(57)【要約】【課題】増幅反応に使用される試薬及び試薬溶液をデコンタミネーションする方法を提供すること。【解決手段】エンドヌクレアーゼ支援ＤＮＡ増幅（「ピンポン」増幅と称される）のためにエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを使用すること、及びピンポン増幅反応の前に、エキソヌクレアーゼ耐性プライマーを含有する増幅溶液をエキソヌクレアーゼで増幅前処理して夾雑核酸を除去することにより、上記課題を解決する。【選択図】図２
2019165739.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＤＮＡに基づいて１以上のアンプリコンを生産する方法であって、
（ａ）標的ＤＮＡを用意する工程と、
（ｂ）１以上のイノシン残基を配列に含む１以上のエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを含むプライマー溶液を用意する工程であって、前記イノシン残基はイノシン類似体であってもよい、工程と、
（ｃ）エキソヌクレアーゼでプライマー溶液を処理して夾雑核酸を除去することによって、プライマー溶液をデコンタミネーションする工程と、
（ｄ）標的ＤＮＡと、プライマー溶液と、鎖置換活性を有する１以上の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼと、イノシン残基の３’側の残基において二本鎖ＤＮＡのイノシン含有鎖にニックを導入することができる１以上のエンドヌクレアーゼとを一緒に混合することによって、ＤＮＡ増幅反応混合物を生成する工程と、
（ｅ）１以上のエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを使用して、ＤＮＡ増幅反応混合物をインキュベートして標的ＤＮＡの１以上の部分を増幅し、１以上のアンプリコンを生産する工程と
を含み、
ヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーのイノシン残基は、３’末端の位置に隣接する位置にあり、前記イノシン残基の５’側又は３’側にホスホロチオエート結合を含有する
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、１以上のエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーと、イノシン残基の３’側の残基においてイノシン残基含有二本鎖ＤＮＡ配列にニックを導入することができる１以上のエンドヌクレアーゼと、１以上の鎖置換ＤＮＡポリメラーゼとを用いる核酸合成方法及び薬剤に関する。それはさらに、ＤＮＡ増幅反応混合物を生成する前に、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを含むプライマー溶液であって、反応緩衝液及び特定のアクセサリータンパク質をさらに含み得るプライマー溶液をエキソヌクレアーゼで前処理して、夾雑核酸を除去する改善されたＤＮＡ増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ増幅は、一本鎖又は二本鎖の標的ＤＮＡをコピーして、複数コピーの標的ＤＮＡを生成するプロセスである。ＤＮＡ鎖は逆平行的かつ相補的であるので、各鎖は、ＤＮＡポリメラーゼによる逆鎖（相補鎖）の生産のテンプレート（鋳型鎖）として機能し得る。鋳型鎖は、全体として又は切断部分として保存され、相補鎖は、ヌクレオシド三リン酸からアセンブルされる。現在、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自立配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）又はローリングサークル増幅（ＲＣＡ）などの様々な効率的な核酸増幅技術が利用可能である。これらの技術の多くは、短期間で多数の増幅産物を生成する。例えば、ＰＣＲでは、標的ＤＮＡ、プライマーペア及びＤＮＡポリメラーゼを混ぜ合せ、融解工程、アニーリング工程及び伸長工程を可能にする反復温度変化に供すると、出発標的ＤＮＡの指数関数的増幅がもたらされる。
【０００３】
ＤＮＡ増幅は、望ましくない偽増幅産物をもたらす非標的又は非特異的増幅反応による高いバックグラウンドシグナルに悩まされることが多い。例えば、核酸増幅反応では、望ましくない核酸（例えば、標的核酸以外の核酸）が様々な形で夾雑して、非標的増幅産物がもたらされ得る。前の増幅反応のキャリーオーバー増幅産物（アンプリコン）から、増幅用のサンプルを収集する部位から、実験室環境の外因性ＤＮＡによって、又は増幅反応に使用する試薬もしくは試薬溶液から、夾雑が生じ得る。核酸テンプレート非依存性プライマー−プライマー相互作用などの様々なプライマージムナスチックスから、非特異的増幅が起こり得る。例えば、プライマーは、（分子内ハイブリダイゼーション又は分子間ハイブリダイゼーションを介した）鎖内プライマーアニーリング又は鎖間プライマーアニーリングによって、プライマー−ダイマー構造を形成し得、増幅され得、標的ＤＮＡ配列の増幅を支配、阻害又は遮蔽することもあり得る。増幅すべき標的核酸を限られた量でしか利用することができない場合には（例えば、単一の標的ＤＮＡ分子からの全ゲノム増幅）、このようなバックグラウンド増幅反応はさらに問題になる。ＤＮＡ増幅技術の増幅効率は高いため、望ましくない核酸分子が、増幅反応に用いる試薬又は試薬溶液にわずかに夾雑したとしても、多量の偽増幅産物又は望ましくない増幅産物が生じ得る。このような増幅技術が診断用途に使用される場合、それらは、偽陽性診断をもたらす可能性がある。
【０００４】
これらの非標的又は非特異的増幅反応を最小限にするために、様々な増幅前滅菌法が開発されている。例えば、ＰＣＲ産物をテンプレートＤＮＡと区別可能にするために、ＰＣＲ増幅において、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）をデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）に置き換える。増幅前工程でウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ酵素（ＵＮＧ）を使用して、組み込まれたウラシル残基においてキャリーオーバーアンプリコンを切断する。同じプライマー及び同じ標的配列を使用する増幅反応では、前の類似増幅反応物からのアンプリコンの酵素的除去も報告されている。これらの方法は、夾雑物アンプリコンは、分子の末端又はその近くにそのプライマー部位を有するのに対して、前のＰＣＲ反応から生じない実質的にすべての他のテンプレートＤＮＡ分子は、そのような位置にそのプライマー部位を有しないという事実を利用する。ＳＤＡ反応では、一本鎖特異的エキソヌクレアーゼがアンプリコンのデコンタミネーションに使用されているのに対して、標的核酸又はアンプリコンのいずれか（又は両方）は一本鎖形態である。このような方法では、標的及びアンプリコンの両方を攻撃したとしても、アンプリコンの長さは短く（２５〜２，０００ヌクレオチド）、二次構造が欠如しているため、アンプリコンが選択的に切断される。試薬溶液をデコンタミネーションするために、ミクロコッカスヌクレアーゼなどの選択的に活性可能な酵素及びＤＮＡ結合剤も用いられている。サンプルを収集する部位に由来する夾雑ＤＮＡを除去又は不活性化するために、サンプルの酵素的、物理的又は化学的な前処理も用いられている。
【０００５】
アンプリコンキャリーオーバーとは別に、核酸を増幅するのに一般に使用される試薬及び試薬溶液はまた、標準的な核酸増幅プロトコール及び手順に潜在的に干渉し得る望ましくない核酸夾雑物を含有し得る。夾雑ＤＮＡは、プライマー又はアンプリコンよりもはるかに長いものであり得、夾雑ＤＮＡに関する具体的な情報はごくわずかであり得ることが多い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／２２１７８５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、増幅反応に使用される試薬及び試薬溶液をデコンタミネーションする必要性が存在する。前述のように、本発明は一般に、エンドヌクレアーゼ支援ＤＮＡ増幅（「ピンポン」増幅と称される）のためにエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを使用すること、及びピンポン増幅反応の前に、エキソヌクレアーゼ耐性プライマーを含有する増幅溶液をエキソヌクレアーゼで増幅前処理して夾雑核酸を除去することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ある実施形態では、標的ＤＮＡと、１以上のエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを含むプライマー溶液とを提供する工程と、標的ＤＮＡと、プライマー溶液と、鎖置換活性を有する１以上の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼと、イノシン残基の３’側の残基において二本鎖ＤＮＡのイノシン含有鎖にニックを導入することができる１以上のエンドヌクレアーゼとを一緒に混合することによって、ＤＮＡ増幅反応混合物を生成する工程と、ＤＮＡ増幅反応物を使用して、標的ＤＮＡの１以上の部分を増幅し、１以上のアンプリコンを生産する工程とを含む核酸増幅方法が使用される。ＤＮＡ増幅混合物を生成する前に、１以上のエキソヌクレアーゼで処理して夾雑核酸を除去することによって、他の核酸増幅試薬（例えば、ｄＮＴＰ、緩衝液、アクセサリータンパク質）をさらに含み得るプライマー溶液をデコンタミネーションし得る。
【０００９】
ある実施形態では、標的ＤＮＡに基づいて１以上のアンプリコンを生産するための方法であって、（ａ）標的ＤＮＡを提供する工程と、（ｂ）エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーから本質的になるプライマー溶液を提供する工程と、（ｃ）エキソヌクレアーゼでプライマー溶液を処理して、プライマー溶液から夾雑核酸を除去する工程と、（ｄ）デコンタミネーション工程（ｃ）の後に、プライマー溶液中のエキソヌクレアーゼを不活性化する工程と、（ｅ）標的ＤＮＡと、デコンタミネーションしたプライマー溶液と、鎖置換活性を有する１以上の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼと、イノシン残基の３’側の残基においてＤＮＡにニックを導入することができる１以上のエンドヌクレアーゼとを一緒に混合することによって、ＤＮＡ増幅反応混合物を生成する工程と、（ｆ）工程（ｅ）のＤＮＡ増幅反応混合物を使用して、標的ＤＮＡの１以上の部分を増幅し、アンプリコンを生産する工程とを含む方法が提供される。プライマー溶液は、ｄＮＴＰ、アクセサリータンパク質及び増幅緩衝液などの他の核酸増幅試薬をさらに含み得る。
【００１０】
キットの実施形態は、１以上のエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーと、鎖置換活性を有する１以上の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼと、イノシン残基の３’側の残基において二本鎖ＤＮＡのイノシン含有鎖にニックを導入することができる１以上のエンドヌクレアーゼとを含む。
【００１１】
添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を読むことによって、本発明のこれらの及び他の特徴、態様並びに利点がより良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】エンドヌクレアーゼ支援核酸増幅反応の実施形態の概略図を示す。
【図２】エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを使用したエンドヌクレアーゼ支援核酸増幅反応の実施形態の概略図を示す。
【図３】エンドヌクレアーゼ支援テンプレートＤＮＡ増幅に対するエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーの効果の例を示す。
【図４】エンドヌクレアーゼ支援テンプレートＤＮＡ増幅の前の、増幅試薬のエキソヌクレアーゼ処理による、夾雑核酸の除去の効果の例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
特許請求の範囲に記載されている発明の主題をより明確かつ簡潔に説明及び指摘するために、以下の説明及び添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語について、以下の定義を提供する。
【００１４】
本明細書で使用される用語「標的ＤＮＡ」は、ＤＮＡ増幅反応において増幅されることが望まれる天然起源又は合成起源のいずれかのＤＮＡ配列を指す。核酸増幅反応では、標的ＤＮＡは、テンプレートとして作用する。ＤＮＡ増幅反応では、ＤＮＡポリメラーゼによって、標的ＤＮＡの一部又は標的ＤＮＡの全領域のいずれかを増幅して、１つ以上の増幅産物（アンプリコン）を生産し得る。標的ＤＮＡは、インビボ又はインビトロで生物学的サンプル（すなわち、生物学的被験体から得られたサンプル）から得られ得る。標的ＤＮＡは、限定されないが、生物学的被験体から、又は生物学的被験体の特定領域（例えば、罹患細胞又は循環腫瘍細胞を含有する領域）から単離された体液（例えば、血液、血漿、血清又は尿）、器官、組織、画分及び切片（例えば、器官又は組織の断面部）及び細胞から得られ得る。標的ＤＮＡを含有するか、又は標的ＤＮＡを含有すると疑われる生物学的サンプルは、真核生物起源、原核生物起源、ウイルス起源又はバクテリオファージ起源のものであり得る。例えば、標的ＤＮＡは、昆虫、原生動物、鳥類、魚類、爬虫類、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウシ、イヌ、モルモット又はウサギ）又は霊長類（例えば、チンパンジー又はヒト）から得られ得る。標的ＤＮＡはまた、ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）であり得る。ｃＤＮＡは、逆転写酵素を使用してＲＮＡテンプレート（例えば、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ）から作製され得る。ライゲーション反応、ＰＣＲ反応などの別の反応によって生成されるＤＮＡ産物又は合成ＤＮＡも、標的ＤＮＡとして機能し得る。標的ＤＮＡは、溶液中に分散され得るか、又は固体支持体（例えば、ブロット、アッセイ、アレイ、ガラススライド、マイクロタイター）上に、ビーズもしくはＥＬＩＳＡプレート上に固定化され得る。
【００１５】
本明細書で使用される用語「夾雑核酸」は、標的ＤＮＡの増幅反応に干渉し得るか、又はＤＮＡ増幅反応で標的ＤＮＡと競合し得る望ましくない核酸（例えば、標的ＤＮＡ以外の核酸）を指す。夾雑核酸は、試薬、試薬溶液、又は標的ＤＮＡの増幅に使用される装置中に存在し得る。換言すれば、夾雑核酸は、実施すべきアッセイにおいて増幅され、さらに特性評価され、存在することが意図されていない核酸である。夾雑核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。例えば、増幅すべき標的ＤＮＡを追加する前に、ＤＮＡ合成反応を実施するのに使用される試薬又は試薬溶液中に存在するＤＮＡは、夾雑核酸であると考えられる。夾雑核酸はまた、前の増幅反応からの前のアンプリコンであり得る。ＤＮＡ合成反応における夾雑核酸は、潜在的なＤＮＡテンプレートとして作用し得るか、又はプライマーとして作用し得るので、ＤＮＡ合成反応に関与して不要な増幅産物をもたらし得る。したがって、夾雑核酸がＤＮＡ増幅反応に干渉しないように、標的ＤＮＡをＤＮＡ増幅反応混合物に追加する前に、このような夾雑核酸を除去することが望ましい。増幅すべきＤＮＡテンプレートが限られた量でしか利用することができない場合には、ＤＮＡ合成反応中の人工物を減少させるために、試薬及び／又は試薬溶液から夾雑ＤＮＡを事前に除去することが特に望まれる。
【００１６】
本明細書で使用される用語「ＤＮＡ増幅反応混合物」は、ＤＮＡ増幅反応を実施するのに必須の試薬の混合物を指す。本明細書に開示されるＤＮＡ増幅反応混合物は、最小限の１以上のエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーと、１以上の標的ＤＮＡと、ｄＮＴＰと、イノシン残基の３’側の残基において二本鎖ＤＮＡのイノシン含有鎖にニックを導入することができる１以上のエンドヌクレアーゼと、鎖置換活性を有する１以上のＤＮＡポリメラーゼとを含む。それは、典型的なＤＮＡ増幅反応に必要な試薬、例えば緩衝液、塩及び他の成分（例えば、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質などのアクセサリータンパク質、尿素、グリセロール又はピロリジンなどの変性剤）をさらに含み得る。
【００１７】
本明細書で使用される用語「デコンタミネーションする」は、溶液又は反応混合物中に存在し得る夾雑核酸が、後のＤＮＡ増幅反応で標的ＤＮＡに干渉することができないように、及び標的ＤＮＡと競合することができないように、それを改変又は修飾することを指す。デコンタミネーションはまた、夾雑核酸を不活性にすること指し得る。デコンタミネーションは、夾雑核酸の化学修飾によって、例えば、夾雑核酸がＤＮＡテンプレート（それがプライマーとして作用する場合）又はＤＮＡポリメラーゼ（それがテンプレートとして作用する場合）と反応することができないように、１つ以上の官能基を除去することによって、作用され得る。また、核酸を分解又は消化することによって、夾雑核酸を不活性にし得る。用いる試薬の性質に応じて、核酸を不活性にする機構は変化し得る。例えば、エキソヌクレアーゼで夾雑核酸を消化して、３’ヒドロキシル基及び５’リン酸基を有する遊離ヌクレオチドを生産することによって、夾雑核酸を不活性にし得る。デコンタミネーションは、夾雑核酸の量の減少、又は夾雑核酸の完全な除去のいずれかをもたらし得る。デコンタミネーションプロセスは、プライマーとして作用し得るか、又は後のＤＮＡ増幅反応のテンプレートとして機能し得るヌクレオチド又はヌクレオチド断片をもたらすことが多い。
【００１８】
本明細書で使用される用語「プライマー」は、標的核酸配列（例えば、標的ＤＮＡ）にハイブリダイズして、核酸合成反応を開始させる短い直鎖状オリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、ＤＮＡオリゴヌクレオチド又はキメラ配列であり得る。プライマーは、天然ヌクレオチド、合成ヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドを含有し得る。例えば、プライマーは、天然に存在するヌクレオチド（Ｇヌクレオチド、Ａヌクレオチド、Ｃヌクレオチド又はＴヌクレオチド）又はそれらの類似体を含み得る。プライマー配列の長さの上限及び下限は両方とも、経験的に決定される。プライマーの長さの下限は、核酸増幅反応条件下で、標的核酸とのハイブリダイゼーション時に安定な二重鎖を形成するのに必要な最小の長さである。非常に短いプライマー（通常は、３ヌクレオチド長未満）は、このようなハイブリダイゼーション条件下で標的核酸との熱力学的に安定な二重鎖を形成しない。上限は、標的核酸中の所定の核酸配列以外の領域において二重鎖形成を有する可能性によって決定されることが多い。一般に、適切なプライマーの長さは、約４ヌクレオチド長〜約４０ヌクレオチド長の範囲である。ある実施形態では、プライマーは、５ヌクレオチド長〜３０ヌクレオチド長の範囲である。用語「フォワードプライマー」は、標的ＤＮＡの第１鎖にアニーリングするプライマーを指し、用語「リバースプライマー」は、標的ＤＮＡの相補的な第２鎖にアニーリングするプライマーを指す。一般に、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ合成を開始して両鎖が複製され得るように、ＰＣＲプライマーと同様の方法で、フォワードプライマー及びリバースプライマーを共に標的ＤＮＡ配列に配向する。
【００１９】
本明細書で使用される用語「イノシン含有プライマー」は、その配列において１以上のイノシン残基を含むプライマーを指す。イノシン残基は、核酸塩基がヒポキサンチンである２’−デオキシリボヌクレオシド又は２’−リボヌクレオシド残基である。イノシン残基は、チミン、アデニン、シチジン又はウリジン残基と塩基対を形成することができる。イノシン残基はまた、イノシン類似体であり得る。例えば、キサンチン構造は、グアニンの脱アミノ化から生じるイノシン残基の代替構造である。イノシン類似体は、核酸塩基がキサンチン、ウリジン、オキサニン（オキサジン）、他のＯ−１プリン類似体、Ｎ−６−ヒドロキシルアミノプリン、ネブラリン、７−デアザヒポキサンチン、他の７−デアザプリン及び２−メチルプリンなどの修飾塩基を含む２’−デオキシリボヌクレオシド又は２’−リボヌクレオシドを指す。イノシン又はイノシン類似体残基は、多くの場合にプライマー配列の３’末端の最後から２番目のヌクレオチドとして、プライマー配列の３’末端近くに配置され得る。
【００２０】
本明細書で使用される用語「エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマー」は、１以上のイノシン残基を含有するプライマー配列であって、エキソヌクレアーゼ酵素の作用に対して耐性である（すなわち、エキソヌクレアーゼによって分解されない）プライマー配列を指す。ある実施形態では、プライマーは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の両方に対して耐性である。ある実施形態では、プライマーは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性に対して耐性である。化学修飾によって、例えば、１以上のホスホロチオエート結合を適切な位置に導入することによって、イノシン含有プライマーをエキソヌクレアーゼ耐性にするように操作し得る。例えば、３’末端ヌクレオチドと最後から２番目の残基との間にホスホロチオエート結合を含有するイノシン含有プライマーは、３’→５’方向のエキソヌクレアーゼの作用に対して耐性である。３’→５’エキソヌクレアーゼは核酸を３’から５’方向に消化するので、この位置のホスホロチオエート結合は、エキソヌクレアーゼの消化作用を妨げる。イノシン残基がホスホロチオエートの５’側に存在する場合、それは、プライマー中に維持されるであろう。同様に、５’末端ヌクレオチドと最後から２番目の残基との間にホスホロチオエート結合を含有するイノシン含有プライマーは、５’→３’方向のエキソヌクレアーゼの作用に対して耐性である。エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーが標的ＤＮＡとハイブリダイズして、二本鎖核酸構造を形成すると、特異的エンドヌクレアーゼが二本鎖構造を認識して、イノシン含有鎖に一本鎖ニックが生じる。例えば、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーが標的ＤＮＡにハイブリダイズすると、エンドヌクレアーゼＶは、イノシン残基の３’側の位置において二本鎖ＤＮＡのイノシン含有鎖にニックを導入することができる。
【００２１】
本明細書で使用される用語「ｄＮＴＰ」は、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ合成に必要とする前駆体として作用するデオキシヌクレオチド三リン酸の混合物を指す。ｄＮＴＰ混合物中の各デオキシヌクレオチド三リン酸は、デオキシリボース糖、有機塩基及び三リン酸形態のリン酸塩を含む。ｄＮＴＰ混合物は、天然に存在する各デオキシヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ又はｄＵＴＰ）を含み得る。ある実施形態では、天然に存在する各デオキシヌクレオチド三リン酸は、合成類似体で代替又は補完され得るが、ただし、イノシン塩基は、ｄＮＴＰ混合物中のグアノシン塩基（Ｇ）を代替及び補完し得ない。ｄＮＴＰ中の各デオキシヌクレオチド三リン酸は、１０μＭ〜２０，０００μＭ、１００μＭ〜１０００μＭ又は２００μＭ〜３００μＭの最終濃度で反応混合物中に存在し得る。
【００２２】
本明細書で使用される用語「アンプリコン」は、標的核酸の増幅から生じる核酸増幅産物を指す。アンプリコンは、増幅産物の混合物（例えば、混合アンプリコン集団）、増幅産物のいくつかの優勢種（例えば、複数の別個のアンプリコン）、又は増幅産物の単一の優勢種を含み得る。アンプリコンの単一種は、当技術分野で認められている技術、例えばアフィニティー精製又は電気泳動を使用して、混合アンプリコン集団から単離され得る。使用される反応スキームに応じて、アンプリコンは、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド又はＲＮＡを含み得る。アンプリコンは、主に一本鎖の、又は部分的に二本鎖の、又は完全に二本鎖のＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド又はＲＮＡであり得る。
【００２３】
本明細書で使用される用語「末端ヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチド又はプライマー配列の末端に位置するヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチド配列の３’末端位置に位置する末端ヌクレオチドは３’末端ヌクレオチドと称され、５’末端位置に位置する末端ヌクレオチドは５’末端ヌクレオチドと称される。最後から２番目の位置に位置するヌクレオチドは、末端ヌクレオチドに直接隣接するヌクレオチドを指す。例えば、ＮＮＮＮＮＮＩＡは、イノシン残基（Ｉ）が最後から２番目の３’位置にあり、アデノシン残基が３’末端ヌクレオチドであるヌクレオチド配列（オクタマー）を示す。
【００２４】
本明細書で使用される用語「突然変異型エンドヌクレアーゼ」又は「人工エンドヌクレアーゼ」は、遺伝子工学又はタンパク質工学によって作製されたエンドヌクレアーゼ酵素であって、１つ以上のアミノ酸残基が野生型エンドヌクレアーゼから改変されているエンドヌクレアーゼ酵素を指す。改変としては、１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入が挙げられ得る。本明細書及び特許請求の範囲を通して、タンパク質配列の１つの特定位置におけるアミノ酸の置換は、「（野生型酵素におけるアミノ酸残基）（野生型酵素におけるアミノ酸の位置）（人工酵素におけるアミノ酸残基）」という表記を使用して言及される。例えば、Ｙ７５Ａという表記は、野生型酵素の７５番目の位置のチロシン（Ｙ）残基の、（突然変異型／人工酵素における）アラニン（Ａ）残基による置換を指す。
【００２５】
本明細書で使用される用語「保存的変異体」は、アミノ酸配列及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、用語「保存的変異体」は、同一又は類似のアミノ酸配列（すなわち、類似の物理化学的特性を有するアミノ酸配列）をコードする核酸であって、縮重配列を含む核酸を指す。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵはすべて、アラニンをコードする。したがって、アラニンが指定されるすべてのアミノ酸位置において、対応するヌクレオチド配列を構築する際に、これらのコドンのいずれかを互換的に使用し得る。（それが配列中の唯一の改変であると仮定すれば）このような核酸変異体は、同じタンパク質をコードするので保存的変異体である。当業者であれば、ＡＵＧ（メチオニンの唯一のコドン）及びＵＧＧ（トリプトファン）を除いて、核酸中の各コドンを保存的に改変して、機能的に同一のペプチド又はタンパク質分子を作製し得ると認識する。アミノ酸配列に関して、当業者であれば、単一のアミノ酸又は少数（典型的には、約１０個未満）のアミノ酸の置換、欠失又は付加によるポリペプチド又はタンパク質配列の改変は、改変したポリペプチド又はタンパク質配列の物理化学的特性が元のものと類似である場合には、「保存的変異体」であり得ると認識するであろう。一部の場合では、改変は、化学的に類似のアミノ酸による１個のアミノ酸の置換であり得る。保存的変異体の例としては、限定されないが、ある疎水性残基（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニン）の相互置換、又はある極性残基による別の極性残基の置換（例えば、アルギニンによるリジンの置換、グルタミンによるアスパラギン酸の置換、又はグルタミンによるアスパラギンの置換）などが挙げられる。遺伝的にコードされたアミノ酸は、一般に、４つのファミリーに分けられ得る：（１）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸、（２）塩基性：リジン、アルギニン、ヒスチジン、（３）非極性：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、及び（４）非荷電極性：グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。
【００２６】
エンドヌクレアーゼ支援ＤＮＡ増幅アッセイのための方法及びキットの１つ以上の実施形態は、イノシン残基の３’側の位置において二本鎖核酸のイノシン含有鎖にニックを導入することができる酵素の使用を含む。ある実施形態では、エンドヌクレアーゼは、遺伝子操作エンドヌクレアーゼである。本明細書に記載されるＤＮＡ増幅アッセイは、１以上のイノシン残基を含むエキソヌクレアーゼ耐性プライマーをさらに用いる。ＤＮＡ増幅反応の前に、適切なエキソヌクレアーゼで処理することによって、エキソヌクレアーゼ耐性プライマー溶液をデコンタミネーションし得る。
【００２７】
ＤＮＡ増幅アッセイについて、特定の標的ＤＮＡを含有することが公知の、又は特定の標的ＤＮＡを含有すると疑われるサンプルは、様々な供給源から得られ得る。サンプルは、例えば、生物学的サンプル、食品、農業サンプル又は環境サンプルであり得る。サンプルはまた、原核生物又は真核生物起源を含む様々な生物学的被験体に由来し得、ウイルスを含む。サンプルは、生体組織又は体液又は浸出液（例えば、血液、血漿、血清又は尿、乳、脳脊髄液、胸膜液、リンパ液、涙、痰、唾液、便、肺吸引物、咽喉又は生殖器スワブなど）、全細胞、循環腫瘍細胞、細胞画分又は培養物に由来し得る。
【００２８】
核酸アッセイの標的ＤＮＡは、溶液中に分散され得るか、又は固体支持体（例えば、ブロット、ペーパーパンチ、アレイ、マイクロタイター又はウェルプレートなど）上に固定化され得る。標的ＤＮＡは、一本鎖又は二本鎖のいずれかであり得る。標的ＤＮＡテンプレートは、環状ＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡ又はニック導入ＤＮＡであり得る。ＤＮＡテンプレートは、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はｃＤＮＡであり得る。標的ＤＮＡを前処理して、それをプライマーとのハイブリダイゼーションに利用可能にし得る。例えば、標的ＤＮＡが二本鎖形態である場合、それを変性させて、一本鎖形態の標的ＤＮＡを生成し得る。標的二本鎖ＤＮＡを熱的もしくは化学的に変性させ得るか、又は熱的かつ化学的に変性させ得る。ある実施形態では、二本鎖ＤＮＡの融解温度を低下させる変性剤（例えば、グリセロール、エチレングリコール、ホルムアミド又はそれらの組合せ）を使用して、二本鎖ＤＮＡを化学的に変性させる。特定の実施形態では、反応混合物に追加する変性剤の１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）毎に、変性剤は、融解温度を３℃〜６℃低下させる。変性剤又は変性剤の組合せは、反応混合物の１％、５％、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）又は２５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含み得る。特定の実施形態では、変性剤は、エチレングリコールを含む。代替的な実施形態では、変性剤は、グリセロール（例えば、１０％）及びエチレングリコール（例えば、１５％〜２０％）の組合せである。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを低下させる塩を反応緩衝液に低濃度で含めて、標的ＤＮＡを低温で化学的に変性させ得る。標的ＤＮＡを熱的に変性させる実施形態では、変性工程は、（例えば、標的ＤＮＡを９５℃で加熱することによって）標的ＤＮＡを熱的に変性させることを含む。
【００２９】
ある実施形態では、エンドヌクレアーゼ支援ＤＮＡ増幅方法は、標的ＤＮＡに基づいて１以上のアンプリコンを生産する。最初に、標的ＤＮＡをエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーとハイブリダイズさせ、続いて、イノシン残基の３’側の位置において二本鎖核酸のイノシン含有鎖にニックを導入することができるエンドヌクレアーゼの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、鎖置換ポリメラーゼ）及びｄＮＴＰを使用して、標的ＤＮＡを増幅する。ｄＮＴＰは、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ合成に必要とするデオキシリボヌクレオチドの組合せを提供する。ＤＮＡポリメラーゼは、ｄＮＴＰ混合物を使用して、ＤＮＡの鋳型鎖に相補的にアニーリングしたプライマーの３’ヒドロキシル末端にヌクレオチドを追加し、標的ＤＮＡテンプレートに相補的な新たなＤＮＡ鎖（アンプリコン）を作る。ある実施形態では、天然に存在する各デオキシヌクレオチドは、合成類似体で代替又は補完され得る。ただし、デオキシイノシン三リン酸（ｄＩＴＰ）は、ｄＮＴＰ混合物中のｄＧＴＰを代替及び補完し得ない。ＤＮＡ増幅反応の産物は、鋳型鎖の末端に伸長することが多い一本鎖又は二本鎖ＤＮＡであり得る。イノシン含有プライマー中のイノシンヌクレオチドは、イノシン含有プライマーの５’末端の少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド又は少なくとも１０ヌクレオチド下流に配置され得る。例えば、イノシン含有ランダムオクタマープライマーは、ＮＮＮＩＮＮＮＮ又はＮＮＮＮＩＮＮなどの配列を有し得る。特定の実施形態では、イノシンヌクレオチドは、プライマーの最後から２番目の３’ヌクレオチドであり得る。代替的な実施形態では、イノシンは、最後から２番目３’残基及び最後の３’残基の両方に存在し得る。ある実施形態では、イノシン含有プライマーは、イノシン類似体を含む。ある実施形態では、ＤＮＡ増幅方法は、標的ＤＮＡと、１以上のエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを含むプライマー溶液とを提供する工程と、標的ＤＮＡと、プライマー溶液と、鎖置換活性を有する１以上の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼと、イノシン残基の３’側の残基において二本鎖ＤＮＡのイノシン含有鎖にニックを導入することができる１以上のエンドヌクレアーゼとを一緒に混合することによって、ＤＮＡ増幅反応混合物を生成する工程と、ＤＮＡ増幅反応物を使用して、標的ＤＮＡの１以上の部分を増幅し、１以上のアンプリコンを生産する工程とを含む。１以上のエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーは、フォワードプライマー又はリバースプライマー又はその両方の混合物であり得る。エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーとは別に、プライマー溶液は、ｄＮＴＰ及び緩衝液などの他の必須の核酸増幅試薬を含み得る。プライマー溶液はまた、ＤＮＡ増幅反応を増強又は支援する試薬、例えば一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢタンパク質）、ホルムアミド、エチレングリコール又はフィコールの１つ以上を含み得る。ＤＮＡ増幅混合物を生成する前に、適切なエキソヌクレアーゼでプライマー溶液を処理して夾雑核酸を除去することによって、プライマー溶液をデコンタミネーションし得る。さらに、デコンタミネーション反応の後、ＤＮＡ増幅反応の前に、追加したエキソヌクレアーゼを不活性化し得る。ある実施形態では、等温増幅法を用いることによって、標的ＤＮＡを増幅する。
【００３０】
図１は、エンドヌクレアーゼ支援標的ＤＮＡ増幅の実施形態の概略図を示す。イノシン含有プライマーが標的ＤＮＡに結合すると、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、５’→３エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ）がイノシン含有プライマーを伸長し、それにより、二本鎖ＤＮＡ（プライマー伸長産物）が生成される。伸長反応は、イノシン残基の３’側の位置において二本鎖ＤＮＡのイノシン含有鎖に一本鎖ニックを作ることができるエンドヌクレアーゼのニック導入部位を作る。エンドヌクレアーゼは、このニック導入部位において二本鎖ＤＮＡにニックを導入する。ニック導入は、ＤＮＡポリメラーゼの新たなＤＮＡ合成開始部位を作る。ＤＮＡポリメラーゼはこの開始部位に結合し、ニック導入プライマーをさらに伸長する。ＤＮＡポリメラーゼは鎖置換活性を有するので、一本鎖ＤＮＡ産物を置換する一方、二本鎖プライマー伸長産物を再形成する。このサイクルが繰り返されて、標的ＤＮＡテンプレートの下流部分に相補的な複数の一本鎖ＤＮＡが合成される。さらなるプライマー又は他のオリゴヌクレオチド、さらなる酵素、さらなるヌクレオチド、染色、色素又は他の標識成分を用いることによって、図１に示されている核酸増幅の概略図は変化し得る。例えば、場合により、色素標識ジデオキシヌクレオチドターミネーターを追加することによって、シングルプライマーによる増幅を、ジデオキシ配列決定、各テンプレート分子の多重配列決定産物の生産に使用し得る。ｍＲＮＡサンプル由来の配列タグ付オリゴｄＴプライマーを用いて作られた二本鎖ｃＤＮＡから、標識プローブを作製し得る。シングルプライマーは、同定及び／又は単離を容易にし得るタグ配列の相補体であり得る。この反応では、エンドヌクレアーゼＶを適切な酵素として使用し得る。エンドヌクレアーゼＶは、イノシン（又はイノシン類似体）を含有するＤＮＡを認識する修復酵素であって、イノシンの３’側の２番目又は３番目のリン酸ジエステル結合を加水分解する（すなわち、イノシンヌクレオチドの２ヌクレオチド３’側の位置（約９５％が２番目のリン酸ジエステル結合であり、約５％が３番目のリン酸ジエステル結合である）においてＤＮＡに特異的にニックを導入する）修復酵素であり、３’−ヒドロキシル及び５’−リン酸を有するニックが残る。標的ＤＮＡが二本鎖である場合、ニックは、イノシン残基を含む鎖において発生する。
【００３１】
ある実施形態では、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼＶ及びエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーをＤＮＡ増幅反応に用いる。ＤＮＡ増幅では、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーは、標的ＤＮＡとハイブリダイズする。プライマー中のイノシン残基は、ヒポキサンチンがグアニンに代わってシトシンと相補しているか、又はアデニンに代わってチミンと相補している標的ＤＮＡ中のシチジン残基又はチミジン残基と塩基対を形成し得る。次いで、ＤＮＡ合成によって、標的ＤＮＡテンプレートの相補鎖が生成され、それにより、二本鎖ＤＮＡが生成される。次に、二本鎖ＤＮＡの生成が、エンドヌクレアーゼＶのニック導入部位を生成する。エンドヌクレアーゼＶは、この二本鎖ＤＮＡのイノシン含有鎖にニックを導入する。次いで、ＤＮＡポリメラーゼが、ニック導入位置から相補鎖を再度生成する。この伸長工程が、エンドヌクレアーゼＶのニック導入部位を再度生成する。したがって、ＤＮＡ増幅反応混合物中の必須ＤＮＡ増幅試薬のいずれか１つが使い果たされるまで、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長と、それに続くエンドヌクレアーゼＶによるニック導入が複数回繰り返される。各サイクルでは、これらの反応に用いられる鎖置換ＤＮＡポリメラーゼが、前のサイクルで生成された相補鎖を置換する。ハイブリダイゼーション、伸長、ニック導入及びさらなる伸長の工程は、実質的に同時に起こり得る。したがって、方法の１つ以上の実施形態は、（オリゴヌクレオチドプライマーを介して）イノシン残基を標的核酸の特定位置に導入し、続いて、ポリメラーゼと、生成された二本鎖核酸のイノシン含有鎖にニックを導入して、ポリメラーゼによる２回目の相補鎖生成サイクルを開始させるエンドヌクレアーゼＶとを使用して、標的核酸の相補鎖を繰り返し生成すること含む。
【００３２】
図２は、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを使用した、エンドヌクレアーゼ支援増幅反応の実施形態の概略図を示す。増幅反応に使用されるエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーの配列は、典型的には、増幅すべきＤＮＡテンプレートの配列、及び／又は増幅の所望の種類（例えば、ランダム対特異的）に依存する。ある実施形態では、本明細書で使用されるエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーは、５’末端残基の少なくとも４ヌクレオチド下流に位置する１以上のイノシン残基を含む。エキソヌクレアーゼ耐性プライマーは、それらをエキソヌクレアーゼ消化に対して耐性にする修飾ヌクレオチドを含み得る。ある実施形態では、プライマーは、プライマーをエキソヌクレアーゼによる（特に、３’→５’エキソヌクレアーゼによる）分解に対して耐性にする１以上のヌクレオチドを含有する。修飾ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチドであり得る。例えば、エキソヌクレアーゼ耐性プライマーは、配列中のヌクレオチド間に１つ、２つ、３つ又は４つのホスホロチオエート結合を有し得る（例えば、ＮＮＮＮＮ＊Ｎ＊Ｎ＊Ｉ＊Ｎ又はＮ＊ＮＮＮＮ＊Ｎ＊Ｎ＊Ｉ＊Ｎ）。修飾ヌクレオチドは、一般に、最後から２番目のイノシン残基を有するプライマー配列の３’末端ヌクレオチドである（例えば、（ＮＮＮ）nＮＩ＊Ｎ又は（ＮＮＮ）nＮＩ＊Ｉ（＊は、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を表し、ｎの整数値は、使用されるプライマーの長さに応じた範囲であり得、例えば、ｎの値は、０〜１３の範囲であり得る）。しかしながら、ある実施形態では、プライマーは、イノシン残基として修飾ヌクレオチドを有し得る（例えば、ＮＮＮＮＮＮ＊ＩＮ）。ある実施形態では、プライマー配列が、修飾残基の隣に位置する１以上のイノシン残基を含有することを条件として、修飾ヌクレオチドは、３’末端位置以外の位置に配置され得る（例えば、ＮＮＮＮＩ＊ＮＮＮＮ又はＮＮＮＮ＊ＩＮＮＮＮ）。修飾ヌクレオチドが、プライマー配列の３’末端以外の位置に位置する場合、プライマーの３’末端ヌクレオチドは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性によって除去され得る。いくつかのエンドヌクレアーゼＶは、関連３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有し得る。チオエートイノシンプライマーは、エンドヌクレアーゼＶがイノシンを除去するのを妨げ得る。ヌクレオチド配列をエキソヌクレアーゼ耐性にする当技術分野で公知の他のヌクレオチド修飾も同様に使用し得る。
【００３３】
増幅すべきＤＮＡテンプレートの配列及び性質に応じて、エキソヌクレアーゼ耐性でもある適切なイノシン含有プライマーを設計及び選択し得る。当技術分野で認められている合成技術のいずれかを使用して、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを合成し得る。エキソヌクレアーゼ耐性のイノシン含有シングルプライマー、イノシン含有ペアプライマー又はイノシン含有ネステッドペアプライマーを使用して、アンプリコンを生成し得る。ＡｕｔｏＤｉｍｅｒ（商標）などのプライマー設計ソフトウェアを用いて、核酸にアニーリングしてポリメラーゼ伸長を容易にすることができるシングルプライマー又はマルチプルプライマーを設計し得る。約６ｍＭの塩濃度でプライマーの融解温度が約５０℃になるように、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを設計し得る。ある実施形態では、比較的短いプライマー（例えば、１０ｍｅｒ〜２０ｍｅｒ、より好ましくは１４ｍｅｒ〜１８ｍｅｒ、最も好ましくは１６ｍｅｒ）を用い得る。エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーは、特異的プライマー又はランダムプライマーのいずれかであり得る。全ゲノム増幅反応では、イノシン残基以外のすべての残基をランダム化することによって作製されたプライマーを含むランダムプライマー混合物を使用し得る。シングルプライマー又はマルチプルプライマーのいずれかを増幅に用い得る。特異的プライマーは、標的ＤＮＡテンプレート中に存在する所定の配列に対して、ワトソン−クリックの意味で相補的なヌクレオチド配列を有するか、又はヌクレオチド配列を有するように操作される。
【００３４】
ある実施形態では、イノシン残基が、標的ＤＮＡ中のシトシン残基に相補的なプライマー中の位置に配置されるように、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを設計する。ある実施形態では、イノシンは、プライマーの最後から２番目の３’塩基として現れる。反応条件（例えば、温度及びイオン強度）は、標的ＤＮＡに対するプライマーのアニーリングに影響を与えるので、反応条件にしたがって、プライマー中のイノシンの最適な位置を調整し得る。一般に、エンドヌクレアーゼによるニック導入後においても、プライマーが標的ＤＮＡにアニーリングし続ける（例えば、核酸アッセイ反応条件下で、ニック導入プライマーの長さが、標的ＤＮＡに結合することができるのに十分である）ように、イノシン残基をプライマーの５’末端から離して配置する。したがって、イノシンの５’側のプライマーセグメントは、選択された反応条件で、反応温度にほぼ等しい融解温度を有すべきである。ある実施形態では、イノシン含有プライマーは、複数のイノシン残基又はイノシン類似体を含み得る。２つのテンプレートＧｓが１列にある場合、２つのイノシンが、最後から２番目の３’残基及び最後の残基の両方としてプライマー中に現れ得る。この場合、エンドヌクレアーゼが、いずれかのイノシン残基の２ヌクレオチド３’側にニックを導入することは、ニック導入ＤＮＡ鎖を作るのと同じ効果を有するであろう。イノシン残基は、最後から２番目の３’位置及び末端の３’位置の両方に位置し得る。これら２つのイノシンは、ホスホロチオエート結合によって連結され得る。ある実施形態では、イノシン含有プライマーは、反応混合物中で２５℃〜８０℃、３０℃〜６５℃又は４０℃〜５５℃の溶融温度を示し得る。ある実施形態では、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーは、反応混合物中で５０℃の融解温度を示す。
【００３５】
シングルフォワードプライマーを用いると、標的ＤＮＡの相補的コピーの合成速度は比較的一定であり、相補的コピーの数は時間と共に着実に直線的に増加する。ある実施形態では、１以上のイノシン残基をそれぞれが含有するエキソヌクレアーゼ耐性のマルチプルプライマーを反応混合物中に含めて、増幅プロセスを加速させ得る。プラス鎖及びマイナス鎖の両方が生成される実施形態では、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含むペアプライマーを反応混合物中に含め得る。例えば、フォワードプライマーから所定の距離で標的ＤＮＡの相補鎖にアニーリングするリバースプライマー（生成された相補鎖（（＋）鎖）にアニーリングして、逆方向の（−）鎖をさらに生成するプライマー）を追加すると、増幅プロセスが加速する。これらの各プライマーの標的は元のテンプレート中に存在するので、２つのプライマースキームで両方の鎖を増幅する（「ピン産物」はフォワードプライマーのアンプリコンであり、「ポン産物」はリバースプライマーのアンプリコンである）。マルチプルペアプライマーを含めることにより、反応混合物中の別個の産物の相対的割合を改善し得る。最も内側のフォワードプライマー及び最も内側のリバースプライマーを互いに対して比較的近くに（例えば、約５０塩基未満離して）配置して、フォワードアンプリコン（（＋）鎖）が、エンドヌクレアーゼＶ切断部位によって規定されるその５’末端に到達するのに必要な時間を最小限にし、それにより、標的ＤＮＡからアンプリコンを生成するのに必要な総時間を減少させ得る。ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ又は他の成分の量が限定的になると、反応速度が最大に達する。また、１以上のイノシン残基をそれぞれが含有するエキソヌクレアーゼ耐性のさらなるネステッドプライマーペアを使用して、増幅速度をさらに増加させ得るか、又は反応の特異性を増加させ得る。元の標的において、一連の各プライマーが互いに隣り合ってハイブリダイズするように、ネステッドプライマーを、前のアンプリコンの３’末端又はその近くに結合するように設計し得る。マルチプルネステッドプライマーを使用する場合、濃度１ｎｇ〜１０μｇのＳＳＢタンパク質を容量１０μＬで反応混合物に含めて、忠実性を増加させ、バックグラウンドを減少させ得る。マルチプルペアプライマーによる増幅は、特定の配列の存在を検出するために、サンプル中に存在する配列の量を定量するために、又はサイズ測定、制限酵素消化、配列決定、ハイブリダイゼーションもしくは他の分子生物学的技術の方法（例えば、電気泳動）による分析のための大量の配列を生産するために有用な迅速かつ大規模な増幅を容易にする。
【００３６】
ある実施形態では、特定のプライマー配列（例えば、ハイブリダイズしたアンプリコンＤＮＡの末端にさらなる配列を追加することを可能にするさらなる５’配列であって、プロモーター配列又は制限エンドヌクレアーゼ部位特異的配列又は新規プライマー結合部位配列を生成するのに使用されるさらなる５’配列を含有するプライマー）である伸長テンプレートを、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーに組み込むことによって、アンプリコンの３’末端にアニーリングさせ得る。アンプリコンの３’末端にアニーリングするように、伸長テンプレートを設計し得る。伸長テンプレートが２つの配列ストレッチ（１つはアンプリコンに相補的であり、１つはアンプリコンに相補的ではない）を含有する場合、ハイブリダイゼーションは、非相補的プライマー配列の５’オーバーハングを作る。次いで、ＤＮＡポリメラーゼが、アンプリコンの３’陥凹末端をさらに伸長し得る。この伸長反応を用いて、特定のＤＮＡ配列をアンプリコンの３’末端に組み込み得る。ある実施形態では、伸長テンプレートの５’末端は、共鳴エネルギー移動によって蛍光色素が主にクエンチされるように、蛍光色素及びクエンチャーがステムのいずれかのアーム上に位置するヘアピンループを含有し得る。ＤＮＡポリメラーゼがアンプリコンの３’陥凹末端を伸長すると、ステム−ループ構造が二本鎖構造に変換され、色素及びクエンチャーのさらなる分離が引き起こされる。これにより、蛍光消光の一部又は全部が排除されて、検出可能なシグナルが生成される。２つ以上の独立した増幅プロセスを同時にモニタリングし得るように、伸長テンプレートの適切な選択及びクエンチされる色素の色によって、このシグナルを多重化し得る。ある実施形態では、伸長テンプレートの５’末端は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の相補体を含み得る。したがって、伸長テンプレートをアンプリコンにハイブリダイズさせ、続いて、ＤＮＡポリメラーゼがアンプリコンの３’陥凹末端を伸長することによって、二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを生成し得る。ＲＮＡポリメラーゼを反応物に含める場合、次いで、一本鎖ＲＮＡポリメラーゼテンプレートとしてアンプリコンを転写して、対応するＲＮＡを生成し得る。
【００３７】
エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーは、エキソヌクレアーゼの作用に対して耐性であるので、ＤＮＡ増幅反応混合物に追加する前に、プライマーを含有する溶液をエキソヌクレアーゼで前処理し得る。エキソヌクレアーゼ処理は、プライマー液中に存在し得る夾雑核酸を除去するか、又は減少させる。エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを含有する溶液は、本明細書に記載されるＤＮＡ増幅反応に必要な他の試薬（標的ＤＮＡを除く）、例えばｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、緩衝液及び／又は一本鎖結合タンパク質をさらに含み得る。ＤＮＡポリメラーゼをプライマー溶液に含める場合、それがエキソヌクレアーゼ不活性化工程に耐え得るように選択すべきである。さらに、デコンタミネーション工程において、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼなどの校正ＤＮＡポリメラーゼをエキソヌクレアーゼとして使用する場合、プライマー溶液は、いかなるｄＮＴＰも含有すべきではない。プライマー溶液を、エキソヌクレアーゼと、エキソヌクレアーゼが夾雑核酸を不活性にすることを可能にするための二価陽イオンと共にインキュベートすることによって、プライマー溶液のデコンタミネーションを達成することが多い。単一のエキソヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼの組合せを使用して、プライマー溶液をデコンタミネーションし得る。ある実施形態では、エキソヌクレアーゼの１つ以上を反応に使用し得る。本発明に使用され得る適切なエキソヌクレアーゼとしては、限定されないが、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、Ｔ７遺伝子−６エキソヌクレアーゼ、脾臓エキソヌクレアーゼ、Ｔ５  Ｄ１５エキソヌクレアーゼ及びラムダエキソヌクレアーゼが挙げられる。一実施形態では、エキソヌクレアーゼＩ及びエキソヌクレアーゼＩＩＩの組合せをプライマー溶液のデコンタミネーションに使用する。Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを適切なエキソヌクレアーゼとして使用する場合、プライマー溶液を４５度でインキュベートすることによって、それを非常に容易に不活性化し得るので、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ増幅に使用される温度で不活性である。
【００３８】
エキソヌクレアーゼを活性化し得る二価陽イオンを、デコンタミネーション反応に使用し得る。いくつかの非限定的な例としては、マグネシウム及びマンガンが挙げられる。二価陽イオンの濃度は、エキソヌクレアーゼの濃度に主に依存する。エキソヌクレアーゼの濃度を決定するいくつかパラメータとしては、夾雑核酸の量、特定のエキソヌクレアーゼのターンオーバー、及びエキソヌクレアーゼ活性の他の動態パラメータが挙げられる。ある実施形態では、エキソヌクレアーゼに対してモル過剰の二価陽イオンを、プライマー溶液のデコンタミネーションに使用する。エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを含有するプライマー溶液を、エキソヌクレアーゼ及び二価陽イオンと共に、夾雑核酸を不活性にするのに十分な時間インキュベートする。インキュベーション時間は、使用するエキソヌクレアーゼ及び二価陽イオンの動態特性に応じて変化し得る。インキュベーション時間はまた、インキュベーションを実施する温度に依存し得る。核酸の存在を特性評価するための当技術分野で公知の技術のいずれかを用いて、デコンタミネーションプロセスの効率を分析することによって、インキュベーション時間を最適化し得る。適切なインキュベーション時間は、約５分間〜約３時間の範囲であり得る。ある実施形態では、インキュベーション時間は、約１分間〜約１００分間の範囲であり得る。いくつかの特定の実施形態では、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを含有するプライマー溶液を、エキソヌクレアーゼ及び二価陽イオンと共に、３７℃で約６０分間インキュベートし得る。プライマー溶液のインキュベーションを実施する温度は、使用する特定のエキソヌクレアーゼの性質によって変化し得る。インキュベーションに使用し得る最高温度は、エキソヌクレアーゼの安定性によって制限され、インキュベーションに用い得る最低温度は、その温度におけるエキソヌクレアーゼ活性によって決定される。ある実施形態では、インキュベーションを５０℃以下の温度で実施する。ある実施形態では、適切なインキュベーション温度は、約０℃〜約４５℃の範囲である。いくつかの特定の実施形態では、インキュベーションを約１０℃〜約４０℃の温度で実施し得る。
【００３９】
ある実施形態では、デコンタミネーションのために、適切なエンドヌクレアーゼをエキソヌクレアーゼと共にプライマー溶液に追加し得る。夾雑核酸が環状ＤＮＡを含み得る実施形態では、又はプライマーの骨格全体がヌクレアーゼ耐性である実施形態では、これは特に有用である。エンドヌクレアーゼは環状ＤＮＡに対して作用して、それらにニックを導入する。ニックが作られると、エキソヌクレアーゼが夾雑物のニック導入ＤＮＡに対して作用し、それらを分解してそれらを不活性し得る。適切なエンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、ＤＮＡｓｅＩなどのＤＮＡｓｅが挙げられる。
【００４０】
ある実施形態では、ＳＳＢタンパク質を、エキソヌクレアーゼと共に、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを含有するプライマー溶液に追加し得る。適切なＳＳＢタンパク質としては、限定されないが、極めて熱安定性の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＥＴ  ＳＳＢ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＭＡ製）、ｒｅｃＡ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡ）、Ｔｔｈ  ＲｅｃＡ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから単離されたＲｅｃＡホモログ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＭＡ製）、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質、Ｔ７遺伝子２．５タンパク質、Ｎｃｐ７及びＥ．ｃｏｌｉ  ＳＳＢタンパク質が挙げられ得る。エキソヌクレアーゼ耐性プライマーを含む溶液へのエキソヌクレアーゼ、二価陽イオン及び／又はＳＳＢの追加を逐次に又は同時に実施し得る。逐次追加を実施する実施形態では、特定の順序で追加を行い得る。例えば、ある実施形態では、最初に、エキソヌクレアーゼ及び二価陽イオンを混合し、次いで、プライマー溶液に追加し、続いて、ＳＳＢタンパク質を追加し得る。いくつかの他の実施形態では、最初に、プライマー溶液をＳＳＢタンパク質と接触させ得、次いで、エキソヌクレアーゼ及び二価陽イオンを追加し得る。
【００４１】
エキソヌクレアーゼを使用するデコンタミネーション工程の後、プライマー溶液中のエキソヌクレアーゼを不活性化し得る。当技術分野で利用可能な様々な方法によって、エキソヌクレアーゼを不活性化し得る。特定の一実施形態では、エキソヌクレアーゼの熱変性によって、エキソヌクレアーゼを不活性化し得る。デコンタミネーションしたプライマー溶液を、ヌクレアーゼが安定ではない温度でインキュベートすることによって、これを達成し得る。エキソヌクレアーゼを不活性化するのに十分な特定の時間にわたって、インキュベーションを実施する。ある実施形態では、デコンタミネーションしたプライマー溶液を６５℃以上の温度でインキュベートすることによって、これを達成し得る。ある実施形態では、デコンタミネーションしたプライマー溶液を６５℃〜約９５℃の温度でインキュベートし得る。エキソヌクレアーゼを熱的に不活性化するのに十分な時間は、使用する温度、及び関与するヌクレアーゼの種類に応じて変化し得る。典型的には、熱不活性化を約３０秒間〜約２時間実施し得る。ある実施形態では、デコンタミネーションしたプライマー溶液を約８５℃で１５分間インキュベートし、次いで約９５℃で５分間インキュベートし得る。エキソヌクレアーゼを熱的に不活性化するのに必要な期間及び温度を最適化し得る。夾雑核酸を除去するためのエキソヌクレアーゼ処理工程において、プライマー溶液が、他の試薬と共に、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼＶを含有する特定の実施形態では、エキソヌクレアーゼを不活性化して、又はエキソヌクレアーゼを不活性化せずに、ＤＮＡ増幅反応を実施し得る。不活性化工程を使用しない実施形態では、ＤＮＡ増幅反応に干渉しないように、エキソヌクレアーゼの量を選択し得る。不活性化工程を実施することが必要な実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼを不活性化せずにエキソヌクレアーゼを選択的に不活性化し得るように、ＤＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼＶ及びエキソヌクレアーゼを選択するか、又はデコンタミネーションに使用したエキソヌクレアーゼを不活性化した後においてのみ、ＤＮＡポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼＶを、デコンタミネーションしたプライマー溶液に追加する。
【００４２】
実質的にすべての夾雑核酸を不活性化したら、増幅すべきＤＮＡテンプレートを、デコンタミネーションしたプライマー溶液に追加し得る。デコンタミネーション工程において、鎖置換活性を有する１以上のＤＮＡポリメラーゼと、イノシン残基の３’側の残基において二本鎖ＤＮＡのイノシン含有鎖にニックを導入することができる１以上のエンドヌクレアーゼと、遊離ヌクレオチドとがプライマー溶液中にまだ存在していない場合には、それらもプライマー溶液に追加する。分解した夾雑核酸はＤＮＡ合成反応に干渉しないので、それらを、デコンタミネーションしたプライマー溶液から除去することは不要であり得る。ＤＮＡテンプレートを増幅するのに用い得るＤＮＡポリメラーゼは、校正ＤＮＡポリメラーゼ又は非校正ＤＮＡポリメラーゼであり得る。いくつかの特定の実施形態では、校正ＤＮＡポリメラーゼ及び非校正ＤＮＡポリメラーゼの組合せを、ＤＮＡテンプレートの効率的な増幅に使用し得る。
【００４３】
ある実施形態では、等温条件下でＤＮＡ増幅反応を実施する。等温増幅反応条件中の反応温度は、設定温度から１℃、５℃又は１０℃の範囲であり得る。ある実施形態では、ＤＮＡ増幅の反応温度を４５℃（±１℃）に保持する。ＤＮＡ増幅反応の反応温度に応じて、熱安定性エンドヌクレアーゼ及び熱ＤＮＡポリメラーゼを使用し得る。
【００４４】
当技術分野で公知のＤＮＡポリメラーゼのいずれかをＤＮＡ増幅に用い得る。本発明の方法に使用するのに適切なＤＮＡポリメラーゼは、以下の特徴の１つ以上示し得る：鎖置換活性、ニックから鎖置換を開始する能力、及び／又は低い一本鎖ＤＮＡ分解活性。ある実施形態では、用いるＤＮＡポリメラーゼは、１つ以上のエキソヌクレアーゼ活性を欠き得る。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼであり得るか、又はＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠き得る。ある実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の両方を欠き得る（すなわち、エキソ（−）ＤＮＡポリメラーゼ）。方法に有用な例示的なＤＮＡポリメラーゼとしては、限定されないが、クレノウ、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼの大断片）、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損デルタＴｔｓ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ（−）クレノウ又はエキソ（−）Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標））が挙げられる。
【００４５】
ある実施形態では、校正ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡ増幅反応に使用し得る。いくつかの特定の実施形態では、デコンタミネーションしたプライマー溶液に追加する前に、校正ＤＮＡポリメラーゼを含有する溶液もデコンタミネーションし得る。ｄＮＴＰの非存在下、二価陽イオン（例えば、Ｍｇ２＋又はＭｎ２＋）で前処理することによって、校正ＤＮＡポリメラーゼ溶液のデコンタミネーションを達成し得る。一実施形態では、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを用い、テンプレートＤＮＡの増幅を行うために、デコンタミネーションしたプライマー溶液に追加する前に、夾雑核酸を不活性化するのに十分な時間にわたって、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ溶液をマグネシウムイオンと共に特定温度でインキュベートすることによって、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ溶液をデコンタミネーションする。
【００４６】
ポリメラーゼ酵素は、典型的には、二価陽イオン（例えば、Ｍｇ+2、Ｍｎ+2、又はそれらの組合せ）を核酸合成に必要とする。したがって、１つ以上の二価陽イオンをＤＮＡ増幅反応混合物に追加し得る。例えば、ＭｇＣｌ2を２ｍＭ〜６ｍＭの濃度範囲で反応混合物に追加し得る。高濃度（例えば、１０ｐｍｏｌ超、２０ｐｍｏｌ超又は３０ｐｍｏｌ超）のイノシン含有プライマーを反応混合物に含める場合、より高濃度のＭｇＣｌ2が好ましい場合がある。
【００４７】
ある実施形態では、イノシン含有二本鎖ＤＮＡにニックを導入するために、突然変異型エンドヌクレアーゼＶをＤＮＡ増幅反応混合物に含める。部位特異的突然変異誘発又は人工遺伝子合成を含む遺伝子工学技術又はタンパク質工学技術によって、突然変異型エンドヌクレアーゼＶを作製し得る。遺伝子工学は、野生型エンドヌクレアーゼＶの１つ以上のアミノ酸残基の改変を含み得る。改変としては、野生型エンドヌクレアーゼＶの１つ以上のアミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失が挙げられ得る。タンパク質の合理的な設計によって、又は指向性進化によって、突然変異型エンドヌクレアーゼＶを作製し得る。ある実施形態では、合理的に設計された突然変異型エンドヌクレアーゼＶ酵素であって、基質結合が増加しており、ニック導入の効率が増加しており、ニック導入の特異性が増加しており、及び／又はニック導入の感度が増加している突然変異型エンドヌクレアーゼＶ酵素を用いる。また、基質結合が可逆的であるように、突然変異型エンドヌクレアーゼＶを設計し得る。その結果、突然変異型エンドヌクレアーゼＶ酵素は、各酵素によって繰り返されるニック導入を支援し得るのに対して、対応する野生型酵素は、わずか１ラウンド（又は、限られた数ラウンド）のニック導入をすることができるにすぎない（例えば、野生型Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶ（配列番号１）は、ニック導入後においても、ＤＮＡに結合し続ける）。このような突然変異型エンドヌクレアーゼＶを化学量論的量未満で反応混合物に使用して、ニック導入反応を引き起こし得る。ある実施形態では、突然変異型エンドヌクレアーゼＶの保存的変異体をＤＮＡ増幅反応に使用し得る。例えば、単一のアミノ酸又は少数（典型的には、約１０個未満）のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加による突然変異型エンドヌクレアーゼＶのさらなる改変は、改変した突然変異型エンドヌクレアーゼＶの物理化学的特性が元の突然変異型エンドヌクレアーゼＶと類似である場合には、「保存的変異体」であり得る。一部の場合では、改変は、化学的に類似のアミノ酸による１個のアミノ酸の置換であり得る。
【００４８】
ある実施形態では、イノシン残基がシトシン残基とペアリングすると、イノシン残基の３’側の位置において二本鎖ＤＮＡのイノシン含有鎖に選択的にニックを導入する突然変異型エンドヌクレアーゼＶを使用し得る。いくつかの他の実施形態では、イノシン残基がチミン残基とペアリングすると、イノシン残基の３’側の位置において二本鎖ＤＮＡのイノシン含有鎖に選択的にニックを導入する突然変異型エンドヌクレアーゼＶを使用し得る。イノシン残基がシトシン又はチミンとペアリングすると、突然変異型エンドヌクレアーゼＶは、野生型エンドヌクレアーゼＶよりも高い効率で、二本鎖ＤＮＡのイノシン含有鎖にニックを導入し得る。さらに、ＤＮＡ増幅反応に用いる突然変異型エンドヌクレアーゼＶは、イノシン含有一本鎖ＤＮＡよりも、二本鎖ＤＮＡのイノシン含有鎖に選択的にニックを導入し得る。例えば、Ｙ７５Ａ  Ｅ．ｃｏｌｉ突然変異型エンドヌクレアーゼＶ（配列番号２）は、イノシン残基を含む一本鎖ＤＮＡよりも、イノシン残基を含む二本鎖ＤＮＡにニックを導入する。対照的に、Ｙ８０Ａ  Ｔｍａ突然変異型エンドヌクレアーゼＶ（配列番号６）は、イノシン残基を含む二本鎖ＤＮＡよりも、イノシン残基を含む一本鎖ＤＮＡにニックを導入する。いくつかの突然変異型エンドヌクレアーゼは、イノシン残基を含有するＤＮＡ配列以外の構造にニックを導入し得るが、いくつかの他のものは、イノシンを含有するＤＮＡ配列に対して非常に特異的であり得る。例えば、Ｔｍａ及びＡｆｕエンドヌクレアーゼ（配列番号３及び配列番号５）は、フラップ及び偽Ｙ構造などの構造にニックを導入しない。ある実施形態では、複数のイノシン残基が二本鎖ＤＮＡ中に存在する場合、用いるエンドヌクレアーゼＶ突然変異体は、チミン残基とペアリングしているイノシン残基よりも、シトシン残基とペアリングしているイノシン残基（多くの場合、イノシン残基の１ヌクレオチド又は２ヌクレオチド３’側）に選択的にニックを導入し得る。いくつかの態様では、エンドヌクレアーゼＶ突然変異体は、塩基対ミスマッチを含有する二本鎖ＤＮＡにニックを導入し得る。ニック導入は、塩基対ミスマッチの位置において、又は１つ以上の塩基によって分離された塩基対ミスマッチの３’側の位置において起こり得る。
【００４９】
ある実施形態では、熱安定性エンドヌクレアーゼＶをＤＮＡ増幅反応に使用する。例えば、標的ＤＮＡの熱変性（部分的な変性又は完全な変性のいずれか）を実施するＤＮＡ増幅アッセイでは、熱安定性エンドヌクレアーゼＶ又は熱安定性エンドヌクレアーゼＶ突然変異体が好ましい場合がある。標的ＤＮＡの熱変性が不要である他の実施形態では、野生型エンドヌクレアーゼＶ、又は比較的低い温度（例えば、４５℃）で最大酵素活性を有するエンドヌクレアーゼＶ突然変異体（例えば、Ｙ７５Ａ突然変異型Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶ）を使用し得る。例えば、Ｙ７５Ａ  Ｅ．ＣｏｌｉエンドヌクレアーゼＶ突然変異体は、５０℃でインキュベートすることによって不活性化されるのに対して、それは、３７〜４５℃でその酵素活性を保持している。ＡｆｕエンドヌクレアーゼＶ（野生型（配列番号３）及びＹ７５Ａ突然変異型（配列番号４）の両方）又はＴｍａエンドヌクレアーゼＶ（野生型（配列番号５）及びＹ８０Ａ突然変異型（配列番号６）の両方）は、一般に、Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶ（野生型（配列番号１）及びＹ７５Ａ突然変異型（配列番号２）の両方）よりも熱安定性である。高温でインキュベートすることによって、ＤＮＡポリメラーゼによる鎖置換ＤＮＡ合成を増加させ得るある実施形態では、高温（例えば、４５〜８０℃）で機能するエンドヌクレアーゼＶを使用し得る。
【００５０】
ある実施形態では、突然変異型Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶをＤＮＡ増幅反応に用いる。突然変異型Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼは、配列番号２に対応するＹ７５Ａ突然変異型Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶであり得る。野生型Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶ（配列番号１）の７５番目の位置のチロシン（Ｙ）残基をアラニン（Ａ）残基で置換することによって、この突然変異体を作製する。ある実施形態では、突然変異型ＡｆｕエンドヌクレアーゼＹ７４Ａ（配列番号４）及び／又はその保存的変異体を用いる。野生型ＡｆｕエンドヌクレアーゼＶ（配列番号３）の７５番目の位置のチロシン（Ｙ）残基をアラニン（Ａ）残基で置換することによって、突然変異型Ｙ７４Ａ  Ａｆｕエンドヌクレアーゼを作製する。
【００５１】
表１は、野生型エンドヌクレアーゼ及び突然変異型エンドヌクレアーゼＶ酵素の配列を提供する。
【００５２】
【表１−１】
2019165739.tif 000003
【表１−２】
2019165739.tif 000004
【００５３】
ある実施形態では、標的ＤＮＡに基づいて１以上のアンプリコンを生産するための方法は、（ａ）標的ＤＮＡを提供する工程と、（ｂ）エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーから本質的になるプライマー溶液を提供する工程と、（ｃ）エキソヌクレアーゼでプライマー溶液を処理して、プライマー溶液から夾雑核酸を除去する工程と、（ｄ）デコンタミネーション工程（ｃ）の後に、プライマー溶液中のエキソヌクレアーゼを不活性化する工程と、（ｅ）標的ＤＮＡと、デコンタミネーションしたプライマー溶液と、鎖置換活性を有する１以上の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼと、イノシン残基の３’側の残基においてＤＮＡにニックを導入することができる１以上のエンドヌクレアーゼとを一緒に混合することによって、ＤＮＡ増幅反応混合物を生成する工程と、（ｆ）工程（ｅ）のＤＮＡ増幅反応混合物を使用して、標的ＤＮＡの１以上の部分を増幅し、１以上のアンプリコンを生産する工程とを含む。プライマー溶液は、ｄＮＴＰ及び増幅緩衝液などの他の核酸増幅試薬をさらに含み得る。プライマー溶液は、ホルムアミド、ＳＳＢタンパク質、エチレングリコール又はフィコールなどの試薬の１つ以上をさらに含み得る。しかしながら、プライマー溶液が、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーから本質的になる実施形態では、プライマー溶液は、前の増幅反応物に由来するアンプリコン、エキソヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチド、イノシン含有オリゴヌクレオチド又はエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマー（例えば、前の増幅反応物からの核酸夾雑物）を欠く。
【００５４】
核酸増幅反応のためのＤＮＡ増幅反応混合物は、界面活性剤（例えば、洗浄剤）、ブロッキング試薬（例えば、アルブミン）、トポイソメラーゼ、還元剤又は緩衝液などの１つ以上の試薬をさらに含み得る。一般に、デコンタミネーション工程の前に（例えば、エキソヌクレアーゼでプライマー溶液を処理して夾雑核酸を除去する前に）、これらの試薬を、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを含有するプライマー溶液に追加する。エキソヌクレアーゼ処理の後、次いで、（他の追加試薬と共にＤＮＡ増幅に使用すべきエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを含有する）デコンタミネーションしたプライマー溶液を、（デコンタミネーションに用いたエキソヌクレアーゼを不活性化して、又はエキソヌクレアーゼを不活性化せずに）核酸増幅反応混合物を生成するのに使用する。いくつかの特定の実施形態では、エキソヌクレアーゼでプライマー溶液を処理する前に、ＤＮＡ増幅に必要なすべての試薬（標的ＤＮＡそれ自体を除く）をプライマー溶液に追加する。このような実施形態では、夾雑ＤＮＡのほとんどすべて（標的ＤＮＡ溶液から生じたものを除く）をＤＮＡ増幅反応混合物から除去し、それにより、標的ＤＮＡの増幅をコンタミネーションフリーにし得る。
【００５５】
６〜９の反応ｐＨをもたらす緩衝液（例えば、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液）をＤＮＡ増幅反応に使用し得る。ある実施形態では、核酸増幅反応混合物のｐＨは、７．７である。ある実施形態では、ＤＮＡの安定性を増強する緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）を使用し得る。デコンタミネーション工程の後に、標的ＤＮＡの熱変性又はエキソヌクレアーゼの熱変性を用いるいくつかの特定のＤＮＡ増幅反応では、トリス−ホウ酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液及びＭＯＰＳ緩衝液などの熱不安定性緩衝液は好ましくない場合がある。反応混合物の第１の成分を導入する前に、界面活性剤を反応チューブにアプライし得る。或いは、他の試薬と同様に、エキソヌクレアーゼによるデコンタミネーション工程の前に、界面活性剤をプライマー溶液に追加し得る。ある実施形態では、界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ−２０、ＮＰ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００又はそれらの組合せから選択される洗浄剤であり得る。ある実施形態では、０．０５％ＮＰ−４０及び０．００５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を反応に使用する。いくつかの特定の実施形態では、ＤＮＡ増幅反応緩衝液は、２５ｍＭトリス−ホウ酸塩、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０１％Ｔｗｅｅｎ、及び２０％エチレングリコールを含み得る。アルブミン（例えば、ＢＳＡ又はＨＳＡ）などのブロッキング剤をＤＮＡ増幅反応混合物に含めて、反応容器（例えば、プラスチック製マイクロ遠心チューブ又はマイクロタイタープレート）の表面に結合させ、それにより、ヌクレアーゼ又はポリメラーゼとの反応に利用可能な標的ＤＮＡの相対量を増加させ得る。ＤＮＡ増幅反応混合物は、１以上のトポイソメラーゼ（例えば、１型トポイソメラーゼ）を含み得る。トポイソメラーゼは、少なくとも０．１ｎｇ／μＬの最終濃度で反応混合物中に存在し得る。ある実施形態では、ＤＮＡ増幅反応混合物は、１以上の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＳＢ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質（Ｔ４ｇ３２ｐ）、Ｔ７遺伝子２．５タンパク質、Ｎｃｐ７、ｒｅｃＡ又はそれらの組合せ）を含み得る。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、少なくとも０．１ｎｇ／μＬの最終濃度で反応混合物中に存在し得る。ＤＮＡ増幅反応混合物はまた、反応混合物中の酵素の酸化を軽減する１つ以上の還元剤であって、生産されるアンプリコンの品質及び収量を改善する１つ以上の還元剤、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（βＭＥ）、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）又は２−メルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）を含み得る。
【００５６】
本ＤＮＡ増幅方法の様々な実施形態によって生産されるアンプリコンを、既存技術のいずれかによって定性的又は定量的に決定し得る。例えば、定性的又は定量的なアッセイでは、発色のために、ＤＮＡ増幅反応後／ＤＮＡ増幅反応中に、末端リン酸標識リボヌクレオチドをホスファターゼと組合せて使用し得る。このような実施形態では、ｄＮＴＰ又はデオキシヌクレオシド四リン酸の末端リン酸メチルエステルを使用することによって、末端リン酸を脱リン酸化から保護し得る。
【００５７】
ある実施形態では、アンプリコン生産キットは、１以上のエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーと、鎖置換活性を有する１以上の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼと、イノシン残基の３’側の残基においてＤＮＡにニックを導入することができる１以上のエンドヌクレアーゼとを含む。イノシン含有プライマーのイノシン残基は、５’末端残基の少なくとも４ヌクレオチド下流に位置する。ある実施形態では、イノシン残基は、プライマー配列の最後から２番目の３’位置に位置する。ある実施形態では、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーは、最後から２番目の３’位置のイノシン残基と３’末端残基との間に、１以上のホスホロチオエート結合を含む。ある実施形態では、キットは、ＤＮＡ合成反応を実施するのに必要な試薬又は試薬溶液をさらに含み得る。キットに含まれるエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーは、特異的プライマー、部分ランダムプライマー又はランダムプライマーのいずれかであり得る。ある実施形態では、キットは、複数のエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを含む。ある実施形態では、キットは、１以上のエンドヌクレアーゼＶを含む。エンドヌクレアーゼＶは、野生型エンドヌクレアーゼＶ又は突然変異型エンドヌクレアーゼＶのいずれかであり得る。ある実施形態では、キットは、Ｙ７５Ａ突然変異型Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶを含む。キットに含まれるＤＮＡポリメラーゼは、クレノウ、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼの大断片）、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損デルタＴｔｓ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソ（−）クレノウ又はエキソ（−）Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標））であり得る。
【００５８】
キットは、ＳＳＢタンパク質をさらに含み得る。キットに含まれ得る適切なＳＳＢタンパク質としては、限定されないが、極めて熱安定性の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＥＴ  ＳＳＢ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＭＡ製）、ｒｅｃＡ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡ）、Ｔｔｈ  ＲｅｃＡ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから単離されたＲｅｃＡホモログ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＭＡ製）、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質、Ｔ７遺伝子２．５タンパク質、Ｎｃｐ７及びＥ．ｃｏｌｉ  ＳＳＢタンパク質が挙げられる。
【００５９】
キットは、１以上のエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを含むプライマー液をデコンタミネーションするのに使用し得るエキソヌクレアーゼをさらに含み得る。キットが含み得る適切なエキソヌクレアーゼは、例えば限定されないが、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、Ｔ７遺伝子−６エキソヌクレアーゼ、脾臓エキソヌクレアーゼ、Ｔ５  Ｄ１５エキソヌクレアーゼ及びラムダエキソヌクレアーゼである。ある実施形態では、キットは、エキソヌクレアーゼＩＩＩを含む。いくつかの他の実施形態では、キットは、エキソヌクレアーゼＩ及びエキソヌクレアーゼＩＩＩの混合物を含み得る。一緒にパッケージされた単一の容器又は複数の容器で、エキソヌクレアーゼの組合せを提供し得る。キットは、キットに含まれる特定の成分を詳述する取扱説明書と、デコンタミネーション反応又はＤＮＡ増幅反応又はその両方にそれらを使用するためのプロトコールとをさらに含み得る。
【００６０】
本発明の実施は、以下の実施例からさらに詳細に理解されよう。これらは、本明細書では例示のために提示されているにすぎず、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００６１】
実施例のセクションで使用されるいくつかの略語は、以下のように展開される：「ｍｇ」：ミリグラム、「ｎｇ」：ナノグラム、「ｐｇ」：ピコグラム、「ｆｇ」：フェムトグラム、「ｍＬ」：ミリリットル、「ｍｇ／ｍＬ」：ミリグラム／ミリリットル、「ｍＭ」：ミリモル、「ｍｍｏｌ」：ミリモル、「ｐＭ」：ピコモル、「ｐｍｏｌ」：ピコモル、「μＬ」：マイクロリットル、「ｍｉｎ．」：分及び「ｈ．」：時間。
【００６２】
本明細書で提供されるすべての融解温度値は、式１００．５＋（４１＊（ｙＧ＋ｚＣ−１６．４）／（ｗＡ＋ｘＴ＋ｙＧ＋ｚＣ））−（８２０／（ｗＡ＋ｘＴ＋ｙＧ＋ｚＣ））＋１６．６＊ＬＯＧ１０（［Ｎａ＋］＋［Ｋ＋］）−０．５６（％ＥＧ）−０．３２（％Ｇ）−０．６２（％Ｆ）（式中、ｗ、ｘ、ｙ及びｚは、プライマーに含まれるそれぞれアデノシン残基、シトシン残基、グアノシン残基及びチミジン残基の数を指し、Ｎａ＋は、ナトリウム濃度（ｍＭ）を指し、Ｋ＋は、カリウム濃度（ｍＭ）を指し、ＥＧは、エチレングリコール濃度（％）を指し、Ｇは、グリセロール濃度（％）を指し、Ｆは、ホルムアミド濃度を指す）にしたがって決定される。
【００６３】
トリス−ＨＣｌ及びＴｗｅｅｎ２０は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手し、ｄＮＴＰは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手し、ＮａＣｌは、Ａｍｂｉｏｎから入手した。特に指示がない限り、以下の表に示されている容量は、マイクロリットル単位である。当技術分野で認められている技術（例えば、サンプル中の種を分離し、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ又はプロフラビンなどのインターカレート色素を使用して観察するための電気泳動）のいずれかを使用して、アンプリコンを可視化及び／又は定量し得る。光学的方法（例えば、ＡＢＩ  Ｓｅｒｉｅｓ  ７５００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｍａｃｈｉｎｅ）及びインターカレート色素（例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ）を使用して、アンプリコンの生産を追跡し得る。以下の実施例で生産したアンプリコンを、電気泳動又は光学的技術を使用して可視化した。
【００６４】
ＨＥＴ緩衝液は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０である。１０×変性緩衝液は、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０及び１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡである。１０×反応緩衝液は、１５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８）、３０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ硫酸マンガン、２．５ｍＭ  ｄＡＴＰ、２．５ｍＭ  ｄＣＴＰ、２．５ｍＭ  ｄＧＴＰ、２．５ｍＭ  ｄＴＴＰ、５０ｍＭ硫酸アンモニウム、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ及び０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０である。酵素希釈緩衝液は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０及び５０％（ｖ／ｖ）グリセロールである。５％（ｗ／ｖ）フィコール４００は、５ｇ／１００ｍｌの水と同等である。
【００６５】
実施例１：テンプレートＤＮＡのエンドヌクレアーゼ支援等温増幅：
エンドヌクレアーゼ支援等温増幅反応では、３つの試薬ミックスを別個に調製し、次いで一緒に混合して、最終的な増幅反応物を作る。これら３つの試薬ミックスを変性ミックス、酵素ミックス及び反応ミックスとする。
【００６６】
０．５μｌの１０×変性緩衝液と、１μｌの適切な濃度の所望の標的ＤＮＡテンプレートと、０．５μｌの２５％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと、ヌクレアーゼ耐性プライマーを含有する１μｌの適切なオリゴミックスと、２μｌのヌクレアーゼフリー水とを最終容量５μｌで混ぜ合せることによって、変性ミックスを調製する。変性ミックスを９５℃で２分間加熱し、次いで室温で放置する。
【００６７】
０．３４μｌの大断片のＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（１２０単位／μｌ）と、０．２μｌのＥ．ｃｏｌｉ  ＳＳＢ（５μｌ／μｌ）と、０．０４１μｌの突然変異型Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶ（６．２３ｍｇ／ｍｌ）と、０．４１９μｌの酵素希釈緩衝液とを最終容量１μｌで混ぜ合せることによって、酵素ミックスを調製する。
【００６８】
１μｌの１０×反応緩衝液と、２μｌのエチレングリコールと、１μｌの５０％（ｖ／ｖ）フィコール４００と、１μｌの酵素ミックスとを最終容量５μｌで混ぜ合せることによって、反応ミックスを調製する。
【００６９】
変性ミックス及び反応ミックスの両方を別個に４５℃で３０秒間予熱することによって、完全なピンポン反応物をアセンブルする。次いで、これらの両ミックスを混ぜ合せて、４５℃で１時間インキュベートする。
【００７０】
インキュベーション後、１５％アクリルアミドＴＢＥ尿素ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してゲル電気泳動によって、増幅を分析する。ゲルローディングの直前に、３μｌの完了ピンポン反応物を６μｌのゲルローディング緩衝液ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混ぜ合せ、９５℃で２分間熱変性し、続いて氷上で直ぐにクエンチする。次いで、５μｌのこの熱変性ピンポン反応物をゲルの１つのウェルにロードする。製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を説明書にしたがって、電気泳動を行う。電気泳動が完了したら、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の２０×溶液でゲルを１５分間染色し、次いで、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ９４１０  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ  Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってフルオレセインをスキャンする。
【００７１】
実施例２：エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを使用した、テンプレートＤ
ＮＡのエンドヌクレアーゼ支援等温増幅。
エンドヌクレアーゼ支援等温増幅に使用したプライマーは、最後から２番目の３’塩基としてイノシンを含有する。エンドヌクレアーゼＶは、イノシンを非天然塩基と認識するので、この異常部位の１塩基３’側において、イノシン残基を含有するＤＮＡ鎖にニックを導入する。本実施例では、イノシン残基と末端３’塩基との間のリン酸結合がホスホロチオエート化されているヌクレアーゼ耐性プライマーを使用した、増強された増幅動態を実証する。
【００７２】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｒｐｏＢ遺伝子の５’領域において、６個のフォワードプライマー及び５個のリバースプライマーの配列を同定した。２セットのこれら１１個のプライマー（一方のセットはホスホロチオエート化されておらず、他方のセットは、各プライマーのイノシンと末端３’塩基との間でホスホロチオエート化されている）を合成した。表２及び表３は、実施例で使用した様々なプライマーの配列を提供する。
【００７３】
【表２】
2019165739.tif 000005
【００７４】
【表３】
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【００７５】
非ホスホロチオエート化プライマーセットを作製するために、４．００μＬのＩＡ  ＴＢｒｐｏＢ  Ｆ１（６２９ｐｍｏｌ／μＬ）、３．１６μＬのＩＡ  ＴＢｒｐｏＢ  Ｆ２（７９３ｐｍｏｌ／μＬ）、３．６４μＬのＩＡ  ＴＢｒｐｏＢ  Ｆ３ｎ（６８６ｐｍｏｌ／μＬ）、３．５０μＬのＩＡ  ＴＢｒｐｏＢ  Ｒ２（７１５ｐｍｏｌ／μＬ）、３．２８μｌのＩＡ  ＴＢｒｐｏＢ  Ｒ３（７６２ｐｍｏｌ／μＬ）、５．７４μＬのＩＡ  ＴＢｒｐｏＢ  Ｆ４（４３６ｐｍｏｌ／Ｌ）、２．８４μＬのＩＡ  ＴＢｒｐｏＢ  Ｆ５（８８０ｐｍｏｌ／μＬ）、４．１７μＬのＩＡ  ＴＢｒｐｏＢ  Ｆ６（５９９ｐｍｏｌ／μＬ）、４．９４μＬのＩＡ  ＴＢｒｐｏＢ  Ｒ４（５０６ｐｍｏｌ／μＬ）、４．１５μＬのＩＡ  ＴＢｒｐｏＢ  Ｒ５（６０２ｐｍｏｌ／μＬ）及び５．６３μＬのＩＡ  ＴＢｒｐｏＢ  Ｒ６（４４４ｐｍｏｌ／μＬ）を２０４．９５μＬのＨＥ（０．１）Ｔ緩衝液（総容量＝２５０μＬ）と混合した。
【００７６】
ホスホロチオエート化プライマーセットを作製するために、３．３２μＬのＩＡ  ＴＢｒｐｏＢ  Ｆ１＊（７５４ｐｍｏｌ／μＬ）、２．７２μＬのＩＡ  ＴＢｒｐｏＢ  Ｆ２＊（９２０ｐｍｏｌ／μＬ）、２．８３μＬのＩＡ  ＴＢｒｐｏＢ  Ｆ３＊（８８３ｐｍｏｌ／μＬ）、４．６８μＬのＩＡ  ＴＢｒｐｏＢ  Ｆ４＊（５３４ｐｍｏｌ／μＬ）、１．７２μＬのＩＡ  ＴＢｒｐｏＢ  Ｆ５＊（１４５１ｐｍｏｌ／μＬ）、１．７６μＬのＩＡ  ＴＢｒｐｏＢ  Ｆ６＊（１４１７ｐｍｏｌ／μＬ）、２．７２μＬのＩＡ  ＴＢｒｐｏＢ  Ｒ２＊（９２０ｐｍｏｌ／μＬ）、１．８０μＬのＩＡ  ＴＢｒｐｏＢ  Ｒ３＊（１３９２ｐｍｏｌ／μＬ）、１．５１μＬのＩＡ  ＴＢｒｐｏＢ  Ｒ４＊（１６５２ｐｍｏｌ／μＬ）、１．７９μＬのＩＡ  ＴＢｒｐｏＢ  Ｒ５＊（１３９８ｐｍｏｌ／μｌ）及び７．００μＬのＩＡ  ＴＢｒｐｏＢ  Ｒ６＊（３５８ｐｍｏｌ／μＬ）を２１８．１５μＬのＨＥ（０．１）Ｔ緩衝液（総容量＝２５０μＬ）と混合した。
【００７７】
次いで、実施例１のように調製及び分析したエンドヌクレアーゼ支援等温増幅反応に各プライマーセットを使用した。ピンポン反応の各オリゴヌクレオチドプライマーの最終濃度は、１０ｐｍｏｌであった。図３に示されているように、ヌクレアーゼ耐性プライマー（すなわち、ホスホロチオエート化を含有するプライマーセット）の使用は、エンドヌクレアーゼ支援等温増幅反応産物の収量を約２倍増加させる。
【００７８】
実施例３：コンタミネーションフリー試薬を使用した、テンプレートＤＮＡのエンドヌクレアーゼ支援等温増幅。
本実施例では、ＤＮＡポリメラーゼ、突然変異型エンドヌクレアーゼＶ及びヒトゲノムＤＮＡテンプレートを除くすべてのピンポン試薬をデコンタミネーションして、エキソヌクレアーゼとの増幅前インキュベーション工程によって外来性ＤＮＡを除去する。本実施例の実施形態では、１１ｎｇのヒトゲノムＤＮＡをテンプレートとして増幅反応に使用し、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する。本実施例では、最初に、エキソヌクレアーゼＩ（Ｅｘｏ  Ｉ）及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｅｘｏ  ＩＩＩ）を適切な試薬と共に一定時間間隔でインキュベートし、次いで加熱によって失活させた。次いで、クリーニングした試薬をピンポン反応物に組み込んだ。
【００７９】
１．２５μＬのエキソヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、０．２５単位／μＬ）、１μＬのエキソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、１単位／μＬ）及び９７．９５μＬの酵素希釈緩衝液を含有する混合物を調製した。１マイクロリットルのこのエキソヌクレアーゼ混合物を、０．５μＬの変性緩衝液、１μＬの１０×反応緩衝液、０．５μＬの２５％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．２μＬのＳＳＢ、０．４１９μＬの酵素希釈緩衝液、２μＬのエチレングリコール、１μＬの５０％（ｖ／ｖ）フィコール４００、１μＬのｐ５３オリゴミックス（表２に記載されているｐ５３増幅に用いたホスホロチオエート化プライマー）及び１μＬの水に最終容量８．６１９μＬで追加した。クリーニング反応物を３７℃で３０分間インキュベートして、エキソヌクレアーゼが夾雑ＤＮＡを分解することを可能にし、次いで、８０℃で３０分間インキュベートしてエキソヌクレアーゼを不活性化した。クリーニングした試薬を必要になるまで＋４℃で保存した。
【００８０】
【表４】
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【００８１】
ｐ５３遺伝子セグメントを増幅するためのホスホロチオエート化プライマーセットを作製するために、５．９６μＬのＩＡ  ｐ５３  Ｆ１＊（８３９ｐｍｏｌ／μＬ）、６．０５μＬのＩＡ  ｐ５３  Ｆ２＊（８２６ｐｍｏｌ／μＬ）、７．４０μＬのＩＡ  ｐ５３  Ｆ３＊（６７６ｐｍｏｌ／μＬ）、６．５５μＬのＩＡ  ｐ５３  Ｆ４＊（７６３ｐｍｏｌ／μＬ）、１０．９９μＬのＩＡ  ｐ５３  Ｆ５＊（４５５ｐｍｏｌ／μＬ）、８．５０μＬのＩＡ  ｐ５３  Ｆ６＊（５８８ｐｍｏｌ／μＬ）、６．１７μＬのＩＡ  ｐ５３  Ｒ１＊（８１１ｐｍｏｌ／μＬ）、１１．２４μＬのＩＡ  ｐ５３  Ｒ２＊（４４５ｐｍｏｌ／μＬ）、１５．３８μＬのＩＡ  ｐ５３  Ｒ３＊（３２５ｐｍｏｌ／μＬ）、４．８１μＬのＩＡ  ｐ５３  Ｒ４＊（１０４０ｐｍｏｌ／μＬ）、４．６８μＬのＩＡ  ｐ５３  Ｒ５＊（１０６９ｐｍｏｌ／μＬ）、８．０５μＬのＩＡ  ｐ５２  Ｒ６＊（６２１ｐｍｏｌ／μＬ）を４０４．２２μＬの０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（総容量＝５００μＬ）と混合した。
【００８２】
０．３４μＬの大断片のＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ及び０．０４１μＬの突然変異型エンドヌクレアーゼＶを、１μｌ（１１ｎｇ、約１５００コピー）のヒトゲノムＤＮＡ又は水（テンプレートなしのコントロール（ＮＴＣ））のいずれかと共に、クリーニングした試薬に追加した。クリーニングしていないコントロール反応物を実施例２のように調製した。実施例２のように、すべての反応物をインキュベート及び分析した。図１は、エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを含むピンポン試薬をエキソヌクレアーゼでクリーニングすることにより、非特異的な増幅産物が排除されることを示している。
【００８３】
上記詳細な説明は例示であり、本出願の発明及び本発明の使用を限定するものではない。本明細書を通して、特定の用語の例示は、非限定的な例とみなされるべきである。文脈上明確な指示がない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、複数形の指示対象を含む。本明細書及び特許請求の範囲を通して本明細書で使用される近似的な文言を使用して、許容範囲で変化し得る定量的表現を、それが関係する基本的機能を変化させずに修飾し得る。したがって、「約」などの用語によって修飾された値は、指定された正確な値に限定されるものではない。特に指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される分子量、反応条件などの成分、特性の量を表すすべての数字は、すべての場合において、用語「約」によって修飾されると理解されるべきである。したがって、特に反対の指示がない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載されている数値パラメータは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、そして均等論を特許請求の範囲に適用しようとするものではないが、報告されている有効数字の数を考慮し、通常の丸め技術を適用することによって、各数値パラメータを少なくとも解釈すべきである。必要であれば、範囲が提供されており、これらの範囲は、その間のすべての部分範囲を含む。
【００８４】
本発明は、その精神及び本質的な特徴から逸脱せずに、他の特定の形態で具体化され得る。上記実施形態は、多種多様なすべての可能な実施形態又は実施例から選択された実施形態又は実施例である。したがって、上記実施形態は、すべての点において、本明細書に記載される本発明を限定するものではなく、例示であるとみなされるべきである。本発明の特定の特徴のみを本明細書で例示及び説明したが、本開示の利益を鑑みれば、当業者であれば、これらの及び他の種類の用途に適切であり、本発明の原理にしたがって方法を使用するための適切な条件／パラメータを特定、選択、最適化又は改変することができるであろうことを理解すべきである。正確な使用、試薬の選択、変数、例えば濃度、容量、インキュベーション時間、インキュベーション温度の選択などは、それが意図される特定の用途に大きく依存し得る。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神の範囲内にあるすべての改変及び変更をカバーするものであると理解すべきである。さらに、特許請求の範囲の均等の意味及び範囲内にあるすべての変更は、その中に包含されるものである。
【００８５】
（請求項１）
標的ＤＮＡに基づいて１以上のアンプリコンを生産する方法であって、
（ａ）標的ＤＮＡを用意する工程と、
（ｂ）１以上のエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを含むプライマー溶液を用意する工程と、
（ｃ）標的ＤＮＡと、プライマー溶液と、鎖置換活性を有する１以上の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼと、イノシン残基の３’側の残基において二本鎖ＤＮＡのイノシン含有鎖にニックを導入することができる１以上のエンドヌクレアーゼとを一緒に混合することによって、ＤＮＡ増幅反応混合物を生成する工程と、
（ｃ）１以上のエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーを使用して、ＤＮＡ増幅反応混合物をインキュベートして標的ＤＮＡの１以上の部分を増幅し、１以上のアンプリコンを生産する工程と
を含む、方法。
（請求項２）
プライマー溶液が遊離デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
（請求項３）
プライマー溶液が、ＤＮＡ増幅緩衝液、ホルムアミド、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、エチレングリコール、フィコール又はそれらの組合せをさらに含む、請求項２に記載の方法。
（請求項４）
ＤＮＡ増幅反応混合物を生成する前に、エキソヌクレアーゼでプライマー溶液を処理して夾雑核酸を除去することによって、プライマー溶液をデコンタミネーションすることをさらに含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の方法。
（請求項５）
夾雑核酸の除去後、ＤＮＡ増幅反応混合物を生成する前に、プライマー溶液中のエキソヌクレアーゼを不活性化することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
（請求項６）
等温条件下で標的ＤＮＡを増幅する、請求項５に記載の方法。
（請求項７）
ヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーのイノシン残基が、５’末端ヌクレオチドの少なくとも４ヌクレオチド下流に位置する、請求項１に記載の方法。
（請求項８）
ヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーのイノシン残基が、最後から２番目の３’位置に位置する、請求項７に記載の方法。
（請求項９）
ヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーが、イノシン残基の５’側又は３’側にホスホロチオエート結合を含む、請求項８に記載の方法。
（請求項１０）
イノシン含有プライマーが、２以上の隣接するイノシン残基を含む、請求項１に記載の方法。
（請求項１１）
イノシン残基が、イノシン含有プライマーの最後から２番目の３’位置及び３’末端の両方に位置する、請求項１０に記載の方法。
（請求項１２）
１以上の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼが、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損クレノウ、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損デルタＴｔｓ  ＤＮＡポリメラーゼ又はそれらの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
（請求項１３）
プライマー溶液が、１以上のイノシン含有フォワードプライマー及び１以上のイノシン含有リバースプライマーを含み、フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方がエキソヌクレアーゼ耐性である、請求項１に記載の方法。
（請求項１４）
１以上のヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーが、伸長テンプレートを含む、請求項１に記載の方法。
（請求項１５）
標的ＤＮＡに基づいて１以上のアンプリコンを生産するための方法であって、
（ａ）標的ＤＮＡを用意する工程と、
（ｂ）エキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーから本質的になるプライマー溶液を用意する工程と、
（ｃ）エキソヌクレアーゼでプライマー溶液を処理して、プライマー溶液から夾雑核酸を除去する工程と、
（ｄ）工程（ｂ）の後に、プライマー溶液中のエキソヌクレアーゼを不活性化する工程と、
（ｅ）標的ＤＮＡと、工程（ｄ）のプライマー溶液と、鎖置換活性を有する５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼと、イノシン残基の３’側の残基においてＤＮＡにニックを導入することができるエンドヌクレアーゼとを一緒に混合することによって、ＤＮＡ増幅反応混合物を生成する工程と、
（ｆ）工程（ｅ）の増幅反応混合物を使用して、標的ＤＮＡの１以上の部分を増幅し、１以上のアンプリコンを生産する工程と
を含む、方法。
（請求項１６）
プライマー溶液が、遊離ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）と、ＤＮＡ増幅緩衝液、ホルムアミド、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、エチレングリコール、フィコール及びそれらの組合せからなる群より選択される試薬とをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
（請求項１７）
エンドヌクレアーゼ支援等温核酸増幅のためのキットであって、
１以上のエキソヌクレアーゼ耐性イノシン含有プライマーと、
鎖置換活性を有する１以上の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼと、
イノシン残基の３’側の残基においてＤＮＡにニックを導入することができる１以上のエンドヌクレアーゼとを含む、キット。
（請求項１８）
イノシン含有プライマーのイノシン残基が、５’末端ヌクレオチドの少なくとも４ヌクレオチド下流に位置する、請求項１７に記載のキット。
（請求項１９）
イノシン含有プライマーのイノシン残基が、最後から２番目の３’位置に位置する、請求項１８に記載のキット。
（請求項２０）
イノシン含有プライマーが、最後から２番目の３’位置のイノシン残基と３’末端残基との間に、１以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項１９に記載のキット。
（請求項２１）
１以上の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼが、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損クレノウ、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損デルタＴｔｓ  ＤＮＡポリメラーゼ又はそれらの組合せから選択される、請求項２０に記載のキット。
（請求項２２）
１以上のヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼＶである、請求項２１に記載のキット。
【図１】
2019165739.tif 000008
【図２】
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【図３】
2019165739.tif 000010
【図４】
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【配列表】
2019165739000001.app
【外国語明細書】
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