(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト及び非ヒトＣＤ３に、及び特に非ヒト哺乳類（例えばカニクイザル）のＣＤ３と交差反応性であるような分子に結合可能なＣＤ３結合分子の提供。【解決手段】抗体の抗原結合フラグメントを含むＣＤ３結合分子であって、前記抗原結合フラグメントが抗体ＣＤ３特異的ＶＬドメイン及び抗体ＣＤ３特異的ＶＨドメインを含み、前記ＣＤ３特異的ＶＬドメイン及び前記ＣＤ３特異的ＶＨドメインが、ヒトＣＤ３のエピトープ及び非ヒト哺乳類のＣＤ３のエピトープの両方に免疫特異的に結合可能な抗原結合ドメインを形成し、（Ｉ）前記ＣＤ３特異的ＶＬドメインが、特定の配列にある３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、（II）前記ＣＤ３特異的ＶＨドメインが、特定の配列にある３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、１以上のアミノ酸置換を含むように修飾されている。【選択図】図１４Ａ
2019142866.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の抗原結合フラグメントを含むＣＤ３結合分子であって、前記抗原結合フラグメントが抗体ＣＤ３特異的ＶＬドメイン及び抗体ＣＤ３特異的ＶＨドメインを含み、前記ＣＤ３特異的ＶＬドメイン及び前記ＣＤ３特異的ＶＨドメインが、ヒトＣＤ３のエピトープ及び非ヒト哺乳類のＣＤ３のエピトープの両方に免疫特異的に結合可能な抗原結合ドメインを形成し、
（Ｉ）前記ＣＤ３特異的ＶＬドメインが、配列ＩＤ番号：５にある３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、
（II）前記ＣＤ３特異的ＶＨドメインが、配列ＩＤ番号：７にある３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、
（ｉ）        Ｉ５１Ｔ；
（ｉｉ）      Ｓ５２ａＮ；
（ｉｉｉ）    Ｙ５２ｃＡ；
（ｉｖ）      Ｎ５４Ｓ
（ｖ）        Ａ５６Ｔ
（ｖｉ）      Ｙ５８Ｅ
（ｖｉｉ）    Ｄ６１Ａ、及び
（ｖｉｉｉ）  Ｄ６５Ｇ
からなる郡から選択される１以上のアミノ酸置換を含むように修飾され、
その番号がＫａｂａｔの番号付け方式に従っている、
ＣＤ３結合分子。
【請求項２】
前記ＣＤ３特異的ＶＬドメインが、ｈ−ｍａｂ２  ＶＬ−４（配列ＩＤ番号：２２）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＬ−６（配列ＩＤ番号：２６）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＬ−７（配列ＩＤ番号：２８）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＬ−８（配列ＩＤ番号：３０）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＬ−９（配列ＩＤ番号：３２）、及びｈ−ｍａｂ２  ＶＬ−１０（配列ＩＤ番号：３４）からなる群から選択される、請求項１に記載のＣＤ３結合分子。
【請求項３】
前記ＣＤ３特異的ＶＨドメインが、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−６Ｌ（配列ＩＤ番号：５４）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−８Ｌ（配列ＩＤ番号：５５）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−８  ｄｉ−１（配列ＩＤ番号：５６）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−８  ｄｉ−２（配列ＩＤ番号：５７）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−６Ｍ（配列ＩＤ番号：７２）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−８Ｍ（配列ＩＤ番号：７４）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−２ｋ（配列ＩＤ番号：８７）、及びｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−５ｋ（配列ＩＤ番号：８８）からなる群から選択される、請求項１又は２に記載のＣＤ３結合分子。
【請求項４】
前記ＣＤ３特異的ＶＨドメインが、前記アミノ置換を含むことにより、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−１（配列ＩＤ番号：３６）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−２（配列ＩＤ番号：３８）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−３（配列ＩＤ番号：４０）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−４（配列ＩＤ番号：４２）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−５（配列ＩＤ番号：４４）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−６（配列ＩＤ番号：４６）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−７（配列ＩＤ番号：４８）、及びｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−８（配列ＩＤ番号：５０）のアミノ酸とは異なるアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のＣＤ３結合分子。
【請求項５】
前記ＣＤ３結合分子が抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＣＤ３結合分子。
【請求項６】
前記抗体が、
（Ａ）Ｆｃ領域を欠損しているか、又は
（Ｂ）Ｆｃ領域を含んでいるが、
（ｉ）エフェクター機能を欠損しているか、
（ｉｉ）エフェクター機能が低下しているか、若しくは
（ｉｉｉ）前記抗体の前記Ｆｃ領域がＦｃ受容体に結合する能力が低減しており、
前記エフェクター機能の欠損、前記エフェクター機能の低下、及び前記結合する能力の低減が、野生型Ｆｃ受容体に対してものである、請求項５に記載のＣＤ３結合分子。
【請求項７】
前記ＣＤ３結合分子が、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含むＣＤ３結合ダイアボディであり、前記鎖が相互に共有結合し、
（Ｉ）前記第１のポリペプチド鎖が、アミノ（Ｎ−）末端とカルボキシ（Ｃ−）末端とを含み、さらにＮ末端からＣ末端への間に、
（ｉ）前記ＣＤ３特異的ＶＬドメインを含むドメイン（Ａ）と、
（ｉｉ）第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を含むドメイン（Ｂ）と、
（ｉｉｉ）ドメイン（Ｃ）とを含み、
前記ドメイン（Ａ）及び（Ｂ）が相互に会合してエピトープ結合部位を形成することなく、
且つ、
（ＩＩ）前記第２のポリペプチド鎖が、アミノ（Ｎ−）末端とカルボキシ（Ｃ−）末端とを含み、さらにＮ末端からＣ末端への間に
（ｉ）前記第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）の結合領域を含むドメイン（Ｄ）と、
（ｉｉ）前記ＣＤ３特異的ＶＨドメインを含むドメイン（Ｅ）と、
（ｉｉｉ）ドメイン（Ｆ）とを含み、
前記ドメイン（Ｄ）及び（Ｅ）が相互に会合してエピトープ結合部位を形成することなく、
さらに、
（１）前記ドメイン（Ａ）及び（Ｅ）が会合して、ヒトＣＤ３と非ヒト哺乳類のＣＤ３との両方に免疫特異的に結合可能な前記抗原結合ドメインを形成し、
（２）前記ドメイン（Ｂ）及び（Ｄ）が会合して、第２のエピトープに免疫特異的に結合する結合部位を形成し、前記第２のエピトープが、前記ドメイン（Ａ）及び（Ｅ）の前記会合から形成された前記抗原結合ドメインと結合する前記ＣＤ３エピトープとは異なり、
（３）前記ドメイン（Ｃ）及び（Ｆ）が相互に共有会合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＣＤ３結合分子。
【請求項８】
前記第２のエピトープが、ＣＤ３のエピトープではない、請求項７に記載のＣＤ３結合分子。
【請求項９】
前記第２のエピトープが、前記ドメイン（Ａ）及び（Ｅ）の前記会合から形成された前記抗原結合ドメインと結合する前記ＣＤ３エピトープとは異なるＣＤ３のエピトープである、請求項７に記載のＣＤ３結合分子。
【請求項１０】
ヒト化された、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＣＤ３結合分子。
【請求項１１】
（ｉ）ＣＤ３及び（ｉｉ）（ａ）腫瘍抗原、又は（ｉｉ）（ｂ）細胞表面の抗原、受容体若しくは受容体リガンドの両方に免疫特異的に結合可能である、請求項１〜４又は７〜１０のいずれか１項に記載のＣＤ３結合分子。
【請求項１２】
前記ＣＤ３結合分子が、ＣＤ３及び腫瘍細胞上に発現した腫瘍抗原に免疫特異的に結合可能であり、前記腫瘍細胞は、乳癌、前立腺癌、胃癌、肺癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、卵巣癌、口腔癌、咽頭癌、食道癌、喉頭癌、骨癌、皮膚癌、黒色腫、子宮癌、精巣癌、膀胱癌、腎臓癌、脳腫瘍、グリア芽腫、甲状腺癌、リンパ腫、骨髄腫、及び白血病からなる群から選択される癌からの腫瘍細胞である、請求項１１に記載のＣＤ３結合分子。
【請求項１３】
前記ＣＤ３結合分子が、ＣＤ３に、及び細胞表面の抗原、受容体又は受容体リガンドに免疫特異的に結合可能であり、前記細胞表面の抗原、受容体又は受容体リガンドがＨＥＲ２／ｎｅｕ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ２０、ＰＳＭＡ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦＲ、Ａ３３、ＣＤ１９又はＥｐ−ＣＡＭである、請求項１１に記載のＣＤ３結合分子。
【請求項１４】
前記ＣＤ３結合分子が、ＣＤ３に、及び細胞表面の抗原、受容体又は受容体リガンドに免疫特異的に結合可能であり、前記細胞表面の抗原、受容体又は受容体リガンドが、Ｔ細胞とＢ細胞の会合に関与する分子であり、前記Ｔ細胞とＢ細胞の会合に関与する分子が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２７、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３及びＣＦＡ−１からなる群から選択される、請求項１１に記載のＣＤ３結合分子。
【請求項１５】
（Ａ）前記ドメイン（Ｂ）が、配列ＩＤ番号：６５の１１９〜２３８位のアミノ酸残基を含み、且つ
（Ｂ）前記ドメイン（Ｄ）が、配列ＩＤ番号：６４の１〜１０７位のアミノ酸残基を含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載のＣＤ３結合分子。
【請求項１６】
（Ａ）前記ドメイン（Ｂ）が、配列ＩＤ番号：６７の１１９〜２４０位のアミノ酸残基を含み、且つ
（Ｂ）前記ドメイン（Ｄ）が、配列ＩＤ番号：６６の１〜１０７位のアミノ酸残基を含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載のＣＤ３結合分子。
【請求項１７】
前記ＣＤ３特異的ＶＬドメインが、ｈ−ｍａｂ２  ＶＬ−６（配列ＩＤ番号：２６）である、請求項７〜１６のいずれか１項に記載のＣＤ３結合分子。
【請求項１８】
前記ＣＤ３結合ダイアボディが、Ｆｃドメイン又はその一部を含む、請求項７〜９又は１５〜１７のいずれか１項に記載のＣＤ３結合分子。
【請求項１９】
（Ａ）前記第１のポリペプチド鎖がさらにＥコイル配列を含むとともに、前記第２のポリペプチド鎖がさらにＫコイル配列を含み、又は
（Ｂ）前記第１のポリペプチド鎖がさらにＫコイル配列を含むとともに、前記第２のポリペプチド鎖がさらにＥコイル配列を含み、
前記Ｅコイル配列が、配列ＩＤ番号：６２の２４４〜２７１位のアミノ酸残基であり、前記Ｋコイル配列が、配列ＩＤ番号：６３の２４７〜２７４位のアミノ酸残基である、請求項７〜９又は１５〜１８のいずれか１項に記載のＣＤ３結合分子。
【請求項２０】
前記ＣＤ３結合分子が、Ｆｃドメイン又はその一部を含む、請求項１９に記載のＣＤ３結合分子。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の前記ＣＤ３結合分子、及び薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項２２】
癌又は自己免疫若しくは炎症性疾患の治療のための医薬の製造における、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の前記ＣＤ３結合分子又は請求項２１に記載の前記医薬組成物の使用。
【請求項２３】
前記自己免疫又は炎症性疾患が、Ｉ型インスリン依存性糖尿病、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、炎症性腸疾患、重症筋無力症、小児脂肪便症、シェーグレン症候群、グレーブス病、クローン病、自己免疫肝炎、乾癬、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー性鼻炎、臓器移植の影響、又は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）からなる群から選択される、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記自己免疫又は炎症性疾患が、Ｉ型インスリン依存性糖尿病である、請求項２３の記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、米国特許出願第６１／４８８，７１６号（２０１１年５月２１日出願、出願中）及び第６１／５３０，３５３号（２０１１年９月１日出願、出願中）に対する優先権を主張し、上記出願はそれぞれ参照により全体を本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
（配列表への参照）
本出願は、米国特許法施行規則１．８２１以下参照に従い、１つ又は複数の配列表を含み、これらは紙及びコンピュータ読み取り可能な媒体の両方で開示され、紙及びコンピュータ読み取り可能な開示は参照により全体を本明細書に組み込むものとする。
【０００３】
本発明は、ヒト及び非ヒトＣＤ３に結合可能なＣＤ３結合分子に、特に非ヒト哺乳類（例えばカニクイザル）のＣＤ３と交差反応性であるような分子に関する。本発明はまた、癌、自己免疫性及び／又は炎症性疾患並びに他の状態の治療における上記抗体及び抗原結合フラグメントの使用にも関する。
【背景技術】
【０００４】
身体の免疫系は例えば、外傷、感染及び新生物形成などの様々な状態に対する防御として働き、別個であるが相互関連する２つの系、すなわち細胞系及び体液性免疫系によって仲介される。一般的に、体液系は、身体に対して異物であると系が認識した生成物と結合し、それを中和する能力を有する可溶性生成物（抗体又は免疫グロブリン）によって仲介される。対照的に、細胞免疫系は、様々な治療の役割を果たし、Ｔ細胞と呼ばれる特定の細胞の動員を含む。Ｔ細胞は、胸腺から誘導され、組織とリンパ系と循環系との間を循環するリンパ球である。これらは様々な異物構造（抗原）に対して、又はそれに応答して作用する。多くの場合、これらの異物抗原は、新生物形成又は感染の結果、宿主細胞で発現する。Ｔ細胞自体は抗体を分泌しないが、通常は、第２のクラスのリンパ球、すなわちＢ
細胞（骨髄から誘導される）が抗体を分泌するために必要とされる。Ｔ細胞は、１つの抗原を別の抗原から識別できるように並外れた免疫特異性を示すことが極めて重要である。
【０００５】
ナイーブＴ細胞、例えばその特定の抗原にまだ遭遇していないＴ細胞は、最初に特定のペプチド、すなわち抗原提示細胞上のＭＨＣ複合体に遭遇すると活性化する。抗原提示細胞は、Ｂ細胞、マクロファージ又は樹状細胞であってよい。ナイーブＴ細胞が特定のペプチド、すなわち抗原提示細胞上のＭＨＣ複合体に遭遇すると、Ｔ細胞受容体を通して信号が送出され、これはＴ細胞のリンパ球機能関連抗原（ＬＦＡ）分子のコンフォメーションに変化を誘発し、抗原提示細胞の表面に存在する細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）に対するその親和性を増大させる。Ｔ細胞と抗原提示細胞との相互作用によって発生した信号は、ナイーブＴ細胞の活性化に必要であるが十分ではない。第２の共刺激信号が必要である。ナイーブＴ細胞は、その表面に特定のペプチドのＭＨＣ複合体と共刺激分子との両方を担持
している抗原提示細胞によってのみ活性化することができる。共刺激がない状態でナイーブＴ細胞が抗原を認識すると、Ｔ細胞がアネルギー性になる。Ｔ細胞及びＢ細胞が適応免疫応答を得るように活性化するために２つの信号が必要であることで、Ｔ細胞が認識できる系内の位置で抗原提示細胞上に存在し得る自己抗原に対して、応答しないようにするメカニズムを提供することができる。Ｔ細胞が抗原提示細胞と接触した結果、必要な２つの信号のうち一方しか発生しない場合、Ｔ細胞は活性化されず、適応免疫応答が生じない。
【０００６】
ヒト及び他の哺乳類が病原体及び異物に対して免疫応答を生じる効率は、２つの特徴に基づいている。すなわち、抗原認識に対する免疫応答の精巧な特異性、及び同じ抗原で再活性化した場合の応答を高速化し、更に活発にすることができる免疫記憶である（Portol&eacute;s, P.他（２００９）の「The TCR/CD3 Complex: Opening the Gate to Successful Vaccination」（Current Pharmaceutical Design 15:3290-3300）、Guy, C.S.他（２００９）の「Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex」（Immunol Rev. 232(1):7-21））。Ｔ細胞の応答の特異性は、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）及び細胞表面受容体リガンドＣＤ３を伴う分子複合体によって抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に提示された抗原の認識によって仲介される。ＴＣＲはα及びβ鎖の共有結合したヘテロ二量体（「ＴＣＲαβ」）である。これらの鎖は、長さが２５９（α）及び２９６（β）のアミノ酸のクラスＩ膜ポリペプチドである。ＣＤ３分子は、３つの二量体（εγ、εδ、ζζ）として会合するＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及び２本のＣＤ３ε鎖を含有する複合体である（Guy, C.S.他（２００９）の「Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex」（Immunol Rev. 232(1):7-21）、Call, M.E.他（２００７）の「Common Themes In The Assembly And Architecture Of Activating Immune Receptors」（Nat. Rev. Immunol. 7:841-850）、Weiss, A.（１９９３）の「T Cell Antigen Receptor Signal Transduction: A Tale Of Tails And Cytoplasmic Protein-Tryosine Kinases」（Cell 73:209-212））。ＴＣＲとＣＤ３の複合体は、ＣＤ３ζ鎖（ゼータ鎖）（Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖又はＣＤ２４７としても知られる）とともにＴＣＲ複合体を構成する（van der Merwe, P.A.他（２０１０年１２月３日電子出版）の「Mechanisms For T Cell Receptor Triggering」（Nat. Rev. Immunol 11:47-55）、Wucherpfennig, K.W.他（２０１０）の「Structural Biology of the T-cell Receptor: Insights into Recepto
r Assembly, Ligand Recognition, and Initiation of Signaling」（Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2:a005140））。この複合体は特に重要である。何故なら、多数（１０個）の免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有するからである。
【０００７】
成熟したＴ細胞では、自己ＭＨＣ分子に結合した異物抗原ペプチドによるＴＣＲ／ＣＤ３の活性化は、抗原特異性Ｔ細胞が増大し、エフェクター又はメモリＴリンパ球に分化するために必要な第１のステップである。これらのプロセスには、ＴＣＲ複合体の免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化が含まれる。ＴＣＲ複合体はこのように多数のＩＴＡＭＳ（全部で１０個）を有し、これらのＩＴＡＭＳは（成分の鎖の二量体化により）タンデムで整列するので、ＴＣＲ連結後に関連するチロシン残基がリン酸化すると、７０ｋＤａのζ鎖結合タンパク質（ＺＡＰ−７０）などのＳｒｃ相同２（ＳＨ２）ドメインを含有するタンパク質のための対をなすドッキング部位が生成され、それによりＴ細胞の活性化及び分化につながる増幅信号伝達カスケードが開始される（Guy, C.S.他（２００９）の「Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex」（Immunol Rev. 232(1):7-21））。
【０００８】
これらのプロセスの結果は、抗原刺激の強度及び質によって、更に補助受容体及び共刺激表面分子によって、又はサイトカイン受容体によって伝えられる同伴信号の性質によって調節される（Portol&eacute;s, P.他（２００９）の「The TCR/CD3 Complex: Opening the Gate to Successful Vaccination」（Current Pharmaceutical Design 15:3290-3300）、Riha, P.他（２０１０）の「CD28 Co-Signaling In The Adaptive Immune Response」（Self/Nonself 1(3):231-240））。ＴＣＲ刺激はＴ細胞の活性化の必要条件であるが、Ｔ細胞の十分な活性化及び分化にはＣＤ２８などの共刺激分子の結合が必要であることが明確に理解されている（Guy, C.S.他（２００９）の「Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex」（Immunol Rev. 232(1):7-21））。
【０００９】
抗抗原応答を開始する際のＣＤ３の基本的性質により、この受容体に対するモノクローナル抗体が、免疫プロセスを遮断するか、又は少なくとも調節することができるものとして、したがって炎症及び／自己免疫疾患を治療する薬剤として提案されている。実際、抗ＣＤ３抗体は、ヒトの治療に認可された最初の抗体であった（St. Clair E.W.（２００９）の「Novel Targeted Therapies for Autoimmunity」（Curr. Opin. Immunol. 21(6):648-657））。抗ＣＤ３抗体（Janssen-CilagからORTHOCLONE（商標）OKT3（商標）として販売されている）が、臓器移植した患者の急性拒絶を軽減するために、及びリンパ芽球性白血病の治療として投与されてきた（Cosimi, A.B.他（１９８１）の「Use Of Monoclonal Antibodies To T-Cell Subsets For Immunologic Monitoring And Treatment In Recipients Of Renal Allografts」（N. Engl. J. Med. 305:308-314）、Kung, P.他（１９７９）の「Monoclonal antibodies defining distinctive human T cell surface antigens」（Science 206:347-349）、Vigeral, P.他（１９８６）の「Prophylactic Use Of OKT3 Monoclonal Antibody In Cadaver Kidney Recipients. Utilization Of OKT3 As The Sole Immunosuppressive Agent」（Transplantation 41:730-733）、Midtvedt, K.他（２００３）の「Individualized T Cell Monitored Administration of ATG Versus OKT3 In Steroid-Resistant Kidney Graft Rejection」（Clin. Transplant. 17(1):69-74）、Gramatzki, M.他（１９９５）の「Therapy With OKT3 Monoclonal Antibody In Refractory T Cell Acute Lymphoblastic Leukemia Induces interleukin-2 Responsiveness」（Leukemia 9(3):382-390）、Herold, K.C.他（２００２）の「Anti-CD3 Monoclonal Antibody In New-Onset Type 1 Diabetes Mellitus」（N. Engl. J. Med. 346:1692-1698）、Cole, M.S.他（１９９７）の「Human IgG2 Variants Of Chimeric Anti-CD3 Are Nonmitogenic to T cells」（J. Immunol. 159(7):3613-3621）、Cole, M.S.他（１９９９）の「Huｍ291, A Humanized Anti-CD3 Antibody, Is Immunosuppressive To T Cells While Exhibiting Reduced Mitogenicity in vitro」（Transplantation 68:563-571）、米国特許第６，４９１，９１６号、第５，５８５，０９７号及び第６，７０６，２６５号）。
【００１０】
しかし、このような抗ＣＤ３治療は、副作用を回避するほど十分に特異的であると証明されていない（Ludvigsson, J.（２００９）の「The Role of Immunomodulation Therapy in Autoimmune Diabetes」（J. Diabetes Sci. Technol. 3(2):320-330））。ＯＫＴ３を毎日繰り返し投与すると、十分な免疫抑制を生じ、腎移植後の拒絶の効果的な治療を提供する。ＯＫＴ３のインビボ投与は、Ｔ細胞の活性化と免疫応答の抑制との両方をもたらす。しかし、ＯＫＴ３の使用は、初期Ｔ細胞活性化事象に、及びＴ細胞応答の免疫抑制前に生じたサイトカインのその後の放出に関連する最初の毒性投与量反応症候群によって妨げられている。このマウスモノクローナル抗体を最初に、及び時には２回目に注射した後に生じる副作用として報告されたものには、高熱、悪寒、頭痛及び胃腸症状（嘔吐及び下痢）で構成された「インフルエンザ様」症候群が含まれ、重篤な事例では治療後数時間以内に肺水腫が認められた（Thistlethwaite, J.R. Jr.他（１９８８）の「Complications and Monitoring of OKT3 Therapy」（Am. J. Kidney Dis. 11:112-119））。この症候群は、Ｔ細胞表面上のＴＣＲ／ＣＤ３複合体のＯＫＴ３が仲介した架橋、及びその結果のサイトカイン、例えば、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、インターフェロン−ガンマ、インタロイキンＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の放出を反映すると考えられている（Masharani, U.B.他（２０１０）の「Teplizumab Therapy For Type 1 Diabetes」（Expert Opin. Biol. Ther. 10(3):459-465）、Abramowicz, D.他（１９８９）の「Release Of Tumor Necrosis Factor, Interleukin-2, And Gamma-Interferon In Serum After Injection Of OKT3 Monoclonal Antibody In Kidney Transplant Recipients」（Transplantation 47:606-608）、Ferran, C.他（１９９０）の「Cytokine-Related Syndrome Following Injection Of Anti-CD3 Monoclonal Antibody: Further Evidence For Transient In Vivo T Cell Activation」（Eur. J. Immunol. 20:509-515）、Hirsch, R.他（１２９８９）の「Effects Of In Vivo Administration Of Anti-CD3 Monoclonal Antibody On T Cell Function In Mice. II. In Vivo Activation Of T Cells」（J. Immunol. 142:737-743））。抗ＣＤ３抗体の使用については、米国特許第７，８８３，７０３号、第７，７２８，１１４号、第７，６３５，４７２号、第７，５７５，９２３号、及び第７，３８１，９０３号、及び米国特許公開第２０１０／０１５０９１８号、第２０１０／０２０９４３７号、第２０１０／０１８３５５４号、第２０１０／００１５１４２号、第２００８／００９５７６６号、第２００７／００７７２４６号、及びＰＣＴ特許公開ＷＯ２００８／１１９５６７号で開示されている。
【００１１】
以前の抗体に特有の限界は、ヒトＣＤ３のみに特異的なことである。この限界は、ヒトの疾患を治療する治療薬剤として、このような抗体を開発するための重大な障害である。市場の承認を得るために、新しい候補投薬法はいずれも厳格な試験を通過しなければならない。この試験は、前臨床相と臨床相に細分することができる。後者は、一般的に知られている臨床第Ｉ相、第ＩＩ相及び第ＩＩＩ相に更に細分され、ヒトの患者で実施されるが、前者は動物で実施される。前臨床試験の目的は、候補薬品が所望の活性を有し、最も重要なことは安全であることを証明することである。前臨床試験で動物での安全性、及び候補薬品に推定される有効性が立証された場合のみ、この候補薬品は、個々の規制当局によりヒトの臨床試験が承認される。候補薬品は、以下の３つの方法にて動物での安全性を試
験することができる。すなわち、（ｉ）関連する種で、すなわち候補薬品がオルソログ抗原を認識できる種で、（ｉｉ）ヒト抗原を含むトランスジェニック動物で、及び（ｉｉｉ）動物に存在するオルソログ抗原を結合することができる候補薬品の代用薬を使用することである。トランスジェニック動物の限界は、このテクノロジが通常は齧歯動物に限定されていることである。しかし、齧歯動物とヒトとは生理機能に重大な違いがあり、そのことは齧歯動物で取得した安全性データからヒトでの安全性を予測することを困難にすることがある。候補薬品の代用薬の限界は、実際の候補薬品と比較して物質の組成が異なり、往々にして使用される動物が、以上で説明したような限界を有する齧歯動物であることである。したがって、齧歯動物で生成された前臨床データは、候補薬品に関して予測能力が限られている。安全性試験のための選択方法は、関連する種、好ましくは下等霊長類を使用することである。当技術分野で説明されているヒトでの治療介入に適切なＣＤ３結合分子の現在の限界は、関連する種が高等霊長類、特にカニクイザルであることである。したがって、ヒトと霊長類両方のＣＤ３に結合可能な抗ＣＤ３抗体が非常に望ましい。このような抗体が、米国特許公開第２０１００１５０９１８号及びＰＣＴ特許公開ＷＯ２００８／１１９５６７号で説明されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
このような進歩にもかかわらず、非ヒト哺乳類（例えばカニクイザル）のＣＤ３と交差反応可能である抗ヒトＣＤ３抗体及びその抗原結合フラグメントがまだ必要とされている。本発明は、この必要性、並びに癌、自己免疫及び炎症性疾患の治療を改善する必要性に対処する。
【００１３】
本発明は、ヒト及び非ヒトＣＤ３に結合可能なＣＤ３結合分子に、特に非ヒト哺乳類（例えばカニクイザル）のＣＤ３に交差反応性であるような分子に関する。本発明はまた、癌、自己免疫及び／又は炎症性疾患及び他の状態の治療にこのような抗体及び抗原結合フラグメントを使用することにも関する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
詳細には、本発明は抗体の抗原結合フラグメントを含むＣＤ３結合分子を提供し、抗原結合フラグメントは抗体ＣＤ３特異的ＶＬドメイン及び抗体ＣＤ３特異的ＶＨドメインを含み、ＣＤ３特異的ＶＬドメイン及びＣＤ３特異的ＶＨドメインは、ヒトＣＤ３のエピトープ及び非ヒト哺乳類のＣＤ３のエピトープの両方に免疫特異的に結合可能な抗原結合ドメインを形成し、
（Ｉ）ＣＤ３特異的ＶＬドメインは、ｈ−ｍａｂ２  ＶＬ−１（配列ＩＤ番号：１６）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＬ−２（配列ＩＤ番号：１８）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＬ−３（配列ＩＤ番号：２０）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＬ−４（配列ＩＤ番号：２２）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＬ−５（配列ＩＤ番号：２４）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＬ−６（配列ＩＤ番号：２６）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＬ−７（配列ＩＤ番号：２８）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＬ−８（配列ＩＤ番号：３０）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＬ−９（配列ＩＤ番号：３２）、及びｈ−ｍａｂ２  ＶＬ−１０（配列ＩＤ番号：３４）からなる群から選択され、上記ＣＤ３特異的ＶＨドメインは、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−１（配列ＩＤ番号：３６）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−２（配列ＩＤ番号：３８）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−３（配列ＩＤ番号：４０）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−４（配列ＩＤ番号：４２）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−５（配列ＩＤ番号：４４）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−６（配列ＩＤ番号：４６）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−６Ｌ（配列ＩＤ番号：５４）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−７（配列ＩＤ番号：４８）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−８（配列ＩＤ番号：５０）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−８Ｌ（配列ＩＤ番号：５５）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−８  ｄｉ−１（配列ＩＤ番号：５６）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−８  ｄｉ−２（配列ＩＤ番号：５７）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−６Ｍ（配列ＩＤ番号：７２）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−８Ｍ（配列ＩＤ番号：７４）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−２ｋ（配列ＩＤ番号：８７）、及びｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−５ｋ（配列ＩＤ番号：８８）からなる群から選択されるか、又は、
（ＩＩ）ＣＤ３特異的ＶＬドメインは、ｈ−ｍａｂ  １  ＶＬ−１（配列ＩＤ番号：１０）及びｈ−ｍａｂ１  ＶＬ−２（配列ＩＤ番号：１２）からなる群から選択され、ＣＤ３特異的ＶＨドメインはｈ−ｍａｂ１  ＶＨ（配列ＩＤ番号：１４）である。
【００１５】
本発明は特に、ＣＤ３特異的ＶＬドメインがｈ−ｍａｂ２  ＶＬ−６（配列ＩＤ番号：２６）である上記ＣＤ３結合分子の実施形態に関する。
【００１６】
本発明は更に、ＣＤ３特異的ＶＨドメインがｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−８（配列ＩＤ番号：５０）、ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−６（配列ＩＤ番号：４６）、又はｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−２ｋ（配列ＩＤ番号：８７）である上記ＣＤ３結合分子の実施形態に関する。
【００１７】
本発明は特に、分子が抗体であり、特に抗体にＦｃ領域がない、又は
（Ａ）エフェクター機能がない、又はエフェクター機能が低下した、又は
（Ｂ）抗体のＦｃ領域がＦｃ受容体に結合する能力が低減している
Ｆｃ領域を有する上記ＣＤ３結合分子の実施形態に関し、
エフェクター機能の低下及び結合能力の低減は、野生型Ｆｃ受容体のそれに関する。
【００１８】
本発明は更に、分子が、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含むＣＤ３結合ダイアボディである上記ＣＤ３結合分子の実施形態に関し、鎖は相互に共有結合し、
（Ｉ）．第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端とカルボキシ末端とを含む、さらにＮ末端からＣ末端への間に、
（ｉ）ＣＤ３特異的ＶＬドメインを含むドメイン（Ａ）と、
（ｉｉ）第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を含むドメイン（Ｂ）と、
（ｉｉｉ）ドメイン（Ｃ）とを含み、
ドメイン（Ａ）及び（Ｂ）はエピトープ結合部位を形成するために相互に会合せず、且つ、
（ＩＩ）第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端とカルボキシ末端とを含む、さらにＮ末端からＣ末端への間に、
（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）の結合領域を含むドメイン（Ｄ）と、
（ｉｉ）ＣＤ３特異的ＶＨドメインを含むドメイン（Ｅ）と、
（ｉｉｉ）ドメイン（Ｆ）とを含み、
ドメイン（Ｄ）及び（Ｅ）はエピトープ結合部位を形成するために相互に会合せず、
（１）ドメイン（Ａ）及び（Ｅ）は、ヒトＣＤ３と非ヒト哺乳類のＣＤ３との両方に免疫特異的に結合可能である抗原結合ドメインを形成するために会合し、
（２）ドメイン（Ｂ）及び（Ｄ）は、第２のエピトープに免疫特異的に結合する結合部位を形成するために会合し、第２のエピトープは、ドメイン（Ａ）及び（Ｅ）の会合から形成された抗原結合ドメインによって結合されたＣＤ３エピトープとは異なり、
（３）ドメイン（Ｃ）及び（Ｆ）は相互に共有会合する。
【００１９】
本発明は更に、第２のエピトープがＣＤ３のエピトープではない上記ＣＤ３結合分子の実施形態に関する。
【００２０】
本発明は更に、第２のエピトープが、ドメイン（Ａ）及び（Ｅ）の会合から形成された抗原結合ドメインと結合するＣＤ３エピトープとは異なるＣＤ３のエピトープである上記ＣＤ３結合分子の実施形態に関する。
【００２１】
本発明は更に、このような分子がヒト化した上記ＣＤ３結合分子又は抗体又はダイアボディの実施形態に関する。
【００２２】
本発明は更に、このような分子がＣＤ３及びフルオレセインに免疫特異的に結合可能である上記ＣＤ３結合分子又は抗体又はダイアボディの実施形態に関する。
【００２３】
本発明は更に、このような分子が（ｉ）ＣＤ３及び（ｉｉ）（ａ）腫瘍抗原、又は（ｉｉ）（ｂ）細胞表面の抗原、受容体若しくは受容体リガンドの両方に免疫特異的に結合可能である上記ＣＤ３結合分子又はダイアボディの実施形態に関する。
【００２４】
本発明は更に、分子又はダイアボディがＣＤ３に、及び腫瘍細胞上に発現した腫瘍抗原に免疫特異的に結合可能である上記ＣＤ３結合分子又はダイアボディの実施形態に関し、腫瘍細胞は、乳癌、前立腺癌、胃癌、肺癌、胃潰瘍、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、卵巣癌、口腔癌、咽頭癌、食道癌、喉頭癌、骨癌、皮膚癌、黒色腫、子宮癌、精巣癌、膀胱癌、腎臓癌、脳腫瘍、グリア芽腫、甲状腺癌、リンパ腫、骨髄腫、及び白血病からなる群から選択される癌からの腫瘍細胞である。
【００２５】
本発明は更に、分子又はダイアボディが、ＣＤ３に、及び細胞表面の抗原、受容体又は受容体リガンドに免疫特異的に結合可能であり、細胞表面の抗原、受容体又は受容体リガンドがＨＥＲ２／ｎｅｕ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ２０、ＰＳＭＡ、ＩＧＦ−１Ｒ、Ｅｐ−ＣＡＭであるか、又は適応免疫応答におけるＴ細胞又はＢ細胞の活性化につながるＴ細胞とＢ細胞との会合に関与する分子である、上記ＣＤ３結合分子又はダイアボディの実施形態に関する。
【００２６】
本発明は更に、分子又はダイアボディがＣＤ３に、及びＴ細胞とＢ細胞の会合に関与する分子に免疫特異的に結合可能であり、Ｔ細胞とＢ細胞の会合に関与する分子が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２７、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＬＦＡ−Ｉ、ＬＦＡ−３及びＣＦＡ−Ｉからなる群から選択される上記ＣＤ３結合分子又はダイアボディの実施形態に関する。
【００２７】
本発明は更に、上記ＣＤ３結合分子、抗体又はダイアボディのいずれかと、薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤のいずれかとを含む医薬組成物に関する。
【００２８】
本発明は更に、癌又は自己免疫若しくは炎症性疾患の治療に使用する上記医薬組成物に関する。
【００２９】
本発明は更に、Ｉ型インスリン依存性糖尿病、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、炎症性腸疾患、重症筋無力症、小児脂肪便症、シェーグレン症候群、グレーブス病、クローン病、自己免疫肝炎、乾癬、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー性鼻炎、臓器移植の影響、又は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）からなる群から選択される自己免疫又は炎症性疾患の治療に使用する上記医薬組成物に関する。本発明は特に、Ｉ型インスリン依存性糖尿病の治療に使用する上記医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ−１Ｂ】ヒト可溶性ＣＤ３（「ｓｈＣＤ３」）を使用して、抗ＣＤ３抗体ｍＡｂ１（図１Ａ）又は抗体ｍＡｂ１のキメラ誘導体（ｃｈ−ｍＡｂ１）（図１Ｂ）の能力を判定した捕捉ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図２Ａ−２Ｂ】ヒト可溶性ＣＤ３（「ｓｈＣＤ３」）又は可溶性カニクイザルＣＤ３（「ｓｃＣＤ３」）を使用して、抗ＣＤ３抗体ｍＡｂ２（図２Ａ）又は抗体ｍＡｂ２のキメラ誘導体（ｃｈ−ｍＡｂ２）（図２Ｂ）の能力を判定した捕捉ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図３】ｍＡｂ２の軽鎖のＫａｂａｔ番号付けしたフレームワーク残基４１〜４６での変動の効果を判定する分析の結果を示す。
【図４】ｍＡｂ２の軽鎖のＫａｂａｔ番号付けしたフレームワーク残基３６、３８、４４及び４６の変動の効果を判定した分析の結果を示す。
【図５】ｍＡｂ２の軽鎖のＫａｂａｔ番号付けしたフレームワーク残基３６、３８及び４６の変動の効果を判定した分析の結果を示す。
【図６】ｍＡｂ２の重鎖のＫａｂａｔ番号付けしたフレームワーク残基３０、４９及び９３の変動の効果を判定した分析の結果を示す。
【図７】ｍＡｂ２の重鎖のＫａｂａｔ番号付けしたフレームワーク残基３０、４９及び９３の変動の効果を判定するために実施した追加の分析の結果を示す。
【図８Ａ−８Ｂ】非ヒトＣＤ３に結合するキメラ及びヒト化ｍＡｂ２の能力を判定するために実施した分析の結果を示す。
【図９Ａ−９Ｄ】ｃｈ−ｍＡＢ２又はｈ−ｍＡｂ２とｓｃＣＤ３又はｓｈＣＤ３との結合の運動学を判定するために実施したＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析のセンサグラムの軌跡を示す。
【図１０Ａ−１０Ｄ】Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、又はＢ７−Ｈ３に結合する抗ＣＤ３の第１のエピトープ結合部位及び第２のエピトープ結合部位を有するＤＡＲＴ（商標）ダイアボディで実施した補則ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１１Ａ−１１Ｂ】Ｂ７Ｈ３×ＣＤ３  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディがＢ７Ｈ３を発現した腫瘍細胞のリダイレクトされた殺傷を仲介する能力を示す。
【図１２Ａ−１２Ｅ】Ａ３３×ＣＤ３  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディがＡ３３を発現した腫瘍細胞のリダイレクトされた殺傷を仲介する能力を示す。
【図１３Ａ−１３Ｂ】ＣＤ１９−ｈ−ｍＡｂ２  ＤＡＲＴ（商標）及びＣＤ１９×ＣＤ３  ＤＡＲＴダイアボディがリダイレクトされたＴ細胞仲介殺傷を引き起こす能力を比較した結果を示す。ＣＤ１９−ｈ−ｍＡｂ２  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディはヒト、更に非ヒトＣＤ３に対する特異性を示し、ＣＤ１９×ＣＤ３  ＤＡＲＴダイアボディはヒトＣＤ３にのみ特異性を示す。図１３ＡはＲａｊｉヒトＢ細胞リンパ腫細胞のリダイレクトされた殺傷、図１３ＢはＪｅＫｏ−１ヒト外套細胞リンパ腫細胞のリダイレクトされた殺傷である。
【図１４Ａ−１４Ｂ】本発明のＣＤ１９−ｈ−ｍＡｂ２  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディが、ヒト又は非ヒトＴ細胞エフェクター細胞の存在下で細胞溶解を仲介できたことを示す。
【図１５Ａ−１５Ｂ】本発明のＥＲＢＩＴＵＸ（商標）−ｈ−ｍＡｂ２  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ又はＥＲＢＩＴＵＸ（商標）−Ｔ細胞受容体ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディが、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞でのインキュベーション後にＣＤ６９  ＭＦＩの増加を仲介する能力を有し、対照標準のＥＲＢＩＴＵＸ（商標）−ＦＮ１８  ＣＤ３  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ（ＥＧＦＲに、及びカニクイザルＣＤ３に結合可能）がＣＤ６９  ＭＦＩの増加を誘発できなかったことを示す。
【図１６Ａ−１６Ｄ】ＥＲＢＩＴＵＸ（商標）−ｈ−ｍＡｂ２  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ、ＥＲＢＩＴＵＸ（商標）−ｍ−ｍＡｂ２  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ又は４４２０−ｈ−ｍＡｂ２  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ（負の対照標準）又は対照標準の２次ダイアボディとＡ４９８又はＡ４３１細胞の結合（それぞれ図１６Ａ及び図１６Ｃ）、及びそのような細胞のリダイレクトされた殺傷の仲介（それぞれ図１６Ｂ及び図１６Ｄ）の調査結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、抗ヒトＣＤ抗体及びその抗原結合フラグメントに、特に非ヒト哺乳類（例えばカニクイザル）のＣＤ３と交差反応性であるような抗体に関する。本発明はまた、癌、自己免疫及び／又は炎症性疾患並びに他の状態の治療にこのような抗体及び抗原結合フラグメントを使用することにも関する。
【００３２】
Ｉ．定義
本明細書で使用する「ＣＤ３結合分子」という用語は、分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位（例えば抗体の抗原結合ドメイン）を通してヒトＣＤ３と非ヒト哺乳類のＣＤ３との両方に免疫特異的に結合可能な分子を指す。本明細書で使用する、ヒトＣＤ３と非ヒト哺乳類のＣＤ３との両方に免疫特異的に結合するこのような能力は、１つの抗原結合ドメインがこのようなＣＤ３分子の両方に同時に結合する能力を指すものではなく、ヒトＣＤ３の存在下でインキュベートされた場合に、ヒトＣＤ３に免疫特異的に結合し、非ヒト哺乳類ＣＤ３の存在下でインキュベートされた場合に、このような非ヒト哺乳類のＣＤ３に免疫特異的に結合するように、このような抗原結合ドメインが交差反応性を示すものである。
【００３３】
本明細書で使用する「ＣＤ３結合分子」という用語は、無処理ポリクローナル又はモノクローナル抗体ばかりでなく、それらのフラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２Ｆｖなど）、単鎖（ＳｃＦｖ）、それらの突然変異体、自然に発生する変異体、必要な特異性を有する抗原認識部位を有する抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、「ＢｉＴＥｓ（登録商標）」、「ＤＡＲＴ（商標)」ダイアボディ分子、及び必要な特異性がある抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾構成も含む。「ＢｉＴＥｓ」（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）という用語は、２つの抗原結合ドメインを有し、その一方は％細胞抗原に結合して、２番目は標的の表面に存在する抗原に結合するポリペプチド単鎖分子を指す（ＷＯ０５／０６１５４７号、Baeuerle, P他（２００８）の「ＢｉＴＥ（登録商標）：A New Class Of Antibodies That Recruit T Cells」（Drugs of the Future 33: 137-147）、Bargou他（２００８）の「Tumor Regression in Cancer Patients by Very Low Doses of a T Cell-Engaging Antibody」（Science 321: 974-977））。
【００３４】
「ＤＡＲＴ（商標）」（二重親和性標的再指向試薬）ダイアボディという用語は、（特に共有結合的相互作用を通して）会合し、少なくとも２つのエピトープ結合部位を形成する少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子を指し、これは同じ又は異なるエピトープを認識することができる。ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのポリペプチド鎖はそれぞれ、免疫グロブリン軽鎖可変領域及び免疫グロブリン重鎖可変領域を含むが、これらの領域が相互作用してエピトープ結合部位を形成するものではない。それどころか、一方（例えば第１）のＤＡＲＴ（商標）ダイアボディポリペプチド鎖の免疫グロブリン重鎖可変領域が、異なる（例えば第２の）ＤＡＲＴ（商標）ポリペプチド鎖の免疫グロブリン軽鎖可変領域と相互作用して、エピトープ結合部位を形成する。同様に、一方（例えば第１）のＤＡＲＴ（商標）ダイアボディポリペプチド鎖の免疫グロブリン軽鎖可変領域が異なる（例えば第２の）ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディポリペプチド鎖の免疫グロブリン重鎖可変領域と相互作用して、エピトープ結合部位を形成する。ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディは単一特異的、二重特異的、三重特異的などであってもよく、したがって１個、２個、３個、又はそれ以上の異なるエピトープ（同じ抗原又は異なる抗原のものであってもよい）と同時に結合することもできる。ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディは、追加的に一価、二価、三価、四価、五価、六価などであってもよく、したがって１個、２個、３個、４個、５個、６個又はそれ以上の分子と同時に結合することもできる。ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのこれら２つの属性（すなわち特異性及び結合価の程度）を組み合わせて、例えば四価（すなわち４組のエピトープと結合可能である）である二重特異的抗体（すなわち２個のエピトープを結合可能である）などを生成することもできる。ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ分子が、ＰＣＴ特許公開ＷＯ２００６／１１３６６５号、ＷＯ２００８／１５７３７９号、及びＷＯ２０１０／０８０５３８号に開示されている。
【００３５】
本発明の二重特異的（又は三重特異的又は多重特異的）分子は、ヒトＣＤ３と非ヒト哺乳類（例えばカニクイザル）のＣＤ３との両方、及び第２（又は追加の）及び異なる抗原又はエピトープと結合可能になる。第２の抗原又はエピトープは、腫瘍細胞上に発現した腫瘍抗原であることが好ましい。このような腫瘍細胞は、例えば、乳癌、前立腺癌、胃癌、肺癌、胃潰瘍、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、卵巣癌、口腔癌、咽頭癌、食道癌、喉頭癌、骨癌、皮膚癌、黒色腫、子宮癌、精巣癌、膀胱癌、腎臓癌、脳腫瘍、グリア芽腫、甲状腺癌、リンパ腫、骨髄腫、又は白血病などの癌とすることができる。追加的な抗原又はエピトープは、細胞表面腫瘍抗原又はエピトープであることが好ましい（例えば、１
７−１Ａ、Ａ３３、成体赤血球１次内胚葉Ｉ抗原、アルファ胎児タンパク質、ＲＮＡ腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原、膀胱腫瘍癌胎児性抗原、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５、Ｂ７−Ｈ６、バーキットリンパ腫抗原−３８．１３、ＣＡ１２５、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ヒトＢリンパ腫抗原−ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＥＡ、ＣＯ１７−１Ａ、ＣＴＡ−１、ＣＴＬＡ−４、表皮性成長因子受容体、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、胎児赤血球Ｉ抗原、線維肉腫抗原、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、ガングリオシドＧＭ３、ＧＩＣＡ１９−９、ｇｐＩＩＩｂ／ＩＩＩａ、ｇｐ７２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、高分子量黒色腫抗原、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、ヒト白血病Ｔ細胞抗原−Ｇｐ３７、ヒト肺癌腫抗原Ｌ２０、ヒト肺癌腫抗Ｌ６、ヒト乳脂肪球抗原、ＩｇＥ、ＫＳ１／４全癌腫抗原ＬＥＡ、肺腺癌Ｆ３抗原、悪性ヒト白血球抗原−ＡＰＯ−１、黒色腫抗原ｇｐ７５、黒色腫会合抗原ｐ９７、ネオ糖タンパク質、ｎｕＣ２４２、多型上皮ムチン抗原、前立腺特異的抗原、前立腺特異的膜抗原、前立腺酸性ホスホターゼ、ＳＫ−１抗原、ＴＡＧ−７２、Ｔ−抗原、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣ１、腫瘍特異的移植型の細胞表面の抗原、血管内皮成長因子、血管内皮成長因子−受容体、及びαｖβ３）。あるいは、このような追加の抗原又はエピトープは、病原体（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、Ｉ型単純ヘルペス（ＨＳＶ−Ｉ）、ＩＩ型単純ヘルペス（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス、パピロマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、天然痘、ＥＢウイルス、Ｉ型ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ−Ｉ）、ＩＩ型ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ−ＩＩ）、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性脳炎、デング熱、天然痘；マイコバクテリアリケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア、肺炎球菌、ボレリアブルグドルフェリ、炭疽菌、連鎖球菌、ブドウ球菌、マイコバクテリア、破傷風、百日咳（Pertissus）、コレラ、悪疫、ジフテリア、クラミジア、及びレジオネラ；リーシュマニア、コクシジア、トリパノソーマ又はマラリア；クラミジア及びリケッチア）と会合することができる。
【００３６】
「モノクローナル抗体」という用語は、均質な抗体集団を指し、モノクローナル抗体は、抗原の選択的結合に関与している（天然で発生、及び非天然で発生した）アミノ酸で構成される。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、１つの抗原性部位に対して配向される。「モノクローナル抗体」という用語は、無処理のモノクローナル抗体及び全長モノクローナル抗体ばかりでなく、そのフラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２Ｆｖなど）、単鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、及び必要な特異性及び抗原に結合する能力を有する抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾構成も含む。これは、抗体の源、又はそれが作成される方法（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組
換えの発現、トランスジェニック動物などによる）に関して限定されるものではない。この用語は、免疫グロブリン全体、更に「抗体」の定義で上記フラグメントなどを含む。
【００３７】
「ヒト化抗体」という用語は、通常は組み換え技術を使用して調製され、非ヒト種からの免役グロブリンから誘導される抗原結合部位、及びヒト免疫グロブリンの構造及び／又は配列に基づく分子の残りの免疫グロブリン構造を有するキメラ分子を指す。抗原結合部位は、定常ドメインに融合した完全可変ドメイン、又は可変ドメイン中の適切なフレームワーク領域に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含むことができる。抗原結合部位は野生型とするか、又は１つ又は複数のアミノ酸置換で修飾することができる。これによって、ヒト個人の免疫原としての定常領域がなくなるが、異物可変領域に対する免疫応答の可能性は残る（LoBuglio, A.F.他（１９８９）の「Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In man: Kinetics And Immune Response」（Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224））。別の方法は、ヒト誘導の定常領域を提供することばかりでなく、ヒトの形態に可能な限り近づけて再形成するように、可変領域を修飾することにも集中している。重鎖及び軽鎖両方の可変領域は、対象となる抗原に応答して変化し、結合機能を決定して、所与の種では比較的保持されてＣＤＲに足場を提供すると想定される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が隣接する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有することが知られている。特定の抗原に対して非ヒト抗体を調製する場合、修飾されるヒト抗体中に存在するＦＲに非ヒト抗体から誘導されるＣＤＲを移植することにより、可変領域を「再形成」又は「ヒト化」することができる。この方法を様々な抗原に適用することが、Sato
, K.他（１９９３）の「Cancer Res 53:851-856」、Riechmann, L.他（１９８８）の「Reshaping Human Antibodies for Therapy」（Nature 332:323-327）、Verhoeyen, M.他（１９８８）の「Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity」（Science 239:1534-1536）、Kettleborough, C.A.他（１９９１）の「Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation」（Protein Engineering 4:773-3783）、Maeda, H.他（１９９１）の「Construclion of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity」（Human Antibodies Hybridoma 2:124-134）、Gorman, S.D.他（１９９１）の「Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody」（Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185）、Tempest, P.R.他（１９９１）の「Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo」（Bio/Technology 9:266-271）、Co, M.S.他（１９９１）の「Humanized Antibodies For Antiviral Therapy」（Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873）、Carter, P.他（１９９２）の「Hummanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy」（Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289）、及びCo, M.S.他（１９９２）の「Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen」（J. Immunol. 148:1149-1154）で報告されている。
【００３８】
幾つかの実施形態では、ヒト化抗体はすべてのＣＤＲ配列（例えば、マウス抗体からの６つのＣＤＲすべてを含有するヒト化マウス抗体）を保持している。他の実施形態では、ヒト化抗体は元の抗体に対して変質している１個又は複数（１個、２個、３個、４個、５個、６個）のＣＤＲを有し、これは元の抗体からの１個又は複数のＣＤＲ「〜から誘導される」１個又は複数のＣＤＲとも呼ばれる。以下で開示するように、本発明の好ましい抗体は特異的に識別されたＣＤＲを有する。しかし、本発明は変質したＣＤＲを有する同等の抗体を想定する。
【００３９】
本明細書で使用する抗体又はポリペプチドは、別のエピトープに対する反応又は会合が、代替エピトープの場合より頻繁、迅速、長い継続時間及び／又は高い親和性である場合、その分子（すなわちエピトープ）の領域と「免疫特異的に」又は同様の意味で「特異的に」結合すると言われる。例えば、ＣＤ３エピトープと特異的に結合する抗体は、他のＣＤ３エピトープ又は非ＣＤ３エピトープと結合する抗体よりも、このＣＤ３エピトープとの結合の親和性、結合力が高く、より迅速であり、及び／又は継続時間が長い抗体である。この定義を読むことにより、例えば第１の標的に免疫特異的に結合する抗体（又は成分又はエピトープ）は、第２の標的に特異的又は優先的に結合しても、又は結合しなくてもよいことも理解される。したがって、「免疫特異的結合」は、「排他的」結合を必ずしも
必要としない（しかし、それを含むことはできる）。通常、結合という場合、それは「免疫特異的」結合を意味するが、これは必然的ではない。
【００４０】
本明細書では、エピトープに関して「免疫活性」であるか、又は「免疫活性のままである」という用語を使用する場合、それは抗体（例えば抗ＣＤ３抗体）が様々な状態で、例えばエピトープが還元及び変性状態に曝露した後で、エピトープに結合する能力を指す。例えば、抗体がもはや変性エピトープに結合できない場合、そのエピトープは免疫不活性になったと言われる。
【００４１】
様々な生物学的機能が本発明の抗ＣＤ３抗体に付随し、このような抗体は、以下の属性のうちいずれか、又はすべてを示すことができるか、又はこのような属性のうち１つ、２つ、３つ又はそれ以上が欠けていることがある。すなわち、正常なヒトＴ細胞の表面に内生発現したままのヒトＣＤ３に特異的に結合する能力、ヒト白血病Ｔ細胞の表面に内生発現したままのヒトＣＤ３に特異的に結合する能力、正常な非ヒト哺乳類Ｔ細胞の表面に内生発現したままの非ヒト哺乳類（例えばカニクイザル）ＣＤ３に特異的に結合する能力、正常な非ヒトＴ細胞の表面に内生発現したままの非ヒトＣＤ３に特異的に結合する能力、非ヒト白血病Ｔ細胞の表面に内生発現したままの非ヒトＣＤ３に特異的に結合する能力、ＣＤ３複合体の形成を中和する（すなわち結合を阻止又は妨害する）能力、ＴＣＲ複合体の形成を中和する能力、ＴＣＲ複合体による信号送出を（アンタゴニスティック又はアゴニスティックに）調節する能力、Ｆｃ受容体に結合する能力、元の抗原が優先的に結合する同じＣＤ３エピトープに優先的に結合する能力などの既知の抗ＣＤ３抗体をＣＤ３に優先的に結合することを競合的に抑制する能力、生細胞の表面に曝露しているＣＤ３の部分にインビトロ又はインビボで結合する能力、生癌細胞の表面に曝露しているＣＤ３の部分に結合する能力、化学療法薬を癌Ｔ細胞に送出する能力、及び／又はＴ細胞に治療薬、毒素又は検出可能なマーカを送出する能力である。本明細書で説明するように、本発明のポリペプチド（抗体を含む）はこれらの特徴の任意の１つ又は複数を有することができる。
【００４２】
本明細書で使用する「薬剤」という用語は、生物学的、薬学的又は化学的化合物を指す。非限定的な例としては、単純又は複雑な有機又は無機分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体誘導体、抗体フラグメント、ビタミン誘導体、炭水化物、毒素、又は化学療法化合物が挙げられる。例えば、小分子及びオリゴマー（例えばオリゴペプチド及びオリゴヌクレオチド）、及び様々な核構造に基づく合成有機化合物などの様々な化合物を合成することができる。また、様々な自然の発生源が、植物又は動物抽出物などのようなスクリーニング用化合物を提供することができる。本発明の方法に使用される薬剤は、ランダムに選択するか、又は合理的に選択又は設計することができる。本明細書では、薬剤は、天然結合パートナー又は既知の抗体を有する分子との会合に関与した特定のアミノ酸又は他の化学成分に関して事前に考察していないか、又は知識がない状態で薬剤を選択した場合、ランダムに選択したと言う。ランダムに選択した薬剤の一例は、化学的ライブラリ又はペプチド組み合わせライブラリの使用及びスクリーニングを通して識別された薬剤である。本明細書では、薬剤は、薬剤の作用に関する標的部位の配列及び／又はそのコンフォメーションを考慮に入れて非ランダムに薬剤を選択した場合、合理的に選択又は設計されたと言う。薬剤は、受容体／リガンド及び／又はＣＤ３／抗ＣＤ３抗体複合体の接触部位を構成するペプチド配列を使用することにより合理的に選択又は合理的に設計することができる。例えば、合理的に選択したペプチド薬剤とは、ＣＤ３が天然環境で生細胞の表面に曝露した状態で、そのＣＤ３上に現れるエピトープと同一であるアミノ酸配列を有するペプチドとすることができる。このような薬剤は、抗ＣＤ３抗体又は天然リガンドに結合することにより、所望に応じて抗ＣＤ３抗体とＣＤ３との会合、又はＣＤ３とその天然リガンドとの会合を還元又は阻止する。
【００４３】
本明細書で抗体に関して「標識付け」という用語を使用する場合、それは、放射性薬剤又は蛍光体（例えばフィコエリトリン（ＰＥ）又はフルオレセインイソチオシアネート（フルオロイソチオシアネート又はＦＩＴＣとしても知られる））などの検出可能な物質を抗体に結合（すなわち物理的にリンク）することによって抗体に直接標識付けをし、更に検出可能な物質との反応性によってプローブ又は抗体に間接的に標識付けをすることを含むものとする。
【００４４】
本明細書で抗体に関して「会合」という用語を使用する場合、それは、薬剤（例えば化学療法薬）を抗体に共有結合及び非共有結合で取り付けるか、又は結合することを含む。抗体は、共通プラットホームに直接結合するか、又は付着を介して間接的に結合することによって、薬剤（例えば化学療法薬）と会合することができ、したがって抗体は、抗体が結合する癌細胞へと薬剤の局所化を指示し、抗体と薬剤とは、抗体が結合する同じ癌細胞を薬剤が標的にしないか、又は薬剤の効力が低下しないように、生理的状態で大幅に解離しない。
【００４５】
「生物学的サンプル」という用語は、固体から採取した様々なサンプルタイプを含み、診断又は監視アッセイに使用することができる。この定義は、唾液、血液及びその他の生理的起源の液体サンプル、生検材料又は組織培養物又はそれから誘導される細胞などの固体組織サンプル、及びその子孫、例えば癌を有すると疑われる個体から採取した組織サンプルから、好ましい実施形態では卵巣、肺、前立腺、膵臓、結腸、及び乳房組織から取得した細胞が含まれる。この定義には、試薬、可溶化、又はタンパク質又はポリヌクレオチドなどの特定の成分の濃縮での処理、又は切片作成の目的で半固体又は固体基質への包埋などにより、獲得した後に何らかの方法で操作されているサンプルも含まれる。「生理学的サンプル」という用語には臨床サンプルも包含され、培養物中の細胞、細胞上澄み、細胞溶解物、血清、血漿、生理学的流体、及び組織サンプルも含まれる。
【００４６】
「宿主細胞」という用語には、ポリヌクレオチド挿入断片を組み込むためにベクターの受容体になり得るか、又はなっている個体の細胞又は細胞培養物が含まれる。宿主細胞には単一宿主細胞の子孫が含まれ、子孫は、自然の、偶発的な、又は意図的な突然変異により、必ずしも元の親細胞と（形態学的に、又はゲノムＤＮＡ補体が）完全には同一でないことがある。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドでインビボにて形質移入した細胞を含む。
【００４７】
本明細書で使用する医薬品組成の「有効量」とは、一実施形態では、有益又は所望の結果を生じさせるのに十分な量であり、それには腫瘍のサイズ又は成長速度を低下させる、炎症反応を遅延又は減衰させる、罹患者の生活の質を向上させる、そのような疾患の治療に必要な他の投薬の量を減少させる、標的指向及び／又は内部移行などを介して別の投薬の効果を強化する、疾患の進行を遅延させる、及び／又は個体の生存時間を延長するような臨床結果が含まれるが、これらに限定されない。このような有効量を、１回又は複数回の投薬で投与することができる。本発明では、薬品、化合物、医薬組成物の有効量は、臨床で観察可能な状態を改善するのに十分な量である。
【００４８】
幾つかの実施形態では、薬品、化合物、又は医薬組成物の有効量は、別の薬品、化合物、又は医薬組成物との組み合わせで達成されてもよく、又はそうでなくてもよい。したがって、「有効量」とは、１つ又は複数の追加の薬剤を投与する状況で考察することができ、１つ又は複数の他の薬剤と組み合わせて所望の結果を獲得できるか、又は獲得している場合、１つの薬剤を有効量与えたと見なすことができる。個体の必要量は変化するが、各成分の有効量の最適範囲を判定するのは、当技術分野の技術の範囲内である。患者に投与する典型的な用量は通常、患者の体重の０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。患者に投与される用量は、患者の体重の０．０００１ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇと５ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇと２ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇと１ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇと０．７５ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇと０．５ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．１５ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．１０ｍｇ／ｋｇの間、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇの間、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇの間、又は０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．１０ｍｇ／ｋｇの間であることが好ましい。本発明の分子の投与量及び投与頻度は、例えば脂質化などを変化させることにより、本発明の分子の摂取及び組織浸透を向上させることにより、減少又は変更することができる。
【００４９】
本明細書では、核酸分子又は薬剤、抗体、組成物又は細胞などは、その核酸分子、薬剤、抗体、組成物、又は細胞などがその発生源に自然に存在する汚染物質の核酸分子、抗体、薬剤、組成物、又は細胞などから実質的に分離された場合、「隔離」されたと言う。
【００５０】
「個体」という用語は、脊椎動物、好ましくは哺乳類を指す。哺乳類にはヒト、家畜、スポーツ用動物、ペット、霊長類、マウス及びラットが含まれるが、これらに限定されない。最も好ましい実施形態では、個体という用語はヒトを指す。
【００５１】
「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために区別なく使用される。ポリマーは直線又は枝分かれしていてもよく、修飾されたアミノ酸を含むことができ、非アミノ酸によって中断することができる。この用語は、自然に、又は介入、例えば、ジスルフィド結合の形成、グルコシル化、脂質化、アセチレン化、リン酸化、又は標識付け成分との接合などの任意の他の操作又は修飾などによって修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。また、この定義には、例えば、１つ又は複数のアミノ酸類似体（例えば人為的アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチドも、また当技術分野で知られている他の修飾も含まれる。本発明のポリペプチドは抗体をベースにしているので、ポリペプチドは単
鎖として、又は会合した鎖として発生できることが理解される。
【００５２】
本明細書で使用する「実質的に純粋」という用語は、少なくとも５０％純粋（すなわち、汚染物質がない）、更に好ましくは少なくとも９０％純粋、更に好ましくは少なくとも９５％純粋、更に好ましくは少なくとも９８％純粋、更に好ましくは少なくとも９９％純粋、最も好ましくは９９％を上回る純粋である材料を指す。
【００５３】
本明細書で使用する「毒素」という用語は、細胞内で有害応答を生じさせる任意の物質を指す。例えば、癌細胞に配向された毒素は、癌細胞に有害作用、時には劣化作用を与える。毒素の例としては、タキサン、マイタンシノイド、オーリスタチン（例えば、モノメチルオーリスタチン（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、オーリスタチンＥ（ＡＥ）など）（米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号、第６，３３３，４１０号、第６，３４０，７０１号、第６，３７２，７３８号、第６，４３６，９３１号、第６，４４１，１６３号、第６，５９６，７５７号、第７，２７６，４９７号、第７，５８５，８５７号又は第７，８５１，４３２号で開示されるようなもの）、カリケアマイシン、アントラサイクリン（例えばドキソルビシン）、ＣＣ−１０６５類似体、ドセタキセル；カテプシンＢ又はＥ；リシン、ゲロニン、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、及びＲＮ分解酵素；放射能標識を付けた抗体（例えば、チウキセタン接合、又は毒性放射性同位体（例えば、９０Ｙ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃなど）で標識を付ける）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
本明細書で使用する「治療（処理）」又は「治療（処理）する」という用語は、有益又は所望の結果、好ましくは有益又は所望の臨床結果を得る方法を表す。このような有益又は所望の臨床結果には炎症又は自己免疫応答を軽減する、癌細胞又は他の疾患細胞の増殖を減少させる（又は破壊する）、癌中に見られる癌細胞の転移を減少させる、腫瘍のサイズを縮小する、疾患の結果である症状を減少させる、罹患者の生活の質を向上させる、疾患の治療に必要な他の投薬の用量を減少させる、疾患の進行を遅延させる、及び／又は個体の生存期間を延長することのうち１つ又は複数が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
ＩＩ．本発明の抗体及びポリペプチドを作成する方法
モノクローナル抗体を作成する方法が当技術分野で知られている。使用できる１つの方法は、Kohler, G.他（１９７５）の「Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity」（Nature 256:495-497 ）の方法、又はその変形である。通常、モノクローナル抗体はマウスなどの非ヒト種で発生する。一般的に、免疫化にはマウス又はラットが使用されるが、他の動物も使用することができる。抗体は、免疫原生量のヒトＣＤ３を含有する細胞、細胞抽出物、又はタンパク質製剤でマウスを免疫化することによって産生される。免疫原は、１次細胞、培養した細胞系統、癌細胞、核酸、又は組織とすることができるが、これらに限定されない。
【００５６】
一実施形態では、ＣＤ３に結合するモノクローナル抗体は、免疫原としてＣＤ３を過剰発現した宿主細胞を使用して獲得される。このような細胞には、例示的にヒトＴ細胞が含まれるが、これに限定されない。
【００５７】
抗体応答を監視するために、動物から小さい生物学的サンプル（例えば血液）を獲得し、免疫原に対する抗体価を試験することができる。脾臓及び／又は幾つかの大リンパ節を取り出し、解離して単細胞にすることができる。所望に応じて、（非特異的に付着細胞を除去した後に）抗原をコーティングしたプレート又はウェルに細胞懸濁液を適用することにより、脾臓細胞をスクリーニングすることができる。抗原に対して特異的な膜結合免疫グロブリンを発現したＢ細胞はプレートに結合され、懸濁液の残りとともに洗い流されない。次に、その結果のＢ細胞、又は解離した全脾臓細胞を、骨髄腫細胞（例えばＸ６３−Ａｇ８．６５３、及びカリフォルニア州サンディエゴのCell Distribution CenterのSalk Instituteからの細胞）と融合させることができる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して、脾臓又はリンパ球を骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマを形成することができる。次に、ハイブリドーマを選択的媒質（例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン媒質で、「ＨＡＴ媒質」としても知られる）で培養する。次に、その結果のハイブリドーマを限界希釈によって平板培養し、例えばＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）又は免疫組織化学的（ＩＨＣ）スクリーニングを使用して、免疫原に特異的に結合した抗体の産生をアッセイで分析する。次に、選択したモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを、（例えば組織培養瓶又は中空糸膜反応器内で）インビトロで、又は（例えばマウスの腹水として）インビボで培養する。
【００５８】
細胞融合技術の別の代替方法として、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）不死化Ｂ細胞を使用して、本発明のモノクローナル抗体を産生することができる。ハイブリドーマを所望に応じて増殖させてサブクローニングし、従来のアッセイ手順（例えば、ＦＡＣＳ、ＩＨＣ、放射免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイなど）で抗免疫原活性がないか、上澄みをアッセイで分析する。
【００５９】
別の代替方法では、当技術分野で知られている任意の手段（例えば、ヒト化、完全にヒトの抗体を産生するためにトランスジェニックマウスを使用、ファージディスプレイ技術など）によって、抗ＣＤ３モノクローナル抗体及び任意の他の同等の抗体を配列決定し、組み換え産生することができる。一実施形態では、抗ＣＤ３モノクローナル抗体を配列決定し、次にポリヌクレオチド配列をクローニングして、発現又は増殖用ベクターにする。対象となる抗体をコード化する配列を宿主細胞中のベクター内で維持することができ、これで宿主細胞を増殖させ、将来使用するために凍結することができる。
【００６０】
抗ＣＤ３モノクローナル抗体及び任意の他の同等の抗体のポリヌクレオチド配列は、「ヒト化」した抗体を生成する、親和性を改善する、又は抗体の他の特徴のために、遺伝子操作に使用することができる。抗体をヒト化する一般原理は、抗体の抗原結合部分の基本的配列を保持しながら、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換することを含む。モノクローナル抗体をヒト化するには概略的に４つのステップがある。それは、（１）開始抗体の軽及び重可変ドメインのヌクレオチド及び予測されるアミノ酸の配列を判定するステップ、（２）ヒト化した抗体を設計する、すなわちヒト化プロセス中にどの抗体フレームワーク領域を使用するか決定するステップ、（３）実際のヒト化方法／技術、及び（４）ヒト化した抗体を形質移入及び発現させるステップである。例えば、米国特許第４，８１６
，５６７号、第５，８０７，７１５号、第５，８６６，６９２号、及び第６，３３１，４１５号を参照されたい。
【００６１】
非ヒト免疫グロブリンから誘導される抗原結合部位を含む幾つかの「ヒト化」された抗体分子について説明されており、それは例えば、ヒト定常ドメインに融合し、齧歯動物又は修飾した齧歯動物のＶ領域及びそれに関連する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するキメラ抗体である（例えばWinter他（１９９１）の「Man-made Antibodies」（Nature 349:293-299）、Lobuglio他（１９８９）の「Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response」（Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989)）、Shaw他（１９８７）の「Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen」（J. Immunol
. 138:4534-4538）、及びBrown他（１９８７）の「Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody」（Cancer Res. 47:3577-3583）を参照されたい）。適切なヒト抗体定常ドメインと融合する前にヒト支持フレームワーク領域（ＦＲ）に移植された齧歯動物のＣＤＲについて説明する参考文献もある（例えば、Riechmann, L.他（１９８８）の「Reshaping Human Antibodies for Therapy」（Nature 332:323-327）、Verhoeyen, M.他（１９８８）の「Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity」（Science 239:1534-1536）、及びJones他（１９８６）の「Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse」（Nature 321:522-525）を参照されたい）。別の参考文献は、組み換え技術で貼り合わせた齧歯動物フレームワーク領域によって支持された齧歯動物のＣＤＲについて説明している。例えば、欧州特許公開第５１９，５９６号を参照されたい。これらの「ヒト化」分子は、ヒト受容者におけるこれら成分の治療適用の継続時間及び有効性を制限する齧歯動物の非ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫応答を最小化するように設計される。抗体をヒト化するために同様に使用できる他の方法が、Daugherty他（１９９１）の「Polymerase Chain Reaction Facilitates The Clonig, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins」（Nucl. Acids Res. 19:2471-2476）及び米国特許第６，１８０，３７７号、第６，０５４，２９７号、第５，９９７，８６７号、及び第５，８６６，６９２号に開示されている。
【００６２】
本発明はまた、μ−抗ＣＤ３など、本発明の抗体の単鎖可変領域フラグメント（「ｓｃＦｖ」）も包含する。単鎖可変領域フラグメントは、短い結合ペプチドを使用して軽鎖及び／又は重鎖可変領域をリンクすることによって作成される。Bird他（１９８８）の（「Single-Chain Antigen-Binding Proteins」、Science 242:423-426）は、一方の可変領域のカルボキシ末端と他方の可変領域のアミノ末端との間に約３．５ｎｍまたがる結合ペプチドの例を説明している。他の配列のリンカーも設計され、使用されている（Bird他（１９８８）の「Single-Chain Antigen-Binding Proteins」（Science 242:423-426））。次に、薬品の付着又は固体支持体への付着など、追加機能のためにリンカーを修飾することができる。単鎖変異体を組み換え技術で、又は合成で産生することができる。ｓｃＦｖを合成産生する場合は、自動合成器を使用することができる。ｓｃＦｖを組み換え技術で産生する場合は、ｓｃＦｖをコード化するポリヌクレオチドを含有する適切なプラスミドを、酵母、植物、昆虫又は哺乳類の細胞などの真核細胞、又は大腸菌などの原核細胞の適切な宿主細胞に導入することができる。対象となるｓｃＦｖをコード化するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの連結など、日常の操作で作成することができる。その結果のｓｃＦｖは、当技術分野で知られている標準的なタンパク質精製技術を使用して隔離することができる。
【００６３】
本発明は、抗ＣＤ３抗体及びその結合フラグメントの修飾を含む。ポリペプチドの修飾は当技術分野の日常的な習慣であり、本明細書では詳細に説明しない。修飾ポリペプチドの例には、アミノ酸残基の保存的置換、機能活性を大幅に劣化させないアミノ酸の１つ又は複数の削除又は追加、又は化学的類似体の使用をしたポリペプチドが含まれる。相互に保存的置換することができるアミノ酸残基には、グリシン／アラニン、バリン／イソロイシン／ロイシン、アスパラギン／グルタミン、アスパラギン酸／グルタミン酸、セリン／トレオニン、リシン／アルギニン、及びフェニルアラニン／チロシンが含まれるが、これらに限定されない。これらのポリペプチドには、グリコシル化及び非グリコシル化ポリペプチド、更に例えば様々な糖でのグリコシル化、アセチル化、及びリン酸化など、他の翻訳後修飾をしたポリペプチドも含まれる。アミノ酸の置換は保存的である、すなわち置換したアミノ酸が元のアミノ酸と同様の化学的性質を保有することが好ましい。このような保存的置換は当技術分野で知られており、その例は以上で提供されている。アミノ酸修飾の範囲は、１つ又は複数のアミノ酸を変化させるか修飾することから、可変領域などの領域を完全に再設計することまで可能である。可変領域の変化は、結合親和性及び／又は特異性を変更することができる。他の修飾方法には、当技術分野で知られている結合技術を使用することが含まれ、それには酵素手段、酸化置換及びキレート化が含まれるが、これらに限定されない。修飾は、例えば放射免疫アッセイ用に放射性成分を付着させるなど、免疫アッセイ用標識を付着させるためなどに使用することができる。修飾ポリペプチドは、当技術分野で確立された手順を使用して作成され、当技術分野で知られている標準的なアッセイを使用してスクリーニングすることができる。
【００６４】
ＣＤＲ残基の１つのアミノ酸を変更すると、機能的結合が失われる結果となり得るという事実（Rudikoff, S.他（１９８２）の「Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-Binding Specificity」（Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79(6):1979-1983））は、代替的な機能的ＣＤＲ配列を体系的に識別する手段を提供する。このような変異体ＣＤＲを得る１つの好ましい方法では、ＣＤＲをコード化するポリヌクレオチドを（例えばランダムな突然変異誘発を介して、又は部位特異的方法（例えば突然変異した座をコード化するプライマでのポリメラーゼ鎖仲介増幅）により）突然変異誘発し、置換したアミノ酸残基を有するＣＤＲを産生する。元の（機能的）ＣＤＲ配列の該当する残基のアイデンティティを、置換した（非機能的）変異体ＣＤＲ配列のアイデンティティと比較することにより、その置換のＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアを識別することができる。ＢＬＯＳＵＭシステムは、信頼できるアラインメントについて配列のデータベースを分析することにより作成されたアミノ酸置換のマトリクスを提供する（Eddy, S.R.（２００４）の「Where Did The BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From?」（Nature Biotech. 22(8):1035-1036）、Henikoff, J.G.（１９９２）の「Amino acid substitution matrices from protein blocks」（Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:10915-10919）、Karlin, S.他（１９９０）の「Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes」（Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:2264-2268）、Altschul, S.F.（１９９１）の「Amino Acid Substitution Matrices From An Information Theoretic Perspective」（J. Mol. Biol. 219, 555-565））。現在、最先端のＢＬＯＳＵＭデータベースはＢＬＯＳＵＭ６２データベース（ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ）である。表１はＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアを提示する（スコアが高いほど、置換は保存的であり、したがって置換が機能に影響しない可能性が高い）。結果となるＣＤＲを含む抗原結合フラグメントがＣＤ３との結合に失敗した場合は、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアは、保存性が不十分とされ、より高い置換スコアを有する新しい候補置換が選択され、産生される。したがって、例えば元の残基がグルタミン（Ｅ）であり、非機能的置換残基がヒスチジン（Ｈ）であった場合、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアは０になり、より保存的な変化（アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、又はリシンなど）が好ましい。
【表１】
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【００６５】
したがって、本発明は改良型ＣＤＲを識別するためにランダムな突然変異誘発を使用することを想定する。ファージディスプレイ技術を代替的に使用して、ＣＤＲの親和力を増大（又は減少）させることができる。このテクノロジは親和性成熟と呼ばれて、突然変異誘発又は「ＣＤＲ歩行」を使用し、再選択は標的抗原又はその抗原フラグメントを使用して、初期抗体又は親抗体と比較した場合に、それより高い（又は低い）親和性で結合するＣＤＲを有する抗体を識別する（例えばGlaser他（１９９２）のJ. Immunology 149:3903を参照されたい）。単独ヌクレオチドではなくコドン全体で突然変異を誘発すると、アミノ酸の突然変異のレパートリが半ランダム化される結果となる。それぞれが単一ＣＤＲの単一アミノ酸の変化だけ異なり、各ＣＤＲ残基で可能な各アミノ酸置換を表す変異体を含有する変異体クローンのプールで構成されたライブラリを構築することができる。固定化した突然変異体を標識を付けた抗原と接触させることにより、抗原に対する結合親和力が増大（又は減少）した突然変異体をスクリーニングすることができる。当技術分野で知られている任意のスクリーニング法を使用して、抗原に対する親和力が増大又は減少した突然変異抗体を識別することができる（例えば、ＥＬＩＳＡ）（Wu他（１９９８）のProc Natl. Acad Sci. USA 95:6037、Yelton他（１９９５）のJ. Immunology 155:1994を参照されたい）。軽鎖をランダム化するＣＤＲ歩行を使用することができる（Schier他（１９９６）のJ. Mol. Bio. 263:551を参照されたい）。
【００６６】
このような親和性の成熟を達成する方法が、例えば、Krause, J.C.他（２０１１）の「An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances Function Of A Human Antibody」（MBio. 2(1)pii: e00345-10. doi: 10.1128/mBio.00345-10）、Kuan, C.T.他（２０１０）の「Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas」（Int. J.Cancer 10.1002/ijc.25645）、Hackel, B.J.他（２０１０）の「Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionality Landscapes」（J. Mol. Biol. 401(1):84-96）、Montgomery, D.L.他（２００９）の「Affinity Maturation And Characterization of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-1 gp41」（MAbs 1(5):462-474）、Gustchina, E.他（２００９）の「Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2 Loop Of A Monoclonal Fab Derived From A Synthetic Naive Human Antibody Library And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set Of Fabs With Improved HIV-1 Neutralization Potency And Breadth」（Virology 393(1):112-119）、Finlay, W.J.他（２００９）の「Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy: Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions」（J.Mol. Biol. 388(3):541-558）、Bostrom, J.他（２００９）の「Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For Therapeutic Development」（Methods Mol. Biol. 525:353-376）、Steidl, S.他（２００８）の「In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification」（Mol. Immunol. 46(1):135-144）、及びBarderas, R.他（２００８）の「Affinity maturation of antibodies assisted by in silico modeling」（Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 105(26):9029-9034）で説明されている。好ましい実施形態では、多ウェルプレートを選択したＣＤ３抗体で（例えば、炭酸塩緩衝剤中の１００ｎｇ／ウェルを室温で２時間）コーティングし、その後に１／１０の希釈率で添加した可溶性ＣＤ３でインキュベートし、室温で１６時間インキュベートするか、又はＰＢＳ−Ｔ−ＢＳＡ中で５０ｎｇ／ｍＬの濃度まで希釈する（０．０５ｍＬを各ウェルに添加し、室温で少なくとも２時間インキュベートする）ことができる。次にプレートを洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ−ＢＳＡ中に０．５μｇ／ｍＬで開始した組み換え抗体の希釈液を次に添加し、室温で１時間インキュベートする。次に、例えば抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ接合及びＴＭＢ基質を使用して、捕捉した抗原に対する組み換え抗体の結合を測定する。希硫酸を使用して発色現象を停止させた後、プレートを４５０ｎＭで読み取り、それより高い親和力の抗体を識別する（例えば、米国特許第７，３５１，８０３号を参照されたい）。
【００６７】
本発明は、本発明の抗体のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは、当技術分野で知られている手順で作成することができる。ポリペプチドは、抗体のタンパク質分解又は他の分解によって、上述したような組み換え法（すなわち単一又は融合ポリペプチド）によって、又は化学的合成によって産生することができる。抗体のポリペプチド、特にアミノ酸約５０個以下の比較的短いポリペプチドは、化学的合成で都合よく作成される。化学的合成の方法は当技術分野で知られており、商業的に入手可能である。例えば、固相法を使用した自動ポリペプチド合成器によって、抗ＣＤ３ポリペプチドを産生することができた。
【００６８】
本発明は、本発明のポリペプチド及び抗体からの１つ又は複数のフラグメント又は領域を含む融合タンパク質も包含する。一実施形態では、可変軽鎖領域の少なくとも１０個の近接アミノ酸、及び可変重鎖領域の少なくとも１０個のアミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、融合ポリペプチドは異種免疫グロブリン定常領域を含有する。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、公的に寄託されたハイブリドーマから産生した抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含有する。本発明では、抗体融合タンパク質は、ＣＤ３に、及び本来の分子では付着しない別のアミノ酸配列、例えば別の領域からの異質配列又は同質配列に特異的に結合する１つ又は複数のポリペプチドドメインを含有する。
【００６９】
抗ＣＤ３ポリペプチド、及び他のＣＤ３アゴニスト、アンタゴニスト及び修飾物質は、当技術分野で知られている方法、例えば化学的に、又は組み換え技術で生成することができる。このような分子を産生する１つの方法は、ポリペプチドを化学的に合成し、その後に本来のコンフォメーション、すなわち適切なジスルフィド結合リンケージを得るのに適切な酸化状態で処理することを含む。これは、当業者に周知の方法を使用して達成することができる（例えば、Kelley, R.F.他（１９９０）の「In: GENETIC ENGINEERING PRINCIPLES AND METHODS」（Setlow, J.K.編集、Plenum Press, N.Y.,vol.12, pp 1 - 19）、Stewart, J.M他（１９８４）の「SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS」（イリノイ州ロックフォードPierce Chemical Co.）を参照されたい。米国特許第４，１０５，６０３号、第３，９７２，８５９号、第３，８４２，０６７号、及び第３，８６２，９２５号も参照されたい）。
【００７０】
本発明のポリペプチドは、固相ペプチド合成を使用して都合よく調製することができる（Merrifield, B（１９８６）の「Solid Phase Synthesis」（Science 232(4748):341-347）、Houghten, R.A.（１９８５）の「General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids」（Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.) 82(15):5131-5135）、Ganesan, A.（２００６）の「Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century」（Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10））。
【００７１】
更に別の代替方法では、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように操作されている市販のマウスを使用することにより、十分なヒト抗体を得ることができる。ヒト化又はヒト抗体を生成するために、より望ましい（例えば十分にヒトの抗体）又はより強靱な免疫応答を生成するように設計された遺伝子組み換え動物も使用することができる。このようなテクノロジの例がＸＥＮＯＭＯＵＳ（商標）（カリフォルニア州フレモントのAbgenix, Inc.）及びＨＵＭＡＢ−ＭＯＵＳＥ（登録商標）及びＴＣ  ＭＯＳＵＥ（商標）（両方ともニュージャージー州プリンストンのMedarex, Inc.から入手）である。
【００７２】
代替方法では、組み換え技術で抗体を作成し、当技術分野で知られている任意の方法を使用して発現させることができる。抗体は、最初に宿主動物から作成した抗体を隔離して、遺伝子配列を取得し、遺伝子配列を使用して抗体を宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）内で組み換え技術により発現させることにより、組み換え技術で作成することができる。使用することができる別の方法は、植物（例えばタバコ）又は遺伝子組み換え乳で抗体配列を発現させることである。植物又は乳中で組み換え技術により抗体を発現させる適切な方法が開示されている（例えば、Peeters他（２００１）の「Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants」（Vaccine 19:2756）、Lonberg, N.他（１９９５）の「Human Antibodies From Transgenic Mice」（Int. Rev. Immunol 13:65-93）、及びPollock他（１９９９）の「Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies」（J. Immunol Methods 231:147-157）を参照されたい）。例えばヒト化、単鎖など、抗体の誘導体を作成する適切な方法が、当技術分野で知られている。別の代替方法では、ファージディスプレイ技術により、抗体を組み換え技術で作成することができる（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号、第５，５８０，７１７号、第５，７３３，７４３号、第６，２６５，１５０号、及びWinter, G.他（１９９４）の「Making Antibodies By Phage Display Technology」（Annu. Rev. Immunol. 12.433-455）を参照されたい）。
【００７３】
対象となる抗体又はタンパク質は、当業者に周知のエドマン分解法により配列決定することができる。質量分析法又はエドマン分解法で生成したペプチド情報を使用して、対象となるタンパク質のクローニングに使用することができる。
【００７４】
対象となるプロテインをクローニングする代替方法は、対象となる抗体又はタンパク質を発現する細胞に、精製したＣＤ３又はそのタンパク質を使用する「パンニング法」によるものである。「パンニング法」の手順は、ＣＤ３を発現する組織又は細胞からｃＤＮＡライブラリを取得し、第２の細胞型でｃＤＮＡを過剰発現させ、ＣＤ３に対する特異的結合に関して、第２の細胞型の形質移入細胞をスクリーニングすることにより実行することができる。「パンニング法」によって細胞表面タンパク質の哺乳類遺伝子コードをクローニングする際に使用する方法の詳細な説明が、当技術分野で見られる（例えば、Aruffo, A.他（１９８７）の「Molecular Cloging Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Cell Expression System」（Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:8573-8577）及びStephan, J.（１９９９）の「Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epitheliul Differentiation」（Endocrinol. 140:5841-5854）を参照されたい）。
【００７５】
抗ＣＤ３抗体、及び他のＣＤ３ペプチドアゴニスト、アンタゴニスト及び修飾因子をコード化するｃＤＮＡは、当技術分野の標準的な方法に従って特定の細胞型からｍＲＮＡを逆転写することにより獲得することができる。特に、ｍＲＮＡは、例えば、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL第３版（Sambrook他（編集）（２００１）、Cold Spring Harbor Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）に記載されている手順に従って、様々な溶菌酵素又は化学溶液を使用して隔離するか、又は製造業者（例えばQiagen、Invitrogen、Promega）によって提供された添付指示書に従って、市販の核酸結合樹脂を使用して抽出することができる。次に、合成したｃＤＮＡを発現ベクターに導入して、第２の型の細胞中に対象となる抗体又はタンパク質を産生することができる。発現ベクターは、エピソープとして、又は染色体ＤＮＡの一体部分として宿主細胞内で複製可能でなければならないと示されている。適切な発現ベクターには、プラスミド、ウイルス性ベクター、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、及びコスミドが含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】
対象となるポリヌクレオチドを含有するベクターは、電気穿孔法、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン又は他の物質を使用した形質移入；微粒子銃；リポフェクション；及び感染（例えばベクターが牛痘ウイルスなどの感染因子である場合）などの任意の数の適切な手段により宿主細胞に導入することができる。ベクター又はポリヌクレオチド導入の選択は、宿主細胞の形体に依存することが多い。
【００７７】
異種ＤＮＡを過剰発現することができる任意の宿主細胞を、対象となる抗体、ポリペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子を隔離する目的で使用することができる。適切な哺乳類の宿主細胞の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、及びＣＨＯ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞は、対応する対象となる内在性抗体又はタンパク質が宿主細胞内に存在する場合、好ましくはｃＤＮＡをその約５倍、更に好ましくは１０倍、更に好ましくは２０倍高いレベルで発現する。ＣＤ３に対する特異的結合についての宿主細胞のスクリーニングは、ＦＡＣＳの免疫アッセイにより実行される。対象となる抗体又はタンパク質を過剰発現する細胞を識別することができる。
【００７８】
ＩＩＩ．ポリペプチド及びモノクローナル抗体のスクリーニング法
ＣＤ３に結合するポリペプチド及びモノクローナル抗体をスクリーニングするために、幾つかの方法を使用することができる。「結合」とは、生物学的又は免疫学的に適切な特異的結合を指し、例えば非特異的標的に対して免疫グロブリンを非常に高い濃度で使用する場合に生じるような、非特異的結合を指すものではないことが理解される。一実施形態では、標準的なスクリーニング技術を使用して、ＣＤ３に結合するためにモノクローナル抗体をスクリーニングする。この方法で、抗ＣＤ３モノクローナル抗体を獲得した。本発明の好ましいハイブリドーマは、抗体ｍＡｂ１及びｍＡｂ２、又はそのキメラ又はヒト化誘導体を生成するものである。しかし、ＣＤ３に結合する追加のモノクローナル抗体を識別することができる。そのために、ヒトＣＤ３、更に霊長類のＣＤ３に結合する区別能力
について、モノクローナル抗体をスクリーニングする。
【００７９】
幾つかの異なる検出システムのいずれかを使用して、組織区間への抗体の結合を検出することができる。通常、免疫組織化学は、１次抗体を組織に結合することを含み、次に１次抗体からの種に対して反応性の２次抗体を生成し、検出可能なマーカ（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、又はジアミノベンゼダイン（ＤＡＢ））に接合させる。使用できる１つの代替方法は、ポリクローン性鏡像相補性抗体又はｐｏｌｙＭＩＣＡ（商標）である（ポリクローン性鏡像相補的抗体、The Binding Site Limited、英国バーミンガム、Mangham, D.C.他（１９９９）の「A Novel Immunohistochemical Detection System Using Mirror Image Complementary Antibodies (MICA)」（Histopathology 35(2):129-33））。ＰｏｌｙＭＩＣＡ（商標）技術を使用して、正常組織及び癌組織への１次抗体（例えば抗ＣＤ３抗体）の結合を試験することができる。数種類のｐｏｌｙＭＩＣＡ（商標）検出キットが市販されている。すなわち製品番号ＨＫ００４．Ｄは、ＤＡＢクロモゲンを使用するｐｏｌｙＭＩＣＡ（商標）検出キットであり、製品番号ＨＫ００４．Ａは、ＡＥＣクロモゲンを使用するｐｏｌｙＭＩＣＡ（商標）検出キットである。あるいは、１次抗体に検出可能なマーカで直接標識を付けることができる。
【００８０】
ＩＶ．抗ＣＤ３抗体を特徴付ける方法
幾つかの方法のいずれかを使用して、抗ＣＤ３抗体を特徴付けることができる。１つの方法は、それが結合するエピトープを識別することである。エピトープのマッピングが様々な供給源、例えばPepscan Systems（オランダ、レリスタット）から商業的に入手可能である。エピトープのマッピングを使用して、抗ＣＤ３抗体が結合する先の配列を判定することができる。エピトープは線状エピトープとする、すなわちアミノ酸の１本鎖に含有されるか、又は必ずしも１本鎖に含有されないアミノ酸の３次元相互作用によって形成された立体配座エピトープとすることができる。
【００８１】
様々な長さ（例えば好ましくは少なくともアミノ酸４〜６個の長さ）のペプチドを（例えば組み換え技術で）隔離又は合成し、抗ＣＤ３抗体での結合アッセイに使用することができる。抗ＣＤ３抗体が結合するエピトープは、細胞外配列から誘導される重複ペプチドを使用し、抗ＣＤ３抗体による結合を判定することにより、体系的スクリーニングで判定することができる。
【００８２】
抗ＣＤ３抗体の特徴付けに使用できる更に別の方法は、同じ抗原、すなわちＣＤ３に結合することが知られている他の抗体での競合的アッセイを使用し、抗ＣＤ３抗体が他の抗体と同じエピトープに結合するか否かを判定することである。ＣＤ３に対する市販の抗体の例を入手可能とすることができ、本明細書で教示する結合アッセイを使用して識別することができる。競合的アッセイは当業者に周知であり、このような手順及び例示的データが実施例で更に詳述されている。抗ＣＤ３抗体は、組織、癌のタイプ、又は結合先の腫瘍のタイプによって更に特徴付けることができる。
【００８３】
Ｖ．本発明の好ましい組成物
本発明は組成物、例えば抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ３抗体から誘導されるポリペプチド、抗ＣＤ３抗体をコード化する配列を含むポリヌクレオチド、及び本明細書で説明するような他の薬剤を含む医薬組成物を包含する。本発明は更に、任意のＣＤ３ペプチドアゴニスト、アンタゴニスト又は修飾因子、及び特定のＣＤ３ペプチドアゴニスト、アンタゴニスト又は修飾因子の意図された１つ又は複数の機能を支援する追加の化学的構造の接合体を提供する。これらの接合体には、本明細書で説明する診断、スクリーニング又は精製手順に使用する任意の可溶性固体支持基質などの高分子に共有結合するＣＤ３ペプチドアゴニスト、アンタゴニスト又は修飾因子が含まれる。適切な基質材料には、化学的に不活性で、高い多孔性を有し、ペプチドリガンドとの共有結合を形成することができる多数の官能基を有する任意の物質が含まれる。基質材料、及び基質−リガンド接合体を調製する手順の例がDean他（編集）の「AFFINITY CHROMATOGRAPHY: A PRACTICAL APPROACH」（IRL Press （１９８５））、Loweの「An Introduction to Affinity Chromatography」、Work他（編集）の「LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY」第７巻パートＩＩ（North-Holland（１９７９））、Porath他の「Biospecific Affinity Chromatography」、Neurath, H.他（編集）の「THE PROTEINS」第３版第１巻ｐｐ．９５〜１７８（１９７５）、及びSchott, H.の「AFFINITY CHROMATOGRAPHY」（Macel Dekker, Inc.、ニューヨーク（１９８４））で説明されている。
【００８４】
本明細書では、ＣＤ３ペプチドアゴニスト、アンタゴニスト又は修飾因子の接合体、及び本明細書で説明する診断手順に使用される任意のレポータ成分も提供される。抗ＣＤ３抗体を含め、本発明のＣＤ３ペプチドアゴニスト、アンタゴニスト又は修飾因子、ポリペプチド及びタンパク質は、以下の基準、すなわち
（１）正常なヒトＴ細胞の表面上に内因的に発現した状態のヒトＣＤ３に特異的に結合する能力、
（２）ヒト白血病Ｔ細胞の表面上に内因的に発現した状態のヒトＣＤ３に特異的に結合する能力、
（３）正常な非ヒトＴ細胞の表面上に内因的に発現した状態の非ヒトＣＤ３（例えばカニクイザルのＣＤ３）に特異的に結合する能力、
（４）非ヒト白血病Ｔ細胞の表面上に内因的に発現した状態の非ヒトＣＤ３に特異的に結合する能力、
（５）ＣＤ３複合体の形成を中和する（すなわち結合を阻止又は妨害する）能力、ＴＣＲ複合体の形成を中和する能力、
（６）ＴＣＲ複合体による信号送出を（アンタゴニスティック又はアゴニスティックに）調節する能力、
（７）Ｆｃ受容体に結合する能力、
（８）元の抗体が優先的に結合する同じＣＤ３エピトープに優先的に結合する能力など、既知の抗ＣＤ３抗体をＣＤ３に優先的に結合するのを競合的に抑制する能力、
（９）生細胞の表面に露出したＣＤ３の部分にインビトロ又はインビボで結合する能力、生癌細胞の表面に露出したＣＤ３の部分に結合する能力、
（１０）化学療法薬を癌Ｔ細胞に送出する能力、及び／又は
（１１）治療薬、毒素又は検出可能なマーカをＴ細胞に送出する能力
のいずれか（１つ又は複数）により、更に識別され、特徴付けられる。
【００８５】
本発明の好ましい抗体は、正常な非癌組織に対する腫瘍組織のＩＨＣ分染を示し、更に抗体効力の霊長類（及び特にカニクイザル）モデルを試験することができる。本発明の好ましい抗体は、追加的に望ましいレベルの親和性及び抗原特異性を示す。本発明の好ましい抗体は、追加的に望ましいレベルの免疫修飾活性及び細胞内在化を示す。
【００８６】
幾つかの実施形態では、本発明の抗体は、それぞれマウスの抗体ｍＡｂ１及びマウス抗体ｍＡｂ２、又はその子孫を発現するハイブリドーマｍＡｂ１又はハイブリドーマｍＡｂ２によって産生された抗体である。本発明は、これらのハイブリドーマ及び同等の抗体又はポリペプチドフラグメント（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２Ｆｖ、Ｆｃなど）、によって産生された抗体、キメラ抗体、単鎖（ｓｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、及び必要な特異性の抗原（ＣＤ３）認識部位を含むこれら又は同等の抗体のいずれかの任意の他の修飾構成の様々な製剤も包含する。本発明はまた、抗ＣＤ３ファミリーの要素の生物学的特徴の１つ又は複数を表示するヒト抗体も提供する。抗ＣＤ３ファミリーの同等の抗体（ヒト化抗体及びヒト抗体を含む）、ポリペプチドフラグメント、及びこれらのフラグメントのいずれかを含むポリペプチドは、上記基準のいずれか（１つ又は複数）によって識別され、特徴付けされる。
【００８７】
したがって、本発明は以下のいずれか（又は以下のいずれかを含む医薬組成物などの組成物）を提供する。すなわち、（ａ）宿主細胞又はその子孫によって産生される抗体、（ｂ）このような抗体のヒト化形態、（ｃ）このような抗体の１つ又は複数の軽鎖及び／又は重鎖可変領域を有する抗体、（ｄ）このような抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域と同質であるか、又はそれから誘導される可変領域、及びヒト抗体の重鎖及び軽鎖の定常領域と同質であるか、又はそれから誘導される定常領域を有するキメラ抗体、（ｅ）このような抗体の１つ又は複数（少なくとも１個、２個、３個、４個、５個又は６個）の軽鎖及び／又は重鎖ＣＤＲを有する抗体、（ｆ）このような抗体の軽鎖及び／又は軽鎖を有する抗体、（ｇ）このような抗体と同等であるヒト抗体である。抗体のヒト化形態は、その元の抗体
、又は以上で識別された宿主細胞によって産生された抗体と同一であるＣＤＲを有しても、又は有していなくてもよい。ＣＤＲ領域の判定は、十分に当技術分野の範囲内である。他の実施形態には、本明細書で識別されたように沈着、又はこのような抗体から誘導されるハイブリドーマから産生される抗体の少なくとも２個、３個、４個、５個又は６個のＣＤＲと実質的に同種である少なくとも２個、３個、４個、５個、又は６個のＣＤＲを有する抗体が含まれる。本発明では、結合特異性及び／又は全体的活性は一般的に保持されるが、沈着したハイブリドーマによって産生された抗体と比較して、活性の程度は変化することがある（大きくなるか、又は小さくなることがある）ことが理解される。本発明は、これらの抗体のいずれかを作成する方法も提供する。抗体の作成方法は当技術分野で知ら
れており、本明細書で説明する。
【００８８】
本発明は、本発明の抗体のアミノ酸配列を有するポリペプチドも提供する。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは抗体の１つ又は複数の軽鎖及び／又は重鎖可変領域を有する。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは抗体の１つ又は複数の軽鎖及び／又は重鎖ＣＤＲを含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは抗体の軽鎖及び重鎖の３個のＣＤＲを含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは以下のいずれかを有する抗体のアミノ酸配列を含む。すなわち、元の抗体の配列の少なくとも５個の近接アミノ酸、少なくとも８個の近接アミノ酸、少なくとも約１０個の近接アミノ酸、少なくとも約１５個の近接アミノ酸、少なくとも約２０個の近接アミノ酸、少なくとも約２５個の近接アミノ酸、少なくとも約３０個の近接アミノ酸であり、ここでアミノ酸の少なくとも３個は抗体の可変領域に
由来する。一実施形態では、可変領域は元の抗体の軽鎖に由来する。別の実施形態では、可変領域は抗体の重鎖に由来する。別の実施形態では、５個（以上）の近接アミノ酸は、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する。
【００８９】
本発明の幾つかの実施形態では、ＣＤ３、ＣＤ３の一部、抗ＣＤ３抗体、又は本発明の他のＣＤ３結合ポリペプチドを発現する本発明の細胞を、個体に直接投与し、ＣＤ３の生物学的活性をインビボで調節する。
【００９０】
本発明の好ましい抗ＣＤ３抗体は、ヒト及びカニクイザルＣＤ３分子に対して反応性であるｍＡｂ１及びｍＡｂ２、ヒト化又はキメラ誘導体、及びその抗原結合フラグメントである。マウス抗体ｍＡｂ１及びｍＡｂ２の可変軽鎖及び可変重鎖のアミノ酸及びコード化ポリヌクレオチド配列を以下に示す。例示的抗体（ｍＡｂ１及びｍＡｂ２）のＣＤＲの配列を肉太活字体で示し、下線を施す。
【００９１】
Ａ．マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ１の可変領域の配列
マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ１可変軽鎖のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１）
【化１】
2019142866.tif 000004
【００９２】
マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ１可変軽鎖をコード化するポリヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：２）
【化２】
2019142866.tif 000005
【００９３】
マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ１可変重鎖のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３）
【化３】
2019142866.tif 000006
【００９４】
ｍＡｂ１マウスモノクローナル抗体可変重鎖をコード化するポリヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：４）
【化４】
2019142866.tif 000007
【００９５】
Ｂ．マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ２の可変領域の配列
マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ２可変軽鎖のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：５）
【化５】
2019142866.tif 000008
【００９６】
マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ２可変軽鎖をコード化するポリヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：６）
【化６】
2019142866.tif 000009
【００９７】
ｍＡｂ２マウスモノクローナル抗体可変重鎖のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：７）
【化７】
2019142866.tif 000010
【００９８】
マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ２可変重鎖のポリヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：８）
【化８】
2019142866.tif 000011
【００９９】
重鎖の位置４０は、親和性が高いＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドアンカ残基である。重鎖の位置４４、４８、５４、９４、９９及び１０８は、親和性が中位のＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドアンカ残基である。軽鎖の位置６９は、親和性が高いＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドアンカ残基である。軽鎖の位置５９は、親和性が中位のＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドアンカ残基である。これらの残基は、標準的な分子生物学技術を使用して、ＭＨＣクラスＩＩ認識部位を減少させるか、又は除去するための残基と置換することができる。
【０１００】
Ｃ．Ｆｃ改変ＣＤ３抗体
従来の免疫機能では、抗体−抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用は、広範囲の応答をもたらし、その範囲は抗体依存の細胞毒性、肥満細胞脱顆粒、及び食作用などのエフェクターの機能から、リンパ球増殖及び抗体分泌の調節などの免疫調節性信号まである。これらの相互作用はすべて、抗体又は免疫複合体のＦｃドメインが造血細胞上の特殊な細胞表面受容体と結合することによって開始する。抗体及び免疫複合体が引き金となる細胞応答の多様性は、３つのＦｃ受容体、すなわちＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の構造的異質性に由来する。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は活性化（すなわち免疫系を増強する）受容体であり、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）は阻害性（すなわち免疫系を減衰させる）受容体である。ＩｇＧ１  Ｆｃ領域のアミノ酸配列を以下に示す（配列ＩＤ番号：９、参照により明示的に本明細書に組み込むものとし、移行は「Ｋａｂａｔ  ＥＵ」と呼ばれるKabat他の「SEQUENCE OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST」第５版（Public Health Service、メリーランド州ＮＩＨ（１９９１））に従って番号付けされている）。残基２３０〜３４１はＦｃ  ＣＨ２領域である。残基３４２〜４４７はＦｃ  ＣＨ３領域である。
配列ＩＤ番号：９
【化９】
2019142866.tif 000012
【０１０１】
Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）非結合ＣＤ３特異的抗体は枯渇が最少であるので、免疫寛容を誘発するかもしれない方法でＴＣＲ信号を変更できると提案されている（St. Clair E.W.（２００９）の「Novel Targeted Therapies for Autoimmunity」（Curr. Opin. Immunol. 21(6):648-657））。したがって、このような治療には、自己免疫疾患及び宿主対移植組織拒絶反応に潜在的用途がある。ＦｃＲ非結合ＣＤ３特異的抗体は、１型糖尿病耐性の軽快を誘発するとの仮説もある（St. Clair E.W.（２００９）の「Novel Targeted Therapies for Autoimmunity」（Curr. Opin. Immunol. 21(6):648-657）、Masharani, U.B.他（２０１０）の「Teplizumab Therapy For Type I Diabetes」（Expert Opin. Biol. Ther. 10(3):459-465））。
【０１０２】
したがって、本発明は（同じＣＤＲを有するが野生型Ｆｃ領域である抗体に対して）Ｆｃ受容体に結合できないか、又は結合力が低いように修飾（例えば１つ又は複数の部分の置換、欠失、挿入）されたＦｃ領域を有する変異体Ｆｃ領域を有するＣＤ３に特異的に結合する抗体を含む。
【０１０３】
一実施形態では、このような抗体は任意のＦｃ受容体に結合可能になる。あるいは、抗体のＦｃ領域は、阻害的であるＦｃγＲＩＩＢなどのＦｃ受容体には結合できるが、免疫系の活性を促進するＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ又はＦｃγＲＩＩＩＢなどのＦｃ受容体には結合できないように修飾される。
【０１０４】
本発明の分子の結合特性は、１つ又は複数のＦｃγメディエータのエフェクター細胞の機能を判定するインビトロの機能アッセイにより特徴付けられることが好ましい。ＦｃγＲに対する本発明の分子、例えば抗体の親和性及び結合性は、抗体と抗原又はＦｃ−ＦｃγＲの相互作用、すなわちそれぞれ抗体に対する抗原の特異的結合又はＦｃγＲに対するＦｃ領域の特異的結合を判定するために当技術分野で知られているインビトロアッセイ（生化学又は免疫学的アッセイ）を使用して判定することができ、それにはＥＬＩＳＡアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイが含まれるが、これらに限定されない。最も好ましい実施形態では、本発明の分子は（本明細書で説明し、開示するような）インビボモデルでin votro系アッセイと同様の結合特性を有する。しかし、本発明は、インビトロ系アッセイで所望の表現型を示さず、インビボで所望の表現型を示す本発明の分子を排除しない。
【０１０５】
幾つかの実施形態では、変異体Ｆｃ領域を有する本発明の分子は、アミノ酸３４２〜４４７から伸長したＦｃ領域のＣＨ３ドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を含む（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又はそれ以上のアミノ酸修飾を保有する）。他の実施形態では、変異体Ｆｃ領域を有する本発明の分子は、アミノ酸２３１〜３４１から伸長すると定義されたＦｃ領域のＣＨ２ドメインに少なくとも１個のアミノ酸修飾を含む（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又はそれ以上のアミノ酸修飾を保有する）。幾つかの実施形態では、本発明の分子は、少なくとも２個のアミノ酸修飾を含み（例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又はそれ以上のアミノ酸修飾を保有し）、少なくとも１個のこのような修飾はＣＨ３領域にあり、少なくとも１個のこのような修飾はＣＨ２領域にある。本発明は更に、蝶番領域のアミノ酸修飾を包含する。特定の実施形態では、本発明は、アミノ酸２１６〜２３０から伸長すると定義されたＦｃ領域のＣＨ１ドメインにアミノ酸修飾を包含する。
【０１０６】
特に好ましい実施形態では、本発明は変異体Ｆｃ領域を有する分子を包含し、上記変異体は、当業者に知られ、本明細書で例示する方法を使用して測定した状態で、低下したＡＤＣＣ活性及び／又はＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）に対する低下した結合を提供するか、又は有する。本発明の方法により使用されるＡＣＣＣアッセイは、ＮＫ依存性又はマクロファージ依存性とすることができる。
【０１０７】
特に好ましい実施形態では、本発明は変異体Ｆｃ領域を有する分子を包含し、上記変異体は、当業者に知られ、本明細書で例示する方法を使用して測定した状態で、低下したＡＤＣＣ活性及び／又はＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）に対する低下した結合を提供するか、又は有する。本発明の方法により使用されるＡＤＣＣアッセイは、ＮＫ依存性又はマクロファージ依存性とすることができる。
【０１０８】
本発明のＦｃ変異体は、米国特許第７，６３２，４９７号、第７，５２１，５４２号、第７，４２５，６１９号、第７，４１６，７２７号、第７，３７１，８２６号、第７，３５５，００８号、第７，３３５，７４２号、第７，３３２，５８１号、第７，１８３，３８７号、第７，１２２，６３７号、及び第６，７３７，０５６号、ＰＣＴ特許公開ＷＯ２００８／１０５８８６号、ＷＯ２００８／００２９３３号、ＷＯ２００７／０２１８４１号、ＷＯ２００７／１０６７０７号、ＷＯ０６／０８８４９４号、ＷＯ０５／１１５４５２号、ＷＯ０５／１１０４７４号、ＷＯ０４／１０３２２６９号、及びＷＯ０４／０６３３５１号、及びPresta, L.G.他（２００２）の「Engineering therapatic antibodies for improved function」（Biochem. Soc. Trans. 30(4):487-490）、Shields, R.L.他（２００２）の「Lack of focus on human IgG1 N-linked ongosaccharide improves binding to human Fcgamma RIII and antibody-dependent cellular toxicity」（J.Biol. Chem. 26;277(30):26733-26740）及びShields, R.L.他（２００１）の「High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R」（J. Biol. Chem. 276(9):6591-6604））で開示されているような他のＦｃ修飾体と組み合わせることができる。本発明は、本発明のＦｃ変異体を他のＦｃ修飾体と組み合わせて、修飾した抗体に追加、相乗的、又は新規の特性を提供することを包含する。
【０１０９】
他の実施形態では、本発明はJefrens, B.J.他（２００２）の「Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models」（Immunol. Lett. 82:57-65）、Presta, L.G.他（２００２）の「Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function」（Biochem. Soc. Trans. 30:487-90）、Idusogie, E.E.他（２００１）の「Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement」（J. Immunol. 166:2571-75）、Shields, R.L.他（２００１）の「High Resolution Mapping Of The Binding Site on Human IgG1 For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgG1 Variants With Improved Binding To The Fc gamma R」（J. Biol. Chem. 276:6591-6604）、Idusogie, E.E.他（２０００）の「Mapping Of The C1q Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc」（J. Immunol. 164:4178-84）、Reddy, M.P.他（２０００）の「Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4」（J. Immunol. 164:1925-1933）、Xu, D.他（２０００）の「In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies」（Cell. Immunol. 200:16-26）、Armour, K.L
.他（１９９９）の「Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities」（Eur. J. Immunol. 29:2613-24）、Jefferis, R.他（１９９６）の「Modulation of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions」（Immunol. Lett.54:101-04）、Lund, J.他（１９９６）の「Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chairns」（J. Immunol. 157:4963-4969）、Hutchins他（１９９５）の「Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant of Campath-1H」（Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92:11980-84）、Jefferis, R.他（１９９５）の「Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation」（Immunol. Lett. 44:111-17）、Lund, J.他（１９９５）の「Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors」（FASEB J. 9:115-19）、Alegre, M.L.他（１９９４）の「A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo」（Transplantation 57:1537-1543）、Lund他（１９９２）の「Multiple Binding Sites on The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma R11」（Mol. Immunol. 29:53-59）、Lund他（１９９１）の「Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overllapping Sites On Human IgG」（J. Immunol. 147:2657-2662）、Duncan, A.R.他（１９８８）の「Localization of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG」（Nature 332:563-564）、米国特許第５，６２４，８２１号、第５，８８５，５７３号、第６，１９４，５５１号、第７，２７６，５８６号、及び第７，３１７，０９１号、及びＰＣＴ特許公開ＷＯ００／４２０７２号及びＰＣＴ特許ＷＯ９９／５８５７２号で開示されているように、当技術分野で知られている任意のＦｃ変異体を使用することを包含する。
【０１１０】
特定の実施形態では、本発明の抗体は変異体Ｆｃ領域（任意のヒト免疫グロブリン型（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、又はクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）又はサブクラスから誘導されるＦｃを含む）を有し、上記変異体Ｆｃ領域は野生型Ｆｃ領域に対して少なくとも１個のアミノ酸修飾を含み、この変異体Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域を有する同等の分子に対して、当技術分野で知られ、本明細書で開示する標準的なアッセイで判定した状態で１個又は複数のエフェクターリガンドに対する結合力の低下又は消滅を示す。特定の実施形態では、本発明の抗体の変異体Ｆｃドメインは、残基２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２６５、２７０、２９７、２９８、２９９の１個又は複数にアミノ酸修飾（すなわち挿入、置換、欠失）を含む。特定の実施形態では、１個又は複数のエフェクターリガンドに対する結合力が低下又は消滅した１個又は複数のアミノ酸修飾は、位置２３３でのフェニルアラニン又はプロリンとの置換、位置２３４でのアラニンとの置換、位置２３５でのアラニン又はグルタミン酸との置換、位置２３６でのアラニンとの置換、位置２３７でのアラニンとの置換、位置２３８でのアルギニンとの置換、位置２６５でのアラニン又はグルタミン酸との置換、位置２７０でのアラニン又はアスパラギンとの置換、位置２９７でのアラニン又はグルタミンとの置換、位置２９８でのフェニルアラニン、アスパラギン又はプロリンとの置換、位置２９９でセリン又はトレオニン以外の任意のアミノ酸との置換、又は以上で列挙した置換のうち２つ以上の組み合わせである。特定の実施形態では、本発明の抗体は位置２６５及び位置２９７でのアラニンとの置換、位置２６５でのアラニン及び位置２９７でのグルタミンとの置換、位置２６５でのグルタミン酸及び位置２９７でのアラニンとの置換、又は位置２６５でのグルタミン酸及び位置２９７でのグルタミンとの置換を有するＦｃドメインを含む。好ましい実施形態では、本発明の抗体はＦｃ領域の位置２３４及び位置２３５での修飾（例えば置換、挿入、欠失）を有するＦｃドメインを含む。この実施形態による特定の例では、本発明の抗体は位置２３４でアラニンとの置換、及び位置２３５でグルタミン酸との置換を有するＦｃドメインを含む。更に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、位置２３４でアラニンとの置換、及び位置２３５でアラニンとの置換を有するＦｃを含む。
【０１１１】
他の実施形態では、本発明の抗体はＦｃ領域を有し、この変異体Ｆｃ領域は、同等の対照標準分子に対して、当技術分野で知られ、本明細書で開示する標準的なアッセイで判定した状態で、１個又は複数のエフェクターリガンドに対する結合力の低下又は消滅を示す。特定の実施形態では、本発明の抗体は１個又は複数のエフェクターリガンドに対する結合力の低下又は消滅を示すＦｃ領域を有し、このＦｃ領域は位置２３３にフェニルアラニン又はプロリン、位置２３４にアラニン、位置２３５にアラニン又はグルタミン酸、位置２３６にアラニン、位置２３７にアラニン、位置２３８にアルギニン、位置２６５にアラニン又はグルタミン酸、位置２７０にアラニン又はアスパラギン、位置２９７にアラニン又はグルタミン、位置２９８にフェニルアラニン、アスパラギン又はプロリン、位置２９９にセリン又はトレオニン以外の任意のアミノ酸、又は以上で列挙した置換のうち２つ以上の組み合わせを含む。特定の実施形態では、本発明の抗体は位置２６５及び位置２９７にアラニン、位置２６５にアラニン及び位置２９７にグルタミン、位置２６５にグルタミン酸及び位置２９７にアラニン、又は位置２６５にグルタミン酸及び位置２９７にグルタミンを有するＦｃドメインを含む。特定の実施形態では、本発明の抗体は２３４にアラニン及び位置２３５にグルタミン酸を有するＦｃドメインを含む。好ましい実施形態では、本発明の抗体は位置２３４にアラニン及び位置２３５にアラニンを有するＦｃを含む。
【０１１２】
Ｋａｂａｔの番号付け方式に従って２３４及び２３５に対応する位置にアラニンを有するＦｃドメインを含む本発明の抗体は、「ａｌａ−ａｌａ」抗体として知られる。特定の実施形態では、本明細書で説明する「ａｌａ−ａｌａ」Ｆｃドメイン及び／又は他のアミノ酸の組み合わせ（「ａｌａ−ａｌａ」Ｆｃドメインを含む組み合わせを含む）を使用することで、全ＦｃγＲに対するＦｃドメインの結合を廃止することができる。１つ又は複数のＦｃγＲに対するＦｃドメインの結合は、本明細書で説明された、及び／又は当技術分野で知られている任意の方法で判定することができる。
【０１１３】
特定の実施形態では、全ＦｃγＲに対する結合を廃止するか、又は１個又は複数のエフェクターリガンドに対する結合力を低下させるか、又は取り消す１個又は複数のアミノ酸修飾は、本明細書で列挙した修飾の組み合わせ、又は本明細書で列挙した修飾と本明細書で開示した、又は当業者に知られている方法で判定された状態の任意のＦｃｒ（例えばＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＴＢ、ＦｃγＲＩＩＡ）に対するゼロ結合を与えることができる修飾の組み合わせを含む。当業者には既に理解されているように、本発明のこのような抗体は、抗ＣＤ３抗体及び抗原結合フラグメントが、抗免疫細胞抗体に一般的な関連する初回投与応答がない状態で、免疫機能を調節する働きをするという点で、自己免疫疾患の治療に特に用途を見出すことができる。
【０１１４】
特定の実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体及び抗原結合フラグメント、又はその抗原結合フラグメントは当技術分野で日常的なアッセイで判定した状態で、Ｆｃドメインを介して任意のＦｃγＲ（例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ又はＦｃγＲＩＩＩ）のうち１つ又は複数に対する検出可能な結合が減少する（例えば対照標準のＦｃドメインを含むタンパク質による結合と比較して５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満又は１％未満であるが、これらに限定されない）、又はその結合がないことが更に好ましい。追加的に又は代替的に、本発明の抗ＣＤ３抗体及び抗原結合フラグメント、又はその抗原結合フラグメントは、日常的に使用するアッセイで判定した状態で、Ｃ１ｑなどの任意の相補的受容体に対する検出可能な結合が減少する（例えば対照標準のＦｃドメインを含む対照標準のタンパク質による結合と比較して５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満又は１％未満であるが、これらに限定されない）、又はその結合がないことが更に好ましい。特定の実施形態では、抗体はアグリコシル化される。他の実施形態では、抗体にはＦｃドメインがない（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２又は単鎖抗体である）。
【０１１５】
したがって、本発明の抗体は特に有用である。何故なら、リンホカイン産生又はサイトカイン放出により引き起こされるインビボの毒性が低下しているか、又は毒性がないからである。リンホカイン産生及びサイトカイン放出の測定方法が知られており、当技術分野で日常的であり、本明細書に包含される。例えば、サイトカイン放出は、インタロイキン−２（ＩＬ−２）、インタロイキン−４（ＩＬ−４）、インタロイキン−６（ＩＬ−６）、インタロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インタロイキン−１６（ＩＬ−１６）、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＳＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＴＦＮ−γ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩを含むが、これらに限定されないサイトカインの分泌を測定することによって測定することができる。例えばIsaacs他（２００１）の「Rheumatology」（40: 724-738）、Soubrane他（１９９３）の「Blood」（81(1): 15-19）を参照されたい。これらはそれぞれ、参照により全体を本明細書に組み込むものとする。
【０１１６】
Ｄ．ＣＤ３  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ
以上で説明したように、本発明は追加的に、二重特異的、三重特異的及び多重特異的抗体を包含する。このような抗体の特に好ましい例としては、少なくとも２つのエピトープ結合部位を形成し、少なくともその１つがＣＤ３に特異的に結合する少なくとも２本のポリペプチド鎖を含む「ＤＡＲＴ（商標）」ダイアボディ分子が挙げられる。例示的「ＤＡＲＴ（商標）」ダイアボディ分子が、ＵＳ２０１００１７４０５３号、ＵＳ２００９００６０９１０号、ＵＳ２００７０００４９０９号、ＥＰ２１５８２２１号、ＥＰ１８６８６５０号、ＷＯ２０１００８０５３８号、ＷＯ２００８１５７３７９号、及びＷＯ２００６１１３６６５号に開示されている。
【０１１７】
好ましい実施形態では、ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディの第１のポリペプチド鎖は、
（ｉ）エピトープ（１）に特異的な第１の免疫グロブリン（ＶＬ１）の軽鎖可変ドメインの結合領域を含むドメイン（Ａ）と、
（ｉｉ）エピトープ（２）に特異的な第２の免疫グロブリン（ＶＨ２）の重鎖可変ドメインの結合領域を含むドメイン（Ｂ）と、
（ｉｉｉ）ドメイン（Ｃ）とを含む。
このようなＤＡＲＴ（商標）ダイアボディの第２のポリペプチド鎖は、
（ｉ）エピトープ（２）に特異的な第２の免疫グロブリン（ＶＬ２）の軽鎖可変ドメインの結合領域を含むドメイン（Ｄ）と、
（ｉｉ）エピトープ（１）に特異的な第１の免疫グロブリン（ＶＨ１）の重鎖可変ドメインの結合領域を含むドメイン（Ｅ）と、
（ｉｉｉ）ドメイン（Ｆ）とを含む。
ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディドメイン（Ａ）及び（Ｂ）は、相互に会合してエピトープ結合部位を形成するものではない。同様に、ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディドメイン（Ｄ）及び（Ｅ）は、相互に会合してエピトープ結合部位を形成するものではない。それどころか、ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディドメイン（Ａ）及び（Ｅ）が会合して、エピトープ（１）を結合する結合部位を形成し、上記ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディドメイン（Ｂ）及び（Ｄ）が会合して、上記エピトープ（２）を結合する結合部位を形成する。ドメイン（Ｃ）及び（Ｆ）は相互に共有結合する。
【０１１８】
ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ分子の各ポリペプチド鎖は、ＶＬドメイン及びＶＨドメインを含み、これはドメインがその自己集合を阻止されるように共有結合する。ポリペプチド鎖のうち２本が相互作用すると、２つのＶＬ−ＶＨ対合を生成し、２つのペプチド結合部位、すなわち二価分子を形成する。ＶＨ又はＶＬドメインがポリペプチド鎖内の任意の位置に強制される、すなわちアミノ（Ｎ）又はカルボキシ（Ｃ）末端に限定されることも、ドメインの相対位置が相互に限定される、すなわちＶＬドメインをＮ末端からＶＨドメインとするか、その逆にすることもない。唯一の制限は、機能的ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディを形成するために、相補的ポリペプチド鎖が使用可能なことである。ＶＬ及びＶＨドメインが同じ抗体から誘導される場合、２つの相補的ポリペプチド鎖は同一とすることができる。例えば、結合ドメインがエピトープＡに特異的な抗体から誘導される（すなわち結合ドメインがＶＬA−ＶＨAの相互作用から形成される）場合、各ポリペプチドはＶＨA及びＶＬAを含む。抗体の２本のポリペプチド鎖がホモ二量体化すると、２つのＶＬA−ＶＨA結合部位が形成され、その結果、二価単一特異的抗体になる。ＶＬ及びＶＨドメインが様々な抗原に特異的な抗体から誘導される場合、機能的二重特異的ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディの形成には、２本の異なるポリペプチド鎖の相互作用、すなわちヘテロ二量体の形成が必要である。例えば、二重特異的ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディの場合、１本のポリペプチド鎖がＶＬA及びＶＬBを含み、上記鎖がホモ二量体化すると、結合しない、又は結合が予測できない２つのＶＬA−ＶＨB結合部位が形成される。対照的に、２本の異なるポリペプチド鎖が、例えば組み換え発現システム内で自由に相互作用し、一方がＶＬA及びＶＨBを含み、他方がＶＬB及びＶＨAを含む場合、２つの異なる結合部位が形成される。ＶＬA−ＶＨA及びＶＬB−ＶＨBである。すべてのＤＡＲＴ（商標）ダイアボディポリペプチド鎖対について、２本の鎖の位置合わせ不良又は結合不良の可能性がある、すなわちＶＬ−ＶＬ又はＶＨ−ＶＨドメインの相互作用があるが、機能的ダイアボディの精製は、当技術分野で知られているか本明細書で例示している方法、例えば親和クロマトグラフィに基づく任意の親和性を使用し、適切に二量体化した結合部位の免疫特異性に基づいて容易に管理される。
【０１１９】
ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのポリペプチド鎖の１本又は複数は、任意選択でＦｃドメイン又はその一部（例えばＣＨ２ドメイン、又はＣＨ３ドメイン）を含むことができる。Ｆｃドメイン又はその一部は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＭが含まれるが、これらに限定されない任意の免疫グロブリンアイソタイプ又はアロタイプから誘導することができる。好ましい実施形態では、Ｆｃドメイン（又はその一部）はＩｇＧから誘導される。特定の実施形態では、ＩｇＧアイソタイプはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４又はそのアロタイプである。一実施形態では、ダイアボディ分子はＦｃドメインを含み、そのＦｃドメインは任意の免疫グロブリンアイソタイプから別個に選択されるＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む（すなわち、Ｆｃドメインは、ＩｇＧから誘導されるＣＨ２ドメイン及びＩｇＥから誘導されるＣＨ３ドメイン、又はＩｇＧ１から誘導されるＣＨ２ドメイン及びＩｇＧ２から誘導されるＣＨ３ドメインなどを含む）。Ｆｃドメインは、改変して他のドメイン又はポリペプチド鎖の一部に対して任意の位置で本発明のダイアボディ分子を含む上記ポリペプチド鎖に組み込むことができる（例えば、Ｆｃドメイン又はその一部は、鎖のペプチドのＶＬ及びＶＨドメイン両方のＣ末端となるか、又はＶＬ及びＶＨドメイン両方のＮ末端になるか、又は一歩のドメインのＮ末端及び別のドメインのｃ末端になる（すなわちポリペプチド鎖の２つのドメインの間になる）ことができる）。
【０１２０】
ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ分子のポリペプチド鎖のＦｃドメインは、優先的に二量体化し、その結果、免疫グロブリン様の特性、例えばＦｃ−ＦｃγＲの相互作用を示すＤＡＲＴ（商標）分子が形成される。ダイアボディを含むＦｃは二量体とすることができる。例えば２本のポリペプチド鎖で構成され、それぞれがＶＨドメイン、ＶＬドメイン及びＦｃドメインを含む。上記ポリペプチド鎖の二量体化の結果、非修飾二価抗体とは別個の構造の構造であるが、Ｆｃドメインを含む二価ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディになる。このようなＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ分子は、野生型免疫グロブリンに対して変化した表現型、例えば変化した血清の半減期、結合特性などを示す。他の実施形態では、Ｆｃドメインを含むＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ分子は四量体とすることができる。このような四量体は、２本の「重い方の」ポリペプチド鎖、すなわちＶＬ、ＶＨ及びＦｃドメインを含むポリペプチド鎖、及び２本の「軽い方の」ポリペプチド鎖、すなわちＶＬ及びＶＨを含むポリペプチド鎖を含む。軽い方の鎖と重い方の鎖が相互作用して単量体を形成し、上記単量体はその不対Ｆｃドメインを介して相互作用し、Ｉｇ様分子を形成する。このようなＩｇ様ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディは四価であり、単一特異的、二重特異的、又は三重特異的とすることができる。
【０１２１】
ＶＩ．本発明の抗ＣＤ３抗体を使用する治療法
本発明の抗ＣＤ３抗体及びその抗原結合フラグメントは、ＣＤ３の発現を伴う癌の治療、及び自己免疫疾患及び他の炎症性疾患の治療に特に有益である。
【０１２２】
それらの使用は、ＣＤ３と、ＣＤ３に特異的に結合する抗体との間で複合体を形成することを含むことができる。このような抗体の例には、抗ＣＤ３モノクローナル抗体ｍＡｂ１及びｍＡｂ２、又は更に好ましくはそのヒト化誘導体が含まれるが、これらに限定されない。このような複合体の形成はインビトロ又はインビボとすることができる。理論に束縛されることなく、抗ＣＤ３抗体はＣＤ３の細胞外ドメインを通してＣＤ３と結合することができ、次に生体の正常細胞又は癌細胞の内側に内部移行することができる。
【０１２３】
Ａ．癌の治療
本発明の抗体及び抗原結合フラグメントは、Ｔ細胞の表面に存在するＣＤ３に結合する。本発明の抗原結合フラグメントは、Ｔ細胞を腫瘍細胞へとリダイレクトするために、ＤＡＲＴ又はＢｉＴＥ分子などの二重特異的（又は三重特異的又は多重特異的）分子の関係で使用することができる。これで、Ｔ細胞が腫瘍細胞を殺傷することができる。本発明の二重特異的（又は三重特異的又は多重特異的）分子は、ヒトＣＤ３及び非ヒト哺乳類（例えばカニクイザル）のＣＤの両方に、及び第２（又は追加的）の異なる抗原又はエピトープに結合することができる。第２の抗原又はエピトープは、腫瘍細胞上に発現する腫瘍抗原であることが好ましい。このような腫瘍細胞は、癌、例えば、乳癌、前立腺癌、胃癌、肺癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、卵巣癌、口腔癌、咽頭癌、食道癌、喉頭癌、骨癌、皮膚癌、メラノーマ、子宮癌、精巣癌、膀胱癌、腎臓癌、脳腫瘍、グリア芽腫、甲状腺癌、リンパ腫、骨髄腫、及び白血病からの可能性がある。このような追加の抗原又はエピトープは、細胞表面腫瘍抗原又はエピトープ（１７−１Ａ、Ａ３３、成体赤血球１次内胚葉Ｉ抗原、アルファ胎児タンパク、ＲＮＡ腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原、膀胱腫瘍癌胎児性抗原、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５、Ｂ７−Ｈ６、バーキットリンパ腫抗原−３８．１３、ＣＡ１２５、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ヒトＢリンパ腫抗原−ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＥＡ、ＣＯ１７−１Ａ、ＣＴＡ−１、ＣＴＬＡ−４、表皮性成長因子受容体、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、胎児赤血球Ｉ抗原、線維肉腫抗原、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、ガングリオシドＧＭ３、ＧＩＣＡ１９−９、ｇｐＩＩＩｂ／ＩＩＩａ、ｇｐ７２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、高分子量黒色腫抗原、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、ヒト白血病Ｔ細胞抗原−Ｇｐ３７、ヒト肺癌腫抗原Ｌ２０、ヒト肺癌腫抗原Ｌ６、ヒト乳脂肪球抗原、ＩｇＥ、ＫＳ１／４全癌腫抗原ＬＥＡ、肺腺癌Ｆ３抗原、悪性ヒト白血球抗原−ＡＰＯ−１、黒色腫抗原ｇｐ７５、黒色腫会合抗原ｐ９７、ネオ糖タンパク質、ｎｕＣ２４２、多型上皮ムチン抗原、前立腺特異的抗原、前立腺特異的膜抗原、前立腺酸性ホスホターゼ、ＳＫ−１抗原、ＴＡＧ−７２、Ｔ−抗原、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣ１、腫瘍特異的移植型の細胞表面の抗原、血管内皮成長因子、血管内皮成長因子−受容体、及びαｖβ３など）であることが好ましい。あるいは、このような追加の抗原又はエピトープは、病原体（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、Ｉ型単純ヘルペス（ＨＳＶ−Ｉ）、ＩＩ型単純ヘルペス（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス、パピロマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、天然痘、ＥＢウイルス、Ｉ型ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ−Ｉ）、ＩＩ型ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ−ＩＩ）、ウイル��性髄膜炎、ウイルス性脳炎、デング熱、天然痘；マイコバクテリアリケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア、肺炎球菌、ボレリアブルグドルフェリ、炭疽菌、連鎖球菌、ブドウ球菌、マイコバクテリア、破傷風、百日咳（Pertissus）、コレラ、悪疫、ジフテリア、クラミジア、及びレジオネラ；リーシュマニア、コクシジア、トリパノソーマ又はマラリア；クラミジア及びリケッチア）と会合することができる。
【０１２４】
本発明の抗体及び抗原結合フラグメントは、Ｔ細胞の表面に存在するＣＤ３に結合する。従来の方法を使用して、このような抗体に上述したようなフルオレセインで標識を付けることができる。このような標識付けした分子を二重特異的分子（例えば、Ｔ細胞受容体に結合するエピトープ結合ドメイン、及びフルオレセインに結合するエピトープ結合ドメインを有するＵＤＡＲＴ（商標）ダイアボディなど（「ＴＣＲ−ＵＤＡＲＴ（商標）」））の存在下でインキュベートする場合、それをフルオレセインに結合し、それによりＣＤ３を発現する細胞の表面に局所化して、このような細胞のリダイレクトされた殺傷を引き起こすことができる。
【０１２５】
代替実施形態では、ＣＤ３及びＣＤ１９を認識する二重特異的抗体、又は更に好ましくはＤＡＲＴ（商標）ダイアボディを使用して、Ｂ細胞特異的抗原（ＣＤ１９）とエフェクターＴ細胞上のＴ細胞受容体／ＣＤ３複合体との同時結合を通してＢ細胞リンパ腫を根絶するように、ＣＤ１９を「第２の」エピトープとして使用することができる。Moore, P.A他（２０１１）の「Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma」（Blood 2011 blood-2010-09-306449）に開示されているように、ＣＤ３／ＣＤ１９  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディを使用して、Ｂ細胞特異的抗原ＣＤ１９とエフェクターＴ細胞上のＴ細胞受容体／ＣＤ３複合体との同時結合を通してＢ細胞リンパ腫を根絶した。同一のＣＤ１９及びＣＤ３抗体Ｆｖ配列を有する単鎖二重特異的抗体と並べて比較したところ、ＤＡＲＴの方がＢ細胞溶解現象の指示に効力があることが判明した。ＣＤ１９×ＣＤ３  ＤＡＲＴでの活性増強は、休止し、予め刺激したヒトＰＢＭＣ又は精製エフェクターＴ細胞集団を使用して評価した全ＣＤ１９発現Ｂ細胞標的で観察された。ＣＤ１９×ＴＣＲ二重特異的ＤＡＲＴの特徴を調べると、リダイレクトされたＴ細胞殺傷用途のためにＴ細胞／Ｂ細胞の会合を支援するＤＡＲＴアーキテクチャの融通性を実証するＣＤ１９×ＣＤ３  ＤＡＲＴと同等の効力があることが判明した。ＤＡＲＴ分子が仲介した殺傷レベルの上昇が、ＣＤ１９ネガティブの細胞の非特異的Ｔ細胞活性又は溶解現象のいかなる増加も伴わなかったことは重要である。細胞会合の研究は、ＤＡＲＴのアーキテクチャは細胞：細胞の接触の維持に非常に適しており、高レベルの標的細胞殺傷に寄与することを示している。最後に、ヒトＰＢＭＣと同時投与した場合に、ＣＤ１９×ＴＣＲ  ＤＡＲＴがＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＢ細胞リンパ腫を阻害する能力があることは、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療におけるＤＡＲＴ分子の価値を実証する。本発明の交差反応性の抗ＣＤ３抗体は、Moore, P.A.他のＣＤ３抗体と同じ方法で使用することができた。したがって、本発明は、ＣＤ３発現癌細胞に関係ある癌（特にリンパ腫及び白血病）の療法を提供する。
【０１２６】
本発明の二重特異的（又は三重特異的又は多重特異的）分子は、患者の体重の典型的な０．０００１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇという単位用量の１回又は複数回分、患者に投与することが好ましい。患者に投与する用量は、患者の体重の０．０００１ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇと５ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１と２ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１と１ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇと０．７５ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇと０．５ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１〜０．１５ｍｇ／ｋｇの間、０．０００１〜０．１０ｍｇ／ｋｇの間、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇの間、０．０１〜０．２５ｍｇ／ｋｇの間、又は０．０１〜０．１０ｍｇ／ｋｇの間であることが好ましい。
【０１２７】
Ｂ．自己免疫疾患及び炎症の治療
本発明は、移植片拒絶、移植片対宿主疾患、望ましくない遅延型過敏反応（遅延型アレルギー反応など）、Ｔ細胞性肺疾患、及び自己免疫疾患などのＴ細胞性疾患又は障害の症状を治療、予防、進行遅延、及び／又は改善する方法も提供する。Ｔ細胞性肺疾患には類肉腫症、過敏性肺臓炎、急性間質肺炎、肺胞炎、肺線維症、突発性肺線維症及び炎症性肺損傷を特徴とする他の疾患が含まれる。Ｔ細胞自己免疫疾患には、多発性硬化症、神経炎、多発性筋炎、乾癬、白斑、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、１型糖尿病、自己免疫膵臓炎、炎症性腸疾患（例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎）、小児脂肪便症、糸球体腎炎、強皮症、類肉腫症、自己免疫甲状腺疾患（例えば、橋本甲状腺炎及びブレーブス病）、重症性筋無力症、アジソン病、自己免疫ブドウ膜網膜炎、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、及び全身性紅斑性狼瘡、狼瘡（特に皮膚）、臓器移植の影響、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）などが含まれる。特に、本発明の方法は早期段階の患者で、自己免疫による障害を遅延させるか、又は軽減し、高レベルの機能を維持し、及び／又は他の療法の必要性を低下させるので有利である（例えば、Ｉ型糖尿病の治療又は予防で、本発明の方法は、被験者の外生インスリン投与の必要性を低下させることができる）。更に、本発明の方法は、以前は治療用抗体、及び特に抗Ｔ細胞（例えば抗ＣＤ３）抗体又は抗原結合フラグメント）の投与に伴っていたサイトカイン放出症候群の発生を減少させるか、又は発生をなくすことができるので有利である。
【０１２８】
特定の実施形態では、本発明の方法による抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントでの治療過程は、２カ月、４カ月、６カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１２カ月、１５カ月、１８カ月、２４カ月、３０カ月、又は３６カ月の間隔で繰り返す。特定の実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントでの治療効力は、本明細書で説明するように、又は当技術分野で知られているように、以前の治療後２カ月、４カ月、６カ月、９カ月、１２カ月、１５カ月、１８カ月、２４カ月、３０カ月、又は３６カ月後に判断される。
【０１２９】
別の実施形態では、自己免疫障害又はＴ細胞悪性腫瘍の予防、治療又は改善のために、約０．５〜５０μｇ／ｋｇ、約０．５〜４０μｇ／ｋｇ、約０．５〜３０μｇ／ｋｇ、約０．５〜２０μｇ／ｋｇ、約０．５〜１５μｇ／ｋｇ、約０．５〜１０μｇ／ｋｇ、約０．５〜５μｇ／ｋｇ、約１〜５μｇ／ｋｇ、約１〜１０μｇ／ｋｇ、約２０〜４０μｇ／ｋｇ、約２０〜３０μｇ／ｋｇ、約２２〜２８μｇ／ｋｇ又は約２５〜２６μｇ／ｋｇという単位用量の１回又は複数回分の１つ又は複数の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントを被験者に投与する。別の実施形態では、自己免疫障害又はＴ細胞悪性腫瘍の予防、治療又は改善のために、２００μｇ／ｋｇ、１７８μｇ／ｋｇ、１８０μｇ／ｋｇ、１２８μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、９５μｇ／ｋｇ、９０μｇ／ｋｇ、８５μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、６５μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、５５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、４５μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、３５μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、２６μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、１３μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、６．５μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、３．２μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ、２．５μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、１．６μｇ／ｋｇ、１．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、０．２５μｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ、又は０．０５μｇ／ｋｇという単位用量の１回又は複数回分の１つ又は複数の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントを被験者に投与する。
【０１３０】
一実施形態では、自己免疫障害又はＴ細胞悪性腫瘍の１つ又は複数の症状の予防、治療又は改善のために、２００μｇ／ｋｇ以内、１７５μｇ／ｋｇ以内、１５０μｇ／ｋｇ以内、１２８μｇ／ｋｇ以内、１００μｇ／ｋｇ以内、９５μｇ／ｋｇ以内、９０μｇ／ｋｇ以内、８５μｇ／ｋｇ以内、８０μｇ／ｋｇ以内、７５μｇ／ｋｇ以内、７０μｇ／ｋｇ以内、６５μｇ／ｋｇ以内、６０μｇ／ｋｇ以内、５５μｇ／ｋｇ以内、５０μｇ／ｋｇ以内、４５μｇ／ｋｇ以内、４０μｇ／ｋｇ以内、３５μｇ／ｋｇ以内、３０μｇ／ｋｇ以内、２５μｇ／ｋｇ以内、２０μｇ／ｋｇ以内、１５μｇ／ｋｇ以内、１０μｇ／ｋｇ以内、５μｇ／ｋｇ以内、２．５μｇ／ｋｇ以内、２μｇ／ｋｇ以内、１．５μｇ／ｋｇ以内、１μｇ／ｋｇ以内、０．５μｇ／ｋｇ以内、０．２５μｇ／ｋｇ以内、０．１μｇ／ｋｇ以内、又は０．０５μｇ／ｋｇ以内という単位用量の１回又は複数回分の１つ又は複数の本発明の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントを被験者に投与する。
【０１３１】
特定の実施形態では、約５〜１２００μｇ／ｍ2、好ましくは５１〜８２６μｇ／ｍ2という投与量１回又は複数回分を被験者に投与する。別の実施形態では、自己免疫障害又はＴ細胞悪性腫瘍の１つ又は複数の症状の予防、治療、進行遅延、遅発又は改善のために、１２００μｇ／ｍ2、１１５０μｇ／ｍ2、１１００μｇ／ｍ2、１０５０μｇ／ｍ2、１０００μｇ／ｍ2、９５０μｇ／ｍ2、９００μｇ／ｍ2、８５０μｇ／ｍ2、８００μｇ／ｍ2、７５０μｇ／ｍ2、７００μｇ／ｍ2、６５０μｇ／ｍ2、６００μｇ／ｍ2、５５０μｇ／ｍ2、５００μｇ／ｍ2、４５０μｇ／ｍ2、４００μｇ／ｍ2、３５０μｇ／ｍ2、３００μｇ／ｍ2、２５０μｇ／ｍ2、２００μｇ／ｍ2、１５０μｇ／ｍ2、１００μｇ／ｍ2、５０μｇ／ｍ2、４０μｇ／ｍ2、３０μｇ／ｍ2、２０μｇ／ｍ2、１５μｇ／ｍ2、１０μｇ／ｍ2、又は５μｇ／ｍ2という単位用量の１回又は複数回分の１つ又は複数の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントを被験者に投与する。
【０１３２】
別の実施形態では、予防的又は治療的に有効量の用量１回又は複数回分の１つ又は複数の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントを含む治療計画を被験者に投与し、治療過程を２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間又は１４日間投与する。一実施形態では、治療計画は予防的又は治療的に有効量の用量の１つ又は複数の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントを毎日、１日おき、２日おき、又は３日おきに投与することを含む。特定の実施形態では、治療計画は、予防的又は治療的に有効量の用量の１つ又は複数の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントを所与の週の月曜日、火曜日、水曜日、木曜日に投与し、同じ週の金曜日、土曜日及び日曜日には予防的又は治療的に有効量の１つ又は複数の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントを投与せず、これを投与量１４回分、１３回分、１２回分、１１回分、１０回分、９回分、又は８回分投与されるまで行うことを含む。特定の実施形態では、投与される用量は計画の毎日で同じである。特定の実施形態では、予防的又は治療的に有効量の用量の１つ又は複数の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントを含む治療計画を被験者に投与し、ここで、予防的又は治療的有効量は、２００μｇ／ｋｇ／日、１７５μｇ／ｋｇ／日、１５０μｇ／ｋｇ／日、１２５μｇ／ｋｇ／日、１００μｇ／ｋｇ／日、９５μｇ／ｋｇ／日、９０μｇ／ｋｇ／日、８５μｇ／ｋｇ／日、８０μｇ／ｋｇ／日、７５μｇ／ｋｇ／日、７０μｇ／ｋｇ／日、６５μｇ／ｋｇ／日、６０μｇ／ｋｇ／日、５５μｇ／ｋｇ／日、５０μｇ／ｋｇ／日、４５μｇ／ｋｇ／日、４０μｇ／ｋｇ／日、３５μｇ／ｋｇ／日、３０μｇ／ｋｇ／日、２６μｇ／ｋｇ／日、２５μｇ／ｋｇ／日、２０μｇ／ｋｇ／日、１５μｇ／ｋｇ／日、１３μｇ／ｋｇ／日、１０μｇ／ｋｇ／日、６．５μｇ／ｋｇ／日、５μｇ／ｋｇ／日、３．２μｇ／ｋｇ／日、３μｇ／ｋｇ／日、２．５μｇ／ｋｇ／日、２μｇ／ｋｇ／日、１．６μｇ／ｋｇ／日、１．５μｇ／ｋｇ／日、１μｇ／ｋｇ／日、０．５μｇ／ｋｇ／日、０．２５μｇ／ｋｇ／日、０．１μｇ／ｋｇ／日、又は０．０５μｇ／ｋｇ／日であり、及び／又は予防的又は治療的有効量は、１２００μｇ／ｍ2／日、１１５０μｇ／ｍ2／日、１１００μｇ／ｍ2／日、１０５０μｇ／ｍ2／日、１０００μｇ／ｍ2／日、９５０μｇ／ｍ2／日、９００μｇ／ｍ2／日、８５０μｇ／ｍ2／日、８００μｇ／ｍ2／日、７５０μｇ／ｍ2／日、７００μｇ／ｍ2／日、６５０μｇ／ｍ2／日、６００μｇ／ｍ2／日、５５０μｇ／ｍ2／日、５００μｇ／ｍ2／日、４５０μｇ／ｍ2／日、４００μｇ／ｍ2／日、３５０μｇ／ｍ2／日、３００μｇ／ｍ2／日、２５０μｇ／ｍ2／日、２００μｇ／ｍ2／日、１５０μｇ／ｍ2／日、１００μｇ／ｍ2／日、５０μｇ／ｍ2／日、４０μｇ／ｍ2／日、３０μｇ／ｍ2／日、２０μｇ／ｍ2／日、１５μｇ／ｍ2／日、１０μｇ／ｍ2／日、又は５μｇ／ｍ2／日である。別の実施形態では、自己免疫障害又はＴ細胞悪性腫瘍の１つ又は複数の症状を予防、治療又は改善するために、１２００μｇ／ｍ2以内、１１５０μｇ／ｍ2以内、１１００μｇ／ｍ2以内、１０５０μｇ／ｍ2以内、１０００μｇ／ｍ2以内、９５０μｇ／ｍ2以内、９００μｇ／ｍ2以内、８５０μｇ／ｍ2以内、８００μｇ／ｍ2以内、７５０μｇ／ｍ2以内、７００μｇ／ｍ2以内、６５０μｇ／ｍ2以内、６００μｇ／ｍ2以内、５５０μｇ／ｍ2以内、５００μｇ／ｍ2以内、４５０μｇ／ｍ2以内、４００μｇ／ｍ2以内、３５０μｇ／ｍ2以内、３００μｇ／ｍ2以内、２５０μｇ／ｍ2以内、２００μｇ／ｍ2以内、１５０μｇ／ｍ2以内、１００μｇ／ｍ2以内、５０μｇ／ｍ2以内、４０μｇ／ｍ2以内、３０μｇ／ｍ2以内、２０μｇ／ｍ2以内、１５μｇ／ｍ2以内、１０μｇ／ｍ2以内、又は５μｇ／ｍ2以内の静脈用量の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントを約２４時間、約２２時間、約２０時間、約１８時間、約１６時間、約１４時間、約１２時間、約１０時間、約８時間、約６時間、約４時間、約２時間、約１．５時間、約１時間、約５０分間、約４０分間、約３０分間、約２０分間、約１０分間、約５分間、約２分間、約１分間、約３０秒間又は約１０秒間投与する。計画の継続時間にわたって、総用量は合計で、９０００μｇ／ｍ2、８０００μｇ／ｍ2、７０００μｇ／ｍ2、６０００μｇ／ｍ2未満であることが好ましく、５０００μｇ／ｍ2、４０００μｇ／ｍ2、３０００μｇ／ｍ2、２０００μｇ／ｍ2、又は１０００μｇ／ｍ2 未満とすることができる。特定の実施形態では、計画で投与される総用量は、１００μｇ／ｍ2〜２００μｇ／ｍ2、１００μｇ／ｍ2〜５００μｇ／ｍ2、１００μｇ／ｍ2〜１０００μｇ／ｍ2、又は５００μｇ／ｍ2〜１０００μｇ／ｍ2である。
【０１３３】
好ましい実施形態では、１つ又は複数の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントの予防的又は治療的に有効な１日量に到達するまで、用量は、治療計画の用量の最初の１／４、１／２又は２／３にわたって（例えば、１日１回の１０日間、１２日間、１４日間、１６日間、１８日間又は２０日間の計画の最初の２日間、３日間、４日間、５日間又は６日間にわたって）増大する。特定の実施形態では、予防的又は治療的有効量の用量の１回又は複数回分の１つ又は複数の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントを含む治療計画を被験者に投与し、予防的又は治療的有効量は、治療が進行するにつれ毎日例えば、０．０１μｇ／ｋｇ、０．０２μｇ／ｋｇ、０．０４μｇ／ｋｇ、０．０５μｇ／ｋｇ、０．０６μｇ／ｋｇ、０．０８μｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ、０．２μｇ／ｋｇ、０．２５μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、０．７５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１．５μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、４μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、３５μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、４５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、５５μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、６５μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、８５μｇ／ｋｇ、９０μｇ／ｋｇ、９５μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、又は１２５μｇ／ｋｇだけ増加するか、又は毎日例えば、１μｇ／ｍ2、５μｇ／ｍ2、１０μｇ／ｍ2、１５μｇ／ｍ2、２０μｇ／ｍ2、３０μｇ／ｍ2、４０μｇ／ｍ2、５０μｇ／ｍ2、６０μｇ／ｍ2、７０μｇ／ｍ2、８０μｇ／ｍ2、９０μｇ／ｍ2、１００μｇ／ｍ2、１５０μｇ／ｍ2、２００μｇ／ｍ2、２５０μｇ／ｍ2、３００μｇ／ｍ2、３５０μｇ／ｍ2、４００μｇ／ｍ2、４５０μｇ／ｍ2、５００μｇ／ｍ2、５５０μｇ／ｍ2、６００μｇ／ｋｇ、又は６５０μｇ／ｍ2だけ増加する。特定の実施形態では、予防的又は治療的有効量の用量の１回又は複数回分の１つ又は複数の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントを含む治療計画を被験者に投与し、１つ又は複数の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントの予防的又は治療的に有効な１日量に到達するまで、予防的又は治療的有効量を１．２５倍、１．５倍、２倍、２．２５倍、２．５倍、又は５倍増加させる。
【０１３４】
特定の実施形態では、自己免疫障害又はＴ細胞悪性腫瘍の１つ又は複数の症状を予防、治療又は改善するために、２００μｇ／ｋｇ以内、好ましくは１７５μｇ／ｋｇ以内、１５０μｇ／ｋｇ以内、１２５μｇ／ｋｇ以内、１００μｇ／ｋｇ以内、９５μｇ／ｋｇ以内、９０μｇ／ｋｇ以内、８５μｇ／ｋｇ以内、８０μｇ／ｋｇ以内、７５μｇ／ｋｇ以内、７０μｇ／ｋｇ以内、６５μｇ／ｋｇ以内、６０μｇ／ｋｇ以内、５５μｇ／ｋｇ以内、５０μｇ／ｋｇ以内、４５μｇ／ｋｇ以内、４０μｇ／ｋｇ以内、３５μｇ／ｋｇ以内、３０μｇ／ｋｇ以内、２５μｇ／ｋｇ以内、２０μｇ／ｋｇ以内、１５μｇ／ｋｇ以内、１０μｇ／ｋｇ以内、５μｇ／ｋｇ以内、２．５μｇ／ｋｇ以内、２μｇ／ｋｇ以内、１．５μｇ／ｋｇ以内、１μｇ／ｋｇ以内、０．５μｇ／ｋｇ以内、又は０．５μｇ／ｋｇ以内という用量の１回又は複数回分の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントを被験者に筋肉内投与する。
【０１３５】
別の実施形態では、自己免疫障害の１つ又は複数の症状を予防、治療又は改善するために、２００μｇ／ｋｇ以内、好ましくは１７５μｇ／ｋｇ以内、１５０μｇ／ｋｇ以内、１２５μｇ／ｋｇ以内、１００μｇ／ｋｇ以内、９５μｇ／ｋｇ以内、９０μｇ／ｋｇ以内、８５μｇ／ｋｇ以内、８０μｇ／ｋｇ以内、７５μｇ／ｋｇ以内、７０μｇ／ｋｇ以内、６５μｇ／ｋｇ以内、６０μｇ／ｋｇ以内、５５μｇ／ｋｇ以内、５０μｇ／ｋｇ以内、４５μｇ／ｋｇ以内、４０μｇ／ｋｇ以内、３５μｇ／ｋｇ以内、３０μｇ／ｋｇ以内、２５μｇ／ｋｇ以内、２０μｇ／ｋｇ以内、１５μｇ／ｋｇ以内、１０μｇ／ｋｇ以内、５μｇ／ｋｇ以内、２．５μｇ／ｋｇ以内、２μｇ／ｋｇ以内、１．５μｇ／ｋｇ以内、１μｇ／ｋｇ以内、０．５μｇ／ｋｇ以内、又は０．５μｇ／ｋｇ以内の投与量の１回又は複数回分の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントを被験者に皮下投与する。
【０１３６】
別の実施形態では、自己免疫障害又はＴ細胞悪性腫瘍の１つ又は複数の症状を予防、治療又は改善するために、１００μｇ／ｋｇ以内、好ましくは９５μｇ／ｋｇ以内、９０μｇ／ｋｇ以内、８５μｇ／ｋｇ以内、８０μｇ／ｋｇ以内、７５μｇ／ｋｇ以内、７０μｇ／ｋｇ以内、６５μｇ／ｋｇ以内、６０μｇ／ｋｇ以内、５５μｇ／ｋｇ以内、５０μｇ／ｋｇ以内、４５μｇ／ｋｇ以内、４０μｇ／ｋｇ以内、３５μｇ／ｋｇ以内、３０μｇ／ｋｇ以内、２５μｇ／ｋｇ以内、２０μｇ／ｋｇ以内、１５μｇ／ｋｇ以内、１０μｇ／ｋｇ以内、５μｇ／ｋｇ以内、２．５μｇ／ｋｇ以内、２μｇ／ｋｇ以内、１．５μｇ／ｋｇ以内、１μｇ／ｋｇ以内、０．５μｇ／ｋｇ以内、又は０．５μｇ／ｋｇ以内の投与量の１回又は複数回分の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントを被験者に静脈投与する。別の実施形態では、自己免疫障害又はＴ細胞悪性腫瘍の１つ又は複数の症状を予防、治療又は改善するために、１００μｇ／ｋｇ以内、９５μｇ／ｋｇ以内、９０μｇ／ｋｇ以内、８５μｇ／ｋｇ以内、８０μｇ／ｋｇ以内、７５μｇ／ｋｇ以内、７０μｇ／ｋｇ以内、６５μｇ／ｋｇ以内、６０μｇ／ｋｇ以内、５５μｇ／ｋｇ以内、５０μｇ／ｋｇ以内、４５μｇ／ｋｇ以内、４０μｇ／ｋｇ以内、３５μｇ／ｋｇ以内、３０μｇ／ｋｇ以内、２５μｇ／ｋｇ以内、２０μｇ／ｋｇ以内、１５μｇ／ｋｇ以内、１０μｇ／ｋｇ以内、５μｇ／ｋｇ以内、２．５μｇ／ｋｇ以内、２μｇ／ｋｇ以内、１．５μｇ／ｋｇ以内、１μｇ／ｋｇ以内、０．５μｇ／ｋｇ以内、又は０．５μｇ／ｋｇ以内の静脈内用量の１つ又は複数の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントを約６時間、約４時間、約２時間、約１．５時間、約１時間、約５０分間、約４０分間、約３０分間、約２０分間、約１０分間、約５分間、約２分間、約１分間、約３０秒間又は約１０秒間投与する。
【０１３７】
投与計画の最初の日々に投与量を増大させる特定の実施形態では、計画の１日目の用量は５〜１００μｇ／ｍ2／日であり、３日目、４日目、５日目、６日目、又は７日目まで直前に引用したような１日量まで増大させる。例えば、１日目には約５１μｇ／ｍ2／日の用量、２日目には約１０３μｇ／ｍ2／日、３日目には約２０７μｇ／ｍ2／日、４日目には約４１３μｇ／ｍ2／日、及び計画のその後の日々（例えば、５日目〜１４日目）には８２６μｇ／ｍ2／日の用量を被験者に投与する。
【０１３８】
他の実施形態では、初回量は計画の最後の１日量の１／４から１／２から同量であるが、６時間、８時間、１０時間又は１２時間の間隔で部分的に投与する。例えば、抗体の投与により引き起こされるサイトカイン放出のレベルを低下させるために、１３μｇ／ｋｇ／日の用量は、６時間の間隔で３〜４μｇ／ｋｇを４回投与する。
【０１３９】
特定の実施形態では、サイトカイン放出及び他の有害作用の可能性を低下させるために、計画の用量の最初の１回、２回、３回又は４回、又は全部の用量を、静脈内投与により更に低速で投与する。例えば、５１μｇ／ｍ2／日の用量を、約５分間、約１５分間、約３０分間、約４５分間、約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、及び約２２時間投与することができる。特定の実施形態では、用量を例えば２０〜２４時間の期間にわたって低速注入で投与する。特定の実施形態では、用量をポンプで注入し、注入が進行するにつれて投与される抗体の濃度を上昇させることが好ましい。
【０１４０】
他の実施形態では、計画の設定フラクションを、用量を増大させながら投与することができる。例えば、上記５１μｇ／ｍ2／日〜８２６μｇ／ｍ2／日の計画では、フラクションは１日量の１／１０、１／４、１／３、１／２、２／３又は３／４とすることができる。したがって、フラクションが１／１０である場合、１日量は１日目には５．１μｇ／ｍ2、２日目には１０．３μｇ／ｍ2、３日目には２０．７μｇ／ｍ2、４日目には４１．３μｇ／ｍ2、５〜１４日目には８２．６μｇ／ｍ2になる。フラクションが１／４である場合、用量は１日目には１２．７５μｇ／ｍ2、２日目には２５．５μｇ／ｍ2、３日目には５１μｇ／ｍ2、４日目には１０３μｇ／ｍ2、及び５〜１４日目には２０７μｇ／ｍ2になる。フラクションが１／３である場合、用量は１日目には１７μｇ／ｍ2、２日目には３４．３μｇ／ｍ2、３日目には６９μｇ／ｍ2、４日目には１３７．６μｇ／ｍ2、及び５〜１４日目には２７５．３μｇ／ｍ2になる。フラクションが１／２である場合、用量は１日目には２５．５μｇ／ｍ2、２日目には５１μｇ／ｍ2、３日目には１０３μｇ／ｍ2、４日目には２０７μｇ／ｍ2、及び５〜１４日目には４１３μｇ／ｍ2になる。フラクションが２／３である場合、用量は１日目には３４μｇ／ｍ2、２日目には６９μｇ／ｍ2、３日目には１３７．６μｇ／ｍ2、４日目には２７５．３μｇ／ｍ2、及び５〜１４日目には５５０．１μｇ／ｍ2になる。フラクションが３／４である場合、用量は１日目には３８．３μｇ／ｍ2、２日目には７７．３μｇ／ｍ2、３日目には１５５．３μｇ／ｍ2、４日目には３０９．８μｇ／ｍ2、及び５〜１４日目には６２０μｇ／ｍ2になる。
【０１４１】
特定の実施形態では、抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントは、数日間にわたって１日量ずつ投与するのではなく、輸注によって４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１５時間、１８時間、２０時間、２４時間、３０時間又は３６時間にわたって中断せずに投与する。輸注は一定にするか、又は例えば、輸注の最初の１時間、２時間、３時間、５時間、６時間又は８時間だけ比較的低い用量で開始し、次にその後、比較的高い用量に増加させることができる。輸注の過程で、患者は上記例示的計画で投与される量と等しい用量を受ける。例えば、約１５０μｇ／ｍ2、２００μｇ／ｍ2、２５０μｇ／ｍ2、５００μｇ／ｍ2、７５０μｇ／ｍ2、１０００μｇ／ｍ2、１５００μｇ／ｍ2、２０００μｇ／ｍ2、３０００μｇ／ｍ2、４０００μｇ／ｍ2、５０００μｇ／ｍ2、６０００μｇ／ｍ2、７０００μｇ／ｍ2、８０００μｇ／ｍ2、又は９０００μｇ／ｍ2の用量である。特に、輸注の速度及び継続時間は、投与後に被験者の遊離抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントのレベルを最低にするように設計される。特定の実施形態では、遊離抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントのレベルは、遊離抗体１ｍＬ当たり２００ｎｇを超えてはならない。更に、輸注は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の複合Ｔ細胞受容体コーティングと調節を達成するように設計される。
【０１４２】
特定の実施形態では、抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントは、当技術分野で周知の方法で判断されるように、Ｔ細胞に対するＴ細胞受容体複合体の組み合わせたコーティングと調節の特定レベルを達成するように投与される。例えば、参照により全体を本明細書に組み込むものとする、米国特許出願公開ＵＳ２００３／０１０８５４８号の実施例１１を参照されたい。特定の実施形態では、投与計画は少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の組み合わせたＴ細胞受容体コーティングと調節を達成し、特定の実施形態では遊離抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントがほとんど、又は全く検出されない（例えば、患者の血液中で検出される薬品は２００ｎｇ／ｍＬ未満である）。
【０１４３】
好ましい実施形態では、抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントは非経口的に、例えば、静脈内、筋肉内又は皮下投与するか、あるいは経口投与する。抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントは、徐放性製剤として投与することもできる。
【０１４４】
特定の実施形態では、１つ又は複数の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントの予防的又は治療的有効量の用量１回又は複数回分、又は投薬計画を投与した場合、他の免疫抑制剤と比較して以下の望ましくない作用又は有害作用の１つ又は複数を誘発しないか、又は軽減する。すなわち、バイタルサイン異常（発熱、頻脈、助脈、高血圧、低血圧）、血液学的事象（貧血、リンパ球減少、白血球減少、血小板減少）、頭痛、悪寒、眩暈、悪心、無力症、背痛、胸痛（胸部圧）、下痢、筋肉痛、疼痛、掻痒、乾癬、鼻炎、発汗、注射部位の反応、血管拡張、日和見感染の危険増大、エプスタインバーウイルスの活性化、Ｔ細胞自滅及び特定タイプの癌発生の危険増大である。別の特定の実施形態では、１つ又は複数の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントの予防的又は治療的有効量の用量１回又は複数回分を投与した場合、他の免疫抑制剤と比較して以下の望ましくない作用又は有害作用の１つ又は複数を誘発しない、又は軽減する。すなわち、バイタルサイン異常（発熱、頻脈、助脈、高血圧、低血圧）、血液学的事象（貧血、リンパ球減少、白血球減少、血小板減少）、頭痛、悪寒、眩暈、悪心、無力症、背痛、胸痛（胸部圧）、下痢、筋肉痛、疼痛、掻痒、乾癬、鼻炎、発汗、注射部位の反応、血管拡張、日和見感染の危険増大、エプスタインバーウイルスの活性化、Ｔ細胞自滅及び特定タイプの癌発生の危険増大である。
【０１４５】
本発明によれば、自己免疫障害を治療する１つ又は複数の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントの予防的又は治療的有効量を含む用量又は投薬計画を、１つ又は複数の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントの予防的又は治療的有効量を含む初期又は前回の用量又は投与計画の後、１カ月、２カ月、４カ月、６カ月、８カ月、１２カ月、１５カ月、１８カ月、又は２４カ月以上繰り返すことができる。初期又は前回の用量又は投薬計画の後に改善した後、上記自己免疫障害に伴う症状が再発するか、又は本発明の方法による抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントの初期用量又は投薬計画の後、上記自己免疫障害に伴う症状が改善しない場合、反復用量又は投薬計画を当然投与することができる。例えば、糖尿病に関して、例えば、抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントの初期又は前回の治療の後、１カ月、２カ月、４カ月、６カ月、８カ月、１２カ月、１５カ月、１８カ月又は２４カ月以上、被験者の平均１日インスリン使用量が、治療前のレベルと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％減少していない場合、１つ又は複数の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントの予防的又は治療的有効量を含む反復用量又は投薬計画を被験者に投与することができる。あるいは、糖尿病に関して、例えば、抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントの初期又は前回の治療の後、１カ月、２カ月、４カ月、６カ月、８カ月、１２カ月、１５カ月、１８カ月又は２４カ月以上、被験者のＨＡ１又はＨＡ１Ｃレベルが、治療前のレベルと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％減少していない場合、１つ又は複数の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントの予防的又は治療的有効量を含む反復用量又は投薬計画を被験者に投与することができる。別の実施形態では、糖尿病に関して、例えば、抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントの初期又は前回の治療の後、１カ月、２カ月、４カ月、６カ月、８カ月、１２カ月、１５カ月、１８カ月又は２４カ月以上、被験者のＣペプチド応答が、治療前のレベルと比較して５％超、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、又は９０％超減少していない場合、１つ又は複数の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントの予防的又は治療的有効量を含む反復用量又は投薬計画を被験者に投与することができる。
【０１４６】
自己免疫疾患は、ヒトの細胞、組織又は器官の正常なコンポーネントに対する免疫応答によって引き起こされる非感染性免疫疾患である。自己免疫疾患は、標的組織又は器官を徐々に浸食する慢性疾患であることが多い。不適切な自己免疫応答の存在により現在自己免疫疾患と分類される一般的疾患には、Ｉ型インスリン依存性糖尿病、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、重症筋無力症、小児脂肪便症、シェーグレン症候群、グレーブス病、クローン病、自己免疫肝炎、乾癬、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー性鼻炎、臓器移植の影響、又は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）及び炎症性免疫応答が関わる多数の他の疾患が含まれる。
【０１４７】
自己免疫疾患は一般的に慢性であるので、通常は一生続く治療及び監視を必要とする。したがって、自己免疫疾患の従来の療法は、主に疾患によって引き起こされる炎症の結果を管理することを指向し、このような治療ではわずかな自己免疫疾患しか治癒又は消滅させることができない。幾つかの自己免疫疾患では、限られた数の免疫抑制投薬のうち１つを投与した結果、活動性疾患の寛解又は消滅期間になることがある。補助療法に使用される免疫抑制剤にはサイトカイン産生を抑制するか、又は自己抗原の発現を下方制御又は抑制するか、又は主要組織適合（ＭＨＣ）抗原を遮断する物質が含まれる。免疫抑制投薬には、抗炎症薬（例えば、非ステロイド抗炎症薬（「ＮＳＡＩＤ」））、シクロフォスファミド、ブロモクリプチンシクロスポリンＡ、メトトレキサート、糖質ステロイドなどのステロイド、及びサイトカイン又はサイトカイン受容体拮抗剤が含まれる。投薬を中止すると自己免疫疾患は通常再発するので、患者がその免疫抑制投薬を中止できることは滅多にない。自己免疫疾患は、免疫抑制投薬を長期間継続すると治療に対して抗療性になることがあるので、免疫抑制剤の用量を増加し続ける必要があることがある。
【０１４８】
ＣＤ３を指向する治療用抗体は、自己免疫疾患のために現在使用可能である免疫抑制化学療法の多くよりも発生する長期的副作用が少ないと考えられている（ＷＯ２００７／１１７６００号）。しかし、以前の抗体性療法は問題があり、特に反復投与を使用した場合に問題があることが判明している。抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）などの抗リンパ球療法、及びリツキシマブ（Rituxin（登録商標））及びアレムツズマブ（CAMPATH（登録商標））などのＢ細胞を指向するモノクローナル抗体は、治療被験者の循環及び組織Ｂ細胞集団を減少させる。しかし、これらの療法も重篤な免疫抑制を引き起こし、これは慢性自己免疫疾患の長期治療にとって望ましくない。重篤な免疫抑制療法の主な合併症は感染である。全身性免疫抑制は、望ましくない毒性作用及び造血幹細胞のレベル低下も伴うことがある。更に、抗体療法を受ける患者は、重大レベルのヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、及び抗イディオタイプ応答を発生することが多く、これは寛解期の終了時の反復治療を制限することがある。
【０１４９】
以上で説明したように、自己免疫疾患の免疫抑制に可能な療法として、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体などのＴ細胞の抗原を指向する抗体が示唆されている。抗ＣＤ３抗体は、病原性Ｔ細胞を減少させ、調節Ｔ細胞を誘発することによって、このような免疫抑制を誘導すると考えられている（ＷＯ２００７／１１７６００号、St. Clair E.W.（２００９）の「Novel Targeted Therapies for Autoimmunity」（Curr. Opin. Immunol. 21(6):648-657）、Ludvigsson, J.（２００９）の「The Role of Immunomodulation Therapy in Autoimmune Diabetes」（J. Diabetes Sci. Technol. 3(2):320-330））。したがって、抗ＣＤ３などの抗Ｔ細胞抗体は、抗原に対するＴ細胞の応答を抑制、亢進又はリダイレクトすることによって、被験者の免疫状態に影響するように使用されている。特に、ｈＯＫＴ３γ１（Ａｌａ−Ａｌａ）としても知られるテプリズマブ（２３４及び２３５の位置にアラニンを含有する）（MacroGenics, Inc.）は、膵臓口のインスリン産生ベータ細胞の破壊を仲介するＴリンパ球の機能を変更するように改変されている抗ＣＤ３抗体である。テプリズマブは、成熟Ｔ細胞上に発現したＣＤ３ε鎖のエピトープに結合し、そうすることによりＴリンパ球の機能を変更する。
【０１５０】
非ヒトＣＤ３との交差反応性（より正確で応答性が高い投薬を可能にする）が一因で、本発明の抗ＣＤ３抗体は、先行技術で明白な欠陥があるにもかかわらず、自己免疫疾患の治療に特に有益であると考えられる。
【０１５１】
このような抗体及びその抗原結合フラグメントは、単独で、又は他の医薬品と併用して使用することができる。特に、本発明は抗Ｂ細胞抗体（又はその抗原結合フラグメント）と併用したこのような抗体又は抗原結合フラグメントを投与することを含む療法を想定している。抗Ｂ細胞抗体は当技術分野で知られている（ＷＯ２００７／１１７６００号、ＷＯ２００５／０００９０１号、ＷＯ２００４／０３５６０７号、米国特許第５，５００，３６２号及び５，７３６，１３７号、米国特許公開第２００３／０２１９４３３号、第２００５／０２７１６５８号、第２００５／０２７１６５８号、第２００５／０２８１８１７号、第２００６／０２４２９５号、第２００６／０２４３００号及び第２００６／０３４８３５号、Clark, E.A.他（１９８５）の「Role Of The Bp35 Cell Surface Polypeptide In Human B-Cell Activation」（Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)82(6):1766-1770）、Press, O.W.他（１９８７）の「Monoclonal Antibody 1F5 (Anti-CD20) Serotherapy of Human B Cell Lymphomas」（Blood 69:584-591）を参照されたい）。このような併用投与は、別個の抗体又はその抗原結合フラグメントを共同投与を使用するか、又は二重特異的抗体を形成するか、又は更に好ましくは、上述したようにＣＤ３及びＢ細胞抗原の両方に結合する能力を有するＤＡＲＴ（商標）ダイアボディを形成することによって遂行することができる。
【０１５２】
使用される抗Ｂ細胞抗体又は抗原結合フラグメントは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ４０、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ３８、ＣＤ２７、リンパ球機能誘発抗原（ＬＦＡ）、例えばＬＦＡ−Ｉ又はＬＦＡ−３、ＣＦＡ−Ｉ、又は適応免疫応答でＴ細胞及びＢ細胞の活性化につながるＴ細胞、Ｂ細胞対合に関係する別のアクセサリ分子から選択されるマーカなどのＢ細胞表面マーカに配向される。更に好ましい実施形態では、抗Ｂ細胞抗体は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ４０、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、リンパ球機能誘発抗原（ＬＦＡ）、例えばＬＦＡ−Ｉ又はＬＦＡ−３、ＣＦＡ−Ｉ、又はＴ細胞、Ｂ細胞対合に関係するアクセサリ分子から選択されるマーカに配向される抗体など、Ｂ細胞枯渇抗体とすることができる。
【０１５３】
あるいは、このような併用療法は、抗原提示細胞（例えばＢ７−Ｈ３）上に存在する抗原を認識する抗体（又はその抗原結合フラグメント）と組み合わせて抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合フラグメントを投与することを含むことができる。更に好ましい実施形態では、併用療法は、Ｂ細胞の活性に（直接的又は間接的に）関係するポリペプチド又はＴＮＦサイトカインファミリーの一員などの免疫調節物質を認識する抗体（又はその抗原結合フラグメント）、又はインターフェロン（例えばα、β又はγインターフェロン）との組み合わせで抗ＣＤ３抗体（又はその抗原結合フラグメント）を投与することを含む。当業者に理解されるように、このようなインターフェロンは、抗原のプロセシング及び提示において一緒に作用するタンパク質の調節に関与する。これらのサイトカインは細胞を刺激して、ＨＬＡクラスＩ重鎖のその発現を増加させる。１つの好ましい実施形態では、併用療法は、活動性自己免疫疾患を有する被験者に、βインターフェロンに対する抗体と組み合わせてＴ細胞抗原に対する抗体を投与することを含む。さらなる好ましい実施形態では、併用療法は、β−インターフェロン抗体ＡＶＯＮＥＸ（登録商標）、ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（登録商標）及びＲＥＢＩＦ（登録商標)から選択される抗体と組み合わせてＴ細胞抗原を標的とする抗体を被験者に投与することを含む。さらなる実施形態では、併用療法は、多発性硬化症を有する被験者を治療するために、β−インターフェロンを標的とする抗体と組み合わせてＴ細胞抗原を標的とする抗体を被験者に投与することを含む。
【０１５４】
さらなる実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞が抗原提示細胞、特に抗原提示Ｂ細胞上のその特異的抗原と接触した場合に、Ｔ細胞の活性化を阻害又は防止する非分裂促進抗体又は分裂促進低減抗体とすることができる。本明細書で使用する「非分裂促進Ｔ細胞抗体」とは、初期活性化事象を誘発しないように抗体のＦｃ受容体を変化させ、Ｔ細胞が活性化した場合に見られるサイトカインの放出を確保することによって改変されている抗体を意味する。「分裂促進低減Ｔ細胞抗体」とは、初期活性化事象、及びＴ細胞の活性化時に生じるサイトカインの放出を減少させるＴ細胞抗原に特異的な抗体である。非分裂促進又は分裂促進低減抗体は、抗リンパ球抗体を患者に投与した場合に見られる初期の「初回投与副作用」を防止するために有用なことがある。非分裂促進又は分裂促進低減抗体は、エフェクター細胞による結合を防止又は阻害する変性Ｆｃフラグメントを有する改変抗体とすることができる。
【０１５５】
Ｃ．投与方法
一態様では、本発明の実施形態は、従来の療法で治療した被験者で達成された寛解よりも長期間の臨床的寛解を達成し、維持するように治療したヒト被験者を提供する。例えば、従来の療法で自己免疫疾患の症状の３カ月の寛解を達成した場合、本発明の組成物は、最大６カ月、最大１２カ月、及び場合によっては最大１年〜２年、又はそれ以上の症状の完全な寛解を提供することができる。特定の自己免疫疾患では、特に自己免疫疾患の診断直後に療法を開始する場合に、再発しない完全な寛解を提供することが可能なことがある。
【０１５６】
併用療法で達成される臨床的寛解は、完全な寛解のこともあり、疾患症状の大幅な軽減が長期間にわたって維持される部分寛解のこともある。例えば、本発明の療法を受けた被験者は、体液又は組織、例えば髄液（ＣＳＦ）、血清、尿又は体組織中で検出可能な自己抗体のレベルが低下したことから判断されるように、自己免疫応答が低下していることがある。併用療法を受ける被験者も、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）又は精製Ｔ細胞を使用した増殖又はサイトカイン産生アッセイによりインビトロで検出されたように、従来の療法で治療した被験者と比較した場合、自己抗原に対するＴ細胞応答が低下していることがある。
【０１５７】
本発明の組成物は、非経口、局所的、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内及び／又は病巣内投与などの任意の適切な手段で投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。更に、抗体はパルス注入、例えば抗体投与量を増加させる状態で適切に投与することができる。投与は、静脈内又は皮下で、更に好ましくは静脈注射で実行することが好ましい。各曝露は、同じ、又は異なる投与手段を使用して提供することができる。一実施形態では、各曝露は静脈内投与による。別の実施形態では、各曝露は皮下投与によって与えられる。更に別の実施形態では、曝露は静脈内及び皮下投与の両方で与えられる。
【０１５８】
一実施形態では、治療用抗体は、時間ベースで開始し、本発明の分子を約１５分〜４時間で送出することができる緩速静脈内注入として投与される。しかし、被験者が注入関連の反応を経験している場合、注入速度を例えば現在速度の半分などに低下させることが好ましい。治療被験者は、注入開始の約３０〜６０分前に、アセトアミノフェン／パラセタモール（例えば約１ｇ）及びジフェンヒドラミンＨＣｌ（例えば約５０ｍｇ又は同等用量の同様の薬剤）の予防的治療を経口で受けることができる。
【０１５９】
本発明の併用組成物（ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディを含む）によって提供される療法は、自己免疫疾患の療法で臨床応答を達成するために単回抗体療法として投与される場合に必要なこのような抗体の量より少ない初回用量の第１の抗体を使用して、被験者に投与することができる。単一の抗体を提供する療法で自己抗原を認識し、それに応答することができるＴ細胞の枯渇を達成するために必要な容量より少ない治療用抗Ｔ細胞抗体の用量は、所望の臨床応答を提供するのに十分なものとすることができる。臨床応答を達成するのに必要な治療用抗体の用量を決定する方法が当業者に知られている。例えば、被験者の臨床応答は、疾患の進行、臨床症状の軽減、ラボラトリマーカのレベル低下、再治療の必要性の低下までの時間として、又は自己免疫疾患の状態改善の有用な指標として認識されている任意の他の臨床手段によって測定することができる。
【０１６０】
併用療法の第２の抗体も、抗体を単独で投与した場合に臨床応答を達成する有効用量よりも少ない初回用量として、治療が必要な被験者に投与することができる。例えば、１００％未満のＢ細胞枯渇、５０％未満のＢ細胞枯渇、３０％未満の枯渇、更にはＢ細胞枯渇がない状態を達成する枯渇抗Ｂ細胞抗体の用量を第１の抗Ｔ細胞抗体と一緒に投与して、単独で投与した場合に被験者のＢ細胞を１００％枯渇させる量のＢ細胞枯渇抗体を投与することにより達成される臨床応答と同等、又はそれより良好な自己抗原に対する免疫応答抑制を提供する臨床応答を達成することができる。
【０１６１】
場合によっては、臨床応答は、単独で投与した場合に第１の抗体でも第２の抗体でも達成されない応答とすることができる。他の場合では、臨床応答は、併用療法では治療被験者の免疫系の免疫抑制が単一抗体療法よりも低い場合、単一抗体療法の投与で達成される応答と同等とすることができる。１つの好ましい実施形態では、併用療法によって提供される相乗応答が、免疫抑制レベルを低下させながら、自己抗原に対する被験者の応答を低下させるか消失させる。全身免疫抑制は、以前から使用可能である抗体療法にとって重大な問題である。
【０１６２】
Ｄ．薬学的製剤
本発明の実施形態で使用する抗体の薬学的製剤は、所望の純度を有する本発明の組成物を、薬学分野で認識されている任意選択の薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤を凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で混合することによって保存、輸送及び投与用に調製される。
【０１６３】
「薬学的に許容可能」という用語は、動物で、及び特にヒトで使用するために、連邦又は州政府の規制当局によって認可されるか、又は米国薬局方又は他の一般的に認識されている薬局方に記載されることを意味する。「担体」という用語は、治療を施す手段である希釈剤、アジュバント（例えばフロイントのアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤、又はビヒクルを指す。このような薬剤担体は、水及び油などの無菌液体とすることができ、それには石油、動物、植物又は合成起源の液体、例えばピーナツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油などが含まれる。薬剤組成物を静脈内投与する場合は、水が好ましい担体である。食塩水及びデキストロース及びグリセロール水溶液も、液体担体として、特に注入可能な溶液に使用することができる。適切な薬剤賦形剤には、澱粉、ブドウ糖、乳糖、蔗糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、滑石、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物は、所望に応じて微量の湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、徐放性製剤などの形態を取ることができる。
【０１６４】
本発明の組成物は、薬剤組成物（例えば不純又は非無菌組成物）の製造に有用な原薬組成物、及び単位用量形態の調製に使用することができる医薬組成物（すなわち被験者又は患者に投与するのに適切な組成物）を含む。このような組成物は、予防的又は治療的に有効量の本明細書で開示した予防及び／又は治療薬剤、又はそれらの薬剤と薬学的に許容可能な担体との組み合わせを含む。本発明の組成物は、予防的又は治療的に有効量の本発明のヒト化抗体及び薬学的に許容可能な担体を含むことが好ましい。
【０１６５】
通常、本発明の組成の成分は、別個に供給するか、又は活性薬剤の量を示すアンプル又はサッシェなどの気密容器内で、例えば凍結乾燥粉末又は水のない濃縮物として、単位用量の形態で一緒に混合する。組成物を注入によって投与すべき場合、医薬品等級の無菌の水又は食塩水を含有する注入瓶で分配することができる。組成物を注射で投与する場合、投与前に成分を混合できるように、注射用無菌水又は食塩水のアンプルを提供することができる。注射に適切な医薬組成物には、無菌水溶液が含まれ、活性薬剤は水溶性であるか、又は注射可能な無菌溶液を即時調製するための分散又は無菌粉末である。併用療法に使用する組成物は、必要量の活性拮抗剤又は抗体を適切な担体、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール）及びその適切な混合物とともに組み込むことによって調製することができる。糖類、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール又は塩化ナトリウムなどの等張薬剤を組成物に含めることができる。
【０１６６】
本発明の組成物は、中性又は塩の形態として処方することができる。薬学的に許容可能な塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるようなアニオンで形成される塩、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるようなカチオンで形成される塩が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６７】
Ｅ．キット
本発明は、本発明のヒト化抗体を充填した１つ又は複数の容器を含む薬品パック又はキットを提供する。更に、疾患の治療に有用な１つ又は複数の他の予防薬又は治療薬も薬品パック又はキットに含めることができる。本発明は、本発明の医薬組成物の１つ又は複数の成分を充填した１つ又は複数の容器を含む薬品パック又はキットも提供する。任意選択で、このような容器には、製造、薬品又は生物学的製品の使用又は販売を規制する政府当局によって規定された形態の通知書を添付することができ、この通知書は、ヒトに投与するための製造、使用又は販売の当局による認可を反映する。
【０１６８】
本発明は、以上の方法で使用することができるキットを提供する。一実施形態では、キットは本発明の１つ又は複数のヒト化抗体を含む。別の実施形態では、キットは癌の治療に有用な１つ又は複数の他の予防薬又は治療薬を１つ又は複数の容器内で更に含む。別の実施形態では、キットは、癌に関連する１つ又は複数の癌抗原と結合する１つ又は複数の細胞毒性抗体を更に含む。特定の実施形態では、他の予防薬又は治療薬は化学療法薬である。他の実施形態では、予防薬又は治療薬は生物又はホルモン療法薬である。
【０１６９】
一実施形態では、本発明は、自己免疫疾患を治療する併用療法に使用される抗体を含有する製造品を提供する。製造品は、Ｔ細胞上に存在する抗原に結合する第１の抗体、薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤を容器内に有する容器を含む。製造品は、Ｂ細胞表面マーカに配向される第２の抗体、及び薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤を有する第２の容器、及び自己免疫疾患の治療を必要とする被験者に組成物を投与するための指示書を更に含む。第１の抗体と第２の抗体が相補的であり、相互に悪影響を与えないと判断された場合、第１及び第２の抗体は、包装インサート及び投与指示書とともに、投与に適切な濃度の第１及び第２の抗体を含有する単一の容器に入れて提供することができる。
【０１７０】
製造品の容器は、製剤に反応しないか、又はそれに影響しない任意の適切な材料であってよい。製造品は、注射用静菌水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液など、薬学的に許容可能な希釈緩衝剤を有する第２又は第３の容器を更に含むことができる。製造品は、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針及びシリンジなど、商業的及び使用者の立場から望ましいような他の材料も含むことができる。
【０１７１】
ＶＩＩ．本発明の抗ＣＤ３抗体を使用する診断法
本明細書で開示した方法によって作成されるＣＤ３に対する抗体は、細胞表面から放出された後に血液中で循環する癌細胞の有無、又はそのレベルの識別にも使用することができる（例えば可溶性ＣＤ３）。このように循環する抗原は、本明細書で教示する方法により検出される能力を保持する無傷のＣＤ３抗原、又はそのフラグメントであってもよい。このような検出は、例えば当技術分野で一般的に使用される標準的な方法を使用するＦＡＣＳ分析によって実行することができる。
【０１７２】
本発明の診断法の好ましい実施形態では、抗体は検出可能な標識を有する。使用することができる標識の例には放射性物質（例えば、スカンジウム４７、テクネチウム９９ｍ、インジウム１１１、ヨウ素１３１、レニウム１８６、スカンジウム４７、イットリウム９００）、フィコエリトリン又はフルオレセインイソチオシアネート（フルオロイソチオシアネート又はＦＩＴＣとしても知られる）などの酵素又は蛍光体が含まれる。
【０１７３】
診断に抗体を使用する１つの方法は、抗体を放射性又は放射線不透過性物質と結合させ、抗体を個体に投与し、Ｘ腺又は他の撮像機を使用して、抗原を発現する癌細胞の表面にて標識付けした抗体の局在を視覚化することによるインビボ腫瘍撮像である。抗体は、生理状態における結合を促進する濃度で投与される。
【０１７４】
ＣＤ３を検出するインビトロ技術は、当技術分野で日常的なものであり、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降法、免疫蛍光法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、及びウェスタンブロット分析が含まれる。
【０１７５】
本発明はまた、ＣＤ３に結合する任意の抗体を使用してＣＤ３を発現する癌細胞を特徴とする癌の診断を補助する方法、及びＣＤ３の発現レベルを判断するために使用できる任意の他の方法も提供する。本明細書で使用する「診断を補助する」方法は、これらの方法が癌の分類又は性質に関する臨床判断を下す際に補助することを意味し、確定診断に対して決定的である場合とない場合がある。したがって、癌の診断を補助する方法は、個体からの生体試料のＣＤ３レベルを検出し、及び／又は試料のＣＤ３発現レベルを判断するステップを含むことができる。抗原又はその一部を認識する抗体は、血液、唾液、尿、肺液又は腹水を含むが、これらに限定されない体液中の生きているか、又は瀕死の癌細胞から放出又は分泌された抗原を検出する診断免疫アッセイの生成にも使用することができる。本明細書で開示した方法で作成した抗ＣＤ３抗体は、がんと診断された個体を、ＣＤ３に対して配向された抗体を使用する免疫療法の候補者と見なすことができるかの判断に使用することができる。一実施形態では、ＣＤ３に配向された抗体を使用して、生検試料がＣＤ３を発現しているか検査することができる。ＣＤ３を発現した癌細胞を有する個体が、ＣＤ３に対して配向された抗体を使用する免疫療法の適切な候補者である。抗ＣＤ３抗体での染色も、正常組織から癌組織を識別するために使用することができる。
【０１７６】
診断目的に抗ＣＤ３抗体を使用する方法は、化学療法又は放射線療法などの任意の形態の抗癌治療の前後両方で、所与の治療に対して応答する可能性が最も高い腫瘍、癌を有する個体の予後、転移疾患の腫瘍サブタイプ又は起源、及び疾患の進行又は治療に対する応答を判断するために有用である。
【０１７７】
本発明の組成物は、他の疾患の（非癌）細胞の用途に以上で概略した方法を使用し、癌以外の疾患状態を診断するのに特に適している。本発明の方法で使用するのに適切な疾患状態には、個体の炎症又は自己免疫応答に関係ある疾患又は障害が含まれるが、これらに限定されない。上記方法は、個体の炎症又は自己免疫応答の調節に使用することができる。本発明の組成物及び方法を使用する診断及び／又は治療を受けることができる炎症及び自己免疫疾患の結果である疾患及び状態には、例示として、限定としてではなく、多発性硬化症、髄膜炎、脳炎、脳卒中、他の脳外傷、潰瘍性大腸炎及びクローン病などの炎症性腸疾患、重症筋無力症、狼瘡、慢性関節リウマチ、喘息、急性若年発症糖尿病、ＡＩＤＳ痴呆症、アテローム性動脈硬化症、腎炎、網膜炎、アトピー性皮膚炎、乾癬、心筋虚血及
び急性白血病性肺障害が含まれる。
【０１７８】
本発明の抗体及び他の治療薬を診断及び／又は治療に使用するための更に他の指標には、器官又は移植片拒絶の危険がある個体に投与することが含まれる。近年、皮膚、腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓及び骨髄などの組織及び器官を移植する外科技術の効率が大幅に改善されてきた。おそらく、一番の顕著な問題は、同種移植片又は移植器官の被移植者に免疫寛容を引き誘発するために満足できる物質がないことである。同種異系細胞又は器官を宿主に移植する（すなわち、提供者と被提供者とが同じ種の異なる個体である）場合、宿主の免疫系は、移植片中の異物抗原に対する免疫応答が高まり（宿主対移植片疾患）、移植組織の破壊につながる可能性が高い。
【０１７９】
本明細書で開示した方法により作成したＣＤ３に対するモノクローナル抗体を使用して、様々な組織中でヒト癌幹細胞の有無を識別することができる。癌幹細胞（ＣＳＣ）は、腫瘍の増殖及び転移に役割を果たすとの仮説が立てられている（Ghotra,V.P.他（２００９）の「The Cancer Stem Cell Microenvironment And Anti-Cancer Therapy」（Int. J.Radiat. Biol. 85(11):955-962）、Gupta, P.B.他（２００９）の「Cancer Stem Cells: Mirage Or Reality?」（Nat. Med. 15(9):1010-1012）、Lawson, J.C.他（２００９）の「Cancer Stem Cells In Breast Cancer And Metastasis」（Breast Cancer Res. Treat. 118(2):241-254）、Hermann, P.C.他（２００９）の「Pancreatic Cancer Stem Cells-Insights And Perspectives」（Expert Opin. Biol. Ther. 9(10):1271-1278）、Schatton, T.他（２００９）の「Identification And Targeting Of Cancer Stem Cells」（Bioessays 31(10):1038-1049）、Mittal, S.他（２００９）の「Cancer Stem Cells: The Other Face Of Janus」（Amer. J. Med. Sci. 338(2):107-112）、Alison, M.R.他（２００９）の「Stem Cells And Lung Cancer: Future Theraputic Targets?」（Expert Opin. Biol. Ther. 9(9):1127-1141）、Charafe-Jauffret, E.他（２００９）の「Breast Cancer Stem Cells: Tools And Models To Rely On」（BMC Cancer 9:202）、Scopelliti, A.他（２００９）の「Therapeutic Implications of Cancer Initiating Cells」（Expert Opin. Biol. Ther. 9(8):1005-1016）、ＰＣＴ特許公開ＷＯ２００８／０９１９０８号）。この仮説では、ＣＳＣは、無限に自己複製し、複製能力が比較的制限された、より成熟した腫瘍細胞内に増殖することができる小さい細胞の別個のサブセットを各腫瘍内に提供する。これらの癌幹細胞は、化学療法薬、放射又は他の毒性状態に対する抵抗性が向上し、したがって臨床治療後も生き残り続け、その後に続発性腫瘍内に増殖するか、転移するか、又は再発の原因になるかもしれないとの仮説が立てられている。ＣＳＣは、「正常」組織の幹細胞から、又は更に分化した組織前駆細胞から生じ得ると示唆されている。
【０１８０】
抗ＣＤ３抗体への使用を列挙した本出願で説明された使用は、癌幹細胞の識別及び治療に使用するために本明細書で説明されているように、他のＣＤ３作動物質、拮抗物質及び修飾物質の使用も包含する。このような実施形態では、抗ＣＤ３抗体及び他のＣＤ３作動物質、拮抗物質及び修飾物質が、説明された同様の方法を使用した癌幹細胞の識別、診断又は治療に使用され、癌幹細胞の識別／診断又は治療に方法を適応させるために、当業者の範囲内で変更を行う。
【０１８１】
ここまで本発明を概略してきたが、これは、例示として提供され、明記されていない限り、本発明を限定するものではない以下の実施例により、更に容易に理解される。
【０１８２】
実施例１
ヒト及びカニクイザル両方のＣＤ３へのｍＡｂ１結合
ｍＡｂ１がヒトＣＤ３に結合する能力を判定するために、捕捉ＥＬＩＳＡを実施した。プレートを１μｇ／ｍＬの可溶性カニクイザルＣＤ３（「ｓＣＤ３」）でコーティングし、様々な濃度のｍＡｂ１抗体のキメラ変異体（ｃｈ−ｍＡｂ１）（ｍＡｂ１の様々な配列及びヒト抗体の定常領域を含有する）と、ヒト化変異体（ｈ−ｍＡｂ１）と、キメラｍＡｂ１抗体の軽鎖及びｍＡｂ１のヒト化変異体の重鎖で構成された抗体とが存在する状態でインキュベートした。その実験結果を図１Ａに示す。実験は、ｍＡｂ１が哺乳類の非ヒト種のＣＤ３に結合する能力を示す。更に、キメラｍＡｂ１抗体の結合を、ヒト化変異体ｍＡｂ１  ＬＣ−２及びｍＡｂ１の重鎖で構成された抗体の結合と比較した。その実験結果を図１Ｂに示す。実験は、ｍＡｂ１がヒトＣＤ３に結合する能力を示す。したがって、図１Ａ及び図１Ｂにより、ヒト化ｍＡｂ１がヒトＣＤ３と非ヒト哺乳類のＣＤ３との両方に結合できたことが明らかになる。ヒト化ｍＡｂは、ｓＣＤ３及びキメラｍＡｂ１のそれと同様のｈＣＤ３に対する結合を示した。
【０１８３】
実施例２
ｍＡｂ１のヒト化
ｍＡｂ１のヒト化誘導体を調製した。このヒト化誘導体のアミノ酸配列及びコード化ポリヌクレオチド配列を以下に示す。ＣＤＲを太字体及び下線で示す。
【０１８４】
ヒト化ｍＡｂ１可変軽鎖変異体１のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１０）：
【化１０】
2019142866.tif 000013
【０１８５】
ポリヌクレオチド配列コード化ヒト化ｍＡｂ１可変軽鎖変異体１（配列ＩＤ番号：１１）
【化１１】
2019142866.tif 000014
【０１８６】
ヒト化ｍＡｂ１可変軽鎖変異体２（ｍＡｂ１  ＬＣ−２）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１２）
【化１２】
2019142866.tif 000015
【０１８７】
ポリヌクレオチド配列コード化ヒト化ｍＡｂ１可変軽鎖変異体２（配列ＩＤ番号：１３）
【化１３】
2019142866.tif 000016
【０１８８】
ヒト化ｍＡｂ１可変重鎖のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１４）
【化１４】
2019142866.tif 000017
【０１８９】
ポリヌクレオチド配列コード化ヒト化ｍＡｂ１可変重鎖（配列ＩＤ番号：１５）
【化１５】
2019142866.tif 000018
【０１９０】
実施例３
ｍＡｂ２のヒト化
ｍＡｂ２のヒト化誘導体を調製した。これらのヒト化誘導体のアミノ酸配列及びコード化ポリヌクレオチド配列を以下に示す。ＣＤＲを太字体及び下線で示す。
【０１９１】
ヒト化ｍＡｂ２可変軽鎖変異体１（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−１）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１６）
【化１６】
2019142866.tif 000019
【０１９２】
ポリヌクレオチド配列コード化ヒト化ｍＡｂ２可変軽鎖辺板１（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−１）（配列ＩＤ番号：１７）
【化１７】
2019142866.tif 000020
【０１９３】
ヒト化ｍＡｂ２可変軽鎖辺板２（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−２）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１８）
【化１８】
2019142866.tif 000021
【０１９４】
ポリヌクレオチド配列コード化ヒト化ｍＡｂ２可変軽鎖変異体２（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−２）（配列ＩＤ番号：１９）
【化１９】
2019142866.tif 000022
【０１９５】
ヒト化ｍＡｂ２可変軽鎖変異体３（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−３）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２０）
【化２０】
2019142866.tif 000023
【０１９６】
ポリヌクレオチド配列コード化ヒト化ｍＡｂ２可変軽鎖変異体３（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−３）（配列ＩＤ番号：２１）
【化２１】
2019142866.tif 000024
【０１９７】
ヒト化ｍＡｂ２可変軽鎖変異体４（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−４）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２２）
【化２２】
2019142866.tif 000025
【０１９８】
ポリヌクレオチド配列コード化ヒト化ｍＡｂ２可変軽鎖変異体４（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−４）（配列ＩＤ番号：２３）
【化２３】
2019142866.tif 000026
【０１９９】
ヒト化ｍＡｂ２可変軽鎖変異体５（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−５）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２４）
【化２４】
2019142866.tif 000027
【０２００】
ポリヌクレオチド配列コード化ヒト化ｍＡｂ２可変軽鎖変異体５（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−５）（配列ＩＤ番号：２５）
【化２５】
2019142866.tif 000028
【０２０１】
ヒト化ｍＡｂ２可変軽鎖変異体６（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−６）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２６）
【化２６】
2019142866.tif 000029
【０２０２】
ポリヌクレオチド配列コード化ヒト化ｍＡｂ２可変軽鎖変異体６（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ６）（配列ＩＤ番号：２７）
【化２７】
2019142866.tif 000030
【０２０３】
ヒト化ｍＡｂ２可変軽鎖変異体７（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−７）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２８）
【化２８】
2019142866.tif 000031
【０２０４】
ポリヌクレオチド配列コード化ヒト化ｍＡｂ２可変軽鎖変異体７（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−７）（配列ＩＤ番号：２９）
【化２９】
2019142866.tif 000032
【０２０５】
ヒト化ｍＡｂ２可変軽鎖変異体８（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−８）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３０）
【化３０】
2019142866.tif 000033
【０２０６】
ポリヌクレオチド配列コード化ヒト化ｍＡｂ２可変軽鎖変異体８（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−８）（配列ＩＤ番号：３１）
【化３１】
2019142866.tif 000034
【０２０７】
ヒト化ｍＡｂ２可変軽鎖変異体９（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−９）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３２
【化３２】
2019142866.tif 000035
【０２０８】
ポリヌクレオチド配列コード化ヒト化ｍＡｂ２可変軽鎖変異体９（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−９）（配列ＩＤ番号：３３）
【化３３】
2019142866.tif 000036
【０２０９】
ヒト化ｍＡｂ２可変軽鎖変異体１０（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−１０）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３４）
【化３４】
2019142866.tif 000037
【０２１０】
ポリヌクレオチド配列コード化ヒト化ｍＡｂ２可変軽鎖変異体１０（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−１０）（配列ＩＤ番号：３５）
【化３５】
2019142866.tif 000038
【０２１１】
ヒト化ｍＡｂ２重鎖変異体１（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＨ−１）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３６）
【化３６】
2019142866.tif 000039
【０２１２】
ポリヌクレオチド配列コード化ヒト化ｍＡｂ２可変重鎖変異体１（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＨ−１）（配列ＩＤ番号：３７）
【化３７】
2019142866.tif 000040
【０２１３】
ヒト化ｍＡｂ２重鎖変異体２（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＨ−２）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：３８）
【化３８】
2019142866.tif 000041
【０２１４】
ポリヌクレオチド配列コード化ヒト化ｍＡｂ２可変重鎖変異体２（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＨ−２）（配列ＩＤ番号：３９）
【化３９】
2019142866.tif 000042
【０２１５】
ヒト化ｍＡｂ２重鎖変異体３（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＨ−３）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：４０）
【化４０】
2019142866.tif 000043
【０２１６】
ポリヌクレオチド配列コード化ヒト化ｍＡｂ２可変重鎖変異体３（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＨ−３）（配列ＩＤ番号：４１）
【化４１】
2019142866.tif 000044
【０２１７】
ヒト化ｍＡｂ２重鎖変異体４（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＨ−４）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：４２）
【化４２】
2019142866.tif 000045
【０２１８】
ポリヌクレオチド配列コード化ヒト化ｍＡｂ２可変重鎖変異体４（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＨ−４）（配列ＩＤ番号：４３）
【化４３】
2019142866.tif 000046
【０２１９】
ヒト化ｍＡｂ２重鎖変異体５（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＨ−５）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：４４）
【化４４】
2019142866.tif 000047
【０２２０】
ポリヌクレオチド配列コード化ヒト化ｍＡｂ２可変重鎖変異体５（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＨ−５）（配列ＩＤ番号：４５）
【化４５】
2019142866.tif 000048
【０２２１】
ヒト化ｍＡｂ２重鎖変異体６（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＨ−６）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：４６）
【化４６】
2019142866.tif 000049
【０２２２】
ポリヌクレオチド配列コード化ヒト化ｍＡｂ２可変重鎖変異体６（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＨ−６）（配列ＩＤ番号：４７）
【化４７】
2019142866.tif 000050
【０２２３】
ヒト化ｍＡｂ２重鎖変異体７（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＨ−７）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：４８）
【化４８】
2019142866.tif 000051
【０２２４】
ポリヌクレオチド配列コード化ヒト化ｍＡｂ２可変重鎖変異体７（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＨ−７）（配列ＩＤ番号：４９）
【化４９】
2019142866.tif 000052
【０２２５】
ヒト化ｍＡｂ２重鎖変異体８（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＨ−８）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：５０）
【化５０】
2019142866.tif 000053
【０２２６】
ポリヌクレオチド配列コード化ヒト化ｍＡｂ２可変重鎖変異体８（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＨ−８）（配列ＩＤ番号：５１）
【化５１】
2019142866.tif 000054
【０２２７】
ヒト化ｍＡｂ２重鎖変異体ＱＶ（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−ＱＶ）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：５２）
【化５２】
2019142866.tif 000055
【０２２８】
ポリヌクレオチド配列コード化ヒト化ｍＡｂ２可変重鎖変異体ＱＶ（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−ＱＶ）（配列ＩＤ番号：５３）
【化５３】
2019142866.tif 000056
【０２２９】
実施例４
ヒト及びカニクイザル両方のＣＤ３へのｍＡｂ２結合
以上で説明したように、ｍＡｂ２抗体は元々、ヒトＣＤ３への結合能力に基づいて分離されていた。ｍＡｂ２が非ヒトＣＤ３に結合する能力を判定するために、捕捉ＥＬＩＳＡを実施した。プレートを１μｇ／ｍＬのＣＤ３（ヒト又はカニクイザル）でコーティングし、様々な濃度のｍＡｂ２抗体のキメラ変異体（ｃｈ−ｍＡｂ２）（ｍＡｂ２の可変配列及びヒト抗体の定常領域を含有する）が存在する状態でインキュベートした。対照標準として、ヒト化ｍＡｂ２抗体の軽鎖及びキメラ抗体の重鎖で構成された抗体でもプレートをインキュベートした。この実験結果を図２Ａ及び図２Ｂに示し、それは、キメラｍＡｂ２変異体がヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に同等の結合を示したことを明らかにする。
【０２３０】
実施例５
ｈ−ｍＡｂ２軽鎖及び重鎖の変異体の結合特徴の分析
ｍＡｂ２の軽鎖のフレームワーク残基が変化する影響を判定するために、分析を実施した。表２は、検査した置換を示す。
【表２】
2019142866.tif 000057
【０２３１】
配列ＩＤ番号：１１のｍＡｂ２軽鎖を有するが、（Ｋａｂａｔ番号で）Ｄ４１Ｇ、Ｈ４２Ｑ、Ｌ４３Ａ、Ｆ４４Ｐ、Ｔ４５Ｒ、又はＧ４６Ｔの置換及びキメラｍＡｂ２の重鎖を含有する抗体（ｈＦＲ１−ｍＦＲ２−ｈＦＲ３−４を有するｍＡｂ２のＣＤＲ）を形成し、捕捉ＥＬＩＳＡを使用してその結合を判定した。プレートを１μｇ／ｍＬのヒトＣＤ３（可溶性ｈＣＤ３又は「ｓｈＣＤ３」）の細胞外ドメインでコーティングし、様々な濃度の抗体が存在する状態でインキュベートした。結果（図３）は、Ｋａｂａｔ位置４６でＴを置換すると、抗体がｓｈＣＤ３に結合する能力が消滅したことを示す。
【０２３２】
Ｋａｂａｔ軽鎖位置３６、３８、４４及び４６における変化の影響を判定するために、追加の調査を実施した。ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−８、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−９又はｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−１０軽鎖及びｍＡｂ２キメラ抗体の重鎖を有する抗体を形成し、上記捕捉ＥＬＩＳＡを使用して評価した。この実験結果を図４に示し、それは、ｈＶＬ−８軽鎖を有する抗体によるｓｈＣＤ３への結合が、キメラｍＡｂ２軽鎖を有する抗体のそれと同様であったことを明らかにする。
【０２３３】
ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−６、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−７又はｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−８軽鎖及びｍＡｂ２キメラ抗体の重鎖を有する抗体も形成し、上記捕捉ＥＬＩＳＡを使用して評価し（ただしプレートをリン酸緩衝食塩水に０．５μｇ／ｍＬのｓｈＣＤ３でコーティングした）、位置３６、３８及び４６における追加的置換の影響を判定した。この実験結果を図５に示し、それは、キメラｍＡｂ２軽鎖を有する抗体と同様のｓｈＣＤ３に対する結合力を有する抗体を生成するのに、Ｋａｂａｔ置換Ｆ３６Ｖ及びＴ４６Ｇが十分であったことを明らかにする。
【０２３４】
キメラｍＡｂ２抗体の軽鎖及び重鎖ｈ−ｍＡｂ２  ＶＨ−５、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＨ−６又はｈ−ｍＡｂ２  ＶＨ−７を有する抗体を形成し、上記捕捉ＥＬＩＳＡを使用して（１μｇ／ｍＬのｓｈＣＤ３のコーティングを使用する）結合を評価することにより、ｍＡｂ２の重鎖の配列における置換の影響を判定した。これらの調査結果を図６に示す。キメラｍＡｂ２抗体の軽鎖及び重鎖ｈ−ｍＡｂ２  ＶＨ−４、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＨ−７又はｈ−ｍＡｂ２  ＶＨ−９のヒト化変異体を有する抗体を、追加的に形成した。上記捕捉ＥＬＩＳＡを使用して、このような抗体の結合を評価した。これらの調査結果を図７に示す。
【０２３５】
重鎖ｈＶＨ−６Ｌ（及びその変異体ｈＶＨ−６Ｍ）及びｈＶＨ−８Ｌ（及びその変異体ＶＨ−８Ｍ）は、表２のｈＶＨ−１、ｈＶＨ−２、ｈＶＨ−３、ｈＶＨ−４、ｈＶＨ−５、ｈＶＨ−６、ｈＶＨ−７又はｈＶＨ−８で構成された抗体よりもＣＤ３に対する親和性が低い抗体を生成するのに特に好ましい。このように親和性が低下した抗体は、軽鎖ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−１、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−２、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−３、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−４、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−５、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−６、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−７、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−８、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−９、又はｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−１０のいずれかと組み合わせた重鎖ｈＶＨ−６Ｌ又は重鎖ＶＨ−８Ｌで構成することが好ましい。特に好ましい脱免疫化抗体は、重鎖ｈＶＨ−６Ｌ（又はその変異体ｈＶＨ−６Ｍ）及び軽鎖ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−６、又は重鎖ｈＶＨ−８Ｌ（又はその変異体ｈＶＨ−８Ｍ）及び軽鎖ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−６で構成される。このようなポリペプチドの配列を以下に提示する。
【０２３６】
ｈＶＨ−６Ｌのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：５４）
【化５４】
2019142866.tif 000058
【０２３７】
ｈＶＨ−８Ｌのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：５５）
【化５５】
2019142866.tif 000059
【０２３８】
重鎖ｈＶＨ−６Ｌ及びｈＶＨ−８Ｌを更に修飾して、位置５２ａの修飾でアスパラギンを保持する変異体（Ｓ５２ａＮ）を産生した。これらの修飾重鎖のアミノ酸配列及び対応するポリヌクレオチドコート化配列は以下の通りである。
【０２３９】
ｈＶＨ−６Ｍのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：７２）
【化５６】
2019142866.tif 000060
【０２４０】
ポリヌクレオチド配列コード化ｈＶＨ−６Ｍ可変重鎖（配列ＩＤ番号：７３）
【化５７】
2019142866.tif 000061
【０２４１】
ｈＶＨ−８Ｍのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：７４）
【化５８】
2019142866.tif 000062
【０２４２】
ポリヌクレオチド配列コード化ｈＶＨ−８Ｍ可変重鎖（配列ＩＤ番号：７５）
【化５９】
2019142866.tif 000063
【０２４３】
重鎖ｈＶＨ−８  ｄｉ−１及びｈＶＨ−８  ｄｉ−２は、表２のｈＶＨ−１、ｈＶＨ−２、ｈＶＨ−３、ｈＶＨ−４、ｈＶＨ−５、ｈＶＨ−６、ｈＶＨ７又はｈＶＨ−８で構成された抗体より免疫原生が低い抗体を生成するために特に好ましい。このような脱免疫化抗体は、軽鎖ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−１、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−２、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−３、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−４、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−５、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−６、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−７、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−８、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−９、又はｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−１０のいずれかと組み合わせた重鎖ｈＶＨ−８ｄｉ−１又は重鎖ｈＶＨ−８  ｄｉ−２で構成することが好ましい。特に好ましい脱免疫化抗体は、重鎖ｈＶＨ−８  ｄｉ−２及び軽鎖ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−６、又は重鎖ｈＶＨ−８  ｄｉ−２及び軽鎖ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−６で構成される。
【０２４４】
ｈＸＲ３２ＶＨ−８  ｄｉ−１のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：５６）
【化６０】
2019142866.tif 000064
【０２４５】
ｈＸＲ３２ＶＨ−８  ｄｉ−２のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：５７）
【化６１】
2019142866.tif 000065
【０２４６】
このような脱免疫化抗体は、軽鎖ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−１、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−２、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−３、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−４、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−５、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−６、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−７、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−８、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−９、又はｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−１０のいずれかと組み合わせた重鎖ｈＶＨ−８Ｌ  ｄｉ−１又は重鎖ＶＨ−８Ｌ  ｄｉ−２で構成することが好ましい。特に好ましい脱免疫化抗体は、重鎖ｈＶＨ−９Ｍ  ｄｉ−１及び軽鎖ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−６、又は重鎖ｈＶＨ−８Ｌ  ｄｉ−２及び軽鎖ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−６で構成する。
【０２４７】
ｍＡｂ２マウスモノクローナル抗体可変重鎖（配列ＩＤ番号：７）の追加のヒト化変異体も産生した。このような変異体のアミノ酸配列を以下で提示し、配列ＩＤ番号：７からの変更を太字体及び下線で示す。
【０２４８】
ヒト化ｍＡｂ２マウスモノクローナル抗体可変重鎖の変異体「ａ」（１５１Ｔ  Ｙ５２ｃＡ）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：７６）
【化６２】
2019142866.tif 000066
【０２４９】
ヒト化ｍＡｂ２マウスモノクローナル抗体可変重鎖の変異体「ｂ」（１５１Ｔ  Ｎ５４Ｓ）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：７７）
【化６３】
2019142866.tif 000067
【０２５０】
ヒト化ｍＡｂ２マウスモノクローナル抗体可変重鎖の変異体「ｃ」（１５１Ｔ  Ａ５６Ｔ）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：７８）
【化６４】
2019142866.tif 000068
【０２５１】
ヒト化ｍＡｂ２マウスモノクローナル抗体可変重鎖の変異体「ｄ」（１５１Ｔ  Ｙ５２ｃＡ  Ｎ５４Ｓ）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：７９）
【化６５】
2019142866.tif 000069
【０２５２】
ヒト化ｍＡｂ２マウスモノクローナル抗体可変重鎖の変異体「ｅ」（１５１Ｔ  Ｎ５４Ｓ  Ａ５６Ｔ）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：８０）
【化６６】
2019142866.tif 000070
【０２５３】
ヒト化ｍＡｂ２マウスモノクローナル抗体可変重鎖の変異体「ｆ」（１５１Ｔ  Ｙ５２ｃＡ  Ｎ５４Ｓ  Ａ５６Ｔ）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：８１）
【化６７】
2019142866.tif 000071
【０２５４】
ヒト化ｍＡｂ２マウスモノクローナル抗体可変重鎖の変異体「ｇ」（１５１Ｔ  Ｄ６１Ａ）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：８２）
【化６８】
2019142866.tif 000072
【０２５５】
ヒト化ｍＡｂ２マウスモノクローナル抗体可変重鎖の変異体「ｈ」（１５１Ｔ  Ｄ６５Ｇ）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：８３）
【化６９】
2019142866.tif 000073
【０２５６】
ヒト化ｍＡｂ２マウスモノクローナル抗体可変重鎖の変異体「ｉ」（１５１Ｔ  Ｙ５２ｃＡ  Ｎ５４Ｓ  Ｄ６１Ａ）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：８４）
【化７０】
2019142866.tif 000074
【０２５７】
ヒト化ｍＡｂ２マウスモノクローナル抗体可変重鎖の変異体「ｊ」（１５１Ｔ  Ｙ５２ｃＡ  Ｎ５４Ｓ  Ｄ６５Ｇ）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：８５）
【化７１】
2019142866.tif 000075
【０２５８】
ヒト化ｍＡｂ２マウスモノクローナル抗体可変重鎖の変異体「ｋ」（１５１Ｔ  Ｙ５２ｃＡ  Ｎ５４Ｓ  Ｄ６１Ａ  Ｄ６５Ｇ）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：８６）
【化７２】
2019142866.tif 000076
【０２５９】
ヒト化ｍＡｂ２マウスモノクローナル抗体可変重鎖の変異体「２ｋ」（１５１Ｔ  Ｙ５２ｃＡ  Ｎ５４Ｓ  Ｄ６１Ａ  Ｄ６５Ｇ（ＶＨ８−Ａ４９Ｇ  Ｖ９３Ａ））のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：８７）
【化７３】
2019142866.tif 000077
【０２６０】
ヒト化ｍＡｂ２マウスモノクローナル抗体可変重鎖の変異体「５ｋ」（１５１Ｔ  Ｙ５２ｃＡ  Ｎ５４Ｓ  Ｄ６１Ａ  Ｄ６５Ｇ（ＶＨ８−Ｖ９３Ａ））のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：８８）
【化７４】
2019142866.tif 000078
【０２６１】
本発明の脱免疫化抗体を形成するために、ｍＡｂ２マウスモノクローナル抗体可変重鎖のこのような追加のヒト化変異体をすべて使用することができる。このような追加の脱免疫化及びヒト化抗体は、軽鎖ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−１、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−２、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−３、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−４、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−５、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−６、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−７、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−８、ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−９、又はｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−１０のいずれかと組み合わせた重鎖ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、２ｋ又は５ｋのいずれかで構成することが好ましい。特に好ましい脱免疫化抗体は、重鎖２ｋ又は５ｋ及び軽鎖ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−６、又は重鎖ｈｖＨ−８Ｍ８Ｌ  ｄｉ−２及び軽鎖ｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−６で構成する。変異体２ｋ及び５ｋは可変領域でタンパク質Ａと結合して、したがって（ダイアボディなどの）分子の精製を促進し、この分子は、Ｆｃ領域又はこのような分子を他の分子から分離するために使用することができる他のドメインがないことがある。変異体ｈＶＨ−８Ｍ、ｈＶＨ−８Ｌ、ｈＶＨ−６Ｍ及びｈＶＨ−６Ｌが提示する免疫原生は、その個々の親ポリペプチドに対して低下している。
【０２６２】
本発明は特に、重鎖ｈＶＨ−８及び軽鎖ＶＬ−６で構成された脱免疫化及びヒト化抗体に関する。本発明は追加的に、重鎖ｈＶＨ−４及び軽鎖ＶＬ−６で構成された脱免疫化及びヒト化抗体に特に関する。本発明は追加的に、重鎖ｈＶＨ−２ｋ及び軽鎖ＶＬ−６で構成された脱免疫化及びヒト化抗体に特に関する。
【０２６３】
実施例６
キメラ及びヒト化ｍＡｂ２軽鎖及び重鎖の変異体の結合特徴の分析
キメラ及びヒト化ｍＡｂ２が非ヒトＣＤ３に結合する能力を判定するために、捕捉ＥＬＩＳＡを実施した。プレートを１μｇ／ｍＬのＣＤ３の細胞外ドメイン（可溶性ＣＤ３）（ヒト又はカニクイザル）でコーティングし、様々な濃度の抗体が存在する状態でインキュベートした。この実験結果を図８Ａ及び図８Ｂに示し、これはｍＡｂ２及びそのヒト化変異体が、可溶性ヒトＣＤ３及び可溶性カニクイザルＣＤ３に同等の結合を示したことを明らかにする。
【０２６４】
実施例７
ヒト及びカニクイザルＣＤ３に対するｍＡｂ２の結合の定量化
ｍＡｂ２とヒト又はカニクイザルＣＤ３の間の結合程度を測定するために、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析を実施した。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析は、解離定数ｋdを測定する。抗体とその標的との結合親和性（ＫD）は、ＫD＝ｋd／ｋaによる会合（会合定数、ｋa）及び解離（解離定数、ｋd）の動力学的定数の関数である。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析は、表面プラズモン共鳴を使用して、これらの動力学的パラメータを直接測定する。抗ＥＫ抗体を使用して抗ＣＤ３抗体ｍＡｂ２（６．３〜１００ｎＭ）を支持体に固定化し、可溶性ヒトＣＤ３（ｓｈＣＤ３）又は可溶性カニクイザルＣＤ３（ｓｃＣＤ３）が存在する状態でインキュベートした。解離の時間経過を測定し、データの二価フィットを実施した。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析の結果を図９Ａ〜図９Ｄに示す。動力学的データを表３に要約する。
【表３】
2019142866.tif 000079
【０２６５】
実施例８
ｈ−ｍＡｂ２のＣＤＲを含有するＤＡＲＴ（商標）ダイアボディの二重特異的結合データ
ヒト化ｍＡｂ２（ｈ−ｍＡｂ２）のＣＤＲを使用して、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ「Ｈｅｒ２−ｈ−ｍＡｂ２」）に、又はＣＤ１９（ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ「ＣＤ１９−ｈ−ｍＡｂ２」）に、又は表皮性成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ「ＥＲＢＩＴＵＸ（商標）−ｈ−ｍＡｂ２」）に結合可能な抗ＣＤ３第１のエピトープ結合部位及び第２のエピトープ結合部位を有するＤＡＲＴ（商標）の系列を産生した。
【０２６６】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ−ｈ−ｍＡｂ２のDART(商標)ダイアボディ
Ｈｅｒ２−ｈ−ｍＡｂ２のＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのｈＸＲ３２ＶＬ−Ｈｅｒ−２ＶＨ−Ｅコイルのアミノ酸配列（ｈＸＲ３２ＶＬ配列とＨｅｒ２ＶＨ配列の間、及びＨｅｒ２ＶＨ配列とＥコイル配列の間のリンカーには下線を付した）（配列ＩＤ番号：５８）
【化７５】
2019142866.tif 000080
【０２６７】
Ｈｅｒ２−ｈ−ｍＡｂ２のＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのＨｅｒ２ＶＬ−ｈＸＲ３２ＶＨ−Ｋコイルのアミノ酸配列（Ｈｅｒ２ＶＨ配列とｈＸＲ３２ＶＨ配列の間、及びｈＸＲ３２ＶＨ配列とＫコイル配列の間のリンカーには下線を付した）（配列ＩＤ番号：５９）
【化７６】
2019142866.tif 000081
【０２６８】
ＣＤ１９−ｈ−ｍＡｂ２のＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ
ＣＤ１９−ｈ−ｍＡｂ２のＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのＣＤ１９ＶＬ−ｈＸＲ３２ＶＨ−Ｅコイルのアミノ酸配列（ＣＤ１９ＶＬ配列とｈＶＲ３２ＶＨ配列の間、及びｈＸＲ３２ＶＨ配列とＥコイル配列の間のリンカーには下線を付した）（配列ＩＤ番号：６０）
【化７７】
2019142866.tif 000082
【０２６９】
ＣＤ１９−ｈ−ｍＡｂ２のＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのｈＸＲ３２ＶＬ−ＣＤ１９ＶＨ−Ｋコイルのアミノ酸配列（ｈＸＲ３２ＶＬ配列とＣＤ１９ＶＨ配列の間、及びＣＤ１９ＶＨ配列とＫコイル配列の間のリンカーには下線を付した）（配列ＩＤ番号：６１）
【化７８】
2019142866.tif 000083
【０２７０】
ＥＲＢＩＴＵＸ（商標）−ｈ−ｍＡｂ２のＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ
ＥＲＢＩＴＵＸ（商標）−ｈ−ｍＡｂ２のＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのｈＸＲ３２ＶＬ−ＥＧＦＲＶＨ−Ｅコイルのアミノ酸配列（ｈＸＲ３２ＶＬ配列とＥＧＦＲＶＨ配列の間、及びＥＧＦＲＶＨ配列とＥコイル配列の間のリンカーには下線を付した）（配列ＩＤ番号：６２）
【化７９】
2019142866.tif 000084
【０２７１】
ＥＲＢＩＴＵＸ（商標）−ｈ−ｍＡｂ２のＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのＥＧＦＲＶＬ−ｈＸＲ３２ＶＨ−Ｋコイルのアミノ酸配列（ＥＧＦＲＶＬ配列とｈＸＲ３２ＶＨ配列の間、及びｈＸＲ３２ＶＨ配列とＫコイル配列の間のリンカーには下線を付した）（配列ＩＤ番号：６３）
【化８０】
2019142866.tif 000085
【０２７２】
このようなＤＡＲＴ（商標）ダイアボディは、カニクイザルＣＤ３に結合可能であることが判明した（図１０Ａ〜図１０Ｃ）。
【０２７３】
ヒト化ｍＡｂ２（ｈ−ｍＡｂ２）のＣＤＲを使用して、Ｂ７−Ｈ３に結合可能な抗ＣＤ３第１のエピトープ結合部位及び第２のエピトープ結合部位を有するＤＡＲＴ（商標）のさらなる系列（ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ「Ｂ７−Ｈ３−１−ｈ−ｍＡｂ２」及び「Ｂ７−Ｈ３−２−ｈ−ｍＡｂ２」）を産生した。
【０２７４】
Ｂ７−Ｈ３−１−ｈ−ｍＡｂ２のＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ
Ｂ７−Ｈ３−１−ｈ−ｍＡｂ２のＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのｈＢＲＣＡ６９ＤＶＬ−ｈＸＲ３２ＶＨ−Ｅコイルのアミノ酸配列（ｈＢＲＣＡ６９ＤＶＬ配列とｈＸＲ３２ＶＨ配列の間、及びｈＸＲ３２ＶＨ配列とＥコイル配列の間のリンカーには下線を付した）（配列ＩＤ番号：６４）
【化８１】
2019142866.tif 000086
【０２７５】
Ｂ７−Ｈ３−１−ｈ−ｍＡｂ２のＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのｈＸＲ３２ＶＬ−ｈＢＲＣＡ６９ＤＶＨ−Ｋコイルのアミノ酸配列（ｈＸＲ３２ＶＬ配列とｈＢＲＣＡ６９ＤＶＨ配列の間、及びｈＢＲＣＡ６９ＤＶＨ配列とＫコイル配列の間のリンカーには下線を付した）（配列ＩＤ番号：６５）
【化８２】
2019142866.tif 000087
【０２７６】
Ｂ７−Ｈ３−２−ｈ−ｍＡｂ２のＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ
Ｂ７−Ｈ３−２−ｈ−ｍＡｂ２のＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのｈＢＲＣＡ８４ＤＶＬ−ｈＸＲ３２ＶＨ−Ｅコイルのアミノ酸配列（ｈＢＲＣＡ８４ＤＶＬ配列とｈＸＲ３２ＶＨ配列の間、及びｈＸＲ３２ＶＨ配列とＥコイル配列の間のリンカーには下線を付した）（配列ＩＤ番号：６６）
【化８３】
2019142866.tif 000088
【０２７７】
Ｂ７−Ｈ３−２−ｈ−ｍＡｂ２のＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのｈＸＲ３２ＶＬ−ｈＢＲＣＡ８４ＤＶＨ−Ｋコイルのアミノ酸配列（ｈＸＲ３２ＶＬ配列とｈＢＲＣＡ８４ＤＶＨ配列の間、及びｈＢＲＣＡ８４ＤＶＨ配列とＫコイル配列の間のリンカーには下線を付した）（配列ＩＤ番号：６７）
【化８４】
2019142866.tif 000089
【０２７８】
このようなＤＡＲＴ（商標）ダイアボディは、可溶性カニクイザルＣＤ３に結合可能であることが判明した（図１０Ｄ）。
【０２７９】
実施例９
ＨＥＲ２／ｎｅｕ及びＣＤ３に特異的な二重親和性再標的決定試薬（ＤＡＲＴ（商標））ダイアボディが強力なリダイレクトされたＴ細胞殺傷を仲介する
ＨＥＲ２／ｎｅｕ及びＣＤ３に特異的な二重親和性再標的決定試薬（ＤＡＲＴ（商標））ダイアボディを調製した。このようなＤＡＲＴ（商標）ダイアボディは、Ｔ細胞を（このようなＴ細胞をＣＤ３結合ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのＣＤ３結合部分に結合することによって）腫瘍細胞の位置に（このような癌細胞をＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのＨＥＲ２／ｎｅｕ結合部分に結合することによって）局在化する能力を有する。これで、局在化したＴ細胞は、本明細書で「リダイレクトされた」殺傷と呼ばれるプロセスで、腫瘍細胞の殺傷を仲介することができる。
【０２８０】
トラスツズマブの抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ可変ドメイン及びｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−８及びｈ−ｍａｂ２  ＶＬ−６の抗ＣＤ３可変ドメインを有するＨＥＲ２／ｎｅｕ及びＣＤ３に特異的な二重親和性再標的決定試薬（ＤＡＲＴ（商標））ダイアボディを構築する（配列ＩＤ番号：５８〜５９）。
【０２８１】
ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディが癌細胞のこのようなリダイレクトされた殺傷を仲介する能力を実証するために、上記ＨＥＲ２／ｎｅｕ×ＣＤ３  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディを、様々な濃度にて標的腫瘍細胞（ＳＫＯＶ−３腫瘍細胞、ＳＫＢＲ−３腫瘍細胞、Ａ５４９腫瘍細胞、及びＭＣＦ−７腫瘍細胞）及びエフェクター休眠ＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ比率＝３０：１）でインキュベートし、細胞毒性を測定した（ＬＤＨアッセイ）。これらの調査結果は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ×ＣＤ３  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディが腫瘍細胞のリダイレクトされた殺傷を仲介する能力を実証する。
【０２８２】
実施例１０
自己免疫疾患の患者の抗ＴＣＲモノクローナル抗体療法
患者：１型糖尿病の患者を４０人、参加するように以下の基準に従って募集した。すなわち、年齢は７歳と２０歳の間、米国糖尿病学会の基準による診断の６週間以内、及び抗ＧＡＤ６５、抗ＩＣＡ５１２及び／又は抗インスリン自己抗体の存在が確認されている。患者は、調査の経過中、その掛かり付けの医師の治療を受け続ける。
【０２８３】
適格の患者を、対照群とヒト化抗ＣＤ３抗体（Ｎ２９７Ｑ）（ｈ−ｍａｂ２  ＶＨ−８及びｈ−ｍａｂ２  ＶＬ−６を含む）治療群に無作為に割り付ける。無作為化の後、血液サンプルを採取してベースラインＨａ１ｃレベルを規定し、ＭＭＴＴに対する治療前Ｃペプチド応答を確認して、ＩＧＴＴに対する治療前ＦＰＩＲを実施する。両群の患者を、ヒト化抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｎ２９７Ｑ）又はプラセボの６日コースの治療を受けるように入院させる。抗体を以下の用量で静脈内投与する。すなわち１日目に１７μｇ／ｍ2、２日目に３４．３μｇ／ｍ2、３日目に６９μｇ／ｍ2、４日目に１３７．６μｇ／ｍ2、及び５日目及び６日目に２７５．３μｇ／ｍ2である。あるいは、抗体を以下の用量で静脈内投与する。すなわち、１日目に１．６μｇ／ｋｇ／日、２日目に３．２μｇ／ｋｇ／日、３日目に６．５μｇ／ｋｇ／日、４日目に１３μｇ／ｋｇ／日、及び５日目〜１４日目に２６μｇ／ｋｇ／日である。用量が増大する調査で、治療は例えば、１日目に１．４２μｇ／ｋｇ／日、２日目に５．７μｇ／ｋｇ／日、３日目に１１μｇ／ｋｇ／日、４日目に２６μｇ／ｋｇ／日、及び５日目〜１４日目に４５．４μｇ／ｋｇ／日とすることができる。その後の調査で、用量を増加させ、及び／又は治療の時間経過を短縮するように治療を変更する。例えば、その後の調査で、患者は４日間の治療を受け、すなわち１日目に６．４μｇ／ｋｇ／日、２日目に１３μｇ／ｋｇ／日、及び３日目及び４日目に２６μｇ／ｋｇ／日を投与することができ、追加の用量が増大する調査で、治療は１日目に８μｇ／ｋｇ／日、２日目に１６μｇ／ｋｇ／日、及び３日目及び４日目に３２μｇ／ｋｇ／日とすることができる。
【０２８４】
初期調査中に、治療の最初の３日間の抗体用量を２０時間にわたる徐放性静脈内注入を介して投与し、有害反応を監視する。その後の調査では、投与時間を短縮し、及び／又は用量を、１２時間の時間経過にわたって均等に分布する大量注射として投与される２つから４つの等しい部分に分割する。対照群の患者は代謝及び免疫学的検査を受けるが、モノクローナル抗体を投与されない。患者は、調査の最初から最後まで、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｎ２９７Ｑ）の免疫抑制効果について監視される。
【０２８５】
患者は、治療後１８カ月間監視される。Ｂ細胞の機能を、耐糖性が損なわれた場合は６カ月毎に、正常な耐糖性の場合は１２カ月毎に測定する。患者は通常の食事を摂取することができ、調査の継続期間を通して掛かり付けの医師の治療を受け続ける。免疫学的アッセイを６カ月の間隔で繰り返す。患者には、掛かり付けの医師の指示に従ってインスリン治療が施される。
【０２８６】
β細胞の機能は、放射免疫測定法によって測定した状態のＣペプチドレベルの変化に従って分析される。ベースラインＣペプチド及びグルコースのサンプルを採取した後、患者に混合食を与える。１５、３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０及び２４０分後に採取したサンプルで、Ｃペプチドレベルを測定する。混合食耐性検査（ＭＭＴＴ）に対するＣペプチド応答を、応答曲線下総面積（ＡＵＣ）で表す。応答の変化は、査開始時の応答からのその応答の差が７．５パーセントを超えた場合に生じると考えられる。ＭＭＴＴに対する患者のＣペプチド応答を、治療後６カ月、９カ月、１２カ月、１５カ月及び１８カ月間、連続的に監視する。あるいは、ＩＧＴＴに対するＦＰＩＲでβ細胞機能を判定する。モノヨウ化チロシンＡ１４で標識を付けたインスリン（Amersham Pharmacia）を使用し、二重抗体放射免疫測定法の変形により血清インスリンレベルを測定する。ＦＰＩＲは、グルコース負荷（０．５ｇ／ｋｇ）の１分及び３分後におけるインスリンレベルの合計として計算される。グリコシル化ヘモグロビンレベルを、ラテックス凝集反応抑制試験で測定する。
【０２８７】
免疫学的監視：ＧＡＤ６５、ＩＡ２／ＩＣＡ５１２、及びインスリンに対する自己抗体のレベルを、当技術分野で知られているような放射結合アッセイで測定する（例えば、Woo他、２０００、J. Immunol Methods 244:91-103）。ＰＣＲ増幅後にエキソン２多形性の直接的配列決定により、ＨＬＡ−ＤＱＡ及びＨＬＡ−ＤＱＢ遺伝子型解析を実施する。モノクローナル抗体投与後の血清中のサイトカインレベルを、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）により測定する。プレート結合抗ＣＤ３（Ｎ２９７Ｑ）を使用したＥＬＩＳＡアッセイ又はフローサイトメトリにより、抗イディオタイプ抗体の産生を監視し、ＴＣＲのＣＤ３鎖に対する抗ＣＤ３−ＦＩＴＣの結合の妨害を測定する。
【０２８８】
統計解析：データ解析は、残余ベータ細胞のファンクション、自己抗体レベル、サイトカインレベル、及びグリコシル化ヘモグロビンレベルに基づいて実施される。χ２解析を実施して、薬剤投与前後に薬剤治療の効果を検査する。対照群と治療群との比較を、マン−ホイットニーのＵ検定で実行する。
【０２８９】
実施例１１
Ｂ７Ｈ３及びＣＤ３に特異的な二重親和性再標的決定試薬（ＤＡＲＴ（商標））ダイアボディが強力なリダイレクトされたＴ細胞殺傷を仲介する
Ｂ７Ｈ３及びＣＤ３に特異的な二重親和性再標的決定試薬（ＤＡＲＴ（商標））ダイアボディを調製した。Ｂ７Ｈ３は、腫瘍細胞系統で免疫組織学的に検出したものである（Chapoval, A.他（２００１）の「B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN- γ Production」（Nature Immunol. 2:269-274）、Saatian, B.他（２００４）の「Expression Of Genes For B7-H3 And Other T Cell Ligands B Nasal Epithelial Cells During Differentiation And Activation」（Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 287:L217-L225）、Castriconi他（２００４）の「Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis」（Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34):12640-12645)）、Sun, M.他（２００２）の「Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes」（J. Immunol. 168:6294-6297））。幾つかの別個の研究が、ヒト悪性腫瘍細胞はＢ７−Ｈ３タンパク質の発現に顕著な増加を示し、この発現増加は疾患重症度の上昇を伴ったことを示し（Zang, X.他（２００７）の「The B7 Family And Cancer Therapy: Costimulation And Coinhibition」（Clin. Cancer Res. 13:5271-5279））、腫瘍が免疫回避経路としてＢ７−Ｈ３を利用していると示唆している（Hofmeyer, K.他（２００８）の「The Contrasting Role Of B7-H3」（Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278））。
【０２９０】
このようなＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのＣＤ３結合部分は、ヒト化抗ＣＤ３  ｍＡｂ２の上記軽鎖及び重鎖可変領域（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＨ−８及びｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−６）で構成されていた。このようなＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのＢ７Ｈ３部分は、ｈＢＲＣＡ８４Ｄ−２軽鎖及びｈＢＲＣＡ８４Ｄ−２重鎖（配列ＩＤ番号：６４〜６５）で構成されていた。
【０２９１】
このようなＤＡＲＴ（商標）ダイアボディは、Ｔ細胞を（このようなＴ細胞をＣＤ３結合ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのＣＤ３結合部分に結合することによって）腫瘍細胞の位置に（このような癌細胞をＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのＢ７Ｈ３結合部分に結合することによって）局在化する能力を有する。これで、局在化したＴ細胞は、「リダイレクトされた」殺傷のプロセスで腫瘍細胞の殺傷を仲介することができる。
【０２９２】
このようなＤＡＲＴ（商標）ダイアボディが癌細胞のこのようなリダイレクトされた殺傷を仲介する能力を実証するために、ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディを、様々な濃度にて標的腫瘍細胞（Ａ４９８腫瘍細胞、ＲＥＣＡ９０５０２１Ｅ腫瘍細胞）及びエフェクター休眠ＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ比率＝３０：１）でインキュベートし、細胞毒性を測定した（ＬＤＨアッセイ）。ＣＤ３（ｈ−ｍＡｂ２）及びフルオレセイン（抗体４４２０）に対する二重特異性を有するＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ（４４２０−ｈ−ｍＡｂ２）を対照標準として使用した。
【０２９３】
４４２０−ｈ−ｍＡｂ２  ＤＡＲＴ(商標)ダイアボディ
４４２０−ｈ−ｍＡｂ２  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディの４４２０ＶＬ−ｈＸＲ３２ＶＨ−Ｅコイルのアミノ酸配列（４４２０ＶＬ配列とｈＸＲ３２ＶＨ配列の間、及びｈＸＲ３２ＶＨ配列とＥコイル配列の間のリンカーには下線を付した）（配列ＩＤ番号：６８）
【化８５】
2019142866.tif 000090
【０２９４】
４４２０−ｈ−ｍＡｂ２  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのｈＸＲ３２ＶＬ−４４２０ＶＨ−Ｋコイルのアミノ酸配列（ｈＸＲ３２ＶＬ配列と４４２０ＶＨ配列の間、及び４４２０ＶＨ配列とＫコイル配列の間のリンカーには下線を付した）（配列ＩＤ番号：６９）
【化８６】
2019142866.tif 000091
【０２９５】
これらの調査結果（図１１Ａ〜図１１Ｂ）は、Ｂ７Ｈ３×ＣＤ３  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディがＢ７Ｈ３を発現する腫瘍細胞のリダイレクトされた殺傷を仲介する能力を実証している。
【０２９６】
実施例１２
Ａ３３及びＣＤ３に特異的な二重親和性再標的決定試薬（ＤＡＲＴ（商標））ダイアボディが強力なリダイレクトされたＴ細胞殺傷を仲介する
Ａ３３抗原及びＣＤ３に特異的な二重親和性再標的決定試薬（ＤＡＲＴ（商標））ダイアボディ（「Ａ３３−ｈ−ｍＡｂ２」ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ）を調製した。Ａ３３は、正常なヒトの結腸及び小腸の上皮に発現し、ヒト結腸癌の９５％を超える膜抗原である（Heath, J.K.他（１９９７）の「The human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily」（Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)94:469-474））。
【０２９７】
このようなＤＡＲＴ（商標）ダイアボディは、Ｔ細胞を（このようなＴ細胞をＣＤ３結合ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのＣＤ３結合部分に結合することによって）腫瘍細胞の位置に（このような癌細胞をＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのＡ３３結合部分に結合することによって）局在化する能力を有する。これで、局在化したＴ細胞は、「リダイレクトされた」殺傷のプロセスを介して腫瘍細胞の殺傷を仲介することができる。
【０２９８】
このようなＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのＣＤ３結合部分は、ヒト化ｍＡｂ２の上記軽鎖及び重鎖可変領域（ｈ−ｍＡｂ２  ＶＨ−８及びｈ−ｍＡｂ２  ＶＬ−６）で構成されていた。このようなＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのＡ３３部分は、抗体ＲＥＣＡ４７で構成されていた。
【０２９９】
Ａ３３−ｈ−ｍＡｂ２  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ
Ａ３３−ｈ−ｍＡｂ２  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのＲＥＣＡ４７ＶＬ−ｈＸＲ３２ＶＨ−Ｋコイルのアミノ酸配列（ＲＥＣＡ４７ＶＬ配列とｈＸＲ３２ＶＨ配列の間、及びｈＸＲ３２ＶＨ配列とＫコイル配列の間のリンカーには下線を付した）（配列ＩＤ番号：７０）
【化８７】
2019142866.tif 000092
【０３００】
Ａ３３−ｈ−ｍＡｂ２  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのｈＸＲ３２ＶＬ−ＲＥＣＡ４７ＶＨ−Ｅコイルのアミノ酸配列（ｈＸＲ３２ＶＬ配列とＲＥＣＡ４７ＶＨ配列の間、及びＲＥＣＡ４７ＶＨ配列とＥコイル配列の間のリンカーには下線を付した）（配列ＩＤ番号：７１）
【化８８】
2019142866.tif 000093
【０３０１】
このようなＤＡＲＴ（商標）ダイアボディが癌細胞のこのようなリダイレクトされた殺傷を仲介する能力を実証するために、ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディを、様々な濃度にて標的腫瘍細胞（Ｃｏｌｏ２０５腫瘍細胞、ＲＥＣＡ９０５０２１Ｅ腫瘍細胞）及びエフェクター休眠ＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔの比率＝３０：１）でインキュベートし、細胞毒性を測定した（ＬＤＨアッセイ）。この調査結果（図１２Ａ〜図１２Ｅ）は、Ａ３３×ＣＤ３  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディがＡ３３を発現する腫瘍細胞のリダイレクトされた殺傷を仲介する能力を実証している。
【０３０２】
実施例１３
ＣＤ３に特異的な二重親和性再標的決定試薬（ＤＡＲＴ（商標））ダイアボディが、他のヒト特異的ＣＤ３ダイアボディと同等のリダイレクトされたＴ細胞仲介殺傷を引き起こす
本発明のＣＤ３特異的二重親和性再標的決定試薬（ＤＡＲＴ（商標））ダイアボディを更に判定するために、上記ＣＤ１９−ｈ−ｍＡｂ２  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディがリダイレクトされたＴ細胞仲介殺傷を引き起こす能力を、Moore, P.A.他（２０１１）の（「Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma」（Blood 117(17):4542-4551））のＣＤ１９×ＣＤ３  ＤＡＲＴダイアボディと比較した。ＣＤ１９−ｈ−ｍＡｂ２  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディは、ヒトＣＤ３に、及び非ヒトＣＤ３に特異性を示し、Moore, P.A.他（２０１１）のＣＤ１９×ＣＤ３  ＤＡＲＴダイアボディはヒトＣＤ３にのみ特異性を示す。
【０３０３】
したがって、ＲａｊｉヒトＢ細胞リンパ腫細胞（Drexler, H.G.他（１９９８）の「History And Classification Of Human Leukemia-Lymphoma Cell Lines」（Leuk. Lymphoma 31(3-4):305-316）、Amdt, R.（１９８４）の「Demonstration Of C3-Binding Circulating Immune Complexes Using Raji, Conglutinin And Anti-C3 Assays--A Qritical Review」（Immun. Infekt. 12(1):3-11）を参照されたい）又はＪｅＫｏ−１ヒト外套細胞リンパ腫細胞（Salaverria, I.他（２００６）の「Mantle Cell Lymphoma: From Pathology And Molecular Pathogenesis To New Therapeutic Perspectives」（Haematologica 91:11-16）、Jeon, H.J.他（１９９８）の「Establishment And Characterization Of A Mantle Cell Lymphoma Cell Line」（Br. J. Haematol. 102(5):1323-1326））を、ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ及び休眠末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（Ｅ：Ｔ＝３０：１）が存在する状態でインキュベートした。この実験結果（図１３Ａ及び図１３Ｂ）は、本発明のＣＤ１９−ｈ−ｍＡｂ２  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディが、ヒトＣＤ３に特異的なＣＤ１９×ＣＤ３  ＤＡＲＴダイアボディを使用して観察した結果と同等のリダイレクトされたＴ細胞仲介殺傷を引き起こすことを明らかにした。したがって、非ヒトＣＤ３ホモログにまで特異性を拡げても、ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディがリダイレクトされた殺傷を仲介する能力を損なわなかった。
【０３０４】
実施例１４
ＣＤ３に特異的なカニクイザル交差反応性二重親和性再標的決定試薬（ＤＡＲＴ（商標））ダイアボディによるリダイレクトされた細胞溶解
上記ＣＤ１９−ｈ−ｍＡｂ２  ＤＡＲＴ(商標)ダイアボディが、ヒト又はカニクイザルの存在する状態でリダイレクトされたＴ細胞仲介殺傷を引き起こす能力を調査した。
【０３０５】
ＨＴ−２９ヒト結腸癌細胞（Marchis-Mouren,G.他（１９８８）の「HT 29, A Model Cell Line: Stimulation By The Vasoactive Intestinal Peptide (VIP); VIP Receptor Structure And Metabolism」（Biochimie 70(5):663-671）、Fogh, J.他（１９７５）、J. Fogh (編集)の「HUMAN TUMOR CELLS IN VITRO」（New York: Plenum Press. 1975））を、ヒト又はカニクイザルＴ細胞（Ｅ：Ｔ比率＝３０：１）、及び抗体ＦＮ−１８から誘導したＣＤ３配列を有する上記ＣＤ１９−ｈ−ｍＡｂ２  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ又はＣＤ１９×ＣＤ３  ＤＡＲＴダイアボディの存在する状態でインキュベートした。抗体ＦＮ−１８は、カニクイザルＣＤ３にのみ特異性を示す（Nooij, F.J.他（１９８６）の「Differentiation Antigens On Rhesus Monkye Lymphocytes. I. Identification Of T Cells Bearing CD3 And CD8, And Of A Subset Of CD8-Bearing Cells」（Eur. J. Immunol. 16(8):975-979）、Meng, G.他（１９９８）の「The Effect Of Anti-CD3-Immunotoxin On T Lymphocyte Function in vitro」（Transpl. Immunol. 6(1):53-59））。抗体濃度の関数として、その結果の細胞毒性率を測定した。結果（図１４Ａ及び図１４Ｂ）は、ＣＤ１９−ｈ−ｍＡｂ２  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディが、ヒト又は非ヒトＴ細胞エフェクター細胞が存在する状態で細胞毒性を仲介可能であったことを示す。対照的に、ＦＮ−１８ダイアボディは、カニクイザルＴ細胞が存在する状態でのみ細胞毒性を仲介可能であった。
【０３０６】
実施例１５
二重親和性再標的決定試薬（ＤＡＲＴ（商標））ダイアボディは標的細胞の結合を必要とする
観察された本発明のＣＤ３  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディにより仲介されたリダイレクトされた殺傷が特異的であったことを実証するために、標的細胞が存在する状態及び存在しない状態で殺傷程度を測定した。
【０３０７】
上記ＥＲＢＩＴＵＸ（商標）−ｈ−ｍＡｂ２  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ、ＥＲＢＩＴＵＸ（商標）Ｔ細胞受容体ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ（ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）及びＴ細胞受容体に結合可能である）、又はＥＲＢＩＴＵＸ（商標）−ＦＮ１８  ＣＤ３  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ（ＥＧＦＲ及びカニクイザルＣＤ３に結合可能である）が存在する状態で、ヒトＰＭＢＣをインキュベートした。インキュベーションは、Ａ４９８腎臓癌標的細胞が存在する状態又は存在しない状態で実施した（Giard, D.J.他（１９７３）の「in vitro Cultivation Of Human Tumors: Establishment Of Cell Lines Derived From A Series Of Solid Tumors」（J.Natl. Cancer Inst. 51:1417-1423）、Fogh, J.（１９８７）の「Cultivation, Characterization, And Identification of Human Tumor Cells With Emphasis On Kidney, Testis And Bladder Tumors」（Natl. Cancer Inst. Monogr. 49:5-9））。
【０３０８】
ＣＤ６９糖タンパクは、刺激後に好中球などの大部分の造血性系譜の細胞上に発現するＴ及びＢリンパ球の早期活性化抗原である（Atzenia, F.他（２００２）の「Induction Of CD69 Activation Molecule on Human Neutrophils by GM-CSF, IFN-γ, and IFN-α」（Cellular Immunol. 220(1):20-29））。したがって、免疫系の活性を判定する手段として、（ダイアボディ濃度の関数として）ＣＤ６９平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した（例えば、Ampel, N.M.他（２００２）の「In Vitro Whole-Blood Analysis of Cellular Immunity in Patients with Active Coccidioidomycosis by Using the Antigen Preparation T27K」（Clinical Diagnostic Laboratory Immunology 9(5):1039-1043）を参照されたい）。
【０３０９】
結果（図１５Ａ及び図１５Ｂ）は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞を本発明のＥＲＢＩＴＵＸ（商標）−ｈ−ｍＡｂ２  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ又はＥＲＢＩＴＵＸ（商標）Ｔ細胞受容体ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ（ＥＧＦＲ及びＴ細胞受容体に結合可能である）でインキュベートした場合のみ、（ＣＤ６９のＭＦＩで測定した状態の）免疫系活性が増大したことを示す。ＥＲＢＩＴＵＸ（商標）−ＦＮ１８  ＣＤ３  ＤＡＲＴ（商標)ダイアボディ（ＥＧＦＲ及びカニクイザルＣＤ３に結合可能である）は、ＣＤ６９  ＭＦＩの増加を誘導することができなかった。
【０３１０】
実施例１６
ヒト化カニクイザル／ヒト交差反応性ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディによるリダイレクトされた殺傷
本発明のＤＡＲＴ（商標）ダイアボディがリダイレクトされた殺傷を仲介する能力を更に実証するために、Ａ４９８腎臓癌標的細胞又はＡ４３１類表皮細胞癌細胞（Lee, C.M.他（２０１０）の「The Distribution of The Therapeutic Monoclonal Antibodies Cetuximab And Trastuzumab Within Solid Tumors」（BMC Cancer 10:255; pages 1-11）、Bryant, J.A.他（２００４）の「EGF Actives Intracellular And Intercellular Calcium Signaling By Distinct Pathways In Tumor Cells」（Cancer Biol. Ther. 3(12):1243-1249））、及びＰＭＢＣエフェクター細胞（Ｅ：Ｔ＝３０：１）の存在する状態で様々なＤＡＲＴ（商標）ダイアボディにより仲介されるリダイレクトされた殺傷の程度を測定した。
【０３１１】
細胞をＥＲＢＩＴＵＸ（商標）−ｈ−ｍＡｂ２  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ、ＥＲＢＩＴＵＸ（商標）−ｍ−ｍＡｂ２  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ又は４４２０−ｈ−ｍＡｂ２  ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ（負の対照標準）又は対照標準の２次抗体が存在する状態でインキュベートした。標的細胞への結合を、ＭＦＩを測定して判定した。リダイレクトされた殺傷を、細胞毒性率を測定して判定した。
【０３１２】
この調査結果を図１６Ａ〜図１６Ｄに示す。ＣＤ３及びＥＧＦＲに特異性を有するダイアボディは、Ａ４９８又はＡ４３１細胞に結合可能であり（それぞれ図１６Ａ及び図１６Ｃ）、これらの細胞のリダイレクトされた殺傷を仲介可能である（それぞれ図１６Ｂ及び図１６Ｄ）ことが判明した。
【０３１３】
本明細書で言及した出版物及び特許はすべて、個々の各出版物又は特許出願が具体的かつ個別的に参照により全体を組み込むものとするように、参照により同程度まで本明細書に組み込むものとする。本発明をその具体的な実施形態に関連して説明してきたが、さらなる変更が可能であることが理解され、本出願は、本発明の原理に一般的に従う本発明の任意の変形、使用、又は適応を対象とし、本開示からのこのような逸脱が、本発明が関係する技術分野内に入るか、又は通常実践され、更に以上で述べた基本的形体に適用できるものとして含まれるものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2019142866.tif 000100
【図６】
2019142866.tif 000101
【図７】
2019142866.tif 000102
【図８Ａ】
2019142866.tif 000103
【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【配列表】
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