(57)【要約】      （修正有）【課題】破骨細胞の分化及び活性を抑制し、骨破壊によって発生する多様な骨疾患に対して優れた予防及び治療効果を有するペプチド、および、その用途の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなる、破骨細胞分化及び活性抑制能を有するペプチド、および、上述のペプチドを含む骨疾患の予防または治療用組成物。前記ペプチドは、破骨細胞分化に係るＴＲＡＰ（ｔａｒｔｒａｔｅｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）の発現を減少させ、カテプシンＫ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ）の発現を減少させ、または、ＮＦ−κＢの核内移動を抑制し、究極的に破骨細胞の分化を抑制する。【選択図】図２ｂ
2019014719.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列からなる、破骨細胞分化及び活性抑制能を有するペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは、ＴＲＡＰ（ｔａｒｔｒａｔｅｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）の発現を減少させることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドは、カテプシンＫ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ）の発現を減少させることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドは、ＮＦ−κＢの核内移動を抑制することを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む骨疾患の予防または治療用組成物。
【請求項６】
前記骨疾患は、骨の損傷、骨粗しょう症、骨軟化症、くる病、線維性骨炎、無形性骨疾患または代謝性骨疾患であることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２０１４年７月３１日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１４−００９８３６２号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は、本明細書に参照として取り込まれる。
【０００２】
本発明は、破骨細胞分化及び活性抑制能を有するペプチド及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
骨（ｂｏｎｅ）は、人体の軟組織と体重を支えて、内部器官を囲んで、内部臓器を外部の衝撃から保護する。また、筋肉や臓器を構造的に支えるだけではなく、体内のカルシウムや他の必須無機質、即ちリンやマグネシウムのような物質を貯蔵する人体の重要な部分の１つである。したがって、成長の終わった成人の骨は、止まることなく死ぬ日まで、古い骨は除去して新しい骨に代替する、生成と吸収過程を非常に力動的、持続的に反復再生しながら均衡を維持する。これを骨再形成（ｂｏｎｅ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）という。古い骨は除去して新しい骨に代替するような骨の循環（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）は、成長とストレスにより起こる骨の微細な損傷を回復させて、適切な骨の機能を維持するに必須的である。
【０００４】
骨再形成には、大きく２種類の細胞が関与すると知られている。その１つは、骨を生成する造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）であり、他の１つは、骨を破壊する破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）である。造骨細胞は、ＲＡＮＫＬ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−κＢ  ｌｉｇａｎｄ）と、その誘導受容体（ｄｅｃｏｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）であるＯＰＧ（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）を生成する。ＲＡＮＫＬが破骨前駆細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）表面に存在する受容体ＲＡＮＫに結合すると、破骨前駆細胞が破骨細胞に成熟化（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）し、骨吸収（ｂｏｎｅ  ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）が起こる。しかし、ＯＰＧがＲＡＮＫＬと結合すると、ＲＡＮＫＬとＲＡＮＫ間結合が遮断され、破骨細胞の形成が抑制されて、必要以上の骨吸収が起こらないようになる。古い骨の吸収または破壊は、血液細胞（造血母細胞）から生じる破骨細胞によりなされて、これは、骨に孔をあけて、少ない量のカルシウムが血流に放出されて身体機能を維持するに使用される。一方、骨細胞で生成された造骨細胞は、膠原質で孔を埋めて、カルシウムとリンの沈着物（ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）を覆って、新しい硬い骨をつくって骨格を再建する。骨が破壊され始めて、再び新しい骨に再形成されるまでは、約１００日くらいかかる。幼児では、１年内に骨のカルシウムが１００％代わるが、成人では、毎年骨格の約１０〜３０％が上記のような過程を通じて再形成されて、破骨速度と造骨速度が同一でなければ、前のような骨密度を維持することができない。このように重要な骨の均衡が崩れる場合、多様な疾病が引き起こされるが、特に、骨粗しょう症と癌細胞の骨転移（ｂｏｎｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）による骨の損傷に係る疾患が代表的である。
【０００５】
骨粗しょう症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）は、多様な原因により骨の質量が減少し、骨組織の微細構造の退化により骨折危険が持続的に増加する疾患で、骨を構成するミネラル（特にカルシウム）と基質が減少した状態であって、骨再形成の均衡が崩れ、破骨作用が造骨作用より増加された状態で発生する。正常的な骨内部は、網目のように緻密な構造をなしているが、骨粗しょう症の場合は、構造間の間隔が広くなって、微細構造が薄くなり、弱い衝撃にも骨が骨折しやすい状態に進行される。骨粗しょう症は、閉経期の始まりと同時に急速な骨損失（年間２〜３％）があらわれて、脊髄の圧迫及び手首骨が骨折する危険が増加する閉経期以後の骨粗しょう症（Ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）、７０歳以上の男女老人に徐々に発生し（年間０．５〜１％）、寛骨（ｈｉｐ  ｂｏｎｅ）と脊髄骨の漸進的な骨損失をもたらす老年期の骨粗しょう症（Ｓｅｎｉｌｅ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）、そして年齢に関係なく、疾病（内分泌疾患、胃腸管疾患、悪性腫瘍）や、薬物（副腎皮質ホルモン、抗がん化学療法、甲状腺ホルモン、抗けいれん剤、抗凝固剤、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ）、ＧｎＲＨなど）、アルコール、喫煙、事故により発生する二次性骨粗しょう症（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）に分類される。
【０００６】
上記のような骨粗しょう症及びがん細胞の骨転移により招来される骨の損傷には、フォサマックス（Ｆｏｓａｍａｘ，  成分名：  ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ）とアクトネル（Ａｃｔｏｎｅｌ，  成分名：  ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ）のようなビスホスホネート（ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）系列の治療剤が利用されている。上記のようなビスホスホネート製剤は、大部分骨を破壊する破骨細胞の機能を弱化して、死滅を誘導し、骨の損失を遅らせるか止める作用をする。しかし、上述の薬は、新しい骨の形成を促進させる作用は有しておらず、最近、ビスホスホネートを服用する患者から、顎骨の壊死（ｏｓｔｅｏｎｅｃｒｏｓｉｓ）、重症心房細動、骨や関節の無力化または筋骨格の痛みが発生する事例が毎年増加している。したがって、骨吸収を抑制することより、骨の形成を促進させる、骨粗しょう症予防及び治療剤の開発に高い関心が集中されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、生物学的に有効な活性を有する優れたペプチドを開発するために鋭意研究した結果、配列番号１、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドが、破骨細胞の分化及び活性を抑制し、骨破壊によって発生する多様な骨疾患に対して優れた予防及び治療効果を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、破骨細胞の分化及び活性抑制能を有するペプチドを提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、骨疾患の予防または治療用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一様態によると、本発明は、配列番号１から配列番号３のアミノ酸配列から構成された群から選択されるアミノ酸配列からなる、破骨細胞分化及び活性抑制能を有するペプチドを提供する。
【００１１】
本発明者らは、生物学的に有効な活性を有する優れたペプチドを開発するために鋭意研究した結果、配列番号１、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドが、破骨細胞の分化及び活性を抑制し、骨破壊によって発生する多様な骨疾患に対して優れた予防及び治療効果を有することを見出した。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の特徴及び利点を要約すると、以下のようである：
（ｉ）本発明の配列番号１から配列番号３のアミノ酸配列から構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなるペプチドは、破骨細胞分化及び活性抑制能を有して、骨破壊に係る骨疾患の予防または治療に非常に有効である。
（ｉｉ）本発明のペプチドは、破骨細胞分化に係るＴＲＡＰ及びカテプシンＫ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ）の発現を減少させて、ＮＦ−κＢの核内移動を抑制し、究極的に破骨細胞の分化を抑制する。
（ｉｉｉ）本発明は、上述のペプチドを含む骨疾患の予防または治療用組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１ａ】本発明のペプチド処理による破骨細胞の分化時発現されるＴＲＡＰタンパク質の発現程度変化を、ＴＲＡＰ染色を通じて確認した結果である（配列番号１のペプチド）。
【図１ｂ】本発明のペプチド処理による破骨細胞の分化時発現されるＴＲＡＰタンパク質の発現程度変化を、ＴＲＡＰ染色を通じて確認した結果である（配列番号２のペプチド）。
【図１ｃ】本発明のペプチド処理による破骨細胞の分化時発現されるＴＲＡＰタンパク質の発現程度変化を、ＴＲＡＰ染色を通じて確認した結果である（配列番号３のペプチド）。
【図２ａ】本発明のペプチド処理による破骨細胞の分化時発現されるＴＲＡＰ及びカテプシンＫのｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲを通じて確認した結果である（配列番号１のペプチド）。
【図２ｂ】本発明のペプチド処理による破骨細胞の分化時発現されるＴＲＡＰ及びカテプシンＫのｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲを通じて確認した結果である（配列番号２のペプチド）。
【図２ｃ】本発明のペプチド処理による破骨細胞の分化時発現されるＴＲＡＰ及びカテプシンＫのｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲを通じて確認した結果である（配列番号３のペプチド）。
【図３ａ】本発明のペプチド処理による破骨細胞の分化時促進されるＮＦ−κＢの核内移動の変化をウェスタンブロッティングを通じて確認した結果である（配列番号１のペプチド）。
【図３ｂ】本発明のペプチド処理による破骨細胞の分化時促進されるＮＦ−κＢの核内移動の変化をウェスタンブロッティングを通じて確認した結果である（配列番号２のペプチド）。
【図３ｃ】本発明のペプチド処理による破骨細胞の分化時促進されるＮＦ−κＢの核内移動の変化をウェスタンブロッティングを通じて確認した結果である（配列番号３のペプチド）。
【図４ａ】本発明のペプチド処理による破骨細胞の分化時発現されるＴＲＡＰの発現程度を、免疫化学染色を通じて確認した結果である（配列番号１のペプチド）。
【図４ｂ】本発明のペプチド処理による破骨細胞の分化時発現されるＴＲＡＰの発現程度を、免疫化学染色を通じて確認した結果である（配列番号２のペプチド）。
【図４ｃ】本発明のペプチド処理による破骨細胞の分化時発現されるＴＲＡＰの発現程度を、免疫化学染色を通じて確認した結果である（配列番号３のペプチド）。
【図５ａ】本発明のペプチド処理による破骨細胞の分化時発現されるカテプシンＫの発現程度を、免疫化学染色を通じて確認した結果である（配列番号１のペプチド）。
【図５ｂ】本発明のペプチド処理による破骨細胞の分化時発現されるカテプシンＫの発現程度を、免疫化学染色を通じて確認した結果である（配列番号２のペプチド）。
【図５ｃ】本発明のペプチド処理による破骨細胞の分化時発現されるカテプシンＫの発現程度を、免疫化学染色を通じて確認した結果である（配列番号３のペプチド）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のペプチドは、配列番号１、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列を含む。具体的には、本発明のペプチドは、必須的に、配列番号１から配列番号３のアミノ酸配列からなる群から選択される１種のアミノ酸配列から構成されている。
【００１５】
本発明のペプチドは、破骨細胞の分化及び活性を効果的に抑制する。
【００１６】
関節内で骨破壊は、破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）が活性化しつつ現れるが、造血母細胞から分化した骨髄性前駆細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）が炎症性環境で破骨細胞に分化する。リウマチ関節内には、たくさんの炎症性サイトカイン及びケモカインが存在して、これらの物質によって、破骨細胞分化に必要な多様な分子の発現が増加し、破骨細胞の形成を誘導するようになる。リウマチ関節炎の治療目標は、骨破壊を抑制し、関節損傷を最小化することが重要であると認識されている。
【００１７】
骨髄性前駆細胞が破骨細胞に分化するに必須的な物質としては、前駆細胞表面でＲＡＮＫ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒκＢ）が誘導されて、これに対するリガンドであるＲＡＮＫＬ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  κＢ  ｌｉｇａｎｄ）を提供する細胞が結合される、いわゆるＲＡＮＫ−ＲＡＮＫＬ相互作用が必須的である。これと共に、Ｍ−ＣＳＦ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）も、破骨細胞が成熟して分化するに重要な役割を担当する。破骨細胞分化の主な信号伝達経路としてＲＡＮＫ−ＲＡＮＫＬ相互作用とＭ−ＣＳＦが必須的であるが、前駆細胞表面にある多様な種類の免疫グロブリン様受容体（Ｉｇ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を通じて、細胞内信号伝達物質であるＤＡＰ１２やＦｃＲγに連結されてｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌを提供する。最も中心となる信号伝達経路は、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫ相互結合がなされた後、細胞内信号伝達物質であるＴＲＡＦ６（ＴＮＦ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ６）を介してＮＦ−ｋＢ活性化を経て、破骨細胞の形成に必要な遺伝子転写を増加させて達成される。また、Ｍ−ＣＳＦも、破骨細胞に分化するに必須的な物質と知られており、受容体チロシンキナーゼスーパーファミリーに属するｃＦＭＳのような特異受容体に結合後、細胞質内Ｓｒｃ−ＰＹＫ２複合体を構成し、これを通じてＮＦ−κＢのような転写調節物質を誘導するか、インテグリンタンパク質を通じて細胞内信号伝達役割を行う。
【００１８】
本発明の一具現例によると、本発明のペプチドは、破骨細胞分化に係るＴＲＡＰ（ｔａｒｔｒａｔｅｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）及びカテプシンＫ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ）の発現を減少させて、ＮＦ−κＢの核内移動を抑制し、結果的に破骨細胞の分化及び活性を抑制する。
【００１９】
本明細書において用語‘ペプチド’は、ペプチド結合により、アミノ酸残基が互いに結合されて形成された線形の分子を意味する。本発明のペプチドは、当業界に公知された化学的合成方法、特に固相合成技術（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５：２１４９−５４（１９６３）；  Ｓｔｅｗａｒｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ．  ｅｄ．，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．：  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  １１１（１９８４））または液相合成技術（ＵＳ登録特許第５，５１６，８９１号）によって製造できる。
【００２０】
本発明の一具現例によると、前記ペプチドのＮ−またはＣ−末端は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群から選択される保護基が結合される。
【００２１】
上述のアミノ酸の変形は、本発明のペプチドの安定性を大きく改善する作用をする。本明細書において用語‘安定性’は、インビボ安定性だけではなく、貯蔵安定性（例えば、常温貯蔵安定性）も意味する。上述の保護基は、生体内のタンパク質切断酵素の攻撃から本発明のペプチドを保護する作用をする。
【００２２】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述の配列番号１から配列番号３のアミノ酸配列から構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む骨疾患の予防または治療用組成物を提供する。
【００２３】
本発明の組成物は、上述の本発明の配列番号１、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含むため、その共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。
【００２４】
下記の実施例で立証されたように、本発明の配列番号１、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドは、破骨細胞の分化及び活性を抑制するため、骨破壊に係る骨疾患の予防または治療に非常に有効である。
【００２５】
本発明の骨疾患予防または治療用組成物は、破骨作用が過度なる場合に発生するあらゆる疾患に使用でき、例えば、骨の損傷、骨粗しょう症、骨軟化症、くる病、線維性骨炎、無形性骨疾患または代謝性骨疾患などに使用できる。
【００２６】
本発明の一具現例によると、本発明の組成物は、（ａ）上述の本発明のペプチドの薬剤学的有効量、及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物で製造できる。
【００２７】
本明細書において用語‘薬剤学的有効量’は、上述のペプチドの効能または活性を達成するに十分な量を意味する。
【００２８】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （１９ｔｈ  ｅｄ．，  １９９５）に詳細に記載されている。
【００２９】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口、好ましくは、非経口で投与でき、非経口投与の場合は、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、局所投与、経皮投与などにより投与できる。
【００３０】
本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様に処方できる。一方、本発明の薬剤学的組成物のある投与量は、１日当たり０．０００１〜２００μｇである。
【００３１】
本発明の薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造するか、または多用量容器内に入れて製造できる。ここで剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤またはゲル（例えば、ハイドロゲル）の形態であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。
【００３２】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【実施例】
【００３３】
合成例１：ペプチド合成
クロロトリチルクロライドレジン（Ｃｈｌｏｒｏ  ｔｒｉｔｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｒｅｓｉｎ；  ＣＴＬ  ｒｅｓｉｎ，  Ｎｏｖａ  ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔ  Ｎｏ．  ０１−６４−００２１）  ７００ｍｇを反応容器に入れて、メチレンクロライド（ＭＣ）  １０ｍｌを加えて３分間攪拌した。溶液を除去してジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）  １０ｍｌを入れて３分間攪拌した後、再び溶媒を除去した。反応器に１０ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液を入れて、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ  （Ｂａｃｈｅｍ，  Ｓｗｉｓｓ）  ２００ｍｍｏｌｅ及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）  ４００ｍｍｏｌｅを入れた後、攪拌してよく溶かし、１時間攪拌しながら反応した。反応後、洗浄して、メタノールとＤＩＥＡ（２：１）をＤＣＭに溶かして１０分間反応して、過量のＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）で洗浄した。溶液を除去して、ＤＭＦを１０ｍｌ入れて、３分間攪拌した後、再び溶媒を除去した。脱保護溶液（２０％のピぺリジン（Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）／ＤＭＦ）  １０ｍｌを反応容器に入れて、１０分間常温で攪拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れて、再び１０分間反応を維持した後、溶液を除去し、それぞれ３分間ずつＤＭＦで２回、ＭＣで１回、ＤＭＦで１回洗浄し、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＣＴＬ  Ｒｅｓｉｎを製造した。
【００３４】
新しい反応器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れて、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，  Ｓｗｉｓｓ）  ２００ｍｍｏｌｅ、ＨｏＢｔ  ２００ｍｍｏｌｅ及びＢｏｐ  ２００ｍｍｏｌｅを入れた後、攪拌して、よく溶かした。反応器に４００ｍｍｏｌｅ  ＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）を分画で２回にかけて入れた後、全ての固体が溶けるまで少なくとも５分間攪拌した。溶かしたアミノ酸混合溶液を、脱保護されたレジンの入った反応容器に入れて、１時間常温で攪拌しながら反応した。反応液を除去して、ＤＭＦ溶液で３回５分間ずつ攪拌した後、除去した。反応レジンを少量取って、カイザーテスト（Ｎｉｈｙｄｒｉｎ  ｔｅｓｔ）を利用して反応程度を点検した。上記と同様に脱保護溶液で２回脱保護反応し、Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＣＴＬ  Ｒｅｓｉｎを製造した。ＤＭＦとＭＣで十分洗浄し、再びカイザーテストを行った後、上記と同様に下記のアミノ酸付着実験を行った。
【００３５】
選定されたアミノ酸配列に基づき、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，  Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），  Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，  Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ，  Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）順に連鎖反応を行った。Ｆｍｏｃ−保護基を脱保護溶液で１０分間ずつ２回反応した後、よく洗浄して除去した。無水酢酸とＤＩＥＡ、ＨｏＢｔ（Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）を入れて一時間アセチル化を行った後、製造されたペプチジルレジンをＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールでそれぞれ３回洗浄し、窒素空気を徐々に流して乾燥した後、五酸化リン（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ  ｐｅｎｔｏｘｉｄｅ，  Ｐ２Ｏ５）下で真空で減圧し、完全に乾燥した後、脱漏溶液［ＴＦＡ（Ｔｒｉｆｌｕｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）  ９５％、蒸留水２．５％、チオアニソール（Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）  ２．５％］  ３０ｍｌを入れた後、常温で時々振りながら２時間反応を維持した。フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量の溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分乾燥し、精製前のＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇペプチド１（配列番号１）を０．８０ｇ合成した（収率：  ８８．８％）。分子量測定器を利用して測定時、分子量８４６．７（理論値：  ８４６．９）が得られた。上記のような方法で、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｔｈｒペプチド２（配列番号２）及びＡｌａ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓペプチド３（配列番号３）も合成した（収率：それぞれ８６．４％、８３．２％）。分子量測定器を利用して測定時、分子量１０８６．３（理論値：  １０８６．３）及び１０７３．０（理論値：１０７３．３）の値がそれぞれ得られた。
【００３６】
【表１】
2019014719.tif 000003
【００３７】
実施例１：ＴＲＡＰ染色
破骨細胞の分化時に発現されるＴＲＡＰタンパク質の程度を、染色を通じて確認し、ペプチド処理時減少される傾向を観察した。
【００３８】
１×１０４細胞／ウェルで４８−ウェルプレートにＲａｗ２６４．７大食細胞をシーディングして、同時に濃度別にペプチドを処理（ペプチド単独または５０  ｎｇ／ｍｌ  ＲＡＮＫＬ同時処理）して、５日間培養して分化を誘導した。Ｓｉｇｍａ  ａｌｄｒｉｃｈ社のａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｋｉｔを使用して、ＴＲＡＰ染色を行った。固定バッファーを添加後、３０秒間反応し、蒸留水で洗浄した。染色溶液をウェル当たり２００μｌを入れて、３７℃で３０分間反応した後、蒸留水で洗浄した。一日間乾燥した後、顕微鏡で観察した。
【００３９】
ＲＡＮＫＬ処理により破骨細胞分化が誘導され、ＴＲＡＰ発現が増加された対照群に比べ、配列番号１乃至３ペプチドを処理した群では、ＴＲＡＰ発現が濃度依存的に減少されたことを観察することができた（図１ａ−ｃ）。
【００４０】
実施例２：ＴＲＡＰ及びカテプシンＫ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ）に対するＲＴ−ＰＣＲ
破骨細胞の分化時発現されるＴＲＡＰ及びカテプシンＫ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ）のｍＲＮＡ  ｌｅｖｅｌを、ＲＴ−ＰＣＲを通じて確認し、ペプチド処理時減少される傾向を観察した。
【００４１】
１×１０４細胞／ウェルの細胞密度で４８−ウェルプレートにＲａｗ２６４．７細胞をシーディングした。５０ｎｇ／ｍｌ  ＲＡＮＫＬとペプチドを濃度別（１０、５０μｇ／ｍｌ）に処理して、５日間３７℃培養器で培養した。培養完了された細胞回収後、ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅａｓｙ  Ｂｌｕｅ，  Ｉｎｔｒｏｎ）処理して、ＲＮＡを用意した後、ＲＴ  ｐｒｅｍｉｘ（Ｉｎｔｒｏｎ）を使用してｃＤＮＡを合成した。各標識因子（カテプシンＫ、ＴＲＡＰ）に対するプライマーとＰＣＲ  ｐｒｅｍｉｘ（Ｉｎｔｒｏｎ）を使用してＰＣＲを行った。１％アガロースゲルにＰＣＲ結果物５μｌずつをローディングして、電気泳動した後、Ｇｅｌ−Ｄｏｃでバンドを確認した。ＲＡＮＫＬ処理により誘導された破骨細胞分化マーカー、ＴＲＡＰ及びカテプシンＫの発現が、配列番号１乃至３ペプチド処理により減少されたことを観察した（図２ａ〜ｃ）。
【００４２】
実施例３：ウェスタンブロットでＮＦ−κＢの位置移動分析
破骨細胞の分化時に促進されるＮＦ−κＢ核内移動を確認するために、核タンパク質を分離して、ＲＡＮＫＬ処理による核内ＮＦ−κＢレベル増加を観察した後、ペプチド処理による減少傾向を観察した。
【００４３】
５×１０５細胞／ウェルで６−ウェルプレートにマウス大食細胞株Ｒａｗ２６４．７大食細胞をシーディングした。一晩中培養後、無血清培地に入れ替え、６時間培養した。ＲＡＮＫＬ  ５０ｎｇ／ｍｌと素材を濃度別に処理し、３０分間培養した。処理完了された細胞から核タンパク質を抽出し、ＢＣＡ定量後、サンプルを用意して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに電気泳動した。ニトロセルロースメンブレインにトランスファーした後、５％スキムミルクを使用して、１時間ブロッキングした。１次抗体の抗−ＮＦ−κＢ  ｐ６５を１：１，０００でブロッキング溶液に希釈し、冷蔵で一晩中培養した。ＰＢＳＴで１５分間３回洗浄後、２次抗体の抗ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ−ＨＲＰを使用して、室温で１時間培養した。ＰＢＳＴで１５分間３回洗浄後、ＥＣＬ溶液で発色を進行した。
【００４４】
ＲＡＮＫＬ処理により誘導されたＮＦ−κＢの核内移動が、配列番号１乃至３のペプチド処理により減少されることを観察した（図３ａ〜ｃ）。
【００４５】
実施例４：ＴＲＡＰに対する免疫化学染色
破骨細胞の分化時に発現されるマーカーであるＴＲＡＰの発現程度を、蛍光染色を通じてより明確に再確認し、ペプチド処理による発現減少傾向を観察した。
【００４６】
２×１０４細胞／ウェルで４８−ウェルプレートにＲａｗ２６４．７大食細胞をシーディングして、同時に素材を濃度別に処理した。分化誘導５日後、細胞に４％パラホルムアルデヒドを入れて、２０分間常温で培養して固定した。ＰＢＳで３回洗浄後、０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｉｎ  ＰＢＳ）を入れて１５分間常温で培養した。その後、ＰＢＳで３回洗浄した。２％  ＢＳＡ（ｉｎ  ＰＢＳ）を入れて、１時間常温で培養してブロッキングさせた。１次抗体（ＴＲＡＰ）を２％  ＢＳＡに１：１００で希釈後、常温で２時間培養した。ＰＢＳで３回洗浄した後、テキサスレッド−融合２次抗体を２％  ＢＳＡに１：１００で希釈後、常温で１時間培養した。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＤＡＰＩが含まれているマウンティング溶液でマウンティングし、翌日蛍光顕微鏡で観察した。
【００４７】
ＲＡＮＫＬ処理により破骨細胞分化が誘導され、ＴＲＡＰ発現が増加された対照群に比べ、配列番号１乃至３のペプチドを処理した群では、ＴＲＡＰ発現が濃度依存的に減少されたことを観察した（図４ａ〜ｃ）。
【００４８】
実施例５：カテプシンＫに対する免疫化学染色
破骨細胞の分化時に発現されるマーカーであるカテプシンＫの発現程度を、蛍光染色を通じてより明確に再確認し、ペプチド処理による発現減少傾向を観察した。
【００４９】
２×１０４細胞／ウェルで４８−ウェルプレートにＲａｗ２６４．７大食細胞をシーディングして、同時に素材を濃度別に処理した。分化誘導５日後、細胞に４％パラホルムアルデヒドを入れて、２０分間常温で培養して固定した。ＰＢＳで３回洗浄後、０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｉｎ  ＰＢＳ）を入れて１５分間常温で培養し、ＰＢＳで３回洗浄した。２％  ＢＳＡ（ｉｎ  ＰＢＳ）を入れて、１時間常温で培養してブロッキングさせた。１次抗体（カテプシンＫ）を２％  ＢＳＡに１：１００で希釈後、常温で２時間培養した。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＦＩＴＣ−融合２次抗体を２％  ＢＳＡに１：１００で希釈後、常温で１時間培養した。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＤＡＰＩが含まれているマウンティング溶液でマウンティングし、翌日蛍光顕微鏡で観察した。
【００５０】
ＲＡＮＫＬ処理により破骨細胞分化が誘導され、カテプシンＫ発現が増加された対照群に比べ、配列番号１乃至３のペプチドを処理した群では、カテプシンＫ発現が濃度依存的に減少された（図５ａ〜ｃ）。
【図１ａ】
2019014719.tif 000004
【図１ｂ】
2019014719.tif 000005
【図１ｃ】
2019014719.tif 000006
【図２ａ】
2019014719.tif 000007
【図２ｂ】
2019014719.tif 000008
【図２ｃ】
2019014719.tif 000009
【図３ａ】
2019014719.tif 000010
【図３ｂ】
2019014719.tif 000011
【図３ｃ】
2019014719.tif 000012
【図４ａ】
2019014719.tif 000013
【図４ｂ】
2019014719.tif 000014
【図４ｃ】
2019014719.tif 000015
【図５ａ】
2019014719.tif 000016
【図５ｂ】
2019014719.tif 000017
【図５ｃ】
2019014719.tif 000018
【配列表】
2019014719000001.app