(57)【要約】      （修正有）【課題】寝たきり者、運動器官（骨、関節）や循環器に負担をかけられない人、毎日忙しい人が持続的な運動に代えてＰＰＡＲδを活性化させ、持続的な運動を継続しているのと同じ状態を食事摂取で作り出すことができる食品組成物の提供。【解決手段】エタノールで抽出したフライ麺のエーテル画分および／または酢酸エチル画分に含まれる成分を有効成分とするＰＰＡＲδ活性化用食品組成物である。また、フライ麺が着味フライ麺であることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エタノールで抽出したフライ麺のエーテル画分および／または酢酸エチル画分に含まれる成分を有効成分とするＰＰＡＲδ活性化用食品組成物。
【請求項２】
フライ麺が着味フライ麺である、請求項１記載のＰＰＡＲδ活性化用食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は食品組成物に関する。より詳しくは、PPARを活性化する食品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
PPARｓ（Peroxisome proliferator-activated receptors )は殆どの脊椎動物において発現している核内受容体の一種であり、多くのＤＮＡの発現を調節する転写因子として機能する。人の細胞内においてはPPARα、γ、δの３種類が見つかっており、このうちαとγの機能や役割については研究が盛んにおこなわれている。一方、PPARδは、最近の研究でようやく機能や役割が明らかになりつつある。
【０００３】
最近の研究で、PPARδの生理機能の一つとして、特に骨格筋において脂質代謝関連遺伝子の発現調節に関与していることが明らかになった。PPARδアゴニスト（GW501516）をラット骨格筋由来細胞に作用させ遺伝子発現を解析した検討では、脂肪酸の取り込み・輸送、ミトコンドリアの脂肪酸β酸化系酵素、脱共役タンパク質などの一連の脂肪酸代謝関連遺伝子の発現を誘導することが報告されている。このPPARδアゴニスト（GW501516）をマウスに投与した場合にも、骨格筋において脂肪酸代謝関連遺伝子の発現誘導および脂肪酸β酸化亢進が認められ、高脂肪食負荷による体重増加の抑制・脂肪重量の減少が見られた。また、インスリン抵抗性が改善されることも認められた（非特許文献１参照）。
【０００４】
肝臓におけるPPARδの役割として、PPARδの活性化によって肝臓における解糖系・ペントースリン酸経路の活性化を介し、肝臓からのグルコース供給減少・インスリン感受性を増加することが報告されている（非特許文献２参照）。
【０００５】
一方、骨格筋特異的にPPARδを過剰発現させたマウスにおいては、高脂肪食負荷による肥満等が生じにくいだけでなく、骨格筋においてミトコンドリアに富むＩ型筋線維が増加したことが報告されている。Ｉ型筋線維は遅筋線維・赤筋とも呼ばれ、疲労しにくい持久力に富んだ筋線維である。Ｉ型筋線維が増加した結果、PPARδ過剰発現マウスにおいて走行時間および走行距離がそれぞれコントロールマウスの約1.7倍、約2倍となったことが報告されている（非特許文献３参照）。このことから、PPARδの活性化がＩ型筋線維の増加・持久力向上に寄与するものと考えられている。
【０００６】
ところで、現在、日本は国民の４人に１人が６５歳以上という超高齢化社会を迎えている。そして、今後も早い速度で高齢者人口が増加し、２０３５年には３人に１人が、２０６０年には約２．５人に１人が６５歳以上になると推計されている。
【０００７】
高齢者の増加にともない、要介護者の割合も増加している。要介護になる原因は様々であるが、運動器の障害が約４分の１を占めている。運動器障害は、加齢により骨格筋量が低下し、筋力・筋持久力の低下または身体能力の低下が起こっている状態（サルコペニア）に起因しているものと考えられている。したがって、サルコペニアと診断された場合、要介護に移行するリスクが高まる。また、脊椎損傷による半身麻痺や脳梗塞などで長期の寝たきりやギプス固定となった場合にも筋萎縮が生じ、筋量が低下する。このような筋萎縮は廃用性筋萎縮と呼ばれ、遅筋型のＩ型繊維が優位に萎縮することが報告されている（非特許文献４）。 
いずれの場合においても、運動習慣を取り入れ、筋量の低下を防ぐことが推奨されている。
【０００８】
一方、食生活、運動習慣、喫煙、飲酒などの生活習慣により引き起こされる生活習慣病も問題となっている。例えば、食習慣が理由で発症する生活習慣病としては、糖尿病、肥満症、高脂血症、高血圧症、大腸がん、歯周病などがある。なかでも、糖尿病、肥満症、高脂血症、高血圧症と言った生活習慣病は、患者数が多いことに加えて、脳梗塞や心筋梗塞の原因となる動脈硬化症の発症と密接に関連していることから特に注目されている。
【０００９】
肥満にはお腹に脂肪がたまる内臓脂肪型肥満（内臓脂肪蓄積）があるが、内臓脂肪蓄積があると、糖尿病や高脂血症・高血圧などがおこりやすくなることがわかっている。しかも、これらが重複し、さらにその数が多くなるほど、動脈硬化を進行させるリスクが高まることもわかっている。そこで、内臓脂肪型肥満に高血糖、高血圧および脂質異常症のうち２つ以上が重なっている状態をメタボリックシンドロームと定義し、メタボリックシンドロームを早期発見・適切な指導を行うことで、生活習慣病の予防や改善が取り組まれている。生活習慣病の予防や改善についても運動習慣を取り入れることが推奨されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 15924-15929, 2003
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 3444-3449, 2006
【非特許文献３】Plos Biol. 2, e294, 2004
【非特許文献４】基礎老化研究  34(4), 5-11, 2010
【００１１】
筋力の低下抑制およびメタボリックシンドロームのいずれにおいても運動習慣を取り入れることが推奨されている。しかし、例えば寝たきり者が運動することはできない。また、運動器官（骨、関節）や循環器に負担をかけられない人、毎日忙しい人も持続的な運動を継続することは難しい。そのため、本人が持続的な運動を望んだとしても実施できないという問題が生じる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものである。すなわち、本発明は、持続的な運動に代えてPPARδを活性化させ、持続的な運動を継続しているのと同じ状態を作り出すことを目的とする。
【００１３】
本発明者らは、持続的な運動を食事摂取で代替できないか検討を行った。そして、フライ麺にPPARδを活性させる成分が含まれることを新たに見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題解決のため、本発明は、エタノールで抽出したフライ麺のエーテル画分および／または酢酸エチル画分に含まれる成分を有効成分とするPPARδ活性化用食品組成物を提供する。
【００１５】
かかる構成によれば、当該画分に含まれる成分はPPARを活性化させ、PPARδ遺伝子の下流にある骨格筋遺伝子の発現を活性化させる。これにより、食事摂取によって骨格筋量を増やすことができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、食事摂取によってPPARを活性化させることができ、PPARδ遺伝子下流にある骨格筋遺伝子の発現も活性化させることができる。これにより、
持続的な運動が困難な者であっても、食事摂取によって骨格筋量を改善することができる。また、骨格筋量を改善することで、サルコペニア、筋萎縮、メタボリックシンドロームの改善につながるものと考えられる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。本発明を説明するに当たり、まずフライ麺の製造方法について説明する。
【００１８】
本発明に用いられるフライ麺は、α化処理した麺を１５０℃前後の高温の油で脱水乾燥させたものを指す。油熱乾燥後のフライ麺は、水分含量が２〜５％、油脂含量が１５〜２０％程度となっている。フライ麺はそのまま抽出操作に供してもよいし、必要に応じて切断、粉砕して抽出操作に供してもよい。本実施形態においては、粉砕して用いることが好ましい。
【００１９】
本実施形態に用いられるフライ麺の製造方法としては特に制限されず、常法により製造された生麺を油熱乾燥させればよい。生麺の製造方法の一例としては、小麦粉等の原料粉に、副原料、練り水を加えて混練した後、複合・圧延・切出すことで生麺線を得ることができる。切出しではなく、エクストルーダ等で押し出して麺線としても良い。主原料たる原料粉としては小麦粉、澱粉等が使用される。副原料としては、かんすい、食塩、増粘剤、グルテン、卵白、色素、ビタミン、カルシウム等を必要に応じて添加することができる。本実施形態にかかる麺線の厚みは特に限定されないが、例えば０．６〜３．０ｍｍの範囲の厚みを例示することができる。
【００２０】
得られた生麺線は、続いて加熱処理を行う。加熱処理方法としては、高温流体に晒す方法、飽和水蒸気による蒸煮、茹で槽でのボイル等の既存技術を用いることができる。なお、ここで言う「高温流体」とは、例えば、高温空気、高温蒸気等を含むが、これに限定されない。加熱処理は複数回行ってもよい。加熱処理を複数回行う場合には、各加熱処理工程の間に、水分を付与する工程を設けてもよい。水分を付与する工程に関しては、シャワーによる方法や水槽への浸漬方法等が挙げられる。また、水分付与工程と同時に着味を行ってもよい。
【００２１】
最後に、乾燥処理を行う。乾燥処理に付す前に、通常は麺線を１食分量の重量にカットされてリテーナ等に型詰めされる。そして、型詰めされた状態で油熱乾燥処理を行う。
【００２２】
次に、フライ麺に含まれる成分の抽出方法について説明する。
まず、フライ麺をフードミルで粉末状となるまで破砕する。破砕後のフライ麺としては、８〜１４０メッシュの篩を通過する程度の大きさが好ましい。破砕した麺が大きすぎると、抽出が不十分になる怖れがある。一方、麺を細かく破砕しようとすると破砕に時間がかかったり、後述するエタノール抽出の際に、浸透しても拡散しづらくなったりする怖れがある。
【００２３】
次に、粉末状にしたフライ麺重量に対して少なくとも１５倍量の高濃度 エタノール を加え、３００ｒｐｍで３０分間振盪する。このとき、破砕した麺がエタノール中に拡散する程度の強さで撹拌することが好ましい。振盪した後、８時間以上静置した。静置後の内容物をろ紙を用いて吸引ろ過し、エタノールと固形残渣とを分離した。得られたエタノールに対して、エバポレーターおよびＮ２ガスを用いてエタノールを飛ばし、エタノールに溶出した成分を乾固した。
ここで、フライ麺に加えるエタノール量の上限は特に制限されない。しかし、フライ麺重量に対して１００倍程度までにすることが好ましい。１００倍を超えるエタノールを加えても、溶出する成分量の差は僅かである。また、大量のエタノールを加えると、エタノールを飛ばすのに時間がかかってしまう。なお、溶出に用いる高濃度エタノールは、９５％以上の濃度のエタノールを用いることが好ましい。
【００２４】
本実施形態ではエタノールで抽出を行ったが、他の溶媒による抽出を制限するものではない。他の溶媒としては、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール等の低級アルコール、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコールなどの室温で液体であるアルコール類を挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いて抽出してもよい。このうち、操作性や環境性の点から、室温で液体であるアルコール類、特に、炭素原子数１〜４の低級アルコールが好ましい。
【００２５】
乾固したエタノール抽出物にヘキサンと水を７：１の割合で加えて３００ｒｐｍで５ｍｉｎ撹拌し、乾固したエタノール抽出物を再度溶解させた。しばらく静置した後、ヘキサン層と水槽とを分離させ、ヘキサン層については上記と同様の手法で濃縮乾固して評価サンプルとした。
【００２６】
一方、ヘキサン層と分離した水層には、ジエチルエーテルを水槽の４倍量加えて３００ｒｐｍで５ｍｉｎ振盪し、上述のヘキサン―水の液液分配と同様の手法でジエチルエーテル層と水槽とを分離させた。ジエチルエーテル層については、上記と同様の手法で濃縮乾固して評価サンプルとした。
【００２７】
最後に、ジエチルエーテル層と分離した水層に対して、酢酸エチルを水槽の４倍量加えて加えて３００ｒｐｍで５ｍｉｎ振盪し、上述のヘキサン―水の液液分配と同様の手法で酢酸エチル層と水槽とを分離させた。酢酸エチル層については、上記と同様の手法で濃縮乾固して評価サンプルとした。最後に残った水層は、凍結乾燥して評価サンプルとした。
以上の手法により、フライ麺から合計４つの画分を得た。
【実施例】
【００２８】
（実施例１）
着味付フライ麺として、市販の製品（商品名「チキンラーメン」：日清食品株式会社製）を用いた。上述の方法に従って麺塊１７０ｇ(二袋分)のうち、１２０ｇを用いて各画分を得た。
【００２９】
（実施例２）
着味をしていない以外は実施例１と同じフライ麺を作成して用いた。得られたフライ麺１７０ｇのうち、１２０ｇを用いて上述の方法に従って各画分を得た。
【００３０】
（比較例）
油熱乾燥の代わりに熱風乾燥を用いた以外は、実施例１と同じ麺塊を作成して用いた。得られたノンフライ麺１７０ｇのうち、１２０ｇを用いて上述の方法に従って各画分を得た。
【００３１】
次に、本実施形態では、PPARδ活性化能についてレポーターアッセイ法を用いて測定した。レポーターアッセイ法は次のようにして行った。
【００３２】
＜プラスミドの作成＞
ラット肝臓のcDNAを鋳型に、PCRによりRat PPARδ リガンド結合部位（NCBI RefSeq NM_011145, nt690-1595）を増幅した。Forward primerには5’側に任意の数塩基とMluＩ制限酵素認識配列を、Reverse primerには5’側に任意の数塩基とKpnＩ制限酵素認識配列を付加したものを用いた。PCR増幅産物を制限酵素処理（MulＩ,KpnＩ(New England Biolabs Japan)）した後、pBIND vector（Promega）のマルチクローニングサイト（MulＩ/KpnＩ）へ挿入し、pBIND-ratPPARδLBDを得た。
【００３３】
＜培養細胞＞
アフリカミドリザル腎臓由来細胞株CV-1を1.0×105個／mLとなるよう調整し、10%FBSを含むDMEM培地（GibcoTM）に懸濁した。500μL／wellで平底24wellプレートへ播種し、5%CO2雰囲気下、37℃、24時間培養した。
【００３４】
＜トランスフェクション＞
Opti-MEM(GibcoTM)を用いて、GAL4結合配列の下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミドpG5luc（Promega）およびpBIND-ratPPARδLBDを各20ng/μL濃度となるよう混合したプラスミド溶液を作成した。プラスミド溶液の1/10量となるようFuGENE（登録商標） HD Transfection Reagent（Promega）を加えて混合した後、15分間静置した。この溶液を上記24時間培養後のCV-1細胞に25μL／wellで添加し、37℃で4時間培養をおこなった。4時間後に培地を除去し、10%FBSを含むDMEM培地500μLを添加した。
【００３５】
＜レポーターアッセイ＞
トランスフェクションの24時間後に培地を除去した。培地を除去後、DMEM（−FBS）培地500μLを加え、さらに実施例１，２及び比較例の各画分が最終濃度0.01%となるようにDMEM（−FBS）培地にそれぞれ添加した。その後、5%CO2雰囲気下、37℃、24時間培養した。なお、コントロールとして何も添加しないwellを、陽性対照にはPPARδの合成リガンドであるGW501516（Chemscene）を最終濃度１nMとなるように添加したwellを、それぞれ用意した。
【００３６】
24時間培養後、培地を除去し、PBS（−）で２回洗浄した。PBS（−）除去後、Dual-Luciferase（登録商標） Reporter Assay System（Promega）のPassive Lysis Bufferを用いて細胞を溶解させた。96well白色マイクロプレート（Corning）へ細胞溶解液を25uLずつ加えた後、ルミノメーターにてルシフェリンを含む基質溶液を加え、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。
【００３７】
PPARδの活性化能は次のようにして求めた。
PPARδ活性化能＝(pG5lucによるホタルルシフェラーゼ活性)／（pBIND-ratPPARδLBDによるウミシイタケルシフェラーゼ活性）
結果はControl（溶媒対照）のPPARδ活性化能を100としたときの相対値で示した。なお、試験を３回行い、その平均値を算出した。結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
表１から明らかなように、実施例１，２における酢酸エチル画分は、どちらも非常に高いPPARδの活性化能を示した。これらの値はPPARδリガンド結合部位に優位的に結合し、下流遺伝子を活性化することが知られているGW501516よりも1.5倍以上高い値であった。また、実施例１においては、ジエチルエーテル画分でも、GW501516よりも高いPPARδ活性化能を示した。
これらの事からエタノールで抽出したフライ麺のエーテル画分および／または酢酸エチル画分には、PPARδリガンド結合部位への結合及び下流遺伝子の発現を活性化する成分が含まれていることが示唆された。
【００４０】
一方、比較例では、いずれの画分においても陽性対象よりも高い活性化能を示すものはなかった。むしろ、実施例１，２では低かったヘキサンにおいて最も活性化能が高いという結果が得られた。しかしながら、ヘキサンにおいて活性化能は高かったが、陽性対象よりは低い結果となった。実施例１，２及び比較例の結果から、水溶性画分についてはコントロールとほぼ同一の結果であり、水溶性画分にPPARδの活性化能は認められなかった。
これらの結果から、次のことが推察された。
【００４１】
実施例１，２と比較例との結果から、フライ麺にはPPARδ活性化能を高める成分が含まれていることが示唆された。また、当該成分は酢酸エチル画分に最も多く含まれていることが明らかとなった。さらに、当該画分は親油性であることが示唆された。
【００４２】
フライ麺には元々PPARδ活性化能を高める成分が含まれている可能性があるが、着味をしてからフライ麺にすると、さらにPPARδ活性化能を高める成分が増加することが示唆された。当該成分は着味液が高温で処理されたことで増加している可能性が示唆された。
【００４３】
以上説明したように、フライ麺にはPPARδの活性化能を高める成分が含まれていることが示唆された。したがって、本発明によれば、持続的な運動に代えてPPARδ遺伝子を高発現させ、持続的な運動を継続しているのと同じ状態を作り出すことができる。これにより、普段の食事で骨格筋量を増やすことができるため、サルコペニア、筋萎縮、メタボリックシンドロームの改善につなげられるという、極めて優れた効果を奏する。