(57)【要約】      （修正有）【課題】人体の細動脈等の小径の人工血管を任意の形状及びサイズで作製可能な方法及び人工血管を提供する。【解決手段】繊維芽細胞を含む第１及び第２の細胞シート１１，１２を用意し、血管を模擬した外形をなすチタン線１７の外面に血管内皮細胞をコートした後、第１及び第２の細胞シートの間にチタン線を挟み込んだ上で、第１及び第２の細胞シートを密着させて所定時間放置することで、血管内皮細胞をチタン線から第１及び第２の細胞シートに移動させ、チタン線を除去することで、チタン線が存在していた第１及び第２の細胞シートの間に内腔部分が形成され、内腔部分の内壁側に血管内皮細胞が付着した状態の人工血管部が作製される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊維芽細胞を含む２次元形状若しくは３次元形状をなす第１及び第２の細胞体を用意し、血管を模擬した外形をなす型部材の外面に血管内皮細胞をコートした後、前記第１及び第２の細胞体の間に前記型部材を挟み込んだ上で、前記第１及び第２の細胞体を密着させて所定時間放置することで、前記血管内皮細胞を前記型部材から前記第１及び第２の細胞体に移動させ、前記型部材を除去することで、当該型部材が存在していた前記第１及び第２の細胞体の間に内腔部分が形成され、当該内腔部分の内壁側に前記血管内皮細胞が付着した状態の人工血管部が作製されることを特徴とする人工血管ユニットの製造方法。
【請求項２】
前記型部材には、前記血管内皮細胞の外側に平滑筋細胞がコートされ、前記型部材を除去することで、前記血管内皮細胞及び前記平滑筋細胞が前記内腔部分の内壁側に付着した状態の人工血管部が作製されることを特徴とする請求項１記載の人工血管ユニットの製造方法。
【請求項３】
前記型部材は、外周面への細胞付着を可能とする材質の線状部材からなり、当該線状部材を前記第１及び第２細胞体の間から引き抜くことで、前記内腔部分が形成されることを特徴とする請求項１又は２記載の人工血管ユニットの製造方法。
【請求項４】
前記型部材は、細胞が外面側へ細胞付着が可能となり、且つ、前記第１及び第２の細胞体を溶解しない所定の化合物により溶解可能なバイオマテリアルからなり、前記第１及び第２の細胞体を密着させて所定時間放置してから、前記第１及び第２の細胞体の少なくとも一方に前記化合物を添加することで、前記型部材を溶解して前記内腔部分を形成することを特徴とする請求項１又は２記載の人工血管ユニットの製造方法。
【請求項５】
繊維芽細胞を含む２次元形状若しくは３次元形状をなす第１及び第２の細胞体と、これら第１及び第２の細胞体の間に形成された内腔部分とを備え、
前記内腔部分は、その内壁側に少なくとも前記血管内皮細胞が存在し、前記内腔部分とその周囲の部分が人工血管部として機能することを特徴とする人工血管ユニット。
【請求項６】
前記内腔部分は、直径２００μｍ未満であることを特徴とする請求項５記載の人工血管ユニット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工血管ユニットの製造方法及び人工血管ユニットに係り、更に詳しくは、人体の細動脈に相当する小径の人工血管部を含む人工血管ユニットの製造方法及び人工血管ユニットに関する。
【背景技術】
【０００２】
任意のサイズ及び形状に作製可能な従来の人工血管としては、人体の動脈等に相当する直径２００μｍ以上の比較的大きな径の人工物が存在するが、人体の細動脈や毛細血管等の直径に相当する２００μｍ未満の小径の人工物の作製は困難とされている。
【０００３】
ところで、特許文献１には、血管内皮細胞からなる内層と、内層上に設けられたコラーゲンに平滑筋細胞を埋め込んでなる中間層と、中間層上に設けられたセグメント化ポリウレタンフィルムからなる外層とからなる人工血管が開示されている。この人工血管は、次のように作製される。すなわち、先ず、ガラス棒等のマンドレル（心棒）の周囲に平滑筋細胞を含むコラーゲンからなる中間層を形成した後、当該中間層上にセグメント化ポリウレタンフィルムを巻き付けて外層とした２層構造体を形成する。そして、２層構造体からマンドレルを抜き出し、その結果得られた円筒状の２層構造体の内面に内皮細胞を播種し、適当な培地中で体温程度の温度で培養することで、人工血管が得られる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−２４３５１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、前記特許文献１に開示された人工血管の製造方法では、人工物からなる外層を設けずに、人体の細動脈に相当する直径の人工血管を得ることができない。すなわち、特許文献１の製造方法では、円筒状の２層構造体の内部からマンドレルを引き抜く際に、それらの間に摩擦力が作用し、２層構造体が内面側からのせん断力により部分的に変形易くなり、セグメント化ポリウレタンフィルムが巻き付けられていないと、２層構造体が破損し易くなる。この問題は、２層構造体を小径にする程、顕著となり、この製造方法では、人体の細動脈に相当する２０μｍ〜２００μｍの径の人工血管を作製することができない。また、特許文献１の製造方法では、人工血管に内皮細胞を付着する工程として、円筒状の２層構造体の内面に内皮細胞を播種しているが、当該工程では、２層構造体を小径にする程、２層構造体の内面に内皮細胞を均一に播種することが難しくなり、この点も、人体の細動脈以下の小径人工血管の作製を阻害する要因となる。
【０００６】
本発明は、このような不都合に着目して案出されたものであり、その目的は、人体の細動脈等に相当する小径の人工血管を任意の形状及びサイズで作製することができる人工血管ユニットの製造方法及び人工血管ユニットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するため、本発明は、繊維芽細胞を含む２次元形状若しくは３次元形状をなす第１及び第２の細胞体を用意し、血管を模擬した外形をなす型部材の外面に血管内皮細胞をコートした後、前記第１及び第２の細胞体の間に前記型部材を挟み込んだ上で、前記第１及び第２の細胞体を密着させて所定時間放置することで、前記血管内皮細胞を前記型部材から前記第１及び第２の細胞体に移動させ、前記型部材を除去することで、当該型部材が存在していた前記第１及び第２の細胞体の間に内腔部分が形成され、当該内腔部分の内壁側に前記血管内皮細胞が付着した状態の人工血管部が作製される、という手法を採っている。
【０００８】
また、前記型部材には、前記血管内皮細胞の外側に平滑筋細胞がコートされ、前記型部材を除去することで、前記血管内皮細胞及び前記平滑筋細胞が前記内腔部分の内壁側に付着した状態の人工血管部が作製される、という手法を採ることもできる。
【０００９】
更に、前記型部材は、外周面への細胞付着を可能とする材質の線状部材からなり、当該線状部材を前記第１及び第２細胞体の間から引き抜くことで、前記内腔部分が形成される、という手法を採ることができる。
【００１０】
また、前記型部材は、細胞が外面側へ細胞付着が可能となり、且つ、前記第１及び第２の細胞体を溶解しない所定の化合物により溶解可能なバイオマテリアルからなり、前記第１及び第２の細胞体を密着させて所定時間放置してから、前記第１及び第２の細胞体の少なくとも一方に前記化合物を添加することで、前記型部材を溶解して前記内腔部分を形成する、という手法を採ることができる。
【００１１】
更に、本発明は、繊維芽細胞を含む２次元形状若しくは３次元形状をなす第１及び第２の細胞体と、これら第１及び第２の細胞体の間に形成された内腔部分とを備え、前記内腔部分は、その内壁側に少なくとも前記血管内皮細胞が存在し、前記内腔部分とその周囲の部分が人工血管部として機能する、という構成を採っている。
【００１２】
ここで、前記内腔部分は直径２００μｍ未満である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、内腔部分が人工血管の管腔部分となる細胞組織内血管構造を人工的に作製することができる。内腔部分の形状及びサイズは、型部材の形状及びサイズに応じて比較的に自由に形成でき、しかも、第１及び第２の細胞体を密着させた状態で型部材が除去されるため、当該型部材を第１及び第２の細胞体から引き抜く場合であっても、内腔部分を周囲から広範囲で支持することができるため、内腔部分を小径にしたときの破損を抑止することができる。更に、第１及び第２の細胞体の内部の型部材を溶解する場合には、前述した型部材の引き抜きの場合よりも、内腔部分の小径化や形状の複雑化をより促進することができる。つまり、本発明によれば、比較的簡単な工程により、従来無かった人体の細動脈等に相当する小径の人工血管部を任意の形状とサイズで作製することができ、当該人工血管部を含むユニット全体として、人体の細動脈等の部位への移植等の利用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の一実施形態に係る人工血管ユニットの模式図である。
【図２】（Ａ）〜（Ｅ）は、前記人工血管ユニットの作製手順を説明するための概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
図１には、本発明の一実施形態に係る人工血管ユニットの模式図が示されている。この図において、人工血管ユニット１０は、繊維芽細胞を含む細胞体としての上下一対の第１及び第２の細胞シート１１，１２と、これら細胞シート１１，１２の間に形成された内腔部分１４とからなる。内腔部分１４は、当該内腔部分１４を形成する内壁側に血管内皮細胞が存在した状態となっている。
【００１６】
前記人工血管ユニット１０の製造方法につき、図２を用いながら、以下に説明する。
【００１７】
先ず、繊維芽細胞を含む第１及び第２の細胞シート１１，１２を用意し、図２（Ａ）に示されるように、培養容器１６内に下側となる第２の細胞シート１２を置く。そして、同図（Ｂ）に示されるように、所望とする血管の径及び外形に相当する形状に設けられた型部材としての線状部材のチタン線１７を第２の細胞シート１２の上面側に載せる。ここで、チタン線１７は、予め外周面に血管内皮細胞が接着され、当該血管内皮細胞を表面にコートした状態となっている。そして、同図（Ｃ）に示されるように、第２の細胞シート１２及びチタン線１７の上方から第１の細胞シート１１を被せる。更に、遠心圧着等により、各細胞シート１１，１２を隙間なく密着させる。その状態で、同図（Ｄ）に示されるように、培養容器１６内に所定の培地１８を入れ、細胞培養を行った後、各細胞シート１１，１２を固定した状態で、それらの間からチタン線１７が引き抜かれる。そして、同図（Ｅ）に示されるように、チタン線１７の存在していた各細胞シート１１，１２の間に内腔部分１４が形成される。この際、血管内皮細胞は、チタン線１７から細胞シート１１，１２に移動しており、内腔部分１４の内壁側に血管内皮細胞が付着し、その外側が繊維芽細胞で囲まれる。このようにして、内腔部分１４とその周囲の部分が人工血管部として機能する細胞組織内血管構造をなす人工血管ユニット１０が作製される。
【００１８】
なお、前記細胞シート１１，１２は、説明の便宜状２層としたが、当該図示例に限定されるものではなく、更に多層構造にしても良い。
【００１９】
また、前記細胞体としては、２次元形状のシート状に限定されるものではなく、繊維芽細胞を含む限りにおいて、バイオ３Ｄプリンター等によって形成されたブロック状や塊状（スフェロイド）等、３次元形状の構造物としても良い。
【００２０】
更に、前述の実施形態では、チタン線１７の外周面に血管内皮細胞のみをコートしているが、更に、血管内皮細胞の上から平滑筋細胞を付着させることで、平滑筋細胞を血管内皮細胞とともにチタン線１７から細胞シート１１，１２に移動させることも可能である。この場合、細胞シート１１，１２において、内腔部分１４を形成する内壁側に、内側から血管内皮細胞、平滑筋細胞及び繊維芽細胞の順で積層された３層構造の人工血管部を作製することができる。
【００２１】
また、前記型部材としては、チタン線１７に限定されるものではなく、血管内皮細胞が表面に付着可能であり、且つ、前記細胞体の内部から除去可能な限りにおいて、金、クロム等の他の金属線、その他種々の線状部材を採用することができる。
【００２２】
更に、前述の実施形態では、チタン線１７を前記細胞体の内部から引き抜いているが、本発明はこれに限らず、前記細胞体の内部に存在する型部材を溶解することで、型部材を前記細胞体の内部から除去する態様を採ることもできる。ここでの型部材としては、ゼラチンやコラーゲン等の細胞外マトリクス成分からなるバイオマテリアル、或いは、フィブリンからなるバイオマテリアルを例示できる。これらの型部材は、前記細胞体を溶解しない所定の化合物により溶解可能なバイオマテリアルであれば何でも良く、前述と同様の手順により、表面に血管内皮細胞が接着された状態で前記細胞体の内部に配置される。そして、これらの型部材を前記細胞体の内部から除去する際には、当該細胞体の表面側から分解酵素等の化合物を添加して型部材のみを溶解する。ここでの分解酵素としては、例えば、ゼラチンに対するゼラチナーゼ、コラーゲンに対するコラゲナーゼ等のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）が適用され、フィブリンに対しては、細胞の溶解を防ぐために蛋白分解酵素阻害薬が混入されたプラスミンが適用される。
【実施例】
【００２３】
（実施例１）
１．ヒト皮膚繊維芽細胞からなる細胞シートの作製
先ず、ヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）を含む細胞シートを、直径１００ｍｍの培養皿を用い、以下（１）〜（７）の手順で作製した。
（１）１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）と１％ＡＢ（ペニシリン−ストレプトマイシン）を混合したＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）を培地として培養したＮＨＤＦを３７℃に温めたＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で２ｍｌ×３回洗浄した。
（２）更に、ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液）を用いて５倍に希釈したトリプシン２ｍｌを加え、３７℃インキュベータ内で５分間放置した。
（３）培養皿の縁を軽く叩き、細胞を培養皿から剥がした上で、ＤＭＥＭを２ｍｌ加え、トリプシンを中和した細胞懸濁液を遠沈管に入れた。この作業は２回行われ、培養皿の全ての細胞が全て遠沈管に入れられた。
（４）細胞懸濁液が入れられた遠沈管を遠心機に入れ、２５℃、３００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。
（５）上澄み液をアスピュレーターで吸引し、ＤＭＥＭを入れて混ぜ、セルカウントを行った。
（６）２００×１０４ｃｅｌｌｓの細胞を、ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）（株式会社セルシード社製の細胞シート回収用温度応答性培養皿）に入れ、合計２ｍｌになるようにＤＭＥＭを入れ、３７℃インキュベータで３日間培養した。
（７）その後、２０℃インキュベータに入れて低温処理を行ってから、細胞シートを剥離した。
【００２４】
２．チタン線表面へのヒト血管内皮細胞の接着
ここでは、細胞が接着しないように超親水性ポリマーを表面に固定してなる培養皿（株式会社セルシード社製、商品名「ＨｙｄｒｏＣｅｌｌ」（登録商標））を用い、当該培養皿に、５０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈのヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と、直径１００μｍのマイクロチタン線とを入れた状態で、ＨＵＶＥＣを３日間培養することで、マイクロチタン線の外周面にＨＵＶＥＣを接着した。
【００２５】
３．細胞シート間の血管構造の作製
次の手順（１）〜（５）により、前述で得られた細胞シートを複数枚積層し、各細胞シートの間に、人工血管の内腔部分に相当する血管構造を作製した。
（１）前述で得られた１枚目の細胞シートを直径６０ｍｍの培養皿に入れ、３７℃インキュベータ中で１時間静置することにより、培養皿と１枚目の細胞シートとを接着させた。
（２）（１）と同様の処理により培養皿に接着した状態の２枚目の細胞シートを培養皿から剥離し、培養皿に接着した状態の１枚目の細胞シートの上面に、ＨＵＶＥＣが表面にコートされた前述のマイクロチタン線を載せ、その上側から、２枚目の細胞シートを積層した状態で２０分間静置した。
（３）次に、遠心機を使って遠心圧着することで、１枚目及び２枚目の細胞シートの間におけるマイクロチタン線の周囲に生じた隙間を消失させ、各細胞シートが密着するように各細胞シートを接着した。
（４）更に、各細胞シートの接着性を高めるために、３７℃インキュベータ中で１時間静置した後、ＤＭＥＭを入れて１日静置した。
（５）その後、４％パラフォルムアルデヒドで各細胞シートを固定してマイクロチタン線を各細胞シートの間から引き抜いた。そして、各細胞シートの間でマイクロチタン線が存在していた部分が中空の内腔（管腔）部分となり、当該内腔部分を形成する内壁側に、マイクロチタン線の外周面に接着していたＨＵＶＥＣが移動した状態となった。この内腔部分を形成する内壁側は、ＮＨＤＦの内側にＨＵＶＥＣが存在する状態となった。このようにして、各細胞シートの間に人工血管部が設けられた細胞組織内血管構造をなす人工血管ユニットが作製された。
【００２６】
前記実施例１で得られた人工血管ユニットにあっては、本発明者らの実験により、マイクロチタン線の外周面に接着していたＨＵＶＥＣのうち、細胞シートに接する部分のＨＵＶＥＣが細胞シート側に移動したことが実証された。すなわち、ここでは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を添加したＨＵＶＥＣを使用し、ＨＵＶＥＣが付着した状態のマイクロチタン線の外周面と、細胞シートから抜き取った後の人工血管ユニットの内腔部分及びマイクロチタン線の外周面とについて、蛍光顕微鏡を使って蛍光観察を行った。その結果、細胞シートから抜き取った後は、マイクロチタン線の外周面における細胞シートに接する部分には、ＨＵＶＥＣが殆ど残っておらず、当該ＨＵＶＥＣが人工血管ユニットの内腔部分を形成する内壁側をなす細胞シートの部分に殆ど移動して付着したことが実証された。
【００２７】
以上によれば、チタン線に接着した血管内皮細胞を剥離する処理を行うことなく、チタン線を細胞シート間に挟んで抜くだけで、チタン線に接着した細胞を細胞シートに付着させることができる。
【００２８】
（実施例２）
本実施例では、実施例１の作製方法におけるマイクロチタン線の代わりにゼラチンファイバーを用い、当該ゼラチンファイバーを溶解することで、前記内腔部分を形成した。
【００２９】
１．ゼラチンファイバーの作製
ここでのゼラチンファイバーは、親水性コロイド溶液にアルコールやケトン類等の沈殿材等を添加することで、濃厚なコロイドゾルが分離する現象を利用したコアセルベーション法により形成した。具体的には、２０％ゼラチン水溶液（新田ゼラチン株式会社製、商品名「Ｇ-１０１７Ｋ」）をケトン類のアセトン（和光純薬工業株式会社製）の中に入れ濃縮させた。当該濃縮後のゼラチンスライムを３０℃以上で湯煎してゾル状に変化させてから、３０℃程度まで冷まし、ゾルとゲルの間の状態にする。その後、ゼラチンスライムをピンセットで引っ張りながら伸ばすことでファイバー状とした。この引き伸ばし直後のゼラチンファイバーは、水分を多少含んでいるため、低摩擦となるポリエチレンテレフタレート製のシート上に載せ、水分を蒸発させ脱水した。そして、そのままのゼラチンファイバーでは、低温環境下であっても水に溶けてしまうため、得られたゼラチンファイバーを付加反応により架橋することで不溶化処理を行った。なお、ここでの架橋は、ラジカル反応、ＵＶ照射、マイクロ波加熱等の他の公知の手法により行っても良い。
【００３０】
２．ゼラチンファイバー表面へのヒト血管内皮細胞の接着
その後、インクジェットプリンタ等を用い、架橋したゼラチンファイバーの表面にＨＵＶＥＣがコートされた。なお、ＨＵＶＥＣや平滑筋細胞をゼラチンファイバーの表面に付着させる手段としては、細胞を含む溶液に対してのディップコート、ＬＢＬ（ＬＡＹＥＲ  ＢＹ  ＬＡＹＥＲ）法等、他の手段を用いることも可能である。
【００３１】
３．細胞シート間の血管構造の作製
ＨＵＶＥＣが表面側に付着したゼラチンファイバーを、実施例１と同様の手順で上下１対の細胞シートで挟み込んで、各細胞シートを密着させる。そして、ＨＵＶＥＣがゼラチンファイバーの表面側から細胞シート側に移動させた後、細胞シートにゼラチナーゼを添加し、架橋されたゼラチンファイバーをゼラチナーゼにより溶解して除去した。これにより、実施例１と同様に、各細胞シートの間でゼラチンファイバーが存在していた部分が中空の内腔部分となり、当該内腔部分を形成する内壁側に、ゼラチンファイバーの表面に接着していたＨＵＶＥＣが移動した状態となった。この管腔部分の周囲は、ＮＨＤＦの内側にＨＵＶＥＣが存在する血管構造部分となった。従って、この手法によっても、各細胞シートの間に、ＨＵＶＥＣがＮＨＤＦの内側に存在する人工血管部を有する人工血管ユニットが作製された。
【００３２】
なお、本発明は、前述の実施形態で説明した各種手法に限定されるものではなく、実質的に同様の作用効果を奏する限りにおいて、前述の実施形態に対して種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【００３３】
１０  人工血管ユニット
１１  細胞シート（型部材）
１２  細胞シート（型部材）
１４  内腔部分
１７  チタン線（型部材）
【図１】
2019198493.tif 000003
【図２】
2019198493.tif 000004