(57)【要約】      （修正有）【課題】十分な細胞透過性、優れたDNA/RNA選択性および長波長レーザーに対応する吸収帯を有する、生細胞DNAイメージングに有用な蛍光色素の提供。【解決手段】式（1A）で表されるシアニン化合物。2019014849.tif 000084［式中、R1及びR2は、置換若しくは非置換アリール基を示し、R3、R4、R5及びR6は、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アミノ基を示し、R7、R8、R9及びR10は同一又は異なって、水素原子、アルキル基、アルコキシ基を示す。X1は水素原子又はハロゲン原子を示す。Yは1価のアニオンを示す。nは0又は1を示す。X1がハロゲン原子である場合nは0である。］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（1A）：
【化１】
2019014849.tif 000082
［式中、R1及びR2は同一又は異なって、置換若しくは非置換アリール基を示す。R3、R4、R5及びR6は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換アルコキシ基、置換若しくは非置換アミノ基を示す。R7、R8、R9及びR10は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換アルコキシ基を示す。X1は水素原子又はハロゲン原子を示す。Yは1価のアニオンを示す。nは0又は1を示す。X1がハロゲン原子である場合nは0である。］
で表されるシアニン化合物。
【請求項２】
前記一般式（1A）におけるR1及びR2が置換又は非置換フェニル基である、請求項１に記載のシアニン化合物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のシアニン化合物を含有する蛍光色素。
【請求項４】
一般式（1）：
【化２】
2019014849.tif 000083
［式中、R1及びR2は同一又は異なって、置換若しくは非置換アリール基、又は置換若しくは非置換ヘテロアリール基を示す。R3、R4、R5及びR6は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換アルコキシ基、置換若しくは非置換アミノ基を示す。R7、R8、R9及びR10は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換アルコキシ基を示す。X1ｄは水素原子又はハロゲン原子を示す。Yは1価のアニオンを示す。nは0又は1を示す。X1がハロゲン原子である場合nは0である。］
で表されるシアニン化合物を含有する蛍光色素。
【請求項５】
前記一般式（1）におけるR1及びR2が置換又は非置換フェニル基である、請求項４に記載の蛍光色素。
【請求項６】
DNA検出剤である、請求項３〜５のいずれかに記載の蛍光色素。
【請求項７】
植物細胞染色剤である、請求項３〜５のいずれかに記載の蛍光色素。
【請求項８】
請求項１若しくは２に記載のシアニン化合物又は請求項３〜７のいずれかに記載の蛍光色素を含む、DNA検出用キット。
【請求項９】
被検材料と、請求項１若しくは２に記載のシアニン化合物又は請求項３〜７のいずれかに記載の蛍光色素と接触させた後に、光照射を行う工程を備える、被検材料中のDNAを検出する方法。
【請求項１０】
前記光照射が、波長が500〜700nmの光を照射する工程である、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シアニン化合物及びそれを用いた蛍光色素に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNA（デオキシリボ核酸）は、生物の遺伝情報を担う生体高分子であり、蛍光色素を用いこれを高感度に蛍光検出する技術は現在の生命科学研究を支える必須な研究ツールとなっている。このような蛍光色素、すなわち蛍光性DNA染色色素はDNA非存在下での蛍光強度が弱いが、DNAに結合すると著しい蛍光増幅を示すため、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Real-time PCR）や、DNAのゲル電気泳動等様々な用途に用いられている。
【０００３】
近年、光学顕微鏡及び検出器技術の目覚ましい発展に伴い、生細胞内DNA（核DNA、ミトコンドリアDNA等）の動的挙動を可視化する研究が精力的に行われている。理想とされる生細胞DNA染色を実現するには、少なくとも、DNA染色分子が、(1)高い細胞透過性を有すること、(2)DNA/RNA選択性に優れること、(3)光毒性を誘発しにくい長波長レーザーに対応する吸収帯を有していること、の3つの性質が求められる。しかし既存の蛍光色素で、上記の3つの性質を全て満たす分子は報告されていない。
【０００４】
例えば、生細胞核染色で幅広く使われているHoechst分子群（例えば、非特許文献１参照）は、細胞に有害な紫外光付近（365nm又は405nm）のレーザーでの光励起が必要である。この問題を解決すべく、近年Hoechstと近赤外蛍光発する分子（Silicon Rhodamin等）を適当なリンカーで連結させた分子（Sir-Hoechst）がKaiらによって報告された（例えば、非特許文献２参照）。報告されたSir-Hoechstの最大吸収波長は650nm付近にあり、汎用の長波長レーザー（633nm）を用いた光励起を実現している。しかし、Sir-HorchstはDNA結合定数においてHoechstよりも1000倍も損ねてしまうことが明らかになっている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００５】
非対称シアシニン分子群もDNA染色に使われている有名な分子骨格であり、合成が容易かつ吸収波長域の制御を自在に行えることから、これまでに多種多様の誘導体が報告された。既存の非対称シアニン色素はDNA/RNA選択性が乏しい欠点がある。2001年にThiazole Orange (TO)を母骨格とするSYBR-Green (SG)及びPico-Green (PG)がMolecular Probe社によって開発された（例えば、特許文献１参照）が、低いDNA/RNA選択性に加え、細胞に有毒とされる488nmレーザーで光励起することが必要である。また、赤色発光を示すTORPO3群も報告されているが、DNA/RNA選択性が低いこと等のために、実用的な生細胞核染色には不向きである。
【０００６】
その他のDNA染色色素に関しては、4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)、Ethidium Bromide (EtBr)、Acridinium Orange (AO)、Crystal Violet (CV), 7-aminoactinomycin D (7-AAD)、及びそれらの誘導体が報告されているが、上記示した生細胞核染色に必要な3つの性質を全て満たす分子は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５６５８７５１号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Latt, S. A.; Wohlleb, J. C. Chromosoma.1975, 52, 297.
【非特許文献２】Nat. Commun. 2015, 6, 8497.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
生細胞DNAイメージングに使用する蛍光色素は、十分な細胞透過性を有し、DNA/RNA選択性に優れ、且つ、光毒性を誘発しにくい長波長レーザーに対応する吸収帯を有することが求められている。しかし、これら3つの課題を満たす分子群は開発されていない。本発明は、上記の課題を解決できる分子群を開発し、生細胞DNAイメージングに有用な分子群を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を鑑み、鋭意検討した結果、本発明者らは、特定の構造を有するシアニン化合物が、十分な細胞透過性を有し、核酸を染色できるとともにDNA/RNA選択性に優れ、且つ、可視光の長波長領域又は近赤外領域の光で励起可能であることを見出した。すなわち、本発明は以下の構成を包含する。
【００１１】
項１．一般式（1A）：
【００１２】
【化１】
2019014849.tif 000002
【００１３】
［式中、R1及びR2は同一又は異なって、置換若しくは非置換アリール基を示す。R3、R4、R5及びR6は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換アルコキシ基、置換若しくは非置換アミノ基を示す。R7、R8、R9及びR10は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換アルコキシ基を示す。X1は水素原子又はハロゲン原子を示す。Yは1価のアニオンを示す。nは0又は1を示す。X1がハロゲン原子である場合nは0である。］
で表されるシアニン化合物。
【００１４】
項２．前記一般式（1A）におけるR1及びR2が置換又は非置換フェニル基である、項１に記載のシアニン化合物。
【００１５】
項３．項１又は２に記載のシアニン化合物を含有する蛍光色素。
【００１６】
項４一般式（1）：
【００１７】
【化２】
2019014849.tif 000003
【００１８】
［式中、R1及びR2は同一又は異なって、置換若しくは非置換アリール基、又は置換若しくは非置換ヘテロアリール基を示す。R3、R4、R5及びR6は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換アルコキシ基、置換若しくは非置換アミノ基を示す。R7、R8、R9及びR10は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換アルコキシ基を示す。X1は水素原子又はハロゲン原子を示す。Yは1価のアニオンを示す。nは0又は1を示す。X1がハロゲン原子である場合nは0である。］
で表されるシアニン化合物を含有する蛍光色素。
【００１９】
項５．前記一般式（1）におけるR1及びR2が置換又は非置換フェニル基である、項４に記載の蛍光色素。
【００２０】
項６．DNA検出剤である、項３〜５のいずれかに記載の蛍光色素。
【００２１】
項７．植物細胞染色剤である、項３〜５のいずれかに記載の蛍光色素。
【００２２】
項８．項１若しくは２に記載のシアニン化合物又は項３〜７のいずれかに記載の蛍光色素を含む、DNA検出用キット。
【００２３】
項９．被検材料と、項１若しくは２に記載のシアニン化合物又は項３〜７のいずれかに記載の蛍光色素と接触させた後に、光照射を行う工程を備える、被検材料中のDNAを検出する方法。
【００２４】
項１０．前記光照射が、波長が500〜700nmの光を照射する工程である、項９に記載の方法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、十分な細胞透過性を有し、核酸を染色できるとともにDNA/RNA選択性に優れ、且つ、可視光の長波長領域又は近赤外領域の光で励起可能である化合物を提供することができる。この化合物は、植物の細胞であってもDNAを選択的に染色することができるため、DNAを検出するための色素又は生細胞での細胞核動態を解析するための色素として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】過剰のdsDNA存在下における色素1（2.1×10-6M）の光学スペクトルの変化を示す。(a) 吸収スペクトル  (b) 最大蛍光波長でモニターした蛍光スペクトル  (c) 532nmの光で励起した固有蛍光スペクトル
【図２】過剰のRNA存在下における色素1（2.1×10-6M）の光学スペクトルの変化を示す。(a) RNA添加時における色素1の吸収スペクトルの変化  (b) RNA添加時における色素1の蛍光増加  (c) 色素1のdsDNA及びRNAに対する蛍光応答性の比較
【図３】過剰のdsDNA及びRNAに対する色素5の光学スペクトルの変化を示す。(a) dsDNA添加時の吸収スペクトルの変化  (b) dsDNA添加時の蛍光スペクトルの変化  (c) 561nmで励起した固有蛍光スペクトル  (d) RNA添加時の吸収スペクトルの変化  (e) RNA添加時の蛍光スペクトルの変化  (f) dsDNA及びRNAに対する蛍光応答性の比較
【図４】過剰のdsDNA及びRNAに対する3種のモノメチン色素（色素2、色素3及び色素6）の光学スペクトルの変化を示す。(a) dsDNA存在下での色素2の吸収スペクトルの変化  (b) dsDNA存在下での色素2の蛍光スペクトルの変化  (d) dsDNA存在下での色素3の吸収スペクトルの変化。(e) dsDNA存在下での色素3の蛍光スペクトルの変化  (g) dsDNA存在下での色素6の吸収スペクトルの変化  (h) dsDNA存在下での色素6の蛍光スペクトルの変化  挿入図(c) (f) (i)は、532nm又は561nmの励起光を用いた場合の、色素2、色素3及び色素6の固有蛍光スペクトルである。
【図５】過剰のdsDNA存在下での4種のモノメチン色素（色素1、色素2、色素3及び色素6）の吸収及び蛍光極大波長の変化を示す。dsDNAの存在下での4つの色素の正規化された光学スペクトルを示す。(a) 吸収スペクトル  (b) 色素1及び色素2には532nmの光、色素3及び色素6には561nmの光を用いて励起する場合の4つの色素の未補正蛍光スペクトル  図内にそれぞれの色素の極大波長も示す。
【図６】過剰のdsDNA又はRNAに対する様々な色素の光学スペクトルの変化を示す。(a) Hoechst (4.8×10-6M)   (b) DAPI (7.8×10-6M)   (c) Pico-Green   (d) 色素2 (3.4×10-6M)   (e) 色素3 (4.9×10-6M)   (f) 色素6 (6.1×10-6M)
【図７】過剰のdsDNA又はRNAに対する色素10（2.1×10-6M）の光学スペクトルの変化を示す。(a) dsDNA添加による吸収スペクトルの変化  (b) dsDNA添加による蛍光スペクトルの変化  (c) 固有蛍光スペクトル  (d) RNA添加による吸収スペクトルの変化  (e) RNA添加による蛍光スペクトルの変化  (f) dsDNA及びRNAに対する蛍光応答性の変化
【図８】過剰のdsDNA存在下での4種のトリメチン色素（色素10、色素12、色素13及び色素14）の吸収及び蛍光極大波長の変化を示す。(a) 吸収スペクトル  (b) 未補正蛍光スペクトル  図内にそれぞれの色素の極大波長も示す。
【図９】過剰のdsDNA存在下での3種のトリメチン色素（色素12、色素13及び色素14）の吸収スペクトル(a, c, e)及び蛍光スペクトル(b, d, f)の変化を示す。 (a, b) 色素12  (c, d) 色素13  (e, f)色素14
【図１０】過剰のdsDNA及びRNAに対する3種のトリメチン色素（色素12、色素13及び色素14）における蛍光応答性の比較を示す。(a) 色素12（4.1×10-6M）  (b) 色素13（3.5×10-6M）  (c) 色素14（2.9×10-6M）
【図１１】トリメチン色素群（色素12、色素13及び色素14）の蛍光量子収率を示す。(a) 過剰のdsDNA存在下での絶対蛍光量子収率  (b) Cresyl violetのメタノール溶液（ΦF= 0.54）を基準として用いたdsDNA非存在下での相対蛍光量子収率
【図１２】過剰のdsDNA存在下でのモノメチン色素（色素1）とトリメチン色素（色素10）のCDスペクトルを示す。(a) 色素1（1.4×10-6M）  (b) 色素10（2.1×10-6M）
【図１３】1μMの色素1によるHeLa細胞の染色像を示す。(a) Plan-Apochromat 20×/0.8を用いて共焦点レーザー顕微鏡LSM780（Zeiss）にて、560nmで励起し570〜693nmの蛍光を収集した蛍光像と透過像の重ね合わせ図である。(b) HCX PL APO 100x/1.40 Oil STED WHITEを用いて共焦点レーザー顕微鏡TCS SP8（Leica）にて、560nmで励起し535〜585nmの蛍光を収集し、Huygens deconvolution software（Scientific Volume Imaging）によるデコンボリューション画像である。(c) 図１３(b)に引かれた黄色の線の相対蛍光強度である。
【図１４】色素1、色素5、色素10及び色素14によるHeLa細胞の生体染色像を示す。Plan-Apochromat 20x/0.8レンズを用いて共焦点レーザー顕微鏡システムLSM780（Zeiss）にて観察した。使用した色素の濃度、励起波長（Ex）及び蛍光波長（Em）は各画像に示している。スケールバーは10μmを示す。
【図１５】色素1 （1μM）による植物細胞染色像を示す。Plan-Apochromat 20x/0.8レンズを用いて共焦点レーザー顕微鏡システムLSM780（Zeiss）にて行った。(a) ヒメツリガネゴケの原糸体  (b) シロイヌナズナの葉  (c) シロイヌナズナの根  (d、e、f)は(a、b、c)で白枠で選択された部分の拡大図である。色素1の観察に使用した励起波長（Ex）及び蛍光波長（Em）を各画像に示している。また、(a, b, d, e)では、色素1の励起波長（514nm）により励起されるクロロフィルの自家蛍光を波長675〜693nmで取得し疑似青色にて示している。
【図１６】色素2（1μM）、色素3（1μM）、色素5（1μM）、及びSir-Hoechst（500nM）による植物細胞染色像を示す。(a-d) ヒメツリガネゴケの原糸体  (e-h) シロイヌナズナの葉  (i-l) シロイヌナズナの根  (a, e, i) 色素2  (b, f, j) 色素3  (c, g, k) 色素5  (d, h, l) Sir-Hoechst  色素2、色素3及び色素5により染色した細胞は、Plan-Apochromat 20x/0.8レンズを用いて共焦点レーザー顕微鏡システムLSM780（Zeiss）にて観察した。Sir-Hoechstにより染色した細胞は、HCS APO L 20x/0.95 IMMを用いてTCS-SP8（Leica）にて観察した。観察に使用した励起波長（Ex）及び蛍光波長（Em）を各画像に示している。
【図１７】ハロゲン置換-色素1の吸収スペクトル及びCDスペクトルを示す。(a) dsDNAに結合したときのBr-色素1の吸収スペクトルの変化  (b) dsDNAの存在下でのBr-色素1のCDスペクトル  (c) dsDNAへの結合時のCl-色素1の吸収スペクトルの変化  (d) dsDNAの存在下でのCl-色素1のCDスペクトル
【図１８】dsDNAに結合したときのBr-色素1に光照射した際の吸収スペクトルの変化を示す。
【図１９】dsDNAに結合したときのCl-色素1に光照射した際の吸収スペクトルの変化を示す。
【図２０】Cl-色素1の細胞内における光活性化を示す。(a) 光照射前の２つのHeLa細胞の蛍光画像  (b) 強い560nm（約5mW）の光を左側の細胞に照射した後の蛍光画像  (c) 小さな点線の円1中の蛍光輝度の経時変化  (d) 小さな点線の円2中の蛍光輝度の経時変化
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本明細書において、「含有」は、「含む（comprise）」、「実質的にのみからなる（consist essentially of）」、及び「のみからなる（consist of）」のいずれも包含する概念である。また、本明細書において、数値範囲を「A〜B」で示す場合、A以上B以下を意味する。
【００２８】
１．シアニン化合物
本発明のシアニン化合物は、一般式（1）：
【００２９】
【化３】
2019014849.tif 000004
【００３０】
［式中、R1及びR2は同一又は異なって、置換若しくは非置換アリール基、又は置換若しくは非置換ヘテロアリール基を示す。R3、R4、R5及びR6は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換アルコキシ基、置換若しくは非置換アミノ基を示す。R7、R8、R9及びR10は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換アルコキシ基を示す。X1は水素原子又はハロゲン原子を示す。Yは1価のアニオンを示す。nは0又は1を示す。X1がハロゲン原子である場合nは0である。］
で表されるシアニン化合物である。このシアニン化合物は、従来からDNA検出剤として知られる蛍光色素と比較して低分子量であり、また、可視光の長波長領域又は近赤外領域の光（特に可視光の長波長領域）で励起可能な化合物である。
【００３１】
モノメチン部位又はトリメチン部位を有するシアニン色素は初期状態の蛍光量子収率が低く、DNA存在下で顕著な蛍光増幅を示し、生細胞の核染色（特に核酸の染色）が可能である。本発明のシアニン化合物（特に、X1が水素原子である化合物）は、モノメチン部位又はトリメチン部位を有するシアニン色素骨格をもつ分子を基盤に、吸収及び蛍光波長の長波長化を図ったものである。得られた一連のシアニン化合物は、置換基（特にR1及びR2）の電子供与能を増大させることにより、DNA結合時の蛍光量子収率を減衰させることなく532nm、561nm等のレーザー源の吸収領域に適合させることが可能である。また、合成したシアニン化合物のDNA結合時の蛍光増幅能は数千倍と非常に高い。さらに、一般にシアニン色素は、DNA/RNA選択性に乏しいにもかかわらず、本発明のシアニン化合物は、非常に高いDNA/RNA選択性（IdsDNA/IRNA）を有し、DNA/RNA選択性が優れるとされるDAPI、Hoechst等の値を大幅に上回っている。また、本発明のシアニン化合物は、好ましい一態様では細胞透過性をより向上させることができるし、別の好ましい一態様では耐光性をより向上させることもできる。このことから、本発明のシアニン化合物が、多量のRNA分子が存在する生細胞内においてもDNAを選択的に染色することが可能である。特に、市販試薬では染色困難なシロイヌナズナ組織（葉、根等）やヒメツリガネゴケ等の植物細胞の核を固定することなく選択的に染色することも可能である。
【００３２】
さらに、シアニン化合物のX1をハロゲン原子（臭素原子、塩素原子等）とすることで、光誘起脱ハロゲン化に伴う蛍光活性化能を付与させることができる。この場合、光照射前後での構造変化及び電子的性質は最小限に抑えられているため、核局在性を保持したまま光照射によってハロゲン原子が水素原子に置換することにより蛍光強度を劇的に向上させることができる。このため、光照射した細胞のみに、特異的に光活性化状態に誘起することで、特定の細胞核を強く光らせることも可能である。従来の蛍光タンパク質を用いた方法と比較した場合、遺伝子導入に頼らないため、様々な生物種の細胞において光照射により細胞核を光らせる蛍光強度を変えることが可能である。
【００３３】
このような本発明のシアニン化合物のうち、一般式（1A）：
【００３４】
【化４】
2019014849.tif 000005
【００３５】
［式中、R1及びR2は同一又は異なって、置換若しくは非置換アリール基を示す。R3、R4、R5及びR6は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換アルコキシ基、置換若しくは非置換アミノ基を示す。R7、R8、R9及びR10は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換アルコキシ基を示す。X1は水素原子又はハロゲン原子を示す。Yは1価のアニオンを示す。nは0又は1を示す。X1がハロゲン原子である場合nは0である。］
で表されるシアニン化合物は、文献未記載の新規化合物である。
【００３６】
一般式（1）において、R1及びR2で示されるアリール基としては、単環アリール基、縮環アリール基及び多環アリール基のいずれも採用でき、例えば、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基、フェナントレニル基、ビフェニル基、ターフェニル基、フルオレニル基、ピレニル基、トリフェニレニル基等のC6-18アリール基（特にC6-14アリール基）が挙げられる。
【００３７】
R1及びR2で示されるアリール基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、特に制限はなく、水酸基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、上記アリール基、後述のヘテロアリール基、後述のアルキル基、後述のアルコキシ基、後述のアミノ基等が挙げられる。なかでも、電子供与性基を導入した場合には、吸収極大波長及び蛍光極大波長を特に大きくすることが可能である。このため、光励起に使用しようとするレーザー光の波長にあわせて、適切な置換基を導入することが好ましい。置換基を有する場合の置換基の数は、特に制限されず、1〜6個が好ましく、1〜3個がより好ましい。
【００３８】
一般式（1）において、R1及びR2で示されるヘテロアリール基としては、単環ヘテロアリール基及び多環ヘテロアリール基のいずれも採用でき、例えば、ピロリジル基、ピロリル基、テトラヒドロチエニル基、チエニル基、オキソラニル基、フラニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、ピペリジル基、ピリジル基、ピラジル基、インドリル基、イソインドリル基、ベンゾイミダゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、キノキサリル基等が挙げられる。
【００３９】
R1及びR2で示されるヘテロアリール基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、特に制限はなく、水酸基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、上記アリール基、上記ヘテロアリール基、後述のアルキル基、後述のアルコキシ基、後述のアミノ基等が挙げられる。なかでも、電子供与性基を導入した場合には、吸収極大波長及び蛍光極大波長を特に大きくすることが可能である。このため、光励起に使用しようとするレーザー光の波長にあわせて、適切な置換基を導入することが好ましい。置換基を有する場合の置換基の数は、特に制限されず、1〜6個が好ましく、1〜3個がより好ましい。
【００４０】
なかでも、R1及びR2としては、置換又は非置換アリール基が好ましく、置換又は非置換フェニル基がより好ましい。なお、吸収極大波長及び蛍光極大波長を小さくする場合はR1及びR2を非置換アリール基（特に非置換フェニル基）とすることが好ましく、吸収極大波長及び蛍光極大波長を大きくする場合は電子供与性の高い基として、例えばR1及びR2をアルコキシ基、アミノ基等で置換されたアリール基（特にアミノ基で置換されたフェニル基）とすることが好ましい。また、DNA/RNA選択性をより向上させる場合は、電子供与性の高い基として、例えばR1及びR2をアルコキシ基、アミノ基等で置換されたアリール基（特にアミノ基で置換されたフェニル基）とすることが好ましい。さらに、耐光性をより向上させる場合は、非置換アリール基（特に非置換フェニル基）が好ましい。
【００４１】
一般式（1）において、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10で示されるアルキル基としては、直鎖アルキル基及び分岐鎖アルキル基のいずれも採用できる。
【００４２】
直鎖アルキル基としては、炭素数1〜6（特に1〜4）の直鎖アルキル基が好ましく、具体的には、メチル基、エチル基、n-プロピル基、n-ブチル基、n-ペンチル基、n-ヘキシル基等が挙げられる。
【００４３】
分岐鎖アルキル基としては、炭素数3〜6（特に3〜5）の分岐鎖アルキル基が好ましく、具体的には、イソプロピル基、イソブチル基、tert-ブチル基、sec-ブチル基、ネオペンチル基、イソヘキシル基、3-メチルペンチル基等が挙げられる。
【００４４】
R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10で示されるアルキル基は、置換基を有していてもよい。アルキル基が有していてもよい置換基としては、特に制限はなく、水酸基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、上記アリール基、上記ヘテロアリール基、後述のアルコキシ基、後述のアミノ基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、特に制限されず、1〜6個が好ましく、1〜3個がより好ましい。
【００４５】
一般式（1）において、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10で示されるアルコキシ基としては、炭素数1〜6（特に1〜4）のアルコキシ基が好ましく、例えば、メトキシ基、エトキシ基、n-プロポキシ基、イソプロピルオキシ基、n-ブチルオキシ基、イソブチルオキシ基、tert-ブチルオキシ基、n-ペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、n-ヘキシルオキシ基等が挙げられる。
【００４６】
R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10で示されるアルコキシ基は、置換基を有していてもよい。アルコキシ基が有していてもよい置換基としては、特に制限はなく、水酸基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、上記アリール基、上記ヘテロアリール基、上記アルコキシ基、後述のアミノ基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、特に制限されず、1〜6個が好ましく、1〜3個がより好ましい。
【００４７】
一般式（1）において、R3、R4、R5及びR6で示されるアミノ基としては、鎖状アミノ基及び環状アミノ基のいずれも採用できる。鎖状アミノ基としては、水酸基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、上記アリール基、上記ヘテロアリール基、上記アルキル基、上記アルコキシ基等の置換基を有していてもよいアミノ基が挙げられ、例えば、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等の炭素数1〜10のアミノ基（ジアルキルアミノ基等）が挙げられる。また、環状アミノ基としては、例えば、ピロリジル基、ピペリジル基、ピペラジニル基、モルホリル基等が挙げられ、水酸基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、上記アリール基、上記ヘテロアリール基、上記アルキル基、上記アルコキシ基等の置換基を有していてもよい。置換基を有する場合の置換基の数は、特に制限されず、1〜6個が好ましく、1〜3個がより好ましい。
【００４８】
なかでも、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10としては、水素原子が好ましい。
【００４９】
一般式（1）において、X1で示されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子が挙げられる。
【００５０】
なかでも、X1としては、可視光領域で励起しやすく、生細胞への毒性をより少なく、DNA選択性、耐光性及び細胞透過性をより向上させ、DNA結合時の蛍光強度を特に向上させる観点からは水素原子が好ましい。一方、光照射前はDNAと結合しても蛍光強度は弱いものの561nmのレーザー光等で励起させることによって蛍光強度を飛躍的に向上させる光活性化型蛍光性能を有する観点からは、X1をハロゲン原子とすることが好ましい。この場合、ハロゲン原子のなかでも、臭素原子が特に光活性化型蛍光性能に優れている。
【００５１】
一般式（1）において、Yで示される1価のアニオンとしては特に制限されない。例えば、ハロゲンイオン（フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン等）、シアンイオン、酢酸イオン、トリフルオロ酢酸イオン、トシレートイオン等が挙げられる。
【００５２】
一般式（1）において、nは0又は1である。吸収極大波長及び蛍光極大波長を小さくしたい場合はnを0とすることが好ましく、吸収極大波長及び蛍光極大波長を大きくしたい場合はnを1とすることが好ましい。また、DNA選択性をより向上させる場合はnを0とすることが好ましい。これらの観点から、要求特性に応じて適宜調整することが好ましい。なお、X1がハロゲン原子である場合はnは0である。
【００５３】
このような条件を満たす本発明のシアニン化合物としては、一般式（1-1）：
【００５４】
【化５】
2019014849.tif 000006
【００５５】
［式中、R1、R2、X1及びYは前記に同じである。］
で表されるシアニン化合物が好ましい。具体的には、
【００５６】
【化６】
2019014849.tif 000007
【００５７】
【化７】
2019014849.tif 000008
【００５８】
［式中、Yは前記に同じである。］
等で表されるシアニン化合物が好ましく、後述の実施例で示されるシアニン化合物が特に好ましい。
【００５９】
２．シアニン化合物の製造方法
本発明のシアニン化合物の製造方法は、特に制限されないが、nが0であるシアニン化合物群は、例えば、以下の反応式1に沿って合成することができる。
【００６０】
【化８】
2019014849.tif 000009
【００６１】
［式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、X1及びYは前記に同じである。］
【００６２】
また、nが1であるシアニン化合物群は、例えば、以下の反応式2に沿って合成することができる。
【００６３】
【化９】
2019014849.tif 000010
【００６４】
［式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10及びYは前記に同じである。R11は置換又は非置換アリール基を示す。R12は置換又は非置換アルキル基を示す。］
【００６５】
（2-1）化合物（2）→化合物（3）
本工程では、化合物（2）と硫化剤とを反応させることで、化合物（3）を得ることができる。
【００６６】
化合物（2）としては、市販品を用いることもできるし、合成することもできる。合成する場合は、所定のアニリン化合物と所定のケリドン酸化合物とを反応させることにより得ることができる。
【００６７】
硫化剤としては、特に制限はなく、五硫化リン（P2S5）、Lawesson’s試薬（2,4-ビス(4-メトキシフェニル)-1,3,2,4-ジチアジホスフェタン-2,4-ジスルフィド）等を用いることができる。これらの硫化剤は、単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。
【００６８】
上記硫化剤の使用量は、特に制限はなく、収率等の観点から、化合物（2）1モルに対して、0.3〜3.0モル（特に0.5〜2.0モル）が好ましい。
【００６９】
本工程において使用され得る有機溶媒としては、公知のものを採用することができ、本工程では、例えば、テトラヒドロフラン、1,4-ジオキサン等の環状エーテル；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素等が好ましい。これらの有機溶媒は、単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。また、反応条件は、反応が十分に進行する程度が好ましく、例えば、還流下において5分〜12時間、特に10分〜6時間とすることができる。
【００７０】
反応後は、必要に応じて通常の精製処理により化合物（3）を得ることができる。また、精製せずに次の工程を行うこともできる。
【００７１】
（2-2）化合物（3）→化合物（4）
本工程では、化合物（3）とメチルp-トルエンスルホナート（TsOCH3）とを反応させることで、化合物（4）を得ることができる。
【００７２】
上記メチルp-トルエンスルホナート（TsOCH3）の使用量は、特に制限はなく、収率等の観点から、化合物（3）1モルに対して、0.3〜3.0モル（特に0.5〜2.0モル）が好ましい。
【００７３】
本工程において使用され得る有機溶媒としては、公知のものを採用することができ、本工程では、例えば、テトラヒドロフラン、1,4-ジオキサン等の環状エーテル等が好ましい。これらの有機溶媒は、単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。また、反応条件は、反応が十分に進行する程度が好ましく、例えば、還流下において5分〜12時間、特に10分〜6時間とすることができる。
【００７４】
反応後は、必要に応じて通常の精製処理により化合物（4）を得ることができる。また、精製せずに次の工程を行うこともできる。
【００７５】
（2-3）化合物（4）→化合物（1B1）
本工程では、化合物（2）と有機リチウム化合物とを反応させた後に化合物（4）と反応させることで、化合物（1B1）を得ることができる。
【００７６】
有機リチウム化合物としては、特に制限はなく、公知のものが採用でき、例えば、メチルリチウム、エチルリチウム、n-プロピルリチウム、イソプロピルリチウム、n-ブチルリチウム、sec-ブチルリチウム、tert-ブチルリチウム、ペンチルリチウム、ヘキシルリチウム等のアルキルリチウム；シクロヘキシルリチウム等のシクロアルキルリチウム；フェニルリチウム等のアリールリチウム等が挙げられる。これらの有機リチウム化合物は、単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。これらのうち、本工程では、収率の観点から、アルキルリチウムが好ましく、メチルリチウムがより好ましい。
【００７７】
上記有機リチウム化合物の使用量は、特に制限はなく、収率等の観点から、化合物（2）1モルに対して、0.5〜5.0モル（特に1.0〜3.0モル）が好ましい。
【００７８】
化合物（2）と有機リチウム化合物との反応において使用され得る有機溶媒としては、公知のものを採用することができ、例えば、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジエトキシメタン等の鎖状エーテル等が好ましい。これらの有機溶媒は、単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。また、反応条件は、反応が十分に進行する程度が好ましく、例えば、0〜100℃、特に10〜50℃において5分〜6時間、特に10分〜3時間とすることができる。
【００７９】
次に、得られた生成物と化合物（4）とを反応させる。この際の化合物（4）の使用量は、特に制限はなく、収率等の観点から、原料として使用した化合物（2）1モルに対して、0.3〜3.0モル（特に0.5〜2.0モル）が好ましい。
【００８０】
化合物（4）との反応では、必要に応じて、塩基を使用することもできる。塩基としては、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン等のアミン等が挙げられる。これらの塩基は、単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。塩基を使用する場合の使用量は、合成の容易さ、収率等の観点から、使用した化合物（2）に対して過剰量とすることが好ましい。  化合物（4）との反応において使用され得る有機溶媒としては、公知のものを採用することができ、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素等が好ましい。これらの有機溶媒は、単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。また、反応条件は、反応が十分に進行する程度が好ましく、例えば、30〜150℃、特に50〜100℃において5分〜48時間、特に10分〜36時間とすることができる。
【００８１】
反応後は、必要に応じて通常の精製処理により本発明のシアニン化合物（1B1）を得ることができる。また、精製せずに次の工程を行うこともできる。
【００８２】
（2-4）化合物（1B1）→化合物（1B2）
本工程では、化合物（1B1）と化合物（5）とを反応させることで、化合物（1B2）を得ることができる。
【００８３】
上記化合物（5）の使用量は、特に制限はなく、収率等の観点から、化合物（1B1）1モルに対して、0.3〜3.0モル（特に0.5〜2.0モル）が好ましい。
【００８４】
本工程において使用され得る有機溶媒としては、公知のものを採用することができ、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素等が好ましい。これらの有機溶媒は、単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。また、反応条件は、反応が十分に進行する程度が好ましく、例えば、-30〜30℃、特に-50〜50℃において1分〜3時間、特に2分〜2時間とすることができる。
【００８５】
反応後は、必要に応じて通常の精製処理により本発明のシアニン化合物（1B2）を得ることができる。
【００８６】
（2-5）化合物（6）→化合物（7）
本工程では、化合物（6）とR1NH2で表される化合物とを反応させることで、化合物（7）を得ることができる。
【００８７】
上記R1NH2で表される化合物の使用量は、特に制限はなく、収率等の観点から、化合物（6）1モルに対して、0.3〜3.0モル（特に0.5〜2.0モル）が好ましい。
【００８８】
本工程において使用され得る有機溶媒としては、公知のものを採用することができ、例えば、エタノール、n-プロピルアルコール等のアルコール等が好ましい。これらの有機溶媒は、単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。また、反応条件は、反応が十分に進行する程度が好ましく、例えば、還流下において10分〜36時間、特に30分〜24時間とすることができる。
【００８９】
反応後は、必要に応じて通常の精製処理により化合物（7）を得ることができる。また、精製せずに次の工程を行うこともできる。
【００９０】
（2-6）化合物（7）→化合物（9）
本工程では、化合物（7）と化合物（8）とを反応させることで、化合物（9）を得ることができる。
【００９１】
化合物（8）の使用量は、特に制限はなく、収率等の観点から、化合物（7）1モルに対して、0.5〜5.0モル（特に1.0〜3.0モル）が好ましい。
【００９２】
本工程において使用され得る有機溶媒としては、公知のものを採用することができ、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン等が好ましい。これらの有機溶媒は、単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。また、反応条件は、反応が十分に進行する程度が好ましく、例えば、還流下において10分〜36時間、特に30分〜24時間とすることができる。
【００９３】
反応後は、必要に応じて通常の精製処理により化合物（9）を得ることができる。また、精製せずに次の工程を行うこともできる。
【００９４】
（2-7）化合物（9）→化合物（10）
本工程では、化合物（9）とR12COOHで表される化合物とを反応させることで、化合物（10）を得ることができる。
【００９５】
上記R12COOHで表される化合物の使用量は、特に制限はなく、収率等の観点から、化合物（9）に対して、過剰量とすることが好ましい。
【００９６】
本工程において使用され得る有機溶媒としては、公知のものを採用することができ、例えば、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン等が好ましい。これらの有機溶媒は、単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。また、反応条件は、反応が十分に進行する程度が好ましく、例えば、30〜100℃、特に40〜80℃において10分〜24時間、特に30分〜12時間とすることができる。
【００９７】
反応後は、必要に応じて通常の精製処理により化合物（10）を得ることができる。また、精製せずに次の工程を行うこともできる。
【００９８】
（2-8）化合物（10）→化合物（1C1）
本工程では、化合物（10）と化合物（6）とを反応させることで、化合物（1C1）を得ることができる。
【００９９】
化合物（10）の使用量は、特に制限はなく、収率等の観点から、化合物（6）1モルに対して、0.3〜3.0モル（特に0.5〜2.0モル）が好ましい。
【０１００】
本工程では、必要に応じて、塩基を使用することもできる。塩基としては、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン等のアミン等が挙げられる。これらの塩基は、単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。塩基を使用する場合の使用量は、合成の容易さ、収率等の観点から、化合物（6）に対して過剰量とすることが好ましい。
【０１０１】
本工程において使用され得る有機溶媒としては、公知のものを採用することができ、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素等が好ましい。これらの有機溶媒は、単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。また、反応条件は、反応が十分に進行する程度が好ましく、例えば、還流下において10分〜48時間、特に30分〜36時間とすることができる。
【０１０２】
反応後は、必要に応じて通常の精製処理により本発明のシアニン化合物（1C1）を得ることができる。
【０１０３】
３．蛍光色素
本発明の蛍光色素は、上記の本発明のシアニン化合物を含有する。
【０１０４】
本発明の蛍光色素のなかでも、X1が水素原子である化合物を用いた蛍光色素は、上記説明したような構造を有しているため、低分子量でありながら、核酸を染色できるとともにDNA/RNA選択性に優れる、つまり、DNAを選択的に染色することが可能である。また、好ましい態様では、耐光性及び細胞透過性に優れた蛍光色素とすることも可能である。この蛍光色素は、可視光の長波長領域又は近赤外領域の光で励起可能である。このため、本発明の蛍光色素は、RNAが多く存在する細胞内であってもDNAを選択的に染色することが可能であり、DNA検出剤（又はDNA染色剤）（Turn-On型核酸染色シアニン色素）として有用である。また、従来は染色が困難とされていた植物細胞の核であっても、固定することなく選択的に染色することも可能であり植物細胞染色剤としても有用である。さらに、DNAへの高い特異性から、本発明の蛍光色素を含むDNA検出用キットを用いて、被検材料と接触させた後に光照射（特に波長500〜700nmの光照射）し、その蛍光を評価することにより被検材料中のDNAを検出することも可能である。
【０１０５】
一方、本発明の蛍光色素のなかでも、X1がハロゲン原子である化合物は、DNA存在下でもほとんど蛍光を発しないが、光照射（特に波長500〜700nmの光照射）により脱ハロゲン化することでDNA存在下において蛍光を発する状態へと変換させることが可能である。このため、本発明の蛍光色素を含むDNA検出用キットを用いて、被検材料と接触させた後に光照射（特に波長500〜700nmの光照射）することにより、細胞集団の特定の細胞の核のみをラベルし、細胞及び核動態を追跡することが可能である。
【実施例】
【０１０６】
実施例1
一般操作
特に明記しない限り、乾燥溶媒を含むすべての物質は、商業的供給元から入手し、精製することなく使用した。既報に従って、1-(2,4-ジニトロフェニル)-4-メチルピリジン-1-イウムクロリド（Synlett 1992, 431.）、化合物10a（Adv. Funct. Mater. 2002, 12, 110.）等の出発物質を調製した。全ての処理及び精製手順は、試薬グレードの溶媒を用いて行った。FT-ESI mass analyzerを用いて、高分解能マススペクトル分析を行った。すべての化合物の融点は、MPA100 Optimelt automated melting point systemで測定した。カラムクロマトグラフィーは、色素1、色素2、色素3、色素6、色素10、色素12及び色素13の精製のため、シリカゲル60N（関東化学（株）、球状、中性、40-50メッシュ）を用いて行った。カラムクロマトグラフィーは、化合物14a、化合物14b、化合物14c、色素5及び色素14の精製のため、アミノシリカゲル（富士シリシア化学（株）、カタログ番号Hu 41003）を用いて行った。他の化合物の精製は、シリカゲル60N（関東化学（株）、球状、中性、40-100メッシュ）を用いて行った。
【０１０７】
核磁気共鳴（NMR）スペクトルは、JEOL JNM-ECA-400（1H 400MHz、13C 100MHz）及びJNM-ECA-600（1H 600MHz、13C 150MHz）を用いて、ジメチルスルホキシド-d6（(CD3)2SO）中で行った。1H NMRのchemical shiftは、(CD3)2SO（δ2.49ppm）に対する百万分率（ppm）で表した。13C NMRのchemical shiftは、(CD3)2SO（δ39.5ppm）に対する百万分率（ppm）で表した。データは以下のように報告した：chemical shift, multiplicity (s = singlet, d = doublet, dd = doublet of doublets, ddd = doublet of doublet of doublets, dt = doublet of triplets, td = triplet of doublets, t = triplet, q = quartet, quin = quintet, m = multiplet, br = broad), coupling constant (Hz), and integration。
【０１０８】
和光純薬工業（株）より購入したトリス−エチレンジアミン四酢酸（EDTA）緩衝液（TE緩衝液; pH8.0）を全ての光学測定に用いた。Calf thymus二本鎖DNA（dsDNA）をSigma-Aldrich Co. LLC.から購入し、酵母由来のリボ核酸（RNA）を和光純薬工業（株）から購入し、精製せずに測定に使用した。
【０１０９】
蛍光量子収率
色素−dsDNA複合体の蛍光量子収率は、積分球系により較正したHamamatsu C9920-02を用いて測定した。モノメチン色素の絶対蛍光量子収率の測定（ΦFdsDNA）は、最大吸収波長（λabsdsDNA）付近で単一波長励起モードで行い、各々の波長で得られた蛍光量子率の平均値を算出した。トリメチン色素の絶対蛍光量子収率（ΦFdsDNA）は、λabsdsDNAのΦFdsDNAの平均値を用いて算出した。波長に対してΦFdsDNA依存性を示す化合物については、ΦFdsDNAの最大値を記録した。相対法を適用して、モノメチン色素については溶液中でのローダミン6Gエタノール（ΦF= 0.94; J. Chem. Phys. Lett. 1996, 260, 115.）、トリメチン色素についてはメタノール溶液中のCresyl violet（ΦF= 0.54; J. Phys. Chem. 1979, 83, 696.）の量子収率と比較して固有の蛍光量子収率（ΦFfree）を決定した。ΦFfreeは次式の式で計算される。
【０１１０】
【数１】
2019014849.tif 000011
【０１１１】
ここで、ΦFreferenceは参照試料の蛍光量子収量を表し、Ffree-dye及びFreferenceは同じ励起波長を用いた色素及び参照試料の補正された蛍光スペクトルの面積を表し、Areference及びAfree-Dyeは、光励起波長における参照試料及び色素の記録された吸光度を表し、nfree-dye及びnreferenceは、測定に用いた溶媒の屈折率を表す。TE緩衝液の反射率は水（n= 1.333）の値を用い算出した。詳細な計算には、エタノール（n= 1.359; J. Chem. Eng. Data 1996, 41, 685.）及びメタノール（n= 1.327; J. Chem. Eng. Data 1996, 41, 685.）の屈折率の値を使用した。
【０１１２】
dsDNA及びRNA存在下での色素の光学スペクトル変化
UV/Vis吸収スペクトルを、0.5nmの分解能を有するShimadzu UV-3510 spectrometerで記録し、蛍光スペクトルを0.2nmの分解能を有するFP-6600 Hitachi spectrometerで測定した。全ての光学測定には1.0cm角の石英セルを使用した。マイクロピペットを用いて室温で各極大波長で約0.2の吸光度を有する色素溶液（2.0mL）に1.0g/L dsDNA溶液（1.0mL）又は2.0g/L RNA溶液（1.0mL）を加えた。滴定後、混合した溶液を穏やかに数回振盪して、すべての試料の吸光度及び蛍光強度を安定させたのち、測定を行った。
【０１１３】
蛍光寿命
使用した光源は、パルス持続時間200fs及び繰返し率200kHzの再生増幅モード同期Ti：サファイアレーザーに基づく波長可変光パラメトリック増幅器である。励起波長は、各試料の最大吸収波長付近に設定した。放出された光子は、アバランシェフォトダイオード（SPD-050-CTE-N1; MPD）を有する単一のモノクロメータを用いて検出した。検出波長は、各試料の蛍光ピーク波長に調整した。各光子到着時間は、時間相関単一光子計数板（SPC-130EM-N1; Becker & Hickl GmbH）を用いて記録した。
【０１１４】
光安定性
500Wキセノンランプ（Ushio, SX-UI501XQ）を用いて、光照射に対する蛍光減衰のプロットを得た。すべての試料の最大波長吸収領域に重なるように、バンドパス又はカットオフ光学フィルターを使用して、適切な波長の光を選択した。各工程の光照射の後、色素−DNA複合体の試料を室温まで注意深く冷却し、励起に対応する最大値の光を用いて蛍光を記録した。
【０１１５】
培養細胞及び植物の培養
HeLa細胞（RIKEN Cell Bank, Japan）を、10%ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM, Wako）中、37℃、5%CO2/95%空気インキュベーター中で培養した。HeLa細胞（2×104）をガラス底8ウェルスライドの各ウェルに移し、1日培養後イメージング実験を行った。
【０１１６】
ヒメツリガネゴケ（学名Physcomitrella patens） 野生株（Science 2008, 319, 64.）を用い、ホモジナイズ後25℃で4〜7日間連続白色光下でBCDAT培地で培養した（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003, 100, 8007.）。また、シロイヌナズナ（学名Arabidopsis thaliana）野生株（Col-0）は、Murashige and Skoog培地（Plant Physiol. 1962, 15, 473.）上に4℃で3日間静置した後、種子を22〜23℃の連続白色光下で発芽させて培養し、7〜12日間培養した。
【０１１７】
蛍光顕微鏡
細胞の蛍光イメージングには、共焦点レーザー顕微鏡（LSM780；Zeiss）、又は同じく共焦点レーザー顕微鏡（TCS-SP8; Leica）を用いて行った。光励起及び蛍光収集のための詳細な励起波長は、各図に示されている。収集されたイメージは、オープンソースソフトウェアImage J（http://imagej.nih.gov/ij/）を用いてプロセシング処理した。
【０１１８】
実施例1-1：対称シアニン骨格を有するモノメチン色素の合成
N-フェニルピリドン化合物1a、2a、3a及び6aは、対応するアニリン化合物とケリドン酸とを反応させることにより得た（Org. Biomol. Chem. 2014, 12, 9207.）。このように生成したケトンは、Lawesson’s試薬での処理によって対応するチオケトン（化合物1b、2b、3b及び6b）を得た。これらのチオケトンをp-トルエンスルホン酸メチルでメチル化すると、化合物1c、2c、3c及び6cが得られた。最後の工程では、化合物1a、2a、3a及び6aをメチルリチウムで処理し、続いてトリエチルアミンの存在下で化合物1c、2c、3c及び6cを添加することによって4種の標的色素を得た。アルキル第三アミノ基を有する色素5も、以下の反応式に示すように調製した。アルキル第三アミノ基の導入は、染色体（Org. Biomol. Chem. 2014, 12, 9207.）の染色を改善し、dsDNAへの色素の結合親和性を強化する（Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 4180.）ことが報告されている。
【０１１９】
【化１０】
2019014849.tif 000012
【０１２０】
1-フェニルピリジン-4(1H)-オン(1a)の合成
【０１２１】
【化１１】
2019014849.tif 000013
【０１２２】
ケリドン酸1水和物（3.00g, 14.8mmol）及びアニリン（1.45g, 15.6mmol, 1.05当量）をDMSO（45mL）に溶解した。混合物を大気中で170℃で2時間攪拌した。室温に冷却した後、DMSOを真空下に除去した。得られた暗色の残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離剤：CH2Cl2/MeOH= 95: 5 to 80: 20）に供した。メタノール及びエーテルからの再結晶により、化合物1aを淡黄色固体として得た（1.45g, 57%）。
【０１２３】
【数２】
2019014849.tif 000014
【０１２４】
1-(4-メトキシフェニル)ピリジン-4(1H)-オン(2a)の合成
【０１２５】
【化１２】
2019014849.tif 000015
【０１２６】
ケリドン酸1水和物（1.00g, 4.95mmol）及びp-アニシジン（640mg, 5.2mmol, 1.05当量）をDMSO（20mL）に溶解した。混合物を大気中で170℃で2時間攪拌した。室温に冷却した後、DMSOを真空下に除去した。得られた固体を酢酸エチル（30mL）中で懸濁し、2時間激しく撹拌した。エーテル（30mL）を添加した後、固体をろ過し、乾燥して化合物2aを淡黄色固体として得た（863mg, 87%）。
【０１２７】
【数３】
2019014849.tif 000016
【０１２８】
1-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)ピリジン-4(1H)-オン(3a)の合成
【０１２９】
【化１３】
2019014849.tif 000017
【０１３０】
ケリドン酸1水和物（1.00g, 4.95mmol）及びN,N-ジメチル-1,4-フェニレンジアミン（741mg, 5.44mmol, 1.10当量）をDMSO（15mL）に溶解させること以外は上記「1-フェニルピリジン-4(1H)-オン(1a)の合成」と同様に、化合物3aを得た（792mg, 75%）。
【０１３１】
【数４】
2019014849.tif 000018
【０１３２】
1-(4-(ジエチルアミノ)フェニル)ピリジン-4(1H)-オン(6a)の合成
【０１３３】
【化１４】
2019014849.tif 000019
【０１３４】
ケリドン酸1水和物（1.00g, 4.95mmol）及びN,N-ジエチル-1,4-フェニレンジアミン（894mg, 5.44mmol, 1.10当量）をDMSO（15mL）に溶解させること以外は上記「1-フェニルピリジン-4(1H)-オン(1a)の合成」と同様に、化合物6aを白色固体として得た（917mg, 77%）。
【０１３５】
【数５】
2019014849.tif 000020
【０１３６】
1-フェニルピリジン-4(1H)-チオン(1b)の合成
【０１３７】
【化１５】
2019014849.tif 000021
【０１３８】
トルエン（50mL）及び1,4-ジオキサン（5.0mL）中の化合物1a（1.00g, 5.84mmol）及びLawesson’s試薬（2.48g, 6.13mmol, 1.05当量）の溶液を還流下で4時間撹拌した。室温に冷却した後、n-ヘキサン（20mL）を混合物に添加し、生成した固体をろ過した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：CH2Cl2/MeOH= 99: 1 to 70: 30）で精製した。メタノール及びエーテルから再結晶して化合物1bを黄色固体として得た（569mg, 52%）。
【０１３９】
【数６】
2019014849.tif 000022
【０１４０】
1-(4-メトキシフェニル)ピリジン-4(1H)-チオン(2b)の合成
【０１４１】
【化１６】
2019014849.tif 000023
【０１４２】
トルエン（20mL）及び1,4-ジオキサン（2.0mL）中の化合物2a（500mg, 2.48mmol）及びLawesson’s試薬（1.06g, 2.61mmol, 1.05当量）の溶液を還流下で4時間撹拌した。室温に冷却した後、エーテル（20mL）を混合物に添加し、生成した黄色固体をろ過した。得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：CH2Cl2/MeOH= 99: 1 to 50: 50）で精製し、化合物2bを黄色固体として得た（252mg, 47%）。
【０１４３】
【数７】
2019014849.tif 000024
【０１４４】
1-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)ピリジン-4(1H)-チオン(3b)の合成
【０１４５】
【化１７】
2019014849.tif 000025
【０１４６】
トルエン（25mL）及び1,4-ジオキサン（2.5mL）中の化合物3a（600mg, 2.80mmol）及びLawesson’s試薬（1.19g, 2.94mmol, 1.05当量）の溶液を還流下で3時間撹拌した。室温に冷却した後、エーテル（30mL）を混合物に添加して沈殿を生成し、ろ過した。固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：CH2Cl2/MeOH= 99: 1 to 60: 40）で精製し、化合物3bを黄色固体として得た（347mg, 54%）。
【０１４７】
【数８】
2019014849.tif 000026
【０１４８】
1-(4-(ジエチルアミノ)フェニル)ピリジン-4(1H)-チオン(6b)の合成
【０１４９】
【化１８】
2019014849.tif 000027
【０１５０】
トルエン（25mL）及び1,4-ジオキサン（2.5mL）中の化合物6a（600mg, 2.48mmol）及びLawesson’s試薬（1.05g, 2.60mmol, 1.05当量）の溶液を還流下で3時間撹拌した。室温に冷却した後、エーテル（20mL）を混合物に添加して固体を生成し、ろ過した。固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：CH2Cl2/MeOH= 99: 1 to 80: 20）で精製し、化合物6bを黄色固体として得た（427mg, 67%）。
【０１５１】
【数９】
2019014849.tif 000028
【０１５２】
4-(メチルチオ)-1-フェニルピリジン-1-イウム 4-メチルベンゼンスルホネート(1c)の合成
【０１５３】
【化１９】
2019014849.tif 000029
【０１５４】
1,4-ジオキサン（20mL）中の化合物1b（420mg, 2.24mmol）及びメチルp-トルエンスルホネート（438mg, 2.35mmol, 1.05当量）の溶液を還流下で2時間撹拌した。室温に冷却した後、エーテル（20mL）を混合物に添加した。上層を分離し、化合物1cを含有する下層をエーテルで2回洗浄した。得られたオイルを真空中で2時間乾燥させた。得られた粗生成物である化合物1c（820mg, 98%）を精製することなく次の反応に使用した。
【０１５５】
1-(4-メトキシフェニル)-4-(メチルチオ)ピリジン-1-イウム 4-メチルベンゼンスルホネート(2c)の合成
【０１５６】
【化２０】
2019014849.tif 000030
【０１５７】
1,4-ジオキサン（10mL）中の化合物2b（230mg, 1.06mmol）及びメチルp-トルエンスルホネート（216mg, 1.16mmol, 1.10当量）の溶液を還流下で2時間撹拌した。室温に冷却した後、エーテル（30mL）を添加して沈殿を生成させろ過し、収集し、乾燥し、化合物2cを白色固体として得た（420mg, 98%）。
【０１５８】
【数１０】
2019014849.tif 000031
【０１５９】
1-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)-4-(メチルチオ)ピリジン-1-イウム 4-メチルベンゼンスルホネート(3c)の合成
【０１６０】
【化２１】
2019014849.tif 000032
【０１６１】
1,4-ジオキサン（20mL）中の化合物3b（300mg, 1.30mmol）及びメチルp-トルエンスルホネート（245mg, 1.32mmol, 1.01当量）の溶液を還流下で2時間撹拌した。室温に冷却した後、エーテル（30mL）を添加して沈殿を生成させろ過し、収集し、乾燥し、化合物3cを黄色固体として得た（540mg, 99%）。
【０１６２】
【数１１】
2019014849.tif 000033
【０１６３】
1-(4-(ジエチルアミノ)フェニル)-4-(メチルチオ)ピリジン-1-イウム 4-メチルベンゼンスルホネート(6c)の合成
【０１６４】
【化２２】
2019014849.tif 000034
【０１６５】
1,4-ジオキサン（20mL）中の化合物6b（400mg, 1.55mmol）及びメチルp-トルエンスルホネート（292mg, 1.57mmol, 1.01当量）の溶液を還流下で2時間撹拌した。室温に冷却した後、エーテル（30mL）を添加して沈殿を生成させろ過し、収集し、乾燥し、化合物6cを黄色固体として得た（681mg, 99%）。
【０１６６】
【数１２】
2019014849.tif 000035
【０１６７】
1-フェニル-4-((1-フェニルピリジン-4(1H)-イリデン)メチル)ピリジン-1-イウム 4-メチルベンゼンスルホネート(色素1)の合成
【０１６８】
【化２３】
2019014849.tif 000036
【０１６９】
THF（20mL）中の化合物1a（300mg, 1.75mmol）の溶液を、窒素雰囲気下、氷浴で0℃に冷却した。シリンジを用いて、ジエトキシメタン中の3Mメチルリチウム（MeLi）の溶液（1.2mL, 3.6mmol, 2.0当量）をゆっくり滴下した。氷浴を外し、混合物を徐々に室温まで温めた。さらに20分間撹拌した後、CH2Cl2（20mL）中の化合物1c（720mg, 1.93mmol, 1.1当量）及びトリエチルアミン（4.0mL）の溶液をシリンジを用いて0℃で添加した。その後、窒素雰囲気下、70℃で24時間攪拌した。室温に冷却した後、溶媒を真空下に除去した。得られた暗赤色の固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：CH2Cl2/MeOH= 95: 5 to 80: 20）に供した。得られた赤色固体を最少量のアセトンに懸濁させ、5分間超音波処理した後、エーテルをさらに添加した。生成した固体をろ過し、色素1を赤色固体として得た（355mg, 41%）。
【０１７０】
【数１３】
2019014849.tif 000037
【０１７１】
1-(4-メトキシフェニル)-4-((1-(4-メトキシフェニル)ピリジン-4(1H)-イリデン)メチル)ピリジン-1-イウム 4-メチルベンゼンスルホネート(色素2)の合成
【０１７２】
【化２４】
2019014849.tif 000038
【０１７３】
THF（10mL）中の化合物2a（200mg, 0.99mmol）の溶液を、窒素雰囲気下、氷浴で0℃に冷却した。ジエトキシメタン中の3Mメチルリチウム（MeLi）の溶液（0.66mL, 2.0mmol, 2.0当量）をゆっくり5分かけて滴下した。氷浴を外し、混合物を徐々に室温まで温めた。さらに20分間撹拌した後、CH2Cl2（10mL）中の化合物2c（400mg, 0.99mmol）及びトリエチルアミン（2.0mL）の溶液をシリンジを用いて0℃で添加した。その後、窒素雰囲気下、70℃で24時間攪拌した。室温に冷却した後、溶媒を真空下に除去した。得られた暗赤色の固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：CH2Cl2/MeOH= 95: 5 to 80: 20）に供して精製した。得られた赤色固体を最少量のアセトンに懸濁させ、5分間超音波処理した後、エーテルをさらに添加した。生成した固体をろ過し、色素2を赤色粉末として得た（153mg, 28%）。
【０１７４】
【数１４】
2019014849.tif 000039
【０１７５】
1-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)-4-((1-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)ピリジン-4(1H)-イリデン)メチル)ピリジン-1-イウム 4-メチルベンゼンスルホネート(色素3)の合成
【０１７６】
【化２５】
2019014849.tif 000040
【０１７７】
THF（20mL）中の化合物3a（250mg, 1.17mmol）の溶液を、窒素雰囲気下、氷浴で0℃に冷却した。シリンジを用いて、ジエトキシメタン中の3Mメチルリチウム（MeLi）の溶液（0.78mL, 2.3mmol, 2.0当量）をゆっくり滴下した。氷浴を外し、混合物を徐々に室温まで温めた。さらに20分間撹拌した後、CH2Cl2（20mL）中の化合物3c（486mg, 1.17mmol）及びトリエチルアミン（4.0mL）の溶液をシリンジを用いて0℃で添加した。その後、窒素雰囲気下、70℃で24時間攪拌した。室温に冷却した後、溶媒を真空下に除去した。得られた暗赤色の固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：CH2Cl2/MeOH= 99: 1 to 85: 15）に供して精製した。得られた紫色固体を最少量のアセトンに懸濁させ、5分間超音波処理した後、エーテルをさらに添加した。生成した固体をろ過し、色素3を紫色固体として得た（227mg, 34%）。
【０１７８】
【数１５】
2019014849.tif 000041
【０１７９】
1-(4-(ジエチルアミノ)フェニル)-4-((1-(4-(ジエチルアミノ)フェニル)ピリジン-4(1H)-イリデン)メチル)ピリジン-1-イウム 4-メチルベンゼンスルホネート(色素6)の合成
【０１８０】
【化２６】
2019014849.tif 000042
【０１８１】
THF（15mL）中の化合物6a（200mg, 0.83mmol）の溶液を、窒素雰囲気下、氷浴で0℃に冷却した。シリンジを用いて、ジエトキシメタン中の3Mメチルリチウム（MeLi）の溶液（0.55mL, 1.7mmol, 2.0当量）をゆっくり滴下した。氷浴を外し、混合物を徐々に室温まで温めた。さらに20分間撹拌した後、CH2Cl2（15mL）中の化合物6c（385mg, 0.87mmol, 1.1当量）及びトリエチルアミン（2.0mL）の溶液をシリンジを用いて0℃で添加した。その後、窒素雰囲気下、70℃で24時間攪拌した。室温に冷却した後、溶媒を真空下に除去した。得られた暗赤色の固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：CH2Cl2/MeOH= 99: 1 to 85: 15）に供し、色素6を紫色固体として得た（53mg, 10%）。
【０１８２】
【数１６】
2019014849.tif 000043
【０１８３】
1-(4-(ジエチルアミノ)フェニル)-4-((1-(4-(4-メチルピペラジン-1-イル)フェニル)ピリジン-4(1H)-イリデン)メチル)ピリジン-1-イウム 4-メチルベンゼンスルホネート(色素5)の合成
【０１８４】
【化２７】
2019014849.tif 000044
【０１８５】
窒素雰囲気下でシリンジを用いて、CH2Cl2（10mL）中の化合物6c（100mg, 0.22mmol）及び後述の化合物14a（72mg, 0.24mmol, 1.1当量）の溶液にトリエチルアミン（1mL）を添加した。反応混合物を還流下で1日間撹拌した。溶媒を真空下に除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：CH2Cl2/MeOH = 100: 0 to 90: 10）で精製し、色素5を湿気に敏感な緑色固体として得た（96mg, 64%）。
【０１８６】
【数１７】
2019014849.tif 000045
【０１８７】
実施例1-2：対称シアニン骨格を有するトリメチン色素の合成
633nmのHe-Neレーザー又は685nmのレーザーダイオードを使用して光励起させるため、新しいトリメチン色素（色素10、色素12、色素13及び色素14）を設計し、合成した。
【０１８８】
【化２８】
2019014849.tif 000046
【０１８９】
4-メチルピリジンから出発して、種々のアルキルアミノ置換アリール基をZincke反応（Justus Liebigs Ann. Chem. 1904, 330, 361.）により導入し、12a、13a及び14aを得た。なお、化合物10aは市販品を用いた。N,N'-ジフェニルホルムアミジンを用いたメチレン鎖の伸長と、アセチル基の導入を行い、前駆体化合物10c、12c、13c及び14cを得た。4つのトリメチン色素を、トリエチルアミンの存在下で化合物10c、12c、13c及び14cと対応する化合物10a、12a、13a及び14aとをカップリングすることにより合成した。
【０１９０】
【化２９】
2019014849.tif 000047
【０１９１】
1-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)-4-メチルピリジン-1-イウムクロリド(12a)の合成
【０１９２】
【化３０】
2019014849.tif 000048
【０１９３】
エタノール（50mL）中の1-(2,4-ジニトロフェニル)-4-メチルピリジン-1-イウムクロリド（2.0g, 6.76mmol）の溶液に、エタノール（10mL）中のN,N-ジメチル-1,4-フェニレンジアミン（1.11g, 8.12mmol, 1.2当量）の溶液を、室温でシリンジを用いて添加した。次いで、混合物を還流下で4時間撹拌した。室温に冷却した後、溶媒を真空下に除去した。次いで、得られた暗色の粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離剤：CH2Cl2/MeOH= 9: 1 to 7: 3）により精製し、化合物12aを黄色固体として得た（1.28g, 76%）。
【０１９４】
【数１８】
2019014849.tif 000049
【０１９５】
1-(4-(ジエチルアミノ)フェニル)-4-メチルピリジン-1-イウムクロリド(13a)の合成
【０１９６】
【化３１】
2019014849.tif 000050
【０１９７】
エタノール（70mL）中の1-(2,4-ジニトロフェニル)-4-メチルピリジン-1-イウムクロリド（5.0g, 17mmol）の溶液に、エタノール（20mL）中のN,N-ジエチル-1,4-フェニレンジアミン（3.33g, 20.3mmol, 1.2当量）の溶液を、室温でシリンジを用いて添加した。次いで、混合物を還流下で12時間撹拌した。室温に冷却した後、溶媒を真空下に除去した。次いで、得られた暗色のオイルをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離剤：CH2Cl2/MeOH= 90: 10 to 70: 30）により精製し、化合物13aを黄色固体として得た（3.86g, 82%）。
【０１９８】
【数１９】
2019014849.tif 000051
【０１９９】
4-メチル-1-(4-(4-メチルピペラジン-1-イル)フェニル)ピリジン-1-イウムクロリド(14a)の合成
【０２００】
【化３２】
2019014849.tif 000052
【０２０１】
エタノール（50mL）中の1-(2,4-ジニトロフェニル)-4-メチルピリジン-1-イウムクロリド（3.0g, 10mmol）の溶液に、エタノール（10mL）中の4-(4-メチルピペラジン-1-イル)アニリン（2.04g, 1.1mmol, 1.1当量）の溶液を、室温でシリンジを用いて添加した。次いで、混合物を還流下で2.5時間撹拌した。室温に冷却した後、溶媒を真空下に除去した。次いで、得られた暗色のオイルをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（アミノシリカゲル、溶離剤：CH2Cl2/MeOH= 100: 1 to 95: 5）により精製し、化合物14aを橙色固体として得た（855mg, 28%）。
【０２０２】
【数２０】
2019014849.tif 000053
【０２０３】
1-フェニル-4-(2-(フェニルアミノ)ビニル)ピリジン-1-イウムクロリド(10b)の合成
【０２０４】
【化３３】
2019014849.tif 000054
【０２０５】
アセトン（20mL）及びCH2Cl2（20mL）中の4-メチル-1-フェニルピリジン-1-イウムクロリド（10a, 150mg, 0.73mmol）及びN,N'-ジフェニルホルムアミジン（286mg, 1.46mmol, 2.0当量）の溶液を還流下で12時間撹拌した。室温に冷却した後、溶媒を真空下に除去した。得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：CH2Cl2/MeOH= 95: 5 to 80: 20）に供し、化合物10bを黄色粉末として得た（136mg, 60%）。得られた粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
【０２０６】
1-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)-4-(2-(フェニルアミノ)ビニル)ピリジン-1-イウムクロリド(12b)の合成
【０２０７】
【化３４】
2019014849.tif 000055
【０２０８】
アセトン（20mL）及びCH2Cl2（20mL）中の化合物12a（200mg, 0.80mmol）及びN,N'-ジフェニルホルムアミジン（316mg, 1.61mmol, 2.0当量）の溶液を還流下で6時間撹拌した。室温に冷却した後、溶媒を真空下に除去した。得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：CH2Cl2/MeOH= 95: 5 to 80: 20）に供し、化合物12bを黄色粉末として得た（162mg, 57%）。
【０２０９】
【数２１】
2019014849.tif 000056
【０２１０】
1-(4-(ジエチルアミノ)フェニル)-4-(2-(フェニルアミノ)ビニル)ピリジン-1-イウムクロリド(13b)の合成
【０２１１】
【化３５】
2019014849.tif 000057
【０２１２】
アセトン（30mL）及びCH2Cl2（30mL）中の化合物13a（300mg, 1.08mmol）及びN,N'-ジフェニルホルムアミジン（425mg, 2.17mmol, 2.0当量）の溶液を還流下で6時間撹拌した。室温に冷却した後、溶媒を除去した。得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：CH2Cl2/MeOH= 95: 5 to 80: 20）に供し、化合物13bを赤色粉末として得た（287mg, 70%）。
【０２１３】
【数２２】
2019014849.tif 000058
【０２１４】
1-(4-(4-メチルピペラジン-1-イル)フェニル)-4-(2-(フェニルアミノ)ビニル)ピリジン-1-イウムクロリド(14b)の合成
【０２１５】
【化３６】
2019014849.tif 000059
【０２１６】
アセトン（25mL）及びCH2Cl2（25mL）中の化合物14a（300mg, 0.99mmol）及びN,N'-ジフェニルホルムアミジン（387mg, 1.97mmol, 2.0当量）の溶液を還流下で12時間撹拌した。室温に冷却した後、溶媒を真空下に除去した。得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（アミノシリカゲル、溶出液：CH2Cl2/MeOH= 100: 0 to 90: 10）に供し、化合物14bを橙色粉末として得た（208mg, 52%）。
【０２１７】
【数２３】
2019014849.tif 000060
【０２１８】
1-フェニル-4-(2-(N-フェニルアセトアミド)ビニル)ピリジン-1-イウムクロリド(10c)の合成
【０２１９】
【化３７】
2019014849.tif 000061
【０２２０】
アセトン（20mL）中の化合物10b（120mg, 0.39mmol）の溶液に、無水酢酸（20mL）を加え、得られた混合物を60℃で4時間撹拌した。室温に冷却した後、アセトン及び無水酢酸を真空下に除去した。得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：CH2Cl2/MeOH= 95: 5 to 80: 20）で精製し、化合物10cを黄色粉末として得た（116mg, 85%）。
【０２２１】
【数２４】
2019014849.tif 000062
【０２２２】
1-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)-4-(2-(N-フェニルアセトアミド)ビニル)ピリジン-1-イウムクロリド(12c)の合成
【０２２３】
【化３８】
2019014849.tif 000063
【０２２４】
窒素雰囲気下、室温で、アセトン（10mL）中の化合物12b（120mg, 0.34mmol）の溶液に、無水酢酸（10mL）を加えた。次いで、得られた混合物を60℃で4時間撹拌した。室温に冷却した後、溶媒を真空下に除去した。得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：CH2Cl2/MeOH= 95: 5 to 80: 20）で精製し、化合物12cを橙色粉末として得た（102mg, 76%）。
【０２２５】
【数２５】
2019014849.tif 000064
【０２２６】
1-(4-(ジエチルアミノ)フェニル)-4-(2-(N-フェニルアセトアミド)ビニル)ピリジン-1-イウムクロリド(13c)の合成
【０２２７】
【化３９】
2019014849.tif 000065
【０２２８】
窒素雰囲気下、室温で、アセトン（10mL）中の化合物13b（250mg, 0.66mmol）の溶液に、シリンジを用いて無水酢酸（20mL）を加えた。得られた混合溶液を窒素雰囲気下で60℃で4時間撹拌した。次いで、溶媒を真空下に除去した。得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：CH2Cl2/MeOH= 95: 5 to 80: 20）で精製し、化合物13cを赤色粉末として得た（131mg, 47%）。
【０２２９】
【数２６】
2019014849.tif 000066
【０２３０】
1-(4-(4-メチルピペラジン-1-イル)フェニル)-4-(2-(N-フェニルアセトアミド)ビニル)ピリジン-1-イウムクロリド(14c)の合成
【０２３１】
【化４０】
2019014849.tif 000067
【０２３２】
窒素雰囲気下、室温で、アセトン（20mL）中の化合物14b（150mg, 0.37mmol）の溶液に、シリンジを用いて無水酢酸（20mL）を加えた。次いで、混合物を60℃で4時間撹拌した。室温に冷却した後、溶媒を真空下に除去した。得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（アミノシリカゲル、溶出液：CH2Cl2/MeOH= 100: 0 to 90: 10）で精製し、化合物14cを赤色粉末として得た（128mg, 77%）。得られた粗生成物をさらに精製することなく次の反応に使用した。
【０２３３】
1-フェニル-4-(3-(1-フェニルピリジン-4(1H)-イリデン)プロプ-1-エン-1-イル)ピリジン-1-イウムクロリド(色素10)の合成
【０２３４】
【化４１】
2019014849.tif 000068
【０２３５】
窒素雰囲気下、CH2Cl2（10mL）中の化合物10a（55mg, 0.267mmol）及び化合物10c（103mg, 0.29mmol, 1.1当量）の溶液に、シリンジを用いて、トリエチルアミン（2.0mL）を添加した。混合物を還流下で1日間撹拌した。室温に冷却した後、溶媒を真空下に除去した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：CH2Cl2/MeOH= 95: 5 to 80: 20）で精製した。青色画分を集め、濃縮して固体を得、次いでこれをアセトンで1回洗浄して色素10を青色固体として得た（81.4mg, 79%）。
【０２３６】
【数２７】
2019014849.tif 000069
【０２３７】
1-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)-4-(3-(1-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)ピリジン-4(1H)-イリデン)プロプ-1-エン-1-イル)ピリジン-1-イウムクロリド(色素12)の合成
【０２３８】
【化４２】
2019014849.tif 000070
【０２３９】
窒素雰囲気下、CH2Cl2（10mL）中の化合物12a（50.0mg, 0.20mmol）及び化合物12c（87.4mg, 0.22mmol, 1.1当量）の溶液に、シリンジを用いて、トリエチルアミン（2.0mL）を添加した。混合物を還流下で1日間撹拌した。室温に冷却した後、溶媒を真空下に除去した。得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：CH2Cl2/MeOH= 95: 5 to 80: 20）で精製した。青色画分を集め、濃縮した。得られた固体をアセトンに溶解させ、エーテルを添加して沈殿を生成し、次いでろ過し色素12を青色固体として得た（28.8mg, 30%）。
【０２４０】
【数２８】
2019014849.tif 000071
【０２４１】
1-(4-(ジエチルアミノ)フェニル)-4-(3-(1-(4-(ジエチルアミノ)フェニル)ピリジン-4(1H)-イリデン)プロプ-1-エン-1-イル)ピリジン-1-イウムクロリド(色素13)の合成
【０２４２】
【化４３】
2019014849.tif 000072
【０２４３】
窒素雰囲気下、CH2Cl2（10mL）中の化合物13a（70.0mg, 0.25mmol）及び化合物13c（112mg, 0.27mmol, 1.05当量）の溶液に、シリンジを用いて、トリエチルアミン（1.0mL）を添加した。混合物を還流下で1日間撹拌した。室温に冷却した後、溶媒を真空下に除去した。得られた暗色固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：CH2Cl2/MeOH= 95: 5 to 80: 20）で精製した。青色画分を集め、濃縮した。得られた固体をアセトンに溶解させ、エーテルを添加して沈殿を生成し、次いでろ過し色素13を青色固体として得た（32.7mg, 25%）。
【０２４４】
【数２９】
2019014849.tif 000073
【０２４５】
1-(4-(4-メチルピペラジン-1-イル)フェニル)-4-(3-(1-(4-(4-メチルピペラジン-1-イル)フェニル)ピリジン-4(1H)-イリデン)プロプ-1-エン-1-イル)ピリジン-1-イウムクロリド(色素14)の合成
【０２４６】
【化４４】
2019014849.tif 000074
【０２４７】
窒素雰囲気下、CH2Cl2（10mL）中の化合物14a（70.0mg, 0.23mmol）及び化合物14c（113mg, 0.25mmol, 1.1当量）の溶液に、シリンジを用いて、トリエチルアミン（1.0mL）を添加した。反応混合物を還流下で1日間撹拌した。室温に冷却した後、溶媒を真空下に除去した。得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（アミノシリカゲル、溶出液：CH2Cl2/MeOH= 100: 0 to 90: 10）で精製した。青色画分を集め、濃縮した。次いで、得られた固体をメタノールから再結晶させ、色素14を光沢のある深緑色粉末として得た（92mg, 69%）。
【０２４８】
【数３０】
2019014849.tif 000075
【０２４９】
［モノメチン色素の光物性］
色素1の光学スペクトル
色素1の吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを、図１〜２に示す。TE緩衝液における色素1の最大吸収波長（λabsfree）は510nmであった。dsDNAに結合すると、色素1の吸収極大波長（λabsdsDNA）は、22nm長波長シフトして532nmとなり、吸収率は増加した（図１(a)）。dsDNA（εdsDNA）の存在下でのモル吸光係数は、1.4×105 M-1 cm-1であり、メタノール溶液中で報告されたピリドシアニン色素（PC色素）のモル吸光係数（J. Org. Chem. 1973, 38, 1098.）と比較して、非常に高いが合理的な範囲であった。エタノール溶液中のローダミン6Gの蛍光量子収率（ΦF= 0.94）を用いて、相対法による色素1の固有蛍光量子収率（ΦFfree）は0.0004であった。dsDNAの存在下で、色素1は546nmで最大蛍光波長（λemdsDNA）を示し、絶対法による量子収率（ΦFdsDNA）は0.09であった。色素1のdsDNA特異的蛍光発生率（IdsDNA/Ifree）は、532nmの励起光を用い546nmでの蛍光をモニターした場合に1600であった（図１(b)及び(c)）。dsDNA添加時のこの大きな蛍光増加は、(i) 吸収スペクトルの長波長シフト、(ii) 増大したモル吸光係数、及び(iii) 蛍光量子収率の劇的な増強等の理由により達成されたと思われる。
【０２５０】
色素溶液をRNA溶液で滴定した場合、スペクトルの変化は異なった。色素1をRNAで処理した場合、最大吸収波長（λabsRNA）は6nmの長波長シフトにより516nmであり、吸収スペクトルは図１(a)とは異なりブロード化した（図２(a)）。さらに、RNA存在下における蛍光増加（IRNA/Ifree）は110であり（図２(b)）、これはdsDNA存在下における蛍光増加よりも著しく低い（図２(c)）。したがって、DNA及びRNA添加時の吸収スペクトルの長波長シフトの差が大きく、RNAとの結合時の蛍光増加が比較的小さいため、色素1はdsDNAをRNAよりも選択的に染色することができる。色素1のRNAに対するdsDNAの蛍光選択性（IdsDNA/IRNA）を計算したところ14であった。したがって、色素1は核DNA及びミトコンドリアDNAのような細胞内DNAを高い選択性で染色すると予想される。
【０２５１】
N-アリール基の吸収スペクトル及び蛍光スペクトルへの影響
ここでは、光学特性の考察は、主に4つの対称性色素、つまり、色素1、色素2、色素3、及び色素6について行った。なお、色素5の詳細なスペクトルデータは図３に示す。
【０２５２】
単純なフェニル置換体である色素1と比較して、p-アニシル基置換体である色素2は、λabsdsDNA（536nm）において4nmの長波長シフトを示した（図４(a)）。N-フェニル基のパラ位にジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等の強い電子供与性基を導入することにより、λabsdsDNAはさらに長波長シフトした。例えば、色素3及び色素6のλabsdsDNAは、それぞれ552nm及び561nmであり、汎用の561nmレーザーでの励起に非常に適している（図４(d, g)）。興味深いことに、吸収領域における長波長シフトと共に、色素のεdsDNAは劇的に減少した。色素6の場合、例えば、最大波長でのモル吸光係数（εdsDNA）は、色素1の約半分程度の7.7×104であった。
【０２５３】
強い電子供与性アリール基が導入された場合、吸収スペクトルが変化するのと同様に、蛍光スペクトルも長波長シフトが確認された。例えば、色素3及び色素6（ジメチルアミノ基及びジエチルアミノ基を有する）のλemdsDNAは、それぞれ600nm及び612nmであった。吸収極大波長と蛍光極大波長の差として定義されるストークスシフトの有意な増加も観察された。例えば、色素1のストークスシフト値はわずか14nmである（図１(a, b)）が、色素6のストークスシフトは51nmであった（図４(g, h)）。
【０２５４】
以上から、ピリジン上に適切なN-アリール基を導入することにより、蛍光顕微鏡で広く利用されている532nm及び561nmレーザーと重なるように、ピリドシアニン（PC）色素の吸収領域を調整することができた。過剰量のdsDNA存在下における4つの色素、色素1、色素2、色素3及び色素6の光学スペクトルを図５に示す。
【０２５５】
dsDNAとの結合時のターンオン型蛍光増加
dsDNAと結合した際に、他のピリドシアニン（PC）誘導体のターンオン型蛍光強度（IdsDNA/Ifree）を、532nm又は561nmの励起光を用いて測定した。色素1で1600倍の蛍光増大がみられたように（図１(b)）、色素2で2500倍（図４(b)）、色素3で3900倍（図４(e)）、色素６でも1700倍（図４(h)）もの蛍光増大が見られた。
【０２５６】
DNA/RNA蛍光応答
細胞中において、RNAはDNAより大量に存在する。したがって、細胞内DNAの選択的染色を達成するには、色素がDNAに結合した際に大きな蛍光増幅を示す一方で、RNA結合時の蛍光増幅が低いことが求められる。これをin-vitroで評価するために、合成した色素にそれぞれ過剰量のDNA及びRNAを加えた時の蛍光増幅値(IdsDNA/Ifree及びIRNA/Ifree)を算出し、両者の比をとることで、DNA/RNA選択性(IdsDNA/RNA)を決定した。同様の実験をHoechst、4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）、Pico-Green等の市販のDNA染色色素に対しても行い、得られた値を各実施例の色素と比較した。DAPI及びHoechstについての計算されたIdsDNA/IRNA値はそれぞれ17及び8.9であり（図６(a, b)）、Pico-Green（1.9）（図６(c)）の数倍であった。対照的に、色素1及び色素2のIdsDNA/IRNA値はそれぞれ14及び15であり（図２(c)、図６(d)）、これはDAPIに匹敵し、Hoechstより高い。より強い電子供与性アリール基を有する色素3及び色素6の値は、さらに増加し30を超えた（図６(e, f)）。
【０２５７】
蛍光量子効率
過剰のdsDNAの存在下での4種のモノメチンPC色素の絶対蛍光量子収率（ΦFdsDNA）を決定した。表１に示すように、より強い電子供与性アリール基を導入するとΦFdsDNAが劇的に増加した。
【０２５８】
［トリメチン色素の光物性］
色素10の光学スペクトル
TE緩衝液中核酸非存在下において色素10は、630nmに吸収最大（λabsfree）を示し（図７(a)）、モノメチン色素1（510nm）（図５(a)）と比較して120nm長波長側にシフトしていた。dsDNAと結合すると、図７(a)に示すように、吸収スペクトルが鋭くなるとともにλabsdsDNAは24nm長波長シフトして654nmとなり、また吸光度が大きく増大し、DNA存在下の吸光係数は（εdsDNA= 1.5×105 M-1cm-1）となった。Cresyl violetのメタノール溶液: 蛍光量子収率（ΦF= 0.54）を用い、TE緩衝液中における色素10のDNA非存在下の相対蛍光量子収率（ΦFfree）を0.039と求められた。一方、dsDNAと結合すると、蛍光極大波長（λemdsDNA）は14nm長波長シフトして666nmとなり、良好な蛍光効率（ΦFdsDNA= 0.40）を示した。dsDNA特異的な蛍光発生性（IdsDNA/Ifree）は140と算出された（図７(b)、(c)）。
【０２５９】
一方、RNAへの結合時の色素10の吸収率は大きく低下した（図７(d)）。RNAへの結合によって蛍光強度（IRNA/Ifree）が増加したが（図７(e)）、その値はDNAと比較すると小さく、IDNA/IRNAは5.7と比較的大きな値となった（図７(f)）。従って、色素10は、本発明のモノメチン色素群には劣るものの、汎用の633nmレーザーを用いて細胞核を高選択性且つ高輝度で染色することが期待できる。
【０２６０】
トリメチン色素の光学スペクトルに及ぼすN-アリール基の影響
モノメチン色素と同様に、強い電子供与性アリール基をトリメチン色素の2つのピリジン核に導入すると、吸収スペクトル及び蛍光スペクトルの長波長シフトが観察された（図８）。例えば、ジアルキルアミノ置換体である色素12及び色素13のdsDNA存在下での吸収極大波長（λabsdsDNA）は、それぞれ671nm及び674nmであり、685nmのレーザー光源によって励起され得る。さらに、モル吸光係数（εdsDNA）も、吸収スペクトル及び蛍光スペクトルの長波長シフトとともに減少した。例えば、色素13のεdsDNA値（9.6×104 M-1cm-1）は、色素10（1.5×105 M-1cm-1）より著しく小さい。蛍光特性に関しては、全てのトリメチン色素は遠赤色の発光を示した。より強い電子供与性アリール基を、例えば、強い電子供与性ジエチルアミノ基を有する色素13の蛍光極大波長（λemdsDNA）は700nmに達した。
【０２６１】
dsDNA結合時のターンオン蛍光増加
すべてのトリメチン色素（色素10、12、13、14）は、吸収スペクトルの変化においてdsDNAへの結合時のスペクトルにおいて特徴的に鋭くなり、長波長シフトした。さらに、トリメチン色素単体の状態での蛍光量子収率はモノメチンより10倍程度増加しているため、dsDNA特異的蛍光発生性（IdsDNA/Ifree）もモノメチン色素と比較して大きく減少した。色素12、13及び14の吸収変化及び対応する蛍光増加を図９に示す。
【０２６２】
DNA/RNA蛍光応答
トリメチン色素のRNAに対するdsDNA選択性（IdsDNA/IRNA）は、モノメチン色素と同程度であった。例えば、ジメチルアミノ置換体である色素12は、Pico-Green、Hoechst、及びDAPIをはるかに上回るdsDNA選択応答性（IdsDNA/IRNA= 28）を有する。色素12、13及び14のスペクトルを図１０に示す。
【０２６３】
蛍光量子収率
4つのトリメチン色素のdsDNA結合状態の蛍光量子収率（ΦFdsDNA）及びそれぞれのDNA非存在下における蛍光量子収率（ΦFfree）を決定した。モノメチン色素とは異なり、トリメチン色素のΦFdsDNAは、図１１(a)に示すようにスペクトルの長波長シフトとともに減少した。これらのトリメチン色素については、比較的大きなdsDNA特異的な蛍光発生性を有しつつ、650nmより長い吸収波長で高い量子効率を有する。例えば、色素13は遠赤色発光である（λemdsDNA= 700nm）にもかかわらず、ΦFdsDNAは0.20であり、既存のシアニン系色素であるTOPRO-3（ΦFdsDNA = 0.11）やTOTO-3（ΦFdsDNA = 0.06）の蛍光量子収率よりも極めて高い。
【０２６４】
［他の物理データ］
DNA結合モード
これらの色素のDNA結合特性に関するさらなる情報を得るために、dsDNAの存在下で、2つの代表的な色素として色素1及び色素10について円偏光二色性（CD）スペクトルを測定した。インターカレーション結合を有する色素-DNA複合体は負のCotton効果を示し（Biochemistry 1993, 32, 2987.）、マイナーグルーブDNA結合剤は正のCotton効果を示す（J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 8459.）ことが知られている。色素1及び色素10は、各色素の吸収極大波長においてCDスペクトル中で強く正のCotton効果を示した（図１２）。これは、これらの色素がマイナーグルーブ結合モードでdsDNAに結合することを示唆している。
【０２６５】
［光物理的データのまとめ］
表１に、測定されたPC色素の光物性のデータをまとめて示す。
【０２６６】
【表１】
2019014849.tif 000076
【０２６７】
［細胞イメージング］
色素1による細胞内DNAイメージング
色素の生細胞中の細胞内DNA染色能を調べるため、色素1を詳細な細胞イメージング実験の代表的な試料として選択した。図１３(a)は、濃度1μMの色素1を用いたHeLa細胞核染色の蛍光画像及び透過画像の重ね合わせ像を示す。色素1は優れた細胞透過性を示し、生存HeLa細胞の核及び染色体を効率的に染色した。次に、従来の共焦点画像取得法よりもピーンホールサイズを絞り込み、Huygens deconvolution softwareを用いて超解像成分を引き出す高解像度イメージングを行った。図１３(b)に示すように、高解像度画像は、色素1が細胞質又は他のオルガネラにおいて蛍光染色を示さず、核のみが明るく染色されることを明らかにした。核内には蛍光染色されない領域が存在し、色素1の優れたDNA選択性を考慮すると、この領域は大量のRNAが貯蔵及び製造される核小体であることが示唆される（図１３(c)）。
【０２６８】
濃度効果
色素1、色素5、色素10及び色素14を詳細な試験のための代表的な色素として選択し、HeLa細胞における生細胞染色実験を、異なる濃度で行った。全ての色素は、1μMでHeLa細胞の核を生細胞にて特異的に染色した（図１４(a)〜(d)）。濃度を100nMまで低下させた場合、色素1及び色素5では顕著な変化は観察されなかったが、色素10及び色素14では核とともに細胞質に粒子状の染色が見られた（図１４(g)、(h)）。同様の局在パターンは色素1でも50nMまで低下させると観察された（図１４(e)）。低濃度で見られる細胞質の粒子状に染色される構造はミトコンドリア内のDNAと考えられ、ミトコンドリアDNAの染色は現在3つの色素（DAPI（J. Microsc. 2001, 204, 196.）、SYBR-Green I（Acta Histochemica 2005, 107, 301.）、及びPico-Green（Exp. Cell Res. 2005, 303, 432.））に限られているため、得られた色素は赤色蛍光を有する代替ミトコンドリアDNAプローブとして機能する可能性が考えられる。
【０２６９】
植物細胞イメージング
植物細胞の核を有機小分子で蛍光染色するには、通常は細胞の固定化が必要である。生細胞核の蛍光ラベリングは遺伝子導入による蛍光タンパク質を用いた方法が主流である。遺伝子導入を伴う蛍光ラベリングは形質転換可能な植物種に限られるため、化合物性核染色色素の開発が望まれている。そこで、1μM濃度の色素1を用いた植物細胞の生体染色の結果を、図１５に示す。ここでは、ヒメツリガネゴケ（学名：Physcomitrella patens）の原糸体及びシロイヌナズナ（学名：Arabidopsis thaliana）の葉及び根を染色した。これらの条件下で、ヒメツリガネゴケの核は、細胞壁のような他の領域からの顕著な蛍光シグナルなしに、細胞核を選択的に染色した。また、色素1は、シロイヌナズナの根及び葉の生細胞核を直接染色することができた。さらに、色素1で染色したシロイヌナズナの根はその後も伸長を続けることを確認している。また、ヒメツリガネゴケの原糸体（図１６(a), (b), (c)）、シロイヌナズナの根（図１６(i), (j), (k)）に関しては色素2、3及び5において細胞核をラベルすることができ、シロイヌナズナの葉に関しては、図１５に示した色素1及び図１６(e)に示す色素2では良好に細胞核をラベルした。一方、色素3及び5では孔辺細胞や表皮細胞の細胞壁に非特異的な吸着が見られた。Sir-Hoecstはいずれの細胞（図１６(d), (h), (l)）でも核は染色されなかった。
【０２７０】
［まとめ］
結論として、本発明では40〜3900倍のdsDNA特異的な蛍光発生性及びRNAに対する低い蛍光応答を示す一連の新規対称シアニン色素を報告した。開発された色素は、HeLa細胞のDNAを選択的に染色した。また、これらの色素は、532nm、561nm、633 nm、685 nm等の汎用のレーザーを使用することができる。さらに、モノメチン色素は、植物細胞の核も化学固定をすることなく染色可能であることを示した。これらの特性は、非モデル生物の様々な生物種における核の動態の研究目的に有用と考えられる。
【０２７１】
実施例2
一般操作
特に明記しない限り、乾燥溶媒を含むすべての材料は、商業的供給元から入手し、精製することなく使用した。色素1は、実施例1に記載の手順に従って調製した。全ての後処理及び精製手順は、試薬グレードの溶媒を用いて行った。FT-ESI質量分析器を用いて、高分解能マススペクトル分析を行った。すべての化合物の融点は、MPA100 Optimelt automated melting point systemで測定した。Cl-色素1及びBr-色素1の精製には、シリカゲル60N（Kanto Chemical Co.、球状、中性、40〜50メッシュ）を用いてカラムクロマトグラフィーを行った。核磁気共鳴（NMR）スペクトルを、ジメチルスルホキシド-d6（(CD3)2SO）中で、JEOL JNM-ECA-400（1H 400MHz、13C 100MHz）及びJNM-ECA-600（1H 600MHz、13C 150MHz）分光計で測定した。1H NMRのchemical shiftは、(CD3)2SO（δ2.49ppm）に対する百万分率（ppm）で表示した。13C NMRのchemical shiftは、(CD3)2SO（δ39.5ppm）に対する百万分率（ppm）で表示した。データは、chemical shift, multiplicity (s = singlet, d = doublet, dd = doublet of doublets, ddd = doublet of doublet of doublets, dt = doublet of triplets, td = triplet of doublets, t = triplet, m = multiplet, br = broad), coupling constant (Hz), integrationの順に示す。全ての光学的測定には、和光純薬工業（株）から購入したTris-EDTA緩衝液（TE緩衝液；pH= 8.0）を用いた。Sigma-Aldrich社（Sigma-Aldrich Co., LLC）から購入したカーフ胸腺二本鎖DNA（dsDNA）を測定に使用した。
【０２７２】
dsDNA添加による色素のスペクトル変化
紫外可視吸収スペクトルを、0.5nmの分解能を有するShimadzu UV-3510 spectrometerで記録し、蛍光スペクトルを0.2nmの分解能を有するFP-6600 Hitachi spectrometerで測定した。全ての光学的測定には1.0cm四方の石英セルを使用した。マイクロピペットを用いて室温で0.3以下の吸収波長を有する色素溶液（2.0mL）に1.0g/LのdsDNA溶液（1.0mL）を添加した。滴定後、混合した溶液を穏やかに数回振とうして、すべての試料の吸光度及び蛍光強度を安定させた。
【０２７３】
光照射による色素-dsDNA複合体のスペクトル変化
色素とdsDNAの混合溶液に、蛍光分光計の光源を用いて、Br-色素1には2時間、Cl-色素1には1時間、561nmの光（非吸収領域）を照射した。サンプルの蛍光変化の進行は、適切な励起光を用いて記録した。全ての測定は、予想外の光反応を避けるために室温暗室下で行った。
【０２７４】
細胞培養
HeLa細胞（RIKEN Cell Bank, Japan）を、10%ウシ胎仔血清を含むDulbecco’s modified Eagle’s medium（DMEM, Wako）中、37℃、5%CO2/95%空気インキュベーター中で培養した。HeLa細胞（2×104）をガラス底8ウェルスライドの各ウェルに移し、１日培養後イメージング実験を行なった。
【０２７５】
光活性化実験
Plan-Apochromat 20×/0.8を用いて共焦点レーザー顕微鏡LSM780（Zeiss）にて局所的光活性化及び観察を行なった。Cl-色素1の光活性化は、560nmの光を10回繰り返して照射することによって行った。観察は、488nmの励起光を用いて蛍光イメージングのを行い、517〜605nmの蛍光シグナルを収集した。 5秒間の間隔で20回の経時的蛍光画像を取得した。収集された画像は、オープンソースソフトウェアImage J（http://imagej.nih.gov/ij/）を用いて処理した。
【０２７６】
実施例2-1
出発原料である色素1は、上記した工程にしたがって合成した。既報（Liebigs Ann. 1995, 1003.）を用いて、色素1とN-クロロスクシンイミド又はN-ブロモスクシンイミドとの反応により、標的ハロゲン置換化合物であるCl-色素1及びBr-色素1を得た。2つの色素の詳細な合成手順及びそれらのデータは後述する。
【０２７７】
【化４５】
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【０２７８】
4-(クロロ(1-フェニルピリジン-4(1H)-イリデン)メチル)-1-フェニルピリジン-1-イウムクロリド(Cl-色素1)の合成
【０２７９】
【化４６】
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【０２８０】
CH2Cl2（10mL）中の色素1（100mg, 0.20mmol）の溶液に、0℃でN-クロロスクシンイミド（27mg, 0.20mmol, 1.0当量）を加えた。次いで、反応混合物を5分間撹拌した。溶媒を除去した後、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：CH2Cl2/MeOH= 100: 0 to 80: 20）で精製し、DOWEXTM 22イオン交換樹脂を用いたトシレートアニオンからクロロアニオンへのイオン交換により、Cl-色素1を紫色固体として得た（36mg, 45%）。
【０２８１】
【数３１】
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【０２８２】
4-(ブロモ(1-フェニルピリジン-4(1H)-イリデン)メチル)-1-フェニルピリジン-1-イウム4-メチルベンゼンスルホネート(Br-色素1)の合成
【０２８３】
【化４７】
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【０２８４】
CH2Cl2（10mL）中の色素1（100mg, 0.20mmol）の溶液に、0℃でN-ブロモスクシンイミド（38mg, 0.21mmol, 1.1当量）を加えた。次いで、反応混合物を0℃で10分間撹拌した。溶媒を除去した後、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：CH2Cl2/MeOH= 100: 0 to 80: 20）で精製し、Br-色素1を紫色粉末として得た（17mg, 15%）。
【０２８５】
【数３２】
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【０２８６】
［光物性評価］
dsDNAへの結合時のハロゲン置換色素のUV/Vis吸収及びCDスペクトル
TE緩衝液中のBr-色素1の溶液の吸収極大波長（λabsfree）は、545nmであり、これはdsDNAの存在下でも全くシフトしなかった（図１７(a)）。一方、吸収スペクトルの形状は、dsDNA溶液中では鋭くなり、吸光度がわずかに増加した。過剰のdsDNAの存在下でのBr-色素1のCDスペクトル分析から、吸収極大領域周辺に大きな正のCotton効果が観察されたため、Br-色素1がマイナーグルーブモードによってdsDNAに結合することが示唆された（図１７(b)）。dsDNA溶液中のCl-色素1の吸収スペクトルにおいても同様にスペクトル形状が鋭くなったが、Cl-色素1の吸光度は減少し、λabsfreeは541nmから547nmへわずかな長波長シフトが見られた（図１７(c)）。CDスペクトル分析の結果は正のCotton効果が観察されたため、Cl-色素1はBr-色素1と同様にマイナーグルーブモードでdsDNAに結合すると考えられる（図１７(d)）。
【０２８７】
光照射によるdsDNAによるハロゲン置換色素の蛍光変化
吸収スペクトルの分析により、dsDNAの存在下でのBr-色素1及びCl-色素1の光化学反応を評価した。図１７に示すように、Br-色素1及びCl-色素1は561nmの光で励起することが可能である。一方、Br-色素1-DNA複合体の蛍光強度はかなり弱く、臭素原子の導入により色素1-DNA複合体が消光している。Br-色素1の蛍光強度は、光照射することにより2時間の間約8倍まで徐々に増加した（図１８）。光照射後の蛍光スペクトルの形状は、dsDNAの存在下における色素1の結果とほとんど同じであり、光照射により色素1が生成されたことを示唆している。つまり、一般に良く知られる光活性化分子の光活性化は紫外領域を用いるが、Br-色素1は、561nmの長波長光を用いて光活性化させて色素1を得ることができる。さらに、生成された色素1は561nmにおいてほとんど吸収がなく（図４）、561nmの光刺激では褪色されにくいため、効率よくBr-色素1から色素1を生成させることが可能である。
【０２８８】
次に、Cl-色素1の光活性化の分光分析を行った。Cl-色素1に561nmの光を1時間照射すると、Br-色素1と同様の挙動が観察でき、蛍光強度は照射後約3倍に増加した（図１９）。Br-色素1の場合と同様に、Cl-色素1の得られた蛍光スペクトルの形状は色素1の蛍光スペクトルとよく一致し、Cl-色素1は561nmの光で励起することができ、色素1が561nmの光照射で生成されたことを示唆している。図５からも理解できるように、色素1は561nmにおいてほとんど吸収がないため、色素1を褪色させることなく効率よくCl-色素1を光活性化させ色素1を生成させることが可能である。2つのハロゲン置換色素を総合的に比較すると、Br-色素1がCl-色素1より高い光活性化蛍光発生能力を有することが明らかになった。
【０２８９】
［ハロゲン置換-色素1の光活性化］
Br-色素1は、光照射を避けて保存しても数日以内に分解するため、Br-色素1は高い光活性化蛍光発生能を持つが、細胞イメージングの汎用性色素としては適していないと考えられる。一方、Cl-色素1は、光及び空気に対する安定性を示す。したがって、細胞イメージング実験はCl-色素1を用いて行った。
【０２９０】
細胞内におけるCl-色素1の光活性化
HeLa細胞染色には、Cl-色素1の1μM溶液を使用した場合、HeLa細胞の核は弱く選択的に染色された（図２０(a)）。次いで、図２０(a)の白い大きな点線円で強調表示されているように、選択された核の1つに強い560nmの光を照射し、蛍光シグナルの変化をモニターしたところ、光照射された細胞の核の蛍光が増大した（図２０(b)）。光照射した細胞の核の領域（小さな白丸1）及び非照射の細胞の核の領域（小さな白丸2）の蛍光強度変化を経時的にモニターした（図２０(c)及び２０(d)）。小さな白丸1内の蛍光強度は、560nmの光照射時に直ちに約4倍増加したが、小さな白丸2の蛍光強度に変化はみられなかった。これらの結果から、Cl-色素1が核に選択的に局在し、強い560nmの光照射を用いて光活性化されることがわかった。
【０２９１】
［まとめ］
ここでは、色素1にさらなる機能性をもたらす光活性化可能な蛍光核マーカーCl-色素1及びBr-色素1の設計及び合成について説明した。光活性化可能な特性の設計は、色素1のメチン部分への光除去可能なハロゲンタグ（Cl及びBr）の導入に基づく。光照射前後のスペクトル変化から、蛍光スイッチのメカニズムは光誘起脱ハロゲン化反応に伴う色素1の形成に起因することが考えられる。ハロゲン原子の導入は、色素1の構造と電子状態の両方の変化を最小限に抑えることが期待されるため、ハロゲン置換色素1は、色素1と類似または同一の局在を有すると予想される。実際、最初は弱い蛍光であったCl-色素1に、強い560nmの光を照射して生細胞を観察したところ、効果的に光活性化して照射した細胞の核を特異的に蛍光ラベルできた。これらのin-vivo及びin-vitroの実験結果は、光誘起ターンオン蛍光は、ハロゲン置換色素1からin-situで生成された色素1によって引き起こされると考えられる。さらに、Br-色素1及びCl-色素1は、非常に長波長の光照射（561nm）による光活性化が可能であることを示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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