(57)【要約】      （修正有）【課題】高純度のＮ−保護Ｌ−カルノシン誘導体、及びＬ−カルノシンの簡便な製造方法の提供。【解決手段】酸ハロゲン化物（１）と、Ｌ−ヒスチジン誘導体（２）とを反応させることを含む製造方法。2019167317.tif 000021（Ｒ１、Ｒ２は、Ｈ又はアミノ基の保護基；Ｘはハロゲン原子を表す）2019167317.tif 000022（ＴＭＳ基はトリメチルシリル基を表す）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
2019167317.tif 000014
（式中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に水素原子、アミノ基の保護基であり、Ｒ１、Ｒ２の少なくとも一つはアミノ基の保護基であり、Ｘはハロゲン原子である。）
で示される酸ハロゲン化物と、
下記式（２）
【化２】
2019167317.tif 000015
（式中、ＴＭＳ基はトリメチルシリル基である。）で示されるＬ−ヒスチジン誘導体とを反応させることにより、
下記式（３）
【化３】
2019167317.tif 000016
（式中、Ｒ１、Ｒ２は、前記式（１）と同義である。）
で示される保護Ｌ−カルノシン誘導体を製造する方法。
【請求項２】
前記Ｒ１およびＲ２のアミノ基の保護基が、置換基を有していてもよいベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、トリフルオロアセチル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、ホルミル基、又は置換ベンジル基のいずれかである、請求項１記載の保護Ｌ−カルノシン誘導体を製造する方法
【請求項３】
塩基の存在下で反応を行う請求項１又は２記載の保護Ｌ−カルノシン誘導体を製造する方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の方法により前記式（３）で示される保護Ｌ−カルノシン誘導体を製造した後、
得られた該保護Ｌ−カルノシン誘導体の脱保護反応を行うことにより、下記式（４）
【化４】
2019167317.tif 000017
で示されるＬ−カルノシンを製造する方法。
【請求項５】
前記式（３）で示される保護Ｌ−カルノシン誘導体におけるトリメチルシリル基の脱保護を行い、下記式（５）
【化５】
2019167317.tif 000018
（式中、Ｒ１、Ｒ２は、前記式（１）と同義である。）
で示されるＮ−保護―Ｌ−カルノシン誘導体を得、次いで該Ｎ−保護―Ｌ−カルノシン誘導体の脱保護反応を行う請求項４記載のＬ−カルノシンを製造する方法。
【請求項６】
前記式（５）で示されるＮ−保護―Ｌ−カルノシン誘導体を、該誘導体、又はその塩として単離する請求項５記載のＬ−カルノシンを製造する方法。
【請求項７】
下記式（６）
【化６】
2019167317.tif 000019
（式中、Ｒ１およびＲ２は、前記式（１）と同義である。）
で示されるＮ−保護−β−アラニン誘導体を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド存在下、ハロゲン化剤と反応させることを特徴とする前記式（１）で示される酸ハロゲン化物を製造する方法。
【請求項８】
化合物（９）で示されるＮ−ベンジルオキシカルボニルーＬ−カルノシン塩酸塩。
【化７】
2019167317.tif 000020
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−カルノシン誘導体及びＬ−カルノシンの新規な製造方法に関する。詳しくは、安全かつ簡便な方法で高純度かつ安価なＬ−カルノシン誘導体及びＬ−カルノシンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
下記式（１）
【０００３】
【化１】
2019167317.tif 000002
【０００４】
で示されるＬ−カルノシンは、組織修復促進作用、免疫調整作用、抗炎症作用を有していることから、医薬品や健康食品などの需要が高まっている。また、該Ｌ−カルノシンは、容易に金属とキレート結合をつくることから、亜鉛と錯形成したポラプレジンクなどの抗潰瘍薬、味覚障害治療薬へ応用されている。
【０００５】
Ｌ−カルノシンは、通常、以下の方法で合成されている。具体的には、Ｌ−ヒスチジン又はその誘導体と、シアノ酢酸エステルとを反応させる方法（例えば、特許文献１参照）、Ｌ−ヒスチジン又はその誘導体とＮ−トリフルオロアセチル―β―アラニン誘導体とを反応させる方法（例えば、非特許文献１参照）、又は、Ｌ−ヒスチジン誘導体とＮ−フタロイル―β―アラニルクロリト誘導体とを反応させる方法（特許文献２参照）が知られている。その他、Ｎ−保護−カルボキシ無水物とＬ−ヒスチジンメチルエステルとをカップリングする方法（非特許文献２参照）、Ｎ−保護−カルボキシ無水物とＬ−ヒスチジンとを反応させる方法（特許文献３参照）、Ｌ−ヒスチジンとＮ−保護―β―アラニルピバリン酸無水物誘導体を反応させる方法（特許文献４）等も知られている。
【０００６】
しかしながら、前記従来法では、以下の点で改善の余地があった。例えば、特許文献１に記載の方法では、反応を進行させるためには高温（例えば、１２０℃）を必要とし、収率が低いという点で改善の余地があった。また、この方法では、シアノ基で保護されたＬ−カルノシン誘導体を、水素還元によって該シアノ基をアミノ基にするため、オートクレーブなど高圧設備が必要なうえ触媒コストなど製造コストが高い点で改善の余地があった。
【０００７】
また、非特許文献１に記載の方法では、活性化剤としてニトロフェノールを使用しなければならず、コスト高となるとともに脱離機の除去等、後処理工程が煩雑になるという点で改善の余地があった。さらに、原料となるＮ−トリフルオロアセチル誘導体が高価であり、工業的な生産を考えると他原料での製造が望まれていた。
【０００８】
さらに、非特許文献２の方法では、Ｎ−カルバメート保護−カルボキシ無水物を合成するために多くの工程が必要であった。そのため、経済的な観点で改善の余地があった。
【０００９】
また、特許文献２の方法は、具体的には、Ｎ−フタロイル誘導体としてＮ−フタロイル−β−アラニルクロリドと、保護基としてトリメチルシリル基を有するＬ−ヒスチジン誘導体とを反応させるものである。しかしながら該方法で必要なフタロイル保護基の製造には高温を要すること、該保護基の脱保護工程において、危険な抱水ヒドラジンを用いていること、さらに、該脱保護工程において、脱離基として分子量が大きく完全に除去することが難しいフタラジン誘導体を副生し、目的物の精製が難しくなるという問題点があり改善の余地があった。
【００１０】
また、特許文献３記載の方法は、高収率でＬ−カルノシンが得られるものの、アミン成分であるＬ−ヒスチジンが２個縮合した下記副生物（すなわち、Ｎ−Ｃｂｚ−β―Ａｌａ−Ｌ−Ｈｉｓ-Ｌ−ＨｉｓＯＨ）が副生し反応生成物から該副生物の除去が困難であることから、この副生が最少になる製法が望まれていた。
【００１１】
【化２】
2019167317.tif 000003
【００１２】
さらにまた、非特許文献３、特許文献４では、Ｌ−カルノシンを含むペプチド合成において、ピバロイルクロリドと反応させこれにより生じた酸無水物とＬ−ヒスチジン誘導体、又はＬ−ヒスチジンとを反応させているが、反応の位置選択性が十分でなく、副生物として、ピバロイル基で反応した下記式で示される生成物（副生物１）を多量に与え、目的物の収率を著しく低下させるという問題点があった。また、本法では、強烈な悪臭を有するピバリン酸（下記式、副生物２）が脱離基として排出されることから、環境衛生面においても課題があった。
【００１３】
【化３】
2019167317.tif 000004
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００１／１０６４６３８号パンフレット
【特許文献２】中国公開公報ＣＮ１０１２８４８６２
【特許文献３】国際公開ＷＯ０９９／０５１６４号パンフレット
【特許文献４】ＫＲ１０−２００７−００５０３１９
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｒｕｓｓ．Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００７，７７（９），  １５７６
【非特許文献２】Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．  ２０１０，７５，７１０７．
【非特許文献３】Ｃｏｌｌｅｃｔ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６２，２７，１２７３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
Ｌ−カルノシンは、前記の通り、医薬品にも使用されており、その適用範囲は広い。そのため、なるべく安全かつ簡便な方法で、高純度かつ安価なＬ−カルノシンを収率よく製造することができれば、その工業的利用価値はさらに高くなる。したがって、本発明の目的は、安全かつ簡便な方法で高純度かつ安価なＬ−カルノシンを製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者等は、上記課題を解決するために、鋭意検討を行った。Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−β−アラニルクロリドと、保護基としてトリメチルシリル基を有するＬ−ヒスチジン誘導体とを反応させることにより、副反応によるＬ−ヒスチジンの損失を最小限にして、高純度のＮ−保護―Ｌ−カルノシン誘導体、又はその塩を高収率に単離・製造することによって、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。Ｌ−カルノシンは、既知の方法に従い該保護基の脱保護を行うことにより製造できる。また、該酸塩化物の製造方法を検討し、触媒量のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの存在下、β―アラニン誘導体と塩化チオニルを反応させることにより、基本的に酸に弱いベンジルオキシカルボニル保護基（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．  １９５２、１７、１５６４−１５７０）の脱保護を伴わず、酸塩化物を得、これと上記のＬ―ヒスチジン誘導体を反応させることにより、Ｌ−カルノシン誘導体を高収率に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、下記式（４）
【００１８】
【化４】
2019167317.tif 000005
【００１９】
（式中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に水素原子、アミノ基の保護基であり、Ｒ１、Ｒ２の少なくとも一つはアミノ基の保護基であり、Ｘはハロゲン原子である。）
で示される酸ハロゲン化物と、
下記式（５）
【００２０】
【化５】
2019167317.tif 000006
【００２１】
（式中、ＴＭＳ基はトリメチルシリル基である。）で示されるＬ−ヒスチジン誘導体とを反応させることにより、
下記式（６）
【００２２】
【化６】
2019167317.tif 000007
【００２３】
（式中、Ｒ１、Ｒ２は、前記式（４）と同義である。）
で示される保護Ｌ−カルノシン誘導体を製造する方法である。
【００２４】
本発明は、以下の態様をとることができる。
（２）前記Ｒ１およびＲ２のアミノ基の保護基が、置換基を有していてもよいベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、トリフルオロアセチル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、ホルミル基、又は置換ベンジル基のいずれかであること。
（３）塩基の存在下で反応を行うこと。
（４）上記いずれかの方法により前記式（６）で示される保護Ｌ−カルノシン誘導体を製造した後、得られた該保護Ｌ−カルノシン誘導体の脱保護反応を行うことにより、下記式（７）
【００２５】
【化７】
2019167317.tif 000008
【００２６】
で示されるＬ−カルノシンを製造すること。
【００２７】
（５）前記式（６）で示される保護Ｌ−カルノシン誘導体におけるトリメチルシリル基の脱保護を行い、下記式（８）
【００２８】
【化８】
2019167317.tif 000009
【００２９】
（式中、Ｒ１、Ｒ２は、前記式（４）と同義である。）
で示されるＮ−保護―Ｌ−カルノシン誘導体を得、次いで該Ｎ−保護―Ｌ−カルノシン誘導体の脱保護反応を行いＬ−カルノシンを製造すること。
（６）前記式（８）で示されるＮ−保護―Ｌ−カルノシン誘導体を、該誘導体、又はその塩として単離すること。
【００３０】
また、第２の本発明は、下記式（９）
【００３１】
【化９】
2019167317.tif 000010
【００３２】
（式中、Ｒ１およびＲ２は、前記式（４）と同義である。）
で示されるＮ−保護−β−アラニン誘導体を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド存在下、塩化チオニルハロゲン化剤と反応させることを特徴とする前記式（４）で示される酸ハロゲン化物を製造する方法である。
【発明の効果】
【００３３】
本発明の方法によれば、特定の原料、すなわち、前記酸ハロゲン化物を原料とすることにより、簡便な方法で保護Ｌ−カルノシン誘導体を製造できる。そして、該保護Ｌ−カルノシン誘導体を脱保護することにより、容易にＬ−カルノシンを製造できる。
【００３４】
以上の通り、前記酸ハロゲン化物を使用することにより、副生物が少なくより簡便かつ環境負荷の少ない方法で高収率にＮ−保護Ｌ−カルノシン誘導体、およびＬ−カルノシンを製造できるため、本発明の工業的利用価値は高い。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、特定の原料、すなわち、前記式（４）で示される酸ハロゲン化物（以下、単に「酸ハロゲン化物」とも言う）と、前記式（５）で示されるＬ−ヒスチジン誘導体（以下、単に「Ｌ−ヒスチジン誘導体」とも言う）とを反応させることにより、前記式（６）で示される保護Ｌ−カルノシン誘導体（以下、単に「保護Ｌ−カルノシン誘導体」とも言う）を製造する方法である。そして、該方法で得られた保護Ｌ−カルノシン誘導体（６）の脱保護反応を行うことにより、Ｌ−カルノシン（１）を製造する方法である。以下、順を追って説明する。
【００３６】
＜酸ハロゲン化物＞
本発明においては、前記式（４）で示される酸ハロゲン化物を原料とする。なお、本発明において、アミノ基の保護基とは、アミノ基に置換して所定反応中に不活性化する基であり、所定反応後、脱保護によりアミノ基が形成される基を示す。前記式（４）のＲ１およびＲ２におけるアミノ基の保護基としては、公知の保護基が挙げられる。中でも、酸ハロゲン化物のコスト、安定性、および最終工程での脱保護反応を考慮すると、置換基を有していてもよいベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、トリフルオロアセチル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロエトキシキカルボニル基、又はホルミル基であることが好ましく、特に脱保護反応の容易性およびコストの観点から、置換基を有してもよいベンジルオキシカルボニル基が好ましい。ベンジルオキシカルボニル基が有する置換基とは、ベンジルオキシカルボニル基のフェニル基が有する置換基である。該置換基としては、メチル基、メトキシ基、ハロゲン基、ニトロ基、ジメチルアミノ基が挙げられる。中でも、最も好ましい保護アミノ基としては、非置換の、単なるベンジルオキシカルボニル基であることが好ましい。Ｒ１およびＲ２の少なくとも一つは上記アミノ基の保護基である。
【００３７】
前記式中、Ｘはハロゲン原子である。酸ハロゲン化物の生産性、および反応時における安定性等を考慮すると、前記ハロゲン化物は、酸クロリド、酸ブロミドであることが好ましく、酸クロリドであることが最も好ましい。  上記酸ハロゲン化物は、特に制限されるものではなく、例えば前記式（９）で表わされるＮ−保護―β―アラニン誘導体（以下、単に「Ｎ−保護―β―アラニン誘導体」とも言う）を、塩化チオニル、臭化チオニルなどハロゲン化剤と反応させることにより製造できる。特にアミノ基の保護基としてベンジルオキシカルボニル保護基を用いる場合には、上記ハロゲン化剤との反応により副生する酸によってベンジルオキシカルボニル基の脱保護が生じるため、かかる脱保護反応を抑制し、高収率で目的の酸ハロゲン化物を得る観点から、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの存在下で上記ハロゲン化剤と反応させ低温かつ短時間に酸ハロゲン化物を製造することが好ましい。以下、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの存在下で上記ハロゲン化剤と反応させて酸ハロゲン化物を製造する方法について説明する。
【００３８】
＜酸ハロゲン化物の製造方法＞
前記Ｎ−保護−β−アラニン誘導体は、公知の化合物であり、例えば、国際公開ＷＯ１９９８０１９７０５号に記載の方法で製造することができる。この中でも、酸ハロゲン化物の生産性、反応時における安定性、および脱保護の容易性等を考慮すると、前記Ｎ−保護−β−アラニン誘導体は、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−β−アラニンであることが最も好ましい。
【００３９】
塩化チオニル、臭化チオニルなどハロゲン化剤は、前記Ｎ−保護−β−アラニン誘導体１モルに対して、１〜５モル使用することが好ましく、さらに１〜２モル使用することが好ましい。なお、本反応では、前記Ｎ−保護−β−アラニン誘導体と前記ハロゲン化剤とをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの存在下ハロゲン化剤を作用させる。
【００４０】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドは、前記Ｎ−保護−β−アラニン誘導体１モルに対して、０．００５〜０．１モル使用することが好ましく、さらに０．０１〜０．０５モル使用することが好ましい。
【００４１】
前記酸ハロゲン化物の製造方法において、有機溶媒を使用する場合、該有機溶媒は、前記Ｎ−保護−β−アラニン誘導体と前記ハロゲン化物との反応を阻害しないものであれば、特に制限されるものではない。好適な有機溶媒を例示すると、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒；塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン系溶媒；トルエン、キシレン等の芳香族系溶媒；アセトン、ジエチルケトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒；ｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）等のエーテル系溶媒；アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン等の極性溶媒等が挙げられる。これら有機溶媒は、単独種でも複数種であってもよい。これら有機溶媒の中でも、特に、塩化メチレン、クロロホルムが好ましい。
【００４２】
前記有機溶媒の使用量は、特に制限されるものではなく、各成分を有機溶媒中で十分に攪拌混合できる量であればよい。具体的には、前記Ｎ−保護−β−アラニン誘導体１ｇに対して、０．５〜１００ｍｌとすることが好ましく、１〜２０ｍｌとすることがより好ましい。
【００４３】
Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドの存在下、前記Ｎ−保護−β−アラニン誘導体とハロゲン化剤とを反応させるには、各成分を攪拌混合して接触させればよい。各成分を反応器中で攪拌するに際し、該反応器中に各成分を導入する手順は特に制限されるものではない。例えば、必要に応じて有機溶媒で希釈したＮ−保護−β−アラニン誘導体、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、およびハロゲン化剤を反応器内に同時に導入し攪拌混合することができる。また、必要に応じて有機溶媒で希釈した２成分を先に反応器内に導入しておき、他成分を後から導入し攪拌混合することもできる。さらには、必要に応じて有機溶媒で希釈した１成分を予め反応器内に導入しておき、他に２成分を同時に反応器に導入して攪拌混合する方法等を採用することができる。
【００４４】
前記Ｎ−保護−β−アラニン誘導体と前記ハロゲン化剤とを反応させる際の反応温度は、特に制限されるものではないが、−３０〜６０℃であることが好ましく、５〜４０℃であることがより好ましい。
【００４５】
反応時間は、原料の消費量、酸ハロゲン化物の生成量等を確認しながら、適宜決定すればよい。上記条件であれば、通常、０．１〜１０時間あれば十分であり、好ましくは０．５〜５時間である。
【００４６】
反応雰囲気も、特に制限されるものではなく、乾燥空気雰囲気下、不活性ガス雰囲気下、通常の空気雰囲気下で実施することができる。また、大気圧下、減圧下、加圧下の何れの圧力下で反応を実施してもよい。そのため、操作性を考慮すると、空気雰囲気下又は不活性ガス雰囲気下、大気圧下で反応を実施することが好ましい。
【００４７】
以上のような方法で前記酸ハロゲン化物を製造することができる。得られた酸ハロゲン化物は、反応終了後そのまま、次の反応に供することもできるし、反応液を室温で濃縮して、濃縮残渣として取り出すこともできる。
【００４８】
＜Ｌ−ヒスチジン誘導体＞
本発明おいては、前記式（５）で示されるＬ−ヒスチジン誘導体を使用する。該Ｌ−ヒスチジン誘導体は、公知の化合物であり、例えば、ＣＮ１０１２８４８６２に記載の方法で製造することができるが、シリル化剤であるヘキサメチルジシラザンは、原料コストを考慮に入れると、Ｌ−ヒスチジンに対して、３〜５当量、好ましくは３〜４当量用いることが望ましい。
【００４９】
上記のＬ−ヒスチジンのトリメチルシリル保護の反応温度は、８０〜１６０℃、好ましくは、１１０〜１３５℃で実施することが望ましい。また、反応時間は長すぎると反応液が着色するため、２０〜１２０分、好ましくは、３０〜６０分で実施することが好ましい。
【００５０】
反応後、有機溶媒を減圧留去することにより、上記Ｌ−ヒスチジン誘導体を単離することができるが、後述の酸ハロゲン化物とＬ−ヒスチジン誘導体との反応において塩基を存在させることが好ましく、Ｌ−ヒスチジン誘導体の製造時に用いた過剰のヘキサメチルジシラザン、および生成したトリメチルシリルアミドが塩基として使用できることから、反応液をそのまま次工程に用いることが好ましい。
【００５１】
＜保護Ｌ−カルノシン誘導体の製造方法＞
本発明の製造方法では、上記酸ハロゲン化物と前記式（５）で示されるＬ−ヒスチジン誘導体とを反応させることにより、前記式（６）で示される保護Ｌ−カルノシン誘導体を製造する。
【００５２】
前記酸ハロゲン化物としては、ハロゲン化剤が安価かつ容易に入手できる点、適度な反応性と安定性を有する点、アトムエコノミーが高い点などの理由からを用いる酸塩化物を用いることが好ましい。
【００５３】
該反応は、有機溶媒中で実施することが好ましい。好適に使用できる有機溶媒としては、前記＜酸ハロゲン物の製造方法＞で説明した有機溶媒が挙げられ、好適な有機溶媒も同じである。また、有機溶媒の使用量は、前記酸塩化物１ｇに対して、０．５〜１００ｍｌであることが好ましく、５〜２０ｍｌであることが好ましい。
【００５４】
本発明の製造方法では、さらに塩基の存在下で上記反応を行うことが好ましい。塩基を存在させることにより、アミン成分であるＬ−ヒスチジンが２個縮合した副生物（すなわち、前記式（２）で示されるＮ−Ｃｂｚ−β―Ａｌａ−Ｌ−Ｈｉｓ-Ｌ−ＨｉｓＯＨ）の副生が抑制できる。用いられる塩基として具体的には、ヘキサメチルジシラザン（（ＴＭＳ）２ＮＨ）、トリメチルシリルアミド（ＴＭＳＮＨ２）、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン、４−Ｎ−モルホリノピリジン、ピリジン、ルチジンなどが挙げられる。なお、塩基としてトリエチルアミンのような比較的強い塩基を用いると、酸塩化物の脱塩化水素反応が進行し、下記式
【００５５】
【化１０】
2019167317.tif 000011
【００５６】
で示される、酸クロリドと比べて反応性の低いケテン誘導体を生じる傾向がある。従って、上記塩基の中でもヘキサメチルジシラザン（ＴＭＳ）２ＮＨ）、または、トリメチルシリルアミド（ＴＭＳＮＨ２）を用いることが好ましい。
【００５７】
前記酸ハロゲン化物と前記Ｌ−ヒスチジン誘導体とを反応させる方法は特に制限されず、具体的には、有機溶媒中で前記酸塩ハロゲン化物、塩基、および前記Ｌ−ヒスチジン誘導体を攪拌混合することにより、実施することができる。特に前記酸塩化物を有機溶媒に希釈した溶液を、前記Ｌ−ヒスチジン誘導体と塩基を有機溶媒に希釈した溶液に滴下する方法が望ましい。
【００５８】
反応温度は、特に制限されるものではないが、−２０〜７０℃であることが好ましく、０〜４０℃であることがより好ましい。
【００５９】
反応時間は、原料の消費量、保護Ｌ−カルノシン誘導体の生成量等を確認しながら、適宜決定すればよい。上記条件であれば、通常、０．１〜４８時間あれば十分であり、好ましくは０．５〜２４時間である。
【００６０】
反応雰囲気も、特に制限されるものではなく、乾燥空気雰囲気下、不活性ガス雰囲気下、通常の空気雰囲気下で実施することができる。また、大気圧下、減圧下、加圧下の何れの圧力下で反応を実施してもよい。そのため、操作性を考慮すると、空気雰囲気下、大気圧下で反応を実施することが好ましい。以上のような方法で反応を行うことにより、保護Ｌ−カルノシン誘導体を製造することができる。
【００６１】
＜Ｌ−カルノシンの製造方法＞
上記本発明の製造方法によって得られた該保護Ｌ−カルノシン誘導体は、トリメチルシリル基、およびＲ１、Ｒ２基の除去反応を行うことにより、Ｌ−カルノシンを製造することができる。脱保護条件は、Ｒ１、Ｒ２に用いた保護基の種類に応じて適宜選択すれば良く、トリメチルシリル基、およびＲ１、Ｒ２基を一気に脱保護しても良く、トリメチルシリル基を脱保護し、次いでＲ１、Ｒ２基を脱保護しても良い、特にアミノ基の保護基としてＮ−ベンジルオキシカルボニル基を用いた場合には、上記保護Ｌ−カルノシン誘導体を製造した反応液へ水を加えることにより、トリメチルシリル基が除去され、得られた水層を濃縮することにより、下記式（１１）
【００６２】
【化１１】
2019167317.tif 000012
【００６３】
に示されるＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−カルノシン塩酸塩が析出する。次いで、析出した結晶を濾過・乾燥することにより、高純度の保護Ｌ−カルノシン誘導体を塩酸塩として得ることができるため好ましい。この時使用する水の量は、保護Ｌ−カルノシン誘導体１ｇに対して、０．１〜５０ｍｌ使用することが好ましい。
【００６４】
得られたＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−カルノシン塩酸塩は、ベンジルトリメチルアンモニウムヒドロキサイド（トリトンＢ）と接触させることにより脱塩化水素が進行し、フリー体のＮ−保護Ｌ−カルノシン誘導体を得ることができる。
【００６５】
反応液に水を加えてトリメチルシリル基を除去後、分液し水層を分取することにより脱保護体を水溶液として得ることもできる。
【００６６】
なお、Ｌ−ヒスチジン誘導体を調製後、反応液を減圧濃縮しない場合、又は本カップリング反応で塩基を加えた場合は、カップリング生成物として、フリー体の保護Ｌ−カルノシン誘導体が直接得られる。
【００６７】
＜Ｌ−カルノシンの製造；Ｎ−保護Ｌ−カルノシン誘導体の脱保護反応＞
前記Ｎ−保護Ｌ−カルノシン誘導体、又はその塩酸塩からＬ−カルノシンを製造するためには、アミノ基の保護基であるベンジルオキシカルボニル基を除去すればよい。本脱保護反応は、特に制限されるものではなく、公知の方法が採用できる。
【００６８】
ベンジルオキシカルボニル基を除去するためには、酸処理を行う方法、パラジウム触媒存在下、水素、又は水素源を存在させる方法が挙げられる。
【００６９】
使用する酸は、特に制限されるものではなく、塩化水素、臭化水素酸、硫酸、メタンスルホン酸が好ましい。また、これら酸は、水溶液、又は酢酸溶液の状態で反応系内に導入することができる。
【００７０】
酸の使用量は、特に制限されるものではないが、前記Ｎ−保護Ｌ−カルノシン誘導体、又はその塩酸塩１モルに対して、酸を０．１〜１００モル使用することが好ましい。中でも、前記Ｎ−保護Ｌ-カルノシン誘導体、又はその塩酸塩と酸とを接触させる反応系内のｐＨが−１以上４未満となる範囲の使用量とすることが好ましい。このような条件で脱保護反応を実施するのが好ましい。前記反応系内ｐＨは、使用する酸全量を反応系内に導入した際のｐＨの範囲である。
【００７１】
＜酸を使用してＲ１を脱保護する場合；溶媒＞
脱保護反応は、溶媒中で実施することができる。前記Ｌ−カルノシン誘導体を取り出した後、脱保護反応を実施する場合には、塩化メチレン等のハロゲン系溶媒；トルエン、キシレン等の芳香族系溶媒；アセトン、ジエチルケトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒；ｔ−ブチルメチルエーテル、ジオキサン等のエーテル系溶媒；等が挙げられる。これら有機溶媒は、単独種でも複数種であってもよい。この中でも、好ましい溶媒としては、塩化メチレン等のハロゲン系溶媒、トルエン等の芳香族系溶媒、ジオキサン等のエーテル系溶媒である。
【００７２】
上記有機溶媒と水とを含む溶媒中で酸処理を行うことが好ましい。水を含む溶媒中で行う場合には、特に制限されるものではないが、有機溶媒／水の体積比が０．０１／１〜１０００／１となることが好ましい。また、溶媒の使用量も、特に制限されるものではなく、前記Ｎ−保護Ｌ−カルノシン誘導体、又はその塩酸塩と酸とが十分に接触混合できるような量であればよい。通常であれば、前記Ｎ−保護Ｌ−カルノシン誘導体１ｇに対して、該媒体を１〜１００ｍｌ使用することが好ましい。
【００７３】
＜酸を使用してベンジルオキシカルボニル基を除去する場合；その他条件＞
酸を使用してＲ１の脱保護反応を行うに際し、反応系内へ前記保護Ｌ−カルノシン誘導体、又はその塩酸塩、及び酸を導入する手順は、特に制限されるものではない。例えば、必要に応じて溶媒で希釈した前記保護Ｌ−カルノシン誘導体、又はその塩酸塩、必要に応じて希釈した前記酸を同時に反応系内に導入し、攪拌混合する方法を採用できる。また、何れか一方を必要に応じて溶媒で希釈して先ず反応系内へ入れておき、必要に応じて溶媒で希釈したもう一方を反応系内へ添加して攪拌混合することもできる。中でも、不純物を低減するという点では、必要に応じて前記溶媒で希釈した前記Ｎ−保護Ｌ−カルノシン誘導体、又はその塩酸塩を先に反応系内に導入し、それに、必要に応じて前記溶媒で希釈した前記酸を添加して、攪拌混合する方法を採用することが好ましい。
【００７４】
脱保護反応を行う際の反応温度は、特に制限されるものではなく、反応時間、収量、不純物副生の抑制等を考慮すると、−１０〜２００℃とすることが好ましく、さらには１０〜１２０℃とすることが好ましい。
【００７５】
脱保護反応の反応時間は、特に制限されるものではないが、原料の消費量、Ｌ−カルノシンの生成量等を確認しながら、適宜決定すればよい。上記条件であれば、通常、０．１〜９６時間あれば十分であり、好ましくは０．５〜２４時間である。
【００７６】
反応雰囲気も、特に制限されるものではなく、乾燥空気雰囲気下、不活性ガス雰囲気下、通常の空気雰囲気下で実施することができる。また、大気圧下、減圧下、加圧下の何れの圧力下で反応を実施してもよい。そのため、操作性を考慮すると、空気雰囲気下、大気圧下で反応を実施することが好ましい。
【００７７】
＜Ｌ−カルノシンの製造；パラジウム系触媒／水素源を使用してベンジルオキシカルボニル基を除去する場合＞
本発明においては、脱ベンジル化等が実施できる、公知のパラジウム系触媒を使用することができる。具体的には、１〜３０質量％（好ましくは１〜２０質量％）のパラジウムが担持したパラジウム炭素触媒、パラジウム硫酸バリウム触媒、パラジウム炭酸カルシウム触媒、パラジウムブラック触媒が挙げられる。
【００７８】
該パラジウム系触媒の使用量は、特に制限されるものではいが、前記保護Ｌ−カルノシン誘導体、又はその塩酸塩１００質量部に対して０．００１〜２０質量部（金属量換算）であれば十分である。
【００７９】
＜パラジウム系触媒／水素源を使用してＲ１、及びＲ２を脱保護する場合；水素＞
本脱保護反応は、水素の存在下で実施することが好ましい。水素の存在下とする際し水素ガスを使用する場合には、反応系内を水素圧０．５〜５０気圧とすることが好ましく、１〜３０気圧とすることがさらに好ましく、１〜１０気圧とすることが特に好ましい。
【００８０】
＜パラジウム系触媒／水素源を使用してＲ１、及びＲ２を脱保護する場合；溶媒＞
パラジウム系触媒を使用する場合、水素ガス存在下、溶媒中で前記Ｎ−保護Ｌ−カルノシン誘導体、又はその塩酸塩とパラジウム触媒とを攪拌混合することが好ましい。
【００８１】
溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール溶媒；酢酸等の酸溶媒；水等を使用することができる。これら溶媒は、単独で使用しようすることもできるし、複数種類の混合溶媒として使用することもできる。以上の溶媒の中も、操作性等を考慮すると、アルコール、水、またはアルコールと水との混合溶媒を使用することが好ましい。混合溶媒を使用する場合には、特に制限されるものではないが、アルコールと水との体積比（アルコール／水）は、２３℃において、０．０１／１〜１０００／１の範囲とすることが好ましい。なお、水単独で反応を行っても良い。
【００８２】
また、溶媒の使用量も、特に制限されるものではなく、前記Ｎ−保護Ｌ−カルノシン誘導体、又はその塩酸塩とパラジウム触媒とが十分に接触混合できるような量であればよい。通常であれば、前記Ｎ−保護Ｌ−カルノシン誘導体、又はその塩酸塩１ｇに対して、該媒体を１〜１００ｍｌ使用することが好ましい。
さらに、添加物として、塩酸、硫酸、リン酸などの無機酸、蟻酸、酢酸、クエン酸などの有機酸を加える場合がある。これらの添加量は、Ｎ−保護Ｌ−カルノシン誘導体（１３）、又はその塩酸塩に対して、０．０１〜１００当量使用することが好ましい。
【００８３】
＜パラジウム系触媒／水素源を使用してＲ１、及びＲ２を脱保護する場合；その他条件＞
パラジウム系触媒を使用してＲ１の脱保護反応を行うに際し、反応系内へ前記Ｎ−保護Ｌ−カルノシン誘導体、又はその塩酸塩、パラジウム系触媒、および水素を導入する手順は、特に制限されるものではない。例えば、必要に応じて溶媒で希釈した前記Ｎ−保護Ｌ−カルノシン誘導体、又はその塩酸塩、必要に応じて該溶媒に分散させたパラジウム系触媒を同時に反応系内に導入し、さらに、水素ガスを反応系内に導入して攪拌混合する方法が挙げられる。また、何れか一方を必要に応じて溶媒で希釈（分散）して先ず反応系内へ入れておき、必要に応じて溶媒で希釈（分散）したもう一方を反応系内へ添加して、水素ガスを反応系内に導入して攪拌混合する方法が挙げられる。なお、前記方法においては、前記Ｎ−保護Ｌ−カルノシン誘導体、又はその塩酸塩、およびパラジウム系触媒を反応系内に導入した後、水素ガスを反応系内に導入する方法を示したが、当然のことながら、予め反応系内に水素ガスを導入し、反応系内を水素雰囲気下とした後、各成分を反応系内に導入することもできる。また、前記には、水素ガスを使用した場合の例を示したが、蟻酸、蟻酸塩など水素ガスを発生する化合物を使用することもできる。
【００８４】
該脱保護反応を行う際の反応温度は、特に制限されるものではなく、反応時間、収量、不純物副生の抑制等を考慮すると、５〜１５０℃とすることが好ましく、さらには１０〜１００℃とすることが好ましい。
【００８５】
脱保護反応の反応時間は、特に制限されるものではないが、原料の消費量、Ｌ−カルノシンの生成量等を確認しながら、適宜決定すればよい。上記条件であれば、通常、０．１〜７２時間あれば十分であり、好ましくは０．２〜４８時間である。
【００８６】
反応雰囲気も、特に制限されるものではなく、乾燥空気雰囲気下、不活性ガス雰囲気下、通常の空気雰囲気下で実施することができる。また、大気圧下、減圧下、加圧下の何れの圧力下で反応を実施してもよい。そのため、操作性を考慮すると、空気雰囲気下、大気圧下で反応を実施することが好ましい。
【００８７】
＜Ｌ−カルノシンの精製方法＞
以上のような方法により、Ｌ−カルノシンが製造できる。塩酸塩の保護Ｌ−カルノシンを用いた場合、又は塩酸を加えて脱保護した場合は、
Ｌ−カルノシン塩酸塩が得られる。
【００８８】
この場合、本化合物のエタノール、又はメタノール溶液に、ベンジルトリメチルアンモニウムヒドロキサイド（トリトンＢ）を接触させることにより、Ｌ−カルノシンのフリー体を得ることができる。トリトンＢは、Ｌ−カルノシン塩酸塩と等モル、又は反応液のｐＨがＬ−カルノシンの等電点である８．２になる量、添加する。また、溶媒は、Ｌ−カルノシン塩酸塩に対して、３〜１５倍量使用する。反応温度は、０〜８０℃で行う。
【００８９】
このようにして得られたフリー体のＬ−カルノシンを精製する場合には、以下の方法を採用することが好ましい。具体的には、アルコール（例えば、メタノール、エタノール）溶媒で再結晶することが好ましい。該アルコールは、水を含んでいてもよい。Ｌ−カルノシンを該再結晶溶媒で溶解させる際の温度は、特に制限されるものではないが、２０〜１２０℃で行うことが好ましく、さらに３０〜８０℃で行うことが好ましい。この際、再結晶溶媒の使用量は、溶解させる対象物（Ｌ−カルノシンを含む対象物）１ｇに対して、１〜５０ｍｌとすることが好ましく、さらに５〜２０ｍｌとすることが好ましい。また、結晶を析出させる際の温度は、−１０〜１００℃が好ましく、さらに−５〜５０℃が好ましい。得られた結晶は、公知の方法で乾燥すればよい。
【００９０】
以上のような方法に従えば、比較的緩和な条件下、純度の高いＬ−カルノシンを容易に得ることができる。
【実施例】
【００９１】
以下、本発明を、実施例を用いて説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。ＨＰＬＣでの分析方法は下記条件にて行った。
【００９２】
サンプル濃度：０．０５％
注入量：５．０μＬ
波長：２１０ｎｍ
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
移動相：０〜５ｍｉｎ（０．１％リン酸）
５〜２０ｍｉｎ（０．１％リン酸〜１００％ＣＨ３ＣＮ）
２０〜３０ｍｉｎ（１００％ＣＨ３ＣＮ）
カラム温度：３０℃
充填剤：Ｘ  Ｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  ５μｍ（４．６×１５０）
【００９３】
実施例１＜酸塩化物の製造例＞
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−β−アラニン（３．０ｇ、１３．４ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１０ｍＬ）溶液に室温で塩化チオニル（３．２ｇ、２６．９ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを一滴加え同温で２時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し濃縮残渣にクロロホルム（５ｍＬ）を加えて酸塩化物のクロロホルム溶液を得た。
【００９４】
実施例２＜保護Ｌ−カルノシン誘導体塩酸塩の製造＞
【００９５】
【化１２】
2019167317.tif 000013
【００９６】
硫酸（０．００５ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）にヘキサメチルジシラザン（５．０ｇ、３１ｍｍｏｌ）を加え５分間攪拌した後、Ｌ−ヒスチジン（１．６ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）を加え還流下で４０分間攪拌した。反応液を減圧濃縮しクロロホルム（１０ｍＬ）に溶解することにより、Ｌ−ヒスチジン誘導体のクロロホルム溶液を得た。
【００９７】
得られたＬ−ヒスチジン誘導体のクロロホルム溶液に上記実施例１で合成した酸塩化物のクロロホルム溶液を１０℃以下で１時間かけて滴下し、さらに同温で１時間撹拌した。
【００９８】
反応液に水２０ｍＬを室温で加え１５分激しく攪拌を行った後クロロホルム層を除去した。再度クロロホルム（１０ｍＬ）を加え洗浄し水層、クロロホルム層（２回分混合）についてＨＰＬＣ測定を行った。
【００９９】
その結果、目的物であるＮ−ベンジルオキシカルボニル―Ｌ−カルノシン塩酸塩が、水層に、３．９６ｇ（収率９７％）、有機層に０．０８２ｇ（収率２％）存在することが分かった。水層に含まれるＮ−ベンジルオキシカルボニル―β―アラニル―Ｌ−ヒスチジル―Ｌ−ヒスチジンは、ＨＰＬＣ単純面積比で１．４６％であった。
【０１００】
得られた保護Ｌ−カルノシン誘導体塩酸塩の水溶液を減圧濃縮し、濃縮残渣にアセトン（３０ｍＬ）加えて室温、１７時間撹拌した。析出した結晶を濾過後、アセトン洗浄、室温で減圧乾燥することにより、保護Ｌ−カルノシン誘導体塩酸塩を３．５０ｇ（Ｌ−ヒスチジンからの収率８６％）得た。本品に含まれるＮ−ベンジルオキシカルボニル―β―アラニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ヒスチジンは、ＨＰＬＣ単純面積比で０．３％であった。得られた保護Ｌ−カルノシン誘導体塩酸塩の分析値は以下の通りであった。
【０１０１】
ｍｐ８５〜１２０℃
ＩＲ（ＫＢｒ）２８１７、１７００、１６５３ｃｍ−１
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ６）  δ  ２．００−３．２５（ｍ、４Ｈ），４．２５−４．８０（ｍ，１Ｈ），５．００（ｓ，２Ｈ），７．２０−７．７５（ｍ，６Ｈ），８．２０−８．７５（ｍ，１Ｈ），９．００（ｓ，１Ｈ）
【０１０２】
実施例３＜フリー体の保護Ｌ−カルノシン誘導体の製造＞
実施例２で得られた保護Ｌ−カルノシン誘導体塩酸塩（１．０ｇ、２．５ｍｍｏｌ）に水（５ｍＬ）を加え得られた溶液に、４０％トリトンＢメタノール溶液（１．１３ｇ、２．７ｍｍｏｌ））を加えることによりｐＨ：６．４に調整した。得られた溶液を減圧濃縮し、濃縮残渣にエタノール（１０ｍＬ）を加えて５０℃で撹拌晶析した。得られた懸濁液を１０℃以下で２時間撹拌後、濾過、エタノール洗浄、乾燥することにより保護Ｌ−カルノシン誘導体を得た（０．８２ｇ、収率：９０％）。得られた保護Ｌ−カルノシン誘導体の分析値は以下の通りであった。
【０１０３】
ｍｐ：１６０−１６４℃
ＩＲ（ＫＢｒ）３３０３、１６８６、１６４２ｃｍ−１
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ６）  δ  ２．００−３．４５（ｍ、２Ｈ）、４．２０−４．７０（ｍ、１Ｈ）、５．００（ｓ、２Ｈ）、６．７５（ｓ、１Ｈ）、７．００−７．７５（ｍ，５Ｈ），７．６０（ｓ，１Ｈ），８．００−８．４０（ｍ，  １Ｈ）
【０１０４】
実施例４
実施例２において、Ｌ−ヒスチジンをヘキサメチルジシラザンでトリメチルシリル化した後、反応液を濃縮しない以外は、実施例２と同様の操作を行い、フリーの保護Ｌ−カルノシン誘導体を得た。得られた保護Ｌ−カルノシン誘導体のアッセイ収率は９９．４％であった。また、本品に含まれるＮ−ベンジルオキシカルボニル―β―アラニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ヒスチジンは、ＨＰＬＣ単純面積比で０．７５％であった。
【０１０５】
実施例５
実施例２において、Ｌ−ヒスチジンをヘキサメチルジシラザンでトリメチルシリル化した後、反応液を濃縮しこれにトリエチルアミンをＬ−ヒスチジンに対して１当量加えた以外は、実施例２と同様の操作を行った。得られた保護Ｌ−カルノシン誘導体のアッセイ収率は６５．８％であった。また、本品に含まれるＮ−ベンジルオキシカルボニル―β―アラニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ヒスチジン（１１）は、ＨＰＬＣ単純面積比で０．５６％であった。
【０１０６】
実施例６＜Ｌ−カルノシンの製造＞
実施例２で得られたＮ−保護Ｌ−カルノシン誘導体塩酸塩（５．５１ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）、メタノール（１５ｍＬ）、純水（３５ｍＬ）を撹拌混合して溶液を得た。次いで、市販の５質量％パラジウムカーボン（５０％ウェット、３０ｍｇ、０．０５ｍｏｌ％）を該溶液に加え、水素雰囲気下（１気圧）で２４時間撹拌した。反応後、反応液を濾過した。得られた濾液を減圧濃縮し、メタノールを留去後、トリトンＢを加えて、溶液のｐＨを８．２に合した後、さらに、減圧濃縮した。得られた濃縮残渣に、水（３ｍＬ）次いで、エタノール（１５ｍＬ）を加えた後、５℃に冷却して２時間撹拌した。析出した結晶を濾過後、エタノール（５ｍＬ）で２回洗浄した。
【０１０７】
得られた固体を４０℃で１２時間減圧乾燥したところ、Ｌ−カルノシン（２．９ｇ、収率：９２．３％）の白色固体を得た。