(57)【要約】【課題】  医薬として有用なCRBNモジュレーターの薬効を高める物質を探索する手段を提供する。【解決手段】  CRBNモジュレーターの薬効を高める補助薬をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含むことを特徴とするスクリーニング方法、（１）CRBNと標識タンパク質の融合タンパク質を発現する細胞を、被験物質の存在下又は非存在下で培養する工程、（２）被験物質の存在下及び非存在下で培養された細胞間におけるCRBNの局在を比較する工程、（３）CRBNの核又は細胞質への局在化を促進する被験物質を選択する工程。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
CRBNモジュレーターの薬効を高める補助薬をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含むことを特徴とするスクリーニング方法、
（１）CRBNと標識タンパク質の融合タンパク質を発現する細胞を、被験物質の存在下又は非存在下で培養する工程、
（２）被験物質の存在下及び非存在下で培養された細胞間におけるCRBNの局在を比較する工程、
（３）CRBNの核又は細胞質への局在化を促進する被験物質を選択する工程。
【請求項２】
標識タンパク質が、蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
CRBNモジュレーターが、CRBNによる核内に局在する基質の分解を誘導する物質であり、選択される被験物質が、CRBNの核への局在化を促進する物質であることを特徴とする請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
CRBNモジュレーターが、CRBNによるIkaros又はAiolosの分解を誘導する物質であることを特徴とする請求項３に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
CRBNモジュレーターが、ポマリドマイド又はレナリドマイドであることを特徴とする請求項４に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
CRBNモジュレーターが、CRBNによる細胞質内に局在する基質の分解を誘導する物質であり、選択される被験物質が、CRBNの細胞質への局在化を促進する物質であることを特徴とする請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
CRBNモジュレーターが、CRBNによるCK1α又はGSPT1の分解を誘導する物質であることを特徴とする請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
CRBNモジュレーターが、レナリドマイド又はCC-885であることを特徴とする請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
被験物質の存在下及び非存在下で培養された細胞間におけるCRBNの局在を比較する工程が、以下の工程を含むことを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項に記載のスクリーニング方法、
（１）被験物質の存在下及び非存在下で培養された細胞を画像化する工程、
（２）工程（１）で得られた画像におけるCRBNの核への局在及び／又は細胞質への局在を数値化する工程、
（３）工程（２）で得られた数値を、被験物質の存在下及び非存在下で培養された細胞間において比較する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レナリドマイドやポマリドマイドなどのCRBNモジュレーターの薬効を高める補助薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
CRBNモジュレーターは、免疫調整薬（immunomodulatory drugs、IMiDs）とも呼ばれ、急速に拡大しつつある薬剤ファミリーの総称である。CRBNモジュレーターの一つであるレナリドマイドは2016年に世界売上高70億ドルを記録した(Celgene社)。
【０００３】
CRBNモジュレーターは、CRBN（セレブロン）というE3ユビキチンリガーゼ複合体の基質認識サブユニットを標的としており、CRBNを介した様々な基質タンパク質のユビキチン化・分解を制御することで薬効を発揮している。
【０００４】
CRBNの基質としては、核に局在するIkarosやAiolosや、細胞質に局在するCK1αやGSPT1などのタンパク質が見つかってきている。IkarosとAiolosは多発性骨髄腫のがん細胞増殖に重要であり、CRBNモジュレーターの投与でその機能を抑制できる（非特許文献１〜３）。また、CK1αはCRBNモジュレーターの骨髄異形成症候群に対する薬効発現に関わっており（非特許文献４、５）、GSPT1はCRBNモジュレーターの急性骨髄性白血病に対する薬効発現に関わっていることが判ってきている（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kronke, J. et al. Science 343, 301-305 (2014)
【非特許文献２】Lu, G. et al. Science 343, 305-309 (2014)
【非特許文献３】Gandhi, A. K. et al. Br. J. Haematol. 164, 811-821 (2013)
【非特許文献４】Kronke, J. et al. Nature 523, 183-188 (2015)
【非特許文献５】Petzold, G. et al. Nature 532, 127-130 (2016)
【非特許文献６】Matyskiela, M. E. et al. Nature 535, 252-257 (2016)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
CRBNモジュレーターであるレナリドマイドやポマリドマイドは、多発性骨髄腫を初めとする種々の難病に優れた効果を発揮することがわかっており、多くの研究者から注目されている。
【０００７】
CRBNモジュレーターの持つ薬効を更に高めることができれば、その利用価値も一層高いものになる。本発明は、このような背景の下になされたものであって、CRBNモジュレーターの薬効を高める物質を探索する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
CRBNモジュレーターの一つであるポマリドマイドは、CRBNを介して核内に局在するタンパク質であるAiolosの分解を誘導するが、後述する実施例に示すように、核外搬出シグナル（NES）によってCRBNを核外へ移行させるとAiolosは分解されなかった（図4C）。一方、CRBNモジュレーターの一つであるCC-885は、CRBNを介して細胞質内に局在するタンパク質であるGSPT1の分解を誘導するが、後述する実施例に示すように、核局在化シグナル（NLS）によってCRBNを核内へ移行させるとGSPT1は分解されなかった（図4D）。
【０００９】
本発明者は、以上の事実から、CRBNと基質タンパク質の細胞内局在の一致がCRBNモジュレーターの薬効発現に重要であり、CRBNの細胞内局在を制御する化合物がCRBNモジュレーターの薬効を高める補助薬となりうることを見出した。
【００１０】
本発明は、これらの知見に基づき完成されたものである。
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔９〕を提供するものである。
【００１１】
〔１〕CRBNモジュレーターの薬効を高める補助薬をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含むことを特徴とするスクリーニング方法、
（１）CRBNと標識タンパク質の融合タンパク質を発現する細胞を、被験物質の存在下又は非存在下で培養する工程、
（２）被験物質の存在下及び非存在下で培養された細胞間におけるCRBNの局在を比較する工程、
（３）CRBNの核又は細胞質への局在化を促進する被験物質を選択する工程。
【００１２】
〔２〕標識タンパク質が、蛍光タンパク質であることを特徴とする〔１〕に記載のスクリーニング方法。
【００１３】
〔３〕CRBNモジュレーターが、CRBNによる核内に局在する基質の分解を誘導する物質であり、選択される被験物質が、CRBNの核への局在化を促進する物質であることを特徴とする〔１〕又は〔２〕に記載のスクリーニング方法。
【００１４】
〔４〕CRBNモジュレーターが、CRBNによるIkaros又はAiolosの分解を誘導する物質であることを特徴とする〔３〕に記載のスクリーニング方法。
【００１５】
〔５〕CRBNモジュレーターが、ポマリドマイド又はレナリドマイドであることを特徴とする〔４〕に記載のスクリーニング方法。
【００１６】
〔６〕CRBNモジュレーターが、CRBNによる細胞質内に局在する基質の分解を誘導する物質であり、選択される被験物質が、CRBNの細胞質への局在化を促進する物質であることを特徴とする〔１〕又は〔２〕に記載のスクリーニング方法。
【００１７】
〔７〕CRBNモジュレーターが、CRBNによるCK1α又はGSPT1の分解を誘導する物質であることを特徴とする〔６〕に記載のスクリーニング方法。
【００１８】
〔８〕CRBNモジュレーターが、レナリドマイド又はCC-885であることを特徴とする〔７〕に記載のスクリーニング方法。
【００１９】
〔９〕被験物質の存在下及び非存在下で培養された細胞間におけるCRBNの局在を比較する工程が、以下の工程を含むことを特徴とする〔１〕乃至〔８〕のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（１）被験物質の存在下及び非存在下で培養された細胞を画像化する工程、
（２）工程（１）で得られた画像におけるCRBNの核への局在及び／又は細胞質への局在を数値化する工程、
（３）工程（２）で得られた数値を、被験物質の存在下及び非存在下で培養された細胞間において比較する工程。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、CRBNモジュレーターの薬効を高める補助薬の新規なスクリーニング方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ポマリドマイドに影響を与える遺伝子の発見のためのshRNAライブラリースクリーニング。（A）shRNAライブラリースクリーニングの概要。OPM-2細胞にレンチウイルスshRNAライブラリーを感染させた。細胞を二つに分け、1μMのポマリドマイドの存在下又は非存在下で5日間培養した。次いで、ゲノムDNAを抽出し、各shRNAを発現する細胞の数を表す各バーコードの量をハイスループット配列決定によって定量した。(B)shRNAライブラリースクリーニングの結果を示す散布図。青い点はポマリドマイドに影響を与える遺伝子を表す。赤い点は、スクリーニングによって同定されたCRL4CRBNサブユニット及びインポーチンβファミリーメンバーを表す。（C）2つの統計値によって同定されたポマリドマイドに影響を与える遺伝子の数を示すベン図。（D）CRBN依存性ユビキチンプロテアソーム経路及びこの経路を調節する因子を説明する図。スクリーニングによって同定された遺伝子は赤色で色付けされている。
【図２】ポマリドマイドに影響を与える遺伝子の検証実験。（A）耐性指数の算出方法の概要。等量のshRNA形質導入RFP陽性細胞及び対照GFP陽性細胞を混合し、1μMのポマリドマイド（Pom）の存在下又は非存在下で6日間インキュベートした。次に、イメージサイトメーターを用いて蛍光生存細胞を計数した。指示されたように耐性指数を計算した。（B）スクリーニングによって同定されたshRNAの耐性指数を示す棒グラフ。エラーバーは標準偏差（S.D.）を表す（n = 3）。* P <0.05、** P <0.01（スチューデントのt検定）。
【図３】KPNB1はCRBNの核移入にとって重要であるが、IPO11は重要ではない。（A）Flag-HA（FH）-CRBNを安定に発現するCRBNノックアウトOPM-2細胞の免疫蛍光顕微鏡分析。 細胞を抗HA又は抗Aiolos抗体（赤色）で染色し、DAPI（青色）で対比染色した。スケールバーは10μmである。（B）対照、KPNB1ノックダウンOPM-2細胞、及びIPO11ノックダウンOPM-2細胞の定量的RT-PCR分析。データは平均±SDを表す。 （n = 3）。 ** P <0.01（両側スチューデントのt検定）。（C）（A）に記載したように、CRBNノックアウト293T細胞を用いて免疫蛍光顕微鏡分析を行った。（D）Aiolosを一過的に発現する293T細胞のイムノブロット分析及び分析に使用したshRNA。分析の前に、示された濃度のポマリドマイドで細胞を12時間処理した。
【図４】CRBNとその基質の空間的な重なりは、CRBNモジュレーターの有効性にとって重要である。（A）FH-CRBN、FH-NLS-CRBN又はFH-NES-CRBNを発現するCRBNノックアウト293T細胞から、抗Flag抗体を用いてCRL4CRBNを免疫沈降（IP）し、イムノブロット分析によりそのサブユニット組成を調べた。（B）Aiolos及びFH-CRBNを一過的に発現するCRBNノックアウト293T細胞の免疫蛍光顕微鏡分析。抗HA（赤色）、抗Aiolos（緑色）、及びDAPI（青色）で細胞を染色した。スケールバーは10μmである。（C、D）AiolosとFH-CRBN、FH-NLS-CRBN、又はFH-NES-CRBNを発現するCRBNノックアウト293T細胞を薬剤処理し、抗体を用いてイムノブロット分析を行った。薬剤処理は、図中に示した濃度のポマリドマイドで12時間(C)又は図中に示した濃度のCC-885で24時間(D)行った。（E）細胞を、0.1又は1μMのCC-885で処理するか、又は未処理のまま48時間放置した。使用した細胞は、CRBNノックアウト293T細胞、WT（CRBNノックアウト293T細胞においてCRBNを再発現するようにした細胞）、NLS融合CRBNを発現するCRBNノックアウト293T細胞、及びNES融合CRBNを発現するCRBNノックアウト293T細胞である。材料及び方法に記載されているように細胞生存率をアッセイし、未処理細胞の数に標準化し、3つの独立した実験の平均値±SDとして示した。
【図５】2つの統計分析によって同定されたヒット遺伝子。
【図６】Gene Ontology（GO）解析で判明したポマリドマイド関連遺伝子群に頻出する生物学的プロセス。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のスクリーニング方法は、CRBNモジュレーターの薬効を高める補助薬をスクリーニングする方法であって、（１）CRBNと標識タンパク質の融合タンパク質を発現する細胞を、被験物質の存在下又は非存在下で培養する工程、（２）被験物質の存在下及び非存在下で培養された細胞間におけるCRBNの局在を比較する工程、及び（３）CRBNの核又は細胞質への局在化を促進する被験物質を選択する工程を含むことを特徴とするものである。
【００２３】
上記工程（１）〜（３）を行うことによって選択される被験物質は、CRBNとその基質との細胞内局在を一致させる作用を持つと考えられることから、CRBNモジュレーターの薬効を高める補助薬の候補となる。
【００２４】
CRBNモジュレーターは、免疫調整薬（immunomodulatory drugs、IMiDs）とも呼ばれ、CRBNと結合し、CRBNによる基質の分解を誘導する。CRBNモジュレーターは、サリドマイドと類似した構造を持ち、通常、サリドマイドと同様グルタルイミド基を持つ。
【００２５】
CRBNモジュレーターには、核内に局在するCRBNの基質の分解を誘導するものと細胞質内に局在するCRBNの基質の分解を誘導するものがあるが、本発明におけるCRBNモジュレーターは、そのいずれであってもよい。核内に局在するCRBNの基質の分解を誘導するCRBNモジュレーターとしては、ポマリドマイド、レナリドマイドなどを挙げることができ、細胞質内に局在するCRBNの基質の分解を誘導するCRBNモジュレーターとしては、レナリドマイド、CC-885を挙げることができる。スクリーニングの対象とする補助薬は、CRBNとその基質の細胞内局在を一致させるようにするものなので、CRBNモジュレーターが核内に局在するCRBNの基質の分解を誘導するものである場合、CRBNの核への局在化を促進する物質を補助薬として選択し、CRBNモジュレーターが細胞質内に局在するCRBNの基質の分解を誘導するものである場合、CRBNの細胞質への局在化を促進する物質を補助薬として選択する。また、核内に局在するCRBNの基質としては、Ikaros、Aiolosなどを挙げることができ、細胞質内に局在するCRBNの基質としては、CK1α、GSPT1などを挙げることができる。
【００２６】
CRBNモジュレーターの薬効としては、例えば、多発性骨髄腫に対する治療効果（ポマリドマイド又はレナリドマイドの薬効）、骨髄異形成症候群(特に5q-症候群）に対する治療効果（レナリドマイドの薬効）、急性骨髄性白血病に対する治療効果（CC-885の薬効）などを挙げることができる。
【００２７】
CRBNは、サリドマイドの主要な標的とされる公知のタンパク質であり、多くの生物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ）においてその存在が確認されている。本発明においては、いずれの生物由来のCRBNを使用してもよいが、本発明は、ヒトの疾患に対する薬効の増強を目的としているので、ヒト由来のCRBNを使用するのが好ましい。CRBNのアミノ酸配列やそれをコードする遺伝子の配列は、公知のデータに登録されている。例えば、ヒト由来のCRBN遺伝子の塩基配列、マウス由来のCRBN遺伝子の塩基配列、ラット由来のCRBN遺伝子の塩基配列、及びゼブラフィッシュ由来のCRBN遺伝子の塩基配列は、それぞれGene ID:51185、Gene ID:58799、Gene ID:297498、及びGene ID:445491でEntre Geneに登録されている。
【００２８】
CRBNは、標識タンパク質との融合タンパク質として使用する。ここで、「標識タンパク質」とは、何らかの手段によって検出可能なタンパク質を意味し、単独で検出可能なタンパク質だけでなく、他の物質と結合して検出可能になるタンパク質も含む。標識タンパク質の具体例としては、蛍光タンパク質、発光タンパク質、色素タンパク質、タグタンパク質などを挙げることができる。これらの中では、蛍光タンパク質又はタグタンパク質が好ましく、蛍光タンパク質が特に好ましい。蛍光タンパク質は、CRBNの細胞内での局在を視覚化できるものであれば特に限定されず、例えば、GFPやその誘導体を使用することができる。GFPの誘導体としては、BFP、CFP、YFP、RFPなどを挙げることができる。タグタンパク質は、低分子の蛍光物質などと特異的に結合でき、融合タンパク質の発現後に標識可能なものであれば特に限定されない。このようなタグタンパク質は市販されており、本発明においても、そのような市販のタグタンパク質を使用することができる。市販のタグタンパク質としては、HaloTag（登録商標、Promega社）、SNAP-tag（New England Biolabs社）、CLIP-tag（New England Biolabs社）、蛍光色素であるFlAsH及びReAsHと結合可能なテトラシステインモチーフ（Thermo Fisher Scientific社）などを挙げることができる。
【００２９】
CRBNと標識タンパク質の融合タンパク質を発現する細胞は、公知の方法に従って作製することができる。例えば、CRBNをコードする遺伝子と標識タンパク質をコードする遺伝子を連結させた融合遺伝子を適当なプロモーターなどと共に細胞に導入することにより、作製することができる。
【００３０】
使用する細胞は特に限定されないが、浮遊性の細胞よりも接着性の細胞が好ましい。培地中を移動する浮遊性の細胞よりも、培地中を移動しない接着性の細胞の方が、CRBNの細胞内での局在を観察しやすいからである。接着性の細胞としては、例えば、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、ES細胞、iPS細胞などを挙げることができる。
【００３１】
細胞の培養は、使用する細胞に応じて、適切な培地、培養条件を選択して行うことができる。
【００３２】
被験物質はどのようなものでもよいが、低分子化合物が好ましい。また、化合物ライブラリーに含まれる物質を被験物質とすることもできる。
【００３３】
CRBNの局在の比較は、蛍光顕微鏡などで観察して行ってもよいが、市販のハイコンテントスクリーニングシステム（例えば、IN Cell Analyzer、GEヘルスケア社）によってCRBNの局在を定量化して行ってもよい。具体的には、（１）被験物質の存在下及び非存在下で培養された細胞を画像化する工程、（２）工程（１）で得られた画像におけるCRBNの核への局在及び／又は細胞質への局在を数値化する工程、及び（３）工程（２）で得られた数値を、被験物質の存在下及び非存在下で培養された細胞間において比較する工程を含む方法によって、CRBNの局在の比較を行うこともできる。
被験物質の存在下及び非存在下で培養された細胞の比較は、通常、CRBNと標識タンパク質の融合タンパク質を発現する細胞を二つに分け、一方を、被験物質を加えた培地で培養し、他方を、被験物質を加えない培地で培養し、両者を観察して行う。但し、細胞を二つに分けずに、被験物質を加えない培地で培養した細胞を観察し、その後、被験物質を加えた培地で培養し、細胞を観察し、両者を比較してもよい。
【００３４】
後述する実施例では、本発明のスクリーニング方法によって実際にCRBNモジュレーターの薬効を高める物質を得たことは示されていないが、以下の理由から、そのような物質は多数存在すると考えられる。細胞中に存在するカリオフェリンベータ1は、CRBNの核への局在を促進する作用を持つ（図3D）。このカリオフェリンベータ1と相互作用をする物質は数多く存在すると考えられ、それらの中にはカリオフェリンベータ1の上記作用を強化する物質が含まれると考えられる。そのような物質は、カリオフェリンベータ1を介してCRBNの核への局在を促進し、CRBNモジュレーターの薬効を高める補助薬の候補になると考えられる。
【実施例】
【００３５】
以下に、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００３６】
（Ａ）材料及び方法
（１）細胞培養
ヒトOPM-2細胞を、10％FBS及び抗生物質を含むRPMI 1640中で維持した。293T細胞を、10％FBS及び抗生物質を含むDMEM中で維持した。CRBNのノックアウト細胞は、CRBNの第1のエキソンを標的とするpX330ベースのCRISPR / Cas9ベクター（Agapova, O. A. et al. Science 339, 819-823 (2013)）をトランスフェクトし、野生型CRBNを保有する細胞を除去するため0.1μMのCC-885で2週間処理することにより、OPM-2及び293T細胞から得た。 OPM-2細胞を、Nucleofector 2b及びA-020プログラム（Lonza）を用いてトランスフェクトした。293T細胞をLipofectamine 2000（Thermo Fisher）を用いてトランスフェクトした。FH-CRBNは、NLS及びNESの有無にかかわらず、レンチウイルス系を用いてOPM-2細胞に、又はLipofectamine 2000を用いて293T細胞に形質導入した。
【００３７】
（２）shRNAライブラリースクリーニング
ハイスループットshRNAライブラリースクリーニングのスキームは、図1Aに記載されている。プールされたバーコード化レンチウイルスshRNAライブラリー（Cellecta）のHuman Modules 1、2、及び3は、各モジュールが、約5,000個の遺伝子を標的とする27,500個のshRNA（遺伝子あたり約5個のshRNA）を含む。これらのモジュールがスクリーニングのために個別に使用された。プラスミドライブラリーを、ViraPower Lentiviral Packaging Mix（Thermo Fisher）を用いてパッケージングした。得られたレンチウイルスライブラリーを3.0×107個のOPM-2細胞に感染多重度0.3で感染させた。感染から3日後、細胞を二つに分け、一方を1μMのポマリドマイドで5日間処理し、他方を未処理のまま5日間放置した。次いで、ゲノムDNAの抽出及び配列決定ライブラリーの調製を、製造者の指示に従って行った。個々のshRNAを表すバーコードの定量は、HiSeq 2000（Illumina）を用いたハイスループット配列決定を用いて行った。各サンプルについて約3億のリードが得られた。配列決定結果は、Barcode Deconvoluter（Cellecta）ソフトウェアを使用して、各shRNA構築物を発現する細胞の数を表す個々のバーコード配列のリード数に変換した。次いで、ポマリドマイド処理したサンプルの100万リード当たりのリード（RPM）数を対照試料のRPM数で割ることにより、各shRNAについて倍率変化（FC）を得た。FCは、各shRNAによるポマリドマイド感受性の変化の尺度である。与えられたshRNAが薬物の有効性と無関係であり、そのshRNAを発現する細胞がポマリドマイドに対して対照細胞と同程度の感受性である場合、FC値は1に近くなる。与えられたshRNAがポマリドマイドに対する耐性を付与する場合、FC値は1より大きくなる。これとは逆に、与えられたshRNAがポマリドマイドに対して過感受性を付与する場合、FC値は1より小さくなる。FCから、各遺伝子についてmaxFC及び偽発見率（FDR）を計算した。maxFCは、同じ遺伝子を標的とする5つ以上のshRNAによって引き起こされる変化の中で最大の絶対値log FC（すなわち、1からの最大の変動）を有するFC値として定義される。一方、FDRは、各遺伝子に関連するすべてのFC値に基づいており、新しいランクプロダクト（NRP）法によって計算された。| log2（maxFC）を持つ遺伝子| > log23又はFDR <0.1が、ポマリドマイドに影響を及ぼす遺伝子として同定された。
【００３８】
（３）個々のshRNAを用いた遺伝子ノックダウン
ライブラリーから単離されたpRSI9プラスミドからバーコード及びshRNA配列を除去することにより、pRSI9ベースの対照ベクターを調製した。得られたpRSI9対照ベクターは、ピューロマイシン耐性遺伝子及びRFPを保有する。shRNAをコードする合成二本鎖オリゴヌクレオチドを対照ベクターにクローニングした。得られたプラスミド及びViraPower Lentiviral Packaging Mix（Thermo Fisher）を用いて組換えレンチウイルスを調製し、安定したノックダウンのためにOPM-2細胞に形質導入した。一過性ノックダウンのために、Lipofectamine 2000（Thermo Fisher）を使用して、293T細胞を対照又はshRNA含有プラスミドでトランスフェクトした。 RFPをGFPに置き換えることによりpRSI9_eGFPを生成した。
【００３９】
（４）イムノブロット分析
高塩濃度溶解緩衝液（150mM Tris-HCl [pH7.9]、500mM NaCl、1％（w / v）Nonidet P-40）を用いて細胞溶解物を調製した。以下の一次抗体用い、標準的な手順に従ってイムノブロット分析を行った： 抗Flag M2（F1804、Sigma）、抗Aiolos（sc-101982、Santa Cruz）、抗DDB1（ab97522、Abcam）、抗CUL4A（ab72548、Abcam）、抗KPNB1（sc-1919、Santa Cruz）、抗GSPT1（ab49878、Abcam）及び抗CRBN（Ren Y. et al. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 24(10), 695-702, (2016)）。
【００４０】
（５）RNA調製及び定量的RT-PCR
Sepasol-RNA I Super G（Nacalai Tesque）を用いて全RNAを調製した。One Step SYBR PrimeScript RT-PCRキット（Takara）、StepOnePlusリアルタイムPCRシステム（Thermo Fisher）を用いて、定量的RT-PCR分析を行った。データ分析のために、GAPDHを 内部標準として使用した。
【００４１】
（６）細胞生存率アッセイ
SFアッセイ及び競合アッセイを使用して、細胞増殖に対するポマリドマイドの効果を調べた。前者の場合、ポマリドマイド処理細胞又は未処理細胞を96ウェルプレートに播種し、Cell Count Reagent SF（Nacalai Tesque）と共に1時間インキュベートした。次いで、450nmでの吸光度を測定することによって、相対的細胞数を推定した。後者の場合、等しい数のshRNA形質導入RFP陽性細胞及び対照GFP陽性細胞を混合し、様々な時間ポマリドマイドと共にインキュベートした。 次に、Taliイメージサイトメーター（Thermo Fisher）を用いて各細胞の数を定量し、図2Aに記載のように耐性指数を算出した。
【００４２】
（７）免疫蛍光
細胞をPBS中の4％パラホルムアルデヒドで固定し、PBS中の0.4％Nonidet P-40で透過性にし、Blocking One（Nacalai Tesque）でブロックした。 Blocking Oneを抗体の希釈にも使用した。以下の一次抗体を使用した： 抗HA（901501、BioLegend）、抗Aiolos（sc-101982、Santa Cruz）及び抗GSPT1（ab49878、Abcam）。
【００４３】
（Ｂ）結果
（１）shRNAライブラリースクリーニングによるポマリドマイドに影響する遺伝子の同定
多発性骨髄腫に対するポマリドマイドの抗がん効果に関与する遺伝子を同定するために、15,377個のヒト遺伝子を標的とする82,500個のshRNAを含むプールされたshRNAライブラリーを用いてゲノムワイドスクリーニングを行った。OPM-2多発性骨髄腫細胞にレンチウイルスshRNAライブラリーを感染させ、各shRNAで形質導入され、ポマリドマイド又は溶媒による処理の5日後に生存した細胞の数を推定した（図1A）。細胞数の推定は、個々のshRNAに特異的である18bpのバーコード配列のハイスループット配列決定により行った。次いで、それぞれのノックダウン細胞のポマリドマイド感受性を、ポマリドマイド処理サンプル及び未処理サンプルからのそれぞれのバーコードの100万リード当たりの相対リード数から推定した。材料と方法に記載されているように、2つの異なる統計値、即ち、FDR及びmaxFCを各遺伝子について計算し、ポマリドマイドに影響する遺伝子を同定するために使用した（図1B、C）。FDR及びmaxFCに基づいて、141（| log2（maxFC）|> log23）及び360遺伝子（FDR <0.1）がそれぞれポマリドマイドに影響する遺伝子として同定され、56の遺伝子が両方の基準によって同定された（図5）。予想どおり、CRBN、ROC1、及びDDB1などのCRBN複合体のサブユニットは、重複遺伝子リストに含まれていた（図1D及び図5）。さらに、NEDD8、COP9シグナルソームの構成要素、26Sプロテアソームの構成要素などのユビキチン - プロテアソーム経路に関与する遺伝子は、445遺伝子中に多かった（図1D及び図5）。 従って、本発明者のスクリーニング結果は、CRL4CRBN複合体がCRBNモジュレーターの主要な薬理学的標的であるという過去の生化学的知見（Ito, T. and Handa, H. Int. J. Hematol. 104, 293-299 (2016)）を確認し、拡大した。
【００４４】
（２）shRNAライブラリースクリーニングの検証
shRNAライブラリースクリーニングの結果を検証するために、本発明者はCRBNを含む29の遺伝子に対して29のshRNAを選んだ。これらの遺伝子はすべて、スクリーニングにおいてポマリドマイドに対する耐性を付与した。等量のshRNA形質導入RFP陽性細胞及び対照GFP陽性細胞を混合し、ポマリドマイドの存在下で6日間インキュベートした。次に、イメージサイトメーターを用いて蛍光生存細胞を計数し、図2Aに記載のように耐性指数を計算した。もしノックダウンがポマリドマイドに耐性を与えるならば、耐性指数は1より大きくなる。結果として、試験したshRNAのほとんどがポマリドマイドに対する耐性を付与し、shRNAライブラリースクリーニングの結果とよく一致していた（図2B）。
【００４５】
（３）KPNB1は、CRBNの核内移入及びポマリドマイドの作用にとって重要である
ポマリドマイド作用に関与する新規因子を探索するために、本発明者はDAVIDを用いてGene Ontology（GO）解析を行った（図6）。驚くべきことに、翻訳（GO：0006412）及びRNAスプライシング（GO：008380）などの遺伝子発現に関連する生物学的プロセスは、非常に頻度が高かった。さらに、インポーチン11（IPO11）及びカリオフェリンベータ1（KPNB1）などのインポリンβファミリーメンバー（Strom, A. C. et al. Genome Biol. 2, REVIEWS3008 (2001)）も頻度が高かった（GO：0006610）。そこで、本発明者は、KPNB1又はIPO11のノックダウンが、CRBN、又はCRBNの薬理学的に関連のある基質であるAiolosの細胞内局在化に影響するかどうかを、免疫蛍光顕微鏡によって調べた。CRISP / Cas9系を用いてCRBNノックアウトOPM-2細胞を作製し、Flag-及びHAタグ付きCRBN（FH-CRBN）を発現するレンチウイルスベクターで形質導入した。対照条件下では、FH-CRBNは核及び細胞質の両方に認められ、Aiolosは核内に局在し、CRBNは核内のAiolosと部分的に共局在していた（図3A）。次に、KPNB1及びIPO11をそれぞれノックダウンした（図3B）。驚くべきことに、FH-CRBNの核分画はKPNB1のノックダウンによって低下した（図3A）。しかし、IPO11のノックダウンでは減少しなかった（図3A）。一方、Aiolosの核局在化はノックダウンの影響を受けなかった。これらの結果がOPM-2細胞に特異的でないことを確認するために、Aiolosを一時的に過剰発現する293T細胞を用いて実験を繰り返し、本質的に同じ結果を得た（図3C）。したがって、KPNB1はCRBNの核内移入にとって重要であり、CRBNはKPNB1の非存在下ではAiolosと空間的に重ならない。
【００４６】
KPNB1がポマリドマイド誘導性のAiolos分解に影響を及ぼすかどうかを調べるために、KPNB1ノックダウン細胞をポマリドマイドで処理し、イムノブロット分析によりAiolosタンパク質レベルを決定した（図3D）。 Aiolosは対照細胞でポマリドマイド処理によって実質的に分解されたが、KPNB1ノックダウン細胞ではAiolosレベルはポマリドマイドによって有意に減少しなかった。以上をまとめると、これらのデータは、KPNB1が、CRBNの核内移入を促進することにより、ポマリドマイド誘導性のAiolos分解に寄与することを示した。
【００４７】
（４）CRBNの細胞内局在は、基質分解効率及びCRBNモジュレーターの有効性に影響する
上記の結果は、CRBNとその基質の共局在が、ポマリドマイドの有効性にとって重要であることを示唆した。この考えを一般化するために、SV40ラージT抗原由来の核局在化シグナル（NLS）又はHIV-1 Rev由来の核外搬出シグナル（NES）に融合したCRBNを用いた（Kalderon, D. et al. Cell 39, 499-509 (1984)及びFornerod, M. et al. Cell 90, 1051-1060 (1997)）。CRBNノックアウト293T細胞に、野生型、NLS融合CRBN、又はNES融合CRBNを形質導入した（図4B）。免疫蛍光顕微鏡分析は、野生型CRBN及びNLS融合CRBNの一部が核内に移入され、Aiolosと重複することを示した（図4A）。対照的に、NES融合CRBNは細胞質中にのみ見出され、Aiolosと重複しなかった。これらの細胞ポマリドマイドで処理すると、Aiolosは野生型又はNLS融合CRBNを発現する細胞で分解されたが、NES融合CRBNを発現する細胞では分解されなかった（図4C）。これは核内にCRBNが存在することが、分解に必要であることを示す。これらの細胞をCC-885で処理すると、細胞質に局在するCC-885依存性CRBN基質であるGSPT1は、野生型又はNES融合CRBNを発現する細胞では分解されたが、NLS融合CRBNを発現する細胞では分解されなかった（図4D）。これは、細胞質中にCRBNが存在することが、分解に必要であることを示している。NLS融合CRBNを発現する細胞はCC-885に対して、元のCRBNノックアウト細胞と同程度の耐性を示したが、野生型又はNES融合CRBNを発現する細胞はCC-885による増殖阻害を受け易かった（図4E）。これらの対照的な結果は、CRBN及びその基質の空間的重複が、それらの効率的なユビキチン化及び分解にとって重要であることを強く示唆している。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明は、CRBNモジュレーターの薬効を高める補助薬をスクリーニングする方法なので、レナリドマイドやポマリドマイドなどのCRBNモジュレーターを生産又は使用する産業分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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