(57)【要約】【課題】味蕾細胞を長期にわたって供給し続ける味蕾の長期幹細胞を同定単離することを課題とする。【解決手段】Hopx遺伝子の発現を指標として、上記幹細胞を同定及び単離する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたHopx陽性の舌上皮幹細胞、又は前記舌上皮幹細胞に由来する細胞塊。
【請求項２】
Hopx陽性の舌上皮幹細胞の単離方法であって、
舌上皮から採取された組織に由来する細胞から、Hopx陽性細胞を回収する工程を含む、
単離方法。
【請求項３】
Hopx陽性細胞を回収する前に、さらに舌上皮から採取された組織に由来する細胞から、Sox-2陽性細胞を回収する工程を含み、
前記Hopx陽性細胞の回収が、Sox-2陽性細胞集団の中から行われる、
請求項２に記載の単離方法。
【請求項４】
さらに、回収されたHopx陽性細胞を培養する工程を含む、請求項２又は３に記載の単離方法。
【請求項５】
請求項１に記載の前記舌上皮幹細胞、又は前記細胞塊に由来する味覚細胞について、その機能を評価することを含む、味覚機能評価システム。
【請求項６】
請求項１に記載の前記舌上皮幹細胞、又は前記細胞塊に由来する味覚細胞を含む、味覚機能評価キット。
【請求項７】
請求項１に記載の前記舌上皮幹細胞、又は前記細胞塊に由来する味覚細胞について、その機能を評価する工程を含む、
味覚機能の評価方法。
【請求項８】
Hopx遺伝子を、味覚細胞に分化しうる舌上皮幹細胞のバイオマーカーとして使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書には、単離されたHopx陽性の舌上皮幹細胞、又は前記舌上皮幹細胞に由来する細胞塊、Hopx陽性の舌上皮幹細胞の単離方法、味覚機能の評価システム、味覚機能の評価キット、味覚機能の評価方法及び味覚細胞に分化しうる舌上皮幹細胞のバイオマーカーとしての使用方法が開示される。
【背景技術】
【０００２】
味覚感覚にとって重要な味蕾は、舌全体に存在する。味蕾は舌後部に位置する有郭乳頭及び葉状乳頭、並びに舌前部に散在する茸状乳頭内に存在する。有郭乳頭と葉状乳頭の両方に多くの味蕾が含まれているが、各茸状乳頭には孤立型の味蕾が存在する。味蕾細胞は、連続的なターンオーバーで供給され、平均寿命は8〜12日である。
【０００３】
味覚は、味蕾の急速なターンオーバーにもかかわらず個体の生涯を通じて維持されるので、味蕾細胞の長期供給を維持する幹細胞の存在が想定されている。しかし、味蕾集団維持の正確なメカニズムはあまり解明されていない。
【０００４】
非特許文献１では、味蕾細胞の幹／前駆細胞としてleucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 6 (Lgr6)を発現する細胞（Lgr6+細胞）が同定されたことが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Wenwen Ren et al.:PNAS | November 18, 2014 | vol. 111 | no. 46 | 16401-16406
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
後述する実施例に示すように、発明者の研究では、Lgr6+細胞の寿命は、24週間程度であり、長期にわたって細胞を供給し続ける長期幹細胞ではないことが明らかとなった。
本発明は、味蕾細胞を長期にわたって供給し続ける味蕾の長期幹細胞を同定単離することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、鋭意研究を重ねたところ、HOP homeobox (Hopx)を発現する細胞が、味蕾の長期幹細胞であることを見出した。
本発明は、当該知見に基づいて完成されたものであり、以下の態様を含む。
項１．単離されたHopx陽性の舌上皮幹細胞、又は前記舌上皮幹細胞に由来する細胞塊。
項２．Hopx陽性の舌上皮幹細胞の単離方法であって、舌上皮から採取された組織に由来する細胞から、Hopx陽性細胞を回収する工程を含む、
単離方法。
項３．Hopx陽性細胞を回収する前に、さらに舌上皮から採取された組織に由来する細胞から、Sox-2陽性細胞を回収する工程を含み、前記Hopx陽性細胞の回収が、Sox-2陽性細胞集団の中から行われる、項２に記載の単離方法。
項４．さらに、回収されたHopx陽性細胞を培養する工程を含む、項２又は３に記載の単離方法。
項５．項１に記載の前記舌上皮幹細胞、又は前記細胞塊に由来する味覚細胞について、その機能を評価することを含む、味覚機能評価システム。
項６．項１に記載の前記舌上皮幹細胞、又は前記細胞塊に由来する味覚細胞を含む、味覚機能評価キット。
項７．項１に記載の前記舌上皮幹細胞、又は前記細胞塊に由来する味覚細胞について、その機能を評価する工程を含む、
味覚機能の評価方法。
項８．Hopx遺伝子を、味覚細胞に分化しうる舌上皮幹細胞のバイオマーカーとして使用する方法。
【発明の効果】
【０００８】
味蕾細胞の長期幹細胞を取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】(a) Rosa26CreERT2/rbwマウスにおける高（左）または低（右）用量のタモキシフェンによる多色ラベリングの模式図を示す。高用量のタモキシフェンを用いた誘導では、隣接するクローン間の境界を不明瞭なものとした（上）。低用量のタモキシフェン誘導では、隣接するクローンと単一のクローンの正確な識別が可能であり、GFP陽性非組換え細胞に囲まれた疎な標識細胞が観察された（下）。(b-j) 図に示す時点において、解析されたRosa26CreERT2/rbwマウスの茸状乳頭の全ての細胞がタモキシフェン投与によってラベルされたことを示す。白い点線は、固有層と上皮層または茸状乳頭との間の境界を示す。タモキシフェンは、1 mg／40 g体重で投与した。スケールバーは50 μmを示す。(k) Rosa26CreERT2/rbwにおける タモキシフェン投与後、4、12、及び48週間後の隣接するIPPの色と共通の色を有する茸状乳頭の割合を示す。(l-n) タモキシフェン投与後48週間のRosa26CreERT2/rbwの茸状乳頭の水平断面切片を示す。タモキシフェン投与量は体重40gあたり(l)5 mg、(m, n)1 mg である。茸状乳頭は白い点線で囲まれている。 (m) の弱拡大を(n)に示す。スケールバーは50 μmを示す。(o)茸状乳頭の3分の1を占める単一色の領域と2〜3個の周囲の糸状乳頭（黄色）を示す。周囲の糸状乳頭を有する茸状乳頭の矢状断面（上）および水平断面（下）を示す。茸状乳頭は３つのクラスタで構成されていた。緑、青、黄色、又は赤でラベルされたそれぞれのエリアは、Rosa26CreERT2/rbwマウスにおいて、組換えなし(GFP)、 mCerulean、 mOrange、及びmCherryの誘導を示す。
【図２】(a-h) HopxCreER2T/+; Rosa26rbw/+ マウスの茸状乳頭におけるHopx+ cellsの標識の様子を示す。図内の時間はタモキシフェン投与後の時間を示す。赤(a) において矢頭はHopx+ cellsを示す。(h) タモキシフェン投与後48週間のHopxCreER2T/+; Rosa26rbw/+ マウスの組織の弱拡大を示す。白い点線は、固有層と上皮層または茸状乳頭との間の境界を示す。スケールバーは 50 μmを示す。(i) qRT-PCRによって定量化され列挙されたmRNAの発現に基づいて、糸状乳頭および茸状乳頭を含む単一セルソーティングによるSox2-GFP+ cellsをクラスタリング下結果を示す。(j, k, o, q, r) Foxa2mcm/+; Rosa26RH2B-mCherry/+マウスの組織のKrt14の免疫染色像を示す。胎生7.5日(E7.5)でタモキシフェン投与を受けた出生後42日目 (P42)の(j) 舌腹側上皮、(k)糸状乳頭、(o)食道、(q)口腔、(r) 硬口蓋を示す。(l-n) 胎生7.5日(E7.5)でタモキシフェン投与を受けたP42のFoxa2mcm/+; Rosa26RH2B-mCherry/+ マウスの組織におけるKrt14及びKrt8の免疫染色を示す。 (l)茸状乳頭、(m)葉状乳頭、(n)有郭乳頭を示す。ボックス内は強拡大像を示す。(p) 胎生7.5日(E7.5)でタモキシフェン投与を受けたP42のFoxa2mcm/+; Rosa26RH2B-mCherry/+ マウスの気管におけるKrt5とFoxj1免疫染色を示す。これらは、それぞれ内胚葉由来の基底細胞と繊毛細胞を示す。白い破線は上皮細胞と固有層の境界線を示す。スケールバーは、50 μmを示す。(s) 舌と口腔の内胚葉由来の組織と非内胚葉由来の組織の強化を示す模式図である。腹側舌上皮 (j)と舌上皮上の全ての乳頭(k-n) は、食道 (o)及び気管 (p)と同様に内胚葉から発生していた。茸状乳頭のKrt8を発現する味蕾細胞は、葉状乳頭及び有郭乳頭(l-n)と同様に内胚葉から発生していた。口腔内の他の組織、例えば口腔床(q)及び硬口蓋 (r)は内胚葉由来ではなかった. D, dorsal; V, ventral; A,anterior; P, posterior; L, left; R, right。
【図３】(a-j) Lgr6EGFP-IRES-CreERT2/+; Rosa26rbw/+マウスの茸状乳頭のLgr6+ cellsを示す図である。図内に示す時間はタモキシフェン投与後の時間である。白い破線は、上皮細胞層又は茸状乳頭及び固有層の境界を示す。スケールバーは50 μmを示す。(k) Lgr6+ cell由来クローン についてHoechst 33342で染色された核の数を示す図である。*P < 0.05.、 n.d. ：not detected。(l) タモキシフェンを投与したLgr6EGFP-IRES-CreERT2/+;Rosa26rbw/+マウスの茸状乳頭を示す模式図である。
【図４】マウス舌における(a, b) Lgr6 (red)及びHopx (green)のin situハイブリダイゼーションの結果を示す。(a)Lgr6とHopx染色をHoechst 33342染色に重ねたも(b)Lgr6とHopx染色のみのものを示す。白い破線は、上皮細胞層又は茸状乳頭及び固有層の境界を示す。スケールバーは50 μmを示す。(c) タモキシフェン投与後12週間目のHopxCreER2T/+; Rosa26loxp-stop-loxp-YFP/+マウスの舌から採取した細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。(d) タモキシフェン投与後12週間目のHopxCreER2T/+; Rosa26loxp-stop-loxp-YFP/+マウスから分離したHopx+ cell由来YFP+ cellsのmRNA発現のqRT-PCR解析に基づく階層的クラスタリングの結果を示す。 (e) Hopx+ cellsがラベルされたHopxCreERT2/+;Rosa26rbw/+マウスの組織の矢状断面（上）及び水平断面（下）の模式図を示す。黄色丸（左）と黄色で着色された領域（右）は,それぞれHopx+ cellとHopx+ cell由来細胞をs雌。 TA cells; 一過性増殖細胞。(f) Sox2-GFP+ cell由来オルガノイドから採取されたSox2+Ki-67 low cells（図１２のclsA to D）のトランスクリプトームシミラリティの t-SNE mapを示す。RaceID2クラスタは、異なる数と色で強調して示す。(g)推定系統樹を示す。 P < 0.01の有意なリンクのみ示す。各クラスタ中心は文字として表す。(h)すべてのクラスタのStemIDスコアのグラフを示す。各細胞型のセントラルトランスクリプトームエントロピーは、クラスタ内のすべての細胞について計算された（上）。このΔエントロピーに各クラスタの有意なリンク数を掛けた（真ん中）、StemIDスコアを返す（下）。(i) t-SNE map上に再ラベルされたclsA〜clsEを強調して示した図である。(j) (i) においてプロットされた個々の細胞のHopx2遺伝子の転写レベルのバイオリンプロットを示す。(k) (i) においてプロットされた個々の細胞のKrt14遺伝子の転写レベルのバイオリンプロットを示す。
【図５】(a) Rosa26CreERT2/rbwマウスを使ったタモキシフェン誘導マルチカラーラベリングの模式図を示す。(b)タモキシフェン投与後２日後のRosa26CreERT2/rbwマウスにおける各ラベルカラーの割合を算出したグラフを示す。３匹のマウスの計601個の細胞について解析した。(c)マウス舌の模式図を示す（下）。味蕾は、舌の数カ所に存在する：後舌に位置する有郭乳頭内と葉状乳頭内、および前舌に散在し、糸状乳頭に囲まれた茸状乳頭内に存在する。糸状乳頭（上、左）および糸状乳頭に囲まれた樹上乳頭（上、右）のヘマトキシリン - エオジン染色像を示す。 矢印および矢頭は、それぞれ茸状乳頭および糸状乳頭を示す（上、右）。略語: D,背側; V, 腹側; A, 前方; P,後方; L,左; R, 右。スケールバーは50 μmを示す。(d) Rosa26CreERT2/rbwマウスにおける茸状乳頭とそれを取り囲む糸状乳頭の模式図を示す。 細胞はランダムにラベルされ、細胞の系譜を追跡できる。青色、黄色、および赤色の丸（左）および領域（中央、右）は、それぞれランダムに標識された細胞および標識された細胞由来のクローンを示す。短時間の追跡では、味蕾細胞は、味蕾に位置する両方のTA細胞から供給されるものとして示された（真ん中、上）。細胞は糸状乳頭と茸状乳頭の間の基底膜に付近に位置していた（真ん中、下）。長期間の追跡では、味蕾細胞、TA細胞、茸状乳頭を取り囲む糸状乳頭は、全て糸状乳頭と茸状乳頭の間の基底膜に付近に存在する一般的な幹細胞に由来していることが示唆された。TA細胞は、一過性増殖細胞を意味する。 左側の３つのナンバリングされた青線は、(f)に示す３つの図の断面の深さ方向の位置を示す。IPP; 傍茸状乳頭間窩。Tx; タモキシフェン処理。(e) タモキシフェン投与後48時間のRosa26CreERT2/rbwマウスの舌組織で、個々の単一の茸状乳頭を取り囲む細胞の数を計数した。１つの茸状乳頭は、２つ以上の茸状乳頭に囲まれていた。３匹のマウスの計156個の茸状乳頭について検討した。(f) Rosa26Rrbw/+マウスの茸状乳頭（FP）（黄色点線）の横断面画像を示す。白い点線は、茸状乳頭と糸状乳頭の間の傍茸状乳頭間窩を示す。１、２、３は、異なる深さの切片画像を示す。水色: Hoechst 33342。緑: GFP。スケールバーは50 μmを示す。
【図６】(a, b) C57BL/6Jマウスの舌における、抗Sox2抗体の免疫染色を示す。(a) Sox2染色とHoechst 33342核染色をマージした画像、(b) Sox2染色のみの画像を示す。(c, d) C57BL/6Jマウスの茸状乳頭における、抗Sox2抗体の免疫染色を示す。(c) Sox2染色とHoechst 33342核染色をマージした画像、(d) Sox2染色のみの画像を示す。白い点線は、固有層と上皮層または茸状乳頭との間の境界を示す。スケールバーは50 μmを示す。(e, f) Sox2-GFP+ cellsを培養して得られたオルガノイドの(e)明視野画像、(f)蛍光画像を示す。スケールバーは200 μmを示す。(g) C57BL/6Jマウス(左)、Sox2GFP/+ マウス(右)の舌組織から分離した細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。点線で囲まれた分画は、Sox2-GFP+ cellsのみをソートするためのゲートのパラメータを示す。
【図７】(a-c) 抗ケラチン５抗体(Krt5, a)、抗ケラチン14抗体(Krt14, b)、及び抗ケラチン8 (Krt8, c)抗体によるHopxCreERT2/+; Rosa26loxp-stop-loxp-YFP/+マウスの舌組織の免疫染色像を示す。組織は、タモキシフェン投与後、３日目に採取した。Hopxの発現は、YFP蛍光で検出した。Hopx+ cellsは味蕾内ではなく、糸状乳頭の基底部付近に存在していた。緑と黄色の矢頭は、(c) Hopx+ cells、(a)Krt5陽性 Hopx+ cells、(b)Krt14陽性 Hopx+ cellsを示す。(d-h) (d)抗Hopx抗体、(e, f)抗Krt5抗体、(g)抗Krt14抗体、(h)抗Krt8抗体による Lgr6EGFP-IRES-CreERT2/+マウスの茸状乳頭の免疫染色を示す。 Lgr6の発現はGFPを免疫染色することで検出した。 Hopx+ cellsとLgr6+ cellsは、同じ位置に存在していなかった。Lgr6+ cellsは、茸状乳頭の基底に存在していた。緑及び黄色の矢頭は、(d, f, g, h)Lgr6+ cells、(e) Krt5陽性Lgr6+ cells、(g) Krt14陽性Lgr6+ cellsを示す。  (d)の赤の矢頭はHopx+ cellsを示す。白い破線は、上皮細胞層又は茸状乳頭及び固有層の境界を示す。スケールバーは50 μmを示す。
【図８】(a, b) 抗Sox2抗体と抗Ki-67抗体によるC57BL/6Jマウスの茸状乳頭の免疫染色像を示す。(a) Sox2とKi-67の二重免疫染色と、Hoechst 33342核染色をマージした画像、(b) Sox2とKi-67の二重免疫染色のみの画像を示す。白い破線は、上皮細胞層又は茸状乳頭及び固有層の境界を示す。スケールバーは50 μmを示す。(c) 糸状乳頭内の上皮細胞ポピュレーションの全Sox2陽性細胞におけるKi-67及びSox2二重陽性細胞のパーセンテージを示す。解析は、C57BL/6Jマウスの組織を用いて行った。ほとんどの、Ki-671及びSox2二重陽性細胞のほとんどが、ポジション +1に存在していた。 ３匹のマウスを用いて、計505個のSox2+ cellsについて解析した。*P < 0.05; **P < 0.01。(d) HopxCreER2T/+; Rosa26rbw/+マウスにタモキシフェンを投与し、茸状乳頭内のHopx+ cellsをラベルし、７日後に解析した。青い矢頭は、Hopx+ cellsを示す。白い破線は、上皮細胞層又は茸状乳頭及び固有層の境界を示す。スケールバーは50 μmを示す。(e) タモキシフェン投与後３日目と７日目にHopxCreERT2/+; Rosa26rbw/+ マウスの舌組織の観察を行い、図に示された部位に位置しているHopx+ single cellsの割合を計数した。３匹のマウスについて、タモキシフェン投与後３日目に計465個の Hopx+ cellsについて解析した。タモキシフェン投与後７日目に計338個の Hopx+ cellsを解析したところ、ポジション＋１の割合が増加していた。 (f) HopxCreER2T/+; Rosa26rbw/+ マウスの茸状乳頭内のHopx+ cellsをタモキシフェン処理によってラベルし、ラベルから28日後に解析した。白い破線は、上皮細胞層又は茸状乳頭及び固有層の境界を示す。スケールバーは50 μmを示す。(g) タモキシフェン投与後28日目に、茸状乳頭内のHopx+ 細胞のクローンの数をHoechst 33342染色陽性核の数を計数してもとめた。３匹のマウスを使って、計77個のHopx+ cell由来クローンについて解析した。３匹の独立したマウスについて、それぞれ、赤、青、緑で示す。
【図９】(a) タモキシフェン処理後３日目のC57BL/6Jマウス（左）、又はHopxCreER2T/+; Rosa26loxp-stop-loxp-YFP/+ マウス（右）の舌組織から分離した細胞の婦ローサイトメトリーの結果を示す。点線で囲まれた分画は、Hopx-YFP+ cellsのみをソートするためのゲートのパラメータを示す。(b)培養開始後図に示した時点で撮像した、single Hopx-YFP+ cellsに由来する培養オルガノイドの明視野画像（上部）及び蛍光画像（下）を示す。スケールバーは50 μmを示す。(c, d) Hopx-YFP+ cellsをYFPでソーティングして得られた細胞に由来する培養オルガノイドの明視野画像 (c)、及び蛍光画像 (d)を示す。培養開始後21日目に撮像した。 スケールバーは200 μmを示す。(e-j) 培養開始後21日目のオルガノイドを抗Krt5抗体 (e, f)、抗 Krt8抗体(e, f)、抗NTPDase2抗体 (g)、抗 Gnat3 (h)抗体、抗Car4抗体(i)及び抗5-TH (j)抗体で免疫染色した画像を示す。各免疫染色の画像とHoechst 33342染色画像をマージした画像（上段）と、各免疫染色単独の画像（下段）を示す。 黄色矢頭はKrt5及びKrt8両陽性細胞 (e)、赤矢印は、Krt8 (f), NTPDase2 (g), Gnat3 (h), Car4 (i), 及び5-TH (j)陽性細胞を示す。 Hopx-YFP+ cell由来オルガノイドは、タイプ1〜3の細胞を含んでいた。スケールバーは50 μmを示す。
【図１０】(a) HopxCreERT2/+; Rosa26rbw/+ マウスの舌組織からシングルセルアイソレーションされた細胞に由来するオルガノイドを調製し、培養３日目にタモキシフェンを培地に添加した。Hopx+ cellsを３つのグループに分けることができた：分化細胞（青円）、休止期細胞（黄色円）、推定幹細胞（赤円）。G/C/O/Chは、GFP、 mCerulean、mOrange、mCherryのシグナルのマージを意味する。スケールバーは50 μmを示す。(b) 単一舌細胞に由来するオルガノイドの模式図を示す。オルガノイドの中心部分は、層状上皮で構成されている。赤で示されたHopx+ cell（）は自己複製幹細胞を示し、オルガノイドの周囲に存在し、自己再生するだけでなく、分化する子孫も生み出す。 黄色で示されたHopx+ cell細胞は休止期の細胞を示し、オルガノイド周囲に単一細胞で存在する。青で示されたHopx+ cell細胞は分化している細胞を示しラベルされた際にオルガノイドの内側に存在している。このような細胞は明らかに迅速に分化して消失する。(c) HopxCreERT2/+; Rosa26rbw/+マウスからシングルセルアイソレーションにより単離され多細胞から形成されたオルガノイドに、培養３日目でタモキシフェンを添加し、３種のHopx+ cellsの比率を算出した。*P < 0.05.
【図１１】(a) Sox2GFP/+マウスからシングルセルアイソレーションにより単離され多細胞から形成されたオルガノイドから採取された細胞をフローサイトメトリーで解析した。点線で囲まれた分画は、Sox2-GFP+ cellsのみをソートするためのゲートのパラメータを示す。(b) Sox2-GFP+ cellsでHopxを発現する細胞(左)と、Lgr6を発現する細胞（右）の主成分分析(PCA)プロットを示す。Hopx+ cellsはLgr6+ cellsと異なることが示された。
【図１２】(a) 図11aの舌オルガノイドから分離されたSox2-GFP+ cellsのトランスクリプトームシミラリティのt-SNE map ofを示す. k-meansクラスタは、異なる色で強調して示す（cls凡例）。(b) Mki67のトランスクリプト数 (color凡例をt-SNE map内に強調して示す。(c) (a)にプロットされた個々の細胞におけるMki67の転写レベルをバイオリンプロットで示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．味蕾細胞の長期幹細胞とその単離
第1の実施形態は、味蕾細胞を供給することができる単離された舌上皮幹細胞、又はその舌上皮幹細胞に由来する細胞塊に関する。前記舌上皮幹細胞は、味蕾細胞に加え、糸状乳頭の上皮細胞も供給しうる。前記舌上皮幹細胞は、HOP homeobox (Hopx)を発現する。より好ましくは、前記舌上皮幹細胞は、SRY (sex determining region Y)-box 2 (Sox2)も発現する。さらに前記上皮幹細胞は、Lgr6を発現しないことが好ましい。前舌上皮幹細胞は、体内では、味蕾ではなく味蕾の周りの傍茸状乳頭間窩に存在する。
【００１１】
前記舌上皮幹細胞は、以下に述べる手法により、取得することができる。
【００１２】
「単離された舌上皮幹細胞」とは、体内に発生し、そこから分離されていない舌上皮幹細胞を含まないことを意味する。「単離された舌上皮幹細胞」には、Hopx陽性の舌上皮幹細胞（本明細書において、Hopx陽性細胞、Hopx+ cell、Hopx + cellsともいう）を培養することによって取得された子孫の細胞も含む。
【００１３】
（１）舌組織からの上皮細胞の回収
哺乳類動物（ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット等）、鳥類（ニワトリ等）の舌、又は舌組織を採取する。
【００１４】
舌組織からの上皮細胞の回収は、公知の方法にしたがって行うことができる。例えば、以下の方法である。
【００１５】
採取した舌、又は舌組織の上皮下にディスパーゼ等のプロテアーゼ溶液を注入し、結合組織から上皮部分を剥がす。剥がした上皮部分をさらにTrypLE（登録商標）Express及びTrypLE（登録商標） Select（Thermo Fisher Scientific社）等の細胞傷害性の低いプロテアーゼで処理し、細胞同士の接着を剥離し、細胞を適切な培養培地又はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に懸濁させる。プロテアーゼ処理は、タンパク分解処理のも目的を達成できる限り制限されない。例えば、プロテアーゼ処理は、プロテアーゼメーカや、論文等で報告されているプロテアーゼ活性濃度で、35〜37℃で、15分から40分程度である。前記細胞懸濁液は、組織残渣等を取り除くため、50μm〜80μm程度のメッシュ径を有するセルストレーナー等で篩過してもよい。また、さらに、前記細胞懸濁液は、細胞それぞれがシングルセルとして懸濁するように、25μm〜40μm程度のメッシュ径を有するセルストレーナー等で篩過してもよい。
（２）上皮細胞の細胞懸濁液からのHopx陽性細胞の回収
【００１６】
Hopx陽性細胞の回収は、例えば、Hopxの発現をマーカーとして、ソーティング、磁気細胞分離等の公知の方法により、上皮細胞集団から回収することができる。好ましくは、Hopx陽性細胞を回収する前に、細胞回収の前工程として、Sox2の発現をマーカーとしてソーティング、磁気細胞分離等でSox2陽性細胞（本明細書において、Sox2+ cell、Sox2+ cellsともいう）を選別して回収し、前工程で回収されたSox2陽性細胞集団から、Hopx陽性細胞を選別して回収してもよい。
【００１７】
ソーティングによるHopx陽性細胞又はSox2陽性細胞の選別は、例えば、マルチカラー細胞系譜追跡法等の遺伝子組換え等により細胞にラベルした蛍光や、抗Hopx抗体、及び抗Sox2抗体等を使った蛍光抗体法で細胞にラベルした蛍光等を指標として行うことができる。磁気細胞分離による選別は、抗Hopx抗体、及び抗Sox2抗体等に磁性粒子を標識した磁気抗体を使って行うことができる。抗Hopx抗体、及び抗Sox2抗体は、公知である。
【００１８】
また、Hopx陽性細胞は、前記細胞懸濁液中の細胞、又は回収されたSox2陽性細胞を後述する舌上皮幹細胞の培養方法で培養することによっても取得することができる。
【００１９】
（２）舌上皮幹細胞の培養方法
前記（１）の工程で取得された細胞懸濁液中の細胞、前記（２）の工程で回収されたSox2陽性細胞、又は回収されたHopx陽性細胞（以下、「回収細胞」ともいう）はin vitroで培養することができる。好ましくは、前記細胞懸濁液中の細胞、回収されたSox2陽性細胞、又は回収されたHopx陽性細胞は、三次元培養を行うことにより、細胞塊（オルガノイド）を形成する。この細胞塊には、Sox2陽性細胞、及びSox2とHopxの二重陽性細胞の他、Hopx陽性細胞の子孫である、糸状乳頭上皮細胞、及び味覚細胞を含む味蕾細胞が含まれ得る。
【００２０】
前記舌上皮幹細胞を培養は、前記舌上皮幹細胞を培養できる限り制限されない。好ましくは、例えば、以下に述べる三次元培養法を挙げることができる。
【００２１】
三次元培養は、回収細胞をゲルマトリックスに包埋し、当該細胞を含むゲルマトリックスを細胞培養培地と接触させて行うことができる。ゲルマトリックスとして用いられる基材としては、多糖類、タンパク質、合成ポリマーハイドロゲルまたはペプチドハイドロゲル等を含むものが挙げられる。これらは、単独で用いてもよいが、２種以上を組み合わせてもよい。ゲルマトリックスとして、BDマトリゲル（登録商標）マトリクス（BD Bioscience社）、VitroGel（登録商標）3D、VitroGel（登録商標）3D-RGB（TheWell BIOSIENCE社）等を使用してもよい。好ましくは、ラミニン、エンタクチン、IV型コラーゲン及びヘパラン硫酸プロテオグリカンを含むＢＤマトリゲル(登録商標)マトリクスである。
【００２２】
回収細胞は、回収から12時間以内、好ましくは６時間以内、さらに好ましくは３時間以内にゲルマトリックスに包埋される。
【００２３】
ゲルマトリックスに包埋する際、回収細胞は、必要に応じて重合剤やチオールクロスリンカーを添加したゲルマトリックス溶液に5×102〜1×104個/ウェル、好ましくは1×103〜3×103個/ウェル程度となるように懸濁され、例えば24ウェルプレートに分注される。分注量はウェルの大きさに応じて適宜調整すればよい。
【００２４】
ゲルマトリックスへの包埋は、回収細胞存在下で、上記ゲルマトリックス溶液を重合させることにより行われる。
【００２５】
ゲルマトリックスの重合は、4〜37℃、より好ましくは25〜37℃、さらに好ましくは35〜37℃で行うことができる。重合時間は、30〜60分、好ましくは20〜40分程度である。
【００２６】
細胞培養培地は、基本培地にL-グルタミン、サイトカイン、Jagged-1フラグメント、リン酸化酵素インヒビター、トランスフェリン、B-27（登録商標）サプリメント（Thermo Fisher Scientific）、N-acetyl cysteine、抗生物質等を添加して調製することができる。
【００２７】
基本培地は、特に制限されないが、DMEM、DMEM/F12、アドバンスドDMEM/F12、RPMI1640、アドバンスドRPMI1640等を使用することができる。好ましくは、DMEM/F12またはアドバンスドDMEM/F12であり、より好ましくはドバンスドDMEM/F12である。また基本培地には、ウシ胎仔血清等の血清を添加しない方がよい。
【００２８】
基本培地にL-グルタミンが予め添加されている場合には、L-グルタミンを加える必要はないが、添加されていない場合には、L-グルタミンを添加することが好ましい。添加量は、L-グルタミンとして１〜３mM程度となるように添加することができる。また、L-グルタミンに代えて、GlutaMAX（登録商標）等の市販のグルタミンサプリメントを使用することができる。この場合には、サプリメントの終濃度がメーカー推奨濃度の１×程度となるように添加すればよい。
【００２９】
サイトカインとしては、上皮増殖因子（EGF）、骨形性因子（BMP）アンタゴニスト、Wntアゴニスト等を添加することができる。
【００３０】
EGFは哺乳類から精製されたものでもよく、また遺伝子組換え技術によって得られたものを使用してもよい。EGFはヒト、サル、マウス、ラット、ウシ等の哺乳動物由来のものが好ましく、より好ましくは、ヒトまたはマウスである。細胞培養培地には、増殖因子としてEGFを含むことができ、好ましくは増殖因子としてEGFを必須成分として含み、さらに好ましくは増殖因子としてEGFのみを含む。添加されるEGF濃度は、細胞培養培地に対する終濃度で1〜300 ng/ml、好ましくは10〜200 ng/ml、より好ましくは25〜100 ng/mlである。細胞培養培地にEGFを添加しない場合、細胞塊が育ちにくいことから、回収細胞の培養にEGFの添加は必須である。
【００３１】
BMPアンタゴニストとしては、Noggin、DAN若しくはDAN様タンパク質（Cerberus）またはGremlinを使用することができ、より好ましくは、Noggin である。BMPアンタゴニストは哺乳類から精製されたものでもよく、また遺伝子組換え技術によって得られたものを使用してもよい。BMPアンタゴニストはヒト、サル、マウス、ラット、ウシ等の哺乳動物由来のものが好ましく、より好ましくは、ヒトまたはマウスである。添加されるBMPアンタゴニスト濃度は、細胞培養培地に対する終濃度で1〜500 ng/ml、好ましくは10〜300 ng/ml、より好ましくは50〜200 ng/mlである。細胞培養培地にBMPアンタゴニストを添加しない場合、細胞塊がやや育ちにくいことから、回収細胞の培養にBMPアンタゴニストを添加することが好ましい。
【００３２】
Wntアゴニストとしては、Wnt-1/Int-1、Wnt-2／Irp（Int-1関連タンパク質）、Wnt-2b/13、Wnt-3/Int-4、Wnt-3a、Wnt-4、Wnt-5a、Wnt-5b、Wnt-6、Wnt-7a、Wnt-7b、Wnt-8a/8d、Wnt-8b、Wnt-9a/14、Wnt-9b/14b/15、Wnt-10a、Wnt-10b/12、Wnt-11、Wnt-16、R-スポンジン1、R-スポンジン2、R-スポンジン3またはR-スポンジン-4を使用することができ、好ましくはWnt-3a、またはR-スポンジン1、より好ましくはR-スポンジン1を使用することができる。
【００３３】
Wntアゴニストはヒト、サル、マウス、ラット、ウシ等の哺乳動物由来のものが好ましく、より好ましくは、ヒトまたはマウスである。添加されるWntアゴニスト濃度は、細胞培養培地に対する終濃度で1〜3000 ng/ml、好ましくは100〜2000 ng/ml、より好ましくは500〜1500 ng/mlである。Wntアゴニストを添加しない場合、細胞塊は育つもののケラチン８の発現が高くなる。ケラチン８は、成熟味蕾細胞のマーカーと考えられることから、Wntアゴニストを添加しない場合、幹細胞から味蕾細胞への分化が進みやすくなることが予測された。Hopx陽性細胞に幹細胞としての機能を維持させる点から、回収細胞の培養にWntアゴニストを添加することが好ましい。
【００３４】
Jagged-1は、Notchリガンドである。Jagged-1フラグメントは、Jagged-1タンパク質のフラグメント（好ましくは、可溶性フラグメント）である限り制限されない。例えば、配列番号1に記載のアミノ酸配列CDDYYYGFGCNKFCRPRを含むことが好ましい。添加されるJagged-1フラグメントの濃度は、細胞培養培地に対する終濃度で0.1〜10μM、好ましくは0.5〜5μM、より好ましくは0.8〜2μMである。Jagged-1フラグメントは、細胞塊に対して、Wnt-3aと似た効果を示す。したがってWnt-3aを細胞培養培地に添加しない場合には、Jagged-1フラグメントを添加することが好ましい。
【００３５】
リン酸化酵素インヒビターとしては、ROCK（Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho結合キナーゼ）インヒビターを添加することができる。ROCKインヒビターとしては、好ましくは、(R)-(+)-trans- N-(4-pyridyl)-4-(1-aminoethyl)- cyclohexanecarboxamide・2HCl・H2O（Y-27632）、1-(5-イソキノリニルスルホニル) ホモピペラジン二塩酸塩（ファスジルまたはHA1077）および（S）-（+）-2-メチル-1-[（4-メチル-5-イソキノリニル）スルホニル]-ヘキサヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン二塩酸塩（H-1152）を使用することができ、より好ましくはY-27632である。添加されるROCKインヒビター濃度は、細胞培養培地に対する終濃度で0.1〜100μM、好ましくは1〜50μM、より好ましくは5〜20μMである。
【００３６】
トランスフェリンとしては、ホロタイプのものが好ましく、N-2サプリメント（例えばInvitrogen社製）として供給されているものを使用することができる。N-2サプリメントは、細胞培養培地に対する終濃度で、例えばメーカー推奨濃度の0.5×〜2×となるように添加することができる。より好ましくは、１×濃度程度である。
【００３７】
B-27（登録商標）サプリメントは、細胞培養培地に対する終濃度で、例えばメーカー推奨濃度の0.5×〜2×となるように添加することができる。より好ましくは、１×濃度である。
【００３８】
N-acetyl cysteineは、細胞培養培地に対する終濃度で、0.5〜2μＭ程度となるように添加することができる。
【００３９】
細胞培養培地には、さらに抗生物質を添加することができる。抗生物質は、ペニシリン、ストレプトマイシンまたはこれらの混合液を常法にしたがって添加することができる。
【００４０】
回収細胞を培養するための細胞培養培地としては、基本培地としてアドバンスドDMEM/F12を使用し、上皮増殖因子ng/mlとして1〜300 ng/mlのEGFを必須成分として含み、かつ１×GlutaMAXTM、0.1μM〜100μMのY-27632、0.5×〜2×のN-2サプリメント、0.5〜2×のB-27TM サプリメント及び0.5〜2μＭのN-acetyl cysteine、BMPアンタゴニストとして、1〜500 ng/mlのNoggin、Wntアゴニストとして1〜3000 ng/ml Rスポンジン1、0.1〜10μMのJagged-1フラグメントを含むものが好ましい。
【００４１】
回収細胞は、細胞培養培地と接触させることにより培養することができる。好ましくは、回収細胞を含むゲルマトリックスと、細胞培養培地とを接触させる
【００４２】
細胞培養培地と回収細胞を含むゲルマトリックスとを接触させる方法は、公知である。回収細胞を含むゲルマトリックスに細胞培養培地を重層する方法；回収細胞を含むゲルマトリックスの一部または全部を細胞培養培地に浸漬する方法；回収細胞を含むゲルマトリックスと細胞培養培地とをセルロースフィルター等を介して接触させる方法等が挙げられる。好ましくは、重層する方法である。
【００４３】
回収細胞を含むゲルマトリックスに細胞培養培地を重層する場合、例えば24ウェルプレートを使用して舌上皮細胞を含むゲルマトリックスを重合させた場合には、１ウェル当たり、300〜1000μl、好ましくは500〜800μlを重層することができる。培地量はウェルの大きさに応じて適宜調整すればよい。培地交換は、ゲルマトリックスに重層された部分を除去し、新たな細胞培養培地を重層することにより行うことができる。培地交換は、２〜７日に一度の頻度で行うことができ、好ましくは３〜４日に一度である。
【００４４】
回収細胞の培養は、汎用されるCO2インキュベータで行うことができ、温度は37℃前後、CO2濃度は５％前後である。
上記条件で培養された回収細胞は、培養開始２日目頃から増殖を開始し、培養開始後15〜40日程度培養することができる。
【００４５】
前記単離された舌上皮幹細胞には、細胞塊をゲルマトリックスから回収し、細胞塊中の細胞の接着をプロテアーゼ処理で剥離して取得される、Hopx陽性細胞も含まれる。細胞塊のプロテアーゼ処理は、舌上皮の細胞の剥離処理に準ずる。
【００４６】
２．味覚機能評価システム、味覚機能評価キット及び味覚機能評価方法
（１）味覚機能の評価方法
第２の実施形態は、in vitroにおける味覚機能の評価に関する。上記１．で述べた細胞塊には、後述する実施例で示すように、Hopx陽性細胞から分化した味覚細胞が含まれる。味覚細胞には、少なくともNTPDase2を発現するI型細胞（支持細胞）と、guanine nucleotide binding protein alpha transducing 3 (Gnat3)を発現するII型細胞（甘味、苦み、うまみの味覚レセプターを発現する細胞）と、carbonic anhydrase 4 (Car4)と5-TH 30を発現する3型細胞（前シナプス細胞）の3種が存在する。前記細胞塊には、これらの全てが含まれる。
【００４７】
細胞塊中の細胞の接着をプロテアーゼ処理で剥離し、細胞塊の中から味覚細胞を単離することができる。単離方法は公知であり、例えば限界希釈法を用いたシングルセルクローニング等により細胞の単離を行うことができる。
【００４８】
細胞塊から単離された各味覚細胞について、味覚レセプター等のmRNAの発現をSingle-cell RNA-Seq、Single cell qRT-PCR等で評価することにより、味覚細胞の機能を評価することができる。
すなわち、味覚機能の評価方法には、上記１．で述べた舌上皮幹細胞、又は上記１．で述べた細胞塊に由来する味覚細胞の機能を評価する工程を含む。
【００４９】
（２）味覚機能の評価システム
ある実施形態は、上記１．で単離された舌上皮幹細胞、又は舌上皮幹細胞に由来する細胞塊に由来する味覚細胞の機能を評価することを含む、味覚機能の評価システムに関する。
【００５０】
本システムは、第1の施設で、生体から採取した舌組織から、上記１．で述べた回収細胞を取得し、上記１．の方法にしたがって、細胞塊を形成させ、第1の施設又は第1の施設とは異なる第２の施設で、細胞塊から単離された味覚細胞の機能を評価する。細胞塊からの味覚細胞の単離は、第1の施設で行っても、第２の施設で行ってもよい。味覚細胞の単離方法は、上記２（１）．で述べたとおりである。
【００５１】
（２）味覚機能の評価キット
ある実施形態は、味覚機能の評価キットに関する。
キットは、少なくとも上記１．で単離された舌上皮幹細胞、又は舌上皮幹細胞に由来する細胞塊に由来する味覚細胞を含む。前記味覚細胞は、細胞塊の状態でキットに含まれていてもよい。また、前記味覚細胞は、凍結されていてもよい。
【００５２】
キットは、前記味覚細胞の他、細胞の培養に必要な細胞培養培地、キットの取扱説明書又は取扱説明書が掲載されたWebページのURLが記載された紙媒体等を含んでいてもよい。
【００５３】
３．バイオマーカー
第３の実施形態は、バイオマーカーに関する。
実施例に示す通り、舌上皮組織において、Hopxは、味蕾細胞、好ましくは味覚細胞に分化し得る性質を有する舌上皮幹細胞に特異的に発現する。この舌上皮幹細胞は、長期にわたって味蕾細胞を供給することができる長期幹細胞である。すなわちHopx遺伝子は、味覚細胞に分化し得る舌上皮幹細胞のバイオマーカーとして使用することができる。より具体的には、Hopx遺伝子の転写調節領域、Hopx遺伝子から転写されるmRNA、このmRNAから翻訳されるHopxタンパク質を、味覚細胞に分化し得る舌上皮幹細胞のバイオマーカーとして使用する。
また、バイオマーカーには、Sox2遺伝子も含み得る。好ましくはSox2遺伝子とHopx遺伝子を組み合わせてバイオマーカーとする。
【実施例】
【００５４】
以下に、実施例を示して本発明の内容について詳細に説明するが、本発明は実施例に限定して解釈されものではない。
また、以下に示す動物実験等は、関西医科大学の指針にしたがって行われ、関西医科大学動物実験委員会の承認を経て行った。
【００５５】
１．材料及び方法
1−1．マウス
C57BL/6J、HopxCreERT2/+ (JAX mice strain 017606)、Lgr6EGFP-IRES-CreERT2/+ (JAX mice strain 016934)、Rosa26loxp-stop-loxp-YFP/+(JAX mice strain 006148)、Sox2GFP/+ (JAX mice strain 017592) マウスはJackson Laboratoriesから購入した。Rosa26rbw/+ライン及びRosa26CreERT2/+ラインはTanaka, T. et al.(Nature cell biology 15, 511-518 (2013))、Ueno, H. et al.(Developmental cell 11, 519-533 (2006))、Ueno, H. et al. (P.N.A,S 106, 175-180 (2009))、Ueno, H.et al. ( Int. J. Dev. Biol. 54, 1019-1031 (2010))、Red-Horse, K., et al. (Nature 464, 549-553 (2010)) に記載の方法で作製した。Foxa2MerCreMer/+ (Foxa2mcm/+) マウスは Dr. Anne M. Moon 36が作製したものを使用した。Rosa26RH2B-mCherry/+ マウスはRIKEN CDB 37より提供を受けた。
【００５６】
タモキシフェン(Sigma, St. Louis, MO, USA, T5648) は、コーン油(Sigma, C8267) に溶解し、６〜10週のマウスの腹腔内に9 mg ／40 g体重で投与した。
【００５７】
HopxCreERT2/+ にはタモキシフェンを３日間連続して投与した。Foxa2mcmマウスは、胎生7.5日の胎児にタモキシフェンが供給されるよう、妊娠マウスに0.12 mg/g体重のタモキシフェンを経口接種させることにより胎児にCreリコンビナーゼを発現させた。
【００５８】
１−２．組織学的解析
マウスを安楽死させた後組織を摘出し、4% パラホルムアルデヒドで一晩4 °Cで固定した。組織を30%シュクロース溶液に一晩浸漬し、optimal cutting temperature compound (Leica Biosystems, Richmond, IL, USA, 3801480)に包埋した。切片は5 μm薄切した。
【００５９】
免疫染色には、一次抗体として、表１に記載の抗体を使用した。二次抗体として、Alexa488-、Alexa594-、Alexa750-標識二次抗体(1:200, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を使用した。核染色はHoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, H3570)で行った。
【００６０】
【表１】
2019165654.tif 000002
【００６１】
１−３．セルソーティング
Hopx-YFP+細胞又はSox2-GFP+細胞を取得するため、HopxCreERT2/+マウス; Rosaloxp-stop-loxp-YFP/+マウス又はSox2GFP/+マウスから舌を採取し、0.5 mLのディスパーゼ (50 U/mL, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA,354235) を上皮下に注入し、37℃で10分インキュベーションした。前舌上皮を結合組織から穏やかに剥がし、TrypLETM Express (Thermo Fisher Scientific,12604021) の中で、37 °Cで30分インキュベーションした。シングルセル浮遊液となるように70-μm cell strainer (Corning, Corning, NY, USA, 352350)で篩過し、大きな凝集塊を除去し、４℃で、1500 rpm、5 minで遠心して細胞を回収し、回収した細胞をさらに35-μm cell strainer (Corning, 352235)を篩過させた。FACSAriaI, III (BD Biosciences) 100-μm又は130-μmノズルを備えた又はSH800 (SONY, Tokyo, Japan)を使用してソーティングを行った。ソーティングした細胞は、 750 μLの培地に回収した。
【００６２】
１−４．Single cell qRT-PCR
RNA抽出は、10% Surfact-Amps NP-40 Detergent Solution (w/v) (Thermo
Fisher Scientific, 28324)とRNasin plus (Promega, Madison, WI, USA, N2611)と、RealTime ready Cell Lysis kit (Roche, Basel, Switzerland, 06366821001)とを用いて行い、抽出後のRNAをDNase I Amp Grade (1U/μL) (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA, 18068-015)で処理した。精製RNAはcDNA合成に供した。cDNA合成はｍSuperScript(登録商標) VILO(登録商標) cDNA Synthesis Kit (Life Technologies, 11754050と表２に記載のプライマーを用いて行った。前増幅は、Platinum（登録商標）Multiplex PCR Master Mix (Life Technologies, 4464269) とExonuclease I (NEB, Ipswich, MA, USA,M0293L)とを用いて行った。 qPCR解析は、QuantiTect SYBR（登録商標）Green PCR Kit (1000) (QIAGEN, Hilden, Switzerland, 204145)及びStepOnePlus real time PCR system (Thermo Fisher Scientific)を用いて行った。DNAのコンタミがないことを逆転写酵素を含まない陰性対照(-RT)を増幅することによって、確認した。
【００６３】
Ct値は、式Log2Ex =LOD (Limit of Detection) Ct-Ct [Gene]を使って発現量に変換した。もしLog2Exが負の時には、発現量は０とした。 LODそれぞれの遺伝子のは、Application Guidance Single cell Data Analysis (Fluidigm, South San Francisco, CA, USA)にしたがって、決定した。簡単に述べると、特異的プライマーを使って前増幅させたcDNAを正確に３倍希釈した。15の希釈サンプルについて、６重測定して求めた平均CtをLOD値の算出に用いた。階層的クラスタリングは、Ward's法に従って行った。解析は、Application Guidance Single cell Data Analysis (Fluidigm) and JMP Pro (version 12.2.0) ソフトウェア (SAS, Cary, NC, USA)を使って行った。
【００６４】
【表２】
2019165654.tif 000003
【００６５】
１−５．Single-cell RNA-Seq
Single-cell RNA-SeqはRamDA-Seqを使って、発明者らの研究室で作った、新しいsingle-cell RNA-Seqプロトコル (Hayashi et. al., https://www.nature.com/articles/s41467-018-02866-0) にしたがって行った。 全てのsingle-cell RNA-Seqサンプルは、MultiNA DNA-12000 kit (Shimadzu, Kyoto, Japan)を使って、改良サンプル混合比率 (1:1:1; サンプル、マーカー、ヌクレアーゼフリー水) 総容積6 μLに合わせた。ライブラリDNAの長さと収率は、150-3000 bpの範囲で計算した。特に、ライブラリDNAの収率は、改良MultiNA条件にしたがって得られた値の 0.5倍とした。96ウェルプレートの各ウェルに200fmolの各ライブラリDNAをプールした。
【００６６】
プールしたライブラリDNAは150-3000の範囲でBioanalyzer Agilent High-Sensitivity DNA Kitを使って平均長を評価し、ibrary quantification kit (Kapa Biosystems)を使ってライブラリの濃度を求めた。最終的に、 1.5 pMのプルしたライブラリDNAについてIllumina HiSeq 2500 (Rapid mode, single-read 50 cycle sequencing; San Diego, CA, USA)使ってシークェンシングを行った。 Fastq-mcf (version 1.04.807)をtrim DNA sequencing adapter配列に使用した。各転写物について、TPM値をsailfish (version 0.10.0) “quant” でparameter “-l U”をコマンドして計算した。全ての転写物はGENCODE gene annotation (vM11)にアノテーションした。発現レベルのTPMを、全てのアイソフォームのTPM値を合計して、遺伝子レベルの発現量に変換した。 解析ソフトRにおいて、log-transformed TPMデータについて、“prcomp” or “tsne”を使って、次元削減分析を行った。機能的濃縮分析は、それぞれのクルスターについて、Metascape (http://metascape.org)とDAVID (https://david.ncifcrf.gov/)を使って行った。クラスタリング解析は、k-means algorithmを使ったt-SNEにより、それぞれのsingle-cellの削減次元の空間状で行った。 single-cell RNA-Seq dataから幹細胞を見つけるために、 StemIDを使った。
【００６７】
１−６．三次元イメージング
凍結包埋組織を60〜80 μmの切片に薄切し、Nikon C2 confocal microscope (Nikon Instech, Tokyo, Japan) 又はOLYMPUS Confocal Laser Scanning Microscope FV3000 (OLYMPUS, Tokyo, Japan)を使って画像を取得した。 三次元画像は、Nikon又はVolocity software (PerkinElmer, Waltham, MA,USA)、あるいはFluoview FV30S-SW (OLYMPUS)を使ってz-stack images (0.8 μm)に圧縮した。
【００６８】
１−７．三次元組織培養
舌からソーティングにより取得されたHopx-YFP+細胞は、サイトカイン存在下で、Matrigel (Becton Dickinson Biosciences, Bedford, MA, USA, 354234)で培養した。簡単に説明すると、細胞をマトリゲルに浮遊させ、24ウェルプレートに1500 cells／wellとなるようにプレーティングした。0.75 mLのadvanced DMED/F-12 medium (Thermo Fisher Scientific, 12634010) にN-2 (Invitrogen,17502-048)、B-27 (Invitrogen, 17504-044)、N-acetyl cysteine (Sigma-Aldrich, A8199)、Glutamax (Thermo Fisher Scientific, 35050-061)及び cytokines (rmEGF: 50 ng/mL, rmNoggin: 100 ng/mL, rhR-spondin1-hFc: 1000 ng/mL)を添加したものをMatrigelが入った各ウェルに加えた。EGF (315-09) 及びnoggin (250-38)はPeprotech (Rocky Hill, NJ, USA)から購入した。 R-spondin 1-hFc containing the C-terminal of human IgGは、発明者の研究室で調製した。 Recombinant human R-spondin 1 cDNAはKyowa Hakko Kirin (Tokyo, Japan)から分与を受けた。 Y-27632 (10 μM, Sigma-Aldrich, Y0503) 及びJagged-1 (1 μM, Anaspec, Fremont, CA, USA, AS-61298)をさらにウェルに添加した。３〜４日ごとに、ウェル内の全ての培地を新しいものに交換した。
【００６９】
HopxCreERT2/+; Rosa26rbw/+マウス由来細胞を培養している間に、マルチカラーラベリングを誘導するために、培養３日目で、4-hydroxytamoxifen (200 ng/mL) を培養培地に添加した。
【００７０】
１−８．オルガノイドのタイム−ラプスイメージング
画像は、KEYENCE BZ-X700 all-in-one fluorescence microscopeで取得した。画像は90分ごとに、タモキシフェンを加えてから2日後から90分ごとに撮像した。
【００７１】
１−９．統計解析
全ての統計解析は、JMP Pro (version 12.2.0) software (SAS)を使って行った。
Hopx+ cellsの位置は、タモキシフェンを添加してから3日目又は7日目に、3匹のHopxCreER2T/+/Rosa26rbw/+ マウスから採取した舌組織を上述の共焦点顕微鏡で確認することで評価した。
【００７２】
3日目又は7日目にHopx+ cellsの位置を決定するために、蛍光波長465 nm及び338 nmの単一蛍光ラベル標識細胞をそれぞれ確認した。Hopx+ cell-由来クローンあたりの細胞数は、 タモキシフェン添加後28日目に、共焦点顕微鏡で3匹の異なるHopxCreER2T/+/Rosa26rbw/+マウスから採取した舌組織のHopx+ cell-由来クローン中のHoechst 33342染色核の数を数えることで求めた。全部で77クローンについて解析した。解析結果は、他に特記しない限り、グループ間のStudent’s t検定によるペアワイズ相関を求めた。統計学的な有意差は、P < 0.05の時に有意差有りと評価した。
【００７３】
3種のlox配列の組替え効率は、タモキシフェンを添加してから２日後のRosa26rbw/+マウスで、mCerulean-、 mOrange-、 及びmCherry-でラベルされたクローンの数を数えることにより評価した。この評価では、601個の個々の細胞について解析した。(n = 3) (図５b).
【００７４】
Rosa26CreERT2/rbwマウスにタモキシフェンを投与してから、4, 12, 及び48習慣後に組織を観察することによって、となりの傍茸状乳頭間窩と同じ色を有する茸状乳頭の割合を計測した。また、その値を色間で比較した。151、 154、及び156箇所の茸状乳頭について、タモキシフェンによる誘導からそれぞれ4週間目 (n = 3)、12週間目 (n = 3)、 及び48週間目 (n = 3) (図１k)に観察した。
【００７５】
Lgr6+ cell-由来クローンあたりの細胞数は、それぞれの時点で、共焦点顕微鏡で3匹又は４匹の異なるLgr6EGFP-IRES-CreERT2/+; Rosa26rbw/+マウスから採取した舌組織のLgr6+ cell-由来クローン中のHoechst 33342染色核の数を数えることで求めた。また、Welch’s t-検定を行って、各群間の比較を行った(図３k)。
【００７６】
Ki67及びSox2二重陽性細胞について、独立したC57BL/6Jマウスについて評価した。細胞は、Ki67及びSox2を免疫染色し、Sox2+ cellsの中のKi67及びSox2二重陽性細胞の分画の細胞を数え定量した。全部で505個の独立した細胞について解析した(n = 3) (図８c) 。
【００７７】
HopxCreERT2/+; Rosa26rbw/+ マウスの単離された単一細胞から形成されたオルガノイド中の3色のHopx+ cellsの割合を、各色間で比較した。全部で118個のオルガノ井戸について、6重の独立した実験を行った (図１０c)。
【００７８】
２．長期幹細胞の同定
味蕾の長期維持をもたらす幹細胞の存在を確認するため、Rosa26CreERT2/rbwマウスを使って48週間マルチカラー系譜追跡を行った。
【００７９】
図５aに示すように、この方法では全て細胞が着色され、その細胞の帰趨を追跡することができる。この方法により、異なる幹細胞由来の各クローンをその色に基づいて容易に区別することができた。
【００８０】
さらに、Rosa26CreERT2/rbwマウスに低用量のタモキシフェンを投与することによりCreリコンビナーゼの発現を誘導することにより、GFP陽性の未結合細胞に囲まれた疎な標識細胞の出現をもたらし、これにより、単一のクローンを他の隣接するクローンと明白に区別することができた（図１a）。長期に舌組織にランダムに標識された細胞の系統追跡の先だって、異なる3種のlox配列の組替え効率を確認した。
【００８１】
その結果は、異なる3種lox配列間でランダムな組替えに差は認められなかった(図５b)。 タモキシフェン投与後２日目の時点で,茸状乳頭とそれを取り囲む周辺上皮はランダムにラベルされていた(図１b, c)。ラベル後８週間の時点で茸状乳頭は同じ色で占められており、茸状乳頭の細胞が１つの細胞に由来するものであることが示された (図１d-f)。特に各色の細胞のクラスタは茸状乳頭に広がるだけでなく、 茸状乳頭に隣接する周囲の糸状乳頭にも広がっていた (図５c) 。分離した細胞のクラスタは前記両方の乳頭にとぎれることなく広がっていることから、これら二つの細胞を補うことができる、これら二つの細胞に共通する幹細胞又は前駆細胞が存在する可能性が示唆された。
【００８２】
長い期間（タモキシフェン投与後48週間まで）観察を続けたところ、８週間後と同じ現象が確認された(図１g-j)。このことは、長期間細胞を供給し続ける幹細胞が存在していることを意味していると考えられた。乳頭全体について、我々は、さらに共焦点顕微鏡画像の三次元イメージングを使って、傍茸状乳頭間窩との色の共通性について、タモキシフェン投与後経時的に定量した。タモキシフェン等予後4、 12、及び48週間の共通性は、 それぞれ63.7%, 83.7%, and 95.2%であった(図１k)。これらの結果は、４週間目までは味蕾内に一過性増殖細胞を供給する細胞が存在するものの (図１d, e, k)、長期間経過すると、そのようなクローンは減少し(図１g, h, k)、最終的には、茸状乳頭内の味蕾のほとんどの細胞が、茸状乳頭の近傍に存在する傍茸状間窩に局在する長期間幹細胞が供給する味蕾細胞に置き換わることを示している(図１j, k; 図５d)。単一幹細胞が味蕾細胞の継続的な産生にどの程度寄与するか評価するために、タモキシフェン投与後48週間で、舌組織の水平断面を観察し、茸状乳頭の１／３と周囲の２〜３の糸状乳頭をカバーする細胞を発見した (図１l-n, o)。48週間の時点で周囲のそれぞれの糸状乳頭のカラーパッチの平均数は、2.2 ± 0.1であった (図５e)。このことは、長期間の細胞の維持を担う少なくとも２つの細胞が存在することを意味している。言い換えると、１つの茸状乳頭は、ほぼ３つの幹細胞で維持されていることが明らかとなった。色の数の平均が３よりも低いのは、全ての幹細胞がsparse-labelingによって組換えが行われていないことを示唆していると考えられる。組換えが起こらなかった細胞を示すEGFP+ クローンの割合は、他の色のクローンの割合よりも高かった。これらのデータから、図１oに示すように、味蕾細胞と上皮細胞の両能性を有する幹細胞が茸状乳頭と糸状乳頭の間の陰窩（IPP）の下部に存在していると仮定した。
【００８３】
茸状乳頭の三次元イメージングは、１つの茸状乳頭が、複数の近傍の糸状乳頭に囲まれ、茸状乳頭と糸状乳頭の構造の間のIPPを有していることを示している(図５f)。
【００８４】
２．Hopx+ cells
次に上述の長期幹細胞の位置、及び長期幹細胞のバイオマーカーを同定するための実験を行った。多数存在しているバイオマーカーの中から、HOP homeobox (Hopx)を選択した。 遺伝子特異的マルチカラーラベリングを使って、Hopx-positive cells in HopxCreERT2/+; Rosarbw/+マウスのHopx+ cells陽性細胞を可視化した。 その結果、Hopxの発現は、茸状乳頭と糸状乳頭の間の基底膜近くに存在していた(図２a)。タモキシフェン等予後12週間後において、Hopx+ cellsは、茸状乳頭と糸状乳頭の両方を占めた (図２b, c)。Hopx+ cellsの子孫細胞のパターンは、Rosa26CreERT2/rbwマウスで確認された幹細胞と同じパターンを示した(図１)。また、タモキシフェン投与後48週間の時点においても、Hopx+ cellsの子孫細胞のパターンとRosa26CreERT2/rbwマウスで確認された幹細胞と同じパターンは同じであった(図２d-h)。さらに、タモキシフェン投与後12週間から48週間にわたって、蛍光を発現した全ての茸状乳頭(19匹のマウスから採取したn = 28の茸状乳頭)が、Rosa26CreERT2/rbwマウスの場合と同様にその周囲の糸状乳頭と同じ色を有していた(図１k)。
【００８５】
これらの結果から、Hopx+ cellsは、茸状乳頭近傍のIPPの基底部に存在しており、
長期幹細胞として、両能性幹細胞として機能することが示された。
【００８６】
舌組織において、Hopx+ cellsの定量的な解析を行うため、上皮細胞及び感覚細胞の他に一細胞ソーティングを行った。そしてこれらの細胞についてHopxの発現量と、その他のバイオマーカー遺伝子の定量を行った。上皮細胞と味覚細胞のみを回収するため、Sox2+ cellsをSox2GFP/+ マウスの舌からソーティングにより回収した。これは、上皮細胞ではない間葉系幹細胞等は、Sox2を発現しないためである。免疫染色により、Sox2が、糸状乳頭 (図６a, b) と、茸状乳頭(図６c, d)の両方に発現していることを確認した。このことから、Sox2+ cellsの細胞系列には、Hopx+ 幹細胞とその子孫の多くが含まれると考えられた。Sox2+ cellsに含まれるHopx+ cellsの機能的評価を、以下で行った。
【００８７】
はじめに、組織を分解して得た舌上皮幹細胞がオルガノイドを形成できるか否かを確認した (図６e)。オルガノイドは異なる細胞群からは形成されないため、この実験は、組織から回収した細胞群に幹細胞が含まれていることを意味する。
【００８８】
第２に、オルガノイドを形成したほとんど全ての細胞(99.7 ± 0.2%) がGFP+であることは、幹細胞がSox2を発現することを意味する (図６f)。 ソーティングにより回収したSox2-GFP+ cellsについてSingle-cell qRT-PCRを行い(図６g) 、その後階層的クラスタリングを行った。この解析から、Sox2-GFP+上皮と味覚細胞について5つのポピュレーションに分類されることが明らかとなった (図２i)。5つのポピュレーションは、 Krt8 high (I)及びLgr6 high (II) は味覚細胞のポピュレーションであることを示唆し、他の(III)、(IV)、(V)は上皮細胞のポピュレーションであることを示唆する。前駆細胞として既に報告されているKrt14を発現する上皮細胞のポピュレーション((III)及び(IV); 図２i)の中で、一部の集団だけがHopxを発現していた ((III) ; 図２i)。このことから、Krt14よりも、Hopxの方が幹細胞に特異的なマーカーであると考えられた。
３．Lgr6+ cells
【００８９】
stem/progenitor cellsは茸状乳頭の内側に存在しており、マーカーとしてleucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 6 (Lgr6)を発現している。Lgr6+ cellsが、長期間にわたって細胞のポピュレーションを供給し続けるかについては、明らかとなっていない。そこで、Lgr6EGFP-IRES-CreERT2/+; Rosa26rbw/+ でマルチカラー系譜追跡を48週間を行った。既に報告されているように、タモキシフェンを投与してから3日目の時点において、単一の蛍光ラベル細胞が、茸状乳頭の基底部に検出された(図３a)。茸状乳頭の約１／３の細胞がタモキシフェン投与後４〜８週間で同じ蛍光色でラベルされた細胞に置き換わった(図３b-f)。蛍光色でラベルされた細胞は1つのLgr6+ cellに由来することを示している。蛍光色でラベルされた茸状乳頭内の細胞の数は、徐々に減少した (図３g, h) 。そして、最終的に24週間後付近で、蛍光色でラベルされた細胞は、消失した (図３i)。さらに、異なる3匹のマウスに由来する279個の茸状乳頭を解析した際には、48週間後の時点で、蛍光でラベルされた細胞は検出されなかった (図３j)。１クローンあたりの細胞の数を共焦点顕微鏡で取得した茸状乳頭全体の画像を観察することにより決定した。これらの測定値は、上記に匹敵するパターンを示した: 蛍光ラベルされたクローンのサイズは８週間で最大値に達し、続く４週間でクローンのサイズは顕著に低くなり、48週間でクローンは消失した (図３k)。これらの結果から、Lgr6+ cellsは味蕾の幹細胞ではなく一過性増殖細胞であることが明らかとなった (図３l)。
【００９０】
４． Hopx+ stem cellsとLgr6+ cellsとの相違
茸状乳頭には、Hopx+ cellsは確認されなかった(図２a)。このことは、Rosa26loxp-stop-loxp-YFP/+ を用いた実験でも確認されている(図７c)。
【００９１】
さらに、Hopx+ cellsは茸状乳頭に存在する細胞に特異的に発現するLgr6を発現していなかった (図７d)。これらの観察と同様に、Sox2+ cellsの中で、Krt8 high又はLgr6 highのポピュレーション (II)は、Hopx及び／又はKrt14を発現するポピュレーション（Hopx+Krt14+ (III), Hopx-Krt14+ (IV), 及びHopx+ (V)）とは相違していた (図２i)。Hopx+ stem cellsとLgr6+ cellsとを区別するため、in situハイブリダイゼーションと免疫染色を行った。Lgr6プローブとHopxプローブを使った二重in situハイブリダイゼーションを行ったところ、これらのmRNAはそれぞれ、茸状乳頭内とその周辺の上皮細胞とに別々に限定して発現していた (図４a, b)。免疫染色でタンパク質レベルの比較を行った。 Hopx+ cellsは、舌上皮基底細胞の大部分が発現するケラチン 5 (Krt5) (図７a) とKrt14 (図２i; 図７b) の両方が陽性となった。
【００９２】
Lgr6+ cellsには２つのタイプの細胞が存在していた。Krt5又はKrt14 (図７e, g)と発現しているタイプと、Krt5及びKrt14を発現していないタイプである (図７f, 7g)。 Hopx+ cellsは、茸状乳頭の外側に位置しているため、Krt8を発現しない (図２i, 図７c)。 Lgr6+ cellsもまた Krt8を発現していなかった(図７h)。このことから、Krt8は 一過性増殖細胞ではなく、十分に部分化した味蕾細胞に発現すると考えられた。
【００９３】
５． Hopx+ stem cellsの傍茸状間窩内での局在
Sox2とKi-67の二重染色を行った。ほとんどのSox2+ cellsは、Ki-67を発現し、基底膜（ポジション  +1）の近くに存在しており、基底膜より上のポジション  +2に存在しているものは１／３程度がKi-67を発現しており、ポジション  ≧＋３ではKi-67を発現する細胞はほとんどなかった (図８a-c)。
【００９４】
このことから、幹細胞は位置+1又は+2のどちらにも存在していると考えられた。このことを証明するため、ポジション  +1とポジション  +2に存在するそれぞれのHopx+ cellsの特性をHopxCreERT2/+; Rosa26rbw/+マウスを使って観察した。タモキシフェンを投与してか３日目において、それぞれのHopx+ cellはシングルセルとして検出された (図２a)。さらに蛍光ラベルされたシングルセルは、７日目でも検出され (図８d)、ポジション+1のシングルセルは、３日目と比較して数が増加していた(図８e)。これに対して、ポジション +2、 +3、 +4、 又は +5に存在するHopx+ のシングルセルは、３日目から７日目にかけて減少していた(図８e)。ポジション ≧+6のHopx+ のシングルセルは変化しなかった。 The change in Hopx+ のシングルセルのポピュレーションの変化が起こった。実験中の４日間、ポジション+2又は +3、 及びポジション +4又は +5のシングルセルは、それぞれポジション+4又は +5, 及び／又は≧+6移動して分化した。同時ポジション≧+6の細胞は、週末分化を迎え消失した。結果として、ポジション+1に存在するHopx+ のシングルセルは明らかに増加した。28日目において、Hopx+ cell由来クローンの数を計測した (図８f)。蛍光ラベルされたシングルセルのクローンが残ることはなかった (図８g)。観察した全てのクローンがポジション +1又は+2の細胞を含んでいた。これらの結果は、上側の層は、 細胞分裂を行うことなく分化するように運命付けられていると考えられた。成長したクラスタはポジション＋１または＋２位のいずれかの細胞に由来すると考えられた。
【００９５】
６．オルガノイド内のHopx+ cell
Hopx+ cellが味蕾細胞に分化することを確認するために以下の実験を行った。蛍光活性化細胞−ソーティングHopx+ cell (図９a)に、オルガノイドを形成させるため、三次元培養下でインキュベーションした。Hopx+ cellsは、球形のオルガノイドを形成した(図９b)。オルガノイドに含まれるほとんど全ての細胞は、YFPを発現していた(図９c, d)。オルガノイドを免疫染色したところ、Krt5とKrt8の発現が確認された(図９e, f)。
【００９６】
オルガノイドの中心部分は、角化した上皮細胞で構成されていた。このことは、周囲の未分化上皮細胞が分化と共に中心に向かって移動していくことを示している。味覚細胞は、形態と機能により３つのカテゴリーに分類される:タイプ1細胞は支持細胞であり、タイプ2は甘味、苦み、うまみのレセプターを発現する細胞であり、タイプ 3酸度を認識する前シナプス細胞である。免疫染色により、オルガノイドが、NTPDase2-expressing type 1 cells、guanine nucleotide binding protein alpha transducing 3 (Gnat3) -positive type 2 cells、 carbonic anhydrase 4 (Car4)と5-TH 30発現するtype 3 cellsを確認した (図９g-j)。 これらの結果は、Hopx+ cellが、全ての種類の味覚細胞に分化できることを意味している。
【００９７】
次に、オルガノイド培養におけるHopx+ cellsの挙動を可視下するため、マルチカラー系譜追跡をオルガノイドに対して行った。舌上皮組織をHopxCreERT2/+;Rosa26rbw/+マウスから採取し、シングルセルとなるように組織を分解した後、これらの細胞を三次元培養で維持した(図１０a)。３日目に４−塩酸タモキシフェンを培地に添加し、Hopx+ cellsのマルチカラーラベリングを行った。タモキシフェンを添加してから１日経過後に蛍光が観察された (図１０a)。 蛍光ラベルされたHopx+ cellsを含むオルガノイドにマークをつけ、その画像を毎日撮像した (図１０a)。蛍光ラベルされたHopx+ cellsの帰趨は以下の３つのタイプのうちのいずれか１つに収束していた: 1つのタイプの標識細胞は、単色細胞集団を産生する幹細胞のように挙動し、オルガノイドの周辺で増殖した。いくつかの細胞はクローンから離れ、分化し内側に向かって遊走した (52.2 ± 22.8%; 図１０a-c)。残るタイプは、オルガノイドの最も外側の層に孤立して残った (14.0 ± 9.1%; 図１０a-c)。７日後に、分化し、消失細胞もあった。 (33.8 ± 17.6%; 図１０a-c)。 オルガノイド中のHopx+ cellsはin vivoでの帰趨に似ていると考えられた。すなわち、オルガノイド中の自己複製幹細胞 (図１０b)は、Hopx及びKi-67の両方が陽性である細胞に対応し、休止期の細胞(図１０b) はKi-67を発現しない、ポジション+1又は+2のHopx+ cellsと同じではないかと考えられた。分化している細胞は上部の層のHopx+ cellsと同一ではないかと考えられた。
【００９８】
７．味蕾細胞の階層的制御
単一茸状乳頭に生じた２又は３の Lgr6+ cell由来クローンについて観察を行った(図３b, c, e-g)。この観察は、タモキシフェン投与後48週のRosa26CreERT2/rbwマウス (図１l-n) の２〜３個の幹細胞によって維持され、それぞれが一過性増殖細胞を含むクローンとして維持される、茸状乳頭のそれぞれの水平断面イメージから得られる情報と組み合わせて評価した。これは、単一の茸状乳頭内のいくつかのLgr6+ 一過性増殖細胞 (図３b, c, e-g)の観察することを意味している。 To investigate whether Hopx+cellsがLgr6+ transit-amplifying and differentiated type1, 2, and 3 taste cellsを産生するか検討するため、タモキシフェン投与から12週間目のHopxCreERT2/+; Rosaloxp-stop-loxp-YFP/+マウスから、YFP蛍光を指標にソーティングで回収した Hopx+ cellsの子孫について、single cell qRT-PCRでこれらの遺伝子のmRNAの発現を解析した(図４c)。
【００９９】
Hopx+ cellsは、タモキシフェン投与後12週間目付近において、味蕾細胞の供給源であることが示され(図２c)、Lgr6を発現することが予測される。Hopx+ cells由来子孫 (n = 145)を対象として、Lgr6及びSlc1a3、glial glutamate transporter (Glast)、 Gnat3、 Car4遺伝子群、 及びtype 1、 type 2及びtype 3 cellsのマーカーそれぞれのmRNAの発現を階層的クラスタリングで解析した (図４d)。 これら発現から細胞は次のクラスタに分類された; Lgr6+ (II, VII)、 Glast+ (III)、 Car4+ (IV, V)、 Lgr6+Glast+ (VI)、Gnat3+ (VIII)クラスタ及びこれらの遺伝子の発現が陰性のクラスタ (I) (図４d)。 これらの結果は、Hopx+ l長期幹細胞が、Lgr6+ 一過性増殖細胞の産生とこれらの細胞の味蕾細胞への分化を介して、味蕾細胞のポピュレーションの維持を行っていることを示している(図４e)。
【０１００】
８．オルガノイドのSingle-cell RNA-Seq解析
上述の方法にしたがって採取した舌組織を分解して取得したSox2-GFP+ cells (図１１a) を培養し、オルガノイドを形成させた。オルガノイド細胞は、シングルセルになるようにオルガノイドを分解して取得した。取得した細胞中のSox2-GFP+ cellsをソーティングで分離した (図１１a)。分離した細胞をRNA-Seqに供した。オルガノイドを使用する目的は、間葉系幹細胞、筋細胞、神経細胞のような他のタイプの細胞のコンタミネーションのない舌上皮細胞、感覚細胞の清浄な混合物を得ることである。
【０１０１】
177個の単一Sox2-GFP+ cellsをシークエンスした結果の主成分分析により (PCA)、PC4が２つのポピュレーションに分かれることが示唆された(図１１b)。２つのポピュレーションは、Hopx+ ポピュレーションに対応するPC4 (-)とLgr6+ポピュレーションに対応するPC4 (+)であり、PC4 (-)とPC4 (+)は、互いに排他的であった。qRT-PCR(図２i)、in situハイブリダイゼーション (図４a, b)、イムノブロット(図７)の結果は、Hopx+ cellsとLgr6+ cellsが異なっていることを示していた。したがって、Single-cell RNA-Seqの結果の主成分分析の結果は、舌組織を用いた解析結果を反映していると考えられた。
【０１０２】
次にt-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) 解析を行い、5つのクラスタ（A〜E）を求めた(図１２a)。Class Eは Ki-67を高発現し(Mki67)分化したと考えられたポピュレーションに対応した(図１２b, c)。
【０１０３】
さらに、系統樹からの幹細胞の同一性をStemID分析によって予測することを試みた。簡単に説明するとRaceID2 algorithmを使ってclass A 〜 Dにイニシャルクラスタリングを行った (図１２a)。同定された各クラスタの有意なリンク数とトランスクリプトームの均一性を反映するトランスクリプトームエントロピーの両方を計算した(図４g, h)。リンク数とΔエントロピーを掛け合わせることにより、StemIDスコアを得た(図４g, h)。このStem ID分析は、以下の2つの概念に基づく：第１に、多分化能の最も高い幹細胞の同一性は、他のクラスタへの有意なリンクの数に相当しうる。第２に、多能性細胞のトランスクリプトームは、分化した細胞のトランスクリプトームよりもより均一である可能性があり、また、集団内において、多様な成熟細胞型を生じさせることができる複数の状態の偏りが共存する可能性があり、結果として高いエントロピーをもたらす。全てのRaceID2クラスタの中で、クラスタ1を含む他のものより高いStem IDスコアを有するクラスタが同定された(図４h)。既知の未分化または分化マーカー遺伝子のStemID及び発現パターンに基づいて、k-平均分析を行って、再ラベルされたクラスタA〜Eを同定した(図４i)。 新しいクラスタ (clsA)において、HopxとKrt14の発現は、他の遺伝子よりも高かった (図４j, k)。
single-cell RNA-Seqの結果に基づいた不偏予測により、同定された幹細胞ポピュレーションは、Hopx陽性であることが示された。
【０１０４】
以上の結果から、味蕾細胞を産生する長期幹細胞は、Hopx+ cell細胞であると結論づけられる。また、これまで、stem/progenitor cellsであるといわれていたLgr6+ cellは、
一過性増殖細胞であることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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