(57)【要約】【課題】化粧料用組成物、機能性食品、医薬品用組成物等の原料として好適な卵殻膜タンパク質可溶化物を製造する方法を提供する。【解決手段】卵殻膜タンパク質を含み、ｐＨ１１以上に調整された懸濁液を得る工程と、  得られた懸濁液にアルカリ性プロテアーゼを添加して、卵殻膜タンパク質の加水分解を進行させる第１の酵素添加工程と、  懸濁液がｐＨ９未満になったのちに、さらにアルカリ性プロテアーゼを添加して卵殻膜タンパク質の加水分解を進行させて、卵殻膜タンパク質を可溶化する第２の酵素添加工程と、  得られた卵殻膜タンパク質可溶化物を含む溶液を加熱してアルカリ性プロテアーゼを失活させる工程と、を有する卵殻膜タンパク質可溶化物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵殻膜タンパク質を含み、ｐＨ１１以上に調整された懸濁液を得る工程と、
得られた懸濁液にアルカリ性プロテアーゼを添加して、卵殻膜タンパク質の加水分解を進行させる第１の酵素添加工程と、
懸濁液がｐＨ９未満になったのちに、さらにアルカリ性プロテアーゼを添加して卵殻膜タンパク質の加水分解を進行させて、卵殻膜タンパク質を可溶化する第２の酵素添加工程と、
得られた卵殻膜タンパク質可溶化物を含む溶液を加熱してアルカリ性プロテアーゼを失活させる工程と、
を有することを特徴とする卵殻膜タンパク質可溶化物の製造方法。
【請求項２】
第２の酵素添加工程の前に、アルカリを添加してｐＨ調整する請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の製造方法で得られる卵殻膜タンパク質可溶化物を含有する組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵殻膜に含まれる卵殻膜タンパク質を加水分解した卵殻膜タンパク質可溶化物の製造方法、並びに当該卵殻膜タンパク質可溶化物を含有する応用製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
卵殻膜に含まれるタンパク質成分やペプチド成分は、線維芽細胞増殖作用、保湿作用、活性酵素除去作用、細胞賦活作用等を有することが知られており、従来より化粧品原料や医薬品原料、食糧品原料等として広く利用されている。
化粧品や毛髪化粧料、医薬品、食糧品等の応用製品に配合する場合、卵殻膜は、原料として配合しやすくするために、卵殻膜に含まれるタンパク質のペプチド結合を加水分解して、より分子量の小さい可溶性の卵殻膜タンパク質可溶化物として用いられている。
【０００３】
卵殻膜タンパク質の加水分解方法として、酸やアルカリを触媒に使用する方法があるが、卵殻膜タンパク質が過剰に分解し、目的とする分子量分布を外れて低分子化しすぎたり、褐色に着色したり、目的とする加水分解物以外にも副生成物が生成しやすいという問題があった。この問題に対し、特許文献１ではアルカリ条件に調整した卵殻膜タンパク質の懸濁液を処理温度１３０℃以上１６０℃以下で、かつ、当該処理温度に５分以内に到達するよう加熱する工程を有する卵殻膜タンパク質可溶化物の製造方法が報告されている。この製造方法では、従来の卵殻膜タンパク質の可溶化物と比較して、分子量が大きい卵殻膜タンパク質可溶化物を得ることができる。一方でこの方法では、１００℃以上に加熱する装置が必須となる。
【０００４】
また、卵殻膜タンパク質の加水分解方法として、プロテアーゼ（タンパク質分解酵素）を触媒として使用する酵素加水分解法がある。酵素加水分解法では４０〜７０℃程度の比較的温和な条件で卵殻膜タンパク質の加水分解でき、高品質の卵殻膜タンパク質の可溶化物を得ることができる。しかしながら、酵素加水分解法では、卵殻膜タンパク質の分解速度がそれほど高くないため、長時間を要すこと、歩留まりが悪いことなどが課題としてあった。
この課題に対し、特許文献２では、還元剤の共存下、卵殻膜にプロテアーゼを作用させる工程を含み、還元剤として、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、Ｌ−システイン塩酸塩、Ｌ−システイン、及びグルタチオンからなる群より選択される一種以上を使用する卵殻膜可溶化方法が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第６２８８６８６号公報
【特許文献２】特許第５９８５３９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献２の方法では、還元剤によりプロテアーゼを活性化することで卵殻膜タンパク質の加水分解速度が向上し、効率的に卵殻膜タンパク質の可溶化を行うことができる。その一方で、還元剤を必須とする方法であるため、還元剤の分、コスト高になり、また、得られる卵殻膜タンパク質可溶化物に還元剤が残存するおそれがあった。また、プロテアーゼと還元剤の割合を制御できないと、反応過剰反応によって有用成分の収率が低下するというおそれがあった。
【０００７】
かかる状況下、本発明の目的は、酵素加水分解法において、還元剤を使用せずに高効率に卵殻膜タンパク質を可溶化することができる卵殻膜タンパク質可溶化物の製造方法、及び該卵殻膜タンパク質可溶化物を含有する組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、タンパク質分解酵素として、アルカリ性プロテアーゼを使用し、反応開示時のみならず、反応途中にも酵素を添加することにより、卵殻膜タンパク質の加水分解が促進され、歩留まりがよくなることを見出し、本発明に至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
＜１＞  卵殻膜タンパク質を含み、ｐＨ１１以上に調整された懸濁液を得る工程と、
得られた懸濁液にアルカリ性プロテアーゼを添加して、卵殻膜タンパク質の加水分解を進行させる第１の酵素添加工程と、
懸濁液がｐＨ９未満になったのちに、さらにアルカリ性プロテアーゼを添加して卵殻膜タンパク質の加水分解を進行させて、卵殻膜タンパク質を可溶化する第２の酵素添加工程と、
得られた卵殻膜タンパク質可溶化物を含む溶液を加熱してアルカリ性プロテアーゼを失活させる工程と、
を有する卵殻膜タンパク質可溶化物の製造方法。
＜２＞  第２の酵素添加工程の前に、アルカリを添加してｐＨ調整する＜１＞に記載の製造方法。
＜３＞  ＜１＞または＜２＞に記載の製造方法で得られる卵殻膜タンパク質可溶化物を含有する組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、酵素加水分解法において、還元剤を使用しなくとも、効率的に卵殻膜タンパク質の可溶化を行うことができる卵殻膜タンパク質可溶化物の製造方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について例示物等を示して詳細に説明するが、本発明は以下の例示物等に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において任意に変更して実施できる。なお、本明細書において、「〜」とはその前後の数値又は物理量を含む表現として用いるものとする。
【００１２】
［１］卵殻膜タンパク質可溶化物の製造方法
本発明の卵殻膜タンパク質可溶化物の製造方法は、卵殻膜タンパク質を含み、ｐＨ１１以上に調整された懸濁液を得る工程と、得られた懸濁液にアルカリ性プロテアーゼを添加して、卵殻膜タンパク質の加水分解を進行させる第１の酵素添加工程と、懸濁液がｐＨ９未満になったのちに、さらにアルカリ性プロテアーゼを添加して卵殻膜タンパク質を加水分解を進行させて、卵殻膜タンパク質を可溶化する第２の酵素添加工程と、得られた卵殻膜タンパク質可溶化物を含む溶液を加熱してアルカリ性プロテアーゼを失活させる工程と、を有する。
【００１３】
本発明において、「卵殻膜タンパク質可溶化物」とは、卵殻膜タンパク質が加水分解して、水に可溶化できる状態に変化したものを意味する。ここで、本発明において、「水に可溶化できる状態」には、卵殻膜タンパク質由来の成分が、水に溶解する状態だけでなく、自然沈降せずに水に分散する状態を含む。
【００１４】
本明細書において、「卵殻膜タンパク質可溶化物」を「卵殻膜可溶化物」、「アルカリ性プロテアーゼ」を、単に「プロテアーゼ」又は「酵素」と称する場合がある。
【００１５】
以下、本発明の製造方法の各工程を詳細に説明するが、本発明のタンパク質可溶化物の製造方法を「本発明の製造方法」と略称し、「卵殻膜タンパク質を含み、ｐＨ１１以上に調整された懸濁液を得る工程」を「工程（１）」、「得られた懸濁液にアルカリ性プロテアーゼを添加して、卵殻膜タンパク質の加水分解を進行させる第１の酵素添加工程を「工程（２）」、「懸濁液がｐＨ９未満になったのちに、さらにアルカリ性プロテアーゼを添加して卵殻膜タンパク質の加水分解を進行させて、卵殻膜タンパク質を可溶化する第２の酵素添加工程を「工程（３）」、「得られた卵殻膜タンパク質可溶化物を含む溶液を加熱してアルカリ性プロテアーゼを失活させる工程」を「工程（４）」と称す場合がある。
【００１６】
＜工程（１）＞
工程（１）は、卵殻膜タンパク質を含み、ｐＨ１１以上に調整された懸濁液を得る工程である。
【００１７】
本発明の製造方法の原料である卵殻膜タンパク質は、卵殻膜に含まれるタンパク質成分を意味する。卵殻膜とは、卵殻膜は卵殻の内側にある繊維質の薄膜であり、外卵殻膜及び内卵殻膜の二層の網目状構造からなる。卵殻膜の主成分はタンパク質であるが、卵殻から卵殻膜を分離する際に卵殻由来のカルシウム成分を含むことがある。
【００１８】
工程（１）における懸濁液は、溶媒に対して、卵殻膜タンパク質を含み、ｐＨ１１以上に調整されていれば、その調製方法は任意である。例えば、アルカリを添加してｐＨ１１以上に調整した溶媒に卵殻膜タンパク質を分散させてもよいし、卵殻膜タンパク質を溶媒に分散させた後にアルカリを添加してｐＨ１１以上に調整してもよい。
ｐＨの上限値は、後工程で添加されるアルカリ性プロテアーゼの種類にもよるが、ｐＨが高すぎると酵素活性が低下する場合が多いため、好適にはｐＨ１２以下である。
【００１９】
ｐＨ調整に使用するアルカリとしては、本発明の目的が達成される限り、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等の無機アルカリであっても、有機アルカリであってもよいが、通常、無機アルカリが用いられ、特に水酸化ナトリウムは好適なアルカリのひとつである。
【００２０】
ｐＨ調整に使用するアルカリの量は、懸濁液のｐＨが所望のアルカリ条件となるように調整され、原料となる未処理卵殻膜に含まれるカルシウム成分の量を考慮して適宜決定される。
【００２１】
溶媒としては、卵殻膜タンパク質及びその分解物が分散、溶解するものであればよく、水、アルコール類、水溶性ケトン類又はこれらの混合物が用いられ、通常、水または水を主体とする溶媒（水５０重量％以上）が用いられる。
【００２２】
懸濁液に対する卵殻膜タンパク質の量は、卵殻膜タンパク質及びその分解物が分散、溶解できる範囲であれば任意である。但し、卵殻膜タンパク質の量が少なすぎると生産性が悪くなり、多すぎると品質にばらつきがでるおそれがあるため、通常、溶媒１００重量部に対して、５〜３０重量部である。
【００２３】
工程（１）における温度は、ｐＨ調整に使用するアルカリが溶解できる温度であればよいが、後工程で添加されるアルカリ性プロテアーゼの至適温度であることが好ましい。そのため、使用されるアルカリ性プロテアーゼの種類にもよるが、通常、２０〜６０℃である。
【００２４】
＜工程（２）＞
工程（２）は、工程（１）で得られた懸濁液にアルカリ性プロテアーゼを添加して、卵殻膜タンパク質の加水分解を進行させる工程（第１の酵素添加工程）である。
【００２５】
本発明におけるアルカリ性プロテアーゼは、アルカリ条件下で、卵殻膜タンパク質を可溶化できる程度に加水分解できるものであればよい。なお、本発明で使用するアルカリ性プロテアーゼは精製品でなくともよいが、精製品であることが好ましい。
【００２６】
アルカリ性プロテアーゼは市販品を用いることができ、例えば、ナガセケムテックス株式会社のビオプラーゼシリーズ（ビオプラーゼＯＰ，ビオプラーゼ ＳＰ−２０ＦＧ等）；天野エンザイム株式会社のプロチンシリーズ（プロチンＳＤ ＡＹ１０等）、プロテアーゼシリーズ（プロテアーゼＰ，プロテアーゼＡ等）など、が挙げられる。
この中でも、実施例で開示されたビオプラーゼＯＰ（ナガセケムテックス株式会社）は好適な市販品の一例である。
【００２７】
工程（２）では、懸濁液中の卵殻膜タンパク質と、アルカリ性プロテアーゼと接触させ、酵素の触媒作用によって卵殻膜タンパク質を加水分解する。この過程において、タンパク質の加水分解に伴う反応生成物の影響のため、ｐＨは徐々に小さくなるが、後工程（工程（３））におけるｐＨ９未満になるまで酵素処理を進行させる。
【００２８】
工程（２）におけるアルカリ性プロテアーゼの使用量は、卵殻膜タンパク質１００重量部に対して、１〜１０重量部程度である。アルカリ性プロテアーゼが少なすぎると、加水分解速度が不足し、多すぎると高コストになるのみならず、原料である卵殻膜タンパク質の加水分解が初期段階で進みすぎて、最終的に目的とする分子量の卵殻膜タンパク質可溶化物が得られなくなる場合がある。
【００２９】
工程（２）の処理温度は、使用されるアルカリ性プロテアーゼの種類に応じて適宜温度が決定される。温度条件の例を挙げると４０℃〜７０℃である。
【００３０】
工程（２）の時間は、ｐＨ９未満になる範囲で決定され、例えば１０分〜３時間である。
【００３１】
＜工程（３）＞
工程（３）は、工程（２）で懸濁液がｐＨ９未満になったのちに、さらにアルカリ性プロテアーゼを添加して卵殻膜タンパク質の加水分解を進行させて、卵殻膜タンパク質を可溶化する工程（第２の酵素添加工程）である。
【００３２】
本発明の製造方法の最大の特徴は工程（３）、すなわち、酵素の添加を複数回に分けて行うことにあり、加水分解の進行を進めて、卵殻膜タンパク質可溶化物の歩留まりを高めることができる。また、酵素の添加を１回で行う場合と比較して、得られる卵殻膜タンパク質可溶化物に含まれるシステイン及びシスチンの合計含有量が増加する傾向にある。
本発明の製造方法により、なぜ歩留よく卵殻膜可溶化物を得ることが可能であるかは完全には明らかではないが、アルカリプロテアーゼの至適ｐＨ条件は、タンパク質が変性を受けやすい高ｐＨであり、酵素自体もタンパク質であるため、反応時間が長くなればなるほど酵素が失活するが、複数回に分けて酵素添加を行うことにより、酵素の失活が抑制されることが一因であると推察される。
また、高熱をかけずに可溶化できるため、タンパク質の変性を抑制することができ、アルカリ条件下であるため、生成した卵殻膜可溶化物同士が電荷によって反発しあうため凝集を抑制することができると推察される。
【００３３】
工程（３）における酵素の添加回数は、１回でも、２回以上でもよいが、通常、１回である（すなわち、工程（２）と併せて、酵素添加２回）。
【００３４】
工程（３）で添加される酵素は、工程（２）で例示したアルカリ性プロテアーゼと同様である。なお、工程（２）と工程（３）で使用する酵素は異なっていてもよいが、同じ酵素であることが好ましい。
【００３５】
工程（２）の後、酵素添加を行う前に、アルカリを添加してｐＨ調整することが好ましい。アルカリ性プロテアーゼは、至適ｐＨ範囲から外れると酵素活性が低下する。そのため、工程（３）にて酵素添加を行う前に、ｐＨ調整を行うことにより、反応環境を至適ｐＨに近づけるという利点がある。
例えば、アルカリ性プロテアーゼが、実施例で開示されたビオプラーゼＯＰの場合であると、ｐＨ１０〜１２に調整すればよい。
【００３６】
ｐＨ調整に使用するアルカリとしては、工程（１）で説明したものと同様である。通常、無機アルカリが用いられ、特に水酸化ナトリウムは好適なアルカリのひとつである。
ｐＨ調整に使用するアルカリの量は、ｐＨが所望のアルカリ条件となるように適宜決定される。
【００３７】
工程（３）の処理温度は、使用されるアルカリ性プロテアーゼの種類に応じて適宜温度が決定される。温度条件の例を挙げると４０℃〜７０℃である。
【００３８】
工程（３）の時間は、卵殻膜タンパク質が、目的の可溶化が達成可能になるように反応時間を設定され、例えば３〜２４時間である。
【００３９】
＜工程（４）＞
工程（４）は、得られた卵殻膜タンパク質可溶化物を含む溶液を加熱してアルカリ性プロテアーゼを失活させる工程である。
【００４０】
工程（３）において、処理液に存在するアルカリ性プロテアーゼは、卵殻膜タンパク質が分解されて可溶化した後においても、その可溶化物をさらに加水分解してより分子量が小さくなる。そのため、目的とする程度の加水分解が終わった後には、酵素を失活させることが求められる。
【００４１】
加熱温度は、使用したアルカリ性プロテアーゼが失活する温度であればよく、通常、９０℃以上である。なお、加熱温度が高すぎると得られた卵殻膜タンパク質可溶化物が変性するおそれがあるため、通常、１１０℃以下である。
加熱方法は特に制限はなく、例えば、熱交換器を使用する方法もあるが、簡易に加熱する方法として、沸騰水（１００℃）による湯煎が挙げられる。
【００４２】
＜その他の工程＞
また、本発明の卵殻膜可溶化物の製造方法は、上記工程を含めばよく、その前後に別の工程を設けてもよい。例えば、上記工程のあとに、脱塩処理等の精製を行ってもよい。
通常、卵殻膜可溶化物の固形物を得るために、まず、卵殻膜可溶化物を含む溶液を公知の方法（フィルタープレス等）で固液分離した後に、乾燥工程に供される。
【００４３】
乾燥工程は、上記工程で得られた卵殻膜可溶化物を含む溶液から、溶媒成分を留去して卵殻膜可溶化物の乾燥物を得る工程である。
乾燥工程を行うことにより、卵殻膜可溶化物の保存性がより向上し、また、卵殻膜可溶化物を後述する応用品に使用しやすくなる。卵殻膜可溶化物の使用用途にもよるが、含水率を通常、３０重量％以下、好ましくは１０重量％以下まで乾燥させる。
【００４４】
乾燥工程に用いる手段としては、卵殻膜可溶化物の品質を損なわない限り特に制限はなく、公知の乾燥方法を採用すればよい。乾燥条件は、卵殻膜可溶化物を目的とする含水量になるように決定すればよい。例えば、温度７０℃〜９０℃で１２時間〜３０時間加熱乾燥すれる方法がある。
【００４５】
また、原料としての卵殻膜について、工程（１）に供する前に前処理を行ってもよい。
卵殻から卵殻膜を分離する際に卵殻由来のカルシウム成分を含むことがある。これをそのまま使用すると、カルシウム成分が残留し、得られる卵殻膜可溶化物の品質が劣化するおそれがある。そこで、このカルシウム成分を除去した卵殻膜タンパク質を使用することで卵殻膜可溶化物の品質が向上する。
【００４６】
より高品質な卵殻膜可溶化物を得ることができる点で、原料の（未処理）卵殻膜タンパク質は、卵殻膜に含まれるカルシウム成分を酸性溶液で溶解させた後に、固液分離して得られる卵殻膜タンパク質であってもよい。すなわち、卵殻膜タンパク質を可溶化する工程の前工程として、原料である（未処理）卵殻膜タンパク質を酸性溶液で処理し、含有するカルシウム成分を溶解させ、固液分離することによりカルシウム成分を除去した卵殻膜タンパク質を得る工程を含んでもよい。
【００４７】
例えば、卵殻膜タンパク質を可溶化する工程の前工程として、原料である（未処理）卵殻膜タンパク質を乳酸で処理し、含有するカルシウム成分を溶解させ、固液分離することによりカルシウム成分を除去した卵殻膜タンパク質を得る工程を含んでもよい。
このようにすることで、カルシウム成分は乳酸カルシウムとして可溶化し、比重の低い不溶性のカルシウム塩は乳酸溶液に浮き、卵殻膜は乳酸溶液に沈降するために、容易に卵殻膜からカルシウム成分を除去することができる。
【００４８】
使用する酸としては、卵殻膜タンパク質の品質劣化を惹起するものでなく、カルシウム成分を溶解することができるものであればよく、塩酸等の無機酸であっても、乳酸やクエン酸、酢酸等の有機酸であってもよい。
【００４９】
上記の通り、本発明の製造方法について説明したが、制限的なものではなく、最適な条件（各工程の反応時間、温度、酵素使用量など）は、本明細書の教示事項を参考にして、予備実験を通して容易に決定することができる。また、明示的に開示されていない条件や、各種パラメータなどは、当業者が通常実施する範囲を逸脱するものではなく、通常の当業者であれば、容易に想定することが可能な値を採用することができる。
【００５０】
［２］卵殻膜タンパク質可溶化物
本発明の製造方法で製造した卵殻膜タンパク質可溶化物（卵殻膜可溶化物）は、水溶性である限り、様々な分子量のタンパク質由来成分を含んでいてもよいが、用途に応じて、所望の分子量分布に調整してもよい。例えば、本発明の製造方法によって様々な分子量の成分を含む卵殻膜可溶化物を得たのちに、さらなる加水分解によって低分子化したり、遠心分離や分離膜等を使用して所望の分子量のものを回収したりして使用してもよい。
【００５１】
なお、本発明の卵殻膜可溶化物において、「水に可溶化する」とは、タンパク質由来の成分が、溶解している状態だけでなく、自然沈降せずに分散している状態を含む。
【００５２】
また、本発明の卵殻膜可溶化物は、重量平均分子量の上限及び下限は、使用目的に応じた安全面等を考慮して、適宜決定すればよい。例えば、重量平均分子量の上限は、感作性の発現しない範囲で、適宜決定すればよい。
なお、重量平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーで得られる分子量分布から求めることができる。
【００５３】
本発明の卵殻膜可溶化物は、液状（可溶化した状態）で用いてもよいし、乾燥させて粉末や顆粒などの固形物として使用してもよい。
【００５４】
本発明の卵殻膜可溶化物は、他の成分と混合し組成物としてもよい。本発明の卵殻膜可溶化物は、上述のように水溶性であり、着色がほとんどないと共に、人体に対する毒性や刺激性が少ない。そのため、本発明の卵殻膜可溶化物は、各種化粧料用組成物、医薬品用組成物（外用剤、服用剤）、機能性食品等の用途に使用することができる。
なお、本発明の卵殻膜可溶化物は、その用途に合わせて所望の分子量分布に調整して使用してもよい。
【００５５】
（化粧料用組成物）
本発明の卵殻膜可溶化物は、他の成分と混合し組成物とし、各種化粧料用組成物の用途に使用してもよい。すなわち、本発明の卵殻膜可溶化物を含む組成物は、化粧料用組成物として使用してもよい。本発明の卵殻膜可溶化物は、各種化粧料基材及び化粧料添加物に対する安定性も高いため、化粧料用組成物に好適に配合することができる。なお、本発明において、化粧料用組成物は、化粧品のみならず医薬部外品も含む。
【００５６】
化粧料用組成物への卵殻膜可溶化物の配合割合は任意であるが、化粧料用組成物が、保湿作用等の卵殻膜可溶化物に由来する作用を発現する範囲で適宜選択される。卵殻膜可溶化物の化粧料用組成物に対する割合は、卵殻膜可溶化物における溶媒の割合や溶媒の種類等にもよるが、例えば、化粧料用組成物の形態がジェルの場合は１〜５０重量％程度、形態が乳液の場合は１〜５０重量％程度、形態がクリームの場合は１〜５０重量％程度である。
【００５７】
本発明の化粧料用組成物は、慣用の化粧料基材を適宜配合し、所望の剤型とすることができる。その形態は特に制限はないが、ジェル、乳液、クリーム等の形態が挙げられる。
【００５８】
化粧料基材としては、目的とする剤型に合わせて、水、水溶性有機溶媒、油脂、ロウ、高級脂肪酸、高級アルコール、エステル類等の従来公知の化粧料基材が適宜選択される。
【００５９】
また、本発明の化粧料用組成物には、本発明の効果を損なわない範囲で通常化粧料や皮膚外用医薬で使用される任意の成分を添加することができる。かかる任意成分の具体例としては、増粘・ゲル化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色素剤、金属封鎖剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、香料、ミツロウ等が挙げられる。これら任意成分の配合割合は、その目的に応じて適宜選択して決定することができる。
【００６０】
本発明の化粧料用組成物は、当業者が通常用いる方法によって製造することができ、卵殻膜可溶化物の配合量、配合方法、配合時期は適宜選択することができる。
【００６１】
本発明の化粧料用組成物は、スキンケア化粧料用、浴用化粧料用、毛髪化粧料用又はメイクアップ化粧料用等に用いることができるが、好適な用途としては、まゆげ用化粧品、まつげ用化粧品、ネイル用品、毛髪化粧料用組成物（ヘアケア製品）等が挙げられる。
【００６２】
まゆげ用化粧品としては、例えば、アイブロウペンシル、アイブロウマスカラ、アイブロウパウダー等が挙げられる。
【００６３】
まつげ用化粧品としては、例えば、まつげエクステ用グルー、まつげエクステ用リムーバー、まつげエクステ用前処理剤、まつげ美容液、まつげエクステ用コーティング剤、マスカラ、マスカラ下地、吸着剤、クレンジング、アイライナー等が挙げられる。
【００６４】
ネイル用品としては、例えば、プレプライマー、クリアジェル、カラージェル、クレンザー、リムーバー、ベースジェル、トップジェル、キューティクルオイル、キューティクルリムーバー、ポリッシュ、ネイルトリートメント等が挙げられる。
【００６５】
以下、本発明の化粧料用組成物の好適な用途の一つである毛髪化粧料用組成物について説明する。
【００６６】
（毛髪化粧料用組成物）
本発明の卵殻膜可溶化物を含む組成物は、毛髪化粧料組成物として好適に使用できる。
毛髪化粧料用組成物としては、例えば、染毛剤やパーマ剤、シャンプー、ヘアリンス、ヘアコンディショナー、ヘアトリートメント、ヘアクリーム、ヘアジェル、ヘアムース、ヘアオイル、スタイリング剤、カーリング剤、縮毛矯正剤、頭髪用カールジェル、育毛剤等が挙げられる。なお、本発明において、毛髪化粧料用組成物には化粧品のみならず医薬部外品も含む。
すなわち、本発明の毛髪化粧料用組成物は、染色やパーマ、トリートメント、毛髪ケア等の毛髪処理に用いることができる。
【００６７】
毛髪化粧料用組成物への卵殻膜可溶化物の配合割合は任意であるが、毛髪化粧料用組成物が、髪のダメージの保護、補修効果等の卵殻膜可溶化物に由来する作用を発現する範囲で適宜選択される。卵殻膜可溶化物の毛髪化粧料用組成物に対する割合は、卵殻膜可溶化物における溶媒の割合や溶媒の種類等に応じて適宜決定されるが、卵殻膜可溶化物の含有量は、毛髪化粧料用組成物の全体に対して１〜５０重量％程度である。
【００６８】
本発明の毛髪化粧料用組成物は、慣用の化粧料基材を適宜配合し、所望の剤型とすることができる。その形態は特に制限はないが、例えば、液状、乳液状、クリーム状、ジェル状、ペースト状、ムース状、エアゾール等の形態が挙げられる。
【００６９】
化粧料基材としては、目的とする剤型に合わせて、水、水溶性有機溶媒、油脂、ロウ、高級脂肪酸、高級アルコール、エステル類等の従来公知の化粧料基材が適宜選択される。
【００７０】
また、本発明の化粧料用組成物には、本発明の効果を損なわない範囲で通常使用される任意の成分を添加することができる。かかる任意成分の具体例としては、還元剤、界面活性剤、増粘・ゲル化剤、アルカリ剤、酸化剤、乳化安定剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色素剤、金属封鎖剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、香料、保湿剤、油剤、ミツロウ、シリコーン、キレート剤、着色料等が挙げられる。これら任意成分の配合割合は、その目的に応じて適宜選択して決定することができる。
【００７１】
本発明の毛髪化粧料用組成物は、当業者が通常用いる方法によって製造することができ、本発明の卵殻膜可溶化物の配合量、配合方法、配合時期は適宜選択することができる。
【００７２】
（医薬品用組成物）
本発明の卵殻膜可溶化物は、他の成分と混合し組成物とし、医薬品用組成物の用途に使用してもよい。すなわち、本発明の卵殻膜可溶化物を含む組成物は、医薬品用組成物として使用してもよい。なお、本発明の卵殻膜可溶化物を含む医薬品用組成物は、医薬品のみならず、医薬部外品に配合してもよい。
本発明の医薬品用組成物の形態としては特に限定はないが、一般に皮膚に塗布する形の皮膚外用剤として用いられる場合には、液状やクリーム状である。この場合、医薬品用組成物は、必要に応じて、通常医薬品、医薬部外品に配合される、油性成分、可溶化剤、保湿剤、色素、乳化剤、増粘剤、香料等の任意の成分を含有することができる。
【００７３】
また、本発明の医薬品用組成物は、入浴剤、ボディーソープ、シャンプー等の入浴用組成物に配合して用いてもよい。剤型としては、一般に用いられる、水溶液、Ｗ／Ｏ型又はＯ／Ｗ型エマルション、適当な賦形剤等を用いて顆粒剤その他の粉末、錠剤等としてもよい。
【００７４】
また、本発明の医薬品用組成物は、人体に対する毒性や刺激性が少なく、安全であるため、外用剤としてのみならず、服用剤として経口投与とすることもできる。
経口投与に利用される剤形としては、具体的には、固形製剤として、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、トローチ等が挙げられる。また、液状製剤として内用液剤、外用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等が例示され、これら剤形やその他の剤形が目的に応じて適宜選択される。また、経口投与用の医薬品組成物として、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤等の各種調剤用配合成分をさらに適宜含有していてもよい。
【００７５】
本発明の医薬品組成物は、当業者が通常用いる方法によって製造することができ、卵殻膜可溶化物の配合量、配合方法、配合時期は適宜選択することができる。医薬品組成物の投与量は、対象者の性別や年齢、体重、投与形態等に応じて適宜選定することができる。
【００７６】
（機能性食品）
一方、日常的に飲食することで、本発明の卵殻膜可溶化物を摂取したい場合には、該食品、飲料に含有させて機能性食品としてもよい。
ここでいう「機能性食品」とは、一般食品に加えて、健康食品、栄養補助食品、栄養機能食品、栄養保健食品等、健康の維持の目的で摂取する食品及び／又は飲料を意味している。なお、機能性食品として製品化する場合には、食品に用いられる様々な添加剤、具体的には、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤漂白剤、防菌防黴剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料等を添加していてもよい。
【００７７】
本発明の機能性食品の対象となる、食品、飲料は特に限定されるものではない。例えば、食品として、ソーセージ、ハム、魚介加工品、ゼリー、キャンディー、チューインガム等の食品類が挙げられる。また、飲料としては、各種の茶類、清涼飲料水、酒類、栄養ドリンク等が挙げられる。本発明の卵殻膜可溶化物は、このような食品、飲料に添加することにより、簡易に経口摂取することができる。また、卵殻膜可溶化物の配合量は、食品、飲料の種類、目的とする作用に応じて適宜決定すればよい。
【実施例】
【００７８】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７９】
実施例において評価対象の物性等は以下の方法で測定した。
【００８０】
（１）タンパク質歩留
卵殻膜タンパク質可溶化物のタンパク質歩留は、原料の卵殻膜中のタンパク質含量及び得られた卵殻膜加水分解物中のタンパク質含量から算出した。なお、タンパク質含量はケルダール法によって求めた。
タンパク質歩留（％） ＝ （卵殻膜タンパク質可溶化物の重量×卵殻膜タンパク質可溶化物のタンパク質含有量（％）／可溶化処理前の卵殻膜タンパク質の重量×可溶化処理前の卵殻膜タンパク質のタンパク質含有量（％））×１００
【００８１】
（２）重量平均分子量
卵殻膜タンパク質可溶化物の重量平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーで得られた分子量分布から算出した。サイズ排除クロマトグラフィーの条件は以下のとおりである；
装置：株式会社島津製作所製  プロミネンス
カラム：GEヘルスケアバイオサイエンス製  Superdex Peptide HR 10/300 
移動相：水：アセトニトリル：トリフルオロ酢酸＝３０：７０：０．１  （ｖ／ｖ）
流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
カラムオーブン温度：４０℃
検出器：紫外吸光光度計  （検出波長  ２１５  ｎｍ）
試料濃度：５〜１０ｍｇ／ｍＬ
試料注入量：２５μＬ
【００８２】
（３）システイン及びシスチンの合計含有量
卵殻膜タンパク質可溶化物について、アミノ酸組成分析によりシステイン及びシスチンの合計含有量を算出した。
アミノ酸組成分析は、酸化剤であるアジ化ナトリウム存在下塩酸加水分解してシステイン及びシスチンについてはシステイン酸の形にし、AccQTag誘導体化（日本ウォーターズ株式会社）して超高圧高速液体クロマトグラフィー（日本ウォーターズ株式会社製UPLC H class）で分析した。
また、システイン及びシスチンの合計含有量は、原料のシステイン及びシスチンの合計含有量に対する残存率として求めた。すなわち、残存率は以下の式で表される。
残存率（％）  ＝  （卵殻膜タンパク質可溶化物のシステイン及びシスチンの合計含有量／可溶化処理前の卵殻膜タンパク質のシステイン及びシスチンの含有量）×１００
【００８３】
「実施例１」
（１．卵殻膜の乳酸による前処理）
粉末状の卵殻膜１０重量部に対し、水１００重量部及びＬ−乳酸（和光純薬工業（株）、濃度８５〜９２％）２４．６３重量部を加え、常温（約２５℃）下、１２時間撹拌し、卵殻膜に含まれるカルシウム成分を溶解させた。なお、撹拌後の混合液のｐＨをｐＨメーター（東亜ディーケーケー製、ＨＭ−３０Ｒ）で測定したところ、ｐＨ３．１９であった。次いで、撹拌後の混合液を、ろ過器を用い、固形物と液体に分離した。得られた固形物を４０℃で減圧乾燥し、乾燥物を得た。最終的に得られた固形物（卵殻膜タンパク質）は、３．１重量部であった。この固形物のタンパク質量をケルダール法により評価したところ、タンパク質の割合が９４．２重量％であった。
【００８４】
（２．卵殻膜タンパク質の可溶化処理）
ハンマークラッシャー（三庄インダストリー株式会社製、スクリーン孔径：０．７ｍｍ）で得られた固形物（卵殻膜タンパク質）を粉砕し、卵殻膜粉末を得た。
得られた卵殻膜粉末（粒度０．７ｍｍ）を容器に入れ、固形分含量１０ｗｔ％になるように水を入れたのち、恒温チャンバー内で撹拌しながら５０℃に調整した。次いで、初発ｐＨ１１．２になるように２５ｗｔ％ＮａＯＨを添加して調整し、直ちに酵素を添加（卵殻膜粉末に対する酵素添加量１ｗｔ％）し、攪拌させながら酵素反応を開始させた。酵素として、市販プロテアーゼ（ビオプラーゼＯＰ、ナガセケムテックス株式会社）を使用した。
反応開始１時間後に、２５ｗｔ％ＮａＯＨを添加してｐＨ１０．８に調整した。さらに反応３時間後に、再度同量の酵素を添加して反応を進行させた（２回目の酵素添加）。
合計で１７時間反応させた後に、遠心分離（２００００ｇ、１５分）により固液分離し、ろ液を得た。得られたろ液を、沸騰水の湯煎（１００℃、２０分）により酵素失活させることにより、実施例１の卵殻膜タンパク質可溶化物を含有する溶液を得た。
【００８５】
「比較例１」
実施例１において、２回目の酵素添加を行わなかった以外は実施例１と同様にして比較例１の卵殻膜タンパク質可溶化物を含有する溶液を得た。
【００８６】
表１に実施例１、比較例１の卵殻膜タンパク質可溶化物のタンパク質歩留及び重量平均分子量、表２にアミノ酸組成分析結果を示す。
【００８７】
【表１】
2019198260.tif 000002
【００８８】
【表２】
2019198260.tif 000003
【００８９】
表１に示す通り、酵素２回添加の実施例１は、酵素１回添加の比較例１に対してタンパク質歩留が大きく、卵殻膜に含まれるタンパク質をより効率よく可溶化物に分解できていることが分かった。また、重量平均分子量は、酵素２回添加の実施例１の卵殻膜タンパク質可溶化物の方が、比較例１より若干小さかった。
【００９０】
また、表２に示す通り、実施例１と比較例１とではアミノ酸組成の大きな変化はないが、実施例１の方がシステイン及びシスチンの合計含有量が多いことが分かる。すなわち、酵素２回添加で加水分解を行うことで、卵殻膜タンパク質可溶化物に含まれるシステイン及びシスチンの合計含有量が増加する傾向にあることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明によれば、化粧料用組成物、医療用組成物、機能性食品の原料として好適に用いられるタンパク質可溶化物を生産することができる製造方法が提供されるので、産業的に有望である。