(57)【要約】      （修正有）【課題】各種疾患におけるシグナル伝達経路及び炎症経路を含めたサイトカイン活性を調節する環状ペプチドの提供。【解決手段】ＡＤＡＭメタロプロテアーゼを阻害するための剤の製造のためのθデフェンシンの使用であって、前記ＡＤＡＭメタロプロテアーゼが、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）変換酵素（ＴＡＣＥ）及びＡＤＡＭ１０からなる群より選択される。好適な組成物を用いて、関節リウマチ、炎症性腸疾患及びその他の慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、癌及びアルツハイマー病、変形性関節症、炎症による神経変性疾患及びその他の炎症による疾患を治療することが可能であると考えられる。【選択図】図１
2019014722.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＤＡＭメタロプロテアーゼを阻害するための剤の製造のためのθデフェンシンの使用であって、前記ＡＤＡＭメタロプロテアーゼが、ＴＡＣＥおよびＡＤＡＭ１０からなる群より選択される、使用。
【請求項２】
前記θデフェンシンがＲＴＤ−１またはθデフェンシンの類似体である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ＡＤＡＭメタロプロテアーゼがＴＡＣＥであり、前記類似体がＲＴＤ−１−２７、ＲＴＤ−１−２８、およびＲＴＤ−１−２８からなる群より選択される、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記θデフェンシンが、配列番号８、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７からなる群より選択され、前記ＡＤＡＭメタロプロテアーゼがＴＡＣＥである、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記θデフェンシンが、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３からなる群より選択され、前記ＡＤＡＭメタロプロテアーゼがＴＡＣＥである、請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１１年６月２日に出願された米国仮特許出願第６１／４９２７５３号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、各種疾患におけるシグナル伝達経路および炎症経路を含めたサイトカイン活性を調節する環状ペプチドの使用に関する。より具体的には、環状ペプチドは、シェダーゼおよびその他の関連するプロテアーゼ（メタロプロテイナーゼおよびシステインプロテアーゼ）の阻害などのこれまで未知の生物活性を有し、上記プロテアーゼの活性疾患の発生機序に関連するあらゆる疾患に適用されるものである。
【背景技術】
【０００３】
本明細書に記載されている刊行物はすべて、各刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に明記された場合と同様に、参照により組み込まれるものとする。以下の記載は、本発明を理解するのに有用であると思われる情報を含むものである。本明細書に提供される情報が、本出願で特許請求される発明の先行技術であること、あるいは本出願で特許請求される発明に関連する事柄であること、また具体的または暗示的に参照される刊行物が先行技術であることは認められない。
【０００４】
本明細書に記載の環状ペプチドは、臨床的に重要であることが知られている炎症誘発性酵素の経路、例えば病的炎症、組織分解および癌細胞増殖を促進する増殖因子の動員に関与する腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）変換酵素（「ＴＡＣＥ」、ＡＤＡＭ１７としても知られる）およびその他の金属酵素（例えば、シェダーゼおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ（「ＭＭＰ」））などの経路を標的とする最近発見された治療剤である。
【０００５】
メタロプロテイナーゼは、発生プログラミングから組織損傷または感染症に対する応答、瘢痕再形成および細胞分裂の刺激にわたる多数の生物学的過程を調節する（３）。メタロプロテイナーゼ活性の調節は、細胞および組織の恒常性にきわめて重要である。病的状態の多くが金属酵素活性の過剰発現によるものである。例えば、リウマチ性関節炎およびその他の形態の関節炎に罹患した関節では、ＭＭＰならびにＴＡＣＥ（７、８、１３、１６）によってプロＴＮＦα発現細胞の細胞表面から放出されるＴＮＦ−αのレベルが高くなる。ＲＡの治療には、低用量メトトレキサートなどの一次治療薬に奏効しない関節リウマチ（ＲＡ）患者のかなりの割合で、モノクローナル抗体によるＴＮＦ−αの遮断が有効であることが示されている。ＲＡに対するＴＮＦ−αの遮断が全症例に有効であるとは限らないこと、ＴＮＦ−α遮断薬による重篤な副作用が一部の患者にみられることから、これに代わる抗炎症戦略を開発する努力が続けられている。これに関連して多数の製薬会社がＴＡＣＥ阻害剤を発見する創薬プログラムに集中的に取り組んできたが（１７）、いずれも未だにＦＤＡによる承認を受けていない。
【０００６】
シータデフェンシン（θデフェンシン）は、アカゲザル、ヒヒなどの旧世界ザルの組織で発現される天然の環状ペプチドである。θデフェンシンは、ヒトその他のヒト科動物では発現されない。天然のθデフェンシンは、既知のいずれのθデフェンシンでも保存されているジスルフィド結合により安定化した１８アミノ酸の環からなる（９、２１〜２３、２５）。θデフェンシンは最初、他のデフェンシンと同じくペプチドの抗微生物特性に基づき発見されたものである。しかし、本発明者らは、θデフェンシンの強力な抗炎症因子としてのこれまでに知られていない第二の特性を発見した。本明細書に詳細に記載する通り、天然の構造および修飾された構造のθデフェンシンにより、ｅｘ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでも炎症をダウンレギュレートすることが可能である。θデフェンシンおよびθデフェンシンの構造から誘導されるペプチド（例えば、環状ペプチド）により、ＴＮＦ−α炎症の重要な因子ＴＡＣＥを阻害することが可能であることが発見されたのは最も重要なことである。θデフェンシンが天然のＴＡＣＥ阻害剤であるというこの全く新しい発見により、対象内に既に内在するサイトカイン関連経路を介して炎症を調節することが可能な分子のきわめて重要な入手源がもたらされる。このペプチドは、動物で発現され、可溶性のＴＡＣＥ調節物質である唯一の既知の天然産物である。したがって、機能障害を起こしたサイトカイン活性に起因する自己免疫疾患およびその他の炎症性疾患などの様々な病的状態または病態ならびに霊長類進化の過程でのθデフェンシン発現の喪失に起因すると考えられるヒトの様々な炎症性疾患および／または病態の全般にわたって、環状ペプチドを治療薬として用いることができる。
【０００７】
さらに、ＴＡＣＥなどの因子は、細胞外タンパク質ドメインを切断する生物活性を有しシェダーゼとして知られる分子のさらに広いクラスのメンバーである。この切断活性は、シェダーゼＡＤＡＭ１０阻害によるトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）などの乳癌に使用する特定の治療法の有効性を高める治療経路をもたらすものである。通常、ＡＤＡＭ１０シェダーゼによりＨｅｒ２が切断されると、恒常的キナーゼ活性を有するＨｅｒ２フラグメントが生じ、増殖細胞にリガンド非依存性の増殖シグナルおよび生存シグナルが伝えられる。しかし、この過程の有害な作用は、シェダーゼ阻害により抑制することができる。したがって、シェダーゼ阻害活性を有する環状ペプチドは、メタロプロテイナーゼの構造、発現および／または機能の変化が発生機序に関与する疾患および／または病態を含めたさらに多岐にわたる疾患および／または病態の治療法をもたらすものである。
【０００８】
この１０年ほどの間、製薬会社ではＴＡＣＥ阻害剤を開発する努力が続けられてきた（１４、１７）。数種類の小分子（ほとんどがヒドロキサメートである）がＲＡの動物モデルにおいて有効であること示されたが、これらの化合物はいずれも、ヒトでは許容できない毒性により承認されていない（１４、１７）。実際、米国では依然として、既存のＴＮＦアンタゴニストにはすべて、薬剤に付され得る米国食品医薬品局（ＦＤＡ）による最も厳しい警告の黒枠警告が付されて販売されている。
【０００９】
したがって、ＲＡなどの疾患に有効な非毒性のＴＡＣＥ阻害剤が登場すれば、ＲＡ、関連する自己免疫および炎症性疾患のみならず、メタロプロテイナーゼ活性に関連する癌などの他の疾患に対する有用な新たな治療法になると考えられる。さらに一般的に言えば、炎症性病態および炎症に関連する病態、特に慢性炎症性病態を治療する薬剤ならびにこのような薬剤を製造し、販売し、投与する方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、炎症性病態を治療するためにθデフェンシンまたはその類似体もしくは誘導体を含む薬物組成物を研究し販売する装置、システムおよび方法を提供する。
【００１１】
本出願日の時点で、好適な薬物組成物にはＲＴＤ−１２７、ＲＴＤ−１−２８およびＲＴＤ−１−２９のうちの少なくとも１つが含まれる。
【００１２】
本発明の研究的側面では、毒性、有効性および用量反応に関する試験が企図される。このような試験はいずれも、製薬会社などの会社が自社の研究所で直接実施しても、子会社、さらには非関連会社で間接的に実施してもよいが、本明細書では、これらはすべて薬物組成物の有効性を判定するという概念に含まれるものであることを理解するべきである。
【００１３】
本明細書で企図される抗炎症性作用（１つまたは複数）は、例えば、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）変換酵素（ＴＡＣＥ）、カテプシンＣまたはその他の炎症性プロテアーゼ、メタロプロテアーゼのＡＤＡＭファミリーおよびその他のシェダーゼの阻害を含めた、臨床的に意義のある炎症関連の化合物の阻害をすべて、広範囲に含むものであると解釈されるべきである。
【００１４】
本明細書では、薬物組成物を市場に提供する段階は、商業量の薬物組成物を製造することもしくは製造された商業量の薬物組成物、または商業量の薬物組成物の製造を監視すること、管理することもしくは他の任意の方法で指示することであると解釈されるべきである。企図される最小限の商業量としては、１つ以上の生産施設において任意の１年間で合計１キログラム、１０キログラム、１００キログラムおよび１０００キログラムが挙げられる。
【００１５】
企図されるθデフェンシンまたはその類似体もしくは誘導体の興味深い側面の１つは、この化合物の多くが酸およびプロテアーゼに対する安定性が高く、経口製剤の形で投与することができるという点である。
【００１６】
少なくとも部分的には、企図される治療用組成物がＴＡＣＥおよび／またはシェダーゼに影響を及ぼし得るという理由から、例えば、関節リウマチ、炎症性腸疾患およびその他の慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、急性菌血症、敗血症、嚢胞性線維症、癌、アルツハイマー病、変形性関節症、炎症関連神経変性疾患およびその他の疾患関連疾患を含めた多岐にわたる炎症性病態を治療し得ると考えられる。特に、本明細書で企図される方法および組成物を、抗ＴＮＦα療法に奏効しない患者を治療するために販売するのが有利であろうと考えられる。
【００１７】
このほか、ヒトまたは非ヒト動物に投与する薬剤および薬剤の製造方法が企図され、ここでは薬剤が、本明細書または優先出願に開示され炎症性病態を治療するために販売される新規なθデフェンシンまたはその類似体もしくは誘導体を少なくとも１つ含む。特に対象となるのがＲＴＤ−１−２７、ＲＴＤ−１−２８およびＲＴＤ−１−２９である。
【００１８】
以下の好適な実施形態の詳細な説明から、本発明の様々な目的、特徴、態様および利点がさらに明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】θデフェンシンの生合成および構造の図である。置換基ノナペプチド（色分けされている）が切り取られ、スプライスされて成熟ペプチドＲＴＤ−１が生成する（（２１）より）。
【図２】プレプロθデフェンシンの配列比較の図である。Ａ．ｃＤＮＡから予想されるＢＴＤ−ａ〜ｄのアミノ酸配列をＲＴＤ１ａ〜１ｃおよびヒトθデフェンシン偽遺伝子（ＨＴＤｐ）と手動で整列させたものである。整列した配列中の点は、ＢＴＤ−ａと一致するアミノ酸を表し、星印は終止コドンの位置を表し、＃記号は翻訳を早期に終了させる停止コドンを表す。Ｂ．ｃＤＮＡ配列から推定される１０種類のＢＴＤペプチドの環状構造。
【図３】ＲＴＤ−１がマウス多菌性敗血症の致死率を低下させることを示す図である。Ｔ＝０時に成体Ｂａｌｂ／ｃマウスに盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）を実施した。マウスには、ＣＬＰ術の４時間後に通常の生理食塩水５０μｌ（●、ｎ＝１０）を、あるいはＣＬＰ術の４時間後（▲、ｎ＝１１）または２４時間後（■、ｎ＝５）にＲＴＤ−１を５ｍｇ／ｋｇ含有する生理食塩水を単回注射した。
【図４】θデフェンシンの抗ＴＮＦ活性を示す図である。Ａ．ＲＴＤ１〜６（２３）の共有結合構造を示す図であり、色分けされた部分が成分ノナペプチドの誘導を示している（２３）。Ｂ．ヒト全血（１：１０）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）生菌１００ＣＦＵ／ｍｌとともに、θデフェンシンＲＴＤ−１および２種類のヒトαデフェンシン（ＨＮＰ−２およびＨＮＰ−４）の０〜１０μｇ／ｍｌ存在下で４時間インキュベートし、ＥＬＩＳＡによりＴＮＦ−αを定量化した。Ｃ．ＲＴＤ１〜５について、パネルＢに示されるヒト全血からのＴＮＦ−α放出に対する効果を試験した。ＥＬＩＳＡによりＴＮＦ−αを定量化し、ＰＭＮ中に微量にしか存在しないＲＴＤ−６については試験しなかった。
【図５】θデフェンシンが、複数のＴＬＲアゴニストによって誘導される炎症誘発性サイトカイン／ケモカインを阻害することを示す図である。ヒト末梢血細胞（５×１０５個／ｍｌ）をＲＰＭＩ１６４０＋５％ヒト血漿中、ＲＴＤ−１単独１０μｇ／ｍｌ（アゴニストを含まない対照）もしくはペプチド溶媒（０．０１％ＨＯＡｃ）とともに、またはＴＬＲアゴニストと同時に、３７℃、５％ＣＯ２中で４時間、穏やかに攪拌しながらインキュベートした。遠心分離により上清を回収し、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘサイトカイン／ケモカインパネルを用いて、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰ分析によりサイトカイン／ケモカインレベルを定量化した。アゴニスト：ＴＬＲ２―熱殺菌したリステリア菌（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）１×１０８個：ＴＬＲ４―大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２のＬＰＳ  ３．３ｎｇ／ｍｌ；ＴＬＲ５―ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のフラジェリン３０ｎｇ／ｍｌ；ＴＬＲ８―ｓｓＲＮＡ４０  ０．９μｇ／ｍｌ。
【図６】θデフェンシンがＴＡＣＥの競合阻害剤であることを示す図である。Ａ．組換えＴＡＣＥ（ｒＴＡＣＥ）を図示される濃度のペプチド＋ＴＡＣＥ−特異的基質（Ｍｃａ−ＰＬＡＱＡＶ−Ｄｐａ−ＲＳＳＳＲ−ＮＨ２）とともにインキュベートし、酵素活性を蛍光定量により測定した。Ｂ．パネルＡに示されるＴＡＣＥ阻害についてＲＴＤ１〜５を分析した。Ｃ．ペプチド濃度０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌおよび１５０ｎｇ／ｍｌにおけるＲＴＤ−１によるｒＴＡＣＥ阻害のＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅ解析。Ｄ．ＲＴＤ−１と「天然の」非環状類似体（Ｓ−７）の構造の比較。Ｅ．ＲＴＤ−１およびＲＴＤ−１−Ｓ７類似体によるｒＴＡＣＥの相対的阻害。Ｆ．休止ＴＨＰ−１細胞またはＬＰＳ刺激した（２時間）ＴＨＰ−１細胞でのＲＴＤ−１によるＴＡＣＥ阻害（１）。
【図７】θデフェンシンがＡＤＡＭ１０の強力な阻害剤であることを示す図である。組換えＡＤＡＭ１０と基質（Ｍｃａ−ＰＬＡＱＡＶ−Ｄｐａ−ＲＳＳＳＲ−ＮＨ２；０．０５μｇ／ｍｌ）をＲＴＤ１〜３とともに３７℃で６０分間インキュベートし、蛍光定量により酵素活性を測定した。
【図８】ミニθデフェンシンのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性ならびに抗ＴＮＦα活性およびＴＡＣＥ遮断活性を示す図である。Ａ．ミニθデフェンシンの共有結合構造。Ｂ．ＣＬＰ敗血症に対するミニθデフェンシンの効果。Ｔ＝０時にＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＬＰ術を実施した。手術の４時間後、ｉ．ｖ．ＰＢＳ（偽対照）またはＰＢＳ中５ｍｇ／ｋｇの図示されるミニθデフェンシンによりマウスを治療した。最大１５日間の生存率として治療効果をモニターした。Ｃ．ミニθデフェンシンについて、ヒト全血からのＴＮＦα放出に対する効果を評価した。ＥＤＴＡで抗凝固処置した全血をＲＰＭＩ１６４０で１：１０に希釈し、ＲＴＤ−１（天然θデフェンシン）または図示される３種類のミニθデフェンシンを加えて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）生細胞とともに４時間インキュベートした。Ｄ．ＴＡＣＥ活性に対するＲＴＤ−１および３種類のミニθデフェンシンの効果を図５に記載されている通りに判定した。
【図９】ラットプリスタン関節炎（ＰＩＡ）に対するＲＴＤ−１の効果を示す図である。本文中に記載されている通りにＤＡラットにＰＩＡを誘発し、無作為化により、生理食塩水（Ｎ＝１０）を毎日注射するグループと５ｍｇ／ｋｇのＲＴＤ−１（Ｎ＝１１）を毎日注射するグループに割り付けた。肉眼的病理所見を評価しスコア化した（２０）。各記号は各個体の肉眼的病理所見のスコアを表す。いずれの場合にも、ＲＴＤ−１治療により、正常な歩行運動の回復をみる関節疾患の解消がもたらされた。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（詳細な説明）
本明細書で引用される参考文献はすべて、その全体が完全に記載された場合と同様に参照により組み込まれるものとする。特に定義されない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ第３版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００１）；Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ第５版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００１）；およびＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２００１）は、本願で使用される多くの用語に関する一般的な指針を当業者に提供するものである。
【００２１】
当業者には、特許請求される発明の実施に使用することができ、本明細書に記載のものとほぼ同等のまたは同等である方法および材料が多数認識されるであろう。実際、本発明は、記載されている方法および材料に限定されるものであると解釈されるべきではない。本目的のために、次の用語を以下で定義する。
【００２２】
文脈上他の意味に解される場合を除き、本明細書に記載される範囲はすべて、その終点を含むものであると解釈されるべきであり、限界が定められていない範囲については、商業上実施可能な数値を含むものであると解釈されるべきである。同様に、列挙される数値はすべて、文脈上他の意味に解される場合を除き、中間にある数値を含むものであると解釈されるべきである。
【００２３】
本明細書で使用される「シータデフェンシン」または「θデフェンシン」という用語は、旧世界ザルおよび無尾猿（例えば、アカゲザル、アヌビスヒヒ、フクロテナガザルおよびオランウータン）などの各種の霊長類にみられるデフェンシンタンパク質のθデフェンシンファミリーのメンバーを包含し、ここでは、θデフェンシン前駆体が転写発現され、翻訳後修飾によりプロセシングされてθデフェンシンとなる。この用語はさらに、類人猿（例えば、ヒト、チンパンジー、ボノボおよびゴリラ）にみられる偽遺伝子を包含し、ここでは、当該技術分野で容易に知ることができる技術により、θデフェンシン偽遺伝子の遺伝子修飾を改変し、哺乳動物細胞内でのθデフェンシンタンパク質発現を可能にし得る。この用語はほかにも、核酸配列および／またはアミノ酸配列の比較ウィンドウに配列相同性または保存されている構造を示すコンピュータモデリング技術あるいは相同なθデフェンシンを同定する核酸プローブを用いる選択的ハイブリダイゼーション技術などの当該技術分野で容易に知ることができる技術により、同じ種または異なる種で同定され得るθデフェンシンタンパク質を包含する。θデフェンシンは、内在する入手源から単離する、自己細胞系もしくは異種細胞系で産生させる、ペプチド合成により作製する、あるいは利用可能な当業者に既知の任意の方法に従って入手することができる。θデフェンシンの例としては、ＲＴＤ−１、ＲＴＤ−２、ＲＴＤ−３、ＲＴＤ−４、ＲＴＤ−５、ＲＴＤ６、ＢＴＤ−１、ＢＴＤ−２、ＢＴＤ−３、ＢＴＤ−４、ＢＴＤ−５、ＢＴＤ−６、ＢＴＤ−７、ＢＴＤ−８、ＢＴＤ−９、ＢＴＤ−１０またはＨＴＤｐが挙げられる。
【００２４】
本明細書で使用される「シェダーゼ」は、膜貫通タンパク質の細胞外部分を切断する酵素タンパク質を包含する。具体例としては、特にタンパク質のディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼファミリー（ＡＤＡＭ）、タンパク質のアスパラギン酸プロテアーゼ（ＢＡＣＥ）ファミリーのメンバーが挙げられる。シェダーゼであるＡＤＡＭタンパク質の例としては、ＡＤＡＭ２、ＡＤＡＭ７、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１１、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ１８（ＡＤＡＭ２７としても知られる）、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２０、ＡＤＡＭ２１（ＡＤＡＭ３１としても知られる）、ＡＤＡＭ２２、ＡＤＡＭ２３、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ２９、ＡＤＡＭ３０およびＡＤＡＭ３３が挙げられる。
【００２５】
本明細書でθデフェンシンに適用される用語「類似体」とは、サイトカイン活性を調節すること、タンパク質分解シェダーゼ活性を阻害すること、細胞表面受容体に関連する酵素機能を変化させることが可能であり、かつ／または抗微生物活性を有するθデフェンシンなどのデフェンシンに由来するコア構造を含むポリペプチドおよびペプチドのことである。具体例としては、複数のシステイン残基または実質的にほぼ同じ置換体の間にジスルフィド結合を１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上含む環状ペプチドが挙げられ、ここでは類似体は、長さが８〜２４アミノ酸の範囲内にあってよく、正味の正電荷をもつ。
【００２６】
デフェンシンは、脊椎動物、無脊椎動物のみならず植物にもみられるように進化的に高度に保存され、小型でシステインに富む陽イオン性タンパク質である。このタンパク質は、細菌、真菌ならびに多くのエンベロープ型ウイルスおよび非エンベロープ型ウイルスなどの広範囲の生物体に対する生物活性を有する。デフェンシンは一般に、６個（脊椎動物）〜８個の保存されたシステイン残基を含めた１８〜４５個のアミノ酸からなる。好中球、顆粒球などの各種免疫細胞およびほぼすべての上皮細胞は、宿主細胞としてこのペプチドを含み、貪食された微生物または細胞外微生物の殺作用という重要な機能を有する。デフェンシンの多くは微生物の細胞膜と結合することによって機能し、膜に組み込まれると膜に細孔様の欠損部分を形成し、必須のイオンや栄養素を流出させて微生物の完全性を崩壊させる。しかし、本明細書でさらに述べるように、θデフェンシンを含めたデフェンシンタンパク質の特定のメンバーは、宿主の細胞免疫機能の調節を介しても作用する。これにはＴＮＦ−αなどのサイトカインに関連する炎症経路が含まれる。
【００２７】
デフェンシン一般
デフェンシンは、白血球および各種上皮によって産生され、陽イオン性でジスルフィドを３つ含む抗微生物ペプチドである。デフェンシンはさらにαデフェンシン、βデフェンシン、θデフェンシンのサブファミリーに分けられ、これらはペプチドの大きさおよびジスルフィドモチーフの違いによって区別される。ヒトでは、４種類のαデフェンシン（ＨＮＰ−１〜ＨＮＰ−４）が好中球から単離されており、また２種類の腸αデフェンシン（ＨＤ−５およびＨＤ−６）が小腸陰窩のパネート細胞によって発現される。このほか、女性泌尿生殖管でＨＤ−５の発現が検出されている。３種類のヒトβデフェンシン（ｈＢＤ−１〜ｈＢＤ−３）が各種器官の上皮細胞種および非上皮細胞種から単離されており、またｃＤＮＡ解析によって、あるいはヒトゲノム解析から、ほかにも数種類のデフェンシンの発現が推定されている。皮膚、呼吸上皮、泌尿生殖管および各種白血球（すなわち、好中球、単球およびＮＫ細胞）においてデフェンシンが抗微生物エフェクター機能を示すことが多数の証拠から示唆されている。さらにデフェンシンは、自然免疫応答および適応免疫応答に関与する細胞をともに活性化し、このことは、デフェンシンが２系統の免疫内で作用し、２つを結び付けることを示唆している。
【００２８】
大環状θデフェンシン
θデフェンシンは、７６アミノ酸のαデフェンシン関連前駆体から生じる２つのノナペプチドの転写後スプライシングによって形成される環状オクタデカペプチドである。ヒトでは、進化の過程でオランウータンが出現した頃に、ペプチド前駆体に早期停止コドンをもたらした突然変異によってθデフェンシンが発現されなくなったため、θデフェンシンペプチドの発現はみられない。
【００２９】
θデフェンシンは、θデフェンシン前駆体から生じる２つの９アミノ酸配列の頭尾スプライシングを用いて生合成することができる。θデフェンシンは最初、アカゲザルの好中球および単球で同定され、のちの系統発生的調査から、他の旧世界ザルおよび２種類の無尾猿（フクロテナガザルおよびオランウータン）でθデフェンシン遺伝子の存在が明らかになったが、新世界ザルまたは原猿類ではθデフェンシンの存在は未だ報告されていない。ヒト、チンパンジー、ボノボおよびゴリラではθデフェンシン偽遺伝子が発現するが、その前駆体ｍＲＮＡにはシグナル配列内に停止コドンを生じる突然変異が含まれているため、θデフェンシン前駆体の翻訳が行われない。アカゲザルθデフェンシン−１（ＲＴＤ−１）は、２つのθデフェンシン前駆体ｐｒｏＲＴＤ１ａおよびｐｒｏＲＴＤ１ｂのヘテロ二量体スプライシングから生成する。ＲＴＤ−２およびＲＴＤ−３の単離によってｐｒｏＲＴＤ１ａおよびｐｒｏＲＴＤ１ｂを含むホモ二量体の除去／連結反応が明らかとなったが、ＲＴＤ−１、ＲＴＤ−２およびＲＴＤ−３には細菌および真菌に対する強力な殺菌活性があり、またこれらが１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に対する抗ウイルス活性を有することが知られている。
【００３０】
本発明者らは、抗菌活性および抗ウイルス活性を有する天然θデフェンシンの配列に基づいて、合成θデフェンシンの設計を作製した。さらに、θデフェンシンが炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の致死毒素と結合して不活性化することが報告されている。θデフェンシンは、生理的濃度の塩、二価陽イオンおよび血清の存在下では殺菌性がある。これに対し、αデフェンシンおよびβデフェンシンの抗微生物活性は、塩および二価陽イオンの存在下で著明に低下する。非環状ＲＴＤ−１は、生理食塩水中で黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に対して不活性であるが、天然の環状型のペプチドはこのような条件下で強力な殺作用を保持することがわかっている。ここに挙げたデータは、θデフェンシンの環状骨格構造が塩に対する非感受性をもたらすと同時に、生理的に適切な条件下で強力な生物学的活性を保持することができる安定な分子をもたらすことを示している。
【００３１】
θデフェンシンの抗微生物活性
典型的なθデフェンシンペプチドは、１８アミノ酸大環状ペプチドのアカゲザルθデフェンシン−１（ＲＴＤ−１）である（２２）。記載されているように、成熟ペプチドは、短縮されたαデフェンシン様前駆体から生じる２つの９アミノ酸ペプチドが頭尾型のスプライシングを受け、３つのジスルフィドによって安定化された大環状分子を形成する固有の過程によって生成する（図１）。成熟大環状θデフェンシンが生じる生合成経路は新規なものである。アカゲザル（２２、２３、２５）およびアヌビスヒヒ（９）ではそれぞれ、３つおよび４つのθデフェンシン前駆体が発現する。各前駆体から、すべて２要素の組合せで同一のナノペプチド（ホモ二量体スプライシング）または異なるノナペプチド（ヘテロ二量体スプライシング）と対になった固有のナノペプチドが生じる。これにより、６種類の固有のマカクθデフェンシンおよび１０種類のヒヒθデフェンシンの生成が可能となる。本発明者らは、予測されるマカクペプチド全６種類を単離し（２３）、ヒヒで予測されるペプチドのうち７種類を単離した（９）。
【００３２】
αデフェンシンなどの他のデフェンシンと同じく、θデフェンシンはマカクおよびヒヒ好中球の一次顆粒内に封入されており、また単球でも発現する（２３）。微生物が好中球、単球およびマクロファージによって貪食されると、デフェンシンが食胞に動員されて、殺菌物質として細胞内殺作用に関与する。θデフェンシンは、グラム陽性菌、真菌に対してマイクロモル以下の濃度で殺菌性を示し（９、２２、２５）、ＨＩＶ−１の細胞内取込みを阻害する（５、６、２７、２８）。本発明者らは特異的中和抗体を用いて、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）に対して示されるマカク好中球の顆粒による抗微生物活性の大部分にθデフェンシンが関与していることをｉｎ  ｖｉｔｒｏで示した（２３）。さらに、ヒト好中球顆粒抽出物より優れたマカクＰＭＮ顆粒抽出物の殺作用活性にθデフェンシンが関与していることが示された（２３）。ヒトで全身性炎症（例えば、敗血症）が起こると、αデフェンシンが直接的な方法および／または偶発的な方法で細胞外間隙に放出される（２、１８）。ヒヒθデフェンシン（２２）も菌血症個体の血清中に同じように放出される。さらに、本明細書で詳細に記載するように、細胞外θデフェンシンは、げっ歯類からヒトにわたる種で作用する抗炎症機序を介して炎症を調節する能力を有すると思われる。したがって、θデフェンシンおよびθデフェンシンの構造から得られるペプチドは、免疫機能調節因子の重要なクラスである。
【００３３】
ＴＮＦ−αおよび炎症
腫瘍壊死因子α（「ＴＮＦ−α」、カヘキシンまたはカケクチンとしても知られる）は全身性炎症に関与するサイトカインであり、急性期反応を誘発するサイトカイン群のメンバーである。
【００３４】
ＴＮＦ−αは、アポトーシス細胞死の誘発、炎症の促進、腫瘍形成およびウイルス複製の阻害を含めた免疫細胞の調節に重要な役割を演じている。広範囲に及ぶＴＮＦ−α活性の作用を考慮すれば、ＴＮＦ−αの発現、産生およびシグナル伝達の調節異常が、特に関節リウマチ、アルツハイマー病、結核、クローン病を含めた様々なヒト疾患に関与することが明らかになっても驚くべきことではない。
【００３５】
ＴＮＦ−αシグナル伝達はまず、成熟時に細胞膜内に挿入される２６ｋＤａ、２１２アミノ酸長のＩＩ型膜貫通タンパク質として生成される。細胞表面では、膜結合ＴＮＦ−α（「プロＴＮＦ−α」）は生物学的に活性な状態にあり、ジャクスタクリン細胞間シグナル伝達を介して免疫応答を誘導することができる。しかし、プロＴＮＦ−αは、そのＡｌａ７６−Ｖａｌ７７アミド結合の部分でメタロプロテイナーゼＴＮＦ−α変換酵素（「ＴＡＣＥ」、ＡＤＡＭ１７としても知られる）によるタンパク質分解切断を受けることがある。この膜に組み込まれた形態から、パラクリンシグナル伝達に極めて重要で、一般にＴＮＦ−αとして知られる可溶性の１７ｋＤａ細胞外ドメイン（外部ドメイン）が解離する。
【００３６】
ＴＮＦ−α活性を標的とする既存の治療戦略は一般に、可溶性かつ／または膜貫通型のＴＮＦ−αに対する抗体を投与して、受容体の結合または可溶性のハイブリッド融合受容体の形成を阻害し、血中ＴＮＦ−αレベルを低下させることに焦点を当てるものである。この治療法には重要な便益性があるが、患者の１／３前後がいずれの形態の抗ＴＮＦ−α療法にも奏効しない一方で、免疫原性、感染症、遅延型過敏症型反応ならびに薬剤誘発性の狼瘡および脱髄などの自己免疫疾患を含めた有害作用が複数報告されている。
【００３７】
ＴＡＣＥおよびシェダーゼ活性
記載したように、ＴＮＦ−αシグナル伝達活性の重要な段階は、「シェディング」として知られる過程のＴＡＣＥによる触媒作用を受けて、膜結合型のタンパク質が遊離し、可溶型の血中ＴＮＦ−αになることである。ＴＡＣＥは８２４個のアミノ酸からなる７０ｋＤａのタンパク質で、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼからなるＡＤＡＭタンパク質ファミリー（Ａ Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）に属する。ＡＤＡＭタンパク質ファミリーのメンバーは、進化的に保存された構造および膜結合プロタンパク質から可溶性の外部ドメインを切断し解離する機能の両方を有する。炎症過程におけるＴＮＦ−αの強力で極めて重要なメディエーターとしての役割を考慮すれば、ＴＡＣＥ阻害剤として機能する環状ペプチドが、現在用いられている抗体または可溶性受容体ベースの組成物などの抗ＴＮＦ−α剤の極めて重要な代用になると考えられる。
【００３８】
さらに、複数の異なるタンパク質に及ぶ「シェディング」活性の幅と多様性ならびに多数の異なる病的状態および／または病態に関与することを考慮すれば、ＴＮＦ−αおよびＴＡＣＥは、環状ペプチドの治療活性のいくつか考えられる治療標的のうちのわずか２つにすぎない。ＴＡＣＥおよびその他のＡＤＡＭファミリー分子が、さらに大きい「シェダーゼ」ファミリーのメンバーのほとんどを構成している。しかし、他のシェダーゼには、アスパラギン酸プロテアーゼ（ＢＡＣＥ）タンパク質ファミリーのメンバーが含まれている。シェダーゼ活性の機能は、シェダーゼの種類の幅を越えて、膜貫通タンパク質受容体外部ドメイン（例えば、Ｈｅｒ２）の切断を介して、あるいはアゴニストと受容体との結合後にシグナル伝達を活性化することに始まり、遊離したアゴニストにさらに別の受容体（例えば、ＥＧＦＲ）を刺激させることに及ぶ。シグナル伝達機能を可能にし伝播するのに極めて重要なこの役割から、シェダーゼ活性の阻害が、新たな治療法への道を開き、既存の薬物治療の有効性を高める重要な治療戦略となる。例えば、Ｈｅｒ２がＡＤＡＭ１０シェダーゼにより切断されると、恒常的キナーゼ活性を有するＨｅｒ２フラグメントが生じ、増殖細胞にリガンド非依存性の増殖シグナルおよび生存シグナルが伝達される。この過程の有害な作用は、トラスツズマブ（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）の投与およびＡＤＡＭ１０シェダーゼ活性の阻害により抑制することができる（３０、３１）。その結果、環状ペプチドを用いて、免疫機能に関連する有害なサイトカイン活性を阻害するとともに、癌などの疾患あるいはシェダーゼ機能不全によるその他の疾患および／または病態を治療する機会をさらに広げることができる。内在性のシェダーゼ阻害活性を有するθデフェンシンのこの側面は、霊長類進化の過程でθデフェンシン発現を喪失したことによりヒト対象にみられる多数の自己免疫、炎症性疾患およびその他の疾患状態を説明するものである。したがって、θデフェンシンおよび各種θデフェンシンの構造から得られる環状ペプチドを、メタロプロテイナーゼ調節異常による疾患および病態に罹患しているヒト対象に適合する治療剤として使用することができる。
【００３９】
各種実施形態において、本発明は環状ペプチドを提供する。一実施形態では、環状ペプチドはデフェンシン、その類似体または誘導体である。別の実施形態では、環状ペプチドはαデフェンシン、βデフェンシン、θデフェンシン、その類似体または誘導体である。別の実施形態では、環状ペプチドはθデフェンシン、その類似体または誘導体である。
【００４０】
別の実施形態では、θデフェンシンは霊長類で内因性に発現するものである。別の実施形態では、θデフェンシンはアカゲザルで内因性に発現するものである。別の実施形態では、θデフェンシンはＲＴＤ−１、ＲＴＤ−２、ＲＴＤ−３、ＲＴＤ−４、ＲＴＤ−５またはＲＴＤ−６である。別の実施形態では、θデフェンシンはアヌビスヒヒで内因性に発現するものである。別の実施形態では、θデフェンシンはＢＴＤ−１、ＢＴＤ−２、ＢＴＤ−３、ＢＴＤ−４、ＢＴＤ−５、ＢＴＤ−６、ＢＴＤ−７、ＢＴＤ−８、ＢＴＤ−９またはＢＴＤ−１０である。別の実施形態では、θデフェンシンはヒトで内因性に発現するものである。別の実施形態では、θデフェンシンはヒトθデフェンシン偽遺伝子（ＨＴＤｐ）である。別の実施形態では、θデフェンシンはフクロテナガザルまたはオランウータンで発現するものである。
【００４１】
別の実施形態では、θデフェンシンは哺乳動物から単離されるものである。別の実施形態では、θデフェンシンは霊長類から単離されるものである。別の実施形態では、θデフェンシンはヒトから単離されるものである。別の実施形態では、θデフェンシンは、哺乳動物から得られた生物試料から精製されるものである。別の実施形態では、θデフェンシンは、霊長類から得られた生物試料から精製されるものである。別の実施形態では、θデフェンシンは、ヒトから得られた生物試料から精製されるものである。
【００４２】
別の実施形態では、環状ペプチドは、長さが８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、２０アミノ酸、２１アミノ酸、２２アミノ酸、２３アミノ酸または２４アミノ酸である。別の実施形態では、環状ペプチドは、長さが２４アミノ酸を上回る。特定の実施形態では、環状ペプチドは、長さが１４アミノ酸である。別の実施形態では、環状ペプチドは、ジスルフィド結合を１つ形成する少なくとも２つのシステイン残基を含む。別の実施形態では、環状ペプチドは、ジスルフィド結合を２つ形成する４つのシステイン残基を含む。別の実施形態では、環状ペプチドは、ジスルフィド結合を３つ形成する６つのシステイン残基を含む。別の実施形態では、環状ペプチドは合成アミノ酸を含む。別の実施形態では、環状ペプチドは正味の正電荷を有する。別の実施形態では、環状ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および／または配列番号７と約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％またはそれ以上のパーセント未満の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされ得る。当業者は、参照配列と第二のポリヌクレオチド配列との間に比較ウィンドウを設定してパーセント同一性の程度を確認することを含めた、当該技術分野で公知の方法に従ってパーセント同一性を確認することができる。
【００４３】
別の実施形態では、環状ペプチドは炎症を調節する。別の実施形態では、環状ペプチドはサイトカインおよび／またはケモカインの活性を調節する。別の実施形態では、環状ペプチドはＴＮＦ−αの活性を調節する。別の実施形態では、環状ペプチドは、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼファミリーのメンバーとの競合阻害を介してＴＮＦ−αの活性を調節する。別の実施形態では、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼファミリーのメンバーはシェダーゼである。別の実施形態では、シェダーゼはＴＡＣＥである。別の実施形態では、シェダーゼはＡＤＡＭ１０である。別の実施形態では、環状ペプチドはタンパク質分解酵素活性を調節することができる。別の実施形態では、環状ペプチドは抗菌殺作用が可能である。
【００４４】
各種実施形態において、本発明はさらに、環状ペプチドを用いて炎症性疾患および／または病態を治療する方法を提供し、この方法は、一定量の環状ペプチドを準備する段階と、炎症性疾患および／または病態の治療を必要とする対象にその量の環状ペプチドを投与する段階とを含み、環状ペプチドは炎症を調節することにより対象を治療することができる。別の実施形態では、環状ペプチドはθデフェンシン、その類似体または誘導体である。別の実施形態では、θデフェンシンはＲＴＤ−１、ＲＴＤ−２、ＲＴＤ−３、ＲＴＤ−４、ＲＴＤ−５、ＲＴＤ−６、ＢＴＤ−１、ＢＴＤ−２、ＢＴＤ−３、ＢＴＤ−４、ＢＴＤ−５、ＢＴＤ−６、ＢＴＤ−７、ＢＴＤ−８、ＢＴＤ−９またはＢＴＤ−１０である。別の実施形態では、環状ペプチドは、長さが８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、２０アミノ酸、２１アミノ酸、２２アミノ酸、２３アミノ酸または２４アミノ酸である。別の実施形態では、環状ペプチドは、長さが２４アミノ酸を上回る。別の実施形態では、環状ペプチドは、長さが１４アミノ酸である。別の実施形態では、環状ペプチドは、ジスルフィド結合を１つ形成する少なくとも２つのシステイン残基を含む。別の実施形態では、環状ペプチドは、２つ以上のジスルフィド結合を形成する少なくとも４つのシステイン残基を含む。別の実施形態では、投与する環状ペプチドの量は環状ペプチドの治療有効量である。別の実施形態では、対象は哺乳動物である。別の実施形態では、対象はヒトである。
【００４５】
各種実施形態において、炎症性疾患および／または病態は、急性もしくは慢性炎症または自己免疫疾患である。別の実施形態では、炎症性疾患および／または病態は、サイトカインまたはケモカインの活性に関連するものである。別の実施形態では、炎症性疾患および／または病態は、ＴＮＦ−αの活性に関連するものである。別の実施形態では、炎症性疾患および／または病態は関節リウマチ、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、自閉症腸炎、乾癬、乾癬性関節炎、クローン病、ベーチェット病、狼瘡、化膿性汗腺炎、難治性喘息、大腸炎、皮膚炎、憩室炎、肝炎、腎炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、うっ血性心不全、アテローム性動脈硬化症、ブドウ膜炎およびアレルギーである。
【００４６】
各種実施形態において、本発明はさらに、環状ペプチドを用いて炎症性疾患および／または病態の治療の有効性を高める方法をさらに提供し、この方法は、一定量の環状ペプチドを準備する段階と、炎症性疾患および／または病態の治療を受けている対象にその量の環状ペプチドを投与する段階とを含み、環状ペプチドは、炎症性疾患および／または病態の治療の有効性を高めることにより治療の有効性を高めることができる。別の実施形態では、環状ペプチドを炎症性疾患および／または病態を治療することができる組成物と同時に投与する。別の実施形態では、環状ペプチドを、炎症性疾患および／または病態を治療することができる組成物の投与前または投与後に逐次的に投与する。別の実施形態では、対象は哺乳動物である。別の実施形態では、対象はヒトである。
【００４７】
各種実施形態において、本発明はさらに、環状ペプチドを用いて対象の疾患および／または病態を治療する方法をさらに提供する。別の実施形態では、疾患および／または病態は癌または神経変性疾患である。各種実施形態において、本発明はさらに、環状ペプチドを用いて疾患および／または病態の治療の有効性を高める方法を提供する。別の実施形態では、環状ペプチドを疾患および／または病態を治療することができる組成物と同時に投与する。別の実施形態では、環状ペプチドを、疾患および／または病態を治療することができる組成物の投与前または投与後に逐次的に投与する。好ましい実施形態では、対象は哺乳動物であり、特に好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【００４８】
各種実施形態において、本発明はさらに医薬組成物を提供する。別の実施形態では、医薬組成物は、環状ペプチドと薬学的に許容される担体とを含む。別の実施形態では、環状ペプチドはθデフェンシン、その類似体または誘導体である。別の実施形態では、θデフェンシンはＲＴＤ−１、ＲＴＤ−２、ＲＴＤ−３、ＲＴＤ−４、ＲＴＤ−５、ＲＴＤ−６、ＢＴＤ−１、ＢＴＤ−２、ＢＴＤ−５、ＢＴＤ−４、ＢＴＤ−５、ＢＴＤ−６、ＢＴＤ−７、ＢＴＤ−８、ＢＴＤ−９またはＢＴＤ−１０である。別の実施形態では、環状ペプチドは、長さが８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、２０アミノ酸、２１アミノ酸、２２アミノ酸、２３アミノ酸または２４アミノ酸である。別の実施形態では、環状ペプチドは、長さが１４アミノ酸である。別の実施形態では、環状ペプチドは、長さが２４アミノ酸を上回る。別の実施形態では、環状ペプチドは、ジスルフィド結合１つ形成する少なくとも２つのシステイン残基を含む。別の実施形態では、環状ペプチドは、２つ以上のジスルフィド結合を形成する少なくとも４つのシステイン残基を含む。別の実施形態では、医薬組成物中の環状ペプチドは治療有効量のサイクリンペプチドを含む。別の実施形態では、医薬組成物は１つ以上の環状ペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む。
【００４９】
各種実施形態において、本発明はさらに、環状ペプチドの製造方法を提供する。別の実施形態では、製造方法は、環状ペプチドをコードするポリヌクレオチドを１つ以上準備する段階と、１つ以上のポリヌクレオチドを宿主細胞内で発現させる段階と、宿主細胞から環状ペプチドを抽出する段階とを含む。別の実施形態では、製造方法は、１つ以上のポリヌクレオチドを宿主細胞内で発現させる段階と、宿主細胞から環状ペプチドを抽出する段階とを含む。別の実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは配列番号１、配列番号２および／または配列番号３を含む。別の実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは配列番号４、配列番号５、配列番号６および／または配列番号７を含む。
【００５０】
別の実施形態では、環状ペプチドはθデフェンシン、その類似体または誘導体である。別の実施形態では、θデフェンシンはＲＴＤ−１、ＲＴＤ−２、ＲＴＤ−３、ＲＴＤ−４、ＲＴＤ−５．ＲＴＤ−６、ＢＴＤ−１、ＢＴＤ−２、ＢＴＤ−３、ＢＴＤ−４、ＢＴＤ−５、ＢＴＤ−６、ＢＴＤ−７、ＢＴＤ−８、ＢＴＤ−９またはＢＴＤ−１０である。別の実施形態では、環状ペプチドは、長さが８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、２０アミノ酸、２１アミノ酸、２２アミノ酸、２３アミノ酸または２４アミノ酸である。別の実施形態では、環状ペプチドは、長さが１４アミノ酸である。別の実施形態では、ジスルフィド結合１つ形成する少なくとも２つのシステイン残基を含む。別の実施形態では、２つ以上のジスルフィド結合を形成する少なくとも４つのシステイン残基を含む。別の実施形態では、製造方法は、液相合成または固相合成を用いるペプチド合成の段階を含む。別の実施形態では、固相合成はＦｍｏｃ合成またはＢＯＣ合成である。
【００５１】
本明細書で企図される組成物の製造は、例えば発現ベクターの使用を含めた任意の適切な方法で実施することができる。当業者には、適切な発現ベクターを選択することが可能であり、また選択肢が多数存在することが認識されるであろう。このようなベクターの多くはウイルスプロモーターを用いるものである。例えば細菌、酵母、昆虫細胞および植物を含めた細胞系の選択肢の多くが、宿主細胞に適するものである。以下、本発明の実施形態について
【実施例】
【００５２】
実施例１―多面的なθデフェンシンに固有の特性および抗炎症性
θデフェンシンは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の取込みを媒介する細胞外膜に小孔を形成することによってその細胞を死滅させる（２４）。この研究では、本発明者らは、θデフェンシンが多くのαデフェンシンおよびβデフェンシンとは異なり、宿主細胞に対して非毒性であり（２４）、各種経路でマウスに投与することができる（２９）という注目すべき事実を発見した。この点に関して、マウスは少なくとも用量８０ｍｇ／ｋｇの３種類の異なるθデフェンシンのｉ．ｖ．投与を容易に許容する。さらに本発明者らは、成体チンパンジー２個体にｉ．ｖ．用量を増加させて（最大３ｍｇ／ｋｇ）ＲＴＤ−１を投与した。すべての注射の後、いずれの項目にも臨床毒性は認められず、また臨床化学検査値および血液学検査値がすべて正常範囲内にあった。いずれの動物種もＲＴＤ−１に対する抗体を産生しなかったことは、様々な哺乳動物種に対する毒性および免疫原性の著明な欠如を示している。ここに挙げたデータおよびその他のデータに基づき、盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）により重度の敗血症を誘発したマウスモデルを用いて、ＲＴＤ−１の有効性を試験した（１２）。図２に示されるように、ＣＬＰ手術の４時間後または２４時間後にペプチドを投与した場合、ＲＴＤ−１（５ｍｇ／ｋｇ）の単回注射によりＢＡＬＢ／ｃマウスの死亡率が著明に減少した（第４日および第７日でＰ＜０．０１）。第７日に生存していた個体は、第１５日に屠殺されるまで臨床的に正常であった。θデフェンシンのＣＬＰ敗血症に対するこの治療効果は再現性が高いものであった（Ｎ＝５の実験）。しかし、多菌性敗血症のミクロビオームがきわめて大きいことから、θデフェンシンのこの有効性の高さは、このモデルでのＲＴＤ−１の有効性が主として抗菌作用によって媒介されたものではないことを示唆していた。むしろ、示された治療効果の高さは、さらに抗炎症機序により媒介されると考えられた。この可能性を検証するため、本発明者らは新たな実験を実施し、ＣＬＰマウスをＲＴＤ−１で治療したところ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＭＩＦを含めた多種多様な血清炎症性サイトカインの著明な減少がみられた。
【００５３】
ほかの研究では、天然のＡＭＰ（１０、１５）または設計された（１１）ＡＭＰが敗血症のげっ歯類モデルに有効であることが示されている。いずれの場合にも、明らかな防御機序は、ペプチドが細菌ＬＰＳと結合して、宿主細胞のタンパク質（ＬＰＳ結合タンパク質）または受容体（ＴＬＲ−４、ＣＤ１４）との相互作用を回避するというものであった。この点に関して、分析したＡＭＰのほぼすべてがＬＰＳと結合して中和することが示されたが、このことは、これが抗敗血症活性を媒介する主要な機序であるという結論を裏付けるものである（１９）。
【００５４】
しかし、θデフェンシンはＬＰＳを直接中和する効果が比較的低く、内毒素を中和する活性がポリミキシンＢより１００倍低い。むしろ、以下で述べるように、θデフェンシンが、宿主細胞との相互作用によって炎症を調節する主要な手段を含めた複数の機能を有することが研究により明らかになっている。この発見は、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）間質性肺炎のマウスモデルを用いてＲＴＤ−１の有効性を評価したこれまでの研究結果と一致する（２９）。この研究では、本発明者らは、ＲＴＤ−１の鼻腔内投与がウイルス感染マウスの死亡を防ぐのに１００％有効であることを発見した。ＲＴＤ−１がＳＡＲＳ−ＣｏＶに対して殺ウイルス作用を示さなかったことは重要である。しかし、ペプチド投与により肺の炎症および数種類の炎症誘発性サイトカインの発現が減少したことから、治療効果がＲＴＤ−１の抗炎症性によって媒介されることが示唆された。特定の理論に束縛されるものではないが、θデフェンシンが炎症誘発性の刺激に対する宿主の応答を調節するという本発明者らの考えは、ＲＴＤ−１がラットのプリスタン誘発性関節炎（図９；以下で述べる）およびコラーゲン誘導性関節炎の治療に有効であることを示すさらなる実験によって確認された。
【００５５】
実施例２―ＲＴＤ−１の活性は、抗微生物作用ではなく宿主細胞の相互作用によって媒介される。
典型的なθデフェンシンＲＴＤ−１が、抗微生物作用を介してではなく、宿主細胞との相互作用によってその抗炎症効果を発揮することが、複数のデータにより示されている（２９）。これらの知見をもとに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）で刺激したヒト全血によるＴＮＦ−α産生に及ぼすＲＴＤの効果を評価するさらなる実験を実施した。図４（ＢおよびＣ）に示した代表的な実験では、ＲＴＤ１〜５（図４Ａ）が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によって誘発されるＴＮＦ−α放出を阻害することが示されている；異なるθデフェンシンの間にも阻害能力の著しい差がみられることに留意されたい。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を用いた実験でもほぼ同じ結果が得られた。対照実験では、本発明者らは、θデフェンシンがＥＬＩＳＡ標準曲線を変化させないこと、またイムノアッセイでは活性な三量体ＴＮＦ−αのみが検出されることを示す結果に基づき、θデフェンシンは他の多くのデフェンシンとは異なり、ＴＮＦ−αタンパク質と直接相互作用しないということを発見した。ここに挙げた実験およびその他の実験の結果は、ＲＴＤ−１のＣＬＰ敗血症における防御作用（図３）が、抗微生物作用ではなく免疫調節活性によるものであることを示唆していた。この結果を受けて、本発明者らは、１０μｇ／ｍｌのＲＴＤ−１を同時に加えて、あるいは加えずに、ヒト末梢血白血球（ＰＢＬ）をＴＬＲ１〜９のアゴニストで４時間刺激した。図５に示されるように、ＰＢＬとＲＴＤ−１を共インキュベートしたところ、ＴＬＲ２、４、５および８のアゴニストによって誘発されるＴＮＦ−α放出が著明に減少した。さらに、ＲＴＤ−１は、各アゴニストによって刺激されるＩＬ−１βおよび１Ｌ−６の放出も阻害し、ＩＬ−８は、ＴＬＲ２アゴニストの存在下を除くすべての誘発において強力に阻害された。ＲＴＤ−１は、無刺激細胞には実質的にいかなる効果も示さなかった（図５、左上のパネル）。ＲＴＤ−１治療のＭＣＰ−１レベルに対する効果には差がみられた。本発明者らは、マウスＳＡＲＳ間質性肺炎でＲＴＤ−１が肺ＭＣＰ−１レベルを著明に減少させたことから（２９）、このケモカインを分析に含めた。これは、ウイルスｓｓＲＮＡで刺激したＰＢＬに及ぼすＲＴＤ−１の効果と一致している（図５）。最後に、本発明者らはさらに、ＲＴＤ−１が、ｅｘ  ｖｉｖｏでエンテロトキシン産生黄色ブドウ菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）により刺激したヒトＰＢＭＣによる１Ｌ−１７Ａの発現を用量依存性に抑制する（８５％を上回る減少）ことを発見した。
【００５６】
実施例３―θデフェンシンによるＴＡＣＥの阻害
ここに挙げた結果は、θデフェンシンが細菌（図４）、各種ＴＬＲアゴニスト（図５）および動物で測定されたもの（上を参照）によって誘発されたＴＮＦ−αの阻害を媒介することを示していることから、ＴＮＦ−α変換酵素の活性がθデフェンシンによって打ち消されるという１つの作用機序が考えられた。このＴＮＦ−α変換酵素（「ＴＡＣＥ」、ＡＤＡＭ（ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）ファミリー）のメンバー、ＡＤＡＭ１７としても知られる）は、膜結合ＴＮＦ−αの放出に関与するシェダーゼである。驚くべきことに、本発明者らは、ＲＴＤ−１が、ＩＣ５０約０．１μｇ／ｍｌ（４８ｎＭ）の強力な組換えＴＡＣＥ（ｒＴＡＣＥ）の阻害剤であることを発見した。注目すべきことは、ヒトαデフェンシン（ＨＮＰ−２、ＨＮＰ−４）がいずれもｒＴＡＣＥを阻害しないという点で（図６Ａ）、θデフェンシンの活性がデフェンシンのなかでも独特なものであったということである。天然のθデフェンシン（ＲＴＤ１〜５；図４Ａの構造）の相対的阻害活性を試験したところ、ＩＣ５０値に約１０倍の範囲にわたる差がみられた（図６Ｂ）。注目すべきことは、ＲＴＤ１〜５によるＴＡＣＥ阻害の序列とヒト血液中のペプチドによるＴＮＦ−α阻害との間に強い相関がみられるということである（図４Ｃ）。ＲＴＤ−１によるＴＡＣＥ阻害がＴＡＣＥとの１５分間のプレインキュベーションによって増強されなかったという結果は、迅速な結合および競合阻害を示唆するものである。このことは酵素反応速度データの二重逆数プロット解析によって確認され（図６Ｃ）、ＲＴＤ−１がＴＡＣＥの偽基質として作用することを示している。ＲＴＤ−１の開鎖類似体（Ｓ−７；図６Ｄ）をＴＡＣＥ阻害について試験し、活性がＲＴＤ−１の２０％未満であることがわかったが、このことは、効果的なＴＡＣＥ阻害に環状構造が必要であることを示している（図６Ｅ）。
【００５７】
細胞ベースのアッセイでＴＡＣＥの阻害をさらに確認した。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｉｇｌｅｓｉａｓら（１）によって記載されているアッセイを修正して用いて、ＲＴＤ−１が休止ＴＨＰ−１細胞およびＬＰＳ刺激ＴＨＰ−１細胞のＴＡＣＥ発現を阻害することが示された（図６Ｆ）。細胞ベースのアッセイで得られたＲＴＤ−１のＩＣ５０は約１５μｇ／ｍｌ（７．４μＭ）であった。この値は、ＴＨＰ−１細胞のＴＡＣＥ遮断に関する研究での小分子ＴＡＣＥ阻害剤ＧＭ６００１のＩＣ５０（５．５±３μＭ）に決して劣るものではない。
【００５８】
実施例４―θデフェンシンはＡＤＡＭ１０を阻害する
各種ＡＤＡＭが、膜に固定された増殖因子、サイトカインおよび受容体を解離する調節シェダーゼに関係があるとされている（３）。ＡＤＡＭは、炎症および癌の調節を含めた多数の重要な生物学的過程に関与することから、ＡＤＡＭ阻害剤の同定は研究の盛んな分野となっている。本発明者らは、天然のθデフェンシンＲＴＤ１〜３が、ＴＡＣＥの阻害で観察されたものとほぼ同じＩＣ５０（図６を参照）でＡＤＡＭ１０を阻害する（図７）ことを確認した。したがって、θデフェンシンは少なくとも２種類のＡＤＡＭのメタロプロテアーゼ阻害剤である。
【００５９】
実施例５―ミニθデフェンシンによる抗ＴＮＦ−αおよびＴＡＣＥ阻害
天然θデフェンシンおよび修飾θデフェンシンの構造活性解析から、これらのペプチドの抗炎症作用を媒介すると予測される特定の配列特性が示唆された。一例をあげると、天然θデフェンシンの抗炎症作用に重要であると考えられる特性をもつよう３種類のテトラデカペプチド（ミニθデフェンシン）を設計した。これらを図８Ａに示すペプチドの配列中に組み込んだ。各ペプチドをマウスＣＬＰ敗血症に対する有効性について評価した。図８Ｂに示されるように、ミニθデフェンシン３種類ともＰＢＳ偽治療よりマウスの致死率を低下させた。本発明者らはさらに、刺激したヒト血液からのＴＮＦ−α放出に及ぼす効果（図８Ｃ）およびＴＡＣＥに対する阻害活性（図８Ｄ）について各ミニθデフェンシンを評価した。図８のデータに示されるように、ミニθデフェンシンは、ＣＬＰアッセイ（図３と比較）、ＴＮＦ−α阻害アッセイ（図８Ｃ）またはＴＡＣＥ阻害アッセイ（図８Ｄ）でＲＴＤ−１とほぼ同じか、これを上回る活性を示した。
【００６０】
成熟θデフェンシンペプチドＲＴＤ−１は、αデフェンシンおよびβデフェンシンと同様に３つのジスルフィドによって安定化された２本鎖のベータシートである。しかし、ＲＴＤ−１ジスルフィド配列の平行配向により、その短軸付近には相当な柔軟性がみられる。αデフェンシンおよびβデフェンシンとは異なり、ＲＴＤ−１には両親媒性のトポロジーがなく、いかなる理論にも束縛されるものではないが、このようなおよびこれと同様の構造の差により、θデフェンシンに固有の免疫調節能力が説明され得る。
【００６１】
実施例６―ラットプリスタン誘発性関節炎（ＰＩＡ）におけるθデフェンシンの効果
本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでのθデフェンシンによるＴＮＦ−αの遮断がこのペプチドの抗炎症作用の中心的な役割を担っているとすれば、ＴＮＦ−αによって進むことが知られている疾患の経過を調節するはずであると考えた。本発明者らは次に、確立されたＰＩＡを有するラットに及ぼすＲＴＤ−１の効果を試験した。代表的な実験（Ｎ＝３）では、Ｖｉｎｇｓｂｏら（２６）に記載されている通りに、第０日にプリスタン０．３ｍｌを成体Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ；ＯｌａＨｓｄ系統）ラット（Ｎ＝２１）に皮下注射した。臨床疾患の最初の徴候がみられた時点（第１４〜２１日；肉眼的病理スケールに基づく参考文献（４））で、ラットを生理食塩水群（Ｎ＝１０）またはＲＴＤ−１治療群（Ｎ＝１１）に交互に割り付けた。関節炎の重症度（３人の観察者によって最大３６日間、毎日盲検的に採点）が以前のゼロに戻るまで（生理食塩水群ではＮ＝１；ＲＴＤ−１群ではＮ＝８）最大１４日間、毎日、尾静脈注射によって生理食塩水（０．２〜０．２５ｍｌ）またはＲＴＤ−１（０．２〜０．２５ｍｌ生理食塩水中５ｍｇ／ｋｇ）の盲検投与を実施した。第７日からＲＴＤ−１治療個体に関節病理の統計的に有意な（＊＝不対両側ＳｔｕｄｅｎｔＴ検定によりｐ≦０．０５）減少がみられた。このモデルではこのほか、同じＲＴＤ＝Ｔの用量および製剤の皮下注射によって効果が示された。治療中止後少なくとも４５日間、疾患再発の証拠はみられなかった。
【００６２】
実施例７―θデフェンシンは安定性が高い
θデフェンシン  ＲＴＤ−１をヒト血漿、ヒト血清中５０μｇ／ｍｌまたはヒト血清アルブミン中５０ｍｇ／ｍｌ、室温で７２時間インキュベートした。定量ＨＰＬＣ分析を実施したところ、各試験条件下でペプチドの９５％超が変化しなかった。さらにθデフェンシンは、低ｐＨ（約ｐＨ２．５）または中性ｐＨ（ｐＨ７．４）条件下での長期間保管に対しても安定である。
【００６３】
総括すると、θデフェンシンには、炎症誘発性のＴＡＣＥなどのプロテアーゼおよびその他の金属酵素の遮断によって媒介される抗炎症特性がある。θデフェンシンは、感染性の炎症性疾患および非感染性の炎症性疾患の動物モデルにおいて有効であり、全身投与時に高い耐容性が認められ、非免疫原性である。さらに、他の抗炎症薬とは異なり、θデフェンシンは免疫抑制性ではない。
【００６４】
薬物組成物、用量、剤形および投与経路
本発明による組成物は経口経路、非経口経路、吸入による経路、局所経路、直腸内経路、経鼻経路または埋め込みリザーバーを介した経路を含めた各種経路を用いて投与することができ、ここでは、本明細書で使用される「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、髄腔内、肝内、病巣内および頭蓋内への各投与（通常は注射または注入）を包含する。好ましくは、組成物を経口的に、皮下に、腹腔内にまたは静脈内に投与する。
【００６５】
例えば、企図される化合物の無菌注射用形態は、水溶液剤または油性懸濁剤であり得る。この懸濁剤は当該技術分野で公知の技術に従い、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて製剤化され得る。また無菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒を用いた無菌注射用液または無菌注射用懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオールの溶液として調製され得る。許容される賦形剤および溶媒のなかでも特に企図される液体としては、水、リンガー溶液および等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、共溶媒または（例えば、天然または合成のモノグリセリドまたはジグリセリド）として無菌の不揮発性油を用いてもよい。このほか脂肪酸を用いてもよく、適切な脂肪酸としては、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体、オリーブ油、ヒマシ油、特にこれらをポリオキシエチル化したものが挙げられる。このような油性液剤または懸濁剤は、長鎖アルコール希釈剤または分散剤をさらに含有し得る。
【００６６】
別の例では、企図される化合物をカプセル剤、錠剤、水性懸濁剤または液剤を含めた任意の経口的に許容される剤形で経口投与し得る。経口使用の錠剤の場合、あらゆる薬学的に許容される担体（例えば、ラクトース、コーンスターチなど）が適切であると考えられる。同様に、各種滑沢剤を添加し得る（例えば、ステアリン酸マグネシウム）。カプセル形態の経口投与には、有用な希釈剤としてラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。経口使用に水性懸濁剤が必要な場合、有効成分を乳化剤および懸濁化剤と組み合わせる。このほか必要に応じて、特定の甘味剤、香味剤または着色剤を添加してもよい。
【００６７】
特に治療標的が眼球、皮膚、下部腸管または外科的介入時に露出する領域の疾患を含めた、局所適用によって容易に到達できる領域または器官を含む場合、本発明の医薬組成物を局所投与し得ることが考慮される。当該技術分野で公知の局所製剤が多数存在し、このような製剤はすべて、本明細書での使用に適するものであると考えられる。
【００６８】
局所適用では、１種類以上の担体中に懸濁または溶解した有効成分を含有する適切な軟膏として、企図される組成物を製剤化し得る。本発明の化合物を局所投与するための担体としては、鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ロウおよび水が挙げられる。あるいは、１つ以上の薬学的に許容される担体に懸濁または溶解した有効成分を含有する適切なローションまたはクリームとして、医薬組成物を製剤化することができる。適切な担体としては、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が挙げられる。
【００６９】
本発明による医薬組成物はほかにも、経鼻エアロゾルまたは吸入によって投与することができる。このような組成物は医薬製剤の分野で周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコールもしくはその他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを増大させる吸収促進剤、フッ化炭素および／またはその他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を用いて生理食塩水溶液として調製され得る。
【００７０】
組成物中の企図される化合物の量については、具体的な量は通常、具体的な製剤、有効成分および所望の目的によって決まることを認識するべきである。したがって、企図される化合物の量に大きな差がみられることを認識するべきである。しかし一般的には、化合物は、治療効果をもたらし、かつ／あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで可視化するのに有効な最小量で存在するのが好ましい。
【００７１】
したがって、ほとんどの好適な液体製剤では、企図される化合物が約２０ｍｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍｌの量、より一般的には典型的には約２４ｍｇ／ｍｌ〜約２６ｍｇ／ｍｌの量、最も一般的には約２５ｍｇ／ｍｌの量で存在する。製剤が固体またはゲルである場合、企図される化合物が約１ｍｇ／ｇ〜約１００ｍｇ／ｇの量で存在する。投与単位については一般に、所望の治療効果を得るのに有効な用量あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで可視化するのに有効な用量で、企図される化合物を投与することが考慮される。
【００７２】
ヒトおよび非ヒト哺乳動物では、企図される化合物の適切な用量が約１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内に収まるべきである。
【００７３】
炎症性疾患の治療および／または予防には一般に、本発明による化合物または組成物を薬学的に許容される方法で製剤化することが好ましい。適切な製剤としては、好ましくは前眼房および／または後眼房内に注射するための液体製剤または側頭骨の半規管、蝸牛および／または骨迷路内に注射するための液体製剤が挙げられる。上記の代わりにまたは上記に加えて、担体が治療有効量の化合物または組成物を含むよう、また担体が化合物または組成物を制御され予め定められた様式で放出できるよう植え込み可能な担体（例えば、生分解性／溶解性のもの）を製剤化してもよい。適切な担体のなかでも、放出は経時的なものおよび／または１種類以上の波長の光を照射されることによって開始されるものであり得る。
【００７４】
本発明による医薬組成物が少なくとも１つの企図される化合物（例えば、ＲＴＤ−１−２７、ＲＴＤ１−２８およびＲＴＤ−１−２９のうちの１つ以上）を薬学的に許容される担体とともに含むことが考慮される。具体的な使用に応じて、製剤、経路および／または投与スケジュールが大きく異なることが認識されるべきであり、また特定の製剤、経路および／または投与が本発明を限定するものではないことが一般に考慮される。
【００７５】
しかし、医薬組成物の投与量には大きな差がみられ、具体的な用量が、少なくとも部分的には（ａ）所望の治療反応を得るのに有効な有効成分の量、（ｂ）企図される化合物の製剤、（ｃ）投与経路、（ｄ）具体的な化合物の薬物動態特性および薬力学特性ならびに（ｅ）治療する患者の年齢、性別、体重、全般的健康状態およびこれまでの既往歴を含めたその他の因子によって決まることを理解するべきである。当業者であれば必要な有効量の医薬組成物を容易に決定し処方することができ、例えば、医師であれば、所望の治療効果に通常必要とされるレベルより低いレベルで患者に投与を開始し、その後、所望の効果が得られるまで用量を増加させるであろう。
【００７６】
一般に、本発明による化合物は非経口使用のための製剤として調製され得るものであり、特に企図される非経口製剤が注射用の液体製剤であることが考慮される。したがって、適切な製剤は一般に、薬学的に許容される溶媒（例えば、無菌の等張水溶液または非水溶液）を含み、分散液、懸濁液または乳液として調製され得るものである。あるいは、非経口製剤を、企図される化合物と他の成分とを含み、使用前に液体製品に再構成され得るキットとして提供してもよい。さらなる企図される態様では、本発明による化合物を、宿主細胞内で化合物が発現できる方法で組換え核酸として投与してもよい。例えば、アデノウイルスベクター、脂質もしくはリポソームを用いるトランスフェクション、エレクトロポレーションまたはその他の当該技術分野で周知の方法を介して、組換え核酸を標的組織に投与することができる。
【００７７】
医薬組成物に使用し得る適切な水性担体および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物、植物油ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。例えば、レシチンなどのコーティング物質を使用することにより、分散液剤の場合は必要な粒子径を維持することにより、また界面活性剤を使用することにより、適切な流動性を維持することができる。最も一般的には、適切な液体は無菌であり、有効成分の安定性および注射部位またはその他の使用に適したｐＨが維持されるよう緩衝されている。
【００７８】
企図される化合物を薬学的に許容される塩（１つまたは複数）として調製することができ、このような塩としては特に、企図される化合物中に存在し得る酸性基または塩基性基の塩が挙げられる。例えば、本来塩基性の企図される化合物は、各種無機酸および有機酸と多種多様な塩を形成し得る。適切な塩からは薬理学的に許容される陰イオンが生じ、このような陰イオンとしては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸、硫酸、硫酸水素、リン酸、酸性リン酸、イソニコチン酸、酢酸、乳酸、サリチル酸、クエン酸、酸クエン酸、酒石酸、パントテン酸、酒石酸水素、アスコルビン酸、コハク酸、マレイン酸、ゲンチジン酸、フマル酸、グルコン酸、グルカロン酸イオン（ｇｌｕｃａｒｏｎａｔｅ）、サッカリン酸、ギ酸、安息香酸、グルタミン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸およびパモ酸［１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトアート）］の各陰イオンが挙げられる。同様に、本来酸性の化合物は、各種薬理学的に許容される陽イオンと塩基性塩を形成することができ、特に適切な陽イオンとしては、アルカリ金属またはアルカリ土類金属のイオン（例えば、ナトリウム陽イオンおよびカリウム陽イオン）が挙げられる。
【００７９】
さらに、本発明による化合物がプロドラッグとしても調製され得ることが特に考慮され、このようなプロドラッグが標的器官または標的細胞での薬物（またはプロドラッグの代謝産物）の濃度を増大させる限り、プロドラッグのあらゆる既知の様式およびタイプが本明細書での使用に適するものであると考えられる。
【００８０】
例えば、化合物が遊離のアミノ基、アミド基、ヒドロキシ基，チオ基またはカルボキシル基が有する場合、このような基を用いて、薬物をプロドラッグに変換する部分と共有結合させるか、放出可能なように結合させることが可能であることが考慮される。したがって、プロドラッグとしては特に、企図される化合物が別の切断可能な部分とエステル結合、アミド結合またはジスルフィド結合を形成するプロドラッグが挙げられる。このような部分は薬物の器官または細胞に特異的な送達を補助し得るものであり、例えば、カルボキシル基を誘導体化し、エーテル基、アミン基および／またはカルボン酸基を含み得るアミドエステルまたはアルキルエステルを形成することができる。Ｄ．Ｆｉｅｉｓｈｅｒ，Ｒ．Ｂｏｎｇ，Ｂ．Ｈ．Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ４０  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９６）１９，１１５に概説されている通りに、ヘミスクシナート、リン酸エステル、ジメチルアミノアセタートおよびホスホリルオキシメチルオキシカルボニルを用いて遊離ヒドロキシ基を誘導体化することができる。ヒドロキシ基の炭酸エステルプロドラッグおよび硫酸エステルと同様に、ヒドロキシ基およびアミノ基のカルバミン酸エステルプロドラッグも挙げられる。アシル基がアルキルエステル（任意選択で置換されている）であり得る、あるいはアシル基がアミノ酸エステルである（アシルオキシ）メチルおよび（アシルオキシ）エチルエーテルとしてのヒドロキシ基の誘導体化も考慮される（このタイプのプロドラッグはＲ．Ｐ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，Ｊ，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６）３９：ｐ．１０に記載されている）。
【００８１】
このほかさらに、企図される化合物が細胞内または細胞外区画で代謝され、このような代謝産物が同じ薬理効果を示すこともあれば、異なる薬理効果を示すこともあることを認識するべきである。例えば、企図される化合物がリン酸化されて、親化合物より活性が高くなることがある。逆に、還元またはグリコシル化が企図される化合物のバイオアベイラビリティに影響を及ぼすこともある。したがって、企図される化合物には、上記の化合物ほかにその代謝産物も含まれる。
【００８２】
諸記
上記の各種方法および技術は、本発明に関連する方法を実施する方法を多数提供するものである。当然のことながら、記載されている目的または利点が、本明細書に記載の任意の特定の実施形態に従えば必ずしも達成されるわけではないということを理解するべきである。したがって、例えば、本明細書で教示または示唆され得る他の目的または利点の達成を必ずしも必要とすることなく、本明細書で教示されるような１つの利点または一群の利点を達成する、または最大限に活用する方法でこれらの方法を実施することができることを当業者は認識するであろう。本明細書では、様々な有利な代替物および不利な代替物が挙げられている。好ましい実施形態にも、１つの、別のまたは複数の有利な特徴を特に含むものがあり、１つの、別のまたは複数の不利な特徴を特に除外するものがあり、さらには１つの、別のまたは複数の有利な特徴を含むことによって既存の不利な特徴を軽減するものもあることを理解するべきである。
【００８３】
さらに、当業者は様々な実施形態の各種特徴の適用性を認識するであろう。同様に、上述の各種要素、特徴および段階ならびにこのような要素、特徴または段階それぞれの他の既知の同等物は、当業者が組み合わせ適合させて、本明細書に記載の原理に従った方法を実施することが可能なものある。各種要素、特徴および段階のうち、多様な実施形態において特に含まれるものもあれば、特に除外されるものもある。
【００８４】
本発明は、特定の実施形態および実施例に照らして開示されているが、当業者には、本発明の実施形態が、具体的に開示されている実施形態にとどまらず他の代替的な実施形態および／または使用ならびにその修正形態および均等物に及ぶことが理解されよう。
【００８５】
本発明の実施形態には変形形態および代替要素が多数開示されている。当業者にはさらにほかの変形形態および代替要素が明らかになるであろう。このような変形形態には、特に限定されないが、θデフェンシンを含めた環状ペプチドの入手源、θデフェンシン、その類似体および誘導体を調製する、単離するまたは精製する方法、θデフェンシン、その類似体および誘導体を用いて各種疾患および／または病態を治療する方法、そこで使用する技術および溶液の組成と使用ならびに本明細書の教示によって作製される製品の特定の使用が含まれる。各種実施形態には、このような変形形態または要素のいずれかが特に含まれることも、除外されることもある。
【００８６】
いくつかの実施形態では、特定の実施形態を説明し特許請求するのに使用され、成分量、濃度、反応条件のような特性などを表す数値が、「約」という用語によって修飾される場合があることを理解するべきである。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載されている数値パラメータは、特定の実施形態によって得ようとする所望の特性によって大きく異なり得る近似値である。いくつかの実施形態では、報告される有効数字の桁数を考慮し、通常の四捨五入法を適用することによって数値パラメータを解釈するべきである。いくつかの実施形態の広い範囲を記載する数値の範囲およびパラメータは近似値であるが、特定の実施例に記載されている数値は、実行可能な程度に正確に報告されている。いくつかの実施形態では示される数値には、個々の試験測定結果にみられる標準偏差から必然的に生じる一定の誤差が含まれ得る。
【００８７】
本明細書の記述および後の請求項全体で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」の意味には、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、複数形の指示対象が含まれる。同様に、本明細書の記述で使用される場合、「ｉｎ」の意味には、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、「ｉｎ」と「ｏｎ」が含まれる。
【００８８】
本明細書における数値の範囲の記載は、単にその範囲内にある個々の数値を個別に明記する簡便な方法として用いることを意図したものである。本明細書で特に明示されない限り、個々の数値については、それが本明細書に個々に記載された場合と同様に本明細書に組み込まれるものとする。本明細書に記載の方法はすべて、本明細書に特に明示されない限り、あるいは文脈上明らかに否定されない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書の特定の実施形態について記載されるあらゆる実施例または例示語（例えば、「〜などの」）の使用は、単に本発明の理解を容易にすることを意図するものであり、特許請求される発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいずれの言葉も、特許請求される発明の実施に不可欠な特許請求されていない任意の要素を示すものとして解釈されるべきではない。
【００８９】
本明細書に開示される本発明の択一的な要素または実施形態の分類は、限定的なものであると解釈されるべきではない。各グループのメンバーが個別に言及され特許請求される場合もあれば、グループ内の他のメンバーまたは本明細書に記載されている他の要素と任意に組み合わされて特許請求される場合もある。利便性および／または特許性を理由に、グループの１つ以上のメンバーがグループに包含されるか、グループから削除されることがある。このような何らかの包含または削除が生じた場合、本明細書は、修正され添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのマーカッシュ群の記載事項を満たすグループを含むものと見なされる。
【００９０】
本発明の好ましい実施形態は、特許請求される発明を実施するための、本発明者らが知る最良の形態を含めて本明細書に記載されている。前述の説明を読めば、このような好ましい実施形態に対する変更が当業者に明らかとなるであろう。当業者が必要に応じてこのような変更を用いることが可能であり、特許請求される発明を本明細書に具体的に記載されている以外の方法で実施することが可能であることが考慮される。したがって、特許請求される発明は、準拠法よって認められる、記載されている対象物のあらゆる修正物および同等物を包含するものとして解釈されるべきである。さらに、本明細書に特に明示されない限り、あるいは文脈上明らかに否定されない限り、上記要素をそのあらゆる可能な変更形態で任意に組み合わせたものが、対応する特許請求される発明に包含される。
【００９１】
さらに、本明細書全体を通して特許および刊行物が多数参照されている。上で引用された参考文献および刊行物はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【００９２】
本明細書に開示される実施形態は、本発明の原理を説明するものであることを理解するべきである。したがって、特に限定されないが、具体例を挙げれば、本明細書の教示に従って本発明の代わりとなる立体配置を用いることができる。したがって、本発明の実施形態は、図示され記載されている通りのものに限定されるわけではない。
【００９３】
本願は、以下の発明をも包含する。
（１）
薬物組成物を販売する方法であって、
前記薬物組成物がθデフェンシン、その類似体または誘導体を含み、
前記方法が、
前記薬物組成物の有効性をヒトにおける抗炎症性効果に関して判定することと、
炎症性病態を治療するために前記薬物組成物を市場に提供することと
を含む方法。
（２）
前記薬物組成物がＲＴＤ−１−２７である、（１）に記載の方法。
（３）
前記薬物組成物がＲＴＤ−１−２８である、（１）に記載の方法。
（４）
前記薬物組成物がＲＴＤ−１−２９である、（１）に記載の方法。
（５）
前記有効性を判定する段階が、前記薬物組成物に関する毒性試験、有効性試験および用量反応試験のうちの少なくとも１つを依頼することを含む、（１）に記載の方法。
（６）
前記有効性を判定する段階が、前記薬物組成物に関する毒性実験、有効性試験および用量反応試験のうちの少なくとも１つに関して別の者によって得られたデータを利用することを含む、（１）に記載の方法。
（７）
前記炎症性効果が、臨床的に意義のある炎症誘発性プロテアーゼの阻害を含む、（１）に記載の方法。
（８）
前記炎症誘発性プロテアーゼが腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）変換酵素（ＴＡＣＥ）である、（７）に記載の方法。
（９）
前記炎症性効果が、臨床的に意義のある炎症誘発性プロテアーゼの阻害を含む、（１）に記載の方法。
（１０）
前記炎症性効果が、臨床的に意義のあるシェダーゼの阻害を含む、（１）（１）に記載の方法。
（１１）
前記炎症性効果が、臨床的に意義のあるカテプシンＣの阻害を含む、（１）に記載の方法。
（１２）
前記薬物組成物を市場に提供する段階が、販売のために前記薬物組成物を少なくとも１キログラム生産することを含む、（１）に記載の方法。
（１３）
前記生産する段階が、前記薬物組成物を少なくとも１キログラム製造することを含む、（１２）に記載の方法。
（１４）
前記薬物組成物を経口製剤として包装することをさらに含む、（１）に記載の方法。
（１５）
前記炎症性病態がタンパク質分解による疾患である、（１）に記載の方法。
（１６）
前記炎症性病態が関節リウマチを含む、（１）に記載の方法。
（１７）
前記炎症性病態が自己免疫疾患を含む、（１）に記載の方法。
（１８）
前記薬物組成物を癌の治療薬として販売することをさらに含む、（１）に記載の方法。
（１９）
前記薬物組成物を神経変性疾患の治療薬として販売することをさらに含む、（１）に記載の方法。
（２０）
前記薬物組成物を炎症性腸疾患の治療薬として販売することをさらに含む、（１）に記載の方法。
（２１）
前記薬物組成物をアルツハイマー病の治療薬として販売することをさらに含む、（１）に記載の方法。
（２２）
前記薬物組成物を変形性関節症の治療薬として販売することをさらに含む、（１）に記載の方法。
（２３）
抗ＴＮＦ−α療法に奏効しない患者を治療するために前記薬物組成物を販売することをさらに含む、（１）に記載の方法。
（２４）
動物に投与して炎症性病態を治療するための薬剤を製造する方法であって、前記薬剤が、θデフェンシン、その類似体または誘導体のうちの少なくとも１つを含む方法。
（２５）
前記薬剤が、ＲＴＤ−１−２７、ＲＴＤ−１−２８およびＲＴＤ−１−２９のうちの少なくとも１つを含む、（２４）に記載の方法。
（２６）
前記薬剤が、臨床的に意義のある炎症誘発性プロテアーゼの阻害をもたらすのに有効である、（２４）に記載の方法。
（２７）
前記炎症誘発性プロテアーゼが腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）変換酵素（ＴＡＣＥ）である、（２６）に記載の方法。
（２８）
前記薬剤が、臨床的に意義のある炎症誘発性プロテアーゼの阻害をもたらすのに有効である、（２５）に記載の方法。
（２９）
前記薬剤が、臨床的に意義のあるシェダーゼの阻害をもたらすのに有効である、（２４）に記載の方法。
（３０）
前記炎症性病態が関節リウマチを含む、（２４）に記載の方法。
（３１）
前記炎症性病態が自己免疫疾患を含む、（２４）に記載の方法。
（３２）
前記薬物組成物を癌の治療薬として販売することをさらに含む、（２４）に記載の方法。
（３３）
前記薬物組成物を神経変性疾患の治療薬として販売することをさらに含む、（２４）に記載の方法。
【００９４】
本願は、以下の発明をも包含する。
(１）
必要とする対象において腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）変換酵素（ＴＡＣＥ）活性を阻害するために使用する薬剤組成物であって、
θデフェンシン、その類似体または誘導体を含み、
θデフェンシン、その類似体または誘導体が、必要とする対象においてＴＡＣＥ活性を阻害するのに有効な量で提供される、
薬物組成物。
(２）
θデフェンシン、その類似体または誘導体がθデフェンシン−１、θデフェンシン−１類似体、θデフェンシン−１誘導体、θデフェンシン−２、θデフェンシン−２類似体、θデフェンシン−２誘導体、θデフェンシン−３、θデフェンシン−３類似体、θデフェンシン−３誘導体、θデフェンシン−４、θデフェンシン−４類似体、θデフェンシン−４誘導体、θデフェンシン−５、θデフェンシン−５類似体、θデフェンシン−５誘導体、およびＲＴＤ−１からなる群より選択される、(１）に記載の薬物組成物。
(３）
θデフェンシン−１類似体がＲＴＤ−１−２８である、(１）に記載の薬物組成物。
(４）
θデフェンシン−１類似体がＲＴＤ−１−２８である、(１）に記載の薬物組成物。
(５）
θデフェンシン−−１類似体がＲＴＤ−１−２９である、(１）に記載の薬物組成物。
(６）
前記ＴＡＣＥ活性がシェダーゼ活性である、(１）に記載の薬物組成物。
(７）
前記薬物組成物が経口製剤である、(１）から（６）のいずれかに記載の薬物組成物。
(８）
過剰なＴＮＦ−α活性に関連する疾患を治療するための動物への投与のための医薬の製造方法であって、
前記医薬が、θデフェンシン、その類似体または誘導体の少なくとも１つをＴＡＣＥ活性を阻害するのに有効な量で含む、
方法。
(９）
θデフェンシン、その類似体または誘導体がθデフェンシン−１、θデフェンシン−１類似体、θデフェンシン−１誘導体、θデフェンシン−２、θデフェンシン−２類似体、θデフェンシン−２誘導体、θデフェンシン−３、θデフェンシン−３類似体、θデフェンシン−３誘導体、θデフェンシン−４、θデフェンシン−４類似体、θデフェンシン−４誘導体、θデフェンシン−５、θデフェンシン−５類似体、θデフェンシン−５誘導体、およびＲＴＤ−１からなる群より選択される、（８）に記載の方法。
(１０）
前記医薬がＲＴＤ−１−２７、ＲＴＤ−１−２８およびＲＴＤ−１−２９の少なくとも１つを含む、（８）に記載の方法。
(１１）
前記ＴＡＣＥ活性がシェダーゼ活性である、（８）に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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