(57)【要約】【課題】生体試料中の認知機能障害疾患のバイオマーカーを短時間で、特異的に且つ高感度に検出する技術を提供する。【解決手段】本発明に係る認知機能障害疾患バイオマーカーの検出方法では、生体試料に含まれる認知機能障害疾患バイオマーカーである１４種のペプチドから成る群から選択される少なくとの一つのペプチドを、ＭＳ／ＭＳ測定が可能な質量分析装置を用いてＭＲＭ（多重反応モニタリング）測定を行い、その結果に基づき前記ペプチドを定量する。この場合、各ペプチドについて、ＭＲＭ測定の測定条件としてプリカーサイオンの質量電荷比とプロダクトイオンの質量電荷比の組み合わせであるＭＲＭトランジションを予め記憶させておき、認知機能障害疾患バイオマーカーを検出するときは、そのＭＲＭトランジションを利用する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＳ／ＭＳ測定が可能な質量分析装置を用いて、生体試料に含まれる認知機能障害疾患バイオマーカーを対象とするＭＲＭ（多重反応モニタリング）測定を行い、その結果に基づき該認知機能障害疾患バイオマーカーを定量する方法であって、
前記認知機能障害疾患バイオマーカーが、
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる補体Ｃ４−Ａ由来ペプチドAD1008、
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる転写因子ＡＰ−２γ由来ペプチドAD1025、
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるオキシトシン受容体由来ペプチドAD1042、
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＥ３ユビキチンリガーゼＨＥＲＣ由来ペプチドAD1046、
配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるプロトロンビン由来ペプチドAD1048、
配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる補体Ｃ４由来ペプチドAD1049、
配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１６由来ペプチドADPEP109315、
配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるゲルソリン由来ペプチドADPEP421488、
配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるニューレキシン-２-βプリカーサー由来ペプチドADPEP1315、
配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるニューレキシン-１-β由来ペプチドADPEP12neu、
配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるプロトロンビンプリカーサー由来ペプチドADPEP1396、
配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるプロトロンビンプリカーサー由来ペプチドADPEP1039、
配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるプロトロンビンプリカーサー由来ペプチドADPEP1250、
配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるプロトカドヘリンγ由来ペプチドAD1389
からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを含み、
前記ＭＲＭ測定の測定条件の一つであるプリカーサイオンの質量電荷比とプロダクトイオンの質量電荷比の組み合わせであるＭＲＭトランジションが、
前記ペプチドAD1008について、646.05/763.95、646.05/410.25、もしくは646.05/615.35、
前記ペプチドAD1025について、538.95/534.25、538.95/484.75、もしくは538.95/541.25、
前記ペプチドAD1042について、520.75/449.70、520.75/401.20、もしくは520.75/801.40、
前記ペプチドAD1046について、856.90/720.25、856.90/993.55、もしくは856.90/555.35、
前記ペプチドAD1048について、776.00/1061.50、776.00/1036.45、もしくは776.00/1150.50、
前記ペプチドAD1049について、512.30/516.30、512.30/629.35、もしくは512.30/453.75、
前記ペプチドADPEP109315について、518.25/642.85、518.25/586.30、もしくは776.90/796.40、
前記ペプチドADPEP421488について、725.40/378.15、725.40/917.45、もしくは725.40/873.95、
前記ペプチドADPEP1315について、744.35/885.45、744.35/757.40、もしくは496.60/472.25、
前記ペプチドADPEP12neuについて、942.00/448.20、628.35/448.20、もしくは942.00/547.25、
前記ペプチドADPEP1396について、781.35/781.40、521.25/533.30、もしくは781.35/1072.50、
前記ペプチドADPEP1039について、638.80/1072.50、638.80/862.40、もしくは638.80/747.35、
前記ペプチドADPEP1250について、478.25/452.25、478.25/509.75、もしくは478.25/351.20、
前記ペプチドAD1089について、458.25/331.20、458.25/602.35、もしくは458.25/701.40
である、質量分析を用いた認知機能障害疾患バイオマーカーの定量方法。
【請求項２】
前記質量分析装置が、トリプル四重極型質量分析装置である請求項１に記載の質量分析を用いた認知機能障害疾患バイオマーカーの定量方法。
【請求項３】
請求項１に記載の認知機能障害疾患バイオマーカーの定量方法に用いられるトリプル四重極型質量分析装置であって、
配列番号が１〜１４までの１４種のペプチドのそれぞれについて、ＭＲＭ測定の際のＭＲＭトランジションを含む測定条件を記憶しておく測定条件記憶部と、
前記測定条件記憶部に記憶されている測定条件を利用して、前記１４種のペプチドについてＭＲＭ測定を実行させる測定実行部とを備える質量分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析を用いて複数種のペプチドを定量することにより認知機能障害疾患のバイオマーカーを検出し定量する方法及び質量分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病を主とする認知機能障害疾患は、患者の記憶能力や認知能力の低下を引き起こす疾患であり、１０〜２０年を経て徐々に、且つ連続的に病状が進行する。病状が進行した高度の認知機能障害疾患では、記憶機能や認知機能の喪失だけでなく人格の崩壊を引き起こし、患者の社会生活機能を喪失させてしまうことから、有効な治療薬の開発が望まれている。
【０００３】
我が国では、１９９９年にアルツハイマー型認知症の治療薬として認可されたアセチルコリンエステラーゼ阻害薬である塩酸ドネペジル（donepezil）を初め、いくつかの治療薬が開発され使用されているが、いずれの治療薬も症状の進行を遅らせるものであって、低下した機能を回復させるものではない。従って、現状の治療薬をより有効なものとするためには、認知機能障害疾患を早期の段階で発見することが望ましい。
【０００４】
認知機能障害疾患の診断に用いられている主な方法として以下の３つが挙げられる。
（１）問診による診断
これは、見当識（現在の年月や時刻、自分がどこにいるかといった基本的な状況把握）や記憶力、計算力、言語力を専門臨床医が問診し、その結果に基づき診断する方法である。Mini-Mental State Examination (MMSE)、長谷川式簡易知能評価スケール（HSD-R）、ウエクセラ成人用知能検査第三版 (WAIS-III)などがある。
（２）画像診断法
これは、PET（Positron Emission Tomogoraphy）やSPECT（Single Photon Emission CT (Computed Tomography)）などによって脳の血流量や糖代謝を調べ、その結果に基づき診断する方法である。
（３） バイオマーカー検査
これは、脳脊髄液中の総tau（t-tau）やアミロイドβペプチドの存在量、存在比率を調べ、その結果に基づき診断する方法である。
【０００５】
（１）の方法は通常、認知機能障害疾患のスクリーニングの目的で用いられ、確定的な診断に至ることはない。また、HSD-R、MMSEでは重症度に分類される認知機能障害疾患の患者を診断することができない（非特許文献１）。（２）の方法は特殊な且つ高価な設備を用いる必要があり、全ての医療機関で実施することは難しい。さらに、（１）及び（２）の方法はいずれも、担当医師によって診断結果が異なることがあり、客観性に欠ける。
（３）の方法は診断感度が高く、客観的な診断が可能であるものの、脳脊髄液の採取は技術的に難しく、普及していないのが実状である。
【０００６】
これに対して、比較的容易に取得できる生体試料である血液（血清、血漿を含む）に含まれる複数種の特定のタンパク質又は該タンパク質から生じるペプチドの含有量が、認知機能障害疾患の患者（認知機能障害疾患被検者）と認知機能障害疾患に罹患していない者（非認知機能障害被検者）との間で差がみられることが見出され、それらのタンパク質又はペプチドをバイオマーカーとして認知機能障害疾患を検出する方法が検討されている(特許文献１〜６）。これらのバイオマーカーの中には、認知機能障害疾患被検者と非認知機能障害被検者の間だけでなく、認知機能障害疾患の進行度によっても含有量に差異がみられるものが含まれることから、該バイオマーカーの含有量の測定は、認知機能障害疾患の早期診断や該疾患の症状の進行度の判定に有効な方法として期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2010-271078号公報
【特許文献２】特開2012-037349号公報
【特許文献３】特開2012-132808号公報
【特許文献４】特開2016-028243号公報
【特許文献５】特開2016-028244号公報
【特許文献６】国際公開WO2014/207888
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】中野今治、水澤英洋編集「よくわかるアルツハイマー病−実際にかかわる人のために」永井書店、2004年4月
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
認知機能障害疾患の早期診断や進行度の判定の精度を高めるためには、生体試料中に含まれる複数種のバイオマーカーを特異的に、且つ高感度に検出することが必要である。また、高齢化に伴い認知機能障害疾患の患者数の増加が見込まれ、認知機能障害疾患の診断のための検体数（生体試料の数）が増加することを考えると、１種類のバイオマーカーの検出にかける時間をできるだけ短くする必要がある。
【００１０】
上述した特許文献１〜６には、認知機能障害疾患バイオマーカーを検出する方法として抗原抗体反応を利用した測定方法、基質と酵素の反応を利用した酵素活性測定法、或いは質量分析法を用いた測定方法が開示されている。しかし、抗原抗体反応を利用した測定方法や酵素活性測定法は、タンパク質やペプチドを単独で測定する方法であり、多種類のバイオマーカーを測定するためには時間や手間がかかる。一方、質量分析法を用いた測定方法では一度に複数のバイオマーカーを測定することができるものの、検出感度を高めるためには複数のバイオマーカーのそれぞれについて測定条件が適切に設定されなければならないところ、特許文献１〜６では測定条件に関する検討はなされていない。このように、現状では、上記要望を満たす認知機能障害疾患のバイオマーカーの検出方法は確立されていないのが実状である。
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、生体試料中の認知機能障害疾患のバイオマーカーを短時間で、特異的に且つ高感度に検出する技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために成された本発明は、ＭＳ／ＭＳ測定が可能な質量分析装置を用いて、生体試料に含まれる認知機能障害疾患バイオマーカーを対象とするＭＲＭ（多重反応モニタリング）測定を行い、その結果に基づき該認知機能障害疾患バイオマーカーを定量する方法であって、
前記認知機能障害疾患バイオマーカーが、
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる補体Ｃ４−Ａ由来ペプチドAD1008、
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる転写因子ＡＰ−２γ由来ペプチドAD1025、
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるオキシトシン受容体由来ペプチドAD1042、
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＥ３ユビキチンリガーゼＨＥＲＣ由来ペプチドAD1046、
配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるプロトロンビン由来ペプチドAD1048、
配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる補体Ｃ４由来ペプチドAD1049、
配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１６由来ペプチドADPEP109315、
配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるゲルソリン由来ペプチドADPEP421488、
配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるニューレキシン-２-βプリカーサー由来ペプチドADPEP1315、
配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるニューレキシン-１-β由来ペプチドADPEP12neu、
配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるプロトロンビンプリカーサー由来ペプチドADPEP1396、
配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるプロトロンビンプリカーサー由来ペプチドADPEP1039、
配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるプロトロンビンプリカーサー由来ペプチドADPEP1250、
配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるプロトカドヘリンγ由来ペプチドAD1389
からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを含み、
前記ＭＲＭ測定の測定条件の一つであるプリカーサイオンの質量電荷比とプロダクトイオンの質量電荷比の組み合わせであるＭＲＭトランジションが、
前記ペプチドAD1008について、646.05/763.95、646.05/410.25、もしくは646.05/615.35、
前記ペプチドAD1025について、538.95/534.25、538.95/484.75、もしくは538.95/541.25、
前記ペプチドAD1042について、520.75/449.70、520.75/401.20、もしくは520.75/801.40、
前記ペプチドAD1046について、856.90/720.25、856.90/993.55、もしくは856.90/555.35、
前記ペプチドAD1048について、776.00/1061.50、776.00/1036.45、もしくは776.00/1150.50、
前記ペプチドAD1049について、512.30/516.30、512.30/629.35、もしくは512.30/453.75、
前記ペプチドADPEP109315について、518.25/642.85、518.25/586.30、もしくは776.90/796.40、
前記ペプチドADPEP421488について、725.40/378.15、725.40/917.45、もしくは725.40/873.95、
前記ペプチドADPEP1315について、744.35/885.45、744.35/757.40、もしくは496.60/472.25、
前記ペプチドADPEP12neuについて、942.00/448.20、628.35/448.20、もしくは942.00/547.25、
前記ペプチドADPEP1396について、781.35/781.40、521.25/533.30、もしくは781.35/1072.50、
前記ペプチドADPEP1039について、638.80/1072.50、638.80/862.40、もしくは638.80/747.35、
前記ペプチドADPEP1250について、478.25/452.25、478.25/509.75、もしくは478.25/351.20、
前記ペプチドAD1089について、458.25/331.20、458.25/602.35、もしくは458.25/701.40
であることを特徴とする。
【００１３】
本発明は、認知機能障害疾患バイオマーカーとして知られている上述した１４種のペプチドを、ＭＳ／ＭＳ測定が可能な質量分析装置を用いてＭＲＭ測定を行い、定量する場合の最適な測定条件として、各ペプチドに対応付けられるプリカーサイオンの質量電荷比とプロダクトイオンの質量電荷比の組み合わせであるＭＲＭトランジションを見出したことにより成されたものである。つまり、１４種のペプチドのそれぞれについて、ＭＲＭ測定におけるトランジションを上述したように定めることにより、生体試料に含まれる１４種のペプチドのいずれについても、特異的に且つ高感度で検出することができる。
【００１４】
また、本発明に係る質量分析装置は、上記認知機能障害疾患バイオマーカーの定量方法に用いられるトリプル四重極型質量分析装置であって、
配列番号が１〜１４までの１４種のペプチドのそれぞれについて、ＭＲＭ測定の際のＭＲＭトランジションを含む測定条件を記憶しておく測定条件記憶部と、
前記測定条件記憶部に記憶されている測定条件を利用して、前記１４種のペプチドについてＭＲＭ測定を実行させる測定実行部とを備える。
【００１５】
前記測定条件記憶部には、１４種のペプチドのＭＲＭトランジションに加えて、コリジョンエネルギ、前段四重極マスフィルタ及び後段四重極マスフィルタの各ロッド電極に印加する電圧値等を記憶するようにしても良い。ここで、コリジョンエネルギ、前段四重極マスフィルタ及び後段四重極マスフィルタの各ロッド電極に印加する電圧値は、本装置を利用して測定を行うユーザが予備的な実験等を行って決めるようにしても良く、本装置を製造するメーカ自身が予備的な実験等を行って決めるようにしても良い。或いは、ユーザからの要求に応じてメーカが該ユーザに測定条件を提供するようにしても良い。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、生体試料中の認知機能障害疾患のバイオマーカーを、短時間で、特異的に且つ高い感度に検出して定量することができるため、認知機能障害疾患の早期診断が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明に係る認知機能障害疾患バイオマーカーの定量方法を実施するために用いられる液体クロマトグラフ質量分析装置の一実施形態の概略構成図。
【図２】１４種の認知機能障害疾患のバイオマーカーペプチドのＭＲＭトラジションを示す図。
【図３】前処理の手順を説明するための図。
【図４】液体クロマトグラフ部の分析のグラジエントプロファイルを示す図。
【図５】本実施形態に係る液体クロマトグラフ質量分析装置を用いて、或る生体試料の測定を行った結果、得られたＭＲＭクロマトグラム。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明に係る認知機能障害疾患バイオマーカーの定量方法の一実施形態について図面を参照して説明する。
【００１９】
図１は本発明に係る認知機能障害疾患バイオマーカーの定量方法を実施するために用いられる液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）の概略構成図である。
液体クロマトグラフ質量分析装置は、液体クロマトグラフ部（ＬＣ部）１０と質量分析部（ＭＳ／ＭＳ部）２０とを含む。
【００２０】
ＬＣ部１０は、移動相が貯留された移動相容器１１と、移動相を吸引して一定流量で送給するポンプ１２と、移動相中に予め用意された試料を所定量ずつ注入するインジェクタ１３と、試料に含まれる各種化合物を時間方向に分離するカラム１４と、を含む。なお、ＬＣ部１０が複数の移動相の組成を連続的に変化させながら試料に含まれる化合物を分離する、いわゆるグラジエント分離を行う場合は、移動相容器１１及びポンプ１２はそれぞれ２個以上設けられる。
【００２１】
ＭＳ／ＭＳ部２０は、タンデム四重極型質量分析装置から成り、大気圧であるイオン化室２１と図示しない高性能の真空ポンプにより真空排気される高真空の分析室２４との間に、段階的に真空度が高められた第１、第２中間真空室２２、２３を備えた多段差動排気系の構成である。イオン化室２１には、試料溶液に電荷を付与しながら噴霧するエレクトロスプレーイオン化用プローブ２５が設置され、イオン化室２１と次段の第１中間真空室２２との間は細径の加熱キャピラリ２６を通して連通している。第１中間真空室２２と第２中間真空室２３との間は頂部に小孔を有するスキマー２８で隔てられ、第１中間真空室２２と第２中間真空室２３にはそれぞれ、イオンを収束させつつ後段へ輸送するためのイオンガイド２７、２９が設置されている。分析室２４には、多重極イオンガイド３２が内部に設置されたコリジョンセル３１を挟み、イオンを質量電荷比に応じて分離する前段四重極マスフィルタ３０と、同じくイオンを質量電荷比に応じて分離する後段四重極マスフィルタ３３、さらにはイオン検出器３４が設置されている。ＣＩＤガス供給部３５はコリジョンセル３１の内部にアルゴン、窒素などのＣＩＤガスを供給するものである。また電源部３６は、エレクトロスプレイイオン化用プローブ２５、イオンガイド２７、２９、３２、四重極マスフィルタ３０、３３などにそれぞれ所定の電圧を印加する。
【００２２】
データ処理部４０は、機能ブロックとして、データ収集部４１、データ記憶部４２、グラフ作成部４３、定量分析部４４等を備える。入力部５２や表示部５３が付設された制御部５０は処理条件パラメータ記憶部５１を備え、該記憶部５１に予め記憶されている処理条件パラメータに基づき、液体クロマトグラフ部１０のポンプ１２やインジェクタ１３、質量分析部２０の電源部３６やＣＩＤガス供給部３５などの各部の動作をそれぞれ制御する。本実施形態においては、制御部５０が本発明の測定実行部として機能し、処理条件パラメータ記憶部５１が測定条件機構部として機能する。なお、制御部５０及びデータ処理部４０の機能の少なくとも一部は、パーソナルコンピュータをハードウエア資源とし、該コンピュータに予めインストールされた専用の制御・処理ソフトウエアをコンピュータ上で実行することにより実現することができる。
【００２３】
本実施形態に係るＬＣ−ＭＳ／ＭＳにおける基本的なＭＳ／ＭＳ測定動作は次の通りである。
まず、ポンプ１２は移動相容器１１から移動相を吸引して一定流量で以てカラム１４に送給する。インジェクタ１３から一定量の試料液が移動相中に導入されると、移動相の流れに乗って試料はカラム１４に導入され、カラム１４を通過する間に試料中の各種化合物は時間方向に分離されてカラム１４出口から溶出し、ＭＳ／ＭＳ部２０に導入される。
【００２４】
ＭＳ／ＭＳ部２０において、エレクトロスプレイイオン化用プローブ２５にカラム１４からの溶出液が到達すると、該プローブ２５の先端において電荷が付与されながら溶出液が噴霧される。噴霧により形成された帯電液滴は付与された電荷による静電気力の作用によって分裂しながら微細化され、その過程で溶媒は気化し化合物由来のイオンが飛び出す。
【００２５】
こうして生成されたイオンは加熱キャピラリ２６を通して第１中間真空室２２に送られ、イオンガイド２７で収束されてスキマー２８頂部の小孔を経て第２中間真空室２３に送られる。そして、化合物由来のイオンはイオンガイド２９で収束されて分析室２４に送られ、前段四重極マスフィルタ３０の長軸方向の空間に導入される。なお、イオン化法はエレクトロスプレイイオン化法に限らず、大気圧化学イオン化法や大気圧光イオン化法などを用いてもよいことは当然である。
【００２６】
ＭＳ／ＭＳ部２０においてＭＳ／ＭＳ分析を行う際には、前段四重極マスフィルタ３０及び後段四重極マスフィルタ３３の各ロッド電極に電源部３６からそれぞれ所定の電圧（高周波電圧と直流電圧とが重畳された電圧）が印加され、コリジョンセル３１内にはＣＩＤガス供給部３５から連続的に又は間欠的にＣＩＤガスが供給される。これにより、前段四重極マスフィルタ３０に送り込まれた各種イオンの中で、前段四重極マスフィルタ３０の各ロッド電極に印加されている電圧に応じた特定の質量電荷比を有するイオンのみが該フィルタ３０を通過し、プリカーサイオンとしてコリジョンセル３１に導入される。コリジョンセル３１内でプリカーサイオンはＣＩＤガスに衝突して開裂し、各種のプロダクトイオンが生成される。生成された各種プロダクトイオンが後段四重極マスフィルタ３３に導入されると、後段四重極マスフィルタ３３の各ロッド電極に印加されている電圧に応じた特定の質量電荷比を有するプロダクトイオンのみが該フィルタ３３を通過し、イオン検出器３４に到達して検出される。イオン検出器３４はパルスカウント型検出器を用いることができ、この場合、入射したイオンの数に応じた個数のパルス信号を検出信号として出力する。
【００２７】
イオン検出器３４の検出信号はデジタル化されてデータ処理部４０に入力される。データ処理部４０では順次入力されるデータに基づいて、測定対象化合物毎にその化合物が表れる時間付近のマスクロマトグラムを作成する。そして、そのマスクロマトグラムにおいて測定対象化合物に対応するピークを検出してピーク面積を算出し、定量分析部４４に格納されているピーク面積値と濃度との関係を示す検量線やテーブル等を参照して、測定対象化合物の濃度値、つまり定量値を算出する。
【００２８】
一般的なＬＣ−ＭＳ／ＭＳと同様、本実施形態でも、ＭＳ／ＭＳ測定のモードとして、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）測定、プロダクトイオンスキャン測定、プリカーサーイオンスキャン測定、ニュートラルロススキャン測定が用意されている。
ＭＲＭ測定では、前段四重極マスフィルタ３０及び後段四重極マスフィルタ３３でそれぞれ所定の質量電荷比のイオンのみを通過させてＭＳ／ＭＳ測定が行われ、これにより、測定対象ペプチド由来の特定のプリカーサイオンに対する特定のプロダクトイオンが検出される。ＭＲＭ測定では、プリカーサイオンの質量電荷比（m/z）とプロダクトイオンの質量電荷比（m/z）とを１組とするチャンネルを複数設定した測定を行うことができる。以下に説明する認知機能障害疾患バイオマーカーの定量分析では、ＭＳ／ＭＳ測定としてＭＲＭ測定が使用される。
【００２９】
次に、本実施形態のＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて、認知機能障害疾患バイオマーカーの定量分析を行う場合の手順について説明する。ここでは、表１に示す１４種の部分ペプチドを認知機能障害疾患バイオマーカーとして用いることとする。これら１４種の部分ペプチドは、いずれも認知機能障害疾患に罹患していない者の生体内では完全な状態で存在するタンパク質（以下「インタクトなタンパク質」という）が、認知機能障害疾患患者の生体では消化分解された結果、部分ペプチドとして生成されたもの、或いは、タンパク質の翻訳合成におけるスプライシング異常等により部分ペプチドとして翻訳合成されたものである。表１には、１４種の部分ペプチドを表す識別番号（ＩＤ）と、該ペプチドの元となるインタクトなタンパク質の名称、該ペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
＜１．測定条件の設定＞
表１に示すように１４種のペプチドはいずれもそのアミノ酸配列が既知であり、予備的な実験を行うことにより、或いは一般的な化合物データベースを利用することにより、本実施形態のＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた定量分析に適した測定条件を求めることができる。このような測定条件として、ＬＣ部１０における所定の分離条件下での各ペプチドの保持時間、ＭＳ／ＭＳ部２０においてＭＲＭ測定を実行する際の条件である、各ペプチドに由来するプリカーサイオンの質量電荷比とプロダクトイオンの質量電荷比の組み合わせ（以下「ＭＲＭトランジション」という）、コリジョンエネルギ、前段四重極マスフィルタ３０の各ロッド電極に印加する電圧（Ｑ１プリロッドバイアス電圧）及び後段四重極マスフィルタ３３の各ロッド電極に印加する電圧（Ｑ３プリロッドバイアス電圧）の各値が挙げられる。
【００３２】
本実施形態では、１４種のペプチドのいずれについても、生体試料中の含有量を求めることができるように、１４種のペプチドのそれぞれについて、適切なＭＲＭトランジション、コリジョンエネルギ値、Ｑ１プリロッドバイアス電圧値、Ｑ３プリロッドバイアス電圧値を予め求め、これらＭＲＭパラメータを処理条件パラメータ記憶部５１に格納しておく。図２は、処理条件パラメータ記憶部５１に格納されたペプチド毎のＭＲＭパラメータを示している。
【００３３】
次に、生体試料の準備からＬＣ部１０及びＭＳ／ＭＳ部２０における測定処理について説明する。
＜２．試薬・用具等の準備＞
まず、以下に示す試薬及び用具等を準備する。
（１）検量線用標準溶液（ＳＴＤ溶液）：認知機能障害疾患のバイオマーカーとなるインタクトなタンパク質（プロトロンビン、ゲルソリン、補体Ｃ４Ａ、補体Ｃ３）のアミノ酸配列の一部からなるペプチド、具体的には、表１に挙げた１４種のペプチドから選ばれる１ないし複数のペプチドを、所定量ずつ含む試薬。標準血清中に、１４種のペプチドから選ばれる１ないし複数のペプチドを所定量ずつ含んだものでも良い。所定の希釈液を用いてＳＴＤ溶液を段階的に希釈することにより検量線上の各検量点用溶液（例えば６点の検量点用の溶液）を作製する。
【００３４】
（２）精度管理用標準溶液（ＱＣ溶液）：ＳＴＤ溶液から作製した検量点用溶液を混合し作製したもの。例えば、６点検量点の場合、検量点１の溶液と検量点２の溶液を混合して作製したもの、検量点３の溶液と検量点４の溶液を混合して作製したもの、検量点５の溶液と検量点６の溶液を混合して作製したものを、それぞれＱＣ溶液として使用する。
（３）安定同位体試薬：上記１４種のペプチドの一部の原子を安定同位体で置換したものを所定量ずつ含む試薬。
【００３５】
（４）溶媒Ａ：0.1％−１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及び５％−50％アセトニトリル（ＡＣＮ）を含む水溶性有機溶媒
（５）溶媒Ｂ：50％−100％メタノール
（６）溶媒Ｃ：0.1％−１％ＴＦＡを含む水溶液
（７）溶媒Ｄ：0.1％−１％ＴＦＡ及び5％−50％メタノールを含む水溶性有機溶媒
（８）アルミシール
（９）９６穴（ウェル）のサンプルプレート
（１０）蒸発防止用プレートマット
【００３６】
＜３．生体試料（血清）の準備＞
被検者から血液を採取し、これを所定時間放置した後、遠心分離し、上澄み（血清）を採取する。
【００３７】
＜４．試料の調製＞
図３に示す手順に従って、前処理を行う。
まず、９６穴のサンプルプレートの各ウェルに生体試料である血清を25μLずつ注入する。また、血清を注入したウェルとは別のウェルにＳＴＤ溶液、ＱＣ溶液をそれぞれ25μLずつ注入する。
【００３８】
次に、血清、ＳＴＤ溶液、ＱＣ溶液を注入したサンプルプレートの各ウェルに溶媒Ｃ（0.1％−１％ＴＦＡを含む水溶液)を475μLずつ添加し、さらに、安定同位体試薬を20μLずつ添加する。これにより、各ウェルには、520μLの液体（混合液）が注入された状態となる。
続いて、サンプルプレートの上面をアルミニウム製シールで封じ、これをプレートシェーカーで攪拌する。その後、サンプルプレートに対応した遠心機で第１回遠心分離（100g, 2min, 4℃）、熱処理（100℃, 15min）、氷中保管（10min）、第２回遠心分離（100g, 2min, 4℃）を行う。
【００３９】
＜５．固相抽出カラム（固相抽出プレート）による処理＞
まず、９６穴プレートに対応した固相抽出カラム（商品名 Oasis HLB μElution Plate、Water社製、以後、「固相抽出プレート」と称する）の各ウェルに、溶媒Ｂ（500μLの50％−100％メタノール）を流して不溶成分を除去し、続いて500μLの溶媒Ｃ（0.1％−１％ＴＦＡを含む水溶液）を流して前記固相抽出プレートを調整する。
【００４０】
次に、前処理の第２回遠心分離後のサンプルプレートの各ウェル中の上澄液500μLを固相抽出プレートの対応するウェルに流す。続いて、500μLの溶媒Ｄ（[0.1％−１％ＴＦＡ]＋[5％−50％メタノール]を含む水溶性有機溶媒）を該固相抽出プレートの各ウェルに流し、固相抽出プレートに非特異的に吸着しているマトリクス成分を洗浄排出する。その後、固相抽出プレートの各ウェルに50μLの溶媒Ａ（[0.1％−１％ＴＦＡ]＋[５％−50％ＡＣＮ]を含む水溶性有機溶媒）を添加して、固相抽出プレートに吸着しているペプチドを質量分析用の９６穴サンプルプレートの各ウェルに溶出する。以上により得られた、９６穴サンプルプレートの各ウェルに収容されている液体が質量分析用試料液となる。
【００４１】
＜６．クロマトグラフ質量分析装置による測定＞
固相抽出カラムによる処理によって得られた質量分析用試料液が収容された９６穴サンプルプレートを上述のＬＣ−ＭＳ／ＭＳのインジェクタ１３の試料載置部にセットして、クロマトグラフ質量分析を実施した。ＬＣ部１０、ＭＳ／ＭＳ部２０の具体的な装置名及び各部における処理条件等と、その分析結果を以下に示す。
＜６．１  ＬＣ部＞
・装置名：  グラジエント分析が可能な高速液体クロマトグラフ装置（商品名 Nexera XR（株式会社島津製作所製）を用いた。
・カラム：  ペプチドやタンパク質の分析用逆相カラム（商品名 Aeris（登録商標） peptide（Phenomenex社）、カラムサイズ；2.1×50mm, 2.6μm（ＭＡＸ Pressure: 1000bar(100MPa)）を用いた。
・分析方式：  以下の溶媒Ｅと溶媒Ｆの混合比を時間的に変化させながら、質量分析用試料液を時間的に分離する、グラジエント分析を採用した。図４にグラジエントプロファイルを示す。
溶媒Ｅ：  水：ＡＣＮ：ギ酸＝９８：２：０．１
溶媒Ｆ：  水：ＡＣＮ：ギ酸＝１０：９０：０．１
加熱温度；55℃
サンプラー温度；5℃
【００４２】
＜６．２  ＭＳ／ＭＳ部＞
・装置名：  ＭＲＭ測定が可能な質量分析装置であるトリプル四重極型質量分析装置（商品名ＬＣＭＳ−８０６０（株式会社島津製作所製））を用いた。分析時の各部の設定値は以下の通りである。
ＣＩＤガス圧：  ２７０ｋＰａ
インターフェイス電圧：    ３ｋＶ
ネブライザーガス流量：    ３Ｌ／ｍｉｎ
ヒーティングガス流量：  １０Ｌ／ｍｉｎ
インターフェイス温度：  ３００℃
DL温度              ：  ２５０℃
ヒートブロック温度  ：  ４００℃
ドライイングガス流量：  １０Ｌ／ｍｉｎ
【００４３】
ＭＳ／ＭＳ部２０におけるＭＲＭ測定は、予め処理条件パラメータ記憶部５１に格納した各ペプチドのＭＲＭパラメータ（図２参照）を用いて行われた。
【００４４】
＜６．３  測定結果＞
図５は、或る被検者から採取された生体試料（血清）について液体クロマトグラフ質量分析を行った結果、得られた１４種のペプチドのイオン強度に基づき作成されたベースピーククロマトグラムである。図５に示す各記号は表１に示す記号に対応している。図５に示すように、１４種のペプチド由来のピークがそれぞれ観測された。
【００４５】
なお、上記した実施形態は本発明の一例にすぎず、例えば液体クロマトグラフに代えてガスクロマトグラフを用いても良い。
また、上記実施形態では、１４種のペプチドの全てについて、ペプチド毎のＭＲＭパラメータを処理条件パラメータ記憶部５１に予め格納したが、１４種のペプチドから選ばれた１ないし複数のペプチドについて、ペプチド毎のＭＲＭパラメータを処理条件パラメータ記憶部５１に格納するようにしても良い。
また、上記実施形態で用いた用具や装置は一例に過ぎず、それらに限定されない。例えば、液体クロマトグラフィの逆相カラムとして一般的なＣ１８カラムを用いて固相抽出プレートを構成しても良い。
その他、本発明の趣旨に沿った範囲で適宜変形や修正、追加を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは明らかである。
【符号の説明】
【００４６】
１０…液体クロマトグラフ部
１４…カラム
２０…ＭＳ／ＭＳ部
３０…四重極マスフィルタ
３０…前段四重極マスフィルタ
３１…コリジョンセル
３２…多重極イオンガイド
３４…イオン検出器
３５…ＣＩＤガス供給部
３６…電源部
４０…データ処理部
４１…データ収集部
４２…データ記憶部
４３…グラフ作成部
４４…定量分析部
５０…制御部
５２…入力部
５３…表示部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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