(57)【要約】【課題】本発明は、トロポロン類の製造につき、弊害が考えられる有機合成ではなく、天然物由来により、製造可能とすることを目的とする。【解決手段】バークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）によるトロポロン類の製造において、その生産能を亢進する因子（例えば、スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌、Ｎ−３−ヒドロキシオクタノイルホモセリンラクトン等）の存在下で微生物を培養（特に、液体培養）することにより、トロポロン類が大量に生産されることにより、上記課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）によるトロポロン類の生産能を亢進する因子の存在下でバークホルデリア・プランタリイ）Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉを培養すること、を特徴とするトロポロン類の製造方法。
【請求項２】
該因子が、下記する物質から選ばれる少なくともひとつであること、を特徴とする請求項１に記載のトロポロン類の製造方法：
スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌培養物、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌培養物、下記化１にて示される化合物であるＮ−３−ヒドロキシオクタノイルホモセリンラクトン、下記化２にて示される化合物であるＮ−３−ヒドロキシオクタノイルホモセリンラクトン（ジアステレオマー）、Ｌ−アラニンのアルコールエステル体（例えば、下記化３にて示される化合物であるＬ−アラニンペンチルエステル）、β−アラニンのアルコールエステル体（例えば、下記化４にて示される化合物であるβ−アラニンペンチルエステル）、下記化５にて示されるプロトカテキ酸、下記化６にて示される没食子酸、下記化７にて示されるキナ酸。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【請求項３】
スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌培養物が、該細菌の培養物全体、これを固液分離して得た該細菌の菌体自体、それを除去して得た培養上清液及びこれらの蒸気殺菌処理物及びそれらの乾燥物の少なくともひとつであること、を特徴とする請求項２に記載のトロポロン類の製造方法。
【請求項４】
スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌培養物が、該細菌の培養物全体、これを固液分離して得た該細菌の菌体自体、それを除去して得た培養上清液及びこれらの蒸気殺菌処理物及びそれらの乾燥物の少なくともひとつであること、を特徴とする請求項２に記載のトロポロン類の製造方法。
【請求項５】
スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌が、スフィンゴビウム・ヤノイクエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｙａｎｏｉｋｕｙａｅ）であること、を特徴とする請求項２又は３に記載のトロポロン類の製造方法。
【請求項６】
スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌が、スフィンゴビウム・ヤノイクエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｙａｎｏｉｋｕｙａｅ）ＥＣ−Ｓ００１株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２６８０）であること、を特徴とする請求項５に記載のトロポロン類の製造方法。
【請求項７】
スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌が、スフィンゴモナス  エスピー（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）であること、を特徴とする請求項２又は４に記載のトロポロン類の製造方法。
【請求項８】
スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌が、スフィンゴモナス  エスピー（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＬＩＡ−１  Ｒｏｏｔ−１株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２６８１）であること、を特徴とする請求項７に記載のトロポロン類の製造方法。
【請求項９】
トロポロン類が、トロポロン及びヒノキチオールから選ばれる少なくともひとつであること、を特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載のトロポロン類の製造方法。
【請求項１０】
下記する物質から選ばれる少なくともひとつを有効成分として含有することを特徴とする、バークホルデリア・プランタリイを培養してトロポロン類を製造する際のトロポロン類の生産能を亢進するための組成物。
スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌培養物、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌培養物、下記化１にて示される化合物であるＮ−３−ヒドロキシオクタノイルホモセリンラクトン、下記化２にて示される化合物であるＮ−３−ヒドロキシオクタノイルホモセリンラクトン（ジアステレオマー）、Ｌ−アラニンのアルコールエステル体（例えば、下記化３にて示される化合物であるＬ−アラニンペンチルエステル）、β−アラニンのアルコールエステル体（例えば、下記化４にて示される化合物であるβ−アラニンペンチルエステル）、下記化５にて示されるプロトカテキ酸、下記化６にて示される没食子酸、下記化７にて示されるキナ酸。
【化１】
2019198296.tif 000016
【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【請求項１１】
トロポロン類の生産量を増加させる作用を有する、スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属菌株  ＥＣ−Ｓ００１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６８０）。
【請求項１２】
トロポロン類の生産量を増加させる作用を有する、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属菌株  ＬＩＡ−１  Ｒｏｏｔ−１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６８１）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トロポロン類の製造方法に関するものである。詳細には、トロポロン類の生産能を亢進する因子、すなわち、特定の生合成活性因子を含む培地を使用してバークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）を培養することで、トロポロン類を効率的に、また、大量に合成、生産させる方法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
トロポロン及びその誘導体は種々の細菌に対して静菌作用と殺菌作用を有し（非特許文献３）、植物病原糸状菌に対しても殺菌作用を有する（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，１９８１）ことが知られている。そのため、トロポロン及びその誘導体は化粧品、医薬品、医薬部外品、食品等に利用されており、産業上重要な物質にもなっている。
そして、トロポロン及びその誘導体であるトロポロン類はトロポロン骨格を有する各種の化合物を合成するうえで重要な合成中間体でもある。
【０００３】
一方、バークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）はイネ苗立枯細菌病を引き起こす病原細菌であり、１９８２年に千葉県において苗立枯症状が発生したイネより分離された。これ以後、バークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）によるイネ苗立枯細菌病は日本全国で発生している。
また、バークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）はトロポロンを生産し、そのトロポロンはイネ苗立枯細菌病の病徴発現に関与している（非特許文献１）。そして、バークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）を液体培養すると、トロポロンが培地中にごく少量生産される（非特許文献２）。
【０００４】
従来、トロポロン類の製造は有機合成によって行われてきた（非特許文献４）。ヒノキ科の植物に含まれているトロポロン誘導体であるヒノキチオール等は、ヒノキ科の植物体から抽出したり、あるいはヒノキ科植物を組織培養して製造されている（特許文献１）。
【０００５】
しかし、植物体からの抽出、組織培養又は微生物培養による製造法では、得られるトロポロン類の製造量は少なく、工業的な利用には不十分であった。また、有機合成は製造コストが高い上、安全性の懸念から、防腐剤等の食品添加物には使用できないなど、用途が限定されていた。
そのため、天然物由来で、大量生産が可能な製造方法が求められてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平７−１３５９８７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｐｈｙｔｏｐａｔｈ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ  ５１：３１５−３１７（１９８５）  Ｔｒｏｐｏｒｏｎ  ａｓ  ａ  Ｒｏｏｔ  Ｇｒｏｗｔｈ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｐｌａｎｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ｃａｕｓｅｉｎｇ  Ｓｅｅｄｌｉｎｇ  Ｂｌｉｇｈｔ  ｏｆ  ｒｉｃｅ
【非特許文献２】微生物遺伝資源利用マニュアル（２６）  イネもみ枯細菌病  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌｕｍａｅとイネ苗立枯細菌病Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ
【非特許文献３】Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｙ  ５００−５０６  Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｒｏｐｏｒｏｎｅ（１９７５）
【非特許文献４】ＷＡＫＯ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｎｏ．２４（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、トロポロン類の製造につき、弊害が考えられる有機合成ではなく、天然物由来により、製造可能とすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明者らは各方面から検討を行い、バークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）がトロポロン類を産生すること（非特許文献２）に着目した。しかしながら、その生産量は非常に少ないため、さらに研究を行い、その結果、該微生物によるトロポロンの生産を亢進する作用を有する因子が存在することをはじめて見出しただけでなく、それらの因子を構成する物質を特定するのにも成功した。そして本発明者らは、鋭意研究した結果、バークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）によるトロポロン類の生産能を亢進する因子の存在下で、バークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）を培養することにより、トロポロン類が大量に生産されることを確認し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明の実施形態を例示すると次のとおりである。
（１）バークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）によるトロポロン類の生産能を亢進する因子の存在下でバークホルデリア・プランタリイ）Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉを培養すること、を特徴とするトロポロン類の製造方法。
（２）該因子が、下記する物質から選ばれる少なくともひとつであること、を特徴とする（１）に記載のトロポロン類の製造方法：
スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌培養物、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌培養物、下記化１にて示される化合物であるＮ−３−ヒドロキシオクタノイルホモセリンラクトン、下記化２にて示される化合物であるＮ−３−ヒドロキシオクタノイルホモセリンラクトン（ジアステレオマー）、アミノ酸のアルコールエステル体（例えば、Ｌ−アラニンのアルコールエステル体（例えば、下記化３にて示される化合物であるＬ−アラニンペンチルエステル）、同じく、β−アラニンのアルコールエステル体（例えば、下記化４にて示される化合物であるβ−アラニンペンチルエステル））、下記化５にて示されるプロトカテキ酸、下記化６にて示される没食子酸、下記化７にて示されるキナ酸。
（３）スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌培養物が、該細菌の培養物全体、これを固液分離して得た該細菌の菌体自体、それを除去して得た培養上清液及びこれらの蒸気殺菌処理物及びそれらの乾燥物の少なくともひとつであること、を特徴とする（２）に記載のトロポロン類の製造方法。
（４）スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌培養物が、該細菌の培養物全体、これを固液分離して得た該細菌の菌体自体、それを除去して得た培養上清液及びこれらの蒸気殺菌処理物及びそれらの乾燥物の少なくともひとつであること、を特徴とする（２）に記載のトロポロン類の製造方法。
（５）スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌が、スフィンゴビウム・ヤノイクエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｙａｎｏｉｋｕｙａｅ）であること、を特徴とする（２）又は（３）に記載のトロポロン類の製造方法。
（６）スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌が、スフィンゴビウム・ヤノイクエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｙａｎｏｉｋｕｙａｅ）ＥＣ−Ｓ００１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６８０）であること、を特徴とする（５）に記載のトロポロン類の製造方法。
（７）スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌が、スフィンゴモナス  エスピー（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）であること、を特徴とする（２）又は（４）に記載のトロポロン類の製造方法。
（８）スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌が、スフィンゴモナス  エスピー（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＬＩＡ−１  Ｒｏｏｔ−１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６８１）であること、を特徴とする（７）に記載のトロポロン類の製造方法。
（９）トロポロン類が、トロポロン及びヒノキチオールから選ばれる少なくともひとつであること、を特徴とする（１）〜（８）のいずれか１つに記載のトロポロン類の製造方法。
（１０）下記する物質から選ばれる少なくともひとつを有効成分として含有することを特徴とする、バークホルデリア・プランタリイを培養してトロポロン類を製造する際のトロポロン類の生産能を亢進するための組成物。
スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌培養物、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌培養物、下記化１にて示される化合物であるＮ−３−ヒドロキシオクタノイルホモセリンラクトン、下記化２にて示される化合物であるＮ−３−ヒドロキシオクタノイルホモセリンラクトン（ジアステレオマー）、Ｌ−アラニンのアルコールエステル体（例えば、下記化３にて示される化合物であるＬ−アラニンペンチルエステル）、β−アラニンのアルコールエステル体（例えば、下記化４にて示される化合物であるβ−アラニンペンチルエステル）、下記化５にて示されるプロトカテキ酸、下記化６にて示される没食子酸、下記化７にて示されるキナ酸。
（１１）トロポロン類の生産量を増加させる作用を有する、スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属菌株  ＥＣ−Ｓ００１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６８０）。
（１２）トロポロン類の生産量を増加させる作用を有する、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属菌株  ＬＩＡ−１  Ｒｏｏｔ１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６８１）。
（１３）バークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）によるトロポロン類の生産能を亢進する因子であって、該因子が下記する物質から選ばれる少なくともひとつであること、を特徴とする因子：
スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌培養物、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌培養物、下記化１にて示される化合物であるＮ−３−ヒドロキシオクタノイルホモセリンラクトン、下記化２にて示される化合物であるＮ−３−ヒドロキシオクタノイルホモセリンラクトン（ジアステレオマー）、Ｌ−アラニンのアルコールエステル体（例えば、下記化３にて示される化合物であるＬ−アラニンペンチルエステル）、β−アラニンのアルコールエステル体（例えば、下記化４にて示される化合物であるβ−アラニンペンチルエステル）、下記化５にて示されるプロトカテキ酸、下記化６にて示される没食子酸、下記化７にて示されるキナ酸。
（１４）バークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）を培養して、トロポロン類を製造する方法において、
下記する物質から選ばれるひとつを用いて、トロポロン類を大量に製造すること、を特徴とするトロポロン類の製造方法：
スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌培養物、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌培養物、下記化１にて示される化合物であるＮ−３−ヒドロキシオクタノイルホモセリンラクトン、下記化２にて示される化合物であるＮ−３−ヒドロキシオクタノイルホモセリンラクトン（ジアステレオマー）、Ｌ−アラニンのアルコールエステル体（例えば、下記化３にて示される化合物であるＬ−アラニンペンチルエステル）、β−アラニンのアルコールエステル体（例えば、下記化４にて示される化合物であるβ−アラニンペンチルエステル）、下記化５にて示されるプロトカテキ酸、下記化６にて示される没食子酸、下記化７にて示されるキナ酸。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、天然物由来のトロポロン類を大量に製造することができる。そして、不純物が極めて少ない、高純度、高濃度なトロポロン類を大量に生産することが可能となる。また、有機合成法でないため、安全性も高く、したがって、化粧品や医薬品、医薬部外品、食品等の幅広い分野においてトロポロン類を利用できることとなり、これら業界の技術発展に大きく貢献することとなる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明によるトロポロン類の製造方法について、詳しく説明する。
【００１３】
本発明において、トロポロン類とは、トロポン（シクロヘプタトリエノン）骨格に水酸基を導入した化合物を広く指すが、最も良く知られている、２位に水酸基を有するトロポンの誘導体（２−ヒドロキシトロポン）がトロポロンの代表例として示される。トロポロン類としては、このトロポロン（ｔｒｏｐｏｌｏｎｅ：２−ヒドロキシシクロヘプター２，４，６−トリエン−１−オン）自体のほか、その誘導体（例えば、イソプロピル基を導入したヒノキチオール等）も包含される。
【００１４】
本発明は、バークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）によるトロポロン類の製造において、トロポロン類の生産能を亢進する因子をはじめて見出し、これらの因子を利用することによって、トロポロン類を大量に生産することに成功したものである。
【００１５】
本発明によるバークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）によるトロポロン類の生産能を亢進する因子とは、バークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）を液体培養する際に、培養液中に存在させることで、培養終了後の培地中に存在するトロポロン類の量を大幅に増加させる作用を有する物質を指し、具体的には、  スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌培養物、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌培養物、下記化１にて示される化合物であるＮ−３−ヒドロキシオクタノイルホモセリンラクトン、下記化２にて示される化合物であるＮ−３−ヒドロキシオクタノイルホモセリンラクトン（ジアステレオマー）、Ｌ−アラニンのアルコールエステル体（例えば、下記化３にて示される化合物であるＬ−アラニンペンチルエステル）、β−アラニンのアルコールエステル体（例えば、下記化４にて示される化合物であるβ−アラニンペンチルエステル）、下記化５にて示されるプロトカテキ酸関連化合物、下記化６にて示される没食子酸、下記化７にて示されるキナ酸である。
【００１６】
なお、本明細書等において、トロポロン類の生産能を亢進する因子とは、トロポロン類を大量に産生せしめる物質をいうが、上記した各物質自体を指すだけでなく、それらを有効成分として含有する組成物も含有するものである。これらの物質は、単用でもよいし、２種以上の併用でもよい。添加（使用）時期は、基本的には、培養中（共培養）がよいが、培養前、培養後の添加を排除するものではない。
【００１７】
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【００１８】
スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌としては、例えば、北海道のホウレンソウ種子より分離したスフィンゴビウム・ヤノイクエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｙａｎｏｉｋｕｙａｅ）ＥＣ−Ｓ００１株や、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌としては、岡山で栽培されたイネの根圏より分離したスフィンゴモナス  エスピー（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＬＩＡ−１  Ｒｏｏｔ−１株を使用することができる。
【００１９】
スフィンゴビウム・ヤノイクエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｙａｎｏｉｋｕｙａｅ）ＥＣ−Ｓ００１株については、１６ＳｒＲＮＡで同定され、細菌学的性質として高いＭｇ２＋要求性を持つことを特徴とした桿菌であるが、イネやその他の植物に対する感染性は認められていない。このＥＣ−Ｓ００１株の菌学的性質は、次のとおりである。
【００２０】
（Ａ）形態学的性質
形態：桿菌
大きさ：幅１〜１．５μｍ、長さ３〜５μｍ
運動性：＋
（Ｂ）培養的性質
コロニーの色：白〜クリーム色
コロニーのサイズ：ＮＢ寒天平板上で０．１ミリ程度
（Ｃ）生理学的性質
グラム染色性：−
硝酸塩の還元：＋
グルコース発酵：−
同化（グルコース）：＋
最適生育ｐＨ：ほぼ中性域
最適生育温度：２０〜２５℃
要求性：高いＭｇ２＋要求性（０．１ｍＭ以上）を有する
特徴：バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属菌のトロポロン類の産生を亢進する
【００２１】
スフィンゴモナス・エスピー（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＬＩＡ−１  Ｒｏｏｔ−１株についても、１６ＳｒＲＮＡで同定され、Ｂ．プランタリイやその他のバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌の菌体増殖を亢進させる特徴を有する。このＬＩＡ−１  Ｒｏｏｔ−１株の菌学的性質は、次のとおりである。
【００２２】
（Ａ）形態学的性質
形態：桿菌
大きさ：幅１〜１．５μｍ、長さ３〜５μｍ
運動性：＋
（Ｂ）培養的性質
コロニーの色：クリーム色〜薄黄色
コロニーのサイズ：ＰＤＡ寒天平板上で０．５ミリ程度
（Ｃ）生理学的性質
グラム染色性：−
硝酸塩の還元：＋
グルコース発酵：−
同化（グルコース）：＋
最適生育ｐＨ：ほぼ中性域
最適生育温度：２０〜３０℃
特徴：バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属菌のトロポロン類の産生を亢進する
【００２３】
これらの菌株（ＥＣ−Ｓ００１株及びＬＩＡ−１  Ｒｏｏｔ−１株）は、それぞれ、独立行政法人製品評価技術基盤機構・特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に２０１８年（平成３０年）４月１３日付けで受託されており、その受託番号は、それぞれ、ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６８０及びＮＩＴＥ  Ｐ−０２６８１である。
【００２４】
これらの菌株の培養に使用することのできる培地は、当該菌株が増殖し得るものであれば任意のものでよい。例えば、ブイヨン培地など一般的な培地の他、グルコース、ペプトン、イーストエキスを含む培地などが挙げられる。ＥＣ−Ｓ００１株の培地としては、好適な培地として、マグネシウム塩を強化したＰＤ培地（培地組成：ポテトデキストロースブロース２４グラム／Ｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４）、ＭＷ培地（培地組成：ウィノグラドスキイ（Ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙ’ｓ無機塩培地）に、０．５％ショ糖−０．００５％酵母エキス添加）培地等が好適例として挙げられる。また、液体培地以外に、寒天入りの斜面培地及び平板培地等の固体培地を用いてもよい。
【００２５】
培地の炭素源としては、これらＥＣ−Ｓ００１株やＬＩＡ−１  Ｒｏｏｔ−１株の菌株が同化しうるあらゆるものが利用可能である。具体的には、グルコース、アラビノース、マンノース、澱粉加水分解物、糖蜜など、これらの菌株が利用し得る各種の合成又は天然炭素源をあげることができる。また、培地の窒素源としては、同様に、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆粕などの有機窒素含有物をはじめ、該菌株が利用し得る各種の合成又は天然物が利用可能である。更に、微生物培養の常法に従って、食塩、リン酸塩などの無機塩類、カルシウム、マグネシウム、鉄などの金属の塩類、ビタミン、アミノ酸、核酸関連物質などの微量栄養源も必要に応じて添加することができる。さらには、必要に応じて消泡剤等の種々の添加剤を添加することもできる。
【００２６】
そして、これらの菌株の培養は、振盪培養法、通気培養法などの好気的条件下で行うことができる。培養条件は、これに限定されるものではないが、温度は２０〜４０℃、好ましくは３０〜３５℃、ｐＨは５〜８、好ましくは６〜７、培養期間は１〜４日、好ましくは２〜３日とするのがよい。
【００２７】
以上のようにして培養したこれらの菌株は、菌体を分離することなく生菌体を含む培養物の状態でトロポロン類の生産能を亢進する因子を構成する有効成分物質として使用することができる。また、上記培養物から、通常の方法、例えば膜分離又は遠心分離等の処理によって生菌体を分離し、必要に応じて洗浄した、培養分離菌体自体又はその処理物（培養分離菌体と他成分の混合物など）、又は培養上清液を有効成分として使用することもできる。更には、上記培養物又は分離した生菌体を凍結乾燥、スプレードライ等の方法によって乾燥した乾燥物や、これらの液体や固体による希釈物等の状態でも使用することができる。また、これらを高圧蒸気殺菌等によって殺菌処理してもよい。したがって、本願にいう培養物には、菌体自体（生菌体、死菌体）も含まれる。
【００２８】
トロポロン類の産生亢進物質の内、Ｎ−３−ヒドロキシオクタノイルホモセリンラクトン類とその関連化合物、アラニンのアルコールエステル体、β−アラニンのアルコールエステル体、プロトカテキ酸、没食子酸、キナ酸については、いずれも市販されているか、又は教科書にも記載されるテトラヒドロフラン中、触媒量の濃硫酸と脱水剤無水硫酸ナトリウムによってアミノ酸とアルキルアルコールから合成することができる。また、Ｎ−３−ヒドロキシオクタノイルホモセリンラクトンおよびその誘導体は、縮合剤としてＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等を用い、市販の３−ヒドロキシオクタン酸や他の中鎖脂肪酸類とホモセリンラクトンとのアミド結合により効率的に合成し、ジアステレオマーをそれぞれ分離することができる。
【００２９】
本発明は、バークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）を培養してトロポロン類を製造するに際して、トロポロン類の生産能を亢進する（生産量を増加させる）因子として、トロポロン類の産生亢進物質（具体的には、トロポロン類の生産能を亢進する物質及び／又はこれ（ら）を有効成分として含有する組成物）を添加することによって、トロポロン類を高生産する方法に関するものである。
【００３０】
バークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）は、イネ苗立枯細菌病の原因菌として知られており、トロポロンを生産することも知られているが、その生産量は液体培養においてごくわずかになることも知られている（非特許文献２）。その菌学的性質は次のとおりである。
【００３１】
本菌は、グラム陰性、好気性の桿菌で、複数の極鞭毛を有し運動性がある。蛍光性色素を産生せず、菌体内にポリ−β−ヒドロキシ酪酸顆粒を集積し、キノンはＱ−８型であるという特徴を有する。ＰＰＧＡあるいはＰＳＡ平板培地におけるコロニーはベージュ〜わずかに黄土色を帯びており、円形、やや中高、平滑で湿光を帯びている。４０℃では生育せず、オキシダーゼ活性を有するが、硝酸塩還元は弱陽性である。Ｌ−ラムノース、シトラコン酸、Ｌ−酒石酸、Ｄ−酒石酸を利用する。
【００３２】
本発明で使用するバークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）は、既知の菌であり、容易に入手することができる。例えば、イネ苗立枯細菌病を発生しているイネの苗から非特許文献２の記載の方法で容易に分離することができる。また、農業生物資源ジーンバンク、すなわち、ＮＩＡＳ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｇｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：独立行政法人  農業生物資源研究所（〒３０５−８６０２  茨城県つくば市観音台２−１−２））ジーンバンクから有償で配布を受けることもでき、いずれにしても本菌は何人も容易に入手することができる。
【００３３】
例えば、ＮＩＡＳジーンバンクが保存している菌株、ＭＡＦＦ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｍａｎｕａｌ（微生物遺伝資源利用マニュアル）Ｎｏ．２６のＭＡＦＦ番号３０１７２３（Ｔｙｐｅ  ｓｔｒａｉｎ）のほか、ＭＡＦＦ番号３０２３８１、３０２４６６、３０２９０７、３０２９１６等が使用できる。
【００３４】
上記のバークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）によるトロポロン類の生産能を亢進する因子の存在下でバークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）を培養するには、バークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）によるトロポロン類の生産能を亢進する因子を加えた液体培地にバークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）細菌を接種した後に振とう培養又は静置培養すれば良い。バークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）によるトロポロン類の生産能を亢進する因子を加える前の培地としては、ＮＢ培地、ペプトン培地、０．５％ショ糖−０．０５％酵母エキス添加Ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙ’ｓ培地等何れの培地でも良いが、トロポロン類産生には特に０．５％ショ糖−０．０５％酵母エキス添加Ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙ’ｓ培地を使用するのが良い。また、培養条件としては、培養温度は１５℃〜３０℃、回転数は３０ｒｐｍ〜６０ｒｐｍあるいは静置培養、培養時間は１０日〜１４日が良い。
【００３５】
また、バークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）によるトロポロン類の生産能を亢進する各種因子としてＮ−３−ヒドロキシオクタノイルホモセリンラクトンとその関連化合物、アラニンのアルコールエステル体、β−アラニンのアルコールエステル体、プロトカテキ酸を使用する場合は、培地中に、Ｎ−３−ヒドロキシオクタノイルホモセリンラクトンは０．０００２５重量％〜０．００００２５重量％、アラニンのアルコールエステル体は０．１６重量％〜０．０１６重量％、β−アラニンのアルコールエステル体は０．１６重量％〜０．０１６重量％、プロトカテキ酸は０．０１５重量％〜０．００１５重量％、没食子酸は０．０１５重量％〜０．００１５重量％、キナ酸は０．４重量％〜０．０４重量％の濃度になるように添加するのが良い。
【００３６】
本方法で生産したＥＣ−Ｓ００１株培養液中の亢進物質の回収方法及び精製方法の１例は以下のとおりである。２００ｍＬのＭＷ培地で３日間振とう培養したＥＣ−Ｓ００１株培養液上清を塩酸でｐＨ４．０の弱酸性に調整後、等量の酢酸エチルで１回抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水した酢酸エチル可溶物濃縮物を順相シリカゲルカラムあるいは逆相担体であるＣｏｓｍｏｓｉｌ  Ｃ１８を用いた逆相カラムで精製し、アモルファス状固体として単離する。このようにしてＥＣ−Ｓ００１株培養物由来の亢進物質（亢進因子）を得る。ＬＩＡ−１  Ｒｏｏｔ１株由来の亢進物質も同様にして得ることができる。トロポロン類の製造にあたっては、該亢進物質をアモルファス状固体として、培地中に化合物によっては０．１ミリグラム〜２００ミリグラム／Ｌで０．００００１重量％〜０．０２重量％の濃度位となるように添加すればよい。
【００３７】
本発明によれば、特定の亢進物質を利用することによって、天然物由来のトロポロン類を効率的に工業生産することができる。
【００３８】
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではなく、本発明の技術的思想内においてこれらの様々な変形が可能である。
【実施例】
【００３９】
（実施例１）
（ＥＣ−Ｓ００１株の分離・入手）
抗菌剤未処理ホウレンソウ（品種名トニック）種子から無菌的に育成した芽生え根のプレスクリーニングにおいてＮＢ寒天平板上で分離された、種子着生細菌の優占株（優占率８０％）。ＮＢ寒天平板上ではもともとコロニーサイズが０．１ミリ程度と貧弱であるが、培養３日目に菌体が衰弱し、４日目には植え継ぎできない。高栄養培地への高い感受性はアンモニアへの耐性欠損による。また、高いＭｇ２＋要求性をもち、１１０μｍ以下のＭｇ２＋では増殖できない。例えば標準的なポテトデキストロース培地は、５０μｍしかＭｇ２＋を含んでいないため、ＥＣ−Ｓ００１株は増殖できず、わずか６０μｍのマグネシウム塩を添加するだけで急速に増殖できるようになる。より安定な増殖のあるいは分離には、市販のホウレンソウ１００グラムを１００〜２００ｍＬの水で煮だした煮汁、あるいはそれを１．５％寒天で固めた平板を用いた。得られた菌株をスフィンゴビウム・ヤノイクエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｙａｎｏｉｋｕｙａｅ）ＥＣ−Ｓ００１と命名し、ＮＩＴＥに寄託した（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６８０）。
【００４０】
（ＬＩＡ−１  Ｒｏｏｔ−１  株の分離・入手）
岡山県のイネの根から、通常のＰＤＡ寒天平板培地でＬＩＡ−１  Ｒｏｏｔ−１株を分離した。得られた菌株をスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＬＩＡ−１  Ｒｏｏｔ−１と命名し、ＮＩＴＥに寄託した（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６８１）。
【００４１】
プロトカテキ酸、没食子酸、キナ酸は市販の試薬を入手できる。
【００４２】
（トロポロン類の回収方法、精製方法及び生産量の測定方法）
試料溶液とする培地上澄１ｍＬに内部標準物質ｐ−ｔｏｌｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを終濃度１ｍＭとなるよう添加し、１Ｍ塩酸でＨＣｌｐＨ４に調整する。アセトンからメタノール、さらには水（それぞれ３ｍＬ）でコンディショニングした逆相Ｓｅｐ−ＰａｋカートリッジＣ１８（担体量２００ｍｇ）に１．００ｍＬの試料溶液を陰圧吸引で通し、さらに３ｍＬの純水でカートリッジを洗浄する。溶出は１．００ｍＬのメタノールで行い、溶出液はそのまま逆相ＨＰＬＣ分析に供した。定量ＨＰＬＣの条件は検出波長：２５５ｎｍ；移動相：ＣＨ３ＣＮ：１０ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ：１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ＝５５：４０：５とした。内部標準としたｐ−ｔｏｌｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（１０  ｎｍｏｌ／１０μＬ）のピーク１３．７ｍｉｎとのピーク比を取り、トロポロン（ｔＲ  １０．３ｍｉｎ，検量範囲０．０５ｎｍｏｌ−７．５μｍｏｌ）およびその前駆体であるフェニル酢酸（ｔＲ  １１．３ｍｉｎ，検量範囲０．０１ｎｍｏｌ−１．３μｍｏｌ）を定量した。
【００４３】
（トロポロン類の製造）
０．５％ショ糖−０．０５％酵母エキス添加Ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙ’ｓ培地（培地組成：ＫＨ２ＰＯ４（５０．０ｇ／Ｌ）；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（２５．０ｇ／Ｌ）；ＮａＣｌ（２５．０ｇ／Ｌ）；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（１．０ｇ／Ｌ）；Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（１．０ｇ／Ｌ）；ａｎｄ  ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ（１．０ｇ／Ｌ）；ＣａＣＯ３（０．２ｇ／Ｌ）  （ｐｌｕｓ  ＮａＯＨ  ｔｏ  ａｄｊｕｓｔ  ｔｈｅ  ｐＨ  ｔｏ  ７．２）を用いて、ＮＩＡＳジーンバンクから配布を受けたバークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）Ｔｙｐｅ  ｓｔｒａｉｎであるＭＡＦＦ番号３０２９１６株を培養することにより、トロポロンを製造した。その際、下記するトロポロン産生亢進因子を培地に添加した場合と無添加の場合（対象）と比較した。培養条件は、温度２５℃、振とう培養、で行った。培養終了後、先に述べた方法にしたがってトロポロンを回収、精製し、生産量を測定した。
【００４４】
トロポロンの生産能を亢進する因子及びその添加量等：
（１）スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌培養物：既述のとおりＥＣ−Ｓ００１株の４日培養物にそのままＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉを接種した。
（２）スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌培養物：既述のとおりＬＩＡ−１  Ｒｏｏｔ−１株の４日培養物にそのままＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉを接種した。
（３）プロトカテキ酸（培地中に０．５ｍＭ）
（４）キナ酸（培地中に１０ｍＭ）
（５）対照（亢進因子無添加）
【００４５】
トロポロンの生産量
Ｂ．ｐｌａｎｔａｒｉｉ  ＭＡＦＦ  ３０２９１６株と上記した亢進因子とを１４日間共培養してトロポロンを高生産させた。その結果を下記表１に示す。
【００４６】
（表１）

亢進因子                    トロポロン生産量（ｍＭ）                    
（１）                            １．４０
（２）                            １．５４
（３）                            １．４０
（４）                            １．４９
（５）対照                        ０．３１                                
【００４７】
（実施例２）
（Ｎ−３−ヒドロキシオクタノイルホモセリンラクトンの例と入手方法）
（＋）−Ｎ−３−ヒドロキシオクタン酸及びＬ−ホモセリンラクトンは和光純薬から購入した。Ｌ−ホモセリン（２０４ｍｇ）を濃硫酸で環化させ、ほぼ全量をＬ−ホモセリンラクトンに導いた。このアミノ基を（＋）−Ｎ−３−ヒドロキシオクタン酸と縮合剤でアミド結合させ、（３Ｓ）−Ｎ−３−ヒドロキシオクタノイルホモセリンラクトンと（３Ｒ）−Ｎ−３−ヒドロキシオクタノイルホモセリンラクトンを調整し、ＨＰＬＣで分離した。
【００４８】
（Ｌ−アラニンペンチルエステル、β−アラニンペンチルエステルの入手方法）
テトラヒドロフラン中、ＤＣＣなどの縮合剤によってアミノ酸（Ｌ−アラニン、もしくはβ−アラニン）とペンチルアルコールから効率良く合成することができる。これをシリカゲルカラムで精製した。
【００４９】
プロトカテキ酸、没食子酸、キナ酸は市販の試薬を入手できる。
【００５０】
（各種因子のトロポロン生産亢進効果）
バークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）によるトロポロンの生産は、非特許文献２の畔上の方法で判定した。すなわち、Ａｙｅｒｓ’ｓ基礎培地に鉄を添加した寒天培地（培地組成：ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４（１．０ｇ／Ｌ）；ＫＣｌ（０．２ｇ／Ｌ）；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．２ｇ／Ｌ）；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．５ｇ／Ｌ）；ブドウ糖（１０ｇ／Ｌ）；寒天（１８．０ｇ／Ｌ）；ｐＨを７．０に調整）に、ＮＩＡＳジーンバンクから配布を受けたバークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）Ｔｙｐｅ  ｓｔｒａｉｎであるＭＡＦＦ番号３０２９１６株を均一に混和した後、ペトリ皿に流し込みトロポロン生産平板培地を作成した。その培地表面に、下記するトロポロン産生亢進因子を浸み込ませたペーパーディスクを密着させ、温度２５℃で２０日間、静置培養を行った。培養終了後、各ペーパーディスクの周囲に形成されたトロポロン第二鉄錯塩の結晶の析出程度を下記指標に従って目視調査した。
【００５１】
−      結晶の析出程度が無添加区と同等
＋      結晶の析出程度が無添加区よりもやや多い
＋＋    結晶の析出程度が無添加区よりもかなり多い
＋＋＋  結晶の析出程度が無添加区よりも非常に多い
【００５２】
（トロポロンの生産能を亢進する因子及びそのペーパーディスクへの添加量等）
（１）Ｎ−３−ヒドロキシオクタノイルホモセリンラクトン（１μｇ／ディスク）
（２）Ｌ−アラニンペンチルエステル（１ｍｇ／ディスク）
（３）β−アラニンペンチルエステル（１ｍｇ／ディスク）
（４）プロトカテキ酸（１ｍｇ／ディスク）
（５）没食子酸（１ｍｇ／ディスク）
（６）キナ酸（１ｍｇ／ディスク）
（７）対照（亢進因子無添加）
【００５３】
（トロポロンの生産量）
Ｂ．ｐｌａｎｔａｒｉｉ  ＭＡＦＦ  ３０２９１６株と上記した亢進因子に曝露させた寒天平板培地でトロポロンを高生産させた。その結果を下記表２に示す。
【００５４】
（表２）

亢進因子                    トロポロン生産量（相対量）                  
（１）                          （＋＋＋）
（２）                            （＋）
（３）                            （＋）
（４）                            （＋＋）
（５）                            （＋）
（６）                            （＋）
（７）対照（無添加）              （−）                                
【００５５】
それぞれの上記結果から明らかなように、各種亢進物質はトロポロンを高生産することが確認され、これらはいずれもすぐれたトロポロン生産能を亢進する因子であることが立証された。
【００５６】
本発明を要約すれば次のとおりである。
【００５７】
本発明は、トロポロン類の製造につき、弊害が考えられる有機合成ではなく、天然物由来により、製造可能とすることを目的とする。
【００５８】
そして、バークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）によるトロポロン類の製造において、その生産能を亢進する因子（例えば、スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌培養物、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌培養物、化１にて示される化合物であるＮ−３−ヒドロキシオクタノイルホモセリンラクトン、化２にて示される化合物であるＮ−３−ヒドロキシオクタノイルホモセリンラクトン（ジアステレオマー）、アミノ酸のアルコールエステル体（例えば、Ｌ−アラニンのアルコールエステル体（例えば、化３にて示される化合物であるＬ−アラニンペンチルエステル）、同じく、β−アラニンのアルコールエステル体（例えば、化４にて示される化合物であるβ−アラニンペンチルエステル））、化５にて示されるプロトカテキ酸、化６にて示される没食子酸、化７にて示されるキナ酸の存在下で、バークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）を培養（特に、液体培養）することにより、トロポロン類が大量に生産されることにより、上記課題を解決する。
【受託番号】
【００５９】
本発明において寄託されている微生物の受託番号を下記に示す。
（１）スフィンゴビウム・ヤノイクエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｙａｎｏｉｋｕｙａｅ）  ＥＣ−Ｓ００１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６８０）。
（２）スフィンゴモナス  エスピー（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＬＩＡ−１  Ｒｏｏｔ−１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６８１）。