(57)【要約】【課題】新たな癌の治療法（特にはアンドロゲン受容体の拮抗薬による治療が無効となった難治性の去勢抵抗性前立腺癌）に対する治療法を提供する。また、前立腺癌の予後または進行を判定する方法を提供する。【解決手段】本発明の癌細胞増殖抑制剤、又は癌の予防若しくは治療用医薬は、有効成分として、ＣＯＢＬＬ１遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸、それをコードする塩基配列を含むＤＮＡ、又は前記ＤＮＡを含む発現ベクターを含む。前記判定方法は、ＣＯＢＬＬ１遺伝子をバイオマーカーとする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＯＢＬＬ１遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸であって、配列番号１〜６のいずれかの標的配列に対応する塩基配列を含むセンス鎖と、前記センス鎖に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖とを含む、二本鎖核酸。
【請求項２】
ｓｉＲＮＡである、請求項１に記載の二本鎖核酸。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の二本鎖核酸をコードする塩基配列を含む、ＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡを含む、発現ベクター。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の二本鎖核酸、請求項３に記載のＤＮＡ、及び請求項４に記載の発現ベクターからなる群から選んだ少なくとも１つの有効成分を含む、癌細胞増殖抑制剤。
【請求項６】
請求項５に記載の癌細胞増殖抑制剤を含む、癌の治療又は予防用医薬。
【請求項７】
前立腺癌の予後を判定する検査方法であって：
（１）患者の前立腺から採取した細胞におけるＣＯＢＬＬ１遺伝子の発現レベルを測定する工程と；
（２）前記発現レベルを正常な前立腺細胞における発現レベルと比較する工程と、
を含む方法。
【請求項８】
前立腺癌の進行を判定する検査方法であって：
（１）患者の前立腺から採取した細胞におけるＣＯＢＬＬ１遺伝子の発現レベルを測定する工程と；
（２）前記発現レベルを正常な前立腺細胞における発現レベルと比較する工程と、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＯＢＬＬ１を標的とする二本鎖核酸、それをコードするＤＮＡ、前記ＤＮＡを含む発現ベクターに関し、また、これらの少なくとも１つを有効成分として含む癌細胞増殖抑制剤、前記癌細胞増殖抑制剤を含む癌の治療又は予防用医薬に関し、更には、前立腺癌の予後または進行を判定する検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は欧米において男性が罹患する最も頻度の高い癌である。日本においても、食生活の欧米化及び人口の高齢化に伴い、前立腺癌の患者数は飛躍的に増加している。その治療技術として臨床的には前立腺摘出術を始めとする外科的治療、抗癌剤による化学療法および放射線治療が広く応用されている。外科的治療が第一選択であるがすでに癌の進行した状態で診断されたとき、外科手術後の再発などにより手術が困難な場合において外科的治療以外の治療法が選択される。一般に前立腺癌の増殖はアンドロゲンにより刺激される。そのためアンドロゲン産生、機能を阻害するホルモン療法がしばしば行われる。その効果は極めてよいものの数年以内に去勢抵抗性前立腺癌（Castration-Resistant Prostate Cancer；ＣＲＰＣ）として再燃することが問題となる。そのため去勢抵抗性癌の制御が最も重要な課題となっている。
【０００３】
アンドロゲン依存性癌から去勢抵抗性癌への進行の詳細な分子メカニズムはいまだ明らかでないが、アンドロゲン受容体（Androgen receptor；ＡＲ）の関与が示唆されている。すなわち去勢抵抗性癌は、アンドロゲン受容体の変異やスプライシング変異体、あるいは増幅により、超低濃度のアンドロゲン、抗アンドロゲン剤、その他のステロイドホルモンなどに感受性を示すことが示唆されている。このような癌では新世代のアンドロゲン受容体拮抗薬に関しても必ずしも反応せず、いずれにせよ治療中に抵抗性を獲得して無効となる。ホルモン療法不応性となった場合、現状では抗癌剤療法が奏功する例もあるが、効果を示す症例は限定的で、その効果を予測するマーカーはない。アンドロゲン受容体の機能を直接抑制するためのＲＮＡ干渉（RNA interference；ＲＮＡｉ）技術を応用した方法も開発されてきている（非特許文献１、２）が、臨床的に十分なものはいまだにない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Snoek R, Cheng H, Margiotti K, Wafa LA, Wong CA, Wong EC, et al. In vivo knockdown of the androgen receptor results in growth inhibition and regression of well-established, castration-resistant prostate tumors. Clin Cancer Res 2009;15:39-47.
【非特許文献２】Yamamoto Y, Loriot Y, Beraldi E, Zhang F, Wyatt AW, Al Nakouzi N, et al.Generation 2.5 antisense oligonucleotides targeting the androgen receptor and its splice variants suppress enzalutamide-resistant prostate cancer cell growth. Clin Cancer Res. 2015;21:1675-1687.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような状況下、本発明は、新たな癌の治療法、特には、アンドロゲン受容体の拮抗薬による治療が無効となった難治性の去勢抵抗性前立腺癌に対する治療法を提供することを課題とする。また、本発明の別の課題は、前立腺癌の予後または進行を判定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前立腺癌においてアンドロゲン受容体は癌の発生、進行に大きな役割を果たしている。本発明者は、今回、前立腺癌の悪性化に伴い発現量が増加する因子として、アンドロゲン受容体の新たな標的遺伝子ｃｏｒｄｏｎ  ｂｌｅｕ−ｌｉｋｅ  １（ＣＯＢＬＬ１）を見出した。また、ＣＯＢＬＬ１はアクチン結合ドメインを持つが、その詳細な機能は不明であったが、本発明者は、ＣＯＢＬＬ１はＡＲシグナルの増強因子として働き、前立腺癌細胞の形態を変容させることを見出した。
本発明者は、これらの知見に基づき、今回、ＣＯＢＬＬ１を標的とする複数のｓｉＲＮＡを設計し、アンドロゲン依存性の前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰを用いて細胞癌細胞増殖抑制効果を調べたところ、設計したｓｉＲＮＡの中でも効果に顕著な差異が認められ、特定の標的配列に対するｓｉＲＮＡが癌細胞増殖抑制剤として有用であることが示唆された。更に、これらの中から効果の優れたｓｉＲＮＡを選択し、難治性の去勢抵抗性前立腺癌のモデルであるＬＴＡＤ細胞及び２２Ｒｖ１細胞を用いて、前記前立腺癌細胞の増殖と、動物モデルでの移植された腫瘍の増殖を有意に抑制することを示した。
また、癌組織でのＣＯＢＬＬ１高発現は前立腺癌患者の予後不良因子であると共に、進行の程度と相関することを示し、診断学的な価値や治療薬選択法のバイオマーカーとしての利用価値を有していることを示した。
【０００７】
従って、本発明は、
［１］ＣＯＢＬＬ１遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸であって、配列番号１〜６のいずれかの標的配列に対応する塩基配列を含むセンス鎖と、前記センス鎖に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖とを含む、二本鎖核酸；
［２］ｓｉＲＮＡである、［１］の二本鎖核酸；
［３］前記［１］又は［２］の二本鎖核酸をコードする塩基配列を含む、ＤＮＡ；
［４］前記［３］のＤＮＡを含む、発現ベクター；
［５］前記［１］又は［２］の二本鎖核酸、前記［３］のＤＮＡ、及び前記［４］の発現ベクターからなる群から選んだ少なくとも１つの有効成分を含む、癌細胞増殖抑制剤；
［６］前記［５］の癌細胞増殖抑制剤を含む、癌の治療又は予防用医薬；
［７］前立腺癌の予後を判定する検査方法であって：
（１）患者の前立腺から採取した細胞におけるＣＯＢＬＬ１遺伝子の発現レベルを測定する工程と；
（２）前記発現レベルを正常な前立腺細胞における発現レベルと比較する工程と、
を含む方法；
［８］前立腺癌の進行を判定する検査方法であって：
（１）患者の前立腺から採取した細胞におけるＣＯＢＬＬ１遺伝子の発現レベルを測定する工程と；
（２）前記発現レベルを正常な前立腺細胞における発現レベルと比較する工程と、
を含む方法；
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の二本鎖核酸、それをコードするＤＮＡ、前記ＤＮＡを含む発現ベクターによれば、ＣＯＢＬＬ１を標的とする新たな癌細胞増殖抑制剤、又は癌の治療又は予防用医薬を提供することができる。
また、本発明の検査方法によれば、前立腺癌の予後または進行を判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】アンドロゲン受容体陽性のアンドロゲン依存性前立腺癌のモデルであるヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ細胞に８種類のｓｉＣＯＢＬＬ１（ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ａ〜ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｈ）を投与し、ｍＲＮＡの相対的発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図２】ＬＮＣａＰ細胞に８種類のｓｉＣＯＢＬＬ１（ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ａ〜ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｈ）を投与し、ＭＴＳアッセイにより生細胞数を測定した結果を示すグラフである。
【図３】去勢抵抗性前立腺癌のモデルであるＬＴＡＤ細胞に４種類のｓｉＣＯＢＬＬ１（ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｃ、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｄ、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｆ、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｇ）を投与し、ｍＲＮＡの相対的発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図４】ＬＮＣａＰ細胞に４種類のｓｉＣＯＢＬＬ１（ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｃ、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｄ、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｆ、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｇ）を投与し、ＭＴＳアッセイにより生細胞数を測定した結果を示すグラフである。
【図５】ＬＮＣａＰ細胞又はＬＴＡＤ細胞に２種類のｓｉＣＯＢＬＬ１（ｓｉＣＯＢＬＬ１＃１、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃２）を投与し、ウエスタンブロッティングの結果を示す図面である。
【図６】皮下にＬＴＡＤ細胞を移植したマウスにｓｉＣＯＢＬＬ１＃１を投与し、腫瘍体積を測定した結果を示すグラフである。
【図７】皮下にＬＴＡＤ細胞を移植したマウスにｓｉＣＯＢＬＬ１＃１を投与した後、腫瘍を摘出し、腫瘍から抽出したタンパク質溶液を用いてウエスタンブロッティングを行った結果を示す図面である。
【図８】皮下に去勢抵抗性前立腺癌の別のモデルである２２Ｒｖ１細胞を移植したマウスにｓｉＣＯＢＬＬ１＃１又はｓｉＣＯＢＬＬ１＃２を投与し、腫瘍体積を測定した結果を示すグラフである。
【図９】皮下に２２Ｒｖ１細胞を移植したマウスにｓｉＣＯＢＬＬ１＃１又はｓｉＣＯＢＬＬ１＃２を投与した後、腫瘍を摘出し、腫瘍から抽出したタンパク質溶液を用いてウエスタンブロッティングを行った結果を示す図面である。
【図１０】１０２例の根治的前立腺全摘術により得られた前立腺癌検体を用いて免疫染色を行い、ＣＯＢＬＬ１の発現量と前立腺全摘術後の癌特異的生存率との関係を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により解析した結果を示すグラフである。
【図１１】図１０で用いた前立腺癌検体（１０２例）について、ＣＯＢＬＬ１の発現量、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の発現量、前立腺癌の進行との関係を解析した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
《二本鎖核酸》
本発明の二本鎖核酸は、ＣＯＢＬＬ１遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸であって、配列番号１〜６のいずれかの標的配列に対応する塩基配列を含むセンス鎖と、前記センス鎖に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖とを含むことを特徴とする。なお、本明細書において「二本鎖核酸」とは、所望のセンス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイズしてなる二本鎖核酸領域を含む核酸分子を意味し、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）であることが好ましい。
【００１１】
（ＣＯＢＬＬ１遺伝子）
前記ＣＯＢＬＬ１（cordon-bleu like 1）遺伝子の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）などの公共データベースを通じて容易に入手することができ、例えば、ヒトＣＯＢＬＬ１遺伝子は、ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿０１４９００．３である。ＣＯＢＬＬ１はアクチン結合ドメインを有するが、その詳細な機能は不明であった。本発明者は、今回、ＣＯＢＬＬ１遺伝子の或る特定の配列を標的とするｓｉＲＮＡが前立腺癌細胞の増殖と、動物モデルでの移植された腫瘍の増殖を有意に抑制することを示し、本発明を完成した。
参考として、ヒトＣＯＢＬＬ１遺伝子の塩基配列を配列番号２５に示す。
【００１２】
（センス鎖及びアンチセンス鎖）
本発明の二本鎖核酸は、２３塩基からなる配列番号１〜６のいずれかの標的配列に対応する塩基配列を含むセンス鎖と、前記センス鎖に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖とを含む。
ここで、「標的配列に対応する塩基配列」とは、標的配列と同一の塩基配列であるか、あるいは、前記標的配列において１若しくは数個（例えば、２〜３個）の塩基が置換された塩基配列を意味する。二本鎖核酸がｓｉＲＮＡである場合、１〜数塩基のミスマッチを含んでいても、ＲＮＡｉ効果が得られることが知られている。本発明では、標的配列と同一の塩基配列だけでなく、ＲＮＡｉ効果が得られる限り、ミスマッチを含む塩基配列であってもよい。
【００１３】
また、アンチセンス鎖における「センス鎖に相補的な塩基配列」とは、センス鎖とハイブリダイズすることができる程度に相補的な塩基配列であればよく、センス鎖に完全に相補的な塩基配列であるか、あるいは、前記センス鎖に完全に相補的な塩基配列において１若しくは数個（例えば、２〜３個）の塩基が置換された塩基配列であることができる。
【００１４】
（核酸の種類と修飾）
二本鎖核酸を構成する核酸の種類は、特に限定されるものではなく、適宜選択することができ、例えば、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ型二本鎖核酸を挙げることができる。キメラ型はＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡの一部をＤＮＡに換えたものであり、血清中での安定性が高く、免疫応答誘導性が低いことが知られている。
また、二本鎖核酸は、例えば、２’−ＯＨ基の修飾、バックボーンのホスホロチオエートによる置換やボラノホスフェート基による修飾、リボースの２位と４位が架橋されたＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）の導入などによって、ヌクレアーゼに対する耐性や安定化を高めることもできる。あるいは、細胞への導入効率を高める等の目的から、二本鎖核酸のセンス鎖の５’端、或いは３’端に、例えば、ナノ粒子、コレステロール、細胞膜通過ペプチド等の修飾を施すこともできる。
【００１５】
（ｓｉＲＮＡ）
本発明の二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（キメラ型を含む）であることが好ましい。ここで、「ｓｉＲＮＡ」とは、１８塩基長〜２９塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖（ガイド鎖）と相補的な配列をもつ標的遺伝子のｍＲＮＡを切断し、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。
前記ｓｉＲＮＡは、先述したようなセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、かつ所望のＲＮＡｉ効果を示すものであれば、その末端構造に特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、前記ｓｉＲＮＡは、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。中でも、前記ｓｉＲＮＡは、各鎖の３’末端が２塩基〜６塩基突出した構造を有することが好ましく、各鎖の３’末端が２塩基突出した構造を有することがより好ましい。
【００１６】
本発明のｓｉＲＮＡとしては、表１に示すように、例えば、配列番号１（２３塩基）を標的配列とする配列番号７（２１塩基）のセンス鎖と配列番号８（２１塩基）のアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ（後述する実施例におけるｓｉＣＯＢＬＬ１＃１、別称としてｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｃ）、配列番号２（２３塩基）を標的配列とする配列番号９（２１塩基）のセンス鎖と配列番号１０（２１塩基）のアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ（同ｓｉＣＯＢＬＬ１＃２、別称としてｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｄ）、配列番号３（２３塩基）を標的配列とする配列番号１１（２１塩基）のセンス鎖と配列番号１２（２１塩基）のアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ（同ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｅ）、配列番号４（２３塩基）を標的配列とする配列番号１３（２１塩基）のセンス鎖と配列番号１４（２１塩基）のアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ（同ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｆ）、配列番号５（２３塩基）を標的配列とする配列番号１５（２１塩基）のセンス鎖と配列番号１６（２１塩基）のアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ（同ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｇ）、配列番号６（２３塩基）を標的配列とする配列番号１７（２１塩基）のセンス鎖と配列番号１８（２１塩基）のアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ（同ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｈ）を挙げることができる。
【００１７】
この中でも、配列番号７のセンス鎖と配列番号８のアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＢＬＬ１＃１、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｃ）、配列番号９のセンス鎖と配列番号１０のアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＢＬＬ１＃２、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｄ）、配列番号１３のセンス鎖と配列番号１４のアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｆ）、配列番号１５のセンス鎖と配列番号１６のアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｇ）が好ましく；配列番号７のセンス鎖と配列番号８のアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＢＬＬ１＃１、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｃ）、配列番号９のセンス鎖と配列番号１０のアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＢＬＬ１＃２、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｄ）、配列番号１５のセンス鎖と配列番号１６のアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｇ）がより好ましく；配列番号７のセンス鎖と配列番号８のアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＢＬＬ１＃１、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｃ）、配列番号９のセンス鎖と配列番号１０のアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＢＬＬ１＃２、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｄ）が更に好ましく；配列番号９のセンス鎖と配列番号１０のアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＢＬＬ１＃２、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｄ）が特に好ましい。
【００１８】
【表１】
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〔表１において、「標的配列」は、配列番号２５で表されるヒトＣＯＢＬＬ１遺伝子（ＮＭ＿０１４９００．３）における塩基番号による。塩基配列欄の３種類の塩基配列は、上から順に、標的配列（２３塩基）、センス鎖（２１塩基）、アンチセンス鎖（２１塩基）である。〕
【００１９】
（製造方法）
本発明の二本鎖ＲＮＡ(特にはｓｉＲＮＡ)は、従来公知の手法に基づき作製することができる。
例えば、所望のセンス鎖とアンチセンス鎖とに相当する１８塩基長〜２９塩基長の一本鎖ＲＮＡを、それぞれ既存のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置等を利用して化学的に合成し、それらをアニーリングすることにより作製することができる。また、後述する本発明のベクターのような、所望のｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、前記発現ベクターを細胞内に導入することにより、細胞内の反応を利用してｓｉＲＮＡを作製することもできる。
【００２０】
《ＤＮＡ、発現ベクター》
本発明のＤＮＡは、先述した、本発明の二本鎖核酸（特にはｓｉＲＮＡ）をコードする塩基配列を含むことを特徴とするＤＮＡであり、本発明の発現ベクターは、前記ＤＮＡを含むことを特徴とする発現ベクターである。
【００２１】
（ＤＮＡ）
前記ＤＮＡとしては、先述した、本発明の二本鎖核酸をコードする塩基配列を含むＤＮＡであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記二本鎖核酸をコードする塩基配列の上流（５’側）に、前記二本鎖核酸の転写を制御するためのプロモーター配列が連結されていることが好ましい。前記プロモーター配列としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、ＣＭＶプロモーター等のｐｏｌ  ＩＩ系プロモーター、Ｈ１プロモーター、Ｕ６プロモーター等のｐｏｌ  ＩＩＩ系プロモーターなどが挙げられる。
【００２２】
また、更に、前記二本鎖核酸をコードする塩基配列の下流（３’側）に、前記二本鎖核酸の転写を終結させるためのターミネーター配列が連結されていることがより好ましい。前記ターミネーター配列としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２３】
前記プロモーター配列、前記二本鎖核酸をコードするヌクレオチド配列、及び前記ターミネーター配列を含む転写ユニットは、前記ＤＮＡにおける好ましい一態様である。なお、前記転写ユニットは、従来公知の手法を用いて構築することができる。
【００２４】
（発現ベクター）
前記ベクターとしては、前記ＤＮＡを含むものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。前記ベクターは、前記二本鎖核酸（特にｓｉＲＮＡ）を発現可能な発現ベクターであることが好ましい。
前記二本鎖核酸の発現様式としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば二本鎖核酸としてｓｉＲＮＡを発現させる方法として、短い一本鎖ＲＮＡを二本発現させる方法（タンデム型）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）として一本鎖ＲＮＡを発現させる方法（ヘアピン型）等が挙げられる。ここで、ｓｈＲＮＡとは、１８塩基〜２９塩基程度のｄｓＲＮＡ領域と３塩基〜９塩基程度のｌｏｏｐ領域を含む一本鎖ＲＮＡであるが、ｓｈＲＮＡは、生体内で発現されることにより、塩基対を形成してヘアピン状の二本鎖ＲＮＡとなる。その後、ｓｈＲＮＡはＤｉｃｅｒ（ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ酵素）により切断されてｓｉＲＮＡとなり、標的遺伝子の発現抑制に機能することができる。
【００２５】
前記タンデム型ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、前記ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖をコードするＤＮＡ配列と、アンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とを含み、かつ、各鎖をコードするＤＮＡ配列の上流（５’側）にプロモーター配列がそれぞれ連結され、また、各鎖をコードするＤＮＡ配列の下流（３’側）にターミネーター配列がそれぞれ連結されたＤＮＡを含む。
【００２６】
また、前記ヘアピン型ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、前記ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖をコードするＤＮＡ配列と、アンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とが逆向きに配置され、前記センス鎖ＤＮＡ配列とアンチセンス鎖ＤＮＡ配列とがループ配列を介して接続されており、かつ、それらの上流（５’側）にプロモーター配列が、また、下流（３’側）にターミネーター配列が連結されたＤＮＡを含む。
前記各ベクターは、従来公知の手法を用いて構築することができ、例えば、前記ＤＮＡを、予め制限酵素で切断したベクターの切断部位に連結（ライゲーション）することにより構築することができる。
【００２７】
前記ＤＮＡ又は前記ベクターを細胞に導入（トランスフェクト）することにより、プロモーターが活性化され、前記二本鎖核酸を生成することができる。例えば、前記タンデム型ベクターにおいては、前記ＤＮＡが細胞内で転写されることにより、センス鎖及びアンチセンス鎖が生成され、それらがハイブリダイズすることによりｓｉＲＮＡが生成される。前記ヘアピン型ベクターにおいては、前記ＤＮＡが細胞内で転写されることにより、まずヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が生成され、次いで、ダイサーによるプロセシングにより、ｓｉＲＮＡが生成される。
【００２８】
《癌細胞増殖抑制剤》
本発明の癌細胞増殖抑制剤は、先述した本発明の二本鎖核酸、ＤＮＡ、又はベクターの少なくともいずれか１つの有効成分を含み、更に必要に応じてその他の成分を含むことができる。
【００２９】
（癌細胞）
前記癌細胞増殖抑制剤の適用対象となる細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前立腺癌細胞が好適に挙げられ、前記前立腺癌細胞は、アンドロゲン依存性前立腺癌細胞であっても、ホルモン療法の効かない難治性の去勢抵抗性前立腺癌細胞であってもよく、特に去勢抵抗性前立腺癌細胞に適用することが好ましい。前記癌細胞増殖抑制剤は、先述した本発明の二本鎖核酸、ＤＮＡ、又はベクターの少なくともいずれかを含むため、ＣＯＢＬＬ１遺伝子の発現抑制を介して、癌細胞の増殖を効果的に抑制することができる。
【００３０】
（投与方法、投与量）
前記癌細胞増殖抑制剤は、例えば、癌細胞に導入（トランスフェクト）することによって、前記細胞に作用させることができる。前記導入の方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トランスフェクション試薬を用いる方法、エレクトロポレーションによる方法、磁気粒子を用いる方法、ウイルス感染を利用する方法などが挙げられる。
癌細胞に対して作用させる癌細胞増殖抑制剤の量としても、特に制限はなく、細胞の種類や所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、１×１０６個の細胞数に対し、二本鎖核酸の量として、０．１μｇ程度が好ましく、５μｇ程度がより好ましく、１５μｇ程度が特に好ましい。
【００３１】
（その他の成分）
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記二本鎖核酸、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを所望の濃度に希釈するための生理食塩水、培養液等の希釈用剤や、対象とする細胞内に前記二本鎖核酸、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを導入（トランスフェクト）するためのトランスフェクション試薬などが挙げられる。
前記癌細胞増殖抑制剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３２】
《医薬》
本発明の医薬（医薬組成物）は、癌を治療又は予防するための医薬であり、先述した本発明の癌細胞増殖抑制剤を含み、更に必要に応じてその他の成分を含むことができる。
【００３３】
（癌）
前記癌治療又は予防用医薬の適用対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前立腺癌及び／又はその転移癌が好適に挙げられ、前記前立腺癌は、アンドロゲン依存性前立腺癌であっても、ホルモン療法の効かない難治性の去勢抵抗性前立腺癌であってもよく、特に去勢抵抗性前立腺癌細胞に適用することが好ましい。
【００３４】
（剤形、投与方法）
前記医薬の剤型としては、特に制限はなく、所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。
また、有効成分以外のその他の成分として、所望の医薬添加物、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等を含むことができる。
【００３５】
前記医薬の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記医薬の剤型、疾患の種類、患者の状態等に応じて、局所投与、全身投与のいずれかを選択することができる。例えば、局所投与においては、前記医薬を、所望の部位（例えば、腫瘍部位）に直接注入することにより投与することができる。前記注入には、注射等の従来公知の手法を適宜利用することができる。また、全身投与（例えば、経口投与、腹腔内投与、血液中への投与等）においては、前記医薬の有効成分が所望の部位（例えば、腫瘍部位）まで安定に、かつ効率良く送達されるよう、従来公知の薬剤送達技術を適宜応用することが好ましい。
【００３６】
前記医薬の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への１日の投与あたり、二本鎖核酸の量として、１ｍｇ〜１００ｍｇが好ましい。
また、前記医薬の投与回数としても、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて、適宜選択することができる。
【００３７】
（癌の治療又は予防方法等）
また、本発明は、癌の治療又は予防用医薬に加えて、
癌の治療又は予防の必要がある対象に、その有効量で、本発明の癌細胞増殖抑制剤を投与することを含む、癌の治療または予防方法；
本発明の癌細胞増殖抑制剤の、癌の治療又は予防用医薬の製造への使用；
癌の治療又は予防用である、本発明の癌細胞増殖抑制剤
にも関する。
【００３８】
《検査方法》
本発明の前立腺癌の予後を判定する検査方法は、患者の前立腺から採取した細胞におけるＣＯＢＬＬ１遺伝子の発現レベルを測定する工程と、その発現レベルを正常な前立腺細胞における発現レベルと比較する工程と、を含む。
また、本発明の前立腺癌の進行を判定する検査方法は、患者の前立腺から採取した細胞におけるＣＯＢＬＬ１遺伝子の発現レベルを測定する工程と、その発現レベルを正常な前立腺細胞における発現レベルと比較する工程と、を含む。
【００３９】
本発明の前立腺癌の予後または進行を判定する検査方法は、測定値（又は予め決定した閾値）等を比較することにより、医師の判断を仰ぐことなく判定結果を得ることができるものであり、前立腺癌の予後または進行の判断を補助するための検査方法である。また、本発明の検査方法は、患者から採取した試料を用いてイン・ビトロで行う検査方法でもある。
【００４０】
（予後の判定）
本発明者は、患者の前立腺癌細胞において、ＣＯＢＬＬ１遺伝子の発現量の上昇が予後不良と相関関係を有することを見出した。従って、本発明の検査方法による検査の結果、ＣＯＢＬＬ１遺伝子の発現が正常細胞に比較して有意に高い場合、予後は不良となる可能性が高いものと予測することができる。
【００４１】
（進行の判定）
また、本発明者は、患者の前立腺癌細胞において、ＣＯＢＬＬ１遺伝子の発現量の上昇が、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の発現量の上昇、あるいは、グリーソンスコア（Ｇｌｅａｓｏｎ  Ｓｃｏｒｅ）の上昇と相関関係を有することを見出した。従って、本発明の検査方法による検査の結果、ＣＯＢＬＬ１遺伝子の発現が正常細胞に比較して有意に高い場合、前立腺癌が進行していると判断することができる。
【００４２】
（発現レベルの測定）
本発明の検査方法において、ＣＯＢＬＬ１遺伝子の発現レベルは、常法により測定することができる。例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ又はノーザンブロッティング等によりｍＲＮＡレベルで測定することもできるし、あるいは、ウエスタンブロッティング又は免疫組織染色等によりタンパク質レベルで測定することもできる。
【００４３】
（正常値との比較）
このようにして測定した患者由来の前立腺癌細胞における測定値と、正常な前立腺細胞における発現レベルとの比較は、常法により行うことができ、例えば、それぞれ別々に採取した各細胞における発現レベルを測定し、それらを比較することもできるし、あるいは、予め決定した正常な前立腺細胞における閾値と比較することもできる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００４５】
《実施例１：ｓｉＣＯＢＬＬ１の設計》
ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）から入手した、配列番号２５で表されるヒトＣＯＢＬＬ１遺伝子（ＮＭ＿０１４９００．３）の塩基配列から、表１に示す８種類のｓｉＲＮＡを設計し、ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈに合成を委託した。なお、前記塩基配列（ＮＭ＿０１４９００．３）は９４８８塩基からなり、コード領域（ＣＤＳ）は２２３番〜３７２３番である。また、ｓｉＲＮＡ＃Ａ〜ｓｉＲＮＡ＃Ｈ（以下、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ａ〜ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｈと称する）は、いずれも、標的配列は２３塩基であり、２１塩基からなるセンス鎖及びアンチセンス鎖は、その３’末端側の２塩基は突出末端（オーバーハング）である。
【００４６】
【表２】
2019165706.tif 000003
〔表２において、「開始位置」及び「終了位置」は、それぞれ、標的配列の開始位置および終了位置を意味し、配列番号２５で表されるヒトＣＯＢＬＬ１遺伝子（ＮＭ＿０１４９００．３）における塩基番号で示す。〕
【００４７】
《実施例２：ｍＲＮＡレベルにおけるｓｉＣＯＢＬＬ１によるＣＯＢＬＬ１ノックダウン効率の検証》
実施例１で合成したｓｉＲＮＡによるＣＯＢＬＬ１発現抑制の効果を検証するため、ＲＮＡレベルでの発現量の測定を行った。アンドロゲン受容体（ＡＲ）陽性のヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７４０）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｓｉｇｍａ）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）にて培養し、６ウェルプレートに３×１０５細胞／ウェルになるようにまき、２４時間以内にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉ  ＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて計８種類のｓｉＲＮＡのトランスフェクションを行った。ｓｉＲＮＡは、２０μｍｏｌ／Ｌネガティブコントロール（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ；Ａｍｂｉｏｎ）と、８種類の５０μｍｏｌ／Ｌ  ｓｉＣＯＢＬＬ１（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１０ｎｍｏｌ／Ｌになるように調整し、細胞へ加えた。トランスフェクション後７２時間以内にＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）でＲＮＡの回収を行った。５００ｎｇ  ＲＮＡをＰｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ）を用いてｃＤＮＡ合成した。ｃＤＮＡ合成後、１０倍希釈し、そのうちの２μＬを用いて定量的リアルタイムＰＣＲを行った。内部コントロールにはＧＡＰＤＨ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）を用いて補正を行い発現レベルの解析を行った。
【００４８】
結果を図１に示す。８種類のｓｉＣＯＢＬＬ１配列（ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ａ〜ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｈ）は、ネガティブコントロール（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）に比べてｍＲＮＡレベルでＣＯＢＬＬ１がノックダウンされていた。その中でもｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｂ、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｃ、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｄ配列が特に効果が高かった。
【００４９】
《実施例３：ＣＯＢＬＬ１ノックダウンによるＬＮＣａＰ細胞増殖への影響》
次にＣＯＢＬＬ１発現抑制によるＬＮＣａＰ細胞の増殖能への影響を検討した。ＬＮＣａＰ細胞は９６ウェルプレートに３×１０３細胞／ウェルになるように継代し、２４時間以内にｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。ｓｉＲＮＡは、２０μｍｏｌ／Ｌネガティブコントロール（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ；Ａｍｂｉｏｎ）と、８種類の５０μｍｏｌ／Ｌ  ｓｉＣＯＢＬＬ１（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１０ｎｍｏｌ／Ｌになるように調整し、細胞へ加えた。細胞の継代後１日後、４日後、５日後、６日後に細胞増殖アッセイを実施した。前記アッセイはＭＴＳアッセイにより行い、ＰＥＳ（phenazine ethosulfate）を介して、テトラゾリウム塩［ＭＴＳ；3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt］を発色物質であるホルマザン産物へ変換する還元反応に基づいて、生細胞数を測定した。マイクロプレートリーダーにて吸光度４９０ｎｍで細胞増殖能を測定した。
【００５０】
結果を図２に示す。ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｃ、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｄ、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｅ、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｆ、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｇ、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｈでは、試薬のみ（ｎ．ｃ．）、ネガティブコントロール（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）と比較して、有意に細胞増殖が抑えられていた。増殖抑制効果が顕著かつ発現抑制効果も顕著なｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｃ、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｄ、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｆ、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｇを次の実験に使用することとした。
【００５１】
《実施例４：去勢抵抗性前立腺癌モデルＬＴＡＤ細胞におけるｍＲＮＡレベルでのｓｉＣＯＢＬＬ１によるＣＯＢＬＬ１ノックダウン効率の検証》
ＬＮＣａＰ細胞の代わりに、難治性の去勢抵抗性前立腺癌（Castration-Resistant Prostate Cancer；ＣＲＰＣ）のモデルであるＬＴＡＤ（long-time androgen deprived）細胞を用いること、８種類のｓｉＣＯＢＬＬ１の代わりに４種類のｓｉＣＯＢＬＬ１を用いること以外は、前記実施例２の手順に従って、ｍＲＮＡの発現レベルを解析した。前記ＬＴＡＤ細胞は、ＬＮＣａＰ細胞をアンドロゲン枯渇培地で６か月間培養して得られたＣＲＰＣモデル細胞である（Takayama, K. et al., EMBO J 2013, 32, 1665-1680.）。
【００５２】
結果を図３に示す。４種類のｓｉＣＯＢＬＬ１配列は、ネガティブコントロール（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）に比べてｍＲＮＡレベルでＣＯＢＬＬ１がノックダウンされていた。その中でもｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｃ、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｄ、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｇ配列が特に効果が高かった。
【００５３】
《実施例５：ＣＯＢＬＬ１ノックダウンによるＬＴＡＤ細胞の去勢抵抗性増殖への影響》
ＬＮＣａＰ細胞の代わりにＬＴＡＤ細胞を用いること、８種類のｓｉＣＯＢＬＬ１の代わりに４種類のｓｉＣＯＢＬＬ１を用いること以外は、前記実施例３の手順に従って、細胞増殖能を解析した。結果を図４に示す。ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｃ、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｄ、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｇでは、試薬のみ（ｎ．ｃ．）、ネガティブコントロール（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）と比較して、有意に細胞増殖が抑えられていた。以下、発現抑制効果の強いｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｃ、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃Ｄ（以下、それぞれ、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃１、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃２と称する）を選択しさらに詳細な実験を行った。
【００５４】
《実施例６：タンパク質レベルにおけるｓｉＣＯＢＬＬ１によるＣＯＢＬＬ１ノックダウン効率の検証》
発現抑制効果の強かったｓｉＣＯＢＬＬ１＃１、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃２によるＣＯＢＬＬ１発現抑制の効果を検証するため、タンパク質レベルでの発現量の測定を行った。ＬＮＣａＰ細胞又はＬＴＡＤ細胞を６ウェルプレートに３×１０５細胞／ウェルになるようにまき、２４時間以内にｓｉＲＮＡのトランスフェクションを行った。ｓｉＲＮＡは、２０μｍｏｌ／Ｌネガティブコントロール（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ；Ａｍｂｉｏｎ）と、２種類の５０μｍｏｌ／Ｌ  ｓｉＣＯＢＬＬ１（ｓｉＣＯＢＬＬ１＃１、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃２；ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１０ｎｍｏｌ／Ｌになるように調整し、細胞へ加えた。内部コントロールにはβ−アクチンを用いて補正を行い、ウエスタンブロッティングによりタンパク質レベルでの発現レベルの解析を行った。その結果を図５に示す。２種類のｓｉＣＯＢＬＬ１配列に関して、ネガティブコントロール（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）に比べてＣＯＢＬＬ１が顕著にノックダウンされており、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃１、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃２の両配列とも効果が高かった。
【００５５】
《実施例７：イン・ビボにおける腫瘍（ＬＴＡＤ細胞）増殖に対するｓｉＣＯＢＬＬ１の投与の効果》
イン・ビボでの腫瘍増殖への影響を調べるため、マウス皮下への腫瘍移植モデルを使用し、ｓｉＣＯＢＬＬ１による効果を検討した。腫瘍移植のためにＬＴＡＤ細胞を１×１０７細胞に調整した後、マトリゲル（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と１：１で混合し、５週齢雄性ヌードマウスへ皮下注射した。マウス皮下注射後５〜８週間、腫瘍体積が１００〜２００ｍｍ３くらいに達したところで精巣摘除を行い、難治性の去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）治療効果を検討するモデルとした。順次週３回のｓｉＣＯＢＬＬ１投与で治療を開始した。ネガティブコントロール（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ；ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と比較し、この動物での検討にはｓｉＣＯＢＬＬ１＃１を用いた。ｓｉＲＮＡはそれぞれ５μｇ／匹になるように使用した。ｓｉＲＮＡはフェノールレッド不含ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１５μＬと混合して１００μＬを腫瘍に注射した。ｓｉＲＮＡ剤による治療は３回／週を４週間繰り返し、腫瘍径（長径ｒ１、短径（２か所）ｒ２、ｒ３）を測定し、ｖ＝０．５×ｒ１×ｒ２×ｒ３の式により腫瘍体積を算出した。結果を図６に示す。ｓｉＣＯＢＬＬ１の投与はマウスにおける腫瘍の増殖を有意に抑制することを見出した。
【００５６】
《実施例８：イン・ビボ腫瘍（ＬＴＡＤ細胞）内におけるｓｉＣＯＢＬＬ１投与によるＣＯＢＬＬ１タンパク質のノックダウン効率の解析》
腫瘍におけるｓｉＲＮＡがＣＯＢＬＬ１を抑制しているかの確認をウエスタンブロッティングにより検証した。タンパク質の抽出のため腫瘍だけを取り除き、さらに５〜１０ｍｍ３の大きさに分けた。腫瘍に５００μＬ  ＮＰ４０溶解緩衝液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］）を加え、ホモジナイザーですりつぶした。その溶液を１５，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心し、上清を回収した。タンパク質をＳＤＳ溶解緩衝液により可溶化した後、ウエスタンブロッティングによるＣＯＢＬＬ１タンパク質発現量の解析を行った。その結果、図７に示すようにｓｉＣＯＢＬＬ１の腫瘍内への投与はＣＯＢＬＬ１の発現レベルを抑制させた。興味深いことに、ｓｉＣＯＢＬＬ１は腫瘍内においてアンドロゲン受容体（ＡＲ）の活性化の指標であるリン酸化ＡＲ（ｐ−ＡＲ）の発現量を抑制していた。以上よりｓｉＣＯＢＬＬ１は腫瘍内においてもＣＯＢＬＬ１を抑制しＣＯＢＬＬ１を標的として阻害することで腫瘍増殖の抑制を促すことが示唆された。
【００５７】
《実施例９：イン・ビボにおける腫瘍（２２Ｒｖ１細胞）増殖に対するｓｉＣＯＢＬＬ１の投与の効果》
イン・ビボでの腫瘍増殖への影響を調べるため、実施例７（ＬＴＡＤ細胞）とは別の難治性の去勢抵抗性前立腺癌によるマウス皮下への腫瘍移植モデルを使用し、ｓｉＣＯＢＬＬ１による効果を検討した。腫瘍移植のために２２Ｒｖ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５０５）を１×１０７細胞に調整した後、マトリゲル（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と１：１で混合し、５週齢雄性ヌードマウスへ皮下注射した。マウス皮下注射後１週間、腫瘍体積が１００〜２００ｍｍ３くらいに達したところで精巣摘除を行い、難治性の去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）治療効果を検討するモデルとした。順次週３回のｓｉＣＯＢＬＬ１投与で治療を開始した。ネガティブコントロール（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ；ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と比較し、この動物での検討には、実施例７（ＬＴＡＤ細胞）で使用したｓｉＣＯＢＬＬ１＃１に加えて、ｓｉＣＯＢＬＬ１＃２も使用した。ｓｉＲＮＡはそれぞれ５μｇ／匹になるように使用した。ｓｉＲＮＡはフェノールレッド不含ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１５μＬと混合して１００μＬを腫瘍に注射した。ｓｉＲＮＡ剤による治療は３回／週を２週間繰り返し、腫瘍径（長径ｒ１、短径（２か所）ｒ２、ｒ３）を測定し、ｖ＝０．５×ｒ１×ｒ２×ｒ３の式により腫瘍体積を算出した。結果を図８に示す。ｓｉＣＯＢＬＬ１＃１及びｓｉＣＯＢＬＬ１＃２の投与は共に本腫瘍モデル実験においてもマウスにおける腫瘍の増殖を有意に抑制することを見出した。
【００５８】
《実施例１０：イン・ビボ腫瘍（２２Ｒｖ１細胞）内におけるｓｉＣＯＢＬＬ１投与によるＣＯＢＬＬ１タンパク質のノックダウン効率の解析》
腫瘍におけるｓｉＲＮＡがＣＯＢＬＬ１を抑制しているかの確認をウエスタンブロッティングにより検証した。タンパク質の抽出のため腫瘍だけを取り除き、さらに５〜１０ｍｍ３の大きさに分けた。腫瘍に５００μＬ  ＮＰ４０溶解緩衝液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］）を加え、ホモジナイザーですりつぶした。その溶液を１５，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心し、上清を回収した。タンパク質をＳＤＳ溶解緩衝液により可溶化した後、ウエスタンブロッティングによるＣＯＢＬＬ１タンパク質発現量の解析を行った。その結果、図９に示すようにｓｉＣＯＢＬＬ１の腫瘍内への投与はＣＯＢＬＬ１の発現レベルを抑制させた。興味深いことに、ｓｉＣＯＢＬＬ１は、腫瘍内においてアンドロゲン受容体（ＡＲ）の活性化の指標であるリン酸化ＡＲ（ｐ−ＡＲ）の発現量と、去勢抵抗性前立腺癌の発症に関わるＡＲ−Ｖ７を含むアンドロゲン受容体の変異体（ＡＲ−Ｖ）のタンパク質発現を抑制していた。以上よりｓｉＣＯＢＬＬ１は腫瘍内においてもＣＯＢＬＬ１を抑制しＣＯＢＬＬ１を標的として阻害することで腫瘍増殖の抑制を促すことが示唆された。
【００５９】
《実施例１１：ＣＯＢＬＬ１の発現と癌特異的生存率との関連性》
ＣＯＢＬＬ１のヒト前立腺癌組織内における発現について、臨床検体を用いた免疫染色により検討を行った。免疫染色は、１０２例の根治的前立腺全摘術により得られた前立腺癌検体を用いて行った。発現の定量は発現強度と発現の割合をスコアリングしたものを用いた。具体的には、染色強度を３段階に、１視野における発現の割合を４段階に分類し、それぞれ加算したものを用いた。結果を図１０、図１１に示す。ＣＯＢＬＬ１高発現群（＋）では前立腺全摘術後の癌特異的生存率が有意に低く（図１０）、また、前立腺全摘患者において、ＣＯＢＬＬ１の発現が、有意にグリーソンスコア（Ｇｌｅａｓｏｎ  Ｓｃｏｒｅ）と相関し、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）とも相関した（図１１）。以上よりＣＯＢＬＬ１は前立腺癌の進行に関連し、予後予測因子となりうることが示された。またこのＣＯＢＬＬ１を標的とした治療法選択する際のバイオマーカーともなりうることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の二本鎖核酸は、ＣＯＢＬＬ１遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有し、癌の治療又は予防に使用することができる。また、前記ＣＯＢＬＬ１遺伝子は、前立腺癌の予後または進行の判定のバイオマーカーとして使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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