(57)【要約】      （修正有）【課題】がん細胞の増殖を効果的に抑制することができ、がんの予防及び／又は治療に用いる二本鎖核酸分子の提供。前記二本鎖核酸分子、前記二本鎖核酸分子をコードする配列を含むＤＮＡ、前記ＤＮＡを含むベクター、の少なくともいずれかを含むがん細胞増殖抑制剤、前記がん細胞増殖抑制剤を含む医薬、卵巣がん細胞の増殖能を判定する方法、卵巣がん個体の卵巣がん治療薬に対する抵抗性を判定する方法、及び、卵巣がん個体における前記医薬の有効性を判定する方法、の提供。【解決手段】（ａ）特定のヌクレオチド配列を含むセンス鎖、（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖と二本鎖を形成する該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖、とを含むＳＰＯＮ１遺伝子、及び、ＴＲＩＭ２９遺伝子との融合遺伝子であるＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の発現を抑制するための二本鎖核酸分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＰＯＮ１遺伝子と、ＴＲＩＭ２９遺伝子との融合遺伝子であるＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の発現を抑制するための二本鎖核酸分子であって、
（ａ）配列番号：１〜配列番号：５のいずれかで表される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、
（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖と二本鎖を形成する該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖とを含むことを特徴とする二本鎖核酸分子。
【請求項２】
前記センス鎖が、配列番号：１〜配列番号：３のいずれかで表される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖である請求項１に記載の二本鎖核酸分子。
【請求項３】
前記センス鎖が、配列番号：１〜配列番号：２のいずれかで表される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖である請求項１から２のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
【請求項６】
請求項１から３のいずれかに記載の二本鎖核酸分子、請求項４に記載のＤＮＡ、及び請求項５に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とするがん細胞増殖抑制剤。
【請求項７】
がんを予防乃至治療するための医薬であって、請求項６に記載のがん細胞増殖抑制剤を含むことを特徴とする医薬。
【請求項８】
卵巣がん細胞の増殖能を判定する方法であって、
個体から調製した試料中におけるＳＰＯＮ１遺伝子と、ＴＲＩＭ２９遺伝子との融合遺伝子であるＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子を検出する工程と、
前記試料中に前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子が検出された場合には、前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子が検出されない細胞と比べて、卵巣がん細胞の増殖が亢進すると判定する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
卵巣がん個体の卵巣がん治療薬に対する抵抗性を判定する方法であって、
個体から調製した試料中におけるＳＰＯＮ１遺伝子と、ＴＲＩＭ２９遺伝子との融合遺伝子であるＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子を検出する工程と、
前記試料中に前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子が検出された場合には、卵巣がん治療薬に対する抵抗性を有すると判定する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
卵巣がん個体における請求項７に記載の医薬の有効性を判定する方法であって、
個体から調製した試料中におけるＳＰＯＮ１遺伝子と、ＴＲＩＭ２９遺伝子との融合遺伝子であるＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子を検出する工程と、
前記試料中に前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子が検出された場合には、請求項７に記載の医薬が有効であると判定する工程とを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん、特に卵巣がんの予防乃至治療に好適に用いることができる二本鎖核酸分子、前記二本鎖核酸分子をコードする配列を含むＤＮＡ、前記ＤＮＡを含むベクター、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含むがん細胞増殖抑制剤、及び前記がん細胞増殖抑制剤を含む医薬、並びにＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の存在の有無を指標とする、卵巣がん細胞の増殖能を判定する方法、卵巣がん個体の卵巣がん治療薬に対する抵抗性を判定する方法、及び卵巣がん個体における前記医薬の有効性を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
卵巣がんは最も致死率が高い婦人科がんであり、年間約４，５００人の日本人女性が死亡している。卵巣がんは、初期には症状に乏しく、多くは進行がんとして発見され、その場合の５年生存率は３０％以下に留まる。卵巣がん特異的な腫瘍マーカーや超音波検査の至適実施時期など、卵巣がんの有効なサーベイランス方法は未だに確立されていない。
【０００３】
卵巣がんは主に高異型度漿液性がん、明細胞がん、類内膜がん、粘液性がんの４組織型に分類され、本邦での発生頻度はそれぞれ３６％、２４％、１７％、１１％である。レジメンの改善により卵巣がんの予後は改善しつつあるが、特に明細胞がんと粘液性がんは化学療法耐性が知られており、依然として予後不良である。また、漿液性がんと類内膜がんは化学療法感受性が比較的高いが、６割以上が再発するとも言われている。近年では、分子標的治療薬や免疫療法の開発が行われるなど、難治性及び化学療法耐性の卵巣がんに対する新たな治療法の開発は急務となっている。
【０００４】
これまでに、卵巣がんにおいて、組織特異的な遺伝子変異の報告がされている（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、詳細な分子メカニズムや治療対象になりうる標的遺伝子は未だに明らかになっていない。
【０００５】
高異型度漿液性がんでは、ＴＰ５３やＢＲＣＡ１／２の遺伝子変異が多いことが知られており、これによりゲノム不安定性が生じるとされる。ゲノムの再構築により複数の遺伝子が連結されて生じる新たな遺伝子を融合遺伝子といい、融合遺伝子から産生される異常なタンパク質は細胞増殖シグナルを活性化する、あるいは細胞分化シグナルを抑制することで腫瘍化の原因となりうる。卵巣がんでも融合遺伝子の報告は幾つかされている（例えば、非特許文献２及び３参照）。しかしながら、診断及び治療意義のある融合遺伝子は不明であるのが現状である。
【０００６】
以上のように、従来の技術だけでは限界があり、腫瘍マーカー、診断、治療標的、治療法選択にあたってのバイオマーカー、創薬などに用い得る技術の速やかな開発が強く求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇｕｒｕｎｇ  Ａ，  Ｈｕｎｇ  Ｔ，  Ｍｏｒｉｎ  Ｊ，  Ｇｉｌｋｓ  ＣＢ．  （２０１３）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｃｌｉｎｉｃａｌ，  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ．  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ６２：  ５９−７０
【非特許文献２】Ｋａｎｎａｎ  Ｋ，  Ｃｏａｒｆａ  Ｃ，  Ｃｈａｏ  ＰＷ１，  Ｌｕｏ  Ｌ，  Ｗａｎｇ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ＢＣＡＭ−ＡＫＴ２  ｆｕｓｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ａ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＡＫＴ２  ｆｕｓｉｏｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ  ｓｅｒｏｕｓ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１２（１１）：  Ｅ１２７２−７
【非特許文献３】Ｋａｎｎａｎ  Ｋ，  Ｃｏａｒｆａ  Ｃ，  Ｒａｊａｐａｋｓｈｅ  Ｋ，  Ｈａｗｋｉｎｓ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  ＣＤＫＮ２Ｄ−ＷＤＦＹ２  ｉｓ  ａ  ｃａｎｃｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｕｓｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｉｎ  ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ  ｓｅｒｏｕｓ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ  １０（３）：  ｅ１００４２１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、がん細胞の増殖を効果的に抑制することができ、がんの予防乃至治療に好適に用いることができる二本鎖核酸分子、前記二本鎖核酸分子をコードする配列を含むＤＮＡ、前記ＤＮＡを含むベクター、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含むがん細胞増殖抑制剤、及び前記がん細胞増殖抑制剤を含む医薬、並びに、卵巣がん細胞の増殖能を判定する方法、卵巣がん個体の卵巣がん治療薬に対する抵抗性を判定する方法、及び卵巣がん個体における前記医薬の有効性を判定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記目的を達成するべく鋭意検討を行った結果、がん組織におけるＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子を初めて同定し、前記融合遺伝子ががん細胞の増殖及び化学療法耐性に関わる可能性を見い出し、また、本発明の二本鎖核酸分子により、前記融合遺伝子の発現を抑制することができることを知見した。
【００１０】
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  ＳＰＯＮ１遺伝子と、ＴＲＩＭ２９遺伝子との融合遺伝子であるＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の発現を抑制するための二本鎖核酸分子であって、
（ａ）配列番号：１〜配列番号：５のいずれかで表される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、
（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖と二本鎖を形成する該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖とを含むことを特徴とする二本鎖核酸分子である。
＜２＞  前記＜１＞に記載の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするＤＮＡである。
＜３＞  前記＜２＞に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクターである。
＜４＞  前記＜１＞に記載の二本鎖核酸分子、前記＜２＞に記載のＤＮＡ、及び前記＜３＞に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とするがん細胞増殖抑制剤である。
＜５＞  がん細胞に、前記＜４＞に記載のがん細胞増殖抑制剤を作用させることを特徴とするがん細胞の増殖抑制方法である。
＜６＞  がんを予防乃至治療するための医薬であって、前記＜４＞に記載のがん細胞増殖抑制剤を含むことを特徴とする医薬である。
＜７＞  個体に、前記＜７＞に記載の医薬を投与することを特徴とするがんの予防乃至治療方法である。
＜８＞  卵巣がん細胞の増殖能を判定する方法であって、
個体から調製した試料中におけるＳＰＯＮ１遺伝子と、ＴＲＩＭ２９遺伝子との融合遺伝子であるＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子を検出する工程と、
前記試料中に前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子が検出された場合には、前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子が検出されない細胞と比べて、卵巣がん細胞の増殖が亢進すると判定する工程とを含むことを特徴とする方法である。
＜９＞  卵巣がん個体の卵巣がん治療薬に対する抵抗性を判定する方法であって、
個体から調製した試料中におけるＳＰＯＮ１遺伝子と、ＴＲＩＭ２９遺伝子との融合遺伝子であるＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子を検出する工程と、
前記試料中に前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子が検出された場合には、卵巣がん治療薬に対する抵抗性を有すると判定する工程とを含むことを特徴とする方法である。
＜１０＞  卵巣がん個体における前記＜７＞に記載の医薬の有効性を判定する方法であって、
個体から調製した試料中におけるＳＰＯＮ１遺伝子と、ＴＲＩＭ２９遺伝子との融合遺伝子であるＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子を検出する工程と、
前記試料中に前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子が検出された場合には、前記＜７＞に記載の医薬が有効であると判定する工程とを含むことを特徴とする方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決することができ、がん細胞の増殖を効果的に抑制することができ、がんの予防乃至治療に好適に用いることができる二本鎖核酸分子、前記二本鎖核酸分子をコードする配列を含むＤＮＡ、前記ＤＮＡを含むベクター、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含むがん細胞増殖抑制剤、及び前記がん細胞増殖抑制剤を含む医薬、並びに、卵巣がん細胞の増殖能を判定する方法、卵巣がん個体の卵巣がん治療薬に対する抵抗性を判定する方法、及び卵巣がん個体における前記医薬の有効性を判定する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１ａ】図１ａは、試験例１−１の融合遺伝子の探索の流れの概要を示す図である。
【図１ｂ】図１ｂは、試験例１−２において、融合転写産物の融合部位を確認した結果を示す図である。
【図１ｃ】図１ｃは、試験例１−３のネスティングＰＣＲの結果を示す図−１である。
【図１ｄ】図１ｄは、試験例１−３のネスティングＰＣＲの結果を示す図−２である。
【図１ｅ】図１ｅは、試験例１−４のネスティングＰＣＲの結果を示す図である。
【図２ａ】図２ａは、ＳＰＯＮ１遺伝子とＴＲＩＭ２９遺伝子のタンパク質レベルの構造と、ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の予想されるタンパク質レベルの構造を示す模式図である。
【図２ｂ】図２ｂは、ＳＰＯＮ１遺伝子とＴＲＩＭ２９遺伝子のエクソンレベルの構造と、ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の予想されるエクソンレベルの構造を示す模式図である。
【図３】図３は、試験例２におけるウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図４ａ】図４ａは、試験例３におけるシスプラチンなし（０μＭ）、シスプラチンあり（０．２μＭ、１μＭ）での細胞増殖試験の結果を示す図である。
【図４ｂ】図４ｂは、試験例３におけるパクリタキセルなし（０ｎＭ）、パクリタキセルあり（２ｎＭ、５ｎＭ）での細胞増殖試験の結果を示す図である。
【図４ｃ】図４ｃは、試験例３におけるオラパリブなし（０μＭ）、オラパリブあり（１μＭ、２μＭ）での細胞増殖試験の結果を示す図である。
【図５ａ】図５ａは、試験例４における薬剤なしの場合のアポトーシス解析の結果を示す図である。
【図５ｂ】図５ｂは、試験例４におけるシスプラチン（１μＭ）を添加した場合のアポトーシス解析の結果を示す図である。
【図５ｃ】図５ｃは、試験例４におけるパクリタキセル（５ｎＭ）を添加した場合のアポトーシス解析の結果を示す図である。
【図５ｄ】図５ｄは、試験例４におけるオラパリブ（２μＭ）を添加した場合のアポトーシス解析の結果を示す図である。
【図５ｅ】図５ｅは、試験例４における薬剤の添加の有無のそれぞれの場合におけるアネキシンＶ陽性のアポトーシス細胞の割合を示した図である。
【図６ａ】図６ａは、試験例５−１のＶｅｃｔｏｒ−Ａ２７８０  ＃Ａ細胞におけるノックダウン効率を確認した結果を示す図である。
【図６ｂ】図６ｂは、試験例５−１のＶｅｃｔｏｒ−Ａ２７８０  ＃Ｂ細胞におけるノックダウン効率を確認した結果を示す図である。
【図６ｃ】図６ｃは、試験例５−１のＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ａ細胞におけるノックダウン効率を確認した結果を示す図である。
【図６ｄ】図６ｄは、試験例５−１のＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ｂ細胞におけるノックダウン効率を確認した結果を示す図である。
【図６ｅ】図６ｅは、試験例５−２における薬剤なしの場合の細胞増殖試験の結果を示す図である。
【図６ｆ】図６ｆは、試験例５−２におけるシスプラチン（１μＭ）添加の場合の細胞増殖試験の結果を示す図である。
【図６ｇ】図６ｇは、試験例５−２におけるパクリタキセル（２ｎＭ）添加の場合の細胞増殖試験の結果を示す図である。
【図６ｈ】図６ｈは、試験例５−２におけるオラパリブ（２μＭ）添加の場合の細胞増殖試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（二本鎖核酸分子）
本発明の二本鎖核酸分子は、ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の発現を抑制するための二本鎖核酸分子であって、（ａ）配列番号：１〜配列番号：５のいずれかで表される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖と二本鎖を形成する該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖とを含む。
なお、本発明において「二本鎖核酸分子」とは、センス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイズしてなる二本鎖の核酸分子をいう。
【００１４】
＜ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子＞
前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子は、ＳＰＯＮ１（Ｓｐｏｎｄｉｎ  １）遺伝子と、ＴＲＩＭ２９（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｍｏｔｉｆ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ２９）遺伝子とが融合した遺伝子である。
前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子は、後述する試験例で示すように、本発明者らによって初めて見い出されたものであり、そのｃＤＮＡ配列は配列番号：１９で表され、タンパク質のアミノ酸配列は配列番号：２０で表される。
前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子は、後述する試験例で示すように、がん細胞の増殖を亢進したり、化学療法に対する耐性を付与したりする機能を有する。
【００１５】
なお、前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、その機能を有する限り、配列番号：１９或いは配列番号：２０で表される配列において、置換、欠失、挿入、付加がされたものであってもよい。
例えば、前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子のｃＤＮＡ配列としては、前記配列番号：１９で表される塩基配列との配列同一性として、７０％以上であるものが好ましく、８０％以上であるものがより好ましく、９０％以上であるものが更に好ましく、９５％以上であるものが特に好ましい。なお、前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子のｃＤＮＡ配列としては、下記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子のタンパク質のアミノ酸配列をコードする配列であれば、前記配列番号：１９で表される塩基配列との配列同一性が、７０％未満となってもよい。
前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子のタンパク質のアミノ酸配列としては、前記配列番号：２０で表されるアミノ酸配列との配列同一性として、８０％以上であるものが好ましく、８５％以上であるものがより好ましく、９０％以上であるものが更に好ましく、９５％以上であるものが特に好ましい。
【００１６】
前記塩基配列或いはアミノ酸配列の配列同一性は、公知の方法により決定することができ、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：ｐ．２２６４−２２６８，  １９９０、及びＰｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：ｐ．５８７３−５８７７，１９９３参照）により決定する方法などが挙げられる。このようなアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｃｈｕｌらによって開発されている（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：ｐ．４０３−４１０，  １９９０参照)。これらは、例えば、ＮＣＢＩタンパク質データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）で利用することができる。
【００１７】
本発明において、前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が前記二本鎖核酸分子の標的となり、前記二本鎖核酸分子によってその発現が抑制されることから、本明細書中において前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子を、前記二本鎖核酸分子の「標的遺伝子」と称することがある。
【００１８】
＜センス鎖、アンチセンス鎖＞
本発明者らは、鋭意検討の結果、前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子のｍＲＮＡ配列の中でも、ある特定の標的配列（配列番号：１〜配列番号：５のいずれか）に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸分子が、前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子に対して顕著に優れた発現抑制効果を有することを見出した。したがって、本発明の二本鎖核酸分子は、（ａ）配列番号：１〜配列番号：５のいずれかで表される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖と二本鎖を形成する該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖とを含むものである。
ここで、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、ＲＮＡ鎖であってもよいし、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ鎖であってもよい。前記センス鎖と前記アンチセンス鎖とは、互いにハイブリダイズすることで前記二本鎖核酸分子を形成することができる。
【００１９】
前記二本鎖核酸分子の中でも、前記センス鎖が、配列番号：１〜配列番号：３のいずれかで表される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖であることが好ましく、配列番号：１〜配列番号：２のいずれかで表される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖であることがより好ましい。
前記センス鎖が、前記好ましいセンス鎖であると、前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子に対する強い発現抑制効果に加え、がん細胞の増殖抑制効果にも優れる点で、有利である。
なお、前記二本鎖核酸分子におけるセンス鎖は、前記所定の配列番号の標的配列に対応するヌクレオチド配列を含んでいればよく、その他のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
また、前記二本鎖核酸分子におけるアンチセンス鎖は、前記センス鎖とハイブリダイズすることができる程度に相補的なヌクレオチド配列を含んでいればよく、その他のヌクレオチド配列を含んでいてもよいが、前記センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を７０％以上含むことが好ましく、８０％以上含むことがより好ましく、９０％以上含むことが更に好ましく、９５％以上含むことが特に好ましい。
【００２０】
＜種類＞
前記二本鎖核酸分子の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラなどが挙げられる。
ここで、「二本鎖ＲＮＡ」とは、センス鎖及びアンチセンス鎖のいずれもがＲＮＡ配列で構成されてなる二本鎖核酸分子をいい、「二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ」とは、センス鎖及びアンチセンス鎖のいずれもがＲＮＡとＤＮＡとのキメラ配列で構成されてなる二本鎖核酸分子をいう。
【００２１】
前記二本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラは、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）若しくはキメラｓｉＲＮＡであることが特に好ましい。
【００２２】
ここで、ｓｉＲＮＡとは、１８塩基長〜２９塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖（ガイド鎖）と相補的な配列をもつ標的ＲＮＡを切断し、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。
前記ｓｉＲＮＡは、前記したようなセンス鎖及びアンチセンス鎖を有し、かつ前記標的遺伝子の発現を抑制し得るものであれば、その末端構造に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ｓｉＲＮＡは、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。中でも、前記ｓｉＲＮＡは、各鎖の３’末端が２塩基〜６塩基突出した構造を有することが好ましく、各鎖の３’末端が２塩基突出した構造を有することがより好ましい。
【００２３】
また、キメラｓｉＲＮＡとは、ｓｉＲＮＡのＲＮＡ配列の一部がＤＮＡに変換された、１８塩基長〜２９塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラをいう。中でも、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’側の８塩基以内、及び、アンチセンス鎖の５’側の６塩基以内の塩基がＤＮＡに変換された、２１塩基長〜２３塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラであることが好ましい。前記キメラｓｉＲＮＡは、前記ｓｉＲＮＡと同様に、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。なお、前記キメラｓｉＲＮＡには、ＤＮＡに変換された配列の一部をＲＮＡに再度変換した態様も含まれる。
前記キメラｓｉＲＮＡの末端構造としても、前記ｓｉＲＮＡ同様、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。
前記キメラｓｉＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ）は、血中安定性が高い、免疫応答誘導性が低い、製造コストが低いなどの点で、有利である。
【００２４】
前記ｓｉＲＮＡ若しくはキメラｓｉＲＮＡの具体例としては、配列番号：７のセンス鎖と配列番号：８のアンチセンス鎖とからなるキメラｓｉＲＮＡ、配列番号：９のセンス鎖と配列番号：１０のアンチセンス鎖とからなるキメラｓｉＲＮＡ、配列番号：１１のセンス鎖と配列番号：１２のアンチセンス鎖とからなるキメラｓｉＲＮＡ、配列番号：１３のセンス鎖と配列番号：１４のアンチセンス鎖とからなるキメラｓｉＲＮＡ、配列番号：１５のセンス鎖と配列番号：１６のアンチセンス鎖とからなるキメラｓｉＲＮＡなどが挙げられる。
これらの中でも、配列番号：７のセンス鎖と配列番号：８のアンチセンス鎖とからなるキメラｓｉＲＮＡ、配列番号：９のセンス鎖と配列番号：１０のアンチセンス鎖とからなるキメラｓｉＲＮＡ、配列番号：１１のセンス鎖と配列番号：１２のアンチセンス鎖とからなるキメラｓｉＲＮＡが好ましく、配列番号：７のセンス鎖と配列番号：８のアンチセンス鎖とからなるキメラｓｉＲＮＡ、配列番号：９のセンス鎖と配列番号：１０のアンチセンス鎖とからなるキメラｓｉＲＮＡがより好ましい。
【００２５】
また、前記二本鎖ＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）であってもよい。ここで、ｓｈＲＮＡとは、１８塩基〜２９塩基程度のｄｓＲＮＡ領域と３塩基〜９塩基程度のｌｏｏｐ領域を含む一本鎖ＲＮＡであるが、ｓｈＲＮＡは、生体内で発現されることにより、塩基対を形成してヘアピン状の二本鎖ＲＮＡとなる。その後、ｓｈＲＮＡはＤｉｃｅｒ（ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ酵素）により切断されてｓｉＲＮＡとなり、標的ＲＮＡの発現抑制に機能することができる。
前記ｓｈＲＮＡの末端構造としても、前記ｓｉＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ同様、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。
【００２６】
＜修飾＞
また、前記二本鎖核酸分子は、目的に応じて、適宜修飾を有していてもよい。例えば、核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）に対する耐性を付与し、培養液中や生体中における安定性を向上させる等の目的から、前記二本鎖核酸分子に、２’Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ化修飾や、ホスホロチオエート化（Ｓ化）修飾、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）修飾等を施すことができる。また、例えば、細胞への導入効率を高める等の目的から、前記二本鎖核酸分子のセンス鎖の５’端、或いは３’端に、ナノ粒子、コレステロール、細胞膜通過ペプチド等の修飾を施すこともできる。なお、前記二本鎖核酸分子にこのような修飾を施す方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法を適宜利用することができる。
【００２７】
＜入手方法＞
前記二本鎖核酸分子の入手方法としては、特に制限はなく、それぞれ従来公知の手法に基づき作製することができる。
例えば、前記ｓｉＲＮＡは、所望のセンス鎖とアンチセンス鎖とに相当する１８塩基長〜２９塩基長の一本鎖ＲＮＡを、それぞれ既存のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置等を利用して化学的に合成し、それらをアニーリングすることにより作製することができる。また、アニーリング済の二本鎖ｓｉＲＮＡの市販品を入手することもできるし、ｓｉＲＮＡ合成受託会社に合成を依頼することにより入手することもできる。また、後述する本発明のベクターのような、所望のｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、前記発現ベクターを細胞内に導入することにより、細胞内の反応を利用してｓｉＲＮＡを作製することもできる。
また、前記キメラｓｉＲＮＡは、例えば、キメラ核酸分子であるセンス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれ化学合成し、それらをアニーリングすることにより、作製することができる。
【００２８】
（ＤＮＡ、ベクター）
本発明のＤＮＡは、前記した本発明の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡであり、また、本発明のベクターは、前記ＤＮＡを含むベクターである。
【００２９】
＜ＤＮＡ＞
前記ＤＮＡとしては、前記した本発明の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列の上流（５’側）に、前記二本鎖核酸分子の転写を制御するためのプロモーター配列が連結されていることが好ましい。前記プロモーター配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣＭＶプロモーター等のｐｏｌ  ＩＩ系プロモーター、Ｈ１プロモーター、Ｕ６プロモーター等のｐｏｌ  ＩＩＩ系プロモーターなどが挙げられる。
また、更に、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列の下流（３’側）に、前記二本鎖核酸分子の転写を終結させるためのターミネーター配列が連結されていることがより好ましい。前記ターミネーター配列としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記プロモーター配列、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列、及び前記ターミネーター配列を含む転写ユニットは、前記ＤＮＡにおける好ましい一態様である。なお、前記転写ユニットは、従来公知の手法を用いて構築することができる。
【００３０】
＜ベクター＞
前記ベクターとしては、前記ＤＮＡを含むものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。前記ベクターは、前記二本鎖核酸分子を発現可能な発現ベクターであることが好ましい。
前記二本鎖核酸分子の発現様式としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば二本鎖核酸分子としてｓｉＲＮＡを発現させる方法として、短い一本鎖ＲＮＡを二本発現させる方法（タンデム型）、ｓｈＲＮＡとしての一本鎖ＲＮＡを発現させる方法（ヘアピン型）等が挙げられる。
前記タンデム型ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、前記ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖をコードするＤＮＡ配列と、アンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とを含み、かつ、各鎖をコードするＤＮＡ配列の上流（５’側）にプロモーター配列がそれぞれ連結され、また、各鎖をコードするＤＮＡ配列の下流（３’側）にターミネーター配列がそれぞれ連結されたＤＮＡを含む。
また、前記ヘアピン型ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、前記ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖をコードするＤＮＡ配列と、アンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とが逆向きに配置され、前記センス鎖ＤＮＡ配列とアンチセンス鎖ＤＮＡ配列とがループ配列を介して接続されており、かつ、それらの上流（５’側）にプロモーター配列が、また、下流（３’側）にターミネーター配列が連結されたＤＮＡを含む。
前記各ベクターは、従来公知の手法を用いて構築することができ、例えば、前記ＤＮＡを、予め制限酵素で切断したベクターの切断部位に連結（ライゲーション）することにより構築することができる。
【００３１】
前記ＤＮＡ又は前記ベクターを細胞に導入（トランスフェクト）することにより、プロモーターが活性化され、前記二本鎖核酸分子を生成することができる。例えば、前記タンデム型ベクターにおいては、前記ＤＮＡが細胞内で転写されることにより、センス鎖及びアンチセンス鎖が生成され、それらがハイブリダイズすることによりｓｉＲＮＡが生成される。前記ヘアピン型ベクターにおいては、前記ＤＮＡが細胞内で転写されることにより、まずヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が生成され、次いで、ダイサーによるプロセシングにより、ｓｉＲＮＡが生成される。
【００３２】
（がん細胞増殖抑制剤）
本発明のがん細胞増殖抑制剤は、がん細胞の増殖を抑制するためのがん細胞増殖抑制剤（「腫瘍増殖抑制剤」と称することもある）であり、前記した本発明の二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含み、更に必要に応じてその他の成分を含む。
【００３３】
＜二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、ベクター＞
前記二本鎖核酸分子の詳細としては、前記した本発明の二本鎖核酸分子の項目に記載した通りである。前記二本鎖核酸分子は、標的とするＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の発現を効果的に抑制することができるので、がん細胞の増殖を抑制するための前記がん細胞増殖抑制剤の有効成分として好適である。また、前記ＤＮＡ、ベクターの詳細としても、前記した本発明のＤＮＡ、ベクターの項目に記載した通りである。
前記がん細胞増殖抑制剤中の前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記がん細胞増殖抑制剤は、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかそのものであってもよい。
【００３４】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを所望の濃度に希釈するための生理食塩水、培養液等の希釈用剤や、対象とする細胞内に前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを導入（トランスフェクト）するためのトランスフェクション試薬などが挙げられる。
前記がん細胞増殖抑制剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３５】
＜がん細胞＞
前記がん細胞増殖抑制剤の適用対象となるがん細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、卵巣がん細胞が好適に挙げられる。
前記卵巣がん細胞の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、上記したＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子を発現する細胞が好適に挙げられる。また、卵巣がん治療薬に対する抵抗性を有する（以下、「化学療法に対する抵抗性を有する」と称することもある）卵巣がん細胞も好適に挙げられる。
前記卵巣がん治療薬としては、特に制限はなく、公知の化学療法に用いられる薬が挙げられ、例えば、シスプラチン、パクリタキセル、及びオラパリブからなる群から選択される少なくとも１種などが挙げられる。
前記がん細胞は、体外で培養されている細胞であってもよいし、また、がんを患う個体の体内に存在する細胞であってもよい。
【００３６】
＜作用＞
前記がん細胞増殖抑制剤は、例えば、がん細胞に導入（トランスフェクト）することによって、前記細胞に作用させることができる。前記導入の方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トランスフェクション試薬を用いる方法、エレクトロポレーションによる方法、磁気粒子を用いる方法、ウイルス感染を利用する方法などが挙げられる。
がん細胞に対して作用させる前記がん細胞増殖抑制剤の量としても、特に制限はなく、細胞の種類や所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、１×１０６個の細胞数に対し、有効成分（前記二本鎖核酸分子）の量として、０．１μｇ程度が好ましく、５μｇ程度がより好ましく、１５μｇ程度が特に好ましい。
【００３７】
＜併用＞
後述する試験例で示すように、本発明のがん細胞増殖抑制剤の有効成分である二本鎖核酸分子を作用させることにより、がん細胞が有する化学療法に対する耐性を低減することができる。そのため、本発明のがん細胞増殖抑制は、前記卵巣がん治療薬と組み合わせて使用してもよい。
【００３８】
（がん細胞増殖抑制方法）
前記がん細胞増殖抑制剤は、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含むので、がん細胞に作用させることにより、前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の発現抑制を介して、がん細胞の増殖を効果的に抑制することができる。したがって、本発明は、がん細胞に、前記がん細胞増殖抑制剤を作用させることを特徴とするがん細胞の増殖抑制方法（「腫瘍増殖抑制方法」と称することもある）にも関する。
前記がん細胞としては、特に制限はなく、上記したがん細胞増殖抑制剤のがん細胞の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
また、前記がん細胞増殖抑制方法では、上記したがん細胞増殖抑制剤の併用の項目に記載したのと同様に、卵巣がん治療薬を更に作用させてもよい。
【００３９】
（医薬）
本発明の医薬は、がんを予防乃至治療するための医薬であって、前記した本発明のがん細胞増殖抑制剤を含み、更に必要に応じてその他の成分を含む。
本発明において、前記予防とは、がんの発生や再発を防止することをいい、前記治療とは、がんの症状を治したり、和らげたり、進行を防いだりすることをいう。
【００４０】
＜がん細胞増殖抑制剤＞
前記がん細胞増殖抑制剤の詳細としては、前記した本発明のがん細胞増殖抑制剤の項目に記載した通りである。
【００４１】
前記がん細胞増殖抑制剤は、前記した本発明の二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含むので、標的とするＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の発現抑制を介して、がん細胞の増殖を効果的に抑制することができる。
即ち、前記がん細胞増殖抑制剤は、がんを予防乃至治療するための医薬として好適に利用可能である。前記がんとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、卵巣がんが好適に挙げられる。
前記卵巣がんの種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、上記したＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子を発現するがんが好適に挙げられる。また、上記した卵巣がん治療薬に対する抵抗性を有する卵巣がんも好適に挙げられる。
【００４２】
前記医薬中の前記がん細胞増殖抑制剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬は、前記がん細胞増殖抑制剤そのものであってもよい。
【００４３】
ここで、前記医薬の有効成分となる前記二本鎖核酸分子としては、非修飾の状態の二本鎖核酸分子そのものを用いてもよいが、適切に予防乃至治療効果が得られるよう、生体への投与に適した形態の二本鎖核酸分子を用いることが好ましい。
例えば、前記二本鎖核酸分子は、生体内における二本鎖核酸分子の安定性を高めることができる点で、修飾が施されていることが好ましい。前記二本鎖核酸分子に施し得る修飾の種類としては、特に制限はなく、例えば、２’Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ化修飾、ホスホロチオエート化（Ｓ化）修飾、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）修飾などが挙げられる。また、標的細胞への導入効率を高める等の目的から、例えば、前記二本鎖核酸分子のセンス鎖の５’端、或いは３’端に、ナノ粒子、コレステロール、細胞膜通過ペプチド等の修飾を施すこともまた好ましい。前記二本鎖核酸分子に前記修飾を施す方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法を適宜利用することができる。
また、前記二本鎖核酸分子は、標的細胞への導入効率を高めることができる点で、リポソームや高分子マトリックス等と複合体を形成していることも好ましい。前記複合体を形成する方法としても、特に制限はなく、従来公知の手法を適宜利用することができる。
【００４４】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４５】
＜剤型＞
前記医薬の剤型としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。
【００４６】
前記経口固形剤としては、例えば、前記有効成分に、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
【００４７】
前記経口液剤としては、例えば、前記有効成分に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
【００４８】
前記注射剤としては、例えば、前記有効成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
【００４９】
前記軟膏剤としては、例えば、前記有効成分に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を配合し、常法により混合し、製造することができる。
前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィンなどが挙げられる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどが挙げられる。
【００５０】
前記貼付剤としては、例えば、公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等を、常法により塗布し、製造することができる。前記支持体としては、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム、発泡体シートなどが挙げられる。
【００５１】
＜投与＞
前記医薬は、がんの予防乃至治療に好適である。したがって、前記医薬は、がんに罹患した個体に投与することにより好適に使用することができる。
【００５２】
前記医薬の投与対象個体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられるが、これらの中でも、ヒトが特に好ましい。
【００５３】
前記医薬の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記医薬の剤型、疾患の種類、患者の状態等に応じて、局所投与、全身投与のいずれかを選択することができる。例えば、局所投与においては、前記医薬の有効成分（前記二本鎖核酸分子）を、所望の部位（例えば、腫瘍部位）に直接注入することにより投与することができる。前記注入には、注射等の従来公知の手法を適宜利用することができる。また、全身投与（例えば、経口投与、腹腔内投与、血液中への投与等）においては、前記医薬の有効成分（前記二本鎖核酸分子）が所望の部位（例えば、腫瘍部位）まで安定に、かつ効率良く送達されるよう、従来公知の薬剤送達技術を適宜応用することが好ましい。
【００５４】
前記医薬の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への１日の投与あたり、有効成分（前記二本鎖核酸分子）の量として、１ｍｇ〜１００ｍｇが好ましい。
また、前記医薬の投与回数としても、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて、適宜選択することができる。
【００５５】
前記医薬の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記疾患に対して、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。中でも、前記医薬は、がん細胞の増殖を阻害し、前記がん細胞の増殖による腫瘍の増大を防ぐ効果に優れることから、前記医薬は前記疾患の出来る限り早期の段階に投与されることが望ましいと考えられる。
【００５６】
後述する試験例で示すように、本発明の医薬の有効成分である二本鎖核酸分子を作用させることにより、がんの化学療法に対する耐性を低減することができる。そのため、本発明の医薬は、上記した卵巣がん治療薬と組み合わせて使用してもよい。
【００５７】
（予防乃至治療方法）
前記医薬は、前記がん細胞増殖抑制剤を含むので、癌を患う個体に投与することにより、標的とするＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の発現抑制を介して、がん細胞の増殖を効果的に抑制し、がんを予防乃至治療することができる。したがって、本発明は、個体に前記医薬を投与することを特徴とするがんの予防乃至治療方法にも関する。
前記がんとしては、特に制限はなく、上記した医薬の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
また、前記予防乃至治療方法では、上記した卵巣がん治療薬を更に投与してもよい。
【００５８】
（卵巣がん細胞の増殖能を判定する方法）
本発明の卵巣がん細胞の増殖能を判定する方法は、検出工程と、増殖能判定工程とを少なくとも含み、必要に応じてその他の工程を含む。
【００５９】
＜検出工程＞
前記検出工程は、個体から調製した試料中におけるＳＰＯＮ１遺伝子と、ＴＲＩＭ２９遺伝子との融合遺伝子であるＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子を検出する工程である。
【００６０】
−試料−
前記試料としては、対象とする個体から調製したものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、病変部位の細胞や組織、血液などが挙げられる。前記試料は、更にＲＮＡ調製処理、タンパク質調製処理などが施されてもよい。前記試料は、１種のみを使用してもよいし、２種以上を使用してもよい。
前記個体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられるが、これらの中でも、ヒトが特に好ましい。
【００６１】
−ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子−
前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子は、上記した本発明の二本鎖核酸分子のＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の項目に記載したとおりである。
【００６２】
−検出−
前記検出の対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００６３】
前記ｍＲＮＡを検出する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ＲＮＡシーケンスによる方法、ｑＲＴ−ＰＣＲで得られた産物をサンガー法でシーケンスする方法、ネスティングＰＣＲ法、ＤＮＡアレイ法、ノーザンブロット法などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００６４】
前記各種ＰＣＲに用いるプライマーセットとしては、ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の塩基配列、若しくはＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子のタンパク質をコードする塩基配列を特異的に増幅できるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、上記した本発明の二本鎖核酸分子のＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の項目にも記載したように、前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、その機能を有する限り、配列番号：１９或いは配列番号：２０で表される配列において、置換、欠失、挿入、付加がされたものであってもよい。
前記プライマーセットの一例としては、後述した試験例で用いたプライマーセットなどが挙げられる。
【００６５】
前記タンパク質を検出する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ウェスタンブロット法などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００６６】
前記ウェスタンブロット法に用いる抗体としては、特に制限はなく、公知の方法により調製した抗体を用いることができる。
【００６７】
＜増殖能判定工程＞
前記増殖能判定工程は、前記検出工程において、前記試料中に前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子が検出された場合には、前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子が検出されない細胞と比べて、卵巣がん細胞の増殖が亢進すると判定する工程である。
後述する試験例で示すように、前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子を発現する細胞は、発現しない細胞と比べて、細胞の増殖が亢進する。
【００６８】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記検出工程に用いる試料を調製する工程などが挙げられる。前記試料を調製する方法としては、特に制限はなく、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質などの検出しようとするＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の態様に応じて、公知の方法を適宜選択することができる。
【００６９】
（卵巣がん個体の卵巣がん治療薬に対する抵抗性を判定する方法）
本発明の卵巣がん個体の卵巣がん治療薬に対する抵抗性を判定する方法は、検出工程と、抵抗性判定工程とを少なくとも含み、必要に応じてその他の工程を含む。
【００７０】
＜検出工程＞
前記検出工程は、個体から調製した試料中におけるＳＰＯＮ１遺伝子と、ＴＲＩＭ２９遺伝子との融合遺伝子であるＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子を検出する工程であり、上記した卵巣がん細胞の増殖能を判定する方法の項目における検出工程と同様にして行うことができる。
【００７１】
＜抵抗性判定工程＞
前記抵抗判定工程は、前記検出工程において、前記試料中に前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子が検出された場合には、卵巣がん治療薬に対する抵抗性を有すると判定する工程である。
後述する試験例で示すように、前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子を発現するがん細胞は、卵巣がん治療薬に対する抵抗性を有する。
前記卵巣がん治療薬としては、特に制限はなく、公知の化学療法に用いられる薬が挙げられ、例えば、シスプラチン、パクリタキセル、及びオラパリブからなる群から選択される少なくとも１種などが挙げられる。
【００７２】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した卵巣がん細胞の増殖能を判定する方法の項目におけるその他の工程と同様の工程などが挙げられる。
【００７３】
（卵巣がん個体における本発明の医薬の有効性を判定する方法）
本発明の卵巣がん個体における本発明の医薬の有効性を判定する方法は、検出工程と、有効性判定工程とを少なくとも含み、必要に応じてその他の工程を含む。
【００７４】
＜検出工程＞
前記検出工程は、個体から調製した試料中におけるＳＰＯＮ１遺伝子と、ＴＲＩＭ２９遺伝子との融合遺伝子であるＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子を検出する工程であり、上記した卵巣がん細胞の増殖能を判定する方法の項目における検出工程と同様にして行うことができる。
【００７５】
＜有効性判定工程＞
前記有効性判定工程は、前記検出工程において、前記試料中に前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子が検出された場合には、上記した本発明の医薬が有効であると判定する工程である。
後述する試験例で示すように、前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子を発現するがん細胞に本発明の二本鎖核酸分子を投与すると、その増殖を抑えることができ、また、上記した卵巣がん治療薬に対する抵抗性を低減することもできる。
【００７６】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した卵巣がん細胞の増殖能を判定する方法の項目におけるその他の工程と同様の工程などが挙げられる。
【実施例】
【００７７】
以下に本発明の試験例を説明するが、本発明は、これらの試験例に何ら限定されるものではない。
【００７８】
（試験例１−１）
卵巣がんの臨床検体は、学校法人埼玉医科大学国際医療センターＩＲＢの承認の下（＃１３−１６５）、匿名化済みの既存検体を用いた。前記臨床検体の内訳は、以下の通りであった。
＜臨床検体＞
・  初発卵巣がん                  ：    ８症例（以下、それぞれ「Ｏｖ１」〜「Ｏｖ８」と称することがある。）
・  初発検体とペアの再発卵巣がん  ：    ８症例（以下、それぞれ「Ｏｖ９」〜「Ｏｖ１６」と称することがある。）
・  初発高異型度漿液性がん        ：  １０症例（以下、それぞれ「Ｏｖ１７」〜「Ｏｖ２６」と称することがある。）
・  初発明細胞がん                ：    ６症例（以下、それぞれ「Ｏｖ２７」〜「Ｏｖ３２」と称することがある。）
・  正常卵巣組織                  ：    ６症例（以下、それぞれ「Ｏｖ３３」〜「Ｏｖ３８」と称することがある。）
【００７９】
＜ＲＮＡシーケンス＞
前記各臨床検体から、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）  ｍｉＲＮＡ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて全てのＲＮＡを調製した。ＲＮＡのクオリティーはバイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で解析し、全てのＲＮＡのＲＩＮ値は７以上であった。
ＲＮＡライブラリをＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＮＡ  ライブラリ  調製キット（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で調製し、ＨｉＳｅｑ  ２５００（登録商標）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いて１００  ｂｐ  Ｐａｉｒｅｄ  Ｅｎｄの条件でＲＮＡシーケンスを施行した。
【００８０】
＜バイオインフォーマティクスを用いた融合遺伝子解析＞
ＲＮＡシーケンスから得られたＦＡＳＴＱファイルの塩基配列からリボソームＲＮＡ配列とアダプター配列を除いた。その後、ＴｏｐＨａｔマッピングプログラムをＢｏｗｔｉｅマッピングプログラムとともに用いてＲｅｆｓｅｑ遺伝子データベース（ｈｇ１９）にマッピングし、エクソン−エクソンで結合し、かつフレームシフトしていない融合遺伝子を探索した。
両方の遺伝子がＲｅｆｓｅｑ遺伝子に該当し、かつ、２つの遺伝子にまたがるリード数が１０以上であり、さらにアミノ酸が５０以上のタンパク質をコードするものに絞り込んだところ、融合遺伝子として、ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子を同定した。
図１ａに、融合遺伝子の探索の流れの概要を示す。
【００８１】
（試験例１−２）
ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子がＲＮＡシーケンス解析結果で予想されたように融合しているかを調べるために、ｑＲＴ−ＰＣＲで得られた産物についてサンガー法でシーケンスを解析した。
【００８２】
＜サンガー法シーケンス＞
１μｇ若しくは０．５μｇのＲＮＡを逆転写反応させ、ｃＤＮＡに変換した。
ｃＤＮＡ  ０．０６７μＬを以下に示したプライマーを用いてＰＣＲにかけた。ＰＣＲは、ＫＡＰＡを用いてアニーリング温度６０℃で施行した。
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで精製し、サンガー法でシーケンス解析をした。具体的には、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１を用いてアニーリング温度５０℃でＰＣＲにかけた。次いで、ＰＣＲ産物をエタノール沈殿で精製し、３５００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｅｒ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてシーケンス解析を施行した。
−プライマー−
・  ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ｆｗ：
５’−ｇａｃｃａｔｇｃｔｇｇｇａｃｃｔｔｃｃ−３’（配列番号：２１）
・  ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ｒｖ：
５’−ｃｔｔｇａｔｇｃｇｇｔｃｃｔｔｃｔｃｃｔｔ−３’（配列番号：２２）
【００８３】
シーケンス解析の結果、ＳＰＯＮ１遺伝子のエクソン２の３’側とＴＲＩＭ２９遺伝子のエクソン２の５’側が転写産物上で結合していることが確認された。図１ｂに、融合部位を確認した結果を示す。
【００８４】
（試験例１−３）
ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の発現の検証を行うために、試験例１−１でＲＮＡシーケンスを施行した卵巣がん臨床検体３８症例（Ｏｖ１〜Ｏｖ３８）と、追加で用意した初発高異型度漿液性がん５０症例（Ｓ１〜Ｓ５０）のＲＮＡから常法によりｃＤＮＡを作製し、以下のプライマーを用いてネスティングＰＣＲを施行した。前記ＰＣＲは、ＥｘＴａｑを用いて、１回目は９４℃２分でホールド後、熱変性は９４℃１０秒、アニーリングは６５℃３０秒、伸張は７２℃１．５分で２０サイクル、２回目は９４℃２分でホールド後、熱変性は９４℃１０秒、アニーリングは６５℃３０秒、伸張は７２℃１分で２５サイクルの条件で施行した。
＜プライマー＞
−１回目−
・  ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−ｎｅｓｔ−Ｆｗ１：
５’−ａｔｇａｇｇｃｔｇｔｃｃｃｃｇｇｃｇｃｃｃｃｔｇ−３’（配列番号：２３）
・  ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−ｎｅｓｔ−Ｒｖ１：
５’−ｔｃａｔｇｇｇｇｃｔｔｃｇｔｔｇｇａｃｃｃａａｔ−３’（配列番号：２４）
−２回目−
・  ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−ｎｅｓｔ−Ｆｗ２：
５’−ａｇａｃｃｃｔｇｇａｃａａａｇｔｇｃｃｃ−３’（配列番号：２５）
・  ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−ｎｅｓｔ−Ｒｖ３：
５’−ｇｔｃｃｇｃｃｔｔｇｃａｃａｔｃｔｔｃｔ−３’（配列番号：２６）
【００８５】
図１ｃ及び１ｄにネスティングＰＣＲの結果を示す。なお、図１ｃ中の「ＮＴ」は、「鋳型なし」を表す。
ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子は、ＲＮＡシーケンスで検出された高異型度漿液性がんの再発検体であるＯｖ１４、分類不能がんの再発検体であるＯｖ１０、及び類内膜がんであるＯｖ７とＯｖ１５の初発再発ペアで発現していることを確認したが、Ｏｖ１４の初発ペア検体であるＯｖ６とＯｖ１０の初発ペア検体であるＯｖ２からは検出されなかった（図１ｃ）。
また、追加で用意した初発高異型度漿液性がん５０症例（Ｓ１〜Ｓ５０）では、１１検体でＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９の発現が確認された（図１ｄ）。
【００８６】
以上の結果から、ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の転写物は、卵巣がん臨床検体８２検体中１５例（１８％）に発現していることがわかった。ジャンクションが完全に一致したＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の転写物が違う患者検体から得られたことから、前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子のタンパク質が、複数の検体で発現していることが示唆された。
【００８７】
（試験例１−４）
以下のヒト卵巣がん由来細胞におけるＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の発現の検証を試験例１−３と同様にして行った。
−ヒト卵巣がん由来細胞−
・  Ａ２７８０
・  ＯＶＣＡＲ３
・  ＯＶ９０
・  ＳＫＯＶ３
・  ＲＭＧ１
なお、Ａ２７８０及びＲＭＧ１は、ＲＰＭＩ−１６４０に１０％ＦＢＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した培地で培養した。ＯＶＣＡＲ３、ＳＫＯＶ３、ＯＶ９０は、ＤＭＥＭに１０％ＦＢＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した培地で培養した。
【００８８】
図１ｅにネスティングＰＣＲの結果を示す。
図１ｅに示されるように、検証した５つの卵巣がん細胞株では、ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の発現は確認されなかった。
【００８９】
ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の予想される構造を図２ａ及び２ｂに示す。
【００９０】
図２ａは、ＳＰＯＮ１遺伝子とＴＲＩＭ２９遺伝子のタンパク質レベルの構造と、ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の予想されるタンパク質レベルの構造を示す模式図である。ＳＰＯＮ１遺伝子は、シグナルペプチド、細胞外マトリックスと結合するリーラー（Ｒｅｅｌｅｒ）、胚神経細胞の発生に関わるスポンジン（Ｓｐｏｎｄｉｎ）＿Ｎ、６つのトロンボスポンジンタイプ１ドメイン（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｔｙｐｅ１  ｄｏｍａｉｎ）を有する。ＴＲＩＭ２９遺伝子は、ジンクフィンガー（Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ）ドメイン、Ｂ−ボックス（Ｂ−ｂｏｘ）、コイルドコイル（Ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ）を有する。ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子はインフレームの融合遺伝子であり、ＴＲＩＭ２９遺伝子のＣ末端側のアミノ酸配列に、ＳＰＯＮ１遺伝子由来のシグナルペプチド配列を含む領域が結合したタンパク質を形成すると予想された。
【００９１】
図２ｂは、ＳＰＯＮ１遺伝子とＴＲＩＭ２９遺伝子のエクソンレベルの構造と、ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の予想されるエクソンレベルの構造を示す模式図である。ＳＰＯＮ１遺伝子のエクソン１〜エクソン２と、ＴＲＩＭ２９遺伝子のエクソン２〜エクソン１１が融合したタンパク質が形成されることが予想された。
【００９２】
ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子のｃＤＮＡ配列を配列番号：１９に、ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子のタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２０に示した。
【００９３】
（試験例２）
＜クローニング＞
ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子のタンパク質を発現させるプラスミドのコンストラクトを以下のようにして作製した。
ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子を発現する上記したＯｖ１４のＲＮＡに対して、以下のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを施行した。得られたＰＣＲ産物のＣ末端にフラッグ（ＦＬＡＧ）タグ配列を付加して、ｐｃＤＮＡ３ベクターに挿入した。
−プライマー−
・  ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−ｆｕｌｌ−Ｆｗ：
５’−ａｔｔｇａａｔｔｃａｇｇｃｔｇｔｃｃｃｃｇｇｃｇｃｃｃｃｔｇａａｇ−３’（配列番号：２７）
・  ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−ｆｕｌｌ−Ｒｖ：
５’−ａｔｔｃｔｃｇａｇｔｃａｔｇｇｇｇｃｔｔｃｇｔｔｇｇａｃｃｃａａｔ−３’（配列番号：２８）
【００９４】
＜トランスフェクション＞
前記クローニングで作製したコンストラクトを、ヒト腎臓由来細胞の２９３Ｔ細胞株又はヒト卵巣がん由来細胞のＡ２７８０細胞株に、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてトランスフェクションし、ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子一過性発現細胞を作製した。
また、前記クローニングで作製したコンストラクトを、融合遺伝子を導入していないｐＣＤＮＡ３ベクターに代えた以外は、同様にして、ヒト腎臓由来細胞の２９３Ｔ細胞株又はヒト卵巣がん由来細胞のＡ２７８０細胞株にトランスフェクションした。
なお、２９３Ｔ細胞はＤＭＥＭに１０％ＦＢＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した培地で培養し、Ａ２７８０細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０に１０％ＦＢＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した培地で培養した。
【００９５】
上記トランスフェクション後のＡ２７８０細胞を１００ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を用いて選択培養し、恒常発現細胞株をそれぞれ２クローンずつ作製した。以下、前記クローニングで作製したコンストラクトをトランスフェクションした恒常発現細胞株を「ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ａ」、「ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ｂ」と、融合遺伝子を導入していないｐＣＤＮＡ３ベクターをトランスフェクションした恒常発現細胞株を「Ｖｅｃｔｏｒ−Ａ２７８０  ＃Ａ」、「Ｖｅｃｔｏｒ−Ａ２７８０  ＃Ｂ」と称することがある。
【００９６】
＜ウェスタンブロッティング＞
上記で作製した細胞における融合遺伝子の発現を以下のようにして確認した。結果を図３に示す。
細胞抽出液は、トランフフェクションの２４時間後に２×サンプルバッファーを用いて調製した。具体的には、細胞をＰＢＳで洗浄した後２×サンプルバッファーを加えて細胞を溶解し、１００℃で１５分間加熱処理した。
ウェスタンブロッティングでは、前記細胞抽出液を１０％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した後、トランスファーバッファー（３９ｍＭ  グリシン、４８ｍＭ  トリスベース、２０％メタノール）を用いてＰＶＤＦメンブレン（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写した。メンブレンを１×ＴＢＳＴで洗浄し、１×ＴＢＳＴで作製した５％スキムミルクで３０分間ブロッキングした。１×ＴＢＳＴで３回洗浄後にＣａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ（ＴＯＹＯＢＯ社）で３，０００倍に希釈した一次抗体を４℃で一晩反応させた。１×ＴＢＳＴで２回洗浄後にＣａｎｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌで３，０００倍に希釈した二次抗体を１時間反応させた。１×ＴＢＳＴで３回洗浄後にＰｉｅｒｃｅ  ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて検出した。抗体は、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｆ３１６５−５ＭＧ，  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、抗マウス抗体（Ｃｏｄｅ：  ＮＡ９３１，  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用した。
【００９７】
図３に示されるように、目的とする細胞株が作製されたことが確認された。
【００９８】
（試験例３）
ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の細胞増殖能に対する影響を調べるために、試験例２で作製した細胞株の「ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ａ」、「ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ｂ」、「Ｖｅｃｔｏｒ−Ａ２７８０  ＃Ａ」、「Ｖｅｃｔｏｒ−Ａ２７８０  ＃Ｂ」を用いて、細胞増殖試験を施行した。
細胞増殖試験は、「Ｉｋｅｄａ  Ｋ，  Ｓｈｉｂａ  Ｓ，  Ｈｏｒｉｅ−Ｉｎｏｕｅ  Ｋ，  Ｓｈｉｍｏｋａｔａ  Ｋ，  Ｉｎｏｕｅ  Ｓ．  （２０１３）  Ａ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｌｅｘ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｅｎｅｒｇｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｍｕｓｃｌｅ．  Ｎａｔ  ｃｏｍｍｕｎ  ４：２１４７．」に記載のＤＮＡアッセイと同様にして解析した。
具体的には、上記細胞を９６ウェルプレートに５，０００個／ウェルずつ播き、その翌日に以下の卵巣がん治療薬を各濃度で振りかけた。卵巣がん治療薬を投与した日をデイ１（Ｄａｙ１）として、Ｄａｙ１、Ｄａｙ３又はＤａｙ５に、培地を除いて−３０℃に凍結した。なお、Ａ２７８０細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０に１０％ＦＢＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した培地で培養した。
前記凍結物に水を１００μＬずつ入れ、１時間後に−８０℃で凍結した。凍結の２時間後に室温で融解した。２０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を入れたＴＮＥ溶液を１００μＬ／ウェルずつ入れてＡＲＶＯマルチプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で蛍光強度を計測した。
＜卵巣がん治療薬及び投与濃度＞
・  シスプラチン  ：  ０μＭ、０．２μＭ、１μＭ
・  パクリタキセル  ：  ０ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ
・  オラパリブ  ：  ０μＭ、１μＭ、２μＭ
【００９９】
シスプラチンを投与した場合の結果を図４ａに、パクリタキセルを投与した場合の結果を図４ｂに、オラパリブを投与した場合の結果を図４ｃに示す。
図４ａ〜４ｃ中の横軸の各項目における棒グラフは、左側から順に、「Ｖｅｃｔｏｒ−Ａ２７８０  ＃Ａ」、「Ｖｅｃｔｏｒ−Ａ２７８０  ＃Ｂ」、「ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ａ」、「ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ｂ」の結果を示す。また、各図中、「＊」はｐ値＜０．０５を表し、「＊＊」はｐ値＜０．０１を表し、「＊＊＊」はｐ値＜０．００１を表し、「＊＊＊＊」はｐ値＜０．０００１を表す。
【０１００】
図４ａ〜４ｃの結果から、「ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ａ」及び「ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ｂ」は、「Ｖｅｃｔｏｒ−Ａ２７８０  ＃Ａ」及び「Ｖｅｃｔｏｒ−Ａ２７８０  ＃Ｂ」に比較して、有意に増殖が亢進していることが示された。また、「ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ａ」及び「ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ｂ」は、各化学療法に対して、有意な耐性を示すことが確認された。
【０１０１】
（試験例４）
ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子による薬剤耐性のメカニズムを解析するために、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）を用いたアポトーシス解析を以下のようにして行った。
試験例２で作製した細胞株の「ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ａ」又は「Ｖｅｃｔｏｒ−Ａ２７８０  ＃Ａ」を６ウェルプレートに１５０，０００個／ウェルずつ播いた。翌日に薬剤（シスプラチン１μＭ、パクリタキセル５ｎＭ、又はオラパリブ２μＭ）を添加した。薬剤を投与した日をＤａｙ１として、Ｄａｙ４に細胞を回収した。また、薬剤を添加しなかった場合についても同様にして細胞を回収した。なお、Ａ２７８０細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０に１０％ＦＢＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した培地で培養した。
回収した細胞をＦＩＴＣアネキシンＶとヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（ＦＩＴＣ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｉ，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で染色し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｌｉｂｕｒ（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて測定した。
【０１０２】
薬剤なしの場合の結果を図５ａに、シスプラチンを添加した場合の結果を図５ｂに、パクリタキセルを添加した場合の結果を図５ｃに、オラパリブを添加した場合の結果を図５ｄに示す。また、薬剤の添加の有無のそれぞれの場合におけるアネキシンＶ陽性のアポトーシス細胞の割合を図５ｅに示す。
これらの図から、薬剤の投与により増加するアネキシンＶ陽性のアポトーシスを示す細胞の割合が、「Ｖｅｃｔｏｒ−Ａ２７８０  ＃Ａ」と比べて、「ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ａ」では有意に減少していることが示され、ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子は、これらの卵巣がん治療薬によって誘導されるアポトーシスに対して抵抗性を付与することにより、細胞増殖を亢進させることが示された。
【０１０３】
（試験例５−１）
＜二本鎖核酸分子の作製＞
細胞増殖の亢進及び薬剤耐性の獲得がＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子によるものかを調べるために、ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の融合部位にまたがる二本鎖核酸分子（ｓｉＦｕｓｉｏｎ  ＃１〜＃６）を設計した。二本鎖核酸分子は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社にて合成した。
なお、ネガティブコントロールとして使用した二本鎖核酸分子（ｓｉＬｕｃ）は、ＲＮＡｉ社にて合成した。
以下に、各二本鎖核酸分子の配列を示す。
【０１０４】
＜＜ｓｉＦｕｓｉｏｎ  ＃１＞＞
−標的配列−
５’−ｇｇａｃｃｔｔｃｃａｇａｃｇｇａｇｃｔ−３’（配列番号：１）
−二本鎖核酸分子（キメラｓｉＲＮＡ）の配列−
−−センス鎖−−
５’−ｇｇａｃｃｕｕｃｃａｇａｃｇｇａｇｃｕｔｔ−３’（配列番号：７）
−−アンチセンス鎖−−
５’−ａｇｃｕｃｃｇｕｃｕｇｇａａｇｇｕｃｃｔｔ−３’（配列番号：８）
配列番号：７及び８中、下線部はＤＮＡを表し、下線部なしはＲＮＡを表す。
【０１０５】
＜＜ｓｉＦｕｓｉｏｎ  ＃２＞＞
−標的配列−
５’−ｃｃｔｔｃｃａｇａｃｇｇａｇｃｔｇｔｃａｔ−３’（配列番号２）
−二本鎖核酸分子（キメラｓｉＲＮＡ）の配列−
−−センス鎖−−
５’−ｃｃｕｕｃｃａｇａｃｇｇａｇｃｕｇｕｃａｕｔｔ−３’（配列番号９）
−−アンチセンス鎖−−
５’−ａｕｇａｃａｇｃｕｃｃｇｕｃｕｇｇａａｇｇｔｔ−３’（配列番号１０）
配列番号：９及び１０中、下線部はＤＮＡを表し、下線部なしはＲＮＡを表す。
【０１０６】
＜＜ｓｉＦｕｓｉｏｎ  ＃３＞＞
−標的配列−
５’−ｇｇａｃｃｔｔｃｃａｇａｃｇｇａｇｃｔｇｔ−３’（配列番号３）
−二本鎖核酸分子（キメラｓｉＲＮＡ）の配列−
−−センス鎖−−
５’−ｇｇａｃｃｕｕｃｃａｇａｃｇｇａｇｃｕｇｕｔｔ−３’（配列番号１１）
−−アンチセンス鎖−−
５’−ａｃａｇｃｕｃｃｇｕｃｕｇｇａａｇｇｕｃｃｔｔ−３’（配列番号１２）
配列番号：１１及び１２中、下線部はＤＮＡを表し、下線部なしはＲＮＡを表す。
【０１０７】
＜＜ｓｉＦｕｓｉｏｎ  ＃４＞＞
−標的配列−
５’−ｇｃｔｇｇｇａｃｃｔｔｃｃａｇａｃｇｇａｇ−３’（配列番号４）
−二本鎖核酸分子（キメラｓｉＲＮＡ）の配列−
−−センス鎖−−
５’−ｇｃｕｇｇｇａｃｃｕｕｃｃａｇａｃｇｇａｇｔｔ−３’（配列番号１３）
−−アンチセンス鎖−−
５’−ｃｕｃｃｇｕｃｕｇｇａａｇｇｕｃｃｃａｇｃｔｔ−３’（配列番号１４）
配列番号：１３及び１４中、下線部はＤＮＡを表し、下線部なしはＲＮＡを表す。
【０１０８】
＜＜ｓｉＦｕｓｉｏｎ  ＃５＞＞
−標的配列−
５’−ｔｇｇｇａｃｃｔｔｃｃａｇａｃｇｇａｇｃｔ−３’（配列番号５）
−二本鎖核酸分子（キメラｓｉＲＮＡ）の配列−
−−センス鎖−−
５’−ｕｇｇｇａｃｃｕｕｃｃａｇａｃｇｇａｇｃｕｔｔ−３’（配列番号１５）
−−アンチセンス鎖−−
５’−ａｇｃｕｃｃｇｕｃｕｇｇａａｇｇｕｃｃｃａｔｔ−３’（配列番号１６）
配列番号：１５及び１６中、下線部はＤＮＡを表し、下線部なしはＲＮＡを表す。
【０１０９】
＜＜ｓｉＦｕｓｉｏｎ  ＃６＞＞
−標的配列−
５’−ｔｔｃｃａｇａｃｇｇａｇｃｔｇｔｃａｔｔｇ−３’（配列番号６）
−二本鎖核酸分子（キメラｓｉＲＮＡ）の配列−
−−センス鎖−−
５’−ｕｕｃｃａｇａｃｇｇａｇｃｕｇｕｃａｕｕｇｔｔ−３’（配列番号１７）
−−アンチセンス鎖−−
５’−ｃａａｕｇａｃａｇｃｕｃｃｇｕｃｕｇｇａａｔｔ−３’（配列番号１８）
配列番号：１７及び１８中、下線部はＤＮＡを表し、下線部なしはＲＮＡを表す。
【０１１０】
＜＜ｓｉＬｕｃ＞＞
−二本鎖核酸分子（ｓｉＲＮＡ）の配列−
−−センス鎖−−
５’−ｇｕｇｇａｕｕｕｃｇａｇｕｃｇｕｃｕｕａａ−３’（配列番号２９）
−−アンチセンス鎖−−
５’−ａａｇａｃｇａｃｕｃｇａａａｕｃｃａｃａｕ−３’（配列番号３０）
【０１１１】
＜ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子発現抑制効果の検討＞
上記で作製した二本鎖核酸分子を試験例２で作製した細胞株の「ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ａ」、「ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ｂ」、「Ｖｅｃｔｏｒ−Ａ２７８０  ＃Ａ」、又は「Ｖｅｃｔｏｒ−Ａ２７８０  ＃Ｂ」にトランスフェクションし、４８時間培養後に全ＲＮＡを回収してｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行うことにより、各二本鎖核酸分子の各細胞におけるＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子発現に対する抑制効果（ノックダウン効果）を検討した。
実験方法の詳細を以下に示す。
【０１１２】
［細胞培養］
前記細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０に１０％ＦＢＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した培地で培養した。
【０１１３】
［トランスフェクション］
６ウェルプレートに、前記細胞を１×１０５個／ウェルとなるようにまき、その翌日に、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及びトランスフェクション試薬であるＲＮＡｉ  ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて二本鎖核酸分子をトランスフェクションした。導入した二本鎖核酸分子の量は、培地中で１０ｎＭとなるように調整した。
【０１１４】
［ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子発現レベルの測定］
トランスフェクションし４８時間培養した後に、ＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン製）を用いて全ＲＮＡを細胞より回収した。前記全ＲＮＡ  １μｇを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により、ｃＤＮＡを合成した。
前記ｃＤＮＡを１０倍希釈し、そのうちの２μＬを用いてｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行った。前記ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲは、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（登録商標）  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、及びＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  Ｆａｓｔ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（日本ジェネティクス株式会社製）を用いて行い、ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子（配列番号：１９）及び内部コントロールであるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現レベルを測定した。
前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子（配列番号：１９）の発現レベルは、前記ＧＡＰＤＨ遺伝子に対する発現レベルをＣｙｃｌｅ数からΔΔＣｔ法を用いて算出した。
なお、ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲに用いたプライマーは、以下の通りである。
−ＧＡＰＤＨ遺伝子−
・  ＧＡＰＤＨ＿ＦＷ：
５’−ｇｇｔｇｇｔｃｔｃｃｔｃｔｇａｃｔｔｃａａｃａ−３’（配列番号：３１）
・  ＧＡＰＤＨ＿ＲＶ：
５’−ｇｔｇｇｔｃｇｔｔｇａｇｇｇｃａａｔｇ−３’（配列番号：３２）
−ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子−
・  ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ｆｗ：
５’−ｇａｃｃａｔｇｃｔｇｇｇａｃｃｔｔｃｃ−３’（配列番号：２１）
・  ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ｒｖ：
５’−ｃｔｔｇａｔｇｃｇｇｔｃｃｔｔｃｔｃｃｔｔ−３’（配列番号：２２）
【０１１５】
Ｖｅｃｔｏｒ−Ａ２７８０  ＃Ａ細胞におけるノックダウン効率を確認した結果を図６ａに、Ｖｅｃｔｏｒ−Ａ２７８０  ＃Ｂ細胞におけるノックダウン効率を確認した結果を図６ｂに、ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ａ細胞におけるノックダウン効率を確認した結果を図６ｃに、ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ｂ細胞におけるノックダウン効率を確認した結果を図６ｄに示す。
図６ａ〜６ｄ中、「ｓｉＬｕｃ」は「ｓｉＬｕｃ」をトランスフェクションした場合の結果を示し、「ＳｉＦｕｓｉｏｎ＃１〜＃６」それぞれ「ＳｉＦｕｓｉｏｎ＃１〜＃６」をトランスフェクションした場合の結果を示す。
図６ａ〜６ｄの結果から、「ＳｉＦｕｓｉｏｎ＃１〜＃６」のうち、ｓｉＦｕｓｉｏｎ＃６以外では、ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子のノックダウンが確認された。
【０１１６】
（試験例５−２）
試験例５−１で作製した「ＳｉＦｕｓｉｏｎ＃１〜＃６」のうち、ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の発現抑制効果が認められた「ＳｉＦｕｓｉｏｎ＃１〜＃５」について、試験例２で作製した細胞株の「ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ａ」、「ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ｂ」、「Ｖｅｃｔｏｒ−Ａ２７８０  ＃Ａ」、「Ｖｅｃｔｏｒ−Ａ２７８０  ＃Ｂ」を用いて、細胞増殖試験を施行した。
細胞増殖試験は、試験例３と同様に、ＤＮＡアッセイにより解析した。
【０１１７】
具体的には、上記細胞を９６ウェルプレートに５，０００個／ウェルずつ播き、その翌日にＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及びトランスフェクション試薬であるＲＮＡｉ  ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて二本鎖核酸分子（ＳｉＦｕｓｉｏｎ＃１〜＃５、又はＳｉＬｕｃ）をトランスフェクションした。なお、導入した二本鎖核酸分子の量は、培地中で１０ｎＭとなるように調整した。さらにその翌日に卵巣がん治療薬（シスプラチン（１μＭ）、パクリタキセル（２ｎＭ）、又はオラパリブ（２μＭ））を添加した。卵巣がん治療薬の添加を行った日をデイ１（Ｄａｙ１）としてＤａｙ４に、培地を除いて−３０℃に凍結した。また、薬剤なし場合も同様にして試験を行った。なお、Ａ２７８０細胞はＲＰＭＩ−１６４０に１０％ＦＢＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した培地で培養した。
前記凍結物に水を１００μＬずつ入れ、１時間後に−８０℃で凍結した。凍結の２時間後に室温で融解した。２０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を入れたＴＮＥ溶液を１００μＬ／ウェルずつ入れてＡＲＶＯマルチプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で蛍光強度を計測した。
【０１１８】
薬剤なしの場合の結果を図６ｅに、シスプラチン（１μＭ）を投与した場合の結果を図６ｆに、パクリタキセル（２ｎＭ）を投与した場合の結果を図６ｇに、オラパリブ（２μＭ）を投与した場合の結果を図６ｈに示す。
図６ｅ〜６ｈ中の横軸の各項目における棒グラフは、左側から順に、「Ｖｅｃｔｏｒ−Ａ２７８０  ＃Ａ」、「Ｖｅｃｔｏｒ−Ａ２７８０  ＃Ｂ」、「ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ａ」、「ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ｂ」の結果を示す。また、各図中、「＊」はｐ値＜０．０５を表し、「＊＊」はｐ値＜０．０１を表し、「＊＊＊」はｐ値＜０．００１を表し、「＊＊＊＊」はｐ値＜０．０００１を表す。
【０１１９】
図６ｅ〜６ｈの結果から、卵巣がん治療薬を添加していない場合では、ＳｉＦｕｓｉｏｎ＃１又は＃２を投与すると、「ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ａ」及び「ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ｂ」で細胞の増殖が低下することが示された。
また、卵巣がん治療薬を添加した場合では、ＳｉＦｕｓｉｏｎ＃１、＃２、又は＃３を投与すると、「ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ａ」及び「ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９−Ａ２７８０  ＃Ｂ」の薬剤耐性が有意に減少することが観察された。
【０１２０】
以上より、ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子は、卵巣がん細胞の増殖能を高めること、及び卵巣がん治療薬に対する耐性を獲得させることが示された。
また、本発明の二本鎖核酸分子により、ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の発現を抑制できること、ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子を発現する細胞の増殖を抑制できること、及びＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子を発現する細胞の卵巣がん治療薬に対する耐性を減少させることができることが示された。
ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子は、卵巣がんの診断及び治療標的となる融合転写物である可能性があり、腫瘍マーカー、診断、治療標的、治療法の選択法、創薬などへの展開が期待される。
【０１２１】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞  ＳＰＯＮ１遺伝子と、ＴＲＩＭ２９遺伝子との融合遺伝子であるＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子の発現を抑制するための二本鎖核酸分子であって、
（ａ）配列番号：１〜配列番号：５のいずれかで表される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、
（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖と二本鎖を形成する該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖とを含むことを特徴とする二本鎖核酸分子である。
＜２＞  前記センス鎖が、配列番号：１〜配列番号：３のいずれかで表される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖である前記＜１＞に記載の二本鎖核酸分子である。
＜３＞  前記センス鎖が、配列番号：１〜配列番号：２のいずれかで表される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子である。
＜４＞  二本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラのいずれかである前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子である。
＜５＞  ｓｉＲＮＡ及びキメラｓｉＲＮＡのいずれかである前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子である。
＜６＞  前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするＤＮＡである。
＜７＞  前記＜６＞に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクターである。
＜８＞  前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子、前記＜６＞に記載のＤＮＡ、及び前記＜７＞に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とするがん細胞増殖抑制剤である。
＜９＞  がん細胞が、卵巣がん細胞である前記＜８＞に記載のがん細胞増殖抑制剤である。
＜１０＞  前記卵巣がん細胞が、卵巣がん治療薬に対する抵抗性を有する前記＜９＞に記載のがん細胞増殖抑制剤である。
＜１１＞  前記卵巣がん治療薬が、シスプラチン、パクリタキセル、及びオラパリブからなる群から選択される少なくとも１種である前記＜１０＞に記載のがん細胞増殖抑制剤である。
＜１２＞  前記卵巣がん治療薬と組み合わせて用いられる前記＜８＞から＜１１＞のいずれかに記載のがん細胞増殖抑制剤である。
＜１３＞  がん細胞に、前記＜８＞から＜１２＞のいずれかに記載のがん細胞増殖抑制剤を作用させることを特徴とするがん細胞の増殖抑制方法である。
＜１４＞  前記がん細胞が、卵巣がん細胞である前記＜１３＞に記載のがん細胞の増殖抑制方法である。
＜１５＞  前記卵巣がん細胞が、卵巣がん治療薬に対する抵抗性を有する前記＜１４＞に記載のがん細胞の増殖抑制方法である。
＜１６＞  更に、前記卵巣がん治療薬を作用させる前記＜１４＞から＜１５＞のいずれかに記載のがん細胞の増殖抑制方法である。
＜１７＞  前記卵巣がん治療薬が、シスプラチン、パクリタキセル、及びオラパリブからなる群から選択される少なくとも１種である前記＜１５＞から＜１６＞のいずれかに記載のがん細胞増殖抑制方法である。
＜１８＞  がんを予防乃至治療するための医薬であって、前記＜８＞から＜１２＞のいずれかに記載のがん細胞増殖抑制剤を含むことを特徴とする医薬である。
＜１９＞  個体に、前記＜１８＞に記載の医薬を投与することを特徴とするがんの予防乃至治療方法である。
＜２０＞  卵巣がん細胞の増殖能を判定する方法であって、
個体から調製した試料中におけるＳＰＯＮ１遺伝子と、ＴＲＩＭ２９遺伝子との融合遺伝子であるＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子を検出する工程と、
前記試料中に前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子が検出された場合には、前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子が検出されない細胞と比べて、卵巣がん細胞の増殖が亢進すると判定する工程とを含むことを特徴とする方法である。
＜２１＞  卵巣がん個体の卵巣がん治療薬に対する抵抗性を判定する方法であって、
個体から調製した試料中におけるＳＰＯＮ１遺伝子と、ＴＲＩＭ２９遺伝子との融合遺伝子であるＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子を検出する工程と、
前記試料中に前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子が検出された場合には、卵巣がん治療薬に対する抵抗性を有すると判定する工程とを含むことを特徴とする方法である。
＜２２＞  前記卵巣がん治療薬が、シスプラチン、パクリタキセル、及びオラパリブからなる群から選択される少なくとも１種である前記＜２１＞に記載の方法である。
＜２３＞  卵巣がん個体における前記＜１８＞に記載の医薬の有効性を判定する方法であって、
個体から調製した試料中におけるＳＰＯＮ１遺伝子と、ＴＲＩＭ２９遺伝子との融合遺伝子であるＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子を検出する工程と、
前記試料中に前記ＳＰＯＮ１−ＴＲＩＭ２９融合遺伝子が検出された場合には、前記＜１８＞に記載の医薬が有効であると判定する工程とを含むことを特徴とする方法である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図６ａ】
2019198271.tif 000018
【図６ｂ】
2019198271.tif 000019
【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図６ｆ】
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【図６ｇ】
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【図６ｈ】
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【配列表】
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