(57)【要約】【課題】安定的かつ低コストのペプチド合成方法を提供する。【解決手段】大腸菌ＢＬ２１−ｐＥＴＨｉｓ−ｙｗｆＥおよび大腸菌ＢＬ２１−ｐＥＴＨｉｓ−ａｃｋをそれぞれ作製し、これらの菌株を別々に培養し、組換えアミノ酸リガーゼおよび酢酸キナーゼを得る。アセチルリン酸のリン酸基が、酢酸キナーゼの作用下でＡＤＰに移行してＡＴＰとなり、このＡＴＰを用いてペプチドを合成する。【選択図】図１
2019014663.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセテートキナーゼ遺伝子を有する第一の組換え大腸菌と、
アミノ酸リガーゼの遺伝子を有する第二の組換え大腸菌と、を培養する工程と、
前記第一の組換え大腸菌由来のアセテートキナーゼを用いてＡＴＰを生成する工程と、
前記ＡＴＰを用いて、第二の組換え大腸菌由来のアミノ酸リガーゼがペプチドを合成する工程を含むペプチド合成方法。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチド合成方法であって、
前記ペプチドがＬアラニルＬグルタミンであるペプチド合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドの合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＬアラニルＬグルタミンの合成は、化学合成や、化学酵素合成によって行われていた。化学合成の過程では、カルボニルクロライドや、Ｄ−２クロロプロピオン酸など毒性のリガントが合成の過程で用いられるＡｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ  Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｕ  Ａｌａ−Ｇｌｕなどでも同様である。
【０００３】
また、化学酵素合成において、Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓやＳｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｙａｎｇｅｎｓｉｓから単離された酵素が、アラニンメチルエステルとＧｌｎからＡｌａ  Ｇｌｎが合成される。しかし、アラニンメチルエステルの合成は困難である。また、Ａｌａ−Ａｌａや、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎの合成でも同様である。また、生物学的な方法としては、遺伝子組換えを行った大腸菌などによるペプチドの合成方法もある（特許文献１）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−４４９０９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、化学合成によるものは、コストがかかる。さらに、遺伝子組換えを行った大腸菌などによるペプチドの合成方法もあるが、合成時にＡＴＰを消費し、製造するためにコストが高くなり、工業生産には適さない（特許文献１）。
【０００６】
本発明は、上述した課題を解決するため、安価でかつ工業的に量産可能な、ペプチドの合成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明では、大腸菌ＢＬ２１−ｐＥＴＨｉｓ−ｙｗｆＥおよび大腸菌ＢＬ２１−ｐＥＴＨｉｓ−ａｃｋをそれぞれ作製し、これらの菌株を別々に培養して組換えアミノ酸リガーゼＹｗｆＥおよび酢酸キナーゼＡｃｋを得る。さらに、アセチルリン酸のリン酸基が酢酸キナーゼの作用下でＡＤＰからＡＴＰを生成し、そのＡＴＰを用いてペプチドを合成する。
【０００８】
本発明は、
アセテートキナーゼ遺伝子を有する第一の組換え大腸菌と、
アミノ酸リガーゼの遺伝子を有する第二の組換え大腸菌と、を培養する工程と、
第一の組換え大腸菌由来のアセテートキナーゼを用いてＡＴＰを生成する工程と、
前記ＡＴＰを用いて、第二の組換え大腸菌由来のアミノ酸リガーゼがペプチドを合成する工程を含むペプチド合成方法である。
【０００９】
また、本発明は、ペプチドがＬアラニルＬグルタミンであるペプチド合成方法であっても良い。
【００１０】
第一の組換え大腸菌が、アセテートキナーゼ（酢酸キナーゼ）を発現し、そのアセテートキナーゼが基質中の酢酸を用いて、ＡＤＰからＡＴＰを合成する。第二の組換え大腸菌が発現したアミノ酸リガーゼがＡＴＰを利用して、基質中のアミノ酸からペプチドを合成する。大腸菌同士は、生育環境がほぼ同じため、一つの培養液で生育できるため、別々の菌株を使うことと比較すると、設備や培地などの金額やスペースなどのコストが節約できる。さらに、酢酸はＡＴＰよりも安価で安定的に入手できるため、安価でかつ工業的に大量生産可能なペプチド合成方法が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施形態にかかるベクターを説明する概念図である。
【図２】本発明の実施形態にかかるベクターを説明する概念図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
［本発明の特徴］
ｙｗｆＥ遺伝子を持つ枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）のアミノ酸リガーゼは、ＡＴＰ依存のジペプチドリガーゼで、Ｌ−Ａｌａｎｙｌ−アンチカプシン（ａｎｔｉｃａｐｓｉｎ）の合成に用いられる。また、ＡＴＰ依存で、Ａｌａ−Ｇｌｎを結合する活性があると考えられている。しかし、この酵素による方法は、基質として多くのＡＴＰが必要となるため、コストがかかってしまう。
【００１３】
出願人は、この問題を解決するために、クロストリジウム  アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）の酢酸キナーゼを用いて、基質の中の酢酸を利用して、ＡＤＰからＡＴＰを生成した。
【００１４】
酢酸は、安価でＡＴＰよりも入手しやすい。組換えアミノ酸リガーゼと酢酸キナーゼとを含む複数の酵素を用いた手法によって、Ａｌａ−Ｇｌｎの大量生産を低コストで安定的に行えるようになる。
【００１５】
［プラスミドの性質］
ｐＥＴ−Ｈｉｓベクターは、アンピシリン耐性を有する大腸菌発現ベクターである。プロモーターはＴ７であり、標識はＮ−Ｈｉｓであり、酵素認識部位はトロンビンであり、プラスミドサイズは２．９ｋｂである。
【００１６】
ｐＥＴ−Ｈｉｓベクターは、多くのコピー（３７℃、ＬＢ）で大腸菌に形質転換することができる。Ｎ末端６のＨｉｓおよびＴ７プロモーターは、ｐＥＴ−Ｈｉｓベクターに存在する。高度に発現された産物のＮ末端は、キレートセファロースアフィニティークロマトグラフィーを用いた標的タンパク質の精製を容易にする６個のＨｉｓを有する。  ｐＥＴ−Ｈｉｓには、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲ  Ｉ、Ｎｈｅ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩの４つの制限部位がある。
【００１７】
この特許では、アミノ酸リガーゼ遺伝子ｐＥＴ−Ｈｉｓ−ｙｗｆＥの組換え発現ベクターおよびアセテートキナーゼ遺伝子ｐＥＴ−Ｈｉｓ−ａｃｋの組換え発現ベクターをそれぞれ構築する。アミノ酸リガーゼ遺伝子は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １５２４５））に由来し、アセテートキナーゼ遺伝子はクロストリジウム  アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ  ４２５９））に由来する。
【００１８】
クロストリジウム  アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ８２４）は、一般に使用されるブタノール生成細菌である。出願人は、ＫＥＧＧのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｅｇｇ．ｊｐ／ｋｅｇｇ−ｂｉｎ／ｓｈｏｗ＿ｐａｔｈｗａｙ？ｃａｃ００６２０）を用いて、ブタノールの代謝経路においてアセチル−ＣｏＡがアセチルトランスフェラーゼと酢酸キナーゼによってアセチルリン酸に変換されることを見出した。
【００１９】
アセチルリン酸は、酢酸キナーゼによって酢酸にさらに変換できる。上記の反応により産生されたＡＴＰは、嫌気性条件下での細胞増殖に使用できる。したがって、我々はＡＴＰリサイクルを達成するためにクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）由来の酢酸キナーゼを使用しようと試みた。
【００２０】
［遺伝子組換えの方法］
遺伝子の連結の方法は、１００μｌの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に対して、氷浴で３０分間および３７℃で６０秒間の熱ショックを与えた。混合物をＳＯＣ培地に加え、１時間インキュベートした。細胞を遠心分離し、アンピシリン（Ａｍｐｒ）耐性を有するＬＢ固体培地中、３７℃で１２時間培養して、陽性形質転換体をスクリーニングした。
【００２１】
［組換え株の性質と培養］
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）は、ファージＴ７プロモーター（例えば、ｐＥＴシリーズ）を含む発現ベクターにクローン化された遺伝子を効率的に発現するために使用される。  Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼは、ラムダファージＤＥ３領域に位置し、大腸菌ＢＬ２１の染色体上に組み込まれる。この株は無毒性タンパク質の発現に適している。
【００２２】
２つの組換え発現ベクターをそれぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＡＣＣＣ１１１７１）に形質転換して、操作された大腸菌ｐＥＴ−Ｈｉｓ−ｙｗｆＥおよび大腸菌ｐＥＴ−Ｈｉｓ−ａｃｋを得る。
【００２３】
組換え株をグリセロールチューブから、接種量０．１％（ｖ  ／  ｖ）の１００μｇ／  ｍＬアンピシリンを含む１００ｍＬ  ＬＢ液体培地に接種し、３７℃および２００ｒｐｍで１２時間培養した。培養液を接種量１％（ｖ  ／  ｖ）のアンピシリン１００μｇ／  ｍＬを含むＬＢ培地４００ｍＬに移し、３７℃、２００ｒｐｍで培養した。細胞濃度ＯＤ６００ｎｍが０．６に達すると、最終濃度０．１ｍｍｏｌ  ／  ＬのＩＰＴＧを添加し、組換え株を２８℃で１０時間培養してタンパク質を発現させた。
【００２４】
［精製方法］
酵素精製：インキュベーション後、４℃および６０００ｒｐｍでの遠心分離によって細胞を回収した。次いで、細胞をｐＨ７．４ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、ｐＨ７．４ＰＢＳ緩衝液で再懸濁し、４℃で２０分間超音波処理し、１００００ｒｐｍで遠心分離して上清を得た。
【００２５】
上清を１ｍＬ／分の流速でＮｉ  ＋  −ＮＴＡ樹脂に通し、流速１ｍＬ／分で５０ｍＭのイミダゾール溶液で溶出し、２５０ｍＭのイミダゾール溶液で１ｍＬ／分の流速で溶出し、標的タンパク質を得た。
【００２６】
溶出した標的タンパク質を透析し、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液で４℃で脱塩した。透析液を２時間ごとに交換した。４回繰り返した後、得られた目的タンパク質を得た。
【００２７】
ＡＴＰがＡｌａ−Ｇｌｎの酵素反応に直接使用される場合、ＡＴＰの量はＡｌａおよびＧｌｎのような他の基質と同量（モル）である。しかし、本発明ではＡＴＰを直接使用していない。ＡＴＰはアセチルリン酸とＡＤＰを用いて酢酸キナーゼによって形成されている。詳細な酵素反応データおよびいくつかの比較データを以下の表に示す。
【表１】
2019014663.tif 000003
【００２８】
枯草菌由来のアミノ酸リガーゼはＡＴＰを用いることによって４４種類のα−ジペプチドを合成できることが知られている。表２に示すように、本発明の手法を用いることによって、そのうちの一部のジペプチドを合成できる。
【表２】
2019014663.tif 000004
なお、表２の黒丸は、対応するジペプチドがＨＰＬＣ分析によって確認された。白抜きの○は、ＡＤＰやリン酸の形成や、ＨＰＬＣのピークなどによって示唆されたが、標準的なジペプチドの入手できなかったため、確認できなかった。
【００２９】
本実施形態にて説明してきたように、組換え大腸菌ＢＬ２１−ｐＥＴＨｉｓ−ｙｗｆＥおよび大腸菌ＢＬ２１−ｐＥＴＨｉｓ−ａｃｋをそれぞれ作製し、これらの菌株を別々に培養して組換えアミノ酸リガーゼＹｗｆＥおよび酢酸キナーゼＡｃｋを得る。さらに、アセチルリン酸のリン酸基が酢酸キナーゼの作用下でＡＤＰからＡＴＰを生成し、その生成したＡＴＰを用いてアミノ酸リガーゼが、ＬアラニルＬグルタミンなどペプチドを合成する。このようにして、高価なＡＴＰを添加しなくても、酢酸を利用して、ペプチド合成の効率を上げることができる。
【００３０】
また、組換え大腸菌ＢＬ２１−ｐＥＴＨｉｓ−ｙｗｆＥおよび大腸菌ＢＬ２１−ｐＥＴＨｉｓ−ａｃｋは、生育環境がほぼ同じため、大腸菌と枯草菌など別の種類の菌株を使うことと比較すると、ほぼ同様の設備を使用でき、ほぼ同じ種類の培地を使用できるため、金額やスペースなどのコストが節約できる。さらに、酢酸はＡＴＰよりも安価で安定的に入手できるため、安価でかつ工業的に大量生産可能なペプチド合成方法が提供できる。
【図１】
2019014663.tif 000005
【図２】
2019014663.tif 000006