(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞により取り込まれ、共焦点蛍光マイクロ内視鏡又は他の光検出器によるその後の可視化を可能にする染料を用い、細胞を可視化する方法の提供。【解決手段】細胞取り込み前は実質的に検出可能な、又は少量しか、蛍光を示さないが、細胞取り込み後は細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで撮像するのに用いられる共焦点内視鏡を用いて検出可能な蛍光の増加を示す、染料構築物、及びその使用。該染料構築物は、蛍光染料に結合した表面基を有す多分岐分子であり、例えば、ペプチド配列を含む多分岐分子である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞取り込み前は実質的に検出可能な、又は少量しか、蛍光を示さないが、細胞取り込
み後は細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで撮像するのに用いられる共焦点内視鏡を用いて検出可能な
蛍光の増加を示す、染料構築物。
【請求項２】
細胞取り込み前は実質的に検出可能な、又は少量しか、蛍光を示さないが、細胞取り込
み後は細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで撮像するのに用いられる共焦点内視鏡を用いて検出可能な
蛍光の増加を示す、染料構築物の使用。
【請求項３】
前記染料構築物が蛍光染料に結合した表面基を有す多分岐分子であることを特徴とする
、請求項１又は２に記載の染料構築物又は使用。
【請求項４】
前記多分岐分子がペプチド配列を含むことを特徴とし、該ペプチド配列が（ｉ）適当な
化学物質若しくは酵素により開裂可能な１つ以上の開裂部位を含む、又は（ｉｉ）化学物
質若しくは酵素により開裂可能な認識可能配列を含まないランダム配列を含むことを特徴
とする、請求項３に記載の染料構築物又は使用。
【請求項５】
消光剤分子を更に含む、請求項４に記載の染料構築物又は使用。
【請求項６】
前記多分岐分子が以下の一般化構造：
【化１】
2019014727.tif 000029
であって、式中、ＲがＮＨ２、ＣＯＮＨ２、アミノ酸、ＯＨ、アミノ酸−ＣＯＮＨ２、Ｃ
ＯＮＨ２−アミノ酸、アルキルアミノ、アルコキシアミノ、尿素、チオール、カルボン酸
、又は他の蛍光部分と同じ又は異なり得る更なる蛍光体部分から選択され、すべてのこう
した基が分岐点に直接結合することができる、又はＰＥＧ基、アルキル若しくはアルケニ
ル鎖、例えばＣ１〜Ｃ１０アルキル若しくはアルケニルであり得るスペーサーにより分岐
点から分離することができる、構造のいずれかを有することを特徴とする、いずれかの前
請求項に記載の染料構築物又は使用。
【請求項７】
前記多分岐分子が以下の構造：
【化２】
2019014727.tif 000030
2019014727.tif 000031
、または
2019014727.tif 000032
であって、式中、（ＡＡ）ｎが任意であり、存在する場合ＡＡがいずれかのアミノ酸を意
味し、ｎが１〜３０の正の整数であり、＊Ｆが蛍光部分である、構造の１つから選択され
ることを特徴とする、請求項６に記載の染料構築物又は使用。
【請求項８】
＊Ｆが独立してＦＡＭ、ローダミン、シアニン染料又はＢＯＤＩＰＹ染料から選択され
ることを特徴とする、請求項７に記載の染料構築物又は使用。
【請求項９】
Ｑ＊が暗消光剤部分であり、独立してＤＡＢＣＹＬ、メチルレッド、ＢＨＱ１、ＢＨＱ
２及びＢＨＱ３から選択されることを特徴とする、請求項７又は８に記載の染料構築物又
は使用。
【請求項１０】
共焦点内視鏡を用いる前記撮像が、大及び小腸を含む腸；動脈及び静脈；肺を含む呼吸
系；脳内カテーテルによるような脳；又は子宮及び卵管を含む生殖系において行われるこ
とを特徴とする、いずれかの前請求項に記載の染料構築物又は使用。
【請求項１１】
前記染料構築物が損傷される組織の領域に局所投与されることを意図することを特徴と
する、いずれかの前請求項に記載の染料構築物又は使用。
【請求項１２】
前記染料構築物を取り込んだ細胞の検出が、前記染料構築物が被験者に投与されてから
１〜３０分以内に行われることを特徴とする、いずれかの前請求項に記載の染料構築物又
は使用。
【請求項１３】
検出される前記１つ又は複数の細胞が活性化好中球であることを特徴とする、いずれか
の前請求項に記載の染料構築物又は使用。
【請求項１４】
被験者に投与される前記染料構築物の量が１００μｇ未満であることを特徴とする、い
ずれかの前請求項に記載の染料構築物又は使用。
【請求項１５】
１つ又は複数の細胞を共焦点マイクロ内視鏡により可視化することができるように被験
者への投与するための、いずれかの前請求項に記載の染料構築物を含む、カテーテル又は
他の適切な投与装置。
【請求項１６】
染料構築物を被験者の細胞に投与するステップであって、該染料構築物が細胞取り込み
前は実質的に検出可能な、又は少量しか、蛍光を示さないが、細胞取り込み後は検出可能
な蛍光の増加を示す、ステップ、及び該染料構築物を取り込んだ１つ又は複数の細胞を、
該１つ又は複数の細胞からの蛍光を共焦点マイクロ内視鏡を用いて観察することにより、
観察するステップを含む、細胞の混合物内の特定の１つ又は複数の細胞を共焦点蛍光マイ
クロ内視鏡を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで可視化する方法。
【請求項１７】
前記構築物が投与され、蛍光が大及び小腸を含む腸；動脈及び静脈；肺を含む呼吸系；
脳内カテーテルによるような脳；又は子宮及び卵管を含む生殖系において行われることを
特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が炎症反応に関連する細胞を検出するため肺において行われることを特徴とす
る、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
検出される前記１つ又は複数の細胞が活性化好中球であることを特徴とする、請求項１
７又は１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞により取り込まれ、よって共焦点蛍光マイクロ内視鏡又は他の光検出器
によるその後の可視化を可能にするデンドリマー染料分子又は多分岐染料分子のような染
料を用い、排他的にではないがとくにｉｎ  ｖｉｖｏで細胞を可視化する方法に関する。
共焦点蛍光マイクロ内視鏡により、排他的にではないがとくにｉｎ  ｖｉｖｏで細胞を可
視化するのに用いられる内部消光されたプローブ、並びに共焦点蛍光マイクロ内視鏡と組
み合わせた内部消光されたプローブの、細胞によるプローブの取り込み及び脱消光によっ
て細胞を可視化するための使用も提供される。特定の実施形態では、細胞は、被験者の肺
内にあるような、活性化好中球である。
【背景技術】
【０００２】
好中球優位肺炎症は罹患及び死亡の主な原因である１１。しかし数十年の調査にもかか
わらず、集中治療中の好中球優位肺傷害を有する患者の正確な層別化は、急性好中球性炎
症を確実に且つ迅速に区別することができる臨床での治療診断の欠如により妨げられてい
る２。臨床診断を行うことができれば、更なる好中球特異的な介入のため、こうした患者
を正確に層別化できる可能性がある。過剰な好中球活性はマトリックス及び細胞受容体を
分解し、前線維形成性媒介物を活性化し、上皮及び内皮細胞損傷に寄与する３、４、５。
急性肺傷害、虚血再潅流傷害６、７、嚢胞性線維症８及び慢性閉塞性肺疾患９のようない
くつかの疾患における好中球の関与により、それらは調節の重要な標的となる。
【０００３】
ヒトの肺炎症における好中球性炎症のｉｎ  ｓｉｔｕ  ｉｎ  ｖｉｖｏ検出はＦＤＧ  
ＰＥＴ撮像、ＰＥＴ撮像に依存してきた１０が、鋭敏な感受性を提供することは厄介であ
り、費用がかかり、臨床分子撮像モダリティとして実施することが困難である。反対に、
プローブ型共焦点レーザー内視鏡のような共焦点内視鏡の出現は、前臨床及び臨床アリー
ナの両方において肺胞腔を直接可視化する能力を大きく変えた。しかしながら、まだこの
モダリティは、肺胞腔内の自家蛍光構造体を撮像するため、又は非特異的な蛍光染料を用
いてしか用いられていない１１、１２。
【０００４】
活性化好中球活性の光検出は、動物の全身における酵素活性の撮像を実行可能である１
３。これらのアプローチは内部消光された分子標識を有する基質特異性を必要とする。多
くの場合、脱消光は時間がかかり得、基質は非好中球プロテアーゼにより開裂され得る。
【０００５】
デンドリマーは十分に定義された構造及び分子組成を有する高分子の１つのクラスであ
る１４、１５。
【０００６】
それらは、世代と称される繰り返し単位層におけるモノマー単位の段階的結合により形
成され、中核上に構築される分岐を形成する。これらの分岐は、必要に応じて更なるデン
ドリマー成長若しくは修飾、又は特定の化合物の結合に用いることができる特定の化学官
能基において終端する。
【０００７】
国際特許公開第ＷＯ２００３０１４７４３号は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ蛍光アッセイシステ
ムにおける信号を向上するための、デンドリマー及び多分岐分子の使用について記載する
１６。
【０００８】
国際特許公開第ＷＯ２００３０１４７４３号に開示される分子は、適当な化学物質又は
酵素で処理される場合、分子内の選択的結合の開裂及びその後の分子の蛍光特性の変化、
もっとも顕著には蛍光の増加をもたらす開裂部位を含む。しかしながら、国際特許公開第
ＷＯ２００３０１４７４３号はｉｎ  ｖｉｔｒｏデータの結果のみを示し、どのように分
子をｉｎ  ｖｉｖｏ環境において用いることができるか、又は実際これが可能であるかの
示唆又は教示はない。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の目的は、前述の不利点の少なくとも１つを除去及び／又は軽減することである
。
【００１０】
本発明の目的は、共焦点マイクロ内視鏡を用い、被験者の肺内の活性化好中球のような
細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで可視化する手段を提供することである。
【００１１】
第一態様では、細胞取り込み前は実質的に検出可能な、又は少量しか、蛍光を示さない
が、細胞取り込み後は細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで撮像するのに用いられる共焦点内視鏡を用
いて検出可能な蛍光の増加を示す、染料構築物が提供される。
【００１２】
染料構築物は、国際特許公開第ＷＯ／２００３／０１４７４３号に開示されるような、
蛍光染料に結合した表面基を有する多分岐分子、又は本明細書に更に記載されるような分
子であってもよい。
【００１３】
「蛍光の検出可能な増加」は、共焦点マイクロ内視鏡技術により検出することができる
蛍光に関すると理解される。染料構築物が初期に低いが検出可能なレベルの蛍光を示す場
合、１つ又は複数の細胞による取り込み後、検出可能な増加を観察することができる。初
めに、本発明において用いられる染料構築物は内部消光される。すなわち、染料構築物は
、蛍光基が消光されるため、全く又は十分には蛍光しない。しかしながら、細胞による取
り込み後、脱消光が起こり、蛍光の増加を検出することができる。
【００１４】
一般的には蛍光検出は蛍光強度に関すると理解され、蛍光寿命及び極性化も検出するこ
とができる。一般的には「低又は少量の蛍光」は共焦点マイクロ内視鏡技術を用いて実際
に検出可能ではなく、又は蛍光の「増加」の明確な識別を可能にするには十分に低い。一
般的には、適切な増加は１．２倍以上の増加であると理解される。
【００１５】
本発明者らは、共焦点内視鏡可視化技術をデンドリマー染料分子又は多分岐分子結合蛍
光染料の局所投与と組み合わせることにより、明らかな蛍光の増加を有する、本発明の染
料構築物又は多分岐分子結合蛍光染料を取り込む特定の細胞を、蛍光によりｉｎ  ｖｉｖ
ｏで観察することが可能であることを見出した。理論に縛られることを望むことなく、本
発明の染料構築物／多分岐染料分子は、細胞内メカニズムが構築物に作用し、蛍光の増加
を引き起こす前に、細胞により取り込まれる、又は吸収されると考えられる。
【００１６】
本発明者らは、本明細書に記載される染料構築物／多分岐分子の使用によって、こうし
た分子は特定の細胞により数秒又は数分以内に取り込まれ得ることを見出した。しかしな
がら、時間とともに多くの異なる細胞型は本明細書に記載される染料構築物／多分岐分子
を取り込むことができ、そのようなものとして、本明細書に記載される染料構築物／多分
岐分子を急速に取り込む所望の細胞を観察するため、蛍光の検出は染料構築物の投与の数
分以内―一般的には数秒〜数分、例えば１〜３０分、一般的には１〜１０分以内に行われ
るべきである。この方法では、こうした構築物を数時間以内のようなかなり長い時間をか
けて取り込まれ得る細胞は検出されず、よって染料構築物を急速に取り込む細胞は他の細
胞から容易に識別可能である。診断手順ができるだけ短時間で行われるので、これは患者
にとっても有益である。更に、内視鏡が取り出されると、染料構築物の投与の部位を再度
見つけることは困難であり得る。
【００１７】
共焦点内視鏡又はマイクロ内視鏡はリアルタイムのｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト及び動物撮
像を可能にする。装置はカスタムビルトの蛍光スリット走査共焦点顕微鏡を光ファイバー
カテーテルに組み合わせる。更なる教示は、当業者に読むことを薦め、その内容を本明細
書に参照により組み入れる、Ｔｈｉｂｅｒｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ１７及び国際特許公開
第ＷＯ２００８０２０１３０号に見ることができる。
【００１８】
更なる態様では、共焦点マイクロ内視鏡を用いて細胞の混合物内の特定の１つ又は複数
の細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで可視化する方法であって、染料構築物又は多分岐分子結合蛍光
染料を該細胞の混合物に加えるステップ、及び該染料構築物又は多分岐分子結合蛍光染料
を取り込んだ１つ又は複数の細胞を、共焦点マイクロ内視鏡を用いて該１つ又は複数の細
胞からの蛍光を観察することにより、観察するステップを含む、方法が提供される。便利
なことに、染料構築物又は多分岐分子結合蛍光染料は本明細書に記載される構築物の１つ
であってもよい。
【００１９】
一般的には、染料構築物又は多分岐分子結合蛍光染料を取り込むことにより検出するこ
とができる細胞は、活性化好中球である。脱顆粒及びプロテアーゼ放出により特徴づけら
れる活性化好中球は、炎症の部位で見ることができ、従って肺内、消化管内、生殖管内又
はその他の内視鏡でアクセス可能な開口部のような被験者の体内のさまざまな場所で共焦
点内視鏡技術を用いて検出することができる。
【００２０】
好適な実施形態では、活性化好中球は被験者の肺において検出される。一般的には、被
験者は、こうした活性化好中球の早期検出が望ましい、集中治療中の患者のような、すで
に入院している被験者であってもよい。
【００２１】
染料構築物又は多分岐分子結合蛍光染料は、適当な化学又は酵素手段により開裂可能な
１つ以上の開裂部位を含む、例えば、国際特許公開第ＷＯ／２００３／０１４７４３号（
当業者に読むことを勧め、その全内容を本明細書に参照により組み入れる）に記載される
形態であってもよい。好適な分子は、３つ以上、一般的には６つ以上の分岐を含み、蛍光
部分の脱消光後、蛍光の顕著な増加を観察することができる。
【００２２】
国際特許公開第ＷＯ２００３／０１４７４３号に記載される分子に加えて、本発明の好
適な多分岐分子は以下のような一般化構造：
【化１】
2019014727.tif 000002
を有し、式中、ＲはＮＨ２、ＣＯＮＨ２、ＮＨ２ＣＯＮＨ−、アミノ酸、ＯＨ、アミノ酸
−ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨ２−アミノ酸、アルキルアミノ、アルコキシアミノ、尿素、チオ
ール、カルボン酸、又は他の蛍光部分と同じ又は異なり得る更なる蛍光体部分から選択さ
れる。すべてのこうした基は分岐点に直接結合することができる、又はＰＥＧ基、アルキ
ル若しくはアルケニル鎖、例えばＣ１〜Ｃ１０アルキル若しくはアルケニルであり得るス
ペーサーにより分岐点から分離することができる。他の結合基については、国際特許公開
第ＷＯ２００３／０１４７４３号及び参考文献１４に記載される。
【００２３】
上記一般化構造は、本発明において用いるのに適切であり得るプローブを模式的に示す
。ペプチド及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の使用はデンドリマー／分
岐分子の可溶性を向上することを意図している。存在する場合、ペプチド配列は酵素若し
くは化学開裂認識配列を含み得る、又はランダムであり得る、すなわち認識可能な酵素若
しくは化学開裂認識配列を含まない。ペプチド及び／又はＰＥＧ部分の代替として、当技
術分野において知られるいずれかの適切な可溶化基を用いることができる。理論に縛られ
ることを望むことなく、ランダムペプチド配列が用いられる場合、ぺプチド配列は、検出
する細胞中に存在する酵素により開裂されるとは考えられない。よって、ランダムペプチ
ド配列を含む本発明の分子の取り込み後に観察される蛍光の増加は、以前の教示とは反対
に、ペプチド部分の開裂及び以前消光された蛍光部分の放出のためであるとは考えられな
い。
【００２４】
酵素開裂可能配列が用いられる場合、ペプチド配列は、細胞の外に存在し得る酵素によ
り開裂することができ、これにより低量の蛍光を観察することができる。しかしながら、
更に大きな観察可能な蛍光の増加は分子／プローブの取り込み後に観察される。このよう
に、脱消光剤部分の蛍光部分及び他の細胞メカニズムからの分離により、蛍光の顕著な増
加が観察される。よって、細胞の外である程度の蛍光を観察することができる実施形態で
は、構築物が取り込まれる場合、検出可能な（例えば、細胞の外で観察されるいずれかの
蛍光と比較して１．２倍より大きい）増加が観察されることが理解されるべきである。あ
るレベルの蛍光がいずれかの細胞の外で観察されることにより細胞を識別することが一般
的には可能であるが、構築物が取り込まれ、蛍光の増加が観察されると、所望の細胞はよ
り容易に識別することができるので、これは実際に利点であり得る。
【００２５】
本発明のとくに好適な分子は、以下の構造：
【化２】
2019014727.tif 000003
2019014727.tif 000004
2019014727.tif 000005
2019014727.tif 000006
、または
2019014727.tif 000007
の１つから選択される。
【００２６】
（ＡＡ）ｎＰＥＧは存在するペプチド及び／又はＰＥＧ部分として理解されるべきであ
る。すなわち一方若しくは他方又は両方である。実際、２つ以上のＰＥＧが存在し得る。
上記分子は、＊Ｆで示される、複数の蛍光消光部分を含む。１つのこうした蛍光部分はＦ
ＡＭであるが、ローダミン、シアニン染料及びＢＯＤＩＰＹ染料のような、多くの他の蛍
光部分を用いることができるので、本発明の分子はＦＡＭの使用に限定されないことが理
解されるべきである。Ｑ＊は、ＤＡＢＣＹＬ、メチルレッド、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２及びＢ
ＨＱ３のような暗消光剤部分である。
【００２７】
本発明の分子は、上記構造において（ＡＡ）ｎと表されるペプチド結合を含むことがで
きるが、式中、ＡＡはいずれかのアミノ酸を意味し、ｎはゼロであり得、又は１〜３０の
正の整数、例えば１〜２０、若しくは１〜１５である。こうしたペプチド配列は従ってラ
ンダム配列であり得、ペプチド又はタンパク質内に含有される既知の配列に一致する。酵
素好中球エラスターゼにより認識される配列としては、Ａ−Ａ−Ｐ−Ｖ、Ａ−Ａ−Ａ−Ｐ
−Ｖ−Ｋ、Ｅ−Ｅ−Ｉ−Ｎｌｅ−Ｒ−Ｒが挙げられる。多くの他のペプチド配列は当業者
に知られ、本発明のプローブにおいて用いることができ、例としてはＧ−Ｐ−Ｋ−Ｇ−Ｌ
−Ｋ−Ｇ（ＭＭＰ−９）、Ｖ−Ａ−Ｄ−Ｃ−Ａ−Ｄ−Ｙ（プロテイナーゼ３）、Ａ−Ａ−
Ｐ−Ｆ、又はＦ−Ｖ−Ｔ−Ｇｎｆ−Ｓ−Ｗが挙げられ、式中、Ｇｎｆ＝非タンパク質原性
４−グアニジン−Ｉ−フェニルアラニン）（カテプシンＧ）及びＤ−Ｃ−Ｖ−Ｄ（カスパ
ーゼ）である。更なる態様では、本発明は、活性化好中球のような細胞をｉｎ  ｖｉｖｏ
で可視化するのに用いられる、上述したような新規染料構築物を提供する。後述するよう
なこうした分子の調製方法も提供される。
【００２８】
本発明の分子及び実際に国際特許公開第ＷＯ／２００３／０１４７４３号に記載される
分子はまず消光される、すなわち、適当な励起後に蛍光部分から検出することができる蛍
光に関して、それらは少ししか、又は全く蛍光を示さない。しかしながら、検出する１つ
又は複数の細胞による分子の取り込み後、分子の脱消光が起こり、適切な波長の光を用い
る励起後、蛍光信号の増加を検出することができる１８。
【００２９】
また、本発明者らは、認識可能に開裂可能なペプチド配列を有さない本発明の特定の分
子がそれにもかかわらず活性化好中球のような特定の細胞により取り込まれ、脱消光、す
なわち蛍光の増加を観察することができることを見出した。理論により縛られることを望
むことなく、プローブは内部消光効率に直接作用する酸性化空胞構造中に取り込むことが
できると考えられる。
【００３０】
よって、例えば、国際特許公開第ＷＯ２００３０１４７４３号により記載されるものと
は異なる方法で、本発明の分子は、細胞及びとくに活性化好中球を可視化するため、認識
可能な酵素開裂可能なペプチド配列を有さなければならないとは限らない。
【００３１】
本発明者らは、共焦点内視鏡によって、細胞をｉｎ  ｓｉｔｕ  ｉｎ  ｖｉｖｏで可視
化することができる。そのようなものとして、「ｉｎ  ｖｉｖｏ」の語は生体内の細胞に
関すると理解され、よって体から抽出又は切除された組織試料から得られる細胞を可視化
することとは区別されるべきである。本方法は、マイクロ内視鏡カテーテルを挿入するこ
とができるいずれの臓器上又は内で行うこともできる。これは、例えば、大及び小腸を含
む腸；動脈及び静脈；肺を含む呼吸系；脳内カテーテルによるような脳；並びに子宮及び
卵管を含む生殖系であってもよい。
【００３２】
とくに好適な実施形態では、本発明の方法は、肺における、例えば肺胞腔における細胞
を可視化しながら行うことができる。
【００３３】
本発明者らは、本明細書において記載される染料構築物／多分岐分子の使用によって、
こうした分子は活性化好中球により取り込まれ得ることを見出した。活性化好中球による
こうした取り込みは非常に急速に、数秒又は数分以内に行われ、こうしたものとして活性
化好中球は、本発明の分子の被検者の検査部位、例えば肺内での投与後１〜３０分、一般
的には１〜１０分以内に可視化することができる。上記のように、本明細書に記載される
ような検出の方法は一般的には、本発明の分子を急速に取り込む、又は吸収する活性化好
中球のような細胞のみが検出されるように、まず消光された分子の局所投与後、短時間以
内に、一般的には投与の数分以内に行われるべきである。他の細胞型も分子を取り込むこ
とができるが、かなり長時間かかる。よって、本発明の技術に従って、混合細胞集団中の
活性化好中球を急速に検出することが可能である。とくに好適な実施形態では、被験者の
肺胞腔中のような肺内の活性化好中球を検出することが可能である。
【００３４】
更に、蛍光部分の脱消光後の感度及び蛍光の増加のため、投与された５０μｇ又は１０
μｇ以下のような微量（一般的には１００μｇ未満）の染料構築物のみから蛍光を検出す
ることが可能である。これはいずれかの外因性分子を投与する場合、多量の使用及び毒性
に関する特定の考えられる規制問題の観点からとくに有益であるが、本発明の分子は実際
いずれの例でも顕著に非毒性であり得る。こうした低微量の分子が、投与される場合、マ
イクロ内視鏡技術を用いて検出可能な信号を誘発することができることは、実際とくに驚
くべきことである。
【００３５】
よって、更なる実施形態では、本発明は、共焦点マイクロ内視鏡を用い、細胞の混合物
内の特定の１つ又は複数の細胞（例えば活性化好中球）をｉｎ  ｖｉｖｏで可視化する方
法であって、微量（すなわち、１００μｇ未満、５０μｇ、又は１０μｇ未満）の染料構
築物又は多分岐分子結合蛍光染料を該細胞の混合物に加えるステップ、及び共焦点マイク
ロ内視鏡を用いて該１つ又は複数の細胞から蛍光を観察することにより、デンドリマー染
料分子又は多分岐分子結合蛍光染料を取り込んだ１つ又は複数の細胞を観察するステップ
を含む、方法を提供する。
【００３６】
本発明は、１００μｇ未満、５０μｇ、又は１０μｇ未満の量の本発明のデンドリマー
染料分子又は多分岐分子結合蛍光染料の、共焦点内視鏡を用いて細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで
可視化するための使用も提供する。
【００３７】
１つ又は複数の細胞が共焦点内視鏡により可視化され得るように、被験者への投与のた
めの、微量（すなわち、１００μｇ未満、５０μｇ、又は１０μｇ未満）の本発明の染料
構築物又は多分岐分子結合蛍光染料を含むカテーテル又は他の適切な投与装置も提供され
る。
【００３８】
本発明の１つの潜在的な利点は、酸素又は空気の投与に関して呼吸サポートを受けてい
る、並びにそのようなものとしてその口及び／若しくは鼻を覆うフェイスマスクを有し得
る、又は挿管されている被験者に対して行うことができることである。こうした状況でも
、共焦点マイクロ内視鏡カテーテルを、鼻経路を通して又は気管内チューブによって肺中
に挿入することが可能である。このように、本発明は、被験者を必ずしも過度に動かす必
要なく、真に臨床で行うことができる。更に、こうした被験者のため、炎症反応の重要な
マーカーであるいずれかの活性化好中球を検出する能力は非常に重要であり、そのような
ものとして本発明は、別の場所に動かすことが望ましくない、及び／又は問題となる場合
もあり得る、こうした重篤患者にとくに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
本発明について、例として、及び以下の図面を参照して、ここで更に記載する。
【図１】一次ヒト細胞によるＦＡＭ吸収のリアルタイムのタイムラプス共焦点撮像を示す。Ａ）新しく単離されたヒト好中球（ＰＭＮ）の１０μＭのＡ２３１８７（カルシウムイオノフォア）での活性化は点状の細胞関連蛍光の急速な出現をもたらす（刺激後１５分で撮像）；Ｂ）このＦＡＭの吸収はダイナミン阻害剤ダイナソール（Ｄｙｎａｓｏｒｅ）での予備処理により妨げられる；Ｃ）細胞特異性：ＰＭＮ（白矢印）、単球（白抜き矢印）、及びリンパ球（矢頭）。活性化ＰＭＮのみがＦＡＭを取り込む。細胞はＳｙｔｏ−８５核染料（赤）により描写される。
【図２】いくつかのデンドリマーの構造を示す。
【図３】新しく単離された好中球の１０μＭのＡ２３１８７（カルシウムイオノフォア）での活性化が点状の細胞関連蛍光の急速な出現をもたらし、これはデキストラン６４７とは共存するが、ダイナソールでの処理により阻害され、液相ＩＱＲ１吸収を示すことを示す。
【図４】本発明による好適な分子の構造を示す。（ＡＡ）ｎはＬ又はＤであってもよい。
【図５】ヒト細胞特異性を示す：活性化ＰＭＮ（白矢印）、単球（白抜き矢印）及びリンパ球（矢頭）。ＰＭＮのみがＩＱＲ１．２を活性化する。細胞はＳｙｔｏ−８５核染料（赤）により描写される；スケールバー：１０μｍ。
【図６】炎症性肺疾患を有する患者から単離された気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）における細胞特異性：ＰＭＮ（白矢印）、肺胞マクロファージ（白抜き矢印）を示す。活性化ＰＭＮのみがＩＱＲ１．２を活性化する。細胞はＳｙｔｏ−８５核染料（赤）により描写される；スケールバー：１０μｍ。
【図７】上皮細胞に対する細胞特異性を示す：活性化ＰＭＮ（ＤｉＤで染色）をヒト肺胞上皮細胞上に配置し（位相画像上で解像）、２４時間連続して撮像した。上皮細胞はＩＱＲ１．２により検出される吸収を２４時間示さなかった；スケールバー：１０μｍ。
【図８】大腸菌リポ多糖を１日前に受容したマウスのＢＡＬから回収された細胞を示す。好中球（白矢印全矢印）及びマクロファージ（白矢印白抜き矢印）の混合細胞浸潤物を得た。ベースライン及びＩＱＲ１．２プローブの存在下で１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡを用いる活性化後１５分での細胞のリアルタイム共焦点撮像。活性化は観察されなかった。画像はｎ＝グループ当たり３動物から２つの実験で得られたデータを表す。スケールバー：１０μｍ。
【図９】点状の細胞関連蛍光の出現をもたらさない、新しく単離されたヒト好中球の非デンドリマー系ＦＲＥＴプローブの存在下での１０μのＡ２３１８７（カルシウムイオノフォア）を用いる活性化を示す。
【図１０】一次ヒト好中球におけるプローブのリアルタイムのタイムラプス共焦点撮像を示す。Ａ）新しく単離されたヒト好中球の１０μＭのＡ２３１８７（カルシウムイオノフォア）での活性化は、ＩＱＲ１．２の点状の細胞関連蛍光の急速な出現（刺激後１５分で撮像）をもたらす。スケールバー：１０μｍ。Ｂ）活性化前のベースラインの割合としての時間に対する好中球当たりの平均蛍光強度の定量化。データは視野当たり平均２０個の好中球を有する高倍率視野上での３つのドナーからの５つの実験を表す。データは平均及び平均の標準誤差である。Ｃ）ＩＱＲ１．２及びデキストラン６４７のこの吸収は、ダイナミン阻害剤ダイナソールでの予備処理により妨げられる。
【図１１】プローブのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ毒性の欠如を示す。Ａ）ＨｅＬａ細胞を１００μＭのプローブＩＱＲ１．３及びＩＱＲ２．３又は１ｍＭのスタウロスポリンで２４時間処理した。細胞生存性をその後、細胞におけるＡＴＰ生成を測定するプロメガのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ生物発光キットを用いて評価した。プローブは対照と比較して毒性を示さなかった；Ｂ）高用量のＩＱＲ２．３、２００μＭの５０μｌを２５ｇのマウスに気管内注射した。動物を４８時間及び１４日後に屠殺した。マウスの体重を週に２回モニターした。対照マウスと比較して、プローブ注射後に体重の減少は見られなかった。ＢＡＬを屠殺後マウスから回収し、ＢＡＬの細胞計数（Ｃ）及びサイトスピンを行った（Ｄ）。ＢＡＬにおいて総細胞数に差は見られず、好中球の浸潤はＩＱＲ２．３の滴下後４８時間又は１４日では明らかでなかった。（Ｅ）Ｈ＆Ｅ染色での肺の組織学的分析は肺毒性を示さなかった。
【図１２】１．５ｍｌのマイクロチューブにおいて活性化された後、異なるＩＱＲに１５分間曝露され、Ｃｅｌｌｖｉｚｉｏ（登録商標）４８８ｎｍ光ファイバー共焦点システムを用いて撮像された、新しく単離されたヒト好中球を示す。その後細胞を遠心沈殿させ、プローブを培地から取り出した。洗浄前、ＦＡＭ、ＩＱＲ１．３及びＩＱＲ２．３の間には明らかな背景の違いがある。活性化細胞をＦＡＭ単独で解像することはできない。洗浄後、活性化細胞は３つのチューブすべてにおいて可視的であるが、消光の増加とともに信号雑音比が増加する。
【図１３】人工呼吸を受けるヒツジモデルを示す。（Ａ）ヒツジの肺の深くにある活性化細胞を識別するという概念の証拠を示す。（Ｂ）新しく単離されたヒト好中球（Ｃ）、プローブ単独（ＩＱＲ２．３）、活性化単球（Ｄ）、及び活性化ヒト好中球（Ｅ）をヒツジの肺のサブセグメントに滴下した。５分後、２ｍｌのＩＱＲ２．３（５μｇの最終濃度）をサブセグメントに滴下した。この後Ｃｅｌｌｖｉｚｉｏ（登録商標）で光ファイバー共焦点撮像を行い、画像を取得した。活性化好中球（Ｅ）を有するセグメントのみ光学的に検出可能な細胞を示した。
【図１４】エンドサイトーシス単独では作用剤の細胞由来信号にとって十分ではないことを示す。ヒト血液単球由来マクロファージ（１０％自家血清で７日培養）のＩＱＲ１の存在下でのカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（１０μＭ）での活性化をレーザー走査共焦点顕微鏡により撮像する（ｔ＋５分で示す）場合、ヒト好中球において見られるような点状の細胞関連蛍光信号の出現をもたらさない。しかしながら、液相エンドサイトーシスを標識するＡｌｅｘａ−６４７標識デキストランの点状の吸収は依然として見られる（白矢印）。スケールバー：１０μｍ。
【図１５】Ａ）ＩＱＲ１．２が、プローブ型共焦点レーザーマイクロ内視鏡（ｐＣＬＥ：Ｃｅｌｌｖｉｚｉｏ、ａｌｖｅｏｆｌｅｘ；４８８ｎｍ励起）により撮像された、ヒト全血で潅流された、人工呼吸を受けるｅｘ  ｖｉｖｏヒツジ肺（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ，２００９参照）における細菌性リポ多糖（ＬＰＳ；１００μｇ）による循環から得られるヒト好中球を検出する；及びＢ）ＩＱＲ１．２が予めＬＰＳを滴下していない同じ肺の対照セグメントに送達される場合、信号は検出されないことを示す。
【図１６】Ａ）組換えヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ；１１．２μｇ／ｍｌ）でのインキュベーションからもたらされるＩＱＲ４脱消光の時間経過が、蛍光プレートリーダーを用いて測定された。ＨＮＥでのインキュベーションが、ＨＮＥ阻害剤、シベレスタット（５０μＭ）の存在により阻害されるプローブＩＱＲ４からの蛍光の急速な増加をもたらす；及びＢ）ヒト好中球ライセート（１×１０−７／ｍｌ）でのインキュベーションが、シベレスタット（５０μＭ）の存在により阻害されるプローブＩＱＲ４蛍光の急速な増加もたらすことを示す。
【図１７】Ａ）新しく単離されたヒト好中球のカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（１０μＭ）での活性化が、レーザー走査共焦点顕微鏡により撮像される（ｔ＋１５分で示される）場合、プローブＩＱＲ４からの点状の細胞関連蛍光信号の急速な出現をもたらす；スケールバー：１０μｍ；及びＢ）シベレスタット（５０μＭ）での予備処理（１０分）が、好中球がＡ２３１８７で活性化される（ｔ＋１５分で示される）場合、プローブＩＱＲ４からのこの点状の細胞関連蛍光の出現を阻害する；スケールバー：１０μｍ；ことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
材料と方法
一般的情報
市販の試薬を更なる精製なく用いた。ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ  ＡＣスペクト
ロメーターを使用し、１Ｈについて２５０、３６０、５００ＭＨｚで操作して記録した。
化学シフトをｐｐｍ単位でδスケールにて記録し、残留した非重水素化溶媒の共鳴を参照
した。カラムクロマトグラフィーによる順相精製をシリカゲル６０（２３０〜４００メッ
シュ）により行った。分析用逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を、Ｄ
ｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ１８逆相カラム（５ｃｍ×４．６ｍｍ、５μｍ）を備えたＨＰ１１
００システムにより、流速１ｍｌ／分で、６分にわたりＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ／ＨＣＯＯＨ（
９５／５／０．０５）〜Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨ／ＨＣＯＯＨ（５／９５／０．０５）で、９５
％ＭｅＯＨで４分間保持して溶出することにより行い、２５４及び４９５ｎｍで、並びに
蒸発光錯乱により検出した。半分取ＲＰ−ＨＰＬＣを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｐｒｏｄ
ｉｇｙ  Ｃ１８逆相カラム（２５０×１０ｍｍ、５μｍ）を備えたＨＰ１１００システム
により、流速２．５ｍｌ／分で、１８分にわたり５〜９５％の勾配のＨ２Ｏ中の０．１％
ＨＣＯＯＨ（Ａ）及びＣＨ３ＣＮ中の０．１％ＨＣＯＯＨ（Ｂ）で、初期の均一濃度時間
を５分間として溶出することにより、行った。エレクトロスプレーイオン化質量分析（Ｅ
ＳＩ−ＭＳ）をＥＳＩモードのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＬＣ／ＭＳ
Ｄシリーズ１１００四重極質量分析計（ＱＭＳ）により行った。ＭＡＬＤＩスペクトルを
、０．１％ＴＦＡを添加した水中の５０％ＭｅＣＮ中のシナピン酸のマトリックス溶液（
１０ｍｇ／ｍｌ）を用いて、Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ（商標）ＳＴＲ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
ＭＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、得た。
【００４１】
（６）モノマーの合成
モノマー６をスキーム１に示されるように６つのステップ１９で合成した。すなわち、
アクリロニトリルへの、１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）アミノ−メタンのヒド
ロキシ基の１，４−付加、それに続くアミノ保護（Ｂｏｃ）、及びボラン−ＴＨＦ複合体
を用いたニトリル基の還元により、３を得た。これを、Ｄｄｅ−ＯＨにより処理し、トリ
ス−Ｄｄｅ（２−アセチル−ジメドン）で保護されたアミン４を得た。Ｂｏｃ保護基を除
去した後、Ｋｎｏｌｋｅｒ２０の手法に従ってイソシアネート６を調製した。
【化３】
2019014727.tif 000008
スキーム１：モノマー（６）の合成
【００４２】
３−［２−アミノ−３−（２−シアノ−エトキシ）−２−（２−シアノ−エトキシメチル
）−プロポキシ］プロピオニトリル（１）
【化４】
2019014727.tif 000009
ＴＨＦ（１００ｍｌ）中のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（６．０ｇ、４９
ｍｍｏｌ）の溶液に、４０％ＫＯＨ水溶液（２ｍｌ）及びアクリロニトリル（１２．９ｍ
ｌ、２００ｍｍｏｌ）を順番に加え、得られた溶液を終夜攪拌した。溶媒を真空下で除去
し、水（１００ｍｌ）を残渣に加えた。水層をジクロロメタン（３×１００ｍｌ）で抽出
し、有機層をＮａ２ＳＯ４により乾燥させた。有機溶媒を真空下で蒸発させ、生成物（１
０．７ｇの油、７３％）を更なる精製なく次のステップで用いた；１Ｈ−ＮＭＲ（５００
ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：５．３（ｓ，２Ｈ，ＮＨ２），３．７（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，６Ｈ
，ＯＣＨ２），３．４（ｓ，６Ｈ，ＣＨ２Ｏ），２．６（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ２
ＣＮ）；ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ：２８１［（Ｍ＋１）＋，１００］，３０３［（Ｍ＋Ｎａ）
＋，２０］。これらのデータは文献１９とよく一致している。
【００４３】
［２−（２−シアノ−エトキシ）−１，１−ビス−（２−シアノ−エトキシメチル）−エ
チル］−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２）
【化５】
2019014727.tif 000010
攪拌したＴＨＦ（１００ｍｌ）中のアミン（１）（１０．７ｇ、３８ｍｍｏｌ）の溶液
に、ＴＨＦ（３０ｍｌ）中の二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１２．４ｇ、５７ｍｍｏｌ）
の溶液を０℃で加え、続いてＤＩＥＡ（１０．０ｍｌ、５７ｍｍｏｌ）を加えた。反応物
を室温まで温め、終夜攪拌した。ＴＨＦを真空下で蒸発させ、残渣を酢酸エチル（２５０
ｍｌ）中に溶解させた。有機層を１Ｎ  ＫＨＳＯ４（１００ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ３（
１００ｍｌ）、及び塩水（１００ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４により乾燥させ、溶媒を
蒸発させて、油として化合物（２）（１４．４ｇ、１００％）を得た；１Ｈ−ＮＭＲ（５
００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：４．９（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），３．８（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，６
Ｈ，ＯＣＨ３，３．７（ｓ，６Ｈ，ＣＨ２Ｏ），２．６（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ２
ＣＮ），１．４（ｓ，９Ｈ，ＣＨ３）；ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ：４０３［（Ｍ＋Ｎａ）＋，
３０］，２８１［（Ｍ−Ｂｏｃ）＋，１００］。これらのデータは文献１９とよく一致し
ている。
【００４４】
［２−（３−アミノ−プロポキシ）−１，１−ビス−（３−アミノ−プロポキシメチル）
−エチル］−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（３）
【化６】
2019014727.tif 000011
攪拌した乾燥ＴＨＦ（５０ｍｌ）中のトリス−ニトリル（２）（４．５ｇ、１２ｍｍｏ
）の溶液に、ＢＨ３・ＴＨＦ複合体（ＴＨＦ中の１Ｍ溶液、７２ｍｍｏｌ、７２ｍｌ）を
滴下し、得られた混合物を５５℃で５時間攪拌した。冷却後、２Ｍ  ＨＣｌを加えて見か
けのｐＨを１〜２とした。混合物をＮａＯＨ（１Ｍ水溶液）で中和し、溶媒を真空下で除
去した。粗生成物を精製なく次のステップに用いた。
【００４５】
［２−｛３−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル
アミノ］プロポキシ｝−１，１−ビス−｛３−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオ
キソシクロヘキシリデン）エチルアミノ］プロポキシメチル｝−エチル］−カルバミン酸
ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４）
【化７】
2019014727.tif 000012
粗生成物（３）（４．５ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）をメタノール（７５ｍｌ）中に溶解し
、ＤＩＰＥＡ（２．４ｍｌ、１３．６８ｍｍｏｌ）を加えた。ジクロロメタン（４０ｍｌ
）中の２−アセチル−ジメドン２１（ＤｄｅＯＨ、７．３ｇ、４０．２ｍｍｏｌ）の溶液
を加え、得られた混合物を終夜攪拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣をカラムクロマト
グラフィー（ジクロロメタン／メタノール  ９／１で溶出）により精製して、無色の油と
して生成物（２．４ｇ、２３％）を得た；１Ｈ−ＮＭＲ（２５０Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：
３．８（ｓ，６Ｈ，ＣＨ２Ｏ），３．７−３．６（ｍ，１２Ｈ，ＣＨ２），２．７（ｓ，
９Ｈ，ＣＨ３），２．５（ｓ，１２Ｈ，ＣＨ２），２．１−２．０（ｍ，６Ｈ，ＣＨ２）
，１．５（ｓ，９Ｈ，ＣＨ３），１．１（ｓ，１８Ｈ，ＣＨ３）；ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ：
８８５［Ｍ＋，１００］。データは文献１９とよく一致している。
【００４６】
［２−｛３−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル
アミノ］プロポキシ｝−１，１−ビス−｛３−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオ
キソシクロヘキシリデン）エチルアミノ］プロポキシメチル｝−エチル］アミン（５）
【化８】
2019014727.tif 000013
保護されたアミン（４）（２．３ｇ、２．７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４０ｍｌ）
中の２０％ＦＴＡに溶解し、得られた混合物を２時間攪拌した。溶媒を真空下で除去し、
残渣をジクロロメタン（１５０ｍｌ）中に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（７５ｍｌ）
及び水（７５ｍｌ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を真空下で除去
した。粗生成物（２．１ｇ）を精製なく直接次のステップで用いた；１Ｈ−ＮＭＲ（３６
０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１３．１（ｂｓ，２Ｈ，ＮＨ２），３．６（ｓ，６Ｈ，ＣＨ
２Ｏ），３．６−３．５（ｍ，１２Ｈ，ＣＨ２），２．５（ｓ，９Ｈ，ＣＨ３），２．３
（ｓ，１２Ｈ，ＣＨ２），１．９−１．８（ｍ，６Ｈ，ＣＨ２），０．９（ｓ，１８Ｈ，
ＣＨ３）；ＭＳ（ＢＳ）  ｍ／ｚ：７８５［Ｍ＋，１００］，７８６［（Ｍ＋１）＋，４
５］，７８７［（Ｍ＋２）＋，１０］；ＨＰＬＣ  ｔＲ＝３．７５分。データは文献１９
とよく一致している。
【００４７】
［２−｛３−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル
アミノ］プロポキシ｝−１，１−ビス−｛３−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオ
キソシクロヘキシリデン）エチルアミノ］プロポキシメチル｝−エチル］イソシアネート
（６）
【化９】
2019014727.tif 000014
乾燥ＤＣＭ（１０ｍｌ）中のＢｏｃ２Ｏ（０．８２ｇ、３．４ｍｍｏｌ）の溶液を乾燥
ＤＣＭ（２０ｍｌ）中のアミン５（２．１ｇ、２．７ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．３６
ｇ、２．９７ｍｍｏｌ）の混合物に滴下して加え、反応混合物を１時間攪拌した。溶媒を
真空下で除去して６（２．０ｇ、９１％）を得た。イソシアネート６は直ちに使用した。
１Ｈ−ＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：３．６−３．４（ｍ，１８Ｈ，ＣＨ２）
，２．５（ｓ，９Ｈ，ＣＨ３），２．３（ｓ，１２Ｈ，ＣＨ２），１．９−１．８（ｍ，
６Ｈ，ＣＨ２），０．９（ｓ，１８Ｈ，ＣＨ３）；ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ：８１１［Ｍ＋，
１００］；ＩＲ（ニート）ｖ（ｃｍ−１）：２９５３，２８６７，２２４４，１６３７，
１５６９，１４６１，１３３２，１１０７，８０６，７２０。データは文献１とよく一致
している。
【００４８】
モノマー（１２）の合成
６分岐デンドリマーの調製に用いられるモノマー（１２）をα−レソルシル酸を出発物
質として用いる５つのステップで合成した（スキーム２）。メタノール中の（７）のエス
テル化により安息香酸メチル（８）が得られ、その後ＤＭＦ中の炭酸カリウムの存在下で
の２−（Ｂｏｃ−アミノ）エチルブロミドを用いたアルキル化を経て、（９）を得た。後
者にその後、ＮａＯＨ／ＭｅＯＨ／ジオキサン混合液を用いることによるメチルエステル
のけん化と、それに続くＨＣｌを用いたＢｏｃ保護基の除去を行い、塩酸塩（１１）とし
てアミンを得た。その後、アミン塩をＦｍｏｃＯＳｕで選択的に保護して分岐モノマー（
１２）を得て、Ｆｍｏｃ系固体支持体において用いた。
【化１０】
2019014727.tif 000015
スキーム２：モノマー（１２）の合成
【００４９】
２−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エチルブロミド
【化１１】
2019014727.tif 000016
ジクロロメタン（１２ｍｌ）中の（２−ブロモエチル）アミン（５．０ｇ、２５ｍｍｏ
ｌ）及び二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（５．４ｇ、２５ｍｍｏｌ）の懸濁液を０℃まで冷
却し、トリエチルアミン（４ｍｌ、３．９ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。２４時間攪拌し
た後、ジクロロメタン（１５０ｍｌ）を加え、溶液を１Ｍ  ＫＨＳＯ４、水、及び塩水で
洗浄し、混合物を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空下で濃縮した。生成物を透明な黄色の
油（５．２２ｇ、９０％）として分離した；１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ：４．９６（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨ），３．６１−３．４３（４Ｈ，ｍ，ＢｒＣＨ２，Ｃ
Ｈ２ＮＨ），１．４８（９Ｈ，ｓ，Ｃ（ＣＨ３）３）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，
ＣＤＣｌ３）  δ：１５５．４（Ｃ＝Ｏ），７９．６（Ｃ），４２．２（ＣＨ２），３２
．４（ＣＨ２），２８．１（ＣＨ３）。データは文献２２とよく一致している。
【００５０】
３，５−ジヒドロキシ安息香酸メチル（８）
【化１２】
2019014727.tif 000017
メタノール（１７０ｍｌ）中の３，５−ジヒドロキシ安息香酸（５．０ｇ、３２ｍｍｏ
ｌ）の溶液に触媒量の硫酸（０．３ｍｌ）を加えた。終夜還流で攪拌した後、混合物を冷
却し、４Ｍ  ＮａＯＨ（水溶液）を用いて中和した。濃縮後、残渣を酢酸エチル中に溶解
させ、水及び塩水で洗浄した。有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空下で濃縮した。
化合物２を白色の固体（５．１３ｇ、９５％）として単離した；融点１６４−１６５℃（
酢酸エチル）；１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）δ：９．６５（２Ｈ，ｓ
），６．８１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，ＣＨａｒ），６．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．
３Ｈｚ，ＣＨａｒ），３．７８（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，
ｄ６−ＤＭＳＯ）  δ：１６６．２（Ｃ＝Ｏ），１５８．４（Ｃ×２），１３１．２（Ｃ
），１０７．１（ＣＨ），１０７．０（ＣＨ×２），５１．９（ＣＨ３）；ＭＳ（ＥＳ）
−ｍ／ｚ：１６７［Ｍ−Ｈ］−；ＨＰＬＣ  ｔＲ＝３．１１；ＩＲ（ニート）ｖ（ｃｍ−
１）：３２２９，１６８８，１６００，１４８６，１３０５，１１６１，１１０２，９９
５，７６５。データは文献２２とよく一致している。
【００５１】
３，５−［ジ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）エトキシ］安息香酸メチル（９）
【化１３】
2019014727.tif 000018
無水ジメチルホルムアミド（１１０ｍｌ）中の２−（ｂｏｃ−アミノ）エチルブロミド
（３６ｇ、１７０ｍｍｏｌ）、化合物（８）（１１．４ｇ、６８ｍｍｏｌ）、炭酸カリウ
ム（３７．３ｇ、２７０ｍｍｏｌ）の混合物を５０℃で１６時間攪拌した。混合物はＣｅ
ｌｉｔｅ（登録商標）を通して濾過し、濾液を減少させた。残渣を酢酸エチル中に溶解さ
せ、水及び塩水で洗浄し、有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空下で濃縮した。結晶
化（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により化合物（３）を白色の固体（１１．９ｇ）として得た
。残りの母液を真空下で減少させ、残留油をヘキサン中の２０％ＥｔＯＡｃを用いたシリ
カカラムクロマトグラフィーにより精製し、１３．７ｇの（９）を得た。（合計収量２５
．６ｇ、８３％）；融点９６−９８℃（ＥｔＯＡ／ヘキサン）；１Ｈ−ＮＭＲ（５００Ｍ
Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．１８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，ＣＨａｒ），６．６３（
１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，ＣＨａｒ），４．９８（２Ｈ，ｓ，ＮＨ），４．０６（４Ｈ
，ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，ＣＨ２），３．９２（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），３．６０−３．５６
（４Ｈ，ｍ，ＣＨ２），１．４７（１８Ｈ，ｓ，Ｃ（ＣＨ３）３）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１
２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１６６．５（Ｃ＝Ｏ），１５９．６（Ｃ×２），１５５．
８（Ｃ＝Ｏ），１３２．１（Ｃ），１０８．１（ＣＨ×２），１０６．４（ＣＨ），７９
．５（Ｃ），６７．５（ＣＨ２），５２．１（ＣＨ３），４０．０（ＣＨ２），２８．３
（ＣＨ３）；ＭＳ（ＥＳ）＋ｍ／ｚ：４７７［Ｍ＋Ｎａ］＋；ＨＰＬＣ  ｔＲ＝４．４６
分；ＩＲ（ニート）ｖ（ｃｍ−１）：３２８１，１７２２，１６８７，１５３７，１２７
６，１２２９，１０６６，８４１，７６６。データは文献２２とよく一致している。
【００５２】
３，５−［ジ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）エトキシ］−安息香酸（１０）
【化１４】
2019014727.tif 000019
化合物９（１．０６ｇ、２．３ｍｍｏｌ）をジオキサン／メタノール／４Ｍ  ＮａＯＨ
（ｅｑ）（１４：５：２、２０ｍｌ）中に溶解させ、５時間攪拌した。混合物のｐＨを１
Ｍ  ＫＨＳＯ４を用いて２に調節し、混合物を真空下で濃縮した。残渣をジクロロメタン
及び水中に溶解させた。有機層を水及び塩水で洗浄し、乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）。化
合物（１０）を白色の固体として分離した（９８５ｍｇ、９６％）；ｍ．ｐ．１３２−１
３４℃（ジクロロメタン）；１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ：７．２１
（２Ｈ，ｂｒｏａｄｓ，ＣＨａｒ），６．７１（１Ｈ，ｂｒｏａｄ  ｓ，ＣＨａｒ），４
．５１（２Ｈ，ｓ，ＮＨ），４．１６−４．２１（４Ｈ，ｍ，ＣＨ２），３．５８−３．
５２（４Ｈ，ｍ，ＣＨ２），１．５２（１８Ｈ，ｓ，Ｃ（ＣＨ３）３）；１３Ｃ−ＮＭＲ
（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１５９．８（Ｃ＝Ｏ），１５９．６（Ｃ×２），１５
７．３（Ｃ＝Ｏ），１５６．１（Ｃ＝Ｏ），１３１．５（Ｃ），１０８．５（ＣＨ×２）
，１０７．６（ＣＨ），７９．９（Ｃ），６７．５（ＣＨ２），６７．４（ＣＨ２），６
７．１（ＣＨ２×２），４０．１（ＣＨ２），２８．４（ＣＨ３）；ＭＳ（ＥＳ）＋ｍ／
ｚ：４６３［Ｍ＋Ｎａ］＋；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）＋ｍ／ｚ：Ｃ２１Ｈ３２Ｎ２Ｏ８［Ｍ＋
Ｈ］＋計算値４４１．２２３１，実測値４４１．２２８３；ＨＰＬＣ  ｔＲ＝４．２６分
；ＩＲ（ニート）ｖ（ｃｍ−１）：３３８９，２９８０，１７１５，１５９８，１５１８
，１１７４，１０７０，８７１，７８６。
【００５３】
３，５−（ジ−アミノエトキシ）−安息香酸塩酸塩（１１）
【化１５】
2019014727.tif 000020
安息香酸（１０）（２．２８ｇ、５．２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３０ｍｌ）中に
溶解させ、塩酸で飽和したジエチルエーテル（３０ｍｌ）を加えた。２時間攪拌した後、
混合物を真空下で濃縮した。塩酸塩（１１）を白色の固体（１．６４ｇ、定量）として得
た；融点＜２５０℃（ジクロロメタン／エーテル）；１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２
Ｏ）δ：７．２０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，ＣＨａｒ），６．８１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝
２．２Ｈｚ，ＣＨａｒ），４．２３（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，ＣＨ２），３．３８（
４Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，ＣＨ２）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ：１
７０．６（Ｃ＝Ｏ），１５８．７（Ｃ×２），１２８．０（Ｃ），１０８．６（ＣＨ×２
），１０６．５（ＣＨ），６４．２（ＣＨ２），３８．８（ＣＨ２）；ＭＳ（ＥＳ）＋ｍ
／ｚ：２４１［Ｍ＋Ｎａ］＋；ＨＲＭＳ（ＥＳ）＋ｍ／ｚ：Ｃ１１Ｈ１６Ｎ２Ｏ４［Ｍ＋
Ｈ］＋計算値２４１．１１８、実測値２４１．１２０；ＨＰＬＣ  ｔＲ＝０．７７分。
【００５４】
３，５−［ジ−（２−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ）エトキシ］−安息香
酸（１２）
【化１６】
2019014727.tif 000021
塩酸塩（１１）（７１７ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）は炭酸ナトリウム（９５０ｍｇ、９ｍ
ｍｏｌ）を含有するアセトン：水（１：１、１００ｍｌ）中に溶解させた。この溶液にア
セトン（２５ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｏｓｕ（１．５７ｇ、４．６ｍｍｏｌ）を室温で滴下
して加えた。溶液を室温で１８時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、残渣を水中に溶解さ
せ、エーテル（２×５０ｍｌ）で抽出した。水層を氷浴中で冷却し、２Ｍ  ＨＣｌでｐＨ
３まで酸性化した。得られた白色の固体（１２）を濾過し、水で洗浄し、真空下で乾燥さ
せた（１．１５ｇ、７７％）；融点１９２−１９５℃（水）；１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨ
ｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）δ:１３．０１（１Ｈ，幅広ｓ，ＯＨ），７．８７（４Ｈ，ｄ，Ｊ
＝７．５Ｈｚ，ＣＨａｒ），７．６７（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，ＣＨａｒ），７．５
１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，ＮＨ），７．３９（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，ＣＨａ
ｒ），７．２９（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，ＣＨａｒ），７．０６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２
．０Ｈｚ，ＣＨａｒ），６．９５（１Ｈ，幅広ｓ，ＣＨａｒ），４．３１（４Ｈ，ｄ，Ｊ
＝６．９Ｈｚ，２×ＣＨ２），４．２１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２×ＣＨ），４．
０１（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，ＣＨ２），３．３８−３．３５（４Ｈ，ｍ，ＣＨ２）
；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）δ：１５９．８（Ｃ＝Ｏ），１５６
．７（Ｃ＝Ｏ×２），１４４．２（Ｃ×４），１４１．２（Ｃ×４），１２８．０，１２
８．９，１２７．５，１２５．６（ＣＨ），１２０．５（ＣＨ×２），１０８．２（ＣＨ
），６７．０（ＣＨ２×２），６５．８（ＣＨ２×２），５５．１（ＣＨ２×２），４７
．２（ＣＨ×２）；ＭＳ（ＥＳ）＋ｍ／ｚ：７０７［Ｍ＋Ｎａ］＋;ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）
＋ｍ／ｚ：Ｃ４１Ｈ３６Ｎ２Ｏ８［Ｍ＋Ｈ］＋計算値６８５．２５４４、実測値６８５．
２６１６；ＨＰＬＣ  ｔＲ＝４．８１分。ＩＲ（ニート）ｖ（ｃｍ−１）：３３２０，１
６９９，１６０３，１５４３，１４４９，１２６８，１１６８，９１６，７６０。
【００５５】
樹脂結合デンドリマー足場（１４）及び（１５）の合成
樹脂結合３分岐デンドリマー足場（１４）
樹脂１３をアミノメチルＰＳ樹脂（１．６ｍｍｏｌ／ｇ、１％ＤＶＢ、１００〜２００
メッシュ）に付着させた４−［（２，４−ジメトキシフェニル）−（Ｆｍｏｃ−アミノ）
メチル］フェノキシ酢酸（Ｒｉｎｋアミドリンカー）を用いて合成した。よって、Ｆｍｏ
ｃ−Ｒｉｎｋ−アミドリンカー（２．６ｇ、４．８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１６ｍｌ）中に
溶解し、ＨＯＢｔ（０．７ｇ、４．８ｍｍｏｌ）を加えて、混合物を１０分間攪拌した。
ＤＩＣ（０．７ｍｌ、４．８ｍｍｏｌ）をその後加え、得られた混合物を更に５分間攪拌
した。溶液をアミノメチルポリスチレン樹脂（１ｇ、１．６ｍｍｏｌ／ｇ）に加え、２時
間振盪した。得られた樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍｌ）、ＤＣＭ（３×１０ｍｌ）及びＭｅ
ＯＨ（３×１０ｍｌ）で洗浄した。
【００５６】
Ｆｍｏｃ脱保護
樹脂（ＤＣＭ中で予め膨潤）に、ＤＭＦ（５ｍｌ）中の２０％ピペリジンを加え、反応
混合物を１０分間振盪した。溶液をその後排出し、樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍｌ）、ＤＣ
Ｍ（３×１０ｍｌ）及びＭｅＯＨ（３×１０ｍｌ）で洗浄した。この手順を２回繰り返し
た。
【００５７】
イソシアネートカップリング
ＤＣＭ（１０ｍｌ）中で予め膨潤させた樹脂１３（６２５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）に、
ＤＣＭ／ＤＭＦ混合物（１：１、１０ｍｌ）中の、イソシアネートモノマー６（２．７ｇ
、３．０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．５ｍｌ、３．０ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（７ｍｇ
、０．６ｍｍｏｌ）の溶液を加え、混合物を終夜振盪し、反応物を定量ニンヒドリン試験
によりモニターした。溶液を排出し、樹脂をＤＭＦ（３×２０ｍｌ）、ＤＣＭ（３×２０
ｍｌ）、ＭｅＯＨ（３×２０ｍｌ）、及び最後にエーテル（３×２０ｍｌ）で洗浄した。
【化１７】
2019014727.tif 000022
スキーム３：３及び６分岐デンドリマー足場（１４）及び（１５）の合成
【００５８】
Ｄｄｅ脱保護
ＤＣＭ（５ｍｌ）中で予め膨潤させた樹脂（２００ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）にＤＭＦ
（３ｍｌ）中の２％ヒドラジンを加え、反応混合物を２時間振盪した。溶液をその後排出
し、樹脂（１４）をＤＭＦ（３×２０ｍｌ）、ＤＣＭ（３×２０ｍｌ）及びＭｅＯＨ（３
×２０ｍｌ）で洗浄した。
【００５９】
樹脂結合６分岐デンドリマー足場（１５）
ＤＭＦ（０．５ｍｌ、１Ｍ）中のモノマー（１２）（３７９ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ、
４．５当量）及びオキシマ（７９ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ、４．５当量）の溶液を１０分
間攪拌した。ＤＩＣ（８７μＬ、０．５５ｍｍｏｌ、４．５当量）をその後加え、得られ
た溶液を更に２分間攪拌した。溶液をその後、ＤＣＭ（２ｍｌ）中で予め膨潤させた樹脂
（１４）（１００ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、１当量）に加え、反応混合物を２時間振盪し
た。溶液を排出し、樹脂（９）をＤＭＦ（３×２ｍｌ）、ＤＣＭ（３×２ｍｌ）及びＭｅ
ＯＨ（３×２ｍｌ）で洗浄した。
【００６０】
レポーターＩＱＲ１、ＩＱＲ２、及びＩＱＲ３の合成
【化１８】
2019014727.tif 000023
【００６１】
５（６）−カルボキシフルオレセイン標識
ＤＭＦ（７００μｌ）中の５（６）−カルボキシフルオレセイン（１０当量）及びオキ
シマ（１０当量）の溶液を１０分間攪拌した。ＤＣＩ（１０当量）をその後加え、得られ
た溶液を更に５分間攪拌した。この溶液をＤＣＭ中で予め膨潤させた適当な樹脂（１当量
）に加え、反応混合物を６時間振盪した。溶液を排出し、樹脂をＤＭＦ（×３）、ＤＣＭ
（×３）及びＭｅＯＨ（×３）で洗浄した。カップリング反応を定量ニンヒドリン試験に
よりモニターした２３。開裂前に、フルオレセインフェノールエステルを除去するため、
樹脂を２０％ピペリジンで洗浄した２４。
【００６２】
５（６）−テトラエチルローダミン標識
ＤＭＦ（７００μｌ）中の５（６）−テトラエチルローダミン（１０当量）及びオキシ
マ（１０当量）の溶液を１０分間攪拌した。ＤＩＣ（１０当量）をその後加え、得られた
溶液を更に５分間攪拌した。この溶液をＤＣＭ中で予め膨潤させた適当な樹脂（１当量）
に加え、反応混合物を６時間振盪した。溶液を排出し、樹脂をＤＭＦ（×３）、ＤＣＭ（
×３）及びＭｅＯＨ（×３）で洗浄した。カップリング反応を定量ニンヒドリン試験によ
りモニターした。
【００６３】
レポーターＩＱＲ１．２、ＩＱＲ１．３、ＩＱＲ２．２及びＩＱＲ２．３の合成
【化１９】
2019014727.tif 000024
【００６４】
ペプチドカップリング
ＤＭＦ（１Ｍ）中の適当なＤ−又はＬ−Ｆｍｏｃアミノ酸（アミン当たり３当量）及び
ＨＯＢｔ又はオキシマ（アミン当たり３当量）の溶液を１０分間攪拌した。ＤＩＣ（アミ
ン当たり３当量）をその後加え、得られた溶液を更に５分間攪拌した。溶液をその後ＤＣ
Ｍ（１０ｍｌ）中で予め膨潤させた適当な樹脂１４／１５（１当量）に加え、反応混合物
を１〜３時間振盪した。溶液を排出し、樹脂をＤＭＦ（３×２０ｍｌ）、ＤＣＭ（３×２
０ｍｌ）及びＭｅＯＨ（３×２０ｍｌ）で洗浄した。カップリング反応を定量ニンヒドリ
ン試験によりモニターした２３。
【化２０】
2019014727.tif 000025
【００６５】
ペグ化
ＤＭＦ（１Ｍ）中の｛２−［２−（Ｆｍｏｃ−アミノ）エトキシ］エトキシ｝酢酸（ア
ミン当たり３当量）及びオキシマ（アミン当たり３当量）の溶液を１０分間攪拌した。Ｄ
ＩＣ（アミン当たり３当量）をその後加え、得られた溶液を更に５分間攪拌した。溶液を
その後ＤＣＭ（１０ｍｌ）中で予め膨潤させた適当な樹脂１４／１５（１当量）に加え、
反応混合物を１時間振盪した。溶液を排出し、樹脂をＤＭＦ（３×２０ｍｌ）、ＤＣＭ（
３×２０ｍｌ）、ＭｅＯＨ（３×２０ｍｌ）で洗浄した。カップリング反応を定量ニンヒ
ドリン試験によりモニターした２３。
【００６６】
ＴＦＡ開裂及びレポーターＩＱＲ１〜ＩＱＲ３の精製
ＤＣＭ（１０ｍｌ）中で予め膨潤させた適当な樹脂（５０ｍｇ）をＴＦＡ／ＤＣＭ／Ｔ
ＩＳ（９５／５／５、５００μｌ）の開裂カクテルで２時間半処理した。溶液を排出し、
樹脂を開裂カクテルで洗浄し、溶液を真空下で除去した。粗物質を最小限の量の開裂カク
テル（３００μｌ）中に溶解させ、氷冷エーテル（７．５ｍｌ）に加えた。沈殿した固体
を遠心分離により回収し、デカンテーションにより溶媒を除去して、沈殿物を冷たいエー
テル（３×５ｍｌ）で洗浄した。沈殿物をその後逆相分取ＨＰＬＣにより精製し、必要な
画分をプールし、凍結乾燥して、ＩＱＲ１〜ＩＱＲ３を得た；レポーターＩＱＲ１：ＨＰ
ＬＣ  ｔＲ＝４．３分、ＥＬＳＤによる純度＞９８％；ＭＡＬＤＩ：Ｃ７７Η６３Ν５Ο
２２：［Ｍ＋］計算値１４１０．３４，［Ｍ＋２］＋実測値１４１２．３８；レポーター
ＩＱＲ１．２：ＨＰＬＣ  ｔＲ＝８．２分、ＥＬＳＤによる純度＞９８％；レポーターＩ
ＱＲ１．３：ＨＰＬＣ  ｔＲ＝２．６７分、ＥＬＳＤによる純度＞９８％；レポーターＩ
ＱＲ２：ＨＰＬＣ  ｔＲ＝３．５５分；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）＋ｍ／ｚ：Ｃ１７３Ｈ１３５
Ｎ１１Ｃ４９（［Ｍ＋４Ｈ］／４）＋計算値７８８．９６９２，実測値７８８．９７９９
；ＩＲ（ニート）ｖ（ｃｍ−１）：１５９０．１，１４５４．４，１１７５．２，１１１
３．６，８５２．６，７２０．５；レポーターＩＱＲ２．２：ＨＰＬＣ  ｔＲ＝５．１７
分、ＥＬＳＤによる純度＞９８％；レポーターＩＱＲ２．３：ＨＰＬＣ  ｔＲ＝３．６６
分、ＥＬＳＤによる純度＞９８％；レポーターＩＱＲ３：ＨＰＬＣ  ｔＲ＝４．０１分；
ＭＡＬＤＩ：［Ｍ＋Ｈ］＋１７４１．３６；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）＋ｍ／ｚ：Ｃ１０１Ｈ１
１７Ｎ１１Ｏ１６（［Ｍ＋３Ｈ］／３）＋計算値５８１．２９７７，実測値５８１．３０
６７；ＩＲ（ｎｅａｔ）ｖ（ｃｍ−１）：１５８８．８，１４１４．８，１３３７．３，
１１７８．３，１１３１．９，６８３．５。
【００６７】
細胞単離及び培養
健康なボランティアからのヒト末梢血白血球を前述のように調製した２５。簡潔には、
クエン酸血を室温で２０分間３５０ｇ遠心分離し、血小板に富んだ血漿を取り出した。２
ｍＭの最終濃度までＣａＣｌ２を加え、血小板に富んだ血漿の再石灰化により自家血清を
調製した。白血球を０．６％デキストランＴ５００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、英国ミルトン
キーンズ）を用いるデキストラン沈殿により赤血球から分離し、白血球に富んだ上層をそ
の後、等張Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて分画した。好中球及び単核白
血球（ＰＢＭＣ）を、それぞれ６８％／８１％及び５５％／６８％界面から回収した。い
くつかの実験では、好中球をＤ−ＰＢＳ（ｗ／ｏ  Ｃａ／Ｍｇ）中のＤｉＤ（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ、分子プローブ）（２．５μＭ）で、２０分間室温で標識した。
【００６８】
ＰＢＭＣ由来マクロファージは以下のように単核白血球から生成した（Ｒｏｓｓｉ  Ａ
Ｇ，ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ  ＪＣ，Ｒｏｙ  Ｎ，Ｃｈｉｌｖｅｒｓ  ＥＲ，Ｈａｓｌｅｔ
ｔ  Ｃ，Ｄａｎｓｆｉｅｌｄ  Ｉ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ
ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃＡＭＰ
．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８  Ａｐｒ  １；１６０（７）：３５６２−８．Ｒｅｇｕ
ｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ａｐｏ
ｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃＡＭＰ）。単核白血球をポリ−ｄ−リシンでコーテ
ィングしたカバースリップに１時間接着させた後、洗浄して非接着細胞を除去した。接着
細胞は１０％自家血清を含有するＩＭＤＭ中で７〜１０日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏで（ＤＩＶ
）培養した。
【００６９】
Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５）を、５％ＣＯ２／９５％空気の、温度調節
され（３７℃）、加湿された雰囲気中、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣ
Ｓ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ストレプトマイシン（５０μｇ．ｍｌ−１）及びペニ
シリン（５０単位．ｍｌ−１）が添加されたダルベッコ改変イーグル培地（４．５ｇ．ｌ
−１グルコース）から構成される培地において８０〜９０％コンフルエンスで維持した。
トリプシン／ＥＤＴＡ曝露後に分離された急速に増殖する細胞（２×１０６細胞）の懸濁
液をその後カバースリップ又は６ウェルマイクロプレート上に播種し、コンフルエンスま
で２４〜４８時間増殖した。
【００７０】
突発性肺線維症（ＩＰＦ）を有する患者から気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を入手した。同
意書はすべての被験者から得た。研究はロシアン研究倫理委員会より認可された。ＢＡＬ
は進行中の臨床研究実験の一部として行った。２００ｍｌの生理食塩水を右中葉に滴下し
、２０ｍｌアリコートで洗浄した。試料を氷上に維持し、１００μｌアリコートをカバー
スリット上にピペットで入れた後、詳述したようにすぐに染色し、ＰＯＣｍｉｎｉ（潅流
開閉）（ＰｅＣｏｎ  ＧｍｂＨ）培養室においてリアルタイム共焦点撮像を行った。
【００７１】
リアルタイム細胞撮像及び共焦点顕微鏡のための染色
直立型ＡｘｉｏｓｋｏｐＦＳ２顕微鏡（対物６３倍）を組み込むレーザー走査共焦点撮
像システム（ＬＳＭ５１０；Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、独国イエナ）を画像取得及び処理に
用いた。光脱色及び毒性を最小化するため、４８８ｎｍ光への曝露を最大レーザー出力の
１〜６％に限定した。すべての例では、画像はカルマン平均なく、一般的には３．２μｓ
の画素滞留時間、１エアリー単位に対応するピンホールの直径で得た。多重標識実験では
、ピンホール直径を、最長励起波長の１エアリー単位に対応する同等深さの光Ｚ断面をも
たらすように調節した。すべてのリアルタイムのタイムラプス撮像をＩＭＤＭにおいて行
った。カバースリップを、３０℃に維持された、温度調節された環境ステージ（ＰＯＣ  
Ｍｉｎｉ）に移した２６。薬剤を槽添加により加えた。フルオレセインが単独で検査され
た実験では、発光体は専用の４８８ｎｍ線で励起し、発散光はＮＦＴ５４５フィルターか
ら反射し、ＬＰ５０５フィルターを通過した。
【００７２】
膜（ＤｉＤ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、又はデキストラン−６４７、及びＩＱＲプロー
ブを含む多重標識実験では、画像を同時に得た。ＤｉＤ又はデキストラン−６４７は専用
の６３３ｎｍ線で励起し、発散光はメタ検出器（６５０〜７０５ｎｍ）で検出した一方、
フルオレセインは専用の４８８ｎｍ線で励起し、発散光はＮＦＴ５４５フィルターから反
射し、ＬＰ５０５フィルターを通過した。
【００７３】
ｓｙｔｏ−８５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２．５μｍ、３０分、３７℃）と組み合わせ
たＩＱＲプローブを用いる多重標識実験では、画像を連続的に取得した。フルオレセイン
は専用の４８８ｎｍ線で励起し、発散光はＮＦＴ５４５フィルターから反射し、ＬＰ５０
５フィルターを通過した一方、ｓｙｔｏ−８５は専用の５４３ｎｍ線で励起し、発散光は
メタ検出器（５７５〜６９５ｎＭ）で検出した。
【００７４】
細胞活性化の時間経過実験
好中球及び単核細胞（合計６×１０５細胞）、又はＰＢＭＣ由来マクロファージを、１
０μｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）で予めコーティングしたガラスカバース
リップ上に播種した。細胞を接着させ、１０μＭ（最終濃度）のＩＱＲ１．２をウェルに
加えた後、ＰＯＣｍｉｎｉに移し、環境室に入れた。リアルタイム撮像を３０ｓ間隔で行
った。ベースライン画像を１０〜１５分間取得した後、Ａ２１３８７（１０μＭ、Ｓｉｇ
ｍａ）を加え、リアルタイムのタイムラプス共焦点画像を更に２０分間取得した。シベレ
スタット又はダイナソールが含まれる場合、細胞は撮像前に１０分間予備処理した。
【００７５】
Ａ５４９上皮細胞／活性化好中球の終夜共培養
カバースリップ上の６ウェルプレート中でコンフルエンス（＞８０％）まで増殖された
Ａ５４９細胞を用い、上述したように培養した。カバースリップをＰＯＣｍｉｎｉに移さ
し、新しく単離された好中球を加えた（０．６〜１．２×１０６）。共培養物を３０分間
沈殿させ、ＰＡＦ（血小板活性因子）（１０ｎＭ、Ｓｉｇｍａ）を５分間加えた後、ｆＭ
ＬＰ（ｆｏｒｍｙｌ−ｍｅｔ−ｌｅｕ−ｐｈｅ）（１０ｎＭ、Ｓｉｇｍａ）（１．８ｍＭ
アルミニウム）を加えた。これらの実験には、ＩＱＲは全体を通して１μＭで存在した。
３Ｄ再構築のためのＺスタック画像は終夜１５時間、１５分毎に取得した。
【００７６】
デコンボリューションのための画像
画像を正しいナイキストサンプリングレートで取得した。走査領域を最小まで低減し、
より速いＺ断面当たりの走査時間を可能にした。画像をＨｙｕｇｅｎｓ  Ｅｓｓｅｎｔｉ
ａｌを用いてデコンボリューションした（最大反復１０００回）。
【００７７】
マウス実験
リポ多糖（ＬＰＳ）肺炎症を誘発するため、以前詳述した方法を用いた２７。簡潔には
、ＬＰＳ（１０μｇ／マウス大腸菌ＬＰＳ）を直接挿管により滴下され、好中球性肺胞炎
を誘発した。２４時間後、８００μｌアリコートの氷冷ＰＢＳの、露出及び挿管されたマ
ウスの気管への３回の投与でのマウスの安楽死後、ＢＡＬを得た。
【００７８】
蛍光マイクロプレートリーダー実験
ＩＱＲ４（０．５μＭ）を、シベレスタット（５０μＭ）を含む、又は含まない、反応
緩衝剤（５０ｍｍ  Ｈｅｐｅｓ緩衝剤、ｐＨ７．４、０．７５ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％
Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０（ｖ／ｖ））中のヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ；１１．
３μｇ／ｍｌ）でインキュベートした。蛍光脱消光の時間経過を、蛍光マイクロプレート
リーダー（励起４８０／２０、発光５２８／２５）で３０分間追った。蛍光増加はＨＮＥ
の存在下でのみ見られ、これはシベレスタットの存在により阻害される。好中球ライセー
トを用いる実験のため、ＩＱＲ４（０．５μＭ）を、シベレスタット（５０μＭ）を含む
、又は含まないＩＭＤＭ中の冷凍−解凍好中球ライセート（１０×１０６細胞／ｍｌ）で
インキュベートする。蛍光脱消光の時間経過を蛍光マイクロプレートリーダー（励起４８
０／２０、発光５２８／２５）で３０分間追った。
【００７９】
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌｖｉｚｉｏ実験
ヒト好中球を上述のように単離し、活性剤を含む、又は含まないＰＢＳに懸濁した。光
ファイバー共焦点システム（４８８  Ｃｅｌｌｖｉｚｉｏ）を用い、遊離ＦＡＭ及びＩＱ
Ｒの存在下、並びに細胞を培地において遊離ＦＡＭ及びＩＱＲから洗浄後の両方の、細胞
のエッペンドルフ中の画像を取得した。撮像を６０秒間行い、代表的な静止フレームをｂ
ｍｐフォーマットに変換した。
【００８０】
Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｃｅｌｌｖｉｚｉｏ実験
市販のヒツジを購入した。ヒツジは鎮静化され、挿管され、人工呼吸を受けた。細胞：好
中球、活性化好中球及び活性単球を、３次気管支までの直接可視化（気管支鏡下）によっ
て異なるヒツジサブセグメント中に滴下し（５００万滴５ｍｌ）、その後マイクロカテー
テルをワーキングチャンネル中に挿入し、細胞を可視化した。対照として、５ｍｌのＩＱ
Ｒ２．２もサブセグメント中に滴下した。この後、マイクロカテーテルを取り外し、５分
後５μｍの２ｍｌの濃度のＩＱＲ２．２を指定サブセグメント中に滴下した。５分後、Ａ
ｌｖｅｏＦｌｅｘ（光ファイバー束）にワーキングチャンネルを通過させることにより肺
胞検査を行い、リアルタイム撮像は末梢肺胞検査の際に行った。画像は１秒当たり１２フ
レームで撮像し、代表的なフレームはｊｐｅｇフォーマットに変換した。
【００８１】
Ｅｘ  Ｖｉｖｏ  Ｃｅｌｌｖｉｚｉｏ実験
Ｅｘ  ｖｉｖｏヒツジ肺は人工呼吸を受け、ヒト血液（１０％ヘマトクリット）で潅流
した。この後、気管支鏡を用い、５００ｍｃｇの大腸菌ＬＰＳを右上セグメントに滴下し
た。対照としてＰＢＳを左上セグメントに滴下した。６時間後、ＩＱＲ１．２を各セグメ
ントに滴下し（１０ｍｃｇ）、プローブ型共焦点レーザーマイクロ内視鏡を用いてすぐに
撮像した。
【００８２】
ＩＱＲ４の合成の実験
プローブＩＱＲ４の構造
【化２１】
2019014727.tif 000026
化学式：Ｃ２１５Ｈ２６４Ｎ３８Ｏ４６
分子量：４１１６．６２
【００８３】
合成の概要：
１）モノマーの調製、
２）Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨの調製、
３）モノマーのＰＳ樹脂への結合、
４）固相合成、
５）樹脂からの開裂、
６）ＨＰＬＣによる精製。
【００８４】
一般的な情報：
すべてのアミノ酸、アミノメチルポリスチレン樹脂（１．２３ｍｍｏｌ／ｇ、１００〜
２００メッシュ、１％ＤＶＢ）及びＲｉｎｋアミドリンカーは、ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（
Ｓｈａｎｇａｉ）Ｌｔｄ及びＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍから購入した。５（６）−カルボキ
シフルオレセインはＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍから、及びオキシマはＡｐｏｌｌｏ  Ｓｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃから購入した。
【００８５】
モノマー（６）の合成については前セクション（２０ページ）に記載される。
【００８６】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨの合成
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨは３つのステップで調製される。
【化２２】
2019014727.tif 000027
スキーム１：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨの合成
【００８７】
Ｄｄｅ−ＯＨの合成：
ジメドン（２１．２ｇ、１５１ｍｍｏｌ、１当量）、４−（ジメチルアミノ）ピリジン
（ＤＭＡＰ、１９．０ｇ、１５６ｍｍｏｌ、１．０５当量）及び１−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣｌ．ＨＣｌ、２９．１ｇ、１５
２ｍｍｏｌ、１．０５当量）をＤＭＦ（１４５ｍＬ）中に溶解した。酢酸（８．５ｍＬ、
１４８ｍｍｏｌ、１．０５当量）を加え、反応物を終夜攪拌した。ＤＭＦを真空下で除去
し、残渣をＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）中に溶解し、１Ｍ  ＨＣｌ（２×２００ｍＬ）及び
水（２×２００ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮し、真空
下で乾燥させ、黄色っぽい固体（２２．４ｇ、８３％）を得、これを更なる精製なく用い
た。（参照：Ｏｒｇ．Ｌｅｔ．，２００８、１０（１０）、２０１５）
【００８８】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨの合成：
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ．ＨＣｌ（１０．２ｇ、２５．２ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ中に溶解
し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ  １．１当量、４．８ｍＬ、２７
．７ｍｍｏｌ）を加え、得られた固体は濾過により回収し、真空オーブンにおいて終夜乾
燥させた。エタノール（２５０ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ（７．９ｇ、２１．４
ｍｍｏｌ、１当量）の攪拌懸濁液に、Ｄｄｅ−ＯＨ（７．８ｇ、４２．８ｍｍｏｌ、２当
量）及びＴＦＡ（１６０μＬ、２．１４ｍｍｏｌ、０．１当量）を加えた。反応物を６０
時間還流した。反応混合物を室温まで冷却した後、溶媒を真空下で除去し、残渣をＥｔＯ
Ａｃ（３００ｍＬ）中に溶解し、１Ｍ  ＫＨＳＯ４（２×２００ｍＬ）及び１Ｍ  ＨＣｌ
（２×２００ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発
させた。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨをフラッシュカラムクロマトグラフィー（１
０％酢酸／酢酸エチルを有する溶出液）により分離し、酢酸エチル／ヘキサンからオフホ
ワイトの固体（７．５ｇ、７０％）として結晶化した。
【００８９】
固相ペプチド合成
固体支持体を用いるＦｍｏｃ脱保護方法に基づくペプチドカップリング。
ペプチド配列：Ｈ−βＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−
【化２３】
2019014727.tif 000028
スキーム２：固相合成
【００９０】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＰＳ樹脂を、アミノメチルＰＳ樹脂（１．２３ｍｍｏｌ／
ｇ、１％ＤＶＢ、１００〜２００メッシュ）に結合した４−［（２，４−ジメトキシフェ
ニル）−（Ｆｍｏｃ−アミノ）メチル］フェノキシ酢酸（Ｒｉｎｋアミドリンカー）を用
いて調製した。よって、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−アミドリンカー（３当量）をＤＭＦ（０．
１Ｍ）中に溶解し、オキシマ（３当量）を加え、混合物を１０分間攪拌した。ＤＩＣ（３
ｅｑ）をその後加え、得られた混合物を更に５分間攪拌した。溶液をアミノメチルポリス
チレン樹脂（１当量）に加え、２時間振盪した。得られた樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍＬ）
、ＤＣＭ（３×１０ｍＬ）及びＭｅＯＨ（３×１０ｍＬ）で洗浄した。３分岐モノマーを
ＤＩＰＥＡ／ＤＭＡＰに室温で終夜結合した（Ｔｅｔ．２００３、５９、３９４５）。Ｄ
ＭＦ溶液中の２％ヒドラジンを１時間半（２回）用い、Ｄｄｅ基を脱保護した。すべての
Ｆｍｏｃ脱保護をＤＭＦ中２０％ピぺリジンで１０分間行う。溶液をその後排出し、樹脂
をＤＭＦ（３×１０ｍＬ）、ＤＣＭ（３×１０ｍＬ）及びＭｅＯＨ（３×１０ｍＬ）で洗
浄した。この手順を２回繰り返した。脱保護はカイザー試験（第１級アミン）及び第２級
アミンについてクロラニル試験によりモニターした。
【００９１】
固相結合：
ＤＭＦ（０．１Ｍ）中の適当なＦｍｏｃ−アミノ酸、メチルレッド（ＭＲ）又は５（６
）−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）（１０当量）及びオキシマ（１０当量）を１０
分間攪拌した。ＤＩＣ（１０当量）をその後加え、得られた溶液を更に５分間攪拌した。
溶液をその後樹脂（１当量）に加え、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中で予め膨潤させ、反応混合物
を６時間振盪した。溶液を排出し、樹脂をＤＭＦ（３×２０ｍＬ）、ＤＣＭ（３×２０ｍ
Ｌ）及びＭｅＯＨ（３×２０ｍＬ）で洗浄した。カップリング反応をカイザー及びクロラ
ニル試験によりモニターした。ＦＡＭカップリング後、樹脂を２０％ピぺリジンで洗浄し
、いずれかのフルオレセインフェノールエステルを除去した。プローブをその後ＴＦＡ／
ＴＩＳ／ＤＣＭ（９０／５／５）のカクテルを用いて樹脂から３時間放出させた。濾液に
冷たいエーテルを加え、生成物を沈殿させた。
【００９２】
プローブＩＱＲ４の精製
初期精製をエーテル沈殿により行った。冷たいエーテルを加え、遠心分離により回収し
た。洗浄を冷たいエーテルで４回繰り返した。プローブの精製を、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  
Ｃ１８逆相カラム（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ）を備えたＲＰ−ＨＰＬＣ（ＨＰ１１０
０）システムにより、１ｍＬ／分の流速で、２５分にわたり５〜９５％の勾配のＨ２Ｏ中
の０．１％ＨＣＯＯＨ（Ａ）及びＣＨ３ＣＮ中の０．１％ＨＣＯＯＨ（Ｂ）で、初期の均
一濃度時間を２分として溶出することにより行った（ｔｒ＝２１．２分）。プローブの分
析は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ１８逆相カラム（５０×４．６ｍｍ、５μｍ）を備えたＲ
Ｐ−ＨＰＬＣ（ＨＰ１２６０）システムにより、１ｍＬ／分の流速で、１３分にわたり５
〜９５％の勾配のＨ２Ｏ中０．１％ＨＣＯＯＨ（Ａ）及びＣＨ３ＣＮ中０．１％ＨＣＯＯ
Ｈ（Ｂ）で、初期の均一濃度時間を２分として溶出することにより行った（ｔｒ＝９．４
５分）。
【００９３】
結果
液相発光体はベンチトップ共焦点内視鏡を用いる活性化好中球における細胞特異的な吸収
／取り込みの検出を可能にする
まず、我々は静止及び活性化ヒト好中球を多数の発光体に曝露し、ヒト好中球における
活性化依存性の発光体吸収を示した。活性化好中球又は透過処理好中球のみが点状に染料
と結合した。好中球を発光体（図１）の存在下で連続的に撮像した。発光体の活性吸収は
ダイナミン阻害剤（図１）の存在により阻害され、このプロセスがダイナミン依存性であ
ったことを示した。重要なことに、単球及びリンパ球は染料を吸収しなかった。
【００９４】
ＩＱＲはヒトマクロファージのような他の高いピノサイトーシス／エンドサイトーシスを
有する細胞と比較してとくに好中球において脱消光する
好中球及びマクロファージのような細胞において高レベルのエンドサイトーシスを示し
たので、我々はＩＱＲ１をマクロファージに用いたが、ＩＱＲ１の脱消光又は蛍光増幅は
示さなかった。これは好中球に密接に関連した細胞がを高いエンドサイトーシス率を有す
るにもかかわらず脱消光を全く示さないことを示す（図１４）。
【００９５】
内部消光デンドリマーレポーターは信号雑音比の向上及びベンチトップ共焦点内視鏡上で
の吸収／取り込みの検出を可能にする
これらの染料による好中球特異的染色を示した後、我々は好中球活性化の光検出のプロ
ファイルを最適化し、高い信号雑音比を可能にすることを望んでいた。その際、我々及び
（より最近では）他者は多価蛍光ぺプチドデンドリマーが内部蛍光消光の現象を示すこと
を示した１８、２８。デンドリマーは従来の線状ポリマーと比較して独特な分子構造及び
寸法を有し、単分散であり、合成しやすく、それらのサイズは正確に制御することができ
る１５。更にそれらの生体適合性、低毒性、及び細胞内コンパートメントにアクセスする
ことができるという重要な能力２９、３０は、蛍光体消光を可能にするための足場として
、及びよって、それらの消光は本質的に炎症環境における高度な信号雑音識別を可能にす
ることができるので、好中球活性の潜在的な「スマートな」可視化可能センサーとしての
それらの使用を支持する。典型的な発光体としてカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）又
はローダミン（ＴＡＭＲＡ）を用い、我々は染料をデンドリマー内部消光レポーター（Ｉ
ＱＲ）として空間的に配向させることにより、高い信号雑音比を有する好中球活性化プロ
ーブが生成されるだろうと仮定した。概念的に、これらのプローブの炎症環境への送達は
十分な細胞周囲消光を可能にし、活性化依存性の染料蓄積が起きた個別の細胞を容易に可
視化する。従って、モノマー発光体とともに我々は、それぞれＩＱＲ１及びＩＱＲ２と称
される、３つ及び６つの分岐を有するデンドリマーを合成した（図２）。ＦＡＭデンドリ
マーがｉｎ  ｖｉｔｒｏでより明るい信号を示したので、及びこの実験において用いられ
た光ファイバー共焦点装置がこの波長に合ったので、他の化合物を開発するのにローダミ
ンではなくＦＡＭデンドリマーを選択した。初期の実験は、これらの構造が好中球吸収／
取り込み（蛍光共役デキストランとの共存により確認）の検出を可能にしたことを示した
（図３）。またこれらの構造は吸収／取り込みの細胞特異的な検出を可能にした（図３）
。
【００９６】
可溶性を向上したＦＲＥＴ  ＩＱＲではなくデンドリマーＩＱＲが細胞特異的な検出を可
能にする
これらの光レポーターのヒトの肺への最終的な送達のため、それらは上述のプローブと
比較して向上した可溶性を必要とする。よってこれらのＩＱＲの向上した可溶性を、少量
のペプチドをデンドリマー骨格（ＩＱＲ１．２及びＩＱＲ２．２）内に組み入れる、又は
プローブ（ＩＱＲ１．３及びＩＱＲ２．３）をペグ化することにより達成した（図４）。
上のように、これらをまず炎症環境から一般的に得られる他の細胞；単球、マクロファー
ジ、リンパ球、及び上皮細胞に対する選択性についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。また
、我々はリアルタイム共焦点撮像を用いてプローブの細胞特異性を確認した（図５）。こ
れを、ＩＰＦを有する患者のＢＡＬから新しく単離された細胞で行った。ＢＡＬ分析は混
合炎症性浸潤物を示したが、同様に、刺激の前後両方で好中球のみがデンドリマープロー
ブ足場を活性化した（図６）。好中球及び上皮細胞の共培養は、２４時間の上皮細胞のＩ
ＱＲへの曝露にもかからわず、上皮細胞上でプローブ活性化は起こらなかったことを示し
た（図７）。加えて驚くべきことに、この活性化依存性標識は種特異的だった（図８）。
【００９７】
重要なことに、ＩＱＲを生成するための代替の構造的方法を用い、ＦＲＥＴプローブは
細胞吸収の直接的な可視化を可能にしなかったが、これについては説明されないままであ
る（図９参照）。よって、これらのデンドリマーＩＱＲは、向上した信号雑音比を提供す
る、新しく単離された生物学的試料における好中球活性化状態を直接評価するための最適
化された手段を提供する。
【００９８】
実験をその後行い、モノマー染料を用いて行われるようなリアルタイムのタイムラプス
共焦点顕微鏡を用い、可溶性デンドリマーレポーターを有する細胞における動的活性化を
確認した。新しく単離されたヒト好中球を、刺激前及び直後に連続的に撮像し（図１０）
、細胞関連蛍光の目覚ましい急速な増加を示した（図１０ｂ）。正確な蛍光細胞位置を割
り出すため、リアルタイム高解像度マルチスタック画像を好中球の刺激後に取得した。こ
れらは細胞内活性化とともに顕著な膜周囲活性を示した（図１０ｃ）。これはピノサイト
ーシスによる吸収を確認する蛍光デキストランと共存し、またダイナミン依存性だった。
【００９９】
我々は非デンドリマーＦＡＭを本発明の分岐デンドリマーと比較した。デンドリマーの
分岐数が増加すると、予想通り消光が増加し、得ることができる信号雑音比の増加をもた
らした。
【０１００】
好中球におけるＩＱＲ蛍光増幅はエンドサイトーシス及び脱顆粒の組み合わせに依存する
我々は、ラトランクリン（アクチン細胞骨格阻害剤）を用いる実験を行い、蛍光の増幅
の増加を示した。これらは、ＩＱＲ好中球特異的信号が細胞活性化のプロセス中にアクチ
ン細胞骨格再構築により影響を及ぼされ得ることを示した。我々は、脱消光はエンドサイ
トーシス及び脱顆粒の組み合わせによるものであると考える。このようなものとして、我
々は好中球顆粒の重要な成分をＩＱＲに対して試験した。ミエロペルオキシダーゼ阻害剤
、反応性酸素種では差は見られなかった。引き出された結論は、本発明のプローブが脱顆
粒及びまたエンドサイトーシスの両方を必要とするということだった。
【０１０１】
可溶化デンドリマーＩＱＲはｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ毒性を示さない
これらのプローブの直接送達をヒト臨床使用に適用するための基本は、毒性、とくに直
接肺中に送達される場合肺毒性を示さないという要件だった。我々が用いた細胞のいずれ
においても細胞毒性は見られなかった（図１１）。また、マウスへの１ｋｇ当たり数ミリ
グラムのプローブの気管内直接投与後、肺炎症反応は起こらなかった（図１１）。
【０１０２】
光ファイバー共焦点内視鏡を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ実験は活性化好
中球を検出するためにプローブを用いる潜在的な有用性を確認する
将来ヒトの肺内及びとくに肺胞腔中深くの活性化好中球を検出するための方法を開発す
るため、我々がサイズの近いモデルを使用することは重要だった。その際、ヒツジ肺は活
性化ヒト好中球の時空間的な可視化を評価するためのポテンシャルモデル３１システムを
提供した。我々はファイバー共焦点マイクロ内視鏡を用いる方法を用いた。これはヒト及
び動物の両方における肺胞レベルでの細胞解像を可能にする。初期の分析はＣｅｌｌｖｉ
ｚｉｏファイバーを用いてエッペンドルフ中で行った。これは優れた信号雑音比を有する
６分岐ＩＱＲ２．３の優れた消光を明確に示した（図１２）。とくにピノサイトーシスを
撮像するのに以前用いられていた単一の遊離染料は光ファイバー共焦点内視鏡でのこうし
た可視化を可能にしない（図１２）。その後、ヒト好中球をマイクロカテーテルによりヒ
ツジ肺の定義されたサブセグメントに送達した。その後、微小量のＩＱＲを同セグメント
に滴下した（４４μｇ）。Ｃｅｌｌｖｚｉｏ４８８での共焦点マイクロ内視鏡撮像を対照
セグメント（活性化単球、静止好中球及びプローブ単独を予め送達）において行い、活性
化好中球を受容したセグメントにおける撮像と比較した（図１３）。活性化好中球を受容
したセグメントのみが蛍光細胞を明確に示した（図１３）。
【０１０３】
更なる実験（図１５）を行い、用いられた活性化ヒト好中球を撮像した。この実験では
、ｅｘ  ｖｉｖｏヒツジ肺は人工呼吸を受け、ヒト血液で潅流した。この後、肺のサブセ
グメントはリポ多糖を受容し、ヒト好中球の使用を誘発した。１０μｇγのＩＱＲ１．２
を対照セグメント及びＬＰＳ滴下セグメント中に送達した。ＬＰＳセグメントのみがプロ
ーブ型共焦点マイクロ内視鏡を用いて撮像された信号向上を示した。この実験は用いられ
た活性化好中球をＩＱＲにより検出することができることを結論的に示した。
【０１０４】
プローブ送達の方法及びタイミングはこのアプローチには重要である。微小量のみが必
要であり（＜１００μｇ）、検出のタイミングは数分以内である。示差好中球ピノトーシ
スを撮像するため、撮像の遅延により数時間以内に他の細胞によるピノトーシス吸収が起
こり得るので、撮像をすぐに行うことが重要である。微小量の直接送達にはいずれの毒性
問題もなく、末梢肺中への直接滴下は共焦点マイクロ内視鏡には最適であり、分子解像を
可能にする。ｉｎ  ｖｉｖｏ概念の証拠が示される。
【０１０５】
要約すると、好中球活性を直接的に可視化可能なレポーターは、とくに急性肺傷害のよ
うな好中球優位条件の環境における、潜在的な診断手段を提供する。臨床方法の開発は、
非炎症性原因による胸部Ｘ線浸潤物を有する患者対無菌又は感染性肺傷害を有する患者の
層別化を補助することができる。小濃度の分子プローブの送達と組み合わせた共焦点レー
ザーマイクロ内視鏡は、肺内深くの可視化を可能にし、ヒトにおけるこうしたプローブの
送達及び撮像のための検出プラットフォームを提供する。
【０１０６】
ＦＲＥＴ系エラスターゼレポーターを含むデンドリマーＩＱＲを生成し、組換えＨＮＥ
及び好中球ライセートにより脱消光されることを示したが、この効果は特定のエラスター
ゼ阻害剤シベレスタットにより阻害された（図１６）。更に、リアルタイム共焦点撮像実
験では、このＦＲＥＴ−デンドリマーＩＱＲ構築物は、蛍光細胞関連信号をシベレスタッ
トが阻害することができたので、好中球に対するエラスターゼ活性を報告した（図１７）
。エラスターゼ活性は暗消光剤部分を発光体／デンドリマー足場から開裂するので、好中
球のエラスターゼ依存性標識は、エラスターゼレポーターペプチド配列の細胞内又は細胞
外開裂及びその後の開裂プローブの吸収／取り込み後、非ＦＲＥＴデンドリマーＩＱＲに
より示される脱顆粒依存性信号により起こると考えられる。
【０１０７】
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Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００４，２８６，８３４．
１１Ｔｈｉｂｅｒｖｉｌｌｅ  Ｌ，Ｓａｌａｕｎ  Ｍ，Ｌａｃｈｋａｒ  Ｓ，Ｄｏｍｉｎ
ｉｑｕｅ  Ｓ，Ｍｏｒｅｎｏ−Ｓｗｉｒｃ  Ｓ，Ｖｅｖｅｒ−Ｂｉｚｅｔ  Ｃ，Ｂｏｕｒ
ｇ−Ｈｅｃｋｌｙ  Ｇ，Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｏｃ．２００９，６，４４４
１２Ｔｈｉｂｅｒｖｉｌｌｅ  Ｌ，Ｓａｌａｕｎ  Ｍ，Ｌａｃｈｋａｒ  Ｓ，Ｄｏｍｉｎ
ｉｑｕｅ  Ｓ，Ｍｏｒｅｎｏ−Ｓｗｉｒｃ  Ｓ，Ｖｅｖｅｒ−Ｂｉｚｅｔ  Ｃ，Ｂｏｕｒ
ｇ−Ｈｅｃｋｌｙ  Ｇ，Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ．２００９，３３，９７４．
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ｄｕｃｔｉｎｆｏＰａｇｅ．ｈｔｍ？ＰｒｏｄｕｃｔＩＤ＝ＮＥＶ１１１６９．
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２６Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ＳＣ，ＭａｃＧｒｅｇｏｒ  Ｉ，Ｚａｍａｎｉ  Ａ，Ｇｏｒｄｏ
ｎ  ＭＷ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ＣＥ，Ｓｔｅｅｄｍａｎ  ＤＪ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｋ，Ｈ
ａｓｌｅｔｔ  Ｃ，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１９９５，
１５１，１４２８．
２７Ｓｈａｐｉｒｏ  ＳＤ，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２
００２，２６，２６６．
２８Ｇａｌａｎｄｅ  ＡＫ，Ｈｉｌｄｅｒｂｒａｎｄ  ＳＡ，Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ  Ｒ
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ａｃｏｌ．２００６，６，５２２．
３１Ｃｏｌｌｉｅ  ＤＤ，ＭａｃＡｌｄｏｗｉｅ  ＣＮ，Ｐｅｍｂｅｒｔｏｎ  ＡＤ，Ｗ
ｏｏｄａｌｌ  ＣＪ，ＭｃＬｅａｎ  Ｎ，Ｈｏｄｇｓｏｎ  Ｃ，Ｋｅｎｎｅｄｙ  ＭＷ，
Ｍｉｌｌｅｒ  ＨＲ，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ．２００１，３１，１６３６．
【図１】
2019014727.tif 000033
【図２】
2019014727.tif 000034
【図３】
2019014727.tif 000035
【図４】
2019014727.tif 000036
【図５】
2019014727.tif 000037
【図６】
2019014727.tif 000038
【図７】
2019014727.tif 000039
【図８】
2019014727.tif 000040
【図９】
2019014727.tif 000041
【図１０】
2019014727.tif 000042
【図１１】
2019014727.tif 000043
【図１２】
2019014727.tif 000044
【図１３】
2019014727.tif 000045
【図１４】
2019014727.tif 000046
【図１５】
2019014727.tif 000047
【図１６】
2019014727.tif 000048
【図１７ａ】
2019014727.tif 000049
【図１７ｂ】
2019014727.tif 000050
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月5日(2018.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｖｏで被験者の細胞を可視化する方法に用いる染料構築物であって、
前記染料構築物が以下の一般化構造のいずれかを有する多分岐分子であり、
【化１】
2019014727.tif 000051
2019014727.tif 000052
式中、ペプチド／ＰＥＧはペプチド及び／又はＰＥＧを表し、前記ペプチドがＡ−Ａ−Ｐ−Ｖ、Ａ−Ａ−Ａ−Ｐ−Ｖ−Ｋ、又はＥ−Ｅ−Ｉ−Ｎｌｅ−Ｒ−Ｒであり、＊Ｆが独立してＦＡＭ、ローダミン、シアニン染料又はＢＯＤＩＰＹ染料であり、
前記染料構築物を取り込んだ１つ又は複数の細胞が、蛍光の１．２倍以上大きい増加を示す、染料構築物。
【請求項２】
前記構築物が局所的に投与され、蛍光が腸；動脈及び静脈；呼吸系；脳；又は子宮及び卵管を含む生殖系において行われる、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
肺において行われる、請求項２に記載の構築物。
【請求項４】
活性化好中球を検出することに用いる、請求項３に記載の構築物。
【請求項５】
前記染料構築物がイメージされる組織の領域に局所投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項６】
前記染料構築物を取り込んだ細胞の検出が、前記染料構築物が被験者に投与されてから１〜３０分以内に行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項７】
検出される前記１つ又は複数の細胞が活性化好中球である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項８】
被験者に投与される前記構築物の量が１００μｇ未満である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の構築物を含む、投与装置。
【外国語明細書】
2019014727000001.pdf