(57)【要約】【課題】乳癌ホルモン療法に対する耐性の獲得の有無を検査する方法を提供すること。【解決手段】miR-221-3p、miR-151b、miR-199a-5p、miR-331-3p、miR-27b-3pおよびmiR-101-3pからなる群より選択される１以上のmiRNAを検出することを含む、乳癌ホルモン療法に対する耐性の獲得の有無を検査する方法及びキットを提供する。【選択図】図２
2019165701.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌のホルモン療法を受けている被験体から取得された生体サンプルについて、乳癌ホ
ルモン療法に対する耐性の獲得の有無を検査するための方法であって、以下の工程
１）  前記乳癌ホルモン療法を受けている被験体から取得された生体サンプルについて、
miR-221-3p、miR-151b、miR-199a-5p、miR-331-3p、miR-27b-3pおよびmiR-101-3pからな
る群より選択される１以上のmiRNAの量を決定するステップ、
２）  前記量を参照と比較するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項２】
参照が、乳癌を有しない閉経後の正常な女性被験体から得られた生体サンプルについて
のmiRNAの量に基づくものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
参照と比較して、乳癌のホルモン療法を受けている被験体から取得された生体サンプル
についてのmiR-221-3p、miR-151b、miR-199a-5p、miR-331-3p、miR-27b-3pおよびmiR-101
-3pからなる群より選択される１以上のmiRNAの量の増大が、乳癌ホルモン療法に対する耐
性の獲得の指標となる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
生体サンプルが血液サンプル又は血清サンプルである、請求項１〜３のいずれか１項に
記載の方法。
【請求項５】
前記miRNAの量を、定量PCRにより決定する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法
。
【請求項６】
前記miRNAの量を、miRNAマイクロアレイ解析により決定する、請求項１〜４のいずれか
１項に記載の方法。
【請求項７】
被験体が閉経後のエストロゲン受容体陽性乳癌被験体である、請求項１〜６のいずれか
１項に記載の方法。
【請求項８】
検査される乳癌ホルモン療法に対する耐性が、アロマターゼ阻害剤を用いた乳癌ホルモ
ン療法に対する耐性である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
miR-221-3p、miR-151b、miR-199a-5p、miR-331-3p、miR-27b-3pおよびmiR-101-3pから
なる群より選択される１以上のmiRNAの検出のための試薬を含む、乳癌ホルモン療法につ
いての薬剤耐性の獲得の有無を検査するための診断キット。
【請求項１０】
定量PCR用試薬を含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
miRNAマイクロアレイ解析用試薬を含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
閉経後のエストロゲン受容体陽性乳癌被験体に使用するための、請求項９〜１１のいず
れか１項に記載のキット。
【請求項１３】
検査される乳癌ホルモン療法に対する耐性が、アロマターゼ阻害剤による乳癌ホルモン
療法に対する耐性である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳癌ホルモン療法に対する耐性獲得の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は年々増加傾向にあり、罹患率、死亡率、ともに増加している。乳癌には種々のリ
スクファクターが知られており、初潮年齢、初産年齢、閉経年齢、高齢、高脂肪食、身体
活動の程度、乳癌の家族歴などが挙げられる。
【０００３】
乳癌は代表的なホルモン依存性癌であり、乳癌の2/3は女性ホルモンであるエストロゲ
ンの受容体、すなわちER（estrogen receptor）を発現している。エストロゲンは、ERを
介して癌細胞を増殖させる。乳癌の治療法としては、分子標的療法、外科療法、化学療法
、放射線療法、ホルモン療法などが挙げられる。ER陽性乳癌については、ホルモン療法が
代表的な治療法となっている。
【０００４】
エストロゲンは、閉経前は卵巣で生成されるが、閉経後は、副腎で生成された男性ホル
モンであるアンドロゲンが、アロマターゼの作用によりエストロゲンに変換される。すな
わち、閉経前後でエストロゲンの供給ルートは異なり、したがって薬剤標的も治療薬も異
なる。閉経後の乳癌では、癌細胞へのエストロゲンの供給を阻害するために、アロマター
ゼ阻害剤が使用される。アロマターゼ阻害剤は、アロマターゼインヒビターともいい、AI
と表記することがある。一般的な閉経後の乳癌のホルモン療法は、AIを用いてアロマター
ゼを阻害する。
【０００５】
乳癌にはER陽性乳癌とHER2の発現により、5つのサブタイプがある。アロマターゼ阻害
剤を用いる乳癌は、閉経後のER陽性症例である（Luminal A、Luminal B、又はLuminal HE
R2）。現在、アロマターゼ阻害剤としては非ステロイド系のArimidex（Anastrozole）、F
emara（Letrozole）及びステロイド系のAromasin（Exemestane）が知られている。AI薬剤
を用いてホルモン療法をER陽性乳癌に施すと、一部は初めから耐性の不応群であるが、残
りは奏効群として奏効する。ところが奏効群には、乳癌がホルモン療法に対する耐性を獲
得する症例が少なからず存在することが知られている。耐性獲得後は転移や再発が見られ
、一般に予後は不良である。
【０００６】
そこで、乳癌ホルモン療法に対する耐性獲得を早期に検出又は診断し、次の治療を開始
することが重要である。ところが癌や乳癌のmiRNAマーカーはいくつか知られているもの
の、乳癌のAIによるホルモン療法に対する耐性を診断する、効果的なマーカーは現在のと
ころ知られていない。
【０００７】
非特許文献１は、miR-27bマイクロRNAの発現が低下または欠損すると、乳癌細胞におい
て薬剤を排出する機構が亢進し、薬剤耐性が誘導されることを報告している。
非特許文献２は、miR-101仲介Akt活性化とエストロゲン独立増殖を記載している。
非特許文献３は、早期段階における乳癌検出のための血清マイクロRNAの新規組み合わ
せを記載している。
非特許文献４は、2178人の乳癌患者からの発現データを利用した生存関連miRNAの妥当
性を示すためのウェブツールを記載している。
特許文献１は、乳癌を除く癌のmiRNAマーカーを記載している。
特許文献２は、乳癌のmiRNAマーカーを記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2015-51011号公報
【特許文献２】国際公開第2015/190591号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Nature Communications 6, Article number: 7318 (2015)(doi:10.1038/ncomms8318)
【非特許文献２】Oncogene (2011) 30, 822-831
【非特許文献３】Cancer Sci 2016, vol. 107, no. 3, 326-334
【非特許文献４】Breast Cancer Res Treat (2016) 160: 439-446
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記の問題に鑑み、本発明は、乳癌ホルモン療法に対する耐性獲得の有無を検査する方
法及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記の問題に鋭意取組み、乳癌ホルモン療法に対して耐性を獲得する患
者に着目し種々の検討を行った結果、驚くべきことに、乳癌ホルモン療法に対する耐性獲
得と特定のmiRNAの発現パターンとが関連することを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
ある実施形態において本発明は、乳癌のホルモン療法を受けている被験体について、ホ
ルモン療法に対する耐性の獲得の有無を検査するための方法を提供することを目的とする
。本発明は以下の実施形態を包含する：
【００１３】
[１]  乳癌のホルモン療法を受けている被験体から取得された生体サンプルについて、乳
癌ホルモン療法に対する耐性の獲得の有無を検査するための方法であって、以下の工程
１）  前記乳癌ホルモン療法を受けている被験体から取得された生体サンプルについて、
miR-221-3p、miR-151b、miR-199a-5p、miR-331-3p、miR-27b-3pおよびmiR-101-3pからな
る群より選択される１以上のmiRNAの量を決定するステップ、
２）  前記量を参照と比較するステップ、
を含む、前記方法。
[２]  参照が、乳癌を有しない閉経後の正常な女性被験体から得られた生体サンプルにつ
いてのmiRNAの量に基づくものである、１に記載の方法。
[３]  参照と比較して、乳癌のホルモン療法を受けている被験体から取得された生体サン
プルについてのmiR-221-3p、miR-151b、miR-199a-5p、miR-331-3p、miR-27b-3pおよびmiR
-101-3pからなる群より選択される１以上のmiRNAの量の増大が、乳癌ホルモン療法に対す
る耐性の獲得の指標となる、２に記載の方法。
[４]  生体サンプルが血液サンプル又は血清サンプルである、１〜３のいずれかに記載の
方法。
[５]  前記miRNAの量を、定量PCRにより決定する、１〜４のいずれかに記載の方法。
[６]  前記miRNAの量を、miRNAマイクロアレイ解析により決定する、１〜４のいずれかに
記載の方法。
[７]  被験体が閉経後のエストロゲン受容体陽性乳癌被験体である、１〜６のいずれかに
記載の方法。
[８]  検査される乳癌ホルモン療法に対する耐性が、アロマターゼ阻害剤を用いた乳癌ホ
ルモン療法に対する耐性である、１〜７のいずれかに記載の方法。
[９]  miR-221-3p、miR-151b、miR-199a-5p、miR-331-3p、miR-27b-3pおよびmiR-101-3p
からなる群より選択される１以上のmiRNAの検出のための試薬を含む、乳癌ホルモン療法
についての薬剤耐性の獲得の有無を検査するための診断キット。
[１０]  定量PCR用試薬を含む、９に記載のキット。
[１１]  miRNAマイクロアレイ解析用試薬を含む、９に記載のキット。
[１２]  閉経後のエストロゲン受容体陽性乳癌被験体に使用するための、９〜１１のいず
れかに記載のキット。
[１３]  検査される乳癌ホルモン療法に対する耐性が、アロマターゼ阻害剤による乳癌ホ
ルモン療法に対する耐性である、９〜１２のいずれかに記載のキット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により乳癌ホルモン療法に対する耐性獲得の有無を検査することができる。ある
症例が乳癌ホルモン療法に対する耐性を獲得していることが分かれば、早期に次の治療を
開始することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】AI耐性症例の血清で増加が認められたmiRNAについてのVolcanoプロットを示す。図中、右側が上方調節を受けたmiRNA、左側が下方調節を受けたmiRNAである。
【図２】qPCRにより測定した、AI耐性症例の血清中のmiRNAの量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において「マイクロRNA(miRNA)」は、特に断らない限り、ヘアピン様構造のRN
A前駆体として転写され、RNase III切断活性を有するdsRNA切断酵素により切断され、RIS
Cタンパク質複合体に取り込まれ、mRNAの翻訳抑制に関与する15〜25塩基の非コーディン
グRNAを言う。miRNAの配列情報やアクセションID番号等の情報は公知のデータベース、例
えばmiRBase release 22 (http://www.mirbase.org/)から取得しうる。
【００１７】
ある実施形態において、「生体サンプル（生物学的サンプル）」は、血液、血清、血漿
、組織、又は体細胞から得られるサンプルでありうる。生体サンプルは、乳癌のホルモン
療法を受けている被験体から取得し得る。例えば血清サンプルから、市販のRNA抽出キッ
トを使用するなどして、RNAを抽出しうる。
【００１８】
本明細書において「参照」という用語は、ホルモン療法に対する耐性に相関付けること
のできる、各miRNAの特徴的特性の値を言う。例えば参照は、検査被検体のサンプルに見
いだされる、閾値と本質的に同じ又はそれより高い値がホルモン療法に対する耐性の指標
となり、一方、低い値が耐性の不在の指標となる、miRNAの閾値（例えば、量又は量の比
）である。別の実施形態では、参照は、検査被検体のサンプル中に見いだされる、閾値と
同じ又はそれより低い値がホルモン療法に対する耐性の指標となり、一方、高い値が耐性
の不在の指標となる、miRNAの閾値であってもよい。
【００１９】
ある実施形態において、参照は、正常被験体から得られた生体サンプルについてのmiRN
Aの量（測定量）に基づくものであり得る。ここで、本発明は乳癌ホルモン療法に対する
耐性の獲得の有無に関するものであるため、本明細書では特に断らない限り、「正常被験
体（健常者）」とは、閉経後の女性被験体をいう。また、本明細書では、特に断らない限
り、乳癌ホルモン療法に対する耐性の獲得の有無について試験される「被験体」は、乳癌
ホルモン療法を受けている女性である。ある実施形態では、被験体は、アロマターゼ阻害
剤を用いた乳癌のホルモン療法を受けている被験体でありうる。ある実施形態では、被験
体は閉経後のエストロゲン受容体陽性乳癌被験体でありうる。
【００２０】
ある実施形態において、参照は、乳癌ホルモン療法に対する耐性を有しないことが知ら
れている被験体又は被験体群、好ましくは健常者、又は健常者の群、又は乳癌ホルモン療
法に対する耐性を有することが知られている被験体もしくはその群から得られる。このよ
うな場合、試験サンプル中に見いだされる少なくとも1つの本発明のmiRNAの、参照と比較
して変化した値は、乳癌ホルモン療法に対する耐性の存在の指標となる。同様のことは、
調査対象の被験体を含む個体集団の少なくとも1つのmiRNAの相対値又は変化度の値の平均
値又は中央値である計算された参照にも当てはまる。該個体集団の少なくとも1つのmiRNA
の相対値又は変化度は、慣用法により、或いは本明細書の教示に従い測定することができ
る。このような参照値、例えば平均値又は中央値の計算方法は、当技術分野で周知である
。被験体集団は、複数の被験体、例えば少なくとも10、50、100、又は1,000の被験体を含
みうる。
【００２１】
別の実施形態において、参照は、乳癌ホルモン療法に対する耐性を有することが知られ
ている被験体又は被験体群由来のサンプルから得られたものであり得る。この場合、サン
プル中に見いだされる少なくとも1つの本発明のmiRNAの値が参照と本質的に同じ又は実質
的に同じであれば、それは乳癌ホルモン療法に対する耐性の存在の指標となる。
【００２２】
定量的測定の場合は、特徴的特性の値の強度値が本質的に同一であれば、試験サンプル
のあるmiRNAの値と参照値とは本質的に同一である。本質的に同一とは、2つの値の差が、
有意ではないことを意味し、強度の値が参照値に基づいて少なくとも1〜99パーセンタイ
ル、5〜95パーセンタイル、10〜90パーセンタイル、20〜80パーセンタイル、30〜70パー
センタイル、40〜60パーセンタイルの範囲内、例えば参照値に基づいて50、60、70、80、
90、若しくは95パーセンタイルであることを特徴とする。2つの量が本質的に同じである
かどうかを決定するための統計学的検定は当技術分野で周知である。
【００２３】
他方で、2つの値について観察される差は統計学的に有意な差である。相対値又は絶対
値の差は、例えば、参照値に基づいて、45〜55パーセンタイル、40〜60パーセンタイル、
30〜70パーセンタイル、20〜80パーセンタイル、10〜90パーセンタイル、5〜95パーセン
タイル、1〜99パーセンタイルの区間から有意に外側にある。これは中央値又は変化度の
相対的変化から判定することができ、そのような方法は当技術分野で周知である。
【００２４】
本明細書において「比較」とは、miRNAの測定値が、参照と実質的に同一であるか、又
は参照と差があるかを判定することを指す。例えばmiRNAの値は、観察される差が統計学
的に有意である場合に、参照と差があるとみなすことができる。差に統計学的有意性がな
い場合、miRNAの値と参照は実質的に同じである。このような比較に基づき、被験体が、
乳癌ホルモン療法に対する耐性の獲得を有しているか又は有していないと評価することが
できる（あるいはそれを補助することができる）。なお、ここでいう評価とは、特に断ら
ない限り、医師の判断行為を含まないものとする。乳癌ホルモン療法に対する耐性の獲得
の有無に関し、本明細書において用いる判定、決定、検出、検査、判断などの用語につい
ても同様に、特に断らない限り、医師の判断行為を含まないものとする。本明細書におい
て、特に断らない限り、乳癌ホルモン療法に対する耐性の獲得の有無に関し、医師の判断
行為が含まれる又は介在する場合は、「診断」との用語を用いる。
【００２５】
ある実施形態においてmiRNAの測定値は、内部標準により補正することができる。ある
実施形態においてmiRNAの測定値は、特定のmiRNAにより正規化することができる。ある実
施形態においてmiRNAの測定値は、全miRNAの平均値により補正することができる。
【００２６】
本明細書において、乳癌に対するホルモン療法とは、特に断らない限り、エストロゲン
の供給を阻害する薬剤を用いた治療を言う。ある実施形態において、エストロゲンの作用
を阻害する薬剤はアロマターゼ阻害剤（AI）である。アロマターゼ阻害剤としては非ステ
ロイド系のArimidex（Anastrozole）、Femara（Letrozole）やステロイド系のAromasin（
Exemestane）が挙げられるがこれに限らない。本明細書において、乳癌ホルモン療法に対
する耐性とは、最初はAIについて奏効群であったが、治療開始後、不奏効となった場合を
いう。乳癌ホルモン療法に対する耐性を、乳癌ホルモン療法に対する抵抗性ということも
ある。本明細書では、これらは同義とする。
【００２７】
ある実施形態において、本発明は、乳癌のホルモン療法を受けている被験体から取得さ
れた生体サンプルについて、乳癌ホルモン療法に対する耐性の獲得の有無を検査する方法
を提供する。この方法は、乳癌のホルモン療法を受けている被験体から取得された生体サ
ンプルについて、本発明のmiRNAの量を決定し、これを参照と比較することを含む。本発
明のmiRNAとしては、miR-221-3p、miR-151b、miR-199a-5p、miR-331-3p、miR-27b-3pおよ
びmiR-101-3pからなる群より選択される１以上のmiRNAが挙げられる。これらのmiRNAのい
ずれか１種、２種、３種、４種又は５種の組み合わせを測定してもよく、或いは全６種を
測定してもよい。ある実施形態では、アロマターゼ阻害剤による乳癌ホルモン療法に対す
る耐性の獲得の有無が検査される。
【００２８】
配列番号１〜７で表される遺伝子の名称とmiRBase Accession No.（登録番号）を以下
の表にまとめた。表中、miR-191-5pはコントロールである。
【００２９】
【表１】
2019165701.tif 000003
【００３０】
ある実施形態において、miRNAの量は、定量PCR（qPCR）により決定することができる。
定量PCRは、リアルタイムPCRとも言い、試料中の核酸分子を定量するための周知の手法で
あり、市販のキットや慣用の装置などにより行うことができる。qPCRでは、反応後の生成
物濃度を検出する従来のPCRと異なり、反応生成物をリアルタムで検出する。反応中の生
成物濃度は通常、蛍光を用いて検出及び定量する。
【００３１】
通常のPCR法では、試料は、標的核酸、標的の特定領域に相補的な一対のオリゴヌクレ
オチドプライマー（以下、プライマーともいう）、耐熱性ポリメラーゼ、及びデオキシヌ
クレオチド三リン酸(dNTP)を含む。標的核酸は、試料の加熱温度を連続的に変化させる所
定のサイクルを繰り返すことによって増幅される。サイクルは通常、変性ステップ、アニ
ーリングステップ及び伸長ステップから構成され、それぞれ設定温度が異なる。変性ステ
ップは、例えば約90〜95℃である。このステップでは二本鎖核酸（DNA）が一本鎖へと変
性される。アニーリングは例えば約45〜65℃で行われ、プライマーが標的核酸と複合体形
成する。伸長ステップは例えば約68〜72℃で行われ、耐熱性ポリメラーゼが、プライマー
−標的核酸複合体に作用し、伸長反応を行う。このとき、標的核酸を鋳型とする新しい二
本鎖核酸が生成する。通常、この3ステップが約20〜50回繰り返される。非特異的色素を
用いる場合は、プライマーダイマーに起因するシグナルを低減するために約80℃での蛍光
測定ステップが数秒設けられることもある。蛍光検出にはインタカレーション色素(SYBR 
Green I等)や蛍光プローブが使用可能である。
【００３２】
qPCRでは、dsDNA蛍光色素の添加は通常通りに行われる。次いで、反応をqPCR装置で行
い、各サイクルの後、蛍光の強度が光検出器で測定される。１以上の特定の波長で各試料
を照射し、励起されたフルオロフォアによって発せられる蛍光を検出する。qPCRでは、標
的核酸が短い場合などは、伸長ステップを省略することもできる。これはアニーリング温
度から変性温度までサーマルサイクラーの温度を上昇させる過程で、伸長反応が完了する
からである。
【００３３】
qPCRでは、蛍光強度を対数表示したサイクル数に対してプロットして核酸を定量しうる
。蛍光検出の閾値は、バックグラウンドノイズの3〜5倍の標準偏差に設定しうる。閾値を
超えたサイクル数を定量サイクル（Ct）と言う。濃度既知のサンプルから希釈系列を作成
し、それらを鋳型にqPCRを行い検量線を作成しうる。各希釈ごとのCtから、線形回帰によ
り傾斜を求め増幅効率を算出しうる。
【００３４】
遺伝子発現を定量するには、標的遺伝子からのRNA又はDNAのCtを、ハウスキーピング遺
伝子のRNA又はDNAのCtから差し引いて、異なるサンプル間でのRNAの量と質の変動につい
て、正規化することができる。このような正規化手法はΔCt法と呼ばれる。さらに、検量
線を使用せず、内部標準（内在性コントロール）でサンプル間の補正をするΔΔCt法（比
較Ct法とも言う）が知られている。これは、基準サンプルと比較して、未知サンプルが何
サイクル先に、あるいは何サイクル後に閾値に到するかを検出し、相対的定量を行う方法
である。内在性コントロールと比較した場合の閾値に達するサイクル数の違いから、未知
サンプルを相対的に定量しうる。ある実施形態において、qPCRはΔΔCt法により行うこと
ができる。なお、本明細書では、定量PCR（qPCR）という場合、絶対的定量のみならず、
相対的定量もこの用語に含まれるものとする。
【００３５】
qPCRをmiRNAについて行う場合、まず逆転写酵素（RT）を用いてDNAを合成しうる。また
、qPCR前に予備的な増幅を任意に行うことができる。次いで、予備増殖した又はしていな
いサンプルをqPCRに供することができる。こうした工程を全て行うキットも市販されてお
り、本発明に使用可能である。
【００３６】
ある実施形態では、適当なプライマーを設計して、本発明のmiRNA、例えばmiR-221-3p
、miR-151b、miR-199a-5p、miR-331-3p、miR-27b-3p及びmiR-101-3pからなる群より選択
される１以上のmiRNAをqPCRにより測定し得る。別の実施形態では、市販のmiRNAアッセイ
キットを使用してもよい（Applied Biosystems, Life Technologies, カタログ番号44408
87等）。なお、Applied Biosystems, Life Technologies, カタログ番号4440887のmiRNA
アッセイキットについては、供給元からプライマーについての配列情報は公表されていな
いが、アッセイID番号から一義的に決定されるため、アッセイID番号により再現試験が可
能である。また、当業者であれば、データベースにあるmiR-221-3p、miR-151b、miR-199a
-5p、miR-331-3p、miR-27b-3p及びmiR-101-3pのmiRNA配列情報に基づきこれらのmiRNAを
検出するプライマーを適宜設計しうる。
【００３７】
ある実施形態において、miRNAの量は、miRNAマイクロアレイにより決定することができ
る（miRNAアレイと言うこともある）。ある実施形態において、miRNAマイクロアレイは、
ヘアピンキャップ構造プローブにより成熟型のmiRNAのみを検出するmiRNAマイクロアレイ
であり得る。miRNAマイクロアレイでは、RNAをダイレクトラベル化してハイブリダイズさ
せることができる。ある実施形態では適当なプローブを設計し、本発明のmiRNA、例えばm
iR-221-3p、miR-151b、miR-199a-5p、miR-331-3p、miR-27b-3p及びmiR-101-3pからなる群
より選択される１以上のmiRNAをハイブリダイゼーションにより検出し得る。或いはmiRNA
マイクロアレイ解析には市販のキットを用いてもよい（Agilent社Human miRNA microarra
ys Rel.21等）。
【００３８】
ある実施形態において、本発明は、乳癌ホルモン療法についての薬剤耐性の獲得の有無
を検査するための診断キットを提供する。このキットは、本発明のmiRNAを検出する手段
を含む。miRNAを検出する手段としては、本発明のmiRNA（或いはmiRNAから逆転写酵素に
より生成された産物）を増幅しうるプライマー対、本発明のmiRNAと特異的にハイブリダ
イズ可能なプローブを有するmiRNAマイクロアレイが挙げられるがこれに限らない。キッ
トはさらに、逆転写酵素や、予備的増幅のために試薬をさらに含みうる。キットは、内部
標準や参照についての試薬も含みうる。ある実施形態において、本発明のキットは配列番
号１〜６のいずれか1以上のmiRNAを検出するためのプライマー対を含み得る。プライマー
対は、逆転写酵素により配列番号１〜６から生じたDNAを標的とするものであり得る。該
キットは、使用説明書を含みうる。
【００３９】
ある実施形態では、参照は、健常な被験者から得られたmiR-221-3p、miR-151b、miR-19
9a-5p、miR-331-3p、miR-27b-3pおよびmiR-101-3pからなる群より選択される１以上のmiR
NAについての量(又は値)に基づくものであり得る。この場合、該参照と比較して、乳癌ホ
ルモン療法に対する薬剤耐性が獲得された可能性のある被験体から得られた生体サンプル
の、miR-221-3p、miR-151b、miR-199a-5p、miR-331-3p、miR-27b-3pおよびmiR-101-3pか
らなる群より選択される１以上のmiRNAの量（又は値）の増大は、乳癌ホルモン療法に対
する薬剤耐性を獲得したことの指標となる。また、参照と比較して、乳癌ホルモン療法に
対する薬剤耐性が獲得された可能性のある被験体から得られた生体サンプルの、miR-221-
3p、miR-151b、miR-199a-5p、miR-331-3p、miR-27b-3pおよびmiR-101-3pからなる群より
選択される１以上のmiRNAの量（又は値）が有意に変化していない場合は、乳癌ホルモン
療法に対する薬剤耐性を獲得していないことの指標となり得る。
【００４０】
本発明により乳癌ホルモン療法に対する耐性獲得の有無を検査することができる。ある
症例が乳癌ホルモン療法に対する耐性を獲得していることが分かれば、早期に次の治療、
例えば異なる薬剤を用いた治療を開始することができる。
【実施例】
【００４１】
本発明を、下記の実施例によりさらに例示する。これらはあくまで例証のためであり、
本発明の範囲をいかなる意味においても限定するものと解されてはならない。本明細書の
教示に鑑み、本発明の精神から逸脱することなく、さまざまな変法や他の実施形態が可能
であることが直ちに理解される。
【００４２】
[実施例１]
１．AI耐性症例の血清サンプル
解析に使用したAI耐性症例17例の年齢、サブタイプ、使用薬剤、投与期間を以下の表に
示す。解析に使用した血清サンプルは、AI耐性（再発、転移）が確認された時点で提供さ
れたものである。
【００４３】
【表２】
2019165701.tif 000004
【００４４】
上記のように、Luminal A: 10例、Luminal B: 5例、Luminal HER2: 2例であり、また、
Arimidex：10例、Femara:4例、Aromasin: 2例、Femara/Aromasn:1例であった。
【００４５】
２．miRNA解析
MicroRNA マイクロアレイは、Agilent社SureScan Microarray Scanner装置を用いて解
析した。用いたアレイはAgilent社Human miRNA Microarray Rel.21, 8×60であった。対
象として、血清は、上記のAI耐性症例17例、及び健常人7例（いずれも乳癌を有しない閉
経後の正常な女性）を使用した。マイクロアレイ解析は、Gene Spring Ver.13.1を用いて
行った。
miR2861で正規化し、血清について主成分分析で解析したところ、AI耐性症例、健常人
ともにmiRNAの分布パターンに偏りがないことを確認した。
【００４６】
次にマイクロRNAの差次的発現を調べるためにvolcano プロットを行った。miR2861で正
規化し、p<0.05, FC>=1.5のものに着目した。結果を図１に示す。
【００４７】
一次試験では、138 miRNAs (130 Up, 8 Down)に有意差が見られた。
【００４８】
次に二次試験においてさらに詳細に調べたところ、58 miRNAs (38 Up, 19 Down)に有意
差が見られた。二次試験の解析でAI耐性症例において高い発現を認めたmiRNA 38個中、32
個は一次試験でも高い群に含まれ、再現性が認められた。   
二次試験について
Advanced Analysis operation:有意性解析により作製
#Entityリスト:全Entities
#解釈: N vs P (非平均化)
#実験: 血清のmiRNAを測定、miR2861で正規化
解析データから p<0.05 だったmiRNAをp valueの順に並べ替えた結果を、以下の表に示
す。
【００４９】
【表３】
2019165701.tif 000005
2019165701.tif 000006
【００５０】
また、解析データから 1.5倍以上のFold change (FC)を示したmiRNAを、FC値の順で並
べ替えた結果を以下の表に示す。
【００５１】
【表４】
2019165701.tif 000007
2019165701.tif 000008
【００５２】
AI耐性17例、健常人9例の血清を対象に解析した結果、耐性症例で高く検出されるmiRNA
38個を明らかにした。特にAI耐性獲得と関連するmiR-101-3p、miR-331-3pは有意に高い発
現が観察された。他にも、miR-221-3p、miR-151b、miR-199a-5p、およびmiR-27b-3pにつ
いて有意の結果が得られた。
【００５３】
uこれらのmiRNAは、AI耐性獲得後に用いられるFASLODEX (Fulvestrant)や新規分子標的薬
（CDK4/6阻害剤など）による次治療を早期開始できる指標となると考えられる。
【００５４】
[実施例２]
＜qPCRによる血清中miRNAの解析＞
マイクロRNAアレイ解析により有意の結果が確認されたmiRNAについて、さらに、qPCR解
析を以下の手順で行った。
【００５５】
１．方法
血清中のmiRNAの検出には、同一容量の血清からmirVana Paris（ThermoFisher Scienti
fic カタログ番号AM1556）により抽出したRNAを対象に、個々のmiRNA特異的にデザインさ
れたTaqMan MicroRNA assays (Applied Biosystems, Life Technologies, カタログ番号4
440887)（下記表参照）を用いてqPCRを行った。
【００５６】
【表５】
2019165701.tif 000009
【００５７】
RTおよびPCRにはApplied Biosystems のTaqMan(登録商標)MicroRNA Reverse Transcrip
tion Kit（カタログ番号4366596）とTaqMan(商標)Fast Advanced Master Mix (カタログ
番号4444556)を用いた。has-miR-191-5pを内在性コントロールmiRNAとし、ΔΔCt法によ
り健常人の平均値に対する各耐性症例の検出量（Fold change）を算出した。
【００５８】
２．結果
miRNAアレイ解析で健常人の血清より高い検出量を認めたmiRNA中6個のmiRNAについては
qPCRの解析においても健常人より2倍以上高く検出された(図２)。よってこれらのmiRNAは
いずれも、乳癌ホルモン療法に対する耐性の獲得の有無を検査するために使用しうるもの
と考えられる。
【００５９】
なお、乳癌に関連するmiRNAについての解析や報告はあるが、本実施例において見出さ
れたmiR-221-3p、miR-151b、miR-199a-5p、miR-27b-3p、miR-101-3p、およびmiR-331-3p
は、そうした解析において見出されておらず、従ってこれらのmiRNAは乳癌ホルモン療法
を受けている被験体のうちのAI耐性を獲得した症例に特有のものと考えられる。したがっ
てこれらのmiRNAは、乳癌ホルモン療法に対する耐性の獲得の有無を検査するために使用
しうると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明により、乳癌ホルモン療法に対する耐性獲得の有無を検査することができる。あ
る症例（被験体）が乳癌ホルモン療法に対する耐性を獲得していることが分かれば、早期
に次の治療、例えば異なる薬剤を用いた治療を開始することができる。
【００６１】
[配列の簡単な説明]
miR-331-3p    gccccugggccuauccuagaa（配列番号１）
miR-101-3p    uacaguacugugauaacugaa（配列番号２）
miR-221-3p    agcuacauugucugcuggguuuc（配列番号３）
miR-27b-3p    uucacaguggcuaaguucugc（配列番号４）
miR-151b      ucgaggagcucacagucu（配列番号５）
miR-199a-5p   cccaguguucagacuaccuguuc（配列番号６）
miR-191-5p    caacggaaucccaaaagcagcug（配列番号７）
【図１】
2019165701.tif 000010
【図２】
2019165701.tif 000011
【配列表】
2019165701000001.app