(57)【要約】【課題】本発明の課題は、アエロモナス属菌に対する抗菌活性を有する抗菌剤、及びアエロモナス属菌の増殖抑制方法を提供することである。【解決手段】本発明は、クマザサエキスを含む、アエロモナス属菌に対する抗菌剤を提供する。前記アエロモナス属菌は、A. salmonicida subsp. achromogenes、A. salmonicida subsp. masoucida、A. salmonicida subsp. salmonicida、A. sobria、A. veronii、及びA. hydrophilaからなる群から選択される１以上であってもよい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クマザサエキスを含む、アエロモナス属菌に対する抗菌剤。
【請求項２】
前記アエロモナス属菌は、A. salmonicida subsp. achromogenes、A. salmonicida subsp. masoucida、A. salmonicida subsp. salmonicida、A. sobria、A. veronii、及びA. hydrophilaからなる群から選択される１以上である請求項１に記載の抗菌剤。
【請求項３】
クマザサエキスを水域に供給することを含む、アエロモナス属菌の増殖抑制方法。
【請求項４】
前記水域は閉鎖性水域であり、前記クマザサエキスは、前記閉鎖性水域における水量に対して、固形分濃度で、１００μｇ／ｍｌ以上１５００μｇ／ｍｌ以下供給される、請求項３に記載の増殖抑制方法。
【請求項５】
前記アエロモナス属菌は、A. salmonicida subsp. achromogenes、A. salmonicida subsp. masoucida、A. salmonicida subsp. salmonicida、A. sobria、A. veronii、及びA. hydrophilaからなる群から選択される１以上である請求項３又は４に記載の増殖抑制方法。
【請求項６】
魚類をクマザサエキスに曝露することを含む、魚類のアエロモナス属菌感染症を治療及び／又は予防するための方法。
【請求項７】
前記クマザサエキスの曝露量は、固形分濃度で、１００μｇ／ｍｌ以上１５００μｇ／ｍｌ以下である、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌剤、アエロモナス属菌の増殖抑制方法、並びに魚類のアエロモナス属菌感染症を治療及び／又は予防するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
穴あき病は、アエロモナス属菌を病原菌とする感染症であり、魚類等に対し充血や鱗の剥離等をもたらす。したがって、アエロモナス属菌に感染した魚類等は外観を損なうので、経済的価値が著しく低下し得る。
【０００３】
アエロモナス属菌への感染の予防や治療の方法として、食塩等を含む薬浴を用いた方法等が挙げられる（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｌｅｔｔ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０００  Ｊａｎ；３０（１）：５７−６０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、多くのアエロモナス属菌は食塩に対して耐性を示すため、アエロモナス属菌に対する、より効果的な抗菌剤が求められていた。
【０００６】
本発明は、以上のような課題に鑑みてなされたものであり、アエロモナス属菌に対する抗菌活性を有する抗菌剤、及びアエロモナス属菌の増殖抑制方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、クマザサエキスがアエロモナス属菌に対する優れた抗菌活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のものを提供する。
【０００８】
（１）  クマザサエキスを含む、アエロモナス属菌に対する抗菌剤。
【０００９】
（２）  前記アエロモナス属菌は、A. salmonicida subsp. achromogenes、A. salmonicida subsp. masoucida、A. salmonicida subsp. salmonicida、A. sobria、A. veronii、及びA. hydrophilaからなる群から選択される１以上である（１）に記載の抗菌剤。
【００１０】
（３）  クマザサエキスを水域に供給することを含む、アエロモナス属菌の増殖抑制方法。
【００１１】
（４）  前記水域は閉鎖性水域であり、前記クマザサエキスは、前記閉鎖性水域における水量に対して、固形分濃度で、１００μｇ／ｍｌ以上１５００μｇ／ｍｌ以下供給される、（３）に記載の増殖抑制方法。
【００１２】
（５）  前記アエロモナス属菌は、A. salmonicida subsp. achromogenes、A. salmonicida subsp. masoucida、A. salmonicida subsp. salmonicida、A. sobria、A. veronii、及びA. hydrophilaからなる群から選択される１以上である（３）又は（４）に記載の増殖抑制方法。
【００１３】
（６）  魚類をクマザサエキスに曝露することを含む、魚類のアエロモナス属菌感染症を治療及び／又は予防するための方法。
【００１４】
（７）  前記クマザサエキスの曝露量は、固形分濃度で、１００μｇ／ｍｌ以上１５００μｇ／ｍｌ以下である、（６）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、アエロモナス属菌に対する抗菌活性を有する抗菌剤、及びアエロモナス属菌の増殖抑制方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】クマザサエキスが、アエロモナス属菌感染後のキンギョの生存率に及ぼす影響を示す図である。
【図２】クマザサエキスが、キンギョが飼育された水槽内の水質に及ぼす影響を示す図である。
【図３】クマザサエキスが、アエロモナス属菌感染後のキンギョに対する酸化ストレスに及ぼす影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されない。
【００１８】
＜抗菌剤＞
本発明の抗菌剤は、クマザサエキスを含む。クマザサエキスは、緑膿菌、黄色ブドウ球菌等に対して抗菌活性を有することが知られていたものの、本発明者による検討の結果、意外なことに、アエロモナス属菌への抗菌活性を有することが見出された。
【００１９】
（クマザサエキス）
本発明におけるクマザサエキスは、クマザサの葉（生葉、乾燥葉等）からの抽出物である。クマザサの葉には桿が含まれていてもよい。
【００２０】
クマザサエキスの抽出方法は特に限定されないが、例えば、実施例に記載した方法や、特許第３２１２２７８号（特開平１１−１９６８１８号公報）に記載された方法を使用することができる。具体的には、クマザサの葉を、加圧熱水抽出機により１００〜１８０℃、５〜３０分処理してエキスを抽出し、該エキスを水分分離器により含水固形分（含水率４０〜７０％）から分離し、次に飽和水蒸気加熱処理機により該含水固形分を１００℃〜２００℃で５分〜６０分処理した後、再度加圧熱水抽出機により１００℃〜１８０℃で５〜３０分処理してエキスを抽出させ、第１回目と第２回目のエキスを合わせてクマザサエキスとして使用することができる。
【００２１】
クマザサエキスとしては、クマザサの葉を、例えば、６０〜１００℃の水で３０分〜１２時間程度抽出して得られるエキスや、撹拌手段及び水蒸気注入手段を備える圧力容器によって処理されたクマザサから抽出されたエキスを使用できる。
【００２２】
クマザサエキスとしては、市販品を利用できる。クマザサエキスの市販品としては、株式会社鳳凰堂の「ＴＷＥＢＳ」が挙げられる。
【００２３】
本発明の抗菌剤は、クマザサエキスからなるものであってもよいし、クマザサエキスを他の成分、担体等と混合したものであってもよい。
【００２４】
本発明の抗菌剤に含まれ得る他の成分としては、水（水道水、天然水、精製水等）、通常の抗菌剤に使用される油性成分、保湿剤、防腐剤、安定化剤、界面活性剤等が挙げられる。これらの成分の種類や配合量は、得ようとする効果等に応じて適宜調整できる。
【００２５】
本発明の抗菌剤中には、クマザサエキスが、抗菌剤全体に対して、固形分濃度で、好ましくは１．００質量％以上、より好ましくは２．００質量％以上、さらに好ましくは４．００質量％以上含まれていてもよい。本発明の抗菌剤中のクマザサエキスの固形分濃度が１．００質量％以上であると、目的とする抗菌性を充分に発現させることができる。また、本発明の抗菌剤中には、クマザサエキスが、抗菌剤全体に対して、固形分濃度で、好ましくは１００質量％以下、より好ましくは５０．０質量％以下、さらに好ましくは２５．０質量％以下含まれていてもよい。本発明の抗菌剤中のクマザサエキスの固形分濃度の上限は、得ようとする効果に応じて適宜調整できる。なお、本発明において、「抗菌剤全体」とは、クマザサエキスだけではなく、抗菌剤に含まれるその他の成分の総量を意味する。
【００２６】
抗菌剤中のクマザサエキスの固形分濃度は、抗菌活性を指標とするバイオアッセイ法によって特定する。
【００２７】
本発明の抗菌剤は、魚類、ヒト、ヒト以外の哺乳類、鳥類、爬虫類等の動物に対して好ましく投与できる。
【００２８】
アエロモナス属菌は特に魚類に対して感染しやすいため、本発明の抗菌剤の対象動物としては、魚類が特に好ましい。魚類としては、特に限定されず、海水魚、淡水魚等が挙げられる。海水魚としては、フグ、ハゼ、マグロ等が挙げられる。淡水魚としては、アユ、コイ、ハス等が挙げられる。また、好ましい魚類として、ナマズ目ナマズ科（ナマズ等）、ウナギ目ウナギ科（ニホンウナギ、オオウナギ等）も挙げられる。
【００２９】
アエロモナス属菌を病原菌とする感染症（穴あき病、潰瘍病、赤斑病、せっそう病、頭部潰瘍病、鰭赤病、立鱗病等）は、魚類の外観を著しく損なうため、本発明は、外観の美しさが経済価値上重要視される観賞魚に対して特に好ましく適用できる。観賞魚としては、キンギョ、メダカ、コイ（ニシキゴイ等）等が挙げられる。
【００３０】
本発明の抗菌剤の剤型は特に限定されないが、液体状、固体状、気体状のいずれであってもよい。本発明の抗菌剤は、局所投与、経口投与、非経口投与のいずれの投与形態で投与してもよい。局所投与剤の剤型としては、本発明の抗菌剤を、天然繊維又は合成繊維製のガーゼ等の担体に含浸させたもの等が挙げられる。経口投与形態としては、例えば、錠剤、丸剤、粉剤、液剤、ドリンク剤等が挙げられる。非経口投与形態としては、注射剤、局所投与剤（クリーム、軟膏等）、座薬等が挙げられる。
【００３１】
本発明の抗菌剤は、動物用の抗菌剤（例えば、ペット用医薬、ペットフード等）として使用することができる。
【００３２】
本発明の抗菌剤の投与対象が魚類である場合、本発明の抗菌剤をエサに混ぜるか、水槽等の閉鎖性水域に供給することで、本発明の抗菌剤を魚類に摂取させることができる。魚類が成魚である場合、本発明の抗菌剤をエサに混ぜることで、本発明の抗菌剤を効率的に魚類に摂取させることができる。魚類が稚魚である場合、本発明の抗菌剤を閉鎖性水域に供給することで、本発明の抗菌剤を効率的に魚類に摂取させることができる。本発明の抗菌剤を閉鎖性水域に供給する態様については後述する。
【００３３】
本発明の抗菌剤は、一般的な組成物の製造方法によって製造できる。例えば、上記の各成分を、撹拌翼等を備えた加熱混合釜に投入し、７０〜９０℃で、１〜２時間撹拌混合することで、本発明の抗菌剤を得ることができる。
【００３４】
本発明の抗菌剤の使用量は、対象動物の種類や、症状に応じて適宜設定できる。
【００３５】
本発明の抗菌剤は安全性が高いため、単回投与だけではなく、複数回投与にも適する。複数回投与を行う場合、１回の投与あたりのクマザサエキスの投与量は、上記の、抗菌剤中のクマザサエキス配合量の範囲で調整できる。複数回投与に際しては、投与期間にわたって同量を投与してもよいが、異なる量を投与してもよい。また、本発明の抗菌剤は、短期（例えば、１〜２１日）だけではなく、長期（例えば、数ヶ月（例えば、１ヶ月）〜数年（例えば、５年））にわたる投与にも適する。
【００３６】
（抗菌活性）
本発明の抗菌剤は、アエロモナス属菌に対する抗菌活性を有する。本発明の抗菌剤による抗菌活性を奏しやすいアエロモナス属菌としては、A. salmonicida subsp. achromogenes、A. salmonicida subsp. masoucida、A. salmonicida subsp. salmonicida、A. sobria、A. veronii、及びA. hydrophilaからなる群から選択される１以上等が挙げられる。
【００３７】
本発明によれば、アエロモナス属菌による感染症を予防及び／又は治療できるため、アエロモナス属菌が病原菌である感染症の発症を効果的に抑制できる。なお、本発明において、「予防」とは、アエロモナス属菌による感染の抑制又は遅延等を意味し、「治療」とは、アエロモナス属菌による感染の進行の遅延、並びに、症状の緩和、軽減、改善及び治癒等を意味する。
【００３８】
アエロモナス属菌が病原菌である感染症としては、穴あき病、潰瘍病、赤斑病、せっそう病、頭部潰瘍病、鰭赤病、立鱗病等が挙げられる。
【００３９】
本発明の抗菌剤による抗菌活性は、実施例に示す方法で評価できる。
【００４０】
＜アエロモナス属菌の増殖抑制方法＞
本発明は、クマザサエキスを用いた、閉鎖性水域におけるアエロモナス属菌の増殖抑制方法も提供する。本発明の増殖抑制方法によれば、閉鎖性水域中のアエロモナス属菌の増殖を抑制できるので、閉鎖性水域に棲息する動物（魚類等）の、アエロモナス属菌による感染を効果的に抑制できる。また、本発明の増殖抑制方法によれば、閉鎖性水域に棲息する動物（魚類等）がアエロモナス属菌に既に感染していても、該魚類等の生存率を高めることができる。
【００４１】
本発明において、「アエロモナス属菌の増殖を抑制する」とは、クマザサエキスの作用により、アエロモナス属菌の増殖や、アエロモナス属菌による感染を抑制することを意味する。アエロモナス属菌の増殖抑制効果は、本発明の抗菌剤による抗菌活性と同様の方法で評価できる。
【００４２】
本発明の増殖抑制方法によって増殖や感染を抑制しやすいアエロモナス属菌としては、A. salmonicida subsp. achromogenes、A.salmonicida subsp. masoucida、A.salmonicida subsp. salmonicida、A. sobria、A. veronii、及びA. hydrophilaからなる群から選択される１以上等が挙げられる。
【００４３】
本発明の増殖抑制方法は、クマザサエキスを、水域に供給する工程を含む。水域とは、水に覆われた領域（例えば、海、河川等）を意味する。本発明の効果を奏しやすいという観点から、水域は閉鎖性水域であることが好ましい。閉鎖性水域とは、外部水域との間での水の出入りが少ない水域を意味する。閉鎖性水域としては、水槽、溜池、湖沼、城濠、ビオトープ施設等が挙げられる。
【００４４】
本発明の増殖抑制方法に用いるクマザサエキスとしては、クマザサエキスを含んでいれば特に限定されず、本発明の抗菌剤を用いてもよい。クマザサエキスの使用量は、得ようとする増殖抑制効果の程度に応じて適宜設定できる。
【００４５】
クマザサエキスの使用量の下限値としては、例えば、閉鎖性水域における水量に対して、クマザサエキスの固形分濃度で、好ましくは１００μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは２００μｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは３００μｇ／ｍｌ以上、さらにより好ましくは３５０μｇ／ｍｌ以上、最も好ましくは３７５μｇ／ｍｌ以上供給できる。クマザサエキスの使用量が上記範囲であれば、アエロモナス属菌の増殖を効果的に抑制できる。
【００４６】
クマザサエキスの使用量の上限値としては、例えば、閉鎖性水域における水量に対して、クマザサエキスの固形分濃度で、好ましくは１５００μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１０００μｇ／ｍｌ以下、さらに好ましくは８００μｇ／ｍｌ以下、最も好ましくは７５０μｇ／ｍｌ以下供給できる。クマザサエキスの使用量が上記範囲であれば、閉鎖性水域に棲息する動物の水環境を損ないにくく、かつ、アエロモナス属菌の増殖を効果的に抑制できる。
【００４７】
本発明の増殖抑制方法に用いるクマザサエキスの使用量は、閉鎖性水域における水量に対して、クマザサエキスの固形分濃度で、３７５μｇ／ｍｌ以上７５０μｇ／ｍｌ以下であることが特に好ましい。クマザサエキスの使用量が上記範囲であれば、閉鎖性水域に棲息する動物の水環境を損ないにくく、該動物への酸化ストレスが抑制されており、かつ、アエロモナス属菌の増殖を効果的に抑制できる。
【００４８】
クマザサエキスの閉鎖性水域への供給方法としては、クマザサエキスと、閉鎖性水域中の水とを接触させることができる任意の方法を選択できる。具体的には、閉鎖性水域内に、クマザサエキスを直接投入する方法等が挙げられる。
【００４９】
＜魚類のアエロモナス属菌感染症を治療又は予防するための方法＞
本発明は、クマザサエキスを用いた、魚類のアエロモナス属菌感染症（穴あき病、潰瘍病、赤斑病、せっそう病、頭部潰瘍病、鰭赤病、立鱗病等）を治療及び／又は予防するための方法も提供する。
【００５０】
本発明の治療方法及び／又は予防方法は、魚類をクマザサエキスに曝露することで実施する。クマザサエキスへの曝露は、魚類の生育する水環境にクマザサエキスを供給することで実施できる。クマザサエキスとしては、クマザサエキスを含んでいれば特に限定されず、本発明の抗菌剤を用いてもよい。
【００５１】
魚類へ曝露するクマザサエキスの使用量（曝露量）の下限値は、得ようとする効果に応じて適宜調整できるが、クマザサエキスの固形分濃度で、好ましくは１００μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは２００μｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは３００μｇ／ｍｌ以上、さらにより好ましくは３５０μｇ／ｍｌ以上、最も好ましくは３７５μｇ／ｍｌ以上である。
【００５２】
魚類へ曝露するクマザサエキスの使用量（曝露量）の上限値は、得ようとする効果に応じて適宜調整できるが、クマザサエキスの固形分濃度で、好ましくは１５００μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１０００μｇ／ｍｌ以下、さらに好ましくは８００μｇ／ｍｌ以下、最も好ましくは７５０μｇ／ｍｌ以下である。
【００５３】
魚類へ曝露するクマザサエキスの使用量（曝露量）は、クマザサエキスの固形分濃度で、３７５μｇ／ｍｌ以上７５０μｇ／ｍｌ以下であることが特に好ましい。クマザサエキスの使用量が上記範囲であれば、特に良好な効果が奏される。
【００５４】
魚類へ曝露するクマザサエキスの量は、魚類と接する水環境の少なくとも一部において上記範囲を満たせばよく、魚類と接する水環境の全てにおいて上記範囲を満たすことが好ましい。
【００５５】
本発明の効果を奏しやすいという観点から、魚類へのクマザサエキスの曝露は閉鎖性水域（水槽等）で行うことが好ましい。閉鎖性水域へのクマザサエキスの供給方法は、上述の本発明の増殖抑制方法と同様の方法を採用できる。閉鎖性水域に供給するクマザサエキスの量は、該水域内の少なくとも一部において上記の曝露量を満たすことが好ましく、水域内の全体において上記の曝露量を満たすことがより好ましい。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５７】
＜クマザサエキスの製造＞
北海道産クマザサの乾燥葉５０ｋｇに１０００リットルの水を加え、１２５℃で１０分間加熱した。８０℃まで温度を下げた後、スクリュウプレスにより第１のエキスと固形物とに分けた。固形物に、さらに１８０℃で１０分間、２０気圧の条件で加熱し、次いで、１１０℃で５分間加水分解を行い、第２のエキスを得た。第１及び第２のエキスを混合し、珪藻土フィルターを用いてろ過した。ろ液を真空で濃縮し、クマザサエキス（Ｂｒｉｘ（糖度）５０％、ｐＨ４．８〜５．０）を得た。得られたクマザサエキスを、以下の試験に供した。
【００５８】
得られたクマザサエキスの固形分１００ｇあたりの組成は、下記のとおりだった。
タンパク質  ５．８ｇ
灰分  １２．５ｇ
炭水化物  ８１．７ｇ
キシロース  ３５．７ｇ
グルコース  ５．１９ｇ
ガラクトース  ２．６ｇ
アラビノース  １．７３ｇ
酢酸  １９，４６０ｐｐｍ
ギ酸  １９，４６０ｐｐｍ
ｐ−クマル酸  ５ｐｐｍ
３−ヒドロキシピリジン  ３ｐｐｍ
フェルラ酸  １５５０ｐｐｍ
プロピオン酸  ５１０ｐｐｍ
フルフラール  １６０ｐｐｍ
【００５９】
なお、以下の試験中、クマザサエキスの濃度は、溶媒（水等）量に対する、クマザサエキスの固形分濃度として特定した。
【００６０】
＜アエロモナス属菌に対するクマザサエキスの抗菌活性の評価−１＞
下記の方法で、９種のアエロモナス属菌株に対するクマザサエキスの抗菌活性を評価した。
【００６１】
（使用した菌株）
（１）マス由来のA. salmonicida subsp. achromogenes（ＮＣＩＭＢ１１１０株及びＪＣＭ７８７５標準株）
（２）ヒメハヤ（Phoxinus phoxinus）由来のA. salmonicida subsp. achromogenes（ＪＣＭ８１８７株）
（３）ヒメマス（Oncorhynchus masou）由来のA. salmonicida subsp. masoucida（ＮＢＲＣ１３７８４株及びＪＣＭ８２３５株）
（４）A. salmonicida subsp. salmonicida（ＡＴＣＣ３３６５８株）
（５）A. sobria(JCM2139株)
（６）A. veronii（ＪＣＭ７６７５株）
（７）A. hydrophila（ＡＴＣＣ７９６６株）
【００６２】
（抗菌活性の評価）
上記９種のアエロモナス属菌株を用いて、「ｔｈｅ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  ｄｏｃｕｍｅｎｔ  Ｍ３１−Ａ３」に基づき、以下の方法でクマザサエキスの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）及び最小殺菌濃度（ＭＢＣ）を測定した。
まず、Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製ミューラーヒントンブロス（以下、「ＭＨＢ」という。）を用いて、異なる濃度（０、１８８、３７５、７５０、１５００、３０００、６０００、又は１２０００μｇ／ｍｌ）のクマザサエキスをマイクロタイタープレートに準備した。
次いで、各菌株を、ＯＤ６００で０．１５となるように滅菌生理食塩水で希釈した。得られた各希釈液を１０μｌ（約１．１〜１．４×１０５個の菌数に相当する。）用いて、クマザサエキスを含むＭＨＢに接種し、２４時間、それぞれの菌に適した温度で培養した。
培養２４時間後、それぞれの培養液から１０μｌ採取し、エキスの入っていないＭＨＢに再接種し、菌株の発育を観察し、ＭＩＣ及びＭＢＣを特定した。その結果を表１に示す。
【００６３】
【表１】
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【００６４】
表１から理解されるとおり、クマザサエキスは、各アエロモナス属菌株に対し、抗菌活性を有していた。クマザサエキスのＭＩＣは３１２．５〜６２５．０μｇ／ｍｌの範囲内にあり、ＭＢＣは６２５．０〜１２５０μｇ／ｍｌの範囲内にあった。なお、ＭＩＣ及びＭＢＣについて、平均±標準偏差は、それぞれ６２５±１８８μｇ／ｍｌ及び８３３±２５０μｇ／ｍｌだった。
【００６５】
＜アエロモナス属菌に対するクマザサエキスの抗菌活性の評価−２＞
下記の方法で、４種のアエロモナス属菌のいずれかに感染したキンギョに対するクマザサエキスの抗菌活性を評価した。
【００６６】
（使用した菌株）
（１）A. salmonicida subsp. achromogenes strains（ＮＣＩＭＢ１１１０株及びＪＣＭ８１８７株）
（２）A. salmonicida subsp. masoucida strains（ＮＢＲＣ１３７８４株及びＪＣＭ８２３５株）
【００６７】
（１）キンギョへの菌接種
３０Ｌの水を入れた水槽を用い、空気ポンプで常に空気を供給し、同じ産卵（同一業者から入手した。）のキンギョを実験室で飼育した。２０個の水槽を使用し、水槽あたり１０匹、合計２００匹のキンギョ（体重５．０〜７．５ｇ）を実験に用い、初めに７日間順応させた。なお、飼育条件は下記のとおりである：温度２０．０〜２１．０℃、ｐＨ７．０〜７．８、溶存酸素レベル５．５〜７．０ｍｇ／ｌ。
また、４種のアエロモナス属菌株を、ＯＤ６００で１．３〜１．４となるように増菌させて、滅菌ＰＢＳで２回洗浄し、菌株を準備した。
キンギョの順応期間後、キンギョを４０ｍｇ／ｌのオイゲノールで麻酔した後、アエロモナス属菌株５０μｌ（１．２〜１．４×１０６個の菌数に相当する。）を、３０Ｇの注射針を用いて各キンギョの背側後部の筋肉内に注射し、感染させた。
【００６８】
（２）クマザサエキスの添加とキンギョの生残数の測定
キンギョへの菌接種後、直ちに、水槽ろ過装置を付けた３０リットルの新たな水槽にキンギョを移した。次いで、それぞれの水槽に、最終濃度が、０μｇ／ｍｌ（グループ１）、３７５μｇ／ｍｌ（グループ２）、７５０μｇ／ｍｌ（グループ３）又は１５００μｇ／ｍｌ（グループ４）となるようにクマザサエキスを添加した。なお、この試験の前に、上記濃度のクマザサエキスが、非感染キンギョ（ｎ＝１０）の生存には全く影響がないことを、１４日間にわたってあらかじめ確認した。
キンギョへの菌接種後、１４日間にわたって、各グループにおけるキンギョの生死状況を毎日観察し、生存率をスコア化した。また、キンギョの平均生存時間（ＭＳＴ）をＭｅｄＣａｌｃ法（Ｏｓｔｅｎｄ、ベルギー）により計算した。なお、水槽は、観察期間中２０℃に維持し、エサはＮＦＧ−２６０（ニッソー社製）を１日１回与え、各水槽のｐＨをｐＨメーター（堀場製作所製）で毎日測定した。
上記試験を３回繰り返し、得られた結果について、Ｋａｐｌａｉｎ−Ｍｅｙｅｒプロット法で作図した。その結果を図１に示す。
【００６９】
図１から理解されるとおり、クマザサエキスを添加せずに飼育した、グループ１の感染魚の生存率は低く、例えば、ＮＣＩＭＢ１１１０菌株の場合、１４日目において４３．３％（３０匹中１３匹の生存）であり、ＮＢＲＣ１３７８４株の場合、１４日目において６０．０％（３０匹中１８匹の生存）であった。グループ１のＭＳＴは、感染後１０．４０±０．７２〜１１．０７±０．７１日であった。
【００７０】
他方、グループ２又は３では、グループ１に比べて、キンギョの生存率が有意に高かった。グループ２及び３のＭＳＴは、いずれも感染後１２．０３±０．６８〜１２．６３±０．５８日の範囲だった。
【００７１】
グループ４では、グループ１よりも生存率は高かったが、グループ２又は３に比べて相対的に低かった。グループ４のＭＳＴは、感染後１１．４０±０．９５〜１１．７７±０．６５日だった。
【００７２】
グループ２又はグループ３と、グループ１との間で、ＭＳＴについて統計的な有意差が認められた（ｐ＜０．０５）。
【００７３】
以上から、３７５〜７５０μｇ／ｍｌの濃度のクマザサエキスが、アエロモナス属菌への抗菌活性が特に高いことがわかった。
【００７４】
＜クマザサエキスによる水環境への影響の評価＞
下記の方法で、クマザサエキスによる、キンギョが生育する水環境への影響を評価した。
【００７５】
クマザサエキスの最終濃度が、０μｇ／ｍｌ（グループ１）、３７５μｇ／ｍｌ（グループ２）又は１５００μｇ／ｍｌ（グループ４）となるように添加した水槽のそれぞれに、ＮＣＩＭＢ１１１０株感染キンギョを１０匹ずつ入れ、ＬＡＱＵＡａｃｔ（堀場製作所製）を用いて、１４日にわたって水槽の水質を測定した。水質は、ｐＨ、総アンモニア濃度、及び溶存酸素濃度を指標とした。クマザサエキスを添加せずに飼育した非感染状態のキンギョを対照とした。その結果を図２に示す。
【００７６】
図２から理解されるとおり、測定期間中、対照では、いずれの指標についても有意な変化が認められなかった。なお、対照についての測定期間中、ｐＨは７．２８〜７．３９、総アンモニア濃度は１．５８〜１．７４ｍｇ／ｌ、溶存酸素濃度は６．２〜６．３ｍｇ／ｌの範囲内だった。
【００７７】
グループ１のｐＨは、１４日間で７．３０から７．５１に増加した。グループ２及び４のｐＨは、グループ１と比較して顕著な増加は認められず、それぞれ、１４日間で７．２５から７．３５（平均±ＳＤは７．３０±０．０３、ｐ＝０．００００１３）、及び、７．１８から７．３８（平均±ＳＤは７．３０±０．０７、ｐ＝０．００００５７）に増加した。
【００７８】
グループ１の総アンモニア濃度は、１４日間で１．６２ｍｇ／ｌから２．３９ｍｇ／ｌに増加した（平均±ＳＤは１．９４±０．２６）。グループ２及び４の総アンモニア濃度は、グループ１と比較して顕著な増加は認められず、それぞれ、１４日間で１．６３ｍｇ／ｌから２．０５ｍｇ／ｌ（平均±ＳＤは１．８１±０．１３ｍｇ／ｌ）、及び、１．６０ｍｇ／ｌから１．９８ｍｇ／ｌ（平均±ＳＤは１．７２±０．１２ｍｇ／ｌ）に増加した。グループ２及び４の１４日後の時点での総アンモニア濃度は、グループ１の１４日後の時点での総アンモニア濃度に対して有意に低かった（ｐ＝０．０５又は０．００４）。
【００７９】
溶存酸素レベルは、いずれのグループにおいても、６．１〜６．３ｍｇ／ｌの範囲内の値であり、各グループ間で有意差は認められなかった。
【００８０】
以上から、３７５又は１５００μｇ／ｍｌのクマザサエキスには、水環境におけるｐＨや総アンモニア濃度の上昇を抑制する作用があり、閉鎖性水域に棲息する動物の水環境を損ないにくいことが推察された。
【００８１】
＜クマザサエキスによる酸化ストレスへの影響の評価＞
クマザサエキスによる、ＮＣＩＭＢ１１１０株感染キンギョの肝臓内の活性酸素分解酵素（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ、ＳＯＤ）活性への影響を以下の方法で検討した。なお、ＳＯＤは酸化ストレスのマーカーであり、ＳＯＤ値が高いほど、酸化ストレスが強いことを示す。
【００８２】
クマザサエキスの最終濃度が、０μｇ／ｍｌ（グループ１）、３７５μｇ／ｍｌ（グループ２）又は１５００μｇ／ｍｌ（グループ４）となるように添加した水槽に、ＮＣＩＭＢ１１１０株感染キンギョ又は非感染キンギョを入れ、１４日にわたって飼育した。飼育開始直後（０日目）及び飼育開始１４日目の時点で、肝臓を無菌的に採取し、その０．１ｇを、冷やしたＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３０秒間ホモジナイズし、４℃で１２０００×ｇで１０分間遠心分離した。その上清を用いて、ＳＯＤ活性を測定した。各条件について５匹のキンギョを用いた。その結果を図３に示す。なお、図３中のエラーバーは、各群のＳＯＤ値の標準偏差を示す。
【００８３】
図３から理解されるとおり、非感染キンギョにおいては、グループ１及び２のいずれについても、１４日間でのＳＯＤ値の変化は認められなかった。他方、グループ４では、１４日間の飼育後にＳＯＤ値が有意に増加した。
【００８４】
感染キンギョにおいては、全てのグループで、１４日間の飼育後にＳＯＤ値が増加した。特に、グループ４では、ＳＯＤ値が、１０．１２±１．３２Ｕ／ｍｇから１４．３０±１．４９Ｕ／ｍｇまで顕著に増加した。この結果は、上記＜アエロモナス属菌に対するクマザサエキスの抗菌活性の評価−２＞の結果におけるグループ４の生存率の低さと対応しているものと推察された。
【００８５】
以上から、高濃度のクマザサエキスに曝露すると、菌への感染の有無に関係なく酸化ストレスが高まり、キンギョの健康状態に影響を及ぼす可能性があることが示唆された。
【００８６】
他方、グループ２の感染キンギョでは、ＳＯＤ値の増加が他のグループよりも抑制されていた。このことは、３７５μｇ／ｍｌ程度のクマザサエキスの添加は、アエロモナス属菌への抗菌活性を奏しながらもＳＯＤ値の増加が抑制されており、キンギョに対する酸化ストレスが低い条件であることが推察された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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