(57)【要約】      （修正有）【課題】黄色ブドウ球菌細胞毒素ＬｕｋＧＨ（ＬｕｋＡＢとも称される）の異なる変異体の間で交差反応性である抗体の提供。【解決手段】ＬｕｋＧＨ複合体を含む単離黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ロイコシジン抗原、ＬｕｋＧＨ複合体に特異的に結合する抗体、および黄色ブドウ球菌ＬｕｋＧＨ二成分細胞溶解素の結合または毒性を決定する方法において使用するためのヒトＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８複合体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬｕｋＧＨ複合体を含む、単離黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ロイコシジン抗原。
【請求項２】
ＬｕｋＧＨ複合体が、二量体またはオリゴマーとして、ＬｕｋＧおよびＬｕｋＨ成分を含む、請求項１に記載の抗原。
【請求項３】
ＬｕｋＧＨ複合体が、組換えタンパク質および／または黄色ブドウ球菌株由来のタンパク質で構成される、請求項１または２に記載の抗原。
【請求項４】
ＬｕｋＧおよびＬｕｋＨ成分が、組換え宿主細胞によって同時発現され、天然供給源から精製され、そして／または同時再フォールディングされる、請求項３に記載の抗原。
【請求項５】
可溶性型のタンパク質複合体として提供される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗原。
【請求項６】
ヒトＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体に結合可能な、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗原。
【請求項７】
ＬｕｋＧＨ複合体に特異的に結合する抗体。
【請求項８】
ＬｕｋＧＨ複合体を中和する、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
ＵＳＡ３００クローン由来の、好ましくはＴＣＨ１５１６株由来のＬｕｋＧＨ複合体、およびＬｕｋＧＨ複合体変異体の少なくとも１つに結合する、請求項７または８に記載の抗体。
【請求項１０】
ＬｕｋＧＨ複合体変異体が、ＵＳＡ３００クローン由来のＬｕｋＧＨ複合体に比較した際に、ＬｕｋＧまたはＬｕｋＨ成分のいずれかのアミノ酸配列中に、少なくとも１つの点突然変異を有する、請求項７〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
ＬｕｋＧＨ複合体変異体が、配列番号８、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＬｕｋＧ成分、ならびに／または配列番号６、１０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＬｕｋＨ成分を含む、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
ＵＳＡ３００クローン由来のＬｕｋＧＨ複合体が、配列番号４のアミノ酸配列を含むＬｕｋＧ成分および／または配列番号２のアミノ酸配列を含むＬｕｋＨ成分を含む、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１３】
ＬｕｋＧＨ複合体およびＬｕｋＧＨ複合体変異体を交差中和する、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
黄色ブドウ球菌ＬｕｋＧＨ二成分細胞溶解素の結合または毒性を決定する方法において使用するための、ヒトＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８複合体。
【請求項１５】
天然型で、あるいは単離型または固定型で用いられる、請求項１４に記載の使用のためのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８複合体。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（Ｓ．アウレウス）は、ヒトにおいて、無症候性コロニー形成および軽度の皮膚感染から重度の深部組織感染、肺炎、血流感染および敗血症に渡る範囲の、幅広い感染を引き起こしうる最も重要なヒト病原体の１つである。この病原体は、疾患を引き起こし、そして宿主防御に干渉する、多数の病原性機構を用いる。最も強力な病原性因子の１つが、白血球、特に食作用細胞を殺傷することに特化したロイコシジンである。ＬｕｋＧＨ（ＬｕｋＡＢとも称される）は、多形核細胞（ＰＭＮ）、単球および樹状細胞を溶解することが可能であり（Ｄｕｍｏｎｔら、２０１１；Ｖｅｎｔｕｒａら、２０１０）、そしてまたこれらの細胞を活性化して炎症促進性サイトカインを産生させることが可能である、ごく最近同定されたロイコシジンである。ＵＳ２０１１０２７４６９３Ａ１は、Ｌｕｋ  ＡまたはＬｕｋＢ抗体、そして特に抗ＬｕｋＡポリクローナル抗体を記載する。
【０００２】
ＬｕｋＧＨは、ＨｌｇＡＢ、ＨｌｇＣＢ、ＬｕｋＥＤおよびＬｕｋＳＦ（ＰＶＬ）と同様の二成分細胞溶解素である。ＬｕｋＨ（Ｓ成分）およびＬｕｋＧ（Ｆ成分）は、それぞれ、上述の二成分ロイコシジンのＳおよびＦ成分と、およそ３０および４０％のアミノ酸相同性を示す。
【０００３】
Ｍａｌａｃｈｏｖａら（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  Ｅｐｕｂ  ２０１２年８月７日，  Ｖｏｌ．２０６，  ｎｏ．８，  ｐｐ  １１８５−１１９３）は、ＬｕｋＧＨの精製を記載し、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、２つの別個のバンドとして得られる。
【０００４】
ＬｕｋＧＨは、最も可変性がある二成分黄色ブドウ球菌毒素である。ＬｕｋＳＦ、ＬｕｋＥＤおよびＨｌｇＡＢＣが異なる黄色ブドウ球菌株で高く保存されている一方、ＬｕｋＧＨは、最大１４％のアミノ酸変化を示す。このレベルのアミノ酸相違は、２つの異なる毒素、例えばＨｌｇＣ対ＬｕｋＳまたはＬｕｋＳ対ＨｌｇＡＣまたはＬｕｋＥ間で観察されるもの（〜１６％の相違）にほぼ到達する。ＬｕｋＧＨの機能に関しては非常に少ないデータしかなく、そしてこれらのデータは、互いにほぼ同一のＮｅｗｍａｎおよびＬＡＣ（ＵＳＡ３００）株由来の２つの配列で作成されている。他の変異体がヒト細胞で活性であるかどうかは知られておらず、特にＵＳＡ３００とは最も異なると見なされる、２つの黄色ブドウ球菌ゲノム、ＭＲＳＡ２５２（ＥＭＲＳＡ１６）およびＭＳＨＲ１１３２（「銀色」黄色ブドウ球菌）、ならびに他の黄色ブドウ球菌同一クローン集団（ｃｌｏｎａｌ
ｃｏｍｐｌｅｘ）由来の２つの配列に関しては知られていない。
【０００５】
黄色ブドウ球菌培養上清のＰＭＮ溶解活性に基づき、ＬｕｋＧＨは、ヒトの自然細胞に対する最も強力なロイコトキシンの１つであるようである（Ｄｕｍｏｎｔら、２０１３、Ｍａｌａｃｈｏｗａら、２０１２）。したがって、中和抗体によってＬｕｋＧＨの毒素機能を阻害すると、黄色ブドウ球菌病の間に陽性の効果があり、そして感染部位に遊走する食作用細胞を節約することによって、宿主防御を補助すると考えるのが妥当である。ＬｕｋＧＨ毒素を中和するモノクローナル抗体で、ヒト黄色ブドウ球菌感染を防止し、そして治療する、ヒト療法剤を開発することが本発明者らの目的である。
【０００６】
文献に基づいて、細胞表面受容体を認識するのは二成分ロイコシジンのＳ成分であり、そしてこの相互作用はコンホメーション変化を誘導し、Ｆ成分の結合、ならびにＬｕｋＳＦおよびＨｌｇＡＢに関して記載される八量体膜貫通孔構造の形成を導く（Ｃｏｌｉｎ，
Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，  １９９４：３１８４；  Ｍｅｕｎｉｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，  １９９７：２７５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＵＳ２０１１０２７４６９３Ａ１
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｄｕｍｏｎｔら、２０１１
【非特許文献２】Ｖｅｎｔｕｒａら、２０１０
【非特許文献３】Ｍａｌａｃｈｏｖａら（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  Ｅｐｕｂ  ２０１２年８月７日，  Ｖｏｌ．２０６，  ｎｏ．８，  ｐｐ  １１８５−１１９３）
【非特許文献４】Ｄｕｍｏｎｔら、２０１３
【非特許文献５】Ｃｏｌｉｎ，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，  １９９４：３１８４
【非特許文献６】Ｍｅｕｎｉｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，  １９９７：２７５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、黄色ブドウ球菌細胞毒素ＬｕｋＧＨ（ＬｕｋＡＢとも称される）の異なる変異体の間で交差反応性であり、そして交差中和能を提供する、この毒素に対して向けられる抗体を提供することである。
【００１０】
この目的は、本発明の主題によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明にしたがって、ＬｕｋＧＨ複合体を含む、単離黄色ブドウ球菌ロイコシジン抗原を提供する。
【００１２】
特に、ＬｕｋＧＨ複合体は、二量体またはオリゴマーとして、ＬｕｋＧおよびＬｕｋＨ成分を含む。特に、ＬｕｋＧＨ複合体は、ヘテロ二量体性またはオリゴマー性ＬｕｋＧＨ抗原である。こうした抗原は、特に、水性相に可溶性であるヘテロ二量体またはオリゴマーとして、特にＬｕｋＧＨ結合に際して細胞溶解に感受性である細胞、例えばＰＭＮ、単球または樹状細胞の表面に結合していないものとして、提供される。
【００１３】
特に、ＬｕｋＧＨ複合体は、組換えタンパク質および／または黄色ブドウ球菌株由来のタンパク質で構成される。
【００１４】
特に、ＬｕｋＧおよびＬｕｋＨ成分は、組換え宿主細胞によって同時発現され、天然供給源から精製され、そして／または同時再フォールディングされる。
【００１５】
特に、該抗原は、可溶性型のタンパク質複合体として提供される。
【００１６】
特に、該抗原は、ヒトＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体に結合可能である。
【００１７】
本発明にしたがって、ＬｕｋＧＨ複合体に特異的に結合する抗体をさらに提供する。特に、ヘテロ二量体またはオリゴマーＬｕｋＧＨ抗原への本発明の抗体の結合は、分離された（単量体）ＬｕｋＧまたはＬｕｋＨの結合に比較して、はるかに改善されたことが立証可能である。
【００１８】
特に、該抗体は、ＬｕｋＧＨ複合体を中和可能である。
【００１９】
特に、該抗体は、ＵＳＡ３００クローン由来の、好ましくはＴＣＨ１５１６株由来のＬｕｋＧＨ複合体、およびＬｕｋＧＨ複合体変異体の少なくとも１つに結合する。
【００２０】
特に、ＬｕｋＧＨ複合体変異体は、ＵＳＡ３００クローン由来のＬｕｋＧＨ複合体に比較した際に、ＬｕｋＧまたはＬｕｋＨ成分のいずれかのアミノ酸配列中に、少なくとも１つの点突然変異、例えば配列中の１またはそれより多いアミノ酸残基の変化を有する。ＭＲＳＡ２５２およびＭＳＨＲ１１３２株由来の非常に異なるＬｕｋＧＨ複合体変異体であっても、本発明の抗体によって交差特異的に結合され、そして交差中和されることも可能である。
【００２１】
特に、ＵＳＡ３００クローン由来のＬｕｋＧＨ複合体は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＬｕｋＧ成分および／または配列番号２のアミノ酸配列を含むＬｕｋＨ成分を含む。
【００２２】
特に、ＬｕｋＧＨ複合体変異体は、配列番号８、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＬｕｋＧ成分、ならびに／または配列番号６、１０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＬｕｋＨ成分を含む。
【００２３】
特に、該抗体は、ＬｕｋＧＨ複合体およびＬｕｋＧＨ複合体変異体を交差中和する。
【００２４】
本発明にしたがって、黄色ブドウ球菌ＬｕｋＧＨ二成分細胞溶解素の結合または毒性を決定する方法において使用するための、ヒトＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８複合体をさらに提供する。
【００２５】
特に、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８複合体は、天然型で、あるいは単離型または固定型で用いられる。
【００２６】
本発明にしたがって、ＵＳＡ３００クローン（例えばＴＣＨ＿１５１６株）由来のＬｕｋＧＨおよびＬｕｋＧＨ変異体の少なくとも１つに結合する少なくとも１つの多重特異性結合部位を含む、交差中和抗体を提供する。特に、ＬｕｋＧＨ毒素は、ＥＭＲＳＡ１６  ＭＲＳＡ２５２株またはＭＳＨＲ１１３２株によって発現される遺伝子からなる群より選択される。
【００２７】
予期せぬことに、黄色ブドウ球菌の他の二成分ロイコトキシンに対する中和抗体を生成するために研究してきたものと同じアプローチの適用が、ＬｕｋＧＨ毒素に関しては無効であることが見出された。この毒素の異なる作用様式を本明細書に記載し、そして抗体の選択および生成のために、単一の非毒性成分ではなく、毒素複合体を特に提供する。
【００２８】
特に、本発明の抗体は、全長モノクローナル抗体、または結合部位を取り込んでいる少なくとも１つの抗体ドメインを含むその抗体断片、好ましくはネズミ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体、重鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、およびＶＨ、ＶＨＨまたはＶＬのような単一ドメイン抗体、好ましくはヒトＩｇＧ１抗体からなる群より選択される抗体である。
【００２９】
該抗体は、好ましくは１０−８Ｍ未満、好ましくは１０−９Ｍ未満のＫｄで、ＬｕｋＧＨ複合体に結合するアフィニティを有する。
【００３０】
特定の側面にしたがって、該抗体は、５０：１  ｍＡｂ：毒素比（ｍｏｌ／ｍｏｌ）未満、好ましくは１０：１未満、より好ましくは１：１未満のＩＣ５０で、細胞に基づくアッセイにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和能を示す。
【００３１】
さらなる特定の側面にしたがって、該抗体は、ヒトおよび非ヒト動物の両方を含む動物において、ターゲティングされる毒素を中和し、そしてｉｎ  ｖｉｖｏで黄色ブドウ球菌病変形成、好ましくは肺炎、菌血症または敗血症、腹膜炎および骨髄炎の任意のモデルを阻害する。
【００３２】
さらなる側面にしたがって、本発明は、本発明の抗体を産生する方法であって、本発明の組換え宿主細胞を、前記抗体を産生する条件下で培養するかまたは維持する、前記方法を提供する。
【００３３】
さらなる側面にしたがって、本発明は、候補防御抗体を同定する方法であって：
（ａ）抗体または抗体産生細胞を含有する試料を提供し；そして
（ｂ）試料中のまたは試料によって産生される抗体と、本発明のＬｕｋＧＨ複合体の結合に関して評価する、ここで抗体およびＬｕｋＧＨ複合体の間の陽性反応が、候補防御抗体として抗体を同定する
前記方法を提供する。
【００３４】
さらなる側面にしたがって、本発明は、本発明の抗体を産生する方法であって
（ａ）本発明の同定法にしたがって同定される候補防御抗体を提供し；そして
（ｂ）モノクローナル抗体、あるいは該候補防御抗体のヒト化型またはヒト型、あるいは該候補防御抗体と同じエピトープ結合特異性を持つその誘導体を産生する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００３５】
さらなる側面にしたがって、本発明は、本発明の抗体を産生する方法であって
（ａ）本発明のＬｕｋＧＨ複合体で、非ヒト動物を免疫し；
（ｂ）単離Ｂ細胞から不死化細胞株を形成し；
（ｃ）ｂ）で得られた細胞株をスクリーニングして、ＬｕｋＧＨ複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞株を同定し；そして
（ｄ）モノクローナル抗体、あるいは該抗体のヒト化型またはヒト型、あるいは該モノクローナル抗体と同じエピトープ結合特異性を持つその誘導体を産生する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００３６】
さらなる側面にしたがって、本発明は、本発明の抗体を産生する方法であって
（ａ）本発明のＬｕｋＧＨ複合体で、非ヒト動物を免疫し；
（ｂ）単離Ｂ細胞から不死化細胞株を形成し；
（ｃ）細胞株をスクリーニングして、ＬｕｋＧＨ複合体および少なくとも１つのＬｕｋＧＨ複合体変異体に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞株を同定し；そして
（ｄ）モノクローナル抗体、あるいは該抗体のヒト化型またはヒト型、あるいは該モノクローナル抗体と同じエピトープ結合特異性を持つその誘導体を産生する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００３７】
さらなる側面にしたがって、本発明は、ヒト医学的および獣医学的使用を含む、医学的使用のための本発明の抗体を提供する。特に、該抗体は、黄色ブドウ球菌感染のリスクがあるかまたは該感染を患っている被験体を治療する際に使用するために提供され、治療は、被験体における感染を限定するか、前記感染から生じる疾患状態を寛解させるか、または黄色ブドウ球菌肺炎病変形成を阻害するために有効な量の抗体を被験体に投与する工程を含む。
【００３８】
特に、該抗体は、黄色ブドウ球菌感染に対して防御するために提供される。
【００３９】
特定の側面にしたがって、黄色ブドウ球菌感染のリスクがあるかまたは該感染を患っている被験体を治療する方法であって、被験体における感染を限定するか、前記感染から生じる疾患状態を寛解させるか、または黄色ブドウ球菌肺炎病変形成を阻害するために有効な量の抗体を被験体に投与する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【００４０】
特に、病原性黄色ブドウ球菌に対して防御するための治療法を提供する。
【００４１】
特定の態様にしたがって、非経口または粘膜配合物中で該抗体を投与する。
【００４２】
さらなる側面にしたがって、本発明は、本発明の抗体の薬学的調製物であって、好ましくは、非経口または粘膜配合物を含み、場合によって薬学的に許容されうるキャリアーまたは賦形剤を含有する、前記調製物を提供する。
【００４３】
さらなる側面にしたがって、本発明は、高毒素産生ＭＲＳＡ感染を含むいかなる黄色ブドウ球菌感染も、例えば壊死性肺炎、ならびにフルンケル症およびカルブンケル症における毒素産生も検出するための診断使用のための本発明の抗体を提供する。
【００４４】
特に、本発明にしたがって使用するための抗体であって、該抗体と被験体の体液試料を接触させることによって、該被験体における黄色ブドウ球菌での全身感染がｅｘ  ｖｉｖｏで決定される、ここで抗体の特異的免疫反応が感染を決定する、前記抗体を提供する。
【００４５】
特定の側面にしたがって、被験体において、高毒素産生ＭＲＳＡ感染を含む黄色ブドウ球菌感染、例えば壊死性肺炎、ならびにフルンケル症およびカルブンケル症における毒素産生を診断する方法をさらに提供する。
【００４６】
特に、該抗体と被験体の体液試料を接触させることによって、該被験体における黄色ブドウ球菌での全身感染がｅｘ  ｖｉｖｏで決定される、ここで抗体の特異的免疫反応が感染を決定する、診断法を提供する。
【００４７】
さらなる側面にしたがって、本発明は、本発明の抗体の診断調製物であって、場合によって標識を含む抗体および／または標識を含むさらなる診断試薬を含有する、前記調製物を提供する。
【００４８】
さらなる側面にしたがって、本発明は：
（ａ）本発明のＬｕｋＧＨ複合体；
（ｂ）場合によって、（ａ）の前記ＬｕｋＧＨ複合体と天然には会合しないさらなるエピトープまたは抗原；および
（ｃ）キャリアー
を含む、免疫原を提供する。
【００４９】
特に、キャリアーは、薬学的に許容されうるキャリアーであり、好ましくは緩衝剤および／またはアジュバント物質を含む。
【００５０】
本発明の免疫原は、好ましくは、ワクチン配合物中で、好ましくは非経口使用のために提供される。
【００５１】
特に、本発明の免疫原は、医学的使用のために、特に、黄色ブドウ球菌感染から被験体
を防御するか、前記感染から生じる疾患状態を防止するか、または黄色ブドウ球菌肺炎病変形成を阻害するために有効な量の前記免疫原を投与することによって、被験体を治療する際に使用するために提供される。
【００５２】
特に、本発明の免疫原は、防御免疫反応を誘発するために提供される。
【００５３】
特定の側面にしたがって、黄色ブドウ球菌感染のリスクがある被験体を治療する治療法であって、被験体における感染を防止する、特に病原性黄色ブドウ球菌に対して防御するために有効な量の免疫原を被験体に投与する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【００５４】
さらなる側面にしたがって、本発明は、本発明の抗体をコードするか、または本発明の抗原をコードする、特にＬｕｋＧＨ複合体または融合タンパク質をコードする、単離核酸を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１−１】Ａ：ＵＳＡ３００＿ＴＣＨ１５１６、ＭＲＳＡ２５２（ＣＣ３０、ＳＴ３６）およびＭＳＨＲ１１３２（ＣＣ７５、ＳＴ１８５０）株由来の３つの最も多様なＬｕｋＧおよびＬｕｋＨ配列タイプを用いた、実施例３に記載するような、ヒト食作用細胞を用いたＬｕｋＧＨ毒性の決定。Ｂ：異なる黄色ブドウ球菌ゲノム由来のＬｕｋＧおよびＬｕｋＨ配列の関連性；Ｃ：ＬｕｋＧおよびＬｕｋＨ配列変異体のアミノ酸配列整列（配列に関しては図１２を参照されたい）：ＬｕｋＧ：  ＳＴ３６＿ＭＲＳＡ２５２−配列番号８；ＳＴ３０＿Ｅ１４１０−配列番号１３；ＣＣ１３３＿ＥＤ１３３−配列番号４；ＳＴ５９＿Ｍ０１３−配列番号２０；ＳＴ１＿ＭＷ２−配列番号１５；ＳＴ８＿ＣＯＬ−配列番号１６；ＳＴ５＿ＵＳＡ３００＿ＴＣＨ１５１６−配列番号４；ＳＴ２３９＿ＪＫＤ６１５９−配列番号１８；ＳＴ３９８＿０３８５−配列番号１４；ＣＣ１０／ＳＴ１０＿Ｈ１９−配列番号１９；ＳＴ１８５０＿ＭＳＨＲ１１３２−配列番号１２．ＬｕｋＨ：  ＳＴ５＿Ｍｕ５０−ｏ−配列番号２３；ＳＴ５＿Ｎ３１５−配列番号２４；ＳＴ８＿ＵＳＡ３００ＴＣＨ１５１６−配列番号２；ＳＴ２３９＿ＪＫＤ６１５９−配列番号２８；ＳＴ８０＿１１８１９−９７−配列番号２５；ＳＴ２２＿ＥＭＲＳＡ−１５−配列番号２７；ＳＴ５９＿Ｍ０１３−配列番号２６；ＳＴ１８５０＿ＭＳＨＲ１１３２−配列番号１０；ＳＴ１０＿Ｈ１９−配列番号２１；ＳＴ３９８＿ＳＴ３９８−配列番号２２；ＳＴ３６＿ＭＲＳＡ２５２−配列番号６
【図１−２】同上
【図１−３】同上
【図１−４】同上
【図１−５】同上
【図１−６】同上
【図２】実施例３に記載するような、ＬｕｋＧまたはＬｕｋＨで生成した抗体による、ＬｕｋＧＨ毒素の中和の欠如。
【図３】実施例３に記載するような、ｍＡｂが単一成分にまず結合した場合の、ＬｕｋＧまたはＬｕｋＨで生成した抗体による、ＬｕｋＧＨ毒素の中和の検出。
【図４】実施例４に記載するように、ＬｕｋＨおよびＬｕｋＧは、ターゲット細胞との接触を伴わない複合体を形成する。
【図５】実施例４に記載するように、ＬｕｋＨおよびＬｕｋＧは、溶液中の二量体として存在する。
【図６】実施例５に記載するように、分化したＨＬ−６０細胞を用いて、ＬｕｋＧＨ複合体での選択によって発見された、非常に強力なＬｕｋＧＨ中和抗体。Ａは：組換えＬｕｋＧＨ＿ＴＣＨ１５１６複合体を用いて試験し；Ｂは：黄色ブドウ球菌ＵＳＡ２００＿ＴＣＨ１５１６によって分泌され、そして細菌培養上清中に存在する、天然ＬｕｋＧＨを用いて試験した。
【図７−１】実施例５に記載するように、新鮮に単離したヒトＰＭＮを用いて、ＬｕｋＧＨ複合体での選択によって発見された、非常に強力なＬｕｋＧＨ中和抗体。Ａは：組換えＬｕｋＧＨ＿ＴＣＨ１５１６複合体を用いて試験し；Ｂは：組換えＬｕｋＧＨ＿ＭＲＳＡ２５２複合体を用いて試験した。Ｃ．実施例５に記載するように、Ｆｏｒｔｅ−Ｂｉｏにおける、ＬｕｋＧ、ＬｕｋＨおよびＬｕｋＧＨ変異体に対する、ＬｕｋＧＨ抗体の結合。
【図７−２】同上
【図８】実施例５に記載するように、ＬｕｋＧＨ毒素中和ｍＡｂは、ヒト食作用細胞へのＬｕｋＧＨの結合を阻害する。
【図９−１】実施例６に記載するように、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８複合体は、ヒトＬｕｋＧＨ受容体と同定される。Ａ：精製タンパク質を含む銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル；Ｂ：トリプシンペプチドの質量分析；Ｃ：抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体を用いた、精製複合体のウェスタンブロット分析。
【図９−２】同上
【図９−３】同上
【図１０】Ａ．黒のＬｕｋＧを、そして灰色の漫画のＬｕｋＨを含むＬｕｋＧＨ八量体の構造。Ｂ．棒として示す静電相互作用および点線として示す塩架橋に関与する残基を伴う、ＬｕｋＧ−ＬｕｋＨ界面１。Ｃ．棒として示す静電相互作用（挿入図中にラベル）および点線として示す塩架橋に関与する残基を伴う、ＬｕｋＧ−ＬｕｋＨ界面２。
【図１１】Ｆｏｒｔｅ−Ｂｉｏにおけるストレプトアビジンセンサー上に固定された、ビオチン化ＬｕｋＨまたはＬｕｋＨ２へのＬｕｋＧの結合。Ｂ．１ｍＭグルタルアルデヒドの存在下で、５０ｍＭ  ＮａＣｌを加えた２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって監視された、提示されている時間に渡って３７℃でインキュベーションした後の、ＬｕｋＧおよびＬｕｋＨ（ＷＴおよび変異体、各々、３５μｇ／ｍｌ）の架橋。
【図１２−１】配列番号  配列番号１：  ＵＳＡ３００  ＴＣＨ１５１６株のＬｕｋＨヌクレオチド配列  配列番号２：  ＵＳＡ３００  ＴＣＨ１５１６株のＬｕｋＨアミノ酸配列  配列番号３  ＵＳＡ３００  ＴＣＨ１５１６株のＬｕｋＧヌクレオチド配列  配列番号４：  ＵＳＡ３００  ＴＣＨ１５１６株のＬｕｋＧアミノ酸配列  配列番号５  ＭＲＳＡ２５２株（Ｇｅｎｂａｎｋ、寄託番号ＢＸ５７１８５６）のＬｕｋＨヌクレオチド配列  配列番号６：  ＭＲＳＡ２５２株のＬｕｋＨアミノ酸配列  配列番号７  ＭＲＳＡ２５２株のＬｕｋＧヌクレオチド配列  配列番号８：  ＭＲＳＡ２５２株のＬｕｋＧアミノ酸配列  配列番号９  ＭＳＨＲ１１３２株（Ｇｅｎｂａｎｋ、寄託番号ＦＲ８２１７７７）のＬｕｋＨヌクレオチド配列  配列番号１０：  ＭＳＨＲ１１３２株のＬｕｋＨアミノ酸配列  配列番号１１  ＭＳＨＲ１１３２株のＬｕｋＧヌクレオチド配列  配列番号１２：  ＭＳＨＲ１１３２株のＬｕｋＧアミノ酸配列  配列番号１３：  ＬｕｋＧ  ＳＴ３０＿Ｅ１４１０アミノ酸配列  配列番号１４：  ＬｕｋＧ  ＳＴ３９８＿０３８５アミノ酸配列  配列番号１５：  ＬｕｋＧ  ＳＴ１＿ＭＷ２アミノ酸配列  配列番号１６：  ＬｕｋＧ  ＳＴ８＿ＣＯＬアミノ酸配列  配列番号１７：  ＬｕｋＧ  ＣＣ１３３＿ＥＤ１３３アミノ酸配列  配列番号１８：  ＬｕｋＧ  ＳＴ２３９＿ＪＫＤ６１５９アミノ酸配列  配列番号１９：  ＬｕｋＧ  ＣＣ１０／ＳＴ１０＿Ｈ１９アミノ酸配列  配列番号２０：  ＬｕｋＧ  ＳＴ５９＿Ｍ０１３アミノ酸配列  配列番号２１：  ＬｕｋＨ  ＳＴ１０＿Ｈ１９  ＬｕｋＨアミノ酸配列  配列番号２２：  ＬｕｋＨ  ＳＴ３９８＿ＳＴ３９８アミノ酸配列  配列番号２３：  ＬｕｋＨ  ＳＴ５＿Ｍｕ５０−ｏアミノ酸配列  配列番号２４：  ＬｕｋＨ  ＳＴ５＿Ｎ３１５アミノ酸配列  配列番号２５：  ＬｕｋＨ  ＳＴ８０＿１１８１９−９７アミノ酸配列  配列番号２６：  ＬｕｋＨ  ＳＴ５９＿Ｍ０１３アミノ酸配列  配列番号２７：  ＬｕｋＨ  ＳＴ２２＿ＥＭＲＳＡ−１５アミノ酸配列  配列番号２８：  ＬｕｋＨ  ＳＴ２３９＿ＪＫＤ６１５９アミノ酸配列
【図１２−２】同上
【図１２−３】同上
【図１２−４】同上
【図１２−５】同上
【図１２−６】同上
【図１２−７】同上
【発明を実施するための形態】
【００５６】
用語「抗体」は、本明細書において、抗体ドメインからなるかまたは抗体ドメインを含むポリペプチドまたはタンパク質を指すものとし、抗体ドメインは、リンカー配列を伴うまたは伴わない、免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖の定常および／または可変ドメインと理解される。ポリペプチドは、ループ配列によって連結される抗体ドメイン構造の少なくとも２つのベータ鎖からなるベータ−バレル構造を含むならば、抗体ドメインと理解される。抗体ドメインは、天然構造でもよいし、あるいは突然変異誘発または誘導体化によって修飾されて、例えば抗原結合特性または任意の他の特性、例えば安定性または機能特性、例えばＦｃ受容体ＦｃＲｎおよび／またはＦｃガンマ受容体への結合が修飾されてもよい。
【００５７】
本明細書記載の抗体は、１またはそれより多い抗原、あるいはこうした抗原の１またはそれより多いエピトープに結合する、特異的結合部位を有し、特に単一可変抗体ドメインのＣＤＲ結合部位、例えばＶＨ、ＶＬまたはＶＨＨ、あるいは可変抗体ドメイン対の結合部位、例えばＶＬ／ＶＨ対、ＶＬ／ＶＨドメイン対および定常抗体ドメインを含む抗体、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、（Ｆａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、あるいは全長抗体を含む。
【００５８】
用語「抗体」は、本明細書において、特に、単一可変抗体ドメイン、例えばＶＨ、ＶＬまたはＶＨＨ、あるいは連結配列またはヒンジ領域を伴うまたは伴わない、可変および／または定常抗体ドメインの組み合わせを含む、あるいはこれらからなる、抗体形式を指すものとし、可変抗体ドメイン対、例えばＶＬ／ＶＨ対、ＶＬ／ＶＨドメイン対および定常抗体ドメインを含むかまたはこれらからなる抗体、例えば重鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、（Ｆａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆｖ、または全長抗体、例えばＩｇＧタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体が含まれる。用語「全長抗体」を用いて、Ｆｃドメインの少なくとも大部分、および天然存在抗体単量体に一般的に見られる他のドメインを含む、任意の抗体分子を指すことも可能である。この句は、本明細書において、特定の抗体分子が抗体断片でないことを強調するために用いられる。
【００５９】
用語「抗体」には、特に、異なるターゲット抗原に対して向けられるか、または抗体ドメインの異なる構造配置を含む、他の抗体を実質的に含まない、単離型の抗体が含まれるものとする。なお、単離抗体は、例えば少なくとも１つの他の抗体、例えば異なる特異性を有するモノクローナル抗体または抗体断片を含む、単離抗体の組み合わせを含有する、組み合わせ調製物に含まれることも可能である。
【００６０】
用語「抗体」は、ヒト種を含む動物起源、例えばヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、ラマ（ｌａｍａ）、ウシおよびウマ、または鳥類、例えば雌鶏（ｈｅｎ）を含む哺乳動物の抗体に適用されるものとする。
【００６１】
用語「抗体」は、さらに、異なる種起源の配列、例えばネズミおよびヒト起源の配列を持つキメラ抗体に適用される。
【００６２】
用語「キメラ」は、抗体に関して用いられる際、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列各々の１つの部分が、特定の種に由来するかまたは特定のクラスに属する抗体中の対応する配列
に相同である一方、鎖の残りのセグメントが、別の種またはクラスの対応する配列に相同である抗体を指す。典型的には、軽鎖および重鎖両方の可変領域は、哺乳動物の１種由来の抗体可変領域を模倣し、一方、定常部分は、別の種由来の抗体配列に相同である。例えば、可変領域は、例えばヒト細胞調製物由来の定常領域と組み合わせて、非ヒト宿主生物由来の、容易に入手可能なＢ細胞またはハイブリドーマを用いて、現在知られる供給源から得られうる。
【００６３】
用語「抗体」は、さらに、ヒト化抗体に適用される。
【００６４】
用語「ヒト化」は、抗体に関して用いた際、非ヒト種由来の免疫グロブリンから実質的に得られる抗原結合部位を有する分子を指し、ここで、分子の残りの免疫グロブリン構造は、ヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく。抗原結合部位は、定常ドメインに融合した完全可変ドメイン、または可変ドメイン中の適切なフレームワーク領域上に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）のみのいずれかを含むことも可能である。抗原結合部位は、野生型でもよいし、あるいは例えば１またはそれより多いアミノ酸置換によって、修飾されていてもよく、好ましくは、ヒト免疫グロブリンにより近く似るように修飾される。ヒト化抗体のいくつかの型は、すべてのＣＤＲ配列を保持する（例えば、マウス抗体由来の６つすべてのＣＤＲを含有するヒト化マウス抗体）。他の型は、元来の抗体に関して改変されている１またはそれより多いＣＤＲを有する。
【００６５】
用語「抗体」は、さらにヒト抗体に適用される。
【００６６】
用語「ヒト」は、抗体に関して用いられる際、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する抗体を含むと理解される。本発明のヒト抗体には、例えばＣＤＲ中に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えばランダムまたは部位特異的突然変異誘発によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで、あるいは体細胞突然変異によってｉｎ  ｖｉｖｏで導入される突然変異）が含まれてもよい。ヒト抗体には、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、あるいは１またはそれより多いヒト免疫グロブリンに関してトランスジェニックである動物から、単離される抗体が含まれる。
【００６７】
該用語は、特に、任意のクラスまたはサブクラスの抗体に適用される。重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体は、抗体ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの主要なクラスに割り当て可能であり、そしてこれらのいくつかは、さらに、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２に分けられうる。
【００６８】
該用語は、さらに、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、特に組換え抗体に適用され、こうした用語には、組換え手段によって調製されるか、発現されるか、生成されるかまたは単離されるすべての抗体および抗体構造が含まれ、例えば、異なる起源由来の遺伝子または配列を含む、例えば動物、例えばヒトを含む哺乳動物から生じる抗体、例えばキメラ、ヒト化抗体、またはハイブリドーマ由来抗体が含まれる。さらなる例は、抗体を発現するよう形質転換された宿主細胞から単離される抗体、あるいは抗体または抗体ドメインの組換えコンビナトリアルライブラリーから単離される抗体、あるいは他のＤＮＡ配列に抗体遺伝子配列をスプライシングする工程を含む、任意の他の手段によって、調製されるか、発現されるか、生成されるか、または単離される抗体を指す。
【００６９】
用語「抗体」はまた、抗体の誘導体、特に機能的に活性である誘導体も指すと理解される。抗体誘導体は、１またはそれより多い抗体ドメインまたは抗体および／または融合タンパク質の任意の組み合わせと理解され、ここで、抗体の任意のドメインを、例えば他の抗体、例えばＣＤＲループを含む結合構造、受容体ポリペプチドであってもよいが、また
リガンド、足場タンパク質、酵素、毒素等の、１またはそれより多い他のタンパク質の任意の位で、融合させてもよい。多様な化学的技術、例えば共有カップリング、静電相互作用、ジスルフィド結合等による、他の物質への会合または結合によって、抗体の誘導体を得てもよい。抗体に結合する他の物質は、脂質、炭水化物、核酸、有機および無機分子またはその任意の組み合わせ（例えばＰＥＧ、プロドラッグまたは薬剤）であってもよい。特定の態様において、抗体は、生物学的に許容されうる化合物との特異的相互作用を可能にするさらなるタグを含む誘導体である。本発明で使用可能なタグに関しては、抗体のターゲットへの結合に対して、まったく負の影響がないかまたは許容されうる負の影響しかない限り、特別な制限はない。適切なタグの例には、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、カルモジュリン・タグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、およびＳタグが含まれる。別の特定の態様において、抗体は、標識を含む誘導体である。用語「標識」は、本明細書において、「標識」抗体を生成するような、抗体に直接または間接的にコンジュゲート化された、検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体検出可能であってもよく、例えば放射性同位体標識または蛍光標識であってもよく、あるいは酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学的改変を触媒してもよい。
【００７０】
本明細書に記載するような好ましい誘導体は、抗原結合に関して機能的に活性であり、好ましくは黄色ブドウ球菌を中和する能力を有し、そして／または防御抗体である。
【００７１】
用語「抗体」はまた、抗体の変異体も指すと理解される。
【００７２】
用語「変異体」は、特に、例えば突然変異誘発法によって、特に特定の抗体アミノ酸配列または領域を欠失させ、交換し、該配列または領域内に挿入物を導入するか、あるいはアミノ酸配列を化学的に誘導体化して、例えば定常ドメインにおいて、抗体安定性、エフェクター機能または半減期を操作するか、あるいは可変ドメインにおいて、例えば当該技術分野において利用可能なアフィニティ成熟技術によって抗原結合特性を改善して、得られる突然変異抗体または抗体断片などの抗体を指すものとする。任意の既知の突然変異誘発法が使用可能であり、これには、例えばランダム化技術によって得られる、望ましい位での点突然変異が含まれる。いくつかの場合、位は、例えば任意のありうるアミノ酸または抗体配列をランダム化するために好ましいアミノ酸の選択のいずれかを用いて、ランダムに選択される。用語「突然変異誘発」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を改変するための、任意の当該技術分野に認識される技術を指す。好ましいタイプの突然変異誘発には、エラープローンＰＣＲ突然変異誘発、飽和突然変異誘発、または他の部位特異的突然変異誘発が含まれる。
【００７３】
用語「変異体」は、特に、機能的に活性である変異体を含むものとする。
【００７４】
用語、抗体の「機能的に活性である変異体」は、本明細書において、１またはそれより多いアミノ酸の挿入、欠失または置換によるこの配列（親抗体または親配列）の修飾、あるいはアミノ酸配列中の１またはそれより多いアミノ酸残基、あるいはヌクレオチド配列内のヌクレオチド、あるいは配列の遠位端のいずれかまたは両方の化学的誘導体化から生じる配列であって、そしてこうした修飾がこの配列の活性に影響を及ぼさない（特に損なわない）、前記配列を意味する。選択されるターゲット抗原に特異性を有する結合部位の場合、抗体の機能的に活性である変異体は、なお、あらかじめ決定された結合特異性を有するであろうが、これを変化させてもよく、例えば特定のエピトープに対する優れた特異性、アフィニティ、アビディティ、ＫｏｎまたはＫｏｆｆ速度等を変化させてもよい。特に、本発明の抗体の機能的に活性である変異体は、本明細書にさらに記載するように、黄色ブドウ球菌のＨｌａおよび少なくとも１つの二成分毒素に結合する、多重特異性結合部位を有する。
【００７５】
機能的に活性である変異体は、例えば親抗体の配列を変化させることによって得られることも可能であるが、結合部位に加えて抗体領域内に修飾を含む抗体、あるいは抗原結合を損なわず、そして好ましくは、黄色ブドウ球菌または黄色ブドウ球菌毒素をターゲットとする特異的結合アッセイまたは機能試験によって決定されるように、特定の強度で、例えば実質的に同じ生物学的活性で、黄色ブドウ球菌のＬｕｋＧＨ複合体に結合し、そして／または黄色ブドウ球菌を中和する能力を含めて、親抗体と類似の生物学的活性を有するであろう修飾によって、親抗体に由来する抗体がある。用語「実質的に同じ生物学的活性」は、本明細書において、親抗体に関して決定されるような活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはさらに少なくとも１００％、または少なくとも１１０％、または少なくとも１２０％、または少なくとも１３０％、または少なくとも１４０％、または少なくとも１５０％、または少なくとも１６０％、または少なくとも１７０％、または少なくとも１８０％、または少なくとも１９０％、例えば最大２００％である、実質的に同じ活性によって示されるような活性を指す。
【００７６】
好ましい態様において、親抗体の機能的に活性である変異体は
ａ）抗体の生物学的活性断片であり、該断片は、分子の配列の少なくとも５０％を含み、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％を含み；
ｂ）少なくとも１つのアミノ酸置換、付加および／または欠失によって、抗体から得られ、ここで、機能的に活性である変異体は、分子またはその部分に配列同一性を有し、例えば少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し；そして／または
ｃ）抗体またはその機能的に活性である変異体、およびポリペプチドまたはヌクレオチド配列に対して異種であるさらに少なくとも１つのアミノ酸またはヌクレオチドからなる。
【００７７】
本発明の１つの好ましい態様において、本発明記載の抗体の機能的に活性である変異体は、本質的には、上記の変異体と同一であるが、異なる種の相同配列から得られている点で、それぞれ、そのポリペプチドまたはヌクレオチド配列とは異なる。これらは、天然存在変異体または類似体と称される。
【００７８】
用語「機能的に活性である変異体」にはまた、天然存在アレル変異体、ならびに突然変異体または任意の他の非天然存在変異体も含まれる。当該技術分野に知られるように、アレル変異体は、ポリペプチドの生物学的機能を本質的には改変しない、１またはそれより多いアミノ酸の置換、欠失または付加を有すると特徴付けられる、（ポリ）ペプチドの代替型である。
【００７９】
機能的に活性である変異体は、例えば１またはそれより多い点突然変異によって、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列中の配列改変によって得られることも可能であり、ここで、配列改変は、本発明と組み合わせて用いられた際、改変されないポリペプチドまたはヌクレオチド配列の機能を保持する。こうした配列改変には、限定されるわけではないが、（保存的）置換、付加、欠失、突然変異および挿入が含まれうる。
【００８０】
特定の機能的に活性である変異体は、ＣＤＲ変異体である。ＣＤＲ変異体には、ＣＤＲ領域中の少なくとも１つのアミノ酸によって修飾されたアミノ酸配列が含まれ、ここで、前記修飾は、アミノ酸配列の化学的または部分的改変であってもよく、修飾は、変異体が
非修飾配列の生物学的特性を保持することを可能にする。ＣＤＲアミノ酸配列の部分的改変は、１から数個のアミノ酸、例えば１、２、３、４または５アミノ酸の欠失または置換によるか、あるいは１から数個のアミノ酸、例えば１、２、３、４または５アミノ酸の付加または挿入、あるいは１から数個のアミノ酸、例えば１、２、３、４または５アミノ酸の化学的誘導体化、あるいはその組み合わせであってもよい。アミノ酸残基における置換は、保存的置換、例えば１つの疎水性アミノ酸の別の疎水性アミノ酸に関する置換であってもよい。
【００８１】
保存的置換は、側鎖および化学的特性において関連するアミノ酸ファミリー内で行われる置換である。こうしたファミリーの例は、塩基性側鎖、酸性側鎖、非極性脂肪族側鎖、非極性芳香族側鎖、非荷電極性側鎖、小側鎖、巨大側鎖等を含むアミノ酸である。
【００８２】
点突然変異は、特に、１またはそれより多い単一の（非保存的）または二つ組のアミノ酸の異なるアミノ酸に関する置換または交換、欠失または挿入において、操作されないアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列の発現を生じる、ポリヌクレオチドの操作と理解される。
【００８３】
好ましい点突然変異は、同じ極性および／または電荷のアミノ酸の交換を指す。これに関連して、アミノ酸は、６４の３つ組コドンによってコードされる２０の天然存在アミノ酸を指す。これらの２０アミノ酸は、中性電荷、陽性電荷、および陰性電荷を有するものに分けられうる。
【００８４】
「中性」アミノ酸を、それぞれの３文字および１文字コードおよび極性とともに、以下に示す：
アラニン：（Ａｌａ、Ａ）非極性、中性；
アスパラギン：（Ａｓｎ、Ｎ）極性、中性；
システイン：（Ｃｙｓ、Ｃ）非極性、中性；
グルタミン：（Ｇｌｎ、Ｑ）極性、中性；
グリシン：（Ｇｌｙ、Ｇ）非極性、中性；
イソロイシン：（Ｉｌｅ、Ｉ）非極性、中性；
ロイシン：（Ｌｅｕ、Ｌ）非極性、中性；
メチオニン：（Ｍｅｔ、Ｍ）非極性、中性；
フェニルアラニン：（Ｐｈｅ、Ｆ）非極性、中性；
プロリン：（Ｐｒｏ、Ｐ）非極性、中性；
セリン：（Ｓｅｒ、Ｓ）極性、中性；
スレオニン：（Ｔｈｒ、Ｔ）極性、中性；
トリプトファン：（Ｔｒｐ、Ｗ）非極性、中性；
チロシン：（Ｔｙｒ、Ｙ）極性、中性；
バリン：（Ｖａｌ、Ｖ）非極性、中性；および
ヒスチジン：（Ｈｉｓ、Ｈ）極性、陽性（１０％）中性（９０％）。
【００８５】
「陽性」荷電アミノ酸は以下の通りである：
アルギニン：（Ａｒｇ、Ｒ）極性、陽性；および
リジン：（Ｌｙｓ、Ｋ）極性、陽性。
【００８６】
「陰性」荷電アミノ酸は以下の通りである：
アスパラギン酸：（Ａｓｐ、Ｄ）極性、陰性；および
グルタミン酸：（Ｇｌｕ、Ｅ）極性、陰性。
【００８７】
「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、本明細書記載の抗体配列および相同体に
関して、配列を整列させ、そして最大配列同一性パーセントを達成するために、必要であればギャップを導入した後、そしていかなる保存的置換も配列同一性の一部とは見なさずに、特定のポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合と定義される。当業者は、整列を測定するための適切なパラメータを決定することが可能であり、これには、比較しようとする配列の全長に渡って、最大整列を達成するために必要ないかなるアルゴリズムも含まれる。
【００８８】
抗体変異体は、機能性であり、そして機能的同等物として働きうる、例えば特定のターゲットに結合し、そして機能的特性を持つ、例えば糖鎖工学によって産生される、特異的グリコシル化パターンを持つ相同体、類似体、断片、修飾または変異体を含むと特に理解される。本明細書に記載するような好ましい変異体は、抗原結合に関して機能的に活性であり、好ましくは黄色ブドウ球菌を中和する能力を有し、そして／または防御抗体である。
【００８９】
本発明の抗体は、Ｆｃエフェクター機能を示してもよいし、または示さなくてもよい。作用様式は、主に、Ｆｃエフェクター機能を持たない中和抗体によって仲介されるが、Ｆｃは、補体を補充し、そして免疫複合体の形成を通じて、循環からのターゲット抗原、例えば毒素の除去を補助することも可能である。
【００９０】
特異的抗体は、活性Ｆｃ部分を欠き、したがって、抗体のＦｃ部分を含有しないか、またはＦｃガンマ受容体結合部位を含有しない抗体ドメインで構成されるかいずれかであってもよいし、あるいは例えばＦｃエフェクター機能を減少させる、特にＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を無効にするかまたは減少させる修飾によって、Ｆｃエフェクター機能を欠く抗体ドメインを含んでもよい。代替抗体を操作して、Ｆｃエフェクター機能を増加させる、特にＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を増進させる修飾を取り込むことも可能である。
【００９１】
こうした修飾は、突然変異誘発、例えばＦｃガンマ受容体結合部位の突然変異によって、あるいは抗体形式のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性に干渉する誘導体または剤によって、達成可能であり、こうしてＦｃエフェクター機能の減少または増加を達成することも可能である。
【００９２】
Ｆｃエフェクター機能の有意な減少は、典型的には、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性によって測定されるような、非修飾（野生型）形式の１０％未満のＦｃエフェクター機能、好ましくは５％未満のＦｃエフェクター機能を指すと理解される。
【００９３】
Ｆｃエフェクター機能の有意な増加は、典型的には、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性によって測定されるような、非修飾（野生型）形式の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％または５０％のＦｃエフェクター機能の増加を指すと理解される。
【００９４】
用語「糖鎖操作（ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」変異体は、抗体配列に関して、糖鎖操作の結果として、修飾された免疫原性特性、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを有するグリコシル化変異体を指すものとする。すべての抗体は、重鎖定常領域において、保存された位で炭水化物構造を含有し、各アイソタイプは、Ｎ連結炭水化物構造の異なるアレイを所持し、これはタンパク質アセンブリ、分泌または機能活性に多様に影響を及ぼす。ＩｇＧ１タイプの抗体は、各ＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に保存されたＮ連結グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に付着した２つの複雑な二分岐オリゴ糖は、ＣＨ２ドメインの間に包埋され、ポリペプチド主鎖との広範な接触を形成し、そしてその存在は、抗体が抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能を仲
介するために必須である。例えば、Ｎ２９７の例えばＡへの突然変異、またはＴ２９９を通じて、Ｎ２９７のＮ−グリカンを除去すると、典型的には、ＡＤＣＣが減少した無グリコシル化抗体形式が生じる。
【００９５】
抗体グリコシル化の大きな相違は細胞株間で生じ、そして異なる培養条件下で増殖する所定の細胞株に関してであってもわずかな相違が見られる。細菌細胞における発現は、典型的には、無グリコシル化抗体を提供する。テトラサイクリンが制御する、二分ＧｌｃＮＡｃの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）の発現を伴うＣＨＯ細胞は、改善されたＡＤＣＣ活性を有すると報告された（Ｕｍａｎａら，  １９９９，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １７：１７６−１８０）。宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換え産生中のグリコシル化に影響を及ぼす要因には、増殖様式、培地配合、培養密度、酸素添加、ｐＨ、精製スキーム等が含まれる。
【００９６】
用語「抗原結合部位」または「結合部位」は、抗原結合に関与する抗体部分を指す。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖および／または軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域、あるいはその可変ドメインのアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と称される、重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの非常に多様なストレッチは、フレームワーク領域として知られる、より保存された隣接ストレッチの間に挿入される。抗原結合部位は、結合するエピトープまたは抗原の三次元表面に相補的な表面を提供し、そして超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称される。ＣＤＲ中に取り込まれる結合部位は、本明細書において、また、「ＣＤＲ結合部位」とも称される。
【００９７】
用語「抗原」は、本明細書において、用語「ターゲット」または「ターゲット抗原」と交換可能に用いられ、全ターゲット分子または抗体結合部位によって認識されるこうした分子の断片を指すものとする。特に、免疫学的に適切である、一般的に「エピトープ」、例えばＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープと称される、抗原の部分構造、例えばポリペプチドまたは炭水化物構造は、こうした結合部位によって認識されうる。
【００９８】
用語「エピトープ」は、本明細書において、特に、抗体の結合部位に対する特異的結合パートナーを完全に構成してもよいし、または特異的結合パートナーの一部であってもよい、分子構造を指すものとする。エピトープは、炭水化物、ペプチド性構造、脂肪酸、有機、生化学的または無機物質またはその誘導体、およびその任意の組み合わせのいずれで構成されてもよい。エピトープが、ペプチド性構造、例えばペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質で構成される場合、通常、これには、少なくとも３アミノ酸、好ましくは５〜４０アミノ酸、そしてより好ましくは約１０〜２０の間のアミノ酸が含まれるであろう。エピトープは直鎖またはコンホメーションエピトープのいずれかであってもよい。直鎖エピトープは、ポリペプチドまたは炭水化物鎖の一次配列の単一セグメントで構成される。直鎖エピトープは近接していてもまたは重複していてもよい。コンホメーションエピトープは、ポリペプチドをフォールディングして、三次構造を形成することによって寄せ集められたアミノ酸または炭水化物で構成され、そしてアミノ酸は、直鎖配列においては、互いに必ずしも隣接しない。特に、そしてポリペプチド抗原に関しては、コンホメーションエピトープまたは不連続エピトープは、一次配列中では分離されているが、ポリペプチドが天然タンパク質／抗原にフォールディングした際には分子表面上の一貫した構造に集合する、２またはそれより多い分散したアミノ酸残基の存在によって特徴付けられる。
【００９９】
本明細書において、用語「エピトープ」は、特に、抗体に認識される単一のエピトープ、または各々、交差反応性抗体によって認識されるエピトープ変異体を含むエピトープ混合物を指すものとする。
【０１００】
特に、ＬｕｋＧＨ複合体をターゲティングする抗体によって認識されるエピトープは、ＬｕｋＧのＬｕｋＨへの結合によって形成される抗原性領域内に位置し、例えばＬｕｋＨおよびＬｕｋＧの両方と接触するタンパク質ドメイン、例えばリムまたはキャップドメインであるが、なおアクセス可能なドメイン上に位置し、そのため、本発明の抗体によって特に認識されるＬｕｋＧＨ複合体のエピトープは、溶液中で二量体またはオリゴマーを形成するよう複合体化された際に、ＬｕｋＧおよびＬｕｋＨ成分によって形成され、そして抗体によって結合されるために曝露されているかまたはアクセス可能である。
【０１０１】
特に、エピトープは、感受性細胞の受容体と、そうでなければ接触するタンパク質ドメイン上に位置し、そして可溶性ＬｕｋＧＨ複合体への抗体結合に際して、推定上の細胞受容体への可溶性ＬＵＫＧＨ複合体の結合を阻害する。したがって、ＬｕｋＧＨ複合体のこうしたエピトープに対して向けられる抗体は、受容体結合に競合して、ＬｕｋＧＨ複合体に結合するであろう。
【０１０２】
特に、エピトープは、可溶性ＬｕｋＧＨ複合体のみの上でアクセス可能であり、ＬｕｋＧＨが感受性細胞に結合した際にはアクセス可能でないタンパク質ドメイン上に位置する。
【０１０３】
用語「発現」は、以下のように理解される。発現産物、例えば本明細書に記載するような抗体の望ましいコード配列を含有する核酸分子、および作動可能であるように連結された制御配列、例えばプロモーターを、発現目的のために用いてもよい。これらの配列で形質転換されたかまたはトランスフェクションされた宿主は、コードされるタンパク質を産生可能である。形質転換を達成するため、発現系はベクター中に含まれていてもよい；が、適切なＤＮＡはまた宿主染色体内に組み込まれてもよい。特に、該用語は、例えばベクターによって所持され、そして宿主細胞に導入される、外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現のために適切な条件下にある、宿主細胞および適合するベクターを指す。
【０１０４】
コードＤＮＡは、例えば抗体のような特定のポリペプチドまたはタンパク質のための特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、コードＤＮＡの発現を開始するか、制御するか、あるいは別の方式で仲介するかまたは調節するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡおよびコードＤＮＡは、同じ遺伝子由来であってもよいし、または異なる遺伝子由来であってもよく、そして同じまたは異なる生物由来であってもよい。組換えクローニングベクターには、しばしば、クローニングまたは発現のための１またはそれより多い複製系、宿主における選択のための１またはそれより多いマーカー、例えば抗生物質耐性、および１またはそれより多い発現カセットが含まれるであろう。
【０１０５】
「ベクター」は、本明細書において、適切な宿主生物において、クローニングされた組換えヌクレオチド配列、すなわち組換え遺伝子の転写、およびそのｍＲＮＡの翻訳に必要な、ＤＮＡ配列と定義される。
【０１０６】
「発現カセット」は、定義される制限部位でベクター内に挿入可能な発現産物をコードする、ＤＮＡコード配列またはＤＮＡセグメントを指す。カセット制限部位は、適切なリーディングフレームでのカセットの挿入を確実にするよう設計される。一般的に、外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１またはそれより多い制限部位で挿入され、そして次いで、ベクターによって、伝達性ベクターＤＮＡとともに、宿主細胞内に運ばれる。挿入されたまたは付加されたＤＮＡを有するＤＮＡのセグメントまたは配列、例えば発現ベクターはまた、「ＤＮＡ構築物」とも称されうる。
【０１０７】
発現ベクターは発現カセットを含み、そしてさらに通常、宿主細胞またはゲノム組込み
部位における自立複製起点、１またはそれより多い選択可能マーカー（例えばアミノ酸合成遺伝子、あるいは抗生物質、例えばゼオシン、カナマイシン、Ｇ４１８またはハイグロマイシンに対する耐性を与える遺伝子）、いくつかの制限酵素切断部位、適切なプロモーター配列および転写終結因子を含み、これらの成分は、機能可能であるように共に連結される。用語「ベクター」には、本明細書において、自律性複製ヌクレオチド配列、ならびにゲノム組込みヌクレオチド配列が含まれる。ベクターの一般的なタイプは「プラスミド」であり、これは一般的に、さらなる（外来）ＤＮＡを容易に受け入れ可能であり、そして適切な宿主細胞内に容易に導入可能である、二本鎖ＤＮＡの自己完結型分子である。プラスミドベクターは、しばしば、コードＤＮＡおよびプロモーターＤＮＡを含有し、そして外来ＤＮＡを挿入するのに適した１またはそれより多い制限部位を有する。特に、用語「ベクター」または「プラスミド」は、宿主を形質転換し、そして導入した配列の発現（例えば転写および翻訳）を促進するように、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）が宿主細胞内に導入可能であるビヒクルを指す。
【０１０８】
用語「宿主細胞」は、本明細書において、特定の組換えタンパク質、例えば本明細書記載の抗体を産生するよう形質転換された一次対象細胞、およびその任意の子孫を指すものとする。すべての子孫が親細胞と正確に同一ではないが（計画的なまたは偶発性の突然変異、あるいは環境の相違による）、こうした改変された子孫は、子孫が元来形質転換された細胞のものと同じ機能性を保持する限り、これらの用語に含まれることが理解されなければならない。用語「宿主細胞株」は、組換え抗体などの組換えポリペプチドを産生する組換え遺伝子を発現するために用いられるような宿主細胞の細胞株を指す。用語「細胞株」は、本明細書において、長期間に渡って増殖する能力を獲得した、特定の細胞タイプの樹立されたクローンを指す。こうした宿主細胞または宿主細胞株を細胞培養中に維持し、そして／またはこれを培養して組換えポリペプチドを産生することも可能である。
【０１０９】
用語「ＬｕｋＧＨ複合体」は、本明細書において、１：１二量体、または任意の他の比のＬｕｋＧおよびＬｕｋＨ成分を含む、二量体またはオリゴマー、好ましくは少なくとも１つのＬｕｋＧおよび少なくとも１つのＬｕｋＨ成分、あるいは少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つのＬｕｋＧまたはＬｕｋＨ成分各々またはいずれか、あるいはＬｕｋＧおよびＬｕｋＨ成分の両方を含む複合体を指すものとする。ＬｕｋＧＨ二量体は、１つのＬｕｋＧおよび１つのＬｕｋＨ分子を含み、二量体複合体を形成するよう結合している、ＬｕｋＧＨ複合体と理解される。ＬｕｋＧＨ四量体は、２つのＬｕｋＧおよび２つのＬｕｋＨ分子を含み、四量体複合体を形成するよう結合している、ＬｕｋＧＨ複合体と理解される。ＬｕｋＧＨ六量体は、３つのＬｕｋＧおよび３つのＬｕｋＨ分子を含み、六量体複合体を形成するよう結合している、ＬｕｋＧＨ複合体と理解される。ＬｕｋＧＨ八量体は、４つのＬｕｋＧおよび４つのＬｕｋＨ分子を含み、八量体複合体を形成するよう結合している、ＬｕｋＧＨ複合体と理解される。三量体または五量体ＬｕｋＧＨ複合体は、典型的には、１：１とは異なる比、例えば１つのＬｕｋＧおよび２つのＬｕｋＨ分子、またはその逆を含み、三量体を形成するか、あるいは２つのＬｕｋＧおよび３つのＬｕｋＨ分子、またはその逆を含み、五量体を形成する。
【０１１０】
組成物、例えば、抗原またはエピトープを含む、本明細書において「免疫原」とも称される免疫原性組成物、あるいは本明細書に記載するようなワクチンに対する「免疫反応」は、関心対象の組成物またはワクチンに対する、細胞および／または抗体仲介性免疫反応の、宿主または被験体における発展である。通常、こうした反応は、関心対象の組成物またはワクチン中に含まれる単数または複数の抗原に対して特異的に向けられる、被験体が産生する抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞からなる。
【０１１１】
「防御免疫反応」は、非免疫集団のものに比較して、誘導されたかまたは天然の感染ま
たは毒素曝露の、有意により優れた結果を提供する免疫反応と理解される。毒素に対する防御免疫反応は、主に、高いアフィニティを有する、例えば１０−８Ｍ未満のＫｄを持つ中和抗体によって仲介される。毒素中和の利点は、ターゲット細胞の保護および炎症の防止である。Ｆｃ仲介性免疫複合体形成は、循環から毒素を除去する（ＲＥＳ細胞を介する）ことによってもまた寄与しうる。
【０１１２】
免疫原または免疫原性組成物は、通常、抗原またはエピトープおよびキャリアーを含み、キャリアーは特にアジュバントを含んでもよい。用語「アジュバント」は、抗原と組み合わせて投与された際、抗原に対する免疫反応を増大し、そして／または再指示するが、単独で投与された際には、抗原に対する免疫反応を生じない化合物を指す。アジュバントは、リンパ球補充、Ｂおよび／またはＴ細胞刺激、ならびにマクロファージ刺激を含む、いくつかの機構によって、免疫反応を増大させうる。例示的なキャリアーは、リポソームまたは陽イオン性ペプチドであり；例示的なアジュバントは、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム、ＭＦ５９またはＣｐＧオリゴヌクレオチドである。
【０１１３】
用語「単離された」または「単離」は、本明細書において、核酸、抗体または他の化合物に関して、「実質的に純粋な」型で存在するように、こうした化合物が天然に会合するであろう環境から十分に分離されている化合物を指すものとする。「単離された」は、他の化合物または物質との人工的なまたは合成混合物、あるいは基本的活性に干渉せず、そして例えば不完全な精製のために存在しうる不純物の存在の排除を必ずしも意味しない。特に、本発明の単離された核酸分子はまた、化学的に合成されたものも含むよう意図される。
【０１１４】
本発明の核酸に関連して、用語「単離された核酸」が時に用いられる。この用語は、ＤＮＡに適用された際、由来する生物の天然存在ゲノムにおいて直ちに隣接する配列から分離されたＤＮＡ分子を指す。例えば、「単離された核酸」は、ベクター、例えばプラスミドまたはウイルスベクター内に挿入されたか、あるいは原核または真核細胞または宿主生物のゲノムＤＮＡ内に組み込まれたＤＮＡ分子を含むことも可能である。ＲＮＡに適用された際、用語「単離された核酸」は、主に、上に定義するような単離されたＤＮＡ分子にコードされるＲＮＡ分子を指す。あるいは、該用語は、天然状態で（すなわち細胞または組織において）会合するであろう他の核酸から十分に分離されているＲＮＡ分子を指すことも可能である。「単離された核酸」（ＤＮＡまたはＲＮＡいずれか）は、さらに、生物学的または合成的手段によって直接産生され、そしてその産生中に存在する他の成分から分離されている分子を指すことも可能である。
【０１１５】
ポリペプチドまたはタンパク質、例えば本発明の抗体またはエピトープに関連して、用語「単離された」は、特に、例えば天然環境において、あるいはこうした調製がｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施される組換えＤＮＡ技術による場合、調製される環境（例えば細胞培養）において、ともに見られる他の化合物などの、天然に会合している物質を含まないかまたは実質的に含まない、化合物を指す。単離された化合物を、希釈剤またはアジュバントとともに配合してもよく、そしてなお、単離される実際的な目的のため、例えば、診断または療法に用いる際には、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを薬学的に許容されうるキャリアーまたは賦形剤と混合してもよい。
【０１１６】
特に、本発明の単離ＬｕｋＧＨ複合体は、生理学的表面、例えばＬｕｋＧおよびＬｕｋＨが固定されて、こうしたＬｕｋＧＨ二成分毒素による細胞溶解に感受性である細胞の表面上に、孔形成性ＬｕｋＧＨ二成分毒素を形成するであろう細胞表面から単離される。
【０１１７】
用語「中和性」または「中和」は、本明細書において、最も広い意味で用いられ、そして中和が達成される機構に関わらず、病原体、例えば黄色ブドウ球菌に、被験体が感染す
るのを阻害するか、または病原体が強力なタンパク質毒素を産生することによって感染を促進するのを阻害するか、または毒素が被験体においてターゲット細胞を損傷するのを阻害する、任意の分子を指す。中和は、例えば、ターゲット細胞上の同族受容体と黄色ブドウ球菌毒素（単数または複数）の結合および／または相互作用を阻害する抗体によって、達成可能である。特定の態様において、本明細書記載の抗体は、毒素活性を中和させることも可能であり、ここで、毒素およびターゲット細胞、例えば赤血球の間の相互作用のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果は、減少するかまたは排除される。中和はさらに、活性毒素の形成を阻害することによって、例えば黄色ブドウ球菌二成分細胞溶解素の場合、ＳおよびＦ成分の結合、または細胞膜におけるオリゴマー性孔の形成の阻害によって、起こることも可能である。
【０１１８】
細胞溶解性毒素に対する抗体の中和能は、典型的には、所定の毒素に感受性である細胞の増加した生存度または機能性を測定することによって、標準アッセイにおいて決定される。中和は、抗体を含むおよび含まない生存細胞のパーセントによって表されうる。非常に強力な抗体に関しては、中和強度を表す好ましい方式は、抗体／毒素モル比であり、ここで、より低い値はより高い強度に対応する。１未満の値は非常に高い強度を定義する。
【０１１９】
用語「交差中和性」は、本明細書において、ＵＳＡ３００クローンのＬｕｋＧＨ複合体および少なくとも１つのＬｕｋＧＨ変異体を含む、ＬｕｋＧＨ複合体の主要な変異体の中和を指すものとする。
【０１２０】
用語「黄色ブドウ球菌」または「Ｓ．アウレウス」または「病原性黄色ブドウ球菌」は、以下のように理解される。黄色ブドウ球菌細菌は、通常、人間および動物の皮膚上または鼻中に見られる。該細菌は、切り傷または他の創傷を通じて体内に進入しない限り、一般的には無害である。典型的には、感染は、健康な人々においては、重要でない皮膚の問題である。歴史的には、感染は、広域抗生物質、例えばメチシリンによって治療された。しかし、現在、メチシリンおよび他のベータ−ラクタム抗生物質、例えばペニシリンおよびセファロスポリンに耐性である特定の株が出現してきている。これらはメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（また、多剤耐性黄色ブドウ球菌、または「ＭＲＳＡ」としても知られる）と称される。
【０１２１】
ＭＲＳＡを含む黄色ブドウ球菌感染は、一般的には、面疱、おできまたはクモの咬傷に似た小さな赤い隆起として始まる。これらの隆起または傷（ｂｌｅｍｉｓｈｅｓ）は、急速に、外科的排出を必要とする、深く有痛性の膿瘍に変わりうる。細菌は時に皮膚に限定されたままである。場合によって、これらは体の深部へと掘り進み、皮膚、軟組織、骨、関節、外科的創傷、血流、心臓弁、肺、または他の臓器を含む、広い範囲のヒト組織において、潜在的に生命の危険を伴う感染を引き起こしうる。したがって、黄色ブドウ球菌感染は、潜在的に致死性の疾患、例えば壊死性筋膜炎、心内膜炎、敗血症、毒素性ショック症候群、および壊死性肺炎を含む多様な型の肺炎、ならびにフルンケル症およびカルブンケル症における毒素産生である、関連する疾患状態を生じうる。ＭＲＳＡ感染は、患者が開放性創傷、侵襲性デバイス、および弱った免疫系のリスクにあるか、またはこうしたものに対する傾向があり、そしてしたがって、一般社会よりも感染のリスクがより大きい、病院または老人ホーム設定においては、特に厄介である。
【０１２２】
黄色ブドウ球菌毒素を中和する抗体は、病原体および病原性反応に干渉し、したがって、感染を限定するかまたは防止し、そして／またはこうした感染から生じる疾患状態を寛解させるか、あるいは黄色ブドウ球菌病変形成、特に肺炎病変形成を阻害することが可能である。これに関連して、「防御抗体」は、本明細書において、能動免疫または受動免疫において観察される感染性病原体に対する免疫を担う中和抗体と理解される。特に、本明細書に記載するような防御抗体は、分泌される病原性因子（外毒素）の毒性効果（例えば
細胞溶解、ターゲット細胞による炎症誘発性サイトカイン発現の誘導）を中和することが可能であり、そしてしたがって、黄色ブドウ球菌の病変形成能に干渉する。
【０１２３】
用語「組換え」は、本明細書において、「遺伝子操作によって調製されるかまたは遺伝子操作の結果」を意味するものとする。組換え宿主は、特に、発現ベクターまたはクローニングベクターを含むか、あるいは特に宿主に対して外来性であるヌクレオチド配列を使用して、組換え核酸配列を含有するよう遺伝子操作されている。組換えタンパク質は、宿主においてそれぞれの組換え核酸を発現することによって産生される。用語「組換え抗体」には、本明細書において、組換え手段によって調製されるか、発現されるか、生成されるか、または単離される抗体、例えば（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックであるかまたはトランス染色体性（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）である動物（例えばマウス）あるいはそこから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアル・ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う、任意の他の手段によって調製されるか、発現されるか、生成されるかまたは単離される抗体が含まれる。こうした組換え抗体は、例えば抗体成熟中に生じる再編成および突然変異を含むよう操作される抗体を含む。
【０１２４】
本明細書において、用語「特異性」または「特異的結合」は、分子の不均一集団において、関心対象の同族リガンドの決定要因である結合反応を指す。したがって、明示される条件（例えばイムノアッセイ条件）下で、抗体は，特定のターゲットに特異的に結合し、そして試料中に存在する他の分子には、有意な量では結合しない。特異的結合は、結合が、選択されるように、ターゲット同一性、高い、中程度または低い結合アフィニティまたはアビディティに関して選択性であることを意味する。選択的結合性は、通常、結合定数または結合動力学が少なくとも１０倍異なる場合、好ましくは相違が少なくとも１００倍である場合、そしてより好ましくは少なくとも１０００倍である場合、達成される。
【０１２５】
該用語はまた、例えば抗体が、いくつかの抗原に交差反応性である特定のエピトープに特異的である場合にも適用可能であり、この場合、特異的抗体は、交差反応性エピトープを所持する多様な抗原に結合可能であろう。抗体のこうした結合部位または交差反応性エピトープに結合する特異性を持つ抗体はまた、それぞれ、多重特異性または交差特異性結合部位および抗体とも称される。例えば、抗体は、エピトープ内の配列相同性および／または構造的類似性を持ち、本質的に同じ構造のコンホメーションエピトープを提供する、多くの異なる抗原と交差反応性である、例えば少なくとも黄色ブドウ球菌のＨｌａおよび二成分毒素に交差反応性であるエピトープに特異的に結合する、多重特異性結合部位を有してもよい。
【０１２６】
交差反応性結合配列に抗体が示す、抗体の免疫特異性、その結合能および付随するアフィニティは、抗体が免疫反応する（結合する）交差反応性結合配列によって決定される。交差反応性結合配列特異性は、少なくとも部分的に、抗体の免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸残基によって、および／または軽鎖可変領域アミノ酸残基配列によって、定義されうる。
【０１２７】
用語「同じ特異性を有する」、「同じ結合部位を有する」または「同じエピトープに結合する」の使用は、同等のモノクローナル抗体が、同じまたは本質的に同じ、すなわち類似の免疫反応（結合）特性を示し、そしてあらかじめ選択されたターゲット結合配列への結合に関して競合することを示す。特定のターゲットに対する抗体分子の相対的特異性は、競合アッセイによって、例えばＨａｒｌｏｗら，  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８８に記載されるように、相対的に決定可能である。
【０１２８】
用語「被験体」は、本明細書において、温血哺乳動物、特にヒトまたは非ヒト動物を指すものとする。ＭＲＳＡは、非常に重要なヒト病原体であり、これはまた、獣医学においても新たに発生している懸念である。該細菌は、広い範囲の非ヒト動物種に存在する。したがって、用語「被験体」はまた、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタおよび家禽を含む動物もまた特に指す可能性もある。特に、本発明の医学的使用またはそれぞれの治療法は、黄色ブドウ球菌感染に関連する疾患状態の予防または治療が必要な被験体に適用される。被験体は、黄色ブドウ球菌感染のリスクがあるか、あるいは初期または後期疾患を含む疾患を患っている患者であってもよい。用語「患者」には、予防的または療法的治療のいずれかを受けているヒトおよび他の哺乳動物被験体が含まれる。用語「治療」は、したがって、予防的および療法的治療の両方を含むよう意図される。
【０１２９】
被験体は、例えば、黄色ブドウ球菌疾患状態の予防または療法のために治療される。特に、感染の、あるいはこうした疾患または疾患再発を発展させるかいずれかのリスクがある被験体、あるいはこうした感染および／またはこうした感染に関連する疾患を患う被験体が治療される。
【０１３０】
特に、用語「予防」は、病変形成の開始の防止または病変形成のリスクを減少させる予防的手段を含むよう意図される、防御手段を指す。
【０１３１】
特に、本明細書に記載するような被験体における疾患状態を治療するか、防止するか、または遅延させるための方法は、状態の原因病原体としての黄色ブドウ球菌の病変形成に干渉することにより、ここで病変形成には、例えば特定の病原性因子または毒素による、被験体の細胞膜上に孔を形成する工程が含まれる。
【０１３２】
黄色ブドウ球菌の病原性は、細菌が真核細胞膜に接着することを可能にする表面会合タンパク質、オプソニン化貪食作用から細菌を保護する莢膜多糖類、およびいくつかの外毒素を含む、多くの病原性因子の組み合わせによる。黄色ブドウ球菌は、主に、分泌される病原性因子、例えば溶血素、エンテロトキシンおよび毒素性ショック症候群毒素の産生を通じて疾患を引き起こす。これらの分泌される病原性因子は、宿主における多くの免疫学的機構を不活性化させることによって、免疫反応を抑制し、そして組織破壊を引き起こし、そして感染確立を補助する。後者は、孔形成毒素群によって達成され、このうち最も顕著なものが、黄色ブドウ球菌肺炎の重要な病原性因子であるＨｌａである。
【０１３３】
黄色ブドウ球菌は、この細菌が異なる種類の免疫細胞、特に体の一次防御系を構成する白血球の下位集団による攻撃を中和し、そしてこれに抵抗することを可能にする、多様なアレイのさらなる病原性因子および毒素を産生する。これらの病原性因子および毒素の産生は、黄色ブドウ球菌が感染状態を維持することを可能にする。これらの病原性因子のうち、黄色ブドウ球菌は、いくつかの二成分ロイコトキシンを産生し、これは、２つの関連しないタンパク質またはサブユニットの相乗作用によって、宿主防御細胞および赤血球の膜を損傷する。これらの二成分毒素のうち、ガンマ溶血素（ＨｌｇＡＢおよびＨｌｇＣＢ）およびパントン−バレンタイン・ロイコシジン（ＰＶＬ）が最もよく特徴付けられている。
【０１３４】
哺乳動物細胞に対するロイコシジンの毒性は、二成分の作用を伴う。最初のサブユニットはクラスＳ成分と称され、そして第二のサブユニットはクラスＦ成分と称される。ＳおよびＦサブユニットは相乗的に作用して、単球、マクロファージ、樹状細胞および好中球（集合的に、食細胞として知られる）を含む白血球上に孔を形成する。黄色ブドウ球菌に
よって産生される二成分ロイコトキシンのレパートリーは、ＦおよびＳ成分の同族および非同族対、例えばＬｕｋＧＨを含むことが知られる。
【０１３５】
用語「実質的に純粋」または「精製された」は、本明細書において、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の化合物、例えば核酸分子または抗体を含む調製物を指すものとする。純度は、化合物に適した方法によって測定される（例えばクロマトグラフィ法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析等）。
【０１３６】
用語「療法的に有効な量」は、本明細書において、用語、化合物、例えば本発明の抗体または免疫原の「有効量」または「十分量」のいずれとも交換可能に用いられ、被験体に投与された際、有益なまたは望ましい、臨床的な結果を含む結果を達成するのに十分な量または活性であり、そしてこうしたものとして、有効量またはその同義語は、適用される背景に応じる。
【０１３７】
有効量は、こうした疾患または障害を治療するか、防止するかまたは阻害するのに十分である化合物の量を意味するよう意図される。疾患の背景において、本明細書に記載するような抗体の療法的有効量は、特に、黄色ブドウ球菌または黄色ブドウ球菌病変形成の阻害から利益を受ける、疾患または状態を治療するか、調節するか、減弱させるか、逆転させるか、または影響を及ぼすように用いられる。
【０１３８】
こうした有効量に対応するであろう化合物の量は、多様な要因、例えば所定の薬剤または化合物、薬学的配合物、投与経路、疾患または障害のタイプ、治療される被験体または宿主の同一性等に応じて多様であろうが、にもかかわらず、当業者によってルーチンに決定可能である。
【０１３９】
本発明の抗体または免疫原を予防的に用いて、黄色ブドウ球菌感染の開始を阻害するか、または黄色ブドウ球菌感染、特に抵抗性であることが知られるＭＲＳＡなどの黄色ブドウ球菌感染、または特定の被験体の場合、他の慣用的な抗生物質療法での治療に抵抗性であることが立証されているものを治療することも可能である。
【０１４０】
治療の必要があるヒト患者に提供されるような、本明細書記載の抗体の療法的有効量は、特に、０．５〜５００ｍｇ、好ましくは１〜４００ｍｇ、さらにより好ましくは最大３００ｍｇ、最大２００ｍｇ、最大１００ｍｇまたは最大１０ｍｇの範囲であることも可能であるが、例えば、急性疾患状態を治療するために、より高い用量が示されうる。
【０１４１】
さらに、療法的有効量の本発明の抗体での被験体の治療または防止投与計画は、単回投与からなることも可能であるし、あるいは一連の適用を含んでもよい。例えば、抗体を少なくとも１年に１回、少なくとも半年に１回または少なくとも１ヶ月に１回投与してもよい。しかし、別の態様において、所定の治療のため、週あたり約１回からほぼ毎日の投与で、抗体を被験体に投与してもよい。治療期間の長さは、多様な要因、例えば疾患の重症度、急性または慢性疾患であるか、患者の年齢、抗体形式の濃度および活性に応じる。治療または予防に用いられる有効投薬量は、特定の治療または予防投与計画の経過に渡って増加させてもまたは減少させてもよいこともまた、認識されるであろう。投薬量変化は、当該技術分野に知られる標準的診断アッセイによって生じ、そして明らかになりうる。いくつかの例では、長期投与が必要でありうる。
【０１４２】
黄色ブドウ球菌感染と関連する疾患状態を発展させるリスクがある患者に提供されるものなどの、本明細書に記載するような免疫原の有効量は、特に、用量あたり、１〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲であることも可能である。
【０１４３】
例えば、プライム−ブースト免疫スキームにしたがって、免疫原を最初の用量として投与して、その後、特定の時間枠内で、１またはそれより多いブースター用量（単数または複数）を投与して、黄色ブドウ球菌感染に対する長期持続性の有効な免疫反応を誘導してもよい。好ましいワクチン接種スケジュールは、３回の用量、例えば第０日の最初の用量、第５〜４０日の第二の用量、および第１０〜１００日の第三の用量、好ましくは第０日、第２８日および第９０日の投与を含むであろう。好ましい加速スケジュールにしたがって、投与は第０日、第７日および第１４日であってもよい。加速スケジュールは、予防のため、例えば待機手術に直面している患者のために示されうる。通常、ミョウバンがアジュバントとして、例えばリン酸塩または水酸化物として、用いられる。
【０１４４】
本発明の好ましい抗体は、前記ＬｕｋＧＨ複合体抗原に、高いアフィニティで、特に高いオンおよび／または低いオフ速度で、あるいは結合の高いアビディティで、特異的に結合する。抗体の結合アフィニティは、通常、解離定数（ＫｄまたはＫＤ）として知られる、抗原結合部位の半数が占有される抗体濃度に関して特徴付けられる。通常、結合剤は、Ｋｄ＜１０−８Ｍ、好ましくはＫｄ＜１０−９Ｍの高アフィニティ結合剤と見なされ、さらにより好ましくはＫｄは＜１０−１０Ｍである。
【０１４５】
にもかかわらず、特定の好ましい態様において、抗原結合アフィニティは、例えば少なくとも２つの抗原に結合する際、例えば１０−６未満であり、そして最大１０−８ＭであるＫｄで、中程度のアフィニティである。
【０１４６】
本発明にしたがって、好ましくは、必要であればアフィニティ成熟プロセスと組み合わせて、中程度のアフィニティの結合剤を提供してもよい。
【０１４７】
アフィニティ成熟は、ターゲット抗原に対して増加したアフィニティを持つ抗体が産生されるプロセスである。本明細書に開示する、本発明の多様な態様にしたがって、アフィニティ成熟抗体を生成するため、当該技術分野で入手可能なアフィニティ成熟ライブラリーを調製し、そして／または用いる、任意の１またはそれより多い方法を使用してもよい。例示的なこうしたアフィニティ成熟法および使用、例えばランダム突然変異誘発、細菌ミューテーター株継代、部位特異的突然変異誘発、突然変異ホットスポットターゲティング、簡潔（ｐａｒｓｉｍｏｎｉｏｕｓ）突然変異誘発、抗体シャフリング、軽鎖シャフリング、重鎖シャフリング、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ１突然変異誘発、ならびに本明細書に開示する本発明の多様な態様にしたがった方法および使用の実施を受け入れ可能なアフィニティ成熟ライブラリーを産生し、そして用いる方法には、例えば：Ｐｒａｓｓｌｅｒら（２００９）；  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，  Ｖｏｌ．  １（４），  ｐｐ．
５７１−５８３；  Ｓｈｅｅｄｙら（２００７），  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ａｄｖ．，  Ｖｏｌ．  ２５（４），  ｐｐ．  ３３３−３５２；  ＷＯ２０１２／００９５６８；  ＷＯ２００９／０３６３７９；  ＷＯ２０１０／１０５２５６；  ＵＳ２００２／０１７７１７０；  ＷＯ２００３／０７４６７９に開示されるものが含まれる。
【０１４８】
アミノ酸突然変異誘発、または免疫グロブリン遺伝子セグメントにおける体細胞突然変異の結果を含む、抗体の構造変化と共に、抗原に対する結合部位の変異体を産生し、そしてより高いアフィニティに関して選択する。アフィニティ成熟抗体は、親抗体より数対数倍（ｌｏｇｆｏｌｄ）大きいアフィニティを示しうる。単一の親抗体をアフィニティ成熟に供してもよい。ターゲット抗原に対して類似の結合アフィニティを持つ抗体の別のプールは、アフィニティ成熟単一抗体またはこうした抗体のアフィニティ成熟プールを得るために変動する親構造と見なされうる。
【０１４９】
本発明記載の抗体の好ましいアフィニティ成熟変異体は、結合アフィニティの少なくと
も１０倍増加、好ましくは少なくとも１００倍増加を示す。親分子のそれぞれのライブラリーを使用する選択キャンペーンの経過において、結合アフィニティＫｄ＜１０−８Ｍの特異的ターゲット結合特性を有する本発明の抗体を得るため、中程度の結合アフィニティを有する抗体いずれかとともにアフィニティ成熟を使用してもよい。あるいは、本発明にしたがった抗体のアフィニティ成熟によって、アフィニティをさらにより増加させて、１０−９Ｍ未満、好ましくは１０−１０Ｍ未満、またはさらに１０−１１Ｍ未満、最も好ましくはピコモル範囲のＫｄに対応する高い値を得ることも可能である。
【０１５０】
補体の活性化を使用する別の経路を通じて、食作用エフェクター細胞を活性化してもよい。微生物上の表面抗原に結合する抗体は、Ｆｃ領域との補体カスケードの最初の成分を誘引し、そして「古典的」補体系の活性化を開始する。これらは、食作用エフェクター細胞の刺激を生じ、これは最終的に、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）によってターゲットを殺す。
【０１５１】
特異的な態様にしたがって、本発明の抗体は、標準的ＡＤＣＣまたはＣＤＣアッセイにおいて測定されるように、免疫エフェクター細胞の存在下で、細胞傷害活性を有する。対照に比較した際、細胞溶解の割合に有意な増加があれば、ＡＤＣＣまたはＣＤＣアッセイのいずれかによって決定されるような細胞傷害活性を、本発明の抗体に関して示してもよい。ＡＤＣＣまたはＣＤＣに関連する細胞傷害活性は、好ましくは、絶対パーセント増加として測定され、これは好ましくは５％より高く、より好ましくは１０％より高く、さらにより好ましくは２０％より高い。
【０１５２】
抗体ライブラリー、例えば酵母ディスプレイ抗体ライブラリーから抗体を選択するために本発明のＬｕｋＧＨ複合体を用いてもよい。
【０１５３】
望ましい中和特性を持つ抗体を同定するためのスクリーニング法は、ターゲット細胞への毒素結合の阻害、二量体またはオリゴマー形成の阻害、孔形成の阻害、細胞溶解の阻害、サイトカイン、リンホカイン、および任意の炎症誘発性シグナル伝達の誘導の阻害、ならびに／あるいは動物に対するｉｎ  ｖｉｖｏ効果（死亡、溶血、オーバーシュート炎症、臓器不全）の阻害であってもよい。例えば標準アッセイを用いて、望ましい毒素への直接結合、または別個のＬｕｋＧまたはＬｕｋＨ（単量体）抗原の結合に比較したＬｕｋＧＨ複合体への示差的結合に基づいて、反応性を評価してもよい。
【０１５４】
ひとたび望ましい特性を持つ抗ＬｕｋＧＨ抗体が同定されたら、抗体によって認識される単数または複数のドミナントエピトープを決定してもよい。エピトープマッピングのための方法が、当該技術分野に周知であり、そして例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＷｅｓｔｗｏｏｄおよびＨａｙ監修，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１に開示される。
【０１５５】
エピトープマッピングは、抗体が結合するエピトープの同定に関する。タンパク質上のエピトープの位置を決定するために当業者に知られる多くの方法があり、これには、抗体−抗原複合体の結晶学分析、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチドに基づくアッセイが含まれる。参照抗体と「同じエピトープに結合する」抗体は、本明細書において、以下の方式で理解される。２つの抗体が、同一であるかまたは立体的に重複するエピトープを認識する場合、抗体は、同じまたは本質的に同じ、あるいは実質的に同じエピトープと結合すると称される。２つの抗体が、同一のまたは立体的に重複するエピトープに結合するかどうかを決定するための、一般的に用いられる方法は、競合アッセイであり、該方法は、標識抗原または標識抗体のいずれかを用いて、多くの異なる形式のすべてに設置可能である。通常、抗原を９６ウェルプレート上に固定して、そして放射性または酵素標識を用いて、非標識抗体が、標識抗体の結合を遮断する能力を測定する。
【０１５６】
ひとたび、望ましい交差中和特性を持つ抗体が同定されたら、抗体断片を含むこうした抗体を、当該技術分野に周知の方法によって産生させることも可能であり、例えば、こうした方法には、ハイブリドーマ技術または組換えＤＮＡ技術が含まれる。
【０１５７】
ハイブリドーマ法において、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターを免疫して、免疫に用いたタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を産生するかまたは産生することが可能なリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫してもよい。次いで、適切な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する。
【０１５８】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培地を、抗原に対して向けられるモノクローナル抗体の産生に関してアッセイする。好ましくは、免疫沈降によって、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を決定する。
【０１５９】
組換えモノクローナル抗体は、例えば、必要な抗体鎖をコードするＤＮＡを単離し、そして周知の組換え発現ベクター、例えば抗体配列をコードするヌクレオチド配列を含む本発明のプラスミドまたは発現カセット（単数または複数）を用いて、発現のためのコード配列で、組換え宿主細胞をトランスフェクションすることによって産生可能である。組換え宿主細胞は、上に記載するものなどの原核および真核細胞であることも可能である。
【０１６０】
特定の側面にしたがって、遺伝子操作のためにヌクレオチド配列を用いて、抗体をヒト化するか、あるいは抗体のアフィニティまたは他の特性を改善することも可能である。例えば、抗体を臨床試験およびヒトにおける治療に用いる場合、定常領域を操作して、免疫反応を回避するために、ヒト定常領域により似せてもよい。抗体配列を遺伝子操作して、ターゲット毒素に対するより高いアフィニティおよび黄色ブドウ球菌に対するより高い有効性を得ることが望ましい可能性もある。当業者には、１またはそれより多いポリヌクレオチド変化を抗体に作製して、そしてなお、ターゲット毒素に対する結合能を維持することが可能であることが明らかであろう。
【０１６１】
多様な手段による抗体分子産生は、一般的によく理解される。米国特許６３３１４１５（Ｃａｂｉｌｌｙら）は、例えば、単一細胞において、単一のベクターから、または２つの別個のベクターから、同時に重鎖および軽鎖が発現される、抗体の組換え産生のための方法を記載する。Ｗｉｂｂｅｎｍｅｙｅｒら（１９９９，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４３０（２）：１９１−２０２）、ならびにＬｅｅおよびＫｗａｋ（２００３，  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０１  ：１８９−１９８）は、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の別個の培養において発現されるプラスミドを用いた、別個に産生される重鎖および軽鎖からのモノクローナル抗体の産生を記載する。抗体産生に適した多様な他の技術は、例えば、Ｈａｒｌｏｗら，  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  （１９８８）に提供される。
【０１６２】
別の側面において、本発明は、本発明の組換え抗体の産生のためにコードする配列を含む単離核酸を提供する。
【０１６３】
別の側面において、本発明は、本発明の組換えエピトープの産生のためにコードする配列を含む単離核酸、または本発明のこうしたエピトープを含む分子を提供する。しかし、
本発明のエピトープはまた、例えば当該技術分野に周知の合成法のいずれかを通じて、合成的に産生されてもよい。
【０１６４】
核酸をコードする抗体またはエピトープは、任意の適切な特性を有し、そして任意の適切な特徴またはその組み合わせを含むことも可能である。したがって、例えば、抗体またはエピトープをコードする核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそのハイブリッドの形であってもよく、そしてこれには、非天然存在塩基、修飾主鎖、例えば核酸の安定性を促進するホスホロチオエート主鎖、またはその両方が含まれてもよい。核酸は、好適には、ターゲット宿主細胞（単数または複数）における望ましい発現、複製、および／または選択を促進する特徴を含む、本発明の発現カセット、ベクターまたはプラスミド中に取り込まれてもよい。こうした特徴の例には、複製起点成分、選択遺伝子成分、プロモーター成分、エンハンサー要素成分、ポリアデニル化配列成分、終結成分等が含まれてもよく、これらの多くの適切な例が知られる。
【０１６５】
本開示はさらに、１またはそれより多い本明細書記載のヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ構築物を提供する。これらの組換え構築物を、任意の開示する抗体をコードするＤＮＡ分子が挿入されているベクター、例えばプラスミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターと組み合わせて用いる。
【０１６６】
培養中の連続細胞株によって抗体分子を産生する任意の方法を用いて、モノクローナル抗体を産生する。モノクローナル抗体を調製するために適した方法の例には、Ｋｏｈｌｅｒらのハイブリドーマ法（１９７５，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，  １９８４，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３３：３００１；およびＢｒｏｄｅｕｒら，  １９８７，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），
ｐｐ．  ５１−６３）が含まれる。
【０１６７】
本発明はさらに、本明細書に記載するような抗体または免疫原および薬学的に許容されうるキャリアーまたは賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。これらの医薬組成物を、ボーラス注射または注入として、あるいは連続注入によって、本発明にしたがって投与してもよい。投与のこうした手段を促進するために適した薬学的キャリアーが当該技術分野に周知である。
【０１６８】
薬学的に許容されうるキャリアーには、一般的に、本発明によって提供される抗体または関連組成物または組み合わせと生理学的に適合する、あらゆる適切な溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。薬学的に許容されうるキャリアーのさらなる例には、無菌水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、ならびにそのいずれかの組み合わせが含まれる。
【０１６９】
１つのこうした側面において、抗体を、所望の投与経路に適した１またはそれより多いキャリアーと組み合わせてもよく、抗体を、例えば、ラクトース、スクロース、デンプン、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム塩、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリジン、ポリビニルアルコールのいずれかと混合してもよく、そして場合によって、慣用的投与のため、さらに錠剤化する（ｔａｂｌｅｔｔｅｄ）かまたは被包してもよい。あるいは、抗体を、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド性溶液、エタノール、コーン油、ピーナツ油、綿実油、ゴマ油、トラガカントゴム、および
／または多様な緩衝剤中に溶解してもよい。他のキャリアー、アジュバント、および投与様式は、薬学業において周知である。キャリアーには、徐放物質または時間遅延物質、例えばモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルのみ、またはワックスと合わせたもの、あるいは当該技術分野に周知の他の物質が含まれてもよい。
【０１７０】
さらなる薬学的に許容されうるキャリアーが当該技術分野に知られ、そして例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳに記載される。液体配合物は、溶液、エマルジョンまたは懸濁物であることも可能であり、そしてこれには、懸濁剤、可溶化剤、界面活性剤、保存剤、およびキレート剤などの賦形剤が含まれてもよい。
【０１７１】
本発明の抗体または免疫原および１またはそれより多い療法活性剤が配合される医薬組成物が意図される。望ましい度合いの純度を有する前記免疫グロブリンを、場合によって薬学的に許容されうるキャリアー、賦形剤または安定化剤と、凍結乾燥配合物または水溶液の形で混合することによって、本発明の抗体または免疫原の安定配合物を保存のために調製する。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に用いようとする配合物は、特に、無菌であり、好ましくは無菌水溶液の形である。これは、無菌濾過膜または他の方法を通じた濾過によって容易に達成される。本明細書に開示する抗体および他の療法活性剤はまた、イムノリポソームとして配合され、そして／または微小カプセル中に捕捉されることも可能である。
【０１７２】
本発明の抗体または免疫原を含む医薬組成物の投与を、経口、皮下、静脈内、鼻内、耳内（ｉｎｔｒａｏｔｉｃａｌｌｙ）、経皮、粘膜、例えばジェル、軟膏（ｓａｌｖｅｓ）、ローション、クリーム等で局所、腹腔内、筋内、例えば吸入技術または肺送達系を使用して肺内、経膣、非経口、直腸、または眼内を含む多様な経路で行ってもよい。
【０１７３】
非経口投与に用いられるような例示的な配合物には、例えば無菌溶液、エマルジョンまたは懸濁物のような、皮下、筋内または静脈内注射に適したものが含まれる。
【０１７４】
１つの態様において、本発明の抗体または免疫原は、例えば疾患を修飾するかまたは防止する単一療法として、被験体に投与される、唯一の療法活性剤である。
【０１７５】
あるいは、本発明の抗体または免疫原を、限定されるわけではないが、標準的治療、例えば抗生物質、炎症のステロイドおよび非ステロイド阻害剤、および／または例えば抗細菌または抗炎症剤を使用する、他の抗体に基づく療法を含めて、１またはそれより多い他の療法剤または予防剤と組み合わせて投与する。
【０１７６】
併用療法は、特に、例えばＭＲＳＡ感染を治療するために用いられるような、標準的な投与計画を使用する。これには、抗生物質、例えばチゲサイクリン、リネゾリド、メチシリンおよび／またはバンコマイシンが含まれうる。
【０１７７】
併用療法において、抗体を混合物として、あるいは１またはそれより多い他の療法投与計画と組み合わせて、例えば同時療法の前に、同時に、または後にのいずれかで投与してもよい。
【０１７８】
いくつかの場合、免疫原の予防的投与は、本発明の免疫原を含むワクチン、すなわち一価ワクチンを使用してもよい。にもかかわらず、同じまたは異なるターゲット病原体に対する免疫反応を誘導するため、異なる免疫原を含む多価ワクチンを使用してもよい。
【０１７９】
本発明の抗体、免疫原またはそれぞれの薬学的調製物の生物学的特性を、細胞、組織、および全生物実験において、ｅｘ  ｖｉｖｏで特徴付けてもよい。当該技術分野に知られ
るように、薬剤はしばしば、疾患または疾患モデルに対する治療に関する薬剤の有効性を測定するため、あるいは薬剤の薬物動態学、薬力学、毒性、および他の特性を測定するため、限定されるわけではないが、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、およびサルを含む動物において、ｉｎ  ｖｉｖｏで試験される。動物は、疾患モデルと称されることも可能である。療法剤は、しばしば、限定されるわけではないが、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植マウス、およびトランスジェニックマウス（ノックインおよびノックアウトを含む）を含むマウスで試験される。こうした実験は、抗体が、能動または受動免疫療法に際して、適切な半減期、エフェクター機能、（交差）中和活性および／または免疫反応を伴う療法剤としてまたは予防剤として、使用される能力の決定のための意義あるデータを提供しうる。任意の生物、好ましくは哺乳動物が、試験に使用可能である。例えば、ヒトに対する遺伝的類似性のため、霊長類、サルが適切な療法モデルである可能性もあり、そしてしたがって、これらを用いて、対象の剤または組成物の有効性、毒性、薬物動態学、薬力学、半減期、または他の特性を試験することも可能である。ヒトにおける試験は、最終的には、薬剤としての認可に必要であり、そしてしたがって、もちろん、これらの実験が意図される。したがって、本発明の抗体、免疫原およびそれぞれの医薬組成物を、ヒトにおいて試験して、療法的または予防的有効性、毒性、免疫原性、薬物動態学、および／または他の臨床特性を決定してもよい。
【０１８０】
本発明はまた、診断目的のため、例えば生物学的液体試料中の免疫試薬またはターゲットとしての毒素または抗体を検出し、そしてその濃度を定量的に決定する方法において使用するための、本発明の対象抗体も提供する。
【０１８１】
本発明はまた、生物学的試料、例えば体液において、毒素または黄色ブドウ球菌感染のレベルを検出するための方法であって、本発明の抗体と試料を接触させる工程を含む、前記方法も提供する。本発明の抗体を、任意の既知のアッセイ法、例えば競合的結合アッセイ、直接および間接的サンドイッチアッセイ、免疫沈降アッセイ、ならびに酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において使用してもよい。
【０１８２】
本発明にしたがって用いられるような体液には、被験体の生物学的試料、例えば組織抽出物、尿、血液、血清、便および痰が含まれる。
【０１８３】
１つの態様において、方法は、固体支持体を、ターゲット、例えば本発明の抗体によってターゲットとされる毒素の少なくとも１つとの複合体を特異的に形成する、特定のタイプの抗体断片の過剰量と、抗体が固体支持体表面に付着するのを可能にする条件下で、接触させる工程を含む。抗体が付着している、生じた固体支持体を、次いで、生物学的液体中のターゲットが抗体に結合し、そしてターゲット−抗体複合体を形成するように、生物学的液体試料と接触させる。複合体を検出可能マーカーで標識してもよい。あるいは、複合体の形成前に、ターゲットまたは抗体のいずれかを標識してもよい。例えば、検出可能マーカー（標識）を抗体にコンジュゲート化してもよい。次いで、複合体を検出し、そして定量的に決定し、それによって、生物学的液体試料中のターゲットを検出し、そしてその濃度を定量的に決定することも可能である。
【０１８４】
特定の適用のため、本発明の抗体を、有機分子、酵素標識、放射性標識、着色標識、蛍光標識、色素原標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属複合体、金属、コロイド性金およびその混合物からなる群より選択される、標識またはレポーター分子にコンジュゲート化する。標識またはレポーター分子にコンジュゲート化された抗体を、例えばアッセイ系または診断法において用いて、例えば黄色ブドウ球菌感染またはそれに関連する疾患状態を診断してもよい。
【０１８５】
本発明の抗体を、例えば結合アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）および結合研究において、
前記コンジュゲートの単純な検出を可能にする他の分子にコンジュゲート化してもよい。
【０１８６】
本発明の別の側面は、１またはそれより多い抗体に加えて、多様な診断または療法剤を含んでもよい、抗体を含むキットを提供する。キットにはまた、診断または療法において使用するための使用説明書も含まれてもよい。こうした使用説明書は、例えば、キット中に含まれているデバイス、例えば診断目的のために生物学的試料を調製する、例えば、疾患を診断しようとするそれぞれの毒素（単数または複数）を決定する前に、細胞および／またはタンパク質含有分画を分離するためのツールまたはデバイス上に含まれてもよい。好適には、こうしたキットには、１またはそれより多くの本明細書記載の多様な診断法において使用可能な抗体および診断剤または試薬が含まれる。別の好ましい態様において、キットには、使用前に混合して近い将来の投与のための注射可能組成物を形成可能な薬学的に許容されうるキャリアー（単数または複数）と組み合わせて、例えば凍結乾燥型の抗体が含まれる。
【実施例】
【０１８７】
実施例１：組換え毒素の生成
６つの黄色ブドウ球菌毒素−ＬｕｋＨ＿ＴＣＨ１５１６、ＬｕｋＨ＿ＭＲＳＡ２５２、ＬｕｋＨ＿ＭＳＨＲ１１３２、ＬｕｋＧ＿ＴＣＨ１５１６、ＬｕｋＧ＿ＭＲＳＡ２５２およびＬｕｋＧ＿ＭＳＨＲ１１３２を、大腸菌（ＢＬ２１、ＲｏｓｅｔｔａまたはＴｕｎｅｒ  ＤＥ３）中で組換え的に産生した。成熟タンパク質のための毒素遺伝子（ＳｉｇｎａｌＰ  ４．１  Ｓｅｒｖｅｒ；  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／を用いて決定）を大腸菌発現のためにコドン最適化して、そして黄色ブドウ球菌株ＵＳＡ３００＿ＴＣＨ１５１６、ＭＲＳＡ２５２およびＭＳＨＲ１１３２の公表されるゲノム配列に基づいた遺伝子合成によって生成した（図１Ａ、配列番号１〜１２、図１０）。すべての毒素は、不溶性型でタグを伴わずに発現され、タンパク質は封入体から再フォールディングされて、そして精製され；精製は、ＬｕｋＨに関してはサイズ排除カラム上の２工程から、そしてＬｕｋＧに関しては、陽イオン交換上の１工程およびｐＨ１０．２〜１１．０での陰イオン交換上の１工程からなった。純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）および単量体状態（サイズ排除による）に関して、ならびに実施例３に記載するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、機能性に関して（図１Ｂ）、タンパク質をアッセイした。すべてのタンパク質を、アミノ反応性試薬スルホ−ＮＨＳ−ＬＣビオチンで標識した。
【０１８８】
実施例２：ＬｕｋＧおよびＬｕｋＨ結合性ヒトモノクローナル抗体の選択
ＷＯ２００９／０３６３７９Ａ２、ＷＯ２０１２００９５６８およびＷＯ２０１０１０５２５６にしたがって発展させた酵母表面ディスプレイライブラリーによって、毒素結合抗体を選択した。実施例１に記載するように、毒素分子を組換え大腸菌産生タンパク質として発現させ、そしてビオチンで標識した。
【０１８９】
およそ１０９〜１０の多様性で、全長ヒトＩｇＧ１抗体を発現するよう操作された酵母細胞のライブラリーを、異なる濃度のビオチン標識毒素とインキュベーションした。磁気ビーズ選択、およびいくつかの連続する（最大５回）選択周期で、ストレプトアビジン二次試薬を使用する蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によって、毒素への結合能を持つ抗体を発現している酵母細胞を単離した。次いで、選択した酵母クローンによって抗体を産生し、そしてプロテインＡアフィニティクロマトグラフィによって精製した。ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ装置［Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ］を用いたインターフェロメトリー測定によって、異なる毒素への個々の可溶性ｍＡｂの結合を確認し；ビオチン化抗原または抗体をセンサー上に固定し、そして抗体Ｆａｂ断片のまたは抗原の会合および解離を、それぞれ（典型的には２００ｎＭ）、溶液中で、測定した。測定した動力学パラメータ（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）に基づいて、アフィニティ（Ｋｄ値
）を計算した。
【０１９０】
実施例３：ＬｕｋＧＨ中和活性に関するヒトｍＡｂの分析。
【０１９１】
実施例２に記載するように、ＬｕｋＨ＿ＴＣＨ１５１６およびＬｕｋＧ＿ＴＣＨ１５１６で選択した、ＬｕｋＧＨ毒素に対するヒトｍＡｂの中和活性を、ヒト好中球を用いた生存度アッセイで評価した。この目的のため、赤十字（ヘパリン処理）から得たか、または正常健康志願者からＫ−ＥＤＴＡバキュテナーチューブ（ＢＤ、米国）中に静脈穿刺によって得たかいずれかの新鮮なヒト全血から、好中球を単離した。赤血球を凝集させるため、１部分のＨｅｔａＳｅｐ溶液（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フランス）を５部分の血液に添加し、混合し、そして血漿／赤血球界面が総体積のおよそ５０％になるまで、３７℃でインキュベーションした。白血球濃縮血漿層を２段階Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配（ＨＢＳＳ中で希釈した７３％および６３％Ｐｅｒｃｏｌｌ  Ｐｌｕｓ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に注意深く重層し、そして６８０ｘｇ、ＲＴ、ノーブレーキで３０分間遠心分離した。スピン後勾配の第一層および第二層（主に血清および単球）を吸引によって除去した。第二の不透明層から好中球を採取し、そして５０ｍｌ  ＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ、米国）＋１０ｍＭグルコース中で２回洗浄した。血球計数器中、トリパンブルー色素排除を用いて、生存細胞数を計数した。記載する単離法は、通常、５０ｍｌ全血から、生存度≧９５％の１〜５ｘ１０Ｅ８の好中球を生じた。生存度アッセイのため、１０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミンおよびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補ったＲＰＭＩ  １６４０（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、オーストリア）（＝好中球培地）中に細胞を再懸濁した。あるいは、ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４０ＴＭ）ヒト前骨髄性白血病細胞株もまた、好中球様細胞の供給源として用いた（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，  Ｂｌｏｏｄ，  １９７９：７１３；  Ｃｏｌｌｉｎｓ，  ＰＮＡＳ，  １９７８：２４５８）。細胞を好中球培地中で培養し、そしてＲｏｍｅｒｏ−Ｓｔｅｉｎｅｒ，  Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １９９７：４１５に記載されるように、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、１００ｍＭ）で５日間処理することで分化させた。文献（例えばＣｏｌｌａｄｏ−Ｅｓｃｏｂａｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，  １９９４：５５３；  Ｔｒａｙｎｅｒ，  Ｌｅｕｋ  Ｒｅｓ，  １９９８：５３７；  Ｗａｔａｎａｂｅ，  Ｊ  Ｌｅｕｋ  Ｂｉｏｌ，  １９９３：４０）に記載される標準法にしたがって、ブリリアント・バイオレット４２１コンジュゲート化抗ＣＤ１１ｂ（クローンＩＣＲＦ４４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、米国）およびＰＥコンジュゲート化抗ＣＤ７１モノクローナル抗体（クローンＯＫＴ９、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）を用い、ＣＤ７１の消失およびＣＤ１１ｂ染色の出現によって、分化を決定した。
【０１９２】
モノクローナル抗体を、好中球培地中で連続希釈し、そして細胞生存度を≧９５％減少させる固定濃度の毒素と混合した［〜１ｎＭ、６０ｎｇ／ｍｌ］。毒素への抗体結合を可能にする、３０分間のプレインキュベーション工程後、生存度アッセイを開始した。ウェルあたり２５，０００細胞を添加し、そして反応を３７℃、５％ＣＯ２を含む加湿大気中で４時間インキュベーションした。製造者の指示にしたがって、細胞ＡＴＰレベルの発光測定に基づく市販の細胞生存度アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存度アッセイ；Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を用いて、ＰＭＮの生存度を評価した。偽処理対照に比較して、％生存度を計算した。以下の式：％阻害＝［（毒素のみの生存度−阻害された活性）／（毒素のみの生存度）］ｘ１００を用いて、毒素活性の％阻害を計算した。すべてのアッセイに、対照ｍＡｂ（関連しない抗原：鶏卵リゾチームに対して生成されたもの）が含まれた。
【０１９３】
この方法を用いて、本発明者らは、ＬｕｋＧまたはＬｕｋＨ毒素成分で生成されるものの中に、強力な中和抗体を同定することが不可能であった（図２中に示す例）。原因を探し求める試みの中で、本発明者らは、選択した抗体が、他の成分の存在下で、同族毒素成
分に結合不能でありうると仮定した。ｆｏｒｔｅＢｉｏ測定を用いた一連の結合研究において、本発明者らは、ＬｕｋＧ  ｍＡｂがＬｕｋＨの存在下ではＬｕｋＧに結合することを阻害され、そして逆に、ＬｕｋＨ  ｍＡｂがＬｕｋＧの存在下ではＬｕｋＨに結合することを阻害されることを証明した。ＬｕｋＨおよびＬｕｋＧの間で接触するタンパク質ドメインに対して、ｍＡｂが生成された疑いを確認するため、中和アッセイを修飾して行った。他の毒素成分を添加する前に、ｍＡｂを同族毒素成分のみとプレインキュベーションした。実際に、ＬｕｋＧおよびＬｕｋＨ  ｍＡｂの大部分で、毒素中和の多大な改善が見られた（図３に示す例）。しかし、これらの抗体は、黄色ブドウ球菌によって産生され、そして細菌培養上清中に存在する天然毒素を中和することは不可能であった。これらの実験はすべて、ＬｕｋＧおよびＬｕｋＨが、ターゲット細胞への結合前に、溶液中で複合体を形成することを示唆し、こうしたことは黄色ブドウ球菌二成分ロイコシジンに関しては報告されたことがなかった。
【０１９４】
実施例４：組換えＬｕｋＧおよびＬｕｋＨは、同時発現され、そして溶液中で二量体を形成する際、大腸菌溶解物から同時精製される。
【０１９５】
本発明者らは、異なる抗生物質耐性マーカーを含有し、そして各々、ｌｕｋＨまたはｌｕｋＧ遺伝子のいずれかを所持する２つのプラスミドで同時トランスフェクションすることによって、同じ大腸菌細胞において、ＬｕｋＨおよびＬｕｋＧ成分を同時発現した。ＬｕｋＧを、Ｎ末端にＮｕｓＡ／Ｈｉｓ６を持つ融合タンパク質として発現させて、複合体の金属アフィニティ精製を可能にする一方、ＬｕｋＨを非タグ化型で発現させた。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で、２０℃で２０時間、発現誘導を行った。２つのタンパク質が可溶性分画に見出され、そしてこれらは固定金属イオンアフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）によって同時精製された。ＮｕｓＡ／Ｈｉｓ６タグをタンパク質分解的に（エンテロキナーゼで）除去し、非タグ化成熟ＬｕｋＧＨ複合体を得て、これをさらに、陽イオン交換クロマトグラフィによって精製した。
【０１９６】
同時発現は、個々のタンパク質を安定させた。個々の成分は常に、大腸菌の不溶性分画において発現され（実施例１を参照されたい）、同時発現ＬｕｋＧＨは可溶性分画に見出された。
【０１９７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、複合体中のＬｕｋＧ：ＬｕｋＨの化学量論は、１：１であることが示された。溶液中の複合体のサイズを決定するため、本発明者らは、静的光散乱検出装置を装備したＤｙｎｏＰｒｏ  ＮａｎｏＳｔａｒ（Ｗｙａｔｔ）装置を用いて、動的光散乱（ＤＬＳ）測定を使用した（図５）。静的光散乱検出装置で測定した分子量（ＭＷ−Ｓ）は、ヘテロ二量体の計算された分子量、７３ｋＤａとよく一致している。
【０１９８】
実施例５：非常に強力なＬｕｋＧＨ中和ｍＡｂが、組換えＬｕｋＧＨ複合体で選択される
抗原として、ビオチン化ＬｕｋＧＨ複合体を用い、実施例２に記載するものと同じ方式で、酵母表面ディスプレイによって、抗体選択を行った。ユニークなＣＤＲ配列を持つ、８４のヒトｍＡｂを選択した。分化したＨＬ−６０細胞または新鮮に単離したヒトＰＭＮのいずれかを用いて、実施例３に記載するように、中和活性を測定し、そして非常に強力なＬｕｋＧＨ複合体、または１％カザミノ酸を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した黄色ブドウ球菌細胞（培養上清）によって産生された天然ＬｕｋＧＨと、抗体のプレインキュベーションを行った。ＬｕｋＧまたはＬｕｋＨ  ｍＡｂで得た結果とは対照的に、ＬｕｋＧＨ複合体で選択した抗体は、強力であることが立証され、これらの３／４は、３００ｎＭ未満の最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を示した。最も有効なｍＡｂは、＜３０ｎＭのＩＣ５０を有した（およそ１０のｍＡｂ：毒素比）。分化したＨＬ−６０細胞を用いた、組換えＬｕｋＧＨ複合体（図６Ａ）または天然ＬｕｋＧＨ（図６Ｂ）のいずれかで
の例を、図６に示す。新鮮に単離したヒトＰＭＮをターゲット細胞として用いた際、強度に関して、同じ順位序列が見られた（図７Ａ）。
【０１９９】
ＬｕｋＧＨは異なる変異体で存在するため、異なる黄色ブドウ球菌株によって発現されるすべてのＬｕｋＧＨ変異体を中和可能であるｍＡｂを選択することが重要な側面である。この目的のため、ＣＣ３０（同一クローン集団）およびＳＴ３６（配列タイプ）に属する、ＭＲＳＡ２５２株によって発現される最も多様な配列変異体ＬｕｋＧＨを、やはり毒素中和アッセイにおいて試験した。特定のｍＡｂが非常に強力であることが立証される一方、他のものは機能性を示さなかったため、このアッセイは、大きな差別化能力を有する（図７Ｂ）。抗体を抗ヒト捕捉センサー上に固定し、そして溶液中の毒素（ＰＢＳ＋３％ＢＳＡ中、１００ｎＭ）の会合を監視した際、強度は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ測定における反応値に基づいて、ＬｕｋＧＨ複合体変異体への結合と相関することが示された。ＬｕｋＧＨ複合体変異体へのｍＡｂの結合は、ＬｕｋＧまたはＬｕｋＨ変異体に対するものより有意に優れている（図７Ｃ）。
【０２００】
ＬｕｋＧＨ中和抗体の作用様式を解明するため、ビオチン化ＬｕｋＧＨ複合体の結合を、フローサイトメトリーに基づく表面染色アッセイにおいて、蛍光ストレプトアビジン（ビオチンに結合する）を用いて、ＬｕｋＧＨ  ｍＡｂの非存在下または存在下で監視した。抗体の存在は、蛍光表面シグナルの欠如と相関し、推定上の受容体への結合が、毒素にｍＡｂが結合した際に阻害されることを示唆した（図８）。
【０２０１】
結論として、溶液中のＬｕｋＧおよびＬｕｋＨによる複合体形成の発見は、ヒト食作用細胞を溶解から保護する強力な毒素中和抗体の同定を導いた。抗体サブグループは、広い結合特異性を有し、そして最も異なるＬｕｋＧＨ配列を交差中和する。中和ＬｕｋＧＨ  ｍＡｂは、食作用細胞に対する毒素の結合を阻害し、そしてしたがって溶解を防止する。ｍＡｂのこれらの特性によって、該ｍＡｂは広い臨床適用に適したものとなる。
【０２０２】
実施例６：ＬｕｋＧＨに対するヒト受容体としてのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８複合体の同定
本発明者らは、フローサイトメトリーに基づく表面染色を用いて、ＬｕｋＧＨ複合体が、ヒトＰＭＮおよび分化したＨＬ−６０細胞に結合するが、未分化ＨＬ−６０細胞には結合しないことを確定した。後者の細胞タイプがＬｕｋＧＨに完全に耐性である（細胞溶解がまったく検出されない）ため、これは毒素感受性に相関した。これらのデータによって、ＬｕｋＧＨ受容体がＰＭＮおよび分化したＨＬ−６０細胞によって発現されることが示唆された。この受容体を同定するため、ビオチン標識ＬｕｋＧＨ（２μｇ）および１０８細胞を用いて、プルダウン実験を行った。ビオチン化ＬｕｋＧＨおよびその結合パートナー（単数または複数）をストレプトアビジン・アガロース樹脂（ビオチンに結合する）上で収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。分子量１５０および９０ｋＤａの２つのユニークなタンパク質バンドが、ＰＭＮおよび分化したＨＬ−６０のプルダウン試料に見られたが、未分化ＨＬ−６０分画には欠けており、そしてまたＬｕｋＧＨを添加せずに精製したＰＭＮ試料からも欠けていた（図９Ａ）。これらのバンドをゲルから切り出し、そして質量分析（ペプチド・マス・フィンガープリンティング）に供した。ゲルバンドを消化し（トリプシン）、得たペプチドを、ナノ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定し、そしてＭａｓｃｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）データベースに対して、ＭＳ／ＭＳスペクトルを問い合わせた。トリプシンペプチドのマスに基づいて、２つのタンパク質は、ＣＤ１１ｂ（１５０ｋＤａ）およびＣＤ１８（９０ｋＤａ）と同定された（図９Ｂ）。ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１８は、ＰＭＮおよび分化したＨＬ−６０細胞の表面上で複合体を形成することが知られ、補体受容体３（ＣＲ３）、または白血球インテグリンＭａｃ−１ともまた称される（ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００２，  ３４，  ２５５）。ＰＭＮおよび分化したＨＬ−６０のプルダウン物質におけるＣＤ１１ｂの存在は、抗ＣＤ１１ｂ特異的ｍＡｂ（Ａ
ｂｃａｍ  ａｂ５２４７８）を用いたウェスタンブロットにおいて確認された（図９Ｃ）。これは興味深い知見であり、そしてすべてＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を発現することが知られる、ヒトＰＭＮ、単球および樹状細胞に対して毒性であると報告される、ＬｕｋＧＨの細胞タイプ特異性を完全に説明する。未分化ＨＬ−６０細胞がこの複合体の表面発現を欠くこともまた、広く確立されている。実際、陽性ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８染色は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＬ−６０細胞の効率的な分化のマーカーとしてルーチンに用いられる。ペプチド質量分析はまた、より低いスコアで、ＰＭＮから単離された１５０ｋＤａバンド中のＣＤ１１ｄを同定した（図９Ｂ）。ＣＤ１１ｄはまた、ＣＤ１８と複合体を形成して、インテグリンαＤβ２を生じ、これは、炎症性マクロファージ上で上方制御され、そしてマクロファージ接着性およびその遊走を調節することが示された（Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ．
Ｒｅｓ．  ２００８，  ３１４，  ２５６９）。αＤβ２は、アミノ酸レベルで、ＣＤ３に５８％同一であり、そしてＬｕｋＧＨの潜在的な代替受容体である。
【０２０３】
これらのデータはまた、齧歯類ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８は、ヒト対応物と〜７５％のアミノ酸同一性しか共有しないため、マウスおよびウサギ細胞に対して向けられる毒性活性が欠如しているかまたは非常に低いことを説明する（文献、Ｍａｌａｃｈｏｗａら、２０１２に報告され、そして本発明者らによって確認される）。同様に、ヒトＣＤ１１ｄは、マウス変異体に〜７０％の同一性しか持たない。
【０２０４】
実施例７：ＬｕｋＧＨ八量体の結晶構造は、二量体形成に重要な残基を同定する
２．８Å解像度で解析されるＬｕｋＧＨ  ＵＳＡ３００の構造によって、八量体孔配置が明らかになり、非対称性単位である２つの八量体があり、各八量体は、ＨｌｇＡＢで得られるもの（ＰＮＡＳ  １０８，  １７３１４，  ２０１１）と同様に、４つの交互のＬｕｋＧおよびＬｕｋＨサブユニットで構成される（図１０Ａ）。毒素プロトマーは、八量体の界面の２つのタイプ：鎖ＡおよびＢの間の界面（界面１）ならびに鎖ＢおよびＣの間の界面（界面２）に関与する。包埋される表面積は、それぞれ、界面１および２に関して、２１８８および２４６１Å２である。界面１において、主な相互作用は、キャップドメイン間で起こり（図１０Ｂ）、一方、界面２において、２つの単量体のキャップドメインおよびリムドメインの間の両方との相互作用がある（図１０Ｃ）。ＬｕｋＧＨ八量体における２つの界面間の接触残基の分析によって、界面１が、３４の水素結合、ならびにＬｕｋＨ由来の残基Ａｓｐ３９、Ａｓｐ７５およびＡｓｐ１９７、ならびにＬｕｋＧ由来のＬｙｓ５６、Ｌｙｓ５８、Ａｒｇ２３およびＬｙｓ２１８を伴う、一連の静電相互作用によって安定化されることが示されてきている。界面２においては、全部で５６の水素結合があり、キャップドメイン間のＬｕｋＨ由来の残基Ａｒｇ４９およびＡｒｇ２４０、ならびにＬｕｋＧ由来のＡｓｐ４９およびＧｌｕ１７１、そしてリムドメイン間のＬｕｋＨ由来の残基Ａｒｇ２１５およびＡｒｇ２３４、ならびにＬｕｋＧ由来のＡｓｐ１８９およびＡｓｐ１９１を伴う静電相互作用がある。ＨｌｇＡＢ八量体（ｐｄｂコード３Ｂ０７）で観察される塩架橋と比較した際、キャップドメイン間で見られるものは、ＬｕｋＧＨおよびＨｌｇＡＢ八量体の間で大部分保存されている（そしてまた、他のＳおよびＦ成分間でも）が、リムドメイン間のもの（界面２におけるもの）は、ＬｕｋＧＨにしか見られず、そして関与する残基は、ＬｕｋＧＨ変異体間で完全に保存されている（図１Ｃ）。２つの界面における包埋された表面積サイズに基づいて、そして界面２において、他のＦおよびＳ成分（溶液中で二量体を形成することが知られていないもの）との塩架橋残基の保存が欠如していることに基づき、ＬｕｋＧＨ二量体に関する最もありうる界面は、界面２である（図１０Ｃ）。この仮説を確認するため、本発明者らは、以下のように、静電相互作用に関与する残基を、Ａｌａに変化させることによって、界面突然変異体を生成した。ＬｕｋＨ中のＡｓｐ７５およびＡｓｐ１９７をＡｌａに突然変異させて、ＬｕｋＨ１（界面１  ＬｕｋＨ突然変異体）を生じ、そしてＬｕｋＧ中のＡｒｇ２３およびＬｙｓ２１８をＡｌａに突然変異させて、ＬｕｋＧ１（界面１  ＬｕｋＧ突然変異体）を生じた。第二の界面の突然変異体、ＬｕｋＨ２およびＬｕｋＧ２を作製するため、ＬｕｋＨ中のＡｒｇ２１５
、Ａｒｇ２３４およびＡｒｇ２４０、ならびにＬｕｋＧ中のＡｓｐ１８９、Ａｓｐ１９１およびＧｌｕ１７１を、それぞれ、Ａｌａに突然変異させた。
【０２０５】
ＬｕｋＧＨ変異体を同時形質転換し、そしてＷＴ複合体に関するように、複合体の同時発現を２０℃で誘導した。同様のレベルですべての複合体が同時発現されたが、可溶性複合体の量は、異なる変異体間で多様であり；界面１突然変異体：ＬｕｋＧ１Ｈ、ＬｕｋＧＨ１およびＬｕｋＧ１Ｈ１はＷＴ複合体と類似の可溶性を示し、一方、界面２突然変異体：ＬｕｋＧ２Ｈ、ＬｕｋＧＨ２およびＬｕｋＧ２Ｈ２は主に不溶性であった。したがって、界面１突然変異体複合体を、ＷＴ  ＬｕｋＧＨに関するものと類似の方法を用いて精製し、そして類似の収量を得た。円二色性（ＣＤ）によって、フォールディングに関して精製ＬｕｋＧＨ変異体をチェックし、そしてそのＣＤスペクトルは、ＷＴ複合体に関するものと本質的に同じであり、突然変異が、複合体の二次構造に影響を及ぼさなかったことが示された。
【０２０６】
個々の成分：ＬｕｋＧ１、ＬｕｋＧ２ならびにＬｕｋＨ１およびＬｕｋＨ２もまた発現させ、そしてＷＴ  ＬｕｋＧおよびＬｕｋＨに関するように封入体から精製した。ＷＴ対応物に関するものと類似の収量が、ＬｕｋＧ１、ＬｕｋＧ２およびＬｕｋＨ２に関して得られ：ＬｕｋＨ２のＣＤスペクトルは、ＷＴ  ＬｕｋＨのものとよく匹敵し、そしてＬｕｋＧ変異体に関して同じことが当てはまったが、タンパク質を配合し、そしてスペクトルを得たｐＨ１０．０緩衝液中では、すべてのＬｕｋＧタンパク質は、主にランダムコイル構造を示す。ＬｕｋＨ１収量は、ＷＴタンパク質に関するより有意に低く、これは、ＬｕｋＨ１が部分的にアンフォールディングされるという事実によって裏付けられ、そしてしたがって、ＬｕｋＨ１は、さらなる実験に含まれなかった。
【０２０７】
ビオチン化ＬｕｋＨまたはＬｕｋＨ２をストレプトアビジンセンサー上に固定し、そしてあらかじめ装填したセンサーに対するＬｕｋＧの会合に関して反応値を測定することによって、個々の成分からのＬｕｋＧＨ複合体の形成をＦｏｒｔｅ−Ｂｉｏにおいて監視した。ＬｕｋＨ２における突然変異が二量体界面に影響を及ぼすことに一致して、ＬｕｋＨ２とよりもＬｕｋＨとの結合が有意に高かった（図１１Ａ）。グルタルアルデヒドを用いたＬｕｋＧおよびＬｕｋＨ変異体（各々、３５μｇ／ｍｌ）の混合物の架橋（図１１Ｂ）によって、界面２突然変異体がＬｕｋＧＨ二量体を形成不能であるが、界面１  ＬｕｋＧ突然変異体は、ＷＴ成分に関して観察されるものと類似のレベルで、二量体を形成可能であることが確認されている。
【０２０８】
参考文献
【０２０９】
【化１】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１２−７】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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