(57)【要約】【課題】家畜、家禽、魚介類等の感染症や疾患の予防に有効な免疫増強剤を提供することを目的とする。【解決手段】カロテノイドを含有するパラコッカス菌体又はその処理物を有効成分として含む免疫増強剤であって、前記処理物は細胞膜成分とカロテノイドとを含む、前記免疫増強剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カロテノイドを含有するパラコッカス菌体又はその処理物を有効成分として含む免疫増強剤であって、前記処理物は細胞膜成分とカロテノイドとを含む、前記免疫増強剤。
【請求項２】
カロテノイドがアスタキサンチン、アドニキサンチン、アドニルビン、カンタキサンチン、アステロイデノン、β-カロテン、エキネノン及び3-ヒドロキシエキネノンを含む、請求項１記載の免疫増強剤。
【請求項３】
処理物のカロテノイド含有量が1質量％以上であり、且つ処理物に含まれるカロテノイド中のアスタキサンチン含有量が40質量％以上である、請求項１又は２記載の免疫増強剤。
【請求項４】
魚介類用である、請求項１〜３のいずれか１項記載の免疫増強剤。
【請求項５】
カロテノイドを含有するパラコッカス菌体又はその処理物を含む免疫増強用飼料添加物であって、前記処理物は細胞膜成分とカロテノイドとを含む、前記免疫増強用飼料添加物。
【請求項６】
カロテノイドがアスタキサンチン、アドニキサンチン、アドニルビン、カンタキサンチン、アステロイデノン、β-カロテン、エキネノン及び3-ヒドロキシエキネノンを含む、請求項５記載の免疫増強用飼料添加物。
【請求項７】
処理物のカロテノイド含有量が1質量％以上であり、且つ処理物に含まれるカロテノイド中のアスタキサンチン含有量が40質量％以上である、請求項５又は６記載の免疫増強用飼料添加物。
【請求項８】
魚介類用である、請求項５〜７のいずれか１項記載の免疫増強用飼料添加物。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項記載の免疫増強用飼料添加物を含む飼料。
【請求項１０】
魚介類の飼料である、請求項９記載の飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えばカロテノイドを含有するパラコッカス菌体又はその処理物を含む免疫増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
畜産や養殖の分野において、家畜、家禽、魚介類等の感染症や疾患を予防又は治療することは、生産性を向上させる上で重要である。従来においては、このような家畜、家禽、魚介類等の感染症や疾患の予防又は治療において、各種微生物又はその処理物が使用されている。
【０００３】
例えば、特許文献１は、アスタキサンチンを含む酵母又は該酵母の処理物であって細胞壁若しくはその構成成分とアスタキサンチンを含むものを有効成分として含有する免疫増強剤を開示する。
【０００４】
特許文献２は、基礎飼料に胆汁末及びペプチドグリカン含有細菌菌体末を混合してなる家畜、家禽及び魚介類用の抗仮性狂犬病並びに抗病性飼料を開示する。
【０００５】
特許文献３は、家禽由来のラクトバチルス・アビアリウス(Lactobacillus aviarius)Z-1株、FERM P-13855の培養物の殺菌体又は細胞壁を家禽の敗血症に対する有効成分とすることを特徴とする家禽の敗血症の予防・治療剤、及び豚由来のビフィドバクテリウム・サーモフィラム(Bifidobacterium thermophilum)ZH株、FERM P-13856の培養物の殺菌体又は細胞壁を豚の敗血症に対する有効成分とすることを特徴とする豚の敗血症の予防・治療剤を開示する。
【０００６】
特許文献４は、ストレプトコッカス属、ビフィドバクテリウム属、及びラクトバチルス属のいずれかに属する微生物の死菌体を有効成分として含有することを特徴とする抗発癌剤を開示する。
【０００７】
特許文献５は、ビフィドバクテリウム ロンガム(Bifidobacterium longum)SBT 2928株(微工研菌寄第10675号)の菌体を有効成分とする生体免疫増強剤を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2002-80351号公報
【特許文献２】特公平6-55107号公報
【特許文献３】特許第2506314号公報
【特許文献４】特公平6-96538号公報
【特許文献５】特許第2796635号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上述の実情に鑑み、家畜、家禽、魚介類等の感染症や疾患の予防に有効な免疫増強剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、カロテノイドを含有するパラコッカス菌体又はその処理物が免疫増強効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）カロテノイドを含有するパラコッカス菌体又はその処理物を有効成分として含む免疫増強剤であって、前記処理物は細胞膜成分とカロテノイドとを含む、前記免疫増強剤。
（２）カロテノイドがアスタキサンチン、アドニキサンチン、アドニルビン、カンタキサンチン、アステロイデノン、β-カロテン、エキネノン及び3-ヒドロキシエキネノンを含む、（１）記載の免疫増強剤。
（３）処理物のカロテノイド含有量が1質量％以上であり、且つ処理物に含まれるカロテノイド中のアスタキサンチン含有量が40質量％以上である、（１）又は（２）記載の免疫増強剤。
（４）魚介類用である、（１）〜（３）のいずれか１記載の免疫増強剤。
（５）カロテノイドを含有するパラコッカス菌体又はその処理物を含む免疫増強用飼料添加物であって、前記処理物は細胞膜成分とカロテノイドとを含む、前記免疫増強用飼料添加物。
（６）カロテノイドがアスタキサンチン、アドニキサンチン、アドニルビン、カンタキサンチン、アステロイデノン、β-カロテン、エキネノン及び3-ヒドロキシエキネノンを含む、（５）記載の免疫増強用飼料添加物。
（７）処理物のカロテノイド含有量が1質量％以上であり、且つ処理物に含まれるカロテノイド中のアスタキサンチン含有量が40質量％以上である、（５）又は（６）記載の免疫増強用飼料添加物。
（８）魚介類用である、（５）〜（７）のいずれか１記載の免疫増強用飼料添加物。
（９）（５）〜（８）のいずれか１記載の免疫増強用飼料添加物を含む飼料。
（１０）魚介類の飼料である、（９）記載の飼料。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、家畜、家禽、魚介類等の免疫力を高めることで感染症や疾患を予防でき、畜産や養殖の分野における生産性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１における、β-カロテンを含む試験飼料、又はカロテノイドを含有するパラコッカス菌体を含む試験飼料を30日間与えたクルマエビ稚エビの総血球数(血リンパ中)を示すグラフである。
【図２】実施例１における、β-カロテンを含む試験飼料、又はカロテノイドを含有するパラコッカス菌体を含む試験飼料を30日間与えたクルマエビ稚エビの貪食率を示すグラフである。
【図３】実施例１における、β-カロテンを含む試験飼料、又はカロテノイドを含有するパラコッカス菌体を含む試験飼料を30日間与えたクルマエビ稚エビのフェノールオキシダーゼ(PO)活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る免疫増強剤は、カロテノイドを含有するパラコッカス菌体又はその処理物を有効成分として含むものである。当該処理物は細胞膜成分とカロテノイドとを含む。本発明に係る免疫増強剤を、家畜、家禽、魚介類等の非ヒト動物の飼料に添加し、これら非ヒト動物に給餌することで、当該非ヒト動物の免疫力を高めることができる。このように、本発明に係る免疫増強剤は、免疫増強用飼料添加物として使用することもできる。また、本発明に係る免疫増強剤をヒトに投与することで、当該ヒトの免疫力を高めることができる。このように、本発明に係る免疫増強剤は、医薬として使用することもできる。
【００１５】
ここで、免疫増強としては、例えば免疫細胞数の増加、フェノールオキシダーゼ活性の増加、貪食能の増加等が挙げられる。例えば、エビ等において、血球は、酸素運搬には関与しておらず、免疫細胞という位置付けのため、その数の多さが免疫賦活に直結する。従って、エビ等における血球数の増加は、免疫増強を意味する。また、エビ等の場合、細胞に関与する異物排除機能のうち、液性のものがフェノールオキシダーゼによって行われる。従って、フェノールオキシダーゼ活性の増加もまた、免疫増強を意味する。さらに、貪食能とは、細胞が食作用によって細胞の外にある物質を取り込む能力を意味し、マクロファージは、この高い貪食能で外敵を捕食して無毒化する。従って、貪食能の増加もまた、免疫増強を意味する。
【００１６】
本発明に係る免疫増強剤の有効成分であるカロテノイドを含有するパラコッカス菌体とは、カロテノイドを含有する(又は産生する)パラコッカス属(Paracoccus)に属する微生物を意味する。当該パラコッカス属に属する微生物が含有する(又は当該パラコッカス属に属する微生物により産生される)カロテノイドとしては、例えばアスタキサンチン、アドニキサンチン、アドニルビン、カンタキサンチン、アステロイデノン、β-カロテン、エキネノン、3-ヒドロキシエキネノンが挙げられ、これらのカロテノイドのうち1種、好ましくは2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上又は7種以上の組合せ、最も好ましくはこれらカロテノイド全てを含むカロテノイド混合物である。さらに、これらカロテノイドに加えて、パラコッカス属に属する微生物の生合成経路で産生されるゼアキサンチン及び/又はβ-クリプトキサンチンを含んでもよい。
【００１７】
このようなパラコッカス属に属する微生物としては、例えばパラコッカス・カロティニファシエンス(Paracoccus carotinifaciens)(特許第4463347号公報)、パラコッカス・マーキュシイ(Paracoccus marcusii)(Int J. Sys. Bacteriol. (1998), 48, 543-548)、パラコッカス・ショーイニア(Paracoccus schoinia)(J. Nat. Prod., 2006, 69 (12), pp 1823-1825)、パラコッカス・ベイブエンシス(Paracoccus beibuensis)(Int. J. Sci. Res. (2015) 1230-1235)、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス(Paracoccus zeaxanthinifaciens)(Int J Syst Evol Microbiol. 2003 Jan;53(Pt 1):231-8)、パラコッカス・ヘウンダエンシス(Paracoccus haeundaensis)(J. Microbiol. Biotechnol. (2013), 23(2), 144-148)、パラコッカス・ボゴリエンシス(Paracoccus bogoriensis)(African J. Microbiol. Res.Vol. Vol.3(8), pp. 426-433, August 2009)等が挙げられる。
【００１８】
また、パラコッカス・カロティニファシエンスの特定の菌株としては、例えばE-396株(FERM BP-4283)(特許第4463347号公報)又はその変異株が挙げられる。E-396株は、平成5年(1993年)4月27日付けで、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(〒305-8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)[寄託時、旧名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所(〒305 日本国茨城県つくば市東1丁目1番3号)]に受託番号FERM BP-4283としてブダペスト条約に基づいて国際寄託された。この菌株は、現在、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許生物寄託センター(NITE-IPOD)(〒292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室)にて保管されている。
【００１９】
E-396株の変異株としては、X線照射、紫外線照射等の物理的方法、化学変異剤(例えば、NTG(N-methyl-N'-nitoro-N-nitrosoguanidine)、EMS(ethylmethane sulfonate)等)による変異処理のような化学的方法を用いた人為的変異処理にE-396株を供することで作製された変異株が挙げられる。具体的なE-396株の変異株としては、特許第4463347号公報に記載のように、E-396株をNTGで変異処理し、赤色の色調が濃いコロニーを選択し、培養液中のカロテノイドを分析し、アスタキサンチンの生産性が向上した変異株が挙げられる。
【００２０】
さらに、16SリボソームRNAに対応するDNAの塩基配列が配列番号１に記載されるE-396株の塩基配列と実質的に相同であるパラコッカス属に属する微生物を用いることもできる。ここで、「実質的に相同である」とは、DNAの塩基配列決定の際のエラー頻度等を考慮し、塩基配列が好ましくは95％以上、より好ましくは96％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上相同であることを意味する。相同性は、例えば、遺伝子解析ソフトClustal Wにより決定することができる。
【００２１】
また、カロテノイドを含有するパラコッカス菌体の処理物は、パラコッカス菌体の細胞膜成分(例えば、β-グルカン、ペプチドグルカン等)とカロテノイドとを含むものであり、このような処理物としては、例えば乾燥又は凍結乾燥、ドラムドライ、スプレードライ等の処理方法を用いて製造されたものが挙げられる。
【００２２】
具体的なカロテノイドを含有するパラコッカス菌体の処理物としては、例えば処理物のカロテノイド含有量が1質量％以上、好ましくは2質量％以上、特に好ましくは3質量％以上であり、且つ処理物に含まれるカロテノイド中のアスタキサンチン含有量が40質量％以上である処理物が挙げられる。このような処理物として、Panaferd-AX、Panaferd-P(登録商標)(パナファード)(JXTGエネルギー株式会社製)が付された商品が挙げられる。Panaferd-AX、Panaferd-Pは、カロテノイド(化合物)を3質量％以上含有する菌体処理物であり、当該カロテノイド(化合物)中の40質量％以上がアスタキサンチンであることを特徴とする。
【００２３】
さらに、カロテノイドを含有するパラコッカス菌体の処理物としては、特許第4463347号公報に記載の微生物培養沈殿物が挙げられる。Panaferd-AX、Panaferd-Pは、E-396株又はその変異株の当該微生物培養沈殿物である。微生物培養沈殿物とは、カロテノイドを含有するパラコッカス菌体を培養してカロテノイド化合物を生産させ、その培養液を濾過、遠心分離機等により処理し、ある程度水分を除去したものを指す。カロテノイドを含有するパラコッカス菌体の培養方法はカロテノイド化合物を生成する条件であればいずれの方法でもよいが、例えば、以下のような方法を採用できる。すなわち、培地としては生産菌が生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩、及び必要であれば特殊な要求物質（例えば、ビタミン、アミノ酸、核酸塩基等）を含むものを使用する。炭素源としてはグルコース、シュークロース、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニトール、マルトース等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マロン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、イソブタノール等のアルコール類等が挙げられる。添加割合は炭素源の種類により異なるが、通常培地1L当たり1〜100g、好ましくは2〜50gである。窒素源としては、例えば硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、尿素等の1種または2種以上が用いられる。添加割合は窒素源の種類により異なるが、通常培地1Lに対し0.1g〜10g、好ましくは1〜3gである。無機塩としてはリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素ニナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸鉄、塩化鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム等の1種または2種以上が用いられる。添加割合は無機塩の種類により異なるが、通常培地1Lに対し0.001〜10gである。特殊な要求物質としてはビタミン類、核酸類、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、麦芽エキス、コーンスチープリカー、乾燥酵母、大豆粕、大豆油、オリーブ油、トウモロコシ油、アマニ油、等の1種または2種以上が用いられる。添加割合は特殊な要求物質の種類により異なるが、通常、培地1Lに対し1g〜200g、好ましくは10〜100gである。培地のpHは2〜12、好ましくは6〜10に調整する。培養条件は15〜80℃、好ましくは20〜35℃の温度であり、通常1日〜20日間、好ましくは2〜8日間振とう培養あるいは通気撹拌培養を行う。
【００２４】
次に、以上の方法により得られた培養液から水分を除去する作業を行う。どの程度の水分除去が必要かは培養液の状態（色素含有量等）により異なるが、一般にまず濾過の作業を行いさらに水分の除去が必要であれば沈殿物の乾燥を行う。濾過の方法は、通常の濾過法、遠心分離法などにより行うことができる。得られた沈殿物は塩類、糖類などの培地成分が溶解した水および沈殿物を含むため、沈殿物中のカロテノイド化合物の含有量をさらに向上させるため、培養液から分離した沈殿物に水を加え懸濁した後、再度沈殿物を分離することも有効である。この工程により、水に溶解している培地成分等をある程度除去することができる。さらに沈殿物中のカロテノイド化合物の含有量を上げる必要がある場合には、沈殿物を乾燥して水分を除去する方法をとることが可能である。乾燥の方法としては、通常の噴霧乾燥、ドラム乾燥、凍結乾燥などが挙げられる。
【００２５】
本発明に係る免疫増強剤は、ヒト、家畜や愛玩動物(ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ)等の哺乳動物、ニワトリ、七面鳥等の家禽、クルマエビ、サクラマス、サケ等の魚介類等に適用することができる。
【００２６】
本発明に係る免疫増強剤を免疫増強用飼料添加物として使用する場合には、飼料への添加量は、飼料全体に対する有効成分のパラコッカス菌体又はその処理物の量で例えば0.5%〜3%であり、好ましくは1%〜1.5%である。
【００２７】
本発明に係る免疫増強剤を医薬として使用する場合には、有効成分のパラコッカス菌体又はその処理物以外に、製薬上許容可能な担体(賦形剤、希釈剤等)や添加剤を含有させることができる。また、本発明に係る免疫増強剤を、経口投与又は非経口投与(静脈内、動脈内、腹腔内、経直腸内、皮下、筋肉内等)用に製剤化することができる。製剤の形態としては、特に限定されないが、例えば溶液剤、錠剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤等が挙げられる。本発明に係る免疫増強剤に含まれるパラコッカス菌体又はその処理物の用量は、患者の年齢、体重、性別、状態等の要因によって変化する。例えば、本発明に係る免疫増強剤の1日当たりの投与量は、有効成分のパラコッカス菌体又はその処理物換算で5〜30mg/kg体重、好ましくは10〜20mg/kg体重であるが、この範囲に限定されない。必要に応じて、用量を数回、例えば2〜3回に分けて分割投与してもよい。
【００２８】
また、本発明に係る免疫増強剤を任意の飲食品に添加することで、本発明に係る免疫増強剤を機能性食品、健康食品又は飲食品とすることができる。機能性食品、健康食品及び飲食品には、例えば、菓子類、レトルト食品、ジュース類、お茶類、乳製品等が含まれるが、これらに限定されない。さらに、本発明に係る免疫増強剤を例えばサプリメント、食品添加物として使用することもできる。
【００２９】
一方、上述の本発明に係る免疫増強剤の記載に準じて、本発明は、
カロテノイドを含有するパラコッカス菌体又はその処理物を含有する飼料を家畜、家禽、魚介類等の非ヒト動物に給餌することを含む、当該非ヒト動物の免疫増強方法；
カロテノイドを含有するパラコッカス菌体又はその処理物を患者又は被験体(ヒト)に投与することを含む、免疫増強方法、
にも関する。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３１】
〔実施例１〕カロテノイド成分を含むパラコッカス菌体によるクルマエビの免疫賦活
１．材料及び方法
１−１．試験区
試験区は以下の通りであった：
(1) コントロール(Control)区(カロテノイド無添加飼料)；
(2) βカロテン区(β-カロテン100ppm添加飼料)；
(3) Panaferd-AX(パナファード)区(試験飼料へのPanaferd-AXの添加率を1%とし、カロテノイドを371ppm（カロテノイド中のアスタキサンチンは200ppmである）の濃度で含有するように、Panaferd-AXを添加した飼料)。
【００３２】
なお、使用したPanaferd-AXのカロテノイド含量は、以下の通りであった：
総カロテノイド：39.0g/Kg；
アスタキサンチン：21.0g/Kg；
アドニルビン：7.8g/Kg；
アドニキサンチン：4.2g/Kg；
カンタキサンチン：2.0g/Kg。
【００３３】
１−２．飼育条件
飼育条件は以下の通りであった：
試験生物：クルマエビ稚エビ(平均体重6.8g)；
試験水槽：100L円形水槽(3L/minの流水式、エアレーション、底質として海砂を1.5cm厚に敷き詰めた)；
飼育尾数：10尾/水槽；
繰り返し数：3水槽/試験区；
給餌方法：目視による飽食給餌(2回/日)。エサを与えて12hr後になくなっていることを確認した；
飼育日数：30日(馴致期間7日を除く)；
光条件：自然光(12L：12D)、夜行性のため自然光だが直射日光ではなく、すだれで直射を防いだ。
【００３４】
１−３．飼料作製方法
飼料作製方法は以下の通りであった：
(1) 魚粉、イカミール、炭水化物、デキストリン、魚油、レシチン、ビタミン類、及びミネラル類＋摂餌誘引剤としてコハク酸Naとクエン酸Naを加えて練った；
(2) ミンチの機械にかけて細長く成形し、適当な長さにカットした；
(3) 乾燥させた；
(4) スチームをかけた；
(5) 乾燥させた。
【００３５】
１−４．飼育試験終了後のサンプリング尾数と測定項目
飼育試験終了後のサンプリング尾数と測定項目は以下の通りであった：
(1) 3尾/水槽→血リンパ採取→血球数・貪食率測定；
(2) 2尾/水槽→血リンパ採取→冷凍保存→フェノールオキシダーゼ(PO)活性測定。
【００３６】
血リンパ採取及び血球測定は以下の様に行った。
飼育試験終了後、各水槽から3尾のクルマエビをランダムに取り上げて、0.8mlの氷冷抗凝固緩衝液(2.9％ NaCl, 10 mM EGTA, 10 mM HEPES, 40 μM L-システイン, pH 7.6)を満たした1mlプラスチックシリンジ(テルモ株式会社)にニードル(26G, 1/2)を装着し、頭胸甲内の間隙から血リンパを0.2ml採取した。
【００３７】
この血リンパ/抗凝固緩衝液混液を15ml容プラスチック遠沈管に移し、さらに2.5mlの氷冷抗凝固緩衝液を加えた後、遠心分離(500×g, 5℃, 10分)して上清を捨てた。沈殿した血球に3mlの氷冷Shrimp saline(140 mM MgCl・6H2O, 4 mM MgSO4・7H2O, 14 mM CaCl2・2H2O, 9 mM KCl, 0.1 % w/v グルコース, 10 mM HEPES, pH 7.6)を加えてピペッティングし、遠心分離(800×g, 5℃, 10分)して上清を捨てた。この操作を3回繰り返して血球を洗浄した。
【００３８】
その後、沈殿した血球に2mlの氷冷Shrimp salineを加えてピペッティングし、細胞浮遊液を調整した。この一部を1.5mlプラスチックチューブに取り、等量の0.5％トリパンブルー染色液(ナカライテスク株式会社)を加えた。直ちに改良ノイバウエル血球計算盤(アズワン株式会社)に滴下し、位相差顕微鏡(ECLIPSE 80i, 株式会社ニコン)を用いて総血球数を計数した。同時に総血球数に対する生細胞数の割合が80％以上であることを確認した。カウントした血球数を血リンパ1 ml当たりに換算した。
【００３９】
貪食率は、以下の様に測定した。
細胞浮遊液中の細胞濃度をShrimp salineを用いて106 cell/mlに調整した。200 μlの細胞浮遊液をカバーガラス(18×18 mm, AGCテクノグラス株式会社)に乗せて、室温で20分間インキュベートし、カバーガラス表面に細胞を付着させた。Shrimp salineでカバーガラスを3回洗浄した後、細胞付着面に熱処理酵母菌懸濁液(4×106 cell/ml Shrimp saline)を乗せて、室温で2時間インキュベートした。このカバーガラスをShrimp salineで3回洗浄した後、1mlの固定液(パラホルムアルデヒド4％、スクロース10％の濃度になるよう0.2 Mカコジル酸緩衝液に添加)を乗せて10分間固定した。蒸留水で3回洗浄し、1時間乾燥させた。ライト染色液(ナカライテスク株式会社)で染色後、リン酸緩衝液に5分間浸漬して、蒸留水で洗浄した。乾燥後、キシレン封入してプレパラートを作製した。このプレパラート上の200細胞を無作為に選び、酵母菌を貪食した細胞数を計数した。貪食率を次式(％貪食率=貪食細胞数/200細胞×100)により算出した。
【００４０】
フェノールオキシダーゼ(PO)活性測定は、以下のように測定した。
飼育試験終了後、各水槽から2尾のクルマエビをランダムに取り上げ、(1)と同様の方法によって血リンパを採取した。この血リンパ/抗凝固緩衝液混液500μlを1.5mlプラスチックチューブに移し、等量のカコジル酸緩衝液(10 mMカコジル酸ナトリウム, 10mM CaCl2・2H2O, pH7.0)を加え、超音波ホモジナイザー(U-200, IKA)で処理(20W, 1分間)した。遠心分離(7000×g, 4℃, 30分)した上清を1.5mlプラスチックチューブに回収し測定サンプルとした。
【００４１】
このサンプルの一部をBCA法によるタンパク分析に供した。また、残りのサンプルを100μlづつ等分し、一方には50μlのカコジル酸緩衝液を加えAssay blankとした。もう一方には50μlのカードラン溶液(1 mg カードラン/mlカコジル酸緩衝液)を加え、それぞれ25℃で1時間インキュベートした。
【００４２】
次に50μlのL-DOPA溶液(3 mg L-DOPA/mlカコジル酸緩衝液)を加えて、20℃で酵素反応を開始した。1分後及び10分後に20μlの反応液を新しいプラスチックチューブに移して、80μlのカコジル酸緩衝液で希釈し、波長490nmにおける吸光度を微量分光光度計(NanoDrop2000, Thermo Fisher Scientific)を用いて測定した。反応時間1分後及び10分後におけるサンプルの吸光度よりAssay blankの吸光度を減じてABS1min及びABS10minを得た。これらの値を次式［（ABS10min - ABS1min）/0.001/10/mgタンパク］に代入し、サンプル溶液のフェノールオキシダーゼ活性(Unit/mg タンパク質)を算出した。
【００４３】
２．結果
結果を表１及び図１〜３に示す。
表１は、給餌における免疫賦活効果を示す。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
β-カロテンを含む試験飼料、又はカロテノイドを含有するパラコッカス菌体を含む試験飼料を30日間与えたクルマエビ稚エビの総血球数を図１に示す。コントロール区とパナファード区の2区間では、1％有意性が見られた。
【００４６】
また、β-カロテンを含む試験飼料、又はカロテノイドを含有するパラコッカス菌体を含む試験飼料を30日間与えたクルマエビ稚エビの貪食率を図２に示す。コントロール区とβカロテン区、コントロール区とパナファード区の2区間の間では、それぞれ5％有意性が見られた。
【００４７】
さらに、β-カロテンを含む試験飼料、又はカロテノイドを含有するパラコッカス菌体を含む試験飼料を30日間与えたクルマエビ稚エビのフェノールオキシダーゼ(PO)活性を図３に示す。コントロール区とβカロテン区、コントロール区とパナファード区の2区間の間では、それぞれ5％有意性が見られた。
【００４８】
以上に説明するように、β-カロテンは貪食率とPO活性において免疫増強効果を有するという結果が得られた。このβ-カロテンの結果によれば、パラコッカス菌体が有するカロテノイド類全てが同様の効果を有することが推測される。
【受託番号】
【００４９】
FERM BP-4283
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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