(57)【要約】      （修正有）【課題】インフルエンザ並びに他の感染症及びがんを治療するための新規な手法の提供。【解決手段】対象において先天性免疫応答を高めることにより疾患を治療又は予防する方法であって、溶液中にＴＬＲ２部分を含む有効量の組成物を対象に投与するステップを含み、ＴＬＲ２部分はＴＬＲ２アゴニストを含み、疾患は、ＴＬＲ２部分に対する液性免疫応答又は細胞性免疫応答により治療又は予防されない方法。ＴＬＲ２アゴニストは、Ｐａｍ２Ｃｙｓ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ｓｔｅ２Ｃｙｓ、Ｌａｕ２Ｃｙｓ及びＯｃｔＣｙｓからなる群から選択される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において先天性免疫応答を高めることにより疾患を治療又は予防する方法であって、
溶液中にＴＬＲ２部分を含む有効量の組成物を対象に投与するステップを含み、
ＴＬＲ２部分がＴＬＲ２アゴニストを含み、
疾患が、ＴＬＲ２部分に対する液性免疫応答又は細胞性免疫応答により治療又は予防されない、方法。
【請求項２】
対象において先天性免疫応答を高めることによりがんを治療又は予防する方法であって、
溶液中にＴＬＲ２部分を含む治療有効量の組成物を対象に投与するステップを含み、
ＴＬＲ２部分がＴＬＲ２アゴニストを含み、
ＴＬＲ２部分が、がんに対する特異的細胞性免疫応答又は液性免疫応答を誘導しない、方法。
【請求項３】
感染因子により引き起こされる疾患を治療又は予防する方法であって、
溶液中にＴＬＲ２部分を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含み、
ＴＬＲ２部分がＴＬＲ２アゴニストを含み、
ＴＬＲ２部分が感染因子に対する特異的な細胞性免疫応答又は液性免疫応答を誘導しない、方法。
【請求項４】
ＴＬＲ２部分が、可溶化剤にコンジュゲートされたＴＬＲ２アゴニストを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＴＬＲ２アゴニストが、Ｐａｍ２Ｃｙｓ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ｓｔｅ２Ｃｙｓ、Ｌａｕ２Ｃｙｓ及びＯｃｔＣｙｓからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＴＬＲ２アゴニストがＰａｍ２Ｃｙｓである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
可溶化剤がＰＥＧ（ポリエチレングリコール）又は極性ポリペプチドである、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
極性ポリペプチドが、Ｒ４、Ｈ４、Ｅ８及びＨ８からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
可溶化剤がＰＥＧである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
可溶化剤が、ＰＥＧ並びにＲ４、Ｈ４、Ｈ８、ＥＢ８及びＥ８のいずれか１つを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
組成物が対象に鼻腔内投与される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
感染因子がウイルスである、請求項３〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ウイルスがインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
感染因子が、マイコバクテリウム・ツベルクローシス又はレジオネラ・ニューモフィラである、請求項３〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
がんが感染因子により引き起こされる、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
がんが、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）又はエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）により引き起こされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
溶液中の有効量のＴＬＲ２部分を、薬学的に許容される担体又は賦形剤と一緒に含む、対象において先天性免疫応答を高めることにより疾患を治療又は予防するための医薬組成物であって、
ＴＬＲ２部分がＴＬＲ２アゴニストを含み、
疾患が、ＴＬＲ２部分に対する液性免疫応答又は細胞性免疫応答により治療又は予防されない、医薬組成物。
【請求項１８】
対象において疾患を治療又は予防するための医薬品の製造のための、溶液中の有効量のＴＬＲ２部分の使用であって、
ＴＬＲ２部分がＴＬＲ２アゴニストを含み、
ＴＬＲ２アゴニストが対象において先天性免疫応答を高め、
疾患が、ＴＬＲ２部分に対する液性免疫応答又は細胞性免疫応答により治療又は予防されない、使用。
【請求項１９】
組成物がＴＬＲ９アゴニストを含まない、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法又は請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
医薬品がＴＬＲ９アゴニストを含まない、請求項１８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＬＲ２アゴニストを含むＴＬＲ２部分の使用を伴う、対象において先天性免疫応答を誘発する新規な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ）の感染は、１年に、最大１０億の感染及び３００，０００〜５００，０００の死を引き起こし、２００９年のブタＨ１Ｎ１の世界的発生によって、パンデミックインフルエンザに立ち向かうために利用可能な抗ウイルス選択肢が限定的であることが強調された。ワクチンが季節性ＩＡＶ流行に対して利用可能であるが、これらのワクチンは、絶え間なく進化するＩＡＶのノイラミニダーゼ及び血球凝集素表面タンパク質に対する抗体を誘導し、したがって、毎年の再処方及び投与を必要とする。さらに、これらのワクチンは、一般に、新生ウイルスにより引き起こされたパンデミック発生に対しては有効ではない。代替としては、ＩＡＶの保存された内部領域を標的とすることである。しかし、ブタＨ１Ｎ１インフルエンザＡウイルスの近年のパンデミックの発生は、パンデミックインフルエンザに対する広範囲の予防ワクチン及び抗ウイルス選択肢を発見するための探求につながった。
【０００３】
本発明は、インフルエンザ並びに他の感染症及びがんを治療するための新規な手法の開発に関する。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の第１の態様において、対象において先天性免疫応答を高めることにより疾患を治療又は予防する方法が提供され、該方法は、溶液中にＴＬＲ２部分を含む有効量の組成物を対象に投与するステップを含み、ＴＬＲ２部分はＴＬＲ２アゴニストを含み、疾患は、ＴＬＲ２部分に対する液性免疫応答又は細胞性免疫応答により治療又は予防されない。
【０００５】
本発明の第２の態様において、感染因子により引き起こされる疾患を治療又は予防する方法が提供され、該方法は、溶液中にＴＬＲ２部分を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含み、ＴＬＲ２部分はＴＬＲ２アゴニストを含み、ＴＬＲ２部分は感染因子に対する特異的な細胞性免疫応答又は液性免疫応答を誘導しない。
【０００６】
本発明の第３の態様において、対象において先天性免疫応答を高めることによりがんを治療又は予防する方法が提供され、該方法は、溶液中にＴＬＲ２部分を含む治療有効量の組成物を対象に投与するステップを含み、ＴＬＲ２部分はＴＬＲ２アゴニストを含み、ＴＬＲ２部分は、がんに対する特異的細胞性免疫応答又は液性免疫応答を誘導しない。
【０００７】
本発明の第４の態様において、溶液中の有効量のＴＬＲ２部分を、薬学的に許容される担体又は賦形剤と一緒に含む、対象において先天性免疫応答を高めることにより疾患を治療又は予防するための医薬組成物が提供され、ＴＬＲ２部分はＴＬＲ２アゴニストを含み、疾患は、ＴＬＲ２部分に対する液性免疫応答又は細胞性免疫応答により治療又は予防されない。
【０００８】
本発明の第５の態様において、対象において疾患を治療又は予防するための医薬品の製造のための、溶液中の有効量のＴＬＲ２部分の使用が提供され、ＴＬＲ２部分はＴＬＲ２アゴニストを含み、ＴＬＲ２アゴニストは対象において先天性免疫応答を高め、疾患は、ＴＬＲ２部分に対する液性免疫応答又は細胞性免疫応答により治療又は予防されない。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】リポペプチドワクチン候補の概略図である。Ｐａｍ２Ｃｙｓに基づく構築体の概略図。（Ａ）ペグ化Ｐａｍ２Ｃｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−ＰＥＧ１１）は、２つのセリンを介してウンデカエチレングリコール（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）にカップリングされた１つのＰａｍ２Ｃｙｓ分子から構成される。（Ｂ）Ｐａｍ２Ｃｙｓに基づくリポペプチドワクチン候補は、１つのリジン（Ｋ）残基を介して連結された、標的ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ及びヘルパーＴエピトープで構成される。Ｐａｍ２Ｃｙｓ脂質部分は、２つのセリン残基（Ｓｅｒ）を介して結合し、分岐型ペプチド構造を形成する。
【図２】リポペプチドの鼻腔内投与が、肺細胞集団を拡大することを示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２５ｎｍｏｌのＯＴ２−Ｐ２Ｃ−ｇＢ４９８−５０５リポペプチド又は２５ｎｍｏｌのペプチドＯＴ２−ｇＢ４９８−５０５（Ｐａｍ２Ｃｙｓを含まない）を鼻腔内接種し、肺細胞集団の特徴付けを、表示の時点で実施した（ｎ＝３／群／時点）。（Ａ）肺細胞の総数を示す。記号は平均細胞数を表し、エラーバーはＳＥＭを示す、＃＝Ｐ＜０．０１  ｖｓ．０日目。（Ｂ）肺細胞の組成を示す。各バーは平均細胞数を表し（ｎ＝３）、エラーバーはＳＤを示す、＊＝Ｐ＜０．０５  ｖｓ．０日目の細胞集団。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡ分析及びポストホックＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ多重比較検定を使用して実施した。反復実験も同様の結果をもたらした。
【図３】Ｐａｍ２Ｃｙｓに基づくリポペプチドがＩＡＶのクリアランスを強化することを示す図である。（Ａ）マウスに、生理食塩水、ＩＡＶ−ＬＰ（ＩＡＶ由来のエピトープを含有する）又は非ＩＡＶ−ＬＰを接種し、リポペプチド接種３日後（上方パネル）又は７日後（下方パネル）に１０４．５ｐｆｕのＭｅｍ７１（Ｈ３Ｎ１）インフルエンザウイルスをチャレンジした（ｎ＝３−５／群）。肺ウイルス価を感染５日目に評価し、ＢＡＬＢ／ｃ（◇）、Ｃ５７ＢＬ／６（□）及びＨＨＤ（〇）のマウスに関して示す。記号は、個別のマウスから得られた力価を表し、線は、群の平均ウイルス価を示す。（Ｂ）生理食塩水対照に対するウイルスクリアランスの百分率を、リポペプチド群の上に示す。ＩＡＶ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、ＬＰ接種後７日目にＭｅｍ７１をチャレンジされたＣ５７ＢＬ／６マウスから検出した。チャレンジの５日目に、ＰＡ２２４−２３３−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、脾臓からＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αに関する細胞内染色アッセイを使用して検出した。バーは、各群における平均サイトカイン特異的応答を意味し、エラーバーはＳＤを示す。＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１  ｖｓ生理食塩水（一元配置ＡＮＯＶＡ分析及びポストホックＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ多重比較検定。
【図４】Ｐａｍ２Ｃｙｓに基づくリポペプチドが、高病原性ＩＡＶ感染症の影響を減少させることを示す図である。上方パネル：生理食塩水、ＩＡＶ−ＬＰ又は非ＩＡＶ−ＬＰ（ｎ＝５／群）を鼻腔内接種され、７日目後にＨ１Ｎ１  ＰＲ８ウイルスをチャレンジされたＣ５７ＢＬ／６マウス（左側）及びＨＨＤマウス（右側）の生存を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロット。下方パネル：感染症後の体重変化。記号は平均を示し、エラーバーはＳＥＭを示す。これらの結果は、両方のマウス系統における、独立した反復実験に反映された。
【図５】肺のサイトカイン環境に対するＰａｍ２Ｃｙｓを示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２０ｎｍｏｌのＰａｍ２Ｃｙｓ−ＰＥＧ１１（Ｐ２Ｃ−ＰＥＧ１１）又は５０μｌの生理食塩水（ｉ．ｎ）を投与し、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中のサイトカイン濃度を、投与後３（Ｄ３）又は７（Ｄ７）日目、ＢＤ（商標）サイトメトリックビーズアレイ（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ）使用して決定した。バーは各群（ｎ＝３）の平均応答を表し、エラーバーはＳＤを示す、＊＝Ｐ＜０．０５；＊＊＝Ｐ＜０．０１；＊＊＊＝Ｐ＜０．００１  ｖｓ．生理食塩水及びナイーブ群（一元配置ＡＮＯＶＡ及びポストホックＴｕｋｅｙ’ｓ多重比較検定）。
【図６】Ｐａｍ２Ｃｙｓがウイルスクリアランスを媒介することを示す図である。マウスに、生理食塩水又は２０ｎｍｏｌのＰａｍ２Ｃｙｓ−ＰＥＧ１１を接種し、１（上方パネル）、３（中央パネル）又は７（下方パネル）日後に１０４．５ｐｆｕのＭｅｍ７１（Ｈ３Ｎ１）ウイルス（ｎ＝３〜５／群）をチャレンジした。ウイルス価を、感染の５日目にＢＡＬＢ／ｃ（◇）、Ｃ５７ＢＬ／６（□）及びＨＨＤ（〇）マウスにおいて評価した。記号は、個別のマウスから得られた力価を表し、線は群の平均ウイルス価を示す、＊＝Ｐ＜０．０５  ｖｓ．生理食塩水（対応のないスチューデントｔ検定）。生理食塩水群に対するウイルスクリアランスの百分率は、Ｐａｍ２Ｃｙｓ応答の上に示す。
【図７】鼻腔内Ｐａｍ２Ｃｙｓ投与が、肺において細胞の亜集団を拡大することを示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２０ｎｍｏｌのペグ化Ｐａｍ２Ｃｙｓ（Ｐ２Ｃ−ＰＥＧ１１）又は５０μｌの生理食塩水（ｉ．ｎ）を投与し、肺細胞集団を投与後７２時間特徴付けた。バーは各群（ｎ＝３）の平均応答を表し、エラーバーはＳＤを示す、＊＝Ｐ＜０．０５；  ｖｓ．生理食塩水群（対応のないスチューデントｔ検定）。
【図８】Ｐａｍ２Ｃｙｓが、悪性ＩＡＶ感染症に対して保護することを示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、生理食塩水又は２０ｎｍｏｌのペグ化Ｐａｍ２Ｃｙｓ（Ｐ２Ｃ−ＰＥＧ１１）（ｎ＝５／群）を鼻腔内接種し、７日後、２００ｐｆｕのＨ１Ｎ１  ＰＲ８ウイルスをチャレンジした。マウスの１群に２０ｎｍｏｌのＰ２Ｃ−ＰＥＧ１１を与え、７２時間後チャレンジした。感染後の体重変化を、元の体重の百分率として示す。記号は平均を表し、エラーバーはＳＥＭを示す。これらの結果は、独立した反復実験に反映された。
【図９】Ｐａｍ２Ｃｙｓによる予防が、ウイルス負荷及びインフルエンザの接触伝染を減少させることを示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、生理食塩水（白いバー）又は２０ｎｍｏｌのペグ化Ｐａｍ２Ｃｙｓ（Ｐ２Ｃ−ＰＥＧ１１）（灰色のバー）を接種し、７日、５日、７２時間又は２４時間後、１０４．５ｐｆｕのＵｄｏｒｎ（Ｈ３Ｎ２）ウイルス（ｎ＝２／群）をチャレンジした。これらのマウスは、スプレッダーマウスと名付けた。チャレンジ２４時間後、スプレッダーマウスを、ナイーブなレシピエントマウスと同時飼育した。同時飼育の２４時間後、スプレッダーマウスを取り出し、鼻甲介、気管及び肺を取り出し、ウイルス価を決定した（上方パネル）。スプレッダーマウスへの曝露３．５日後、レシピエントマウスから器官を採取し、ウイルス価を評価した（下方パネル）。白又は灰色の矢印は、それぞれの処置群から同時飼育レシピエントへの、接触により媒介される伝染が成功したことを示す。
【図１０】ＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓが、鼻腔内送達された場合、単回用量でＩＡＶに対して保護することを示す図である。マウスに、ＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓ（２０ｎｍｏｌ）を、鼻腔内（ｉ．ｎ）、皮下（ｓ．ｃ）又は静脈内（ｉ．ｖ）経路を介して予防投与し、３日後、致死量のＰＲ８ウイルスをチャレンジした。マウスはその後、体重及び生存に関してＰＲ８後８日間にわたってモニターされ、エンドポイントで安楽死処分された。
【図１１】いくつかのＰａｍ２Ｃｙｓ変異体もまた、ＩＡＶチャレンジに対する保護をもたらすことを示す図である。マウスに、２０ｎｍｏｌのさまざまなＰａｍ２Ｃｙｓ含有構築体を、鼻腔内経路を介して予防投与し、３日後、致死量のＰＲ８ウイルスをチャレンジした。マウスはその後、体重（Ａ）及び生存（Ｂ）に関してＰＲ８後８日間にわたってモニターされた。生理食塩水群において見られた体重の減少が、他の処置群のそれぞれと比較した場合、統計的に有意であった（Ｐ＜０．０１）。
【図１２】反復用量で与えた場合、ＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓが有効であることを示す図である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、単回用量のＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓ又は３週間空けて２回用量のＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓを投与し、その後、第２の用量の３日後にＰＲ８をチャレンジした。マウスはその後、体重及び生存に関してチャレンジ後８日間にわたってモニターされ、肺のウイルス負荷の評価に関して、ＰＲ８後７日目に処分された。生理食塩水群において見られた体重の減少が、他の処置群のそれぞれと比較した場合、統計的に有意であった（Ｐ＜０．０１）（Ａ）。ＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓにより処置されたマウスにおけるウイルス負荷は、生理食塩水のみを与えられたマウスにおけるものよりも実質的に低かった（Ｂ）。
【図１３】ＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓのより低い用量もまた有効であることを示す図である。マウスを、より低い用量のＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓの２、５及び１０ｎｍｏｌ（２０ｎｍｏｌと比較されたい）で予防処置し、３日後、致死量のＰＲ８ウイルスをチャレンジした。マウスは体重変化及び生存に関してチャレンジ後１８日間にわたってモニターされ、エンドポイントで安楽死処分された。生理食塩水群内のマウスは、ＰＲ８チャレンジ後８日を越えて生存しなかった。
【図１４】ＩＡＶチャレンジに対する保護が、ＩＦＮ−γ又は１型インターフェロン（すなわちＩＦＮ−α）に依存しないことを示す図である。ＩＦＮ−γ欠損マウス（Ｂ６．ＩＦＮ−γ−／−）（Ａ）又は１型インターフェロン受容体欠損マウス（ＩＦＮＡＲ−／−）（Ｂ）に、２０ｎｍｏｌのＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓ（ｉ．ｎ．）を予防投与し、３日後、致死量のＰＲ８ウイルスをチャレンジした。これらのマウスは、ＰＲ８感染症に関連する体重減少及び致死に対して保護された。生理食塩水群が安楽死処分されるエンドポイントである５日目に、Ｂ６．ＩＦＮ−γ−／−コホートは処分された。
【図１５】ＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓが治療薬として有効であることを示す図である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、１０４．５ＰＦＵのＵｄｏｒｎウイルスをｉ．ｎ．でチャレンジし、４時間後、２０ｎｍｏｌのＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓを投与した（ｉ．ｎ．）。２日後、動物を処分し、鼻、中咽頭、気管及び肺においてウイルス負荷を決定した。
【図１６】ＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓが抗菌剤として有効であることを示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、２０ｎｍｏｌのＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓで予備処置し（ｉ．ｎ）、３日後、１ｘ１０６ＣＦＵのＬ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）（ＪＲ３２Δｆｌａ株）をチャレンジした。マウスは、Ｌ．ニューモフィラによる鼻腔内チャレンジ後毎日モニターされ、マウスの肺における細菌負荷を、チャレンジの１，２及び３日後に評価した（Ａ）。各記号は、各時点において得られた平均細菌負荷を表し、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表す。統計的有意差を、生理食塩水とＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓ処置群とを比較するスチューデントｔ検定を使用して得られた＊（ｐ＜０．０５）により表示する。生理食塩水群に関する細菌減少の平均百分率を、各記号の上に示す。ＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓによる保護期間を明示するために、マウスを、Ｌ．ニューモフィラによるチャレンジ前３日（Ｂ）又は７日（Ｃ）に、ＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓで予備処置した。感染後３日目の細菌負荷を、図Ｂ及びＣに示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［詳細な説明］
本明細書を通して、文脈が他のことを要求していない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、述べられている要素若しくは整数又は要素若しくは整数の群の組み入れを意味し、任意の他の要素若しくは整数又は要素若しくは整数の群の除外を意味するものではないと理解されるものとする。
【００１１】
任意の先行する出版物（又はそれに由来する情報）又は公知である任意の事柄に対する本明細書における参照は、先行する出版物（又はそれに由来する情報）又は公知の事柄が、本明細書が関連する試みの分野における共通の一般知識の一部を形成するという示唆の承認又は了承又は任意の形態ではなく、そのように解釈すべきではない。
【００１２】
本明細書に述べられるすべての出版物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１３】
本明細書において使用する場合、文脈が明らかに他のことを表していない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の態様を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「薬剤（ａｎ  ａｇｅｎｔ）」に対する言及は、１つの薬剤及び２つ以上の薬剤を含み、「組成物（ｔｈｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」に対する言及は、１つの組成物及び２つ以上の組成物を含む。
【００１４】
本明細書において、「ＴＬＲ２」という用語は、Ｔｏｌｌ様受容体２タンパク質を意味することが意図される。ＴＬＲ２は、ＴＬＲ１、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及びＴＬＲ９を含むＴｏｌｌ様受容体（すなわち「ＴＬＲ」）の膜受容体タンパク質ファミリーである。ヒトにおいて、ＴＬＲ２は、ＴＬＲ２遺伝子によりコードされる。ＴＬＲ２は、特定の細胞の表面において発現され、病原体の認識及び先天性免疫の活性化において基本的な役割を果たす。
【００１５】
ＴＬＲ２アゴニストは、Ｔｏｌｌ様受容体２と結合する薬剤である。ＴＬＲ２  アゴニストは、ホモ二量体又はヘテロ二量体としてＴＬＲ２と結合することもできる。
【００１６】
本発明は、Ｓ−［２，３−ｂｉｓ（パルミトイルオキシ）プロピル］システイン（Ｐａｍ２Ｃｙｓ）などのＴＬＲ２アゴニストが、対象における先天性免疫応答を高める能力を示す、特に、ウイルス（例えば、インフルエンザＡ）及び細菌（例えばＬ．ニューモフィラ）などの感染因子に対する予防効果及び治療効果を、非抗原特異的様式で誘発するという観察を前提としている。
【００１７】
したがって、本発明の第１の態様において、対象において先天性免疫応答を高めることにより疾患を治療又は予防する方法が提供され、該方法は、溶液中にＴＬＲ２部分を含む有効量の組成物を対象に投与するステップを含み、ＴＬＲ２部分はＴＬＲ２アゴニストを含み、疾患は、ＴＬＲ２部分に対する液性免疫応答又は細胞性免疫応答により治療又は予防されない。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ＴＬＲ２アゴニストはリポペプチドであるか、又は脂質部分を含む。
【００１９】
本発明のこの実施形態に従った例示的リポペプチドは、リポペプチド「Ｐａｍ２Ｃｙｓ」である。当業者は、「リポペプチド」という用語が、１種又は複数種の脂質部分及び１種又は複数種のコンジュゲートされたアミノ酸配列を含む任意の組成物を意味することを理解するはずである。「Ｐａｍ２Ｃｙｓ」（ジパルミトイル−Ｓ−グリセリル−システイン又はＳ−［２，３ｂｉｓ（パルミトイルオキシ）プロピル］システインとしても知られている）が合成されており、マイコプラズマ・ファーメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）から単離されたＭＡＬＰ−２、マクロファージ活性化リポペプチドの脂質部分に対応する。Ｐａｍ２Ｃｙｓは、ＴＬＲ２のリガンドであることが公知である。
【００２０】
Ｐａｍ２Ｃｙｓは下記の構造を有する：
【化１】
2019167369.tif 000002
【００２１】
別の例示的リポペプチドは、リポアミノ酸のＮ−パルミトイル−Ｓ−［２，３−ｂｉｓ（パルミトイルオキシ）プロピル］システインであり、Ｐａｍ３Ｃｙｓ又はＰａｍ３Ｃｙｓ−ＯＨとしても知られており、グラム陰性菌の内膜及び外膜に広がるＢｒａｕｎリポタンパク質のＮ末端部分の合成型である。Ｐａｍ３Ｃｙｓは下記の構造を有する：
【化２】
2019167369.tif 000003
【００２２】
米国特許第５，７００，９１０号は、合成アジュバント、Ｂリンパ球刺激剤、マクロファージ刺激剤又は合成ワクチンとして使用されるリポペプチドの調製における中間体として使用するための、いくつかのＮ−アシル−Ｓ−（２−ヒドロキシアルキル）システインを記載している。米国特許第５，７００，９１０はまた、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＯＨの合成、及びＮ末端にこのリポアミノ酸又はこれらのアナログを含むリポペプチドの合成における中間体として、このような化合物を使用することを教示している。
【００２３】
細胞表面ＴＬＲの標的化に使用され得る他の脂質部分は、パルミトイル、ミリストイル、ステアロイル、ラウロイル、オクタノイル又はデカノイルを含む。
【００２４】
Ｐａｍ２Ｃｙｓ及びＰａｍ３Ｃｙｓに加えて、本発明は、本発明に従ったＳｅｔ２Ｃｙｓ、Ｌａｕ２Ｃｙｓ及びＯｃｔ２Ｃｙｓの使用も企図する。当業者は、Ｓｔｅ２Ｃｙｓが、Ｓ−［２，３−ｂｉｓ（ステアロイルオキシ）プロピル］システイン又はジステアロイル−Ｓ−グリセリル−システインとしても公知であること、Ｌａｕ２Ｃｙｓが、Ｓ−［２，３−ｂｉｓ（ラウロイルオキシ）プロピル］システイン又はジラウロイル−Ｓ−グリセリル−システイン）としても公知であること、及びＯｃｔ２Ｃｙｓが、Ｓ−［２，３−ｂｉｓ（オクタノイルオキシ）プロピル］システイン又はジオクタノイル−Ｓ−グリセリル−システイン）としても公知であることを承知しているであろう。
【００２５】
他の適切なＴＬＲ２アゴニストは、限定するものではないが、合成のトリアシル化及びジアシル化のリポペプチド、ＦＳＬ−Ｉ（マイコプラズマ・サリバリウム１（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ  １）由来の合成リポタンパク質）、Ｐａｍ３Ｃｙｓ（トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン）及びＳ−［２，３−ｂｉｓ（パルミトイルオキシ）−（２ＲＳ）−プロピル］−Ｎ−パルミトイル−（Ｒ）−システインを含み、「Ｐａｍ３」は「トリパルミトイル−Ｓ−グリセリル」である。Ｐａｍ３Ｃｙｓの誘導体もまた適切なＴＬＲ２アゴニストであり、誘導体は、限定するものではないが、Ｓ−［２，３−ｂｉｓ（パルミトイルオキシ）−（２−Ｒ，Ｓ）−プロピル］−Ｎ−パルミトイル−（Ｒ）−Ｃｙｓ−（Ｓ）−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４−ヒドロキシトリヒドロクロリド、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ；  ＰａＭ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ；Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ、ＰａＭ３ＣｙＳ−ＯＭｅ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＯＨ、ＰａｍＣＡＧ、パルミトイル−Ｃｙｓ（（ＲＳ）−２，３−ジ（パルミトイルオキシ）−プロピル）−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＯＨなどを含む。適切なＴＬＲ２アゴニストの別の限定されない例は、Ｐａｍ２ＣＳＫ４、ＰａＭ２ＣＳＫ４（ジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン−セリン−（リジン）４であり又はＰａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４）は合成のジアシル化リポペプチドである。他の合成のＴＬＲアゴニストは、例えば、Ｋｅｌｌｎｅｒら、（１９９２年、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７３：１：５１〜５頁）；Ｓｅｉｆｅｒら（１９９０年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ、２６：７９５〜８０２頁）及びＬｅｅら（２００３年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．、４４：４７９〜４８６頁）に記載のものを含む。
【００２６】
当業者には理解されることであろうが、ＴＬＲ２アゴニストは通常非極性であり、したがって、非極性溶媒中では可溶性であるが、極性溶媒及び水性溶媒中では難溶性でしかない。ＴＬＲ２アゴニストを極性溶媒又は水性溶媒中で使用することが望ましい場合、ＴＬＲ２アゴニストは、可溶化剤とコンジュゲートされてもよい。
【００２７】
可溶化剤は、ＴＬＲ２部分の溶解度を改善するためにＴＬＲ２アゴニストにコンジュゲートされ得る、１種又は複数種の可溶化剤を含んでもよい。可溶化剤は一般に、極性溶媒又は水性溶媒中でＴＬＲ２部分の溶解度を増加する極性部分である。
【００２８】
本発明の他のさらなる実施形態において、可溶化剤は「ＰＥＧ」（又はポリエチレングリコール）並びに極性ポリペプチド、例えば「Ｒ４」、超分岐テトラアルギニン複合体；「Ｈ４」、超分岐テトラヒスチジン複合体；「Ｈ８」、ヒスチジン残基を含有する直鎖ペプチド；及び「Ｅ８」、グルタミン酸残基を含有する直鎖ペプチドからなる群の１つ又は複数を含む。グルタミン酸残基を含有する超分岐ペプチドを含む、他の直鎖及び分岐型脂質可溶化剤もまた想定される（例えば、下記の「分岐型Ｅ８」を参照されたい）。本発明の他のさらなる実施形態において、可溶化剤は、ＰＥＧ並びにＲ４、Ｈ４、Ｈ８及びＥ８（直鎖又は分岐型）からなる群の１つ又は複数を含む。Ｒ４、Ｈ４、Ｈ８及びＥ８は、すでにＰＣＴ／ＡＵ２００９／０００４６９（ＷＯ／２０１０／１１５２３０）に記載されており、下記の構造を有する：
【００２９】
【化３】
2019167369.tif 000004
【００３０】
【化４】
2019167369.tif 000005
【００３１】
【化５】
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【００３２】
【化６】
2019167369.tif 000007
【００３３】
【化７】
2019167369.tif 000008
【００３４】
当業者は、本発明が、例示された特定の可溶化剤に限定されず、当技術分野において公知の他の適切な可溶化剤、例えば炭水化物が、本発明に従って使用できることは理解されるであろう。
【００３５】
１種又は複数種の可溶化剤を、本発明に従った脂質にコンジュゲートできる方法は、当業者には周知のものである。例えば、Ｆｍｏｃ化学を介した、ジスルフィド又はジエーテル（ｄｉｏｅｔｈｅｒ）架橋を介した、又はオキシム化学を介したコンジュゲーションが予想される。本発明の特定の実施形態において、Ｐａｍ２Ｃｙｓの可溶性形態が、Ｏ−（Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノエチル）−Ｏ’−（２−カルボキシエチル）−ウンデカエチレングリコール（Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ１１−ＯＨ、Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ）のＰａｍ２Ｃｙｓへの付加により調製された。これにより、脂質のペグ化形態、Ｐａｍ２Ｃｙｓ−ＰＥＧ１１の形成がもたらされ、これはその後対象への投与に適切である。
【００３６】
本発明に従った特に好ましい形態において、ＴＬＲ２部分は、ＰＥＧにコンジュゲートされたＰａｍ２Ｃｙｓを含むコンジュゲートを含む。
【００３７】
先に示したように、本発明者らはＰａｍ２Ｃｙｓが、感染因子、例えばウイルス（例えばインフルエンザＡ）又は細菌（例えばＬ．ニューモフィラ）による感染症に対する予防活性及び治療活性を、非抗原特異的様式で明示するという驚くべき観察を行った。例えば、鼻腔内（ｉｎｔｒａｎｓａｌｌｙ）送達された場合、単回用量の可溶性Ｐａｍ２Ｃｙｓは、軽症のＨ３Ｎ１感染症後のウイルス負荷の最大９９％の減少により明示され、高病原性Ｈ１Ｎ１感染症に関係する罹患率及び死亡率が有意に減少したように、Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ及びＨＨＤマウスにおけるインフルエンザＡ感染症の異種サブタイプに対する即時の、有意な保護を提供した。
【００３８】
本発明者らは、本発明の方法に従ったＴＬＲ２アゴニストの投与が、任意の同時投与された、ＴＬＲ９アゴニストを含むＴＬＲアゴニストの不在下で、対象において先天性免疫応答を誘発することもまた見出した。したがって、いくつかの実施形態において、本発明に従った組成物はＴＬＲ９アゴニストを含まない。
【００３９】
本発明者らは、本発明に従ったＴＬＲ２アゴニストが、対象において非抗原特異的、先天性免疫応答を高めることができることを示した。このことは、１種又は複数種のペプチド抗原を含むＴＬＲ２部分の投与を伴う実験により明示されており、このペプチド抗原は治療又は予防される疾患とは「無関係」である。本明細書において使用する場合「無関係」という用語は、特異的な抗原又は抗原（複数）に対する液性応答又は細胞性応答を高めることができず、本発明に関連して、ＴＬＲ２部分に対する液性免疫応答又は細胞性免疫応答を高めないことを意味することを意図している。
【００４０】
したがって、本発明に従ったＴＬＲ２アゴニストは、限定するものではないが、ヘルパーＴエピトープ及び／又は細胞毒性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含む、１種又は複数種の、疾患の治療又は予防とは無関係のペプチド抗原をさらに含むことができる。本発明に従ったＴＬＲ２部分は、対象において非抗原特異的様式で先天性免疫応答を起こすことができるので、当業者は、ＴＬＲ２部分が、予防又は治療される疾患と無関係であろう１種又は複数種のペプチド抗原を含むことができる、又はＴＬＲ２部分が、１種又は複数種のペプチド抗原の不在下で使用され得ることを理解するであろうことを心に留めることは重要である。
【００４１】
例示の目的で、本発明は、ＩＡＶの治療において、１種又は複数種の「無関係な」ペプチド抗原を含むＴＬＲ２部分が、この部分の投与後、同一であるが、結合されたペプチド抗原を含まないＴＬＲ２アゴニストと同じ、非抗原特異的／先天性免疫応答を高める能力を明示することを明示する。これらの実験において、本発明者らは、ＴＬＲ２部分を含む組成物を使用し、ＴＬＲ２部分は、ＴＬＲ２アゴニスト（例えばＰａｍ２Ｃｙｓ）、ヘルパーＴエピトープ（ＯＴ２）及び／又は細胞毒性Ｔリンパ球エピトープ単純ヘルペスウイルス１由来ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（表１を参照されたい）を含んだ。両方のエピトープはＩＡＶとは無関係である。したがって、本発明者らは、本発明に従ったＴＬＲ２部分が、それを投与された対象において非抗原依存性の先天性免疫応答を高め得ることを示した。
【００４２】
したがって、本発明の別の態様において、感染因子により引き起こされる疾患を治療又は予防する方法が提供され、該方法は、溶液中にＴＬＲ２部分を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含み、ＴＬＲ２部分はＴＬＲ２アゴニストを含み、ＴＬＲ２部分は感染因子に対する特異的な細胞性免疫応答又は液性免疫応答を誘導しない。
【００４３】
いくつかの実施形態において、本発明は、感染後、ウイルスに対する即時の抗ウイルス効果を有する対象において先天性免疫応答を高める方法を提供する。特に、これは、本発明に従ったＴＬＲ２部分の投与が、ウイルス感染、特にインフルエンザＡ感染後に、対象において予防効果を有し得ることを意味する。したがって、本発明に従ったさらなる実施形態において、ＴＬＲ２受容体アゴニストの投与は、対象において感染因子により引き起こされる疾患の予防に使用できる。このような方法で、本発明に従った方法を使用し、限定するものではないが、インフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｌ．ニューモフィラ及びがんを引き起こすことが公知の感染因子を含む、感染因子による感染症の予防において先天性免疫応答を誘発することができる。
【００４４】
本発明は、すでに感染因子に感染している、又は感染因子が定着している対象において先天性免疫応答を高める方法もまた企図する。特に、これは、本発明に従った組成物の投与が、対象において感染因子による感染又は定着後の治療効果を有し得ることを意味する。したがって、さらなる実施形態において、本発明に従った組成物の投与が、対象において感染因子により引き起こされる疾患の治療に使用できる。
【００４５】
本発明者らは、本発明に従ったＴＬＲ２部分により対象を予備処置すると、細菌による感染症がＴＬＲ２部分の投与７日後に起こる場合でさえ、細菌による鼻腔内チャレンジ後の肺及び気管中の細菌負荷を有意に減少させることができることもさらに示した。したがって、いくつかの実施形態において、感染因子は細菌である。細菌は、細胞内のグラム陽性又はグラム陰性の細菌であり得る。一実施形態において、細菌は、限定するものではないが、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）及びマイコバクテリウム・ツベルクローシスを含む。一実施形態において、感染因子はマイコバクテリウム・ツベルクローシスである。別の実施形態において、感染因子はレジオネラ・ニューモフィラである。
【００４６】
いくつかの実施形態において、感染因子は、対象における二次感染症（例えば肺炎）の原因である。したがって、本発明は、先天性免疫応答を高めることにより、対象において二次感染症を治療又は予防する方法もまた提供し、該方法は、溶液中にＴＬＲ２部分を含む有効量の組成物を、対象に投与するステップを含み、二次感染症は、可溶性ＴＬＲ２部分に対する液性免疫応答又は細胞性免疫応答により治療又は予防されない。
【００４７】
本発明者らは、予防投与された場合、本発明に従ったＴＬＲ２部分を含む組成物が、感染因子、例えばインフルエンザＡによる軽度の病原性感染症に対する即時の保護を提供でき、この保護が、先天性免疫メディエーターの肺への流入と関係があることもさらに明示している。この抗ウイルス活性は抗原特異的ではない。
【００４８】
本発明は、本明細書において定義されたＴＬＲ２部分の、対象におけるがんの治療のための使用もまた企図する。したがって、本発明の別の態様において、対象において先天性免疫応答を高めることによりがんを治療又は予防する方法が提供され、該方法は、溶液中にＴＬＲ２部分を含む治療有効量の組成物を対象に投与するステップを含み、ＴＬＲ２部分はＴＬＲ２アゴニストを含み、ＴＬＲ２部分は、がんに対する特異的細胞性免疫応答又は液性免疫応答を直接誘導しない。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ２部分の投与は、がんの成長又は広がりを阻害する。
【００４９】
当業者は、がんが感染因子により引き起こされ得るか、又は引き起こされ得ないことを認識するであろう。したがって、感染因子により引き起こされない確立されたがんもまた、本発明の方法に従って治療され得る。例えば、ＴＬＲ２部分を、対象において先天性免疫応答を誘導するように、対象においてがんを引き起こす腫瘍部位に直接投与することができる。ＴＬＲ２アゴニストのがんを引き起こす腫瘍部位への直接投与は、先天性免疫系の細胞（例えば、好中球、マクロファージ及びサイトカイン）の腫瘍部位への動員を伴うことができる。したがって、いくつかの実施形態において、組成物は、がんを引き起こす腫瘍部位に直接投与される。「腫瘍」という用語は、細胞の異常な成長により形成される新生物又は固体病変（時として「新生物性（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）」と呼ばれる）を意味することを意図している。腫瘍という用語が、必ずしもがんと同意語ではないことを心に留めることが重要である。腫瘍は良性、前悪性又は悪性であり得、一方、がんは定義により悪性であるが、多くの場合、腫瘍はがんと関係がある。本明細書において使用する場合、「がん」という用語は、それらの細胞の、特殊化された、異なる細胞へのいかなる分化も伴わない、制御できない細胞成長（例えば腫瘍形成）により特徴付けられる、疾患又は障害の群を指す。
【００５０】
本明細書において使用する場合、「対象」という用語は、動物、特に哺乳動物及びより特別には下等霊長類を含む霊長類及びさらにより特別には本発明の医療プロトコルから利益を得ることができるヒトを指す。ヒト又は非ヒト動物又は胚であるかどうかにかかわらず、対象は、個体、対象、動物、患者、宿主又はレシピエントと称され得る。本発明は、ヒト及び獣医学的用途の両方を有する。便宜上、「動物」は特に家畜動物、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ラクダ、ヤギ及びロバを含む。ウマに関しては、これらは、レース業界に使用されるウマ及びレクリエーション又は畜産業に使用されるウマを含む。研究室の実験動物の例は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット及びハムスターを含む。ウサギ及びげっ歯類動物、例えばラット及びマウスは、霊長類及び下等霊長類と同様の便利な試験系又は動物モデルを提供する。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。
【００５１】
本発明に従った組成物は、有効量で投与される。ＴＬＲ２部分の「有効量」及び「治療有効量」という用語は、本明細書において使用する場合、その過程において所望の治療効果又は生理的効果を少なくとも統計有意数の対象に提供する十分量を意味する。望ましくない効果、例えば副作用が、時として所望の治療効果と一緒に現れ、したがって、施術者は、適切な「有効量」が何であるかの決定において、潜在的利益対潜在的危険性のバランスを保つ。必要な正確な量は対象ごとに変動し、対象の種、年齢及び全身状態、投与の様式などに依存する。したがって、正確な「有効量」を明示することができない場合がある。しかし、任意の個別の症例における適切な「有効量」は、日常実験のみを使用して、当業者により決定できる。いくつかの実施形態において、ヒト対象に関する有効量は、約０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ体重／用量〜１ｍｏｌ／ｋｇ体重／用量の範囲にある。いくつかの実施形態において、該範囲は、約１ｎｍｏｌ〜１ｍｏｌ、約１μｍｏｌ〜１ｍｏｌ、１μｍｏｌ〜５００μｍｏｌ、１μｍｏｌ〜２５０μｍｏｌ、１μｍｏｌ〜５０μｍｏｌ又は１ｎｍｏｌ〜１μｍｏｌ／ｋｇ体重／用量である。いくつかの実施形態において、該範囲は、約０．０８μｍｏｌ〜０．１１μｍｏｌ／ｋｇ体重／用量のＴＬＲ２部分である。投薬レジメンは、状況の緊急性に合わせて調整され、最適な治療用量をもたらすために調整できる。例えば、いくらかの用量を、毎日、毎週、毎月又は他の適切な時間間隔で提供できる。
【００５２】
「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、限定するものではないが、（ｉ）疾患の進行を遅延させる又は停止させること、（ｉｉ）疾患の進行を部分的に回復させること、及び（ｉｉｉ）疾患の進行を完全に回復させること（すなわち疾患の治癒）を含む。「予防（ｐｒｅｖｅｎｔ）」又は「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」という用語は、疾患の完全な予防（すなわち、疾患を発症させないこと）に限定されると解釈されるべきではなく、疾患の進行の最小化、例えば、本発明に従った組成物の予防投与の結果として、疾患が対象においてより低い強度で起こる、又はより遅い速度で進行することを含んでもよい。
【００５３】
本発明に従った組成物は、単回用量で投与されても、又は一連の用量で投与されてもよい。コンジュゲートを単独で投与することが可能であるが、組成物、好ましくは医薬組成物として存在することが好ましい。このような組成物の製剤は、当業者に周知である。該組成物は、任意の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含有してもよい。適切な投薬量及び投薬レジメンは、担当医が決定でき、治療される特定の状態、状態の重症度及び対象の全般的な年齢、健康及び体重に依存し得る。
【００５４】
「薬学的に許容される」担体、賦形剤又は希釈剤は、生物学的その他で望ましくないことはない材料からなる医薬ビヒクルを意味し、すなわち該材料は、選択されたコンジュゲートと一緒に、任意の又は実質的な有害反応を引き起こすことなく対象に投与できる。担体は、賦形剤及び他の添加剤、例えば希釈剤、洗浄剤、着色剤、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、保存料などを含むことができる。担体は、すべての従来の溶媒、分散媒、充填剤、固体担体、コーティング剤、抗真菌剤及び抗菌剤、皮膚透過剤、界面活性剤、等張剤及び吸収剤などをさらに含むことができる。本発明の組成物は、他の補足の生理学的活性薬剤もさらに含むことができると理解されることであろう。
【００５５】
したがって、本発明はまた、溶液中の有効量のＴＬＲ２部分を、薬学的に許容される担体又は賦形剤と一緒に含む、対象において先天性免疫応答を高めることにより疾患を治療又は予防するための医薬組成物を提供し、ＴＬＲ２部分はＴＬＲ２アゴニストを含み、疾患は、ＴＬＲ２部分に対する液性免疫応答又は細胞性免疫応答により治療又は予防されない。
【００５６】
本発明の組成物は、限定するものではないが、鼻腔内、経口及び静脈内を含む、当業者に公知の任意の手段により投与できる。いくつかの実施形態において、組成物は鼻腔内投与される。
【００５７】
本発明はまた、対象において疾患を治療又は予防するための医薬品の製造のための、溶液中の有効量のＴＬＲ２部分の使用を企図し、ＴＬＲ２部分はＴＬＲ２アゴニストを含み、ＴＬＲ２アゴニストは対象において先天性免疫応答を高め、疾患は、ＴＬＲ２部分に対する液性免疫応答又は細胞性免疫応答により治療又は予防されない。
【００５８】
当業者は、本明細書に記載の発明が、特に記載されたもの以外の変形及び改変を受け入れる余地があることを理解されることであろう。本発明が、本発明の精神及び範囲内に納まる、すべてのこのような変形及び改変を含むことは理解されることであろう。本発明は、本明細書に言及又は示されたすべてのステップ、特長、組成物及び化合物もまた、個別に又は全体的に含み、前記ステップ又は特長の任意の２つ以上のあらゆる組み合わせもまた含む。
【００５９】
本発明の特定の実施形態を、下記の実施例を参照してここに説明するが、これらは単なる例示目的を意図し、前述の一般性の範囲を限定する意図のものではない。
【実施例】
【００６０】
材料及び方法
ペプチド及びリポペプチドの合成、精製及び確証。リポペプチド及びペプチドの合成を、従来の固相合成により、全体にわたって、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシ  カルボニル）化学を使用して実施した。ペプチドを、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ、Ａｒｉｚｏｎａ、ＵＳＡ）又はマイクロ波技術を使用して高忠実性ペプチド配列の作製を容易にするＬｉｂｅｒｔｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒ（ＣＥＭ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ、ＵＳＡ）使用して、自動的にアセンブリさせた。ペプチド及びリポペプチドを、逆相高性能液体クロマトグラフィーにより精製し、生成物の信頼性を、質量分析により決定した。ペプチドのアセンブリ、精製及び特徴付けに使用した手順は、他に詳細に記載されている（参考文献１、２、３）。Ｐａｍ２Ｃｙｓの可溶性形態を、Ｏ−（Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノエチル）−Ｏ’−（２−カルボキシエチル）−ウンデカエチレングリコール（Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ１１−ＯＨ、Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ）のＰａｍ２Ｃｙｓへの付加により調製した。これにより、脂質のペグ化形態、Ｐａｍ２Ｃｙｓ−ＰＥＧ１１が形成された。リポペプチド構築体及び個別のリポペプチド組成物に含まれるエピトープを表１に示す。
【００６１】
動物。６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｂ６．ＩＦＮ−γ−／−、Ｂ６．ＩＦＮＡＲ−／−及びＨＨＤの雄及び雌のマウスを使用した。ＨＨＤ「ノックアウト」マウスは、ＨＬＡ−Ａ２．１のα１−α２ドメイン並びにＨ−２Ｄｂのα３及び細胞質及び膜貫通ドメインのキメラ単鎖を発現する。これらのマウスは、血清学的に検出可能なネズミＨ−２Ｄｂ分子を発現できない、ダブルノックアウトＨ−２Ｄｂ−／−β２ｍ−／−マウスに構築される（参考文献４、５）。ＨＨＤマウスは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、Ｐａｒｉｓにおいて開発され、Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈのご厚意により供給された。マウスを、Ａｎｉｍａｌ  Ｈｏｕｓｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙにおいて繁殖させ、飼育した。Ｂ６．ＩＦＮ−γ−／−マウスは、インターフェロン−γを欠損しており、Ｂ６．ＩＦＮＡＲ−／−マウスは１型インターフェロン受容体を保有していない。ＴＬＲ２欠損マウスは、Ｄｒ  Ｓｈｉｚｕｏ  Ａｋｉｒａ、Ｏｓａｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのご厚意により提供された。マウスに伴うすべての手順は、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。
【００６２】
接種手順。マウスに、ペントラン（Ｐｅｎｔｈｒａｎｅ）（商標）又はイソフルラン吸入により麻酔をかけ、２５ｎｍｏｌのリポペプチド、２５ｎｍｏｌの非脂質付加ペプチド又は２〜２０ｎｍｏｌのＰａｍ２Ｃｙｓ含有構築体を、鼻腔内経路により接種した。Ｐａｍ２Ｃｙｓ含有構築体及びリポペプチド及びペプチドを生理食塩水に溶解し、５０μｌの体積で投与し、一方、生理食塩水対照群には５０μｌの生理食塩水のみを与えた。
【００６３】
インフルエンザＡウイルスのチャレンジ。リポペプチド接種後１、３又は７日目、マウスに、生ＩＡＶを鼻腔内チャレンジした。軽度のＩＡＶ感染症のために、マウスに、１０４．５ＰＦＵのＨ３Ｎ１ウイルス、Ｍｅｍ７１、Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１［Ｈ３Ｎ２］ｘＡ／Ｂｅｌｌａｍｙ／４２［Ｈ１Ｎ１］の遺伝子再集合体を投与した。チャレンジ５日目、肺をウイルス価決定のために採取し、脾臓を、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の特徴付けのために採取した。高病原性ＩＡＶのチャレンジを、５０ＰＦＵ（ＨＨＤマウス）、２００ＰＦＵ（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）又は５００ＰＦＵ（ＢＡＬＢ／ｃマウス）のＨ１Ｎ１ウイルスＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（ＰＲ８）を使用して、鼻腔内経路を介して実施した。この高病原性ウイルスは、体重減少及び脱水症状を特徴とする症候性感染症を誘導する。マウスを、罹患の兆候に関して毎日モニターし、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された臨床症状及び体重減少の程度の組み合わせを使用して決定される、安楽死エンドポイントにおいて必要な場合、処分した。
【００６４】
レジオネラ・ニューモフィラ菌のチャレンジ。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、２０ｎｍｏｌのＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓで鼻腔内予備処置し、３日後、１ｘ１０６ＣＦＵのＬ．ニューモフィラ（ＪＲ３２Δｆｌａ株）により鼻腔内チャレンジした。マウスの肺における細菌負荷を、感染１、２及び３日後に評価した。
【００６５】
接触伝染研究。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるウイルス伝染を評価するために、「ドナー」マウス（ｎ＝２）に、５０μｌの生理食塩水中１０４．５ｐｆｕのＨ３Ｎ２  Ｕｄｏｒｎウイルス（Ａ／Ｕｄｏｒｎ／７２）を鼻腔内経路により与えた。チャレンジ１日後、ドナーマウスを、ナイーブな「レシピエント」マウス（ｎ＝３）と一緒に２４時間同時飼育し、その後、ドナーマウスを取り出し、鼻甲介、気管及び肺を採取し、ウイルス価を評価した。ドナーマウスへの曝露の３日半後、レシピエントマウスの鼻甲介、気管及び肺をウイルス価の評価のために採取した。このプロトコルは、Ｅｄｅｎｂｏｒｏｕｇｈらにより開発された接触伝染モデルに基づく（出版準備中）。
【００６６】
鼻甲介、気管及び肺におけるウイルス価の評価。マウスの鼻甲介、気管及び肺を３ｍｌのＲＰＭＩ中で均一化し、肺上清中のＩＡＶ  ウイルス価を、前記Ｍａｄｉｎｅ  Ｄａｒｂｙ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）Ｐｌａｑｕｅ  Ａｓｓａｙを使用して決定した（参考文献６）。
【００６７】
器官からの単一細胞懸濁液の調製。ＣＯ２による窒息後、マウスの肺を、１０ｍｌのＰＢＳで心臓の右心室を介して還流し、循環細胞を除去した。肺を細断し、コラーゲナーゼＡ（２ｍｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によりＲＰＭＩ中で３０分間酵素消化に供した。消化された肺断片を、篩で濾し、３ｍｌのあらかじめ温めたＴｒｉｓ−緩衝化塩化アンモニウム溶液（ＡＴＣ）により２分、室温において、赤血球を溶解するために処理した。その後、肺細胞を、ＲＰ１０（１０％ＦＣＳ［ＣＳＬ、Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ］７．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、７６μＭの２−メルカプトエタノール、１５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、１５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び１５０μＭの非必須アミノ酸［Ｇｉｂｃｏ］を添加したＲＰＭＩ１６４０培地［Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ］）中で２回洗浄した。脾臓を１０ｍｌのＲＰ１０中に回収し、単一細胞懸濁液を、篩を介して破砕することによって調製し、その後ＡＴＣにより５分、３７℃において処理した。細胞を、使用前にＲＰ１０で２回洗浄した。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液を得るために、マウスの気管に注射器の付いたカニューレを挿入し、気腔をＲＰＭＩの３つの別個の１ｍｌ洗浄液で洗い流し、最後の１ｍｌで注射器をすすいだ。ＢＡＬ洗浄液由来の上清を、後のサイトカイン分析のために−７０℃において保存した。ＢＡＬ洗浄液由来の上清を、後のサイトカイン分析のために−７０℃において保存した。生存細胞を、血球計算器及びトリパンブルー色素排除を使用して計数した。
【００６８】
肺サイトカイン環境の特徴付け。ＢＡＬ上清中のサイトカインレベルを、ＢＤ（商標）サイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して、２μｌの各捕捉ビーズをそれぞれ５０μｌのＢＡＬ試料に対して使用したことのみを除いて、製造業者の取扱説明書に従って決定した。標準曲線（２０〜５０００ｐｇ／ｍｌ）を、以下のサイトカイン、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）及びインターロイキン−１２ｐ７０（ＩＬ−１２ｐ７０）に関して用意した。サイトカイン濃度を、ＢＡＬ上清の原液又は１／１０希釈液から決定した。試料を、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ及びＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。
【００６９】
肺細胞の特徴付け。５×１０５肺細胞を、以下の抗マウス抗体；ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１１ｂ、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５抗ＧＲ−１（Ｌｙ−６Ｇ及びＬｙ−６ＧＣ）、ＰＥ標識抗ＣＤ１１ｃ、ＡＰＣ抗Ｆ４／８０、ＦＩＴＣ抗ＩＡ／ＩＥクラス２、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５抗ＣＤ８、ＰＥ抗ＣＤ４（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｉｇｅｎ）の組み合わせにより染色した。肺細胞のサブセットを以下のように分類した；好中球：ＣＤ１１ｂｈｉ，ＧＲ１ｈｉ、ＣＤ１１ｃ−、Ｆ４／８０−；肺胞マクロファージ：ＣＤ１１ｃｈｉ、Ｆ４／８０＋、ＣＤ１１ｂｉｎｔ／ｌｏ、ＧＲ１ｉｎｔ／ｌｏ及びＣＤ１１ｃｈｉ、Ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｈｉ；樹状細胞：ＣＤ１１ｃｈｉ及びＭＨＣクラス２ｈｉ、ＧＲ１ｉｎｔ；単球マクロファージ及び間質性マクロファージ：ＣＤ１１ｂｈｉ、ＧＲ１ｉｎｔ、ＣＤ１１ｃｉｎｔ／ｌｏ、Ｆ４／８０＋；ＣＤ８＋Ｔ細胞：ＣＤ８＋；ＣＤ４＋Ｔ細胞：ＣＤ４＋（７、８、９）。
【００７０】
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイ。肺又は脾臓細胞の単一細胞懸濁液を、１μｇ／ｍｌ（Ｃ５７ＢＬ／６及びＢＡＬＢ／ｃ）又は１０ｕｇ／ｍｌ（ＨＨＤ）のペプチドにより、６時間３７℃において、５μｇ／ｍｌのＧｏｌｇｉＰｕｌｇ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）２５Ｕ／ｍｌ及び組換えヒトＩＬ−２  （Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）の存在下で、総体積２００μｌのＲＰ１０で刺激した。細胞を、ラット抗マウスＣＤ８α抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で標識されたＰｅｒＣＰ（Ｃｙ５，５）により、３０分間氷上において染色した。細胞を固定し、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  ｋｉｔ  ＴＭ（ＢＤ）を使用して製造業者の指示書に従って透過化し、ＦＩＴＣ標識抗ＩＦＮ−γ及びＡＰＣ標識抗ＴＮＦ−α（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）により３０分間４℃において染色した。試料を、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用して分析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。
【００７１】
統計分析。時点比較のために、一元配置ＡＮＯＶＡ（ポストホックＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ多重比較検定）を使用して、予備接種（０日目）群と接種後（１、３、６、８日目）群の間の差を決定した。他の研究のために、両側対応のないスチューデントｔ検定又は一元配置ＡＮＯＶＡ（ポストホックＴｕｋｅｙ’ｓ多重比較検定）を使用して、２つ以上の群の間の統計差をそれぞれ決定した。Ｐ値＜０．０５は有意であると考えられた。
【００７２】
結果
Ｐａｍ２Ｃｙｓに基づくリポペプチド接種が、肺細胞集団を拡大する。肺細胞環境に対するＰａｍ２Ｃｙｓに基づくリポペプチドの効果を、ヘルパーＴエピトープ（Ｔｈ）ＯＴ２及び単純ヘルペスウイルス１由来ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含有するリポペプチドＯＴ２−Ｐ２Ｃ−ｇＢ４９８−５０５（ｇＢ４９８−５０５；表１を参照されたい）を鼻腔内接種されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて検査した。ＰＢＳで還流された肺における肺常在細胞集団を、細胞フローサイトメトリを使用して特徴付けた。
【００７３】
ＯＴ２−Ｐ２Ｃ−ｇＢ４９８−５０５の鼻腔内接種は、肺細胞の総数の劇的な増加を誘発し、３日目には最大に達し、８日目まで上昇し続けた（図２Ａ）。対照的に、ペプチドＯＴ２−ｇＢ４９８−５０５（Ｐａｍ２Ｃｙｓを欠いている）を与えられたマウスは、細胞の総数又は肺に存在する細胞型の割合に有意な変化は示さず、細胞流入のメディエーターとしてＰａｍ２Ｃｙｓを示した（図２Ａ）。リポペプチド接種マウスにおいて、接種後３日における細胞浸潤物は、大部分は好中球及び間質性マクロファージからなった（図２Ｂ）。Ｇｉｅｍｓａ染色による顕微鏡検査により、好中球が高度に空胞の表現型を示すことが明らかにされ、活性化を示し、一方、Ｆ４８０＋単球／間質性マクロファージ集団は、大型の核のある形態の間質性マクロファージで優勢に構成され、単球に特徴的なドーナツ型又は腎臓型の核を保有する細胞は、ほとんど同定されなかったことが見出された（データ非掲載）。肺胞マクロファージ（ＡＭ）は、定常状態の肺に非常に低いレベルで存在するが（０日目）、この集団における有意な増加が、リポペプチド接種後に明らかであった。最終的に、本発明者らは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球並びにＣＤ１１ｃｈｉ樹状様細胞における接種後３〜８日の間の増加も観察した。ＢＡＬＢ／ｃ及びＨＨＤマウスの肺細胞流入の検査により、好中球の早期浸潤、続く間質性マクロファージ及びＣＤ１１ｂｈｉ肺胞マクロファージ集団の拡大の同様のパターンが明らかにされた（データ非掲載）。
【００７４】
ペグ化Ｐａｍ２Ｃｙｓの投与は、肺細胞集団を拡大する。ペグ化Ｐａｍ２Ｃｙｓ（Ｐ２Ｃ−ＰＥＧ１１）の鼻腔内投与もまた、Ｃ５７ＢＬ／６（図７）及びＢＡＬＢ／ｃマウスにおける好中球、間質性マクロファージ及び肺胞マクロファージ並びにリンパ球の肺（肺間質及びＢＡＬ液が含有するものを含む）集団全体における有意な増加をもたらす（データ非掲載）。活性ＩＦＮ−γ産生ＮＫ細胞及びγδＴ細胞のレベルの増加もまた観察された（図７）。
【００７５】
Ｐａｍ２Ｃｙｓによる予防は、高病原性ＩＡＶチャレンジに対して有効である。Ｐａｍ２Ｃｙｓの抗ウイルス活性がＩＡＶの悪性株に対して有効であるかどうかを決定するために、ペグ化Ｐａｍ２Ｃｙｓ（Ｐ２Ｃ−ＰＥＧ１１）を与えられたマウスに、７２時間又は７日後に致死量のＨ１Ｎ１ウイルス  ＰＲ８をチャレンジした。生理食塩水処置（７２時間後にチャレンジ）マウスは、実質的体重減少、感染症の臨床症状の発症を経験し、８日目までにすべてのマウスが感染症で死亡した（図８）。対照的に、ＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓで予備処置されたマウスは体重減少が実質的に少なく、すべてのマウスが感染症を切り抜けて生き残った（図８）。
【００７６】
Ｐａｍ２Ｃｙｓによる予防は、伝染率を減少させることができる。Ｐａｍ２Ｃｙｓで予備処置されたインフルエンザ感染マウスが、ウイルスを伝染させる能力が減少したかどうかを決定するために、接触伝染のマウスモデルを利用した（Ｅｄｅｎｂｏｒｏｕｇｈら、出版準備中）。ＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓで予備処置された「ドナー」マウスに、その後さまざまな時点で１０４．５ｐｆｕのＨ３Ｎ２  Ｕｄｏｒｎウイルスをチャレンジした。結果は、Ｐａｍ２Ｃｙｓによる予防が、鼻、気管及び肺のウイルス価を減少させることを示す（図９）。生理食塩水処置ドナーマウスと同時飼育されたすべてのレシピエントマウスは感染し、ウイルスを伝染させるドナーマウスの能力が確認された。チャレンジ前５又は７日にＰａｍ２Ｃｙｓを与えられたマウスはウイルスをレシピエントマウスに伝染させたが、ウイルスチャレンジ前２４時間又は７２時間にＰａｍ２Ｃｙｓを与えられたマウスは、同時飼育されたレシピエントマウスに感染症を伝染させなかった。
【００７７】
リポペプチドの鼻腔内送達は、ＩＡＶチャレンジに対する即時の保護を提供する。リポペプチドの鼻腔内送達による誘導される肺の変化が、ＩＡＶチャレンジの影響を減少できるかどうかを決定するために、軽度（Ｈ３Ｎ１）及び高度に悪性のＰＲ８（Ｈ１Ｎ１）ＩＡＶウイルスに対するリポペプチド接種の保護的影響を検査した。マウスの３つの系統に、特定のマウス系統に制限されたリポペプチド含有ＩＡＶ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（ＩＡＶ−ＬＰ）又は無関係な非ＩＡＶ由来ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（非ＩＡＶ−ＬＰ）を投与した（表１）。すべてのリポペプチドにおいて、ＣＤ４＋Ｔｈ細胞エピトープは、インフルエンザウイルスとは関係がなかった（表１）。ＩＡＶ−ＬＰは、送達されたＩＡＶ由来エピトープに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することができたが、一方、非ＩＡＶ−ＬＰ中のＩＡＶ−特異的エピトープ（ＣＤ８＋Ｔ又はＣＤ４＋）の不在は、ＩＡＶ−特異的応答が接種に対して誘導されないことを意味する。
【００７８】
Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ及びＨＨＤマウスに、ＩＡＶ−ＬＰ又は非ＩＡＶ−ＬＰのいずれかを接種後３又は７日のいずれかに、１０４．５ＰＦＵのＨ３Ｎ１ウイルス、Ｍｅｍ７１を、鼻腔内チャレンジし、肺ウイルス価を、感染５日目に評価した。図３ａの結果は、すべての系統のマウスにおいて、ＩＡＶ−ＬＰ及び非ＩＡＶ−ＬＰの接種が、リポペプチドを与えなかった動物と比較した場合、肺ウイルス価の有意な減少をもたらしたことを示す。非ＩＡＶＬＰ群において、チャレンジが接種３日後に起こった場合、ウイルスクリアランスはもっとも著しかった（図３Ａ）。
【００７９】
非ＩＡＶ−ＬＰ中のＩＡＶ−特異的エピトープ（ＣＤ８＋Ｔ又はＣＤ４＋）の不在は、非ＩＡＶ−ＬＰの抗ウイルス活性がＰａｍ２Ｃｙｓ部分によりもたらされたことを示唆する。この理論を確認するために、本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス中の免疫優勢ＩＡＶ−特異的標的であるＰＡ２２４−２３３に対するＩＡＶ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の存在を検査し、同じエピトープが、ＩＡＶ−ＬＰに含まれるが、非ＩＡＶ−ＬＰには含まれなかった。リポペプチド接種Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＩＡＶ−ＬＰを与えられたマウスだけが、有意なレベルのＩＦＮ−γ＋又はＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α＋ＰＡ２２４−２３３−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を示したが、一方、生理食塩水又は非ＩＡＶ−ＬＰ群のいずれも、これらのエピトープに対する検出可能な応答を誘発しなかった（図３Ｂ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答のこの同じパターンが、ＢＡＬＢ／ｃ及びＨＨＤマウス系統において観察された。非ＩＡＶ−ＬＰを接種されたマウスにおけるＩＡＶ−特異的細胞の不在は、観察された早期抗ウイルス効果が、Ｐａｍ２Ｃｙｓの作用によるものであり、ＩＡＶ−特異的適応免疫応答を開始する促進能力によるものではないことを明示する。
【００８０】
ＩＡＶ−ＬＰとは対照的に、非ＩＡＶ  ＬＰは、ＩＡＶ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導に関係する長期保護を提供しないことに留意すべきである。接種後６〜８週にＨ３Ｎ１をチャレンジした場合、ＩＡＶ−ＬＰを接種されたＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウスのみが、有意なレベルのウイルスのクリアランス（（それぞれ）９８±１％及び６５±１４％）を示した（データ非掲載）。したがって、抗原特異的応答の不在下で、非ＩＡＶＬＰの抗ウイルス活性は時間とともに減少し、リポペプチドのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ成分がＩＡＶ−ＬＰによる長期保護に必須であることを明示している。
【００８１】
リポペプチドによる予防は、高病原性ＩＡＶチャレンジに対して有効である。Ｐａｍ２Ｃｙｓの抗ウイルス活性が高病原性感染症に対して有効であったかどうかを決定するために、リポペプチド接種マウスに、７日後、高病原性Ｈ１Ｎ１ウイルス、ＰＲ８をチャレンジした。ＩＡＶ−ＬＰ及び非ＩＡＶ  ＬＰ両方のリポペプチド接種は、ＰＲ８をチャレンジされたマウスの生存率を劇的に増加させた（図４）。生理食塩水を接種されたマウスの大部分が感染症で死亡し、ＩＡＶ−ＬＰを接種された動物の１００％及び非ＩＡＶ−ＬＰを接種された動物の８０％が、感染症から生き残った。生存率の改善に加えて、感染症に普通に付随する体重減少及び臨床症状の程度が、非ＩＡＶ−ＬＰ群においても減少された（図４）。
【００８２】
可溶性Ｐａｍ２Ｃｙｓにより誘導されるサイトカインのスペクトル。ペプチド又はエピトープ特異的応答の影響をこの系から除去するために、本発明者らは、普通は不溶性のＰａｍ２Ｃｙｓをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートすることにより、Ｐａｍ２Ｃｙｓの可溶性形態を構築した。Ｐａｍ２Ｃｙｓ−ＰＥＧ１１の肺環境に対する影響を特定するために、本発明者らは、２０ｎｍｏｌのＰａｍ２Ｃｙｓ−ＰＥＧ１１（ｉ．ｎ）を投与されたＣ５７ＢＬ／６マウスの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中の炎症関連サイトカイン濃度を、サイトメトリックビーズアレイ分析により測定した（図５）。投与後３日目において、本発明者らは、Ｐａｍ２Ｃｙｓ−ＰＥＧ１１接種マウスにおいて、ナイーブなマウス又は生理食塩水接種マウスと比較して、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２ｐ７０の濃度の有意な増加を検出した。７日目までに、Ｐａｍ２Ｃｙｓ−ＰＥＧ１１群中のサイトカイン濃度は、投与前レベルに対して正常化し、ナイーブ群と有意に異ならなかった（図５）。
【００８３】
Ｐａｍ２Ｃｙｓの抗ウイルス活性は抗原独立性である。Ｐａｍ２Ｃｙｓ部分がリポペプチドの早期抗ウイルス活性に主に関与することを確認するために、マウスに、２０ｎｍｏｌのＰａｍ２Ｃｙｓ−ＰＥＧ１１を鼻腔内接種し、１、３又は７日後のいずれかに１０４．５ＰＦＵのＨ３Ｎ１ウイルスをチャレンジした。図６に示した結果は、Ｐａｍ２Ｃｙｓ−ＰＥＧ１１の接種が肺ウイルス負荷を非ＩＡＶ−ＬＰと同じ程度に減少させることを明示し、観察されたリポペプチド（ｌｉｐｏｅｐｅｐｔｉｄｅｓ）の早期抗ウイルス活性がＰａｍ２Ｃｙｓにより媒介されたことが確認される。Ｐａｍ２Ｃｙｓ−ＰＥＧ１１による予防は、チャレンジ後のウイルス負荷を、投与後ほとんど即時、１日目及び７日目に減少させ、少なくとも７日間の保護が、Ｐａｍ２Ｃｙｓ−ＰＥＧ１１による予防により提供され得ることが明らかになった。
【００８４】
単回用量で鼻腔内送達された場合、Ｐａｍ２ＣｙｓはＩＡＶに対して保護する。マウスにおけるペグ化Ｐａｍ２Ｃｙｓ（ＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓ）（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−ＰＥＧ１１又はＰ２Ｃ−ＰＥＧ１１とも称される）の鼻腔内（ｉ．ｎ）、皮下（ｓ．ｃ）又は静脈内（ｉ．ｖ）経路を介した予防投与、及び続く３日後の致死量のＰＲ８ウイルスのチャレンジの後、ＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓを鼻腔内投与されたマウスのみが、ＰＲ８感染症に関係する死及び体重減少に対して保護された（図１０）。
【００８５】
【表１】
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【００８６】
多重Ｐａｍ２Ｃｙｓ変異体は、ＩＡＶチャレンジに対する保護をもたらす。２０ｎｍｏｌのさまざまなＰａｍ２Ｃｙｓ含有構築体を、鼻腔内経路を介して予防投与されたマウスは、致死量のＰＲ８ウイルスのチャレンジ後、体重減少（図１１Ａ）及び死（図１１Ｂ）に対して保護された。マウスは、ＰＲ８感染症に関係する他の臨床症状に対しても保護された（データ非掲載）。
【００８７】
Ｐａｍ２Ｃｙｓは、反復用量で与えられた場合有効である。単回用量のＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓ（又は２回用量のＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓを３週間空けて）投与されたＢａｌｂ／ｃマウスは、致死量のＰＲ８のチャレンジ後、体重減少（図１２Ｂ）、死及び他の臨床症状に対して保護された。ＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓ処置マウス中のウイルス負荷は処分時点で有意により低かった（図１２Ａ）。
【００８８】
ＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓは、より低用量で有効である。マウスをより低用量のＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓにより予防処置し、３日後に致死量のＰＲ８ウイルスをチャレンジした場合、体重減少及び死に対する保護が、生理食塩水群と比較してすべてのマウスにおいてさらに達成された（図１３）。
【００８９】
ＩＡＶチャレンジに対する保護は、ＩＦＮ−γ又は１型インターフェロン（すなわちＩＦＮ−α）に依存性ではない。ＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓにより処置された、ＩＦＮ−γを欠損したマウス（Ｂ６．ＩＦＮ−γ−／−）又は１型インターフェロン（例えばインターフェロン−α；ＩＦＮＡＲ−／−）に応答する能力を欠損したマウスは、ＰＲ８感染症に関係する体重減少及び致死に対して保護された（図１４）。
【００９０】
ＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓは治療薬として有効である。マウスに１０４．５ＰＦＵのＵｄｏｒｎウイルス（インフルエンザＡ）（ｉ．ｎ．）をチャレンジし、４時間後、２０ｎｍｏｌのＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓ（ｉ．ｎ．）を投与した場合、ウイルス負荷の減少が、鼻、中咽頭、気管及び肺において見出された。特に、肺におけるウイルス負荷は、生理食塩水群と比較してＬｏｇ１０４又は１０，０００倍の減少を示した（図１５）。
【００９１】
Ｐａｍ２Ｃｙｓは抗菌剤として有効である。マウスをＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓ（ｉ．ｎ．）により予備処置した場合、マウスは、Ｌ．ニューモフィラ（図１６Ａ）によるｉ．ｎ．チャレンジ後、肺及び気管の細菌負荷の有意な減少を示した。肺における細菌負荷は、２及び３日目にピークであった。細菌負荷の減少は、ＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓ投与後７日目までに達成することもでき、感染後３日目の細菌負荷は、チャレンジ３（図１６Ｂ）又は７日（図１６Ｃ）前にＰＥＧ−Ｐａｍ２Ｃｙｓによる予防を与えられたマウスに示される。
【００９２】
考察
先天性免疫応答が感染症の制御において果たすきわめて重要な役割は、感染前の先天性免疫系の早期活性化が、感染因子、例えばウイルス又は細菌によるチャレンジに対する保護強化を提供できることを示唆している。この研究の結果は、ＴＬＲ２アゴニストを含む可溶性ＴＬＲ２部分の投与が、投与された対象において先天性免疫応答を高め、免疫応答が非抗原特異的であることを明示した。さらに、本発明に従った組成物の鼻腔内予防投与により誘発される肺の変化がウイルス及び細菌への続く曝露に対する抵抗性の増加に関係した。このような組成物が、ウイルス感染症及び細菌感染症に対する予防薬として、特に流行又はパンデミックの発生の高い危険性がある場合、適切であることを示唆している。本発明に従った予防方法及び治療方法はまた、感染因子（又はその抗原成分若しくは特定の菌株）の予備知識を必要としないという有利性を有し、したがって、例えばインフルエンザのパンデミックの期間に特に有用であり得る。凍結乾燥でき、室温において安定である、本発明に従った組成物の安定性は、パンデミックの状況に対する備蓄に非常に適切であることもまた意味する。
【００９３】
［参考文献］
【表２】
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【図１】
2019167369.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年7月4日(2019.7.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において先天性免疫応答を高めることにより疾患を治療又は予防する方法であって、
溶液中にＴＬＲ２部分を含む有効量の組成物を対象に投与するステップを含み、
ＴＬＲ２部分がＴＬＲ２アゴニストを含み、
疾患が、ＴＬＲ２部分に対する液性免疫応答又は細胞性免疫応答により治療又は予防されない、方法。
【外国語明細書】
2019167369000001.pdf