(57)【要約】      （修正有）【課題】イネ科植物等の植物における病害に対して優れた防除効果を発揮する、新規な細菌株２種以上を有効成分とする植物病害防除剤の提供。【解決手段】ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＳＭＡＬ株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１７）、同ＳＭＡＬＵＶ１７株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６４）、同ＳＭＡＬＵＶ２８株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６５）から選択される１種以上と、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＲＳＢ１株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１４）、同ＲＳＢ１０株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１５）、同ＲＳＢ１５株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１６）から選択される１種以上を有効成分として含有する植物病害防除剤。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＳＭＡＬ株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１７）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＳＭＡＬＵＶ１７株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６４）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＳＭＡＬＵＶ２８株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６５）から選択される１種以上と、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＲＳＢ１株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１４）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＲＳＢ１０株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１５）およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＲＳＢ１５株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１６）から選択される１種以上を有効成分として含有することを特徴とする、植物病害防除剤。
【請求項２】
上記植物がイネ科植物であることを特徴とする、請求項１記載の植物病害防除剤。
【請求項３】
上記病害が細菌病害であることを特徴とする、請求項１または２に記載の植物病害防除剤。
【請求項４】
ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＳＭＡＬ株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１７）、ＳＭＡＬＵＶ１７株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６４）またはＳＭＡＬＵＶ２８株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６５）である細菌。
【請求項５】
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＲＳＢ１株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１４）、ＲＳＢ１０株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１５）またはＲＳＢ１５株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１６）である細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のステノトロフォモナス属細菌株、新規のシュードモナス・プチダ属細菌株および、これら新規の細菌株２種を含有する植物病害防除剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
病害感受性のイネ等の植物に病原菌などが接触し、増殖することで発症する植物病害は、農作物生産における大きな脅威であり、世界の食糧生産の損失の１割にも達するといわれている。例えば、植物育苗中に発生する植物病害には、大きく分けて種子伝染性病害と土壌伝染性病害の２つがある。種子伝染性病害は、種子や球根等に病気が付着していて、催芽時あるいは出芽時に病気が拡散する病害である。また、土壌伝染性病害は、土壌中で腐生的に生存しているカビが育苗土壌中で増殖することにより発生する病害である。近年では、箱育苗に人工培土を使用することが多いため、折衷苗代や畑苗代に比べ、カビ等が原因となる苗立枯病等の土壌伝染性病害は減少している。
これらの植物病害としては、代表的に細菌によりひき起こされるイネもみ枯細菌病、イネ苗立枯細菌病、白葉枯細菌病、褐条病などや、糸状菌によりひき起こされるばか苗病、ごま葉枯病、いもち病などが挙げられる。特に、イネもみ枯細菌病やイネ苗立枯細菌病は、幼苗の腐敗と萎凋枯死を、ばか苗病は幼苗腐敗や徒長苗を生じるため、感染・発症した苗をそのまま本田や畑に植え込むと、伝染源となり、本田や畑での病害の発生を助長してしまい、移植不能となり廃棄するほかないのが現状である。幼病腐敗等の被害が発現していない場合でも、保菌した苗を本田や畑に移植すれば、イネもみ枯細菌病はイネもみ枯症発生の原因となり、ばか苗病については不稔や枯死株発生の原因となるほか、このような植物体から収穫された種子は保菌しているため、次年度の病害発生源となる。
【０００３】
植物育苗中の病害を防ぐために、育苗箱や使用する培土等を十分に消毒、洗浄し、塩水洗した健全な種子を使い、消毒剤を使用して消毒した種子を播種する予防法が推奨されている。発芽前の種子の消毒に用いられる化学農薬としては、モミガードＣ・ＤＦ、スミチオン乳剤、スポルタック乳剤、トリフミン水和剤、ヘルシード水和剤、スターナ水和剤、スポルタックスターナＳＥ、テクリードＣフロアブルなどが知られている（例えば、非特許文献１等）。また、化学農薬以外による殺菌処理として、種子に対し６０℃の温湯で１０分間の浸漬処理を行なう温湯処理、および、エコホープ 、エコホープＤＪ 、タフブロック 、モミゲンキ水和剤 、モミホープ水和剤などの微生物農薬による防除が知られている（例えば、非特許文献２、３等）。
化学農薬は顕著な殺菌効果が得られるが、ある程度の期間使用すると耐性菌が出現するという問題がある。また、生物農薬は、化学農薬に比べて短期間で開発できることや、薬剤耐性菌の発生が少なく環境負荷が低いことから、農薬の散布回数にカウントされないというメリットもあるが、化学農薬に比べ防除効果が病害の発生程度や処理時の環境条件に大きく左右されやすいという問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】「イネ苗立枯細菌病及びもみ枯細菌病の育苗期における薬剤防除法」、関東東山病害虫研究会年報、第４１集、第９〜１１頁、１９９４年
【非特許文献２】「水稲種子消毒で使用できる生物農薬の効果的な使用方法」、研究レポートＮｏ．３０４、岩手県農業研究センター、平成１７年４月
【非特許文献３】「生物農薬（殺菌剤）の現状」、関西病虫研報（５０）、第３３〜３４頁、２００８年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、植物における病害に対して優れた防除効果を発揮する、新規な細菌株２種以上を有効成分とする植物病害防除剤を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、植物病害に感染した植物から、当該植物病害の発症抑制能を有する新たな細菌株が得られ、この新たな細菌株を親株とする変異株も含めたこれらの細菌株を２種組み合わせることにより、植物病害に対して優れた防除効果を発揮する植物病害防除剤とし得ることを見出し、上記課題を解決するに至ったものである。
【０００７】
本発明は、具体的には次の事項を要旨とする。
１．ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＳＭＡＬ株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１７）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＳＭＡＬＵＶ１７株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６４）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＳＭＡＬＵＶ２８株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６５）から選択される１種以上と、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＲＳＢ１株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１４）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＲＳＢ１０株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１５）およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＲＳＢ１５株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１６）から選択される１種以上を有効成分として含有することを特徴とする、植物病害防除剤。
２．上記植物がイネ科植物であることを特徴とする、１．記載の植物病害防除剤。
３．上記病害が細菌病害であることを特徴とする、１．または２．に記載の植物病害防除剤。
４．ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＳＭＡＬ株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１７）、ＳＭＡＬＵＶ１７株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６４）またはＳＭＡＬＵＶ２８株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６５）である細菌。
５．シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＲＳＢ１株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１４）、ＲＳＢ１０株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１５）またはＲＳＢ１５株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１６）である細菌。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＳＭＡＬ株、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＳＭＡＬＵＶ１７株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６４）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＳＭＡＬＵＶ２８株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６５）から選択される１種以上と、同じく本発明のシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＲＳＢ１株、ＲＳＢ１０株およびＲＳＢ１５株から選択される１種以上を有効成分として含有する植物病害防除剤は、それぞれ単独での植物病害防除効果に比べ、相加効果以上の相乗効果を発揮するものである。この本発明の植物病害防除剤は、植物における病原菌による発症を強く抑制することができるほか、薬害等の心配がなく、収穫直前まで使用することが可能であるため、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１のイネもみ枯細菌病菌接種８日後の成長状況を示す写真である。
【図２】実施例３の催芽処理＋イネもみ枯細菌病菌接種により増殖した細菌確認試験における細菌培養状況等を示す写真である。
【図３】ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株の塩基配列である。
【図４】シュードモナス・プチダＲＳＢ１株の塩基配列である。
【図５】シュードモナス・プチダＲＳＢ１０株の塩基配列である。
【図６】シュードモナス・プチダＲＳＢ１５株の塩基配列である。
【図７】ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬＵＶ１７株の塩基配列である。
【図８】ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬＵＶ２８株の塩基配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、優れた植物病害防除能を有する新規のステノトロフォモナス属の細菌株と新規のシュードモナス属の細菌株を含有する植物病害防除剤に関する。
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１１】
（新規な細菌株）
本発明における新規のステノトロフォモナス属の細菌株と新規のシュードモナス属の細菌株は、組み合わせることにより優れた植物病害防除能を発揮する。このステノトロフォモナス属の細菌株は、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＳＭＡＬ株、ＳＭＡＬＵＶ１７株およびＳＭＡＬＵＶ２８株として、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、それぞれＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１７（受託日：２０１８年  １月２４日）、ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６４（受託日：２０１９年  １月１６日）およびＮＩＴＥ  Ｐ−０２８６５（受託日：２０１９年  １月１６日）である。また、新規のシュードモナス属の細菌株は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＲＳＢ１株、ＲＳＢ１０株およびＲＳＢ１５株として、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、それぞれＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１４（受託日：２０１８年  １月２４日）、ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１５（受託日：２０１８年  １月２４日）およびＮＩＴＥ  Ｐ−０２６１６（受託日：２０１８年  １月２４日）である。
また、これらの新たな細菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ塩基配列は、それぞれ配列番号１〜６の配列表に示されるもの、または、本発明の相乗的な植物病害防除効果を損なわないことを限度として、１個もしくは複数個の塩基が欠損、置換、付加することにより配列表の配列番号１〜６に示された塩基配列と相同性を有する塩基配列を有する。なお、配列番号１は、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＳＭＡＬ株の配列表であり、配列番号２、３、４は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＲＳＢ１株、ＲＳＢ１０株およびＲＳＢ１５株、さらに、配列番号５、６は、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＳＭＡＬＵＶ１７株およびＳＭＡＬＵＶ２８株それぞれの配列表である。
【００１２】
本発明の新たなステノトロフォモナス属のＳＭＡＬ株と、シュードモナス属のＲＳＢ１株、ＲＳＢ１０株およびＲＳＢ１５株それぞれの細菌株は、植物病害に感染した植物から新たに見出されたものであり、さらに、新たなステノトロフォモナス属のＳＭＡＬＵＶ１７株とＳＭＡＬＵＶ２８株は、上記ＳＭＡＬ株を親株とする紫外線変異株である。後述する実施例において詳細に説明するが、見出された経緯について、以下簡単に説明する。
アンチホルミンによる殺菌処理後催芽処理をしたイネ籾に対して、イネもみ枯細菌病菌を感染させたところ、催芽処理せずにイネもみ枯細菌病菌を感染させた場合に比べて、イネもみ枯細菌病の発症がより強く抑制されることが確認された。ここで「催芽」とは、イネ籾をあらかじめ発芽させることをいい、本発明における催芽処理は、３０℃の温水にイネ籾を２日間浸漬させて、発芽し成長を開始させることを意味する。
催芽処理をしたイネ籾が、催芽処理をしないイネ籾に比べて、イネもみ枯細菌病の発症がより強く抑制された原因を探るために、イネ籾の細胞内で増殖した菌類の数を計測したところ、催芽処理せずにイネもみ枯細菌病菌を感染させた場合には、感染させたイネもみ枯細菌病菌のみが増殖するのに対し、催芽処理をしたイネ籾にイネもみ枯細菌病菌を感染させた場合は、感染させたイネもみ枯細菌病菌以外の菌類が増殖していることが判明した。このイネもみ枯細菌病菌以外の菌類を、抗生物質（クロラムフェニコール）を含む寒天培地上でコロニーを選抜し、１６Ｓ  ｒＲＮＡ系統解析を行った結果、形態の異なるステノトロフォモナス属の細菌株１種と、シュードモナス属の細菌株３種であることが確認された。
これらのことは、催芽処理をしたイネ籾の細胞内で増殖し、今回新たに得られたステノトロフォモナス属の細菌株１種と、シュードモナス属の細菌株３種が、イネもみ枯細菌病菌の増殖を抑え、イネもみ枯細菌病の発症抑制に関与していることを示唆するものと考えられる。
さらに、新たに見出されたステノトロフォモナス属の細菌株１種を親株として、紫外線照射により変異させた中にバイオフィルム形成能が増強されたものが見出された。この新たに得られたＵＶ変異株２種は、上記の新規なシュードモナス属の細菌株３種の何れかとの併用により、イネもみ枯細菌病菌の増殖を抑え、イネもみ枯細菌病の発症抑制において、より優れた効果を発揮することが明らかとなった。
【００１３】
（相乗効果）
新たに得られたステノトロフォモナス属の細菌株３種と、シュードモナス属の細菌株３種について、イネもみ枯細菌病の発症抑制効果の有無について確認したところ、シュードモナス属の細菌株３種は、単独でも発症抑制効果を示すが、ステノトロフォモナス属の細菌株は単独では発症抑制効果を示さないにも関わらず、ステノトロフォモナス属の細菌株とシュードモナス属の細菌株とを組み合わせると、イネもみ枯細菌病の発症を極めて有効に抑制することが明らかとなった。中でも、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株の細菌と、シュードモナス・プチダＲＳＢ１５株の細菌との組み合わせにおいて、さらには、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬＵＶ１７株またはＳＭＡＬＵＶ２８株の細菌と、シュードモナス・プチダＲＳＢ１５株の細菌との組み合わせにおいて、より優れたイネもみ枯細菌病の発症抑制効果が得られることも明らかとなった。
本発明のステノトロフォモナス属の細菌株とシュードモナス属の細菌株との組み合わせにおいて、相加効果以上の相乗的な植物病害防除効果が得られるメカニズムについての詳細は明確ではないものの、下記実施例において説明するように、本発明のステノトロフォモナス属の細菌株が、極めて高いバイオフィルム形成能を有し、この高いバイオフィルム形成能がシュードモナス属の細菌株の定着性を向上させることが、この相乗的な植物病害防除効果の発現に大きく関与しているものと推測される。したがって、この相乗効果は、本発明のステノトロフォモナス属の細菌株とシュードモナス属の細菌株とを組み合わせることにより初めて得られる効果であり、これは本発明者が初めて確認した格別顕著な効果である。
さらに、本発明のステノトロフォモナス属の細菌株とシュードモナス属の細菌株との組み合わせは、イネ苗立枯細菌病に対しても相乗的に発症抑制効果を発揮することが確認されている。このことから、本発明の植物病害防除剤は、イネもみ枯細菌病のみならず植物病害全般にわたり、発症抑制効果を発揮するものと考えられる。
【００１４】
（植物病害）
本発明の植物病害防除剤は、細菌、糸状菌などによる各種植物病害に対し有用であるが、特にこれらに限定されるものではない。例えば、シュードペロノスポラ（Pseudoperonospora）属菌（例えばキュウリべと病菌）、ベンチュリア（Venturia）属菌（例えばリンゴ黒星病菌）、エリシフェ（Erysiphe）属菌（例えばコムギうどんこ病菌）、ボトリチス（Botrytis）属菌（例えばキュウリ灰色かび病菌）、リゾクトニア（Rhizoctonia）属菌（例えばナス立枯病菌）、パクシニア（Puccinia）属菌（例えばコムギ赤さび病菌）、セプトリア（Septoria）属菌（例えばコムギふ枯病菌）、スクレロティニア（Sclerotinia）属菌（例えばキュウリ菌核病菌）、ピシウム（Pythium）属菌（例えばキュウリ苗立枯病菌）、スフェロテカ（Sphaerotheca）属菌（例えばキュウリうどんこ病菌）、シュードモナス（Pseudomonas）属細菌（例えばトマト茎えそ細菌病菌）などによる植物病害が挙げられる。
中でも、本発明の植物病害防除剤は、イネ科植物病害に対して有用である。例えば、いもち病（Pyricularia oryzae）、紋枯病（Thanatephorus cucumeris, Rhizoctonia solani）、馬鹿苗病（Gibberella fujikuroi）、ごま葉枯病（Cochliobolus miyabeanus）、苗立枯病（Fusarium avenaceum）、イネ苗立枯細菌病（Burkholderia plantarii）、白葉枯病（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）、褐条病（Acidovorax avenae subsp. avenae）、イネもみ枯細菌病（Burkholderia glumae, Burkholderia gladioli）、株腐病（Dickeya zeae）、かさ枯病（Pseudomonas syringae pv. oryzae）、内頴褐変病（Pantoea ananatis）、葉鞘褐変病（Pseudomonas fuscovaginae）、稲こうじ病（Villosiclava virens）、疫病（Phytophthora japonica）、黄化萎縮病（Sclerophthora macrospora）、褐色米(Curvularia intermedius)、褐色菌核病（Ceratobasidium setariae）、褐色小粒菌核病（Waitea circinata）、褐色葉枯病（Monographella albescens）、褐色紋枯病（Thanatephorus cucumeris）、褐紋病（Nigrospora oryzae）、眼斑病（Drechslera gigantea）、黒しゅ病（Entyloma dactylidis）、シナモン色かび病（Peziza ostracoderma）、小球菌核病（Magnaporthe salvinii）、白絹病（Sclerotium rolfsii, Thanatephorus cucumeris）、墨黒穂病（Tilletia barclayana）、赤色菌核病（Waitea circinata）、立枯病（Gaeumannomyces graminisvar. graminis）、にせいもち病（Alternaria oryzae）、綿疫病（Phytophthora sojae）、ブラキスポリウム病（Curvularia senegalensis）、葉枯病（Phaeosphaeria oryzae）、灰色葉枯病（Hendersonia oryzae）、灰色菌核病（Ceratobasidium cornigerum）、灰紋病（Cladosporium miyakei）、斑点病（Cochliobolus sativus）、穂黒粒病（Epicoccum hyalopes）、株枯病（Gibberella fujikuroi）、黄枯病（Pyrenochaeta oryzae）、小黒菌核病（Helminthosporium sigmoideum var. irregulare）、黒変病（Cladosporium herbarum）、黒粒菌核病（Helicoceras oryzae）、球状菌核病（Sclerotium hydrophilum）、種もみ腐敗病（Fusarium merismoides）、もみ枯病（Phoma glumarum）、苗腐病（Achlya americana）、ねずみかび病（Alternaria oryzae）、さび色小粒菌核病（Sclerotium sp.）、ささら病（Sphaerulina miyakei）、すす病（Cladosporium herbarum）、すす紋病（Pseudocochliobolus lunatus）、すじ葉枯病（Sphaerulina oryzina）、葉しょう網斑病（Cylindrocladium scoparium）、葉しょう腐敗病（Sarocladium oryzae）、葉しょう褐斑病（Pyrenochaeta sp.）などを挙げることができる。これらのうち、本発明の植物病害防除剤は、細菌によるイネ科植物病害に対し有用であり、特に、イネもみ枯細菌病菌またはイネ苗立枯細菌病菌に起因する病害の防除に好適である。
【００１５】
本発明におけるステノトロフォモナス属の細菌株３種と、シュードモナス属の細菌株３種の培養方法、固定化、製剤化、また、本発明の植物病害防除剤の施用方法、調製方法は、慣用の手法で行うことができる。  
【００１６】
（培養方法）
本発明におけるステノトロフォモナス属の細菌株３種と、シュードモナス属の細菌株３種の培養方法については、特に制限はなく、これらの細菌を、それぞれ別々に培養してもよいが、２つの細菌を混合させた後に、培養することもできる。しかしながら、これら２つの細菌をそれぞれ別々に培養する方が、取り扱いが容易であるため好ましい。培養の際に用いる培地についても、特に制限はなく、ステノトロフォモナス属の細菌株とシュードモナス属の細菌株を、別々に、または混合させた場合でも同様に実施することができる。培地としては、ステノトロフォモナス属の細菌株およびシュードモナス属の細菌株が増殖するものであれば特に限定するものではない。生育に可能な炭素源、窒素源、無機物を適当に含有している培地であれば、天然培地、合成培地のいずれも用いることができる。培地としては、例えば、８０２培地、ブイヨン培地、キングＢ培地、ＰＳ培地、ＰＤＢ培地などが挙げられる。これらの培地で１５〜４２℃、好ましくは２８℃〜３５℃で、１０〜３５時間培養し増殖させたのち、遠心分離機もしくは膜濃縮機により濃縮して集菌を行い、培地成分を取り除く。この操作によりそれぞれの菌体の濃度は通常１〜５０×１０１０ＣＦＵ／ｍｌ（colony forming unit (CFU)／ml）程度に濃縮される。得られた湿菌体は、糖類とグルタミン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム緩衝液等の保護剤を加え、真空乾燥する。この操作を、固定化という。真空乾燥する前に保護剤と混合した菌体を予備凍結し、凍結したまま真空乾燥することが、菌の生存率を維持するためには好ましい。なお、保護剤は水溶液の状態で菌体と混合してもよく、固体のまま混合してもよい。
【００１７】
（固定化）
固定化についても特に制限はなく、ステノトロフォモナス属の細菌株とシュードモナス属の細菌株を、それぞれ別々に固定化してもよく、それぞれを混合させて固定化することもできる。固定化の際に用いる保護剤としては、サッカロース、フルクトース、グルコース、ソルビトール等の１種または２種以上からなる糖類を用い、菌体と混合し、真空乾燥もしくは凍結真空などの方法で乾燥することにより行うことができる。
（製剤化）
本発明のステノトロフォモナス属の細菌株とシュードモナス属の細菌株は、培養後の生菌をそのまま使用しても良いが、菌体を上述した固定化後に固体（粉剤、粒剤もしくは水和剤）または液体の担体と混合し、製剤化することができる。ここで、液体の担体と混合した場合は、菌体懸濁液として製剤化される。
製剤の調製方法としては、２つの細菌を、それぞれ別々に製剤化しても、混合した後に製剤化しても何れでもよいが、それぞれ別々に製剤にした方が、取り扱いが容易であるため好ましい。本発明の植物病害防除剤は、有効成分であるステノトロフォモナス属の細菌株とシュードモナス属の細菌株とが、予め混合された混合物の状態であってもよいし、使用時まで混合せず別々に含まれた状態でもよく、その態様は限定されない。
【００１８】
本発明の植物病害防除剤は、不活性な液体または固体の担体で希釈し、必要に応じて界面活性剤、その他の補助剤を加えてもよい。具体的な製剤例としては、例えば粉剤、粒剤、乳剤、水和剤、懸濁製剤、フロアブル剤等の剤型が挙げられる。また、好ましい担体の例としては、タルク、ベントナイト、クレー、カオリン、珪藻土、ホワイトカーボン、バーミキュライト、消石灰、珪砂、硫安、尿素、多孔質な固体担体、水、イソプロピルアルコール、グリコールなどの液体担体が挙げられる。界面活性剤および分散剤としては、例えばジナフチルメタンスルホン酸塩、アルコール硫酸エステル塩、アルキルアリールスルホン酸塩、リグニンスルホン酸塩、ポリオキシエチレングリコールエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノアルキレート等が挙げられる。補助剤としては、例えばカルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、アラビアガム、キサンタンガム等が、保護剤としては、例えばスキムミルク、ｐＨ緩衝剤等が挙げられる。これらの使用量は、本発明のステノトロフォモナス属の細菌株とシュードモナス属の細菌株の量、薬剤の施用時期や施用量などに応じて適宜設定すれば良い。
本発明の植物病害防除剤は、本発明の効果を損なわない範囲において、他の殺虫成分、除草成分、植物生長調節成分や肥料成分を併用することができる。
【００１９】
（植物病害防除剤の施用方法）
本発明の植物病害防除剤の施用方法は、防除対象である植物体に接触させる方法であれば特に制限はなく、例えば、本発明の植物病害防除剤を植物体に直接塗布または散布する方法、葉や茎に接種する方法が挙げられる。例えば、本発明のステノトロフォモナス属の細菌株とシュードモナス属の細菌株を、そのまま水に希釈した菌体懸濁液を散布して施用してもよいし、上記２つの細菌株を、前述した固体または液体の担体を用いて製剤化した後に、水に希釈し（菌体懸濁液の態様も含む）散布して施用してもよい。また、別の施用方法としては、植物を栽培している土壌に接触させる方法、例えば、本発明の植物病害防除剤を、植物を栽培している土壌に混和させる方法で施用することもできる。本発明の効果を損なわない範囲において、施用方法は施用する植物病害や植物体に合わせ、適宜調整することができる。
本発明の植物病害防除剤は、ステノトロフォモナス属の細菌株とシュードモナス属の細菌株を、それぞれを別々に固体または液体の担体を用いて製剤にした後、２つの製剤を混合して水に希釈して散布させるか、２つの細菌株を先に混合させて、その混合した細菌株を固体または液体の担体を用いて製剤化した後に、水に希釈して散布させることで使用できる。本発明では、これら２つの細菌株を、それぞれ別々に固体または液体の担体を用いて製剤にした後に、２つの製剤を混合して水に希釈し（菌体混合物）散布させて使用することが好ましい。
【００２０】
本発明のステノトロフォモナス属の細菌株とシュードモナス属の細菌株を施用する際の具体的な菌濃度について説明する。
２つの細菌株をそのまま水に希釈して散布する場合、菌濃度は、それぞれの細菌について、通常１０６ＣＦＵ/ｍｌ〜１０８ ＣＦＵ/ｍｌの範囲内に調整すると良い。
一方、前述した固体または液体の担体を用いて製剤化した後に、水に希釈して散布する場合、菌濃度は、それぞれの細菌について、通常１０４ＣＦＵ/ｍｌ〜１０１１ＣＦＵ/ｍｌの範囲内に調整すると良いが、好ましくは１０５ＣＦＵ/ｍｌ〜１０１０ＣＦＵ/ｍｌ、より好ましくは１０５ＣＦＵ/ｍｌ〜１０９ＣＦＵ/ｍｌである。また、固体の担体として水和剤を用いて得られた製剤の場合、通常１０６ＣＦＵ/ｍｌ〜１０１２ＣＦＵ/ｍｌの範囲内に調整すると良いが、好ましくは１０７ＣＦＵ/ｍｌ〜１０１１ＣＦＵ/ｍｌ、より好ましくは１０８ＣＦＵ/ｍｌ〜１０１１ＣＦＵ/ｍｌである。なお、液体の担体を用いて得られた製剤を水に希釈して散布する場合に関しては、上記の固体の担体を用いて得られた製剤と同様の濃度範囲にて調製すればよい。
次に、ステノトロフォモナス属の細菌株とシュードモナス属の細菌株の各菌体の混合比率（重量比）については、特に限定はないが、通常ステノトロフォモナス属の細菌株：シュードモナス属の細菌株＝１〜１００：１〜１００であるが、好ましくは１〜５０：１〜５０、より好ましくは１〜１０：１〜１０の比率で、植物病害の発症抑制を好適に行うことができる。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の技術範囲はこれらにより限定されるものではない。
＜実施例１＞催芽処理の有無による、植物病害発症確認試験
（１）試験検体の調製
アンチホルミンで１０分間表面殺菌したコシヒカリの籾を、３０℃の温水に２日間浸漬させて催芽処理をしたイネ籾に対して、イネもみ枯細菌病菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌｕｍａｅ、ＯＤ＝０．００４）「ＭＡＦＦ３０１６８２」または「ＭＡＦＦ３０１１１６９」を減圧接種し、試験検体Ａ（「ＭＡＦＦ３０１６８２」を接種）または試験検体Ｂ（「ＭＡＦＦ３０１１１６９」を接種）を得た。また、催芽処理を行わない以外は同様の操作を行い、試験検体ａ（「ＭＡＦＦ３０１６８２」を接種）および試験検体ｂ（「ＭＡＦＦ３０１１６９」を接種）を得た。ここで、「ＭＡＦＦ３０１６８２」は病原性が強いイネもみ枯細菌病菌であり、「ＭＡＦＦ３０１１６９」は病原性が弱いイネもみ枯細菌病菌である。
（２）植物病害発症に関する確認試験
試験検体Ａ、Ｂ、ａ、ｂそれぞれ２０個を、ボンソル１号土壌に播種し、明期１４時間（２８℃）と暗期１０時間（２４℃）の反復環境下で育成し、接種後８日目の葉の長さを計測し、その平均値をもってイネもみ枯細菌病の発症を確認する指標とした。その結果を表１に示す。図１は、接種後８日目の成長の様子を示す写真であり、図１中左より、試験検体Ａ、試験検体ａ、試験検体Ｂ、試験検体ｂを示す。
【００２２】
【表１】
2019142847.tif 000003
【００２３】
（３）結果
表１および図１より、接種したイネもみ枯細菌病菌の病原性の強弱に関わらず、催芽処理をしないイネ籾（試験検体ａ、ｂ）に比べて、催芽処理をしたイネ籾（試験検体Ａ、Ｂ）は、葉が概略３〜５倍程度成長しており、イネもみ枯細菌病の発症が抑制され、イネもみ枯細菌病菌による葉の伸長が阻害されることなく順調に生育していることが確認された。この結果から、発明者は、イネ籾の催芽処理がイネもみ枯細菌病の発症抑制に関与しているのではないかと考え、次なる実験を行った。
【００２４】
＜実施例２＞催芽処理の有無による、増殖細菌確認試験
（１）試験検体における細菌数の確認
前記「実施例１」の試験検体Ａ、ａを使用して、前記「実施例１」と同じ条件で育成した。イネもみ枯細菌病菌を接種した日（接種日、０日）、１日目、２日目、３日目、４日目それぞれの、試験検体３個における茎葉も含めた植物全体の細菌数（ｃｆｕ／３個の植物体）を計測した。すなわち、接種０〜４日目の植物体３個それぞれをエッペンドルフチューブに回収し、蒸留水１ｍｌ及びステレンスビーズ（４．８ｍｍ）２個を添加した後、マイクロスマッシュで撹拌し、植物粉砕液を得た。得られた植物粉砕液を段階希釈し、抗生物質（クロラムフェニコール）を補充した寒天培地において３０℃にて３日間培養し、コロニー数を計測した。このコロニー数を上記希釈率で除した値を、試験検体３個における細菌数とした。その結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
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【００２６】
（２）結果
表２より、イネもみ枯細菌病菌を接種後の植物体内の細菌数は、催芽処理の有無により大きく変化することが明らかとなった。詳しくは、植物体内の細菌数は、イネもみ枯細菌病菌接種後1日目以降は、催芽処理をしないイネ籾（試験検体ａ）に比べ、催芽処理をしたイネ籾（試験検体Ａ）の方が常に多く、特に、接種後１〜２日目は、概略３〜４倍程度多いことが確認された。詳細な試験の結果、催芽処理をしないイネ籾（試験検体ａ）は、感染したイネもみ枯細菌病菌のみの増殖が確認された一方で、催芽処理をしたイネ籾（試験検体Ａ）には、感染したイネもみ枯細菌病菌以外の細菌が増殖していることが判明した。この試験検体Ａにおいて増殖した、イネもみ枯細菌病菌以外の細菌を確認するために、次の試験を行った。
【００２７】
＜実施例３＞催芽処理＋イネもみ枯細菌病菌接種により増殖した細菌確認試験
（１）試験検体の調製
上記「実施例１」の試験検体Ａ、ａを使用して、接種後４日目の植物体３個（図２のＩＩＩ）をエッペンドルフチューブに回収し、蒸留水１ｍｌ及びステレンスビーズ（４．８ｍｍ）２個を添加した後、マイクロスマッシュで撹拌し、植物粉砕液を得た。得られた植物粉砕液を段階希釈し図２中に示された希釈率で、抗生物質（クロラムフェニコール）を補充した寒天培地において３０℃にて３日間培養した。この３日培養後の状態を、図２のＩａ、ｂ（試験検体Ａ）、ＩＩａ、ｂ（試験検体ａ）に示す。得られたコロニーからさらに１コロニーを選択し、１晩液体培養し、ＯＤ１．０に調整した菌液を２μｌ寒天培地上に接種し、３０℃で３日間培養した。この３日培養後の状態を、図２のＩＶ〜ＶＩＩに示す。
【００２８】
（２）菌株の同定
上記選抜コロニーから分離した菌株について、発生したコロニーを鋳型に、１６Ｓ ｒＤＮＡ増幅プライマー（AAGGAGGGGATCCAGCCGCA及びGTGCCAGCAGCCGCGGもしくはTGGAAAGCTTGATCCTGGCT及びAAGGAGGGGATCCAGCCGCA）にてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、アガロース電気泳動にて増幅したバンドについてゲルから切り出し精製した後、シークエンスを行った。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析による細菌の系統分類方法に準拠して、遺伝子解析を行い菌の同定を行った。日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のデータベースでｂｌａｓｔｎ（Basic Local Alignment Search Tool）を利用して相同性の高い菌を検索した。
ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＳＭＡＬ株は、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ  ｓｔｒａｉｎ ＡＡ１の １６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の１４６８個のうち１４４５個が一致した(９８％) 。よって本菌は、ステノトロフォモナス・マルトフィリアに属すると考えられる。
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＲＳＢ１株はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の８８０個のうち８６３個が一致した(９８％)。
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＲＳＢ１０株はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ｓｔｒａｉｎ  ＫＴ２４４０の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の９９１個のうち９８９個が一致した(９９％)。
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＲＳＢ１５株はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ｓｔｒａｉｎ ＩＡＲＩ−ＲＰ５５の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の９９０個のうち９８９個が一致した(９９％)。
よってＲＳＢ菌は、シュードモナス・プチダに属すると考えられる。
【００２９】
（３）菌株の性質
新たに見出された本発明の菌株の性状・性質は以下のとおりである。
ＳＭＡＬ株  細胞形態：桿状、コロニー：黄白色、特徴：運動性低い、バイオフィルム形成能高い。
ＲＳＢ１株  細胞形態：桿状、コロニー：黄白色、特徴：グラム陰性、運動性を有する。
ＲＳＢ１０株  細胞形態：桿状、コロニー：黄色、特徴：運動性を有する。
ＲＳＢ１５株  細胞形態：桿状、コロニー：白色、特徴：運動性低い。
【００３０】
＜実施例４＞新たな細菌株の植物病害抑制能の確認試験
（１）試験検体の調製
催芽処理をしていないイネ籾に対して、イネもみ枯細菌病菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌｕｍａｅ）「ＭＡＦＦ３０１６８２」を以下に示す濃度で減圧接種時に、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株、シュードモナス・プチダＲＳＢ１株、ＲＳＢ１０株およびＲＳＢ１５株の何れか１種を作用させて試験検体Ｃ〜Ｆを得た。また、イネもみ枯細菌病菌のみを減圧接種した試験検体Ｇを得た。さらに、催芽処理をしてイネもみ枯細菌病菌を減圧接種して試験検体Ｈを得た。試験検体の詳細は以下のとおりである。なお、「ＯＤ（Optical Density）」は菌体濃度「g-dry-cell／L」を意味する用語であり
、ＯＤ１は１０９ＣＦＵ/ｍｌ（colony forming unit (CFU)／ml）に相当する。
試験検体Ｃ：イネもみ枯細菌病菌（OD0.00004）＋ＳＭＡＬ株（OD0.04）
試験検体Ｄ：イネもみ枯細菌病菌（OD0.00004）＋ＲＳＢ１株（OD0.04）
試験検体Ｅ：イネもみ枯細菌病菌（OD0.00004）＋ＲＳＢ１０株（OD0.04）
試験検体Ｆ：イネもみ枯細菌病菌（OD0.00004）＋ＲＳＢ１５株（OD0.04）
試験検体Ｇ：イネもみ枯細菌病菌（OD0.00004）のみ
試験検体Ｈ：催芽処理＋イネもみ枯細菌病菌（OD0.00004）
（２）植物病害抑制能に関する確認試験
上記「実施例１」の「（２）植物病害発症に関する確認試験」と同じように、試験検体Ｃ〜Ｈを育成し、接種８日後の試験検体の葉の長さと根の長さを計測した。２０個体の葉及び根の長さを測定し、その平均値を表３に示す。
【００３１】
【表３】
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【００３２】
（３）結果
表３の結果より、イネもみ枯細菌病菌を接種時にシュードモナス・プチダＲＳＢ１株、ＲＳＢ１０株およびＲＳＢ１５株の何れかを作用させたイネ籾（試験検体Ｄ、Ｅ、Ｆ）は、イネもみ枯細菌病菌のみを接種したイネ籾（試験検体Ｇ）に比べて、葉または根が概略２〜５倍程度成長しており、イネもみ枯細菌病の発症が抑制され順調に生育していることが確認された。特に、イネもみ枯細菌病菌を接種時にシュードモナス・プチダＲＳＢ１５株を作用させたイネ籾（試験検体Ｆ）は、催芽処理をしてイネもみ枯細菌病菌のみを接種したイネ籾（試験検体Ｈ）と比べて、根は同等程度、葉はそれ以上に成長しており、イネもみ枯細菌病の発症の抑制効果に優れていることも確認された。一方、イネもみ枯細菌病菌を接種時にステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株を作用させたイネ籾（試験検体Ｃ）は、イネもみ枯細菌病菌のみを接種したイネ籾（試験検体Ｇ）に比べて、葉または根が概略半分程度しか成長しておらず、イネもみ枯細菌病の発症を抑制し得ないことが確認された。
この結果から、シュードモナス・プチダＲＳＢ１株、ＲＳＢ１０株およびＲＳＢ１５株の何れか、特に、シュードモナス・プチダＲＳＢ１５株は、イネもみ枯細菌病に関する発症抑制効果に優れていることが明らかとなった。
【００３３】
＜実施例５＞相乗効果の確認試験１
（１）試験検体の調製
催芽処理をしていないイネ籾に対して、イネもみ枯細菌病菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌｕｍａｅ、ＯＤ＝０．００００４）「ＭＡＦＦ３０１６８２」の減圧接種時に、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株（ＯＤ０．０４）とシュードモナス・プチダＲＳＢ１５株（ＯＤ０．０４）を作用させて試験検体Ｘを得た。また、上記「実施例４」の試験検体Ｇ、Ｃ、Ｆを使用した。
（２）相乗効果確認試験
上記「実施例１」の「（２）植物病害発症に関する確認試験」と同じように、試験検体Ｇ、Ｃ、Ｆ、Ｘを２０個育成し、接種８日後の試験検体の葉の長さを測定し、その平均値を表４に示す。
【００３４】
【表４】
2019142847.tif 000006
【００３５】
（３）結果
表４には、イネもみ枯細菌病菌を接種時にステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株とシュードモナス・プチダＲＳＢ１５株を組み合わせて作用させたイネ籾（試験検体Ｘ）の葉の長さは５．４８ｃｍであることが示されている。一方、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株を作用させたイネ籾（試験検体Ｃ）の葉の長さは０．４４ｃｍであり、シュードモナス・プチダＲＳＢ１５株を作用させたイネ籾（試験検体Ｆ）の葉の長さは１．７６ｃｍであることも示されている。詳しく説明すると、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株とシュードモナス・プチダＲＳＢ１５株を組み合わせて作用させたイネ籾（試験検体Ｘ）の葉の長さ（５．４８ｃｍ）は、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株とシュードモナス・プチダＲＳＢ１５株をそれぞれ単独で作用させたイネ籾（試験検体Ｃ、Ｆ）の葉の長さの和（０．４４＋１．７６＝２．２０）より、約２．５倍の長さに成長していることを示している。
すなわち、表４の結果より、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株とシュードモナス・プチダＲＳＢ１５株を組み合わせて作用させることにより、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株とシュードモナス・プチダＲＳＢ１５株それぞれを単独で作用させる場合に比べて葉が数倍成長し、イネもみ枯細菌病の発症を極めて良好に抑制し得ることが確認された。
このようにステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株とシュードモナス・プチダＲＳＢ１５株を組み合わせることにより得られたイネもみ枯細菌病の発症の抑制効果は、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株またはシュードモナス・プチダＲＳＢ１５株それぞれを単独の効果の単なる相加効果に留まらず、相乗的な効果であることが確認された。
【００３６】
＜実施例６＞相乗効果の確認試験２
（１）試験検体の調製
催芽処理をしていないイネ籾に対して、イネもみ枯細菌病菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌｕｍａｅ、ＯＤ＝０．００００４）「ＭＡＦＦ３０１６８２」の減圧接種時に、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株（ＯＤ０．０４）とシュードモナス・プチダＲＳＢ１株（ＯＤ０．０４）またはＲＳＢ１０株（ＯＤ０．０４）を作用させて試験検体Ｙまたは試験検体Ｚを得た。また、上記「実施例４」の試験検体Ｇ、Ｃ、Ｄ、Ｅを使用した。
（２）相乗効果確認試験
上記「実施例１」の「（２）植物病害発症に関する確認試験」と同じように、試験検体Ｇ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｚを２０個育成し、接種８日後の試験検体の葉の長さを測定し、その平均値をまとめて表５に示す。
【００３７】
【表５】
2019142847.tif 000007
【００３８】
（３）結果
表５には、イネもみ枯細菌病菌を接種時にステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株とシュードモナス・プチダＲＳＢ１株を組み合わせて作用させたイネ籾（試験検体Ｙ）の葉の長さは２．２９ｃｍであることが示されている。一方、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株を作用させたイネ籾（試験検体Ｃ）の葉の長さは０．４１ｃｍであり、シュードモナス・プチダＲＳＢ１株を作用させたイネ籾（試験検体Ｄ）の葉の長さは１．１３ｃｍであることも示されている。詳しく説明すると、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株とシュードモナス・プチダＲＳＢ１株を組み合わせて作用させたイネ籾（試験検体Ｙ）の葉の長さ（２．２９ｃｍ）は、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株とシュードモナス・プチダＲＳＢ１株をそれぞれ単独で作用させたイネ籾（試験検体Ｃ、Ｆ）の葉の長さの和（０．４１＋１．１３＝１．５４）より、約１．５倍の長さに成長していることを示している。
また、表５には、イネもみ枯細菌病菌を接種時にステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株とシュードモナス・プチダＲＳＢ１０株を組み合わせて作用させたイネ籾（試験検体Ｚ）の葉の長さは２．００ｃｍであることが示されている。一方、シュードモナス・プチダＲＳＢ１０株を作用させたイネ籾（試験検体Ｅ）の葉の長さは１．３４ｃｍであることも示されている。詳しく説明すると、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株とシュードモナス・プチダＲＳＢ１０株を組み合わせて作用させたイネ籾（試験検体Ｚ）の葉の長さ（２．００ｃｍ）は、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株とシュードモナス・プチダＲＳＢ１０株をそれぞれ単独で作用させたイネ籾（試験検体Ｃ、Ｅ）の葉の長さの和（０．４１＋１．３４＝１．７５）より、約１．２倍の長さに成長していることを示している。
すなわち、表５の結果より、イネもみ枯細菌病菌を接種時にステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株とシュードモナス・プチダＲＳＢ１株またはＲＳＢ１０株を組み合わせて作用させたイネ籾（試験検体Ｙ、Ｚ）は、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株、シュードモナス・プチダＲＳＢ１株またはＲＳＢ１０株それぞれを単独で作用させたイネ籾（試験検体Ｃ、Ｄ、Ｅ）に比べて葉が数倍成長しており、イネもみ枯細菌病の発症抑制効果に優れていることが確認された。
このようにステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株とシュードモナス・プチダＲＳＢ１株またはＲＳＢ１０株を組み合わせることにより得られたイネもみ枯細菌病の発症の抑制効果も、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株とシュードモナス・プチダＲＳＢ１５株との組み合わせと同様に、単なる相加効果に留まらず、相乗的な効果であることが確認された。
【００３９】
＜実施例７＞イネ苗立枯細菌病に対する防除効果
（１）試験検体の調製
催芽処理をしていないイネ籾に対して、イネ苗立枯細菌病菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ、ＯＤ＝０．００４）を減圧接種時に、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株とシュードモナス・プチダＲＳＢ１５株を作用させて試験検体Ｐを得た。また、下記に示す試験検体Ｉ、Ｊ、Ｋを同様に得た。
試験検体Ｉ：イネ苗立枯細菌病菌（OD0.004）のみ
試験検体Ｊ：イネ苗立枯細菌病菌（OD0.004）＋ＳＭＡＬ株（OD0.04）
試験検体Ｋ：イネ苗立枯細菌病菌（OD0.004）＋ＲＳＢ１５株（OD0.04）
（２）相乗効果確認試験
上記「実施例１」の「（２）植物病害発症に関する確認試験」と同じように、試験検体Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｐを２０個育成し、接種８日後の試験検体の葉の長さを測定し、その平均値を表６に示す。
【００４０】
【表６】
2019142847.tif 000008
【００４１】
（３）結果
表６には、イネ苗立枯細菌病菌を接種時にステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株とシュードモナス・プチダＲＳＢ１５株を組み合わせて作用させたイネ籾（試験検体Ｐ）の葉の長さは６．３８ｃｍであることが示されている。一方、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株を作用させたイネ籾（試験検体Ｊ）の葉の長さは０．９８ｃｍであり、シュードモナス・プチダＲＳＢ１５株を作用させたイネ籾（試験検体Ｋ）の葉の長さは３．１４ｃｍであることも示されている。詳しく説明すると、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株とシュードモナス・プチダＲＳＢ１５株を組み合わせて作用させたイネ籾（試験検体Ｐ）の葉の長さ（６．３８ｃｍ）は、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株とシュードモナス・プチダＲＳＢ１５株をそれぞれ単独で作用させたイネ籾（試験検体Ｊ、Ｋ）の葉の長さの和（０．９８＋３．１４＝４．１２）より、約１．５倍の長さに成長していることを示している。
すなわち、表６の結果より、イネ苗立枯細菌病菌を接種時にステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株とシュードモナス・プチダＲＳＢ１５株を組み合わせて作用させたイネ籾（試験検体Ｐ）は、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株、シュードモナス・プチダＲＳＢ５株それぞれを単独で作用させたイネ籾（試験検体Ｊ、Ｋ）に比べて葉が数倍成長しており、イネ苗立枯細菌病の発症抑制効果に極めて優れていることが確認された。
このようにステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株とシュードモナス・プチダＲＳＢ１５株を組み合わせることにより得られたイネ苗立枯細菌病の発症の抑制効果も、イネもみ枯細菌病と同様に、単なる相加効果に留まらず、相乗的な効果であることが確認された。
これらのことより、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株と、シュードモナス・プチダＲＳＢ１株、ＲＳＢ１０株、ＲＳＢ１５株との組み合わせは、植物病害に対して相乗的な防除効果を発揮することが明らかとなった。
【００４２】
上記実施例５〜７において具体的に示した、本発明の相乗的な植物病害防除効果について、その発現要因を明らかにするため、以下の実施例８〜１０の試験を実施した。
【００４３】
＜実施例８＞バイオフィルム形成能の確認試験
ステノトロフォモナス・マルトフィリア「ＳＭＡＬ」株、シュードモナス・プチダ「ＲＳＢ１」株、「ＲＳＢ１０」株、「ＲＳＢ１５」株それぞれのバイオフィルム形成能を確認するため、下記試験を行った。念のため、イネもみ枯細菌病菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌｕｍａｅ）ＭＡＦＦ「３０１１１６９」、ＭＡＦＦ「３０１６８２」のバイオフィルム形成能についても、併せ確認した。（１）バイオフィルム形成能の確認試験方法
一晩寒天培地で培養した上記６種類の細菌それぞれＯＤ＝０．１に調製した３ｍｌを、３０℃にて４８時間静置培養した。培養液を除去して、同量の滅菌水で３回洗浄後、０．１重量％のクリスタルバイオレット水溶液３ｍｌを添加して、２０分間静置した。引き続き、クリスタルバイオレット水溶液を除去して、同量の滅菌水で３回洗浄後、７０容量％エタノール水溶液で溶出して、５９５ｎｍの吸光度よりＯＤ５９５値を測定した。この結果を表７に示す。
【００４４】
【表７】
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【００４５】
（２）結果
表７より、ステノトロフォモナス・マルトフィリア「ＳＭＡＬ」株は、シュードモナス・プチダ「ＲＳＢ１」株、「ＲＳＢ１０」株、「ＲＳＢ１５」株やイネもみ枯細菌病菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌｕｍａｅ）ＭＡＦＦ「３０１６８２」、「３０１１１６９」に比べて、バイオフィルム形成能が極めて高いことが明らかとなった。
このステノトロフォモナス・マルトフィリア「ＳＭＡＬ」株のバイオフィルム形成能が、上記実施例５〜７により確認された相乗的な植物病害防除効果の発現に関与しているかを確認するために、以下の実施例９、１０の試験を行った。
【００４６】
＜実施例９＞バイオフィルム形成能増強株／抑制株の創出試験
（１）バイオフィルム形成能増強株／抑制株の創出方法
一晩培養したステノトロフォモナス・マルトフィリア「ＳＭＡＬ」株について５ｍｌ分を集菌し、１ｍｌの滅菌水に再懸濁した。得られた菌液を１０−６ＣＦＵ／ｍｌとなるように希釈し、ＬＢプレートにプレーティングした。３０℃で９０分静置後、ＵＶ（クリーンベンチ内の殺菌灯：Germicidal f15t8 / UVB）を１分照射し、３０℃で２日間培養し、得られたコロニーを変異体とした。なお、このＵＶ照射の結果、コロニー数はＵＶ照射なしの場合と比較して半数となった。
得られた約１０００の変異体について、マイクロプレートを用いた簡易法にてバイオフィルム形成能を測定する１次スクリーニングを行った。１次スクリーニングにおいて、バイオフィルム形成能に変化のあった変異体１９株について、実施例８と同じ方法により、バイオフィルム形成能を測定する２次スクリーニングを行った。この２次スクリーニングの結果から、バイオフィルム形成能増強株としてＮｏ．１７、Ｎｏ．２８を、バイオフィルム形成能抑制株としてＮｏ．４５、Ｎｏ．６０を選抜した。
表８に２次スクリーニングの結果を示す。表８中の水平軸の数字は、１次スクリーニングにより選抜した株番号であり、「ＳＭＡＬ」はＵＶ照射していない、ステノトロフォモナス・マルトフィリア「ＳＭＡＬ」株を意味する。
【００４７】
【表８】
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【００４８】
（２）菌株の同定
上記選抜コロニーから分離した菌株について、発生したコロニーを鋳型に、１６Ｓ ｒＤＮＡ増幅プライマー（GTTTGATCCTGGCTCA及びTACCAGGGTATCTAATCC）にてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、アガロース電気泳動にて増幅したバンドについてゲルから切り出し精製した後、シークエンスを行った。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析による細菌の系統分類方法に準拠して、遺伝子解析を行い菌の同定を行った。日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のデータベースでｂｌａｓｔｎ（Basic Local Alignment Search Tool）を利用して相同性の高い菌を検索した。
ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＳＭＡＬＵＶ１７株は、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ｓｔｒａｉｎ  ＯＵＣ  Ｅｓｔ１０の １６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の７６３個のうち７６３個が一致し (１００％)、ＳＭＡＬＵＶ２８株は、同様に７６４個のうち７６４個が一致した(１００％) 。よって、上記２つのＳＭＡＬＵＶ株は、ステノトロフォモナス・マルトフィリアに属すると考えられる。
【００４９】
（３）菌株の性質
新たに見出された本発明の菌株の性状・性質は以下のとおりである。
ＳＭＡＬＵＶ１７株  細胞形態：桿状、コロニー：黄白色、特徴：運動性低い、バイオフィルム形成能高い。
ＳＭＡＬＵＶ２８株  細胞形態：桿状、コロニー：黄白色、特徴：運動性低い、バイオフィルム形成能高い。
【００５０】
＜実施例１０＞バイオフィルム形成能増強株／抑制株を使用したイネもみ枯細菌病に対する防除効果
（１）試験検体の調製
催芽処理をしていないイネ籾に対して、イネもみ枯細菌病菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌｕｍａｅ、ＯＤ＝０．０００４）を減圧接種時に、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株とシュードモナス・プチダＲＳＢ１５株を作用させて試験検体８を得た。また、下記に示す試験検体１〜７、９〜１２を同様に得た。
試験検体１：イネもみ枯細菌病菌（OD0.0004）のみ
試験検体２：イネもみ枯細菌病菌（OD0.0004）＋ＲＳＢ１５株（OD0.04）
試験検体３：イネもみ枯細菌病菌（OD0.0004）＋ＳＭＡＬ株（OD0.04）
試験検体４：イネもみ枯細菌病菌（OD0.0004）＋Ｎｏ．１７株（OD0.04）
試験検体５：イネもみ枯細菌病菌（OD0.0004）＋Ｎｏ．２８株（OD0.04）
試験検体６：イネもみ枯細菌病菌（OD0.0004）＋Ｎｏ．４５株（OD0.04）
試験検体７：イネもみ枯細菌病菌（OD0.0004）＋Ｎｏ．６０株（OD0.04）
試験検体８：イネもみ枯細菌病菌（OD0.0004）＋ＲＳＢ１５株（OD0.04）＋ＳＭＡＬ株（OD0.04）
試験検体９：イネもみ枯細菌病菌（OD0.0004）＋ＲＳＢ１５株（OD0.04）＋Ｎｏ．１７株（OD0.04）
試験検体１０：イネもみ枯細菌病菌（OD0.0004）＋ＲＳＢ１５株（OD0.04）＋Ｎｏ．２８株（OD0.04）
試験検体１１：イネもみ枯細菌病菌（OD0.0004）＋ＲＳＢ１５株（OD0.04）＋Ｎｏ．４５株（OD0.04）
試験検体１２：イネもみ枯細菌病菌（OD0.0004）＋ＲＳＢ１５株（OD0.04）＋Ｎｏ．６０株（OD0.04）
【００５１】
（２）バイオフィルム形成能増強株／抑制株による相乗効果確認試験
上記「実施例１」の「（２）植物病害発症に関する確認試験」と同じように、試験検体１〜１２を２０個育成し、接種８日後の試験検体の葉の長さを測定し、その平均値を表９に示す。
【００５２】
【表９】
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【００５３】
（３）結果
表９には、試験検体８の葉の長さに比べて、試験検体９、１０は長くなり、試験検体１１、１２は短くなることが示されている。すなわち、表９の結果より、バイオフィルム形成能増強株であるＮｏ．１７、Ｎｏ．２８は、ステノトロフォモナス・マルトフィリア「ＳＭＡＬ」株に比べて、シュードモナス・プチダＲＳＢ１５株との併用によるイネもみ枯細菌病の発症抑制効果における相乗効果を、より高めることが理解できる。一方、バイオフィルム形成能抑制株であるＮｏ．４５、Ｎｏ．６０は、ステノトロフォモナス・マルトフィリア「ＳＭＡＬ」株に比べて、シュードモナス・プチダＲＳＢ１５株との併用によるイネもみ枯細菌病の発症抑制効果における相乗効果を、低下させることが理解できる。
したがって、実施例８〜１０の結果より、本発明のステノトロフォモナス・マルトフィリア「ＳＭＡＬ」株が、極めて高いバイオフィルム形成能を有し、この高いバイオフィルム形成能が、シュードモナス・プチダＲＳＢ１株、ＲＳＢ１０株、ＲＳＢ１５株の定着性を向上させて、本発明の植物病害防除剤における相乗的な植物病害防除効果を発現させる要因の１つとなっているのではないかと推測された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
このように、本発明の植物病害防除剤は、ステノトロフォモナス・マルトフィリアＳＭＡＬ株、ＳＭＡＬＵＶ１７およびＳＡＭＬＵＶ２８株から選択される１種以上と、シュードモナス・プチダＲＳＢ１株、ＲＳＢ１０株およびＲＳＢ１５株から選択される１種以上とを共に有効成分として含むことにより、イネ科植物等の植物体における細菌等の病原菌による発症を強く抑制することができるほか、化学農薬と異なり薬害等の心配がなく、収穫直前まで使用することが可能であるため、非常に有用である。しかも、薬剤耐性菌の発生が少なく環境負荷が低いことから、農薬の散布回数にカウントされないというメリットがある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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