(57)【要約】      （修正有）【課題】慢性骨髄性白血病を効果的に予防または治療するために、チロシンキナーゼとＴＧＦ−β信号伝逹経路とを効率的に阻害することができる薬学的組成物の提供。【解決手段】化学式ＩＩで例示される化合物とチロシンキナーゼ阻害剤と、を含む慢性骨髄性白血病の予防用または治療用の薬学的組成物。2019142963.tif 000006【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式Ｉの化合物、その薬学的に許容可能な塩、溶媒化物、立体異性質体、またはそれらの組み合わせ：
【化１】
2019142963.tif 000004
前記化学式Ｉで、Ｒａは、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキル、Ｃ３−６シクロアルキル、ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−Ｏ−Ｃ１−６ハロアルキル、−Ｏ−Ｃ３−６シクロアルキル、ＮＨ２、−ＮＨ−Ｃ１−６アルキル、−ＮＨ−Ｃ１−６ハロアルキル、−ＮＨ−Ｃ３−６シクロアルキル、−Ｓ−Ｃ１−６アルキル、−Ｓ−Ｃ１−６ハロアルキル、−Ｓ−Ｃ３−６シクロアルキル、ＣＮまたはＮＯ２であり、
ｍは、０、１、２、３または４であり、
Ａ１及びＡ２のうち一つは、Ｎであり、他の一つは、ＮＲ１であり、ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ３−６シクロアルキルであり、
Ｘは、−ＮＲ２−、−Ｏ−または−Ｓ−であり、ここで、Ｒ２は、ＨまたはＣ１−３アルキルであり、
それぞれのＲｂは、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキル、Ｃ３−６シクロアルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、−（ＣＨ２）ｑ−ＯＲ３、−（ＣＨ２）ｑ−ＮＲ３Ｒ４、−（ＣＨ２）ｑ−ＳＲ３、−（ＣＨ２）ｑ−ＮＯ２、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯＮＨＯＨ、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＮ、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯＲ３、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯ２Ｒ３、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯＮＲ３Ｒ４、−（ＣＨ２）ｑ−テトラゾール、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＮ、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ２Ｒ３、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＮＲ３Ｒ４、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＨ＝ＣＨ−テトラゾール、−（ＣＨ２）ｑ−ＮＨＣＯＲ３、−（ＣＨ２）ｑ−ＮＨＣＯ２Ｒ３、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯＮＨＳＯ２Ｒ３、−（ＣＨ２）ｑ−ＮＨＳＯ２Ｒ３、−（ＣＨ２）ｑ−Ｃ≡Ｃ−ＣＮ、−（ＣＨ２）ｑ−Ｃ≡Ｃ−ＣＯ２Ｒ３、−（ＣＨ２）ｑ−Ｃ≡Ｃ−ＣＯＮＲ３Ｒ４、−（ＣＨ２）ｑ−Ｃ≡Ｃ−テトラゾール、−（ＣＨ２）ｑ−ＳＯＲ５、−（ＣＨ２）ｑ−ＳＯ２Ｒ５または−（ＣＨ２）ｒ−（ＯＲ３）２であり、ここで、Ｒ３及びＲ４は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ３−６シクロアルキルであるか、またはそれらが結合された窒素原子と共に、単環式環、例えば、イミダゾール、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、ピペラジン及びホモピペラジンを形成し、Ｒ５は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ３−６シクロアルキルであり、ｑは、０、１、２、３または４であり、ｒは、１、２、３または４であり、
ｎは、０、１、２、３、４または５である化合物と、
チロシンキナーゼ阻害剤と、を含む慢性骨髄性白血病の予防用または治療用の薬学的組成物。
【請求項２】
前記化学式Ｉの化合物は、下記化学式ＩＩの化合物であることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物：
【化２】
2019142963.tif 000005
。
【請求項３】
前記チロシンキナーゼ阻害剤は、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ボスチニブ、ポナチニブ、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記慢性骨髄性白血病は、チロシンキナーゼ阻害剤抵抗性であることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記チロシンキナーゼ阻害剤抵抗性は、３１５番チロシン残基がイソロイシン残基に突然変異されたＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質によって引き起こされたものであることを特徴とする請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記薬学的組成物は、単一組成物または個別的な組成物であることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の化学式Ｉの化合物、その薬学的に許容可能な塩、溶媒化物、立体異性質体、またはそれらの組み合わせ、及びチロシンキナーゼ阻害剤を個体に投与する段階を含む個体の慢性骨髄性白血病を予防または治療する方法。
【請求項８】
前記投与は、同時、個別または順次的に投与することを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記投与は、チロシンキナーゼ阻害剤を個体に投与した後、請求項１に記載の化学式Ｉの化合物、その薬学的に許容可能な塩、溶媒化物、立体異性質体、またはそれらの組み合わせを、前記個体に投与することを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記個体は、慢性骨髄性白血病にかかるか、あるいは慢性骨髄性白血病にかかる危険があることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性骨髄性白血病を予防または治療するための薬学的組成物、及びそれを利用して慢性骨髄性白血病を予防または治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ：chronic myeloid leukemia）は、造血幹細胞（hematopoietic stem cell）のクローンが非正常的に発生しながら、骨髄内に非正常的な細胞が過度に増殖して生ずる疾患である。ＣＭＬは、９番染色体と２２番染色体との転座（translocation）（ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１））によって生じたフィラデルフィア染色体によって発病する。該染色体転座によって、９番染色体のＡＢＬ遺伝子と、２２番染色体のＢＣＲ遺伝子との融合が起き、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子によって、非正常的なチロシンキナーゼ（tyrosine kinase）活性を有するＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質が生成される。ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼは、非正常的な細胞分裂を誘導する。最近、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）治療後、ＣＭＬ患者において、ＴＫＩ非敏感性ＣＭＬ（ＴＫＩ−insensitive ＣＭＬ）が発生して問題になっている。ＴＫＩは、活発に分裂するＣＭＬ細胞のみを標的にするために、休止状態の（quiescent）ＣＭＬ幹細胞は、ＴＫＩによって除去されない。従って、ＣＭＬを根本的に治療するためには、ＣＭＬ細胞だけではなく、ＣＭＬ幹細胞を死滅させる必要がある。
【０００３】
形質転換成長因子（ＴＧＦ：transforming growth factor：ＴＧＦ）−βは、細胞の増殖及び分化、傷治癒、及び細胞外基質（extracellular matrix）生産などを調節するサイトカイン（cytokine）である。ＴＧＦ−βファミリは、ＴＧＦ−βスーパーファミリに属し、ＴＧＦ−βスーパーファミリは、アクチビン（activin）、インヒビン（inhibin）、骨形成タンパク質及び抗ミュレリアン（Mullerrian）ホルモンを含む。多様な癌の末期段階腫瘍内の腫瘍細胞及び間質細胞は、一般的に、ＴＧＦ−βを過発現する。ＴＧＦ−βは、新生血管生成、細胞運動の刺激、免疫系の阻害、及び腫瘍細胞と細胞外基質との相互作用増大を引き起こす。ＴＧＦ−β受容体は、セリン／トレオチンキナーゼ受容体であり、ＴＧＦ−β受容体１、ＴＧＦ−β受容体２及びＴＧＦ−β受容体３に分けられる。そのうちＴＧＦ−β受容体１は、アクチビンＡ受容体タイプＩＩ類似キナーゼ（ＡＬＫ５：activin Ａ receptor type ＩＩ−like kinase）とも呼ばれる。
【０００４】
従って、ＣＭＬを効果的に予防または治療するために、チロシンキナーゼとＴＧＦ−β信号伝逹経路とを効率的に阻害することができる薬学的組成物が要求される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＴＧＦ−β信号伝逹経路を阻害する活性を有する化合物、及びチロシンキナーゼ阻害剤を含む慢性骨髄性白血病の予防用または治療用の薬学的組成物を提供する。
【０００６】
ＴＧＦ−β信号伝逹経路を阻害する活性を有する化合物、及びチロシンキナーゼ阻害剤を含む慢性骨髄性白血病予防または治療方法を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
一様相による慢性骨髄性白血病の予防用または治療用の薬学的組成物、及びそれを利用した慢性骨髄性白血病の予防方法または治療方法は、慢性骨髄性白血病を効果的に予防または治療するところに利用される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ポナチニブまたはＴＥＷ−７１９７の単独、またはそれらの組み合わせの存在で培養されたＬＴ−ＣＭＬ幹細胞のコロニー形成能を示すグラフである。
【図２Ａ】薬物投与によるＴＴ−ＣＭＬ発病マウスの生存率（％）を示すグラフである。
【図２Ｂ】ドキシサイクリン中断後の経時的なｔｇ−ＣＭＬ発病マウスの生存率（％）を示すグラフである。
【図２Ｃ】薬物投与によるＴＫＩ抵抗性Ｔ３１５Ｉ ＴＴ−ＣＭＬ発病マウスの生存率（％）を示すグラフである。
【図３Ａ】薬物を投与したＴＴ−ＣＭＬ発病マウスにおいて、末梢血液中にける白血球の数を示すグラフある。
【図３Ｂ】薬物を投与したＴＴ−ＣＭＬ発病マウスにおける脾臓の写真である。
【図３Ｃ】薬物を投与したＴＴ−ＣＭＬ発病マウスにおける脾臓の重量を示すグラフである。
【図３Ｄ】ＴＥＷ−７１９７を投与したＴＴ−ＣＭＬ発病マウスの末梢血液において、総ＧＦＰ／ＢＣＲ−ＡＢＬ＋細胞のうち、Ｔ細胞、Ｂ細胞及び骨髄細胞の比率（％）を示すグラフである。
【図４Ａ】薬物を投与したＴＴ−ＣＭＬ発病マウスにおいて、ＧＦＰ／ＢＣＲ−ＡＢＬ＋ＫＬＳ＋細胞（太線四角形）及びＫＬＳ−細胞（点線四角形）を流細胞分析したグラフである。
【図４Ｂ】ＧＦＰ＋ ＣＭＬ細胞において、ＣＭＬ ＫＬＳ−細胞の比率（％）を示したグラフである。
【図４Ｃ】ＧＦＰ＋ ＣＭＬ細胞において、ＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞の比率（％）を示したグラフである。
【図５Ａ】薬物を投与したＴＴ−ＣＭＬ発病マウスにおいて、Ｔ３１５Ｉ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＧＦＰ＋ ＫＬＳ＋細胞（太線四角形）及びＫＬＳ−細胞（点線四角形）を流細胞分析したグラフである。
【図５Ｂ】Ｔ３１５Ｉ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＧＦＰ＋細胞において、Ｔ３１５Ｉ ＫＬＳ−細胞の比率（％）を示したグラフである。
【図５Ｃ】Ｔ３１５Ｉ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＧＦＰ＋細胞において、Ｔ３１５Ｉ ＫＬＳ＋細胞の比率（％）を示したグラフである。
【図６Ａ】患者１に由来するヒトＣＭＬ開始細胞のコロニー形成能を示すグラフである。
【図６Ｂ】患者２に由来するヒトＣＭＬ開始細胞のコロニー形成能を示すグラフである。
【図６Ｃ】患者３に由来するヒトＣＭＬ開始細胞のコロニー形成能を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
一様相は、下記化学式Ｉの化合物、その薬学的に許容可能な塩、溶媒化物、立体異性質体、またはそれらの組み合わせ、及びチロシンキナーゼ阻害剤を含む慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ：chronic myeloid leukemia）の予防用または治療用の薬学的組成物を提供する：
【００１０】
【化１】
2019142963.tif 000002
【００１１】
前記化学式Ｉで、Ｒａは、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキル、Ｃ３−６シクロアルキル、ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−Ｏ−Ｃ１−６ハロアルキル、−Ｏ−Ｃ３−６シクロアルキル、ＮＨ２、−ＮＨ−Ｃ１−６アルキル、−ＮＨ−Ｃ１−６ハロアルキル、−ＮＨ−Ｃ３−６シクロアルキル、−Ｓ−Ｃ１−６アルキル、−Ｓ−Ｃ１−６ハロアルキル、−Ｓ−Ｃ３−６シクロアルキル、ＣＮまたはＮＯ２でもある。
【００１２】
ｍは、０、１、２、３または４でもある。
【００１３】
Ａ１及びＡ２のうち一つは、Ｎであり、他の一つは、ＮＲ１でもあり、ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ３−６シクロアルキルである。
【００１４】
Ｘは、−ＮＲ２−、−Ｏ−または−Ｓ−でもあり、ここで、Ｒ２は、ＨまたはＣ１−３アルキルである。
【００１５】
Ｒｂは、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキル、Ｃ３−６シクロアルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、−（ＣＨ２）ｑ−ＯＲ３、−（ＣＨ２）ｑ−ＮＲ３Ｒ４、−（ＣＨ２）ｑ−ＳＲ３、−（ＣＨ２）ｑ−ＮＯ２、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯＮＨＯＨ、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＮ、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯＲ３、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯ２Ｒ３、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯＮＲ３Ｒ４、−（ＣＨ２）ｑ−テトラゾール、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＮ、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ２Ｒ３、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＮＲ３Ｒ４、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＨ＝ＣＨ−テトラゾール、−（ＣＨ２）ｑ−ＮＨＣＯＲ３、−（ＣＨ２）ｑ−ＮＨＣＯ２Ｒ３、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯＮＨＳＯ２Ｒ３、−（ＣＨ２）ｑ−ＮＨＳＯ２Ｒ３、−（ＣＨ２）ｑ−Ｃ≡Ｃ−ＣＮ、−（ＣＨ２）ｑ−Ｃ≡Ｃ−ＣＯ２Ｒ３、−（ＣＨ２）ｑ−Ｃ≡Ｃ−ＣＯＮＲ３Ｒ４、−（ＣＨ２）ｑ−Ｃ≡Ｃ−テトラゾール、−（ＣＨ２）ｑ−ＳＯＲ５、−（ＣＨ２）ｑ−ＳＯ２Ｒ５または−（ＣＨ２）ｒ−（ＯＲ３）２でもあり、ここで、Ｒ３及びＲ４は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ３−６シクロアルキルや、またはそれらが結合された窒素原子と共に、単環式環、例えば、イミダゾール、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、ピペラジン及びホモピペラジンを形成し、Ｒ５は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ３−６シクロアルキルであり、ｑは、０、１、２、３または４であり、ｒは、１、２、３または４である。
【００１６】
ｎは、０、１、２、３、４または５でもある。
【００１７】
前記アルキル基は、直鎖でもあったり、分枝されていたりもする。アルキル基の例は、メチル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、２級ブチル、３級ブチル、ｎ−ペンチルル及びｎ−ヘキシルである。アルキル基は、例えば、１以上のアルコキシ、シクロアルコキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、スルホまたはメルカプトでも置換される。
【００１８】
前記シクロアルキル基は、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルル及びシクロヘキシルである。
【００１９】
前記ハロは、例えば、フッ素、塩素、ホウ素またはヨードである。
【００２０】
前記アルケニル基は、直鎖でもあったり、分枝されていたりもする。アルケニル基は、例えば、ビニル、アリル、イソプレニル、２−ブテニル及び２−ヘキセニルである。アルケニル基は、例えば、アルコキシ、シクロアルコキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、スルホまたはメルカプトでも置換される。
【００２１】
前記アルキニル基は、直鎖でもあったり、分枝されていたりもする。アルキニル基は、例えば、エチニル、プロパギル及び２−ブチニルである。アルキニル基は、例えば、アルコキシ、シクロアルコキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、スルホまたはメルカプトでも置換される。
【００２２】
前記化合物は、下記化学式ＩＩの化合物でもある：
【００２３】
【化２】
2019142963.tif 000003
【００２４】
前記化学式ＩＩの化合物は、Ｎ−（（４−（［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−６−イル）−５−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）−２−フルオロアニリン（ＴＥＷ−７１９７）である。
【００２５】
前記化学式Ｉの化合物、例えば、化学式ＩＩの化合物は、ＴＧＦ−β受容体１（ＡＬＫ５）及び／またはアクチビン受容体タイプ−１Ｂ（ＡＣＶＲ１ＢまたはＡＬＫ−４：activin receptor type−１Ｂ）を選択的に抑制することができる。
【００２６】
前記薬学的に許容可能な塩は、化合物が投与される有機体に深刻な刺激を誘発せず、化合物の生物学的活性と物性とを損傷させない塩でもある。前記塩は、例えば、無機酸塩、有機酸塩または金属塩でもある。該無機酸塩は、塩酸塩、ブロム酸塩、リン酸塩、硫酸塩または二硫酸塩でもある。該有機酸塩は、メシル酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、ベシル酸塩、カムシル酸塩、エジシル酸塩、卜リクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ベンゾ酸塩、グルコン酸塩、メタンスルホン酸塩、グリコール酸塩、コハク酸塩、４−トルエンスルホン酸塩、ガラクツロン酸塩、エンボン酸塩、グルタム酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸またはアスパラギン酸塩でもある。該金属塩は、カルシウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、ストロンチウム塩またはカリウム塩でもある。
【００２７】
前記溶媒化物（solvate）は、溶質と溶媒分子との引力によって形成された化合物でもある。前記溶媒化物は、例えば、水和物（hydrate）でもある。
【００２８】
前記立体異性質体（stereoisomer）は、分子式及び構成原子の連結方法も同じであるが、原子間の空間的配置が異なることをいう。前記立体異性質体は、前記化学式Ｉの化合物の部分立体異性質体または鏡像異性質体でもある。
【００２９】
用語「チロシンキナーゼ（ＴＫ：tyrosine kinase）」は、ＡＴＰのリン酸基を、タンパク質のチロシン残基に伝達することができるタンパク質をいう。チロシンキナーゼは、細胞活性、例えば、細胞分裂を調節する信号を伝達するのに重要な役割を行う。前記チロシンキナーゼは、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼでもある。Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼは、ヒト９番染色体とヒト２２番染色体との転座（translocation）（ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１））によって、９番染色体のＡＢＬ遺伝子と、２２番染色体のＢＣＲ遺伝子とが融合されたＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子から生成されたタンパク質でもある。
【００３０】
用語「チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ：tyrosine kinase inhibitor：ＴＫＩ）」は、チロシンキナーゼを阻害する薬物をいう。前記チロシンキナーゼ阻害剤は、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤でもある。前記チロシンキナーゼ阻害剤は、例えば、イマチニブ（imatinib）、ダサチニブ（dasatinib）（商品名Sprycel）、ニロチニブ（nilotinib）（商品名Tasigna）、ボスチニブ（bosutinib）、ポナチニブ（ponatinib）、またはそれらの組み合わせでもある。イマチニブは、イマチニブメシル酸塩（商品名GleevecまたはGlivec）でもある。
【００３１】
前記ＣＭＬは、チロシンキナーゼ阻害剤抵抗性でもある。チロシンキナーゼ阻害剤抵抗性は、ＣＭＬを治療している間、抵抗性になった場合だけではなく、初期に、チロシンキナーゼ阻害剤によって治療されない場合も含む。チロシンキナーゼ阻害剤抵抗性は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ依存性またはＢｃｒ−Ａｂｌ非依存性のメカニズムによっても誘発される。Ｂｃｒ−Ａｂｌ依存性メカニズムは、Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子の増幅、Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子の突然変異、チロシンキナーゼ結合部位の突然変異、またはそれらの組み合わせを含む。Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子の突然変異は、リン酸結合ループ（ｐ−loop）突然変異（例：Ｇ２５０Ｅ、Ｑ２５２Ｈ、Ｙ２５３Ｆ、Ｙ２５３Ｈ、Ｅ２５５Ｋ及びＥ２５５Ｖ）でもある。チロシンキナーゼ結合部位の突然変異は、例えば、Ｔ３１５Ｉ、Ｔ３１５Ａ、Ｆ３１７Ｌ及びＦ３１７Ｖでもある。例えば、チロシンキナーゼ抑制剤抵抗性は、Ｎ末端から、３１５番チロシン残基がイソロイシン残基に突然変異（Ｔ３１５Ｉ）されたＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質によって引き起こされたものでもある。Ｂｃｒ−Ａｂｌ非依存性メカニズムは、Ｐ−糖蛋白質によって引き起こされた薬物の流出、有機陽イオン伝達体１（ＯＣＴ１：organic cation transporter）による薬物の流入、及び他の信号伝達経路、例えば、Ｓｒｃファミリキナーゼの活性化を含む。ＴＥＷ−７１９７は、ＣＭＬ幹細胞を抑制することができるために、いかなるメカニズムのチロシンキナーゼ阻害剤抵抗性ＣＭＬに対しても、予防効果または治療効果を有することができる。
【００３２】
前記用語「予防」は、前記薬学的組成物の投与によって、慢性骨髄性白血病を抑制したり、慢性骨髄性白血病の発病を遅らせたりする全ての行為をいう。前記用語「治療」は、前記薬学的組成物の投与によって、慢性骨髄性白血病の症状が好転したり、好ましく変更したりする全ての行為をいう。
【００３３】
前記薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。前記担体は、賦形剤、希薄剤または補助剤を含む意味で使用される。前記担体は、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、生理食塩水、ＰＢＳのようなバッファ、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルからなる群のうちから選択されたものでもある。前記組成物は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、風味剤、乳化剤、保存剤などを含んでもよい。
【００３４】
前記薬学的組成物は、通常の方法によって、任意の剤形で準備することができる。前記組成物は、例えば、経口投与剤形（例：粉末、錠剤、カプセル、シロップ、丸剤、顆粒）または非経口剤形（例：注射剤）に剤形化される。また、前記組成物は、全身剤形または局所剤形に製造される。
【００３５】
前記薬学的組成物は、単一組成物または個別的な組成物で準備することができる。
【００３６】
前記薬学的組成物は、前記化学式Ｉの化合物、その薬学的に許容可能な塩、溶媒化物、立体異性質体、またはそれらの組み合わせ、及びチロシンキナーゼ阻害剤を有効量で含む。用語「有効量」は、予防または治療を必要とする個体に投与される場合、予防または治療の効果を示すのに十分な量をいう。前記有効量は、当業者が、選択される細胞または個体によって適切に選択することができる。疾患の重症度、患者の年齢・体重・健康状態・性別、患者の薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出の比率、治療期間、使用された組成物と配合されたり同時使用されたりする薬物を含んだ要素、並びにその他医学分野に周知の要素によって決定される。前記化学式Ｉの化合物、その薬学的に許容可能な塩、溶媒化物、立体異性質体、またはそれらの組み合わせの有効量は、前記薬学的組成物当たり約０．５μｇないし約２ｇ、約１μｇないし約１ｇ、約１０μｇないし約５００ｍｇ、約１００μｇないし約１００ｍｇ、約１ｍｇないし約９０ｍｇ、約５ｍｇないし約８０ｍｇ、約１０ｍｇないし約７０ｍｇ、約１５ｍｇないし約６０ｍｇ、または約２０ｍｇないし約５０ｍｇでもある。前記チロシンキナーゼ阻害剤の有効量は、前記薬学的組成物当たり約０．５μｇないし約２ｇ、約１μｇないし約１ｇ、約１０μｇないし約５００ｍｇ、約１００μｇないし約１００ｍｇ、約１ｍｇないし約５０ｍｇ、約５ｍｇないし約４０ｍｇ、または約１０ｍｇないし約３０ｍｇでもある。
【００３７】
前記薬学的組成物の投与量は、例えば、大人基準で、約０．００１ｍｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇないし約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇないし約１ｍｇ／ｋｇの範囲内でもある。前記投与は、１日１回、１日多回、１週２回ないし３回、１月１回ないし４回、または１年１回ないし１２回投与される。
【００３８】
他の様相は、一様相による化学式Ｉの化合物、その薬学的に許容可能な塩、溶媒化物、立体異性質体、またはそれらの組み合わせ、及びチロシンキナーゼ阻害剤を個体に投与する段階を含む個体の慢性骨髄性白血病を予防または治療する方法を提供する。
【００３９】
前記化学式Ｉの化合物、薬学的に許容可能な塩、溶媒化物、立体異性質体、チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ阻害剤、慢性骨髄性白血病、並びにその予防及び治療は、前述の通りである。
【００４０】
前記個体は、哺乳動物、例えば、ヒト、牛、馬、豚、犬、羊、ヤギまたは猫でもある。前記個体は、慢性骨髄性白血病にかかったり、慢性骨髄性白血病にかかる危険があったりする個体でもある。
【００４１】
前記化合物、その薬学的に許容可能な塩、溶媒化物、立体異性質体、またはそれらの組み合わせ、及びチロシンキナーゼ阻害剤は、例えば、経口（oral）、静脈内、筋肉内、経口（buccal）、経皮（transdermal）、粘膜、鼻内（intranasal）、器官内（intratracheal）または皮下投与のような任意の手段によって、個体に直接的に投与される。前記化合物、その薬学的に許容可能な塩、溶媒化物、立体異性質体、またはそれらの組み合わせ、及びチロシンキナーゼ阻害剤は、全身的にまたは局所的に投与され、単独、または他の薬学的活性化合物と共に投与される。
【００４２】
前記化合物、その薬学的に許容可能な塩、溶媒化物、立体異性質体、またはそれらの組み合わせ、及びチロシンキナーゼ阻害剤は、同時、個別、または順次的に投与される。例えば、ダサチニブルを個体に投与した後、前記化学式Ｉの化合物、その薬学的に許容可能な塩、溶媒化物、立体異性質体、またはそれらの組み合わせを前記個体に投与することができる。
【００４３】
前記化合物、その薬学的に許容可能な塩、溶媒化物、立体異性質体、またはそれらの組み合わせ、及びチロシンキナーゼ阻害剤の望ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適切に選択される。前記投与量は、例えば、大人基準で、約０．００１ｍｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇないし約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇないし約１ｍｇ／ｋｇの範囲内でもある。前記投与は、１日１回、１日多回、１週２回ないし３回、１月１回ないし４回、または１年１回ないし１２回投与される。
【００４４】
ここで、実施例を詳細に参照し、該実施例を添付図面に例示し、全体を通じて同様の参照番号は、同様の要素を示す。それについて、本実施形態は、異なる形態を有してもよく、本明細書に記載された説明に限定されると解釈されるものではない。従って、例示的な実施形態は、本明細書の態様を説明するために、図面を参照し、以下で説明されるのみである。本明細書で使用される場合、「および/または」という用語は、関連する列挙された項目の一つまたは複数の任意の全ての組み合わせを含む。
【００４５】
以下、実施例を通じて、さらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
【００４６】
実施例１．チロシンキナーゼ阻害剤とＴＥＷ−７１９７との組み合わせによるＣＭＬ治療効果の確認
１．マウスモデル及びＣＭＬ幹細胞の準備
Ｓｃｌ／Ｔａｌ１−ｔＴＡ形質転換（ｔｇ：transgenic）マウス（ＪＡＸ（登録商標）mice、Stock Ｎｏ．００６２０９、Jackson Laboratory）と、ＴＲＥ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１形質転換マウス（ＪＡＸ（登録商標）mice、Stock Ｎｏ．００６２０２、Jackson Laboratory）とを交配させ、Ｓｃｌ／Ｔａｌ１−ｔＴＡ ｘ ＴＲＥ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１二重ｔｇマウスを準備した。該マウスを、２０ｍｇ／Ｌのドキシサイクリン（Sigma−Aldrich）を含む水を供給しながら維持した。生後５週後、ドキシサイクリンを含んだ飲み水を、ドキシサイクリンを含まない一般水に替え（ドキシサイクリン中断）、ＢＣＲ−ＡＢＬ１癌遺伝子（oncogene）の発現を誘導した。ドキシサイクリン中断日から約２週後ないし５週後、前記形質転換マウスにおいて、ＣＭＬ類似疾病が発病した。該マウスは、ＳＣＬ−ｔＴＡ／ＢＣＲ−ＡＢＬ−ｔｅｔＯ二重陽性マウスであり、テトラサイクリン（tet：tetracyclin：ｔｅｔ）誘導性「ｔｇ−ＣＭＬ発病（affected）マウス」と命名した。
【００４７】
前記ｔｅｔ−誘導性ｔｇ−ＣＭＬ発病マウスから、原始（primitive）長期間（ＬＴ：long term）−ＣＭＬ幹細胞（ＣＤ１５０＋ＣＤ１３５−ＣＤ４８−ｃ−Ｋｉｔ＋Lineage−Ｓｃａ−１＋細胞）を分離した。
【００４８】
一方、ヒトＢＣＲ−ＡＢＬ１−ＧＦＰ遺伝子を導入したマウス造血幹細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６（Sankyo−Ｌａｂ Service、日本）マウスに移植し、形質導入／移植（ＴＴ：transduction／transplantation）−ＣＭＬ発病マウスモデルを準備した（Naka et. Al., Nature 2010; 463: 676-680）。ＴＴ−ＣＭＬ発病マウスにおいて、ＧＦＰ／ＢＣＲ−ＡＢＬ１−陽性及びＧＦＰ／ＢＣＲ−ＡＢＬ１Ｔ３１５Ｉ−陽性ｃ−Ｋｉｔ＋Lineage−Ｓｃａ−１＋（ＫＬＳ＋）細胞を含むＣＭＬ−ＭＰＰ（multipotent progenitor）分画を分離した（Naka et. al., Nature 2010; 463: 676-680）。また、前記記載された方法で、ヒトＢＣＲ−ＡＢＬ１Ｔ３１５Ｉ突然変異−ＧＦＰ遺伝子を導入したマウス造血幹細胞をマウスに移植し、ＴＫＩ抵抗性Ｔ３１５Ｉ ＴＴ−ＣＭＬ発病マウスを準備した（Naka et. al., Nature 2010; 463: 676-680）。
【００４９】
２．薬物の準備
担体として、７ｍｌの３７％（ｖ／ｖ）胃酸、２．０ｇのＮａＣｌ、３．２ｇのペプシン（Sigma−Aldrich）、及び蒸溜水を混合し、１，０００ｍｌの人工胃液を準備した。
【００５０】
投与薬物として、Ｎ−（（４−（［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−６−イル）−５−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）−２−フルオロアニリン（以下、「ＴＥＷ−７１９７」とする）（Syngene、インド）を担体に溶解させ、２ｍｇ／ｍｌのＴＥＷ−７１９７溶液を準備した。ＴＥＷ−７１９７に対する比較群として、Ｌｙ２１５７２９９（Selleck Chemicals）を担体に溶解させ、Ｌｙ２１５７２９９溶液を準備した。
【００５１】
また、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ：tyrosine kinase inhibitor）として、イマチニブメシレート（Gleevec（登録商標）、Novartis）、ニロチニブ（Tasigna（登録商標）、Novartis）、ダサチニブ（Sprycel（登録商標）、Bristo−Myers Squibb）及びポナチニブ（Selleck Chemicals、ＡＰ２４５３４）をそれぞれ担体に溶解させて薬物を準備した。
【００５２】
３．試験管内での（in vitro）、チロシンキナーゼ阻害剤とＴＥＷ−７１９７との組み合わせによるＣＭＬ治療効果の確認
約１００，０００個のマウス間葉幹細胞であるＯＰ−９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２７４９）を、２４ウェルプレートで１日単層培養した。培養されたＯＰ−９細胞に、１．で準備した１００，０００個のＬＴ−ＣＭＬ幹細胞を加え、細胞培養液を準備した。
【００５３】
細胞培養液に、５μＭのＴＥＷ−７１９７を加え、前記細胞を３％酸素及び３７℃の条件下で１日培養した。翌日、培養された細胞に、１μＭのイマチニブメシレート、１μＭのニロチニブ、１μＭのダサチニブまたは１μＭのポナチニブをそれぞれ添加し、３％酸素及び３７℃の条件下で２日間培養した。ＬＴ−ＣＭＬ幹細胞がＯＰ−９細胞と共培養された期間は総３日である。対照群として、薬物の代わりに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を使用した。その後、細胞培養液をリン酸緩衝液を使用して洗浄し、細胞を得た。得られた細胞をメチルセルロース（Stem cell technologies、ＧＦＭ３４３４）で、３％酸素及び３７℃の条件下で１週間培養し、培養された細胞から、ＣＭＬ幹細胞のコロニー形成能を測定した。
【００５４】
イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブまたはポナチニブの単独、またはＴＥＷ−７１９７とそれらとの組み合わせの存在下で培養されたＬＴ−ＣＭＬ幹細胞のコロニー形成能を図１に示した。図１から分かるように、ＴＥＷ−７１９７、イマチニブ、ニロチニブまたはダサチニブ単独に比べ、ＴＥＷ−７１９７と、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブまたはポナチニブとの組み合わせにおいて、コロニー形成能が有意に低下した。特に、ＴＥＷ−７１９７とダサチニブとの組み合わせ、及びＴＥＷ−７１９７とポナチニブとの組み合わせにおいて、コロニー形成能が有意に抑制された。従って、ＴＥＷ−７１９７とチロシンキナーゼ阻害剤との組み合わせは、ＣＭＬ幹細胞に対する抑制効果があるということを確認した。
【００５５】
４．インビボ（in vivo）での、チロシンキナーゼ阻害剤とＴＥＷ−７１９７との組み合わせによるマウス生存率の確認
（１）ＴＴ−ＣＭＬ発病マウスにおける、イマチニブとＴＥＷ−７１９７との組み合わせによる効果
１．に記載されてるように準備されたＴＴ−ＣＭＬ発病マウスに細胞を移植した後、８日目から、担体またはイマチニブ（２００ｍｇ／ｋｇ／日）を経口投与した。移植後の１５日目から９０日目まで、追加して、担体、担体及びＴＥＷ−７１９７（２．５ｍｇ／ｋｇ、３日に１回）、担体及びイマチニブ（２００ｍｇ／ｋｇ／日）、イマチニブ（２００ｍｇ／ｋｇ／日）及びＬｙ２１５７２９９（１５０ｍｇ／ｋｇ、３日に１回）、またはイマチニブ（２００ｍｇ／ｋｇ／日）及びＴＥＷ−７１９７（２．５ｍｇ／ｋｇ、３日に１回）を投与した。
【００５６】
薬物を投与したマウスの生存を、移植後１２５日までモニタリングした。その結果から、経時的なＴＴ−ＣＭＬ発病マウスの生存率（％）を算出し、その結果を図２Ａに示した（- - - -：担体（ｎ＝２３）、─ - - ─：担体及びＴＥＷ−７１９７（ｎ＝２４）、太線：担体及びイマチニブ（ＩＭ）（ｎ＝２４）、─ - ─：イマチニブ及びＬｙ２１５７２９９（ｎ＝２４）、実線：イマチニブ及びＴＥＷ−７１９７（ｎ＝２４））。
【００５７】
図２Ａから分かるように、イマチニブとＴＥＷ−７１９７との組み合わせが、イマチニブ単独、ＴＥＷ−７１９７単独、及びイマチニブとＬｙ２１５７２９９との組み合わせより、ＴＴ−ＣＭＬ発病マウスの生存率を上昇させた。従って、生体内において、ＴＥＷ−７１９７とイマチニブとの組み合わせは、ＣＭＬの予防効果または治療効果があるということを確認した。
【００５８】
（２）ｔｇ−ＣＭＬ発病マウスにおける、ダサチニブとＴＥＷ−７１９７との組み合わせによる効果
マウス生体内で、ＴＥＷ−７１９７とダサチニブとの組み合わせによるｔｇ−ＣＭＬ発病マウスにおける治療効果を確認するために、１．に記載されてるように、ｔｇ−ＣＭＬ発病マウスを準備した。
【００５９】
ｔｇ−ＣＭＬ発病マウスが摂取する水を、ドキシサイクリンを含まない一般水に替えた。ｔｇ−ＣＭＬ発病マウスに、ダサチニブを５ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、ドキシサイクリン中断後、１日ないし３６日間、１日１回経口投与した。さらには、ドキシサイクリン中断後、８日ないし３６日の期間内、２日に１回ずつ、ダサチニブ単独、またはダサチニブ及びＴＥＷ−７１９７（２．５ｍｇ／ｋｇ／日）を経口で投与した。対照群として、薬物を含まない担体を使用した。
【００６０】
ドキシサイクリン中断後、経時的なｔｇ−ＣＭＬ発病マウスの生存率（％）を算出し、その結果を図２Ｂに示した（点線：担体（ｎ＝２０）、太線：ダサチニブ単独（ｎ＝１２）、実線：ダサチニブ及びＴＥＷ−７１９７（ｎ＝１１））。
【００６１】
図２Ｂから分かるように、ダサチニブ及びＴＥＷ−７１９７の組み合わせが、対照群及びダサチニブ単独に比べ、ｔｇ−ＣＭＬ発病マウスの生存率を上昇させた。従って、生体内において、ＴＥＷ−７１９７とダサチニブとの組み合わせは、ＣＭＬの予防効果または治療効果があるということを確認した。
【００６２】
（３）ＴＫＩ抵抗性Ｔ３１５Ｉ ＴＴ−ＣＭＬ発病マウスにおける、ポナチニブとＴＥＷ−７１９７との組み合わせによる効果
１．に記載されているように準備されたＴＫＩ抵抗性Ｔ３１５Ｉ ＴＴ−ＣＭＬ発病マウスに細胞を移植した後、８日目から、担体またはポナチニブ（１５ｍｇ／ｋｇ／日）を経口投与した。移植後の１５日目から６０日目まで、追加して担体、担体及びＴＥＷ−７１９７（２．５ｍｇ／ｋｇ、３日に１回）、担体及びポナチニブ（１５ｍｇ／ｋｇ／日）、またはポナチニブ（１５ｍｇ／ｋｇ／日）及びＴＥＷ−７１９７（２．５ｍｇ／ｋｇ、３日に１回）を投与した。
【００６３】
薬物を投与したマウスの生存を、移植後１００日までモニタリングした。その結果から、経時的なＴＫＩ抵抗性Ｔ３１５Ｉ ＴＴ−ＣＭＬ発病マウスの生存率（％）を算出し、その結果を図２Ｃに示した（−−−−：担体（ｎ＝３４）、実線：担体及びＴＥＷ−７１９７（ｎ＝３７）、太線：担体及びポナチニブ（ｎ＝３２）、― - ─：ポナチニブ及びＴＥＷ−７１９７（ｎ＝３２））。
【００６４】
図２Ｃから分かるように、ポナチニブとＴＥＷ−７１９７との組み合わせが、ポナチニブ単独またはＴＥＷ−７１９７単独より、ＴＫＩ抵抗性Ｔ３１５Ｉ ＴＴ−ＣＭＬ発病マウスの生存率を上昇させた。従って、生体内において、ＴＥＷ−７１９７とポナチニブとの組み合わせは、チロシンキナーゼ抵抗性があるＣＭＬの予防効果または治療効果があるということを確認した。
【００６５】
５．インビボにおける、チロシンキナーゼ阻害剤とＴＥＷ−７１９７との組み合わせによる効果
（１）ＴＴ−ＣＭＬ発病マウスにおける、ダサチニブとＴＥＷ−７１９７との組み合わせによるＣＭＬ治療効果
１．に記載されてるように準備されたＴＴ−ＣＭＬ発病マウスに、ダサチニブ（５ｍｇ／ｋｇ／日）、ＴＥＷ−７１９７（２．５ｍｇ／ｋｇ／日、３日に１回）、またはダサチニブ（５ｍｇ／ｋｇ／日）及びＴＥＷ−７１９７（２．５ｍｇ／ｋｇ／日、３日に１回）を３０日間経口投与した。
【００６６】
薬物を投与したＴＴ−ＣＭＬ発病マウスの末梢血液内の白血球数を図３Ａに示し（ｎ＝５、ＮＳ：非有意）、脾臓の写真を図３Ｂに示し（バー１０ｍｍ）、及び脾臓の重量を図３Ｃに示した（ｎ＝３）。また、ＴＥＷ−７１９７を投与したＴＴ−ＣＭＬ発病マウスの末梢血液内の総ＢＣＲ−ＡＢＬ１−ＧＦＰ＋細胞中のＴ細胞（抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体を使用して検出する）、Ｂ細胞（抗Ｂ２２０抗体を使用して検出する）、及び骨髄細胞（抗Ｍａｃ１抗体及び抗Ｇｒ−１抗体を使用して検出する）の比率（％）を図３Ｄに示した（ｎ＝３、ＮＳ：非有意）。
【００６７】
図３Ａないし図３Ｃから分かるように、ＴＥＷ−７１９７を投与したＴＴ−ＣＭＬ発病マウスは、担体を投与した対照群に比べ、末梢血液内の白血球数が増加し、脾臓肥大症を促進した。しかし、ダサチニブとＴＥＷ−７１９７とを投与したＴＴ−ＣＭＬ発病マウスは、末梢血液内の白血球数の増加と脾臓肥大症とを抑制した。図３Ｄから分かるように、ＴＥＷ−７１９７の投与は、ＢＣＲ−ＡＢＬ１−ＧＦＰ＋細胞中の骨髄細胞分化に影響がなかった。従って、生体内において、ダサチニブは、ＴＥＷ−７１９７によって誘導された分化されたＣＭＬ細胞の増殖を抑制することができるということを確認した。
【００６８】
また、ＴＴ−ＣＭＬ発病マウスに、ダサチニブ（５ｍｇ／ｋｇ／日）、ＴＥＷ−７１９７（２．５ｍｇ／ｋｇ／日、３日に１回）、またはダサチニブ（５ｍｇ／ｋｇ／日）及びＴＥＷ−７１９７（２．５ｍｇ／ｋｇ／日、３日に１回）を、細胞移植後、３０日間経口投与した。末梢血液から、ＧＦＰ／ＢＣＲ−ＡＢＬ＋ｃ−Ｋｉｔ＋Lineage−Ｓｃａ−１＋（ＫＬＳ＋）細胞（太線四角形）、及びｃ−Ｋｉｔ＋Lineage−Ｓｃａ−１−（ＫＬＳ−）細胞（点線四角形）を流細胞分析し、その結果を図４Ａに示した。細胞を、ＧＦＰ＋及びLineage−で選別（gated on）し、ＴＴ−ＣＭＬ発病マウスの総ＧＦＰ／ＢＣＲ−ＡＢＬ＋細胞内での、ＧＦＰ／ＢＣＲ−ＡＢＬ＋ＫＬＳ−細胞とＫＬＳ＋細胞との比率（％）を、それぞれ図４Ｂ及び図４Ｃに示した（ｎ＝３、ＮＳ：非有意）。
【００６９】
図４Ａないし図４Ｃから分かるように、ＴＥＷ−７１９７を投与したＴＴ−ＣＭＬ発病マウスにおいて、ＢＣＲ−ＡＢＬ１−ＧＦＰ＋ ＣＭＬ細胞において、ＫＬＳ−細胞とＫＬＳ＋細胞との比率が著しく低下した。ダサチニブ単独は、ＣＭＬ ＫＬＳ−細胞の比率を低下させたが、ダサチニブとＴＥＷ−７１９７との投与は、ＣＭＬ ＫＬＳ−細胞の比率をさらに低下させた。それは、ＴＥＷ−７１９７は、原始ＣＭＬ−ＭＰＰの自己再生（self-renewal）能力を抑制することができるが、分化されたＣＭＬ細胞の増殖を抑制することができないということを示す。従って、ダサチニブとＴＥＷ−７１９７との組み合わせ投与は、ＴＫＩ非敏感性ＣＭＬ−ＭＰＰを除去し、ＣＭＬ患者に治療的効果を提供することができる。
【００７０】
（２）ＴＫＩ抵抗性Ｔ３１５Ｉ ＴＴ−ＣＭＬ発病マウスにおける、ポナチニブとＴＥＷ−７１９７との組み合わせによるＴＫＩ抵抗性ＣＭＬ治療効果
１．に記載されているように準備されたＴＫＩ抵抗性Ｔ３１５Ｉ ＴＴ−ＣＭＬ発病マウスに、ポナチニブ（１５ｍｇ／ｋｇ／日）、ＴＥＷ−７１９７（２．５ｍｇ／ｋｇ／日、３日に１回）、またはポナチニブ（１５ｍｇ／ｋｇ／日）及びＴＥＷ−７１９７（２．５ｍｇ／ｋｇ／日、３日に１回）を３０日間経口投与した。末梢血液から、Ｔ３１５Ｉ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＧＦＰ＋ ＫＬＳ＋細胞（太線四角形）、及びＫＬＳ−細胞（点線四角形）を流細胞分析し、その結果を図５Ａに示した。細胞をＧＦＰ＋及びLineage−で選別（gated on）し、ＴＫＩ抵抗性Ｔ３１５Ｉ ＴＴ−ＣＭＬ発病マウスの総Ｔ３１５Ｉ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＧＦＰ＋細胞における、Ｔ３１５Ｉ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＧＦＰ＋ ＫＬＳ−細胞とＫＬＳ＋細胞との比率（％）をそれぞれ図５Ｂ及び図５Ｃに示した（ｎ＝３、ＮＳ：非有意）。
【００７１】
図５Ａないし図５Ｃから分かるように、ＴＥＷ−７１９７を投与したＴＫＩ抵抗性Ｔ３１５Ｉ ＴＴ−ＣＭＬ発病マウスにおいて、Ｔ３１５Ｉ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＧＦＰ＋ＫＬＳ＋細胞の比率が著しく低下した。また、ポナチニブとＴＥＷ−７１９７との投与は、Ｔ３１５Ｉ ＢＣＲ−ＡＢＬ−ＧＦＰ＋ＫＬＳ＋細胞の比率をはるかに低下させた。従って、ＴＥＷ−７１９７だけではなく、ポナチニブとＴＥＷ−７１９７は、Ｔ３１５Ｉ−ＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞の自己再生（self-renewal）を効果的に遮断することができ、それにより、ＣＭＬ患者に治療的効果を提供することができる。
【００７２】
６．試験管内における、ダサチニブとＴＥＷ−７１９７との組み合わせによるヒトＣＭＬ開始細胞のコロニー形成能抑制効果
慢性期ＣＭＬにかかった３人の患者の骨髄単核細胞（Allcells、Ｃａｔ．Ｎｏ．０６−２５５、０６−６２０及び１４７７４２、ＣＡ）を準備した。
【００７３】
骨髄単核細胞を、抗ＣＤ３４（８Ｇ１２）抗体（ＢＤ Biosciences）、抗ＣＤ３８（ＨＩＴ２）抗体（ＢＤ Biosciences）、抗ＣＤ３（ＳＫ７）抗体（ＢＤ Biosciences）、抗ＣＤ１６（３Ｇ８）抗体（ＢＤ Biosciences）、抗ＣＤ１９（ＳＪ２５Ｃ１）抗体（ＢＤ Biosciences）、抗ＣＤ２０（Ｌ２７）抗体（ＢＤ Biosciences）、抗ＣＤ１４（ＭｆＰ９）抗体（ＢＤ Biosciences）及び抗ＣＤ５６（ＮＣＡＭ１６．２）抗体（ＢＤ Biosciences）を使用して染色した。ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１４及びＣＤ５６を認識するマウス抗体混合物を、Lineage−（Ｌｉｎ−）細胞確認に利用し、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−Ｌｉｎ−細胞を分離した。ＴＥＷ−７１９７単独、ダサチニブ単独、またはＴＥＷ−７１９７及びダサチニブの存在下で、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−Ｌｉｎ−細胞を、３％酸素及び３７℃の条件下で、ＯＰ−９基質細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２７４９）と共培養した。対照群として、ＤＭＳＯを使用したことを除いては、同一に行った。細胞を収穫してＰＢＳで洗浄した後、メチルセルロース（Stem cell technologies、ＧＦＭ３４３４）で培養し、ヒトＣＭＬ開始細胞のコロニー形成能を測定した。測定された３人の患者における、ヒトＣＭＬ開始細胞のコロニー形成能を図６Ａないし図６Ｃに示した。
【００７４】
図６Ａないし図６Ｃから分かるように、ＴＥＷ−７１９７は、試験管内において、ヒトＣＭＬ開始細胞のコロニー形成能を有意に抑制した。また、ＴＥＷ−７１９７及びダサチニブの組み合わせは、ダサチニブ単独に比べ、ヒトＣＭＬ開始細胞のコロニー形成能を有意に抑制した。従って、ＴＫＩとＴＥＷ−７１９７との組み合わせは、ヒトＣＭＬ患者において、原始ＣＭＬ開始細胞を除去することができるということを確認した。
【００７５】
本明細書に記載された例示的な実施形態は、説明的な意味でのみ考慮され、限定の目的で考慮されるものではないということが理解されねばならない。各例示的な実施形態における特徴、または態様の説明は、典型的には、他の例示的な実施形態における、他の同様の特徴または態様に利用可能であるとみなされる。
【００７６】
1以上の例示的な実施形態について、図面を参照して説明したが、本発明の概念の精神および範囲から外れることなしに、形態および詳細におけるさなざまな変更は、特許請求の範囲によって定義されるようになされるということは、当業者に理解されるであろう。
【図１】
2019142963.tif 000007
【図２Ａ】
2019142963.tif 000008
【図２Ｂ】
2019142963.tif 000009
【図２Ｃ】
2019142963.tif 000010
【図３Ａ】
2019142963.tif 000011
【図３Ｂ】
2019142963.tif 000012
【図３Ｃ】
2019142963.tif 000013
【図３Ｄ】
2019142963.tif 000014
【図４Ａ】
2019142963.tif 000015
【図４Ｂ】
2019142963.tif 000016
【図４Ｃ】
2019142963.tif 000017
【図５Ａ】
2019142963.tif 000018
【図５Ｂ】
2019142963.tif 000019
【図５Ｃ】
2019142963.tif 000020
【図６Ａ】
2019142963.tif 000021
【図６Ｂ】
2019142963.tif 000022
【図６Ｃ】
2019142963.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月10日(2019.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式Ｉの化合物、その薬学的に許容可能な塩、溶媒化物、立体異性質体、またはそれらの組み合わせ：
【化１】
2019142963.tif 000024
前記化学式Ｉで、Ｒａは、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキル、Ｃ３−６シクロアルキル、ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−Ｏ−Ｃ１−６ハロアルキル、−Ｏ−Ｃ３−６シクロアルキル、ＮＨ２、−ＮＨ−Ｃ１−６アルキル、−ＮＨ−Ｃ１−６ハロアルキル、−ＮＨ−Ｃ３−６シクロアルキル、−Ｓ−Ｃ１−６アルキル、−Ｓ−Ｃ１−６ハロアルキル、−Ｓ−Ｃ３−６シクロアルキル、ＣＮまたはＮＯ２であり、
ｍは、０、１、２、３または４であり、
Ａ１及びＡ２のうち一つは、Ｎであり、他の一つは、ＮＲ１であり、ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ３−６シクロアルキルであり、
Ｘは、−ＮＲ２−、−Ｏ−または−Ｓ−であり、ここで、Ｒ２は、ＨまたはＣ１−３アルキルであり、
それぞれのＲｂは、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキル、Ｃ３−６シクロアルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、−（ＣＨ２）ｑ−ＯＲ３、−（ＣＨ２）ｑ−ＮＲ３Ｒ４、−（ＣＨ２）ｑ−ＳＲ３、−（ＣＨ２）ｑ−ＮＯ２、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯＮＨＯＨ、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＮ、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯＲ３、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯ２Ｒ３、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯＮＲ３Ｒ４、−（ＣＨ２）ｑ−テトラゾール、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＮ、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ２Ｒ３、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＮＲ３Ｒ４、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＨ＝ＣＨ−テトラゾール、−（ＣＨ２）ｑ−ＮＨＣＯＲ３、−（ＣＨ２）ｑ−ＮＨＣＯ２Ｒ３、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯＮＨＳＯ２Ｒ３、−（ＣＨ２）ｑ−ＮＨＳＯ２Ｒ３、−（ＣＨ２）ｑ−Ｃ≡Ｃ−ＣＮ、−（ＣＨ２）ｑ−Ｃ≡Ｃ−ＣＯ２Ｒ３、−（ＣＨ２）ｑ−Ｃ≡Ｃ−ＣＯＮＲ３Ｒ４、−（ＣＨ２）ｑ−Ｃ≡Ｃ−テトラゾール、−（ＣＨ２）ｑ−ＳＯＲ５、−（ＣＨ２）ｑ−ＳＯ２Ｒ５または−（ＣＨ２）ｒ−（ＯＲ３）２であり、ここで、Ｒ３及びＲ４は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ３−６シクロアルキルであるか、またはそれらが結合された窒素原子と共に、単環式環、例えば、イミダゾール、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、ピペラジン及びホモピペラジンを形成し、Ｒ５は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルまたはＣ３−６シクロアルキルであり、ｑは、０、１、２、３または４であり、ｒは、１、２、３または４であり、
ｎは、０、１、２、３、４または５である化合物と、
チロシンキナーゼ阻害剤と、を含む慢性骨髄性白血病の予防用または治療用の薬学的組成物。
【外国語明細書】
2019142963000001.pdf