(57)【要約】【課題】近位尿細管の性質を正確に反映した近位尿細管上皮細胞株を提供する。【解決手段】Ｇａｍｍａ−Ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  １（Ｇｇｔ１）、Ｔｉｇｈｔ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＺＯ−１（ＺＯ−１）、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、β−Ｃａｔｅｎｉｎ及びＭｅｇａｌｉｎを発現しており、アルブミン取り込み能を有しており、培地へのアルブミン又はＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β（ＴＧＦ−β）の添加により上皮間葉移行を誘導することができ、細胞外マトリックス中で３次元培養することによりスフェロイドを形成することができる、近位尿細管上皮細胞株。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇａｍｍａ−Ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  １（Ｇｇｔ１）、Ｔｉｇｈｔ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＺＯ−１（ＺＯ−１）、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、β−Ｃａｔｅｎｉｎ及びＭｅｇａｌｉｎを発現しており、
アルブミン取り込み能を有しており、
培地へのアルブミン又はＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β（ＴＧＦ−β）の添加により上皮間葉移行を誘導することができ、
細胞外マトリックス中で３次元培養することによりスフェロイドを形成することができる、近位尿細管上皮細胞株。
【請求項２】
不死化しやすい遺伝的背景を有している、請求項１に記載の近位尿細管上皮細胞株。
【請求項３】
前記遺伝的背景がｐ５３遺伝子のノックアウトである、請求項２に記載の近位尿細管上皮細胞株。
【請求項４】
受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６７４である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の近位尿細管上皮細胞株。
【請求項５】
腎線維症の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下且つアルブミン又はＴＧＦ−βの存在下で、請求項１〜４のいずれか一項に記載の近位尿細管上皮細胞株を培養する工程と、
前記近位尿細管上皮細胞株における、Ｇｇｔ１又はＭｅｇａｌｉｎの発現量を測定する工程と、を含み、
被験物質の存在下且つアルブミン又はＴＧＦ−βの存在下における、Ｇｇｔ１又はＭｅｇａｌｉｎの発現量の低下量が、前記被験物質の非存在下且つアルブミン又はＴＧＦ−βの存在下における発現量の低下量と比較して減少することが、前記被験物質が腎線維症の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
【請求項６】
腎線維症の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、
被験物質及びアルブミンの存在下で、請求項１〜４のいずれか一項に記載の近位尿細管上皮細胞株を培養する工程と、
前記近位尿細管上皮細胞株による前記アルブミンの取り込みを測定する工程と、を含み、
被験物質の存在下における前記アルブミンの取り込み量が、前記被験物質の非存在下における取り込み量と比較して低下することが、前記被験物質が腎線維症の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
【請求項７】
近位尿細管の管腔構造の形成に関与する因子のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下、細胞外マトリックス中で、請求項１〜４のいずれか一項に記載の近位尿細管上皮細胞株を３次元培養する工程と、
前記近位尿細管上皮細胞株のスフェロイド形成率を測定する工程と、を含み、
被験物質の存在下におけるスフェロイド形成率が、前記被験物質の非存在下におけるスフェロイド形成率と比較して有意に変化することが、前記被験物質が近位尿細管の管腔構造の形成に関与する因子であることを示す、スクリーニング方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の近位尿細管上皮細胞株を備える、腎線維症の予防若しくは治療剤又は近位尿細管の管腔構造の形成に関与する因子のスクリーニングキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、近位尿細管上皮細胞株及びその使用に関する。より詳細には、本発明は、近位尿細管上皮細胞株、腎線維症の予防又は治療剤のスクリーニング方法、近位尿細管の管腔構造の形成に関与する因子のスクリーニング方法及びスクリーニングキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓の近位尿細管は、尿中に濾過された有用物質の再吸収、代謝物の排出を担う主要な部位である。また、近位尿細管は、薬物代謝及び薬物排泄において重要な役割を果たしており、虚血性や薬物毒性に起因する急性腎症の標的部位である。また、腎線維化は慢性腎症における近位尿細管障害に次いで起こる反応であり、近位尿細管を修復することが慢性腎症の進展を抑制するうえで重要である。したがって、近位尿細管に関する知見は、例えば腎線維症の発症機構の解明や、治療技術の開発に重要である。
【０００３】
従来、尿細管細胞株が複数知られている。例えば、非特許文献１には、イヌ腎臓由来の遠位尿細管上皮細胞株であるＭＤＣＫ細胞が記載されている。また、非特許文献２にはマウス近位尿細管上皮細胞株であるＴＫＰＴＳ細胞が記載されており、非特許文献３にはヒト近位尿細管上皮細胞株であるＨＫ−２細胞が記載されており、非特許文献４にはヒト近位尿細管上皮細胞株であるＲＰＴＥＣ細胞が記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Gaush CR., et al., Characterization of an established line of canine kidney cells (MDCK)., Proc Soc Exp Biol Med., 122, 931-935, 1966.
【非特許文献２】Ernest S., et al., Expression and function of P-glycoprotein in a mouse kidney cell line., Am J Physiol., 269, C323-333, 1995.
【非特許文献３】Ryan M. J., et al., HK-2: an immortalized proximal tubule epithelial cell line from normal adult human kidney., Kidney Int., 45 (1), 48-57, 1994.
【非特許文献４】Simon-Friedt B. R., The RPTEC/TERT1 cell line as an improved tool for in vitro nephrotoxicity assessments, Biol Trace Elem Res., 166 (1), 66-71, 2015.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、非特許文献１に記載されている細胞株は遠位尿細管上皮細胞株であり、近位尿細管上皮細胞株ではない。また、非特許文献２〜４に記載されている細胞株は、近位尿細管の性質を正確に反映したものであるとはいえない。そこで、本発明は、近位尿細管の性質を正確に反映した近位尿細管上皮細胞株を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］Ｇａｍｍａ−Ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  １（Ｇｇｔ１）、Ｔｉｇｈｔ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＺＯ−１（ＺＯ−１）、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、β−Ｃａｔｅｎｉｎ及びＭｅｇａｌｉｎを発現しており、アルブミン取り込み能を有しており、培地へのアルブミン又はＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β（ＴＧＦ−β）の添加により上皮間葉移行を誘導することができ、細胞外マトリックス中で３次元培養することによりスフェロイドを形成することができる、近位尿細管上皮細胞株。
［２］不死化しやすい遺伝的背景を有している、［１］に記載の近位尿細管上皮細胞株。
［３］前記遺伝的背景がｐ５３遺伝子のノックアウトである、［２］に記載の近位尿細管上皮細胞株。
［４］受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６７４である、［１］〜［３］のいずれかに記載の近位尿細管上皮細胞株。
［５］腎線維症の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下且つアルブミン又はＴＧＦ−βの存在下で、［１］〜［４］のいずれかに記載の近位尿細管上皮細胞株を培養する工程と、前記近位尿細管上皮細胞株における、Ｇｇｔ１又はＭｅｇａｌｉｎの発現量を測定する工程と、を含み、被験物質の存在下且つアルブミン又はＴＧＦ−βの存在下における、Ｇｇｔ１又はＭｅｇａｌｉｎの発現量の低下量が、前記被験物質の非存在下且つアルブミン又はＴＧＦ−βの存在下における発現量の低下量と比較して減少することが、前記被験物質が腎線維症の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
［６］腎線維症の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質及びアルブミンの存在下で、［１］〜［４］のいずれかに記載の近位尿細管上皮細胞株を培養する工程と、前記近位尿細管上皮細胞株による前記アルブミンの取り込みを測定する工程と、を含み、被験物質の存在下における前記アルブミンの取り込み量が、前記被験物質の非存在下における取り込み量と比較して低下することが、前記被験物質が腎線維症の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
［７］近位尿細管の管腔構造の形成に関与する因子のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下、細胞外マトリックス中で、［１］〜［４］のいずれかに記載の近位尿細管上皮細胞株を３次元培養する工程と、前記近位尿細管上皮細胞株のスフェロイド形成率を測定する工程と、を含み、被験物質の存在下におけるスフェロイド形成率が、前記被験物質の非存在下におけるスフェロイド形成率と比較して有意に変化することが、前記被験物質が近位尿細管の管腔構造の形成に関与する因子であることを示す、スクリーニング方法。
［８］［１］〜［４］のいずれかに記載の近位尿細管上皮細胞株を備える、腎線維症の予防若しくは治療剤又は近位尿細管の管腔構造の形成に関与する因子のスクリーニングキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、近位尿細管の性質を正確に反映した近位尿細管上皮細胞株を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】（ａ）〜（ｄ）は、実験例１の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図２】（ａ）及び（ｂ）は、実験例２の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図３】（ａ）は、実験例３において培養した近位尿細管上皮細胞株（ＭｕＲＴＥ細胞株）の顕微鏡写真である。（ｂ）は、実験例３におけるＲＴ−ＰＣＲの結果を示すアガロースゲル電気泳動の写真である。
【図４】（ａ）〜（ｃ）は、実験例４の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図５】実験例５の結果を示す顕微鏡写真である。
【図６】実験例５の結果を示す透過型電子顕微鏡写真である。
【図７】実験例６におけるＲＴ−ＰＣＲの結果を示すアガロースゲル電気泳動の写真である。
【図８】実験例７におけるＲＴ−ＰＣＲの結果を示すアガロースゲル電気泳動の写真である。
【図９】（ａ）〜（ｃ）は、実験例７におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［近位尿細管上皮細胞株］
１実施形態において、本発明は、Ｇｇｔ１、ＺＯ−１、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、β−Ｃａｔｅｎｉｎ及びＭｅｇａｌｉｎを発現しており、アルブミン取り込み能を有しており、培地へのアルブミン又はＴＧＦ−βの添加により上皮間葉移行を誘導することができ、細胞外マトリックス中で３次元培養することによりスフェロイドを形成することができる、近位尿細管上皮細胞株を提供する。これらの特性は、近位尿細管の性質を正確に反映している。このため、本実施形態の細胞株は、基礎研究や医薬品のスクリーニング等に有用である。
【００１０】
本実施形態の細胞株は、不死化しやすい遺伝的背景を有していることが好ましい。不死化しやすい遺伝的背景としては、例えばｐ５３遺伝子のノックアウトが挙げられる。
【００１１】
実施例において後述するように、発明者らは、ｐ５３遺伝子のノックアウトマウスの腎臓から本実施形態の近位尿細管上皮細胞株を樹立することに成功した。したがって、不死化しやすい遺伝的背景を有する動物の腎臓から細胞株を樹立すれば、ある確率で、近位尿細管の性質を正確に反映した近位尿細管上皮細胞株を得ることができると考えられる。このような細胞株の樹立方法は、様々なマウス系統やラット等の実験動物にも応用することができる。
【００１２】
マウスには、馬杉腎炎、ＬＰＳ腎炎、アドリアマイシン腎症、ストレプトゾトシン投与による糖尿病性腎症モデル等、多数の薬物誘導腎症モデルが知られている。近年、これらの薬物誘導腎症を遺伝子改変マウスに適用し、創薬の分子標的の同定、作用機序の解明等が行われている。しかしながら、動物愛護の観点から、生体を用いた評価系の削減が求められている。これに対し、本実施形態の細胞株を用いることにより、動物試験を減らことができる。
【００１３】
本実施形態の近位尿細管上皮細胞株は、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６７４である細胞株であることが好ましい。実施例において後述するように、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６７４である近位尿細管上皮細胞株は、近位尿細管の性質を正確に反映していることが確認されている。また、樹立した細胞株によっては、遺伝子導入効率が低い場合がある。しかしながら、本実施形態の近位尿細管上皮細胞株はリポフェクション法により効率よく遺伝子導入することができることも確認された。したがって、本実施形態の近位尿細管上皮細胞株は、遺伝子導入を伴う検討に利用することもできる。
【００１４】
［腎線維症の予防又は治療剤のスクリーニング方法］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下且つアルブミン又はＴＧＦ−βの存在下で、上述した近位尿細管上皮細胞株を培養する工程と、前記近位尿細管上皮細胞株における、Ｇｇｔ１又はＭｅｇａｌｉｎの発現量を測定する工程と、を含み、被験物質の存在下且つアルブミン又はＴＧＦ−βの存在下における、Ｇｇｔ１又はＭｅｇａｌｉｎの発現量の低下量が、前記被験物質の非存在下且つアルブミン又はＴＧＦ−βの存在下における発現量の低下量と比較して減少することが、前記被験物質が腎線維症の予防又は治療剤であることを示す、腎線維症の予防又は治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００１５】
上皮間葉移行とは、上皮細胞がその細胞極性や周囲細胞との細胞接着機能を失い、遊走、浸潤能を得ることで間葉系様の細胞へと変化する現象である。近位尿細管上皮細胞にアルブミン又はＴＧＦ−βを作用させると上皮間葉移行が生じることが知られている。上皮間葉移行は腎線維化に関わると考えられている。
【００１６】
Ｇｇｔ１及びＭｅｇａｌｉｎは、近位尿細管上皮細胞のマーカーであり、アルブミン又はＴＧＦ−βの存在下における、Ｇｇｔ１又はＭｅｇａｌｉｎの発現量の低下は、近位尿細管上皮細胞が上皮間葉移行を示していることの指標となる。
【００１７】
したがって、被験物質の存在下且つアルブミン又はＴＧＦ−βの存在下における、Ｇｇｔ１又はＭｅｇａｌｉｎの発現量の低下の程度が減少することは、上記被験物質が近位尿細管上皮細胞の上皮間葉移行を抑制すること、すなわち、上記被験物質が腎線維症の予防又は治療剤であることを示す。
【００１８】
被験物質としては特に制限されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。
【００１９】
（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、被験物質及びアルブミンの存在下で、上述した近位尿細管上皮細胞株を培養する工程と、前記近位尿細管上皮細胞株による前記アルブミンの取り込みを測定する工程と、を含み、被験物質の存在下における前記アルブミンの取り込み量が、前記被験物質の非存在下における取り込み量と比較して低下することが、前記被験物質が腎線維症の予防又は治療剤であることを示す、腎線維症の予防又は治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００２０】
実施例において後述するように、上述した近位尿細管上皮細胞株は、アルブミンの取り込みを示す。また、近位尿細管上皮細胞がアルブミンを取り込むと上皮間葉移行を示し、腎線維症へとつながる。
【００２１】
したがって、近位尿細管上皮細胞によるアルブミンの取り込み量を低下させる被験物質は、近位尿細管上皮細胞の上皮間葉移行を抑制するものであり、腎線維症の予防又は治療剤であるということができる。
【００２２】
被験物質としては上述したものと同様のものを用いることができる。また、アルブミンを蛍光物質等で標識しておくと、蛍光顕微鏡で観察することにより、近位尿細管上皮細胞にアルブミンが取り込まれたか否かを判断することができるため、スクリーニングを容易に実施することができる。
【００２３】
［近位尿細管の管腔構造の形成に関与する因子のスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下、細胞外マトリックス中で、上述した近位尿細管上皮細胞株を３次元培養する工程と、前記近位尿細管上皮細胞株のスフェロイド形成率を測定する工程と、を含み、被験物質の存在下におけるスフェロイド形成率が、前記被験物質の非存在下におけるスフェロイド形成率と比較して有意に変化することが、前記被験物質が近位尿細管の管腔構造の形成に関与する因子であることを示す、近位尿細管の管腔構造の形成に関与する因子のスクリーニング方法を提供する。
【００２４】
実施例において後述するように、上述した近位尿細管上皮細胞株は、３次元培養することによりスフェロイドを形成する。そこで、近位尿細管上皮細胞株のスフェロイド形成率を有意に変化させる被験物質は、近位尿細管の管腔構造の形成に関与する因子であるということができる。
【００２５】
スフェロイド形成率は、例えば、マトリゲル１０μＬあたり約２００個の近位尿細管上皮細胞株を播種して３次元培養を行い、７〜１４日後に形成されたスフェロイドを観察し、下記式（１）等により計算することができる。
スフェロイド形成率（％）＝内腔を有するスフェロイドの数／顕微鏡下で観察した細胞又は細胞塊の数×１００  …（１）
【００２６】
本実施形態のスクリーニング方法により、近位尿細管の管腔構造の形成に関与する因子をスクリーニングすることができる。被験物質としては上述したものの他、ｓｈＲＮＡライブラリー、ｓｉＲＮＡライブラリー等を用いることができる。
【００２７】
例えば、ｓｈＲＮＡライブラリー、ｓｉＲＮＡライブラリーを細胞に導入した結果、スフェロイド形成率が有意に変化した場合、導入したｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡにより発現が阻害された遺伝子が、近位尿細管の管腔構造の形成に関与する因子であると考えられる。
【００２８】
本実施形態のスクリーニング方法により同定された因子は、例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞から近位尿細管細胞を分化誘導する技術の開発等に有用である。
【００２９】
［腎線維症の予防又は治療剤のスクリーニングキット］
１実施形態において、本発明は、上述した近位尿細管上皮細胞株を備える、腎線維症の予防若しくは治療剤又は近位尿細管の管腔構造の形成に関与する因子のスクリーニングキットを提供する。本実施形態のキットを用いることにより、上述した腎線維症の予防又は治療剤のスクリーニング、近位尿細管の管腔構造の形成に関与する因子のスクリーニング等を行うことができる。
【実施例】
【００３０】
次に、実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００３１】
［実験例１］
（近位尿細管上皮細胞株の樹立）
ｐ５３遺伝子ノックアウトマウスの腎臓から細胞株を樹立した。具体的には、まず、８週齢のｐ５３遺伝子ノックアウトマウスから腎臓を摘出した。続いて、摘出した腎臓を、カルシウム、マグネシウム不含有のリン酸バッファー（ＰＢＳ）で洗浄してペトリディッシュに入れ、カミソリを用いて腎皮質を切り取った。続いて、腎皮質を細断しミンチ状にした。
【００３２】
続いて、ミンチ状にした組織を消化酵素ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて３７℃、１５分間消化した。続いて、消化した組織に尿細管上皮培養培地（型式「ＲＥＧＭ」、ロンザ社）を加えて、消化反応を止め、組織を１００μｍのセルストレイナーに通した。セルストレイナー上にトラップされた組織塊は２．５ｍＬ注射シリンジのプランジャーを用いて穏やかに解し、ＲＥＧＭでリンスした。回収した細胞浮遊液をもう一度、新しい１００μｍのセルストレイナーに通し、７５×ｇで５分間遠心した。続いて、上清を捨て、細胞ペレットを新しいＲＥＧＭで懸濁し、再び７５×ｇで５分間遠心した。
【００３３】
続いて、細胞ペレットを新しいＲＥＧＭで再懸濁し、これをＮｕｎｃｌｏｎ  Ｄｅｌｔａ  ｓｕｒｆａｃｅ処理された細胞培養ディッシュ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。
【００３４】
最初の継代まで２日に１回培地を交換した。細胞が８０％コンフルエントになった時、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ処理により細胞を継代した。１回目の継代以降、３日に１回培地を交換した。継代を１０回行った後、１，０００個の細胞を１０ｃｍの培養ディッシュに播種し、培養した。続いて、位相差顕微鏡下でマイクロピペットを用いて、均一な細胞で形成されたコロニーを剥がして吸い込み、９６ウェルプレートにそれぞれ移植し、培養を続けた。さらに４回の継代を行い、この間、増殖能が劣る細胞株は廃棄した。続いて、１００個の細胞（継代数１５）を６ウェルプレートに播種し、もう一度上記と同様にしてコロニーの単離と培養を行った。
【００３５】
以上の操作によりクローナルな細胞株が得られた。得られた細胞株は、３日に１回、１：４の比率で継代した。
【００３６】
続いて、樹立した細胞株（以下、「ＭｕＲＴＥ細胞株」又は「ＭｕＲＴＥ細胞」という場合がある。）をパラホルムアルデヒド固定し、免疫染色により解析し、近位尿細管上皮細胞のマーカータンパク質の発現を検討した。近位尿細管上皮細胞のマーカータンパク質として、ＺＯ−１、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、β−Ｃａｔｅｎｉｎ及びＭｅｇａｌｉｎの発現を検討した。
【００３７】
図１（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ、ＭｕＲＴＥ細胞株における、ＺＯ−１、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、β−Ｃａｔｅｎｉｎ及びＭｅｇａｌｉｎの発現を確認した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍを示す。免疫染色の結果、ＭｕＲＴＥ細胞株は、ＺＯ−１、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、β−Ｃａｔｅｎｉｎ及びＭｅｇａｌｉｎを発現することが確認された。また、後述するように、ＭｕＲＴＥ細胞株は、近位尿細管上皮細胞マーカーの１種であるＧｇｔ１を発現することも確認された。以上の結果から、ＭｕＲＴＥ細胞株が近位尿細管上皮細胞株であることが明らかとなった。
【００３８】
樹立したＭｕＲＴＥ細胞株を、独立行政法人製品評価技術基盤機構（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託した（受託日：平成３０年４月５日、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６７４、微生物の識別の表示「ＭｕＲＴＥ細胞」）。
【００３９】
［実験例２］
（ＭｕＲＴＥ細胞株への遺伝子導入効率の検討）
実験例１で樹立したＭｕＲＴＥ細胞株への遺伝子導入効率を検討した。ＭｕＲＴＥ細胞株を８ウェルチャンバースライドに播種し、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現ベクター（型式「ｐＥＧＦＰ−Ｃ１」、アドジーン社）を０．７μｇ／ｍＬの終濃度でリポフェクションした。リポフェクションには市販のキット（型式「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００  ＃Ｌ３０００００１」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いた。
【００４０】
続いて、ＭｕＲＴＥ細胞株におけるＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡で検討した。図２（ａ）及び（ｂ）は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現ベクターを導入したＭｕＲＴＥ細胞株の顕微鏡写真である。倍率は、１０倍である。図２（ａ）は明視野の顕微鏡写真であり、図２（ｂ）は、図２（ａ）と同じ視野の蛍光顕微鏡写真である。
【００４１】
その結果、ＭｕＲＴＥ細胞株のほとんどがＧＦＰを発現していることが明らかとなった。この結果は、実験例１で樹立したＭｕＲＴＥ細胞株への遺伝子導入効率が高いことを示す。
【００４２】
従来知られている尿細管細胞株は遺伝子導入効率が低く、遺伝子導入にウイルスベクター等を使用する必要がある場合があった。これに対し、ＭｕＲＴＥ細胞株は、より簡便に遺伝子導入を効率よく行うことができることが明らかとなった。
【００４３】
［実験例３］
（ＭｕＲＴＥ細胞株の上皮間葉移行の検討）
実験例１で樹立したＭｕＲＴＥ細胞株が上皮間葉移行を示すか否かを検討した。上述したように、近位尿細管上皮細胞の培地にアルブミン又はＴＧＦ−βを作用させると上皮間葉移行が生じることが知られている。
【００４４】
具体的には、ＭｕＲＴＥ細胞株の培地に、終濃度２０μｇ／ｍＬのアルブミン（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、メルク社）、又は、終濃度５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β（型式「＃２４０−Ｂ」、Ｒ＆Ｄシステムズ社）を添加し、２４時間培養した。続いて、ＭｕＲＴＥ細胞株を回収して全ＲＮＡを抽出し、尿細管上皮マーカーであるＧｇｔ１の発現をＲＴ−ＰＣＲにより検討した。尿細管上皮マーカーの発現量の低下は、上皮間葉移行が生じたことを示す。
【００４５】
図３（ａ）は通常の培地（型式「ＲＥＧＭ」、ロンザ社）、ウシ血清アルブミンを添加したＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ＋ＢＳＡ）、ＴＧＦ−βを添加したＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ＋ＴＧＦ−β）で培養したＭｕＲＴＥ細胞株の顕微鏡写真である。スケールバーは１００μｍである。
【００４６】
また、図３（ｂ）は、各ＭｕＲＴＥ細胞株におけるＧｇｔ１遺伝子のＲＴ−ＰＣＲの結果を示すアガロースゲル電気泳動の写真である。対照として、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇａｐｄｈ）遺伝子の発現を検討した。その結果、ＭｕＲＴＥ細胞株は、アルブミン又はＴＧＦ−βの存在下で上皮間葉移行を示すことが明らかとなった。
【００４７】
［実験例４］
（ＭｕＲＴＥ細胞株によるアルブミンの取り込みの検討）
実験例１で樹立したＭｕＲＴＥ細胞株がアルブミンの取り込みを示すか否かを検討した。まず、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を蛍光色素であるＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ５５５（Ａｎａｓｐｅｃ社）で標識した。
【００４８】
続いて、蛍光標識したＢＳＡをＭｕＲＴＥ細胞株の培地に添加し、蛍光顕微鏡で継時的に観察した。また、蛍光顕微鏡観察用の試料調製時に４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）含有の褪色防止封入剤（商品名「ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ」、型式「＃Ｐ３６９６２」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を添加して核を染色した。図４（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、蛍光標識したＢＳＡを培地に添加した直後（０分後）、１５分後及び３０分後のＭｕＲＴＥ細胞株の蛍光顕微鏡写真である。倍率は４０倍である。
【００４９】
その結果、ＭｕＲＴＥ細胞株の内部におけるＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ５５５の蛍光強度が継時的に高くなる様子が観察された。この結果から、ＭｕＲＴＥ細胞株がアルブミンの取り込みを示すことが明らかとなった。
【００５０】
［実験例５］
（ＭｕＲＴＥ細胞株によるスフェロイド形成能の検討）
実験例１で樹立したＭｕＲＴＥ細胞株をマトリゲル中で３次元培養し、スフェロイド形成能を有するか否かを検討した。また、比較のために、代表的なヒト尿細管上皮細胞株であるＨＫ−２細胞株についても同様の検討を行った。
【００５１】
具体的には、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ処理した細胞株を２５μｍのセルストレイナーに通し、遠心した。続いて、細胞ペレットをＧｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（型式「＃３５６２３０」、コーニング社）で懸濁し、細胞浮遊液（１μＬあたり細胞２０個）を２０μＬずつ、培養プレート又はチャンバースライドのウェルに滴下した。続いて、３７℃で１５分間保温し、マトリゲルを重合（ゲル化）した後、ウェルにＲＥＧＭを加えて、３７℃、５％ＣＯ２で７〜１４日間培養した。培地は３日に１回交換した。
【００５２】
図５は、３次元培養の結果を示す顕微鏡写真である。スケールバーは２０μｍを示す。図５中、「ＭｕＲＴＥ」はＭｕＲＴＥ細胞株の結果であることを示し、「ＨＫ−２」はＨＫ−２細胞株の結果であることを示す。また、「明視野」は明視野の顕微鏡写真であることを示し、「ファロイジン」はファロイジンを用いてアクチンフィラメントを染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真であることを示し、「ヘキスト」はヘキスト３３３４２染色により核を染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真であることを示し、「マージ」は、ファロイジン染色の結果とヘキスト３３３４２染色の結果を合成した結果を示す写真であることを示す。
【００５３】
その結果、ＭｕＲＴＥ細胞株がスフェロイド形成能を有することが明らかとなった。形成されたスフェロイドは内腔を有していた。一方、ＨＫ−２細胞はスフェロイドを形成できないことが明らかとなった。
【００５４】
続いて、ＭｕＲＴＥ細胞株から形成されたスフェロイドの薄切切片を透過型電子顕微鏡で観察した。図６はスフェロイドの薄切切片の透過型電子顕微鏡写真である。スケールバーは２μｍを示す。図６中、「Ｎｕ」は核を示し、「ＴＪ」はタイトジャンクションを示し、「Ｍｖ」は微小絨毛を示す。
【００５５】
その結果、形成されたスフェロイドは、内腔側に刷子縁（Ｂｒｕｓｈ  ｂｏｒｄｅｒ）と呼ばれる近位尿細管に特徴的な構造を有することが確認された。この結果は、ＭｕＲＴＥ細胞株が近位尿細管の性質を正確に反映していることを更に支持するものである。
【００５６】
［実験例６］
（ＭｕＲＴＥ細胞株における排出輸送体（ｅｆｆｌｕｘ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）遺伝子の発現の検討）
【００５７】
薬物性腎障害の評価は、新薬開発において大きな問題となる。多くの化合物は、種々の排出輸送体を介して尿細管毒性を示すことから、腎臓毒性モデルは、種々の排出輸送体遺伝子を発現していることが必要である。
【００５８】
ＲＴ−ＰＣＲにより、ＭｕＲＴＥ細胞における排出輸送体遺伝子の発現を検討した。排出輸送体遺伝子としては、Ｓｌｃ４７ａ１（別名  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｎ  ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（Ｍａｔｅ１））、Ａｂｃｃ２（別名  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（Ｍｒｐ２））、Ａｂｃｃ４（別名  Ｍｒｐ４）、Ａｂｃｂ１ａ（別名  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １Ａ（Ｍｄｒ１ａ））、Ｓｌｃ２２ａ２（別名  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃａｔｉｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ２（Ｏｃｔ２））の発現を検討した。また、陽性対照としてＧａｐｄｈ遺伝子の発現も検討した。また、比較のために、マウス由来の腎臓組織を同様のＲＴ−ＰＣＲに供した。
【００５９】
図７は、ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真である。図７中、「＃１５」、「＃２４」、「＃６１」、「＃７１」は、それぞれ、実験例１で樹立した細胞株のクローン番号を表す。クローン＃６１がＭｕＲＴＥ細胞株である。また、「Ｋｉｄｎｅｙ」はマウス由来の腎臓組織の結果であることを表し、「Ｎｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ」は非特異的なバンドであることを表す。
【００６０】
その結果、ＭｕＲＴＥ細胞は、Ｓｌｃ４７ａ１、Ａｂｃｃ２、Ａｂｃｃ４、Ａｂｃｂ１ａの各遺伝子を発現することが明らかとなった。また、後述する実験例６の結果から、ＭｕＲＴＥ細胞が、Ｓｌｃ２２ａ２遺伝子も発現することが明らかとなった。
【００６１】
以上の結果から、ＭｕＲＴＥ細胞が腎臓毒性モデルとして有用であることが明らかとなった。
【００６２】
［実験例７］
（ＭｕＲＴＥ細胞株へのシスプラチンの投与の検討）
癌化学療法では、高い頻度で患者が急性腎症を発症し、薬物の減量や中止を余儀なくされる。また、最も頻用される抗癌剤であるシスプラチンの投与によって、しばしば急性尿細管壊死が生じる。
【００６３】
本実験例では、ＭｕＲＴＥ細胞の培地に、終濃度０、１、５、１０μＭのシスプラチンを添加し、シスプラチンを排出する排出輸送体をコードするＳｌｃ２２ａ２遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲにより検討した。また、陽性対照としてＧａｐｄｈ遺伝子の発現も検討した。また、フローサイトメトリーにより死細胞の割合を測定した。
【００６４】
図８は、ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真である。その結果、シスプラチンの投与量が増加するとＳｌｃ２２ａ２遺伝子の発現が亢進することが明らかとなった。
【００６５】
また、図９（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、シスプラチンの終濃度０、５、１０μＭにおける死細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。その結果、シスプラチンの投与量が増加すると死細胞の割合が増加することが明らかとなった。
【００６６】
以上の結果から、ＭｕＲＴＥ細胞を用いることによって、シスプラチンによる腎障害発症機構の解明や予防法の開発を行うことができることが明らかとなった。また、ＭｕＲＴＷ細胞は、シスプラチン以外の薬物による腎障害発症機構の解明や予防法の開発にも用いることができると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明によれば、近位尿細管の性質を正確に反映した近位尿細管上皮細胞株を提供することができる。
【受託番号】
【００６８】
ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６７４
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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