(57)【要約】【課題】インドナガコショウ（Ｐｉｐｅｒ Ｌｏｎｇｕｍ Ｌ．）抽出物を有効成分として含む排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物の提供。インドナガコショウ（Ｐｉｐｅｒ Ｌｏｎｇｕｍ Ｌ．）抽出物を有効成分として含む排尿障害の予防又は改善用の健康機能食品の提供。【解決手段】本発明は、インドナガコショウ（Ｐｉｐｅｒ  Ｌｏｎｇｕｍ  Ｌ．）抽出物を有効成分として含む排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物及び排尿障害の予防又は改善用の健康機能食品に関する。本発明のインドナガコショウ抽出物は、天然抽出物であり、人体に無害であるだけではなく、排尿障害に関与する様々な機序に同時に関与することにより排尿間隔を増加させ、排尿圧を減少させ、膀胱の容積を増加させ、排尿筋の収縮を抑制し、排尿筋の弛緩を誘導することができる。様々な排尿障害を予防、治療又は改善する効果に優れている。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
インドナガコショウ（Ｐｉｐｅｒ  Ｌｏｎｇｕｍ  Ｌ．）の抽出物を有効成分として含む排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物であって、前記排尿障害が、過活動膀胱症候群、切迫尿失禁、切迫尿、頻尿、夜間頻尿及び間質性膀胱炎よりなる群から選ばれる１種以上である、薬学的組成物。
【請求項２】
前記抽出物は、アルコール抽出物、グリセリン抽出物、ブチレングリコール抽出物、プロピレングリコール抽出物、メチルアセテート抽出物、エチルアセテート抽出物、アセトン抽出物、ベンゼン抽出物、ヘキサン抽出物、ジエチルエーテル抽出物、クロロホルム抽出物及びジクロロメタン抽出物よりなる群から選ばれる１種以上の抽出物である、請求項１に記載の排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物。
【請求項３】
前記アルコールは、炭素原子１乃至４の無水若しくは含水の低級アルコールである、請求項２に記載の排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物。
【請求項４】
前記無水若しくは含水の低級アルコールは、３０乃至１００体積％のメタノールである、請求項３に記載の排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物。
【請求項５】
前記インドナガコショウの抽出物は、排尿間隔を増加させるものである、請求項１に記載の排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物。
【請求項６】
前記インドナガコショウの抽出物は、排尿圧を減少させ、膀胱の体積を増加させるものである、請求項１に記載の排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物。
【請求項７】
前記インドナガコショウの抽出物は、排尿筋の収縮抑制及び排尿筋の弛緩を誘導するものである、請求項１に記載の排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物。
【請求項８】
前記インドナガコショウの抽出物は、ムスカリンＭ３受容体又はムスカリンＭ２受容体を阻害するものである、請求項１に記載の排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物。
【請求項９】
前記インドナガコショウの抽出物は、β３−アドレナリン受容体を活性化する請求項１に記載の排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物。
【請求項１０】
インドナガコショウ（Ｐｉｐｅｒ  Ｌｏｎｇｕｍ  Ｌ．）の抽出物を有効成分として含む、排尿障害の予防又は改善用の健康機能食品であって、前記排尿障害が、過活動膀胱症候群、切迫尿失禁、切迫尿、頻尿、夜間頻尿及び間質性膀胱炎よりなる群から選ばれる１種以上である、健康機能食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インドナガコショウ（Ｐｉｐｅｒ Ｌｏｎｇｕｍ Ｌ．）抽出物を有効成分として含む排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物及び排尿障害の予防又は改善用の健康機能食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
排尿障害とは、正常的な排尿形態を外れた一体の排尿行為のことをいう。排尿障害は、老若男女を問わず誰にでも起こるが、神経学的な異常により発生する神経因性膀胱、非神経因性原因による下部尿路症状と前立腺肥大症、尿失禁に代表される女性泌尿器疾患を含む（尿失禁学会、２００３）。排尿障害は、成人において有病割合が高く報告されており、年齢に伴い増加するが、特に、男性において線形的に増加を示すことが報告されている。排尿障害による下部尿路症状のうち男女の両方において頻尿及び過活動膀胱に代表される貯蔵機能障害症状の有病割合が最も高いことが知られており、排尿障害、排尿後症状の順に現れることが報告されている。
【０００３】
過活動膀胱のような色々な排尿障害症状は、飲料の摂取を制限しなければならず、トイレに頻繁に行かなければならないという面倒さを経験し、対人関係及び社会生活に影響を受け、衛生上の問題が発生したり、夜に十分な睡眠が取れないことなどにより個人の生活の質が低下せざるを得ないが故に（キム・ズンイム、キム・ヨンホ、＆アン・ヒョンチョル、２００２；イ・ユシク、２００１ａ）、様々な側面から個人の健康に関わる生活の質に否定的な影響を及ぼしている。
【０００４】
過活動膀胱症候群（ｏｖｅｒａｃｔｉｖｅ ｂｌａｄｄｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＯＡＢ）とは、最近に疾患の概念が定立した複合的な症状群であり、尿路感染がなく、他の明白な病因がない条件下で切迫性尿失禁の有無を問わずに腎臓でつくられた尿で膀胱が満たされる間に膀胱が非正常的に頻繁に収縮することにより、頻繁に尿意を感じる頻尿（1日８回以上）、排尿したくて我慢がきかず、急にトイレに行きたくなる切迫尿、尿意を感じたときに十分に尿意の我慢ができず、尿が漏れて衣類や寝具を濡らす切迫尿失禁、夜眠りについたあと排尿のために１回以上起きなければならない夜間頻尿の症状のうちのいずれか一つ以上の症状が現れることをいう。過活動膀胱の症状は、ほとんどの場合、排尿筋（膀胱）の不随意収縮と関連しているため、過活動膀胱（ｂｌａｄｄｅｒ ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ）の状態を招く。
【０００５】
膀胱は平滑筋により構成されており、排尿機能は神経系により調節されるため、過活動膀胱のような様々な排尿障害は、平滑筋及び神経系の異常により発生することができる。過活動膀胱の原因としては、一般に、脳疾患や脊髄の損傷に起因する神経因性（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ）及び男性の前立腺肥大症に代表される膀胱出口閉塞（ｏｕｔｌｅｔ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）、女性の骨盤構造の弱化、尿道及び膀胱の局所疾患などが挙げられるが、排尿筋細胞の老化、原因不明の排尿筋機能障害などにより招かれる場合が多いため、未だ主な発病原因については明確に知られていない（非特許文献１：キム・テヒョン、中央医大誌２８（３）、ｐ１４３−１４９、２００３）。
【０００６】
過活動膀胱症候群が老化の一つの過程ではないが、年をとるにつれて発生確率は増加する。男女比は略同じであるが、切迫性尿失禁は女性においてさらに頻繁に発生する。韓国においても１２．７％から３０．５％と様々に報告されており、ヨーロッパの調査によれば、過活動膀胱は４０歳以上の男性の１６％において、女性の１７％において発生し、特に、７５歳以上の男性は４２％、女性は３１％に至るほどとてもありふれた疾患であり、このような統計は、アメリカ、日本など先進国においても同じレベルを示す（非特許文献２：２０１１、大韓排尿障害尿失禁学会、過活動膀胱ガイドライン）。過活動膀胱症は、基本的な身体活動から、性生活、社会活動まで社会的や精神的に影響を与えて生活の質の減少が現れ、患者を対象としたＨＲＱＯＬ（ｈｅａｌｔｈ−ｒｅｌａｔｅｄ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ、健康に関連した生活の質）のアンケートを行ったところ、過活動膀胱症が生活の質に及ぼす影響は、糖尿よりも大きいことが分かった（非特許文献３：Ｌｉｂｅｒｍａｎ ＪＮ， Ｈｕｎｔ ＴＬ， Ｓｔｅｗａｒｔ ＷＦ， Ｗｅｉｎ Ａ， Ｚｈｏｕ Ｚ， ＨｅｒｚｏｇＡＲ， ｅｔ ａｌ． Ｈｅａｌｔｈ−ｒｅｌａｔｅｄ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ ａｍｏｎｇ ａｄｕｌｔｓ ｗｉｔｈ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｏｖｅｒａｃｔｉｖｅ ｂｌａｄｄｅｒ： ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ａ Ｕ．Ｓ． ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ｂａｓｅｄ ｓｕｒｖｅｙ． Ｕｒｏｌｏｇｙ ２００１；５７：１０４４−５０）。
【０００７】
過活動膀胱の初期の標準治療として、現在、抗ムスカリン製剤が広く用いられているが、これまで効果を確実に裏付けるべき国際的に通用される臨床試験(ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ）の報告はなく、この薬剤が有している神経系の全般に影響を及ぼす抗コリンの性質に起因して１０人のうちの１〜２人の割合で口喝及び便秘、霧視(ｂｌｕｒｒｅｄ ｖｉｓｉｏｎ）、急性尿閉などの副作用が発生することが報告されている。このような副作用は、水分の摂取の調節が必要な排尿障害患者の場合、服薬順応度を低下させる原因であることが報告され、この理由から、過活動膀胱のような排尿障害の新たな代案的な薬物の開発へのニーズが絶えず生まれ続けている（非特許文献４：大韓排尿障害尿失禁学会誌、Ｊ Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｎｔｉｎｅｎｃｅ Ｓｏｃ ２００９；１３：７−２２）。
【０００８】
切迫尿失禁は、激しい尿切迫症状後に急に不随意的な尿漏れが発生するものであり、特定の光景、音、流水との接触、姿勢の変化などが誘発原因になることが知られている。切迫尿とは、尿切迫とも呼ばれ、排尿しようとする欲求が急に発生する症状のことをいい、とりあえず尿意を感じると、排尿したくて我慢がきかない状態を意味する。この場合、即座に排尿できなければ痛症が引き起こされ、酷い場合には、膀胱が勝手に収縮して尿をもらしてしまう切迫性尿失禁に進行することができるものと知られている。頻尿は、1日４乃至６回の排尿をし、１回の排尿量が約３００ｃｃ程度である健常人とは異なり、２４時間の間に８回以上の排尿をする場合と定義されているが、２００２年、国際尿失禁学会では、患者自分があまりにも頻繁に排尿をすると感じる場合を頻尿と定義して、頻尿の定義を拡大している。頻尿は、過多な水分の摂取、排尿筋の過活動性、膀胱容積の減少、膀胱の過敏感性などが原因となって起こるものであり、異常排尿症状をいう排尿障害の代表的な症状の一つである。夜間尿は、夜眠りについたあと排尿のために起きなければならない場合をいい、夜間の尿量が一日の排尿量に比べて相対的に多い夜間多尿及びそうではない夜間頻尿に分けられる。夜間尿と定義するためには、必ず排尿の前後に睡眠が伴わなければならず、夜間頻尿がある患者は、睡眠中に随時目が覚めて眠りにつき難いため、睡眠が妨げられて昼間に眠くなり、疲れ、日常生活に支障を来たす。また、老人においては、落傷や骨折の危険性が増加するという問題がある。夜間頻尿は、年齢、生活習慣、多尿、夜間多尿、膀胱障害、睡眠障害、心理的な要因などの種々の因子と関連していることが報告されている。間質性膀胱炎は、膀胱疼痛症候群又は慢性膀胱炎とも呼ばれる。バクテリア感染など特徴的な病理学的所見がなく、これまで正確な原因は判明していない。膀胱上皮細胞に欠陥が生じて尿と血流との間の膀胱粘膜壁が損傷されることにより現れると知られているが、膀胱内炎症や膀胱の血管障害、膀胱粘膜損傷及び精神身体障害なども誘発因子として働く。男女の両方において発病されるが、約９０％が女性において発病され、主として４０代中半に発病される。症状としては、非正常的な感覚性切迫尿及び頻尿が挙げられ、ほとんどの場合に膀胱痛を訴える。特に、膀胱が尿で満たされているときには症状がさらに激しくなり、排尿をするときには痛症がほとんどない。夜間にも１〜２回以上、平均的に４回の排尿をするが、血尿はほとんどない。昼間には少なくとも８回以上、平均的に１６回の排尿をし、健常人の場合に１回の排尿量が２５０ｍｌ以上であるが、この疾患にかっかった患者の排尿量は、平均的に７５ｍｌである。４人の患者のうち３人以上が性行為により症状がさらに激しくなり、生理周期・ストレス・食べ物なども症状の悪化に影響を及ぼす。治療のために抗うつ剤の投与と麻酔後に膀胱水圧拡大術、膀胱剥離術、膀胱拡大術、尿路転換術などの手術を行ったり、抗コリン系薬物やαアドレナリン受容体遮断剤、抗ヒスタミン剤、ステロイド、硝酸銀、ヘパリンなどの薬物を投与したりするが、治療効果は大きくないため、このような排尿障害の治療のための新たな薬物が必要である。
【０００９】
一方、コショウ科（ｐｉｐｅｒａｃｅａｅ）蔓性木本植物であるインドナガコショウ（Ｐｉｐｅｒｉｓ Ｌｏｎｇｕｍ Ｌ．）の実であるインドナガコショウ（畢撥、Ｐｉｐｅｒｉｓ Ｌｏｎｇｉ Ｆｒｕｃｔｕｓ）は、インドが原産地であり、中国、インドネシアなどの国において栽培されて韓国に輸入されており、漢方ではヒハツ(畢撥）という名前の生薬として韓国で使用されている。
【００１０】
インドナガコショウには、精油（カンフェン、ピペロナール、サビネン、リモネン、ミルセン）、脂肪酸（パルミチン酸）及びアルカロイド（ピペリジン、ピペリン、ピペラニン）などの様々な成分が含有されており、漢方において、インドナガコショウは、脾胃を暖める温裏薬であり、温中止痛の効能を有し、下痢、嘔吐、腹部膨満及び歯痛、鎮痛、止瀉に使用されることが知られている。インドのアーユルヴェーダにおいて、インドナガコショウはＰＩＰＰＡＬＩという名称として通用され、消化刺激剤、駆風剤、去痰剤、気管支拡張剤、駆虫剤、鎮静剤、循環刺激剤、催淫剤として用いられていることが知られており（非特許文献５：インドの伝統の薬、シニルブックス、２０１１年１２月）、インドナガコショウの薬理作用として、抗菌作用、抗痙攣作用、皮膚血管拡張作用、抗酸化作用、抗心筋虚熱作用、高脂血降下作用、抗癌及び抗肥満作用などが報告されている。しかしながら、これまでインドナガコショウの排尿障害の改善効果については知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】キム・テヒョン、中央医大誌２８（３）、ｐ１４３−１４９、２００３
【非特許文献２】２０１１、大韓排尿障害尿失禁学会、過活動膀胱ガイドライン
【非特許文献３】Ｌｉｂｅｒｍａｎ ＪＮ， Ｈｕｎｔ ＴＬ， Ｓｔｅｗａｒｔ ＷＦ， Ｗｅｉｎ Ａ， Ｚｈｏｕ Ｚ， ＨｅｒｚｏｇＡＲ， ｅｔ ａｌ． Ｈｅａｌｔｈ−ｒｅｌａｔｅｄ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ ａｍｏｎｇ ａｄｕｌｔｓ ｗｉｔｈ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｏｖｅｒａｃｔｉｖｅ ｂｌａｄｄｅｒ： ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ａ Ｕ．Ｓ． ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ｂａｓｅｄ ｓｕｒｖｅｙ． Ｕｒｏｌｏｇｙ ２００１；５７：１０４４−５０
【非特許文献４】大韓排尿障害尿失禁学会誌、Ｊ Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｎｔｉｎｅｎｃｅ Ｓｏｃ ２００９；１３：７−２２
【非特許文献５】インドの伝統の薬、シニルブックス、２０１１年１２月
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは、様々な排尿障害を効果的に予防、治療及び改善する天然物について鋭意検討した結果、インドナガコショウ抽出物が人体に無害であるだけではなく、排尿障害に関与している様々な機序に同時に関与することにより優れた排尿障害の予防、治療及び改善効果を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
したがって、本発明の目的は、インドナガコショウ（Ｐｉｐｅｒ Ｌｏｎｇｕｍ Ｌ．）抽出物を有効成分として含む排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物を提供することである。
【００１４】
また、本発明の目的は、インドナガコショウ（Ｐｉｐｅｒ Ｌｏｎｇｕｍ Ｌ．）抽出物を有効成分として含む排尿障害の予防又は改善用の健康機能食品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、インドナガコショウ（Ｐｉｐｅｒ Ｌｏｎｇｕｍ Ｌ．）抽出物を有効成分として含む排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物を提供する。
【００１６】
また、本発明は、前記インドナガコショウ抽出物が、水、アルコール、グリセリン、ブチレングリコール、プロピレングリコール、メチルアセテート、エチルアセテート、アセトン、ベンゼン、ヘキサン、ジエチルエーテル、クロロホルム及びジクロロメタンよりなる群から選ばれる１種以上の抽出溶媒により抽出されたものである排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物を提供する。好ましくは、前記抽出溶媒は、水、アルコール、エチルアセテート、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタンよりなる群から選ばれる１種以上の抽出溶媒である場合もある。より好ましくは、前記抽出溶媒は、水、アルコール又は含水アルコール(アルコール水溶液)である場合もある。前記アルコールは、メタノール、エタノール又はイソプロパノールである。最も好ましくは、前記抽出溶媒は、水又は含水エタノール（エタノール水溶液）である場合もある。
【００１７】
さらに、本発明は、前記アルコールが炭素数１乃至４の無水若しくは含水低級アルコールである排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物を提供する。好ましくは、前記アルコールは、含水メタノール（メタノール水溶液）又は含水エタノールである場合もある。より好ましくは、前記アルコールは、含水エタノール（エタノール水溶液）である場合もある。
【００１８】
さらにまた、本発明は、前記無水若しくは含水の低級アルコールが、３０乃至１００体積％のメタノール又はエタノールである排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物を提供する。好ましくは、前記含水低級アルコールは、３０乃至１００体積（ｖｏｌｕｍｅ／ｖｏｌｕｍｅ；ｖｏｌ／ｖｏｌ）％のエタノール水溶液である場合もある。より好ましくは、前記含水低級アルコールは、３０乃至９５体積％のエタノール水溶液である場合もある。さらに好ましくは、前記含水低級アルコールは、９５体積％のエタノール水溶液である場合もある。
【００１９】
さらにまた、本発明は、前記インドナガコショウ抽出物が、極性溶媒可溶抽出物又は非極性溶媒可溶抽出物である排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物を提供する。前記極性溶媒可溶抽出物は、水、メタノール、ブタノール又はこれらの混合溶媒から選ばれる溶媒、好ましくは、飽和ｎ−ブタノールに可溶の抽出物である場合もあり、非極性溶媒可溶抽出物は、ジクロロメタン又は酢酸エチルに可溶の抽出物である場合もある。
【００２０】
さらにまた、本発明は、前記インドナガコショウ抽出物が、排尿間隔を増加させるものである排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物を提供する。
【００２１】
さらにまた、本発明は、前記インドナガコショウ抽出物が、排尿圧を減少させ、膀胱の体積を増加させるものである排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物を提供する。
【００２２】
さらにまた、本発明は、前記インドナガコショウ抽出物が、排尿筋の収縮抑制及び排尿筋の弛緩を誘導するものである排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物を提供する。
【００２３】
さらにまた、本発明は、前記インドナガコショウ抽出物が、ムスカリンＭ３又はムスカリンＭ２受容体を阻害するものである排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物を提供する。
【００２４】
さらにまた、本発明は、前記インドナガコショウ抽出物が、β３−アドレナリン受容体の作用剤である排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物を提供する。
【００２５】
さらにまた、本発明は、前記排尿障害が、過活動膀胱症候群、切迫尿失禁、切迫尿、頻尿、夜間尿及び間質性膀胱炎よりなる群から選ばれるいずれか１種以上である排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物を提供する。
【００２６】
さらにまた、本発明は、インドナガコショウ（Ｐｉｐｅｒ Ｌｏｎｇｕｍ Ｌ．）抽出物を有効成分として含む、排尿障害の予防又は改善用の健康機能食品を提供する。
【００２７】
さらにまた、本発明は、前記排尿障害が、過活動膀胱症候群、切迫尿失禁、切迫尿、頻尿、夜間尿及び間質性膀胱炎よりなる群から選ばれるいずれか１種以上である排尿障害の予防又は改善用の健康機能食品を提供する。
【００２８】
さらにまた、本発明は、前記インドナガコショウ抽出物が、極性溶媒可溶抽出物又は非極性溶媒可溶抽出物である排尿障害の予防又は改善用の健康機能食品を提供する。
【００２９】
さらに、本発明の目的は、排尿障害の予防又は治療するのに用いるためのインドナガコショウ（Ｐｉｐｅｒ Ｌｏｎｇｕｍ Ｌ．）抽出物を有効成分として含む薬剤学的組成物を提供することである。
【００３０】
さらにまた、本発明の目的は、排尿障害の予防又は改善するのに用いるためのインドナガコショウ（Ｐｉｐｅｒ Ｌｏｎｇｕｍ Ｌ．）抽出物を有効成分として含む組成物を提供することである。
【００３１】
さらにまた、本発明の目的は、排尿障害の予防又は治療用の薬剤学的製剤を製造するためのインドナガコショウ（Ｐｉｐｅｒ Ｌｏｎｇｕｍ Ｌ．）抽出物の用途を提供することである。
【００３２】
さらにまた、本発明の目的は、インドナガコショウ（Ｐｉｐｅｒ Ｌｏｎｇｕｍ Ｌ．）抽出物を有効成分として含む排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物を哺乳類をはじめとする対象体に投与して排尿障害を予防又は治療する方法を提供することである。
【発明の効果】
【００３３】
本発明のインドナガコショウ抽出物は天然抽出物であり、人体に無害であるだけではなく、排尿障害に関与している様々な機序に同時に関与することにより排尿間隔を増加させ、排尿圧を減少させ、膀胱の容積を増加させ、排尿筋の収縮を抑え、排尿筋の弛緩を誘導することができるので、様々な排尿障害を予防、治療又は改善する効果に優れている。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】インドナガコショウの９５体積％のエタノール水溶液抽出物（２００ｍｇ／ｋｇ）を投与したときの基底圧（ＢＰ）、排尿圧（ＭＰ）及び排尿間隔（ＭＩ）の変化を正常対照群及び過活動膀胱症の溶媒対照群と比較した結果を示した図である。
【図２】インドナガコショウの９５体積％のエタノール水溶液抽出物（２００ｍｇ／ｋｇ）を投与したときの基底圧（ＢＰ）、排尿圧（ＭＰ）、臨界圧（ＴＰ）及び排尿間隔（ＭＩ）の変化を正常対照群、溶媒対照群及びオキシブチニン処理陽性対照群と比較した結果を示した図である。
【図３】インドナガコショウの９５体積％のエタノール水溶液抽出物（２００ｍｇ／ｋｇ）又はインドナガコショウの水抽出物（２００ｍｇ／ｋｇ）の処理による排尿間隔（ＭＩ ）及び排尿量（ＶＶ）の変化を確認した結果を示した図である。
【図４】インドナガコショウの３０体積％のエタノール水溶液抽出物（３００ｍｇ／ｋｇ）又はインドナガコショウの水抽出物（３００ｍｇ／ｋｇ）の処理による排尿回数、排尿量及び１回の排尿量の変化を確認した結果を示した図である。
【図５】トルテロジンを陽性対照群とし、インドナガコショウの水抽出物（３００ｍｇ／ｋｇ）前後による膀胱容積（ＢＣ）、排尿量（ＶＶ）及び排尿間隔（ＭＩ）の変化を比較した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、インドナガコショウ（Ｐｉｐｅｒ Ｌｏｎｇｕｍ Ｌ．）抽出物を有効成分として含む排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物を提供する。
【００３６】
本発明のインドナガコショウ抽出物は、人体に無害であるだけではなく、排尿障害に関与している様々な機序に同時に関与することにより排尿間隔を増加させ、排尿圧を減少させ、膀胱の容積を増加させ、排尿筋の収縮を抑え、排尿筋の弛緩を誘導することができる。本発明のインドナガコショウ抽出物の排尿障害の予防、治療及び改善効果は、インドナガコショウ抽出物が膀胱だけではなく、脊髄及び脊髄上部経路の神経系（ｅｎｔｅｒｉｃ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ）において膀胱の収縮及び弛緩に関与するムスカリンＭ３受容体又はムスカリンＭ２受容体を阻害したり、β３−アドレナリン受容体（ｂｅｔａ−３ ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）受容体を活性化させたりすることに起因するものと推察される。但し、本発明の範囲が前記機序により限定されるものではない。
【００３７】
本発明の「インドナガコショウ」は、栽培、採取又は市販のものを制限なしに用いることができ、排尿障害の予防、治療又は改善効果を示す限り、インドナガコショウの茎、葉、根、実を網羅し、好ましくは、インドナガコショウの実である場合もある。
【００３８】
本発明のインドナガコショウ抽出物は、通常の抽出溶媒により抽出されたものである可能性があり、例えば、水；無水若しくは含水のアルコール；グリセリン、ブチレングリコール、プロピレングリコールなどの多価アルコール；メチルアセテート、エチルアセテート、アセトン、ベンゼン、ヘキサン、ジエチルエーテル、ジクロロメタンなどの炭化水素系溶媒；又はこれらの混合物が使用可能であるが、これらに限定されない。また、本発明のインドナガコショウ抽出物は、好ましくは、水、アルコール、グリセリン、ブチレングリコール、プロピレングリコール、メチルアセテート、エチルアセテート、アセトン、ベンゼン、ヘキサン、ジエチルエーテル、クロロホルム及びジクロロメタンよりなる群から選ばれる１種以上の抽出溶媒により抽出されたものである場合もある。好ましくは、前記抽出溶媒は、水、アルコール、エチルアセテート、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタンよりなる群から選ばれる１種以上の抽出溶媒である場合もある。より好ましくは、前記抽出溶媒は、水、アルコール又は含水アルコールである場合もある。さらに好ましくは、前記アルコールは、メタノール、エタノール又はイソプロパノールである。最も好ましくは、前記抽出溶媒は、水又は含水エタノールである場合もある。
【００３９】
また、好ましくは、本発明のインドナガコショウ抽出物は、炭素数１乃至４の無水若しくは含水の低級アルコールを抽出溶媒として抽出されたものである可能性があり、前記炭素数１乃至４の無水若しくは含水の低級アルコールは、１０乃至１００体積％、好ましくは、３０乃至１００体積％、さらに好ましくは、７０乃至１００体積％のメタノール又はエタノールである場合もある。好ましくは、抽出溶媒は、水又は３０乃至９５体積％のエタノールである場合もある。以下、本明細書において、「％アルコール」と記載されるものは、「体積％アルコール」と同じ意味で用いられる。
【００４０】
前記インドナガコショウ抽出物は、下記のステップを含む製造方法により製造されることが好ましいが、これに限定されない。
（１）インドナガコショウを乾燥させた後に細切りするステップ;
（２）細切りされたインドナガコショウに抽出溶媒を加えて抽出物を抽出するステップ;
（３）抽出物を冷却させた後にろ過するステップ;
（４）ろ過された抽出物を濃縮するステップ;
【００４１】
前記ステップ（１）において用いられるインドナガコショウは、栽培、採取又は市販のものが制限なしに使用可能であり、ステップ（１）の乾燥は、日陰で干す陰乾しであることが好ましい。
【００４２】
前記ステップ（２）の抽出は、攪拌抽出、還流冷却抽出、冷針抽出、超音波抽出、超臨界抽出などの抽出方法が利用可能であるが、これに限定されない。抽出温度は、５０乃至１２０℃であることが好ましく、８０乃至１００℃であることがさらに好ましい。また、抽出時間は、１乃至２０時間であることが好ましく、さらに好ましくは、２時間乃至５時間の間抽出することができる。さらに、抽出回数は、１乃至５回であることが好ましく、さらに好ましくは、２回又は３回である場合もある。なお、前記ステップ（２）の抽出は、インドナガコショウの１倍乃至２０倍の体積量に見合う分だけ抽出溶媒を加えて抽出することでなりたつことができる。
【００４３】
前記ステップ（３）のろ過は、１００〜５００メッシュで行うことが好ましいが、さらに好ましくは、３００メッシュで行う。
【００４４】
前記ステップ（４）の濃縮は、１０乃至１００℃で行われることが好ましく、さらに好ましくは、５０乃至８０℃であり、真空減圧濃縮器又は真空回転蒸発器を用いて行うことが好ましい。
【００４５】
また、前記製造方法は、ステップ（５）の乾燥ステップをさらに含み、乾燥は、減圧乾燥、真空乾燥、沸騰乾燥、噴霧乾燥又は凍結乾燥の方法を用いて行うことが好ましい。
【００４６】
さらに、本発明のインドナガコショウ抽出物は、インドナガコショウ抽出物の分画物を含む。インドナガコショウ抽出物の分画抽出物は、炭素数１乃至４の無水若しくは含水低級アルコールを抽出溶媒として得られたインドナガコショウ抽出物に炭素数１乃至４の無水若しくは含水アルコール又はアセトニトリルと水との混合溶媒を移動相として用いる濃度勾配カラムクロマトグラフィなど当分野において一般的に分画物を得る方法を用いて得る。
【００４７】
さらにまた、本発明は、前記インドナガコショウ抽出物が、極性溶媒可溶抽出物又は非極性溶媒可溶抽出物である排尿障害の予防又は治療用の薬学的組成物を提供する。前記極性溶媒可溶抽出物は、水、メタノール、ブタノール又はこれらの混合溶媒から選ばれる溶媒、好ましくは、飽和ｎ−ブタノールに可溶の抽出物であり、非極性溶媒可溶抽出物は、ジクロロメタン又は酢酸エチルに可溶の抽出物である。好ましくは、インドナガコショウエタノール水溶液抽出物に水及びジクロロメタンを加えてジクロロメタン可溶性抽出物及びジクロロメタン不溶性抽出物（水層）を製造し、前記ジクロロメタン不溶性抽出物に水及び酢酸エチルを加えて酢酸エチル可溶性抽出物及び酢酸エチル不溶性抽出物（水層）を製造し、前記エチルアセテート不溶性抽出物に水及び飽和ｎ−ブタノールを加えて飽和ｎ−ブタノール可溶性抽出物及び飽和ｎ−ブタノール不溶性抽出物（水層）を製造する方法により分画抽出したものである。前記エタノール水溶液は、３０〜９５体積％のエタノール水溶液であり、さらに好ましくは、前記の含水低級アルコールは、９５体積％のエタノール水溶液である場合もある。
【００４８】
本発明のインドナガコショウ抽出物は、既存の排尿障害治療剤の標的である抗ムスカリン機序だけではなく、β３−アドレナリン受容体のｃＡＭＰ信号伝達経路にも関与することができるので、排尿障害に関与する複合機序をターゲットとすることができて、様々な排尿障害の改善効果を示す。
【００４９】
このため、本発明のインドナガコショウ抽出物は、排尿圧を減少させ、膀胱の容積を増加させるものである。また、本発明のインドナガコショウ抽出物は、排尿筋の収縮抑制及び排尿筋の弛緩を誘導するものである場合もある。
【００５０】
さらに、本発明のインドナガコショウ抽出物は、ムスカリンＭ３又はムスカリンＭ２受容体を阻害するものであり、β３−アドレナリン受容体の作用剤である場合もある。
【００５１】
Ｍ３／Ｍ２受容体は、副交感神経作用受容体であり、目、泌尿器、胃腸管、心血管系に分布し、関連する疾患又は症状としては、慢性閉鎖性肺疾患、慢性気管支炎、喘息、成人／急性呼吸困難症候群、慢性呼吸閉鎖、気管支過反応性、肺線維症、肺気腫又はアレルギー性鼻炎、過敏性腸症候群、痙攣性大腸炎、胃・十二指腸潰瘍、胃腸痙攣又は運動機能亢進症、憩室炎、胃腸平滑筋の痙攣を伴う疼痛；神経原性頻尿症、神経原性膀胱、夜尿症、精神身体的膀胱、膀胱痙攣又は慢性膀胱炎に関連する失禁、過活動膀胱症候群、急尿症又は頻尿症を含む排尿障害などが挙げられる。
【００５２】
β３−アドレナリン受容体は、膀胱体部及び褐色脂肪細胞と白色脂肪細胞に分布し、関連する疾患又は症状としては、過体重、肥満、耐糖能障害、第１型糖尿、第２型糖尿、切迫尿、夜尿症及び尿失禁、神経原性膀胱、過活動膀胱症候群、急尿症又は頻尿症を含む排尿障害などが挙げられる。
【００５３】
このため、本発明の「排尿障害」は、排尿と関連して現れる正常的な排尿形態を外れた様々な障害を制限なしに含み、排尿筋の異常収縮又は弛緩などの排尿筋の低活動性、排尿筋の不安定、感覚性切迫尿などにより現れる障害である場合もある。特に、排尿障害は、好ましくは、頻尿、夜間尿、切迫尿、尿失禁、夜尿症を含む貯留症状；弱尿、分散尿、間歇尿、排尿躊躇 、腹圧排尿、排尿末尿点滴を含む排尿症状；残尿感、排尿後尿点滴を含む排尿後症状又は間質性膀胱炎などを含み、さらに好ましくは、過活動膀胱症候群、切迫尿失禁、切迫尿、頻尿、夜間尿及び間質性膀胱炎よりなる群から選ばれるいずれか１種である場合もある。
【００５４】
また、本発明の薬学的組成物は、排尿障害の予防、治療又は改善のために、単独で用いられてもよく、又は手術、ホルモン治療、薬物治療及び生物学的な反応調節剤を用いる方法と併用してもよい。
【００５５】
本発明の薬学組成物は、薬学的に許容される担体を添加して製剤化可能であり、製剤化に関する内容は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（最新版）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ ＰＡの文献を参照することができる。前記薬学的に許容可能な担体は、医薬発明部分に属する通常の技術者が医薬組成物の製造に際して通常的に用いるものを意味する。例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油などがある。なお、薬学的に許容される担体は、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を含む。
【００５６】
経口投与のための固形製剤としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤及びカプセル剤などが挙げられ、このような固形製剤は、本発明の薬学的組成物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース及びゼラチンなどを混ぜて調製される。なお、単純な賦形剤に加えて、マグネシウムステアレート、タルクなどの潤滑剤も使用可能である。
【００５７】
経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内容液剤、乳剤及びシロップ剤などが挙げられるが、汎用される単純希釈剤としての水、液状パラフィンに加えて、種々の賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤及び保存剤などが含まれる。
【００５８】
皮膚投与のために言及可能な例として、ダスティングパウダー、乳液、懸濁液、油、スプレイ、軟膏、油脂性軟膏、クリームペースト、ゲル、フォーム、又は溶液を生成するのに適しており、経皮吸収治療システム（ＴＴＳ：Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ）に適した担体及び／又は賦形剤が挙げられる。本発明の局所用薬学製剤は、半固体状剤形である場合もあり、特に、軟膏（溶液軟膏、懸濁液軟膏）、クリーム、ゲル又はペーストが挙げられる。油相に主として用いられるものとしては、脂肪アルコール、例えば、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、脂肪酸、例えば、パルミチン酸又はステアリン酸、液状又は固体相パラフィン又はオゾケライト、液状若しくは固体相ワックス、例えば、イソプロピルミリステート、天然脂肪又は一部の合成脂肪、例えば、ココナッツ脂肪酸トリグリセリド、硬化油、例えば、水素化されたピーナッツ又はキャスターオイル、或いはグリセロールの脂肪酸部分エステル、例えば、グリセロールモノステアレート又はグリセロールジステアレートが挙げられる。好適な乳化剤としては、界面活性剤、例えば、アニオン性界面活性剤、例えば、ポリアルコール又はこの酸化エチレン付加物の脂肪酸エステル、例えば、ポリグリセロール脂肪酸エステル又はポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、例えば、ソルビタンオレエート及び／又はソルビタンイソステアレートなど、イソステアレート、ステロール、又はポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル又は脂肪酸エステル、アニオン性界面活性剤、例えば、脂肪アルコールスルフェートのアルカリ金属塩、例えば、ナトリウムラウリルスルフェート、ナトリウムセチルスルフェート又はナトリウムステアリルスルフェートが挙げられ、これらは、前記脂肪アルコール、例えば、セチルアルコール又はステアリルアルコールの存在下で一般的に用いられる。中でも、クリーム乾燥を防ぐ製剤、例えば、ポリアルコール、例えば、グリセロール、ソルビトール、プロピレングリコール及び／又はポリエチレングリコールを水相に添加したり、又は保存剤、香料などを水相に添加することが可能である。
【００５９】
しかしながら、前記列挙された薬剤学的に許容される担体などで見た本発明が限定されることはなく、これらは単なる例示に過ぎない。
【００６０】
前記薬学的組成物に含有されるインドナガコショウ抽出物の適用量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物の形態、投与経路及び期間に応じて異なるが、場合によって適切に選ばれる。本発明において、用語「投与」は、ある適切な方法を用いて患者に本発明の排尿障害の予防又は治療用の組成物を導入することを意味し、本発明の排尿障害の予防又は治療用の組成物の投与経路は、目的の組織に達する限り、通常の経路を介して投与されてもよい。例えば、前記インドナガコショウ抽出物は、６０ｋｇの成人を基準として１日につき１乃至２４００ｍｇ／ｄａｙの容量で、好ましくは、１０乃至 １０００ｍｇ／ｄａｙの容量で投与可能であり、前記適用は、１日につき１回又は数回に分けて適用することもできる。なお、前記薬学的組成物は、組成物の総重量に対して前記インドナガコショウ抽出物を０．０００１乃至５０重量％で含む。前記薬学的組成物は、ヒトなどの哺乳動物に様々な経路で、例えば、経皮、経口、静脈、筋肉、又は皮下注射により適用されることができる。
【００６１】
また、本発明は、インドナガコショウ（Ｐｉｐｅｒ Ｌｏｎｇｕｍ Ｌ．）抽出物を有効成分として含む排尿障害の予防又は改善用の健康機能食品を提供する。 
【００６２】
本願発明の健康機能食品は、２００２年８月２６日付けで制定された韓国の健康機能食品に関する法律（ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＨＥＡＬＴＨ ＦＯＯＤＳ ＡＣＴ）に定義された食品を含む。具体的に、「健康機能食品」は、人体に有用な機能性を有する原料や成分を用いて錠剤・カプセル・粉末・顆粒・液状・丸などの剤形に製造・加工した食品を含む。
【００６３】
前記排尿障害は、排尿と関連して現れる正常的な排尿形態を外れた様々な障害を制限なしに含み、排尿筋の異常収縮又は弛緩などの排尿筋の低活動性、排尿筋の不安定、感覚的な切迫尿などにより現れる障害である、好ましくは、過活動膀胱症候群、切迫尿失禁、切迫尿、頻尿、夜間尿及び間質性膀胱炎よりなる群から選ばれるいずれか１種である。
【００６４】
前記健康機能食品は、各種の栄養剤、ビタミン、鉱物(電解質)、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含有し、これらに加えて、天然果物ジュース及び果物ジュース飲料並びに野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。このような成分は、単独で又は組み合わせて用いる。
【００６５】
前記健康機能食品は、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、ガム類、アイスクリーム類、スープ、飲料水、茶、機能水、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤のうちのいずれか一つの形である。
【００６６】
前記健康機能食品は、食品添加物をさらに含み、「食品添加物」としての適合有無は、別途の定めがない限り、韓国食品医薬品安全処に承認された食品添加物公典の総則及び一般試験法などに従い当該品目に関する規格及び基準により判定する。
【００６７】
前記「食品添加物公典」に収載された品目として、例えば、ケトン類、グリシン、クエン酸カリウム、ニコチン酸、けい皮酸などの化学的合成品、カキ色素、甘草抽出物、結晶セルロース、コウリャン色素、グアガムなどの天然添加物、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム製剤、麺類添加アルカリ剤、保存料製剤、タール色素製剤などの混合製剤類などが挙げられる。
【００６８】
本発明の健康機能食品を製造する過程において、飲料を含む食品に添加される本発明のインドナガコショウ抽出物は、必要に応じてその含量を適宜加減することができ、好ましくは、全体食品の１００重量％に対して１乃至１５重量％含まれるように添加することが好ましい。
【００６９】
以上、本明細書に記載の数値は、別途の断りのない限り、均等な範囲まで含むものと解釈されるべきである。
【実施例】
【００７０】
以下、本発明の理解の一助となるために、好適な製造例、実施例及び製剤例を提示する。しかし、下記の製造例、実施例及び製剤例は、本発明をさらに理解し易くするために提供されるものに過ぎず、製造例、実施例及び製剤例により本発明の内容が限定されることはない。下記の製造例１乃至５において、インドナガコショウ抽出物の製造のためにインドナガコショウ実を京東市場のブヨン薬業社（ソウル特別市東大門区旺山路１４７）から購入して使用した。
【００７１】
製造例１．インドナガコショウ抽出物の製造
製造例１．１．インドナガコショウの水抽出物の製造
陰乾ししたインドナガコショウ実１００ｇに１Ｌの水を加えて９５℃の恒温水浴槽（現代科学社製、Ｂ−９０）で３時間３０分間還流抽出した。これにより得られた抽出物はろ紙を用いて減圧ろ過した後、ろ液を５０乃至６０℃の条件で減圧濃縮し 、これから固形物８７．１％のインドナガコショウ抽出物軟エキス（インドナガコショウの水抽出物）９．６±０．１ｇを得て下記の毒性確認実験の試料として使用した。
【００７２】
製造例１．２．インドナガコショウの３０体積％のエタノール水溶液抽出物の製造
また、インドナガコショウの３０体積％のエタノール水溶液抽出物を製造するために、陰乾ししたインドナガコショウ実１２０ｇに１Ｌの３０体積％のエタノール水溶液を加え、８５乃至９５℃の恒温水浴槽（現代科学社製、Ｂ−９０）で３時間３０分間還流抽出した。これにより得られた抽出物はろ紙を用いて減圧ろ過した後、ろ液を５０乃至６０℃の条件の真空回転蒸発器（ＥＹＥＬＡ、Ｎ−１１００）を用いて蒸発濃縮し、真空乾燥器（ＪＥＩＯテック社製、ＯＶ−１２）で１２時間以上乾燥させてインドナガコショウの３０体積％のエタノール水溶液抽出物１０．８６ｇを得て下記の毒性確認実験の試料として使用した。
【００７３】
実施例１．インドナガコショウ抽出物の毒性確認
１−１．急性毒性実験
６週齢の無特定病原（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ；ＳＰＦ）ＳＤ系雌雄ラット（オリエント、韓国）を用いて急性毒性実験を行った。１群当たりに５匹ずつの実験動物に製造例１．１において製造されたインドナガコショウの水抽出物を２ｇ／ｋｇの単一の濃度で無特定病原（ＳＰＦ）ＳＤ系雌雄ラットのそれぞれ５匹（オリエント、韓国）に単回経口投与した。実験物質を投与した後、動物の斃死有無、臨床症状、体重の変化を観察し、剖検して目視で腹腔臓器及び胸腔臓器の異常有無を観察した。 その結果、実験物質を投与した全ての動物において特記すべき臨床症状や斃死された動物は無かった。なお、体重の変化及び剖検所見などにおいても毒性の変化は観察されなかった。以上の結果から、インドナガコショウの水抽出物は、経口投与最小半数致死量（ＬＤ５０）が２ｇ／ｋｇ以上である安全な物質であると判断された。
【００７４】
１．２．１週間の繰り返し投与毒性実験
長期に亘っての繰り返し投与毒性試験の容量設定の根拠として用いるために、無特定病原（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ；ＳＰＦ）雌性ＩＣＲマウス（オリエント、韓国）を用いて１週間繰り返し経口投与毒性実験を行った。１群当たりに５匹ずつの実験動物に製造例１．２において製造されたインドナガコショウの水抽出物の３０体積％のエタノール水溶液抽出物を１０００、５００、２５０ｍｇ／ｋｇの容量で毎日１回ずつ７日間経口投与した。実験物質を投与した後、動物の斃死有無、臨床症状、体重の変化を観察し、剖検して目視で腹腔臓器及び胸腔臓器の異常有無を観察した。 その結果、実験物質を投与した全ての動物において斃死された動物は無かった。また、１０００ｍｇ／ｋｇの投与群において、投与を始めてから２日目まで僅かな体重及び運動減少傾向が観察されたが、以降回復されて特記すべき臨床症状や体重の変化、剖検所見などにおいても毒性の変化は観察されなかった。以上の結果から、インドナガコショウの３０体積％のエタノール水溶液抽出物は、マウスにおいて１ｇ／ｋｇまで１週間繰り返し投与した場合にも毒性を示さない安全な物質であることを確認した。
【００７５】
１．３．４週間の繰り返し投与毒性実験
長期に亘っての投与時の毒性有無を確認するために、無特定病原（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ；ＳＰＦ）ＩＣＲマウスを用いて４週間繰り返し経口投与毒性実験を行った。１群当たりに５匹ずつの実験動物に製造例１．１において製造されたインドナガコショウの水抽出物を２０００、１０００、５００、２５０、１２５ｍｇ／ｋｇの容量で毎日１回ずつ２８日間経口投与した。実験物質を投与した後、動物の斃死有無、臨床症状、体重の変化を観察し、剖検して目視で腹腔臓器及び胸腔臓器の異常有無を観察した。 その結果、実験物質を投与した全ての動物において特記すべき臨床症状や斃死された動物は無かった。また、体重の変化及び剖検所見などにおいても毒性の変化は観察されなかった。以上の結果から、インドナガコショウの水抽出物は、マウスにおいて２ｇ／ｋｇまで４週間繰り返し投与した場合にも毒性を示さない安全な物質であることを確認した。
【００７６】
製造例２．インドナガコショウ抽出物の製造
抽出溶媒として、水及び有機溶媒であるエタノール、メタノール、エチルアセテート、イソプロパノール、ジクロロメタン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンを用いて、インドナガコショウ抽出物をそれぞれ製造した。
【００７７】
製造例２．１．インドナガコショウの水抽出物の製造
陰乾ししたインドナガコショウ実各５ｇを１００ｍＬの精製水を用いて８０乃至９０℃の恒温水浴槽（現代科学社製、Ｂ−９０）において３時間かけて還流抽出した。得られた抽出物をろ紙を用いて減圧ろ過した後、ろ液を５０乃至６０℃条件の真空回転蒸発器（ＥＹＥＬＡ、Ｎ−１１００）を用いて蒸発濃縮し、真空乾燥器（ＪＥＩＯテック社製、ＯＶ−１２）を用いて１２時間以上乾燥してインドナガコショウの水抽出物０．７６ｇを得、下記表１に示した。
【００７８】
製造例２．２．インドナガコショウ有機溶媒抽出物の製造
水の代わりに、抽出溶媒としてそれぞれエタノール、９５体積％のエタノール水溶液、メタノール、エチルアセテートを用いた以外は、前記製造例２．１の方法と同様にして抽出物を製造した。また、抽出溶媒としてそれぞれジクロロメタン、クロロホルム、ヘキサンを用いるときには、６０〜７０℃恒温水浴槽（現代科学社製、Ｂ−９０）において抽出した以外は、前記製造例２．１の方法と同様にして抽出物を製造した。得られた抽出物は０．２１ｇ〜０．８１ｇであり、これを具体的に表１に示した。
【００７９】
【表１】
2019014761.tif 000003
【００８０】
製造例２．３．インドナガコショウエタノール水溶液の濃度別の抽出物の製造
抽出溶媒をエタノール３０体積％、５０体積％、７０体積％、９５体積％のエタノール水溶液に変えた以外は、前記製造例２．１の方法と同様にして抽出物を製造した。得られた抽出物は０．６１ｇ乃至０．８６ｇであり、これを具体的に表２に示した。
【００８１】
【表２】
2019014761.tif 000004
【００８２】
製造例２．４．インドナガコショウの９５体積％のエタノール水溶液抽出物の有機溶媒分画物の製造
陰乾ししたインドナガコショウ実１ｋｇを約１０Ｌの９５体積％のエタノール水溶液を用いて恒温水浴槽（ＪＩＳＩＣＯ、Ｊ−ＢＡＬ）において３時間３０分間２回還流抽出した。得られた抽出物をろ紙を用いて減圧ろ過した後、ろ液を５０乃至６０℃条件の真空回転蒸発器（ＥＹＥＬＡ、Ｎ−１１００）を用いて蒸発濃縮し、真空乾燥器（ＪＥＩＯテック社製、ＯＶ−１２）を用いて１２時間以上乾燥させてインドナガコショウの９５体積％のエタノール水溶液抽出物８２．９９ｇを得た。前記インドナガコショウの９５体積％のエタノール水溶液抽出物を分画漏斗に蒸留水１．５Ｌを加えて懸濁した後、１．２乃至１．５Ｌの有機溶媒を加えて振とうさせ、有機溶媒の層分離を確認した後、当該有機溶媒を取って減圧濃縮する過程を行った。これは、ジクロロメタン、酢酸エチル、水飽和ｎ−ブタノールを順次進めており、有機溶媒分画物（５６．１３ｇ乃至２．２ｇ）及び有機溶媒層を除いた水層分画物約１０ｇが製造され、これを下記表３に示した。
【００８３】
【表３】
2019014761.tif 000005
【００８４】
実施例２．ムスカリンＭ３受容体の活性阻害効果の測定
ムスカリン（Ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ）Ｍ３受容体が発現されたヒトの膀胱平滑筋由来の一次培養細胞（ｈｕｍａｎ ｂｌａｄｄｅｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌｓ；ｈＢｄＳＭＣ）をロンザ（キャンブレックス）社から購入して使用した。培養液としては、同様にロンザ（キャンブレックス）社から購入した牛胎血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、５％）、組み換え成長因子（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ｈＥＧＦ、ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ｈＦＧＦ）、抗生剤（ゲンタマイシン）、インシュリン入り平滑筋細胞培地（ＳｍＧＭ−２）を使用し、５％のＣＯ２インキュベーターにおいて前記細胞をパッセージ１０乃至１３まで継代培養した。培養された細胞を６ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に接種（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、２４時間後に無血清ＤＭＥＭ培地(ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ＤＭＥＭ）において再び４８時間培養した。製造例２において製造されたインドナガコショウ抽出物を表４及び表５に表記した濃度で製造して培養された細胞に２時間かけて前処理し、排尿筋の収縮を引き起こすアセチルコリン（ＡＣｈ）２５μＭを２分間投与してＭ３受容体の活性を誘導した。対照群としては、アセチルコリン及びインドナガコショウ抽出物を処理しなかった細胞と、アセチルコリンのみを単独で２５μＭ処理した細胞を使用した。前記細胞を氷のように冷たいＰＢＳで洗浄した後、ｌｙｓｉｓ緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ、０．７５％のＤＯＣ（デオキシコール酸）、０．５％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、１ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）、２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ・ｐＨ８．０）に溶かして遠心分離した後、上澄み液を電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて分離した。次いで、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＬＣ２０（ｐ−ＭＬＣ２０抗体）を用いて平滑筋細胞の収縮に最も重要なＭＬＣ２０（ミオシン軽鎖）の活性をウェスタンブロット方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． （２００３）３７４：１４５）を用いて確認し、濃度計（デンシトメーター）（Ｂｉｏ−ｒａｄ， ＧＳ−７００）を用いて活性化度を定量化させた。アセチルコリンのみを入れた対照群ウェルの結果値を０％抑制にして薬物の濃度によるＭＬＣ２０活性（ｐＭＬＣ２０）抑制率（％）を計算し、その結果を下記表４及び５に示した。
【００８５】
【表４】
2019014761.tif 000006
【００８６】
【表５】
2019014761.tif 000007
【００８７】
ヒトの膀胱平滑筋細胞に神経伝達物質であるアセチルコリンを処理して不随意排尿筋収縮に関与するＭＬＣ２０活性を誘導した後、インドナガコショウ抽出物による活性抑制率を調べてみたところ、前記表４に示すように、様々な溶媒を用いて抽出したインドナガコショウ抽出物において抑制活性を示すことが確認された。これらの溶媒別のインドナガコショウ抽出物に対する結果に基づいて、エタノール含量別、９５％エタノール抽出物分画別の抽出物を製造例２において提示された方法を用いて製造して、上記の方法と同様にしてＭＬＣ２０活性を測定した。その結果、表５に示すように、エタノールを３０体積％以上含有するエタノール水溶液を用いて抽出した抽出物はいずれも１００μｇ／ｍｌ処理群において４５乃至５０％以上の抑制率を示し、且つ、９５％のエタノール抽出物のジクロロメタン及び酢酸エチル分画物においても高いＭＬＣ２０の活性抑制を示すことを確認した。以上の結果から、本発明によるインドナガコショウ抽出物及びエタノール抽出物の分画物は、尿貯留器にＭ３受容体を介して伝達されたアセチルコリンなどにより誘導される排尿筋の過活動性(収縮)を抑えることにより排尿障害を改善する効果があると推察される。
【００８８】
製造例３．インドナガコショウの９５体積％のエタノール水溶液抽出物の製造
インドナガコショウ実７００ｇを陰乾しした後、乾燥されたインドナガコショウに７ｌの９５体積％のエタノール水溶液を加えて９５℃において３時間３０分間還流抽出した。得られた抽出物をろ過した後、真空回転蒸発器を用いて５０乃至６０℃の条件下で減圧濃縮し、インドナガコショウの９５体積％のエタノール水溶液抽出物である軟エキス５２．７±０．１ｇを得て以下の実験に使用した。
【００８９】
実施例３．ムスカリンＭ２受容体活性阻害効果の測定
ムスカリン（Ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ）Ｍ２受容体は、ＧＰＣＲ(Ｇタンパク質共役受容体、Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）の一つで、作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）であるアセチルコリンが結合されると、アデニリルシクラーゼ酵素（ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ）の活性を抑えて細胞内のｃＡＭＰの濃度が下がることが知られている。一般に、細胞内のｃＡＭＰの量が増えると、排尿筋は弛緩し、逆に、ｃＡＭＰの量が減ると、排尿筋が収縮するため、排尿障害の改善有無を確認するに当たって、ｃＡＭＰの量を増加又は減少させる効果があるかを確認することが重要である。このため、９５体積％のインドナガコショウエタノール水溶液抽出物を前処理した後、ムスカリンＭ２受容体活性剤として働くアセチルコリンを処理してｃＡＭＰの濃度の減少を誘導し、膀胱平滑筋細胞にアデニリルシクラーゼ酵素（ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ）の活性化を通じて細胞内のｃＡＭＰの濃度を上昇させるフォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）を処理して、インドナガコショウ抽出物がアセチルコリンによるｃＡＭＰの濃度の減少を抑えるムスカリンＭ２受容体阻害活性を有するか否かを確認した。より具体的には、下記の通りである。
【００９０】
ムスカリンＭ２受容体が発現されたヒトの膀胱平滑筋由来の一次培養細胞（ｈＢｄＳＭＣ）をロンザ（キャンブレックス）社から購入して使用した。培養液としては、同様にロンザ（キャンブレックス）社から購入した牛胎血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、５％）、組換え成長因子（ｈＥＧＦ、ｈＦＧＦ）、抗生剤（ゲンタマイシン）、インシュリン入り平滑筋細胞培地（ＳｍＧＭ−２）を使用し、５％のＣＯ２インキュベータにおいてパッセージ１０乃至１３まで継代培養した。培養した膀胱平滑筋由来の一次培養細胞（ｈＢｄＳＭＣ）を２４ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に一杯に満たして生長させた後、ＰＢＳで洗浄し、無血清ＤＭＥＭ培地に０．５ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を３０分間前処理した後、対照薬物であるオキシブチニン又は製造例３において製造されたインドナガコショウエタノール抽出物を濃度別に３０分間処理した。次いで、アセチルコリン（ＡＣｈ）１０uＭを５分間投与した後、細胞内のｃＡＭＰの濃度を増加させるフォルスコリン１０uＭとともに１５分間培養し、０．１ＭのＨＣｌを入れて反応を終えた。０．１ＭのＨＣｌに溶解された細胞を遠心分離した後、上澄み液を取ってＥＬＩＳＡキットを用いて吸光度(４０８ｎｍ)を測定することにより細胞内のｃＡＭＰの量を評価した。 結果を下記表６に示す。
【００９１】
【表６】
2019014761.tif 000008
【００９２】
前記表６に示すように、アセチルコリン単独処理群は、フォルスコリンがアデニリルシクラーゼ酵素を直接的に活性化させることにより誘導される細胞内のｃＡＭＰの急激な増加を約１１％のレベルまで減少させたのに対し、インドナガコショウ抽出物を処理した実験群においては、インドナガコショウ抽出物の処理濃度に依存してｃＡＭＰの濃度が増加した。すなわち、インドナガコショウ抽出物は、ムスカリンＭ２受容体を阻害して細胞内のｃＡＭＰ蓄積の抑制を緩和させることにより細胞内のｃＡＭＰの濃度を増加させることができるということが確認できた。特に、インドナガコショウ抽出物を１５０uｇ／ｍｌで処理した実験群においては、フォルスコリン単独処理群の８４．８２％までｃＡＭＰの濃度を回復させる優れた効果を示した。このような結果から、インドナガコショウ抽出物は、ｃＡＭＰの量を増加させることにより排尿筋を効果的に弛緩させる作用を有する物質として使用可能であることが分かる。
【００９３】
実施例４．β３−アドレナリン受容体活性効果の測定
β３−アドレナリン受容体は、ｃＡＭＰ信号伝達経路を介して排尿筋の弛緩に関与するものであることが知られているため、この活性指標である細胞内のｃＡＭＰの量を測定してインドナガコショウ抽出物の排尿異常症状の改善効果を確認した。β３及びβ１−アドレナリン受容体が過発現されたＳＫ−Ｎ−ＭＣ（神経芽細胞腫細胞）を２４ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に５×１０５個／ウェルで分注し、２４時間後にＰＢＳで洗った後、無血清培地に交換し、０．５ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）及びβ１−アドレナリンの効果を排除するためのβ１−アドレナリン受容体拮抗剤であるＣＧＰ−２０７１２Ａ ５uＭを３０分間前処理した。このような前処理は、β１−アドレナリン受容体による効果を排除し、β３−アドレナリン受容体の効果によるｃＡＭＰの量の変化を確認するために行った。処理した細胞に製造例２のインドナガコショウ抽出物を下記表に表記した濃度で製造して投与し、培養器において３０分間反応させた後、０．１ＭのＨＣｌを入れて細胞を溶かした。細胞内のｃＡＭＰの量は、ＥＬＩＳＡキットを用いて測定し、抽出物を処理しなかった対照群とその量を比較し、結果を下記表７、８に示した。
【００９４】
【表７】
2019014761.tif 000009
【００９５】
【表８】
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【００９６】
前記表７に示すように、インドナガコショウエタノール抽出物は、インドナガコショウ抽出物未処理対照群と比較して、細胞内のｃＡＭＰの量をはっきりと濃度依存的に増加させ、１００μｇ／ｍｌ以上のインドナガコショウ抽出物処理群においては、約３倍以上の顕著なｃＡＭＰ増加効果が確認できた。また、インドナガコショウのジクロロメタン、メタノール抽出物だけではなく、水抽出物においても、ｃＡＭＰの量が増加されることを示した。前記表７の９５％のエタノール抽出物の結果に基づいて、エタノール含量別、９５％のエタノール分画別の抽出物を上記の方法と同様にして細胞に処理して細胞内のｃＡＭＰの量を測定した後、対照群と比較した。その結果、表８に示すように、エタノールを３０体積％以上含有する水溶液を用いて抽出した抽出物は、いずれも１００uｇ／ｍｌ処理群において対照群に比べて約２倍以上のｃＡＭＰの増加効果を確認し、且つ、９５％のエタノール抽出物のジクロロメタン分画物においてもｃＡＭＰの増加効果を確認した。このため、様々な濃度の含水エタノールを用いて抽出したインドナガコショウのエタノール水溶液抽出物及びエタノール水溶液抽出物の様々な有機溶媒分画物が排尿筋の弛緩を誘導することを確認した。
【００９７】
上述した結果から、インドナガコショウ抽出物は、アセチルコリンにより誘導されるＭＬＣ２０の活性を阻害し、ムスカリンＭ２受容体を用いた細胞内のｃＡＭＰの蓄積の抑制を効果的に緩和するとともに、排尿筋の弛緩にあずかるβ３−アドレナリン受容体の活性指標である細胞内のｃＡＭＰの量を増加させる物質であることを確認した。このため、インドナガコショウ抽出物は、ムスカリンＭ３／Ｍ２受容体及びこれと関連する信号伝達体系を抑えることにより、これらの受容体の拮抗剤の役割を果たすだけではなく、β３−アドレナリン受容体の亢進作用の複合作用を用いて排尿筋の収縮を抑え、排尿筋の弛緩を誘導することから、排尿異常症状に対する治療又は改善効果を有するものと推察される。
【００９８】
製造例４．インドナガコショウ抽出物の製造
インドナガコショウ抽出物の排尿障害の改善効果を動物モデルにおいてさらに確認するために、インドナガコショウの９５％のエタノール水溶液抽出物及びインドナガコショウの水抽出物を製造した。
【００９９】
製造例４．１．インドナガコショウの９５％のエタノール水溶液抽出物の製造
インドナガコショウ実２００ｇに、１．０ｌの９５体積％のエタノール水溶液を加え、９５℃において３時間３０分間２回還流抽出した。抽出物はろ過した後に濃縮して乾燥させて９５％のエタノール水溶液抽出物を準備した。
【０１００】
製造例４．２．インドナガコショウの水抽出物の製造
インドナガコショウの水抽出物は、抽出溶媒を水に変えた以外は、前記製造例４．１のインドナガコショウの９５体積％のエタノール抽出物の製造方法と同様にしてインドナガコショウの水抽出物を準備した。
【０１０１】
実施例５．インドナガコショウ抽出物を７日間前処理したＣＹＰ膀胱炎症モデルにおける排尿圧力及び排尿間隔の調節効果
ＣＹＰを用いた動物モデルを用いて、インドナガコショウ抽出物の排尿圧力及び膀胱容積に関する効果を確認した。 膀胱炎症誘発モデルとしてシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ；以下、ＣＹＰと称する。）を用いた実験モデルは、炎症が膀胱にのみ限定され、薬物を投与してから数時間内に炎症を引き起こし、手術や気道の挿管が不要であり、ヒトにおいてもＣＹＰが膀胱炎を引き起こすため、痛症の形態と排尿症状が略同じであるというメリットがある（シクロホスファミドにより引き起こされた白鼠膀胱の排尿筋過活動性に対するボツリヌストキシン及びレシニフェラトキシンの効果に関する研究、大韓泌尿器科学会誌：第４７券第１号２００６）。これにより、シクロホスファミド（ＣＹＰ）は、動物及びヒトの膀胱に化学的な炎症を用いて膀胱過活動を誘導することから、極性排尿症状とともに尿力動学検査において排尿筋過活動性などを示して、過活動膀胱に対する動物モデルと見なされている （ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＹＳＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ ２００９， ６０， ４， ８５−９１． Ｕｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌａｄｄｅｒ ｃ−ｆｉｂｅｒ ａｆｆｅｒｅｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｏｖｅｒａｃｔｉｖｅ ｂｌａｄｄｅｒ ｉｎ ｒａｔｓ）。
【０１０２】
５．１．実験動物
８週齢の無特定病原（ＳＰＦ）ＳＤ系雌性ラット２０匹をオリエント（韓国）から購入して使用した。昼及び夜を１２時間の周期に調節し、食べ物及び水は自由に摂取させた。
【０１０３】
５．２．インドナガコショウ抽出物の尿力動学指標の改善効果
排尿障害の改善を確認するための指標である膀胱圧及び排尿間隔を測定するために、正常対照群を除いたラットにおいて、まず、膀胱内圧測定法（ｃｙｓｔｏｍｅｔｒｙ）遂行３日前にシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）を１５０ｍｇ／ｋｇで単回腹腔投与して過活動膀胱症を引き起こした。膀胱内圧測定７日前から、溶媒対照群には、溶媒（ＤＭＳＯ／１０％のクレモフォールＥＬ＝１：９、ｖｏｌ／ｖｏｌ）を投与し、実験群には、製造例４．１において製造されたインドナガコショウ実の９５体積％のエタノール水溶液抽出物を２００ｍｇ／ｋｇで投与した。 膀胱内圧の測定及び生理食塩水の注入のために、尿力動学指標測定当日にラットに麻酔をした後、下腹部の中央を切開してカフス付きポリエチレンカテーテル（ＰＥ−５０、ベクトン・ディッキンソン、パーシッパニー、米国）を膀胱穹窿部にタバコ嚢縫合法を用いて固定した。膀胱内管及び腹圧測定管挿入術を行った後、ラットの膀胱内管を３方コックを用いて顕微注射ポンプ（ＫＤＳ１００シングルシリンジ注入ポンプ；ＫＤサイエンティフィック社製）及び圧力測定計（圧力変換器、ＧＲＡＳＳ ＭＯＤＥＬ ７ ＰＯＬＹＧＲＡＰＨ；ＧＲＡＳＳインストゥルメント社製、米国）に連結した。次いで、挿入３０分後から２時間かけて膀胱内の注入ポンプを用いて０．０４ｍｌ／分の速度で室温の生理食塩水を注入しながら膀胱の内圧など尿力動学的指標を測定した。膀胱内圧の資料収集及び分析は、チャート４パワーラブ（ＡＤインストゥルメント社製、米国）を用いて行い、測定した排尿サイクルのうち、薬物の投与前後のそれぞれ４〜５個の連続的な排尿収縮ピークを選んで平均を取った。
【０１０４】
測定されたＣＹＰ動物モデルにおける尿力動学検査の数値及びそれぞれの定義は、次の通りである。 ５回の繰り返し的な排尿周期において、膀胱内圧指標である基底圧（ｂａｓａｌ ｐｒｅｓｓｕｒｅ；ＢＰ）は、膀胱内圧検査において最も低い圧力であり、臨界圧（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ；ＴＰ）は、膀胱収縮直前の圧力であり、排尿圧（ｍｉｃｔｕｒｉｔｉｏｎ ｐｒｅｓｓｕｒｅ；ＭＰ）は、排尿時に現れる最大の膀胱圧である。 排尿間隔（ｍｉｃｔｕｒｉｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｖａｌ；ＭＩ）は、排尿圧とその直後の排尿周期の排尿圧との間の時間間隔を測定して計算した。排尿周期を１２０分間測定し、測定された排尿周期から最も代表的な５個の連続的な周期を選んで各変数の平均値を計算した。 結果を下記表９及び図１に示した。
【０１０５】
【表９】
2019014761.tif 000011
【０１０６】
前記表９及び図１から明らかなように、インドナガコショウの９５体積％のエタノール水溶液抽出物は、インドナガコショウ抽出物を処理しなかった過活動膀胱症候群溶媒対照群と比較して、排尿間隔（ＭＩ）を１９５．９０±９２．９１と非常に顕著に増加させ、排尿障害と関連する様々な膀胱圧力指数であるＢＰ、ＩＭＰ、ＭＰ、ＴＰをいずれも均一に正常対照群のレベルに保つことを確認し、特に、膀胱の貯留機能と関連する膀胱圧測定変数である臨界圧（ＴＰ）に対して有意的な改善効果を示すことを確認した。
【０１０７】
実施例６．インドナガコショウ抽出物を３日間前処理したＣＹＰ膀胱炎症モデルにおける排尿圧、膀胱容積、排尿間隔の調節効果
６．１．実験動物
無特定病原（ＳＰＦ）ＳＤ系雌系ラット６５匹をオリエント（韓国）から購入して使用した。昼及び夜を１２時間の周期に調節し、食物及び水は自由に摂取させた。
【０１０８】
６．２．インドナガコショウ抽出物の尿力動学指標の改善効果
排尿障害の改善を確認するための指標である膀胱圧、膀胱容積及び排尿量を測定するために、正常対照群を除いたラットにおいて、まず、膀胱内圧測定法（ｃｙｓｔｏｍｅｔｒｙ）遂行３日前にシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）を１５０ｍｇ／ｋｇで単回腹腔投与して過活動膀胱症を引き起こした。膀胱内圧測定３日前に、溶媒対照群には、溶媒（ＤＭＳＯ／１０％のクレモフォールＥＬ＝１：９、ｖｏｌ／ｖｏｌ）を投与し、実験群には、製造例４．１において製造されたインドナガコショウ実の９５体積％のエタノール水溶液抽出物を２００ｍｇ／ｋｇで投与した。なお、陽性対照群としてのオキシブチニンを実験当日に０．３ｍｇ／ｋｇ尾静脈を介して注入した。
【０１０９】
膀胱内圧の測定及び生理食塩水の注入のために用いた膀胱内管挿入法及び膀胱内圧の測定のための器具は、前記実施例５．２と同様であり、排尿量及び残尿量は、１．５ｍｌのチューブに尿を採取してその重さを測定して記録した。
【０１１０】
測定されたＣＹＰ動物モデルにおける尿力動学検査の数値及びそれぞれの定義は、次の通りである。 膀胱内圧指標である基底圧（ｂａｓａｌ ｐｒｅｓｓｕｒｅ；ＢＰ）、臨界圧（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ；ＴＰ）、排尿圧（ｍｉｃｔｕｒｉｔｉｏｎ ｐｒｅｓｓｕｒｅ；ＭＰ）及び排尿間隔（ｍｉｃｔｕｒｉｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｖａｌ；ＭＩ）は、前記実施例５．２と同様に定義される。また、容積変数指標である排尿量（Ｖｏｉｄｉｎｇ Ｖｏｌｕｍｅ；ＶＶ）は、尿力動学測定時間のうち最後の排尿時に１．５ｍｌのチューブに尿を採尿してその重さを測定して決定した。残尿量（ｒｅｓｉｄｕａｌ ｖｏｌｕｍｅ；ＲＶ）は、排尿が終わった後に膀胱に挿入された管を所定の時間の間にラットよりも下部に誘致させて得た食塩水の重さを測定して決定した。膀胱容積（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｐａｃｉｔｙ；ＢＣ）は、測定されたラットの残尿量（Ｒｅｓｉｄｕａｌ Ｖｏｌｕｍｅ；ＲＶ）及び排尿量（Ｖｏｉｄｉｎｇ Ｖｏｌｕｍｅ；ＶＶ）を合算して計算した。 排尿周期を１２０分間測定し、測定された排尿周期から最も代表的な５個の連続的な周期を選んで各変数の平均値を測定した。 結果を表１０及び図２に示した。
【０１１１】
【表１０】
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【０１１２】
前記表１０及び図２に示すように、インドナガコショウエタノール抽出物は、排尿障害状態である過活動膀胱において現れる頻尿と関連する変数である排尿間隔（ＭＩ）において、過活動膀胱症誘発溶媒対照群に比べて、有意的な改善効果を示す。また、膀胱の貯留機能と関連する膀胱圧の測定変数である非排尿時の基底圧（ＢＰ）、排尿圧（ＭＰ）、臨界圧（ＴＰ）に対しても過活動膀胱症の改善効果を示す。排尿量（ＶＶ）もまた、陽性対照群であるオキシブチニン処理群と略同じレベルに改善可能であることを確認した。
【０１１３】
６．３．インドナガコショウのエタノール及び水抽出物の尿力動学指標の改善効果
抽出溶媒として水を用いたインドナガコショウ抽出物もまた、尿力動学指標が改善できるか否かを確認した。より具体的に、製造例４．１のインドナガコショウの９５体積％のエタノール抽出物に加えて、追加実験群として、製造例４．２のインドナガコショウの水抽出物を処理した以外は、前記実施例６．２の方法と同様にして尿力動学指標改善効果をＣＹＰ動物モデルを用いて評価し、過活動膀胱症と関連する排尿障害を評価する代表的な指標である排尿量（ＶＶ）及び排尿間隔（ＭＩ）を測定して比較した。 結果を下記表１１及び図３に示す。
【０１１４】
【表１１】
2019014761.tif 000013
【０１１５】
前記表１１及び図３から明らかなように、インドナガコショウエタノール抽出物及びインドナガコショウの水抽出物は、両方とも排尿量（ＶＶ）を過活動膀胱溶媒対照群と比較して非常に有意的に増加させ、排尿間隔（ＭＩ）もまた、溶媒対照群と比較して約２倍以上に顕著に増加させた。このような結果から、インドナガコショウのエタノール抽出物だけではなく、インドナガコショウの水抽出物もまた、排尿障害に伴われる排尿間隔の減少及び排尿量の減少を改善することから、頻尿、切迫尿などを伴う過活動膀胱症候群などの様々な排尿障害を市販中のオキシブチニンと略同じレベルで予防又は治療する優れた効果を有する物質であることを確認した。
【０１１６】
製造例５．インドナガコショウ抽出物の製造
製造例５．１．インドナガコショウの水抽出物の製造
陰乾ししたインドナガコショウ実１Ｋｇに６．０Ｌの水を加え、８０乃至９０℃の恒温水浴槽（現代科学社製、Ｂ−９０）において３時間３０分間２回還流抽出した。これにより得られた抽出物は、ろ紙を用いて減圧ろ過した後、ろ液を５０乃至６０℃条件の真空回転蒸発器（ＥＹＥＬＡ、Ｎ−１１００）を用いて蒸発濃縮し、真空乾燥器（ＪＥＩＯテック社製、ＯＶ−１２）を用いて１２時間以上乾燥させてインドナガコショウの水抽出物を得た。
【０１１７】
製造例５．２．インドナガコショウの３０体積％のエタノール水溶液抽出物の製造
陰乾ししたインドナガコショウ実１Ｋｇに６．０Ｌの３０体積％のエタノール水溶液を加え、８０乃至９０℃の恒温水浴槽（現代科学社製、Ｂ−９０）において３時間３０分間２回還流抽出した。これにより得られた抽出物は、ろ紙を用いて減圧ろ過した後、ろ液を５０〜６０℃条件の真空回転蒸発器（ＥＹＥＬＡ、Ｎ−１１００）を用いて蒸発濃縮し、真空乾燥器（ＪＥＩＯテック社製、ＯＶ−１２）を用いて１２時間以上乾燥させてインドナガコショウの３０体積％のエタノール水溶液抽出物を得た。
【０１１８】
製造例５．３．インドナガコショウの９５体積％のエタノール水溶液抽出物の製造
陰乾ししたインドナガコショウ実７００ｇに７．０Ｌの９５体積％のエタノール水溶液を加え、８０〜９０℃の恒温水浴槽（現代科学社製、Ｂ−９０）において３時間３０分間２回還流抽出した。これにより得られた抽出物は、ろ紙を用いて減圧ろ過した後、ろ液を５０〜６０℃条件の真空回転蒸発器（ＥＹＥＬＡ、Ｎ−１１００）を用いて蒸発濃縮し、真空乾燥器（ＪＥＩＯテック社製、ＯＶ−１２）を用いて１２時間以上乾燥させてインドナガコショウの９５体積％のエタノール水溶液抽出物を得た。 具体的な内容を下記表１２に示す。
【０１１９】
【表１２】
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【０１２０】
実施例７．ＳＨＲ非麻酔排尿回数の評価モデルを用いたインドナガコショウ抽出物の効果
排尿障害診断は、患者が感じる症状に基づいて行われるため、膀胱及び神経系の支配に加えて、精神的な要因もまた重要な役割を果たす。このため、排尿障害を評価するためには、非麻酔下の動物における排尿変数を客観的に観察することが重要である。このような必要性を考慮して、自然発生高血圧のラット（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ Ｒａｔ；以下、ＳＨＲ）モデルを用いたヒトの過活動膀胱への取り組みが盛んに行われている。自然発生高血圧のラットは、もともとはヒトの高血圧に対する動物モデルとして開発されたが、最近には、過活動膀胱モデルとして用いられており、これらは、頻尿とともに尿力動学検査において排尿筋過活動などを示して、客観的に公認されたヒトの過活動膀胱に対する動物モデルと見なされている（Ｊｉｎ ＬＨ ｅｔ ａｌ． Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｄｅｔｒｕｓｏｒ ｏｖｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｃｏｎｓｃｉｏｕｓ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｅ ｂｅｈａｖｉｏｕｒ． Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｕｒｏｌ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００９； ４３： ３−７）。ヒトの過活動膀胱症候群と最も類似している自然発生高血圧のラットを用いた実験において、薬物を投与してから排尿間隔の増加を評価するモデルは、いずれか一つの機序による効果ではなく、様々な機序による改善度を評価する発展されたモデルである。このため、本発明のインドナガコショウ抽出物の過活動膀胱症候群に対する改善及び治療効果をＳＨＲモデルにおいて確認した。
【０１２１】
７．１ 実験動物
１２週齢の雄性ＳＨＲをＳＬＣ（日本）から購入して使用した。昼及び夜を１２時間の周期に調節し、食物及び水は自由に摂取させた。１８週齢のＳＨＲに溶媒及び製造例５の薬物を投与した後、排尿回数を測定する実験を行った。
【０１２２】
７．２ インドナガコショウ抽出物の排尿回数の減少効果
同じＳＨＲに、実験の１日目には溶媒を投与し、２日目には製造例５．２の実験薬物（インドナガコショウの水及び３０体積％のエタノール水溶液抽出物）を３００ｍｇ／ｋｇで投与し、二日間の投与ボリュームはｋｇ／１０ｍｌと同様にした。このとき、インドナガコショウの水抽出物の投与群に１日目に投与された溶媒は蒸留水（Ｄ．Ｗ）であり、インドナガコショウの３０体積％のエタノール水溶液抽出物の投与群に１日目に投与された溶媒は、ＤＭＳＯ／１０％のクレモフォール ＥＬ＝１：９、ｖｏｌ／ｖｏｌ）である。 同じＳＨＲ個体において、溶媒を投与したＳＨＲの排尿回数、排尿量、１回の排尿量の測定結果を対照群の数値とし、実験薬物を投与したＳＨＲの排尿回数、排尿量、１回の排尿量の測定結果を実験群の数値とした。具体的に、１日目に溶媒を投与した後、ＳＨＲを直ちに代謝ケージに入れ、水のみを供給した状態で１６時間（ＰＭ５時〜ＡＭ９時）かけてアイソメトリックトランスジューサー（ハーバードアパレイタス）及びＭＰ１５０（ＢＩＯＰＡＣシステムズ社製、品番：ＭＰ１５０ＣＥ）を用いて排尿回数、排尿量、１回の排尿量を測定し、これを対照群の数値とした。１日目に溶媒を投与したＳＨＲに２日目に製造例５．２の実験薬物（インドナガコショウの水及び３０体積％のエタノール水溶液抽出物）を投与した後、ＳＨＲを直ちに代謝ケージに入れ、水のみを供給した状態で１６時間（ＰＭ５時〜ＡＭ９時）かけてアイソメトリックトランスジューサー（ハーバードアパレイタス）及びＭＰ１５０（ＢＩＯＰＡＣシステムズ社製、品番：ＭＰ１５０ＣＥ）を用いて、排尿回数、排尿量、１回の排尿量を測定し、これを実験群数値とした。溶媒（１日目）及び実験薬物（２日目）を投与した後、１６時間の排尿回数、排尿量、１回の排尿量のデータを比較して統計処理した（対応標本ｔ-検定）。 結果を下記表１３及び図４に示す。
【０１２３】
【表１３】
2019014761.tif 000015
【０１２４】
前記表１３及び図４から明らかなように、インドナガコショウの水抽出物及びインドナガコショウの３０体積％のエタノール水溶液抽出物は、両方とも過活動膀胱において現れる頻尿と関連する変数である排尿回数において、溶媒対照群に比べて有意的な改善効果を示す。特に、インドナガコショウの３０体積％のエタノール水溶液抽出物は、膀胱の貯留機能と関連する１回の排尿量に対しても溶媒対照群に比べて有意的に増加させることから、過活動膀胱症に対してインドナガコショウの水抽出物よりも優れた改善効果を示すことを確認した。 
【０１２５】
実施例８．ＳＨＲにおける非麻酔下での尿力動学検査を用いたインドナガコショウ抽出物の効果
８．１ 実験動物
１２乃至１８週齢の雄性ＳＨＲをチャールスリバー（日本）から購入して使用した。昼及び夜を１２時間の周期に調節し、食物及び水は自由に摂取させた。全てのラットにいかなる薬物を注入しなかった状態で３乃至５周期で排尿させた。いかなる薬物も投与しなかった状態のラットの排尿変数を尿力動学指標の対照群とし、尿力動学検査の測定当日に製造例４．２において製造されたインドナガコショウ実の水抽出物を３００ｍｇ／ｋｇで胃に連結されたカテーテルを介して胃腸管に自ら投与したラットを実験群とした。陽性対照群として、トルテロジンを１ｍｇ／ｋｇで投与したラットを使用した。インドナガコショウの水抽出物及びトルテロジンの投与ラットは、それぞれ６匹に設定した。
【０１２６】
８．２．インドナガコショウ抽出物の尿力動学指標の改善効果
排尿障害の改善を確認するための指標である膀胱圧、膀胱容積、排尿量及び排尿間隔を測定するために、ＳＨＲモデルに膀胱内管及び腹圧測定管の挿入術を行った。まず、膀胱内圧の測定及び生理食塩水の注入のために尿力動学測定日３日前にラットの下腹部の中央を切開し、カフス付きポリエチレンカテーテル（ＰＥ−１０、ベクトン・ディッキンソン、パーシッパニー、米国）を膀胱の上に固定し、別のポリエチレンカテーテル（ＰＥ−１０、ベクトン・ディッキンソン、パーシッパニー、米国）を胃腸管に挿入した後に固定した。前記カテーテルを皮膚の下側に通過させた後、背側の皮膚に固定し、先端部分は熱を加えて閉塞した。膀胱内管及び腹圧測定管の挿入術施行３日後に代謝ケージに無麻酔の自由な状態のラットを入れ、Ｔ字管を用いて首の後ろの管を顕微注射ポンプ（ＰＨＤ２２／２０００ポンプ；ハーバードアパレイタス）及び圧力測定計（圧力変換器、リサーチグレード血液圧力変換器；ハーバードアパレイタス、ホリストン、米国）に連結した後、１０ｍｌ／時間の速度で室温の生理食塩水を注入しながら膀胱内圧を測定した。これは、膀胱が所定の体積の生理食塩水で満たされると、排尿のために膀胱が収縮するという原理を用いて、ラットの膀胱内圧を測定することである。腹圧測定管は、他の圧力測定計に連結して腹圧を測定した。また、容積変数指標である排尿量の測定のために尿採取カップをフォース変位トランスデューサー（リサーチグレード アイソメトリックトランスジューサー；ハーバードアパレイタス）に連結してこのカップに集められた尿の量で排尿量を測定した。膀胱内圧及び腹圧、排尿量の資料の収集及び分析は、ＭＰ１５０データ収集システム（ＢＩＯＰＡＣシステムズ社製、ゴリータ、米国）及びＡｃｑ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ３．８．１ソフトウェアを用いて観察した。
【０１２７】
インドナガコショウ抽出物及びトルテロジンを投与する前に、尿力動学指標の測定を始めて３乃至５回の安定化された排尿サイクル記録を得た。次いで、カテーテルの連結を解除し、インドナガコショウ抽出物及びトルテロジンを経口投与した。薬物を経口投与してから２０分後から再びカテーテルを連結してラットを３回〜５回排尿させながら排尿サイクル及び尿力動学検査を行った。測定した排尿サイクルのうち、薬物の投与前後に測定された排尿周期から最も代表的な３つの連続的な周期を選んで各変数の平均値を測定した。
【０１２８】
本実験の尿力動学的数値及びそれぞれの定義は、次の通りである。 ３回の繰り返し的な排尿周期において、膀胱内圧指標である基底圧（ｂａｓａｌ ｐｒｅｓｓｕｒｅ；ＢＰ）は、膀胱内圧検査において最も低い圧力であり、臨界圧（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ；ＴＰ）は、膀胱収縮直前の圧力であり、排尿圧（ｍｉｃｔｕｒｉｔｉｏｎ ｐｒｅｓｓｕｒｅ；ＭＰ）は、排尿時に現れる最大の膀胱圧である。残尿量（ｒｅｓｉｄｕａｌ ｖｏｌｕｍｅ；ＲＶ）は、排尿が終わった後に膀胱に挿入された管を所定の時間の間にラットよりも下部に誘致させて得た食塩水を測定して導き出した。膀胱容積（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｐａｃｉｔｙ；ＢＣ）は、測定されたラットの残尿量（Ｒｅｓｉｄｕａｌ Ｖｏｌｕｍｅ；ＲＶ）及び排尿量（Ｖｏｉｄｉｎｇ Ｖｏｌｕｍｅ；ＶＶ）を合算して計算した。 排尿周期を１２０分間測定し、測定された排尿周期から最も代表的な５個の連続的な周期を選んで各変数の平均値を測定した。 ＳＨＲモデルにおける排尿間隔（ｍｉｃｔｕｒｉｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｖａｌ；ＭＩ）は、３回の排尿周期のうち、排尿圧と直後の排尿周期の排尿圧との間の時間間隔を測定し、その時間間隔から残尿を測定した時間を差し引いた値を意味する。 結果を下記表１４及び図５に示す。
【０１２９】
【表１４】
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【０１３０】
前記表１４及び図５から明らかなように、インドナガコショウ抽出物は、排尿間隔（ＭＩ）を投与前の対照群と比較して６０．７％増加させた。これは、過活動膀胱症候群の最もはっきりとした症状である頻尿を効果的に改善することを意味する。また、排尿量（ＶＶ）及び膀胱容積（ＢＣ）もまた、対照群と比較して６０％以上増加させた。上述した結果から、本発明のインドナガコショウ抽出物は、過活動膀胱症候群の状態で現れる頻尿と関連する体積変数である排尿量（ＶＶ）、膀胱容積（ＢＣ）及び排尿間隔（ＭＩ）をいずれも顕著に改善することができ、インドナガコショウ抽出物が市販中のトルテロジンよりもなお一層優れた排尿障害の改善効果を示すことを確認した。
【０１３１】
製剤例１．医薬品の製造
１．１．散剤の製造
インドナガコショウ抽出物 １００ｍｇ 乳糖 １００ｍｇ タルク １０ｍｇ 上記の成分を混合し、気密布に充填して散剤を製造する。
【０１３２】
１．２．錠剤の製造
インドナガコショウ抽出物 １００ｍｇ トウモロコシ澱粉 １００ｍｇ 乳糖 １００ｍｇ ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ 上記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法に従って打錠して錠剤を製造する。
【０１３３】
１．３．カプセル剤の製造
インドナガコショウ抽出物 １００ｍｇ トウモロコシ澱粉 １００ｍｇ 乳糖 １００ｍｇ ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ 通常のカプセル剤の製造方法に従って上記の成分を混合し、ゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造する。
【０１３４】
１．４．注射剤の製造
インドナガコショウ抽出物 １００ｍｇ 注射用滅菌蒸留水 適量 ｐＨ調節剤 適量 通常の注射剤の製造方法に従い、１アンプル当たり（２ｍｌ）、上記の成分含量に製造する。
【０１３５】
１．５．液剤の製造
インドナガコショウ抽出物 １００ｍｇ 砂糖 ２０ｇ 異性化糖 ２０ｇ レモン香り 適量 精製水を加えて、全体１，００ｍｌに合わせた。通常の液剤の製造方法に従い、上記の成分を混合した後、褐色瓶に充填し、滅菌させて液剤を製造する。
【０１３６】
製剤例２．健康機能食品の製造
インドナガコショウ抽出物 １００ｍｇ ビタミン混合物 適量 ビタミンＡアセテート ７０μｇ ビタミンＥ １．０ｍｇ ビタミンＢ１ ０．１３ｍｇ ビタミンＢ２ ０．１５ｍｇ ビタミンＢ６ ０．５ｍｇ ビタミンＢ１２ ０．２μｇ ビタミンＣ １０ｍｇ ビオチン １０μｇ ニコチン酸アミド １．７ｍｇ 葉酸 ５０μｇ パントテン酸カルシウム ０．５ｍｇ 無機質混合物 適量 硫酸第１鉄 １．７５ｍｇ 酸化亜鉛 ０．８２ｍｇ 第１リン酸カリウム １５ｍｇ 第２リン酸カルシウム ５５ｍｇ クエン酸カリウム ９０ｍｇ 炭酸カルシウム １００ｍｇ 塩化マグネシウム ２４．８ｍｇ 上記のビタミン及びミネラル混合物の組成比は、比較的に健康機能食品に好適な成分を好適な実施例を用いて混合して造成したが、その配合比を任意に変形して実施しても構わなく、通常の健康機能食品の製造方法に従い上記の成分を混合した後、通常の方法に従い健康機能食品組成物の製造（例えば、栄養キャンディなど)に使用可能である。
【０１３７】
製剤例３．健康機能性飲料の製造
インドナガコショウ抽出物 １００ｍｇ クエン酸 １０００ｍｇ オリゴ糖 １００ｇ 梅濃縮液 ２ｇ タウリン １ｇ 精製水 残量（合計で９００ｍｌになるまで） 通常の健康機能性飲料の製造方法に従い上記の成分を混合した後、約１時間かけて８５℃で攪拌・加熱した後、調製された溶液をろ過して滅菌済みの２ｌの容器にとって密封・滅菌した後、冷蔵保管した後、本発明の健康機能性飲料組成物の製造に使用する。
【０１３８】
前記組成比は、比較的に嗜好飲料に好適な成分を好適な実施例を用いて混合して造成したが、需要階層、需要国、使用用途など地域的、民族的な好み度に応じてその配合比を任意に変形して実施しても構わない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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