(57)【要約】      （修正有）【課題】タバコの低アルカロイド品種の提供。【解決手段】特定の配列を有する１つまたは複数の内因性核酸に変異を有する植物を含んでなるタバコ交雑種、品種、系統または栽培品種、およびこのような植物から作られたタバコ製品。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、および90からなる群より選択される配列を有する1つまたは複数の内因性核酸に変異を有する植物を含んでなるタバコ交雑種、品種、系統、または栽培品種。
【請求項２】
前記植物からの葉が、前記変異を欠く植物からの葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す、請求項1に記載のタバコ交雑種、品種、系統、または栽培品種。
【請求項３】
前記植物からの乾葉（cured leaf）が、前記変異を欠く植物からの乾葉と比べて、少なくとも1種のタバコ特異的ニトロソアミン(TSNA)の減少した量を示す、請求項2に記載のタバコ交雑種、品種、系統、または栽培品種。
【請求項４】
SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、および90からなる群より選択される配列を有する1つまたは複数の内因性核酸に変異を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のタバコ交雑種、品種、系統、または栽培品種により産生された種子。
【請求項５】
ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)細胞において変異誘発を引き起こして突然変異細胞を作製する段階；
該突然変異細胞から1つまたは複数の植物を得る段階；および
SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、および90からなる群より選択される配列を有する1つまたは複数の内因性核酸に変異を含む植物の少なくとも1つを同定する段階；
を含んでなる、タバコ植物の作出方法。
【請求項６】
前記変異を欠く植物からの葉と比べて少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す葉を含む前記植物の少なくとも1つを同定する段階をさらに含む、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
乾燥した場合に、前記変異を欠く植物からの乾葉と比べて少なくとも1種のTSNAの減少した量を示す葉を含む前記植物の少なくとも1つを同定する段階をさらに含む、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
変異誘発が化学的変異原または電離放射線を用いて引き起こされる、請求項5に記載の方法。
【請求項９】
化学的変異原が亜硝酸、アジ化ナトリウム、アクリジンオレンジ、臭化エチジウム、およびメタンスルホン酸エチル(EMS)からなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
電離放射線がX線、ガンマ線、高速中性子照射、およびUV照射からなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
【請求項１１】
変異誘発がTALENを用いて引き起こされる、請求項5に記載の方法。
【請求項１２】
変異誘発がジンクフィンガー技術を用いて引き起こされる、請求項5に記載の方法。
【請求項１３】
第1のタバコ系統の少なくとも1つの植物を第2のタバコ系統の少なくとも1つの植物と交配させる段階であって、第1のタバコ系統の植物は、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、および90からなる群より選択される配列を有する1つまたは複数の内因性核酸に変異を有する、段階；および
該変異を有する後代タバコ植物について選択する段階；
を含んでなる、タバコ植物の作出方法。
【請求項１４】
前記変異を欠く植物からの葉と比べて少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す葉を含む後代タバコ植物について選択する段階をさらに含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
乾燥した場合に、前記変異を欠く植物からの乾葉と比べて少なくとも1種のTSNAの減少した量を示す葉を含む後代タバコ植物について選択する段階をさらに含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、および90からなる群より選択される配列を有する1つまたは複数の内因性核酸に変異を有するタバコ植物からの乾葉を含むタバコ製品。
【請求項１７】
葉が、前記変異を欠く植物からの葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す、請求項16に記載のタバコ製品。
【請求項１８】
乾葉が、前記変異を欠く植物からの乾葉と比べて、少なくとも1種のTSNAの減少した量を示す、請求項17に記載のタバコ製品。
【請求項１９】
SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、および90からなる群より選択される配列を有する1つまたは複数の内因性核酸に変異を有するタバコ植物からの乾葉を提供する段階；および
該乾葉を用いてタバコ製品を製造する段階；
を含んでなる、タバコ製品の製造方法。
【請求項２０】
前記乾葉が、前記変異を欠く植物からの乾葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記乾葉が、前記変異を欠く植物からの乾葉と比べて、少なくとも1種のTSNAの減少した量を示す、請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
前記変異が点変異、挿入、欠失、および置換からなる群より選択される、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項1〜3のいずれか一項に記載の植物からの植物材料を提供する段階；および
植物組織中の1種または複数種のアルカロイドの量を測定する段階；
を含んでなる、植物のスクリーニング方法。
【請求項２４】
植物組織が葉である、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
植物組織が根である、請求項23に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は概してタバコ植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
タバコの低アルカロイド品種を作出しようという試みがなされている。しかし、こうした品種のほとんどは、結果的に、低品質の葉をもたらし、葉のアルカロイド含有量が減少した商業的に利用可能なタバコ系統は皆無である。したがって、タバコの葉のアルカロイドのプロファイル、特に葉のニコチン系アルカロイドのプロファイル、が変更され得るように遺伝子の発現を調節することができる、タバコ遺伝子を同定する必要がある。
【発明の概要】
【０００３】
概要
タバコにおいて根から葉へのアルカロイドの輸送に関与する複数の配列を記載する。また、こうした配列を使用する方法も記載する。
【０００４】
一局面では、タバコの交雑種(hybrid)、品種(variety)、系統(line)、または栽培品種(cultivar)が提供される。このようなタバコ交雑種、品種、系統、または栽培品種には、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90などの1つまたは複数の内因性核酸に変異を有する植物が含まれる。いくつかの態様では、該植物からのタバコ葉は、該変異を欠く植物からのタバコ葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す。いくつかの態様では、該植物からの乾葉(cured leaf)は、該変異を欠く植物からの乾葉と比べて、少なくとも1種のタバコ特異的ニトロソアミン(TSNA)の減少した量を示す。また、このようなタバコ交雑種、品種、系統、または栽培品種により産生された種子も提供され、その場合に該種子は、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90などの配列を有する1つまたは複数の内因性核酸に変異を含む。
【０００５】
別の局面では、タバコ植物の作出方法が提供される。こうした方法は、典型的には、ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)細胞において変異誘発を引き起こして突然変異細胞を作製する段階、該突然変異細胞から1つまたは複数の植物を得る段階、およびSEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90などの1つまたは複数の内因性核酸に変異を含む、該植物の少なくとも1つを同定する段階を含んでなる。このような方法はさらに、該変異を欠く植物からの葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す葉を含む、前記植物の少なくとも1つを同定する段階を含むことができる。このような方法はまた、得られる乾葉が、該変異を欠く植物からの乾葉と比べて、少なくとも1種のTSNAの減少した量を示す、前記植物の少なくとも1つを同定する段階を含むことができる。
【０００６】
変異誘発は、化学的変異原または電離放射線を用いて引き起こすことができる。代表的な化学的変異原としては、亜硝酸、アジ化ナトリウム、アクリジンオレンジ、臭化エチジウム、およびメタンスルホン酸エチル(EMS)が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な電離放射線としては、X線、ガンマ線、高速中性子照射、およびUV照射が挙げられるが、これらに限定されない。変異誘発はTALENまたはジンクフィンガー技術を用いて引き起こすことができる。
【０００７】
別の局面では、タバコ植物の作出方法が提供される。こうした方法はまた、第1のタバコ系統の少なくとも1つの植物を第2のタバコ系統の少なくとも1つの植物と交配させる段階、および該変異を有する後代タバコ植物について選択する段階を含むことができる。一般的に、第1のタバコ系統の植物は、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90などの配列を有する1つまたは複数の内因性核酸に変異を有する。こうした方法はさらに、該変異を欠く植物からの葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す葉を有する、後代タバコ植物について選択する段階を含むことができる。このような方法はまた、該変異を欠く植物からの乾葉と比べて、乾葉が少なくとも1種のTSNAの減少した量を示す、後代タバコ植物について選択する段階を含むことができる。
【０００８】
別の局面では、タバコ製品が提供される。こうしたタバコ製品は、典型的には、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90などの配列を有する1つまたは複数の内因性核酸に変異を有するタバコ植物からの乾葉を含む。いくつかの態様では、タバコ製品の中に含まれる乾葉は、該変異を欠く植物から得られるタバコ製品に含まれる乾葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す。いくつかの態様では、タバコ製品の中の乾葉は、該変異を欠く植物から得られるタバコ製品に含まれる乾葉と比べて、少なくとも1種のTSNAの減少した量を示す。
【０００９】
別の局面では、タバコ製品の製造方法が提供される。こうした方法は、一般的に、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90などの配列を有する1つまたは複数の内因性核酸に変異を有するタバコ植物からの乾葉を提供する段階、および該乾葉を用いてタバコ製品を製造する段階を含んでなる。いくつかの態様では、該乾葉は、該変異を欠く植物からの乾葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す。いくつかの態様では、該乾葉は、該変異を欠く植物からの乾葉と比べて、少なくとも1種のTSNAの減少した量を示す。
【００１０】
本明細書に記載される変異は、点変異、挿入、欠失、または置換であり得るが、これらに限定されない。
【００１１】
さらに別の局面では、植物発現ベクターを含むトランスジェニックタバコ植物が提供される。典型的には、該発現ベクターは、長さが少なくとも25ヌクレオチドであり、かつSEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90などの配列に対して少なくとも91％の配列同一性を有する、核酸分子を含む。いくつかの態様では、この核酸分子の発現は、結果的に、該核酸分子を発現しないタバコ植物からの葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す葉をもたらす。いくつかの態様では、この核酸分子の発現は、結果的に、該核酸分子を発現しないタバコ植物からの乾葉と比べて、少なくとも1種のTSNAの減少した量を示す乾葉をもたらす。また、このようなトランスジェニックタバコ植物により産生された種子も提供され、その場合に該種子は該発現ベクターを含む。
【００１２】
一局面では、長さが少なくとも25ヌクレオチドの異種核酸分子を含むトランスジェニックタバコ植物が提供され、ここで、該核酸分子は、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90などの核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。いくつかの態様では、この異種核酸分子の発現は、結果的に、該核酸分子を発現しないタバコ植物からの葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す葉をもたらす。いくつかの態様では、この異種核酸分子の発現は、結果的に、該核酸分子を発現しないタバコ植物からの乾葉と比べて、少なくとも1種のTSNAの減少した量を示す乾葉をもたらす。また、このようなトランスジェニックタバコ植物により産生された種子も提供され、その場合に該種子は上記の異種核酸分子を含む。
【００１３】
一局面では、ベクターを含むトランスジェニックタバコ植物からの葉が提供される。一般的に、該ベクターは、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90などの核酸配列の25以上連続するヌクレオチドに対して少なくとも91％の配列同一性を有する核酸分子を含む。いくつかの態様では、この核酸分子の発現は、結果的に、該核酸分子を発現しないタバコ植物からの葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す葉をもたらす。いくつかの態様では、この核酸分子の発現は、結果的に、該核酸分子を発現しないタバコ植物からの乾葉と比べて、少なくとも1種のTSNAの減少した量を示す乾葉をもたらす。
【００１４】
別の局面では、トランスジェニック植物の作出方法が提供される。こうした方法は、典型的には、該植物において導入遺伝子を発現させる段階を含む。この導入遺伝子は、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90などの核酸配列からの発現を阻害する二本鎖RNA分子をコードする。この二本鎖RNA分子は、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90などの配列に対して91％以上の配列同一性を有する、少なくとも25連続するヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、この導入遺伝子の発現は、結果的に、該導入遺伝子を発現しない植物からの葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す、該植物からの葉をもたらす。いくつかの態様では、この導入遺伝子の発現は、結果的に、該核酸分子を発現しない植物からの乾葉と比べて、少なくとも1種のTSNAの減少した量を示す乾葉をもたらす。いくつかの態様では、上記の二本鎖RNA分子は、例えばSEQ ID NO: 51〜56などの配列を有する。
【００１５】
別の局面では、タバコ植物における葉の成分を変化させる方法が提供される。こうした方法は、一般的に、プロモーターに機能的に連結された異種核酸分子をタバコ細胞に導入してトランスジェニックタバコ細胞を作製する段階、および該トランスジェニックタバコ細胞からトランスジェニックタバコ植物を再生する段階を含んでなる。典型的には、この異種核酸分子は、長さが少なくとも25ヌクレオチドであり、かつSEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90などの核酸配列に対して少なくとも91％の配列同一性を有する。このようなトランスジェニックタバコ植物は葉の成分が変化している。こうした方法はさらに、該異種核酸分子を発現しないタバコ植物からの葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す葉を有する、該トランスジェニックタバコ植物の少なくとも1つを選択する段階を含むことができる。こうした方法はさらに、該異種核酸分子を発現しないタバコ植物からの乾葉と比べて、少なくとも1種のTSNAの減少した量を示す乾葉を有する、該トランスジェニックタバコ植物の少なくとも1つを選択する段階を含むことができる。
【００１６】
別の局面では、ベクターを含むトランスジェニックタバコ植物からのタバコ乾葉が提供される。一般的に、該ベクターは、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90などの核酸配列の25以上連続するヌクレオチドに対して少なくとも91％の配列同一性(例えば、少なくとも92、93、94、95、96、97、98、99または100％の配列同一性)を有する核酸分子を含む。いくつかの態様では、この核酸分子の発現は、結果的に、該核酸分子を発現しないタバコ植物からの葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す葉をもたらす。いくつかの態様では、この核酸分子の発現は、結果的に、該核酸分子を発現しないタバコ植物からの乾葉と比べて、少なくとも1種のTSNAの減少した量を示す乾葉をもたらす。ある態様では、この核酸はセンス方向にあり、また、ある態様では、この核酸はアンチセンス方向にある。
【００１７】
さらに別の局面では、植物発現ベクターを含むトランスジェニックタバコ植物が提供される。一般的に、該発現ベクターは、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、もしくは90などの配列、または機能性ポリペプチドをコードするこれらの配列のいずれかの断片に対して少なくとも95％の配列同一性を有する核酸分子を含む。いくつかの態様では、この核酸分子またはその機能性断片の発現は、結果的に、該核酸分子またはその機能性断片を発現しないタバコ植物からの葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの増加した量を示す葉をもたらす。また、このようなトランスジェニックタバコ植物により産生された種子も提供され、その場合に該種子は該発現ベクターを含む。
【００１８】
別の局面では、異種核酸分子を含むトランスジェニックタバコ植物が提供される。一般的に、該核酸分子は、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、もしくは90などの核酸配列、または機能性ポリペプチドをコードするその断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。いくつかの態様では、この異種核酸分子またはその機能性断片の発現は、結果的に、該核酸分子またはその機能性断片を発現しないタバコ植物からの葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの増加した量を示す葉をもたらす。また、このようなトランスジェニックタバコ植物により産生された種子も提供され、その場合に該種子は該異種核酸分子を含む。
【００１９】
一局面では、ベクターを含むトランスジェニックタバコ植物からの葉が提供される。典型的には、こうしたベクターは、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、もしくは90などの核酸配列、または機能性ポリペプチドをコードするその断片に対して少なくとも95％の配列同一性を有する核酸分子を含む。いくつかの態様では、該核酸分子またはその機能性断片の発現は、結果的に、該核酸分子またはその機能性断片を発現しないタバコ植物からの葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの増加した量を示す葉をもたらす。
【００２０】
別の局面では、タバコ植物における葉の成分を変化させる方法が提供される。こうした方法は、典型的には、プロモーターに機能的に連結された異種核酸分子をタバコ細胞に導入してトランスジェニックタバコ細胞を作製する段階、および該トランスジェニックタバコ細胞からトランスジェニックタバコ植物を再生する段階を含んでなり、ここで、該トランスジェニックタバコ植物は葉の成分が変化している。この異種核酸分子は、典型的には、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、もしくは90などの核酸配列、または機能性ポリペプチドをコードするその断片に対して少なくとも95％の配列同一性を有する。こうした方法はさらに、該異種核酸分子またはその機能性断片を発現しないタバコ植物からの葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの増加した量を示す葉を有する、該トランスジェニックタバコ植物の少なくとも1つを選択する段階を含むことができる。いくつかの態様では、異種核酸分子は、粒子ボンバードメント、アグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介形質転換、マイクロインジェクション、ポリエチレングリコール媒介形質転換、リポソーム媒介DNA取り込み、またはエレクトロポレーションを用いて、タバコ細胞中に導入される。
【００２１】
一局面では、ベクターを含むトランスジェニックタバコ植物からのタバコ乾葉が提供される。典型的には、このベクターは、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、もしくは90などの核酸配列、または機能性ポリペプチドをコードするその断片に対して少なくとも95％の配列同一性を有する核酸分子を含む。いくつかの態様では、この核酸分子またはその機能性断片の発現は、結果的に、該核酸分子またはその機能性断片を発現しないタバコ植物からの葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの増加した量を示すタバコ葉をもたらす。
【００２２】
代表的なアルカロイドとしては、ニコチン、ノルニコチン、アナバシン、ミオスミン、およびアナタビンが挙げられるが、これらに限定されない。通常、1種または複数種のアルカロイドの量は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)-質量分析(MS)または高性能薄層クロマトグラフィー(HPTLC)を用いて測定される。
【００２３】
本明細書に記載の方法で使用するのに適したタバコ植物は、バーレー種(Burley type)、ダーク種(dark type)、黄色種(flue-cured type)、メリーランド種(Maryland type)、またはオリエント種(Oriental type)であり得る。本明細書に記載の方法で使用するのに適したタバコ植物はN.タバカム(N. tabacum)由来であり、さまざまなN.タバカム品種からのものであってよい。品種は以下のものであり得る：BU 64、CC 101、CC 200、CC 13、CC 27、CC 33、CC 35、CC 37、CC 65、CC 67、CC 301、CC 400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、CC 1063、Coker 176、Coker 319、Coker 371 Gold、Coker 48、CU 263、DF911、Galpaoタバコ、GL 26H、GL 338、GL 350、GL 395、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、GF 157、GF 318、RJR 901、HB 04P、K 149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、NC 196、NC 37NF、NC 471、NC 55、NC 92、NC2326、NC 95、NC 925、PVH 1118、PVH 1452、PVH 2110、PVH 2254、PVH 2275、VA 116、VA 119、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY 10、KY 14、KY 160、KY 17、KY 171、KY 907、KY907LC、KTY14 x L8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY 14xL8、Narrow Leaf Madole、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal Smith Madole、OXFORD 207、「Perique」タバコ、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R 7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight 168、Speight 172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、TI 1406、TI 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN90LC、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR (Tom Rosson) Madole、VA 309、またはVA359。
【００２４】
別の局面では、植物のスクリーニング方法が提供される。こうした方法は、典型的には、本明細書に記載される変異型植物からの植物材料を提供する段階、および植物組織中の1種または複数種のアルカロイドの量を測定する段階を含んでなる。いくつかの態様では、植物組織は葉である。いくつかの態様では、植物組織は根である。こうした方法は、植物組織中の1種または複数種のTSNAの量を測定する段階をさらに含むことができる。
【００２５】
[本発明1001]
SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、および90からなる群より選択される配列を有する1つまたは複数の内因性核酸に変異を有する植物を含んでなるタバコ交雑種、品種、系統、または栽培品種。
[本発明1002]
前記植物からの葉が、前記変異を欠く植物からの葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す、本発明1001のタバコ交雑種、品種、系統、または栽培品種。
[本発明1003]
前記植物からの乾葉（cured leaf）が、前記変異を欠く植物からの乾葉と比べて、少なくとも1種のタバコ特異的ニトロソアミン(TSNA)の減少した量を示す、本発明1002のタバコ交雑種、品種、系統、または栽培品種。
[本発明1004]
SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、および90からなる群より選択される配列を有する1つまたは複数の内因性核酸に変異を含む、本発明1001〜1003のいずれかのタバコ交雑種、品種、系統、または栽培品種により産生された種子。
[本発明1005]
ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)細胞において変異誘発を引き起こして突然変異細胞を作製する段階；
該突然変異細胞から1つまたは複数の植物を得る段階；および
SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、および90からなる群より選択される配列を有する1つまたは複数の内因性核酸に変異を含む植物の少なくとも1つを同定する段階；
を含んでなる、タバコ植物の作出方法。
[本発明1006]
前記変異を欠く植物からの葉と比べて少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す葉を含む前記植物の少なくとも1つを同定する段階をさらに含む、本発明1005の方法。
[本発明1007]
乾燥した場合に、前記変異を欠く植物からの乾葉と比べて少なくとも1種のTSNAの減少した量を示す葉を含む前記植物の少なくとも1つを同定する段階をさらに含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
変異誘発が化学的変異原または電離放射線を用いて引き起こされる、本発明1005の方法。
[本発明1009]
化学的変異原が亜硝酸、アジ化ナトリウム、アクリジンオレンジ、臭化エチジウム、およびメタンスルホン酸エチル(EMS)からなる群より選択される、本発明1008の方法。
[本発明1010]
電離放射線がX線、ガンマ線、高速中性子照射、およびUV照射からなる群より選択される、本発明1008の方法。
[本発明1011]
変異誘発がTALENを用いて引き起こされる、本発明1005の方法。
[本発明1012]
変異誘発がジンクフィンガー技術を用いて引き起こされる、本発明1005の方法。
[本発明1013]
第1のタバコ系統の少なくとも1つの植物を第2のタバコ系統の少なくとも1つの植物と交配させる段階であって、第1のタバコ系統の植物は、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、および90からなる群より選択される配列を有する1つまたは複数の内因性核酸に変異を有する、段階；および
該変異を有する後代タバコ植物について選択する段階；
を含んでなる、タバコ植物の作出方法。
[本発明1014]
前記変異を欠く植物からの葉と比べて少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す葉を含む後代タバコ植物について選択する段階をさらに含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
乾燥した場合に、前記変異を欠く植物からの乾葉と比べて少なくとも1種のTSNAの減少した量を示す葉を含む後代タバコ植物について選択する段階をさらに含む、本発明1014の方法。
[本発明1016]
SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、および90からなる群より選択される配列を有する1つまたは複数の内因性核酸に変異を有するタバコ植物からの乾葉を含むタバコ製品。
[本発明1017]
葉が、前記変異を欠く植物からの葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す、本発明1016のタバコ製品。
[本発明1018]
乾葉が、前記変異を欠く植物からの乾葉と比べて、少なくとも1種のTSNAの減少した量を示す、本発明1017のタバコ製品。
[本発明1019]
SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、および90からなる群より選択される配列を有する1つまたは複数の内因性核酸に変異を有するタバコ植物からの乾葉を提供する段階；および
該乾葉を用いてタバコ製品を製造する段階；
を含んでなる、タバコ製品の製造方法。
[本発明1020]
前記乾葉が、前記変異を欠く植物からの乾葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記乾葉が、前記変異を欠く植物からの乾葉と比べて、少なくとも1種のTSNAの減少した量を示す、本発明1019の方法。
[本発明1022]
前記変異が点変異、挿入、欠失、および置換からなる群より選択される、本発明1001〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
本発明1001〜1003のいずれかの植物からの植物材料を提供する段階；および
植物組織中の1種または複数種のアルカロイドの量を測定する段階；
を含んでなる、植物のスクリーニング方法。
[本発明1024]
植物組織が葉である、本発明1023の方法。
[本発明1025]
植物組織が根である、本発明1023の方法。
別段の定義がない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本方法および組成物が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料は、本方法および組成物の実施または試験に使用できるが、好適な方法および材料を以下に記載する。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図したものではない。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図1は、本明細書に記載する新規Nup配列と、以前から知られているN.タバカムNup1およびNup2とのアラインメントである。Nup1-予測される膜貫通ヘリックスをボックスで示す。
【図２】図2は、本明細書に記載する4つの新規MDR配列と、代表的なMDRポリペプチド(アクセッション番号XP_004233862)とのアラインメントである。ボックスで囲った領域は、保存されたATPアーゼドメインを表す。
【図３】図3は、新規MATE配列と、N.タバカムMATE1とのアラインメントである。ボックスは予測される膜貫通ドメインを示す；予測されるN末端局在は陰影を付けてあり、予測される保存された切断部位は矢印で示してある。
【図４Ａ】図4Aは、新規MDR配列の一つであるC11099と、ソラナム・リコペルシカム(Solanum lycopersicum：トマト)からの推定上のABC輸送体Bファミリーメンバー8様とのアラインメントである。
【図４Ｂ】図4Bは、同定された他の輸送体配列の一つであるC43677と、ソラナム・リコペルシカムからの双方向性糖輸送体SWEET12様とのアラインメントである。
【図５】図5は、N.アラタ(N. alata：ヒョウタンウツボカズラ)およびN.タバカムの葉と根に含まれるニコチンの量を示すグラフである。
【図６】図6は、本明細書に記載するトランスジェニック植物においてRNAi分子を発現させるために使用した構築物の概略図である。
【図７】図7は、TALEN変異誘発のために使用した構築物の概略図である。
【図８Ａ】図8Aは、フロートトレイ(float tray)プロトコルを用いてニコチンを供給した後のニコチン含有量の葉/根の比である。
【図８Ｂ】図8Bは、個々の植物の根と葉のニコチン含有量である。
【図９Ａ】図9Aは、底無しポットでの供給プロトコルを用いてニコチンを供給した後の個々の植物の葉のニコチン含有量である。
【図９Ｂ】図9Bは、同じ植物の供給前と供給後の葉のニコチン含有量である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
詳細な説明
タバコの低アルカロイド品種を生み出すために経路を変更する以前の試みは、低品質の葉をもたらすことがあった。現在のところ、(例えば、野生型タバコ植物からの)標準アルカロイド含有量を含む乾葉と同じ品質の乾葉を提供する、葉のアルカロイド含有量が減少した商業的タバコ系統は存在しない。
【００２８】
本開示は、N.タバカム由来のアルカロイド輸送体および調節ポリペプチドをコードする新規核酸の発見に基づいている。このような核酸SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90、およびそれによりコードされるポリペプチドSEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、または91が本明細書において提供され、特徴づけられる。この発見に基づいて、前記核酸配列の発現のレベルおよび/または前記ポリペプチドの機能がN.タバカムにおいてモジュレートされ、結果として生じる植物のアルカロイド輸送への影響が評価され得る。ポリペプチドの機能および/または遺伝子の発現をモジュレートすることは、タバコの葉および結果として得られるタバコ製品におけるアルカロイド組成の改善された制御を可能にすることができる。
【００２９】
核酸およびポリペプチド
新規核酸が本明細書中に提供される(例えば、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90を参照されたい)。本明細書で使用する場合、核酸はDNAおよびRNAを含むことができ、1つまたは複数のヌクレオチド類似体または骨格修飾を含む核酸が含まれる。核酸は一本鎖でも二本鎖でもよく、これは通常、その意図した用途に依存する。本明細書に提供される新規核酸は、新規ポリペプチド(例えば、SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、または91参照)をコードする。
【００３０】
また、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90およびSEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、または91と異なる、それぞれ、核酸およびポリペプチドも提供される。配列がSEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90およびSEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、または91と異なる核酸およびポリペプチドは、それぞれ、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90およびSEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、または91に対して少なくとも50％の配列同一性(例えば、少なくとも55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性)を示すことができる。
【００３１】
配列同一性パーセントを計算するには、2つの配列をアラインメントさせて、これら2つの配列間のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の完全な一致の数を決定する。その完全一致の数をアラインメントした領域の長さ(すなわち、アラインメントしたヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数)で割って100を掛けると、配列同一性パーセントの値になる。アラインメントされる領域の長さは、一方または両方の配列の一部分から最も短い配列の全長サイズまでとすることができることが理解されよう。また、単一の領域を2つ以上の他の配列とアラインメントすることができ、したがって、その単一の領域はアラインメントしたそれぞれの領域に対して異なる配列同一性パーセント値を有し得ることも理解されるであろう。
【００３２】
配列同一性パーセントを決定するための2つ以上の配列のアラインメントは、コンピュータプログラムClustalWおよびデフォルトパラメータを用いて行うことができ、これは核酸またはポリペプチド配列のアラインメントをそれらの全体の長さにわたって実施することを可能にする(グローバルアライメント)。Chenna et al., 2003, Nucleic Acids Res., 31(13):3497-500。ClustalWは、クエリー(query)配列と1つまたは複数のサブジェクト(subject)配列との間の最良の一致を計算して、同一性、類似性および相違を決定することができるようにそれらを並置する。配列アラインメントを最大にするために、クエリー配列、サブジェクト配列、または両方に1個以上の残基のギャップを挿入することができる。核酸配列の高速ペアワイズアラインメントでは、デフォルトパラメータが使用される(すなわち、ワードサイズ：2；ウィンドウサイズ：4；スコアリング法：パーセンテージ；トップ対角線の数：4；およびギャップペナルティ：5)；多重核酸配列のアラインメントでは、次のパラメータが使用される：ギャップ開始ペナルティ：10.0；ギャップ伸長ペナルティ：5.0；およびウエイトトランジション(weight transitions)：あり。ポリペプチド配列の高速ペアワイズアラインメントでは、次のパラメータが使用される：ワードサイズ：1；ウィンドウサイズ：5；スコアリング法：パーセンテージ；トップ対角線の数：5；およびギャップペナルティ：3。ポリペプチド配列の多重アラインメントでは、次のパラメータが使用される：ウエイトマトリックス(weight matrix)：blosum；ギャップ開始ペナルティ：10.0；ギャップ伸長ペナルティ：0.05；親水性ギャップ：オン；親水性残基：Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg、Lys；および残基特異的ギャップペナルティ：オン。ClustalWは、例えば、ワールド・ワイド・ウェブ上のBaylor College of Medicine Search LauncherのウェブサイトまたはEuropean Bioinformatics Instituteのウェブサイトで実行することができる。
【００３３】
変化を核酸分子(例えば、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90)に導入することができ、それによって、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列(例えば、SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、または91)の変化につながる。例えば、変化は、変異誘発(例：部位特異的変異誘発、PCR媒介変異誘発)を用いて、またはこのような変化を有する核酸分子を化学的に合成することによって、核酸コード配列に導入することができる。こうした核酸の変化は、1個以上のアミノ酸残基での保存的および/または非保存的アミノ酸置換につながることがある。「保存的アミノ酸置換」は、1個のアミノ酸残基が類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置換されるものであり(例えば、アミノ酸置換のための度数分布表を提供するDayhoffら(1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(Suppl. 3):345-352)を参照)、非保存的置換は、あるアミノ酸残基が類似の側鎖をもたないアミノ酸残基で置換されるものである。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「単離された」核酸分子は、その単離された核酸分子が由来する生物のゲノム中の該核酸の一端または両端に天然で隣接する配列を含まない核酸分子である(例えば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成されたcDNAまたはゲノムDNA断片)。このような単離された核酸分子は、一般的に、操作の利便性のために、または融合核酸分子を作製するために、ベクター(例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター)に導入されるが、これについては以下で詳細に説明する。また、単離された核酸分子は、組換え体などの遺伝子操作された核酸分子または合成核酸分子を含むことができる。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「精製された」ポリペプチドは、該ポリペプチドに天然で付随する細胞成分から分離または精製されているポリペプチドである。典型的には、ポリペプチドが乾燥重量で少なくとも70％(例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、または99％)であり、それが天然で会合しているポリペプチドまたは天然由来の分子を含まない場合に、該ポリペプチドは「精製された」と考えられる。化学的に合成されたポリペプチドは、もともと、それに天然で付随する成分から分離されているので、合成ポリペプチドは「精製された」ものである。
【００３６】
核酸は、当技術分野で日常的な技術を用いて単離することができる。例えば、核酸は、組換え核酸技術および/またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含むがこれらに限定されない任意の方法を用いて単離される。一般的なPCR技術は、例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995に記載されている。組換え核酸技術は、例えば、制限酵素消化およびライゲーションを含み、これは核酸を単離するために使用される。単離された核酸はまた、単一の核酸分子としてまたは一連のオリゴヌクレオチドとして、化学的に合成することもできる。
【００３７】
ポリペプチドは、例えば、DEAEイオン交換、ゲルろ過、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの公知の方法により、天然の供給源(例えば、生物学的サンプル)から精製することができる。ポリペプチドはまた、例えば、発現ベクター中の核酸を発現させることによっても、精製することができる。さらに、精製されたポリペプチドは化学合成によっても得ることができる。ポリペプチドの純度の程度は、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析などの任意の適切な方法を用いて、測定することができる。
【００３８】
また、核酸(例えば、ポリペプチドをコードする核酸)を含むベクターも提供される。ベクターは、発現ベクターを含めて、市販されているか、または当技術分野で日常的な組換えDNA技術により作製され得る。核酸を含むベクターは、こうした核酸に機能的に連結された発現エレメントを有し、さらに、選択マーカー(例えば、抗生物質耐性遺伝子)をコードする配列などの配列を含むことができる。核酸を含むベクターは、キメラまたは融合ポリペプチド(すなわち、ポリペプチドのN末端またはC末端にあり得る、異種ポリペプチドと機能的に連結されたポリペプチド)をコードすることができる。代表的な異種ポリペプチドは、コードされたポリペプチドの精製において使用できるもの(例えば、6xHisタグ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST))である。
【００３９】
発現エレメントは、核酸コード配列の発現を指令および調節する核酸配列を含む。発現エレメントの一例はプロモーター配列である。発現エレメントはまた、イントロン、エンハンサー配列、応答エレメント、または核酸の発現をモジュレートする誘導可能なエレメントを含むことができる。発現エレメントは細菌、酵母、昆虫、哺乳動物、またはウイルス起源のものであってよく、ベクターは異なる起源からのエレメントの組み合わせを含むことができる。本明細書で使用する場合、機能的に連結されたとは、プロモーターまたは他の発現エレメント(複数可)が核酸の発現を指令または調節するように(例えば、インフレームで)該核酸に対してベクター中に位置づけられる、ことを意味する。宿主細胞に核酸をインビボおよびインビトロの両方で導入するための多くの方法は、当業者によく知られており、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール(PEG)形質転換、熱ショック、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルス媒介核酸導入が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
本明細書に記載のベクターは、宿主細胞に導入することができる。本明細書で使用する「宿主細胞」とは、核酸が導入される特定の細胞を指し、また、該ベクターを保有するそのような細胞の子孫も含まれる。宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、核酸は、大腸菌(E. coli)などの細菌細胞中で、または昆虫細胞、酵母もしくは哺乳動物細胞(例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、COS細胞など)中で発現させることができる。その他の適切な宿主細胞は当業者に公知である。
【００４１】
核酸は、さまざまな増幅技術(例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, 1995, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; ならびに米国特許第4,683,195号、第4,683,202号、第4,800,159号および第4,965,188号参照)を適切なオリゴヌクレオチド対(例えば、プライマー)と共に使用して検出することができる。オリジナルのPCRに対する複数の変更形態が開発されており、核酸を検出するために使用され得る。
【００４２】
核酸はまた、ハイブリダイゼーションを用いて検出することができる。核酸間のハイブリダイゼーションは、Sambrookら(1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; セクション7.37-7.57, 9.47-9.57, 11.7-11.8および11.45-11.57)に詳細に説明されている。Sambrookらは、約100ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチドプローブに適したサザンブロット条件を開示している(セクション11.45-11.46)。長さが100ヌクレオチド未満である配列と第2の配列との間のTmは、セクション11.46に提供される式を用いて算出することができる。Sambrookらはさらに、約100ヌクレオチドを超えるオリゴヌクレオチドプローブのためのサザンブロット条件を開示している(セクション9.47-9.54参照)。長さが100ヌクレオチドを超える配列と第2の配列との間のTmは、Sambrookらのセクション9.50-9.51に提供される式を用いて算出することができる。
【００４３】
核酸を含む膜がプレハイブリダイズおよびハイブリダイズされる条件、ならびに核酸を含む膜が非特異的に結合した過剰のプローブを除去するために洗浄される条件は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに重要な役割を果たし得る。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄は、必要に応じて、中程度または高度のストリンジェンシー条件下で実施することができる。例えば、洗浄条件は、洗浄液中の塩濃度を減少させることによって、かつ/または洗浄が実施される温度を増加させることによって、よりストリンジェントにすることができる。単なる例として、高ストリンジェンシー条件は、典型的には、0.2×SSC中65℃での膜の洗浄を含む。
【００４４】
さらに、ハイブリダイゼーションの量の読み取りは、例えば、標識オリゴヌクレオチドプローブの特異的活性によって、プローブがハイブリダイズされているテンプレート核酸上のプローブ結合部位の数によって、およびオートラジオグラフィーまたは他の検出媒体の露光量によって、影響を受ける可能性がある。当業者には容易に理解されるように、固定化標的核酸へのプローブ核酸分子のハイブリダイゼーションを試験するために、さまざまなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が使用され得るが、標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーションを同一のハイブリダイゼーション、洗浄および露光条件の下で試験することがより重要である。好ましくは、標的核酸は同じ膜上にある。
【００４５】
ある核酸へのハイブリダイゼーションが別の核酸へのハイブリダイゼーションよりも少なくとも5倍(例えば、少なくとも6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、または100倍)高い場合、核酸分子はある核酸にハイブリダイズするが、別の核酸にはハイブリダイズしないと見なされる。ハイブリダイゼーションの量は、膜上で直接的に、またはオートラジオグラフから、例えばPhosphorImagerまたはデンシトメータ(Molecular Dynamics社, Sunnyvale, CA)を用いて、定量化することができる。
【００４６】
ポリペプチドは、抗体を用いて検出することができる。抗体を用いてポリペプチドを検出するための技術としては、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ウェスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光が挙げられる。抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。ポリペプチドに対する特異的結合親和性を有する抗体は、当技術分野で周知の方法を用いて作製することができる。抗体は、当技術分野で公知の方法を用いて、マイクロタイタープレートなどの固相支持体に結合させることができる。ポリペプチドの存在下では、抗体-ポリペプチド複合体が形成される。
【００４７】
検出(例えば、増幅産物、ハイブリダイゼーション複合体、またはポリペプチドの検出)は、通常、検出可能な標識を用いて達成される。用語「標識」は、直接標識の使用だけでなく間接標識の使用をも包含することが意図される。検出可能な標識としては、酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。
【００４８】
本明細書に記載される特定の核酸(例えば、SEQ ID NO: 1、3、5、7または82)は、ニコチン取り込みパーミアーゼ(nicotine uptake permease: Nup)ファミリーの配列に属するポリペプチド(例えば、SEQ ID NO: 2、4、6、8または83)をコードすると予測される。Nupポリペプチドは、より大きなプリンパーミアーゼファミリーのメンバーである。例えば、Hildreth et al., 2011, PNAS USA, 108:18279-84を参照されたい。本明細書に開示される新規なNup核酸およびポリペプチド配列に加えて、ニコチアナ・タバカム由来の代表的なNup1およびNup2配列はアクセッション番号GU174268.1およびGU174267.1に示される。
【００４９】
本明細書に記載される特定の核酸(例えば、SEQ ID NO: 9、11、13、15、70、72、74、76、78または80)は、多剤耐性(MDR)ファミリーの配列に属するポリペプチド(例えば、SEQ ID NO: 10、12、14、16、71、73、75、77、79または81)をコードすると予測される。多剤輸送体は、ほとんどの生物の細胞中に存在する膜タンパク質の大きなクラスを構成する。これらのタンパク質は潜在的に細胞毒性のさまざまな化合物に結合して、ATPまたはプロトン依存的プロセスにおいて細胞からそれらを除去する(Zhelenova et al., 2000, Trends Biochem. Sci., 25:39-43)。多剤輸送体は、以前に、4つのスーパーファミリーに分類されている：ATP結合カセット(ATP binding cassette: ABC)スーパーファミリー、主要ファシリテーター(major facilitator)スーパーファミリー、小型多剤耐性(small multidrug resistance)ファミリー、および耐性-結節形成-細胞分裂(resistance-nodulation-cell division)ファミリー(以下で詳細に述べるMATEファミリーは、多剤輸送体の5番目のスーパーファミリーであると最近認定された)。ATP結合カセットスーパーファミリーおよび主要ファシリテータースーパーファミリーに属する排出ポンプタンパク質は、多剤耐性(MDR)への最も顕著な寄与因子である。
【００５０】
本明細書に記載される特定の核酸(例えば、SEQ ID NO: 17、19、21、23、25、27、29、31、86、88または90)は、多剤・毒性化合物排出型(MATE)ファミリーの配列に属するポリペプチド(例えば、SEQ ID NO: 18、20、22、24、26、28、30、32、87、89または91)をコードすると予測される。MATEポリペプチドファミリーは、12の推定上の膜貫通セグメントの存在および他の多剤輸送体スーパーファミリーに特異的な「シグネチャ配列」(signature sequences)の非存在によって特徴づけられる(Brown et al., 1999, Mol. Microbiol., 31:394-5)。MATEタンパク質は、プロトン依存性排出輸送体として機能すると考えられ、細菌および植物に豊富に存在する。
【００５１】
本明細書に記載される特定の核酸(例えば、SEQ ID NO: 33および35)は、多面的薬剤耐性(pleiotropic drug resistance: PDR)ファミリーの配列に属するポリペプチド(例えば、SEQ ID NO: 34および36)をコードすると予測される。例えば、Moons, 2008, Planta, 229:53-71を参照されたい。PDRファミリーは、真菌および植物にのみ見出され、非特異的薬剤排出輸送体タンパク質をコードする遺伝子の発現増加によってサッカロマイセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)において最初に特徴づけられた。PDRポリペプチドは、広範囲の機能的および構造的に無関係な毒性化合物(例えば、抗真菌剤および抗癌剤)に対する耐性を付与し、かつ弱有機酸を輸送することが確認されている。また、複数のPDR遺伝子が、例えばシロイヌナズナ(Arabidopsis)およびイネを含めて、いくつかの植物種において同定されている。
【００５２】
葉の中のアルカロイドの量を減少させた植物および作出方法
本明細書に記載の1つまたは複数の内因性核酸(例えば、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90)に変異を有するタバコ交雑種、品種、系統、または栽培品種が提供される。本明細書に記載するように、内因性核酸(例えば、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90)の1つまたは複数に変異を有する植物からの葉は、(例えば、該変異を欠く植物からの葉と比較して)少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示すことができる。また、内因性核酸(例えば、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90)の1つまたは複数に変異を有する植物からの葉は、(例えば、該変異を欠く植物からの葉と比較して)少なくとも1種のタバコ特異的ニトロソアミン(TSNA)の減少した量を示すことができる。
【００５３】
本明細書で言及するアルカロイドは、典型的には、ピリジンアルカロイドであり、これにはニコチン、ノルニコチン、アナバシン、ミオスミン、およびアナタビンが含まれる。例えば、Sheng et al., 2005, Chromatographia, 62:63-8を参照されたい。TSNAは乾燥(curing)時に生成される。亜硝酸は細菌による硝酸還元の結果として蓄積することがあり、TSNAは亜硝酸(ニトロソ化種の供給源)とアルカロイドとの化学反応によって形成される。代表的なTSNAとしては、例えば、N'-ニトロソノルニコチン(NNN)、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン(NNK)、N'-ニトロソアナタビン(NAT)、N'-ニトロソアナバシン(NAB)、および4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタナール(NNAL)が挙げられる。
【００５４】
アルカロイドまたはTSNAを検出する方法、および1種または複数種のアルカロイドまたはTSNAの量を測定する方法は、当技術分野で公知である。例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)-質量分析(MS)(HPLC-MS)または高性能薄層クロマトグラフィー(HPTLC)を使用して、1種または複数種のアルカロイドの存在を検出し、かつ/または1種または複数種のアルカロイドの量を測定することができる。また、さまざまなクロマトグラフィー法(例えば、ガスクロマトグラフィー/熱エネルギー分析(GC/TEA)、液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/MS)、およびイオンクロマトグラフィー(IC))を用いて、1種または複数種のTSNAの存在を検出し、かつ/または1種または複数種のTSNAの量を測定することができる。
【００５５】
変異を有するタバコ植物の作出方法は、当技術分野で公知である。変異はランダム変異または標的変異であり得る。ランダム変異誘発では、例えば、化学的変異原、電離放射線、または高速中性子ボンバードメントを用いて、細胞(例えば、ニコチアナ・タバカム細胞)に変異を誘発させることができる(例えば、Li et al., 2001, Plant J., 27:235-42を参照されたい)。代表的な化学的変異原としては、限定するものではないが、亜硝酸、アジ化ナトリウム、アクリジンオレンジ、臭化エチジウム、およびメタンスルホン酸エチル(EMS)が挙げられ、一方、代表的な電離放射線としては、限定するものではないが、X線、ガンマ線、高速中性子照射、およびUV照射が挙げられる。変異原性の化学物質または放射線の投与量は、致死性または生殖不稔性によって特徴づけられる閾値レベルを下回る変異頻度が得られるように、植物組織の種類ごとに実験的に決定される。変異誘発処理から得られるM1世代種子の数またはM1植物集団のサイズは、予想される変異頻度に基づいて推定される。標的変異誘発では、代表的な技術にTALEN(例えば、Li et al., 2011 , Nucleic Acids Res., 39(14):6315-25参照)またはジンクフィンガー(例えば、Wright et al., 2005, The Plant J., 44:693-705参照)が含まれる。ランダムまたは標的にかかわらず、変異は、点変異、挿入、欠失、置換、またはこれらの組み合わせであり得る。
【００５６】
ポリペプチド中の保存されたドメインは、ポリペプチドの機能だけでなく、細胞および細胞内局在にとっても重要であり得る。図1は、本明細書に記載の新規Nup配列を含めて、Nup配列のアラインメントを示し、予測される膜貫通へリックスをボックスで示してある。図2は、本明細書に記載の新規MDR配列を含めて、MDR配列のアラインメントを示し、保存されたATPアーゼドメインをボックスで示してある。図3は、本明細書に記載の新規MATE配列を含めて、MATE配列のアラインメントを示す。図3のボックスは予測される膜貫通ドメインを示し、予測されるN末端シグナルペプチドを陰影で示してあり、予測される保存された切断部位を矢印で示してある。また、図4Aは、新規MDR配列の一つであるC11099と、ソラナム・リコペルシカムからの推定上のABC輸送体Bファミリーメンバー8様とのアラインメントを示す。以下の表5に示すように、これらの配列は、ヌクレオチドレベルで84％の配列同一性、およびアミノ酸レベルで85％の配列同一性を有する。さらに、図4Bは、「その他」の輸送体配列として同定された新規配列の一つであるC43677と、ソラナム・リコペルシカムからの双方向性糖輸送体SWEET12様配列とのアラインメントを示す。以下の表8に示すように、これらの配列は、ヌクレオチドレベルで71％の配列同一性、およびアミノ酸レベルで67％の配列同一性を有する。
【００５７】
本明細書で述べるように、1個以上のヌクレオチドを変異させて、対応する野生型ポリペプチドの発現および/または機能と比べて、コードされたポリペプチドの発現および/または機能を変更することができる。例えば、高度に保存された領域(例えば、図1、2、3および4に示したアラインメントを参照)の1つまたは複数の変異は、ポリペプチドの機能を変える可能性が高いが、これらの保存された領域の外側の変異は、おそらくポリペプチドの機能にほとんどまたは全く影響を与えない、ことが理解されるであろう。また、単一のヌクレオチドの変異は終止コドンを生成することがあり、これはトランケートされたポリペプチドおよび、トランケーションの程度に応じて、機能喪失をもたらすであろう。
【００５８】
好ましくは、本明細書に開示する新規核酸の1つにおける変異は、結果的に、該変異を含むタバコ植物において輸送体活性の低下または完全な消失さえも生じさせる。輸送体コード配列における適切な変異の種類には、ヌクレオチドの挿入、ヌクレオチドの欠失、または野生型輸送体コード配列におけるトランジションもしくはトランスバージョンが含まれるが、これらに限定されない。コード配列における変異は、コードされたポリペプチドにおいて1個以上のアミノ酸の挿入、1個以上のアミノ酸の欠失、および/または非保存的アミノ酸置換をもたらす可能性がある。いくつかの場合には、輸送体のコード配列は、複数の変異または複数の種類の変異を含む。
【００５９】
コード配列中のアミノ酸の挿入または欠失は、例えば、コードされたポリペプチドの立体構造を破壊する可能性がある。アミノ酸の挿入または欠失はまた、結合リガンド(すなわち、輸送される分子(複数可))の認識にとって、またはポリペプチドの活性(すなわち、輸送体活性)にとって重要な部位を破壊し得る。より多数の連続アミノ酸の挿入または欠失が、より少数のアミノ酸の挿入または欠失と比較して、遺伝子産物を非機能的にする可能性が高いことは、当技術分野で公知である。また、1つまたは複数の変異(例えば、点変異)は、輸送体ポリペプチドの局在化を変更したり、終止コドンを導入してトランケート型ポリペプチドをもたらしたり、ポリペプチド内の活性部位またはドメイン(例えば、触媒部位またはドメイン、結合部位またはドメイン)を破壊したりする可能性がある。
【００６０】
単なる例として、MATE輸送体配列(例えば、図3；例えば、C9954 (SEQ ID NO:26)、C46276 (SEQ ID NO:22)、C48594 (SEQ ID NO:24)、およびDC38072 (SEQ ID NO:20))は、残基24の荷電アミノ酸を非荷電アミノ酸に変えるように変異させることができる。こうした変異は、細胞表面への輸送ポリペプチドの通常の標的指向性(targeting)を破壊することができ、このことは、植物内の1種または複数種のアルカロイドの(例えば、木部への、および/または根から葉への)輸送を変更する可能性がある。また、MDR輸送体(例えば、C11099 (SEQ ID NO: 16))は、ヌクレオチド124のTをAに変えるように変異させることができ、これは8番目のアミノ酸残基の後に終止コドンをもたらすであろう。このような変異は、植物において輸送体ポリペプチドを大幅に減少させるか、または本質的に排除するであろう；終止コドンを導入する変異は、本明細書に開示の輸送体配列のいずれにも同様に適用することができる。さらに、MDR(例えば、図2および4A)およびPDR(例えば、SEQ ID NO: 33〜36)ファミリーのポリペプチドは、輸送のためにATPの加水分解を必要とする；ATPアーゼドメインは高度に保存されており、加水分解に必要なアミノ酸残基が知られている(例えば、図2の残基676-682のWalker Aアミノ酸モチーフ(GXXGXGK))。したがって、MDRポリペプチド(例えば、DC3222 (SEQ ID NO: 10)、C11099 (SEQ ID NO: 16)、DC62783 (SEQ ID NO: 12)、およびDC26451 (SEQ ID NO: 14))またはPDRポリペプチド(例えば、C53160 (SEQ ID NO:34)、C22474 (SEQ ID NO:36))は、Walker Aモチーフ内で(例えば、保存されたリシン(K)アミノ酸で)変異させることができ、これは、ATPを加水分解することができず、かつその輸送能力を果たすことができないか、またはこうした能力が少なくとも減退している、ポリペプチドをもたらすであろう。
【００６１】
非保存的アミノ酸置換は、あるクラスのアミノ酸を別のクラスのアミノ酸で置換することができる。非保存的置換は、遺伝子産物の電荷または疎水性に大きな変化を加える可能性がある。非保存的アミノ酸置換はまた、例えばイソロイシン残基の代わりにアラニン残基を用いて、残基側鎖のかさに大きな変化をもたらすことができる。非保存的置換の例には、非極性アミノ酸の代わりに塩基性アミノ酸、または酸性アミノ酸の代わりに極性アミノ酸が含まれる。
【００６２】
輸送体ポリペプチドなどの膜貫通ポリペプチドは、該ポリペプチドが細胞内で局在化する場所を決定する特定の配列を含んでいる。例えば、以前に記載したMATE1タンパク質は、それを液胞に向かわせる配列を含むが、本明細書に記載の新規MATE配列は異なるN末端ドメインを有する(図3のアラインメントを参照されたい)。標的ペプチド配列は、多くの場合、該ポリペプチドが膜に挿入された後に(例えば、特定のヌクレオチドモチーフを認識する特異的プロテアーゼにより)切断される。標的配列または切断モチーフを変異させることによって、該ポリペプチドの標的指向性を変えることができる。
【００６３】
変異誘発後、その変異誘発細胞からM0植物を再生させ、これらの植物またはその集団の後続の世代(例えば、M1、M2、M3など)を関心対象の配列(例えば、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90)における変異についてスクリーニングすることができる。関心対象の配列に変異を有する植物のスクリーニングは、当技術分野でルーチンの方法(例えば、ハイブリダイゼーション、増幅、これらの組み合わせ)を用いて、または表現型を評価する(例えば、根および/または葉に含まれる1種または複数種のアルカロイドおよび/または1種または複数種のTSNAを検出しかつ/またはその量を測定する)ことによって行うことができる。一般的に、本明細書に開示する核酸配列(例えば、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90)の1つまたは複数に変異が存在することは、該変異を欠く対応する(例えば、同じ品種のバックグラウンドを有する)植物と比較して、変異型植物の葉に含まれる1種または複数種のアルカロイドおよび/または変異型植物の乾葉に含まれる1種または複数種のTSNAの減少につながる。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「減少した」または「減少」は、緑葉または乾葉のいずれかのタバコ葉に含まれる1種または複数種のアルカロイドの量、および/または緑葉または乾葉に含まれる1種または複数種のTSNAの量が、該変異を欠くタバコ植物からの同様に処理した葉(例えば、緑葉または乾葉)と比べて、少なくとも約5％〜約95％(例えば、約5％〜約10％、約5％〜約20％、約5％〜約50％、約5％〜約75％、約10％〜約25％、約10％〜約50％、約10％〜約90％、約20％〜約40％、約20％〜約60％、約20％〜約80％、約25％〜約75％、約50％〜約75％、約50％〜約85％、約50％〜約95％、および約75％〜約95％)減少すること(例えば、統計的に有意な減少)を意味する。本明細書で使用する場合、統計的有意性とは、統計的有意性の適切な尺度を用いて、例えば片側2標本t検定を用いて、0.05未満のp値、例えば、0.025未満のp値、または0.01未満のp値を指す。
【００６５】
M1タバコ植物は、変異対立遺伝子についてヘテロ接合性であって、野生型の表現型を示す可能性がある。このような場合には、こうした植物の第一世代の自家受粉子孫の少なくとも一部は、野生型の表現型を示す。これとは別に、M1タバコ植物は変異対立遺伝子を有し、変異型の表現型を示す可能性がある。このような植物はヘテロ接合性であって、野生型対立遺伝子の存在にもかかわらず、ドミナントネガティブ抑制などの現象のために変異型の表現型を示す可能性があるか、またはこのような植物は両方の対立遺伝子において独立して誘発された変異のためにホモ接合性であり得る。
【００６６】
変異対立遺伝子を保有するタバコ植物は、新規で有用な栽培品種、系統、品種および交雑種を作り出すために植物育種プログラムにおいて使用することができる。したがって、いくつかの態様では、少なくとも1つの変異を含むM1、M2、M3またはそれ以降の世代のタバコ植物が、第2のニコチアナ・タバカム植物と交配されて、変異(複数可)が存在する交配種の子孫を特定する。第2のニコチアナ・タバカム植物は本明細書に記載する種および品種の一つであり得ることが理解されよう。また、第2のニコチアナ・タバカム植物は、それが交配される植物と同じ変異、もしくは異なる変異を含むことができ、またはその遺伝子座において野生型であってもよいことが理解されよう。追加的にまたは選択的に、第2のタバコ系統は、例えば、次のような表現型形質を示すことができる：耐病性、高い収穫量、高い等級指数、乾燥性(curability)、乾燥品質、機械的収穫性、保持能力、葉の品質、高さ、植物の成熟(例えば、早生、中早生、中生、中晩生、または晩生)、茎の大きさ(例えば、小、中、または大)、および/または植物あたりの葉数(例えば、少数(例：5〜10枚)、中位の数(例：11〜15枚)、または多数(例：16〜21枚)の葉)。
【００６７】
育種は公知の手法を用いて行われる。DNAフィンガープリンティング、SNPまたは類似の技術は、本明細書に記載するように、変異対立遺伝子を他のタバコに導入または継承するために、マーカーアシスト選抜(MAS)育種プログラムで使用することができる。この交配種の子孫は、本明細書に記載の方法を用いて変異についてスクリーニングされ、本明細書に開示する核酸配列(例えば、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90)に変異を有する植物が選抜され得る。例えば、F2または戻し交配世代の植物は、本明細書に記載する技術の一つを使用して、本明細書に記載の配列またはその断片から開発されたマーカーを用いてスクリーニングすることができる。また、子孫植物からの葉(適宜に、緑葉または乾葉)を1種または複数種のアルカロイドおよび/または1種または複数種のTSNAの量についてスクリーニングすることもでき、該変異を欠く対応する植物と比較して、減少した量を有する植物が選抜され得る。変異対立遺伝子および/または変異型の表現型を保有すると同定された植物は、スクリーニングされる第2の集団を生み出すために戻し交配または自家受粉させることができる。反復親の所望の表現型が回復されるまで、戻し交配または他の育種法を繰り返すことができる。
【００６８】
成功した交配は、繁殖力があって、必要であれば両親の一方と戻し交配することができるF1植物をもたらす。いくつかの態様では、F2世代の植物集団は、標準的な方法(例えば、本明細書に開示する核酸配列に基づくプライマーを用いたPCR)を用いて、変異または変異型遺伝子の発現についてスクリーニングされる。次に、選抜された植物を一方の親と交配させ、第1戻し交配(BC1)世代の植物を自家受粉させてBC1F2集団を作り出し、これは変異型遺伝子の発現について再度スクリーニングされる。戻し交配、自家受粉およびスクリーニングのプロセスは、繁殖力がありかつ反復親にかなり類似する植物が最終スクリーニングによって得られるまで、例えば少なくとも4回、繰り返される。この植物は、必要に応じて、自家受粉され、続いてその子孫は、その植物が変異を含みかつ変異型遺伝子の発現を示すことを確認するために再度スクリーニングされる。選抜された植物の育種家種子(breeder's seed)は、標準方法、例えば圃場試験、ヌル条件(null condition)の確認、および/またはアルカロイドのレベルを測定するための葉(例えば、乾葉)の化学分析を用いて、生産することができる。
【００６９】
本明細書に記載の変異型タバコ植物を用いた植物育種プログラムの結果は、新規で有用な栽培品種、品種、系統、および交雑種である。本明細書で使用する用語「品種」(variety)とは、一定した特性を共有する植物の集団を指し、かかる特性が同じ種の他の植物からそれらを分離する。品種は、必ずではないけれども、多くの場合、市販されている。1つまたは複数の特徴的な形質を保持しつつ、品種は、その品種内の個体間での非常に小さな全体的変化によってさらに特徴づけられる。「純系」(pure line)品種は、数世代の自家受粉と選抜によって、または組織もしくは細胞培養技術を用いる単一の親からの栄養繁殖によって、作り出すことができる。品種と区別される「系統」(line)は、ほとんどの場合、非商業的に、例えば植物の研究において、使用される一群の植物を表す。系統は、典型的には、関心対象の1つまたは複数の形質について個体間で全体的変化をほとんど示さないが、他の形質については個体間で多少の変化があるかもしれない。
【００７０】
品種は、別の系統または品種に本質的に由来することができる。植物の新品種の保護に関する国際条約(International Convention for the Protection of New Varieties of Plants)(1961年12月2日、ジュネーブで1972年11月10日に、1978年10月23日に、および1991年3月19日に改正された)によって定義されるように、品種は、以下の要件を満たす場合に、原品種(initial variety)に「本質的に由来する」：a)それは原品種に主として由来するか、原品種に主として由来する品種に由来するが、原品種の遺伝子型またはその組み合わせから生ずる本質的な特性の表現を維持していることを条件とする；b)それは原品種と明確に区別される；およびc)由来する品種を得る行為から生ずる差異を除いて、それは原品種の遺伝子型またはその組み合わせから生ずる本質的な特性の表現において原品種に合致している。本質的に由来する品種は、例えば、自然的もしくは人工的突然変異体の選抜、ソマクローナル変異体(somaclonal variant)の選抜、原品種からの個々の変異型植物体の選抜、戻し交配、または形質転換によって得ることができる。
【００７１】
タバコ交雑種は、第1の品種の雌性親植物(すなわち、種子親)の自家受粉を防止し、第2の品種の雄性親植物からの花粉を雌性親植物に受粉させ、該雌性植物にF1雑種種子を形成させることによって作出することができる。雌性植物の自家受粉は、花の発生の初期段階で花の除雄を行うことによって防止することができる。あるいは、花粉の形成は、雄性不稔の一形態を用いて雌性親植物で防止することができる。例えば、雄性不稔は、細胞質雄性不稔(CMS)、核雄性不稔、遺伝的雄性不稔、分子雄性不稔(この場合には、導入遺伝子が小胞子生成および/もしくは花粉形成、または自家不和合性を阻害する)によってもたらされる。CMSを含む雌性親植物は特に有用である。雌性親植物がCMSである態様では、雄性親植物は、典型的には、F1雑種が確実に稔性となるように稔性回復遺伝子を含む。雌性親がCMSである他の態様では、稔性回復因子を含まない雄性親を使用することができる。このような両親から作出されたF1雑種は雄性不稔性である。雄性不稔性の雑種種子は、得られる雄性不稔性植物での結実(seed-set)のための花粉を提供する雄性稔性の種子と混植することができる。
【００７２】
本明細書に記載の品種、系統および栽培品種は、単交配(single-cross)タバコF1雑種を形成するために使用することができる。このような態様では、親品種の植物は、雄性親植物から雌性親植物への自然な他家受粉を促進するために、隣接する実質的に均質な集団として栽培することができる。雌性親植物に形成されたF2種子は、従来の手段により選択的に収穫される。また、これら2つの親植物品種をまとめて(in bulk)栽培し、雌性親に形成されたF1雑種種子と、自家受粉の結果として雄性親に形成された種子とのブレンドを収穫することもできる。あるいは、三系交配(three-way cross)を行うことができ、その場合には、単交配F1雑種を雌性親として使用して、別の雄性親と交配させる。別の方法として、複交配(double-cross)雑種を作出することができ、その場合には、2つの異なる単のF1子孫それら自体を交配させる。自己不和合性は、複交雑雑種を形成する際に雌性親の自家受粉を防止するために特に有利に使用することができる。
【００７３】
本明細書に記載の方法で使用されるタバコ植物は、バーレー種、ダーク種、黄色種、メリーランド種、またはオリエント種であり得る。本明細書に記載の方法で使用されるタバコ植物は典型的にはN.タバカム由来であり、さまざまなN.タバカム品種に由来し得る。品種は以下のものとすることができる：BU 64、CC 101、CC 200、CC 13、CC 27、CC 33、CC 35、CC 37、CC 65、CC 67、CC 301、CC 400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、CC 1063、Coker 176、Coker 319、Coker 371 Gold、Coker 48、CU 263、DF911、Galpaoタバコ、GL 26H、GL 338、GL 350、GL 395、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、GF 157、GF 318、RJR 901、HB 04P、K 149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、NC 196、NC 37NF、NC 471、NC 55、NC 92、NC2326、NC 95、NC 925、PVH 1118、PVH 1452、PVH 2110、PVH 2254、PVH 2275、VA 116、VA 119、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY 10、KY 14、KY 160、KY 17、KY 171、KY 907、KY907LC、KTY14 x L8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY 14xL8、Narrow Leaf Madole、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal Smith Madole、OXFORD 207、「Perique」タバコ、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R 7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight 168、Speight 172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、TI 1406、TI 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN90LC、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR (Tom Rosson) Madole、VA 309、またはVA359。
【００７４】
変異に加えて、タバコの葉に含まれるアルカロイドの量を低減させることができる別の方法は、阻害性RNA(すなわち、RNAi)を使用することである。したがって、少なくとも1つのRNAi分子をコードする導入遺伝子を含むトランスジェニックタバコ植物が提供され、この導入遺伝子は、発現された場合、本明細書に記載の内因性核酸(例えば、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90)の少なくとも1つをサイレンシングする。本明細書に記載するように、このようなトランスジェニック植物からの葉は、(例えば、該RNAiを欠くまたは発現しない植物からの葉と比較して)少なくとも1種のアルカロイドの減少した量を示す。また、このようなトランスジェニック植物からの葉は、(例えば、該RNAiを欠くまたは発現しない植物からの葉と比較して)少なくとも1種のタバコ特異的ニトロソアミン(TSNA)の減少した量を示す。
【００７５】
RNAi技術は、当技術分野において公知であり、転写後遺伝子サイレンシングの非常に有効な形態である。RNAi分子は、典型的には、標的遺伝子に相補的なヌクレオチド配列(例えば、約18ヌクレオチド長(例：約19または20ヌクレオチド長)から約700ヌクレオチド長まで)をセンスおよびアンチセンスの両方向で含む。センス鎖とアンチセンス鎖は短い「ループ」配列(例えば、約5ヌクレオチド長から約800ヌクレオチド長まで)により連結されて、単一の転写産物として発現されるか、またはセンス鎖とアンチセンス鎖は別々のベクターもしくは構築物で標的細胞に送達され、該細胞において発現され得る。複数の会社がRNAiの設計および合成サービスを提供しており(例えば、Life Technologies社、Applied Biosystems社)、本明細書に記載の複数の新規配列に対する代表的なRNAi分子がSEQ ID NO: 51〜56に提供される。
【００７６】
RNAi分子は、植物発現ベクターを用いて発現させることができる。RNAi分子は、典型的には、少なくとも25ヌクレオチド長であり、本明細書に開示する核酸配列(例えば、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90)の1つに対して少なくとも91％の配列同一性(例えば、少なくとも95％、96％、97％、98％または99％の配列同一性)を有するか、またはストリンジェントな条件下で本明細書に開示する核酸配列(例えば、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90)の1つにハイブリダイズする。ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、先に記載されている。
【００７７】
核酸(例えば、異種核酸)を植物細胞に導入する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、粒子ボンバードメント、アグロバクテリウム媒介形質転換、マイクロインジェクション、ポリエチレングリコール媒介形質転換(例えば、プロトプラストを使用、例えば、Yooら(2007, Nature Protocols, 2(7):1565-72)を参照)、リポソーム媒介DNA取り込み、またはエレクトロポレーションを含む。形質転換に続いて、トランスジェニック植物細胞をトランスジェニックタバコ植物体に再生させることができる。本明細書に記載するように、導入遺伝子の発現は、結果的に、導入遺伝子を発現しない植物からの葉と比較して、得られる乾葉中の少なくとも1種のアルカロイドおよび/または少なくとも1種のTSNAの減少した量を示す葉につながる。再生されたトランスジェニック植物の葉は、得られる乾葉中の1種または複数種のアルカロイドおよび/または1種または複数種のTSNAの量についてスクリーニングされ、対応する非トランスジェニック植物における該量と比較して、得られる乾葉中の少なくとも1種のアルカロイドおよび/または少なくとも1種のTSNAの減少した量を有する植物が、例えば本明細書で説明するような育種プログラムにおいて、使用するために選択され得る。
【００７８】
除草剤抵抗性(除草剤耐性とも呼ばれる)、昆虫抵抗性、またはストレス耐性などの形質を付与する核酸もまた、本明細書に記載の新規なタバコ植物中に存在することができる。成長点または分裂組織を阻害する除草剤、例えばイミダゾリノンまたはスルホニル尿素など、に対する耐性を付与する遺伝子が適切であり得る。このカテゴリー中の典型的な遺伝子は、例えば米国特許第5,767,366号および第5,928,937号に記載されるような、変異型ALSおよびAHAS酵素をコードする。米国特許第4,761,373号および第5,013,659号は、種々のイミダゾリノンまたはスルホンアミド除草剤に対して耐性を示す植物に向けられる。米国特許第4,975,374号は、変異型グルタミン合成酵素(GS)をコードする遺伝子を含む植物細胞および植物体に関し、これは、GSを阻害することが知られている除草剤、例えばホスフィノトリシンおよびメチオニンスルホキシミン、による阻害に耐性である。米国特許第5,162,602号には、シクロヘキサンジオンおよびアリールオキシフェノキシプロパン酸除草剤による阻害に耐性を示す植物が開示される。
【００７９】
グリホサートに対する耐性のための遺伝子も適している。例えば、米国特許第4,940,835号および第4,769,061号を参照されたい。こうした遺伝子は、グリホサート塩、例えばトリメチルスルホニウム塩、イソプロピルアミン塩、ナトリウム塩、カリウム塩およびアンモニウム塩など、を含むがこれらに限定されない、グリホサート除草剤組成物に対する耐性を付与することができる。例えば、米国特許第6,451,735号および第6,451,732号を参照されたい。また、ホスホノ化合物、例えばグルホシネートアンモニウムまたはホスフィノトリシンなど、ピリジノキシまたはフェノキシプロピオン酸類、およびシクロヘキソン類に対する耐性のための遺伝子も適切である。例えば、米国特許第5,879,903号、第5,276,268号および第5,561,236号、ならびに欧州特許出願第0 242 246号を参照されたい。
【００８０】
他の適切な除草剤には、光合成を阻害するもの、例えばトリアジンおよびベンゾニトリル(ニトリラーゼ)など、が含まれる。米国特許第4,810,648号を参照されたい。他の適切な除草剤としては、2,2-ジクロロプロピオン酸、セトキシジム、ハロキシホップ、イミダゾリノン除草剤、スルホニルウレア除草剤、トリアゾロピリミジン除草剤、s-トリアジン除草剤およびブロモキシニルが挙げられる。また、プロトックス(protox)酵素に対する耐性を付与する除草剤も適している。例えば、米国特許第6,084,155号およびUS 20010016956を参照されたい。
【００８１】
昆虫、例えば鱗翅目(Lepidoptera)の昆虫、に対する耐性を付与する複数の遺伝子が利用可能である。典型的な遺伝子には、トランケート型Cry1A(b)およびCry1A(c)毒素をコードするものが含まれる。例えば、米国特許第5,545,565号、第6,166,302号および第5,164,180号に記載される遺伝子を参照されたい。また、Vaeck et al., 1997, Nature, 328:33-37およびFischhoff et al., 1987, Nature Biotechnology, 5:807-813も参照されたい。特に有用なものは、タバコスズメガ(Manduca sexta)(タバコイモムシ)、ニセアメリカタバコガ(Heliothis virescens Fabricius)(オオタバコガ幼虫)および/またはハスモンヨトウ(S. litura Fabricius)(タバコネキリムシ)に対して殺虫活性を示す毒素をコードする遺伝子である。
【００８２】
葉の中のアルカロイドの量を増加させた植物および作出方法
本明細書に記載の配列は、葉の中の1種または複数種のアルカロイド(および/または1種または複数種のTSNA)の量を増加させるために、植物において過剰発現させることができる。したがって、植物において発現を引き出すことができるプロモーター(例えば、植物プロモーター)の制御下に本明細書に記載の核酸分子(例えば、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90)またはその機能性断片で形質転換された、トランスジェニックタバコ植物またはこのような植物からの葉が提供される。本明細書で説明するように、植物発現ベクター中で使用される核酸分子は、本明細書に記載の配列とは異なる配列を有することができ、こうした配列は、(例えば、SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90に対する)配列同一性パーセントとして、あるいは該配列がSEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、または90にハイブリダイズする条件に基づいて、表現され得る。
【００８３】
全長配列を使用する代わりに、所望の機能性を有するポリペプチド断片(本明細書では「機能性断片」という)をコードする、該配列の一部を使用することができる。核酸に関して使用される場合、それは、機能性を保有する核酸断片のことではなく、コードされたポリペプチド断片のことである、と理解されるであろう。本明細書の開示ならびに図1、2、3および4に示したアラインメントに基づいて、当業者は、所望の機能性を付与しうるポリペプチドの部分(例えば、1つまたは複数のドメイン)を予測することができる。
【００８４】
形質転換に続いて、トランスジェニックタバコ細胞は、トランスジェニックタバコ植物体に再生することができる。再生されたタバコ植物の葉は、1種または複数種のアルカロイドの量についてスクリーニングされ、対応する非トランスジェニック植物における該量と比較して、少なくとも1種のアルカロイドの増加した量を有する植物を選択して、例えば本明細書で説明するような育種プログラムにおいて、使用することができる。前記核酸分子またはその機能性断片の発現は、該核酸分子またはその機能性断片を発現しないタバコ植物からの葉と比較して、少なくとも1種のアルカロイドの増加した量を示す葉をもたらす可能性がある。除草剤抵抗性、昆虫抵抗性、またはストレス耐性を付与する核酸もまた、このようなタバコ植物に導入することができる。
【００８５】
タバコ製品および製造方法
本明細書に記載の方法は、タバコ植物中の葉成分を変化させることが可能である。本明細書に記載するように、葉成分を変化させることは、葉の中の少なくとも1種のアルカロイドの量を減少または増加させることを指す。本明細書に記載するように、こうした方法は変異誘発(例えば、ランダムもしくは標的)または(例えば、RNAiもしくは過剰発現を用いる)トランスジェニック植物の作出を含むことができる。
【００８６】
このようなタバコ(例えば、1種または複数種のアルカロイドの減少または増加した量を有する)からの葉は、乾燥させ、熟成させ、コンディショニングし、かつ/または発酵させることができる。タバコを乾燥させる方法はよく知られており、例えば、自然乾燥、火力乾燥、熱風乾燥および日干し乾燥が含まれる。熟成もまた知られており、一般的には、木製ドラム(例えば、大だる)または段ボール箱に圧縮した状態で入れて、約10％〜約25％の含水率で数年間(例えば、2〜5年間)実施される(例えば、米国特許第4,516,590号および第5,372,149号を参照されたい)。コンディショニングは、例えば、US 2004/0118422またはUS 2005/0178398に記載されるような加熱、スェッティング(sweating)または低温殺菌工程を含むが、発酵は一般的に、高い初期水分含量、発熱、および乾燥重量の10〜20％損失により特徴づけられる。例えば、米国特許第4,528,993号、第4,660,577号、第4,848,373号および第5,372,149号を参照されたい。また、タバコは、必要に応じて、さらに加工処理(例えば、切断、膨張、ブレンド、破砕、または粉末化)して、タバコ製品において使用することができる。
【００８７】
タバコ製品は、当技術分野で公知であり、タバコ製品の任意の成分、部品、または付属品を含めて、ヒトでの消費を対象とした、タバコから作られたまたはタバコに由来する製品を包含する。代表的なタバコ製品としては、限定するものではないが、以下の製品が挙げられる：無煙タバコ製品、タバコ由来のニコチン製品、シガリロ、非通気型リセスフィルター(recess filter)タバコ、通気型リセスフィルタータバコ、葉巻、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、葉巻タバコ、紙巻タバコ、噛みタバコ、葉タバコ、刻みタバコ、およびカットタバコ。代表的な無煙タバコ製品には、例えば、噛みタバコ、スヌース(snus)、パウチ、フィルム、タブレット、コーティングされたダボ(dowel)、ロッドなどが含まれる。代表的な紙巻タバコおよび他の喫煙物品には、例えば、フィルター部材またはロッド部材を含む喫煙物品が含まれ、喫煙可能材料のロッド部材はタバコブレンド内に乾燥タバコを含むことができる。本明細書に記載のアルカロイド低減タバコに加えて、タバコ製品は、結合剤、可塑剤、安定剤、および/または香味剤を含むがこれらに限定されない、他の成分をも含むことができる。タバコ製品の例については、例えば、US 2005/0244521、US 2006/0191548、US 2012/0024301、US 2012/0031414、およびUS 2012/0031416を参照されたい。
【００８８】
本発明は以下の実施例においてさらに説明されるが、これらの実施例は特許請求の範囲に記載された方法および組成物の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００８９】
実施例1−根から葉へのアルカロイドの輸送
以前の研究では、ニコチアナ・タバカムの近縁種であるニコチアナ・アラタ(Nicotiana alata：ハナタバコ)は、葉にアルカロイドを輸送しないことが証明されている(Pakdeechanuan et al., 2012, Plant Cell Physiol., 53(7):1247-54)。この表現型は図5に示すように確認された。また、N.アラタが摘芯後にアルカロイドを輸送することができるという可能性についても試験された。表1を参照されたい。試験したどの条件下でも、アルカロイドの葉への輸送は見出されなかった。
【００９０】
(表1) 摘芯ありおよび摘芯なしのN.アラタの葉と根のアルカロイド含有量
2019165729.tif 000002
LOQ, 定量レベル; ND, 検出されず
【００９１】
実施例2−RNAの調製および配列決定
摘芯前および摘芯後のN.アラタ植物の根組織からのRNAを回収し、Illumina社からのTrue-Seqライブラリー構築キットを用いてRNAシークエンシングライブラリーを作製した。N.アラタRNAの配列決定は、Illumina MiSeqプラットフォームを用いて達成した。配列決定ランは150サイクルのペアエンドリード(paired end read)パラメータで実施し、ライブラリーの品質と平均サイズをE遺伝子キャピラリー電気泳動装置により測定した。TN90タバコにおける根特異的遺伝子の発現は、ArrayXpress社(Raleigh, NC)によって実施されたRNAディープシークエンシングにより決定した。
【００９２】
配列決定の後、得られた配列をトリミングし、30を上回る品質スコアを有するリードをコンティグ(contig)にアセンブルした。次に、個々の配列リードをこれらのコンティグ上にマッピングした。配列決定ラン1は、合計69Mbの配列データに関して460万のマッピングされたリードをもたらし、配列決定ラン2は、合計37.5Mbの配列データに関して250万のマッピングされたリードをもたらした。これにより、106.5Mbの配列リードがN.アラタ遺伝子発現の分析に使用されることになった。
【００９３】
全長コード配列は、95％配列同一性のカットオフを用いてN.ベンサミアナ(N. benthamiana：ベンサミアナタバコ)の参照ゲノムと比較することによって決定した。全長コード配列およびそれによりコードされる予測ポリペプチドは、SEQ ID NO: 1〜50および70〜91に示される。
【００９４】
実施例3−発現レベルの分析
N.タバカムと比較して、N.アラタで異なって発現されるかまたは検出されない輸送関連遺伝子を同定するために、TN90とN.アラタの遺伝子発現データを分析した。TN90発現データを、他の組織との発現の差(＞9倍高い遺伝子発現、p値＜0.000001)に基づいて、根特異的発現についてフィルタリングした。次に、その結果を、高い根発現についてフィルタリングした(摘芯後に＞100のリード)。続いて、二次代謝産物の輸送体を表す遺伝子オントロジー(GO)用語について遺伝子をフィルタリングした(例えば、用語「輸送」を「薬物」または「プリン」と一緒に用いて、その結果をフィルタリングした)。2つの独立した配列決定ランにおいてN.アラタでは検出されなかった遺伝子を、同じGO基準を用いてフィルタリングした。その後、これらのデータセットを比較して、3つ全てのカテゴリー(すなわち、(i)高い根特異的発現、(ii)GO基準、および(iii)N.アラタでは発現されない)に分類される遺伝子を決定した。
【００９５】
これらの遺伝子は、TN90タバコでのそれらの発現レベルと共に、表2に示される。
【００９６】
(表2) TN90における遺伝子発現
2019165729.tif 000003
*, 摘芯後の時間; ND＝検出されず
【００９７】
また、N.アラタで高度に発現されたが、N.タバカムでは発現されなかった、可能性のある調節および/または生合成遺伝子を決定するために、N.アラタ遺伝子の発現レベルをTN90発現と比べて分析した。4つの標的が同定され、それらを表3に示す。
【００９８】
(表3) N.アラタで高度に発現された遺伝子の発現
2019165729.tif 000004
a, 摘芯の72時間後に回収した根組織; *, 摘芯後の時間
【００９９】
実施例4−配列アラインメント
輸送に関与すると予測される遺伝子は、5つの主なカテゴリーに分類される：ニコチン取り込みパーミアーゼ(Nup)ファミリー、多剤・毒性化合物排出型(MATE)ファミリー、多剤耐性(MDR)ファミリー、および多面的薬剤耐性(PDR)ファミリー、ならびに無関係な遺伝子のグループ。ヌクレオチド配列および予測されるポリペプチド配列を公開データベースに寄託された配列と比較した。これらの比較の結果は、表4(Nup配列)、表5(MDR配列)、表6(MATE配列)、表7(PDR配列)、表8(その他の輸送体配列)、および表9(高レベルで発現されたN.アラタ遺伝子)に示される。
【０１００】
(表4) Nup配列
2019165729.tif 000005
【０１０１】
(表5) MDR配列
2019165729.tif 000006
【０１０２】
(表6) MATE配列
2019165729.tif 000007
【０１０３】
(表7) PDR配列
2019165729.tif 000008
【０１０４】
(表8) その他の輸送体配列
2019165729.tif 000009
【０１０５】
(表9) N.アラタにおいて高レベルで発現された遺伝子
2019165729.tif 000010
【０１０６】
N.タバカムと比べてN.アラタにおいて高度に発現された遺伝子の一つ、C33728は、ACリッチ結合因子(ACBF)調節タンパク質であるようである。このポリペプチドは、タバコに導入した場合、マメ由来の異種木部関連プロモーターの該プロモーター中のACリッチリピート領域に結合することが示され、全ての組織において発現されることが見出されたが、植物の茎において最も多く見られた(Seguin et al., 1997, Plant Mol. Biol., 35(3):281-91)。このポリペプチドは、遺伝子の活性化に関与している可能性がある、3つのはっきりと異なる予測RNA結合ドメインおよびグルタミンリッチ領域を含む。これらの予測ドメインは、以下のSEQ ID NO:50に下線で示される。N末端ドメインはグルタミンリッチである。このタイプのドメインアーキテクチャは複数のスプライシング因子において見出される(Lorkovic and Barta, 2002, Nuc. Acids Res., 30:623-35)。
2019165729.tif 000011
【０１０７】
実施例5−RNAi系統の開発、プラスミドの構築および形質転換
候補遺伝子の機能を評価するために、一つは全長コード配列を使用し、一つはRNAi配列を使用して、二組のトランスジェニック植物を作出した(図6参照)。全長コード配列またはRNAi配列の発現のために、発現ベクター(SEQ ID NO:21)を使用したが、該ベクターは、CsVMVプロモーターおよびNOSターミネーター、ならびにアクチン2プロモーターの指令下のカナマイシン選択マーカー(NPT II)を有しかつNOSターミネーターを有するカセットを含有する。関心対象の導入遺伝子を担持する核酸構築物は、DNAボンバードメントまたは微粒子銃アプローチを用いて、タバコ葉ディスクに導入した。例えば、Sanford et al., 1993, Methods Enzymol., 217:483-510; およびOkuzaki and Tabei, 2012, Plant Biotechnology, 29:307-310を参照されたい。
【０１０８】
簡単に説明すると、形質転換カセットを含むプラスミドDNAを1μmの金粒子(DNA/金)に次のようにコーティングした。1μmの金粒子を180℃で12時間焼成し、ストック溶液(40mg/ml)を調製した。10ショット用の混合物を作るために、1.5mlチューブ内で100μlのストック溶液を40μlの発現ベクターDNA(1μg/μl)、100μlの2.5M CaCl2、および40μlの0.1Mスペルミジンと混合した。この混合物を13,000×gで30秒間遠心分離し、ペレットを500μlの100％エタノールで洗浄した。DNA/金混合物を100μlの水に懸濁し、10μlをマクロキャリアに塗布し、乾燥後に打ち込んだ(bombarded)。PDS-1000/Heシステム(Bio-Rad Laboratories社, Hercules, CA, 米国)で不完全真空(711mmHg)下に1,100psiラプチャーディスク(rupture disc)を用いて、プレートあたり2ショットを打ち込んだ。
【０１０９】
Narrow Leaf Madole(NLM)およびTennessee 90(TN90)タバコのリーフディスクをRNAi構築物による形質転換に使用し、また、ニコチアナ・アラタタバコのリーフディスクを全長候補遺伝子構築物による形質転換に使用した。全タバコ葉(長さ約45×30mm)をMS培地上に一晩置き、2日目にリーフディスクに該構築物を打ち込んだ。次に、葉を小片(約5×5mm)に切断し、TOM培地(20gスクロース/L、1mg/L IAAおよび2.5mg/L BAPを含むMS培地)上に再び置いて27℃で3〜5日間生育させ、その後、300mg/1のカナマイシンを含むTOM培地(TOM-Kan)に移して生育させた。組織を新しいTOM-Kanプレートに2〜3週間ごとに4〜6週間移した(27℃、光線16時間)。カナマイシン耐性初代シュートは、ボンバードメント後4〜6週間で再生された。シュートをMS-カナマイシンプレートに移して根を生育させた。
【０１１０】
T1植物体(および後続世代)からの葉および/または根は、1種または複数種のアルカロイドおよび/または1種または複数種のTSNAの量を測定するために評価される。
【０１１１】
実施例6−RNAi分子および発現構築物の配列
RNAi分子の配列は以下に示される。二重下線を引いた部分はループであり、これはタバコQS遺伝子配列に由来する。
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【０１１２】
発現カセットの配列は以下に示され、関連部分を左余白に示す。図6も参照されたい。
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【０１１３】
実施例7−ランダム変異誘発および変異体の特性解析
EMS変異のために、Tennessee 90タバコ(TN90)の変換種子(converter seed)1グラム(約10,000個の種子)を0.1％ Tween(登録商標)中で15分間洗浄し、次いで30mlのddH2O中に2時間浸漬した。その後、150μlの0.5％ EMS (Sigma社, カタログ番号M-0880)を種子/ddH2O溶液に混合し、換気フード下に室温(RT；約20℃)で(30rpmで回転しながら)8〜12時間インキュベートした。次いで、液体を種子から除去し、その液体を除染および廃棄のために1M NaOH中で一晩混合した。その後、種子を2〜4時間かけて100mlのddH2Oで2回洗浄した。洗浄した種子は、次いで、0.1％寒天：水の溶液中に懸濁した。
【０１１４】
寒天溶液中のEMS処理した種子を、薄い木箱(flat)内の水に浸したCarolina's Choice Tobacco Mix(商標)(Carolina Soil社, Kinston, NC)上に約2000個/木箱でむらなく広げた。次に、木箱をプラスチックのラップで覆い、生育チャンバーに入れた。実生の苗が土から出てきたら、プラスチックのラップに穴をあけ、湿度を徐々に低下させた。2週間後にプラスチックのラップを完全に取り除いた。木箱を温室に移して、NPK肥料を施した。苗をフロートトレイに詰め込んで、移植に適した大きさになるまで生育させた。植物を圃場に移植した。生育中に、植物を自家受粉させてM1種子を形成させた。成熟した段階で、各植物から5つの鞘を収穫し、各植物からの種子のセットに個別の名称を与えた。これによりM1集団が形成された。
【０１１５】
各M0植物からのM1種子の混合物を生育させ、M1植物からの葉を集めてDNAを抽出した。標的遺伝子を増幅させ、変異の同定のために配列決定した。
【０１１６】
実施例8−TALENを用いた標的変異誘発
遺伝子特異的TALEN認識配列は、特定の遺伝子標的内またはプロモーター配列内のいずれかに見出され、遺伝子の発現を低下させたり、または組織特異的発現を変更したりするために、標的欠失またはプロモーター挿入を可能にする。関心対象の領域の配列を以下に示す(SEQ ID NO: 61〜69)。遺伝子C22474のための特定の標的配列(Pdr5b)は、関心対象の領域の対応する配列に下線が引かれている。関心対象のTALEN領域の全ての位置を図7に概略的に示す。黄色のバーは、イントロンを含む一次転写産物を表す。緑色は、プロモーター領域としてマークされる上流領域を表す。これらのTALEN部位は、既知のゲノム配列情報に基づいて、単一の遺伝子標的に特異的である。各遺伝子のTALEN領域1および2はプロモーターまたはコード領域の5'末端を破壊するために使用されるが、他の領域はコード配列のみを破壊するために使用される。
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【０１１７】
関心対象の遺伝子の標的配列は、転写活性化因子様(TAL)エフェクタータンパク質の可能な結合部位配列を決定するために、Life Technology社(Carlsbad, CA)に送られる。TALをLife Technology社により合成し、本発明者らの植物発現ベクターpALCS1にクローニングして、エントリーベクターとして使用する。目的に応じて、5つの異なるプロトコルを使用して変異原性タバコ系統を作出し得る：1) 1つまたは複数のエントリーベクター(標的TALを含むpALCS1)をタバコプロトプラストに直接形質転換して、ランダム配列欠失または挿入変異原性タバコ系統を作出する；2) 標的挿入配列と相同である配列が左右に配置されたドナー配列(例えばレポーター遺伝子、例：GUS遺伝子)を、1つまたは複数のエントリーベクター(標的TALを含むpALCS1)と共に、タバコプロトプラストに同時形質転換して、レポーター遺伝子を含む変異原性タバコ系統を作出する；3) 点変異を有する標的TALを含むドナー配列を、1つまたは複数のエントリーベクター(標的TALを含むpALCS1)と共に、タバコプロトプラストに同時形質転換して、点変異を有する変異原性タバコ系統を作出する；4) 組織特異的プロモーター配列を含むドナー配列により、組織特異的様式で内因性遺伝子を発現する変異型タバコ系統を作出する；および5) 上記のドナー配列とレポーター遺伝子構築物との組み合わせを含むドナー配列により、変異型タバコのスクリーニングを容易にする。
【０１１８】
生育室内のMagenta容器で生育中のTN90タバコ葉からタバコプロトプラストを分離する。3〜4週齢の植物の十分に展開した葉(5cm)を中心部から0.5〜1mmの葉片に切り取る。葉片は、葉片の両側を浸漬することによって、調製済みの酵素溶液(1％セルラーゼR10、0.25％マセロザイム(macerozyme)R10、0.4Mマンニトール、20mM KCl、20mM MES(pH5.7)、10mM CaCl2、0.1％ BSA)に移す。葉片を、振盪せずに室温で4時間から一晩かけて暗所にて消化を続けながら、デシケーターを用いて暗所で30分間減圧浸潤処理する。プロトプラストを100μmナイロンフィルターでろ過し、3mlのLymphoprepを用いて精製する。プロトプラストを遠心分離し、W5n溶液(154mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl、2mM MES、991mg/lグルコースpH5.7)で洗浄し、W5n溶液に5×105個/mlの濃度で懸濁する。プロトプラストを氷上に30分間保持して、チューブの底に重力によって沈降させる。W5n溶液を除去し、プロトプラストを室温でP2溶液中に再懸濁した。50μlのDNA(10〜20μgのプラスミド)、500μlのプロトプラスト(2×l05個のプロトプラスト)および550μlのPEG溶液(40％v/v 10ml 4g PEG4000、0.2Mマンニトール、0.1M CaCl2)を15mlマイクロチューブ内で穏やかに混合し、その混合物を室温で5分間インキュベートする。
【０１１９】
プロトプラストをペレット化し、1mlの2×8EN1 (8EN1：NH4NO3を含まないMS塩、MSビタミン、0.2％ myo-イノシトール、4mM MES、1mg/l NAA、1mg/l IAA、0.5Mマンニトール、0.5mg/l BAP、1.5％スクロース)により再懸濁する。形質転換されたプロトプラストを等量の低融点アガロース(LMA)でゼリー状にし、0.2mlのプロトプラスト-LAMを滴下してビーズを形成させる。該ビーズに10mlの8EN1を添加し、7日で、5mlの8EN1を取り出して、5mlの8EN2 (0.25Mマンニトールを含む8EN1)を追加する；さらに7日後(14日目)に、10mlの8EN2を取り出して、10mlの8EN2を追加する；さらに7日後(21日目)に、5mlの8EN2を取り出して、5mlの8EN3 (3％スクロースを含み、マンニトールを含まない8EN1)を追加する；さらに7日後(28日目)に、10mlの8EN3を取り出して、10mlの8EN3を追加する。プロトプラストをマイクロカルスの増殖まで2週間保持する。カルスが約5mmに達するまで(通常は約2週間)、それをNCM固形培地に移す。カルスをTOM-Kan固形培地に移してシュートを出させ、本明細書に記載の方法を用いて形質転換タバコ植物体を再生させた。
【０１２０】
(表10) TALエフェクター結合部位の配列
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下線＝TAL結合部位；TAL結合部位間の非下線領域＝DNA切断が起こるように設計されている位置。
【０１２１】
実施例9−アルカロイド含有量の変更についての植物のスクリーニング
実施例5、6、7または8で同定されたトランスジェニック変異型タバコ植物を、10インチのポットに入れたCarolina's Choice Tobacco Mix (Carolina Soil社, Kinston, NC)で畑に似た条件下の温室で生育させる。開花期に、植物を摘芯して、2週間後に展開した葉と根から組織サンプルを採取する。
【０１２２】
該組織をすり鉢とすりこぎですりつぶす。アルカロイド含有量を、Arista Laboratories社からの認定プロトコルを用いて、質量分析に連結したガスクロマトグラフィーによって測定する。ニコチン、ノルニコチン、アナバシン、およびアナタビンの量、ならびに総アルカロイド含有量を測定する。
【０１２３】
実施例10−ニコチン供給アッセイ
若いトランスジェニック植物におけるニコチンの輸送は、内因性アルカロイドが測定可能になるのを待つよりもはるかに早くニコチンの量を増加させて表現型を決定するために、肥料を含んだ水と一緒にニコチンを供給することによって試験することができる。供給アッセイは2つの別々の方法で行った。第1の方法では、実生の苗をスタイロフォーム(Styrofoam)のフロートトレイに移した。これらの植物を、該トレイの底から根が出始めるまで、100ppmの肥料を含んだ水(Pete's Professional)で生育させた。次に、肥料を含んだニコチン溶液(1mMニコチン、100ppm肥料)に該トレイを3日間浮かべた。根と葉の組織を採取し、アルカロイドを上記のように抽出して分析した。葉と根のニコチン含有量だけでなく、葉と根のニコチンレベルの比率も計算した(図8)。第2の方法では、植物を4インチのポットに移した。根が土をまとめて保持する程度に十分生育した後、底を取り払った4インチのポットにそれらを移した。2週間の生育後、肥料を含んだニコチン溶液で1日2回2日間植物を処理した。ニコチン供給の前後に葉を採取し、アルカロイドを上記のように抽出して分析した。供給前後の葉のニコチン含有量を図9に示す。
【０１２４】
ニコチンレベルの減少は、PDRファミリー遺伝子C22474を標的とするRNAi構築物(pALCS-TDNA-R1)を発現する2つの植物において見出された；MDRファミリー遺伝子11099を標的とするRNAi構築物(pALCS-TDNA-R2)を発現する一つの植物は、供給後にニコチンレベルの減少を示した；さらに未分類遺伝子C43677を標的とするRNAi構築物(pALCS-TDNA-R4)を発現する一つの植物もまた、葉におけるニコチンレベルの減少を示した。RNAiの標的部位の位置を図7に示す。
【０１２５】
実施例11−N.タバカムとN.オトフォラとの比較
N.タバカムは、タバコ属の2つの異なる系統の交配に由来した。N.アラタは、アルカロイドを輸送しないN.シルベストリス(N. sylvestris)系統のメンバーに相当する(上記実施例3参照)。N.オトフォラ(N. otophora)は、他の系統(N.トメントシフォルミス(N. tomentosiformis))の非輸送性メンバーである。N.オトフォラからは失われているが、N.タバカムには高レベルで存在している輸送関連遺伝子を決定するために、RNAシークエンシングを実施した。
【０１２６】
簡単に述べると、N.オトフォラおよびN.タバカムTN90からの根サンプルを摘芯の10日後に採取した。RNAを抽出し、シークエンシングをAmbry Genetics社(Aliso Viejo, CA)で行った。RNAシークエンシングは1.25億の配列リードをもたらした。デノボコンティグ配列をN.オトフォラのために作製し、TN90から以前に得られたゲノム配列を比較のために使用した。配列リードをN.オトフォラのデノボコンティグ配列にマッピングし、次に、マッピングされなかった残りのリードをTN90ゲノムにマッピングして、N.オトフォラから欠落していると予測される遺伝子のリストを作成した。二次代謝産物の輸送に関連した遺伝子を遺伝子オントロジーの用語に基づいて選択した。さまざまな時点でのこれらの遺伝子の発現レベルを表11に示す。
【０１２７】
(表11) TN90における遺伝子発現
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*, 摘芯後の時間；ND＝検出されず
【０１２８】
ヌクレオチド配列および予測されるポリペプチド配列を公開データベースに寄託された配列と比較した。これらの比較の結果を表12に示す。
【０１２９】
(表12) 配列アラインメント
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【０１３０】
前記の方法および組成物は複数の異なる局面に関連して本明細書に説明されているが、さまざまな局面の前述の説明は、例示することを意図したものであり、前記の方法および組成物の範囲を限定するものではない、ことを理解すべきである。その他の局面、利点、および変更形態は、以下の特許請求の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年5月14日(2019.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO: 15に対して少なくとも95％同一の配列を有する内因性核酸に変異を含む植物を含むニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)交雑種、品種、系統、または栽培品種の植物から作出され、該変異を含むタバコ乾葉であって、該変異を欠く対応する植物と比べて、該変異が該内因性核酸にコードされる輸送体の発現または機能の減少を生じさせる、前記タバコ乾葉。
【請求項２】
前記内因性核酸が、SEQ ID NO: 15に対して100％同一の配列を有する、請求項１記載のタバコ乾葉。
【請求項３】
前記ニコチアナ・タバカム交雑種、品種、系統、または栽培品種が、バーレー種(Burley type)、ダーク種(dark type)、黄色種(flue-cured type)、メリーランド種(Maryland type)、およびオリエント種(Oriental type)からなる群より選択される、請求項１記載のタバコ乾葉。
【請求項４】
前記変異を欠く植物からのタバコ乾葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの少なくとも5％の減少を示す、請求項１記載のタバコ乾葉。
【請求項５】
前記少なくとも1種のアルカロイドが、ニコチン、ノルニコチン、アナバシン、ミオスミン、およびアナタビンからなる群より選択される、請求項４記載のタバコ乾葉。
【請求項６】
前記変異を欠く植物からのタバコ乾葉と比べて、少なくとも1種のタバコ特異的ニトロソアミン(TSNA)の量の少なくとも5％の減少を示す、請求項１記載のタバコ乾葉。
【請求項７】
前記少なくとも1種のTSNAが、N'-ニトロソノルニコチン、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン、N'-ニトロソアナタビン、N'-ニトロソアナバシン、および4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタナールからなる群より選択される、請求項６記載のタバコ乾葉。
【請求項８】
自然乾燥、火力乾燥、熱風乾燥および日干し乾燥からなる群より選択される方法を用いて乾燥される、請求項１記載のタバコ乾葉。
【請求項９】
前記変異が、点変異、挿入、欠失、および置換からなる群より選択される、請求項１記載のタバコ乾葉。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項記載のタバコ乾葉を含む、タバコ製品。
【請求項１１】
無煙タバコ製品である、請求項１０記載のタバコ製品。
【請求項１２】
前記無煙タバコ製品が、噛みタバコ、スヌース(snus)、パウチ、フィルム、タブレット、コーティングされたダボ(dowel)、およびロッドからなる群より選択される、請求項１１記載のタバコ製品。
【請求項１３】
シガリロ、非通気型リセスフィルター(recess filter)タバコ、通気型リセスフィルタータバコ、葉巻、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、葉巻タバコ、紙巻タバコ、葉タバコ、刻みタバコ、およびカットタバコからなる群より選択される、請求項１０記載のタバコ製品。
【請求項１４】
フィルター部材またはロッド部材を含む、請求項１０記載のタバコ製品。
【請求項１５】
SEQ ID NO: 15に対して少なくとも95％同一の配列を有する内因性核酸に変異を含む植物を含むニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)交雑種、品種、系統、または栽培品種であって、該変異を欠く対応する植物と比べて、該変異が該内因性核酸にコードされる輸送体の発現または機能の減少を生じさせる、前記交雑種、品種、系統、または栽培品種。
【請求項１６】
前記植物からの葉が、前記変異を欠く植物からのタバコ乾葉と比べて、少なくとも1種のアルカロイドの少なくとも5％の減少を示す、請求項１５記載のニコチアナ・タバカム交雑種、品種、系統、または栽培品種。
【請求項１７】
前記少なくとも1種のアルカロイドが、ニコチン、ノルニコチン、アナバシン、ミオスミン、およびアナタビンからなる群より選択される、請求項１６記載のニコチアナ・タバカム交雑種、品種、系統、または栽培品種。
【請求項１８】
前記植物からの乾葉が、前記変異を欠く植物からのタバコ乾葉と比べて、少なくとも1種のタバコ特異的ニトロソアミンの量の少なくとも5％の減少を示す、請求項１５記載のニコチアナ・タバカム交雑種、品種、系統、または栽培品種。
【請求項１９】
バーレー種(Burley type)、ダーク種(dark type)、黄色種(flue-cured type)、メリーランド種(Maryland type)、およびオリエント種(Oriental type)からなる群より選択される種である、請求項１５記載のニコチアナ・タバカム交雑種、品種、系統、または栽培品種。
【請求項２０】
前記変異が、点変異、挿入、欠失、および置換からなる群より選択される、請求項１５記載のニコチアナ・タバカム交雑種、品種、系統、または栽培品種。
【請求項２１】
請求項１５〜２０のいずれか一項記載のニコチアナ・タバカム交雑種、品種、系統、または栽培品種より産生され、前記変異を含む、種子。