(57)【要約】【課題】診断および療法のためのエキソソーム中のゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の分析の提供。【解決手段】本発明は、ヒトの体液試料由来のエキソソームが染色体全てにわたる二本鎖ゲノムＤＮＡを含有し、がんなどの疾患における目的の遺伝子の変異状態を決定するために使用することができることを提供する。さらに、本発明は、治療用タンパク質を作製するためのエキソソームの使用、および療法における治療用タンパク質の使用、ならびに、がんを診断し、治療応答をモニタリングするための、がん細胞由来エキソソームの検出を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１３年１２月４日に出願された米国仮特許出願第６１／９１１，８６３号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、一般に、遺伝学、タンパク質生化学、および腫瘍学の分野に関する。より詳細には、本発明は、遺伝子解析および治療における、エキソソームのゲノムＤＮＡおよびタンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
ＰＤＡＣ患者に関して、腫瘍が明白な切除縁（ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｍａｒｇｉｎ）を伴って早期に検出された場合には、膵頭十二指腸切除術（ウィップル手順）が治癒的なものになり得る。膵がんの診断の遅れに起因して、外科的に切除可能な腫瘍が見られるのは患者のおよそ１５％のみである（Ｃｏｎｌｏｎら、１９９６年）。疾患の病期と外科手術後の転帰を比較する試験では、疾患がより早い段階で診断されればＰＤＡＣの死亡率が低下することが示唆されている（Ｂｉｌｉｍｏｒｉａら、２００７年）。
【０００４】
サイトカインおよびケモカインなどの可溶性因子を介した直接の細胞間接触に加えて、エキソソームが細胞間コミュニケーションにおいて中心的な役割を果たすという新たな証拠が存在する（ＫａｈｌｅｒｔおよびＫａｌｌｕｒｉ、２０１３年）。エキソソームは、サイズが４０〜１５０ｎｍの、小さな、膜に結合した小胞である（Ｐａｎら、１９８５年；Ｔｒａｍｓら、１９８１年）。エキソソームは、がん細胞、間葉細胞、栓球（ＫａｈｌｅｒｔおよびＫａｌｌｕｒｉ、２０１３年；Ｈｅｉｊｎｅｎら、１９９９年；Ｒａｐｏｓｏら、１９９６年）、免疫細胞（Ｔｈｅｒｙら、２００９年）、血小板（Ｊａｎｏｗｓｋａ−Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋら、２００５年）、および内皮細胞（Ｈｅｒｇｅｎｒｅｉｄｅｒら、２０１２年）などの多くの異なる細胞型から分泌される。エキソソーム生合成の第１のステップは、後期エンドソームの境界膜から内向きに突き出ることを伴う（Ｔｒａｊｋｏｖｉｃら、２００８年）。このプロセスの間に、エキソソームに親細胞由来のＲＮＡ分子およびタンパク質がパッケージングされる（Ｔｒａｍｓら、１９８１年；Ｔｒａｊｋｏｖｉｃら、２００８年）。細胞外空間に放出された後、腫瘍由来のエキソソームから、発がん活性を有するタンパク質およびＲＮＡがレシピエント細胞に移行し得る（Ｋａｃｈａｒｚｅｗｓｋａら、２０１２年；Ｇｒａｎｇｅら、２０１１年；Ｐｅｉｎａｄｏら、２０１２年）。エキソソームは様々な条件下で非常に安定なため、それらの生物学的カーゴを細胞外環境における分解および変性から保護することができる（ＴａｙｌｏｒおよびＧｅｒｃｅｌ−Ｔａｙｌｏｒ、２００８年）。循環中のゲノムＤＮＡが主にエキソソームに含有される（Ｋａｈｌｅｒｔら、２０１４年）。星状細胞および神経膠芽腫細胞由来のエキソソームはミトコンドリアＤＮＡを担持する（Ｇｕｅｓｃｉｎｉら、２０１０年）。さらに、神経膠芽腫細胞株由来のエキソソームは少量の一本鎖ＤＮＡならびに高レベルの転移因子を含有することが示されている（Ｂａｌａｊら、２０１１年）。
【０００５】
エキソソームは、血清、唾液、脳脊髄液、骨髄吸引液、眼滲出液／涙、および腹水などの、がん患者の体液の全てにおいて見いだされる（Ｐｅｉｎａｄｏら、２０１２年；Ｌａｕら、２０１３年；Ｃｈｏｉら、２０１１年）。そのようなものとして、エキソソームは、がんにおける有望な診断用および予測用バイオマーカーである。しかし、がん患者由来の循環ＤＮＡに対する遺伝子プロファイリング試験では、単離されたＤＮＡが体の全ての細胞を代表していることから変異および遺伝的欠陥を難しくしているという事実のために混乱している（Ｍｕｒｔａｚａら、２０１３年；Ｙｏｎｇ、２０１４年；Ｋｉｒｋ、２０１３年；Ｃｏｒｗｌｅｙら、２０１３年）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｏｎｌｏｎら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ（１９９６）２２３：２７３〜２７９
【非特許文献２】Ｂｉｌｉｍｏｒｉａら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ（２００７）２４６：１７３〜１８０
【非特許文献３】ＫａｈｌｅｒｔおよびＫａｌｌｕｒｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．（Ｂｅｒｌ．）（２０１３）９１：４３１〜４３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
いくつかのエキソソームマーカーが提唱されており、それらとして、テトラスパニンファミリーのメンバー（ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１）、輸送のために必要なエンドソーム選別複合体のメンバー（ＥＳＣＲＴ；ＴＳＧ１０１、Ａｌｉｘ）、および熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０）が挙げられる（ＴａｙｌｏｒおよびＧｅｒｃｅｌ−Ｔａｙｌｏｒ、２０１１年）。上皮腫瘍細胞は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を保有するエキソソームを分泌する（ＴａｙｌｏｒおよびＧｅｒｃｅｌ−Ｔａｙｌｏｒ、２００８年；Ｓｉｌｖａら、２０１２年；Ｒｕｎｚら、２００７年）。黒色腫由来のエキソソームは、腫瘍関連抗原Ｍａｒｔ−１およびチロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＹＲＰ２）を含有する（Ｐｅｉｎａｄｏら、２０１２年；Ｍｅａｒｓら、２００４年；Ａｎｄｒｅら、２００２年）。胃がん、乳がん、および膵がんに由来するエキソソームは、ヒト上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ）ファミリーのメンバーを担持する（Ａｄａｍｃｚｙｋら、２０１１年；Ｂａｒａｎら、２０１０年；Ｃｉｒａｖｏｌｏら、２０１２年）。しかし、これらのマーカーはいずれもがん由来のエキソソームに特異的なものではなく、がんエキソソームを同定し、他の細胞によって産生されるエキソソームと区別するために使用することができる特異的なマーカーがないために、がん患者の血清からエキソソームを特異的に単離することは難しいままである。がん由来のエキソソームに対するマーカーにより、循環中の低頻度の変異の検出の感度が有意に上昇する。したがって、循環中のがん細胞由来エキソソームを特異的に検出し、単離する手順が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明は、ヒト血清試料由来のエキソソームが、染色体全てにわたる二本鎖ゲノムＤＮＡを含有し、例えば、ＫＲＡＳおよびｐ５３の変異状態を決定するために使用することができることを提供する。さらに、本発明は、がん細胞由来エキソソームを、例えば、エキソソーム表面マーカーグリピカン−１（ＧＰＣ１）に基づいてなどで同定し、単離するための方法を提供する。さらに、本発明は、エキソソームを使用して、治療用タンパク質または核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）を作製し、疾患細胞に送達し得ることを提供する。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、被験体からゲノム二本鎖ＤＮＡを単離する方法であって、（ａ）患者から試料を得るステップと、（ｂ）試料のエキソソーム画分を単離するステップと、（ｃ）エキソソーム画分からゲノム二本鎖ＤＮＡを単離するステップとを提供する。一部の態様では、ステップ（ｂ）は、グリピカン１（ＧＰＣ１）を含むエキソソームを単離することを含み得る。
【００１０】
一部の態様では、方法は、ＤＮＡの配列解析を実施するステップ、例えば、遺伝子（例えば、ＫＲＡＳまたはｐ５３）の変異状態を決定するステップを含み得る。一部の態様では、変異状態は、がんバイオマーカーであってよい。一部の態様では、がんバイオマーカーの存在を使用して、患者ががんを有すると診断することができる。一部の態様では、方法は、遺伝子の変異状態および／または患者に関する診断を報告するステップを含み得る。一部の態様では、報告するステップは、書面での報告書または電子報告書を作成することを含み得る。一部の態様では、報告するステップは、報告書を患者、医師、病院または保険会社に提供することを含み得る。
【００１１】
一部の態様では、試料は、リンパ液、唾液、尿、血清、または脳脊髄液であってよい。一部の態様では、試料は、細胞を本質的に含まないものであってよい。
【００１２】
一部の態様では、被験体は、乳がん、肺がん、頭頸部がん、前立腺がん、食道がん、気管がん、脳がん、肝がん、膀胱がん、胃がん、膵がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、精巣がん、結腸がん、直腸がんまたは皮膚がんなどのがんを有してよい。一部の態様では、がんは、膵管腺癌であってよい。一部の態様では、被験体は、がんについて以前に治療され得る。一部の態様では、被験体は、腫瘍の外科的除去を以前に受けていてよい。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、被験体におけるがんバイオマーカーを同定する方法であって、（ａ）本発明の実施形態に従ってゲノムＤＮＡを単離するステップと、（ｂ）ゲノムＤＮＡの配列解析を実施するステップと、（ｃ）少なくとも１種の遺伝子の変異状態を決定し、それにより、がんバイオマーカーを同定するステップとを含む方法を提供する。一部の態様では、ステップ（ｃ）は、少なくとも２種の遺伝子の変異状態を決定することを含み得る。
【００１４】
一部の態様では、がんバイオマーカーの存在により、患者ががんを有すると診断することができる。がんは、乳がん、肺がん、頭頸部がん、前立腺がん、食道がん、気管がん、脳がん、肝がん、膀胱がん、胃がん、膵がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、精巣がん、結腸がん、直腸がんまたは皮膚がんなどの任意の型のがんであってよい。一態様では、がんは、膵管腺癌であってよい。一部の態様では、被験体は、がんについて以前に治療され得る。一部の態様では、被験体は、腫瘍の外科的除去を以前に受けていてよい。
【００１５】
一部の態様では、方法は、遺伝子の変異状態および／または患者に関する診断を報告するステップを含み得る。一部の態様では、報告するステップは、書面での報告書または電子報告書を作成することを含み得る。一部の態様では、報告するステップは、報告書を患者、医師、病院または保険会社に提供することを含み得る。
【００１６】
一実施形態では、本発明は、被験体におけるがんを治療する方法であって、本発明の実施形態に従って被験体ががんバイオマーカーを有することを同定するステップ、および被験体に抗がん療法を施すステップを含む方法を提供する。一部の態様では、抗がん療法は、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、標的化療法、免疫療法または外科療法であってよい。一態様では、被験体は、ヒトであってよい。
【００１７】
一実施形態では、本発明は、疾患の治療を必要とする患者における疾患を治療する方法であって、（ａ）試料からエキソソームを得るステップと、（ｂ）エキソソームに治療用タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトするステップと、（ｃ）トランスフェクトされたエキソソームを患者に提供し、それにより、患者における疾患を治療するステップとを含む方法を提供する。一部の態様では、エキソソームは、患者にとって自己由来であってよい。一部の態様では、疾患はがんであってよい。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、治療用タンパク質の投与を必要とする患者に治療用タンパク質を投与する方法であって、（ａ）試料からエキソソームを得るステップと、（ｂ）エキソソームに治療用タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトするステップと、（ｃ）エキソソームを、治療用タンパク質をエキソソーム内で発現させることを可能にする条件下でインキュベートするステップと、（ｄ）インキュベートしたエキソソームを患者に提供し、それにより、治療用タンパク質を患者に投与するステップとを含む方法を提供する。一部の態様では、エキソソームは、患者にとって自己由来であってよい。
【００１９】
一実施形態では、本発明は、被験体における疾患を治療する方法であって、本実施形態に従って被験体ががんバイオマーカーを有することを同定するステップと、本実施形態に従って被験体に治療用タンパク質を投与するステップとを含む方法を提供する。一態様では、がんバイオマーカーはｐ５３変異であってよく、治療用タンパク質は野生型ｐ５３であってよい。別の態様では、がんバイオマーカーはＫＲＡＳ変異であってよく、治療用タンパク質は野生型ＫＲＡＳであってよい。
【００２０】
一実施形態では、本発明は、組換えタンパク質を作製する方法であって、（ａ）試料からエキソソームを得るステップと、（ｂ）エキソソームに組換えタンパク質をコードする核酸をトランスフェクトするステップと、（ｃ）エキソソームを、組換えタンパク質を発現させることを可能にする条件下でインキュベートし、それにより、組換えタンパク質を作製するステップとを含む方法を提供する。
【００２１】
一部の態様では、方法は、組換えタンパク質を精製するステップを含み得る。ある特定の態様では、方法は、それを必要とする患者に、精製された、組換えタンパク質を投与するステップを含み得る。一部の態様では、方法は、それを必要とする患者に、インキュベートしたエキソソームを投与するステップを含み得る。一部の態様では、エキソソームは、患者にとって自己由来であってよい。一態様では、患者は、がんと診断され得る。
【００２２】
実施形態の一部の態様では、試料は、組織培養培地試料であってよい。実施形態の他の態様では、試料は、体液試料（例えば、リンパ液、唾液、尿、脳脊髄液、骨髄吸引液、眼滲出液／涙、または血清）であってよい。ある特定の態様では、体液試料、したがって、それから得られるエキソソームは、治療方法を受けている患者から得ることができる。
【００２３】
実施形態の一部の態様では、核酸は、ｍＲＮＡであってよい。実施形態の一部の態様では、核酸は、プラスミドであってよい。
【００２４】
一実施形態では、本発明は、実施形態の方法に従って作製された、精製された組換えタンパク質を提供する。
【００２５】
一実施形態では、本発明は、がん細胞由来エキソソームを単離する方法であって、（ａ）がん患者から体液試料を得るステップと、（ｂ）体液試料のエキソソーム画分を単離するステップと、（ｃ）エキソソーム画分からグリピカン１を含むエキソソームを単離し、それにより、がん細胞由来エキソソームを単離するステップとを含む方法を提供する。一部の態様では、方法は、がん細胞由来エキソソームからゲノム二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を単離するステップを含み得る。一部の態様では、方法は、がん細胞由来エキソソームにおける特定のＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、またはタンパク質の存在を検出するステップを含み得る。一部の態様では、特定のＤＮＡ配列を検出するステップは、ＤＮＡ配列における特定の変異または欠損を検出することを含み得る。一部の態様では、特定のＤＮＡ配列を検出するステップは、ＤＮＡ配列の特定のエピジェネティック状態を検出することを含み得る。一部の態様では、特定のＲＮＡ配列を検出するステップは、ＲＮＡ配列における特定の変異または欠損を検出することを含む。一部の態様では、タンパク質を検出するステップは、例えば、変異したタンパク質、付加変異タンパク質、欠失変異タンパク質、改変タンパク質（例えば、翻訳後修飾の状態が変更されたタンパク質）、または短縮されたタンパク質などの、欠陥のあるタンパク質を検出することを含む。一部の態様では、タンパク質を検出するステップは、エピジェネティック変化を検出することを含み得る。
【００２６】
ある特定の態様では、ステップ（ｂ）または（ｃ）の単離は、免疫磁気捕捉、接着に基づく選別、磁気活性化選別、または蛍光活性化選別（ＦＡＣＳ）を含み得る。一部の態様では、方法は、患者におけるがん細胞由来エキソソームの数を定量化するステップを含み得る。一部の態様では、方法は、がん細胞由来エキソソームについて遺伝子型決定するステップを含み得る。
【００２７】
ある特定の態様では、体液試料は、リンパ液、唾液、尿、または血清であってよい。ある特定の態様では、がんは、乳がん、肺がん、頭頸部がん、前立腺がん、食道がん、気管がん、脳がん、肝がん、膀胱がん、胃がん、膵がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、精巣がん、結腸がん、直腸がんまたは皮膚がんであってよい。
【００２８】
一実施形態では、本発明は、患者におけるがんを診断する方法であって、（ａ）患者から体液試料を得るステップと、（ｂ）体液試料のエキソソーム画分を単離するステップと、（ｃ）エキソソーム画分中のグリピカン１の存在についてアッセイするステップであって、グリピカン１が存在している場合、患者ががんを有すると診断するステップとを含む方法を提供する。一部の態様では、方法は、患者におけるグリピカン１を含有するエキソソームの数を定量化するステップを含み得る。患者におけるグリピカン１を含有するエキソソームの数を定量化するステップは、例えば、免疫アフィニティ―捕捉、血球計算分析（ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、またはＥＬＩＳＡを含み得る。
【００２９】
一部の態様では、方法は、がん患者における療法に対する応答をモニタリングする方法と定義することができ、ここでグリピカン１を含有するエキソソームの数が時間をわたって減少すれば、患者が療法に対して陽性に応答しているといえる。一部の態様では、患者は、がんを有すると以前に診断されていなくてもよく、方法は、早期がん検出の方法であってよい。一部の態様では、患者は寛解の状態にあってよく、方法は、再発を検出する方法であってよい。一態様では、方法は、患者に抗がん療法を施すステップを含み得る。
【００３０】
ある特定の態様では、体液試料は、リンパ液、唾液、尿、脳脊髄液、骨髄吸引液、眼滲出液／涙、または血清であってよい。ある特定の態様では、がんは、乳がん、肺がん、頭頸部がん、前立腺がん、食道がん、気管がん、脳がん、肝がん、膀胱がん、胃がん、膵がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、精巣がん、結腸がん、直腸がんまたは皮膚がんであってよい。
【００３１】
一部の態様では、方法は、患者に関する診断を報告するステップを含み得る。一部の態様では、報告するステップは、書面での報告書または電子報告書を作成することを含み得る。一部の態様では、報告するステップは、報告書を患者、医師、病院または保険会社に提供することを含み得る。
【００３２】
一部の実施形態では、本発明は、試料からエキソソームを単離すること、エキソソーム由来のゲノムＤＮＡを単離すること、がん細胞由来エキソソームを単離すること、試料および／または患者におけるがん細胞由来エキソソームの数を定量化すること、エキソソーム内で組換えタンパク質を発現させること、エキソソーム内で発現させた組換えタンパク質を用いて患者を治療すること、および／または組換えタンパク質を発現するエキソソームを用いて患者を治療することにおいて使用するためのキットを提供し得る。
【００３３】
一実施形態では、患者における疾患の治療に使用するための、治療用タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトしたエキソソームを含む組成物が提供される。一部の態様では、疾患は、がんであってよい。一部の態様では、エキソソームは、患者にとって自己由来であってよい。一部の態様では、エキソソームは、治療用タンパク質をエキソソーム内で発現させることを可能にする条件下でインキュベートしたものであってよい。一部の態様では、患者は、本実施形態に従って、がんバイオマーカーを有することが同定されていてよい。一部の態様では、がんバイオマーカーはｐ５３変異であってよく、治療用タンパク質は野生型ｐ５３であってよい。
【００３４】
一実施形態では、疾患を治療するための医薬品の製造における、治療用タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトしたエキソソームの使用が提供される。一部の態様では、疾患は、がんであってよい。
【００３５】
本発明の方法および／または組成物の文脈において考察されている実施形態を本明細書に記載されている任意の他の方法または組成物に関して使用することができる。したがって、１つの方法または組成物に関するある実施形態を本発明の他の方法および組成物にも同様に適用することができる。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「ａ（１つの）」または「ａｎ（１つの）」という特定は、１つまたは複数を意味し得る。特許請求の範囲で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語と同時に使用される場合、「ａ（１つの）」または「ａｎ（１つの）」という単語は、１つまたは１つ超を意味し得る。
【００３７】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみを指すかまたは代替物が相互排他的であることが明示されていなければ、「および／または」の意味を示すために使用されるが、本開示は、代替物のみ、ならびに「および／または」を指すという定義を支持する。本明細書で使用される場合、「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」とは、少なくとも第２のまたはそれ超を意味し得る。
【００３８】
本出願全体を通して、「約」という用語は、値が、その値を決定するために使用されるデバイス、方法に固有の誤差の変動、または試験対象の中で存在する変動を含むことを示すために使用される。
【００３９】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の発明の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、この発明の詳細な説明から本発明の主旨および範囲内の様々な変化および改変が当業者に明らかになるので、発明の詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、単に例示として示されていることが理解されるべきである。
【００４０】
以下の図は本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、これらの図の１つまたは複数を、本明細書で提示されている特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによってよく理解することができる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
がん細胞由来エキソソームを単離する方法であって、
（ａ）がん患者から体液試料を得るステップと、
（ｂ）前記体液試料のエキソソーム画分を単離するステップと、
（ｃ）前記エキソソーム画分からグリピカン１を含むエキソソームを単離し、それにより、がん細胞由来エキソソームを単離するステップと
を含む、方法。
（項目２）
前記がん細胞由来エキソソームからゲノム二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を単離するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記がん細胞由来エキソソームから単離されたＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を検出するステップをさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ステップ（ｂ）または（ｃ）の単離が、免疫磁気捕捉、接着に基づく選別、磁気活性化選別、または蛍光活性化選別（ＦＡＣＳ）を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記患者におけるがん細胞由来エキソソームの数を定量化するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記がん細胞由来エキソソームについて遺伝子型決定するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記体液試料が、リンパ液、唾液、尿、脳脊髄液、骨髄吸引液、眼滲出液／涙、または血清である、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記がんが、乳がん、肺がん、頭頸部がん、前立腺がん、食道がん、気管がん、脳がん、肝がん、膀胱がん、胃がん、膵がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、精巣がん、結腸がん、直腸がんまたは皮膚がんである、項目１に記載の方法。
（項目９）
患者におけるがんを診断する方法であって、
（ａ）患者から体液試料を得るステップと、
（ｂ）前記体液試料のエキソソーム画分を単離するステップと、
（ｃ）前記エキソソーム画分中のグリピカン１の存在についてアッセイするステップであって、グリピカン１が存在している場合、前記患者はがんを有すると診断されるステップと
を含む、方法。
（項目１０）
前記患者におけるグリピカン１を含有するエキソソームの数を定量化するステップをさらに含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記方法が、がん患者における療法に対する応答をモニタリングする方法としてさらに定義され、ここでグリピカン１を含有するエキソソームの数が時間をわたって減少する場合、前記患者は、療法に対して陽性に応答していたといえる、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記患者が以前にがんと診断されておらず、前記方法が早期がん検出の方法である、項目９に記載の方法。
（項目１３）
前記患者が寛解状態にあり、前記方法が再発を検出する方法である、項目９に記載の方法。
（項目１４）
前記患者に抗がん療法を施すステップをさらに含む、項目９に記載の方法。
（項目１５）
前記体液試料が、リンパ液、唾液、尿、脳脊髄液、骨髄吸引液、眼滲出液／涙、または血清である、項目９に記載の方法。
（項目１６）
前記がんが、乳がん、肺がん、頭頸部がん、前立腺がん、食道がん、気管がん、脳がん、肝がん、膀胱がん、胃がん、膵がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、精巣がん、結腸がん、直腸がんまたは皮膚がんである、項目９に記載の方法。
（項目１７）
前記患者に関する前記診断を報告するステップをさらに含む、項目９に記載の方法。
（項目１８）
報告するステップが、書面での報告書または電子報告書を作成することを含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記報告書を前記患者、医師、病院または保険会社に提供するステップをさらに含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
被験体からゲノム二本鎖ＤＮＡを単離する方法であって、
（ａ）患者から試料を得るステップと、
（ｂ）前記試料のエキソソーム画分を単離するステップと、
（ｃ）前記エキソソーム画分からゲノム二本鎖ＤＮＡを単離するステップと
を含む、方法。
（項目２１）
ステップ（ｂ）が、グリピカン１を含むエキソソームを単離することをさらに含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記ＤＮＡの配列解析を実施するステップをさらに含む、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
遺伝子の変異状態を決定するステップをさらに含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記遺伝子がＫＲＡＳまたはｐ５３である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記遺伝子の前記変異状態が、がんバイオマーカーである、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記がんバイオマーカーを使用して、前記患者ががんを有すると診断する、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記遺伝子の前記変異状態を報告するステップをさらに含む、項目２３に記載の方法。（項目２８）
報告するステップが、書面での報告書または電子報告書を作成することを含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記報告書を前記患者、医師、病院または保険会社に提供するステップをさらに含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記試料が、リンパ液、唾液、尿、または血清である、項目２０に記載の方法。
（項目３１）
前記試料が、細胞を本質的に含まない、項目２０に記載の方法。
（項目３２）
前記被験体が、がんを有する、項目２０に記載の方法。
（項目３３）
前記がんが、乳がん、肺がん、頭頸部がん、前立腺がん、食道がん、気管がん、脳がん、肝がん、膀胱がん、胃がん、膵がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、精巣がん、結腸がん、直腸がんまたは皮膚がんである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記がんが膵管腺癌である、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
前記被験体が、がんについて以前に治療されている、項目２０に記載の方法。
（項目３６）
前記被験体が、腫瘍の外科的除去を以前に受けている、項目２０に記載の方法。
（項目３７）
被験体におけるがんバイオマーカーを同定する方法であって、
（ａ）項目２０に従ってゲノムＤＮＡを単離するステップと、
（ｂ）前記ゲノムＤＮＡの配列解析を実施するステップと、
（ｃ）少なくとも１種の遺伝子の変異状態を決定し、それにより、がんバイオマーカーを同定するステップと
を含む、方法。
（項目３８）
ステップ（ｃ）が、少なくとも２種の遺伝子の前記変異状態を決定することを含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記がんバイオマーカーの存在を使用して、前記患者ががんを有すると診断する、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記がんが、乳がん、肺がん、頭頸部がん、前立腺がん、食道がん、気管がん、脳がん、肝がん、膀胱がん、胃がん、膵がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、精巣がん、結腸がん、直腸がんまたは皮膚がんである、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記がんが膵管腺癌である、項目３９に記載の方法。
（項目４２）
前記被験体が、がんについて以前に治療されている、項目３７に記載の方法。
（項目４３）
前記被験体が、腫瘍の外科的除去を以前に受けている、項目３７に記載の方法。
（項目４４）
前記遺伝子の前記変異状態を報告するステップをさらに含む、項目３７に記載の方法。（項目４５）
報告するステップが、書面での報告書または電子報告書を作成することを含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記報告書を前記患者、医師、病院または保険会社に提供するステップをさらに含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
被験体におけるがんを治療する方法であって、項目３７に従って被験体ががんバイオマーカーを有することを同定するステップと、前記被験体に抗がん療法を施すステップとを含む、方法。
（項目４８）
前記抗がん療法が、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、標的化療法、免疫療法または外科療法である、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記被験体がヒトである、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
疾患の治療を必要とする患者における疾患を治療する方法であって、
（ａ）試料からエキソソームを得るステップと、
（ｂ）前記エキソソームに治療用タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトするステップと、
（ｃ）トランスフェクトされた前記エキソソームを患者に提供し、それにより、前記患者における前記疾患を治療するステップと
を含む、方法。
（項目５１）
前記疾患が、がんである、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
治療用タンパク質の投与を必要とする患者に治療用タンパク質を投与する方法であって、
（ａ）試料からエキソソームを得るステップと、
（ｂ）前記エキソソームに治療用タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトするステップと、
（ｃ）前記エキソソームを、前記治療用タンパク質を前記エキソソーム内で発現させることを可能にする条件下でインキュベートするステップと、
（ｄ）インキュベートした前記エキソソームを患者に提供し、それにより、治療用タンパク質を前記患者に投与するステップと
を含む、方法。
（項目５３）
前記試料が、前記患者から得られる、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
被験体における疾患を治療する方法であって、項目３７に従って被験体ががんバイオマーカーを有することを同定するステップと、項目５２に従って前記被験体に治療用タンパク質を投与するステップとを含む、方法。
（項目５５）
前記がんバイオマーカーがｐ５３変異であり、前記治療用タンパク質が野生型ｐ５３である、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
組換えタンパク質を作製する方法であって、
（ａ）試料からエキソソームを得るステップと、
（ｂ）前記エキソソームに組換えタンパク質をコードする核酸をトランスフェクトするステップと、
（ｃ）前記エキソソームを、前記組換えタンパク質を発現させることを可能にする条件下でインキュベートし、それにより、前記組換えタンパク質を作製するステップと
を含む、方法。
（項目５７）
前記組換えタンパク質を精製するステップをさらに含む、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
それを必要とする患者に前記タンパク質を投与するステップをさらに含む、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
それを必要とする患者にインキュベートした前記エキソソームを投与するステップをさらに含む、項目５６に記載の方法。
（項目６０）
インキュベートした前記エキソソームが、前記患者にとって自己由来である、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記患者が、がんと診断されている、項目５８または５９に記載の方法。
（項目６２）
前記試料が、組織培養培地試料である、項目５０、５２または５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記試料が、体液試料である、項目５０、５２または５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記体液試料が、リンパ液、唾液、尿、脳脊髄液、骨髄吸引液、眼滲出液／涙、または血清である、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記体液試料が、前記患者から得られる、項目６３に記載の方法。
（項目６６）
前記核酸がｍＲＮＡである、項目５０、５２または５７のいずれか一項に記載の方法。（項目６７）
前記核酸がプラスミドである、項目５０、５２または５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
項目５６に記載の方法に従って作製された、精製された組換えタンパク質。
（項目６９）
患者における疾患の治療に使用するための、治療用タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトしたエキソソームを含む組成物。
（項目７０）
前記疾患が、がんである、項目６９に記載の組成物。
（項目７１）
前記エキソソームが、前記患者にとって自己由来である、項目６９に記載の組成物。
（項目７２）
前記エキソソームが、前記治療用タンパク質を前記エキソソーム内で発現させることを可能にする条件下でインキュベートされたものである、項目６９に記載の組成物。
（項目７３）
項目３７に従って、前記患者が、がんバイオマーカーを有すると同定されている、項目６９に記載の組成物。
（項目７４）
前記がんバイオマーカーがｐ５３変異であり、前記治療用タンパク質が野生型ｐ５３である、項目７３に記載の組成物。
（項目７５）
疾患を治療するための医薬品の製造における、治療用タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトしたエキソソームの使用。
（項目７６）
前記疾患が、がんである、項目７５に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｆは、エキソソームが二本鎖ゲノムＤＮＡの長い断片を含有することを示す図である。図１Ａ〜Ｂ、ヒト膵がん細胞株由来のエキソソームおよび膵がんを有する患者由来のヒト血清試料由来のエキソソームの存在および濃度を、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）ＬＭ１０（図１Ａ）および電子顕微鏡（図１Ｂ）を使用して決定した。図１Ｃ、ウエスタンブロット法により、ＴＳＧ１０１のエキソソーム特異的発現によってエキソソームを特徴付けた。図１Ｄ、エキソソーム溶解およびＤＮＡ抽出後のＲＮＡ汚染を排除するために、２種の細胞株（Ｐａｎｃ−１およびＴ３Ｍ４）由来のＤＮＡ溶出液ならびに対応するエキソソーム由来のＤＮＡ溶出液をＤＮａｓｅ  ＩおよびＲＮＡｓｅ  Ａで処理した。その後、溶出液を２％アガロースゲルに流した。図１Ｅ、Ｐａｎｃ−１エキソソーム由来の二本鎖ＤＮＡおよび膵がんを有する患者および有さない患者由来のヒト血清エキソソーム由来の二本鎖ＤＮＡの存在を二本鎖ＤＮＡ検出キットによって確認した（Ｐａｎｃ−１由来のエキソソームＤＮＡ、健康なドナー１名由来のエキソソームＤＮＡ、および膵がんを有する患者１名由来のエキソソームＤＮＡについての代表図）。図１Ｆ、ウエスタンブロット法により、ＴＳＧ１０１およびＣＤ６３のエキソソーム特異的発現によってエキソソームを特徴付けた。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｆは、エキソソームが二本鎖ゲノムＤＮＡの長い断片を含有することを示す図である。図１Ａ〜Ｂ、ヒト膵がん細胞株由来のエキソソームおよび膵がんを有する患者由来のヒト血清試料由来のエキソソームの存在および濃度を、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）ＬＭ１０（図１Ａ）および電子顕微鏡（図１Ｂ）を使用して決定した。図１Ｃ、ウエスタンブロット法により、ＴＳＧ１０１のエキソソーム特異的発現によってエキソソームを特徴付けた。図１Ｄ、エキソソーム溶解およびＤＮＡ抽出後のＲＮＡ汚染を排除するために、２種の細胞株（Ｐａｎｃ−１およびＴ３Ｍ４）由来のＤＮＡ溶出液ならびに対応するエキソソーム由来のＤＮＡ溶出液をＤＮａｓｅ  ＩおよびＲＮＡｓｅ  Ａで処理した。その後、溶出液を２％アガロースゲルに流した。図１Ｅ、Ｐａｎｃ−１エキソソーム由来の二本鎖ＤＮＡおよび膵がんを有する患者および有さない患者由来のヒト血清エキソソーム由来の二本鎖ＤＮＡの存在を二本鎖ＤＮＡ検出キットによって確認した（Ｐａｎｃ−１由来のエキソソームＤＮＡ、健康なドナー１名由来のエキソソームＤＮＡ、および膵がんを有する患者１名由来のエキソソームＤＮＡについての代表図）。図１Ｆ、ウエスタンブロット法により、ＴＳＧ１０１およびＣＤ６３のエキソソーム特異的発現によってエキソソームを特徴付けた。
【図１Ｃ】図１Ａ〜Ｆは、エキソソームが二本鎖ゲノムＤＮＡの長い断片を含有することを示す図である。図１Ａ〜Ｂ、ヒト膵がん細胞株由来のエキソソームおよび膵がんを有する患者由来のヒト血清試料由来のエキソソームの存在および濃度を、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）ＬＭ１０（図１Ａ）および電子顕微鏡（図１Ｂ）を使用して決定した。図１Ｃ、ウエスタンブロット法により、ＴＳＧ１０１のエキソソーム特異的発現によってエキソソームを特徴付けた。図１Ｄ、エキソソーム溶解およびＤＮＡ抽出後のＲＮＡ汚染を排除するために、２種の細胞株（Ｐａｎｃ−１およびＴ３Ｍ４）由来のＤＮＡ溶出液ならびに対応するエキソソーム由来のＤＮＡ溶出液をＤＮａｓｅ  ＩおよびＲＮＡｓｅ  Ａで処理した。その後、溶出液を２％アガロースゲルに流した。図１Ｅ、Ｐａｎｃ−１エキソソーム由来の二本鎖ＤＮＡおよび膵がんを有する患者および有さない患者由来のヒト血清エキソソーム由来の二本鎖ＤＮＡの存在を二本鎖ＤＮＡ検出キットによって確認した（Ｐａｎｃ−１由来のエキソソームＤＮＡ、健康なドナー１名由来のエキソソームＤＮＡ、および膵がんを有する患者１名由来のエキソソームＤＮＡについての代表図）。図１Ｆ、ウエスタンブロット法により、ＴＳＧ１０１およびＣＤ６３のエキソソーム特異的発現によってエキソソームを特徴付けた。
【図１Ｄ】図１Ａ〜Ｆは、エキソソームが二本鎖ゲノムＤＮＡの長い断片を含有することを示す図である。図１Ａ〜Ｂ、ヒト膵がん細胞株由来のエキソソームおよび膵がんを有する患者由来のヒト血清試料由来のエキソソームの存在および濃度を、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）ＬＭ１０（図１Ａ）および電子顕微鏡（図１Ｂ）を使用して決定した。図１Ｃ、ウエスタンブロット法により、ＴＳＧ１０１のエキソソーム特異的発現によってエキソソームを特徴付けた。図１Ｄ、エキソソーム溶解およびＤＮＡ抽出後のＲＮＡ汚染を排除するために、２種の細胞株（Ｐａｎｃ−１およびＴ３Ｍ４）由来のＤＮＡ溶出液ならびに対応するエキソソーム由来のＤＮＡ溶出液をＤＮａｓｅ  ＩおよびＲＮＡｓｅ  Ａで処理した。その後、溶出液を２％アガロースゲルに流した。図１Ｅ、Ｐａｎｃ−１エキソソーム由来の二本鎖ＤＮＡおよび膵がんを有する患者および有さない患者由来のヒト血清エキソソーム由来の二本鎖ＤＮＡの存在を二本鎖ＤＮＡ検出キットによって確認した（Ｐａｎｃ−１由来のエキソソームＤＮＡ、健康なドナー１名由来のエキソソームＤＮＡ、および膵がんを有する患者１名由来のエキソソームＤＮＡについての代表図）。図１Ｆ、ウエスタンブロット法により、ＴＳＧ１０１およびＣＤ６３のエキソソーム特異的発現によってエキソソームを特徴付けた。
【図１Ｅ】図１Ａ〜Ｆは、エキソソームが二本鎖ゲノムＤＮＡの長い断片を含有することを示す図である。図１Ａ〜Ｂ、ヒト膵がん細胞株由来のエキソソームおよび膵がんを有する患者由来のヒト血清試料由来のエキソソームの存在および濃度を、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）ＬＭ１０（図１Ａ）および電子顕微鏡（図１Ｂ）を使用して決定した。図１Ｃ、ウエスタンブロット法により、ＴＳＧ１０１のエキソソーム特異的発現によってエキソソームを特徴付けた。図１Ｄ、エキソソーム溶解およびＤＮＡ抽出後のＲＮＡ汚染を排除するために、２種の細胞株（Ｐａｎｃ−１およびＴ３Ｍ４）由来のＤＮＡ溶出液ならびに対応するエキソソーム由来のＤＮＡ溶出液をＤＮａｓｅ  ＩおよびＲＮＡｓｅ  Ａで処理した。その後、溶出液を２％アガロースゲルに流した。図１Ｅ、Ｐａｎｃ−１エキソソーム由来の二本鎖ＤＮＡおよび膵がんを有する患者および有さない患者由来のヒト血清エキソソーム由来の二本鎖ＤＮＡの存在を二本鎖ＤＮＡ検出キットによって確認した（Ｐａｎｃ−１由来のエキソソームＤＮＡ、健康なドナー１名由来のエキソソームＤＮＡ、および膵がんを有する患者１名由来のエキソソームＤＮＡについての代表図）。図１Ｆ、ウエスタンブロット法により、ＴＳＧ１０１およびＣＤ６３のエキソソーム特異的発現によってエキソソームを特徴付けた。
【図１Ｆ】図１Ａ〜Ｆは、エキソソームが二本鎖ゲノムＤＮＡの長い断片を含有することを示す図である。図１Ａ〜Ｂ、ヒト膵がん細胞株由来のエキソソームおよび膵がんを有する患者由来のヒト血清試料由来のエキソソームの存在および濃度を、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）ＬＭ１０（図１Ａ）および電子顕微鏡（図１Ｂ）を使用して決定した。図１Ｃ、ウエスタンブロット法により、ＴＳＧ１０１のエキソソーム特異的発現によってエキソソームを特徴付けた。図１Ｄ、エキソソーム溶解およびＤＮＡ抽出後のＲＮＡ汚染を排除するために、２種の細胞株（Ｐａｎｃ−１およびＴ３Ｍ４）由来のＤＮＡ溶出液ならびに対応するエキソソーム由来のＤＮＡ溶出液をＤＮａｓｅ  ＩおよびＲＮＡｓｅ  Ａで処理した。その後、溶出液を２％アガロースゲルに流した。図１Ｅ、Ｐａｎｃ−１エキソソーム由来の二本鎖ＤＮＡおよび膵がんを有する患者および有さない患者由来のヒト血清エキソソーム由来の二本鎖ＤＮＡの存在を二本鎖ＤＮＡ検出キットによって確認した（Ｐａｎｃ−１由来のエキソソームＤＮＡ、健康なドナー１名由来のエキソソームＤＮＡ、および膵がんを有する患者１名由来のエキソソームＤＮＡについての代表図）。図１Ｆ、ウエスタンブロット法により、ＴＳＧ１０１およびＣＤ６３のエキソソーム特異的発現によってエキソソームを特徴付けた。
【図２−１】図２Ａ〜Ｅは、エキソソームが、変異したＫＲＡＳおよびｐ５３  ＤＮＡを含有することを示す図である。図２Ａ、ＫＲＡＳのエクソン２およびイントロン２にわたる４６６ｂｐの断片ならびにｐ５３の４エクソンおよび３イントロンにわたる１５６４ｂｐの断片をＰＣＲによって増幅した。図２Ｂ、Ｐａｎｃ−１細胞および対応するエキソソーム由来のゲノムＤＮＡのサンガー配列決定法により、ＫＲＡＳのコドン１２における同じヘテロ接合性変異（ＧＧＴからＧＡＴへ）およびｐ５３のコドン２７３における同様のホモ接合性変異（ＣＧＴからＣＡＴへ）が明らかになった。Ｔ３Ｍ４細胞および対応するエキソソームでは、ｐ５３のコドン２２０における同じホモ接合性変異（ＴＡＴからＴＧＴへ）が示された。図２Ｃ、ＰＣＲ増幅により、膵がんを有する患者２名由来の循環エキソソームにおけるＤＮＡの長い断片に関する証拠がもたらされた。ＫＲＡＳ  ＤＮＡの４６６ｂｐの断片およびｐ５３  ＤＮＡのエクソン７および８ならびにイントロン７にわたる６０９ｂｐの断片が回収された。エキソソームが枯渇した血清試料をＰＣＲに供したところ、ＫＲＡＳアンプリコンもｐ５３アンプリコンも検出されなかった。図２Ｄ、血清エキソソーム由来ＤＮＡのサンガー配列決定法により、コドン２２にＫＲＡＳ変異を有するＤＮＡが検出された。第２の患者では、サンガー配列決定法により、コドン１２におけるＫＲＡＳ変異およびコドン２７３におけるｐ５３変異が明らかになった。図２Ｅ、ＰＣＲ増幅により、健康なドナー２名および膵がんを有する患者２名由来の循環エキソソーム内のＤＮＡの長い断片に関する証拠がもたらされた。
【図２−２】図２Ａ〜Ｅは、エキソソームが、変異したＫＲＡＳおよびｐ５３  ＤＮＡを含有することを示す図である。図２Ａ、ＫＲＡＳのエクソン２およびイントロン２にわたる４６６ｂｐの断片ならびにｐ５３の４エクソンおよび３イントロンにわたる１５６４ｂｐの断片をＰＣＲによって増幅した。図２Ｂ、Ｐａｎｃ−１細胞および対応するエキソソーム由来のゲノムＤＮＡのサンガー配列決定法により、ＫＲＡＳのコドン１２における同じヘテロ接合性変異（ＧＧＴからＧＡＴへ）およびｐ５３のコドン２７３における同様のホモ接合性変異（ＣＧＴからＣＡＴへ）が明らかになった。Ｔ３Ｍ４細胞および対応するエキソソームでは、ｐ５３のコドン２２０における同じホモ接合性変異（ＴＡＴからＴＧＴへ）が示された。図２Ｃ、ＰＣＲ増幅により、膵がんを有する患者２名由来の循環エキソソームにおけるＤＮＡの長い断片に関する証拠がもたらされた。ＫＲＡＳ  ＤＮＡの４６６ｂｐの断片およびｐ５３  ＤＮＡのエクソン７および８ならびにイントロン７にわたる６０９ｂｐの断片が回収された。エキソソームが枯渇した血清試料をＰＣＲに供したところ、ＫＲＡＳアンプリコンもｐ５３アンプリコンも検出されなかった。図２Ｄ、血清エキソソーム由来ＤＮＡのサンガー配列決定法により、コドン２２にＫＲＡＳ変異を有するＤＮＡが検出された。第２の患者では、サンガー配列決定法により、コドン１２におけるＫＲＡＳ変異およびコドン２７３におけるｐ５３変異が明らかになった。図２Ｅ、ＰＣＲ増幅により、健康なドナー２名および膵がんを有する患者２名由来の循環エキソソーム内のＤＮＡの長い断片に関する証拠がもたらされた。
【図２−３】図２Ａ〜Ｅは、エキソソームが、変異したＫＲＡＳおよびｐ５３  ＤＮＡを含有することを示す図である。図２Ａ、ＫＲＡＳのエクソン２およびイントロン２にわたる４６６ｂｐの断片ならびにｐ５３の４エクソンおよび３イントロンにわたる１５６４ｂｐの断片をＰＣＲによって増幅した。図２Ｂ、Ｐａｎｃ−１細胞および対応するエキソソーム由来のゲノムＤＮＡのサンガー配列決定法により、ＫＲＡＳのコドン１２における同じヘテロ接合性変異（ＧＧＴからＧＡＴへ）およびｐ５３のコドン２７３における同様のホモ接合性変異（ＣＧＴからＣＡＴへ）が明らかになった。Ｔ３Ｍ４細胞および対応するエキソソームでは、ｐ５３のコドン２２０における同じホモ接合性変異（ＴＡＴからＴＧＴへ）が示された。図２Ｃ、ＰＣＲ増幅により、膵がんを有する患者２名由来の循環エキソソームにおけるＤＮＡの長い断片に関する証拠がもたらされた。ＫＲＡＳ  ＤＮＡの４６６ｂｐの断片およびｐ５３  ＤＮＡのエクソン７および８ならびにイントロン７にわたる６０９ｂｐの断片が回収された。エキソソームが枯渇した血清試料をＰＣＲに供したところ、ＫＲＡＳアンプリコンもｐ５３アンプリコンも検出されなかった。図２Ｄ、血清エキソソーム由来ＤＮＡのサンガー配列決定法により、コドン２２にＫＲＡＳ変異を有するＤＮＡが検出された。第２の患者では、サンガー配列決定法により、コドン１２におけるＫＲＡＳ変異およびコドン２７３におけるｐ５３変異が明らかになった。図２Ｅ、ＰＣＲ増幅により、健康なドナー２名および膵がんを有する患者２名由来の循環エキソソーム内のＤＮＡの長い断片に関する証拠がもたらされた。
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｂは、血清由来のエキソソームが、染色体全てにわたるゲノムＤＮＡを含有することを示す図である。患者２名からの血清由来のエキソソームＤＮＡおよび対応する原発性腫瘍に対して全ゲノム配列決定を行った。ヒト染色体全てにわたるＢＩＣ−ｓｅｑコントロールフリーｌｏｇ２コピー数プロファイル、ビンサイズ１０００ｂｐ；ＲＡＷプロファイル−黒色、分割−中央、灰色の線。プロファイルにより、体細胞染色体の増加（アップ）および減少（ダウン）、ならびに正常な多型が実証される。第２の場合（図３Ｂ）では、試料中のがん細胞が少数である可能性に起因して、ＰＤＡＣに関して予測される構造的な染色体再編成の欠乏が説明される。配列決定により、循環エキソソームが染色体全てにわたるゲノムＤＮＡを含有することが明らかになった。
【図３Ｂ】図３Ａ〜Ｂは、血清由来のエキソソームが、染色体全てにわたるゲノムＤＮＡを含有することを示す図である。患者２名からの血清由来のエキソソームＤＮＡおよび対応する原発性腫瘍に対して全ゲノム配列決定を行った。ヒト染色体全てにわたるＢＩＣ−ｓｅｑコントロールフリーｌｏｇ２コピー数プロファイル、ビンサイズ１０００ｂｐ；ＲＡＷプロファイル−黒色、分割−中央、灰色の線。プロファイルにより、体細胞染色体の増加（アップ）および減少（ダウン）、ならびに正常な多型が実証される。第２の場合（図３Ｂ）では、試料中のがん細胞が少数である可能性に起因して、ＰＤＡＣに関して予測される構造的な染色体再編成の欠乏が説明される。配列決定により、循環エキソソームが染色体全てにわたるゲノムＤＮＡを含有することが明らかになった。
【図４−１】図４Ａは、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）技術を使用した粒子トラッキング解析を示す図である。左側の画像は、エキソソームの動画のスナップショットを示す。右側のグラフは、エキソソームのサイズ分布およびそれらの濃度の総合解析を示す。図４Ｂは、培養培地から採取したエキソソームの画像を示す電子顕微鏡図である。
【図４−２】図４Ｃは、エキソソームマーカーである抗ＣＤ９抗体を使用した、培養培地から採取したエキソソームの免疫金染色を示す図である。図４Ｄは、抗ＣＤ９抗体を使用した、培養培地から採取したエキソソームのフローサイトメトリー分析を示すグラフである。
【図４−３】図４Ｅは、いくつかの異なる細胞株から採取した培地におけるエキソソームの存在を示すために、ＣＤ９およびＣＤ６３エキソソームマーカーを使用した免疫ブロット分析を示す図である。
【図５−１】図５Ａは、異なる細胞株に由来するエキソソームのｔＲＮＡのノーザンブロットを示す図である。図５Ｂは、異なる細胞株から抽出されたエキソソームにおけるアミノ酸の存在を示す質量分析のヒートマップである。
【図５−２】図５Ｃは、異なる細胞株に由来するエキソソームにおける１８Ｓ  ｒＲＮＡおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲを示すグラフである。説明文の各試料は、上から下に、グラフ上の各棒を左から右の順で表す。図５Ｄは、異なるエキソソームのタンパク質抽出物における真核生物翻訳開始因子３Ａ、４Ａ１および１Ａの免疫ブロット分析を示す図である。ＣＤ９を、エキソソームの存在を示すためのエキソソームマーカーとして使用した。
【図５−３】図５Ｅは、真核生物翻訳開始因子４Ａ１の免疫沈降、その後の真核生物翻訳開始因子４Ａ１および３Ａの、エキソソームにおけるこれらの２種のタンパク質間の相互作用を示す免疫ブロットを示す図である。
【図６−１】図６Ａは、エキソソームからのタンパク質抽出物および陽性対照として細胞およびＧＦＰベクターを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳アッセイを示す図である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳アッセイキットからのタンパク質溶解物を第２の陽性対照として使用した。ＧＡＤＰＨをローディング対照として使用した。図６Ｂは、ＧＦＰ抗体を使用した、ＧＦＰベクターを用いて電気穿孔したエキソソームの免疫金染色を示す図である。上のパネルは陰性対照を示し、下のパネルはエキソソームにおけるＧＦＰ染色を示す。
【図６−２】図６Ｃは、［３５Ｓ］メチオニンと一緒に培養したエキソソームのオートラジオグラフィーを示す図である。シクロヘキシミドおよび細胞をそれぞれ陰性対照および陽性対照として使用した。
【図７】図７は、野生型ｐ５３タンパク質をコードするプラスミドをＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来のエキソソームに電気穿孔した。４８時間の無細胞培養後に、電気穿孔したエキソソームを使用して、シクロヘキシミドを用いて前処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を処理し、野生型ｐ５３機能の下流の標的としてｐ２１発現を評価した。
【図８−１】図８Ａは、Ｅ１０細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨＤＦ細胞、ＭＣＦ１０Ａ細胞およびＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の培養培地由来のエキソソームにおけるグリピカン１に関する質量分析の結果を示すグラフである。図８Ｂは、非腫瘍形成性乳房上皮細胞（ＭＣＦ１０Ａ）および乳がん細胞（ＭＣＦ７およびＭＤＡ−ＭＢ２３１）から抽出したエキソソームのグリピカン１ウエスタンを示す図である。
【図８−２】図８Ｃは、非腫瘍形成性乳房上皮細胞（ＭＣＦ１０Ａ）に由来するエキソソームおよび乳がん細胞（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）に由来するエキソソームのフローサイトメトリー分析を示すグラフである。
【図９Ａ】図９Ａ〜Ｅは、ＧＰＣ１が、がんエキソソームに特異的に存在することを示す図である。図９Ａ、非腫瘍形成性細胞株由来のエキソソーム（ＨＭＬＥ）（左側のパネル）および膵がん由来のエキソソーム（Ｔ３Ｍ４）（右側のパネル）におけるＧＰＣ１の免疫金透過型電子顕微鏡写真。金粒子が黒色の点で示されている。右上の画像はデジタルズームした挿入図を示す。図９Ｂ、エキソソームの表面上のＧＰＣ１のＦＡＣＳ分析の略図。図９Ｃ、アルデヒド／硫酸塩ビーズとカップリングしたエキソソームの透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）（左側のパネル）。アルデヒド／硫酸塩ビーズとカップリングしたＴ３Ｍ４およびＨＭＬＥエキソソームにおけるＧＰＣ１の免疫金標識（下の２つのパネル）。金粒子が黒色の点で示されている。陰性対照を、二次抗体のみを使用して実施した（右上）。図９Ｄ、がん細胞由来のＧＰＣ１＋エキソソーム（灰色）および非腫瘍形成性細胞由来のＧＰＣ１＋エキソソーム（黒色）のパーセントを示すグラフ。図９Ｅ、超遠心分離によって単離した、ＨＭＬＥ、ＨＭＥＬ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｔ３Ｍ４、ＰＡＮＣ−１、およびＭＩＡ  ＰａＣａ２由来の、アルデヒド／硫酸塩ビーズとカップリングしたＧＰＣ１＋エキソソームのＦＡＣＳ分析の代表的なヒストグラム。
【図９Ｂ】図９Ａ〜Ｅは、ＧＰＣ１が、がんエキソソームに特異的に存在することを示す図である。図９Ａ、非腫瘍形成性細胞株由来のエキソソーム（ＨＭＬＥ）（左側のパネル）および膵がん由来のエキソソーム（Ｔ３Ｍ４）（右側のパネル）におけるＧＰＣ１の免疫金透過型電子顕微鏡写真。金粒子が黒色の点で示されている。右上の画像はデジタルズームした挿入図を示す。図９Ｂ、エキソソームの表面上のＧＰＣ１のＦＡＣＳ分析の略図。図９Ｃ、アルデヒド／硫酸塩ビーズとカップリングしたエキソソームの透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）（左側のパネル）。アルデヒド／硫酸塩ビーズとカップリングしたＴ３Ｍ４およびＨＭＬＥエキソソームにおけるＧＰＣ１の免疫金標識（下の２つのパネル）。金粒子が黒色の点で示されている。陰性対照を、二次抗体のみを使用して実施した（右上）。図９Ｄ、がん細胞由来のＧＰＣ１＋エキソソーム（灰色）および非腫瘍形成性細胞由来のＧＰＣ１＋エキソソーム（黒色）のパーセントを示すグラフ。図９Ｅ、超遠心分離によって単離した、ＨＭＬＥ、ＨＭＥＬ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｔ３Ｍ４、ＰＡＮＣ−１、およびＭＩＡ  ＰａＣａ２由来の、アルデヒド／硫酸塩ビーズとカップリングしたＧＰＣ１＋エキソソームのＦＡＣＳ分析の代表的なヒストグラム。
【図９Ｃ】図９Ａ〜Ｅは、ＧＰＣ１が、がんエキソソームに特異的に存在することを示す図である。図９Ａ、非腫瘍形成性細胞株由来のエキソソーム（ＨＭＬＥ）（左側のパネル）および膵がん由来のエキソソーム（Ｔ３Ｍ４）（右側のパネル）におけるＧＰＣ１の免疫金透過型電子顕微鏡写真。金粒子が黒色の点で示されている。右上の画像はデジタルズームした挿入図を示す。図９Ｂ、エキソソームの表面上のＧＰＣ１のＦＡＣＳ分析の略図。図９Ｃ、アルデヒド／硫酸塩ビーズとカップリングしたエキソソームの透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）（左側のパネル）。アルデヒド／硫酸塩ビーズとカップリングしたＴ３Ｍ４およびＨＭＬＥエキソソームにおけるＧＰＣ１の免疫金標識（下の２つのパネル）。金粒子が黒色の点で示されている。陰性対照を、二次抗体のみを使用して実施した（右上）。図９Ｄ、がん細胞由来のＧＰＣ１＋エキソソーム（灰色）および非腫瘍形成性細胞由来のＧＰＣ１＋エキソソーム（黒色）のパーセントを示すグラフ。図９Ｅ、超遠心分離によって単離した、ＨＭＬＥ、ＨＭＥＬ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｔ３Ｍ４、ＰＡＮＣ−１、およびＭＩＡ  ＰａＣａ２由来の、アルデヒド／硫酸塩ビーズとカップリングしたＧＰＣ１＋エキソソームのＦＡＣＳ分析の代表的なヒストグラム。
【図９Ｄ】図９Ａ〜Ｅは、ＧＰＣ１が、がんエキソソームに特異的に存在することを示す図である。図９Ａ、非腫瘍形成性細胞株由来のエキソソーム（ＨＭＬＥ）（左側のパネル）および膵がん由来のエキソソーム（Ｔ３Ｍ４）（右側のパネル）におけるＧＰＣ１の免疫金透過型電子顕微鏡写真。金粒子が黒色の点で示されている。右上の画像はデジタルズームした挿入図を示す。図９Ｂ、エキソソームの表面上のＧＰＣ１のＦＡＣＳ分析の略図。図９Ｃ、アルデヒド／硫酸塩ビーズとカップリングしたエキソソームの透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）（左側のパネル）。アルデヒド／硫酸塩ビーズとカップリングしたＴ３Ｍ４およびＨＭＬＥエキソソームにおけるＧＰＣ１の免疫金標識（下の２つのパネル）。金粒子が黒色の点で示されている。陰性対照を、二次抗体のみを使用して実施した（右上）。図９Ｄ、がん細胞由来のＧＰＣ１＋エキソソーム（灰色）および非腫瘍形成性細胞由来のＧＰＣ１＋エキソソーム（黒色）のパーセントを示すグラフ。図９Ｅ、超遠心分離によって単離した、ＨＭＬＥ、ＨＭＥＬ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｔ３Ｍ４、ＰＡＮＣ−１、およびＭＩＡ  ＰａＣａ２由来の、アルデヒド／硫酸塩ビーズとカップリングしたＧＰＣ１＋エキソソームのＦＡＣＳ分析の代表的なヒストグラム。
【図９Ｅ】図９Ａ〜Ｅは、ＧＰＣ１が、がんエキソソームに特異的に存在することを示す図である。図９Ａ、非腫瘍形成性細胞株由来のエキソソーム（ＨＭＬＥ）（左側のパネル）および膵がん由来のエキソソーム（Ｔ３Ｍ４）（右側のパネル）におけるＧＰＣ１の免疫金透過型電子顕微鏡写真。金粒子が黒色の点で示されている。右上の画像はデジタルズームした挿入図を示す。図９Ｂ、エキソソームの表面上のＧＰＣ１のＦＡＣＳ分析の略図。図９Ｃ、アルデヒド／硫酸塩ビーズとカップリングしたエキソソームの透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）（左側のパネル）。アルデヒド／硫酸塩ビーズとカップリングしたＴ３Ｍ４およびＨＭＬＥエキソソームにおけるＧＰＣ１の免疫金標識（下の２つのパネル）。金粒子が黒色の点で示されている。陰性対照を、二次抗体のみを使用して実施した（右上）。図９Ｄ、がん細胞由来のＧＰＣ１＋エキソソーム（灰色）および非腫瘍形成性細胞由来のＧＰＣ１＋エキソソーム（黒色）のパーセントを示すグラフ。図９Ｅ、超遠心分離によって単離した、ＨＭＬＥ、ＨＭＥＬ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｔ３Ｍ４、ＰＡＮＣ−１、およびＭＩＡ  ＰａＣａ２由来の、アルデヒド／硫酸塩ビーズとカップリングしたＧＰＣ１＋エキソソームのＦＡＣＳ分析の代表的なヒストグラム。
【図１０−１】図１０Ａ〜Ｆは、腫瘍を有するマウスにおけるがん細胞に由来するＧＰＣ１＋循環エキソソーム（ｃｒＥｘｏｓ）を示す図である。図１０Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を同所性に注射したヌードマウスからの縦断的血液採取の概略図。血液試料を、腫瘍細胞を注射する前、ならびに腫瘍体積が３００ｍｍ３、５５０ｍｍ３、１０００ｍｍ３、および１３５０ｍｍ３に到達した時に得た。図１０Ｂ、示されている体積のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を有するヌードマウス由来のＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのＦＡＣＳ分析についての代表的な散布図。図１０Ｃ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を同所性に注射したヌードマウスにおける腫瘍体積とＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの百分率（％）の相関（ピアソン相関検定、相関係数ｒ＝０．９８、Ｐ＝０．００４）。図１０Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＣＤ６３−ＧＦＰ細胞に由来するエキソソームに関する４８８レーザーと併せたＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）。黒い線は４８８レーザーを用いていないトラッキング解析を示し、灰色の線は４８８レーザーを用いた解析を示す。図１０Ｅ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＣＤ６３−ＧＦＰを注射したマウス由来のｃｒＥｘｏｓについてのＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）。黒い線は４８８レーザーを用いていないトラッキング解析を示し、灰色の線は４８８レーザーを用いたトラッキング解析を示す。図１０Ｆ、ｃｒＥｘｏｓにおけるＣＤ６３−ＧＦＰとＧＰＣ１の重複発現についての共局在試験。ＦＡＣＳ分析により、陰性対照としてＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に由来するエキソソーム（左上のパネル）、陽性対照としてＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＣＤ６３−ＧＦＰ細胞に由来するエキソソーム（中央上のパネル）、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＣＤ６３−ＧＦＰ細胞を注射したマウスに由来するエキソソームを評価し、Ａｌｅｘａ５９４とコンジュゲートした二次抗体のみを陰性対照として使用して分析した（右上のパネル）。ＦＡＣＳ分析により、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＣＤ６３−ＧＦＰを同所性に注射したマウスに由来するＣＤ６３−ＧＦＰ＋エキソソームの画分のみが、ＧＰＣ１陽性であることが示された（下の３つのグラフ）。
【図１０−２】図１０Ａ〜Ｆは、腫瘍を有するマウスにおけるがん細胞に由来するＧＰＣ１＋循環エキソソーム（ｃｒＥｘｏｓ）を示す図である。図１０Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を同所性に注射したヌードマウスからの縦断的血液採取の概略図。血液試料を、腫瘍細胞を注射する前、ならびに腫瘍体積が３００ｍｍ３、５５０ｍｍ３、１０００ｍｍ３、および１３５０ｍｍ３に到達した時に得た。図１０Ｂ、示されている体積のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を有するヌードマウス由来のＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのＦＡＣＳ分析についての代表的な散布図。図１０Ｃ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を同所性に注射したヌードマウスにおける腫瘍体積とＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの百分率（％）の相関（ピアソン相関検定、相関係数ｒ＝０．９８、Ｐ＝０．００４）。図１０Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＣＤ６３−ＧＦＰ細胞に由来するエキソソームに関する４８８レーザーと併せたＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）。黒い線は４８８レーザーを用いていないトラッキング解析を示し、灰色の線は４８８レーザーを用いた解析を示す。図１０Ｅ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＣＤ６３−ＧＦＰを注射したマウス由来のｃｒＥｘｏｓについてのＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）。黒い線は４８８レーザーを用いていないトラッキング解析を示し、灰色の線は４８８レーザーを用いたトラッキング解析を示す。図１０Ｆ、ｃｒＥｘｏｓにおけるＣＤ６３−ＧＦＰとＧＰＣ１の重複発現についての共局在試験。ＦＡＣＳ分析により、陰性対照としてＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に由来するエキソソーム（左上のパネル）、陽性対照としてＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＣＤ６３−ＧＦＰ細胞に由来するエキソソーム（中央上のパネル）、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＣＤ６３−ＧＦＰ細胞を注射したマウスに由来するエキソソームを評価し、Ａｌｅｘａ５９４とコンジュゲートした二次抗体のみを陰性対照として使用して分析した（右上のパネル）。ＦＡＣＳ分析により、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＣＤ６３−ＧＦＰを同所性に注射したマウスに由来するＣＤ６３−ＧＦＰ＋エキソソームの画分のみが、ＧＰＣ１陽性であることが示された（下の３つのグラフ）。
【図１０−３】図１０Ａ〜Ｆは、腫瘍を有するマウスにおけるがん細胞に由来するＧＰＣ１＋循環エキソソーム（ｃｒＥｘｏｓ）を示す図である。図１０Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を同所性に注射したヌードマウスからの縦断的血液採取の概略図。血液試料を、腫瘍細胞を注射する前、ならびに腫瘍体積が３００ｍｍ３、５５０ｍｍ３、１０００ｍｍ３、および１３５０ｍｍ３に到達した時に得た。図１０Ｂ、示されている体積のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を有するヌードマウス由来のＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのＦＡＣＳ分析についての代表的な散布図。図１０Ｃ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を同所性に注射したヌードマウスにおける腫瘍体積とＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの百分率（％）の相関（ピアソン相関検定、相関係数ｒ＝０．９８、Ｐ＝０．００４）。図１０Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＣＤ６３−ＧＦＰ細胞に由来するエキソソームに関する４８８レーザーと併せたＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）。黒い線は４８８レーザーを用いていないトラッキング解析を示し、灰色の線は４８８レーザーを用いた解析を示す。図１０Ｅ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＣＤ６３−ＧＦＰを注射したマウス由来のｃｒＥｘｏｓについてのＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）。黒い線は４８８レーザーを用いていないトラッキング解析を示し、灰色の線は４８８レーザーを用いたトラッキング解析を示す。図１０Ｆ、ｃｒＥｘｏｓにおけるＣＤ６３−ＧＦＰとＧＰＣ１の重複発現についての共局在試験。ＦＡＣＳ分析により、陰性対照としてＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に由来するエキソソーム（左上のパネル）、陽性対照としてＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＣＤ６３−ＧＦＰ細胞に由来するエキソソーム（中央上のパネル）、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＣＤ６３−ＧＦＰ細胞を注射したマウスに由来するエキソソームを評価し、Ａｌｅｘａ５９４とコンジュゲートした二次抗体のみを陰性対照として使用して分析した（右上のパネル）。ＦＡＣＳ分析により、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＣＤ６３−ＧＦＰを同所性に注射したマウスに由来するＣＤ６３−ＧＦＰ＋エキソソームの画分のみが、ＧＰＣ１陽性であることが示された（下の３つのグラフ）。
【図１０−４】図１０Ａ〜Ｆは、腫瘍を有するマウスにおけるがん細胞に由来するＧＰＣ１＋循環エキソソーム（ｃｒＥｘｏｓ）を示す図である。図１０Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を同所性に注射したヌードマウスからの縦断的血液採取の概略図。血液試料を、腫瘍細胞を注射する前、ならびに腫瘍体積が３００ｍｍ３、５５０ｍｍ３、１０００ｍｍ３、および１３５０ｍｍ３に到達した時に得た。図１０Ｂ、示されている体積のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を有するヌードマウス由来のＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのＦＡＣＳ分析についての代表的な散布図。図１０Ｃ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を同所性に注射したヌードマウスにおける腫瘍体積とＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの百分率（％）の相関（ピアソン相関検定、相関係数ｒ＝０．９８、Ｐ＝０．００４）。図１０Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＣＤ６３−ＧＦＰ細胞に由来するエキソソームに関する４８８レーザーと併せたＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）。黒い線は４８８レーザーを用いていないトラッキング解析を示し、灰色の線は４８８レーザーを用いた解析を示す。図１０Ｅ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＣＤ６３−ＧＦＰを注射したマウス由来のｃｒＥｘｏｓについてのＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）。黒い線は４８８レーザーを用いていないトラッキング解析を示し、灰色の線は４８８レーザーを用いたトラッキング解析を示す。図１０Ｆ、ｃｒＥｘｏｓにおけるＣＤ６３−ＧＦＰとＧＰＣ１の重複発現についての共局在試験。ＦＡＣＳ分析により、陰性対照としてＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に由来するエキソソーム（左上のパネル）、陽性対照としてＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＣＤ６３−ＧＦＰ細胞に由来するエキソソーム（中央上のパネル）、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＣＤ６３−ＧＦＰ細胞を注射したマウスに由来するエキソソームを評価し、Ａｌｅｘａ５９４とコンジュゲートした二次抗体のみを陰性対照として使用して分析した（右上のパネル）。ＦＡＣＳ分析により、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＣＤ６３−ＧＦＰを同所性に注射したマウスに由来するＣＤ６３−ＧＦＰ＋エキソソームの画分のみが、ＧＰＣ１陽性であることが示された（下の３つのグラフ）。
【図１１−１】図１１Ａ〜Ｉは、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓが膵がんに対する非侵襲的なバイオマーカーであることを示す図である。図１１Ａ、膵がんを有する患者由来のｃｒＥｘｏｓについてのＴＥＭ。右上の画像はデジタルズームした挿入図を示す。図１１Ｂ、ＣＤ９について免疫金標識したｃｒＥｘｏｓのＴＥＭ画像。金粒子が黒色の点で示されている。右上の画像はデジタルズームした挿入図を示す。図１１Ｃ、健康なドナー（ｎ＝１００）、乳がん患者（ｎ＝３２）、および膵管腺癌を有する患者（ＰＤＡＣ；ｎ＝１９０）におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのＦＡＣＳ分析を表す散布図（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１１Ｄ、膵がんを有する患者４７名のＫＲＡＳの状態を表す棒グラフ。図１１Ｅ、膵がんを有する患者３名由来のｃｒＥｘｏｓについてのＴＥＭ。ＧＰＣ１の免疫金標識前に、ＦＡＣＳを使用してエキソソームをＧＰＣ１＋集団（左側の列）とＧＰＣ１−集団（右側の列）に分離した。金粒子が黒色の点で示されている。図１１Ｆ、ＦＡＣＳによってＧＰＣ１＋集団（＋；灰色）とＧＰＣ１−集団（−；黒色）に分けられたエキソソームにおけるＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ野生型ｍＲＮＡ、および１８Ｓ  ｒＲＮＡ発現（左側のパネル）またはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ野生型ｍＲＮＡ、および１８ｓ  ｒＲＮＡ発現（右側のパネル）を表す散布図。図１１Ｇ、健康なドナー（ｎ＝１００）、良性膵疾患を有する患者（ＢＰＤ；ｎ＝２６）、膵がん前駆病変を有する患者（ＰＣＰＬ；ｎ＝７）およびＰＤＡＣを有する患者におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのＦＡＣＳ分析についての代表的な散布図（ｎ＝１９０；分散分析（ＡＮＯＶＡ）、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１１Ｈ、図１１Ｅと同じ膵がんを有する患者のコホートにおける血清ＣＡ  １９−９のＥＬＩＳＡアッセイを表す散布図（ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１１Ｉ、膵がんを有する患者（ｎ＝１９０）と、対照（健康なドナー（ｎ＝１００）および良性膵疾患を有する患者（ｎ＝２６）、全部でｎ＝１２６）におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ（灰色の線）、ＣＡ  １９−９（灰色の破線）、エキソソーム濃度（黒い線）、およびエキソソームサイズ（黒い破線）についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析。略語：曲線下面積（ＡＵＣ）、信頼区間（ＣＩ）、ナノメートル（ｎｍ）。
【図１１−２】図１１Ａ〜Ｉは、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓが膵がんに対する非侵襲的なバイオマーカーであることを示す図である。図１１Ａ、膵がんを有する患者由来のｃｒＥｘｏｓについてのＴＥＭ。右上の画像はデジタルズームした挿入図を示す。図１１Ｂ、ＣＤ９について免疫金標識したｃｒＥｘｏｓのＴＥＭ画像。金粒子が黒色の点で示されている。右上の画像はデジタルズームした挿入図を示す。図１１Ｃ、健康なドナー（ｎ＝１００）、乳がん患者（ｎ＝３２）、および膵管腺癌を有する患者（ＰＤＡＣ；ｎ＝１９０）におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのＦＡＣＳ分析を表す散布図（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１１Ｄ、膵がんを有する患者４７名のＫＲＡＳの状態を表す棒グラフ。図１１Ｅ、膵がんを有する患者３名由来のｃｒＥｘｏｓについてのＴＥＭ。ＧＰＣ１の免疫金標識前に、ＦＡＣＳを使用してエキソソームをＧＰＣ１＋集団（左側の列）とＧＰＣ１−集団（右側の列）に分離した。金粒子が黒色の点で示されている。図１１Ｆ、ＦＡＣＳによってＧＰＣ１＋集団（＋；灰色）とＧＰＣ１−集団（−；黒色）に分けられたエキソソームにおけるＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ野生型ｍＲＮＡ、および１８Ｓ  ｒＲＮＡ発現（左側のパネル）またはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ野生型ｍＲＮＡ、および１８ｓ  ｒＲＮＡ発現（右側のパネル）を表す散布図。図１１Ｇ、健康なドナー（ｎ＝１００）、良性膵疾患を有する患者（ＢＰＤ；ｎ＝２６）、膵がん前駆病変を有する患者（ＰＣＰＬ；ｎ＝７）およびＰＤＡＣを有する患者におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのＦＡＣＳ分析についての代表的な散布図（ｎ＝１９０；分散分析（ＡＮＯＶＡ）、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１１Ｈ、図１１Ｅと同じ膵がんを有する患者のコホートにおける血清ＣＡ  １９−９のＥＬＩＳＡアッセイを表す散布図（ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１１Ｉ、膵がんを有する患者（ｎ＝１９０）と、対照（健康なドナー（ｎ＝１００）および良性膵疾患を有する患者（ｎ＝２６）、全部でｎ＝１２６）におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ（灰色の線）、ＣＡ  １９−９（灰色の破線）、エキソソーム濃度（黒い線）、およびエキソソームサイズ（黒い破線）についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析。略語：曲線下面積（ＡＵＣ）、信頼区間（ＣＩ）、ナノメートル（ｎｍ）。
【図１１−３】図１１Ａ〜Ｉは、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓが膵がんに対する非侵襲的なバイオマーカーであることを示す図である。図１１Ａ、膵がんを有する患者由来のｃｒＥｘｏｓについてのＴＥＭ。右上の画像はデジタルズームした挿入図を示す。図１１Ｂ、ＣＤ９について免疫金標識したｃｒＥｘｏｓのＴＥＭ画像。金粒子が黒色の点で示されている。右上の画像はデジタルズームした挿入図を示す。図１１Ｃ、健康なドナー（ｎ＝１００）、乳がん患者（ｎ＝３２）、および膵管腺癌を有する患者（ＰＤＡＣ；ｎ＝１９０）におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのＦＡＣＳ分析を表す散布図（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１１Ｄ、膵がんを有する患者４７名のＫＲＡＳの状態を表す棒グラフ。図１１Ｅ、膵がんを有する患者３名由来のｃｒＥｘｏｓについてのＴＥＭ。ＧＰＣ１の免疫金標識前に、ＦＡＣＳを使用してエキソソームをＧＰＣ１＋集団（左側の列）とＧＰＣ１−集団（右側の列）に分離した。金粒子が黒色の点で示されている。図１１Ｆ、ＦＡＣＳによってＧＰＣ１＋集団（＋；灰色）とＧＰＣ１−集団（−；黒色）に分けられたエキソソームにおけるＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ野生型ｍＲＮＡ、および１８Ｓ  ｒＲＮＡ発現（左側のパネル）またはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ野生型ｍＲＮＡ、および１８ｓ  ｒＲＮＡ発現（右側のパネル）を表す散布図。図１１Ｇ、健康なドナー（ｎ＝１００）、良性膵疾患を有する患者（ＢＰＤ；ｎ＝２６）、膵がん前駆病変を有する患者（ＰＣＰＬ；ｎ＝７）およびＰＤＡＣを有する患者におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのＦＡＣＳ分析についての代表的な散布図（ｎ＝１９０；分散分析（ＡＮＯＶＡ）、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１１Ｈ、図１１Ｅと同じ膵がんを有する患者のコホートにおける血清ＣＡ  １９−９のＥＬＩＳＡアッセイを表す散布図（ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１１Ｉ、膵がんを有する患者（ｎ＝１９０）と、対照（健康なドナー（ｎ＝１００）および良性膵疾患を有する患者（ｎ＝２６）、全部でｎ＝１２６）におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ（灰色の線）、ＣＡ  １９−９（灰色の破線）、エキソソーム濃度（黒い線）、およびエキソソームサイズ（黒い破線）についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析。略語：曲線下面積（ＡＵＣ）、信頼区間（ＣＩ）、ナノメートル（ｎｍ）。
【図１１−４】図１１Ａ〜Ｉは、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓが膵がんに対する非侵襲的なバイオマーカーであることを示す図である。図１１Ａ、膵がんを有する患者由来のｃｒＥｘｏｓについてのＴＥＭ。右上の画像はデジタルズームした挿入図を示す。図１１Ｂ、ＣＤ９について免疫金標識したｃｒＥｘｏｓのＴＥＭ画像。金粒子が黒色の点で示されている。右上の画像はデジタルズームした挿入図を示す。図１１Ｃ、健康なドナー（ｎ＝１００）、乳がん患者（ｎ＝３２）、および膵管腺癌を有する患者（ＰＤＡＣ；ｎ＝１９０）におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのＦＡＣＳ分析を表す散布図（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１１Ｄ、膵がんを有する患者４７名のＫＲＡＳの状態を表す棒グラフ。図１１Ｅ、膵がんを有する患者３名由来のｃｒＥｘｏｓについてのＴＥＭ。ＧＰＣ１の免疫金標識前に、ＦＡＣＳを使用してエキソソームをＧＰＣ１＋集団（左側の列）とＧＰＣ１−集団（右側の列）に分離した。金粒子が黒色の点で示されている。図１１Ｆ、ＦＡＣＳによってＧＰＣ１＋集団（＋；灰色）とＧＰＣ１−集団（−；黒色）に分けられたエキソソームにおけるＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ野生型ｍＲＮＡ、および１８Ｓ  ｒＲＮＡ発現（左側のパネル）またはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ野生型ｍＲＮＡ、および１８ｓ  ｒＲＮＡ発現（右側のパネル）を表す散布図。図１１Ｇ、健康なドナー（ｎ＝１００）、良性膵疾患を有する患者（ＢＰＤ；ｎ＝２６）、膵がん前駆病変を有する患者（ＰＣＰＬ；ｎ＝７）およびＰＤＡＣを有する患者におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのＦＡＣＳ分析についての代表的な散布図（ｎ＝１９０；分散分析（ＡＮＯＶＡ）、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１１Ｈ、図１１Ｅと同じ膵がんを有する患者のコホートにおける血清ＣＡ  １９−９のＥＬＩＳＡアッセイを表す散布図（ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１１Ｉ、膵がんを有する患者（ｎ＝１９０）と、対照（健康なドナー（ｎ＝１００）および良性膵疾患を有する患者（ｎ＝２６）、全部でｎ＝１２６）におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ（灰色の線）、ＣＡ  １９−９（灰色の破線）、エキソソーム濃度（黒い線）、およびエキソソームサイズ（黒い破線）についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析。略語：曲線下面積（ＡＵＣ）、信頼区間（ＣＩ）、ナノメートル（ｎｍ）。
【図１１−５】図１１Ａ〜Ｉは、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓが膵がんに対する非侵襲的なバイオマーカーであることを示す図である。図１１Ａ、膵がんを有する患者由来のｃｒＥｘｏｓについてのＴＥＭ。右上の画像はデジタルズームした挿入図を示す。図１１Ｂ、ＣＤ９について免疫金標識したｃｒＥｘｏｓのＴＥＭ画像。金粒子が黒色の点で示されている。右上の画像はデジタルズームした挿入図を示す。図１１Ｃ、健康なドナー（ｎ＝１００）、乳がん患者（ｎ＝３２）、および膵管腺癌を有する患者（ＰＤＡＣ；ｎ＝１９０）におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのＦＡＣＳ分析を表す散布図（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１１Ｄ、膵がんを有する患者４７名のＫＲＡＳの状態を表す棒グラフ。図１１Ｅ、膵がんを有する患者３名由来のｃｒＥｘｏｓについてのＴＥＭ。ＧＰＣ１の免疫金標識前に、ＦＡＣＳを使用してエキソソームをＧＰＣ１＋集団（左側の列）とＧＰＣ１−集団（右側の列）に分離した。金粒子が黒色の点で示されている。図１１Ｆ、ＦＡＣＳによってＧＰＣ１＋集団（＋；灰色）とＧＰＣ１−集団（−；黒色）に分けられたエキソソームにおけるＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ野生型ｍＲＮＡ、および１８Ｓ  ｒＲＮＡ発現（左側のパネル）またはＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ野生型ｍＲＮＡ、および１８ｓ  ｒＲＮＡ発現（右側のパネル）を表す散布図。図１１Ｇ、健康なドナー（ｎ＝１００）、良性膵疾患を有する患者（ＢＰＤ；ｎ＝２６）、膵がん前駆病変を有する患者（ＰＣＰＬ；ｎ＝７）およびＰＤＡＣを有する患者におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのＦＡＣＳ分析についての代表的な散布図（ｎ＝１９０；分散分析（ＡＮＯＶＡ）、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１１Ｈ、図１１Ｅと同じ膵がんを有する患者のコホートにおける血清ＣＡ  １９−９のＥＬＩＳＡアッセイを表す散布図（ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１１Ｉ、膵がんを有する患者（ｎ＝１９０）と、対照（健康なドナー（ｎ＝１００）および良性膵疾患を有する患者（ｎ＝２６）、全部でｎ＝１２６）におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ（灰色の線）、ＣＡ  １９−９（灰色の破線）、エキソソーム濃度（黒い線）、およびエキソソームサイズ（黒い破線）についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析。略語：曲線下面積（ＡＵＣ）、信頼区間（ＣＩ）、ナノメートル（ｎｍ）。
【図１２−１】図１２Ａ〜Ｆは、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓがＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ  ｍＲＮＡを特異的に有することを示す図である。図１２Ａ、縦断的コホートにおける患者の血液採取を例示するための概略図。血液試料を、外科手術の前（ｐｒｅ−ｏｐ）、および手術後として外科手術後７日目に得た。図１２Ｂ、ＢＰＤ（ｎ＝４）、ＰＣＰＬ（ｎ＝４）、またはＰＤＡＣ（ｎ＝２９）を有する縦断的コホートの患者における、切除後のＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのＦＡＣＳ分析の代表的な散布図（対応のある両側スチューデントｔ検定、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１２Ｃ、切除後にＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの降下≧中央値の減少であった患者（上の線）およびＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの降下＜中央値の減少であった患者（下の線）の全生存を示すカプランマイヤー曲線（ログランク検定）（Ｐ＝０．０１６）。図１２Ｄ、切除後にＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの降下≧中央値の減少であった患者（上の線）およびＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの降下＜中央値の減少であった患者（下の線）の疾患特異的生存を示すカプランマイヤー曲線（ログランク検定）（Ｐ＝０．００７）。図１２Ｅ、０日目から７日目の間にＣＡ  １９−９の降下≧中央値の減少であった患者（上の線）およびＣＡ  １９−９の降下＜中央値の減少であった患者（下の線）の全生存を示すカプランマイヤー曲線（ログランク検定）（Ｐ＝０．１２０）。図１２Ｆ、０日目から７日目の間にＣＡ  １９−９の降下≧中央値の減少であった患者（上の線）およびＣＡ  １９−９の降下＜中央値の減少であった患者（下の線）の疾患特異的生存を示すカプランマイヤー曲線（ログランク検定）（Ｐ＝０．１８０）。
【図１２−２】図１２Ａ〜Ｆは、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓがＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ  ｍＲＮＡを特異的に有することを示す図である。図１２Ａ、縦断的コホートにおける患者の血液採取を例示するための概略図。血液試料を、外科手術の前（ｐｒｅ−ｏｐ）、および手術後として外科手術後７日目に得た。図１２Ｂ、ＢＰＤ（ｎ＝４）、ＰＣＰＬ（ｎ＝４）、またはＰＤＡＣ（ｎ＝２９）を有する縦断的コホートの患者における、切除後のＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのＦＡＣＳ分析の代表的な散布図（対応のある両側スチューデントｔ検定、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１２Ｃ、切除後にＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの降下≧中央値の減少であった患者（上の線）およびＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの降下＜中央値の減少であった患者（下の線）の全生存を示すカプランマイヤー曲線（ログランク検定）（Ｐ＝０．０１６）。図１２Ｄ、切除後にＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの降下≧中央値の減少であった患者（上の線）およびＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの降下＜中央値の減少であった患者（下の線）の疾患特異的生存を示すカプランマイヤー曲線（ログランク検定）（Ｐ＝０．００７）。図１２Ｅ、０日目から７日目の間にＣＡ  １９−９の降下≧中央値の減少であった患者（上の線）およびＣＡ  １９−９の降下＜中央値の減少であった患者（下の線）の全生存を示すカプランマイヤー曲線（ログランク検定）（Ｐ＝０．１２０）。図１２Ｆ、０日目から７日目の間にＣＡ  １９−９の降下≧中央値の減少であった患者（上の線）およびＣＡ  １９−９の降下＜中央値の減少であった患者（下の線）の疾患特異的生存を示すカプランマイヤー曲線（ログランク検定）（Ｐ＝０．１８０）。
【図１２−３】図１２Ａ〜Ｆは、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓがＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ  ｍＲＮＡを特異的に有することを示す図である。図１２Ａ、縦断的コホートにおける患者の血液採取を例示するための概略図。血液試料を、外科手術の前（ｐｒｅ−ｏｐ）、および手術後として外科手術後７日目に得た。図１２Ｂ、ＢＰＤ（ｎ＝４）、ＰＣＰＬ（ｎ＝４）、またはＰＤＡＣ（ｎ＝２９）を有する縦断的コホートの患者における、切除後のＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのＦＡＣＳ分析の代表的な散布図（対応のある両側スチューデントｔ検定、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１２Ｃ、切除後にＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの降下≧中央値の減少であった患者（上の線）およびＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの降下＜中央値の減少であった患者（下の線）の全生存を示すカプランマイヤー曲線（ログランク検定）（Ｐ＝０．０１６）。図１２Ｄ、切除後にＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの降下≧中央値の減少であった患者（上の線）およびＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの降下＜中央値の減少であった患者（下の線）の疾患特異的生存を示すカプランマイヤー曲線（ログランク検定）（Ｐ＝０．００７）。図１２Ｅ、０日目から７日目の間にＣＡ  １９−９の降下≧中央値の減少であった患者（上の線）およびＣＡ  １９−９の降下＜中央値の減少であった患者（下の線）の全生存を示すカプランマイヤー曲線（ログランク検定）（Ｐ＝０．１２０）。図１２Ｆ、０日目から７日目の間にＣＡ  １９−９の降下≧中央値の減少であった患者（上の線）およびＣＡ  １９−９の降下＜中央値の減少であった患者（下の線）の疾患特異的生存を示すカプランマイヤー曲線（ログランク検定）（Ｐ＝０．１８０）。
【図１３−１】図１３Ａ〜Ｇは、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓにより、ＧＥＭＭにおける膵がんが予測されることを示す図である。図１３Ａ、縦断的コホートにおけるＰｔｆ１ａｃｒｅ／＋；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｔｇｆｂｒ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＰＫＴ）マウスおよび対照マウスからの血液採取を例示するための概略図。安楽死させる前に、４週齢、５週齢、６週齢、７週齢、および８週齢の時点で血液試料を得た。図１３Ｂ、ＰＫＴマウス（Ｅ）および対照マウス（Ｃ）における、４週齢、５週齢、６週齢、７週齢、および８週齢の時点で測定したＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのＦＡＣＳ分析の代表的な散布図（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１３Ｃ、ＰＫＴマウスにおける腫瘍体積とＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの相関（ピアソン相関検定、相関係数ｒ＝０．６７、Ｐ＝０．０００５）。図１３Ｄ、４週齢のＰＫＴマウス（ｎ＝７）と、対照（対照同腹仔（ｎ＝６）および急性膵炎を誘導したマウス（ｎ＝４；全部でｎ＝１０）における、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ（灰色の線）、エキソソーム濃度（黒い線）、およびエキソソームサイズ（破線）についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析。図１３Ｅ、横断的試験におけるＰＫＴマウスおよび対照マウスからの血液採取を例示するための概略図。安楽死させる前に、１６日齢または２０日齢の時点で血液試料を得た。図１３Ｆ、横断的試験のＰＫＴマウスおよび対照マウスにおけるＧＰＣ１＋エキソソームのＦＡＣＳ分析についての代表的な散布図。マウスを１６日齢から２０日齢の間に屠殺した（対応のある両側スチューデントｔ検定、Ｐ＜０．０００１）。図１３Ｇ、ＰＫＴマウスおよび対照において、１６日齢から２０日齢の間に診断されたＰａｎＩＮ病変の量についての代表的な散布図（左側のパネル）。
【図１３−２】図１３Ａ〜Ｇは、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓにより、ＧＥＭＭにおける膵がんが予測されることを示す図である。図１３Ａ、縦断的コホートにおけるＰｔｆ１ａｃｒｅ／＋；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｔｇｆｂｒ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＰＫＴ）マウスおよび対照マウスからの血液採取を例示するための概略図。安楽死させる前に、４週齢、５週齢、６週齢、７週齢、および８週齢の時点で血液試料を得た。図１３Ｂ、ＰＫＴマウス（Ｅ）および対照マウス（Ｃ）における、４週齢、５週齢、６週齢、７週齢、および８週齢の時点で測定したＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのＦＡＣＳ分析の代表的な散布図（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１３Ｃ、ＰＫＴマウスにおける腫瘍体積とＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの相関（ピアソン相関検定、相関係数ｒ＝０．６７、Ｐ＝０．０００５）。図１３Ｄ、４週齢のＰＫＴマウス（ｎ＝７）と、対照（対照同腹仔（ｎ＝６）および急性膵炎を誘導したマウス（ｎ＝４；全部でｎ＝１０）における、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ（灰色の線）、エキソソーム濃度（黒い線）、およびエキソソームサイズ（破線）についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析。図１３Ｅ、横断的試験におけるＰＫＴマウスおよび対照マウスからの血液採取を例示するための概略図。安楽死させる前に、１６日齢または２０日齢の時点で血液試料を得た。図１３Ｆ、横断的試験のＰＫＴマウスおよび対照マウスにおけるＧＰＣ１＋エキソソームのＦＡＣＳ分析についての代表的な散布図。マウスを１６日齢から２０日齢の間に屠殺した（対応のある両側スチューデントｔ検定、Ｐ＜０．０００１）。図１３Ｇ、ＰＫＴマウスおよび対照において、１６日齢から２０日齢の間に診断されたＰａｎＩＮ病変の量についての代表的な散布図（左側のパネル）。
【図１３−３】図１３Ａ〜Ｇは、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓにより、ＧＥＭＭにおける膵がんが予測されることを示す図である。図１３Ａ、縦断的コホートにおけるＰｔｆ１ａｃｒｅ／＋；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｔｇｆｂｒ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＰＫＴ）マウスおよび対照マウスからの血液採取を例示するための概略図。安楽死させる前に、４週齢、５週齢、６週齢、７週齢、および８週齢の時点で血液試料を得た。図１３Ｂ、ＰＫＴマウス（Ｅ）および対照マウス（Ｃ）における、４週齢、５週齢、６週齢、７週齢、および８週齢の時点で測定したＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのＦＡＣＳ分析の代表的な散布図（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１３Ｃ、ＰＫＴマウスにおける腫瘍体積とＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの相関（ピアソン相関検定、相関係数ｒ＝０．６７、Ｐ＝０．０００５）。図１３Ｄ、４週齢のＰＫＴマウス（ｎ＝７）と、対照（対照同腹仔（ｎ＝６）および急性膵炎を誘導したマウス（ｎ＝４；全部でｎ＝１０）における、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ（灰色の線）、エキソソーム濃度（黒い線）、およびエキソソームサイズ（破線）についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析。図１３Ｅ、横断的試験におけるＰＫＴマウスおよび対照マウスからの血液採取を例示するための概略図。安楽死させる前に、１６日齢または２０日齢の時点で血液試料を得た。図１３Ｆ、横断的試験のＰＫＴマウスおよび対照マウスにおけるＧＰＣ１＋エキソソームのＦＡＣＳ分析についての代表的な散布図。マウスを１６日齢から２０日齢の間に屠殺した（対応のある両側スチューデントｔ検定、Ｐ＜０．０００１）。図１３Ｇ、ＰＫＴマウスおよび対照において、１６日齢から２０日齢の間に診断されたＰａｎＩＮ病変の量についての代表的な散布図（左側のパネル）。
【図１３−４】図１３Ａ〜Ｇは、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓにより、ＧＥＭＭにおける膵がんが予測されることを示す図である。図１３Ａ、縦断的コホートにおけるＰｔｆ１ａｃｒｅ／＋；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｔｇｆｂｒ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＰＫＴ）マウスおよび対照マウスからの血液採取を例示するための概略図。安楽死させる前に、４週齢、５週齢、６週齢、７週齢、および８週齢の時点で血液試料を得た。図１３Ｂ、ＰＫＴマウス（Ｅ）および対照マウス（Ｃ）における、４週齢、５週齢、６週齢、７週齢、および８週齢の時点で測定したＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのＦＡＣＳ分析の代表的な散布図（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１３Ｃ、ＰＫＴマウスにおける腫瘍体積とＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの相関（ピアソン相関検定、相関係数ｒ＝０．６７、Ｐ＝０．０００５）。図１３Ｄ、４週齢のＰＫＴマウス（ｎ＝７）と、対照（対照同腹仔（ｎ＝６）および急性膵炎を誘導したマウス（ｎ＝４；全部でｎ＝１０）における、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ（灰色の線）、エキソソーム濃度（黒い線）、およびエキソソームサイズ（破線）についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析。図１３Ｅ、横断的試験におけるＰＫＴマウスおよび対照マウスからの血液採取を例示するための概略図。安楽死させる前に、１６日齢または２０日齢の時点で血液試料を得た。図１３Ｆ、横断的試験のＰＫＴマウスおよび対照マウスにおけるＧＰＣ１＋エキソソームのＦＡＣＳ分析についての代表的な散布図。マウスを１６日齢から２０日齢の間に屠殺した（対応のある両側スチューデントｔ検定、Ｐ＜０．０００１）。図１３Ｇ、ＰＫＴマウスおよび対照において、１６日齢から２０日齢の間に診断されたＰａｎＩＮ病変の量についての代表的な散布図（左側のパネル）。
【図１４−１】図１４Ａ〜Ｈは、エキソソームの単離を示す図である。図１４Ａ、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）分析により、最頻サイズが１０５ナノメートル（ｎｍ）であるＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＭＣＦ  １０Ａ細胞、ＨＤＦ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびＥ１０細胞のエキソソームサイズ分布および濃度が示される。図１４Ｂ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来のエキソソームの透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）。右上の画像はデジタルズームした挿入図を示す。図１４Ｃ、ＣＤ９のＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来のエキソソームの免疫金およびＴＥＭ。金粒子が黒色の点で示されている。右上の画像はデジタルズームした挿入図を示す。図１４Ｄ、Ｅ１０細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＭＣＦ  １０Ａ細胞およびＨＤＦ細胞から抽出されたエキソソームタンパク質におけるフロチリン（ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ）１およびＣＤ８１の免疫ブロット。図１４Ｅ、ＨＭＥＬ、ＨＤＦ、ＨＭＬＥ、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｔ３Ｍ４、ＰＡＮＣ−１、ＭＩＡ  ＰａＣａ２におけるＧＰＣ１  ｍＲＮＡのＲＴ−ｑＰＣＲ測定。結果は平均±標準偏差として示されている（両側スチューデントｔ検定、Ｐ＜０．０５）。図１４Ｆ、ＨＭＥＬ細胞株、ＨＤＦ細胞株、ＨＭＬＥ細胞株、ＭＣＦ７細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株、Ｔ３Ｍ４細胞株、ＰＡＮＣ−１細胞株およびＭＩＡ  ＰａＣａ２細胞株におけるＧＰＣ１の免疫ブロット（上のパネル）。β−アクチンをローディング対照として使用した（下のパネル）。図１４Ｇ、非腫瘍形成性細胞株３種（ＨＤＦ、ＨＭＥＬ、ＨＭＬＥ）および腫瘍形成性細胞株５種（ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｔ３Ｍ４、ＰＡＮＣ−１、ＭＩＡ  ＰａＣａ２）に由来するエキソソームにおけるタンパク質の発現を示すためのＧＰＣ１の免疫ブロット（上のパネル）。ローディング対照としてフロチリン１の免疫ブロット（下のパネル）。図１４Ｈ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来のエキソソームおよびＴ３Ｍ４由来のエキソソームを供した異なる層のスクロース勾配でのフロチリン１の免疫ブロット。
【図１４−２】図１４Ａ〜Ｈは、エキソソームの単離を示す図である。図１４Ａ、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）分析により、最頻サイズが１０５ナノメートル（ｎｍ）であるＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＭＣＦ  １０Ａ細胞、ＨＤＦ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびＥ１０細胞のエキソソームサイズ分布および濃度が示される。図１４Ｂ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来のエキソソームの透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）。右上の画像はデジタルズームした挿入図を示す。図１４Ｃ、ＣＤ９のＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来のエキソソームの免疫金およびＴＥＭ。金粒子が黒色の点で示されている。右上の画像はデジタルズームした挿入図を示す。図１４Ｄ、Ｅ１０細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＭＣＦ  １０Ａ細胞およびＨＤＦ細胞から抽出されたエキソソームタンパク質におけるフロチリン（ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ）１およびＣＤ８１の免疫ブロット。図１４Ｅ、ＨＭＥＬ、ＨＤＦ、ＨＭＬＥ、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｔ３Ｍ４、ＰＡＮＣ−１、ＭＩＡ  ＰａＣａ２におけるＧＰＣ１  ｍＲＮＡのＲＴ−ｑＰＣＲ測定。結果は平均±標準偏差として示されている（両側スチューデントｔ検定、Ｐ＜０．０５）。図１４Ｆ、ＨＭＥＬ細胞株、ＨＤＦ細胞株、ＨＭＬＥ細胞株、ＭＣＦ７細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株、Ｔ３Ｍ４細胞株、ＰＡＮＣ−１細胞株およびＭＩＡ  ＰａＣａ２細胞株におけるＧＰＣ１の免疫ブロット（上のパネル）。β−アクチンをローディング対照として使用した（下のパネル）。図１４Ｇ、非腫瘍形成性細胞株３種（ＨＤＦ、ＨＭＥＬ、ＨＭＬＥ）および腫瘍形成性細胞株５種（ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｔ３Ｍ４、ＰＡＮＣ−１、ＭＩＡ  ＰａＣａ２）に由来するエキソソームにおけるタンパク質の発現を示すためのＧＰＣ１の免疫ブロット（上のパネル）。ローディング対照としてフロチリン１の免疫ブロット（下のパネル）。図１４Ｈ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来のエキソソームおよびＴ３Ｍ４由来のエキソソームを供した異なる層のスクロース勾配でのフロチリン１の免疫ブロット。
【図１４−３】図１４Ａ〜Ｈは、エキソソームの単離を示す図である。図１４Ａ、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）分析により、最頻サイズが１０５ナノメートル（ｎｍ）であるＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＭＣＦ  １０Ａ細胞、ＨＤＦ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびＥ１０細胞のエキソソームサイズ分布および濃度が示される。図１４Ｂ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来のエキソソームの透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）。右上の画像はデジタルズームした挿入図を示す。図１４Ｃ、ＣＤ９のＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来のエキソソームの免疫金およびＴＥＭ。金粒子が黒色の点で示されている。右上の画像はデジタルズームした挿入図を示す。図１４Ｄ、Ｅ１０細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＭＣＦ  １０Ａ細胞およびＨＤＦ細胞から抽出されたエキソソームタンパク質におけるフロチリン（ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ）１およびＣＤ８１の免疫ブロット。図１４Ｅ、ＨＭＥＬ、ＨＤＦ、ＨＭＬＥ、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｔ３Ｍ４、ＰＡＮＣ−１、ＭＩＡ  ＰａＣａ２におけるＧＰＣ１  ｍＲＮＡのＲＴ−ｑＰＣＲ測定。結果は平均±標準偏差として示されている（両側スチューデントｔ検定、Ｐ＜０．０５）。図１４Ｆ、ＨＭＥＬ細胞株、ＨＤＦ細胞株、ＨＭＬＥ細胞株、ＭＣＦ７細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株、Ｔ３Ｍ４細胞株、ＰＡＮＣ−１細胞株およびＭＩＡ  ＰａＣａ２細胞株におけるＧＰＣ１の免疫ブロット（上のパネル）。β−アクチンをローディング対照として使用した（下のパネル）。図１４Ｇ、非腫瘍形成性細胞株３種（ＨＤＦ、ＨＭＥＬ、ＨＭＬＥ）および腫瘍形成性細胞株５種（ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｔ３Ｍ４、ＰＡＮＣ−１、ＭＩＡ  ＰａＣａ２）に由来するエキソソームにおけるタンパク質の発現を示すためのＧＰＣ１の免疫ブロット（上のパネル）。ローディング対照としてフロチリン１の免疫ブロット（下のパネル）。図１４Ｈ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来のエキソソームおよびＴ３Ｍ４由来のエキソソームを供した異なる層のスクロース勾配でのフロチリン１の免疫ブロット。
【図１５−１】図１５Ａ〜Ｃは、ヒト血清試料におけるＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）分析を示す図である。図１５Ａ、患者血清由来のエキソソームを供した異なる層のスクロース勾配から抽出されたタンパク質のフロチリン１の免疫ブロット。図１５Ｂ、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）分析により、健康なドナー（ｎ＝１００）、乳がん患者（ｎ＝３２）、およびＰＤＡＣを有する患者（ｎ＝１９０）に由来する循環エキソソームの濃度（血清１ｍＬ当たりのエキソソームの数）が示される（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１５Ｃ、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）分析により、健康なドナー（ｎ＝１００）、乳がん患者（ｎ＝３２）、およびＰＤＡＣを有する患者（ｎ＝１９０）に由来する循環エキソソームのサイズが示される（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１５−２】図１５Ａ〜Ｃは、ヒト血清試料におけるＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）分析を示す図である。図１５Ａ、患者血清由来のエキソソームを供した異なる層のスクロース勾配から抽出されたタンパク質のフロチリン１の免疫ブロット。図１５Ｂ、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）分析により、健康なドナー（ｎ＝１００）、乳がん患者（ｎ＝３２）、およびＰＤＡＣを有する患者（ｎ＝１９０）に由来する循環エキソソームの濃度（血清１ｍＬ当たりのエキソソームの数）が示される（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１５Ｃ、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）分析により、健康なドナー（ｎ＝１００）、乳がん患者（ｎ＝３２）、およびＰＤＡＣを有する患者（ｎ＝１９０）に由来する循環エキソソームのサイズが示される（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１６−１】図１６Ａ〜Ｅは、腫瘍病期に特異的な分析を示す図である。図１６Ａ、上皮内癌（ＣＩＳ）またはＩ期膵がんを有する患者（ｎ＝５）と、対照（健康なドナー（ｎ＝１００）および良性膵疾患を有する患者（ｎ＝２６、全部でｎ＝１２６））におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ（灰色の線）、ＣＡ  １９−９（灰色の破線）、エキソソーム濃度（黒い線）、およびエキソソームサイズ（黒い破線）についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析。図１６Ｂ、ＩＩａ期膵がんを有する患者（ｎ＝１８）と、対照（健康なドナー（ｎ＝１００）および良性膵疾患を有する患者（ｎ＝２６）、全部でｎ＝１２６）におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ（灰色の線）、ＣＡ  １９−９（灰色の破線）、エキソソーム濃度（黒い線）、およびエキソソームサイズ（黒い破線）についてのＲＯＣ曲線分析。図１６Ｃ、ＩＩｂ期膵がんを有する患者（ｎ＝１１７）と、対照（健康なドナー（ｎ＝１００）および良性膵疾患を有する患者（ｎ＝２６、全部でｎ＝１２６））における、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ（灰色の線）、ＣＡ  １９−９（灰色の破線）、エキソソーム濃度（黒い線）、およびエキソソームサイズ（黒い破線）についてのＲＯＣ曲線分析。図１６Ｄ、ＩＩＩ期膵がんを有する患者（ｎ＝１１）と、対照（健康なドナー（ｎ＝１００）および良性膵疾患を有する患者（ｎ＝２６、全部でｎ＝１２６））における、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ（灰色の線）、ＣＡ  １９−９（灰色の破線）、エキソソーム濃度（黒い線）、およびエキソソームサイズ（黒い破線）についてのＲＯＣ曲線分析。図１６Ｅ、ＩＶ期膵がんを有する患者（ｎ＝４１）と、対照（健康なドナー（ｎ＝１００）および良性膵疾患を有する患者（ｎ＝２６、全部でｎ＝１２６））における、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ（灰色の線）、ＣＡ  １９−９（灰色の破線）、エキソソーム濃度（黒い線）、およびエキソソームサイズ（黒い破線）のＲＯＣ曲線分析（略語：曲線下面積（ＡＵＣ）、信頼区間（ＣＩ）、ナノメートル（ｎｍ））。
【図１６−２】図１６Ａ〜Ｅは、腫瘍病期に特異的な分析を示す図である。図１６Ａ、上皮内癌（ＣＩＳ）またはＩ期膵がんを有する患者（ｎ＝５）と、対照（健康なドナー（ｎ＝１００）および良性膵疾患を有する患者（ｎ＝２６、全部でｎ＝１２６））におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ（灰色の線）、ＣＡ  １９−９（灰色の破線）、エキソソーム濃度（黒い線）、およびエキソソームサイズ（黒い破線）についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析。図１６Ｂ、ＩＩａ期膵がんを有する患者（ｎ＝１８）と、対照（健康なドナー（ｎ＝１００）および良性膵疾患を有する患者（ｎ＝２６）、全部でｎ＝１２６）におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ（灰色の線）、ＣＡ  １９−９（灰色の破線）、エキソソーム濃度（黒い線）、およびエキソソームサイズ（黒い破線）についてのＲＯＣ曲線分析。図１６Ｃ、ＩＩｂ期膵がんを有する患者（ｎ＝１１７）と、対照（健康なドナー（ｎ＝１００）および良性膵疾患を有する患者（ｎ＝２６、全部でｎ＝１２６））における、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ（灰色の線）、ＣＡ  １９−９（灰色の破線）、エキソソーム濃度（黒い線）、およびエキソソームサイズ（黒い破線）についてのＲＯＣ曲線分析。図１６Ｄ、ＩＩＩ期膵がんを有する患者（ｎ＝１１）と、対照（健康なドナー（ｎ＝１００）および良性膵疾患を有する患者（ｎ＝２６、全部でｎ＝１２６））における、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ（灰色の線）、ＣＡ  １９−９（灰色の破線）、エキソソーム濃度（黒い線）、およびエキソソームサイズ（黒い破線）についてのＲＯＣ曲線分析。図１６Ｅ、ＩＶ期膵がんを有する患者（ｎ＝４１）と、対照（健康なドナー（ｎ＝１００）および良性膵疾患を有する患者（ｎ＝２６、全部でｎ＝１２６））における、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ（灰色の線）、ＣＡ  １９−９（灰色の破線）、エキソソーム濃度（黒い線）、およびエキソソームサイズ（黒い破線）のＲＯＣ曲線分析（略語：曲線下面積（ＡＵＣ）、信頼区間（ＣＩ）、ナノメートル（ｎｍ））。
【図１６−３】図１６Ａ〜Ｅは、腫瘍病期に特異的な分析を示す図である。図１６Ａ、上皮内癌（ＣＩＳ）またはＩ期膵がんを有する患者（ｎ＝５）と、対照（健康なドナー（ｎ＝１００）および良性膵疾患を有する患者（ｎ＝２６、全部でｎ＝１２６））におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ（灰色の線）、ＣＡ  １９−９（灰色の破線）、エキソソーム濃度（黒い線）、およびエキソソームサイズ（黒い破線）についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析。図１６Ｂ、ＩＩａ期膵がんを有する患者（ｎ＝１８）と、対照（健康なドナー（ｎ＝１００）および良性膵疾患を有する患者（ｎ＝２６）、全部でｎ＝１２６）におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ（灰色の線）、ＣＡ  １９−９（灰色の破線）、エキソソーム濃度（黒い線）、およびエキソソームサイズ（黒い破線）についてのＲＯＣ曲線分析。図１６Ｃ、ＩＩｂ期膵がんを有する患者（ｎ＝１１７）と、対照（健康なドナー（ｎ＝１００）および良性膵疾患を有する患者（ｎ＝２６、全部でｎ＝１２６））における、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ（灰色の線）、ＣＡ  １９−９（灰色の破線）、エキソソーム濃度（黒い線）、およびエキソソームサイズ（黒い破線）についてのＲＯＣ曲線分析。図１６Ｄ、ＩＩＩ期膵がんを有する患者（ｎ＝１１）と、対照（健康なドナー（ｎ＝１００）および良性膵疾患を有する患者（ｎ＝２６、全部でｎ＝１２６））における、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ（灰色の線）、ＣＡ  １９−９（灰色の破線）、エキソソーム濃度（黒い線）、およびエキソソームサイズ（黒い破線）についてのＲＯＣ曲線分析。図１６Ｅ、ＩＶ期膵がんを有する患者（ｎ＝４１）と、対照（健康なドナー（ｎ＝１００）および良性膵疾患を有する患者（ｎ＝２６、全部でｎ＝１２６））における、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ（灰色の線）、ＣＡ  １９−９（灰色の破線）、エキソソーム濃度（黒い線）、およびエキソソームサイズ（黒い破線）のＲＯＣ曲線分析（略語：曲線下面積（ＡＵＣ）、信頼区間（ＣＩ）、ナノメートル（ｎｍ））。
【図１７】図１７Ａ〜Ｂは、縦断的ヒト試験。図１７Ａ、膵がんを有する患者におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのＦＡＣＳ分析についての代表的な散布図（ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５）。図１７Ｂ、手術前日および手術後７日目の、良性膵疾患を有する縦断的コホートの患者（ＢＰＤ）（ｎ＝４）、膵がん前駆病変（ＰＣＰＬ）を有する縦断的コホートの患者（ｎ＝４）、および膵管腺癌（ＰＤＡＣ）（ｎ＝２９）を有する縦断的コホートの患者における、血清ＣＡ  １９−９（Ｕ／ｍＬ）のＥＬＩＳＡアッセイについての代表的な散布図（対応のある両側スチューデントｔ検定、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図１８−１】図１８Ａ〜Ｄは、ＰＤＡＣ  ＧＥＭＭ縦断的試験を示す図である。図１８Ａ、ＰＫＴマウス（Ｅ）および対照マウス（Ｃ）における、４週齢、５週齢、６週齢、７週齢、および８週齢の時点で測定したエキソソームサイズのＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）分析についての代表的な散布図（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、＊Ｐ＜０．０５）。図１８Ｂ、ＰＫＴマウス（Ｅ）および対照マウス（Ｃ）における、４週齢、５週齢、６週齢、７週齢、および８週齢の時点で測定したエキソソーム濃度のＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）分析についての代表的な散布図（ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５）．（略語：対照（Ｃ）、実験的（Ｅ））。図１８Ｃ、個々のＰＫＴマウスにおける時間をわたっての、ＭＲＩによって測定された腫瘍体積および％ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓを示すグラフ（破線を伴う丸：腫瘍体積；実線を伴う四角：％ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ）。図１８Ｄ、対照マウス（ｎ＝３）およびセルレイン（Ｃｅｒｕｌｉｎ）により誘導された急性膵炎を有するマウス（ｎ＝４）におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのＦＡＣＳ分析についての代表的な散布図（両側スチューデントｔ検定、ｎｓ＝Ｐ＞０．０５）。
【図１８−２】図１８Ａ〜Ｄは、ＰＤＡＣ  ＧＥＭＭ縦断的試験を示す図である。図１８Ａ、ＰＫＴマウス（Ｅ）および対照マウス（Ｃ）における、４週齢、５週齢、６週齢、７週齢、および８週齢の時点で測定したエキソソームサイズのＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）分析についての代表的な散布図（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、＊Ｐ＜０．０５）。図１８Ｂ、ＰＫＴマウス（Ｅ）および対照マウス（Ｃ）における、４週齢、５週齢、６週齢、７週齢、および８週齢の時点で測定したエキソソーム濃度のＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）分析についての代表的な散布図（ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５）．（略語：対照（Ｃ）、実験的（Ｅ））。図１８Ｃ、個々のＰＫＴマウスにおける時間をわたっての、ＭＲＩによって測定された腫瘍体積および％ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓを示すグラフ（破線を伴う丸：腫瘍体積；実線を伴う四角：％ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ）。図１８Ｄ、対照マウス（ｎ＝３）およびセルレイン（Ｃｅｒｕｌｉｎ）により誘導された急性膵炎を有するマウス（ｎ＝４）におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのＦＡＣＳ分析についての代表的な散布図（両側スチューデントｔ検定、ｎｓ＝Ｐ＞０．０５）。
【図１９】図１９、ＰＤＡＣ  ＧＥＭＭ横断的試験。ＦＡＣＳ選別によってＧＰＣ１＋集団（＋；灰色）とＧＰＣ１−集団（−；黒色）に分けられたエキソソームにおけるＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ野生型および１８ｓ  ｍＲＮＡの発現についての代表的な散布図。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
エキソソームは、多くの異なる細胞型によって放出される、エンドサトーシス起源の小さな小胞（４０〜１５０ｎｍ）である。腫瘍微小環境におけるエキソソームは、細胞間コミュニケーションを容易にすることにおいて重要な役割を果たし得る。エキソソームは、主にＲＮＡおよびタンパク質を含有することが報告されている。本明細書で教示する通り、膵がん細胞由来のエキソソームおよび膵管腺癌を有する患者の血清由来のエキソソームは、ゲノムＤＮＡを含有する。
【００４３】
本発明では、エキソソームは、二本鎖ゲノムＤＮＡの長い断片を含有することが見いだされ、これは、循環ＤＮＡは高度に断片化されており、推定される長さはたった６０〜１００ｂｐであるという現在の見解と矛盾する（ＭｏｕｌｉｅｒｅおよびＴｈｉｅｒｒｙ、２０１２年）。ＫＲＡＳおよびｐ５３の変異を、膵がん細胞株に由来するエキソソーム由来のゲノムＤＮＡおよび膵がんを有する患者の血清に由来するエキソソーム由来のゲノムＤＮＡを使用して検出することができる。さらに、膵がんを有する患者由来の血清エキソソームは、染色体全てにわたるゲノムＤＮＡを含有し、エキソソーム由来ＤＮＡは、それらの親のがん細胞または腫瘍と同一の変異を担持する。これらの結果は、ゲノムＤＮＡ変異を決定して、がん患者の予後を予測し、個人向けの医学的手法による治療を改善するために血清由来のエキソソームを使用することができ、それにより、治療を調整するために特異的な変異の検出を使用することができることを示すものである。例として、ＫＲＡＳ変異およびＥＧＦＲ増幅により、転移性結腸直腸がんの一部の場合に効率的であることが証明されている薬物であるセツキシマブに対する耐性が予測される（Ｌｉｅｖｒｅら、２００６年）。さらに、腫瘍にＫＲＡＳ変異を有するがん患者は、エルロチニブを使用したＥＧＦＲ標的化療法により悪化する。
【００４４】
また、エキソソームは、ｍＲＮＡの転写およびタンパク質翻訳を行う能力を有することが見いだされた。エキソソームにｐ５３をコードするプラスミドをトランスフェクトしたところ、エキソソームは、ｐ５３タンパク質を発現し、タンパク質をｐ５３欠損標的細胞に送達することができ、それにより、ｐ２１発現が増加した。これらの結果は、治療用タンパク質を疾患細胞において発現させ、かつ／または疾患細胞に送達するためにエキソソームを使用することができることを示すものである。
【００４５】
正常な細胞に由来するエキソソームおよびがん細胞に由来するエキソソームに対して超高速液体クロマトグラフィー、続いて質量分析（ＵＰＬＣ−ＭＳ）を使用して、細胞表面プロテオグリカンであるグリピカン−１が、がん細胞由来エキソソームの表面上に特異的に濃縮されることが見いだされた。循環ＧＰＣ１＋エキソソーム（ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ）をモニタリングし、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を使用してがん患者の血清およびがんを有するマウスの血清から単離した。ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓは、膵がんを有する患者の血清において絶対的な特異度および感度で検出され、これにより、健康な被験体および良性膵疾患を有する患者と、初期膵がんおよび後期膵がんを有する患者とが区別される。腫瘍の外科的切除前後の患者からの血清の比較分析において、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのレベルは腫瘍量に対応した。膵臓特異的ＫＲＡＳＧ１２Ｄによって駆動される、自然発生膵臓腫瘍を有する患者由来のＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓおよび遺伝子操作されたマウスモデル（ＧＥＭＭ）由来のＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓは、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ変異を有するＲＮＡを特異的に含有した。ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓは、ＭＲＩによるシグナルが陰性であるにもかかわらず初期ＰａｎＩＮ病変を検出するための信頼できるバイオマーカーとしての機能を果たした。ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓは、循環中のがんエキソソームを特異的に検出するために使用することができ、また、治癒的な外科療法の見込みを補助し得る、初期の膵がんを検出するための非侵襲的な診断およびスクリーニングツールである。さらに、グリピカン１陽性エキソソームの単離により、がん細胞由来のゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質を単離する手段がもたらされる。
【００４６】
Ｉ．エキソソーム
「微小胞」および「エキソソーム」という用語は、本明細書で使用される場合、直径（または粒子が球状でない場合には最大寸法）が約１０ｎｍから約５０００ｎｍの間、より一般には３０ｎｍから１０００ｎｍの間、最も典型的には約５０ｎｍから７５０ｎｍの間の膜様粒子を指し、エキソソームの膜の少なくとも一部は、細胞から直接得られる。最も一般的には、エキソソームのサイズ（平均直径）は、ドナー細胞のサイズの最大５％である。したがって、特に意図されているエキソソームとして、細胞から発せられるものが挙げられる。
【００４７】
エキソソームは、例えば体液などの任意の適切な試料型から検出または単離することができる。本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、本発明によって提供される方法に適した任意の試料を指す。試料は、検出または単離に適したエキソソームを含む任意の試料であってよい。試料の供給源としては、血液、骨髄、胸膜液、腹腔液（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｆｌｕｉｄ）、脳脊髄液、尿、唾液、羊水、悪性腹水、気管支肺胞洗浄液、滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｌｕｉｄ）、母乳、汗、涙、滑液（ｊｏｉｎｔ  ｆｌｕｉｄ）、および気管支洗浄液が挙げられる。一態様では、試料は、例えば、全血または任意のその画分または成分を含めた血液試料である。本発明と共に使用するのに適した血液試料は、例えば、静脈、動脈、末梢、組織、臍帯などの血液細胞またはその成分を含む公知の任意の供給源から抽出することができる。例えば、試料は、周知の常套的な臨床的方法（例えば、全血を抜き取り処理するための手順）を使用して入手し、処理することができる。一態様では、例示的な試料は、がんを有する被験体から抜き取られた末梢血であり得る。
【００４８】
エキソソームは、外科的試料、生検試料、組織、糞便、および培養細胞などの組織試料から単離することもできる。エキソソームを組織供給源から単離する場合には、単一細胞懸濁物を得るために組織を均質化し、その後に細胞を溶解してエキソソームを放出させることが必要な場合がある。エキソソームを組織試料から単離する場合には、エキソソームの破壊をもたらさない均質化および溶解手順を選択することが重要である。本明細書において意図されているエキソソームは、生理的に許容される溶液、例えば、緩衝生理食塩水、増殖培地、種々の水性培地などの中の体液から単離することが好ましい。
【００４９】
エキソソームは、新しく採取した試料から単離することもでき、冷凍または冷蔵で保管されている試料から単離することもできる。必要ではないが、体液試料を清澄化した後に体積排除ポリマーを用いて沈殿させて試料に由来するあらゆる残屑を除去すると、より純度の高いエキソソームを得ることができる。清澄化の方法としては、遠心分離、超遠心分離、濾過、または限外濾過が挙げられる。最も典型的に、エキソソームは、当技術分野で周知の多数の方法によって単離することができる。１つの好ましい方法は、体液または細胞培養上清からの分画遠心分離である。エキソソームを単離するための例示的な方法は、（Ｌｏｓｃｈｅら、２００４年；ＭｅｓｒｉおよびＡｌｔｉｅｒｉ、１９９８年；Ｍｏｒｅｌら、２００４年）に記載されている。あるいは、エキソソームは、（Ｃｏｍｂｅｓら、１９９７年）に記載の通りフローサイトメトリーによって単離することもできる。
【００５０】
エキソソームを単離するための許容されるプロトコールの１つとして、比較的低密度のエキソソームを浮遊させるための、スクロース密度勾配またはスクロースクッション（ｓｕｃｒｏｓｅ  ｃｕｓｈｉｏｎ）と組み合わせることも多い超遠心分離が挙げられる。逐次的な分画遠心分離によるエキソソームの単離は、他の微小胞または高分子複合体とサイズ分布が重複している可能性によって複雑になる。さらに遠心分離は、それらのサイズに基づいて小胞を分離するための手段としては不十分となる可能性がある。しかし、逐次的な遠心分離は、スクロース勾配超遠心分離と組み合わせれば、エキソソームの高濃縮を達成することができる。
【００５１】
別の選択肢は、超遠心分離経路に対する代替法を使用したサイズに基づくエキソソームの単離である。超遠心分離よりも時間がかからず、また、特別な設備を使用する必要がない限外濾過手順を使用したエキソソーム精製の成功が報告されている。同様に、流体を駆動する陽圧を使用して１つのマイクロフィルターでの細胞、血小板、および細胞の残屑の除去、ならびに第２のマイクロフィルターへの３０ｎｍよりも大きな小胞の捕捉を可能にする市販のキットが利用可能である（ＥＸＯＭＩＲ（商標）、Ｂｉｏｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。このプロセスに関しては、エキソソームは回収せず、それらのＲＮＡ内容物を第２のマイクロフィルターに捕捉した材料から直接抽出し、次いでそのＲＮＡ内容物をＰＣＲ分析に使用することができる。ＨＰＬＣに基づくプロトコールにより、高度に純粋なエキソソームを得ることを潜在的に可能にすることができるが、これらのプロセスは専用の設備を必要とし、スケールアップが難しい。重大な問題は、血液と細胞培養培地がどちらも多数のナノ粒子（一部は非小胞）を同じサイズ範囲内にエキソソームとして含有することである。例えば、一部のｍｉＲＮＡは、エキソソームではなく細胞外タンパク質複合体内に含有され得るが、プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）を用いた処理を行ってあらゆる可能性のある「エキソソーム外」タンパク質による汚染を排除することができる。
【００５２】
別の実施形態では、がん細胞由来エキソソームは、免疫特異性相互作用（例えば、免疫磁気捕捉）を伴うものなどの、試料をエキソソームについて濃縮するために一般に使用される技法によって捕捉することができる。免疫磁気捕捉は、免疫磁気細胞分離としても公知であり、一般には、特定の細胞型に見いだされるタンパク質に指向される抗体を小さな常磁性ビーズに付着させることを伴う。抗体をコーティングしたビーズを血液などの試料と混合すると、それらのビーズは特定の細胞に付着し、それを取り囲む。次いで、試料を強力な磁場に置き、それにより、ビーズを一方の側面にペレット化させる。血液を除去した後、捕捉された細胞はビーズと共に保持される。この一般的な方法の多くの変形が当技術分野で周知であり、エキソソームを単離するための使用に適する。一実施例では、エキソソームを磁気ビーズ（例えば、アルデヒド／硫酸塩ビーズ）に付着させ、次いで、抗体を混合物に添加して、ビーズに付着したエキソソームの表面上のエピトープを認識させることができる。
【００５３】
本明細書で使用される場合、分析は、エキソソームの直接または間接的な視覚化を可能にし、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるものであってもｅｘ  ｖｉｖｏにおけるものであってもよい任意の方法を含む。例えば、分析としては、これだけに限定されないが、固体基質に結合したエキソソームのｅｘ  ｖｉｖｏにおける顕微鏡または血球計算による検出および視覚化、フローサイトメトリー、蛍光イメージングなどが挙げられる。例示的な態様では、グリピカン１に指向される抗体を使用してがん細胞由来エキソソームを検出し、その後、固体基質に結合させ、顕微鏡または血球計算による検出を使用して視覚化する。
【００５４】
ＩＩ．疾患の診断、予後判定、および治療
本発明の方法を使用したがん細胞由来エキソソームの検出、単離、および特徴付けは、がんの予後の評価において、および疾患の再発を導き得る治療失敗を早期検出するための治療有効性のモニタリングにおいて有用である。さらに、本発明に従ったがん細胞由来エキソソーム分析により、治療過程が完了している前駆症状性患者における早期再発の検出が可能になる。これは、がん細胞由来の存在が、ある期間にわたって腫瘍の進行および拡散、療法に対する不十分な応答、疾患の再発、および／または生存の減少に伴う、かつ／または相関する可能性があるので、可能である。したがって、がん細胞由来エキソソームの数え上げおよび特徴付けにより、患者を、療法に対する応答に基づいて最初のリスクおよびその後のリスクを予測するベースライン特性について層別化する方法がもたらされる。
【００５５】
したがって、別の実施形態では、本発明は、被験体におけるがんの診断または予後判定を行う方法を提供する。本発明に開示されている方法に従って単離されたがん細胞由来エキソソームを分析して、被験体におけるがんの診断または予後判定を行うことができる。そのように、本発明の方法は、例えば、がん患者およびがんのリスクがある者を評価するために使用することができる。本明細書に記載されている診断または予後判定の方法のいずれにおいても、ゲノムの変異もしくはがん特異的エキソソーム表面マーカーなどのがんの１つもしくは複数の指標、または任意の他の障害の１つもしくは複数の指標の、存在または非存在のいずれかを、診断または予後判定を行うために使用することができる。
【００５６】
一態様では、本明細書に記載の通り血液試料を患者から抜き取り、がん細胞由来エキソソームを検出し、かつ／または単離する。例えば、エキソソームをグリピカン１に結合する１つまたは複数の抗体で標識することができ、抗体には蛍光標識が共有結合していてよい。次いで、分析を実施して、試料中のがん細胞由来エキソソームの数および特徴付けを決定することができ、この測定から、最初の血液試料中に存在するがん細胞由来エキソソームの数を決定することができる。がん細胞由来エキソソームの数は、エキソソームを視覚的に定量化し、特徴付けるための血球計算または顕微鏡による技法によって決定することができる。がん細胞由来エキソソームは、当技術分野で公知の他の方法（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって検出し、定量化することができる。
【００５７】
種々の態様では、被験体のがん細胞由来エキソソームの数および特徴付けの分析は、被験体の進行および病態を評価するために特定の時間経過にわたって、種々の間隔で行う。例えば、分析は、がん細胞由来エキソソームのレベルおよび特徴付けを時間に応じて追跡するために、１日、２日、３日、１週間、２週間、１カ月、２カ月、３カ月、６カ月、または１年などの定期的な間隔で実施することができる。現存するがん患者の場合では、これにより、疾患の進行の有用な指示がもたらされ、医療実施者ががん細胞由来エキソソームの増加、減少、または変化がないことに基づいて適切な治療上の選択を行う助けとなる。がん細胞由来エキソソームの時間をわたっての２倍、５倍、１０倍またはそれ超の任意の増加により、患者の予後が低下し、これは、患者が療法を変化させるべきであるという早期指標である。同様に、２倍、５倍、１０倍またはそれ超の任意の増加により、患者が、予後および療法に対する応答をさらに評価するためにイメージングなどのさらなる検査を受けるべきであることが示される。がん細胞由来エキソソームにおける時間をわたっての２倍、５倍、１０倍またはそれ超である任意の減少により、疾患の安定化および患者の療法に対する応答が示され、これは、療法を変化させないことの指標である。がんのリスクがある者については、検出されるがん細胞由来エキソソームの数が突発的に増加することにより、患者に腫瘍が発生しているという早期警告がもたらされ得、したがって、これにより、早期診断がもたらされる。一実施形態では、がん細胞由来エキソソームの検出は、がんの病期分類と共に増加する。
【００５８】
本明細書において提供される方法のいずれにおいても、追加的な臨床的評価をもたらすために、追加的な分析も実施してがん細胞由来エキソソームを特徴付けることができる。例えば、画像解析およびバルク数測定に加えて、特定のがんマーカーに特異的なプライマーを用いた多重化などのＰＣＲ技法を使用して、がん細胞由来エキソソームが由来する腫瘍の型、転移の状態、および悪性疾患の程度などの情報を得ることができる。さらに、患者のがんの特徴付けに関する追加的な情報を評価する手段として、ＤＮＡまたはＲＮＡ分析、プロテオーム解析、またはメタボローム解析を実施することができる。
【００５９】
例えば、追加的な分析により、特定の治療レジメンに対する被験体の応答性の決定を行うため、またはがんの治療における候補薬剤の効果を決定するために十分なデータがもたらされる。したがって、本発明は、本明細書に記載の通り被験体のがん細胞由来エキソソームを検出／単離し、前記がん細胞由来エキソソームを分析することによって特定の治療レジメンに対する被験体の応答性またはがんの治療における候補薬剤の効果を決定する方法を提供する。例えば、薬物治療を患者に施したら、本発明の方法を使用して薬物治療の有効性を決定することが可能である。例えば、薬物治療前に患者から取得した試料、ならびに薬物治療と同時にまたはその後に患者から取得した１つまたは複数の試料を、本発明の方法を使用して処理することができる。処理した試料それぞれの分析結果を比較することにより、薬物治療の有効性または薬剤に対する患者の応答性を決定することができる。このように、失敗した化合物の早期同定を行うこともでき、有望な化合物の早期検証を行うこともできる。
【００６０】
本発明のある特定の態様は、エキソソームから単離したゲノムＤＮＡに見いだされる遺伝子変異の存在に基づいて疾患または障害を予防または治療するために使用することができる。本発明の他の態様は、組換えタンパク質を発現するエキソソームを用いたまたはエキソソームから単離された組換えタンパク質を用いた患者の治療を提供する。本発明の他の態様は、患者試料中のがん細胞由来エキソソームの存在に基づいた疾患の診断を提供する。
【００６１】
「被験体」という用語は、本明細書で使用される場合、本主題の方法が実行される任意の個体または患者を指す。一般に、被験体はヒトであるが、当業者には理解される通り、被験体は動物であってよい。したがって、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットを含む）、ネコ、イヌ、ウサギ、農場動物（ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタなどを含む）、および霊長類（サル、チンパンジー、オランウータン、およびゴリラを含む）などの哺乳動物を含めた他の動物が被験体の定義の範囲内に含まれる。
【００６２】
「治療」および「治療すること」とは、疾患または健康に関連する状態に関する治療的利益を得るために治療剤を被験体に投与もしくは適用することまたは手順もしくはモダリティを被験体に対して実施することを指す。例えば、治療は、化学療法、免疫療法、もしくは照射療法を施すこと、外科手術を実施すること、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【００６３】
「治療的利益」または「治療的に有効」という用語は、本出願全体を通して使用される場合、この状態の医学的治療に関して、被験体の健康（ｗｅｌｌ−ｂｅｉｎｇ）を促進または増強する任意のものを指す。これは、これだけに限定されないが、疾患の徴候または症状の頻度または重症度の低下を含む。例えば、がんの治療は、例えば、腫瘍の侵襲性の低下、がんの成長速度の低下、または転移の予防を伴い得る。がんの治療とは、がんを有する被験体の生存の延長を指す場合もある。
【００６４】
「がん」という用語は、本明細書で使用される場合、固形腫瘍、転移性がん、または非転移性のがんを記載するために使用することができる。ある特定の実施形態では、がんは、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、十二指腸、小腸、大腸、結腸、直腸、肛門、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮において生じるものであり得る。
【００６５】
がんは、具体的には以下の組織型のものであり得るが、これらに限定されない：新生物、悪性；癌腫；癌腫、未分化；巨細胞および紡錘体細胞癌；小細胞癌；乳頭状癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；石灰化上皮腫（ｐｉｌｏｍａｔｒｉｘ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管癌；肝細胞癌；混合型肝細胞癌および胆管癌；柱状腺癌（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）；腺様嚢胞癌；腺腫様ポリープ内腺癌；腺癌、大腸家族性ポリポーシス；固形癌；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支肺胞腺癌（ｂｒａｎｃｈｉｏｌｏ−ａｌｖｅｏｌａｒ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）；乳頭状腺癌；嫌色素性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞性腺癌；乳頭状濾胞性腺癌；非被包性硬化性癌；副腎皮質癌；類内膜癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳道腺癌（ｃｅｒｕｍｉｎｏｕｓ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）；粘液性類表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液性腺癌；印環細胞癌；浸潤性腺管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病、乳房；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；腺癌ｗ／扁平上皮化生；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；アンドロブラストーマ、悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫、悪性；脂質細胞腫、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；グロムス血管肉腫（ｇｌｏｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑における悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胎生期癌；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル芽細胞歯牙肉腫（ａｍｅｌｏｂｌａｓｔｉｃ  ｏｄｏｎｔｏｓａｒｃｏｍａ）；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；神経膠芽腫；乏突起神経膠腫；乏突起膠芽細胞腫；原始神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経原性腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン；側肉芽腫（ｐａｒａｇｒａｎｕｌｏｍａ）；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉腫；特定された他の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病（ｌｙｍｐｈｏｓａｒｃｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞性白血病；巨核芽球性白血病（ｍｅｇａｋａｒｙｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）；骨髄性肉腫；およびヘアリー細胞白血病。
【００６６】
「接触される」および「曝露される」という用語は、細胞に適用される場合、本明細書では、治療剤を標的細胞に送達するまたは標的細胞の直接近位に置くプロセスを記載するために使用される。細胞死滅を達成するために、例えば、１つまたは複数の薬剤を、細胞を死滅させるまたは細胞が分裂するのを防ぐために有効な量で細胞に送達する。
【００６７】
治療に対する患者の有効な応答または患者の「応答性」とは、疾患または障害のリスクがあるまたはそれに罹患している患者にもたらされる臨床的または治療的利益を指す。そのような利益としては、細胞応答または生物学的応答、完全奏効、部分奏効、安定病態（進行も再発もない）、または後の再発を伴う応答を挙げることができる。例えば、有効な応答は、がんと診断された患者における腫瘍サイズの縮小または無増悪生存であり得る。
【００６８】
本明細書に記載の方法により、治療転帰を予測およびモニタリングし、かつ／またはそのような治療の利益を得る患者を同定または選択することができる。
【００６９】
腫瘍性状態の治療に関しては、腫瘍性状態の病期に応じて、腫瘍性状態の治療は、以下の療法のうちの１つまたはそれらの組合せを伴う：腫瘍性組織を除去するための外科手術、放射線療法、および化学療法。他の治療レジメンを、抗がん剤、例えば、治療用組成物および化学療法剤の投与と組み合わせることができる。例えば、そのような抗がん剤を用いて治療される患者は、放射線療法も受けることができ、かつ／または外科手術も受けることができる。
【００７０】
疾患の治療に関して、治療用組成物の適切な投与量は、上で定義した治療される疾患の型、重症度および疾患の経過、患者の臨床的な病歴および薬剤に対する応答、および主治医の裁量に左右される。薬剤は、一度にまたは一連の治療にわたって患者に適切に投与される。
【００７１】
治療的なおよび予防的な方法および組成物は、所望の効果を達成するために有効な組み合わせた量でもたらすことができる。組織、腫瘍、もしくは細胞は、１つもしくは複数の薬剤を含む１つもしくは複数の組成物もしくは薬理学的製剤（複数可）と接触させることができる、または組織、腫瘍、および／もしくは細胞を２つもしくはそれ超の別個の組成物もしくは製剤と接触させる。また、そのような併用療法を化学療法、照射療法、外科療法、または免疫療法と併せて使用することができることが意図されている。
【００７２】
組み合わせでの投与としては、２つまたはそれ超の薬剤を同じ剤形で同時に投与すること、別々の剤形で同時に投与すること、および別々に投与することが挙げられる。すなわち、対象とする治療用組成物および別の治療剤を共に同じ剤形に製剤化し、同時に投与することができる。あるいは、対象とする治療用組成物および別の治療剤を同時に投与することができ、この場合、両剤は別々の製剤中に存在する。別の代替法では、治療剤が投与され、直後に他の治療剤が投与され得るか、または逆もまた同じである。別々の投与プロトコールでは、対象とする治療用組成物および別の治療剤は、数分離して、または数時間離して、または数日離して投与することができる。
【００７３】
第１の抗がん治療（例えば、組換えタンパク質を発現するエキソソームまたはエキソソームから単離された組換えタンパク質を有するエキソソーム）は、第２の抗がん治療よりも前に、その間に、その後に、または種々の組合せで投与することができる。投与は、同時〜数分〜数日〜数週間にわたる間隔であってよい。第１の治療を第２の治療と別々に患者にもたらす実施形態では、一般に、各送達の時間の間に著しい期間が過ぎず、したがって、２つの化合物がなお有利に組み合わさった効果を患者に対して発揮できることを確実にする。そのような例では、患者に第１の療法と第２の療法を互いと約１２時間〜２４時間または７２時間以内に、より詳細には、互いと約６〜１２時間以内にもたらすことが意図されている。いくつかの状況では、それぞれの投与の間に数日（２日、３日、４日、５日、６日、または７日）〜数週間（１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、または８週間）が経過する場合に治療の期間を相当に延長することが望ましい。
【００７４】
ある特定の実施形態では、治療の過程は、１〜９０日間またはそれ超（この範囲は間にある日を含む）続く。１つの薬剤を１日目〜９０日目（この範囲は間にある日を含む）のいずれかまたはそれらの任意の組合せの日にもたらすことができ、別の薬剤を１日目〜９０日目（この範囲は間にある日を含む）のいずれかまたはそれらの任意の組合せの日にもたらすことが意図されている。１日の中で（２４時間の期間）、患者に薬剤（複数可）を１回または多数回投与することができる。さらに、治療の過程後に、抗がん治療を投与しない期間があることが意図されている。この期間は、例えば患者の予後、耐久力、健康などの患者の状態に応じて１〜７日、および／または１〜５週間、および／または１〜１２カ月またはそれ超（この範囲は間にある日を含む）であり得る。治療サイクルを必要に応じて繰り返すことが予想される。
【００７５】
種々の組合せを使用することができる。以下の例に関しては第１の抗がん療法が「Ａ」であり、第２の抗がん療法が「Ｂ」である：
【００７６】
【化１】
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本発明の任意の化合物または療法の患者への投与は、そのような化合物を投与するための一般的なプロトコールに従い、もしあれば、薬剤の毒性を考慮に入れる。したがって、一部の実施形態では、併用療法に起因する毒性をモニタリングするステップが存在する。
【００７７】
１．化学療法
多種多様な化学療法剤を本発明に従って使用することができる。「化学療法」という用語は、がんを治療するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」とは、がんの治療において投与される化合物または組成物を示すために使用される。これらの薬剤または薬物は、細胞内でのそれらの活性の様式、例えば、それらが細胞周期に影響を及ぼすかどうか、およびどの段階に影響を及ぼすかによってカテゴリー化される。あるいは、薬剤は、ＤＮＡと直接架橋結合する能力、ＤＮＡにインターカレートする能力、または核酸合成に影響を及ぼすことによって染色体異常および有糸分裂異常を誘導する能力に基づいて特徴付けることができる。
【００７８】
化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）など；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなど；アジリジン、例えば、ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ）など；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド（ｔｒｉｅｔｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、およびトリメチルオロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含めたエチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン合成類似体、カルゼレシン合成類似体およびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、クロロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ  ｏｘｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、およびウラシルマスタードなど；ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）など；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリチアマイシン、特に、カリチアマイシンガンマＩＩおよびカリチアマイシンオメガＩＩ）など；ジネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）Ａを含めたジネミシン；ビスホスホネート、例えば、クロドロネートなど；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗菌性発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラルナイシン（ａｕｔｈｒａｒｎｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カルビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソル��シンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｒｎｙｃｉｎ）、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、およびゾルビシンなど；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）など；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、プテロプテリン、およびトリメトレキサートなど；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、およびチオグアニンなど；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、およびフロクスウリジンなど；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、およびテストラクトンなど；抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）、例えば、ミトタンおよびトリロスタンなど；葉酸補充剤、例えば、フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）など；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフロルニチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；エリプチニウム酢酸塩（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシノイド、例えば、マイタンシンおよびアンサマイトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ）；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）など；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａおよびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル・ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；白金配位錯体、例えば、シ���プラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチンなど；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸など；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリカマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｅｎ）、ナベルビン、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。
【００７９】
２．照射療法
ＤＮＡ損傷を引き起こすものであり、広範囲にわたって使用されている他の因子としては、一般に、γ線、Ｘ線、および／または放射性同位元素の腫瘍細胞への指向性送達として公知のものが挙げられる。マイクロ波、陽子線照射（米国特許第５，７６０，３９５号および同第４，８７０，２８７号）、およびＵＶ照射などの他の形態のＤＮＡ損傷性因子も意図されている。これらの因子は全て、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体の集合および維持に対する広範囲の損傷に影響を及ぼす可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３〜４週間）にわたって５０〜２００レントゲンの１日線量から、２０００〜６０００レントゲンの単回線量までにわたる。放射性同位元素の投与量範囲は広範に変動し、同位元素の半減期、放出される放射線の強度および型、および腫瘍性細胞による取り込みに左右される。
【００８０】
３．免疫療法
追加的な免疫療法を本発明の方法と組み合わせてまたは併せて使用することができることが当業者には理解されよう。がん治療の文脈において、免疫療法薬は、一般に、がん細胞を標的化し破壊する免疫エフェクター細胞および分子の使用に依拠する。リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））がそのような例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であってよい。抗体は、単独では、療法のエフェクターとしての機能を果たし得る、または他の細胞を動員して実際に細胞死滅に影響を及ぼし得る。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法薬、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）とコンジュゲートすることもでき、ただ単に標的化薬剤として機能する。あるいは、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接または間接的に相互作用する表面分子を有するリンパ球であってよい。種々のエフェクター細胞として、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が挙げられる。
【００８１】
免疫療法の一態様では、腫瘍細胞は、標的化に適している、すなわち、大多数の他の細胞には存在しないマーカーをいくつか有するものでなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらはいずれも、本発明の文脈において、標的化するのに適し得る。一般的な腫瘍マーカーとしては、ＣＤ２０、がん胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂ  Ｂ、およびｐ１５５が挙げられる。免疫療法の代替の態様は、抗がん効果と免疫賦活効果を組み合わせることである。サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ガンマ−ＩＦＮなど、ケモカイン、例えば、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８など、および増殖因子、例えばＦＬＴ３リガンドなどを含めた免疫賦活分子も存在する。
【００８２】
現在調査されているまたは使用されている免疫療法の例は、免疫アジュバント、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ジニトロクロロベンゼン、および芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５号および同第５，７３９，１６９号；ＨｕｉおよびＨａｓｈｉｍｏｔｏ、１９９８年；Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓら、１９９８年）；サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、β、およびγ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＴＮＦ（Ｂｕｋｏｗｓｋｉら、１９９８年；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、１９９８年；Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄら、１９９８年）；遺伝子療法、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、およびｐ５３（Ｑｉｎら、１９９８年；Ａｕｓｔｉｎ−ＷａｒｄおよびＶｉｌｌａｓｅｃａ、１９９８年；米国特許第５，８３０，８８０号および同第５，８４６，９４５号）；ならびにモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２、および抗ｐ１８５（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ、２０１２年；Ｈａｎｉｂｕｃｈｉら、１９９８年；米国特許第５，８２４，３１１号）である。１つまたは複数の抗がん療法を本明細書に記載されている抗体療法と共に使用することができることが意図されている。
【００８３】
４．外科手術
がんを有する人のおよそ６０％が、予防的外科手術、診断的または病期分類外科手術、治癒的外科手術、および待機的外科手術を含めた、何らかの型の外科手術を受ける。治癒的外科手術は、がん性組織の全部または一部を物理的に除去する、切り取る、および／または破壊する切除を含み、本発明の治療、化学療法、照射療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、および／または代替療法などの他の療法と併せて使用することができる。腫瘍の切除とは、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを指す。腫瘍の切除に加えて、外科手術による治療としては、レーザー外科手術、冷凍外科、電気外科、および顕微鏡下手術（モース手術）が挙げられる。
【００８４】
がん性細胞、組織、または腫瘍の一部または全部を切除すると、体内に腔が形成され得る。追加的な抗がん療法を用いた、その領域への灌流、直接注射、または局所的な適用によって治療を達成することができる。そのような治療は、例えば、１日毎、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、もしくは７日毎に、または１週間毎、２週間毎、３週間毎、４週間毎、および５週間毎に、または１カ月毎、２カ月毎、３カ月毎、４カ月毎、５カ月毎、６カ月毎、７カ月毎、８カ月毎、９カ月毎、１０カ月毎、１１カ月毎、または１２カ月毎に繰り返すことができる。これらの治療は、同様に投与量が変動するものである。
【００８５】
５．他の薬剤
他の薬剤を本発明のある特定の態様と組み合わせて使用して、治療の有効性を改善することができることが意図されている。これらの追加的な薬剤としては、細胞表面受容体およびギャップ結合の上方制御に影響を及ぼす薬剤、細胞増殖抑制剤および分化誘導剤（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）、細胞接着阻害剤、過剰増殖性細胞のアポトーシス誘導因子への感受性を上昇させる薬剤、または他の生物学的薬剤が挙げられる。ギャップ結合の数を増加させることによる細胞間シグナル伝達の増加により、近くの過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖効果が増大する。他の実施形態では、細胞増殖抑制剤または分化誘導剤を本発明のある特定の態様と組み合わせて使用して、治療の抗過剰増殖の有効性を改善することができる。細胞接着阻害剤により本発明の有効性を改善することが意図されている。細胞接着阻害剤の例は、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。さらに、抗体ｃ２２５などの、過剰増殖性細胞のアポトーシスに対する感受性を増大させる他の薬剤を本発明のある特定の態様と組み合わせて使用して、治療有効性を改善することができることが意図されている。
【００８６】
ＩＩＩ．医薬組成物
局所的に進行したがんまたは転移性がんを有するがん患者における腫瘍細胞の成長を阻害するため、最も好ましくは、がん細胞を死滅させるために、組換えタンパク質を発現するエキソソームまたはエキソソームから単離された組換えタンパク質を全身的にまたは局所的に投与することができることが意図されている。これらは、静脈内、髄腔内、かつ／または腹腔内に投与することができる。これらは、単独で、または抗増殖性薬と組み合わせて投与することができる。一実施形態では、これらを、外科手術または他の手順の前に患者におけるがん負荷量を減少させるために投与する。あるいは、これらを外科手術後に投与して、あらゆる残存するがん（例えば、外科手術で排除できなかったがん）が生存しないことを確実にすることができる。
【００８７】
本発明は、治療用調製物の特定の性質によって限定されるとは意図されない。例えば、そのような組成物は、生理的に許容される液体、ゲル、固体担体、希釈剤、または賦形剤と共に製剤でもたらすことができる。これらの治療用調製物は、家畜動物を用いたものなどの獣医学的な使用、および他の治療剤と同様にヒトにおける臨床使用に関して哺乳動物に投与することができる。一般に、治療有効性のために必要な投与量は、使用の型および投与形式、ならびに個々の被験体の特定の要件に応じて変動する。
【００８８】
臨床的適用が意図されている場合、組換えタンパク質および／またはエキソソームを意図された適用に適した形態で含む医薬組成物を調製することが必要な場合がある。一般に、医薬組成物は、薬学的に許容される担体中に溶解または分散させた、有効量の１つまたは複数の組換えタンパク質および／またはエキソソームまたは追加的な薬剤を含有する。「薬学的または薬理学的に許容される」という句は、必要に応じて、例えばヒトなどの動物に投与した際に有害な反応、アレルギー反応、または他の不都合な反応を生じさせない分子実体および組成物を指す。本明細書に開示されている組換えタンパク質および／またはエキソソームを含む医薬組成物、または追加的な活性成分の調製は、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、１９９０年に例示されている通り、本開示を考慮すれば当業者にとって公知である。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与に関しては、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓにより求められる無菌性、発熱性、一般的な安全性、および純度の基準を満たすべきであることが理解されよう。
【００８９】
さらに本発明のある特定の態様によると、投与に適した組成物は、不活性な希釈剤を伴ってまたは伴わずに、薬学的に許容される担体中でもたらすことができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」とは、当業者にとって公知であるような任意のかつ全ての水性溶媒（例えば、水、アルコール／水溶液、エタノール、食塩溶液、非経口ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム、リンゲルデキストロースなど）、非水性溶媒（例えば、脂肪、油、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルなど）、脂質、リポソーム、分散媒、コーティング（例えば、レシチン）、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗細菌剤または抗真菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、不活性ガス、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはこれらの組合せ）、等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）（例えば、糖および塩化ナトリウム）、吸収遅延剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）、塩、薬物、薬物安定剤、ゲル、樹脂、充填剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、色素、流体および栄養分補充剤、同様の材料およびこれらの組合せを含む。担体は、同化できるものであるべきであり、それらとして、液体担体、半固体担体、すなわちペースト剤、または固体担体が挙げられる。さらに、所望であれば、組成物は、微量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、安定化剤、またはｐＨ緩衝剤などを含有してよい。医薬組成物中の種々の成分のｐＨおよび正確な濃度は、周知のパラメータに応じて調整する。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散物の場合では必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。
【００９０】
薬学的に許容される担体は、特に、ヒトへの投与用に製剤化されるが、ある特定の実施形態では、非ヒト動物への投与用に製剤化されたものであり、ヒトへの投与は許容されない（例えば、政府の規制によって）薬学的に許容される担体を使用することが望ましい。任意の従来の担体が活性成分と適合しない（例えば、レシピエントまたは担体に含有される組成物の治療効果に対して有害である）場合を除き、治療用組成物または医薬組成物への担体の使用が意図されている。本発明のある特定の態様によると、組成物を担体と任意の都合がよく実用的な様式で、すなわち、溶解、懸濁、乳化、混合、封入、吸収などによって組み合わせる。そのような手順は当業者には常套的なものである。
【００９１】
本発明のある特定の実施形態は、それを固体形態で投与するか、液体形態で投与するか、またはエアロゾル形態で投与するか、および、注射などの投与経路のために滅菌する必要があるかどうかに応じて異なる型の担体を含み得る。組成物は、静脈内に、皮内に、経皮的に、髄腔内に、動脈内に、腹腔内に、鼻腔内に、膣内に、直腸内に、筋肉内に、皮下に、粘膜に、経口的に、局部的に（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、局所的に（ｌｏｃａｌｌｙ）、吸入（例えば、エアロゾル吸入）によって、注射によって、注入によって、持続注入によって、直接標的細胞を浸漬する限局的灌流によって、カテーテルを介して、洗浄を介して、脂質組成物（例えば、リポソーム）中で、または当業者に公知の他の方法または上記の任意の組合せによって投与することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、１９９０年を参照されたい）。
【００９２】
活性化合物は、非経口投与用に製剤化することができ、例えば、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、またはさらには腹腔内経路による注射用に製剤化することができる。一般には、そのような組成物は、液体溶液または懸濁物として調製することができ、注射前に液体を添加して溶液または懸濁物を調製するために使用するのに適した固体形態を調製することもでき、調製物はまた、乳化されていてもよい。
【００９３】
注射での使用に適した医薬形態は、滅菌した水溶液または分散物；ゴマ油、ピーナッツ油、または水性プロピレングリコールを含めた製剤；および滅菌された注射用溶液または分散物を即時調製するための滅菌粉末を含む。全ての場合において、形態は、滅菌しなければならず、容易に注射することができる程度に流体でなければならない。形態はまた、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。
【００９４】
治療薬は、遊離塩基、中性、または塩の形態で組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩、例えば、タンパク質様組成物の遊離のアミノ基を用いて形成されるもの、または、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、またはマンデル酸などの有機酸を用いて形成されるものが挙げられる。同様に、遊離のカルボキシ基を用いて形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、もしくは水酸化第二鉄などの無機塩基、またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、またはプロカインなどの有機塩基に由来するものであってよい。製剤化されたら、溶液を投薬製剤（ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）と適合する様式で、治療的に有効な量で投与する。製剤は、注射溶液などの非経口投与用に製剤化されたもの、または肺に送達するためのエアロゾル、または薬物放出カプセル剤などの食事による投与用に製剤化されたものなどの種々の剤形で容易に投与される。
【００９５】
本発明の特定の実施形態では、組成物を半固体または固体担体と徹底的に組み合わせるまたは混合する。混合は、粉砕などの任意の都合のよい様式で行うことができる。組成物を治療的活性の喪失、すなわち、胃における変性から保護するために、混合プロセスに安定化剤を加えることもできる。組成物に使用するための安定剤の例としては、緩衝液、グリシンおよびリシンなどのアミノ酸、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトールなどの炭水化物が挙げられる。
【００９６】
さらなる実施形態では、本発明は、１つまたは複数の脂質および水性溶媒を含む医薬脂質ビヒクル組成物の使用に関し得る。本明細書で使用される場合、「脂質」という用語は、特徴的に水に不溶性であり、有機溶媒を用いて抽出可能である広範囲の物質をいずれも含むものと定義される。この広範なクラスの化合物は当業者には周知であり、「脂質」という用語は、本明細書で使用される場合、任意の特定の構造に限定されない。例として、長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体を含有する化合物が挙げられる。脂質は、天然に存在するものであっても合成されたもの（すなわち、人間が設計または作製したもの）であってもよい。しかし、脂質は、通常、生物学的物質である。生物学的脂質は当技術分野で周知であり、それらとして、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質（ｌｙｓｏｌｉｐｉｄ）、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、スルファチド（ｓｕｌｐｈａｔｉｄｅ）、エーテルと連結した脂肪酸およびエステルと連結した脂肪酸を有する脂質、重合可能な脂質、およびこれらの組合せが挙げられる。当然、本明細書に具体的に記載されているもの以外の、当業者に脂質であると理解される化合物も組成物および方法に包含される。
【００９７】
当業者は、組成物を脂質ビヒクル中に分散させるために使用することができる技法の範囲に詳しいであろう。例えば、治療剤を、当業者に公知の任意の手段により、脂質を含有する溶液に分散させること、脂質を用いて溶解させること、脂質を用いて乳化すること、脂質と混合すること、脂質と組み合わせること、脂質と共有結合させること、脂質に懸濁物として含有させること、ミセルまたはリポソームに含有させるもしくはそれと複合体を形成すること、または他のやり方で脂質または脂質構造と結び付けることができる。分散によりリポソームの形成がもたらされてもよく、もたらされなくてもよい。
【００９８】
「単位用量」または「投与量」という用語は、被験体における使用に適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、その投与、すなわち、適切な経路および治療レジメンに伴って上記で検討した所望の応答が生じるように算出された所定の量の治療用組成物を含有する。治療回数および単位用量の両方に応じて投与される量は、所望の効果に左右される。患者または被験体に投与される本発明の組成物の実際の投与量は、被験体の体重、年齢、健康、および性別などの身体的因子および生理的因子、治療される疾患の型、疾患の侵入の程度、以前または同時の治療介入、患者の特発性疾患、投与経路、ならびに特定の治療用物質の効力、安定性、および毒性によって決定することができる。例えば、用量は、投与当たり約１μｇ／ｋｇ／体重〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重（この範囲は、間に入る用量を含む）またはそれ超、およびその中で導き出せる任意の範囲を構成し得る。本明細書において列挙されている数から導き出せる範囲の非限定的な例では、約５μｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ／体重などの範囲で投与することができる。いずれにしても、投与の責任がある実施者が、個々の被験体に対する組成物中の活性成分（複数可）の濃度および適切な用量（複数可）を決定する。
【００９９】
動物患者に投与される組成物の実際の投与量は、体重などの身体的因子および生理的因子、状態の重症度、治療される疾患の型、以前または同時の治療介入、患者の特発性疾患、および投与経路によって決定することができる。投与量および投与経路に応じて、好ましい投与量および／または有効量の投与の回数は、被験体の応答に応じて変動し得る。いずれにしても、投与の責任がある実施者が、個々の被験体に対する組成物中の活性成分（複数可）の濃度および適切な用量（複数可）を決定する。
【０１００】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含み得る。他の実施形態では、活性化合物は、単位の重量の約２％〜約７５％、または約２５％〜約６０％、例えば、およびその中で導き出せる任意の範囲を構成し得る。当然、治療的に有用な組成物それぞれの中の活性化合物（複数可）の量は、化合物の任意の所与の単位用量で適切な投与量が得られるように調製することができる。溶解度、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品の貯蔵寿命、ならびに他の薬理学的考察事項などの因子が、そのような医薬製剤を調製する当業者により考慮され、したがって、種々の投与量および治療レジメンが望ましい可能性がある。
【０１０１】
他の非限定的な例では、用量は、投与当たり約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重から、約１０００ミリグラム／ｋｇ／体重またはそれ超まで、およびその中で導き出せる任意の範囲も含み得る。本明細書において列挙されている数から導き出せる範囲の非限定的な例では、上記の数に基づいて約５ミリグラム／ｋｇ／体重〜約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲で投与することができる。
【０１０２】
ＩＶ．核酸およびベクター
本発明のある特定の態様では、治療用タンパク質をコードする核酸配列または治療用タンパク質を含有する融合タンパク質をコードする核酸配列が開示され得る。どんな発現系を使用するかに応じて、核酸配列を従来の方法に基づいて選択することができる。例えば、それぞれの遺伝子またはその改変体は、ある特定の系において発現させるためにコドン最適化することができる。目的のタンパク質を発現させるために、種々のベクターを使用することもできる。例示的なベクターとしては、これだけに限定されないが、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾン、またはリポソームに基づくベクターが挙げられる。
【０１０３】
Ｖ．組換えタンパク質
一部の実施形態は、組換えタンパク質およびポリペプチドに関する。特定の実施形態は、少なくとも１つの治療的活性を示す組換えタンパク質またはポリペプチドに関する。別の態様では、タンパク質またはポリペプチドを、血清中での安定性が増大するように修飾することができる。したがって、本出願で「改変タンパク質」または「改変ポリペプチド」の機能または活性に言及する場合、これは、例えば、修飾されていないタンパク質またはポリペプチドに対して追加的な利点を有するタンパク質またはポリペプチドを含むことが当業者には理解されよう。「改変タンパク質」に関する実施形態は、「改変ポリペプチド」について実施され得、逆もまた同じであることが明確に意図されている。
【０１０４】
組換えタンパク質は、アミノ酸の欠失および／または置換を有し得、したがって、欠失を有するタンパク質、置換を有するタンパク質、および欠失と置換を有するタンパク質は、改変タンパク質である。一部の実施形態では、これらのタンパク質は、アミノ酸の挿入または付加をさらに含んでよく、例えば融合タンパク質またはリンカーを有するタンパク質である。「改変欠失タンパク質」は、天然のタンパク質の１つまたは複数の残基を欠くが、天然のタンパク質の特異性および／または活性を有し得る。「改変欠失タンパク質」はまた、免疫原性または抗原性が低下したものであり得る。改変欠失タンパク質の例は、少なくとも１つの抗原性領域、すなわち、改変タンパク質を投与することができる生物体の型などの特定の生物体において抗原性であることが決定されたタンパク質の領域からアミノ酸残基が欠失したものである。
【０１０５】
置換または置き換え改変体は、一般には、タンパク質内の１つまたは複数の部位において１つのアミノ酸と別のアミノ酸の交換を含有し、ポリペプチドの１つまたは複数の性質、特に、そのエフェクター機能および／または生物学的利用能を調節するために設計することができるものである。置換は、保存的なもの、すなわち、１つのアミノ酸が形状および電荷が同様のアミノ酸で置き換えられたものであってもよく、保存的なものでなくてもよい。保存的置換は当技術分野で周知であり、それらとして、例えば、アラニンからセリンへの変化；アルギニンからリシンへの変化；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンへの変化；アスパラギン酸からグルタミン酸への変化；システインからセリンへの変化；グルタミンからアスパラギンへの変化；グルタミン酸からアスパラギン酸への変化；グリシンからプロリンへの変化；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへの変化；イソロイシンからロイシンまたはバリンへの変化；ロイシンからバリンまたはイソロイシンへの変化；リシンからアルギニンへの変化；メチオニンからロイシンまたはイソロイシンへの変化；フェニルアラニンからチロシン、ロイシン、またはメチオニンへの変化；セリンからトレオニンへの変化；トレオニンからセリンへの変化；トリプトファンからチロシンへの変化；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへの変化；およびバリンからイソロイシンまたはロイシンへの変化が挙げられる。
【０１０６】
欠失または置換に加えて、改変タンパク質は、残基の挿入を有し得、これは、一般には、ポリペプチド内の少なくとも１つの残基の付加を伴う。これは、標的化ペプチドまたはポリペプチドまたは単に単一の残基の挿入を含む。融合タンパク質と称される末端付加を以下に考察する。
【０１０７】
「生物学的機能的に同等」という用語は、当技術分野においてよく理解され、本明細書においてさらに詳細に定義される。したがって、タンパク質の生物活性が維持されることを条件に、対照ポリペプチドのアミノ酸と同一であるまたは機能的に同等であるアミノ酸を約７０％から約８０％の間、または約８１％から約９０％の間、またはさらには約９１％から約９９％の間有する配列が含まれる。ある特定の態様では、組換えタンパク質は、その天然の対応物と生物学的機能的に同等である。
【０１０８】
アミノ酸および核酸配列は、追加的なＮ末端またはＣ末端アミノ酸または５’配列または３’配列などの追加的な残基を含んでよく、それでも、配列が、タンパク質の発現に関する場合には生物学的なタンパク質の活性の維持を含めた、上記の基準を満たす限りは、本明細書に開示されている配列のうちの１つに記載されているものと本質的に同様であることも理解されよう。末端配列の付加は、特に、例えば、コード領域の５’部分もしくは３’部分のいずれかに隣接する種々の非コード配列を含み得る、または遺伝子内に存在することが公知である種々の内部配列、すなわちイントロンを含み得る核酸配列に当てはまる。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、タンパク質またはペプチドは、一般には、これだけに限定されないが、約２００アミノ酸超、最大で遺伝子から翻訳される全長配列のタンパク質；約１００アミノ酸超のポリペプチド；および／または約３アミノ酸から約１００アミノ酸までのペプチドを指す。便宜上、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸残基」とは、当技術分野で公知の任意の天然に存在するアミノ酸、任意のアミノ酸誘導体、または任意のアミノ酸模倣物を指す。ある特定の実施形態では、タンパク質またはペプチドの残基は連続しており、いかなる非アミノ酸によってもアミノ酸残基の配列が遮られていない。他の実施形態では、配列は１つまたは複数の非アミノ酸部分を含んでよい。特定の実施形態では、タンパク質またはペプチドの残基の配列は、１つまたは複数の非アミノ酸部分で遮られていてよい。
【０１１１】
したがって、「タンパク質またはペプチド」という用語は、天然に存在するタンパク質、または少なくとも１つの修飾されたまたは通常のものではないアミノ酸に見いだされる２０種の共通のアミノ酸の少なくとも１つを含むアミノ酸配列を包含する。
【０１１２】
本発明のある特定の実施形態は、融合タンパク質に関する。これらの分子は、Ｎ末端またはＣ末端において異種ドメインと連結した治療用タンパク質を有し得る。例えば、融合物に他の種由来のリーダー配列を使用して、異種宿主におけるタンパク質の組換え発現を可能にすることもできる。別の有用な融合としては、融合タンパク質の精製を容易にするために切断可能であることが好ましい、血清アルブミンアフィニティータグもしくは６ヒスチジン残基などのタンパク質アフィニティータグ、または抗体エピトープなどの免疫学的に活性なドメインの付加が挙げられる。非限定的なアフィニティータグとして、ポリヒスチジン、キチン結合性タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が挙げられる。
【０１１３】
特定の実施形態では、治療用タンパク質を、ＸＴＥＮポリペプチド（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら、２００９年）、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、アルブミン、またはアルブミン結合性ペプチドなどの、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増大させるペプチドに連結することができる。
【０１１４】
融合タンパク質を生成する方法は当業者には周知である。そのようなタンパク質は、例えば、完全な融合タンパク質の新規合成によって、または異種ドメインをコードするＤＮＡ配列を付着させ、その後、インタクトな融合タンパク質を発現させることによって、作製することができる。
【０１１５】
親タンパク質の機能活性が回復する融合タンパク質の作製は、遺伝子を、タンデムに接続したポリペプチド間でスプライスされるペプチドリンカーをコードする架橋ＤＮＡセグメントと接続することによって容易にすることができる。リンカーは、生じる融合タンパク質の適切なフォールディングを可能にするのに十分な長さのものであってよい。
【０１１６】
ＶＩ．タンパク質の精製
タンパク質の精製技法は当業者には周知である。これらの技法は、１つのレベルでは、細胞、組織、または器官をポリペプチド画分および非ポリペプチド画分に均質化および粗分画することを伴う。別段の指定がない限り、部分的または完全な精製（または均質性までの精製）を達成するために、クロマトグラフィー技法および電気泳動技法を使用して目的のタンパク質またはポリペプチドをさらに精製することができる。純粋なペプチドの調製に特に適する分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、および等電点電気泳動である。ペプチド精製の特に効率的な方法は、中高圧液体クロマトグラフィー（ｆａｓｔ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＦＰＬＣ）またはさらには高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。
【０１１７】
精製されたタンパク質またはペプチドとは、他の成分から単離可能な組成物を指すものとし、ここで、タンパク質またはペプチドは、その天然に得られる状態に対して任意の程度まで精製される。したがって、単離または精製されたタンパク質またはペプチドとは、それが天然に存在し得る環境から離れたタンパク質またはペプチドも指す。一般に、「精製された」とは、分画に供して種々の他の成分を除去したタンパク質またはペプチド組成物を指し、当該組成物は、その発現した生物活性を実質的に保持する。「実質的に精製された」という用語が使用される場合、この指定は、タンパク質またはペプチドが組成物の主要な成分を形成する、例えば、組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、またはそれ超を構成するなどの組成物を指す。
【０１１８】
タンパク質の精製における使用に適した種々の技法は当業者には周知である。これらとしては、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などを用いた沈殿、または熱変性、その後の遠心分離によるもの；イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーステップ；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；ならびにこれらおよび他の技法の組合せが挙げられる。当技術分野で公知の通り、種々の精製ステップを実施する順序は変化させることができる、またはある特定のステップを省くことができ、それでも実質的に精製されたタンパク質またはペプチドを調製するために適した方法がもたらされると考えられる。
【０１１９】
タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量化するための種々の方法は、本開示に照らして当業者に公知である。これらとしては、例えば、活性画分の比活性を決定すること、または画分内のポリペプチドの量をＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって評価することが挙げられる。画分の純度を評価するための好ましい方法は、画分の比活性を算出すること、それを最初の抽出物の比活性と比較すること、したがって、画分中の純度の程度を算出し、「精製の倍率数（−ｆｏｌｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）」によって評価することである。活性の量を表すために使用される実際の単位は、当然、精製の後に続けるために選択される特定のアッセイ技法、および発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すがどうかに左右される。
【０１２０】
一般に、タンパク質またはペプチドを常にその最も精製された状態でもたらす必要はない。実際に、ある特定の実施形態ではより程度が低くしか実質的に精製されていない産物が有用であり得ることが意図されている。部分的な精製は、より少ない精製ステップを組み合わせて使用することによって、または同じ一般的な精製スキームの異なる形態を利用することによって達成することができる。例えば、ＨＰＬＣ機器を利用して陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを実施することにより、一般に、低圧クロマトグラフィーシステムを利用した同じ技法よりも高い精製「倍率」がもたらされることが理解される。相対的な精製の程度が低い方法には、タンパク質産物の総回収に関して、または発現されたタンパク質の活性の維持に関して利点があり得る。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、タンパク質またはペプチドを単離または精製することができる。例えば、精製を容易にするためにＨｉｓタグまたはアフィニティ―エピトープを組換えタンパク質に含めることができる。アフィニティークロマトグラフィーは、単離される物質とそれが特異的に結合する分子の間の特異的なアフィニティ―に依拠するクロマトグラフィーの手順である。これは、受容体−リガンド型の相互作用である。結合パートナーの一方を不溶性マトリックスに共有結合によりカップリングすることによってカラム材料を合成する。その後、カラム材料は、溶液からの物質に特異的に吸着することができる。溶出は、結合が起こらないように条件を変化させること（例えば、ｐＨ、イオン強度、温度などの変更）によって行う。マトリックスは、いかなる有意な程度にも分子を吸着せず、広範囲の化学的安定性、物理的安定性、および熱安定性を有する物質であるべきである。リガンドは、その結合特性に影響を及ぼさないようにカップリングするべきである。リガンドはまた、比較的密接な結合をもたらすものであるべきである。試料もリガンドも破壊せずに物質を溶出することが可能であるはずである。
【０１２２】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、溶液中の分子をそれらのサイズ、より技術的な用語では、それらの流体力学的体積に基づいて分離するクロマトグラフィー方法である。ＳＥＣは、通常、タンパク質および工業用ポリマーなどの大きな分子または高分子複合体に適用される。一般には、水溶液を使用してカラムを通して試料を輸送する場合には、技法はゲル濾過クロマトグラフィーとして公知であり、それに対して、ゲル浸透クロマトグラフィーという名称は、有機溶媒を移動相として使用する場合のものである。
【０１２３】
ＳＥＣの根本原理は、サイズの異なる粒子が固定相を通って異なる速度で溶出する（濾過される）というものである。これにより、粒子の溶液がサイズに基づいて分離される。全ての粒子を同時にまたはほぼ同時にローディングすれば、同じサイズの粒子は一緒に溶出するはずである。各サイズ排除カラムは、分離することができる分子量の範囲を有する。排除限界により、この範囲の上限の分子量が規定され、そこが、分子が固定相に捕捉されるには大きすぎるところである。浸透限界により、分離の範囲の下限の分子量が規定され、そこが、十分に小さなサイズの分子が固定相のポアに完全に浸透することが可能なところであり、この分子質量を下回る分子は全て、単一バンドとして溶出するほどに小さい。
【０１２４】
高速液体クロマトグラフィー（または高圧液体クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）は、生化学および分析化学において化合物を分離、同定、および定量化するために頻繁に使用されるカラムクロマトグラフィーの形態である。ＨＰＬＣでは、クロマトグラフィー充填材料（固定相）を保持するカラム、カラムを通して移動相（複数可）を移動させるポンプ、および分子の保持時間を示す検出器を利用する。保持時間は、固定相、分析される分子、および使用される溶媒（複数可）の間の相互作用に応じて変動する。
【０１２５】
ＶＩＩ．キットおよび診断
本発明の種々の態様では、体液からエキソソームを精製し、そこからゲノムＤＮＡを単離するために必要な成分を含有するキットが構想される。キットは、標的ＤＮＡ配列の増幅および／または標的ＤＮＡのセグメントの配列決定に使用するためのオリゴヌクレオチドをさらに含有してよい。他の態様では、エキソソームを単離し、それに治療用タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトするために必要な成分を含有するキットが構想される。さらに他の態様では、エキソソームを単離し、単離されたエキソソーム内のがん細胞由来エキソソーム特異的マーカーの存在を決定するために必要な成分を含有するキットが構想される。
【０１２６】
キットは、そのような成分のいずれかを含有する１つまたは複数の密閉されたバイアルを含んでよい。一部の実施形態では、キットは、エッペンドルフチューブ、アッセイプレート、シリンジ、ビン、またはチューブなどの、キットの成分と反応しない容器である適切な容器手段も含んでよい。容器は、プラスチックまたはガラスなどの滅菌可能な材料から作製されていてもよい。
【０１２７】
キットは、本明細書に記載の方法の手順ステップの概要を示す指示書をさらに含んでよく、本明細書に記載されているまたは当業者に公知である実質的に同じ手順に従う。指示情報は、コンピュータを使用して実行されると、試料からエキソソームを精製し、エキソソームからゲノムＤＮＡを単離する、エキソソームにおいて組換えタンパク質を発現させる、またはエキソソーム上のがん細胞由来マーカーを同定する実際または仮想の手順が表示される機械可読指示を含有するコンピュータ可読媒体に入っていてよい。
【実施例】
【０１２８】
ＶＩＩＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示されている技法は、本発明者により、本発明の実施においてよく機能することが発見された技法であり、したがって、それを実施するための好ましい方式を構成するとみなすことができることが当業者には理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、それでもなお、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを理解するべきである。
【０１２９】
材料および方法
患者試料および組織採取。Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇにより、患者からの血清採取が認可された。試験はＲｅｐｏｒｔｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｔｕｄｉｅｓ（ＲＥＭＡＲＫ）基準に従って行った。膵がんを有する患者由来の血清試料および組織試料、ならびに良性膵疾患を有する患者および急性または慢性疾患の証拠がなく、過去１２カ月以内に外科手術を受けていない健康なドナー由来の血清試料のみを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇのｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ，Ｖｉｓｃｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｓｕｒｇｅｒｙから受け取った。膵臓コホートには、膵臓の腺癌（ＰＤＡＣ）を有する患者１９０名、膵炎を有する患者１８名、良性漿液性嚢胞腺腫を有する患者８名、膵管内乳頭状粘液性腫瘍（ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ  ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｍｕｃｉｎｏｕｓ  ｎｅｏｐｌａｓｍ）（ＩＰＭＮ）を有する患者５名、および膵上皮内腫瘍（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ）（ＰａＮＩＮ）Ｉｂを有する患者２名が含まれた。患者は、２００６年から２０１２年の間にＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ，Ｖｉｓｃｅｒａｌ，ａｎｄ
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇにおいて外科手術を受けた患者であった。臨床情報には、年齢、性別、ＡＪＣＣ腫瘍病期、腫瘍サイズ（ｐＴ）、リンパ節転移の存在および数（ｐＮ）、腫瘍悪性度（Ｇ）、および（ｎｅｏ−）／アジュバント化学療法を用いた治療が含まれた。
【０１３０】
乳がんを有する患者３２名由来の血清試料をＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｔｅｘａｓにおいて採取した。臨床情報には、年齢、性別、ＡＪＣＣ腫瘍病期、腫瘍サイズ（ｐＴ）、リンパ節転移の存在および数（ｐＮ）、腫瘍悪性度、および（ｎｅｏ−）／アジュバント化学療法を用いた治療が含まれた。
【０１３１】
血清試料採取および腫瘍試料採取に関する書面でのインフォームドコンセントを、全ての患者から手術前に、および各健康なドナーから得た後に、潜在的な予後マーカーに関する分析計画の開示と共に採取を行った。患者の腫瘍を外科的に切除する前に、ネオアジュバント照射療法も化学療法も提供しなかった。外科手術日に、外科的切開の直前に１０ｍＬの血清分離器チューブを使用して、中心静脈カテーテルを通じて血液試料を採取した。ブロッキング食塩水による希釈を防止するために、抜き取った血液の最初の５〜７ｍＬを廃棄した。次いで、血液試料を２．５００×ｇで１０分遠心分離して血清を抽出し、血清を分析するまで−８０℃で保管した。同様に、膵臓の腺癌（ＰＤＡＣ）を有する患者２９名、慢性膵炎を有する患者４名、および膵管内乳頭状粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）を有する患者４名において、外科手術の７日後に血液試料を採取した。
【０１３２】
動物試験。ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した）に、乳房パッド（ｂｒｅａｓｔ  ｐａｄ）当たり注射したＰＢＳ２０μＬ中５０万個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＣＤ６３ＧＦＰ細胞での乳房パッド注射を行った。ブプレノルフィンを外科手術前に１回、および手術後２４時間にわたって８〜１２時間ごとに皮下投与した（生理食塩水０．１ｍＬ中０．１ｍｇ／ｋｇ）。注射前、および腫瘍体積が２５０ｍｍ３、５００ｍｍ３、１０００ｍｍ３、および１５００ｍｍ３の時点で血液を後眼窩から採取し、エキソソームを単離した。腫瘍サイズが１５００ｍｍ３に達した時、または重症の疾患症状が存在した場合にマウスを安楽死させた。
【０１３３】
Ｐｔｆ１ａｃｒｅ／＋；ＬＳＬＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｔｇｆｂｒ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＰＫＴ）マウスに関する疾患の進行および遺伝子型決定は以前に記載されている（Ｉｊｉｃｈｉら、２００６年；Ｏｚｄｅｍｉｒら、２０１４年）。縦断的コホートにおいて、４週齢、５週齢、６週齢、７週齢、および８週齢の時点で後眼窩血液採取を実施した。８週齢の時点でまたは重症の疾患症状が存在した場合にマウスを安楽死させた。膵がんを有さない対照同腹仔４匹において、セルレイン（Ｃｅｒｕｌｅａｎ）をｉ．ｐ．注射することによって急性膵炎を誘導した（体重１ｋｇ当たり５０μｇ、５時間にわたって１時間に１回（全部で５回注射））。注射に２４時間後にマウスを屠殺した。全てのマウスを、ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＭＤＡＣＣ）動物施設において標準の収容条件下で収容し、動物手順は全て、ＭＤＡＣＣ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ
ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより精査され認可された。
【０１３４】
細胞株。以下のヒト細胞株を使用した：ＨＭＬＥ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ細胞（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）、ＢＪ細胞（ＡＴＣＣ）、ＨＤＦ細胞（ＡＴＣＣ）、ＨＭＥＬ細胞（ＡＴＣＣ）、ＭＣＦ−７細胞（ＡＴＣＣ）、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞（ＡＴＣＣ）、ＰＡＮＣ−１細胞（ＡＴＣＣ）、ＳＷ４８０細胞（ＡＴＣＣ）、ＨＣＴ  １１６細胞（ＡＴＣＣ）、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞（ＡＴＣＣ）、およびＴ３Ｍ４細胞（Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ、ＲＩＫＥＮ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｊａｐａｎ）。以下のマウス細胞株を使用した：ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ）、Ｅ１０細胞（ＡＴＣＣ）、ＮＭｕＭＧ細胞（ＡＴＣＣ）、４Ｔ１細胞（ＡＴＣＣ）、およびＢ１６−Ｆ１０細胞（ＡＴＣＣ）。ＨＤＦ細胞およびＢＪ細胞は、２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で培養した。ＨＭＬＥ細胞およびＭＣＦ  １０Ａ細胞は、５％（ｖ／ｖ）ウマ血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、０．５ｍｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン、１００ｎｇ／ｍＬのコレラ毒素、および１０μｇ／ｍＬのインスリンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２中で成長させた。ＨＭＥＬ細胞、ＭＣＦ７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＨＣＴ  １１６細胞、ＳＷ４８０細胞、４Ｔ１細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、Ｅ１０細胞、Ｕ−８７細胞、およびＢ１６  Ｆ１０細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で維持した。ＰＡＮＣ−１細胞、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞、およびＴ３Ｍ４細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、アンホテリシンＢ、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中で培養した。ＮＭＵＭＧ細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および１０μｇ／ｍＬのインスリンを補充したＤＭＥＭ中で成長させた。すべての細胞株を加湿雰囲気中、５％ＣＯ２、３７℃で維持した。ｓｉＲＮＡについて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトランスフェクションを実施した。ＧＰＣ１  ｓｉＲＮＡ（カタログ番号ＳＩ０００３２４４５、ＳＩ０００３２４５９、ＳＩ０００３２４６６、ＳＩ０３０７１０３３）およびスクランブルｓｉＲＮＡはＱｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
【０１３５】
細胞からのエキソソームの単離。いくつかの改変を伴って以前に記載されている通り細胞の上清からエキソソームを得た（Ｋａｈｌｅｒｔら、２０１４年）。簡単に述べると、細胞をＴ２２５ｃｍ２のフラスコ中で８０％〜９０％集密に達するまで成長させた。次に、培地を採取し、８００×ｇで５分にわたって遠心分離し、その後、２０００×ｇで１０分の遠心分離ステップを行って細胞のデトリタスを廃棄した。次いで、０．２μｍのポアフィルター（シリンジフィルター、カタログ番号６７８６−１３０２、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＧＢ）を使用して培地を濾過した。その後、採取した培地を、４℃、１００，０００×ｇで２時間にわたって超遠心分離した。エキソソームペレットを３５ｍＬの１×ＰＢＳで洗浄し、その後、第２の超遠心分離のステップを４℃、１００，０００×ｇで２時間にわたって行った。その後、上清を廃棄した。ＲＮＡ抽出のために使用するエキソソームはＴＲＩｚｏｌ（登録商標）５００μＬに再懸濁させ、タンパク質抽出のために使用するエキソソームは溶解緩衝液（８Ｍ尿素／２．５％ＳＤＳ、５μｇ／ｍＬのロイペプチン、１μｇ／ｍＬのペプスタチン、および１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ））２５０μＬに再懸濁させた。フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、および免疫金染色のために使用するエキソソームは、１００μＬの１×ＰＢＳに再懸濁させた。この試料１０マイクロリットルを１×ＰＢＳ中１：１００に希釈し、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）ＬＭ１０（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  Ｌｔｄ．、Ｍｉｎｔｏｎ  Ｐａｒｋ、Ａｍｅｓｂｕｒｙ、ＧＢ）を使用して分析した。
【０１３６】
ヒト血清試料からのエキソソームの単離。以前に記載されている通り、無細胞血清試料２５０μＬを氷上で解凍した（Ｋａｈｌｅｒｔら、２０１４年）。血清を１１ｍＬの１×ＰＢＳ中に希釈し、０．２μｍのポアフィルターを通して濾過した。その後、試料を４℃、１５０，０００×ｇで終夜超遠心分離した。次に、エキソソームペレットを１１ｍＬの１×ＰＢＳで洗浄し、その後、第２の超遠心分離のステップを４℃、１５０，０００×ｇで２時間にわたって行った。その後、上清を廃棄した。ＲＮＡ抽出のために使用するエキソソームはＴＲＩｚｏｌ（登録商標）５００μＬに再懸濁させ、タンパク質抽出のために使用するエキソソームは溶解緩衝液（８Ｍ尿素／２．５％ＳＤＳ、５μｇ／ｍＬのロイペプチン、１μｇ／ｍＬのペプスタチン、および１ｍＭのＰＭＳＦ）２５０μＬに再懸濁させた。ＦＡＣＳ、ＴＥＭ、および免疫金染色のために使用するエキソソームは、１００μＬの１×ＰＢＳに再懸濁させた。この試料１０マイクロリットルを１×ＰＢＳ中１：１００に希釈し、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）ＬＭ１０（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  Ｌｔｄ．、Ｍｉｎｔｏｎ  Ｐａｒｋ、Ａｍｅｓｂｕｒｙ、ＧＢ）を使用して分析した。
【０１３７】
エキソソームのフローサイトメトリー分析。エキソソームを、４μｍのアルデヒド／硫酸塩ラテックスビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）に、１００μＬ体積のビーズ中エキソソーム約３０μｇを室温で１時間にわたって混合することによって付着させた。この懸濁物を、１×ＰＢＳを用いて１ｍＬまで希釈し、１×ＰＢＳ中１００ｍＭのグリシンおよび２％ＢＳＡを使用して反応を停止させた。エキソソームが結合したビーズを１×ＰＢＳ／２％ＢＳＡ中で洗浄し、２％ＢＳＡを用いてブロッキングし、ＦＡＣＳのために抗グリピカン−１（ＧＰＣ１；ＰＩＰＡ５２８０５５、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて染色した。二次抗体Ａｌｅｘａ−４８８またはＡｌｅｘａ−５９４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用した。
【０１３８】
Ｃａｎｃｅｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ＣＡ１９−９ヒトＥＬＩＳＡ。膵がんを有する患者、膵がん前駆病変を有する患者、良性膵疾患を有する患者、および健康なドナーにおける血清Ｃａｎｃｅｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ＣＡ  １９−９を、Ｃａｎｃｅｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ＣＡ１９−９  Ｈｕｍａｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ、ａｂ１０８６４２）を製造者のプロトコールに従って使用して評価した。
【０１３９】
細胞からのＤＮＡ抽出。細胞をＴ２２５ｃｍ２のフラスコ中で６０％〜７０％集密に達するまで２〜３日間成長させた。次に、細胞を無血清培地で４８時間培養した。培地を採取し、１０００ｒｐｍで５分にわたって遠心分離し、その後、３０００ｒｐｍで１０分の遠心分離ステップを行って細胞デトリタスを廃棄した。その後、０．２２μｍのポアフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して培地を濾過した。馴化培地を合計２２５ｍＬ採取し、４℃で２時間超遠心分離した。上清を廃棄し、追加的な２２５ｍＬの馴化させ、濾過した培地を４℃で２時間超遠心分離した。各超遠心分離ステップのエキソソームペレットをプールし、ＤＮａｓｅ  Ｉ（１Ｕ／μＬ、カタログ番号Ｍ６１０１、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）１０μＬと一緒に３７℃で３０分インキュベートした。その後、ＤＮａｓｅ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（カタログ番号Ｍ１９９Ａ、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）５０μＬを添加し、試料をウォーターバス中、６５℃で５分加熱した。次に、プールしたエキソソームペレットをＰＢＳで洗浄し、第２の超遠心分離のステップを４℃、１５０，０００×ｇで２時間にわたって実施した。上清を吸引した後、ペレットを２００μＬのＰＢＳに懸濁させた。この試料５マイクロリットルを得、１：１００に希釈し、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）ＬＭ１０を使用したさらなる分析のために−２０℃で保管した。残りのエキソソームペレットのＤＮＡを、市販のＤＮＡ抽出キット（ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ、カタログ番号６９５０６、Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者の説明書に従って使用して抽出した。最後に、ＤＮＡをＡＥ緩衝液５０μＬ中に溶出させ、処理するまで−２０℃で保管した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ  ７５００  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（カタログ番号５０６７−１５０７、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を使用して二本鎖ＤＮＡを解析した。
【０１４０】
ヒト血清試料からのＤＮＡ抽出。血清試料を解凍した後、血清５００μＬ（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ分析の場合には血清５ｍＬ）を１１ｍＬの１×ＰＢＳ中に希釈し、０．２２μｍのポアシリンジフィルター（カタログ番号６７８６−１３０２、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＧＢ）を通して濾過し、４℃、１５０，０００×ｇで終夜超遠心分離した。その後、エキソソーム枯渇血清を採取し、さらに処理するまで−８０℃で保管し、一方、エキソソームペレットはＤＮａｓｅ  Ｉ（１Ｕ／μＬ、カタログ番号Ｍ６１０１、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）１μＬと一緒に３７℃で３０分インキュベートした。その後、ＤＮａｓｅ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（カタログ番号Ｍ１９９Ａ、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）５μＬを添加し、試料をウォーターバス中、６５℃で５分加熱した。次に、エキソソームペレットを１１ｍＬの１×ＰＢＳで洗浄し、第２の超遠心分離のステップを４℃、１５０，０００×ｇで２時間にわたって実施した。上清を吸引した後、ペレットを２００μＬのＰＢＳに懸濁させた。この試料５マイクロリットルを１：１００に希釈し、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）ＬＭ１０を使用したさらなる分析のために−２０℃で保管した。残りのエキソソームペレットのＤＮＡを、市販のＤＮＡ抽出キット（ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ、カタログ番号６９５０６、Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者の説明書に従って使用して抽出した。最後に、ＤＮＡをＡＥ緩衝液５０μＬ中に溶出させ、処理するまで−２０℃で保管した。
【０１４１】
ヒト原発性膵がんからのＤＮＡ抽出。切除後すぐに、膵腫瘍試料を液体窒素で急速凍結し、さらに処理するまで−８０℃で保管した。腫瘍組織および近接する腫瘍間質の割合を評価するために、標準の方法により、各試料の参照切片１０μｍを切り取り、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。腫瘍間質の割合が３０％を超える試料をこの試験に含めた。市販のＤＮＡ抽出キット（ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ、カタログ番号６９５０６、Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して製造者のプロトコールに従ってＤＮＡ単離を実施した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）１０００  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）を使用して腫瘍試料由来のＤＮＡの量を定量化した。
【０１４２】
細胞およびエキソソームからのＲＮＡ抽出。ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ精製キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１２１８３５５５）を製造者のプロトコールに従って使用して細胞およびエキソソームのＲＮＡを単離した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡを定量化した。
【０１４３】
ウエスタンブロット分析および抗体。ＴＳＧ１０１および他のタンパク質のエキソソームでの発現をモニタリングするために、５μｇ／ｍＬのロイペプチン、１μｇ／ｍＬのペプスタチン、および１ｍＭのＰＭＳＦを含有する８Ｍ尿素／２．５％ＳＤＳ緩衝液中にエキソソームを収集し、５μｇ／ｍＬのロイペプチン、１μｇ／ｍＬのペプスタチン、および１ｍＭのＰＭＳＦを含有するＲＩＰＡ緩衝液中に細胞を溶解させた。ブラッドフォード法による定量化に従って試料をローディングし、アクリルアミドゲルを使用して分析した。湿式電気泳動転写（ｗｅｔ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）を使用してゲル内のタンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ）に転写した。タンパク質ブロットを、１×ＰＢＳ中５％脱脂粉乳および０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を用いて室温で１時間にわたってブロッキングし、以下の一次抗体と一緒に４℃で終夜インキュベートした：１：３００の抗ＴＳＧ１０１（抗ａｂ８３；Ａｂｃａｍ）、１：３００の抗ＧＰＣ１（ＰＩＰＡ５２８０５５；Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；１：３００の抗β−アクチン（Ａ３８５４；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；１：３００の抗ＣＤ８１（ｓｃ−１６６０２９；Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ）；１：３００の抗フロチリン１（ｓｃ−２５５０６；Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ）。二次抗体を室温で１時間にわたってインキュベートした。抗体をインキュベートした後、１×ＰＢＳおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を用いた洗浄をオービタルシェーカーにおいて１０分間隔で４回実施した。Ｐｉｅｒｃｅからの化学発光試薬を使用してブロットを発光（ｄｅｖｅｌｏｐ）させた。
【０１４４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）。細胞由来のＤＮＡの量および細胞培地由来のエキソソーム由来のＤＮＡの量を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）１０００  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）を使用して定量化した。ヒト血清由来のエキソソーム由来のＤＮＡの量を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、カタログ番号Ｐ１１４９６、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を使用して定量化した。１０μＬの鋳型ＤＮＡ、１μＭの各プライマー、２．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、２．５  １０×ＰＣＲ緩衝液、２５ｍＭのＭｇ溶液、０．５μＬのＨ２Ｏ、および２．５μＬのＴａｑポリメラーゼを含有する２５μＬの反応チューブでＰＣＲを実施した。Ｔ１００サーモサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）において以下の条件下で増幅を行った：９４℃で１分間；９４℃で１０秒、６７℃で３０秒、７０℃で３０秒を２サイクル；９４℃で１０秒、６４℃で３０秒、７０℃で３０秒を２サイクル；９４℃で１０秒、６１℃で３０秒、７０℃で３０秒を２サイクル；９４℃で１０秒、５９℃で３０秒、７０℃で３０秒を３５サイクル；および４℃で最終的な保持。ＫＲＡＳ分析を以下のプライマーを使用して実施した：フォワード５’−ＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧ−３’（配列番号１）、リバース５’−ＴＣＡＣＡＡＴＡＣＣＡＡＧＡＡＡＣＣＣＡＴ−３’（配列番号２）。Ｐ５３分析を以下のプライマーを使用して実施した：ｐ５３エクソン７−８ｐ（６０９ｂｐ）：フォワード５’−ＴＣＣＴＡＧＧＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＣ−３’（配列番号３）、リバース５’−ＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＴＡＣＣＴＣＧＣＴ−３’（配列番号４）；ｐ５３エクソン５−８（１５６４ｂｐ）：フォワード５’−ＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＡＣＡＧＴＡＣＴＣＣ−３’（配列番号５）、リバース５’−ＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＴＡＣＣＴＣＧＣＴ−３’（配列番号６）。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して精製した。その後、配列決定反応をＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ターミネーターキット（ｖ３．１、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を製造者の説明書に従って使用して実施した。配列決定には以下のプライマーを使用した：ＫＲＡＳ、フォワード５’−ＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧ−３’（配列番号７）およびリバース５’−ＡＧＡＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡ−３’（配列番号８）；ｐ５３エクソン５〜８、フォワード５’−ＴＣＴＴＣＣＴＡＣＡＧＴＡＣＴＣＣＣＣＴ−３’（配列番号９）およびリバース５’−ＧＣＴＴＧＣＴＴＡＣＣＴＣＧＣＴＴＡＧＴ−３’（配列番号１０）；ｐ５３エクソン７〜８、フォワード５’−ＴＡＧＧＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＴ−３’（配列番号１１）およびリバース５’−ＧＣＴＴＧＣＴＴＡＣＣＴＣＧＣＴＴＡＧＴ−３’（配列番号１２）。配列決定産物をＡＢＩ  ３７３０自動シーケンサー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）で分離した。ＫＲＡＳ変異状���をＦｉｎｃｈ  ＴＶ（Ｇｅｏｓｐｉｚａ、Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ、ＵＳＡ）を使用して評価した。
【０１４５】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）。ｑＲＴ−ＰＣＲを、ＤＮａｓｅで処理したＲＮＡを用い、７３００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）においてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号１１７３２−０８８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）を製造者の推奨に従って使用して実施した。ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ  ｍＲＮＡに対するプライマーおよびＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ  ｍＲＮＡに対するプライマー（どちらもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を以前報告されている通り設計した（Ｒａｃｈａｇａｎｉら、２０１１年）。簡単に述べると、フォワードプライマーの３’末端におけるＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄの塩基の変更およびＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ変異を保持した。変異体ＫＲＡＳ対立遺伝子の増幅の特異性を増大させるために、ＫＲＡＳ変異の２つ前の位置に追加的な塩基変異を含めた。
【０１４６】
【化２】
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ＫＲＡＳ野生型ｍＲＮＡに対するフォワードプライマー配列：Ｆ−５’−ＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧ−３’（配列番号１５）。全てのＫＲＡＳに対するリバースプライマー：Ｒ−５’−ＴＴＧＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡ−３’（配列番号１６）。ＧＰＣ１  ｍＲＮＡプライマー対（カタログ番号ＰＰＨ０６０４５Ａ）および１８ｓ  ｍＲＮＡプライマー対（カタログ番号ＱＦ００５３０４６７）はＱｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。閾値サイクル（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら、２００１年）（Ｃｔ）（すなわち、増幅された標的の量が固定閾値に達する分別サイクル数）を決定し、発現を、以前報告されている通り２−ΔＣｔ式を使用して測定した（ＬｉｖａｋおよびＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎ、２００１年）。
【０１４７】
電子顕微鏡。試料を、ポリ−Ｌ−リシンを用いて１時間処理した、４００メッシュのホルムバールでコーティングした銅グリッドに置いた。過剰な試料を濾紙を用いてブロットし、次いで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅで濾過した水性１％酢酸ウラニルを用いて１分にわたって陰性染色した。濾紙を用いて染料をグリッドからブロット乾燥し、試料を乾燥させた。次いで、試料を、ＪＥＭ  １０１０透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ，ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｐｅａｂｏｄｙ、ＭＡ）を８０Ｋｖの加速電圧で使用して検査した。ＡＭＴ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）を使用してデジタル画像を得た。
【０１４８】
免疫金標識。最適な濃度で固定した検体を４００メッシュの炭素／ホルムバールでコーティングしたグリッドに置き、最低でも１分間ホルムバールに吸収させた。免疫金染色のために、グリッドをブロッキング／透過処理ステップのためのブロッキング緩衝液に１時間入れた。グリッドを、すすがずにすぐに適切な希釈度の一次抗体に４℃で終夜（１：３００の抗ＣＤ９（ａｂ９２７２６、Ａｂｃａｍ）および抗ＧＰＣ１（ＰＩＰＡ５２８０５５、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に入れた。対照として、一部のグリッドは一次抗体に曝露させなかった。次の日に、グリッドの全てをＰＢＳですすぎ、次いで、１０ｎｍの金粒子（ＡＵＲＩＯＮ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）を付着させた適切な二次抗体の液滴に室温で２時間浮遊させた。グリッドをＰＢＳですすぎ、０．１Ｍのリン酸緩衝液中２．５％グルタルアルデヒドに１５分入れた。ＰＢＳおよび蒸留水ですすいだ後、グリッドを乾燥させ、酢酸ウラニルを使用して対比のために染色した。試料をＴｅｃｎａｉ（商標）ＢｉｏＴｗｉｎ透過型電子顕微鏡（ＦＥＩ、Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ、ＯＲ）を用いて調べ、ＡＭＴ  ＣＣＤ  Ｃａｍｅｒａ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｃｏｒｐ．）を用いて画像を取得した。
【０１４９】
スクロース勾配。エキソソームをさらに特徴付けるために、スクロース密度勾配を実施した。簡単に述べると、エキソソームをＨＥＰＥＳ／スクロースストック溶液（２．５Ｍのスクロース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ溶液、ｐＨ７．４）２ｍＬに再懸濁させた。エキソソーム懸濁物を、ＳＷ４１チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ）中で直線的なスクロース勾配（２．０〜０．２５Ｍのスクロース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．４）の上に置いた。勾配を４℃、２１０，０００×ｇで１６時間にわたって超遠心分離した。次いで、勾配画分１ｍＬを頂部から底部に採取した。屈折計を使用して密度を評価した。次に、エキソソームペレットを１×ＰＢＳで洗浄し、その後、第２の超遠心分離のステップを４℃、１５０，０００×ｇで２時間にわたって行った。さらなる免疫ブロッティングおよびＦＡＣＳ分析のために、エキソソームペレットをＬａｅｍｍｌｉ緩衝液および／またはＰＢＳに再懸濁させた。
【０１５０】
全ゲノムショットガン配列決定。全ゲノム配列決定を、エキソソームおよび対応する腫瘍試料において、ＴｈｒｕＰＬＥＸ（登録商標）−ＦＤライブラリープレップテクノロジー（カタログ番号Ｒ４００４８、Ｒｕｂｉｃｏｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）をＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＨｉＳｅｑ２０００配列決定プラットフォーム、ペアエンド２×５１ｂｐと組み合わせて使用して、網羅度（ｃｏｖｅｒａｇｅ）深さ４×まで実施した。コピー数プロファイルを評価し、構造的再配列に関する追加的な洞察を得るために、ＢＩＣ−ｓｅｑと称されるアルゴリズムを利用した（Ｘｉら、２０１１年）。
【０１５１】
ＭＲＩイメージング。７Ｔ小動物ＭＲシステムを使用してＭＲＩ試験を行った。ＢｉｏＳｐｅｃ（登録商標）ＵＳＲ７０／３０（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ  ＭＲＩ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）は、口径３０ｃｍおよび冷凍・冷蔵を備えた能動的に遮蔽された７Ｔ磁石に基づく。このシステムは、最大勾配磁場９５０ｍＴ／ｍを送達する６ｃｍの内径勾配を備える。内径３．５ｃｍの直線状バードケージコイルによりＭＲシグナルを送受信する。画像撮像のために、Ｔ２強調、呼吸同期、マルチスライイメージングを、腹部のモーションアーチファクトを最小限にするために呼吸を毎分２５呼吸に保持して実施した。マウスに関しては、脂肪シグナルによってＴ２強調画像が遮蔽される場合には、脂肪抑制パルスモジュールを利用した。撮像パラメータは、Ｓｃｈｍｉｄら（２０１３年）から最低限に改変した。ＲＡＲＥ−Ｔ２強調パルスシーケンスを、５６ｍｓの有効なＴｅを含み、総ＴＲが２２６５ｍｓになるように改変した。マウス当たり１８枚から２０枚の間の冠状スライスをスライス厚０．７５ｍｍおよびスライス間隔１ｍｍで撮像した。平面では、平面内部分体積効果（ｉｎ  ｐｌａｎｅ  ｐａｒｔｉａｌ  ｖｏｌｕｍｅ  ｅｆｆｅｃｔ）を最小限にし、腹部を網羅するために十分なＦＯＶを維持しながら、実験に十分な処理量ももたらされるように、画素サイズ０．１５６ｍｍ×０．１５６ｍｍ、マトリックスサイズ２５６×１９２（４０ｍｍ×３０ｍｍ  ＦＯＶ）を選択した。腫瘍量を測定するために、画像強度を正規化した後、各スライスに関して、疑わしい病変の領域にブラインドを引いた。体積を、ｍｍ２×１ｍｍスライス距離で描かれた関心領域を加算することによって算出した。
【０１５２】
統計解析。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＭｅｄＣａｌｃ統計ソフトウェアバージョン１３．０（ＭｅｄＣａｌｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｂｖｂａ、Ａｃａｃｉａｌａａｎ  ２２、Ｏｓｔｅｎｄ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を全ての算出に使用した。スチューデントｔ検定を適用してｑＰＣＲ結果の発現差異を算出した。分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定を実施して、マウス血清試料およびヒト血清試料における多数の血清因子の差異を算出した。ＡＮＯＶＡ検定が陽性であった場合、サブグループのペアワイズ比較にチューキー・クレーマー検定を適用した。対応のある両側スチューデントｔ検定を適用して、手術前血液試料と手術後の検体の間の、縦断的コホートにおけるＧＰＣ１＋集団およびＣＡ  １９−９の差異を算出した。Ｄｅｌｏｎｇ方法（ＤｅＬｏｎｇら、１９８８年）を使用して血清因子の感度、特異度、陽性的中度、陰性的中度、および曲線下面積（ＡＵＣ）を決定し、比較するために受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用した。Ｙｏｕｄｅｎ−Ｉｎｄｅｘを使用してカットオフ値を決定した。膵がんを有する患者の縦断的コホートにおける疾患特異的生存（診断からがんに関連した死亡または最後の経過観察までの時間）を視覚化するため（カプランマイヤー曲線）および評価するために、ログランク検定による単変量解析を行った。コックス比例ハザード回帰モデルを使用した多変量解析を実施して、年齢（連続変数）、ＡＪＣＣ腫瘍病期、および腫瘍悪性度（Ｇ）およびＣＡ  １９−９（Ｕ／ｍＬ）に加えてＧＰＣ１＋集団の減少の効果を評価した。マウス腫瘍量とＧＰＣ１＋エキソソームの間の相関分析を、スピアマン相関検定を使用して実施した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＭｅｄＣａｌｃ統計ソフトウェアバージョン１３．０（ＭｅｄＣａｌｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｂｖｂａ、Ａｃａｃｉａｌａａｎ  ２２、Ｏｓｔｅｎｄ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用することによって図面を作成した。示されているＰ値は全て両側性であり、Ｐ値＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。
【０１５３】
（実施例１）
エキソソームは、二本鎖ゲノムＤＮＡの１０ｋｂ未満の断片を含有する
細胞のエキソソームを２種のヒト膵がん細胞株（Ｐａｎｃ−１およびＴ３Ｍ４）ならびに膵がんを有する患者の血清から単離した（Ｌｕｇａら、２０１２年；Ｔｈｅｒｙら、２００６年）。外部ＤＮＡ汚染を減少させるために、以前に記載されている通り（Ｂａｌａｊら、２０１１年）、ＤＮＡ抽出前にエキソソームをＤＮａｓｅ  Ｉで広範囲にわたって処理した。ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）ＬＭ１０を使用して、がん細胞株および血清試料の両方からエキソソームの存在およびそれらの濃度を確認した（図１Ａ）。さらに、エキソソームを同種の集団として電子顕微鏡によって（図１Ｂ）、およびエキソソームマーカー、ＴＳＧ１０１およびＣＤ６３の発現によって（図１ＣおよびＦ）同定した。さらに、エキソソームＤＮＡをがん細胞株から抽出した後、溶出液をＲＮａｓｅ  Ａに供してＲＮＡを排除した。その後、前処理した溶出液を２％アガロースゲルで分析した（図１Ｄ）。これにより、ＲＮＡを伴わないエキソソーム中にＤＮＡの長い断片が存在することが明らかになった。二本鎖ＤＮＡ検出キットを使用することによって、膵がん細胞由来のエキソソームおよび血清試料由来のエキソソームがゲノム二本鎖ＤＮＡを含有することが示された（図１Ｅ）。
【０１５４】
（実施例２）
エキソソームは、変異したＫＲＡＳおよびｐ５３  ＤＮＡを含有する
ＫＲＡＳおよびｐ５３は、膵管腺癌において最も頻繁に変異した遺伝子である（Ｂｉａｎｋｉｎら、２０１２年）。細胞株およびその細胞株に由来するエキソソームから単離したＤＮＡの両方から、エクソン２およびイントロン２の一部をコードするＫＲＡＳの４６６ｂｐの断片、ならびにイントロン５、６、および７を含む、エクソン５からエクソン８までにわたるｐ５３の１５６４ｂｐの断片を増幅した（図２Ａ）。Ｐａｎｃ−１およびＴ３Ｍ４におけるＫＲＡＳ変異およびｐ５３変異は、以前に記載されている（Ｍｏｏｒｅら、２００１年）。Ｐａｎｃ−１は、コドン１２においてヘテロ接合性ＫＲＡＳ変異（グリシンからアスパラギン酸へ）およびコドン２７３においてホモ接合性ｐ５３変異（アルギニンからヒスチジンへ）を示す（Ｍｏｏｒｅら、２００１年）。Ｔ３Ｍ４細胞は、野生型ＫＲＡＳを含有するが、コドン２２０においてホモ接合性ｐ５３変異（チロシンからシステインへ）を示す（Ｍｏｏｒｅら、２００１年）。ＰＣＲ増幅されたＤＮＡのサンガー配列決定法により、Ｐａｎｃ−１細胞に由来するエキソソームから単離したＤＮＡにおいて同一のＫＲＡＳ変異およびｐ５３変異が検出され、また、Ｔ３Ｍ４細胞に由来するエキソソームから単離したＤＮＡにおいて同一のｐ５３変異が検出された（図２Ｂ）。Ｔ３Ｍ４細胞においてもそれから単離されたエキソソームにおいてもＫＲＡＳ  ＤＮＡにおける変異は検出されなかった。
【０１５５】
細胞株を使用した観察に基づいて、膵がんを有する患者由来の循環血清エキソソームもＫＲＡＳ  ＤＮＡおよびｐ５３  ＤＮＡを含有し得ることが仮定された。エクソン２およびイントロン２の一部をコードするＫＲＡＳの４６６ｂｐの断片を増幅した。その後、全てのヒト試料においてエクソン７および８ならびにイントロン７が重複している６０９ｂｐのｐ５３のＤＮＡ断片を単離した（図２ＣおよびＥ）。エキソソームが枯渇した血清試料中のＤＮＡの存在を評価するために、当該血清試料を使用したＫＲＡＳおよびｐ５３についてのＰＣＲも実施した。しかし、エキソソーム枯渇血清ではＫＲＡＳ  ＰＣＲ産物もｐ５３  ＰＣＲ産物も増幅されなかった（図２ＣおよびＥ）。エキソソームから単離したＤＮＡからのＰＣＲアンプリコンをサンガー配列決定法に供した。サンガー配列決定法により、膵がんを有する患者の血清試料においてＫＲＡＳ変異を有するＤＮＡが検出された（図２Ｄ）。１つのＫＲＡＳ変異はコドン１２に位置し、ＧＧＴからＴＧＴへの塩基変化を特徴とするものであった。第２のＫＲＡＳ変異はコドン２２において見いだされ、ＣＡＧからＣＴＧへの塩基変化を伴うものであった。さらに、膵がんを有する患者１名において、コドン２７３において、ＣＧＴからＣＡＴへの塩基変化を伴うｐ５３変異が検出された（図２Ｄ）。
【０１５６】
（実施例３）
ＰＤＡＣ患者の末梢血由来の循環エキソソームは、全染色体にわたる二本鎖ゲノムＤＮＡを含有する
２つの膵がん試料を、対になった血清エキソソームＤＮＡおよび対応する腫瘍試料を使用して調査した。約１６０ｂｐの推定ライブラリー挿入断片サイズを用いて４×全ゲノム配列網羅度が達成された。ヒトゲノムにマッピングされた読み取りのパーセントはおよそ９６％であった。腫瘍ゲノムＤＮＡとエキソソームゲノムＤＮＡの間の適正に対になった百分率読み取りは約９２％であった。固有の読み取り数としての配列の複雑性は全ての試料において９×１０８を超えた。血清由来のエキソソームの大部分が、核ゲノムＤＮＡと同様に全ての染色体に均一にわたるＤＮＡを含有した（図３Ａおよび３Ｂ）。
【０１５７】
（実施例４）
哺乳動物のエキソソームはタンパク質を産生する
エキソソームが網状赤血球分化の副産物として最初に発見されてから（ＲａｐｏｓｏおよびＳｔｏｏｒｖｏｇｅｌ、２０１３年；Ｈａｒｄｉｎｇら、１９８４年）、エキソソームは、もう使われていないタンパク質の細胞排除の主に不活性な形態であると広範に考えられていた。しかし、まもなく、エキソソームがほとんど全ての哺乳動物細胞から分泌され、ほとんどの体液において実際に見いだされることが明らかになった（Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉら、２０１３年）。エキソソームは、現在、細胞間コミュニケーションにおいて多数の機能を有し、抗原の提示と同程度に多様なプロセス（Ｒａｐｏｓｏら、１９９６年；Ｚｅｅｌｅｎｂｅｒｇら、２００８年）、ＨＩＶおよびマラリアなどの病原体の拡散（ＷｉｌｅｙおよびＧｕｍｍｕｌｕｒｕ、２００６年；Ｒｅｇｅｖ−Ｒｕｄｚｋｉら、２０１３年）、線維症の発症（Ｂｏｒｇｅｓら、２０１３年）、およびおそらくとりわけ、がんの進行および転移（ＫａｈｌｅｒｔおよびＫａｌｌｕｒｉ、２０１３年；Ｓｋｏｇら、２００８年；Ｌｕｇａら、２０１３年；Ｐｅｉｎａｄｏら、２０１２年）に関与することが公知である。それらはそのような幅広い病態に関与するので、エキソソーム生物学および内容物のより深い理解が不可避になっている。結果として、特に、がんの文脈において、いくつかの試験により、エキソソームの核酸またはタンパク質プロファイルが疾患の進行と相関し得ることが実証された（Ｓｋｏｇら、２００８年；Ｓｉｌｖａら、２０１２年；ＴａｙｌｏｒおよびＧｅｒｃｅｌ−Ｔａｙｌｏｒ  ２００８年；Ｊｉら、２０１３年）。結腸直腸がん細胞由来のエキソソームのプロテオミクスクラスタリングを伴うそのような最近のプロファイルの１つにより、タンパク質生合成の数種の構成成分が同定された（Ｃｈｏｉら、２０１２年）。これにより、真核生物開始因子、ＡＤＰリボシル化因子、およびリボソームタンパク質などの、エキソソームにおけるタンパク質翻訳機構の構成成分を同定した以前の質量分析試験が確認される（Ｖａｌａｄｉら、２００７年；Ｐｉｓｉｔｋｕｎら、２００４年）。これにより、ｍＲＮＡおよびそれらの対応するタンパク質が同じエキソソームの内側にパッケージングされて見いだされ得るという観察と同様に、エキソソームが、それらのドナー細胞とは独立して核酸をタンパク質に翻訳することができるという興味深い可能性が生じる。
【０１５８】
エキソソームを、異なるマウスおよびヒト細胞株（正常な線維芽細胞および不死化線維芽細胞、ＨＤＦおよびＮＩＨ  ３Ｔ３；肺上皮細胞、Ｅ１０；非腫瘍形成性ヒト上皮乳房、ＭＣＦ１０Ａ；三重陰性ヒト転移性乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１；およびマウス転移性乳癌（ｍａｍｍａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、４Ｔ１）から、確立された超遠心分離技法（Ｂｏｒｇｅｓら、２０１３年；Ｔｈｅｒｙら、２００６年）を使用して単離した。ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）（Ｓｏｏら、２０１２年）ナノ粒子トラッキング解析により、サイズ分布のピークが直径１０４±１．５ｎｍである粒子が明らかになった（図４Ａ）。エキソソーム抽出物を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によってさらに分析し、それにより、脂質二重層を有し、サイズが５０〜１５０ｎｍである構造が明らかになった（図４Ｂ）。さらに、ＣＤ９抗体を使用した免疫金標識により、エキソソーム表面におけるテトラスパニンの発現が明らかになった（図４Ｃ）。エキソソームの正体を確認するために、エキソソームテトラスパニン表面マーカーＣＤ９の発現を示すフローサイトメトリー分析も実施した（図４Ｄ）。エキソソームタンパク質抽出物の免疫ブロット分析によってＣＤ９マーカー、ＣＤ６３マーカー、およびＴＳＧ１０１マーカーの発現も確認した（図４Ｅ）。
【０１５９】
選択された細胞株から収集されたエキソソームの正体および純度が確認されたので、エキソソーム内のタンパク質翻訳機構の成分の存在を決定した。エキソソームにはｍＲＮＡだけでなく、ｍｉＲＮＡおよびｔＲＮＡ断片を含めた小さな非コードＲＮＡも濃縮されている（Ｎｏｌｔｅ−‘ｔ  Ｈｏｅｎら、２０１２年）。ノーザンブロット分析により、一連の細胞株から収集されたエキソソーム由来のＲＮＡ抽出物におけるメチオニン、セリン、グリシン、バリン、およびロイシンに対するｔＲＮＡの存在を同定した（図５Ａ）。さらに、エキソソームからのタンパク質抽出物の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析により、それらが遊離アミノ酸を含有することが示された（図５Ｂ）。エキソソームがリボソームＲＮＡを含有することが、以前にハイスループット配列決定（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）技法を使用して示されている。エキソソームＲＮＡ抽出物の定量的ＰＣＲ分析を使用してリボソームＲＮＡの存在を確認し、それにより、全てのエキソソームにおいてｒＲＮＡ断片１８ｓおよび２８ｓの存在が示された（図５Ｃ）。エキソソームにおけるリボソームタンパク質の存在が同定された、以前公開されたプロテオミクスデータと共に、これにより、エキソソーム内に機能的なリボソームサブユニットが存在することが示唆される。翻訳が行われるためには、ｍＲＮＡを認識し、翻訳を開始するために真核生物開始因子（ｅＩＦ）が４０ｓリボソームサブユニットおよびメチオニンとカップリングしたｔＲＮＡと複合体を形成する必要がある。ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｅ、およびｅＩＦ４Ｇを含有するｅＩＦ４複合体は、真核生物ｍＲＮＡに存在する５’キャップ構造を認識するので、特に重要である。以前の質量分析試験により、エキソソームにおける異なるｅＩＦの存在が同定された（Ｖａｌａｄｉら、２００７年；Ｐｉｓｉｔｋｕｎら、２００４年）。免疫ブロット分析を使用してエキソソームにおけるｅＩＦ４Ａ１、ｅＩＦ３Ａ、およびｅＩＦ１Ａの発現を確認した（図５Ｄ）。さらに、開始因子ｅＩＦ４ＡおよびｅＩＦ３Ａが免疫共沈降し、それにより、エキソソーム内に開始複合体が存在することが示唆された（図５Ｅ）。総合すると、これらのデータにより、エキソソーム内で活性なタンパク質翻訳が起こり得るという興味深い可能性がもたらされる。
【０１６０】
エキソソームの翻訳能力を決定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳アッセイにおいて、ＭＣＦ１０Ａ由来のエキソソームのタンパク質抽出物およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来のエキソソームのタンパク質抽出物を、哺乳動物細胞では発現しない緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするｍＲＮＡと一緒にインキュベートした。タンパク質抽出物のウエスタンブロット分析により、ＧＦＰのｍＲＮＡと一緒にインキュベートした後にＧＦＰの発現が示され、これにより、タンパク質形成が確認される（図６Ａ）。以前公開された技法（Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉら、２０１２年）を使用して、インタクトなエキソソームにＧＦＰをコードするプラスミドを電気穿孔することにより、インタクトなエキソソームにおける同じ翻訳コンピテンシーを調査した。電気穿孔したエキソソームを、タンパク質合成が起こるのを可能にするために３７℃で４８時間インキュベートした。電気穿孔したエキソソームのＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）粒子トラッキング解析により、以前に記載された同じピーク１００ｎｍが明らかになり、これにより、エキソソーム完全性が電気穿孔プロセスによって損なわれないことが実証される。しかし、４８８ｎｍレーザーを用いた粒子トラッキング解析を使用して、電気穿孔したエキソソームのみが検出され、これにより、ＧＦＰタンパク質の発現が示される。金標識した抗体を用いたエキソソームの電子顕微鏡分析により、電気穿孔したエキソソームにおけるＧＦＰ発現がさらに示された（図６Ｂ）。ウエスタンブロット分析により、電気穿孔したエキソソームにおけるＧＦＰ発現が確認され、タンパク質翻訳阻害剤シクロヘキシミドを使用すると観察されなかった。ドナー細胞からのタンパク質抽出物を再度陽性対照として使用し、ＧＦＰプラスミドを電気穿孔した細胞において観察されたエキソソームにおいて見られたものと同等のサイズのＧＦＰバンドが伴った。新規タンパク質合成の存在を探索するために、ＭＣＦ１０Ａ由来のエキソソームおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来のエキソソームを［３５Ｓ］メチオニンと一緒にインキュベートした。［３５Ｓ］メチオニンの存在下で培養したエキソソームからのタンパク質抽出物のオートラジオグラフィーにより、新しく形成されたタンパク質への当該アミノ酸の組み入れが確認された（図６Ｃ）。［３５Ｓ］メチオニンの組み入れは、タンパク質翻訳の公知の阻害剤であるシクロヘキシミドを添加することにより阻害することができた。陽性対照として、対応するドナー細胞も［３５Ｓ］メチオニンと一緒にインキュベートし、［３５Ｓ］メチオニンの組み入れが示された（図６Ｃ）。さらに、エキソソームに、ホタルルシフェラーゼを５’キャップ依存的様式で発現し、ウミシイタケルシフェラーゼをキャップ非依存的様式で発現するバイシストロン性プラスミドを電気穿孔した。発光分析により、電気穿孔したエキソソームにおけるホタルルシフェラーゼ活性が実証され、これにより、電気穿孔したエキソソームが古典的な真核生物キャップ依存的翻訳の能力を有することが実証される。
【０１６１】
エキソソームの、それらの元の細胞とは独立してタンパク質を新規に合成する能力が実証されたので、次に、これにより、新しく形成された機能的なタンパク質のレシピエント細胞への送達がもたらされ得るかどうかを決定した。予めＧＦＰプラスミドで電気穿孔したエキソソームを、シクロヘキシミドで処理し、したがって、それらの翻訳能力が損なわれた正常なヒト線維芽細胞と一緒にインキュベートした。エキソソームで処理した線維芽細胞を共焦点顕微鏡で観察することにより、細胞を、ＧＦＰを電気穿孔したエキソソームを用いて処理した場合には緑色のシグナルが検出されたが、対照エキソソームを用いた場合には検出されなかった。これにより、エキソソームにおいて新しく合成されたタンパク質をレシピエント細胞に送達することができることが確認された。エキソソームにおいて翻訳されたタンパク質が、レシピエント細胞に送達された際に機能的に活性であることをさらに確認するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いた試験を実施した。この細胞株は、変異体不活性型の腫瘍抑制因子遺伝子ｐ５３を発現することが公知である（Ｇａｒｔｅｌら、２００３年）。ｐ５３は、ＤＮＡ損傷に応答して作用して、ｐ２１の発現を誘導し、それにより、細胞周期の停止を導き得る（ＺｉｌｆｏｕおよびＬｏｗｅ、２００９年）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞由来のエキソソームを、野生型のｐ５３をコードするプラスミドを用いて電気穿孔し、翻訳が起こるのを可能にするために４８時間インキュベートした。電気穿孔したエキソソームをまたドナーＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と一緒にインキュベートすることにより、ｐ２１遺伝子発現の増加がもたらされた（図７）。これにより、エキソソームにおいて新しく翻訳された機能的な形態のｐ５３が細胞に送達されたことが示唆される。したがって、哺乳動物細胞由来のエキソソームは、機能的なタンパク質を翻訳し、それらをレシピエント細胞に送達する能力を有する。
【０１６２】
血小板は、刺激に応答して巨核球分化の後に残ったｍＲＮＡからタンパク質を産生する能力を有する（Ｗｅｙｒｉｃｈら、２００４年）。神経生物学では、シナプス領域に沿って、大きなニューロンの樹状突起棘上にポリリボソームおよびｍＲＮＡ結合性タンパク質を含む小さな翻訳の巣が観察されている（ＳｔｅｗａｒｄおよびＬｅｖｙ、１９８２年；Ｗｅｌｌｓ、２００６年）。したがって、いくつかの生物学的構造は、それらの生物学的機能を支持するために、細胞の遺伝学的中心から離れた獲得生合成能を有する。しかし、これは、細胞外タンパク質翻訳に関する最初で唯一の報告である。これは、エキソソーム内の予想外のレベルの生物活性を示唆する他の最近の観察の結果として生じたものである。ウシ白血病ウイルスに感染したウシ乳由来のエキソソームが、例えば、逆転写酵素活性を有することが最近示された（Ｙａｍａｄａら、２０１３年）。最近のデータにより、がん細胞に由来するエキソソームがｍｉＲＮＡの前駆体からｍｉＲＮＡを生成可能であることがさらに示されている。エキソソーム内でのタンパク質翻訳が存在することの生物学的意義はまだ解明されていない。しかし、細胞がｍＲＮＡをエキソソームに選択的に組み入れることが可能であることが公知である（ＲａｐｏｓｏおよびＳｔｏｏｒｖｏｇｅｌ、２０１３年）。これにより、起源の細胞では発現が抑圧されるｍＲＮＡをエキソソーム内に選択的にパッケージングし、それをタンパク質に翻訳することができるという興味深い可能性が生じる。これには、バイオマーカー評価ならびにエキソソームの治療的利用に関する潜在的意味があり得る。
【０１６３】
（実施例５）
ＧＰＣ１は、がん細胞由来のエキソソーム上の特異的な表面タンパク質である
がん細胞に由来するエキソソームには存在するが、正常細胞に由来するエキソソームには存在しない表面マーカーであるタンパク質マーカーグリピカン１を使用して、がん細胞由来エキソソームを特異的に同定した。がん性および非腫瘍形成性の両方の種々の細胞株に由来するエキソソームに対して質量分析を実施した。グリピカン１タンパク質の存在は、がん細胞由来エキソソームにおいて排他的に認められ、その他では認められなかった（図８Ａ）。免疫ブロット分析を実施し、がん由来のエキソソームでは、グリピカン１タンパク質の発現が示され、非腫瘍形成性細胞由来エキソソームではそれが示されなかった（図８Ｂ）。フローサイトメトリー分析を実施し、がん由来のエキソソームの表面でグリピカン１発現が示された（図８Ｃ）。
【０１６４】
がん細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、三重陰性ヒト転移性乳癌）、線維芽細胞（ＨＤＦ、ヒト皮膚線維芽細胞；ＮＩＨ／３Ｔ３、マウス胚線維芽細胞）、および非腫瘍形成性上皮細胞（ＭＣＦ  １０Ａ、ヒト乳房上皮細胞；Ｅ１０、マウス肺上皮細胞）由来のエキソソームを、確立された超遠心分離法（Ｌｕｇａら、２０１２年；Ｔｈｅｒｙら、２００６年）を使用して単離した。収集したエキソソームをＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）ナノ粒子トラッキング解析および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって分析し、これにより、それぞれ１０５±５ｎｍおよび１１２±４ｎｍの範囲の直径が明らかになった（図１４Ａ〜Ｂ）（Ｔｈｅｒｙら、２００２年）。エキソソーム純度を、免疫金標識およびＴＥＭによるＣＤ９の検出（図１４Ｃ）、フロチリン１およびＣＤ８１についてはウエスタンブロット分析（図１４Ｄ）を使用して評価した（Ｔｈｅｒｙら、２００２年）。超高速液体クロマトグラフィー−質量分析（ＵＰＬＣ−ＭＳ）を使用してエキソソームプロテオームを評価した（Ｗｉｌｓｏｎら、２００５年）。全ての細胞型（ＨＤＦ、ＮＩＨ／３Ｔ３、Ｅ１０、ＭＣＦ  １０Ａ、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１）由来の全てのエキソソームにおいて、エキソソームマーカーＴＳＧ１０１、ＣＤ９、およびＣＤ６３（各エキソソーム型におけるタンパク質の総数は、ＨＤＦ＝２６１、ＮＩＨ／３Ｔ３＝１７１、Ｅ１０＝２３２、ＭＣＦ  １０Ａ＝２１４、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１＝２４２であった）を含めた、合計１１２０種のタンパク質が見いだされた。Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ分析により、４８種のタンパク質（２５種の細胞質タンパク質、７種の核内タンパク質、５種の膜貫通タンパク質、１種の膜アンカータンパク質、および７種分泌タンパク質）ががん細胞由来エキソソーム（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１；表１）に排他的に存在することが明らかになった。これらの中で、グリピカン−１（ＧＰＣ１）は、唯一の膜アンカータンパク質として現れ、これはまた、乳がんおよび膵がんを含めた様々ながんにおいて過剰発現すると報告されている（表１）（Ｍａｔｓｕｄａら、２００１年；Ｋｌｅｅｆｆら、１９９８年；Ｓｕら、２００６年）。ＧＰＣ１発現は、いくつかの乳がん細胞株および膵がん細胞株において、非腫瘍形成性細胞と比較して上昇した（図１４Ｅ〜Ｆ）。非腫瘍形成性細胞株に由来するエキソソームとは対照的に、ＧＰＣ１タンパク質は、免疫ブロット分析によってがん細胞由来エキソソームにおいてのみ検出された（図１４Ｇ）。さらに、免疫金ＴＥＭにより、ＧＰＣ１＋エキソソームはがんエキソソーム（Ｔ３Ｍ４膵がん株）では検出されたが、非がんエキソソームでは検出されなかった（ＨＭＬＥ；図９Ａ）。アルデヒド／硫酸塩ビーズとカップリングしたエキソソームのＦＡＣＳ分析を使用して、エキソソームの表面にＧＰＣ１タンパク質が検出された（図９Ｂ）。免疫金およびＴＥＭにより、ビーズの表面にＧＰＣ１発現を伴うがんエキソソームが示されたが、非腫瘍形成性エキソソームではＧＰＣ１発現は示されなかった（図９Ｃ）。さらに、細胞株からスクロース勾配を使用して得られたエキソソームでは、ＧＰＣ１発現はがんエキソソームでは同定されたが、非腫瘍形成性細胞株��由来するエキソソームでは同定されなかった（図９Ｂ〜Ｄおよび図１４Ｈ）。異なるエキソソーム精製方法により、ＧＰＣ１が、多様ながん細胞株から単離されたがんエキソソームに特異的に存在することが確認された（図９Ｅ）。
【０１６５】
【表１−１】
2019198327.tif 000004
【０１６６】
【表１−２】
2019198327.tif 000005
腫瘍を有するマウスの体循環からＧＰＣ１＋エキソソームを単離することができるかどうかを決定するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳がん細胞をヌードマウスの乳房脂肪パッドに埋め込んだ。マウスから、がん細胞を接種する前に採血し、腫瘍の平均体積が３００ｍｍ３、５５０ｍｍ３、１０００ｍｍ３、および１３５０ｍｍ３に達した時に繰り返して採血し、循環エキソソーム（ｃｒＥｘｏｓ）をＧＰＣ１の存在について評価した（図１０Ａ）。ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの相対的な百分率は腫瘍の成長に比例して上昇し、腫瘍量と相関した（図１０Ｂ〜Ｃ；ｒ＝０．９８、Ｐ＝０．００４）。がん細胞起源のＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓをさらに確認するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、確立されたエキソソームのマーカーであるＣＤ６３のプロモーターの下でＧＦＰが安定に発現されるように操作した（Ｔｈｅｒｙら、２００６年）。培養物中でこれらの細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＣＤ６３ＧＦＰ）から分泌されるがんエキソソームはＧＦＰについて陽性であった（図１０Ｄ）。ヌードマウスへのＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＣＤ６３ＧＦＰ細胞の同所性埋め込み後、腫瘍のサイズが約１５００ｍｍ３であるマウスからｃｒＥｘｏｓを採取した。ｃｒＥｘｏｓの選択された集団は、ＧＦＰ＋であることが見いだされ（図１０Ｅ）、また、ＧＰＣ１はＧＦＰ−ｃｒＥｘｏｓでは検出されなかったので、がん細胞特異的ＧＦＰ＋ｃｒＥｘｏｓのみがＧＰＣ１について陽性であった（図１０Ｆ）。
【０１６７】
（実施例６）
ＧＰＣ１＋エキソソームはがんの存在に対するバイオマーカーである
がん細胞株に由来するエキソソームおよび腫瘍を有するマウス由来の循環エキソソームは、ＧＰＣ１について１００％陽性であった（図９Ｄおよび図１０Ｆ）。次に、ｃｒＥｘｏｓを、乳がんを有する患者（ｎ＝３２）、膵管腺癌を有する患者（ＰＤＡＣ、ｎ＝１９０）、および健康なドナー（ｎ＝１００）（患者データは表２に示されている）から単離した。超遠心分離によって血清から精製したｃｒＥｘｏｓのＴＥＭ分析により、脂質二重層ならびにＣＤ９陽性が明らかになった（図１１Ａ〜Ｂ）。スクロース勾配単離によって精製したｃｒＥｘｏｓでもエキソソームマーカーフロチリン１の発現が示された（図１５Ａ）（Ｔｈｅｒｙら、２００２年；Ｔｈｅｒｙら、２００６年）。興味深いことに、ｃｒＥｘｏｓの相対的な濃度は、がん患者の血清において健康な個体と比較して有意に高く（図１５Ｂ）、また、ＰＤＡＣ  ｃｒＥｘｏｓの平均サイズは、他のｃｒＥｘｏｓの全て（乳がん患者および健康なドナー、図１５Ｃ）と比較して有意に小さかった。健康な個体由来の血清の分析により、ｃｒＥｘｏｓにおけるＧＰＣ１についての０．３％から４．７％までにわたる（平均２．３％）ベースライン陽性が明らかになった。乳がん患者３２名のうち２４名（７５％）では、ｃｒＥｘｏｓ  ＧＰＣ１＋レベルが健康な個体で認められるベースラインレベルに勝ることが実証された（Ｐ＜０．０００１；図１５Ｃ）。対照的に、１９０のＰＤＡＣ  ｃｒＥｘｏｓでは全て、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのレベルが健康な個体のレベルを勝ることが示された（Ｐ＜０．０００１；図１５Ｃ）。これらの結果により、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓと、がん、特にＰＤＡＣの強力な相関が示される。
【０１６８】
【表２−１】
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【０１６９】
【表２−２】
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（実施例７）
ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓは、発がん性ＫＲＡＳＧ１２ＤをコードするｍＲＮＡを特異的に含有する
エキソソームは、ＤＮＡおよびＲＮＡを含有し得る（ＫａｈｌｅｒｔおよびＫａｌｌｕｒｉ、２０１３年）。ＫＲＡＳは、膵がんにおいて頻繁に変異する遺伝子であり、変異した転写物が循環中に見いだされている（Ｓｋｏｇら、２００８年；Ｍｏｒｒｉｓら、２０１０年；Ｃｈｅｎら、２０１３年）。ＰＤＡＣを有する患者４７名からの原発性腫瘍試料について配列決定して、発がん性ＫＲＡＳの状態を評価した。１６個のＰＤＡＣ腫瘍が野生型ＫＲＡＳ対立遺伝子のみを含有し、１４個のＰＤＡＣ腫瘍がＧ１２Ｄ変異した対立遺伝子を有し、１１個のＰＤＡＣ腫瘍がＧ１２Ｖ変異した対立遺伝子を有し、５個のＰＤＡＣ腫瘍がＧ１２Ｒ変異した対立遺伝子を有し、そして１個のＰＤＡＣ腫瘍がＧ１２Ｖ／Ｃ変異を含有した（図１１Ｄ）。十分な量の対応する血清がＫＲＡＳＧ１２Ｄ変異を有する患者１０名およびＫＲＡＳＧ１２Ｖ変異を有する患者５名から入手可能であった。これらの患者由来のＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓおよびＧＰＣ１−ｃｒＥｘｏｓを、免疫金ＴＥＭに供して特異的なＧＰＣ１発現を確認した（図１１Ｅ）。発がん性ＫＲＡＳ変異が検証された腫瘍を有するＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ１５個全てで、特異的なプライマーを使用したエキソソームｍＲＮＡのｑＰＣＲ分析により、同一の変異が明らかになった（図１１Ｆ）。野生型ＫＲＡＳ  ｍＲＮＡはＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓおよびＧＰＣ１−ｃｒＥｘｏｓのどちらにおいても見いだされた（図１１Ｆ）。
【０１７０】
（実施例８）
ＧＰＣ１＋循環エキソソームにより初期膵がんが検出される
組織学的に検証された膵がん前駆病変（ＰＣＰＬ）を有する患者７名からの血清、および組織学的に検証された良性膵疾患（ＢＰＤ）を有する患者２６名からの血清のさらなる分析から、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのレベルにより、ＰＣＰＬを有する患者を健康な個体およびＢＰＤを有する患者と区別できることが示された（図１１Ｇ）。具体的には、ＰＣＰＬ群（ＰａＮＩＮ、ｎ＝２；ＩＰＭＮ、ｎ＝５）のＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓは常に健康なドナー群よりも高く（Ｐ＝０．００６１）、同様に、ＢＰＤ群（慢性膵炎を有する患者１８名および嚢胞性腺腫を有する８名を含む；図１１Ｇ）におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓよりも有意に高い。ＢＰＤ群では、健康なドナーと比較して同様のＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓレベル（平均２．１％のＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ）が示された（図１１Ｇ）。
【０１７１】
ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの特異度および感度を、膵臓腺癌を有する患者に対する腫瘍マーカーとして現在使用されている循環タンパク質であるＣＡ  １９−９と比較した（Ｄｅｌ  Ｖｉｌｌａｎｏら、１９８３年）。ＣＡ  １９−９レベルはＰＤＡＣを有する患者の血清において健康なドナーと比較して上昇したが、ＣＡ１９−９レベルは良性膵疾患を有する患者の血清においても有意に上昇した（Ｐ＜０．０００１；図１１Ｈ）。重要なことに、ＣＡ  １９−９血清レベルでは、ＰＣＰＬを有する患者を健康なドナーと区別することはできなかった（図１１Ｈ）。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線から、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓにより、膵がんＩ期〜ＩＶ期を有する患者と健康なドナーおよび良性膵疾患を有する患者を比較した場合にＡＵＣが１．０（９５％ＣＩ：０．９８８〜１．０）、感度が１００％（９５％ＣＩ：９８．１〜１００％）、特異度が１００％（９５％ＣＩ：９７．１〜１００％）、陽性的中度が１００％（９５％ＣＩ：９８．１〜１００％）、および陰性的中度が１００％（９５％：８６．８〜１００％；図１１Ｉ）である、ほぼ完全な分類子が明らかになることが示された（図１１Ｉおよび１６Ａ〜Ｅ；表３〜８）。対照的に、ＣＡ  １９−９は、膵がんを有する患者と健康な対照の区別では劣る（ＡＵＣが０．７３９、９５％ＣＩ：７０．２〜８２．６％、ｐ＜０．００１；図１１Ｉおよび１６Ａ〜Ｅ；表３〜８）。注目すべきことに、エキソソームの濃度もエキソソームのサイズも、膵がんを有する患者を対照と比較して層別化するための有効なパラメータではなかった（図１１Ｇ、１１Ｉ、および１６Ａ〜Ｅ；表３〜８）。ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓは膵がんの各病期（上皮内癌、Ｉ期ならびにＩＩ〜ＩＶ期）において１００％の感度および特異度を示し、これにより、膵がん進行の全ての病期におけるその有用性が裏付けられ、膵がんの早期検出におけるその潜在的役割が強調される。
【０１７２】
【表３】
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【０１７３】
【表４】
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【０１７４】
【表５】
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【０１７５】
【表６】
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【０１７６】
【表７】
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【０１７７】
【表８】
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（実施例９）
ＧＰＣ１＋循環エキソソームにより膵がん負荷量についての情報が得られる
ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓレベルは、マウスにおける腫瘍量と相関した（図１０Ｂ〜Ｃ）。したがって、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓレベルにより、ＰＤＡＣを有する患者の転移性疾患負荷量についての情報が得られるかどうかを評価した。遠隔転移性疾患を有するＰＤＡＣ患者のＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓでは、リンパ節に限定された転移性疾患を有する患者（平均５０．５％）または転移が分かっていない患者（平均３９．９％；図１７Ａ）と比較して有意に高い百分率のＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ（平均５８．５％）が示された。さらに、外科手術前の段階および外科手術後の段階（手術後７日目；ＰＤＡＣ、ｎ＝２９、ＰＣＰＬ、ｎ＝４、およびＢＰＤ、ｎ＝４；図１２Ａ）のＰＤＡＣ患者の血清におけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓを評価した。縦断的血液採取を受けたＰＤＡＣ患者２９名のうち２８名およびＰＣＰＬ患者全員で、外科的切除後にＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓレベルの有意な低下が示された（ＰＤＡＣ：Ｐ＜０．０００１；ＰＣＰＬ：ｐ＜０．００１；図１２Ｂ）。対照的に、ＣＡ  １９−９レベルは、ＰＤＡＣ患者２９名のうち１９名においてのみ低下し、ＰＣＰＬ患者では低下しなかった（ＰＤＡＣ：Ｐ＝０．００３；ＰＣＰＬ：Ｐ＝０．８１；図１７Ｂ）。ＢＰＤ患者では、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓおよびＣＡ  １９−９のどちらにも切除前と切除後で差異は示されなかった（図１２Ｂおよび１７Ｂ）。
【０１７８】
縦断的試験コホートにおけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの予後の関連性を決定するために、患者を２つの群に分けた。群１は、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの減少がＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの中央値の減少よりも大きいまたはそれと同等であること（≧）によって定義され、群２は、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの減少がＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの中央値の減少よりも小さいこと（＜）によって定義された。群１では、群２（全生存および疾患特異的生存のどちらも１５．５カ月）と比較して全生存（２６．２カ月）および疾患特異的生存（２７．７カ月）の改善が示され、これにより、外科手術後のＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの減少が大きいことが生存の増大に関連することが示される（図１２Ｃ〜Ｄ）。ＣＡ  １９−９レベルの低下は切除前の採血と切除後の採血を比較した場合に認められるが、この低下は、全生存および疾患特異的生存と有意には関連しない（図１２Ｅ〜Ｆおよび１７Ｂ）。ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの降下、年齢の中央値、ＡＪＣＣ病期、腫瘍悪性度、およびＣＡ  １９−９レベルを含めるための多変量検定についてコックス回帰モデルを使用して、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのみが、疾患特異的生存に対する独立した予後および予測マーカーであることが明らかになった（ハザード比：８．２３、ＣＩ：２．３７〜２８．５４、Ｐ＝０．００１；表９および１０）。
【０１７９】
【表９】
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【０１８０】
【表１０】
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（実施例１０）
ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓを使用して初期ＰａｎＩＮ病変を検出することができる
膵がんにおけるＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの特異度が高く感度の高い検出を踏まえて、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓ出現の時間経過を血清において膵腫瘍量に対して評価した。この目的のために、ＰＤＡＣについて遺伝子操作したマウスモデル（ＧＥＭＭ）を使用した。Ｐｔｆ１ａｃｒｅ／＋；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｔｇｆｂｒ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス（ＰＫＴマウス）（Ｏｚｄｅｍｉｒら、２０１４年）では、ヒト疾患の臨床的特徴および病理組織学的特徴が確実に再現される、完全な浸透度を伴うＰＤＡＣが発生する（Ｏｄｅｍｉｒら、２０１４年；Ｉｊｉｃｈｉら、２００６年）。このマウスは、４．５週齢で膵上皮内腫瘍（ＰａｎＩＮ）から一貫して進行し、８週齢でＰＤＡＣにより死亡する（Ｏｄｅｍｉｒら、２０１４年；Ｉｊｉｃｈｉら、２００６年）。縦断的試験において、ＰＫＴおよび同腹仔対照マウスから４週齢、５週齢、６週齢、７週齢、および８週齢の時点で繰り返し採血した（ｎ＝７のＰＫＴマウスおよびｎ＝６の対照マウス；図１３Ａ）。ＰＫＴマウス７匹のうち３匹を、対照６匹のうち４匹と共に、第７週までに安楽死させ、ＰＫＴマウス３匹および対照２匹は第８週に安楽死させた。４週齢の時点で、ＰＫＴマウスでは平均８．４％のＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓが示され、これは時間（および腫瘍量）に比例して上昇したが、対照マウスでは平均１．２％のＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓが示され、このレベルは時間と共に一定に保たれた（図１３Ｂおよび１８Ａ〜Ｂ）。ＰＤＡＣの評価に使用される確立されたイメージングモダリティである磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）（ＬｅｅおよびＬｅｅ、２０１４年）を、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓを測定するためにマウスの採血を行ったのと同時点で（例えば、４週、５週、６週、および７週に）実施した。群として評価すると、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓレベルは、ＭＲＩにより検出可能な膵臓腫瘤よりも前に現れた（図１３Ｃおよび１８Ｃ）。ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓのサイズおよび濃度は、膵がんと最小限にしか相関せず（図１８Ａ〜Ｂ）、一方、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓレベルは、ＭＲＩにより決定された腫瘍体積と相関し、腫瘍の成長に先立つようだった（ピアソン相関検定、ｒ＝０．６７、Ｐ＝０．０００５、９５％ＣＩ：０．３５０４〜０．８４６２；図１３Ｃおよび１８Ｃ）。重要なことに、セルレインにより誘導された急性膵炎を有するマウスにおいてＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの上昇は認められず、これにより、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓの上昇が膵がん特異的なものであることが裏付けられる（図１８Ｄ）。ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓについてのＲＯＣ曲線分析により、評価した全ての年齢において、健康な同腹仔対照マウスと比較して、ＰＫＴマウスにおいて１．０のＡＵＣ（９５％ＣＩ：０．７５〜１．０）が示された（図１３Ｄおよび表１１〜１２）。
【０１８１】
【表１１】
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【０１８２】
【表１２】
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１６日齢および２０日齢ほどの早期のＰＫＴマウスにおける腫瘍量およびＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓをアッセイするために横断的試験も開始した（図１３Ｅ）。マウスをＭＲＩにより画像化し、採血し、マウスが前ＰａｎＩＮ〜初期ＰａｎＩＮ病変を示した、これらの早期時点で安楽死させた（図１３Ｅ）。全てのＰＫＴマウスでＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓが検出された（ＰＫＴ：平均８．３％、対照：平均１．８％；図１３Ｆ）。ＰＫＴマウスの組織学的分析により、ＰＫＴマウス７匹のうち３匹において前ＰａｎＩＮ病変が確認され、それにもかかわらず、ＰＫＴマウス７匹のうち４匹では組織学的病変は観察されず、ＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓにより将来の膵がん出現が予測された（図１３Ｇ）。さらに、１６日齢および２０日齢のＰＫＴマウスにおいてＭＲＩによって膵臓関連腫瘤は観察されなかった。注目すべきことに、組織学的病変が観察されなかったＰＫＴマウス７匹のうち４匹では、リン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）などのＫｒａｓ活性化のための下流のシグナルが膵臓組織において検出された（図１３Ｇ）。ＧＰＣ１−ｃｒＥｘｏｓと比較してＧＰＣ１＋ｃｒＥｘｏｓにおける変異体ＫＲＡＳＧ１２ＤｍＲＮＡの排他的な検出も観察された（図１９）。
【０１８３】
本明細書において開示され、特許請求されている方法は全て、本開示に照らして、過度な実験を伴わずに作製し実行することができる。本発明の組成物および方法は好ましい実施形態に関して記載されているが、本発明の概念、主旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法および方法のステップまたは一連のステップに変形を適用することができることが当業者には明らかになろう。より詳細には、化学的にかつ生理的に関連するある特定の薬剤で本明細書に記載されている薬剤を置換することができるが、同じまたは同様の結果が達成されることが明らかになろう。当業者に対して明らかであるそのような同様の置換および改変は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の主旨、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
【０１８４】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載されている事項を補足する例示的な手続き上のまたは他の詳細をもたらす範囲で、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
【０１８５】
【化３】
2019198327.tif 000018
【０１８６】
【化４】
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【０１８７】
【化５】
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【０１８８】
【化６】
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【０１８９】
【化７】
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【０１９０】
【化８】
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【０１９１】
【化９】
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【０１９２】
【化１０】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2019198327.tif 000027
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
2019198327.tif 000029
【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２−１】
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【図２−２】
2019198327.tif 000033
【図２−３】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
2019198327.tif 000040
【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【配列表】
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