(57)【要約】【課題】  真菌感染を処置するための、ならびに、真菌感染によって生じる疼痛および／または痒みを処置するため、ならびに／あるいは、真菌感染を処置するための、方法および薬学的組成物を提供する。【解決手段】  真菌感染によって生じる疼痛および／または痒みならびに／あるいは真菌感染自体を処置するための、ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物を含む薬学的組成物が提供される。真菌感染によって生じる疼痛および／または痒みならびに／あるいは真菌感染自体を処置するための医薬の製造における、ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物の使用が提供される。ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物を投与する工程を包含する、真菌感染によって生じる疼痛および／または痒みならびに／あるいは真菌感染自体を処置する方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
真菌感染によって生じる疼痛および／または痒みを処置するための、ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物を含む薬学的組成物。
【請求項２】
真菌感染を処置するための薬学的組成物であって、ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物および抗真菌剤を含む薬学的組成物。
【請求項３】
真菌感染を処置するための組合わせ医薬であって、ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物および抗真菌剤を含む組合わせ医薬。
【請求項４】
前記抗真菌剤が、ミコナゾール、クロトリアゾール、エコナゾール硝酸塩、イソコナゾール硝酸塩、ビホナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール、テルビナフィン塩酸塩、トルナフタート、および、リラナフタートからなる群から選択される、請求項２に記載の薬学的組成物または請求項３に記載の組合わせ医薬。
【請求項５】
前記ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物は、ＶＮＵＴによるＡＴＰの取り込みを阻害する効果を有する化合物、ＶＮＵＴによって小胞内に蓄積されたＡＴＰの細胞外への放出を阻害する効果を有する化合物、ＶＮＵＴとＣｌ−との結合を阻害するアロステリック薬物、ＶＮＵＴと結合しＶＮＵＴとＡＴＰとの結合を阻害するＡＴＰアナログ、およびＶＮＵＴの発現を特異的に抑制する化合物からなる群から選択される化合物である、請求項１または２に記載の薬学的組成物あるいは請求項３に記載の組合わせ医薬。
【請求項６】
前記ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物は、
（Ｉ）
以下の式１
【化１０１】
2019014684.tif 000017
で示される化合物であり、
ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ３、および、ＣＨ２ＯＨからなる群から選択され、Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、および、Ｒ４からなる群から選択され、ここで、Ｒ４は
【化１０２】
2019014684.tif 000018
であり、ここで、
【化１０３】
2019014684.tif 000019
は単結合が３つ、または、単結合が２つと二重結合が１つであり、かつ、ＮがＮ＋であり；Ｌは結合またはＣ１−４アルキレンまたはＣ１−４置換アルキレンまたはＣ１−４アルケニレンであり；Ｒ４１は、Ｈ、Ｃ１−４アルキレン、Ｃ１−４置換アルキレン、Ｃ１−４アルケニレンおよびＣ１−４置換アルケニレンからなる群から選択され、−ＣＨ＝が存在する場合その半数以下が−Ｎ＝で置換されていてもよく、Ｒ４２またはＲ４３と５員環を形成してもよく；Ｒ４２およびＲ４３は、Ｃ１−７アルキレン、Ｃ１−７置換アルキレン、Ｃ１−７アルケニレンおよびＣ１−７置換アルケニレンからなる群から独立して選択され、−ＣＨ＝が存在する場合その半数以下が−Ｎ＝で置換されていてもよく、Ｒ４２とＲ４３とは６員環を形成してもよく；
Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ３、および、ＣＨ２ＯＨからなる群より独立して選択される、化合物であるか；あるいは、
（ＩＩ）
以下の式２
【化１１１】
2019014684.tif 000020
で示される化合物であり、
ここで、ｎは０または１であり、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、および、ＣＨ３、ならびに、一緒になって、Ｏからなる群から選択され、
ここで、Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、および、ＣＨ２ＯＨからなる群から選択され、ただし、Ｒ３がＨである場合、Ｒ１およびＲ２は一緒になってＯであり、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の少なくとも１つは酸素原子を含む化合物であるか；
（ＩＩＩ）
Ｕ−７３１２２（Ｓｉｇｍａ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．Ｕ６７５６）であるか；
あるいは上記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の化合物の誘導体であり、ここで、該化合物の誘導体は、該化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、エステル、代謝産物、保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、またはアセチル化誘導体である、請求項１または２に記載の薬学的組成物あるいは請求項３に記載の組合わせ医薬。
【請求項７】
前記ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物がアセトアセテート、３−ヒドロキシ酪酸、グリオキシル酸、クロドロン酸、メドロン酸、ミノドロン酸、イバンドロン酸、ジフルオロメチレン２リン酸、メチレンビスフォスフォ２リン酸、Ｕ−７３１２２、あるいは、その薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、エステル、代謝産物、保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、またはアセチル化誘導体である、請求項１または２に記載の薬学的組成物あるいは請求項３に記載の組合わせ医薬。
【請求項８】
前記ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物がＶＮＵＴ遺伝子発現阻害剤である、請求項１または２に記載の薬学的組成物あるいは請求項３に記載の組合わせ医薬。
【請求項９】
内服剤、注射剤、軟膏、および、スプレーからなる群から選択される、請求項１または２に記載の薬学的組成物あるいは請求項３に記載の組合わせ医薬。
【請求項１０】
請求項７に記載の薬学的組成物または組合わせ医薬であって、被験体の体重１ｋｇあたり０．００１〜１０ｍｇの用量のクロドロン酸、あるいは、その薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、エステル、代謝産物、保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、またはアセチル化誘導体を含む、薬学的組成物あるいは組合わせ医薬。
【請求項１１】
さらに、副腎皮質ステロイドを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の薬学的組成物あるいは組合わせ医薬。
【請求項１２】
前記副腎皮質ステロイドが、クロベタゾールプロピオン酸エステル、ジフロラゾン酢酸エステル、ベタメタゾンジプロピオン酸エステル、ジフルプレドナート、および、フルオシノニドからなる群から選択される、請求項１１に記載の薬学的組成物あるいは組合わせ医薬。
【請求項１３】
真菌感染によって生じる疼痛および／または痒みを処置するための医薬の製造、あるいは、真菌感染を処置するための医薬の製造における、ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物の使用。
【請求項１４】
前記ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物は、ＶＮＵＴによるＡＴＰの取り込みを阻害する効果を有する化合物、およびＶＮＵＴによって小胞内に蓄積されたＡＴＰの細胞外への放出を阻害する効果を有する化合物、ＶＮＵＴとＣｌ−との結合を阻害するアロステリック薬物、ＶＮＵＴと結合しＶＮＵＴとＡＴＰとの結合を阻害するＡＴＰアナログ、およびＶＮＵＴの発現を特異的に抑制する化合物からなる群から選択される化合物である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物は、
（Ｉ）
以下の式１
【化１２１】
2019014684.tif 000021
で示される化合物であり、
ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ３、および、ＣＨ２ＯＨからなる群から選択され、Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、および、Ｒ４からなる群から選択され、ここで、Ｒ４は
【化１２２】
2019014684.tif 000022
であり、ここで、
【化１２３】
2019014684.tif 000023
は単結合が３つ、または、単結合が２つと二重結合が１つであり、かつ、ＮがＮ＋であり；Ｌは結合またはＣ１−４アルキレンまたはＣ１−４置換アルキレンまたはＣ１−４アルケニレンであり；Ｒ４１は、Ｈ、Ｃ１−４アルキレン、Ｃ１−４置換アルキレン、Ｃ１−４アルケニレンおよびＣ１−４置換アルケニレンからなる群から選択され、−ＣＨ＝が存在する場合その半数以下が−Ｎ＝で置換されていてもよく、Ｒ４２またはＲ４３と５員環を形成してもよく；Ｒ４２およびＲ４３は、Ｃ１−７アルキレン、Ｃ１−７置換アルキレン、Ｃ１−７アルケニレンおよびＣ１−７置換アルケニレンからなる群から独立して選択され、−ＣＨ＝が存在する場合その半数以下が−Ｎ＝で置換されていてもよく、Ｒ４２とＲ４３とは６員環を形成してもよく；
Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ３、および、ＣＨ２ＯＨからなる群より独立して選択される、化合物であるか；あるいは、
（ＩＩ）
以下の式２
【化１３１】
2019014684.tif 000024
で示される化合物であり、
ここで、ｎは０または１であり、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、および、ＣＨ３、ならびに、一緒になって、Ｏからなる群から選択され、
ここで、Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、および、ＣＨ２ＯＨからなる群から選択され、ただし、Ｒ３がＨである場合、Ｒ１およびＲ２は一緒になってＯであり、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の少なくとも１つは酸素原子を含む化合物であるか；
（ＩＩＩ）
Ｕ−７３１２２（Ｓｉｇｍａ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．Ｕ６７５６）であるか；
あるいは上記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の誘導体であり、ここで、該化合物の誘導体は、該化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、エステル、代謝産物、保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、またはアセチル化誘導体である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
前記ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物がアセトアセテート、３−ヒドロキシ酪酸、グリオキシル酸、クロドロン酸、メドロン酸、ミノドロン酸、イバンドロン酸、ジフルオロメチレン２リン酸、メチレンビスフォスフォ２リン酸、Ｕ−７３１２２、あるいは、その薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、エステル、代謝産物、保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、またはアセチル化誘導体である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１７】
前記ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物がＶＮＵＴ遺伝子発現阻害剤である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１８】
前記医薬が抗真菌剤をさらに含む、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
前記抗真菌剤が、ミコナゾール、クロトリアゾール、エコナゾール硝酸塩、イソコナゾール硝酸塩、ビホナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール、テルビナフィン塩酸塩、トルナフタート、および、リラナフタートからなる群から選択される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記医薬が副腎皮質ステロイドをさらに含む、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
前記副腎皮質ステロイドが、クロベタゾールプロピオン酸エステル、ジフロラゾン酢酸エステル、ベタメタゾンジプロピオン酸エステル、ジフルプレドナート、および、フルオシノニドからなる群から選択される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物を投与する工程を包含する、真菌感染を処置する方法。
【請求項２３】
披検物質が、ＶＮＵＴ阻害活性を有するか否かを評価する工程を含む、真菌感染によって生じる疼痛および／または痒みを処置する化学物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真菌感染の治療薬、特に真菌感染における宿主応答、例えば、疼痛や痒みを抑制する治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌感染症とは原因となる真菌が様々な原因で動物の組織内に定着し増殖することに起因する感染症であり、カンジタ症、白癬など多様な疾病が知られている。未曾有の高齢化に不随した整形外科的手術件数の増大や免疫不全・抗癌剤投与の増加に伴って、これまで遭遇することが比較的稀であった皮膚粘膜の真菌感染や真菌性骨髄炎がにわかに顕在化してきた。臨床的に問題となる真菌の大半はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓであり、低病原性の酵母型真菌が菌糸型に変化して皮膚粘膜表層から深部組織へ浸潤を開始すると、かゆみや痛みを伴った炎症が惹起される。たとえば、抗癌剤投与中の高齢者にみられる口腔／食道カンジダ症は著名な口腔粘膜痛や嚥下痛を伴い、患者ＱＯＬを著しく低下させる原因となっている。また、女性の２５％が生涯のうち一度は罹患するとされるカンジダ膣炎はおりものを伴った痒みや性交痛をもたらす。ことほど左様にＣ．ａｌｂｉｃａｎｓは不快な感覚を我々にもたらす真菌であるにもかかわらず、これらの症状を緩和するための薬剤は存在しない。その治療は、アズール系抗真菌薬、ポリエン系抗生物質等抗真菌薬を外用、または内服ないし注射薬として用い、真菌の生育を阻害することが主体である。一方、カンジタ膣症等に代表されるように感染により感染の進行に伴う宿主応答の結果、患部に堪え難い疼痛やかゆみが発生することが多く、その対応は大きな問題となっている。
【０００３】
かゆみや痛みをひきおこす白癬菌やカンジダの表在感染に対する一般的な治療としては、アゾール系抗真菌薬の外用が選択される。アゾール系抗真菌薬にはイミダゾール系とトリアゾール系が存在するが、本邦ではイミダゾール系が外用薬として処方可能であり、１日1回の塗布で効果を発揮する優れた薬剤も登場してきている。また、カンジダ膣錠としてはイミダゾール系のクロトリマゾールの選択が一般的である。内服療法としてはトリアゾール系のイトラコナゾールが汎用されており、表在性/深在性真菌症や内臓真菌症への適応が認められている。トリアゾール系のフルコナゾールは深在性真菌症やカンジダ膣炎に対する内服薬として一般的であり、イトラコナゾールより腸管吸収がよいとされる。また、免疫不全患者に頻発する口腔内カンジダ症に対してはポリエンマクロライド系抗生物質であるアムホテリシンBを配合するシロップが汎用される(非特許文献１)。いずれの薬剤も数週間から半年にわたる長期の連用が必要であり、その間の感染に随伴する不快感を取り除くための具体的な工夫はなされていないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】日本皮膚科学会 皮膚真菌症診断・治療ガイドライン、日皮会誌：１１９（５），８５１−８６２，２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
以上の経緯により、真菌感染の治療薬、特に真菌感染における宿主応答、例えば、疼痛や痒みを抑制する治療薬が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、痛覚神経に真菌受容体であるＤｅｃｔｉｎ−１が発現していることを見出し（Ｍａｒｕｙａｍａら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  印刷中）、この受容体がＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ感染の際の疼痛センサーとして働いていることを見出した（Ｍａｒｕｙａｍａら、論文投稿中）。また、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞壁の主要な構成成分であるβ−ｇｌｕｃａｎは、クロロキン誘発性の掻痒を著名に増幅するという現象を見出した。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの皮膚感染は疼痛閾値の減弱（アロディニア）をもたらすが、本発明者らは、ＡＴＰ分泌小胞の形成に不可欠であるＡＴＰトランスポーターＶＮＵＴのノックアウトマウスにおいてＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ誘発性アロディニアが消失することを見出した（Ｍａｒｕｙａｍａら、論文投稿中）。以上より、Ｄｅｃｔｉｎ−１やＶＮＵＴは真菌感染随伴症状の発現に深くかかわっていると考えられる。
【０００７】
発明者らはカンジタ症に伴う疼痛の発生機構を解明し、本発明を完成した。すなわち、発明者らはカンジタ症に伴う疼痛はカンジタの感染を皮膚ケラチノサイトが関知しプリン作動性化学伝達を惹起させ感覚神経を興奮させることにより発生することを発見した。ケラチノサイトから惹起されるプリン作動性化学伝達は小胞型ヌクレオチドトランスポーター（ＶＮＵＴ）によるＡＴＰの開口放出であるため、この過程を阻害すれば、疼痛等の感覚の発生を抑えることができるものと考えた。そこで、発明者らは、ＣＳＢＧ（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来の可溶性β−ｇｌｕｃａｎ）をマウスに注入し疼痛を発生せしめ、ＶＮＵＴの特異的阻害剤クロドロン酸を静注し、その効果を調べたところ明確な鎮痛効果を認め、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、真菌感染の治療薬、より具体的には、真菌感染によって生じる疼痛および／または痒みの治療薬を提供する。
【０００９】
本発明はまた、以下を提供する。
（項目１）
真菌感染によって生じる疼痛および／または痒みを処置するための、ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物を含む薬学的組成物。
（項目２）
真菌感染を処置するための薬学的組成物であって、ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物および抗真菌剤を含む薬学的組成物。
（項目３）
真菌感染を処置するための組合わせ医薬であって、ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物および抗真菌剤を含む組合わせ医薬。
（項目４）
前記抗真菌剤が、ミコナゾール、クロトリアゾール、エコナゾール硝酸塩、イソコナゾール硝酸塩、ビホナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール、テルビナフィン塩酸塩、トルナフタート、および、リラナフタートからなる群から選択される、項目２に記載の薬学的組成物または項目３に記載の組合わせ医薬。
（項目５）
前記ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物は、ＶＮＵＴによるＡＴＰの取り込みを阻害する効果を有する化合物、ＶＮＵＴによって小胞内に蓄積されたＡＴＰの細胞外への放出を阻害する効果を有する化合物、ＶＮＵＴとＣｌ−との結合を阻害するアロステリック薬物、ＶＮＵＴと結合しＶＮＵＴとＡＴＰとの結合を阻害するＡＴＰアナログ、およびＶＮＵＴの発現を特異的に抑制する化合物からなる群から選択される化合物である、項目１または２に記載の薬学的組成物あるいは項目３に記載の組合わせ医薬。
（項目６）
前記ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物は、
（Ｉ）
以下の式１
【００１０】
【化００１】
2019014684.tif 000002
【００１１】
で示される化合物であり、
ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ３、および、ＣＨ２ＯＨからなる群から選択され、Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、および、Ｒ４からなる群から選択され、ここで、Ｒ４は
【００１２】
【化００２】
2019014684.tif 000003
【００１３】
であり、ここで、
【００１４】
【化００３】
2019014684.tif 000004
【００１５】
は単結合が３つ、または、単結合が２つと二重結合が１つであり、かつ、ＮがＮ＋であり；Ｌは結合またはＣ１−４アルキレンまたはＣ１−４置換アルキレンまたはＣ１−４アルケニレンであり；Ｒ４１は、Ｈ、Ｃ１−４アルキレン、Ｃ１−４置換アルキレン、Ｃ１−４アルケニレンおよびＣ１−４置換アルケニレンからなる群から選択され、−ＣＨ＝が存在する場合その半数以下が−Ｎ＝で置換されていてもよく、Ｒ４２またはＲ４３と５員環を形成してもよく；Ｒ４２およびＲ４３は、Ｃ１−７アルキレン、Ｃ１−７置換アルキレン、Ｃ１−７アルケニレンおよびＣ１−７置換アルケニレンからなる群から独立して選択され、−ＣＨ＝が存在する場合その半数以下が−Ｎ＝で置換されていてもよく、Ｒ４２とＲ４３とは６員環を形成してもよく；
Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ３、および、ＣＨ２ＯＨからなる群より独立して選択される、化合物であるか；あるいは、
（ＩＩ）
以下の式２
【００１６】
【化０１１】
2019014684.tif 000005
【００１７】
で示される化合物であり、
ここで、ｎは０または１であり、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、および、ＣＨ３、ならびに、一緒になって、Ｏからなる群から選択され、
ここで、Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、および、ＣＨ２ＯＨからなる群から選択され、ただし、Ｒ３がＨである場合、Ｒ１およびＲ２は一緒になってＯであり、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の少なくとも１つは酸素原子を含む化合物であるか；
（ＩＩＩ）
Ｕ−７３１２２（Ｓｉｇｍａ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．Ｕ６７５６）であるか；
あるいは上記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の化合物の誘導体であり、ここで、該化合物の誘導体は、該化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、エステル、代謝産物、保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、またはアセチル化誘導体である、項目１または２に記載の薬学的組成物あるいは項目３に記載の組合わせ医薬。
（項目７）
前記ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物がアセトアセテート、３−ヒドロキシ酪酸、グリオキシル酸、クロドロン酸、メドロン酸、ミノドロン酸、イバンドロン酸、ジフルオロメチレン２リン酸、メチレンビスフォスフォ２リン酸、Ｕ−７３１２２、あるいは、その薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、エステル、代謝産物、保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、またはアセチル化誘導体である、項目１または２に記載の薬学的組成物あるいは項目３に記載の組合わせ医薬。
（項目８）
前記ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物がＶＮＵＴ遺伝子発現阻害剤である、項目１または２に記載の薬学的組成物あるいは項目３に記載の組合わせ医薬。
（項目９）
内服剤、注射剤、軟膏、および、スプレーからなる群から選択される、項目１または２に記載の薬学的組成物あるいは項目３に記載の組合わせ医薬。
（項目１０）
項目７に記載の薬学的組成物または組合わせ医薬であって、被験体の体重１ｋｇあたり０．００１〜１０ｍｇの用量のクロドロン酸、あるいは、その薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、エステル、代謝産物、保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、またはアセチル化誘導体を含む、薬学的組成物あるいは組合わせ医薬。
（項目１１）
さらに、副腎皮質ステロイドを含む、項目１〜１０のいずれか一項に記載の薬学的組成物あるいは組合わせ医薬。
（項目１２）
前記副腎皮質ステロイドが、クロベタゾールプロピオン酸エステル、ジフロラゾン酢酸エステル、ベタメタゾンジプロピオン酸エステル、ジフルプレドナート、および、フルオシノニドからなる群から選択される、項目１１に記載の薬学的組成物あるいは組合わせ医薬。
（項目１３）
真菌感染によって生じる疼痛および／または痒みを処置するための医薬の製造、あるいは、真菌感染を処置するための医薬の製造における、ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物の使用。
（項目１４）
前記ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物は、ＶＮＵＴによるＡＴＰの取り込みを阻害する効果を有する化合物、およびＶＮＵＴによって小胞内に蓄積されたＡＴＰの細胞外への放出を阻害する効果を有する化合物、ＶＮＵＴとＣｌ−との結合を阻害するアロステリック薬物、ＶＮＵＴと結合しＶＮＵＴとＡＴＰとの結合を阻害するＡＴＰアナログ、およびＶＮＵＴの発現を特異的に抑制する化合物からなる群から選択される化合物である、項目１３に記載の使用。
（項目１５）
前記ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物は、
（Ｉ）
以下の式１
【００１８】
【化０２１】
2019014684.tif 000006
【００１９】
で示される化合物であり、
ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ３、および、ＣＨ２ＯＨからなる群から選択され、Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、および、Ｒ４からなる群から選択され、ここで、Ｒ４は
【００２０】
【化０２２】
2019014684.tif 000007
【００２１】
であり、ここで、
【００２２】
【化０２３】
2019014684.tif 000008
【００２３】
は単結合が３つ、または、単結合が２つと二重結合が１つであり、かつ、ＮがＮ＋であり；Ｌは結合またはＣ１−４アルキレンまたはＣ１−４置換アルキレンまたはＣ１−４アルケニレンであり；Ｒ４１は、Ｈ、Ｃ１−４アルキレン、Ｃ１−４置換アルキレン、Ｃ１−４アルケニレンおよびＣ１−４置換アルケニレンからなる群から選択され、−ＣＨ＝が存在する場合その半数以下が−Ｎ＝で置換されていてもよく、Ｒ４２またはＲ４３と５員環を形成してもよく；Ｒ４２およびＲ４３は、Ｃ１−７アルキレン、Ｃ１−７置換アルキレン、Ｃ１−７アルケニレンおよびＣ１−７置換アルケニレンからなる群から独立して選択され、−ＣＨ＝が存在する場合その半数以下が−Ｎ＝で置換されていてもよく、Ｒ４２とＲ４３とは６員環を形成してもよく；
Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ３、および、ＣＨ２ＯＨからなる群より独立して選択される、化合物であるか；あるいは、
（ＩＩ）
以下の式２
【００２４】
【化０３１】
2019014684.tif 000009
【００２５】
で示される化合物であり、
ここで、ｎは０または１であり、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、および、ＣＨ３、ならびに、一緒になって、Ｏからなる群から選択され、
ここで、Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、および、ＣＨ２ＯＨからなる群から選択され、ただし、Ｒ３がＨである場合、Ｒ１およびＲ２は一緒になってＯであり、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の少なくとも１つは酸素原子を含む化合物であるか；
（ＩＩＩ）
Ｕ−７３１２２（Ｓｉｇｍａ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．Ｕ６７５６）であるか；
あるいは上記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の誘導体であり、ここで、該化合物の誘導体は、該化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、エステル、代謝産物、保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、またはアセチル化誘導体である、項目１３に記載の使用。
（項目１６）
前記ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物がアセトアセテート、３−ヒドロキシ酪酸、グリオキシル酸、クロドロン酸、メドロン酸、ミノドロン酸、イバンドロン酸、ジフルオロメチレン２リン酸、メチレンビスフォスフォ２リン酸、Ｕ−７３１２２、あるいは、その薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、エステル、代謝産物、保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、またはアセチル化誘導体である、項目１３に記載の使用。
（項目１７）
前記ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物がＶＮＵＴ遺伝子発現阻害剤である、項目１３に記載の使用。
（項目１８）
前記医薬が抗真菌剤をさらに含む、項目１３〜１７のいずれか一項に記載の使用。
（項目１９）
前記抗真菌剤が、ミコナゾール、クロトリアゾール、エコナゾール硝酸塩、イソコナゾール硝酸塩、ビホナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール、テルビナフィン塩酸塩、トルナフタート、および、リラナフタートからなる群から選択される、項目１８に記載の使用。
（項目２０）
前記医薬が副腎皮質ステロイドをさらに含む、項目１３〜１９のいずれか一項に記載の使用。
（項目２１）
前記副腎皮質ステロイドが、クロベタゾールプロピオン酸エステル、ジフロラゾン酢酸エステル、ベタメタゾンジプロピオン酸エステル、ジフルプレドナート、および、フルオシノニドからなる群から選択される、項目２０に記載の使用。
（項目２２）
ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物を投与する工程を包含する、真菌感染を処置する方法。
（項目２３）
披検物質が、ＶＮＵＴ阻害活性を有するか否かを評価する工程を含む、真菌感染によって生じる疼痛および／または痒みを処置する化学物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、ＶＮＵＴ活性が直接的ないし間接的に制御されることで真菌感染によって生じる疼痛および／または痒みを処置することができる。また、本発明は、真菌感染によって生じる疼痛および／または痒みを処置する治療薬も提供する。また、本発明は、ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物を含む薬学的組成物であって、真菌感染によって生じる疼痛および／または痒みを処置するための、薬学的組成物を提供する。本発明によって、これまで対応不能であった真菌感染にともなう疼痛やカユミのような宿主応答を抑えることが可能となった。直接的に考えても、カンジタ膣症にともなう堪え難い痛みカユミを抱えた多くの女性（数百万人／日本）の福音となることはいうまでもない。本発明は、真菌感染症にともない惹起されるプリン作動性化学伝達に係る宿主応答すべてに適用できるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、市販されている種々のビスホスホネートを示した図である。
【図２】図２は、種々のビスホスホネートについて、ＶＮＵＴ阻害のＩＣ５０と骨粗鬆症治療効果とをまとめた表である。
【図３】図３は、クロドロン酸がＣｌ競合を通して可逆的にＶＮＵＴを阻害した結果をしめす。（Ａ）Ｖａｌ誘発Ｄｙ構造を１００μＭのクロドロン酸の存在下または非存在下でオキソノールＶ蛍光の２分消光として測定した。コントロール活性をＣＣＣＰの存在下における消光から減じた；ｎ＝７〜８。（Ｂ）１００ｎＭのクロドロン酸の存在下（白三角形）もしくは非存在下（黒円）またはバリノマイシン（白円）の非存在下における様々な［Ｃｌ−］での１分間のＡＴＰ取り込み；ｎ＝３〜１２。（Ｃ）１００ｎＭのクロドロン酸存在下または非存在下におけるＡＴＰ取り込みのヒルプロット。データは図３Ｂより取得。（Ｄ）様々な化合物の示された濃度１の存在下または非存在下におけるビオチン−１１−ＡＴＰを用いたＵＶ照射時のＶＮＵＴタンパク質の光親和性標識（上段）。各タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析し、ＣＢＢ染色を用いて可視化している（下段）。矢印はＶＮＵＴタンパク質の位置を示す。（Ｅ）１μＭのクロドロン酸による阻害は、プロテオリポソームの洗浄後に完全に元通りに戻った；ｎ＝４〜８。全件においてデータは平均±ＳＥＭ．＊＊Ｐ＜０．０１；ＮＳ、統計的有意差なし（両側対応有スチューデントのｔ検定）。
【図４】図４は、クロドロン酸が神経細胞からの小胞ＡＴＰ放出を阻害した結果を示す。２０分後の培養神経細胞からのＡＴＰ（Ａ）およびグルタミン酸（Ｂ）のＫＣｌ依存性放出を、示されたクロドロン酸濃度の存在下（グレイのバー）または非存在下（黒のバー）においてアッセイした。１００ｎＭのクロドロン酸による阻害は、培養神経細胞の洗浄後に完全に元通りに戻された。洗い出し実験において、クロドロン酸処理細胞を培地で洗浄し、さらに２４時間インキュベートした；ｎ＝４〜８（Ｃ、Ｄ）２０分後の培養星状細胞からのＡＴＰ（Ｃ）およびグルタミン酸（Ｄ）のＫＣｌ依存性放出を、示されたクロドロン酸濃度の存在下（グレイのバー）または非存在下（黒のバー）においてアッセイした；ｎ＝８。（Ｅ）１００μＭもしくは１ｍＭのクロドロン酸の存在下（グレイのバー）または非存在下（黒のバー）または１ｍＭ無機リン酸（Ｐｉ）における１０分間にわたる培養神経細胞または星状細胞へのアレンドロン酸の取り込み；ｎ＝４〜６。データは平均±ＳＥＭ．＊＊Ｐ＜０．０１；ＮＳ、統計的有意差なし（片側ＡＮＯＶＡに続きダネットの検定）。
【図５】図５は、クロドロン酸がＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来可溶ベータ−グルカン（ＣＳＢＧ）誘発機械的アロディニアを阻害した結果を示す。クロドロン酸の予備注射後のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来可溶ベータ−グルカン（ＣＳＢＧ）誘発機械的アロディニア（１０ｍｇ／ｋｇ静脈注射、足蹠へのＣＳＢＧ注射の６０分前）。エラーバー、ＳＥＭ；＊ｐ＜０．０５。
【図６】図６は、ＣＳＢＧによるヒスタミン非依存性掻痒感の増進がクロドロン酸処理により消失した結果を示す。ＰＢＳまたはクロドロン酸（３００μｇ／２５μｌ）を頬に注射した。６０分後、クロロキン（ＣＱ）を、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来可溶ベータ−グルカン（ＣＳＢＧ）とともに／なしで頬に注射し、引っ掻き行動を観察した（各注射グループにおいてｎ＝７）。エラーバー、ＳＥＭ；＊ｐ＜０．０５。各時間（０〜１０分、１０〜２０分、および、２０〜３０分）での各棒グラフは、左から順番に、ＰＢＳ→ＣＱ、クロドロネート→ＣＱ、ＰＢＳ→ＣＱ＋ＣＳＢＧ、および、クロドロネート→ＣＱ＋ＣＳＢＧである。
【図７】図７は、ＣＳＢＧによるヒスタミン非依存性掻痒感の増進がラミナリン（デクチン１アンタゴニスト）処理により消失した結果を示す。ＰＢＳまたはラミナリン（５μｇ／２５μｌ）を頬に注射した。６０分後、クロロキン（ＣＱ）を、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来可溶ベータ−グルカン（ＣＳＢＧ）とともに／なしで頬に注射し、引っ掻き行動を観察した（各注射グループにおいてｎ＝７）。エラーバー、ＳＥＭ；＊ｐ＜０．０５。各時間（０〜１０分、１０〜２０分、および、２０〜３０分）での各棒グラフは、左から順番に、ＰＢＳ→ＣＱ、ラミナリン→ＣＱ、ＰＢＳ→ＣＱ＋ＣＳＢＧ、および、ラミナリン→ＣＱ＋ＣＳＢＧである。
【図８】図８Ａは、ケラチノサイト（野生型およびＤｅｃｔｉｎ−１−／−）を種々の物質で３時間刺激し、培地上清中に放出されたＡＴＰを測定した結果を示す。図８Ｂは、Ｕ−７３１２２がＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来可溶ベータ−グルカン（ＣＳＢＧ）誘発機械的アロディニアを阻害した結果を示す。Ｕ−７３１２２の予備注射３０分後のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来可溶ベータ−グルカン（ＣＳＢＧ）誘発機械的アロディニア（Ｕ７３１２２  １０μＭ、２５μＬ足趾注射、３０分後に足趾にＣＳＢＧ注射）の結果を示す。エラーバー、ＳＥＭ；＊ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。また、本明細書において「ｗｔ％」は、「質量パーセント濃度」と互換可能に使用される。
【００２９】
（１．用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００３０】
本明細書において使用される用語「クロドロン酸」は、クロドロン酸（ＣＨ４Ｃｌ２Ｏ６Ｐ２）およびその薬学的に許容される塩、水和物、および、溶媒和物を包含する。
【００３１】
本明細書において使用される用語「小胞型ヌクレオチドトランスポーター」は「ＶＮＵＴ」と互換可能に使用される。代表的には、配列番号１、３、５、７、もしくは９に示される核酸配列、またはヌクレオチド輸送活性を保持する改変体核酸配列によってコードされるポリペプチド、あるいは、配列番号２、４、６、８、または１０に示されるアミノ酸配列、またはヌクレオチド輸送活性を保持する改変体アミノ酸配列からなるポリペプチドをいう。
【００３２】
本明細書において使用される用語「ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物」とは、ＶＮＵＴによって小胞内に蓄積したＡＴＰの放出によって生じる作用を阻害する化合物であって、ＶＮＵＴを直接阻害する化合物であってもＶＮＵＴを直接阻害しない化合物であってもよい。ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物としては、例えば、ＶＮＵＴによるＡＴＰの取り込みを阻害する効果を有する化合物、ＶＮＵＴによって小胞内に蓄積されたＡＴＰの細胞外への放出を阻害する効果を有する化合物、細胞外に放出されたＡＴＰによる作用を阻害する効果を有する物質が挙げられるがこれらに限定されない。より詳細には、ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物としては、例えば、ＶＮＵＴとＣｌ−との結合を阻害する化合物（アロステリック薬物）、ＡＴＰアナログなどのＶＮＵＴと結合しＶＮＵＴとＡＴＰとの結合を阻害する化合物、ＶＮＵＴの発現を特異的に抑制する核酸等のＶＮＵＴの発現を特異的に抑制する化合物、小胞内に蓄積されたＡＴＰの放出（エキソサイトーシス）を阻害する化合物などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３３】
ＶＮＵＴの発現を特異的に抑制する核酸としては、例えば、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、および、ｍｉＲＮＡが挙げられるがこれらに限定されない。
所定の遺伝子からｓｉＲＮＡを調製する方法は周知であり、例えば、当該分野で公知のｓｉＲＮＡ提供業者（例えば、株式会社  ニッポンイージーティー、富山、日本）により、アニーリングしている２本鎖の合成ｓｉＲＮＡを入手することができる。その合成ｓｉＲＮＡをＲＮＡｓｅフリーの溶液に溶解し、最終濃度が２０μＭになるように調整し、その後細胞へ導入する。ｓｉＲＮＡを調製する場合には、例えば、（１）ＧまたはＣが連続して４つ以上存在しない、（２）ＡまたはＴが連続して４つ以上存在しない、（３）ＧあるいはＣが９塩基以上存在しない、などの条件を加えてもよい。本発明のｓｉＲＮＡは、１９塩基長、２０塩基長、２１塩基長、２２塩基長、２３塩基長、２４塩基長、２５塩基長、２６塩基長、２７塩基長、２８塩基長、２９塩基長、または３０塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡは、好ましくは、１９塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２０塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２１塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２２塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２３塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２４塩基長である。ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物としては、ＶＮＵＴの機能を阻害する限り特に限定されることではないが、例えば、アセト酢酸、３−ヒドロキシ酪酸等のケトン体、グリオキシル酸、クロドロン酸、及びＶＮＵＴの発現を特異的に抑制する核酸又はこれらの核酸を発現し得るベクター等が挙げられる。
【００３４】
好ましくは、ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物は、アセト酢酸及び３−ヒドロキシ酪酸等のケトン体、グリオキシル酸、又はクロドロン酸であり、より好ましくはアセト酢酸、グリオキシル酸、３−ヒドロキシ酪酸及びクロドロン酸からなる群より選択されるＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物であり、さらに好ましくは、クロドロン酸である。本発明の治療効果・予防効果を奏するために、これらの誘導体もまた使用可能である。
【００３５】
好ましくは、小胞内に蓄積されたＡＴＰの放出（エキソサイトーシス）を阻害する化合物としては、例えば、Ｕ−７３１２２（１−［６−［［１７β−３−メトキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１７−イル］アミノ］ヘキシル］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオネル（１−［６−［［１７ｂｅｔａ−３−ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒａ−１，３，５（１０）−ｔｒｉｅｎ−１７−ｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｈｅｘｙｌ］−１Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｅ−２，５−ｄｉｏｎｅｌ）、Ｓｉｇｍａ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．Ｕ６７５６）が挙げられるがこれに限定されない。
【００３６】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖形態、二本鎖形態、または他の形態である、リン酸エステルポリマー形態のリボヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、もしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオチド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン（ＤＮＡ分子」）、またはそれらの任意のホスホエステルアナログ（例えば、ホスホロチオエートおよびチオエステル）を指し得る。
【００３７】
「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）中の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオシド」とも呼ばれる）であり、２つの以上のヌクレオチドの任意の鎖またはその相補鎖を意味する。本発明の好ましい核酸は、配列番号１、３、５、７、もしくは９のいずれかに示される核酸またはその相補鎖、あるいはそれらの改変体またはフラグメントを包含する。
【００３８】
「相補鎖」とは、ある核酸配列に対して塩基対を形成し得るようなヌクレオチドの鎖を意味する。例えば、二本鎖ＤＮＡの各々の鎖は互いに相補的な塩基配列を有し、一方の鎖から見て他方の鎖は相補鎖である。
【００３９】
本明細書において遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。また、本明細書において配列（核酸配列、アミノ酸配列など）の同一性とは、２以上の対比可能な配列の、互いに対する同一の配列（個々の核酸、アミノ酸など）の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて相同性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、相同性と類似性とは同じ数値を示す。
【００４０】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて算出される。
【００４１】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。
【００４２】
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃（好ましくは６８℃）、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％  ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
【００４３】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【００４４】
（２．本発明の治療効果）
本発明の治療効果は、小胞型核酸トランスポーター（ＶＮＵＴ）の機能および／または活性および／または発現を阻害ないし抑制することによって発揮される。
【００４５】
具体的には、「ＶＮＵＴの機能」とは、細胞内分泌小胞へのＡＴＰの取り込みや細胞外へのＡＴＰの放出等が挙げられ、「ＶＮＵＴの機能を阻害する」とは、例えば、ＶＮＵＴによる小胞へのＡＴＰの取り込みを阻害する、または、ＶＮＵＴによる小胞性ＡＴＰの細胞外への放出を阻害する等を指し、例えば、「ＶＮＵＴの発現を抑制する」ことも結果としてＶＮＵＴによるＡＴＰの取り込みを阻害するため、ＶＮＵＴの機能を阻害することに含まれる。
【００４６】
「ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物」とは、例えば、ＶＮＵＴによるＡＴＰの取り込みを阻害する効果を有する化合物、ＶＮＵＴによって小胞内に蓄積されたＡＴＰの細胞外への放出を阻害する効果を有する化合物、細胞外に放出されたＡＴＰによる作用を阻害する効果を有する物質が挙げられるがこれらに限定されない。より詳細には、ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物としては、例えば、ＶＮＵＴとＣｌ−との結合を阻害する化合物（アロステリック薬物）、ＡＴＰアナログなどのＶＮＵＴと結合しＶＮＵＴとＡＴＰとの結合を阻害する化合物、ＶＮＵＴの発現を特異的に抑制する核酸等のＶＮＵＴの発現を特異的に抑制する化合物、小胞内に蓄積されたＡＴＰの放出（エキソサイトーシス）を阻害する化合物などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４７】
本発明に用いられるＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物は、ＶＮＵＴ阻害活性を有する限り特に限定されず、無機塩基、有機塩基、無機酸、有機酸等との塩の形態であってもよい。上記無機塩基との塩の例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。上記有機塩基との塩の例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンとの塩が挙げられる。上記無機酸との塩の例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸との塩が挙げられる。上記有機酸との塩の例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸との塩が挙げられる。これらの塩のなかでも、薬理学的に許容される塩が好ましい。
【００４８】
ＶＮＵＴに対するアンチセンス核酸等のＶＮＵＴの発現を特異的に抑制する核酸、又はこれらの核酸を発現し得るベクターも、ＶＮＵＴの発現を抑制することにより結果としてＶＮＵＴによるＡＴＰの取り込みを阻害するため、ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物に含まれ得る。ＶＮＵＴの発現を特異的に抑制する核酸又はこれらの核酸を発現し得るベクター等を使用することもできる。
【００４９】
ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物としては、ＶＮＵＴを介したＡＴＰ神経伝達を阻害する限り特に限定されることはなく、ＶＮＵＴを直接阻害する物質であっても、直接阻害しない物質であってもよい。理論に拘束されることは望まないが、本発明における疼痛、痒み、および／または、真菌感染の処置におけるＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物が作用するメカニズムは、以下のとおりである。ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物は、ＶＮＵＴによって小胞内に蓄積したＡＴＰの放出によって生じる作用を阻害する化合物であって、ＶＮＵＴを直接阻害する化合物であってもＶＮＵＴを直接阻害しない化合物であってもよい。ＶＮＵＴは神経伝達物質であるＡＴＰを分泌小胞に蓄積し、蓄積されたＡＴＰはエキソサイトーシスによって細胞外に放出され、ＡＴＰを介した神経伝達（信号伝達）を行う。すなわち、神経伝達物質であるＡＴＰによるシナプス前細胞からシナプス後細胞へのシナプス伝達には、シナプス前細胞中の分泌小胞へのＡＴＰの蓄積およびシナプス前細胞でのエキソサイトーシスによるＡＴＰの細胞外への放出が必須である。そのため、ＶＮＵＴによるＡＴＰの分泌小胞への蓄積が阻害されると、ＡＴＰが分泌小胞内に蓄積されなくなり、その結果、シナプス伝達が阻害される。また、シナプス前細胞からのエキソサイトーシスが阻害されると、分泌小胞内に蓄積されたＡＴＰが細胞外に放出されなくなり、シナプス伝達が阻害される。あるいは、Ｖ−ＡＴＰａｓｅを阻害しＡＴＰ輸送の駆動力をなくすこと、あるいは、Ｖ−ＡＴＰａｓｅがもたらしたプロトン濃度勾配をプロトンコンダクターによって消失させることによっても、ＡＴＰが分泌小胞に蓄積されなくなるので、ＶＮＵＴを介したＡＴＰ神経伝達を阻害することができる。その一方で、例えば、プロトンコンダクターなどはＡＴＰの分泌小胞への蓄積のみならず他の多くの事象を阻害する（例えば、ＡＴＰ以外の化学伝達物質（例えば、グルタミン酸、ＧＡＢＡ、モノアミン類など）の化学伝達を阻害）可能性があるため、ＶＮＵＴを直接阻害する化合物と同程度に効力を発揮する可能性は低いか、および／または、副作用が大きいと予測される。
【００５０】
しかしながら、本発明者らは、ＶＮＵＴによって小胞内に蓄積されたＡＴＰの細胞外への放出を阻害する効果を有する化合物であるＵ−７３１２２（１−［６−［［１７β−３−メトキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１７−イル］アミノ］ヘキシル］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオネル（１−［６−［［１７ｂｅｔａ−３−ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒａ−１，３，５（１０）−ｔｒｉｅｎ−１７−ｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｈｅｘｙｌ］−１Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｅ−２，５−ｄｉｏｎｅｌ）、Ｓｉｇｍａ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．Ｕ６７５６）がＶＮＵＴを直接阻害する化合物と同程度に薬理効果を発揮し、かつ、重篤な副作用を示さないことを始めて示した。
【００５１】
ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：
（Ｉ）例えば、ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物としては、以下の式１
【００５２】
【化０４１】
2019014684.tif 000010
【００５３】
で示される化合物であって、
ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ３、および、ＣＨ２ＯＨからなる群から選択され、Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、および、Ｒ４からなる群から選択され、ここで、Ｒ４は
【００５４】
【化０４２】
2019014684.tif 000011
【００５５】
であり、ここで、
【００５６】
【化０４３】
2019014684.tif 000012
【００５７】
は単結合が３つ、または、単結合が２つと二重結合が１つであり、かつ、ＮがＮ＋であり；Ｌは結合またはＣ１−４アルキレンまたはＣ１−４置換アルキレンまたはＣ１−４アルケニレンであり；Ｒ４１は、Ｈ、Ｃ１−４アルキレン、Ｃ１−４置換アルキレン、Ｃ１−４アルケニレンおよびＣ１−４置換アルケニレンからなる群から選択され、−ＣＨ＝が存在する場合その半数以下が−Ｎ＝で置換されていてもよく、Ｒ４２またはＲ４３と５員環を形成してもよく；Ｒ４２およびＲ４３は、Ｃ１−７アルキレン、Ｃ１−７置換アルキレン、Ｃ１−７アルケニレンおよびＣ１−７置換アルケニレンからなる群から独立して選択され、−ＣＨ＝が存在する場合その半数以下が−Ｎ＝で置換されていてもよく、Ｒ４２とＲ４３とは６員環を形成してもよく；
Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ３、および、ＣＨ２ＯＨからなる群より独立して選択される、化合物（ビスホスホネートまたはその誘導体もしくは類似体）、あるいは、その薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、エステル（例えば、脂肪酸エステル）、代謝産物、保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、またはアセチル化誘導体が挙げられる。そのような化合物またはその誘導体としては、例えば、クロドロン酸、エチドロン酸、メドロン酸、ミノドロン酸、イバンドロン酸、エチドロン酸、ジフルオロメチレン２リン酸、および、メチレンビスフォスフォ２リン酸が挙げられるがこれらに限定されない。理論に拘束されることは好まないが、上記Ｒ４がアデノシンと類似の構造を持つことがＶＮＵＴ阻害効果にとって重要である。
【００５８】
（ＩＩ）あるいは、ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物としては、以下の式２
【００５９】
【化０５１】
2019014684.tif 000013
【００６０】
で示される化合物であり、
ここで、ｎは０または１であり、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、および、ＣＨ３、ならびに、一緒になって、Ｏからなる群から選択され、
ここで、Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、および、ＣＨ２ＯＨからなる群から選択され、ただし、Ｒ３がＨである場合、Ｒ１およびＲ２は一緒になってＯであり、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の少なくとも１つは酸素原子を含む化合物であるか；
（ＩＩＩ）
Ｕ−７３１２２（Ｓｉｇｍａ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．Ｕ６７５６）であるか；
あるいは上記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の化合物の誘導体であり、ここで、該化合物の誘導体は、該化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、エステル、代謝産物、保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、またはアセチル化誘導体である。
【００６１】
ＶＮＵＴ阻害活性を有する物質としては、例えば、アセトアセテート、３−ヒドロキシ酪酸、グリオキシル酸、クロドロン酸、メドロン酸、ミノドロン酸、イバンドロン酸、ジフルオロメチレン２リン酸、メチレンビスフォスフォ２リン酸およびＵ−７３１２２が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６２】
さらに、アミノ酸代謝物、脂肪酸代謝物のような化合物もまたＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物として利用可能である。また、これら化合物の誘導体もまた、本発明において使用可能である。誘導体としては、例えば、薬学的に許容される塩、アミド、水和物、溶媒和物、エステル化誘導体（例えば、脂肪酸エステル）、代謝産物、保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、又はアセチル化誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６３】
ＡＴＰアナログもまた、ＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物として利用可能である。種々のＡＴＰアナログが周知であり、市販されている。ＡＴＰアナログとしては、例えば、ＡＭＰ−ＰＣＰ、ＡＭＰ−ＰＮＰ、ＡＴＰγＳ、ＡＭＰ−ＰＣＨ２Ｐ、ＡＭＰ−ＰＳＰ、ｄＡＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄ−α−Ｓ−ＡＴＰ、およびＡＴＰβＳが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６４】
（３．真菌感染における疼痛および／または痒みに対する治療効果）
本発明者らは、痛覚神経に真菌受容体であるＤｅｃｔｉｎ−１が発現していることを見出し（Ｍａｒｕｙａｍａら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  印刷中）、この受容体がＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ感染の際の疼痛センサーとして働いていることを見出した（Ｍａｒｕｙａｍａら、論文投稿中）。また、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞壁の主要な構成成分であるβ−ｇｌｕｃａｎは、クロロキン誘発性の掻痒を著名に増幅するという現象を見出した。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの皮膚感染は疼痛閾値の減弱（アロディニア）をもたらすが、本発明者らは、ＡＴＰ分泌小胞の形成に不可欠であるＡＴＰトランスポーターＶＮＵＴのノックアウトマウスにおいてＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ誘発性アロディニアが消失することを見出した（Ｍａｒｕｙａｍａら、論文投稿中）。以上より、Ｄｅｃｔｉｎ−１やＶＮＵＴは真菌感染随伴症状の発現に深くかかわっていると考えられる。
【００６５】
発明者らはカンジタ症に伴う疼痛の発生機構を解明し、本発明を完成した。すなわち、発明者らはカンジタ症に伴う疼痛はカンジタの感染を皮膚ケラチノサイトが関知しプリン作動性化学伝達を惹起させ感覚神経を興奮させることにより発生することを発見した。ケラチノサイトから惹起されるプリン作動性化学伝達は小胞型ヌクレオチドトランスポーター（ＶＮＵＴ）によるＡＴＰの開口放出であるため、この過程を阻害すれば、疼痛等の感覚の発生を抑えることができるものと考えた。そこで、発明者らは、ＣＳＢＧ（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来の可溶性β−ｇｌｕｃａｎ）をマウスに注入し疼痛を発生せしめ、ＶＮＵＴの特異的阻害剤クロドロン酸を静注し、その効果を調べたところ明確な鎮痛効果を認め、本発明を完成した。さらに本発明者らは、ＡＴＰの分泌小胞からのエキソサイトーシスを阻害する化合物を用いた場合にも、ＶＮＵＴを直接阻害する化合物と同様の薬理効果が発揮され、かつ、副作用が観察されなかったことを実証した。
【００６６】
それゆえ、本発明が対象とする疼痛および／または痒みとしては、真菌感染に関連する疼痛および／または痒みが挙げられる。本発明が対象とする真菌感染としては、任意の真菌による真菌感染、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  および  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉからなる群から選択される真菌による感染が包含される。
【００６７】
（４．薬学的組成物の処方）
本発明はまた、有効量の治療剤の被験体へのクロドロン酸などのようにＶＮＵＴを直接阻害する化合物および／またはＵ−７３１２２のようにＶＮＵＴを直接阻害することなくＡＴＰのエキソサイトーシスを阻害する化合物の投与によってＶＮＵＴを阻害し、真菌感染に起因する疼痛および／または痒みを治療するための方法および薬学的組成物を提供する。治療剤とは、薬学的に受容可能なキャリア型（例えば、滅菌キャリア）と組み合せた、本発明の組成物を意味する。
【００６８】
治療剤を、個々の患者の臨床状態（特に、治療剤単独処置の副作用）、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入れ、医療実施基準（ＧＭＰ＝ｇｏｏｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）を遵守する方式で処方および投薬する。従って、本明細書において目的とする「有効量」は、このような考慮を行って決定される。
【００６９】
一般的提案として、クロドロン酸などのＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物の用量としては、限定されることはないが、例えば、約０．１μｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、約０．２μｇ／ｋｇ／日〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．５μｇ／ｋｇ／日〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日、および、約１μｇ／ｋｇ／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日が挙げられるがこれらに限定されない。最も好ましくは、クロドロン酸の用量は、患者体重を基準として、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。
【００７０】
あるいは、本発明の薬学的組成物の投与量は、週に１回をまとめて服用することも可能である。例えば、本発明の薬学的組成物の用量は、約０．７μｇ／ｋｇ／週〜約７００ｍｇ／ｋｇ／週、約１．４μｇ／ｋｇ／週〜約３５０ｍｇ／ｋｇ／週、約３．５μｇ／ｋｇ／週〜約１４０ｍｇ／ｋｇ／週、および、約７μｇ／ｋｇ／週〜約７０ｍｇ／ｋｇ／週、ならびに、約５μｇ／ｋｇ／月〜約５０００ｍｇ／ｋｇ／月、約１０μｇ／ｋｇ／月〜約２５００ｍｇ／ｋｇ／月、約２５μｇ／ｋｇ／月〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／月、および、約５０μｇ／ｋｇ／月〜約５００ｍｇ／ｋｇ／月が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７１】
皮下注射の１０ｍｇ／ｋｇの効果は、静注の０．０１ｍｇ／ｋｇと同等（約５０％の治療効果）と考えられ、その場合、皮下注は１０００倍の薬剤を投与可能ということになる。クロドロン酸経口投与の場合は、吸収量が２％程度と言われている（ＢＯＮＥＦＯＳ：クロドロン酸の医薬品名の説明文書に記載）。したがって、経口投与であれば、静注の５０倍多く投与することで同等の効果が得られると考えられる。
【００７２】
治療剤を、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして、あるいは点眼薬としてまたは眼球内注射によって投与し得る。代表的には、本発明の薬学的組成物は静脈内投与されるが、投与経路は当業者が適宜選択することができる。当業者はまた、投与経路に応じて用量を適切に調整することができる。
【００７３】
本発明の治療剤は、例えば、内服剤、注射剤、軟膏、および、スプレーからなる群から選択される薬学的組成物である。
【００７４】
「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の処方補助剤をいう。
【００７５】
本発明の治療剤・予防剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療剤の適切な例は、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与され得る。あるいは、本発明の薬学的組成物は、点眼薬としてまたは眼球内注射によって投与され得る。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。代表的には、本発明の薬学的組成物は静脈内投与されるが、投与経路は当業者が適宜選択することができる。当業者はまた、投与経路に応じて用量を適切に調整することができる。
【００７６】
本発明の治療剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療剤の適切な例は、適切なポリマー物質（例えば、成形品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態の半透過性ポリマーマトリックス）、適切な疎水性物質（例えば、許容品質油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂、および貧可溶性誘導体（例えば、貧可溶性塩）を包含する。
【００７７】
徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：  １６７−２７７（１９８１）、およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、同書）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。
【００７８】
徐放性治療剤はまた、リポソームに包括された本発明の治療剤を包含する（一般に、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３１７−３２７頁および３５３−３６５（１９８９）を参照のこと）。治療剤を含有するリポソームは、それ自体が公知である方法により調製され得る：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出  願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号ならびにＥＰ第１０２，３２４号。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）ユニラメラ型であり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも多く、選択された割合が、最適治療剤のために調整される。
【００７９】
なおさらなる実施態様において、本発明の治療剤は、ポンプにより送達されうる（Ｌａｎｇｅｒ、前出；Ｓｅｆｔｏｎ、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。
【００８０】
他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））による総説において議論される。
【００８１】
非経口投与のために、１つの実施態様において、一般に、治療剤は、それを所望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合するものと、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で混合することにより処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化、および治療剤に対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。
【００８２】
一般に、治療剤を液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはその両方と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、生成物を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルもまた、リポソームと同様に本明細書において有用である。
【００８３】
キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、このような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；および／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【００８４】
治療剤は、代表的には約４〜９のｐＨで、このようなビヒクル中に処方される。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用することにより、塩が形成されることが理解される。
【００８５】
治療的投与に用いられるべき任意の薬剤は、細菌・ウイルスを含まない状態、すなわち、無菌状態であり得る。滅菌濾過膜（例えば０．２ミクロンメンブレン）で濾過することにより無菌状態は容易に達成される。一般に、治療剤は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに配置される。
【００８６】
治療剤は、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物として貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾過した５％（ｗ／ｖ）治療剤水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。凍結乾燥した治療剤を、注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製する。
【００８７】
本発明はまた、本発明の治療剤の１つ以上の成分を満たした一つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。さらに、治療剤を他の治療用化合物と組み合わせて使用し得る。
【００８８】
本発明の治療剤は、単独または他の治療剤と組合わせて投与され得る。組合わせは、例えば、混合物として同時に；同時にまたは並行してだが別々に；あるいは経時的のいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療用混合物として共に投与されるという提示、およびまた、組み合わされた薬剤が、別々にしかし同時に、例えば、同じ個体に別々の静脈ラインを通じて投与される手順を含む。「組み合わせて」の投与は、一番目、続いて二番目に与えられる化合物または薬剤のうち１つの別々の投与をさらに含む。
【００８９】
（５．ＶＮＵＴ遺伝子発現阻害剤）
本発明において使用されるＶＮＵＴ阻害活性を有する化合物としては、クロドロン酸以外に例えば、ＶＮＵＴ遺伝子発現阻害剤が挙げられるがこれらに限定されない。ＶＮＵＴ遺伝子発現阻害剤は、本発明の薬学的組成物の有効成分として用いることができる。ＶＮＵＴ遺伝子発現阻害剤としては、例えば、ｓｉＲＮＡが挙げられるがこれに限定されない。
【００９０】
本発明の遺伝子は、ｓｉＲＮＡを用いてその発現をノックダウン（抑制）することが可能である。所定の遺伝子からｓｉＲＮＡを調製する方法は周知であり、例えば、当該分野で公知のｓｉＲＮＡ提供業者（例えば、株式会社  ニッポンイージーティー、富山、日本）により、アニーリングしている２本鎖の合成ｓｉＲＮＡを入手することができる。その合成ｓｉＲＮＡをＲＮＡｓｅフリーの溶液に溶解し、最終濃度が２０μＭになるように調整し、その後細胞へ導入する。ｓｉＲＮＡを調製する場合には、例えば、（１）ＧまたはＣが連続して４つ以上存在しない、（２）ＡまたはＴが連続して４つ以上存在しない、（３）ＧあるいはＣが９塩基以上存在しない、などの条件を加えてもよい。本発明のｓｉＲＮＡは、１９塩基長、２０塩基長、２１塩基長、２２塩基長、２３塩基長、２４塩基長、２５塩基長、２６塩基長、２７塩基長、２８塩基長、２９塩基長、または３０塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡは、好ましくは、１９塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２０塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２１塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２２塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２３塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２４塩基長である。
【００９１】
ＶＮＵＴ遺伝子発現阻害剤によるＶＮＵＴ遺伝子発現の阻害効果は、周知の方法で確認することが可能である。
【００９２】
（６．他の薬剤との併用）
本発明のＶＮＵＴ阻害剤は、以下からなる群から選択される活性成分と併用することが可能である：
・抗真菌剤（カンジダ、白癬などに使用）
・ステロイド剤（掻痒症状がひどい場合にやむをえず）
・乾癬の治療薬（自己免疫疾患であり痒みや痛みを伴うことがある）
・褥瘡などの潰瘍に使用する薬剤
・痛みどめの外用剤
・痒みどめの外用剤
・アトピー性皮膚炎の治療薬
・にきび治療薬
・皮膚細菌感染症一般。
これらを以下の表にまとめた。
【００９３】
【表１】
2019014684.tif 000014
【００９４】
【表２】
2019014684.tif 000015
【００９５】
【表３】
2019014684.tif 000016
【００９６】
複数の活性成分は、単一の組成物として処方しても、別々の組成物として処方してもよい。あるいは、複数の活性成分は、単一の処方物において、別の層として、別の微粒子として、別の相として存在してもよい。複数の活性成分を別々の組成物として処方した場合、これら別々の組成物は、同じ投与レジメンによって投与されても、異なる投与レジメンによって投与されてもよい。あるいは、これら別々の組成物は、ほぼ同時に投与されても、逐次的に投与されても、あるいは、別の時点で投与されてもよい。
【００９７】
本発明において、周知の種々の抗真菌剤を使用することができる。抗真菌剤は、例えば、ミコナゾール、クロトリアゾール、エコナゾール硝酸塩、イソコナゾール硝酸塩、ビホナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール、テルビナフィン塩酸塩、トルナフタート、および、リラナフタートからなる群から選択されるが、これらに限定されない。
【００９８】
本発明において、周知の種々の副腎皮質ステロイド剤を使用することができる。副腎皮質ステロイド剤は、例えば、クロベタゾールプロピオン酸エステル、ジフロラゾン酢酸エステル、ベタメタゾンジプロピオン酸エステル、ジフルプレドナート、および、フルオシノニドからなる群から選択されるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００９９】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
【０１００】
（方法および材料）
（１）昆虫細胞における輸送体の発現および精製
小胞神経伝達物質輸送体を昆虫細胞において発現し、精製した（Ｊｕｇｅら、（２０１０）Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｒｅｌｅａｓｅ、Ｎｅｕｒｏｎ  ６８：９９−１１２）。目的の遺伝子を含む組換えバキュロウイルスは、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してメーカーの手順に従って作製された。細胞（１〜２×１０８）を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、１０％グリセロール、０．５ｍＭジチオスレイトール、１０μｇ／ｍＬペプスタチンＡ、および１０μｇ／ｍＬロイペプチンを含む緩衝液に懸濁し、ＴＯＭＹ  ＵＤ２００超音波発生機を使用した超音波処理により破砕した。細胞溶解物を、破片を除去するために７００×ｇで１０分間遠心分離し、得られた上清を１６０，０００×ｇで１時間４℃で遠心分離した。ペレット（膜画分）を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０％グリセロール、１０μｇ／ｍＬペプスタチンＡ、および１０μｇ／ｍＬロイペプチンを含む緩衝液に約１．５ｍｇタンパク質／ｍＬで懸濁し、２％オクチルグルコシド（同仁化学研究所、熊本）で可溶化した。２６０，０００×ｇでの３０分間の遠心分離後、上清が採取され、１ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。４℃で４時間のインキュベーション後、樹脂を２０ｍＬの２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、４ｍＭイミダゾール、２０％グリセロール、および１％オクチルグルコシドで洗浄した。タンパク質が６０ｍＭイミダゾールを含む３ｍＬの同様の緩衝液で樹脂から溶出され、少なくとも数ヶ月間活性を失うことなく−８０℃での保存が可能であった。
【０１０１】
（２）蛍光消光を介したΔψの測定
発明者らは、オキソノールＶ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の蛍光消光を測定することによってΔψ（内側プラス）をアッセイした。プロテオリポソームに組み込まれた１μｇのタンパク質、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、１４０ｍＭ酢酸カリウム、５ｍＭの酢酸マグネシウム、１０ｍＭ  ＫＣｌ、および１μＭオキソノールＶからなる反応混合物（４５０μＬ）を２７℃で５０秒間インキュベートした。反応は、列挙されている阻害剤の存在下／不在下における２μＭバリノマイシンの追加により開始され、２μＭカルボニルシアニド−ｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）の追加により停止した。
【０１０２】
（３）ＡＴＰ結合アッセイ
ＶＮＵＴタンパク質の光親和性標識を実質的に前記されたように実施した（Ｓｈｉｍａｄａ−Ｓｈｉｍｉｚｕら、（２０１３）  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  Ｎａ＋／Ｈ＋  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  １  ｉｓ  ａｎ  ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＦＥＢＳ  Ｊ．２８０：１４３０−１４４２）。２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ酢酸カリウム、２ｍＭ酢酸マグネシウム、１０ｍＭ  ＫＣｌ、および０．１％ＤＴＭを含む５０μＬの緩衝液において、２０μＭの濃度のビオチン−１１−ＡＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を４μｇのＶＮＵＴタンパク質と暗所において氷上で混合した。氷上で３分のインキュベーション後、１０分間携帯ＵＶランプを用いて２５４ｎｍで溶液を照射した。照射後、１０％ＳＤＳ、５０％グリセロール、０．３％ＥＤＴＡ、６％トリスおよびブロモフェノールブルーを含む試料緩衝液を追加することにより架橋反応を中止させた。その後、試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）、続いて抗ストレプトアビジン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）による免疫ブロットに供した。
【０１０３】
（４）動物実験
動物実験は、岡山大学動物実験委員会、大阪大学実験動物委員会、および味の素株式会社により制定されたガイドラインに従って行われた。すべての実験は承認された施設ガイドラインに従って実施された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびウィスターラットを日本エスエルシー株式会社（浜松）より購入した。ＶＮＵＴ−／−マウスを前記されたように生成した（Ｓａｋａｍｏｔｏら、（２０１４）Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ＡＴＰ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ、Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．４：６６８９）。これらの動物を１２時間の明暗周期下において２３±１℃の温度で個別で、またはケージにつき４匹以下のグループで飼育し、飼料および水への自由なアクセスを与えた。慢性炎症性疼痛モデルでは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雄、試験時２２〜３０ｇ）に対し、２７ゲージ針を有する１００μＬハミルトンマイクロシリンジを使用して左後足の足底表面に２０μＬの１ｍｇ／ｍＬ  ＣＦＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）または１％カラゲニン溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を注射した（Ｘｕら、（２０１０）Ｒｅｓｏｌｖｉｎｓ  ＲｖＥ１  ａｎｄ  ＲｖＤ１  ａｔｔｅｎｕａｔｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐａｉｎ  ｖｉａ  ｃｅｎｔｒａｌ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ａｃｔｉｏｎｓ、Ｎａｔ．Ｍｅｄ、１６：５９２−５９７）。慢性神経障害性疼痛モデルでは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雄、試験時２２〜３０ｇ）に対し、上腿部の約半分の坐骨神経を片側結紮に供した（Ｓｅｌｔｚｅｒら、（１９９０）Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ｐａｉｎ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ｂｙ  ｐａｒｔｉａｌ  ｓｃｉａｔｉｃ  ｎｅｒｖｅ  ｉｎｊｕｒｙ、Ｐａｉｎ  ４３：４５０−４５６）。すべての実験において、動物を各実験グループに無作為に分割した。
【０１０４】
（５）細胞培養ならびに神経細胞および星状細胞の単離
ラット胎児海馬神経細胞を単離し、前記されたように培養した（Ｂａｎｋｅｒら、（１９７７）Ｒａｔ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１２６：３９７−４４２）。単離後、海馬を３７℃で１５分間０．２５％トリプシンと０．０１％デオキシリボヌクレアーゼＩを含むハンクス液においてインキュベートした。細胞をダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で二度洗浄し、３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気下において０．５ｍＭグルタミン、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍＬファンギゾン、およびＢ２７サプリメント（ＧＩＢＣＯ）を追加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（ＧＩＢＣＯ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）において２．０×１０５個／３．５ｃｍ培養皿で培養した。海馬星状細胞を、神経細胞に対して使用されたものと同様な手順を使用して単離し、３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気下において１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭにおいて培養した。
【０１０５】
（６）アレンドロン酸の神経細胞および星状細胞への取り込み
初代培養細胞（２．０×１０５個／３．５ｃｍ培養皿）を、１２８ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）から構成される取込溶液で二度洗浄した。３７℃で２０分間の取込溶液におけるインキュベーション後、細胞を、１２８ｍＭ  ＮａＣｌまたは２５６ｍＭショ糖、２ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）から構成される取込溶液で再度二度洗浄した。アレンドロン酸を、１０μＭ［ｌ−１４Ｃ］アレンドロン酸（０．５ＭＢｑ／μｍｏｌ；Ｍｏｒａｖｅｋ；Ｂｒｅａ，ＣＡ）を含む取込溶液において３７℃で１０分間取り込ませた。インキュベーション後、細胞を取込溶液において三度洗浄し、１％ＳＤＳで溶解した。液体シンチレーション計数法を介して溶解物における放射能を測定した（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）。
【０１０６】
（７）足底試験
足底試験を前記されたように実施した（Ｘｕら、（２０１０）Ｒｅｓｏｌｖｉｎｓ  ＲｖＥ１  ａｎｄ  ＲｖＤ１  ａｔｔｅｎｕａｔｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐａｉｎ  ｖｉａ  ｃｅｎｔｒａｌ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ａｃｔｉｏｎｓ、Ｎａｔ．Ｍｅｄ、１６：５９２−５９７）。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雄、試験時２２〜３０ｇ）を、足底試験前に６０分間にわたり高架アクリル観察室（１４．０×１７．０×１１．０ｃｍ）に順応させた。熱痛覚過敏をハーグリーブス放射熱装置（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ，Ｖａｒｅｓｅ，Ｉｔａｌｙ）を用いて評価した。熱源である携帯型赤外線フォトビームを左後足の足底表面の下に配置した。未処理コントロールマウスにおける組織損傷を防止するために、停止点を２０秒に設定した。クロドロン酸を１００μＬ／１０ｇ体重の容量で足底試験の６０分前に尾静脈から静脈注射した。
％ＭＰＥ＝［（ＰＬ−ＢＬ２）／（ＢＬ１−ＢＬ２）］×１００
と算定し、ここでＢＬ１は炎症以前の標準潜伏期間を表し、ＢＬ２は炎症後であるが投薬前の標準潜伏期間を表し、ＰＬは投薬後の潜伏期間を表す。
【０１０７】
（実施例１）
クロドロン酸は、ビスホスホネートの一種である。ビスホスホネートは骨粗鬆症の治療薬の有効成分として第一世代から第三世代まで開発されている。世代が進むにつれ、骨粗鬆症の治療効果は高いものの、副作用も強くなる。第一世代のクロドロン酸は骨粗鬆症の治療効果も弱く、副作用も弱い特徴がある。市販されている種々のビスホスホネートを図１に示す。
【０１０８】
図２は、図１に示した種々のビスホスホネートについて、ＶＮＵＴ阻害のＩＣ５０と骨粗鬆症治療効果とをまとめたものである。ＩＣ５０は１０ｍＭ  Ｃｌ存在下で、２分間の処理によってＶＮＵＴ活性の５０％を阻害するために必要な濃度である。ＶＮＵＴ活性は、精製ＶＮＵＴを含むプロテオリポソームへのΔψ依存性ＡＴＰ取り込みによって測定した（ｎ＝３〜１３）。骨粗鬆症治療効果は、以下の指標により示した：−効果なし；＋弱い効果；＋＋中程度の効果；＋＋＋強力な効果；＋＋＋＋非常に強力な効果。
【０１０９】
（実施例２：クロドロン酸はＶＮＵＴ  Ｃｌ−依存性のアロステリック調節因子である）
発明者らは、ＶＮＵＴ媒介ＡＴＰ取り込みに対するクロドロン酸の阻害効果の根本的なメカニズムを検討した。オキソノール―Ｖ蛍光消光に基づいた実験で、高濃度のクロドロン酸への暴露がΔψに影響を与えなかったことが示された（図３Ａ）。ＡＴＰの取り込みのＣｌ−依存性の分析から、２ｍＭＣｌ−までの暴露後のＡＴＰ輸送に変化がないことが明らかになった：ＡＴＰの取り込みは３〜７ｍＭのＣｌ−での処理後に顕著に増加し、８ｍＭ  Ｃｌ−以上で安定化した（図３Ｂ）。特に、Ｃｌ−依存性ＶＮＵＴ活性化は、ＡＴＰ輸送に対し高い正の協働性を示し、ヒル係数はＣｌ−に対し約３であった（図３Ｃ）。クロドロン酸は、Ｃｌ−濃度をより高い活性化水準に移行させるため、これは競争的相互作用を示唆する（図３Ｂ、Ｃ）。ＡＴＰ結合の光親和性標識はＡＴＰ輸送媒介基質特異性に対するものとほぼ同一であり、クロドロン酸とエチドロン酸のいずれによっても阻害されなかった（図３Ｄ）。また、Ｃｌ−依存的にＳＬＣ１７輸送体を阻害することが知られている（Ｊｕｇｅら、（２０１０）Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｒｅｌｅａｓｅ、Ｎｅｕｒｏｎ  ６８：９９−１１２、および、Ｈｉａｓａら、（２０１４）Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｉｎ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｒａｇｅ  ａｎｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｒｅｐ．２：ｅ１２０３４）アセト酢酸またはグリオキシル酸などのケト酸は、ＡＴＰ結合を阻害しなかった（図３Ｄ）。これらのクロドロン酸の効果は完全に可逆的であった（図３Ｅ）。
【０１１０】
（実施例３：クロドロン酸は小胞ＡＴＰ放出を調整する）
ＡＴＰは主にＶＮＵＴ媒介性開口放出を介して神経細胞または星状細胞から放出される（Ｓａｋａｍｏｔｏら、（２０１４）Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ＡＴＰ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ、Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．４：６６８９、および、Ｊｕｎｇら、（２０１３）Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ＡＴＰ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４３０：４８８−４９３）。１００ｎＭの低濃度でのクロドロン酸は、骨吸収阻害について記載されたものと比較して、高ＫＣｌ濃度を介した脱分極依存性刺激時の神経細胞ＡＴＰ放出を完全に阻害した（図４Ａ）（Ｓａｈｎｉら、（１９９３）Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ  ａｃｔ  ｏｎ  ｒａｔ  ｂｏｎｅ  ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｍｅｄｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２００４−２０１１）。並行して実施された実験においては、１μＭのクロドロン酸は、グルタミン酸放出を阻害しないため、これはクロドロン酸が選択的に小胞ＡＴＰ放出を選択的に阻害することを示唆する（図４Ｂ）。また、ＡＴＰ放出に対するクロドロン酸の効果は、完全に可逆的であった（図４Ａ）。さらに、星状細胞からの分極依存性ＡＴＰおよびグルタミン酸放出は１μＭのクロドロン酸でも阻害されなかった（図４Ｃ、Ｄ）。神経細胞および星状細胞へのビスホスホネートのアクセス性を調査するために、発明者らは、市販の放射標識されたビスホスホネートの取り込みを測定した。Ｎａ＋依存性ビスホスホネート輸送活性は、神経細胞において検出されるが星状細胞においては検出されず、クロドロン酸および無機リン酸（Ｐｉ）により完全に阻害されるため、Ｐｉ輸送に神経細胞へのビスホスホネートの取り込みが関与することを示唆する（図４Ｅ）。
【０１１１】
（実施例４：クロドロン酸はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来可溶ベータ−グルカン（ＣＳＢＧ）誘発機械的アロディニアを阻害する）
Ｂ６Ｊマウスを１２〜３６時間、試験を行う部屋で飼育し環境に慣れさせた。Ｂ６ＪマウスにＰＢＳまたはクロドロネートを静注（１０ｍｇ／ｋｇ  ｂｗ）し６０分後、後肢にＰＢＳまたはカンジダ由来の可溶性βグルカン（１５μｇ／２５μｌ  ＰＢＳ）を、Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら（（２００２）Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ｃｅｌｌ  ｗｅｌｌ  ｂｅｔａ−ｇｌｕｃａｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２（８）：１１０９−１１２２）の方法に従ってカンジダより抽出）を皮下注射した。その後、経時的に電子Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ痛覚測定装置（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｍｅｔｅｒ，ＩＩＴＣ  Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｌａｎｄ  Ｈｉｌｌｓ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を用いてマウス後肢のメカニカルセンシティビティーを測定した。その結果、図５に示されるように、クロドロン酸がＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来可溶ベータ−グルカン（ＣＳＢＧ）誘発機械的アロディニアを阻害したことが示された。
【０１１２】
（実施例５：ＣＳＢＧによるヒスタミン非依存性掻痒感の増進はクロドロン酸処理により消失する）
Ｂ６Ｊマウスを１２〜３６時間、試験を行う部屋で飼育し環境に慣れさせた。Ｂ６Ｊマウスの頬にＰＢＳまたはクロドロネート（３００μｇ／２５μｌ  ＰＢＳ）を皮下注し６０分後、同じ頬にクロロキン（ＣＱ）（２００μｇ／２５μｌ  ＰＢＳ，Ｃ６６２８，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）またはクロロキン（２００μｇ／２５μｌ  ＰＢＳ，Ｃ６６２８，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  ＵＳＡ）にカンジダ由来可溶性βグルカン（１５０  μｇ  ｐｅｒ  ２５  μｌ  ＰＢＳ）を追加した混合物を投与し、後肢による頬のひっかき行動の回数を計測した。その結果、図６に示されるように、ＣＳＢＧによるヒスタミン非依存性掻痒感の増進はクロドロン酸処理により消失したことが示された。
【０１１３】
（実施例６：ＣＳＢＧによるヒスタミン非依存性掻痒感の増進はラミナリン（デクチン１アンタゴニスト）処理により消失する）
Ｂ６Ｊマウスを１２〜３６時間、試験を行う部屋で飼育し環境に慣れさせた。Ｂ６Ｊマウスの頬にＰＢＳまたはラミナリン（ｌａｍｉｎａｒｉｎ  ５μｇ／２５μｌ  ＰＢＳ，ｓｉｇｍａ  ｃａｓ−ｎｏ  ９００８  ２２−４）を皮下注し６０分後、同じ頬にクロロキン（ＣＱ）（２００μｇ／２５μｌ  ＰＢＳ，Ｃ６６２８，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）またはクロロキン（２００μｇ／２５μｌ  ＰＢＳ，Ｃ６６２８，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）にカンジダ由来可溶性βグルカン（１５０μｇ／２５μｌ  ＰＢＳ）を添加した混合物を投与し、後肢による頬のひっかき行動の回数を計測した。その結果、図７に示されるように、ＣＳＢＧによるヒスタミン非依存性掻痒感の増進はラミナリン（デクチン１アンタゴニスト）処理により消失したことが示された。
【０１１４】
（実施例７：小胞内に蓄積されたＡＴＰの放出（エキソサイトーシス）を阻害する化合物による薬理効果）
ＶＮＵＴによって小胞内に蓄積したＡＴＰの細胞外への放出を阻害する効果を有する化合物が、真菌感染によって生じる疼痛および／または痒みの処置、ならびに／あるいは、真菌感染の処置において優れた効果を発揮することが以下のとおり示された。
【０１１５】
ＶＮＵＴによって小胞内に蓄積したＡＴＰはエキソサイトーシスによって細胞外へ放出される。そこで、ホスホリパーゼＣおよびＡ２のインヒビターであるＵ−７３１２２（１−［６−［［１７β−３−メトキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１７−イル］アミノ］ヘキシル］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオネル（１−［６−［［１７ｂｅｔａ−３−ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒａ−１，３，５（１０）−ｔｒｉｅｎ−１７−ｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｈｅｘｙｌ］−１Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｅ−２，５−ｄｉｏｎｅｌ）、Ｓｉｇｍａ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．Ｕ６７５６）を用いた疼痛および／または痒みに対する治療効果を試験した。
【０１１６】
（Ａ）まず最初に、Ｕ−７３１２２がインビトロ（ケラチノサイト）においてＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに起因するＡＴＰ放出を抑制するか否かについて試験した。マンナン（１００μｇ／ｍｌ）、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来可溶ベータ−グルカン（ＣＳＢＧ）（１００μｇ／ｍｌ）、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来微粒子状ベータ−グルカン（ＣＰＢＧ）（１００μｇ／ｍｌ）、ｈｋ  Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（６５℃で１時間加熱して死滅させたＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、または、ｈｋ  Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ＋Ｕ−７３１２２（１０μＭ）の組み合わせのそれぞれを用いてケラチノサイト（野生型およびＤｅｃｔｉｎ−１−／−）を３時間刺激し、培養上清に放出されたＡＴＰ濃度を測定した。結果を図８Ａに示す（ｎ＝４）。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに起因するＡＴＰ放出がＵ−７３１２２によって抑制されたことが示された。また、Ｄｅｃｔｉｎ−１−／−ケラチノサイトでは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに起因するＡＴＰ放出が大きく減少したことから、ＡＴＰ放出は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来の物質が、真菌受容体であるＤｅｃｔｉｎ−１に結合することによって生じたと考えられる。
【０１１７】
（Ｂ）次に、Ｕ−７３１２２がＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来可溶ベータ−グルカン（ＣＳＢＧ）誘発機械的アロディニアを阻害するか否か試験した。Ｕ−７３１２２の予備注射３０分後にＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来可溶ベータ−グルカン（ＣＳＢＧ）を注射し（１０ｍｇ／ｋｇ静脈注射、足蹠へのＣＳＢＧ注射）、誘発された機械的アロディニアを測定した。結果を図８Ｂに示す（ｎ＝６／グループ）。エラーバー、ＳＥＭ；＊ｐ＜０．０５。その結果、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来可溶ベータ−グルカン（ＣＳＢＧ）によって誘発される機械的アロディニア（疼痛および／または痒みの指標）がＵ−７３１２２によって顕著に抑制されたことが示された。この抑制のレベルは、ＶＮＵＴを直接阻害する化合物の場合と同程度であった（図５参照）。
【０１１８】
（実施例８）
ＶＮＵＴへの阻害活性を指標として、真菌感染によって生じる疼痛および／または痒みを処置するための治療剤の探索を以下のとおりに行う。例えば、候補物質（被検物質）がＶＮＵＴへの阻害活性を有するか否か、また、候補物質（被検物質）が下記疾患の予防剤又は治療剤であるか否かを決定する方法を以下のとおりに行うことができる。
【０１１９】
本発明はさらに、被検物質が、ＶＮＵＴを阻害し得るか否かを評価する工程を含む、真菌感染によって生じる疼痛および／または痒みの治療剤のスクリーニング方法（本発明のスクリーニング方法）を提供する。後述の実施例に示されるように、ＶＮＵＴの働きを阻害すると、これら疾患の症状が軽減されるので、ＶＮＵＴの阻害活性を指標として、真菌感染によって生じる疼痛および／または痒みの治療剤をスクリーニングすることが可能である。
【０１２０】
本発明のスクリーニング方法は、被検物質が、ＶＮＵＴ活性を阻害し得るか否かを評価する工程を含む。ＶＮＵＴ活性を阻害し得るか否かを評価する工程は、具体的には、被検物質の存在下及び非存在下でのＶＮＵＴ活性を測定し両者を比較することによって実施される。ＶＮＵＴ活性の測定は、通常、インビトロにおいて行われる。
【０１２１】
本発明のスクリーニング方法は、具体的には、以下の工程を含む：
（１）被検物質の存在下において、ＶＮＵＴ活性を測定する工程；
（２）当該被検物質の非存在下において、ＶＮＵＴ活性を測定する工程；
（３）当該被検物質の存在下における当該ＶＮＵＴ活性を、当該被検物質の非存在下における当該ＶＮＵＴ活性と比較する工程；及び
（４）比較の結果、当該被検物質の非存在下におけるＶＮＵＴの活性と比較して、当該被検物質の存在下におけるＶＮＵＴ活性が低い被検物質を、真菌感染によって生じる疼痛および／または痒みの治療剤の候補物質として選択する工程。
【０１２２】
本発明のスクリーニング方法に供される被検物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、ランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【０１２３】
ＶＮＵＴ活性の指標としては、トランスポーター活性、ＡＴＰによるシグナル伝達活性が挙げられるがこれらに限定されない。一実施態様として、ＶＮＵＴ活性の測定は、例えば、Ｊｕｇｅ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ  ６８，９９−１１２．（２０１０）に記載の方法、上述の方法等に準じて、ＶＮＵＴを介したＡＴＰのとりこみを測定することにより測定することができる。例えば、精製したＶＮＵＴタンパク質が組込まれたプロテオリポソームを、標識したＡＴＰ（例えば、［３Ｈ］−ＡＴＰ等の放射性同位元素で標識されたＡＴＰ等）を含む測定溶液中でインキュベートし、リポソーム内に取り込まれたＡＴＰ量を測定することにより（例えば、標識したＡＴＰとして放射性同位元素で標識されたＡＴＰを用いる場合、液体シンチレーションカウンターを用いて測定する等）、ＶＮＵＴの活性を測定することができるが、これに限定されない。ＶＮＵＴが組込まれたプロテオリポソームは、例えば、精製したＶＮＵＴタンパク質とリポソームとを混合し、凍結させた後に溶解をし、再構成バッファーに溶解することにより作製することができる。このプロテオリポソームを、Δψを付与する物質（例、バリノマイシン等）、Ｃｌ−（例、ＫＣl等）及び標識したＡＴＰ（例、［３Ｈ］−ＡＴＰ）を含む溶液中で、一定時間インキュベートし、遠心カラムを用いてプロテオリポソームを外部培地から分離することにより輸送を終結させ、液体シンチレーションカウンターにより得られた溶出物中の放射線を測定し取り込まれたＡＴＰ量を計算することにより、ＶＮＵＴの活性を測定することができる。
【０１２４】
また別の態様として、ＶＮＵＴ活性の測定は、ＶＮＵＴ依存的にＡＴＰを細胞外に放出し得る細胞を用い、ＡＴＰ放出刺激に対して、細胞外に放出されるＡＴＰ量を測定することにより測定することができる。ＶＮＵＴ依存的にＡＴＰを細胞外に放出し得る細胞を用いたＶＮＵＴの活性の測定は、例えば、Ｊｕｇｅら、Ｎｅｕｒｏｎ  ６８，９９−１１２．（２０１０）に記載の方法、Ｓａｋａｍｏｔｏら、Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．４，１−１０（２０１４）に記載の方法、ＨｉａｓａらＰｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｐ．２，ｅ１２０３４（２０１４）に記載の方法等に準じて行うことができる。ＶＮＵＴ依存的にＡＴＰを細胞外に放出し得る細胞としては、海馬神経初代培養等の神経細胞、血小板などが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、ＶＮＵＴの活性の測定は、ＶＮＵＴ依存的にＡＴＰを細胞外に放出し得る細胞に被検物質を接触させた後、該細胞にＶＮＵＴ依存的なＡＴＰ放出刺激を与え、細胞外に放出されるＡＴＰ量を測定することにより、測定することができる。
【０１２５】
工程（１）及び（２）は、同時に行ってもよく、別々に行ってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に行うことが好ましい。
【０１２６】
ＶＮＵＴの活性の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれ得る。なお、被検物質の非存在下におけるＶＮＵＴの活性は、被検物質の存在下におけるＶＮＵＴの活性の測定に対し、事前に測定した値であっても、同時に測定した値であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した値であることが好ましい。
【０１２７】
尚、被検物質の存在下におけるＶＮＵＴの活性測定についての試験条件（リポソームの作製方法、用いる細胞の種類及び培養条件等）は、被検物質が存在する点を除き、被検物質の非存在下で行うＶＮＵＴの活性測定と同一であることが好ましい。
【０１２８】
そして、比較の結果、ＶＮＵＴの活性を抑制した被検物質を、真菌感染によって生じる疼痛および／または痒みを治療する作用を有する物質の候補物質として選択することが出来る。
【０１２９】
このようにして選択された候補物質が、実際に真菌感染によって生じる疼痛および／または痒みを治療する作用を有するか確認する試験を引き続き行ってもよい。具体的には、本発明のスクリーニング方法は、さらに下記の（５）〜（７）の工程を含み得る；
（５）真菌感染によって生じる疼痛および／または痒みの疾患または状態モデル非ヒト哺乳動物に工程（４）で選択した候補物質を投与すること；
（６）該非ヒト哺乳動物における真菌感染によって生じる疼痛および／または痒みを評価すること；
（７）候補物質を投与した非ヒト哺乳動物における疾患の症状を、候補物質を投与していない対照非ヒト哺乳動物における真菌感染によって生じる疼痛および／または痒みと比較すること。
【０１３０】
非ヒト哺乳動物における真菌感染によって生じる疼痛および／または痒み症状の評価は、当業者に周知のパラメーター等に基づき行われる。
【０１３１】
尚、対照非ヒト哺乳動物についての試験条件（動物の種類、疾患モデルの種類等）は、候補物質を投与しない点を除き、候補物質を投与する非ヒト哺乳動物と同一であることが好ましい。
【０１３２】
そして、候補物質を投与した非ヒト哺乳動物における症状が、候補物質を投与していない対照非ヒト哺乳動物における症状よりも有意に軽減されている場合には、当該候補物質を、真菌感染によって生じる疼痛および／または痒みを治療する活性を有する物質として得ることが出来る。
【０１３３】
本明細書中、ＶＮＵＴは、通常、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、カンガルー、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット等の哺乳動物由来のものを意味する。本明細書中、ＶＮＵＴが哺乳動物由来であるとは、ＶＮＵＴのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列が、哺乳動物のものであることを意味する。
【０１３４】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【配列表フリーテキスト】
【０１３５】
配列番号１は、ヒトＳＬＣ１７Ａ９の核酸配列である。
配列番号２は、ヒトＳＬＣ１７Ａ９のアミノ酸配列である。
配列番号３は、マウスＳＬＣ１７Ａ９の核酸配列である
配列番号４は、マウスＳＬＣ１７Ａ９のアミノ酸配列である。
配列番号５は、ラットＳＬＣ１７Ａ９の核酸配列である
配列番号６は、ラットＳＬＣ１７Ａ９のアミノ酸配列である。
配列番号７は、ウシＳＬＣ１７Ａ９の核酸配列である
配列番号８は、ウシＳＬＣ１７Ａ９のアミノ酸配列である。
配列番号９は、イヌＳＬＣ１７Ａ９の核酸配列である
配列番号１０は、イヌＳＬＣ１７Ａ９のアミノ酸配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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