(57)【要約】      （修正有）【課題】ボツリヌス菌神経毒素による中毒を治療するための組成物及び方法の提供。【解決手段】ボツリヌス菌の１つ以上の血清型に由来する神経毒素を用いた致死的攻撃に対する防御をもたらす抗神経毒素ワクチン。【選択図】図１Ａ−Ｃ
2019142947.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボツリヌス神経毒素に対する免疫反応を誘導する１つ以上の抗原をコードする核酸分子を含むワクチンであって、前記１つ以上の抗原は、
（ａ）ボツリヌス神経毒素血清型Ａの重鎖アミノ酸配列（配列番号２）、
（ｂ）ボツリヌス神経毒素血清型Ｂの重鎖アミノ酸配列（配列番号４）、
（ｃ）ボツリヌス神経毒素血清型Ｅの重鎖アミノ酸配列（配列番号６）、
（ｄ）ボツリヌス神経毒素血清型Ｆの重鎖アミノ酸配列（配列番号８）、
（ｅ）ボツリヌス神経毒素血清型Ａの重鎖アミノ酸配列（配列番号２）と９６％以上同一であるアミノ酸配列、
（ｆ）ボツリヌス神経毒素血清型Ｂの重鎖アミノ酸配列（配列番号４）と９６％以上同一であるアミノ酸配列、
（ｇ）ボツリヌス神経毒素血清型Ｅの重鎖アミノ酸配列（配列番号６）と９６％以上同一であるアミノ酸配列、及び
（ｈ）ボツリヌス神経毒素血清型Ｆの重鎖アミノ酸配列（配列番号８）と９６％以上同一であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ワクチン。
【請求項２】
前記核酸分子が、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号７からなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記核酸分子がプラスミドである、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
前記核酸分子が１つ以上のプラスミドである、請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】
アジュバント分子をさらに含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項６】
前記アジュバントがＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８またはＲＡＮＴＥＳである、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
請求項１に記載のワクチンを含む、ボツリヌス神経毒素に対する免疫反応を誘導するための医薬組成物。
【請求項８】
請求項１に記載のワクチンを含む、ボツリヌス中毒から対象を防御するための医薬組成物。
【請求項９】
電気穿孔法を介して投与される、請求項７または８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ボツリヌス神経毒素に対する免疫反応を誘導する２つの抗原をコードする１つ以上の核酸分子を含むワクチンであって、前記２つの抗原は、
（ａ）ボツリヌス神経毒素血清型Ａの重鎖アミノ酸配列（配列番号２）、
（ｂ）ボツリヌス神経毒素血清型Ｂの重鎖アミノ酸配列（配列番号４）、
（ｃ）ボツリヌス神経毒素血清型Ｅの重鎖アミノ酸配列（配列番号６）、
（ｄ）ボツリヌス神経毒素血清型Ｆの重鎖アミノ酸配列（配列番号８）、
（ｅ）ボツリヌス神経毒素血清型Ａの重鎖アミノ酸配列（配列番号２）と９６％以上同一であるアミノ酸配列、
（ｆ）ボツリヌス神経毒素血清型Ｂの重鎖アミノ酸配列（配列番号４）と９６％以上同一であるアミノ酸配列、
（ｇ）ボツリヌス神経毒素血清型Ｅの重鎖アミノ酸配列（配列番号６）と９６％以上同一であるアミノ酸配列、及び
（ｈ）ボツリヌス神経毒素血清型Ｆの重鎖アミノ酸配列（配列番号８）と９６％以上同一であるアミノ酸配列からなる群から選択される２つのアミノ酸配列を含む、ワクチン。
【請求項１１】
前記核酸分子が、ボツリヌス神経毒素血清型Ａの重鎖アミノ酸配列及びボツリヌス神経毒素血清型Ｂの重鎖アミノ酸配列をコードする、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記ボツリヌス神経毒素血清型Ａ及びボツリヌス神経毒素血清型Ｂの重鎖アミノ酸配列が、単一のアミノ酸配列（配列番号９）内に含まれる、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記核酸分子が、ボツリヌス神経毒素血清型Ｅの重鎖アミノ酸配列及びボツリヌス神経毒素血清型Ｆの重鎖アミノ酸配列をコードする、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記ボツリヌス神経毒素血清型Ｅ及びボツリヌス神経毒素血清型Ｆの重鎖アミノ酸配列が、単一のアミノ酸配列（配列番号１０）内に含まれる、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
ボツリヌス神経毒素に対する免疫反応を誘導する３つの抗原をコードする１つ以上の核酸分子を含むワクチンであって、前記３つの抗原は、
（ａ）ボツリヌス神経毒素血清型Ａの重鎖アミノ酸配列（配列番号２）、
（ｂ）ボツリヌス神経毒素血清型Ｂの重鎖アミノ酸配列（配列番号４）、
（ｃ）ボツリヌス神経毒素血清型Ｅの重鎖アミノ酸配列（配列番号６）、
（ｄ）ボツリヌス神経毒素血清型Ｆの重鎖アミノ酸配列（配列番号８）、
（ｅ）ボツリヌス神経毒素血清型Ａの重鎖アミノ酸配列（配列番号２）と９６％以上同一であるアミノ酸配列、
（ｆ）ボツリヌス神経毒素血清型Ｂの重鎖アミノ酸配列（配列番号４）と９６％以上同一であるアミノ酸配列、
（ｇ）ボツリヌス神経毒素血清型Ｅの重鎖アミノ酸配列（配列番号６）と９６％以上同一であるアミノ酸配列、及び
（ｈ）ボツリヌス神経毒素血清型Ｆの重鎖アミノ酸配列（配列番号８）と９６％以上同一であるアミノ酸配列からなる群から選択される３つのアミノ酸配列を含む、ワクチン。
【請求項１６】
ボツリヌス神経毒素に対する免疫反応を誘導する４つの抗原をコードする１つ以上の核酸分子を含むワクチンであって、前記４つの抗原は、
（ａ）ボツリヌス神経毒素血清型Ａの重鎖アミノ酸配列（配列番号２）、
（ｂ）ボツリヌス神経毒素血清型Ｂの重鎖アミノ酸配列（配列番号４）、
（ｃ）ボツリヌス神経毒素血清型Ｅの重鎖アミノ酸配列（配列番号６）、
（ｄ）ボツリヌス神経毒素血清型Ｆの重鎖アミノ酸配列（配列番号８）、
（ｅ）ボツリヌス神経毒素血清型Ａの重鎖アミノ酸配列（配列番号２）と９６％以上同一であるアミノ酸配列、
（ｆ）ボツリヌス神経毒素血清型Ｂの重鎖アミノ酸配列（配列番号４）と９６％以上同一であるアミノ酸配列、
（ｇ）ボツリヌス神経毒素血清型Ｅの重鎖アミノ酸配列（配列番号６）と９６％以上同一であるアミノ酸配列、及び
（ｈ）ボツリヌス神経毒素血清型Ｆの重鎖アミノ酸配列（配列番号８）と９６％以上同一であるアミノ酸配列からなる群から選択される４つのアミノ酸配列を含む、ワクチン。
【請求項１７】
前記核酸分子が、ボツリヌス神経毒素血清型Ａの重鎖アミノ酸配列、ボツリヌス神経毒素血清型Ｂの重鎖アミノ酸配列、ボツリヌス神経毒素血清型Ｅの重鎖アミノ酸配列及びボツリヌス神経毒素血清型Ｆの重鎖アミノ酸配列をコードする、請求項１６に記載のワクチン。
【請求項１８】
前記ボツリヌス神経毒素血清型Ａ、ボツリヌス神経毒素血清型Ｂ、ボツリヌス神経毒素血清型Ｅ及びボツリヌス神経毒素血清型Ｆの重鎖アミノ酸配列が単一のアミノ酸配列に含まれる、請求項１７に記載のワクチン。
【請求項１９】
前記核酸分子が、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号７からなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２０】
前記核酸分子がプラスミドである、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２１】
前記核酸分子が１つ以上のプラスミドである、請求項１０、１５及び１６のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２２】
アジュバント分子をさらに含む、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２３】
前記アジュバントがＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８またはＲＡＮＴＥＳである、請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２４】
請求項１０〜１８のいずれか一項に記載のワクチンを含む、ボツリヌス神経毒素に対する免疫反応を誘導するための医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１０〜１８のいずれか一項に記載のワクチンを含む、ボツリヌス中毒から対象を防御するための医薬組成物。
【請求項２６】
電気穿孔法を介して投与される、請求項２４または２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
ボツリヌス神経毒素に対する免疫反応を誘導する１つ以上の抗原をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記１つ以上のヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１と９５％以上同一であるヌクレオチド配列、配列番号３と９５％以上同一であるヌクレオチド配列、配列番号５と９５％以上同一であるヌクレオチド配列、配列番号７と９５％以上同一であるヌクレオチド配列及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、核酸分子。
【請求項２８】
前記核酸分子がプラスミドである、請求項２７に記載の核酸分子。
【請求項２９】
前記核酸分子が１つ以上のプラスミドである、請求項２７に記載の核酸分子。
【請求項３０】
前記１つ以上のヌクレオチド配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号２と９５％以上同一のアミノ酸配列、配列番号４と９５％以上同一のアミノ酸配列、配列番号６と９５％以上同一のアミノ酸配列、配列番号８と９５％以上同一のアミノ酸配列、配列番号９と９５％以上同一のアミノ酸配列、配列番号１０と９５％以上同一のアミノ酸配列、配列番号１１と９５％以上同一のアミノ酸配列、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸配列についてコードする、請求項２７に記載の核酸分子。
【請求項３１】
前記ワクチンが、１価構築物、多価構築物及びこれらの組み合わせからなる群から選択される構築物を含み、前記核酸が１、２、３、４つまたはそれ以上のプラスミドである、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３２】
前記ワクチンが、１価構築物、２価構築物、３価構築物、４価構築物及びこれらの組み合わせからなる群から選択される構築物を含み、前記核酸が１、２、３、４つまたはそれ以上のプラスミドである、請求項１に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１３年３月１５日出願の米国仮特許出願第６１／７９９，０９４号に対する優先権を主張するものである。この出願の全教示内容は、参照することで本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神経毒素による中毒を治療するための組成物及び方法が本明細書にて開示される。具体的には、ボツリヌス菌の１つ以上の血清型を用いた、致死的攻撃に対する防御をもたらすワクチンが開示される。
【背景技術】
【０００３】
ボツリヌス毒素は、バクテリアであるボツリヌス菌、ブチリカム菌（Ｃ．  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、バラチ菌（Ｃ．  ｂａｒａｔｉｉ）及びアルゲンチネンス菌（Ｃ．  ａｒｇｅｎｔｉｎｅｎｓｅ）によって産生される。食餌性ボツリヌス中毒は、缶詰にされる前に正しく加熱されなかった食物または缶詰から正しく調理されなかった食物を介して感染し得る。ほとんどの乳児ボツリヌス中毒の症例は、この疾患を引き起こすバクテリアが土壌中及び塵埃中に存在するため、防ぐことができない。このバクテリアは、家庭内の床、カーペット及び調理台の上に、清掃後であっても、認められる場合がある。食餌性ボツリヌス中毒は、通常、芽胞に汚染された嫌気性環境にある食物（穴の空いた缶詰など）の摂取により生じる。芽胞は嫌気性環境で発芽し、成長する。この成長（増殖性）バクテリアが毒素を産生する。ボツリヌス中毒を引き起こすのは、芽胞または増殖性バクテリアの摂取ではなく、毒素の摂取である。乳児ボツリヌス中毒及び創傷性ボツリヌス中毒は、芽胞の感染により生じる。芽胞はその後発芽し、毒素を産出してボツリヌス中毒の症状を引き起こす。
【０００４】
ボツリヌス毒素は、バクテリアのボツリヌス菌が産出するタンパク質であり、神経毒素である。ボツリヌス毒素は、目、粘膜、気道または傷のある皮膚から吸収され得る。ボツリヌス毒素は、最も激しい毒性のある物質として知られており、ヒトの平均致死量は、静脈内または筋肉内で１．３〜２．１ｎｇ／ｋｇ、吸引の場合で１０〜１３ｎｇ／ｋｇと推定されている。ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）による中毒は、運動神経及び自律神経の急性弛緩性麻痺を特徴とする重篤な神経疾患を招き、場合によっては死に至ることもある。ヒトの疾患は、ボツリヌス菌の４つの血清型Ａ、Ｂ、Ｅ及びＦによって産生される毒素に起因する。ボツリヌス中毒は稀であるが、アメリカ疾病管理予防センター（ＣＤＣ）は、ボツリヌス毒素をアメリカ合衆国に対するバイオテロリスト攻撃の６つの最大脅威のうちの１つと定めている。現在、ＢｏＮＴ中毒の治療は抗血清の送達だけであるが、ＢｏＮＴ中毒の迅速な特定はもとより、数週間から数ヶ月の支持療法を必要とする。ＢｏＮＴ抗血清の有効性により、中和抗体を誘導するＢｏＮＴワクチンが曝露後の疾患を防止できることが明らかになっている。軍事関係者ならびに研究所及び製造所に雇用された個人で、クロストリジウム神経毒素産生種を扱う者については、試験的な５価トキソイド（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）ワクチンを以前には利用できたが、限られた有効性及び耐性問題を理由に、ＣＤＣによって中止されている。さらに、２価（Ａ、Ｂ）の組み換えトキソイドワクチンは、調査中である。
【０００５】
したがって、ボツリヌス菌の１つ以上の血清型、具体的には、血清型Ａ、Ｂ、Ｅ及び／またはＦに対して広範な免疫性を提供する効果的なＢｏＮＴワクチン、好ましくは包括的に効果的であり得る汎用ワクチンに対する要求が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ボツリヌス神経毒素血清型Ａの重鎖アミノ酸配列（配列番号２）、ボツリヌス神経毒素血清型Ｂの重鎖アミノ酸配列（配列番号４）、ボツリヌス神経毒素血清型Ｅの重鎖アミノ酸配列（配列番号６）、ボツリヌス神経毒素血清型Ｆの重鎖アミノ酸配列（配列番号８）、ボツリヌス神経毒素血清型Ａの重鎖アミノ酸配列（配列番号２）と９５％以上同一であるアミノ酸配列、ボツリヌス神経毒素血清型Ｂの重鎖アミノ酸配列（配列番号４）と９５％以上同一であるアミノ酸配列、ボツリヌス神経毒素血清型Ｅの重鎖アミノ酸配列（配列番号６）と９５％以上同一であるアミノ酸配列、ボツリヌス神経毒素血清型Ｆの重鎖アミノ酸配列（配列番号８）と９５％以上同一であるアミノ酸配列、ボツリヌス神経毒素血清型Ａの重鎖アミノ酸配列（配列番号２）と９８％以上同一であるアミノ酸配列、ボツリヌス神経毒素血清型Ｂの重鎖アミノ酸配列（配列番号４）と９８％以上同一であるアミノ酸配列、ボツリヌス神経毒素血清型Ｅの重鎖アミノ酸配列（配列番号６）と９８％以上同一であるアミノ酸配列、及びボツリヌス神経毒素血清型Ｆの重鎖アミノ酸配列（配列番号８）と９８％以上同一であるアミノ酸配列からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸配列をコードする核酸を含むワクチンに関する。
【０００７】
核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号７からなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含み得る。核酸分子は、プラスミドであってもよい。核酸は、１つ以上のプラスミドであってよい。ワクチンは、アジュバント分子をさらに含み得る。アジュバントは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２８、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＣＤ３４、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫ、Ｏｘ４０、ＴＡＰ−１またはＴＡＰ−２であり得る。特に、アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８またはＲＡＮＴＥＳであり得る。
【０００８】
本発明はまた、１価ワクチンまたは多価ワクチン、例えば、限定するものではないが、２価ワクチン、３価ワクチン、４価ワクチン及び５価ワクチンに関する。当該ワクチンは、ボツリヌス菌の１つ以上の血清型に由来する１、２、３、４またはそれ以上の神経毒素またはその断片についてコードする単一プラスミドまたは複数のプラスミドを含み得る。断片は、例えば、限定するものではないが、ボツリヌス菌の１つ以上の血清型に由来する１つ以上の神経毒素の軽鎖及び／または重鎖を含み得る。複数のプラスミドは、例えば、限定するものではないが、１、２、３、４またはそれ以上のプラスミドであり得る。
【０００９】
本発明はまた、上記のワクチンのいずれかを対象に投与することを含む、ボツリヌス神経毒素に対する免疫反応を誘導する方法に関する。投与には、電気穿孔法が含まれ得る。
【００１０】
本発明はさらに、上記のワクチンのいずれかを対象に投与することを含む、対象をボツリヌス中毒から防御する方法に関する。投与には、電気穿孔法が含まれ得る。
【００１１】
本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１と９５％以上同一であるヌクレオチド配列、配列番号３と９５％以上同一であるヌクレオチド配列、配列番号５と９５％以上同一であるヌクレオチド配列、配列番号７と９５％以上同一であるヌクレオチド配列、配列番号１と９８％以上同一であるヌクレオチド配列、配列番号３と９８％以上同一であるヌクレオチド配列、配列番号５と９８％以上同一であるヌクレオチド配列及び配列番号７と９８％以上同一であるヌクレオチド配列からなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。
【００１２】
ヌクレオチド配列は、プラスミドであってもよい。１つ以上のヌクレオチド配列は、１つ以上のプラスミドであってよい。１つ以上のヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号２と９５％以上同一のアミノ酸配列、配列番号４と９５％以上同一のアミノ酸配列、配列番号６と９５％以上同一のアミノ酸配列、配列番号８と９５％以上同一のアミノ酸配列、配列番号９と９５％以上同一のアミノ酸配列、配列番号１０と９５％以上同一のアミノ酸配列、配列番号１１と９５％以上同一のアミノ酸配列、配列番号４と９８％以上同一のアミノ酸配列、配列番号６と９８％以上同一のアミノ酸配列、配列番号８と９８％以上同一のアミノ酸配列、配列番号９と９８％以上同一のアミノ酸配列、配列番号１０と９８％以上同一のアミノ酸配列及び配列番号１１と９８％以上同一のアミノ酸配列からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸配列についてコードし得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ−Ｃ】１価、２価及び４価のボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）重鎖（Ｈｃ）プラスミドまたは発現ベクターの構造をそれぞれ示す。
【図２】１価発現ベクターＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｅ及びＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｆ、ならびに陰性対照として使用したｐＶＡＸベクターによるボツリヌス神経毒素重鎖の代表的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を示す。
【図３Ａ−Ｂ】ＢｏＮＴ  Ｈｃワクチンに対する体液性反応を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ−Ｂに同じ。
【図４Ａ−Ｂ】ボツリヌス菌神経毒素による致死的攻撃に対するＢｏＮＴ  Ｈｃワクチンの防御を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ−Ｂに同じ。
【図５】ワクチン投与、血液及び組織の採取ならびに神経毒素による攻撃のスケジュールを模式的に示す。
【図６Ａ−Ｃ】（Ａ）ボツリヌス菌血清型Ａ由来の神経毒素、（Ｂ）ボツリヌス菌血清型Ｂ由来の神経毒素、及び（Ｃ）ボツリヌス菌血清型Ｅ由来の神経毒素に反応した採取血清中の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の力価を示す。
【図７Ａ−Ｂ】（Ａ）ボツリヌス菌血清型Ａ由来の神経毒素による免疫付与後の時間（時）と生存率をプロットしたグラフ、及び（Ｂ）マウスと中毒症状の臨床スコアをプロットしたグラフを示す。図７Ａ中の三角、四角及び丸はそれぞれＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａで免疫付与したマウス、ナイーブマウス及びＧｅｌ−Ｎａ2ＰＯ4の希釈液を与えたマウスを示す。図７Ａにおいて、免疫付与したマウスとナイーブマウスは神経毒素で攻撃したが、希釈液を与えたマウスは陰性対照とし、神経毒素による攻撃はしなかった。
【図８Ａ−Ｂ】（Ａ）ボツリヌス菌血清型Ｂ由来の神経毒素による免疫付与後の時間（時）と生存率をプロットしたグラフ、及び（Ｂ）マウスと中毒症状の臨床スコアをプロットしたグラフを示す。図８Ａ中の三角、四角及び丸はそれぞれＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂで免疫付与したマウス、ナイーブマウス及びＧｅｌ−Ｎａ2ＰＯ4の希釈液を与えたマウスを示す。図８Ａにおいて、免疫付与したマウスとナイーブマウスは神経毒素で攻撃したが、希釈液を与えたマウスは陰性対照とし、神経毒素による攻撃はしなかった。
【図９Ａ−Ｂ】（Ａ）ボツリヌス菌血清型Ｅ由来の神経毒素による免疫付与後の時間（時）と生存率をプロットしたグラフ、及び（Ｂ）マウスと中毒症状の臨床スコアをプロットしたグラフを示す。図９Ａ中の三角、四角及び丸はそれぞれＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｅで免疫付与したマウス、ナイーブマウス及びＧｅｌ−Ｎａ2ＰＯ4の希釈液を与えたマウスを示す。図９Ａにおいて、免疫付与したマウスとナイーブマウスは神経毒素で攻撃したが、希釈液を与えたマウスは陰性対照とし、神経毒素による攻撃はしなかった。
【図１０Ａ−Ｄ】（Ａ）ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂ及びＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｅの構築物の混合物である３価ワクチンを示す概略図、（Ｂ）ボツリヌス菌血清型Ａ由来の神経毒素に反応した採取血清中のＩｇＧの力価、（Ｃ）ボツリヌス菌血清型Ｂ由来の神経毒素に反応した採取血清中のＩｇＧの力価、ならびに（Ｄ）ボツリヌス菌血清型Ｅ由来の神経毒素に反応した採取血清中のＩｇＧの力価を示す。
【図１１Ａ−Ｂ】（Ａ）ボツリヌス菌血清型Ａ由来の神経毒素による免疫付与後の時間（時）と生存率をプロットしたグラフ、（Ｂ）マウスと中毒症状の臨床スコアをプロットしたグラフを示す。
【図１１Ｃ−Ｄ】（Ｃ）ボツリヌス菌血清型Ｂ由来の神経毒素による免疫付与後の時間（時）と生存率をプロットしたグラフ、（Ｄ）マウスと中毒症状の臨床スコアをプロットしたグラフを示す。
【図１１Ｅ−Ｆ】（Ｅ）ボツリヌス菌血清型Ｅ由来の神経毒素による免疫付与後の時間（時）と生存率をプロットしたグラフ、及び（Ｆ）マウスと中毒症状の臨床スコアをプロットしたグラフを示す。図１１Ａ、１１Ｃ及び１１Ｅ中の三角はそれぞれＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂ及びＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｅで免疫付与したマウスを示す。また、図１１Ａ、１１Ｃ及び１１Ｅ中の四角及び丸はそれぞれナイーブマウス及びＧｅｌ−Ｎａ2ＰＯ4の希釈液を与えたマウスを示す。図１１Ａ、１１Ｃ及び１１Ｅにおいて、免疫付与したマウスとナイーブマウスは神経毒素で攻撃したが、希釈液を与えたマウスは陰性対照とし、神経毒素による攻撃はしなかった。
【図１２Ａ−Ｂ】（Ａ）血清−毒素混合物の形成を示す概略図、（Ｂ）血清−ボツリヌス菌血清型Ａ由来の神経毒素による免疫付与後の時間（時）と生存率をプロットしたグラフを示す。
【図１２Ｃ】（Ｃ）血清−ボツリヌス菌血清型Ｂ由来の神経毒素による免疫付与後の時間（時）と生存率をプロットしたグラフを示す。
【図１２Ｄ】（Ｄ）血清−ボツリヌス菌血清型Ｅ由来の神経毒素による免疫付与後の時間（時）と生存率をプロットしたグラフを示す。
【図１２Ｅ】（Ｅ〜Ｇ）マウスと中毒症状の臨床スコアをプロットしたグラフを示す。図１２Ｂ、１２Ｃ及び１２Ｄ中の三角はそれぞれＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａで免疫付与したマウスから得た血清−血清型Ａ由来の神経毒素の混合物、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂで免疫付与したマウスから得た血清−血清型Ｂ由来の神経毒素の混合物、及びＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｅで免疫付与したマウスから得た血清−血清型Ｅ由来の神経毒素の混合物を与えたマウスを示す。図１２Ｂ、１２Ｃ及び１２Ｄ中の四角及び丸はそれぞれナイーブマウス及びＧｅｌ−Ｎａ2ＰＯ4の希釈液を与えたマウスを示す。図１２Ｂ、１２Ｃ及び１２Ｄにおいて、希釈液を与えたマウスには血清−毒素混合物を与えなかった。
【図１２Ｆ】図１２Ｅに同じ。
【図１２Ｇ】図１２Ｅに同じ。
【図１３】ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆを含む４価のボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）重鎖（Ｈｃ）プラスミドまたは発現ベクターの構造を模式的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、ボツリヌス菌由来の神経毒素タンパク質の使用に関する。神経毒素タンパク質は、ボツリヌス菌の１つ以上の血清型に由来し得る。ボツリヌス菌の１つ以上の血清型はＡ、Ｂ、Ｃ1、Ｃ2、Ｄ、Ｅ、Ｆ及び／またはＧであり得る。いくつかの実施形態において、ボツリヌス菌の１つ以上の血清型は、Ａ、Ｂ、Ｅ及び／またはＦであり得る。
【００１５】
本発明はまた、ボツリヌス菌、例えば、血清型Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｃ2、Ｄ、Ｅ、Ｆ及び／またはＧに由来する重鎖の神経毒素タンパク質の使用に関する。いくつかの実施形態において、重鎖の神経毒素タンパク質は、ボツリヌス菌の血清型Ａ、Ｂ、Ｅ及び／またはＦに由来し得る。これらのボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）重鎖（Ｈｃ）ＤＮＡワクチンは、体液性免疫反応を誘導し、ボツリヌス菌神経毒素による致死的攻撃に対する防御を提供する。これは、当該１価または３価及び２価のＢｏＮＴ  Ｈｃワクチン構築物をそれぞれワクチン投与した後の致死的攻撃に対して、少なくとも５０％の防御、好ましくは６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の防御、より好ましくは７５％または１００％の防御を示すものである。誘導された体液性免疫反応には、ボツリヌス菌血清型由来の神経毒素に反応する中和抗体の誘導が含まれる。さらに、本発明の１価、２価、３価及び４価の構築物のワクチンは、ヒト疾患の主たる原因であるボツリヌス毒素血清型Ａ、Ｂ、Ｅ及び／またはＦを対象にすることによって、血清型Ａ及びＢに対する効力しか示さない現在の試験的ＤＮＡワクチンよりも高い防御をもたらす。
１．定義
【００１６】
本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的にしており、限定することを意図していない。特に定義していない限り、本明細書で使用する全ての技術的用語及び科学的用語は、当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。矛盾が生じる場合には、定義を含めて本明細書が優先となる。本発明の実施または試験において、本明細書中に記載されたものと同様または同等の方法及び材料を用いることはできるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。記載が矛盾する場合には、用語の定義を含め本明細書が優先するものとする。尚、本明細書で開示した材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、限定することを意図していない。
【００１７】
本明細書で使用する「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「を有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「を含む（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」という用語、及びその変形は、付加的な行為あるいは構造の可能性を妨げない、制限しない移行句、用語、または単語であることを意図している。単数形である「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上例外が明記されていない限り、複数形の意味を持つこともある。本開示は、明示的に記載されているかどうかに関わらず、本明細書に示される実施形態または要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」、及び「から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」他の実施形態も企図する。
【００１８】
本明細書中の数値範囲の記述について、同程度の精度でその間に入る各数が明示的に企図される。例えば、６〜９という範囲の場合、６及び９に加えて７及び８という数が企図され、６．０〜７．０という範囲の場合、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０という数が明示的に企図される。
【００１９】
本明細書で用いられる「アジュバント」は、本明細書の以下に記載されるＤＮＡプラスミド及びコード核酸配列によりコードされる抗原の免疫原性を高めるために本明細書に記載のＤＮＡプラスミドワクチンに添加される任意の分子を意味する。
【００２０】
本明細書で用いられる「抗体」は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤもしくはＩｇＥの抗体、またはその断片もしくは誘導体（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄを含む）、ならびにその一本鎖抗体、ダイアボディ、二重特異性抗体、二機能性抗体及び誘導体を意味する。抗体は、哺乳動物の血清サンプルから単離された抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製抗体、またはこれらの混合物のうち、所望のエピトープもしくはそれに由来する配列に対する十分な結合特異性を示すものであり得る。
【００２１】
本明細書で使用する「コード配列」または「コード化核酸」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、核酸の投与先である個体または哺乳動物の細胞中の発現を誘導できるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントと機能的に連結した、開始及び終了シグナルをさらに含むことができる。
【００２２】
本明細書で使用する「相補体」または「相補的」は、ヌクレオチド間または核酸分子のヌクレオチド類似体間のワトソン・クリック（例えば、Ａ−Ｔ／Ｕ及びＣ−Ｇ）またはフーグスティーン塩基対を意味する。
【００２３】
本明細書で用いられる「コンセンサス」または「コンセンサス配列」は、特定のＢｏＮＴ  Ｈｃ抗原の複数のサブタイプのアライメント分析に基づいたポリペプチド配列を意味する。コンセンサスポリペプチド配列をコードする核酸配列を調製することができる。タンパク質をコードするコンセンサス配列及び／または核酸分子からなるタンパク質を含むワクチンを用いて、特定の抗原の複数のサブタイプまたは血清型に対する幅広い免疫を誘導することができる。
【００２４】
本明細書で互換的に使用する「電気穿孔」、「電気透過処理」、「界面動電増強」（「ＥＰ」）は、生体膜に微細経路（細孔）を生じさせるための膜貫通電場パルスの使用を意味する。こうした微細経路の存在により、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬剤、イオン、及び水などの生体分子が、細胞膜の片側から他方の側に通過することが可能になる。
【００２５】
本明細書で核酸配列に関して使用する「断片」は、完全長の野生型株抗原と交差反応する哺乳動物において免疫反応を誘発することができるポリペプチドをコードする核酸配列またはその一部を意味する。断片は、以下に記載のタンパク質断片をコードする様々なヌクレオチド配列のうち少なくとも１つから選択されるＤＮＡ断片であり得る。断片は、以下に記載の１つ以上の核酸配列の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、以下に記載の少なくとも１つの核酸配列の少なくとも２０個以上のヌクレオチド、少なくとも３０個以上のヌクレオチド、少なくとも４０個以上のヌクレオチド、少なくとも５０個以上のヌクレオチド、少なくとも６０個以上のヌクレオチド、少なくとも７０個以上のヌクレオチド、少なくとも８０個以上のヌクレオチド、少なくとも９０個以上のヌクレオチド、少なくとも１００個以上のヌクレオチド、少なくとも１５０個以上のヌクレオチド、少なくとも２００個以上のヌクレオチド、少なくとも２５０個以上のヌクレオチド、少なくとも３００個以上のヌクレオチド、少なくとも３５０個以上のヌクレオチド、少なくとも４００個以上のヌクレオチド、少なくとも４５０個以上のヌクレオチド、少なくとも５００個以上のヌクレオチド、少なくとも５５０個以上のヌクレオチド、少なくとも６００個以上のヌクレオチド、少なくとも６５０個以上のヌクレオチド、少なくとも７００個以上のヌクレオチド、少なくとも７５０個以上のヌクレオチド、少なくとも８００個以上のヌクレオチド、少なくとも８５０個以上のヌクレオチド、少なくとも９００個以上のヌクレオチド、少なくとも９５０個以上のヌクレオチドまたは少なくとも１０００個以上のヌクレオチドを含み得る。
【００２６】
ポリペプチド配列に関する「断片」または「免疫原性断片」は、完全長の野生型株抗原と交差反応する哺乳動物において免疫反応を誘発することができるポリペプチドを意味する。タンパク質またはコンセンサスタンパク質の断片は、タンパク質またはコンセンサスタンパク質の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％を含み得る。いくつかの実施形態において、タンパク質またはコンセンサスタンパク質の断片は、以下に記載のタンパク質またはコンセンサスタンパク質の少なくとも２０個以上のアミノ酸、少なくとも３０個以上のアミノ酸、少なくとも４０個以上のアミノ酸、少なくとも５０個以上のアミノ酸、少なくとも６０個以上のアミノ酸、少なくとも７０個以上のアミノ酸、少なくとも８０個以上のアミノ酸、少なくとも９０個以上のアミノ酸、少なくとも１００個以上のアミノ酸、少なくとも１１０個以上のアミノ酸、少なくとも１２０個以上のアミノ酸、少なくとも１３０個以上のアミノ酸、少なくとも１４０個以上のアミノ酸、少なくとも１５０個以上のアミノ酸、少なくとも１６０個以上のアミノ酸、少なくとも１７０個以上のアミノ酸、少なくとも１８０個以上のアミノ酸を含み得る。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「遺伝子構築物」という用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を指す。コード配列は、核酸分子の投与先である個体の細胞中の発現を誘導できるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントと機能的に連結した、開始及び終了シグナルを含む。本明細書で使用する場合、「発現可能な形態」という用語は、個体の細胞中に存在しているときにコード配列が発現するように、タンパク質をコードするコード配列に機能的に連結している必要な調節エレメントを含んでいる遺伝子構築物を指す。
【００２８】
本明細書で使用する「相同」という用語は、相補の程度を指す。部分的相同も完全相同（すなわち、同一）もあり得る。完全に相補的な配列が標的核酸にハイブリダイズすることを少なくとも一部阻害する部分的に相補的な配列は、「実質的に相同の」という機能的用語を使用して呼ばれる。ｃＤＮＡクローンまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列に関して使用される場合、本明細書で使用する「実質的に相同」という用語は、低ストリンジェンシーの条件下で二本鎖核酸配列の鎖にハイブリダイズすることができるプローブを指す。一本鎖核酸配列に関して使用される場合、本明細書で使用する「実質的に相同」という用語は、低ストリンジェンシーの条件下で一本鎖の核酸鋳型配列にハイブリダイズすることができる（すなわち、相補体である）プローブを指す。
【００２９】
本明細書において２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈で使用する「同一」または「同一性」は、当該配列が指定領域に渡って指定の割合の同一残基を有することを意味する。この割合を計算するには、２つの配列を最適に整列させ、指定領域に渡って２つの配列を比較し、両配列の同一残基が発生する位置の数を確定して一致位置の数を得て、一致位置の数を指定領域の総位置数で割り、計算結果に１００を掛けることにより、配列同一性のパーセント値が得られる。２つの配列の長さが異なるか、アライメントにより１つ以上の付着末端が生じ、指定の比較領域に単一配列のみが含まれる場合には、単一配列の残基を計算の分母に含めるが、分子には含めない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合には、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）を同等とみなすことができる。同一性の計算は、手作業で行うこともできるし、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２．０等のコンピューター配列アルゴリズムを使用して行うこともできる。
【００３０】
本明細書で使用する「免疫反応」は、抗原の導入に反応して、宿主の免疫系、例えば哺乳動物の免疫系が活性化することを意味する。この免疫反応は、細胞性もしくは体液性の形態、またはその両方であり得る。
【００３１】
本明細書で使用する「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、互いに共有結合している少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖を表現することにより、相補鎖の配列も定義される。したがって、核酸は、表現される一本鎖の相補鎖も包含する。ある核酸の多くの変異体を、所与の核酸として同一目的で使用できる。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸及びその相補体も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズできるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
【００３２】
核酸は、一本鎖または二本鎖であってもよく、二本鎖と一本鎖の両方の配列の一部分を含むこともできる。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、またはハイブリッドであってもよく、核酸はデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組み合わせを含むことができ、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、及びイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含むことができる。核酸は、化学合成法または組み換え法により取得できる。
【００３３】
本明細書で使用する「機能的に連結」は、遺伝子と空間的に接続しているプロモーターの制御下で遺伝子が発現することを意味する。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置できる。プロモーターと遺伝子の間の距離は、プロモーターの派生元遺伝子において当該プロモーターが制御する遺伝子とプロモーターの間の距離とほぼ同一であり得る。当技術分野で知られているように、プロモーター機能を失うことなく、この距離の変化に適応することができる。
【００３４】
本明細書で核酸配列に関して使用する「最適化された」とは、コドン使用頻度及び対応するＲＮＡ転写産物について核酸配列を改変し、未修飾の核酸配列と比較して、コードしたタンパク質の発現を改善することを意味する。核酸配列の別の改変には、翻訳の効率を高めるためのＫｏｚａｋ配列（例えば、ＧＣＣ  ＡＣＣ）の付加、及び翻訳終結の効率を高めるための複数の終止コドン（例えば、ＴＧＡ  ＴＧＡ）の付加を含み得る。
【００３５】
本明細書で使用する「ペプチド」、「タンパク質」または「ポリペプチド」は、アミノ酸の結合配列を意味することができ、天然、合成、または天然及び合成の修飾あるいはその組み合わせであってもよい。
【００３６】
本明細書で使用する「プロモーター」は、核酸の細胞中発現を授与、活性化、または増強することのできる合成分子または天然由来分子を意味する。プロモーターは、発現をさらに増強し、かつ／または空間的発現及び／またはその一時的発現を改変する目的で、１つ以上の特定の転写調節配列を含むことができる。プロモーターは遠位のエンハンサーエレメントまたは抑制エレメントを含むこともでき、このエンハンサーエレメントまたは抑制エレメントは、転写開始部位から数千塩基対も離れた場所に位置できる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び動物を含む源に由来し得る。プロモーターは、発現が発生する細胞、組織、もしくは臓器に関して、もしくは発現が生じる発生段階に関して、恒常的もしくは差次的に遺伝子成分の発現を調節でき、または、例えば生理的ストレス、病原体、金属イオン、誘発剤等の外部刺激に反応して遺伝子成分の発現を調節できる。プロモーターの代表例として、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、及びＣＭＶ  ＩＥプロモーターが挙げられる。
【００３７】
「シグナルペプチド」及び「リーダー配列」は、本明細書で互換的に使用され、本明細書に記載の抗原タンパク質のアミノ末端に結合することができるアミノ酸配列を指す。一般に、シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質の局在化を指示する。本明細書で使用するシグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質を産生する細胞からタンパク質を分泌し易くすることが好ましい。シグナルペプチド／リーダー配列は、細胞からの分泌時に、タンパク質（しばしば成熟タンパク質と呼ばれる）の残余から切断されることが多い。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のアミノ末端（すなわち、Ｎ末端）に結合する。
【００３８】
本明細書で用いられる「対象」は、本明細書に記載のワクチンで免疫を得ることを望むかまたは必要とする哺乳動物を意味し得る。哺乳動物は、ヒト、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、マウス、またはネズミであり得る。
【００３９】
本明細書で使用する、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、例えば核酸の複合混合物において、第１の核酸配列（例えばプローブ）が第２の核酸配列（例えば標的）とハイブリダイズする際の条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列に依存するため、状況によって異なる。ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度ｐＨにおける特定の配列に対する融点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低くなるように選択することができる。Ｔｍは、（規定のイオン強度、ｐＨ、及び核酸濃度下で）標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度であり得る（標的配列は過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、プローブの５０％が平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３において約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、例えば約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば約１０〜５０ヌクレオチド）では最低約３０℃、長いプローブ（例えば約５０ヌクレオチド超）では最低約６０℃であり得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミド等の不安定化剤の添加によって達成することもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルはバックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であり得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件例には、以下の条件が含まれる：５０％ホルムアミド、５倍ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベートまたは、５倍ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベート、０．２倍ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６５℃での洗浄。
【００４０】
本明細書で使用する「実質的に相補的」は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０個またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域に渡って、第１の配列が第２の配列の相補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であること、あるいは、２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。
【００４１】
本明細書で使用する「実質的に同一」は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０個またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域に渡って、第１の配列と第２の配列が少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であること、あるいは、核酸に関して、第１の配列が第２の配列の相補体と実質的に相補的である場合を意味する。
【００４２】
本明細書で使用する、「治療」または「治療する」は、疾患を予防するか、抑制するか、抑圧するかまたは完全に除去することで動物を疾患から防御することを意味することができる。疾患を予防することは、その疾患の発症前に動物に本発明のワクチンを投与することを含む。疾患を抑制することは、その疾患の誘導後でその疾患の臨床的出現前に、動物に本発明のワクチンを投与することを含む。疾患を抑圧することは、その疾患の臨床的出現後に、動物に本発明のワクチンを投与することを含む。
【００４３】
核酸に関して本明細書で使用する「変異体」は、（ｉ）基準ヌクレオチド配列の一部分もしくは断片；（ｉｉ）基準ヌクレオチド配列もしくはその一部分の相補体；（ｉｉｉ）基準核酸もしくはその相補体と実質的に同一の核酸；または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、基準核酸、その相補体、もしくはその実質的に同一の配列とハイブリダイズする核酸を意味する。
【００４４】
ペプチドまたはポリペプチドに関して使用する「変異体」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によりアミノ酸配列が異なっているが、少なくとも１つの生物活性を保持しているものである。また、変異体は、基準タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、あるアミノ酸を類似特性（例えば、荷電領域の親水性、程度、及び分布）の別のアミノ酸に置換することは、当技術分野では、通常は軽微な変化を伴うものと認識されている。こうした軽微な変化は、当技術分野で理解されているように、アミノ酸の疎水性親水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）を検討することにより部分的に特定できる。Ｋｙｔｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性親水性指標は、その疎水性と電荷の考察に基づく。類似の疎水性親水性指標を有するアミノ酸は置換可能であり、その後もタンパク質機能を維持することが当技術分野において公知である。一態様において、±２の疎水性親水性指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を用いて、生物機能を保持したタンパク質となる置換を明らかにすることもできる。ペプチドに関連してアミノ酸の親水性を検討することにより、そのペプチドの局所的な最大平均親水性を計算でき、抗原性及び免疫原性と良く相関すると報告されている有用な尺度となる。米国特許第４，５５４，１０１号（この文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。当技術分野で理解されているように、類似の親水性値を有するアミノ酸を置換すると、例えば免疫原性等の生物活性を保持したペプチドが得られる。親水性値が互いに±２以内のアミノ酸を用いて、置換を実施できる。アミノ酸の疎水性指標と親水性値の両方とも、そのアミノ酸の特定の側鎖の影響を受ける。こうした知見と一致して、生物機能に適合するアミノ酸置換とは、アミノ酸の相対的類似性、特に当該アミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存するものと理解されており、この相対的類似性は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、その他の特性により明らかになる。
【００４５】
変異体は、完全遺伝子配列またはその断片の全長にわたって実質的に同一な核酸配列であってもよい。核酸配列は、遺伝子配列またはその断片の全長にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であってもよい。変異体は、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって実質的に同一なアミノ酸配列であってもよい。アミノ酸配列は、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であってもよい。
【００４６】
本明細書で使用する、「ベクター」は、複製起点を含む核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクターであり得、好ましくはＤＮＡプラスミドである。ベクターは、１つ以上の異種核酸配列を含み得る。
２．ワクチン
【００４７】
本発明は、ボツリヌス菌神経毒素（ＢｏＮＴ）ワクチンに関する。ＢｏＮＴは、哺乳動物においてボツリヌス中毒を引き起こすことがあり、１００ｋＤａの重鎖がジスルフィド結合を介して５０ｋＤａの軽鎖に結合した二本鎖のポリペプチドである。この重鎖は、コリン作動性の特異性（すなわち、特定の軸索または神経終末を標的にする）を持ち、シナプス前膜に毒素を結合させ、エンドソーム膜への軽鎖の移動を促す。神経毒素のエンドサイトーシス後、重鎖と軽鎖を結ぶジスルフィド結合が開裂し、これにより軽鎖が細胞質内に放出される。軽鎖は酵素（プロテアーゼ）であり、神経筋接合部に存在する融合タンパク質（例えば、ＳＮＡＰ−２５、シンタキシンまたはシナプトブレビン）の１つを攻撃または切断し、小胞が膜に結合してアセチルコリンを放出しないようにする。アセチルコリンは、神経筋接合部に存在する主要な神経伝達物質であるが、自律神経節、副交感神経節後神経終末及び交感神経節後神経終末にも存在しており、ＢｏＮＴは、これらの種のニューロンも標的にする。ＢｏＮＴは、アセチルコリンの放出を阻害することで、ＢｏＮＴに曝された哺乳動物において弛緩性麻痺を生じさせる。ボツリヌス菌の血清型Ａ、Ｂ、Ｅ及びＦに由来するＢｏＮＴは、アセチルコリンの放出に影響を与えるため、中毒または疾患（すなわち、ボツリヌス中毒）を引き起こし得る。これらの症状には、弛緩性麻痺、呼吸困難、呼吸不全及び運動機能障害が挙げられる。ボツリヌス菌の血清型Ｃ1、Ｃ2、Ｄ及びＧも毒素を産出する。
【００４８】
したがって、ＢｏＮＴワクチンは、ボツリヌス菌由来の１つ以上の神経毒素抗原を含む。神経毒素抗原は、ボツリヌス菌の１つ以上の血清型に由来し得る。ボツリヌス菌の１つ以上の血清型はＡ、Ｂ、Ｃ1、Ｃ2、Ｄ、Ｅ、Ｆ及び／またはＧであり得る。いくつかの実施形態において、ボツリヌス菌の１つ以上の血清型は、Ａ、Ｂ、Ｅ及び／またはＦであり得る。
【００４９】
いくつかの実施形態において、神経毒素抗原は、ボツリヌス菌、例えば、血清型Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｃ2、Ｄ、Ｅ、Ｆ及び／またはＧに由来する重鎖の神経毒素タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、重鎖の神経毒素タンパク質は、ボツリヌス菌の血清型Ａ、Ｂ、Ｅ及び／またはＦに由来し得る。ＢｏＮＴワクチンは、ボツリヌス菌血清型Ａ、Ｂ、Ｅ及び／またはＦの重鎖のポリペプチド配列に関し得る。
【００５０】
ＢｏＮＴワクチンは、ボツリヌス菌血清型Ａ（ＢｏＮＴ−Ａ）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｂ（ＢｏＮＴ−Ｂ）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｃ1（ＢｏＮＴ−Ｃ1）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｃ2（ＢｏＮＴ−Ｃ2）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｄ（ＢｏＮＴ−Ｄ）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｅ（ＢｏＮＴ−Ｅ）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｆ（ＢｏＮＴ−Ｆ）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｇ（ＢｏＮＴ−Ｇ）由来のＢｏＮＴ抗原、またはこれらの組み合わせのうち１つ以上をコードする核酸を含み得る。核酸は、異種核酸であり得、かつ／または１つ以上の異種核酸配列を含み得る。
【００５１】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、ボツリヌス菌血清型Ａ（ＢｏＮＴ−Ａ）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｂ（ＢｏＮＴ−Ｂ）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｅ（ＢｏＮＴ−Ｅ）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｆ（ＢｏＮＴ−Ｆ）由来のＢｏＮＴ抗原、またはこれらの組み合わせのうち１つ以上をコードする核酸を含み得る。核酸は、異種核酸であり得、かつ／または１つ以上の異種核酸配列を含み得る。
【００５２】
他の実施形態において、ＢｏＮＴワクチンは、ボツリヌス菌血清型Ａ（ＢｏＮＴ−Ａ）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｂ（ＢｏＮＴ−Ｂ）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｃ1（ＢｏＮＴ−Ｃ1）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｃ2（ＢｏＮＴ−Ｃ2）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｄ（ＢｏＮＴ−Ｄ）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｅ（ＢｏＮＴ−Ｅ）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｆ（ＢｏＮＴ−Ｆ）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｇ（ＢｏＮＴ−Ｇ）由来のＢｏＮＴ抗原、またはこれらの組み合わせのうち１つ以上をコードする最適化核酸を含み得る。最適化核酸は、異種核酸であり得、かつ／または１つ以上の異種核酸配列を含み得る。
【００５３】
いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴワクチンは、ボツリヌス菌血清型Ａ（ＢｏＮＴ−Ａ）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｂ（ＢｏＮＴ−Ｂ）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｅ（ＢｏＮＴ−Ｅ）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｆ（ＢｏＮＴ−Ｆ）由来のＢｏＮＴ抗原、またはこれらの組み合わせのうち１つ以上をコードする最適化核酸を含み得る。最適化核酸は、異種核酸であり得、かつ／または１つ以上の異種核酸配列を含み得る。
【００５４】
他の実施形態において、ＢｏＮＴワクチンは、ボツリヌス菌血清型Ａ（ＢｏＮＴ−Ａ）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｂ（ＢｏＮＴ−Ｂ）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｃ1（ＢｏＮＴ−Ｃ1）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｃ2（ＢｏＮＴ−Ｃ2）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｄ（ＢｏＮＴ−Ｄ）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｅ（ＢｏＮＴ−Ｅ）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｆ（ＢｏＮＴ−Ｆ）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｇ（ＢｏＮＴ−Ｇ）由来のＢｏＮＴ抗原、またはこれらの組み合わせのうち１つ以上をコードする１つ以上の異種核酸を含み得る。
【００５５】
いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴワクチンは、ボツリヌス菌血清型Ａ（ＢｏＮＴ−Ａ）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｂ（ＢｏＮＴ−Ｂ）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｅ（ＢｏＮＴ−Ｅ）由来のＢｏＮＴ抗原、ボツリヌス菌血清型Ｆ（ＢｏＮＴ−Ｆ）由来のＢｏＮＴ抗原、またはこれらの組み合わせのうち１つ以上をコードする１つ以上の異種核酸を含み得る。
【００５６】
ＢｏＮＴ−Ａ抗原は、複数のボツリヌス菌血清型ＡによるＢｏＮＴの重鎖のアミノ酸配列に由来するコンセンサスタンパク質を含み得る。ＢｏＮＴ−Ｂ抗原は、複数のボツリヌス菌血清型ＢによるＢｏＮＴの重鎖のアミノ酸配列に由来するコンセンサスタンパク質を含み得る。ＢｏＮＴ−Ｃ1抗原は、複数のボツリヌス菌血清型Ｃ1によるＢｏＮＴの重鎖のアミノ酸配列に由来するコンセンサスタンパク質を含み得る。ＢｏＮＴ−Ｃ2抗原は、複数のボツリヌス菌血清型Ｃ2によるＢｏＮＴの重鎖のアミノ酸配列に由来するコンセンサスタンパク質を含み得る。ＢｏＮＴ−Ｄ抗原は、複数のボツリヌス菌血清型ＤによるＢｏＮＴの重鎖のアミノ酸配列に由来するコンセンサスタンパク質を含み得る。ＢｏＮＴ−Ｅ抗原は、複数のボツリヌス菌血清型ＥによるＢｏＮＴの重鎖のアミノ酸配列に由来するコンセンサスタンパク質を含み得る。ＢｏＮＴ−Ｆ抗原は、複数のボツリヌス菌血清型ＦによるＢｏＮＴの重鎖のアミノ酸配列に由来するコンセンサスタンパク質を含み得る。ＢｏＮＴ−Ｇ抗原は、複数のボツリヌス菌血清型ＧによるＢｏＮＴの重鎖のアミノ酸配列に由来するコンセンサスタンパク質を含み得る。
【００５７】
したがって、本発明のワクチンは、ボツリヌス菌の複数の血清型に交差反応を呈する免疫反応を引き起こすことができ、対象に対する多数の損傷要因、例えば、自然感染、食物媒介疾患及びバイオテロ攻撃などに直面する多くの人々にとって有用である。加えて、本発明のワクチンは、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ、ＢｏＮＴ−Ｇまたはこれらの組み合わせ、特に、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆまたはこれらの組み合わせに関する１つ以上のアミノ酸配列をコードする特定の核酸に調整することができる。他の実施形態において、本発明のワクチンは、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ、ＢｏＮＴ−Ｇまたはこれらの組み合わせ、特に、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆまたはこれらの組み合わせに関する１つ以上のコンセンサスに基づくアミノ酸配列をコードする特定の核酸に調整することができる。換言すれば、本発明のワクチンは、ボツリヌス菌の１つ以上の血清型に由来する神経毒に対して広範な免疫性をもたらすための核酸すなわちＤＮＡ、または最適化核酸すなわちＤＮＡプラットフォームを提供することを企図するものである。
【００５８】
ワクチンは、ＤＮＡワクチンであり得る。ＤＮＡワクチンについては、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，７３９，１１８号、同第５，８１７，６３７号、同第５，８３０，８７６号、同第５，９６２，４２８号、同第５，９８１，５０５号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号及び同第５，６７６，５９４号に開示されており、これらの開示は参照により完全に本明細書に組み込まれる。ＤＮＡワクチンは、当該ワクチンが染色体に組み込まれないようにするエレメントまたは試薬をさらに含み得る。
【００５９】
ワクチンは、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ、ＢｏＮＴ−Ｇまたはこれらの組み合わせのＲＮＡ、特に、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆまたはこれらの組み合わせのＲＮＡであり得る。ＲＮＡワクチンは、細胞内に導入することができる。
【００６０】
ワクチンは、体液性免疫反応を誘導し、ボツリヌス菌神経毒素による致死的攻撃に対する防御を提供し、１価構築物または多価構築物、例えば、限定するものではないが、以下に記載するような２価、３価または４価のＢｏＮＴワクチン構築物によるワクチン投与後の致死的攻撃に対して、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の防御を提供する。１価または３価のＢｏＮＴワクチン構築物は、以下に記載するワクチン投与後の致死的攻撃に対して、１００％の防御を提供し得る。本発明のワクチンによって誘導された体液性免疫反応は、ボツリヌス菌神経毒素による致死的攻撃に対する防御を仲介する中和抗体の誘導を含む。
ａ．ＢｏＮＴ−Ａ
【００６１】
本発明のワクチンは、血清型Ａのボツリヌス菌（ＢｏＮＴ−Ａ）に由来する抗原を含み得る。ＢｏＮＴ−Ａは、（１）Ｂ細胞反応を介した体液性免疫、（２）細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応、及び（３）ヘルパーＴ細胞反応、またはクロスプレゼンテーションについては好ましくは上記の全てを誘導することによる免疫介在性反応にとって重要な標的である。ＢｏＮＴ−Ａ抗原は、組織全体と神経系の両方において、抗原特異性Ｔ細胞及び高力価の抗体反応を誘導する。ＢｏＮＴ−Ａ抗原は、致死量のボツリヌス菌神経毒素に対して防御能のある中和抗体を誘導する。これらの中和抗体は、ボツリヌス菌血清型Ａに由来する致死量の神経毒素に対して防御能がある。
【００６２】
ＢｏＮＴ−Ａ抗原は、抗ＢｏＮＴ−Ａ免疫反応を誘導し得る免疫原としての有効性を高めるタンパク質エピトープを含み得る。ＢｏＮＴ−Ａ抗原は、全長翻訳産物、その変異体、その断片またはこれらの組み合わせを含み得る。ＢｏＮＴ−Ａ抗原は、ＢｏＮＴ−Ａの重鎖、ＢｏＮＴ−Ａの軽鎖、その変異体、その断片またはこれらの組み合わせを含み得る。ＢｏＮＴ−Ａ抗原は、最適化核酸によってコードされ得、かつ／または以下でより詳細に記載するコンセンサスタンパク質を含み得る。したがって、いかなるユーザも、ＢｏＮＴ−Ａ抗原またはＢｏＮＴ−Ａコンセンサス抗原（ワクチン中の核酸によってコードされ得るものの一方またはその両方）を含むように本発明のワクチンを設計して、ボツリヌス菌神経毒素血清型Ａに対する広範な免疫性をもたらすことができる。このように、ＢｏＮＴ−Ａ抗原をコードする核酸、ＢｏＮＴ−Ａコンセンサス抗原をコードする核酸、ＢｏＮＴ−Ａ抗原、ＢｏＮＴ−Ａコンセンサス抗原またはこれらの組み合わせを含むワクチンによって、神経系への防御免疫反応が提供される。
（１）最適化ＢｏＮＴ−Ａ
【００６３】
ＢｏＮＴ−Ａ抗原は、最適化核酸配列によってコードされ得る。この最適化核酸配列は、異種核酸配列であり得、かつ／または１つ以上の異種核酸配列を含み得る。ＢｏＮＴ−Ａ抗原のＮ末端に、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）リーダー配列を位置させるか、結合させることができる。これにより、最適化核酸は、ＩｇＥリーダー配列もコードし得る。他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ａ抗原のＮ末端に、ＩｇＥリーダー配列を位置させなくても、結合させなくてもよい。したがって、最適化核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含まないか、当該配列を有しない。さらに他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ａアミノ酸配列は、ＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグに結合していてよい。これにより、最適化核酸は、ＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグもコードし得る。
【００６４】
最適化核酸の配列番号１は、ＢｏＮＴ−Ａ抗原（配列番号２）をコードする。具体的には、配列番号１は、ＩｇＥリーダー配列に結合したＢｏＮＴ−Ａ抗原（配列番号２）をコードする。さらに、ＢｏＮＴ−Ａタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２である。ＩｇＥリーダーに結合したＢｏＮＴ−Ａタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２である。ＩｇＥリーダーに結合したＢｏＮＴ−Ａタンパク質のアミノ酸配列はまた、ＨＡタグに結合していてもよい。
【００６５】
いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴ−Ａをコードする核酸は、配列番号１に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴ−Ａをコードする核酸は、配列番号１に記載の核酸配列であり得る。他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ａ抗原をコードする核酸は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。さらに他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ａ抗原は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ａ抗原は、配列番号２に記載のアミノ酸配列であり得る。
【００６６】
いくつかの実施形態は、配列番号１の断片に関する。断片は、配列番号１の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であり得る。断片は、配列番号１の断片と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％相同であり得る。断片は、配列番号１の断片と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり得る。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【００６７】
いくつかの実施形態は、本明細書の核酸コード配列と９５％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子に関する。いくつかの実施形態は、本明細書の核酸コード配列と９６％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子に関する。いくつかの実施形態は、本明細書の核酸コード配列と９７％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子に関する。いくつかの実施形態は、本明細書の核酸コード配列と９８％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子に関する。いくつかの実施形態は、本明細書の核酸コード配列と９９％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子に関する。いくつかの実施形態において、本明細書にて開示されるタンパク質のコード配列と相同である本明細書にて開示されるコード配列を有する核酸分子は、本明細書にて開示される相同のタンパク質配列をコードするコード配列の５’末端に結合したＩｇＥリーダー配列をコードする配列を含む。
【００６８】
いくつかの実施形態は、ＢｏＮＴ−Ａタンパク質と相同のタンパク質、ＢｏＮＴ−Ａタンパク質の免疫原性断片及び相同のタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列に関する。ＢｏＮＴ−Ａアミノ酸配列に対して最大９５％の相同性、ＢｏＮＴ−Ａアミノ酸配列に対して最大９６％の相同性、ＢｏＮＴ−Ａアミノ酸配列に対して最大９６％の相同性、ＢｏＮＴ−Ａアミノ酸配列に対して最大９７％の相同性、ＢｏＮＴ−Ａアミノ酸配列に対して最大９８％の相同性、及びＢｏＮＴ−Ａアミノ酸配列に対して最大９９％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子が提供され得る。同様に、本明細書に記載の免疫原性断片及び本明細書に記載のタンパク質と相同のタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列もまた提供される。
【００６９】
いくつかの実施形態は、完全長ＢｏＮＴ−Ａタンパク質に対して特定の割合の同一性を有するタンパク質、ＢｏＮＴ−Ａタンパク質の免疫原性断片及びＢｏＮＴ−Ａタンパク質に対して同一性を有するタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列に関する。完全長ＢｏＮＴ−Ａアミノ酸配列に対して最大８０％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ａアミノ酸配列に対して最大８５％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ａアミノ酸配列に対して最大９０％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ａアミノ酸配列に対して最大９１％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ａアミノ酸配列に対して最大９２％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ａアミノ酸配列に対して最大９３％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ａアミノ酸配列に対して最大９４％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ａアミノ酸配列に対して最大９５％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ａアミノ酸配列に対して最大９６％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ａアミノ酸配列に対して最大９７％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ａアミノ酸配列に対して最大９８％の同一性、及び完全長ＢｏＮＴ−Ａアミノ酸配列に対して最大９９％の同一性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子が提供され得る。同様に、本明細書に記載の免疫原性断片及び本明細書に記載のＢｏＮＴ−Ａタンパク質に対して上記の割合と類似の同一性を有するタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列もまた提供される。
【００７０】
いくつかの実施形態において、核酸配列は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。いくつかの実施形態において、核酸配列は、ＩｇＥリーダーをコードするコード配列を含まない。
【００７１】
いくつかの実施形態は、配列番号２と相同であるタンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号２に記載のタンパク質配列と９５％の相同性を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号２に記載のタンパク質配列と９６％の相同性を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号２に記載のタンパク質配列と９７％の相同性を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号２に記載のタンパク質配列と９８％の相同性を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号２に記載のタンパク質配列と９９％の相同性を有する免疫原性タンパク質に関する。
【００７２】
いくつかの実施形態は、配列番号２と同一であるタンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号２に記載の完全長アミノ酸配列と８０％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号２に記載の完全長アミノ酸配列と８５％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号２に記載の完全長アミノ酸配列と９０％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号２に記載の完全長アミノ酸配列と９１％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号２に記載の完全長アミノ酸配列と９２％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号２に記載の完全長アミノ酸配列と９３％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号２に記載の完全長アミノ酸配列と９４％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号２に記載の完全長アミノ酸配列と９５％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号２に記載の完全長アミノ酸配列と９６％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号２に記載の完全長アミノ酸配列と９７％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号２に記載の完全長アミノ酸配列と９８％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号２に記載の完全長アミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。
【００７３】
いくつかの実施形態において、タンパク質は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ＩｇＥリーダーを含まない。ＢｏＮＴ−Ａタンパク質の断片は、ＢｏＮＴ−Ａタンパク質の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。配列番号２の免疫原性断片が提供され得る。免疫原性断片は、配列番号２の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含まない。
【００７４】
配列番号２の免疫原性断片と相同のアミノ酸配列を持つタンパク質の免疫原性断片が提供され得る。かかる免疫原性断片は、配列番号２と９５％以上相同であるタンパク質の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のタンパク質配列の免疫原性断片と９６％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のタンパク質配列の免疫原性断片と９７％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のタンパク質配列の免疫原性断片と９８％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のタンパク質配列の免疫原性断片と９９％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含まない。
【００７５】
配列番号２の免疫原性断片と同一のアミノ酸配列を持つタンパク質の免疫原性断片が提供される。かかる免疫原性断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるタンパク質の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含まない。
【００７６】
タンパク質のＮ末端へのシグナルペプチドまたはリーダー配列の結合に関して本明細書で述べる場合、当該シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のＮ末端メチオニンと置き代わる。Ｎ末端メチオニンは、シグナルペプチドのコード配列なしでタンパク質をコードする核酸配列の開始コドンによってコードされている。
（２）コンセンサスＢｏＮＴ−Ａ
【００７７】
ＢｏＮＴ−Ａ抗原は、複数のボツリヌス菌血清型Ａによる神経毒素の重鎖のアミノ酸配列に由来するコンセンサスタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態は、ＢｏＮＴ−Ａコンセンサスタンパク質と相同のタンパク質、ＢｏＮＴ−Ａコンセンサスタンパク質の免疫原性断片及び相同のタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列に関する。コンセンサス配列に対して最大９５％の相同性、コンセンサス配列に対して最大９６％の相同性、コンセンサス配列に対して最大９７％の相同性、コンセンサス配列に対して最大９８％の相同性、及びコンセンサス配列に対して最大９９％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子が提供され得る。同様に、本明細書に記載の免疫原性断片及び本明細書に記載のタンパク質と相同のタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列もまた提供される。
【００７８】
いくつかの実施形態は、完全長ＢｏＮＴ−Ａコンセンサスタンパク質に対して特定の割合の同一性を有するタンパク質、ＢｏＮＴ−Ａコンセンサスタンパク質の免疫原性断片及びＢｏＮＴ−Ａコンセンサスタンパク質に対して同一性を有するタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列に関する。完全長ＢｏＮＴ−Ａコンセンサス配列に対して最大８０％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ａコンセンサス配列に対して最大８５％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ａコンセンサス配列に対して最大９０％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ａコンセンサス配列に対して最大９１％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ａコンセンサス配列に対して最大９２％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ａコンセンサス配列に対して最大９３％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ａコンセンサス配列に対して最大９４％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ａコンセンサス配列に対して最大９５％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ａコンセンサス配列に対して最大９６％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ａコンセンサス配列に対して最大９７％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ａコンセンサス配列に対して最大９８％の同一性、及び完全長ＢｏＮＴ−Ａコンセンサス配列に対して最大９９％の同一性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子が提供され得る。同様に、本明細書に記載の免疫原性断片及び本明細書に記載のＢｏＮＴ−Ａタンパク質に対して上記の割合と類似の同一性を有するタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列もまた提供される。
【００７９】
いくつかの実施形態において、核酸配列は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。いくつかの実施形態において、核酸配列は、ＩｇＥリーダーをコードするコード配列を含まない。
【００８０】
いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴ−Ａコンセンサスタンパク質は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴ−Ａコンセンサスタンパク質は、ＩｇＥリーダーを含まない。他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ａコンセンサスタンパク質は、リーダー配列、例えば、限定するものではないが、ＩｇＥリーダー配列を含み得る。ＢｏＮＴ−Ａコンセンサスタンパク質に少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するタンパク質もまた提供される。
【００８１】
ＢｏＮＴ−Ａコンセンサスタンパク質の断片は、ＢｏＮＴ−Ａコンセンサスタンパク質の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含まない。
【００８２】
いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９６％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９７％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９８％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９９％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含まない。
【００８３】
いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９６％の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９７％の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９８％の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９９％の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含まない。
ｂ．ＢｏＮＴ−Ｂ
【００８４】
本発明のワクチンは、血清型Ｂのボツリヌス菌（ＢｏＮＴ−Ｂ）に由来する抗原を含み得る。ＢｏＮＴ−Ｂは、（１）Ｂ細胞反応を介した体液性免疫、（２）細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応、及び（３）ヘルパーＴ細胞反応、またはクロスプレゼンテーションについては好ましくは上記の全てを誘導することによる免疫介在性反応にとって重要な標的である。ＢｏＮＴ−Ｂ抗原は、組織全体と神経系の両方において、抗原特異性Ｔ細胞及び高力価の抗体反応を誘導する。ＢｏＮＴ−Ｂ抗原は、致死量のボツリヌス菌神経毒素に対して防御能のある中和抗体を誘導する。これらの中和抗体は、ボツリヌス菌血清型Ｂに由来する致死量の神経毒素に対して防御能がある。
【００８５】
ＢｏＮＴ−Ｂ抗原は、抗ＢｏＮＴ−Ｂ免疫反応を誘導し得る免疫原としての有効性を高めるタンパク質エピトープを含み得る。ＢｏＮＴ−Ｂ抗原は、全長翻訳産物、その変異体、その断片またはこれらの組み合わせを含み得る。ＢｏＮＴ−Ｂ抗原は、ＢｏＮＴ−Ｂの重鎖、ＢｏＮＴ−Ｂの軽鎖、その変異体、その断片またはこれらの組み合わせを含み得る。ＢｏＮＴ−Ｂ抗原は、最適化核酸によってコードされ得、かつ／または以下でより詳細に記載するコンセンサスタンパク質を含み得る。したがって、いかなるユーザも、ＢｏＮＴ−Ｂ抗原またはＢｏＮＴ−Ｂコンセンサス抗原（ワクチン中の核酸によってコードされ得るものの一方またはその両方）を含むように本発明のワクチンを設計して、ボツリヌス菌神経毒素血清型Ｂに対する広範な免疫性をもたらすことができる。このように、ＢｏＮＴ−Ｂ抗原をコードする核酸、ＢｏＮＴ−Ｂコンセンサス抗原をコードする核酸、ＢｏＮＴ−Ｂ抗原、ＢｏＮＴ−Ｂコンセンサス抗原またはこれらの組み合わせを含むワクチンによって、神経系への防御免疫反応が提供される。
（１）最適化ＢｏＮＴ−Ｂ
【００８６】
ＢｏＮＴ−Ｂ抗原は、最適化核酸配列によってコードされ得る。この最適化核酸配列は、異種核酸配列であり得、かつ／または１つ以上の異種核酸配列を含み得る。ＢｏＮＴ−Ｂ抗原のＮ末端に、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）リーダー配列を位置させるか、結合させることができる。これにより、最適化核酸は、ＩｇＥリーダー配列もコードし得る。他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｂ抗原のＮ末端に、ＩｇＥリーダー配列を位置させなくても、結合させなくてもよい。したがって、最適化核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含まないか、当該配列を有しない。さらに他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｂアミノ酸配列は、ＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグに結合していてよい。これにより、最適化核酸は、ＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグもコードし得る。
【００８７】
最適化核酸の配列番号３は、ＢｏＮＴ−Ｂ抗原（配列番号４）をコードする。具体的には、配列番号３は、ＩｇＥリーダー配列に結合したＢｏＮＴ−Ｂ抗原（配列番号４）をコードする。さらに、ＢｏＮＴ−Ｂタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４である。ＩｇＥリーダーに結合したＢｏＮＴ−Ｂタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４である。ＩｇＥリーダーに結合したＢｏＮＴ−Ｂタンパク質のアミノ酸配列はまた、ＨＡタグに結合していてもよい。
【００８８】
いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｂをコードする核酸は、配列番号３に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｂをコードする核酸は、配列番号３に記載の核酸配列であり得る。他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｂ抗原をコードする核酸は、配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。さらに他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｂ抗原は、配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｂ抗原は、配列番号４に記載のアミノ酸配列であり得る。
【００８９】
いくつかの実施形態は、配列番号３の断片に関する。断片は、配列番号３の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であり得る。断片は、配列番号３の断片と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％相同であり得る。断片は、配列番号３の断片と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり得る。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【００９０】
いくつかの実施形態は、本明細書の核酸コード配列と９５％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子に関する。いくつかの実施形態は、本明細書の核酸コード配列と９６％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子に関する。いくつかの実施形態は、本明細書の核酸コード配列と９７％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子に関する。いくつかの実施形態は、本明細書の核酸コード配列と９８％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子に関する。いくつかの実施形態は、本明細書の核酸コード配列と９９％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子に関する。いくつかの実施形態において、本明細書にて開示されるタンパク質のコード配列と相同である本明細書にて開示されるコード配列を有する核酸分子は、本明細書にて開示される相同のタンパク質配列をコードするコード配列の５’末端に結合したＩｇＥリーダー配列をコードする配列を含む。
【００９１】
いくつかの実施形態は、ＢｏＮＴ−Ｂタンパク質と相同のタンパク質、ＢｏＮＴ−Ｂタンパク質の免疫原性断片及び相同のタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列に関する。ＢｏＮＴ−Ｂアミノ酸配列に対して最大９５％の相同性、ＢｏＮＴ−Ｂアミノ酸配列に対して最大９６％の相同性、ＢｏＮＴ−Ｂアミノ酸配列に対して最大９６％の相同性、ＢｏＮＴ−Ｂアミノ酸配列に対して最大９７％の相同性、ＢｏＮＴ−Ｂアミノ酸配列に対して最大９８％の相同性、及びＢｏＮＴ−Ｂアミノ酸配列に対して最大９９％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子が提供され得る。同様に、本明細書に記載の免疫原性断片及び本明細書に記載のタンパク質と相同のタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列もまた提供される。
【００９２】
いくつかの実施形態は、完全長ＢｏＮＴ−Ｂタンパク質に対して特定の割合の同一性を有するタンパク質、ＢｏＮＴ−Ｂタンパク質の免疫原性断片及びＢｏＮＴ−Ｂタンパク質に対して同一性を有するタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列に関する。完全長ＢｏＮＴ−Ｂアミノ酸配列に対して最大８０％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｂアミノ酸配列に対して最大８５％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｂアミノ酸配列に対して最大９０％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｂアミノ酸配列に対して最大９１％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｂアミノ酸配列に対して最大９２％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｂアミノ酸配列に対して最大９３％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｂアミノ酸配列に対して最大９４％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｂアミノ酸配列に対して最大９５％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｂアミノ酸配列に対して最大９６％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｂアミノ酸配列に対して最大９７％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｂアミノ酸配列に対して最大９８％の同一性、及び完全長ＢｏＮＴ−Ｂアミノ酸配列に対して最大９９％の同一性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子が提供され得る。同様に、本明細書に記載の免疫原性断片及び本明細書に記載のＢｏＮＴ−Ｂタンパク質に対して上記の割合と類似の同一性を有するタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列もまた提供される。
【００９３】
いくつかの実施形態において、核酸配列は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。いくつかの実施形態において、核酸配列は、ＩｇＥリーダーをコードするコード配列を含まない。
【００９４】
いくつかの実施形態は、配列番号４と相同であるタンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号４に記載のタンパク質配列と９５％の相同性を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号４に記載のタンパク質配列と９６％の相同性を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号４に記載のタンパク質配列と９７％の相同性を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号４に記載のタンパク質配列と９８％の相同性を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号４に記載のタンパク質配列と９９％の相同性を有する免疫原性タンパク質に関する。
【００９５】
いくつかの実施形態は、配列番号４と同一であるタンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号４に記載の完全長アミノ酸配列と８０％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号４に記載の完全長アミノ酸配列と８５％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号４に記載の完全長アミノ酸配列と９０％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号４に記載の完全長アミノ酸配列と９１％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号４に記載の完全長アミノ酸配列と９２％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号４に記載の完全長アミノ酸配列と９３％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号４に記載の完全長アミノ酸配列と９４％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号４に記載の完全長アミノ酸配列と９５％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号４に記載の完全長アミノ酸配列と９６％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号４に記載の完全長アミノ酸配列と９７％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号４に記載の完全長アミノ酸配列と９８％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号４に記載の完全長アミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。
【００９６】
いくつかの実施形態において、タンパク質は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ＩｇＥリーダーを含まない。ＢｏＮＴ−Ｂタンパク質の断片は、ＢｏＮＴ−Ｂタンパク質の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。配列番号４の免疫原性断片が提供され得る。免疫原性断片は、配列番号４の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含まない。
【００９７】
配列番号４の免疫原性断片と相同のアミノ酸配列を持つタンパク質の免疫原性断片が提供され得る。かかる免疫原性断片は、配列番号４と９５％以上相同であるタンパク質の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のタンパク質配列の免疫原性断片と９６％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のタンパク質配列の免疫原性断片と９７％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のタンパク質配列の免疫原性断片と９８％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のタンパク質配列の免疫原性断片と９９％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含まない。
【００９８】
配列番号４の免疫原性断片と同一のアミノ酸配列を持つタンパク質の免疫原性断片が提供される。かかる免疫原性断片は、配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるタンパク質の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含まない。
【００９９】
タンパク質のＮ末端へのシグナルペプチドまたはリーダー配列の結合に関して本明細書で述べる場合、当該シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のＮ末端メチオニンと置き代わる。Ｎ末端メチオニンは、シグナルペプチドのコード配列なしでタンパク質をコードする核酸配列の開始コドンによってコードされている。
（２）コンセンサスＢｏＮＴ−Ｂ
【０１００】
ＢｏＮＴ−Ｂ抗原は、複数のボツリヌス菌血清型Ｂによる神経毒素の重鎖のアミノ酸配列に由来するコンセンサスタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態は、ＢｏＮＴ−Ｂコンセンサスタンパク質と相同のタンパク質、ＢｏＮＴ−Ｂコンセンサスタンパク質の免疫原性断片及び相同のタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列に関する。コンセンサス配列に対して最大９５％の相同性、コンセンサス配列に対して最大９６％の相同性、コンセンサス配列に対して最大９７％の相同性、コンセンサス配列に対して最大９８％の相同性、及びコンセンサス配列に対して最大９９％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子が提供され得る。同様に、本明細書に記載の免疫原性断片及び本明細書に記載のタンパク質と相同のタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列もまた提供される。
【０１０１】
いくつかの実施形態は、完全長ＢｏＮＴ−Ｂコンセンサスタンパク質に対して特定の割合の同一性を有するタンパク質、ＢｏＮＴ−Ｂコンセンサスタンパク質の免疫原性断片及びＢｏＮＴ−Ｂコンセンサスタンパク質に対して同一性を有するタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列に関する。完全長ＢｏＮＴ−Ｂコンセンサス配列に対して最大８０％の同一性、完全長コンセンサス配列に対して最大８５％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｂコンセンサス配列に対して最大９０％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｂコンセンサス配列に対して最大９１％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｂコンセンサス配列に対して最大９２％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｂコンセンサス配列に対して最大９３％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｂコンセンサス配列に対して最大９４％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｂコンセンサス配列に対して最大９５％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｂコンセンサス配列に対して最大９６％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｂコンセンサス配列に対して最大９７％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｂコンセンサス配列に対して最大９８％の同一性、及び完全長ＢｏＮＴ−Ｂコンセンサス配列に対して最大９９％の同一性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子が提供され得る。同様に、本明細書に記載の免疫原性断片及び本明細書に記載のＢｏＮＴ−Ｂタンパク質に対して上記の割合と類似の同一性を有するタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列もまた提供される。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、核酸配列は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。いくつかの実施形態において、核酸配列は、ＩｇＥリーダーをコードするコード配列を含まない。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｂコンセンサスタンパク質は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｂコンセンサスタンパク質は、ＩｇＥリーダーを含まない。他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｂコンセンサスタンパク質は、リーダー配列、例えば、限定するものではないが、ＩｇＥリーダー配列を含み得る。ＢｏＮＴ−Ｂコンセンサスタンパク質に少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するタンパク質もまた提供される。
【０１０４】
ＢｏＮＴ−Ｂコンセンサスタンパク質の断片は、ＢｏＮＴ−Ｂコンセンサスタンパク質の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含まない。
【０１０５】
いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９６％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９７％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９８％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９９％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含まない。
【０１０６】
いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９６％の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９７％の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９８％の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９９％の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含まない。
ｃ．ＢｏＮＴ−Ｅ
【０１０７】
本発明のワクチンは、血清型Ｅのボツリヌス菌（ＢｏＮＴ−Ｅ）に由来する抗原を含み得る。ＢｏＮＴ−Ｅは、（１）Ｂ細胞反応を介した体液性免疫、（２）細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応、及び（３）ヘルパーＴ細胞反応、またはクロスプレゼンテーションについては好ましくは上記の全てを誘導することによる免疫介在性反応にとって重要な標的である。ＢｏＮＴ−Ｅ抗原は、組織全体と神経系の両方において、抗原特異性Ｔ細胞及び高力価の抗体反応を誘導する。ＢｏＮＴ−Ｅ抗原は、致死量のボツリヌス菌神経毒素に対して防御能のある中和抗体を誘導する。これらの中和抗体は、ボツリヌス菌血清型Ｅに由来する致死量の神経毒素に対して防御能がある。
【０１０８】
ＢｏＮＴ−Ｅ抗原は、抗ＢｏＮＴ−Ｅ免疫反応を誘導し得る免疫原としての有効性を高めるタンパク質エピトープを含み得る。ＢｏＮＴ−Ｅ抗原は、全長翻訳産物、その変異体、その断片またはこれらの組み合わせを含み得る。ＢｏＮＴ−Ｅ抗原は、ＢｏＮＴ−Ｅの重鎖、ＢｏＮＴ−Ｅの軽鎖、その変異体、その断片またはこれらの組み合わせを含み得る。ＢｏＮＴ−Ｅ抗原は、最適化核酸によってコードされ得、かつ／または以下でより詳細に記載するコンセンサスタンパク質を含み得る。したがって、いかなるユーザも、ＢｏＮＴ−Ｅ抗原またはＢｏＮＴ−Ｅコンセンサス抗原（ワクチン中の核酸によってコードされ得るものの一方またはその両方）を含むように本発明のワクチンを設計して、ボツリヌス菌神経毒素血清型Ｅに対する広範な免疫性をもたらすことができる。このように、ＢｏＮＴ−Ｅ抗原をコードする核酸、ＢｏＮＴ−Ｅコンセンサス抗原をコードする核酸、ＢｏＮＴ−Ｅ抗原、ＢｏＮＴ−Ｅコンセンサス抗原またはこれらの組み合わせを含むワクチンによって、神経系への防御免疫反応が提供される。
（１）最適化ＢｏＮＴ−Ｅ
【０１０９】
ＢｏＮＴ−Ｅ抗原は、最適化核酸配列によってコードされ得る。この最適化核酸配列は、異種核酸配列であり得、かつ／または１つ以上の異種核酸配列を含み得る。ＢｏＮＴ−Ｅ抗原のＮ末端に、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）リーダー配列を位置させるか、結合させることができる。これにより、最適化核酸は、ＩｇＥリーダー配列もコードし得る。他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｅ抗原のＮ末端に、ＩｇＥリーダー配列を位置させなくても、結合させなくてもよい。したがって、最適化核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含まないか、当該配列を有しない。さらに他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｅアミノ酸配列は、ＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグに結合していてよい。これにより、最適化核酸は、ＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグもコードし得る。
【０１１０】
最適化核酸の配列番号５は、ＢｏＮＴ−Ｅ抗原（配列番号６）をコードする。具体的には、配列番号５は、ＩｇＥリーダー配列に結合したＢｏＮＴ−Ｅ抗原（配列番号６）をコードする。さらに、ＢｏＮＴ−Ｅタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号６である。ＩｇＥリーダーに結合したＢｏＮＴ−Ｅタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号６である。ＩｇＥリーダーに結合したＢｏＮＴ−Ｅタンパク質のアミノ酸配列はまた、ＨＡタグに結合していてもよい。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｅをコードする核酸は、配列番号５に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｅをコードする核酸は、配列番号５に記載の核酸配列であり得る。他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｅ抗原をコードする核酸は、配列番号６に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。さらに他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｅ抗原は、配列番号６に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｅ抗原は、配列番号６に記載のアミノ酸配列であり得る。
【０１１２】
いくつかの実施形態は、配列番号５の断片に関する。断片は、配列番号５の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であり得る。断片は、配列番号５の断片と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％相同であり得る。断片は、配列番号５の断片と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり得る。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【０１１３】
いくつかの実施形態は、本明細書の核酸コード配列と９５％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子に関する。いくつかの実施形態は、本明細書の核酸コード配列と９６％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子に関する。いくつかの実施形態は、本明細書の核酸コード配列と９７％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子に関する。いくつかの実施形態は、本明細書の核酸コード配列と９８％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子に関する。いくつかの実施形態は、本明細書の核酸コード配列と９９％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子に関する。いくつかの実施形態において、本明細書にて開示されるタンパク質のコード配列と相同である本明細書にて開示されるコード配列を有する核酸分子は、本明細書にて開示される相同のタンパク質配列をコードするコード配列の５’末端に結合したＩｇＥリーダー配列をコードする配列を含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態は、ＢｏＮＴ−Ｅタンパク質と相同のタンパク質、ＢｏＮＴ−Ｅタンパク質の免疫原性断片及び相同のタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列に関する。ＢｏＮＴ−Ｅアミノ酸配列に対して最大９５％の相同性、ＢｏＮＴ−Ｅアミノ酸配列に対して最大９６％の相同性、ＢｏＮＴ−Ｅアミノ酸配列に対して最大９６％の相同性、ＢｏＮＴ−Ｅアミノ酸配列に対して最大９７％の相同性、ＢｏＮＴ−Ｅアミノ酸配列に対して最大９８％の相同性、及びＢｏＮＴ−Ｅアミノ酸配列に対して最大９９％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子が提供され得る。同様に、本明細書に記載の免疫原性断片及び本明細書に記載のタンパク質と相同のタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列もまた提供される。
【０１１５】
いくつかの実施形態は、完全長ＢｏＮＴ−Ｅタンパク質に対して特定の割合の同一性を有するタンパク質、ＢｏＮＴ−Ｅタンパク質の免疫原性断片及びＢｏＮＴ−Ｅタンパク質に対して同一性を有するタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列に関する。完全長ＢｏＮＴ−Ｅアミノ酸配列に対して最大８０％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｅアミノ酸配列に対して最大８５％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｅアミノ酸配列に対して最大９０％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｅアミノ酸配列に対して最大９１％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｅアミノ酸配列に対して最大９２％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｅアミノ酸配列に対して最大９３％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｅアミノ酸配列に対して最大９４％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｅアミノ酸配列に対して最大９５％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｅアミノ酸配列に対して最大９６％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｅアミノ酸配列に対して最大９７％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｅアミノ酸配列に対して最大９８％の同一性、及び完全長ＢｏＮＴ−Ｅアミノ酸配列に対して最大９９％の同一性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子が提供され得る。同様に、本明細書に記載の免疫原性断片及び本明細書に記載のＢｏＮＴ−Ｅタンパク質に対して上記の割合と類似の同一性を有するタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列もまた提供される。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、核酸配列は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。いくつかの実施形態において、核酸配列は、ＩｇＥリーダーをコードするコード配列を含まない。
【０１１７】
いくつかの実施形態は、配列番号６と相同であるタンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号６に記載のタンパク質配列と９５％の相同性を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号６に記載のタンパク質配列と９６％の相同性を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号６に記載のタンパク質配列と９７％の相同性を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号６に記載のタンパク質配列と９８％の相同性を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号６に記載のタンパク質配列と９９％の相同性を有する免疫原性タンパク質に関する。
【０１１８】
いくつかの実施形態は、配列番号６と同一であるタンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号６に記載の完全長アミノ酸配列と８０％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号６に記載の完全長アミノ酸配列と８５％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号６に記載の完全長アミノ酸配列と９０％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号６に記載の完全長アミノ酸配列と９１％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号６に記載の完全長アミノ酸配列と９２％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号６に記載の完全長アミノ酸配列と９３％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号６に記載の完全長アミノ酸配列と９４％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号６に記載の完全長アミノ酸配列と９５％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号６に記載の完全長アミノ酸配列と９６％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号６に記載の完全長アミノ酸配列と９７％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号６に記載の完全長アミノ酸配列と９８％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号６に記載の完全長アミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、タンパク質は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ＩｇＥリーダーを含まない。ＢｏＮＴ−Ｅタンパク質の断片は、ＢｏＮＴ−Ｅタンパク質の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。配列番号６の免疫原性断片が提供され得る。免疫原性断片は、配列番号６の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含まない。
【０１２０】
配列番号６の免疫原性断片と相同のアミノ酸配列を持つタンパク質の免疫原性断片が提供され得る。かかる免疫原性断片は、配列番号６と９５％以上相同であるタンパク質の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のタンパク質配列の免疫原性断片と９６％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のタンパク質配列の免疫原性断片と９７％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のタンパク質配列の免疫原性断片と９８％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のタンパク質配列の免疫原性断片と９９％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含まない。
【０１２１】
配列番号６の免疫原性断片と同一のアミノ酸配列を持つタンパク質の免疫原性断片が提供される。かかる免疫原性断片は、配列番号６に記載のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるタンパク質の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含まない。
【０１２２】
タンパク質のＮ末端へのシグナルペプチドまたはリーダー配列の結合に関して本明細書で述べる場合、当該シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のＮ末端メチオニンと置き代わる。Ｎ末端メチオニンは、シグナルペプチドのコード配列なしでタンパク質をコードする核酸配列の開始コドンによってコードされている。
（２）コンセンサスＢｏＮＴ−Ｅ
【０１２３】
ＢｏＮＴ−Ｅ抗原は、複数のボツリヌス菌血清型Ｅによる神経毒素の重鎖のアミノ酸配列に由来するコンセンサスタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態は、ＢｏＮＴ−Ｅコンセンサスタンパク質と相同のタンパク質、ＢｏＮＴ−Ｅコンセンサスタンパク質の免疫原性断片及び相同のタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列に関する。コンセンサス配列に対して最大９５％の相同性、コンセンサス配列に対して最大９６％の相同性、コンセンサス配列に対して最大９７％の相同性、コンセンサス配列に対して最大９８％の相同性、及びコンセンサス配列に対して最大９９％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子が提供され得る。同様に、本明細書に記載の免疫原性断片及び本明細書に記載のタンパク質と相同のタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列もまた提供される。
【０１２４】
いくつかの実施形態は、完全長ＢｏＮＴ−Ｅコンセンサスタンパク質に対して特定の割合の同一性を有するタンパク質、ＢｏＮＴ−Ｅコンセンサスタンパク質の免疫原性断片及びＢｏＮＴ−Ｅコンセンサスタンパク質に対して同一性を有するタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列に関する。完全長ＢｏＮＴ−Ｅコンセンサス配列に対して最大８０％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｅコンセンサス配列に対して最大８５％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｅコンセンサス配列に対して最大９０％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｅコンセンサス配列に対して最大９１％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｅコンセンサス配列に対して最大９２％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｅコンセンサス配列に対して最大９３％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｅコンセンサス配列に対して最大９４％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｅコンセンサス配列に対して最大９５％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｅコンセンサス配列に対して最大９６％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｅコンセンサス配列に対して最大９７％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｅコンセンサス配列に対して最大９８％の同一性、及び完全長ＢｏＮＴ−Ｅコンセンサス配列に対して最大９９％の同一性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子が提供され得る。同様に、本明細書に記載の免疫原性断片及び本明細書に記載のＢｏＮＴ−Ｅタンパク質に対して上記の割合と類似の同一性を有するタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列もまた提供される。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、核酸配列は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。いくつかの実施形態において、核酸配列は、ＩｇＥリーダーをコードするコード配列を含まない。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｅコンセンサスタンパク質は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｅコンセンサスタンパク質は、ＩｇＥリーダーを含まない。他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｅコンセンサスタンパク質は、リーダー配列、例えば、限定するものではないが、ＩｇＥリーダー配列を含み得る。ＢｏＮＴ−Ｅコンセンサスタンパク質に少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するタンパク質もまた提供される。
【０１２７】
ＢｏＮＴ−Ｅコンセンサスタンパク質の断片は、ＢｏＮＴ−Ｅコンセンサスタンパク質の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含まない。
【０１２８】
いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９６％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９７％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９８％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９９％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含まない。
【０１２９】
いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９６％の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９７％の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９８％の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９９％の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含まない。
ｄ．ＢｏＮＴ−Ｆ
【０１３０】
本発明のワクチンは、血清型Ｆのボツリヌス菌（ＢｏＮＴ−Ｆ）に由来する抗原を含み得る。ＢｏＮＴ−Ｆは、（１）Ｂ細胞反応を介した体液性免疫、（２）細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応、及び（３）ヘルパーＴ細胞反応、またはクロスプレゼンテーションについては好ましくは上記の全てを誘導することによる免疫介在性反応にとって重要な標的である。ＢｏＮＴ−Ｆ抗原は、組織全体と神経系の両方において、抗原特異性Ｔ細胞及び高力価の抗体反応を誘導する。ＢｏＮＴ−Ｆ抗原は、致死量のボツリヌス菌神経毒素に対して防御能のある中和抗体を誘導する。これらの中和抗体は、ボツリヌス菌血清型Ｆに由来する致死量の神経毒素に対して防御能がある。
【０１３１】
ＢｏＮＴ−Ｆ抗原は、抗ＢｏＮＴ−Ｆ免疫反応を誘導し得る免疫原としての有効性を高めるタンパク質エピトープを含み得る。ＢｏＮＴ−Ｆ抗原は、全長翻訳産物、その変異体、その断片またはこれらの組み合わせを含み得る。ＢｏＮＴ−Ｆ抗原は、ＢｏＮＴ−Ｆの重鎖、ＢｏＮＴ−Ｆの軽鎖、その変異体、その断片またはこれらの組み合わせを含み得る。ＢｏＮＴ−Ｆ抗原は、最適化核酸によってコードされ得、かつ／または以下でより詳細に記載するコンセンサスタンパク質を含み得る。したがって、いかなるユーザも、ＢｏＮＴ−Ｆ抗原またはＢｏＮＴ−Ｆコンセンサス抗原（ワクチン中の核酸によってコードされ得るものの一方またはその両方）を含むように本発明のワクチンを設計して、ボツリヌス菌神経毒素血清型Ｆに対する広範な免疫性をもたらすことができる。このように、ＢｏＮＴ−Ｆ抗原をコードする核酸、ＢｏＮＴ−Ｆコンセンサス抗原をコードする核酸、ＢｏＮＴ−Ｆ抗原、ＢｏＮＴ−Ｆコンセンサス抗原またはこれらの組み合わせを含むワクチンによって、神経系への防御免疫反応が提供される。
（１）最適化ＢｏＮＴ−Ｆ
【０１３２】
ＢｏＮＴ−Ｆ抗原は、最適化核酸配列によってコードされ得る。この最適化核酸配列は、異種核酸配列であり得、かつ／または１つ以上の異種核酸配列を含み得る。ＢｏＮＴ−Ｆ抗原のＮ末端に、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）リーダー配列を位置させるか、結合させることができる。これにより、最適化核酸は、ＩｇＥリーダー配列もコードし得る。他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｆ抗原のＮ末端に、ＩｇＥリーダー配列を位置させなくても、結合させなくてもよい。したがって、最適化核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含まないか、当該配列を有しない。さらに他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｆアミノ酸配列は、ＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグに結合していてよい。これにより、最適化核酸は、ＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグもコードし得る。
【０１３３】
最適化核酸の配列番号７は、ＢｏＮＴ−Ｆ抗原（配列番号８）をコードする。具体的には、配列番号７は、ＩｇＥリーダー配列に結合したＢｏＮＴ−Ｆ抗原（配列番号８）をコードする。さらに、ＢｏＮＴ−Ｆタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号８である。ＩｇＥリーダーに結合したＢｏＮＴ−Ｆタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号８である。ＩｇＥリーダーに結合したＢｏＮＴ−Ｆタンパク質のアミノ酸配列はまた、ＨＡタグに結合していてもよい。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｆをコードする核酸は、配列番号７に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｆをコードする核酸は、配列番号７に記載の核酸配列であり得る。他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｆ抗原をコードする核酸は、配列番号８に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。さらに他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｆ抗原は、配列番号８に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｆ抗原は、配列番号８に記載のアミノ酸配列であり得る。
【０１３５】
いくつかの実施形態は、配列番号７の断片に関する。断片は、配列番号７の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であり得る。断片は、配列番号７の断片と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％相同であり得る。断片は、配列番号７の断片と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり得る。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【０１３６】
いくつかの実施形態は、本明細書の核酸コード配列と９５％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子に関する。いくつかの実施形態は、本明細書の核酸コード配列と９６％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子に関する。いくつかの実施形態は、本明細書の核酸コード配列と９７％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子に関する。いくつかの実施形態は、本明細書の核酸コード配列と９８％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子に関する。いくつかの実施形態は、本明細書の核酸コード配列と９９％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子に関する。いくつかの実施形態において、本明細書にて開示されるタンパク質のコード配列と相同である本明細書にて開示されるコード配列を有する核酸分子は、本明細書にて開示される相同のタンパク質配列をコードするコード配列の５’末端に結合したＩｇＥリーダー配列をコードする配列を含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態は、ＢｏＮＴ−Ｆタンパク質と相同のタンパク質、ＢｏＮＴ−Ｆタンパク質の免疫原性断片及び相同のタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列に関する。ＢｏＮＴ−Ｆアミノ酸配列に対して最大９５％の相同性、ＢｏＮＴ−Ｆアミノ酸配列に対して最大９６％の相同性、ＢｏＮＴ−Ｆアミノ酸配列に対して最大９６％の相同性、ＢｏＮＴ−Ｆアミノ酸配列に対して最大９７％の相同性、ＢｏＮＴ−Ｆアミノ酸配列に対して最大９８％の相同性、及びＢｏＮＴ−Ｆアミノ酸配列に対して最大９９％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子が提供され得る。同様に、本明細書に記載の免疫原性断片及び本明細書に記載のタンパク質と相同のタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列もまた提供される。
【０１３８】
いくつかの実施形態は、完全長ＢｏＮＴ−Ｆタンパク質に対して特定の割合の同一性を有するタンパク質、ＢｏＮＴ−Ｆタンパク質の免疫原性断片及びＢｏＮＴ−Ｆタンパク質に対して同一性を有するタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列に関する。完全長ＢｏＮＴ−Ｆアミノ酸配列に対して最大８０％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｆアミノ酸配列に対して最大８５％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｆアミノ酸配列に対して最大９０％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｆアミノ酸配列に対して最大９１％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｆアミノ酸配列に対して最大９２％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｆアミノ酸配列に対して最大９３％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｆアミノ酸配列に対して最大９４％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｆアミノ酸配列に対して最大９５％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｆアミノ酸配列に対して最大９６％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｆアミノ酸配列に対して最大９７％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｆアミノ酸配列に対して最大９８％の同一性、及び完全長ＢｏＮＴ−Ｆアミノ酸配列に対して最大９９％の同一性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子が提供され得る。同様に、本明細書に記載の免疫原性断片及び本明細書に記載のＢｏＮＴ−Ｆタンパク質に対して上記の割合と類似の同一性を有するタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列もまた提供される。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、核酸配列は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。いくつかの実施形態において、核酸配列は、ＩｇＥリーダーをコードするコード配列を含まない。
【０１４０】
いくつかの実施形態は、配列番号８と相同であるタンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号８に記載のタンパク質配列と９５％の相同性を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号８に記載のタンパク質配列と９６％の相同性を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号８に記載のタンパク質配列と９７％の相同性を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号８に記載のタンパク質配列と９８％の相同性を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号８に記載のタンパク質配列と９９％の相同性を有する免疫原性タンパク質に関する。
【０１４１】
いくつかの実施形態は、配列番号８と同一であるタンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号８に記載の完全長アミノ酸配列と８０％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号８に記載の完全長アミノ酸配列と８５％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号８に記載の完全長アミノ酸配列と９０％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号８に記載の完全長アミノ酸配列と９１％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号８に記載の完全長アミノ酸配列と９２％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号８に記載の完全長アミノ酸配列と９３％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号８に記載の完全長アミノ酸配列と９４％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号８に記載の完全長アミノ酸配列と９５％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号８に記載の完全長アミノ酸配列と９６％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号８に記載の完全長アミノ酸配列と９７％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号８に記載の完全長アミノ酸配列と９８％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号８に記載の完全長アミノ酸配列と９９％同一であるアミノ酸配列を有する免疫原性タンパク質に関する。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、タンパク質は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ＩｇＥリーダーを含まない。ＢｏＮＴ−Ｆタンパク質の断片は、ＢｏＮＴ−Ｆタンパク質の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。配列番号８の免疫原性断片が提供され得る。免疫原性断片は、配列番号８の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含まない。
【０１４３】
配列番号８の免疫原性断片と相同のアミノ酸配列を持つタンパク質の免疫原性断片が提供され得る。かかる免疫原性断片は、配列番号８と９５％以上相同であるタンパク質の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のタンパク質配列の免疫原性断片と９６％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のタンパク質配列の免疫原性断片と９７％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のタンパク質配列の免疫原性断片と９８％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のタンパク質配列の免疫原性断片と９９％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含まない。
【０１４４】
配列番号８の免疫原性断片と同一のアミノ酸配列を持つタンパク質の免疫原性断片が提供される。かかる免疫原性断片は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるタンパク質の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含まない。
【０１４５】
タンパク質のＮ末端へのシグナルペプチドまたはリーダー配列の結合に関して本明細書で述べる場合、当該シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のＮ末端メチオニンと置き代わる。Ｎ末端メチオニンは、シグナルペプチドのコード配列なしでタンパク質をコードする核酸配列の開始コドンによってコードされている。
（２）コンセンサスＢｏＮＴ−Ｆ
【０１４６】
ＢｏＮＴ−Ｆ抗原は、複数のボツリヌス菌血清型Ｆによる神経毒素の重鎖のアミノ酸配列に由来するコンセンサスタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態は、ＢｏＮＴ−Ｆコンセンサスタンパク質と相同のタンパク質、ＢｏＮＴ−Ｆコンセンサスタンパク質の免疫原性断片及び相同のタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列に関する。コンセンサス配列に対して最大９５％の相同性、コンセンサス配列に対して最大９６％の相同性、コンセンサス配列に対して最大９７％の相同性、コンセンサス配列に対して最大９８％の相同性、及びコンセンサス配列に対して最大９９％の相同性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子が提供され得る。同様に、本明細書に記載の免疫原性断片及び本明細書に記載のタンパク質と相同のタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列もまた提供される。
【０１４７】
いくつかの実施形態は、完全長ＢｏＮＴ−Ｆコンセンサスタンパク質に対して特定の割合の同一性を有するタンパク質、ＢｏＮＴ−Ｆコンセンサスタンパク質の免疫原性断片及びＢｏＮＴ−Ｆコンセンサスタンパク質に対して同一性を有するタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列に関する。完全長ＢｏＮＴ−Ｆコンセンサス配列に対して最大８０％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｆコンセンサス配列に対して最大８５％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｆコンセンサス配列に対して最大９０％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｆコンセンサス配列に対して最大９１％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｆコンセンサス配列に対して最大９２％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｆコンセンサス配列に対して最大９３％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｆコンセンサス配列に対して最大９４％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｆコンセンサス配列に対して最大９５％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｆコンセンサス配列に対して最大９６％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｆコンセンサス配列に対して最大９７％の同一性、完全長ＢｏＮＴ−Ｆコンセンサス配列に対して最大９８％の同一性、及び完全長ＢｏＮＴ−Ｆコンセンサス配列に対して最大９９％の同一性を有する免疫原性タンパク質をコードする核酸分子が提供され得る。同様に、本明細書に記載の免疫原性断片及び本明細書に記載のＢｏＮＴ−Ｆタンパク質に対して上記の割合と類似の同一性を有するタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列もまた提供される。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、核酸配列は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。いくつかの実施形態において、核酸配列は、ＩｇＥリーダーをコードするコード配列を含まない。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｆコンセンサスタンパク質は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｆコンセンサスタンパク質は、ＩｇＥリーダーを含まない。他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｆコンセンサスタンパク質は、リーダー配列、例えば、限定するものではないが、ＩｇＥリーダー配列を含み得る。ＢｏＮＴ−Ｆコンセンサスタンパク質に少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するタンパク質もまた提供される。
【０１５０】
ＢｏＮＴ−Ｆコンセンサスタンパク質の断片は、ＢｏＮＴ−Ｆコンセンサスタンパク質の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含まない。
【０１５１】
いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９６％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９７％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９８％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９９％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含まない。
【０１５２】
いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９６％の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９７％の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９８％の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片と９９％の同一性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどの免疫グロブリンリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。いくつかの実施形態において、断片は、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含まない。
３．ＢｏＮＴ抗原のワクチン組み合わせ
【０１５３】
ワクチンは、上記のＢｏＮＴ抗原のうちの１つ以上の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、この組み合わせは、上記のＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、Ｂｏ−ＮＴＤ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及びＢｏＮＴ−Ｇ抗原のうちの１つ以上の組み合わせであり得る。ＢｏＮＴ抗原を組み合わせると、１つ以上のボツリヌス菌血清型、いくつかの実施形態では血清型Ａ、Ｂ、Ｅ及び／またはＦのうち１つ以上に対する免疫反応を哺乳動物において誘発することができる。ワクチンは、ＢｏＮＴ抗原の特定の組み合わせが得られるように設計または調整することができる。これにより、哺乳動物における免疫反応のレベルまたは強さを制御する能力がもたらされる。ワクチンを設計または調整することで、ワクチンによって誘導される中和抗体の反応性（すなわち、ボツリヌス菌の１つ以上の血清型に由来する神経毒素に対する反応）を制御する能力をユーザに提供することができる。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、組み合わせは、（１）ＢｏＮＴ−ＡとＢｏＮＴ−Ｂ、（２）ＢｏＮＴ−ＡとＢｏＮＴ−Ｃ1、（３）ＢｏＮＴ−ＡとＢｏＮＴ−Ｃ2、（４）ＢｏＮＴ−ＡとＢｏＮＴ−Ｄ、（５）ＢｏＮＴ−ＡとＢｏＮＴ−Ｅ、（６）ＢｏＮＴ−ＡとＢｏＮＴ−Ｆ、（７）ＢｏＮＴ−ＡとＢｏＮＴ−Ｇ、（８）ＢｏＮＴ−ＢとＢｏＮＴ−Ｃ1、（９）ＢｏＮＴ−ＢとＢｏＮＴ−Ｃ2、（１０）ＢｏＮＴ−ＢとＢｏＮＴ−Ｄ、（１１）ＢｏＮＴ−ＢとＢｏＮＴ−Ｅ、（１２）ＢｏＮＴ−ＢとＢｏＮＴ−Ｆ、（１３）ＢｏＮＴ−ＢとＢｏＮＴ−Ｇ、（１４）ＢｏＮＴ−Ｃ1とＢｏＮＴ−Ｃ2、（１５）ＢｏＮＴ−Ｃ1とＢｏＮＴ−Ｄ、（１６）ＢｏＮＴ−Ｃ1とＢｏＮＴ−Ｅ、（１７）ＢｏＮＴ−Ｃ1とＢｏＮＴ−Ｆ、（１８）ＢｏＮＴ−Ｃ1とＢｏＮＴ−Ｇ、（１９）ＢｏＮＴ−Ｃ2とＢｏＮＴ−Ｄ、（２０）ＢｏＮＴ−Ｃ2とＢｏＮＴ−Ｅ、（２１）ＢｏＮＴ−Ｃ2とＢｏＮＴ−Ｆ、（２２）ＢｏＮＴ−Ｃ2とＢｏＮＴ−Ｇ、（２３）ＢｏＮＴ−ＤとＢｏＮＴ−Ｅ、（２４）ＢｏＮＴ−ＥとＢｏＮＴ−Ｆ、（２５）ＢｏＮＴ−ＤとＢｏＮＴ−Ｇ、（２６）ＢｏＮＴ−ＥとＢｏＮＴ−Ｆ、（２７）ＢｏＮＴ−ＥとＢｏＮＴ−Ｇ、及び（２８）ＢｏＮＴ−ＦとＢｏＮＴ−Ｇを任意の順序でコードする２つの核酸を含み得る。
【０１５５】
代表的実施形態は、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、Ｂｏ−ＮＴＤ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及びＢｏＮＴ−Ｇのうち１つ以上を任意の順序でコードする１つ以上の核酸を含むワクチンに関する。また別の代表的実施形態は、１つ以上のＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、Ｂｏ−ＮＴＤ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及びＢｏＮＴ−Ｇを任意の順序でコードする１つ以上の核酸ならびにＩＬ−１２などのアジュバントを含むワクチンに関する。他の可能なアジュバントについては、以下でより詳細に説明する。
【０１５６】
組み合わせワクチンはまた、１つ以上のＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、Ｂｏ−ＮＴＤ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及びＢｏＮＴ−Ｇタンパク質、１つ以上のコンセンサスＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、Ｂｏ−ＮＴＤ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及びＢｏＮＴ−Ｇタンパク質、１つ以上のＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、Ｂｏ−ＮＴＤ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及びＢｏＮＴ−Ｇを含む１つ以上の不活化ウイルス粒子、１つ以上のコンセンサスＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、Ｂｏ−ＮＴＤ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及びＢｏＮＴ−Ｇを含む１つ以上の不活化ウイルス粒子、１つ以上のＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、Ｂｏ−ＮＴＤ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及びＢｏＮＴ−Ｇを含む１つ以上の弱毒化ウイルス粒子、または１つ以上のコンセンサスＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、Ｂｏ−ＮＴＤ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及びＢｏＮＴ−Ｇを含む１つ以上の弱毒化ウイルス粒子を含む。弱毒化ワクチンは、弱毒化生ワクチン、不活化ワクチンならびに１つ以上のＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、Ｂｏ−ＮＴＤ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及びＢｏＮＴ−Ｇタンパク質、または１つ以上のコンセンサスＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、Ｂｏ−ＮＴＤ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及びＢｏＮＴ−Ｇタンパク質をコードする外来遺伝子を運搬する組み換えベクターを用いるワクチンであり得、サブユニットワクチン及び糖タンパク質ワクチンも含まれる。弱毒化生ワクチン、外来抗原を運搬する組み換えベクターを用いるワクチン、サブユニットワクチン及び糖タンパク質ワクチンの例は、米国特許第４，５１０，２４５号、同第４，７９７，３６８号、同第４，７２２，８４８号、同第４，７９０，９８７号、同第４，９２０，２０９号、同第５，０１７，４８７号、同第５，０７７，０４４号、同第５，１１０，５８７号、同第５，１１２，７４９号、同第５，１７４，９９３号、同第５，２２３，４２４号、同第５，２２５，３３６号、同第５，２４０，７０３号、同第５，２４２，８２９号、同第５，２９４，４４１号、同第５，２９４，５４８号、同第５，３１０，６６８号、同第５，３８７，７４４号、同第５，３８９，３６８号、同第５，４２４，０６５号、同第５，４５１，４９９号、同第５，４５３，３６４号、同第５，４６２，７３４号、同第５，４７０，７３４号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４８２，７１３号、同第５，５９１，４３９号、同第５，６４３，５７９号、同第５，６５０，３０９号、同第５，６９８，２０２号、同第５，９５５，０８８号、同第６，０３４，２９８号、同第６，０４２，８３６号、同第６，１５６，３１９及び同第６，５８９，５２９号に開示されており、当該開示の各々は、参考により本明細書に組み込まれる。
ａ．ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／もしくはＢｏＮＴ−Ｇの組み合わせまたはこれらの組み合わせ
【０１５７】
組み合わせワクチンは、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／またはＢｏＮＴ−Ｇをコードする１つ以上の核酸を含み得る。１つ以上の核酸は、最適化核酸配列であり得るか、最適化核酸配列を含み得る。１つ以上の核酸は、異種核酸配列であり得るか、異種核酸配列を含み得る。１つ以上の核酸は、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／またはＢｏＮＴ−Ｇをコードする単一の発現ベクターまたはプラスミドであり得る。他の実施形態において、１つ以上の核酸は、１つ目がＢｏＮＴ−Ａをコードし、２つ目がＢｏＮＴ−Ｂをコードし、３つ目がＢｏＮＴ−Ｃ1をコードし、４つ目がＢｏＮＴ−Ｃ2をコードし、５つ目がＢｏＮＴ−Ｄをコードし、６つ目がＢｏＮＴ−Ｅをコードし、７つ目がＢｏＮＴ−Ｆをコードし、８つ目がＢｏＮＴ−Ｇをコードする８つの発現ベクターまたはプラスミドであり得る。さらに他の実施形態において、１つ以上の核酸は、１つ以上（例えば、１、２、３、４またはそれ以上）の発現ベクターまたはプラスミドであり得、当該１つ以上の発現ベクターまたはプラスミドがＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／またはＢｏＮＴ−Ｇをともにコードする。
【０１５８】
１つ以上の核酸は、転写及び翻訳の際に、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／またはＢｏＮＴ−Ｇが単一のポリペプチドまたはタンパク質内に含まれるようにＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／またはＢｏＮＴ−Ｇをコードするヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、１つ以上の核酸は、転写及び翻訳の際に、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／またはＢｏＮＴ−Ｇのそれぞれが個別のポリペプチドまたはタンパク質内に含まれるようにＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／またはＢｏＮＴ−Ｇをコードするヌクレオチド配列を含み得る。１つ以上の核酸は、転写及び翻訳の際に、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／またはＢｏＮＴ−Ｇがともに（任意の組み合わせで）１つ以上（例えば、１、２、３、４またそれ以上）の個別のポリペプチド内に含まれるようにＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／またはＢｏＮＴ−Ｇをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【０１５９】
１つ以上の核酸は、１つ以上のＩｇＥリーダー配列を、ＩｇＥリーダー配列がＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／もしくはＢｏＮＴ−Ｇ、またはＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／もしくはＢｏＮＴ−Ｇのそれぞれ、またはこれらの組み合わせに結合するようにコードし得る。他の実施形態において、１つ以上の核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含まないか、当該配列を有しない。
【０１６０】
さらに他の実施形態において、１つ以上の核酸は、フリン開裂部位をコードするヌクレオチド配列を、フリン開裂部位がＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／もしくはＢｏＮＴ−Ｇまたはこれらの組み合わせをコードする個々のヌクレオチド配列の間に位置または配置するように含み得る。他の実施形態において、１つ以上の核酸は、フリン開裂部位をコードするヌクレオチド配列を含まないか、当該配列を有しない。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／またはＢｏＮＴ−Ｇをコードする１つ以上の核酸は、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／またはＢｏＮＴ−Ｇをコードする対応する核酸配列に記載された核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／またはＢｏＮＴ−Ｇをコードする１つ以上の核酸は、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／またはＢｏＮＴ−Ｇを含む対応するアミノ酸配列に記載されたアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。
ｂ．ＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｂの組み合わせ
【０１６２】
組み合わせワクチンは、ＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｂをコードする１つ以上の核酸を含み得る。１つ以上の核酸は、最適化核酸配列であり得るか、最適化核酸配列を含み得る。１つ以上の核酸は、異種核酸配列であり得るか、異種核酸配列を含み得る。１つ以上の核酸は、ＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｂをコードする単一の発現ベクターまたはプラスミドであり得る。他の実施形態において、１つ以上の核酸は、２つの発現ベクターまたはプラスミドであり得、一方がＢｏＮＴ−Ａをコードし、他方がＢｏＮＴ−Ｂをコードする。１つ以上の核酸は、ＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｂをコードするヌクレオチド配列を、転写及び翻訳の際にＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｂが単一のポリペプチドまたはタンパク質内に含まれるように含み得る。他の実施形態において、１つ以上の核酸は、ＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｂをコードするヌクレオチド配列を、転写及び翻訳の際にＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｂがそれぞれ個別のポリペプチドまたはタンパク質内に含まれるように含み得る。
【０１６３】
１つ以上の核酸は、１つ以上のＩｇＥリーダー配列を、ＩｇＥリーダー配列がＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−ＢまたはＢｏＮＴ−ＡとＢｏＮＴ−Ｂの両方に結合するようにコードし得る。他の実施形態において、１つ以上の核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含まないか、当該配列を有しない。さらに他の実施形態において、１つ以上の核酸は、フリン開裂部位をコードするヌクレオチド配列を、フリン開裂部位がＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｂをコードする個々のヌクレオチド配列の間に位置または配置するように含み得る。他の実施形態において、１つ以上の核酸は、フリン開裂部位をコードするヌクレオチド配列を含まないか、当該配列を有しない。
【０１６４】
ＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｂの組み合わせは、配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードする最適化核酸配列によってコードされ得る。配列番号９に記載のアミノ酸配列は、ＢｏＮＴ−Ｂのアミノ酸配列に連結したＢｏＮＴ−Ａのアミノ酸配列を含み得、フリン開裂部位がＢｏＮＴ−ＡとＢｏＮＴ−Ｂの各々のアミノ酸配列を分離している。フリンによる開裂後、ＢｏＮＴ−ＡとＢｏＮＴ−Ｂのアミノ酸配列は、個別のポリペプチドまたはタンパク質内に含まれる。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｂをコードする核酸は、配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｂの組み合わせをコードする核酸は、配列番号９に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。さらに他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ａ抗原及びＢｏＮＴ−Ｂ抗原の組み合わせは、配列番号９に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０５、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。
【０１６６】
いくつかの実施形態は、提供され得る配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列の断片に関する。断片は、配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【０１６７】
配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列の断片と同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸の断片が提供され得る。かかる断片は、配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列と９５％以上の同一性を有する核酸の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書のＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｂの組み合わせをコードする核酸配列の断片と９６％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｂの組み合わせをコードする核酸配列の断片と９７％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｂの組み合わせをコードする核酸配列の断片と９８％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｂの組み合わせをコードする核酸配列の断片と９９％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【０１６８】
配列番号９の断片が提供され得る。断片は、配列番号９の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９０％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
【０１６９】
配列番号９の断片と同一性を有するアミノ酸配列を持つタンパク質の断片が提供され得る。かかる断片は、配列番号９と９５％以上の同一性を有するタンパク質の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書のＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｂの組み合わせを含むタンパク質配列の断片と９６％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｂの組み合わせを含むタンパク質配列の断片と９７％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｂの組み合わせを含むタンパク質配列の断片と９８％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｂの組み合わせを含むタンパク質配列の断片と９９％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
ｃ．ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆの組み合わせ
【０１７０】
組み合わせワクチンは、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆをコードする１つ以上の核酸を含み得る。１つ以上の核酸は、最適化核酸配列であり得るか、最適化核酸配列を含み得る。１つ以上の核酸は、異種核酸配列であり得るか、異種核酸配列を含み得る。１つ以上の核酸は、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆをコードする単一の発現ベクターまたはプラスミドであり得る。他の実施形態において、１つ以上の核酸は、２つの発現ベクターまたはプラスミドであり得、一方がＢｏＮＴ−Ｅをコードし、他方がＢｏＮＴ−Ｆをコードする。１つ以上の核酸は、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆをコードするヌクレオチド配列を、転写及び翻訳の際にＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆが単一のポリペプチドまたはタンパク質内に含まれるように含み得る。他の実施形態において、１つ以上の核酸は、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆをコードするヌクレオチド配列を、転写及び翻訳の際にＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆがそれぞれ個別のポリペプチドまたはタンパク質内に含まれるように含み得る。
【０１７１】
１つ以上の核酸は、１つ以上のＩｇＥリーダー配列を、ＩｇＥリーダー配列がＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−ＦまたはＢｏＮＴ−ＥとＢｏＮＴ−Ｆの両方に結合するようにコードし得る。他の実施形態において、１つ以上の核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含まないか、当該配列を有しない。さらに他の実施形態において、１つ以上の核酸は、フリン開裂部位をコードするヌクレオチド配列を、フリン開裂部位がＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆをコードする個々のヌクレオチド配列の間に位置または配置するように含み得る。他の実施形態において、１つ以上の核酸は、フリン開裂部位をコードするヌクレオチド配列を含まないか、当該配列を有しない。
【０１７２】
ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆの組み合わせは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列をコードする最適化核酸配列によってコードされ得る。配列番号１０に記載のアミノ酸配列は、ＢｏＮＴ−Ｆのアミノ酸配列に連結したＢｏＮＴ−Ｅのアミノ酸配列を含み得、フリン開裂部位がＢｏＮＴ−ＥとＢｏＮＴ−Ｆの各々のアミノ酸配列を分離している。フリンによる開裂後、ＢｏＮＴ−ＥとＢｏＮＴ−Ｆのアミノ酸配列は、個別のポリペプチドまたはタンパク質内に含まれる。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆをコードする核酸は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆの組み合わせをコードする核酸は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。さらに他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ｅ抗原及びＢｏＮＴ−Ｆ抗原の組み合わせは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０５、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。
【０１７４】
いくつかの実施形態は、提供され得る配列番号１０に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列の断片に関する。断片は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【０１７５】
配列番号１０に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列の断片と同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸の断片が提供され得る。かかる断片は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列と９５％以上の同一性を有する核酸の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書のＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆの組み合わせをコードする核酸配列の断片と９６％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆの組み合わせをコードする核酸配列の断片と９７％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆの組み合わせをコードする核酸配列の断片と９８％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆの組み合わせをコードする核酸配列の断片と９９％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【０１７６】
配列番号１０の断片が提供され得る。断片は、配列番号１０の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９０％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
【０１７７】
配列番号１０の断片と同一性を有するアミノ酸配列を持つタンパク質の断片が提供され得る。かかる断片は、配列番号１０と９５％以上の同一性を有するタンパク質の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書のＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆの組み合わせを含むタンパク質配列の断片と９６％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆの組み合わせを含むタンパク質配列の断片と９７％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆの組み合わせを含むタンパク質配列の断片と９８％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆの組み合わせを含むタンパク質配列の断片と９９％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
ｄ．ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ及びＢｏＮＴ−Ｅの組み合わせ
【０１７８】
組み合わせワクチンは、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ及びＢｏＮＴ−Ｅをコードする１つ以上の核酸を含み得る。１つ以上の核酸は、最適化核酸配列であり得るか、最適化核酸配列を含み得る。１つ以上の核酸は、異種核酸配列であり得るか、異種核酸配列を含み得る。１つ以上の核酸は、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ及びＢｏＮＴ−Ｅをコードする単一の発現ベクターまたはプラスミドであり得る。他の実施形態において、１つ以上の核酸は、３つの発現ベクターまたはプラスミドであり得、１つ目がＢｏＮＴ−Ａをコードし、２つ目がＢｏＮＴ−Ｂをコードし、３つ目がＢｏＮＴ−Ｅをコードする。他の実施形態において、１つ以上の核酸は、２つの発現ベクターまたはプラスミドであり得、一方がＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ及びＢｏＮＴ−Ｅのうち２つをコードし、他方が残りのＢｏＮＴをコードする（例えば、１つ目のベクターまたはプラスミドでＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｂをコードし、２つ目のベクターまたはプラスミドでＢｏＮＴ−Ｅをコードするなど）。
【０１７９】
１つ以上の核酸は、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ及びＢｏＮＴ−Ｅをコードするヌクレオチド配列を、転写及び翻訳の際にＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ及びＢｏＮＴ−Ｅが単一のポリペプチドまたはタンパク質内に含まれるように含み得る。他の実施形態において、１つ以上の核酸は、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ及びＢｏＮＴ−Ｅをコードするヌクレオチド配列を、転写及び翻訳の際にＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ及びＢｏＮＴ−Ｅがそれぞれ個別のポリペプチドまたはタンパク質内に含まれるように含み得る。１つ以上の核酸は、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ及びＢｏＮＴ−Ｅをコードするヌクレオチド配列を、転写及び翻訳の際にＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｂが第１のポリペプチドまたはタンパク質内に含まれ、ＢｏＮＴ−Ｅが第２のポリペプチドまたはタンパク質内に含まれるように含み得る。１つ以上の核酸は、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ及びＢｏＮＴ−Ｅをコードするヌクレオチド配列を、転写及び翻訳の際にＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｅが第１のポリペプチドまたはタンパク質内に含まれ、ＢｏＮＴ−Ｂが第２のポリペプチドまたはタンパク質内に含まれるように含み得る。１つ以上の核酸は、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ及びＢｏＮＴ−Ｅをコードするヌクレオチド配列を、転写及び翻訳の際にＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｂが第１のポリペプチドまたはタンパク質内に含まれ、ＢｏＮＴ−Ａが第２のポリペプチドまたはタンパク質内に含まれるように含み得る。
【０１８０】
１つ以上の核酸は、１つ以上のＩｇＥリーダー配列を、ＩｇＥリーダー配列がＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−ＥまたはＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ及びＢｏＮＴ−Ｅのそれぞれに結合するようにコードし得る。他の実施形態において、１つ以上の核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含まないか、当該配列を有しない。さらに他の実施形態において、１つ以上の核酸は、フリン開裂部位をコードするヌクレオチド配列を、フリン開裂部位がＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｂをコードする個々のヌクレオチド配列、ＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｅをコードする個々のヌクレオチド配列、ＢｏＮＴ−Ｂ及びＢｏＮＴ−Ｅをコードする個々のヌクレオチド配列、またはこれらの組み合わせの間に位置または配置するように含み得る。他の実施形態において、１つ以上の核酸は、フリン開裂部位をコードするヌクレオチド配列を含まないか、当該配列を有しない。
ｅ．ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆの組み合わせ
【０１８１】
組み合わせワクチンは、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆをコードする１つ以上の核酸を含み得る。１つ以上の核酸は、最適化核酸配列であり得るか、最適化核酸配列を含み得る。１つ以上の核酸は、異種核酸配列であり得るか、異種核酸配列を含み得る。１つ以上の核酸は、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆをコードする単一の発現ベクターまたはプラスミドであり得る。他の実施形態において、１つ以上の核酸は、４つの発現ベクターまたはプラスミドによってコードされ得、１つ目がＢｏＮＴ−Ａをコードし、２つ目がＢｏＮＴ−Ｂをコードし、３つ目がＢｏＮＴ−Ｅをコードし、４つ目がＢｏＮＴ−Ｆをコードする。他の実施形態において、１つ以上の核酸は、２つまたは３つの発現ベクターまたはプラスミドであり得、２つまたは３つの発現ベクターまたはプラスミドがＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆをともにコードする。
【０１８２】
１つ以上の核酸は、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆをコードするヌクレオチド配列を、転写及び翻訳の際にＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆが単一のポリペプチドまたはタンパク質内に含まれるように含み得る。他の実施形態において、１つ以上の核酸は、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆをコードするヌクレオチド配列を、転写及び翻訳の際にＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆがそれぞれ個別のポリペプチドまたはタンパク質内に含まれるように含み得る。１つ以上の核酸は、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆをコードするヌクレオチド配列を、転写及び翻訳の際にＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆがともに（任意の組み合わせで）３つの個別のポリペプチド内に含まれるように含み得る。１つ以上の核酸は、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆをコードするヌクレオチド配列を、転写及び翻訳の際にＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆがともに（任意の組み合わせで）２つの個別のポリペプチド内に含まれるように含み得る。
【０１８３】
１つ以上の核酸は、１つ以上のＩｇＥリーダー配列を、ＩｇＥリーダー配列がＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−ＦまたはＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆのそれぞれまたはこれらの組み合わせに結合するようにコードし得る。他の実施形態において、１つ以上の核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含まないか、当該配列を有しない。さらに他の実施形態において、１つ以上の核酸は、フリン開裂部位をコードするヌクレオチド配列を、フリン開裂部位がＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｂをコードする個々のヌクレオチド配列、ＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｅをコードする個々のヌクレオチド配列、ＢｏＮＴ−Ａ及びＢｏＮＴ−Ｆをコードする個々のヌクレオチド配列、ＢｏＮＴ−Ｂ及びＢｏＮＴ−Ｅをコードする個々のヌクレオチド配列、ＢｏＮＴ−Ｂ及びＢｏＮＴ−Ｆをコードする個々のヌクレオチド配列、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆをコードする個々のヌクレオチド配列またはこれらの組み合わせの間に位置または配置するように含み得る。他の実施形態において、１つ以上の核酸は、フリン開裂部位をコードするヌクレオチド配列を含まないか、当該配列を有しない。
【０１８４】
ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆの組み合わせは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列をコードする最適化核酸配列によってコードされ得る。配列番号１１に記載のアミノ酸配列は、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆが互いに結合した個々のアミノ酸配列を含み得、フリン開裂部位が各々のアミノ酸配列を分離している。フリンによる開裂後、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆのアミノ酸配列は、個別のポリペプチドまたはタンパク質内に含まれる。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆをコードする核酸は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する核酸配列であり得る。他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆの組み合わせをコードする核酸は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。さらに他の実施形態において、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆの抗原の組み合わせは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０５、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。
【０１８６】
いくつかの実施形態は、提供され得る配列番号１１に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列の断片に関する。断片は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【０１８７】
配列番号１１に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列の断片と同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸の断片が提供され得る。かかる断片は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列と９５％以上の同一性を有する核酸の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書のＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆの組み合わせをコードする核酸配列の断片と９６％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆの組み合わせをコードする核酸配列の断片と９７％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆの組み合わせをコードする核酸配列の断片と９８％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆの組み合わせをコードする核酸配列の断片と９９％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【０１８８】
配列番号１１の断片が提供され得る。断片は、配列番号１１の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９０％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
【０１８９】
配列番号１１の断片と同一性を有するアミノ酸配列を持つタンパク質の断片が提供され得る。かかる断片は、配列番号１１と９５％以上の同一性を有するタンパク質の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含み得る。いくつかの実施形態は、本明細書のＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆの組み合わせを含むタンパク質配列の断片と９６％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆの組み合わせを含むタンパク質配列の断片と９７％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆの組み合わせを含むタンパク質配列の断片と９８％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆの組み合わせを含むタンパク質配列の断片と９９％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列などの免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
４．ワクチン構築物及びプラスミド
【０１９０】
ワクチンは、上記のＢｏＮＴ抗原をコードする核酸構築物またはプラスミドを含み得る。タンパク質配列、コンセンサスタンパク質配列、タンパク質配列またはコンセンサスタンパク質配列と相同の配列、タンパク質配列またはコンセンサスタンパク質配列の断片、及びタンパク質配列またはコンセンサスタンパク質配列の断片と相同の配列を含む、本明細書で開示されるＢｏＮＴ抗原をコードする核酸配列を含み得る遺伝子構築物が本明細書にて提供される。遺伝子構築物は、機能性染色体外分子として細胞内に存在することができる。遺伝子構築物は、セントロメア、テロメアを含む線状ミニ染色体、プラスミドまたはコスミドであり得る。遺伝子構築物は、１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含み得る。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、遺伝子構築物は、ＢｏＮＴ抗原を発現する１価プラスミドの形態であり得る。他の実施形態において、遺伝子構築物は、複数のＢｏＮＴ抗原を発現する多価プラスミド、例えば、限定するものではないが、２価プラスミド、３価プラスミド、４価プラスミド及び５価プラスミドの形態であり得る。さらに他の実施形態において、遺伝子構築物は、１価プラスミド及び／または多価プラスミドの組み合わせの形態であり得、したがって、本明細書に開示されるＢｏＮＴ抗原のうち１、２、３、４つまたはそれ以上についてコードする単一のプラスミドまたは複数のプラスミドであり得る。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、遺伝子構築物は、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−ＦまたはＢｏＮＴ−Ｇの抗原を発現する１価プラスミドの形態であり得る。遺伝子構築物は、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及びＢｏＮＴ−Ｇのうち任意の２つのＢｏＮＴ抗原の組み合わせを発現する２価プラスミドの形態であり得る。１つの実施形態は、（１）ＢｏＮＴ−ＡとＢｏＮＴ−Ｂ、（２）ＢｏＮＴ−ＡとＢｏＮＴ−Ｅ、（３）ＢｏＮＴ−ＡとＢｏＮＴ−Ｆ、（４）ＢｏＮＴ−ＢとＢｏＮＴ−Ｅ、（５）ＢｏＮＴ−ＢとＢｏＮＴ−Ｆ、及び（６）ＢｏＮＴ−ＥとＢｏＮＴ−Ｆを任意の順序で含み得る。
【０１９３】
遺伝子構築物は、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及びＢｏＮＴ−Ｇのうち任意の３つのＢｏＮＴ抗原の組み合わせを発現する３価プラスミドの形態であり得る。１つの実施形態は、（１）ＢｏＮＴ−ＡとＢｏＮＴ−ＢとＢｏＮＴ−Ｅ、（２）ＢｏＮＴ−ＡとＢｏＮＴ−ＢとＢｏＮＴ−Ｆ、（３）ＢｏＮＴ−ＢとＢｏＮＴ−ＥとＢｏＮＴ−Ｆ、及び（４）ＢｏＮＴ−ＡとＢｏＮＴ−ＥとＢｏＮＴ−Ｆを任意の順序で含み得る。
【０１９４】
遺伝子構築物は、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／またはＢｏＮＴ−Ｇのうち任意の４つのＢｏＮＴ抗原の組み合わせを発現する４価プラスミドの形態であり得る。１つの実施形態は、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆのコードを任意の順序で含み得る。
【０１９５】
遺伝子構築物はまた、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス関連ウイルス及びワクシニアウイルスを含む、組み換えウイルスベクターのゲノムの一部であり得る。遺伝子構築物は、弱毒化した生きた微生物または細胞内で生存する組み換え微生物ベクター中の遺伝子物質の一部であり得る。
【０１９６】
遺伝子構築物は、核酸のコード配列の遺伝子発現に関する調節エレメントを含み得る。調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、終止コドンまたはポリアデニル化シグナルであり得る。
【０１９７】
核酸配列は、ベクターであり得る遺伝子構築物を構成することができる。ベクターは、哺乳動物の細胞内において、当該哺乳動物の免疫反応を誘発するのに有効な量の抗原を発現することができる。ベクターは、組み換え型であり得る。ベクターは、抗原をコードする異種核酸を含み得る。ベクターは、プラスミドであり得る。ベクターは、ＢｏＮＴ抗原をコードする核酸で細胞をトランスフェクトするのに有用であり得、形質転換された宿主細胞を、抗原の発現が起こる条件下で培養し、維持する。
【０１９８】
コード配列は、安定性と高発現性のために最適化され得る。場合によっては、分子内結合によって形成されるものなどのＲＮＡの２次構造形成を抑えるように、コドンを選択する。
【０１９９】
ベクターは、ＢｏＮＴ抗原をコードする異種核酸を含み得、抗原コード配列の上流にあり得る開始コドンと、抗原コード配列の下流にあり得る終止コドンとをさらに含み得る。開始コドン及び終止コドンは、ＢｏＮＴ抗原コード配列とインフレームであり得る。ベクターはまた、抗原コード配列に機能的に連結しているプロモーターも含み得る。抗原コード配列に機能的に連結しているプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター、エプステイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子からのプロモーターであり得る。プロモーターはまた、筋肉または皮膚特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターでよく、天然もしくは合成であり得る。かかるプロモーターの例は、米国特許公開公報ＵＳ２００４０１７５７２７に記載され、その内容は全体として本明細書に組み入れられる。
【０２００】
ベクターはまた、ポリアデニル化シグナルを含み得、これは、抗原コード配列の下流であり得る。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州）からのポリアデニル化シグナルであり得る。
【０２０１】
ベクターはまた、ＢｏＮＴ抗原配列の上流にエンハンサーを含み得る。エンハンサーは、ＤＮＡ発現に必要な場合がある。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンもしくはＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶまたはＥＢＶなどのウイルスエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、及びＷＯ９４／０１６７３７に記載されており、それぞれの内容は参照により全体が組み入れられる。
【０２０２】
ベクターはまた、ベクターを染色体外に維持し、かつ、細胞中でベクターの複数のコピーを産生するために、哺乳動物の複製起点も含み得る。ベクターは、インビトロジェン（サンディエゴ、カリフォルニア州）からのｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４、またはｐＲＥＰ４であり得、これらは、エプステイン・バー・ウイルスの複製起点と、核抗原ＥＢＮＡ−１のコード領域とを含み得、統合しないで高いコピーのエピソーム複製を生じることができる。ベクターは、ｐＶＡＸ１または本明細書に記載される変異プラスミドなどの変異を有するｐＶａｘ１変異体であり得る。変異ｐＶａｘ１プラスミドは、バックボーンベクタープラスミドｐＶＡＸ１（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）の２９９８塩基対の変異体である。ＣＭＶプロモーターは、塩基１３７〜７２４に位置する。Ｔ７プロモーター／プライミングサイトは、塩基６６４〜６８３にある。マルチクローニングサイトは、塩基６９６〜８１１にある。ウシＧＨポリアデニル化シグナルは、塩基８２９〜１０５３にある。カナマイシン耐性遺伝子は、塩基１２２６〜２０２０にある。ｐＵＣオリジンは、塩基２３２０〜２９９３にある。
【０２０３】
インビトロジェンから入手可能なｐＶＡＸ１の配列に基づくと、本明細書に記載のプラスミド１〜６のバックボーンとして用いたｐＶＡＸ１の配列に以下の変異が認められた。
【０２０４】
Ｃ＞Ｇ２４１  ＣＭＶプロモーター中
【０２０５】
Ｃ＞Ｔ  １９４２  バックボーン、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐｏｌｙＡ）の下流
【０２０６】
Ａ＞−  ２８７６  バックボーン、カナマイシン遺伝子の下流
【０２０７】
Ｃ＞Ｔ  ３２７７  ｐＵＣ複製起点（Ｏｒｉ）高コピー数変異中（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９８５を参照）
【０２０８】
Ｇ＞Ｃ  ３７５３  ＲＮＡＳｅＨ部位の上流ｐＵＣ  Ｏｒｉの末端中
【０２０９】
塩基対２、３及び４は、ＣＭＶプロモーターの上流のバックボーン中でＡＣＴからＣＴＧに変化している。
【０２１０】
ベクターのバックボーンは、ｐＡＶ０２４２であり得る。ベクターは、複製欠損アデノウイルス５型（Ａｄ５）ベクターであり得る。
【０２１１】
ベクターは、調節配列も含んでもよく、これは、ベクターを投与された哺乳動物細胞またはヒト細胞中での遺伝子発現に十分に適し得る。コンセンサスコード配列は、宿主細胞内においてコード配列をより効率的に転写することができるコドンを含み得る。
【０２１２】
ベクターは、ｐＳＥ４２０（インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州）であり得、それを大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）中でのタンパク質産生のために用いることができる。ベクターは、ｐＹＥＳ２（インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州）であってもよく、それを酵母のサッカロマイセス・セレビシエ株でのタンパク質産生に用いることができる。ベクターは、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州）のものであってもよく、それを昆虫細胞中でのタンパク質産生に用いることができる。ベクターは、ｐｃＤＮＡ  ＩまたはｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州）であってもよく、それを哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中でのタンパク質産生に用いることができる。ベクターは、タンパク質を産出する発現ベクターまたは発現系であり得、参照により全体が本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）をはじめとする通常の技術及び容易に入手できる出発材料を用いることができる。
【０２１３】
いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７の核酸配列、配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードする核酸、配列番号１０に記載のアミノ酸配列をコードする核酸、及び／または配列番号１１に記載のアミノ酸配列をコードする核酸うち１つ以上を含み得る。代表的なベクターを図１に示す。
５．ワクチンの医薬組成物
【０２１４】
ワクチンは、医薬組成物の形態であり得る。医薬組成物は、ワクチンを含み得る。
【０２１５】
医薬組成物は、約５ナノグラム〜約１０ｍｇのＤＮＡを含み得る。いくつかの実施形態において、本発明による医薬組成物は、約２５ナノグラム〜約５ｍｇのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約５０ナノグラム〜約１ｍｇのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約１０〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約１５〜約１５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約２０〜約１００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約２５〜約７５μｇのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約３０〜約５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約３５〜約４０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約１００〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約１０マイクログラム〜約１００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約２０マイクログラム〜約８０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約２５マイクログラム〜約６０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約３０ナノグラム〜約５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約３５ナノグラム〜約４５マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約２５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約１００〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含む。
【０２１６】
いくつかの実施形態において、本発明による医薬組成物は、ワクチンのＤＮＡを少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ナノグラムを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ワクチンのＤＮＡを少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５，１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５または１０００マイクログラム含み得る。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ワクチンのＤＮＡを１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０ｍｇまたはそれ以上含み得る。
【０２１７】
他の実施形態において、医薬組成物は、ワクチンのＤＮＡを１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ナノグラム以下含み得る。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ワクチンのＤＮＡを１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５，１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５または１０００マイクログラム以下含み得る。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ワクチンのＤＮＡを１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５または１０ｍｇ以下含み得る。
【０２１８】
医薬組成物は、用いられる投与様式に従って配合するための他の試薬をさらに含み得る。医薬組成物が注射可能な医薬組成物である場合、当該医薬組成物は、滅菌されたパイロジェンフリー及び微粒子フリーであってもよい。等張性配合剤が好ましくは用いられる。一般に、等張性のための添加剤として、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースを挙げることができる。場合によっては、リン酸緩衝生理食塩水などの等張性溶液が好ましい。安定化剤には、ゼラチン及びアルブミンが挙げられる。いくつかの実施形態において、製剤には血管収縮剤が添加される。
【０２１９】
ワクチンは、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容しうる賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤としての機能的分子であり得る。薬学的に許容し得る賦形剤は、界面活性剤を含み得るトランスフェクション促進剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質ＡをはじめとするＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレン及びスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知のトランスフェクション促進剤であり得る。
【０２２０】
トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマート（ＬＧＳ）をはじめとするポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマートであり、より好ましくは、ポリ−Ｌ−グルタマートは、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度でワクチン中に存在する。トランスフェクション促進剤は、界面活性剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質ＡをはじめとするＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレン及びスクアレンなどの小胞を含み得、ヒアルロン酸を用いて、遺伝的構築物と一体化させて投与することもできる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡベクターワクチンはまた、トランスフェクション促進剤、例えば脂質、レシチンリポソームまたはＤＮＡリポソーム混合物（例えば、Ｗ０９３２４６４０参照）などの当該技術分野で公知の他のリポソームをはじめとするリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知トランスフェクション促進剤も含み得る。好ましくは、トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマート（ＬＧＳ）をはじめとするポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。ワクチン中のトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【０２２１】
薬学的に許容可能な賦形剤は、アジュバントであり得る。アジュバントは、別のプラスミドから発現される他の遺伝子であることが可能であり、または、ワクチン中に上記プラスミドと組み合わせてタンパク質として送達される。アジュバントは、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘因性ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、欠失され、かつ、ＩｇＥ由来のシグナルペプチドを任意に含むシグナル配列を有するＩＬ−１５からなる群から選択され得る。アジュバントは、ＩＬ−１２、Ｌ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、またはそれらの組み合わせであり得る。代表的実施形態において、アジュバントはＩＬ−１２である。
【０２２２】
有用なアジュバントであり得る他の遺伝子としては、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、変異体型ＩＬ−１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮細胞増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン反応遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、及びその機能的断片をコードするものが挙げられる。
６．ワクチン投与方法
【０２２３】
ＢｏＮＴ抗原であるＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／もしくはＢｏＮＴ−Ｇまたはこれらの任意の組み合わせを含むＢｏＮＴの遺伝子構築物及びタンパク質をもたらすための医薬配合物を投与する方法が本明細書にて提供される。これらの抗原は、ボツリヌス菌血清型ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／もしくはＢｏＮＴ−Ｇまたは任意の組み合わせに由来する神経毒素に対する免疫反応を誘導し得る免疫原の有効性を高めるエピトープを含む。いくつかの実施形態において、投与する方法は、ＢｏＮＴ抗原であるＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及び／またはＢｏＮＴ−Ｆを含むＢｏＮＴの遺伝子構築物及びタンパク質を提供することを含み得る。これらの抗原は、ボツリヌス菌血清型Ａ、Ｂ、Ｅ及び／またはＦに由来する神経毒素に対する免疫反応を誘導し得る免疫原の有効性を高めるエピトープを含む。
【０２２４】
治療的免疫反応及び／または予防的免疫反応を誘導するためのワクチンを投与する方法または当該ワクチンを接種する方法が提供され得る。ワクチン投与プロセスは、哺乳動物において、血清型Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｃ2、Ｄ、Ｅ、Ｆ及び／もしくはＧまたはこれらの組み合わせを含む複数のボツリヌス菌血清型に対する免疫反応を引き起こすことができ、いくつかの実施形態では、血清型Ａ、Ｂ、Ｅ及び／またはＦに対する免疫反応を引き起こすことができる。
【０２２５】
ワクチンは、哺乳動物の免疫系の活性を調節し、免疫反応を高めるために、個体にワクチンを投与することができる。ワクチンの投与は、細胞内で発現し、その上で免疫系が認識し、細胞性反応、体液性反応、または細胞性反応と体液性反応を誘導する細胞表面に投与される核酸分子としてのＢｏＮＴのトランスフェクションであり得る。本明細書に記載のワクチンを哺乳動物に投与することにより、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ１、ＢｏＮＴ−Ｃ２、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／もしくはＢｏＮＴ−Ｇまたはこれらの任意の組み合わせを含む複数のＢｏＮＴに対する免疫反応、ならびにいくつかの実施形態においてはＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及び／またはＢｏＮＴ−Ｆに対する免疫反応を哺乳動物内で誘導または誘発するために、ワクチンの投与を用いることができる。本明細書に記載のワクチンを哺乳動物に投与することにより、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ１、ＢｏＮＴ−Ｃ２、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／もしくはＢｏＮＴ−Ｇまたはこれらの任意の組み合わせを含む複数のＢｏＮＴに対する中和抗体、ならびにいくつかの実施形態においてはＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及び／またはＢｏＮＴ−Ｆに対する中和抗体を誘導または誘発するために、ワクチンの投与を用いることができる。
【０２２６】
哺乳動物にワクチンを投与し、哺乳動物の細胞にベクターが取り込まれると、トランスフェクト細胞がＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ１、ＢｏＮＴ−Ｃ２、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／もしくはＢｏＮＴ−Ｇまたはこれらの任意の組み合わせを含むＢｏＮＴ抗原、ならびにいくつかの実施形態においてはＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及び／またはＢｏＮＴ−Ｆを含むＢｏＮＴ抗原を発現し、分泌する。他の実施形態において、哺乳動物にワクチンを投与し、哺乳動物の細胞にベクターが取り込まれると、トランスフェクト細胞がＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ１、ＢｏＮＴ−Ｃ２、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／もしくはＢｏＮＴ−Ｇまたはこれらの任意の組み合わせを含むＢｏＮＴ抗原、ならびにいくつかの実施形態においてはＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及び／またはＢｏＮＴ−Ｆを含むコンセンサスＢｏＮＴ抗原を発現し、分泌する。これらの分泌タンパク質すなわち合成抗原は、免疫系によって異物として認識され、当該抗原に対して作られた抗体及び当該抗原に特異的なＴ細胞反応を含み得る免疫反応が開始される。
【０２２７】
いくつかの実施例では、本明細書に記載のワクチンを投与した哺乳動物は、免疫系が活性化し、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ１、ＢｏＮＴ−Ｃ２、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／もしくはＢｏＮＴ−Ｇまたはこれらの任意の組み合わせを含むＢｏＮＴ抗原を用いて攻撃すると、活性化した免疫系は、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ１、ＢｏＮＴ−Ｃ２、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／もしくはＢｏＮＴ−Ｇまたはこれらの任意の組み合わせを含む後続のＢｏＮＴを、体液性（例えば、中和抗体）、細胞性またはその両方によって、迅速に除去することができるようになる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のワクチンを投与した哺乳動物は、免疫系が活性化し、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及び／またはＢｏＮＴ−Ｆを含むＢｏＮＴ抗原を用いて攻撃すると、活性化した免疫系は、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及び／またはＢｏＮＴ−Ｆを含む後続のＢｏＮＴを、体液性（例えば、中和抗体）、細胞性またはその両方によって、迅速に除去することができるようになる。ワクチンは、個人の免疫系の活性を調節して免疫反応を高めるために、個体に投与することができる。
【０２２８】
ワクチンのＤＮＡを投与する方法は、米国特許第４，９４５，０５０号及び同第５，０３６，００６号に開示されており、両特許の全体を参照により本明細書に組み込む。
【０２２９】
哺乳動物内で免疫反応を誘発するために、哺乳動物にワクチンを投与することができる。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、レイヨウ、バイソン、水牛、ウシ属、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラットまたはニワトリであり得、好ましくは、ヒト、ウシ、ブタまたはニワトリである。
【０２３０】
ワクチンの用量は、１μｇ〜１０ｍｇ成分／ｋｇ体重／時間であり得、２０μｇ〜１０ｍｇ成分／ｋｇ体重／時間であり得る。ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３１日おきに投与することができる。効果的な治療のためのワクチンの投与回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上であり得る。
ａ．ワクチンを用いて免疫反応を引き起こす方法
【０２３１】
ワクチンは、哺乳動物において、治療的免疫反応または予防的免疫反応を含む免疫反応を引き起こすために使用することができる。この免疫反応により、ＢｏＮＴ抗原であるＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ１、ＢｏＮＴ−Ｃ２、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／もしくはＢｏＮＴ−Ｇまたはこれらの任意の組み合わせに対する抗体（例えば、中和抗体）及び／またはキラーＴ細胞が生じ得る。このような抗体及びＴ細胞は単離することができる。免疫反応により、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ１、ＢｏＮＴ−Ｃ２、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／もしくはＢｏＮＴ−Ｇまたはこれらの任意の組み合わせに反応する中和抗体が産生され得る。
【０２３２】
いくつかの実施形態は、ＢｏＮＴ抗原であるＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ１、ＢｏＮＴ−Ｃ２、ＢｏＮＴ−Ｄ、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／もしくはＢｏＮＴ−Ｇまたはこれらの任意の組み合わせに対する免疫反応を引き起こす方法を提供するものであり、当該方法はワクチンを個人に投与することを含む。いくつかの実施形態は、ボツリヌス菌血清型Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｃ2、Ｄ、Ｅ、Ｆ及び／もしくはＧまたはこれらの任意の組み合わせによる感染に対して、個人に予防的にワクチン投与する方法を提供するものであり、当該方法はワクチンを投与することを含む。いくつかの実施形態は、ボツリヌス菌の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｃ2、Ｄ、Ｅ、Ｆ及び／もしくはＧまたはこれらの任意の組み合わせに由来する１つ以上の神経毒素による神経毒素に対して、個人に予防的にワクチン投与する方法を提供するものであり、当該方法はワクチンを投与することを含む。いくつかの実施形態は、ボツリヌス菌の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｃ2、Ｄ、Ｅ、Ｆ及び／もしくはＧまたはこれらの任意の組み合わせに感染した個人に治療的にワクチン投与する方法を提供するものであり、当該方法はワクチンを投与することを含む。いくつかの実施形態は、ボツリヌス菌の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｃ2、Ｄ、Ｅ、Ｆ及び／もしくはＧまたはこれらの任意の組み合わせに由来する神経毒素に曝された個人に治療的にワクチン投与する方法を提供するものであり、当該方法はワクチンを投与することを含む。ワクチン投与の前のボツリヌス菌血清型Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｃ2、Ｄ、Ｅ、Ｆ及び／もしくはＧもしくはこれらの任意の組み合わせによる感染、または血清型Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｃ2、Ｄ、Ｅ、Ｆ及び／もしくはＧもしくはこれらの任意の組み合わせに由来する神経毒素への曝露に関する診断は、通常通り行うことができる。
【０２３３】
ワクチンは、体液性免疫反応を誘導し、ボツリヌス菌神経毒素による致死的攻撃に対する防御を提供し、上記の１価、２価、３価または４価のＢｏＮＴワクチン構築物によるワクチン投与後の致死的攻撃に対して、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の防御を提供する。誘導された体液性免疫反応は、ボツリヌス菌神経毒素による致死的攻撃に対する防御を促進する中和抗体を含み得る。
ｂ．ワクチンを用いた治療方法
【０２３４】
ワクチンは、神経毒症状及び弛緩性麻痺に対する防御である免疫反応を哺乳動物において引き起こすために用いることができる。ワクチンはまた、呼吸困難、弛緩性麻痺、呼吸不全及び運動機能障害の症状を含む疾患（すなわち、中毒症状）に対する防御である免疫反応を哺乳動物において引き起こすために用いることができる。この免疫反応により、脳または神経系への損傷または炎症を起こすことなく、抗原特異的ＣＴＬ反応が引き起され得る。いくつかの実施形態において、ワクチンは、損傷を与えたり、神経毒症状及び弛緩性麻痺または他の中毒症状を引き起こすことなく、神経系を標的にする抗原特異的免疫反応を確立し、ボツリヌス菌血清型Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｃ2、Ｄ、Ｅ、Ｆ及び／もしくはＧまたはこれらの組み合わせを除去または排除するために、末梢に送達することができる。他の実施形態において、ワクチンは、損傷を与えたり、神経毒症状及び弛緩性麻痺または他の中毒症状を引き起こすことなく、ボツリヌス菌血清型Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｃ2、Ｄ、Ｅ、Ｆ及び／もしくはＧまたはこれらの組み合わせに由来する神経毒素に反応する中和抗体を確立するために、末梢に送達することができる。
【０２３５】
いくつかの実施形態において、治療は、損傷を与えたり、神経毒症状及び弛緩性麻痺を引き起こすことなく、神経系を標的にする抗原特異的免疫反応を確立し、ボツリヌス菌血清型Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｃ2、Ｄ、Ｅ、Ｆ及び／もしくはＧまたはこれらの組み合わせを除去または排除するために、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／もしくはＢｏＮＴ−Ｇの抗原またはこれらの組み合わせを含むワクチンを末梢に送達することを含み得る。いくつかの実施形態において、治療は、損傷を与えたり、神経毒症状及び弛緩性麻痺を引き起こすことなく、神経系を標的にする抗原特異的免疫反応を確立し、ボツリヌス菌血清型Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｃ2、Ｄ、Ｅ、Ｆ及び／もしくはＧまたはこれらの組み合わせに由来する神経毒素を除去または排除するために、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／もしくはＢｏＮＴ−Ｇの抗原またはこれらの組み合わせを含むワクチンを末梢に送達することを含み得る。他の実施形態において、治療は、損傷を与えたり、神経毒症状及び弛緩性麻痺または他の中毒症状を引き起こすことなく、ボツリヌス菌血清型Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｃ2、Ｄ、Ｅ、Ｆ及び／もしくはＧまたはこれらの組み合わせに由来する神経毒素に反応する中和抗体を確立するために、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／もしくはＢｏＮＴ−Ｇの抗原またはこれらの組み合わせを含むワクチンを末梢に送達することを含み得る。
【０２３６】
他の実施形態において、治療は、損傷を与えたり、神経毒症状及び弛緩性麻痺を引き起こすことなく、神経系を標的にする抗原特異的免疫反応を確立し、ボツリヌス菌血清型Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｃ2、Ｄ、Ｅ、Ｆ及び／もしくはＧまたはこれらの組み合わせを除去または排除するために、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／もしくはＢｏＮＴ−Ｇのコンセンサス抗原またはこれらの組み合わせを含むワクチンを末梢に送達することを含み得る。他の実施形態において、治療は、損傷を与えたり、神経毒症状及び弛緩性麻痺を引き起こすことなく、神経系を標的にする抗原特異的免疫反応を確立し、ボツリヌス菌血清型Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｃ2、Ｄ、Ｅ、Ｆ及び／もしくはＧまたはこれらの組み合わせに由来する神経毒素を除去または排除するために、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／もしくはＢｏＮＴ−Ｇのコンセンサス抗原またはこれらの組み合わせを含むワクチンを末梢に送達することを含み得る。他の実施形態において、治療は、損傷を与えたり、神経毒症状及び弛緩性麻痺または他の中毒症状を引き起こすことなく、ボツリヌス菌血清型Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｃ2、Ｄ、Ｅ、Ｆ及び／もしくはＧまたはこれらの組み合わせに由来する神経毒素に反応する中和抗体を確立するために、ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｃ1、ＢｏＮＴ−Ｃ2、ＢｏＮＴ−Ｅ、ＢｏＮＴ−Ｆ及び／もしくはＢｏＮＴ−Ｇのコンセンサス抗原またはこれらの組み合わせを含むワクチンを末梢に送達することを含み得る。
７．投与経路
【０２３７】
ワクチンまたは医薬組成物を、経口、非経口、舌下、経皮、経直腸、経粘膜、局所、吸入、口腔投与、胸腔内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻内、髄腔内、及び関節内、またはそれらの組み合わせをはじめとする異なる経路で投与することができる。獣医学的使用では、通常の獣医学的実践に従い、当該組成物を適切に許容しうる配合剤として投与することができる。獣医は、特定の動物に最も適した投与レジメン及び投与経路を、容易に決定することができる。ワクチンは、伝統的なシリンジ、針なし注射装置、「微粒子衝撃遺伝子銃」、または他の物理的方法、例えば電気穿孔法（「ＥＰ」）、「水力学的方法」、または超音波により投与することができる。
【０２３８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法、リポソーム介在法、ナノ粒子促進法、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス関連ウイルス及び組み換えワクシニアウイルスなどの組み換えベクターを用いる、及び用いないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン投与とも称される）を含むいくつかの周知の技術により哺乳動物にワクチンのベクターを投与することができる。ＤＮＡ注入により、ｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法と共に抗原を送達することができる。
ａ．電気穿孔法
【０２３９】
ワクチンまたは医薬組成物は、電気穿孔法により投与することができる。電気穿孔によるワクチンの投与は、細胞膜に可逆的な孔を形成させるのに効果的なエネルギーパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成することができる電気穿孔装置を用いて達成され得、好ましくは、エネルギーパルスは、ユーザにより入力されたプリセット電流に近い定電流である。電気穿孔装置は、電気穿孔構成要素及び電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを含み得る。電気穿孔構成要素は、制御器、電流波形発生器、インピーダンステスタ、波形ロガー、入力要素、ステータス報告要素、コミュニケーションポート、メモリー成分、電源、及び電源スイッチをはじめとする電気穿孔装置の１種以上の様々な要素を含み、それらを組み込むことができる。電気穿孔は、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを容易化するｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔装置、例えばＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）ＥＰシステム（イノビオファーマシューティカルズ社製、ペンシルベニア州ブルーベル）またはＥｌｇｅｎエレクトロポレーター（イノビオファーマシューティカルズ社製）を用いて達成され得る。
【０２４０】
本発明のＤＮＡワクチンの送達を促進し得る電気穿孔装置及び電気穿孔法の例としては、内容が全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されたそれらのものが挙げられる。ＤＮＡワクチンの送達を促進するのに用いられ得る他の電気穿孔装置及び電気穿孔法としては、その全てが全体として参照により本明細書に組み入れられた、２００６年１０月１７日出願の米国特許仮出願第６０／８５２，１４９号及び２００７年１０月１０日出願の同第６０／９７８，９８２号に対して３５ＵＳＣ１１９（ｅ）による利益を主張する、２００７年１０月１７日出願の同時係属中及び共有の米国特許出願第１１／８７４０７２号に提供されたものが挙げられる。
【０２４１】
Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号には、体内または植物内の選択された組織の細胞中への生体分子の導入を促進するためのモジュラー電極システム及びその使用が記載されている。モジュラー電極システムは、複数の針電極；皮下注射針；プログラム可能な定電流パルス制御器から複数の針電極への導電的連結を提供する電気コネクター；及び電源を含み得る。操作者は、支持構造に搭載される複数の針状電極を握り、生体または植物の選択された組織の中へそれをしっかりと挿入することができる。その後、皮下注射針を介して、生体分子を選択された組織へ送達する。プログラム可能な定電流パルス制御器が活性化され、複数の針状電極に定電流の電気パルスが印加される。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間での細胞への生体分子導入を促進する。米国特許第７，２４５，９６３号の全体的内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２４２】
Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号には、体内または植物内の選択された組織の細胞中への生体分子導入を効果的に促進するために用いられ得る電気穿孔装置が記載されている。該電気穿孔装置は、操作がソフトウエアまたはファームウエアに特定される電気運動装置（「ＥＫＤ装置」）を含む。ＥＫＤ装置は、ユーザ制御に基づく一列の電極とパルスパラメータ入力との間で一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生成し、電流波形データの保存及び取得を可能にする。電気穿孔装置は、針電極、注射針用の中央注入チャネル、及び取り外し可能なガイドディスクのアレイを有する交換可能な電極ディスクも含む。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全体的内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２４３】
米国特許第７，２４５，９６３号及び米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載された電極アレイ及び方法は、筋肉などの組織だけでなく、他の組織または臓器にも深く浸透させるように適合され得る。電極アレイの形態によって、注射針（選択された生体分子を送達する）が、標的臓器にも完全に挿入され、電極によってあらかじめ描かれた領域の標的組織に垂直に注射投与される。米国特許第７，２４５，９６３号及び米国特許公開第２００５／００５２６３号に記載された電極は、好ましくは２０ｍｍ長及び２１ゲージである。
【０２４４】
加えて、電気穿孔装置及びその使用を組み込んだいくつかの実施形態で予期される通り、以下の特許：１９９３年１２月２８日発行の米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日発行の米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日発行の同第６，２６１，２８１号、２００５年１０月２５日発行の同第６，９５８，０６０号、及び２００５年９月６日発行の米国特許第６，９３９，８６２号に記載された電気穿孔装置が存在する。さらに、様々な装置のいずれかを用いたＤＮＡの送達に関係する２００４年２月２４日発行の米国特許第６，６９７，６６９号、及びＤＮＡ注入の方法が注目された２００８年２月５日発行の米国特許第７，３２８，０６４号に提供された主題を含む特許が、本明細書で企図される。先の特許は、全体として参照により組み入れられる。
８．ワクチンの調製方法
【０２４５】
本明細書に記載したワクチンを含むＤＮＡプラスミドを調製する方法が本明細書にて提供される。ＤＮＡプラスミドを、哺乳動物発現プラスミドにサブクローニング最終的なステップの後、当該技術分野で公知の方法を用いて、大規模発酵タンクで細胞培養物に接種するのに用いることができる。
【０２４６】
ＥＰ装置で用いられる本発明のＤＮＡプラスミドは、公知の装置及び技術の組み合わせを利用して配合または製造することができるが、好ましくはそれらは、２００７年５月２３日に出願された米国公開出願第２００９０００４７１６号に記載された最適化プラスミド製造技術を用いて製造される。いくつかの例において、これらの研究で用いたＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で配合させることができる。その製造技術は、米国特許出願第６０／９３９７９２号に記載されたものに加えて、２００７年７月３日発行の許諾対象特許である米国特許第７，２３８，５２２号に記載されたものをはじめとする、当業者に概ね公知の様々な装置及びプロトコルも含み、組み入れている。先に参照された出願及び特許である、米国特許出願第６０／９３９，７９２号及び米国特許第７，２３８，５２２号は、それぞれ全体が本明細書に組み入れられる。
９．実施例
【０２４７】
以下の実施例を参照することによって、前述の事項をより一層理解できるであろう。以下の実施例は例示を目的にするものであり、本発明の範囲を限定する意図はない。
実施例１
発現ベクター
【０２４８】
Ａ、Ｂ、Ｅ及びＦは、ボツリヌス菌の４つの血清型にそれぞれ由来するボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）である。神経毒素Ａ、Ｂ、Ｅ及びＦのそれぞれの非毒性重鎖（Ｈｃ）をコードする核酸配列をコドン最適化及びＲＮＡ最適化し、さらに、ＢｏＮＴ重鎖の分泌を増大させるＩｇＥリーダー配列についてもコードするように合成した。
【０２４９】
配列番号１は、神経毒素Ａの非毒性重鎖及びＩｇＥリーダー配列をコードする最適化核酸配列に相当する。配列番号３は、神経毒素Ｂの非毒性重鎖及びＩｇＥリーダー配列をコードする最適化核酸配列に相当する。配列番号５は、神経毒素Ｅの非毒性重鎖及びＩｇＥリーダー配列をコードする最適化核酸配列に相当する。配列番号７は、神経毒素Ｆの非毒性重鎖及びＩｇＥリーダー配列をコードする最適化核酸配列に相当する。
【０２５０】
最適化核酸配列をｐＵＣ５７ベクターに挿入し、翻訳終了のためにポリＡテールを付加した。その後、挿入物をｐＶａｘ１発現ベクターのＢａｍＨＩ部位とＮｏｔ１部位の間にクローニングするか移行した（図１Ａ）。ｐＶａｘ１発現ベクターのＣＭＶプロモーター、ＢＧＨポリＡシグナル、カナマイシン耐性遺伝子及びｐＵＣオリジンも図１に示す。得られるベクターは、１価の発現ベクターであり、言い換えれば、（１）ＩｇＥリーダー配列を有する神経毒素Ａの重鎖（配列番号２）、（２）ＩｇＥリーダー配列を有する神経毒素Ｂの重鎖（配列番号４）、（３）ＩｇＥリーダー配列を有する神経毒素Ｅの重鎖（配列番号６）または（４）ＩｇＥリーダー配列を有する神経毒素Ｆの重鎖（配列番号８）のタンパク質のうちの１つの発現を起こさせるものである。
【０２５１】
さらに、ＢｏＮＴの重鎖Ａ、Ｂ、ＥまたはＦ（例えば、配列番号１、３、５及び７）のうち２つをコードする最適化核酸配列をｐＶａｘ１発現ベクターのＢａｍＨＩ部位とＮｏｔ１部位の間に挿入した２価の発現ベクターを生成した（図１Ｂ）。２つのＢｏＮＴ重鎖は、フリン開裂部位で分離して、個々のＢｏＮＴ重鎖がそれぞれ分泌されるようにした。
【０２５２】
神経毒素Ａ、Ｂ、Ｅ及びＦ（例えば、配列番号１、３、５及び７）の重鎖をコードする最適化核酸配列をｐＶａｘ１発現ベクターのＢａｍＨＩ部位とＮｏｔ１部位の間に配置することで、図１Ｃに示すような４価の発現ベクターを生成した。４価の発現ベクターは、４つの重鎖の発現を起こさせるためにデュアルプロモーターを持たせた。４価の発現ベクターはまた、図１３に示すように構築した。
実施例２
１価発現ベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現
【０２５３】
上記実施例１に記載した図１Ａに示す１価ＢｏＮＴ／Ｈｃ構築物をヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞にトランスフェクトすることによって、神経毒素Ａ、Ｂ、Ｅ及びＦの重鎖の発現を確認した。各々の１価ＢｏＮＴ／Ｈｃ構築物には、個々の重鎖に結合した赤血球凝集素（ＨＡ）配列も含め、重鎖の検出ができるようにした。トランスフェクトした細胞の免疫蛍光分析を図２に示す。神経毒素Ａ、Ｂ、Ｅ及びＦの重鎖のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現が確認された。図２中の横棒は１６０μｍに等しい。具体的には、ＤＡＰＩを細胞核の染色に用い、ＦＩＴＣ染色を各重鎖の検出に用いた。合成パネルは、ＤＡＰＩとＦＩＴＣのそれぞれの染色の重ね合わせを示す。
実施例３
ＢｏＮＴ  Ｈｃワクチンに対する体液性免疫反応
【０２５４】
上記実施例１に記載した図１に示す構築物を分析して、当該構築物が有効なワクチンであるかどうかを評価した。具体的には、Ｂａｌｂ／ｃマウスを１価ＢｏＮＴ／Ｈｃ構築物（すなわち、ワクチン）または２価ＢｏＮＴ／Ｈｃワクチンのいずれかで免疫にすることによって、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける体液性免疫反応を調べた。
【０２５５】
３つのグループのＢａｌｂ／ｃマウスを以下に記載するように免疫にした。ＢｏＮＴ／Ｈｃワクチンによって誘導された体液性反応の程度は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いて検出した。ＥＬＩＳＡによって、それぞれのＢｏＮＴ重鎖に特異的な抗体を検出した。
【０２５６】
グループ１は、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ１価ワクチンで免疫にしたマウス５匹と対照マウス５匹（すなわち、ナイーブ）とした。血清中の抗ボツリヌス神経毒素ＡのＩｇＧ反応を図３Ａに示す。色のない丸はナイーブマウスを示し、塗りつぶされた四角はＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ免疫化マウスを示す。
【０２５７】
グループ２は、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂ１価ワクチンで免疫にしたマウス５匹と対照マウス５匹（すなわち、ナイーブ）とした。血清中の抗ボツリヌス神経毒素ＢのＩｇＧ反応を図３Ｂに示す。色のない丸はナイーブマウスを示し、半分塗りつぶされた四角はＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂ免疫化マウスを示す。
【０２５８】
グループ３は、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／ＡＢ２価ワクチンで免疫にしたマウス５匹と対照マウス５匹（すなわち、ナイーブ）とした。血清中の抗ボツリヌス神経毒素Ａ及びＢのＩｇＧ反応を図３Ｃに示す。色のない丸はナイーブマウスを示す。ＢｏＮＴ／Ｈｃ／ＡＢ２価ワクチンで免疫にしたマウスは、神経毒素Ａ（すなわち、塗りつぶされた四角）と神経毒素Ｂ（すなわち、半分塗りつぶされた四角）の重鎖に対する抗原を産生した。
【０２５９】
上記のデータにより、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ１価ワクチン及びＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂ１価ワクチンが神経毒素Ａ及び神経毒素Ｂの重鎖に対してそれぞれ特異な抗体を産生したことが示された。また、上記のデータにより、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／ＡＢ２価ワクチンが神経毒素Ａ及びＢの重鎖に対して特異な抗体を産生したことも示された。したがって、当該１価及び２価のワクチンは、ボツリヌス神経毒素に対する特異的体液性反応を誘導することができた。
実施例４
ボツリヌス菌神経毒素による致死的攻撃
【０２６０】
上記実施例１に記載した図１に示す構築物をさらに分析して、当該構築物が有効なワクチンであるかどうかを評価した。具体的には、１価ＢｏＮＴ／Ｈｃ構築物（すなわち、ワクチン）または２価ＢｏＮＴ／Ｈｃワクチンのいずれかで免疫にしたＢａｌｂ／ｃマウスについて、それぞれ致死量のボツリヌス神経毒素で攻撃して、当該ワクチンが免疫化したＢａｌｂ／ｃマウスにおいて疾患（すなわち、死亡）を防ぐかどうかを評価した。
【０２６１】
３つのグループのマウスを以下に記載するように免疫にした。免疫付与スケジュールの終了後、各グループのマウスにボツリヌス菌の各血清型の１０2  ＬＤ５０を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与すなわち攻撃した。ＢｏＮＴ／Ｈｃワクチンの防御能を、攻撃後に生存したマウスの割合として測定した。
【０２６２】
グループ１は、３つの種類のマウスとした。（ａ）神経毒素Ａによる攻撃の前に最適投薬量のＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ１価ワクチンで免疫化したマウス（すなわち、図４Ａの塗りつぶされた三角）、（ｂ）神経毒素Ａで攻撃した非免疫化マウス（すなわち、ナイーブ）（すなわち、図４Ａの白抜きの丸）、（ｃ）神経毒素希釈液（すなわち、Ｇｅｌ−ＮａＨ2ＰＯ4）を与え、攻撃しなかった陰性対照としてのマウス（すなわち、図４Ａの白抜きの四角）。図４Ａに示す通り、免疫化したマウスの１００％が致死量の神経毒素Ａの攻撃後も生存したが、攻撃を受けたナイーブマウスは６時間のうちに死亡した。
【０２６３】
グループ２は、３つの種類のマウスとした。（ａ）神経毒素Ｂによる攻撃の前に最適投薬量のＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂ１価ワクチンで免疫化したマウス（すなわち、図４Ｂの塗りつぶされた三角）、（ｂ）神経毒素Ｂで攻撃した非免疫化マウス（すなわち、ナイーブ）（すなわち、図４Ｂの白抜きの丸）、（ｃ）神経毒素希釈液（すなわち、Ｇｅｌ−ＮａＨ2ＰＯ4）を与え、攻撃しなかった陰性対照としてのマウス（すなわち、図４Ｂの白抜きの四角）。図４Ｂに示す通り、免疫化したマウスの１００％が致死量の神経毒素Ｂの攻撃後も生存したが、攻撃を受けたナイーブマウスは２４時間のうちに死亡した。
【０２６４】
グループ３は、４つの種類のマウスとした。（ａ）神経毒素Ａ及びＢによる攻撃の前に最適投薬量のＢｏＮＴ／Ｈｃ／ＡＢ２価ワクチンで免疫化したマウス（すなわち、図４Ｃの塗りつぶされた三角）、（ｂ）神経毒素Ａで攻撃した非免疫化マウス（すなわち、ナイーブ）（すなわち、図４Ｃの横方向に半分塗りつぶされた丸）、（ｃ）神経毒素Ｂで攻撃した非免疫化マウス（すなわち、ナイーブ）（すなわち、図４Ｃの縦方向に半分塗りつぶされた丸）、（ｄ）神経毒素希釈液（すなわち、Ｇｅｌ−ＮａＨ2ＰＯ4）を与え、攻撃しなかった陰性対照としてのマウス（すなわち、図４Ｃの白抜きの四角）。図４Ｃに示す通り、免疫化したマウスの約７５％が致死量の神経毒素Ａ及びＢの攻撃後も生存した。神経毒素Ａによる攻撃を受けたナイーブマウスは６時間のうちに死亡し、神経毒素Ｂによる攻撃を受けたナイーブマウスは２４時間のうちに死亡した。
【０２６５】
上記のデータにより、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ１価ワクチン及びＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂ１価ワクチンがそれぞれ致死量の神経毒素Ａ及び神経毒素Ｂを介する死亡からＢａｌｂ／ｃマウスを防御したことが示された。特に、１価ワクチンは、免疫化マウスにおける各神経毒素に対して、１００％の防御（すなわち、死亡なし）をもたらした。また、上記のデータにより、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／ＡＢ２価ワクチンが致死量の神経毒素Ａ及びＢを介する死亡からＢａｌｂ／ｃマウスを防御したことも示された。したがって、当該１価及び２価のワクチンは、免疫化マウスを疾患から防御できた。
実施例５
実施例６〜９の免疫原性試験及び攻撃試験の方法
【０２６６】
上記実施例１に記載した図１Ａに示す構築物をさらに分析して、これらの構築物による免疫付与の結果として誘導された免疫反応及び神経毒素攻撃に対する防御を評価した。具体的には、以下に記載する図５に示したスキームを用いて、１価ワクチン及び３価ワクチンの構築物を試験した。
【０２６７】
１価ワクチン。本試験には、６つのグループのＢａｌｂ／ｃマウスを含めた。各グループは、５匹のマウスで構成した。６つのグループを免疫原性試験に用いた。別の６つのグループのマウスをボツリヌス菌由来の神経毒素でマウスを攻撃する試験に用いた。
【０２６８】
グループ１のマウスはワクチン投与せず（すなわち、ナイーブまたは対照マウス）、グループ２のマウスはＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ１価ワクチンを２回投与した。ワクチン投与はそれぞれ、１０μｇのＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ構築物を筋肉内投与するもので、ワクチン投与には３週間の間を空けた。
【０２６９】
グループ３のマウスはワクチン投与せず（すなわち、ナイーブまたは対照マウス）、グループ４のマウスはＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂ１価ワクチンを２回投与した。ワクチン投与はそれぞれ、１０μｇのＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂ構築物を筋肉内投与するもので、ワクチン投与には３週間の間を空けた。
【０２７０】
グループ５のマウスはワクチン投与せず（すなわち、ナイーブまたは対照マウス）、グループ６のマウスはＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｅ１価ワクチンを２回投与した。ワクチン投与はそれぞれ、１０μｇのＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｅ構築物を筋肉内投与するもので、ワクチン投与には３週間の間を空けた。
【０２７１】
それぞれのグループについて、各ワクチン投与の前に各マウスから血清を採取した（すなわち、図５の０週及び３週）。免疫原性試験の終了時点で、各屠殺マウスから組織に加えて血清を再び採取した（すなわち、図５の６週（最終免疫付与後３週間））。
【０２７２】
神経毒素攻撃試験では、最終免疫付与から４週後に動物を各神経毒素により攻撃した（すなわち、図５の７週）。神経毒素は、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。攻撃後、中毒の症状、すなわち、身体活動低下、運動機能障害、呼吸困難、弛緩性麻痺及び呼吸不全についてマウスを観察し、それぞれの症状に対して５を最高スコアとする１〜５の臨床スコアを付けた。
【０２７３】
具体的には、グループ１及び２の動物は、１０2  ＬＤ50の血清型Ａ由来の神経毒素を用いてそれぞれ攻撃した。グループ３及び４の動物は、１０2  ＬＤ50の血清型Ｂ由来の神経毒素を用いてそれぞれ攻撃した。グループ５及び６の動物は、１０2  ＬＤ50の血清型Ｅ由来の神経毒素を用いてそれぞれ攻撃した。神経毒素攻撃試験の終了時点（すなわち、図５の８週（攻撃後１週間））で、動物を屠殺した。
【０２７４】
３価ワクチン。３価ワクチンは、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂ及びＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｅの構築物の混合物である（図１０Ａ）。本試験には、６つのグループのＢａｌｂ／ｃマウスを含めた。各グループは、５匹のマウスで構成した。６つのグループを免疫原性試験に用いた。別の６つのグループのマウスをボツリヌス菌由来の神経毒素でマウスを攻撃する試験に用いた。
【０２７５】
グループ１、３及び５のマウスはワクチン投与せず（すなわち、ナイーブまたは対照マウス）、グループ２、４及び６のマウスは３価ワクチンを２回投与した。ワクチン投与はそれぞれ、３０μｇの３価ワクチン（すなわち、１０μｇのＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ構築物、１０μｇのＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂ構築物及び１０μｇのＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｅ構築物）を筋肉内投与するもので、ワクチン投与には３週間の間を空けた。
【０２７６】
それぞれのグループについて、各ワクチン投与の前に各マウスから血清を採取した（すなわち、図５の０週及び３週）。免疫原性試験の終了時点で、各屠殺マウスから組織に加えて血清を再び採取した（すなわち、図５の６週（最終免疫付与後３週間））。
【０２７７】
神経毒素攻撃試験では、グループ１及び２の動物は、１０2  ＬＤ50の血清型Ａ由来の神経毒素を用いてそれぞれ攻撃した。グループ３及び４の動物は、１０2  ＬＤ50の血清型Ｂ由来の神経毒素を用いてそれぞれ攻撃した。グループ５及び６の動物は、１０2  ＬＤ50の血清型Ｅ由来の神経毒素を用いてそれぞれ攻撃した。具体的には、最終免疫付与から４週後に動物を各神経毒素により攻撃した（すなわち、図５の７週）。神経毒素は、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。攻撃後、中毒の症状、すなわち、身体活動低下、運動機能障害、呼吸困難、弛緩性麻痺及び呼吸不全についてマウスを観察し、それぞれの症状に対して５を最高スコアとする１〜５の臨床スコアを付けた。神経毒素攻撃試験の終了時点（すなわち、図５の８週（攻撃後１週間））で、動物を屠殺した。
実施例６
１価ワクチンによって誘導される体液性免疫反応
【０２７８】
ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／ＢまたはＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｅの構築物を含有する１価ワクチンを用いて、免疫原性試験を実施した。１価ワクチンによる免疫付与は、上記実施例６に記載した図５に示す１価ワクチンの場合と同様に行った。免疫原性試験により、採取した血清中のボツリヌス菌神経毒素に反応する抗体の力価を調べた。
【０２７９】
免疫付与後、試験終了時点（すなわち、最終免疫付与後３週間）で採取した血清中の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の力価を酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。具体的には、各神経毒素に反応したＩｇＧ抗体の力価をＥＬＩＳＡで測定した。
【０２８０】
図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃの各図において、丸は各マウスから採取した血清で測定した力価を示し、横線は各グループの平均力価を示す。図６Ａに示すように、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ構築物を含有する１価ワクチンを投与したマウスは、ナイーブマウスと比較して、血清型Ａ由来の神経毒素に反応したＩｇＧ抗体の力価が高かった。ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂ構築物を含有する１価ワクチンを投与したマウスは、ナイーブマウスと比較して、血清型Ｂ由来の神経毒素に反応したＩｇＧ抗体の力価が高かった（図６Ｂ）。ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｅ構築物を含有する１価ワクチンを投与したマウスは、ナイーブマウスと比較して、血清型Ｅ由来の神経毒素に反応したＩｇＧ抗体の力価が高かった（図６Ｃ）。これらのデータから、各１価ワクチンがそれぞれの神経毒素血清型に反応する強い体液性免疫反応を誘導したことが示された。
実施例７
ボツリヌス菌神経毒素による致死的攻撃に対する１価ワクチンの防御
【０２８１】
ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／ＢまたはＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｅの構築物を含有する１価ワクチンを用いて試験を行い、当該１価ワクチンがボツリヌス菌神経毒素による致死的攻撃を防御するかどうかを確認した。１価ワクチンによる免疫付与は、上記実施例６に記載した図５に示す１価ワクチンの場合と同様に行った。攻撃試験では、致死的攻撃に対する生存率ならびに中毒症状、すなわち、身体活動低下、運動機能障害、呼吸困難、弛緩性麻痺及び呼吸不全についての臨床スコアを調べた。
【０２８２】
上記実施例６に記載した１価ワクチンの場合と同様に、免疫付与後、グループ１〜６にそれぞれ致死量の神経毒素を投与した。さらに、神経毒素で攻撃しないＢａｌｂ／ｃマウスには、対照として、神経毒素の希釈液（すなわち、Ｇｅｌ−ＮａＨ2ＰＯ4）を投与し、いかなる影響も希釈液に帰することができるようにした。
【０２８３】
図７Ａ、８Ａ及び９Ａは、カプラン・マイヤー生存曲線を用いた分析による生存率の結果を示す。図７Ｂ、８Ｂ及び９Ｂは、グループ１〜６の各動物についての中毒症状の臨床スコアによる結果を示す。図７Ａ、７Ｂ、８Ａ、８Ｂ、９Ａ及び９Ｂに示すデータは、３つの独立した試験の平均結果である。
【０２８４】
図７Ａに示す通り、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ構築物をワクチン投与したマウス（三角）では１００％が致死量の血清型Ａ由来の神経毒素による攻撃後も生存したが、ナイーブマウス（四角）では１００％が致死量の付与から１４時間以内に死亡した。希釈液を与えたマウスも１００％が実験後も生存した。これは、希釈液が生存に影響を与えなかったことを示している（図７Ａの丸）。さらに、ナイーブマウスでは中毒症状のスコアが高かったのに対し、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ構築物でワクチン投与したマウスでは中毒の症状がほとんどあるいはまったくみられなかった（図７Ｂ）。したがって、これらのデータから、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ構築物を含有する１価ワクチンによる免疫付与が、中毒の症状をほとんどあるいはまったく伴わずに、ボツリヌス菌血清型Ａ由来の神経毒素に対する完全な防御（すなわち、生存率１００％または死亡なし）をもたらすことが示された。
【０２８５】
図８Ａに示す通り、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂ構築物をワクチン投与したマウス（三角）では１００％が致死量の血清型Ｂ由来の神経毒素による攻撃後も生存したが、ナイーブマウス（四角）では１００％が致死量の付与から１４時間以内に死亡した。希釈液を与えたマウスも１００％が実験後も生存した。これは、希釈液が生存に影響を与えなかったことを示している（図８Ａの丸）。さらに、ナイーブマウスでは中毒症状のスコアが高かったのに対し、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂ構築物でワクチン投与したマウスでは中毒の症状がほとんどあるいはまったくみられなかった（図８Ｂ）。したがって、これらのデータから、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂ構築物を含有する１価ワクチンによる免疫付与が、中毒の症状をほとんどあるいはまったく伴わずに、ボツリヌス菌血清型Ｂ由来の神経毒素に対する完全な防御（すなわち、生存率１００％または死亡なし）をもたらすことが示された。
【０２８６】
図９Ａに示す通り、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｅ構築物をワクチン投与したマウス（三角）では１００％が致死量の血清型Ｃ由来の神経毒素による攻撃後も生存したが、ナイーブマウス（四角）では１００％が致死量の付与から１４時間以内に死亡した。希釈液を与えたマウスも１００％が実験後も生存した。これは、希釈液が生存に影響を与えなかったことを示している（図９Ａの丸）。さらに、ナイーブマウスでは中毒症状のスコアが高かったのに対し、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｅ構築物でワクチン投与したマウスでは中毒の症状がほとんどあるいはまったくみられなかった（図９Ｂ）。したがって、これらのデータから、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｅ構築物を含有する１価ワクチンによる免疫付与が、中毒の症状をほとんどあるいはまったく伴わずに、ボツリヌス菌血清型Ｅ由来の神経毒素に対する完全な防御（すなわち、生存率１００％または死亡なし）をもたらすことが示された。
【０２８７】
要するに、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／ＢまたはＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｅの構築物を含有する１価ワクチンは、ボツリヌス菌血清型Ａ、ＢまたはＥのそれぞれに由来する致死量の神経毒素への曝露に対して、１００％の生存率をもたらした。
実施例８
３価ワクチンによって誘導される体液性免疫反応
【０２８８】
ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂ及びＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｅの構築物を含有する３価ワクチンを用いて、免疫原性試験を実施した。３価ワクチンによる免疫付与は、上記実施例６に記載した図５に示す３価ワクチンの場合と同様に行った。免疫原性試験により、採取した血清中のボツリヌス菌神経毒素に反応する抗体の力価を調べた。
【０２８９】
免疫付与後、試験終了時点（すなわち、最終免疫付与後３週間）で採取した血清中のＩｇＧの力価をＥＬＩＳＡによって測定した。具体的には、血清型Ａ、ＢまたはＥに由来する神経毒素に反応したＩｇＧ抗体の力価をＥＬＩＳＡで測定した。
【０２９０】
図１０Ｂ、１０Ｃ及び１０Ｄの各図において、丸は各マウスから採取した血清で測定した力価を示し、横線は各グループの平均力価を示す。図１０Ｂ、１０Ｃ及び１０Ｄに示す通り、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂ及びＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｅの構築物を含有する３価ワクチンを投与したマウスでは、血清型Ａ、Ｂ及びＥに由来する神経毒素に反応したＩｇＧ抗体の力価が高かった。これらにより、当該３価ワクチンが神経毒素のサブタイプＡ、Ｂ及びＥに反応する強い体液性免疫反応を誘導したことが示された。したがって、当該３価ワクチンは、ボツリヌス菌の複数の血清型、すなわち、血清型Ａ、Ｂ及びＥに由来する神経毒素に反応する免疫反応を誘導した。
実施例９
ボツリヌス菌神経毒素による致死的攻撃に対する３価ワクチンの防御
【０２９１】
ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂ及びＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｅの構築物を含有する３価ワクチンについてさらに試験し、当該３価ワクチンがボツリヌス菌神経毒素による致死的攻撃を防御するかどうかを確認した。３価ワクチンによる免疫付与は、上記実施例６に記載した図５に示す３価ワクチンの場合と同様に行った。攻撃試験では、致死的攻撃に対する生存率ならびに中毒症状、すなわち、身体活動低下、運動機能障害、呼吸困難、弛緩性麻痺及び呼吸不全についての臨床スコアを調べた。
【０２９２】
上記実施例６に記載した３価ワクチンの場合と同様に、免疫付与後、グループ１〜６にボツリヌス菌血清型Ａ、ＢまたはＥに由来する致死量の神経毒素を投与した。さらに、神経毒素で攻撃しないＢａｌｂ／ｃマウスには、対照として、神経毒素の希釈液（すなわち、Ｇｅｌ−ＮａＨ2ＰＯ4）を投与し、いかなる影響も希釈液に帰することができるようにした。
【０２９３】
図１１Ａ、１１Ｃ及び１１Ｅは、カプラン・マイヤー生存曲線を用いた分析による生存率の結果を示す。図１１Ｂ、１１Ｄ及び１１Ｆは、グループ１〜６の各動物についての中毒症状の臨床スコアによる結果を示す。
【０２９４】
図１１Ａ、１１Ｃ及び１１Ｅに示す通り、３価ワクチンを投与したマウス（すなわち、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／ＡＢＥ、三角）では１００％が血清型Ａ、Ｂ及びＥのそれぞれに由来する致死量の神経毒素による攻撃後も生存したが、ナイーブマウス（四角）では１００％が致死量の付与から１４時間以内に死亡した。希釈液を与えたマウスも１００％が実験後も生存した。これは、希釈液が生存に影響を与えなかったことを示している（図１１Ａ、１１Ｃ及び１１Ｅの丸）。さらに、ナイーブマウスでは中毒症状のスコアが高かったのに対し、３価ワクチン（すなわち、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／ＡＢＥ）を投与したマウスでは中毒の症状がほとんどあるいはまったくみられなかった（図１１Ｂ、１１Ｄ及び１１Ｆ）。したがって、これらのデータから、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂ及びＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｅの構築物を含有する３価ワクチンによる免疫付与が、中毒症状をほとんどあるいはまったく伴わずに、ボツリヌス菌血清型Ａ、Ｂ及びＥに由来する神経毒素に対する完全な防御（すなわち、生存率１００％または死亡なし）をもたらすことが示された。さらに、３価ワクチンは、血清型Ａ、Ｂ及びＥに由来する神経毒素に対して、一様に効果的な防御をもたらした（すなわち、生存率１００％）。
実施例１０
ボツリヌス菌神経毒素による致死的攻撃に対する１価ワクチンの防御によって誘導された抗体
【０２９５】
上記実施例１に記載した図１Ａに示す構築物をさらに試験して、１価ワクチンによって中和抗体が誘導されたかどうかを確認した。Ｂａｌｂ／ｃマウスを本試験に用いた。具体的には、ナイーブマウス（すなわち、１価ワクチンを投与しなかったマウス）、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ構築物を含有する１価ワクチンで免疫付与したマウス、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂ構築物を含有する１価ワクチンで免疫付与したマウス、及びＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｅ構築物を含有する１価ワクチンで免疫付与したマウスから血清を採取した。その後、血清とそれぞれの神経毒素とを混合した。すなわち、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂ及びＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｅをワクチン投与したマウスから得た６００μｌの血清と、ボツリヌス菌血清型Ａ、Ｂ及びＥに由来する神経毒素１０2  ＬＤ50とをそれぞれ１：１で混合した（図１２Ａ）。ナイーブマウスから得た血清は、血清型Ａ、Ｂ及びＥに由来する神経毒素と個別に１：１で混合した。血清−毒素混合物を摂氏３７度で１時間インキュベートした。
【０２９６】
その後、２００μｌの血清−毒素混合物の各々をナイーブマウス（すなわち、１価ワクチンを投与しなかったマウス）の各グループに腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。各グループは、マウス５匹とした。生存率ならびに疾患（すなわち、中毒）の臨床症状、すなわち、呼吸不全、弛緩性麻痺、呼吸困難、運動機能障害及び身体活動低下について、マウスを７日間観察した。具体的には、臨床症状ごとに５を最高スコアとする１〜５のスコアを付けた。さらに、対照として、血清−毒素混合物の代わりに神経毒素の希釈液（すなわち、Ｇｅｌ−ＮａＨ2ＰＯ4）を投与した別グループのマウスを試験に含め、いかなる影響も希釈液に帰することができるようにした。
【０２９７】
図１２Ｂ、１２Ｃ及び１２Ｄは、カプラン・マイヤー生存曲線を用いた生存率の結果を示す。図１２Ｅ、１２Ｆ及び１２Ｇは、マウスごとの疾患症状に関する臨床スコアの結果を示す。
【０２９８】
血清型Ａ由来の神経毒素とＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ構築物を含有する１価ワクチンで免疫付与したマウスから得た血清との混合物を与えたマウスの１００％が生存した（図１２Ｂの三角）。これらのマウスは、中毒の症状をほとんどあるいはまったく示さなかった（図１２Ｅ）。対照的に、血清型Ａ由来の神経毒素とナイーブマウスから得た血清との混合物を与えたマウスでは、１００％が混合物付与後６時間以内に死亡した（図１２Ｂの四角）。これらのマウスはまた、中毒症状のスコアが高かった（図１２Ｅ）。希釈液を与えたマウスも１００％が実験後も生存した。これは、希釈液が生存に影響を与えなかったことを示している（図１２Ｂ）。したがって、これらのデータから、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ構築物で免疫付与したマウスから得た血清中に存在する抗体が血清型Ａ由来の神経毒素を中和し、これにより動物が神経毒素による攻撃後も生存できたことが示された。このように、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ａ構築物を含有する１価ワクチンは、高い力価の抗体を誘導し（上記実施例６及び図６Ａに記載した通り）、これらの抗体が血清型Ａ由来の神経毒素を中和した。この１価ワクチンは、神経毒素に反応する中和抗体を誘導する強い体液性免疫反応の誘導を介して、ボツリヌス菌血清型Ａに由来する致死量の神経毒素に対する生存をもたらした。
【０２９９】
血清型Ｂ由来の神経毒素とＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂ構築物を含有する１価ワクチンで免疫付与したマウスから得た血清との混合物を与えたマウスの１００％が生存した（図１２Ｃの三角）。これらのマウスは、中毒の症状をほとんどあるいはまったく示さなかった（図１２Ｆ）。対照的に、血清型Ｂ由来の神経毒素とナイーブマウスから得た血清との混合物を与えたマウスでは、１００％が混合物付与後６時間以内に死亡した（図１２Ｃの四角）。これらのマウスはまた、中毒症状のスコアが高かった（図１２Ｆ）。希釈液を与えたマウスも１００％が実験後も生存した。これは、希釈液が生存に影響を与えなかったことを示している（図１２Ｃ）。したがって、これらのデータから、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂ構築物で免疫付与したマウスから得た血清中に存在する抗体が血清型Ｂ由来の神経毒素を中和し、これにより動物が神経毒素による攻撃後も生存できたことが示された。このように、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｂ構築物を含有する１価ワクチンは、高い力価の抗体を誘導し（上記実施例６及び図６Ｂに記載した通り）、これらの抗体が血清型Ｂ由来の神経毒素を中和した。この１価ワクチンは、神経毒素に反応する中和抗体を誘導する強い体液性免疫反応の誘導を介して、ボツリヌス菌血清型Ｂに由来する致死量の神経毒素に対する生存をもたらした。
【０３００】
血清型Ｅ由来の神経毒素とＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｅ構築物を含有する１価ワクチンで免疫付与したマウスから得た血清との混合物を与えたマウスの１００％が生存した（図１２Ｄの三角）。これらのマウスは、中毒の症状をほとんどあるいはまったく示さなかった（図１２Ｇ）。対照的に、血清型Ａ由来の神経毒素とナイーブマウスから得た血清との混合物を与えたマウスでは、１００％が混合物付与後６時間以内に死亡した（図１２Ｄの四角）。これらのマウスはまた、中毒症状のスコアが高かった（図１２Ｇ）。希釈液を与えたマウスも１００％が実験後も生存した。これは、希釈液が生存に影響を与えなかったことを示している（図１２Ｄ）。したがって、これらのデータから、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｅ構築物で免疫付与したマウスから得た血清中に存在する抗体が血清型Ｅ由来の神経毒素を中和し、これにより動物が神経毒素による攻撃後も生存できたことが示された。このように、ＢｏＮＴ／Ｈｃ／Ｅ構築物を含有する１価ワクチンは、高い力価の抗体を誘導し（上記実施例６及び図６Ｃに記載した通り）、これらの抗体が血清型Ｅ由来の神経毒素を中和した。この１価ワクチンは、神経毒素に反応する中和抗体を誘導する強い体液性免疫反応の誘導を介して、ボツリヌス菌血清型Ｅに由来する致死量の神経毒素に対する生存をもたらした。
【０３０１】
要するに、上記実施例におけるデータにより、当該ワクチンがボツリヌス菌由来の神経毒素に反応する高い力価の抗体を誘導し、これらの抗体が神経毒素を中和することによって、中毒症状をほとんどあるいはまったく伴わずに、致死量の神経毒素に対する著しい防御（すなわち、７５〜１００％の生存率）をもたらすことが示された。さらに、２価及び３価のワクチンも同じく、ボツリヌス菌の異なる血清型に由来する神経毒素に対する著しい防御（すなわち、それぞれ７５％と１００％の生存率）をもたらした。
【０３０２】
前述の詳細な説明及び添付の実施例は単に例証であり、添付された特許請求の範囲及びそれらの等価物によってのみ定義される本発明の範囲の限定としてみなすべきではないことが理解される。
【０３０３】
開示された実施形態に対する、様々な変更及び修正は当業者に明白であろう。そのような変更及び修正は、本発明の化学構造、代替物、派生物、中間体、合成物、製剤及び／または使用の方法に関するものを限定することなく含み、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく行うことができる。
【図１Ａ−Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ−Ｃ】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図１０Ａ−Ｄ】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１１Ｃ−Ｄ】
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【図１１Ｅ−Ｆ】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１３】
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【配列表】
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