(57)【要約】【課題】生体適合性粒子の連続製造方法を提供すること。【解決手段】（工程2）生体適合性粒子形成成分を含有する液（液1）、及び生体適合性粒子形成成分に対する貧溶媒を含有する液（液2）を混合槽に連続的に投入する工程、並びに（工程3）混合槽中の生体適合性粒子を含有する液を連続的に排出する工程、を含む、生体適合性粒子の連続製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（工程2）生体適合性粒子形成成分を含有する液（液1）、及び生体適合性粒子形成成分に対する貧溶媒を含有する液（液2）を混合槽に連続的に投入する工程、並びに
（工程3）混合槽中の生体適合性粒子を含有する液を連続的に排出する工程、
を含む、生体適合性粒子の連続製造方法。
【請求項２】
前記生体適合性粒子が、リポソーム、ナノスフェア、又は薬物ナノ結晶である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体適合性粒子がナノスフェアである場合、平均滞留時間が20分以上である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記生体適合性粒子がナノスフェアである場合、平均滞留時間が20分未満である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記工程2及び前記工程3が同時に行われる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
さらに、前記工程2及び前記工程3の前に、
（工程1）前記液2を含む混合槽に、前記液1を投入する工程、
を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
さらに、前記工程1の前に、
（工程0）混合槽に前記液2を投入する工程、
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記液2がカチオン性物質を含有する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記生体適合性粒子がナノ粒子である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体適合性粒子の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品のドラッグデリバリーシステム（DDS）には高分子ナノ粒子やリポソームなど生体適合性DDSナノ粒子が利用される。また近年、難溶解性の医薬品化合物が増加しており、溶解性改善には薬物のナノ結晶化が有効である。
【０００３】
DDSナノ粒子や薬物ナノ結晶の製造方法の多くはバッチ製造であり液中で合成される。バッチ製造の場合、研究開発から実生産へ移管するためにスケールアップ検討が必要で効率が悪く、フレキシブルな製造が困難である。
【０００４】
一方で、DDS微粒子の連続製造法として、マイクロフルイディクス法によるマイクロ流路を利用した方法が報告されている（非特許文献１）。しかし、本方法は装置自体が高価でありコスト削減につながりにくい。さらに、マイクロ流路が詰まりやすく単位時間あたりの製造量が極めて少ない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 3952 -3956.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、生体適合性粒子の連続製造方法を提供することを課題とする。好ましくは、本発明は、生体適合性粒子をより効率的に製造することができる、連続製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は上記課題に鑑みて鋭意件有を進めた結果、（工程2）生体適合性粒子形成成分を含有する液（液1）、並びに生体適合性粒子形成成分に対する貧溶媒を含有する液（液2）を混合槽に連続的に投入する工程、及び（工程3）混合槽中の生体適合性粒子を含有する液を連続的に排出する工程により、生体適合性粒子を連続的に製造できることを見出した。本発明者はこの知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
【０００８】
項１．  （工程2）生体適合性粒子形成成分を含有する液（液1）、及び生体適合性粒子形成成分に対する貧溶媒を含有する液（液2）を混合槽に連続的に投入する工程、並びに（工程3）混合槽中の生体適合性粒子を含有する液を連続的に排出する工程、
を含む、生体適合性粒子の連続製造方法。
【０００９】
項２．  前記生体適合性粒子が、リポソーム、ナノスフェア、又は薬物ナノ結晶である、項１に記載の方法。
【００１０】
項３．  前記生体適合性粒子がナノスフェアである場合、平均滞留時間が20分以上である、項１又は２に記載の方法。
【００１１】
項４．  前記生体適合性粒子がナノスフェアである場合、平均滞留時間が20分未満である、項１又は２に記載の方法。
【００１２】
項５．  前記工程2及び前記工程3が同時に行われる、項１〜４のいずれかに記載の方法。
【００１３】
項６．  さらに、前記工程2及び前記工程3の前に、（工程1）前記液2を含む混合槽に、前記液1を投入する工程、を含む、項１〜５のいずれかに記載の方法。
【００１４】
項７．  さらに、前記工程1の前に、（工程0）混合槽に前記液2を投入する工程、を含む、項６に記載の方法。
【００１５】
項８．  前記液2がカチオン性物質を含有する、項１〜７のいずれかに記載の方法。
【００１６】
項９．  前記生体適合性粒子がナノ粒子である、項１〜８のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、生体適合性粒子の連続製造方法を提供することができる。本発明の方法によれば、効率的に生体適合性粒子を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】薬物未封入であり、且つ平均滞留時間が30分である場合の、経時的な粒子径変化（実施例1）を示す。縦軸は粒子径を示し、横軸は粒子調製開始からの経過時間を示す。
【図２】薬物未封入であり、且つ平均滞留時間が30分である場合の、経時的なゼータ電位変化（実施例1）を示す。縦軸はゼータ電位を示し、横軸は粒子調製開始からの経過時間を示す。
【図３】薬物封入し、脂質としてEPCを用い、且つ粒子調製開始から120分経過時のリポソーム懸濁液を調べた場合の、平均滞留時間別の粒子径（実施例1）を示す。縦軸は粒子径を示し、横軸は平均滞留時間を示す。
【図４】薬物封入し、脂質としてEPCを用い、且つ粒子調製開始から120分経過時のリポソーム懸濁液を調べた場合の、平均滞留時間別の封入率（実施例1）を示す。縦軸は封入率を示し、横軸は平均滞留時間を示す。
【図５】薬物封入し、脂質としてHSPCを用い、且つ粒子調製開始から120分経過時のリポソーム懸濁液を調べた場合の、平均滞留時間別の粒子径（実施例1）を示す。縦軸は粒子径を示し、横軸は平均滞留時間を示す。
【図６】薬物封入し、脂質としてHSPCを用い、且つ粒子調製開始から120分経過時のリポソーム懸濁液を調べた場合の、平均滞留時間別の封入率（実施例1）を示す。縦軸は封入率を示し、横軸は平均滞留時間を示す。
【図７】リアクター温度が室温であり、Pluronic F-127濃度が1w/v%であり、且つ粒子調製開始から180分経過時のPLGAナノ粒子懸濁液を調べた場合の、平均滞留時間別の粒子径（実施例2）を示す。縦軸は粒子径を示し、横軸は平均滞留時間を示す。
【図８】リアクター温度が室温であり、Pluronic F-127濃度が1w/v%であり、且つ粒子調製開始から180分経過時のPLGAナノ粒子懸濁液を調べた場合の、平均滞留時間別のゼータ電位（実施例2）を示す。縦軸はゼータ電位を示し、横軸は平均滞留時間を示す。
【図９】リアクター温度が室温であり、Pluronic F-127濃度が1w/v%であり、且つ粒子調製開始から180分経過時のPLGAナノ粒子懸濁液を調べた場合の、平均滞留時間別の封入率（実施例2）を示す。縦軸は封入率を示し、横軸は平均滞留時間を示す。
【図１０】平均滞留時間が10分であり、Pluronic F-127濃度が1w/v%であり、且つ粒子調製開始から180分経過時のPLGAナノ粒子懸濁液を調べた場合の、リアクター温度別の粒子径（実施例2）を示す。縦軸は粒子径を示し、横軸はリアクター温度を示す。
【図１１】平均滞留時間が10分であり、Pluronic F-127濃度が1w/v%であり、且つ粒子調製開始から180分経過時のPLGAナノ粒子懸濁液を調べた場合の、リアクター温度別のゼータ電位（実施例2）を示す。縦軸はゼータ電位を示し、横軸はリアクター温度を示す。
【図１２】平均滞留時間が10分であり、Pluronic F-127濃度が1w/v%であり、且つ粒子調製開始から180分経過時のPLGAナノ粒子懸濁液を調べた場合の、リアクター温度別の封入率（実施例2）を示す。縦軸は封入率を示し、横軸はリアクター温度を示す。
【図１３】リアクター温度が室温であり、平均滞留時間が10分であり、且つ粒子調製開始から180分経過時のPLGAナノ粒子懸濁液を調べた場合の、Pluronic F-127濃度別の粒子径（実施例2）を示す。縦軸は粒子径を示し、横軸はPluronic F-127濃度を示す。
【図１４】リアクター温度が室温であり、平均滞留時間が10分であり、且つ粒子調製開始から180分経過時のPLGAナノ粒子懸濁液を調べた場合の、Pluronic F-127濃度別のゼータ電位（実施例2）を示す。縦軸はゼータ電位を示し、横軸はPluronic F-127濃度を示す。
【図１５】リアクター温度が室温であり、平均滞留時間が10分であり、且つ粒子調製開始から180分経過時のPLGAナノ粒子懸濁液を調べた場合の、Pluronic F-127濃度別の封入率（実施例2）を示す。縦軸は封入率を示し、横軸はPluronic F-127濃度を示す。
【図１６】経時的な粒子径変化（実施例3）を示す。縦軸は粒子径を示し、横軸は粒子調製開始からの経過時間を示す。Chitosan-modifiedは液2がキトサンを含む場合を示し、Unmodifiedは液2がキトサンを含まない場合を示す。
【図１７】経時的なゼータ電位変化（実施例3）を示す。縦軸はゼータ電位を示し、横軸は粒子調製開始からの経過時間を示す。Chitosan-modifiedは液2がキトサンを含む場合を示し、Unmodifiedは液2がキトサンを含まない場合を示す。
【図１８】経時的な粒子径変化（実施例4）を示す。縦軸は粒子径を示し、横軸は粒子調製開始からの経過時間を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００２０】
本発明は、その一態様において、（工程2）生体適合性粒子形成成分を含有する液（液1）、及び生体適合性粒子形成成分に対する貧溶媒を含有する液（液2）を混合槽に連続的に投入する工程、並びに（工程3）混合槽中の生体適合性粒子を含有する液を連続的に排出する工程、を含む、生体適合性粒子の連続製造方法（本明細書において、「本発明の方法」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
【００２１】
＜1．生体適合性粒子＞
生体適合性粒子は、生体適合性材料から構成されるナノ粒子である限り特に限定されない。例えば、ドラッグデリバリーシステムのキャリアとして利用されているナノ粒子が挙げられる。具体的には、リポソーム、エマルション、ナノスフェア、薬物ナノ結晶、ナノカプセル、高分子ミセル等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはリポソーム、ナノスフェア、薬物ナノ結晶等が挙げられる。
【００２２】
生体適合性粒子の粒子径は、例えば1000nm以下であることができ、好ましくは800nm以下、より好ましくは650nm以下、さらに好ましくは10〜500nm、よりさらに好ましくは50〜400nm、特に好ましくは50〜200nmである。
【００２３】
生体適合性粒子の具体的態様は、特に制限されない。以下に、リポソーム、エマルション、ナノスフェア、及び薬物ナノ結晶について、具体的な態様を説明する。
【００２４】
＜1-1．リポソーム、エマルション＞
リポソーム又はエマルションにおいて、脂質層を構成する成分については、リポソーム又はエマルションの膜を構成する成分（本明細書において、「生体適合性粒子形成成分」又は「膜構成成分」と略記することもある。）として一般に使用されるものであれば特に限定されない。膜構成成分として、具体的には、例えば脂質、膜安定化剤、荷電物質、抗酸化剤、膜タンパク質等が挙げられる。
【００２５】
脂質は、リポソーム又はエマルションにおいて必須成分であり、その具体例としては、リン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸等が例示される。
【００２６】
リン脂質の具体例としては、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ミリストイルパルミトイルホスファチジルコリン、ミリストイルステアロイルホスファチジルコリン、パルミトイルステアロイルホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン；ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジリノレオイルホスファチジルグリセロール、ミリストイルパルミトイルホスファチジルグリセロール、ミリストイルステアロイルホスファチジルグリセロール、パルミトイルステアロイルホスファチジルグリセロール等のホスファチジルグリセロール；ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、ミリストイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ミリストイルステアロイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトイルステアロイルホスファチジルエタノールアミン等のホスファチジルエタノールアミン；ホスファチジルセリン；ホスファチジン酸；ホスファチジルイノシトール；スフィンゴミエリン；カルジオリピン；卵黄レシチン；大豆レシチン；及びこれらの水素添加物等が例示される。
【００２７】
糖脂質の具体例としては、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド等のグリセロ糖脂質；ガラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等のスフィンゴ糖脂質；ステアリルグルコシド、エステル化ステアリルグリコシド等が例示される。
【００２８】
ステロールの具体例としては、コレステロール、コレステリルヘミスクシネート、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール、フィトステロール、フィトステロール、スチグマステロール、チモステロール、エルゴステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール、等が例示される。特に、当該ステロールには、リポソーム膜を安定化させたり、リポソーム膜の流動性を調節したりする作用があるため、リポソーム膜の構成脂質として含まれていることが望ましい。
【００２９】
飽和又は不飽和の脂肪酸の具体例としては、デカン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、オレイン酸、ドコサン酸等の炭素数10〜22の飽和又は不飽和の脂肪酸が例示される。
【００３０】
リポソーム又はエマルションの膜構成脂質は、1種単独で使用してもよいが、2種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの膜構成脂質中でも、好ましくはリン脂質とステロールの組み合わせが挙げられる。リン脂質とステロールを組み合わせる場合、両者の比率については、特に制限されないが、例えば、リン脂質100モルに対して、ステロールが1〜100モル、好ましくは5〜50モル、更に好ましくは10〜30モルとなる比率が挙げられる。
【００３１】
膜構成脂質の含有量は、特に制限されないが、例えば、膜構成成分の総量に対して、モル比で50〜100％、好ましくは80〜100％、より好ましくは90〜100％、さらに好ましくは95〜100％である。
【００３２】
抗酸化剤は、膜の酸化防止のために含有させることができ、膜の構成成分として必要に応じて使用される。膜の構成成分として使用される抗酸化剤としては、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、トコフェロール、酢酸トコフェロール、濃縮混合トコフェロール、ビタミンE、アスコルビン酸、L-アスコルビン酸ステアリン酸エステル、パルミチン酸アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エリソルビン酸、クエン酸等が例示される。
【００３３】
膜に含まれる酸化防止剤の割合については、特に制限されないが、例えば、膜の構成成分の総量に対して、モル比で0〜40％、好ましくは0〜20％、更に好ましくは0〜10％が例示される。
【００３４】
膜タンパク質は、膜への機能付加又は膜の構造安定化を目的として含有させることができ、膜構成成分として必要に応じて使用される。膜タンパク質としては、例えば、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質、アルブミン、組換えアルブミン等が挙げられる。
【００３５】
膜に含まれる膜タンパク質の割合については、特に制限されないが、例えば、膜の構成成分の総量に対して、モル比で0〜20％、好ましくは0〜10％、更に好ましくは0〜8％が例示される。
【００３６】
＜1-2．ナノスフェア＞
ナノスフェアとは生体適合性高分子（本明細書において、「生体適合性粒子形成成分」と表記することもある。）が凝集してナノサイズの粒子となったものである。
【００３７】
ナノスフェアを構成する生体適合性高分子としては、特に限定されない。例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸共重合体、乳酸・アスパラギン酸共重合体、ポリアクリルシアノアクリレート等が挙げられ、好ましくは乳酸・グリコール酸共重合体が挙げられる。
【００３８】
生体適合性高分子の分子量は、凝集することにより粒子を形成できる程度の大きさであれば、特に制限されない。該分子量は、例えば1000〜1000000、好ましくは2000〜100000、より好ましくは5000〜50000、さらに好ましくは10000〜30000である。
【００３９】
生体適合性高分子は1種単独でもよいし、2種又は3種以上の組み合わせであってもよい。
【００４０】
＜1-3．薬物ナノ結晶＞
薬物ナノ結晶とは、コア粒子が薬物分子で構成されているサブミクロンサイズ以下のナノ粒子であり、主に難水溶性薬物の溶解性改善のために利用される形態であり、薬物ナノ結晶はこの限りにおいて特に制限されない。
【００４１】
薬物ナノ結晶を構成する薬物（本明細書において、「生体適合性粒子形成成分」と表記することもある。）は、難水溶性であることが好ましい。この観点から、該薬物の水への溶解度は、日本薬局方の溶解性の定義において、薬物1gを溶かすのに要する水の量が、例えば30mL以上、好ましくは100mL以上、より好ましくは1000mL以上、さらに好ましくは10000mL以上である。
【００４２】
また、該薬物の分子量は、特に制限されないが、例えば1000以下、好ましくは100〜1000、より好ましくは300〜1000である。
【００４３】
該薬物は1種単独でもよいし、2種又は3種以上の組み合わせであってもよい。
【００４４】
＜2．生体適合性粒子形成成分を含有する液（液1）＞
液1は、上記した生体適合性粒子形成成分を含有する限りにおいて、特に制限されない。
【００４５】
液1の溶媒は、生体適合性粒子形成成分を溶解可能な溶媒である限り、特に制限されず、生体適合性粒子形成成分の種類に応じて適宜選択することができる。該溶媒としては、代表的には有機溶媒が挙げられ、より具体的には、例えばエタノール、ブタノール等のアルコール、ジメチルスルホキシド、アセトン、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトニトリル、酢酸エチル等が挙げられる。溶媒は1種単独でもよいし、2種又は3種以上の組み合わせであってもよい。
【００４６】
液1中の生体適合性粒子形成成分の濃度は、特に制限されず、生体適合性粒子形成成分の種類に応じて適宜設定することができる。例えば生体適合性粒子がリポソーム又はエマルションである場合は、生体適合性粒子形成成分の濃度は、例えば1〜500mM、好ましくは2〜200mM、より好ましくは5〜150mM、さらに好ましくは10〜100mM、よりさらに好ましくは20〜60mMである。例えば生体適合性粒子がナノスフェアである場合は、生体適合性粒子形成成分の濃度は、例えば0.5〜500g/L、好ましくは2〜200g/L、より好ましくは5〜100g/L、さらに好ましくは8〜50g/L、よりさらに好ましくは10〜40g/Lである。例えば、生体適合性粒子が薬物ナノ結晶である場合は、生体適合性粒子形成成分の濃度は、例えば0.1〜200g/L、好ましくは0.5〜150g/L、より好ましくは1〜100g/L、さらに好ましくは2〜50g/L、よりさらに好ましくは5〜20g/Lである。
【００４７】
生体適合性粒子が薬物ナノ粒子以外の粒子の場合、すなわち生体適合性粒子形成成分が薬物以外の成分の場合、液1は、さらに薬物を含んでいてもよい。この場合、本発明の方法により、薬物を保持する生体適合性粒子を得ることができる。この場合の薬物は、液1の溶媒に溶解可能なものである限り特に制限されず、低分子化合物のみならず、タンパク質等の高分子化合物も包含する。該薬物は、他の分子と複合体を形成している状態であってもよい。
【００４８】
液1が上記薬物を含む場合の該薬物の含有量は、特に制限されない。該含有量は、例えば、生体適合性粒子形成成分の含有量よりも低く、具体的には、生体適合性粒子形成成分の含有量の例えば1/200〜1/2、好ましくは1/120〜1/5である。
【００４９】
＜3．生体適合性粒子形成成分に対する貧溶媒を含有する液（液2）＞
液2は、生体適合性粒子形成成分に対する貧溶媒を含有する限りにおいて、特に制限されない。
【００５０】
貧溶媒は、生体適合性粒子形成成分の溶解性が低い溶媒である限り特に制限されない。貧溶媒としては、例えば、日本薬局方の溶解性の定義において、生体適合性粒子形成成分1gを溶かすのに要する溶媒量が、例えば30mL以上、100mL以上、1000mL以上、10000mL以上の溶媒が挙げられる。貧溶媒として、具体的には、水等が挙げられる。
【００５１】
液2には、貧溶媒以外の溶媒が少量含まれていてもよいが、その量はより少ないことが望ましい。液2の溶媒中の貧溶媒の割合（v/v）は、例えば90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上、特に好ましくは100％である。
【００５２】
液2は、生体適合性粒子の分散安定剤を含有してもよい。分散安定剤としては、界面活性剤（好ましくは非イオン性界面活性剤）、水溶性高分子（例えばポリビニルアルコール等）等が挙げられる。
【００５３】
液2が分散安定剤を含む場合、その濃度は、特に制限されない。該濃度は、例えば0.01〜20％（w/v）、好ましくは0.1〜10％（w/v）、より好ましくは1〜10％（w/v）、さらに好ましくは2〜8％（w/v）、よりさらに好ましくは3〜6％（w/v）、特に好ましくは3〜5％（w/v）である。分散安定剤の量を調製することにより粒子物性を調節することができる。
【００５４】
液2は、カチオン性物質を含有してもよい。この場合、本発明の方法により、カチオン性物質を表面及び／又は内部に保持する生体適合性粒子を得ることができる。
【００５５】
カチオン性物質は、正電荷を有する物質であれば特に限定されない。例えば、カチオン性脂質やカチオン性ポリマーが挙げられる。
【００５６】
カチオン性脂質としては、例えば、ラウリルアミン、ミリスチルアミン、パルミチルアミン、ステアリルアミン、オレイルアミン等の脂肪族第1級アミン、DOTAP（N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N, N, N-trimethylammonium methyl-sulfate）、DC-Cholesterol、DOBAQ（N-(4-carboxybenzyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-1-aminium）、14:0 DAP（1,2-dimyristoyl-3-dimethylammonium-propane）、16:0 DAP（1,2-dipalmitoyl-3-dimethylammonium-propane）、18:0 DAP（1,2-distearoyl-3-dimethylammonium-propane）、18:0 DDAB（Dimethyldioctadecylammonium (Bromide Salt)）、12:0 EPC (Cl Salt)（
1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt)）、14:0 EPC (Cl Salt)（1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt)）、14:1 EPC (Tf Salt)（1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (Tf salt)）、16:0 EPC (Cl Salt)（1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt)）、18:0 EPC (Cl Salt)（1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt)）、18:1 EPC (Cl Salt)（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt)）、16:0-18:1 EPC (Cl Salt)（1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt)）、DOTMA（1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane (chloride salt)）、MVL5（N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropyl)amino]-4-[di(3-amino-propyl)amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]-benzamide）等が挙げられる
カチオン性ポリマーとしては、ポリアルキレンイミン、キトサン、ポリリジン、ポリアルギニン等が挙げられる
ポリアルキレンイミンとは、例えばエチレンイミン、プロピレンイミン、ブチレンイミン、ジメチルエチレンイミン、ペンチレンイミン、ヘキシレンイミン、ヘプチレンイミン、オクチレンイミンといった炭素数2〜8のアルキレンイミン、特に炭素数2〜4のアルキレンイミンの1種または2種以上を常法により重合して得られるポリマー、ならびにそれらを種々の化合物と反応させて化学的に変性させたポリマーを意味する。これらのポリアルキレンイミンの中でも、ポリエチレンイミン（PEI）が本発明において特に好ましい
ポリアルキレンイミンは直鎖或いは分枝状のいずれでもよい。またポリアルキレンイミンは様々な分子量をとりうるが、本発明で用いるポリアルキレンイミンの重量平均分子量は300〜3000000の範囲内である。特に重量平均分子量が5，000〜2000000、中でも50000〜1500000、とりわけ300000〜1000000の範囲であるとより好ましい。
【００５７】
カチオン性物質は1種単独でもよいし、2種又は3種以上の組み合わせであってもよい。
【００５８】
液2がカチオン性物質を含む場合、その濃度は、特に制限されない。該濃度は、例えば0.001〜10％（w/v）、好ましくは0.01〜2％（w/v）、より好ましくは0.05〜1％（w/v）である。
【００５９】
液2は、粒子製造効率を著しく阻害しない限りにおいて、上記以外にも、他の成分、例えば緩衝剤、抗体、核酸、薬物等を含有してもよい。
【００６０】
＜4．工程2及び工程3＞
混合槽は、内部の液を混合可能な形態、サイズである限りにおいて、特に制限されない。混合槽は、通常、撹拌手段（例えば、撹拌棒等の回転式撹拌手段）を備える。混合槽としては、好適には、完全混合槽型・連続晶析装置（MSMPR：Mixed-Suspension, Mixed-Product Removal）が使用される。
【００６１】
液1及び液2の混合槽への投入は、通常、混合槽外から混合槽内へ至る送液管により行われる。
【００６２】
液1及び液2は、混合槽へ投入されるまでは接触しない態様で投入されてもよいし、混合槽へ投入される前に接触する或いは混合される態様で投入されてもよい。
【００６３】
液1及び液2の投入時、及び投入後、通常は、混合槽内は常時或いは断続的に撹拌されている。撹拌強度は、混合槽の形態、サイズ、撹拌手段等に応じて適宜調節されるものであるが、一例として、回転式撹拌手段を用いる場合、回転速度は、例えば100〜1000rpm、好ましくは200〜600rpm、より好ましくは300〜500rpm、さらに好ましくは350〜450rpmである。
【００６４】
液1の投入速度と液2の投入速度は、特に制限されず、生産効率等を考慮して適宜設定することができる。一例として、液1の投入速度に対する液2の投入速度の比（＝液2の投入速度／液1の投入速度）は、0.1〜300である。該比は、好ましくは0.5〜100、より好ましくは2〜50、さらに好ましくは5〜30、よりさらに好ましくは7〜25である。また、リポソーム、エマルション、薬物ナノ結晶を製造する場合、該比の特に好ましい範囲は7〜15であり、ナノスフェアを製造する場合、該比の特に好ましい範囲は15〜25である。
【００６５】
工程2により、混合槽内には、液1及び液2が混合されることにより、生体適合性粒子が生成される。工程3では、該生体適合性粒子を含有する液を連続的に排出する。
【００６６】
排出は、通常、混合槽内から混合槽外へ至る送液管により行われる。
【００６７】
生体適合性粒子を含有する液の排出速度は、通常、液1の投入速度と液2の投入速度の合計と同程度である。このようにしないと、混合槽内の溶液量が増減してしまい、混合槽内の液があふれる、或いは枯渇してしまい、望ましくない。排出速度に対する、液1の投入速度と液2の投入速度の合計の比は、例えば0.7〜1.5、好ましくは0.8〜1.3、より好ましくは0.9〜1.1、さらに好ましくは0.95〜1.05であり、この範囲内で、混合槽内の液が著しく増減しないように適宜調整される。また、同様の観点から、通常、工程2及び工程3は同時に行われる。
【００６８】
「連続的に投入」、及び「連続的に排出」とは、投入及び排出が、実質的に連続的に行われていることを意味する。すなわち、投入及び排出が、わずかな時間停止されることにより見かけ上断続的に行われている場合（例えば、投入及び排出が実行されている総時間に対する、投入及び排出を停止している総時間の比が、0.1以下、0.05以下、0.01以下、0.005以下、0.001以下の場合）は、本発明の方法における「連続的な」投入及び排出に包含される。
【００６９】
工程2及び工程3における混合槽内の温度は、特に制限されない。該温度は、例えば5〜80℃、好ましくは10〜80℃、より好ましくは15〜70℃である。本発明の方法の一態様において（例えば、ナノスフェアを製造する場合）は、該温度は、好ましくは50〜70℃である。混合槽内の温度を調節することにより、粒子物性を調節することができる。
【００７０】
平均滞留時間（＝工程2開始時の混合槽内の液量／（液1の投入速度＋液2の投入速度））は、特に制限されないが、例えば1〜240分、好ましくは3〜180分、より好ましくは5〜120分である。本発明の方法の一態様において（例えば、ナノスフェアを製造する場合）は、平均滞留時間は、薬物の封入率をより向上させることができるという観点から、好ましくは20分以上、より好ましくは20〜90分、さらに好ましくは25〜70分、よりさらに好ましくは30〜70分である。一方、薬物を粒子表面により多く吸着し得るという観点からは、平均滞留時間は、好ましくは20分未満、より好ましくは5〜20分、さらに好ましくは5〜15分である。平均滞留時間を調節することにより、粒子物性を調節することができる。
【００７１】
工程3で排出された液には、生体適合性粒子が懸濁状態で含まれる。また、得られる生体適合性粒子の粒子物性は、連続製造プロセス中で大きく変化することなく、安定している。回収された生体適合性粒子は、各種分野、例えば医薬分野、食品分野、化粧品分野等で利用することができる。
【００７２】
＜5．工程1＞
本発明の方法は、さらに、工程2及び工程3の前に、（工程1）液2を含む混合槽に、液1を投入する工程、を含むこのが好ましい。
【００７３】
工程1における混合槽には、液2が既に投入されている。
【００７４】
液1の投入時、及び投入後、通常は、混合槽内は常時或いは断続的に撹拌されている。撹拌強度は、混合槽の形態、サイズ、撹拌手段等に応じて適宜調節されるものであるが、一例として、回転式撹拌手段を用いる場合、回転速度は、例えば100〜1000rpm、好ましくは200〜600rpm、より好ましくは300〜500rpm、さらに好ましくは350〜450rpmである。
【００７５】
工程1における液1の投入量は、投入開始時の混合槽内の液2の容量100％に対して、例えば1〜30％、好ましくは2〜20％、より好ましくは4〜12％である。
【００７６】
工程1における液1の投入速度は、工程2と同程度とすることが望ましい。
【００７７】
＜6．工程0＞
本発明の方法が工程1を含む場合、本発明の方法は、さらに、工程1の前に、（工程0）混合槽に液2を投入する工程、を含むことが好ましい。
【００７８】
工程0における混合槽は、空の状態である。工程0では、そこへ液2を投入する。投入量、投入速度は、特に制限されず、混合槽のサイズ等に応じて、適宜調整することができる。
【００７９】
＜7．その他＞
本明細書に開示される技術の全部又は一部を利用することにより、低分子化合物やバイオ医薬品を封入したDDSナノ粒子及び薬物ナノ結晶の製造を連続プロセス化することができ、従来よりも効率的な製造を達成することができる。また、製造工程におけるプロセスパラメータにより粒子物性を制御することも可能である。
【００８０】
本明細書に開示される技術の全部又は一部を利用する場合、既存のバッチ製造設備をそのまま使用することが可能であり、大型の設備投資の必要性が低い。また、原料投入や回収に用いるチューブの大きさを選択できるため、マイクロ流路で問題となる目詰まりや製造量の問題も回避できる。
【００８１】
本明細書に開示される技術の全部又は一部を利用することにより、既存技術（バッチ製造）と比べて、以下の利点が得られ得る。
【００８２】
ロットサイズ：稼働時間または処理速度を変えることで柔軟に変更できるため、製品仕様の個別対応が可能である。
【００８３】
製品開発手法：開発時と商用生産で同じ機器を使用できるため、実生産の製造条件を短期間で確立でき、速やかな商用生産化が可能である。
【００８４】
製品品質：プロセス解析工学（PAT）技術により常時モニタリングを行うことで、粗悪品を系外へ除去できるため、より高度な品質保証が可能である。
【００８５】
製造設備：稼働時間の延長でロットサイズを大きくできるため、製造量によらず同一の製造設備で対応可能である。また、設備の縮小化、省スペース化が可能なため、初期投資を大幅に削減できる。
【実施例】
【００８６】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００８７】
実施例1．MSMPRによるリポソームの調製
＜脂質・薬物溶液（液1）の調製＞
脂質（SPC：大豆レシチン、HSPC：水素添加大豆レシチン、又はEPC：卵黄レシチン）、コレステロール、インドメタシン（薬物）が下記比率となるように、エタノールに溶解した。
SPC：コレステロール：インドメタシン＝31.5 mM：8 mM：0 mM
HSPC：コレステロール：インドメタシン＝20.4 mM：5.1 mM：0 mM
SPC：コレステロール：インドメタシン＝31.5 mM：8 mM：1 mM
HSPC：コレステロール：インドメタシン＝20.4 mM：5.1 mM：0.25 mM
EPC：コレステロール：インドメタシン＝20.4 mM：5.1 mM：0.25 mM。
【００８８】
＜リポソームの調製＞
30 mLのPBS溶液が入ったリアクター（直径55mm、高さ100mm）（400 rpmで攪拌）へ、脂質・薬物溶液（液1）を一定速度で投入し、脂質・薬物溶液（液1）の投入量が3 mLになった時点で、新しいPBS溶液（液2）を一定速度でリアクターに投入し且つリアクター内のリポソーム懸濁液を一定速度で排出した。平均滞留時間が5、10、30、60、又は120分となるように投入速度及び排出速度を制御した。リアクター温度は室温とした。試験条件を表１に示す。
【００８９】
【表１】
2019167300.tif 000002
【００９０】
Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK)を用いて、リポソーム懸濁液中の粒子の粒子径及びゼータ電位を測定した。さらに、リポソーム中のインドメタシンの封入率（＝（リポソーム中のインドメタシン量／リポソーム調製に使用したインドメタシン量）×100）をHPLCにより測定した。
【００９１】
薬物未封入であり、且つ平均滞留時間が10分である場合の、経時的な粒子物性変化を図１〜２に示す。相転移温度が異なるいずれのリン脂質の場合でも、粒子径は約100 nm程度となった。連続調製開始から30分には定常状態となり、リポソームを安定に連続製造できることが分かった。
【００９２】
薬物封入し、脂質としてEPCを用い、且つ粒子調製開始から120分経過時のリポソーム懸濁液を調べた場合の、平均滞留時間別の粒子物性を図３〜４に示す。平均滞留時間が長くなるにつれて、リポソームの粒子径が大きくなる傾向が観察された。またインドメタシン封入率は平均滞留時間が30分の場合に若干高くなった。この結果より、薬剤封入に対して最適な平均滞留時間が存在することが示唆された。
【００９３】
薬物封入し、脂質としてHSPCを用い、且つ粒子調製開始から120分経過時のリポソーム懸濁液を調べた場合の、平均滞留時間別の粒子物性を図５〜６に示す。EPCの場合と同様に、平均滞留時間を上げることで粒子径が増大する傾向が観察された。また、薬物封入率は滞留時間の延長とともに低下し、最適な滞留時間があることが示唆された。
【００９４】
実施例2．MSMPRによるリゾチーム封入PLGAナノ粒子の調製
＜リゾチームとオレイン酸ナトリウム複合体の調製＞
20 mgのリゾチームを10 mM Tris buffer（pH10） 10 mLに溶かした溶液に、2.61 mgのオレイン酸ナトリウムを10 mM Tris buffer（pH10） 1 mLに溶かした溶液を加え、400 rpm で撹拌しながら6時間放置し、リゾチームとオレイン酸ナトリウムの複合体を調製した。複合体懸濁液を4℃、36670 g、10分の条件で遠心分離を行った。上清を取り除き、ペレットはTris bufferを適量加えて再分散させた後、懸濁液を凍結乾燥し、粉末化した。
【００９５】
＜リゾチーム封入PLGAナノ粒子の調製＞
PLGA 7520（和光純薬）とリゾチーム・オレイン酸ナトリウム複合体をDMSOに溶解し、PLGA薬物溶液（液1）（PLGA7520: 18 g/L, リゾチーム・オレイン酸ナトリウム複合体：2 g/L）を調製した。またアンチソルベント（液2）として、0.5%から4.0%（w/v）のPluronic F-127水溶液を用いた。Pluronic F-127はPLGAナノ粒子の分散安定化剤ポリマーとして使用した。50 mLのアンチソルベント（液2）が入ったリアクター（400 rpmで攪拌）へPLGA薬物溶液（液1）を一定速度で投入し、PLGA薬物溶液（液1）の投入量が2.5 mLになった時点で、新しいアンチソルベント（液2）を一定速度でリアクターに投入し且つリアクター内のPLGAナノ粒子懸濁液を一定速度で排出した。試験条件を表２に示す。
【００９６】
【表２】
2019167300.tif 000003
【００９７】
Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK)を用いて、PLGAナノ粒子懸濁液中の粒子の粒子径及びゼータ電位を測定した。さらに、PLGAナノ粒子中のリゾチームの封入率（＝（リポソーム中のリゾチーム量／リポソーム調製に使用したリゾチーム量）×100）をHPLCにより測定した。
【００９８】
リアクター温度が室温であり、Pluronic F-127濃度が1w/v%であり、且つ粒子調製開始から180分経過時のPLGAナノ粒子懸濁液を調べた場合の、平均滞留時間別の粒子物性を図７〜９に示す。
【００９９】
平均滞留時間が10分のPLGAナノ粒子の場合、粒子径は約90 nmで封入率は約20%であった。また表面電荷の指標であるゼータ電位は−16mVを示した。PLGAはカルボキシル基を有し中性では負電荷をもつため、PLGAナノ粒子のゼータ電位は負の値を示す。平均滞留時間を30分以上にすることで、粒子径と封入率は滞留時間が10分の時と比較し、大きくなった。ゼータ電位は中性付近にシフトしたことから、平均滞留時間を30分以上とすることで、正電荷を持つリゾチームがPLGAナノ粒子内部だけでなく、PLGAナノ粒子表面にも多く存在することが示唆された。
【０１００】
平均滞留時間が10分であり、Pluronic F-127濃度が1w/v%であり、且つ粒子調製開始から180分経過時のPLGAナノ粒子懸濁液を調べた場合の、リアクター温度別の粒子物性を図１０〜１２に示す。温度を60℃まで上げることで、封入率が100%近くまで大幅に向上した。温度を60℃にすることで、粒子径とゼータ電位が増大したことから、リゾチームの粒子内部への封入向上と同時に、一部のリゾチームが粒子表面に吸着していることが考えられる。リアクター温度を制御することで粒子物性をコントロールできることが示唆された。
【０１０１】
リアクター温度が室温であり、平均滞留時間が10分であり、且つ粒子調製開始から180分経過時のPLGAナノ粒子懸濁液を調べた場合の、Pluronic F-127濃度別の粒子物性を図１３〜１５に示す。Pluronic F-127の濃度を4%まで上げることで、封入率が向上し、それに伴い粒子径とゼータ電位が向上した。ゼータ電位が負電荷からニュートラル方向にシフトしたことから、非イオン性界面活性剤であるPluronic F-127もしくはリゾチームの粒子表面への吸着が考えられた。
【０１０２】
実施例3．MSMPRによるキトサン修飾PLGAナノ粒子の調製
PLGA7520をアセトンとエタノールの混液（5/3）に25 g/Lの濃度で溶解しPLGA溶液（液1）を調製した。アンチソルベント（液2）として、100 mM酢酸緩衝液 (pH 4.4)又は100 mM酢酸緩衝液 (pH 4.4)に0.1% w/vになるようにキトサン（Sigma）を溶解してなる溶液と、2% w/vポリビニルアルコール（PVA）水溶液を等量混合したものを用いた。50 mLのアンチソルベント（液2）が入ったリアクター（400 rpmで攪拌）へPLGA溶液（液1）を一定速度（0.1 mL/min）で投入し、PLGA溶液（液1）の滴下量が4 mLになった時点で、新しいアンチソルベント（液2）を一定速度（1.0 mL/min）でリアクターに投入し且つリアクター内のPLGAナノ粒子懸濁液を一定速度で排出した。平均滞留時間が10分となるように投入速度及び排出速度を制御した。リアクター温度は40℃に設定した。
【０１０３】
Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK)を用いて、PLGAナノ粒子懸濁液中の粒子の粒子径及びゼータ電位を測定した。
【０１０４】
経時的な粒子物性変化を図１６〜１７に示す。キトサン修飾を行うことで粒子径は増大した。粒子表面にキトサンのポリマー層ができたためと考えられた。また、ゼータ電位は未修飾の負の値からキトサン修飾により正の値にシフトした。これらの結果より、カチオン性ポリマーのキトサンで粒子表面を修飾できることが確認でき、安定した連続製造が可能であることが実証された。
【０１０５】
実施例4．MSMPRによるプロブコールナノ結晶の調製方法
プロブコールをエタノールに溶解し、10 g/Lの薬物溶液（液1）とした。アンチソルベント（液2）として2 w/v%のPVA水溶液を用いた。30 mLのアンチソルベント（液2）が入ったリアクター（500 rpmで攪拌）へ薬物溶液（液1）を一定速度（0.1 mL/min）で投入し、薬物溶液の投入量が3 mLになった時点で、新しいアンチソルベント（液2）を一定速度（1.0 mL/min）でリアクターに投入し且つリアクター内のナノ粒子懸濁液を一定速度で排出した。平均滞留時間が30分となるように投入速度及び排出速度を制御した。リアクター温度は室温とした。
【０１０６】
Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK)を用いて、ナノ粒子懸濁液中の粒子の粒子径を測定した。また、粒子の透過型電子顕微鏡（TEM）で観察し、観察像を取得した。
【０１０７】
経時的な粒子径変化を図１８に示す。難水溶性薬物プロブコールナノ結晶を連続調製できることが示された。
【図１】
2019167300.tif 000004
【図２】
2019167300.tif 000005
【図３】
2019167300.tif 000006
【図４】
2019167300.tif 000007
【図５】
2019167300.tif 000008
【図６】
2019167300.tif 000009
【図７】
2019167300.tif 000010
【図８】
2019167300.tif 000011
【図９】
2019167300.tif 000012
【図１０】
2019167300.tif 000013
【図１１】
2019167300.tif 000014
【図１２】
2019167300.tif 000015
【図１３】
2019167300.tif 000016
【図１４】
2019167300.tif 000017
【図１５】
2019167300.tif 000018
【図１６】
2019167300.tif 000019
【図１７】
2019167300.tif 000020
【図１８】
2019167300.tif 000021