(57)【要約】【課題】本発明の目的は、日常的に摂取することができ、副作用の心配がなく、優れた効果が期待できる免疫賦活用組成物を提供することである。【解決手段】前記課題は、本発明のエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを含むことを特徴とする免疫賦活組成物によって解決することができる。本発明によれば、生体の免疫作用を賦活化することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを含むことを特徴とする免疫賦活組成物。
【請求項２】
前記免疫賦活活性が、抗体産生促進活性、サイトカイン産生促進活性、及びマクロファージ活性化からなる群から選択される少なくとも１つの免疫賦活活性である、請求項１に記載の免疫賦活組成物。
【請求項３】
前記エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼが植物由来である、請求項１又は２に記載の免疫賦活組成物。
【請求項４】
エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを含むことを特徴とする免疫賦活用食品組成物。
【請求項５】
前記免疫賦活活性が、抗体産生促進活性、サイトカイン産生促進活性、及びマクロファージ活性化からなる群から選択される少なくとも１つの免疫賦活活性である、請求項４に記載の免疫賦活用食品組成物。
【請求項６】
前記エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼが植物由来である、請求項４又は５に記載の免疫賦活用食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫賦活組成物及び免疫賦活用食品組成物に関し、具体的にはエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを含む免疫賦活組成物及び免疫賦活用食品組成物に関する。本発明によれば、生体の免疫作用を賦活化することができる。
【背景技術】
【０００２】
免疫賦活用組成物は、医療分野において各種疾患の治療にも使用されている。例えば、癌治療においては、化学療法や放射線治療に免疫増強剤を併用することにより治療効果の向上が認められている。
【０００３】
一方、免疫賦活用組成物の投与により生体の免疫機能を向上させ、微生物又はウイルスによる感染症を予防したり、癌細胞を排除する予防医学も注目されている。この予防医学に用いられる免疫賦活用組成物は、日常的に摂取されるものである。従って、日常的に、安全に、そして簡便に摂取することができ、副作用の心配がなく、優れた効果が期待できる免疫賦活用組成物が望まれている。
例えば、特許文献１には、乳酸菌と共にＤ−マンノース、アラビノキシランなどの多糖類を共存させた免疫賦活剤が記載されている。また特許文献２には、トウモロコシ外皮から得られたヘミセルロースの部分分解物を有効成分とする免疫賦活剤が記載されている。しかしながら、更に安全で簡便に日常的に継続して摂取することができ、かつ顕著な免疫賦活作用を有する免疫賦活組成物が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−８６１６号公報
【特許文献２】特開２００１−３２２９４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、日常的に摂取することができ、副作用の心配がなく、優れた効果が期待できる免疫賦活用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、日常的に摂取することができ、副作用に心配がなく、優れた効果が期待できる免疫賦活用組成物について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼが優れた免疫賦活作用を有することを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを含むことを特徴とする免疫賦活組成物、
［２］前記免疫賦活活性が、抗体産生促進活性、サイトカイン産生促進活性、及びマクロファージ活性化からなる群から選択される少なくとも１つの免疫賦活活性である、［１］に記載の免疫賦活組成物、
［３］前記エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼが植物由来である、［１］又は［２］に記載の免疫賦活組成物、
［４］エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを含むことを特徴とする免疫賦活用食品組成物、
［５］前記免疫賦活活性が、抗体産生促進活性、サイトカイン産生促進活性、及びマクロファージ活性化からなる群から選択される少なくとも１つの免疫賦活活性である、［４］に記載の免疫賦活用食品組成物、及び
［６］前記エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼが植物由来である、［４］又は［５］に記載の免疫賦活用食品組成物、
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の免疫賦活用組成物及び免疫賦活用食品組成物によれば、免疫作用を賦活化することができる。また、本発明の免疫賦活用組成物及び免疫賦活用食品組成物は、抗体産生の促進、サイトカイン産生の促進、及びマクロファージの活性化を行うことができる。本発明の免疫賦活用食品組成物は、安全性の高い飲食品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＲＡＷ２６４．７細胞にエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを添加して、培養上清中のＩＬ−６およびＴＮＦ−α産生量を測定したグラフである。
【図２】エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼのＲＡＷ２６４．７細胞に対する細胞毒性を測定したグラフである。
【図３】エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを含むクミン水性溶媒抽出物がＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生を促進することを示したグラフである。
【図４】エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを含むクミン水性溶媒抽出物がＲＡＷ２６４．７細胞のＩＬ−６、及びＴＮＦ−αの産生を促進することを示したグラフである。
【図５】エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを含むクミン水性溶媒抽出物が初代マウス腹腔内マクロファージ（Ｐ−Ｍａｃ）のＩＬ−６、及びＴＮＦ−αの産生を促進することを示したグラフである。
【図６】エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを含むクミン水性溶媒抽出物がＲＡＷ２６４．７細胞の一酸化窒素（ＮＯ）産生を促進することを示したグラフである。
【図７】エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを含むクミン水性溶媒抽出物がＲＡＷ２６４．７細胞の貪食活性を促進することを示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［１］免疫賦活組成物
本発明の免疫賦活組成物は、エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを含む。
【００１０】
《エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ》
エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼは、加水分解される結合が、還元末端にあるグルコース残基のＣ−３位が置換されている場合、β−Ｄ−グルカンの（１→３）−結合をエンド型に加水分解する酵素である。
本発明の組成物に含まれるエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼは、前記エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ活性を有する限りにおいて、特に限定されるものではない。例えば、大麦のエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼは、ＧＩ、ＧII、及びＧIIIの３つのアイソザイムを含むが、これらの３つのアイソザイムを、本発明の免疫賦活組成物の有効成分として用いることができる。
エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼの１つの実施態様として、配列番号１、２、３、４、又は５で表されるアミノ酸配列からなるエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを挙げることができる。
また、別のエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼの実施態様として、配列番号１、２、３、４、又は５で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列からなり、且つエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ活性を有するエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを挙げることができる。
更に、別のエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼの実施態様として、配列番号１、２、３、４、又は５で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失、若しくはその一方または両末端への付加されたアミノ酸配列を含み、且つエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ活性を有するエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを挙げることができる。
本発明の組成物の有効成分であるエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼは、天然のエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼでもよいが、遺伝子工学的に製造された組換えエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを使用することもできる。
【００１１】
エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼの由来も特に限定されるものではない。例えば、動物由来又は植物由来のエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを用いることができるが植物由来のエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼが好ましい。動物由来のエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼとしては、キタノニシキガイ（配列番号５）などの貝類由来のエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼが挙げられる。エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼが得られる植物は、特に限定されるものではないが、大麦（配列番号１〜３）、コムギ、エンバク、ライムギ、ハトムギなどの穀物、ジャガイモ（配列番号４）等のイモ類、クミン、コンブなどの海藻、キノコ、又は地衣類などの植物を挙げられるが、大麦又はクミン由来のエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼが好ましい。
【００１２】
《免疫賦活》
本発明の免疫賦活組成物が有する免疫賦活活性としては、例えば抗体産生促進活性、サイトカイン分泌促進活性、及びマクロファージの活性化が挙げられる。本発明の免疫賦活組成物は、前記のすべての免疫賦活活性を示してもよく、前記のいずれか１つの免疫賦活活性を示してもよい。
【００１３】
（抗体産生促進）
抗体は、抗体産生細胞から産生される。本発明の免疫賦活組成物は、抗体産生細胞からの抗体の産生を促進する。抗体産生細胞は、好ましくは哺乳動物（ヒトなどの霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、又はマウス）の細胞であり、最も好ましくはヒトの細胞である。また、抗体産生細胞は、インビボ又はインビトロの細胞であることができる。産生が促進される抗体は、好ましくは、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及び／又はＩｇＧ抗体であり、最も好ましくは、ＩｇＭ抗体である。
【００１４】
（サイトカイン産生促進）
分泌が促進されるサイトカインとしては、例えばインターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、リンフォカイン、造血因子、細胞増殖因子、細胞傷害因子、アディポカイン、及び神経栄養因子などが挙げられる。インターロイキンとしては、ＩＬ１〜３５などが挙げられる。インターフェロンとしては、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、及びＩＦＮ−γなどが挙げられる。ケモカインとしては、ＭＩＰ及びＭＣＰなどが挙げられる。造血因子としては、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、及びトロンボポエチンなどが挙げられる。細胞増殖因子としては、上皮成長因子、繊維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、肝細胞成長因子、及びトランスフォーミング成長因子などが挙げられる。細胞傷害因子としては、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βなどが挙げられる。アディポカインとしては、レプチンなどが挙げられる。神経栄養因子としては、ＮＧＦなどが挙げられる。好ましいサイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α及び／又はＩＦＮ−γである。分泌が促進されるサイトカインは、これらの１種であってもよく、又は２種以上であってもよい。
【００１５】
（マクロファージ活性化）
本発明の免疫賦活組成物が奏する具体的なマクロファージ活性化の作用としては、例えば貪食活性促進、活性酸素産生促進、一酸化窒素産生促進、及び抗原提示機能の増強から選択される１つ又は２つ以上が挙げられる。
【００１６】
マクロファージの貪食作用とは、マクロファージが、細菌、ウイルス、又は死細胞等の異物を取り込み、これらを分解する機能であり、食作用又はファゴサイトーシスとも呼ばれる。本発明の免疫賦活組成物は、このマクロファージの貪食作用を促進することができる。
【００１７】
マクロファージは、微生物、ウイルス、及び癌細胞などの異物に対して強い毒性を示す、活性酸素、例えばスーパーオキサイド若しくは過酸化水素、又は一酸化窒素を産生することにより、これらの異物を殺傷又は排除する。本発明の免疫賦活組成物は、このマクロファージの活性酸素産生促進作用及び／又は一酸化窒素産生促進作用を促進することができる。
【００１８】
抗原提示とは、抗原提示細胞が細菌などの抗原を細胞内へ取り込んで分解を行った後に、細胞表面へその一部を提示する機構である。マクロファージは、貪食作用により取り込みそして分解した細菌などをいくつかの断片にして、マクロファージ内に存在するＭＨＣクラスＩＩ分子と結合させ、細胞表面に提示する。本発明の免疫賦活組成物は、このマクロファージの抗原提示機能を促進することができる。
【００１９】
本発明の免疫賦活組成物の投与剤型としては、特には限定がなく、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は非経口剤を挙げることができる。
【００２０】
前記経口剤は、例えばゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
【００２１】
非経口剤としては、例えば注射剤を挙げることができる。注射剤の調製においては、有効成分の他に、例えば生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
【００２２】
本発明の免疫賦活組成物は、限定されるものではないが、エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを、例えば０．０１〜５００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、０．１〜４００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．５〜３００ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１〜２００ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは２〜１５０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは１〜１００ｍｇ／ｍＬで含有することができる。
【００２３】
本発明の免疫賦活組成物の投与量は、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができるが、例えばエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを、０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは０．５〜５００ｍｇ／ｋｇ体重／日、より好ましくは１〜２５０ｍｇ／ｋｇ体重／日、さらに好ましくは３〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、さらに好ましくは５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重／日、又は最も好ましくは８〜３０ｍｇ／ｋｇ体重／日であることができる。
【００２４】
もちろん、上記の投与法は一例であり、他の投与法であってもよい。ヒトへの免疫賦活組成物の投与方法、投与量、投与期間、及び投与間隔等は、管理された臨床治験によって決定されることが望ましい。
【００２５】
本発明の免疫賦活組成物は、ヒトに対して投与することができるが、投与対象はヒト以外の動物であってもよく、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、及びリス等のペット；牛及び豚等の家畜；マウス、ラット等の実験動物；並びに、動物園等で飼育されている動物等が挙げられる。
【００２６】
本発明の免疫賦活組成物は、免疫賦活用医薬組成物であることができる。本発明の免疫賦活用医薬組成物の対象疾患としては、癌、免疫不全症、又は感染症を挙げられる。
【００２７】
癌としては、舌癌、歯肉癌、悪性リンパ腫、悪性黒色腫、上顎癌、鼻癌、鼻腔癌、喉頭癌、咽頭癌、神経膠腫、髄膜腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、甲状乳頭腺癌、甲状腺濾胞癌、甲状腺髄様癌、原発性肺癌、扁平上皮癌、腺癌、肺胞上皮癌、大細胞性未分化癌、小細胞性未分化癌、カルチノイド、睾丸腫瘍、前立腺癌、乳癌、乳房ペーシジェット病、乳房肉腫、骨腫瘍、甲状腺癌、胃癌、肝癌、急性骨髄性白血病、急性前髄性白血病、急性骨髄性単球白血病、急性単球性白血病、急性リンパ性白血病、急性未分化性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人型Ｔ細胞白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、原発性マクログロブリン血症、小児性白血病、食道癌、胃癌、胃・大腸平滑筋肉腫、胃・腸悪性リンパ腫、膵・胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、原発性肝癌、肝芽腫、子宮上皮内癌、子宮頸部扁平上皮癌、子宮腺癌、子宮腺扁平上皮癌、子宮体部腺類癌、子宮肉腫、子宮癌肉腫、子宮破壊性奇胎、子宮悪性絨毛上皮腫、子宮悪性黒色腫、卵巣癌、中胚葉性混合腫瘍、腎癌、腎盂移行上皮癌、尿管移行上皮癌、膀胱乳頭癌、膀胱移行上皮癌、尿道扁平上皮癌、尿道腺癌、ウィルムス腫瘍、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、滑液膜肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、ユーイング肉腫、皮膚扁平上皮癌、皮膚基底細胞癌、皮膚ボーエン病、皮膚ページェット病、皮膚悪性黒色腫、悪性中皮癌、転移性腺癌、転移性扁平上皮癌、転移性肉腫および中皮腫が挙げられる。
【００２８】
免疫不全症としては、例えば、癌、再生不良性貧血、白血病、骨髄線維症、腎不全、糖尿病、肝疾患もしくは脾疾患に伴う免疫不全、ヒト免疫不全ウイルス感染症による後天性免疫不全症候群、及原発性免疫不全症候群が挙げられる。
【００２９】
感染症としては、ヒト肝炎ウイルス、ヒトレトロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒトＴリンパ向性ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型もしくは２型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、日本脳炎ウイルス、おたふくウイルス、インフルエンザウイルス、風邪ウイルス、重症急性呼吸器症候群を発症するウイルス、エボラウイルス、又は西ナイルウイルスによるウイルス感染症が挙げられる。また、感染症として、病原性原生動物、細菌、又は真菌による感染症が挙げられる。
【００３０】
［２］免疫賦活用食品組成物
本発明の免疫賦活用食品組成物は、エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを含む。
本明細書における免疫賦活用食品組成物とは、エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼと、食品又は飲料とを含むものを意味する。エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼとしては、前記「［１］免疫賦活組成物」に記載のエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを限定することなく、使用することができる。
【００３１】
食品としては、具体的には、サラダなどの生鮮調理品；ステーキ、ピザ、ハンバーグなどの加熱調理品；野菜炒めなどの炒め調理品；トマト、ピーマン、セロリ、ニガウリ、ニンジン、ジャガイモ、及びアスパラガスなどの野菜及びこれら野菜を加工した調理品；クッキー、パン、ビスケット、乾パン、ケーキ、煎餅、羊羹、プリン、ゼリー、アイスクリーム類、チューインガム、クラッカー、チップス、チョコレート及び飴等の菓子類；うどん、パスタ、及びそば等の麺類；かまぼこ、ハム、及び魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品；チーズ、クリーム、及びバターなどの乳製品；みそ、しょう油、ドレッシング、ケチャップ、マヨネーズ、スープの素、麺つゆ、カレー粉、みりん、ルウ、シーズニングスパイス等の調味料類；豆腐などの大豆食品；こんにゃく；並びにサプリメントなどを挙げることができる。食品は、好ましくは、ルウ（例えばカレー用若しくはシチュー用のもの）、シーズニングスパイス、又はサプリメントが挙げられる。
【００３２】
飲料としては、例えばコーヒー飲料；ココア飲料；前記の野菜から得られる野菜ジュース；グレープフルーツジュース、オレンジジュース、ブドウジュース、及びレモンジュース等の果汁飲料；緑茶、紅茶、煎茶、及びウーロン茶等の茶飲料；ビール、ワイン（赤ワイン、白ワイン、又はスパークリングワインなど）、清酒、梅酒、発泡酒、ウィスキー、ブランデー、焼酎、ラム、ジン、及びリキュール類等のアルコール飲料；乳飲料；豆乳飲料；流動食；並びにスポーツ飲料などを挙げることができる。飲料は、好ましくは、スパイスティー（例えばハーブティー又はチャイ）が挙げられる。
【００３３】
本明細書における食品又は飲料には、動物に対する飼料が含まれる。対象となる動物は、例えばヒトなどの霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、又はマウス等が挙げられる。
【００３４】
これらの食品又は飲料には、所望により、酸化防止剤、香料、酸味料、着色料、乳化剤、保存料、調味料、甘味料、香辛料、ｐＨ調整剤、安定剤、酸化防止剤、植物油、動物油、糖及び糖アルコール類、ビタミン、有機酸、果汁エキス類、野菜エキス類、穀類、豆類、野菜類、肉類、魚介類等の食品添加物及び食品素材を単独で又は２種以上組み合わせて配合することができる。これらの食品素材及び食品添加物の配合量は、本発明の目的を損なわない範囲内で適宜決定することができる。
【００３５】
これらの食品又は飲料は、例えばレトルト及びオートクレーブなどの加熱加圧滅菌、バッチ式殺菌、プレート殺菌、通電加熱殺菌、マイクロ波加熱殺菌、並びに、インジェクション及びインフュージョンなどのスチーム殺菌などの一般的な殺菌処理を行うことができる。
【００３６】
食品及び飲料には、機能性食品（飲料）及び健康食品（飲料）が含まれる。本明細書において「健康食品（飲料）」とは、健康に何らかの効果を与えるか、あるいは、効果を期待することができる食品又は飲料を意味し、「機能性食品（飲料）」とは、前記「健康食品（飲料）」の中でも、生体調節機能（すなわち、免疫賦活機能）を充分に発現することができるように設計及び加工された食品又は飲料を意味する。機能性食品及び健康食品は、顆粒状、固形状、液状、カプセル状、ゲル状、又は錠剤状であることができる。
【００３７】
クミン抽出物は、本発明の免疫賦活組成物及び免疫賦活用食品組成物の有効成分であるエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを含む。このエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを含むクミン抽出物をマウスに経口投与することによって、マウス生体内でＩｇＭなどの抗体の産生が促進される。また、ＩＬ−４又はＩＬ−６などのサイトカインの産生が促進される。本発明の免疫賦活組成物及び免疫賦活用食品組成物は、経口投与によって、免疫賦活活性を示すことができる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３９】
《実施例１》
本実施例では、エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼの免疫賦活活性を解析した。
（エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ溶液の調製）
大麦由来のエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社）を滅菌水で２ｍｇ／ｍＬに希釈し、０．４５μｍの滅菌フィルターでろ過滅菌した。また、コントロールとして、エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼの溶解液（０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム−５０％（ｖ／ｖ）グリセロール水溶液）を調製し、０．４５μｍフィルターでろ過滅菌したものを用いた。
【００４０】
（サイトカイン産生）
マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞（３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を、９６穴プレートに２００μＬ／ｗｅｌｌで播種し、１２時間の前培養を行った。前培養後、培地を除去し、コントロール、及び各濃度のエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを添加した１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで培養した。１２時間培養後、培養上清を回収し、培養上清中のＩＬ−６およびＴＮＦ−α産生量を酵素抗体法（Ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ  ＭＡＸ  Ｓｔａｎｄａｒｄ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製；Ｍｏｕｓｅ  ＴＮＦ−α  ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｙ−ｓｅｔ−ｇｏ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）により定量した。結果を図１に示す。
【００４１】
図１に示すように、エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼの添加により、低濃度領域において、ＩＬ−６およびＴＮＦ−α産生が促進した。一方、ＩＬ−６においては、４０μｇ／ｍＬ以上、ＴＮＦ−αにおいては、２００μｇ／ｍＬ以上の添加濃度において、産生促進効果の低下が認められた。
【００４２】
エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼのＲＡＷ２６４．７細胞に対する毒性を評価した。種々の濃度のエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼで培養した後、ＷＳＴ−８法により生存率を評価した。その結果、図２に示したように１０００μｇ／ｍＬにおいて、有意な生存率の低下が認められたことから、高濃度域におけるＩＬ−６及びＴＮＦ−α産生促進効果の低下は、細胞毒性によるものと推察された。
【００４３】
《調製例１》
本調整例では、クミンの種子から、クミン水溶性抽出物を調製し、エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼの含有を解析した。
クミン種子粉末を０．１ｇ／ｍＬとなるように１０ｍＭ  ＮａＰＢ（リン酸緩衝液）で懸濁し、１５回／分で２４時間撹拌抽出した。４℃条件下で、遠心処理（１，２０００ｒｐｍ）を２０分間行った後、上清を回収した。４℃条件下で、遠心処理（７０，０００ｒｐｍ）を３０分間行った後、上清を回収した。分画分子量１４ｋＤの透析膜を用いて１０ｍＭ  ＮａＰＢに対して一晩透析処理した。１Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを７．４に合わせ、ポアサイズ０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌したものをクミン水性溶媒抽出物（ＣＣＥ）とした。
【００４４】
得られたクミン水性溶媒抽出物を、ＭＳ／ＭＳにより解析した。試料を脱塩し、アセトニトリル／トリフルオロ酢酸に溶出した。溶出した試料を自然乾燥させ、質量分析計によって解析した。得られたマススペクトルのピークの質量値からデータベース検索を行ったところ、クミン水性溶媒抽出物はエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを含んでいた。
【００４５】
《実施例２》
本実施例では、ヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞に対するエンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを含むクミン水性溶媒抽出物の抗体産生効果を検討した。
クミン水性溶媒抽出物を、ＩＴＥＳ−ＥＲＤＦ培地にいくつかの濃度で添加した。ヒトハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞を５．０×１０４細胞／ｍＬで播種し、６時間培養後、培養上清を回収した。抗ヒトＩｇＭ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＭ抗体（Ａｂｃａｍ社製）、及び発色基質であるＡＢＴＳ（和光純薬社製）を用いて、ＥＬＩＳＡ法により培養液中のＩｇＭ抗体量を測定した。コントロールには１０ｍＭ  ＮａＰＢ（リン酸緩衝液）を用いた。結果を図３に示す。ＨＢ４Ｃ５細胞の抗体産生において、コントロールに対し、エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを含むクミン水性溶媒抽出物はＩｇＭ産生促進効果を示し、その効果は最も高いところで２．２倍程度であった。
【００４６】
《実施例３》
本実施例では、マウスマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞に対するクミン水性溶媒抽出物のサイトカインの産生効果を検討した。
希釈したクミン水性溶媒抽出物を添加した１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地で、マウス由来マクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞（３×１０５細胞／ｍＬ）を１２時間培養した後、ＥＬＩＳＡ法（Ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ  ＭＡＸ  Ｓｔａｎｄａｒｄ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製；Ｍｏｕｓｅ  ＴＮＦ−α  ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｙ−ｓｅｔ−ｇｏ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて培養液中のＩＬ−６、及びＴＮＦ−αの量を測定した。コントロールには１０ｍＭ  ＮａＰＢを用いた。結果を図４に示す。エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを含むクミン水性溶媒抽出物は、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αの産生促進効果を示した。
【００４７】
《実施例４》
本実施例では、初代マウス腹腔内マクロファージ（Ｐ−Ｍａｃ）に対するクミン水性溶媒抽出物のサイトカイン産生効果を検討した。
ＢＡＬＢ／ｃマウス腹腔からマクロファージ（Ｐ−Ｍａｃ）を回収し、希釈したクミン水性溶媒抽出物を添加した１０％  ＦＢＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地でＰ−Ｍａｃ（３×１０６細胞／ｍＬ）を１２時間培養した後、ＥＬＩＳＡ法を用いて、培養液中のＩＬ−６、及びＴＮＦ−α量を測定した。ＥＬＩＳＡ法には、実施例３と同じキットを使用した。コントロールには１０ｍＭ  ＮａＰＢを用いた。結果を図５に示す。エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを含むクミン水溶性抽出物は、濃度依存的にＩＬ−６及びＴＮＦ−αの産生を促進させることが分かった。最も産生が多い濃度においては、コントロールと比較して、ＩＬ−６産生は約７５倍、ＴＮＦ−α産生は約６倍の産生促進効果が認められた。
【００４８】
《実施例５》
本実施例では、マウスマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞に対するクミン水性溶媒抽出物の一酸化窒素（ＮＯ）産生効果を検討した。一酸化窒素（ＮＯ）は活性酸素の一種であり、マクロファージはバクテリアを処理するために一酸化窒素を産生する。本実施例では、ＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ産生に及ぼすクミン水性溶媒抽出物の効果を検討した。
希釈したクミン水性溶媒抽出物を添加した１０％  ＦＢＳ−ＤＭＥＭでＲＡＷ２６４．７細胞（３×１０５細胞／ｍＬ）を１２時間培養した後、その培養液中のＮＯ濃度をＧｒｉｅｓｓ法により測定した。コントロールには１０ｍＭ  ＮａＰＢを用いた。結果を図６に示す。エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを含むクミン水性溶媒抽出物は、ＲＡＷ２６４．７細胞において、一酸化窒素の産生を促進することが分かった。
【００４９】
《実施例６》
本実施例では、マウスマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞の貪食活性に対するクミン水性溶媒抽出物の効果を検討した。
総タンパク質濃度１０００μｇ／ｍＬとなるようにクミン水性溶媒抽出物を添加した１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地でＲＡＷ２６４．７細胞（３×１０５細胞／ｍＬ）を６時間培養した後、テキサスレッドで標識したザイモサンＡを添加し、１時間培養した後、フローサイトメーターを用いてその貪食活性を測定した。コントロールには１０ｍＭ  ＮａＰＢを用いた。結果を図７に示す。エンド−１，３−β−Ｄ−グルカナーゼを含むクミン水性溶媒抽出物はＲＡＷ２６４．７細胞の貪食活性を有意に促進することが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の免疫賦活組成物及び免疫賦活用食品組成物は、免疫作用を賦活化することができる。さらに、本発明の免疫賦活用食品組成物は、免疫賦活作用を有し、かつ安全性の高い飲食品を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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