(57)【要約】【課題】本発明は、肝実質細胞を高精度で検出することができる肝実質細胞の検出方法や、肝実質細胞を高純度、かつ、高収率で精製することができる肝実質細胞の選択方法や、肝実質細胞を高純度、かつ、高収率で精製することができる肝実質細胞の製造方法等を提供することを目的とする。【解決手段】肝実質細胞含有細胞混合物から、（ａ）細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位、並びに、（ｂ）細胞が、心筋細胞から肝実質細胞を区別し得る所定のマーカータンパク質群から選択される１種又は２種以上のマーカータンパク質に陽性であること、を指標として肝実質細胞を検出することができる。また、検出した肝実質細胞を選択することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝実質細胞含有細胞混合物において、（ａ）細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位、並びに、（ｂ）細胞が、心筋細胞から肝実質細胞を区別し得る以下のマーカータンパク質群から選択される１種又は２種以上のマーカータンパク質に陽性であること、を指標として肝実質細胞を検出する方法。
（マーカータンパク質群）
ＣＤ１６６、ＥＰＣＡＭ、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＧ２、ＣＤＨＲ３、ＡＤＡＭＴＳ１８、ＡＭＩＣＡ１、ＡＮＰＥＰ、ＡＲＴ１、ＡＳＧＲ１、ＢＤＫＲＢ２、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＢＳＴ１、Ｃ５ＡＲ１、ＣＡＤＭ２、ＣＣＲ７、ＣＤ１６３、ＣＤ２、ＣＤ２２６、ＣＤ２４Ｌ４、ＣＤ３０２、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ６８、ＣＤ７４、ＣＤ８Ｂ、ＣＤ９、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤＣＰ１、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１２、ＣＤＨ１６、ＣＤＨ１７、ＣＤＨ３、ＣＤＲ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＥＡＣＡＭ２０、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＴＮＮＤ１、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ７、ＤＰＰ４、ＤＳＧ１、ＤＳＰ、ＥＭＣＮ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ１、ＥＲＢＢ３、Ｆ１１Ｒ、Ｆ２ＲＬ１、ＦＣＧＲＴ、ＦＬＶＣＲ１、ＧＡＢＲＰ、ＧＣＧＲ、ＧＰＲ１０９Ａ、ＧＰＲ１１５、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲ１２８、ＧＰＲ１６０、ＧＰＲ３７Ｌ１、ＧＰＲ５６、ＧＰＲ８７、ＧＰＲＣ５Ａ、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＧＰＲＣ５Ｃ、ＧＲＩＡ４、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＩＣＡＭ１、ＩＣＯＳ、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ４Ｒ、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ８、ＩＴＬＮ１、ＩＴＰＲ３、ＪＡＧ１、ＫＥＬ、ＬＧＡＬＳ３、ＬＧＡＬＳ４、ＬＰＡＲ１、ＭＭＤ、ＮＲＣＡＭ、ＮＴ５Ｅ、Ｐ２ＲＸ４、Ｐ２ＲＹ５、ＰＡＲＤ３、ＰＣＤＨ１１Ｙ、ＰＣＤＨ１２、ＰＣＤＨＡ１１、ＰＣＤＨＡＣ１、ＰＣＤＨＢ１１、ＰＬＡＵＲ、ＰＰＬ、ＰＴＰＲＦ、ＰＶＲ、ＳＣＡＲＢ１、ＳＤＣ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＬＣ１Ａ５、ＳＰＡＧ９、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＸ１Ａ、ＴＥＫ、ＴＥＸ１０１、ＴＬＲ２、ＴＭ４ＳＦ１、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＲＯ、ＴＲＰＶ６、ＴＸＮ；
【請求項２】
ミトコンドリア標識試薬を用いて肝実質細胞含有細胞混合物を標識し、及び、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位を測定する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標識された抗前記マーカータンパク質抗体で肝実質細胞含有細胞混合物を標識し、及び、細胞が前記マーカータンパク質に陽性であるか否かを決定する工程を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
肝実質細胞を検出することにより、肝実質細胞含有細胞混合物中における非肝実質細胞に対する肝実質細胞の比率を計測する工程をさらに含む請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の肝実質細胞を検出する方法により検出した肝実質細胞を選択する工程を含む、肝実質細胞を選択する方法。
【請求項６】
肝実質細胞含有細胞混合物が、肝臓組織由来の肝実質細胞を含有する細胞混合物、又は、肝実質細胞へ分化可能な細胞に由来する肝実質細胞を含有する細胞混合物である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ミトコンドリア標識試薬が、A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669及びT3168からなる群から選択される請求項２〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
（Ａ）肝実質細胞へ分化可能な細胞から、肝実質細胞を分化誘導し、肝実質細胞含有細胞混合物を調製する工程；及び、
（Ｂ）肝実質細胞含有細胞混合物から、（ａ）細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位、並びに、（ｂ）細胞が、心筋細胞から肝実質細胞を区別し得る以下のマーカータンパク質群から選択される１種又は２種以上のマーカータンパク質に陽性であること、を指標として肝実質細胞を検出し及び選択する工程；
を含む、肝実質細胞を製造する方法。
（マーカータンパク質群）
ＣＤ１６６、ＥＰＣＡＭ、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＧ２、ＣＤＨＲ３、ＡＤＡＭＴＳ１８、ＡＭＩＣＡ１、ＡＮＰＥＰ、ＡＲＴ１、ＡＳＧＲ１、ＢＤＫＲＢ２、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＢＳＴ１、Ｃ５ＡＲ１、ＣＡＤＭ２、ＣＣＲ７、ＣＤ１６３、ＣＤ２、ＣＤ２２６、ＣＤ２４Ｌ４、ＣＤ３０２、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ６８、ＣＤ７４、ＣＤ８Ｂ、ＣＤ９、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤＣＰ１、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１２、ＣＤＨ１６、ＣＤＨ１７、ＣＤＨ３、ＣＤＲ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＥＡＣＡＭ２０、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＴＮＮＤ１、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ７、ＤＰＰ４、ＤＳＧ１、ＤＳＰ、ＥＭＣＮ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ１、ＥＲＢＢ３、Ｆ１１Ｒ、Ｆ２ＲＬ１、ＦＣＧＲＴ、ＦＬＶＣＲ１、ＧＡＢＲＰ、ＧＣＧＲ、ＧＰＲ１０９Ａ、ＧＰＲ１１５、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲ１２８、ＧＰＲ１６０、ＧＰＲ３７Ｌ１、ＧＰＲ５６、ＧＰＲ８７、ＧＰＲＣ５Ａ、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＧＰＲＣ５Ｃ、ＧＲＩＡ４、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＩＣＡＭ１、ＩＣＯＳ、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ４Ｒ、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ８、ＩＴＬＮ１、ＩＴＰＲ３、ＪＡＧ１、ＫＥＬ、ＬＧＡＬＳ３、ＬＧＡＬＳ４、ＬＰＡＲ１、ＭＭＤ、ＮＲＣＡＭ、ＮＴ５Ｅ、Ｐ２ＲＸ４、Ｐ２ＲＹ５、ＰＡＲＤ３、ＰＣＤＨ１１Ｙ、ＰＣＤＨ１２、ＰＣＤＨＡ１１、ＰＣＤＨＡＣ１、ＰＣＤＨＢ１１、ＰＬＡＵＲ、ＰＰＬ、ＰＴＰＲＦ、ＰＶＲ、ＳＣＡＲＢ１、ＳＤＣ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＬＣ１Ａ５、ＳＰＡＧ９、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＸ１Ａ、ＴＥＫ、ＴＥＸ１０１、ＴＬＲ２、ＴＭ４ＳＦ１、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＲＯ、ＴＲＰＶ６、ＴＸＮ；
【請求項９】
細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位を指標とすることが、ミトコンドリア標識試薬を用いて肝実質細胞含有細胞混合物を標識する工程、及び、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位を測定する工程を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞がマーカータンパク質に陽性であることを指標とすることが、標識された抗前記マーカータンパク質抗体で肝実質細胞含有細胞混合物を標識する工程、及び、細胞が前記マーカータンパク質に陽性であるか否かを決定する工程を含む請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
肝実質細胞含有細胞混合物が、肝臓組織由来の肝実質細胞を含有する細胞混合物、又は、肝実質細胞へ分化可能な細胞に由来する肝実質細胞を含有する細胞混合物である請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ミトコンドリア標識試薬が、A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669及びT3168からなる群から選択される請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
肝実質細胞を検出し及び選択することにより、細胞混合物における肝実質細胞の細胞数の割合が４５％以上である細胞混合物を調製する工程をさらに含む、請求項８〜１２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝実質細胞の検出方法や、かかる検出方法を利用した肝実質細胞の選択方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、何百種類もの酵素による栄養素の代謝；薬物や添加物等の解毒；胆汁産生；アルブミン合成；等の、重要な、数多くの生理機能を有している。肝臓は、肝実質細胞と、非肝実質細胞（肝類洞内皮細胞、クッパー細胞、肝星細胞、ピット細胞、胆管上皮細胞、中皮細胞等）から構成されており、前述の生理機能は肝実質細胞が担っている。
【０００３】
重篤な肝障害に対する有効な治療手段は、現状では、肝臓移植しかないのが実状である。しかし、肝臓移植には慢性的なドナー不足という大きな問題があり、肝臓移植を受けられない患者が多く存在している。そのため、多能性幹細胞を分化させて得られた肝細胞を用いた再生医療への期待が高まっており、中でも、肝実質細胞は肝臓の生理機能を担っているため、その期待は特に高い。
【０００４】
また、前述したように、肝実質細胞は、肝臓の重要な、数多くの生理機能を担っているため、肝実質細胞は、薬剤のスクリーニングや、薬剤の毒性試験等に利用されている。しかし、ヒトの生体から肝細胞を入手することは、きわめて困難であり、また、仮にそれを入手できたとしても、肝細胞が均一でない等の問題があった。そのため、多能性幹細胞を分化させて得られた肝細胞（多能性幹細胞由来肝細胞）を、薬剤のスクリーニングや、薬剤の毒性試験等に利用することが試みられている。このように、肝実質細胞を用いた再生医療や、肝実質細胞を用いた薬理作用の検討に注目が集まっており、肝実質細胞のみを得る技術が求められている。
【０００５】
生体由来又は多能性幹細胞由来の肝実質細胞を精製する方法としては、密度勾配遠心法（非特許文献１）、遺伝子改変による方法（非特許文献２、３）、抗Asialoglycoprotein receptor 1（ＡＳＧＲ１）抗体法（非特許文献４）などが知られている。前述の密度勾配遠心法は、分離精度が比較的低く、肝実質細胞を高純度で精製することが不可能であるという問題があり、前述の遺伝子改変による方法には、遺伝子を改変することによる毒性や副作用の懸念があるという問題や、精製純度や収率が十分とは言えないという問題があり、前述のＡＳＧＲ１抗体法には、多能性幹細胞由来の肝実質細胞の場合、一部の割合（最大で３０％程度）の肝実質細胞にしかＡＳＧＲ１が発現しないため、収率が低くなり、また、一部の特殊な細胞だけを抽出してしまうことになるという問題があった。
【０００６】
肝実質細胞を精製する他の技術として、例えば、特許文献１には、細胞表面上のニューリチンを指標として、試料中の肝細胞を検出する方法が開示されている。しかし、この方法は、ヒトの肝細胞の検出に実際に利用することができるか不明であるという問題や、ニューリチンは肝実質細胞のうち、類洞に面した領域に強く発現するため、一部の特殊な肝実質細胞だけを検出してしまうという問題があった。また、特許文献２には、抗ＣＤ４４抗体、抗Ｄ６．１Ａ抗体及び抗ＢＲＩ３抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体によって、小型肝細胞を分離する方法が開示されている。しかし、この方法も、ヒトの肝細胞の検出に実際に利用することができるか不明であるという問題や、肝細胞のうち、特別な種類の小型の細胞だけを検出してしまうという問題があった。
【０００７】
多能性幹細胞から肝細胞へ分化させる、様々な方法が知られているが、肝細胞への分化効率を安定的に１００％にすることは困難であった。分化誘導後の細胞を生体に移植した場合、かかる細胞の中に未分化細胞が残存していると、生体内で癌化する恐れがある。多能性幹細胞から肝細胞へ分化させる途中で生じる肝前駆細胞を精製する方法として、非特許文献５には、抗ＣＤ１３抗体及び抗ＣＤ１３３抗体を用いて肝前駆細胞を精製する方法が開示されている。しかし、精製された肝前駆細胞は、肝実質細胞と胆管上皮細胞への二分化能を持っており、かかる肝前駆細胞から肝実質細胞のみを取得できるかは確認されていない。また、現状では、多能性幹細胞由来の肝細胞単独では、成体の肝実質細胞と同等の機能まで成熟させることは困難である。肝実質細胞に体外で成熟させる方法として、マウスの線維芽細胞や、ヒトの内皮細胞や間葉系幹細胞と共培養を行う方法がある。しかし、ヒト体内に移植する際には動物細胞の混入は許されない。ヒト体内への細胞移植に用いる細胞には、より高い安全性が求められるため、共培養したヒト非肝細胞と共に移植する場合、多種細胞の安全性試験をクリアしなければならない。
【０００８】
これまでに述べたように、肝実質細胞を精製する技術は知られていなかった。
【０００９】
ところで、本発明者らは、心筋細胞含有細胞混合物から、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位に基づいて、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を選択する方法をこれまでに開発している（非特許文献６、特許文献４）。この方法において、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位は、生きた細胞のミトコンドリアに蓄積する蛍光色素（ミトコンドリア指示薬）を利用して測定している。
【００１０】
一方、活性化白血球細胞接着分子（activated leukocyte cell adhesion molecule：ＡＬＣＡＭ）としても知られるＣＤ１６６は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、活性化白血球や胸腺上皮細胞で発現しており、リンパ球抗原のＣＤ６のリガンドである。ＣＤ１６６は、マウスとヒトにおいて造血系ニッチにおける造血系幹細胞（ＨＳＣ）と骨芽細胞のマーカーとして知られている。特許文献３には、肝中皮細胞等の中皮細胞の製造方法が記載されており、ヒト中皮細胞マーカーとして、ポドカリキシン様タンパク質１（ＰＣＬＰ１）陽性、且つ活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）陽性であることが開示されている。しかし、肝中皮細胞は、肝臓の最表面を被覆する単層細胞であり、肝実質細胞ではない。
【００１１】
このように、以下の（ａ）及び（ｂ）を指標として、肝実質細胞含有細胞混合物から肝実質細胞を検出又は選択することができることはこれまでに知られていなかった。
（ａ）細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位が高いこと：
（ｂ）細胞が、心筋細胞から肝実質細胞を区別し得る所定のマーカータンパク質群（ＣＤ１６６等）から選択される１種又は２種以上のマーカータンパク質に陽性であること：
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００５−１５６２９５号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／００１４７２号パンフレット
【特許文献３】特開２０１７−０１８１０５号公報
【特許文献４】特許第４７６２１４６号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Exp Biol Med (Maywood). 2015 May;240(5):645-56
【非特許文献２】Stem Cells, 25 (2007), pp. 3058-3068
【非特許文献３】BMC Biol, 11 (2013), p. 86
【非特許文献４】Development (2016) 143, 1475-1481
【非特許文献５】PLoS One. 2013 Jul 25;8(7):e67541
【非特許文献６】Nat Methods. 2010 Jan;7(1):61-66.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、肝実質細胞を高精度で検出することができる肝実質細胞の検出方法や、肝実質細胞を高純度、かつ、高収率で精製することができる肝実質細胞の選択方法や、肝実質細胞を高純度、かつ、高収率で精製することができる肝実質細胞の製造方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前述したように、本発明者らは、心筋細胞含有細胞混合物から、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位に基づいて、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を選択する方法をこれまでに開発している（非特許文献６、特許文献４）。この方法において、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位は、生きた細胞のミトコンドリアに蓄積する蛍光色素（ミトコンドリア染色）を利用して測定している。
【００１６】
本発明者らは、肝実質細胞に発現していると考えられる細胞表面タンパク質を探索したところ、ＡＬＣＡＭ（ＣＤ１６６）を見いだした。
【００１７】
本発明者らは、ヒトＥＳ細胞を自然分化して得られた胚様体に由来する細胞群を、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）（ミトコンドリア標識試薬の１種）で染色するとともに、抗ＣＤ１６６抗体で検出し、ＴＭＲＭ含量が高く（すなわち、細胞の相対的ミトコンドリア含有量が多く、及び／又は、細胞の相対的ミトコンドリア膜電位が高く）、かつ、ＣＤ１６６陽性の細胞分画をフローサイトメーターで分離した。この細胞分画の細胞集団は、心筋細胞とは異なり、自立拍動性を全く持たない細胞集団であった。
【００１８】
本発明者らは、この細胞集団がどのような細胞の集団であるかを調べるために、網羅的な遺伝子発現解析を行った。その結果、ＴＭＲＭ含量が高くかつＣＤ１６６陽性である細胞は、肝実質細胞に特徴的に高発現する遺伝子群（α−フェトプロテイン遺伝子、アルブミン遺伝子、フィブリノーゲン遺伝子等）を高発現していることを見いだした。本発明者らは、これらの結果から、細胞の相対的ミトコンドリア含有量が多い、及び／又は、細胞の相対的ミトコンドリア膜電位が高いこと（以下、これらのいずれかの場合と両方の場合を合わせて「細胞の相対的ミトコンドリア活性が高いこと」とも表示する）、及び、細胞がＣＤ１６６陽性であること、を指標として、肝実質細胞を検出又は選択することができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１９】
本発明者らはさらに、ヒトＥＳ細胞由来の肝実質細胞（相対的ミトコンドリア活性が高く、かつ、ＣＤ１６６陽性である細胞）と、ヒトＥＳ細胞由来の心筋細胞（相対的ミトコンドリア活性が高く、かつ、ＣＤ１６６陰性である細胞）の遺伝子発現プロファイルの解析を行ったところ、心筋細胞と比較して肝実質細胞で２倍以上高発現しており、かつ、肝実質細胞の表面タンパク質をコードすると考えられる遺伝子として、後述の表２に記載のマーカー遺伝子を見いだした。本発明者らは、この結果から、細胞の相対的ミトコンドリア活性が高いこと、及び、表２に記載のマーカー遺伝子がコードするマーカータンパク質群から選択される１種又は２種以上のマーカータンパク質に陽性であること、を指標として肝実質細胞を検出又は選択することができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００２０】
すなわち、本発明は、
（１）肝実質細胞含有細胞混合物において、（ａ）細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位、並びに、（ｂ）細胞が、心筋細胞から肝実質細胞を区別し得る以下のマーカータンパク質群から選択される１種又は２種以上のマーカータンパク質に陽性であること、を指標として肝実質細胞を検出する方法；
（マーカータンパク質群）
ＣＤ１６６、ＥＰＣＡＭ、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＧ２、ＣＤＨＲ３、ＡＤＡＭＴＳ１８、ＡＭＩＣＡ１、ＡＮＰＥＰ、ＡＲＴ１、ＡＳＧＲ１、ＢＤＫＲＢ２、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＢＳＴ１、Ｃ５ＡＲ１、ＣＡＤＭ２、ＣＣＲ７、ＣＤ１６３、ＣＤ２、ＣＤ２２６、ＣＤ２４Ｌ４、ＣＤ３０２、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ６８、ＣＤ７４、ＣＤ８Ｂ、ＣＤ９、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤＣＰ１、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１２、ＣＤＨ１６、ＣＤＨ１７、ＣＤＨ３、ＣＤＲ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＥＡＣＡＭ２０、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＴＮＮＤ１、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ７、ＤＰＰ４、ＤＳＧ１、ＤＳＰ、ＥＭＣＮ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ１、ＥＲＢＢ３、Ｆ１１Ｒ、Ｆ２ＲＬ１、ＦＣＧＲＴ、ＦＬＶＣＲ１、ＧＡＢＲＰ、ＧＣＧＲ、ＧＰＲ１０９Ａ、ＧＰＲ１１５、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲ１２８、ＧＰＲ１６０、ＧＰＲ３７Ｌ１、ＧＰＲ５６、ＧＰＲ８７、ＧＰＲＣ５Ａ、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＧＰＲＣ５Ｃ、ＧＲＩＡ４、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＩＣＡＭ１、ＩＣＯＳ、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ４Ｒ、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ８、ＩＴＬＮ１、ＩＴＰＲ３、ＪＡＧ１、ＫＥＬ、ＬＧＡＬＳ３、ＬＧＡＬＳ４、ＬＰＡＲ１、ＭＭＤ、ＮＲＣＡＭ、ＮＴ５Ｅ、Ｐ２ＲＸ４、Ｐ２ＲＹ５、ＰＡＲＤ３、ＰＣＤＨ１１Ｙ、ＰＣＤＨ１２、ＰＣＤＨＡ１１、ＰＣＤＨＡＣ１、ＰＣＤＨＢ１１、ＰＬＡＵＲ、ＰＰＬ、ＰＴＰＲＦ、ＰＶＲ、ＳＣＡＲＢ１、ＳＤＣ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＬＣ１Ａ５、ＳＰＡＧ９、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＸ１Ａ、ＴＥＫ、ＴＥＸ１０１、ＴＬＲ２、ＴＭ４ＳＦ１、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＲＯ、ＴＲＰＶ６、ＴＸＮ；
（２）ミトコンドリア標識試薬を用いて肝実質細胞含有細胞混合物を標識し、及び、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位を測定する工程を含む上記（１）に記載の方法；
（３）標識された抗前記マーカータンパク質抗体で肝実質細胞含有細胞混合物を標識し、及び、細胞が前記マーカータンパク質に陽性であるか否かを決定する工程を含む上記（１）又は（２）に記載の方法；
（４）肝実質細胞を検出することにより、肝実質細胞含有細胞混合物中における非肝実質細胞に対する肝実質細胞の比率を計測する工程をさらに含む上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法；
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の肝実質細胞を検出する方法により検出した肝実質細胞を選択する工程を含む、肝実質細胞を選択する方法；
（６）肝実質細胞含有細胞混合物が、肝臓組織由来の肝実質細胞を含有する細胞混合物、又は、肝実質細胞へ分化可能な細胞に由来する肝実質細胞を含有する細胞混合物である上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法；
（７）ミトコンドリア標識試薬が、A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669及びT3168からなる群から選択される上記（２）〜（６）のいずれかに記載の方法；
（８）（Ａ）肝実質細胞へ分化可能な細胞から、肝実質細胞を分化誘導し、肝実質細胞含有細胞混合物を調製する工程；及び、
（Ｂ）肝実質細胞含有細胞混合物において、（ａ）細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位、並びに、（ｂ）細胞が、心筋細胞から肝実質細胞を区別し得る以下のマーカータンパク質群から選択される１種又は２種以上のマーカータンパク質に陽性であること、を指標として肝実質細胞を検出し及び選択する工程；
を含む、肝実質細胞を製造する方法；
（マーカータンパク質群）
ＣＤ１６６、ＥＰＣＡＭ、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＧ２、ＣＤＨＲ３、ＡＤＡＭＴＳ１８、ＡＭＩＣＡ１、ＡＮＰＥＰ、ＡＲＴ１、ＡＳＧＲ１、ＢＤＫＲＢ２、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＢＳＴ１、Ｃ５ＡＲ１、ＣＡＤＭ２、ＣＣＲ７、ＣＤ１６３、ＣＤ２、ＣＤ２２６、ＣＤ２４Ｌ４、ＣＤ３０２、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ６８、ＣＤ７４、ＣＤ８Ｂ、ＣＤ９、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤＣＰ１、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１２、ＣＤＨ１６、ＣＤＨ１７、ＣＤＨ３、ＣＤＲ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＥＡＣＡＭ２０、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＴＮＮＤ１、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ７、ＤＰＰ４、ＤＳＧ１、ＤＳＰ、ＥＭＣＮ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ１、ＥＲＢＢ３、Ｆ１１Ｒ、Ｆ２ＲＬ１、ＦＣＧＲＴ、ＦＬＶＣＲ１、ＧＡＢＲＰ、ＧＣＧＲ、ＧＰＲ１０９Ａ、ＧＰＲ１１５、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲ１２８、ＧＰＲ１６０、ＧＰＲ３７Ｌ１、ＧＰＲ５６、ＧＰＲ８７、ＧＰＲＣ５Ａ、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＧＰＲＣ５Ｃ、ＧＲＩＡ４、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＩＣＡＭ１、ＩＣＯＳ、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ４Ｒ、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ８、ＩＴＬＮ１、ＩＴＰＲ３、ＪＡＧ１、ＫＥＬ、ＬＧＡＬＳ３、ＬＧＡＬＳ４、ＬＰＡＲ１、ＭＭＤ、ＮＲＣＡＭ、ＮＴ５Ｅ、Ｐ２ＲＸ４、Ｐ２ＲＹ５、ＰＡＲＤ３、ＰＣＤＨ１１Ｙ、ＰＣＤＨ１２、ＰＣＤＨＡ１１、ＰＣＤＨＡＣ１、ＰＣＤＨＢ１１、ＰＬＡＵＲ、ＰＰＬ、ＰＴＰＲＦ、ＰＶＲ、ＳＣＡＲＢ１、ＳＤＣ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＬＣ１Ａ５、ＳＰＡＧ９、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＸ１Ａ、ＴＥＫ、ＴＥＸ１０１、ＴＬＲ２、ＴＭ４ＳＦ１、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＲＯ、ＴＲＰＶ６、ＴＸＮ；
（９）細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位を指標とすることが、ミトコンドリア標識試薬を用いて肝実質細胞含有細胞混合物を標識する工程、及び、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位を測定する工程を含む上記（８）に記載の方法；
（１０）細胞がマーカータンパク質に陽性であることを指標とすることが、標識された抗前記マーカータンパク質抗体で肝実質細胞含有細胞混合物を標識する工程、及び、細胞が前記マーカータンパク質に陽性であるか否かを決定する工程を含む上記（８）又は（９）に記載の方法；
（１１）肝実質細胞含有細胞混合物が、肝臓組織由来の肝実質細胞を含有する細胞混合物、又は、肝実質細胞へ分化可能な細胞に由来する肝実質細胞を含有する細胞混合物である上記（８）〜（１０）のいずれかに記載の方法；
（１２）ミトコンドリア標識試薬が、A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669及びT3168からなる群から選択される上記（９）〜（１１）のいずれかに記載の方法；
（１３）肝実質細胞を検出し及び選択することにより、細胞混合物における肝実質細胞の細胞数の割合が４５％以上である細胞混合物を調製する工程をさらに含む、上記（８）〜（１２）のいずれかに記載の方法；
に関する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、肝実質細胞を高精度で検出することができる肝実質細胞の検出方法や、肝実質細胞を高純度、かつ、高収率で精製することができる肝実質細胞の選択方法や、肝実質細胞を高純度、かつ、高収率で精製することができる肝実質細胞の製造方法等を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】長期間浮遊培養したヒトＥＳ細胞由来胚様体を、ミトコンドリア標識試薬（ＴＭＲＭ）と、２次抗体（Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG）のみ（図１Ａ）か、あるいは、上記ミトコンドリア標識試薬と、１次抗体（抗ＣＤ１６６抗体）及び上記２次抗体（図１Ｂ）を用いて、フローサイトメトリー解析した結果を示す図である。
【図２】図１のフローサイトメトリー解析の結果を基に、４種類の細胞分画（Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、及びＰ７）にソーティングし、肝実質細胞に特異的な３種類の遺伝子（ＨＮＦ４Ａ遺伝子、ＡＦＰ遺伝子、及びＡＬＢ遺伝子）のｍＲＮＡの発現レベルを解析した結果を示す図である。縦軸の各遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを１としたときの相対値（平均値±標準偏差［ＳＤ］、ｎ＝３）として示す。図中の「Ｐｒｅ」は、ソーティング前の細胞を示す。
【図３】図１のフローサイトメトリー解析の結果を基に、４種類の細胞分画（Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、及びＰ７）にソーティングし、心筋細胞に特異的な２種類の遺伝子（ＮＫＸ２．５遺伝子及びＡＣＴＮ２遺伝子）のｍＲＮＡの発現レベルを解析した結果を示す図である。縦軸の各遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを１としたときの相対値（平均値±標準偏差［ＳＤ］、ｎ＝３）として示す。図中の「Ｐｒｅ」は、ソーティング前の細胞を示す。
【図４】図１のフローサイトメトリー解析の結果を基に、２種類の細胞画分（Ｐ４及びＰ５）をソーティングし、培養後、抗α−アクチニン抗体及び抗α−フェトプロテイン抗体を用いた間接蛍光抗体法により解析した結果を示す図である。
【図５】マウス胎仔由来の内臓組織から得られた細胞集団について、ミトコンドリア標識試薬（ＴＭＲＭ）と、抗ＣＤ１６６抗体を用いて、フローサイトメトリー解析した結果を示す図である。
【図６】図５のフローサイトメトリー解析の結果を基に、２種類の細胞分画（Ｐ４及びＰ５）をソーティングし、培養後、抗ＨＮＦ４α抗体及び抗α−アクチニン抗体を用いた間接蛍光抗体法により解析した結果を示す図である。
【図７】ヒトＥＳ細胞から肝細胞分化誘導した細胞を、ミトコンドリア標識試薬（ＴＭＲＭ）と、抗ＣＤ１６６抗体を用いて、フローサイトメトリー解析した結果を示す図である。
【図８】図７のフローサイトメトリー解析の結果を基に、２種類の細胞分画（Ｐ４及びＰ５）をソーティングし、抗ＨＮＦ４α抗体及び抗アルブミン抗体を用いた間接蛍光抗体法により解析した結果を示す図である。
【図９】ヒトｉＰＳ細胞から肝細胞分化誘導した細胞を、ミトコンドリア標識試薬（ＴＭＲＭ）と、抗ＣＤ１６６抗体を用いて、フローサイトメトリー解析した結果を示す図である。
【図１０】図９のフローサイトメトリー解析の結果を基に、２種類の細胞分画（Ｐ４及びＰ５）をソーティングし、肝実質細胞に特異的な３種類の遺伝子（ＨＮＦ４Ａ遺伝子、ＡＦＰ遺伝子、及びＡＬＢ遺伝子）のｍＲＮＡの発現レベルを解析した結果を示す図である。縦軸の各遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを１としたときの相対値（平均値±標準偏差［ＳＤ］、ｎ＝３）として示す。図中の「Ｐｒｅ」は、ソーティング前の細胞を示す。
【図１１】図９のフローサイトメトリー解析の結果を基に、１種類の細胞分画（Ｐ５）をソーティングし、未分化マーカー遺伝子（ＰＯＵ５Ｆ１［variant 1］）のｍＲＮＡの発現レベルを解析した結果を示す図である。縦軸の「ＰＯＵ５Ｆ１（variant 1）遺伝子発現レベル」は、ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを１としたときの相対値として示す（ｎ＝３）。図中の「Ｐｒｅ」は、ソーティング前の細胞を示す。
【図１２】図１２Ａは、図９のフローサイトメトリー解析の結果を基に、２種類の細胞画分（Ｐ４及びＰ５）をソーティングし、培養後、抗ヒト核抗体及び抗アルブミン抗体を用いた間接蛍光抗体法により解析した結果を示す図である。図１２Ｂは、図１２Ａの結果を基に、アルブミン陽性細胞÷ヒト核陽性細胞の割合を測定した結果（ｎ＝５）を示す図である。
【図１３】ヒトｉＰＳ細胞から肝細胞分化誘導した細胞を固定後、ミトコンドリアの構成タンパク質の一つであるＣｏｍｐｌｅｘIVに対する抗体（抗ComplexIV抗体）と、抗ＣＤ１６６抗体及び抗ＨＮＦ４α抗体を用いて、フローサイトメトリー解析した結果を示す図である。
【図１４】図１３のフローサイトメトリー解析の結果を基に、４種類の細胞画分（Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、及びＰ８）をゲーティングし、それぞれの細胞集団の抗ＨＮＦ４α抗体で検出される蛍光強度（各図の横軸参照）を測定した結果を示す図である。
【図１５】ヒトｉＰＳ細胞から肝細胞分化誘導した細胞を、ミトコンドリア標識試薬（ＴＭＲＭ）と、抗ＥＰＣＡＭ抗体を用いて、フローサイトメトリー解析した結果を示す図である。
【図１６】図１５のフローサイトメトリー解析の結果を基に、３種類の細胞分画（Ｐ５、Ｐ６、及びＰ７）をソーティングし、肝実質細胞に特異的な３種類の遺伝子（ＨＮＦ４Ａ遺伝子、ＡＦＰ遺伝子、及びＡＬＢ遺伝子）のｍＲＮＡの発現レベルを解析した結果を示す図である。縦軸の各遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを１としたときの相対値として示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、
［１］肝実質細胞含有細胞混合物において、（ａ）細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位（指標ａ）、並びに、（ｂ）細胞が、心筋細胞から肝実質細胞を区別し得る以下のマーカータンパク質群から選択される１種又は２種以上のマーカータンパク質（以下、「本発明におけるマーカータンパク質」とも表示する）に陽性であること（指標ｂ）、を指標として肝実質細胞を検出する方法（以下、「本発明の検出方法」とも表示する）；や、
（マーカータンパク質群）
ＣＤ１６６、ＥＰＣＡＭ（Epithelial Cell Adhesion Molecule）、ＡＢＣＢ１（ATP-binding cassette sub-family B member 1）、ＡＢＣＧ２（ATP Binding Cassette Subfamily G Member 2）、ＣＤＨＲ３（cadherin related family member 3）、ＡＤＡＭＴＳ１８（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 18）、ＡＭＩＣＡ１（Adhesion molecule interacting with CXADR antigen 1）、ＡＮＰＥＰ（aminopeptidase N）、ＡＲＴ１  ｍｏｎｏ（ADP-ribosyl)transferase-1）、ＡＳＧＲ１（asialoglycoprotein receptor 1）、ＢＤＫＲＢ２（Bradykinin receptor B2）、ＢＭＰＲ１Ｂ（bone morphogenetic protein receptor type 1B）、ＢＳＴ１（Bone marrow stromal cell antigen 1）、Ｃ５ＡＲ１（complement component 5a receptor 1）、ＣＡＤＭ２（Cell adhesion molecule 2）、ＣＣＲ７（C-C motif chemokine receptor 7）、ＣＤ１６３、ＣＤ２、ＣＤ２２６、ＣＤ２４Ｌ４、ＣＤ３０２、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ６８、ＣＤ７４、ＣＤ８Ｂ、ＣＤ９、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤＣＰ１（CUB domain-containing protein 1）、ＣＤＨ１（Cadherin 1）、ＣＤＨ１２（Cadherin 12）、ＣＤＨ１６（Cadherin 16）、ＣＤＨ１７（Cadherin 17）、ＣＤＨ３（Cadherin 3）、ＣＤＲ１（Cerebellar Degeneration Related Protein 1）、ＣＥＡＣＡＭ１（Carcinoembryonic Antigen Related Cell Adhesion Molecule 1）、ＣＥＡＣＡＭ１６（Carcinoembryonic Antigen Related Cell Adhesion Molecule 16）、ＣＥＡＣＡＭ２０（Carcinoembryonic Antigen Related Cell Adhesion Molecule 20）、ＣＥＡＣＡＭ３（Carcinoembryonic Antigen Related Cell Adhesion Molecule 3）、ＣＥＡＣＡＭ６（Carcinoembryonic Antigen Related Cell Adhesion Molecule 6）、ＣＥＡＣＡＭ８（Carcinoembryonic Antigen Related Cell Adhesion Molecule 8）、ＣＬＤＮ３（Claudin 3）、ＣＬＤＮ４（Claudin 4）、ＣＴＮＮＤ１（Catenin Delta 1）、ＣＸＣＬ１６（C-X-C Motif Chemokine Ligand 16）、ＣＸＣＲ７（C-X-C chemokine receptor type 7）、ＤＰＰ４（Dipeptidyl Peptidase 4）、ＤＳＧ１（Desmoglein 1）、ＤＳＰ（Desmoplakin）、ＥＭＣＮ（Endomucin）、ＥＰＨＡ２（EPH Receptor A2）、ＥＰＨＢ１（EPH Receptor B1）、ＥＲＢＢ３（Erb-B2 Receptor Tyrosine Kinase 3）、Ｆ１１Ｒ（F11 Receptor）、Ｆ２ＲＬ１（F2R Like Trypsin Receptor 1）、ＦＣＧＲＴ（Fc Fragment Of IgG Receptor And Transporter）、ＦＬＶＣＲ１（Feline Leukemia Virus Subgroup C Cellular Receptor 1）、ＧＡＢＲＰ（Gamma-Aminobutyric Acid Type A Receptor Pi Subunit）、ＧＣＧＲ（Glucagon Receptor）、ＧＰＲ１０９Ａ（Hydroxycarboxylic Acid Receptor 2）、ＧＰＲ１１５（G protein-coupled receptor 115）、ＧＰＲ１２６（G protein-coupled receptor 126）、ＧＰＲ１２８（G protein-coupled receptor 128）、ＧＰＲ１６０（G protein-coupled receptor 160）、ＧＰＲ３７Ｌ１（G Protein-Coupled Receptor 37 Like 1）、ＧＰＲ５６（G protein-coupled receptor 56）、ＧＰＲ８７（G protein-coupled receptor 87）、ＧＰＲＣ５Ａ（G Protein-Coupled Receptor Class C Group 5 Member A）、ＧＰＲＣ５Ｂ（G Protein-Coupled Receptor Class C Group 5 Member B）、ＧＰＲＣ５Ｃ（G Protein-Coupled Receptor Class C Group 5 Member C）、ＧＲＩＡ４（Glutamate Ionotropic Receptor AMPA Type Subunit 4）、ＨＬＡ−ＤＰＡ１（HLA class II histocompatibility antigen, DP alpha 1 chain）、ＨＬＡ−ＤＲＢ１（HLA class II histocompatibility antigen, DRB1-1 beta chain）、ＩＣＡＭ１（Intercellular Adhesion Molecule 1）、ＩＣＯＳ（Inducible T-Cell Costimulator）、ＩＦＮＧＲ１（Interferon gamma receptor 1）、ＩＦＮＧＲ２（Interferon gamma receptor 2）、ＩＬ１Ｒ１（Interleukin 1 Receptor Type 1）、ＩＬ４Ｒ（Interleukin 4 Receptor）、ＩＴＧＡ２（Integrin Subunit Alpha 2）、ＩＴＧＡ���（Integrin Subunit Alpha 6）、ＩＴＧＢ４（Integrin Subunit Beta 4）、ＩＴＧＢ６（Integrin Subunit Beta 6）、ＩＴＧＢ８（Integrin Subunit Beta 8）、ＩＴＬＮ１（Intelectin 1）、ＩＴＰＲ３（Inositol 1,4,5-Trisphosphate Receptor Type 3）、ＪＡＧ１（Jagged 1）、ＫＥＬ（Kell Glycoprotein）、ＬＧＡＬＳ３（Galectin 3）、ＬＧＡＬＳ４（Galectin 4）、ＬＰＡＲ１（Lysophosphatidic Acid Receptor 1）、ＭＭＤ（Monocyte To Macrophage Differentiation Associated）、ＮＲＣＡＭ（Neuronal Cell Adhesion Molecule）、ＮＴ５Ｅ（5'-Nucleotidase Ecto）、Ｐ２ＲＸ４（Purinergic Receptor P2X 4）、Ｐ２ＲＹ５（Purinergic Receptor P2Y 5）、ＰＡＲＤ３（Par-3 Family Cell Polarity Regulator）、ＰＣＤＨ１１Ｙ（Protocadherin 11 Y-Linked）、ＰＣＤＨ１２（Protocadherin 12）、ＰＣＤＨＡ１１（Protocadherin Alpha 11）、ＰＣＤＨＡＣ１（Protocadherin Alpha Subfamily C, 1）、ＰＣＤＨＢ１１（Protocadherin Beta 11）、ＰＬＡＵＲ（Plasminogen Activator, Urokinase Receptor）、ＰＰＬ（Periplakin）、ＰＴＰＲＦ（Protein Tyrosine Phosphatase, Receptor Type F）、ＰＶＲ（Poliovirus Receptor）、ＳＣＡＲＢ１（cavenger Receptor Class B Member 1）、ＳＤＣ１（Syndecan 1）、ＳＥＭＡ７Ａ（Semaphorin 7A）、ＳＬＣ１Ａ５（Solute Carrier Family 1 Member 5）、ＳＰＡＧ９（Sperm Associated Antigen 9）、ＳＴＥＡＰ１（STEAP Family Member 1）、ＳＴＸ１Ａ（Syntaxin 1A）、ＴＥＫ（TEK Receptor Tyrosine Kinase）、ＴＥＸ１０１（Testis Expressed 101）、ＴＬＲ２（Toll Like Receptor 2）、ＴＭ４ＳＦ１（Transmembrane 4 L Six Family Member 1）、ＴＮＦＲＳＦ９（TNF Receptor Superfamily Member 9,）、ＴＮＦＳＦ１０（TNF Superfamily Member 10）、ＴＲＯ（Trophinin）、ＴＲＰＶ６（Transient Receptor Potential Cation Channel Subfamily V Member 6）、ＴＸＮ（Thioredoxin）；
［２］本発明の検出方法により検出した肝実質細胞を選択する工程を含む、肝実質細胞を選択する方法（以下、「本発明の選択方法」とも表示する）；や、
［３］（Ａ）肝実質細胞へ分化可能な細胞において、肝実質細胞を分化誘導し、肝実質細胞含有細胞混合物を調製する工程；及び、
（Ｂ）肝実質細胞含有細胞混合物から、（ａ）細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位（指標ａ）、並びに、（ｂ）細胞が本発明におけるマーカータンパク質に陽性であること（指標ｂ）、を指標として肝実質細胞を検出し及び選択する工程；
を含む、肝実質細胞を製造する方法；等を含む。
【００２４】
本発明において、指標ａと指標ｂを適用する順序は特に制限されず、指標ａ、指標ｂの順に適用してもよいし、指標ｂ、指標ａの順に適用してもよいし、指標ａ及び指標ｂを同時に適用してもよい。
【００２５】
本発明において、指標ａ及び指標ｂを指標として肝実質細胞を検出又は選択することの好ましい態様として、細胞の相対的ミトコンドリア活性が高く（指標ａ’）、かつ、本発明におけるマーカータンパク質に陽性である（指標ｂ）細胞を、肝実質細胞である又は肝実質細胞である可能性が高いと評価して検出又は選択することを好ましく挙げることができる。
【００２６】
（肝実質細胞）
肝実質細胞として、より具体的には、肝実質細胞において特徴的に高発現している１又は２以上の遺伝子を高発現している細胞が好ましく挙げられる。肝実質細胞において特徴的に高発現している遺伝子としては、ＡＰＯＢ（Apolipoprotein B-100 Precursor）遺伝子、ＦＧＧ（Fibrinogen gamma chain Precursor）遺伝子、ＦＧＡ（Fibrinogen alpha chain Precursor）遺伝子、ＦＧＢ（Fibrinogen beta chain Precursor）遺伝子、ＡＬＢ（Serum albumin Precursor）遺伝子、ＡＦＰ（alpha-fetoprotein Precursor）遺伝子、ＨＮＦ４α（Hepatocyte nuclear factor 4 alpha）遺伝子、ＣＹＰ１Ａ１（Cytochrome P450 1A1）遺伝子などが挙げられる。これらの遺伝子のどの程度の発現を高発現と評価するかは、当業者であれば適宜設定することができるが、心筋細胞におけるその遺伝子の発現量に対して１０倍以上、好ましくは２０倍以上であることを挙げることができる。
【００２７】
（肝実質細胞含有細胞混合物）
本発明において「肝実質細胞含有細胞混合物」とは、肝実質細胞とそれ以外の細胞とを含有する細胞混合物を意味し、例えば、肝臓組織由来の肝実質細胞を含有する細胞混合物（好ましくは、肝臓を構成するすべての種類の細胞を含有する細胞混合物）や、肝実質細胞へ分化可能な細胞に由来する肝実質細胞を含有する細胞混合物を挙げることができる。肝臓組織由来の肝実質細胞を含有する細胞混合物としては、同種又は異種の肝臓組織を種々の酵素で処理した結果得られる、肝実質細胞、肝類洞内皮細胞、クッパー細胞、肝星細胞、ピット細胞、胆管上皮細胞、中皮細胞等の細胞を含む混合物が挙げられる。また、肝実質細胞へ分化可能な細胞に由来する肝実質細胞を含有する細胞混合物としては、肝実質細胞へ分化可能な細胞（例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、体性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：induced pluripotent stem cell）等の幹細胞；前駆細胞；及び、受精卵細胞や体細胞クローン等の卵細胞；）を、当該細胞から肝実質細胞に分化させ得る条件下にて培養した結果得られる、肝実質細胞、肝類洞内皮細胞、クッパー細胞、肝星細胞、ピット細胞、胆管上皮細胞、中皮細胞等の細胞を含む混合物を挙げることができる。
【００２８】
本発明において、「肝実質細胞含有細胞混合物」や「細胞」が由来する生物種としては、肝実質細胞を備える脊椎動物である限り特に制限されず、好ましくは温血脊椎動物であり、より好ましくは哺乳動物である。かかる哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマなどを挙げることができ、中でも、マウス、ラット等の齧歯目動物、ヒトを好ましく挙げることができ、中でも、ヒトをより好ましく挙げることができる。
【００２９】
（指標ａ：細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位）
本発明における指標ａは、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位である。肝実質細胞や心筋細胞は、その他の細胞と比較して細胞内のミトコンドリア含有量が多く、またミトコンドリア膜電位が高いため、ミトコンドリア標識試薬を用いて肝実質細胞含有細胞混合物を標識すると、肝実質細胞（あるいは、細胞混合物が心筋細胞も含有している場合は、肝実質細胞及び心筋細胞）は他の細胞と比較して、ミトコンドリア標識試薬由来のシグナル量がより多くなる（標識が蛍光発光する場合は、より強い蛍光強度を示す）。
【００３０】
細胞のミトコンドリア含有量及びミトコンドリア膜電位は、ミトコンドリア標識試薬を用いて細胞内のミトコンドリアを標識することにより、定量化することができる。しかしながら、ミトコンドリア含有量及びミトコンドリア膜電位を反映するミトコンドリア標識試薬に由来するシグナルの絶対値は、標識試薬の種類、暴露時間などの暴露条件によっても変化する。そのため、本発明において重要なのは、ミトコンドリア標識試薬由来シグナル量の絶対値ではなく、肝実質細胞と非肝実質細胞との間におけるミトコンドリア標識試薬由来シグナル量の相対関係である。そして、本発明においては、相対的に高い蛍光強度を示す細胞を、相対的ミトコンドリア活性が高い細胞（すなわち、細胞の相対的ミトコンドリア含有量が多い及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位が高い細胞）であると評価して検出することができる。また、肝実質細胞のミトコンドリア含有量は、肝実質細胞の成熟度の上昇に伴い増加する。この性質を生かし、分取する細胞の相対的成熟度を判定し、目的に合わせて分取する肝実質細胞の成熟度を選択することができる。
【００３１】
ある細胞のミトコンドリア標識試薬由来シグナルがどの程度の量であるときに、その細胞の相対的ミトコンドリア活性が高いと評価するかは、当業者であれば、適宜設定することができる。例えば、実際に使用を予定している肝実質細胞含有細胞混合物の試料を用いて予備的実験を行い、指標ｂを満たす細胞において、ミトコンドリア標識試薬由来シグナル量の範囲を区分けし、肝実質細胞が得られる精度が所望の高さ以上となるようなミトコンドリア標識試薬由来シグナル量を、細胞の相対的ミトコンドリア活性が高いと評価することができるシグナル量と設定することができる。細胞のミトコンドリア活性が高いと評価することができる具体例としては、後述の実施例１の１．の［方法：フローサイトメトリー解析及びセルソーティング］に記載の方法で測定した場合のミトコンドリア標識試薬の蛍光強度が１０４以上であることを好適に挙げることができる。
【００３２】
細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位を指標とすることとしては、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位を指標とする限り特に制限されないが、ミトコンドリア標識試薬を用いて肝実質細胞含有細胞混合物を標識する工程、及び、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位を測定する工程を含むことを好ましく挙げることができ、細胞の相対的ミトコンドリア含有量が多い及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位が高い細胞（すなわち、相対的ミトコンドリア活性が高い細胞）を肝実質細胞の候補細胞であると評価する工程（より好ましくは、肝実質細胞又は心筋細胞である、又は、肝実質細胞又は心筋細胞である可能性が高いと評価する工程）をさらに含むことをより好ましく挙げることができる。
【００３３】
また、本発明の検出方法及び本発明の製造方法において、ミトコンドリア標識試薬を用いて肝実質細胞含有細胞混合物を標識する工程より後であって、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位を測定する工程より前に、ミトコンドリア標識試薬の非存在下にて、標識した細胞を例えば１〜１０日間、好ましくは４〜８日間、培養する工程をさらに含むことが好ましい。ミトコンドリア標識試薬で肝実質細胞含有細胞混合物を標識した後、ミトコンドリア標識試薬の非存在下でさらに培養を行うと、細胞が分裂するにつれて、１細胞あたりに含まれるミトコンドリア標識試薬含有量は減少する。従って、増殖性の細胞では培養時間が長くなればなるほど、細胞内のミトコンドリア標識試薬含有量が減少し、その標識に由来するシグナル量（好ましくは蛍光強度）が低下する。その一方で、心筋細胞は分裂能を失っているか又は非常に低下しており、また、肝実質細胞も通常は分裂能が低いため、培養時間が長くなっても、１細胞あたりのミトコンドリア標識試薬含有量が他の細胞ほど減少せず、相対的により多いシグナル量を維持する。従って、肝実質細胞含有細胞混合物（あるいはさらに心筋細胞を含有している細胞混合物）をミトコンドリア標識試薬で標識した後、ミトコンドリア標識試薬の非存在下にてさらに一定期間（例えば１〜１０日間、好ましくは２〜８日間）培養すると、肝実質細胞（あるいは肝実質細胞及び心筋細胞）と、その他の細胞との間でのシグナル量の差が拡大し、細胞混合物において肝実質細胞（あるいは肝実質細胞及び心筋細胞）をより高精度で検出することに寄与するため、好ましい。また、肝実質細胞においてだけでなく、心筋細胞においても肝実質細胞においてもＣＤ１６６を発現する齧歯目動物においては、前述の培養工程をさらに含むことが特に好ましい。前述の培養工程をさらに含むと、心筋細胞と肝実質細胞との間でのシグナル量の差も拡大し、心筋細胞において肝実質細胞よりもシグナル量が多いことが明確になる傾向があるため、かかるミトコンドリア標識試薬由来のシグナル量により心筋細胞と肝実質細胞を区別することができるからである。
【００３４】
本発明において、「ミトコンドリア標識試薬」とは、生細胞に接触させた場合に、生細胞中のミトコンドリアを特異的に標識することができてその存在量を測定しうる物質、生細胞中のミトコンドリアを特異的に標識することができてミトコンドリア膜電位を測定しうる物質、又は生細胞中のミトコンドリアを特異的に標識することができてその存在量とミトコンドリア膜電位の両方を測定しうる物質であれば、どのような物質であってもよい。かかるミトコンドリア標識試薬としては、例えば、（１）蛍光を有し、ミトコンドリア構造物質（例えば、タンパク質、脂質、糖鎖、核酸又はこれらの代謝産物等）と結合する物質、（２）蛍光を有し、ミトコンドリアの膜電位によってミトコンドリア内に選択的に取り込まれる物質、（３）ミトコンドリア構造物質の作用により蛍光を発する物質に変換される物質、又は（４）ミトコンドリア構造物質の作用によりミトコンドリア外に拡散できなくなる物質などを挙げることができる。ミトコンドリア標識試薬における標識化合物としては、標識の存在や量を迅速かつ簡便に測定できる点で、蛍光標識を好ましく挙げることができる。
【００３５】
本発明におけるミトコンドリア標識試薬として、具体的には、Ａ１３７２、Ｄ２７３、Ｄ２８８、Ｄ３０８、Ｄ３７８、Ｄ４２６、Ｄ６３２、Ｄ６３３、Ｄ２２４２１、Ｄ２３８０６、Ｌ６８６８、Ｍ７５０２、Ｍ７５１０、Ｍ７５１１、Ｍ７５１２、Ｍ７５１３、Ｍ７５１４、Ｍ２２４２２、Ｍ２２４２３、Ｍ２２４２５、Ｍ２２４２６、Ｒ３０２、Ｒ６３４、Ｒ６４８、Ｒ１４０６０、Ｒ２２４２０、Ｓ７５６３、Ｔ６３９、Ｔ６６８、Ｔ６６９又はＴ３１６８等（化合物製品番号：いずれもMolecular Probe社から入手可能）を挙げることができ、中でも、Ｍ７５１４、Ｍ７５１０、Ｍ７５１１、Ｍ７５１２、Ｍ７５１３、Ｍ２２４２５、Ｍ２２４２６、Ｔ６６８、Ｒ３０２、又はＴ３１６８を好ましく挙げることができ、中でも、Ｔ６６８、Ｒ３０２、Ｍ７５１４又はＴ３１６８を最も好ましく挙げることができる。例示したこれらのミトコンドリア標識試薬は、それぞれ以下の構造を有している。
【００３６】
【化１】
2019165686.tif 000002
【００３７】
【化２】
2019165686.tif 000003
【００３８】
【化３】
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【００３９】
【化４】
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【００４０】
【化５】
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【００４１】
【化６】
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【００４２】
【化７】
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【００４３】
【化８】
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【００４４】
【化９】
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【００４５】
【化１０】
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【００４６】
【化１１】
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【００４７】
【化１２】
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【００４８】
【化１３】
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【００４９】
【化１４】
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【００５０】
【化１５】
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【００５１】
【化１６】
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【００５２】
【化１７】
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【００５３】
【化１８】
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【００５４】
【化１９】
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【００５５】
【化２０】
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【００５６】
【化２１】
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【００５７】
【化２２】
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【００５８】
【化２３】
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【００５９】
【化２４】
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【００６０】
【化２５】
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【００６１】
【化２６】
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【００６２】
【化２７】
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【００６３】
【化２８】
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【００６４】
【化２９】
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【００６５】
【化３０】
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【００６６】
さらに、ミトコンドリア標識試薬として、Ｓ７５６３、Ｓ７５６７及びＳ７５８５（化合物製品番号：Molecular Probe社から入手可能）も用いることができる。なお、Ｔ６６８はテトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）であり、Ｔ６６９はテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）であり、Ｒ３０２はローダミン１２３であり、Ｔ３１６８はＪＣ−１である。
【００６７】
これらのミトコンドリア標識試薬は、それぞれの物質に特有の励起波長を有し、特有の波長を有する蛍光を発光することが知られている。例えば、Ｍ７５１４の場合には、４９０ｎｍの励起波長を受けて５１６ｎｍの蛍光を発光し、また、Ｔ３１６８の場合には、５３５ｎｍの励起波長を受けて５９０ｎｍの蛍光を発光することが知られている。
【００６８】
また、他のミトコンドリア標識試薬として、ミトコンドリア電子伝達系複合体に対する標識抗体も好ましく挙げられ、具体的には、抗Complex IV抗体が好ましく挙げられる。かかる抗体は市販されているものを用いることができる。
【００６９】
（指標ｂ：本発明におけるマーカータンパク質に陽性であること）
本発明における指標ｂは、細胞が、心筋細胞から肝実質細胞を区別し得る以下のマーカータンパク質群から選択される１種又は２種以上のマーカータンパク質に陽性であることである。
（マーカータンパク質群）
ＣＤ１６６、ＥＰＣＡＭ、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＧ２、ＣＤＨＲ３、ＡＤＡＭＴＳ１８、ＡＭＩＣＡ１、ＡＮＰＥＰ、ＡＲＴ１、ＡＳＧＲ１、ＢＤＫＲＢ２、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＢＳＴ１、Ｃ５ＡＲ１、ＣＡＤＭ２、ＣＣＲ７、ＣＤ１６３、ＣＤ２、ＣＤ２２６、ＣＤ２４Ｌ４、ＣＤ３０２、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ６８、ＣＤ７４、ＣＤ８Ｂ、ＣＤ９、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤＣＰ１、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１２、ＣＤＨ１６、ＣＤＨ１７、ＣＤＨ３、ＣＤＲ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＥＡＣＡＭ２０、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＴＮＮＤ１、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ７、ＤＰＰ４、ＤＳＧ１、ＤＳＰ、ＥＭＣＮ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ１、ＥＲＢＢ３、Ｆ１１Ｒ、Ｆ２ＲＬ１、ＦＣＧＲＴ、ＦＬＶＣＲ１、ＧＡＢＲＰ、ＧＣＧＲ、ＧＰＲ１０９Ａ、ＧＰＲ１１５、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲ１２８、ＧＰＲ１６０、ＧＰＲ３７Ｌ１、ＧＰＲ５６、ＧＰＲ８７、ＧＰＲＣ５Ａ、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＧＰＲＣ５Ｃ、ＧＲＩＡ４、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＩＣＡＭ１、ＩＣＯＳ、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ４Ｒ、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ８、ＩＴＬＮ１、ＩＴＰＲ３、ＪＡＧ１、ＫＥＬ、ＬＧＡＬＳ３、ＬＧＡＬＳ４、ＬＰＡＲ１、ＭＭＤ、ＮＲＣＡＭ、ＮＴ５Ｅ、Ｐ２ＲＸ４、Ｐ２ＲＹ５、ＰＡＲＤ３、ＰＣＤＨ１１Ｙ、ＰＣＤＨ１２、ＰＣＤＨＡ１１、ＰＣＤＨＡＣ１、ＰＣＤＨＢ１１、ＰＬＡＵＲ、ＰＰＬ、ＰＴＰＲＦ、ＰＶＲ、ＳＣＡＲＢ１、ＳＤＣ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＬＣ１Ａ５、ＳＰＡＧ９、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＸ１Ａ、ＴＥＫ、ＴＥＸ１０１、ＴＬＲ２、ＴＭ４ＳＦ１、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＲＯ、ＴＲＰＶ６、ＴＸＮ；
【００７０】
本発明における前述の指標ａと指標ｂの組み合わせにより、基本的に、肝実質細胞を、心筋細胞等のそれら以外の細胞と区別することができる。ただし、例外的にマウス等の齧歯目動物の胎児期では、本発明におけるマーカータンパク質のうち、ＣＤ１６６は心筋細胞でも陽性である。そのようなＣＤ１６６陽性心筋細胞の混在がある場合、肝実質細胞を検出等する場合の指標ｂとしては、ＣＤ１６６が陽性であることに代えて、又は、それに加えて、ＣＤ１６６以外のマーカータンパク質に陽性であることを用いるのがより好ましい。
【００７１】
本発明におけるマーカータンパク質は、齧歯目動物におけるＣＤ１６６の場合を除いて、心筋細胞における発現量と比較して肝実質細胞における発現量が格段に高いため、かかるマーカータンパク質に陽性であることを指標として、心筋細胞から肝実質細胞を区別することができる。
【００７２】
細胞が本発明におけるマーカータンパク質に陽性であることを指標とすることとしては、本発明におけるマーカータンパク質に陽性であることを指標とする限り特に制限されないが、標識された抗マーカータンパク質抗体で肝実質細胞含有細胞混合物を標識する工程、及び、細胞が前記マーカータンパク質に陽性であるか否かを決定する工程を含むことを好ましく挙げることができ、前記マーカータンパク質に陽性である細胞を肝実質細胞の候補細胞であると評価する工程（より好ましくは、肝実質細胞であると評価する工程）をさらに含むことをより好ましく挙げることができる。
【００７３】
標識された抗マーカータンパク質抗体で肝実質細胞含有細胞混合物を標識する方法としては、公知の方法にしたがって行うことができる。また、標識された抗マーカータンパク質抗体は、市販されているものを用いることができる。本発明における「標識された抗マーカータンパク質抗体」には、抗マーカータンパク質抗体に標識物質を直接結合させた抗体のほか、標識物質は直接結合していない抗マーカータンパク質抗体であって、該抗体に対する２次抗体で標識する抗マーカータンパク質抗体も便宜上含まれる。
【００７４】
標識された抗マーカータンパク質抗体における標識としては、標識の存在や量を迅速かつ簡便に測定できる点で、蛍光標識を好ましく挙げることができる。蛍光標識の種類としては、ＦＩＴＣ、ＰＥ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＡＰＣ、ＰＥ−Ｃｙ７、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰｅｒＣＰ、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５７０、又はＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１を挙げることができる。指標ａ及び指標ｂの合計で２種以上の蛍光標識を用いる場合は、用いる蛍光標識の蛍光励起波長や蛍光波長のピークができるだけ重ならないものを選択することが好ましい。
【００７５】
マーカータンパク質に陽性であるか陰性であるかの評価は、公知の方法に従って、標識された細胞が発する蛍光量に基づいて行うことができる。例えば、ネガティブコントロール細胞（具体的には、例えばアイソタイプコントロール抗体で染色された細胞）が発する蛍光量をバックグラウンドの蛍光量とし、バックグラウンドに対して十分に高い蛍光量を基準に、該基準よりも蛍光量が低い細胞を陰性細胞と評価し、該基準よりも蛍光量が高い細胞を陽性細胞と評価することができる。
【００７６】
（非肝実質細胞に対する肝実質細胞の比率の計測）
本発明の検出方法は、肝実質細胞を検出することにより、肝実質細胞含有細胞混合物中における非肝実質細胞に対する肝実質細胞の比率を計測する工程をさらに含むことを好ましく挙げることができる。肝実質細胞含有細胞混合物中の肝実質細胞の細胞数は、前述の指標ａ及び指標ｂにより計測することができ、肝実質細胞含有細胞混合物中の全細胞数は、核染色等の手段により計測することができる。
【００７７】
（肝実質細胞を選択する方法）
本発明の肝実質細胞を選択する方法としては、本発明の検出方法により検出した肝実質細胞を選択する工程をさらに含んでいる限り特に制限されない。本発明において「肝実質細胞を選択する」ことには、肝実質細胞含有細胞混合物から肝実質細胞のみを選択して分離することの他、肝実質細胞含有細胞混合物中の肝実質細胞の割合を高めて、肝実質細胞含有細胞混合物から肝実質細胞を濃縮することなども含まれる。
【００７８】
肝実質細胞含有細胞混合物から肝実質細胞を選択する程度としては、肝実質細胞含有細胞混合物における肝実質細胞の細胞数の割合（％）が、選択前よりも選択後に高くなっている限り特に制限されないが、選択後の肝実質細胞含有細胞混合物における肝実質細胞の細胞数の割合（％）が好ましくは３０％以上、より好ましくは４５％以上、さらに好ましくは６０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、最も好ましくは１００％であることが挙げられる。
【００７９】
（肝実質細胞を検出又は選択する手段）
肝実質細胞を検出又は選択する手段としては、肝実質細胞を検出又は選択することができる限り特に制限されないが、簡便かつ迅速に検出又は選択することができる点で、フローサイトメトリーを利用する手段を好ましく挙げることができ、より具体的には、フローサイトメーターを用いる方法、より好ましくは、セルソーター付きフローサイトメーターを用いる方法を挙げることができる。セルソーター付きフローサイトメーターとしては、市販の装置を用いることができ、例えば、蛍光細胞分取機（Fluorescent Activated Cell Sorter；FACS（登録商標））（BD, Franklin Lakes, NJ USA）を使用することができるが、これ以外の装置（Beckman社、Coulter社、Cytomation社など）を使用してもよい。
【００８０】
（肝実質細胞含有細胞混合物を調製する方法）
本発明の肝実質細胞を製造する方法は、
（Ａ）肝実質細胞へ分化可能な細胞において、肝実質細胞を分化誘導し、肝実質細胞含有細胞混合物を調製する工程；及び、
（Ｂ）肝実質細胞含有細胞混合物から、（ａ）細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位、並びに、（ｂ）細胞が本発明におけるマーカータンパク質に陽性であること、を指標として肝実質細胞を検出し及び選択する工程；
を含む。
【００８１】
上記（Ａ）における、肝実質細胞へ分化可能な細胞から、肝実質細胞を分化誘導し、肝実質細胞含有細胞混合物を調製する方法としては、公知の方法を用いることができる。かかる方法としては、特開２０１０−０７５６３１号公報、特開２０１４−１２８２１０号公報、特開２０１６−０５４６９６号公報、特開２０１７−０８５９４５号公報等に記載の方法を挙げることができる。肝実質細胞へ分化可能な細胞から、肝実質細胞を分化誘導し、肝実質細胞含有細胞混合物を調製する方法として、具体的には、肝実質細胞へ分化可能な細胞を、血清又は血清代替物質を含む細胞培養液で培養する（好ましくは浮遊培養する）方法；や、また、文献「Stem Cell Reports. 2015 May 12;4(5):939-52」に記載の方法を参考にして、肝前駆細胞へ分化誘導を行った後、長期間の浮遊培養を行い、肝実質細胞へ分化、成熟させる方法；が挙げられる。
【００８２】
本発明の製造方法において、肝実質細胞含有細胞混合物から肝実質細胞を選択する程度としては、肝実質細胞含有細胞混合物における肝実質細胞の細胞数の割合（％）が、選択前よりも選択後に高くなっている限り特に制限されないが、選択後の肝実質細胞含有細胞混合物における肝実質細胞の細胞数の割合（％）が好ましくは３０％以上、より好ましくは４５％以上、さらに好ましくは６０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、最も好ましくは１００％であることが挙げられる。
【００８３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、以下の実施例１及び３において、ヒトＥＳ細胞（京都大学より譲渡を受けたｋｈＥＳ２株）は、０．１ｍＭ MEM Non-Essential Amino Acids solution（Sigma社製）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Sigma社製）、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（Sigma社製）、及び４ｎｇ／ｍＬ 塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；Wako社製）を含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２混合培養液（Wako社製）（以下、「ヒトＥＳ細胞用培養液」という）中でマイトマイシンＣ処理したマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）と共培養することにより、未分化性を維持した。また、以下の実施例４及び実施例５において、ヒトｉＰＳ細胞（京都大学より譲渡を受けた２５３Ｇ１株）は、培養基質（iMatrix-511［nippi社製］）上で、Essential 8培養液（Life Technologies）存在下でフィーダーフリー培養を行い、未分化性を維持した。また、細胞培養は、５％ ＣＯ２／２０％ Ｏ２、３７℃条件下で行った。
【実施例１】
【００８４】
１．ヒトＥＳ細胞由来胚様体からの肝実質細胞の精製
［方法：胚様体形成による分化誘導法］
ヒトＥＳ細胞を以下の手順〔１〕〜〔４〕に従って分化誘導した。
【００８５】
〔１〕セミコンフルエントの状態のヒトＥＳ細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培養液（Wako社製）で３回洗浄後、ＲＰＭＩ１６４０培養液のみで、１週間培養を行うことにより、分化誘導を開始した。
〔２〕０．１％ コラゲナーゼ（Wako社製）で処理し、細胞塊を回収した。
〔３〕回収した細胞塊を、７．５％ ＢＳＡFraction V溶液（Life Technologies社製）でコーティングした培養皿（滅菌シャーレ、IWAKI社製）、又はUltra-Low Attachmentの培養皿（Corning社製）に移し、５％ ＦＢＳ（Biowest社製）、及び０．５ｍＭ アスコルビン酸を含むＲＰＭＩ１６４０／ＭＥＭα＝１：１（ともにWako社製）混合培養液（以下、「浮遊培養用培養液」という）中で、浮遊培養を行い、胚様体を形成させた。
〔４〕浮遊培養は、細胞塊の浮遊培養開始から約２〜３か月間行い、その間、１週間ごとに培地交換を行った。
【００８６】
［方法：フローサイトメトリー解析及びセルソーティング］
浮遊培養後の細胞を、以下の手順〔１〕〜〔４〕に従ってフローサイトメトリー解析及びセルソーティングした。
〔１〕浮遊培養後の細胞をチューブに回収し、ＰＢＳ（−）で洗浄後、０．２５％ トリプシン（DIFCO社製）及び０．１％ コラゲナーゼ（Wako社製）を含むＡｄｓ緩衝液（１１６ｍＭ 塩化ナトリウム、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ ７．３５］、１２．５ｍＭ リン酸二水素ナトリウム、５．６ｍＭ グルコース、５．４ｍＭ 塩化カリウム、０．８ｍＭ 硫酸マグネシウム）中に移し、３７℃で保温しながらスターラーで混合することにより、単一の状態の細胞を得た。
〔２〕ミトコンドリア標識試薬（ＴＭＲＭ［Tetramethyl rhodamine, methyl ester perchlorate］［invitrogen社製］］を、５％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液（Wako社製）に、終濃度３０〜１００ｎＭとなるように調製した溶液中に、上記〔１〕で得られた単一の状態の細胞を移し、３７℃で約３０分間、染色した。
〔３〕１次抗体反応処理及び２次抗体反応処理を、それぞれ抗ＣＤ１６６抗体（濃度１:５０）（Cat No.:ＡＦ１１７２、R&D社製）、及びAlexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG（濃度１:１００）（Life Technologies社製）を用いて、氷冷条件下で行った。
〔４〕細胞における蛍光強度の測定は、セルソーター（FACS ariaIII［BD社製］）を用いて行った。また、セルソーター（FACS ariaIII［BD社製］）を用いて、ＴＭＲＭ含量が高く、かつＣＤ１６６陰性の細胞分画（Ｐ４）と、ＴＭＲＭ含量が高く、かつＣＤ１６６陽性の細胞分画（Ｐ５）と、ＴＭＲＭ含量が低く、かつＣＤ１６６陰性の細胞分画（Ｐ６）と、ＴＭＲＭ含量が低く、かつＣＤ１６６陽性の細胞分画（Ｐ７）とをソーティングした。なお、セルソーター（FACS ariaIII［BD社製］）における蛍光パラメーターのVoltageは、ＦＳＣ：２３０、ＳＳＣ：２８５、ＦＩＴＣ：３０２、ＰＥ：２９７に設定し、Thresholdは、ＦＳＣ：５０，０００、ＳＳＣ：２０，０００に設定した。
【００８７】
［結果１］
図１に示すようにＴＭＲＭ軸が、およそ１０４以上を目安として、細胞を分取することにより、ＴＭＲＭ含量が多く、かつＣＤ１６６陽性の細胞集団（Ｐ５）を得ることができた。ところが、かかるＣＤ１６６陽性細胞集団は、自立拍動性を全く有しない細胞集団であった。そこで、Ｐ５のＣＤ１６６陽性細胞集団の性質を詳細に解析するために、マイクロアレイを用いて遺伝子発現プロファイルを解析した。また、ＴＭＲＭ含量が多く、かつＣＤ１６６陰性の細胞集団（Ｐ４）についてもあわせて解析した。
【００８８】
その結果、Ｐ５のＣＤ１６６陽性細胞集団は、肝実質細胞に特異的な７種類の遺伝子（ＡＰＯＢ遺伝子、ＦＧＧ遺伝子、ＦＧＡ遺伝子、ＦＧＢ遺伝子、ＡＬＢ遺伝子、ＡＦＰ遺伝子、及びＣＹＰ１Ａ１遺伝子）のｍＲＮＡが発現することが示された。一方、Ｐ４のＣＤ１６６陰性細胞集団は、心筋細胞に特異的な５種類の遺伝子（ＮＫＸ２．５遺伝子、ＡＣＴＮ２遺伝子、ＴＮＮＴ２遺伝子、ＰＬＮ遺伝子、及びＭＹＨ６遺伝子）のｍＲＮＡが発現することが示された。
【００８９】
［方法：定量ＰＣＲ解析］
Ｐ５のＣＤ１６６陽性細胞集団が、心筋細胞ではなく肝実質細胞であることを確認するために、以下の手順〔１〕〜〔３〕に従って定量ＰＣＲ解析を行った。
〔１〕上記［方法：フローサイトメトリー解析及びセルソーティング］の項目に記載の方法に従って調製したソーティング前後の細胞から、ISOGEN（ニッポンジーン社製）を用い、添付のマニュアルに従って、それぞれの全ＲＮＡを抽出した。
〔２〕抽出した全ＲＮＡを基に、Super ScriptIIReverse Transcriptase（Thermo Fisher Scientific社製）を用い、添付のマニュアルに従って、ｃＤＮＡを合成した。
〔３〕合成したｃＤＮＡを鋳型とし、肝実質細胞に特異的な３種類の因子（ＨＮＦ４α［Hepatocyte nuclear factor 4 alpha］、α−フェトプロテイン、及びアルブミン）をコードする遺伝子（それぞれ、ＨＮＦ４Ａ遺伝子、ＡＦＰ遺伝子、及びＡＬＢ遺伝子）のｍＲＮＡの発現レベルと、心筋細胞に特異的な２種類の因子（ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ−２．５及びα−アクチニン−２）をコードする遺伝子（それぞれ、ＮＫＸ２．５遺伝子及びＡＣＴＮ２遺伝子）のｍＲＮＡの発現レベルを解析するために、以下の表１に示すプライマー及びプローブセット（ＵＰＬ［Universal Probe Library］［Roche社製］）と、リアルタイムＰＣＲシステム（ViiA 7［Applied Biosystems社製］）とを用いて定量ＰＣＲ解析を行った。なお、内部標準遺伝子としてＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルも同様に検出した。
【００９０】
【表１】
2019165686.tif 000032
【００９１】
［方法：間接蛍光抗体法］
ＴＭＲＭ含量が高く、かつＣＤ１６６陰性のＰ４の細胞集団と、ＴＭＲＭ含量が高く、かつＣＤ１６６陽性のＰ５の細胞集団とを、それぞれマトリゲル（Corning社製）上に播種し、５％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液（Wako社製）中で十分に接着させるため、６日間培養した。培養後の細胞を、４％パラホルムアルデヒド（武藤化学社製）で固定処理した後、抗α−フェトプロテイン抗体（Sigma社製）及び抗α−アクチニン抗体（Sigma社製）を用いた間接蛍光抗体法を、定法に従って行った。また、細胞核は、ＤＡＰＩ染色した。
【００９２】
［結果２］
定量ＰＣＲ解析を行った結果、ＴＭＲＭ含量が高く、かつＣＤ１６６陽性のＰ５の細胞集団は、他の細胞分画の細胞集団（ＴＭＲＭ含量が高く、かつＣＤ１６６陰性のＰ４の細胞集団、ＴＭＲＭ含量が低く、かつＣＤ１６６陰性のＰ６の細胞集団、及びＴＭＲＭ含量が低く、かつＣＤ１６６陽性のＰ７の細胞集団）と比べ、肝実質細胞に特異的な３種類の遺伝子（ＨＮＦ４Ａ遺伝子、ＡＦＰ遺伝子、及びＡＬＢ遺伝子）のｍＲＮＡが高発現していることが示された（図２参照）。一方、心筋細胞に特異的な２種類の遺伝子（ＮＫＸ２．５遺伝子及びＡＣＴＮ２遺伝子）のｍＲＮＡは、ＴＭＲＭ含量が高く、かつＣＤ１６６陰性のＰ４の細胞集団では高発現していたものの、ＴＭＲＭ含量が高く、かつＣＤ１６６陽性のＰ５の細胞集団ではほとんど検出されなかった。また、ＴＭＲＭ含量が低い（相対的ミトコンドリア活性が低い）細胞では、ＣＤ１６６陽性、陰性（Ｐ７，Ｐ６）共に心筋細胞や肝実質細胞特異的遺伝子の発現が極めて低く、これら細胞がほとんど含まれないことが示された（図３参照）。
【００９３】
また、間接蛍光抗体法を行った結果、ＴＭＲＭ含量が高く、かつＣＤ１６６陽性のＰ５の細胞集団は、肝実質細胞に特異的な因子であるα−フェトプロテインが陽性であり、心筋細胞に特異的な因子であるα−アクチニンが陰性であったのに対して、ＴＭＲＭ含量が高く、かつＣＤ１６６陰性のＰ４の細胞集団は、肝実質細胞に特異的な因子であるα−フェトプロテインが陰性であり、心筋細胞に特異的な因子であるα−アクチニンが陽性であることが示された（図４参照）。
【００９４】
以上の結果は、長期間浮遊培養したヒトＥＳ細胞由来胚様体の中には、ＴＭＲＭ含量が多く（相対的ミトコンドリア活性が高く）、かつＣＤ１６６陽性の肝実質細胞集団が含まれていることを示すとともに、細胞における高いＴＭＲＭ含量と、ＣＤ１６６陽性とを指標として、肝実質細胞を、心筋細胞等の他の細胞と区別して、単離・精製できることを示している。
【実施例２】
【００９５】
２．マウス胎仔由来の内臓組織から肝実質細胞の調製
マウスにおいても、細胞における高いＴＭＲＭ含量と、ＣＤ１６６陽性とを指標として、肝実質細胞を単離・精製できるかどうか検討した。
【００９６】
［方法］
〔１〕マウス胎生１４日の胎仔の内臓を単離し、実施例１の項目［方法：フローサイトメトリー解析及びセルソーティング］に記載の方法に従って、フローサイトメトリー解析を行った（図５参照）。
〔２〕フローサイトメトリー解析の結果、ＴＭＲＭ含量（相対的ミトコンドリア活性）が一番高く、かつＣＤ１６６陽性の細胞分画（Ｐ４）と、ＴＭＲＭ含量が次に高く、かつＣＤ１６６陽性の細胞分画（Ｐ５）とを、実施例１の項目［方法：フローサイトメトリー解析及びセルソーティング］に記載の方法に従って、それぞれソーティングした。
〔３〕Ｐ４の細胞集団とＰ５の細胞集団を、それぞれマトリゲル上に播種し、１０μＭ Ｙ−２７６３２（Wako社製）及び２０ｎＭ サイクロスポリンＡ（Wako社製）を含む肝細胞成熟化用培養液（８．３％ 「tryptose phosphate broth solution」［Sigma社製］、０．５８％ インスリン−トランスフェリン−セレニウム［ＩＴＳ；Life Technologies社製］、１％ GlutaMAX［Life Technologies社製］、５％ ＦＢＳ［Biowest社製］、１０μＭ ヒドロコルチゾン２１−ヘミサクシネート［Sigma社製］、１００ｎＭ デキサメタゾン［Wako社製］、及び５０μｇ／ｍＬ Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム［Sigma社製］と、１００ｎＭ N-hexanoic-Tyr, Ile-(6) aminohexanoic amide［dihexa；toronto research chemicals社製］又は４０ｎｇ／ｍＬ 肝細胞増殖因子［ＨＧＦ；Peprotech社製］とを含むLeibovitz’s
L-15培養液［Wako社製］）中で培養した。なお、細胞は培養皿の中心部に集め、細胞密度を高くして培養した。
〔４〕５日間培養した細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定処理した後、１次抗体（抗ＨＮＦ４α抗体［Santa cruz社製］及び抗α−アクチニン抗体［Sigma社製］）と、２次抗体（Alexa Fluor 546 donkey anti-rabbit IgG及びAlexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG）とを用いた間接蛍光抗体法を、定法に従って行った（図６参照）。また、細胞核は、ＤＡＰＩ染色した。
【００９７】
［結果］
図５のＰ４の細胞集団は、心筋細胞に特異的な因子であるα−アクチニンが陽性であり、肝実質細胞に特異的な因子であるＨＮＦ４αが陰性の心筋細胞であったのに対して、図５のＰ５の細胞集団は、心筋細胞に特異的な因子であるα−アクチニンが陰性であり、肝実質細胞に特異的な因子であるＨＮＦ４αが陽性の肝実質細胞であることが確認された（図６参照）。
この結果は、マウス胎仔では肝実質細胞だけでなく、心筋細胞もＣＤ１６６陽性となること、マウス胎仔では心筋細胞のＴＭＲＭ含量は肝実質細胞のそれよりも高くなるので、それらのことを指標として、肝実質細胞を、心筋細胞等の他の細胞と区別して、単離・精製できることを示している。
【実施例３】
【００９８】
３．ヒトＥＳ細胞から肝前駆細胞分化誘導を経由した肝実質細胞の精製
ヒトＥＳ細胞を、文献「Methods Mol Biol. 2016;1357:295-310.」に記載の方法に従って、肝前駆細胞へ分化誘導を行った後、長期間の浮遊培養を行い、肝実質細胞へ分化、成熟させた（以下の手順〔１〕〜〔５〕参照）。その後、以下の手順〔６〕〜〔８〕に従って、肝実質細胞の精製を行った。
【００９９】
［方法］
〔１〕ヒトＥＳ細胞を、セミコンフルエントの状態まで培養を行い、ＲＰＭＩ１６４０培養液（Wako社製）で３回洗浄後、２％ 「B-27 Supplement, minus insulin」（Life Technologies社製）及び１００ｎｇ／ｍＬ アクチビンＡ（R&D社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培養液中で４日間培養した。
〔２〕細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培養液（Wako社製）で３回洗浄後、２％ 「B-27 Supplement, minus insulin」及び２０ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ−４（R&D社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培養液中で４日間培養した。
〔３〕細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培養液（Wako社製）で３回洗浄後、２％ 「B-27 Supplement, minus insulin」及び４０ｎｇ／ｍＬ ＨＧＦ（Peprotech社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培養液中で４日間培養し、肝前駆細胞へ分化誘導した。
〔４〕０．１％ コラゲナーゼで処理し、肝前駆細胞を回収した。
〔５〕回収した肝前駆細胞を、７．５％ ＢＳＡFraction V溶液でコーティングした培養皿、又はUltra-Low Attachmentの培養皿に移し、浮遊培養用培養液中で約１か月間浮遊培養した。
〔６〕浮遊培養後の細胞を、実施例１の項目［方法：フローサイトメトリー解析及びセルソーティング］に記載の方法に従って、フローサイトメトリー解析を行った（図７参照）。
〔７〕フローサイトメトリー解析の結果、ＴＭＲＭ含量が高く、かつＣＤ１６６陰性の細胞分画（Ｐ４）と、ＴＭＲＭ含量が高く、かつＣＤ１６６陽性の細胞分画（Ｐ５）とを、実施例１の項目［方法：フローサイトメトリー解析及びセルソーティング］に記載の方法に従って、それぞれソーティングした。
〔８〕Ｐ４の細胞集団とＰ５の細胞集団を、それぞれマイトマイシンＣ処理済みのＭＥＦ上に播種し、実施例２に記載の肝細胞成熟化用培養液中で培養した。６日間培養した細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定処理した後、１次抗体（抗ＨＮＦ４α抗体及び抗アルブミン抗体［DAKO社製］）と、２次抗体（Alexa Fluor 546  donkey anti-goat IgG及びAlexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG）とを用いた間接蛍光抗体法を、定法に従って行った（図８参照）。また、細胞核は、ＤＡＰＩ染色した。
【０１００】
［結果］
肝実質細胞に特異的な因子であるＨＮＦ４α及びアルブミンは、ＴＭＲＭ含量が高く、かつＣＤ１６６陰性のＰ４の細胞集団においては、共に陰性であったのに対して、ＴＭＲＭ含量が高く、かつＣＤ１６６陽性のＰ５の細胞集団においては、共に陽性であることが確認された（図８参照）。
この結果は、ヒトＥＳ細胞由来の肝前駆細胞を長期間の浮遊培養によって、ＴＭＲＭ含量が多く（相対的ミトコンドリア活性が高く）、かつＣＤ１６６陽性の肝実質細胞集団が出現することを示すとともに、細胞における高いＴＭＲＭ含量と、ＣＤ１６６陽性とを指標として、肝実質細胞を、他の細胞と区別して、単離・精製できることを示している。
【実施例４】
【０１０１】
４．ヒトｉＰＳ細胞から肝細胞分化誘導した細胞からの肝実質細胞の精製及び未分化細胞が除去されていることの確認
ヒトＥＳ細胞に代えて、ヒトｉＰＳ細胞を用いて肝実質細胞へ分化誘導した。具体的には、ヒトｉＰＳ細胞を、文献「Stem Cell Reports. 2015 May 12;4(5):939-52」に記載の方法を参考にして、肝実質細胞へ分化、成熟させた（以下の手順〔１〕〜〔５〕参照）。その後、以下の手順〔６〕〜〔１０〕に従って、肝実質細胞が精製できることを確認した。
【０１０２】
［方法］
〔１〕ヒトｉＰＳ細胞を内胚葉へ分化誘導するため、ヒトｉＰＳ細胞における培養液を、２％ 「B-27 Supplement, minus insulin」、１％ GlutaMAX、及び３〜６μＭ ＧＳＫ−３阻害剤（CHIR-99021［Cat. NO.HY-10182、medchemexpress社製］）を含むＲＰＭＩ１６４０培養液に交換し、２４時間培養した。
〔２〕培養液を、２％ 「B-27 Supplement, minus insulin」を含むＲＰＭＩ１６４０培養液に交換し、さらに２４時間培養した。
〔３〕培養液を、２％ 「B-27 Supplement, minus insulin」、１％ GlutaMAX、及び１％ ＤＭＳＯ（Wako社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培養液に交換し、５日間培養することにより、肝前駆細胞へ分化誘導した。
〔４〕細胞剥離液（TrypLE Select［Life Technologies社製］）で処理し、肝前駆細胞を剥離・回収した。
〔５〕回収した肝前駆細胞を、マトリゲル（Growth Factor Reduced；Corning社製）をコーティングした培養皿に播種し、肝細胞成熟化用培養液（８．３％ 「tryptose phosphate broth solution」、０．５８％ ＩＴＳ、１％ GlutaMAX、５％ ＦＢＳ、１０μＭ ヒドロコルチゾン２１−ヘミサクシネート、１００ｎＭ  デキサメタゾン、及び５０μｇ／ｍＬ Ｌ−アスコルビン酸ナトリウムと、１００ｎＭ dihexa又は４０ｎｇ／ｍＬ ＨＧＦとを含むLeibovitz’s L-15培養液）中で、約２０日間培養した。
〔６〕培養後の細胞を、ＰＢＳ（−）で洗浄後、０．０８３％ トリプシン、０．１％ コラゲナーゼ、１０μＭ Ｙ−２７６３２、２０ｎＭ サイクロスポリンＡ、及び５０μｇ／ｍＬ Ｌ−アスコルビン酸ナトリウムを含むＡｄｓ緩衝液中で、３７℃で保温しながら細胞が剥離するまでシェーカーで水平旋回（約２００ｒｐｍ）させた。剥離後、ピペッティングにより単一の状態の細胞を得た。
〔７〕ＴＭＲＭを、ヒドロコルチゾン２１−ヘミサクシネート、アスコルビン酸ナトリウム、dihexa、及びＨＧＦを除いた肝細胞成熟化用培養液に、終濃度１００ｎＭとなるように調製後、上記〔６〕で得られた単一の状態の細胞を添加し、３７℃で約３０分間、染色した。
〔８〕フルオレセインで標識された抗ＣＤ１６６抗体（Cat No.:FAB1172F、R&D社製）を用いて抗原・抗体反応を氷冷条件下で行った。
〔９〕細胞における蛍光強度の測定を、セルソーター（FACS ariaIII［BD社製］）を用いて行った。また、セルソーター（FACS ariaIII［BD社製］）を用いて、ＴＭＲＭ含量が高く、かつＣＤ１６６陰性の細胞分画（Ｐ４）と、ＴＭＲＭ含量が高く、かつＣＤ１６６陽性の細胞分画（Ｐ５）とをソーティングした（図９参照）。なお、セルソーター（FACS ariaIII［BD社製］）における蛍光パラメーターのVoltageとThresholdは、実施例１と同様に設定した。
〔１０〕Ｐ４のＣＤ１６６陰性細胞集団と、Ｐ５のＣＤ１６６陽性細胞集団について、肝実質細胞に特異的な３種類の遺伝子（ＨＮＦ４Ａ遺伝子、ＡＦＰ遺伝子、及びＡＬＢ遺伝子）のｍＲＮＡの発現レベルと、未分化マーカー遺伝子（ＰＯＵ５Ｆ１［variant 1］）のｍＲＮＡの発現レベルをソーティング前の細胞と比較、解析するために、実施例１の［方法：定量ＰＣＲ解析］に記載の方法に従って、定量ＰＣＲ解析を行った（図１０及び１１参照）。また、未分化マーカー遺伝子（ＰＯＵ５Ｆ１［variant 1］）については、購入したヒト胎児肝臓のＲＮＡ（Clontech）も追加して、解析を行った。また、Ｐ４のＣＤ１６６陰性細胞集団と、Ｐ５のＣＤ１６６陽性細胞集団とを、それぞれＭＥＦ上に播種し、２０ｎＭ サイクロスポリンＡ及び０．１ｍＭ Trolox（CALBIOCHEM社製）を含む肝細胞成熟化用培養液中で約１週間培養した。培養後の細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定処理した後、１次抗体（抗ヒト核抗体［CHEMICON社製］及び抗アルブミン抗体）と、２次抗体（Alexa Fluor 546 donkey anti-mouse IgG及びAlexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG）とを用いた間接蛍光抗体法を、定法に従って行った（図１２参照）。
【０１０３】
［結果］
定量ＰＣＲ解析の結果、肝実質細胞に特異的な３種類の遺伝子（ＨＮＦ４Ａ遺伝子、ＡＦＰ遺伝子、及びＡＬＢ遺伝子）のｍＲＮＡの発現レベルは、ソーティング前の細胞や、Ｐ４のＣＤ１６６陰性細胞集団と比べ、Ｐ５のＣＤ１６６陽性細胞集団の方が高いことが確認された（図１０参照）。また、未分化マーカー遺伝子（ＰＯＵ５Ｆ１［variant 1］）のｍＲＮＡの発現レベルは、ソーティング前の細胞と比べ、Ｐ５のＣＤ１６６陽性細胞集団の方が低く、Ｐ５のＣＤ１６６陽性細胞集団における発現レベルは、胎児肝臓と同レベルまで低下していた（図１１参照）。
【０１０４】
また、間接蛍光抗体法を実施後、蛍光顕微鏡で５視野のヒト核陽性細胞数とアルブミン（肝実質細胞に特異的な因子）陽性細胞数をカウントし、アルブミン陽性細胞数の割合を算出した結果、Ｐ４のＣＤ１６６陰性細胞集団では、０％であったのに対して、Ｐ５のＣＤ１６６陽性細胞集団では９７±０．３８％と顕著に多かった（図１２参照）。
【０１０５】
これらの結果は、ヒトｉＰＳ細胞から肝細胞分化誘導した細胞には、ＴＭＲＭ含量が多く（相対的ミトコンドリア活性が高く）、かつＣＤ１６６陽性の肝実質細胞集団が含まれていることを示すとともに、細胞における高いＴＭＲＭ含量と、ＣＤ１６６陽性とを指標として、肝実質細胞を、未分化細胞等の他の細胞と区別して、単離・精製できることを示している。
【実施例５】
【０１０６】
５．ＴＭＲＭ以外のミトコンドリア標識試薬の検討
実施例１〜４において、生細胞に対するミトコンドリア標識にＴＭＲＭを使用した。今回、ヒトｉＰＳ細胞から肝細胞分化誘導した細胞を固定し、相対的なミトコンドリア含有量の検出をミトコンドリア電子伝達系複合体の一つであるComplex IVに対する抗体（抗Complex IV体；invitrogen社製）を用いて行った。同時に、抗体によるＣＤ１６６及びＨＮＦ４αの検出を行い、ミトコンドリア含有量とＣＤ１６６の発現量の違いにより、ＨＮＦ４αの発現量の違いをＦＡＣＳ解析により調べた。
【０１０７】
まず、ヒトｉＰＳ細胞を、２つの培養基質（iMatrix-511及びマトリゲル［Growth Factor Reduced］）でコーティングした培養皿上で数日間培養した後、実施例４に記載した方法に従って肝前駆細胞へ分化誘導した。肝前駆細胞から、肝実質細胞への成熟化は、実施例４のような細胞の剥離処理及びマトリゲル上への播種処理は行わず、培養液を肝細胞成熟化用培養液へ交換することにより行った。肝前駆細胞を、肝細胞成熟化用培養液中で約２０日間培養した後、実施例４に記載した方法に従って単一の状態の細胞を得た。
【０１０８】
次に、フローサイトメトリー解析の際に死細胞除去を行うため、固定前の細胞をＤＡＰＩ染色した。その後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、１次抗体（抗ＣＤ１６６抗体、抗Complex IV抗体、及び抗ＨＮＦ４α抗体）反応処理と、２次抗体（Alexa Flour 633 donkey anti goat、Alexa Flour 488 donkey anti mouse、及びAlexa Flour 546 donkey anti rabbit）反応処理を行った後、フローサイトメトリー解析を行った（図１３参照）。なお、ネガティブコントロールとして、２次抗体反応処理のみを行ったサンプル（図１４Ａの「ＮＣ」）についても同様に、フローサイトメトリー解析を行った。
【０１０９】
その結果、Complex IVの蛍光強度が高く、かつＣＤ１６６陽性の細胞集団（Ｐ５）は、他の細胞分画（Ｐ６〜Ｐ８）における細胞集団と比べ、肝実質細胞に特異的なＨＮＦ４α発現レベルの高い細胞が顕著に多かった（図１４参照）。
この結果は、Complex IVの高発現と、ＣＤ１６６陽性を指標として、ヒトｉＰＳ細胞を肝細胞分化誘導した細胞から肝実質細胞を、他の細胞と区別して、単離・精製できることを示している。Complex IVの免疫染色によって、直接ミトコンドリアを定量化した場合も、ＴＭＲＭ染色と同様の結果を得ることが出来たことから、細胞のミトコンドリア含有量を示す方法であれば、本法には活用可能であることが示された。また、実施例１〜４の結果を総合すると、肝実質細胞は、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は相対的ミトコンドリア膜電位が高く、かつ、ＣＤ１６６が陽性及び/又は、指標ｂが陽性であることを指標として単離・精製できることを示している。
【実施例６】
【０１１０】
６．肝実質細胞特異的な細胞表面マーカーの探索
ＣＤ１６６以外の肝実質細胞特異的な細胞表面マーカーを探索するために、マイクロアレイ解析を行った。
具体的には、実施例１において、Ｐ４のＣＤ１６６陰性細胞集団ら抽出した全ＲＮＡと、Ｐ５のＣＤ１６６陽性細胞集団から抽出した全ＲＮＡを基に、マイクロアレイ解析を東レ株式会社に委託して行った（Human 25k ver2.10）。
【０１１１】
Ｐ４のＣＤ１６６陰性細胞集団におけるｍＲＮＡの発現量に対してＰ５のＣＤ１６６陽性細胞集団におけるｍＲＮＡの発現量が２倍以上であった細胞表面に存在する分子をコードする遺伝子を選択したところ、表２に示す遺伝子が同定された。
【０１１２】
そこで、表２に示す遺伝子のうち、ＥＰＣＡＭに対する抗体（抗ＥＰＣＡＭ抗体；Novocastra社製）を用いて、実施例４に記載の方法を行い、肝実質細胞を分離・精製できるかどうか検討した。
【０１１３】
フローサイトメトリー解析の結果（図１５参照）、ＴＭＲＭ含量が高く、かつＥＰＣＡＭ陽性の細胞分画（Ｐ５）と、ＴＭＲＭ含量が低く、かつＥＰＣＡＭ陰性の細胞分画（Ｐ６）と、ＴＭＲＭ含量が低く、かつＥＰＣＡＭ陽性の細胞分画（Ｐ７）とを、それぞれソーティングし、実施例１に記載した方法で定量ＰＣＲ解析行ったところ、肝実質細胞に特異的な３種類の遺伝子（ＨＮＦ４Ａ遺伝子、ＡＦＰ遺伝子、及びＡＬＢ遺伝子）のｍＲＮＡの発現レベルは、Ｐ６のＥＰＣＡＭ陰性細胞集団や、Ｐ７のＥＰＣＡＭ陽性細胞集団と比べ、Ｐ５のＣＤ１６６陽性細胞集団の方が高いことが確認された（図１６参照）。
【０１１４】
この結果は、ＴＭＲＭ含量と、ＴＭＲＭ等の表２に記載の細胞表面分子が陽性であることを指標として、肝実質細胞を、他の細胞と区別して、単離・精製できることを示している。
【０１１５】
【表２−１】
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【０１１６】
【表２−２】
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【０１１７】
【表２−３】
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【０１１８】
【表２−４】
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表中の「Ｐ５のＣＤ１６６陽性細胞集団／Ｐ４のＣＤ１６６陰性細胞集団」は、図１ｂの「Ｐ４のＣＤ１６６陰性細胞集団」における遺伝子発現量に対する「Ｐ５のＣＤ１６６陽性細胞集団」における遺伝子発現量の比率を示す。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明によれば、肝実質細胞を高精度で検出することができる肝実質細胞の検出方法や、肝実質細胞を高純度、かつ、高収率で精製することができる肝実質細胞の選択方法や、肝実質細胞を高純度、かつ、高収率で精製することができる肝実質細胞の製造方法等を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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