(57)【要約】【課題】新規な化粧料と抗炎症剤、肌荒れ防止剤、美白剤、にきび改善剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、基底膜タンパク産生促進剤、基底膜タンパク分解抑制剤、シワ改善又は抑制剤、皮膚のたるみ・はり改善剤、フケ改善剤、育毛剤を提供することを課題とする。【解決手段】配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのアミノ酸配列に対し９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含有する、化粧料、抗炎症剤、肌荒れ防止剤、美白剤、にきび改善剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、基底膜タンパク産生促進剤、基底膜タンパク分解抑制剤、シワ改善又は抑制剤、皮膚のたるみ・はり改善剤、フケ改善剤、育毛剤。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのアミノ酸配列に対し９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含有する、化粧料。
【請求項２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのアミノ酸配列に対し９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含有する、抗炎症剤。
【請求項３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのアミノ酸配列に対し９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含有する、肌荒れ防止剤。
【請求項４】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのアミノ酸配列に対し９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含有する、美白剤。
【請求項５】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのアミノ酸配列に対し９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含有する、にきび改善剤。
【請求項６】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのアミノ酸配列に対し９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含有する、フケ改善剤。
【請求項７】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのアミノ酸配列に対し９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含有する、育毛剤。
【請求項８】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのアミノ酸配列に対し９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含有する、コラーゲン及び／又はヒアルロン酸の産生促進剤、基底膜タンパクの産生促進剤、基底膜タンパクの分解抑制剤、シワ改善又は抑制剤、皮膚のたるみ・はり改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧料及び抗炎症剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸配列ＧＲＬＫＲＭＧＥＲＬＫＲＫＩＱＫＷＩＲＷからなるポリペプチドが抗菌作用を有することが知られており、このポリペプチドを含有する抗菌剤、抗真菌剤または消毒剤、及び、熱傷、褥瘡、創傷、皮膚潰瘍、下肢潰瘍、糖尿病性潰瘍、閉塞性動脈疾患及び閉塞性動脈硬化症、蜂巣炎、急性リンパ管炎、リンパ節炎、丹毒、皮膚膿瘍、壊死性皮下感染、ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群（ＳＳＳＳ）、毛包炎、フルンケル（面疔）、化膿性汗腺炎、カルブンケル（癰）、感染性爪囲炎、紅色陰癬及び重症感染症（敗血症）から成る群から選択される疾患の予防、改善又は治療剤が提案されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１０１２３７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
新規な化粧料と抗炎症剤、肌荒れ防止剤、美白剤、にきび改善剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、基底膜タンパク産生促進剤、基底膜タンパク分解抑制剤、シワ改善又は抑制剤、皮膚のたるみ・はり改善剤、フケ改善剤、育毛剤を提供することを課題とする。特に、化粧料としては、肌荒れ防止剤、美白剤、にきび改善剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、基底膜タンパク産生促進剤、基底膜タンパク分解抑制剤、シワ改善又は抑制剤、皮膚のたるみ・はり改善剤等の皮膚化粧料、フケ改善剤、育毛剤等の毛髪化粧料を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の課題を解決するための手段は、次のとおりである。
１．配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのアミノ酸配列に対し９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含有する、化粧料。
２．配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのアミノ酸配列に対し９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含有する、抗炎症剤。
３．配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのアミノ酸配列に対し９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含有する、肌荒れ防止剤。
４．配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのアミノ酸配列に対し９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含有する、美白剤。
５．配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのアミノ酸配列に対し９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含有する、にきび改善剤。
６．配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのアミノ酸配列に対し９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含有する、フケ改善剤。
７．配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのアミノ酸配列に対し９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含有する、育毛剤。
８．配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのアミノ酸配列に対し９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含有する、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸の産生促進剤、基底膜タンパクの産生促進剤、基底膜タンパクの分解抑制剤、シワ改善又は抑制剤、皮膚のたるみ・はり改善剤。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のポリペプチドを用いることにより、化粧料、抗炎症剤、肌荒れ防止剤、美白剤、にきび改善剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、基底膜タンパク産生促進剤、基底膜タンパク分解抑制剤、シワ改善又は抑制剤、皮膚のたるみ・はり改善剤、フケ改善剤、育毛剤を提供することができた。特に、化粧料としては、肌荒れ防止剤、美白剤、にきび改善剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、基底膜タンパク産生促進剤、基底膜タンパク分解抑制剤、シワ改善又は抑制剤、皮膚のたるみ・はり改善剤等の皮膚化粧料、フケ改善剤、育毛剤等の毛髪化粧料を提供することができた。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】実施例１において、ＰＭＡで惹起した炎症により発現するＴＮＦ−αの発現量を示すグラフ。
【図２】実施例１において、ＰＭＡで惹起した炎症により発現するＭＭＰ−９の発現量を示すグラフ。
【図３】実施例１において、ＰＭＡで惹起した炎症により発現するＮＧＡＬの発現量を示すグラフ。
【図４】実施例１において、ＰＭＡで惹起した炎症により発現するＩＬ−８の発現量を示すグラフ。
【図５】実施例２において、Ｐ．ａｃｎｅｓの死菌で惹起した炎症により発現するＭＭＰ−９の発現量を示すグラフ。
【図６】実施例２において、Ｐ．ａｃｎｅｓの死菌で惹起した炎症により発現するＮＧＡＬの発現量を示すグラフ。
【図７】実施例３において、Ｍａｌａｓｅｚｚｉａの死菌で惹起した炎症により発現するＭＭＰ−９の発現量を示すグラフ。
【図８】実施例３において、Ｍａｌａｓｅｚｚｉａの死菌で惹起した炎症により発現するＮＧＡＬの発現量を示すグラフ。
【図９】実施例３において、Ｍａｌａｓｅｚｚｉａの死菌で惹起した炎症により発現するＩＬ−６の発現量を示すグラフ。
【図１０】実施例３において、Ｍａｌａｓｅｚｚｉａの死菌で惹起した炎症により発現するＩＬ−８の発現量を示すグラフ。
【図１１】実施例４において、外毛根鞘細胞の増殖率を示すグラフ。
【図１２】実施例５において、線維芽細胞のヒトプロコラーゲンＩ型Ｃ末端ペプチド産生量を示すグラフ。
【図１３】実施例５において、線維芽細胞のヒアルロン酸産生量を示すグラフ。
【図１４】実施例６において、ケラチノサイトの基底膜タンパク産生量を示すグラフ。
【図１５】実施例６において、ケラチノサイトの基底膜分解酵素産生量を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、下記配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはそのアミノ酸配列に対し９５％以上の相同性を有するポリペプチドを使用することを特徴とする。
配列番号１：ＧＲＬＫＲＭＧＥＲＬＫＲＫＩＱＫＷＩＲＷ
【０００９】
なお、本発明で使用するポリペプチドは、既知の抗菌活性物質であるが、抗炎症作用、肌荒れ防止作用、美白作用、にきび改善作用、コラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用、基底膜タンパク産生促進作用、基底膜タンパク分解抑制作用、シワ改善又は抑制作用、皮膚のたるみ・はり改善作用、フケ改善作用、育毛作用を有することは、これまでに知られていない新規な知見である。
そして、本発明は、このポリペプチドの抗炎症作用、肌荒れ防止作用、美白作用、にきび改善作用、コラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用、基底膜タンパク産生促進作用、基底膜タンパク分解抑制作用、シワ改善又は抑制作用、皮膚のたるみ・はり改善作用、フケ改善作用、育毛作用を利用した化粧料と抗炎症剤、肌荒れ防止剤、美白剤、にきび改善剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、基底膜タンパク産生促進剤、基底膜タンパク分解抑制剤、シワ改善又は抑制剤、皮膚のたるみ・はり改善剤、フケ改善剤、育毛剤に関する。本発明の化粧料としては、にきび改善剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、基底膜タンパク産生促進剤、基底膜タンパク分解抑制剤、シワ改善又は抑制剤、皮膚のたるみ・はり改善剤等の皮膚化粧料、フケ改善剤、育毛剤等の毛髪化粧料が挙げられる。
【００１０】
本発明で使用するポリペプチドは、アミノ末端（Ｎ末端）及び／又はカルボキシル末端（Ｃ末端）が修飾されていてもよい。
本発明のポリペプチドは、キャッピング構造が付加されていてもよい。ここで、キャッピング構造は、ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に付加し、反応性を失わせる構造である。
本発明で使用するポリペプチドは、市販のペプチド合成機を用いた化学合成等の常法により製造することができる。また、末端修飾も、周知の方法により行うことができる。
【００１１】
本発明で使用するポリペプチドは、抗炎症作用、肌荒れ防止作用、美白作用を有するので、抗炎症、肌荒れ防止、美白を目的とする医薬品、医薬部外品、皮膚化粧料、毛髪化粧料として用いることができる。
本発明で使用するポリペプチドは、抗炎症作用を有するので、抗炎症を目的とする医薬品、医薬部外品、皮膚化粧料、毛髪化粧料として用いることができる。
本発明で使用するポリペプチドは、肌荒れ防止作用、美白作用を有するので、肌荒れ防止、美白を目的とする医薬品、医薬部外品、皮膚化粧料、毛髪化粧料として用いることができる。
【００１２】
本発明の抗炎症剤を医薬品、医薬部外品、皮膚化粧料、毛髪化粧料として用いる場合は、皮膚外用剤、皮膚洗浄剤、毛髪洗浄剤、育毛剤、洗口剤、うがい薬、点眼剤、貼付剤、毛髪化粧料、メイクアップ化粧料等として用いることができる。
本発明の肌荒れ防止剤を医薬品、医薬部外品、皮膚化粧料、毛髪化粧料として用いる場合は、皮膚外用剤、皮膚洗浄剤、毛髪洗浄剤、育毛剤、毛髪化粧料、メイクアップ化粧料等として用いることができる。
本発明の美白剤を医薬品、医薬部外品、皮膚化粧料、毛髪化粧料として用いる場合は、皮膚外用剤、メイクアップ化粧料等として用いることができる。
【００１３】
本発明のにきび改善剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、基底膜タンパク産生促進剤、基底膜タンパク分解抑制剤、シワ改善又は抑制剤、皮膚のたるみ・はり改善剤、フケ改善剤、育毛剤を医薬品、医薬部外品、皮膚化粧料、毛髪化粧料として用いる場合は、皮膚外用剤、皮膚洗浄剤、毛髪洗浄剤、育毛剤、毛髪化粧料、メイクアップ化粧料として用いることができる。
【実施例】
【００１４】
以下、本発明を実施例に基づき説明する。
実施例において、ポリペプチドとして、ＧＲＬＫＲＭＧＥＲＬＫＲＫＩＱＫＷＩＲＷ−ａｍｉｄｅ（以下、ポリペプチド１という）を使用した。
【実施例１】
【００１５】
１．ホルボール  １２−ミリスタート  １３−アセタート（以下、ＰＭＡという。）による炎症に対する抗炎症効果
表皮角化細胞にＰＭＡ刺激により炎症を惹起させ、ポリペプチド１による２４時間後の炎症関連タンパクの変化を検討した。
【００１６】
１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／２ｍｌとなるように調整した正常ヒト新生児ケラチノサイト（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）（以下ＨＥＫｎとする）を、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２増殖添加剤セット（５００ｍｌ用）（倉敷紡績株式会社製）を添加したＥｐｉ−Ｌｉｆｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）（以下Ｅｐｉ−Ｌｉｆｅ・ＫＧ２培地という。）で、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内でサブコンフルエントになるまで培養した。
培養後、Ｅｐｉ−Ｌｉｆｅ・ＫＧ２培地にＰＭＡを５０ｎｇ／ｍｌ、ポリペプチド１を０．００１％添加した培養液に培地交換し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。なお、ポリペプチド１を添加していないものをｃｏｎｔｒｏｌとした。
２４時間培養後、培養上清を回収し、培養上清中のＴＮＦ−α、ＭＭＰ−９、ＮＧＡＬ、ＩＬ−８量をＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定した。結果を図１〜４に示す。
【００１７】
（結果）
図１に示したように、ＰＭＡ刺激による炎症により、ＴＮＦ−αが３８ｐｇ／ｍｌ発現した。しかし、ポリペプチド１を０．００１％添加することにより、ＰＭＡを添加しても、ＴＮＦ−αの発現量は８ｐｇ／ｍｌと小さくなり、炎症が抑制できた。
図２に示したように、ＰＭＡ添加前はＭＭＰ−９の発現量が１７１ｐｇ／ｍｌであったが、ＰＭＡ添加後の炎症により、ＭＭＰ−９が１６５０ｐｇ／ｍｌと増大した。一方、ポリペプチド１を０．００１％添加することにより、ＰＭＡを添加してもＭＭＰ−９の発現量は２７７ｐｇ／ｍｌと、ＰＭＡ添加前と同程度となり、炎症が抑制できた。
図３に示したように、ＰＭＡ添加前はＮＧＡＬの発現量が６８１５ｐｇ／ｍｌであったが、ＰＭＡ添加後の炎症により、ＮＧＡＬが１２２３６ｐｇ／ｍｌと増大した。一方、ポリペプチド１を０．００１％添加することにより、ＰＭＡを添加してもＮＧＡＬの発現量は８３４０ｐｇ／ｍｌとＰＭＡ添加前と近い値となり、炎症が抑制できた。
図４に示したように、ＰＭＡ添加前はＩＬ−８の発現量が９４ｐｇ／ｍｌであったが、ＰＭＡ添加後の炎症により、ＩＬ−８が５１８０ｐｇ／ｍｌと増大した。一方、ポリペプチド１を０．００１％添加することにより、ＰＭＡを添加してもＩＬ−８の発現量は２７３６ｐｇ／ｍｌと小さくなり、炎症が抑制できた。
【実施例２】
【００１８】
２．Ｐ．ａｃｎｅｓ死菌による炎症に対する抗炎症効果
佐藤らの報告（Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ．３４（２），２９５−２９９，（２０１１））を参考に、ニキビの原因菌であるＰ．ａｃｎｅｓの死菌を使用した炎症の系を用いて、表皮角化細胞での抗炎症作用を検討した。
ＮＧＡＬはニキビの部位にて増加するタンパクとして知られている（Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１６５（２），３０２−３１０，（２０１１））。
表皮角化細胞にＰ．ａｃｎｅｓの死菌刺激により炎症を惹起させ、ポリペプチド１による２４時間後の炎症関連タンパクの変化を検討した。
【００１９】
アクネ菌としては、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ（ＮＢＲＣ１０７６０５）を用いた。ＧＡＭ寒天培地を用いて３５℃、５日間嫌気培養した後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に分散し、菌数を測定した。菌数測定後、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（−）で３０ｍｉｎ振とうしながら固定し、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、ＰＢＳ（−）に分散させてアクネ菌死菌溶液とした。
１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／２ｍｌとなるように調整したＨＥＫｎをＥｐｉ−Ｌｉｆｅ・ＫＧ２培地で３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内でサブコンフルエントになるまで培養した。
培養後、Ｅｐｉ−Ｌｉｆｅ・ＫＧ２培地にアクネ菌死菌溶液を１×１０８ｃｆｕ／ｍｌの濃度となるように、またポリペプチド１をそれぞれ０．０００１％、０．０００５％、０．００１％添加した培養液に培地交換し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。なおポリペプチド１を添加していないものをｃｏｎｔｒｏｌとした。
２４時間培養後、培養上清を回収し、培養上清中のＭＭＰ−９、ＮＧＡＬ量をＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定した。結果を図５、６に示す。
【００２０】
（結果）
図５に示したように、Ｐ．ａｃｎｅｓの死菌添加前はＭＭＰ−９の発現量が４２８ｐｇ／ｍｌであったが、Ｐ．ａｃｎｅｓの死菌添加後の炎症により、ＭＭＰ−９が１４３２ｐｇ／ｍｌと増大した。一方、ポリペプチド１を０．０００１％、０．０００５％、０．００１％添加することにより、Ｐ．ａｃｎｅｓの死菌を添加してもＭＭＰ−９の発現量はそれぞれ７０１ｐｇ／ｍｌ、４９２ｐｇ／ｍｌ、３８５ｐｇ／ｍｌと小さくなり、添加量に依存して、炎症を抑制した。特に、ポリペプチド１を０．００１％添加することにより、Ｐ．ａｃｎｅｓの死菌の添加前後でＭＭＰ−９の発現量が変わらず、炎症を抑制できた。
図６に示したように、Ｐ．ａｃｎｅｓの死菌添加前はＮＧＡＬの発現量が５１００ｐｇ／ｍｌであったが、Ｐ．ａｃｎｅｓの死菌添加後の炎症により、ＮＧＡＬが７４３９ｐｇ／ｍｌと増大した。一方、ポリペプチド１を０．０００１％、０．０００５％、０．００１％添加することにより、Ｐ．ａｃｎｅｓの死菌を添加してもＮＧＡＬの発現量はそれぞれ５８１５ｐｇ／ｍｌ、６２９０ｐｇ／ｍｌ、５２１８ｐｇ／ｍｌと小さくなり、炎症を抑制できた。特に、ポリペプチド１を０．００１％添加することにより、Ｐ．ａｃｎｅｓの死菌の添加前後でＮＧＡＬの発現量が変わらず、炎症を抑制できた。
すなわち、ポリペプチド１は、Ｐ．ａｃｎｅｓ死菌による炎症に対する抗炎症効果があり、にきび改善作用を有することが確認できた。
【実施例３】
【００２１】
３．Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ死菌による炎症に対する抗炎症効果
脂漏性皮膚炎やマラセチア毛包炎、フケの原因菌となるＭａｌａｓｓｅｚｉａ  ｆｕｒｆｕｒの死菌を使用した炎症の系を用いて、表皮角化細胞での抗炎症作用を検討した。
ＩＬ−６、ＩＬ−８はマラセチア菌との共培養により増加するタンパクとして知られている。（ＦＦＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４，２０３−２１４，（２００８））
表皮角化細胞にＭａｌａｓｓｅｚｉａ死菌刺激により炎症を惹起させ、ポリペプチド１による２４時間後の炎症関連タンパクの変化を検討した。
【００２２】
Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ菌としては、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｆｕｒｆｕｒ（ＮＢＲＣ０６５６）を用いた。ＧＰＬＰ寒天培地を用いて３０℃、５日間培養した後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に分散し、菌数を測定した。菌数測定後、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（−）で３０ｍｉｎ振とうしながら固定し、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、ＰＢＳ（−）に分散させてＭａｌａｓｓｅｚｉａ菌死菌溶液とした。
１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／２ｍｌとなるように調整したＨＥＫｎをＥｐｉ−Ｌｉｆｅ・ＫＧ２培地で３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内でサブコンフルエントになるまで培養した。
培養後、Ｅｐｉ−Ｌｉｆｅ・ＫＧ２培地にＭａｌａｓｓｅｚｉａ菌死菌溶液を１×１０７ｃｆｕ／ｍｌの濃度となるように、またポリペプチド１を０．０００２５％、０．０００５％、０．００１％添加した培養液に培地交換し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。なおポリペプチド１を添加していないものをｃｏｎｔｒｏｌとした。
２４時間培養後、培養上清を回収し、培養上清中のＭＭＰ−９、ＮＧＡＬ、ＩＬ−６、ＩＬ−８量をＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定した。結果を図７〜１０に示す。
【００２３】
（結果）
図７に示したように、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａの死菌添加前はＭＭＰ−９の発現量が８８ｐｇ／ｍｌであったが、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａの死菌添加後の炎症により、ＭＭＰ−９が３５４ｐｇ／ｍｌと増大した。一方、ポリペプチド１を０．０００２５％、０．０００５％、０．００１％添加することにより、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａの死菌を添加してもＭＭＰ−９の発現量はそれぞれ１６５ｐｇ／ｍｌ、１１０ｐｇ／ｍｌ、９５ｐｇ／ｍｌと小さくなり、添加量に依存して、炎症を抑制できた。特に、ポリペプチド１を０．０００５％、０．００１％添加することにより、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａの死菌の添加前後でＭＭＰ−９の発現量がほぼ同じ値を示し、炎症が抑制された。
図８に示したように、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａの死菌添加前はＮＧＡＬの発現量が４２８３ｐｇ／ｍｌであったが、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａの死菌添加後の炎症により、ＮＧＡＬが５０７２ｐｇ／ｍｌと増大した。一方、ポリペプチド１を０．０００２５％、０．０００５％、０．００１％添加することにより、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａの死菌を添加してもＮＧＡＬの発現量はそれぞれ４４２５ｐｇ／ｍｌ、４５８１ｐｇ／ｍｌ、３７２６ｐｇ／ｍｌと小さくなり、炎症を抑制できた。
図９に示したように、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａの死菌添加後の炎症により、ＩＬ−６が１６ｐｇ／ｍｌと増大した。一方、ポリペプチド１を０．０００２５％、０．０００５％、０．００１％添加することにより、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａの死菌を添加してもＩＬ−６の発現量は２ｐｇ／ｍｌ、１ｐｇ／ｍｌ、検出限界以下と小さく、添加量に依存して、炎症を抑制できた。
図１０に示したように、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａの死菌添加前はＩＬ−８の発現量が１１９ｐｇ／ｍｌであったが、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａの死菌添加後の炎症により、ＩＬ−８が４７０ｐｇ／ｍｌと増大した。一方、ポリペプチド１を０．０００２５％、０．０００５％、０．００１％添加することにより、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａの死菌を添加してもＩＬ−８の発現量はそれぞれ１０２ｐｇ／ｍｌ、１１１ｐｇ／ｍｌ、８６ｐｇ／ｍｌと小さく、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａの死菌添加前と同程度であり、炎症を抑制できた。
すなわち、ポリペプチド１は、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｆｕｒｆｕｒの死菌による炎症に対する抗炎症効果があり、フケの改善作用があることが確認できた。
【実施例４】
【００２４】
４．外毛根鞘細胞の増殖促進作用
毛髪の毛球から毛包の全長に存在している外毛根鞘細胞の増殖促進作用を検討した。
毛包外毛根鞘細胞 （Ｈａｉｒ  Ｏｕｔｅｒ  Ｒｏｏｔ  Ｓｈｅａｔｈ  Ｃｅｌｌｓ  以下「ＯＲＳ」、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、９６−ｗｅｌｌプレートに２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種して、２４時間培養した。培養後、培地を除去して、ポリペプチド１を添加したポリペプチド１含有ＭＳＣＭ培地に替えた。
ポリペプチド１は、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に付属の５％牛胎児血清を添加した培地（以下ＭＳＣＭ培地という。）で、０．０００３１２５、０．０００６２５、０．００１２５質量％となるよう希釈してポリペプチド１含有ＭＳＣＭ培地を調製した。
サンプル添加処理から２４時間後に培養上清を回収し、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（同仁化学研究所）を用いてＷＳＴ−１  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙにより細胞増殖率を算出した。結果を図１１に示す。
【００２５】
（結果）
図１１に示したように、ポリペプチド１を添加しなかった外毛根鞘細胞に比べて、ポリペプチド１を０．０００３１２５、０．０００６２５、０．００１２５質量％となるよう希釈したポリペプチド１含有ＭＳＣＭ培地を添加した外毛根鞘細胞は、それぞれ１０６．９２、１１４．３３、１１８．１８％と、増殖率が増大した。
すなわち、ポリペプチド１は、外毛根鞘細胞の増殖を促進し、育毛作用があることが確認できた。
【実施例５】
【００２６】
５．コラーゲンとヒアルロン酸の産生促進作用
線維芽細胞に対するヒトプロコラーゲンＩ型Ｃ末端ペプチドとヒアルロン酸の産生促進効果を検討した。
新生児由来正常ヒト線維芽細胞（Ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ以下「ＮＨＤＦ」、ＬＯＮＺＡ）は、２４−ｗｅｌｌプレートに４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種して、６日間培養した。培養後、培地を除去して、ポリペプチド１を添加したポリペプチド１含有ＤＭＥＭ培地に替えた。
ポリペプチド１は、０．５％牛胎児血清（株式会社ニチレイバイオサイエンス）、および１％（ｖ／ｖ）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）含有ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地（ＧＩＢＣＯ）（以下ＤＭＥＭ培地という。）で、０．０００１、０．００１質量％となるよう希釈してポリペプチド１含有ＤＭＥＭ培地を調製した。
サンプル添加処理から２４時間後に培養上清を回収し、培養上清中のヒトプロコラーゲンＩ型Ｃ末端ペプチド（タカラバイオ）とヒアルロン酸量（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をそれぞれＥＬＩＳＡキットで測定した。また、細胞をＭＴＴ  Ａｓｓａｙにより細胞生存率を測定した。ＥＬＩＳＡにて算出した結果をＭＴＴ  Ａｓｓａｙにより算出した細胞生存率で割り返したものを結果として用いた。結果を図１２、１３に示す。
【００２７】
（結果）
図１２に示したように、ポリペプチド１を添加しなかった線維芽細胞に比べて、ポリペプチド１を０．０００１、０．００１質量％となるよう希釈したポリペプチド１含有ＤＭＥＭ培地を添加した線維芽細胞は、ヒトプロコラーゲンＩ型Ｃ末端ペプチドの産生量が、それぞれ１１０．３７、１２４．２４％と増大した。
図１３に示したように、ポリペプチド１を添加しなかった線維芽細胞に比べて、ポリペプチド１を０．００１質量％となるよう希釈したポリペプチド１含有ＤＭＥＭ培地を添加した線維芽細胞は、ヒアルロン酸の産生量が、１３２．３１％に増大した。
すなわち、ポリペプチド１は、ヒトプロコラーゲンＩ型Ｃ末端ペプチド及びヒアルロン酸の産生量を増大し、シワ改善、シワ抑制、皮膚のたるみ・はり改善作用があることが確認できた。
【実施例６】
【００２８】
６．基底膜タンパクの産生促進及び分解抑制作用
ケラチノサイトに対する４型コラーゲン、ラミニン３３２、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９の産生量を検討した。４型コラーゲンとラミニン３３２は表皮基底膜の構成成分であり、ＭＭＰ−２は４型コラーゲンとラミニン３３２の、ＭＭＰ−９は４型コラーゲンの分解酵素であることが知られている。
【００２９】
ＨＥＫｎを６−ｗｅｌｌプレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種して、Ｅｐｉ−Ｌｉｆｅ・ＫＧ２培地にてサブコンフルエントの状態まで培養した。培養後、培地を除去して、ポリペプチド１を添加したポリペプチド１含有Ｅｐｉ−Ｌｉｆｅ・ＫＧ２培地に替えた。
ポリペプチド１は、Ｅｐｉ−Ｌｉｆｅ・ＫＧ２培地で、０．０００１、０．００１質量％となるよう希釈してポリペプチド１含有Ｅｐｉ−Ｌｉｆｅ・ＫＧ２培地を調製した。
サンプル添加処理から２４時間後に培養上清を回収し、培養上清中のＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９量をＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定した。また細胞を１００μｌ  Ｌａｅｍｍｌｉ  ｂｕｆｆｅｒ（０．０９Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、３％  ＳＤＳ、１０．３％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に溶解し、３０分間４℃にてシェイカー上で細胞を溶解させた。
次いで、４°Ｃで１５，０００×ｇの条件で１０分間遠心分離した。上清を４×ＳＤＳ−ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒと混合し、９５°Ｃで３分間熱処理した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてタンパク質を分離した。ゲル内のタンパク質は、電気的にＰＶＤＦ膜に転写した。
【００３０】
転写後、膜をＳｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に浸し、約３０分間ブロッキングした。
次に、ＰＶＤＦ膜をＳｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒで２０００倍希釈した一次抗体（Ａｎｔｉ−Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ＩＶ、Ａｂｃａｍ、およびＡｎｔｉ−Ｌａｍｉｎｉｎ  ３３２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に浸し、４°Ｃで一晩反応させた。次いで、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）を用いて３回洗浄後、１０，０００倍希釈した二次抗体（Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＨＲＰ、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、およびＧｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＨＲＰ、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に浸し、室温で１時間反応させた。
ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＥＣＬ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、化学発光検出装置（ＬＡＳ−４０００  ｍｉｎｉ、富士フィルム株式会社）でシグナルを検出した。
検出されたバンドのシグナル強度を解析（Ｍｕｌｔｉ  Ｇａｕｇｅ、フジフィルム株式会社）し、コントロールに対する相対値を算出し４型コラーゲンおよびラミニン３３２の増加量を評価した。
結果を図１４、１５に示す。
【００３１】
（結果）
図１４に示したように、ポリペプチド１を添加しなかったケラチノサイトに比べて、ポリペプチド１を０．０００１質量％となるよう希釈したポリペプチド１含有Ｅｐｉ−Ｌｉｆｅ・ＫＧ２培地を添加したケラチノサイトは、４型コラーゲンとラミニン３３２の産生量が、それぞれ１４４．７５、１２９．９６％増大した。
図１５に示したように、ポリペプチド１を添加しなかったケラチノサイトに比べて、ポリペプチド１を０．０００１、０．００１質量％となるよう希釈したポリペプチド１含有Ｅｐｉ−Ｌｉｆｅ・ＫＧ２培地を添加したケラチノサイトは、４型コラーゲンとラミニン３３２の分解酵素であるＭＭＰ−２の産生量が、それぞれ９６．０９、７１．８３％に抑制され、４型コラーゲンの分解酵素であるＭＭＰ−９の産生量が、それぞれ６４．８８、７４．３９％に抑制された。
すなわち、ポリペプチド１は、基底膜タンパクの産生を促進するとともに、基底膜分解酵素の産生を抑制し、シワの改善・抑制作用、皮膚のたるみ・はり改善作用があることが確認できた。
【００３２】
処方例１  皮膚外用剤
成分                                              配合量（重量％）
１．本発明で使用するポリペプチド                  ０．０００１
２．精製水                                        １
３．ワセリン                                      残余
処方例２  皮膚洗浄料
成分                                              配合量（重量％）
１．本発明で使用するポリペプチド                  ０．００００１
２．ラウロイルグルタミン酸Ｎａ                  １５
３．ココイルグルタミン酸Ｋ                      １０
４．ココイルアスパラギン酸Ｎａ                    ５
５．ココイルメチルタウリンＮａ                    ２．４
６．スルホコハク酸ラウレス２Ｎａ                  ０．２
７．トリメチルグリシン                            ６
８．モノステアリン酸デカグリセリル                ０．５
９．変性デンプン                                  ０．４
１０．グリセリン                                ２５
１１．１，３−ブチレングリコール                １４
１２．ココアンホ酢酸Ｎａ                          ３．９
１３．ポリクオタニウム−７                        ０．１
１４．精製水                                      残余 
【００３３】
処方例３  毛髪洗浄料
成分                                              配合量（重量％）
１．本発明で使用するポリペプチド                  ０．０００５
２．ラウラミドプロピルヒドロキシスルタイン        ５
３．ココイルアラニンＮａ                          ５
４．ココイルメチルアラニンＮａ                    ５
５．セテアレス−６０ミリスチルグリコール          １
６．ペンチレングリコール                          １
７．ココイルグルタミン酸Ｎａ                      １
８．ポリクオタニウム−５１                        ０．００１
９．（メタクリル酸グリセリルアミドエチル／メタクリルサンステアリル）コポリマー
０．００１
１０．ヒドロキシプロピルグアーヒドロキシプロピルトリモニウムクロリド
０．００１
１１．クエン酸                                    ０．２
１２．精製水                                      残余
処方例４  育毛剤
成分                                              配合量（重量％）
１．本発明で使用するポリペプチド                  ０．０００００５
２．エタノール                                  ５０
３．１，３−ブチレングリコール                  １０
４．センブリ抽出物                                ０．５
５．パントテニルエチルエーテル                    ０．５
６．精製水                                        残余 
【００３４】
処方例５  洗口剤
成分                                              配合量（重量％）
１．本発明で使用するポリペプチド                  ０．００１
２．マスティック                                  １
３．ソルビトール                                １０
４．ポリグリセリン脂肪酸エステル                １０
５．エタノール                                  ２０
６．精製水                                        残余
処方例６  点眼剤
成分                                              配合量（重量％）
１．本発明で使用するポリペプチド                  ０．０００１
２．ホウ酸                                        １．５
３．ホウ砂                                        ０．１
４．ポリソルベート８０                            ０．５
５．ｌ−メントール                                ０．０１
６．ヒドロキシプロピルメチルセルロース            ０．１
７．精製水                                        残余
処方例７  メイクアップ化粧料
成分                                              配合量（重量％）
１．本発明で使用するポリペプチド                  ０．００００１
２．シクロメチコン                              １０
３．ジメチコン                                  ３０
４．ポリエーテル変性シリコーン                    ６
５．トリイソステアリン酸ポリグリセリル−２        １
６．シリコーン処理酸化チタン                      ８
７．シリコーン処理酸化鉄                          ０．５
８．シリコーン処理酸化亜鉛                        １
９．シリコーン処理群青                            ２
１０．パルミチン酸デキストリン                    ０．５
１１．ポリメタクリル酸メチル                      ４
１２．シリカ                                      ２
１３．１，３−ブチレングリコール                  ５
１４．精製水                                      残余 
【図１】
2019142835.tif 000003
【図２】
2019142835.tif 000004
【図３】
2019142835.tif 000005
【図４】
2019142835.tif 000006
【図５】
2019142835.tif 000007
【図６】
2019142835.tif 000008
【図７】
2019142835.tif 000009
【図８】
2019142835.tif 000010
【図９】
2019142835.tif 000011
【図１０】
2019142835.tif 000012
【図１１】
2019142835.tif 000013
【図１２】
2019142835.tif 000014
【図１３】
2019142835.tif 000015
【図１４】
2019142835.tif 000016
【図１５】
2019142835.tif 000017
【配列表】
2019142835000001.app