(57)【要約】【課題】本発明は、「さんかくシビラン」の抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬組成物、飲食品組成物または飲食品添加物、血中脂質（中性脂肪、遊離脂肪酸）上昇抑制剤、インスリン分泌促進剤及びレプチン分泌促進剤を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、さんかくシビランの抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬組成物、飲食品組成物または飲食品添加物、血中脂質（中性脂肪、遊離脂肪酸）上昇抑制剤、インスリン分泌促進剤及びレプチン分泌促進剤であることを特徴とする。【選択図】図４
2019142846.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
さんかくシビランの抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬組成物。
【請求項２】
さんかくシビランの茎または葉からの抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬組成物。
【請求項３】
さんかくシビランの茎または葉を切断して得られた抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬組成物。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の抽出物を有効成分として含む、飲食品組成物または飲食品添加物。
【請求項５】
さんかくシビランの抽出物を有効成分として含む、血中脂質上昇抑制剤。
【請求項６】
前記血中脂質が中性脂肪であることを特徴とする請求項５に記載の血中脂質上昇抑制剤。
【請求項７】
前記血中脂質が遊離脂肪酸であることを特徴とする請求項５に記載の血中脂質上昇抑制剤。
【請求項８】
さんかくシビランの抽出物を有効成分として含む、インスリン分泌促進剤。
【請求項９】
さんかくシビランの抽出物を有効成分として含む、レプチン分泌促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗肥満効果を有する医薬、医薬組成物、飲食品組成物及び飲食品添加物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、主に（１）前駆脂肪細胞の分化及び脂肪の蓄積（肥大化）、（２）脂肪細胞数の増加、により進行する。
つまり、前駆脂肪細胞は、線維芽細胞同様の形態や増殖能を有するが、分化誘導因子の刺激により、成熟脂肪細胞に分化し、脂肪を蓄積（肥大化）する。
そして、肥大化が進行すると脂肪細胞数が増加するが、これが肥満を進行させる原因である。
そこで、前駆脂肪細胞の分化や脂肪の蓄積を抑制することが、肥満の予防になると考えられている。
【０００３】
発明者は、これまでに沖縄県内で採れる様々な未利用生物資源について鋭意研究を行ってきたところ、沖縄県内の一部の地域に自生する「さんかくシビラン」（Talinum triangulare）の抽出物が、抗肥満活性を有することを見出した。
【０００４】
なお、特許文献１には、スベリヒユ科（Portulacaceae）ハゼラン（Talinum）属植物が、マクロファージでのTNF-α産生のみならず、脂肪組織からのTNF-α産生に対しても抑制作用を示す有効成分を含有していることが開示されているが、このハゼラン（Talinum）属植物は、発明者が抽出物に抗肥満活性を有することを見出した「さんかくシビラン」（Talinum triangulare）とは、同属であるが別種の植物である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2003-026586
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本願発明は、「さんかくシビラン」の抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬、医薬組成物、飲食品組成物及び飲食品添加物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、
さんかくシビランの抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬組成物
であることを特徴とする。
【０００８】
本発明は、
さんかくシビランの茎または葉からの抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬組成物
であることを特徴とする。
【０００９】
本発明は、
さんかくシビランの茎または葉を切断して得られた抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬組成物
であることを特徴とする。
【００１０】
本発明は、
上記したいずれかの抽出物を有効成分として含む、飲食品組成物または飲食品添加物
であることを特徴とする。
【００１１】
本発明は、
さんかくシビランの抽出物を有効成分として含む、血中脂質上昇抑制剤
であることを特徴とする。
【００１２】
本発明は、
上記した血中脂質が中性脂肪である血中脂質上昇抑制剤
であることを特徴とする。
【００１３】
本発明は、
上記した血中脂質が遊離脂肪酸である血中脂質上昇抑制剤
であることを特徴とする。
【００１４】
本発明は、
さんかくシビランの抽出物を有効成分として含む、インスリン分泌促進剤
であることを特徴とする。
【００１５】
本発明は、
さんかくシビランの抽出物を有効成分として含む、レプチン分泌促進剤
であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、「さんかくシビラン」の抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬、医薬組成物、飲食品組成物及び飲食品添加物を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】3T3-L1細胞の位相差顕微鏡撮影写真（×100）
【図２】分化誘導スケジュールを示した図
【図３】蛍光強度測定箇所を示した図
【図４】脂肪滴蛍光強度（乾燥及び冷凍処理抽出液の抗肥満活性試験）の測定結果を表したグラフ
【図５】各種抽出液添加細胞の位相差顕微鏡撮影写真（×100）
【図６】脂肪滴蛍光強度（乾燥及び冷凍処理抽出液の抗肥満活性試験）の測定結果を表したグラフ
【図７】脂肪滴蛍光強度（生茎及び生葉抽出液の抗肥満活性試験結果）の測定結果を表したグラフ
【図８】細胞の生存率の測定結果を表したグラフ
【図９】各群の体重変化を表したグラフ
【図１０】中性脂肪測定結果を表したグラフ
【図１１】遊離脂肪酸測定結果を表したグラフ
【図１２】レプチン測定結果を表したグラフ
【図１３】インスリン測定結果を表したグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１８】
＜実施例１＞
本発明にかかる「さんかくシビラン」の抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬組成物及び飲食品組成物または飲食品添加物について、次のとおり説明する。
【００１９】
１．抽出液
（１）試料
さんかくシビランは、茎と葉を使った。
それぞれを乾燥（水分含量５%以下）、冷凍（−８０℃）、未処理の３つ処理方法によって試料を得た。
茎の「冷凍」と「未処理」の２つの試料は、茎を縦（茎の長さ方向と同じ向き）と横（茎の長さ方向に対して直交する断面方向）とで切断方向を分け、抗肥満活性がある成分を効率良く抽出できる方法を検討した。
なお、試料ごとの違いは、次の表１のとおりである。
【００２０】
【表１】
2019142846.tif 000003
【００２１】
（２）抽出方法
（１）の各試料を、100g（湿重量）に対して350mlのMilli-Q水を加え、オートクレーブ（SX-500、TOMY社）で105℃、5minの条件で熱水抽出を行った。
得られた上清に4倍量の99.5%のエタノール（富士フィルム和光純薬（Wako）株式会社）を加え，-30℃で1時間以上静置した。
高速遠心機（Suprema21、TOMY社、ローター：NA-16）にて4℃、9500rpm、10minの遠心分離を行った。
上清を廃棄し、35℃の定温乾燥機（OFW-600S、Lot No.42596162、アズワン株式会社）に静置して、エタノールを完全に除き、エタノール沈殿物を得た。
得られた沈殿物に、Milli-Q水またはPBSを加え、沈殿物を溶解した。
これを0.22μｍフィルター付シリンジを用いて濾過滅菌を行い、得られた溶液を抽出液として試験に用いた。
【００２２】
２．使用細胞株及び細胞培養培地
（１）使用細胞株
抗肥満活性評価試験には、前駆脂肪細胞である3T3-L1（マウス胎児線維芽細胞、前駆脂肪細胞：国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所JCRB細胞バンクより購入）を用いた。
本細胞株は、休止期に分化誘導をかけることで脂肪細胞へと分化し、脂肪を蓄積するため、分化誘導後７日目には多数の脂肪滴を確認することができた（図３）。
【００２３】
（２）細胞培養培地
3T3-L1細胞の培養には、次の表２のとおり、分化誘導前後で組成が異なる培地３種（Maintenance Medium，Differentiation Activation Medium（D/A），Differentiation Maintenance Medium（D/M））を用い、CO2インキュベーター（ASTEC社製，Water jacket type）内でCO2濃度5%、37℃の条件下で培養を行った。
【００２４】
【表２】
2019142846.tif 000004
【００２５】
D/A，D/M培地には、分化誘導剤であるinsulin，Dexamethasone（Dex），3-isobuthyl-methylxanthine（IBMX）を添加した。
【００２６】
３．抗肥満活性試験
（１）分化誘導及び抽出液添加
3T3-L1細胞を96well plateに4×103cells/100μl/wellの密度で播種し、2日間の培養でコンフルエントな状態にした。
培地は、 Maintenance Mediumを用いた。
その後さらに2日間培養を継続後、分化誘導剤を含むD/A培地に入れ替え、分化誘導を行った（分化誘導0日目）。
この時点で、各抽出液を10%（v/v）添加した。
N数は3とした。
分化誘導7日目まで、2〜3日おきにD/M培地に交換し、培養を継続した。
培地交換の都度、抽出液を添加した（図２）。
【００２７】
（２）脂肪滴の蛍光強度測定
分化誘導7日目に脂肪滴の蛍光染色を行った。
培地を取り除いた後、PBS（生理食塩水）で細胞表面を一度洗浄した。
AdipoRed（Lonza Japan社）を各wellに200μlずつ添加し、10min以上遮光下で静置した。
マイクロプレートリーダー（Tecan社）にて励起波長485nm、検出波長572nmで蛍光強度を測定した。
1つのwell内で5箇所（図３）の蛍光強度を測定し、その平均値を各wellの値とした。
ソフトウェアは、i-controlを用いた。
得られた値をもとに、1サンプルにつき3wellの蛍光強度の平均値及び標準偏差を算出後、グラフを作成した。
細胞が剥離していた箇所の蛍光強度は除外して計算を行った。
【００２８】
４．結果
（１）抽出液の調製
熱水抽出液10mlから22.5mgのエタノール沈殿物が得られた。
これを熱水抽出液と同量の水に再溶解したため、濃度は2.25mg/mlになった。
冷凍処理の抽出液について、粘度が高く0.22μmフィルターの詰まりが頻繁に発生したため、0.45μmフィルターを通した後に0.22μmフィルター濾過滅菌を行った。
これらの水溶液を抗肥満活性試験に供した。
【００２９】
（２）抗肥満活性試験結果
ア）乾燥，冷凍
乾燥及び冷凍の各試料において脂肪蓄積抑制効果を確認することができた。
冷凍の試料は、茎の切断方向による活性の変化は見られなかった（図４。未分化な細胞は分化誘導をかけずにMaintenance Mediumにて培養を続けた。分化後7日の細胞は抽出液を添加しなかった。）。
顕微鏡観察によれば、抽出液を添加せずに分化誘導した細胞に比べ、抽出液を添加した細胞では、脂肪滴が少なかった（図５）。
次に、それぞれの抽出液の有効濃度の目安を確認すため、添加量を10%（v/v）（最終濃度：225ng/ml）から1%（v/v）（最終濃度：22.5 ng/ml）に変更した。
その結果、1%濃度でも、僅かだが脂肪蓄積が抑制されていた（図６）。
イ）未処理抽出液（葉部、茎部）
茎を縦方向に切断した試料４の抽出液を添加した細胞では、脂肪蓄積の増加が見られ、横方向に切断した試料５の抽出液を添加した細胞では、脂肪蓄積の減少が見られた（図７）。
また、切断しない葉から得た抽出液では、脂肪蓄積量の変化が見られなかったのに対し、1cm幅に切断した葉から得た抽出液では、茎の抽出液よりも高い脂肪蓄積抑制効果が示された（図７）。
【００３０】
以上のことから、茎の乾燥及び冷凍の各試料並びに未処理（横方向切断）の試料、さらに、葉（切断）の試料からの抽出液には、脂肪蓄積抑制効果を確認できた。
したがって、これらの抽出液を含む医薬組成物は、抗肥満効果を有する。
また、これらの抽出液を含む飲食品組成物または飲食品添加物も、抗肥満効果が得られ、例えば、飲料、加工食品、調味料、食品添加物及びサプリメントなどの食品としても提供できる。
【００３１】
＜実施例２＞
本発明にかかる「さんかくシビラン」の抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬について、次のとおり説明する。
【００３２】
１．抽出液
（１）試料
さんかくシビランは、輪切り（５ｍｍ以下）にした茎部を使った。
【００３３】
（２）抽出方法
茎を輪切りにしたさんかくシビラン100g（湿重量）に対し、350mlのMilli-Q水を加え、オートクレーブ（SX-500、TOMY社）で105℃、5minの条件で熱水抽出を行った。
得られた上清に4倍量の99.5%のエタノール（富士フィルム和光純薬（Wako）株式会社）を加え、-30℃で1時間以上静置した。
高速遠心機（Suprema21、TOMY社、ローター：NA-16）にて4℃、9500rpm、10minの遠心分離を行った。
上清を廃棄し、35℃の定温乾燥機（OFW-600S、Lot No.42596162、アズワン株式会社）に静置して、エタノールを完全に除き、エタノール沈殿物を得た。
得られた沈殿物に、Milli-Q水またはPBSを加え、沈殿物を溶解した。
これを0.22μｍフィルター付シリンジを用いて濾過滅菌を行い、得られた溶液を抽出液として試験に用いた。
【００３４】
２．使用細胞株及び細胞培養培地
（１）使用細胞株
細胞毒性試験には、前駆脂肪細胞である3T3-L1（マウス胎児線維芽細胞、前駆脂肪細胞：国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所JCRB細胞バンクより購入）を用いた。
【００３５】
（２）細胞培養培地
3T3-L1細胞の培養には、10% calf serum及び抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシンを最終濃度100units/mL）含有DMEM（以下「DMED培地」という。）を用い、CO2インキュベーター（ASTEC社製，Water jacket type）内でCO2濃度5%、37℃の条件下で培養を行った。
【００３６】
３．細胞毒性試験
96well plateに1.0×104cells/100μl/wellの密度で播種して培養した24時間後の3T3-L1細胞に、抽出液を、終濃度が、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0（mg/ml）になるように添加（培養液の液量に対して10％（v/v））した。
抽出液添加後、さらに24時間培養を継続した。
その後、細胞の生存を確認するため、Premix WST-1試薬（タカラバイオ株式会社）を各wellに10μｌずつ添加し、CO2インキュベーター（ASTEC社製，Water jacket type）内で2時間培養を行った。
その後、マイクロプレートリーダー（サンライズレインボーサーモ、テカンジャパン株式会社）を用いて、波長440nm、対照波長660nmの条件で吸光度を測定し、MTT Assay（WST-1 Assay）にて細胞の生存率を評価した。
細胞生存率は、抽出液未添加細胞（Control）を100%として算出した。
図８は、PBS（生理食塩水）のみを添加した場合の細胞活性を100％としたときの抽出液の添加濃度ごとの生存率を示したものである。
添加濃度が最も低い0.125mg/mlでは活性はほぼ100％、0.25mg/mlでは約95％、0.5および1.0mg/mlでは約90％、最高濃度の2mg/mlでは約86％の細胞生存率であった。
そこで、添加濃度が最も高い2mg/mlで、マウスの血清試験を行った。
【００３７】
４．抗肥満活性試験
（１）モデルマウス
生後5週齢のマウス（雄性、C57BL/6J、日本チャールスリバー株式会社）を次の３群（１群あたり４匹）に分けて、各群２か月間、次の飼料を２日ごとに新しいものと交換しながら、給餌器にて自由に給餌させた。
Ａ）普通食群：マウス特殊系繁殖用飼料（ＣＭＦ、オリエンタル酵母工業株式会社）
毎日1回定時に、経口ゾンデ（DISPOSABLE 経口ゾンデ FLEXIBLE TYPE マウス用滅菌済（有限会社フチガミ器械））と注射筒（ツベルクリン用（テルモ株式会社））を用いて、PBS（生理食塩水）を300マイクロリットル経口投与
Ｂ）高脂肪食群：D12492（60kcal%脂肪含有、Research Diets社）
毎日1回定時に、経口ゾンデ（DISPOSABLE 経口ゾンデ FLEXIBLE TYPE マウス用滅菌済（有限会社フチガミ器械））と注射筒（ツベルクリン用（テルモ株式会社））を用いて、PBS（生理食塩水）を300マイクロリットル経口投与
Ｃ）抽出液投与群：D12492（60kcal%脂肪含有、Research Diets社）
毎日1回定時に、経口ゾンデ（DISPOSABLE 経口ゾンデ FLEXIBLE TYPE  マウス用滅菌済（有限会社フチガミ器械））と注射筒（ツベルクリン用（テルモ株式会社））を用いて、終濃度2mg/mlの抽出液を300マイクロリットル経口投与
【００３８】
各群のマウスは、個別代謝ケージ（SN-783-0、アズワン株式会社）を用いて1匹ずつ飼育し、体重変化を測定した。
図９は、各群の体重変化を示している。
【００３９】
給餌から2か月後に採血し、血清中の中性脂肪、遊離脂肪酸、レプチン、インスリンを測定した。
血液は、ヒートブロックにて37℃、1時間インキュベート、4℃で一晩静置して血餅を凝集させた。
スパーテルで血餅を剥がした後に微量遠心分離機で1200xG、4℃、15min遠心分離して血清を回収し、-80℃にて凍結した。
血清中の各成分の分析は、富士フイルム和光純薬株式会社に委託した。
測定の詳細と測定結果は、次のとおりである。
なお、測定結果は各群の平均値±標準誤差で示し、統計的検定は、ANOVA解析後、Tukey-Kramer法にて多重比較検定を行い、危険率p＜0.05で有意差有りと判定した。
【００４０】
（２）中性脂肪測定
測定方法：酵素法
使用試薬：Lタイプワコー  TG・M（和光純薬）
測定装置：日立7180型自動分析装置
測定結果：図１０に示す。
抽出液投与群の中性脂肪測定値は、有意に下がった。特に、普通食群よりも低かった。
【００４１】
（３）遊離脂肪酸（NEFA）測定
試験方法：酵素法（自動分析装置用試薬−HR NEFA−HR（和光純薬）
使用試薬：自動分析装置用試薬−HR NEFA−HR（和光純薬）
測定装置：日立7180型自動分析装置
測定結果：図１１に示す。
抽出液投与群は、高脂肪食群との間に有意差は認められなかったが、普通食群とほぼ同等値であり、平均値は高脂肪食群より低かった。
【００４２】
（４）レプチン測定
試験方法：ELISA法
使用試薬：マウス/ラットレプチン測定キット（森永生科学研究所）
測定装置：MTP-300  MICROPLATE READER
測定結果：図１２に示す。
抽出液投与群は、高脂肪食群との間に有意差は認められなかったが、４個体とも高いレプチン値（12.0、7.3、7.4、25.6以上）を示し、平均して、高脂肪食群よりも高かった。
また、抽出液投与群は、普通食群との間には有意差があり（0.03）、抽出液を投与するとレプチンの放出が盛んになることが明らかになった。
【００４３】
（５）インスリン測定
試験方法：ELISA法
使用試薬：超高感度マウスインスリン測定キット（森永生科学研究所）
測定装置：MTP-300  MICROPLATE READER
測定結果：図１３に示す。
抽出液投与群は、インスリン値が高かった。
【００４４】
（６）まとめ
以上の測定結果から、さんかくシビランの抽出物には、血中脂質（中性脂肪、遊離脂肪酸）の上昇を抑制する効果があり、レプチンやインスリンの分泌を促進する効果があることから、抗肥満効果を有する医薬として利用可能である。
【図１】
2019142846.tif 000005
【図２】
2019142846.tif 000006
【図３】
2019142846.tif 000007
【図４】
2019142846.tif 000008
【図５】
2019142846.tif 000009
【図６】
2019142846.tif 000010
【図７】
2019142846.tif 000011
【図８】
2019142846.tif 000012
【図９】
2019142846.tif 000013
【図１０】
2019142846.tif 000014
【図１１】
2019142846.tif 000015
【図１２】
2019142846.tif 000016
【図１３】
2019142846.tif 000017