(57)【要約】      （修正有）【課題】シェル及び充填材料を含む複数のマイクロカプセルを含む組成物の提供。【解決手段】生体分解可能なマイクロカプセルは、生体分解可能なポリマー・シェル及び充填材料を含む。前記ポリマー・シェルは前記充填材料を完全に封入する。前記充填材料は、一つ以上の生体分解可能なマイクロ粒子又は治療薬あるいは両者を含んでよい。【選択図】図１
2019014729.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シェル及び充填材料を含む複数のマイクロカプセルを含む組成物であって、前記シェルが生体分解可能なポリマーを含み、そして前記充填材料が少なくとも第一の治療薬を含みそして前記シェルが前記充填材料を封入する、組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
生体分解可能なポリマーから成るマイクロ粒子は、治療薬の制御放出にとって有用である。テンプレートを用いたマイクロ製造技術を用いると、狭いサイズ分布を有するマイクロ粒子を製造することができる。マイクロ粒子のサイズ及び組成を操作することにより、多様な所望の放出プロファイルのいずれをも持つ粒子を調製することができる。
【０００２】
ここでは、生体分解可能なマイクロ粒子又は治療薬あるいは両者を含有する、生体分解可能なマイクロカプセルを解説する。本マイクロカプセルは、生体分解可能なポリマー・シェル及び充填材料を含む。前記シェルは前記充填材料を完全に取り囲む。本マイクロカプセルは一つ以上のマイクロ粒子を含有することができる。従って、前記充填材料は一つ以上のマイクロ粒子を含んでもよい。前記生体分解可能なポリマーシェル及び／又は前記充填材料は、選択的に一つ以上の治療薬を含むことができる。本マイクロカプセルが複数のマイクロ粒子を含む場合、当該のマイクロ粒子は、単一の種類のものでも、又は二つ以上の異なる種類のものであってもよい。例えば本マイクロカプセルは、二つの異なるサイズ及び／又は二つの異なる組成のマイクロ粒子を含むことができる。場合によっては、各マイクロ粒子は異なる組成のものである。本マイクロカプセルは異なるサイズ及び組成のマイクロ粒子を含むことができるため、異なる治療薬放出プロファイルを有するマイクロ粒子を含有するために、数週間又は数か月の期間にわたって治療薬を放出することができるマイクロカプセルを作製することができる。このように、本マイクロカプセルは、２、３又はより多い異なる放出プロファイルの粒子を含むマイクロカプセルを提供することにより、一定に制御された薬物放出レベルとin vivoでの暴露を提供することができる。
【０００３】
更に、多様な層が選択的に組成の点で異なり得る多層マイクロカプセルも解説されている。このようなマイクロカプセルは、それ自体が第二マイクロ粒子を含有する第一マイクロ粒子を含有することができる。このような構成においては、前記第一マイクロ粒子は基本的に前記第二マイクロ粒子のマイクロカプセル又はシェルとして作用する。
【０００４】
本開示は更に、マイクロカプセルを調製する方法や、マイクロ粒子及び治療薬などの一つ以上の成分でマイクロカプセルを充填する方法を特徴とする。
【０００５】
マイクロカプセルは、一つ以上の開放した空洞を有するテンプレートを提供することにより、調製することができる。一層のマイクロカプセル形成組成物（例えば生体分解可能なポリマーを含む溶液など）を前記空洞の内側表面に被覆し、乾燥させることで、開放したシェル又はカップを形成する。次にこの開放したシェルを、例えば一つ以上のマイクロ粒子又は何らかの他の充填材料（例えば治療薬を含有する固体、液体又はペースト組成物など）で充填することができる。その後、前記空洞の内側表面を被覆するのに用いたとの同じでもよい組成物を塗布して、開放したシェル内のコア材料を密封することで、充填材料を完全に封入した、閉鎖したシェルを形成して、マイクロカプセルを形成する。その後、該マイクロカプセルをテンプレートから解放する。
【０００６】
ここでは、シェル及び充填材料を含む複数のマイクロカプセルを含む組成物であって、前記シェルが生体分解可能なポリマーを含み、そして前記充填材料が少なくとも第一の治療薬を含み、そして前記シェルが前記充填材料を完全に封入する、組成物を解説する。いくつかの実施態様では、本マイクロカプセルの平均（粒子体積ベースで）Dv（同じ体積の球形粒子の直径）は100μm未満であり；本マイクロカプセルの平均Dvは90、80、70、60又は50μm未満から選択され、組成中の本マイクロカプセルの少なくとも７０％は組成中の本マイクロカプセルの平均Dvから５０％以下、異なり；本マイクロカプセルの平均最大直線寸法は100、90、80、70、60、50、又は40μm未満から選択され；本マイクロカプセルは、患者に注射されたときに少なくとも３０日間の期間にわたって前記第一治療薬を放出するように調合され；本マイクロカプセルは、患者に注射されたときに少なくとも９０日間の期間にわたって前記第一治療薬を放出するように調合され；本マイクロカプセルは、患者に導入されたときに少なくとも９０日間の期間にわたって前記治療薬を放出するように調合され；本マイクロカプセルは、患者の眼に導入されたときに少なくとも９０日間の期間にわたって前記治療薬を放出するように調合され；本マイクロカプセルは、患者の眼に導入されたときに少なくとも１８０日間の期間にわたって前記治療薬を放出するように調合され；前記シェルは外側のシェルであり、そして前記充填材料は、治療薬を含む組成物を封入した生体分解可能なポリマーを含む内側シェルを含み；そして前記内側シェルにより封入された前記組成物はマイクロ粒子を含む。
【０００７】
ここで解説する方法は更に、より大型のマイクロカプセルを作製するためにも用いることができる。例えば、0.5乃至10mmの間の最大直線寸法を有するマイクロカプセルである。従って、本マイクロカプセルは、例えば2mm×0.75mmの寸法を持つ筒状のロッドであってよい。いくつかの場合、前記筒状のロッドは、100ミクロン未満の寸法（例えば30-100ミクロン、75ミクロン、又は50ミクロン）及び150ミクロン未満の高さ（例えば50-150ミクロン、125ミクロン、100ミクロン、75ミクロン、又は50ミクロン）を有する。いくつかの場合では、最大直線寸法は300ミクロン未満、200ミクロン未満、又は1000ミクロン未満である。適した最大直線寸法は500（400、300、200又は100）ミクロン乃至25ミクロン、30ミクロン又は40ミクロンの間であろう。当該粒子はテンプレートを用いて形成されるため、本マイクロカプセルを含む組成物は相対的に単分散であろう。
【０００８】
本マイクロカプセルの総重量は100乃至5000マイクログラム（例えば250乃至1000マイクログラム）であってよい。このような大型のマイクロカプセルはより大量の治療薬を含有することができ、該治療薬を長期間にわたって放出させることができる。このように、より大型のマイクロカプセルは治療薬を少なくとも６か月、１年、２年の期間にわたって放出させることができ、本マイクロカプセルの多様な個々の成分は、治療薬を３か月６か月、９か月、１年、１８か月、２年又はより以上の期間にわたって放出させることができる。
【０００９】
更に、a)シェル及び充填材料を含む第一型のマイクロカプセルであって、前記シェルが生体分解可能なポリマーを含み、前記充填材料が治療薬を含み、そして前記シェルが前記充填材料を完全に封入する、マイクロカプセルと、b) シェル及び充填材料を含む第二型のマイクロカプセルであって、前記シェルが生体分解可能なポリマーを含み、前記充填材料が治療薬を含み、そして前記シェルが前記充填材料を完全に封入する、マイクロカプセル、とを含む組成物であって、このとき前記第一型のマイクロカプセルと前記第二型のマイクロカプセルは、平均Dv及び組成の一方又は両方で異なる、組成物を提供する。
【００１０】
多様な実施態様では：前記第一型のマイクロカプセルは、患者に注射されたときに少なくとも３か月間の期間にわたって治療薬を放出するように調合され、前記第二型のマイクロカプセルは、患者に注射されたときに少なくとも６か月間の期間にわたって治療薬を放出するように調合され；前記充填材料は複数の第一型のマイクロ粒子を含み、この場合の前記第一型のマイクロ粒子は生体分解可能なポリマーを含み；前記充填材料は更に、第二型のマイクロ粒子を含み、この場合の前記第二型のマイクロ粒子は生体分解可能なポリマーを含み；前記第一型のマイクロ粒子は治療薬を含み、そして前記第二型のマイクロ粒子は治療薬を含み；前記第一型のマイクロ粒子は第一治療薬放出プロファイルを有し、前記第二型のマイクロ粒子は第二治療薬放出プロファイルを有し；前記第一型のマイクロ粒子は生理的溶液への暴露から１乃至３か月間以内にそれらの治療薬の９０％を放出し；前記第二型のマイクロ粒子は生理的溶液への暴露から３乃至６か月間以内にそれらの治療薬の９０％を放出し；前記第一及び第二治療薬は同じであり；前記第一及び第二治療薬は異なり；前記充填材料は更に第三型のマイクロ粒子を含み、この場合の前記第三型のマイクロ粒子は生体分解可能なポリマーを含み、前記シェルは治療薬を含み、前記者エルは治療薬を含まず；前記充填材料は、生体分解可能なポリマーとは混合していない治療薬を含み；そして前記充填材料はポリペプチドを含む。
【００１１】
更に、シェル及び充填材料を含むマイクロカプセルを調製する方法を開示するが、本方法は：少なくとも一つの空洞を有するテンプレートを提供するステップと；生体分解可能なポリマーを含む組成物の一層を前記少なくとも一つの空洞の表面上に形成するステップと；生体分解可能なポリマーを含む前記組成物を固化させることで、開放したシェルを形成するステップと；前記開放したシェルをコア材料で充填するステップと；生体分解可能なポリマーを含む組成物の一層を施すことで前記開放したシェルを密封し、前記生体分解可能なポリマーを含む前記組成物を固化させることで、前記コア材料を封入したシェルを含むマイクロカプセルを形成するステップと；前記マイクロカプセルを前記テンプレートから解放するステップと、を含む。
【００１２】
本方法の態様な実施態様では：前記テンプレートは水溶性のポリマーを含み；前記テンプレートはヒドロゲルを含み；そして生体分解可能なポリマーを含む前記組成物は液体又はペーストである。
【００１３】
本マイクロカプセルを調製するために用いられるテンプレートは、多様なマイクロ製造技術のいずれを用いても形成することができ、複数の、均一に成型され、そして均一な大きさの空洞を含むことができるため、ここで解説する方法は、多機能のマイクロカプセル及びより大型の移植可能な構造の製造を可能にする、信頼でき、かつ拡張可能なプロセスを提供するものである。ここで解説する方法は、所定の態様で組織された構造、即ち特定の厚さの外側シェルと、一つ以上の異なる種類のマイクロ粒子などの多様な成分を含有する充填材料で充填された内側チャンバーという構造、を持つマイクロカプセルの製造を可能にする。前記シェルをマイクロ粒子で充填するとき、マイクロ粒子の数、大きさ、及び配置を制御することができる。
【００１４】
本マイクロカプセルは、水性又は有機性の組成物（例えば溶液、懸濁液、ペースト又はゲル）に溶かした薬物で、又は、乾燥薬物粉末で充填することができる。液体を含有する組成物を用いて本マイクロカプセルを充填する場合、液体を蒸発させて、結晶質又は非晶質の薬物などの固体材料を残してもよい。薬物含有溶液又は薬物粉末は、薬物含有マイクロ粒子に加えて存在することができる。
【００１５】
場合によっては、マイクロカプセルのシェルを形成するのに用いる材料は治療薬を含有し、そしてこの治療薬は、充填材料中にある治療薬と同じでも、又は異なっていてもよい。場合によっては、本マイクロカプセルのシェルを形成するのに用いる材料は治療薬を含有しない。このようなマイクロカプセルはコア材料中の薬物を即時の放出から守ることができるため、本マイクロカプセルからのバースト薬物放出はないであろう。代替的には、意図された治療目的にとって好ましいのであれば、薬物を含有する外側の層を用いて最初の放出を提供してもよい。
【００１６】
本マイクロカプセルは、例えば注射による患者への投与に向けて調合することができる。本マイクロカプセルは、一種以上の薬学的に許容可能な担体又は医薬品添加物と一緒に組成物中に存在することができる。
【００１７】
幅広いポリマーを用いて本マイクロカプセルを形成することができる。ポリマーの非限定的な例には：ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）(PLGA)、ポリ（乳酸） (PLA)、ポリ（グリコール酸）(PGA)、ポリ（ε-カプロラクトン）、及びポリ（オルトエステル）、並びにコラーゲン、キトサン、及びポリ（アミノ酸）などの他の天然の生体分解可能なポリマーがある。ポリマーの組合せも用いてよい。移植用シェル及び充填材料は、上に挙げた生体分解可能なポリマー、又は、ポリエチレンコビニルアセテート、ポリメチルメタクリレート、ポリブチルメタクリレート、ポリ1,2 ブタジエンなどの非生体分解可能なポリマーから調製できよう。他の適したポリマーには、多様なホモポリマー、コポリマー、直鎖、分枝鎖、もしくは架橋誘導体、例えばポリカルバメート又はポリウレア、架橋ポリ（ビニルアセテート）、4乃至80%のエステル含有量を有するエチレン-ビニルエステルコポリマー、例えばエチレン-ビニルアセテート(EVA)コポリマー、エチレン-ビニルヘキサノエートコポリマー、エチレンビニルプロピオネートコポリマー、エチレン-ビニルブチレートコポリマー、エチレン-ビニルペンタトエートコポリマー、エチレン-ビニルトリメチルアセテートコポリマー、エチレン-ビニルジエチルアセテートコポリマー、エチレン-ビニル3-メチルブタノエートコポリマー、エチレン-ビニル3-3-ジメチルブタノエートコポリマー、及びエチレン-ビニルベンゾエートコポリマー、並びにこれらの混合物を含めることができる。
【００１８】
いったん形成されたら、本マイクロカプセルをテンプレートから多様な方法のいずれかにより解放させることができる。例えばゼラチン又は、ヒドロゲル・テンプレートなどのゾル-ゲル遷移を行うことのできる別の材料から形成されたテンプレートの場合、本マイクロカプセルを、テンプレートの温度を変更するか、あるいは、テンプレートを溶解させることで本マイクロカプセルを解放することのできる水溶液中にテンプレートを配置することにより、解放することができる。別の場合では、テンプレートを保存しながら本マイクロカプセルをテンプレートから機械的に開放することができる。
【００１９】
本マイクロカプセルを形成するテンプレートは、限定はしないが例えばゼラチン、ポリ（アクリル酸）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（ビニルアルコール）、デキストラン、及びエチルセルロースなどのヒドロゲルを含むことができる。
【００２０】
他の適したテンプレート材料には、プルロニックス及びポリ（エチレングリコール）(pEG)の混合物、ポリビニルピロリドン(PVP) 及びデキストランなどの水溶性のポリマー、並びにPVP 及び PEGなどの水溶性のポリマーの混合物.を含めることができる。
【００２１】
ヒドロゲルテンプレートを用いたマイクロ製造技術は、Park et al. Journal of Controlled Release 141:314-319に解説されている。他の形のテンプレートを用いた他のマイクロ製造技術はWhitesides et al. 2001 Annual Review Biomed Engineering 3:335−73に解説されている。
【００２２】
テンプレートは、例えばシリコーン・ウェーファを光レジストで被覆することにより調製されるなどした鋳型を用い、テンプレートにとって所望の形状に食刻することにより、形成することができる。テンプレートは、できた鋳型上に形成される。テンプレート中の空洞は、できたマイクロカプセルが、正方形、矩形、円形又は何らかの他の所望の形状である少なくとも一つの断面を有することができるような、いずれの所望の形状であってもよい。
【００２３】
前記シェル及び前記マイクロ粒子は概ね実質的に均質な塊であり、形状、表面積、高さ及び質量において実質的に単分散である。例えば一集団の粒子（例えば単回分の医薬組成物に含まれる一集団）においては、当該粒子の僅かに１％以下が、１５％を超えて平均最大直線寸法から異なる（例えば当該粒子の５％未満が、5、6、7、8、9、又は10 ミクロン分、平均最大直線寸法から異なる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】マイクロ粒子を含有する、50μmの直径のマイクロカプセルの写真である。青色蛍光ビーズを負荷したマイクロカプセル（10μmの直径）。
【図１Ｂ】マイクロ粒子を含有する、50μmの直径のマイクロカプセルの写真である。赤色及び青色蛍光ビーズを負荷したマイクロカプセル（10μmの直径）。
【図１Ｃ】マイクロ粒子を含有する、50μmの直径のマイクロカプセルの写真である。赤色及び青色蛍光ビーズを負荷したマイクロカプセル（5.5μmの直径）。
【図１Ｄ】マイクロ粒子を含有する、50μmの直径のマイクロカプセルの写真である。赤色、緑色及び青色蛍光ビーズを負荷したマイクロカプセル（それぞれ10μm、15μm、及び5.5μmの直径）。スケール棒は25μmに相当する。
【図１Ｅ】そのコアに蛍光ビーズの存在を実証する一連の方向を向いた青色、緑色、及び赤色蛍光ビーズを含有するマイクロカプセルの蛍光画像である（〜5.5μmの直径）。ｚ軸での上面図。
【図１Ｆ】そのコアに蛍光ビーズの存在を実証する一連の方向を向いた青色、緑色、及び赤色蛍光ビーズを含有するマイクロカプセルの蛍光画像である（〜5.5μmの直径）。ｙ軸での側面図。
【図１Ｇ】そのコアに蛍光ビーズの存在を実証する一連の方向を向いた青色、緑色、及び赤色蛍光ビーズを含有するマイクロカプセルの蛍光画像である（〜5.5μmの直径）。４５°での側面図。
【図１Ｈ】そのコアに蛍光ビーズの存在を実証する一連の方向を向いた青色、緑色、及び赤色蛍光ビーズを含有するマイクロカプセルの蛍光画像である（〜5.5μmの直径）。x軸での側面図。蛍光ビーズ周囲の拡散光は、PLGAマトリックスの蛍光の散乱及び反射光が原因である。
【図２】ヒドロゲル・テンプレート戦略により作製された空間的に規定された域を持つマイクロカプセルの写真である。本マイクロカプセルは、青色のマイクロ粒子を含有するPLGAシェルと、赤色のマイクロ粒子を含有する内側のコアを有する。
【００２５】
図１は、数多くの異なるマイクロ粒子を含有するマイクロカプセルを概略的に示す。各粒子は、基本的に即時の放出から長期間の放出まで様々な特異的放出プロファイルに好ましい調合物から成ってよい。各粒子調合物は、生体分解可能なポリマー及び第一薬物を単独で、又は、：安定化剤、医薬品添加物（例えば放出速度を低下させる医薬品添加物、又は、放出速度を上昇させる医薬品添加物）、第二薬物、添加剤（例えば、周囲のポリマー系の放出速度を上昇又は低下させる添加剤、含水量を増す又は減らす添加剤、周囲の環境のｐＨを上昇又は低下させる添加剤）のうちの一つ以上と組み合わせて含有してよい。二つ以上の異なる種類のマイクロ粒子が存在する場合、これらは、化学的組成、分子量、結晶性、又は他の因子で異なる生体分解可能なポリマーから成ることができる。
【００２６】
図２に示すように、多様な型の薬物を含有するマイクロカプセルを調製することにより、薬物を数週間又は数か月間にわたって放出し、薬物濃度を長期間、期待される治療的濃度に維持するマイクロカプセルを調製することができる。例えば、第一型は、粒子懸濁媒質に入れた天然の薬物単独、又は、ポリマーを含んでも含まなくてもよい急速放出計に調合された薬物など、注射時に即時放出するようにデザインされた薬物の調合物である。第二型は、普通のPLGA放出プロファイル、即ち、最初の放出、ラグ段階、そして１か月から３か月間持続する長期の放出段階、を有する同じ薬物のPLGAマイクロ粒子調合物である。第三型は、PLA又はポリカプロラクトンなど、より遅い放出のポリマーの外側層に封入された、直前に解説したマイクロ粒子と同様なPLGAマイクロ粒子である。この外側の層は、３乃至１２か月間の期間にわたって分解することで、更なる２、３か月間にわたって分解する内側のPLGAマイクロ粒子を放出する。その結果のPKプロファイルは、三つの薬物放出プロファイルの組合せであり、暴露を６乃至１２か月間、治療的レベルよりも上に保つ。
【００２７】
マイクロカプセル、又はマイクロカプセル内に充填される充填材料（例えばマイクロ粒子）、に取り入れることのできる治療薬の中には、限定はしないが、低分子薬物、ペプチド薬物、たんぱく質薬物、オリゴヌクレオチド、抗体がある。
【００２８】
限定はしないが、生体分解可能なポリマー、非生体分解可能なポリマー、天然由来材料のポリマー、天然の生体ポリマー、ヒドロゲルを形成するポリマー、及び熱可逆性ポリマーを含め、多様な異なるポリマーをマイクロ粒子中に用いることができる。有用なポリマーの例には、限定はしないが：ポリ（アクリル酸）；ポリ（メタクリル酸）；ポリ（ヒドロキシル酸）；PLA；PGA；PLGA；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリアミド；ポリカーボネート；ポリアルキレン；ポリエチレン；ポリプロピレン；ポリアルキレングリコール；ポリ（エチレングリコール）；ポリ（酸化アルキレン）；ポリ（酸化エチレン）；ポリ（アルキレンテレフタレート）；ポリ（ビニルアルコール）、ポリビニルエーテル；ポリビニルエステル；ポリビニルハリド；ポリ（塩化ビニル）；ポリビニルピロリドン；ポリシロキサン；ポリ（酢酸ビニル）；ポリウレタン；ポリウレタンのコポリマー；誘導体化セルロース；アルキルセルロース；ヒドロキシアルキルセルロース；セルロースエーテル；アセルロースエステル；ニトロセルロース；メチルセルロース；エチルセルロース；ヒドロキシプロピルセルロース；ヒドロキシル-プロピルメチルセルロース；ヒドロキシブチルメチルセルロース；酢酸セルロース；プロピオン酸セルロース；セルロースアセテートブチレート；セルロースアセテートフタレート；カルボキシエチルセルロース；セルローストリアセテート；セルロース硫酸ナトリウム塩；ポリ（メチルメタクリレート）；ポリ（エチルメタクリレート）；ポリ（ブチルメタクリレート）；ポリ（イソブチルメタクリレート）；ポリ（ヘキシルメタクリレート）；ポリ（イソデシルメタクリレート）；ポリ（ラウリルメタクリレート）；ポリ（フェニルメタクリレート）；ポリ（メチルアクリレート）；ポリ（イソプロピルアクリレート）；ポリ（イソブチルアクリレート）；ポリオクタデシルアクリレート）；ポリ（酪酸）；ポリ（吉草酸）；ポリ（ラクチド-コ-カプロラクトン）；ポリ（ラクチド-コ-カプロラクトン）のコポリマー；ポリ（ラクチド-コ-カプロラクトン）の混合物；ポリガラクチン；ポリ（イソブチルシアノアクリレート）；ポリ（2-ヒドロキシエチル-L-グルタミン）；ポリ（DL-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）(DLPLCL)；コラーゲン；ゼラチン；アガロース；ゼラチン/ε-カプロラクトン；コラーゲン-GAG；フィブリン；生体分解可能なポリシアノアクリレート、生体分解可能なポリウレタン及び多糖；ポリピロール、ポリアニリン、ポリチオフェン、ポリスチレン、ポリエステル、非生体分解可能なポリウレタン、ポリウレア、ポリ（エチレンビニルアセテート）、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ（酸化エチレン）、ポリアルケニルエーテル又はジビニルグリコール（例えば CARBOPOL（登録商標） 934P、71G、971P、974P）と架橋させたアクリル鎖のポリマー、シリコーンポリマー；ヒアルロナンゲル、PEG-PLGA-PEGトリブロックコポリマー、RESOMER RGP t50106（Boehringer Ingelheim ）；ReGel（登録商標） （MacroMed Incorporated）、ABA-型又はBAB-型トリブロックコポリマー又はその混合物、ポリエステル又はポリ（オルトエステル）を含む生体分解可能な疎水性Ａポリマーブロックであって、前記ポリ��ステルがモノマー（例えば、D,L-ラクチド、D-ラクチド、L-ラクチド、D,L-乳酸、D-乳酸、L-乳酸、グリコリド、グリコール酸、ε-カプロラクトン、ε-ヒドロキシヘキサン酸、γ-ブチロラクトン、γ-ヒドロキシ酪酸、δ-バレロラクトン、δ-ヒドロキシ吉草酸、ヒドロキシ酪酸、リンゴ酸、及び約600乃至3000ダルトンの平均分子量を有するこれらのコポリマーから成る群より選択されるなど）から合成される、ポリマーブロック、グリセリン・ベースのゲル、グリセリン由来化合物、共役又は架橋ゲル、マトリックス、ヒドロゲル、及びポリマー、アルギン酸塩、及びアルギン酸塩ベースのゲル、天然及び合成ヒドロゲル並びにヒドロゲル由来化合物；アルギン酸塩ヒドロゲル SAF（登録商標）-Gel（ニュージャージー州プリンストン、ConvaTec）、Duoderm（登録商標）ヒドロアクティブ・ゲル（Convatec）、Nu-gel（登録商標）（テキサス州アーリントン、Johnson & Johnson Medical；Carrasyn（登録商標）(V) Acemannan ヒドロゲル(テキサス州アーヴィング、Carrington Laboratories社)；グリセリンゲル Elta（登録商標） ヒドロゲル (テキサス州ダラス、Swiss-American Products, Inc.) 及び K-Y（登録商標） Sterile (Johnson & Johnson)がある。これらの多様なポリマーのコポリマーも用いることができる。
【実施例】
【００２９】
材料及び方法
実験は、市販の材料を用いて行われた：様々な分子量（MW 36,000、IV 0.7 dL/g；MW 65,000、IV 0.82 dL/g；MW 112,000、IV 1.3 dL/g)のゼラチン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリビニルピロリドン、デキストラン、及びエチルセルロース（Sigma）、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）(PLGA, Akina 及びLactel) が我々の実験で用いられた。蛍光マイクロビーズはBangs 研究所から購入された。量子ドットはAldrichから購入された。
【００３０】
１．  e-ビームリソグラフィーによるシリコン・マスター・テンプレートの作成
500nmの直径の円形パターンをAuto CAD 2007 プログラムを用いてデザインした。1 μmの厚さの SiO2 層 (University Wafer) で被覆した3” シリコン・ウェーファ (100) を、300nmの厚さのポリ（メチルメタクリレート）(PMMA、 Microchem) フォトレジスト層で、SCS P6708 回転被覆システムを用いて3500 rpm、３０秒で回転被覆した。被覆した PMMA フォトレジスト層を電子線ビーム(e-beam) で予めプログラムされたパターンで Leica VB6 高分解能ウルトラワイド・フィールド・フォトリソグラフィー装置（Ultrawide Field Photolithography Instrument ）(100 KV、伝送速度 25 MHz 電流 5 nAで作動)を用いて暴露した。e-beam リソグラフィー後、シリコン・ウェーファを 3:1 イソプロパノール：メチルイソブチルケトン溶液で現像して、フォトレジストの暴露領域を取り除いた。5 nmのクロム層及び20 nm の金層をこのパターンの上に析出させた後、残余PMMAフィルムを潅流アセトン中で剥離した。SF6/OF2プラズマを用いた深い反応性イオンエッチングにより、その下の酸化シリコンにパターンを移した。生成したシリコン・マスター・テンプレートをヒドロゲル・テンプレートの作成に用いた。
【００３１】
２．  フォトリソグラフィーによるシリコン・ウェーファ・マスター・テンプレートの作成
シリコン・ウェーファを SU8 2010 フォトレジスト（マサチューセッツ州Microchem）で3,500 rpm で３０秒間、回転被覆して所望の厚さを得たのち、９５℃で３分間、焼成した。フォトレジストで被覆されたシリコン・ウェーファを、10μmの直径の円形パターンを含有するマスクを通して紫外線照射に１２秒間、暴露した。暴露後、シリコン・ウェーファを９５℃３３分間、ポストベースした後、SU-8 現像剤中で２分間、現像した。シリコン・ウェーファをイソプロパノールですすいだ後、窒素ガスで乾燥させた。こうして作製されたウェーファは、1.5μm乃至50μm又はそれ以上の直径を持つウェルを含有していた。
【００３２】
３．  溶解可能なテンプレートの作成
マイクロカプセルを作成するための一時的なテンプレートは、水溶液又は水性及び有機溶液の混合液（例えば水及びエタノール）中に溶解させることのできるポリマーにより作製することができる。前記一時的テンプレートを溶解させるために、温度は室温から増減させるなど変更することができる。代替的には、水溶液のｐＨを一時的テンプレートを溶解させるために変更することができる。５０℃の澄んだゼラチン溶液（水中30% w/v、10 ml) を、シリコン・ウェーファのマスター・テンプレートか、又は、円形のピラー（例えば10μmの直径及び10μmの高さのものなど）を含有するポリ（ジメチルシロキサン） (PDMS)から成る選択的な中間テンプレート（3” 直径）にピペットで移した。このゼラチン溶液を均一に広げて、PDMSテンプレートを完全に覆う薄膜を形成し、冷蔵庫にそれを維持することにより、４℃に５分間、冷却した。冷却の結果、弾性で機械的に強力なゼラチン・テンプレートが形成された。冷却後、ゼラチン・テンプレートをPDMSテンプレートから剥がした。得られたゼラチン・テンプレートは直径で最大3” であり、円形のウェル（例えば10μmの直径及び10μmの深さのものなど）を含有していた。ゼラチン・テンプレートを、明視野反射顕微鏡下で調べてその構造上の一体性を判定した。
【００３３】
澄んだポリ（ビニルアルコール） (PVA) 溶液（水中15% w/v 、5 ml）をピペットで円形のピラー（例えば10μmの直径及び10μmの高さのものなど）を含有するPDMSテンプレート (3” の直径) に移した。このPVA溶液を均一に広げて、PDMSテンプレートを完全に覆う薄膜を形成し、３０分間、７０℃のオーブン中に維持した。このステップの結果、薄い、そして機械的に強力なPVAテンプレートが形成された。このPVAテンプレートをPDMSテンプレートから剥がした。得られたPVA テンプレートは直径が最大3” であり、円形のウェル（例えば10μmの直径及び10μmの深さのものなど）を含有していた。このPVAテンプレートを、明視野反射顕微鏡下で調べてその構造上の一体性を判定した。
【００３４】
澄んだポリビニルピロリドン (PVP) 溶液 (水中7.5% w/v、5 ml) をピペットで円形のピラー（例えば10μmの直径及び10μmの高さのものなど）を含有するPDMSテンプレート(3” の直径) に移した。このPVP溶液を均一に広げて、PDMSテンプレートを完全に覆う薄膜を形成し、３０分間、７０℃のオーブン中に維持した。このステップの結果、薄い、そして機械的に強力なPVPテンプレートが形成された。このPVPテンプレートをPDMSテンプレートから剥がした。得られたPVP テンプレートは直径が最大3” であり、円形のウェル（例えば10μmの直径及び10μmの深さのものなど）を含有していた。このPVPテンプレートを、明視野反射顕微鏡下で調べてその構造上の一体性を判定した。
【００３５】
澄んだデキストラン溶液 (水中10% w/v、5 ml) をピペットで円形のピラー（例えば10μmの直径及び10μmの高さのものなど）を含有するPDMSテンプレート(3” の直径) に移した。このデキストラン溶液を均一に広げて、PDMSテンプレートを完全に覆う薄膜を形成し、３０分間、７０℃のオーブン中に維持した。このステップの結果、薄い、そして機械的に強力なテキストラン・テンプレートが形成された。このデキストラン・テンプレートをPDMSテンプレートから剥がした。得られたデキストラン・ テンプレートは直径が最大3” であり、円形のウェル（例えば10μmの直径及び10μmの深さのものなど）を含有していた。このデキストラン・テンプレートを、明視野反射顕微鏡下で調べてその構造上の一体性を判定した。
【００３６】
澄んだエチルセルロース溶液 (水中10% w/v、5 ml) をピペットで円形のピラー（例えば10μmの直径及び10μmの高さのものなど）を含有するPDMSテンプレート(3” の直径) に移した。このエチルセルロース溶液を均一に広げて、PDMSテンプレートを完全に覆う薄膜を形成し、３０分間、７０℃のオーブン中に維持した。このステップの結果、薄い、そして機械的に強力なエチルセルロース・テンプレートが形成された。このエチルセルロース・テンプレートをPDMSテンプレートから剥がした。得られたエチルセルロース・ テンプレートは直径が最大3” であり、円形のウェル（例えば10μmの直径及び10μmの深さのものなど）を含有していた。
【００３７】
４．  蛍光ビーズで充填されたマイクロカプセル
簡単に説明すると、100μlのw/v で10% PLGA (MW 65,000、IV 0.82 dL/g) 溶液のジクロロメタン溶液をピペットで、50μmの直径及び深さの円形ウェルを含有する3"の直径のヒドロゲル・テンプレートに移した。PLGA 溶液をヒドロゲル・テンプレート上で均一に広げた後、CH2Cl2を蒸発させた（１０分間、室温）。このステップの結果、ゼラチン・テンプレートにカップ型のマイクロ構造が形成された。二番目のステップでは、ゼラチン・カプセル中のPLGAで覆われたウェルを30μlの蛍光マイクロ球の水性懸濁液（氷様青色、直径5.5μm）で充填した。次にゼラチン・テンプレートを室温に１０分間、放置した後、窒素ガスの緩やかな流れで洗浄して、ウェルから水を取り除いた。最後に、100μlのPLGA 溶液 (MW 65,000、IV 0.82 dL/g) をゼラチン・テンプレートに移した後、それをテンプレート上に均一に広げた。このステップの結果、PLGAカップが蛍光マイクロ球で充填されて蓋をされた。ゼラチン・テンプレートを水に溶解させて、蛍光マイクロ球を含有する遊離マイクロカプセルを得た。得られたマイクロカプセルを明視野及び蛍光顕微鏡法で特徴付けた。
【００３８】
５．  赤色、緑色及び青色蛍光ビーズで充填されたマイクロカプセル
赤色、青色、及び緑色の蛍光ビーズを含有するマイクロカプセルは、上記の実験手法４番を行うことにより作製された。この実験では、赤色、緑色及び青色の蛍光ビーズの混合物が用いられた。
【００３９】
６．  シェル中に青色量子ドット、そしてコアに赤色量子ドットを持つマイクロカプセル
簡単に説明すると、25μlの赤色量子ドット（直径20nm）を含有する100μlのw/v で10% PLGA (MW 65,000, IV 0.82 dL/g) のジクロロメタン溶液をピペットで、それぞれ50μmの直径及び深さの円形ウェルを含有する3"の直径のヒドロゲル・テンプレートに移した。
PLGA 溶液をヒドロゲル・テンプレート上で均一に広げた後、CH2Cl2を蒸発させた（１０分間、室温）。このステップの結果、ゼラチン・テンプレートにカップ型のマイクロ構造が形成された。二番目のステップでは、ゼラチン・カプセル中のPLGAで覆われたウェルを、25μlの青色量子ドット（直径20nm）を含有するw/vで100μlの20% PLGA (MW 65,000、IV 0.82 dL/g)のジクロロメタン溶液で充填した。最後に、25μlの赤色量子ドット（直径20nm）を含有するw/vで100μlの10% PLGA (MW 65,000、IV 0.82 dL/g) のジクロロメタン溶液をゼラチン・テンプレートに移した後、それをテンプレート上で均一に広げた。 このステップの結果、PLGAカップが蛍光マイクロ球で充填されて蓋をされた。ゼラチン・テンプレートを水に溶解させて、蛍光マイクロ球を含有する遊離マイクロカプセルを得た。得られたマイクロカプセルを明視野及び蛍光顕微鏡法で特徴付けた。
【００４０】
７．  In situで結晶化可能なドキソルビシン薬物をコアに持つマイクロカプセル
まず、w/vで100μlの10% PLGA (MW 65,000、IV 0.82 dL/g) のジクロロメタン溶液をピペットで、それぞれ50μmの直径及び深さの円形ウェルを含有する32の直径のヒドロゲル・テンプレートに移した。PLGA 溶液をヒドロゲル・テンプレート上で均一に広げた後、CH2Cl2を蒸発させた（１０分間、室温）。このステップの結果、ゼラチン・テンプレートにカップ型のマイクロ構造が形成された。二番目のステップでは、ゼラチン・カプセル中のPLGAで覆われたウェルを、30μlのドキソルビシンのメタノール（1mg/ml）溶液で充填した。次にゼラチン・テンプレートを室温で１５分間、放置して、ウェル中にドキソルビシンの結晶を形成させた。このステップに続き、窒素ガスでやさしく洗浄してメタノールを完全に取り除いた。最後に100μlのPLGA 溶液 (MW 65,000、IV 0.82 dL/g) をゼラチン・プレート上に移した後、それをテンプレート上で均一に広げた。このステップの結果、PLGAカップが蛍光マイクロ球で充填されて蓋をされた。
【００４１】
８．  リン酸鉄リチウム・マイクロシリンダーの作成
まず、250μlのリン酸鉄リチウム (LiFePO4) を溶かしたトルエン (250mg/ml) スラリをピペットで、それぞれ50μmの直径及び深さの円形ウェルを含有する直径3"のPVPテンプレートに移した。このスラリをPVPテンプレート上に均一に広げた。この充填されたテンプレートをオーブン中に維持した（８０℃、５時間）。このステップの結果、PVPテンプレート中に固体のLiFePO4 マイクロシリンダーが形成された。
【００４２】
９．  遊離マイクロカプセルの採集
量子ドット／PLGA溶液で充填されたゼラチン・テンプレートを室温で１０分間、放置して、全てのCH2Cl2 溶媒をテンプレートから確実に蒸発させた。１０枚のゼラチン・テンプレートの一バッチを、４０℃のナノピュア水を50ml含有する100ml入りビーカーで溶解させ、２分間、やさしく振盪してテンプレートを完全に溶解させた。このステップの結果、遊離マイクロカプセルが溶液中に完全に放出された。この溶液を円錐型試験管(15 ml) に移し、５分間、遠心分離した（エッペンドルフ試験管、ロータA-4- 44、 5, 000 rpmで、19.1 RCF）。遠心分離で得られたペレットを凍結乾燥させ、冷蔵庫で保管した。1mlのナノピュア水に再懸濁させたとき、このペレットは、遊離し、単離したマイクロカプセルの懸濁液を形成した。PVP/PEG テンプレートを室温の水に溶解させて、形成されたマイクロカプセルを採集した。他のものに比べたときのPVP/PEGテンプレートの主な長所は、室温以下の水に溶解させられることであり、そのため、たんぱく質薬物及び抗体など、温度感受性の薬物を含有するマイクロカプセルを採集する際に柔軟であることである。
【００４３】
１０．  ポリマーマイクロ構造の特徴付け
前記のポリマーマイクロ構造を、明視野、共焦点蛍光撮像及び走査電子顕微鏡法で特徴付けた。明視野及び共焦点蛍光撮像は、自動化されたZ-スタック及び3-D画像解析用のインテリジェント・イメージング・イノベーションズ・スライド・ブック（原語：Intelligent Imaging Innovations Slide Book ）4.0 ソフトウェアを装備したオリンパス・スピニング・ディスク・コンフォーカル・イメージング・マイクロスコープ（原語：Olympus Spinning Disc Confocal Imgaing Microscope）BX61-DSU で行われた。走査電子顕微鏡法はFEI NOVA ナノ SEM及びヒタチ4800 SEMで行われた。
【００４４】
上述のマイクロカプセルは、50μmの直径を有するPLGAであり、異なる蛍光色のビーズで充填された。他のサイズを有するマイクロカプセルは、同様なプロセスにより作製することができる。青色蛍光ビーズ（直径5.5μm）で充填されたマイクロカプセルは、マイクロカプセルのコア中にビーズが存在することを明確に示す（図２）。異なる充填材料を混合する能力は、蛍光ビーズの混合物でマイクロカプセルを充填することにより、実証される。本マイクロカプセルは、青色蛍光ビーズ（図２Ａ）赤色及び青色蛍光ビーズ（図３Ｂ及び図３Ｃ）、そして更に青色、緑糸、及び赤色蛍光ビーズ（図３Ｄ）で充填された。重要なことは、蛍光ビーズはカプセルのコアに配されることである（図３Ｅ、図３Ｆ、図３Ｇ、及び図３Ｈ）。蛍光ビーズ周囲の拡散光は、マトリックス中のPLGA層中の蛍光の反射及び散乱の結果である。本マイクロカプセルのコア中のビーズの位置から、多成分のナノ-及びマイクロ装置の作製を想到することができる。蛍光標識されたビーズの様々な混合物で充填されたマイクロカプセルはマーカーとして有用である。
【図１】
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【図２】
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