(57)【要約】【課題】飲食品に由来する抗糖化剤、並びに当該抗糖化剤を有効成分とする医薬品及び機能性食品の提供。【解決手段】下記一般式（１）〜（３）［式（１）〜（３）中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、カフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基を表す。ただし、Ｒ１〜Ｒ３が全て水素原子である場合を除く。］のいずれかで表されるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とすることを特徴とする、抗糖化剤。［化１］2019014677.tif 000008【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）〜（３）
【化１】
2019014677.tif 000007
［式（１）〜（３）中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、カフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基を表す。ただし、Ｒ１〜Ｒ３が全て水素原子である場合を除く。］
のいずれかで表されるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とすることを特徴とする、抗糖化剤。
【請求項２】
前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか２つが水素原子であり、残る１つがカフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基である、請求項１に記載の抗糖化剤。
【請求項３】
前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか２つがそれぞれ独立して、カフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基であり、残る１つが水素原子である、請求項１に記載の抗糖化剤。
【請求項４】
前記一般式（１）で表され、前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか２つが水素原子であり、残る１つがカフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とする、請求項１に記載の抗糖化剤。
【請求項５】
前記一般式（１）で表され、前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか２つがそれぞれ独立して、カフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基であり、残る１つが水素原子であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とする、請求項１に記載の抗糖化剤。
【請求項６】
前記一般式（１）で表され、前記Ｒ３が水素原子であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とする、請求項１に記載の抗糖化剤。
【請求項７】
前記一般式（１）で表され、前記Ｒ３が水素原子であり、前記Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、カフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とする、請求項１に記載の抗糖化剤。
【請求項８】
前記一般式（１）で表され、前記Ｒ３が水素原子であり、前記Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、水素原子又はカフェオイル基であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とする、請求項１に記載の抗糖化剤。
【請求項９】
前記一般式（１）で表され、前記Ｒ３が水素原子であり、前記Ｒ１及びＲ２がカフェオイル基であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とする、請求項１に記載の抗糖化剤。
【請求項１０】
糖尿病の治療又は再発予防に用いられる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗糖化剤。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗糖化剤を含有することを特徴とする、医薬品。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗糖化剤を含有し、体内における終末糖化産物の産生又は蓄積による影響を抑制するために摂取されることを特徴とする、機能性食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、飲食品に由来する抗糖化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
終末糖化産物（Advanced Glycation End Products；ＡＧＥｓ）は、タンパク質の糖化反応に因って作られる生成物の総称であり、身体の様々な老化に関与する物質と考えられている。例えば、ＡＧＥｓの集積は糖尿病性合併症、アテローム性動脈硬化、アルツハイマー病等に関与している。ＡＧＥｓの生成を阻害することによって、健康の維持、長寿が期待されており、ＡＧＥｓの産生を防止し得る抗糖化成分の開発が盛んである。特に、効果的にＡＧＥｓの産生や蓄積を防止するためには、抗糖化成分の継続的な摂取が重要であることから、安全性の高い天然物由来の抗糖化成分の探索が続けられている。また、生成してしまったＡＧＥｓの作用を緩和する成分の需要も高まっている。
【０００３】
これまでにも天然物由来の抗糖化成分が幾つか報告されている。例えば、特許文献１にはエクオールを含有する抗糖化剤が、特許文献２にはイソフラボンアグリコン又はイソフラバノンアグリコンを含有する抗糖化剤が、特許文献３には葛花処理物を主成分とする抗糖化用組成物が、特許文献４には、焼酎残渣もろみの濃縮エキスを主成分とする抗糖化剤が、それぞれ記載されている。また、特許文献５にはガルシニア・コラ抽出物を含有する抗糖化剤が、特許文献６にはブドレジャアキシラリス葉抽出物を有効成分とする抗糖化剤が、特許文献７にはプロポリスを有効成分とする抗糖化剤が、それぞれ記載されている。さらに、非特許文献１には、ポリフェノール類には抗糖化作用があることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１５−１６８６６８号公報
【特許文献２】特開２０１５−２０９４２３号公報
【特許文献３】特許第５６８６３２８号公報
【特許文献４】特許第５８０４３９１号公報
【特許文献５】特開２０１４−１０１３６５号公報
【特許文献６】特開２０１１−１０２２７０号公報
【特許文献７】特開２０１２−７７０４２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Sadowska-Bartosz, et al., Molecules, 2015, vol.20, p.3309-3334.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１〜７及び非特許文献１に記載の抗糖化成分は、原料となる天然物からの精製や単離が困難であったり、抗糖化効果が不充分であった。
【０００７】
本発明は、世界で最も利用されている嗜好飲料であるコーヒーの焙煎豆に由来する抗糖化剤、並びに当該抗糖化剤を有効成分とする医薬品及び機能性食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、焙煎コーヒー豆に含まれているクロロゲン酸ラクトン類が高い抗糖化作用を有していること、及びクロロゲン酸ラクトン類は、ＡＧＥｓによる老化作用を抑制する作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
［１］  本発明の第一の態様に係る抗糖化剤は、下記一般式（１）〜（３）
【００１０】
【化１】
2019014677.tif 000002
【００１１】
［式（１）〜（３）中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、カフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基を表す。ただし、Ｒ１〜Ｒ３が全て水素原子である場合を除く。］
のいずれかで表されるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とすることを特徴とする。
［２］  前記［１］の抗糖化剤としては、前記一般式（１）〜（３）のいずれかで表され、クロロゲン酸ラクトンのうち、前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか２つが水素原子であり、残る１つがカフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とすることが好ましい。
［３］  前記［１］の抗糖化剤としては、前記一般式（１）〜（３）のいずれかで表され、クロロゲン酸ラクトンのうち、前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか２つがそれぞれ独立して、カフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基であり、残る１つが水素原子であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とすることが好ましい。
［４］  前記［１］の抗糖化剤としては、前記一般式（１）で表され、前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか２つが水素原子であり、残る１つがカフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とすることが好ましい。
［５］  前記［１］の抗糖化剤としては、前記一般式（１）で表され、前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか２つがそれぞれ独立して、カフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基であり、残る１つが水素原子であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とすることが好ましい。
［６］  前記［１］の抗糖化剤としては、前記一般式（１）で表され、前記Ｒ３が水素原子であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とすることが好ましい。
［７］  前記［１］の抗糖化剤としては、前記一般式（１）で表され、前記Ｒ３が水素原子であり、前記Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、カフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とすることが好ましい。
［８］  前記［１］の抗糖化剤としては、前記一般式（１）で表され、前記Ｒ３が水素原子であり、前記Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、水素原子又はカフェオイル基であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とすることが好ましい。
［９］  前記［１］の抗糖化剤としては、前記一般式（１）で表され、前記Ｒ３が水素原子であり、前記Ｒ１及びＲ２がカフェオイル基であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とすることが好ましい。
［１０］  前記［１］〜［９］のいずれかの抗糖化剤としては、糖尿病の治療又は再発予防に用いられるものであることが好ましい。
［１１］  本発明の第二の態様に係る医薬品は、前記［１］〜［１０］のいずれかの抗糖化剤を含有することを特徴とする。
［１２］  本発明の第三の態様に係る機能性食品は、前記［１］〜［１０］のいずれかの抗糖化剤を含有し、体内におけるＡＧＥｓの産生又は蓄積による影響を抑制するために摂取されることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る抗糖化剤は、天然にはコーヒーに比較的多く含まれている成分であるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とする。このため、当該抗糖化剤は、高い抗糖化活性を備えることに加えて、比較的安全に投与可能であるため、サプリメントや医薬品等の有効成分として好適であり、特に、糖尿病等のＡＧＥｓの産生や蓄積によって発症又は症状が悪化する疾患の治療若しくは予防のための医薬品の有効成分として好適である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１における、ＡＧＥｓ処理したヒト繊維芽細胞の生存性に対する、５−クロロゲン酸（５−ＣＱＡ）、３−カフェオイルキナ酸ラクトン（３−ＣＱＬ）、３−フェルロイルキナ酸ラクトン（３−ＦＱＬ）の影響を調べた結果（ｎ＝３）を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明及び本願明細書において、抗糖化作用とは、ＡＧＥｓの産生又は蓄積により引き起こされる各種生理機能を抑制する作用を意味し、抗糖化剤は抗糖化作用を有する剤である。抗糖化剤には、ＡＧＥｓの産生反応、具体的には、ペプチドやタンパク質等のアミノ基と還元糖が有するカルボニル基とが結合するメイラード反応を抑制する作用を有するもの、ＡＧＥｓを分解する作用又は分解作用を促進する作用を有するもの、ＡＧＥｓ自体の生理活性を抑制する作用を有するもの、が含まれる。
【００１５】
本発明に係る抗糖化剤は、下記一般式（１）〜（３）のいずれかで表されるクロロゲン酸ラクトンを有効成分とする。下記一般式（１）〜（３）中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ独立して、水素原子、カフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基を表す。ただし、Ｒ１〜Ｒ３が全て水素原子である場合を除く。
【００１６】
【化２】
2019014677.tif 000003
【００１７】
カフェオイル基を下記式（ａ）に、フェルロイル基を下記式（ｂ）に、クマロイル基を下記式（ｃ）に、それぞれ示す。式（ａ）〜（ｃ）中、「＊」が付された結合手は、一般式（１）〜（３）中のシクロヘキサン環に結合した酸素原子との結合手を示す。
【００１８】
【化３】
2019014677.tif 000004
【００１９】
一般式（１）〜（３）で表されるクロロゲン酸ラクトンとしては、前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか２つが水素原子であり、残る１つがカフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基である化合物であってもよく、前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか２つがそれぞれ独立して、カフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基であり、残る１つが水素原子であってもよく、前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３の全てがそれぞれ独立して、カフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基であってもよい。
【００２０】
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか１つが水素原子である場合、残る２つの基は、同種の基であってもよく、異種の基であってもよい。同様に、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３の全てがカフェオイル基、フェルロイル基、又はクマロイル基の場合、これら３つ基は全て同種の基であってもよく、２種以上の基が組み合わせられていてもよい。
【００２１】
一般式（１）〜（３）で表されるクロロゲン酸ラクトンのＲ１、Ｒ２、及びＲ３の基の組み合わせを表１に示す。表１中、「Ｈ」は水素原子、「（ａ）」はカフェオイル基、「（ｂ）」はフェルロイル基、「（ｃ）」はクマロイル基を示す。
【００２２】
【表１】
2019014677.tif 000005
【００２３】
本発明に係る抗糖化剤の有効成分としては、一般式（１）で表されるクロロゲン酸ラクトンが好ましく、一般式（１）で表され、かつＲ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか２つがそれぞれ独立して、カフェオイル基、フェルロイル基、若しくはクマロイル基であり、残る１つが水素原子であるクロロゲン酸ラクトン、又は一般式（１）で表され、かつＲ１、Ｒ２、及びＲ３のうち、いずれか２つがそれぞれ独立して、カフェオイル基、フェルロイル基、若しくはクマロイル基であり、残る１つが水素原子であるクロロゲン酸ラクトンがより好ましく、一般式（１）で表され、かつＲ３が水素原子であるクロロゲン酸ラクトン（表１の組み合わせ１〜６、１０〜１２のいずれかの一般式（１）で表されるクロロゲン酸ラクトン）がさらに好ましく、一般式（１）で表され、かつＲ３が水素原子であり、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して水素原子又はカフェオイル基であるクロロゲン酸ラクトン（表１の組み合わせ１、４、又は１０のいずれかの一般式（１）で表されるクロロゲン酸ラクトン）がよりさらに好ましく、一般式（１）で表され、Ｒ３が水素原子であり、Ｒ１及びＲ２がカフェオイル基であるクロロゲン酸ラクトン（表１の組み合わせ１０の一般式（１）で表されるクロロゲン酸ラクトン）が特に好ましい。
【００２４】
一般式（１）〜（３）で表されるクロロゲン酸ラクトンは、例えば、焙煎コーヒー豆から精製することができる。具体的には、焙煎コーヒー豆の熱水抽出物又は熱水抽出物残渣から、ＯＤＳカラム（Ｃ１８カラム）等の逆相系カラムを用いた高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法により単離精製することができる。
【００２５】
一般式（１）〜（３）で表されるクロロゲン酸ラクトンは、例えば、キナ酸ラクトン（一般式（１）〜（３）であって、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３の全てが水素原子である化合物）の水酸基と、カフェ酸、フェルラ酸、又はｐ−クマル酸のカルボキシル基とを、脱水縮合させることによって合成することができる。脱水縮合反応は、常法により行うことができる。
【００２６】
また、一般式（１）で表されるクロロゲン酸ラクトンは、例えば、１−カフェオイルキナ酸（CAS ID：1241-87-8）、クロロゲン酸（３−カフェオイルキナ酸）（CAS ID：327-97-9）、シクロヘキサンカルボン酸（CAS ID：327161-03-5）、クリプトクロロゲン酸（CAS ID：905-99-7）、ネオクロロゲン酸（CAS ID：906-33-2）、１，３−ジカフェオイルキナ酸（CAS ID：19870-46-3）、１，３−ジカフェオイルキナ酸（CAS ID：14534-61-3）、４，５−ジカフェオイルキナ酸（CAS ID：57378-72-0）、１，３−ジカフェオイルキナ酸（CAS ID：30964-13-7）、３，５−ジカフェオイルキナ酸（CAS ID：2450-53-5）、３−フェルロイルキナ酸（CAS ID：1899-29-2）、４−フェルロイルキナ酸（CAS ID：2613-86-7）、５−フェルロイルキナ酸、４，５−ジフェルロイルキナ酸、３，５−ジフェルロイルキナ酸、３，４−ジフェルロイルキナ酸、３，５−ジフェルロイルキナ酸、３−ｐ−クマロイルキナ酸（CAS ID：1899-30-5）、４−ｐ−クマロイルキナ酸（CAS ID：93451-44-6）、５−ｐ−クマロイルキナ酸（CAS ID：32451-86-8）、１−ｐ−クマロイルキナ酸、３−カフェオイル−４−フェルロイルキナ酸、３−カフェオイル−５−フェルロイルキナ酸、４−カフェオイル−５−フェルロイルキナ酸、１−カフェオイル−５−フェルロイルキナ酸、３−フェルロイル−４−カフェオイルキナ酸、３−フェルロイル−５−カフェオイルキナ酸、４−フェルロイル−５−カフェオイルキナ酸等のクロロゲン酸を加熱処理し、シクロヘキサン環に結合したカルボキシル基と水酸基の脱水反応により合成することができる。クロロゲン酸の加熱処理によるラクトン化は、常法により行うことができる。
【００２７】
本発明に係る抗糖化剤は、一般式（１）〜（３）のいずれかで表されるクロロゲン酸ラクトンを、１種類のみ含有していてもよく、２種類以上を組み合わせて含有していてもよい。例えば、本発明に係る抗糖化剤は、有効成分として、表１の組み合わせ１０の一般式（１）で表されるクロロゲン酸ラクトンのみを含有するものであってもよく、表１の組み合わせ１０の一般式（１）で表されるクロロゲン酸ラクトンと表１の組み合わせ１の一般式（１）で表されるクロロゲン酸ラクトンと表１の組み合わせ４の一般式（１）で表されるクロロゲン酸ラクトンを含有するものであってもよい。
【００２８】
本発明に係る抗糖化剤は、有効成分である一般式（１）〜（３）のいずれかで表されるクロロゲン酸ラクトンのみからなるものであってもよく、他の成分を含有するものであってもよい。当該他の成分としては、一般式（１）〜（３）のいずれかで表されるクロロゲン酸ラクトンによる抗糖化作用を損なわないものであればよく、例えば、賦形剤、結合剤、流動性改良剤（固結防止剤）、安定剤、保存剤、ｐＨ調整剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、粘稠剤、矯味剤、甘味料、酸味料、香料、着色料等として用いられている各種物質を、所望の製品品質に応じて適宜含有させてもよい。
【００２９】
本発明に係る抗糖化剤の剤型は、特に限定されるものではなく、各種の剤型を適用できる。当該剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、スプレー剤、注射剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤等が挙げられる。服用が容易であることから、本発明に係る抗糖化剤の剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等の経口投与に適したものが好ましい。
【００３０】
本発明に係る抗糖化剤の有効成分であるクロロゲン酸ラクトンは、焙煎コーヒー豆に比較的多く含まれている物質であり、比較的安全に服用できる。そこで、これらは、飲食品、飼料、化粧料、医薬品等の原料として好適であり、特に、体内におけるＡＧＥｓの産生又は蓄積による影響を抑制するために摂取される飲食品、飼料、化粧料、医薬品等の有効成分として好適である。具体的には、本発明に係る抗糖化剤は、ＡＧＥｓの産生又は蓄積によって引き起こされる各種疾患の予防又は治療に用いられる医薬品やサプリメント等の機能性食品の有効成分として有用である。当該疾患としては、例えば、糖尿病及びその合併症、動脈硬化、悪性腫瘍、アルツハイマー型認知症、骨代謝異常等が挙げられる。糖尿病の合併症としては、白内障、網膜症、神経障害、腎不全等が挙げられる。また、ＡＧＥｓは老化の原因因子であることから、本発明に係る抗糖化剤の摂取により、老化リスクを低減できることが期待できる。例えば、本発明に係る抗糖化剤を配合させた機能性食品を継続的に摂取することにより、加齢に伴う皮膚の皺やたるみ、関節痛などの老化現象の予防や改善が期待できる。
【実施例】
【００３１】
次に、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等に限定されるものではない。
【００３２】
［実施例１］
正常ヒト繊維芽細胞を用いて、クロロゲン酸ラクトンが、ＡＧＥｓによるダメージからの保護又は回復の作用を有するかを検証した。
【００３３】
＜被検物質＞
クロロゲン酸ラクトンとしては、３−カフェオイルキナ酸ラクトン（３−ＣＱＬ：前記一般式（１）で表され、Ｒ２及びＲ３が水素原子であり、Ｒ１がカフェオイル基であるクロロゲン酸ラクトン）及び３−フェルロイルキナ酸ラクトン（３−ＦＱＬ）：前記一般式（１）で表され、Ｒ２及びＲ３が水素原子であり、Ｒ１がフェルロイル基であるクロロゲン酸ラクトン）を用いた。比較対象として、５−クロロゲン酸（５−ＣＱＡ）も被検物質とした。また、陽性対照物質として、ＡＧＥｓに対する保護作用を有することが既知のアスコルビン酸（Vitamin C：ＶＣ）及びＮＡＣ（N-acetyl-L-Cysteine）を使用した。
【００３４】
ＣＱＡ、３−ＣＱＬ、及び３−ＦＱＬは、予め５０％ＤＭＳＯ／ＰＢＳ溶液に溶解させた濃溶解液を調製しておき、各濃度区の溶媒濃度を統一（１％）するために、濃溶解液を溶媒（５０％ＤＭＳＯ／ＰＢＳ溶液）にて希釈系列を作成し、それらを培地に添加して使用した。
【００３５】
アスコルビン酸とＮＡＣはいずれも水溶性であることから、予め２００ｎＭのＰＢＳ溶解液を調製しておき、それらを終濃度０．４ｎＭとなるように培地に添加して使用した。
【００３６】
＜細胞と培養方法＞
細胞としては、正常ヒト繊維芽細胞（クラボウ社製、ＫＦ−４１０９）を用いた。細胞培養は、ＤＭＥＭ（ナカライテスク社製、Cat. No. 08456-65）に、ＦＢＳ（biowest社製、Cat. No. S1820, Lot No. 516536）を終濃度１０％となるように、抗生物質（Penicillin-Streptomycin Mixed Solution、ナカライテスク社製、Cat. No.26253-84）を終濃度１％となるように、それぞれ含有させた試験培地を用いて、ＣＯ２インキュベーター（５％  ＣＯ２、３７℃）内で行った。
【００３７】
正常ヒト繊維芽細胞はＴ７５フラスコにて必要細胞数に達するまで前培養した。前培養された細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（2.5g/1-Trypsin/1mmol/1EDTA Solution、ナカライテスク社製、Cat. No32777-44）を用いて細胞フラスコから剥離し、試験培地でトリプシンを中和した後に遠心処理によって回収した細胞を再び試験培地に再懸濁した細胞懸濁液を、試験に用いた。
【００３８】
＜試薬＞
ＡＧＥｓとしては、Glyceraldehyde-AGE-BSA（医学生物学研究所製、Cat. No. CY-R 2058）を用いた。生細胞数の測定には、市販の生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク社製、Cat. No. 07553-44）を用いた。
【００３９】
＜ＡＧＥｓ保護回避試験＞
細胞を２×１０４個／１００μＬ／ウエルの濃度で９６ウエルプレートに播種・培養し、その翌日に１００％コンフルエントな状態を確認した後に、３段階濃度の被検物質、ＡＧＥｓ（終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含む培地に交換した。培地交換後の９６ウエルプレートをＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した後に、細胞の生細胞数を生細胞測定試薬で測定した。
【００４０】
培地にＷＳＴ−８を添加して経時的に培地の吸光度（測定波長：４５０ｎｍ、対象波長：５９５ｎｍ）を測定し、生細胞によりＷＳＴ−８から生じたホルマザンの量を、１時間当たりの吸光度（ＡＢＳ／ｈ）として測定し、これを細胞の生存性の指標とした。結果を図１に示す。図中、「Control」は被検物質を添加しなかったウェルの結果であり、「Vehicle」は溶媒（５０％ＤＭＳＯ／ＰＢＳ溶液）を添加したウェルの結果である。
【００４１】
この結果、ＣＱＡ、３−ＣＱＬ、及び３−ＦＱＬを添加したウェルでは、濃度依存的にＡＧＥｓによるダメージが軽減されており、これらの物質がＡＧＥｓによるダメージから細胞を保護する能力（抗糖化作用）を有することがわかった。３−ＣＱＬ及び３−ＦＱＬは、ＣＱＡよりも保護能力が顕著に高いことが確認された。
【００４２】
［実施例２］
クロロゲン酸ラクトンのＡＧＥｓ生産抑制能を調べた。
【００４３】
＜被検物質＞
クロロゲン酸ラクトンとしては、３−ＣＱＬ、４−カフェオイルキナ酸ラクトン（４−ＣＱＬ：前記一般式（１）で表され、Ｒ１及びＲ３が水素原子であり、Ｒ２がカフェオイル基であるクロロゲン酸ラクトン）、３，４−カフェオイルキナ酸ラクトン（３，４−ＣＱＬ）：前記一般式（１）で表され、Ｒ３が水素原子であり、Ｒ１及びＲ２がカフェオイル基であるクロロゲン酸ラクトン）、３，５−カフェオイルキナ酸ラクトン（３，４−ＣＱＬ）：前記一般式（１）で表され、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ１及びＲ３がカフェオイル基であるクロロゲン酸ラクトン）、及び３−ＦＱＬを用いた。比較対象として、５−ＣＱＡも被検物質とした。
【００４４】
被検物質約０．０２ｇを５０容量％エタノール溶液２ｍＬで抽出した後、遠心分離処理（２５００ｒｐｍ、５分間）したものを被検物質溶液として試験に用いた。
【００４５】
＜ＡＧＥｓ生産試験＞
１．５ｍＬマイクロチューブに、１００ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ溶液を１００μＬ、２００ｍｇ／ｍＬ Ｄ−グルコース溶液を５００μＬ、被検物質溶液を２０μＬ、及び1/15mol/l  リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を３８０μＬ加えた後、６０℃で４８時間加温したものを反応溶液とした。
【００４６】
反応溶液２０μＬを９６ウェルマイクロプレートに注ぎ、水２００μＬを加えた後、マイクロプレートリーダーで蛍光強度を測定した（励起波長：３７０ｎｍ、蛍光波長：４４０ｎｍ）。ＡＧＥｓ産生抑制能は、被検物質溶液の代わりに1/15mol/lリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて同様に操作したものを未処置対照とし、下記式により算出した。なお、ブランクはＤ−グルコース溶液の代わりに1/15mol/lリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて同様に操作したものを用いた。
【００４７】
［ＡＧＥｓ生産抑制率（％）］＝（［未処置対照の蛍光強度＊］−［反応溶液の蛍光強度］）／［未処置対照の蛍光強度＊］×１００
【００４８】
［未処置対照の蛍光強度＊］＝［未処置対照の蛍光強度］−［ブランクの蛍光強度］
【００４９】
各反応溶液の測定結果から各被検物質について、ＡＧＥｓ生産抑制率（％）が５０％（ＩＣ５０）になる被検物質濃度を算出した。算出結果を表２に示す。この結果、５−ＣＱＡ、３−ＣＱＬ、３−ＣＱＬ、３，４−ＣＱＬ、及び３，５−ＣＱＬは、いずれも高いＡＧＥｓ生産抑制能を示した。一方で、３−ＦＱＬは、ＡＧＥｓ生産抑制能を示さなかった。これらの結果から、５−ＣＱＡ、３−ＣＱＬ、３−ＣＱＬ、３，４−ＣＱＬ、及び３，５−ＣＱＬの抗糖化作用と、３−ＦＱＬの抗糖化作用は作用機序が異なることが示された。
【００５０】
【表２】
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【図１】
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