(57)【要約】【課題】脊髄性筋萎縮症、特にII型及びIII型の脊髄性筋萎縮症に有効な新規治療手段を提供することを課題とする。【解決手段】Notchシグナル阻害剤又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、脊髄性筋萎縮症治療薬が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Notchシグナル阻害剤又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、脊髄性筋萎縮症治療薬。
【請求項２】
Notchシグナル阻害剤がLY-411575、DAPT、L-685.458、BMS-299897、JLK-6、Semagacestat、RO4929097、MK-0752、及びavagacestatからなる群より選択される化合物である、請求項１に記載の治療薬。
【請求項３】
Notchシグナル阻害剤がLY-411575である、請求項１に記載の治療薬。
【請求項４】
アストロサイトの増殖抑制を介して運動機能の改善をもたらす、請求項１〜３のいずれか一項に記載の治療薬。
【請求項５】
脊髄性筋萎縮症II型又はIII型の患者に投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の治療薬。
【請求項６】
その投与の際にSMN補充療法が併用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の治療薬。
【請求項７】
脊髄性筋萎縮症の患者に対して、Notchシグナル阻害剤又はその薬理学的に許容される塩を治療上有効量投与するステップを含む、脊髄性筋萎縮症の治療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は脊髄性筋萎縮症治療薬及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊髄性筋萎縮症（spinal muscular atrophy：SMA）は、脊髄運動神経変性及び筋萎縮を特徴とし、常染色体劣性遺伝様式をとる難治性神経変性疾患である。SMAは主に全身性にsurvival motor neuron 1(SMN1)遺伝子の突然変異又は欠失によって引き起こされ、SMN1のコピー遺伝子であるSMN2遺伝子は保存される。SMN2遺伝子の翻訳効率は著しく低いため、脊髄運動ニューロンの維持ができず、発症、病態形成に繋がる。
【０００３】
多くの研究グループがSMAの治療法開発に取り組んでおり、SMN2遺伝子の転写活性の向上、完全長SMNタンパク質の安定化、欠失したSMN1遺伝子の導入などの方法が試みられている（例えば非特許文献１〜３を参照）。また、近年、SMN2遺伝子のサイレンサーを標的としたアンチセンスオリゴ（ASO）であるSpinraza（登録商標）（Nusinerse）が承認され、SMN補充療法が臨床応用されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Mohseni J et al., Genet Mol Biol. 2013 Sep;36(3):299-307
【非特許文献２】Makhortova NR, Hayhurst M, Cerqueira A et al. Nat Chem Biol 2011;7:544-552.
【非特許文献３】Robbins KL et al., Hum Mol Genet. 2014 Sep 1;23(17):4559-68.
【非特許文献４】Kariya S et al., J Clin Invest. 2014 Feb;124(2):785-800.
【非特許文献５】Tarabal O et al., J Neuropathol Exp Neurol. 2014 Jun;73(6):519-35.
【非特許文献６】Caraballo-Miralles et al., Int J Mol Sci. 2013 May 29;14(6):11424-37.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
SMN補充療法は一定の臨床成績を挙げているが、完治をもたらすものではなく、治療満足度は高いとはいえない。一方、マウスにおいてSMNの要求量は成体になるにつれ減少することが報告され（非特許文献４）、SMNが発達段階で非常に重要なタンパク質であることが知られており、元々SMN2遺伝子のコピー数が多い遅発型SMA（II型及びIII型）の運動神経変性に関しては、SMN翻訳量低下とは別の発症メカニズム（SMN非依存的は発症メカニズム）が考えられる。実際、SMN療法が効果を示さない患者も存在する。このような状況に鑑み本発明は、SMN補充療法に代わる、或いはそれを補助（補足）する新たな治療手段、特にII型及びIII型のSMAに対しても有効な治療手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
SMA病態におけるGFAP陽性アストロサイトの異常な増加が報告されている（非特許文献５）。この報告を踏まえ、アストロサイトの異常な増加がSMAの病態形成に重要であり、アストロサイトの増加を阻害することがSMA（特にII型及びIII型のSMA）に対する治療戦略になるとの仮説を立てた。この仮説の下、本発明者らはNotch（ノッチ）シグナルに着目した。SMAモデルマウスの脊髄運動神経においてNotchシグナルの活性化が認められたとの報告があるが（非特許文献６）、Notchシグナルは本来アストロサイト分化を促進するシグナルであることから、アストロサイトにおけるNotchシグナルがSMAの発症、病態形成に重要であると考え、その検証を行った。その結果、SMA病態におけるアストロサイトの増加にNotchシグナルが関与し、Notchシグナルの制御が病態形成の阻止ないし抑制に有効であることが示唆された。更に検討を進めたところ、培養細胞及びモデルマウスを用いた実験において、Notchシグナル阻害剤に治療効果が認められ、Notchシグナルの制御を介してアストロサイトの増加を阻害することが有効な治療法になることが裏付けられた。以下の発明は以上の成果に基づく。
［１］Notchシグナル阻害剤又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、脊髄性筋萎縮症治療薬。
［２］Notchシグナル阻害剤がLY-411575、DAPT、L-685.458、BMS-299897、JLK-6、semagacestat、RO4929097、MK-0752及びavagacestatからなる群より選択される化合物である、［１］に記載の治療薬。
［３］Notchシグナル阻害剤がLY-411575である、［１］に記載の治療薬。
［４］アストロサイトの増殖抑制を介して運動機能の改善をもたらす、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の治療薬。
［５］脊髄性筋萎縮症II型又はIII型の患者に投与される、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の治療薬。
［６］その投与の際にSMN補充療法が併用される、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の治療薬。
［７］脊髄性筋萎縮症の患者に対して、Notchシグナル阻害剤又はその薬理学的に許容される塩を治療上有効量投与するステップを含む、脊髄性筋萎縮症の治療法。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１−１】SMAモデルマウス脊髄におけるアストロサイトマーカーの発現。
【図１−２】図１の続き。
【図２−１】SMAモデルマウス脊髄におけるNotchシグナル及びアストロサイト分化関連因子の発現。
【図２−２】図２の続き。
【図３】Notchシグナル阻害剤LY-411575のSMA病態下アストロサイトに対する作用。
【図４】LY-411575のSMNΔ7マウスの運動機能改善作用。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は脊髄性筋萎縮症（SMA）の治療薬及びその用途に関する。SMAは脊髄運動神経変性及び筋萎縮を特徴とする下位運動ニューロン病である。10万人あたり1〜2人の割合で発症する。I型（重症型。別名：ウェルドニッヒ・ホフマン病）、II型（中間型。別名：デュボビッツ病）、III型（軽症型。別名：クーゲルベルグ・ウェランダー病）、及びIV型に分類される。I型〜III型は小児期に発症し、IV型は成人期に発症する。根治療法は確立されておらず、対症療法が行われる。1995年にSMN1遺伝子が原因遺伝子として同定された。
【０００９】
本発明において「治療薬」とは、標的の疾病ないし病態（即ちSMA）に対する治療的又は予防的効果を示す医薬のことをいう。治療的効果には、標的疾患／病態に特徴的な症状又は随伴症状を緩和すること（軽症化）、症状の悪化を阻止ないし遅延すること等が含まれる。後者については、重症化を予防するという点において予防的効果の一つと捉えることができる。このように、治療的効果と予防的効果は一部において重複する概念であり、明確に区別して捉えることは困難であり、またそうすることの実益は少ない。尚、予防的効果の典型的なものは、標的疾患／病態に特徴的な症状の再発を阻止ないし遅延することである。標的疾患／病態に対して何らかの治療的効果又は予防的効果、或いはこの両者を示す限り、標的疾患／病態に対する治療薬に該当する。
【００１０】
本発明の治療薬の有効成分となるNotchシグナル阻害剤には、がん細胞の増殖抑制及び血管新生の脱調節等の作用が知られており、髄芽腫の治療等への利用が期待されている。本発明はNotchシグナル阻害剤の新たな用途を提供するものであるともいえる。理論に拘泥する訳ではないが、後述の実施例に示した実験結果に鑑みると、Notchシグナル阻害剤を有効成分とする本発明の治療薬はアストロサイトの増殖抑制を介して患者の運動機能の改善をもたらす。
【００１１】
本発明の治療薬が適用される者、即ち、SMAの患者は特に限定されない。I型〜IV型のいずれも治療対象となり得る。好ましい一態様では、本発明の治療薬はSMA II型又はIII型の治療に用いられる。即ち、II型の患者又はIII型の患者が治療対象となる。本発明によれば、SMN補充療法では治療効果を期待できない患者に対して、SMN補充療法とは異なる作用機序によって治療効果が得られる。一方、本発明の治療薬の投与に並行してSMN補充療法による治療を行うことにしてもよい。換言すれば、本発明の治療薬の適用にあたり、SMN補充療法を併用してもよい。このようにすれば、Notchシグナルの制御とSMNの補充という、二つの異なる作用機序によって複合的な治療効果を期待できる。
【００１２】
SMAを発症する可能性のある者に対して、SMA発症の阻止ないし軽度化を目的として本発明の治療薬を投与することにしてもよい。即ち、予防的に本発明の治療薬を用いることもできる。
【００１３】
本発明の治療薬はNotchシグナル阻害剤又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する。Notchシグナル阻害剤の具体例はLY-411575（(S)-2-((S)-2-(3,5-difluorophenyl)-2-hydroxyacetamido)-N-((S)-5-methyl-6-oxo-6,7-dihydro-5H-dibenzo[b,d]azepin-7-yl)propanamide；CAS番号209984-57-6）、DAPT (N-[(3,5-Difluorophenyl)acetyl]-L-alanyl-2-phenyl]glycine-1,1-dimethylethyl ester)、L-685.458 ((5S)-(tert-Butoxycarbonylamino)-6-phenyl-(4R)-hydroxy-(2R)-benzylhexanoyl)-L-leucy-L-phenylalaninamide)、BMS-299897 (2-[(1R)-1-[[(4-Chlorophenyl)sulfonyl](2,5-difluorophenyl)amino]ethyl]-5-fluoro-benzenebutanoic acid)、JLK-6 （7-Amino-4-chloro-3-methoxy-1H-2-benzopyran）、semagacestat (N-[(1S)-2-Oxo-3-methyl-1,2,4,5-tetrahydro-3H-3-benzoazepine-1α-yl]-N2-[(S)-2-hydroxy-3-methylbutanoyl]-L-alaninamide、RO4929097 (N1-[(7S)-6,7-dihydro-6-oxo-5H-dibenz[b,d]azepin-7-yl]-2,2-dimethyl-N3-(2,2,3,3,3-pentafluoropropyl)-propanediamide)、MK-0752 (3-((1r,4s)-4-(4-chlorophenylsulfonyl)-4-(2,5-difluorophenyl)cyclohexyl)propanoic acid)、avagacestat ((2R)-2-[N-[(4-Chlorophenyl)sulfonyl]-N-[[2-fluoro-4-(1,2,4-oxadiazol-3-yl)phenyl]methyl]amino]-5,5,5-trifluoropentanamide)である。これらの中でも、LY-411575は特に好ましい。二種類以上のNotchシグナル阻害剤を併用することにしてもよい。
【００１４】
本発明の治療薬の有効成分として、Notchシグナル阻害剤の薬理学的に許容される塩を用いても良い。「薬理学的に許容される塩」は特に限定されるものではなく、様々な塩、例えば、酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等の利用が想定される。酸付加塩の例としては塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩などの無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩が挙げられる。金属塩の例としてはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩が挙げられる。アンモニウム塩の例としてはアンモニウム、テトラメチルアンモニウムなどの塩が挙げられる。有機アミン付加塩の例としてはモルホリン付加塩、ピペリジン付加塩が挙げられる。アミノ酸付加塩の例としてはグリシン付加塩、フェニルアラニン付加塩、リジン付加塩、アスパラギン酸付加塩、グルタミン酸付加塩が挙げられる。
【００１５】
本発明の治療薬の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
【００１６】
製剤化する場合の剤形も特に限定されない。剤形の例は錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、及び座剤である。本発明の治療薬はその剤形に応じて経口投与又は非経口投与（静脈内、動脈内、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、脊髄腔内、脳室内等への注射又は点滴、経皮、経鼻、経粘膜など）によって患者に適用される。また、全身的な投与と局所的な投与も対象により適応される。これらの投与経路は互いに排他的なものではなく、任意に選択される二つ以上を併用することもできる（例えば、静脈内注射と同時に又は所定時間経過後に脳室内への注射を行う等）。本発明の治療薬には、期待される治療効果を得るために必要な量（即ち治療上有効量）の有効成分が含有される。本発明の治療薬中の有効成分量は一般に剤形によって異なるが、所望の投与量を達成できるように有効成分量を例えば約0.1重量％〜約99重量％の範囲内で設定する。
【００１７】
本発明の治療薬の投与量は、期待される治療効果が得られるように設定される。治療上有効な投与量の設定においては一般に症状、患者の年齢、性別、及び体重などが考慮される。当業者であればこれらの事項を考慮して適当な投与量を設定することが可能である。投与量の一例として、有効成分としてLY-411575を採用した場合であれば、一日当たり一回〜数回、好ましくは三日に一回〜数回を挙げることができる。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、患者の病状や有効成分の効果持続時間などを考慮することができる。
【００１８】
以上の記述から明らかな通り、本出願は、SMAの患者に対してNotchシグナル阻害剤を治療上有効量投与することを特徴とする、SMAの治療法も提供する。SMN補充療法による治療を受けている患者を治療対象とすれば複合的な治療効果を期待できる。
【実施例】
【００１９】
SMA（特にII型及びIII型）に対する新たな治療法の開発を目指し、Notchシグナルに着目し、以下の実験を行った。
＜方法・材料＞
1. 薬物及び試薬
霊長類ES（embryonic stem）細胞用培地はRepro CELL（Kanagawa, Japan)、Knockout serum replacement（KSR)、2-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸（Non-Essential Amino Acid; NEAA)、Dulbeco’s modified Eagles’s medium（DMEM）F12+GlutaMAX、phosphate buffered saline（PBS)、N2 supplement、ペニシリン/ストレプトマイシン、Alexa Flour 594 rabbit-IgG、Alexa Fluor 594 donkey anti-goat IgG、Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG、Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG、Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG、Alexa Fluor 488 Donkey Anti-goat IgG、Hoechst33342はLife Technologies（Carlsbad, CA, USA)、Pluronic F-127、dorsomorphin、dimethyl sulfoxide（DMSO)、β-メルカプトエタノール、Retinoic Acid（RA)、ascorbic acid（AA)、50 mM Tris hydrochloride、150 mM sodium chloride、0.5% sodium deoxycholate、0.1% sodium dodecyl sulfate（SDS)、protease inhibitor cocktail、phosphatase inhibitor cocktail II、 phosphatase inhibitor cocktail III、Igepal CA-630はSigma Aldrich（St. Louis, MO, USA)、環状アデノシン一リン酸（cAMP; cyclic-Adenosine monophosphate)、SB431542（SB）はCayman（San Diego, California)、グリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF; Glial cell line derived neurotrophic factor)、脳由来神経栄養因子（BDNF; brain-derived neurotrophic factor)、accutaseはinnovative cell technologies（San Diego, California, USA)、matrigel basement membrane matrix growth factorはBecton, Dickinson and Company（Franklin Lakes, NJ, USA)、パラホルムアルデヒド（PFA; paraformaldehyde)、Blocking One-PはNacalai Tesque（Kyoto, Japan)、normal donkey serumはmerckmillipore（Billerica, MA, USA)、Can get signal solution 1、Can get signal solution 2はToyobo（Osaka, Japan)、rabbit anti-Notch1 intracellular domain（NICD)、mouse anti-glial fibrillary acidic protein（GFAP), rabbit anti-signal transducers and activator of transcription（STAT）3はCell Signaling Technology（Danvers, MA, USA)、rabbit anti-S100 はabcam（Cambridge, MA, USA)、purmorphamine（PMN）はMiltenyi Biotec（Bergisch, Gladbach, Germany)、LY-411575は（Xcess Biosciences Inc, CA, USA)、basic fibroblast growth factor（bFGF)、Y-27632は（Wako, Japan）よりそれぞれ購入した。
【００２０】
2. iPS細胞から運動神経細胞への誘導
iPS細胞のコロニーを、4 ng/mlのbFGF及び500 U/mLのペニシリン/ストレプトマイシン含有霊長類の胚性幹（embryonic stem; ES）細胞培地（ReproCELL）を用いて維持した。iPS細胞コロニーは37℃で5%のCO2で培養し、7日毎に継代した。第一段階では無血清浮遊凝集培養法（serum-free Floating culture of Embryoid Body-like aggregates with quick reaggregation method; SFEBq法)を採用した。はじめに2μM dorsomorphin、10μM SB及び10μM RhoK（Rho-associated coiled-coil forming kinase）阻害剤のY-27632で9,000個のiPS細胞を処理し、最初の2日間、5% KSR及び500 U/mL PSを含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM)/F12で培養した。2、3日ごとに2μM dorsomorphin及び10μM SBを含む培地に培地交換した。SFEBq法で神経誘導開始後7日後、凝集した胚葉体をマトリゲルコーティングした96ウェルプレート（Becton Dickinson and Company）に移し、2μM dorsomorphin及び10μM SBでさらに7日間処理した。その後、神経幹細胞をDMEM/F12、1% N2 supplement及び7日間500 U/mL PSを含む培地に0.1μM RA中で培養した。形成された神経前駆細胞は、さらに7日間、1μMのpurmorphamine及び0.1μM RAを有する培地で培養した。最終段階で形成される脊髄運動神経細胞は、10 ng/ml BDNF、10 ng/mL GDNF、cAMP及び200 ng/ml AAを含む培地で培養した。この培地は、2日または3日毎に交換した。
【００２１】
3. マウス
Heterozygous SMNΔ7マウス（mSmn+/-, SMN2+/+, SMNΔ7+/+）はJackson Laboratory（Bar Harbor, ME, USA）から購入し実験に使用した。
【００２２】
4. 運動機能評価（正向反射試験、傾斜板テスト)
SMNΔ7マウス（mSmn+/-, SMN2+/+, SMNΔ7+/+）を、親マウスのもとで飼育した。出生時にマウス尻尾DNAから遺伝子型を決定し、生後2日目から体重及び運動機能評価を毎日行った。正向反射は生後2日齢から測定開始し、反応時間は、仰向けに置かれた時点から四肢で姿勢を維持するまでの時間（最大35秒）として定義した。傾斜板テストは生後6日目から開始し、各新生児マウスは17.5°の傾斜板上に置かれ、傾斜面を指す頭部が180°回転するまでの時間を測定した（最大180秒)。
【００２３】
5. 蛍光免疫染色（in vitro)
PBSで細胞を洗浄した後、4℃で20分間、4%パラホルムアルデヒド（Nacalai Tesque）で固定し、PBSで再度洗浄した。次に、細胞を4℃、30分間、5% donkey serum及び0.1%TritonX-100（Nacalai Tesque）を用いて、ブロッキングを行った。続いて、4℃で一晩、一次抗体とインキュベートし、適切な二次抗体で標識し、室温で1時間反応させた。二次抗体以降の作業は遮光条件下で行った。最後にPBST（PBS/0.1%TritonX）で3回洗浄した後、HSオールインワン蛍光顕微鏡（Keyence, Osaka, Japan）を使用して撮影した。
【００２４】
6. 蛍光免疫染色（in vivo)
6-1. 免役染色用凍結切片作製
生後11日後にマウス脊髄を還流後に摘出し、4%パラホルムアルデヒド含有0.1 M PB（pH 7.4）にて一晩放置した。ついで25%スクロース含有0.1 M PB（pH7.4）液に48時間放置した。その後、液体窒素を用いてO.C.T. compoundにより凍結し、薄切するまで-80℃にて保存した。O.C.T. compoundによって凍結した脊髄を包埋し、クリオスタット（Leica,Wetzlar, Hesse, Germany）を用いて、-20℃で厚さ10μmの切片を作製し、MASコーティングされたカバーグラス（Matsunami, Osaka, Japan ）に載せ、-80℃で保存した。
【００２５】
6-2. 免役染色
-80℃で保存しておいた凍結切片を染色時、-20℃で1時間放置した後、4℃で1時間放置し、さらに室温で2時間乾燥させた。その後、Super PAP pen（Invitrogen）にて反応液の流出を防ぐために切片の周囲を囲んだ。その後、一次抗体がマウス抗体の時には、M.O.M Blocking Reagentにより1時間ブロッキングした。それ以外の場合は、10% goat serumまたはhorse serumにより1時間ブロッキングを行った。ブロッキング後、一次抗体（溶媒：M.O.M protein concentrateをPBSで希釈）を用いて4℃で一晩反応させた。その後、二次抗体（溶媒：M.O.M protein concentrateをPBSで希釈）によって1時間反応させた。続いて、Hoechst 33342により核染色を行った。染色後、Fluoromount（水溶性封入基材）で封入した。また、ネガティブコントロールとして、一次抗体を除いたコントロールを用意した。染色した切片はHSオールインワン蛍光顕微鏡（Keyence, Osaka, Japan)を用いて撮影した。
【００２６】
7. 統計学的解析
統計学的解析はStudent's t-test、Dunnett's testまたは2元配置分散分析（ANOVA）を用いた。実験結果は平均値±標準誤差で表し、危険率5%以下を有意とした。
【００２７】
＜結果＞
（１）SMAモデルマウスでのアストロサイトの分化
SMNΔ7マウス（以下「SMAモデルマウス」）病態期において、GFAP陽性アストロサイトの発現が増加し、特に灰白質において約6.2倍増加した（図１Ａ−Ｃ)。S100（別のアストロサイトマーカー）陽性アストロサイトが、アストロサイト分化が起こる脊髄中心管付近で増加した（図１Ｄ−Ｈ）。一方、SMAモデルマウスの病態期において、Notch細胞内ドメイン(NICD)及びGFAPの発現が増加した（図２Ａ）。発症期でも、SMAモデルマウスではNICDの発現が増加しており、さらにはGFAP、S100に加えて、アストロサイト分化に関与するp-STAT3の発現も増加していた（図２Ａ）。全脳及び腓腹筋ではNICDの発現量に変化は認められなかった（図２Ｃ）。よって、アストロサイト分化に関与するNotchシグナルは病変部位である脊髄で特異的に変化している可能性があり、病態形成に非常に重要な役割を担うことが明らかとなった。
【００２８】
（２）患者iPS細胞由来運動神経細胞培養系（SMA-iPSC MNs）における、LY-411575のGFAP陽性アストロサイト抑制作用
次に、患者iPS細胞を用いたin vitro SMAモデルにおいて、Notchシグナル阻害剤であるLY-411575を2週間、培地に混ぜて添加したところ、GFAP陽性アストロサイトが濃度依存的に抑制された（図３Ａ−Ｃ。50 nMと5μMで有意差あり）。
【００２９】
（３）SMAモデルマウスにおけるLY-411575の運動機改善作用
SMAモデルマウスの運動機能失調を回復させるか否かを検討するため、Notchシグナル阻害剤LY-411575を生後2日目及び5日目にSMAモデルマウスの脳室内に投与（1.4ng/body/day）したところ（図４Ａ）、生存期間及び体重に変化は認められなかったが（図４Ｂ、Ｃ）、DMSO投与群（コントロール群）と比較して、LY-411575投与群では正向反射の消失及び躯幹反射の消失が抑制された（図４Ｄ、Ｅ）。正向反射試験では生後3、5、6、13日目、傾斜板試験では生後10、12、13日目で有意であった。
【００３０】
＜考察／結論＞
NotchシグナルはSMA病態におけるアストロサイト病変に関与し、有効な治療ターゲットとなることが明らかとなった。また、LY-411575がSMA病態下のアストロサイトを効果的に抑制し、SMAモデルマウスの運動機能を改善したことが明らかになった。LY-411575等のNotchシグナル阻害剤は、SMA病態における運動機能改善薬として有効といえる。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
現在、SMAに対する治療薬としてはSpinraza（登録商標）（Nusinerse）が国内における唯一の承認薬である。Spinraza（登録商標）は、SMN2遺伝子のサイレンサーを標的としたアンチセンスオリゴ（ASO）であり、SMN量の増大をもたらし、治療効果を発揮する。実際、Spinraza（登録商標）を用いたSMN補充療法は一定の臨床効果を挙げている。しかしながら、SMN補充療法は完治をもたらすものではない。
【００３２】
一方、SMNタンパク質の神経細胞での役割は解明されていない。SMNタンパク質は胎児期、発達期において非常に重要な役割を果たすが、成長が進むにつれてSMNタンパク質の要求量は低くなることがマウスレベルで報告されている。この報告からも、遅発型SMA（II型及びIII型）は、SMN非依存的なメカニズムによって発症、進展すると推定される。従って、遅発型SMA（II型及びIII型）に対するSMN補充療法の効果は期待しがたい。本発明の治療薬は、SMN補充療法では治療できないと考えられるSMA患者に対する新規治療アプローチを提供する。また、本発明によれば、SMN補充療法で効果を示している患者においても相乗効果が期待でき、治療満足度の向上が図られる。
【００３３】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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