(57)【要約】      （修正有）【課題】メンブレンフィルタを通って移動した試料と移動しなかった試料との双方を観察できる試料観察装置及び試料観察方法を提供する。【解決手段】試料観察装置１は、メンブレンフィルタを透過する面状光の照射によって発生した観察光を撮像して蛍光画像データを出力する撮像部１３と、第１の試料保持空間に対応する第１の領域と第２の試料保持空間に対応する第２の領域とを特定し、第１の領域に対応する第１の部分画像データと第２の領域に対応する第２の部分画像データとを生成する部分画像生成部と、これらの部分画像データに基づいて第１の観察画像データ及び第２の部分画像データを生成する観察画像生成部と、第１の観察画像データ及び第２の観察画像データに基づいて試料Ｓの解析を行う解析部と、を備える。【選択図】図１
2019020125.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メンブレンフィルタによって仕切られた第１の試料保持空間及び第２の試料保持空間を有する試料容器に保持された試料を観察する試料観察装置であって、
前記メンブレンフィルタを透過する波長を含む面状光を励起光として前記試料に照射する照射光学系と、
前記面状光の照射面に対して前記試料を走査する走査部と、
前記面状光の照射によって発生した蛍光を含む観察光を撮像し、当該撮像結果に基づく蛍光画像データを出力する撮像部と、
前記蛍光画像データにおいて前記第１の試料保持空間に対応する第１の領域と前記第２の試料保持空間に対応する第２の領域とを特定し、前記第１の領域に対応する第１の部分画像データと前記第２の領域に対応する第２の部分画像データとを生成する部分画像生成部と、
前記第１の部分画像データに基づいて第１の観察画像データを生成し、前記第２の部分画像データに基づいて第２の観察画像データを生成する観察画像生成部と、
前記第１の観察画像データ及び前記第２の観察画像データに基づいて前記試料の解析を行う解析部と、を備える試料観察装置。
【請求項２】
前記撮像部は、前記面状光の照射によって発生した前記励起光の散乱光を更に撮像し、当該撮像結果に基づく散乱光画像データを出力し、
前記部分画像生成部は、前記散乱光画像データに基づいて前記蛍光画像データにおける前記第１の領域と前記第２の領域とを特定する請求項１記載の試料観察装置。
【請求項３】
前記照射光学系は、前記メンブレンフィルタを透過する波長を含む第１の面状光と、前記メンブレンフィルタを透過しない波長を含む第２の面状光とを前記励起光として前記試料に照射し、
前記撮像部は、前記第１の面状光の照射によって発生した第１の蛍光を含む観察光及び前記第２の面状光の照射によって発生した第２の蛍光を含む観察光を撮像し、それぞれの撮像結果に基づく第１の蛍光画像データ及び第２の蛍光画像データを出力し、
前記部分画像生成部は、前記第２の蛍光画像データに基づいて、前記第１の蛍光画像データにおける前記第１の領域及び前記第２の領域を特定する請求項１記載の試料観察装置。
【請求項４】
前記試料は、前記メンブレンフィルタを透過する波長の光によって励起される第１の蛍光物質、及び前記メンブレンフィルタを透過しない波長の光によって励起される第２の蛍光物質によって染色されている請求項３記載の試料観察装置。
【請求項５】
前記試料は、前記メンブレンフィルタを透過する波長の光によって励起される第１の蛍光物質によって染色されており、
前記第１の試料保持空間及び前記第２の試料保持空間には、前記メンブレンフィルタを透過しない波長の光によって励起される第２の蛍光物質を含む溶液が注入されている請求項３記載の試料観察装置。
【請求項６】
前記解析部は、前記第１の観察画像データ及び前記第２の観察画像データに基づいて、前記第１の試料保持空間に位置する前記試料の数と前記第２の試料保持空間に位置する前記試料の数とをそれぞれ計数する請求項１〜５のいずれか一項記載の試料観察装置。
【請求項７】
前記照射面に対して傾斜する観察軸を有し、前記観察光を前記撮像部に結像する結像光学系を更に備える請求項１〜６のいずれか一項記載の試料観察装置。
【請求項８】
メンブレンフィルタによって仕切られた第１の試料保持空間及び第２の試料保持空間を有する試料容器に保持された試料を観察する試料観察方法であって、
前記メンブレンフィルタを透過する波長を含む面状光を励起光として前記試料に照射する照射ステップと、
前記面状光の照射面に対して前記試料を走査する走査ステップと、
前記面状光の照射によって発生した蛍光を含む観察光を撮像し、当該撮像結果に基づく蛍光画像データを出力する撮像ステップと、
前記蛍光画像データにおいて前記第１の試料保持空間に対応する第１の領域と前記第２の試料保持空間に対応する第２の領域とを特定し、前記第１の領域に対応する第１の部分画像データと前記第２の領域に対応する第２の部分画像データとを生成する部分画像生成ステップと、
前記第１の部分画像データに基づいて第１の観察画像データを生成し、前記第２の部分画像データに基づいて第２の観察画像データを生成する観察画像生成ステップと、
前記第１の観察画像データ及び前記第２の観察画像データに基づいて前記試料の解析を行う解析ステップと、を備える試料観察方法。
【請求項９】
前記撮像ステップでは、前記面状光の照射によって発生した前記励起光の散乱光を更に撮像し、当該撮像結果に基づく散乱光画像データを出力し、
前記部分画像生成ステップでは、前記散乱光画像データに基づいて前記蛍光画像データにおける前記第１の領域と前記第２の領域とを特定する請求項８記載の試料観察方法。
【請求項１０】
前記照射ステップでは、前記メンブレンフィルタを透過する波長を含む第１の面状光と、前記メンブレンフィルタを透過しない波長を含む第２の面状光とを前記励起光として前記試料に照射し、
前記撮像ステップでは、前記第１の面状光の照射によって発生した第１の蛍光を含む観察光及び前記第２の面状光の照射によって発生した第２の蛍光を含む観察光を撮像し、それぞれの撮像結果に基づく第１の蛍光画像データ及び第２の蛍光画像データを出力し、
前記部分画像生成ステップでは、前記第２の蛍光画像データに基づいて、前記第１の蛍光画像データにおける前記第１の領域及び前記第２の領域を特定する請求項８記載の試料観察方法。
【請求項１１】
前記メンブレンフィルタを透過する波長の光によって励起される第１の蛍光物質、及び前記メンブレンフィルタを透過しない波長の光によって励起される第２の蛍光物質によって前記試料を染色する準備ステップを更に有する請求項１０記載の試料観察方法。
【請求項１２】
前記メンブレンフィルタを透過する波長の光によって励起される第１の蛍光物質によって前記試料を染色し、前記メンブレンフィルタを透過しない波長の光によって励起される第２の蛍光物質を含む溶液を前記第１の試料保持空間及び前記第２の試料保持空間に注入する準備ステップを更に有する請求項１０記載の試料観察方法。
【請求項１３】
前記解析ステップでは、前記第１の観察画像データ及び前記第２の観察画像データに基づいて、前記第１の試料保持空間に位置する前記試料の数と前記第２の試料保持空間に位置する前記試料の数とをそれぞれ計数する請求項８〜１２のいずれか一項記載の試料観察方法。
【請求項１４】
前記撮像ステップでは、前記照射面に対して傾斜する観察軸によって前記観察光を結像する請求項８〜１３のいずれか一項記載の試料観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料観察装置及び試料観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、メンブレンフィルタを用い、癌細胞などの試料の移動能を評価する手法が知られている（例えば非特許文献１〜３参照）。移動能の評価には、例えば浸潤能評価（Cell Invasion Assay）がある。浸潤能評価は、主に癌細胞が細胞外マトリクスを破壊しながら移動する能力を評価するものである。浸潤能評価では、細胞外マトリクスを塗布したメンブレンフィルタを細胞が通過する能力を評価する。
【０００３】
癌細胞は、より栄養が豊富な領域に移動する性質を有する。そこで、試料容器において、メンブレンフィルタで仕切られた２つの空間の一方を栄養の乏しい溶液で満たすと共に、他方を栄養の豊富な溶液で満たすことで、メンブレンフィルタの微細孔を介して一方の空間側から他方の空間に細胞を移動させることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Nina Kramer et al., “In vitro cell migration and invasion assays” MutationResearch 752 (2013) 10-24
【非特許文献２】Keren I. Hulkower and Renee L. Herber “Cell Migration and InvasionAssays as Tools for Drug Discovery” Pharmaceutics 2011, 3, 107-124; doi:10.3390/pharmaceutics3010107
【非特許文献３】Vladimir Mastyugin et al., “A Quantitative High-Throughput EndothelialCell Migration Assay” Journal of Biomolecular Screening 9(8); 2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来では、メンブレンフィルタを介して一方の空間から他方の空間に移動した試料を蛍光などで標識してプレートリーダで観察し、コントロール（薬剤未処理の状態）との比較が行われていた。しかしながら、かかる従来の手法では、メンブレンフィルタを通って一方の空間から他方の空間に移動した試料と移動しなかった試料との双方を観察することが困難であった。
【０００６】
メンブレンフィルタを通って移動した試料の観察だけでは、観察時間が長くなる場合や薬剤の作用によっては、細胞増殖或いは細胞死といった現象と細胞の浸潤能とを区別することが困難となる。そのため、浸潤能の評価の精度を十分に確保できなくなることが考えられる。浸潤能の評価の精度向上には、メンブレンフィルタを通って移動した試料と移動しなかった試料とのそれぞれの生存性を求めることが好適である。
【０００７】
本発明は、上記課題の解決のためになされたものであり、メンブレンフィルタを通って移動した試料と移動しなかった試料との双方を観察できる試料観察装置及び試料観察方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一側面に係る試料観察装置は、メンブレンフィルタによって仕切られた第１の試料保持空間及び第２の試料保持空間を有する試料容器に保持された試料を観察する試料観察装置であって、メンブレンフィルタを透過する波長を含む面状光を励起光として試料に照射する照射光学系と、面状光の照射面に対して試料を走査する走査部と、面状光の照射によって発生した蛍光を含む観察光を撮像し、当該撮像結果に基づく蛍光画像データを出力する撮像部と、蛍光画像データにおいて第１の試料保持空間に対応する第１の領域と第２の試料保持空間に対応する第２の領域とを特定し、第１の領域に対応する第１の部分画像データと第２の領域に対応する第２の部分画像データとを生成する部分画像生成部と、第１の部分画像データに基づいて第１の観察画像データを生成し、第２の部分画像データに基づいて第２の観察画像データを生成する観察画像生成部と、第１の観察画像データ及び第２の観察画像データに基づいて試料の解析を行う解析部と、を備える。
【０００９】
この試料観察装置では、メンブレンフィルタを透過する波長を含む面状光を励起光として試料に照射する。これにより、メンブレンフィルタで仕切られた第１の試料保持空間及び第２の試料保持空間の双方からの蛍光を含む観察光の撮像結果に基づく蛍光画像データを取得できる。また、この試料観察装置では、取得した蛍光画像データから第１の試料保持空間に対応する第１の領域と第２の試料保持空間に対応する第２の領域とを特定し、それぞれの領域の部分画像データに基づく観察画像データを生成する。これにより、メンブレンフィルタを通って移動した試料と移動しなかった試料との双方を観察できる。
【００１０】
また、撮像部は、面状光の照射によって発生した励起光の散乱光を更に撮像し、当該撮像結果に基づく散乱光画像データを出力し、部分画像生成部は、散乱光画像データに基づいて蛍光画像データにおける第１の領域と第２の領域とを特定してもよい。この場合、散乱光画像データにより、蛍光画像データにおいてメンブレンフィルタに対応する領域を特定できる。したがって、蛍光画像データにおける第１の領域と第２の領域とを容易に特定できる。
【００１１】
また、照射光学系は、メンブレンフィルタを透過する波長を含む第１の面状光と、メンブレンフィルタを透過しない波長を含む第２の面状光とを励起光として試料に照射し、撮像部は、第１の面状光の照射によって発生した第１の蛍光を含む観察光及び第２の面状光の照射によって発生した第２の蛍光を含む観察光を撮像し、それぞれの撮像結果に基づく第１の蛍光画像データ及び第２の蛍光画像データを出力し、部分画像生成部は、第２の蛍光画像データに基づいて、第１の蛍光画像データにおける第１の領域及び第２の領域を特定してもよい。この場合、第１の蛍光画像データには、メンブレンフィルタを挟んだ双方の試料保持空間からの蛍光像が含まれるのに対し、第２の蛍光画像データには、メンブレンフィルタを挟んだ一方の試料保持空間からの蛍光像のみが含まれる。したがって、第１の蛍光画像データと第２の蛍光画像データとを照合することで、第１の蛍光画像データにおける第１の領域と第２の領域とを容易に特定できる。
【００１２】
また、試料は、メンブレンフィルタを透過する波長の光によって励起される第１の蛍光物質、及びメンブレンフィルタを透過しない波長の光によって励起される第２の蛍光物質によって染色されていてもよい。この場合、第１の蛍光画像データに含まれる試料の蛍光像と、第２の蛍光画像データに含まれる試料の蛍光像とに基づいて、第１の試料保持空間に対応する領域と第２の試料保持空間に対応する領域とを容易に判別できる。したがって、第１の蛍光画像データと第２の蛍光画像データとの照合により、第１の蛍光画像データにおける第１の領域と第２の領域とを容易に特定できる。
【００１３】
また、試料は、メンブレンフィルタを透過する波長の光によって励起される第１の蛍光物質によって染色されており、第１の試料保持空間及び第２の試料保持空間には、メンブレンフィルタを透過しない波長の光によって励起される第２の蛍光物質を含む溶液が注入されていてもよい。この場合、溶液の蛍光像に基づいて、第１の試料保持空間に対応する領域と第２の試料保持空間に対応する領域とを容易に判別できる。したがって、第１の蛍光画像データと第２の蛍光画像データとの照合により、第１の蛍光画像データにおける第１の領域と第２の領域とを容易に特定できる。
【００１４】
また、解析部は、第１の観察画像データ及び第２の観察画像データに基づいて、第１の試料保持空間に位置する試料の数と第２の試料保持空間に位置する試料の数とをそれぞれ計数してもよい。これにより、試料の評価を迅速に実行できる。
【００１５】
また、試料観察装置は、照射面に対して傾斜する観察軸を有し、観察光を撮像部に結像する結像光学系を更に備えていてもよい。この場合、視野選択動作が不要となり、試料の走査と撮像とを同時進行することが可能となる。したがって、観察画像データを得るまでのスループットの向上が図られる。
【００１６】
本発明の一側面に係る試料観察方法は、メンブレンフィルタによって仕切られた第１の試料保持空間及び第２の試料保持空間を有する試料容器に保持された試料を観察する試料観察方法であって、メンブレンフィルタを透過する波長を含む面状光を励起光として試料に照射する照射ステップと、面状光の照射面に対して試料を走査する走査ステップと、面状光の照射によって発生した蛍光を含む観察光を撮像し、当該撮像結果に基づく蛍光画像データを出力する撮像ステップと、蛍光画像データにおいて第１の試料保持空間に対応する第１の領域と第２の試料保持空間に対応する第２の領域とを特定し、第１の領域に対応する第１の部分画像データと第２の領域に対応する第２の部分画像データとを生成する部分画像生成ステップと、第１の部分画像データに基づいて第１の観察画像データを生成し、第２の部分画像データに基づいて第２の観察画像データを生成する観察画像生成ステップと、第１の観察画像データ及び第２の観察画像データに基づいて試料の解析を行う解析ステップと、を備える。
【００１７】
この試料観察方法では、メンブレンフィルタを透過する波長を含む面状光を励起光として試料に照射する。これにより、メンブレンフィルタで仕切られた第１の試料保持空間及び第２の試料保持空間の双方からの蛍光を含む観察光の撮像結果に基づく蛍光画像データを取得できる。また、この試料観察方法では、取得した蛍光画像データから第１の試料保持空間に対応する第１の領域と第２の試料保持空間に対応する第２の領域とを特定し、それぞれの領域の部分画像データに基づく観察画像データを生成する。これにより、メンブレンフィルタを通って移動した試料と移動しなかった試料との双方を観察できる。
【００１８】
また、撮像ステップでは、面状光の照射によって発生した励起光の散乱光を更に撮像し、当該撮像結果に基づく散乱光画像データを出力し、部分画像生成ステップでは、散乱光画像データに基づいて蛍光画像データにおける第１の領域と第２の領域とを特定してもよい。この場合、散乱光画像データにより、蛍光画像データにおいてメンブレンフィルタに対応する領域を特定できる。したがって、蛍光画像データにおける第１の領域と第２の領域とを容易に特定できる。
【００１９】
また、照射ステップでは、メンブレンフィルタを透過する波長を含む第１の面状光と、メンブレンフィルタを透過しない波長を含む第２の面状光とを励起光として試料に照射し、撮像ステップでは、第１の面状光の照射によって発生した第１の蛍光を含む観察光及び第２の面状光の照射によって発生した第２の蛍光を含む観察光を撮像し、それぞれの撮像結果に基づく第１の蛍光画像データ及び第２の蛍光画像データを出力し、部分画像生成ステップでは、第２の蛍光画像データに基づいて、第１の蛍光画像データにおける第１の領域及び第２の領域を特定してもよい。この場合、第１の蛍光画像データには、メンブレンフィルタを挟んだ双方の試料保持空間からの蛍光像が含まれるのに対し、第２の蛍光画像データには、メンブレンフィルタを挟んだ一方の試料保持空間からの蛍光像のみが含まれる。したがって、第１の蛍光画像データと第２の蛍光画像データとを照合することで、第１の蛍光画像データにおける第１の領域と第２の領域とを容易に特定できる。
【００２０】
また、試料観察方法は、メンブレンフィルタを透過する波長の光によって励起される第１の蛍光物質、及びメンブレンフィルタを透過しない波長の光によって励起される第２の蛍光物質によって試料を染色する準備ステップを更に有していてもよい。この場合、第１の蛍光画像データに含まれる試料の蛍光像と、第２の蛍光画像データに含まれる試料の蛍光像とに基づいて、第１の試料保持空間に対応する領域と第２の試料保持空間に対応する領域とを容易に判別できる。したがって、第１の蛍光画像データと第２の蛍光画像データとの照合により、第１の蛍光画像データにおける第１の領域と第２の領域とを容易に特定できる。
【００２１】
また、試料観察方法は、メンブレンフィルタを透過する波長の光によって励起される第１の蛍光物質によって試料を染色し、メンブレンフィルタを透過しない波長の光によって励起される第２の蛍光物質を含む溶液を第１の試料保持空間及び第２の試料保持空間に注入する準備ステップを更に有していてもよい。この場合、溶液の蛍光像に基づいて、第１の試料保持空間に対応する領域と第２の試料保持空間に対応する領域とを容易に判別できる。したがって、第１の蛍光画像データと第２の蛍光画像データとの照合により、第１の蛍光画像データにおける第１の領域と第２の領域とを容易に特定できる。
【００２２】
また、解析ステップでは、第１の観察画像データ及び第２の観察画像データに基づいて、第１の試料保持空間に位置する試料の数と第２の試料保持空間に位置する試料の数とをそれぞれ計数してもよい。これにより、試料の評価を迅速に実行できる。
【００２３】
また、撮像ステップでは、照射面に対して傾斜する観察軸によって観察光を結像してもよい。この場合、視野選択動作が不要となり、試料の走査と撮像とを同時進行することが可能となる。したがって、観察画像データを得るまでのスループットの向上が図られる。
【発明の効果】
【００２４】
この試料観察装置及び試料観察方法では、メンブレンフィルタを通って移動した試料と移動しなかった試料との双方を観察できる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】試料観察装置の一実施形態を示すブロック図である。
【図２】図１に示した試料観察装置における照射光学系、試料容器、及び結像光学系の構成例を示す概略図である。
【図３】撮像部の構成例を示す図である。
【図４】試料観察装置を構成するコンピュータの機能的な構成要素の一例を示すブロック図である。
【図５】（ａ）は蛍光画像データの一例、（ｂ）は散乱光画像データの一例、（ｃ）は第１の領域及び第２の領域の特定の様子を示す図である。
【図６】（ａ）は第１の部分画像データの一例、（ｂ）は第２の部分画像データの一例を示す図である。
【図７】（ａ）は第１の観察画像データの一例、（ｂ）は第２の観察画像データの一例を示す図である。
【図８】図１に示した試料観察装置を用いた試料観察方法の一例を示すフローチャートである。
【図９】試料観察装置の別形態を示すブロック図である。
【図１０】図９に示した試料観察装置における照射光学系、試料容器、及び結像光学系の構成例を示す概略図である。
【図１１】（ａ）は第１の蛍光画像データの一例、（ｂ）は第２の蛍光画像データの一例、（ｃ）は第１の領域及び第２の領域の特定の様子を示す図である。
【図１２】（ａ）は第１の蛍光画像データの別例、（ｂ）は第２の蛍光画像データの別例、（ｃ）は第１の領域及び第２の領域の特定の様子を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、図面を参照しながら、本発明の一側面に係る試料観察装置及び試料観察方法の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２７】
図１は、試料観察装置の一実施形態を示すブロック図である。この試料観察装置１は、試料Ｓの内部で発生した蛍光及び／又は散乱光を結像面に結像させて試料Ｓの観察画像データを取得し、当該観察画像データに基づいて試料Ｓの解析及び評価を行う装置である。
【００２８】
この種の試料観察装置１としては、スライドガラスに保持される試料Ｓの画像を取得し表示するスライドスキャナ、あるいはマイクロプレートに保持される試料Ｓの画像データを取得し、画像データを解析するプレートリーダなどがある。観察対象となる試料Ｓとしては、例えばヒト或いは動物の細胞、組織などが挙げられる。試料Ｓは、後述の面状光Ｌ２によって励起される蛍光物質によって染色されている。蛍光物質としては、例えばカルセインＡＭ（励起波長４９０ｎｍ／蛍光波長５２５ｎｍ）、カルセインブルー（励起波長３６０ｎｍ／蛍光波長４５０ｎｍ）などが挙げられる。これらの蛍光物質を用いる場合、生きている細胞を選択的に染色することができる。
【００２９】
試料Ｓは、図２に示すように、試料容器２に保持されている。試料容器２は、例えばマイクロプレートである。試料容器２は、試料Ｓが配置される複数のウェル３が一直線状（或いはマトリクス状）に配列された板状の本体部４と、本体部４の一面側においてウェル３の一端側を塞ぐように設けられた板状の透明部材５とを有している。
【００３０】
ウェル３内には、メンブレンフィルタ６が配置されている。メンブレンフィルタ６は、試料Ｓが通過するための多数の微細孔７が設けられた膜である。メンブレンフィルタ６の材質は、例えばポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレートなどである。メンブレンフィルタ６の厚さは、一般に非常に薄く、例えば７μｍ〜２５μｍ程度である。また、微細孔７の内径（直径）は、例えば８μｍ〜１０μｍ程度である。メンブレンフィルタ６は、透明部材５と反対側の第１の試料保持空間Ｖ１と、透明部材５側の第２の試料保持空間Ｖ２とにウェル３を仕切るように、支持部材８によってウェル３の略中央位置で保持されている。
【００３１】
観察対象となる試料Ｓが癌細胞である場合、試料Ｓが第１の試料保持空間Ｖ１側に位置するように、細胞外マトリクスを塗布したメンブレンフィルタ６の一方面に試料Ｓを保持する。メンブレンフィルタ６の一方面に保持された試料Ｓの一部は、時間の経過と共にメンブレンフィルタ６の微細孔７に進入し、微細孔７を通ってメンブレンフィルタ６の他方面（すなわち第２の試料保持空間Ｖ２）に移動する。したがって、メンブレンフィルタ６の一方面に試料Ｓを保持してから所定時間経過後に、メンブレンフィルタ６の一方面に存在する試料Ｓと他方面に存在する試料Ｓとを観察することで、癌細胞の浸潤能を評価できる。
【００３２】
試料観察装置１は、図１に示すように、照射光学系１１と、走査部１２と、撮像部１３と、コンピュータ１４とを備えて構成されている。照射光学系１１は、メンブレンフィルタ６を透過する波長を含む面状光Ｌ２を励起光として試料Ｓに照射する。照射光学系１１は、図２に示すように、光源１５と、面状光形成部１６とによって構成されている。光源１５は、面状光Ｌ２の形成元となる光Ｌ１を出力する。光源１５としては、例えばレーザダイオード、固体レーザ光源といったレーザ光源などが挙げられる。また、光源１５は、発光ダイオード、スーパールミネッセントダイオード、ランプ系光源であってもよい。光源１５から出力された光Ｌ１は、面状光形成部１６に導光される。
【００３３】
面状光形成部１６は、光源１５から出力された光Ｌ１を面状光Ｌ２に整形し、整形された面状光Ｌ２を光軸Ｐ１に沿って試料Ｓに照射する。本実施形態では、面状光形成部１６の光軸が面状光Ｌ２の光軸Ｐ１となっている。面状光形成部１６は、例えばシリンドリカルレンズ、アキシコンレンズ、或いは空間光変調器などの光整形素子を含んで構成され、光源１５に対して光学的に結合されている。面状光形成部１６は、対物レンズ、光シャッタなどを含んで構成されていてもよい。
【００３４】
メンブレンフィルタ６をポリカーボネートで構成する場合、メンブレンフィルタ６は、４００ｎｍ以下の波長の光に対して非透過性を呈する。このため、光Ｌ１及び面状光Ｌ２の波長は、例えば４５０ｎｍ〜７５０ｎｍであることが好適である。試料Ｓの厚さ方向に観察を行う場合、分解能を考慮して、面状光Ｌ２は、厚さ２ｍｍ以下の薄い面状光であることが好ましい。また、試料Ｓの厚さが非常に小さい場合、すなわち、Ｚ方向解像度以下の厚さの試料Ｓを観察する場合には、面状光Ｌ２の厚さは分解能に影響しない。この場合には、厚さ２ｍｍを超える面状光Ｌ２を用いてもよい。
【００３５】
照射光学系１１によって形成された面状光Ｌ２は、試料容器２に保持された試料Ｓに照射される。上述したように、面状光Ｌ２は、メンブレンフィルタ６を透過する波長を含む。したがって、試料Ｓに対する面状光Ｌ２の照射面Ｒは、第１の試料保持空間Ｖ１からメンブレンフィルタ６を含んで第２の試料保持空間Ｖ２に至る。面状光Ｌ２の照射により、面状光Ｌ２の照射面Ｒでは、観察光Ｌ３が発生する。観察光Ｌ３には、例えば面状光Ｌ２によって試料Ｓで励起された蛍光、及びメンブレンフィルタ６を通過せずにメンブレンフィルタ６の表面で散乱した面状光Ｌ２の散乱光がそれぞれ含まれる。
【００３６】
走査部１２は、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して試料Ｓを走査する機構である。走査部１２は、例えば試料Ｓを保持する試料容器２を移動させる移動ステージを含んで構成されている。移動ステージは、コンピュータ１４からの制御信号に従い、予め設定された方向に試料容器２を走査する。本実施形態では、移動ステージは、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と直交する平面内の一方向に試料容器２を走査する。以下の説明では、図２に示すように、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１方向をＺ軸、移動ステージによる試料容器２の走査方向をＹ軸、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と直交する平面内においてＹ軸に直交する方向をＸ軸と称する。試料Ｓに対する面状光Ｌ２の照射面Ｒは、ＸＺ平面内の面となる。
【００３７】
本実施形態では、図２に示すように、面状光Ｌ２の照射によって照射面Ｒで発生した観察光Ｌ３を結像する結像光学系１７が設けられている。結像光学系１７は、図２に示すように、例えば対物レンズ１８を含んで構成されている。結像光学系１７は、対物レンズ１８に加えて結像レンズを含んでいてもよい。結像光学系１７の光軸は、観察光Ｌ３の観察軸Ｐ２となっている。この観察軸Ｐ２は、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して傾斜角度θをもって傾斜している。傾斜角度θは、試料Ｓに向かう面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と観察軸Ｐ２とがなす角とも一致する。傾斜角度θは、例えば１０°〜８０°となっている。観察画像の解像度を向上させる観点から、傾斜角度θは、２０°〜７０°であることが好ましい。また、観察画像の解像度の向上及び視野の安定性の観点から、傾斜角度θは、３０°〜６５°であることが更に好ましい。
【００３８】
撮像部１３は、図１に示すように、観察光Ｌ３を撮像し、撮像結果に基づく蛍光画像データを出力する撮像装置によって構成されている。本実施形態では、撮像部１３は、面状光Ｌ２の照射によって発生した蛍光を撮像する第１の撮像装置（第１の光検出器）１３Ａと、メンブレンフィルタ６の表面で生じた面状光Ｌ２の散乱光を撮像する第２の撮像装置（第２の光検出器）１３Ｂとを有している。
【００３９】
第１の撮像装置１３Ａ及び第２の撮像装置１３Ｂとしては、例えばＣＭＯＳイメージセンサ、ＣＣＤイメージセンサといったエリアイメージセンサが挙げられる。これらのエリアイメージセンサは、結像光学系１７による結像面に配置され、例えばグローバルシャッタ或いはローリングシャッタによって光像を撮像し、二次元画像のデータをコンピュータ１４に出力する。第１の撮像装置１３Ａには、散乱光をカットするフィルタが設けられていてもよく、第２の撮像装置１３Ｂには、蛍光をカットするフィルタが設けられていてもよい。
【００４０】
第１の撮像装置１３Ａ及び第２の撮像装置１３Ｂにラインスキャン方式を適用し、照射面Ｒにおける蛍光像及び散乱光像を部分的に撮像してもよい。例えば図３（ａ）に示すように、エリアイメージセンサ２１の撮像面においてサブアレイを設定してもよい。この場合、サブアレイに含まれる画素列２１ａのみを読み出すことができるので、観察光Ｌ３による光像を部分的に撮像できる。また、図３（ｂ）に示すように、エリアイメージセンサ２１の全ての画素列を読み出しエリアとし、その後の画像処理によって二次元画像の一部を抽出してもよい。
【００４１】
さらに、図３（ｃ）に示すように、エリアイメージセンサ２１に代えてラインセンサ２２を用い、撮像面自体を一の画素列に限定して部分的な撮像を行ってもよい。図３（ｄ）に示すように、観察光Ｌ３の一部のみを透過させるスリット２３をエリアイメージセンサ２１の前面に配置し、スリット２３に対応する画素列２１ａの画像データを取得してもよい。スリット２３を用いる場合、エリアイメージセンサに代えて光電子増倍管などのポイントセンサを用いてもよい。
【００４２】
コンピュータ１４は、物理的には、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリ、及びＣＰＵ等のプロセッサ（演算回路）、通信インターフェイス、ハードディスク等の格納部、ディスプレイ等の表示部を備えて構成されている。かかるコンピュータ１４としては、例えばパーソナルコンピュータ、マイクロコンピュータ、クラウドサーバ、スマートデバイス（スマートフォン、タブレット端末など）などが挙げられる。コンピュータ１４は、メモリに格納されるプログラムをコンピュータシステムのＣＰＵで実行することにより、光源１５、走査部１２、及び撮像部１３の動作を制御するコントローラとして機能する。
【００４３】
コントローラとしてのコンピュータ１４は、ユーザによる測定開始の操作の入力を受け、光源１５、走査部１２、及び撮像部１３を同期させて駆動する。これにより、照射面Ｒに対して試料容器２がＹ方向に走査されると共に、照射面Ｒにおける複数のＸＺ画像が撮像部１３によって撮像される。コンピュータ１４は、走査部１２による試料容器２の移動中に、光源１５が光Ｌ１を連続的に出力するように光源１５を制御してもよく、撮像部１３による撮像に合わせて光源１５による光Ｌ１の出力のＯＮ／ＯＦＦを制御してもよい。また、照射光学系１１が光シャッタを備えている場合、コンピュータ１４は、当該光シャッタの制御によって面状光Ｌ２の照射をＯＮ／ＯＦＦさせてもよい。
【００４４】
また、コンピュータ１４は、機能的な構成要素として、図４に示すように、撮像結果受信部３１と、部分画像生成部３２と、観察画像生成部３３と、解析部３４とを備えている。撮像結果受信部３１は、撮像部１３から撮像データを受信する部分である。すなわち、撮像結果受信部３１は、観察光Ｌ３に含まれる蛍光像に基づく蛍光画像データを第１の撮像装置１３Ａから受信し、観察光Ｌ３に含まれる散乱光像に基づく散乱光画像データを第２の撮像装置１３Ｂから受信する。撮像結果受信部３１は、受信した蛍光画像データ及び散乱光画像データを部分画像生成部３２に出力する。
【００４５】
図５（ａ）は、蛍光画像データの一例を示す図である。この蛍光画像データＧは、面状光Ｌ２の照射面Ｒで生じた蛍光のＸＺ像に対応する。蛍光は、試料Ｓに含まれる蛍光物質が面状光Ｌ２によって励起されて生じる。したがって、同図に示すように、蛍光画像データＧには、メンブレンフィルタ６の一方面に位置する試料Ｓに対応する蛍光像Ｍ１と、メンブレンフィルタ６の他方面に位置する試料Ｓに対応する蛍光像Ｍ２とがそれぞれ出現し得る。メンブレンフィルタ６は蛍光を発生しないので、メンブレンフィルタ６に対応する領域には蛍光像は出現しない。
【００４６】
図５（ｂ）は、散乱光画像データの一例を示す図である。この散乱光画像データＦは、面状光Ｌ２の照射面Ｒで生じた散乱光のＸＺ像に対応する。散乱光は、面状光Ｌ２がメンブレンフィルタ６で散乱されて生じる。したがって、同図に示すように、散乱光画像データＦには、メンブレンフィルタ６の一方面に位置する試料Ｓに対応する散乱光像Ｎ１と、メンブレンフィルタ６の他方面に位置する試料Ｓに対応する散乱光像Ｎ２と、メンブレンフィルタ６に対応する散乱光像Ｎ３とがそれぞれ出現し得る。
【００４７】
部分画像生成部３２は、蛍光画像データに基づく部分画像データを生成する。部分画像生成部３２は、撮像部１３から蛍光画像データＧ及び散乱光画像データＦを受け取ると、まず、散乱光画像データＦにおける散乱光像Ｎ３に基づいてメンブレンフィルタ６に対応する領域Ｑ（図５（ｂ）参照）を特定する。メンブレンフィルタ６に対応する領域Ｑは、所定の画像処理によって特定してもよく、メンブレンフィルタ６の厚さに基づいて特定してもよい。
【００４８】
次に、部分画像生成部３２は、図５（ｃ）に示すように、メンブレンフィルタ６に対応する領域Ｑを蛍光画像データＧに適用し、蛍光画像データＧにおいて第１の試料保持空間Ｖ１に対応する第１の領域Ｋ１と第２の試料保持空間Ｖ２に対応する第２の領域Ｋ２とを特定する。第１の領域Ｋ１及び第２の領域Ｋ２を特定した後、部分画像生成部３２は、第１の領域Ｋ１に相当する部分を蛍光画像データＧから抽出し、図６（ａ）に示すように、第１の領域Ｋ１に対応する第１の部分画像データＥ１を生成する。同様に、部分画像生成部３２は、第２の領域Ｋ２に相当する部分を蛍光画像データＧから抽出し、図６（ｂ）に示すように、第２の領域Ｋ２に対応する第２の部分画像データＥ２を生成する。部分画像生成部３２は、生成した第１の部分画像データＥ１及び第２の部分画像データＥ２を観察画像生成部３３に出力する。
【００４９】
観察画像生成部３３は、部分画像データに基づいて観察画像データを生成する。観察画像生成部３３は、部分画像生成部３２から受け取った第１の部分画像データＥ１及び第２の部分画像データＥ２をＺ軸方向に圧縮する。Ｚ軸方向に圧縮された部分画像データは、Ｘ軸方向についての蛍光輝度を示す。上述したように、試料観察装置１では、照射面Ｒに対して試料容器２がＹ軸方向に走査されると共に、照射面Ｒにおける複数のＸＺ画像が撮像部１３によって撮像される。このため、観察画像生成部３３では、Ｚ軸方向に圧縮された部分画像データがＹ軸方向について複数生成される。
【００５０】
観察画像生成部３３は、第１の部分画像データＥ１について、Ｚ軸方向に圧縮された部分画像データをＹ軸方向に合成し、各部分画像データにおける蛍光輝度を積算する。これにより、図７（ａ）に示すように、第１の領域Ｋ１に対応する第１の観察画像データＪ１を生成する。同様に、観察画像生成部３３は、第２の部分画像データＥ２について、Ｚ軸方向に圧縮された部分画像データをＹ軸方向に合成し、各部分画像データにおける蛍光輝度を積算する。これにより、図７（ｂ）に示すように、第２の領域Ｋ２に対応する第２の観察画像データＪ２を生成する。観察画像生成部３３は、生成した第１の観察画像データＪ１及び第２の観察画像データＪ２を解析部３４に出力する。
【００５１】
解析部３４は、第１の観察画像データＪ１及び第２の観察画像データＪ２に基づいて試料Ｓの解析を行う。第１の観察画像データＪ１に出現している蛍光像Ｄ１は、メンブレンフィルタ６を通過せずに第１の試料保持空間Ｖ１に留まった試料Ｓを表している。また、第２の観察画像データに出現している蛍光像Ｄ２は、メンブレンフィルタ６を通過して第２の試料保持空間Ｖ２に移動した試料Ｓを表している。解析部３４は、第１の観察画像データＪ１に出現している蛍光像Ｄ１を計数することにより、第１の試料保持空間Ｖ１に位置する試料Ｓの数を計数する。また、解析部３４は、第２の観察画像データＪ２に出現している蛍光像Ｄ２を計数することにより、第２の試料保持空間Ｖ２に位置する試料Ｓの数を計数する。解析部３４は、蛍光像Ｄ１，Ｄ２の蛍光強度に基づいて、第１の試料保持空間Ｖ１に位置する試料Ｓ及び第２の試料保持空間Ｖ２に位置する試料Ｓのそれぞれの蛍光強度を解析してもよい。
【００５２】
次に、上述した試料観察装置１を用いた試料観察方法について説明する。図８は、図１に示した試料観察装置１を用いた試料観察方法の一例を示すフローチャートである。
【００５３】
この試料観察方法は、図８に示すように、準備ステップ（ステップＳ０１）と、照射ステップ（ステップＳ０２）と、走査ステップ（ステップＳ０３）と、撮像ステップ（ステップＳ０４）と、部分画像生成ステップ（ステップＳ０５）と、観察画像生成ステップ（ステップＳ０６）と、解析ステップ（ステップＳ０７）とを備えて構成されている。
【００５４】
準備ステップでは、試料容器２への試料Ｓの保持を行う。ここでは、メンブレンフィルタ６を透過する波長の光によって励起される蛍光物質によって試料Ｓを染色する。次に、試料Ｓが第１の試料保持空間Ｖ１側に位置するように、細胞外マトリクスを塗布したメンブレンフィルタ６の一方面に試料Ｓを保持する。試料Ｓを保持して一定の時間が経過したのち、試料容器２を走査部１２にセットする。
【００５５】
照射ステップでは、試料Ｓに面状光Ｌ２を照射する。ユーザによって測定開始の操作が試料観察装置１に入力されると、コンピュータ１４からの制御信号に基づいて光源１５が駆動し、光源１５から光Ｌ１が出力される。光源１５から出力された光Ｌ１は、面状光形成部１６によって整形されて面状光Ｌ２となり、試料容器２に保持された試料Ｓに照射される。
【００５６】
走査ステップでは、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して試料Ｓを走査する。ユーザによって測定開始の操作が入力されると、コンピュータ１４からの制御信号に基づいて、光源１５の駆動と同期して走査部１２が駆動する。これにより、試料容器２がＹ軸方向に一定の速度で直線的に駆動し、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対してウェル３内の試料Ｓが走査される。
【００５７】
撮像ステップでは、面状光Ｌ２の照射によって発生した観察光Ｌ３を撮像する。より具体的には、撮像ステップでは、照射面Ｒに対して傾斜する観察軸Ｐ２を有する結像光学系１７により、面状光Ｌ２の照射によって試料Ｓで発生した観察光Ｌ３を撮像部１３の結像面に対して結像する。撮像ステップでは、結像光学系１７によって結像された蛍光画像による光像の一部に対応する部分的な画像を第１の撮像装置１３Ａによって複数取得し、散乱光画像による光像の一部に対応する部分的な画像を第２の撮像装置１３Ｂによって複数取得する。
【００５８】
部分画像生成ステップでは、第１の領域Ｋ１に対応する第１の部分画像データＥ１と第２の領域Ｋ２に対応する第２の部分画像データＥ２とを生成する。部分画像生成ステップでは、まず、散乱光画像データＦに基づいてメンブレンフィルタ６に対応する領域Ｑ（図５（ｂ）参照）を特定する。次に、メンブレンフィルタ６に対応する領域Ｑを蛍光画像データＧに適用し、蛍光画像データＧにおいて、第１の試料保持空間Ｖ１に対応する第１の領域Ｋ１と、第２の試料保持空間Ｖ２に対応する第２の領域Ｋ２とを特定する（図５（ｃ）参照）。
【００５９】
第１の領域Ｋ１及び第２の領域Ｋ２を特定した後、第１の領域Ｋ１に相当する部分を蛍光画像データＧから抽出し、第１の領域Ｋ１に対応する第１の部分画像データＥ１を生成する（図６（ａ）参照）。同様に、第２の領域Ｋ２に相当する部分を蛍光画像データＧから抽出し、第２の領域Ｋ２に対応する第２の部分画像データＥ２を生成する（図６（ｂ）参照）。
【００６０】
観察画像生成ステップでは、第１の部分画像データＥ１に基づいて第１の観察画像データＪ１を生成し、第２の部分画像データＥ２に基づいて第２の観察画像データＪ２を生成する。より具体的には、観察画像生成ステップでは、第１の部分画像データＥ１について、Ｚ軸方向に圧縮された複数の部分画像データをＹ軸方向に合成し、第１の領域Ｋ１に対応する第１の観察画像データＪ１を生成する（図７（ａ）参照）。同様に、第２の部分画像データＥ２について、Ｚ軸方向に圧縮された複数の部分画像データをＹ軸方向に合成し、第２の領域Ｋ２に対応する第２の観察画像データＪ２を生成する（図７（ｂ）参照）。
【００６１】
解析ステップでは、第１の観察画像データＪ１及び第２の観察画像データＪ２に基づいて試料Ｓの解析を行う。解析ステップでは、例えば第１の観察画像データＪ１に出現している蛍光像Ｄ１を計数し、第１の試料保持空間Ｖ１に位置する試料Ｓの数を計数する。また、第２の観察画像データＪ２に出現している蛍光像Ｄ２を計数することにより、第２の試料保持空間Ｖ２に位置する試料Ｓの数を計数する。第１の試料保持空間Ｖ１に位置する試料Ｓ及び第２の試料保持空間Ｖ２に位置する試料Ｓのそれぞれの蛍光強度を解析する。
【００６２】
以上説明したように、試料観察装置１では、メンブレンフィルタ６を透過する波長を含む面状光Ｌ２を励起光として試料に照射する。これにより、メンブレンフィルタ６で仕切られた第１の試料保持空間Ｖ１及び第２の試料保持空間Ｖ２の双方からの蛍光を含む観察光Ｌ３の撮像結果に基づく蛍光画像データＧを取得できる。また、試料観察装置１では、取得した蛍光画像データＧから第１の試料保持空間Ｖ１に対応する第１の領域Ｋ１と第２の試料保持空間Ｖ２に対応する第２の領域Ｋ２とを特定し、それぞれの領域の部分画像データに基づく観察画像データを生成する。これにより、メンブレンフィルタ６を通って移動した試料Ｓと移動しなかった試料Ｓとの双方を観察できる。
【００６３】
また、試料観察装置１では、蛍光を撮像する第１の撮像装置１３と、散乱光を撮像する第２の撮像装置１３とによって撮像部１３が構成されている。そして、部分画像生成部３２は、散乱光画像データに基づいて蛍光画像データにおける第１の領域Ｋ１と第２の領域Ｋ２とを特定している。これにより、散乱光画像データＦを用い、蛍光画像データＧにおいてメンブレンフィルタ６に対応する領域Ｑを特定できる。したがって、蛍光画像データＧにおける第１の領域Ｋ１と第２の領域Ｋ２とを容易に特定できる。
【００６４】
また、試料観察装置１では、第１の観察画像データＪ１及び第２の観察画像データＪ２に基づいて、第１の試料保持空間Ｖ１に位置する試料Ｓの数と、第２の試料保持空間Ｖ２に位置する試料Ｓの数とを解析部３４がそれぞれ計数する。これにより、試料Ｓの評価を迅速に実行できる。
【００６５】
さらに、試料観察装置１では、照射面Ｒ３に対して傾斜する観察軸Ｐ２を有し、観察光Ｌ３を撮像部１３に結像する結像光学系１７が設けられている。この場合、視野選択動作が不要となり、試料Ｓの走査と撮像とを同時進行することが可能となる。したがって、観察画像データを得るまでのスループットの向上が図られる。
【００６６】
図９は、試料観察装置の別形態を示すブロック図である。同図に示すように、別形態に係る試料観察装置４１は、第１の照射光学系１１Ａ及び第２の照射光学系１１Ｂによって照射光学系１１が構成されている点で、上述した試料観察装置１と相違している。
【００６７】
この試料観察装置４１を用いて試料Ｓの観察を行うにあたっては、メンブレンフィルタ６を透過する波長の光によって励起される第１の蛍光物質、及びメンブレンフィルタ６を透過しない波長の光によって励起される第２の蛍光物質によって試料Ｓを染色する。第１の蛍光物質としては、例えばカルセインＡＭ（励起波長４９０ｎｍ／蛍光波長５２５ｎｍ）が挙げられる。また、第２の蛍光物質としては、例えばカルセインブルー（励起波長３６０ｎｍ／蛍光波長４５０ｎｍ）が挙げられる。
【００６８】
第１の照射光学系１１Ａは、図１０に示すように、第１の光源１５Ａと第１の面状光形成部１６Ａとを含んで構成されている。第１の光源１５Ａは、メンブレンフィルタ６を透過し、かつ第１の蛍光物質を励起する波長を含む第１の光Ｌ１ａを出力する。第１の面状光形成部１６Ａは、第１の光源１５Ａから出力された第１の光Ｌ１ａを第１の面状光Ｌ２ａに整形し、第１の面状光Ｌ２ａを光軸Ｐ１に沿って試料Ｓに照射する。第１の面状光Ｌ２ａは、メンブレンフィルタ６を透過するため、第１の面状光Ｌ２ａの照射面Ｒａは、第１の試料保持空間Ｖ１からメンブレンフィルタ６を含んで第２の試料保持空間Ｖ２に至る。
【００６９】
第２の照射光学系１１Ｂは、第２の光源１５Ｂと第２の面状光形成部１６Ｂとを含んで構成されている。第２の光源１５Ｂは、メンブレンフィルタ６を透過せず、かつ第２の蛍光物質を励起する波長を含む第２の光Ｌ１ｂを出力する。第２の面状光形成部１６Ｂは、第２の光源１５Ｂから出力された第２の光Ｌ１ｂを第２の面状光Ｌ２ｂに整形し、第２の面状光Ｌ２ｂを例えばミラー４２及びダイクロイックミラー４３によって光軸Ｐ１と同軸にした状態で試料Ｓに照射する。第２の面状光Ｌ２ｂは、メンブレンフィルタ６を透過しないため、第２の面状光Ｌ２ｂの照射面Ｒｂは、第２の試料保持空間Ｖ２のみに存在する。
【００７０】
本実施形態では、観察光Ｌ３には、第１の面状光Ｌ２ａによって試料Ｓで励起された第１の蛍光と、第２の面状光Ｌ２ｂによって試料Ｓで励起された第２の蛍光とが含まれる。第１の蛍光は、照射面Ｒａに対して傾斜する観察軸Ｐ２を有する結像光学系１７Ａによって第１の撮像装置１３Ａの撮像面に結像し、第２の蛍光は、例えばダイクロイックミラー４４及びミラー４５によって第１の蛍光と分離され、照射面Ｒｂに対して傾斜する観察軸Ｐ２を有する結像光学系１７Ｂによって第２の撮像装置１３Ｂの結像面に結像する。
【００７１】
第１の撮像装置１３Ａは、第１の面状光Ｌ２ａの照射によって発生した第１の蛍光の光像を撮像し、第１の蛍光画像データをコンピュータ１４に出力する。また、第２の撮像装置１３Ｂは、第２の面状光Ｌ２ｂの照射によって発生した第２の蛍光の光像を撮像し、第２の蛍光画像データをコンピュータ１４に出力する。第１の撮像装置１３Ａには、第２の蛍光をカットするフィルタが設けられていてもよく、第２の撮像装置１３Ｂには、第１の蛍光をカットするフィルタが設けられていてもよい。
【００７２】
図１１（ａ）は、第１の蛍光画像データの一例を示す図である。第１の面状光Ｌ２ａの照射面Ｒａは、第１の試料保持空間Ｖ１からメンブレンフィルタ６を含んで第２の試料保持空間Ｖ２に至る。したがって、第１の蛍光画像データＧ１には、メンブレンフィルタ６の一方面に位置する試料Ｓに対応する蛍光像Ｍ１と、メンブレンフィルタ６の他方面に位置する試料Ｓに対応する蛍光像Ｍ２とがそれぞれ出現し得る。また、図１１（ｂ）は、第２の蛍光画像データの一例を示す図である。第２の面状光Ｌ２ｂの照射面Ｒｂは、第２の試料保持空間Ｖ２のみに存在する。したがって、第２の蛍光画像データＧ２には、メンブレンフィルタ６の他方面に位置する試料Ｓに対応する蛍光像Ｍ３のみが出現し得る。
【００７３】
この場合、部分画像生成部３２は、メンブレンフィルタ６の厚さに基づいてメンブレンフィルタ６に対応する領域Ｑ１を抽出すると共に、蛍光像Ｍ３の出現範囲に基づいて第２の蛍光画像データＧ２から第２の試料保持空間Ｖ２に対応する領域Ｑ２を抽出する。そして、部分画像生成部３２は、図１１（ｃ）に示すように、メンブレンフィルタ６に対応する領域Ｑ１と、第２の試料保持空間Ｖ２に対応する領域Ｑ２とを第１の蛍光画像データＧ１に適用し、第１の蛍光画像データＧ１において、第１の試料保持空間Ｖ１に対応する第１の領域Ｋ１と、第２の試料保持空間Ｖ２に対応する第２の領域Ｋ２とを特定する。
【００７４】
このような試料観察装置４１においても、上述した試料観察装置１と同様の作用効果を奏し、メンブレンフィルタ６を通って移動した試料Ｓと移動しなかった試料Ｓとの双方を観察できる。また、試料観察装置１では、第１の蛍光画像データＧ１に含まれる試料Ｓの蛍光像Ｍ１，Ｍ２と、第２の蛍光画像データＧ２に含まれる試料の蛍光像Ｍ３とに基づいて、第１の試料保持空間Ｖ１に対応する領域と、第２の試料保持空間Ｖ２に対応する領域とを容易に判別できる。したがって、第１の蛍光画像データＧ１と第２の蛍光画像データＧ２との照合により、第１の蛍光画像データＧ１における第１の領域Ｋ１と第２の領域Ｋ２とを容易に特定できる。
【００７５】
また、試料Ｓの種類によっては、２つの蛍光物質で同時に試料Ｓを染色することが難しい場合も想定される。この場合、メンブレンフィルタ６を透過する波長の光によって励起される第１の蛍光物質によって試料Ｓを染色すると共に、メンブレンフィルタ６を透過しない波長の光によって励起される第２の蛍光物質を含む溶液を第１の試料保持空間Ｖ１及び第２の試料保持空間Ｖ２に注入してもよい。
【００７６】
この場合、図１２（ａ）に示すように、第１の蛍光画像データＧ１には、メンブレンフィルタ６の一方面に位置する試料Ｓに対応する蛍光像Ｍ１と、メンブレンフィルタ６の他方面に位置する試料Ｓに対応する蛍光像Ｍ２とがそれぞれ出現し得る。また、図１２（ｂ）に示すように、第２の蛍光画像データＧ２には、試料Ｓに対応する蛍光像は出現せず、第２の試料保持空間Ｖ２内の溶液に対応する蛍光像Ｍ４のみが出現し得る。
【００７７】
この場合、部分画像生成部３２は、メンブレンフィルタ６の厚さに基づいてメンブレンフィルタ６に対応する領域Ｑ１を抽出すると共に、蛍光像Ｍ４の出現範囲に基づいて第２の蛍光画像データＧ２から第２の試料保持空間Ｖ２に対応する領域Ｑ２を抽出する。そして、部分画像生成部３２は、図１２（ｃ）に示すように、メンブレンフィルタ６に対応する領域Ｑ１と、第２の試料保持空間Ｖ２に対応する領域Ｑ２とを第１の蛍光画像データＧ１に適用し、第１の蛍光画像データＧ１において、第１の試料保持空間Ｖ１に対応する第１の領域Ｋ１と、第２の試料保持空間Ｖ２に対応する第２の領域Ｋ２とを特定する。
【００７８】
この場合においても、上述した試料観察装置１と同様の作用効果を奏し、メンブレンフィルタ６を通って移動した試料Ｓと移動しなかった試料Ｓとの双方を観察できる。また、溶液の蛍光像Ｍ４に基づいて、第１の試料保持空間Ｖ１に対応する領域と、第２の試料保持空間Ｖ２に対応する領域とを容易に判別できる。したがって、第１の蛍光画像データＧ１と第２の蛍光画像データＧ２との照合により、第１の蛍光画像データＧ１における第１の領域Ｋ１と第２の領域Ｋ２とを一層容易に特定できる。
【００７９】
本発明は、上記実施形態に限られるものではない。例えば上記実施形態では、面状光を出力する照射光学系１１とラインスキャン方式を採用した撮像部１３とを組み合わせているが、試料容器２におけるウェル３の深さ方向の断面を一度に測定できるものであれば他の方式を採用してもよい。例えば米国特許第８５８２２０３号に記載のOblique Plane Microscopyの光学系を採用することも可能である。
【符号の説明】
【００８０】
１，４１…試料観察装置、２…試料容器、６…メンブレンフィルタ、１１，１１Ａ，１１Ｂ…照射光学系、１２…走査部、１３…撮像部、１７，１７Ａ，１７Ｂ…結像光学系、３２…部分画像生成部、３３…観察画像生成部、３４…解析部、Ｅ１…第１の部分画像データ、Ｅ２…第２の部分画像データ、Ｆ…散乱光画像データ、Ｇ…蛍光画像データ、Ｇ１…第１の蛍光画像データ、Ｇ２…第２の蛍光画像データ、Ｊ１…第１の観察画像データ、Ｊ２…第２の観察画像データ、Ｋ１…第１の領域、Ｋ２…第２の領域、Ｌ２…面状光、Ｌ２ａ…第１の面状光、Ｌ２ｂ…第２の面状光、Ｌ３…観察光、Ｒ，Ｒａ，Ｒｂ…照射面、Ｓ…試料、Ｖ１…第１の試料保持空間、Ｖ２…第２の試料保持空間。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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