(57)【要約】      （修正有）【課題】リソソーム蓄積症の治療のための改善されたタンパク質ターゲティングを目的とした、リソソーム酵素−リソソーム標的化ペプチド結合体であるＩＧＦ−２連結タンパク質の提供。【解決手段】ａ．特定の配列について、特定の修飾を含む組換ヒトＩＧＦ−２；ｂ．組換ヒトリソソーム酵素；及びｃ．組換ＩＧＦ−２と組換ヒトリソソーム酵素とを結合するリンカーを含む、ＩＧＦ−２結合タンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．リソソーム酵素を第１の架橋剤と接触させて、アルデヒド基を導入するステップと、
ｂ．リソソーム標的化ペプチドを第２の架橋剤と接触させて、Ｎ末端残基にヒドラジド基を導入するステップと、
ｃ．前記ステップａ．のアルデヒド基を有するリソソーム酵素を、前記ステップｂのＮ末端残基にヒドラジド基を有するリソソーム標的化ペプチドと接触させるステップと、
ｄ．リソソーム酵素−リソソーム標的化ペプチド結合体を形成するステップと
を含む、化学的結合方法。
【請求項２】
前記リソソーム標的化ペプチドが変異インスリン様成長因子２（ｖＩＧＦ２）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の架橋剤がＮ−スクシンイミジル−４−ホルミルベンズアミド（Ｓ−４ＦＢ）を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の架橋剤が、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔＢｏｃ）保護ヒドラジドクロスリンカー（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ｔＢｏｃ−ヒドラジド）を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の架橋剤が、アセトン保護ヒドラジド基、ジメチルベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、トリメチルベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
二官能性クロスリンカーが、アセトン保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、ジメチルベンジルカルボニル保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、トリメチルベンジルオキシカルボニル保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１〜３または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記リソソーム酵素が、酸性α−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）、酸性α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、酸性β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、酸性α−イズロニダーゼＡ（ＩｄｕＡ）、酸性イズロン酸２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）、β−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）、β−ヘキソサミニダーゼＢ（ＨｅｘＢ）、酸性α−マンノシダーゼＡ、β−グルコセレブロシダーゼ（ＧｌｃＣｅｒａｓｅ）、酸性リパーゼ（ＬＰＡ）、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記リソソーム酵素がヒト型である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｃ．において、前記Ｎ末端残基にヒドラジド基を有するリソソーム標的化ペプチドが約４倍モル過剰で添加される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｃ．において、アニリンが添加される、請求１〜９項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
アセトン保護ヒドラジド基、ジメチルベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、トリメチルベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、またはこれらの任意の組み合わせを含む、二官能性クロスリンカー。
【請求項１２】
前記二官能性クロスリンカーが、アセトン保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、ジメチルベンジルカルボニル保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、トリメチルベンジルオキシカルボニル保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１１に記載の二官能性クロスリンカー。
【請求項１３】
保護ヒドラジド基を含む、修飾リソソーム標的化ペプチド。
【請求項１４】
前記修飾リソソーム標的化ペプチドが修飾ｖＩＧＦ２ペプチドを含む、請求項１２に記載の修飾リソソーム標的化ペプチド。
【請求項１５】
前記ヒドラジド基が、アセトン基、ジメチルベンジルオキシカルボニル基、トリメチルベンジルオキシカルボニル基、またはこれらの任意の組み合わせによって保護されている、請求項１３または１４に記載の修飾リソソーム標的化ペプチド。
【請求項１６】
リソソーム標的化ペプチドを架橋剤と接触させて、Ｎ末端残基にヒドラジド基を導入するステップを含む、修飾リソソーム標的化ペプチドの製造方法。
【請求項１７】
前記リソソーム標的化ペプチドがｖＩＧＦ２である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記架橋剤がＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔＢｏｃ）保護ヒドラジドクロスリンカー（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ｔＢｏｃ−ヒドラジド）を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記架橋剤が、アセトン保護ヒドラジド基、ジメチルベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、トリメチルベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
二官能性クロスリンカーが、アセトン保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、ジメチルベンジルカルボニル保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、トリメチルベンジルオキシカルボニル保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１６、１７または１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記修飾リソソーム標的化ペプチドの保護ヒドラジド基を脱保護するステップをさらに含む、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
１つまたは複数のリソソーム標的化ペプチドをリソソーム酵素に連結する方法であって、
ａ．ヒドラジド修飾リソソーム標的化ペプチドを溶液中で脱保護して、脱保護ヒドラジド修飾リソソーム標的化ペプチドを形成するステップと、
ｂ．少なくとも１つの脱保護ヒドラジン修飾リソソーム標的化ペプチドをリソソーム酵素に連結するステップと
を含む方法。
【請求項２３】
前記リソソーム標的化ペプチドがｖＩＧＦ２である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記リソソーム酵素が、酸性α−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）、酸性α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、酸性β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、酸性α−イズロニダーゼＡ（ＩｄｕＡ）、酸性イズロン酸２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）、β−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）、β−ヘキソサミニダーゼＢ（ＨｅｘＢ）、酸性α−マンノシダーゼＡ、β−グルコセレブロシダーゼ（ＧｌｃＣｅｒａｓｅ）、酸性リパーゼ（ＬＰＡ）、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
１つまたは複数の二官能性クロスリンカーを介して１つまたは複数のリソソーム標的化ペプチドに架橋されたリソソーム酵素を含む、リソソーム酵素−リソソーム標的化ペプチド結合体。
【請求項２６】
前記二官能性クロスリンカーが、アセトン保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、ジメチルベンジルカルボニル保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、トリメチルベンジルオキシカルボニル保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、Ｎ−スクシンイミジル−４−ホルミルベンズアミド（Ｓ−４ＦＢ）、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記リソソーム酵素が、酸性α−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）、酸性α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、酸性β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、酸性α−イズロニダーゼＡ（ＩｄｕＡ）、酸性イズロン酸２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）、β−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）、β−ヘキソサミニダーゼＢ（ＨｅｘＢ）、酸性α−マンノシダーゼＡ、β−グルコセレブロシダーゼ（ＧｌｃＣｅｒａｓｅ）、酸性リパーゼ（ＬＰＡ）、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記リソソーム標的化ペプチドがｖＩＧＦ２を含む、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願第６１／７９４，７８４号の利益を主張する。
【０００２】
開示される発明は、一般に、化学架橋のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
リソソームは特殊な細胞内小器官であり、そこでは、タンパク質、種々の脂質（糖脂質およびコレステロールを含む）および炭水化物が、新しいタンパク質、膜成分および他の分子の合成を可能にするその主成分に分解されて再生利用される。またリソソームは、リソソーム活性を増大させて種々のタンパク質（例えば、抗体およびインターフェロン）の生合成の増大のために付加的なアミノ酸を提供するオートファジーとして知られている適応性の細胞プロセスを通して恒常性の維持および細胞の健康を助けるために、かつ、エネルギー生成のための栄養を供給して栄養欠乏またはウィルス感染のストレスの多い期間に対処するために、細胞によって利用される。各代謝プロセスは、特定の常在リソソーム酵素によって触媒される。遺伝子変異は、代謝プロセスを変化させるリソソーム生物活性の欠損を引き起こし、臨床疾患をもたらし得る。リソソーム蓄積障害（ＬＳＤ）は、エンドソーム／リソソーム区画内に種々の物質を蓄積させる特定のリソソームタンパク質の欠損によって引き起こされる約５０の異なるヒト代謝疾患の一種である。これらの疾患の多くは、欠損リソソームタンパク質およびその結果である代謝障害を理解するために十分に特徴付けられている。例えば、ゴーシェ、ファブリー、およびテイ・サックス／サンドホフなど、糖脂質異化の変化によるいくつかのＬＳＤが存在する。ニーマン・ピック病Ｃ型は脂質およびコレステロール代謝障害によって特徴付けられており、一方、糖原病ＩＩ型（ポンペ）およびＩＩＩ型（コーリー−フォーブス病）などの炭水化物代謝の変化による疾患も特徴付けられている。他のＬＳＤは、骨または細胞外基質の代謝［例えば、ムコ多糖症（ＭＰＳ  Ｉ〜ＶＩＩ）、ゴーシェ］およびタンパク質代謝回転（神経セロイドリポフスチン症、バッテン病など）を変化させる。ＬＳＤは比較的まれであるが、有効に治療されなければ、重篤な慢性疾患および多くの場合は死を引き起こし得る。
【０００４】
リソソーム蓄積症の既知の治療法は存在しないが、種々のＬＳＤについて、骨髄および臍帯血移植、酵素補充療法（ＥＲＴ）、基質減少療法（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）（ＳＲＴ）および薬理学的シャペロン療法を含むいくつかの異なる治療アプローチが研究されている。遺伝子療法も開発されているが、臨床的に試験されていない。これらの治療アプローチのうちＥＲＴは最も確立されており、複数のＥＲＴがゴーシェ、ファブリー、ポンペ、ＭＰＳ  Ｉ、ＭＰＳ  ＩＩおよびＭＰＳ  ＶＩを含む種々のＬＳＤの治療のために認可されている一方、１つのＳＲＴ薬がゴーシェ病の治療のために認可されている。
【０００５】
リソソーム蓄積症の治療のためのＥＲＴの概念はかなり直接的であり、欠損した生物活性を補充して臨床症状を改善するために、組換えヒトリソソーム酵素が患者に投与される。しかしながら、主に細胞表面または細胞の外側で機能する他のタンパク質治療的処置（例えば、抗ＶＥＧＦおよび他の抗体、エリスロポエチン、凝固因子など）とは異なり、リソソーム酵素はリソソーム内の細胞内部で機能しなければならず、従って、外側から細胞に侵入し、続いてこれらの内部区画へ送達されるためのメカニズムを使用する。哺乳類では、ほとんどの可溶性リソソーム酵素のための特定のアスパラギン残基におけるタンパク質骨格の分枝状炭水化物構造（Ｎ連結オリゴ糖、Ｎ−グリカン）は翻訳後に修飾され、マンノース６リン酸（Ｍ６Ｐ）と呼ばれる特殊な炭水化物構造を形成する。Ｍ６Ｐは、新しく合成されたリソソームタンパク質の同定および膜結合Ｍ６Ｐ受容体を介したゴルジ装置からリソソームへのその輸送のための天然の生体シグナルである。ある種のＭ６Ｐ受容体（カチオン非依存性Ｍ６Ｐ受容体、ＣＩ−ＭＰＲ）は原形質膜へも循環し、外因性リソソームタンパク質の結合および内部移行のために機能的に活性である。ＣＩ−ＭＰＲは、細胞から逃れた（細胞からの分泌によって）リソソームタンパク質を再捕捉するように発達しており、従って外因性リソソームタンパク質を内部移行させるためのターゲティングメカニズムを提供すると考えられ、種々のＬＳＤのための酵素補充療法の基礎である。
【０００６】
組換えリソソーム酵素補充療法は一般に安全であることが示されているが、臨床症状の低減に対するその有効性は大きく異なる。例えば、隔週に１ｍｇ／ｋｇ体重で投与されるＦａｂｒａｚｙｍｅＴＭ（組換え酸性α−ガラクトシダーゼＡ、Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐ．）ＥＲＴは、ファブリー病において蓄積した基質を内皮細胞から排除するのに十分であるが、隔週に投与される４０ｍｇ／ｋｇのＭｙｏｚｙｍｅＴＭ（組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ、ｒｈＧＡＡ、Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐ．）はポンペ病に対して中程度に有効なだけである。異なる効力は主としてＭ６Ｐ含量の違いに起因し、低レベルのＭ６Ｐは不十分な薬物ターゲティングおよびより低い効力と相関する。哺乳類発現系において炭水化物のプロセシング、特にＭ６Ｐのレベルを制御するのは極めて困難であるため、組換えリソソーム酵素の製造は大きな課題である。２つの特殊なゴルジ酵素がＭ６Ｐの修飾を触媒する。Ｎ−アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼは、特定の末端マンノース残基にリン酸連結Ｎ−アセチルグルコサミンを付加し、一方、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ジエステルα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（アンカバーリング酵素（Ｕｎｃｏｖｅｒｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ）としても知られている）は被覆Ｎ−アセチルグルコサミンを除去して、Ｍ６Ｐシグナルを暴露する。しかしながら、Ｎ−アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼは細胞内において限定的であり、この生化学反応は種々のリソソームタンパク質に対して本質的に非効率的である。製造プロセス中のリソソームタンパク質の過剰発現はこの問題を大きく悪化させ、非常に可変的な量のＭ６Ｐをもたらす。従って、炭水化物のプロセシングは通常不完全であり、Ｍ６Ｐを含有するＮ−グリカン、高マンノース型Ｎ−グリカンの非Ｍ６Ｐ構造、および複合型Ｎ−グリカン（分泌タンパク質に典型的）の混合物を有する組換えリソソーム酵素の製造をもたらす。厄介なことに、死細胞または損傷細胞は細胞培地内にホスファターゼなどの酵素を放出し、これはＭ６Ｐを除去する。従って、Ｍ６Ｐ含量の減少は、組換えリソソーム酵素のＭ６Ｐ受容体に対する結合親和性を低下させ、その細胞取込みを少なくし、それにより薬物効力を低減する。死細胞または損傷細胞は、他の炭水化物（例えば、シアル酸、ガラクトースなど）を除去する他のグリコシダーゼを放出して、通常は露出されない内部炭水化物を暴露し、これらのＮ−グリカンは、異常であると容易に同定される。これらの不完全なＮ−グリカン構造は循環からの組換えリソソームタンパク質の排除速度を増大させ、これも薬物の効力を低下させ得る。従って、効力の低下を補償するために、より高い薬物用量が必要である。しかしながら、より高い薬物用量の必要性は複数の否定的な意味合いを有する：（１）より高い薬物用量は、既に高価な治療の増大によって法外なコストがかかり得る、（２）高い薬物用量は、長い注入時間を必要とする、（３）大量の循環薬物は顕著な抗体応答を生じ（ほとんどのポンペ患者において見られる）、多数の患者は注入中にアレルギー反応も経験している。ＦＤＡはミオザイム（Ｍｙｏｚｙｍｅ）に対して「ブラックラベル警告（ｂｌａｃｋ−ｌａｂｅｌ  ｗａｒｎｉｎｇ）」を発行しており、この薬物は、通常、最初は非常にゆっくり投与されるが、注入の過程で増大される。この戦略はアレルギー応答の軽減に役立つが、注入時間が著しく長くなり、１２時間の注入も珍しくない。
【０００７】
種々のリソソームＥＲＴのための薬物ターゲティングを改善するための１つの可能な戦略は標的化ペプチドを用いて、従来のＭ６Ｐ炭水化物構造を必要とすることなく、効率的にＥＲＴをリソソームに標的化する。カチオン非依存性Ｍ６Ｐ受容体はインスリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）と呼ばれる小ペプチドのための別個の結合ドメインを含有するため、これは概念的に実行可能であり、従って、この受容体はＩＧＦ−２／（ＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲ）として知られている。ＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲは細胞表面に存在して生物学的に活性であるため、この受容体は、実際、外因性Ｍ６Ｐを有するリソソームタンパク質の内部移行を単独で担う。他の種類のＭ６Ｐ受容体であるカチオン依存性Ｍ６Ｐ受容体（ＣＤ−ＭＰＲ）は、細胞表面で生物学的に活性でなく、ＩＧＦ−２ペプチド結合ドメインが欠けているため、細胞内のリソソームタンパク質の輸送に関与するだけである。ＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲは、中程度の親和性を有するモノ−Ｍ６ＰＮ−グリカン（Ｎ−グリカン上に１つのＭ６Ｐ残基）、または約３０００倍高い親和性を有するビス−Ｍ６ＰＮ−グリカン（同一のＮ−グリカン上に２つのＭ６Ｐ残基）に結合するように、Ｍ６Ｐに対する２つの別々の結合部位（それぞれ、ドメイン１−３および７−９）を有する。リソソームタンパク質は、複合体（Ｍ６Ｐなし）、モノ−およびビス−Ｍ６ＰＮ−グリカンの混合物を含有するため、ＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲに対するこれらの親和性は、Ｍ６Ｐを有するＮ−グリカンのタイプおよび量に応じて大きく異なる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
改善されたタンパク質ターゲティングのためにＩＧＦ−２連結タンパク質を作製するための戦略を開発することが依然として必要とされている。正確なタンパク質高次構造を保持する構築物が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書において、ａ）リソソーム酵素を第１の架橋剤と接触させて、アルデヒド基を導入するステップと、ｂ）リソソーム標的化ペプチド（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を第２の架橋剤と接触させて、Ｎ末端残基にヒドラジド基を導入するステップと、ステップａ）のアルデヒド基を有するリソソーム酵素を、ステップｂ）のＮ末端残基にヒドラジド基を有するリソソーム標的化ペプチドと接触させるステップと、リソソーム酵素−リソソーム標的化ペプチド結合体を形成するステップとを含む、化学的結合（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）方法が開示される。
【００１０】
また本明細書において、アセトン保護ヒドラジド基、ジメチルベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、トリメチルベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、またはこれらの任意の組み合わせを含む、二官能性クロスリンカーも提供される。また本明細書において、保護ヒドラジド基を含む修飾リソソーム標的化ペプチドも提供される。
【００１１】
本明細書において、リソソーム標的化ペプチドを架橋剤と接触させて、Ｎ末端残基にヒドラジド基を導入するステップを含む、修飾リソソーム標的化ペプチドの製造方法が開示される。また、１つまたは複数のリソソーム標的化ペプチドをリソソーム酵素に連結する方法も提供され、本方法は、ヒドラジド修飾リソソーム標的化ペプチドを溶液中で脱保護して、脱保護ヒドラジド修飾リソソーム標的化ペプチドを形成するステップと、少なくとも１つの脱保護ヒドラジド修飾リソソーム標的化ペプチドをリソソーム酵素に連結するステップとを含む。
【００１２】
本明細書において、１つまたは複数の二官能性クロスリンカーを介して１つまたは複数のリソソーム標的化ペプチドに架橋されたリソソーム酵素を含む、リソソーム酵素−リソソーム標的化ペプチド結合体が開示される。
【００１３】
本開示は添付図面と併せて読むとさらに理解される。主題を説明する目的で、主題の例示的な実施形態が図面に示されているが、本発明が開示する主題は、開示される特定の方法、デバイス、およびシステムに限定されない。さらに、図面は、必ずしも一定の縮尺で描かれているわけではない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＨＰＬＣシステムでモニターされるようなｖＩＧＦ２ペプチドの修飾を示す。
【図２】結合プレートアッセイにおいて、ｖＩＧＦ２−ＧＡＡ結合体がＩＧＦ２−ＣＩ−ＭＰＲ受容体に結合する能力を示す。
【図３】開示されるクロスリンカーのいくつかの化学構造を示す。
【図４Ａ】（Ａ）は、出発の非修飾ｖＩＧＦ２ペプチド（上部パネル）に対して、ｔＢｏｃ保護ヒドラジドリンカーの結合したｖＩＧＦ２ペプチド（中央パネル）の保持時間を示しており、ｔＢｏｃ保護基の除去は、Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣにおける保持時間の別のシフト（減少）を引き起こすことが示された（下部パネル）。
【図４Ｂ】（Ｂ）は、ＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体プレート結合アッセイにおけるｖＩＧＦ２ペプチド結合ｒｈＧＡＡ（結果として生じるヒドラゾン連結を介する）の結果を示す。
【図５Ａ】Ｌ６ラット骨格筋芽細胞において、外因性非結合ｒｈＧＡＡ（１０〜５００ｎＭ）およびｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡ（２〜５０ｎＭ）の内部移行による、ヒドラゾン連結ｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡの細胞取込みの評価を示す。（Ａ）試験した全てのタンパク質濃度で、ｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡは、Ｌ６筋芽細胞において非結合ｒｈＧＡＡよりも実質的に良好に内部移行されることが示された。
【図５Ｂ】Ｌ６ラット骨格筋芽細胞において、外因性非結合ｒｈＧＡＡ（１０〜５００ｎＭ）およびｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡ（２〜５０ｎＭ）の内部移行による、ヒドラゾン連結ｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡの細胞取込みの評価を示す。（Ｂ）ウサギ抗ヒトＧＡＡポリクローナル一次抗体を用いて、ウエスタンブロット法によってＬ６筋芽細胞ライセートを分析した。
【図６】２０倍モル過剰の二官能性クロスリンカーメチルベンジルオキシカルボニル（ＢＯＭ）保護ヒドラジド（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ＢＯＭ−ヒドラジド）によって化学修飾されて、ペプチドのＮ末端にＢＯＭ保護ヒドラジド官能基が導入された精製ｖＩＧＦ２ペプチドのＣ４ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイにおける保持時間を示す。
【図７Ａ】（Ａ）は、２０倍モル過剰の二官能性クロスリンカーフタルイミドオキシ−ＰＥＧ１２−ＮＨＳエステルによって化学修飾されて、ペプチドのＮ末端にフタルイミドオキシ官能基が導入された精製ｖＩＧＦ２ペプチドのＣ４ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイにおける保持時間を示す。
【図７Ｂ】（Ｂ）は、結合されたｖＩＧＦ２ペプチドがＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体に対するｒｈＧＡＡの親和性を改善したかどうかを決定するために、ＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体プレート結合アッセイにおけるオキシム連結ｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡの親和性アッセイを示す。
【図８】２０倍モル過剰の二官能性クロスリンカーｔＢｏｃ−アミノオキシ−ＰＥＧ１２―ＰＦＢによって化学修飾されて、ペプチドのＮ末端にｔＢｏｃ保護アミノオキシ官能基が導入された精製ｖＩＧＦ２ペプチドのＣ４ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイにおける保持時間を示す。
【図９】化学的に酸化されたｒｈＧＡＡ（炭水化物上に化学反応性アルデヒド基を含有する）に直接結合されて、結果としてオキシム連結が形成されたアミノオキシ修飾ｖＩＧＦ２ペプチドのＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体プレート結合アッセイを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の主題は、本開示の一部を形成する以下の詳細な説明を参照することによって、さらに容易に理解することができる。本発明が、本明細書に記載および／または図示される特定の製品、方法、条件またはパラメータに限定されず、本明細書で使用される専門用語が単なる例として特定の実施形態を説明するためのものであり、特許請求される本発明の限定は意図されないことは理解されるべきである。
【００１６】
本明細書において他に定義されない限り、本出願と関連して使用される科学技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって他に要求されない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。
【００１７】
上記および本開示を通して使用される場合、以下の用語および略語は、他に記載されない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【００１８】
本開示において、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は複数の言及を含み、特定の数値への言及は、文脈が他に明確に示さない限り、少なくともその特定の値を含む。従って、例えば、「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」への言及は、１つまたは複数のこのような化合物および当業者に知られているその均等物への言及である。「複数」という用語は、本明細書で使用される場合、２つ以上を意味する。値の範囲が表示される場合、別の実施形態は、１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約」の使用によって値が概数として表示される場合、特定の値が別の実施形態を形成すると理解される。全ての範囲は包括的かつ結合可能である。
【００１９】
化学的結合アプローチは、保護ヒドラジド基を導入するためにｖＩＧＦ２ペプチドの修飾に利用することができる新規の二官能性クロスリンカーによって改善することができる。酸に不安定な保護基は、修飾ｖＩＧＦ２ペプチドのより良好な回収のために弱酸性緩衝液を用いて効率的に除去することができる。脱保護されたヒドラジド修飾ｖＩＧＦ２ペプチドは次に、ヒドラジド部分の化学反応性を保存するために、凍結乾燥させて乾燥粉末として貯蔵することができる。脱保護ヒドラジド修飾ｖＩＧＦ２ペプチドは、リソソーム酵素への化学的カップリングまで無期限に貯蔵することができる。従って、これらの新規のクロスリンカーは、著しくより安定な成分と、化学的結合プロセスのより良好な制御とを提供して、プロセスのスケールアップを可能にすることができる。
【００２０】
この化学的結合アプローチは、第１の架橋剤を用いて組換えヒトリソソーム酵素上のアミノ（Ｎ）末端および１つまたは複数のリジン残基を修飾して、新規のアセトン保護ヒドラジド基を組換えヒトリソソーム酵素に導入するステップを含む。第１の架橋剤で修飾された組換えヒトリソソーム酵素は次に、過剰のクロスリンカーおよび反応副産物を除去するために精製することができる。精製は酸性ｐＨ緩衝液を用いて実施することができ、リソソーム酵素の触媒活性を保存し、アセトン保護基を置き換えて、化学反応性ヒドラジド基を露出させる。これとは別に、上記のｖＩＧＦ２ペプチドの短い伸長リンカー領域のアミノ（Ｎ）末端を、第２の架橋剤を用いて修飾することができ、新規の化学反応性アルデヒド基がｖＩＧＦ２ペプチドに導入される。修飾ｖＩＧＦ２ペプチドは次に、過剰のクロスリンカーおよび反応副産物を除去するために精製し、その後、凍結乾燥させることができる。最終のカップリング反応では、ヒドラジド修飾組換えヒトリソソーム酵素は、凍結乾燥したアルデヒド修飾ｖＩＧＦ２ペプチドへ直接添加され、ｖＩＧＦ２−酵素結合体を生じさせることができる。この方法はｖＩＧＦ２−酵素結合体を生成するために有効であるが、導入されたヒドラジド基は水溶液中で安定ではなく、従って化学反応性は比較的短時間（１〜２日以内）で減少されるため、最終の化学的結合反応は、好ましくは、迅速に実施される。従って、二官能性クロスリンカーによるリソソーム酵素の修飾およびヒドラジド修飾リソソーム酵素の精製を迅速に完了させる（好ましくは、１日以内）ことができなければ、プロセスのスケールアップは困難であり得る。
【００２１】
修飾の順序を変化させ、リソソーム酵素がアルデヒド基を導入するように架橋剤で修飾され、ｖＩＧＦ２ペプチドがヒドラジドを導入するように架橋剤で修飾されることが好ましいであろう。しかしながら、スクシンイミジル６−ヒドラジノニコチン酸アセトン（Ｓ−Ｈｙｎｉｃ）または関連のクロスリンカーなどのヒドラジド含有クロスリンカーの大多数はｖＩＧＦ２ペプチドの凝集および／または沈殿を引き起こし、ペプチドの著しい損失をもたらす。二官能性クロスリンカーによりｖＩＧＦ２ペプチドを修飾して、ｖＩＧＦ２ペプチド上に保護ヒドラジド基を導入するための適切なクロスリンカーおよび方法が本明細書において提供される。保護基は、その後、酸性緩衝液中のインキュベーションによって除去することができ、ヒドラジド修飾されたｖＩＧＦ２ペプチドは、ＨＰＬＣにおける逆相クロマトグラフィによって精製することができる。次に、精製されたヒドラジド修飾ｖＩＧＦ２ペプチドは、凍結乾燥させて粉末として貯蔵することができる。この戦略により、ヒドラジド基は、リソソーム酵素とのカップリングのために化学的に活性なままであることが保証される。別の反応において、組換えリソソーム酵素は、新規のアルデヒド基を導入するように架橋剤によって修飾され得る。精製によって過剰のクロスリンカーおよび反応副産物を除去した後、導入されたアルデヒド基は水溶液中で化学的に安定であるため、アルデヒド修飾リソソーム酵素はその後ｖＩＧＦ２ペプチドとのカップリングまで貯蔵され得る。この新しい戦略はプロセスに「保持ステップ」を提供し、個々の成分（修飾リソソーム酵素および修飾ｖＩＧＦ２）をｖＩＧＦ２−酵素結合体を生成するためのカップリングまで無期限に貯蔵することができる。従って、この新しい方法は実質的により安定性の高い個々の成分を生成し、プロセスのスケールアップにつながる、結合プロセスのより良好な全体的な制御を提供する。
【００２２】
適切な化学的結合方法は、ａ）リソソーム酵素を第１の架橋剤と接触させて、アルデヒド基を導入するステップと、ｂ）リソソーム標的化ペプチドを第２の架橋剤と接触させて、Ｎ末端残基にヒドラジド基を導入するステップと、ステップａ）のアルデヒド基を有するリソソーム酵素を、ステップｂ）のＮ末端残基にヒドラジド基を有するリソソーム標的化ペプチドと接触させるステップと、リソソーム酵素−リソソーム標的化ペプチド結合体を形成するステップとを含むことができる。
【００２３】
リソソーム標的化ペプチドは、変異インスリン様成長因子２（ｖＩＧＦ２）、好ましくは、ヒトインスリン様成長因子２の変異体を適切に含み得る。一実施形態では、このような変異ＩＧＦ２は、ＩＧＦ−１およびインスリン受容体に対するペプチド結合親和性を低下させながら、ｖＩＧＦ２ペプチドがＩＧＦ−２／ＣＩ−ＭＰＲに対する高親和性を維持することを可能にするアミノ酸の欠失および置換を含み得る。例えば、欠失および置換は、以下の変化のうちの１つまたは複数を含むことができる：Ｎ末端アミノ酸残基１〜４の欠失（これらの残基は、対象とするＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体に結合するために必要とされず、位置４におけるプロリンと、それに関連するＮ末端におけるタンパク質の屈曲またはねじれとを除去するため）、野生型ヒトＩＧＦ２の位置６におけるグルタミン酸残基のアルギニンによる置換（血清ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）へのペプチド結合を低減または除去するため）、野生型ヒトＩＧＦ２の位置２７におけるチロシン残基のロイシンによる置換（インスリンおよびＩＧＦ−１受容体に結合するペプチドを低減または除去するため）、およびヒトＩＧＦ−２の位置６５におけるリジン残基のアルギニンによる置換（その位置におけるペプチドの化学修飾を防止するため）。
【００２４】
またさらなる実施形態では、変異ＩＧＦ２は以下の配列のうちの１つを含むことができる、あるいは以下の配列のうちの１つであり得る。
配列番号１
【化１】
2019142889.tif 000002
配列番号２
【化２】
2019142889.tif 000003
配列番号３
【化３】
2019142889.tif 000004
配列番号４
【化４】
2019142889.tif 000005
【００２５】
適切な第１の架橋剤は、Ｎ−スクシンイミジル−４−ホルミルベンズアミド（Ｓ−４ＦＢ）を含む。適切な第２の架橋剤は、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔＢｏｃ）保護ヒドラジドクロスリンカー（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ｔＢｏｃ−ヒドラジド）またはメトキシベンジルオキシカルボニル（ＢＯＭ）保護ヒドラジド（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ＢＯＭ−ヒドラジド）を含む。他の適切な実施形態では、第２の架橋剤は、アセトン保護ヒドラジド基、ジメチルベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、トリメチルベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。他の適切な実施形態では、二官能性クロスリンカーは、アセトン保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、ジメチルベンジルカルボニル保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、トリメチルベンジルオキシカルボニル保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【００２６】
適切なリソソーム酵素には、酸性α−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）、酸性α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、酸性β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、酸性α−イズロニダーゼＡ（ＩｄｕＡ）、酸性イズロン酸２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）、β−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）、β−ヘキソサミニダーゼＢ（ＨｅｘＢ）、酸性α−マンノシダーゼＡ、β−グルコセレブロシダーゼ（ＧｌｃＣｅｒａｓｅ）、酸性リパーゼ（ＬＰＡ）、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。他の適切な実施形態では、リソソーム酵素は哺乳類型であり、哺乳類リソソーム酵素はヒト型であり得る。
【００２７】
Ｎ末端残基にヒドラジド基を有するリソソーム標的化ペプチドは、通常、約４倍モル過剰でリソソーム酵素に添加される。その際にアニリンも適切に添加することができる。本明細書において提供される方法はさらに、リソソーム酵素−リソソーム標的化ペプチド結合体の１つまたは複数の精製ステップを含むことができる。例えば、精製はサイズ排除クロマトグラフィを用いて行うことができる。
【００２８】
本明細書において提供される方法はさらに、リソソーム酵素−リソソーム標的化ペプチド結合体がＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体に結合する能力を評価するステップを含むことができる。リソソーム酵素−リソソーム標的化ペプチド結合体の結合は、通常、約２５ｎＭ以上のリソソーム酵素−リソソーム標的化ペプチド結合体で飽和する。従って、リソソーム酵素−リソソーム標的化ペプチド結合体は、ＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体に対する高親和性の結合を可能にすることによって、正確なタンパク質確認を保持することができる。
【００２９】
適切な二官能性クロスリンカーは、アセトン保護ヒドラジド基、ジメチルベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、トリメチルベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。他の適切な実施形態では、二官能性クロスリンカーは、アセトン保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、ジメチルベンジルカルボニル保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、トリメチルベンジルオキシカルボニル保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【００３０】
適切な修飾リソソーム標的化ペプチドは、保護ヒドラジド基を含むことができる。他の適切な実施形態では、修飾リソソーム標的化ペプチドは、修飾ｖＩＧＦ２ペプチドを含むことができる。他の適切な実施形態では、ヒドラジド基は、アセトン基、ジメチルベンジルオキシカルボニル基、トリメチルベンジルオキシカルボニル基、またはこれらの任意の組み合わせによって保護される。他の適切な実施形態では、修飾リソソーム標的化ペプチドは粉末状である。他の適切な実施形態では、修飾リソソーム標的化ペプチドは凍結乾燥される。
【００３１】
修飾リソソーム標的化ペプチドの適切な製造方法は、リソソーム標的化ペプチドを架橋剤と接触させて、Ｎ末端残基にヒドラジド基を導入するステップを含む。適切なリソソーム標的化ペプチドはｖＩＧＦ２である。適切な架橋剤は、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔＢｏｃ）保護ヒドラジドクロスリンカー（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ｔＢｏｃ−ヒドラジド）を含む。架橋剤は、アセトン保護ヒドラジド基、ジメチルベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、トリメチルベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。二官能性クロスリンカーは、アセトン保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、ジメチルベンジルカルボニル保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、トリメチルベンジルオキシカルボニル保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。本明細書において提供される方法はさらに、修飾リソソーム標的化ペプチドの保護ヒドラジド基を脱保護するステップを含むことができる。同様に、修飾リソソーム標的化ペプチドを凍結乾燥するさらなるステップを実行して、粉末を形成することができる。
【００３２】
１つまたは複数のリソソーム標的化ペプチドをリソソーム酵素に連結する適切な方法は、溶液中でヒドラジド修飾リソソーム標的化ペプチドを脱保護して、脱保護ヒドラジド修飾リソソーム標的化ペプチドを形成するステップと、少なくとも１つの脱保護ヒドラジン修飾リソソーム標的化ペプチドをリソソーム酵素に連結するステップとを含むことができる。リソソーム標的化ペプチドはｖＩＧＦ２を含むことができ、リソソーム酵素は、酸性α−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）、酸性α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、酸性β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、酸性α−イズロニダーゼＡ（ＩｄｕＡ）、酸性イズロン酸２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）、β−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）、β−ヘキソサミニダーゼＢ（ＨｅｘＢ）、酸性α−マンノシダーゼＡ、β−グルコセレブロシダーゼ（ＧｌｃＣｅｒａｓｅ）、酸性リパーゼ（ＬＰＡ）、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【００３３】
適切なリソソーム酵素−リソソーム標的化ペプチド結合体は、１つまたは複数の二官能性クロスリンカーを介して１つまたは複数のリソソーム標的化ペプチド（例えば、ｖＩＧＦ２）に架橋されたリソソーム酵素を含むことができる。適切な二官能性クロスリンカーは、アセトン保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、ジメチルベンジルカルボニル保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、トリメチルベンジルオキシカルボニル保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、Ｎ−スクシンイミジル−４−ホルミルベンズアミド（Ｓ−４ＦＢ）、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。リソソーム酵素は、酸性α−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）、酸性α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、酸性β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、酸性α−イズロニダーゼＡ（ＩｄｕＡ）、酸性イズロン酸２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）、β−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）、β−ヘキソサミニダーゼＢ（ＨｅｘＢ）、酸性α−マンノシダーゼＡ、β−グルコセレブロシダーゼ（ＧｌｃＣｅｒａｓｅ）、酸性リパーゼ（ＬＰＡ）、またはこれらの任意の組み合わせを適切に含む。
【実施例】
【００３４】
以下の実施例は、実例となる個々の実施形態であるが、記載される本発明の範囲を限定することは意図されず、読者は以下の実施例をそのように解釈すべきではない。
【００３５】
実施例１
ＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体への結合を増大させるために、ｖＩＧＦ２ペプチドのリソソーム酵素への化学的カップリングのために新しい化学的結合アプローチを利用した。このアプローチは既に記載されているものとは異なり、リソソーム酵素は、アルデヒド基を導入するために第１の架橋剤により修飾され、一方、ｖＩＧＦ２ペプチドは、Ｎ末端残基にヒドラジド基を導入するために第２の架橋剤により修飾される。特に、組換え野生型ヒト酸性α−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）を、５０ｋＤａ分子量カットオフ膜を備えた濃縮器によって７．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮してから、４℃で一晩、透析によって緩衝液を５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）／１００ｍＭのＮａＣｌ／０．０５％のポリソルベート−８０に交換した。次に、２０倍モル過剰のＮ−スクシンイミジル−４−ホルミルベンズアミド（Ｓ−４ＦＢ、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）クロスリンカーを用いて、周囲温度で２時間ｒｈＧＡＡを化学修飾して、新規のベンズアルデヒド基を導入した。次に、ベンズアルデヒド修飾ｒｈＧＡＡは５０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．８）／５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中で精製されて、過剰のクロスリンカーおよび反応副産物が除去され、ｖＩＧＦ２ペプチドへの化学的カップリングまで４℃で貯蔵される。
【００３６】
別の反応において、精製ｖＩＧＦ２ペプチドを５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）／５０ｍＭのＮａＣｌ／０．０５％のポリソルベート−８０中０．６ｍｇ／ｍｌで再構成し、２０倍〜４０倍モル過剰のＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔＢｏｃ）保護ヒドラジドクロスリンカー（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ｔＢｏｃ−ヒドラジド、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）により修飾した。ｖＩＧＦ２ペプチドの修飾は、図１に示されるように、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）ＨＰＬＣシステム（Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣ）において４．６×２５０ｍｍ、５μｍ、３００ÅのＣ４  Ｊｕｐｉｔｅｒカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，ＣＡ）を用いてモニターした。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％のＴＦＡ）および緩衝液Ｂ［アセトニトリル（ＭｅＣＮ）中０．１％のＴＦＡ］で構成した。Ｃ４逆相ＨＰＬＣ（Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣ）と称されるこの分析方法を利用し、７４％の緩衝液Ａ、２６％の緩衝液Ｂで予め平衡化したＣ４カラムに５〜１００μＬのサンプルを２ｍＬ／分で注入することによって、ＩＧＦ２ペプチドサンプルを特徴付けた。サンプル注入の２分後、２６％から３３％までの緩衝液Ｂの直線的なグラジエントを１３分間にわたって展開させた。これらの条件下で、非修飾ｖＩＧＦ２ペプチドは約１１．５分で溶出した。修飾反応中にクロスリンカーがｖＩＧＦ２に化学的に結合すると、修飾ＩＧＦ２ペプチドは別個のクロマトグラフプロファイルを有し、Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて約１３．５分の見かけの保持時間を有する新しい後方の溶出ピークとして現れる。ｖＩＧＦ２ペプチドがクロスリンカーにより９５％を超えて修飾されたら、ＴＦＡ（１５％の最終濃度）の添加により反応を停止させ、最長４時間までインキュベートした。このインキュベーションステップは、Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣにおけるｖＩＧＦ２の保持時間の著しいシフトから明らかであるように、ｔＢｏｃ保護基を除去するために使用した。これらの実験条件下で、ｔＢｏｃの約５０％が除去された。より長いインキュベーションまたはより高いＴＦＡ濃度を使用すると、修飾ｖＩＧＦ２ペプチドの著しい損失が生じた。次に、ヒドラジド修飾ｖＩＧＦ２ペプチドを、調製用Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、凍結乾燥して、乾燥粉末として貯蔵し、ｒｈＧＡＡへの化学的カップリングまで４℃で貯蔵した。
【００３７】
４倍モル過剰のペプチドにおいて、凍結乾燥したペプチドに直接リソソーム酵素を添加することにより、最終の反応においてベンズアルデヒド修飾ｒｈＧＡＡを脱保護ヒドラジド修飾ｖＩＧＦ２ペプチドに化学的に結合した。この反応の化学触媒であるアニリンを１０ｍＭの最終濃度まで添加し、反応を穏やかに揺り動かしながら、周囲温度で一晩インキュベートした。翌日、サイズ排除クロマトグラフィを用いてｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡ結合体を精製し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．２）／１００ｍＭのＮａＣｌ／０．０５％（ｖ／ｖ）ポリソルベート−８０緩衝液を用いて過剰のｖＩＧＦ２ペプチドを除去した。
【００３８】
ｔＢｏｃ保護基を除去した後に修飾ｖＩＧＦ２ペプチドが正確なタンパク質構造を保持しているかどうかを決定するために、図２に示されるように、プレート結合アッセイにおいてＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体に結合する能力についてｖＩＧＦ２−ＧＡＡ結合体を評価した。簡単に言うと、０．０１〜１０μｇ／ｍｌの範囲の最終ＧＡＡ濃度を得るように、非結合ｒｈＧＡＡおよびｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡを結合緩衝液［４０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．７）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび０．０２％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０］で連続的に希釈し、ＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体被覆プレートにおいて３７℃で３０分間インキュベートした。受容体プレートを結合緩衝液で３回洗浄して非結合酵素を除去し、蛍光発生４−メチルウンベリフェリル−α−グルコース基質［４−ＭＵ−α−Ｇｌｃ、５０μｌの０．１ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．８）中１ｍＭの最終基質濃度］を用いて結合ＧＡＡ酵素の量を測定した。次に、４５μＬの反応サンプルを新しい９６ウェルの黒色透明底アッセイプレートに移し、１２５μＬの０．５ＭのＮａＯＨを添加して酵素反応を停止させ、ｐＨを上昇させた。次に、蛍光プレートリーダーにおいて（３７０ｎｍの励起波長および４６０ｎｍの発光波長をそれぞれ用いて）、個々の酵素反応から解放された４−ＭＵ蛍光を定量化した。図２に示されるように、ｖＩＧＦ２−ＧＡＡは、試験した全ての濃度において、ｒｈＧＡＡ出発材料よりも実質的に良好にＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体に結合した。ｖＩＧＦ２−ＧＡＡの結合は、予想通りに、２５ｎＭ以上で飽和されるようであった。従って、これらの結果は、ｔＢｏｃ脱保護基を除去した後、ｖＩＧＦ２ペプチドが正確なタンパク質高次構造を保持できたことを示し、これは、ＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体に対する高親和性の結合を可能にした。
【００３９】
実施例２
ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ｔＢｏｃ−ヒドラジドクロスリンカーは、ペプチドに対する良好な溶解度を保持しながら、ｖＩＧＦ２ペプチドを効率的に修飾して新規のヒドラジド基を導入することが示された。しかしながら、ｔＢｏｃ保護基は弱酸条件を用いて除去するのが困難であり、脱保護のために高濃度のＴＦＡ（１５％）および４時間のインキュベーションを使用した。これらの厳しい条件下でも、脱保護ヒドラジド修飾ｖＩＧＦ２ペプチドの約５０％しか回収できなかった。効率的な除去および修飾ペプチドのより良好な回収のためにより不安定な保護基を用いてクロスリンカーを設計することができれば、アプローチはさらに改善されるであろう。
【００４０】
ｖＩＧＦ２ペプチドへの効率的な結合のために、かつ、ペプチドに対する良好な溶解度を保持しながら保護ヒドラジド基を導入するために、新規の二官能性クロスリンカーが開発された。これらの新しいクロスリンカーは、図３に示されるように、アセトン保護ヒドラジド基、ジメチルベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、またはトリメチルベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基を含有する。これらの保護基はｔＢｏｃよりもはるかに不安定であり、効率的な除去および修飾ペプチドの高回収率のために弱酸条件（例えば、５％未満のＴＦＡ）が使用されるであろう。さらに、これらの新しいクロスリンカーは、精製および凍結乾燥後に、脱保護修飾ｖＩＧＦ２ペプチドの長期の貯蔵を可能にするはずである。従って、これらの新しいクロスリンカーは、化学的結合プロセスのスケールアップおよびより良好な制御を可能にするであろう。
【００４１】
実施例３
遠心濃縮器（例えば、５０ｋＤａ公称分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）膜を有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、小さいスケール（すなわち、１００ｍｇ未満）で、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）を８〜１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮してから、４℃で一晩、透析によって修飾緩衝液［５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）／１００ｍＭのＮａＣｌ／１００ｍＭのグルコース／２％のマンニトール／０．０５％のポリソルベート−８０］に緩衝液交換した。より大きいスケールの調製（例えば、２００ｍｇよりも多いｒｈＧＡＡ）の場合、タンパク質濃度および緩衝液交換は、５０ｋＤａのＭＷＣＯ膜を有するタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）システムを用いて、ダイアフィルトレーション／濃縮によって達成することができる。ｒｈＧＡＡタンパク質の濃度は、１６６，１１７Ｍ−１ｃｍ−１のモル吸光係数（ε）を用いて２８０ｎｍでのＵＶ吸光分光法によって決定される。次に、修飾緩衝液で希釈することによって、ｒｈＧＡＡタンパク質濃度を７．５ｍｇ／ｍｌに調整し、２５倍モル過剰の二官能性クロスリンカースクシンイミジル４−ホルミル安息香酸（ＳＦＢ）と共に約２０℃で４時間インキュベートして、ｒｈＧＡＡ上に新規のベンズアルデヒド（芳香族アルデヒド）基を導入した。ベンズアルデヒド修飾ｒｈＧＡＡを、４℃で５０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．８）／１００ｍＭのＮａＣｌ／０．０５％のポリソルベート−８０に対して、緩衝液を複数変化させて透析して、過剰のクロスリンカーおよび反応副産物を除去した。化学修飾ｒｈＧＡＡはこの緩衝液中で安定であり、ｖＩＧＦ２ペプチドへの化学的結合まで無期限に貯蔵することができる。重要なことに、ｒｈＧＡＡ上に導入されたベンズアルデヒド基は、ヒドラジド修飾またはアミノオキシ修飾ｖＩＧＦ２ペプチドに対する結合のために化学反応性を保持する。また、ベンズアルデヒド修飾ｒｈＧＡＡが、ＧＡＡの安定性またはカップリング効率に悪影響を与えることなく、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）／１００ｍＭのＮａＣｌ／０．０５％のポリソルベート−８０中で貯蔵可能であることも決定した。
【００４２】
化学修飾の程度を決定するために、かつ、修飾された特定のアミノ酸残基を同定するために、ベンズアルデヒド修飾ｒｈＧＡＡからのペプチドマップを作成し、液体クロマトグラフィ／質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって出発の非修飾出発ｒｈＧＡＡサンプルと直接比較した。簡単に言うと、特定のプロテアーゼの混合物を用いてｒｈＧＡＡをペプチド断片に消化した後、Ｃ１８逆相高速液体クロマトグラフィを行い、質量分析によって個々のペプチド断片を分析することにより、出発の非修飾ｒｈＧＡＡサンプルの参照ペプチドマップを作成した。ベンズアルデヒド修飾ｒｈＧＡＡの４つの異なる調製物を同じ方法で消化および処理し、非修飾出発ｒｈＧＡＡの参照ペプチドマップと比較した。ＬＣ−ＭＳの結果は、この化学修飾手順を用いて平均約２個の新規のベンズアルデヒド基がｒｈＧＡＡ上に導入されることを示す。さらに、ＬＣ−ＭＳの結果は、ｒｈＧＡＡの化学修飾がｒｈＧＡＡ中の異なるリジン残基にわたって無作為に分配されないことを示す。むしろ表１に示されるように、ｒｈＧＡＡの化学修飾ははるかにより規則正しく、少数のリジン残基に限定されるようである。ＬＣ−ＭＳデータは、Ｌｙｓ９０２の約９０％がベンズアルデヒド部分によって修飾され、一方、Ｌｙｓ７３２およびＬｙｓ８３８の約５０％が修飾されることを示す。これらの実験条件下でＬｙｓ１１３（８％）およびＬｙｓ１６１（１７％）の著しくより少ない部分が修飾される。このＬＣ−ＭＳ分析の実験誤差は±１０％であると推定された。
【００４３】
【表１】
2019142889.tif 000006
【００４４】
ＬＣ−ＭＳデータは情報価値があり、記載される化学的結合アプローチにとって非常に重要な意味を有する。ｒｈＧＡＡには１５個の異なるリジン残基が存在し、それぞれ、理論的には、化学修飾に対して同じ可能性を有する。しかしながら、実験データはこの仮説に反して、化学修飾プロセスが予想よりもはるかに規則正しいようであることを示しており、ここでは、本明細書に記載される方法を用いて、ＳＦＢ修飾ｒｈＧＡＡの４つの異なるバッチについて、ごく少数の選択リジン残基だけがベンズアルデヒド基により一貫して修飾された。さらに、ＬＣ−ＭＳデータは、Ｌｙｓ９０２はクロスリンカーにより常に修飾されるが、Ｌｙｓ７３２およびＬｙｓ８３８残基は約半分がクロスリンカーにより修飾されるように、リジン残基の優先的修飾が存在することを示す。Ｌｙｓ１１３およびＬｙｓ１６１のごくわずかな部分がベンズアルデヒド基によって修飾された。これらのデータは、観察される優先的修飾が、クロスリンカーによる化学修飾に対する個々のリジン残基の到達性および化学的適格性に依存したことを示唆する。例えば、リジン残基はプロトン化され、負に帯電したアスパラギン酸またはグルタミン酸残基との塩橋（すなわち、静電相互作用）の形成に関与することがあり、化学修飾に利用できない。ＬＣ−ＭＳデータは、修飾のためにＬｙｓ９０２が最も到達しやすく、化学的適格性であり、おそらく修飾される第１の残基であることを示唆する。さらに、Ｌｙｓ７３２およびＬｙｓ８３８はＬｙｓ９０２よりも化学修飾のための到達性が低いが、Ｌｙｓ７３２およびＬｙｓ８３８は、それぞれほぼ同じ割合で修飾されるため、互いに対して同様の到達性を有する。これらのデータは、Ｌｙｓ７３２またはＬｙｓ８３８のいずれかが、修飾される第２のリジン残基であることを示唆する。Ｌｙｓ１１３およびＬｙｓ１６１は化学修飾のために部分的にしか到達性でないため、ｒｈＧＡＡのごくわずかな部分がこれらのリジン残基にベンズアルデヒドを含有する。ｒｈＧＡＡについてアミノ（Ｎ）末端の化学修飾は観察されなかったが、この酵素は、細胞内で自然に修飾（環化）されて、二官能性クロスリンカーによる修飾のために化学的に適格性ではないピログルタミン酸を形成することが分かっている。
【００４５】
これらの集合的なデータは、記載される化学修飾手順を用いて、ｖＩＧＦ２ペプチドへのカップリングのために平均２．１２個のベンズアルデヒド基が導入されたｒｈＧＡＡを再現性良く生成できることを示す。ｒｈＧＡＡに結合されるｖＩＧＦ２ペプチドの数は、導入されたベンズアルデヒド基の数に依存するため、これらの結果は、平均２個のｖＩＧＦ２ペプチドがｒｈＧＡＡに結合可能であることを示す。
【００４６】
ＳＦＢによる化学修飾の後、ベンズアルデヒド修飾ｒｈＧＡＡは、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）／１００ｍＭのＮａＣｌ／０．０５％のポリソルベート−８０または５０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．８）／１００ｍＭのＮａＣｌ／０．０５％のポリソルベート−８０などのわずかに酸性の緩衝液中で非常に安定であり、化学的結合まで長期間貯蔵することができ、これは、この結合プロセスのスケールアップを可能にするために非常に望ましい。
【００４７】
実施例４
ベンズアルデヒド修飾ｒｈＧＡＡは、以下のようにヒドラゾン連結を形成するためにヒドラジドなどの特定の化学基を介して、ｖＩＧＦ２ペプチドへの化学的結合のために利用することができる。凍結乾燥した精製ｖＩＧＦ２ペプチドを、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）／５０ｍＭのＮａＣｌ／０．０５％のポリソルベート−８０中０．６ｍｇ／ｍｌで再構成し、２０倍モル過剰の二官能性クロスリンカーＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔＢｏｃ）保護ヒドラジドクロスリンカー（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ｔＢｏｃ−ヒドラジド、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）と共に周囲温度でインキュベートして、Ｎ末端に新規のｔＢｏｃ保護ヒドラジド基を導入した。ｖＩＧＦ２の修飾の進行および程度を評価するために、Ｃ４逆相高速液体クロマトグラフィ（Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって反応をモニターした。Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣ法は、１１００シリーズのクォータナリポンプ、自動サンプラー、サーモスタット付カラムコンパートメント、およびＡｇｉｌｅｎｔ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ｒｅｖ．Ｂ．０４．０３）を有するダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）からなるＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）ＨＰＬＣシステムにおいて４．６×２５０ｍｍ、５μｍ、３００ÅのＣ４  Ｊｕｐｉｔｅｒカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，ＣＡ）を用いた。移動相は、緩衝液Ａ：水中０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および緩衝液Ｂ：アセトニトリル（ＭｅＣＮ）中０．１％のＴＦＡで構成した。２６％のアセトニトリル（ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ）で予め平衡化したＣ４カラムにペプチドサンプルを装填した。２分後に、ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡの２６〜３３％の直線的なグラジエントを用いて、１３分間にわたってカラムを展開させた。図４Ａに示されるように、ＰＥＧ４−ｔＢｏｃ−ヒドラジドを結合するためのｖＩＧＦ２ペプチドの化学修飾において保持時間の著しいシフト（増大）が観察される（中央パネル）。ｖＩＧＦ２ペプチドの化学修飾が完了（通常２時間まで）したら、過剰のクロスリンカーおよび反応副産物を除去するために調製用Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣによりｔＢｏｃ−ヒドラジド修飾ｖＩＧＦ２ペプチドを精製し、揮発性溶媒を除去するために凍結乾燥した。次に、乾燥したペプチドを２％のＴＦＡ（ｄＨ２Ｏ中）中で再構成し、周囲温度で最長７２時間までインキュベートして、ｔＢｏｃ保護基を除去し、その後のリソソーム酵素への結合のためにヒドラジド基を露出させた。ｔＢｏｃ脱保護の進行もＣ４ＲＰ−ＨＰＬＣによってモニターし、通常、ｔＢｏｃが除去されるとペプチドの保持時間を出発の非修飾ｖＩＧＦ２ペプチドの付近まで減少させることが示された（図４Ａ、下部パネル）。ｔＢｏｃ基の完全な脱保護は、通常、これらの実験条件下で約６０時間を必要とした。次に、調製用Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣによってｔＢｏｃ脱保護ヒドラジド修飾ｖＩＧＦ２を精製し、凍結乾燥し、ベンズアルデヒド修飾ｒｈＧＡＡへの化学的結合まで乾燥貯蔵した。また、より高いＴＦＡ濃度（例えば、４％のＴＦＡ）および他の酸および有機溶媒を用いてｔＢｏｃ保護基の除去を試験したが、これらの条件は遥かにより低い���ドラジド修飾ｖＩＧＦ２ペプチドの回収率をもたらした。以下のように、結果として生じるヒドラゾン連結を介して脱保護ヒドラジドｖＩＧＦ２ペプチドをベンズアルデヒド修飾ｒｈＧＡＡに化学的に結合した（ｒｈＧＡＡに対して４倍モル過剰のｖＩＧＦ２ペプチドを用いる）。ベンズアルデヒド修飾ｒｈＧＡＡのタンパク質濃度を、通常、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）／１００ｍＭのＮａＣｌ／０．０５％のポリソルベート−８０緩衝液により４〜５ｍｇ／ｍｌに調整し、凍結乾燥した脱保護ヒドラジド修飾ｖＩＧＦ２ペプチドに酵素を（１モルのｒｈＧＡＡ：４モルのｖＩＧＦ２ペプチドのモル比で）直接添加し、約２０℃で約１６時間インキュベートした。カップリングの速度を増大するためにアニリン（５〜１０ｍＭ）も添加することができるが、これらの実験条件下でカップリングのために絶対に必要とされるわけではないことが見出された。次に、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）／１００ｍＭのＮａＣｌ／２％のマンニトール／０．０５％のポリソルベート−８０緩衝液中におけるサイズ排除クロマトグラフィによってｖＩＧＦ２ペプチド結合ｒｈＧＡＡを精製し、過剰のｖＩＧＦ２ペプチドを除去した。ｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡのピーク画分をプールし、３０ｋＤａ公称分子量カットオフ酢酸セルロース膜によるＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａを用いて濃縮した。ヒドラゾン連結ｖＩＧＦ２ペプチドが、対象とするＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体に対するｒｈＧＡＡの結合を増大させるかどうかを決定するために、受容体プレート結合アッセイによってｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡを特徴付けた。図４Ｂに示されるように、ｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡは、非結合ｒｈＧＡＡよりも著しく良くＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体に結合し、骨格筋細胞モデルにおける実質的により良好な外因性リソソーム酵素の細胞取込みと相関した（図５Ａ）。これらの結果は、標的筋肉細胞における外因性治療薬の細胞取込みの増強のための改善された受容体結合の機能的重要性を示す。筋肉細胞ライセートのウエスタンブロット分析は、内部移行したｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡがリソソームに送達され、そこでｖＩＧＦ２ペプチドが除去され、非結合ｒｈＧＡＡ酵素について観察されるようにｒｈＧＡＡが正常に処理されたことを示す（図５Ｂ）。ＩＧＦ２ペプチドは、常在リソソームプロテアーゼによって自然に分解されることが既に報告されていたことから、これらの結果は予想された。重要なことに、ウエスタンブロットデータは、化学結合されたｖＩＧＦ２ペプチドが除去され、リソソームにおけるＧＡＡプロセシングを妨害しなかったことを示す（ＧＡＡプロセシングは、天然グリコーゲン基質を加水分解するために、高親和性結合および最適なＧＡＡ酵素の動態学のために必要とされる）。
【００４８】
従って、これらの集合的なデータは、この代替の化学的結合を用いて、改善された細胞の取込み、および標的細胞のリソソームへの治療薬の送達のために、対象とするＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体に対して実質的により良好な結合を有するｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡ酵素結合体を生成できることを確認する。この代替の化学修飾／結合手順は、最終の化学的結合および精製の前に無期限に貯蔵することができる安定した中間化合物を生成する。安定した中間体の異なるバッチをプールして、最終の結合反応のためのより大きいバッチを形成することもできる。従って、本明細書に記載される方法は、改善されたＥＲＴを生じるための化学的結合プロセスのスケールアップを可能にするために、重要な前進を表す。
【００４９】
実施例５
ｖＩＧＦ２ペプチドの修飾のためのｔＢｏｃ保護ヒドラジドクロスリンカーの利用に加えて、異なる保護基を有する他のクロスリンカーも利用することができる。本発明者らは、ｖＩＧＦ２ペプチドのＮ末端に新規のヒドラジド基を導入するためにメチルベンジルオキシカルボニル（ＢＯＭ）保護ヒドラジド（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ＢＯＭ−ヒドラジド）を含有する二官能性クロスリンカーを化学的に合成した。ＢＯＭ保護基を除去した後、以下のように、ベンズアルデヒド修飾リソソーム酵素に対するその後の結合（結果として生じるヒドラゾン連結を介する）のために化学反応性ヒドラジド基が露出される。凍結乾燥した精製ｖＩＧＦ２ペプチドを５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）／５０ｍＭのＮａＣｌ／０．０５％のポリソルベート−８０中０．６ｍｇ／ｍｌで再構成し、２０倍モル過剰のＮＨＳ−ＰＥＧ４−ＢＯＭ−ヒドラジドと共に周囲温度でインキュベートして、Ｎ末端に新規のＢＯＭ保護ヒドラジド基を導入した。ｖＩＧＦ２の修飾の進行および程度を評価するために、Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣによって反応をモニターした。ＰＥＧ４−ＢＯＭ−ヒドラジドを結合するためのｖＩＧＦ２ペプチドの化学修飾において保持時間の著しいシフト（増大）が観察される（図６、中央パネル）。ｖＩＧＦ２ペプチドの化学修飾が完了（通常２時間まで）したら、過剰のクロスリンカーおよび反応副産物を除去するために調製用Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣによりＢＯＭ−ヒドラジド修飾ｖＩＧＦ２ペプチドを精製し、揮発性溶媒を除去するために凍結乾燥した。次に、乾燥したペプチドを２％のＴＦＡ（ｄＨ２Ｏ中）中で再構成し、周囲温度で最長７２時間までインキュベートして、ＢＯＭ保護基を除去し、その後のリソソーム酵素への結合のためにヒドラジド基を露出させた。ＢＯＭ脱保護の進行もＣ４ＲＰ−ＨＰＬＣによってモニターし、通常、ＢＯＭが除去されるとペプチドの保持時間を出発の非修飾ｖＩＧＦ２ペプチドの付近まで減少させることが示された（図６、下部パネル）。ＢＯＭ基の完全な脱保護は、通常、これらの実験条件下で約６０時間を必要とした。次に、調製用Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣによってＢＯＭ脱保護ヒドラジド修飾ｖＩＧＦ２を精製し、凍結乾燥し、ベンズアルデヒド修飾ｒｈＧＡＡへの化学的結合まで乾燥貯蔵した。
【００５０】
次に、脱保護ヒドラジド修飾ｖＩＧＦ２ペプチドは、ｔＢｏｃ脱保護ヒドラジド−ｖＩＧＦ２ペプチドについて実施例２において上述されるように、ベンズアルデヒド修飾ｒｈＧＡＡへ化学的に結合させることができる。これらのデータは、種々の保護ヒドラジド基を含有する二官能性クロスリンカーによってｖＩＧＦ２ペプチドを化学的に修飾することができ、保護基を除去した後、ｖＩＧＦ２ペプチドをベンズアルデヒド修飾リソソーム酵素に結合させるために同じ化学反応性ヒドラジドが生成されたことを示す。
【００５１】
実施例６
またベンズアルデヒド修飾ｒｈＧＡＡは、以下のように、非常に安定したオキシム連結を介したアミノオキシ修飾ｖＩＧＦ２ペプチドへの化学的結合のために利用することができる。凍結乾燥した精製ｖＩＧＦ２ペプチドを５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）／５０ｍＭのＮａＣｌ／０．０５％のポリソルベート−８０中０．６ｍｇ／ｍｌで再構成し、２０倍モル過剰のフタルイミドオキシ−ＰＥＧ１２−ＮＨＳエステル（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）と共に周囲温度でインキュベートして、Ｎ末端に新規のフタルイミドオキシ基を導入した。ｖＩＧＦ２ペプチドの化学修飾が完了（通常２時間まで）したら、次にフタルイミドオキシ修飾ｖＩＧＦ２ペプチドを０．５Ｍのヒドラジンと共に周囲温度で３０〜６０分間インキュベートして、中間体フタルイミドオキシ基を所望のアミノオキシ基に変換した。Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣを利用して、化学修飾反応、およびフタルイミドオキシ基のアミノオキシ基への変換をモニターした。図７Ａに示されるように、アミノオキシ修飾ｖＩＧＦ２ペプチドは、非修飾ｖＩＧＦ２ペプチドと比較して、Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣにおいてわずかに長い保持時間を有した。アミノオキシ修飾ｖＩＧＦ２ペプチドはＴＦＡにより酸性化されてから、過剰のクロスリンカーおよび反応副産物を除去するために調製用Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製され、揮発性溶媒を除去するために凍結乾燥される。結果として生じるオキシム連結を介したベンズアルデヒド修飾ｒｈＧＡＡへの化学的結合のために、乾燥したアミノオキシ修飾ヒドラジドｖＩＧＦ２ペプチドを直接使用した。簡単に言うと、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）／１００ｍＭのＮａＣｌ／０．０５％のポリソルベート−８０緩衝液によってベンズアルデヒド修飾ｒｈＧＡＡのタンパク質濃度を通常４〜５ｍｇ／ｍｌに調整し、乾燥アミノオキシ修飾ｖＩＧＦ２ペプチドに酵素を（１モルのｒｈＧＡＡ：４モルのｖＩＧＦ２ペプチドのモル比で）直接添加し、約２０℃で約１６時間インキュベートした。次に、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）／１００ｍＭのＮａＣｌ／２％のマンニトール／０．０５％のポリソルベート−８０緩衝液中におけるサイズ排除クロマトグラフィによってｖＩＧＦ２ペプチド結合ｒｈＧＡＡを精製し、上記のように、過剰のｖＩＧＦ２ペプチドを除去した。
【００５２】
オキシム連結ｖＩＧＦ２ペプチドが、対象とするＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体に対するｒｈＧＡＡの結合を増大させるかどうかを決定するために、受容体プレート結合アッセイによってｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡを特徴付けた。図７Ｂに示されるように、ｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡは、非結合ｒｈＧＡＡよりも実質的に良くＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体に結合した。さらに、オキシム連結は非常に安定であり、ｖＩＧＦ２ペプチドがｒｈＧＡＡに結合したままであり、治療薬の送達後にリソソーム内で分解されるときにだけ除去されることが保証される。
【００５３】
実施例７
またｖＩＧＦ２ペプチドは、ｔＢｏｃ保護アミノオキシ二官能性クロスリンカーを用いてオキシム連結を介してリソソーム酵素へ化学的に結合させることもできる。このアプローチは、潜在的に危険なヒドラジンを用いる化学変換を必要とすることなく、ベンズアルデヒド修飾リソソーム酵素への化学的結合のためにアミノオキシ修飾ｖＩＧＦ２ペプチドをもたらす。簡単に言うと、凍結乾燥した精製ｖＩＧＦ２ペプチドを５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）／５０ｍＭのＮａＣｌ／０．０５％のポリソルベート−８０中０．６ｍｇ／ｍｌで再構成し、２０倍モル過剰の二官能性クロスリンカーｔＢｏｃ保護アミノオキシクロスリンカー（ＮＨＳ基またはペンタフルオロベンゼン基のいずれかを有する）と共に周囲温度でインキュベートして、Ｎ末端に新規のｔＢｏｃ保護アミノオキシ基を導入し、Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣによりモニターした。図８（中央パネル）に示されるように、ＰＥＧ化ｔＢｏｃ−アミノオキシクロスリンカーを結合するためのｖＩＧＦ２ペプチドの化学修飾において保持時間の著しいシフト（増大）が観察される（中央パネル）。ｖＩＧＦ２ペプチドの化学修飾が完了（通常２時間まで）したら、過剰のクロスリンカーおよび反応副産物を除去するために調製用Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣによりｔＢｏｃ−アミノオキシ修飾ｖＩＧＦ２ペプチドを精製し、揮発性溶媒を除去するために凍結乾燥した。次に、乾燥したペプチドを２％のＴＦＡ（ｄＨ２Ｏ中）中で再構成し、周囲温度で最長７２時間までインキュベートして、ｔＢｏｃ保護基を除去し、その後のリソソーム酵素への結合のためにアミノオキシ基を露出させた。ｔＢｏｃ脱保護の進行もＣ４ＲＰ−ＨＰＬＣによってモニターし、通常、ｔＢｏｃが除去されるとペプチドの保持時間を出発の非修飾ｖＩＧＦ２ペプチドの付近まで減少させることが示された（図８、下部パネル）。ｔＢｏｃ基の完全な脱保護は、通常、これらの実験条件下で約５０時間を必要とした。次に、調製用Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣによってｔＢｏｃ脱保護アミノオキシ修飾ｖＩＧＦ２を精製し、凍結乾燥し、ベンズアルデヒド修飾リソソーム酵素への化学的結合まで乾燥貯蔵した。
【００５４】
実施例８
単一のクロスリンカーを用いてオキシム連結ｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡを生成するための代替の方法は、以下のように化学的に酸化されたｒｈＧＡＡにアミノオキシ修飾ｖＩＧＦ２ペプチドをカップリングさせることによって達成することができる。透析またはサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によってｒｈＧＡＡを０．１ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）中に緩衝液交換し、同じ緩衝液によりタンパク質濃度を５ｍｇ／ｍｌに調整した。次に、ｒｈＧＡＡを２ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウムと共に４℃で３０分間インキュベートして、ｒｈＧＡＡのＮ−グリカンにおいて炭水化物（大部分は末端シアル酸およびガラクトース）を酸化し、アミノオキシ修飾ｖＩＧＦ２ペプチドへの化学的結合のために化学反応性アルデヒド基を生じさせた。次に、過剰のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去するために、化学的に酸化されたｒｈＧＡＡを０．１ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）に対して透析するか、あるいはＳＥＣにさらした。酸化ｒｈＧＡＡ（約４ｍｇ／ｍｌで貯蔵）を乾燥アミノオキシ修飾ｖＩＧＦ２ペプチドに、１モルのｒｈＧＡＡ：４モルのｖＩＧＦ２ペプチドのモル比で直接添加し、約２０℃で約１６時間インキュベートし、結果として生じるオキシム連結を形成する。次に、上記のように過剰のｖＩＧＦ２ペプチドを除去するために、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）／１００ｍＭのＮａＣｌ／２％のマンニトール／０．０５％のポリソルベート−８０緩衝液中におけるＳＥＣによってｖＩＧＦ２ペプチド結合ｒｈＧＡＡを精製した。
【００５５】
オキシム連結ｖＩＧＦ２ペプチドが、対象とするＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体に対するｒｈＧＡＡの結合を増大させるかどうかを決定するために、受容体プレート結合アッセイによってｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡを特徴付けた。図９に示されるように、ｖＩＧＦ２−ｒｈＧＡＡは、非結合ｒｈＧＡＡよりも実質的に良くＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体に結合した。酸化ｒｈＧＡＡ（ｖＩＧＦ２ペプチドがない）は出発の非結合ｒｈＧＡＡ酵素と同様の結合を有することが示されたため、改善された受容体の結合はｖＩＧＦ２の存在に依存した。受容体結合データは、ＳＦＢ（ベンズアルデヒド）修飾ｒｈＧＡＡよりも、多くのｖＩＧＦ２ペプチドが化学的に酸化されたｒｈＧＡＡに結合されたことも示唆する。十分に到達性であり、アルデヒドを形成するために化学的に酸化可能である、より多くの末端炭水化物がＮ−グリカン上に存在するため、ＳＦＢ修飾ｒｈＧＡＡ（本明細書に記載される手順を用いてｖＩＧＦ２ペプチドへのカップリングのために平均２個のベンズアルデヒド基を導入する）と比較して、より多くのｖＩＧＦ２ペプチドへの結合の可能性が高い。従って、これらの結果は、治療薬のより良好な送達のために、対象とするＩＧＦ２／ＣＩ−ＭＰＲ受容体への結合を改善するためにアミノオキシ修飾ｖＩＧＦ２ペプチドをアルデヒド含有リソソーム酵素へのカップリングに利用可能であることを確認する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年4月25日(2019.4.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．配列番号１について、少なくとも以下の修飾：
アミノ酸１−４の欠損、
６位のグルタミン酸のアルギニンへの置換、
２７位のチロシンのロイシンへの置換
及び任意選択的に以下の修飾：
６５位のリジンのアルギニンへの置換、
アミノ酸７の欠損、又は
７位のスレオニンのリジンへの置換
を含む組換ヒトＩＧＦ−２；
ｂ．組換ヒトリソソーム酵素；及び
ｃ．組換ＩＧＦ−２と組換ヒトリソソーム酵素とを結合するリンカー
を含む、ＩＧＦ−２結合タンパク質。
【請求項２】
組換ヒトＩＧＦ−２が、６５位のリジンのアルギニンへの置換を含む、請求項１に記載のＩＧＦ−２結合タンパク質。
【請求項３】
組換ヒトリソソーム酵素が、酸性α−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）、酸性α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、酸性β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、酸性α−イズロニダーゼＡ（ＩｄｕＡ）、酸性イズロニダーゼ−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）、β−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）、β−ヘキソサミニダーゼＢ（ＨｅｘＢ），酸性α−マンノシダーゼＡ，β―グルコセレブロシダーゼ（ＧｌｃＣｅｒａｓｅ），酸性リパーゼ（ＬＰＡ）からなる群の内の1つである、請求項１又は２に記載のＩＧＦ−２結合タンパク質。
【請求項４】
組換ヒトＩＧＦ−２が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１−３のいずれか一項に記載のＩＧＦ−２結合タンパク質。
【請求項５】
リンカーが組換ヒトＩＧＦ−２のＮ末端にある、請求項１−４のいずれか一項に記載のＩＧＦ−２結合タンパク質。
【請求項６】
組換ヒトＩＧＦ−２が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１−５のいずれか一項に記載のＩＧＦ−２結合タンパク質。
【請求項７】
組換ヒトＩＧＦ−２が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１−５のいずれか一項に記載のＩＧＦ−２結合タンパク質。
【請求項８】
リンカーが組換ヒトＩＧＦ−２のＣ末端にある、請求項１−６のいずれか一項に記載のＩＧＦ−２結合タンパク質。
【請求項９】
組換ヒトリソソーム酵素が、酸性α−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）である、請求項１−４のいずれか一項に記載のＩＧＦ−２結合タンパク質。
【請求項１０】
組換ヒトリソソーム酵素が、酸性α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）である、請求項１−４のいずれか一項に記載のＩＧＦ−２結合タンパク質。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
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【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
また本明細書において、アセトン保護ヒドラジド基、ジメトキシベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、トリメトキシベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、またはこれらの任意の組み合わせを含む、二官能性クロスリンカーも提供される。また本明細書において、保護ヒドラジド基を含む修飾リソソーム標的化ペプチドも提供される
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
適切な第１の架橋剤は、Ｎ−スクシンイミジル−４−ホルミルベンズアミド（Ｓ−４ＦＢ）を含む。適切な第２の架橋剤は、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔＢｏｃ）保護ヒドラジドクロスリンカー（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ｔＢｏｃ−ヒドラジド）またはメトキシベンジルオキシカルボニル（ＢＯＭ）保護ヒドラジド（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ＢＯＭ−ヒドラジド）を含む。他の適切な実施形態では、第２の架橋剤は、アセトン保護ヒドラジド基、ジメトキシベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、トリメトキシベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。他の適切な実施形態では、二官能性クロスリンカーは、アセトン保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、ジメトキシベンジルカルボニル保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、トリメトキシベンジルオキシカルボニル保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
適切な二官能性クロスリンカーは、アセトン保護ヒドラジド基、ジメトキシベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、トリメトキシベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。他の適切な実施形態では、二官能性クロスリンカーは、アセトン保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、ジメトキシベンジルカルボニル保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、トリメトキシベンジルオキシカルボニル保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
適切な修飾リソソーム標的化ペプチドは、保護ヒドラジド基を含むことができる。他の適切な実施形態では、修飾リソソーム標的化ペプチドは、修飾ｖＩＧＦ２ペプチドを含むことができる。他の適切な実施形態では、ヒドラジド基は、アセトン基、ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、トリメトキシベンジルオキシカルボニル基、またはこれらの任意の組み合わせによって保護される。他の適切な実施形態では、修飾リソソーム標的化ペプチドは粉末状である。他の適切な実施形態では、修飾リソソーム標的化ペプチドは凍結乾燥される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
修飾リソソーム標的化ペプチドの適切な製造方法は、リソソーム標的化ペプチドを架橋剤と接触させて、Ｎ末端残基にヒドラジド基を導入するステップを含む。適切なリソソーム標的化ペプチドはｖＩＧＦ２である。適切な架橋剤は、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔＢｏｃ）保護ヒドラジドクロスリンカー（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ｔＢｏｃ−ヒドラジド）を含む。架橋剤は、アセトン保護ヒドラジド基、ジメトキシベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、トリメトキシベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。二官能性クロスリンカーは、アセトン保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、ジメトキシベンジルオキシカルボニル保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、トリメトキシベンジルオキシカルボニル保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。本明細書において提供される方法はさらに、修飾リソソーム標的化ペプチドの保護ヒドラジド基を脱保護するステップを含むことができる。同様に、修飾リソソーム標的化ペプチドを凍結乾燥するさらなるステップを実行して、粉末を形成することができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
適切なリソソーム酵素−リソソーム標的化ペプチド結合体は、１つまたは複数の二官能性クロスリンカーを介して１つまたは複数のリソソーム標的化ペプチド（例えば、ｖＩＧＦ２）に架橋されたリソソーム酵素を含むことができる。適切な二官能性クロスリンカーは、アセトン保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、ジメトキシベンジルオキシカルボニル保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、トリメトキシベンジルオキシカルボニル保護ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ヒドラジド、Ｎ−スクシンイミジル−４−ホルミルベンズアミド（Ｓ−４ＦＢ）、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。リソソーム酵素は、酸性α−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）、酸性α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、酸性β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、酸性α−イズロニダーゼＡ（ＩｄｕＡ）、酸性イズロン酸２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）、β−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）、β−ヘキソサミニダーゼＢ（ＨｅｘＢ）、酸性α−マンノシダーゼＡ、β−グルコセレブロシダーゼ（ＧｌｃＣｅｒａｓｅ）、酸性リパーゼ（ＬＰＡ）、またはこれらの任意の組み合わせを適切に含む。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
ｖＩＧＦ２ペプチドへの効率的な結合のために、かつ、ペプチドに対する良好な溶解度を保持しながら保護ヒドラジド基を導入するために、新規の二官能性クロスリンカーが開発された。これらの新しいクロスリンカーは、図３に示されるように、アセトン保護ヒドラジド基、ジメトキシベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、またはトリメトキシベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基を含有する。これらの保護基はｔＢｏｃよりもはるかに不安定であり、効率的な除去および修飾ペプチドの高回収率のために弱酸条件（例えば、５％未満のＴＦＡ）が使用されるであろう。さらに、これらの新しいクロスリンカーは、精製および凍結乾燥後に、脱保護修飾ｖＩＧＦ２ペプチドの長期の貯蔵を可能にするはずである。従って、これらの新しいクロスリンカーは、化学的結合プロセスのスケールアップおよびより良好な制御を可能にするであろう。
【外国語明細書】
2019142889000001.pdf