(57)【要約】【課題】ＭＭＰ産生抑制作用を有する組成物を提供すること。【解決手段】バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとトリペプチド５質量％以上を含むコラーゲンペプチドを含有するマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。【選択図】図１
2019142845.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとトリペプチド５質量％以上を含むコラーゲンペプチドを含有するマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
【請求項２】
コラーゲンペプチドが、トリペプチドを１０〜２０質量％含有するものである請求項１に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
【請求項３】
バラ科バラ属の植物が、ガリカローズ、ドッグローズ、アポテカリーズローズ、スイートブライヤー、ダマスクバラ、セイヨウバラ及びハマナシから選ばれる１種以上である請求項１又は２に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
【請求項４】
バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスが水、親水性有機溶媒又はこれらの混合液により抽出処理して得られたエキスである請求項１〜３のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
【請求項５】
トリペプチド５質量％以上を含むコラーゲンペプチドが、コラーゲン又はゼラチンをコラゲナーゼにより酵素加水分解した酵素加水分解物である請求項１〜４のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
【請求項６】
バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキス１質量部に対し、トリペプチド５質量％以上を含むコラーゲンペプチドを５０〜４００質量部の比率で含有する請求項１〜５のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体のマトリックスメタロプロテアーゼの産生を抑制するための新規な組成
物に関する。
【背景技術】
【０００２】
マトリックスメタロプロテアーゼ（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ以下  「ＭＭＰ」と略記する）は、メタロプロテアーゼ（活性中心に金属イオンが配座しているタンパク質分解酵素の総称）の一群であり、その活性中心には亜鉛イオン（Ｚｎ＋＋）やカルシウムイオン（Ｃａ＋＋）が含まれるたんぱく質分解酵素である。コラーゲンやプロテオグリカン、エラスチンなどから成る細胞外マトリックスの分解をはじめとし、細胞表面に発現するタンパク質の分解、生理活性物質のプロセシングなどその作用は多岐にわたるといわれている。
特に皮膚の老化や関節炎の障害などにＭＭＰが関与することが知られており、ＭＭＰの阻害作用を示す物質の探索が積極的に行なわれている。本出願人もＭＭＰ阻害作用を有する物質の探索を行なっており、タイソウ、ゼニアオイ、サボテン、ケイヒ、サーチ、ニンジン、ビワ、シークワシャー、ハス、ホソバヤマジソなどの植物由来のエキスに、強いＭＭＰ阻害作用を見いだし、すでに特許出願を行なっている（特許文献１）。
【０００３】
また、本出願人は、長年にわたり、コラーゲンの加水分解によって得られるコラーゲンペプチドを含有する組成物の研究を行い、多様な生理活性を見いだし、これを特許出願（特許文献２〜４）している。
特許文献２には、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐのアミノ酸配列を有するコラーゲンペプチドを含む組成物に生体コラーゲン合成促進作用を見出し、生体コラーゲン合成促進剤として使用することが記載されている。
特許文献３には、コラーゲントリペプチドとシリマリン及びリンゴ抽出物を有効成分とするコラーゲンゲル収縮剤の発明が記載されている。
また、特許文献４には、コラーゲントリペプチドを含むティラピアの皮のプロテアーゼ加水分解物に強いメラニン産生抑制作用を見いだし、これをメラニン産生抑制剤とすることが記載されている。
しかしコラーゲンペプチドに何らかのＭＭＰ産生抑制作用が存在することは知られていない。
【０００４】
一方、バラ科バラ属の植物の花弁又はつぼみのエキスに様々な作用を見いだし、これを化粧品や健康食品に配合できることが知られている。特許文献５には、ドッグローズ、アポテカリーズローズ、スイートブライヤー、ダマスクバラ、セイヨウバラ及びハマナシから選ばれる少なくとも１種のバラ科バラ属の植物のつぼみ又は花弁を水、親水性有機溶媒又はこれらの混合液により抽出処理して得られたエキスを有効成分とする抗菌作用組成物や飲食品が記載されている。
特許文献６には、特許文献５と同様のエキスであって、ドッグローズ、アポテカリーズローズ、スイートブライヤー、ダマスクバラ、セイヨウバラ及びハマナシから選ばれる少なくとも１種のバラ科植物のつぼみ又は花弁を水、親水性有機溶媒又はこれらの混合液により抽出処理して得られたエキスが記載されている。そして、このエキスに抗インフルエンザウィルス作用を見いだし、これを有効成分とする抗インフルエンザウィルス剤及びこれを配合した飲食品の発明が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−００８５３９号公報
【特許文献２】特許第３８０２７２１号公報
【特許文献３】特許第５５７２４０６号公報
【特許文献４】特開２０１６−１８５９０８号公報
【特許文献５】特許第４６３３２２６号公報
【特許文献６】特開２００２−１４５７９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、コラーゲンペプチドの研究をする過程で、コラーゲンペプチドとバラ科バラ属の植物の花弁及び／またはつぼみのエキスを含有する組成物がＭＭＰ産生を抑制することを見いだし、本発明をなした。特に、コラーゲンペプチドは、単独ではＭＭＰ産生を抑制する作用を持たないが、驚くべきことにバラ科バラ属の植物の花弁及び／またはつぼみのエキスと併用すると、極めて強いＭＭＰ産生抑制作用を示すという、全く新しい知見を得た。
すなわち、本発明は、ＭＭＰ産生抑制作用を有する組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとトリペプチド５質量％以上を含むコラーゲンペプチドを含有するマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
（２）コラーゲンペプチドが、トリペプチドを１０〜２０質量％含有するものである（１）に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
（３）バラ科バラ属の植物が、ガリカローズ、ドッグローズ、アポテカリーズローズ、スイートブライヤー、ダマスクバラ、セイヨウバラ及びハマナシから選ばれる１種以上である（１）又は（２）に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
（４）バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスが水、親水性有機溶媒又はこれらの混合液により抽出処理して得られたエキスである（１）〜（３）のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
（５）トリペプチド５質量％以上を含むコラーゲンペプチドが、コラーゲン又はゼラチンをコラゲナーゼにより酵素加水分解した酵素加水分解物である（１）〜（４）のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
（６）バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキス１質量部に対し、トリペプチド５質量％以上を含むコラーゲンペプチドを５０〜４００質量部の比率で含有する（１）〜（５）のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の組成物は、生体の産生するＭＭＰの産生量を抑制する作用を有している。またコラーゲンペプチドによるコラーゲン産生促進効果を併せ持つため、皮膚の老化を抑制し、関節炎などによる関節の変形や炎症を抑制する。また本発明の組成物は、原料とする成分の食経験が長く、安全性が確認されているため、飲食品として経口で摂取することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＭＭＰ産生抑制試験の結果を示すグラフである。
【図２】低分子コラーゲンとバラつぼみエキスの併用によるＭＭＰ産生抑制作用を確認した試験結果のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとトリペプチド５質量％以上を含むコラーゲンペプチドを含有するマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物に関する。
本発明の組成物について説明する。
本発明の組成物にあっては、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとコラーゲンペプチドの相乗作用によってＭＭＰの産生を抑制する。
バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみは、どのような品種から採取したものでもかまわないが、園芸種として大量に栽培されているものが産業上好ましい。このようなものとして特にガリカローズ（Ｒｏｓａ  ｇａｌｌｉｃａ）、ドッグローズ（Ｒｏｓａｃａｎｉｎａ）、アポテカリーズローズ（Ｒｏｓａ  ｇａｌｌｉｃａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、スイートブライヤー（Ｒｏｓａ  ｒｕｂｉｇｉｎｏｓａ）、ダマスクバラ（Ｒｏｓａ  ｄａｍａｓｃｅｎａ  ｔｒｉｇｉｎｔｉｐｅｔａｌａ）、セイヨウバラ（Ｒｏｓａ  ｃｅｎｔｉｆｏｌｉａ）及びハマナシ（Ｒｏｓａ  ｒｕｇｏｓａｒｕｂｒａ）が好ましい。
【００１１】
例えば、バラ科バラ属の植物の花弁又はつぼみを生のまま又は乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用い粉砕して溶媒抽出に供することにより本発明のエキスを得ることができる。抽出に用いる溶媒としては、水、親水性有機溶媒又はこれらの混合溶媒を室温乃至溶媒の沸点以下の温度で用いることが好ましい。具体的には、メタノール、エタノール等の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール等の炭素数２〜４の多価アルコール、及びこれら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。なお、水と親水性有機溶媒との混合系溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１〜４０質量部、多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１０〜９０質量部添加することが好ましい。
【００１２】
この場合、抽出処理は、室温乃至還流加熱下で、任意の装置を用いて行うことができる。例えば、抽出溶媒を満たした処理槽にバラ科植物のつぼみ（又は花弁）を投入し、必要に応じて時々攪拌しながら、３０分〜２時間静置して可溶性成分を溶出した後、濾過して固形物を除去し、得られた抽出液から抽出溶媒を溜去し、乾燥することにより赤褐色のバラエキスが得られる。抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常５０〜９０℃で３０分〜２時間程度である。また、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いた場合には、通常４０〜８０℃で３０分〜２時間程度である。なお、溶媒で抽出することにより得られる抽出液は、抽出溶媒が安全性の高いものであればそのまま配合して本発明の有効成分として用いることができる。特許文献５には具体的な製造方法が開示されており、これにしたがって本発明に適したエキスを得ることができる。
【００１３】
このようにして得られるバラ科植物のエキスは、原料に由来する好ましい風味を有しており、そのまま本発明に利用可能であるが、必要に応じて、脱色等を目的とする精製を施し、配合用途に応じて、アルコールその他の有機溶媒の溶液又は水溶液として利用することができる。
【００１４】
本発明に用いるバラ科バラ属の植物のエキスは、必要によりデキストリンやシクロデキストリンを添加して粉末化することもできる。
本発明に用いるバラ科バラ属の植物のエキスは、市販されているものを使用することができる。本発明に適した、ガリカローズのつぼみのエキスの噴霧乾燥品である「ローズバッツエキスパウダーＭＦ」を例示できる。
本発明に用いるバラ科バラ属の植物エキスは、ポリフェノールとして５質量％以上含有し、好ましくは１０〜８０質量％、特に好ましくは１０〜２０質量％含有するものである。
【００１５】
コラーゲンペプチドは、トリペプチドを含有し、通常一般のコラーゲンと称するものとは区別されるものである。さらに詳しくは、アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ、Ｙはアミノ酸）であるペプチドを含有するものが好ましく、特に好ましくはアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐのペプチドを含有するものである。トリペプチドを５質量％以上含有するものが好ましく、さらに好ましくはトリペプチドを７〜３０質量％含有するものであり、特に好ましくは、１０〜２０質量％を含有するものである。
本発明に用いるコラーゲンペプチドは、豚、ウシなどの動物由来、魚由来いずれも使用可能である。
【００１６】
本発明に用いるコラーゲンペプチドは、主にコラーゲン又はゼラチンを酵素加水分解して製造することができる。コラーゲン又はゼラチン加水分解物は、既に市販されているが、これらの酵素的に加水分解されたコラーゲンの多くは、分子量の分布範囲が２０００〜８００００である。これらの加水分解物は水に対する分散性の向上を目的とするものである。これに対して本発明で用いるコラーゲン加水分解物は、コラーゲン又はゼラチンをコラゲナーゼによって酵素加水分解して得られるもので、特定の有効成分として上記のアミノ酸配列であるＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐのペプチドを主とする分子量で約４００以下のペプチドを含むことが特徴である。このようなコラーンゲペプチドとしては、市販されているものを使用することができる。市販されているもので、本発明に使用可能なものとしては、ゼライス株式会社が販売する「ＨＡＣＰ−０１」を例示することができる。また特許文献２に開示された方法に従って、本発明に適したコラーゲンペプチドを調製することもできる。
【００１７】
本発明にあっては、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとコラーゲンペプチドの相乗作用によってＭＭＰの産生を抑制する。このような相乗効果を得るためには、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとコラーゲンペプチドが、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキス１質量部に対し、コラーゲンペプチドを１〜１００００質量部、好ましくは、１０〜１０００質量部、特に好ましくは５０〜４００質量部の比率で含有する組成物とする。
【００１８】
この組成物を飲食品に添加する場合、添加量は、０．０１質量％以上、好ましくは０．５〜９５質量％、特に好ましくは５〜９０質量％である。医薬品又は化粧品とする場合、症状及び対象とする年齢や、体重、投与する剤形によって異なるため一義的に配合量を決定できないが、１質量％以上含有することで、ＭＭＰの産生を抑制することができる。
【００１９】
食品としては、通常の食品の他、栄養補助食品、機能性食品、健康食品、特定保健用食品等として、例えば、錠剤、カプセル、パウダー等のような形態が好ましい。
その他、ジュースのような飲料、ゼリーに配合することもできる。  
【００２０】
医薬品用途において、投与に関しては、有効成分を経口摂取、非経口摂取の場合、直腸内投与、注射等の投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。形態としては、例えば、粉末、散剤、顆粒、錠剤、カプセル等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤、外用剤等が挙げられる。これらの製剤は常套手段により調製することが可能である。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングルコール、ヒドロキシエチレンデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤等の添加剤を適宜添加することも可能である。
【００２１】
本発明の組成物を化粧品とする場合、本発明の効果を損なわない範囲で、通常化粧料に常用される、各種の成分を適宜配合することができる。このような配合可能なその他の成分としては、本発明の目的を妨げない限り特に限定されず、例えば、油分、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、色材、アルコール類、紫外線防止剤、アミノ酸類、ビタミン類、美白剤、有機酸、無機塩類、酵素、酸化防止剤、安定剤、防腐剤、殺菌剤、皮膚賦活剤、血行促進剤、抗脂漏剤、抗炎症剤等の薬剤、金属イオン封鎖剤、ｐＨ調整剤、収斂剤、清涼剤、香料、色素、水が挙げられる。
【００２２】
本発明の組成物を含む化粧料の形態は特に限定されず、例えば、化粧水、乳液、クリーム、美容液、ファンデーション等の形態でスキンケア化粧料やメーキャップ化粧料、マッサージ化粧料、パック化粧料に用いることができる。また、本発明の組成物は、薬事法の言う化粧品、医薬部外品、医薬品等に含まれる製品とすることができる。乳液、クリーム、ローションのようなスキンケア製品、軟膏等に用いられる。特に限定されるものではないが、その剤型は水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水―油２層系、水―油―粉末３層系等、幅広い剤型を取り得る。
【実施例】
【００２３】
以下に本発明の組成物を用いたＭＭＰ産生抑制試験例を示し、本発明を具体的に説明する。
＜試験１＞  ＭＭＰ産生抑制試験
バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとして、丸善製薬株式会社が販売しているローズバッツエキスパウダーＭＦを用いた。またコラーゲンペプチドとして、ゼライス株式会社が販売するトリペプチドを１０〜２０質量％含有するＨＡＣＰ−０１を用いた。
【００２４】
（１）試験方法
・使用細胞
正常ヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）(ロンザジャパン株式会社)
・使用サンプル
コラーゲンペプチド（ＨＡＣＰ−０１：ゼライス株式会社：トリペプチド１０〜２０質量％含有品）、バラつぼみエキス（ローズバッツエキスパウダーＭＦ：丸善製薬株式会社：ポリフェノール１０〜２０質量％含有品）を試験サンプルとした。
【００２５】
１）細胞培養
細胞は３７℃、５％二酸化炭素、９５％空気の条件下で培養を行った。培地は非働化したウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１０％、ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）１％を添加したＤＭＥＭ，ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。以降、この培地を基礎培地と表記する。通常培養には１０ｃｍまたは１５ｃｍディッシュを用い、継代時の細胞剥離には０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。
【００２６】
２）サンプル調製
各サンプルは培地で溶解した。ＵＶＡ照射前は基礎培地を用い、ＵＶＡ照射後はＦＢＳ不含基礎培地を用いた。
サンプルの最終濃度
バラつぼみエキス（ローズバッツエキスパウダーＭＦ）      ６．２５（μｇ／ｍＬ）
コラーゲンペプチド（ＨＡＣＰ−０１）                      ５００（μｇ／ｍＬ）
コラーゲンペプチド（ＨＡＣＰ−０１）                    １０００（μｇ／ｍＬ）
併用  各濃度の組合せ
下記の表１に示す添加濃度で試験を実施した。
【００２７】
【表１】
2019142845.tif 000003
【００２８】
３）細胞の形態観察
形態観察には倒立型システム顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ  ＩＸ７０）を用いて行った。
【００２９】
４）ＭＭＰ産生抑制作用の確認試験
２４ｗｅｌｌプレートに細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ／５００μＬ／ｗｅｌｌで播種した。１日前培養の後、サンプル入り基礎培地５００μＬと交換して１日培養した。
その後、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ，ｃａｌｃｉｕｍ，ｍａｇｎｅｓｉｕｍ，ｎｏ  ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）５００μＬに置換し、蓋を取ったディッシュをＵＶＡ照射ランプの下に一列に置いて１５Ｊ／ｃｍ２照射した（約１５９分）。照射後、ＨＢＳＳを取り除き、サンプル入りのＦＢＳ不含基礎培地５００μＬと交換して２日間培養した。培養上清を回収し、−８０度中に保存した。培養上清回収後、ディッシュを５００μＬのＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（和光純薬株式会社）で３回洗浄し、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液２００μＬで細胞を懸濁し、タンパク定量に用いた。
上清を１５０００×ｇ，１０分遠心し、その上清を用いて培地中に分泌されたＭＭＰ−１量を「Ｈｕｍａｎ  Ｔｏｔａｌ  ＭＭＰ−１（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ）」を用いて測定した。細胞懸濁液は１００００×ｇ，１０分遠心し、その上清を用いて「Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ」（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いてタンパク量を測定した。培地中ＭＭＰ−１量は細胞タンパク量で補正した。
【００３０】
（２）試験結果
結果を図１に示す。
コラーゲンペプチド（ＨＡＣＰ−０１）はＭＭＰ−１の産生を抑制しなかった。一方バラつぼみエキス６．２５μｇ添加により、ＭＭＰ−１産生量は８８％に減少した。
バラつぼみエキスによるＭＭＰ産生抑制作用は、コラーゲンペプチドの添加によって顕著に増強された。すなわちコラーゲンペプチド５００μｇを併用するとＭＭＰ−１産生量は２３％に減少し、コラーゲンペプチド１０００μｇを併用するとＭＭＰ−１産生量は１８％に減少した。なお、各試験群において、コラーゲンペプチド及びバラつぼみエキスの添加は、細胞の生育や形態には影響しないことをＷＳＴ−８アッセイ（ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８、株式会社同仁化学研究所）と顕鏡観察により確認している。
以上の試験結果から、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとコラーゲンペプチドを含有する組成物は、細胞の生育に影響を及ぼさずにＭＭＰの産生を抑制することが明らかとなった。またバラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとコラーゲンペプチドの配合比は、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキス１質量部に対してコラーゲンペプチドを５０〜４００質量部含むように調製することが効果的であるものと考えられた。
【００３１】
＜試験２＞
コラーゲンペプチドに含有されているトリペプチド及びトリペプチドの含有量が５％未満のコラーゲン加水分解ペプチドを用いたＭＭＰ産生抑制試験
コラーゲンペプチドのＭＭＰ産生抑制作用を確認した。
【００３２】
（１）試験方法
・使用細胞
細胞株：正常ヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）(ロンザジャパン株式会社)
・試験試料
ローズバッツエキスパウダーＭＦ（以下「バラつぼみ」丸善製薬株式会社）低分子コラーゲン（平均分子量５０００、トリペプチド含量５質量％以下、ゼライス社）を試験試料とした。
【００３３】
１）細胞培養
細胞は３７℃、５％二酸化炭素、９５％空気の条件下で培養を行った。培地は非働化したウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１０％、ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ  （Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）１％を添加したＤＭＥＭ，ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ，ｌｉｑｕｉｄ  （ＤＭＥＭ）（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。以降、この培地を基礎培地と表記する。通常培養には１０ｃｍディッシュに細胞を起こしたのちコンフルエント時に０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、にて剥離し１５ｃｍディッシュに継代を行った。
【００３４】
２）サンプル調製
サンプルは培地で溶解した。培養は基礎培地を用い、サンプル添加時（ＵＶＡ照射前後）はＦＢＳを含まない基礎培地を用いた。
試験サンプルの培地中最終濃度
バラつぼみエキス  ６．２５，  １２．５μｇ／ｍＬ
低分子コラーゲン  １０００μｇ／ｍＬ
併用  各濃度の組合せ
【００３５】
３）細胞の形態観察
細胞形態観察には倒立型システム顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ  ＩＸ７０）を用いて行った。
【００３６】
４）ＭＭＰ産生抑制作用確認試験
２４ｗｅｌｌプレートに細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ／５００μＬ／ｗｅｌｌで播種した。１日間前培養の後、サンプル入りＦＢＳを含まない基礎培地５００μＬと交換して１日間培養した。その後、ハンクス液（ＨＢＳＳ，ｃａｌｃｉｕｍ，ｍａｇｎｅｓｉｕｍ，ｎｏ  ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）５００μＬに置換し、蓋を取ったディッシュをＵＶＡ照射ランプの下に一列に置いて１５Ｊ／ｃｍ２照射した（約１５９分）。照射後、ハンクス液を取り除き、サンプル入りのＦＢＳを含まない基礎培地５００μＬと交換して２日間培養した。上清を回収し、−８０度中に保存した。上清回収後、ディッシュを５００μＬのＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（和光純薬株式会社）で３回洗浄し、０．１Ｎ  ＮａＯＨ  ２００μＬで細胞を懸濁し、タンパク定量に用いた。
上清を１００００×ｇ，１０分遠心し、その上清を用いて培地中に分泌されたＭＭＰ−１量をＨｕｍａｎ  Ｔｌｔａｌ  ＭＭＰ−１（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ，ＤＹ９０１Ｂ）を用いて測定した。細胞懸濁液は１００００×ｇ，１０分遠心し、その上清を用いてＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いてタンパク量を測定した。培地中ＭＭＰ−１量は細胞タンパク量で補正した。
【００３７】
（２）試験結果
下記表２に各試験試料の添加濃度と、無添加の場合のＭＭＰ−１産生量を１００としたＭＭＰ−１の産生率を示す。また図２にＭＭＰ−１産生率のグラフを示す。
【００３８】
【表２】
2019142845.tif 000004
【００３９】
低分子コラーゲンはＭＭＰ−１の産生を抑制しなかった。一方バラつぼみエキス６．２５μｇ添加により、ＭＭＰ−１産生量は５７％に減少し、１２．５μｇ添加により５０％に減少した。
しかしバラつぼみエキスによるＭＭＰ−１産生抑制作用は、低分子コラーゲンの添加によって殆ど増強されなかった。
なお、各試験群において低分子コラーゲン及びバラつぼみエキスの添加は、細胞の生育や形態には影響しないことをＷＳＴ−８アッセイ（ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８、株式会社同仁化学研究所）と顕鏡観察により確認している。
【００４０】
以上の＜試験１＞、＜試験２＞の結果から、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとコラーゲンペプチドを含有する組成物は、細胞の生育に影響を及ぼさずにＭＭＰ−１の産生を抑制することが明らかとなった。この作用は、トリペプチド５質量％以上を含むコラーゲンペプチドに特有であって、低分子コラーゲンには確認できなかった。
【００４１】
飲料に配合した処方
コラーゲンペプチド（ゼライス株式会社）６ｇ、ローズバッツエキス（丸善製薬株式会社）０．０１ｇ、ビタミンＣ３００ｍｇを用い、常法によりドリンク剤を製造した。
【００４２】
参考製造例１
バラ科バラ属の植物のつぼみのエキスの製造例
バラのつぼみ（Ｒｏｓａ  ｇａｌｌｉｃａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）３００ｇに５０重量％エタノールを２０００ｍＬ加え、還流冷却器を付けて、８０℃にて１時間抽出した後濾紙で濾過して抽出液１を得た。また、抽出残渣に５０重量％エタノール１５００ｍＬを加え、同様に還流冷却器を付けて、８０℃にて１時間抽出した後、濾紙で濾過して抽出液２を得た。得られた抽出液１、２を合わせて減圧下で濃縮、乾燥させて粉末エキス１００ｇを得た（収率３３．３％）。
【００４３】
参考製造例２
バラ科バラ属の植物のつぼみのエキスの製造例
バラのつぼみ（Ｒｏｓａ  ｃｅｎｔｉｆｏｌｉａ）３００ｇに水２０００ｍＬを加え、９０℃にて１時間抽出を行った後、濾紙にて濾過し、抽出液を得た。得られた抽出液を減圧下で濃縮、乾燥させて、製造例２の粉末エキス１００ｇを得た（収率３３．３％）。
【００４４】
参考製造例３
コラーゲンペプチドの製造例
コラーゲンタンパクとして、ウシ真皮より調製したゼラチン３０ｇを蒸留水３００ｍＬに加温溶解し、０．４５μｍのフィルターで滅菌濾過した。
このゼラチン３０ｇを蒸留水３００ｍＬに加温溶解した。コラゲナーゼタイプＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．）３００ｍｇを加え、アンモニア水にてｐＨを７．５に調整した後３７℃で１時間放置した。反応終了後、反応液を１００℃で３分間加熱しコラゲナーゼを失活させ、次いで０．４５μｍのフィルターで滅菌濾過した。この濾液をＣＤＰ−０とした。この濾液ＣＤＰ−０を蒸留水で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）によるゲル濾過を行い２つの画分（ＣＤＰ−１，ＣＤＰ−２）に分け、それぞれを凍結乾燥した。それぞれのピークをＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＨＲ１０／３０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．２）を溶出液に用いて分子量を求めたところ、ＣＤＰ−１が約１２０００〜５００に分布し、ＣＤＰ−２が約３５０だった。ＣＤＰ−２の約５０％がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐであった。
【図１】
2019142845.tif 000005
【図２】
2019142845.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月17日(2019.6.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとトリペプチド５質量％以上を含むコラーゲンペプチドを含有するマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物であって、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキス１質量部に対し、トリペプチド５質量％以上を含むコラーゲンペプチドを５０〜４００質量部の比率で含有する、マトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物（化粧品を除く）。
【請求項２】
コラーゲンペプチドが、トリペプチドを１０〜２０質量％含有するものである請求項１
に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
【請求項３】
バラ科バラ属の植物が、ガリカローズ、ドッグローズ、アポテカリーズローズ、スイー
トブライヤー、ダマスクバラ、セイヨウバラ及びハマナシから選ばれる１種以上である請
求項１又は２に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
【請求項４】
バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスが水、親水性有機溶媒又はこれら
の混合液により抽出処理して得られたエキスである請求項１〜３のいずれかに記載のマト
リックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
【請求項５】
トリペプチド５質量％以上を含むコラーゲンペプチドが、コラーゲン又はゼラチンをコ
ラゲナーゼにより酵素加水分解した酵素加水分解物である請求項１〜４のいずれかに記載
のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとトリペプチド５質量％以上を含むコラーゲンペプチドを含有するマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物であって、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキス１質量部に対し、トリペプチド５質量％以上を含むコラーゲンペプチドを５０〜４００質量部の比率で含有する、マトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物（化粧品を除く）。
（２）コラーゲンペプチドが、トリペプチドを１０〜２０質量％含有するものである（１）に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
（３）バラ科バラ属の植物が、ガリカローズ、ドッグローズ、アポテカリーズローズ、スイートブライヤー、ダマスクバラ、セイヨウバラ及びハマナシから選ばれる１種以上である（１）又は（２）に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
（４）バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスが水、親水性有機溶媒又はこれらの混合液により抽出処理して得られたエキスである（１）〜（３）のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
（５）トリペプチド５質量％以上を含むコラーゲンペプチドが、コラーゲン又はゼラチンをコラゲナーゼにより酵素加水分解した酵素加水分解物である（１）〜（４）のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。