(57)【要約】【課題】この発明は、抗酸化機構を活性化して活性酸素を低減できる活性促進剤、該活性促進剤を含有する化粧料及び前記活性促進剤を含有する皮膚外用剤を提供することを目的とする。【解決手段】セイヨウカボチャ由来の抽出物からなる、活性酸素を低減させる抗酸化機構の活性化を促進させる活性促進剤であること。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
セイヨウカボチャ由来の抽出物からなる、活性酸素を低減させる抗酸化機構の活性化を促進させる
活性促進剤。
【請求項２】
前記抗酸化機構の活性化が、
酸化ストレス応答遺伝子群の発現の活性化である
請求項１に記載の活性促進剤。
【請求項３】
Ｎｒｆ−２の核内移行を促進させて、酸化ストレス応答遺伝子群の発現の活性化させる
請求項２に記載の活性促進剤。
【請求項４】
前記酸化ストレス応答遺伝子群が、カタラーゼ遺伝子を含む
請求項２又は請求項３に記載の活性促進剤。
【請求項５】
前記酸化ストレス応答遺伝子群は、グルタチオン（ＧＳＨ）の合成に関与するグルタチオン合成遺伝子群を含む
請求項２乃至請求項４のうちのいずれかに記載の活性促進剤。
【請求項６】
前記グルタチオン合成遺伝子群は、γ―グルタミルシステイン合成酵素遺伝子である
請求項５に記載の活性促進剤。
【請求項７】
請求項１乃至請求項６のうちのいずれかに記載の活性促進剤を含有する
化粧料。
【請求項８】
請求項１乃至請求項６のうちのいずれかに記載の活性促進剤を含有する
皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、抗酸化機構を活性化できる活性促進剤、前記活性促進剤を含む化粧料、及び前記活性促進剤を含む皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、紫外線が肌に照射されると生体内で活性酸素が発生し、刺激を受けたメラノサイトで産出されたメラニンが表皮角化細胞に供給されて肌が褐色となる。このように表皮角化細胞に蓄積されたメラニンは、表皮のターンオーバーによって角質とともに垢として排出される。しかし、紫外線対策をせずに慢性的に紫外線を浴び続けたり、加齢により皮膚のターンオーバーのサイクルの長くなったりすると、メラニンの排出がにぶくなり、表皮角化細胞中に残って褐色のシミ（老人性色素斑）となる。
【０００３】
このようなシミ（老人性色素斑）の生成を抑える様々な化粧料が提案されている。例えば、特許文献１には、チロシナーゼの活性を抑制する、パシフロリーネ、テペズコヒテ、フローデピタジャヤ、アルニカ、マメイ及びアラントからなる群より選ばれる少なくとも１種の植物から得られた抽出物を配合した化粧料が開示されている。
【０００４】
この化粧料によると、メラニンの生成に関与するチロシナーゼの活性を抑制することができるため、メラニンの生成を抑制できる。これにより、優れた美白効果を有するとされている。
【０００５】
しかしながら、特許文献１に開示された化粧料では、メラニンの生成を抑制できるものの、メラニンの生成の根本的な原因と考えられる活性酸素に対する対応はされておらず、チロシナーゼの活性が戻るとメラニンは再び生成されることとなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平０７−１１８１３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
この発明は、上述した問題を鑑み、抗酸化機構を活性化して活性酸素を低減できる活性促進剤、該活性促進剤を含有する化粧料及び前記活性促進剤を含有する皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この発明は、セイヨウカボチャ由来の抽出物からなる、活性酸素を低減させる抗酸化機構の活性化を促進させる活性促進剤であることを特徴とする。  
またこの発明は、上述の活性促進剤を含有する化粧料又は皮膚外用剤であることを特徴とする。
【０００９】
上述のセイヨウカボチャ由来の抽出物とは、セイヨウカボチャの種子や花、実、茎、葉、根などの各部分から抽出した物をさす。
上述の抗酸化機構の活性化とは、活性酸素を還元するための機構をさし、例えば、酸化ストレス応答遺伝子群の発現の活性化や、酸化ストレス応答遺伝子群のうちの一部の遺伝子群又は一の遺伝子の発現の活性化、抗酸化作用を有する化合物の合成に関わる遺伝子群の発現の活性化、細胞内に発現されている抗酸化タンパク質の活性化をさす。
【００１０】
前記化粧料は、性状が液状、ゲル状、クリーム状、半固形状、固形状、スティック状、パウダー状等のいずれであってもよく、乳液、クリーム、化粧水、美容液、パック、洗顔料、メーキャップ化粧料等の皮膚用化粧料等とすることができる。  
同様に、前記皮膚外用剤も液状、ゲル状、クリーム状、半固形状、固形状、スティック状、パウダー状等のいずれであってもよい。
【００１１】
この発明によると、前記抗酸化機構が活性化されることにより、前記活性酸素の還元などが促進されるため、紫外線などの刺激により増加した前記活性酸素を低減できる。これにより、例えば前記活性酸素に起因するメラニンの合成などを抑制できる。
【００１２】
したがって、肌に老人性色素斑が発生することを防止でき、美白効果を奏する。また、前記活性酸素を減らすことができるため、前記活性酸素により細胞やＤＮＡなどが損傷することを防止できる
【００１３】
この発明の態様として、前記抗酸化機構の活性化が、酸化ストレス応答遺伝子群の発現の活性化であってもよい。  
前記酸化ストレス応答遺伝子群は、例えば、スーパーオキシドディスムターゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼなどの抗酸化酵素や、抗酸化物質であるグルタチオン（ＧＳＨ）の合成に関与するγ―グルタミルシステイン合成酵素（γ−ＧＣＳ）やグルタチオンシンターゼなどに対応する遺伝子群、抗酸化酵素などの発現を促進させる転写因子の発現に対応する遺伝子群などの少なくとも一部を含む。
【００１４】
この発明によると、生体内において存在する酸化ストレス応答遺伝子群が活性化されて発現が促進されるため、例えば活性酸素である過酸化水素などを水と酸素などに分解する酵素や、抗酸化機能を有するＧＳＨの合成に関与する酵素などの発現が促進される。このような発現物質の働きにより、生体内における活性酸素を確実に低減できる。これにより、活性酸素に起因するメラニンの合成などを抑制できる。
【００１５】
またこの発明の態様として、Ｎｒｆ−２の核内移行を促進させて、前記酸化ストレス応答遺伝子群の発現を活性化させてもよい。  
この発明により、確実に前記酸化ストレス応答遺伝子群を活性化させることができるため、前記活性酸素をより確実に低減できる。
【００１６】
詳述すると、酸化ストレス応答遺伝子群の発現を促進させる転写因子であるＮｒｆ−２の核内移行を促進させることにより、前記酸化ストレス応答遺伝子群を発現させることができる。これにより、抗酸化機能を有するタンパク質や抗酸化物質の発現量を増加させることができ、生体内の活性化酸素を確実に低減できる。
【００１７】
またこの発明の態様として、前記酸化ストレス応答遺伝子群が、カタラーゼ遺伝子を含んでもよい。  
この発明により、生体内においてカタラーゼの発現量を増加できるため、活性酸素の一種である過酸化水素を水と酸素とに分解できる。これにより、生体内の過酸化水素の濃度を低減できる。
【００１８】
またこの発明の態様として、前記酸化ストレス応答遺伝子群は、ＧＳＨの合成に関与するグルタチオン合成遺伝子群を含んでもよい。  
この発明によると、フリーラジカルや過酸化物といった活性酸素を還元するＧＳＨの合成が活性化されるため、生体内における活性酸素の濃度を低減できる。
【００１９】
またこの発明の態様として、前記グルタチオン合成遺伝子群は、γ―グルタミルシステイン合成酵素遺伝子としてもよい。  
この発明によると、フリーラジカルや過酸化物といった活性酸素を還元して消去するＧＳＨの前駆体であるγ−グルタミルシステインを生成するγ―グルタミルシステイン合成酵素の発現量を増加させることができる。これにより、抗酸化物質であるＧＳＨの生成量を増加させることができるため、生体内の活性酸素種をより低減できる。
【発明の効果】
【００２０】
この発明により、抗酸化機構を活性化して活性酸素を低減できる活性促進剤、該活性促進剤を含有する化粧料及び前記活性促進剤を含有する皮膚外用剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】セイヨウカボチャエキスの有無に対する細胞内における活性酸素濃度を示した棒グラフ。
【図２】セイヨウカボチャエキスの有無に対するＮｒｆ−２の核内移行を示した蛍光画像。
【図３】セイヨウカボチャエキスの有無に対するＮｒｆ−２遺伝子の発現量を示した棒グラフ。
【図４】セイヨウカボチャエキスの有無に対するγ―グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の発現量を示した棒グラフ。
【図５】セイヨウカボチャエキスの有無に対するカタラーゼ遺伝子の発現量を示した棒グラフ。
【図６】セイヨウカボチャエキスの有無に対するカタラーゼの発現量を示した説明図。
【図７】セイヨウカボチャエキスの有無に対するＧＳＨの発現量を示した棒グラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本実施形態に係るセイヨウカボチャ由来の抽出物は、部位は特定されず、例えば、種子や花、実、葉、茎、根等の各部分も使用できるが、種子を用いることが好ましい。
【００２３】
セイヨウカボチャから抽出物を得る方法は、セイヨウカボチャ由来の成分を抽出したものであれば特に限定されることなく、いかなる溶媒や手段を用いても良い。例えば、そのまま又は粉砕物を適当な抽出溶媒に浸漬する方法、そのまま又は粉砕物を適当な抽出溶媒に浸漬させて常温から抽出溶媒の沸点の範囲内において攪拌する方法等によって得ることができる。好ましくは２５℃以上８０℃以下の温度の水又は２０〜７０％エタノール水溶液で抽出して濾過する方法などが挙げられる。  
なお、本発明が化粧料や皮膚用外溶剤として使用される場合には、水及びエタノールを適当な割合で混合して抽出溶媒とすることが好ましい。
【００２４】
このようにして得られたセイヨウカボチャ由来の抽出物は、抗酸化機構の活性化を促進させる効果を有する。  
具体的には、前記抗酸化機構が活性化することにより、過酸化水素やフリーラジカルなどの前記活性酸素の還元が促進されるため、生体内における前記活性酸素量を低減できる。これにより、紫外線などにより増加した前記活性酸素量を低減でき、例えば前記活性酸素に起因するメラニンの合成などを抑制され、肌のシミ（老人性色素班斑）の発生を抑制して美白効果を奏する。さらにまた、活性酸素による肌の損傷や老化などを防止できる。
【００２５】
このように抽出されたセイヨウカボチャ由来の抽出物は、抗酸化機構を活性化させることにより美白効果及び肌の老化を防止できるため、例えば、化粧料や皮膚外用剤として用いることができる。
【００２６】
化粧料又は皮膚外用剤の性状は液状、ゲル状、クリーム状、半固形状、固形状、スティック状、パウダー状等のいずれであってもよく、乳液、クリーム、化粧水、美容液、パック、洗顔料、メーキャップ化粧料等の皮膚用化粧料等とすることができる。
【００２７】
本実施形態に係る化粧料又は皮膚外用剤には、上記抽出物が有する抗酸化機構の活性化の促進を妨げない限り、通常の皮膚外用剤や化粧料の製造に用いられる主剤、助剤又はその他の成分、例えば、収斂剤、殺菌・抗菌剤、防腐剤、金属イオン封鎖剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、清涼剤、乳化剤、増泡剤、増粘剤、消臭・脱臭剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、消炎・抗アレルギー剤、美白剤、酵素、ホルモン類、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料、精製水などを配合することができる
【００２８】
前記皮膚外用剤は、上記抽出物が有する抗酸化機構の活性化の促進を妨げない限り、皮膚外用剤に通常用いられる種々の成分、例えば、保湿剤、油性物質、界面活性剤、増粘剤、中和剤、防腐剤、抗酸化剤、色素、香料、紫外線吸収剤、細胞賦活剤、他の薬効成分などが挙げられる。
【実施例】
【００２９】
以下実施例をもって詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００３０】
実施例１：セイヨウカボチャ抽出物の調製
乾燥させたセイヨウカボチャの種子（１００ｇ）をミキサーで粉砕した後に、５０ｗ／ｗ％のエタノールを加えて室温にて２週間静置し，濾過を行った。得られた濾液を濃縮・乾燥させてセイヨウカボチャ抽出物（８ｇ）を得た。
【００３１】
試験例１：細胞内活性酸素の抑制作用の測定
セイヨウカボチャ抽出物を添加した新生児ヒト皮膚ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）における活性酸素の抑制作用の測定方法について記載する。
【００３２】
ＮＨＥＫを、ヒト正常新生児表皮角化細胞長期培養用培地（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地）を入れた９６穴マイクロプレートに２．５×１０４個／穴播種し、３７℃、５．０％ＣＯ２の条件下に１日間プレ培養した。その後、各穴のＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地を抜き取り、最終濃度が０ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、及び５００ｎｇ／ｍｌとなるように調製したセイヨウカボチャ抽出物であるセイヨウカボチャエキスを溶解したＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地を１００μｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。
【００３３】
次に、９６穴プレートの各穴に対してＲＯＳ検出蛍光プローブ（fluorescein-5-thiosemicarbazide）を添加して、３７℃、５％ＣＯ２下で３０分培養した後に、終濃度５００μＭとなるように過酸化水素を各穴に対して添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で３０分培養した。その後、各穴の蛍光強度をマイクロプレートリーダで励起波長４９２ｎｍ、蛍光波長５１６ｎｍにて計測して評価した。その結果を図１に示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００３４】
図１は、セイヨウカボチャ抽出物を添加したＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地で培養したＮＨＥＫに対して、過酸化水素を添加した場合におけるセイヨウカボチャ抽出物の活性酸素の抑制効果を示す棒グラフであり、縦軸は総タンパクの質量に対する蛍光強度を示し、横軸は、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に添加したセイヨウカボチャエキスの濃度を示す。
【００３５】
図１に示すように、ＮＨＥＫを培養するＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に対して過酸化水素を添加することにより、活性酸素の濃度が大幅に増加するが、過酸化水素処理する前に添加したセイヨウカボチャエキスの濃度が濃いほど、過酸化水素（活性酸素）が減少することが分かった。このことから、セイヨウカボチャ抽出物を添加することにより活性酸素濃度を減少できる。  
なお、過酸化水素を添加していない場合でも、セイヨウカボチャ抽出物を充分に添加した場合には、優位に過酸化水素（活性酸素）が減少する。
【００３６】
試験例２：ＮＨＥＫにおけるＮｒｆ−２の核内移行  
ＮＨＥＫを、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地を入れた９６穴マイクロプレートに１．０×１０４個／穴播種し、３７℃、５．０％ＣＯ２の条件下に１日間プレ培養した後、各穴のＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地を抜き取り、最終濃度が０ｎｇ／ｍｌ及び５００ｎｇ／ｍｌとなるように調製したセイヨウカボチャエキスを溶解したＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に１００μｌずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で６時間培養した。その後、９６穴マイクロプレートで培養したＮＨＥＫの細胞内へ移行したＮｒｆ−２の量を免疫染色で調べて、評価した。
【００３７】
＜免疫染色＞
上述の培養により得られたＮＨＥＫをＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、４％ホルムアルデヒドにて１５分間処理して固定した。これをＰＢＳ−Ｔにて２回洗浄し、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ（−）を添加して５分間静置した。続いて、ＰＢＳ（−）にて５分間静置した後に、ブロッキング液１５０μｌを加え室温，１時間、静置した。
【００３８】
続いて、ＰＢＳ−Ｔにて３回洗浄してから、１００倍希釈した一次抗体（anti-Nrf2 antibody）を添加して、４℃にて一晩静置した。このようにして一次抗体反応をさせた後にＰＢＳ−Ｔにて３回洗浄後、５００倍希釈した二次抗体（goat anti Rabbit IgG-Biot）を添加し、室温にて２時間静置して二次抗体反応を行った。そして、ＰＢＳ−Ｔにて３回洗浄後、１０００倍希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０（Thermo Fisher Scientific社製）を添加し、室温遮光下にて１時間静置した。さらに、５００倍希釈したＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を添加し、３７℃にて５分間静置した。ＰＢＳ（−）にて２回洗浄後、蛍光顕微鏡にて観察した。その結果を図２に示す。
【００３９】
試験例３：遺伝子発現量の測定方法  
ＮＨＥＫを、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地を入れた９６穴マイクロプレートに２．０×１０４個／穴播種し、３７℃、５．０％ＣＯ２の条件下に１日間プレ培養した後、各穴のＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地を抜き取り、セイヨウカボチャ抽出物を溶解して最終濃度が０ｎｇ／ｍｌ及び５００ｎｇ／ｍｌとしたＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に１００μｌずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。その後、９６穴マイクロプレートで培養したＮＨＥＫから全ＲＮＡを抽出してリアルタイムＰＣＲ法を行った。
【００４０】
上述のようにセイヨウカボチャ抽出物の濃度が０ｎｇ／ｍｌ及び５００ｎｇ／ｍｌとして２４時間培養させたＮＨＥＫ細胞内のＲＮＡを回収し、測定対象に対応するプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲ法を行い、セイヨウカボチャ抽出物の添加の有無において発現されたｍＲＮＡの発現量を測定して、評価する。その結果を図３〜図５に示す。
【００４１】
なお、プライマーに関しては、Ｎｒｆ−２及びγ−ＧＣＳ、カタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）に対応するプライマーを作成し、これらを用いてそれぞれの発現量を調べた。なお、リアルタイムＰＣＲは遺伝子解析の分野においては、当業者であるならば周知の技術であるため詳細は省く。
【００４２】
図３はセイヨウカボチャエキスの添加の有無に対するＮｒｆ−２遺伝子の発現量の表す棒グラフであり（＊ｐ＜０．０５）、図４はセイヨウカボチャエキスの添加の有無に対するγ−ＧＣＳの遺伝子の発現量の表す棒グラフであり（＊＊ｐ＜０．０１）、図５はセイヨウカボチャエキスの添加の有無に対するカタラーゼの発現量を示した棒グラフである（＊ｐ＜０．０５）。
【００４３】
図３に示すように、ＮＨＥＫを培養するＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地にセイヨウカボチャエキスの添加することにより、Ｎｒｆ−２遺伝子の発現が促進され、抗酸化機構の転写因子であるＮｒｆ−２が発現されている。
【００４４】
また、図２に示すように、発現されたＮｒｆ−２は生体の核内に移行されるため、Ｎｒｆ−２が核内のＤＮＡに結合して抗酸化機構の活性が促進され、抗酸化に寄与するタンパク質群が発現されることとなる。したがって、生体内の活性酸素濃度を減少できる。
【００４５】
また、図４及び図５に示すように、ＮＨＥＫを培養するＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地にセイヨウカボチャエキスの添加することにより、ＧＳＨの前駆体であるγ−グルタミルシステインの生成に関わるγ−ＧＣＳ及び過酸化水素を還元する酵素であるカタラーゼの発現量も増加していることが分かる。
【００４６】
試験例４：カタラーゼの発現量の測定方法  
ＮＨＥＫを、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地を入れた９６穴マイクロプレートに２．５×１０４個／穴播種し、３７℃、５．０％ＣＯ２の条件下に１日間プレ培養した後、各穴のＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地を抜き取り、最終濃度が０ｎｇ／ｍｌ及び５００ｎｇ／ｍｌに調製したセイヨウカボチャエキスを溶解したＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地を１００μｌずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。その後、９６穴マイクロプレートで培養したＮＨＥＫで細胞内のカタラーゼの量をウェスタンブロッティング法で測定した。
【００４７】
このウェスタンブロット法について説明する。はじめに、ＮＨＥＫ細胞の全タンパク質を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動をして分離し、ＰＶＤＦメンブレン（WSE-405、アトー株式会社）に転写させた。そして、このＰＶＤＦ膜は、１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中に浸して６０分間振とうさせることでブロッキングし、ＰＶＤＦ膜を洗浄した後に、抗カタラーゼ抗体（PAC418Hu71、Cloud-Clone社）を希釈した０．３％のＢＳＡを含むＰＢＳに浸して室温で６０分間振とうさせ、再度ＰＶＤＦ膜を洗浄し、抗ウサギＩｇＧ抗体（65-6120、Thermo Fisher社）を希釈した３％のスキムミルクを含むＰＢＳ−Ｔに浸して室温で６０分間振とうさせた。その結果を図６に示す。
【００４８】
検出は、ＥＣＬ化学発光キット（RPN2106、GE Healthcare社）により実施した。抗カタラーゼ抗体（Bioton-LinkedantibodytoCatalase、Cloud-Clone社；１：５０）を用い、コントロールとしては、抗βアクチン抗体（4967、Cellsignaling Technology社、１：１００００）を用いた。
【００４９】
図６に示すように、生体内において発現されるカタラーゼ量は、ＮＨＥＫの培地であるＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に添加したセイヨウカボチャエキスの量が多いほど、より多く発現していることが分かった。
【００５０】
このことから、セイヨウカボチャエキスを添加して培養したＮＨＥＫでは、活性酸素の一種である過酸化水素を水と酸素に還元できるため、生体内の活性酸素濃度を減少させることができる。これにより、活性酸素に起因するメラニンの生成を抑えることができるため、美白効果を奏する。
【００５１】
試験例５：ＧＳＨの定量測定  
ＮＨＥＫを、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地を入れた９６穴マイクロプレートに２．５×１０４個／穴播種し、３７℃、５．０％ＣＯ２の条件下に１日間プレ培養した後、各穴のＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地を抜き取り、セイヨウカボチャ抽出物を溶解して最終濃度が０ｎｇ／ｍｌ及び５００ｎｇ／ｍｌとしたＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地を１００μｌずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。その後、９６穴マイクロプレートで培養したＮＨＥＫで細胞内のＧＳＨの量を測定した。その結果を図７に示す。
【００５２】
ＧＳＨの量は、グルタチオンレダクターゼリサイクリング法を用いて定量した。細胞を１００μｌの０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００を用いて溶解し、これを２５μｌ分取したものと、２ｍＭのＮＡＤＰＨ２５μｌと、グルタチオンレダクターゼ溶液２５μｌとを混合し、３７℃にて１０分間インキュベートした。その後、１０ｍＭの５，５’−Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）水溶液を２５μｌ添加し、５分後の４５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に酸化型グルタチオンを用いて作成した検量線よりＧＳＨを定量した。
【００５３】
図７に示すように、細胞内において発現されたＧＳＨ量は、ＮＨＥＫの培地であるＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に添加したセイヨウカボチャエキスの量が多いほど、より多く発現していることが分かった。
【００５４】
このように、セイヨウカボチャエキスを添加したＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地で培養されたＮＨＥＫは、ラジカルの捕捉や酸化還元による細胞機能の調節など抗酸化機能を有することが知られているＧＳＨの生成量が増加するため、生体内において、例えば、過酸化水素やスーパーオキサイドの濃度を減少させることができる。これにより、活性酸素に起因するメラニンの生成を抑えることができるため、美白効果を奏する。
【００５５】
以上に示すように、本発明は、生体内において、酸化ストレス応答遺伝子群の発現を活性化させ、生体内の活性酸素種を低減させ、メラニンなどの生成を抑えさせることができるとともに、活性酸素に起因する老化現象も抑えることができる。
【００５６】
また、本発明は、生体内に存在する抗酸化機構を活性化させる構成であるため、例えば所定のタンパク質の活性を抑制する阻害剤などを加える場合に比べて、安全性が高いと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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