(57)【要約】      （修正有）【課題】放射線療法若しくは化学療法による抗癌療法によって罹患する口腔粘膜炎等の粘膜炎又は大腸炎の発生率、重症度及び／又は罹患期間を低下又は短縮するための新規方法の提供。【解決手段】必須の構成アミノ酸としてプロリンを含有する特定の直鎖状若しくは環状のテトラペプチド又はペンタペプチドを投与する工程を含む、有害量の放射又は化学療法剤に暴露された個体の口腔粘膜炎の発生率、重症度及び／又は罹患期間を減じるための処置方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射線または化学療法薬剤の有害量に曝露された個体における口腔粘膜炎を処置する方法であって、有効量の以下：
ａ）７個のアミノ酸までのアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｐであるアミノ酸配列（配列番号：５６）を含み、ここで、
Ｘ１は、Ｒであり、
Ｘ２は、ＩまたはＶであって、ここでＸ２はＮ−メチル化されていてもよい、
Ｘ３は、ＩまたはＶであって、ここでＸ３はＮ−メチル化されていてもよい、
Ｐは、プロリンまたはプロリン類似体であり、
配列番号：５６は、前記ペプチドのＮ末端における最初の４個のアミノ酸であるペプチド、またはその薬学的な塩、エステルもしくはそのアミド、および、
薬学的に許容可能な担体、希釈剤
または、
ｂ）配列番号：５、７、１０、１４、１７、１８、２２、２３、２４、２７、２８、３１、３４、３５、６３、６４、６６〜６９、７２、７６、７７、９０及び９２で示されるアミノ酸配列のいずれかを含むペプチド、またはその薬学的な塩、エステルもしくはアミド、ならびに、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤
を個体に投与する工程を含む方法。
【請求項２】
前記ペプチドが、配列番号：５、またはその薬学的な塩、エステルもしくはアミド、ならびに、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ペプチドが、経口的に、皮下に、筋肉内に、静脈内に、経皮的に、鼻腔内に、肺投与により、または浸透圧ポンプにより、投与される請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチドの有効量が少なくとも１．５ｍｇ／ｋｇである請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドが、放射線または化学療法薬剤の投与中３日目毎に個体に投与される請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチドが、局所的に活性なコルチコステロイドまたはその代謝物の経口剤形の組み合わせで個体に投与され、前記経口剤形は、個体の消化管および口腔の局部的または局所的な処置に有効であり、さらに、前記個体は、放射線または化学療法処置に起因する組織損傷による炎症の症状を示している請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記局所的に活性なコルチコステロイドがジプロピオン酸ベクロメタゾンである請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記代謝物が１７−モノプロピオン酸ベクロメタゾンである請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記局所的に活性なコルチコステロイドの有効量が８ｍｇ/日である請求項６記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドが有効量の抗生物質との組み合わせで投与される請求項１記載の方法。
【請求項１１】
配列番号：９１もしくは配列番号：９２で示されるアミノ酸、またはその薬学的な塩、エステルもしくはアミドを含む単離されたペプチド。
【請求項１２】
Ｒ（ｔＢｇ）Ｖ１ＫＲ（ｔＢｇ）Ｖ２であるアミノ酸配列からなる単離されたペプチドであって、
ここで、ｔＢｇ＝ ｔｅｒｔ−ブチルグリシンであり、
さらに、Ｒ（ＴｔＢｇ）Ｖ２は、Ｖ２と側鎖中のリジンアミノ基との間のアミド結合を介して連結されている（配列番号：９１）ペプチド。
【請求項１３】
ＲＩＶ（ｍｐ２）Ａ−ＮＨ２のアミノ酸配列からなる単離ペプチドであって、
ここで、ｍｐ２＝４-アミノ−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸
【化１】
2019142910.tif 000006
である（配列番号：９２）単離ペプチド。
【請求項１４】
表１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを個体に投与する工程を含む、細菌感染、粘膜炎及び大腸炎からなる群より選択される疾患、または急性放射線への曝露を患う個体を処置する方法。
【請求項１５】
前記アミノ酸配列が、配列番号：５、配列番号：９１および配列番号：９２からなる群より選択される請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記疾患が細菌感染である請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記アミノ酸の配列が、配列番号：９１または配列番号：９２であり、さらに前記ペプチドが、有効量の抗生物質との組み合わせで投与される請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
個体において感染症を予防するための方法であって、有効量の以下： 
ａ）７個のアミノ酸までのアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｐであるアミノ酸配列（配列番号：５６）を含み、ここで、
Ｘ１は、Ｒであり、
Ｘ２は、ＩまたはＶであって、ここでＸ２はＮ−メチル化されていてもよい、
Ｘ３は、ＩまたはＶであって、ここでＸ３はＮ−メチル化されていてもよい、
Ｐは、プロリンまたはプロリン類似体であり、
配列番号：５６は、前記ペプチドのＮ末端における最初の４個のアミノ酸であるペプチド、またはその薬学的な塩、エステルもしくはそのアミド、および、
薬学的に許容可能な担体、希釈剤
または、
ｂ）配列番号：５、７、１０、１４、１７、１８、２２、２３、２４、２７、２８、３１、３４、３５、６３、６４、６６〜６９、７２、７６、７７、９０及び９２で示されるアミノ酸配列のいずれかを含むペプチド、またはその薬学的な塩、エステルもしくはアミド、ならびに、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤
を前記個体に投与することを含む方法。
【請求項１９】
前記ペプチドが配列番号：９１または配列番号：９２で示されるアミノ酸配列を含む請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
前記ペプチドが有効量の抗生物質との組み合わせで投与される請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
Oreola Donini, Coquitlam, BC Annett Rozek, Port Moody, BC, Jackson Lee, Richmond, BC John North, Comox, BC and Michael Abrams, 米国 ワシントン州 シアトル市
【０００２】
関連出願
本出願は、２０１３年９月１３日に出願された、出願番号第６１／８７７，７６７の米国仮出願の利益を主張し、その出願の開示内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００３】
序論
先天性免疫系
先天性免疫反応は、組織と外部環境との間のバリア、例えば皮膚、経口胃粘膜、気道などに関連する進化的に保存された防護システムである。侵入する病原体の速やかな認識および根絶ならびに細胞損傷への応答を提供することは、しばしば、炎症反応に関連し、および適応免疫の活性化に重要な貢献をしている。病原体および／または損傷関連分子（ＲＡＭＰまたはＤＡＭＰ）の、例えばトール様受容体（ＴＬＲ）などのパターン認識受容体への結合によって、先天性防御は誘引される。パターン認識受容体は、多くの細胞型中または細胞型上で見出され、循環性コンパートメント及び組織常在性のコンパートメントの両方中に全身を通じて分布しており、および非特異的な抗菌分子、サイトカイン、ケモカイン、ならびにホスト防御タンパク質およびペプチドの遊離、そして高度に組織化された様式での免疫細胞（好中球、マクロファージ、単球）の補充をもたらす早期の「危険」信号を提供するように機能する（Janeway, 2002、Beutler, 2003、Beutler, 2004、Athman, 2004、Tosi, 2005、Doyle, 2006、Foster, 2007、Matzinger, 2002）。さらに、先天性免疫系は、消化管中の共生微生物叢への耐性の産出ならびに消化管修復および免疫防御に直接関与する（Santaolalla, 2011、Molloy 2012）。
【０００４】
粘膜炎
粘膜炎は抗癌療法によって与えられる粘膜への損傷に関する臨床用語である。これは任意の粘膜領域で起こり得るが、最も一般的には、口、そしてそれに続いて小腸に関連している。多くの粘膜炎に対する尺度が臨床的に使用されているが、最も一般的に使用されている２つの評価システムは、ＮＣＩ尺度およびＷＨＯ尺度である。
【０００５】
粘膜炎のメカニズムは広く研究されてきており、そして、最近、化学療法および／または放射線療法の先天性防御システムとの相互作用に関連付けられた（Sonis, 2010）。現在では、潰瘍性病変の細菌感染は、病変の第一の要因としてよりも、治療によって誘導された細胞死により誘引される調節不全の局所炎症の２次的な結果として考えられている。粘膜炎は米国で年間５０万人に発症し、および化学療法を受けている患者の４０％に起こっている（Sonis, Current Opinion in Chemical Biology, 2010）。粘膜炎は、放射線療法を用いて頭頸部癌を治療している患者にほぼいつでも起きる（８０％を超える重度の粘膜炎の発生率）（Eltingら、2008）。粘膜炎は、高用量の化学療法を受けている患者及び幹細胞移植（ＳＣＴ）を受けている患者（粘膜炎の発生率及び重症度は骨髄破壊のために使用される前処理レジメンの性質に大きく依存する）に一般的（４０〜１００％の発生率）である（Murphy, 2007）。確立した化学療法薬剤のうち、５−ＦＵ及びイリノテカンは粘膜炎を起こすことで特に知られているが、ｍＴＯＲ阻害剤及びキナーゼ阻害剤などのより新しい薬剤でも粘膜炎は起きる（Mateusら、2009、Sankhalaら、2009）。粘膜炎は重度の衰弱をもたらし得、および、感染症、敗血症、非経口栄養及び麻薬性鎮痛剤の必要性をもたらし得る。腸の損傷は重度の下痢を起こさせる。これらの症状は癌治療の用量及び期間を制限し得るため、したがって、低下した生存率を含む最適以下の治療結果をもたらす。粘膜炎の直接的及び間接的な影響は、患者１人当たり癌治療費に１８，０００米ドルを追加していると見積もられている（Nonzeeら、2008）。粘膜炎は放射線治療の開始後３〜１２週間で、または化学療法の開始後３〜１２日で発生し、そして、さらなる化学療法または放射線治療が行われないと仮定すると、２〜３週間後に回復する。
【発明の概要】
【０００６】
ＲＩＶＰＡ（配列番号５）はＩＤＲ（先天的防御レギュレータ）であり、新規なメカニズムを有する新しいクラスの短鎖合成ペプチドである。最近発見された天然の粘膜防御ペプチドの機能の一つを模倣するように設計されることにより、ＩＤＲは直接的な抗菌活性をもたないが、ホスト応答を調節し、広い範囲のグラム陰性細菌及びグラム陽性細菌病原体による感染後の生存率を向上させ、そして、細菌性病原体、外傷、化学または放射線療法を含む、さまざまな薬剤への曝露後の組織損傷の消散を促進する。
【０００７】
化学療法誘導性粘膜炎、放射線誘導性粘膜炎、好中球減少性の感染症、および大腸炎のモデルにおいて得られた前臨床データに基づいて、口腔粘膜炎は、ＲＩＶＰＡ（配列番号５）及び他のＩＤＲペプチド適応であることが期待される。化学療法の注入または放射線の直後に薬剤は投与されると考えられるので、ＲＩＶＰＡ（配列番号５）のＩＶ剤形が粘膜炎適応に最適である。マウスおよびハムスターの粘膜炎モデルにおいて得られたＲＩＶＰＡ（配列番号５）の前臨床的効果の結果は、化学療法または放射線への曝露の期間に応じて、７〜１４回の服用を伴う、３日毎の服用が、粘膜炎の「ウインドウ」を網羅し得るはずであることを示している。
【０００８】
乳癌に関しては、ＡＣＴ療法を受けた患者の約２０％が、１回目の化学療法中に潰瘍性粘膜炎に苦しむが、それら患者らの部分集団である約７０％は、２回目には潰瘍性粘膜炎を患うであろう（Sonis, 2010）。これは、ＲＩＶＰＡ（配列番号５）治療によって利益を享受し得るであろう「高リスク」患者集団を示している。現在、この集団における粘膜炎の改善のために承認された全身性薬剤は存在しない。
【０００９】
血液癌の治療のために高用量化学療法及びＳＣＴを受けている患者は、感染症の高いリスクにある免疫抑制集団である。この治療では、高用量の化学療法（時には放射線との組み合わせで）、「前処理レジメン」が癌細胞の大部分を殺すために使用される。これらの治療レベルは、血液細胞の再構成を可能にするためにその後に幹細胞（骨髄または血液から）が投与されない限り、致命的な骨髄機能抑制をもたらすであろう。自己移植は、この目的のために患者自身の幹細胞を使用し、一方、同種異系移植は、健康な適合ドナーからの細胞を使用する。自己移植は、多発性骨髄腫（ＭＭ）及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の治療において最も頻繁に使用される。同種異系移植は典型的には、例えばＡＭＬなどの白血病を治療するために使用される。
【００１０】
ＳＣＴに関して、最近まで、さまざまな前処理化学療法レジメンは全て、比較的高い割合の口腔粘膜炎（４０〜１００％）をもたらし、および、大部分の米国のセンターではこれらの患者は院内管理されている。頭頸部癌に対する放射線および／または化学放射線療法に関連する口腔粘膜炎は大きな問題であり、８５％の被験者がある程度の粘膜炎を患い、４２％はグレード３または４を患っている。
【００１１】
急性放射線症候群
急性放射線症候群（ＡＲＳ）は、全身（またはその大部分）が高い用量の放射線を、典型的には短い期間にわたって、受けた場合に発生する重篤な疾患である。１９４０年代における広島および長崎の原子爆弾の多くの生存者ならびに１９８６年のチェルノブイリ原子力発電所事故後に最初に応じた消防士の多くが、ＡＲＳに罹った（CDC, 2013）。
【００１２】
放射線に曝露された個体は、以下の場合にのみＡＲＳを患うであろう。
・放射線量が高かった（胸部Ｘ線検査などの医療行為からの用量はＡＲＳを起こすには低すぎる）、
・放射線が透過した（すなわち、臓器に到達することができた）、
・個体の全身またはその大部分が線量を受けた、および
・放射線を、短期間で、通常数分以内で受けた。
【００１３】
放射線は哺乳動物の細胞及び組織に放射線量に比例した傷害を誘導する。低線量では、損傷は、例えば癌または先天性異常の増大されたリスクなどの長期的な影響と関連付けられ得る体細胞および／または生殖細胞系ＤＮＡにおける点突然変異に限られるであろう。中程度の線量では、放射線は、やはり癌または先天性異常のリスクを増大させる、例えば切断裂および転座などの染色体異常を誘導し、および、充分に重篤であった場合、曝露から数時間以内に急速に分裂している細胞の死が起きるであろう。非常な高線量では、放射線はタンパク質を変性させ得、これは細胞及び組織のほとんど瞬間的な死をもたらす。中程度の放射線量によって最も一般的に影響される急速に分裂している細胞を含む組織としては、骨髄、消化管、および精巣などが挙げられる。放射線への暴露は、例えば皮膚の発疹および火傷などを含む急性効果、例えば貧血、白血球数減少、血小板減少などの骨髄機能不全、ならびに、例えば下痢などの胃腸毒性、ならびに、例えば腫瘍の発生、特には肉腫と白血病、および先天性異常などのより慢性的な効果に関連付けられる。
【００１４】
ＡＲＳの最初の症状は、典型的には、吐き気、嘔吐、および下痢である。これらの症状は、曝露後数分以内から数日までに開始され、数分から数日間まで続き、および出たり、消えたりするかもしれない。その後、その者は通常、短時間は健康的に見えおよび感じるが、その後、彼または彼女は再度、食欲不振、倦怠感、発熱、吐き気、嘔吐、下痢、および、ことによると発作および昏睡をも伴う病気を発病するであろう。この重篤な病のステージは数時間から数ヶ月まで続くかもしれない。
【００１５】
ＡＲＳを患う人々は、典型的にはまた、なんらかの皮膚の損傷を負っている。この損傷は、暴露後数時間以内に現れ始め得、そして、腫れ、かゆみ、皮膚の赤み、および脱毛を含み得る。他の症状と同じように、皮膚は短時間で治癒するかもしれないが、その後、腫れ、かゆみ、および発赤の数日または数週間後の再発が続く。皮膚の完全治癒は、その者の皮膚が受けた放射線量に依存して、数週間から数年までの期間がかかるかもしれない。
【００１６】
消化管におけるＡＲＳの顕在化は、胃腸急性放射線症候群またはＧＩ−ＡＲＳと称される。ＧＩ−ＡＲＳは、下痢、脱水、腸内細菌感染症、ならびに重症の場合には敗血症性ショックおよび死からなる（Potten, 1990）。放射線曝露に続いて、ＧＩ−ＡＲＳは、リーベルキューン腺小窩の底部内の幹細胞への直接的な損傷によって起きると考えられており、アポトーシス機構を介して、有糸分裂停止および死を結果として生じる（Potten, 1997a、Potten, 1997b）。胃腸粘膜の完全性は、陰窩の底部の多能性幹細胞のプールの急速な増殖に依存する（Brittan, 2002、Gordon, 1994、Potten, 1997b）。したがって、生き残った腸管幹細胞が陰窩−絨毛ユニットの再構成に十分であると思われるため、幹細胞の死はこのプロセスにおいて重要な要素であると考えられる（Potten, 1990）。腸上皮バリアの再生は、造血組織と同様に活性な幹細胞コンパートメントに依存する。腸陰窩−絨毛前駆クロノゲン細胞は、電離放射線への暴露に特に感応性であり、放射線量が増大すると、陰窩−絨毛クロノゲン細胞は絨毛を再配置するための十分な細胞を産生することができない。これは絨毛の高さにおける滑化および減少ならびに最終的な機能不能をもたらし、低下した栄養吸収およびバリア機能、流体および電解質の喪失、ならびに腸のバリアを介した細菌転移につながる（Monti, 2005、Zhao, 2009）。８グレイ（Ｇｙ）以上で、用量依存性の幹細胞の死は、再生レベルがＧＩ粘膜を回復させるために不十分となるまで、陰窩再生の減少をもたらす。マウスにおける研究により、上皮の進行性の裸出は、放射線照射後６〜７日までにＧＩ症候群による死をもたらす。有糸分裂活性が再開されると、おそらく陰窩クロノゲンの増殖死の開始の結果として、陰窩の急激な減少が起こる（Withers, 1971）。より低い線量範囲（８〜１３Ｇｙ）では、生き残ったクロノゲンが陰窩系統を再生し、傷ついた粘膜の完全な回復をもたらす。１４Ｇｙを超える線量では、大量のクロノゲン損失が、陰窩−絨毛系統の不全、粘膜の裸出、および胃腸症候群による動物の死をもたらす（Paris, 2001、 Potten, 1990、Withers, 1971、Withers, 1969）。
【００１７】
腸管幹細胞コンパートメントは、電離放射線に感応性である唯一のコンパートメントではない。別の重篤な因子が関与する主要な身体の損傷への消化管の応答は腸の低潅流である。持続性の腸の低潅流は、全身性炎症反応症候群及び多臓器不全（ＭＯＦ）の発症に重要な誘発事象である（Moore, 1999）。毛細血管漏出と共に増大された腸血管透過性が放射線照射後の早い期間に観察されている（Cockerham, 1984、Eddy, 1968、Willoughby, 1960）。追加の照射後の変質は、小動脈血管の中等度の拡張及び屈曲、血管の数および／または長さの減少、それに続く後で起きる出血性パターンが挙げられる（Eddy, 1968）。これは、放射線照射後の原発巣が腸の上皮幹細胞死であるのかまたは内皮細胞死の結果であるものであるのかに係る継続中の論議が存在している（Kirsch, 2010）。原発巣であるかどうかを問わず、放射線照射が、腸管上皮細胞、内皮細胞の死、腸の低灌流を含む複雑な傷害応答をもたらすことは明らかである（Williams, 2010）。
【００１８】
造血成長因子、すなわち顆粒球および／または顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ及びＧ／Ｍ−ＣＳＦ）及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）、造血幹細胞／骨髄移植などの治療モダリティ―が、造血不全による死亡率を低減させるために使用可能である。
【００１９】
放射線量の増加に伴って、ＡＲＳを患う人々の生存の可能性は減少する。放射線への暴露の１５日以内の死因は、通常、消化管への損傷であり、一方、１５日以降の死は、通常、骨髄損傷の結果である。生存者のための回復プロセスは、数週間から２年まで続き得る（ＣＤＣ  ２０１３）。
【００２０】
現在、急性放射線症候群の治療に承認されたものが存在しないため、放射線緩和剤の開発への緊急の必要性がある。ＲＩＶＰＡ（配列番号５）は、支持療法の取り組みを可能にし、ＡＲＳにおける急性死亡率を低下させる、および皮膚損傷の回復を助ける可能性がある。
【００２１】
感染
ウイルス、細菌、真菌、寄生生物などのさまざまな微生物が、疾患を起こし得る。微生物細胞は、天然において単独で生きることが不可能である、多細胞生物の一部としてのみ存在する動物および植物の細胞からは異なっている。微生物細胞は、病原性または非病原性であり、これは、部分的には、微生物および宿主の状態に依存する。例えば、免疫不全宿主においては、通常は無害な細菌が病原体となり得る。宿主細胞への侵入は、細胞内環境内で複製を行う細菌性病原体の生存に重要である。細胞外サイトで複製を行う生物においては、宿主細胞への細菌進入の重要性はよく規定されていない。
【００２２】
薬剤耐性は、感染症と闘うための継続中の努力における障害として残っている。例えば、ペニシリンは、細菌が耐性を獲得するまで、黄色ブドウ球菌の治療に有効であった。２０世紀後半のあいだに、新しい抗生物質、例えばバンコマイシン及びメチシリンなどが開発され、これらは黄色ブドウ球菌感染症を治療することができた。しかしながら、黄色ブドウ球菌のメチシリン耐性菌が１９７０年代に生まれ、そしてそれ以来世界中で病院を悩ませてきた。より最近では、黄色ブドウ球菌のバンコマイシン耐性菌が表面化した。
【００２３】
抗菌薬に対する耐性への高まる脅威、および新たな感染症の出現により、新規な治療化合物に対する継続的な必要性が存在する。病原体ではなく宿主に作用する治療薬が望ましく、それは、それらが病原体耐性を喚起しないためである。とりわけ、先天性免疫系を介して宿主に作用する薬が、有望な治療薬源を提供する。先天性の応答が大部分の感染を制御することに役立つこと、および、炎症応答にも寄与することを示す証拠が存在する。感染によって誘引される炎症応答は、病因の中心的な構成要素であることが知られている。炎症を制御しながら、感染に対する宿主抵抗性を増大させる能力が、耐性菌によって起きる感染症を含む感染症に対する継続中の戦いにおいて非常に有益であろう。
【００２４】
ＩＤＲおよび先天性免疫系
先天性防衛レギュレータ（ＩＤＲｓ）は、細胞内シグナル伝達事象と相互作用し、および先天性防御反応を調節する。ＩＤＲｓとの初期作業の多くは炎症を制御しながらの感染との戦いにおけるそれらの役割に焦点が当てられるのに対し、化学療法または放射線により誘導される粘膜炎及び創傷治癒の動物モデルにおける最近の結果は、ＩＤＲｓが、病原体以上により広い範囲の損傷誘導剤への応答のあいだ有益であり得ることを示唆している。ＩＤＲｓは、ＰＡＭＰｓまたはＤＡＭＰｓによって活性化された際、身体の先天性防御応答を選択的に改変することによって感染を、関連する炎症応答を誘起することなく処置および予防する（Matzinger 2002）。同じメカニズムが、ＤＡＭＰｓの認識の下流の信号伝達が影響を受けている粘膜炎及び創傷治癒モデルにおいて見られるプラスの効果の下にもある。ＲＩＶＰＡ（配列番号５）は、ヒトにおける安全性、ならびに、分割照射により誘導されたおよび化学療法により誘導された口腔粘膜炎の動物モデル、消化管への化学療法により誘導された損傷のモデル、および、免疫応答性及び易感染性宿主における局所性及び全身性のグラム陽性及びグラム陰性感染症のモデルにおける有効性を実証した。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は、分割照射モデルにおける重度の口腔粘膜炎の罹患期間を減少させることを示す図である。
【図２】ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は、最適化された投薬計画を使用して、分割照射モデルにおける重度の口腔粘膜炎の罹患期間を減少させることを示す図である。
【図３】ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は、７、１４、および２１日目におけるの内視鏡検査（Ａ）、ならびに、２１日目（Ｂ、Ｃ、Ｄ）における組織病理学（Ｂ）によって測定されるＤＳＳ誘導性大腸炎の重症度を低下させることを示す図である。
【図４】ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は、化学療法モデル（最初の試験）における重症の口腔粘膜炎の罹患期間（Ａ）、大腸炎の重症度（Ｂ）、体重減少（Ｃ）を減少させることを示す図である。
【図５】ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は、化学療法モデル（第２回の試験）における重症の口腔粘膜炎の罹患期間（Ａ）、大腸炎の重症度（Ｂ）、体重減少（Ｃ）を減少させることを示す図である。
【図６】ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は、用量応答様式での化学療法モデルにおける重症の口腔粘膜炎の罹患期間（Ａ）、大腸炎の重症度（Ｂ）、体重減少（Ｃ）を減少させることを示す図である。
【図７】ＭＲＳＡ  ＩＰ感染モデルにおけるＲＩＶＰＡ（配列番号：５）およびバンコマイシンの組み合わせ処置を示す図である。
【図８】大腿の黄色ブドウ球菌膿瘍感染モデルでの好中球減少性マウスにおけるＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の活性を示す図である。
【図９】免疫適応マウスにおけるＭＲＳＡ菌血症モデルにおけるＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の用量応答を示す図である。
【図１０】Ｔ細胞欠損マウスでのＭＲＳＡ菌血症モデルにおけるＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の用量応答を示す図である。
【図１１】黄色ブドウ球菌の急性腹膜感染モデルにおける治療学的ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の有効性を示す図である。
【図１２】）の大腿の黄色ブドウ球菌膿瘍感染モデルでの好中球減少性マウスにおけるＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の活性を示す図である。
【図１３】高い細菌感染（Ａ）及び低い細菌感染（Ｂ）を有するクレブシエラ腹膜感染モデルにおけるＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の有効性を示す図である。*（Ａ）におけるバーの不在は、すべてのマウスが死亡したことを示す（０％生存）。
【図１４】ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は、MRSAに局所感染した皮膚における組織損傷の消散を促進する。４８時間細菌負荷（Ａ）、９６時間の散布図（Ｂ）、４８時間での盲検写真のスコアリング（Ｃ）、９６時間での盲検写真のスコアリング（Ｄ）を示す図である。*（Ｃ）及び（Ｄ）におけるバーの不存在は、すべてのマウスがゼロスコアをもち、平均値および０±０の平均値標準誤差（ＳＥＭ）を与えることを示す。
【図１５】ＣＤ−１マウスでの白血球減少性の誘導後の、循環血液細胞白血球（Ａ）または好中球（Ｂ）の回復におけるＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の不在を示す図である。
【図１６】Ｒ（ｔＢｇ）Ｖ１ＫＲ（ｔＢｇ）Ｖ２（配列番号：９１）は、化学療法モデルにおける口腔粘膜炎の重症度を軽減することを示す図である。
【図１７】ＲＩＶ（ｍｐ２）Ａ−ＮＨ２（配列番号：９２）は、化学療法モデルにおける口腔粘膜炎の重症度を軽減することを示す図である。
【図１８】Ｒ（ｔＢｇ）Ｖ１ＫＲ（ｔＢｇ）Ｖ２（配列番号：９１）は、ＭＲＳＡ菌血症モデルにおける生存率を向上させることを示す図である。
【図１９】ＲＩＶ（ｍｐ２）Ａ−ＮＨ２（配列番号：９２）は、ＭＲＳＡ菌血症モデルにおける生存を向上させることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の目的は、Ｒ（ｔＢｇ）Ｖ１ＫＲ（ｔＢｇ）Ｖ２のアミノ酸配列からなる単離ペプチドであって、ｔＢｇ＝tert-ブチルグリシンであり、さらにＲ（ｔＢｇ）Ｖ２がＶ１とＫとの間のアミドを介して連結されている単離ペプチドを提供することである。
【００２７】
本発明の目的はＲＩＶ（ｍｐ２）Ａ−ＮＨ２のアミノ酸配列からなる単離ペプチドを提供することであって、
ここで、ｍｐ２＝４-アミノ−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸
【化１】
2019142910.tif 000002
である。
【００２８】
本発明のさらなる別の目的は、放射線または化学療法薬剤の有害量に曝露された個体における口腔粘膜炎を処置する方法であって、有効量の以下：
ａ）表１に記載のアミノ酸配列を含むペプチド、または
ｂ）配列番号：５、７、１０、１４、１７、１８、２２、２３、２４、２７、２８、３１、３４、３５、６３、６４、６６〜６９、７２、７６、７７、９０、９１及び９２で示されるアミノ酸配列のいずれかを含むペプチド、およびその薬学的な塩、エステルまたはアミド、ならびに、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤
を個体に投与する工程を含む方法を提供することである。
【００２９】
本発明の目的は、放射線または化学療法薬剤の有害量に曝露された個体における口腔粘膜炎を処置する方法であって、有効量の以下：
ａ）７個のアミノ酸までのアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｐであるアミノ酸配列（配列番号：５６）を含み、ここで、
Ｘ１は、Ｒであり、
Ｘ２は、ＩまたはＶであって、ここでＸ２はＮ−メチル化されていてもよい、
Ｘ３は、ＩまたはＶであって、ここでＸ３はＮ−メチル化されていてもよい、
Ｐは、プロリンまたはプロリン類似体であり、
配列番号：５６は、前記ペプチドのＮ末端における最初の４個のアミノ酸であるペプチド、またはその薬学的な塩、エステルもしくはそのアミド、および、
薬学的に許容可能な担体、希釈剤
または、
ｂ）配列番号：５、７、１０、１４、１７、１８、２２、２３、２４、２７、２８、３１、３４、３５、６３、６４、６６〜６９、７２、７６、７７、９０及び９２で示されるアミノ酸配列のいずれかを含むペプチド、またはその薬学的な塩、エステルもしくはアミド、ならびに、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤
を個体に投与する工程を含む方法を提供することである。
【００３０】
本発明の別の目的は、放射線または化学療法薬剤の有害量に曝露された個体における口腔粘膜炎を処置する方法であって、ここでペプチドは配列番号：５または、その薬学的な塩、エステルもしくはアミド及び薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤である。
【００３１】
本発明の別の目的は、放射線または化学療法薬剤の有害量に曝露された個体における口腔粘膜炎を処置する方法であって、ペプチドが、経口的に、非経口的に、経皮的に、鼻腔内で投与される方法を提供することである。。
【００３２】
本発明のさらなる別の目的は、放射線または化学療法薬剤の有害量に曝露された個体における口腔粘膜炎を処置する方法であって、ここで個体に投与されるペプチドの有効量は、少なくとも１ｍｇ/ｋｇである方法を提供することである。。好ましい実施形態において、個体に投与されるペプチドの有効量は、約１．５ｍ/ｋｇ〜６ｍ/ｋｇである。
【００３３】
本発明のさらなる別の目的は、放射線または化学療法薬剤の有害量に曝露された個体における口腔粘膜炎を処置する方法であって、ペプチドが、放射線または化学療法薬剤の投与期間中３日目毎に投与される方法を提供することである。
【００３４】
本発明のさらなる別の目的は、放射線または化学療法薬剤の有害量に曝露された個体における口腔粘膜炎を処置する方法であって、ペプチドが、局所的に活性なコルチコステロイドまたはその代謝物の経口剤形の組み合わせで個体に投与され、前記経口剤形は、個体の消化管と口腔の局部的または局所的な処置に有効であり、さらに、個体は、放射線または化学療法処置に起因する組織損傷による炎症の症状を示している方法を提供することである。局所的に活性なコルチコステロイドの代表的な例としては、ベクロメタゾン１７，２１−ジプロピオン、アルクロメタゾンジプロピオネート、ブデソニド、２２Ｓブデソニド、２２Ｒブデソニド、ベクロメタゾン−１７−モノプロピオネート、プロピオン酸クロベタゾール、酢酸ジフロラゾン、フルニソリド、フルランドレノリド、プロピオン酸フルチカゾン、プロピオン酸ハロベタゾール、ハルシノサイド、フランカルボン酸モメタゾン、およびトリアムシノロンアセトニドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の好ましい実施形態において、局所的に活性なコルチコステロイドは、ジプロピオン酸ベクロメタゾンである。それぞれの剤形における局所的に活性なコルチコステロイドの有効量は、患者毎によって異なり得、当該技術分野における当業者によって公知の用量反応試験により容易に決定され得る。このような有効量は、一般的に、約０．１ｍｇ／日〜約８ｍｇ/日の範囲であり、さらにより典型的には、約２ｍｇ／日から約４ｍｇ／日の範囲であろう。
【００３５】
本発明のさらなる別の目的は、短期間に身体の相当な部分に高線量の透過性放射線を受けた個体において、急性放射線症候群の胃腸、造血、皮膚への影響を緩和する方法を提供することである。
【００３６】
本発明のさらなる別の目的は、短期間に身体の相当な部分に高線量の透過性放射線を受けた個体における急性放射線症候群を処置する方法であって、ペプチドが、局所的に活性なコルチコステロイドまたはその代謝物の経口剤形の組み合わせで個体に投与され、前記経口剤形は、個体の消化管と口腔の局部的または局所的な処置に有効であり、さらに、個体は、放射線または化学療法処置に起因する組織損傷による炎症の症状を示している方法を提供することである。局所的に活性なコルチコステロイドの代表的な例としては、ベクロメタゾン１７，２１−ジプロピオン、アルクロメタゾンジプロピオネート、ブデソニド、２２Ｓブデソニド、２２Ｒブデソニド、ベクロメタゾン−１７−モノプロピオネート、プロピオン酸クロベタゾール、酢酸ジフロラゾン、フルニソリド、フルランドレノリド、プロピオン酸フルチカゾン、プロピオン酸ハロベタゾール、ハルシノサイド、フランカルボン酸モメタゾン、およびトリアムシノロンアセトニドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の好ましい実施形態において、局所的に活性なコルチコステロイドは、ジプロピオン酸ベクロメタゾンである。それぞれの剤形における局所的に活性なコルチコステロイドの有効量は、患者毎によって異なり得、当該技術分野における当業者によって公知の用量反応試験により容易に決定され得る。このような有効量は、一般的に、約０．１ｍｇ／日〜約８ｍｇ/日の範囲であり、さらにより典型的には、約２ｍｇ／日から約４ｍｇ／日の範囲であろう。
【００３７】
本発明のさらなる別の目的は、表１に記載のアミノ酸配列を有するもしくは含むペプチドまたはその類似体、誘導体、もしくは変異体、またはその明らかな化学的等価物を個体に投与することによって、個体ににおける感染症（例えば、微生物感染）を処置するおよび／または予防するを提供することである。例として、個体は感染症を患っているか、または患うリスクにある。ある実施形態において、ペプチドは、個体における先天性免疫を調節し、それによって個体における感染症を処置または予防する。
【００３８】
本発明の方法によって処置され得るおよび／または予防され得る感染症の例としては、細菌（例えば、グラム陽性またはグラム陰性細菌）による感染、真菌による感染、寄生虫による感染、ウイルスによる感染が挙げられる。本発明のある実施形態において、感染は細菌感染（例えば、大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、サルモネラ属菌種、黄色ブドウ球菌、連鎖球菌属菌種、またはバンコマイシン耐性腸球菌による感染）である。別の実施形態において、感染は真菌感染（例えば、カビ、酵母、高等真菌による感染）である。さらなる別の実施形態において、感染は寄生虫感染（例えば、ランブル鞭毛虫、クリプトスポリジウム  パルバム（Cryptosporidium parvum）、サイクロスポラ  カイエタネンシス（Cyclospora cayetanensis）、およびトキソプラズマ  ゴンディイ（Toxoplasma gondii）などを含む、単細胞または多細胞寄生虫による感染症）である。さらに別の実施形態において、感染はウイルス感染（例えば、エイズ、鳥インフルエンザ、水痘、ヘルペス、風邪、胃腸炎、腺熱、インフルエンザ、はしか、おたふく風邪、咽頭炎、肺炎、風疹、ＳＡＲＳ、及び上下気道感染症（例えば、呼吸器合胞体ウイルスなど）に関連したウイルスによる感染）である。
【００３９】
剤形の処方
ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の剤形は、注射用の水性、無菌処理された、滅菌溶液である。各バイアルには、５ｍＬの６０ｍｇ／ｍＬ溶液（３００ｍｇのＲＩＶＰＡ（配列番号：５））を含む。ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は、注入のための水中に処方され、そして、ｐＨが目標値６．０に調整される。処方は賦形剤を含まず、そして約３００ｍＯｓｍ／ｋｇの重量モル浸透圧濃度を有する。
【００４０】
投与経路
ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）製剤は、受容個体の体重及び指定された用量レベルに従ってｍｇ／ｋｇベースで決定される、注入のために適切な濃度まで滅菌生理食塩水中に希釈される。希釈されたＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は、３日に１度、４分以上で、２５ｍＬの静脈内（ＩＶ）注入として投与えるされる。
【００４１】
実施例
ペプチド合成
表１記載のペプチドは、固相ペプチド合成技術を用いて合成された。
【００４２】
すべての必要なＦｍｏｃ保護アミノ酸が、所望ペプチドの１ミリモルに対して３倍モル過剰に秤取された。アミノ酸は、その後、３ｍＭ溶液を調製するためにジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（７．５ｍＬ）中に溶解された。適量のＲｉｎｋアミドＭＢＨＡレジンがレジンの置換を考慮して、秤取された。レジンはその後、自動合成反応容器に移され、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で１５分間予浸された。
【００４３】
レジンは、ＤＭＦ中の２５％ピペリジン（３０ｍＬ）をレジンに添加し、そして２０分間混合することにより、脱保護された。樹脂の脱保護後、最初のカップリングが、３ｍＭのアミノ酸溶液を、４ｍＭの２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、８ｍＭのＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＰＡ）と混合することにより行われた。溶液は、レジンに添加される前に５分間予備活性化された。アミノ酸は４５分間カップリングされた。
【００４４】
カップリング後、樹脂は充分にＤＭＦ及びジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）で十分にリンスさた。付加されているＦｍｏｃ保護アミノ酸が、上記と同様に脱保護され、そして次のアミノ酸が同一のカップリングスキームＡＡ：ＨＢＴＵ：ＤＩＥＰＡを用いて結合された。
合成完了後、ペプチドは、９７．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及び２．５％の水を含有する開裂反応混液を用いてレジンから切断された。レジンは１時間半の間、開裂反応混液中に浸された。溶液はその後ブフナー漏斗を用いて重力ろ過され、ろ液は５０ｍＬの遠心チューブ中に回収された。ペプチドは、冷ジエチルエーテルを用いて沈殿させることにより単離された。遠心分離およびジエチルエーテルをデカントした後、粗ペプチドは再度ジエチルエーテルで洗浄され、その後真空デシケーター中で２時間乾燥させされた。ペプチドは、その後、脱イオン水（１０ｍＬ）中に溶解され、−８０℃で凍結及び凍結乾燥された。そして乾燥ペプチドはＨＰＬＣ精製の準備が完了した。
【００４５】
これらのペプチドの親水性の性質のために、ジエチルエーテルによるペプチドの単離は機能しなかった。したがって、クロロホルム抽出が必要であった。ＴＦＡが蒸発され、そして得られたペプチド残渣が１０％酢酸（１５ｍＬ）中に溶解された。不純物及びスカベンジャーは、酢酸ペプチド溶液から、溶液をクロロホルム（３０ｍＬ）で２回洗浄することにより除去された。その後、ペプチド水溶液は−８０℃で凍結され、および凍結乾燥されてＨＰＬＣ精製が可能な粉末ペプチドが得られた。
【００４６】
ペプチド＋ＲＩｘＶＰＡ（配列番号：３３）及び＋ＲＩＶＰＡｘ（配列番号：３４）はそれぞれ１個のＮ−メチルアミノ酸を含んでいた。このカップリングは、レジンを含むＲＶ中で、Ｎ−メチルアミノ酸、ＰｙＢｒｏＰおよびＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール・Ｈ２Ｏ（ＨＯＢｔ）、およびＤＩＥＰＡ溶液を一緒に混合して行われた。４５分間カップリングされた後、Ｎ−メチルアミノ酸は、カップリングの完了を確実とするために再度カップリングされた。Ｎ−メチルアミノ酸へと続くカップリングが完全には完了していなかったことが観察された。したがって、このカップリングは、ＨＢＴＵに替えて、Ｎ、Ｎ、Ｎ‘、Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）を使用して行われた。これは、依然として、全純度のうち３０〜４０％を全体として占める２つの不純物を典型的には含む粗ペプチドをもたらした。ペプチドは、近接して溶出する不純物から純粋なペプチドピークを分離するために改変されたＨＰＬＣ条件下で精製された。
【００４７】
Ｒ（ｔＢｇ）Ｖ１ＫＲ（ｔＢｇ）Ｖ２（配列番号：９１）は、２個の機能性アミン基を有する４番目のアミノ酸リジンからの対称的な分岐を有する８−残基のペプチドデンドリマーである。ペプチドは、上述の一般的な合成技術を用いて、分岐のカップリングを可能にするために２個のＦｍｏｃ保護を有する４番目のアミノ酸を使用して、固相ペプチド合成技術によって合成された。
【００４８】
加えて、これらのペプチドはまた、液相ペプチド合成技術（Tsuda他,2010）および当該技術分野における当業者にとって公知の技術を用いて合成されてもよい。
【００４９】
腔粘膜炎における有効性
ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）及び他のＩＤＲは、炎症カスケードによって起きる重篤な損傷を低減し、及び疾患の消散を促進して、組織損傷に対する先天性防御応答を調節する。ＩＤＲのこの特性は、マウスでの化学療法誘導性の口腔及びＧＩ粘膜炎において、ハムスターでの放射線誘導性の口腔粘膜炎において、およびマウスでのＤＳＳ誘導性の大腸炎において、示されてきた。これらのモデルの各々において、初期の損傷が、損傷の重篤度を上昇させる先天的防御シグナル伝達カスケードを誘起すると考えられている（Marks, 2011、Sonis, 2010）。ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）及び他のＩＤＲは、傷害の結果として生じる重篤度を低下させ、および重篤な組織損傷の期間を減少させて、シグナル伝達カスケードを相殺する。
【００５０】
ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）およびＭＲＳＡ菌血症モデルにおいて同定される他のＩＤＲのための最適な投与計画が、疾患の長い罹患期間が反復投与をより情報価値のあるものとしている傷害モデルにおいてさらに確認された。３日毎の２５ｍｇ／ｋｇの投与が、そのマウス循環からの迅速な（数分以内）ＰＫクリアランスにもかかわらず、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）及び他のＩＤＲの持続性の薬力学的影響を反映して、最適であることが判明した。
【００５１】
ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は、ハムスターの放射線誘導性の口腔粘膜炎のモデルにおいて、粘膜炎の重篤度及び罹患機間を、とりわけ分割照射療法中での３日おきの投与において、減少させた。これらの研究は、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の最適投与が、３日毎の投与を含み、および、２５ｍｇ／ｋｇの用量レベルが効果的であることを確認した。このモデルでは、カニューレ処置された雄のゴールデンシリアンハムスターが、０、１、２、３、６、７、８、９日目に、裏返された左頬袋に向けて、７．５Ｇｙの放射線で処置された。粘膜炎は、７日目と３５日目との間２日毎に評価され、粘膜炎の重篤性のピークは一般的に１９日目頃に起こった。最初の研究において、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）（２５ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）は、０日目から開始されて３日毎に３３日目まで継続して（Ｑ３ｄ  ｄ０〜３３）、または放射線療法の日（０、１、２、３、４、７、８、９日目）に、または６日目から開始されて３日目毎に２４日目まで継続して（Ｑ３ｄ  ｄ６〜２４）、のいずれかの方法で投与された。ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）および放射線の両方が投与された日には、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は照射後２時間で投与された。この研究の結果が図１に示されている。ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）処置は、全期間にわたって３日毎に、または放射線療法の日に投与された場合に最も効果的であり、一方、放射線療法開始後６日目から開始された処置は有益ではなかった（すなわち、Ｑ３ｄ  ｄ６〜２４）。フォローアップ研究は、２５ｍｇ/ｋｇ  ＩＶ  ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）Ｑ３ｄ  ｄ０〜３３を用いて、放射線療法日、または放射線治療中３日毎（すなわち、０、３、６、９日目）に、投与を評価するために実施された。この研究の結果が図２に示されている。照射期間中の３日後との処置が最適であることが見いだされ、これはおそらくＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の薬力学的効果の持続性を反映しており、これらの小型げっ歯類におけるより少ない数のＩＶ注入によってもたらされる注入ストレスの低減に結びつけられる。
【００５２】
ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）はまた、化学療法および／または放射線による損傷への先天性免疫応答である応答と一致して、化学療法誘導性の口腔及び胃腸粘膜炎のマウスモデルにおいて有効性を示した。これらの研究において、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の投与は、マウスでの化学療法誘導性の粘膜炎モデルにおける重篤な口腔粘膜炎の罹患期間の統計学的にな減少と関連付けられた。対照群における軽いＧＩ損傷は、結果を統計的に有意なものとはしなかった一方、大腸炎の減少へと向かう傾向もまた観察された。それぞれの研究において、５−フルオロウラシル（６０ｍｇ/ｋｇ  ＩＰ）がＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスの雄に、−４日目および−２日目に投与された。０日目に、化学熱傷がマウスの舌下に適用され、一般的に２日目にピークとなる粘膜炎を誘導した。マウス舌は、３以上のスコアを重篤粘膜炎として、１日目から１４日目まで毎日の粘膜炎に関するスコアが付けられた。体重がまた毎日測定され、そして大腸炎の重症度が４日目および７日目にビデオ内視鏡検査によって測定された。最初の研究において、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）（２５ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）は、化学療法の直前の−４日目に一度、化学療法の直後の−４日目および−２日目に２度、−１、２、５日目に３度の、いずれかで投与された。粘膜炎損傷のピーク期間にわたる複数機会におけるＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の投与が最も効果的であった（すなわち、−１、２および５日目）。この研究の結果が図４に示されている。２番目の研究において、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）（２５ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）は、−１、２および５日目に、または−１、１および３日目、または０、２、４日目のいずれかで投与された。この研究の結果が図５に示されている。重篤な粘膜炎の罹患期間（図５−パネルＡ）、４日目における大腸炎の重症度（図５−パネルＢ）、および体重減少の平均値（図５−パネルＣ）における統計学的に有意な変化がグループ間で相関付けされた。３番目の研究において、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）、（示されているように、２５または５ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）が、−１、２および５日目、または、１および３日目のいずれかで投与された。再び、３日毎にＲＩＶＰＡ（配列番号：５）を利用する投薬計画が最も効果的であり、ここで服用レベルの減少は効果の減少をもたらした。この研究による粘膜炎、大腸炎、および体重の結果が、それぞれ、図６中のＡ、ＢおよびＣに示されている。統計的有意差が、口腔粘膜炎についてカイ二乗分析を用いて、および体重について順位に基づく分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いた曲線下面積（ＡＵＣ）を用いて評価された。Ｒ（ｔＢｇ）Ｖ１ＫＲ（ｔＢｇ）Ｖ２（配列番号：９１）および９２がまた、化学療法誘導性の粘膜炎のマウスモデルにおいて効果を示しており、ここで粘膜炎のスコアは粘膜炎の誘導後４日間評価された（図１６、図１７）。Ｒ（ｔＢｇ）Ｖ１ＫＲ（ｔＢｇ）Ｖ２（配列番号：９１）及びＲＩＶ（ｍｐ２）Ａ−ＮＨ２（配列番号：９２）を用いた処置は、２５ｍｇ／ｋｇ  ＩＶの用量で、−１日及び２日目に投与された。
【００５３】
放射線損傷への応答における効果
ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）及び他のＩＤＲは、炎症カスケードによって起きる重篤な損傷を低減し、及び疾患の消散を促進して、組織損傷に対する先天性防御応答を調節する。上述のように、ＩＤＲｓは、口腔粘膜炎モデル（図１、図２）において放射線損傷に対する応答を緩和することができる。別のモデルでは、放射線誘導性の粘膜炎（２５Ｇｙが０日目にマウスの鼻に照射された）の予防が評価され、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）（２日毎にＩＶ投与される２５ｍｇ／ｋｇ用量を５回）は、疾患の進行にはなんらの顕著な影響を及ぼさなかった。マウス舌の進行性の薄化は、０、２、４、６、８、１０日目に、単位面積当たりおよび単位長さ当たりの、基底層および基底層上アポトーシス性、有糸分裂期の、および総計の上皮細胞の数の組織病理学的な分析によって評価した。使用される放射線線量（２５Ｇｙ）が、舌上皮の進行性薄化が観察されるが、明白な粘膜炎が発生しないように選択されたことに留意するべきである。この結果は、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の増殖性の欠如を示しており、そしてＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の効果が、関連する経路が明白な組織損傷または病原体の侵入によって刺激された場合にのみ、観測可能であることを示唆している。
【００５４】
消化管における有効性
直接的にＧＩ粘膜表面を保護するための、予防的または治療的に投与された、ＩＶ  ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の能力が、ＤＳＳ誘導大腸炎モデルにおいて確認された。このモデルでは、ＤＳＳが研究の０日目から５日目までにＣ５７ＢＬ/６雄マウスの飲水中での３％ＤＳＳ溶液として投与した。大腸炎は、７、１４および２１日目にビデオ内視鏡検査によりモニターされた。ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）（２５ｍｇ／ｋｇ）が、０日目から１８日目まで３日毎（Ｑ３ｄ  ｄ０〜１８）、３日目から１８日目まで３日毎（Ｑ３ｄ  ｄ３〜１８）、６日目から１８日目まで３日毎（Ｑ３ｄ  ｄ６〜１８）に投与された。この研究の結果を図３に示されている。1４日目までに、すべてのＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の治療レジメンは、内視鏡的な大腸炎の重症度スコアにおいて統計的に有意な減少を示した。しかし、７日目のスコアにおける減少は、その時までにＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の少なくとも２回用量を受けていたグループ（すなわち、Ｑ３ｄ  ｄ６〜１８ではなく、Ｑ３  ｄ０〜１８及びＱ３ｄ  ｄ３〜１８）のみで観察された。２１日目に、すべての３つの処置群は、同様の様式で応答しているように見えた。２１日目の結腸の組織病理学は、いくつかのＲＩＶＰＡ（配列番号：５）処理群では、統計的に有意に減少された浮腫や壊死を有していたが、他のＲＩＶＰＡ（配列番号：５）処理群では類似の応答を有しているものの、統計的な有意差には達しなかったことを示していた。統計分析は、t検定を用いて実施され、アスタリスクは対照からの統計学的に有意な差異（Ｐ＜０．０５）を示す。
【００５５】
上述のように、ＩＤＲｓはまた、化学療法誘導性粘膜炎モデルにおいて胃腸粘膜炎の罹患期間および／または重症度を軽減することができる（図４、図５、図６）。
【００５６】
感染動物における有効性
ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は、さまざまなマウス感染モデルにおいて、抗生物質処置の存在下または非存在下、細菌性負荷を低減し、および生存率を改善し、そしてこの効果は、２５ｍｇ/ｋｇ  ＩＶおよびそれより高い用量レベルで一貫しており、および５日間までの持続的な薬力学的効果である。ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の効果は、通常及び免疫低下マウスの両方において抗生物質処置に対して相補的である。ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の効果は、グラム陽性（黄色ブドウ球菌及びＭＲＳＡ）及びグラム陰性（クレブシエラ、大腸菌及びＢ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）感染によって起きる疾患に対して示された。
【００５７】
黄色ブドウ球菌
ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は、バンコマイシン処置との組み合わせ及び独立した処置の両方で試験された。
【００５８】
ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）処置は、ＭＲＳＡ腹膜感染モデルにおいて、準最適の抗生物質用量のバンコマイシンと組み合わせて投与された場合に、生存率を増加させた（研究番号：Ｄ−７−Ｅ−１１）。ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）（５０ｍｇ／ｋg）または生理食塩水処置が、雌ＣＦ−１マウス（Ｎ＝１０／群）へのＭＲＳＡ（ＵＣ６６８５；８．２×１０７コロニー形成単位［ＣＦＵ］）の接種の４８または７２時間前にＩＶ投与された。バンコマイシン処置（３ｍｇ／ｋｇ）が、感染後１及び５時間目に皮下（ＳＣ）投与された。生存が５日間毎日１回モニターされた。この研究の結果は図７に示されている。
【００５９】
ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は、それ自体で投与された場合も有効であるＲＩＶＰＡ（配列番号：５）のＩＶ投与の複数の研究が、ＭＲＳＡ菌血症モデルで実施された。ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の投与は、免疫応答性Ｂａｌｂ/ｃマウスまたはＴ細胞欠損ｎｕ/ｎｕマウスでのこのモデルにおける用量応答性を示し、5０ｍｇ／ｋｇの単回投与が生理食塩水を用いた対照に対して統計学的に有意な向上された生存率をもたらした。最初の研究では、ＭＲＳＡ（ＵＳＡ３００、７．３ｌｏｇ１０  ＣＦＵ）は、０時間に、雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの尾静脈中にＩＶ注入によって投与された。感染の４時間前に、示された用量レベルの生理食塩水またはＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の単回用量が、尾静脈中にＩＶ注入された。準最適抗生物質治療（リネゾリド、６．２５ｍｇ／ｋｇ）は、感染後直ちに経口的に一回投与された。生存率が、感染後２１日間モニターされた。この研究の結果が図９に示されている。第二の研究において、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）（ＩＶ）または生理食塩水（ＩＶ）は、雌のｎｕ／ｎｕマウスに尾静脈を介して、ＭＲＳＡ（ＵＳＡ３００株、７．０ｌｏｇ１０  ＣＦＵ）による感染の４時間前に一回投与された。図１０に示されるように、生存が１４日間モニターされた。、統計的に有意な差異（すなわち、Ｐ≦０．０５）が、生理食塩水対照群と比較した各処置群の、カプランマイヤー分析を用いた分析として、５０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで見いだされた。
【００６０】
要約すると、様々な黄色ブドウ球菌感染症における独立したＩＶ  ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）処置を用いた研究は、以下を示した。
・ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の効果は、マウスにおいて１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの間で用量依存性であり、２５ｍｇ／ｋｇ以上の用量レベルは一貫した有効性を示した（表２、図９及び図１０）。この用量レベルはまた、損傷モデルにおいて得られるより多くの慢性疾患環境においても有効であった（図１〜図６）。
【００６１】
表２：用量レベルに応じたシングルＩＶ  ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）単回処置を用いた黄色ブドウ球菌感染症の治療成功率
2019142910.tif 000003
・ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の毎日の投与は不要であり、および、１日おき、または２日おきの投与で十分であった。損傷モデルにおいて得られるより慢性の疾患環境において、２日おきの投与が最適であることがさらに確認された（データは示さず）。
・ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は、ＭＲＳＡ菌血症モデルにおいて感染の開始後２４時間までに投与でき、そして依然として、延命効果をもたらすことができる（データは示さず）。したがって、その作用は迅速である。
・用量レベルに依存して、一回量のＲＩＶＰＡ（配列番号：５）を、感染開始の５日前までに投与でき、そして依然として、延命効果をもたらすことができ（データは示さず）、これは、マウス循環からの迅速（数分以内）な薬物動態（ＰＫ）クリアランスにもかかわらず、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の薬力学的影響の持続性を反映している。
・ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）処置によってもたらされる延命効果は、少なくとも２１日間持続され得る（図９）。
【００６２】
ＲＩＶＰＡＹ＊（配列番号：９０）及びＲ（ｔＢｇ）Ｖ１ＫＲ（ｔＢｇ）Ｖ２（試験番号：９１）（感染の４時間前の５ｍｇ／ｋｇ投与）はまた、ＭＲＳＡ菌血症モデルにおける生存率を向上させる（図１８、図１９）。
【００６３】
ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の局部投与はまた、投与が感染部位に局所的である場合、効果的であることが示された。マウスでのグラム陽性腹膜感染モデルにおいて、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は、大幅にログで７倍以上、顕著に細菌負荷を減少させた（試験番号D-7-E-14）。黄色ブドウ球菌（カタログ番号２５９２３、ＡＴＣＣ、６×１０７  ＣＦＵ）の５％ムチンとの腹腔内（ＩＰ）注入が、雌ＣＤ−１マウス（Ｎ＝８/群）にＩＰ投与され、そして、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）（９．５ｍｇ／ｋｇ）が4時間後にＩＰ注入された。マウスは感染後24時間で犠牲死させ、そして腹膜洗浄液が細菌数カウントを評価をされた。この研究の結果は図１１に示されている（各データポイントは、個々のマウスからの結果を表しており、死亡したマウスは、試験で得られたマウスのなかで最も高い細菌数カウントをしめしており、グラフでは白抜きの記号で表わされている）。
【００６４】
ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）はまた、局所的筋肉内（ＩＭ）注入として投与される場合、大腿の黄色ブドウ球菌膿瘍感染モデルでの好中球減少性マウスにおいて細菌負荷を顕著に減少させた。雌スイスアルビノマウス（Ｎ＝８／群）は、黄色ブドウ球菌（カタログ番号２９２１３、ＡＴＣＣ、約９．５×１０５  ＣＦＵ）を用いたＩＭ感染の３日および１日前に、Ｃｐ（１００ｍｇ／ｋｇ）で処置されることにより好中球減少性とされた。ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）（５０ｍｇ／ｋｇ）が感染の２４時間前にＩＭ投与され、バンコマイシン（１００ｍｇ／ｋｇ）が、感染Ｉ、６および１８時間後、ＳＣ投与された。感染された大腿部に存在する細菌数ｃｆｕが、各群において感染の開始後２４時間で評価された。この試験の結果が図１２に示されている。
【００６５】
クレブシエラ属
ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は、全身性（ＩＶ）また局所的（ＩＰ）のどちらかで投与された場合、グラム陰性腹膜感染モデルにおいて生存率を上昇させた。特に、全身性投与は局所投与と同等かより良好であった。ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）処置（２４ｍｇ／ｋｇ）は、肺炎桿菌 （カタログ番号４３８１６、ＡＴＣＣ）を２．８×１０５  ＣＦＵ（図１３  パネルＡ）または５．３×１０２  ＣＦＵ（図１３  パネルＢ）のいずれで播種された雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｎ＝８／群）に対して、ＩＰ（感染の24時間前または感染後4時間）またはＩＶ（感染後4時間）のいずれかで投与され、そして生存が２４時間以上にわたってモニターされた。この状況におけるＲRIVPA（SEQ ID NO.5）の保護効果は、図１３に示されている。生存エンドポイントは、細菌をより多く播種された動物において示されている（パネルＡ）。より低い播種量を受けたすべての動物は、すべてのグループで生存し（パネルＢ）、そして感染後２４時間の臨床徴候（例えば、立毛、運動減少、丸めた腹部）について評価された。これらは臨床スコアとしてまとめられた。
【００６６】
皮膚損傷における有効性
全身性で投与されたＲＩＶＰＡ（配列番号：５）はまた、皮膚損傷及び感染の場合に有効であり、ＭＲＳＡ皮膚感染モデルにおける皮膚治癒を促進する。感染は、各マウスの背側の領域から毛が取り除かれた後、１日で開始された。ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）（２５ｍｇ／ｋｇ  ＩＶまたは１００ｍｇ／ｋｇ  ＳＣ）が感染の４時間前及び示されているように感染後のさまざまな時点で投与された。経口リネゾリドは比較物として使用され、そして１２．５ｍｇ／ｋｇで毎日投与された。１日（−１時間）目に、各マウスはイソフルランを用いて麻酔され、そして剃毛された背部皮膚が７回の連続した外科テープの適用および除去によって損傷された。この病変は、直ちに、１０μＬの細菌懸濁液の局所投与によって、合計でマウス当たり７．６ｌｏｇ１０  ＣＦＵの曝露に付して、感染された。有効性は、細菌への曝露後４８時間（図１４  パネルＡ）及び９６時間（図１４  パネルＢ）での皮膚のパンチ生検材料における細菌負荷の測定によって、及び、感染後４８時間（図１４、パネルＣ）及び９６時間（図１４、パネルＤ）での、盲検の、公認の病理学者による皮膚のデジタル画像の巨視的評価によって評価された。特に、いかなる単離された細菌の局在化（すなわち、皮膚表面上または組織内）は測定されなかったが、リネゾリドもＲＩＶＰＡ（配列番号：５）も、対照群と比較して、４８または９６時間の生検材料において細菌負荷を減少させなかった。それにもかかわらず、創傷治癒が明白に起こった。それぞれの処置群における細菌負荷の平均値が、不等分散を仮定したエクセル上での平均値のｔ−検定比較を使用して、時間が一致している生理食塩水の対照の値と統計学的に比較された。０．０５以下のｐ値を示した比較が、統計学的に有差であると考慮された。
【００６７】
健康な動物における医薬品の安全性保証
でにより、２つのパイロットおよび２つの最終的な反復用量毒性試験が、静脈内（ＩＶ；ゆっくりとしたボーラス投与）への投与経路を用いて、マウス及びカニクイザルでＲＩＶＰＡ（配列番号：５）を用いて行われた。すべての試験は、LAB Research Inc., Canadaで実施された。
【００６８】
非ＧＬＰパイロット毒性試験は、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の単回投与の最大許容用量（ＭＴＤ）が、マウスにおいて、３０〜６０秒にわたってＩＶ注入として投与される場合に、８８ｍｇ／ｋｇ（実際の用量）であることを示した。ヒト以外の霊長類（ＮＨＰ）における非ＧＬＰパイロット試験においては、軽度の臨床徴候（浅呼吸/努力性呼吸、活動性の低下、部分的に閉じた目、および筋肉のけいれん）が、９０ｍｇ／ｋｇ（1匹の動物）、１８０ｍｇ／ｋｇ（両方の動物）のＲＩＶＰＡ（配列番号：５）投与後の1匹または両方に、および２２０ｍｇ／ｋｇ（1匹の動物）の投与中または投与後直ちに、に観察された。
【００６９】
ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の複数の毎日の注入の安全性が、マウス及びカニクイザルにおけるGLP研究において評価された。マウスでは、１日当たり、２０、６０、９０ｍｇ／ｋｇの用量が１４日間ＩＶで投与された。死亡例は、高用量で観察され、その前には主として努力性呼吸および横臥位が観察されていた。致死性が、６０ｍｇ／ｋｇを与えられた１匹の動物で観察されたが、他の動物はこの用量では臨床徴候を示さなかった。試験物に関連した死または臨床徴候は、２０ｍｇ／ｋｇでは観察されなかった。すべてのグループの生存動物において、いかなる器官における毒性の症候も、また異常な生化学もしくは血液学の証拠も見られなかった。14日間の２０ｍｇ／ｋｇではなんらの副作用も観察されなかった。
【００７０】
２０、８０、１６０ｍｇ／ｋｇ／日のＲＩＶＰＡ（配列番号：５）が、１４日間、カニクイザルにＩＶ投与された。一時的な活動の低下および部分的な閉眼が、１６０ｍｇ／ｋｇでの投与のあいだおよび直後、大部分の動物において３日間、そしてその後、残りの投与期間を通じて散発的に観察された。すべてのケースにおいて、これらの臨床徴候は数分以内に消散した。いかなる組織においても他の測定パラメータについてまたは微視的に有害な効果は見られなかった。ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の２０及び８０ｍｇ／ｋｇ／日の用量での投与は、いかなる毒性の証拠ももたらさなかった。本研究においては、８０ｍｇ／ｋｇ／日の用量レベルが、無毒性量（ＮＯＡＥＬ）であると考慮された。
【００７１】
ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の影響は、いずれの研究においても、どの用量レベルでも、中枢神経系（ＣＮＳ）においては観察されず、および、放射標識ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は、２０または９０ｍｇ／ｋｇのどちらの用量レベルでもマウスのＣＮＳ中にほとんど観察されなかった。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）と一連のＣＮＳ受容体およびイオンチャネルとのあいだの相互作用は検出されなかった。
【００７２】
２０または８０ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ用量を使用した、カニクイザルにおける心血管（ＣＶ）／肺試験は、いかなる心血管への影響または心電図（ＥＣＧ）パラメータにおける変化も示さなかった。２０または８０ｍｇ／ｋｇの用量では呼吸作用への影響は観察されなかった。本試験における８０ｍｇ／ｋｇの用量において、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は、投与中の一過性のまぶたの垂下および虚脱状況に関連付けられた。２２０ｍｇ／ｋｇでは、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の投与は、例えばまぶたの垂下、震え、虚脱、蒼白、痙攣、および卒倒などの一過性の重篤な臨床徴候と関連付けられた。１匹の動物においては、高用量は呼吸速度の著しい低下をもたらし、続いて徐脈、低血圧および死に至った。
【００７３】
総体的には、一過性の臨床徴候がただ一件の試験にのみに限定され、そしてこの用量レベルでの薬剤の９８件の投与のうち２例のみに発生したため、カニクイザルの場合ＮＯＡＥＬは８０ｍｇ／ｋｇ／日であると考慮される。
【００７４】
ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）を用いての、発癌性、変異原性、生殖毒性試験は実施されなかった。
【００７５】
ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の先天的防御システムへの効果は、高度に選択的である。これらの発見に一致して、マウスおよびＮＨＰの１４日間毒性試験のあいだ、免疫関連の臓器重量、組織病理学、血液学、および臨床化学には、変化は認められなかった。後者の研究では、ＮＨＰへの静脈内ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）投与の14日後、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはＮＫ細胞の数に対するなんらの影響も観察されなかった。ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、マウスまたはヒトの正常血液細胞、または、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける原発性ヒト白血病細胞の増殖を促進しなかった。まとめると、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）が免疫毒性または非特異的免疫活性化を起こす可能性についてのなんらの兆候も存在しない。適応免疫応答の過剰活性化もしくは抑制、または適応免疫性に関連付けられる細胞の表現型における他の影響は、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の投与後には検出されなかった。
【００７６】
要約すると、主要な毒性学的所見は、努力性呼吸、横臥、および一過性の活動の低下を伴う急性発症呼吸抑制である。最も深刻な場合、急性毒性は死をもたらした。臨床徴候はすべて可逆的であって、投与が中止されると動物は、臨床症状または毒性学的所見のその後の有害な二次的結果なしに、数分内に回復することが観察された。ヒト以外の霊長類における心血管系／肺の安全性薬理試験により、心毒性またはＱＴ延長が発生しないことが確認された。
【００７７】
観察された呼吸抑制は、異なる種においては異なる用量レベルで発生し、そして相対尺度によって予測されなかった。具体的には、マウスが急性毒性に最も感応性である種であるようであり、６０ｍｇ／ｋｇ（ＨＥＤ：約５ｍｇ／ｋｇ）で稀に発生し、および９０ｍｇ／ｋｇ（ＨＥＤ：約７ｍｇ／ｋｇ）で一般的に発生した。これとは対照的に、ＮＨＰ（カニクイザル）では、急性毒性は、１６０ｍｇ／ｋｇ（ＨＥＤ：約５０ｍｇ／ｋｇ）で時折発生し、および２４０ｍｇ／ｋｇ（約７８ｍｇ／ｋｇ）では常に発生した。ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）類似体を用いたマウス急性毒性試験におけるさらなる試験は、毒性は特定の構造（アミノ酸配列）または標的タンパク質の分子との結合状態ではなく、電荷に関係していることを示しており、これは、急性毒性が非比例的とは対照的に血液量とともに変化する荷電分子の瞬間的に高い濃度に起因することを示唆している。さらに、マウスにおける機構的試験は、呼吸抑制が横隔神経の変化された活性に起因することを示した。
【００７８】
白血球減少および／または感染に関する医薬品の安全性保証
非GLＰ薬理試験において、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は、ＣＤ−１マウスにおける白血球減少の誘導後の血液細胞集団の循環の回復を変化させなかった。白血球減少は、２回のＣｐのＩＰ注入（1日目における１５０ｍｇ／ｋｇ及び４日目における１００ｍｇ／ｋｇ）によって誘導され、４日目までに良好に確立された白血球減少症をもたらし、これは約１０日目まで持続した。生理食塩水またはＲＩＶＰＡ（配列番号：５）（２０または５０ｍｇ／ｋｇ）が、５、７、９および１１日目にＩＶ投与された。１グループ当たり６匹の動物が、６、８、１０、１２、および１４日目のそれぞれに犠牲死され、そして、全血球数および差分が評価された。溶媒対照群と比較した場合、全白血球及び分画白血球数のレベルまたはダイナミクスのどちらも、回復の過程のあいだに変化はなかった（図１５）。
【００７９】
白血球減少症の動物における感染試験は、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の抗菌効果の干渉を示さなかった。
【００８０】
ＣＹＰ４５０酵素によるＲＩＶＰＡ（配列番号：５）プロセッシングの不全またはその阻害、身体組織全体を通じたプロテアーゼによるＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の一次代謝およびＲＩＶＰＡ（配列番号：５）のクリアランスにおいて尿、糞および胆汁によって行われる非常に小さな役割は、薬物動態学的な薬物−薬物相互作用が最小であろうことを示唆している。
【００８１】
iv.  臨床治験 
ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）を用いた臨床治験は、フェーズ１試験で得られた。本試験の主な目的は、健康なボランティアにおける、ＩＶ投与後の、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）注入可能溶液の単回および反復投与用量漸増用法におけるＩＶ用量の最大耐量（ＭＴＤ）を決定することであった。本試験の第２の目的は、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の単一および反復漸増投与後のＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の用量制限毒性（ＤＬＴ）、安全性、ＰＫおよび薬力学（ＰＤ）プロファイルのの評価が含んでいた。試験は、２つのフェーズに分割された：単回投与用量漸増試験（ＳＡＤ）フェーズおよび反復投与用量漸増試験（ＭＡＤ）。
【００８２】
人間への安全性 
ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の単回ＩＶ用量は、最大試験値（８ｍｇ／ｋｇ）まで良好な耐容性を示し、そして毎日のＩＶ用量は最大試験値（６．５ｍｇ／ｋｇ、７日間）まで良好な耐容性を示した。用量制限毒性（ＤＬＴ）は存在せず、そして、いずれの治験のフェーズにおいてもＭＴＤには達しなかった。試験中、死亡例はなく、臨床的に、顕著な、重篤な、深刻な有害事象（ＡＥｓ）の報告はなかった。安全性の懸念、または平均値もしくはベースラインからの変化における有意な差異は、薬剤処置群およびプラセボ対照被験者のあいだでのバイタルサイン測定、臨床検査結果または心電図（ＥＣＧ）結果について認められなかった。
【００８３】
単回投与用量漸増漸増試験フェーズ：
ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）を受けた被験者におけるＴＥＡＥの発生率は、用量応答性でなく、および事象は、プラセボを受けた被験者と比較してＲＩＶＰＡ（配列番号：５）をうけた被験者に臨床的に有意に高い割合でも発生しなかった。最も頻繁に報告されたＴＥＡＥｓ（ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）を受けた複数の被験者で観察され、プラセボ被験者よりも高い割合（％）で観察されたる）は、例えば血管穿刺部位血腫、血管穿刺部位反応および血管穿刺部位の痛みなどの、試験処置手順に関連した事象（全身障害および投与局所様態）であった。すべての血管穿刺に関連する事象は軽度であり、ＱＩによる治療処置には無関係であることが判明した。２番目に頻繁に報告されたＴＥＡＥｓは、神経系障害であり、具体的には頭痛およびめまいであったが、これらの事象は軽度から中度にすぎなかった。他のすべてのＴＥＡＥｓは、全ての試験された用量レベル（最大３用量レベル）において１人の被験者によってのみ報告された。ＴＥＡＥｓの特性または期間における臨床的に顕著な傾向は、任意の研究コホートにおいて示されなかった。
【００８４】
反復投与用量漸増試験フェーズ：
ＴＥＡＥｓの最も高い発生率は、（４．５及び６．５ｍｇ／ｋｇ／日）で観察された。2つの最高用量レベルにおいても、「関連している可能性のある」事象の発生率はまた、２つの最高用量レベルにおいて高かった。しかし、サンプルサイズの小ささ（それぞれのコホートにおいて４被験者が動的治療を受けた）のため、結果が間違いなく用量応答性を表すかどうかを結論付けることはできなかった。ＴＥＡＥｓの大部分は治験処置に関連せず、および重症度において軽微であり、１件の事象のみが中程度と報告された。ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）を受けた被験者において最も頻繁に報告されたＴＥＡＥｓは、例えば血管穿刺部位血腫、血管穿刺部位反応および血管穿刺部位の痛みなどの、全身障害及び投与局所様態（すなわち、手順に関連した事象）であった。すべての血管穿刺に関連する事象は軽度であり、治療処置には無関係であることが判明した。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の増加及び背部痛が、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）を受けた３人の被験者（１５．０％）によって報告され、そしてこれらの事象は、プラセボを受けた被験者では唯１人の被験者（１０．０％）によってのみ観察された。
【００８５】
ヒトにおける薬物動態
ヒト被験者への静脈内投与後、および動物試験における発見と一致して、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は数分以内に循環から除去された。健康なボランティアによるフェーズ１試験の単回投与量試験フェーズにおいて、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は、迅速に除去され、４分間のＩＶ注入の開始後９分以内に血漿レベルは最大濃度（Ｃｍａｘ）の１０％未満までに減少した。急速な低下に続き、より遅い排出フェーズが観察された。最大濃度の平均時間（Ｔｍａｘ）は、０．１５ｍｇ／ｋｇから８ｍｇ／ｋｇの範囲の用量の注入の開始後、約４分〜約４．８分の間であった。最大血漿濃度及び総曝露レベルは、用量比例性であり、および循環からのＲＩＶＰＡ（配列番号：５）のクリアランスは迅速であって、マウスおよびＮＨＰの実験と一致していた。
【００８６】
高いクリアランスおよび短い排出半減期に照らして、毎日の注入後の蓄積の発生は予想されなかった。反復投与用量試験のフェーズ１試験において、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は、７日間毎日投与され、そして５、６、７日、そして８日目（７日目の投与開始から２４時間後）における投与前の測定濃度は、すべての被験者の定量下限（ＬＬＯＱ）未満であった。
【００８７】
ヒトにおける薬力学
フェーズ１のあいだに健康なヒトボランティア試験から得られた血液サンプルを用いたｅｘ  ｖｉｖｏ研究において、いくつかのサイトカイン及びケモカイン分析物が、全血のＬＰＳを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激の４時間後に定量された。分析物のレベルにおける個体間変動は、時間における、またはＲＩＶＰＡ（配列番号：５）もしくはプラセボの投与に対する応答におけるいかなる変動よりも大きく、したがってデータは、個々の被験者それぞれの全ての応答を標準化するために、個々の投与前の分析物レベルを使用して自己正規化された（アクティビティー率）。ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の分析物アクティビティー比率（ＡＲｓ）に及ぼす影響は、時間を通じて一定でなく、また、線形な用量応答性でもなかった。それにもかかわらず、０．１５〜２ｍｇ／ｋｇの用量範囲において、「抗炎症状態」（すなわち、各個体からの血液のＬＰＳ刺激後の、より低いＴＮＦαおよびＩＬ−１βレベルを伴った、より高い抗炎症性ＴＮＦ  ＲIIおよびＩＬ−１ｒａレベル）の増加の証拠が見られた。
【００８８】
ｂ.ＩＤＲ注入の科学的根拠 
粘膜炎
粘膜炎は先天性防御系の異常調節にリンクされており、粘膜内層にさらに損傷を与え、および明白な粘膜炎をもたらす一連の炎症作用を引き起こす（Sonis, 2004）。具体的には、化学療法または放射線治療は基底にある内皮及び上皮への損傷を誘起する一方、結果として生じる「ＤＡＭＰＳ」に対する先天性防御システムの応答は、この損傷を悪化させる炎症カスケードをもたらす。深刻な口腔粘膜炎に罹りやすい動物およびヒトにおける遺伝子発現を評価している最近の研究は、疾患における先天性防御システムの役割を支持した（Sonis, 2010）。さらに、下部消化管の粘膜炎がまた、同様の機構に起因していた（Bowen, 2008）。
【００８９】
急性放射線症候群
急性放射線被曝は、上皮（皮膚）、骨髄（造血症候群）および消化管（GI）への損傷に関係付けられる。さらに、放射線被曝が増大するにつれ、死亡率は急激に増加し、治療学的介入の可能性を制限する。急性放射線曝露後の早期死亡率（＜２週間）は、胃腸管への損傷に関連付けられる。急性放射線はリーベルキューン腺小窩の底部内の幹細胞への直接的な損傷を引き起こし、アポトーシス機構を介して、有糸分裂停止および死をもたらす（Potten, 1997a、Potten, 1997b）。この損傷の回復および／または長期の二次的結果は、ＧＩの微生物叢及び先天性免疫修復応答の両方に関連されることが示されている（Crawford, 2005、Garg, 2010）。正常及び癌化組織の放射線生物学における進行中の研究は、放射線への先天性免疫システムの応答に顕著な役割を示した（Schaue and McBride, 2010、Lauber, 2012、Burnette, 2012）。さらに、先天性の防御システムを標的とするアゴニスト（すなわち、ＴＬＲ−９アゴニスト）は、ＧＩ  ＡＲＳの設定で放射線防護性であることが示されている（Saha, 2012）。
【００９０】
放射線による腫瘍治療の結果としての口腔及びGI粘膜炎は、ＡＲＳのＧＩコンポーネントに関する適切な代理として機能する。ＩＤＲの機能および粘膜炎における先天性防御の役割と一致して、ＩＤＲの有効性が多様な粘膜損傷モデルで実証されている。具体的には、化学療法および放射線誘導性の口腔及び胃腸粘膜炎の両方における研究が、ＩＤＲが粘膜炎のピーク強度および罹患期間を減少させ得ること、重篤な粘膜炎の罹患期間において約50％の減少をもたらしたことを明らかにした（図１、図２、図４、図５、図６、図７、図８、図１６、図１７）。
【００９１】
また、ＩＤＲの宿主先天性免疫への影響と一致して、感染モデルにおける効果が、グラム陰性およびグラム陽性の両方の細菌性病原体を用いて、免疫応答性（例えば、図９）および易感染性（白血球減少またはＴ細胞欠損）マウスの両方において示された（図９、図１０、図１８、図１９）。
【００９２】
ＩＤＲは全身性で投与され、そして粘膜表面（例えば、口腔粘膜、直腸［図３］）および肌に影響を与え、ならびに、全身性（図７、図８、図９および図１０）及び局所性の感染の両方に効果的である。
【００９３】
要約すると、ＩＤＲｓは損傷に対する先天性防御反応を調節する（図１〜図８、図１６、図１７）。特には、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は、放射線によって生じる損傷を緩和し（図１、図２）、および化学療法に応答して胃腸管で観察される毛顕著な保護効果を伴って、全身的に活性である（図３、図４、図５、図６）。さらに、ＩＤＲｓは、免疫応答性および白血球減少性の動物の両方において有効であり、これは、ＡＲＳのＧＩコンポーネントに付随して発こる造血性の影響が、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の有効性を損なわせないであろうことを示唆している。その抗感染薬としての役割によって、ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）はまた、ＡＲＳの造血亜症候群においても有効であり得るが、このための唯一の直接的な評価は準最適な腹腔内投与を利用するものであった。ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は、薬物動態学的に併用療法と干渉するとは予想されず、そして、主要な種類の抗生物質との干渉を示さなかった（データは示さず）。ＲＩＶＰＡ（配列番号：５）は、白血球減少症からの回復を妨げない（図１５）。ヒトボランティアの試験において示されているＲＩＶＰＡ（配列番号：５）の安全性（上記４.ａ.ｉｖ項参照）と組み合わせて、これらの試験は、急性放射線被曝に対するＲＩＶＰＡ（配列番号：５）及び他のＩＤＲｓ処置の、急性死亡率を減少させるための使用を強く支持している。
【００９４】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年5月9日(2019.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有害量の放射又は化学療法剤に暴露された個体の口腔粘膜炎の発生率、重症度及び／又は罹患期間を減じるために処置する方法であって、有効量の以下：
ａ）７個のアミノ酸までのアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｐであるアミノ酸配列（配列番号：５６）を含み、ここで、
Ｘ１は、Ｒであり、
Ｘ２は、ＩまたはＶであって、ここでＸ２はＮ−メチル化されていてもよい、
Ｘ３は、ＩまたはＶであって、ここでＸ３はＮ−メチル化されていてもよい、
Ｐは、プロリンであり、
配列番号：５６は、前記ペプチドのＮ末端における最初の４個のアミノ酸であるペプチド、またはその薬学的な塩、エステルもしくはそのアミド、および、
薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤、
または、
ｂ）配列番号：５、７、１０、１４、１７、１８、２２、２３、２４、２７、２８、３１、３４、３５、６３、６４、６６〜６９、７２、７６、７７、９０及び９１で示されるアミノ酸配列のいずれかを含むペプチド、またはその薬学的な塩、エステルもしくはアミド、ならびに、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤
を個体に投与する工程を含む方法。
【請求項２】
前記ペプチドの有効量が少なくとも１．５ｍｇ／ｋｇである請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ペプチドが、経口的に、皮下に、筋肉内に、静脈内に、経皮的に、鼻腔内に、肺投与により、または浸透圧ポンプにより、投与される請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチドが、放射線または化学療法薬剤の投与中３日目毎に個体に投与される請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドが有効量の抗生物質との組み合わせで投与される請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
個体における疾患の発生率、重症度及び／又は罹患期間を減じるための組成物であって、該病気は粘膜炎及び大腸炎からなる群より選択される疾患、または急性放射線への曝露であり、有効量の以下：
ａ）７個のアミノ酸までのアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｐであるアミノ酸配列（配列番号：５６）を含み、ここで、
Ｘ１は、Ｒであり、
Ｘ２は、ＩまたはＶであって、ここでＸ２はＮ−メチル化されていてもよい、
Ｘ３は、ＩまたはＶであって、ここでＸ３はＮ−メチル化されていてもよい、
Ｐは、プロリンであり、
配列番号：５６は、前記ペプチドのＮ末端における最初の４個のアミノ酸であるペプチド、またはその薬学的な塩、エステルもしくはそのアミド、および、
薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤、
または、
ｂ）配列番号：５、７、１０、１４、１７、１８、２２、２３、２４、２７、２８、３１、３４、３５、６３、６４、６６〜６９、７２、７６、７７、９０及び９１で示されるアミノ酸配列のいずれかを含むペプチド、またはその薬学的な塩、エステルもしくはアミド、ならびに、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤
を含む組成物。
【請求項７】
前記ペプチドの有効量が少なくとも１．５ｍｇ／ｋｇである請求項６記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、経口的に、皮下に、筋肉内に、静脈内に、経皮的に、鼻腔内に、肺投与により、または浸透圧ポンプにより、投与される請求項６又は７記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、放射線または化学療法薬剤の投与中３日目毎に個体に投与される請求項６〜８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が有効量の抗生物質をさらに含む請求項６〜９のいずれか１項記載の組成物。
【外国語明細書】
2019142910000001.pdf