(57)【要約】【課題】細胞と培地成分と有用物質の混合物（細胞培養物）から、単一のプロセスによって前二者を回収するための手段および方法を提供すること。【解決手段】刺激応答性高分子によって修飾されたポリペプチドであって、前記刺激応答性高分子が、刺激に応答して前記修飾ポリペプチドの全体としての物性の変化を誘起するものであり、前記変化が可逆的または擬可逆的であることを特徴とする修飾ポリペプチド。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
刺激応答性高分子によって修飾されたポリペプチドであって、
前記刺激応答性高分子が、刺激に応答して前記修飾ポリペプチドの全体としての物性の変化を誘起するものであり、
前記変化が可逆的または擬可逆的であることを特徴とする修飾ポリペプチド。
【請求項２】
前記物性の変化が分子量または見かけの分子量の変化である、請求項１に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項３】
前記修飾ポリペプチドの全体としての見かけの分子量が、前記刺激の存在下および不在下において10％以上変化する、請求項２に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項４】
前記刺激応答性高分子が、生理学的条件内における温度変化、pH変化、イオン濃度変化およびジオール濃度変化からなる群より選択される少なくとも1つの刺激に対して応答するものである、請求項１に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項５】
前記刺激が4℃〜42℃の範囲内における温度変化を含む、請求項４に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項６】
前記刺激応答性高分子が、ポリアクリルアミド誘導体、ポリプロピレングリコール誘導体、ポリメタクリレート誘導体、ポリビニルエーテル誘導体、ポリビニルアミン誘導体、ポリオキサゾリン誘導体、ポリサッカライド誘導体、ポリペプチド、およびポリペプチド誘導体からなる群より選択される少なくとも1つの高分子である、請求項１に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項７】
前記刺激応答性高分子が、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)またはその誘導体である、請求項１に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、成長因子、増殖因子、造血因子、骨形成因子および血液タンパク質からなる群より選択される少なくとも1種のポリペプチドである、請求項１に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、インスリン、トランスフェリン、上皮成長因子（EGF）、インスリン様成長因子（IGF）、トランスフォーミング成長因子（TGF）、神経成長因子（NGF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、血小板由来成長因子（PDGF）、エリスロポエチン（EPO）、トロンボポエチン（TPO）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、肝細胞増殖因子（HGF）、トランスフォーミング増殖因子（TGF）、骨形成タンパク質（BMP）、神経栄養因子（BDNFもしくはNGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、およびウシ血清アルブミン（BSA）からなる群より選択される少なくとも1種のポリペプチドである、請求項１に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項１０】
前記刺激応答性高分子が、前記ポリペプチドのリシン残基中のアミノ基もしくはシステイン残基中のチオール基と直接、または前記ポリペプチドとリンカーを介して結合している、請求項１に記載の修飾ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の刺激応答性高分子によって修飾されたポリペプチドを含む培養培地において、前記刺激の存在下または不在下で、有用物質を産生する細胞を培養する工程、
前記刺激の不在下または存在下で細胞培養物を半透膜を用いて処理し、前記細胞および前記修飾ポリペプチドを前記有用物質から分離する工程
を含む、細胞において有用物質を製造する方法。
【請求項１２】
前記分離された細胞および修飾ポリペプチドを前記培養培地に添加し、前記細胞を培養する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記有用物質が、IgG、IgA、IgMおよびIgEからなる群より選択される少なくとも1つを含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養において再利用容易な培地成分に関する。より具体的には、培地成分として利用可能な修飾されたポリペプチド、およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、動物細胞、植物細胞、微生物細胞などの細胞を所定の培地で培養することによって有用物質を産生し回収する様々な細胞培養方法が知られている。中でも、連続培養法は回分培養法や流加培養法と異なり、培養工程と並行して有用物質の回収工程を連続的に行うことができる利点がある。このような連続培養法は、培地の単位体積当たりの細胞密度を高く設定することによって有用物質の生産性の向上を図ることができる。
【０００３】
従来、連続培養法においては、培養槽内の細胞密度を高く維持するために、培養槽から有用物質とともに抜き出された液体培地に含まれる細胞を培養槽に返送する技術が知られている（特許文献１）。しかし、従来の連続培養法では、抜き出される液体培地量に応じて培養槽に新たに液体培地を追加投入する必要がある。
【０００４】
一方、細胞を除去した培養液から有用物質を取り除いた精製廃液から老廃物等が含まれる低分子量画分を取り除いた高分子量画分を培養槽に戻すことで培地の使用量を低減する技術（特許文献２）が開発されている。しかし、有用物質のカラム精製後にさらに分画処理を行うことから、プロセスが複雑になるという課題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１６−５４６８６号公報
【特許文献２】特開２０１０−５１１７３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明は、細胞と培地成分と有用物質の混合物（細胞培養物）から、単一のプロセスによって前二者を回収するための手段および方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため本発明者が鋭意検討を行った結果、培養槽より抜き出された液体培地から回収し培養槽に戻す目的の培地成分に刺激応答性高分子を導入することによって、上記課題を解決できることを見出した。具体的には、刺激応答性高分子によって修飾された培地成分は、培養条件下では無修飾の培地成分と同等に振る舞う一方で、刺激を印加した回収条件では刺激応答性高分子に由来する特徴的な物性を示すようになる。細胞、刺激印加状態での培地成分、有用物質、が混合した状態から、細胞と刺激応答状態での培地成分を回収可能な分離機構を用いることで、1ステップの簡便なプロセスにて有用物質を取得した上で、細胞と培地成分を培養槽に戻すことができる。
【０００８】
したがって、本発明は以下を包含する：
（１）刺激応答性高分子によって修飾されたポリペプチドであって、
前記刺激応答性高分子が、刺激に応答して前記修飾ポリペプチドの全体としての物性の変化を誘起するものであり、
前記変化が可逆的または擬可逆的であることを特徴とする修飾ポリペプチド。
【０００９】
（２）（１）の刺激応答性高分子によって修飾されたポリペプチドを含む培養培地において、前記刺激の存在下または不在下で、有用物質を産生する細胞を培養する工程、
前記刺激の不在下または存在下で細胞培養物を半透膜を用いて処理し、前記細胞および前記修飾ポリペプチドを前記有用物質から分離する工程
を含む、細胞において有用物質を製造する方法。
【００１０】
（３）（１）に記載の刺激応答性高分子によって修飾されたポリペプチドを含むことを特徴とする細胞培養試薬。
【００１１】
（４）（１）の刺激応答性高分子によって修飾されたポリペプチドを含む培養培地を用いて、前記刺激の存在下または不在下で細胞を培養する工程を含む、細胞培養方法。
【００１２】
（５）（１）の刺激応答性高分子によって修飾されたポリペプチド、細胞、および前記細胞の少なくとも1種の分泌物を含む細胞培養物を半透膜を用いて処理する工程を含む、細胞培養物の処理方法。
【００１３】
（６）（１）の刺激応答性高分子によって修飾されたポリペプチドおよび細胞を含む培養培地を入れる培養槽と、
半透膜を備えた分離デバイスと、
前記刺激を印加するデバイスと
を備えることを特徴とする細胞培養装置。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、細胞培養に使用する培地成分を簡便に回収し再利用することが可能である。そのため、細胞培養により得られる有用物質の製造コストを低減し、製造プロセスを簡便化することができる。よって、本発明は、細胞培養、細胞を利用した有用物質の製造、医薬品製造などの分野に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】半透膜を用いた培地成分の分離を説明する模式図である。
【図２】高分子で修飾された培地成分の半透膜を用いた分離を説明する模式図である。
【図３】培養条件および回収条件における、刺激応答性高分子で修飾された培地成分の変化を説明する模式図である。
【図４】連続培養装置の構成例を示す模式図である。
【図５】半透膜の孔径と、温度応答性高分子で修飾したインスリンおよび有用物質（IgG）の透過性の検討結果を示すグラフである。
【図６】インスリンと刺激応答性高分子で修飾されたインスリンの細胞増殖に対する効果の比較を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、図面等を用いて、本発明の実施形態について説明する。以下の説明は本発明の内容の具体例を示すものであり、本発明がこれらの説明に限定されるものではなく、本明細書に開示される技術的思想の範囲内において当業者による様々な変更および修正が可能である。
【００１７】
本発明は、細胞培養の際に、培地に添加される培地成分（ポリペプチド）を簡便かつ低コストで回収するため、培地成分を刺激応答性高分子で修飾する。これにより、刺激の存在下または不存在下で、可逆的または擬可逆的に培地成分の全体の物性（例えば見かけの分子量）が変化するため、培養条件と回収条件で刺激の印加を変更することにより、変化した物性に基づいて簡便かつ低コストに培地成分を回収することが可能となる。
【００１８】
有用物質を生産するために細胞を培養する際、液体培地に培地成分（ポリペプチド）が添加される。細胞は一般にサイズが数μm程度の粒子状であり、培養槽から抜き出した液体培地中では分散した状態となるが、培地成分も有用物質も液体培地中に溶解した状態である。分散状態の成分と溶解状態の成分の分離は、濾過のような手法を用いることで容易に達成できるが、複数種の溶解状態の成分の分離は、その分子量や物性の差を用いることとなる。もし有用物質の分子量が培地成分よりも十分に小さい場合（例えば有用物質が低分子ペプチドの場合やステロイド類のような二次代謝物の場合）には、分画分子量が有用物質と培地成分の間である半透膜を用いた透析によって容易に有用物質のみ分離可能である（図１のＡ）。しかし、そうでない場合（すなわち、図１のＢに示すように、有用物質の方が培地成分よりも大きい場合）には、そのような単純な手法は適用できない。
【００１９】
有用物質の分子量が培地成分よりも大きい場合、例えばその培地成分をベース化合物としてポリエチレングリコール（PEG）のような細胞毒性の低い高分子によって修飾することで分子量を増大して有用物質の分子量よりも大きくすることは技術的に可能である。しかし、高分子量の化合物で修飾することで、ベース化合物である培地成分の活性サイトがブロックされること、動態が変化すること、などの影響による活性低下が考えられるため、一般的に適用可能な方法論ではない（図２）。
【００２０】
これに対し、本発明では、上述のような培地成分（ベース化合物）の活性低下を抑制可能な方法論を提供する。本発明の特徴は、刺激応答性高分子によってベース化合物を修飾することである。すなわち、培養条件では刺激応答性高分子は活性に対する影響が小さい状態を取り、回収条件では刺激応答性高分子は有用物質との分離に利用可能な程度の特徴的な物性を発現する状態を取る、という刺激応答性を実現することで、課題を解決することができる。
【００２１】
したがって、一態様において、刺激応答性高分子によって修飾されたポリペプチドであって、
前記刺激応答性高分子が、刺激に応答して前記修飾ポリペプチドの全体としての物性の変化を誘起するものであり、
前記変化が可逆的または擬可逆的であることを特徴とする修飾ポリペプチドを提供する。
【００２２】
修飾対象の培地成分（ポリペプチド）は、刺激の有無に応じて変化する性質を利用して回収することが望まれる成分であれば特に限定されるものではなく、好ましくは細胞培養培地に添加される成分である。具体的には、刺激応答性高分子によって修飾されても活性が発現する成分を、修飾する成分、すなわちベース化合物とする。細胞内に取り込まれた上で活性が発現する成分の場合、刺激応答性高分子によって修飾されることで細胞膜透過性や動態が変化する可能性があるが、その影響が十分に小さい場合には、ベース化合物として適している。
【００２３】
ベース化合物として高分子化合物を使用することが好ましい。これは、低分子化合物が高分子によって修飾された際の影響は、高分子化合物が高分子によって修飾された際の影響よりも、相対的に大きいためである。このような影響の現れ方は修飾する高分子と修飾される化合物との関係に依存するため、限定されるものではないが、ベース化合物としては、培地中の高分子成分が最も適している。
【００２４】
したがって、本発明において使用するベース化合物は、ペプチドまたはタンパク質であることが好ましい。具体的には、ベース化合物としては、例えば細胞の膜タンパク質と結合してシグナルを与えることで細胞の増殖や有用物質の産生促進を促す因子である。このような因子としては、例えば成長因子であるインスリンやトランスフェリン、増殖因子、造血因子、骨形成因子、血液タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
上述したインスリン、トランスフェリンに加え、本発明を適用できるベース化合物としては、上皮成長因子（EGF）、インスリン様成長因子（IGF）、トランスフォーミング成長因子（TGF）、神経成長因子（NGF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、血小板由来成長因子（PDGF）、エリスロポエチン（EPO）、トロンボポエチン（TPO）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、肝細胞増殖因子（HGF）、トランスフォーミング増殖因子（TGF）、骨形成タンパク質（BMP）、ニューロトロフィン［神経栄養因子］（BDNF、NGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、ウシ血清アルブミン（BSA）なども挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
本発明で提供する刺激応答性高分子によって修飾された培地成分（以下、修飾タンパク質ともいう）は、細胞、修飾タンパク質、有用物質、の混合物（細胞培養物）から、1ステップのプロセスにて前二者を回収するために必要な機能を有する。
【００２７】
本発明において、刺激応答性高分子とは、刺激に応答して物性（好ましくは分子量または見かけの分子量）の変化を誘起することができる高分子であり、この変化が可逆的または擬可逆的であるものである。刺激応答性高分子による修飾によって、刺激の存在下または不在下において刺激応答性高分子で修飾されたポリペプチドの全体としての物性の変化が誘起される。
【００２８】
具体的な実施形態において、変化する物性は分子量または見かけの分子量である。例えば、培地成分の回収を制御する場合、少なくとも回収条件において修飾されたポリペプチド全体としての分子量または見かけの分子量が、分離対象である有用物質よりも大きくなり、透過性が有用物質より低い状態となるようにする。半透膜の分画分子量は、実際の分子量ではなく、溶媒和された分子の見かけの分子量（運動性と相関）によって決定される。そのため、本発明では、刺激に応答して見かけの分子量の変化を誘起できる高分子を刺激応答性高分子として使用することができる。
【００２９】
刺激応答性高分子の刺激は、細胞の培養時および培養成分の回収時に印加を制御することができる刺激であれば特に限定されるものではない。例えば、そのような刺激としては、生理学的条件内における温度変化（例として、4℃〜42℃の範囲内における温度変化）、pH変化、イオン濃度変化、ジオール濃度変化などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００３０】
一例として、刺激応答性高分子として温度応答性高分子を用いることができる。この場合、温度応答性高分子はいわゆるLCST型（下限臨界溶解温度型）の高分子であって、培養条件である37℃において脱水和して収縮した状態となり、液体培地が培養槽から取り出されて室温に低下する回収条件において水和して見かけの分子量が増加した状態となる、という応答性を用いる（図３）。培養条件では刺激応答性高分子が収縮した状態であるためベース化合物に対する影響が少なく、回収条件では刺激応答性高分子が溶媒和して見かけの分子量が増加することで、有用物質は半透膜を通過するが修飾タンパク質は半透膜を通過しないという組合せを実現することができる。細胞が半透膜を通過することはないため、このような組合せを実現できれば、半透膜を用いて細胞と修飾タンパク質（すなわち培地成分）を有用物質などと簡単に分離することが可能である。
【００３１】
このような用途に用いることのできる温度応答性高分子は、LCSTが室温と37℃の間にある高分子であり、例えばポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)（PNIPAM）等のポリアクリルアミド誘導体、ポリエチレングリコール-ポリプロピレングリコール共重合体等のポリアルキレングリコール誘導体、ポリ(オリゴエチレングリコールメタクリレート)等のポリメタクリレート誘導体、ポリ(メチルビニルエーテル)等のポリビニルエーテル誘導体、ポリ(N-ビニルカプロラクトン)等のポリビニルアミン誘導体、ポリ(オキサゾリン)等のポリオキサゾリン誘導体、ヒドロキシプロピルセルロース等のポリサッカライド誘導体、ポリペプチド、ポリペプチド誘導体などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、当該技術分野において慣用的に使用されている温度およびpH応答性ポリマーであるPNIPAMまたはその誘導体である。
【００３２】
また、別の例として、pH応答性高分子を用いることもできる。一般に培養中は一定量の二酸化炭素がガスとして供給されており、培養槽中の液体培地は炭酸イオンや炭酸水素イオンが溶解した状態であるが、そこから液体培地が取り出されると化学平衡の移動により炭酸イオンや炭酸水素イオンが抜け、液体培地はアルカリ性に変化する。このような変化に対して高分子の見かけの分子量が増加する組合せを用いれば、上記の温度応答性高分子を用いる例と同様の効果が得られる。
【００３３】
このような用途に用いることのできるpH応答性高分子は、培養時のpH（例えば7.2）から回収時のpH（例えば7.8）への変化が水和状態に影響する高分子であり、pKaが2以上12以下の官能基が共重合された温度応答性高分子、例えばPNIPAMまたはその誘導体、具体的にはPNIPAM-アクリル酸共重合体、PNIPAM-メタクリル酸共重合体などである。このような高分子では、分子量やpKaが2以上12以下の官能基の導入率の制御によって、水和-脱水和の臨界温度がpHに対して依存性を示し、培養条件（例えば37℃、pH7.2）では脱水和状態で、回収条件（例えば25℃、pH7.8）では水和状態となる物性などを得ることができる。なお、一つの分子内に同一の官能基が複数存在する場合にはそれぞれのpKaが異なり得る。単独で存在する場合の水中でのpKaが上記範囲内に入らなくとも、複数で存在する場合に水中でのpKaが上記範囲内に入る場合には、上記のpH応答の効果が得られる。
【００３４】
さらに別の例として、ジオール応答性高分子を用いることもできる。液体培地には一般に栄養分としてグルコースが添加されている。グルコースは培養中に消費されるため、適宜グルコースを追加投入することで細胞の増殖や活性を高い状態に保つ培養方法が開発されている。このような培養方法を連続培養と組合せることができ、培養槽中から抜き出した液体培地にグルコースを添加することにより、細胞と修飾タンパク質を有用物質と分離することも技術的に成立する。この場合、例えばジオール応答性官能基であるボロン酸部位を有するジオール応答性高分子によってベース化合物を修飾すれば、グルコース濃度の上昇に由来する化学平衡の移動によってジオール応答性高分子の分子量増大や溶媒和による見かけの分子量の増大が期待できる。
【００３５】
他にも、刺激としては、特定の成分の添加、特定のイオンの添加、光照射などが想定されるが、物性の変化、好ましくは分子量または見かけの分子量の変化を誘起し得る刺激であれば、これらに限定されるものではない。
【００３６】
一般に、半透膜を用いて分子量の異なるタンパクを分離する場合、分子量に2倍程度の差があれば分離しやすいと考えられている。すなわち回収条件における培地成分の見かけの分子量は有用物質の見かけの分子量の2倍以上となるように、培地成分、修飾に使用する刺激応答性高分子、および回収プロセスを設計することが望ましい。例えば、25℃の生理学的条件内における見かけの分子量が300kDa以上となるように設計する。
【００３７】
なお、培養条件や回収条件における培地成分の見かけの分子量は、それぞれの条件を模した状態での半透膜に対する透過性から見積もることができる。すなわち、ポアサイズ（孔径）が異なる複数の半透膜に対して、培地成分および種々の分子量の球状タンパク質（標準物質として使用）の透過性を測定する。培地成分の透過性と同等の透過性を示す球状タンパク質の分子量がその条件における培地成分の見かけの分子量である。この際、標準物質として用いる球状タンパク質は一般的に半透膜やゲル浸透クロマトグラフィ（GPC）等の分子量の測定の際に用いられる球状タンパク質を用いることができる。なお、使用する半透膜の素材等によって得られる結果が異なることが十分に考えられるため、このような測定は実際に培地成分の分離に用いる半透膜を用いて検討することが好ましい。必ずしも相関性が得られるわけではないが、簡便には、培地成分を水系GPCで測定し、球状タンパク質に対するGPCの検量線を用いて見かけの分子量を推定することもできる。
【００３８】
一方、培養条件における刺激応答性高分子の見かけの分子量についてもベース化合物の活性に影響するため重要である。高分子修飾によるベース化合物の活性低下は、ベース化合物、高分子の修飾位置および修飾数、高分子の分子量等に応じて異なる。当業者であれば、活性低下を抑制しつつ刺激応答により回収性を制御するためには、刺激応答によって（すなわち刺激の存在下と不在下とで）少なくとも培地成分全体（修飾タンパク質全体）としての見かけの分子量がおよそ10％以上変化することが望ましいことを理解し得る。
【００３９】
本発明に用いることのできる刺激応答性高分子の刺激応答による物性の変化は、上述したような分子量や見かけの分子量に限定されない。分子量や見かけの分子量以外の一例として、表面電荷量が挙げられる。この場合、例えばpH応答性高分子を用いることができ、培養条件では中性に近い表面電荷であった高分子が、回収条件で正電荷もしくは負電荷に大きく表面電荷が変化するという応答性を用いることができる。このような系に対しては、有用物質との分離には、通常の半透膜でなく、回収条件において刺激応答性高分子が示す電荷と同じ符号の電荷を有する半透膜を用いる必要がある。この場合、透過性の分子サイズに対する依存性に加えて、透過性の電荷反発に対する依存性を用いて、有用物質と培地成分を分離する。なお、この際の透過性から逆に電荷の寄与も含めた見かけの分子量を求めることができ、このようにして求められる見かけの分子量を用いることで、前述の温度応答による水和-脱水和の変化による見かけの分子量の変化の議論と同様にして、細胞と培地成分と有用物質の混合物から前二者を回収する効果に必要な物性の条件を設定することができる。この際も、前述のようにして半透膜を用いて見かけの分子量を見積もることが可能である。
【００４０】
培地成分回収に対する別の方法論として、ベース化合物に精製タグを導入し、導入された精製タグを捕捉する成分を有する濾過膜等を用いて細胞を濾別しつつ培地成分を濾過膜に吸着させ、その後に濾過膜から培地成分を溶出させることで、細胞と培地成分と有用物質の混合物から前二者を回収することもできる。例えば、精製タグを捕捉する成分として、温度応答性で、培養槽から抜き出した直後の37℃では精製タグを吸着し、25℃では精製タグと解離するという成分を用いれば、比較的簡便なプロセスにて細胞と培地成分と有用物質の混合物から前二者を回収することができる。
【００４１】
培地成分であるベース化合物に対して刺激応答性高分子を導入する方法としては、ベース化合物に対してモノマを作用させるgraft-fromの手法と、ベース化合物に対して反応性の官能基を有する刺激応答性高分子を作用させるgraft-toの手法が考えられる。ベース化合物の活性が低下しない温和な条件であればどちらの手法でも構わないが、反応制御や再現性の観点からgraft-toの手法の方が好ましい。
【００４２】
例えば、graft-toの手法で刺激応答性高分子をベース化合物に導入する場合、例えばリシン残基のアミノ基に対してNHSエステルのような活性エステル基、エポキシ基、アルデヒド基、のような反応性官能基を有する刺激応答性高分子を作用させることができる。また、別の一例では、システイン残基のチオール基に対してマレイミド基、チオール基、のような反応性官能基を有する刺激応答性高分子を作用させることができる。さらに別の一例では、カルボン酸残基に対して活性化剤を作用させて活性エステルに変換した後にアミノ基のような反応性官能基を有する刺激応答性高分子を作業させることができる。他にも、ネイティブケミカルリゲーション（NCL）のような手法を用いてもよい。また、刺激応答性高分子はベース化合物に直接導入しなくてもよく、あるいはリンカーを介して刺激応答性高分子をベース化合物に結合させることができる。例えば、ベース化合物をビオチン化した後に、ストレプトアビジンと刺激応答性高分子の複合体を作用させてもよい。逆に、ベース化合物をストレプトアビジンと複合化させた後にビオチン化された刺激応答性高分子を導入してもよい。
【００４３】
これらの刺激応答性高分子の導入手法や導入サイト、導入数は、ベース化合物として用いられる成分に適したものを選ぶことができる。
【００４４】
本発明では、刺激応答性高分子が導入された培地成分を回収し、再度細胞培養に用いることを想定しているため、培地成分は培養条件-回収条件の繰り返しの刺激に暴露されることとなる。そのため、そのような刺激に対して刺激応答性高分子は、少なくとも細胞培養に用いる期間の間では可逆的もしくは擬可逆的であることが好ましい。
【００４５】
本発明の刺激応答性高分子によって修飾されたポリペプチドは、細胞培養時および培養成分回収時における物性（好ましくは分子量または見かけの分子量）が変化するものであるため、細胞培養や有用物質の製造において使用することができる。
【００４６】
したがって、別の態様において、上述した刺激応答性高分子によって修飾されたポリペプチドを含むことを特徴とする細胞培養試薬または細胞培養キットを提供する。
【００４７】
また別の態様において、上述した刺激応答性高分子によって修飾されたポリペプチドを含む培養培地を用いて、前記刺激の存在下または不在下で細胞を培養する工程を含む、細胞培養方法を提供する。上記方法は、前記刺激の不在下または存在下で、上述した刺激応答性高分子によって修飾されたポリペプチドを回収する工程、および回収された前記修飾ポリペプチドを含む培養培地を用いて、前記刺激の存在下または不在下で細胞を培養する工程をさらに含んでもよい。
【００４８】
さらに別の態様において、上述した刺激応答性高分子によって修飾されたポリペプチドおよび細胞を含む培養培地を入れる培養槽と、
半透膜を備えた分離デバイスと、
前記刺激を印加するデバイスと
を備えることを特徴とする細胞培養装置を提供する。
【００４９】
上記細胞培養装置において、
前記培養槽において、前記刺激印加デバイスによる刺激を印加したまたは印加しない条件下で、細胞培養が行われ、
前記分離デバイスにおいて、前記刺激を印加しないまたは印加した条件下で、前記培養槽からの細胞培養物が処理されることが好ましい。
【００５０】
本開示の細胞培養試薬、細胞培養キット、細胞培養方法および細胞培養装置は、細胞培養のための培地成分として、上述した刺激応答性高分子によって修飾されたポリペプチドを含む。かかるポリペプチドは、刺激応答の性質に基づいて、細胞培養時には細胞培養に適した活性を発揮して細胞の増殖や細胞による有用物質の分泌に好適な影響を及ぼす一方、細胞や有用物質の回収時には刺激に応答して細胞培養時とは異なる物性を示し、有用物質や副産物と簡便に（特に1ステップで）分離することができる。結果として、培地成分である刺激応答性高分子によって修飾されたポリペプチドを回収して細胞培養に再利用することができ、低コスト化を実現できる。本発明において、細胞培養は連続培養法であることが好ましく、培養培地は液体培地であることが好ましい。
【００５１】
さらなる態様において、有用物質を製造する方法であって、
上述した刺激応答性高分子によって修飾されたポリペプチドを含む培養培地において、前記刺激の存在下または不在下で、有用物質を産生する細胞を培養する工程、
前記刺激の不在下または存在下で細胞培養物を半透膜を用いて処理し、前記細胞および前記修飾ポリペプチドを前記有用物質から分離する工程
を含む方法を提供する。上記方法は、前記分離された細胞および修飾ポリペプチドを前記培養培地に添加し、前記細胞を培養する工程をさらに含むものであってもよい。
【００５２】
また別の態様において、上述した刺激応答性高分子によって修飾されたポリペプチド、細胞、および前記細胞の少なくとも1種の分泌物を含む細胞培養物を半透膜を用いて処理する工程を含む、細胞培養物の処理方法を提供する。
【００５３】
上記細胞培養物の処理方法において、
前記半透膜が前記細胞の分泌物に対して透過性かつ前記細胞に対して非透過性であり、
前記修飾ポリペプチドの見かけの分子量が前記細胞の分泌物の見かけの分子量の2倍以上となる条件で前記処理が実施されることが好ましい。
【００５４】
本発明の方法を適用して産生可能な有用物質または細胞の分泌物としては、細胞培養により慣用的に製造されている物質であれば特に限定されるものではなく、例えば、免疫グロブリン（IgG、IgA、IgM、IgE）、組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）などが挙げられる。有用物質または分泌物は遺伝子組み換えタンパク質であってもよいし、または複合化タンパク質であってもよい。
【００５５】
本発明の有用物質の製造方法および細胞培養物の処理方法により、有用物質または細胞の分泌物を、細胞および培地成分（すなわち刺激応答性高分子によって修飾されたポリペプチド）から簡便に回収することができる。分離された細胞および培地成分は再利用可能であり、特に培地成分が高価な場合には、低コスト化を実現できる。
【実施例】
【００５６】
本実施例では、細胞としてチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、培地成分として温度応答性成長因子（温度応答性高分子で修飾したインスリン）、培地成分のベース化合物としてインスリン、有用物質としてIgGを想定した検討を実施した。前二者の回収には半透膜を用いた。
【００５７】
＜細胞および培地＞
培養実験にはチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞；CRL-9606細胞）（付着培養細胞を浮遊細胞に順化）をAmerican Type Culture Collection（ATCC）より購入し、使用した。使用培地はHam’s F12基本培地に、インスリンおよびトランスフェリン（ともに最終濃度10μg/mL）、ウシ胎仔血清（FBS）（最終濃度10％）を添加した（以下、標準培地という）。
【００５８】
＜培養液循環試験＞
1L培養槽（エイブル社）と中空糸フィルタ 孔径300kDa（スペクトラム社）を用いて、図４に示す装置を構成した。標準培地でCHO細胞を1×105細胞/mLに希釈し、1L培養槽に入れ、温度37℃、溶存酸素2.7 mg/L、pH7.2に維持しながら、所定の循環速度（0、4、10 mL/min）で循環させ、8日間細胞を培養した。1日に1回、培養槽から培養液をサンプリングし、抗体（IgG）濃度、生細胞数、生存率、乳酸濃度、アンモニア濃度、グルタミン濃度、およびグルコース濃度を計測した。
【００５９】
＜温度応答性成長因子の調製＞
成長因子であるインスリンの溶液（10 mg/mL、1.0 mL）に、温度応答で構造を変化させるポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)-N-ヒドロキシスクシンイミド（PNIPAM-NHS）（Mn＝9.0×103, Mw/Mn＝1.8）のジメチルホルムアミド（DMF）溶液（12.5 mg/mL, 2.5 mL, 2.0 eq.）を加えた。得られた白色懸濁液を37℃にて12時間反応させることでインスリンのリシン残基にPNIPAMを導入した。以後、この温度応答性高分子PNIPAMで修飾されたインスリンを温度応答性成長因子という。
【００６０】
＜温度応答性成長因子のフィルタ透過性試験＞
100mLガラス容器（培養槽の代替）と中空糸フィルタ（孔径10kDa、100kDa、300kDaの3種類のいずれか）（スペクトラム社）を用いて、図４に示す装置を構成した。100mLガラス容器に、緩衝溶液（PBS）で希釈した温度応答性成長因子の溶液（濃度10μg/mL）を入れ、ペリスタポンプを用いて10 mL/minの速度で溶液を循環させ、中空糸フィルタの抜き出し口から1 mL/minで溶液を抜き出した。この時、ガラス容器、配管チューブ、中空糸フィルタをすべて恒温槽に入れ、一定の温度（25℃、37℃、42℃のいずれか）に維持した。100mLガラス容器と中空糸フィルタの抜き出し口からそれぞれ溶液をサンプリングし、成長因子の濃度をELISA法により定量し、以下の式1に示す式により透過率を求めた。インスリンおよび抗体についても対照実験として上記と同等の試験を行い、透過率を求めた。
【００６１】
【数１】
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【００６２】
結果を図５に示す。孔径10kDaの中空糸膜の場合、温度に関係なく、すべての分子が透過できない（図５の(a)）。インスリンは孔径10kDaより小さいが、分子の立体的な大きさが大きいため、通過できなかったと考えられる。孔径100kDaの中空糸膜の場合、温度応答性成長因子は、透過率の温度依存性を持ち、温度が低くなるに従い透過率が低くなる（図５の(b)）。これは、温度応答性成長因子の温度応答性高分子の部分が、温度が低くなることで水和状態に移行し、見かけの分子量が増大することにより孔を抜けにくくなったためと考えられる。一方、IgGの温度依存性は少なく、約60％の透過率となった（図５の(b)）。これは孔径とIgGの分子サイズは比較的近く、一部のIgGが透過することを示している。孔径300kDaの中空糸膜の場合、温度応答性成長因子の透過率は温度依存性があり、25℃で20％、42℃で100%となった（図５の(c)）。一方、IgGおよびインスリンは、分子サイズが孔径300kDaより小さいため、すべてが透過することがわかる（図５の(c)）。
【００６３】
以上より、本条件下では、細胞分離の際に孔径300kDaの中空糸膜を25℃の条件で使用することにより、温度応答性成長因子の透過を防ぎ、医薬品であるIgGを透過させることができることがわかった。
【００６４】
なお、この結果から、今回検討した温度応答性成長因子は、37℃の培養条件における見かけの分子量が100kDa程度であり、25℃の回収条件における見かけの分子量が300kDa程度以上であることが示唆された。高分子修飾タンパク質が実際の分子量を大きく上回る見かけの分子量を示すことは一般的であるため、本結果は妥当である。
【００６５】
＜温度応答性成長因子を用いたフラスコ培養試験＞
培養用6ウェルプレートにインスリンの代わりに温度応答性成長因子（10 μg/mL）を含む培地にCHO細胞を播種し、インキュベータ内（5% CO2、37℃）で5日間培養した。播種密度と培養5日後の細胞数を計測し、増殖倍率を計算した。対照実験として、通常のインスリンを含む培地、またはインスリンを含まない培地を用いて同様にCHO細胞を培養した。
【００６６】
結果を図６に示す。温度応答性成長因子を含む培地で温度37℃で培養した場合、インスリンを添加した培地と同等の増殖倍率であった。これはインスリンも温度応答性成長因子も無添加の培地と比較して約2倍である（図６の(a)）。一方、温度25℃で培養した場合、温度応答性成長因子を含む培地およびインスリンを含む培地のいずれの培地でもCHO細胞は増殖しなかった（図６の(b)）。生存率を見ると、37℃と25℃のいずれの培養でも90％程度維持しており、本実施例で調製した温度応答性成長因子は細胞の生存率に影響を与えないことがわかる。この結果から、今回検討した温度応答性成長因子は、修飾に使用した温度応答性高分子による悪影響がなく、修飾前のインスリンと同等の活性を示すことが実証された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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