(57)【要約】      （修正有）【課題】癌患者の治療方法の提供。【解決手段】細胞傷害性Ｔ−リンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）およびプログラム死−１（ＰＤ−１）等の免疫チェックポイントを遮断する免疫チェックポイント阻害抗体を含む、癌患者を治療するための癌患者への投与用の薬学的組成物であって、前記癌が結腸癌、胃癌、子宮内膜癌、胆管癌、膵臓癌、および前立腺癌からなる群から選択され、前期癌患者はマイクロサテライト不安定性癌（ＭＳＩ）を有する、前記薬学的組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫チェックポイント阻害抗体を含む、癌患者を治療するための癌患者への投与用の薬学的組成物であって、前記癌患者がマイクロサテライト不安定性癌（ＭＳＩ）を有する、前記薬学的組成物。
【請求項２】
前記癌が、結腸癌、胃癌、子宮内膜癌、胆管癌、膵臓癌、および前立腺癌からなる群から選択される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記抗体が抗ＰＤ−１抗体である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記抗体が抗ＩＤＯ抗体である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記抗体が抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記抗体が抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記抗体が抗ＬＡＧ−３抗体である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記投与の前に、前記ＭＳＩ癌患者からのサンプルが、１つまたはそれ以上のマイクロサテライトマーカーの安定性を評価するために試験されている、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記抗体がヒト化モノクローナル抗体である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記抗体がＭＫ−３４７５である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記抗体がＩｇＧ４抗体である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記マイクロサテライトマーカーが複数のマイクロサテライトマーカーである、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記１つまたはそれ以上のマイクロサテライトマーカーが、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮ０−２７、ＮＲ−２１、ＮＲ−２４、Ｐｅｎｔａ  Ｃ、およびＰｅｎｔａ  Ｄからなる群から選択される、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記複数のマイクロサテライトマーカーが、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮ０−２７、ＮＲ−２１、ＮＲ−２４、Ｐｅｎｔａ  Ｃ、およびＰｅｎｔａ  Ｄを含む、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
抗ＰＤ−１抗体を含む、癌患者を治療するための癌患者への投与用の薬学的組成物であって、前記癌患者からのサンプルが試験され、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮ０−２７、ＮＲ−２１、ＮＲ−２４、Ｐｅｎｔａ  Ｃ、およびＰｅｎｔａ  Ｄからなる群から選択される１つまたはそれ以上のマイクロサテライトマーカーの不安定性が判定されており、前記癌が、結腸癌、胃癌、子宮内膜癌、胆管癌、膵臓癌、および前立腺癌からなる群から選択される、前記薬学的組成物。
【請求項１６】
ヒトの腫瘍の分類方法であって、
１つまたはそれ以上のマイクロサテライトマーカーの安定性を評価するために、前記ヒトからのサンプルを試験する工程と、
前記サンプルにおけるマイクロサテライト不安定性を判定する工程と、
免疫チェックポイント阻害抗体による治療のための良好な候補として前記腫瘍を特定する工程と、を含む、前記方法。
【請求項１７】
前記ヒトに免疫チェックポイント阻害抗体を処方する判断を補助する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つまたはそれ以上のマイクロサテライトマーカーが、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮ０−２７、ＮＲ−２１、ＮＲ−２４、Ｐｅｎｔａ  Ｃ、およびＰｅｎｔａ  Ｄからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ヒトの腫瘍の分類方法であって、
１つまたはそれ以上のマイクロサテライトマーカーの安定性を評価するために、前記ヒトからのサンプルを試験する工程と、
前記サンプルにおけるマイクロサテライト安定性を判定する工程と、
免疫チェックポイント阻害抗体による治療のための不良な候補として前記腫瘍を特定する工程と、を含む、前記方法。
【請求項２０】
前記ヒトが免疫チェックポイント阻害抗体により治療されている場合に、免疫チェックポイント阻害抗体による治療を停止する判断を補助する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つまたはそれ以上のマイクロサテライトマーカーが、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮ０−２７、ＮＲ−２１、ＮＲ−２４、Ｐｅｎｔａ  Ｃ、およびＰｅｎｔａ  Ｄからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
免疫チェックポイント阻害抗体を含む、癌患者を治療するための癌患者への投与用の薬学的組成物であって、前記癌患者が１腫瘍につき少なくとも１００個の体細胞突然変異の突然変異負荷を有する、前記薬学的組成物。
【請求項２３】
前記抗体が抗ＰＤ−１抗体である、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記抗体が抗ＩＤＯ抗体である、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
前記抗体が抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
前記抗体が抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
前記抗体が抗ＬＡＧ−３抗体である、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
前記投与の前に、前記腫瘍における高い突然変異負荷が判定されている、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＣＡ４３４６０およびＣＡ６２９２４の下で、政府支援によりなされたものである。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、癌の領域に関する。具体的には、癌療法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）は、マイクロサテライトにおける配列の誤りの蓄積である。これは、ＤＮＡミスマッチ修復に欠陥のある腫瘍で生じる。ＭＳＩは、患者を、結腸癌、子宮内膜癌、胃癌、卵巣癌、小腸癌、肝臓癌、肝胆道癌、上部尿路癌、脳癌、および前立腺癌に罹りやすくする遺伝性癌症候群であるリンチ症候群に存在する。ＭＳＩはまた、散発性結腸直腸癌、胃癌、前立腺癌、肺癌、膨大部癌、および子宮内膜癌の１０〜２０％に存在する。膵臓癌の０．３％〜１３％もまた、ＭＳＩであることが報告されている。
【０００４】
悪性形質転換の副産物の制御における無傷免疫学的監視の重要性は、数十年間知られている。累積証拠は、癌組織における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の間の相関関係および様々な悪性腫瘍における良好な予後を示す。具体的には、ＣＤ８＋Ｔ細胞の出現およびＣＤ８＋エフェクターＴ細胞／ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の比率は、卵巣、結腸直腸、および膵臓癌、肝細胞癌腫、悪性ＭＥＬおよびＲＣＣ等の固体悪性腫瘍における改善された予後および長期生存と相関すると思われる。ＴＩＬは、エクスビボで拡張し、再注入されて、黒色腫等の癌における永続的な客観的腫瘍応答を誘発することができる。
【０００５】
ＰＤ−１受容体−リガンドの相互作用は、免疫による制御を抑制するための腫瘍によって乗っ取られた主要経路である。健常条件下で、活性化したＴ細胞の細胞表面に発現した、ＰＤ−１の正常な機能は、自己免疫反応を含む望ましくないまたは過剰な免疫応答を下方調節するものである。ＰＤ−１（ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２）のリガンドは、構成的に発現されるか、または様々な腫瘍に誘発され得る。ＰＤ−１へのいずれかのＰＤ−１リガンドの結合は、Ｔ細胞受容体を通して引き起こされるＴ細胞の活性化を阻害する。ＰＤ−Ｌ１は、様々な非造血組織、最も顕著には、血管内皮に低レベルで発現されるが、一方、ＰＤ−Ｌ２タンパク質は、リンパ系組織または慢性炎症性環境において見出される抗原提示細胞にのみ検出可能に発現される。ＰＤ−Ｌ２は、リンパ系器官における免疫Ｔ細胞の活性化を制御すると考えられるが、一方、ＰＤ−Ｌ１は、末梢組織における望ましくないＴ細胞機能を抑制する役割を果たす。健常な器官は、ほとんど（もしあれば）ＰＤ−Ｌ１を発現しないが、様々な癌は、このＴ細胞阻害剤の十分なレベルを発現することが実証された。腫瘍細胞におけるＰＤ−Ｌ１の高い発現（およびＰＤ−Ｌ２のより少ない範囲まで）は、腎細胞癌（ＲＣＣ）、膵臓癌、肝細胞癌、卵巣癌、および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む、様々な癌タイプにおいて不良な予後および生存と相関することが見出されている。さらに、ＰＤ−１は、悪性ＭＥＬを患っている患者における腫瘍特異的なＴ細胞の増殖を調節することが示唆されている。複数の癌におけるＰＤ−Ｌ１の発現と臨床予後の観察された相関関係は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路が腫瘍免疫回避に重要な役割を果たし、治療的介入の格好の標的として考慮されるべきであることを示唆している。
【０００６】
細胞傷害性Ｔ−リンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）およびプログラム死−１（ＰＤ−１）等の免疫チェックポイントの遮断が、癌を患っている患者において有望である。ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞において上方調節され、活性化を受けるＴ細胞に阻害シグナルを提供する。これらの受容体を対象とする阻害抗体は、免疫寛容を破壊し、抗腫瘍免疫を促進することが示されている。ＭＫ−３４７５は、ＰＤ−１に対するヒト化モノクローナルＩｇＧ４抗体であり、黒色腫および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む複数の腫瘍タイプにおいて活性を示す。これまでは、異なるＰＤ−１遮断抗体、ＢＭＳ−９３６５５８、完全ヒト化モノクローナルＩｇＧ４抗体の活性はまた、結腸直腸癌を患っている１人の患者において、黒色腫、ＮＳＣＬＣの活性、および完全寛解も示した。
【０００７】
ＭＫ−３４７５（以前は、ＳＣＨ  ９００４７５として知られている）は、ＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２との間の相互作用を直接遮断するように設計されたＩｇＧ４／カッパイソタイプの強力かつ高度選択的なヒト化ｍＡｂである。ＭＫ−３４７５は、突然変異を安定化するＳ２２８Ｐを含有し、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の活性を有さない。ＭＫ−３４７５は、健常なヒトドナー、癌患者、および霊長類から培養された血液細胞中のＴリンパ球免疫応答を強く増強する。ヒトドナー血細胞を用いたＴ細胞活性化アッセイにおいて、ＥＣ５０は、０．１〜０．３ｎＭの範囲内であった。ＭＫ−３４７５はまた、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、およびその他のサイトカインのレベルも調節する。抗体は、抗原の存在下のみ既存の免疫応答を増強し、Ｔ細胞を非特異的に活性化しない。
【０００８】
プログラム死１（ＰＤ−１）経路は、調節されない場合、宿主を損傷し得るＴｈ１細胞傷害性免疫応答を表す負のフィードバックシステムである１〜３。それは、多くの腫瘍およびそれらの周辺の微環境において上方調節される。ＰＤ−１またはそのリガンドに対して抗体によるこの経路の遮断は、黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、およびホジキンリンパ腫を含む、多くの異なる癌タイプを有する患者の中には、著明な応答を示した４〜１０。腫瘍細胞または免疫細胞の表面上のＰＤ−１（ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２）に対するリガンドの発現は重要であるが、ＰＤ−１遮断に対する応答の決定的な予測バイオマーカーではない４、６〜８、１１。
【０００９】
我々は、ヒト腫瘍におけるＰＤ−１遮断の効果の報告において、かなりの割合の黒色腫、腎細胞癌、および肺腫瘍を患っている患者とは対照的に、３３人の結腸直腸癌（ＣＲＣ）患者のうちの１人の患者のみが、この治療に応答したことに興味を持った１０、１２。この単一の患者との違いは何であろうか。我々は、ＭＭＲ欠損が進行ＣＲＣのごく一部でしか見られず１３、１４、腫瘍において見られた体細胞突然変異は、患者自身の免疫系によって認識することができ１５、ＭＭＲ欠損癌が、ＭＭＲ能のある（ＭＭＲ−ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）ＣＲＣよりも１０倍〜１００倍の体細胞突然変異を有している１６〜１８ため、この患者がＭＭＲ欠損を有していたと仮定した。さらに、ＭＭＲ欠損癌は、顕著なリンパ球浸潤を含み、免疫応答と一致する１９〜２２。Ｔｏｐａｌｉａｎらによる研究１０におけるＰＤ−１遮断に対して最も応答する腫瘍タイプのうちの２つが、タバコの喫煙（肺癌）または紫外線放射（黒色腫）への曝露の結果として体細胞突然変異の増加を有した２３、２４。ＰＤ−１遮断に応答した単一ＣＲＣ患者の腫瘍がＭＭＲ欠損であったという、我々の仮説は、正しかった２５。したがって、我々は、ＭＭＲ欠損腫瘍がＭＭＲ能のある腫瘍よりもＰＤ−１遮断に対してより応答が良いと仮定した。
【００１０】
この仮説を試験するために、腫瘍がＭＭＲ欠損を有したまたは有さなかった患者における免疫チェックポイント遮断を評価するために第２相臨床試験を開始した。腫瘍におけるＭＭＲ欠損が２つの経路を通して生じるため２６〜２８、我々は、遺伝性非ポリープ症結腸直腸癌（ＨＮＰＣＣ、リンチ症候群としても知られている）を患っている患者を動員し、これらは、４つのＭＭＲ遺伝子のうちの１つにおける先天性生殖系列欠失により生じ、続いて、第２に、残りの野生型対立遺伝子の体細胞変化を不活性化した。また、ＭＭＲ遺伝子の両方の対立遺伝子が体細胞突然変異によって、またはエピジェネティックなサイレンシングによって不活性化される場合に、散発性ＭＭＲ欠損腫瘍を患っている患者も動員した２９。いずれにしても、生じる新生物は、何百または何千の突然変異を宿す１６、１８。
【００１１】
患者の生命が短縮されないように、また、生活の質が低下しないように、癌治療を改善する必要性が、当該技術分野において継続的に存在する。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の一実施形態によれば、癌患者の治療方法が提供される。癌患者は、マイクロサテライト不安定性癌（ＭＳＩ）に見られるような、高い突然変異負荷を有する。免疫チェックポイント阻害抗体は、癌患者に投与される。
【００１３】
本発明の別の実施形態によれば、癌患者の治療方法が提供される。癌患者からのサンプルを、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮ０−２７、ＮＲ−２１、ＮＲ−２４、Ｐｅｎｔａ  Ｃ、およびＰｅｎｔａ  Ｄからなる群から選択される１つ以上のマイクロサテライトマーカーについて試験して、マイクロサテライト不安定性を有することを判定する。癌は、結腸癌、胃癌、子宮内膜癌、胆管癌、膵臓癌、および前立腺癌からなる群から選択される。抗ＰＤ−１抗体は、癌患者に投与される。
【００１４】
本発明の別の実施形態によれば、方法が、ヒトの腫瘍を分類するために提供される。ヒトからのサンプルを、１つ以上のマイクロサテライトマーカーの安定性を評価するために試験する。マイクロサテライト不安定性は、サンプルにおいて判定される。腫瘍は、免疫チェックポイント阻害抗体による治療のための良好な候補として特定される。
【００１５】
本発明のさらに別の実施形態によれば、方法が、ヒトの腫瘍を分類するために提供される。ヒトからのサンプルを、１つ以上のマイクロサテライトマーカーの安定性を評価するために試験する。サンプルにおけるマイクロサテライト安定性が判定される。腫瘍は、免疫チェックポイント阻害抗体による治療のための不良な候補として特定される。
【００１６】
本明細書を読むことにより、当業者には明らかになるであろうこれらおよび他の実施形態は、マイクロサテライト不安定性癌を治療するための方法を用いて当該技術を提供する。
[本発明1001]
マイクロサテライト不安定性癌（ＭＳＩ）を有する癌患者に、免疫チェックポイント阻害抗体を投与する工程を含む、癌患者の治療方法。
[本発明1002]
前記癌が、結腸癌、胃癌、子宮内膜癌、胆管癌、膵臓癌、および前立腺癌からなる群から選択される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記抗体が抗ＰＤ−1抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記抗体が抗ＩＤＯ抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記抗体が抗ＣＴＬＡ−4抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記抗体が抗ＰＤ−Ｌ1抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記抗体が抗ＬＡＧ−3抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記投与工程の前に、前記ＭＳＩ癌患者からのサンプルが、1つまたはそれ以上のマイクロサテライトマーカーの安定性を評価するために試験される、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記抗体がヒト化モノクローナル抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記抗体がＭＫ−3475である、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記抗体がＩｇＧ4抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1012]
複数のマイクロサテライトマーカーが試験される、本発明1008の方法。
[本発明1013]
前記1つまたはそれ以上のマイクロサテライトマーカーが、ＢＡＴ−25、ＢＡＴ−26、ＭＯＮ0−27、ＮＲ−21、ＮＲ−24、Ｐｅｎｔａ  Ｃ、およびＰｅｎｔａ  Ｄからなる群から選択される、本発明1008の方法。
[本発明1014]
前記複数のマイクロサテライトマーカーが、ＢＡＴ−25、ＢＡＴ−26、ＭＯＮ0−27、ＮＲ−21、ＮＲ−24、Ｐｅｎｔａ  Ｃ、およびＰｅｎｔａ  Ｄを含む、本発明1012の方法。
[本発明1015]
癌患者からのサンプルを試験して、ＢＡＴ−25、ＢＡＴ−26、ＭＯＮ0−27、ＮＲ−21、ＮＲ−24、Ｐｅｎｔａ  Ｃ、およびＰｅｎｔａ  Ｄからなる群から選択される1つまたはそれ以上のマイクロサテライトマーカーの不安定性を判定する工程と、
前記癌患者に抗ＰＤ−1抗体を投与する工程と、
を含む、癌患者の治療方法であって、
前記癌が、結腸癌、胃癌、子宮内膜癌、胆管癌、膵臓癌、および前立腺癌からなる群から選択される、前記方法。
[本発明1016]
ヒトの腫瘍の分類方法であって、
1つまたはそれ以上のマイクロサテライトマーカーの安定性を評価するために、前記ヒトからのサンプルを試験する工程と、
前記サンプルにおけるマイクロサテライト不安定性を判定する工程と、
免疫チェックポイント阻害抗体による治療のための良好な候補として前記腫瘍を特定する工程と、を含む、前記方法。
[本発明1017]
前記ヒトに免疫チェックポイント阻害抗体を処方する工程をさらに含む、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記1つまたはそれ以上のマイクロサテライトマーカーが、ＢＡＴ−25、ＢＡＴ−26、ＭＯＮ0−27、ＮＲ−21、ＮＲ−24、Ｐｅｎｔａ  Ｃ、およびＰｅｎｔａ  Ｄからなる群から選択される、本発明1016の方法。
[本発明1019]
前記1つまたはそれ以上のマイクロサテライトマーカーが、ＢＡＴ−25、ＢＡＴ−26、ＭＯＮ0−27、ＮＲ−21、ＮＲ−24、Ｐｅｎｔａ  Ｃ、およびＰｅｎｔａ  Ｄからなる群から選択される、本発明1016の方法。
[本発明1020]
ヒトの腫瘍の分類方法であって、
1つまたはそれ以上のマイクロサテライトマーカーの安定性を評価するために、前記ヒトからのサンプルを試験する工程と、
前記サンプルにおけるマイクロサテライト安定性を判定する工程と、
免疫チェックポイント阻害抗体による治療のための不良な候補として前記腫瘍を特定する工程と、を含む、前記方法。
[本発明1021]
前記ヒトが免疫チェックポイント阻害抗体により治療されており、免疫チェックポイント阻害抗体による治療を停止する工程をさらに含む、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記1つまたはそれ以上のマイクロサテライトマーカーが、ＢＡＴ−25、ＢＡＴ−26、ＭＯＮ0−27、ＮＲ−21、ＮＲ−24、Ｐｅｎｔａ  Ｃ、およびＰｅｎｔａ  Ｄからなる群から選択される、本発明1020の方法。
[本発明1023]
前記1つまたはそれ以上のマイクロサテライトマーカーが、ＢＡＴ−25、ＢＡＴ−26、ＭＯＮ0−27、ＮＲ−21、ＮＲ−24、Ｐｅｎｔａ  Ｃ、およびＰｅｎｔａ  Ｄからなる群から選択される、本発明1020の方法。
[本発明1024]
1腫瘍につき少なくとも100個の体細胞突然変異の突然変異負荷を有する癌患者に、免疫チェックポイント阻害抗体を投与する工程を含む、癌患者の治療方法。
[本発明1025]
前記抗体が抗ＰＤ−1抗体である、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記抗体が抗ＩＤＯ抗体である、本発明1024の方法。
[本発明1027]
前記抗体が抗ＣＴＬＡ−4抗体である、本発明1024の方法。
[本発明1028]
前記抗体が抗ＰＤ−Ｌ1抗体である、本発明1024の方法。
[本発明1029]
前記抗体が抗ＬＡＧ−3抗体である、本発明1024の方法。
[本発明1030]
前記投与工程の前に、前記腫瘍における高い突然変異負荷を判定する工程をさらに含む、本発明1024の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ペンブロリズマブに対する臨床応答。（図１Ａ）生化学的応答。血清タンパク質バイオマーカーレベルは、各サイクルで測定され、これらの値は、ベースラインからの変化パーセントを表す。ベースラインの腫瘍マーカー値が正常の上限値よりも大きかった場合、患者が含まれた。ＣＡ−１２５は、子宮内膜癌を患っている患者のために使用され、ＣＡ１９−９は、ある胆管癌およびある膨大部癌のために使用され、ＣＥＡが、すべての他の患者のために使用された。緑色、赤色、および黒色線は、それぞれ、ＭＭＲ欠損ＣＲＣ、ＭＭＲ能のあるＣＲＣ、およびＭＭＲ欠損非ＣＲＣを表す。（図１Ｂ）放射線学的応答。腫瘍応答を一定間隔で測定し、値は、各測定可能な腫瘍のベースライン測定から最長径の和（ＳＬＤ）の最良の分数の変化を示す。
【図２】ＭＭＲ状態によるペンブロリズマブへの臨床的利点。カプランマイヤー曲線を、（図２Ａ）結腸直腸癌コホートにおける無増悪生存率、（図２Ｂ）結腸直腸癌コホートにおける全生存、（図２Ｃ）結腸直腸以外のＭＭＲ欠損癌を患っている患者の無増悪生存率（ＰＦＳ中央値＝５．４カ月、９５％信頼区間、３％〜評価不可能）、および（図２Ｄ）結腸直腸以外のＭＭＲ欠損癌を患っている患者の全生存に対して示す。ＭＭＲ欠損腫瘍（ＣＲＣおよび非ＣＲＣ）を有する両方のコホートでは、全生存中央値に達しなかった。ＭＭＲ能のある癌を患っているコホートにおける患者は、２．２カ月のＰＦＳ中央値（９５％信頼区間  １．４〜２．８％）および５．０カ月のＯＳ中央値（９５％信頼区間  ３．０〜評価不可能）を有した。
【図３】（図Ｓ２．）放射線学的応答のスパイダープロット。腫瘍応答を一定間隔で測定し、値は、各測定可能な腫瘍のベースライン測定から最長径の和（ＳＬＤ）の変化パーセントを示す。患者はベースラインおよび研究時治療走査が利用可能であった場合のみ含まれた。緑色および赤色は、それぞれ、ＭＭＲ欠損ＣＲＣおよびＭＭＲ能のあるＣＲＣを患っている患者を表す。青色は、ＣＲＣ以外のＭＭＲ欠損癌を患っている患者を表す。
【図４】（図Ｓ３）ＭＭＲ能のあるＣＲＣおよびＭＭＲ欠損ＣＲＣは、同等の研究登録前の治療時間および転移性疾患の期間を有する。このペンブロリズマブ研究における、（図４Ａ）研究登録直前の療法における時間（ＨＲ  ０．８１、９５％信頼区間  ０．３８〜１．７５２、ｐ＝０．６０）および（図４Ｂ）登録前の転移性疾患の期間（ＨＲ  １．１３、９５％信頼区間  ０．４９〜２．６２、ｐ＝０．７８）のカプランマイヤー推定は、ＭＭＲ欠損ＣＲＣコホートとＭＭＲ能のあるＣＲＣコホートとの間で同等であった。治療難治性ＣＲＣ集団には先行の療法における短期間が予想される。
【図５】（図Ｓ４．）生化学的応答の滝プロット。血清タンパク質バイオマーカーレベルは、各サイクルで測定され、これらの値は、ベースラインからの最良の変化パーセントを表す。ベースラインの腫瘍マーカー値が正常の上限値よりも大きかった場合、患者が含まれた。ＣＡ−１２５は、子宮内膜癌を患っている患者のために使用され、ＣＡ１９−９は、ある胆管癌およびある膨大部癌のために使用され、ＣＥＡは、すべての他の患者のために使用された。緑色および赤色は、それぞれ、ＭＭＲ欠損ＣＲＣおよびＭＭＲ能のあるＣＲＣを患っている患者を表す。青色は、ＣＲＣ以外のＭＭＲ欠損癌を患っている患者を表す。
【図６】（図Ｓ５．）ＭＭＲ欠損腫瘍およびＭＭＲ能のある腫瘍における体細胞突然変異。腫瘍および適合した正常ＤＮＡのエクソームシークエンシング（図６Ａ）および客観的応答との相関関係（図６Ｂ）によって特定された１腫瘍当たりの体細胞突然変異の合計（非パラメトリックＷｉｌｃｏｘｏｎ検定、ｐ＝０．００７、およびＪｏｎｃｋｈｅｅｒｅ−Ｔｅｒｐｓｔｒａ傾向検定、ｐ＝０．０２）。
【図７】（図Ｓ６）ＣＤ８およびＰＤ−Ｌ１の発現の免疫組織化学。ＭＭＲ欠損ＣＲＣ（対象＃１６、上）およびＭＭＲ能のあるＣＲＣ（対象＃３、下）からの侵襲最深部（黄色の破線）。黄色の破線が腫瘍（Ｔ）と正常な（Ｎ）組織を分ける。ＭＭＲ欠損腫瘍のある患者（上パネル）においてＰＤ−Ｌ１（青色矢印）およびＣＤ８（茶色の点）の顕著な発現があるが、一方、ＭＭＲ能のある腫瘍（下パネル）においては、いずれのマーカーの発現もほんのわずかであった。ＣＤ８に対して抗体で免疫標識した（茶色の点）別のＭＭＲ欠損ＣＲＣ（対象＃１９、上）およびＭＭＲ能のあるＣＲＣ（対象＃３、下）における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の代表的な画像。ＭＭＲ欠損腫瘍におけるＣＤ８細胞の浸潤に留意されたい。侵襲最深部の元の倍率  １０倍およびＴＩＬ  ２０倍。
【図８】（図Ｓ７．）ＭＭＲ欠損およびＭＭＲ能のある腫瘍の微環境におけるＣＤ８およびＰＤ−Ｌ１発現。Ｔ細胞密度単位は、細胞／ｍｍ２（腫瘍）である。侵襲最深部とは、腫瘍と正常組織との接合部の免疫細胞（ＴＩＬおよびマクロファージ）を指す。Ｐ値は、不対ｔ検定を用いて得た。
【図９】（図Ｓ８．）ＣＤ８発現およびペンブロリズマブへの臨床的利点。腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞密度（細胞／ｍｍ２）と客観的応答との間の相関関係（Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ−Ｔｅｒｐｓｔｒａ検定、ｐ＝０．０２）
【図１０】（表Ｓ１．）免疫関連およびＲＥＣＩＳＴ応答基準の比較（出典Ｗｏｌｃｈｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎ  Ｒｅｓ  ２００９；１５：７４１２−２０．）
【図１１】（表Ｓ２．）治療に対する免疫関連応答
【図１２】（表Ｓ４．）全体細胞突然変異および突然変異関連の新抗原（ＭＡＮＡ）と臨床転帰の相関関係
【図１３】（表Ｓ５．）免疫マーカーと臨床転帰の相関関係
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明者らは、免疫チェックポイント阻害剤が、高い突然変異負荷を有する腫瘍において最も良く働くことを見出した。さらに、ミスマッチ修復に欠損のある腫瘍は、この表現型が高頻度で突然変異の継続的蓄積をもたらすため、免疫療法の特定の形態に特に影響を受けやすい。本発明者らは、マイクロサテライト不安定性の表現型または他の高い突然変異負荷を示す癌患者のための治療を開発した。本治療は、免疫チェックポイントのための阻害抗体を含む。そのようなチェックポイントは、ＰＤ−１、ＩＤＯ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、およびＬＡＧ−３を含む。その他の免疫チェックポイントも使用することができる。抗体は、静脈内注射、経口投与、皮下投与、舌下投与、眼内投与、経鼻投与等が挙げられるが、これらに限定されない、便利な任意の手段によって投与することができる。
【００１９】
マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）腫瘍はＤＮＡミスマッチ修復に欠損があり、これが高い自然突然変異率および新抗原の発現の可能性をもたらす。さらに、黒色腫と同様に、ＭＳＩ陽性結腸癌において、しばしば、顕著なリンパ球浸潤がある。ＭＳＩまたはそうでなければ高い突然変異負荷がある任意の腫瘍が、本発明により治療され得る。それらは、下の実施例１に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない、当該技術分野で周知の任意の方法によりＭＳＩの属性について試験され得る。１つ以上のＭＳＩマーカーのうちのいずれかを、ＭＳＩ表現型を判定するために試験することができる。サンプルは、１腫瘍ゲノム当たり少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、少なくとも１２００、少なくとも１３００、少なくとも１４００、少なくとも１５００、または少なくとも１６００個の突然変異を有する腫瘍を特定することによって高い突然変異負荷について試験され得る。高い突然変異負荷は、個体の正常な組織と比較して、腫瘍における多数の体細胞突然変異を意味する。非ＭＳＩ腫瘍における体細胞突然変異の平均数は、約７０個の体細胞突然変異である。
【００２０】
ＭＳＩ表現型または高い突然変異負荷を示す任意のタイプの腫瘍は、本発明により試験および／または治療され得る。これらには、結腸、胃、子宮内膜、胆管、膵臓の癌、および前立腺癌が含まれるが、これらに限定されない。神経膠腫、胸部、肺、皮膚、食道、肝臓、腎臓、卵巣、肉腫、子宮、頸部、膀胱、睾丸、口腔、舌、ならびに小および大腸を含む、膨大部、胆管、脳の腫瘍はまた、試験および／または治療され得る。
【００２１】
ＭＳＩの試験は、当該技術分野で周知の任意の手段によって達成され得る。５つのほぼ単形性のモノヌクレオチド反復マーカー（ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮ０−２７、ＮＲ−２１、およびＮＲ−２４）ならびに２つの高度に多様性のあるペンタヌクレオチド反復マーカー（Ｐｅｎｔａ  ＣおよびＰｅｎｔａ  Ｄ）のマーカーのうちの１つ以上が、試験され得る。使用することができるある商業用システムにおいて、蛍光標識されたプライマー（マーカーパネル）が、上記の指名されたマーカーのうちの７つすべての共増幅のために使用される。断片は、遺伝子型／表現型の割り当ての増幅後に検出される。
【００２２】
ＭＳＩについて試験することができるサンプルは、腫瘍組織、およびある特定の核酸が腫瘍から排せつされる体液を含む。そのような組織および体液中の腫瘍ＤＮＡについての試験は、周知である。
【００２３】
使用することができる抗体のタイプには、免疫チェックポイント阻害剤に対して開発されている任意のものが含まれる。これらは、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。それらは、酵素的切断または組換えＤＮＡ技術によって作製されたものを含む、一本鎖断片または完全抗体の他の断片であってもよい。それらは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥが挙げられるが、これらに限定されない、任意のイソタイプのものであってもよい。抗体は、ヒト、ヤギ、ウサギ、マウス、ウシ、チンパンジーを含む、任意の種源のものであってもよい。抗体は、ヒト化であっても、キメラであってもよい。抗体は、治療用分子であろうとトレーサー分子であろうと、別の部分に結合されるように共役または操作され得る。治療用分子は、例えば、毒素であってもよい。
【００２４】
ＭＭＲの欠損があるおよび欠損のない腫瘍を治療するためのペンブロリズマブの小規模な第２相試験からのデータは、ＭＭＲ欠損腫瘍がＭＭＲ能のある腫瘍よりもＰＤ−１遮断に対してより応答が良いという仮説を支持する。ＭＭＲ欠損は、結腸直腸、子宮、胃、胆道、膵臓、卵巣、前立腺、および小腸の癌を含む、多くの癌において生じる１８、３４〜４２。これらのタイプのＭＭＲ欠損腫瘍を患っている患者はまた、ＰＯＬＤ、ＰＯＬＥ、またはＭＹＨにおける突然変異を有するもののように、患者の腫瘍が他のＤＮＡ修復欠損を含み得るように、抗ＰＤ−１療法からの恩恵を受ける１８、４３、４４。
【００２５】
ＭＭＲ欠損腫瘍が免疫系を刺激する仮説は、新たな見解ではなく４５、ＭＭＲ欠損腫瘍において観察された濃厚な免疫浸潤およびＴｈ１関連のサイトカインリッチな環境によって支持されている１９〜２２、４６。最近の研究は、ＭＭＲ欠損腫瘍微環境が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、およびＩＤＯを含むいくつかの免疫チェックポイントリガンドを強力に発現することを示すことによってこれらの古典的な観察を精緻化し、このことはそれらの活性免疫微環境が腫瘍消失に抵抗する免疫阻害シグナルによって平衡されることを示した４７。ＭＭＲ欠損癌腫と関連した免疫浸潤が新抗原に対して行われたことは、古いおよび新しい見解の両方に対して最も適切な説明であった。黒色腫における抗ＣＴＬＡ−４４１および肺癌における抗ＰＤ−１４８に対するより高度な突然変異負荷およびより高度な奏功率の相関関係は、ＭＡＮＡ認識が内因性抗腫瘍免疫応答の重要な要素であるという考えに対するさらなる支持を提供する。
【００２６】
現在およびこれまでの研究の結果に基づいて、我々は、ＭＭＲ欠損から生じる大いに（２０倍超）増加した数の突然変異関連の新抗原（図１２（表Ｓ４）、また、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅのオンラインでも入手可能であり、参照により本明細書に組み込まれる）が、この遺伝的に定義された癌の一部の増強された抗ＰＤ−１応答性への基盤であることを示唆している。結合親和性のコンピュータ内の予測のみに基づいた腫瘍における突然変異関連の新抗原の数の我々の推量を通して、この示唆は、ＭＭＲ能のある腫瘍がＭＭＲ欠損腫瘍よりもリンパ球の浸潤がはるかに少なかったという観察と一致する（図７（Ｓ６）、図８（Ｓ７）、および図１３（表Ｓ５）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅのオンラインで入手可能であり、参照により本明細書に組み込まれる）。最近の研究４９、５０は、わずかな割合の予測したネオエピトープのみが、ＭＨＣを有する細胞表面上に実際に提示され、内因性Ｔ細胞応答の標的であることを示す。予測された突然変異関連の新抗原の数が実際の突然変異関連の新抗原の数に比例しているが、実際の突然変異関連の新抗原の増加を有する腫瘍が、腫瘍に対して反応するように免疫系を刺激する可能性が高いように思われる。ＭＭＲ欠損腫瘍とＭＭＲ能のある腫瘍との間の抗ＰＤ−１応答性の差の根底にある代替の機序もまた、考慮されるべきである。例えば、ＭＭＲ欠損腫瘍およびＭＭＲ能のある腫瘍において活性化される異なるシグナル伝達経路は、腫瘍微環境内のＰＤ−１経路の活性化差異に生じ得る可溶性因子の分泌における差をもたらし得る２６〜２８。遺伝的な差は、腫瘍関連の自己抗原の発現を変化させ、同様に、腫瘍の抗原性を変化させ得る後成的な差に影響を及ぼし得る。抗原特異的な免疫応答の実験解析および免疫微環境の変化は、ＰＤ−１抗体に対するＭＭＲ欠損腫瘍の著しい応答性に対するこれらの因子の相対的寄与率を定義するのに役立てなければならない。
【００２７】
いくつかの注目に値すべき観察が、この研究の過程においてなされた。第１に、ＣＥＡのような血清タンパク質バイオマーカーの変化は、治療薬の単回投与後の臨床的利点と一致した。ＣＥＡレベルの減少は、数カ月で客観的な放射線学的証拠に先行し、恐らく、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）等の他のバイオマーカーはまた、初期応答の代理マーカーとして有益であり得る５１、５２。第２に、我々の結果は、腫瘍ゲノムの評価が免疫療法を決めるのに役立ち得ることを示唆している。それらは、代替物の数およびタイプが、ＭＭＲ能のある癌においてでさえ、免疫チェックポイント阻害剤の潜在的有用性を判断するのに有用であるのが分かり得るという見解を支持する４１、４８、５３。最も重要なことだが、我々の結果は、すなわち、根底にある腫瘍タイプを問わず、遺伝的状態だけに基づいて特定の種類の腫瘍の治療に対して新規のアプローチを実証する。
【００２８】
上述の開示は、概して、本発明を説明する。本明細書を開示するすべての参照は、参照により明確に組み込まれる。以下の特定の実施例を参照することにより、より完全な理解が得ることができるが、これらの実施例は例示の目的でのみ本明細書に提供され、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００２９】
実施例１
ＭＳＩ試験
ＭＳＩ試験は、アッセイの開発を必要とせずに、すでに標準化され、ＣＬＩＡで認定された実験室において行われる。アーカイブした腫瘍サンプルまたは新たに得られた生検は、ＭＳＩを決定するために使用されよう。ＭＳＩ状態は、ＣＬＩＡで認定された免疫組織化学（ＩＨＣ）または適格性のためのＰＣＲ系試験によって局所的に行われるであろう。評価可能患者は、Ｊｏｈｎｓ  ＨｏｐｋｉｎｓのＰｒｏｍｅｇａからのＭＳＩ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて確認されるであろう。この試験は、５つのほぼ単形性のモノヌクレオチド反復マーカー（ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮ０−２７、ＮＲ−２１、およびＮＲ−２４）における反復単位の挿入または欠失を通してＭＳＩ状態を決定するであろう。少なくとも２つのＭＳＩ遺伝子座は、コホートＡおよびＣにおいて評価が可能であることが必要とされる。患者は、新しいコホートに割り当てられ、および／またはＰｒｏｍｅｇａ試験の結果に基づいて置き換えられ得る。
【００３０】
実施例２
方法
患者
この第２相研究のための治療難治性の進行性転移性癌患者は、３つの参加施設から動員された（表１）。コホートＡは、ＭＭＲ欠損の結腸直腸腺癌を患っている患者からなり、コホートＢは、ＭＭＲ能のある結腸直腸腺癌を患っている患者からなり、コホートＣは、結腸直腸以外のタイプのＭＭＲ欠損癌からなる、３つのコホートが、評価された。
【００３１】
研究の監視
ＮＥＪＭ．ｏｒｇで見出され得るプロトコルは、各施設での施設内治験審査委員会で承認され、研究は、ヘルシンキ宣言およびｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅに従って行われた。すべての患者より、研究登録前に、書面によるインフォームド・コンセントを得た。治験責任医師（Ｄ．Ｌ．）および研究スポンサー（Ｌ．Ａ．Ｄ．）は、研究の監視に関与した。Ｍｅｒｃｋは、研究薬物を提供し、プロトコルおよびこの原稿の最終草案を再検討した。臨床研究は、主に、慈善的支持を通して資金供給された。
【００３２】
研究設計
この第２相試験は、Ｇｒｅｅｎ−Ｄａｈｌｂｅｒｇの二段階設計を用いて行われ、上記の３つの並行コホートからなった。研究薬剤のペンブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ）を、１４日毎に、１０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。ペンブロリズマブは、ＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２との間の相互作用を遮断するＩｇＧ４／カッパイソタイプのヒト化モノクローナル抗ＰＤ−１抗体である。
【００３３】
安全性評価は、各治療前に行われた。全腫瘍量の評価は、各サイクルの開始時に血清バイオマーカーの測定を介して行われた。放射線学的評価は、１２週間で、その後、８週間毎に行われた。臨床的プロトコルに関するさらなる詳細は、実施例３において提供される。
【００３４】
ミスマッチ修復状態の解析
ＭＭＲ経路における遺伝的異常を有する腫瘍は、特に、マイクロサテライトとして知られている反復ＤＮＡの領域で、何千もの体細胞突然変異を宿すことが知られている。ゲノムのこれらの領域における突然変異の蓄積は、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）と称される２６〜２８。ＭＭＲ状態は、ＭＭＲに障害が起きた場合に、エラーをコピーする傾向がある選択されたマイクロサテライト配列の評価を通じて、ＰｒｏｍｅｇａからのＭＳＩ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、腫瘍において評価された２６〜２８。さらなる詳細については、追加の別表を参照のこと。
【００３５】
ゲノムおよびバイオインフォマティクス解析
主要な腫瘍サンプルおよび一致した正常な末梢血標本を、ＭＭＲ欠損を患っている対象およびＭＭＲ能のある癌腫を患っている対象の一部から得、十分な腫瘍組織は、エクソンシークエンシング３０およびＨＬＡハプロタイピングに対して利用可能であった。突然変異体ペプチド結合の可能性を評価するために、個々の患者のＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡハプロタイプと併せた体細胞エクソンデータを、エピトープ予測アルゴリズムに適用した３１、３２。このアルゴリズムは、各腫瘍における突然変異関連の新抗原の総数の推定値を提供した。さらなる詳細は、追加の別表（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅのオンラインで入手可能であり、参照により本明細書に組み込まれる）において提供される。
【００３６】
統計解析
主要評価項目は、コホートＡおよびＢでは、免疫関連応答基準（ｉｒＲＣ）を用いて評価した２０週での免疫関連客観的奏功率（ｉｒＯＲＲ）および免疫関連無増悪生存（ｉｒＰＦＳ）率であった３３。主要評価項目は、コホートＣでは、２０週でのｉｒＰＦＳ率であった。免疫関連基準（すなわち、免疫系療法を評価するために使用される基準）は、放射線学的応答に基づいており、ＲＥＣＩＳＴ基準とは異なり、疾患進行後に疾患の範囲を捕捉し、これらの基準は、図１０（表Ｓ１）中に定義され、ＲＥＣＩＳＴ  ｖ１．１と比較される。２０週間での奏功率およびＰＦＳ率は、ＲＥＣＩＳＴ  ｖ１．１およびｉｒＲＣ（図１０（表Ｓ１））を用いて、この研究において評価され、報告された。ＰＦＳおよび全生存は、カプランマイヤー法によって要約された。仮説の詳細、ヌル仮説を拒絶する決定規則ならびに有効性および無益性に関する早期中止規則、ならびに統計的方法は、追加の別表に提供される。
【００３７】
実施例３
補充方法
患者
この研究に参加するための対象者であるために、患者は、少なくとも１８歳であり、以前に治療された進行癌の証拠を組織学的に確認されていなくてはならない。すべての患者は、登録前に、ＭＭＲの状態の試験を受けた。すべての患者は、固形腫瘍における応答評価基準（ＲＥＣＩＳＴ）、バージョン１．１、米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）のパフォーマンススコアが０または１、ならびに十分な血液、肝臓、および腎機能によって定義されるように、少なくとも１つの測定可能な病変を有した。ＣＲＣを有する適格患者は、少なくとも２つの事前の癌療法を受けていなければならず、他の癌タイプを有する患者は、少なくとも１つの事前の癌療法を受けていなければならない。未治療の脳転移、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、臨床的に重要な腹水症／浸出、または自己免疫疾患の病歴を有する患者は、除外された。
【００３８】
研究の監視
原稿の初期草案は、最終原稿に寄与する著者の一部およびすべての著者によって準備された。すべての著者は、刊行物の原稿を提出することを決定した。治験責任医師および研究スポンサーは、報告されたデータの正確性および完全性、ならびにプロトコルの順守を保証する。
【００３９】
ＨＬＡタイピング
ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃ配列ベースタイピングは、下記のように、３つの異なるステップに分類することができる。Ａジェネリック、Ａ＊０２特異的、Ｂジェネリック、Ｂ群特異的、ＣジェネリックおよびＣ＊０７特異的ＰＣＲ、ならびにシークエンシング混合を、ＪＨＵコア施設においてなされた。Ｃｅｌｅｒａの対立遺伝子ＳＥＱＲ  ＨＬＡ−Ｂ配列ベースのタイピングキットを、ＢジェネリックＳＢＴのために使用した。ＨＬＡ−Ａタイピングスキームは、２つのＰＣＲ反応物、ＡジェネリックおよびＡ＊０２特異的からなる。Ａジェネリック単位複製配列は、部分エクソン１〜部分エクソン５を包含する。Ａ＊０２単位複製配列は、部分エクソン１〜部分エクソン５を包含する。ＨＬＡ−Ｂタイピングスキームは、２つのＰＣＲ反応物、ＢジェネリックおよびＢ群特異的からなる。ＢジェネリックＰＣＲは、エクソン２−エクソン３およびエクソン４−エクソン７を包含する２つのＰＣＲ単位複製配列を含む多重反応物である。Ｂ群特異的単位複製配列は、部分エクソン１〜部分エクソン５を包含する。ＨＬＡ−Ｃタイピングスキームは、２つのＰＣＲ反応物、ＣジェネリックおよびＣ＊０７特異的からなる。ＣジェネリックおよびＣ＊０７特異的単位複製配列は、エクソン１〜７を包含する。
【００４０】
ＨＬＡ−ＡおよびＢ  ＰＣＲの特異性は、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた。ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ酵素は、ＨＬＡ−ＣおよびＣ＊０７  ＰＣＲの混合のために使用される。この酵素は、２つのポリメラーゼ：ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（非プルーフリーディングポリメラーゼ）およびプルーフリーディングポリメラーゼの混合である。この酵素混合は、より大きな完全長ＨＬＡ−Ｃ単位複製配列の十分かつロバストな増幅を生成するために必要である。
【００４１】
ＰＣＲ生成物の精製は、エクソヌクレアーゼＩおよびエビアルカリホスファターゼを用いて行われた。ＡジェネリックおよびＢジェネリックおよび単位複製配列は、エクソン２、３、４に対して双方向で配列決定された。Ｃジェネリック単位複製配列は、エクソン２、３に対して双方向で配列決定され、エクソン１、４、５、６、７に対して単一方向で配列決定された。Ａ＊０２特異的、Ｂ群特異的、およびＣ＊０７特異的単位複製配列は、エクソン２、３に対して単一方向で配列決定された。すべてのシークエンシング反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｖ１．１で行われ、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３５００ＸＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒで配列決定された。Ｃｏｎｅｘｉｏ  Ｇｅｎｏｍｉｃの「Ａｓｓｉｇｎ  ＳＢＴ」対立遺伝子割り当てソフトウェアを用いて、データファイルを処理した。
【００４２】
ミスマッチ修復状態試験１、２
６片の腫瘍および正常（非病変部のリンパ節または縁部の切除）を切断し（各５ミクロン）、脱パラフィン化し（キシレン）、１つはヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＋Ｅ）で染色した。有資格の解剖学的病理学者によって表された少なくとも２０％の腫瘍細胞を含む腫瘍領域は、Ｐｉｎｐｏｉｎｔ  ＤＮＡ単離システム（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いてマクロ解剖し、プロテナーゼＫで８時間消化し、ＤＮＡをＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて単離した。ＭＳＩは、ＭＳＩおよび２−ペンタヌクレオチド反復遺伝子座（ＰｅｎｔａＣおよびＰｅｎｔａＤ）を検出するために、５つの偽単形性モノヌクレオチド反復（ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＮＲ−２１、ＮＲ−２４、およびＭＯＮＯ−２７）からなる、ＭＳＩ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて評価して、製造業者の説明書によって、正常サンプルと腫瘍サンプルとの間の同一性を確認した。５０〜１００ｎｇのＤＮＡの増幅後、蛍光ＰＣＲ生成物は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌキャピラリー電気泳動装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｓｂａｄ，ＣＡ）において大きさ順に並べた。ペンタヌクレオチド遺伝子座は、すべての場合において同一性を確認した。対照は、陰性対照として水を含み、陽性対照として８０％の生殖細胞ＤＮＡと２０％のＭＳＩ癌ＤＮＡの混合物を含んだ。基準の大きさは、各マイクロサテライト遺伝子座に対して決定され、腫瘍は、２つ以上のモノヌクレオチド遺伝子座が生殖細胞ＤＮＡと比較して長さが異なる場合、ＭＳＩとして指定された。
【００４３】
シークエンシング解析
サンプル
ＦＦＰＥ遮断または凍結組織として提供されるサンプルは、腫瘍の細胞質を決定するために病理学的再調査を行った。腫瘍をマクロ解剖して、混濁している正常な組織を除去し、２０％超の腫瘍細胞を含むサンプルをもたらした。一致した正常サンプルを、血液、唾液、または外科的手術から得られた正常組織として提供した。
【００４４】
サンプル調製および次世代のシークエンシング３
サンプル調製、ライブラリー構築、エクソーム捕捉、次世代のシークエンシング、ならびに腫瘍および正常サンプルのバイオインフォマティクス解析は、Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）で行われた。簡潔に言えば、ＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥ組織キットまたはＱｉａｇｅｎ  ＤＮＡ血液ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）を用いて一致した血液または唾液サンプルと共に、凍結またはホルマリンで固定したパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から抽出した。腫瘍および正常サンプルからのゲノムＤＮＡを、製造業者の説明書に従って、または４で前述に記載されるように、断片化し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑライブラリー構築（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のために使用した。簡潔に言えば、１００マイクロリットル（μｌ）のＴＥ中の５０ナノグラム（ｎｇ）〜３マイクログラム（μｇ）のゲノムＤＮＡを、Ｃｏｖａｒｉｓ超音波処理器（Ｃｏｖａｒｉｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）で１５０〜４５０ｂｐの大きさに断片化した。１５０ｂｐよりも短い断片を除去するために、ＤＮＡを、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＩＮ）を用いて、ＰＣＲ生成物対ビーズを１．０対０．９の比率で２回精製し、製造業者の説明書に従って７０％のエタノールを用いて洗浄した。精製し、断片化したＤＮＡを、３６μｌのＨ２Ｏ、１０μｌのＥｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ反応緩衝液、５μｌのＥｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ酵素ミックス（カタログ番号＃Ｅ６０５０，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と混合した。１００μｌのｅｎｄ−ｒｅｐａｉｒ混合物を、２０℃で３０分間インキュベートし、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＩＮ）を用いて、ＰＣＲ生成物対ビーズを１．０対１．２５の比率で精製し、製造業者の説明書に従って７０％のエタノールを用いて洗浄した。Ａテールの４２μｌのｅｎｄ−ｒｅｐａｉｒｅｄ  ＤＮＡに、５μｌの１０Ｘ  ｄＡ  Ｔａｉｌｉｎｇ反応緩衝液および３μｌのＫｌｅｎｏｗ（エキソ−）（カタログ番号＃Ｅ６０５３，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と混合した。５０μｌの混合物を、３７℃で３０分間インキュベートし、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＩＮ）を用いて、ＰＣＲ生成物対ビーズを１．０対１．０の比率で精製し、製造業者の説明書に従って７０％のエタノールを用いて洗浄した。アダプターのライゲーションのため、２５μｌのＡテール処理したＤＮＡを、６．７μｌのＨ２Ｏ、３．３μｌのＰＥ−アダプター（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、１０μｌの５Ｘライゲーション緩衝液、および５μｌのＱｕｉｃｋ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（カタログ番号＃Ｅ６０５６，ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と混合した。ライゲーションの混合物を、２０℃で１５分間インキュベートし、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＩＮ）を用いて、ＰＣＲ生成物対ビーズを１．０対０．９５および１．０の比率で２回精製し、製造業者の説明書に従って７０％のエタノールを用いて洗浄した。増幅ライブラリー��得るために、各２５μｌのＰＣＲを１２個用意し、各々は、１５．５μｌのＨ２Ｏ、５μｌの５×Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ緩衝液、１０ｍＭの各ｄＮＴＰを含有する０．５μｌのｄＮＴＰミックス、１．２５μｌのＤＭＳＯ、０．２５μｌのＩｌｌｕｍｉｎａ  ＰＥプライマー＃１、０．２５μｌのＩｌｌｕｍｉｎａ  ＰＥプライマー＃２、０．２５μｌのＨｏｔｓｔａｒｔ  Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ、および２μｌのＤＮＡを含んだ。使用したＰＣＲプログラムは、９８℃で２分間、９８℃で１５秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を１２サイクル、および７２℃で５分間であった。ＤＮＡを、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＩＮ）を用いて、ＰＣＲ生成物対ビーズを１．０対１．０の比率で精製し、製造業者の説明書に従って７０％のエタノールを用いて洗浄した。エクソームまたは標的領域を、製造業者の説明書に従ってＡｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ｖ．４キット（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いて溶液中に捕捉した。次いで、捕捉したライブラリーを、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅカラム精製キットで精製し、１７μｌの７０℃のＥＢ中に溶出して、１５μｌの補足したＤＮＡライブラリーを得た。（５）捕捉したＤＮＡライブラリーを、以下の方法で増幅した：各々が、１９μｌのＨ２Ｏ、６μｌの５×Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ緩衝液、０．６μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１．５μｌのＤＭＳＯ、０．３０μｌのＩｌｌｕｍｉｎａ  ＰＥプライマー＃１、０．３０μｌのＩｌｌｕｍｉｎａ  ＰＥプライマー＃２、０．３０μｌのＨｏｔｓｔａｒｔ  Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを含む、３０ｕＬのＰＣＲ反応物を８個、および２μｌの補足したエクソームライブラリーを用意した。使用したＰＣＲプログラムは、９８℃で３０秒間；９８℃で１０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を１４サイクル（エクソーム）または１６サイクル（標的）；および７２℃で５分間であった。ＰＣＲ生成物を精製するために、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩ精製キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，ＰＡ）を、製造業者の説明書に従って使用した。エクソームライブラリーについては断片の各エンドから１００塩基、標的ライブラリーについては断片の各エンドから１５０塩基を得る、ペアエンドシークエンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００／２５００およびＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて行った。
【００４５】
次世代のシークエンシングデータの一次処理および推定上の体細胞突然変異３の特定
体細胞突然変異を、適合腫瘍および正常サンプル中の突然変異を特定するために、ＶａｒｉａｎｔＤｘカスタムソフトウェア（Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いて特定した。突然変異のコーリング前に、腫瘍および正常サンプルの両方に対するシークエンスデータの一次処理は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＣＡＳＡＶＡソフトウェア（ｖ１．８）を用いて行い、これには、アダプター配列のマスキングが含まれる。シークエンスの読み込みは、ＥＬＡＮＤを用いてヒト参照ゲノム（バージョンｈｇ１８）に対して整列し、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ方法５を用いて選択領域のさらなる再整列を行った。次いで、点突然変異、挿入、および欠失からなる候補の細胞変異を、ＶａｒｉａｎｔＤｘを用いて、対象となる全エクソームまたは領域にわたって特定した。ＶａｒｉａｎｔＤｘは、適合した正常サンプルに対して腫瘍サンプルの配列アライメントを試験するが、フィルターを適用して、アライメントおよびシークエンシングアーチファクトを除外する。簡潔に言えば、アライメントフィルターを適用して、腫瘍におけるクオリティの悪い読み込み、不対の読み込み、および不良にマッピングされた読み出しを除外した。塩基クオリティフィルターを適用して、腫瘍については３０超、正常のものについては２０超の報告されたｐｈｒｅｄクオリティスコアを有する塩基の含有を制限した。腫瘍における突然変異は、（ｉ）異なる対の読み込みが腫瘍の突然変異を含んだ、（ｉｉ）腫瘍における特定の突然変異を含む異なる対の読み込みの数が、読み込み対のうちの少なくとも１０％であった、（ｉｉｉ）ミスマッチ塩基が適合した正常サンプルにおいて１％超の読み込み中に存在せず、ｄｂＳＮＰ由来の一般の生殖細胞変異体のカスタムデータベース中に存在しなかった、ならびに（ｉｖ）位置が１５０倍超で腫瘍および正常の両方で覆われた場合のみに、候補体細胞突然変異として特定された。パラロガス配列を含む、間違った位置のゲノムアライメントから生じる突然変異は、参照ゲノムを探索することによって特定され、除外された。
【００４６】
候補の体細胞突然変異を、遺伝子アノテーションに基づいてさらにフィルターをかけて、タンパク質をコードする領域に生じるものを特定した。機能的結果を、ｓｎｐＥｆｆ、ならびにＵＣＳＣからのｈｇ１８において最新の転写バージョン（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）を用いたＣＣＤＳ、ＲｅｆＳｅｑ、およびＥｎｓｅｍｂｌアノテーションのカスタムデータベースを用いて予測した。この予測は、正準開始および終止コドンを有する好ましい転写、および利用可能である場合に、Ｅｎｓｅｍｂｌにわたって、ＣＣＤＳまたはＲｅｆｓｅｑ転写を指示した。最後に、突然変異を濾過して、イントロンおよびサイレント変化を除外したが、残りの突然変異は、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、フレームシフト、またはスプライス部位の変異を生じた。手動の目視検査ステップを用いて、人為的変化をさらに排除した。
【００４７】
突然変異体ペプチドＭＨＣ結合予測
アミノ酸変化をもたらすと予測された体細胞のフレームシフト、挿入、欠失、およびミスセンス突然変異は、個々の患者のＨＬＡハプロタイプに基づいて、ＭＨＣクラスＩ結合の可能性について分析した。我々の初期解析は、ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂに焦点を当てた。アミノ酸の突然変異は、それらの対応するＣＣＤＳ受入番号に連結させ、これが入手できない場合には、Ｒｅｆｓｅｑまたはアンサンブル転写物を使用して、タンパク質配列を抽出した。８量体、９量体、および１０量体エピトープを特定するために、各突然変異を取り囲むアミノ酸断片を特定した。これらの１５、１７、および１９個の突然変異体のアミノ酸断片は、エピトープ予測プログラムＮｅｔＭＨＣ  ３．４．６によって分析された。５０ｎｍ未満の予測された親和性を有するエピトープは、強い潜在性がある結合剤であると考えられ、５００ｎｍ未満の予測された親和性を有するエピトープは、ＮｅｔＭＨＣグループ６によって示唆されるように、弱い潜在性がある結合剤であると考えられた。
【００４８】
全新抗原負荷をさらに精緻化するために、我々は、各突然変異体ペプチドに対して相補的野生型ペプチドと同じプロセスを繰り返した。次いで、相補的野生型ペプチドが弱い潜在性がある結合剤であると予測された場合に、強い潜在性がある結合剤であった突然変異体ペプチドについてフィルターをかけた。これらの突然変異体ペプチドは、突然変異関連の新抗原（ＭＡＮＡ）と称される。患者が、ＮｅｔＭＨＣ  ３．４によって支持されない（例えば、症例１、１７、および２１）の単一のＭＨＣハロタイプを有する場合に、個々のハロタイプは、我々の分析には含まれなかった。
【００４９】
統計方法
試験７の設計
この試験は、抗ＰＤ−１療法のための治療選択マーカーとしてのＭＫ−３４７５およびＭＳＩの有効性を同時に評価するために、並行の二段階設計を用いて行われた。それは、次に記載される３つのコホートの患者における並行の二段階第２相研究からなった。研究薬剤のＭＫ−３４７５を、１４日毎に、１０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。
【００５０】
コホートＡおよびＢの各々において、共一次エンドポイントは、２０週で無増悪生存率（ｉｒＰＦＳ）であり、客観的応答（ｉｒＯＲ）は、免疫関連基準を用いて評価した。ステップダウンのゲートキーピングの手順を使用して、全タイプＩのエラーを保存した。二段階のＧｒｅｅｎ−Ｄａｈｌｂｅｒｇ設計を使用して、中間および最終分析はそれぞれ、１５人および２５人の患者でｉｒＰＦＳを評価した。段階１で、２０週間で１５の無増悪のうちの１つ以上が、第２段階に進むことが必要とされ、２０週間で２５の無増悪のうちの４つ以上が、ｉｒＯＲのための試験に進むことが必要とされ、２５の応答者（ｉｒＣＲまたはｉｒＰＲ）のうちの４つ以上が、そのコホートにおける有望な有効性を示した。各コホートは、２０週で４つ以上の無増悪および４つ以上の応答が確認されるとすぐに、有効性のために終了され得たか、または段階１において１５のうちの０が２０週で無増悪であるか、または２２人以上の対象が２０週で疾患の増悪を有するとすぐに、無益であるため終了され得る。この設計は、２０週間で２５％のｉｒＰＦＳ率を検出するために９０％の検出力および２１％のｉｒＯＲ率（ｉｒＯＲＲ）を検出するために８０％の検出力を達成し、２０週間で５％のｉｒＰＦＳ率および５％ｉｒＯＲＲの帰無仮説で０．０５の全タイプＩエラーを有する。
【００５１】
コホートＣについては、主要評価項目は、２０週でｉｒＰＦＳであった。２段階のＧｒｅｅｎ−Ｄａｈｌｂｅｒｇの２段階設計が、中間および最終分析後に１４および２１人の患者に使用され、段階１で、２０週間で１４の無増悪のうちの１つ以上が、第２段階に進むことが必要とされ、最後には、２０週間で２１の無増悪のうちの４つ以上が、コホートＣにおいて十分な有効性を示した。コホートは、２０週間で４つ以上の無増悪が確認されるとすぐに、終了され得る。この設計は、２０週間で２５％のｉｒＰＦＳ率を検出するために８１％の検出力を有し、２０週間で５％のｉｒＰＦＳ率の帰無仮説で５％のタイプＩエラーを有する。
【００５２】
統計分析
応答および進行は、ＲＥＣＩＳＴ  ｖ１．１、および二次元の腫瘍測定の積の合計を使用し、新しい病変をこの合計に取り込む、Ｗｏｌｃｈｏｋら８から採用された免疫関連応答基準（ｉｒＲＣ）を用いて評価された。２０週での無増悪生存（ＰＦＳ）率およびｉｒＰＦＳ率は、ペンブロリズマブの開始から２０週後に無疾患増悪であり、かつ生存していた患者の割合として推定された。２０週前に疾患の進行を有した、または研究データが照合された時点で２０週を超えて登録された患者は、２０週のＰＦＳ（ｉｒＰＦＳ）率を推定するためにこの解析に含まれた。毒性または疾患の悪化により早期に脱落し、それ故に、２０週での腫瘍評価を有さなかった患者は、進行性疾患を有すると見なされた。ＯＲＲ（ｉｒＯＲＲ）は、ＣＲまたはＰＲ（ｉｒＣＲまたはｉｒＰＲ）の最良の全体応答を達成した患者の割合であった。腫瘍の応答評価を有するのに十分長い研究に携わった患者は、奏功率を推定するための解析に含まれた。応答した者（ＣＲまたはＰＲ）のうち、応答の持続時間は、初めのＲＥＣＩＳＴ応答から疾患の進行の時間であり、進行しなかった応答者における最後の評価可能な腫瘍評価で打ち切られた。
【００５３】
ＰＦＳおよびｉｒＰＦＳは、初期投与した日から疾患が進行した日または何らかの病因により死亡した日のどちらかが初めに生じたまでの期間として定義された。ＰＦＳおよびｉｒＰＦＳは、生存し、かつ無増悪であった患者に対して進行性疾患の不在を文書化する最後の評価可能な腫瘍を評価した日で打ち切られた。全生存（ＯＳ）は、初期投与した日から何らかの病因により死亡した日までの期間として定義された。解析の期間に依然として生存していた患者については、ＯＳ期間は、患者が生存していることが知られていた最終日で打ち切られた。生存期間は、カプランマイヤー法によって要約された。事後解析として、ログランク検定は、コホートＡおよびＢを比較するために使用され、ハザード比は、Ｃｏｘモデルに基づいて推定された。
【００５４】
１サイクル後のＣＥＡ割合の低下と、ＰＦＳまたはＯＳとの関係は、Ｃｏｘ回帰モデルに基づいた画期的な解析を用いて評価された。相関研究のために、非パラメトリックＷｉｌｃｏｘｏｎ検定は、ＭＭＲ欠損患者とＭＭＲ能のある患者との間の突然変異負荷を比較するために使用された。応答および生存期間におけるベースラインの突然変異負荷および免疫マーカーの効果は、それぞれ、ロジスティック回帰およびＣｏｘ回帰を用いて試験された。
【００５５】
免疫組織化学および画像解析
Ｂ７−Ｈ１の発現の膜パターンおよび侵襲最深部での割合を示す悪性細胞の画分は、これまでに報告されたように、３人の病理学者（Ｒ．Ａ．Ａ．、Ｆ．Ｂ．、およびＪ．Ｍ．Ｔ．）によって定量化された９，１０。画像解析は、ＣＤ８のジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で染色した細胞の数を決定するために使用された。各症例については、Ｈ＆Ｅで染色したスライドを使用して、以下の領域を特定した：ｉ）腫瘍、ｉｉ）侵襲最深部（悪性組織と非悪性組織との間の境界）、およびｉｉｉ）正常な組織。ＣＤ８で染色したスライドを、Ａｐｅｒｉｏ  ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＡＴ上で２０倍の同等倍率（１ピクセル当たり０．４９マイクロメートル）で走査した。腫瘍、侵襲最深部、および正常な組織（上の、Ｈ＆Ｅより）に対応する領域は、Ａｐｅｒｉｏ  ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅ  ｖ１２．１．０．５０２９を用いて別々の層上に注釈を付けた。
【００５６】
ＣＤ８陽性リンパ球密度は、ＰＩＰ１１において実施されたカスタムアルゴリズムを用いて上の領域のそれぞれにおいて算出された。結果は、ＶＩＰＳライブラリー１２を用いてＤｅｅｐｚｏｏｍ画像に変換し、ＯｐｅｎＳｅａｄｒａｇｏｎビューアー（ｈｔｔｐ：／／ｏｐｅｎｓｅａｄｒａｇｏｎ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ）を用いて可視化した。
【００５７】
実施例３のみの参照文献
2019142881.tif 000002
2019142881.tif 000003
【００５８】
実施例４
患者
４１人の継続的な患者を、２０１３年９月から２０１５年１月まで登録し、治療した（表１）。動員は、治験選択肢を追求して、ミスマッチ修復を有する腫瘍を患っていることが分かっている患者、または不明の状態の腫瘍を患っており、試験した患者を含んだ。ＭＭＲ欠損ＣＲＣコホートにおける１人の患者を、グレード３のビリルビンレベルを可能にするＩＲＢの適格の権利放棄下で登録した。合計３２人のＣＲＣ患者を、コホートＡおよびＢに登録した。１回の化学療法および１回（非ＰＤ１系）免疫療法のレジメンを受けたことがある１人のＭＭＲ能のある患者を除いて、すべてのＣＲＣ患者は、２回以上の事前化学療法レジメン（中央値＝４）を受けた。
【００５９】
ＣＲＣ以外のＭＭＲ欠損の固形腫瘍があると診断された９人の対象を、コホートＣに登録した。コホートＣの患者は、１回以上の事前化学療法レジメン（中央値＝２）を受けた。
【００６０】
実施例５
主要評価項目の評価
コホートＡにおいては、２０週でのｉｒＯＲＲおよびｉｒＰＦＳ（図１１（表Ｓ２））は、４０％（１０人の患者のうち４人、９５％信頼区間、１２〜７４％）および７８％（９人の患者のうち７人、９５％信頼区間、４０〜９７％）であり、コホートＣにおいては、７１％（７人の患者のうち５人、９５％信頼区間、２９〜９６％）および６７％（６人の患者のうち４人、９５％信頼区間、２２〜９６％）であった。ＭＭＲ能のあるＣＲＣからなるコホートＢにおいて、ｉｒＯＲＲおよび２０週間でのｉｒＰＦＳは、０％（９５％ＣＩ、０〜２０％）および１１％（１８人の患者のうち２人、９５％信頼区間、１〜３５％）であった。ＭＭＲ欠損のコホートＡおよびＣの両方は、４人の対象が２０週で無疾患進行であり、４つの客観的応答が免疫関連応答基準（図１１（表Ｓ２）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅのオンラインで入手可能であり、参照により本明細書に組み込まれ、上の補充方法）に基づいて観察された場合に、有効性においてそれらの所定の早期中止規則に達した。
【００６１】
患者に対する追跡期間の中央値は、ＭＭＲ欠損ＣＲＣを患っている患者（コホートＡ）については、３２週間（範囲、５〜５１週間）であり、ＭＭＲ能のあるＣＲＣを患っている患者（コホートＢ）については、１２週間（範囲、２〜５６週間）であり、ＭＭＲ欠損の非ＣＲＣ腫瘍を患っている患者（コホートＣ）については、１２週間（範囲、４〜４２週間）であった。２０週間でのｉｒＰＦＳに対して評価可能なすべての患者は、少なくとも２０週間追跡調査された。
【００６２】
実施例６
放射線学的評価
コホートＡにおいて１０人の評価可能なＭＭＲ欠損ＣＲＣ患者のうち、４人（４０％；９５％信頼区間、１２〜７４％）は、ＲＥＣＩＳＴ基準によって客観的応答を達成した（表２、図１および図３（Ｓ２））。患者は、１２週間の走査が行われなかった場合、評価が不可能であったと見なされた。疾患制御率は、客観的応答を達成し、疾患が安定していた患者の割合として定義され、コホートＡにおいて９０％であった（１０人の患者のうち９人、９５％信頼区間、５５〜１００％）。
【００６３】
コホートＣにおいて登録されたＣＲＣ以外のＭＭＲ欠損の癌タイプを有する７人の評価可能な患者のうち、５人（７１％、９５％信頼区間、２９〜９６％）が、ＲＥＣＩＳＴ基準を用いて客観的応答（表２、図３（Ｓ２）および図１）を達成し、疾患制御率は、７１％（７人の患者のうち５人、９５％信頼区間、２９〜９６％）であった。
【００６４】
コホートＣの患者は、コホートＡの患者よりも速く応答した（１２対２８週間のＲＥＣＩＳＴによる応答までの期間中央値、ｐ＝０．０３）。さらに、リンチ症候群と関連しなかった６つすべてのＭＭＲ欠損腫瘍（１００％）は、客観的応答を達成したが、リンチ症候群と関連した１１個の腫瘍のうち３個のみ（２７％）が応答した（表Ｓ３、ｐ＝０．００９、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅのオンラインでも入手可能であり、参照により本明細書に組み込まれる）。その他のベースラインの特徴付けは、客観的応答との統計学的に有意な関連を示さなかった。
【００６５】
コホートＢにおいてＭＭＲ能のあるＣＲＣを患っている１８人の患者のうち、ＲＥＣＩＳＴ基準を用いた客観的応答は観察されず（表２、図３（Ｓ２）および図１）、疾患制御率は１１％（１８人の患者のうち２人、９５％信頼区間、１〜３５％）であった。
【００６６】
ＲＥＣＩＳＴ基準によって応答を達成したすべての患者（図１１（表２））はまた、免疫関連応答基準によっても応答を達成した（図１１（表Ｓ２））。
【００６７】
実施例７
生存
コホートＡにおいて、ＭＭＲ欠損ＣＲＣを患っている患者は、無増悪生存率（ＰＦＳ）中央値および全生存（ＯＳ）中央値に達しなかった（図２）。対照的に、コホートＢにおけるＭＭＲ能のある癌を患っている患者は、わずか２．２カ月のＰＦＳ（９５％信頼区間、１．４〜２．８）、および５．０カ月のＯＳ中央値（９５％信頼区間、３．０〜評価不能）を達成した。コホートＣ（ＭＭＲ欠損の非ＣＲＣ）において、ＰＦＳ中央値は、５．４カ月（９５％信頼区間、３〜評価不能）であり、ＯＳ中央値に達しなかった。
【００６８】
ＭＭＲ欠損およびＭＭＲ能のあるＣＲＣのコホートの事後（図２）比較は、疾患の進行に対してハザード比（ＨＲ）（ＨＲ＝０．１０、９５％信頼区間、０．０３〜０．３７、ｐ＜０．００１）および全生存（ＨＲ＝０．２２、９５％信頼区間、０．０５〜１．００、ｐ＝０．０５）、ＭＭＲ欠損ＣＲＣを患っている候補患者を示した。
【００６９】
生存の差が予後の差によるものであり得るかどうかを評価するために、患者が転移性疾患があると診断されている期間の持続時間、および登録前に、患者のこれまでのレジメンにおける患者の臨床成績を測定した。患者のこれまでのレジメンにおける、転移性疾患の持続時間（ｐ＝０．７７、ログランク検定）またはＰＦＳ中央値（ｐ＝０．６０、ログランク検定）に関して、ＭＭＲ欠損ＣＲＣ患者対ＭＭＲ能のあるＣＲＣ患者間で有意な差がないことを見出した（図４（Ｓ３））。また、初期診断以来の経過時間を調節する、ＭＭＲ欠損ＣＲＣとＭＭＲ能のある腫瘍との間の結果の差を試験するために、ＰＦＳおよびＯＳのさらなる多変量分析を行った。ＭＭＲ欠損腫瘍とＭＭＲ能のある腫瘍との間のペンブロリズマブの異なる効果を表す、ＰＦＳ（ＨＲ０．０４、９５％信頼区間  ０．０１〜０．２１、Ｐ＜０．００１）およびＯＳに対するハザード比の大きさ（ＨＲ０．１８、９５％信頼区間  ０．０３〜１．０１、Ｐ＝０．０５）は、この潜在的差異に対して調節した後に、維持された。
【００７０】
実施例８
安全性評価
５％超の患者に生じる有害事象を表３に列記する。選択有害事象は、発疹／掻痒症（２４％）、甲状腺炎／甲状腺機能低下症／下垂体炎（１０％）、および無症候性膵炎（１５％）を含んだ。数は少なかったが、甲状腺機能の異常は、ＭＭＲ欠損のコホートに制限された（表３）。
【００７１】
実施例９
腫瘍マーカー
２つのＣＲＣコホートにおいて、ベースラインのＣＥＡレベルが評価可能であり、登録前の３２人の患者のうちの２９人において、正常（３ｍｇ／ｄｌ）の上限を上回った。主なＣＥＡの低下は、ＭＭＲ欠損ＣＲＣを患っている１０人の患者のうちの７人に生じ、ＭＭＲ能のあるＣＲＣを患っている１９人の患者のいずれにも生じず、ＣＥＡが評価可能であった（図１および図５（Ｓ４））。非ＣＲＣのＭＭＲ欠損患者において、腫瘍マーカーレベル（ＣＥＡ、ＣＡ１９−９またはＣＡ−１２５）は、４人の患者において正常の上限を上回って上昇した。７０％超のＣＡ１９−９またはＣＡ−１２５の低下は、これらの４人の患者のうちの３人において生じた。すべて３つのコホートの腫瘍マーカー動力学を図１に示す。ペンブロリズマブの１回の投与後（１４日目〜２８日目）のＣＥＡのレベルの低下は、無増悪（ｐ＝０．０１）および全生存転帰（ｐ＝０．０２）の両方を予測した。ＣＥＡ応答は、疾患制御の放射線学的確認より前に十分に生じた（範囲、１０〜３５週間）。対照的に、進行した患者は、治療薬を介しする３０日以内に、急速なバイオマーカーの上昇を示した。それ故に、ＣＥＡレベルの変化は、有意に先行し、最終的な放射線学的変化と相関していた。
【００７２】
実施例１０
ゲノム解析
全エクソーム配列の解析は、ＭＭＲ能のある患者（ｎ＝６）における１腫瘍当たり７３個の突然変異と比較して、ＭＭＲ欠損患者（ｎ＝９）における１腫瘍当たり１，７８２個の体細胞突然変異の平均を示した（非パラメトリックＷｉｌｃｏｘｏｎ検定、ｐ＝０．００７）（図６Ａ〜６Ｂ（Ｓ５）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅのオンラインで入手可能である表Ｓ３も参照のこと、参照により本明細書に組み込まれる）。これらの突然変異の大部分（６３％）は、アミノ酸を改変することが予想される。
【００７３】
次いで、これらの突然変異は、各患者の個々のＭＨＣハロタイプの文脈においてそれらの免疫原性の潜在性について評価された。それによって、ＭＭＲ欠損患者およびＭＭＲ能のある患者の腫瘍から、それぞれ、５７８個および２１個の潜在的な突然変異関連の新抗原の平均を特定した（表Ｓ３、これはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅのオンラインで入手可能であり、参照により本明細書に組み込まれる）。すべての体細胞突然変異のうちで、潜在的な突然変異関連の新抗原の割合は、両コホートにおいて同様であった（ＭＭＲ欠損患者およびＭＭＲ能のある患者において、それぞれ、３２％および２９％の平均化）。体細胞突然変異および突然変異関連の新抗原の増加は、改善された無増悪生存率および客観的応答を支持する傾向と関連した（図１３（Ｓ５）および図１２（表Ｓ４）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅのオンラインでも入手可能であり、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００７４】
実施例１１
免疫組織化学
ＣＤ８およびＰＤ−Ｌ１の発現は、腫瘍内で、および腫瘍組織が入手可能である（図７（Ｓ６）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅのオンラインでも入手可能であり、参照により本明細書に組み込まれる）３０症例における腫瘍の侵襲最深部で免疫組織化学によって評価された。コホートＡおよびＣにおいて患者からの腫瘍は、コホートＢの患者からの腫瘍に含まれるよりもより密度の高いＣＤ８陽性リンパ細胞を含み（図８（Ｓ７）；ｐ＝０．１０）、ＣＤ８の標識化は、傾向が好ましい客観的応答および安定疾患と関連した（図９（Ｓ８）および図１３（表Ｓ５）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅのオンラインでも入手可能であり、参照により本明細書に組み込まれる）。このＣＤ８陽性リンパ細胞浸潤は、特に、腫瘍の侵襲最深部で顕著であった（図８（Ｓ７）、ｐ＝０．０４）。有意な膜ＰＤ−Ｌ１発現は、ＭＭＲ欠損患者のみに生じ、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）において顕著であり、腫瘍関連マクロファージは、腫瘍の侵襲最深部に位置した（図８（Ｓ７）、ｐ＝０．０４）。ＣＤ８およびＰＤ−Ｌ１の発現は、ＰＦＳまたはＯＳで統計的に関連しなかった（図１３（表Ｓ５））。
【００７５】
（表１）患者の人口統計学的およびベースラインの特徴
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ＭＭＲ、ミスマッチ修復；ＣＲＣ、結腸直腸癌
１ＭＭＲ欠損ＣＲＣ対ＭＭＲ能のあるＣＲＣ
２ＥＣＯＧ、米国東海岸癌臨床試験グループ
【００７６】
（表２）客観的ＲＥＣＩＳＴ応答
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１元は１２週でＰＲ、２０週でＣＲに変換
２１２週間での１つのＰＲ
３患者は、臨床的進行による１２週間の走査が行われなかった場合、評価が不可能であると見なされた。
４疾患制御率は、完全寛解、部分応答、または安定疾患を１２週間以上有した患者の割合として定義された。
５ＭＭＲ能のあるＣＲＣ患者に対して記録された応答なし
【００７７】
（表３）薬物関連の有害事象
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１５％超の患者に生じる有害事象
２膵炎のすべての症例は、無症候性であった。
３肺炎１事象発生（２％）
【００７８】
参照文献
言及された各参照文献の開示は、本明細書に明示的に組み込まれる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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