(57)【要約】【課題】  サナギタケ（Cordyceps militaris）の培養方法、その培養物からの生理活性物質の抽出方法及び活性の種類、並びにその培養物又はその培養物からの抽出物を含有する組成物を提供すること。貧血、特に腎性貧血の予防又は治療に有用な、エリスロポエチン誘導作用を示す組成物を提供すること。【解決手段】  サナギタケ菌糸体を固体培地又は液体培地で培養し、培養物を得、その培養物そのもの又はその培養物からの抽出物を使用して、エリスロポエチン誘導作用を示す組成物を製造する。貧血の予防又は治療のために、この組成物を摂取させる。【選択図】  図５
2019167326.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サナギタケ（Cordyceps militaris）の培養物又はその培養物からの抽出物を含有する、エリスロポエチン誘導作用を示す組成物。
【請求項２】
サナギタケの培養物が菌糸体培養物である、請求項１に記載のエリスロポエチン誘導作用を示す組成物。
【請求項３】
サナギタケ培養物が、固体培地で培養された培養物を含む、請求項１又は２に記載のエリスロポエチン誘導作用を示す組成物。
【請求項４】
固体培地が虫体を含む、請求項３に記載のエリスロポエチン誘導作用を示す組成物。
【請求項５】
さらに白血球数増加作用を示す、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のエリスロポエチン誘導作用を示す組成物。
【請求項６】
医薬品又は飲食品である、請求項１乃至５のいずれか一項に記載のエリスロポエチン誘導作用を示す組成物。
【請求項７】
蛋白質及び穀類を含む固体培地にサナギタケ（Cordyceps militaris）の種菌を接種し、菌糸体を培養する工程（Ｉ）を含む、エリスロポエチン誘導作用を示す組成物の製造方法。
【請求項８】
さらに、工程（Ｉ）を経て得られたサナギタケの固体培養物から、エリスロポエチン誘導作用を示す成分を含む抽出液を得る工程（ＩＩ）を含む、請求項７に記載のエリスロポエチン誘導作用を示す組成物の製造方法。
【請求項９】
工程（ＩＩ）が、濃度が２０乃至５０重量％のエタノールを用い、加温抽出及び加熱抽出を行う工程を含む、請求項７又は８に記載のエリスロポエチン誘導作用を示す組成物の製造方法。
【請求項１０】
蛋白質が、虫体由来の蛋白質を含む、請求項７乃至９のいずれか一項に記載のエリスロポエチン誘導作用を示す組成物の製造方法。
【請求項１１】
ブドウ糖、酵母エキス、米糠、酒粕、大豆粉、アスパラギン酸ナトリウム、無機質及び水を含む液体培地にサナギタケ（Cordyceps militaris）の種菌を接種し、菌糸体を培養する工程（１）を含む、エリスロポエチン誘導作用を示す組成物の製造方法。
【請求項１２】
さらに、工程（１）を経て得られたサナギタケの液体培養物から、エリスロポエチン誘導作用を示す成分を含む抽出液を得る工程（２）を含む、請求項１１に記載のエリスロポエチン誘導作用を示す組成物の製造方法。
【請求項１３】
工程（２）が、工程（１）を経て得られたサナギタケの液体培養物にエタノールを添加し、加温抽出及び加熱抽出を行う工程を含み、ここで、液体培養物とエタノールとを含む液体中のエタノール濃度が２０乃至５０重量％である、請求項１２に記載のエリスロポエチン誘導作用を示す組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エリスロポエチン誘導作用を示すサナギタケ培養物又はその培養物からの抽出物を含有する組成物、及びその組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
第二次世界大戦後、日本は高度成長期を経て所得水準が上がり、食生活の改善がなされたが、同時に高カロリー摂取による糖尿病の発症率も上昇し、これによる余病の発生率も年々増加している。そのような余病の中でも、腎臓疾患の発生は特に顕著であり、腎性貧血や透析患者数は年々増加傾向にある。
【０００３】
腎機能の低下は、造血因子の一種であり、主として腎臓で産生されているエリスロポエチンの不足を来し、その結果として腎性貧血をもたらす。また、近年は、各種スポーツの普及に伴い、プロスポーツ選手はもとよりアマチュアのスポーツ選手も各種場面で活躍する時代となった。種々のスポーツは楽しさもあるが、記録や勝敗の世界では身体の鍛え方や練習も年々ハードになり、スポーツマンといえども貧血者が続出しているのが実情といわれている。
【０００４】
ところで、中医学の分野においては、従来より虫草類のキノコ（中草菌）、中でも冬虫夏草（Cordyceps sinensis (Berkeley) Saccardo）という菌が使用されてきたが、その天然ものは絶滅状態に近くなった。そのため、その他の虫草類が、冬虫夏草の代用品としての有用性を探るべく、培養方法、生理活性及びその生理活性を示す有効成分等について研究されてきている。
【０００５】
特許文献１には、サナギタケ（Cordyceps militaris (Vuill.)）子実体の人工培養方法と、その子実体には、その生理活性物質として、アデノシン及び抗腫瘍活性を示すコルジセピンが含有されていることが開示されている。特許文献１には、サナギタケ菌糸体（培養種菌）の培養液として、グルコース、ペプトン、ポテトエキス、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び蒸留水を含むものが、また、サナギタケ子実体の培養培地として、おから、米糠及び大豆かすを含むものが開示されている。
【０００６】
特許文献２には、虫草類のハナサナギタケ（Isaria japonica Yasuda）又はツクツクボウシタケ（Isaria sinclairii (Berk.) Lloyd）からの培養物乾燥粉末の製造方法と、これらのキノコの培養物もしくは抽出物、又は処理物には、サイトカイン産生増強剤が含有されていることが記載されている。特許文献２には、ハナサナギタケやツクツクボウシタケの培養物は、サイトカイン中、ＧＭ−ＣＳＦの産生増強効果を示し、ＧＭ−ＣＳＦは、白血球の造血機能を上昇する働きがあることも記載されている。また、特許文献２には、ハナサナギタケやツクツクボウシタケの大量培養液体培地として、グルコース及び乾燥酵母を含む液体培地が開示されている。
【０００７】
特許文献３には、コルジセプス・ミリタリス（Cordyceps militaris）の培養菌糸体の培養濾液及び／又はその菌糸体の溶媒抽出物を含有してなることを特徴とする組成物が開示されている。特許文献３には、この組成物は、おだやかな強心作用及び気管支拡張作用ないし鎮咳作用を併有する旨が記載されている。また、特許文献３には、コルジセプス・ミリタリスの液体培養培地として、Ｍ２０Ｙ２培地（１００ｍＬ中の組成：麦芽エキス２ｇ、酵母エキス０．２ｇ；ｐＨ５．５）が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第５８００２１１号公報
【特許文献２】特開２００５−１０４８４８号公報
【特許文献３】特開平８−１２５８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
虫草類には様々な生理活性物質が含有されている可能性がある。したがって、本発明の目的は、虫草類中、サナギタケ（Cordyceps militaris）の培養方法を検討するとともに、その培養物からの生理活性物質の抽出方法、及びその培養物又は抽出物中に含まれる物質の生理活性を検討することにより、サナギタケの新たな有用性を見出すことにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、サナギタケ（Cordyceps militaris）について、その培養方法を検討するとともに、その培養物からの生理活性物質の抽出方法、及びその培養物又は抽出物中に含まれる物質の生理活性を検討し、その結果として本発明を完成させた。
【００１１】
即ち、本発明は、以下の組成物に関する：
（１）サナギタケ（Cordyceps militaris）培養物又はその培養物からの抽出物を含有する、エリスロポエチン誘導作用を示す組成物；
（２）サナギタケ培養物が菌糸体培養物である、（１）に記載の組成物；
（３）サナギタケ培養物が、固体培地で培養された培養物を含む、（１）又は（２）に記載の組成物；
（４）固体培地が虫体を含む、（３）に記載の組成物；
（５）さらに白血球数増加作用を示す、（１）乃至（４）のいずれかに記載の組成物；及び
（６）医薬品又は飲食品である、（１）乃至（５）のいずれかに記載の組成物。
【００１２】
また、本発明は、以下のエリスロポエチン誘導作用を示す組成物の製造方法に関する：
（７）蛋白質及び穀類を含む固体培地にサナギタケ（Cordyceps militaris）の種菌を接種し、菌糸体を培養する工程（Ｉ）を含む、エリスロポエチン誘導作用を示す組成物の製造方法；
（８）さらに、工程（Ｉ）を経て得られたサナギタケの固体培養物から、エリスロポエチン誘導作用を示す成分を含む抽出液を得る工程（ＩＩ）を含む、（７）に記載の製造方法；
（９）工程（ＩＩ）が、濃度が２０乃至５０重量％のエタノールを用い、加温抽出及び加熱抽出を行う工程を含む、（７）又は（８）に記載の製造方法；及び
（１０）蛋白質が、虫体由来の蛋白質を含む、（７）乃至（９）のいずれかに記載の製造方法。
【００１３】
さらに、本発明は、以下のエリスロポエチン誘導作用を示す組成物の製造方法に関する：
（１１）ブドウ糖、酵母エキス、米糠、酒粕、大豆粉、アスパラギン酸ナトリウム、無機質及び水を含む液体培地にサナギタケ（Cordyceps militaris）の種菌を接種し、菌糸体を培養する工程（１）を含む、エリスロポエチン誘導作用を示す組成物の製造方法；
（１２）さらに、工程（１）を経て得られたサナギタケの液体培養物から、エリスロポエチン誘導作用を示す成分を含む抽出液を得る工程（２）を含む、（１１）に記載の製造方法；及び
（１３）工程（２）が、工程（１）を経て得られたサナギタケの液体培養物にエタノールを添加し、加温抽出及び加熱抽出を行う工程を含み、ここで、液体培養物とエタノールとを含む液体中のエタノール濃度が２０乃至５０重量％である、（１２）に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の組成物は、エリスロポエチン誘導作用を示し、且つ安全性が高いので、飲食品又は医薬品として、腎性貧血の予防又は治療に有効である。
【００１５】
白血球数増加作用をも示す本発明の組成物においては、エリスロポエチン誘導作用と相俟って、さらに優れた造血効果が期待できる。
【００１６】
本発明の組成物は、サナギタケ菌糸体の培養物から調製することができ、また、サナギタケ菌糸体は人工培養できるので、原材料を安定的に供給できる。
【００１７】
サナギタケ培養物からの有効成分の抽出は、比較的穏やかな条件下で実施可能であるという効果もある。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１−１乃至１−４は、Cordyceps militaris FT26K3のITS-5.8S rDNAの解析結果報告書である。
【図２】図２−１乃至２−７は、Cordyceps militaris KT16514のITS-5.8S rDNAの解析結果報告書である。
【図３】図３は、ＣＭ−Ａ投与マウスのへパリン加血漿エリスロポエチン濃度を示すグラフである。
【図４】図４は、ＣＭ−Ｂ投与マウスのへパリン加血漿エリスロポエチン濃度を示すグラフである。
【図５】図５は、ＣＭ−Ａ投与マウスのへパリン加血漿エリスロポエチン濃度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の組成物は、虫草類のサナギタケ（Cordyceps militaris）の培養物又はその培養物からの抽出物を含有する。サナギタケには、図１−２及び１−３並びに図２−４及び２−５に記載されているもの等、多くの株が知られているが、いずれを使用してもよい。また、図１−１乃至１−４に示すように、これらの公知の株と遺伝子的に高い相同率を有するCordyceps militaris FT26K3や、図２−１乃至２−７に示すように、これらの公知の株と遺伝子的に高い相同率を有するCordyceps militaris KT16514も使用することができる。なお、これらの菌株名は、本発明者らが命名したものである。
【００２０】
Cordyceps militaris FT26K3は、福島県内の山林に自生したサナギタケ子実体より、菌糸体の純粋分離に成功した菌株である。また、Cordyceps militaris KT16514は、栃木県内の山林に自生したサナギタケ子実体より、菌糸体の純粋分離に成功した菌株である。
【００２１】
本発明においては、サナギタケの菌糸体又は子実体培養物を使用する。サナギタケの菌株は、保存用菌株を調製することで維持する。例えば、ポテトデキストロース寒天培地、麦芽エキス寒天培地、バレイショーブドウ糖寒天培地等を使用して、試験管内で殺菌済みの斜面培地を調製し、それに菌糸塊を接種し、培養することにより、保存用菌株を調製する。培養条件は、例えば２０乃至３０℃で２乃至６週間、好ましくは２４乃至２７℃で３乃至５週間である。培養後の菌株は、室温で又は冷蔵庫内で保存する。
【００２２】
通常は、大量培養に先立ち、保存用菌株から接種用種菌を調製する。キノコの接種用種菌の培養には、従来はおがくず等を主成分とする固体培地が使用されていたが、近年は液体培地も使用されるようになってきた。種菌の培養に使用される液体培地の例としては、ＳＭＹ培地（ショ糖１重量％、麦芽エキス１重量％、酵母エキス０．４重量％、残部水）、ＭＹ培地（ブドウ糖０．４重量％、麦芽エキス１重量％、酵母エキス０．４重量％、残部水）、ＰＤ培地（バレイショ２０重量％、ブドウ糖２重量％、残部水）、Ｍ培地（麦芽エキス２重量％、残部水）、及びこれらの培地にさらに他の栄養成分を添加したものが挙げられる。種菌の培養に使用される液体培地の具体例としては、ブドウ糖、酵母エキス、米糠、酒粕、大豆粉、アスパラギン酸ナトリウム及び水を含む水溶液、並びにブドウ糖、赤糠、大豆粉、酵母エキス、アスパラギン酸ナトリウム及び水を含む水溶液が挙げられる。また、液体培地を使用する場合の種菌の培養条件は、攪拌下において、例えば２０乃至３０℃で３乃至１０日間、好ましくは２４乃至２７℃で６乃至８日間である。
【００２３】
本発明の組成物に使用する培養物の大量培養は、固体培養でも液体培養でもよい。例えば菌糸体の固体培養は、大豆等を含む高蛋白培地（例えば大豆培地；大豆（ひき割りでも粉末であってもよい）、米（玄米でも白米でもよい）及び水を含む）で培養することができる。また、サナギタケは虫草類であり、天然においては天蚕（ヤママユガ）蛹等を宿主として成長するので、蛋白質として虫体、例えば天蚕や白色蚕（家蚕）等の蚕のサナギ（粉末であってもよい）を含有する固体培地（例えばサナギ培地；蚕のサナギ（粉末であってもよい）、大豆（ひき割りでも粉末であってもよい）、米（玄米でも白米でもよい）及び水を含む）を使用することもできる。上記の固体培養培地では、米の代わりに大麦、小麦、フスマ又は赤糠を使用することもできる。固体培養は、殺菌された多量（培地全量の４０乃至６０％程度）の水分を含む固体培地に接種用種菌を接種し、例えば２０乃至３０℃で２０乃至４０日間、好ましくは２４℃前後で３０日間程度培養すればよい。
【００２４】
菌糸体は、液体培養によって大量培養することもできる。大量培養に使用される液体培地の具体例としては、ブドウ糖、酵母エキス、米糠、酒粕、大豆粉、アスパラギン酸ナトリウム、無機質及び水を含む水溶液、並びにブドウ糖、赤糠、大豆粉、酵母エキス、アスパラギン酸ナトリウム及び水を含む水溶液が挙げられる。また、液体培地を使用する大量培養では、常法による殺菌及び冷却後、種菌を接種し、例えば２０乃至３０℃で１０乃至３０日間、好ましくは２５℃前後で２１日間程度、通気量０．５乃至５ＶＶＭ（１分あたり、単位体積当たりの通気用量）で通気培養をすればよい。
【００２５】
菌糸体が培養培地全体に蔓延したら、菌糸体を子実体培養用固体培地に移し、光刺激や二酸化炭素刺激によって子実体を形成させる。子実体培養用固体培地の具体例としては、蛹又は蛹粉、米糠、小麦麩及び水を含み、水分量は６０乃至６５重量％であるもの、並びにコーヒー抽出粕、チップダスト、玄米、大豆、大豆粉、籾殻及び水を含むものが挙げられる。
【００２６】
大量培養後、分取したサナギタケ菌糸体もしくは子実体を、又は固体培養物もしくは液体培養物そのものを、凍結乾燥や噴霧乾燥に供する。このようにして得られる乾燥体は、そのまま、本発明の組成物又はその一部として使用することができる。また、分取した菌糸体もしくは子実体、又は固体培養物もしくは液体培養物から溶媒抽出を行い、固液を分離して抽出液体を得、その抽出液体を、そのまま、濃縮して、又は凍結乾燥もしくは噴霧乾燥に供して、得られたものを本発明の組成物又はその一部として使用することができる。必要に応じ、抽出液体に、例えばｐＨ調整剤や粉末化基剤を添加することができる。
【００２７】
抽出溶媒は、例えば水や有機溶媒である。有機溶媒を用いる場合、飲食品又は医薬品に使用可能なものが好ましく、その例として、アセトン、ヘキサン、ブタノール、エタノール等が挙げられる。中でも、適宜の濃度となるように水で希釈したエタノールが好ましい。また、抽出条件は、抽出溶媒が水の場合は、９５乃至１００℃、３０乃至１２０分間の熱水抽出とする。抽出溶媒が希釈エタノールの場合、エタノールとして濃度２０乃至５０重量％のものを使用することが好ましく、３０乃至４０重量％のものを使用することがさらに好ましく、５０乃至６５℃程度の加温抽出と、９０乃至９６℃程度での沸騰抽出の併用が好ましい。
【００２８】
本発明の組成物は、エリスロポエチン誘導作用を示すので、その赤血球系の造血作用を期待して、腎性貧血等の貧血の予防や治療のための医薬品として使用することができる。また、本発明の組成物は、貧血の予防を目的として、特定保健用食品、機能性表示食品、特別用途食品及びサプリメント等の食品において使用することができる。
【００２９】
本発明の組成物の形態は特に限定されない。飲食品の場合は、その形態は、固体（粉末、顆粒や錠剤を含む）、ペースト、液体等であり、医薬品やサプリメントの場合は、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、散剤、顆粒剤、細粒剤等である。
【００３０】
本発明の組成物は、サナギタケの培養物又はその培養物からの抽出物に加えて、エリスロポエチン誘導作用に悪影響を与えない限り、任意の成分を含有していてもよい。そのような任意成分の例は、甘味剤、酸味剤、矯味矯臭剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤、賦形剤、溶解補助剤及び懸濁化剤である。
【００３１】
本発明の組成物は、天然物に由来し、後記する実施例において示されているように安全性が高いので、多量に摂取しても特に問題は生じないものと思われる。しかし、摂取量の例を挙げると、成人１日当たり、組成物中に含まれる培養物の量で、例えば１乃至５０ｇ、好ましくは６乃至３０ｇであり、組成物中に含まれる抽出物の量で、例えば０．１乃至５．０ｇ、好ましくは０．５乃至２．０ｇである。
【実施例】
【００３２】
以下に、実施例を示し、本発明を具体的に説明する。
【００３３】
［実施例１］  サナギタケ菌糸体の培養方法
サナギタケ菌糸体の培養方法は、以下のとおりである。
１．サナギタケの菌株の保存方法
試験管（１８ｍｍφ）に、常法通りに調製したポテトデキストロース寒天培地を充填し、寒天を固化させて斜面培地とした。接種用鈎を用い、サナギタケの約５乃至８ｍｍ長の菌糸塊を斜面培地中央部に接種した。その後、２４乃至２７℃にて３乃至５週間、培養した。培養後の菌株を、室温又は１０℃の冷蔵庫内で保存した。
【００３４】
なお、菌糸塊は、天然のサナギタケ（Cordyceps militaris FT26K3及びCordyceps militaris KT16514）の各々から純粋分離したものに由来する保存用菌株であり、これらがサナギタケであることは、それぞれ、図１−１乃至１−４及び図２−１乃至２−７に示すとおりである。
【００３５】
２．接種用種菌の培養方法
５００ｍＬ容の三角フラスコに、下記組成の溶液１５０ｍＬを入れ、常法通り、１２１℃にて１５分間殺菌した。溶液温度が２５℃以下となった後、Cordyceps militaris FT26K3の保存用菌株から約５乃至８ｍｍ長の菌糸塊をこの溶液に接種した。別に、同様に準備したフラスコ内の溶液に、Cordyceps militaris KT16514の保存用菌株から約５乃至８ｍｍ長の菌糸塊を接種した。培養液を１２０ｒｐｍで攪拌しながら、２４乃至２７℃で７日間培養し、一次接種用種菌を得た。さらに、一次接種用種菌の培養に使用したものと同じ溶液１５００ｍＬを５Ｌ容の三角フラスコに入れ、常法通り殺菌した。冷却後に、この溶液に一次接種用種菌二種を全量接種した。２４乃至２７℃で７乃至１０日間培養し、液体培養用及び固体培養用種菌を得た。
【００３６】
【表１】
2019167326.tif 000003
【００３７】
３．大量培養方法
３−１．液体培養方法
５００Ｌ容の発酵槽に、下記組成の溶液４００Ｌを入れ、常法通り殺菌した。溶液温度が２５℃以下となった後、２．と同様の方法で調製した接種用種菌３Ｌを接種した。２５℃、通気量０．５ＶＶＭ（１分あたり、単位体積当たりの通気用量）で２１日間培養し、液体培養物を得た。
【００３８】
【表２】
2019167326.tif 000004
【００３９】
３−２．固体培養方法
（１）サナギ培地を使用する方法
下記組成の培地８００ｇを培養器に入れ、常法通り殺菌した。培地温度が２５℃以下となった後、２．と同様の方法で調製した接種用種菌１０ｍｌを接種し、２４℃で３０日間培養し、固体培養物（Ａ）を得た。
【００４０】
【表３】
2019167326.tif 000005
【００４１】
（２）大豆培地を使用する方法
下記組成の培地１０００ｇを培養器に入れ、常法通り殺菌した。培地温度が２５℃以下となった後、２．と同様の方法で調製した接種用種菌１０ｍｌを接種し、２４℃で３０日間培養し、固体培養物（Ｂ）を得た。
【００４２】
【表４】
2019167326.tif 000006
【００４３】
［実施例２］  マウスへの投与用試料の調製方法
マウスへの投与用試料は、次のようにして調製した。
１．サナギタケ菌糸体培養エキス末（マウス投与試験記号：ＣＭ−Ａ）の調製方法
固体培養物（Ａ）７０ｋｇ、８５％エタノール９０Ｌ、液体培養物７０Ｌ及び水道水５０Ｌを抽出用容器に入れ、５５乃至５８℃に６０分間保持し、その後９２〜９５℃に６０分間保持した。抽出用容器の内容物が６０℃以下となったら、その内容物を圧搾濾過に供した。濾液を、固形分濃度が１３重量％となるまで濃縮し、得られた濃縮液に、クエン酸１ｋｇを添加し、マルトデキストリン６ｋｇを添加溶解し、全量１２０Ｌの凍結乾燥用原料を得た。この原料を、常法通り凍結乾燥し、得られた凍結乾燥品を粉砕した。その後、防湿のためにマルトデキストリン粉末を添加し、以下の表に示す分析値のサナギタケ菌糸体培養エキス末（マウス投与試験記号：ＣＭ−Ａ）を得た。
【００４４】
【表５】
2019167326.tif 000007
【００４５】
２．サナギタケ菌糸体培養蛋白粉末（マウス投与試験記号：ＣＭ−Ｂ）の調製方法
固体培養物（Ｂ）を、１２１℃にて２０分間殺菌し、凍結乾燥用原料を得た。この原料を、常法通り凍結乾燥し、得られた凍結乾燥品を粉砕した。以下の表に示す分析値のサナギタケ菌糸体培養蛋白粉末（マウス投与試験記号：ＣＭ−Ｂ）を得た。
【００４６】
【表６】
2019167326.tif 000008
【００４７】
［実施例３］  マウスへのサナギタケ菌糸体培養エキス末（ＣＭ−Ａ）及びサナギタケ菌糸体培養蛋白粉末（ＣＭ−Ｂ）の投与試験（その１）
マウスにＣＭ−Ａ又はＣＭ−Ｂを投与し、これらの安全性を調べるとともに、血中成分及びエリスロポエチンの濃度等への影響を調べた。
【００４８】
１．実験条件
（１）使用動物：ＩＣＲ雄マウス
６０匹のＩＣＲ雄マウスを７週令にて購入し、１週間の予備飼育後に４２匹を実験に使用した。
【００４９】
（２）試料の投与量及び投与方法
試料（ＣＭ−Ａ又はＣＭ−Ｂ）を０．３ｍＬの蒸留水に分散、溶解させ、マウス用の胃ゾンデを用いて経口投与した。対照群には、蒸留水０．３ｍＬを同様に経口投与した。投与回数は、１日１回で連続した６日間とした。試料の投与量は、１回につき、マウスの体重１ｋｇ当たり２００ｍｇ、４００ｍｇ又は８００ｍｇとした。即ち、表７に示す投与群について実験を行った。
【００５０】
【表７】
2019167326.tif 000009
【００５１】
（３）マウスの解剖及び血液試料の採取
試料の最終投与の２４時間後に、動物用吸入麻酔剤「イソフル」（イソフルラン：ＤＳファーマアニマルヘルス（株）製）の過剰吸入による安楽死を実施した。安楽死後直ちに、腹部大静脈よりへパリン加採血を実施した。得られたヘパリン加全血の一部を遠心分離に供し、ヘパリン加血漿を得た。この血漿は、分離後直ちに−３０℃にて凍結保存した。
【００５２】
（４）検討方法及びその結果
（４−１）安全性試験
（４−１−１）マウス体重の変動（試験期間中の体重測定）
試験期間中、試料投与前の空腹時（午後２時〜４時）に、マウスの体重を測定した。結果を表８に示す。
６日目体重は、試験開始前に比べ、対照群では約３．５重量％増加していた。ＣＭ−Ａ投与群では、投与量によって異なるが、４．０乃至５．８重量％増加していた。ＣＭ−Ｂ投与群では、投与量によって異なるが、１．６乃至４．８重量％増加していた。しかし、体重に関し、試験期間中を通じて、いずれの投与群についても、対照群に対して統計上の有意差はなかった。
【００５３】
【表８】
2019167326.tif 000010
【００５４】
（４−１−２）試験期間中のマウスの運動性及び食欲の観察と、解剖前のマウス外観の検査
試験期間中、マウスの運動性及び食欲を観察したが、全てのマウスについて異常は見られなかった。安楽死後にマウス外観を検査したが、全てのマウスについて、体毛の汚れや下痢などの異常は見られなかった。
【００５５】
（４−１−３）解剖時における臓器の目視検査
安楽死後に開腹を行い、各臓器の位置、形状、出血の有無、癒着の有無を目視検査したが、全てのマウスについて、これらの検査項目に異常は見られなかった。
【００５６】
（４−１−４）解剖直前の体重及び解剖時の臓器重量の測定
解剖直前に、マウスの体重を測定した。また、摘出した肝臓、腎臓、脾臓、胸腺及び精巣の各々について、重量を測定した。結果を表９に示す。
【００５７】
体重：  いずれの投与群も、対照群に対して統計上の有意差はなかった。
肝臓重量：  いずれの投与群も、対照群に対して統計上の有意差はなかった。
腎臓重量：  各群の平均値を比較すると、いずれの投与群も対照群よりも重かった。しかし、個体差が大きく、対照群に対して有意に重いと判定できたのは、ＣＭ−Ａ２００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群（危険率：１％未満）及びＣＭ−Ａ８００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群（危険率：５％未満）のみであった。
脾臓重量：  対照群に対して、重量が増加している群と減少している群とがあり、特定の傾向はみられなかった。但し、ＣＭ−Ｂ８００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群については、危険率５％未満で重量が増加していた。
胸腺重量：  対照群に対して、重量が増加している群と減少している群とがあり、特定の傾向はみられず、また、統計的な有意差のある投与群もなかった。
精巣重量：  対照群に対して、重量が増加している群と減少している群とがあり、特定の傾向はみられず、また、統計的な有意差のある投与群もなかった。
以上より、ＣＭ−Ａ投与群及びＣＭ−Ｂ投与群のいずれも、腎臓重量については増加傾向が見られたが、安全性が危惧されるような異常は見られなかったといえる。
【００５８】
【表９】
2019167326.tif 000011
【００５９】
（４−２）血液検査
安楽死後直ちに採血したヘパリン加全血を使用して、白血球数、赤血球数、ヘモグロビン濃度、ヘマトクリット値及び血小板数を、自動血球測定装置（シスメックス（株）製、ｐｏｃＨ−１００ｉ）を用いて測定した。結果を表１０に示す。
【００６０】
白血球数：  各群の平均値を比較すると、いずれの投与群も対照群よりも多かった。対照群に対して有意に多いと判定できたのは、ＣＭ−Ａ２００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群（危険率：５％未満）、並びにＣＭ−Ｂ２００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群（危険率：１％未満）、ＣＭ−Ｂ４００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群（危険率：５％未満）及びＣＭ−Ｂ８００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群（危険率：５％未満）であった。
赤血球数：  対照群に対して、赤血球数が増加している群と減少している群とがあり、特定の傾向はみられなかった。但し、ＣＭ−Ａ８００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群については、危険率５％未満で赤血球数が増加していた。
ヘモグロビン濃度：  ヘモグロビン濃度は、対照群と同等又は対照群より若干増加している傾向にあった。但し、ＣＭ−Ａ８００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群については、危険率５％未満でヘモグロビン濃度が増加していた。
ヘマトクリット値：  対照群に対して、ヘマトクリット値が増加している群と減少している群とがあり、特定の傾向はみられなかった。但し、ＣＭ−Ａ８００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群については、危険率１％未満でヘマトクリット値が増加していた。
血小板数：  ＣＭ−Ａ投与群では、対照群と同等又は対照群より若干減少している傾向にあった。一方、ＣＭ−Ｂ投与群では、対照群より若干増加している傾向にあり、特にＣＭ−Ｂ８００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群については、危険率５％未満で血小板数が増加していた。
以上より、ＣＭ−Ａ及びＣＭ−Ｂのいずれも、経口摂取されると白血球数を増加させる傾向にあったといえる。
【００６１】
【表１０】
2019167326.tif 000012
【００６２】
（４−３）血漿エリスロポエチン濃度の測定
Mouse Erythropoietin Quantikine ELISA Kit（R&D Systems, Cat. No. MEP00B, Lot. No. P144663）を使用して、解剖時に採取し、分離したマウスへパリン加血漿について、エリスロポエチン濃度を測定した。結果を表１１並びに図３及び４に示す。
【００６３】
いずれの投与群も、対照群に比べて高いエリスロポエチン濃度を示した。中でも、ＣＭ−Ａ２００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群及びＣＭ−Ｂ８００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群については、危険率１％未満で、対照群よりも有意に高いエリスロポエチン濃度を示した。
以上より、ＣＭ−Ａ又はＣＭ−Ｂが経口摂取されると、エリスロポエチン濃度が高まる傾向にあることが分かった。なお、念のためにＣＭ−Ａ及びＣＭ−Ｂの各々についてエリスロポエチン濃度を測定したが、エリスロポエチンは検出されなかった。
【００６４】
【表１１】
2019167326.tif 000013
【００６５】
（４−４）マウス腎臓の組織学的検討
腎臓重量に有意な増加が認められたＣＭ−Ａ投与群（０ｍｇ／ｋｇ−体重／回（対照）、２００ｍｇ／ｋｇ−体重／回、４００ｍｇ／ｋｇ−体重／回及び８００ｍｇ／ｋｇ−体重／回）の腎臓組織標本（各４個）を作製し、腎肥大の組織学的な検討を行なった。（株）新組織科学研究所に、マウス腎臓の病理組織学的検査を依頼した。ＨＥ染色によって作製した腎臓組織標本を顕微鏡下で観察した。
【００６６】
４００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群及び８００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群については、各々、４標本中１標本について、近位尿細管に微細な空胞変性がみられた。空胞変性が、４００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群及び８００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群では２００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群ほどエリスロポエチン濃度が高くならなかった原因であるかもしれない。よって、より少量のＣＭ−Ａを投与した場合のエリスロポエチン濃度の変化について、追試を行う必要があると考えた。
【００６７】
［実施例４］  マウスへのＣＭ−Ａの投与試験（その２）
マウスにＣＭ−Ａを投与し、これらの安全性を調べるとともに、血中成分及びエリスロポエチンの濃度等への影響を調べた。
【００６８】
１．実験条件
（１）使用動物：ＩＣＲ雄マウス
３６匹のＩＣＲ雄マウスを８週令にて購入し、３日間の予備飼育後に実験に使用した。
【００６９】
（２）試料の投与量及び投与方法
試料（ＣＭ−Ａ）を０．２ｍＬの蒸留水に分散、溶解させ、マウス用の胃ゾンデを用いて経口投与した。対照群には、蒸留水０．２ｍＬを同様に経口投与した。投与回数は、１日１回で連続した６日間とした。但し、２００ｍｇ／ｋｇ−体重での投与のみ、６日間の投与のほかに、１日１回で連続した３日間の投与も実施した。試料の投与量は、１回につき、マウスの体重１ｋｇ当たり２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ又は２００ｍｇとした。
即ち、表１２に示す投与群について実験を行った。
【００７０】
【表１２】
2019167326.tif 000014
【００７１】
（３）マウスの解剖及び血液試料の採取
試料の最終投与の２４時間後に、動物用吸入麻酔剤「イソフル」（イソフルラン：ＤＳファーマアニマルヘルス（株）製）の過剰吸入による安楽死を実施した。安楽死後直ちに、腹部大静脈よりへパリン加採血を実施した。得られたヘパリン加全血の一部を遠心分離に供し、ヘパリン加血漿を得た。この血漿は、分離後直ちに−３０℃にて凍結保存した。
【００７２】
（４）検討方法及びその結果
検討方法は、実施例３に記載のものと同様のものについては記載を省略して結果のみを記載し、方法が異なるものについては以下に記載した。
【００７３】
（４−１）安全性試験
（４−１−１）マウス体重の変動（投与期間中の体重測定）
結果を表１３に示す。
６日目体重は、試験開始前に比べ、対照群では約５．３重量％増加していた。ＣＭ−Ａ投与群では、投与量によって異なるが、３．９乃至５．６重量％増加していた。しかし、体重に関し、試験期間中を通じて、いずれの投与群についても、対照群に対して統計上の有意差はなかった。
【００７４】
【表１３】
2019167326.tif 000015
【００７５】
（４−１−２）試験期間中のマウスの運動性及び食欲の観察と、解剖前のマウス外観の検査
試験期間中のマウスの運動性及び食欲については、全てのマウスに異常は見られなかった。安楽死後のマウス外観の検査においても、全てのマウスについて、体毛の汚れや下痢などの異常は見られなかった。
【００７６】
（４−１−３）解剖時における臓器の目視検査
全てのマウスについて、各臓器の位置、形状、出血の有無、癒着の有無の目視検査で異常は見られなかった。
【００７７】
（４−１−４）解剖直前の体重及び解剖時の臓器重量の測定
解剖時の臓器重量として、肝臓重量、腎臓重量、脾臓重量、胸腺重量及び精巣重量に加え、精巣周囲（腹腔内）脂肪重量も測定した。なお、この測定は、ＣＭ−Ａを２００ｍｇ／ｋｇ−体重／回で３回（連続した３日間）投与した群についても実施した。結果を表１４及び表１５に示す。表１４は、臓器の測定された絶対重量を示し、表１５は、体重１０ｇ当たりの臓器の相対重量を示す。
【００７８】
体重：  いずれの投与群も、また絶対重量も相対重量も、対照群に対して統計上の有意差はなかった。
肝臓重量：  いずれの投与群も、また絶対重量も相対重量も、対照群よりも重かった。中でも、絶対重量については２５ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群（危険率：１％未満）が、並びに相対重量については２５ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群（危険率：５％未満）及び５０ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群（危険率：５％未満）が、対照群に対して有意に重くなっていた。
腎臓重量：  ２５ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群を除き、いずれの投与群も対照群よりも重かった。しかし、対照群に対して有意に重いと判定できたのは、２００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群（３回）の相対重量（危険率：５％未満）のみであった。
脾臓重量：  ２００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群（６回）は、絶対重量も相対重量も、対照群に対して有意に増加していた。これら以外は、対照群とほぼ同等であった。
胸腺重量：  対照群に対して、重量が増加している群と減少している群とがあり、特定の傾向はみられず、また、統計的に有意差のある投与群もなかった。
精巣重量：  ６回投与群はいずれも、また絶対重量も相対重量も、対照群に対して有意に減少していた。２００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群（３回）は、絶対重量も相対重量も、対照群とほぼ同等であった。
精巣周囲脂肪重量：  ６回投与群はいずれも、また絶対重量も相対重量も、対照群に対して増加傾向にあったが、統計的に有意差のある投与群はなかった。また、２００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群（３回）は、絶対重量も相対重量も、最も増加量が大きかったが、対照群との間に有意差はなかった。
以上より、ＣＭ−Ａを経口投与することで、肝臓重量については増加傾向が見られ、胸腺重量については減少傾向が見られたが、安全性が危惧されるような異常は見られなかったといえる。
【００７９】
【表１４】
2019167326.tif 000016
【００８０】
【表１５】
2019167326.tif 000017
【００８１】
（４−２）血液検査
結果を表１６に示す。
白血球数：  各群の平均値を比較すると、いずれの投与群も対照群よりも多かった。対照群に対して有意に多いと判定できたのは、いずれも６回投与群で、２５ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群（危険率：５％未満）、１００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群（危険率：５％未満）及び２００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群（危険率：５％未満）であった。
赤血球数：  各群の平均値を比較すると、いずれの投与群も対照群よりも多かった。しかし、対照群に対して有意に多いと判定できたのは、１００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群（６回）のみであった。
ヘモグロビン濃度：  各群の平均値を比較すると、ヘモグロビン濃度は、６回投与群ではいずれの投与群も、対照群よりも若干高い値を示した。２００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群（３回）は、対照群よりも若干低い値を示した。しかし、いずれの投与群も、対照群に対して有意差はなかった。
ヘマトクリット値：  対照群に対して、ヘマトクリット値が増加している群と減少している群とがあり、特定の傾向はみられなかった。但し、１００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群（６回）については、危険率５％未満でヘマトクリット値が増加していた。
血小板数：  対照群に対して、ヘマトクリット値が増加している群と減少している群とがあり、特定の傾向はみられなかった。
以上より、ＣＭ−Ａは、経口摂取されると白血球数を増加させる傾向にあったといえる。
【００８２】
【表１６】
2019167326.tif 000018
【００８３】
（４−３）血漿エリスロポエチン濃度の測定
結果を表１７及び図５に示す。
６回投与群では、２５ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群、５０ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群及び１００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群について、並びに２００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群（３回）について、対照群よりも高いエリスロポエチン濃度を示した。２００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群（６回）は、対照群とほぼ同等のエリスロポエチン濃度であった。なお、対照群に対して有意に高いエリスロポエチン濃度を示したのは、２５ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群（６回）及び２００ｍｇ／ｋｇ−体重／回投与群（３回）のみであった。
以上より、ＣＭ−Ａが経口摂取されると、エリスロポエチン濃度が高まる傾向にあることが分かった。なお、念のためにＣＭ−Ａについてエリスロポエチン濃度を測定したが、エリスロポエチンは検出されなかった。
【００８４】
【表１７】
2019167326.tif 000019
【図１−１】
2019167326.tif 000020
【図１−２】
2019167326.tif 000021
【図１−３】
2019167326.tif 000022
【図１−４】
2019167326.tif 000023
【図２−１】
2019167326.tif 000024
【図２−２】
2019167326.tif 000025
【図２−３】
2019167326.tif 000026
【図２−４】
2019167326.tif 000027
【図２−５】
2019167326.tif 000028
【図２−６】
2019167326.tif 000029
【図２−７】
2019167326.tif 000030
【図３】
2019167326.tif 000031
【図４】
2019167326.tif 000032
【図５】
2019167326.tif 000033
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月19日(2019.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サナギタケ（Cordyceps militaris）の培養物又はその培養物からの抽出物を含有する、エリスロポエチンを誘導するための医薬組成物。
【請求項２】
サナギタケの培養物が菌糸体培養物である、請求項１に記載のエリスロポエチンを誘導するための医薬組成物。
【請求項３】
サナギタケ（Cordyceps militaris）の培養物又はその培養物からの抽出物を含有する、腎性貧血の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項４】
サナギタケの培養物が菌糸体培養物である、請求項３に記載の腎性貧血の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項５】
サナギタケ（Cordyceps militaris）の培養物又はその培養物からの抽出物を含有する、エリスロポエチンを誘導するための食品組成物。
【請求項６】
サナギタケの培養物が菌糸体培養物である、請求項５に記載のエリスロポエチンを誘導するための食品組成物。
【請求項７】
サナギタケ（Cordyceps militaris）の培養物又はその培養物からの抽出物を含有する、腎性貧血の予防用食品組成物。
【請求項８】
サナギタケの培養物が菌糸体培養物である、請求項７に記載の腎性貧血の予防用食品組成物。
【請求項９】
蛋白質及び穀類を含む固体培地にサナギタケ（Cordyceps militaris）の種菌を接種し、菌糸体を培養する工程（Ｉ）を含む、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の医薬組成物の製造方法。
【請求項１０】
さらに、工程（Ｉ）を経て得られたサナギタケの固体培養物から、エリスロポエチン誘導作用を示す成分を含む抽出液を得る工程（ＩＩ）を含む、請求項９に記載の医薬組成物の製造方法。
【請求項１１】
ブドウ糖、酵母エキス、米糠、酒粕、大豆粉、アスパラギン酸ナトリウム、無機質及び水を含む液体培地にサナギタケ（Cordyceps militaris）の種菌を接種し、菌糸体を培養する工程（１）を含む、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の医薬組成物の製造方法。
【請求項１２】
さらに、工程（１）を経て得られたサナギタケの液体培養物から、エリスロポエチン誘導作用を示す成分を含む抽出液を得る工程（２）を含む、請求項１１に記載の医薬組成物の製造方法。
【請求項１３】
蛋白質及び穀類を含む固体培地にサナギタケ（Cordyceps militaris）の種菌を接種し、菌糸体を培養する工程（Ｉ）を含む、請求項５乃至８のいずれか一項に記載の食品組成物の製造方法。
【請求項１４】
さらに、工程（Ｉ）を経て得られたサナギタケの固体培養物から、エリスロポエチン誘導作用を示す成分を含む抽出液を得る工程（ＩＩ）を含む、請求項１３に記載の食品組成物の製造方法。
【請求項１５】
ブドウ糖、酵母エキス、米糠、酒粕、大豆粉、アスパラギン酸ナトリウム、無機質及び水を含む液体培地にサナギタケ（Cordyceps militaris）の種菌を接種し、菌糸体を培養する工程（１）を含む、請求項５乃至８のいずれか一項に記載の食品組成物の製造方法。
【請求項１６】
さらに、工程（１）を経て得られたサナギタケの液体培養物から、エリスロポエチン誘導作用を示す成分を含む抽出液を得る工程（２）を含む、請求項１５に記載の食品組成物の製造方法。