(57)【要約】【課題】癌の転移抑制に有効な薬剤を提供することを目的とする。【解決手段】メチルベータシクロデキストリン若しくはその塩、メトホルミン若しくはその塩、及びマンノースリン酸イソメラーゼ遺伝子に対するsiRNAから成る群より選択される1以上の物質を有効成分として含有する癌転移抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチルベータシクロデキストリン若しくはその塩、メトホルミン若しくはその塩、及びマンノースリン酸イソメラーゼ遺伝子に対するsiRNAから成る群より選択される1以上の物質を有効成分として含有する癌転移抑制剤。
【請求項２】
癌がメラノーマである、請求項１記載の癌転移抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば癌の転移抑制に有効な薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の転移は、患者の予後を著しく悪くすることから、転移抑制法・薬の開発が望まれている。
一方、これまでに、メラノーマ(悪性黒色腫)の転移の原因の1つは、細胞外小胞による肝細胞増殖因子受容体(Met、c-MET、HGFR等とも称される；以下、「Met」と称する)の分泌であることが報告されている(非特許文献１）。Metの分泌抑制効果を示す物質は知られているが、その選択性、安全性及び救済性に問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Peinado H et al., Nat Med 18:883-891, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上述の実情に鑑み、癌の転移抑制に有効な薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ブドウ糖誘導体のメチルベータシクロデキストリン、2型糖尿病治療薬のメトホルミン及び糖代謝酵素遺伝子であるマンノースリン酸イソメラーゼ(以下、「MPI」と称する)遺伝子に対するsiRNAオリゴヌクレオチドが、メラノーマ等の癌の転移の原因となる細胞外小胞によるMetの分泌を抑制することで、癌の転移を抑制することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）メチルベータシクロデキストリン若しくはその塩、メトホルミン若しくはその塩、及びMPI遺伝子に対するsiRNAから成る群より選択される1以上の物質を有効成分として含有する癌転移抑制剤。
（２）癌がメラノーマである、（１）記載の癌転移抑制剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、癌の転移を安全且つ有効に抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】メチルβ-シクロデキストリンがMet分泌を低下させることを示す図である。
【図２】メトホルミンがMet分泌を低下させることを示す図である。
【図３】MpiのノックダウンがMet分泌を低下させることを示す図である。
【図４】ゴルジβ1,6N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼV(以下、「Mgat5」と称する)のノックダウンがMet発現及び分泌を低下させることを示す図である。
【図５】2-デオキシグルコースがMet発現及び分泌を低下させることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る癌転移抑制剤は、メチルベータシクロデキストリン若しくはその塩、メトホルミン若しくはその塩、及びMPI遺伝子に対するsiRNAから成る群より選択される1以上の物質(すなわち、これらの物質のうちいずれか1種、又はいずれか2種若しくは3種全ての組合せ)を有効成分として含有するものである。本発明に係る癌転移抑制剤によれば、メラノーマ等の癌の転移の原因となる細胞外小胞によるMetの分泌を抑制することで、癌の転移を抑制することができる。細胞外小胞により分泌されるMetは、転移先の臓器に取り込まれ、血管透過性、炎症、及び骨髄由来細胞の遊走を惹起することによって転移を促進する。
【００１０】
本発明において転移抑制の対象となる癌としては、細胞外小胞によるMetの分泌を転移の原因とする癌であれば良く、例えばメラノーマ等が挙げられる。
【００１１】
本発明に係る癌転移抑制剤における有効成分であるメチルベータシクロデキストリンは、以下の式で示される構造式を有するものである。
【００１２】
【化１】
2019142789.tif 000002
【００１３】
メチルベータシクロデキストリンの塩としては、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、ピロ硫酸、メタリン酸等の無機酸との塩、クエン酸、安息香酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、スルホン酸(例えば、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸)等の有機酸との塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩等が挙げられる。
【００１４】
メチルベータシクロデキストリン又はその塩は、細胞に発現するMetの量には全く影響しないが、細胞外小胞で分泌されるMetの量だけを減少させることができ、分泌されるMetに対する選択性が高いという特徴を有する。
【００１５】
本発明に係る癌転移抑制剤は、当該癌転移抑制剤に対してメチルベータシクロデキストリン又はその塩を例えば5 mMで含有する。
【００１６】
また、本発明に係る癌転移抑制剤における有効成分であるメトホルミンは、以下の式で示される構造式を有するものである。
【００１７】
【化２】
2019142789.tif 000003
【００１８】
メトホルミンの塩としては、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、ピロ硫酸、メタリン酸等の無機酸との塩、クエン酸、安息香酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、スルホン酸(例えば、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸)等の有機酸との塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩等が挙げられる。
【００１９】
メトホルミン又はその塩は、細胞外小胞で分泌されるMetの量を減少させ、一方、従来より2型糖尿病治療薬として使用されており、安全性の点で優れている。
【００２０】
本発明に係る癌転移抑制剤は、当該癌転移抑制剤に対してメトホルミン又はその塩を例えば5 mMで含有する。
【００２１】
さらに、本発明に係る癌転移抑制剤における有効成分であるMPI遺伝子に対するsiRNAは、MPI遺伝子によりコードされるmRNA(ヒトMPI mRNAの塩基配列：配列番号１；NCBIアクセッション番号NM_002435.2)に対して設計されたMPI遺伝子発現阻害活性を有するsiRNAオリゴヌクレオチドである。MPI遺伝子に対するsiRNAとしては、例えば配列番号１に示されるヒトMPI mRNAの塩基配列における18〜25個(好ましくは21〜23個)の連続する塩基配列を含むセンス鎖とその相補配列を含むアンチセンス鎖から成る二重鎖である。また、当該siRNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖のうち一方又は双方の5'末端又は3'末端において1〜3個程度の塩基の付加によるオーバーハングを有してもよい。
【００２２】
MPIは、マンノース-6-リン酸からフルクトース-6-リン酸への異性化を触媒する酵素活性を有する。MPI遺伝子に対するsiRNAは、細胞外小胞で分泌されるMetの量を減少させる一方、MPI遺伝子発現阻害活性により当該MPIの酵素活性を抑制してしまう。しかしながら、マンノース負荷療法によって、MPIの欠損から生じる糖鎖修飾の低下、腸管出血、及び慢性腸炎を救済でき、当該MPIの酵素活性抑制による患者への悪影響を回避でき、MPI遺伝子に対するsiRNAは救済性の点で優れている。
【００２３】
本発明に係る癌転移抑制剤は、当該癌転移抑制剤に対して、MPI遺伝子に対するsiRNAを例えば3 nMで含有する。
【００２４】
本発明に係る癌転移抑制剤は、これら有効成分以外に、例えば製剤担体、賦形剤、安定剤等の成分を含有することもできる。
【００２５】
また、本発明に係る癌転移抑制剤は、医薬品又は医薬部外品として使用することができ、あるいは飲食品等に配合することもできる。
【００２６】
本発明に係る癌転移抑制剤は、その剤形に応じてそれ自体公知の種々の方法で投与することが可能であり、その投与量、投与部位、投与する間隔、期間等は、患者の年齢や体重、病状あるいは他の薬剤や治療法と併用した場合等を考慮して適宜決定することができる。投与方法としては、特に制限されないが、例えば、経口投与、注射や点滴静注等が挙げられる。
【００２７】
本発明に係る癌転移抑制剤の投与量は、その剤形、投与方法、又は治療しようとする症状により異なるが、例えば、患者の体重1kg当たりの投与量として有効成分換算で、メチルベータシクロデキストリン又はその塩については5 mM、メトホルミン又はその塩については5 mM、MPI遺伝子に対するsiRNAについては3 nMとすることができ、1日1回又は数回、あるいは数日毎に1回というような、適当な投与頻度によって投与することが可能である。
【００２８】
本発明に係る癌転移抑制剤の剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、坐剤、注射剤、点滴等が挙げられるが、特に制限されない。
【００２９】
また、本発明は、メチルベータシクロデキストリン若しくはその塩、メトホルミン若しくはその塩、及びMPI遺伝子に対するsiRNAから成る群より選択される1以上の物質(すなわち、これらの物質のうちいずれか1種、又はいずれか2種若しくは3種全ての組合せ)をヒトや動物等の被験体(患者)に投与することを含む、癌転移抑制方法に関する。メチルベータシクロデキストリン若しくはその塩、メトホルミン若しくはその塩、及びMPI遺伝子に対するsiRNAの剤形、投与様式、投与量等は、上述の本発明に係る癌転移抑制剤に準じて決定することができる。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３１】
１．材料及び方法
１−１．材料
マウスメラノーマB16-F10細胞、2-デオキシグルコース、メチルベータシクロデキストリン、メトホルミン、MPI又はMgat5に対するsiRNAを用いた。
１−２．方法
B16-F10細胞を、1、1.3、2.5及び5 mMの2-デオキシグルコース、又は5 mMのメチルベータシクロデキストリン、又は1及び5 mMのメトホルミン、又は各3 nMのMPIに対する2種のsiRNA(5'-UUGACCUUUGAGCCCAAGCAG-3'(配列番号３；配列番号２に示すマウスMPI mRNAの塩基配列(NCBIアクセッション番号NM_025837.2)における273〜293番目の塩基配列に相当)とその相補配列を含む二重鎖、又は5'-UACACCUGAAAUAUGGAGCUG-3'(配列番号４；配列番号２に示すマウスMPI mRNAの塩基配列における1347〜1367番目の塩基配列に相当)とその相補配列を含む二重鎖)のうちいずれか1つ、又は6 nMのMgat5に対するsiRNA(5'-UUGCUCUCCAAGGUAAACGAG-3'(配列番号５)とその相補配列を含む二重鎖)で24時間処理した後、細胞と培養上清に分離し、エクソソームを超遠心法によって培養上清から調製した。
次に、細胞とエクソソームを変性し、sodium dodecyl sulfate polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE)で分離後、polyvinylidene difluoride (PVDF)膜に転写し、Met又はベータアクチン又はCD81に対する特異的な抗体でブロットした。この膜を西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗IgG抗体でブロットした後、enhanced chemiluminescence試薬で検出した。
【００３２】
２．結果
結果を図１〜５に示す。図中、「Cell」は細胞のウエスタンブロッティングの結果であり、「EV」はエクソソームのウエスタンブロッティングの結果である。
2-デオキシグルコース(図５)、メチルベータシクロデキストリン(図１)、メトホルミン(図２)、MPI又はMgat5に対するsiRNA(図３及び４)のいずれの処理によっても、エクソソームによって分泌されるMetの量が減少した。
【００３３】
３．考察
癌(転移)の予防薬又は抑制剤の開発・発見は、基礎研究者及び医療従事者の永遠の課題の1つである。これまでに、アスピリン(抗血小板薬、鎮痛剤)、心房性ナトリウム利尿ペプチド(心不全の治療薬)、プロパゲルマニウム(肝炎治療薬)等の癌転移抑制作用が報告されている(Rothwell PM et al., Lancet 379:1591-1601, 2012；Nojiri T et al., PNAS 112:4086-4091, 2015；Sato I et al., J Biol Response Mod 4:159-168, 1985)。しかしながら、これらの薬効はMet分泌抑制ではない。
【００３４】
Mgat5に対するsiRNAオリゴヌクレオチド(Mgat5の機能抑制効果)や2-デオキシグルコースはメラノーマ細胞に発現するMetの量を減少させるだけでなく、Met分泌抑制効果を持つ(図４及び５；すなわち、選択性が低い)。Mgat5の機能の抑制は、細胞に発現する機能的に重要な膜タンパク質の翻訳後修飾を変化させ、それによって癌の増殖、転移抑制作用を示すが(Granovsky M et al., Nat Med 6:306-312, 2000)、自己免疫疾患や多発性硬化症のリスクも懸念されている(Demetriou M et al., Nature 409:733-739)。2-デオキシグルコースはエネルギー代謝の阻害剤であり(Wick AN et al., JBC 224:963-969, 1957)、全身性の副作用が懸念される。いずれの物質においても、選択性が低く、人体に対する悪影響を回避する方法が存在しない。
【００３５】
一方、メチルベータシクロデキストリンは、細胞に発現するMetの量には全く影響しないが、細胞外小胞で分泌されるMetの量だけを減少させることができる(図１)。従って、従来技術に比べて選択性が向上したと言える。メトホルミン(図２)は、ガレガと呼ばれる薬草に見出された世界で一番量の多い2型糖尿病治療薬であり、その安全性は高い(UK prospective Diabetic Study Group. Lancet 352:854-865, 1998)。MPI遺伝子に対するsiRNAは、細胞内の糖代謝に関連するMpi酵素の機能抑制をもって、Met分泌抑制効果を示す(図３)。これまでに、Mpi遺伝子疾患の患者に対して、マンノース負荷療法が有効であることが示されており(Niehues R et al., J Clin Invest 101:1414-1420, 1998)、MPI遺伝子に対するsiRNAによって引き起こされる人体への悪影響は、マンノース負荷療法で回避できる。
【００３６】
以上のことから、本発明は新規の標的分子（Met)をターゲットとした癌転移抑制剤であり、従来技術に比べて安全性、選択性、救済性に優れている。
【図１】
2019142789.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
2019142789.tif 000007
【図５】
2019142789.tif 000008
【配列表】
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