(57)【要約】      （修正有）【課題】ジンセノサイドを高収率で生産するための酵母、及びそのような酵母の製造方法の提供。【解決手段】ジンセノサイド生産能を有する酵母においてＡｌｄ２、Ａｌｄ６、Ｚｗｆ１及びＺｍｓ１を変化させ、ジンセノサイド生産能を向上させる。前記酵母を用いてジンセノサイドを生産する。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＡＤＰＨ生合成関与遺伝子の発現レベルが内在的発現レベルに比べて変化した、ジンセノサイド生産用酵母。
【請求項２】
前記ＮＡＤＰＨ生合成関与遺伝子は、Ａｌｄ２、Ａｌｄ６、Ｚｗｆ１及びＺｍｓ１からなる群から選択された１以上である、請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
前記Ａｌｄ２の発現レベルは内在的発現レベルに比べて減少し、Ａｌｄ６発現レベルは内在的発現レベルに比べて増加した、請求項２に記載の酵母。
【請求項４】
前記酵母は、Ｚｗｆ１の発現レベルが内在的発現レベルに比べてさらに減少した、請求項３に記載の酵母。
【請求項５】
前記酵母は、Ｚｍｓ１の発現レベルが内在的発現レベルに比べてさらに増加した、請求項３に記載の酵母。
【請求項６】
前記酵母は、ＮＡＤＰＨの生産能が内在的レベルに比べて増加した、請求項１に記載の酵母。
【請求項７】
前記酵母は、さらにジンセノサイド合成に関与する遺伝子の発現が内在的発現レベルに比べて増加した、請求項１に記載の酵母。
【請求項８】
前記遺伝子は、ＰｇＤＤＳ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ，ｄａｍｍａｒｅｎｅｄｉｏｌ−ＩＩ  ｓｙｎｔｈａｓｅ），ＰｇＰＰＤＳ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ＣＹＰ７１６Ａ４７），ＰｇＣＰＲ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ，ＮＡＤＰＨ−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ），ｔＨＭＧ１（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＭＧ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）及びＰｇＳＥ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ，ｓｑｕａｌｅｎｅ  ｅｐｏｘｉｄａｓｅ）で構成された群から選択された１以上の遺伝子である、請求項７に記載の酵母。
【請求項９】
ジンセノサイド生産酵母菌株にＮＡＤＰＨ生合成関与遺伝子の発現レベルを、内在的発現レベルに比べて変化させる段階を含む、ジンセノサイド生産能が向上した酵母の製造方法。
【請求項１０】
前記ＮＡＤＰＨ生合成関与遺伝子は、Ａｌｄ２、Ａｌｄ６、Ｚｗｆ１及びＺｍｓ１からなる群から選択された１以上である、請求項９に記載の酵母の製造方法。
【請求項１１】
前記Ａｌｄ２の発現レベルは内在的発現レベルに比べて減少し、Ａｌｄ６発現レベルは内在的発現レベルに比べて増加した、請求項９に記載の酵母の製造方法。
【請求項１２】
前記酵母は、Ｚｗｆ１の発現レベルが内在的発現レベルに比べてさらに減少した、請求項１１に記載の酵母の製造方法。
【請求項１３】
前記酵母は、Ｚｍｓ１の発現レベルが内在的発現レベルに比べてさらに増加した、請求項１１に記載の酵母の製造方法。
【請求項１４】
前記ジンセノサイド生産酵母菌株は、ＰｇＤＤＳ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ，ｄａｍｍａｒｅｎｅｄｉｏｌ−ＩＩ  ｓｙｎｔｈａｓｅ），ＰｇＰＰＤＳ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ＣＹＰ７１６Ａ４７），ＰｇＣＰＲ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ，ＮＡＤＰＨ−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ），ｔＨＭＧ１（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＭＧ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）及びＰｇＳＥ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ，ｓｑｕａｌｅｎｅ  ｅｐｏｘｉｄａｓｅ）で構成された群から選択された１以上の遺伝子の発現レベルが内在的発現レベルに比べて増加した、請求項８に記載の酵母の製造方法。
【請求項１５】
（ａ）請求項１〜８のいずれか一項に記載の酵母を培地で培養する段階；及び
（ｂ）前記酵母または培地からジンセノサイドを得る段階を含む、ジンセノサイド生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジンセノサイドの生産を増大するための酵母及びそれを用いてジンセノサイドを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サポニンとは、植物界に広く存在する配糖体において糖でない部分が様々な環式化合物からなる物質を意味する。高麗人参又は紅参に主要生理活性成分として含まれるサポニン成分であるトリテルペンサポニン（ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ  ｓａｐｏｎｉｎ）は、他の植物において見られるサポニンとは化学構造が異なるので、この高麗人参サポニンを他の植物系サポニンと区別するために、高麗人参（Ｇｉｎｓｅｎｇ）配糖体（Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）という意味でジンセノサイド（Ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ）と呼ぶ。ジンセノサイドは、アグリコン（ａｇｌｙｃｏｎｅ）の構造によってプロトパナキサジオール系（Ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ−ｔｙｐｅ，ＰＰＤタイプ）ジンセノサイド、プロトパナキサトリオール系（Ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｔｒｉｏｌ−ｔｙｐｅ，ＰＰＴタイプ）ジンセノサイド、及びオレアノール酸系（Ｏｌｅａｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄタイプ）ジンセノサイドの３種類に分類される。
【０００３】
高麗人参の薬理学的な研究結果は、人参サポニン成分であるジンセノサイドに対する関心を増大させ、それらの大量生産の必要性が台頭しているが、一般的な耕作方法によって人参の有用物質を大量生産することは４〜６年の長い栽培期間、遮光栽培による病虫害防除の困難さ、輪作栽培などのような問題点を含むので、新たな代替生産方法に関する開発が切実に求められている。
【０００４】
最近バイオテクノロジーに基づいた人参サポニン関連遺伝子が多く発掘され、これらの遺伝子を用いてジンセノサイドを酵母から大量生産するための技術開発も最近になって注目を集め始めた。ジンセノサイドは植物体からメバロン酸生合成経路を含むイソプレノイド合成経路を通じて生合成されるため、酵母のエルゴステロール生合成経路を再設計してジンセノサイド生産菌株を開発しようとする合成生物学の研究が試みられている。最近、中国のＨｕａｎｇとＺｈａｎｇの共同研究チームで高麗人参のプロトパナキサジオールダンマレンジオール−ＩＩ合成酵素（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ  ｄａｍｍａｒｅｎｅｄｉｏｌ−ＩＩ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）プロトパナキサジオール合成酵素（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ  ｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅｓ）遺伝子をシロイヌナズナから確保したＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０還元酵素（ＮＡＤＰＨ−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子とともに酵母サッカロマイセス・セレビシエに発現させてプロトパナキサジオールを生産することに成功したことを報告した（Ｄａｉ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅｓ．Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．２０：１４６−１５６．（非特許文献１））。  今後、より最適化作業を通じてジンセノサイド生産合成酵母は、植物体から抽出する複雑な工程過程を代替することができる経済的な生産工程を提供すると期待されている。
【０００５】
このような背景の下で、本発明者らは、酵母を用いたジンセノサイド生産量を増大させるために鋭意研究努力した結果、ジンセノサイド生産酵母のＮＡＤＰＨ生合成関与遺伝子の発現が変化した酵母、及び前記酵母の製造方法を開発し、前記酵母は、既存のジンセノサイド生産能を有する酵母よりジンセノサイド生合成の中間産物であるプロトパナキサジオールの生産量が増加することを確認し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Dai，Z.et al.，(2013) Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of ginsenosides.Metab.Eng.20：146-156.
【非特許文献２】J.Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory press，Cold Spring Harbor，New York，1989
【非特許文献３】F.M.Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，New York
【非特許文献４】Ju Young Lee et al，(2015) Biotechnol.Bioeng.，112，751-758.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ジンセノサイド生産用酵母を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記酵母を製造する方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記酵母を用いてジンセノサイドを高収率で生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
これを具体的に説明すると次の通りである。一方、本出願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用することができる。すなわち、本出願で開示された多様な要素の全ての組み合わせが本出願のカテゴリに属する。また、下記記述された具体的な叙述によって、本出願のカテゴリが制限されるとは見られない。
【０００９】
本発明の目的を達成するための一つの様態として、ＮＡＤＰＨ生合成関与遺伝子の発現レベルが内在的発現レベルに比べて変化した、ジンセノサイド生産用酵母を提供することである。
【００１０】
本発明の目的を達成するためのもう一つの様態として、ＮＡＤＰＨ生合成関与遺伝子の発現レベルが内在的発現レベルに比べて変化した、ジンセノサイド生産用酵母を含むジンセノサイド生産用組成物を提供することである。
【００１１】
本発明における用語、「ＮＡＤＰＨ（ｒｅｄｕｃｅｄ  ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）」とは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド構造を共有するＮＡＤＨと共に多くの酸化還元酵素（ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅとｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の反応に電子供与体として参与し、還元力を提供する補酵素の一種である。これら補酵素の酸化物（ＮＡＤ＋とＮＡＤＰ＋）は、生体異化反応で生成されるエネルギーを電子とプロトンの形態で受容する重要な機能を担当し、酸化還元酵素反応に電子受容体として参与していることが知られている。
【００１２】
本発明は、ＮＡＤＰＨ生合成関与遺伝子の発現レベルを変化（増加または減少）させることによってジンセノサイドの生産を増大させる特徴がある。本発明の目的上、前記ＮＡＤＰＨ生合成関与遺伝子中、ジンセノサイド、具体的には、プロトパナキサジオール（ＰＰＤ）の大量生産に関与する遺伝子であれば制限なく利用可能である。
【００１３】
本発明の実施例では、ＮＡＤＰＨ生合成経路に関連する遺伝子変異菌株を製作し、野生型酵母細胞及び形質転換された酵母細胞のＮＡＤＰＨ生産量を確認した（実施例１〜実施例３）。具体的には、Ａｌｄ２またはＧｄｈ１遺伝子が不活性された菌株、Ｇｎｄ１、Ｇｄｈ２、Ａｌｄ６、Ｚｗｆ１またはＳｔｂ５遺伝子が過発現された菌株、Ａｌｄ２不活性及びＡｌｄ６過発現菌株、またはＧｄｈ１不活性及びＧｄｈ２過発現菌株など、ＮＡＤＰＨ生合成に関連する多様な遺伝子を不活性させたり、または過発現させた多様な菌株を製作し、ＮＡＤＰＨの生産量が増加するかを確認した。
【００１４】
ＮＡＤＰＨ生合成関与遺伝子は、Ａｌｄ２、Ｇｄｈ１、Ｇｎｄ１、Ｇｄｈ２、Ａｌｄ６、Ｓｔｂ５、Ｚｗｆ１またはＺｍｓ１からなる群から選択された１以上のものであってもよく、より具体的には、Ａｌｄ２、Ａｌｄ６、Ｚｗｆ１及びＺｍｓ１からなる群から選択された１以上のものであってもよいが、これに限定されない。前記ＮＡＤＰＨ生合成関連遺伝子は、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個であってもよい。
【００１５】
前記遺伝子又は前記遺伝子などによりコードされる酵素の配列は公知となったデータベースから得ることができ、その例としてＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなどがあり得るが、これに限定されない。
【００１６】
前記Ａｌｄ２遺伝子によりコードされる酵素であるＡＬＤ２はアセトアルデヒドを酢酸に転換させる酵素であり、その過程でＮＡＤＨを生成することが知られている。また、ＡＬＤ６はＡＬＤ２と同一の反応をする酵素（ｉｓｏｚｙｍｅ）であり、同様に、その過程でＮＡＤＰＨを生成することが知られている。また、前記Ｚｍｓ１遺伝子によってコードされる酵素であるＺＭＳ１は転写調節因子であり、Ａｌｄ６の過発現を誘導することが知られている。
【００１７】
具体的には、前記Ａｌｄ２は、配列番号１の遺伝子配列を有することができ、Ａｌｄ６は配列番号２の遺伝子配列を有することができるが、それぞれＡＬＤ２、ＡＬＤ６酵素またはＡＬＤ２、ＡＬＤ６酵素をコードする配列は、制限なく含まれる。
【００１８】
前記Ｚｗｆ１遺伝子によってコードされる酵素であるＺＷＦ１はペントースリン酸経路（ＰＰ  ｐａｔｈｗａｙ）の必須の酵素であり、ＰＰ  ｐａｔｈｗａｙの最初の段階を触媒する。酸化ストレスに関与し、細胞内で五炭糖（ｐｅｎｔｏｓｅ）とＮＡＤＰＨの生産を担当することが知られている。
【００１９】
具体的には、前記Ｚｗｆ１は配列番号３の遺伝子配列を有することができ、Ｚｍｓ１は配列番号４の遺伝子配列を有することができるが、それぞれＺＷＦ１、ＺＭＳ１酵素またはＺＷＦ１、ＺＭＳ１酵素をコードする配列は、制限なく含まれる。それ以外にもＧｄｈ１、Ｇｎｄ１、Ｇｄｈ２、及びＳｔｂ５は、それぞれ配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４の遺伝子配列を有することができるが、それぞれＧＤＨ１、ＧＮＤ１、ＧＤＨ２、及びＳＴＢ５酵素をコードする配列は、制限なく含まれる。
【００２０】
本発明の目的上、ＮＡＤＰＨ生合成を増加させるのに関与し、ジンセノサイドまたはプロトパナキサジオール（ＰＰＤ）系ジンセノサイドを増加させる遺伝子であれば制限なく適用可能である。
【００２１】
また、本発明において、前記遺伝子は、記載された配列番号だけではなく、前記配列と８０％以上、具体的には９０％以上、さらに具体的には９５％以上、より一層具体的には、９９％以上の相同性を示す遺伝子を含むことができる。また、前記配列と相同性を示す塩基配列であり、実質的に前記酵素と同一または相応する効能を示す酵素をコードする遺伝子配列であれば制限なく含まれる。また、このような相同性を有する塩基配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加された塩基配列も、本発明の範囲内に含まれることは自明である。
【００２２】
前記における用語「相同性」とは、与えられた塩基配列と一致する程度を意味し、パーセンテージで表示することができる。本明細書において、与えられた塩基配列と同一または類似の活性を有するその相同性配列が「％相同性」と表示される。例えば、スコア（ｓｃｏｒｅ）、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）及び類似度（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）などの媒介パラメータ（ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を計算する標準ソフトウェア、具体的には、ＢＬＡＳＴ２．０を利用したり、定義された厳格な条件の下でサザン混成化実験によって配列を比較することにより確認することができ、定義される適切な混成化条件は、当該技術の範囲内であり、当業者によく知られている方法（例えば、J.Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory press，Cold Spring Harbor，New York，1989（非特許文献２）；F.M.Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，New York（非特許文献３））で決定されてもよい。
【００２３】
本発明の酵母は、ＮＡＤＰＨ生合成関連タンパク質の発現レベルが内在的発現レベルに比べて変化したことを特徴とする。
【００２４】
本発明における「内在性発現レベル」とは、微生物が天然の状態又は当該タンパク質の発現レベルを改変する前の親菌株において発現するｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルを意味する。これは、本質的に菌株などの細胞及び組織などにおいて正常な状況又は特定タンパク質の発現を調節する前の状況で与えられたｍＲＮＡ又はタンパク質を生産する程度である。内在的発現レベルは、菌株の種類、細胞のタイプ及び組織間で比較されてもよく、または一部の刺激により誘発された発現レベルと比較されてもよい。具体的には、ＮＡＤＰＨ生合成関連タンパク質の発現を調節していない微生物において発現するｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルであってもよい。
【００２５】
前記における用語における「変化」とは、減少または増加の両方を含む意味で使用することができ、本発明の目的上、特定の遺伝子を不活性させて発現を減少させるか、特定の遺伝子を過発現させて発現を増加させることをいずれも含む。すなわち、「減少」は「発現レベルが内在的発現レベルに比べて減少」という意味で使用することができ、「増加」は「発現レベルが内在的発現レベルに比べて増加」という意味で使用することができる。
【００２６】
具体的には、「発現レベルが内在的発現レベルに比べて増加」とは、当該ポリペプチドを暗号化する遺伝子が自然の状態または変形前の状態より多く発現され機能性のある該当ポリペプチドを多く生産することを意味する。具体的には、
１）前記タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドのコピー数の増加、
２）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形、
３）前記タンパク質の活性が強化するように、染色体上のポリヌクレオチド配列の変形、または
４）その組み合わせにより強化されるように変形する方法などにより行うことができるが、これらに限定されない。
【００２７】
前記１）ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、特にこれに限定されないが、ベクターに作動可能に連結された形態で実行されてもよく、宿主細胞内の染色体内に挿入されることによって実行されてもよい。具体的には、本発明の酵素を暗号化するポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主と無関係に複製されて機能することができるベクターが宿主細胞内に導入されることによって実行されてもよく、前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することができるベクターが宿主細胞内に導入されることにより、前記宿主細胞の染色体内の前記ポリヌクレオチドのコピー数を増加させる方法で行ってもよい。前記導入は、公知となった形質転換方法を当業者が適宜選択して行うことができ、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現されることにより、酵素が生成され、その活性が増加されてもよい。
【００２８】
次に、２）ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形は、特にこれに限定されないが、前記発現調節配列の活性をさらに強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して行ってもよく、さらに強い活性を有する核酸配列で交換することによって行われてもよい。前記発現調節配列は、特にこれに限定されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び解読の終結を調節する配列などを含むことができる。
【００２９】
併せて、３）染色体上のポリヌクレオチド配列の変形は、特にこれに限定されないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性をさらに強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行ってもよく、さらに強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列で交換することによって行われてもよい。
【００３０】
最後に、４）前記１）〜３）の組み合わせによって強化されるように変形する方法は、前記酵素を暗号化するポリヌクレオチドのコピー数の増加、その発現が増加するように発現調節配列の変形、染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の変形及び前記酵素の活性を示す外来ポリヌクレオチドまたはそのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドの変形中、１以上の方法を共に適用して実行することができる。
【００３１】
本発明で使用された用語「ベクター」とは、適切な宿主内で目的タンパク質を発現させることができるように、適切な調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始することができるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含むことができる。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノムそのものに統合することができる。
【００３２】
本発明で使用されるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界において公知となった任意のベクターを利用することができる。通常使用されるベクターの例としては、天然の状態または組換えされた状態のプラスミドとして前記複製開始点は、酵母自己複製配列（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＡＲＳ）を含んでもよい。前記酵母自己複製配列は、酵母動原体配列（ｃｅｎｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＣＥＮ）によって安定化される。前記プロモーターは、ＣＹＣプロモーター、ＴＥＦプロモーター、ＧＰＤプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＡＤＨプロモーターなどからなる群から選択されたものであってもよい。前記ターミネーターはＰＧＫ１、ＣＹＣ１、及びＧＡＬ１などからなる群から選択されてもよい。前記ベクターは、選別マーカーをさらに含むことができる。
【００３３】
本出願で使用可能なベクターは、特に制限されるものではなく、公知となった発現ベクターを使用することができる。また、細胞内の染色体挿入用ベクターを通じて染色体内に目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界において公知となった任意の方法、例えば、相同組換えによって行うことができるが、これに限定されない。前記染色体挿入有無を確認するための選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ）をさらに含むことができる。選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、すなわち、目的核酸分子の挿入有無を確認するためのものであり、薬剤耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能表現型を与えるマーカーが使用されてもよい。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみが生存したり、または他の表現形質を示すので、形質転換された細胞を選別することができる。
【００３４】
本発明における「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現さえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、それら全てを含むことができる。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡやＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現することができるものであれば、どのような形態で導入されても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自体で発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入することができる。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含むことができる。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。前記形質転換する方法は、核酸を細胞内に導入する如何なる方法も含まれ、宿主細胞に応じて当分野において公知となったように、適切な標準的な技術を選択して実行することができる。例えば、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、カチオンリポソーム法、及び酢酸リチウム−ＤＭＳＯ法などがあるが、これらに限定されない。
【００３５】
また、前記における用語「作動可能に連結された」とは、本出願の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列と、前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されていることを意味する。動作可能な連結は、当業界において公知となった遺伝子組換え技術を用いて製造することができ、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は、当業界の切断及び連結酵素などを使用して製作することができるが、これに限定されない。
【００３６】
本出願における用語「発現レベルが内在的発現レベルに比べて減少」とは、特定の遺伝子を不活性させることであり、具体的には、「不活性化」とは、本来微生物が有する酵素タンパク質の内在的活性または変換前の活性に比べて、その活性が弱化する場合、全く発現されていない場合、または発現されても、その活性がない場合を意味する。また、本発明において、前記不活性化は、減少、欠失、または弱化を全て含む意味で使用することができる。
【００３７】
具体的には、前記不活性化は、酵素をコードするポリヌクレオチドの変異などにより酵素自体の活性が本来の微生物が有している酵素の活性に比べて弱化したり、除去された場合と、それをコードする遺伝子の発現阻害または翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）阻害などにより細胞内で全体的な酵素活性の程度が、天然型微生物に比べて低いか、または除去された場合、前記遺伝子の一部または全体が欠失された場合、及びこれらの組み合わせも含む概念であり、これに限定されない。
【００３８】
このような酵素活性の不活性化は、当該分野においてよく知られている多様な方法の適用により達成することができる。前記方法の例として、１）前記酵素の活性が除去された場合を含め、前記酵素の活性が弱化するように突然変異された遺伝子であり、染色体上の前記酵素をコードする遺伝子を代替する方法；２）前記酵素をコードする染色体上の遺伝子の発現調節配列を変形する方法；３）前記酵素をコードする遺伝子の発現調節配列を活性が弱いか、存在しない配列に交換する方法；４）前記酵素をコードする染色体上の遺伝子の全体または一部を欠失させる方法；５）前記染色体上の遺伝子の転写体に相補的に結合して前記ｍＲＮＡから酵素への翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入する方法；６）前記酵素をコードする遺伝子のＳＤ配列の前段にＳＤ配列と相補的な配列を人為的に付加して２次構造物を形成させてリボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）の付着が不可能にする作り方または７）該当配列のＯＲＦ（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）の３’末端に逆転写されるようにプロモーターを付加するＲＴＥ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）方法などがあり、これらの組み合わせでも達成することができるが、これに、特に制限されるものではない。
【００３９】
前記染色体上の遺伝子配列を変形する方法は、前記酵素の活性をさらに弱化するように遺伝子配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して行ってもよく、さらに弱い活性を有するように改良された遺伝子配列または活性がないように改良された遺伝子配列で交換することにより行ってもよいが、これに限定されるものではない。
【００４０】
前記発現調節配列を変形する方法は、前記発現調節配列の活性をさらに弱化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行ってもよく、さらに弱い活性を有する核酸配列で交換することにより行ってもよい。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列を含むが、これに限定されるものではない。
【００４１】
また、酵素をコードするポリヌクレオチドの一部または全体を欠失する方法は、細胞内の染色体挿入用ベクターを通じて染色体内の内在的目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、一部の核酸配列が欠失したポリヌクレオチドまたはマーカー遺伝子で交換することにより行うことができる。このようなポリヌクレオチドの一部または全体を欠失させる方法の一例として、相同組換えによりポリヌクレオチドを欠失させる方法を使用することができるが、これに限定されない。
【００４２】
前記ポリヌクレオチドは、機能をすることができるポリヌクレオチド集合体である場合、遺伝子として記載されてもよい。本出願においてポリヌクレオチドと遺伝子は混用されてもよい。
【００４３】
前記における「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類によって異なるが、具体的には１〜３００個、より具体的には１〜１００個、より一層具体的には１〜５０個であってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
【００４４】
本発明の一実施例では、ＮＡＤＰＨ濃度が対照群に比べて増加された菌株を選別し、前記菌株からＮＡＤＰＨ生合成経路に影響を与える遺伝子がＰＰＤ酵母細胞の成長及びＰＰＤの生産にも影響を与えるかを確認するために、ＰＰＤ酵母細胞にＡｌｄ２不活性及びＡｌｄ６過発現された菌株（ＰＰＤ、△ａｌｄ２：：ａｌｄ６）を作製した（実施例４）。また、前記菌株に、さらにＺｗｆ１が不活性化された菌株（ＰＰＤ、△ａｌｄ２：：ａｌｄ６、△ｚｗｆ１）及びＺｍｓ１が過発現された菌株（ＰＰＤ△ａｌｄ２：：ａｌｄ６、ｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｚｍｓ１）を作製した。
【００４５】
その結果、製作された形質転換酵母は、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて優れたプロトパナキサジオール（ＰＰＤ）を生産することを確認した。具体的には、Ａｌｄ２不活性及びＡｌｄ６過発現菌株は、対照群に比べて約４倍程度のプロトパナキサジオールを生産し、Ａｌｄ２不活性及びＡｌｄ６過発現菌株にＮＡＤＰＨ生合成経路で影響を与える遺伝子であるＺｗｆ１をさらに不活性させるか、Ｚｍｓ１をさらに過発現させた場合にプロトパナキサジオールの生産量が著しく増加することを確認した（表５、図７及び図８）。
【００４６】
これは、ＮＡＤＰＨ生合成関与遺伝子（Ａｌｄ２、Ａｌｄ６、Ｚｗｆ１及びＺｍｓ１）の発現レベルが内在的発現レベルによって変化した場合、ジンセノサイド生合成中間体産物であるプロトパナキサジオールの生産量が増加するところ、これは最終的にジンセノサイド生産能が向上することを示唆することである。
【００４７】
本発明における用語、「ジンセノサイド生産用酵母」とは、自然にジンセノサイド生産能を有している酵母またはジンセノサイドの生産能のない親菌株にジンセノサイドの生産能が付与された酵母を意味する。
【００４８】
具体的には、本発明においてジンセノサイドを生産する微生物は、天然型微生物自体または外部ジンセノサイド生合成に関連する遺伝子を導入してジンセノサイド生産能を有するようになった微生物または外部ＮＡＤＰＨ生産メカニズムと関連する遺伝子が挿入されるか、内在的遺伝子の活性を強化したり、不活性させてジンセノサイド生産能が増加した微生物を意味することができる。
【００４９】
より具体的には、本願の前記酵母はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ジゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジタ（Ｃａｎｄｉｄａ）、シゾサッカロミセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、イサケンキア（Ｉｓｓａｃｈｅｎｋｉａ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）またはハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）に属する菌株であってもよい。
【００５０】
サッカロミセスに属する菌株は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロミセス・ブラウディ（Ｓ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、サッカロミセス・ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）、サッカロミセス・カリオカヌス（Ｓ．ｃａｒｉｏｃａｎｕｓ）、サッカロミセス・カリオカス（Ｓ．ｃａｒｉｏｃｕｓ）、サッカロミセス・シュバリエ（Ｓ．ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）、サッカロミセス・ダイレネンシス（Ｓ．ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・エリプソイデウス（Ｓ．ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ）、サッカロミセス・ユーバヤヌス（Ｓ．ｅｕｂａｙａｎｕｓ）、サッカロミセス・エクシグウス（Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ）、サッカロミセス・フロレンティヌス（Ｓ．ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・マティニアエ（Ｓ．ｍａｒｔｉｎｉａｅ）、サッカロミセス・モナセンシス（Ｓ．ｍｏｎａｃｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓ．ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・パラドキサス（Ｓ．ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、サッカロミセス・パストリアヌス（Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、サッカロミセス・スペンセロルム（Ｓ．ｓｐｅｎｃｅｒｏｒｕｍ）、サッカロミセス・トゥリセンシス（Ｓ．ｔｕｒｉｃｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・ユニスポラス（Ｓ．ｕｎｉｓｐｏｒｕｓ）、サッカロミセス・ウバルム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）、またはサッカロミセス・ゾナトゥス（Ｓ．ｚｏｎａｔｕｓ）であってもよい。より具体的には、前記酵母はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  であってもよいが、これに限定されない。
【００５１】
前記ジンセノサイドを生産する微生物は、特にこれに限定されないが、Ａｌｄ２の発現レベルは、内在的発現レベルに比べて減少し、Ａｌｄ６発現レベルは、内在的発現レベルに比べて増加したものであってもよく、さらにＺｗｆ１の発現レベルが内在的発現レベルに比べて減少したものであってもよい。また、さらにＺｍｓ１の発現レベルが内在的発現レベルに比べて増加したものであってもよいが、これらに限定されない。
【００５２】
また、前記ジンセノサイドを生産する酵母は、特にこれに限定されないが、ジンセノサイド生合成に不可欠な前駆体であるスクアレンの生合成の増大のためのメバロン酸代謝経路を強化するためにＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に転換するＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ；ｔＨＭＧ１）及びスクアレンを２，３−オキシドスクアレンに転換する人参由来スクアレンエポキシダーゼ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ、ｓｑｕａｌｅｎｅ  ｅｐｏｘｉｄａｓｅ；ＰｇＳＥ）の活性を内在的活性に比べて増加させるように変形し、ジンセノサイド生合成代謝経路を導入するために２，３−オキシドスクアレンをダンマレンジオール−IIに転換する人参由来ダンマレンジオール−II合成酵素（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ、ｄａｍｍａｒｅｎｅｄｉｏｌ−ＩＩ  ｓｙｎｔｈａｓｅ；ＰｇＤＤＳ）、ダンマレンジオール−IIをプロトパナキサジオールに転換する人参由来シトクロムＰ４５０  ＣＹＰ７１６Ａ４７（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ＣＹＰ７１６Ａ４７；ＰｇＰＰＤＳ）及び人参由来ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０還元酵素（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ  ＮＡＤＰＨ−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ；ＰｇＣＰＲ）の活性を導入するように変形されたものであってもよい。
【００５３】
本発明における用語「ジンセノサイド（ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ）」とは、高麗人参由来のダンマラン（ｄａｍｍａｒａｎｅ）系サポニンまたはその誘導体を意味するが、他の植物で発見されるサポニンとは異なる特異な化学構造を有している。具体的には、ジンセノサイドは、アグリコン（ａｇｌｙｃｏｎｅ）の構造に応じてプロトパナキサジオール系（Ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ−ｔｙｐｅ、ＰＰＤタイプ）ジンセノサイド、プロトパナキサトリオール系（Ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｔｒｉｏｌ−ｔｙｐｅ、ＰＰＴタイプ）ジンセノサイド及びオレアノール酸系（Ｏｌｅａｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄタイプ）ジンセノサイドの３種類に分類される。これら３つのグループは、さらに化合物構造中の環の３位の炭素、６位の炭素及び２０位の炭素位置にグリコシド結合（ｇｌｙｃｏｓｉｃｉｄ  ｂｏｎｄ）により付着する糖部分（アグリコン）（ｓｕｇａｒ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ（ａｇｌｙｃｏｎｅｓ））の位置及び数によって分類される。オレアノール酸系ジンセノサイドの基本骨格は、５環状であり、これには唯一ジンセノサイドＲｏがあり、そのアグリコンはオレアノール酸（ｏｌｅａｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）である。現在、４０種類以上のジンセノサイドが分離され、これらのほとんどはＰＰＤタイプのジンセノサイドである。ＰＰＤタイプのジンセノサイドはＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｃ、Ｒｄ、ギペノシドＸＶＩＩ（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ  ＸＶＩＩ）、化合物Ｏ（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｏ）、化合物Ｍｃ１（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｍｃ１）、Ｆ２、化合物Ｙ（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｙ）、化合物Ｍｃ（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｍｃ）、Ｒｇ３、Ｒｈ２、ＣＫが含まれる。ＰＰＴタイプのジンセノサイドにはＲｅ、Ｒｇ１、Ｒｆ、Ｒｇ２、Ｒｈ１などが含まれる。
【００５４】
前記ジンセノサイドは、特にこれに限定されないが、一例としてＰＰＤ（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ）系のジンセノサイド、ＰＰＴ（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｔｒｉｏｌ）系のジンセノサイドなどであってよく、他の例としてＰＰＤ、ＰＰＴ、Ｒａ３、Ｒｂ１、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｇ１、Ｒｇ２、Ｒｇ３、Ｒｈ１、Ｒｈ２、Ｒｓ１、Ｃ−Ｏ、Ｃ−Ｙ、Ｃ−Ｍｃ１、Ｃ−Ｍｃ、Ｆ１、Ｆ２、コンパウンドＫ（ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｋ）、ギペノシドＸＶＩＩ（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ  ＸＶＩＩ）、ギペノシドＬＸＸＶ（Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ  ＬＸＸＶ）、Ｒｓ２、ＰＰＤ、Ｒｅ、Ｒｇ１、Ｒｆ、Ｆ１、Ｒｇ２、ＰＰＴ及びＲｈ１などを単独でまたは混合物として使用することができ、他の例としては、ＰＰＤ、ＰＰＴ、コンパウンドＫ（ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｋ）、Ｒｂ１、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｆ１、Ｆ２、Ｒｇ１、Ｒｇ２、Ｒｇ３、Ｒｈ１、Ｒｈ２などを単独でまたは混合物として使用することができる。具体的には、プロトパナキサジオール系ジンセノサイドであってもよい。
【００５５】
また、本発明の酵母は、ＮＡＤＰＨの生産能が内在的レベルに比べて増加したものであってもよい。
【００５６】
本発明のもう一つの具体例は、前記酵母は、さらにジンセノサイド合成に関与する遺伝子の発現が内在的発現レベルに比べて増加したものである、組換え酵母を提供する。
【００５７】
本発明のもう一つの具体例は、前記遺伝子は、ＰｇＤＤＳ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ，ｄａｍｍａｒｅｎｅｄｉｏｌ−ＩＩ  ｓｙｎｔｈａｓｅ），ＰｇＰＰＤＳ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ＣＹＰ７１６Ａ４７），ＰｇＣＰＲ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ，ＮＡＤＰＨ−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）  、ｔＨＭＧ１（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＭＧ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）及びＰｇＳＥ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ，ｓｑｕａｌｅｎｅ  ｅｐｏｘｉｄａｓｅ）で構成された群から選択された一つ以上の遺伝子である、酵母を提供する。
【００５８】
前記ジンセノサイド生合成代謝経路に関する酵素には、それぞれ配列番号５〜９のアミノ酸配列、又はそれと７０％以上、より具体的には８０％以上、さらに具体的には９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列が含まれてもよい。
【００５９】
本発明の他の態様は、ジンセノサイド生産酵母菌株にＮＡＤＰＨ生合成関与遺伝子の発現レベルを、内在的発現レベルに比べて変化させる段階を含む、ジンセノサイド生産能が向上した酵母の製造方法を提供する。
【００６０】
本発明の一つの具体例は、前記ＮＡＤＰＨ生合成関与遺伝子としてＡｌｄ２、Ａｌｄ６、Ｚｗｆ１及びＺｍｓ１からなる群から選択された１以上の発現レベルが内在的発現レベルに比べて増加させる、酵母の製造方法を提供する。
【００６１】
前記ジンセノサイド生産酵母菌株、ＮＡＤＰＨ生合成関与遺伝子、Ａｌｄ２、Ａｌｄ６、Ｚｗｆ１、Ｚｍｓ１及び内在的発現レベルなどについては前述した通りである。
【００６２】
本発明のもう一つの具体例は、前記ジンセノサイド生産酵母菌株は、ＰｇＤＤＳ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ、ｄａｍｍａｒｅｎｅｄｉｏｌ−ＩＩ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＰｇＰＰＤＳ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ＣＹＰ７１６Ａ４７）、ＰｇＣＰＲ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ、ＮＡＤＰＨ−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ｔＨＭＧ１  （Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＭＧ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）及びＰｇＳＥ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ、ｓｑｕａｌｅｎｅ  ｅｐｏｘｉｄａｓｅ）で構成された群から選択された１以上の遺伝子の発現レベルが内在的発現レベルに比べて増加したものであってもよい。
【００６３】
本発明のもう一つの態様は、前記酵母を培地で培養する段階；及び前記酵母または培地からジンセノサイドを得る段階を含む、ジンセノサイド生産方法を提供することである。
【００６４】
前記方法において、前記酵母を培養する段階は、特にこれに限定されないが、公知となった回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われる。このとき、培養条件は、特にそれに限定されないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）を使用して適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、具体的にはｐＨ６〜８、最も具体的には、ｐＨ６．８）を調節することができ、酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持することができる。培養温度は２０〜４５℃、具体的には２５〜４０℃を維持することができ、約１０〜１６０時間培養することができる。前記培養によって生産されたジンセノサイドは培地中に分泌されたり、細胞内に残留してもよい。
【００６５】
併せて、使用される培養用培地は、炭素供給源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、澱粉及びセルロース）、油脂及び脂肪（例えば、大豆油、ヒマワリの種油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール及びエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に使用したり、または混合して使用することができるが、これに限定されない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆泊分及び尿素）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に使用したり、または混合して使用することができるが、これに限定されない。リン供給源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別に使用したり、または混合して使用することができるが、これに限定されず、その他の金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンのような必須の成長促進物質を含むことができる。
【００６６】
前記方法は、生産されたジンセノサイドを回収する段階をさらに含むことができる。この回収段階は、培養された細胞またはその上澄液から回収する段階であってもよく、回収に適切なプロセスを当業者が選択することができる。
【００６７】
本発明の前記培養段階で生産されたジンセノサイドを回収する方法は、培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式培養方法などによって、当該分野において公知となった適切な方法を用いて培養液から目的とする生産物を収集することができる。例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが使用されてもよく、当該分野において公知となった適切な方法を用いて培地または微生物から、目的とするジンセノサイドを回収することができる。前記ジンセノサイドを回収する方法は、精製段階をさらに含むことができる。
【発明の効果】
【００６８】
本発明のジンセノサイド生産酵母のＮＡＤＰＨ生合成関与遺伝子の発現が変化した酵母は、既存のジンセノサイド生産能を有する酵母よりジンセノサイド生合成の中間産物であるプロトパナキサジオールの生産量を増加させる効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ＮＡＤＰＨ生合成経路の改良を通じたジンセノサイド生産増大について簡単に説明した図である。
【図２】ジンセノサイド生合成代謝経路に関する図である。
【図３】Ａｌｄ２またはＧｄｈ１遺伝子を不活性させるために製作されたベクターであるｐＵＣ５７−ＵＲＡ３Ｍｙｃのベクターマップを示す図である。
【図４】Ｇｎｄ１、Ｇｄｈ２、Ａｌｄ６、Ｚｗｆ１またはＳｔｂ５遺伝子を過発現するために製作されたベクターであるｐ４１６＿ＧＰＤのベクターマップを示す図である。
【図５】Ａｌｄ２不活性及びＡｌｄ６過発現させ、Ｇｄｈ１不活性及びＧｄｈ２過発現させるために製作されたベクターであるｐＵＣ５７ＧＰＤ−ＵＲＡ３Ｍｙｃのベクターマップを示す図である。
【図６】野生型酵母細胞及び形質転換された酵母細胞のＮＡＤＰＨを示す図である。具体的には、Ｃは対照群菌株として野生型Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄを表し；−Ａｌｄ２は  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ，ΔＡｌｄ２；−Ｇｄｈ１は  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ，ΔＧｄｈ１；＋ＧＮＤ１は  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ，ｐ４１６＿ＧＰＤ＿ＧＮＤ１；＋Ｇｄｈ２は  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ，ｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｇｄｈ２；＋Ａｌｄ６は  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ，ｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ａｌｄ６；＋Ｚｗｆ１は  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ，ｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｚｗｆ１；＋ＳＴＢ５は  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ，ｐ４１６＿ＧＰＤ＿ＳＴＢ５；−Ａｌｄ２／＋Ａｌｄ６は  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ，Δａｌｄ２：：ａｌｄ６及び−Ｇｄｈ１／＋Ｇｄｈ２は  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ，ΔＧｄｈ１：：Ｇｄｈ２  をそれぞれ示す。
【図７】形質転換された酵母細胞内のＰＰＤの生産量を示すグラフである。具体的には、Ｃｏｎｔｒｏｌは、ＰＰＤ菌株（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ  Δｔｒｐ１：：ＰＧＰＤ１  ｔＨＭＧ１＋ＰＧＰＤ１  ＰｇＳＥ  Δｌｅｕ２：：ＰＧＰＤ１  ＰｇＤＤＳ  ＋ＰＧＰＤ１  ＰｇＰＰＤＳ＋ＰＧＰＤ１  ＰｇＣＰＲ）を示し；＋Ｚｗｆ１は  ＰＰＤ，ｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｚｗｆ１；＋ＳＴＢ５は  ＰＰＤ，ｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｓｔｂ５；−Ａｌｄ２／＋Ａｌｄ６は  ＰＰＤ，△ａｌｄ２：：ａｌｄ６  そして、−Ｇｄｈ１／＋Ｇｄｈ２は  ＰＰＤ，ΔＧｄｈ１：：Ｇｄｈ２を示す。
【図８】形質転換された酵母細胞内のＰＰＤの生産量を相対値で表したグラフである。具体的には、Ｃｏｎｔｒｏｌ（対照群）はＰＰＤ菌株（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ  Δｔｒｐ１：：ＰＧＰＤ１  ｔＨＭＧ１＋ＰＧＰＤ１  ＰｇＳＥ  Δｌｅｕ２：：ＰＧＰＤ１  ＰｇＤＤＳ  ＋ＰＧＰＤ１  ＰｇＰＰＤＳ＋ＰＧＰＤ１  ＰｇＣＰＲ）を示し；＋Ｚｍｓ１は  ＰＰＤ，ｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｚｍｓ１；−Ａｌｄ２／＋Ａｌｄ６は  ＰＰＤ，Δａｌｄ２：：ａｌｄ６；−Ａｌｄ２／＋Ａｌｄ６／−Ｚｗｆ１は  ＰＰＤ，Δａｌｄ２：：ａｌｄ６，ΔＺｗｆ１  そして、−Ａｌｄ２／＋Ａｌｄ６／＋Ｚｍｓ１は  ＰＰＤ， Δａｌｄ２：：ａｌｄ６，ｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｚｍｓ１を示す。値は、対照群菌株の７２時間におけるプロトパナキサジオール生産濃度を１と置いたとき、製作された菌株で生産されたプロトパナキサジオールのｆｏｌｄ変化値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
以下、本発明を実施例及び実験例を通じてより詳しく説明する。しかし、これらの実施例及び実験例は本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例及び実験例に限定されるものではない。
【００７１】
実施例１：ＰＰＤ酵母変異株の作製
本特許の酵母細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ  野生型菌株［（ＭＡＴα  ｕｒａ３−５２；ｔｒｐ１−２８９；ｌｅｕ２−３，１１２；ｈｉｓ３△  １；ＭＡＬ２−８；ＳＵＣ２）、ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ：３００００Ｂ］にジンセノサイド生合成代謝経路の導入及びジンセノサイド生合成に不可欠な前駆体であるスクアレン（ｓｑｕａｌｅｎｅ）の生合成を増大させるためのメバロン酸代謝経路の強化によるプロトパナキサジオール（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ；ＰＰＤ）を生産する酵母菌株を製作し、前記酵母菌株をＰＰＤ酵母変異株と命名した。
【００７２】
ＰＰＤ菌株の遺伝子型は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ  Δｔｒｐ１：：ＰＧＰＤ１  ｔＨＭＧ１＋ＰＧＰＤ１  ＰｇＳＥ＋Δｌｅｕ２：：ＰＧＰＤ１  ＰｇＤＤＳ＋ＰＧＰＤ１  ＰｇＰＰＤＳ＋ＰＧＰＤ１  ＰｇＣＰＲである。ジンセノサイド生合成酵素である  ＰｇＤＤＳ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ，ｄａｍｍａｒｅｎｅｄｉｏｌ−ＩＩ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，配列番号５）、ＰｇＰＰＤＳ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ＣＹＰ７１６Ａ４７，配列番号６）及び  ＰｇＣＰＲ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ，ＮＡＤＰＨ−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，配列番号７）とメバロン酸代謝経路を強化させるために代謝経路の酵素である  ｔＨＭＧ１（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＭＧ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，配列番号８）及び  ＰｇＳＥ（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ，ｓｑｕａｌｅｎｅ  ｅｐｏｘｉｄａｓｅ，配列番号９）をコードする遺伝子を、それぞれ高発現の常時性プロモーターであるＧＰＤ１（ＴＤＨ３）プロモーターから転写されて発現されるようにした。
【００７３】
実施例２：ＮＡＤＰＨ生合成経路に関連する変異菌株の製作
２−１：Ａｌｄ２またはＧｄｈ１不活性菌株の製作
ＰＰＤ酵母変異株において、ＮＡＤＰＨ生合成または消費経路に関連する遺伝子Ａｌｄ２またはＧｄｈ１の不活性が、前記酵母変異株の成長及びＰＰＤの生産能に関与するかどうかを確認するために、前記Ａｌｄ２またはＧｄｈ１遺伝子が不活性された酵母変異株を作製した。
【００７４】
ゲノム上のＡｌｄ２遺伝子を不活性させるために、既存に製作されたｐＵＣ５７−ＵＲＡ３Ｍｙｃベクター（Ｊｕ  Ｙｏｕｎｇ  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，（２０１５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１１２，７５１−７５８．（非特許文献４））を鋳型とし（図３及び配列番号１８）、Ｄｅｌ＿Ａｌｄ２＿Ｆ及びＤｅｌ＿Ａｌｄ２＿Ｒのゲノム上のＡｌｄ２部位の相同組換え配列をプライマーとして使用したＰＣＲによってＡｌｄ２を不活性するカセットを得た。製作された不活性カセットを前記野生型酵母細胞（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ）に形質導入した。形質導入は、一般的な熱衝撃（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって実行され、形質導入後、ｕｒａｃｉｌ  ｄｒｏｐ−ｏｕｔ培地で細胞を培養してゲノム上のＡｌｄ２がＵＲＡ３を含む前記カセットで置換されるようにした。  
【００７５】
その結果、得られた菌株に対してＡｌｄ２不活性を確認するために、前記細胞のゲノムを鋳型とし、Ａｌｄ２＿ｃｏｎｆ＿ＦとＡｌｄ２＿ｃｏｎｆ＿Ｒプライマーセットを使用したＰＣＲによってＡｌｄ２不活性を確認し、ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ、ΔＡｌｄ２菌株と命名した。これと同様の方法でＤｅｌ＿Ｇｄｈ１＿ＦとＤｅｌ＿Ｇｄｈ１＿Ｒプライマーセットを使用してＧｄｈ１不活性カセットを製作し、Ｇｄｈ１＿ｃｏｎｆ＿ＦとＧｄｈ１＿ｃｏｎｆ＿Ｒプライマーセットを使用してＧｄｈ１不活性を確認し、ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ、ΔＧｄｈ１菌株と命名した。前記で使用したプライマーは、下記表１に示した。
【００７６】
【表１】
2019198313.tif 000003
【００７７】
２−２：Ｇｎｄ１，Ｇｄｈ２，Ａｌｄ６，Ｚｗｆ１またはＳｔｂ５の過発現菌株の作製
Ｇｎｄ１の過発現のために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡからＧｎｄ１をプライマーセットＧｎｄ１＿ＦとＧｎｄ１＿Ｒを使用してＰＣＲによって増幅し、増幅産物をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化させた後、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化されたｐ４１６＿ＧＰＤベクター（図４及び配列番号２９）に連結してｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｇｎｄ１ベクターを製造した。
【００７８】
Ｇｄｈ２の過発現のために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡからＧｄｈ２をプライマーセットＧｄｈ２＿ＦとＧｄｈ２＿Ｒを使用してＰＣＲによって増幅し、増幅産物をＸｂａＩとＳｍａＩで消化させた後、ＸｂａＩとＳｍａＩで消化されたｐ４１６＿ＧＰＤベクターに連結してｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｇｄｈ２ベクターを製造した。
【００７９】
Ａｌｄ６の過発現のために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡからＡｌｄ６をプライマーセットＡｌｄ６＿ＦとＡｌｄ６＿Ｒを使用してＰＣＲによって増幅し、増幅産物をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化させた後、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化されたｐ４１６＿ＧＰＤベクターに連結してｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ａｌｄ６ベクターを製造した。
【００８０】
Ｚｗｆ１の過発現のために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡからＺｗｆ１をプライマーセットＺｗｆ１＿ＦとＺｗｆ１＿Ｒを使用してＰＣＲによって増幅し、増幅産物をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化させた後、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化されたｐ４１６＿ＧＰＤベクターに連結してｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｚｗｆ１ベクターを製造した。
【００８１】
Ｓｔｂ５の過発現のために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡからＳｔｂ５をプライマーセットＳｔｂ５＿ＦとＳｔｂ５＿Ｒを使用してＰＣＲによって増幅し、増幅産物をＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化させた後、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化されたｐ４１６＿ＧＰＤベクターに連結してｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｓｔｂ５ベクターを製造した。
【００８２】
前記で使用したプライマーは下記表２に示した。
【００８３】
【表２】
2019198313.tif 000004
【００８４】
Ｇｎｄ１，Ｇｄｈ２，Ａｌｄ６，Ｚｗｆ１またはＳｔｂ５遺伝子を過発現するために、前記で製作したｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｇｎｄ１、ｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｇｄｈ２、ｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ａｌｄ６、ｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｚｗｆ１またはｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｓｔｂ５ベクターを前記野生型Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ酵母菌株にそれぞれ導入した。導入は、一般的な熱衝撃形質転換（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって実行され、ｕｒａｃｉｌ  ｄｒｏｐ−ｏｕｔ培地で細胞を培養して過発現の対象となる特定の遺伝子とＵＲＡ３を含むベクターが導入された菌株のみが成長できるようにした。
【００８５】
その結果、製造された菌株をそれぞれＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ＋  Ｇｎｄ１、ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ＋  Ｇｄｈ２、ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ＋  Ａｌｄ６、ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ＋  Ｚｗｆ１、ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ＋  Ｓｔｂ５と命名した。
【００８６】
２−３：Ａｌｄ２  不活性及びＡｌｄ６  過発現菌株、Ｇｄｈ１  不活性及びＧｄｈ２  過発現菌株の製作
Ａｌｄ２  不活性及びＡｌｄ６過発現のためにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１ＤゲノムＤＮＡからＡｌｄ６をプライマーセットＡｌｄ６＿ＦとＡｌｄ６＿Ｒを使用（表２）し、ＰＣＲによって増幅し、増幅産物をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化させた後、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化されたｐＵＣ５７ＧＰＤ−ＵＲＡ３Ｍｙｃベクター（Ｊｕ  Ｙｏｕｎｇ  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１１２，７５１−７５８．（非特許文献４））に連結して（図５及び配列番号３０）ｐＵＣ５７ＧＰＤ−ＵＲＡ３Ｍｙｃ＿Ａｌｄ６ベクターを製造した。Ａｌｄ２不活性及びＡｌｄ６過発現のために、前記で作製したｐＵＣ５７ＧＰＤ−ＵＲＡ３Ｍｙｃ＿Ａｌｄ６ベクターを鋳型とし、Ｄｅｌ＿Ａｌｄ２＿Ｆ及びＤｅｌ＿Ａｌｄ２＿ＲのＡｌｄ２部位の相同組換え配列をプライマーとして使用したＰＣＲによってＡｌｄ２をＡｌｄ６で置換するカセットを得た。
【００８７】
Ｇｄｈ１  不活性及びＧｄｈ２過発現のためにプライマーセットＧｄｈ２＿ＦとＧｄｈ２＿Ｒを使用（表２）し、実施例２−２と同様の方法でＸｂａＩとＳｍａＩで消化させて連結してｐＵＣ５７ＧＰＤ−ＵＲＡ３Ｍｙｃ＿Ｇｄｈ２ベクターを製造した。Ｇｄｈ１不活性及びＧｄｈ２過発現のためにｐＵＣ５７ＧＰＤ−ＵＲＡ３Ｍｙｃ＿Ｇｄｈ２ベクターを鋳型とし、Ｄｅｌ＿Ｇｄｈ１＿Ｆ及びＤｅｌ＿Ｇｄｈ１＿ＲのＧｄｈ１部位の相同組換え配列をプライマーとして使用したＰＣＲによってＧｄｈ１をＧｄｈ２で置換するカセットを得た。
【００８８】
製作されたカセットを、前記野生型Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ酵母菌株にそれぞれ導入した。導入は、一般的な熱衝撃形質転換（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって実行され、形質導入後、ｕｒａｃｉｌ  ｄｒｏｐ−ｏｕｔ培地で細胞を培養してゲノム上のＡｌｄ２またはＧｄｈ１がＵＲＡ３を含む前記カセットで置換されるようにした。その結果、得られた菌株についてＡｌｄ６またはＧｄｈ２で置換されたことを確認するために、前記細胞のゲノムを鋳型とし、Ａｌｄ２＿ｃｏｎｆ＿ＦとＡｌｄ２＿ｃｏｎｆ＿ＲプライマーセットまたはＧｄｈ１＿ｃｏｎｆ＿ＦとＧｄｈ１＿ｃｏｎｆ＿Ｒプライマーセットを使用したＰＣＲによってＡｌｄ２がＡｌｄ６またはＧｄｈ１がＧｄｈ２で置換されたことを確認した。その結果、製造された菌株をそれぞれＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ、Δａｌｄ２：：ａｌｄ６とＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ、ΔＧｄｈ１：：Ｇｄｈ２と命名した。
【００８９】
実施例３：野生型酵母及び形質転換された酵母のＮＡＤＰＨ生産量の確認
野生型Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ酵母及び前記で製作された形質転換酵母を２％のグルコースを含有する最小培地（ｍｉｎｉｍａｌ  ｕｒａｃｉｌ  ｄｒｏｐ−ｏｕｔ  ｍｅｄｉａ）５０ｍｌにＯＤ６００値が０．５になるように接種し、３０℃で２５０ｒｐｍで攪拌しながら２４時間好気条件で培養した。
【００９０】
培養終了時点で、細胞内のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＰＤＨ）は  ＥｎｚｙＣｈｒｏｍＴＭ  ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ  （ＥＣＮＰ−１００）を用いて分析した。分析方法は、同封された手続きを実験条件に合わせて変形して行い、これは次の通りである。具体的には、分光計を用いたＯＤ６００測定値に基づいて、１０  ＯＤ（〜８×１０９ｃｅｌｌｓ）を含む細胞培養液を遠心機で分離した後、上澄み液は捨て、ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）形態の細胞のみを集めた後、集められた細胞を冷ＰＢＳバッファーで洗浄した後、ＮＡＤＰＨ抽出バッファーと混ぜる。６０℃で５分間熱を加えた後、２０μＬのアッセイバッファーと１００μＬのＮＡＤＰ抽出バッファーを入れる。よく混ざった溶液は遠心機を用いて１４０００ｒｐｍで５分間分離した後、上清液のみを用いて５６５ｎｍで合わせた分光計で標本値を測定する。Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅに測定値を代入した後、正確なＮＡＤＰＨの濃度値を求める。２４時間の培養の結果、細胞内のＮＡＤＰＨ濃度は、図８に示した通りである。
【００９１】
具体的には、図８に示したように、ＮＡＤＰＨ濃度はＺｗｆ１の過発現菌株（ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ＋Ｚｗｆ１）、ＳＴＢ５の過発現菌株（ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ＋ＳＴＢ５）、Ａｌｄ２不活性及びＡｌｄ６過発現菌株（ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ、Δ ａｌｄ２：：ａｌｄ６）、Ｇｄｈ１不活性及びＧｄｈ２過発現菌株（ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ、ΔＧｄｈ１：：Ｇｄｈ２）で、細胞内のＮＡＤＰＨ濃度が対照群に比べて高くなることを確認した。
【００９２】
実施例４：形質転換された変異株の成長及びＰＰＤの生産量の確認
実施例３を通じて細胞内のＮＡＤＰＨ濃度が対照群に比べて増加した菌株を選別し、前記菌株からＮＡＤＰＨ生合成経路に影響を与える遺伝子がＰＰＤ酵母細胞の成長及びＰＰＤの生産にも影響を与えるかを確認しようとした。
【００９３】
４−１：ＰＰＤ酵母細胞においてＺｗｆ１またはＳｔｂ５過発現菌株の製作
まず、ＰＰＤ酵母細胞においてＺｗｆ１とＳｔｂ５遺伝子を導入して過発現させ、その過発現がＰＰＤ酵母細胞の成長及びＰＰＤの生産に与える影響を確認しようとした。
【００９４】
具体的には、ＰＰＤ酵母細胞においてＺｗｆ１またはＳｔｂ５遺伝子過発現のために、前記実施例１で製作されたｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｚｗｆ１とｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｓｔｂ５ベクターを前記ＰＰＤ酵母菌株にそれぞれ導入した。導入は、一般的な熱衝撃形質転換（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって実行され、ｕｒａｃｉｌ  ｄｒｏｐ−ｏｕｔ培地で細胞を培養してＵＲＡ３を含むｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｚｗｆ１またはｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｓｔｂ５ベクターが導入された菌株のみが成長できるようにした。
その結果、製作された菌株は、それぞれＰＰＤ、ｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｚｗｆ１及びＰＰＤ、ｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｓｔｂ５と命名した。
【００９５】
４−２：ＰＰＤ酵母細胞においてＡｌｄ２不活性及びＡｌｄ６過発現、Ｇｄｈ１不活性及びＧｄｈ２過発現菌株の作製
ＰＰＤ酵母細胞においてＡｌｄ２遺伝子をＡｌｄ６遺伝子で置換し、Ａｌｄ２発現を抑制すると共に、ｓｔｒｏｎｇ  ＧＰＤ  ｐｒｏｍｏｔｅｒの下でＡｌｄ６を過発現させ、その過発現がＰＰＤ酵母細胞の成長及びＰＤの生産に与える影響を確認しようとした。同様な方式でＧｄｈ１遺伝子をＧｄｈ２遺伝子で置換及びＧｄｈ２遺伝子を過発現してＰＰＤ酵母細胞の成長及びＰＰＤの生産に与える影響を確認しようとした。
【００９６】
具体的には、ＰＰＤ酵母細胞においてＡｌｄ２不活性及びＡｌｄ６過発現またはＧｄｈ１不活性及びＧｄｈ２過発現のために、前記実施例１で作製したｐＵＣ５７ＧＰＤ−ＵＲＡ３Ｍｙｃ＿Ａｌｄ６とｐＵＣ５７ＧＰＤ−ＵＲＡ３Ｍｙｃ＿Ｇｄｈ２ベクターを用いて前記と同様の方法で相同組換え用ＤＮＡカセットを得た。製作されたカセットを、前記ＰＰＤ酵母菌株にそれぞれ導入した。導入は、一般的な熱衝撃形質転換（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって実行され、形質導入後、ｕｒａｃｉｌ  ｄｒｏｐ−ｏｕｔ培地で細胞を培養してゲノム上のＡｌｄ２またはＧｄｈ１がＵＲＡ３を含む前記カセットで置換されるようにした。その結果、得られた菌株に対してＡｌｄ６またはＧｄｈ２で置換されたことを確認するために、前記細胞のゲノムを鋳型とし、Ａｌｄ２＿ｃｏｎｆ＿ＦとＡｌｄ２＿ｃｏｎｆ＿ＲプライマーセットまたはＧｄｈ１＿ｃｏｎｆ＿ＦとＧｄｈ１＿ｃｏｎｆ＿Ｒプライマーセットを使用したＰＣＲによってＡｌｄ２がＡｌｄ６またはＧｄｈ１がＧｄｈ２で置換されたことを確認した。
【００９７】
その結果、製造された菌株は、それぞれＰＰＤ、Δａｌｄ２：：ａｌｄ６及びＰＰＤ、ΔＧｄｈ１：：Ｇｄｈ２と命名した。
【００９８】
４−３：ＰＰＤ  酵母細胞においてＺｗｆ１不活性菌株の製作
前記実施例４−２で製造した菌株に、さらにＺｗｆ１遺伝子を不活性してＰＰ  ｐａｔｈｗａｙを統制し、それに伴うＤｅｔｏｕｒｅｄ  ｃａｒｂｏｎ−ｆｌｕｘがＰＰＤ酵母細胞の成長及びＰＰＤの生産に与える影響を確認しようとした。
【００９９】
具体的には、Ｚｗｆ１遺伝子を不活性するために、既存に製作されたｐＵＣ５７−ＵＲＡ３Ｍｙｃベクター（Ｊｕ  Ｙｏｕｎｇ  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１１２，７５１−７５８．（非特許文献４））を鋳型とし、Ｄｅｌ＿Ｚｗｆ１＿Ｆ及びＤｅｌ＿Ｚｗｆ１＿Ｒのゲノム上のＺｗｆ１部位の相同組換え配列をプライマーとして使用したＰＣＲによってＺｗｆ１を不活性するカセットを得た。製作された不活性カセットを前記ＰＰＤ、Δａｌｄ２：：ａｌｄ６酵母菌株に導入した。導入は、一般的な熱衝撃形質転換（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって実行され、形質導入後、ｕｒａｃｉｌ  ｄｒｏｐ−ｏｕｔ培地で細胞を培養してゲノム上のＺｗｆ１がＵＲＡ３を含む前記カセットで置換されるようにした。
【０１００】
また、得られた菌株に対してＺｗｆ１不活性を確認するために、前記細胞のゲノムを鋳型とし、Ｚｗｆ１＿ｃｏｎｆ＿ＦとＺｗｆ１＿ｃｏｎｆ＿Ｒプライマーセットを使用したＰＣＲによってＺｗｆ１不活性を確認した。
【０１０１】
その結果、製造された菌株は、ＰＰＤ、Δａｌｄ２：：ａｌｄ６、ΔＺｗｆ１と命名した。前記で使用したプライマーは下記表３に示す。
【０１０２】
【表３】
2019198313.tif 000005
【０１０３】
４−４：ＰＰＤ酵母細胞においてＺｍｓ１の過発現のためのベクターの製作
また、前記実施例４−２で製造した菌株にＺｍｓ１遺伝子を過発現させ、その過発現がＰＰＤ酵母細胞の成長及びＰＰＤの生産に与える影響を確認しようとした。
【０１０４】
具体的には、Ｚｍｓ１の過発現のためにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡからＺｍｓ１をプライマーセットＺｍｓ１＿ＦとＺｍｓ１＿Ｒを使用してＰＣＲによって増幅し、増幅産物をＸｍａＩとＸｈｏＩで消化させた後、ＸｍａＩとＸｈｏＩで消化されたｐ４１６＿ＧＰＤベクターに連結してｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｚｍｓ１ベクターを製造した。前記で使用したプライマーは下記表４に示した。
【０１０５】
【表４】
2019198313.tif 000006
【０１０６】
Ｚｍｓ１  遺伝子を過発現するために、前記で作製したｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｚｍｓ１ベクターを前記ＰＰＤ酵母菌株とＰＰＤ、Δａｌｄ２：：ａｌｄ６にそれぞれ導入した。
【０１０７】
導入は、一般的な熱衝撃形質転換（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって実行され、ｕｒａｃｉｌ  ｄｒｏｐ−ｏｕｔ培地で細胞を培養してＵＲＡ３を含むｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｚｍｓ１ベクターが導入された菌株のみが成長できるようにした。
【０１０８】
その結果、製造された菌株は、ＰＰＤ、ｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｚｍｓ１及びＰＰＤ、 Δａｌｄ２：：ａｌｄ６、ｐ４１６＿ＧＰＤ＿Ｚｍｓ１と命名した。
【０１０９】
実施例５：形質転換された酵母変異株の成長及びＰＰＤの生産量の確認
前記で作製された形質転換酵母変異株を２％のグルコースを含有した最小培地（ｍｉｎｉｍａｌ  ＵＲＡ  ｄｒｏｐ−ｏｕｔ  ｍｅｄｉａ）５０ｍｌにＯＤ６００値が０．５になるように接種し、３０℃で２５０ｒｐｍで攪拌しながら１４４時間好気条件で培養した。培養中の細胞の成長は、分光計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）を用いてＯＤ６００値を測定した。培養中の細胞内代謝産物（ｓｑｕａｌｅｎｅ、２，３−ｏｘｉｄｏｓｑｕａｌｅｎｅ、Ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ）はＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて分析した。
【０１１０】
その結果、細胞の成長、すなわち、培養物のＯＤ６００値及び細胞内の各代謝産物の濃度は、下記表５、図７及び図８に示した通りである。
【０１１１】
【表５】
2019198313.tif 000007
【０１１２】
具体的には、図７の結果を見ると、Ａｌｄ２不活性及びＡｌｄ６過発現菌株でＰＰＤの生産量が対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて１４４ｈ培養後の約４倍程度のプロトパナキサジオールを生産することを確認した。また、前記Ａｌｄ２不活性及びＡｌｄ６過発現菌株にＮＡＤＰＨ生合成経路で影響を与える遺伝子であるＺｗｆ１をさらに不活性させたり、Ｚｍｓ１をさらに過発現させた場合にプロトパナキサジオールの生産量が著しく増加することを確認し、特にＡｌｄ２不活性及びＡｌｄ６過発現菌株にＺｗｆ１遺伝子をさらに不活性させた場合に、対照群に比べて約２０倍以上のプロトパナキサジオールを生産することを確認した（図８）。
【０１１３】
前記結果から、ＮＡＤＰＨ生合成関与タンパク質（Ａｌｄ２、Ａｌｄ６、Ｚｗｆ１及びＺｍｓ１）の発現レベルが内在的発現レベルによって変化した場合、プロトパナキサジオールの生産量が著しく増加することが分かった。  
【０１１４】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されることがあることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【図１】
2019198313.tif 000008
【図２】
2019198313.tif 000009
【図３】
2019198313.tif 000010
【図４】
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【図５】
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【図６】
2019198313.tif 000013
【図７】
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【図８】
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【配列表】
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