(57)【要約】【課題】  被検体中に存在する１種類又は複数種類の菌株を同定する方法を提供し、必要に応じて当該生菌数も測定できる方法を提供すること。【解決手段】  １種類又は複数種類の菌株を含む被検体中の前記菌株の生菌数を測定する方法であり、下記工程を含む生菌数測定方法。（１）前記被検体を希釈した液を用いて培地上に又は培地中に複数のコロニーを形成させた後に、形成されたコロニーのなかから全部又は一部のコロニーを選択する工程、（２）前記選択された各コロニーの菌株を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法により、同定する工程、（３）前記各コロニーの菌株同定結果及び前記被検体を希釈したときの希釈倍率に基づき、前記被検体中に含まれる前記菌株の割合及び生菌数を測定する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種類又は複数種類の菌株を含む被検体中の前記菌株の生菌数を測定する方法であり、下記工程を含む生菌数測定方法。
（１）前記被検体を希釈した液を用いて培地上又は培地中に複数のコロニーを形成させた後に、形成されたコロニーのなかから全部又は一部のコロニーを選択する工程、
（２）前記選択された各コロニーの菌株を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法により、同定する工程、
（３）前記各コロニーの菌株同定結果及び前記被検体を希釈したときの希釈倍率に基づき、前記被検体中に含まれる前記菌株の菌株割合及び生菌数を測定する工程。
【請求項２】
前記（１）コロニー選択工程において、
前記被検体を各希釈倍率に希釈して複数の希釈液を作製し、それぞれの希釈液を各培地上に又は培地中に接種してコロニーを形成させた後に、そのなかから所定数のコロニーが形成された培地を選択する、請求項１に記載の生菌数測定方法。
【請求項３】
前記（２）菌株同定工程において、
前記選択された各コロニーをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法により測定した後に、当該各コロニーのマススペクトルと、ライブラリにある各菌株のマススペクトルとを対比することにより、各コロニーの菌株を同定する、請求項１又は２に記載の生菌数測定方法。
【請求項４】
前記（３）菌株割合及び生菌数の測定工程において、
選択されたコロニーを各菌株グループに分け、各菌株グループのコロニー数×被検体の希釈倍率に基づき、被検体中に含まれる各菌株割合及び各生菌数を（ＣＦＵ／ｇ）にて算出する、請求項１〜３の何れか１項に記載の生菌数測定方法。
【請求項５】
前記被検体中の菌株は、ビフィズス菌及び／又は乳酸菌の菌株であり、
前記培地は、ビフィズス菌用及び／又は乳酸菌用の生育培地であり、
前記ライブラリにある菌株は、ビフィズス菌及び／又は乳酸菌の菌株である、請求項１〜４の何れか１項に記載の生菌数測定方法。
【請求項６】
１種類又は複数種類の菌株を含む組成物の製造方法であり、
前記請求項１〜５の何れか１項に記載の菌株の生菌数の測定方法を用いて、被検体となる組成物中の菌株の生菌数を測定する工程、
前記測定された組成物中の各菌株の生菌数に基づいて、目的生菌数になるように組成物中の各菌株の配合量を調整し設計する工程を含み、
前記各菌株の配合量の設計に基づき、前記１種類又は複数種類の菌株を含む組成物を得る、前記組成物の製造方法。
【請求項７】
複数種類の菌株を含む被検体中の前記菌株を同定する方法であり、下記工程を含む同定方法。
（１）前記被検体を希釈した液を用いて培地上に又は培地中に複数のコロニーを形成させ、このなかから全部又は一部のコロニーを選択する工程、
（２）前記選択された各コロニーの菌株を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法により、同定する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、１種類又は複数種類の菌株を含む被検体中の前記菌株の生菌数を測定する方法、及び当該生菌数測定方法を用いる組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
製品中に添加されている有用菌の生菌数を個別に表示することは、消費者にとって製品の情報量が多く表示されている観点から、有益なことであると考えられている。また、国によっては、製品中に添加されている有用菌について、菌株ごとに生菌数を表示することが、義務化されている又は推奨されている。
また、製品中に含まれているグラム陽性菌及びグラム陰性菌を含む菌株の生菌数を測定することができれば、コンタミネーション等を確認でき、製品の品質を向上させることができる。また、製品中の生菌数を正確に把握できることは、製品製造時や製品保管時等の製品の品質を管理する上でも重要である。
【０００３】
近年の健康志向によって、ビフィズス菌及び乳酸菌は腸内に有用な菌株として一般的に認識されるようになり、ビフィズス菌及び乳酸菌はヒトにおける健康保健効果を期待して種々の食品や健康食品に添加されている。このようなビフィズス菌及び乳酸菌等の、ヒトに良い影響を与える有用菌（善玉菌ともいう）、又は、それらを含む製品や飲食品は、プロバイオティクスと一般的に呼ばれている。
また、ビフィズス菌及び乳酸菌であっても、その効能は、使用する菌株に依存することが多い。このため、効能目的に応じて、有用菌のなかから期待する効能が発現できる菌株を１種類又は複数種類選択し添加されたプロバイオティクス製品（例えば、菌末、飲食品や飼料等）が製造され、多く市販されている（非特許文献１の表１参照）。
【０００４】
上述のように有用菌の表示の義務化や推奨等の観点から、ビフィズス菌及び乳酸菌を含む製品について、製造直後、流通後又は保管時における製品中の生菌数を測定する方法が検討されている。
【０００５】
生菌数を測定する方法として、例えば、ビフィズス菌のみが生育する培地を用いる方法、好気培養により乳酸菌のみを培養する方法等が知られている。
より具体的には、例えば、寒天培地を用いた培養法による生菌数測定方法のうち、ビフィズス菌及び／又は乳酸菌を含む検体から、ビフィズス菌のみを検出する寒天培地としては、ＴＯＳ  ＭＵＰ寒天培地、ＭＧＬＰ寒天培地等が利用されている（非特許文献２及び３）。
【０００６】
同様に、ビフィズス菌及び／又は乳酸菌を含む検体から、乳酸菌のみを検出する寒天培地としては、ビフィズス菌が酸素を含む大気中では生育できないことを利用し、ＭＲＳ寒天培地、ＢＣＰ寒天培地を用いた好気培養により、乳酸菌のみを生育させる方法が広く知られている。
また、ビフィズス菌又は乳酸菌を複数種類含む製品中の各菌株及びその生菌数を測定する方法としては、ＢＬ寒天培地に無菌脱繊血液を加えた培地上に塗抹し、嫌気培養により培地上に生育させて形成したコロニーの形態（色、形状等）、又はグラム染色法による菌の形態などから判定する方法がある（非特許文献３）。
【０００７】
また、商業的に利用されるビフィズス菌の中で、ビフィズス菌ロンガム種・ブレーベ種を選択的に生育させる培地も開発されている（特許文献１及び２）。
【０００８】
また、近年、菌株同定の手段としては、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを使用した菌株同定手法が開発され、製品中の菌株同定に利用されている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／１１８７６５
【特許文献２】ＷＯ２０１１／１１８７６４
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】光岡知足著「ビフィズス菌の研究」、財団法人日本ビフィズス菌センター、１９９４年、第２８２−２８３頁
【非特許文献２】Milk Products - Enumeration of presumptive bifidobacteria - Colony count technique at 37 ℃ ISO29981/IDF220 2010年発刊
【非特許文献３】「はっ酵乳・乳酸菌飲料中のビフィズス菌の菌数測定法」、社団法人全国はっ酵乳乳酸菌飲料協会  ビフィズス菌検査法検討委員会、２０００年３月第１−１３頁
【非特許文献４】腸内細菌学雑誌，２０１５年，vol. 29, pp169-176
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、上記の従来技術のうち、ビフィズス菌及び／又は乳酸菌の同種の菌株が複数含まれている被検体では、ＴＯＳ  ＭＵＰ寒天培地又はＭＲＳ寒天培地で生育させても同一の菌株のコロニーしか形成されない。このため、異なる菌株が被験体中に存在した場合、菌株ごとの生菌数の測定を正確に行うことは不可能であった。
また、上記の従来技術のうち、ＢＬ寒天培地上にコロニーを生育した場合でも、ビフィズス菌・乳酸菌の菌株が同じ場合には、異なる菌株であっても似たようなコロニー形状になる場合が多く、ＢＬ寒天培地でも菌株ごとの生菌数を簡便に正確に測定することは不可能であった。
【００１２】
また、上記の培地を利用した生菌数を測定する方法の場合、被検体中のビフィズス菌及び／又は乳酸菌の配合する菌株の種類が増えるにつれて、コロニー形状で各菌株を正確に見分けかつ各生菌数を正確に測定することは、複数の生菌数の測定方法が必要になったり、高度な経験が必要となったりするので、簡便に正確に各生菌数を測定することは困難である。
このように、菌株（例えば、ビフィズス菌及び乳酸菌等の菌株）を複数種類含む検体から、培地組成を変更し培地上に形成されたコロニーを観察する方法では、正確な菌株割合及び生菌数を簡便に測定することは困難であった。
【００１３】
また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを使用した菌株の同定方法では、微生物菌体そのものを測定対象とし、タンパク質由来のピークが見られる２０００〜２００００Ｄａの範囲のスペクトルを用いて微生物同定を行っている。
現在ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを用いる方法の位置づけは、菌株の同定に特化した方法であり、以下の理由（１）及び（２）から、当該ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法を用いて製品中の正確な生菌数を測定することは不可能であると考えられていた。
【００１４】
（１）ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）の特性上、新鮮なコロニーを直接ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用サンプルプレートに載せることはできる。しかし、塗布する菌株量や形等の菌株塗布の仕方を一定にすることは不可能であるため、測定のたびにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳでの検出強度が変わること等が挙げられる。
（２）また、サンプルプレート上の各菌株量を同じにできたとしても、その後に、マトリックス塗布の仕方及びサンプルに対する照射レーザーの当たり方によって、脱離及びイオン化する菌株量が変化するため、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの検出強度が変わること等も挙げられる。
【００１５】
そこで、本技術は、被検体中に存在する１種類又は複数種類の菌株をより簡便に同定する方法を提供し、必要に応じて当該生菌数も、より正確に測定できる方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、被検体を所定の希釈倍率で希釈した液を培地上で又は培地中で培養し複数のコロニーを生育させ、このコロニー群のなかから所定数のコロニーを選択すること；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法により選択されたコロニーの菌株を同定すること；同定されたコロニーを菌株を分類、かつカウントし、さらに前記所定の希釈倍率及び前記所定数のコロニーを考慮することで、各菌株の菌株割合及び生菌数の測定が可能であることを見出した。
【００１７】
上述のように、従来の生菌数測定方法は、被検体中に複数種類の菌株が含まれている場合、特殊な培地を用いて特定の種類の菌株に限定してこの生菌数のみを測定する考え方であった。しかし、本技術では、従来とは逆に、特殊な培地を用いるのではなく汎用的な培地を用いて複数種類の菌株を同時に測定可能にする考え方である。
従来の生菌数の測定方法では、特殊な培地、すなわち特殊な成分を使用した場合、特殊な成分によって菌株の種類ごとに生育状況に差が生じ、場合によっては熟練者の観察結果が必要になるので、菌株割合及び生菌数の正確さに欠ける。このため、特定の菌株に限定する考え方を採用している従来の方法は、被検体中の菌株割合及び各生菌数を正確に測定しているとはいえない。
しかしながら、本技術の生菌数測定方法によれば、汎用的な培地を用いることができ、かつ被検体中に存在する１種類又は複数種類の菌株を同時に同定することができ、また熟練者の観察結果も不要になるので、より正確に簡便に菌株割合及び各生菌数を測定することができる。
このようにして、本発明者らは、以下の本発明を完成させた。
【００１８】
本技術における菌株とは、1つの細胞から分化し原則的に親細胞と同じ遺伝形質を備えた子孫の集団を純粋に養い育て、保存した状態のものをいう。当該菌株は、特定の表示(保存番号や由来の表現等で他の培養物と区別できるもの)がされているものである。
例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムは種名であり、そのあとにつけるNITE BP-02621が菌株表示となる。菌株は継代培養したものも含まれるが、親細胞と同じ性質を保持していることが求められる。本技術では同一菌株か否かは、後述する同定の判定方法（特にRange又はスコア結果）にて判定できる。
【００１９】
本技術における菌株の上位概念として、種、属、科、目、網、門があるが、この種〜門は国際細菌分類命名委員会International Committee on Systemtic Bacteriology(ICSB)で決定される。これらの分類階級は、上位から門(Division)→網(Class)→目(Order)→科(Family)→属(Genus)→種(Species)と設定されている。また、亜(Sub-)はそれぞれの階級の分類群で分割されるときに接頭語として使用できる。
例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムは、網(Class)は放射菌網、目(Order)はビフィドバクテリウム目、科(Family)はビフィドバクテリウム科、属(Genus)はビフィドバクテリウム属、種(Species)がビフィドバクテリウム・ロンガム、そして亜種(Subspecies)はビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムとなる。
【００２０】
なお、本技術における細菌のグループ（又は、「細菌グループ」、「細菌群」ともいう）とは、科、属、種、亜種、又は菌株等の少なくともいずれか１つの分類で分類できるグループのことを意味するが、望ましくは菌株レベルで分類されることが好ましい。
また、本技術における「菌株割合」とは、菌株をグルーピングしたときの各菌株の割合をいう。
【００２１】
〔１〕
１種類又は複数種類の菌株を含む被検体中の前記菌株の生菌数を測定する方法であり、下記工程を含む生菌数測定方法。
（１）前記被検体を希釈した液を用いて培地上又は培地中に複数のコロニーを形成させた後に、形成されたコロニーのなかから全部又は一部のコロニーを選択する工程、
（２）前記選択された各コロニーの菌株を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法により、同定する工程、
（３）前記各コロニーの菌株同定結果及び前記被検体を希釈したときの希釈倍率に基づき、前記被検体中に含まれる前記菌株の菌株割合及び生菌数を測定する工程。
〔２〕
前記（１）コロニー選択工程において、
前記被検体を各希釈倍率に希釈して複数の希釈液を作製し、それぞれの希釈液を各培地上に又は培地中に接種してコロニーを形成させた後に、そのなかから所定数のコロニーが形成された培地を選択する、前記〔１〕に記載の生菌数測定方法。
〔３〕
前記（２）菌株同定工程において、
前記選択された各コロニーをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法により測定した後に、当該各コロニーのマススペクトルと、ライブラリにある各菌株のマススペクトルとを対比することにより、各コロニーの菌株を同定する、前記〔１〕又は〔２〕に記載の生菌数測定方法。
〔４〕
前記（３）菌株割合及び生菌数の測定工程において、
選択されたコロニーを各菌株グループに分け、各菌株グループのコロニー数×被検体の希釈倍率に基づき、被検体中に含まれる各菌株割合及び各生菌数を（ＣＦＵ／ｇ）にて算出する、前記〔１〕〜〔３〕の何れか１つに記載の生菌数測定方法。
〔５〕
前記被検体中の菌株は、ビフィズス菌及び／又は乳酸菌の菌株であり、
前記培地は、ビフィズス菌用及び／又は乳酸菌用の生育培地であり、
前記ライブラリにある菌株の菌株は、ビフィズス菌及び／又は乳酸菌の菌株である、前記〔１〕〜〔４〕の何れか１つに記載の生菌数測定方法。
〔６〕
１種類又は複数種類の菌株を含む組成物の製造方法であり、
前記〔１〕〜〔５〕の何れか１つに記載の菌株の生菌数の測定方法を用いて、被検体となる組成物中の菌株の生菌数を測定する工程、
前記測定された組成物中の各菌株の生菌数に基づいて、目的生菌数になるように組成物中の各菌株の配合量を調整し設計する工程を含み、
前記各菌株の配合量の設計に基づき、前記１種類又は複数種類の菌株を含む組成物を得る、前記組成物の製造方法。
〔７〕
複数種類の菌株を含む被検体中の前記菌株を同定する方法であり、下記工程を含む同定方法。
（１）前記被検体を希釈した液を用いて培地上に又は培地中に複数のコロニーを形成させ、このなかから全部又は一部のコロニーを選択する工程、
（２）前記選択された各コロニーの菌株を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法により、同定する工程。
【発明の効果】
【００２２】
本技術によれば、被検体中に存在する１種類又は複数種類の菌株を同定する方法を提供し、必要に応じて当該生菌数も測定できる方法を提供することができる。
なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本技術中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
【００２４】
＜１．本技術の生菌数の測定方法＞
本技術の１種類又は複数種類の菌株を含む被検体中の前記菌株の生菌数を測定する方法であり、下記工程を含む生菌数測定方法である。
（１）前記被検体を希釈した液を用いて培地上に又は培地中に複数のコロニーを形成させた後に、形成されたコロニーのなかから全部又は一部のコロニーを選択する工程、
（２）前記選択された各コロニーの菌株を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法により、同定する工程、
（３）前記各コロニーの菌株同定結果及び前記被検体を希釈したときの希釈倍率に基づき、前記被検体中に含まれる前記菌株の菌株割合及び生菌数を測定する工程。
【００２５】
〔被検体〕
本技術に用いる被検体は、１種類又は複数種類の菌株（被検菌）を含むものであれば特に限定されないが、生菌体が含まれているものが望ましい。例えば、飲食品（例えば、発酵乳、菌末、菓子、飲料、健康食品、機能性食品、機能性表示食品、特定保健用食品、育児用粉乳等）、医薬品、家畜用飼料等の製品、前記製品に対して粉砕、希釈液による希釈等の処理を施した製品等が挙げられる。品質管理の必要性の観点から、生菌数の調製がされている製品が好ましく、例えば、飲食品又は医薬品が好ましい。
【００２６】
本技術の生菌数測定方法が適用されうる、食品、健康食品等の製品は、菌株を含む製品であれば特に限定されないが、例えば、有用菌であるビフィズス菌及び／又は乳酸菌が配合される食品、健康食品等が挙げられる。当該有用菌が含まれる製品として、より具体的な例を挙げれば、乳児用粉乳、幼児用粉乳、発酵乳、乳成分を含む又は乳成分を含まない飲料や食品、菌末、チョコレート、タブレット、カプセル、サシェット等が挙げられる。
【００２７】
〔被検体中の菌株〕
本技術による生菌数測定が適用されうる１種類又は複数種類の菌株は、グラム陰性菌株及びグラム陽性菌株のいずれでもよいが、本技術は製品中の生菌数を測定し表示する等に利用できる観点から、有用菌株であることが好ましい。当該有用菌株は、市販の製品に含まれる有用菌株、微生物保存機関でカルチャー・コレクションとして保存されている有用菌株、ブダペスト条約に基づく国際寄託機関で受託菌株として保存されている有用菌株、将来見出される有用菌株等が挙げられる。
さらに、本技術の菌株のうち、グラム陽性菌株が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法において菌株由来のタンパク質が検出し易い観点から、好ましい。グラム陽性菌株のうち、ビフィズス菌及び／又は乳酸菌の菌株が好ましく、これらは一般的に有用菌株である観点、及び培地でのコロニー形成が行い易い観点から好適である。
【００２８】
本技術における前記ビフィズス菌は特に限定されないが、好適にはBifidobacterium属の細菌である。当該ビフィズス菌として、より具体的な例を挙げれば、Bifidobacterium longum subsp.longum、Bifidobacterium longum subsp.infantis、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium animalis subsp. animalis、Bifidobacterium animalis subsp.lactis、Bifidobacterium adolescentis等が挙げられる。
このうち好ましい例として、Bifidobacterium longum subsp.longum、Bifidobacterium longum subsp.infantis、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium bifidum等が挙げられる。
【００２９】
本技術における前記乳酸菌は特に限定されないが、好適にはLactobacillus属、Lactococcus属、Streptococcus属の細菌である。当該乳酸菌として、より具体的な例を挙げれば、Lactobacillus casei、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus gaserri、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus bulgaricus、Lactobacillus salivarius、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus brevis、Lactobacillus jensenii、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus helveticus、Lactococcus lactis subsp. lactis、Lactococcus lactis subsp. cremoris、Streptococcus thermophilus等が挙げられる。
このうち好ましい例として、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus casei、Lactobacillus paracasei等が挙げられる。
【００３０】
本技術では、前記ビフィズス菌及び／又は前記乳酸菌は、上述のような有用菌に該当するものが好ましい。また、本技術は、前記ビフィズス菌及び／又は前記乳酸菌の群から選ばれる１種又は２種以上について適用することが可能である。
【００３１】
本技術における前記ビフィズス菌及び／又は乳酸菌の菌株うち、［１］ビフィドバクテリウム・ロンガム NITE BP-02621（Bifidobacterium longum BB536）菌株、［２］ビフィドバクテリウム・インファンティス NITE BP-02623（Bifidobacterium infantis M-63）菌株、［３］ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP-02622（Bifidobacterium breve M-16V）菌株、［４］ビフィドバクテリウム・ブレーベ FERM BP-11175（Bifidobacterium breve FERM BP-11175）菌株、［５］Lactobacillus acidophilus NITE BP-01695菌株、［６］Lactobacillus gasseri BP-01669菌株、［７］Lactobacillus rhamnosus LCS-742菌株からなる群から選ばれる１種又は２種以上が、有用菌株として製品に使用されている観点から、好適である。
また、これら［１］〜［７］から選ばれる１種又は２種以の菌株又は近縁菌が製品に存在すると予想される場合、想定される［１］〜［７］の菌株を予め基準菌株として設定することが、これらの菌株割合及び生菌数をより精度よく測定できるので、好ましい。
また、本技術において被検体中に既知の菌株が含まれていることが好適である。当該被検体中にこれら［１］〜［７］の菌株以外の菌株（例えば、ビフィズス菌及び／又は乳酸菌）の菌株が含まれていてもよいが、これら菌株のみに限定されない。
【００３２】
本技術において、少なくとも、［１］ビフィドバクテリウム・ロンガム NITE BP-02621菌株、［２］ビフィドバクテリウム・インファンティス NITE BP-02623菌株、及び［３］ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP-02622菌株、［４］ビフィドバクテリウム・ブレーベ FERM BP-11175菌株の何れか１種類又は２種類以上の菌株が含まれる製品を被検体にすることが好適である。
【００３３】
さらに、本技術において、[２］ビフィドバクテリウム・インファンティス NITE BP-02623菌株、及び［３］ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP-02622菌株の２種類は、無菌脱繊維素血液を使用しないＢＬ培地でコロニー形態判別が困難であるが本技術では簡便に正確に測定可能な観点から、この２種類の菌株が含まれる製品を被検体にすることが好適である。
【００３４】
さらに、本技術において、［１］ビフィドバクテリウム・ロンガム NITE BP-02621菌株、［２］ビフィドバクテリウム・インファンティス NITE BP-02623菌株、及び［３］ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP-02622菌株の３種類又はさらに［４］ビフィドバクテリウム・ブレーベ FERM BP-11175菌株を加えた４種類は、特殊な培地を利用しても、又は従来のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法を利用しても、菌株割合及び各生菌数を正確に測定することが困難であるが、本技術はこれら３種類又は４種類であっても簡便に正確に測定可能な観点から、この３種類又は４種類の菌株が含まれる製品を被検体にすることが好適である。
【００３５】
［１］  ビフィドバクテリウム・ロンガム NITE BP-02621（Bifidobacterium longum BB536）菌株は、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に、２０１８年１月２６日にＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の受託番号で、ブダペスト条約に基づく国際寄託がなされたものである。また、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１（ＢＢ５３６）菌株と同一の菌株であるビフィドバクテリウム・ロンガム  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９菌株は、米国の保存機関であるAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）（米国、２０１１０  バージニア州  マナサス  ユニバーシティ・ブルバード  １０８０１）に、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９の受託番号で寄託されている。
［２］  ビフィドバクテリウム・インファンティス  NITE BP-02623（Bifidobacterium infantis M-63）菌株は、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に、２０１８年１月２６日にＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２３の受託番号で、ブダペスト条約に基づく国際寄託がなされたものである。ビフィドバクテリウム・インファンティスＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２３（Ｍ−６３）菌株と同一の菌株であるビフィドバクテリウム・インファンティス  ＢＣＣＭ  ＬＭＧ２３７２８菌株は、ベルギーの保存機関であるBelgian Coordinated Collections of Microorganisms（ＢＣＣＭ）（ベルギー、Ｂ−１０００  ブリュッセル  シアンス通り（ウェーテンスカップ通り）８）に、ＢＣＣＭ  ＬＭＧ２３７２８の受託番号で寄託されている。
［３］  ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP-02622（Bifidobacterium breve M-16V）菌株は、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に、２０１８年１月２６日にＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２２の受託番号で、ブダペスト条約に基づく国際寄託がなされたものである。
［４］  ビフィドバクテリウム・ブレーベ FERM BP-11175（Bifidobacterium breve FERM BP-11175）菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、平成２１年８月２５日付けで受託番号FERM BP-11175にて、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
［５］  Lactobacillus acidophilus NITE BP-01695菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、平成２５年８月２３日付けで受託番号FERM BP-01695にて、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
［６］  Lactobacillus gasseri BP-01669菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に、２０１３年７月２９日に、受託番号NITE BP-01669にて、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
［７］  Lactobacillus rhamnosus LCS-742菌株は、森永乳業株式会社よりLactobacillus rhamnosus LCS-742として、販売されている（例えば、特表2009-522280参照）。
【００３６】
なお、前記菌株を培養する場合、従来、培養法による微生物の生菌数の測定に用いられている公知の培養法が利用できる。前記培養法としては固体培養法（寒天培地にて培養を行う培養法）が挙げられる。
固体培養法として具体的には、混釈法、平板塗抹法、スパイラル法等が挙げられる。混釈法は、試験試料（検体、又は検体を希釈液で希釈した希釈物）を、加温溶解した寒天培地と混和し、冷却固形化して培養する方法である。平板塗抹法は、試験試料を、寒天培地上に塗抹して培養する方法である。スパイラル法は、試験試料を、機器等を使用して濃度勾配を付けて培地上にプレーティングする方法である。
本技術において、培地上でコロニーを形成させる場合、平板塗抹法又はスパイラル法を用いればよく、また、培地中でコロニーを形成させる場合、混釈法を用いればよい。このうち、平板塗抹法及び混釈法が好ましい。
【００３７】
本技術の生菌数測定方法における、（１）前記被検体を希釈した液を用いて培地上又は培地中に複数のコロニーを形成させ、このなかから全部又は一部のコロニーを選択する工程、（２）前記選択された各コロニーの菌株を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法により、同定する工程、（３）前記各コロニーの菌株同定結果及び前記被検体を希釈したときの希釈倍率に基づき、前記被検体中に含まれる前記菌株の生菌数及び菌株割合を測定する工程について、以下に説明する。
【００３８】
〔（１）コロニー選択工程〕
本技術におけるコロニー選択工程は、前記被検体を希釈した液を用いて培地上に又は培地中に複数のコロニーを形成させた後に、形成されたコロニーのなかから全部又は一部のコロニーを選択する工程である。
当該コロニー選択工程には、被検体を液体にて希釈する希釈工程、被検体に含まれる菌株（以下、「被検菌」ともいう）を培地上に又は培地中に培養して各菌株のコロニーを形成するコロニー形成工程、形成された全コロニー数の全部又は一部のなかから選択されたコロニー数をカウントするカウント工程が、少なくとも含まれることが望ましい。
【００３９】
本技術のコロニー選択工程において、前記被検体を希釈した液を用いることが好適である。
本技術において、前記被検体を液体に溶解又は懸濁させて、前記被検菌を含む混合溶液を作成する。この混合溶液は、培地に直接塗布するための希釈液として用いてもよいし、希釈用の原液として用いてもよい。この混合溶液又はこれをさらに希釈した混合溶液を、本技術において前記被検体を希釈した液として用いればよい。
【００４０】
本技術において、懸濁や希釈等の目的で被検体に使用する液体は、目的とする又は想定される被検菌（具体的にはグラム陰性菌又はグラム陽性菌）の培養又は観察に通常用いられているものであれば、特に限定されず、被検菌の浸透圧に影響がでない液体が好ましい。
本技術において、被検菌がビフィズス菌及び／又は乳酸菌の場合、培養又は観察に用いられている液体として、例えば、０．８５％生理食塩水、０．１％ペプトン加生理食塩水、光岡バッファー、バッファードペプトンウォーター、1/4強度リンゲル溶液等が挙げられる。
【００４１】
本技術では、前記被検体を希釈することが、培地上で又は培地中でコロニー同士が接触していないコロニーを選択しやすいので好ましい。培地上において又は培地中において、コロニー同士が接触しないことは、釣菌のためのコロニーとして選択し易い観点及びコロニー数をカウントし易い観点から、望ましい。本技術では、被検体中の菌株が適切な濃度になるように液体にて希釈することがより望ましい。このようにして被検体を適切な希釈倍率に希釈した液を用いて、培地上に又は培地中に適切な数及びサイズのコロニーを形成させることが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定用のサンプル数を確保しつつ、かつ釣菌コロニーを選択し易くなることで生菌数測定の精度が向上する観点から、望ましい。
【００４２】
上述の希釈倍率が適切であるかどうかは、培養後の培地上に又は培地中に形成されるコロニー数及びその状態（サイズや形状等）が適切であるかによって、判断してもよい。この場合、希釈倍率が異なる複数の希釈液を作製する；それぞれの希釈倍率に希釈された液を用いてそれぞれの培地上又は培地中に接種する；接種後、それぞれの培地を培養してコロニーを形成させる；コロニー形成後に、複数の培地のなかから所定数のコロニーが形成された培地を選択する。この選択の判断は、各培地のコロニー観察にて行えばよい。そして、作製された複数の希釈液のなかから、適切な濃度（言い換えると、適切な希釈倍率）を選択することができる。希釈倍率が適切と判断するときのコロニー数の目安は、１シャーレ（直径８〜１２ｃｍ）内に３０〜３００個である。
【００４３】
本技術のコロニー選択工程において、前記希釈液を用いて接種し、接種後に培地上に又は培地中に培養することによって、培地上に又は培地中に複数のコロニーを形成させることが、好適である。
【００４４】
本技術で用いる培地は、目的とする又は想定される被検菌が生育可能な培地成分を含むものを用いれば、特に限定されず、汎用的な培地を用いればよい。
前記培地を固形とする成分として、細菌培養に使用できるものであれば特に限定されないが、例えば、寒天、ジェランガム、ゼラチン等が挙げられ、このうち寒天が好ましい。例えば、寒天は、通常固化できる濃度であれば特に配合量は限定されないが、一般的には最終的に得られる培地中の濃度が１．５質量％程度（１．３〜１．８質量％）となるように配合されている。
【００４５】
従来の生菌数測定方法では、複数種類の種々な菌株が含まれている被検体を培地上又は培地中で培養し、培養後に培地上又は培地中で目的とする菌株が目視等により判別できるように培地組成が調整されていた。しかし、本技術では、むしろ従来の考えとは逆となる目的菌株のみの専用培地ではなく、目的とする菌株が生育可能な一般的な基礎培地成分（汎用的な培地組成ともいう）を用いることが好適である。本技術は、汎用的な培地での培養が可能であることから、培地組成による、菌株割合及び生菌数への影響が少ないことを、有利な点とする。
【００４６】
前記基礎培地成分としては、特に限定はされないが、例えば、酵母エキス、肉エキス、ペプトン等の窒素源；塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム等のナトリウム塩、Ｌ−システイン塩酸塩、リン酸塩、金属塩類（例えば、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン等の硫酸塩）等の塩類；糖類（例えば、グルコース、ラクトース、オリゴ糖、スクロース、ラフィノース、デンプン等）；が挙げられる。
【００４７】
前記培地は、被検菌がビフィズス菌及び／又は乳酸菌の場合、ビフィズス菌及び／又は乳酸菌用の生育培地が好適であり、一般的なビフィズス菌及び／又は乳酸菌用の基礎培地を用いればよい。
ビフィズス菌及び／乳酸菌培養用の生育培地成分として、使用可能な酵母エキス、肉エキス、ペプトンとして、それぞれ、通常、微生物の培養のために用いられるものが利用できる。
酵母エキスは、酵母を原料として自己消化酵素などによって適度に分解された栄養源であり、具体的には、Yeast Extract（ＢＤ社製）等を例示することができる。肉エキスは、肉の浸出液から得られる栄養源であり、ペプトンに備わっていないミネラル、リン酸、エネルギー源等の必須な要素を付与することにより、ペプトンの栄養素の特性を補完する栄養源である。具体的には、'LAB-MEMCO' powder（ＯＸＯＩＤ社製）等を例示することができる。ペプトンは、牛乳カゼイン、獣肉、大豆タンパク質等をタンパク質分解酵素又は酸で部分的に加水分解したものである。具体的には、BactoTM peptone（ＢＤ社製）等を例示することができる。
培地１０００ｍＬ中、酵母エキスの含有量は、１．８〜４．２ｇ／１０００ｍＬが好ましい。より好ましくは２．７〜４．２ｇ／１０００ｍＬである。
培地１０００ｍＬ中、肉エキスの含有量は、６．０〜１４．０ｇ／１０００ｍＬが好ましい。より好ましくは９．０〜１４．０ｇ／１０００ｍＬである。
培地１０００ｍＬ中、ペプトンの含有量は、６．０〜１４．０ｇ／１０００ｍＬが好ましい。より好ましくは９．０〜１４．０ｇ／１０００ｍＬである。
上記酵母エキス、肉エキス、ペプトンそれぞれの含有量（ｇ／１０００ｍＬ）は、培地１０００ｍＬ中に含まれる固形分量（ｇ）を示す。
【００４８】
ビフィズス菌及び／乳酸菌培養用の培地成分は、浸透圧の観点から、前記塩類を含むことが好ましい。前記塩類としては、ナトリウム塩が好ましく、塩化ナトリウム、及び酢酸ナトリウムが特に好ましい。
培地中、前記塩類の含有量は、培地１０００ｍＬ中、５〜１５ｇ／１０００ｍＬが好ましい。
ビフィズス菌及び／乳酸菌培養用の基礎培地成分は、浸透圧及び生育の観点から、前記糖類を含むことが好ましい。前記糖類として、グルコース、スクロース、ラフィノースからなる群から選択される１種又は２種以上が好ましい。
培地中、前記糖類の含有量は、培地１０００ｍＬ中、１０〜４０ｇ／１０００ｍＬが好ましい。
【００４９】
本技術の培地は、必要に応じて、本技術の効果を損なわない範囲で、上記以外の他の成分を含有してもよく、前記他の成分としては、特に限定されず、一般的に培地に添加されている成分を含有できる。
また、本技術の培地の作製方法は、特に限定されず、公知の方法を利用して作製することができる。例えば、基礎培地成分を含む培地成分を、滅菌処理（オートクレーブ１２１℃１５分間）後、滅菌シャーレ等の滅菌容器に流し込み固化させればよい。また、市販品の生培地（シャーレに分注済みの培地）を購入してもよい。
【００５０】
被検菌としてビフィズス菌及び／又は乳酸菌を目的又は想定する場合、ビフィズス菌及び／又は乳酸菌の観察用又は生菌数測定用に使用可能な寒天培地を用いることが好ましい。
ビフィズス菌の寒天培地として、例えば、ＲＣＭ寒天培地、ＢＬ寒天培地、ＢＬ寒天培地、ＴＯＳ寒天培地、ＴＯＳ  ＭＵＰ寒天培地、ＭＧＬＰ寒天培地、ＭＲＳ寒天培地、ＭＲＳＣ寒天培地等、ＧＡＭ寒天培地等が挙げられる。
乳酸菌の寒天培地として、例えば、ＢＣＰ寒天培地、ＭＲＳ寒天培地、、Ｍ１７寒天培地等が挙げられる。
【００５１】
また、接種方法としては、寒天培地の表面に菌を接種する塗抹法でもシャーレに菌懸濁液を添加し、直後に加温溶解した寒天培地を流し込む混釈法のどちらであってもよい。
また、各培地の培地組成に合わせた培養条件にて培養を行えばよく、被検菌としてビフィズス菌を想定する場合、嫌気培養で行うのが好ましく、乳酸菌を想定する場合、嫌気培養もしくは好気培養が好ましい。一般的に３７℃で１〜３日間培養で行うことが好ましい。
【００５２】
本技術における培養後の培地上又は培地中の適切なコロニー数とは、少なくとも２以上の複数のコロニーの数であるのが好ましい。
本明細書におけるカウントするコロニーの形態として、目視できる大きさの円形状が好ましく、より具体的には直径０．７ｍｍ以上が好ましく、コロニーのサンプル数を多くしつつコロニー同士を接触させないようにするため、より好ましくは０．７〜３ｍｍ程度、さらに好ましくは１〜２ｍｍ程度の円形である。
本技術における培地上に又は培地中における適切なコロニー数は、隣接するコロニーが接触することなく、略円形を保つコロニーが培地上又は培地中の選定エリアに２以上で多く存在することが好ましい。
本技術において、前記被検体を各希釈倍率に希釈した液を用いて、それぞれの培地上に又は培地中に接種してコロニーを形成させる。そのなかから適切なコロニーが形成された培地を、次の同定工程のサンプルとして用いることが好適である。
培養後の培地上に又は培地中における適切なコロニー数として、３０〜３００個／１シャーレ（直径９ｃｍの場合）が好ましい。より好ましくは５０〜２５０個／ｃｍ２である。コロニー数を増やすために直径が大きいシャーレを使用してもよい。
【００５３】
本技術のコロニー選択工程において、培地上に又は培地中に存在する全てのコロニーを選択しこの数をカウントしてもよく、また、コロニー観察にて良好なコロニー形成がされている一部のエリアを選択し、この選択されたエリア内のコロニーをカウントしてもよい。一定エリア内のコロニー数をカウントする場合には、当該エリアを１シャーレ（直径９ｃｍ）全体に換算することで、培地上に又は培地中に存在する全てのコロニー数とすることができる。
前記カウントされるコロニー数は、少なくとも１０個以上が好ましく、より好ましくは３０個以上、さらに好ましくは１００個以上３００個以下である。
【００５４】
本技術において、培地上又は培地中の全てのコロニーをカウントすることは、被検体中の各菌株の生菌数及び菌株割合の算出精度を高める観点から好ましい。
また、本技術において、培地上又は培地中における一部のエリア内のコロニーをカウントすることは、コロニー数が数百個等と多い場合や一部のエリアでコロニー同士が重なっていた場合等でも再度培養又は再度希釈倍率設定を行わなくてもよいので、作業効率の観点から好ましい。また、本技術において、培地上又は培地中における所定エリア内のコロニーをカウントすることは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの測定数を減らすことができるので、作業効率の観点から好ましい。
【００５５】
培養後に培地上又は培地中のコロニー数及びその状態に基づいたコロニー選択は、目視でも可能であるが、本技術であれば高度な経験によるコロニー形態の判定をしなくともよいので、カメラ（ＣＣＤ等）を用いてコロニー数を画像解析にて計測することも可能である。画像解析等を利用することで、コロニー判定を自動化できると共に、被検体中の生菌数算出を自動化できる観点で有利である。
【００５６】
〔（２）菌株同定工程〕
本技術の菌株同定工程は、前記各コロニーの菌株を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法により、同定する工程である。
本技術において、培地上に又は培地中に存在するコロニーに対応するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用サンプルに調製するサンプル調製工程、サンプルプレート上にあるサンプルに対して、レーザー照射によるイオン化（ＭＡＬＤＩ）法及びイオン化成分の分離（ＴＯＦＭＳ）法により、サンプルのピーク測定を行うＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定工程を少なくとも含むことが好適である。
本技術におけるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法の測定原理は、公知の方法（例えば、非特許文献４及び特許文献３）を参照にして行うことができる。
【００５７】
本技術におけるサンプル調製工程（前処理工程）は、上述した培地上に又は培地中に存在する全部又は一部の選択されたコロニーごとに、釣菌を行い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用サンプルプレート上のサンプル設置場所（ウェルや窪み等）ごとに、設置する。これにより、上述で選択された全部又は一部のコロニー数が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用サンプル数になる。例えば、選択したコロニー数５０個の場合、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用サンプル数は５０個となる。
なお、釣菌は、先端の尖った棒状のもので、釣菌に使用後、廃棄するか、滅菌処理して再利用してもよい。
【００５８】
本技術のサンプル調製工程において、コロニーを直接ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用サンプルプレートに塗布する方法を一般的にセルスメア法といい、作業が簡易な観点から好ましい。このセルスメア法で次工程にて良好なマススペクトルパターンが得られない場合には、コロニーを、エタノール・ギ酸抽出法で処理し、このコロニーからの抽出液をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用サンプルプレートに塗布してもよいが、グラム陰性菌及びグラム陽性菌の菌株の場合にはセルスメア法で行うことが可能である。
【００５９】
各コロニーの菌株を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用サンプルプレート（各サンプル設置場所）に塗布後、コロニーの菌株を乾燥させる。なお、エタノール・ギ酸抽出法を用いた場合には、抽出液を塗布し、乾燥させる。
乾燥後、各サンプルに、マトリックス（例えば、ＨＣＣＡ（α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸）マトリックス等）を１μＬ載せて、乾燥する。これにより、サンプルを結晶化することができる。
【００６０】
本技術では、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによる菌株同定工程として、サンプルプレート上にあるサンプルに対して、レーザー照射によるイオン化（ＭＡＬＤＩ）法及びイオン化成分の分離（ＴＯＦＭＳ）法により、サンプルのピーク測定を行う。
このとき、タンパク質由来のピークが見られる約２，０００〜２０，０００Ｄａを測定範囲とすることが、菌株の菌体に由来するタンパク質由来のピークを測定する観点から、好適である。マススペクトル測定で得られる主なピークは、リポソームタンパク質由来のピークであり、概ね４，０００〜１５，０００Ｄａである。このリポソームタンパク質が各菌株によって異なってことから、このマススペクトラムパターンの範囲を基準とすることで、各菌株の同定を行うことができる。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法により、上述で選択された各コロニーの調製されたサンプルごとのマススペクトラムパターンを得ることができる。これにより、コロニーごと、すなわち釣菌した菌株ごとのマススペクトラムパターンを得ることができる。例えば、上記釣菌で選択したコロニー数５０個の場合、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用サンプル数は５０個となり、この５０個の菌株のマススペクトラムを得ることができる。この得られた各菌株のマススペクトルは、データベースに記憶され、データストックすることによってライブラリとすることができる。
【００６１】
そして、得られた各コロニー由来の各菌株のマススペクトルは、データベース（ライブラリ）にある各菌株のマススペクトルや、すでに測定された菌株対比することにより、各サンプルの菌株を同定することが好適である。好適には、基準菌株のマススペクトラムと対比することであり、対比結果は、スコアとして得ることができる。このスコア結果により、基準菌株と近縁種か否か又は基準菌株と同種或いは同属であるかをより容易に判定することができる。これにより、各コロニーの菌株を同定することができ、また、測定した各菌株を菌株グループにまとめる（必要に応じて、同種、近縁種、同属等グループ化）ことができる。
【００６２】
なお、本技術における「基準菌株」について、各カルチャーコレクション機関（例えば、ATCC、BCCM等）及び市販品等から属や種、亜種等が判明している菌株を入手して、これらを基準菌株とすることができる。また、未同定菌株であっても同定後に基準菌株とすることができる。そして、これら基準菌株のマススペクトルパターンを得、この得られた各菌株のマススペクトルは、データベースに記憶され、データストックすることによって基準菌株のライブラリとすることができる。
また、データベースに基準菌株として多数を登録し過ぎると却って基準となる中心が不明瞭となり、同定エラーが発生しやすくなることがある。このようなことを回避する場合、基準菌株の中でアクセスの優先順位をケースバイケースでつけることが、望ましい。すなわち、測定者が必要と考える基準菌株を設定できる。
例えば、上記［１］〜［７］の菌株又はこの近縁菌が含まれていると想定される製品に対しては、上記の［１］〜［７］の菌株を基準菌株として設定して対応することが望ましい。
【００６３】
同定の判定として、Ｒａｎｇｅ２．５００〜３．０００は、菌株が同一である高い可能性あり；Ｒａｎｇｅ２．０００〜２．２９９は、種が同一であり及び属が安全に同一である；Ｒａｎｇｅ１．７００〜１．９９９は、属が同一である可能性あり；Ｒａｎｇｅ０．０００〜１．６９９は、同一の信頼性がない。
なお、当該Ｒａｎｇｅの幅を調整することでコロニーの菌株の判定精度を調整できる。例えば、「ある基準菌株のＲａｎｇｅ２．５００〜１．７００に該当する菌株を同一菌株とする」と設定することができる。これにより、当該Ｒａｎｇｅに該当したコロニーの菌株を基準菌株と同じ菌株と判定できる。なお、Ｒａｎｇｅ２．５００〜３．０００と設定することが、精度の高い同定結果及び菌株割合を得ることができるので、好ましい。
【００６４】
また、同定の判定として、例えば、基準菌株のマススペクトラムと対比して得られた菌株のスコア結果及び基準菌株のスコア結果から、「菌株のスコア／基準菌株のスコア」のスコア結果対比（％）に基づき、１００％に近いほど菌株の同一性が高いと判定することも可能である。例えば、スコア結果対比が、７０％以上８５％未満のとき同一の菌株であると判定できる。；８５％以上のとき同株の可能性が高い等と判定することができる。
また、本技術は基準菌株を複数設定できるので、被検体に含まれる個々の被検菌は、それぞれ最も近いスコアの基準菌株と判定することができる。
【００６５】
上述したスコア算出及び同点の判定は、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定装置に付随する同定ソフトにて行うことが可能であり、必要に応じて基準菌株等を入力（削除）したり設定（再設定）したりすることも可能である。例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定装置として、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ  ＬＴ  ＭＡＬＤＩ  Ｂｉｏｔｙｐｅｒが挙げられる。
【００６６】
本技術におけるライブラリとは、各菌株の名前と各菌株の細菌分類及びこれに対応する各菌株のマススペクトルの多数のデータがデータストックされ、収納されているものをいい、当該ライブラリにアクセスすることで、データを記憶させること、データを取り出すことや削除すること等ができる。
本技術で使用されるデータベース（ライブラリ）の保管場所として、記憶媒体（ＵＳＢメモリ、ＨＤＤ、ＣＤ、ネットワークサーバ等）に記憶することができ、記憶媒体にアクセスすることができる状態であればよい。
【００６７】
〔（３）菌株割合及び生菌数の測定工程〕
本技術の菌株割合及び生菌数の測定工程は、前記各コロニーの菌株同定結果及び前記組成物を希釈したときの希釈倍率に基づき、前記被検体中に含まれる前記菌株の割合及び生菌数を測定する工程である。
本技術において、前記各コロニーの菌株同定結果と前記被検体を希釈したときの希釈倍率とに基づき、前記被検体中に含まれる前記菌株割合及び生菌数を測定し、決定することができる。
より具体的には、本技術では、選択されたコロニーを各菌株グループに分け、「各菌株グループのコロニー数×被検体の希釈倍率」に基づき、被検体中に含まれる各菌株割合及び各生菌数を（ＣＦＵ／ｇ）にて算出することが好適である。
本技術で使用される「生菌数の単位」は、被検体１ｇもしくは１ｍＬの希釈液を用いて培地上又は培地中のコロニー数に基づき、各菌株の生菌数を求めているので、「ＣＦＵ（colony forming unit；コロニー形成単位）／製品１ｇもしくは１ｍＬ」で表されることが好ましい。
さらに、本技術では、汎用的な培地組成を使用しているため、製品中に含まれる１種類又は複数種類の菌株全てを生育させやすいので、「各菌株のコロニー数／全てのコロニー数」に基づき各菌株割合を算出させた場合の分母の「全てのコロニー数」がより正確であることから、正確な生菌数及び菌株割合を得やすい利点がある。
【００６８】
製品１ｇを液体懸濁して希釈液を作成した場合；
全生菌数（ＣＦＵ／製品１ｇ）＝希釈倍率×［希釈液１ｍＬ／塗布量ｍＬ］×培地上に又は培地中に形成されたコロニー数。
各菌株の生菌数（ＣＦＵ／製品１ｇ）＝希釈倍率×［希釈液１ｍＬ／塗布量ｍＬ］×ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによる各菌株のコロニー数。
各菌株割合（％）＝ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによる各菌株のコロニー数／ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにより測定された全コロニー数（又は培地上に又は培地中に形成された全コロニー数）×１００
培地上又は培地中の全面積は、１シャーレ（例えば、直径９ｃｍの場合）の全面積とするのが好ましい。なお、培地上又は培地中の一部エリアを抜き取りこのエリア内の全コロニーをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳのサンプルとした場合、このエリアの全コロニー数から培地上又は培地中の全面積の全コロニー数を算出してもよい。
【００６９】
また、本技術において、同定できなかった菌株（コロニー）は、生菌数及び菌株割合を算出する際の各グループ中のサンプル数及び選択されたコロニー数から排除することが、所定エリア内のコロニーをカウントすることを選択することで、可能となり、より簡便でかつ正確な各菌株の生菌数及び菌株割合を測定することができる。
【００７０】
＜２．本技術の複数の菌株を含む被検体中の前記菌株を同定する方法＞
本技術は、別の側面として、以下の工程を含むことによって、複数の菌株を含む被検体中の前記菌株を同定する方法を提供することも可能である。なお、上記＜１．本技術の生菌数の測定方法＞と共通する構成についてはその説明を省略する。＜１．本技術の生菌数の測定方法＞にて菌株割合及び生菌数を測定する測定工程において、被検体中に含まれる複数の菌株の同定も同時に行い、菌株のグルーピングを行っているため、上記生菌数の測定工程以外は、共通する構成である。
（１）前記被検体を希釈した液を用いて培地上に又は培地中に複数のコロニーを形成させ、このなかから全部又は一部のコロニーを選択する工程、
（２）前記各コロニーの菌株を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法により、同定する工程。
【００７１】
従来のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法では、製品中に異なる菌株が多く存在するほど、マススペクトルパターンが複雑になるため、マススペクトルパターン強度から同定する場合、正確な同定が難しくなる。しかしながら、本技術の同定方法であれば、前記（１）のコロニー選択工程を有することで、３種又は４種以上といった多く菌株が存在しても正確に同定することができる。さらに、希釈倍率を調整することで、適切なコロニー数を選択することができるため、より正確に多数の菌株を同時に同定し、菌株割合を測定することも可能である。
さらに、上述した［１］〜［７］のビフィズス菌及び／又は乳酸菌からなる群から選ばれる１種又は２種以上を基準菌株にすることで、より正確に、製品中の菌株を測定することも可能である。
【００７２】
本技術の被検体中の前記菌株（例えば、菌株のグループごと）の生菌数を測定する方法について、例えば本技術の具体的な一例として以下の手順が挙げられるが、本技術はこれに限定されない。
【００７３】
被検体として、ビフィズス菌、乳酸菌又はその混合物（被検菌）を含む食品、健康食品等の製品を用意する。被検体について希釈用の液体を用いて段階希釈をし、適切な濃度の菌懸濁液を調製する。培地として、ビフィズス菌用の寒天培地又は乳酸菌用の寒天培地を用いる。
そして、培地上に又は培地中に対して希釈された菌懸濁液（以下、希釈液ともいう）を塗布し、至適条件下で静置することにより、この培地上に又は培地中に菌株のコロニーを生育させる。培地（直径８〜１２ｃｍ）上のコロニー数は、３０〜３００個が、好ましい。１培地に対して１希釈液の塗布が、生菌数測定の精度向上の観点から、好ましい。
【００７４】
シャーレ内の培地上に又は培地中に生育した全て又は所定数のコロニーを選択し、選択したコロニーの一つ一つを釣菌し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用のプレートサンプル上（ウェルや窪み）に一つ一つサンプル調製する。
選択される所定数のコロニーは、培地上又は培地中から任意に選択された複数のコロニーである。当該所定数のコロニーとして、生菌数測定の精度向上の観点から、コロニー同士が接触していないコロニーを複数選択することが好ましい。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定に使用するため釣菌するコロニー数は、生菌数測定の精度向上の観点から、上述した〔（１）コロニー選択工程〕と同じでもよい。
釣菌された各コロニーをサンプル上に調製した後に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにより各コロニーの菌株の特徴的なタンパク質由来のＭＳスペクトルピークを測定し、データベース上の菌株のＭＳスペクトルピークのデータと対比することで、それぞれのコロニーの菌株（より具体的には、被検菌）を同定する。
【００７５】
同定後、各コロニーの菌株を各グループに分類することで、被検体中の菌株グループ割合（菌株割合）を求めることができる。
分類後、上記の希釈倍率及び釣菌コロニー数に基づき、菌株のグループごとの生菌数を算出する。この算出結果より、１種類又は複数種類の菌株（同じ菌種又は異なる菌株）を含む製品中の菌株割合及び菌株ごとの生菌数（ＣＦＵ／ｇ）、さらに菌株をグルーピングすることで各菌株割合を測定することができる。
【００７６】
例えば、製品１ｇを生理食塩水に懸濁後、懸濁液を１０の８乗倍希釈する；培地（１シャーレ）中に又は上に希釈液の塗布量０．１ｍＬで接種し培養する；培養後、培地上又は培地中の全コロニー１６５個を釣菌し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用にサンプル調製する。調製後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法によって、培地（１シャーレ）上又は中に形成された全コロニー数（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の全サンプル数）のうちビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP-02622菌株が４１個と同定される（Ｒａｎｇｅ２．５００〜３．０００を同一菌株とする設定）；その結果、４１個×１０の８乗×（１ｇ／０．１ｍＬ）＝４．１×１０１０（ＣＦＵ／ｇ）の生菌数及び２４．８％の菌株割合で、ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP-02622菌株が製品中に存在すると判定する。
【００７７】
＜３．本技術の１種類又は複数種類の菌株を含む組成物の製造方法＞
本技術は、別の側面として、上記＜１．本技術の生菌数の測定方法＞を用いて、１種類又は複数種類の菌株を含む組成物の製造法を提供することも可能である。なお、上記＜１．本技術の生菌数の測定方法＞と共通する構成についてはその説明を省略する。
本技術の組成物の製造方法の「組成物」は、特に限定されず、本技術の被検体に使用可能な組成物であればよく、製品であってもよく試作品であってもよい。例えば、飲食品組成物、医薬品組成物、飼料組成物等の何れでも良いが、上記＜１．本技術の生菌数の測定方法＞にて説明した製品が好適である。
【００７８】
本技術の組成物の製造方法は、１種類又は複数種類の菌株を含む組成物の製造方法であり、（１）上記＜１．本技術の生菌数の測定方法＞の生菌数の測定方法を用いて、被検体となる組成物中の各菌株グループ（各細菌グループであってもよい）の生菌数を測定する工程；前記測定された組成物中の各菌株の生菌数に基づいて、目的生菌数になるように組成物中の各菌株の配合量を調整し設計する工程を含み、
前記各菌株の配合量の設計に基づき、前記１種類又は複数種類の菌株を含む組成物を得ることが好適である。
【００７９】
本技術の組成物の製造方法における前記（１）の生菌数測定工程は、上記＜１．本技術の生菌数の測定方法＞と共通する構成について、その説明を省略する。
本技術の組成物の製造方法において、被検体となる組成物は、１種類又は複数種類であり、複数の場合には、同一ロット、製造時期が同時期、製造原材料が同一であるものが好ましい。
目的生菌数とは、１種類又は複数種類でもよい。また、目的生菌数とは、特に限定されず、製造者の任意によって設定することができ、製造時に組成物に配合する生菌数である。例えば、目的生菌数として、製造時に基準として設定された生菌数；製造直後の生菌数マイナス製造保管時の生菌数に基づき生菌数の減少分を補充するように補正された生菌数等が挙げられる。
【００８０】
組成物に１種類又は複数種類の菌株が含まれているが、経時的変化によって、この組成物中の１種類の菌株又は複数種類の各菌株の生存率等が変化してくる。このため、菌株を含む組成物の品質管理では、長期間保存したときにこの変化を想定して各菌株の配合量及び菌株割合を調整する対策も必要となっている。本技術では、このような菌株の配合量及び配合割合の調整をより正確に行うことができる。
また、菌株を通常長期間保存すると菌株の生育力も低下しやすいので、特殊な成分を使用して生菌数を測定する方法ではその特殊な成分の影響によって真の生存率よりもより低い生存率を算出しやすく、正確さに欠けるリスクがある。しかしながら、本技術では、汎用的な培地を使用できるので、そのリスクを低減することができる。
また、本技術では、保管による組成物中の各菌株の生菌数及び菌株割合の変化をモニタリングし正確に把握することもできる。そして、本技術では、このモニタリング結果を製造プロセスにフィードバックし、製造プロセスにおける組成物中の各菌株の生菌数及び菌株割合を調整（増量又は減量）することによって、一定期間保存後の組成物中における目的とする生菌数及び菌株割合にすることができる。
【００８１】
本技術の方法とその結果及び／又は当該結果と組成物の製造方法を、装置のＣＰＵ等を含む制御部、及び記憶媒体（ＵＳＢメモリ、ＨＤＤ、ＣＤ、ネットワークサーバ等）等を備えるハードウエア資源にプログラムとして格納し、制御部によって実現させることも可能である。
また、本技術は、本技術の方法及び／又は当該結果と組成物の製造方法として、コンピュータを機能させるためのプログラムとすることも可能である。
【００８２】
本技術のステップの一例を以下に挙げるがこれに限定されることはない。
本技術は、例えば、本技術の各菌株の同定又は生菌数測定の制御ステップとして、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定及び各菌株の同定ステップ（Ｓ１）→各菌株グループ化ステップ、菌株割合の算出ステップ及び生菌数の算出ステップ（Ｓ２）にて、各菌株の同定、各菌株の生菌数及び菌株割合を算出し、測定することができる。なお、各菌株結果を、さらに属等にグルーピングして、菌株グループごとの割合及びその菌数も表示することもできる。
本技術では、人為的な作業工程を含めることが可能であり、ソフト等により各菌株の生菌数及び菌株割合を算出する際に、希釈倍率やコロニー数等は任意にデータ入力させることが可能である。
【実施例】
【００８３】
以下、実施例に基づいて本技術を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本技術の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
【００８４】
［試験例１］
試験試料としてビフィズス菌の生菌末でビフィドバクテリウム・ロンガム NITE BP-02621菌株、ビフィドバクテリウム・インファンティス NITE BP-02623菌株、ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP-02622菌株、ビフィドバクテリウム・ブレーベ FERM BP-11175菌株を用意した。この生菌末をそれぞれ生理食塩水を希釈液として段階希釈し、塗抹法にてRCM寒天培地（ＯＸＯＩＤ社製）に接種し、嫌気培養により37℃にて48時間培養した。
得られたコロニーをそれぞれ釣菌し、それぞれのコロニーをWell-Plateに塗布し、マトリックス（1μL-CHCA）を塗布することにより、結晶化し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによりＭＳスペクトルを得た。その結果をBruker社製（Bruke altonics社製  micronexLT MALDI Biotyper）のを用いて解析を行った。
その結果、C1は、ビフィドバクテリウム・ロンガム NITE BP-02621菌株、ビフィドバクテリウム・インファンティス NITE BP-02623菌株、ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP-02622菌株、ビフィドバクテリウム・ブレーベ FERM BP-11175菌株は自己株が2.845と高い値を示す一方、自己株以外は最大でも2.343以下であった。これらの結果から、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを使用し、それぞれの菌株を区別することで、サンプル中のそれぞれの菌株ごとの菌数を測定することが可能であることが示された。
【００８５】
【表１】
2019165704.tif 000002
【００８６】
【表２】
2019165704.tif 000003
【００８７】
表３にC1サンプル（ビフィドバクテリウム・ブレーベ FERM BP-11175菌株）のＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ分析結果を示す。
【００８８】
【表３】
2019165704.tif 000004
【００８９】
表４にC2サンプル（ビフィドバクテリウム・ロンガム NITE BP-02621菌株）のＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ分析結果を示す。
【００９０】
【表４】
2019165704.tif 000005
【００９１】
表５にC3サンプル（ビフィドバクテリウム・インファンティス NITE BP-02623菌株）のＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ分析結果を示す。
【００９２】
【表５】
2019165704.tif 000006
【００９３】
表6にC4サンプル（ビフィドバクテリウム・ブレーベNITE BP-02622菌株）のＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ分析結果を示す。
【００９４】
【表６】
2019165704.tif 000007
【００９５】
［実施例２］
生菌数の濃度が既知である、上記実施例１で使用したビフィドバクテリウム・ロンガム NITE BP-02621菌株、ビフィドバクテリウム・インファンティス NITE BP-02623）菌株、ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP-02622菌株、ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ビフィドバクテリウム・ブレーベ FERM BP-11175菌株の各生菌末を用意する。
これら生菌末を、表７に示すように、それぞれ同重量ずつ混合し、この混合物を生理食塩水にて１０８倍希釈する。
【００９６】
混合物の希釈液を塗抹法にてＲＣＭ寒天培地（ＯＸＯＩＤ社製）に１００μＬ接種し、嫌気培養により３７℃にて４８時間培養する。培養したときの全コロニー数は１６５となる。
得られるコロニーをすべて釣菌し、それぞれのコロニーをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用Ｗｅｌｌ−Ｐｌａｔｅの各ウェル塗布し、マトリックスを塗布することによって結晶化する。結晶化後に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにより、全コロニーごとのマススペクトルを得る。
【００９７】
なお、データベースにある基準菌株は、［１］ビフィドバクテリウム・ロンガム NITE BP-02621菌株、［２］ビフィドバクテリウム・インファンティス NITE BP-02623菌株、［３］ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP-02622菌株、［４］ビフィドバクテリウム・ブレーベ FERM BP-11175菌株である。
【００９８】
全コロニーの各マススペクトルと、データベースにある基準菌株のマススペクトルとを対比し、各菌株のスコア結果が算出される。このスコア結果に基づきコロニーごとの菌株の判定ができる。
全てのコロニーの菌株の同定の結果に基づき、グルーピングを行う。具体的には、スコア表（レンジ分類）又はスコア対比（９９％以上）に基づき、混合物中の各菌株は、ビフィドバクテリウム・ロンガム NITE BP-02621菌株、ビフィドバクテリウム・インファンティス NITE BP-02623菌株、ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP-02622菌株、ビフィドバクテリウム・ブレーベ FERM BP-11175菌株の４種類であることが分かり、これらのそれぞれのコロニー数が菌株割合となる。
【００９９】
本実施例２に使用する混合物にある複数種類の各菌株は、以下の表８に示すとおりにグルーピングできる。このグルーピングにより菌株ごとのコロニー数が得られ、これが混合物中の菌株割合となる。
その結果、下記の通りに菌株が決定され、例えばビフィドバクテリウム・ロンガム NITE BP-02621菌株のコロニー数は４１個、１０の８乗倍希釈した後に１００μＬの溶液を接種したため、４１×１０の８乗×１０＝４．１×１０１０の生菌数と計算される。ビフィドバクテリウム・インファンティス NITE BP-02623菌株、ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP-02622菌株、ビフィドバクテリウム・ブレーベ FERM BP-11175菌株も同様にして生菌数を計算する。このように得られた生菌数は理論菌数とほぼ同等の値を示す。
得られる各生菌数は論理菌数とほぼ同等の値を示す。
【０１００】
さらに、６ヶ月保管した混合物について、同様にして、各菌株割合及び各菌株の生菌数を測定する。この結果により、製造時の各菌株の生菌数マイナス６ヶ月保管したときの各菌株の生菌数に基づき、再び混合物を製造する際に、各菌株の減量した分について製造する際に各菌株を増量する。
【０１０１】
【表７】
2019165704.tif 000008
【０１０２】
【表８】
2019165704.tif 000009
【受託番号】
【０１０３】
（１）ビフィドバクテリウム・ロンガムＢＢ５３６（受託番号：NITE BP-02621）（受託日：２０１８年１月２６日）、受託先：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）。
（２）ビフィドバクテリウム・ブレーベＭ−１６Ｖ（受託番号：NITE BP-02622）（受託日：２０１８年１月２６日）、受託先：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）。
（３）ビフィドバクテリウム・インファンティスＭ−６３（受託番号：NITE BP-02623）（受託日：２０１８年１月２６日）、受託先：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）。
（４）  ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＦＥＲＭ  ＢＰ‐１１１７５（受託番号：FERM BP‐11175）（受託日：２００９年８月２５日）、受託先：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（現  独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）。