(57)【要約】      （修正有）【課題】被験者における癌を処置する方法、被験者の免疫系を刺激する方法、腫瘍細胞への抗癌剤の送達を強化する方法の提供。【解決手段】細菌細胞及び腫瘍浸透剤を含む、組成物及びキット。また、被験者に細菌細胞及び腫瘍浸透剤の有効量を投与する工程、腫瘍細胞を、細菌細胞、腫瘍浸透剤及び抗癌剤に接触させる工程を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者に細菌細胞及び腫瘍浸透剤の組み合わせ有効量を投与することを含み、投与は前記被験者における癌を処置することである、被験者における癌を処置する方法。
【請求項２】
前記組み合わせ有効量が、組み合せ相乗量である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験者に、細菌細胞及び腫瘍浸透剤の組み合わせ有効量を投与することを含む、被験者において免疫系を刺激する方法であって、前記細菌細胞及び腫瘍浸透剤の投与が被験者の免疫系を刺激する方法。
【請求項４】
免疫応答が、抗癌免疫応答である、請求項３に記載の前記方法。
【請求項５】
被験者に抗癌剤を投与することを更に含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗癌剤が、前記細菌細胞及び腫瘍浸透剤の投与後に投与される、請求項５に記載の前記方法。
【請求項７】
腫瘍細胞に、細菌細胞、腫瘍浸透剤及び抗癌剤を接触させることを含む、抗癌剤の腫瘍細胞への送達を促進する方法であって、前記腫瘍細胞に前記細菌細胞及び腫瘍浸透剤を接触させることは、抗癌剤の送達を促進する方法。
【請求項８】
前記抗癌剤が、小分子、核酸、ポリペプチド、及び、抗体からなる群から選択される、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記細菌細胞がサルモネラ細菌細胞である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌細胞が、サルモネラチフィムリウムの弱毒化株である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記サルモネラ細菌細胞が、ＹＳ１６４６（ＡＴＣＣ＃２０２１６５）、ＲＥ８８、ＬＨ４３０、ＳＬ７２０７、χ８４２９、χ８４３１、及び、χ８４６８からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌細胞が、アンチセンス核酸を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記アンチセンス核酸が、代謝酵素を標的とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アンチセンス核酸が、免疫抑制標的を標的とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記免疫抑制標的が、ＳＴＡＴ３、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、アルギナーゼ１、ｉＮＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ｐＧＥ２、または、ＶＥＧＦである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記免疫抑制標的が、ＩＤＯ１である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アンチセンス核酸が、ｓｈＲＮＡである、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記アンチセンス核酸が、配列番号：３〜３１からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍浸透剤がヒアルロニダーゼポリペプチドである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヒアルロニダーゼポリペプチドが改変されたヒアルロニダーゼポリペプチドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヒアルロニダーゼポリペプチドが、ペグ化されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヒアルロニダーゼポリペプチドが、配列番号：１を含む、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記腫瘍浸透剤が細菌細胞の前に投与される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
サルモネラ細菌細胞、及び、ヒアルロニダーゼポリペプチドを含む組成物。
【請求項２５】
前記サルモネラ細菌細胞が、サルモネラチフィムリウムの弱毒株である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記サルモネラ細菌細胞が、ＹＳ１６４６（ＡＴＣＣ＃２０２１６５）、ＲＥ８８、ＬＨ４３０、ＳＬ７２０７、χ８４２９、χ８４３１、及びχ８４６８からなる群から選択される、請求項２４、または、２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記細菌細胞がアンチセンス核酸を含む、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記アンチセンス核酸が、代謝酵素を標的とする、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記アンチセンス核酸が、免疫抑制標的を標的とする、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
前記免疫抑制標的が、ＳＴＡＴ３、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、アルギナーゼ１、ｉＮＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ｐＧＥ２、または、ＶＥＧＦである、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記免疫抑制標的が、ＩＤＯ１である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】
前記アンチセンス核酸が、ｓｈＲＮＡである、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記アンチセンス核酸が、配列番号：３〜３１からなる群から選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ヒアルロニダーゼポリペプチドが、改変ヒアルロニダーゼポリペプチドである、請求項２４〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ヒアルロニダーゼポリペプチドが、ペグ化されている、請求項２４〜３４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ヒアルロニダーゼポリペプチドが、配列番号：１を含む、請求項２４〜３５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３７】
抗癌剤を更に含む、請求項２４〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記抗癌剤が、小分子、核酸、ポリペプチド、及び、抗体からなる群から選択される、請求項３７記載の組成物。
【請求項３９】
前記サルモネラ細菌細胞及びヒアルロニダーゼポリペプチドが、組み合せ相乗有効量で存在する、請求項２４〜３８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４０】
サルモネラ細菌細胞含む第一の組成物、及び、ヒアルロニダーゼポリペプチドを含む第二の組成物を含むキット。
【請求項４１】
前記サルモネラ細菌細胞及びヒアルロニダーゼポリペプチドは、組み合せ相乗的に有効量で存在する、請求項４０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年７月３日に出願した米国特許仮出願第６１／８４２，７４９号に優先権を主張し、これにより、その特許の内容全体を参照により本明細書に引用したものとする。
【背景技術】
【０００２】
進行性の膵管腺癌（ＰＤＡＣ）は、しばしば手術不能であり、既存の処置で一時的にのみ応答する。ＰＤＡＣにおけるインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の過剰発現は、抗腫瘍免疫を抑制することにより疾患の進行を加速することで主要な役割を果たす。全身のオフターゲット効果はその毒性に寄与するが、現在のＩＤＯ阻害剤は、免疫抑制の逆転に不十分である。その結果、腫瘍、及び、腫瘍の微小環境に関連する免疫抑制機構を標的とする、更なる癌処置法を提供する必要がある。本明細書に、これら、及び、当該分野における他の問題に対処する解決策が本明細書に提供される。
【発明の概要】
【０００３】
細菌細胞、及び、腫瘍浸透剤を含む組成物、並びに、キットが本明細書に提供される。また、被験者に、細菌細胞、及び、腫瘍浸透剤の有効量を投与する工程を含む、被験者における癌処置法を提供する。被験者において免疫系を刺激する方法が提供される。方法は、被験者に、細菌細胞、及び、腫瘍浸透剤の有効量を投与することを含む。また、細菌細胞、腫瘍浸透剤、及び、抗癌剤を腫瘍細胞に接触させる工程を含む、腫瘍細胞への抗癌剤の送達を強化する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】同所性のＫＰＣ−ｌｕｃモデルマウスにおける、ｓｈＩＤＯ−ＳＴ、ＰＥＧＰＨ２０（商標）、及び、ｓｈＩＤＯ−ＳＴ、及び、ＰＥＧＰＨ２０（商標）の組み合せの効果を実証する一連の画像を示す。マウスは、腫瘍移植後の示された時点で生体内イメージングシステム（ＩＶＩＳ）を用いて画像化した。腫瘍の減少は、ｓｈＩＤＯ−ＳＴ、及び、ＰＥＧＰＨ２０（商標）の組み合わせ処置で観察された。
【図２Ａ】異なる投与計画の下での、ｓｈＩＤＯ−ＳＴ、及び、ＰＥＧＰＨ２０（商標）の組み合わせ処置効果を実証する一連の画像を示す。マウスは、腫瘍移植後の示された時点での生体内イメージングシステム（ＩＶＩＳ）を用いて画像化した。ｓｈＩＤＯ−ＳＴ（５Ｍ  ｃｆｕ）、及び、ＰＥＧＰＨ２０（商標）（４５μｇ）の組み合わせは、制御された腫瘍増殖、及び、３匹の内２匹のマウスにおいて、ＫＰＣ−ｌｕｃ膵臓腫瘍の完全な除去をもたらした。ＰＥＧＰＨ２０（商標）、及び、制御された細菌、ｓｈＳｃｒ−ＳＴの組み合わせも、また、初期の時点で有意な腫瘍増殖の抑制を示したが、全てのマウスは、最終的には、腫瘍の進行を止められなかった。
【図２Ｂ】異なる投与計画の下での、ｓｈＩＤＯ−ＳＴ、及び、ＰＥＧＰＨ２０（商標）の組み合わせ処置効果を実証する一連の画像を示す。マウスは、腫瘍移植後の示された時点での生体内イメージングシステム（ＩＶＩＳ）を用いて画像化した。ｓｈＩＤＯ−ＳＴ（５Ｍ  ｃｆｕ）、及び、ＰＥＧＰＨ２０（商標）（４５μｇ）の組み合わせは、制御された腫瘍増殖、及び、３匹の内２匹のマウスにおいて、ＫＰＣ−ｌｕｃ膵臓腫瘍の完全な除去をもたらした。ＰＥＧＰＨ２０（商標）、及び、制御された細菌、ｓｈＳｃｒ−ＳＴの組み合わせも、また、初期の時点で有意な腫瘍増殖の抑制を示したが、全てのマウスは、最終的には、腫瘍の進行を止められなかった。
【図３】図２Ａ、及び、図２ＢのためのＩＶＩＳの定量化を示すグラフである。図２で画像化されたマウスから放出された光子を定量した。それぞれ特定用量で、ｓｈＩＤＯ−ＳＴ、及び、ＰＥＧＰＨ２０（商標）で処置したマウスからの腫瘍は、他の全てのグループよりも有意に良好に制御されていた。
【図４】ＫＰＣ−ｌｕｃ腫瘍に対する、ｓｈＩＤＯ−ＳＴとＰＥＧＰＨ２０（商標）、ｓｈＳｃｒ−ＳＴとＰＥＧＰＨ２０（商標）、ゲムシタビンとＰＥＧＰＨ２０（商標）、並びに、薬剤単独の効果を実証する一連の画像を示す。他の全ての処置計画は、急速な腫瘍の進行と関連していたが、有意な腫瘍の減少は、ｓｈＩＤＯ−ＳＴとＰＥＧＰＨ２０（商標）で処置したマウスにおいて観察された。
【図５】図４のためにＩＶＩＳの定量化を示すグラフである。図４で画像化したマウスから放出された光子を定量した。ｓｈＩＤＯ−ＳＴとＰＥＧＰＨ２０（商標）で処置したマウスからの腫瘍は、他の全てのグループよりも有意に良好に制御され、そして実験の終了時にはマウスは生存していた。
【図６】処置がマウスの体重を有意に変化させないことを示すグラフである。図４のマウスは、各画像化点で秤量した。いずれのグループにおいても、マウスの体重低下は観察されなかった。
【図７】同所性のＫＰＣ−ｌｕｃモデルマウスにおける、ＰＥＧＰＨ２０（商標）のｓｈＡｒｇ−ＳＴ、または、対照群のｓｈＳｃｒ−ＳＴとの組み合わせの効果を実証する一連の画像を示す。マウスは、腫瘍移植後の示された時点において生体内イメージングシステム（ＩＶＩＳ）を用いて画像化した。腫瘍の減少は、ｓｈＡｒｇ−ＳＴとＰＥＧＰＨ２０（商標）の組み合わせ処置、並びに、ｓｈＳｃｒ−ＳＴとＰＥＧＰＨ２０（商標）の組み合わせ処置で観察された。
【図８】異なる投与計画の元で、ｓｈＡｒｇ−ＳＴとＰＥＧＰＨ２０（商標）との組み合わせ処置の効果を実証する一連の画像を示す。マウスは、腫瘍移植後の示された時点における生体内イメージングシステム（ＩＶＩＳ）を用いて画像化した。ｓｈＩＤＯ−ＳＴとＰＥＧＰＨ２０（商標）の組み合わせは、腫瘍増殖の制御をもたらした。ＰＥＧＰＨ２０（商標）と対照群の細菌、ｓｈＳｃｒ−ＳＴの組み合わせは、再び、腫瘍増殖の減衰を示した。
【図９】ｓｈＩＤＯ−ＡＴとＰＥＧＰＨ２０（商標）の組み合わせ処置の効果を実証する一連の画像を示す。マウスは、腫瘍移植後の示された時点における生体内イメージングシステム（ＩＶＩＳ）を用いて画像化した。ｓｈＩＤＯ−ＳＴとＰＥＧＰＨ２０（商標）の組み合わせは、腫瘍退縮をもたらし、マウスの生存を延長した。
【図１０】腫瘍移植後の異なる時点における腫瘍負荷の定量化グラフである。具体的には、図９に示されたマウスグループのＩＶＩＳイメージングから放出された光子を定量した。他の全てのグループが耐久性のある制御を全く示さなかったが、ｓｈＩＤＯ−ＳＴとＰＥＧＰＨ２０（商標）の組み合わせは、腫瘍の統計的に有意な制御が得られた。
【図１１】グラフに示された各時点での図９に示されたマウスグループの体重を示すグラフである。図１１は、ｓｈＩＤＯ−ＳＴとＰＥＧＰＨ２０（商標）の組み合せ療法を用いてＰＤＡＣ腫瘍の除去することが、体重減少をもたらさなかったことを示す。
【図１２】ＰＥＧＰＨ２０（商標）で処置したマウスの腫瘍をヒアルロナン（ＨＡ）染色した画像を示す。ＰＥＧＰＨ２０（商標）で処置した後４８時間で、ヒアルロナンの有意な枯渇が観察された。
【図１３】ＰＥＧＰＨ２０（商標）で処置したマウスの腫瘍における開放血管の画像を示す。未処置マウス、または、ＰＥＧＰＨ２０（商標）で処置したマウスの１４日後の腫瘍切片は、腫瘍塊内の血管の断面を見つけるために、抗ＣＤ３１抗体で染色した。さらに多くの開放血管が、ＰＥＧＰＨ２０（商標）で処置したマウスの腫瘍で観察された。
【図１４】ｓｈＩＤＯ−ＳＴとＰＥＧＰＨ２０（商標）の組み合わせ療法で処置した腫瘍にサルモネラチフィムリウム（ＳＴ）、及び、好中球（ＰＭＮ）を流入した画像を示す。
【図１５】ＰＥＧＰＨ２０（商標）／ｓｈＳｃｒ−ＳＴ、または、ＰＥＧＰＨ２０（商標）／ｓｈＩＤＯ−ＳＴで処置した後９６時間で、ＰＭＮについて分析した外科的に摘出した腫瘍画像を示す。
【図１６】ｓｈＩＤＯ−ＳＴ／ＰＥＧＰＨ２０（商標）の組み合せ療法で処置した腫瘍コアにおける腫瘍細胞の壊死を示す画像である。
【図１７】１２週後での、ｓｈＩＤＯ−ＳＴ／ＰＥＧＰＨ２０（商標）の組み合わせ療法で処置した正常なＢＬ／６マウス、または、ＫＰＣ−Ｂｒｃａ１マウスから採取した脾臓、及び、膵臓の画像を示す。
【図１８】ｓｈＩＤＯ−ＳＴ／ＰＥＧＰＨ２０（商標）の組み合わせ療法が、自発的な膵臓腫瘍を制御する上で有効性を有するかどうかを判断するために、ＫＰＣ−Ｂｒｃａ１マウスの処置法の概略図を示す。
【図１９】ＰＥＧＰＨ２０（商標）／ｓｈＳｃｒ−ＳＴ、または、ＰＥＧＰＨ２０（商標）／ｓｈＩＤＯ−ＳＴで処置したマウス、または、対照群の同腹子のマウスからの膵臓の画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
細菌細胞、及び、腫瘍浸透剤を含む組成物、並びに、キットが、本明細書に提供される。また、被験者に細菌細胞、及び、腫瘍浸透剤の有効量を投与する工程を含む、被験者の癌処置法が提供され、ここに、投与が被験者の癌を処置する。
【０００６】
被験者の免疫系を刺激する方法も提供される。方法は、被験者に、細菌細胞、及び、腫瘍浸透剤の有効量を投与することを含み、ここに、投与は、被験者の免疫系を刺激する。また、腫瘍細胞を細菌細胞、腫瘍浸透剤、及び、抗癌剤と接触させる工程を含む、腫瘍細胞への抗癌剤の送達を強化する方法が提供され、ここに、腫瘍細胞を細菌細胞、及び、腫瘍浸透剤と接触させることは、腫瘍細胞に対する抗癌剤の送達を強化する。
【０００７】
本明細書で用いられる用語「腫瘍浸透剤」は、腫瘍、及び／または、腫瘍細胞に浸透することができる薬剤を意味する。従って、腫瘍浸透剤は、腫瘍細胞自体に浸透するか、または、腫瘍細胞の周辺領域、例えば、細胞外マトリックスに浸透することができる。一例として、腫瘍浸透剤は、腫瘍細胞の周囲の細胞外マトリックスを破壊し、または、分解することにより腫瘍に浸透する。或いは、腫瘍浸透剤は、腫瘍細胞自体に侵入することにより、腫瘍に浸透する。提供される組成物、及び、方法において使用するための浸透剤の例としては、ヒアルロニダーゼポリペプチド、ピルフェニドン、サリデジブ（ＩＰＩ−９２６）、ナノ粒子、アルブミンナノ粒子、デキストラン、リポソーム、及び、細胞浸透ペプチドが挙げられるが、それに限定されない。薬剤を製造し、及び、使用する方法を含むそのような腫瘍浸透剤は、公知であり、例えば、以下の文献に記載される；ＵＳ７，７６７，４２９；ＵＳ７，８２９，０８１；ＵＳ７，８４６，４３１；ＵＳ７，８７１，６０７；ＵＳ８，１０５，５８６；ＵＳ８，２０２，５１７；ＵＳ８，２５７，６９９；ＵＳ８，４３１，３８０；及び、ＵＳ８，４５０，４７０；Ｋｏｚｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７３（７）：２３４５〜５６（２０１３）；Ｏｌｉｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４（５９３３）：１４５７〜６１（２００９）；Ｍａｒｒａｃｈｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０（２８）：３５００〜１４（２０１３）；Ｊｕｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２０（２８）：３４８８〜３４９９（２０１３）；Ｍａｔｔｈｅｏｌａｂａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  （Ｌｏｎｄｏｎ）  ７（１０）：１５７７〜１５９０（２０１２）；Ｍａｌａｍ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，３０（１１）：５９２〜５９９（２００９）；Ｖａｒｓｈｏａｚ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．，  ９（５）：５０９〜２３（２０１２）；  ＭａｃＥｗａｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｌｋｏｔｉ，  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ  Ｒｅｖ  Ｎａｎｏｍｅｄ  Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５（１）：３１〜４８  （２０１３）。それらは、その内容全体を参照により本明細書に取り入れたものとする。場合により、ヒアルロニダーゼポリペプチドは、配列番号：１、若しくは、配列番号：２、または、そのフラグメントを含む。場合により、ヒアルロニダーゼポリペプチドは、改変したヒアルロニダーゼポリペプチドである。場合により、ヒアルロニダーゼポリペプチドは、ペグ化される。場合により、ヒアルロニダーゼポリペプチドは、ＰＥＧＰＨ２０（商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）である。
【０００８】
「核酸」は、一本鎖、若しくは、二本鎖形状のデオキシリボヌクレオチド、または、リボヌクレオチド、及び、そのポリマー、並びに、その相補体を意味する。この用語は、公知のヌクレオチド類似体、または、改変した骨格残基、若しくは、連結を含む核酸を包含し、これは、合成され、天然に存在し、及び、天然に非存在であり、参照核酸と同様の結合特性を有し、及び、参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される。その様な類似体の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラルのメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、それに限定されない。
【０００９】
特に指示のない限り、特定の核酸配列は、また、その保存的に改変された変異体（例えば、縮重コドン置換）及び、相補配列、並びに、明確に示された配列を暗示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ若しくはそれ以上の選択された（または全ての）コドンの第三の位置が、混合塩基で、及び／または、デオキシイノシン残基で置換された配列を生成することにより、達成することができる（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８  （１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１〜９８（１９９４））。用語、核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、及び、ポリヌクレオチドと互換的に使用される。
【００１０】
特定の核酸配列は、また、暗示的に「スプライス変異体」を包含する。同様に、核酸によりコードされる特定のタンパク質は、暗示的に、その核酸のスプライス変異体によりコードされる任意のタンパク質を包含する。名前が示唆する通り「スプライス変異体」は、遺伝子の選択的スプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なった（選択的）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするように、スプライスされ得る。スプライス変異体の産生機構は変化するが、エキソンの選択的スプライシングを含む。リードスルー転写による同一核酸に由来する別のポリペプチドも、また、この定義に包含される。スプライス産物の組み換え型を含むスプライシング反応の任意の産物も、この定義に含まれる。カリウムチャネルのスプライス変異体の例は、Ｌｅｉｃｈｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（５２）：３５０９５−３５１０１（１９９８）で、議論されている。
【００１１】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係にあるとき、「操作可能に連結される」。例えば、プレ配列、または、分泌リーダーのためのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに操作可能に連結される；プロモーター、または、エンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に操作可能に連結される；または、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置する場合、コード配列に操作可能に連結される。一般的に、「操作可能に連結された」は、連結されたＤＮＡ配列が、互いに近くに連結され、そして、分泌リーダーの場合には、位相を読むとき、隣接して連結されることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、好都合な制限部位での結紮により達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター、または、リンカーは、従来の慣行に従って使用される。
【００１２】
２つ若しくはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、用語「同一」または「同一性」のパーセントは、ＢＬＡＳＴ、または、以下で説明するデフォルトパラメータを有するＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを用いて、または、手動アラインメント、及び、目視検査により、測定したものと同一である（即ち、比較したとき、及び、比較ウィンドウにわたって最大の一致性を得るために整列したとき、または、領域を指定したとき、特定領域に対して、約６０％の同一性、好ましくは、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは、それ以上高い同一性の）アミノ酸残基、または、ヌクレオチドを特定割合含有する２つ若しくはそれ以上の配列または部分配列を意味する（参照、例えば、ＮＣＢＩのウェブサイトなど）。それ故、このような配列は、「実質的に同一」であると言われる。この定義は、また、試験配列の相補体を意味し、または、それに適用することができる。定義は、また、欠失、及び／または、付加、並びに、置換を有するものを含有する配列を含む。以下で記載する通り、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどを説明することができる。好ましくは、同一性は、少なくとも約２５個のアミノ酸、または、ヌクレオチド長、または、より好ましくは、５０〜１００個のアミノ酸、または、ヌクレオチド長である領域にわたって存在する。
【００１３】
配列比較のために、一般的に、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列、及び、参照配列は、コンピューターに入力し、必要に応じて、部分座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。好ましくは、デフォルトプログラムパラメータを使用することができ、または、別のパラメータを指定することもできる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【００１４】
本明細書で使用する「比較ウィンドウ」は、２０〜６００、一般的には、約５０〜約２００、より一般的には、約１００〜約１５０からなる群から選択される連続した位置数のいずれか１つのセグメントに対する参照を含み、ここに、２つの配列が最適に整列された後、配列は、同数の連続位置の参照配列と比較することができる。比較のための配列アラインメントの方法は、当該分野において周知である。比較のための最適な配列アラインメントの方法は、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより；Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似方法の検索により；これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行により（ウィスコンシン遺伝学ソフトウエアパッケージ、遺伝学コンピュータグループ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及び、ＴＦＡＳＴＡ）；または、手動アラインメント、及び、目視検査により実施できる（参照、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．  １９９５  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ））。
【００１５】
パーセント配列同一性、及び、配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴ、及び、ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２  （１９７７）、及び、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０  （１９９０）に、それぞれ記載されている。核酸、及び、タンパク質のパーセント配列同一性を決定するために、本明細書に記載のパラメータで、ＢＬＡＳＴ、及び、ＢＬＡＳＴ２．０を用いた。当該分野で公知の通り、ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターを通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、問い合わせ配列における長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を識別することを含み、これは、データベース配列中の同一長のワードを整列させた場合、幾つかの正の値の閾値スコアＴに合致するか、または、それに満足するかのいずれかである。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．；上記参照）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加させることができるように、各配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド用としてパラメータＭ（残基マッチングペアに対する報酬スコア；常に＞０）、及び、Ｎ（ミスマッチ残基に対するペナルティースコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列に対しては、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアが、その最大達成値から量Ｘだけ低下するとき；累積スコアが、１つ若しくはそれ以上のマイナススコアの残基アラインメントの蓄積のために、ゼロ以下になったとき；または、いずれかの配列の末端に到達したとき、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及び、Ｘは、アラインメントの感度、及び、速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用の）は、デフォルト値として、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び、両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列用としては、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルト値として、３のワード長、１０の期待値（Ｅ），及び、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（参照：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０９１５  （１９８９））、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び、両鎖の比較を使用する。
【００１６】
「阻害性核酸」は、標的核酸（例えば、ＰＴＰＲＳ内に翻訳可能なｍＲＮＡ）に結合すること；及び、標的核酸の転写（例えば、ＤＮＡからｍＲＮＡ）を減少させること；または、標的核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の翻訳を減少させること；または、阻害性核酸の非存在に対する転写物のスプライシング（例えば、一本鎖のモルホリノオリゴ）を改変すること；が可能な核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド類似体のポリマー）である。「モルホリノオリゴ」は、あるいは、「モルホリノ核酸」とも呼ばれ、当該分野で一般に知られているモルホリン含有核酸の核酸を意味する（例えば、ホスホルアミデートモルホリノオリゴ、または「ＰＭＯ」）。参照：Ｍａｒｃｏｓ，Ｐ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３５８  （２００７）  ５２１〜５２７。幾つかの実施形態では、「阻害性核酸」は、標的核酸（例えば、ＲＰＴＰＳへの翻訳可能なｍＲＮＡ）への結合（例えば、ハイブリダイジング）；及び、標的核酸の翻訳を減少させることが可能な核酸である。標的核酸は、阻害性核酸が結合（例えばハイブリダイズ）する、１つ若しくはそれ以上の標的核酸配列であるか、または、それを含む。従って、阻害性核酸は、一般的に、標的核酸配列において標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズすることができる配列（また、本明細書では、「アンチセンス核酸配列」と呼ばれる）であるか、または、それを含む。阻害性核酸の例としては、アンチセンス核酸がある。阻害性核酸の別の例としては、ｓｉＲＮＡ、または、ＲＮＡｉ（例えば、ヌクレオチド類似体などのその誘導体、または、前駆体を含む）がある。さらなる例としては、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈｍｉＲＮＡ、または，その誘導体、若しくは、前駆体の特定部が含まれる。幾つかの実施形態では、阻害性核酸は一本鎖である。他の実施形態では、阻害性核酸は、二本鎖である。
【００１７】
「アンチセンス核酸」は、ｍＲＮＡ分子（例えば、標的ｍＲＮＡ分子）（参照、例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，  ２６２：４０（１９９０））、例えば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｈｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ（ミクロＲＮＡ）などの特定標的核酸の少なくとも一部（例えば、標的核酸配列）に対して少なくとも相補的である核酸（例えば、ＤＮＡ，ＲＮＡ、または、その類似体）である。従って、アンチセンス核酸は、標的核酸（例えば標的ｍＲＮＡ）にハイブリダイズする（例えば、選択的にハイブリダイズする）ことができる。幾つかの実施形態では、アンチセンス核酸は、ストリンジェントなハイブリッド化条件下で標的核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）にハイブリダイズする。幾つかの実施形態では、アンチセンス核酸は、中程度にストリンジェントなハイブリッド化条件下で標的核酸（例えば、ｍＲＮＡ）にハイブリダイズする。アンチセンス核酸は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、及び、アノマー糖−ホスフェート、骨格改変のヌクレオチドなどの、天然に存在するヌクレオチド、または、改変ヌクレオチドを含んでもよい。「抗ＰＴＰＲＳアンチセンス核酸」とは、ＰＴＰＲＳの少なくとも一部をコードするｍＲＮＡ分子などの標的核酸配列の少なくとも一部に対して少なくとも部分的に相補的であるアンチセンス核酸である。幾つかの実施形態では、アンチセンス核酸は、モルホリノオリゴである。幾つかの実施形態では、当該分野で公知のモルホリノオリゴは、一本鎖のアンチセンス核酸である。幾つかの実施形態では、モルホリノオリゴは、標的タンパク質の発現を減少させ；標的ｍＲＮＡの翻訳を低下させ；標的ｍＲＮＡの翻訳開始を減少させ；または、転写産物のスプライシングを変更させる。幾つかの実施形態では、モルホリノオリゴは、細胞透過性部分（例えばペプチド）に抱合される。アンチセンス核酸は、一本鎖または二本鎖核酸であってもよい。
【００１８】
細胞において、アンチセンス核酸は、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズして、二本鎖分子を形成する。細胞が二本鎖であるｍＲＮＡを翻訳しないので、アンチセンス核酸は、ｍＲＮＡの翻訳を妨害する。遺伝子の生体外翻訳を阻害するためのアンチセンス方法の使用は、当該分野で公知である（Ｍａｒｃｕｓ−Ｓａｋｕｒａ，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７２：２８９，（１９８８））。ＤＮＡに直接結合するアンチセンス分子は、使用することができる。
【００１９】
阻害性核酸は、注射、吸入、または、経口摂取を含む、当該分野で公知の任意の適切な手段を使用して被験者に送達することができる。他の適切な送達システムは、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、並びに、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及び、リポソームを含む脂質ベース系などのコロイド分散系である。本発明のコロイド系の例は、リポソームである。リポソームは、生体外、及び、生体内での送達媒体として有用な人工膜小胞である。リポソーム内のＲＮＡ、及び、ＤＮＡを含む核酸は、生物学的に活性な形態で細胞に送達される（Ｆｒａｌｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，６：７７，１９８１）。リポソームは、当該分野で公知の任意の手段を使用して、特定の細胞型、または、組織を標的化することができる。阻害性核酸（例えば、アンチセンス核酸、モルホリノオリゴ）は、細胞透過性の送達システム（例えば、細胞透過性ペプチド）を用いて細胞に送達することができる。幾つかの実施形態では、阻害性核酸は、ウイルスベクターまたはウイルスを使用して、特定の細胞、または、組織に送達される。
【００２０】
「ｓｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡを形成する核酸を意味し、ここで、ｓｉＲＮＡが遺伝子または標的遺伝子と同じ細胞内で存在するとき（例えば、表現するとき）、二本鎖ＲＮＡは、遺伝子または標的遺伝子の発現を減少させ、または、阻害する能力を有する。ｓｉＲＮＡは、一般的には、約５〜約１００ヌクレオチド長であり、より一般的には、約１０〜約５０ヌクレオチド長であり、より一般的には、約１５〜約３０ヌクレオチド長であり、最も一般的には、約２０〜約３０ヌクレオチド長であり、または、約２０〜２５、または、約２４〜２９ヌクレオチド長であり、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８，２９、または、３０ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡ分子、及び、それらを生成する方法は、例えば、Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８〜４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４〜４９８；ＷＯ００／４４８９５；ＷＯ０１／３６６４６；ＷＯ９９／３２６１９；ＷＯ００／０１８４６；ＷＯ０１／２９０５８；ＷＯ９９／０７４０９；及び、ＷＯ００／４４９１４に記載されている。ｄｓＲＮＡ、または、ｓｉＲＮＡを（例えば、ヘアピン二重状で）転写するＤＮＡ分子は、また、ＲＮＡｉを提供する。ｄｓＲＮＡを転写するためのＤＮＡ分子は、ＵＳ６，５７３，０９９、及び、米国特許出願第２００２／０１６０３９３号、及び、米国特許出願第２００３／００２７７８３号、及び、Ｔｕｓｃｈｌ  ａｎｄ  Ｂｏｒｋｈａｒｄｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ，２：１５８（２００２）に開示されている。小さい、または、短いヘアピン状のＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）は、例えば、転写により細胞内で、そのようなＤＮＡ分子により生成される。ｓｈＲＮＡは、一般的に、天然に存在するｍｉＲＮＡに見られるヘアピンに類似したヌクレオチドの短いループにより連結された２つの相補的ＲＮＡ配列を含む。一般的に、ｓｈＲＮＡ分子は、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、または、１２ヌクレオチド長であるヘアピンを形成するヌクレオチドの短いループを有する、約２０〜３０塩基のヌクレオチド、または、約１９〜２２、または、約２０〜２５、または、約２４〜２９のヌクレオチド長、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長である。
【００２１】
ｓｉＲＮＡは、直接投与することができ、または、ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、異なる設計基準を有するＲＮＡｉを誘導するために使用できる。ベクターは、短いスペーサー配列により分離し、転写を終結するのに役立つＴの文字列で終わる２つの逆方向反復配列を挿入することができる。
【００２２】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び、「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために、本明細書において互換的に使用される。該用語は、一つ若しくはそれ以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的な化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、並びに、天然に存在するアミノ酸ポリマー、及び、非天然のアミノ酸ポリマーに適用する。
【００２３】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸、及び、合成アミノ酸、並びに、天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体、及び、アミノ酸模倣物を意味する。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによりコードされるもの、並びに、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、及び、Ｏ−ホスホセリンなど、後で改変されるアミノ酸である。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、即ち、α−炭素が、水素、カルボキシル基、アミノ基、及び、Ｒ基に結合するもの、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを意味する。このような類似体は、Ｒ基を改変するか（例えば、ノルロイシン）、または、ペプチド骨格を改変するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化学化合物を意味する。
【００２４】
アミノ酸は、本明細書では、一般に知られた３文字記号で、または、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会により推奨された１文字記号で参照されてもよい。同様に、ヌクレオチドは、一般的に受け入れられている１文字コードで参照されてもよい。
【００２５】
「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸配列、及び、核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関しては、保存的に改変された変異体は、同一、または、本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を参照し、または、核酸は、アミノ酸配列を本質的に同一配列にコードしない。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸は、任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及び、ＧＣＵは、全て、アミノ酸のアラニンをコードする。従って、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、コドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。このような核酸変異は、保存的に改変された変異の一種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書のあらゆる核酸配列は、また、核酸の全ての可能なサイレント変異について説明する。当業者は、核酸中の各コドンは（通常は、メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除いて）、機能的に同一の分子を生じるように改変できることを認識するであろう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、発現産物に関するそれぞれ記載された配列において暗示的であるが、実際のプローブ配列に関してはそうではない、
【００２６】
アミノ酸配列に関しては、単一のアミノ酸、または、コードされた配列中のアミノ酸の小割合を、変更し、加え、または、欠失する、個々の置換、欠失、または、核酸、ペプチド、ポリペプチド、または、タンパク質配列への付加は、変更が化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす「保存的に修飾された変異体」であることを、当業者は認識するであろう。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該分野で公知である。このような保存的に改変された変異体は、多型変異体、種間ホモログ、及び、対立遺伝子を、更に、排除しない。
【００２７】
以下の８群は、各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプロファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（参照、例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （１９８４））。
【００２８】
語句「ストリンジェントなハイブリッド化条件」とは、プローブが、一般的には、核酸の複雑な混合物中で、他の配列ではなく、その標的部分配列にハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、違った環境では異なるであろう。配列が長くなると、より高い温度で特異的にハイブリダイズすることになる。核酸のハイブリッド化に対する広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ”（１９９３）で、見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度、ｐＨにおける、特定配列の熱融点（Ｔｍ）より、約５〜１０℃低い程度であるように選択される。Ｔｍは、標的に対して相補的なプローブの５０％が、平衡状態（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態で占有する）で、標的配列にハイブリダイズする（規定のイオン強度、ｐＨ、及び、核酸濃度下での）温度である。ストリンジェントな条件は、また、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加により達成することができる。選択的、または、特異的ハイブリッド化のため、陽性シグナルは、少なくともバックグラウンドの２倍、好ましくは、１０倍のバックグラウンドハイブリッド化である。例示的なストリンジェントハイブリッド化条件は、以下のようにすることができる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び、１％ＳＤＳを、４２℃で培養し、または、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃で培養し、次いで、０．２×ＳＳＣ、及び、０．１％ＳＤＳで洗浄する。
【００２９】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、尚、実質的に同一である。これは、例えば、核酸の転写が、遺伝子コードにより許容される最大コドン縮重を使用して作製されたとき発生する。そのような場合、核酸は、一般的には、中程度にストリンジェントなハイブリッド化条件下でハイブリダイズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリッド化条件」は、３７℃で、４０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳの緩衝液中でのハイブリッド化、及び、４５℃で、１×ＳＳＣの洗浄が含まれる。正のハイブリッド化は、バックグラウンドの少なくとも２倍である。当業者は、代替のハイブリッド化、及び、洗浄条件は、同様のストリンジェントな条件を提供するために利用することができることを容易に認識するであろう。ハイブリッド化パラメータを決定するための更なるガイドラインは、多数の文献に、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｅｄ．  Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓに提供されている。
【００３０】
アニーリング温度は、プライマー長に応じて、３２℃〜４８℃の間で変化してもよいが、ＰＣＲのためには、約３６℃の温度は、低ストリンジェンシー増幅には、一般的である。高ストリンジェンシーアニーリング温度は、プライマー長、及び、特異性に依存して、約５０℃〜約６５℃の範囲とすることができるが、高ストリンジェンシーＰＣＲ増幅については、約６２℃の温度が一般的である。高い、及び、低いストリンジェント増幅の両方に対する一般的なサイクル条件は、９０℃〜９５℃、３０秒〜２分の変性相、３０秒〜２分間続くアニーリング相、及び、約７２℃、１〜２分の伸長相を含む。低い、及び、高いストリンジェンシー増幅反応のための、プロトコル、及び、ガイドラインは、例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  Ｎ．Ｙ．）において提供される。
【００３１】
「対照群」サンプル、または、値は、試験試料と比較するために、基準として、通常、既知の基準として機能するサンプルを指す。例えば、試験サンプルは、例えば試験剤の存在下での試験条件から取り出すことができ、公知の条件から、例えば、試験薬剤の非存在下（陰性対照群）で、または、公知の薬剤の存在下（陽性対照群）で、サンプルと比較する。対照群も、また、多くの試験または結果から集められた平均値を表すことができる。当業者であれば、対照群は、任意の数のパラメータを評価するために設計できることを認識するであろう。例えば、対照群は、薬理学的データ（例えば、半減期）、または処置手段（例えば、副作用の比較）に基づいて、処置効果を比較するために考案できる。当業者は、所定の状況下では、対照群が貴重であり、そして、値を制御するために比較に基づいてデータを分析できることを理解するであろう。対照群は、データの重要性を決定するために価値がある。例えば、所定のパラメータ値が、対照群内で幅広く変化する場合、試験サンプル中の変化は、有意であると考えられないであろう。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「癌」は、白血病、癌腫、及び、肉腫を含む、哺乳動物において見出される癌、新生物、または悪性腫瘍のすべての種類を指す。例示的な癌としては、脳癌、乳癌、子宮頚部癌、結腸癌、頭頸部癌、肝臓癌、腎臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、中皮腫、卵巣癌、肉腫、胃癌、子宮癌、及び、髄芽腫が含まれる。更なる例としては、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、癌、悪性膵臓インスリノーマ、悪性カルチノイド、膀胱癌、前悪性皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽細胞腫、食道癌、尿生殖路癌、悪性高カルシウム血症、子宮内膜癌、副腎皮質癌、内分泌、及び、外分泌膵臓腫瘍、並びに、前立腺癌が挙げられる。
【００３３】
用語「白血病」は、血液形成器官の進行性、悪性疾患を広く意味し、そして、一般的に、血液、及び、骨髄中の白血球、並びに、その前駆体の歪んだ増殖、及び、発達により特徴づけられる。白血病は、一般的に、臨床的に、（１）疾患の急性または慢性の持続時間と特徴；（２）関与する細胞のタイプ；骨髄（骨髄性）、リンパ（リンパ行性）、または単球性；及び、（３）血液白血病または非白血性病（半白血性病）での異常細胞数の増加、または、非増加に基づいて分類される。Ｐ３８８白血病モデルは、広く、生体内での抗白血病活性のあることを予測として受け入れられる。Ｐ３８８アッセイにおいて陽性のテスト化合物は、一般的に、処置される白血病のタイプに関わらず、生体内での抗白血病活性のあるレベルを示すであろうと考えられる。従って、本出願は、白血病を処置する方法、好ましくは、急性非リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、非白血性白血病、白球血症性白血病、好塩基球性白血病、芽細胞白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胚性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、ヘアリー細胞白血病、血芽球症白血病、血球芽細胞白血病、組織球性白血病、幹細胞白血病、急性単球性白血病、白血球減少症、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ行性白血病、リンパ様白血病、リンパ肉腫細胞白血病、肥満細胞白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄性白血病、骨髄顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞性白血病、多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーデル細胞白血病、シリング白血病、幹細胞白血病、亜白血病、及び、未分化細胞白血病を処置する方法を含む。
【００３４】
用語「肉腫」は、一般的に、胚性結合組織のような物質で構成されている腫瘍を指し、そして、一般的に、原線維性、または、均質性物質に埋め込まれた密に詰まった細胞で構成されている。抗悪腫瘍性のチオール結合性ミトコンドリア酸化剤、及び、抗癌剤の組み合わせで処置できる肉腫としては、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アベメシー（Ａｂｅｍｅｔｈｙ）肉腫、脂肪肉腫、脂質肉腫、胞巣状軟部肉腫、エナメル芽細胞肉腫、ブドウ状肉腫、緑色腫肉腫、絨毛癌、胎児性肉腫、ウィルムス（Ｗｉｌｍｓ）腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質肉腫、ユーイング（Ｅｗｉｎｇ）肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨大細胞肉腫、顆粒球肉腫、ホジキン（Ｈｏｄｇｋｉｎ）肉腫、突発性マルチ色素出血性肉腫、Ｂ細胞の免疫芽球性肉腫、Ｔ細胞の免疫芽球性肉腫、イェンセン（Ｊｅｎｓｅｎ）肉腫、カポジ（Ｋａｐｏｓｉ）肉腫、クッパー（Ｋｕｐｆｆｅｒ）細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉腫肉腫、傍骨性肉腫、網状赤血球肉腫、ラウス（Ｒｏｕｓ）肉腫、漿液嚢胞肉腫、滑膜肉腫、及び、毛細血管拡張性肉腫が挙げられる。
【００３５】
用語「黒色腫」は、皮膚、及び、他の器官のメラニン細胞系から生じる腫瘍を意味する。抗悪腫瘍性のチオール結合ミトコンドリア酸化剤、及び、抗癌剤の組み合わせで処置できる黒色腫としては、例えば、末端性黒子性黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン（Ｃｌｏｕｄｍａｎ）黒色腫、Ｓ９１メラノーマ、ハーディング・パッセイ（Ｈａｒｄｉｎｇ−Ｐａｓｓｅｙ）黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子性黒色腫、悪性黒色腫、結節性黒色腫、爪下黒色腫、及び、表在拡大型黒色腫が挙げられる。
【００３６】
用語「癌腫」は、周囲の組織に浸潤し、転移を生じる傾向にある上皮細胞からなる悪性の新成長物を指す。抗腫瘍性チオール結合性ミトコンドリア酸化剤、及び、抗癌剤の組み合わせで処置できる例示的な癌腫としては、例えば、腺房癌、小葉癌、腺嚢癌腫、腺様嚢胞癌、腺腫様癌腫、副腎皮質の癌、肺胞腺癌、肺胞細胞癌、基底細胞癌(ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ)、基底細胞癌腫(ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂａｓｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ)、類基底細胞癌(ｂａｓａｌｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ)、基底有棘細胞癌、気管支肺胞上皮癌、細気管支癌、気管支原性癌、脳状癌、胆管細胞癌、絨毛癌、コロイド癌、面皰癌、子宮体部癌、篩状癌、鎧状癌、皮膚癌、円筒形状癌、円筒状細胞癌、管癌、デュラム癌、胎生期癌、脳様癌、類表皮癌、上皮アデノイド癌、外部寄生癌、潰瘍癌、線維性癌、ゲル化形成癌、ゼラチン状癌、巨大細胞癌（ｇｉａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｇｉｇａｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、腺癌（ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、顆粒膜細胞癌、ヘアマトリックス癌、血液様癌、肝細胞癌、ヒュルトレ細胞癌（Ｈｕｒｔｈｌｅ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ガラス状癌、副腎腫、乳児胎生期癌、上皮内癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）、表皮内癌（ｉｎｔｒａｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、上皮内癌腫（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クロンペクラー癌（Ｋｒｏｍｐｅｃｈｅｒ’ｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クルチズキー細胞癌（Ｋｕｌｃｈｉｔｚｋｙ−ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、大細胞癌、レンズ状癌（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、レンズ状癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪癌腫、リンパ腺癌、脊髄癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄様癌（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色腫、軟性癌、粘液癌（ｍｕｃｉｎｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘膜癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｉｐａｒｕｍ）、粘性細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、粘膜表皮癌（ｍｕｃｏｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘液癌（ｍｕｃｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液腫症（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｙｘｏｍａｔｏｄｅｓ）、上咽頭癌（ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、燕麦細胞癌、骨化癌、類骨癌、乳頭癌、門脈周囲癌、前浸潤癌、有棘細胞癌、粥状癌、腎臓の腎細胞癌、予備細胞癌、肉腫様癌、シュナイダー癌、スキルス癌、陰嚢癌、印環細胞癌（ｓｉｇｎｅｔ−ｒｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、シンプレックス癌、小細胞癌、ナス状癌、球状細胞癌、紡錘細胞癌、海綿癌、扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌、糸状癌、毛細血管拡張癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｔｉｃｕｍ）、毛細血管拡張症様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔｏｄｅｓ）、移行上皮癌、結節性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、結節腫（ｔｕｂｅｒｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、いぼ状癌、及び、長軟毛状癌が挙げられる。
【００３７】
ｓｈＩＤＯ−ＳＴは、具体的に、インドールアミン−ピロール−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）を発現停止させて毒性を減少するために、小分子ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡを発現するサルモネラチフィムリウム（ＳＴ）細胞である。具体的には、ｓｈＩＤＯ−ＳＴは、配列番号：８を含むＩＤＯを標的とする低分子ヘアピン型ＲＮＡを発現するＹＳ１６４６（ＡＴＣＣ受託番号２０２１６５、また、ＶＮＰ２０００９と参照される）として知られている弱毒化サルモネラチフィムリウム株から構成されている。この細胞をベースとする処置は、例えば、ＷＯ２０１２／１４９３６４に記載され、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。下記の実施例で記載する通り、組織内の豊富なヒアルロナンを枯渇させ、血管透過性を増加させる、ペグ化組換えヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０（ＰＥＧＰＨ２０（商標）、Ｈａｌｏｚｙｍｅ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、及び、幾つかのケースでは、効果的な制御をもたらすｓｈＩＤＯ−ＳＴの組み合わせは、原発性、及び、同所性モデルで確立された膵臓腫瘍排除を完結する。更に、ＰＥＧＰＨ２０（商標）との組み合わせで、対照群の小分子ヘアピンＲＮＡを含むＳＴは、また、腫瘍が小さいサイズのものであったときに、腫瘍の増殖を制御することができるということが観察された。組換えヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０、及び、ＰＨ２０のペグ化形態が公知であり、例えば、Ｂｏｏｋｂｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  １１４：２３０−２４１  （２００６）  、及び、  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．９：３０５２−３０６４  （２０１０）に記載されている。それは、その全体を参照することにより、本明細書に取り入れたものとする。
【００３８】
従って、細菌細胞、及び、腫瘍浸透剤を含む組成物が提供される。場合により、組成物は、更に、抗癌剤を含む。抗癌剤は、小分子、核酸、ポリペプチド、及び、抗体からなる群から選択することができる。腫瘍浸透剤の例としては、ヒアルロニダーゼポリペプチド、ピルフェニドン、サリデジブ（ＩＰＩ−９２６）、ナノ粒子、アルブミンナノ粒子、デキストラン、リポソーム、及び、細胞透過性ペプチドが挙げられるが、それに限定されない。特定の実施形態では、腫浸透瘍剤は、ヒアルロニダーゼポリペプチドである。場合により、細菌細胞、及び、ヒアルロニダーゼポリペプチドは、有効量、例えば、相乗的に有効量で存在する。場合により、細菌細胞は、サルモネラ細菌細胞である。従って、サルモネラ細菌細胞、及び、ヒアルロニダーゼポリペプチドを含む組成物が提供される。
【００３９】
ヒアルロニダーゼは、一般的に３つの異なるクラスに分類される中性、及び、酸活性酵素である、哺乳類型ヒアルロニダーゼ、細菌ヒアルロニダーゼ、及び、ヒル、その他の寄生虫甲殻類からのヒアルロニダーゼのグループである。哺乳類型ヒアルロニダーゼは、加水分解性、及び、トランスグリコシダーゼ活性の両方を有する、ｅｎｄｏ−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼであり、更に、２つのグループ、中性活性、及び、酸性活性酵素に分けることができる。ヒトゲノム中の６つのヒアルロニダーゼ様遺伝子、ＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２、ＨＹＡＬ３、ＨＹＡＬ４、ＨＹＡＬＰ１、及び、ＰＨ２０／ＳＰＡＭ１があり、それらは、ヒアルロナン、及び、コンドロイチン硫酸塩（ＣＳ）、特にＣ４−Ｓ、及び、Ｃ６−Ｓを分解することができる。ヒアルロナンは、多くの細胞の細胞外マトリックス中に存在し、腫瘍形成を含む細胞の移動性に関連する生物学的現象において重要な役割を果たす。提供される方法、及び、組成物に使用するのに適したヒアルロニダーゼポリペプチドは、哺乳類ヒアルロニダーゼ、例えば、ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼを含む。場合により、ヒアルロニダーゼポリペプチドは、配列番号：１、または、配列番号：２、若しくは、そのフラグメントを含む。全体を通して使用する場合、用語「ヒアルロニダーゼポリペプチド」は、ドメイン、フラグメント、及び、その変異体を含む。従って、本明細書に記載の通り、フラグメントは、触媒活性を残留し、例えば、ポリペプチドは、ヒアルロン、及び／または、コンドロイチン硫酸塩を分解する能力を保持する限り、ヒアルロニダーゼポリペプチドは、配列番号：１、または、配列番号：２のフラグメントを含むことができる。更に、ヒアルロニダーゼポリペプチドは、ヒアルロニダーゼポリペプチドが、触媒活性を残留する限り、再度、１つ若しくはそれ以上のアミノ酸置換を有する配列番号：１、または、配列番号：２、若しくは、配列番号：１、または、配列番号：２のフラグメントを含むことができる。場合により、アミノ酸置換は、上記でより詳細に記載されるように、保存的アミノ酸置換である。一例として、ヒアルロニダーゼポリペプチドは、配列番号：１のフラグメント、例えば、配列番号：１のアミノ酸３５〜４６４、または、配列番号：１に記載のアミノ酸配列全体を含むことができる。ヒアルロニダーゼの例示的な核酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３１１７、及び、ＮＭ＿１５３１８９．２で見出すことができ、そして、ヒアルロニダーゼの例示的なポリペプチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、ＮＰ＿００３１０８、及び、ＮＰ＿６９４８５９で見出すことができる。組成物、キット、及び、方法で提供される使用に適したヒアルロニダーゼポリペプチドは、ＵＳ７，７６７，４２９；ＵＳ７，８２９，０８１；ＵＳ７，８４６，４３１；ＵＳ７，８７１，６０７；ＵＳ８，１０５，５８６；ＵＳ８，２０２，５１７；ＵＳ８，２５７，６９９；ＵＳ８，４３１，３８０；及び、ＵＳ８，４５０，４７０に記載されているが、それら各々はその全体を参照することにより本明細書に取り入れたものとする。場合により、ヒアルロニダーゼポリペプチドは、化学的に修飾さ���たヒアルロニダーゼポリペプチドであり、即ち、ポリペプチドは、１つ若しくはそれ以上のグリコシル化、及び／または、ペグ化部分を含むように改変される。場合により、ヒアルロニダーゼポリペプチドはペグ化される。必要に応じて、ヒアルロニダーゼポリペプチドは、以下の実施例で使用されるＰＥＧＰＨ２０（商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）である。ＰＥＧＰＨ２０（商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）は、ペグ化により改変される組換えヒトヒアルロニダーゼＰＨ−２０（配列番号：１）である。従って、ＰＥＧＰＨ２０（商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ社、ＳａｎＤｉｅｇｏ、  ＣＡ）は、ペグ化された組換えヒトヒアルロニダーゼＰＨ−２０である。
【００４０】
本明細書で使用される通り、用語、ペプチド、ポリペプチド、または、タンパク質は、ペプチド結合によって連結された２つ若しくはそれ以上のアミノ酸を意味するために広く使用されている。タンパク質、ペプチド、及び、ポリペプチドは、また、アミノ酸配列を指すために互換的に使用される。ポリペプチドという用語は、特定のサイズ、または、分子を含むアミノ酸の数を示唆するために本明細書中では使用されていないこと、及び、本発明のペプチドは、幾つかのアミノ酸残基、または、それ以上までを含むことができることを認識すべきである。そのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列、変異体、及び、その断片をコードし得る核酸も、また、開示されることが理解される。これは、特定のポリペプチド配列に関連する全ての縮重配列、即ち、一つの特定のポリペプチド配列をコードする配列を有する全ての核酸、並びに、ポリペプチド配列の開示された変異体、及び、誘導体をコードする縮重核酸を含む全ての核酸を含むであろう。従って、各特定の核酸配列は、本明細書に書き出されないかもしれないが、それぞれの、及び、すべての配列は、実際には、開示されたポリペプチド配列を通じて本明細書に開示され、及び、記載されていることを理解するであろう。
【００４１】
その断片を含む、全てのペプチド、ポリペプチド、及び、タンパク質と同様に、ペプチド、ポリペプチド、若しくは、タンパク質の性質、または、機能を変更しないポリペプチドである提供された薬剤のアミノ酸配列の更なる改変は、起こり得ることを理解すべきであろう。従って、ヒアルロニダーゼポリペプチドが、触媒活性を残存し、例えば、ポリペプチドは、ヒアルロン、及び／または、コンドロイチン硫酸塩を分解する能力を保持する限り、ヒアルロニダーゼポリペプチドの改変が可能である。このような改変は、例えば、保存的アミノ酸置換を含む。従って、ポリペプチドまたは核酸を含む提供された薬剤は、更に、望ましい機能が保持される限り、改変し、変更できる。本明細書の開示された核酸配列、及び、タンパク質の、発生する可能性のある公知の改変、及び、誘導体を定義する一つの方法は、特定の既知の配列との同一性の観点で、改変、及び、誘導体の定義を介して行われるということが理解される。本明細書において提供されるポリペプチドに対して、少なくとも、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の同一性を有するポリペプチドが具体的に開示される。当業者は、上記でより詳細に議論した通り、２つのポリペプチドの同一性を決定する方法を理解するであろう。
【００４２】
提供される組成物、キット、及び、方法において有用な細菌細胞は、サルモネラ細菌細胞、ビフィズス菌細菌細胞、リステリア菌細菌細胞、クロストリジウムヒストリチクス細菌細胞、クロストリジウムノビイ細菌細胞、ビブリオコレラ菌細菌細胞、シゲラ菌細菌細胞、ストレプトコッカス細菌細胞、マイコバクテリウムボビス細菌細胞、腸炎エルシニア細菌細胞、炭疽菌細菌細胞、ラクトバチルス属細菌細胞、ブドウ球菌細菌細胞は、大腸菌細菌細胞を含むがそれに限定されない。場合により、ストレプトコッカス細菌細胞は、ストレプトコッカスピロゲネス細菌細胞、または、ストレプトコッカスゴルドニ細菌細胞である。適切な細菌細胞は、ＷＯ２０１２／１４９３６４に記載された細菌細胞を含み、それを全て参照することにより、本明細書に取り入れたものとする。場合により、サルモネラ細菌細胞は、サルモネラチフィムリウム、サルモネラエンテリチジス、または、サルモネラチフィーを含むが、それに限定されない弱毒化サルモネラ株、例えば、任意の血清型、または、サルモネラエンテリカである。場合により、サルモネラ細菌細胞は、サルモネラチフス菌の弱毒株である。弱毒サルモネラチフス菌株としては、ＹＳ１６４６、ＲＥ８８、ＬＨ４３０、ＳＬ７２０７、χ８４２９、χ８４３１、若しくは、χ８４６８を含むが、これらに限定されない。場合により、弱毒サルモネラチフィムリウム株は、ＹＳ１６４６サルモネラチフィムリウム株（ＡＴＣＣアクセッション番号２０２１６５、また、ＶＮＰ２０００９とも呼ばれている）であり、それは、以下の実施例で使用され、ｓｈＩＤＯ−ＳＴを生成するために使用される株である。
【００４３】
場合により、本明細書で提供される細菌細胞は、疾患または障害の処置のために適した１つ若しくはそれ以上の分子を含む。場合により、疾患、または、障害は、癌である。従って、細菌細胞は、抗体、または、その機能的フラグメント、小分子、アプタマー、核酸、及び、ＲＮＡ干渉分子（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡの））を含むが、それに限定されない、１つ若しくはそれ以上の標的遺伝子の発現、または、標的タンパク質活性を、遮断し、阻害し、または、抑制することが可能な薬剤を含有することができる。場合により、細菌細胞は、機能性核酸、例えば、アンチセンス核酸を含む。
【００４４】
機能的核酸は、標的分子に結合するか、特定の反応を触媒するなど、特定の機能を有する核酸分子である。機能的核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、または、炭水化物鎖などの任意の巨大分子と相互作用することができる。従って、機能的核酸は、直接、標的分子と相互作用することができる。しばしば、機能的核酸は、標的分子、及び、機能的核酸分子との間の配列相同性に基づいて他の核酸と相互作用するように設計される。
【００４５】
アンチセンス核酸、または、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、正規の、または、非正規のいずれかの塩基対形成を介して標的核酸分子と相互作用するように設計される。アンチセンス分子、及び、標的分子との相互作用は、例えば、ＲＮＡｓｅＨを媒介するＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分解を通して標的分子の破壊を促進するように設計される。あるいは、アンチセンス分子は、通常、転写、または、複製などの標的分子上で起こるプロセシング機能を中断するように設計される。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計することができる。標的分子の最も接近可能な領域を見つけることにより、アンチセンス効率の最適化のための多数の方法が存在する。参照、例えば、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＲＮＡ  １３：７２３−７３０  （２００７）、及び、ＷＯ２００７／０９５３８７、及び、ＷＯ２００８／０３６８２５；Ｙｕｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  １０（７）：４７８−９２  （２００９）、及び、Ｌｅｎｎｏｘ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１８（１２）：１１１１−２０  （２０１１）、それらは、その全体を参照することにより、本明細書に取り入れたものとする。場合により、アンチセンス核酸は、タイトなヘアピン回転を作るＲＮＡの配列である短いヘアピンＲＮＡである。場合により、アンチセンス核酸は、ｓｉＲＮＡ、または、ｍｉＲＮＡである。アンチセンス核酸は、標準的な核酸合成技術を使用して設計し、作ることができ、または、民間会社から、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から、または、Ｒｅｇｕｌｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から得ることができる。
【００４６】
場合により、アンチセンス核酸の主鎖は、生体外、及び、生体内安定性を改善するために、並びに、アンチセンス分子のインビボ送達を改善するために様々な化学改変により改変される。アンチセンス分子の改変は、２’−Ｏ−メチル改変；末端のホスホロチオエート、及び、３’−末端のコレステロール基を有する２’−Ｏ−メチル改変リボース糖；２’−Ｏ−メトキシ（２’−ＭＯＥ）改変；２’−フルオロ改変；及び、２’，４’−メチレン改変（「ロック核酸」、または、ＬＮＡと呼ばれている）を含むが、それに限定されない。従って、阻害核酸は、例えば、改変オリゴヌクレオチド（２’−Ｏ−メチル化、または、２’−Ｏ−メトキシエチル）；ロック核酸（ＬＮＡ；参照、例えば、Ｖａｌｏｃｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２（２２）：ｅｌ７５  （２００４））；モルホリノオリゴヌクレオチド（参照、例えば、Ｋｌｏｏｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ５（８）：ｅ２０３（２００７））；ペプチド核酸（ＰＮＡ）；ＰＮＡ−ペプチド共役体；及び、ＬＮＡ／２’−Ｏ−メチル化オリゴヌクレオチド混合物を含む（参照、例えば、Ｆａｂｉａｎｉ  ａｎｄ  Ｇａｉｔ，ＲＮＡ  １４：３３６〜４６（２００８））。
【００４７】
場合により、アンチセンス核酸は、代謝酵素、免疫抑制の標的または癌標的を標的とする。場合により、アンチセンス核酸は、免疫標的を標的とし、免疫抑制標的は、ＳＴＡＴ３、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、アルギナーゼ１、ｉＮＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ｐＧＥ２、または、ＶＥＧＦである。場合により、免疫抑制標的は、ＩＤＯ１である。
【００４８】
免疫抑制の標的遺伝子、または、タンパク質の抑制、阻害、若しくは、封鎖は、最終的に、直接的、または、間接的なメカニズムを介して、腫瘍の微小環境内での腫瘍から誘導される免疫抑制の破壊をもたらす。従って、薬剤は、ＳＴＡＴ３、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、アルギナーゼ１（Ａｒｇ１）、ｉＮＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ−１０、ＶＥＧＦ、ｐＥＧＦ２またはＴＧＦ−βを標的とするアンチセンス核酸であってもよい。そのアミノ酸配列、及び、核酸配列を含むこれらの標的は公知であり、本明細書に記載されている。これらの標的の核酸配列は、公知の方法を用いて、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及び、ショートヘアピンＲＮＡを含む阻害核酸分子を生成するために使用できる。一例として、細菌細胞は、配列番号：３〜３１の次のアンチセンス核酸のいずれか１つ若しくはそれ以上を含むことができる。従って、アンチセンス核酸は、ＳＴＡＴ３を標的とすることができ、ｓｈＳＴＡＴ３＃５８：ＡＧＴＴＣＣＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＧＡＴＴＧＡＧＡＧＴＣＡＡ（配列番号：３）；ｓｈＳＴＡＴ３＃５９：ＡＣＴＧＧＡＴＡＡＣＴＴＣＡＴＴＡＧＣＡＧＡＡＴＣＴＣＡＡ（配列番号：４）；ｓｈＳＴＡＴ３＃６０：ＣＡＴＣＡＡＴＣＣＴＧＴＧＧＴＡＴＡＡＣＡＴＧＣＴＧＡＣＣ（配列番号：５）；または、ｓｈＳＴＡＴ３＃６１：ＡＣＣＴＧＡＡＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＡＣＡ（配列番号：６）を含む、短いヘアピンＲＮＡであり得る。アンチセンス核酸は、ＩＤＯ１を標的とすることができ、ｓｈＩＤＯ１−８：ＣＣＴＣＧＣＡＡＴＡＧＴＡＧＡＴＡＣＴ（配列番号：７）；ｓｈＩＤＯ１−９：ＣＧＴＣＴＣＴＣＴＡＴＴＧＧＴＧＧＡＡ（配列番号：８）；ｓｈＩＤＯ１−１０：ＧＣＡＡＡＧＡＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＡ（配列番号：９）；ｓｈＩＤＯ１−１１：ＧＣＣＣＡＴＧＡＣＡＴＡＣＧＡＧＡＡＣ（配列番号：１０）、または、ｓｈＩＤＯ１−１２：ＣＣＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＴＴＴＧＴＣＡ（配列番号：１１）を含む短いヘアピンＲＮＡであり得る。アンチセンス核酸は、Ａｒｇ１を標的とすることができ、ｓｈＡｒｇ１−５：ＧＣＡＧＴＴＣＣＴＴＴＣＴＧＧＴＡＴＧ（配列番号：１２）；ｓｈＡｒｇ１−６：ＧＣＣＴＴＴＧＴＴＧＡＴＧＴＣＣＣＴ（配列番号：１３）；ｓｈＡｒｇ１−７：ＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＡＣＴＡＣＣＴＴＡ（配列番号：１４）；ｓｈＡｒｇ１−８：ＧＣＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣＧＴＧＴＡＣＡ（配列番号：１５）；または、ｓｈＡｒｇ１−９：ＴＣＴＣＴＡＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＧＡ（配列番号：１６）を含む、短いヘアピンＲＮＡであり得る。アンチセンス核酸は、ｉＮＯＳを標的とすることができ、ｓｈｉＮＯＳ−４３：ＧＴＡＴＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＧＡＣＴＡ（配列番号：１７）；ｓｈｉＮＯＳ−４４：ＣＣＡＧＴＡＴＴＡＴＧＧＣＴＣＣＴＴＴＡＡ（配列番号：１８）；ｓｈｉＮＯＳ−４５：ＧＣＣＡＣＡＧＣＡＡＴＡＴＡＧＧＣＴＣＡＴ（配列番号：１９）；ｓｈｉＮＯＳ−４６：ＣＣＴＡＴＣＴＣＣＡＴＴＣＴＡＣＴＡＣＴＡ（配列番号：２０）；または、ｓｈｉＮＯＳ−４７：ＧＣＴＧＴＡＡＣＡＡＡＧＧＡＡＡＴＡＧＡＡ（配列番号：２１）を含む、短いヘアピンＲＮＡであり得る。アンチセンス核酸は、ＩＤＯ２を標的とするこ���ができ、ＣＧＣＡＧＴＴＡＴＧＡＧＣＴＴＴＣＴＴＡＡ（配列番号：２２）；ＣＣＧＣＡＧＴＴＡＴＧＡＧＣＴＴＴＣＴＴＡ（配列番号：２３）；ＣＣＴＧＧＧＡＴＡＡＡＧＧＣＴＣＴＴＧＴＴ（配列番号：２４）；ＧＡＡＡＧＣＴＡＴＣＡＣＡＴＡＴＣＴＧＡＡ（配列番号：２５）；ＣＴＴＴＧＧＡＡＡＧＣＴＡＴＣＡＣＡＴＡＴ（配列番号：２６）；ＣＣＡＴＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＡＡＧＣＴＡＴ（配列番号：２７）；ＣＴＴＣＴＴＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡ（配列番号：２８）；ＧＣＴＴＣＡＡＧＣＴＣＡＴＧＴＧＧＡＣＡＡ（配列番号：２９）；ＣＡＡＧＧＡＡＴＣＴＴＧＣＣＣＴＴＣＣＡＴ（配列番号：３０）；ＧＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＡ（配列番号：３１）を含む短いヘアピンＲＮＡであり得る。上述したように、アンチセンス分子は、容易に設計でき、公知の方法を用いて、既知の標的核酸配列を用いて、民間会社から、例えば、Ｒｅｇｕｌｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手できる。
【００４９】
標的遺伝子発現、または、標的タンパク質の活性を、遮断し、阻害し、または、抑制することができる薬剤、例えば、アンチセンス核酸は、細菌細胞における発現ベクターまたはカセットから発現させることができる。適切な発現ベクター、例えば、プラスミド、及び、その使用方法は、知られている。
【００５０】
本明細書に提供される薬剤を含む組成物が、本明細書に提供される。提供される薬剤は、単一の薬剤、例えば、細菌細胞、または、１つより多くの薬剤、例えば、細菌細胞、及び、腫瘍浸透剤を含むことができる。提供される組成物は、場合により、生体外、または、生体内での処方、及び、投与に適している。場合により、組成物は、一つまたはそれ以上の提供される薬剤、及び、薬学的に許容される担体を含む。適切な担体、及び、その製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｄａｖｉｄ  Ｂ．Ｔｒｏｙ，ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）に記載されている。薬学的に許容される担体は、生物学的でなく、または、そうでなければ、望ましくない物質を意味する、即ち、物質は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、または、それが含まれる医薬組成物の他の成分と有害な様式で相互作用することなく、被験者に投与される。被験者に投与される場合、担体は、場合により、活性成分の分解を最小にし、被験者における有害な副作用を最小にするように選択される。
【００５１】
用語「薬学的に許容される塩」、または、「薬学的に許容される担体」は、本明細書に記載される薬剤に見られる特定の置換基に依存して、相対的に無毒の酸、または、塩基を用いて調製される活性剤の塩を含むことを意味する。本発明の薬剤が、相対的に酸性の官能基を含む場合、塩基付加塩は、原液のままで、または、適切な不活性溶媒中のいずれかで、十分な量の所望の塩基を有する薬剤の中性形体と接触させることにより入手できる。薬学的に許容される塩基付加塩の例としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、若しくは、マグネシウム塩、または、類似の塩が挙げられる。本出願の薬剤が相対的に塩基性の官能基を含有する場合、酸付加塩は、原液のままで、または、適切な不活性溶媒中のいずれかで、十分な量の所望の酸とそのような薬剤の中性形体を接触させることにより入手することができる。薬学的に許容される酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、炭酸一水素、リン酸、リン酸一水素、リン酸二水素、硫酸、硫酸一水素、ヨウ化水素酸、または、亜リン酸などの無機酸から誘導される塩；並びに、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などの相対的に非毒性の有機酸から誘導される塩が挙げられる。また、アルギン酸などのアミノ酸の塩、及び、グルクロン酸、または、ガラクツロン酸などの有機酸の塩も含まれる（参照、例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６６：１−１９  （１９７７））。当業者に公知の他の薬学的に許容される担体は、本出願の組成物に適している。
【００５２】
薬剤は、静脈内投与、例えば、ボーラスとして、または、一定期間にわたる連続注入により、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、髄腔内、腔内、経皮、経口、局所、腫瘍内、非経口、または、吸入経路などの公知の方法に基づき投与される。従って、組成物は、局所、または、全身処置が望ましいかどうか、及び、処置すべき領域に応じて多くの方法で投与される。
【００５３】
投与のための組成物は、一般的に、本明細書で記載の、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体に溶解される物質を含むであろう。種々の水性担体としては、例えば、緩衝食塩水などを用いることができる。これらの溶液は無菌であり、一般的に、望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌され得る。組成物は、ｐＨ調整剤、及び、緩衝剤、毒性調節剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど、適切な生理学的条件に対して、必要に応じて、薬学的に許容される補助物質を含有していてもよい。これらの製剤における活性剤の濃度は、広く変化してもよく、選択された特定の投与様式、及び、被験者の必要性に合致して、流体の体積、粘度、体重などに基づいて、主として、選択される。
【００５４】
遊離塩基、または、薬理学的に許容される塩としての活性剤の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤を好適に混合した水中で調製することができる。分散液は、また、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及び、その混合物中、並びに、油中で調製することができる。通常の保存、及び、使用条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために防腐剤を含有することができる。
【００５５】
経口製剤は、例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの医薬品グレードなどの賦形剤を含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤、または、粉末の形態を取る。幾つかの実施形態では、経口医薬組成物は、不活性希釈剤、または、吸収できる食用担体を含み；または、それらは、ハードまたはソフトシェルゼラチンカプセルに封入することができ；または、それらは錠剤に圧縮することができ；または、それらは、食事の食品に、直接、組み込まれてもよい。経口処置投与のために、活性薬剤は、賦形剤と共に組み入れ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハーなどの形態で使用される。そのような組成物、及び、製剤は、活性剤の少なくとも０．１％を含有すべきである。組成物、及び、調製物の百分率は、もちろん、変動してもよく、都合良くは、重量単位で、約２％〜約７５％、または、好ましくは、約２５％〜約６０％の間であり得る。そのような組成物中の活性剤の量は、適切な投薬量が得られるようなものである。
【００５６】
水溶液での非経口投与のためには、例えば、溶液は、適切に緩衝されるべきであり、そして液体希釈剤は、最初に十分な生理食塩水、または、グルコースで等張液とすべきである。水溶液は、特に、無菌の水性媒体中で、静脈内、筋肉内、皮下、及び、腹腔内投与に特に適している。例えば、一服用量は、等張ＮａＣｌ溶液１ｍｌ中に溶解することができ、いずれかは、注入の提案された部位に皮下液１０００ｍｌに加え、または、注入する。
【００５７】
滅菌注射溶液は、濾過滅菌に続いて、適切な溶媒中に必要量の活性薬剤、または、構築物を組み込むことによって調製できる。一般に、分散液は、基本的な分散媒体を含む滅菌ビヒクル内に様々な滅菌活性成分を組み込むことにより調製される。活性成分、及び、任意の更なる所望成分の粉末を生成する真空乾燥、及び、凍結乾燥技術は、滅菌注射用溶液を再構成するために滅菌粉末を調製することができる。より多くの、または、高度に濃縮した、直接注射用の溶液の調製も、また、意図される。ＤＭＳＯは、小さな領域に高濃度の活性剤を送達する、極めて迅速な浸透のための溶媒として使用することができる。
【００５８】
薬剤の製剤は、アンプル、及び、バイアルなどの、単位用量、または、複数回用量のシール容器で提供することができる。従って、組成物は、単位投薬形態であり得る。そのような形態において、調製物は、適切な量の活性成分を含有する単位用量に細分される。従って、組成物は、投与方法に応じて様々な単位剤形で投与することができる。例えば、経口投与に適した単位剤形としては、粉末、錠剤、ピル、カプセル、及び、トローチが挙げられるが、それに限定されない。
【００５９】
組成物、及び、本明細書に記載された薬剤は、予防的、及び、治療的処置の両方に有用である。予防的使用のために、本明細書に記載の薬剤の治療的有効量は、早期発症の前、または、その間に、被験者に投与される（例えば、癌の早期の徴候、及び、症状に応じて）。治療的処置は、疾患の診断、または、発症後に、本明細書に記載の薬剤の治療有効量を被験者に投与することを含む。
【００６０】
被験者に有効量、例えば、細菌細胞、及び、腫瘍浸透剤の組み合わせ有効量を投与することを含む被験者の癌を処置する方法が、本明細書に提供され、ここに、投与は、被験者の癌を処置する。場合により、有効量、または、組み合わせ有効量は、相乗効果を生じる量、または、相乗効果を生じる組み合わせ有効量である。また、被験者に細菌細胞、及び、腫瘍浸透剤の有効量を投与することを含む、被験者に免疫系を刺激する方法が提供されるが、ここで、細菌細胞、及び、腫瘍浸透剤の投与は、被験者の免疫系を刺激する。場合により、免疫応答は、抗癌免疫応答である。場合により、提供される方法は、更に、被験者に抗癌剤を投与することを含む。場合により、抗癌剤は、細菌細胞、及び、腫瘍浸透剤の投与後に投与される。
【００６１】
細菌細胞、腫瘍浸透剤、及び、抗癌剤と腫瘍細胞を接触させることを含む腫瘍細胞への抗癌剤の送達を強化する方法が、更に、提供され、ここに、細菌細胞、及び、細胞浸透剤の投与は、抗癌剤の送達を強化する。
【００６２】
抗癌剤は、小分子、核酸、ポリペプチド、及び、抗体からなる群から選択することができる。抗癌剤は、当業者に公知である。参照、例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｒｕｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  １２ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，（２００７）、または、Ｃｈｕ  及び  ＤｅＶｉｔａによるＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｄｒｕｇ  Ｍａｎｕａｌ  ２０１３，Ｊｏｎｅｓ  ＆  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，ＬＬＣ，（２０１３）。場合により、抗癌剤は、化学療法剤である。化学療法剤は、腫瘍の増殖を阻害し得る薬剤である。そのような薬剤としては、５−フルオロウラシル；ゲムシタビン；マイトマイシンＣ；メトトレキサート；ヒドロキシ尿素；シクロホスファミド；ダカルバジン；ミトキサントロン；アントラサイクリン（エピルビシン及びドキソルビシン）；ヘルセプチンなどの受容体に対する抗体；エトポシド；プレグナソン；タモキシフェン、及び、抗エストロゲンなどのホルモン療法；インターフェロン；アロマターゼ阻害剤；プロゲステロン剤；及び、ＬＨＲＨ類似体が挙げられるが、それに限定されない。
【００６３】
場合により、提供される方法において、腫瘍浸透剤は、細菌細胞の前に投与される。方法は、抗癌剤の投与を含む場合、抗癌剤は、細菌細胞、及び／または、腫瘍浸透剤の投与後に投与することができる。従って、薬剤または組成物の組み合わせは、併用して（例えば、混合物として）、別々に、しかし、同時に、（例えば、別々の静脈ラインを介して）のいずれかの方式で、または、逐次的に投与することができる（例えば、一つの薬剤が、初めに投与され、続いて、第二の薬剤が投与される）。従って、用語、「組み合わせ」は、２つ若しくはそれ以上の薬剤、または、組成物の、併用、同時、若しくは、逐次投与を指すために使用される。
【００６４】
提供される方法では、細菌細胞、及び、ヒアルロニダーゼポリペプチドは、場合により、効果的な量、例えば、相乗効果を出す有効量で存在する。場合により、細菌細胞はサルモネラ細菌細胞である。場合により、腫瘍に浸透させる薬剤は、ヒアルロニダーゼポリペプチドである。場合により、ヒアルロニダーゼポリペプチドは、配列番号：１、または、配列番号：２、若しくは、そのフラグメントを含む。提供される組成物、キット、及び、方法で使用するのに適したヒアルロニダーゼポリペプチドは、ＵＳ７，７６７，４２９；ＵＳ７，８２９，０８１；ＵＳ７，８４６，４３１；ＵＳ７，８７１，６０７；ＵＳ８，１０５，５８６；ＵＳ８，２０２，５１７；ＵＳ８，２５７，６９９；ＵＳ８，４３１，３８０；及び；ＵＳ８，４５０，４７０に記載されており、それら各々は、全体を参照することにより、本明細書に取り入れたものとする。場合により、ヒアルロニダーゼポリペプチドは、改変されたヒアルロニダーゼポリペプチドですある。場合により、ヒアルロニダーゼポリペプチドはペグ化される。必要に応じて、ヒアルロニダーゼポリペプチドは、ＰＥＧＰＨ２０（商標）である（Ｈａｌｏｚｙｍｅ社，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。
【００６５】
場合により、腫瘍浸透剤は、ピルフェニドン（Ｋｏｚｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７３（７）：２３４５−５６  （２０１３））；ＩＰＩ−９２９（Ｏｌｉｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４（５９３３）：１４５７−６１（２００９））；ナノ粒子；アルブミンナノ粒子；デキストラン；リポソーム；及び、細胞透過性ペプチドからなる群から選択される。
【００６６】
提供される方法において有用な細菌細胞としては、サルモネラ細菌細胞、ビフィドバクテリア細菌細胞、リステリアモノサイトゲニス細菌細胞、クロストリジウムヒストリチクス細菌細胞、クロストリジウムノビイ細菌細胞、ビブリオコレラ細菌細胞、シゲラ細菌細胞、ストレプトコッカス細菌細胞、マイコバクテリウムボビス細菌細胞、腸炎エルシニア細菌細胞、炭疽菌細菌細胞、ラクトバチルス細菌細胞、ブドウ球菌細菌細胞、大腸菌細菌細胞が挙げられるが、それに限定されない。場合により、スレプトコッカス細菌細胞は、スレプトコッカスピロゲネス細菌細胞、または、スレプトコッカスゴルドニ細菌細胞である。適切な細菌細胞は、ＷＯ２０１２／１４９３６４に記載の細菌細胞が挙げられ、その全体を参照することにより、本明細書に取り入れたものとする。場合により、サルモネラ細菌細胞は、弱毒サルモネラ株である。場合により、サルモネラ細菌細胞は、サルモネラコレラスイス細菌細胞である。場合により、サルモネラ細菌細胞は、サルモネラチフィリウムの弱毒株である。弱毒性サルモネラチフィリウム株は、ＹＳ１６４６、ＲＥ８８、ＬＨ４３０、ＳＬ７２０７、χ８４２９、χ８４３１、または、χ８４６８を含むが、それに限定されない。場合により、弱毒性サルモネラチフィリウム株は、ＹＳ１６４６サルモネラチフィリウム株である（ＡＴＣＣアクセッション番号：２０２１６５、また、本明細書では、ＶＮＰ２０００９と参照される）。場合により、トキソプラズマゴンジ細胞が提供される組成物、キット、及び、方法で使用することができる。
【００６７】
場合により、本明細書で提供される細菌細胞は、疾患、または、障害の処置のために適した１つ若しくはそれ以上の分子を含む。従って、細菌細胞は、標的遺伝子発現、または、標的タンパク質の活性を遮断し、阻害し、または、抑制することが可能な、抗体、または、その機能的フラグメント、小分子、アプタマー、核酸、及び、ＲＮＡ干渉分子（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））を含むが、それに限定されない、１つ若しくはそれ以上の薬剤を含むことができる。場合により、細菌細胞は、機能性核酸、例えば、アンチセンス核酸を含む。場合により、アンチセンス核酸は、代謝酵素、免疫抑制の標的、または、癌標的を標的とする。場合により、アンチセンス核酸は、免疫抑制標的を標的とする。免疫抑制標的は、ＳＴＡＴ３、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、アルギナーゼ１、ｉＮＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ｐＧＥ２またはＶＥＧＦである。場合により、免疫抑制標的は、ＩＤＯ１ある。場合により、アンチセンス核酸は、配列番号：３〜３１からなる群から選択される。
【００６８】
本明細書における「有効な用量、または、量」とは、それが投与による効果を生じる用量を意味する。本明細書における「組み合わせた有効用量、または、量」とは、２種若しくはそれ以上の薬剤の同時に投与される（例えば、混合物として）、個別に投与される、同時に投与される（例えば、個別の静脈ラインを経由して）、または、逐次的に投与される（第一の薬剤を初めに投与し、続いて第二の薬剤を投与する）、それが投与による効果を生じる用量を意味する。例えば、処置上有効な量、または、組み合せ効果量とは、疾患、または、障害の１つ若しくはそれ以上の症状を低下し、または、改善するのに十分な薬剤量、若しくは、その組み合せ量を含む。例えば、所定のパラメータに対して、有効量は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、または、少なくとも１００％の増加、または、低下を示すであろう。効能は、「倍」の増加、または、減少として表すことができる。例えば、処置上有効な量は、対照群に比べて少なくとも、１．２倍、１．５倍、２倍、５倍、または、それ以上の効果を有することができる。正確な用量、及び、製剤は、処置の目的に依存し、公知の技術を用いて当業者により確認される（参照、例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  （ｖｏｌｓ．１−３，１９９２）；Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ  Ａｒｔ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ  （１９９９）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ｅｄｉｔｏｒ  （２００３），  及び  Ｐｉｃｋａｒ，  Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９））。
【００６９】
本明細書に記載する薬剤の同時投与の文脈において、用語「相乗的」、「相乗効果」、「相乗的な処置効果」、「相乗的に有効量」などは、２つ若しくはそれ以上の薬剤が、他の薬剤、または、薬剤の非存在下で各薬剤を投与する際の加算効果を考慮して投与されるときの多くの添加剤（例えば、相乗的添加）の応答（例えば、生物学的応答）を意味する。例えば、２つの薬剤が相乗的な処置効果を提供する場合、その後、両方の薬剤の同時投与時に観察される処置効果は、いずれかの薬剤が他の薬剤の非存在下で投与されるときに観察される加算処置効果よりも大きい。同様に、両方の薬剤の同時投与時に観察される処置効果が、いずれかの薬剤が、他の薬剤の非存在下で投与されるとき観察される加算処置効果よりも大きい場合に、第一の薬剤の第一の量と第二の薬剤の第二の量が一緒になって相乗的に有効量を提供する。
【００７０】
本明細書において使用される用語、「処置する」、「処置」、または、「処置中」は、プロテアーゼの発現により特徴付けられる疾患、または、状態の１つ若しくはそれ以上の症状、または、プロテアーの発現によって特徴付けられる疾患、または、状態の単数の症状を低減する方法を意味する。従って、開示された方法では、処置は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または、１００％の、疾患、若しくは、状態での確立された疾患、状態、または、症状の重症度の減少を参照することができる。例えば、対照群と比較して、被験者における疾患の１つ若しくはそれ以上の症状の１０％の減少がある場合、疾患を処置するための方法は、治療であると考えられる。従って、減少は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％であり、または、自然、または、対照群のレベルと比較して、１０％と１００％の間の任意の割合の減少であり得る。処置は、疾患、状態の治癒、または、完全な除去、または、疾患若しくは状態の症状の治癒、または、完全な除去を、必ずしも意味するものではないことが理解される。更に、本明細書で使用される、減少する、低下する、または、阻害することへの参照は、対照群と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または、それ以上の変化を含み、そのような用語には、完全な排除を含めることができるが、必ずしも含むとは限らない。
【００７１】
「被験者」、「個体」または「患者」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指し、本明細書において互換的に使用される。哺乳動物としては、マウス、サル、ヒト、家畜、競技用動物、及び、ペットが挙げられるが、これらに限定されない。組織、細胞、及び、生体外で得られるか、または、生体外で培養される生物学的実体の、その子孫も包含される。
【００７２】
１つまたはそれ以上の提供される組成物を含むキットが、本明細書に提供される。従って、細菌細胞、及び、腫瘍浸透剤を含むキットが提供される。場合により、細菌細胞、及び、腫瘍浸透剤は、有効量、例えば、相乗的な有効量で存在する。場合により、キットは、サルモネラの細菌細胞、及び、ヒアルロニダーゼポリペプチドを有する第二の組成物を含む第一の組成物を含有する。場合により、サルモネラ細菌細胞、及び、ヒアルロニダーゼポリペプチドは、有効量、例えば、相乗的に有効量で存在する。場合により、組成物は、バイアルまたはパケットなどの容器中に存在する。場合により、キットは、１つ若しくはそれ以上の追加の薬剤を含む。従って、例えば、キットは、更に、追加の処置剤、例えば、抗癌剤を含む。追加の処置剤は、細菌細胞、及び／または、腫瘍浸透剤を含む組成物中に含まれるか、または別の組成物として処方することもできる。場合により、キットは、例えば、注射器、針、チューブ、カテーテル、パッチなどの、組成物を投与する手段を含む。キットは、また、使用前に滅菌、及び／または、希釈が必要な配合物、及び／または、物質を含むことができる。場合により、提供されるキットは、使用説明書を含む。
【００７３】
使用できる、併用して使用できる、調製用に使用できる、または、開示された方法、及び、組成物の生成物である、物質、組成物、及び、構成成分が開示される。これら、及び、他の材料は、本明細書に開示され、そして、様々な個人や集団の組み合わせ、及び、これらの薬剤の並び替えの具体的な参照が開示されているが、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが明確に開示されないとき、各々は、具体的に、本明細書に意図され、記載されることが理解される。例えば、方法が開示され、方法を含む多数の分子に対して実施できる多数の改変が議論される場合、それぞれ、及び、全ての組み合わせ、及び、方法の並び替え、及び、可能な改変は、具体的に反対されない限り、具体的に想定される。同様に、これらの任意のサブセット、または、組み合わせも、特に、意図し、及び、開示される。この概念は、開示された組成物を使用する方法の工程を含むが、これに限定されない本開示の全ての態様に適用される。従って、実施することができる追加の様々な工程が存在する場合、それぞれのこれらの追加の工程は、任意の特定の方法の工程、または、開示された方法の工程の組み合わせを用いて実施することができ、そして、各々のその様な組合せ、または、組み合せのサブセットは、具体的に意図され、開示されることが理解される。
【００７４】
本明細書に引用される出版物、それらが引用する物質は、その全体を参照することにより、本明細書に取り入れたものとする、
【００７５】
多くの実施形態が記載される。[0001]      それにもかかわらず、様々な改変が実施できることが理解されるであろう。従って、他の実施形態も、特許請求の範囲内である。
【実施例】
【００７６】
［実施例１］
癌処置のためのｓｈＩＤＯ−ＳＴ、及び、ＰＥＧＰＨ２０（商標）の組み合わせ：
ｓｈＩＤ−ＳＴ、及び、ＰＥＧＰＨ２０（商標）の効果を決定するために、９匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０５のＫＰＣ−ｌｕｃ細胞を同所的に注射（膵臓に）した。３つの小グループ（ｎ＝３）：ｓｈＩＤＯ−ＳＴ単体、ＰＥＧＰＨ２０（商標）単体、及び、ｓｈＩＤＯ−ＳＴ及びＰＥＧＰＨ２０（商標）の組み合わせが作製された。ｓｈＩＤＯ−ＳＴ単体のグループは、ｓｈＩＤＯ−ＳＴを、静脈注射（ｉ．ｖ．）を介在して、５×１０６ｃｆｕ／マウスの用量で、８日間、及び、１２日間に亘って摂取した。ＰＥＧＰＨ２０（商標）単体のグループは、ＰＥＧＰＨ２０（商標）をｉ．ｖ．注射を介在して、４．５ｍｇ／ｋｇ（〜９０μｇ／マウス）の用量で、７日間に亘って摂取した。ｓｈＩＤＯ−ＳＴ及びＰＥＧＰＨ２０（商標）の組み合わせグループは、ＰＥＧＰＨ２０（商標）を、４．５ｍｇ／ｋｇで、７日間に亘って摂取し、次いでｓｈＩＤＯ−ＳＴを、５×１０６ｃｆｕ／マウスで８日間に亘って処置した。マウスは、腫瘍細胞移植後の示された時点で、生体内イメージングシステム（ＩＶＩＳ）を用いて画像化した。マウスは、指定された日にＤ−ルシフェリンを注射し、注射後５〜１０分で、画像化した。露光時間は、全ての時点で２秒であった。ｓｈＩＤＯ−ＳＴグループ、及び、組み合せグループの両方において、マウスはｓｈＩＤＯ−ＳＴの毒性に基づく病気の兆候を示したが、それはおそらく、あまりにも高用量の結果であったからである。組み合わせグループにおける腫瘍の減少、及び、ｓｈＩＤＯ−ＳＴ単体グル―プにおけるより少ない程度の腫瘍が観察された。ＰＥＧＰＨ２０（商標）グループのマウスが、すべての場合、移動度の問題が原因で非常に大きな腫瘍が発生し、３匹の内２匹に病気が発生したために安楽死させた。
【００７７】
ｓｈＩＤＯ−ＳＴ及びＰＥＧＰＨ２０（商標）との組み合わせ処置の滴定が、初期の実験で観察された毒性を低減するために実施した（図２）。ｓｈＩＤＯ−ＳＴ及びＰＥＧＰＨ２０（商標）の３つの異なる用量の組み合わせを表す３つのグループは、ほとんど無いか、または、無毒性であって、腫瘍増殖を少なく制御し続けるための最適な用量を決定するために作製した。グループは、ｓｈＩＤＯ−ＳＴの半分の用量（２．５×１０６ｃｆｕ／マウス、即ち、２５０万ｃｆｕ（２．５Ｍ））を有する、ＰＥＧＰＨ２０（商標）の全用量（〜９０μｇ）；ｓｈＩＤＯ−ＳＴの全用量を有するＰＥＧＰＨ２０（商標）の半用量、または、両者の半用量から成る。ＰＥＧＰＨ２０（商標）の全用量、及び、任意の遺伝子標的に特異的ではないスクランブル制御（ｓｈＳｃｒ−ＳＴ）の全用量からなる対照群が追加された。前の通りに、マウスは、ＰＥＧＰＨ２０（商標）を７日間、及び、ｓｈＩＤＯ−ＳＴ、または、ｓｈＳｃｒ−ＳＴを８日間、摂取した。この実験では、いずれのマウスも、上記の投与量を用いた処置により病気になることが観察されなかった。ｓｈＩＤＯ−ＳＴの半用量を有するＰＥＧＰＨ２０（商標）の全用量を投与したマウスは、当初、腫瘍を制御したが、腫瘍は急速にリバウンドし、大腫瘍になったためグループを安楽死させた。半用量のＰＥＧＰＨ２０（商標）及び全用量のｓｈＩＤＯ−ＳＴを摂取したグループは、有意に腫瘍を制御し、そして、３匹の内２匹のマウスにおいて、腫瘍注射後８０日に亘って、ＫＰＣ−ｌｕｃの完全な治癒をもたらした。腫瘍がまだ明らかである３匹のマウスの内１匹では、同一用量での第二の処置は、５６〜５７日間に与えられた。腫瘍信号の幾つかの退化が発生したが、光子信号の継続的な増加で証明されるように、腫瘍は増殖し続けた（図３）。ＰＥＧＰＨ２０（商標）及びｓｈＩＤＯ−ＳＴの両方の半用量を与えられたマウスでのＫＰＣ−ｌｕｃ腫瘍は、有意な腫瘍増殖の制御を示さなかった（図１のＰＥＧＰＨ２０（商標）単体グループと比較して）。ＰＥＧＰＨ２０（商標）のｓｈＳｃｒ−ＳＴとの組み合わせは、過渡的ではあるが、測定可能な腫瘍増殖の制御をもたらしたが、腫瘍は３匹の内２匹のマウスでは急速にリバウンドし、全てのマウスは、まだ４５日目で、尚、腫瘍を有していたので、マウスのＫＰＣ−ｌｕｃは、治癒しなかった。図２で画像化されたマウスから放出された光子は、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ（登録商標）ソフトウェアを使用して定量した。４５μｇのＰＥＧＰＨ２０（商標）（ＰＥＧ）、及び、５ＭのｓｈＩＤＯ−ＳＴで処置したマウスからの腫瘍は、他の全てのグループよりも有意に良好に制御された（図３）。
【００７８】
ＰＥＧＰＨ２０（商標）及びｓｈＳｃｒ−ＳＴの組み合わせ処置に対する７日目のＫＰＣ−ｌｕｃ腫瘍の感受性のために（図２）、移植されたＫＰＣ−ｌｕｃ腫瘍の処置は、１４日間に延期された。これは、ＰＥＧＰＨ２０（商標）との組み合わせで、ｓｈＩＤＯ−ＳＴ対ｓｈＳｃｒ−ＳＴの有効性をより良く比較するために、腫瘍の大きな確定を可能にした。この実験は、６つの処置群から構成され、その内３グループは、ＰＥＧＰＨ２０（商標）及びｓｈＳｃｒ−ＳＴ、ｓｈＩＤＯ−ＳＴ、または、ゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇのＧＥＭ）で処置した。他の３グループは、ｓｈＳｃｒ−ＳＴ、ｓｈＩＤＯ−ＳＴ、または、ＧＥＭのいずれかで処置し、ＰＥＧＰＨ２０（商標）では処置しなかった。（以前に図２で説明した滴定実験から決定された）用量は、４５μｇのＰＥＧＰＨ２０（商標）、その後、５×１０６ｃｆｕ／マウスの、ｓｈＩＤＯ−ＳＴ、または、ｓｈＳｃｒ−ＳＴから成り立っていた。前述の通り、マウスは、（ＰＥＧＰＨ２０（商標）で、または、ビヒクルの対照群で）１４日間の処置を開始した。次いで、マウスは、１５日間の処置で単回投与を摂取した。腫瘍の増殖は、ＩＶＩＳにより縦方向で可視化した。画像は図４に示す。ＰＥＧＰＨ２０（商標）及びｓｈＩＤＯ−ＳＴの組み合わせグループを除く、全てのグループは、マウスでの移動性の問題や病気が原因となる著しく大きい腫瘍のため、３０日まで安楽死させた。再度、腫瘍増殖の有意な減少は、２１日目と３０日目のＰＥＧＰＨ２０（商標）及びｓｈＩＤＯ−ＳＴの組み合わせグループにおける３匹中の２匹のマウスで観察された。有意ではなかったが、第三のマウスも、生存を延長する腫瘍制御を示した。３７日までに、腫瘍がマウスに再び現れた。従って、第二の処置は、これが、さらに、腫瘍退縮を誘導するかどうかを決定するために、これらのマウスに投与した。４４日目を通して穏やかな腫瘍の減少が見られた。図４で画像化されたマウスから放出された光子は、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ（登録商標）ソフトウェアを使用して定量した。ＰＥＧＰＨ２０（商標）（ＰＥＧ）＋ｓｈＩＤＯ−ＳＴで処置されたマウスからの腫瘍は、他の全てのグループよりも有意に良好に制御されていた。図５を参照。更に、図４のマウスは、各画像化時点で秤量した。いずれのグループもマウスの体重に有意な変化はなかった。図６を参照。
【００７９】
［実施例２］
癌処置のためのｓｈＡｒｇ−ＳＴ及びＰＥＧＰＨ２０（商標）の組み合わせ：
ＰＥＧＰＨ２０（商標）と組み合わせたｓｈＡｒｇ−ＳＴの効果を決定するために、５匹のマウスに、同所的に、５×１０５のＫＰＣ−ｌｕｃ腫瘍細胞を移植した。２匹のマウスは、いかなる公知の遺伝子も標的としないｓｈＲＮＡプラスミドを運ぶＰＥＧＰＨ２０（商標）及びサルモネラ（ＳＴ）療法（ｓｈＳｃｒ−ＳＴ）を用いた処置からなる対照群に使用した（Ｓｃｒ＝スクランブル）。３匹のマウスは、ＰＥＧＰＨ２０（商標）及びｓｈＡｒｇ−ＳＴを摂取する実験群に使用した。全てのグループは、ＰＥＧＰＨ２０（９０μｇ／マウス、静脈内）を７日間摂取し、ＳＴ療法を８日、１１日間摂取した（静脈内、５×１０６ｃｆｕ／マウス）。ＰＥＧＰＨ２０（商標）との組み合わせで、ｓｈＳｃｒ−ＳＴの対照群の処置、並びに、ｓｈＡｒｇ−ＳＴの処置は、腫瘍増殖の減衰をもたらした。しかし、幾つかの毒性が観察された。結果を図７に示す。
【００８０】
ｓｈＩＤＯ−ＳＴ及びＰＥＧＰＨ２０（商標）との組み合わせ処置に使用される用量は、最初の実験で観察された毒性を低減するために変更した（図７）。同所性のＫＰＣ−ｌｕｃ腫瘍を有する２つのグループ（ｎ＝４）が生成され、ｓｈＳｃｒ−ＳＴ、または、ｓｈＡｒｇ−ＳＴのいずれかでＰＥＧＰＨ２０（商標）処置を受けた。両グループのために、ＰＥＧＰＨ２０（商標）は、４５μｇ／マウス（以前に使用されたものより半分の投与量）で、後の時点での９日目に投与した（以前の実験の７日目とは対照的に）、次いで、ｓｈＳｃｒ−ＳＴ、または、ｓｈＡｒｇ−ＳＴ（全用量、５×１０６ｃｆｕ）を１０日及び１３日間処置した。５０％の対照群マウスの腫瘍が治癒し、実験群が、尚、わずかに良好に作用していた。ｓｈＡｒｇ−ＳＴの処置を受けたマウスは、まだ、幾つかの毒性兆候を示した。結果を図８に示す。
【００８１】
［実施例３］
ｓｈＩＤＯ−ＳＴ／ＰＥＧＰＨ２０（商標）の組み合わせ処置の有効性：
更に、ｓｈＩＤＯ−ＳＴ／ＰＥＧＰＨ２０（商標）の組み合わせ療法の有効性を評価するために、マウスのグループは、ルシフェラーゼ（ＫＰＣ−ｌｕｃ細胞）を発現する５０万のＫＰＣ（ＫｒａｓＬＳＬ．Ｇ１２Ｄ／＋；ｐ５３Ｒ１７２Ｈ／＋；ＰｄｘＣｒｅｔｇ／＋）細胞を同所的に移植した。移植後１４日間、全てのマウスを、表１に概要を示したスケジュールに従って、示唆した療法で処置した。
【表１】
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【００８２】
それぞれ指示した時点で、グループは、Ｘｅｎｏｇｅｎ１００装置を用いて生体内画像化の５分前に、ルシフェリンを注射した。図９で示す通り、画像化結果を元に、ＰＥＧＰＨ２０（商標）／ｓｈＩＤＯ−ＳＴで処置した１００％のマウスが、実質的な腫瘍退縮を有することを観察し、マウスの７５％近くが、健康的で、腫瘍のないマウスに匹敵する、注目すべき腫瘍の除去と無期限の生存率（＞１Ｙ）を示した。他の処置法との組み合わせは、ほとんど有効ではなかった。
【００８３】
統計的分析のために、図９に示したマウスグループのＩＶＩＳ画像化から放出された光子を定量した。図１０で示す通り、ルシフェラーゼシグナルの定量は、ＰＥＧＰＨ２０（商標）＋ｓｈＩＤＯ−ＳＴのみで処置したマウスが、試験したＰＥＧＰＨ２０（商標）と標準化学療法の全ての組み合わせと比較して、統計的に有意な腫瘍の制御（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ）を有することを示した。
【００８４】
図９に示したマウスのグループは、指示された各時点で計量した。図１１で示す通り、ＰＥＧＰＨ２０（商標）／ｓｈＩＤＯ−ＳＴの組み合わせ療法を用いたＰＤＡＣ腫瘍の除去は、いずれの有意な毒性（体重減少）とも関連していなかった。全体として、いかなる処置グループも、関連する体重減少を示さなかった。
【００８５】
未処置、または、ＰＥＧＰＨ２０（商標）で処置したマウスから１４日目の同所に移植した腫瘍は、ヒアルロナンのより高い強度の染色のために、１０％の酸ホルマリン及び７０％エタノールを活用する修正された方法（標準の１０％ホルマリン固定より優れた）を用いて固定した（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  １９９７）。図１２に示すように、染色は、移植後１４日目のＫＰＣ−ｌｕｃ腫瘍がヒアルロナンを有意に発現することを明らかにした。ＰＥＧＰＨ２０（商標）で処置した後４８時間で、ＫＰＣ−ｌｕｃ腫瘍組織の切片におけるヒアルロナンの有意な枯渇が観察された（図１２）。
【００８６】
未処置、または、ＰＥＧＰＨ２０で処置したマウスの腫瘍の１４日後の切片は、腫瘍塊内の血管の断面を見つけるために、抗ＣＤ３１抗体で染色した。ＣＤ３１一次に対して二次特異的に共役したＦＩＴＣ及びＤＡＰＩ染色は、蛍光顕微鏡により可視化した。図１３に示す通り、画像はマウスの腫瘍において、未処置の腫瘍の密閉血管の大部分、及び、ＰＥＧＰＨ２０（商標）で処置したマウスの腫瘍におけるより多くの開放血管を表す。
【００８７】
指示した処置グループにおける腫瘍及び好中球は、サルモネラで処置を開始した後、７２時間のスパンで画像化した。時点はサルモネラ菌で処置した後の時間を表す。（即ち、ＰＥＧＰＨ２０（商標）は、−２４時間の時点で与えられた）。図１４に示すように、腫瘍への好中球の著しい移動は、具体的に、腫瘍内で観察され、ＰＥＧＰＨ２０（商標）／ｓｈＩＤＯ−ＳＴで処置したマウスでのみ発生する重複領域を形成した。ＰＥＧＰＨ２０（商標）／ｓｈＩＤＯ−ＳＴで処置したマウスは、ＰＭＮの流入（７２時間時点の指摘）で、劇的な腫瘍退縮の一致を示した。
【００８８】
ＰＥＧＰＨ２０（商標）／ｓｈＳｃｒ−ＳＴ及びＰＥＧＰＨ２０（商標）／ｓｈＩＤＯ−ＳＴで処置したマウスに対して、図１４に示された腫瘍は、具体的には、腫瘍塊内のＰＭＮの存在を確認するために、サルモネラ処置後９６時間で切除した。マウスは、腫瘍切除（ＰＭＮに特異的に）の１時間前に、近赤外造影剤を注入された。図１５で分かる通り、ＰＥＧＰＨ２０（商標）／ｓｈＩＤＯ−ＳＴで処置したマウスから切除した腫瘍（右側）は、対照群のＰＥＧＰＨ２０／ｓｈＳｃｒ−ＳＴで処置したマウス（左）と比較して、有意に多くのＰＭＮ浸潤を有することが観察された。
【００８９】
対照群の腫瘍と、図１５で示す腫瘍は、サルモネラ、ＰＭＮ、及び、無傷の核の免疫蛍光染色（ＤＡＰＩ）のために切片化した。ＰＥＧＰＨ２０（商標）／ｓｈＩＤＯ−ＳＴで処置されたマウスのみ、サルモネラとＰＭＮの劇的な流入を有することが観察された（図１６）。ＰＭＮは、定量的ＰＣＲによりＩＤＯｍＲＮＡの有意なノックダウンを有することが観察された。瘍細胞のかなりの壊死（ＤＡＰＩ染色の欠如）が、ＰＥＧＰＨ２０（商標）／ｓｈＩＤＯ−ＳＴで処置した腫瘍のコアで可視化された（図１６）。
【００９０】
更に、ＰＥＧＰＨ２０（商標）／ｓｈＩＤＯ−ＳＴの組み合わせ処置の効果を調べるために、条件付きで、特に、膵臓でのＣｒｅ（ＫＰＣ−Ｂｒｃａ１）の存在下で発現し、自発的な膵臓癌をもたらした、Ｋｒａｓ、ｐ５３、及び、Ｂｒｃａ１の突然変異を組み込んだ遺伝子操作されたマウスモデル（ＧＥＭＭ）が処置された。左側の脾臓と膵臓は、１２週齢の正常なＣ５７ＢＬ／６マウスから摘出し、一方、右側の脾臓と膵臓を、ＰＥＧＰＨ２０（商標）／ｓｈＩＤＯ−ＳＴで処理した７週齢のＫＰＣ−Ｂｒｃａ１マウスから採取した。処置スケジュールは、図１８に概要を示す。処置したＫＰＣ−Ｂｒｃａ１マウスが５週間後に（１２週齢で）安楽死させた。図１７に示すように、ＫＰＣ−Ｂｒｃａ１マウスは、正常な膵臓の大きさと比較して，有意に小さい膵臓を有することが観察された。
【００９１】
追加の実験は、その後、適切に制御処置したマウス（即ち、ＰＥＧＰＨ２０（商標）／ｓｈＳｃｒ−ＳＴ）、及び、ＫＰＣ−Ｂｒｃａ１マウスで行なった。雄と雌のＫＰＣ−Ｂｒｃａ１マウスは、図１８に概要を示す処置スケジュールを使用して、ＰＥＧＰＨ２０（商標）とｓｈＳｃｒ−ＳＴ、または、ｓｈＩＤＯ−ＳＴのいずれかで処置した。再度、ＰＥＧＰＨ２０（商標）／ｓｈＩＤＯ−ＳＴで処置したマウスにおける腫瘍サイズの有意な制御／縮小は、ＰＥＧＰＨ２０（商標）／ｓｈＳｃｒ−ＳＴで処理したものと比較し、厳密な自生／自発的なモデルにおいて有効性を示した（図１９）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年6月4日(2019.6.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者に細菌細胞及び腫瘍浸透剤の組み合わせ有効量を投与することを含み、投与は前記被験者における癌を処置することである、被験者における癌を処置する方法。
【外国語明細書】
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