(57)【要約】      （修正有）【課題】ミエリン障害の治療のための誘導多能性細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞の提供。【解決手段】ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα陽性細胞の調製物であって、調製物が、ＯＬＩＧ２及びＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲαを同時発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞を含み、細胞の調製物が、皮膚細胞に由来する多能性細胞に由来する、調製物。細胞の調製物が、臍帯血に由来する多能性細胞に由来する、調製物。細胞の調製物が、末梢血に由来する多能性細胞に由来する、調製物。細胞の調製物が、骨髄に由来する多能性細胞に由来する、調製物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα陽性細胞の調製物であって、前記調製物が、ＯＬＩＧ２及びＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲαを同時発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞を含み、前記細胞の調製物が、皮膚細胞に由来する多能性細胞に由来する、調製物。
【請求項２】
ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα陽性細胞の調製物であって、前記調製物が、ＯＬＩＧ２及びＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲαを同時発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞を含み、前記細胞の調製物が、臍帯血に由来する多能性細胞に由来する、調製物。
【請求項３】
ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα陽性細胞の調製物であって、前記調製物が、ＯＬＩＧ２及びＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲαを同時発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞を含み、前記細胞の調製物が、末梢血に由来する多能性細胞に由来する、調製物。
【請求項４】
ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα陽性細胞の調製物であって、前記調製物が、ＯＬＩＧ２及びＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲαを同時発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞を含み、前記細胞の調製物が、骨髄に由来する多能性細胞に由来する、調製物。
【請求項５】
調製物の少なくとも９５％がＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα陽性細胞である細胞の調製物であって、前記調製物が、ＯＬＩＧ２及びＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲαを同時発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞を含み、前記オリゴデンドロサイト前駆細胞が、オリゴデンドロサイト以外の分化体細胞の１つまたは複数のエピジェネティックマーカーを保持する、調製物。
【請求項６】
前記調製物の前記細胞が、ヒト細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項７】
前記調製物の前記オリゴデンドロサイト前駆細胞が、ＳＯＸ１０、ＣＤ９、またはこれらの組み合わせを更に発現する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項８】
前記細胞の調製物が、ＭＡＰ２抗体によって定められるニューロンを含有しない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項９】
１％未満の残留多能性細胞を含有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項１０】
前記細胞の調製物の１％未満が、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、またはＳＳＥＡ４タンパク質のいずれかを発現する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項１１】
Ａ２Ｂ５＋／ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−選別胎児ヒト組織由来オリゴデンドロサイト前駆細胞の調製物のインビボミエリン形成効率を超えるインビボミエリン形成効率を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項１２】
移植時に、Ａ２Ｂ５＋／ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−選別胎児ヒト組織由来オリゴデンドロサイト前駆細胞の調製物で達成可能なインビボミエリン形成密度を超えるインビボミエリン形成密度を達成することができる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項１３】
Ａ２Ｂ５＋／ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−選別胎児ヒト組織由来オリゴデンドロサイト前駆細胞の調製物で達成可能な生存率と比較して、移植時に、ミエリン形成欠損哺乳動物において改善された生存率を達成することができる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項１４】
前記調製物の少なくとも９０％が、オリゴデンドロサイト前駆細胞を含む、請求項５に記載の調製物。
【請求項１５】
前記調製物の少なくとも９５％が、オリゴデンドロサイト前駆細胞を含む、請求項５に記載の調製物。
【請求項１６】
前記１つまたは複数のエピジェネティックマーカーが、体性皮膚細胞の１つまたは複数のエピジェネティックマーカーを含む、請求項５に記載の調製物。
【請求項１７】
前記１つまたは複数のエピジェネティックマーカーが、１つまたは複数のメチル化マーカーを含む、請求項５に記載の調製物。
【請求項１８】
前記調製物の細胞の９５％超が、ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα陽性細胞である、請求項５に記載の調製物。
【請求項１９】
ミエリンの喪失またはオリゴデンドロサイトの喪失によって媒介される状態を有する対象を治療する方法であって、
前記状態の治療に有効な条件下で、前記対象に請求項１〜５のいずれか一項に記載の調製物を投与する段階を含む、方法。
【請求項２０】
前記調製物の前記細胞が、ヒト細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記調製物の前記オリゴデンドロサイト前駆細胞が、ＳＯＸ１０、ＣＤ９、またはこれらの組み合わせを更に発現する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞の調製物が、ＭＡＰ２抗体によって定められるニューロンを含有しない、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記調製物が、１％未満の残留多能性細胞を含有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞の調製物の１％未満が、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、またはＳＳＥＡ４タンパク質のいずれかを発現する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記調製物が、脳、脳幹、脊髄、またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上の部位に投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記調製物が、脳室内に、脳梁内に、または実質内に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記調製物が、前記対象に由来する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記投与する段階が、前記調製物の前記オリゴデンドロサイト前駆細胞による脳脊髄軸全体への移植を達成するのに有効な条件下で実行される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記状態が、自己免疫性脱ミエリン化状態である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記自己免疫性脱ミエリン化状態が、多発性硬化症、視神経脊髄炎、横断性脊髄炎、及び視神経炎からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記状態が、血管性白質脳症である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
前記血管性白質脳症が、皮質下梗塞、糖尿病性白質脳症、高血圧性白質脳症、加齢に伴う白質疾患、及び脊髄損傷からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記状態が、放射線誘導脱ミエリン化状態である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
前記状態が、小児白質ジストロフィーである、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
前記小児白質ジストロフィーが、ペリツェウス・メルツバッハー病、テイ・サックス病、サンドホフ病ガングリオシドーシス、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症、ニーマン・ピックＡ病、副腎白質ジストロフィー、カナバン病、消失白質疾患、及びアレキサンダー病からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記状態が、脳室周囲白質軟化症または脳性麻痺である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３７】
オリゴデンドロサイト前駆細胞の濃縮調製物を生成する方法であって、以下の段階を含む、方法：
前記細胞が胚様体を形成するのに有効な条件下で、誘導多能性幹細胞の集団を培養する段階と、
前記胚様体の細胞の神経上皮細胞への分化、及び神経上皮細胞コロニーの形成を誘導する段階と、
前記神経上皮細胞コロニーを、オリゴデンドロサイト前駆細胞への分化を誘導するのに有効な条件に曝露する段階であって、それによりＯＬＩＧ２及びＣＤ１４０α／ＰＤＧＦＲαを同時発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞の濃縮調製物を形成する、段階。
【請求項３８】
前記濃縮調製物の前記オリゴデンドロサイト前駆細胞が、ＳＯＸ１０、ＣＤ９、またはこれらの組み合わせを更に発現する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
オリゴデンドロサイト前駆細胞の前記濃縮調製物から、ＣＤ１４０α／ＰＤＧＦＲα陽性細胞を分離する段階であって、それによりＣＤ１４０α／ＰＤＧＦＲαを発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞の精製調製物を生成する、段階
を更に含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記神経上皮細胞が、ＰＡＸ６及びＳＯＸ１を同時発現する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記誘導多能性幹細胞が、ヒト誘導多能性幹細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
非多能性細胞の集団を多能性状態に再プログラミングする段階であって、それにより誘導多能性幹細胞の前記集団を形成する、段階
を更に含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
非多能性細胞の前記集団が、皮膚細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞、または骨髄細胞の集団を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記曝露する段階が、
前記神経上皮細胞を、ＯＬＩＧ２＋／ＮＫＸ２．２−であるプレオリゴデンドロサイト前駆細胞に変換することと、
前記ＯＬＩＧ２＋／ＮＫＸ２．２−プレオリゴデンドロサイト前駆細胞を、ＯＬＩＧ２＋／ＮＫＸ２．２＋プレオリゴデンドロサイト前駆細胞に形質転換することと、
前記ＯＬＩＧ２＋／ＮＫＸ２．２＋プレオリゴデンドロサイト前駆細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞の前記濃縮集団を形成することと
を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
オリゴデンドロサイト前駆細胞の前記濃縮調製物を、オリゴデンドロサイト及び／またはアストロサイトに分化させる段階
を更に含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
請求項３７に記載の方法によって生成される、調製物。
【請求項４７】
請求項３９に記載の方法によって生成される、調製物。
【請求項４８】
請求項４５に記載の方法によって生成される、調製物。
【請求項４９】
ミエリンの喪失またはオリゴデンドロサイトの喪失によって媒介される状態を有する対象を治療する方法であって、
前記状態を治療するのに有効な条件下で、前記対象に、請求項４６または４７に記載の調製物を投与する段階を含む、方法。
【請求項５０】
前記調製物が、脳、脳幹、脊髄、またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上の部位に投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記調製物が、脳室内に、脳梁内に、または実質内に投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記調製物が、前記対象に由来する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記投与する段階が、前記調製物の前記オリゴデンドロサイト前駆細胞による脳脊髄軸全体への移植を達成するのに有効な条件下で実行される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記状態が、自己免疫性脱ミエリン化状態である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記自己免疫性脱ミエリン化状態が、多発性硬化症、視神経脊髄炎、横断性脊髄炎、及び視神経炎からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記状態が、血管性白質脳症である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
前記血管性白質脳症が、皮質下梗塞、糖尿病性白質脳症、高血圧性白質脳症、加齢に伴う白質疾患、及び脊髄損傷からなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記状態が、放射線誘導脱ミエリン化状態である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
前記状態が、小児白質ジストロフィーである、請求項４９に記載の方法。
【請求項６０】
前記小児白質ジストロフィーが、ペリツェウス・メルツバッハー病、テイ・サックス病、サンドホフ病ガングリオシドーシス、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症、ニーマン・ピックＡ病、副腎白質ジストロフィー、カナバン病、消失白質疾患、及びアレキサンダー病からなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記状態が、脳室周囲白質軟化症または脳性麻痺である、請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年２月６日に出願された、米国仮特許出願第６１／７６１，５８４号、及び２０１３年３月１３日に出願された、同第６１／７８０，２６５号の利益を主張し、これらは本明細書によりその全体が参照により組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、誘導多能性細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞の調製物、並びにこれらの細胞を作製、単離、及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
遺伝性白質ジストロフィーから血管性白質脳症、多発性硬化症まで、幅広い疾患は、ミエリン損傷または喪失から生じる。特に、小児白質ジストロフィーにおいて、毒素性蓄積異常の場合には、コンパクトミエリンは、正常に発達していないかまたは損傷しているかのいずれかである。最近の研究は、これらの先天性ミエリン疾患の治療のための、移植されたオリゴデンドロサイトまたはそれらの前駆細胞の使用に焦点を当ててきた。げっ歯類由来細胞及びヒト由来細胞の埋め込みの両方が、先天性ミエリン形成異常の様々な実験的モデルにおいて評価されている。埋め込まれた脳細胞のミエリン形成の潜在能力は、シバラーマウスにおいて最初に認められた（Ｌａｃｈａｐｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＮＳ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  Ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｂｒａｉｎ  ｏｆ  Ｓｈｉｖｅｒｅｒ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｍｉｃｅ：Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  Ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｉｍｐｌａｎｔｅｄ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ，"Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ６：３２５−３３４（１９８３）（非特許文献１））。シバラーは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）における変異的欠損であり、ＭＢＰ遺伝子内の早期停止コドンによってその最後の５つのエクソンの脱落がもたらされている（Ｒｏａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｙｅｌｉｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｒｔｉａｌｌｙ  Ｄｅｌｅｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｓｈｉｖｅｒｅｒ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｍｉｃｅ，"Ｃｅｌｌ４２：１４９−１５５（１９８５）（非特許文献２））。シバラーは常染色体性劣性変異であり、ｓｈｉ／ｓｈｉ同型接合体は、中枢コンパクトミエリンが発達しない。それらは、運動失調症、共調運動不全、痙縮、及び発作によって、典型的には生後２０〜２２週で早死にする。胎児ヒト脳組織がシバラー内に埋め込まれる際、オリゴデンドロサイトの分化及び局所ミエリン形成の両方の証拠が認められた（Ｌａｃｈａｐｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ＣＮＳ  Ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｂｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｓｈｉｖｅｒｅｒ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｍｉｃｅ：Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  Ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｉｍｐｌａｎｔｅｄ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ，"Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ６：３２６−３３４（１９８３）（非特許文献１）、Ｇｕｍｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  Ｉｎｔｏ  Ｓｈｉｖｅｒｅｒ  Ｂｒａｉｎ，"Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ４９５：７１−８５（１９８７）（非特許文献３）、及びＳｅｉｌｈｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｆｔｅｒ  Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ，"Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ９１：８２−８８（１９９６）（非特許文献４））。しかしながら、これらの分画されていない埋め込み物は、斑状の再ミエリン形成のみを生じさせ、他の潜在的に望ましくない表現型の同時発生を可能にしてしまう。そこで、濃縮グリア前駆細胞のミエリン形成能力が評価され、おそらく移植された細胞によるアストロサイトの分化が理由で、低い効率であるもののシバラーの軸索をミエリン形成することができることが発見された（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｍｙｅｌｉｎｏｇｅｎｉｃ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｕｐｏｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｉｎｔｏ  Ｈｙｐｏｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ  Ｈｏｓｔｓ，"Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ３４：１−１３（１９９３）（非特許文献５））。Ｙａｎｄａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｇｌｏｂａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｓ  Ｆｅａｓｉｂｌｅ  ｖｉａ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｄｙｓｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  Ｓｈｉｖｅｒｅｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｂｒａｉｎ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：７０２９−７０３４（１９９９）（非特許文献６）は、続いて、不死化した多能性前駆細胞もまたシバラーにおけるミエリン形成に寄与し得ることを記述した。Ｄｕｎｃａｎらは、げっ歯類新生仔の脳室下帯から成長させたオリゴスフェア由来細胞を、別のミエリン形成異常変異体であるミエリン欠損ラットに、周産期の脳室内投与時に移植し得ることを同様に記述した（Ｌｅａｒｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｉｎｔｏ  ａ  Ｆｅｔａｌ  Ｍｙｅｌｉｎ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｅｌｉｎ，"Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ４６：７１６−７２２（１９９９）（非特許文献７））。
【０００４】
オリゴデンドロサイトの成熟及びミエリン形成の能力を有するヒトグリア前駆細胞は、胎児及び成人のヒト脳組織の両方に由来しており（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａ２Ｂ５＋Ｇｌｉａｌ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｆｒｏｍ  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｔａｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｇｌｉａ４０：６５−７７（２００２）（非特許文献８）、Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｔｏｔｉｃ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｕｂｃｏｒｔｉｃａｌ  Ｗｈｉｔｅ  Ｍａｔｔｅｒ，"Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：９９８６−９９９５（１９９９）（非特許文献９）、Ｗｉｎｄｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｆｅｔａｌ  ａｎｄ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｅｓ  Ｍｙｅｌｉｎａｔｅ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｌｙ  Ｄｙｓｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  Ｂｒａｉｎ，"Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：９３−９７（２００４）（非特許文献１０））、ヒト胚性幹細胞にもまた由来しており（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．４：１６１４−１６２２（２００９）（非特許文献１１）、Ｉｚｒａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｎｏｇｇｉｎ  ｏｎ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｏｎ  Ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ，"Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３４：３１０−３２３（２００７）（非特許文献１２）、及びＫｅｉｒｓｔｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ  Ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｔｏｒｅ  Ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ  Ａｆｔｅｒ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｉｎｊｕｒｙ，"Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：４６９４−４７０５（２００５）（非特許文献１３））、先天性ミエリン形成異常（Ｓｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，"ＣＤ１４０ａ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｍｙｅｌｉｎｏｇｅｎｉｃ，Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  Ｅｎｇｒａｆｔｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：９３４−９４１（２０１１）（非特許文献１４）、Ｗｉｎｄｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｆｅｔａｌ  ａｎｄ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｅｓ  Ｍｙｅｌｉｎａｔｅ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｌ��  Ｄｙｓｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  Ｂｒａｉｎ，"Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：９３−９７（２００４）（非特許文献１５）、Ｗｉｎｄｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｃｈｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｌｉａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｃａｎ  Ｂｏｔｈ  Ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｃｕｅ  ｔｈｅ  Ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ  Ｌｅｔｈａｌｌｙ  Ｈｙｐｏｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  Ｓｈｉｖｅｒｅｒ  Ｍｏｕｓｅ，"Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ２：５５３−５６５（２００８）（非特許文献１６））、並びに成人脱ミエリン化（Ｗｉｎｄｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｕｂｃｏｒｔｉｃａｌ  Ｗｈｉｔｅ  Ｍａｔｔｅｒ  Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ａｓ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  Ｗｉｔｈｉｎ  Ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｂｒａｉｎ，"Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．６９：９６６−９７５（２００２）（非特許文献１７））脳及び脊髄の両方の実験的モデルにおいて有効であることが証明されている。免疫不全マウスにおけるこれらの成功にも関わらず、これまでのところ、免疫拒絶が移植ベクターとしての同種ヒト細胞の使用を妨害している。ドナー細胞拒絶に対する懸念は、それらの障害の基底にある炎症プロセスがあらゆる同種移植片に対して本質的敵対環境を呈し得る、多発性硬化症などの成人脱ミエリン化疾患に関して特に問題になっている（Ｋｅｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｍａｎ，"Ｇｌｉａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ−Ｂａｓｅｄ  Ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  Ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，"Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．１８：９３−１０４（２００７）（非特許文献１８））。
【０００５】
本発明は、これ及び当該技術分野における他の不足を克服することを対象とする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌａｃｈａｐｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＮＳ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  Ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｂｒａｉｎ  ｏｆ  Ｓｈｉｖｅｒｅｒ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｍｉｃｅ：Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  Ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｉｍｐｌａｎｔｅｄ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ，"Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ６：３２５−３３４（１９８３）
【非特許文献２】Ｒｏａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｙｅｌｉｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｒｔｉａｌｌｙ  Ｄｅｌｅｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｓｈｉｖｅｒｅｒ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｍｉｃｅ，"Ｃｅｌｌ４２：１４９−１５５（１９８５）
【非特許文献３】Ｇｕｍｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  Ｉｎｔｏ  Ｓｈｉｖｅｒｅｒ  Ｂｒａｉｎ，"Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ４９５：７１−８５（１９８７）
【非特許文献４】Ｓｅｉｌｈｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｆｔｅｒ  Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ，"Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ９１：８２−８８（１９９６）
【非特許文献５】Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｍｙｅｌｉｎｏｇｅｎｉｃ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｕｐｏｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｉｎｔｏ  Ｈｙｐｏｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ  Ｈｏｓｔｓ，"Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ３４：１−１３（１９９３）
【非特許文献６】Ｙａｎｄａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｇｌｏｂａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｓ  Ｆｅａｓｉｂｌｅ  ｖｉａ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｄｙｓｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  Ｓｈｉｖｅｒｅｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｂｒａｉｎ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：７０２９−７０３４（１９９９）
【非特許文献７】Ｌｅａｒｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｉｎｔｏ  ａ  Ｆｅｔａｌ  Ｍｙｅｌｉｎ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｅｌｉｎ，"Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ４６：７１６−７２２（１９９９）
【非特許文献８】Ｄｉｅｔｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａ２Ｂ５＋Ｇｌｉａｌ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｆｒｏｍ  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｔａｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｇｌｉａ４０：６５−７７（２００２）
【非特許文献９】Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｔｏｔｉｃ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｕｂｃｏｒｔｉｃａｌ  Ｗｈｉｔｅ  Ｍａｔｔｅｒ，"Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：９９８６−９９９５（１９９９）
【非特許文献１０】Ｗｉｎｄｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｆｅｔａｌ  ａｎｄ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｅｓ  Ｍｙｅｌｉｎａｔｅ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｌｙ  Ｄｙｓｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  Ｂｒａｉｎ，"Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：９３−９７（２００４）
【非特許文献１１】Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．４：１６１４−１６２２（２００９）
【非特許文献１２】Ｉｚｒａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｎｏｇｇｉｎ  ｏｎ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｏｎ  Ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ，"Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３４：３１０−３２３（２００７）
【非特許文献１３】Ｋｅｉｒｓｔｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ  Ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｔｏｒｅ  Ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ  Ａｆｔｅｒ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｉｎｊｕｒｙ，"Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：４６９４−４７０５（２００５）
【非特許文献１４】Ｓｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，"ＣＤ１４０ａ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｍｙｅｌｉｎｏｇｅｎｉｃ，Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  Ｅｎｇｒａｆｔｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：９３４−９４１（２０１１）
【非特許文献１５】Ｗｉｎｄｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｆｅｔａｌ  ａｎｄ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｅｓ  Ｍｙｅｌｉｎａｔｅ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｌｙ  Ｄｙｓｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  Ｂｒａｉｎ，"Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：９３−９７（２００４）
【非特許文献１６】Ｗｉｎｄｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｃｈｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｌｉａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｃａｎ  Ｂｏｔｈ  Ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｃｕｅ  ｔｈｅ  Ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ  Ｌｅｔｈａｌｌｙ  Ｈｙｐｏｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  Ｓｈｉｖｅｒｅｒ  Ｍｏｕｓｅ，"Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ２：５５３−５６５（２００８）
【非特許文献１７】Ｗｉｎｄｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｕｂｃｏｒｔｉｃａｌ  Ｗｈｉｔｅ  Ｍａｔｔｅｒ  Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ａｓ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  Ｗｉｔｈｉｎ  Ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｂｒａｉｎ，"Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．６９：９６６−９７５（２００２）
【非特許文献１８】Ｋｅｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｍａｎ，"Ｇｌｉａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ−Ｂａｓｅｄ  Ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  Ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，"Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．１８：９３−１０４（２００７）
【発明の概要】
【０００７】
本発明の第１の態様は、ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα陽性細胞の調製物を対象とし、調製物は、ＯＬＩＧ２及びＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲαを同時発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞を含み、細胞の調製は、皮膚細胞に由来する多能性細胞に由来する。
【０００８】
本発明の第２の態様は、ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα陽性細胞の調製物を対象とし、調製物は、ＯＬＩＧ２及びＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲαを同時発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞を含み、細胞の調製は、臍帯血に由来する多能性細胞に由来する。
【０００９】
本発明の別の態様は、ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα陽性細胞の調製物を対象とし、調製物は、ＯＬＩＧ２及びＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲαを同時発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞を含み、細胞の調製は、末梢血に由来する多能性細胞に由来する。
【００１０】
本発明の別の態様は、ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα陽性細胞の調製物を対象とし、調製物は、ＯＬＩＧ２及びＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲαを同時発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞を含み、細胞の調製は、骨髄に由来する多能性細胞に由来する。
【００１１】
本発明の別の態様は、調製物の少なくとも９５％がＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα陽性細胞である細胞の調製物を対象とし、調製物は、ＯＬＩＧ２及びＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲαを同時発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞を含み、オリゴデンドロサイト前駆細胞が、オリゴデンドロサイト以外の分化体細胞の１つ以上のエピジェネティックマーカーを保持する。
【００１２】
本発明の別の態様は、オリゴデンドロサイト前駆細胞の濃縮調製物を生成する方法を対象とする。本方法は、細胞が胚様体を形成するのに有効な条件下で、誘導多能性幹細胞の集団を培養することと、胚様体の細胞の神経上皮細胞への分化、及び神経上皮細胞コロニーの形成を誘導することと、を含む。本方法は、神経上皮細胞コロニーを、オリゴデンドロサイト前駆細胞への分化を誘導するのに有効な条件に曝露し、それによりＯＬＩＧ２及びＣＤ１４０α／ＰＤＧＦＲαを同時発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞の濃縮調製物を形成することを更に含む。
【００１３】
本発明の別の態様は、状態を治療するのに有効な条件下で、本発明の細胞調製物のいずれか１つを対象に投与することを含む、ミエリンの喪失またはオリゴデンドロサイトの喪失よって媒介される状態を有する対象を治療する方法を対象とする。
【００１４】
これまで、誘導多能性細胞（ｉＰＳＣ）からのミエリン形成オリゴデンドロサイトの濃縮調製物及び／または精製調製物の、スケーラブルな生成のための堅固なプロトコルは報告されていない。本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｐｏｕｙａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｒａｔ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃ  Ｃｈｉａｓｍ  Ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ，"ＰＬｏＳ  ＯＮＥ６（１１）：ｅ２７９２５（２０１１）（"Ｐｏｕｙａ"）は、ヒトｉＰＳｃ由来オリゴデンドロサイト前駆細胞の生成を報告するが、Ｐｏｕｙａによって利用された胚性幹細胞に基づく分化プロトコルは、オリゴデンドロサイト前駆細胞生成に続く、神経前駆細胞分化の特異的かつ制御可能な指向に関して調整されていなかった。Ｐｏｕｙａのプロトコルにおける制御された分化の欠如は、不規則な分化、及び多能性細胞型が混入した異種細胞調製物（例えば、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ２発現細胞）、完全には分化していない細胞型（例えば、Ｐａｘ６及びＴｕｊ１発現細胞）、並びに分化非オリゴデンドロサイト前駆細胞型（例えば、ニューロン、アストロサイト、及び非神経細胞型）の発生につながる。更に、不規則な分化のため、非脳細胞の混合集団ではなく脳細胞の混合集団内のオリゴデンドロサイト前駆細胞のみに特異的である、ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲαなどの単一のマーカーに基づく細胞選別または選択技術は、Ｐｏｕｙａの調製物から望ましいオリゴデンドロサイト前駆細胞を確実に濃縮または精製するためには使用し得ない。したがって、Ｐｏｕｙａの調製物は、オリゴデンドロサイトの喪失またはミエリンの喪失から生じる状態の治療のために、臨床的または治療的に有用ではない。
【００１５】
本明細書に記載するように、出願人は、皮膚由来ヒトｉＰＳＣからの、ミエリン形成オリゴデンドロサイトの高度濃縮調製物のスケーラブルな生成のための、堅固かつ確実なプロトコルを開発した。本明細書で実証するように、ｉＰＳＣは、インビトロでの神経前駆細胞、グリア前駆細胞、オリゴデンドロサイト、及びアストロサイト分化の連続のステージを通して確実に進行する。不規則な分化が回避されるため、集団のＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα＋細胞は、臨床的使用前にＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲαに基づく選別を使用して更に精製及び濃縮され得る、オリゴデンドロサイト前駆細胞である。本発明のｈｉＰＳＣ由来オリゴデンドロサイト前駆細胞のミエリン形成の適格性は、先天性ミエリン形成不全の遺伝子モデルであるシバラーマウスモデルにおいて評価された。これらの細胞は、腫瘍形成または異所性非グリア分化いずれの証拠もなく、ミエリン形成不全のシバラーの脳で効率的かつ堅固にミエリン形成する。移植された動物はそれらの未処置の対応物よりも有意に長く生存し、さもなければ多数の動物は早期の致死率を明らかに免れ、これはｉＰＳＣに基づく計画を介した、致命的な遺伝性障害からの顕著な臨床的救済であった。したがって、正常な条件下で、ヒトｉＰＳＣは、オリゴデンドロサイト前駆細胞の実現可能かつ有効な供給源であり、それらに由来するミエリン形成中枢オリゴデンドロサイトは、中枢ミエリンの障害の治療のための、患者特異的な治療的ベクターとしての使用に適する。
[本発明1001]
ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα陽性細胞の調製物であって、前記調製物が、ＯＬＩＧ２及びＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲαを同時発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞を含み、前記細胞の調製物が、皮膚細胞に由来する多能性細胞に由来する、調製物。
[本発明1002]
ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα陽性細胞の調製物であって、前記調製物が、ＯＬＩＧ２及びＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲαを同時発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞を含み、前記細胞の調製物が、臍帯血に由来する多能性細胞に由来する、調製物。
[本発明1003]
ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα陽性細胞の調製物であって、前記調製物が、ＯＬＩＧ２及びＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲαを同時発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞を含み、前記細胞の調製物が、末梢血に由来する多能性細胞に由来する、調製物。
[本発明1004]
ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα陽性細胞の調製物であって、前記調製物が、ＯＬＩＧ２及びＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲαを同時発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞を含み、前記細胞の調製物が、骨髄に由来する多能性細胞に由来する、調製物。
[本発明1005]
調製物の少なくとも９５％がＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα陽性細胞である細胞の調製物であって、前記調製物が、ＯＬＩＧ２及びＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲαを同時発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞を含み、前記オリゴデンドロサイト前駆細胞が、オリゴデンドロサイト以外の分化体細胞の１つまたは複数のエピジェネティックマーカーを保持する、調製物。
[本発明1006]
前記調製物の前記細胞が、ヒト細胞である、本発明1001〜1005のいずれかの調製物。
[本発明1007]
前記調製物の前記オリゴデンドロサイト前駆細胞が、ＳＯＸ１０、ＣＤ９、またはこれらの組み合わせを更に発現する、本発明1001〜1005のいずれかの調製物。
[本発明1008]
前記細胞の調製物が、ＭＡＰ２抗体によって定められるニューロンを含有しない、本発明1001〜1005のいずれかの調製物。
[本発明1009]
１％未満の残留多能性細胞を含有する、本発明1001〜1005のいずれかの調製物。
[本発明1010]
前記細胞の調製物の１％未満が、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、またはＳＳＥＡ４タンパク質のいずれかを発現する、本発明1001〜1005のいずれかの調製物。
[本発明1011]
Ａ２Ｂ５＋／ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−選別胎児ヒト組織由来オリゴデンドロサイト前駆細胞の調製物のインビボミエリン形成効率を超えるインビボミエリン形成効率を有する、本発明1001〜1005のいずれかの調製物。
[本発明1012]
移植時に、Ａ２Ｂ５＋／ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−選別胎児ヒト組織由来オリゴデンドロサイト前駆細胞の調製物で達成可能なインビボミエリン形成密度を超えるインビボミエリン形成密度を達成することができる、本発明1001〜1005のいずれかの調製物。
[本発明1013]
Ａ２Ｂ５＋／ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−選別胎児ヒト組織由来オリゴデンドロサイト前駆細胞の調製物で達成可能な生存率と比較して、移植時に、ミエリン形成欠損哺乳動物において改善された生存率を達成することができる、本発明1001〜1005のいずれかの調製物。
[本発明1014]
前記調製物の少なくとも９０％が、オリゴデンドロサイト前駆細胞を含む、本発明1005の調製物。
[本発明1015]
前記調製物の少なくとも９５％が、オリゴデンドロサイト前駆細胞を含む、本発明1005の調製物。
[本発明1016]
前記１つまたは複数のエピジェネティックマーカーが、体性皮膚細胞の１つまたは複数のエピジェネティックマーカーを含む、本発明1005の調製物。
[本発明1017]
前記１つまたは複数のエピジェネティックマーカーが、１つまたは複数のメチル化マーカーを含む、本発明1005の調製物。
[本発明1018]
前記調製物の細胞の９５％超が、ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα陽性細胞である、本発明1005の調製物。
[本発明1019]
ミエリンの喪失またはオリゴデンドロサイトの喪失によって媒介される状態を有する対象を治療する方法であって、
前記状態の治療に有効な条件下で、前記対象に本発明1001〜1005のいずれかの調製物を投与する段階を含む、方法。
[本発明1020]
前記調製物の前記細胞が、ヒト細胞である、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記調製物の前記オリゴデンドロサイト前駆細胞が、ＳＯＸ１０、ＣＤ９、またはこれらの組み合わせを更に発現する、本発明1019の方法。
[本発明1022]
前記細胞の調製物が、ＭＡＰ２抗体によって定められるニューロンを含有しない、本発明1019の方法。
[本発明1023]
前記調製物が、１％未満の残留多能性細胞を含有する、本発明1019の方法。
[本発明1024]
前記細胞の調製物の１％未満が、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、またはＳＳＥＡ４タンパク質のいずれかを発現する、本発明1019の方法。
[本発明1025]
前記調製物が、脳、脳幹、脊髄、またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上の部位に投与される、本発明1019の方法。
[本発明1026]
前記調製物が、脳室内に、脳梁内に、または実質内に投与される、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記調製物が、前記対象に由来する、本発明1019の方法。
[本発明1028]
前記投与する段階が、前記調製物の前記オリゴデンドロサイト前駆細胞による脳脊髄軸全体への移植を達成するのに有効な条件下で実行される、本発明1019の方法。
[本発明1029]
前記状態が、自己免疫性脱ミエリン化状態である、本発明1019の方法。
[本発明1030]
前記自己免疫性脱ミエリン化状態が、多発性硬化症、視神経脊髄炎、横断性脊髄炎、及び視神経炎からなる群から選択される、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記状態が、血管性白質脳症である、本発明1019の方法。
[本発明1032]
前記血管性白質脳症が、皮質下梗塞、糖尿病性白質脳症、高血圧性白質脳症、加齢に伴う白質疾患、及び脊髄損傷からなる群から選択される、本発明1031の方法。
[本発明1033]
前記状態が、放射線誘導脱ミエリン化状態である、本発明1019の方法。
[本発明1034]
前記状態が、小児白質ジストロフィーである、本発明1019の方法。
[本発明1035]
前記小児白質ジストロフィーが、ペリツェウス・メルツバッハー病、テイ・サックス病、サンドホフ病ガングリオシドーシス、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症、ニーマン・ピックＡ病、副腎白質ジストロフィー、カナバン病、消失白質疾患、及びアレキサンダー病からなる群から選択される、本発明1034の方法。
[本発明1036]
前記状態が、脳室周囲白質軟化症または脳性麻痺である、本発明1019の方法。
[本発明1037]
オリゴデンドロサイト前駆細胞の濃縮調製物を生成する方法であって、以下の段階を含む、方法：
前記細胞が胚様体を形成するのに有効な条件下で、誘導多能性幹細胞の集団を培養する段階と、
前記胚様体の細胞の神経上皮細胞への分化、及び神経上皮細胞コロニーの形成を誘導する段階と、
前記神経上皮細胞コロニーを、オリゴデンドロサイト前駆細胞への分化を誘導するのに有効な条件に曝露する段階であって、それによりＯＬＩＧ２及びＣＤ１４０α／ＰＤＧＦＲαを同時発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞の濃縮調製物を形成する、段階。
[本発明1038]
前記濃縮調製物の前記オリゴデンドロサイト前駆細胞が、ＳＯＸ１０、ＣＤ９、またはこれらの組み合わせを更に発現する、本発明1037の方法。
[本発明1039]
オリゴデンドロサイト前駆細胞の前記濃縮調製物から、ＣＤ１４０α／ＰＤＧＦＲα陽性細胞を分離する段階であって、それによりＣＤ１４０α／ＰＤＧＦＲαを発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞の精製調製物を生成する、段階
を更に含む、本発明1037の方法。
[本発明1040]
前記神経上皮細胞が、ＰＡＸ６及びＳＯＸ１を同時発現する、本発明1037の方法。
[本発明1041]
前記誘導多能性幹細胞が、ヒト誘導多能性幹細胞である、本発明1037の方法。
[本発明1042]
非多能性細胞の集団を多能性状態に再プログラミングする段階であって、それにより誘導多能性幹細胞の前記集団を形成する、段階
を更に含む、本発明1037の方法。
[本発明1043]
非多能性細胞の前記集団が、皮膚細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞、または骨髄細胞の集団を含む、本発明1042の方法。
[本発明1044]
前記曝露する段階が、
前記神経上皮細胞を、ＯＬＩＧ２＋／ＮＫＸ２．２−であるプレオリゴデンドロサイト前駆細胞に変換することと、
前記ＯＬＩＧ２＋／ＮＫＸ２．２−プレオリゴデンドロサイト前駆細胞を、ＯＬＩＧ２＋／ＮＫＸ２．２＋プレオリゴデンドロサイト前駆細胞に形質転換することと、
前記ＯＬＩＧ２＋／ＮＫＸ２．２＋プレオリゴデンドロサイト前駆細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞の前記濃縮集団を形成することと
を含む、本発明1037の方法。
[本発明1045]
オリゴデンドロサイト前駆細胞の前記濃縮調製物を、オリゴデンドロサイト及び／またはアストロサイトに分化させる段階
を更に含む、本発明1037の方法。
[本発明1046]
本発明1037の方法によって生成される、調製物。
[本発明1047]
本発明1039の方法によって生成される、調製物。
[本発明1048]
本発明1045の方法によって生成される、調製物。
[本発明1049]
ミエリンの喪失またはオリゴデンドロサイトの喪失によって媒介される状態を有する対象を治療する方法であって、
前記状態を治療するのに有効な条件下で、前記対象に、本発明1046または1047の調製物を投与する段階を含む、方法。
[本発明1050]
前記調製物が、脳、脳幹、脊髄、またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上の部位に投与される、本発明1049の方法。
[本発明1051]
前記調製物が、脳室内に、脳梁内に、または実質内に投与される、本発明1050の方法。
[本発明1052]
前記調製物が、前記対象に由来する、本発明1049の方法。
[本発明1053]
前記投与する段階が、前記調製物の前記オリゴデンドロサイト前駆細胞による脳脊髄軸全体への移植を達成するのに有効な条件下で実行される、本発明1049の方法。
[本発明1054]
前記状態が、自己免疫性脱ミエリン化状態である、本発明1049の方法。
[本発明1055]
前記自己免疫性脱ミエリン化状態が、多発性硬化症、視神経脊髄炎、横断性脊髄炎、及び視神経炎からなる群から選択される、本発明1054の方法。
[本発明1056]
前記状態が、血管性白質脳症である、本発明1049の方法。
[本発明1057]
前記血管性白質脳症が、皮質下梗塞、糖尿病性白質脳症、高血圧性白質脳症、加齢に伴う白質疾患、及び脊髄損傷からなる群から選択される、本発明1056の方法。
[本発明1058]
前記状態が、放射線誘導脱ミエリン化状態である、本発明1049の方法。
[本発明1059]
前記状態が、小児白質ジストロフィーである、本発明1049の方法。
[本発明1060]
前記小児白質ジストロフィーが、ペリツェウス・メルツバッハー病、テイ・サックス病、サンドホフ病ガングリオシドーシス、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症、ニーマン・ピックＡ病、副腎白質ジストロフィー、カナバン病、消失白質疾患、及びアレキサンダー病からなる群から選択される、本発明1059の方法。
[本発明1061]
前記状態が、脳室周囲白質軟化症または脳性麻痺である、本発明1049の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）が、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）へと指向され得ることを示す。図１Ａは、ｈｉＰＳＣのＯＰＣへの指向された分化の、概略的プロトコルである。インビトロでの培養日数０〜５日からの未分化のｈｉＰＳＣ（ステージ１）から胚様体（ＥＢ）を分化させた。その後、ｂＦＧＦを有する神経誘導培地（ＮＩＭ；材料及び実施例１〜９の方法を参照されたい）内で、ＥＢを神経上皮（ＮＥ）細胞として分化させた。図１Ｂ〜１Ｄは、未分化のｈｉＰＳＣ（ステージ１）及びｈｉＰＳＣコロニーが、多能性マーカーＳＳＥＡ４及びＯＣＴ４を発現したことを示す。位相差（図１Ｂ）；ＳＳＥＡ４（赤色）（図１Ｃ）；ＤＡＰＩ（青色）。ＯＣＴ４（緑色）（図１Ｄ）；ＤＡＰＩ（青色）。赤血球体（ＥＢ）（図１Ｅ）及び神経上皮細胞（図１Ｆ及び１Ｇ）は、ｈｉＰＳＣ（ステージ２及び３）から発生し得る。このステージでのｈｉＰＳＣ由来神経上皮細胞は、神経上皮マーカーＰＡＸ６及びＳＯＸ１を発現した。位相差（図１Ｅ）；ＰＡＸ６（緑色）（図１Ｆ）；ＳＯＸ１（赤色）（図１Ｇ）。図１Ｈ及び１Ｉは、ＯＬＩＧ２＋及びＮＫＸ２．２−早期グリア前駆細胞が、レチノイン酸（ＲＡ）、及びソニックヘッジホッグ信号伝達の小分子作動薬であるパルモルファミンの影響下で出現することを実証する。ステージ４までに、ＯＬＩＧ２は、早期プレＯＰＣにおいて発現し、これはその後ＮＫＸ２．２発現を連続的に発達した。ＯＬＩＧ２（赤色）（図１Ｈ）；ＮＫＸ２．２（緑色）（図１Ｉ）。図１Ｊは、ＲＡが、ステージ５でｂＦＧＦによって交換される際、ＯＬＩＯ２＋／ＮＫＸ２．２−早期プレＯＰＣが、より後のステージのＯＬＩＧ２＋／ＮＫＸ２．２＋プレＯＰＣに分化したことを示す。ＯＬＩＧ２（赤色）；ＮＫＸ２．２（緑色）。図１Ｋ〜１Ｍは、プレＯＰＣが、ＰＤＧＦ−ＡＡ、Ｔ３、ＮＴ３、及びＩＧＦを補充したグリア誘導培地（ＧＩＭ；材料及び実施例１〜９の方法を参照されたい）内で、二分化能を有するＯＰＣに更に分化したことを示す。ミエリン形成性ＯＰＣの生成の最大化のために、ステージ６を最長３〜４ヶ月延長した。移植時までに、これらの細胞は、ＯＬＩＧ２及びＮＫＸ２．２（図１Ｋ）だけでなく、ＳＯＸ１０（図１Ｌ）及びＰＤＧＦＲα（図１Ｍ）をもまた発現した。ステージ６の終了時までに、ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣを、ＯＬＩＧ２＋／ＮＫＸ２．２＋／ＳＯＸ１０＋／ＰＤＧＦＲα＋として特定することができた。ＯＬＩＧ２（赤色）、ＮＫＸ２．２（緑色）（図１Ｋ）；ＳＯＸ１０（赤色）、ＮＫＸ２．２（緑色）（図１Ｌ）；ＰＤＧＦＲα（赤色）、ＯＬＩＧ２（緑色）（図１Ｍ）。図１Ｎ〜１Ｐは、Ｏ４＋（図１Ｎ）及びＭＢＰ＋（図１０）によって特定される、インビトロでの、ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣのｈｉＰＳＣ由来オリゴデンドロサイト（ｈｉＯＬ）への最終分化を示す。ＯＬ及びＧＦＡＰ＋アストロサイト（図１Ｐ）は、グリアマイトジェンの減少と共に生じた。Ｏ４（緑色）。（図１Ｎ）；ＭＢＰ（赤色）（図１０）；ＧＦＡＰ（緑色）（図１Ｐ）；ＤＡＰＩ（青色）。スケール：１００μｍ（図１Ｂ〜１Ｎ、１Ｐ）及び２５μｍ（図１０）。
【図２】ｈｉＰＳＣ株の特性評価を示す。本研究における３つ全てのｈｉＰＳＣ株は、ｈＥＳＣ株ＷＡ０９／Ｈ９（上段）と比較すると、ｈＥＳＣ様形態（位相画像）を示す。免疫標識は、ｈｉＰＳＣが、免疫反応性物であるＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ４及びＴＲＡ−１−６０を発現したことを確認した。スケール：２００μｍ。
【図３】図３Ａ〜３Ｊは、アストロサイト及びオリゴデンドロサイトの両方が、ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣから効率的に発生することを実証する。図３Ａは、ステージ３におけるオリゴデンドログリア系列ｈｉＰＳＣ由来神経上皮細胞の誘導中、ステージ４及び５におけるプレＯＰＣの誘導中、並びにステージ６におけるＯＰＣの誘導中の、神経マーカーの発現を示す。培養物を、ＰＡＸ６及びＳＯＸ１、またはＯＬＩＧ２及びＮＫＸ２．２についてそれぞれ免疫染色した。各マーカーの組の免疫陽性クラスタの割合を、各ｈｉＰＳＣ株について記録した。各群において少なくとも３度の反復を実行し、データを平均±ＳＥＭとして提供した。ステージ６において、グリア形成クラスタを単一の細胞懸濁液に解離し、ＧＩＭ内に播種した。これは、アストロサイト及びミエリン形成性ＯＬの両方の最終分化につながった。図３Ｂ及び３Ｃは、ＧＦＡＰ＋アストロサイトが、インビトロでの培養日数９５日までのｈｉＰＳＣ  ＯＰＣの培養物中で明らかであったことを実証し、ここでは、Ｃ２７由来（図３Ｂ）及びＫ０４由来（図３Ｃ）アストロサイトを示す。図３Ｄは、インビトロでの培養日数９５日での、培養された全ての細胞中のＧＦＡＰ＋アストロサイトの割合を示すグラフであり、残りは、オリゴデンドログリア系列マーカーを発現した（平均±ＳＥＭ；図４Ｉを参照されたい）。ＩＣＣ、免疫細胞化学。図３Ｅ〜３Ｊは、ステージ６の後（インビトロでの培養日数１６０日）に撮影した画像であり、ｈｉＰＳＣ由来ＯＰＣは、Ｏ４＋（図３Ｅ及び３Ｆ）並びにＭＢＰ＋（図３Ｇ）ＯＬの両方として分化した。図３Ｈ〜３Ｊは、ヒト胎児皮質ニューロンと共に同時培養される際に、Ｃ２７ｈｉＰＳＣ（図３Ｈ）、Ｃ１４ｈｉＰＳＣ（図３Ｉ）、及びＫ０４ｈｉＰＳＣ（図３Ｊ）由来のｈｉＰＳＣ  ＯＰＣが全て、ＮＦ＋軸索と係合したＭＢＰ＋ミエリン形成性ＯＬを発生したことを示す（ＭＢＰ、赤色；ＮＦ、緑色）。スケール：５０μｍ。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｍは、ｈｉＰＳＣからの連続的な神経上皮及びグリア分化を示す。図４Ａは、神経上皮細胞が、ケラチノサイト由来Ｋ０４ｈｉＰＳＣ株並びに線維芽細胞由来Ｃ１４及びＣ２７ｈｉＰＳＣ株の両方から効率的に誘導され得ることを示す。ステージ３までに、神経幹細胞は明らかであり、ロゼット様構造に組織化され、前神経マーカー、ＰＡＸ６及びＳＯＸ１を同時発現した（図４Ａと表示された細胞画像のパネル）。図４Ｂ〜４Ｃは、早期（ステージ４；図４Ｂ）プレＯＰＣ及び後期（ステージ５：図４Ｃ）ＯＰＣが、Ｈ９ｈＥＳＣ（ＷＡ０９）細胞からだけでなく、試験された３つ全てのｈｉＰＳＣ（Ｃ１４、Ｃ２７、及びＫ０４）株からも誘導され得ることを示す。ステージ４までに、ほとんどのｈｉＰＳＣまたはｈＥＳＣ由来プレＯＰＣがＯＬＩＧ２を発現し、より少ないものがＮＫＸ２．２を発現した。ステージ５までに、より多くのＮＫＸ２．２＋プレＯＰＣが出現し、二重標識ＯＬＩＧ２＋／ＮＫＸ２．２＋細胞は、典型的に評価された各株における全てのＤＡＰＩ＋細胞のうちの７０〜９０％を構成するようになった。図４Ｄ〜４Ｈは、各ｈｉＰＳＣ及びｈＥＳＣ株からの神経上皮細胞が、ＯＬＩＧ２＋／ＮＫＸ２．２＋／ＳＯＸ１０＋ＯＰＣに確実に分化し得ることを示す。図４Ｅ〜４Ｆは、図４Ｄを単一の色ごとに分けたものである。図４Ｉは、ステージ６でのＫ０４ｉＰＳＣ  ＯＰＣにおいて定量化される、ＯＬＩＧ２、ＮＫＸ２．２、またはＳＯＸ１０発現ＯＰＣの割合を示す棒グラフである。スケール：図４Ａ〜４Ｈ、５０μｍ。
【図４−２】図４Ｊ〜４Ｍは、オリゴデンドロサイト前駆細胞分化が、ＯＣＴ４（図４Ｊ）、ｈＴＥＲＴ（図４Ｋ）、ＯＬＩＧ２（図４Ｌ）、またはＮＫＸ２．２（図４Ｍ）を含む、多能性に関連する転写物の枯渇と並行して発生したことを示す棒グラフである。未分化の（ステージ１）ｈｉＰＳＣからのｍＲＮＡを、Ｃ２７、Ｋ０４、及びＷＡ９／Ｈ９細胞由来の分化（ステージ６）ｉＰＳＣ  ｈＯＰＣから抽出したそれと比較した。一方、ステージ６までに、ＯＣＴ４及びｈＴＥＲＴ転写物の両方がｈｉＰＳＣ  ＯＰＣにおいて有意に下方制御され、プレオリゴデンドログリア転写物ＯＬＩＧ２及びＮＫＸ２．２が有意に上方制御された。データを、平均±ＳＥＭとして示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、ＯＰＣが、ＣＤ１４０ａ及びＣＤ９指向ＦＡＣＳによって、混合ｈｉＰＳＣ培養物から単離され得ることを示す。図５Ａに示すように、ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣ由来ＯＬを、スルファチドを識別するモノクローナル抗体Ｏ４を使用して、ＦＡＣＳによって識別し、単離した。Ｏ４＋オリゴデンドログリアの発生率は、異なるｈｉＰＳＣ株にわたって、４％〜１２％の間で変動した（表３を参照されたい；ｎ＝４〜７回の実験）。図５Ｂは、ｈｉＰＳＣ（Ｃ２７及びＫ０４）に由来するＯＰＣが、細胞表面マーカーＡ２Ｂ５で容易に識別され得ることを示す。図５Ｃは、ｈｉＰＳＣ（Ｃ２７及びＫ０４）またはｈＥＳＣ（ＷＡ０９／Ｈ９）のいずれかに由来するＯＰＣが、ＦＡＣＳ分析によって、細胞表面マーカー、ＰＤＧＦＲα（ＣＤ１４０ａ）及びＣＤ９で容易に識別され得ることを示す。ＣＤ１４０ａ、ＣＤ９、及びＣＤ１４０ａ／ＣＤ９二重標識細胞の相対割合は、異なる細胞株由来ＯＰＣにわたって変動した（ｎ＝４〜７回の実験）。
【図６】図６Ａ〜６Ｇは、ｈｉＰＳＣが、広く遊走し、アストログリア及びミエリン形成性ＯＬとして分化することを実証する。３つ全てのｈｉＰＳＣ株から発生したｈｉＰＳＣ  ＯＰＣは、シバラーの脳中を遊走し、白質において最も密に生着した。Ｃ２７（図６Ａ）及びＫ０４（図６Ｂ）ｈｉＰＳＣ由来ＯＰＣの分布を示す（ｈＮＡ＋、赤色、Ｓｔｅｒｅｏ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒでマッピング）。生後１３週までに、Ｃ２７ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣ（図６Ｃ）、Ｋ０４ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣ（図６Ｅ及び６Ｇ）、並びにＣ１４ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣ（図６Ｈ）は、脳梁及び内包（図６Ｃ、６Ｅ、及び６Ｈ）、並びに線条体（図６Ｇ）領域を含む皮質下白質中で、ＭＢＰ発現オリゴデンドログリア（緑色）に成熟した。これらの生後１３週のシバラーマウスレシピエントにおいて、ｈｉＰＳＣ由来ＯＰＣであるＣ２７（図６Ｄ）、Ｋ０４（図６Ｆ）、及びＣ１４（図６Ｉ）はまた、アストログリア（ヒト特異的ＧＦＡＰ、緑色）、特に中枢白質における線維性アストロサイトとして分化した。スケール：１００μｍ（図６Ｃ〜６Ｉ）。
【図７】図７Ａ〜７Ｋは、ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣが、インビボで堅固にミエリン形成することを示す。３つ全ての試験されたｈｉＰＳＣ株由来のｈｉＰＳＣ  ＯＰＣを移植した、マウスの白質の脳梁及び内包の共焦点画像は、ドナー由来の密なミエリン形成を実証する：Ｃ２７由来（図７Ａ及び７Ｂ）、Ｋ０４由来（図７Ｅ〜７Ｇ）、並びにＣ１４由来（図７Ｉ及び７Ｊ）。図７Ａ、７Ｇ、及び７Ｊは、それぞれ、Ｃ２７、Ｋ０４、及びＣ１４ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣ（ｈＮＡ、赤色）による、豊富なドナー由来ＭＢＰ発現（緑色）を示す。個別のｈＮＡ＋ＯＬの代表的なＺスタックを、アスタリスクとして（図７Ａ及び７Ｅ）に示す。ここで評価される１９週の時点までに、Ｃ２７（図７Ｂ）、Ｋ０４（図７Ｆ及び７Ｇ）、並びにＣ１４（図７Ｊ）ｈｉＰＳＣオリゴデンドログリアは、軸索に堅固にミエリン形成した（ＮＦ、赤色）。ｈｉＰＳＣ由来オリゴデンドログリア形態を、図７Ｆ（Ｋ０４）及び図７Ｉ（Ｃ１４）に例示し、図７Ｆは、線条体内の単一のＯＬによる多軸索ミエリン形成を示す。ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣはまた、ヒトアストロサイトに典型的な、複雑な線維性形態を呈するアストログリア（ヒト特異的ＧＦＡＰ、緑色）を発生させた（図７Ｃ、Ｃ２７；図７Ｈ、Ｋ０４）。多くの細胞はまた、前駆細胞のままであった。ＮＧ２の免疫染色（図７Ｄ、Ｃ２７）及びヒト特異的ＰＤＧＦＲα（図７Ｋ、Ｃ１４）。スケール：５０μｍ（図７Ａ〜７Ｃ、７Ｇ、７Ｊ）；２０μｍ（図７Ｃ〜７Ｆ、７Ｈ、７Ｋ）；及び１０μｍ（図７Ｉ、並びに７Ａ及び７Ｅへの挿入図）。
【図８】図８Ａ〜８Ｅは、ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣが広くミエリン形成して、ミエリン形成不全のマウスの生存率を大幅に延長させることを示す。図８Ａは、新生仔への移植後の、生後７ヶ月でのｈｉＰＳＣ由来ドナー細胞（Ｃ２７）のシバラーマウスの脳における分布を示すドットマップである。ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣによる広範な分散及びキメラ化が、明白である（ｈＮＡ、赤色）。図８Ｂは、７ヶ月でのシバラーの前脳における、ｈｉＰＳＣ−ＯＰＣ由来ミエリン形成を示す。図８Ａの切片の１ｍｍ側方の切片。ＭＢＰ免疫反応性（緑色）は、全てのドナー由来であった。図８Ｃ及び８Ｄは、それぞれ出生時にＣ２７ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣを移植した２匹の追加の生後７ヶ月のマウスからの、異なる内外方向レベルで撮影した、前後切片におけるミエリン形成を示す。図８Ｅは、生理食塩水注入対照マウス（ｎ＝１９）と対比した、Ｃ２７ｉＰＳＣ−ＯＰＣ移植マウス（ｎ＝２２）の生存率を示す、カプラン−マイヤープロットである。残りの移植マウスを、生後９〜１０ヶ月（≧２７０日）で、電子顕微鏡のために屠殺した。スケール：２ｍｍ（図８Ａ及び８Ｂ）。
【図９】Ｋ０４由来ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣによる広範なミエリン形成を示す。新生仔期に移植されたシバラーの脳の冠状切片における、生後４．５ヶ月での、Ｋ０４由来ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣによるミエリン形成。ＭＢＰ、緑色。スケール：２ｍｍ。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｉは、ｈｉＰＳＣ由来オリゴデンドロサイトが、コンパクトミエリンを生成し、ランビエ絞輪を誘導することを示す。Ｃ２７ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣを新生仔期に移植した、生後４０週のシバラーマウスの脳梁（図１０Ａ及び１０Ｂ）並びに腹側橋（図１０Ｃ）にわたる切片の代表的な電子顕微鏡画像は、マウス軸索を鞘で覆う明白な主周期線（major dense line）を有する、ドナー由来コンパクトミエリンを示す。図１０Ｄ〜１０Ｇは、同じく４０週での、脳梁におけるドナー由来ミエリンの、より高倍率の画像を示す。図１０Ｄ及び１０Ｅは、成熟ミエリンの特性である、交互に並ぶ主周期線（矢頭）および周期間線（intraperiod line）が、明白であることを示す。図１０Ｆ及び１０Ｇは、それらの成熟が、タイトジャンクション（図１０Ｆ、矢頭）及び主周期線（図１０Ｇ、矢頭）の平行な配列によって示される、中央の軸索を鞘で覆う脳梁内のミエリン鞘を示す。この成熟ミエリン形成は、ｈｉＰＳＣオリゴデンドログリアによる、構造的に適切なランビエ絞輪の組織化を可能にした。図１０Ｈ及び図１０Ｉは、移植されたシバラーにおける絞輪部の再構成を、オリゴデンドロサイトの傍絞輪部のＣａｓｐｒタンパク質（赤色）の免疫染色によって実証し、ここでは、観察される隣接したランビエ絞輪を、βＩＶスペクトリン（緑色）によって特定する。単離された絞輪部を、図１０Ｉ内の共焦点断面図に示す。スケール：２００ｎｍ（図１０Ａ〜１０Ｅ）；１００ｎｍ（図１０Ｆ及び１０Ｇ）；並びに５μｍ（図１０Ｈ及び１０Ｉ）。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｅは、未処置のシバラーマウスではなく、ｈｉＰＳＣ−ＯＰＣ移植シバラーマウスにおけるミエリン形成を示す。トルイジン青は、Ｃ２７ｈｉＰＳＣ由来ＯＰＣ移植（図１１Ａ）または未処置の（図１１Ｂ）シバラーの脳内の、脳梁及び皮質層ＶＩにわたる半薄切片を染色した。図１１Ｃ及び１１Ｄは、移植された（図１１Ｃ）及び未処置の（図１１Ｄ）シバラーの脳の脳梁の電子顕微鏡写真である。図１１Ｅは、未移植のシバラー白質の低倍率図である。同一の動物を、図１１Ｄに示す。スケール：図１１Ａ〜１１Ｂ、１０μｍ；図１１Ｃ〜１１Ｄ、５００ｎｍ；図１１Ｅ、１μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα陽性細胞の調製物を対象とし、この調製物は、ＯＬＩＧ２及びＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲαを同時発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞を含む。本発明の一態様において、この細胞の調製物は、皮膚細胞に由来する多能性細胞に由来する。本発明の別の態様において、この細胞の調製物は、臍帯血に由来する多能性細胞に由来する。本発明の別の態様において、この細胞の調製物は、末梢血に由来する多能性細胞に由来する。本発明の別の態様において、この細胞の調製物は、骨髄に由来する多能性細胞に由来する。
【００１８】
オリゴデンドロサイト前駆細胞は、本明細書で言及される場合、オリゴデンドロサイト及びアストロサイトの両方を生じさせ得る二分化能を有する前駆細胞の集団を含む。
【００１９】
本明細書に記載したように、ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα陽性細胞の調製物は、制御された分化プロセスを指向する堅固かつスケーラブルなプロトコルを使用して、多能性細胞から派生する。本発明の一実施形態において、多能性細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。「誘導多能性幹細胞」は、本明細書で使用される場合、体細胞または組織幹細胞などの非多能性細胞に由来する多能性細胞に言及する。限定されることはないが、例えば、ｉＰＳＣ成人線維芽細胞（例えば、本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｓｔｒｅｃｋｆｕｓｓ−Ｂｏｍｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｃｅｌｌｓ，Ｈａｉｒ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ，ａｎｄ  Ｓｋｉｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，"Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｅｕｒｈｅａｒｔｊ／ｅｈｓ２０３（２０１２）を参照されたい）、臍帯血（例えば、本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｍａｔｒｉｘ  ａｎｄ  Ａｍｎｉｏｔｉｃ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（１５）：１１２２２７−１１２３４（２１１０）、及びＧｉｏｒｇｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｏｎｌｙ  Ｔｗｏ  Ｆａｃｔｏｒｓ：Ｏｃｔ４  ａｎｄ  Ｓｏｘ２，"Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，５（４）：８１１−８２０（２０１０））、骨髄（例えば、本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｓｔｒｅｃｋｆｕｓｓ−Ｂｏｍｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｃｅｌｌｓ，Ｈａｉｒ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ，ａｎｄ  Ｓｋｉｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，"Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｅｕｒｈｅａｒｔｊ／ｅｈｓ２０３（Ｊｕｌｙ１２，２０１２）、及びＨｕ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ−Ｆｒｅｅ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  ａｎｄ  Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｂｌｏｏｄ  ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１０−０７−２９８３３１（Ｆｅｂ．４，２０１１））、並びに末梢血（例えば、本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｓｏｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＳＴＥ��ＣＣＡ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ，"Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．６８：ｅ４３２７ｄｏｉ：１０．３７９１／４３２７（２０１２）に由来し得る。ｉＰＳＣはまた、ケラチノサイト、成熟Ｂ細胞、成熟Ｔ細胞、膵臓β細胞、メラノサイト、肝細胞、包皮細胞、頬細胞、肺線維芽細胞、骨髄前駆細胞、造血幹細胞、脂肪由来幹細胞、神経幹細胞、及び肝前駆細胞に由来し得る。ｉＰＳＣを非多能性細胞から発生させる方法が、本明細書により詳細に記載される。
【００２０】
脳内において、ＰＤＧＦＲαは、オリゴデンドロサイト前駆細胞によって高度かつ特異的に発現する（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｓｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，"ＣＤ１４０ａ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｍｙｅｌｉｎｏｇｅｎｉｃ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  Ｅｎｇｒａｆｔｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９（１０）：９３４−９４１（２０１１））。ＣＤ１４０ａは容易に検出され得、それゆえＰＤＧＦＲα発現の確実な指標またはマーカーとしての役割を果たす、ＰＤＧＦＲαの外部ドメインである。したがって、ＰＤＧＦＲα陽性細胞はＣＤ１４０ａによって特定され得、ＰＤＧＦＲα細胞の集団はＣＤ１４０ａを使用して濃縮され得る。そのような細胞は、ＰＤＧＦα＋／ＣＤ１４０ａ＋細胞と称される。
【００２１】
脳由来細胞の集団内のオリゴデンドロサイト前駆細胞のＰＤＧＦＲαは高度に特異的なマーカーである一方で、ＰＤＧＦＲαは脳外の複数の細胞によって発現し、それゆえ脳及び非脳細胞型の両方を含有する細胞の混合集団の状況において、オリゴデンドロサイト特異的なマーカーを構成しない。ｉＰＳＣの多能性特質、及びこれらの細胞の可能性のある不規則な分化のために、２つ以上のオリゴデンドロサイトマーカーの使用が、ｉＰＳＣに由来する細胞の調製物中のオリゴデンドロサイト前駆細胞の正確な特定のために望ましい。したがって、本発明の様々な細胞調製物のオリゴデンドロサイト前駆細胞は、ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα及びオリゴデンドロサイト転写物因子２（ＯＬＩＧ２）のそれらの同時発現によって特定される。本発明のいくつかの実施形態において、調製物のオリゴデンドロサイト前駆細胞は、ＳＯＸ１０、ＣＤ９、ＮＫＸ２．２、またはこれらの任意の組み合わせなどの１つ以上の他のオリゴデンドロサイト前駆細胞マーカーの同時発現によって、更にまたは代替的に特定される（例えば、本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｇｏｌｄｍａｎらに与えられた米国特許出願第２０１１／００５９０５５号を参照されたい）。
【００２２】
本発明の調製物のＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα／ＯＬＩＧ２オリゴデンドロサイト前駆細胞画分は、調製物の３０％超を構成し得る。本発明の別の実施形態において、調製物のオリゴデンドロサイト前駆細胞画分は、調製物の４０％超を構成する。本発明の他の実施形態において調製物のオリゴデンドロサイト前駆細胞画分は、調製物の４５％超、調製物の５０％超、調製物の５５％超、調製物の６０％超、調製物の６５％超、調製物の７０％超、調製物の７５％超、調製物の８０％超、または調製物の９０％超を構成する。
【００２３】
本発明の別の態様は、オリゴデンドロサイト前駆細胞について濃縮された細胞の調製物に関する。本発明の本態様は、調製物の少なくとも９５％がＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα陽性細胞である細胞の調製物を対象とし、この調製物は、ＯＬＩＧ２及びＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲαを同時発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞を含み、オリゴデンドロサイト前駆細胞は、オリゴデンドロサイト以外に分化体細胞の１つ以上のエピジェネティックマーカーを保持する。本発明の一実施形態において、調製物中の細胞の９５％超が、ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα陽性細胞である。本発明の別の実施形態において、調製物中の細胞の９８％超が、ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα陽性細胞である。本発明の本態様の一実施形態において、細胞調製物の少なくとも９０％は、オリゴデンドロサイト前駆細胞を含む。本発明の本態様の別の実施形態において、細胞調製物の少なくとも９５％は、オリゴデンドロサイト前駆細胞を含む。
【００２４】
本発明の細胞調製物は、好適には、非オリゴデンドロサイト前駆細胞である混入物質を実質的に含まない。特に、ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα陽性細胞の調製物は、アストロサイト（例えば、ＧＦＡＰ抗体によって定められる細胞）、ニューロン（例えば、ＭＡＰ２及びＰＳＡ−ＮＣＡＭ抗体によって定められる細胞）、ミクログリア（例えば、ＣＤ１１、ＣＤ３２、及びＣＤ３６抗体によって定められる細胞）、または非脳細胞型などの他の神経細胞型を実質的に含まない（例えば、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満を含有する）。オリゴデンドロサイト前駆細胞を含有する本発明の細胞調製物はまた、分化していない、残留する性多能性細胞型を実質的に含まず（例えば、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満を含有する）、例えば、調製物は、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、またはＳＳＥＡ４のいずれかを発現する細胞を実質的に含まず、それほど分化していない細胞系列、例えば、ＰＡＸ６及び／またはＴＵＪ１発現によって特定される神経前駆細胞を実質的に含まない。
【００２５】
本発明の一実施形態において、本発明の調製物の細胞は哺乳動物細胞であり、限定されることはないが、例えば、ヒト、サル、ラット、またはマウス細胞を含む。
【００２６】
本発明の細胞調製物、及び特に本発明のオリゴデンドロサイト前駆細胞集団は、その体細胞起源の１つ以上のエピジェネティックマーカーの維持に基づいて、組織由来または胚性幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞対応物から機能上区別され得る。例えば、ｉＰＳＣが皮膚線維芽細胞などの皮膚細胞に由来する際、ｉＰＳＣ由来オリゴデンドロサイト前駆細胞は、体性皮膚細胞の１つ以上のエピジェネティックマーカーを維持する。１つ以上のエピジェネティックマーカーは、メチル化マーク（例えば、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡメチル化マーカー）、またはヒストン修飾（例えば、アセチル化、メチル化、ユビキチン化、リン酸化、またはＳＵＭＯ化）を、限定されることなく含み得る。
【００２７】
本発明のオリゴデンドロサイト前駆細胞調製物は、それらの組織由来または胚性幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞対応物から、機能的に区別可能である。本明細書で実証するように、本発明の細胞調製物は、Ａ２Ｂ５＋／ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−またはＣＤ１４０ａ＋選別胎児ヒト組織由来オリゴデンドロサイト前駆細胞の調製物のインビボミエリン形成効率を超えるインビボミエリン形成効率を有する。ミエリン形成効率は、移植後の時間の関数として、ミエリン形成した中枢軸索の割合によって測定される。本明細書で実証するように、本発明の細胞調製物はまた、移植時に、Ａ２Ｂ５＋／ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−またはＣＤ１４０ａ＋選別胎児ヒト組織由来オリゴデンドロサイト前駆細胞の調製物で達成可能なインビボミエリン形成密度を超えるインビボミエリン形成密度を達成することができる。更に、本発明の細胞調製物は、Ａ２Ｂ５＋／ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−またはＣＤ１４０ａ＋選別胎児ヒト組織由来オリゴデンドロサイト前駆細胞の調製物で達成可能な生存率と比較して、移植時に、ミエリン形成欠損哺乳動物において改善された生存率を達成することができる。言い換えると、任意の所定の時点で生存するミエリン形成欠損哺乳動物の割合は、それ以外は同様に処置された胎児ヒト組織由来Ａ２Ｂ５＋／ＰＳ−ＮＣＡＭ−細胞で移植された哺乳動物よりも、ｉＰＳＣオリゴデンドロサイト前駆細胞で移植された哺乳動物において大きい。例えば、胎児組織由来オリゴデンドロサイト前駆細胞で移植された動物のうちの約２５％のみが、生後６ヶ月を超えて生存した一方で、ｉＰＳＣ由来オリゴデンドロサイト前駆細胞で移植された動物のうちの５０％が、６ヶ月を超えて生存した。したがって、本発明のオリゴデンドロサイト前駆細胞調製物は、非ｉＰＳＣ由来オリゴデンドロサイト前駆細胞調製物から機能的に区別可能である。
【００２８】
ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲαで濃縮した調製物を含む本発明の細胞調製物は、細胞の総数を増加させるために、培養物中で任意に増殖され得る。細胞は、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を支持するマイトジェンとしてのＰＤＧＦ−ＡＡまたはＡＢへの、連続的または断続的な曝露のいずれかによって増殖され得る。それらは、グリア前駆細胞の有糸分裂による増殖を支持し得るが、それらの分化をオリゴデンドロサイト並びにアストロサイトの混合集団へと偏らせ得る、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８、及びＦＧＦ９を含む線維芽細胞成長因子に曝露され得る。細胞はまた、血小板枯渇血清または全血清のいずれかで任意に補充し得る、ＦＧＦ２、ＰＤＧＦ、及びＮＴ３の組み合わせを補充した培地において増殖され得る（そこに記載される方法及び組成物が参照により組み込まれる、Ｎｕｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．"Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｓｕｂｃｏｒｔｉｃａｌ  Ｗｈｉｔｅ  Ｍａｔｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ，"Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ９：２３９−２４７、Ｗｉｎｄｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｆｅｔａｌ  ａｎｄ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｅｓ  Ｍｙｅｌｉｎａｔｅ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｌｙ  Ｄｙｓｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  Ｂｒａｉｎ，"Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ１０：９３−９７（２００４）を参照されたい）。
【００２９】
オリゴデンドロサイト前駆細胞の集団は、任意で遺伝子組換えされて、対象の１つ以上のタンパク質を発現する。例えば、細胞は、外因性標的化部分、外因性マーカー（例えば、撮像目的のもの）、または同様物を発現させるために修飾され得る。本発明の細胞調製物のオリゴデンドロサイト前駆細胞は、内因性標的化部分、マーカー、ミエリン塩基性タンパク質、または同様物を過剰発現させるために任意で修飾され得る。
【００３０】
本発明の別の態様は、オリゴデンドロサイト前駆細胞の濃縮調製物を生成する方法を対象とする。本方法は、細胞が胚様体を形成するのに有効な条件下で、誘導多能性幹細胞の集団を培養することと、胚様体の細胞の神経上皮細胞への分化、及び神経上皮細胞コロニーの形成を誘導することと、を含む。本方法は、神経上皮細胞コロニーを、オリゴデンドロサイト前駆細胞への分化を誘導するのに有効な条件に曝露し、それによりＯＬＩＧ２及びＣＤ１４０α／ＰＤＧＦＲαを同時発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞の濃縮調製物を形成することを更に含む。オリゴデンドロサイト前駆細胞の濃縮調製物は、ＳＯＸ１０、ＣＤ９またはこれらの組み合わせを更に発現し得る。
【００３１】
ｉＰＳＣは、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット）、有蹄動物（ウシ、ヒツジなど）、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、ヤギ、及び同様物を含むが、これらに限定されない、任意の種に由来し得る。ｉＰＳＣは、末梢血、臍帯血、及び骨髄からの胚性、胎児/胎仔、新生児/新生仔、及び成人/成体組織から取得され得る。使用され得る例示的な体細胞は、皮膚試料または生検から取得される皮膚線維芽細胞などの線維芽細胞、滑膜組織からの滑膜細胞、ケラチノサイト、成熟Ｂ細胞、成熟Ｔ細胞、膵臓β細胞、メラノサイト、肝細胞、包皮細胞、頬細胞、または肺線維芽細胞を含む。ｉＰＳＣ生成に適した例示的な幹または前駆細胞は、限定されることはないが、骨髄前駆細胞、造血幹細胞、脂肪由来幹細胞、神経幹細胞、肝前駆細胞を含む。皮膚及び頬は、適切な細胞の容易に利用可能かつ容易に達成可能な供給源を提供するものの、実質的には任意の細胞が使用され得る。
【００３２】
誘導多能性幹細胞は、体細胞内で再プログラミング因子の組み合わせを発現させることによって生成され得る。ｉＰＳＣ発生を促進及び誘導する、適した再プログラミング因子は、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｃ／ＥＢＰα、Ｅｓｒｒｂ、Ｌｉｎ２８、及びＮｒ５ａ２のうちの１つ以上を含む。特定の実施形態において、少なくとも２つの再プログラミング因子が、体細胞内で発現して、体細胞をうまく再プログラミングする。他の実施形態において、少なくとも３つの再プログラミング因子が、体細胞内で発現して、体細胞をうまく再プログラミングする。他の実施形態において、少なくとも４つの再プログラミング因子が、体細胞内で発現して、体細胞をうまく再プログラミングする。
【００３３】
ｉＰＳＣは、細胞再プログラミングを促進する遺伝子を送達するために、統合ウイルス性ベクター（例えば、レンチウイルス性ベクター、誘導可能レンチウイルス性ベクター、及びレトロウイルス性ベクター）、切除可能ベクター（例えば、トランスポゾン及びｌｏｘＰ導入レンチウイルス性ベクター）、並びに非統合ベクター（例えば、アデノウイルス性及びプラスミドベクター）の使用を含む、当該技術分野において既知の方法によって派生し得る（例えば、本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ１２６：６６３−６７６（２００６）、Ｏｋｉｔａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４４８：３１３−３１７（２００７）、Ｎａｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１０１−１０６（２００７）、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ１３１：１−１２（２００７）、Ｍｅｉｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５：１１７７−１１８１（２００７）、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３１８：１９１７−１９２０（２００７）、Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ４５１：１４１−１４６（２００８）、及び米国特許出願公開第２００８／０２３３６１０号を参照されたい）。ＩＰＳ細胞を発生させるための他の方法は、本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００９／００６９３０、ＷＯ２００９／００６９９７、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００８／１１８８２０、Ｉｋｅｄａらに与えられた米国特許出願公開第２０１１／０２００５６８号、Ｅｇｕｓａらに与えられた同第２０１０／０１５６７７８号、Ｍｕｓｉｃｋに与えられた同第２０１２／０２７６０７０、及びＮａｋａｇａｗａに与えられた同第２０１２／０２７６６３６号、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ３（５）：５６８−５７４（２００８）、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４５４：６４６−６５０（２００８）、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ１３６（３）：４１１−４１９（２００９）、Ｈｕａｎｇｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２６：１２６９−１２７５（２００８）、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ３：４７５−４７９（２００８）、Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１１：１９７−２０３（２００９）、並びにＨａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ１３３（２）：２５０−２６４（２００８）に公開されるものを含む。
【００３４】
トランスジェニック配列を含まないｉＰＳＣを派生させるための統合を含まないアプローチ、すなわち、非統合ベクター及び切除可能ベクターを使用するものが、治療的状況において特に適する。非統合ベクターを利用するｉＰＳＣ生成の適した方法は、アデノウイルス性ベクター（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｖｉｒａｌ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ３２２：９４５−９４９（２００８）、及びＯｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ３２２：９４９−９５３（２００８））、センディ（Ｓｅｎｄｉ）ウイルスベクター（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｆｕｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ−Ｆｒｅｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｓｅｎｄｉ  Ｖｉｒｕｓ，ａｎ  ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｈａｔ  Ｄｏｅｓ  Ｎｏｔ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｈｏｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ，"Ｐｒｏｃ  Ｊｐｎ  Ａｃａｄ．８５：３４８−３６２（２００９））、多シストロン性ミニサークルベクター（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａ  Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｄｅｒｉｖｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  ｉＰＳ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ７：１９７−１９９（２０１０））、並びに自己複製選択可能エピソーム（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｆｒｅｅ  ｏｆ  Ｖｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ３２４：７９７−８０１（２００９））を使用する方法を含む。切除可能ベクターを使用するｉＰＳＣ発生のための適した方法は、本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｋａｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｖｉｒｕｓ−Ｆｒｅｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ａｎｄ  Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  Ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒｓ，"Ｎａｔｕｒｅ４５８：７７１−７７５（２００９）、Ｓｏｌｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐａｔｉｅｎｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｆｒｅｅ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒｓ，"Ｃｅｌｌ１３６：９６４−９７７（２００９）、Ｗｏｌｔｊｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，"ＰｉｇｇｙＢａｃ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｓ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｔｏ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｎａｔｕｒｅ４５８：７６６−７７０（２００９）、及びＹｕｓａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ−Ｆｒｅｅ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｍｏｕｓｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＰｉｇｇｙＢａｃ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ，"Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ６：３６３−３６９（２００９）によって記載されている。ｉＰＳＣ発生のための適した方法はまた、組み換え型タンパク質としての（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，"Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ４：３８１−３８４（２００９））、またはＥＳＣから単離された全細胞抽出としての（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ａｄｕｌｔ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，"Ｂｌｏｏｄ１１６：３８６−３９５（２０１０））再プログラミング因子の直接送達を含む方法を含む。
【００３５】
以上に記載されるｉＰＳＣ発生の方法は、再プログラミング効率を改良する、または再プログラミング因子に代わりさえする、小分子を含むように修正され得る。これらの小分子は、限定されることはないが、Ｌ型カルシウムチャネル作動薬であるＢａｙＫ８６４４と共に、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤５'−アザシチジンなどのエピジェネティックモジュレーター、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬ＶＰＡ、及びＧ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤ＢＩＸ−０１２９４、を含む。他の小分子再プログラミング因子は、ＴＧＦ−β阻害剤及びキナーゼ阻害剤（例えば、ケンパウロン）などの、シグナル伝達経路を標的化するものを含む（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｓｏｍｍｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｓｔｏｓｌａｖｓｋｙ，"Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．１：２６ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓｃｒｔ２６（Ａｕｇｕｓｔ１０，２０１０）による概説を参照されたい）。
【００３６】
成人線維芽細胞に由来する適したｉＰＳＣは、本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｓｔｒｅｃｋｆｕｓｓ−Ｂｏｍｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｃｅｌｌｓ，Ｈａｉｒ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ，ａｎｄ  Ｓｋｉｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，"Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｅｕｒｈｅａｒｔｊ／ｅｈｓ２０３（２０１２）に記載される手順に従って取得され得る。臍帯血細胞に由来するｉＰＳＣは、本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｍａｔｒｉｘ  ａｎｄ  Ａｍｎｉｏｔｉｃ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（１５）：１１２２２７−１１２３４（２１１０）、及びＧｉｏｒｇｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｏｎｌｙ  Ｔｗｏ  Ｆａｃｔｏｒｓ：Ｏｃｔ４  ａｎｄ  Ｓｏｘ２，"Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，５（４）：８１１−８２０（２０１０）に記載されるように取得され得る。骨髄細胞に由来する適したｉＰＳＣは、本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｓｔｒｅｃｋｆｕｓｓ−Ｂｏｍｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｃｅｌｌｓ，Ｈａｉｒ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ，ａｎｄ  Ｓｋｉｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，"Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｅｕｒｈｅａｒｔｊ／ｅｈｓ２０３（Ｊｕｌｙ１２，２０１２）、及びＨｕ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ−Ｆｒｅｅ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  ａｎｄ  Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｂｌｏｏｄ  ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１０−０７−２９８３３１（Ｆｅｂ．４，２０１１）に記載される方法を使用して取得され得る。末梢血に由来するｉＰＳＣは、本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｓｏｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＳＴＥＭＣＣＡ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ，"Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．６８：ｅ４３２７ｄｏｉ：１０．３７９１／４３２７（２０１２）に記載される方法に従って取得され得る。本発明の方法における使用のために企図されるｉＰＳ細胞は、以上の参照において記載されるものに限定されない��、むしろ細胞が、多能性幹細胞以外の細胞から人工的に誘導される限り、任意の方法によって調製された細胞を含む。
【００３７】
本明細書に記載し、図１Ａに示すように、神経及びグリア前駆細胞分化の連続するステージを通してｉＰＳＣを指向するプロトコルを使用して、オリゴデンドロサイト前駆細胞はｉＰＳＣから派生し得る。系列限定の各ステージは、特定の細胞タンパク質の発現によって特徴付けられ、特定される。
【００３８】
図１Ａを参照すると、プロセスのステージ１は、胚様体形成を誘導するのに有効な条件下で、ｉＰＳＣを培養することを含む。本明細書に記載したように、ｉＰＳＣは、胚性幹細胞（ＥＳＣ）培地（例えば、適した血清代替物及びｂＦＧＦを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２）において、胚性線維芽細胞などの他の細胞との同時培養物において維持され得る。ｉＰＳＣは、コロニーの直径が約２５０〜３００μｍである際、１００％コンフルエンスに達する前に、例えば、８０％コンフルエンスで継代培養される。細胞の多能性状態は、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＯＣＴ−４、ＮＡＮＯＧ、及び／またはＳＯＸ２マーカーを使用して容易に評価し得る。
【００３９】
多能性幹細胞の複雑な三次元細胞凝集体である、胚様体（ＥＢ）を発生させる（ステージ２）ために、ｉＰＳＣ培養物は、それらが、コロニー直径２５０〜３００μｍまたは約２５０〜３００μｍで約８０％コンフルエンスを達成すると、解離される。ＥＢは、ｂＦＧＦを有さないＥＳＣ培地内の懸濁液でまず培養され、その後ｂＦＧＦ及びヘパリンを有する神経誘導培地に交換される。神経上皮分化を誘導する（ステージ３）ために、ＥＢが播種され、ｂＦＧＦ、ヘパリン、ラミニンを補充した神経誘導培地内で培養され、その後レチノイン酸を補充した神経誘導培地に交換される。神経上皮分化は、中枢神経幹細胞及び前駆細胞を特徴付ける、ＰＡＸ６及びＳＯＸ１の同時発現によって評価される。
【００４０】
プレオリゴデンドロサイト前駆細胞（「プレＯＰＣ」）分化を誘導するために、神経上皮細胞コロニーは、レチノイン酸、Ｂ２７補助、及びソニックヘッジホッグ（ｓｈｈ）作動薬（例えば、パルモファミン（ｐｕｒｍｏｐｈａｍｉｎｅ））を含む追加の因子の存在下で培養される。プレＯＰＣコロニーの出現は、ＯＬＩＧ２及び／またはＮＫＸ２．２発現の存在によって評価され得る。ＯＬＩＧ２及びＮＫＸ２．２の両方が中枢オリゴデンドロサイト前駆細胞によって発現する一方で、ＮＫＸ２．２はオリゴデンドログリア分化のより特異的な指標である。したがって、早期プレオリゴデンドロサイト前駆細胞ステージは、ＯＬＩＧ＋／ＮＫＸ２．２−細胞コロニーによってマークされる。ＯＬＩＧ＋／ＮＫＸ２．２−早期プレＯＰＣは、レチノイン酸をｂＦＧＦと交換することによって、後期ステージのＯＬＩＧ＋／ＮＫＸ２．２＋プレＯＰＣに分化する。ステージ５の終了時に、ＯＬＩＧ２＋／ＮＫＸ２．２＋発現プロファイルによって示されるように、有意なパーセンテージの細胞は、プレＯＰＣである。
【００４１】
プレＯＰＣは、トリヨードチロニン（Ｔ３）、ニューロトロフィン３（ＮＴ３）、インスリン成長因子（ＩＧＦ−１）、及び血小板由来成長因子−ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）（ステージ６）などの成長因子を補充したグリア誘導培地内での培養によって、二分化能を有するオリゴデンドロサイト前駆細胞に更に分化する。これらの培養条件は、ミエリン形成性オリゴデンドロサイト前駆細胞の生成を最大化するために、３〜４ヶ月間またはそれ以上延長され得る。治療的移植に適した細胞調製物は、ＯＬＩＧ２＋／ＮＫＸ２．２＋／ＳＯＸ１０＋／ＰＤＧＦＲα＋オリゴデンドロサイト前駆細胞を含有するものとして特定される。Ｏ４＋及びミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）によって特定される、オリゴデンドロサイト前駆細胞のオリゴデンドロサイトへのインビトロでの最終分化は、グリアマイトジェンを減少させた更なる培養において生じた。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法を使用して生成された細胞調製物中のオリゴデンドロサイト前駆細胞を、濃縮することが好適であり得る。したがって、一実施形態において、ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα陽性細胞の選択が、オリゴデンドロサイト前駆細胞の精製または濃縮調製物を生成するために用いられる。本発明の別の実施形態において、ＣＤ９陽性細胞の選択を用いて、オリゴデンドロサイト前駆細胞の精製または濃縮調製物が生成される。更に別の実施形態において、ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα及びＣＤ９陽性細胞の両方の選択を用いて、オリゴデンドロサイト前駆細胞の精製または濃縮調製物が生成される。
【００４３】
ＰＤＧＦＲαマーカー及び／またはＣＤ９マーカーに関する選択は、連続的または順次的に実行され得、免疫パニングなどの当該技術分野において既知である従来の方法を使用して実行され得る。選択方法は、蛍光選別（ＦＡＣＳ）、磁気選別（ＭＡＣＳ）、または迅速かつ効率的な細胞選別を可能にする、任意の他の方法の使用を任意で含む。細胞選別のための方法の例は、例えば、本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、米国特許第６，６９２，９５７号に教示される。
【００４４】
一般的に、細胞選別方法は検出可能な部分を使用する。検出可能な部分は、酵素、フルオロフォア、ビオチン、発色団、放射性同位体、着色ビーズ、電気化学、化学修飾または化学発光部分を含むが、これに限定されない、任意の適した直接的または間接的標識を含む。一般的な蛍光部分は、フルオレセイン、シアニン色素、クマリン、フィコエリトリン、フィコビリンタンパク質、塩化ダンシル、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、及びランタニド複合体またはその誘導体を含む。磁気細胞選別が使用され得る。
【００４５】
細胞選別が実行される際、マーカーは外部ドメインであり得、細胞透過処理または膜破壊技術は使用されない。一例として、ＰＤＧＦＲαマーカー選択工程は、ＰＤＧＦＲαの外部ドメイン（例えば、ＣＤ１４０ａ）と結合する、抗体または他の結合部分を使用して任意で実行される。適した抗体は、モノクローナル及びポリクローナル抗体、キメラ抗体、選択されたマーカーに結合することができる抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ断片）、並びに単鎖抗体を含むが、これに限定されない。他の結合部分は、マーカーに特異的に結合する、マーカーリガンド、補助因子、及び同様物を含む。したがって、受容体であるマーカーの場合、受容体リガンドまたはその結合部分が、検出可能な部分として使用され得る。抗体及び他の結合部分は、商業的に利用可能である、または当業者に利用可能な技術を使用して作製され得る。
【００４６】
当業者は、特異的なマーカーに従って、またはそれに対抗して選択する方法を容易に理解する。したがって、一例として、特定のマーカーに従って選別された細胞の集団は、その特定のマーカーについて陽性である細胞を特定することと、更なる使用または更なる選択工程のためにそれらの細胞を保持することと、を含む。特異的なマーカーに対抗して選別された細胞の集団は、その特定のマーカーについて陽性である細胞を特定することと、更なる使用または更なる選択工程のためにそれらの細胞を排除することと、を含む。
【００４７】
本発明の別の態様は、ミエリンの喪失またはオリゴデンドロサイトの喪失によって媒介される状態を有する対象を治療する方法を対象とする。本方法は、状態の治療に有効な条件下で、対象に本発明のオリゴデンドロサイト前駆細胞調製物のいずれか１種を投与することを含む。本発明の本態様に従うと、本明細書に記載される細胞調製物のうちのいずれも、治療的処置に適する。
【００４８】
本発明の方法に従って治療され得る、ミエリンの喪失またはオリゴデンドロサイトの喪失よって媒介される状態は、ミエリン形成不全障害及び脱ミエリン化障害を含む。本発明の一実施形態において、状態は、例えば、多発性硬化症、視神経脊髄炎、横断性脊髄炎、及び視神経炎などの、自己免疫性脱ミエリン化状態である。本発明の別の実施形態において、ミエリン関連障害は、例えば、皮質下梗塞、糖尿病性白質脳症、高血圧性白質脳症、加齢に伴う白質疾患、及び脊髄損傷などの血管性白質脳症である。本発明の別の実施形態において、ミエリン関連状態は、放射線誘導脱ミエリン化状態である。本発明の別の実施形態において、ミエリン関連障害は、例えば、ペリツェウス・メルツバッハー病、テイ・サックス病、サンドホフ病ガングリオシドーシス、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症、ニーマン・ピックＡ病、副腎白質ジストロフィー、カナバン病、消失白質疾患、及びアレキサンダー病などの小児白質ジストロフィーである。本発明の更に別の実施形態において、ミエリン関連状態は、脳室周囲白質軟化症または脳性麻痺である。
【００４９】
対象に投与されるオリゴデンドロサイト前駆細胞の数は、レシピエントのサイズ及び種、並びにミエリン生成または交換を必要とする組織の体積に応じて、各移植（例えば、注入部位）あたり、細胞約１０２〜１０８個の範囲であり得る。単一の移植（例えば、注入）用量は、細胞１０３〜１０５、１０４〜１０７、及び１０５〜１０８個の範囲、または移植レシピエント患者のための任意の合計量に及び得る。
【００５０】
対象への細胞の送達は、神経系内へ直接の、単一の工程または複数の工程のいずれかの注入を含み得る。特に、細胞は、脳、脳幹、脊髄、及び／またはこれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上の部位に直接送達され得る。視神経の脱ミエリン化などの局在化障害のためには、単一の注入が使用され得る。本発明のオリゴデンドロサイト前駆細胞は、移植レシピエントの脳内で広く分散するものの、広範な脱ミエリン化またはミエリン形成不全障害については、治療を最適化するために、複数の注入部位が実行され得る。注入は、脳室内、脳梁内、または実質内注入を介して、脳梁（例えば、原基の前後内に）、脊髄後柱、小脳脚、大脳脚のような、白質域などの中枢神経系の領域内に任意で指向される。そのような注入は、任意で付随する撮像方法（例えば、高解像度ＭＲＩ撮像）で、定位脳手術などの精密な局在化方法を使用して、片側または両側に行われ得る。当業者は脳領域は種にわたって異なることを認識するが、当業者はまた、哺乳動物種にわたって同等な脳領域を認識する。
【００５１】
細胞移植片は、解離した細胞として任意で注入されるが、それは、解離していない細胞の局所配置によっても提供され得る。いずれの場合においても、細胞移植は許容可能な溶液を任意で含む。そのような許容可能な溶液は、望ましくない生物活性及び汚染を回避する溶液を含む。適した溶液は、製剤の等張性を与えるための適切な量の薬学的に許容可能な塩を含む。薬学的に許容可能な溶液の例は、生理食塩水、リンゲル溶液、ブドウ糖溶液、及び培養培地を含むが、これに限定されない。溶液のｐＨは、好適には約５〜約８、及びより好適には約７〜約７．５である。
【００５２】
解離した細胞移植片の注入は、注入装置の入口経路、出口経路、または入口経路及び出口経路の両方にわたって行われる流動注入であり得る（例えば、カニューレ、針、チューブ）。均一な入口及び出口速度、並びに注入速度及び体積を提供するために、自動化が使用され得る。
【００５３】
任意で、例えば、実施例に記載されるような多箇所への送達計画が使用され得る。そのような多箇所への送達計画は、レシピエントの中枢神経系を通して、広範、密、かつ脳脊髄軸全体へのドナー細胞移植を達成するように設計される。注入部位は、間にある灰白質構造からの妨害（または限定された妨害）のない、主要な脳領域、脳幹、及び脊髄白質域のうちの１つ以上の部位内への、遊走ドナー細胞の連続的な浸潤を可能にするように選択され得る。例えば、注入部位は、前脳皮質下内の４つの位置、特に脳梁原基の前後内に（両側に）、並びに小脳脚内の第５の位置内に（背側性に）、を任意で含み得る。
【００５４】
任意で、本明細書に提供される治療の方法は、再ミエリン形成を直接的または間接的に評価することを更に含む。例えば、画像化技術、伝導速度、または症候性の改善が、移植に続いて任意で試験される。
【００５５】
本発明のオリゴデンドロサイト前駆細胞の利点は、自家細胞治療のための患者に特異的な調製物（すなわち、細胞調製物は、治療される対象に由来する）を取得する能力である。自家オリゴデンドロサイト前駆細胞は、例えば、治療される対象の体性皮膚細胞、臍帯血液、末梢血、または骨髄に由来し得る。同種及び／または異種供給源に由来するオリゴデンドロサイト前駆細胞はまた、本発明の方法における使用のために適する。
【実施例】
【００５６】
以下の実施例は、本発明の実施形態を図示するために提供されるが、それらは、決してその範囲を限定することを意図されない。
【００５７】
実施例１〜９の材料及び方法
ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ培養物。多能性細胞の４つの異なる株を本研究において使用した。これらは、ｈＥＳＣ（ＷＡ０９／Ｈ９；Ｗｉ細胞，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）、並びにケラチノサイト起源（Ｋ０４；Ｋ．Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ）及び線維芽細胞起源の両方のｈｉＰＳＣを含んだ（Ｃ１４及びＣ２７ｈｉＰＳＣ；Ｌ．Ｓｔｕｄｅｒ）。記載される実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｖｅｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
【００５８】
ＯＰＣ生成。図１に概略化し、以下に詳細に記載するように、公開されたプロトコルの修正を使用して、ｈＥＳＣ及びｉＰＳＣからＯＰＣを誘導した（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ＳＨＨ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ａｎｄ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ＦＧＦ  Ｅｆｆｅｃｔｓ，"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１３６：１４４３−１４５２（２００９）、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．４：１６１４−１６２２（２００９ｂ）、Ｉｚｒａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｎｏｇｇｉｎ  ｏｎ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｏｎ  Ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ，"Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３４：３１０−３２３（２００７））。
【００５９】
アストロサイトまたはオリゴデンドロサイトを指向する成熟。インビトロでの培養日数１２０〜１７０日での、ｈｉＰＳＣまたはｈＥＳＣに由来するグリア形成塊を、血小板由来成長因子−ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ；１０ｎｇ／ｍｌ）、インスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１；１０ｎｇ／ｍｌ）、及びニューロトロフィン−３（ＮＴ３；１０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＧＩＭ内の懸濁液中で培養した。これらのＯＰＣを成熟オリゴデンドロサイト（ＯＬ）またはアストロサイトに分化させるために、塊を、Ｓｈａｒｐｏｉｎｔブレード（Ｓｕｒｇｉｍｅｄ−ＭＬＢ）で機械的に、小さな細胞クラスタ（直径約５０〜１００ｍｍ）に刻んだ。刻まれたＯＰＣクラスタをポリオルニチン／ラミニン被覆１２ウェルの平板上に播種し、ＧＩＭ内で１〜２週間培養した。アストロサイトの誘導のために、ＰＤＧＦ−ＡＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＧＦ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）、及びＮＴ３（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＧＩＭ内、または１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ）を補充したＧＩＭ内のいずれかで、ＯＰＣクラスタを１〜２週間培養した。ＯＬの成熟を指向するために、ＰＤＧＦ−ＡＡ（５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＧＦ−１（５ｎｇ／ｍｌ）、及びＮＴ３（５ｎｇ／ｍｌ）を補充した半量のＧＩＭに、Ｂ２７（１×）及び脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ；１０ｎｇ／ｍｌ）を補充した半量のＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）加えたものに培養液を交換し、２〜４週間成長させた。成熟アストロサイトを、抗ＧＦＡＰまたは抗ＣＤ４４の免疫染色で識別した。Ｏ４及びＭＢＰ抗体を使用して、オリゴデンドログリアを特定した。
【００６０】
共培養のための胎児神経前駆細胞の単離。第２の三半期である妊娠週数２０週の中絶胎児から、ヒト胎児前脳組織を取得した。Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒによって承認されるように、組織を非特定化した組織として取得した。組織試料を、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋（ＨＢＳＳ＋／＋）を有する無菌ハンク平衡塩溶液で２〜３度洗浄した。皮質平板組織を脳室帯／脳室下帯から分離し、その後、以下に記載されるように、パパイン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）で解離させた（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｋｅｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｈｉｇｈ−Ｙｉｅｌｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｆｅｔａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ，"Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：８４３−８５０（２００１）、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，Ｕｓｉｎｇ  ｓｏｘ２  Ｅｎｈａｎｃｅｒ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ，"Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３０：１４６３５−１４６４８（２０１０））。Ｎ−２サプリメント（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ；２０ｎｇ／ｍｌ）を補充した、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２内で、２〜４×１０６個の細胞／ｍｌで細胞を再懸濁し、懸濁培養皿内で播種した。１日後、細胞を回収し、磁気活性化細胞選別によってニューロンを単離した（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｗｉｎｄｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｃｈｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｌｉａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｃａｎ  Ｂｏｔｈ  Ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｃｕｅ  ｔｈｅ  Ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ  Ｌｅｔｈａｌｌｙ  Ｈｙｐｏｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  Ｓｈｉｖｅｒｅｒ  Ｍｏｕｓｅ，"Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ２：５５３−５６５（２００８））。簡潔にいうと、回収された神経前駆細胞を、１：１００でＰＳＡ−ＮＣＡＭ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）と共に３０分間インキュベートし、その後洗浄し、ラット抗マウス免疫グロブリンＭマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で標識化した。結合したＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋ニューロンを溶出させ、遠心分離し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２で洗浄し、その後ＤＭＥＭ／Ｆ１２内でＮ２、０．５％のＰＤ−ＦＢＳ、及びｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）と共に４〜６日間培養した。ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣとの共培養のために、胎児皮質ニューロンを単一の細胞に解離させ、その後ポリ−Ｌ−オルニチン／ラミニン被覆２４ウェルの平板、またはポリ−Ｌ−オルニチン／フィブロネクチン被覆カバーガラス（１ウェルまたは１カバーガラスにつき、５０，０００〜１００，０００個の細胞）のいずれかの上に播種した。その後、再播種したニューロンを、共培養の前に更に６〜１０日間、Ｂ２７（１X）及びＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有するＮＢ培地に交換した。
【００６１】
インビトロでの、ｈｉＰＳＣ由来ＯＰＣのヒト胎児皮質ニューロンとの共培養。Ｋ０４またはＣ２７ｈｉＰＳＣのいずれかに由来するグリア形成ＯＰＣ塊を、共培養の前にインビトロでの培養日数１３０日まで誘導した。これらを、１ｍｍ３未満の小片に刻み、２〜３週間培養して、ＯＰＣを、コアクラスタを囲む単層膜として増殖させた。その後、ＯＰＣクラスタ及びそれらの単層膜囲繞物を、寒冷ＨＢＳＳ−／−で培養物から再回収し、直径１００〜２００μｍの小断片に手作業で刻んだ。少量の一定分量を、５分間の室温でのＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で、単一の細胞に完全に解離させ、その後血球計算法によって評価した。その後、共培養のために、ヒト皮質ニューロンの有無のいずれかで、２００，０００個の細胞／ｍｌでｈｉＰＳＣ  ＯＰＣを播種し、ＮＢ／Ｂ２７／ＢＤＮＦ及びＧＩＭ／ＮＴ３／ＩＧＦ−１／ＰＤＧＦ−ＡＡ培地の１：１の混合物中で培養した。皮質ニューロンのみの培養物、ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣのみの培養物、または両方の集団共の培養物を、固定化、並びにＯ４、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、及びβＩＩＩ−チューブリンについての免疫標識の前に更に２〜４週間成長させた。
【００６２】
ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲ。ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、未分化のｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ、またはｈＥＳＣ由来及びｈｉＰＳＣ由来ＯＰＣから、全ＲＮＡを抽出した。ＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ＃Ｎ８０８−０２３４）を使用して、第１の相補的ＤＮＡのストランドを転写した。プライマー配列を、以下の表１に提供する。ｍＲＮＡの転写物発現の相対存在量を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７０００システムで測定した。結果としての発現データを、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡの発現レベルで正規化した。変換したデータを用いて、統計分析を実行した。平均及びＳＥＭを、対応ｔ検定に従って計算した。
【００６３】
（表１）ｑＲＴ−ＰＣＲのために使用されるヒト遺伝子のプライマー
2019167375.tif 000002
【００６４】
シバラーマウスへの新生仔異種移植片。ｓｈｉ／ｓｈｉ×ｒａｇ２−／−ミエリン欠損、免疫不全マウスの発生のために、ホモ接合性シバラーマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）を、Ｃ３Ｈバックグラウンド（Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ，ＵＳＡ）で、ホモ接合性ｒａｇ２−欠損免疫不全マウス（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｓｈｉｎｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，"ＲＡＧ−２−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｍｉｃｅ  Ｌａｃｋ  Ｍａｔｕｒｅ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  Ｏｗｉｎｇ  ｔｏ  Ｉｎａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  Ｉｎｉｔｉａｔｅ  Ｖ（Ｄ）Ｊ  Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ，"Ｃｅｌｌ６８：８５５−８６７（１９９２））と交雑させた。インビトロ共培養に関して記述したように、移植のためにｈｉＰＳＣ由来ＯＰＣを調製した。新生仔である仔に対して、本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｗｉｎｄｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｆｅｔａｌ  ａｎｄ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｅｓ  Ｍｙｅｌｉｎａｔｅ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｌｙ  Ｄｙｓｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  Ｂｒａｉｎ，"Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：９３−９７（２００４）に記載されるように、脳梁の両側に１００，０００個の細胞を移植するか、または、本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｗｉｎｄｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｃｈｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｌｉａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｃａｎ  Ｂｏｔｈ  Ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｃｕｅ  ｔｈｅ  Ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ  Ｌｅｔｈａｌｌｙ  Ｈｙｐｏｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  Ｓｈｉｖｅｒｅｒ  Ｍｏｕｓｅ，"Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ２：５５３−５６５（２００８）に記載される手順を使用して、３００，０００個の細胞を移植するか、のいずれかを施した。生後３ヶ月で、移植マウスをペントバルビタールで麻酔し、その後寒冷ＨＢＳＳ＋／＋、続いて４％のパラホルムアルデヒドで灌流固定した。全ての手順は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓによって承認された。脳を抽出し、寒冷パラホルムアルデヒド内で２時間、さらに固定した。電子顕微鏡のために処理した脳を、４％のパラホルムアルデヒド及び０．２５％のグルタルアルデヒド内で灌流した。
【００６５】
組織切片の免疫組織化学。ヒト細胞を、マウス抗ｈＮＡ、クローン２３５−１で特定した（１：８００でのＭＡＢ１２８１；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）。表現型を、ヒト特異的ＮＧ２（１：２００でのＭＡＢ２０２９；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ラット抗ＭＢＰ（１：２５でのＡｂ７３４９）、ウサギ抗ＯＬＩＧ２（１：１０００でのＡｂ３３４２７；Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ヒト特異的マウス抗ＧＦＡＰ（１：５００でのＳＭＩ−２１）、マウス抗ＮＦ（１：１，０００でのＳＭＩ−３１１及びＳＭＩ−３１２；Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）、並びにウサギ抗Ｋｉ６７（１：２００でのＲＭ−９１０６；Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ，Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）で特定した。４８８、５６８、５９４、及び６４７ｎｍフルオロフォアと結合した、ヤギ抗マウス、抗ラット、及び抗ウサギ抗体を含む、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ二次抗体を、１：４００で使用した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）。インビトロでの状態と同一の状態を使用して、ＰＡＸ６、ＮＫＸ２．２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＳＯＸ２抗体を用いた。
【００６６】
ミエリン形成した軸索の計数。ＮＦ及びＭＢＰ染色のために、ヒト細胞での密な移植の領域を選択し、０．１μｍ間隔で撮像し１０枚重ねた光学スライスの１μｍのスタック（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦｌｕｏＶｉｅｗ３００）を、脳梁内の３つの視野のそれぞれに関して作成した。３本の平行で等距離の線を、軸索に垂直に画像の上に置いた。ミエリン形成した（両側のＭＢＰに接近して並置）か、またはミエリン形成しなかったかのいずれかとして、線との交差で、軸索を記録した。
【００６７】
ヒト細胞移植のマッピング。全ての抗ヒト核＋細胞の位置を、ブレグマの前方−後方 −３．２〜１．２を、１６０μｍ間隔で、２０μｍの冠状切片上にマッピングした。
【００６８】
細胞計数。ブレグマの−０．４〜１．２に、３つの片側の、等しく離間配置した脳梁の試料を、ＭＢＰ、ｈＧＦＡＰ、ＯＬＩＧ２、またはＫｉ６７のいずれかと共にｈＮＡを発現する細胞について計数した。白質をまた、ＨｕＣ／ＨｕＤ、ＯＣＴ４、またはＮＡＮＯＧを同時発現するあらゆるｈＮＡ＋細胞の存在について評価した。全てのデータを、平均±ＳＥＭとして提供する。
【００６９】
電子顕微鏡。ヒトｉＰＳＣ由来グリアキメラ白質の試料を、生後２２〜４０週で屠殺したマウスから採取し、半分の強度のＫａｒｎｏｖｓｋｙ固定液で灌流し、その後既に記載した技術を使用して、ミエリン形態及び質の超微細構造的分析のために処理した（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｗｉｎｄｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｃｈｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｌｉａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｃａｎ  Ｂｏｔｈ  Ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｃｕｅ  ｔｈｅ  Ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ  Ｌｅｔｈａｌｌｙ  Ｈｙｐｏｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  Ｓｈｉｖｅｒｅｒ  Ｍｏｕｓｅ，"Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ２：５５３−５６５（２００８））。
【００７０】
細胞調製物。ステージ１  ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣの両方を、照射したマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）細胞上で培養し、ｂＦＧＦ（４ｎｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した、２０％のＫＯ血清代替物を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２からなるｈＥＳＣ培地を毎日供給した。ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣの両方を、典型的にはＷＡ０９／Ｈ９について３〜４日毎、及びｈｉＰＳＣについて４日毎（Ｋ０４細胞）または７日毎（Ｃ１４及びＣ２７）に、それらが直径２５０〜３００μｍのコロニーで８０％コンフルエンスに達した際に、継代培養した。未分化の幹細胞を、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＳＯＸ２を含む、ヒト多能性幹細胞マーカーのそれらの発現について、免疫細胞化学的に確認した（図２）。留意すべきは、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２の両方をまた、その発生が以前に記載されている、ｈｉＰＳＣの発生において再プログラミング因子として利用したことである。コラゲナーゼ型ＩＶ（１ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内での５〜１０分間のインキュベーションの後に培養皿から穏やかにかき取り、その後磨いたガラスピペットを通してそれらを５回分散させ、その後遠心分離し、洗浄し、２度再懸濁して、細胞を継代培養した。その後、照射されたＭＥＦ細胞で事前被覆した６ウェルの平板上に、細胞を１：３〜１：４に分割した。
【００７１】
ステージ２  胚様体（ＥＢ）を発生させるために、それらが、２５０〜３００ｍのコロニー直径で、８０％コンフルエンスを達成すると、明白な分化がない状態で、Ｄｉｓｐａｓｅ（０．５ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｈＥＳＣまたはｈｉＰＳＣ培養物を３７℃で５〜１０分間解離させた。ステージ１〜２の移行でのｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ培養物の質が、それらに由来するＥＢの質、及びそれらの続くＯＰＣへの分化に決定的な影響を与えることが認められたため、これらの基準が重要であることが証明された。ｂＦＧＦを有さないＥＳＣ培地内で、組織培養用フラスコ（Ｎｕｎｃ  ＥａｓＹＦｌａｓｋｓ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内で懸濁液としてＥＢを５日間培養し、その後、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）及びヘパリン（２μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を補充した神経誘導培地（ＮＩＭ；非必須アミノ酸及びＮ２を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２）に交換して、２日間（ＷＡ９／Ｈ９ｈＥＳ）または７日間（Ｋ０４、Ｃ１４、及びＣ２７ｈｉＰＳＣ）のいずれかの期間置いた。その後、ＥＢを、ラミニン／ポリ−オルニチン被覆６ウェルの平板上に播種し、ｂＦＧＦ、ヘパリン、及びラミニン（１０μｇ／ｍｌ）を補充したＮＩＭ内で更に３日間培養し、その後、培地を、レチノイン酸（ＲＡ、１００ｎＭ、Ｓｉｇｍａ）を補充したＮＩＭに交換して４日間置いた。
【００７２】
ステージ３  この時点、つまりステージ３の終了時で、神経上皮分化効率を、ＰＡＸ６及びＳＯＸ１の免疫標識によって評価した。これらのマーカーの同時発現は、中枢神経幹細胞及び前駆細胞を特徴付ける。（ＰＡＸ６＋／ＳＯＸ１＋）／全ロゼット様コロニーとして定められる神経上皮コロニーの収率は、Ｋ０４、Ｃ１４、及びＣ２７培養物から、それぞれ５２．２±７．５％、７８．４±４．７％、及び７６．０±７．０％であった（Ｎ＝３〜６の記録培養物／株）。Ｃ１４及びＣ２７ｈｉＰＳＣからの神経上皮コロニー生成の効率は、ＷＡ０９／Ｈ９の効率（７５．４±８．８％）と類似した（図３Ａ及び４Ａ）。
【００７３】
ステージ４  １４日目（Ｈ９について）または１９日目（Ｋ０４及びＣ２７について）（ステージ３の終了時、ＲＡの添加の４日後）に、パルモルファミン（１μＭ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ソニックヘッジホッグ（ｓｈｈ）作動薬、及びＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培地に添加した。９日後、インビトロでの培養日数２３日（ＷＡ９／Ｈ９ｈＥＳ）またはインビトロでの培養日数２８日（Ｋ０４、Ｃ１４、及びＣ２７ｈｉＰＳＣ）のいずれかで、培養したＮＥコロニーを機械的に剥離し、その後６ウェルの超低クラスタ平板内の懸濁液中で培養した（図４Ｂ）。
【００７４】
ステージ５  超低クラスタ平板内への播種の１日後、パルモファミン及びＢ２７に加えて、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充した培地をＮＩＭと交換した。その時点で、ＲＡ処理後のプレＯＰＣコロニーの出現を確認するために、一定分量の表現型組成物を、ＯＬＩＧ２及び／またはＮＫＸ２．２の染色によって評価した。ＮＫＸ２．２は、オリゴデンドログリア分化のより特異的な指標であるものの（引用文献１６〜１７を参照されたい）、ＯＬＩＧ２及びＮＫＸ２．２の両方が、中枢ＯＰＣに発現した。この早期プレＯＰＣステージで、ＯＬＩＧ２発現コロニーのパーセンテージは、ＯＬＩＧ２のより早期の出現を反映して、ＮＫＸ２．２＋コロニーのパーセンテージよりも高かった（図３Ａ及び４Ｃ）。対照的に、ステージ５（ＷＡ０９／Ｈ９についてインビトロでの培養日数３５日、またはＫ０４、Ｃ１４、及びＣ２７についてインビトロでの培養日数４０日）の終了時までに、ＲＡを有さないｂＦＧＦの影響下で、ＯＬＩＧ２発現のピークと並行して、より多くのＮＫＸ２．２＋コロニーが出現した。このステージの終了時までに、ＯＬＩＧ２＋／ＮＫＸ２．２＋同時発現コロニーのパーセンテージは、本研究における４つ全ての株の間で類似した（図３Ａ）。
【００７５】
ステージ６  ステージ６（ＷＡ０９／Ｈ９について３５日目、またはＫ０４、Ｃ１４、及びＣ２７について４０日目）を開始するために、ステージ５の懸濁液中のＯＬＩＧ２／ＮＫＸ２．２で定められるプレＯＰＣを、ＰＤＧＦ  ＡＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＧＦ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）、及びＮＴ３（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充したグリア誘導培地（ＧＩＭ；６０ｎｇ／ｍｌでのＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ１、Ｂ２７、Ｔ３、１００ｎｇ／ｍｌでのビオチン、１μＭでのジブチリル−ｃＡＭＰ；全てＳｉｇｍａから）に交換した。この長期間のＯＰＣ懸濁液培養中、培地体積の２／３を３日毎に変更した。結果としてのステージ６グリアスフェアを、培地変更中、Ｐ１０００ピペットチップを通して穏やかに分散させ、凝集から防いだ。
【００７６】
インビトロでの培養日数９５日から開始して、Ａ２Ｂ５、ＣＤ１４０ａ、及びＣＤ１４０ａ／ＣＤ９の同時発現によって定められる、ｈＯＰＣ分化の効率を、連続する時点でのＩＣＣ、ｑＲＴ−ＰＣＲ、及び新生仔のシバラーマウス内への異種移植片を使用して、インビトロ及びインビボで評価した。グリアスフェアは、インビトロでの培養日数１２０日の時点で、成熟オリゴデンドロサイト及びミエリン形成性ＯＰＣの両方を生じさせることができた。インビトロでの培養日数１２０〜２００日の間で、ＯＰＣ関連コロニーの発生率は着実に上昇し、Ｋ０４、Ｃ１４、及びＣ２７からのＯＰＣの、ＯＬＩＧ２及びＮＫＸ２．２同時発現コロニーの割合が、それぞれ７３．８±８．７％、７８．９±６．１％、及び７９．５±８．５％であった。興味深いことに、ｈｉＰＳＣ細胞によるｈＯＰＣ生成の効率は、ＷＡ０９／Ｈ９細胞が呈する効率（４５．４±２０．３％）よりも常に高かった（図３Ａ）。
【００７７】
ステージ６後期／前移植  この時点（ステージ６後期）までに、新しく生成したｈＯＰＣはまた、典型的にはＯＬＧ２またはＮＫＸ２．２と同時発現する、ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦＲα及びＳＯＸ１０などの他のＯＰＣマーカーを発現した（図４Ｄ〜４Ｈ）。このステージで、全てのＤＡＰＩ特定細胞の中で、ＯＬＧ２＋、ＮＸＫ２．２＋、またはＳＯＸ１０＋のパーセンテージは、ｈｉＰＣＳ／Ｋ０４由来ＯＰＣの中で、６１．９±１０．３％、６３．４±７．３％、及び８４．６±７．０％であった一方で、ＮＫＸ２．２／ＳＯＸ１０同時発現ＯＰＣの対応する割合は、６０．６±４．４％であった（図４Ｉ）。ＯＰＣ分化の効率の更なる確認のために、ＯＬＩＧ２、ＮＫＸ２．２、及びＧＦＡＰｍＲＮＡについてのＲＴ−ＰＣＲを実行したところ、それらの対応するタンパク質生成物と同様に、全ての遺伝子がステージ６ＯＰＣにおいて実質的に上方制御していた（図１１Ｃ〜Ｄ及び３Ｃ）。
【００７８】
フローサイトメトリープロトコル及び分析。ｈＥＳＣ由来またはｈｉＰＳＣ由来ＯＰＣのフローサイトメトリーを、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩＩＵ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で実行した。細胞を培養皿から穏やかにかき取り、その後静かに振盪しながら、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で、３７℃で５分間処理した。その後、単一の細胞懸濁液が取得されるまで、試料を狭幅ガラスＰａｓｔｅｕｒピペットで分散させた。その後、細胞を遠心分離し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＷＢ）内で１×１０６個の細胞／ｍｌで再懸濁した。一次抗体、直接結合抗体、またはそれらの対応するアイソタイプ対照を、以下に列記する濃度で細胞に添加し、その後氷上で１５分間インキュベートした。５ｍｌのＭＷＢを添加し、細胞を遠心沈殿させた。非結合抗体に関しては、ペレット化した細胞をＭＷＢ内で１×１０６個の細胞／ｍｌまで再懸濁し、適切な二次抗体、Ａｌｅｘａ−４８８結合ヤギ抗マウスＩｇＭを１：５００希釈で添加した。試料を、氷上で１５分間インキュベートし、その後５ｍｌのＭＷＢで１０分間洗浄した。その後、全ての試料を、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２内で、１〜１．５×１０６個の細胞／ｍｌの濃度まで再懸濁し、その後４０μｍの細胞ストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＢＤ）を通過させた。ＤＡＰＩを１ｇ／ｍｌで添加した。前方散乱及び側方散乱によって、ＰＥ蛍光については５８２±１５ｎｍの帯域濾波器を通して、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８／ＦＩＴＣ蛍光については５３０±３０ｎｍの帯域濾波器を通して、ＰＥＲＣＰ−Ｃｙ５．５については６９５±４０ｎｍの帯域濾波器を通して、ＤＡＰＩ蛍光については４５０±５０ｎｍの帯域濾波器を通して、細胞を分析した。未染色の細胞を使用して、バックグラウンド蛍光を設定し、０．５％の偽陽性率が受容された。使用した抗体は、マウスＩｇＭアイソタイプ対照（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＰＰ５０）、マウス抗Ａ２Ｂ５（ＩｇＭ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＭＡＢ３１２）、マウス抗Ｏ４（ＩｇＭ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＭＡＢ３４５）、ＰＥマウスＩｇＧ２ａ、кアイソタイプ対照（ＢＤ，５５５５７４）、ＰＥマウス抗ヒトＣＤ１４０ａ（ＩｇＧ２ａ、ＢＤ，５５６００２）、ＰＥＲＣＰ−Ｃｙ５．５マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＢＤ，３４７２１２）及びＰＥＲＣＰ−Ｃｙ５．５マウス抗ヒトＣＤ９（ＩｇＧ１、ＢＤ，３４１６４９）であった。
【００７９】
インビトロ免疫細胞化学。照射したＭＥＦ細胞上で成長させた多能性ｈＥＳＣまたはｈｉＰＳＣを、４％のパラホルムアルデヒドでの固定化前に３〜４日間培養した。同様に、分化神経原性クラスタまたはグリア形成クラスタを、ポリ−オルニチン及びラミニン被覆２４ウェルの平板上に播種し、４％のパラホルムアルデヒドで固定する前に３日間培養した。より後のステージでｈＯＰＣを含有するグリア形成塊を、小断片に刻み、ポリ−オルニチン／ラミニン被覆２４ウェルの平板上に播種し、実験に応じて、固定する前に２〜４週間培養した。固定化は、４％のパラホルムアルデヒドで、室温で５分間実行し、その後ＰＢＳで３度洗浄した。免疫標識した細胞を、一次抗体で、４℃で一晩、二次抗体で、２５℃で３０分間インキュベートした。一次抗体は、マウス抗ＯＣＴ４、マウス抗ＳＳＥＡ４、マウス抗ＴＲＡ−６０（全て、１：１００の希釈で使用、Ｃｈｅｍｉｃｏｎから）、ウサギ抗ＮＡＮＯＧ（１：５００、Ａｂｃａｍ）；ウサギ抗ＰＡＸ６（１：４００、Ｃｏｖａｎｃｅ）、ヤギ抗ＯＬＩＧ２（１：２００、Ｒ＆Ｄ）、マウス抗ＮＫＸ２．２（１：１００、ＤＳＨＢ）、ウサギ抗ＰＤＧＦＲ（１：４００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギ抗ＳＯＸ１０（１：４００、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）、ヤギ抗ＳＯＸ１（１：１００、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヤギ抗ＳＯＸ２（１：１０００、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓマウス抗ＧＦＡＰ（１：４００、Ｃｏｖａｎｃｅ）、ウサギ抗ＧＦＡＰ（１：１０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ＮＥＳＴＩＮ（１：１０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ）、マウス抗ＩＩＩ−チューブリン（１：１０００、Ｃｏｖａｎｃｅ）、ＭＡｂ  Ｏ４によって識別されるオリゴデンドロサイトスルファチド（１：１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、及びラット抗ＭＢＰ（１：２５、Ａｂｃａｍ）を含んだ。
【００８０】
実施例１−ヒトｉＰＳＣは、グリア前駆細胞へと効率的に指向され得る
３つの異なる供給源からの４つの異なるｉＰＳＣ株を、本研究に使用し、これらは、ＷＡ０９／Ｈ９ｈＥＳＣ（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：１１４５−１１４７（１９９８））、ケラチノサイト由来Ｋ０４ｈｉＰＳＣ（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｍａｈｅｒａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ３：３４０−３４５（２００８））、並びに線維芽細胞由来Ｃ１４及びＣ２７ｈｉＰＳＣ（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｈｉｇｈｌｙ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ＥＳ  ａｎｄ  ｉＰＳ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｄｕａｌ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＭＡＤ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，"Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７：２７５−２８０（２００９））を含んだ。いくつかの公開されたプロトコルの特定の特徴を、ｈＥＳＣからのグリア前駆細胞の生成のために選択し（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．４：１６１４−１６２２（２００９）、Ｉｚｒａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｎｏｇｇｉｎ  ｏｎ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｏｎ  Ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ，"Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３４：３１０−３２３（２００７））、その後ＷＡ０９／Ｈ９ｈＥＳＣとの使用のための、結果としてのハイブリッドプロトコルを生成するために最適化した。結果としてのプロトコルを修正して、異なる細胞供給源から、異なる研究室で派生した３つのｈｉＰＳＣ株で、異なる再プログラミングプロトコルを使用して、その効率を更に最適化した（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｈｉｇｈｌｙ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ＥＳ  ａｎｄ  ｉＰＳ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｄｕａｌ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＭＡＤ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，"Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７：２７５−２８０（２００９）、Ｍａｈｅｒａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ３：３４０−３４５（２００８））（図２）。以上に記載し、図１に概略化す��、インビトロで１１０〜１５０日間の範囲に及ぶ、結果としての６つのステージのＯＰＣ分化プロトコルは、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ類似物から、アストロサイト及びＯＬの両方を含む、ヒトＯＰＣ（ｈＯＰＣ）及びそれらの成熟した後代細胞を効率的に発生させた（図１Ｂ〜１Ｐ）。ステージ６におけるＯＬＩＧ２＋／ＮＫＸ２．２＋グリア形成（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｎｋｘ２．２Ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ，"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２８：２７２３−２７３３（２００１）、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｈｅ  ｂＨＬＨ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｏｌｉｇ２  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｋｘ２．２，"Ｎｅｕｒｏｎ３１：７９１−８０７（２００１）、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｌｉｎｅａｇｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂａｓｉｃ  Ｈｅｌｉｘ−Ｌｏｏｐ−Ｈｅｌｉｘ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｓ，"Ｎｅｕｒｏｎ２５：３３１−３４３（２０００））細胞クラスタの発生率によって定められる、ＯＰＣ生成のその効率は、ＷＡ０９／Ｈ９由来ｈＥＳＣにおいて４５．４±２０．３％から、Ｋ０４、Ｃ１４、及びＣ２７由来ＯＰＣにおいてそれぞれ７３．８±８．７％、７８．９±６．１％、及び７９．５±８．５％までの範囲であった（全てのデータは、平均±ＳＥＭとして提供する；図３Ａ及び４）。したがって、ｈｉＰＳＣ及びｈＥＳＣ株のそれぞれは、ＯＬＩＧ２＋／ＰＤＧＦＲａ＋／ＮＫＸ２．２＋／ＳＯＸ１０＋ＯＰＣの高度な濃縮調製物に指向され得る。実際、ｈｉＰＳＣからのＯＰＣの分化の効率は、ケラチノサイト（Ｋ０４細胞）または線維芽細胞（Ｃ１４及びＣ２７細胞）から誘導されるかどうかに関わらず、ＷＡ０９／Ｈ９ｈＥＳＣの効率よりも常に高かった。
【００８１】
実施例２−アストロサイト及びＯＬの両方は、ｈｉＰＳＣ由来ｈＯＰＣから効率的に派生する
インビトロ及びインビボの両方で、ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣは、アストロサイト及びＯＬに容易に分化した。ＧＦＡＰで定められるアストログリアは、まずインビトロで７０日目（インビトロでの培養日数）までに出現し、これはＯＬが出現するよりも有意に早かった。ステージ６後期までに、インビトロでの培養日数１２０日で、ＧＦＡＰ＋アストロサイトは、グリア形成塊をポリオルニチン／ラミニン被覆表面上に播種した場合に豊富であることが発見された（図３Ｂ〜３Ｄ）。その時点までに、ＧＦＡＰ＋細胞は、全ての細胞株にわたって、ＯＰＣ誘導培養物中の細胞の４０％〜５０％を構成した（図３Ｄ）。定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、全ての細胞株における、ＯＰＣ分化中のＧＦＡＰメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現の上方制御を確認した（表２）。
【００８２】
（表２）ＯＰＣ誘導中のアストロサイトの出現：ＧＦＡＰのｑＰＣＲ
2019167375.tif 000003
ヒトｉＰＳＣ培養物を、アストロサイトのグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）（ＧＡＰＤＨに標準化）について、インビトロでの細胞株及びＯＰＣ分化のステージの双対関数としての、定量的実時間ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に供した。全てのデータを、平均±ＳＥＭとして提供する。
【００８３】
ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来ＯＰＣからのＯＬの生成は、グリア形成成長因子を正常レベルの半分まで除去することによって誘導された（材料及び方法を参照されたい）。ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣをこれらの状態に２週間曝露したところ、一部は、Ｏ４＋及び／またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）＋ＯＬに成熟した（図３Ｅ〜３Ｇ）。フローサイトメトリーによると、Ｃ２７、Ｃ１４、及びＫ０４ｈｉＰＳＣ由来ＯＰＣ培養物中のＯ４＋ＯＬは、全ての細胞の１１．９±３．８％、４．１±０．９％、及び７．６±１．５％をそれぞれ構成した（それぞれインビトロでの培養日数１９４±１５日、１８６±１４日、及び２０５±１４日で；平均±ＳＥＭ）（図５Ａ；表３）。留意すべきは、より成熟しているがそれほど移植可能ではない、プロセスを経たＯＬよりも、むしろ、移植可能な分化系列に偏った前駆細胞の集団及び未熟オリゴデンドログリアの調製に焦点を当てていたため、培養条件は、初期オリゴデンドロサイトの分化を優遇し、有糸分裂後のオリゴデンドロサイトの生存率は優遇しなかったことである。
【００８４】
（表３）インビトロでのｈｉＰＳＣオリゴデンドログリア存在量のフローサイトメトリーの記述
2019167375.tif 000004
異なる細胞株（Ｃ２７、Ｃ１４、及びＫ０４）からのヒトｉＰＳＣ由来ＯＰＣ及び早期オリゴデンドログリアを回収し、ステージ６の後期（インビトロで１２０日間超、つまりインビトロでの培養日数）に、ＭＡｂ  Ｏ４によって識別される、オリゴデンドロサイトスルファチドについて染色し、フローサイトメトリーによって分析した。結果を、Ｏ４＋細胞の割合（平均パーセンテージ±ＳＥＭ）として得た。Ｎ＝４〜７回の反復／細胞株。
【００８５】
実施例３−ＯＰＣは、ＣＤ１４０ａ及びＣＤ９指向蛍光活性細胞選別によってｈｉＰＳＣ培養物から単離され得る
Ａ２Ｂ５、ＣＤ１４０ａ／ＰＤＧＦａＲ、及びテトラスパニンＣＤ９のフローサイトメトリー（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｌｉｎｅａｇｅ  ｏｆ  ＮＧ２−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｇｌｉａ，"Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ．３１：４５７−４６７（２００２）、Ｔｅｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｈｅ  Ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＤ９，Ｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｔｏ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｉｓ  Ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  Ｂｅｔａ１  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ，ＣＤ８１，ａｎｄ  Ｔｓｐａｎ−２，"Ｇｌｉａ４０：３５０−３５９（２００２））を、ステージ６培養物中のｈｉＰＳＣ  ＯＰＣの特定及び定量化のために次に使用した（図５Ｂ及び５Ｃ）。Ｃ２７、Ｃ１４、及びＫ０４ｈｉＰＳＣにそれぞれ由来するＣＤ１４０ａ＋ＯＰＣは、Ｈ９由来細胞の３７．５±１０．２％と比較して、全ての細胞の３３．０±１０．３％、３２．８±１２．０％、及び４１．１±６．１％を構成した（図５Ｃ；表４）。より後のステージの、ＯＰＣの貯蔵で定められるＣＤ９＋ＣＤ１４０ａ＋の画分細胞は、ステージ６のＣ２７及びＫ０４ｈｉＰＳＣ培養物中のそれぞれの細胞の２４．０±８．０％及び１２．４±２．３％を構成した。Ｈ９由来ＯＰＣの同等の培養物は、１５．０±４．９％のＣＤ９＋／ＣＤ１４０ａ＋細胞を含んだ（図５Ｃ；表４；それぞれｎ＝４〜７回の反復）。したがって、ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣは、Ａ２Ｂ５、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ９、及びＯ４によって連続的に示される、系列を限定する異なるステージで、特定され単離され得る。これらのエピトープに基づく選択は、残留する未分化細胞を単離物から除去しながら、ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣの比較的純粋な集団の単離を可能にする。
【００８６】
（表４）ＯＰＣ誘導中の、細胞選択的表面マーカーのフローサイトメトリー
2019167375.tif 000005
３つの異なるｈｉＰＳＣ細胞株（Ｃ２７、Ｃ１４、及びＫ０４）に由来するＯＰＣ、並びにｈＥＳＣ（ＷＡ９／Ｈ９）を回収して、ステージ６の後期（インビトロでの培養日数１２０日超）に、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ９、またはＡ２Ｂ５について染色し、その後フローサイトメトリーによって分析した。データは、ＣＤ１４０ａ＋、ＣＤ９＋、ＣＤ１４０ａ＋／ＣＤ９＋、及びＡ２Ｂ５＋細胞の平均割合（平均±ＳＥＭ）を含む（ｎ＝４〜７回の反復／細胞；平均±ＳＥＭ）。
【００８７】
実施例４−ｈｉＰＳＣ由来ＯＬは、ヒト軸索とのインビトロでの接触において、ＭＢＰを発生させる
ｈｉＰＳＣＯＬがインビトロで軸索にミエリン形成する能力を試験した。ポリシアル化神経細胞接着分子（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ）に指向する選択を使用して、各細胞株からのｈｉＰＳＣ  ＯＰＣを、妊娠期間の（ｇ．ａ．）胎児脳と共培養した（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｗｉｎｄｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｃｈｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｌｉａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｃａｎ  Ｂｏｔｈ  Ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｃｕｅ  ｔｈｅ  Ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ  Ｌｅｔｈａｌｌｙ  Ｈｙｐｏｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  Ｓｈｉｖｅｒｅｒ  Ｍｏｕｓｅ，"Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ２：５５３−５６５（２００８））。ニューロンをラミニン上で１０〜１４日間培養して、表現型の成熟及び線維伸張を可能にし、Ｏ４免疫標識によって組織由来ＯＬを含まないことを確認した。その後、ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣを、直径５０〜１００ｍｍのクラスタとして調製し、胎児ニューロンと共に４週間共培養し、その後、培養物をＭＢＰ及び神経フィラメント（ＮＦ）について免疫標識した。共焦点撮像は、軸索に接触して被鞘を開始した豊富なＭＢＰ＋プロセスを明らかにしたが（図３Ｈ〜３Ｊ）、明確なミエリン形成は、撮像された時点では認められなかった。したがって、ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣによるミエリン形成をより良く評価するために、それらの移植及びインビボでのミエリン形成を評価した。
【００８８】
実施例５−ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣは、シバラーの脳に効率的かつ機能的にミエリン形成する
ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣのミエリン形成の適格性を決定的に確立するために、これらの細胞を、新生仔ホモ接合性シバラー（ｓｈｉ／ｓｈｉ）×ｒａｇ２−／−免疫不全マウスに移植した。この実験のために、既に記載した方法を使用して、マウスに、脳梁の両側に１００，０００個のｈｉＰＳＣ由来ＯＰＣを埋め込んだ（Ｋ０４、Ｃ２７、及びＣ１４ｈｉＰＳＣ由来ＯＰＣのｈｉＰＳＣ株につき、ｎ＝４〜７匹のマウス）（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｗｉｎｄｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｃｈｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｌｉａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｃａｎ  Ｂｏｔｈ  Ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｃｕｅ  ｔｈｅ  Ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ  Ｌｅｔｈａｌｌｙ  Ｈｙｐｏｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  Ｓｈｉｖｅｒｅｒ  Ｍｏｕｓｅ，"Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ２：５５３−５６５（２００８））。生後３ヶ月または４．５ヶ月で、マウスを屠殺し、それらの脳を、ドナー細胞分布及び密度、ミエリン生成及びミエリン形成された軸索の割合、並びに絞輪部の再構成の観点から分析した。３つ全てのｈｉＰＳＣ株由来ＯＰＣが、レシピエント脳に堅固にミエリン形成することができ、各株から、前脳白質を通して高いドナー細胞密度及び広範な分散が観察された（図６Ａ及び６Ｂ）。Ｃ２７、Ｃ１４、及びＫ０４ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣ由来オリゴデンドロサイトの分化及びミエリン形成は、脳梁及び内包の堅固なミエリン形成を有しており、程度において類似していた（図６Ｃ、６Ｅ、６Ｈ、７Ｂ、７Ｇ、及び７Ｊ）。Ｃ２７及びＫ０４ｈｉＰＳＣで、より高いＯＰＣの正味収率が達成され、これはＣ１４と比較して、これらの２つの株で初期神経誘導が優れる、という結果である。そこで、Ｃ２７またはＫ０４ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣのレシピエントにおけるミエリン形成の定量的評価を行った。
【００８９】
定量的組織学は、生後３ヶ月（１３週）のシバラーレシピエントの脳梁内で、ヒト核内抗原（ｈＮＡ）＋／ＯＬＩＧ２＋として定められるＣ２７及びＫ０４ｈｉＰＳＣ由来ＯＰＣ及びオリゴデンドログリアが、それぞれ２９，４９８±１３，１４４及び３７，０３２±８，３９２個の細胞／ｍｍ３の密度を達成することを明らかにした。これらの中で、７，２９８±２，６５９（Ｃ２７）及び２，３２８±６５０（Ｋ０４）個の細胞／ｍｍ３がＭＢＰを発現し、これらは、１３週の時点での脳梁の試料採取した正中内の全てのドナー細胞の１０．９±５．１％（Ｃ２７）及び４．７±１．１％（Ｋ０４）を構成した。ミエリン形成された軸索の割合の観点からミエリン形成効率を評価するために、共焦点分析を使用して、Ｃ２７ｈｉＰＳＣ由来ＯＰＣを移植した３匹のマウスにおいて、ｈｉＰＳＣオリゴデンドログリアによって鞘で覆われた脳梁軸索の画分を定量化した。分析した１３週の時点で、試料採取した３つの脳梁内で、宿主マウス軸索の１７．２±７．２％が鞘で覆われた（図７Ｂ）。驚くべきことに、１３週での、ｈｉＰＳＣ−ＯＰＣドナー由来ミエリン形成の密度、及び鞘で覆われた軸索の割合は、Ａ２Ｂ５＋／ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−として単離されるか、またはＣＤ１４０ａ＋細胞として単離されるかに関わらず、第２の三半期の胎児脳組織由来のＯＰＣによって達成される割合と同等以上であることを証明した（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｓｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，"ＣＤ１４０ａ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｍｙｅｌｉｎｏｇｅｎｉｃ，Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  Ｅｎｇｒａｆｔｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：９３４−９４１（２０１１）、Ｗｉｎｄｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｆｅｔａｌ  ａｎｄ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｅｓ  Ｍｙｅｌｉｎａｔｅ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｌｙ  Ｄｙｓｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  Ｂｒａｉｎ，"Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：９３−９７（２００４）、Ｗｉｎｄｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｃｈｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｌｉａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｃａｎ  Ｂｏｔｈ  Ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｃｕｅ  ｔｈｅ  Ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ  Ｌｅｔｈａｌｌｙ  Ｈｙｐｏｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  Ｓｈｉｖｅｒｅｒ  Ｍｏｕｓｅ，"Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ２：５５３−５６５（２００８））。
【００９０】
実施例６−ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣは、インビボでアストロサイト及びＯＬを効率的に発生させる
シバラーマウス脳内でミエリン形成性ＯＬとして分化した多数のｈｉＰＳＣ  ＯＰＣに加えて、多くはまた、常在ＯＬＩＧ２＋及びＮＧ２＋前駆細胞のままであり、３つ全てのｈｉＰＳＣ株のうちの多くのＯＰＣは、アストロサイトとして、特に白質の線維性アストロサイトとしてもまた分化した（図６Ｄ、６Ｆ、及び６Ｉ）。ｈｉＰＳＣ−ＯＰＣ移植マウスを新生仔への移植後１３週で評価した際、ほとんどのドナー細胞が前駆細胞として持続したか、またはオリゴデンドログリア分化を開始していた。その時点までに、全てのＫ０４及びＣ２７移植細胞から生じるＯＰＣ及びオリゴデンドログリアの両方を含んだＯＬＩＧ２＋細胞の正味割合は、７８．７±２．４％であった一方で、残部は多くがドナー由来ＧＦＡＰ＋アストログリアであった（以下の表５）。
【００９１】
興味深いことに、レシピエント脳のｈｉＰＳＣ  ＯＰＣによる広範な浸潤にも関わらず、実質的なアストロサイトの分化は、ｈｉＰＳＣ由来ＯＬと密接に関連して、その内部でドナー細胞が形態的に明白な線維性アストロサイトとして分化する、白質予定部内のこれらの細胞によって認められた。これらのｈｉＰＳＣ由来アストロサイトは、系列限定ｈｉＰＳＣ由来アストログリア形成前駆体から、または依然として二分化能を有するｈＯＰＣからの、インサイチューでのアストロサイトへの分化によって発生した可能性がある。いずれの場合においても、新生仔への移植の３ヶ月後までに、３つ全てのｈｉＰＳＣ株に由来するＯＰＣ移植片のシバラーレシピエントの白質の脳梁及び内包は、密に移植されたミエリン形成性ＯＬを有するヒトアストロサイトの骨格を示し、それぞれの場合において、実質的に再構築されかつ密にミエリン形成された中枢白質を生じた（図６Ｄ、６Ｆ、及び６Ｉ）。
【００９２】
（表５）生後１３週間の、インビボでのｈｉＰＳＣ−ＯＰＣ誘導体の表現型分化
2019167375.tif 000006
生後１３週の移植マウスの免疫標識は、移植されたｈｉＰＳＣ  ＯＰＣ及びこれらの後代のうちの多数が、ＯＬＩＧ２＋／ｈＧＦＡＰ−ＭＢＰ−ＯＰＣのままであることを明らかにした。それにも関わらず、ｈｉＰＳＣ由来ＭＢＰ＋オリゴデンドログリアの有意な補足物、特にＣ２７株に由来するＯＰＣは、ｈＧＦＡＰ＋アストロサイトと同様に、移植マウス内に認められた。１３週でのＫｉ６７インデックスは比較的高かったが、同一の生後年齢での、新生仔期に送達された胎児組織由来ＯＰＣのインデックスよりは高くなかった。
【００９３】
実施例７−ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣでの新生仔への移植は、シバラーマウスを救済し得る
移植シバラーマウスにおいて認められた堅固な移植及びミエリン形成が、神経学的劣化を緩和し、典型的には生後２０週までに死亡するシバラーマウスの生存率を延長するために十分であるかどうかを評価した。この目的のために、移植されたＯＰＣを介して脳脊髄軸全体への移植を達成する５つの部位の前脳及び脳幹注入プロトコルを使用して、新生仔ホモ接合性シバラー×ｒａｇ２欠損の２２匹のセットに、３００，０００個のＣ２７由来ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣを移植した（図８Ａ〜８Ｄ）（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｗｉｎｄｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｃｈｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｌｉａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｃａｎ  Ｂｏｔｈ  Ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｃｕｅ  ｔｈｅ  Ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ  Ｌｅｔｈａｌｌｙ  Ｈｙｐｏｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  Ｓｈｉｖｅｒｅｒ  Ｍｏｕｓｅ，"Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ２：５５３−５６５（２００８））。同等の１９匹の同腹仔対照に生理食塩水のみを注入し、更なる操作なく、両方のセットを収容した。予想通り、埋め込みをしない１９匹のシバラー対照は生後５ヶ月前に死亡し、中央生存率は１４１日間であった。対照的に、埋め込みをした２２匹のマウスのうちの１９匹は、最も長く生存した対照マウスよりも長く生存した。移植マウスは、９ヶ月間の観察期間にわたって減少した死亡と共に、大幅に延長した生存率を呈し（図８Ｅ）、その後生存するマウスを、ステージ後期のミエリン形成及び絞輪部の再構成の免疫組織化学的評価、並びに超微細構造的分析の両方のために処理することを可能とするために、実験を終了した（実施例８を参照されたい）。移植マウス及び対照マウスのカプラン−マイヤー生存率プロットの比較は、高度に有意な差を明らかにした（Ｇｅｈａｎ−Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ試験によるカイ二乗＝１７．９５；ｐ０．０００１未満）（図８Ｅ）。６ヶ月を超えて生存したこれらの移植マウスは、脳、脳幹、及び小脳の実質的なミエリン形成を均一に呈した（図８Ａ〜８Ｄ及び９）。驚くべきことに、大脳のミエリン形成の時点の整合の程度、及び任意の所定の時点で生きているシバラーの割合は、それ以外は同様に処理された、胎児ヒト組織由来Ａ２Ｂ５選別ＯＰＣを事前に移植したマウスにおいてよりも、ｈｉＰＳＣ−ＯＰＣ移植マウスにおいて大きかった（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｗｉｎｄｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｃｈｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｌｉａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｃａｎ  Ｂｏｔｈ  Ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｃｕｅ  ｔｈｅ  Ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ  Ｌｅｔｈａｌｌｙ  Ｈｙｐｏｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  Ｓｈｉｖｅｒｅｒ  Ｍｏｕｓｅ，"Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ２：５５３−５６５（２００８））。
【００９４】
実施例８−ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣは、絞輪部の再構成を有する超微細構造的成熟ミエリンを発生させた
ｈｉＰＳＣ−ＯＰＣ移植マウスの著しく延長した生存率を鑑みて、これが、ｈｉＰＳＣ  ＯＬによる、宿主軸索まわりの超微細構造的コンパクトミエリンの形成に関連するのかどうかを試験した。この目的のために、生後２２〜３６週の移植シバラー（ｎ＝３）に由来する脳梁の試料に電子顕微鏡を使用した。これらのマウスは、５つの部位の注入プロトコルに供されており、それらの移植がない対照よりも有意に長く生存する動物を含んだ。これらのミエリンの完全性及び質の評価を可能にするために、これらの明らかに救済されたマウスを比較的長い生存時点の後に屠殺した。レシピエントの脳梁は、同心円状に組織化した主周期線（図１０Ａ〜１０Ｅ）及び層間のタイトジャンクション（図１０Ｆ、１０Ｇ、１１Ｃ）によって特徴付けられる成熟コンパクトミエリンによって密にミエリン形成した。移植脳梁は、それらの移植がないシバラー対照の脳梁とはかなり異なり、主周期線またはミエリンコンパクションのいかなる他の証拠も呈さなかった（図１１Ｂ、１１Ｄ、及び１１Ｅ）。
【００９５】
それぞれ、新しくミエリン形成された軸索の傍絞輪部及び絞輪部のセグメントを特定する、Ｃａｓｐｒ及びβＩＶスペクトリンの免疫標識によって決定される、ランビエ絞輪の解剖学的な再構成もまた、これらのマウスにおいて認められた（図１０Ｈ及び１０Ｉ）。過去の研究において、絞輪部構造の解剖学的及び抗原性再構成は、迅速な伝導及び機能的適格性の両方の回復と相関した（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｗｉｎｄｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｃｈｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｌｉａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｃａｎ  Ｂｏｔｈ  Ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｃｕｅ  ｔｈｅ  Ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ  Ｌｅｔｈａｌｌｙ  Ｈｙｐｏｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  Ｓｈｉｖｅｒｅｒ  Ｍｏｕｓｅ，"Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ２：５５３−５６５（２００８））。これらのマウスにおける絞輪部構造の迅速かつ堅固な再取得は、ｈｉＰＳＣ由来ＯＬが、機能的ランビエ絞輪の形成が依存する軸索タンパク質の絞輪部の組織化のために必要なきっかけを発生させることを示す。
【００９６】
共に、これらのデータは、ｈｉＰＳＣ由来ＯＰＣがＯＬを効率的に発生させ得、それが今度はミエリン形成不全のシバラー前脳に堅固にミエリン形成し得ること、及びそれにより発生したミエリンが絞輪部構造を回復させると同時に、胎児組織由来ＯＰＣの精製単離物と同等に効率的に軸索を鞘で覆うことができることを示す。
【００９７】
実施例９−ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣはインビボで非腫瘍形成性であった
未分化の多能性幹細胞の持続は、移植片レシピエントにおいて、奇形腫または神経上皮腫瘍のいずれかを引き起こし得る（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃｎｅｕｒｏｎｓ  Ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｂｙ  Ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ  Ｗｉｔｈ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ−Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  Ｍｉｄｂｒａｉｎ  Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ，"Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１２：１２５９−１２６８（２００６））。任意の多能性または不完全に分化したｈＥＳＣまたはｈｉＰＳＣが、名目上完全に分化したＯＬ培養物のままであったかどうかを評価するために、免疫標識及びｑＲＴ−ＰＣＲの両方を使用して、ステージ後期のｈｉＰＳＣ由来ＯＰＣによる多能性マーカーの発現を評価した。インビトロでの培養日数１００日までに、本研究において使用されるｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ株のいずれかに由来するＯＰＣ内で、検出可能なＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、またはＳＳＥＡ４タンパク質は発見されなかった。同様に、ｑＲＴ−ＰＣＲは、ＯＣＴ４及びヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）の転写物が、９５日以上のインビトロでの培養日数までに、本質的に検出不可能なレベルまで下方制御されることを明らかにした（図４Ｊ及び４Ｋ）。移植の３ヶ月後の、移植ＯＰＣによるＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＳＳＥＡ４のインビボでの発現を試験した。認められたように、ｈＮＡ＋ドナー細胞のうちのごく少数が、ＯＬＩＧ２、ＭＢＰ、またはＧＦＡＰによって染色されなかった。多くのドナー由来細胞は、神経前駆細胞としてのそれらの持続性を示す、ネスチンまたはＳＯＸ２を発現したが、評価された任意の株由来の、これらの細胞のいずれにおいても、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、またはＳＳＥＡ４の持続的な発現は検出不可能であった。
【００９８】
したがって、新生仔期に１００，０００個の細胞を移植し、３ヶ月後（ｎ＝１１）または４．５ヶ月後（ｎ＝５）のいずれかに屠殺したマウスを含んだ、この目的のために試験された１６匹のｓｈｉ／ｓｈｉ×ｒａｇ２−／−マウスのうちのいずれにおいても、奇形腫形成の証拠は発見されなかった。その全てに、５つの部位で合計３００，０００個の細胞を移植したが、生後４〜９ヶ月の間に死亡した（ｎ＝１０）、生存率系列において利用可能なマウスもまた試験し、いずれも、奇形腫、異所形成、またはいかなる種類の腫瘍形成のいかなる証拠も有さなかった。更に、ｈｉＰＳＣを、正常にミエリン形成したｒａｇ２欠損マウスに移植して、野生型ミエリン環境における腫瘍形成能も評価した。試験した５匹のマウスは、移植の６ヶ月後、いずれも、腫瘍形成、異所形成、または未分化の増大の病巣のいかなる証拠も示さなかった。留意すべきは、レンチウイルスを用いて挿入された再プログラミング遺伝子の、いくらかのレベルの発現抑制されていない発現を反映するＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃ−ＭＹＣｍＲＮＡの持続的な発現が、ｈｉＰＳＣ由来細胞において、ｑＰＣＲによって認められたことである。それにも関わらず、これらの転写物の発現は、ステージ６の終了時に移植した細胞による腫瘍形成とは関連付けられなかった。
【００９９】
ｈｉＰＳＣ−ＯＰＣ移植マウスにおける腫瘍形成の欠如は、移植後の時間の関数としての、埋め込みｈｉＰＳＣ  ＯＰＣの有糸分裂の画分における有意な減少と関連付けられた。インビボでのｈｉＰＳＣ  ＯＰＣ増殖を、全てのヒトドナー細胞によるＫｉ６７発現として測定し、これは生後３ヶ月（１３．６±０．６％）〜６ヶ月（４．３±０．０４％）に直線的に減少することが認められた（Ｒ２＝０．９；ｐ＝０．００１；ｎ＝７）。
【０１００】
腫瘍形成のリスクを減少させることにおける分化プロトコルの役割を確立するために、ｒａｇ２欠損マウスにもまた、ステージ１及び３の終了時に、Ｃ２７及びＫ０４ｈｉＰＳＣの両方を移植した。ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣ（ステージ６）移植マウスにおける観察された腫瘍の欠如（移植の最長９ヶ月後でも）を考慮して、これはまた、腫瘍検出のための陽性対照として行われた。しかし、一切腫瘍を含まなかったｈｉＰＳＣ−ＯＰＣ移植マウスとは対照的に、早期ステージｈｉＰＳＣを移植した全ての動物は、３ヶ月までに組織学的に明らかな腫瘍形成を示した（ｎ＝８、ステージ１のｈｉＰＳＣを移植したマウス；ｎ＝６、ステージ３の細胞を移植したマウス）。したがって、この分化プロトコルは、持続的に未分化である細胞のドナー細胞貯蔵を有効的に枯渇させるようであった。結果として生じたｈｉＰＳＣ  ＯＰＣの移植片は、移植の９ヶ月後までに研究される際、一様に非腫瘍形成性であることを証明した。
【０１０１】
実施例１〜９の考察
本研究において、高い効率及び収率で、アストロサイト及びミエリン形成性中枢ＯＬの両方の高度な濃縮集団を発生させるために、ｈｉＰＳＣを使用することの実行可能性が確立されている。ＷＡ０９／Ｈ９ｈＥＳＣ、並びにＫ０４、Ｃ１４、及びＣ２７ｉＰＳＣを含む本研究で使用される４つ全ての株における、本明細書に記載されるプロトコルの成功は、その幅広い適用性を示し、本計画によって産出される高度に効率的なグリア新生は、その堅固な特質を示す。最も重要なことに、組織由来胎児ヒトグリア前駆細胞によって以前に実証されたミエリン形成に有利に匹敵する、インビボで認められた堅固なミエリン形成は、ほぼ確実な機能的統合及びこれらの移植片の有用性を示した。したがって、新生仔期にｈｉＰＳＣ  ＯＰＣを移植したミエリン形成欠損シバラーが、それらの移植をしない対照及び生理食塩水注入対照の両方よりも、実質的に長く生存することが認められた。実際、４分の３を超えるｈｉＰＳＣ−ＯＰＣ移植マウスが、全ての未処置の対照マウスが死亡してからずっと後である６ヶ月を超えて生存した。結果として、単一の患者皮膚試料からのｈｉＰＳＣ  ＯＰＣは、ここで、もしかすると完全でないにしてもほとんどが拒絶リスクを含まない、ミエリン形成自家移植片を提供するために十分な数で確実に生成され得る（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｎａｔｕｒｅ４７４：２１２−２１５（２０１１））。
【０１０２】
重要な事に、移植後の時間の関数としてのミエリン形成された中枢軸索の割合として定義される、埋め込みｉＰＳＣ由来ＯＰＣのミエリン形成効率は、組織由来、ＣＤ１４０ａ選別ＯＰＣを使用して以前に達成されたミエリン形成効率と同等に高いことを証明した（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｓｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，"ＣＤ１４０ａ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｍｙｅｌｉｎｏｇｅｎｉｃ，Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  Ｅｎｇｒａｆｔｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：９３４−９４１（２０１１））。実際、鞘で覆われた軸索の割合が、濃縮はされたが、未選別のｈｉＰＳＣ−ＯＰＣ移植片において、移植前にＣＤ１４０ａ＋細胞に対して選別された胎児組織由来ＯＰＣ移植片と同等に高いことが認められたことは注目に値した。実際、ｈｉＰＳＣ−ＯＰＣ移植片は、おそらくそれらの収集及び移植時までの、ｈｉＰＳＣ−ＯＰＣ集団におけるより高い割合の二分化能を有するグリア前駆細胞を反映して、Ａ２Ｂ５＋／ＰＳＡ−ＮＣＡＭ選別胎児組織由来細胞よりも、より多くの軸索をより迅速にミエリン形成した。
【０１０３】
ｈｉＰＳＣ−ＯＰＣ移植片によって産出される堅固なミエリン形成を鑑みて、ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣの新生仔への移植が、胎児ヒト脳由来ＯＰＣを移植した少数のシバラーにおいて以前観察されているように、レシピエントシバラー同型接合体の表現型及び生存率を救済するために十分であり得るのかどうかが問われた。ｈｉＰＳＣ−ＯＰＣ移植マウスは、実際、著しく改善した生存率を呈した。９ヶ月間の観察期間にわたって、死亡は、移植された群において全体的に遅延し、減少した。胎児脳組織由来ＯＰＣ移植片について以前に記述されているように、救済されたマウスでは、それらの神経学的欠陥が徐々に消散することが示された（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｗｉｎｄｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｃｈｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｌｉａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｃａｎ  Ｂｏｔｈ  Ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｃｕｅ  ｔｈｅ  Ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ  Ｌｅｔｈａｌｌｙ  Ｈｙｐｏｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  Ｓｈｉｖｅｒｅｒ  Ｍｏｕｓｅ，"Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ２：５５３−５６５（２００８））。しかしながら、驚くべきことに、その生存率がｈｉＰＳＣ−ＯＰＣ移植から恩恵を得た動物の割合は、組織由来ヒトＯＰＣを使用して以前に報告された割合よりも実質的に高かった。組織由来ＯＰＣを移植したシバラーマウスのうちの４分の１のみが、生後６ヶ月を超えて生存することが観察された（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｗｉｎｄｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｃｈｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｌｉａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｃａｎ  Ｂｏｔｈ  Ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｃｕｅ  ｔｈｅ  Ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ  Ｌｅｔｈａｌｌｙ  Ｈｙｐｏｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  Ｓｈｉｖｅｒｅｒ  Ｍｏｕｓｅ，"Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ２：５５３−５６５（２００８））一方で、本研究においては、半数を超えるｈｉＰＳＣ−ＯＰＣ移植マウスが、生後６ヶ月を超えて生存した（図８Ｅ）。それにも関わらず、生後７ヶ月を超えた、より後での死亡が依然としていくつか認められた。これは、その特質が現在調査中である、いくつかの動物において観察されたｈｉＰＳＣ  ＯＰＣの不均質な分散を反映し得る。これらの後での死亡にも関わらず、マウスのうちの少なくとも５分の１が即座の臨床的救済を示すようであったが、これらの生存個体を９ヶ月以上で組織学的及び超微細構造的分析のために屠殺した。これらの刺激的なデータは治療的ベクターとしてのｈｉＰＳＣ  ＯＰＣの優位性を実証し、これは、本ＯＰＣ誘導プロトコルにおいて用いられた、長期にわたる分化状態の機能であり得る、おそらくそれらのより迅速なミエリン形成によるものである。
【０１０４】
興味深いことに、移植後９ヶ月もの間に、埋め込みｈｉＰＳＣ由来グリア前駆細胞から腫瘍形成の証拠は観察されなかった。以前の研究では、残留する未分化の細胞（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｐｒｕｓｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，"ＣＤ１５，ＣＤ２４，ａｎｄ  ＣＤ２９  Ｄｅｆｉｎｅ  ａ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｃｏｄｅ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ２７：２９２８−２９４０（２００９））から、またはｈＥＳＣ由来移植片における部分的に分化した神経上皮細胞（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃｎｅｕｒｏｎｓ  Ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｂｙ  Ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ  Ｗｉｔｈ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ−Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  Ｍｉｄｂｒａｉｎ  Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ，"Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１２：１２５９−１２６８（２００６））からの腫瘍形成のリスクの豊富な証拠が提供されていたことを考慮すると、これは驚きであった。ＯＰＣを生成するために用いられた長期にわたる分化プロトコルが、移植前にあらゆる残留する未分化細胞を効果的に除去するために十分に堅固であった可能性がある。再プログラミングされたｈｉＰＳＣにおける持続エピジェネティックマークが、それらの分化誘導体による腫瘍形成の後のリスクを効果的に低下させたことも同様に可能性がある。いずれの場合においても、これらの移植片の安全性を確信を持って宣言する前に、より多くの動物で、及びインビボでのあらゆる残留する未分化の及び／または潜在性な腫瘍形成性細胞のための徹底的な探索に関して、更により長い生存率時点が必要とされるであろう。任意の時点で腫瘍形成が懸念である場合、決定的プレオリゴデンドロサイトのＣＤ９＋／ＣＤ１４０ａ＋細胞の高い発生率、及びこれらの細胞をそれらの同時発現したエピトープに基づいて蛍光活性細胞選別（ＦＡＣＳ）によって単離する能力に基づいて、移植前にｈｉＰＳＣ  ＯＰＣを純化のために選別し得る（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｓｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，"ＣＤ１４０ａ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｍｙｅｌｉｎｏｇｅｎｉｃ，Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  Ｅｎｇｒａｆｔｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：９３４−９４１（２０１１））。
【０１０５】
これらの発見は、高い効率のインビボでのオリゴデンドロサイトの分化及びミエリン形成がｈｉＰＳＣから達成され得ることを示し、ミエリンの後天性障害の治療におけるｉＰＳＣ由来自家移植片の有用性を示す。しかし、移植ｈｉＰＳＣ  ＯＰＣからの、線維性及び原形質性アストロサイトの両方の効率的かつ状況に依存した発生に留意することもまた重要である。ミエリン形成異常領域の構造的かつ生理的な再構成をもたらすことにおけるアストログリアの重要性に加えて、アストロサイトのリソソーム酵素が、酵素欠損宿主を救済するために潜在性に十分な様式で、脳組織内で野生型から欠損グリアに容易に転移し得ることが発見されていることを考慮すると、アストロサイトの移植は、酵素欠損のミエリン形成異常障害を正すことにおいて特に重要であり得る（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｃｔ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｔｏ  Ｂｅｎｅｆｉｔ  Ｍｉｃｅ  Ｗｉｔｈ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ，"Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３：４３９−４４７（２００７））。更に、ｈｉＰＳＣ由来アストロサイトは、ミエリン喪失が発生するが、アストロサイトの機能不全に対して副次的である、アレキサンダー病及び消失白質障害（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｂｕｇｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  Ｇｌｉａｌ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｖａｎｉｓｈｉｎｇ  Ｗｈｉｔｅ  Ｍａｔｔｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ，"Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．７０：６９−８２（２０１１））などの主にアストロサイトの病理の疾患にとって、決定的に重要な治療的ベクターであることが証明され得る（本明細書によりその全体が参照により組み込まれる、Ｋｒｅｎｃｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｂｌｅ  Ａｓｔｒｏｇｌｉａｌ  Ｓｕｂｔｙｐｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，"Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：５２８−５３４（２０１１））。しかしながら、これらの場合のいずれにおいても、ｉＰＳＣ由来アストログリアの治療的使用は、これらの障害の遺伝子の異常特性の、エクスビボでの是正のための方法と組み合わせられる必要があるだろう。
【０１０６】
したがって、ヒトｉＰＳＣ  ＯＰＣは、様々な疾患の設定においてグリア集団を回復させる、または交換するために魅力的なベクターであり得る。最も決定的なことに、本明細書に提示されるデータは、遺伝子の異常がｉＰＳＣ供給源としての患者自身の体細胞の使用を複雑化し得ない多発性硬化症及び外傷性脱ミエリン化などの障害において、喪失したミエリンを回復させるための、ｈｉＰＳＣ由来ＯＰＣの優先的な使用を示す。基底にある遺伝子の異常が、グリア前駆細胞誘導及び埋め込み前にドナー体細胞内でまず修復されなくてはならないことを認識すると、ｉＰＳＣ  ＯＰＣも、ペリツェウス・メルツバッハー病などのミエリンの遺伝子の障害において同様に治療的に価値があると証明され得る。したがって、本研究は、ｈｉＰＳＣからミエリン形成性ＯＬを発生させる技術的な実行可能性及び有効性を確立し、本アプローチが最も適切であり得る臨床的状況を示す。ミエリンの後天性障害及びより幅広い範囲のヒトグリア病理の治療のための、患者特異的な、体細胞由来のグリア前駆細胞移植の臨床的適用がここで合理的に企図され得る。
【０１０７】
好適な実施形態が本明細書において詳細に図示され、記載されるものの、本発明の主旨から逸脱することなく、様々な修正、追加、代用、及び同様物が行われ得ることは関連技術の当業者にとって明白であり、したがって、これらは、後続する特許請求の範囲において定義されるように本発明の範囲内にあると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年7月10日(2019.7.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願の明細書に記載される発明。