(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカン、その形成および使用方法の提供。【解決手段】コンドロイチン硫酸に結合した合成ペプチドを含むヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンであって、合成ペプチドが、ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧのアミノ酸配列、または、ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧに保存的アミノ酸置換を含めることにより改変されたアミノ酸配列を含み、保存的アミノ酸置換が、式Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｂ２（式中、Ｘ１−Ｘ８は非酸性アミノ酸であり、Ｂ１およびＢ２は塩基性アミノ酸である）で定義されるモチーフを変更しない、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカン。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンドロイチン硫酸に結合した合成ペプチドを含むヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンであって、合成ペプチドが、ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧのアミノ酸配列、または、ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧに保存的アミノ酸置換を含めることにより改変されたアミノ酸配列を含み、保存的アミノ酸置換が、式Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｂ２（式中、Ｘ１−Ｘ８は非酸性アミノ酸であり、Ｂ１およびＢ２は塩基性アミノ酸である）で定義されるモチーフを変更しない、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカン。
【請求項２】
合成ペプチドが、ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の合成ペプチドグリカン。
【請求項３】
合成ペプチドグリカンがアグリカナーゼに抵抗性である、請求項１または請求項２に記載の合成ペプチドグリカン。
【請求項４】
合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、ペプチドのＣ末端に結合したグリシン−システインを有する、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の合成ペプチドグリカン。
【請求項５】
合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、リンカーを介してコンドロイチン硫酸に結合している、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の合成ペプチドグリカン。
【請求項６】
リンカーが１個ないし約３０個の炭素原子を含む、請求項５に記載の合成ペプチドグリカン。
【請求項７】
リンカーがアミノ酸を含む、請求項６に記載の合成ペプチドグリカン。
【請求項８】
合成ペプチドグリカンがマトリックスメタロプロテアーゼに抵抗性である、請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の合成ペプチドグリカン。
【請求項９】
請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の合成ペプチドグリカンを含む組成物であって、コンドロイチン硫酸に結合している合成ペプチドの数が平均３個ないし１０．５個である、組成物。
【請求項１０】
請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の合成ペプチドグリカンまたは請求項９に記載の組成物、および、１種またはそれ以上の医薬的担体または希釈剤を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１１年５月２４日に出願された米国仮出願番号６１／４８９,６０２および２０１１年１０月２４日に出願された米国仮出願番号６１／５５０,６２１に、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１１９（ｅ）の優先権を主張する。両方の開示を出典明示により本明細書の一部とする。
【０００２】
技術分野
本発明は、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカン（a hyaluronic acid-binding synthetic peptidoglycan）、その形成および使用方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景および概要
関節軟骨は、身体の骨の保護に重要な成分である。特に、関節軟骨は、骨の運動のために殆ど摩擦のない表面を提供し、関節に圧縮強度も提供することにより、関節の骨を損傷から保護するように機能する。関節軟骨は、広義には、３種の主要な成分：コラーゲン足場（scaffold）、ヒアルロン酸（ＨＡ）およびアグリカンに由来する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含む。関節軟骨の材料組成は、その組織の生物学的、化学的および機械的特性を定める。健康な軟骨の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、主として、コラーゲン原線維のネットワーク（湿重量１５−２２％、ＩＩ型コラーゲン）、プロテオグリカン（湿重量４−７％）、糖タンパク質、水（６０−８５％）および電解質からなり、深度に依存する構造的および機械的異方性を有する粘弾性組織を生じさせる。
【０００４】
軟骨の分解および摩耗は、骨関節症（ＯＡ）の特徴である。ＯＡの初期段階で、軟骨の主要なプロテオグリカンであるアグリカンは、早期に分解される成分である。アグリカンの単量体は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）側鎖を共有結合で有するタンパク質コアであり、球状ドメインおよび連結タンパク質を介して糸状のヒアルロン酸に結合する。アグリカナーゼなどのプロテアーゼは、アグリカンを特定の部位で切断し、ＨＡに再結合できないタンパク質断片および遊離ＧＡＧ鎖を創製する。それどころか、これらの遊離ＧＡＧ鎖は、マトリックスから突き出し、圧縮強度を減ずるのみならず、炎症促進性サイトカインおよびマトリックスメタロプロテアーゼの増加も起こす。アグリカンの存在は、プロテアーゼの拡散を低減し、根底にあるコラーゲン線維をタンパク質分解的切断から保護すると示された。アグリカンの損失は正常な軟骨でも起こり、直ちにＯＡと相関づけられるものではない。しかしながら、ＩＩ型コラーゲンの損失は不可逆的過程であると考えられ、早発性の摩耗を導く。
【０００５】
骨関節症は、関節炎の最も一般的な形態であり、米国のみで２７００万人を冒している。最も蔓延している骨関節症の症状には、強い疼痛、関節の硬化および圧痛のある炎症関節が含まれる。進行した段階の骨関節症は、関節軟骨の完全な分解をもたらし、関節の不動および根底にある骨への損傷を引き起こし得る。米国における関節炎の直接的なコストは、毎年約１８５５億ドルと見積もられている。
【０００６】
生活様式が変化し、骨関節症の処置に複数の薬物療法がしばしば使用されているが、欠損した軟骨の再生および軟骨の損失に起因する症状の軽減においては、ほとんど成功がなかった。骨関節症の進行を停止し、既存の損傷を修復することに対するこの無力さは、典型的には、侵襲性の最終段階の軟骨置換術をもたらす。従って、骨関節症の代替的な処置選択肢が、強く望まれている。
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、軟骨再生用の改良された生体材料を説明する。それは、罹患者の損傷した軟骨を再建するのに利用できるヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを含み、この合成ペプチドグリカンの形成および使用方法を伴う。さらに、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンは、機能的にはアグリカンを模倣し、アグリカナーゼ分解に抵抗し、タンパク質分解を制限するように設計されている。アグリカンに見られる天然アミノ酸配列の不在により、これらの分子はタンパク質分解的切断を受けにくい。
【０００８】
以下の番号を付けた実施態様が企図され、それらは非限定的である：
１．グリカンに結合した合成ペプチド（a synthetic peptide conjugated to a glycan）を含み、合成ペプチドがヒアルロン酸結合配列を含む、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカン。
２．合成ペプチドが、式Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｂ２
（式中、Ｘ８は、存在するか、または存在せず、
式中、Ｂ１は塩基性アミノ酸であり、
式中、Ｂ２は塩基性アミノ酸であり、そして、
式中、Ｘ１−Ｘ８は、非酸性アミノ酸である）
のアミノ酸配列を含む、第１項の合成ペプチドグリカン。
【０００９】
３．合成ペプチドが、
ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧ；
ＧＤＲＲＲＲＲＭＷＨＲＱ；
ＧＫＨＬＧＧＫＨＲＲＳＲ；
ＲＧＴＨＨＡＱＫＲＲＳ；
ＲＲＨＫＳＧＨＩＱＧＳＫ；
ＳＲＭＨＧＲＶＲＧＲＨＥ；
ＲＲＲＡＧＬＴＡＧＲＰＲ；
ＲＹＧＧＨＲＴＳＲＫＷＶ；
ＲＳＡＲＹＧＨＲＲＧＶＧ；
ＧＬＲＧＮＲＲＶＦＡＲＰ；
ＳＲＧＱＲＧＲＬＧＫＴＲ；
ＤＲＲＧＲＳＳＬＰＫＬＡＧＰＶＥＦＰＤＲＫＩＫＧＲＲ；
ＲＭＲＲＫＧＲＶＫＨＷＧ；
ＲＧＧＡＲＧＲＨＫＴＧＲ；
ＴＧＡＲＱＲＧＬＱＧＧＷＧＰＲＨＬＲＧＫＤＱＰＰＧＲ；
ＲＱＲＲＲＤＬＴＲＶＥＧ；
ＳＴＫＤＨＮＲＧＲＲＮＶＧＰＶＳＲＳＴＬＲＤＰＩＲＲ；
ＲＲＩＧＨＱＶＧＧＲＲＮ；
ＲＬＥＳＲＡＡＧＱＲＲＡ；
ＧＧＰＲＲＨＬＧＲＲＧＨ；
ＶＳＫＲＧＨＲＲＴＡＨＥ；
ＲＧＴＲＳＧＳＴＲ；
ＲＲＲＫＫＩＱＧＲＳＫＲ；
ＲＫＳＹＧＫＹＱＧＲ；
ＫＮＧＲＹＳＩＳＲ；
ＲＲＲＣＧＱＫＫＫ；
ＫＱＫＩＫＨＶＶＫＬＫ；
ＫＬＫＳＱＬＶＫＲＫ；
ＲＹＰＩＳＲＰＲＫＲ；
ＫＶＧＫＳＰＰＶＲ；
ＫＴＦＧＫＭＫＰＲ；
ＲＩＫＷＳＲＶＳＫ；および
ＫＲＴＭＲＰＴＲＲ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、第１項または第２項の合成ペプチドグリカン。
上記のペプチドの実施態様の各々において、ペプチドは、ペプチドのＣ末端に結合したグリシン−システイン（ＧＣ）またはＮ末端に結合したグリシン−システイン−グリシン（ＧＣＧ）を有してもよい。
【００１０】
４．グリカンが、デキストラン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパリン、ケラチン、ケラタン硫酸およびヒアルロン酸からなる群から選択される、第１項ないし第３項のいずれかの合成ペプチドグリカン。
５．グリカンがコンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸からなる群から選択される、第１項ないし第４項のいずれかの合成ペプチドグリカン。
６．合成ペプチドグリカンがアグリカナーゼに抵抗性である、第１項ないし第５項のいずれかの合成ペプチドグリカン。
７．合成ペプチドグリカンが凍結乾燥されている、第１項ないし第６項のいずれかの合成ペプチドグリカン。
【００１１】
８．式ＰｎＧｘ
（式中、ｎは１ないし２０であり；
式中、ｘは１ないし２０であり；
式中、Ｐは、ヒアルロン酸結合配列を含む約５個ないし約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；そして、
式中、Ｇはグリカンである）
の化合物。
【００１２】
９．式（ＰｎＬ）ｘＧ
（式中、ｎは１ないし２０であり；
式中、ｘは１ないし２０であり；
式中、Ｐは、ヒアルロン酸結合配列を含む約５個ないし約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
式中、Ｌはリンカーであり；そして、
式中、Ｇはグリカンである）
の化合物。
【００１３】
１０．式Ｐ（ＬＧｎ）ｘ
（式中、ｎは１ないし２０であり；
式中、ｘは１ないし２０であり；
式中、Ｐは、ヒアルロン酸結合配列を含む約５個ないし約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
式中、Ｌはリンカーであり；そして、
式中、Ｇはグリカンである）
の化合物。
【００１４】
１１．式ＰｎＧｘ
（式中、ｎはＭＷＧ／１０００であり；
式中、ＭＷＧは、最も近い１ｋＤａに端数処理したＧの分子量であり；
式中、ｘは１ないし２０であり；
式中、Ｐは、ヒアルロン酸結合配列を含む約５個ないし約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；そして、
式中、Ｇはグリカンである）
の化合物。
【００１５】
１２．式（ＰｎＬ）ｘＧ
（式中、ｎはＭＷＧ／１０００であり；
式中、ＭＷＧは、最も近い１ｋＤａに端数処理したＧの分子量であり；
式中、ｘは１ないし２０であり；
式中、Ｐは、ヒアルロン酸結合配列を含む約５個ないし約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
式中、Ｌはリンカーであり；そして、
式中、Ｇはグリカンである）
の化合物。
【００１６】
１３．合成ペプチドが、式Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｂ２
（式中、Ｘ８は、存在するか、または存在せず、
式中、Ｂ１は塩基性アミノ酸であり、
式中、Ｂ２は塩基性アミノ酸であり、そして、
式中、Ｘ１−Ｘ８は、非酸性アミノ酸である）
のアミノ酸配列を含む、第８項ないし第１２項のいずれかの化合物。
【００１７】
１４．合成ペプチドが、
ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧ；
ＧＤＲＲＲＲＲＭＷＨＲＱ；
ＧＫＨＬＧＧＫＨＲＲＳＲ；
ＲＧＴＨＨＡＱＫＲＲＳ；
ＲＲＨＫＳＧＨＩＱＧＳＫ；
ＳＲＭＨＧＲＶＲＧＲＨＥ；
ＲＲＲＡＧＬＴＡＧＲＰＲ；
ＲＹＧＧＨＲＴＳＲＫＷＶ；
ＲＳＡＲＹＧＨＲＲＧＶＧ；
ＧＬＲＧＮＲＲＶＦＡＲＰ；
ＳＲＧＱＲＧＲＬＧＫＴＲ；
ＤＲＲＧＲＳＳＬＰＫＬＡＧＰＶＥＦＰＤＲＫＩＫＧＲＲ；
ＲＭＲＲＫＧＲＶＫＨＷＧ；
ＲＧＧＡＲＧＲＨＫＴＧＲ；
ＴＧＡＲＱＲＧＬＱＧＧＷＧＰＲＨＬＲＧＫＤＱＰＰＧＲ；
ＲＱＲＲＲＤＬＴＲＶＥＧ；
ＳＴＫＤＨＮＲＧＲＲＮＶＧＰＶＳＲＳＴＬＲＤＰＩＲＲ；
ＲＲＩＧＨＱＶＧＧＲＲＮ；
ＲＬＥＳＲＡＡＧＱＲＲＡ；
ＧＧＰＲＲＨＬＧＲＲＧＨ；
ＶＳＫＲＧＨＲＲＴＡＨＥ；
ＲＧＴＲＳＧＳＴＲ；
ＲＲＲＫＫＩＱＧＲＳＫＲ；
ＲＫＳＹＧＫＹＱＧＲ；
ＫＮＧＲＹＳＩＳＲ；
ＲＲＲＣＧＱＫＫＫ；
ＫＱＫＩＫＨＶＶＫＬＫ；
ＫＬＫＳＱＬＶＫＲＫ；
ＲＹＰＩＳＲＰＲＫＲ；
ＫＶＧＫＳＰＰＶＲ；
ＫＴＦＧＫＭＫＰＲ；
ＲＩＫＷＳＲＶＳＫ；および
ＫＲＴＭＲＰＴＲＲ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、第８項ないし第１３項のいずれかの化合物。
上記のペプチドの実施態様の各々において、ペプチドは、ペプチドのＣ末端に結合したグリシン−システイン（ＧＣ）またはＮ末端に結合したグリシン−システイン−グリシン（ＧＣＧ）を有してもよい。
【００１８】
１５．グリカンが、デキストラン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパリン、ケラチン、ケラタン硫酸およびヒアルロン酸からなる群から選択される、第８項ないし第１４項のいずれかの化合物。
１６．グリカンがコンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸からなる群から選択される、第８項ないし第１５項のいずれかの化合物。
１７．合成ペプチドグリカンがアグリカナーゼに抵抗性である、第８項ないし第１６項のいずれかの化合物。
【００１９】
１８．重合したコラーゲン、ヒアルロン酸、および、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを含む、人工コラーゲンマトリックス。
１９．コラーゲンが、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲンおよびこれらの組合せからなる群から選択される、第１８項の人工コラーゲンマトリックス。
【００２０】
２０．合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、式Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｂ２
（式中、Ｘ８は、存在するか、または存在せず、
式中、Ｂ１は塩基性アミノ酸であり、
式中、Ｂ２は塩基性アミノ酸であり、そして、
式中、Ｘ１−Ｘ８は、非酸性アミノ酸である）
のアミノ酸配列を含む、第１８項または第１９項の人工コラーゲンマトリックス。
【００２１】
２１．合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、
ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧ；
ＧＤＲＲＲＲＲＭＷＨＲＱ；
ＧＫＨＬＧＧＫＨＲＲＳＲ；
ＲＧＴＨＨＡＱＫＲＲＳ；
ＲＲＨＫＳＧＨＩＱＧＳＫ；
ＳＲＭＨＧＲＶＲＧＲＨＥ；
ＲＲＲＡＧＬＴＡＧＲＰＲ；
ＲＹＧＧＨＲＴＳＲＫＷＶ；
ＲＳＡＲＹＧＨＲＲＧＶＧ；
ＧＬＲＧＮＲＲＶＦＡＲＰ；
ＳＲＧＱＲＧＲＬＧＫＴＲ；
ＤＲＲＧＲＳＳＬＰＫＬＡＧＰＶＥＦＰＤＲＫＩＫＧＲＲ；
ＲＭＲＲＫＧＲＶＫＨＷＧ；
ＲＧＧＡＲＧＲＨＫＴＧＲ；
ＴＧＡＲＱＲＧＬＱＧＧＷＧＰＲＨＬＲＧＫＤＱＰＰＧＲ；
ＲＱＲＲＲＤＬＴＲＶＥＧ；
ＳＴＫＤＨＮＲＧＲＲＮＶＧＰＶＳＲＳＴＬＲＤＰＩＲＲ；
ＲＲＩＧＨＱＶＧＧＲＲＮ；
ＲＬＥＳＲＡＡＧＱＲＲＡ；
ＧＧＰＲＲＨＬＧＲＲＧＨ；
ＶＳＫＲＧＨＲＲＴＡＨＥ；
ＲＧＴＲＳＧＳＴＲ；
ＲＲＲＫＫＩＱＧＲＳＫＲ；
ＲＫＳＹＧＫＹＱＧＲ；
ＫＮＧＲＹＳＩＳＲ；
ＲＲＲＣＧＱＫＫＫ；
ＫＱＫＩＫＨＶＶＫＬＫ；
ＫＬＫＳＱＬＶＫＲＫ；
ＲＹＰＩＳＲＰＲＫＲ；
ＫＶＧＫＳＰＰＶＲ；
ＫＴＦＧＫＭＫＰＲ；
ＲＩＫＷＳＲＶＳＫ；および
ＫＲＴＭＲＰＴＲＲ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、第１８項ないし第２０項のいずれかの人工コラーゲンマトリックス。
上記のペプチドの実施態様の各々において、ペプチドは、ペプチドのＣ末端に結合したグリシン−システイン（ＧＣ）またはＮ末端に結合したグリシン−システイン−グリシン（ＧＣＧ）を有してもよい。
【００２２】
２２．合成ペプチドグリカンのグリカン成分が、デキストラン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパリン、ケラチン、ケラタン硫酸およびヒアルロン酸からなる群から選択される、第１８項ないし第２１項のいずれかの人工コラーゲンマトリックス。
２３．合成ペプチドグリカンのグリカン成分が、コンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸からなる群から選択される、第１８項ないし第２２項のいずれかの人工コラーゲンマトリックス。
２４．合成ペプチドグリカンがアグリカナーゼに抵抗性である、第１８項ないし第２３項のいずれかの人工コラーゲンマトリックス。
２５．マトリックスが組織移植片として有効である、第１８項ないし第２４項のいずれかの人工コラーゲンマトリックス。
２６．組織移植片が患者に移植される、第２５項の人工コラーゲンマトリックス。
２７．マトリックスがゲルの形態である、第１８項ないし第２４項のいずれかの人工コラーゲンマトリックス。
２８．ゲルが注入により患者に投与される、第２７項の人工コラーゲンマトリックス。
２９．マトリックスが細胞のインビトロ培養用の組成物として有効である、第１８項ないし第２４項のいずれかの人工コラーゲンマトリックス。
３０．マトリックスが、さらに、外来性の細胞集団を含む、第２９項の人工コラーゲンマトリックス。
３１．細胞が軟骨細胞および幹細胞からなる群から選択される、第３０項の人工コラーゲンマトリックス。
３２．幹細胞が、骨芽細胞、骨原性細胞および間葉性幹細胞からなる群から選択される、第３１項の人工コラーゲンマトリックス。
３３．１種またはそれ以上の栄養分をさらに含む、第１８項ないし第３２項のいずれかの人工コラーゲンマトリックス。
３４．１種またはそれ以上の増殖因子をさらに含む、第１８項ないし第３３項のいずれかの人工コラーゲンマトリックス。
３５．マトリックスが滅菌されている、第１８項ないし第３４項のいずれかの人工コラーゲンマトリックス。
【００２３】
３６．ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを含む、軟骨細胞または幹細胞のインビトロ培養用の組成物。
３７．合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、式Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｂ２
（式中、Ｘ８は、存在するか、または存在せず、
式中、Ｂ１は塩基性アミノ酸であり、
式中、Ｂ２は塩基性アミノ酸であり、そして、
式中、Ｘ１−Ｘ８は、非酸性アミノ酸である）
のアミノ酸配列を含む、第３６項の組成物。
【００２４】
３８．合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、
ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧ；
ＧＤＲＲＲＲＲＭＷＨＲＱ；
ＧＫＨＬＧＧＫＨＲＲＳＲ；
ＲＧＴＨＨＡＱＫＲＲＳ；
ＲＲＨＫＳＧＨＩＱＧＳＫ；
ＳＲＭＨＧＲＶＲＧＲＨＥ；
ＲＲＲＡＧＬＴＡＧＲＰＲ；
ＲＹＧＧＨＲＴＳＲＫＷＶ；
ＲＳＡＲＹＧＨＲＲＧＶＧ；
ＧＬＲＧＮＲＲＶＦＡＲＰ；
ＳＲＧＱＲＧＲＬＧＫＴＲ；
ＤＲＲＧＲＳＳＬＰＫＬＡＧＰＶＥＦＰＤＲＫＩＫＧＲＲ；
ＲＭＲＲＫＧＲＶＫＨＷＧ；
ＲＧＧＡＲＧＲＨＫＴＧＲ；
ＴＧＡＲＱＲＧＬＱＧＧＷＧＰＲＨＬＲＧＫＤＱＰＰＧＲ；
ＲＱＲＲＲＤＬＴＲＶＥＧ；
ＳＴＫＤＨＮＲＧＲＲＮＶＧＰＶＳＲＳＴＬＲＤＰＩＲＲ；
ＲＲＩＧＨＱＶＧＧＲＲＮ；
ＲＬＥＳＲＡＡＧＱＲＲＡ；
ＧＧＰＲＲＨＬＧＲＲＧＨ；
ＶＳＫＲＧＨＲＲＴＡＨＥ；
ＲＧＴＲＳＧＳＴＲ；
ＲＲＲＫＫＩＱＧＲＳＫＲ；
ＲＫＳＹＧＫＹＱＧＲ；
ＫＮＧＲＹＳＩＳＲ；
ＲＲＲＣＧＱＫＫＫ；
ＫＱＫＩＫＨＶＶＫＬＫ；
ＫＬＫＳＱＬＶＫＲＫ；
ＲＹＰＩＳＲＰＲＫＲ；
ＫＶＧＫＳＰＰＶＲ；
ＫＴＦＧＫＭＫＰＲ；
ＲＩＫＷＳＲＶＳＫ；および
ＫＲＴＭＲＰＴＲＲ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、第３６項または第３７項の組成物。
上記のペプチドの実施態様の各々において、ペプチドは、ペプチドのＣ末端に結合したグリシン−システイン（ＧＣ）またはＮ末端に結合したグリシン−システイン−グリシン（ＧＣＧ）を有してもよい。
【００２５】
３９．合成ペプチドグリカンのグリカン成分が、デキストラン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパリン、ケラチン、ケラタン硫酸およびヒアルロン酸からなる群から選択される、第３６項ないし第３８項のいずれかの組成物。
４０．合成ペプチドグリカンのグリカン成分が、コンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸からなる群から選択される、第３６項ないし第３９項のいずれかの組成物。
４１．合成ペプチドグリカンがアグリカナーゼに抵抗性である、第３６項ないし第４０項のいずれかの組成物。
４２．幹細胞が、骨芽細胞、骨原性細胞および間葉性幹細胞からなる群から選択される、第３６項ないし第４１項のいずれかの組成物。
４３．１種またはそれ以上の栄養分をさらに含む、第３６項ないし第４２項のいずれかの組成物。
４４．１種またはそれ以上の増殖因子をさらに含む、第３６項ないし第４３項のいずれかの組成物。
４５．組成物が滅菌されている、第３６項ないし第４４項のいずれかの組成物。
【００２６】
４６．既存の生体材料の軟骨または骨置換材料に添加するためのヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを含む、生体材料の軟骨または骨置換組成物用の添加物。
４７．合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、式Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｂ２
（式中、Ｘ８は、存在するか、または存在せず、
式中、Ｂ１は塩基性アミノ酸であり、
式中、Ｂ２は塩基性アミノ酸であり、そして、
式中、Ｘ１−Ｘ８は、非酸性アミノ酸である）
のアミノ酸配列を含む、第４６項の添加物。
【００２７】
４８．合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、
ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧ；
ＧＤＲＲＲＲＲＭＷＨＲＱ；
ＧＫＨＬＧＧＫＨＲＲＳＲ；
ＲＧＴＨＨＡＱＫＲＲＳ；
ＲＲＨＫＳＧＨＩＱＧＳＫ；
ＳＲＭＨＧＲＶＲＧＲＨＥ；
ＲＲＲＡＧＬＴＡＧＲＰＲ；
ＲＹＧＧＨＲＴＳＲＫＷＶ；
ＲＳＡＲＹＧＨＲＲＧＶＧ；
ＧＬＲＧＮＲＲＶＦＡＲＰ；
ＳＲＧＱＲＧＲＬＧＫＴＲ；
ＤＲＲＧＲＳＳＬＰＫＬＡＧＰＶＥＦＰＤＲＫＩＫＧＲＲ；
ＲＭＲＲＫＧＲＶＫＨＷＧ；
ＲＧＧＡＲＧＲＨＫＴＧＲ；
ＴＧＡＲＱＲＧＬＱＧＧＷＧＰＲＨＬＲＧＫＤＱＰＰＧＲ；
ＲＱＲＲＲＤＬＴＲＶＥＧ；
ＳＴＫＤＨＮＲＧＲＲＮＶＧＰＶＳＲＳＴＬＲＤＰＩＲＲ；
ＲＲＩＧＨＱＶＧＧＲＲＮ；
ＲＬＥＳＲＡＡＧＱＲＲＡ；
ＧＧＰＲＲＨＬＧＲＲＧＨ；
ＶＳＫＲＧＨＲＲＴＡＨＥ；
ＲＧＴＲＳＧＳＴＲ；
ＲＲＲＫＫＩＱＧＲＳＫＲ；
ＲＫＳＹＧＫＹＱＧＲ；
ＫＮＧＲＹＳＩＳＲ；
ＲＲＲＣＧＱＫＫＫ；
ＫＱＫＩＫＨＶＶＫＬＫ；
ＫＬＫＳＱＬＶＫＲＫ；
ＲＹＰＩＳＲＰＲＫＲ；
ＫＶＧＫＳＰＰＶＲ；
ＫＴＦＧＫＭＫＰＲ；
ＲＩＫＷＳＲＶＳＫ；および
ＫＲＴＭＲＰＴＲＲ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、第４６項または第４７項の添加物。
上記のペプチドの実施態様の各々において、ペプチドは、ペプチドのＣ末端に結合したグリシン−システイン（ＧＣ）またはＮ末端に結合したグリシン−システイン−グリシン（ＧＣＧ）を有してもよい。
【００２８】
４９．合成ペプチドグリカンのグリカン成分が、デキストラン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパリン、ケラチン、ケラタン硫酸およびヒアルロン酸からなる群から選択される、第４６項ないし第４８項のいずれかの添加物。
５０．グリカンが、コンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸からなる群から選択される、第４６項ないし第４９項のいずれかの添加物。
５１．合成ペプチドグリカンがアグリカナーゼに抵抗性である、第４６項ないし第５０項のいずれかの添加物。
【００２９】
５２．ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを患者に投与する段階を含み、合成ペプチドグリカンが関節炎に関連する症状を低減する、患者の関節炎の処置方法。
５３．合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、式Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｂ２
（式中、Ｘ８は、存在するか、または存在せず、
式中、Ｂ１は塩基性アミノ酸であり、
式中、Ｂ２は塩基性アミノ酸であり、そして、
式中、Ｘ１−Ｘ８は、非酸性アミノ酸である）
のアミノ酸配列を含む、第５２項の方法。
【００３０】
５４．合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、
ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧ；
ＧＤＲＲＲＲＲＭＷＨＲＱ；
ＧＫＨＬＧＧＫＨＲＲＳＲ；
ＲＧＴＨＨＡＱＫＲＲＳ；
ＲＲＨＫＳＧＨＩＱＧＳＫ；
ＳＲＭＨＧＲＶＲＧＲＨＥ；
ＲＲＲＡＧＬＴＡＧＲＰＲ；
ＲＹＧＧＨＲＴＳＲＫＷＶ；
ＲＳＡＲＹＧＨＲＲＧＶＧ；
ＧＬＲＧＮＲＲＶＦＡＲＰ；
ＳＲＧＱＲＧＲＬＧＫＴＲ；
ＤＲＲＧＲＳＳＬＰＫＬＡＧＰＶＥＦＰＤＲＫＩＫＧＲＲ；
ＲＭＲＲＫＧＲＶＫＨＷＧ；
ＲＧＧＡＲＧＲＨＫＴＧＲ；
ＴＧＡＲＱＲＧＬＱＧＧＷＧＰＲＨＬＲＧＫＤＱＰＰＧＲ；
ＲＱＲＲＲＤＬＴＲＶＥＧ；
ＳＴＫＤＨＮＲＧＲＲＮＶＧＰＶＳＲＳＴＬＲＤＰＩＲＲ；
ＲＲＩＧＨＱＶＧＧＲＲＮ；
ＲＬＥＳＲＡＡＧＱＲＲＡ；
ＧＧＰＲＲＨＬＧＲＲＧＨ；
ＶＳＫＲＧＨＲＲＴＡＨＥ；
ＲＧＴＲＳＧＳＴＲ；
ＲＲＲＫＫＩＱＧＲＳＫＲ；
ＲＫＳＹＧＫＹＱＧＲ；
ＫＮＧＲＹＳＩＳＲ；
ＲＲＲＣＧＱＫＫＫ；
ＫＱＫＩＫＨＶＶＫＬＫ；
ＫＬＫＳＱＬＶＫＲＫ；
ＲＹＰＩＳＲＰＲＫＲ；
ＫＶＧＫＳＰＰＶＲ；
ＫＴＦＧＫＭＫＰＲ；
ＲＩＫＷＳＲＶＳＫ；および
ＫＲＴＭＲＰＴＲＲ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、第５２項または第５３項の方法。
上記のペプチドの実施態様の各々において、ペプチドは、ペプチドのＣ末端に結合したグリシン−システイン（ＧＣ）またはＮ末端に結合したグリシン−システイン−グリシン（ＧＣＧ）を有してもよい。
【００３１】
５５．合成ペプチドグリカンのグリカン成分が、デキストラン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパリン、ケラチン、ケラタン硫酸およびヒアルロン酸からなる群から選択される、第５２項ないし第５４項のいずれかの方法。
５６．グリカンが、コンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸からなる群から選択される、第５２項ないし第５５項のいずれかの方法。
５７．合成ペプチドグリカンがアグリカナーゼに抵抗性である、第５２項ないし第５６項のいずれかの方法。
５８．関節炎が骨関節症である、第５２項ないし第５７項のいずれかの方法。
５９．関節炎がリウマチ性関節炎である、第５２項ないし第５７項のいずれかの方法。
６０．合成ペプチドグリカンが注入により患者に投与される、第５２項ないし第５９項のいずれかの方法。
６１．注入が関節内注入である、第６０項の方法。
６２．注入が患者の関節包へのものである、第６０項の方法。
６３．合成ペプチドグリカンが針または点滴用装置を使用して投与される、第５２項ないし第６２項のいずれかの方法。
６４．合成ペプチドグリカンが潤滑剤として作用する、第５２項ないし第６３項のいずれかの方法。
６５．合成ペプチドグリカンが、骨が接触する関節（bone on bone articulation）を防止するか、または、軟骨の損失を防止する、第５２項ないし第６４項のいずれかの方法。
【００３２】
６６．合成ペプチドグリカンおよび既存の生体材料または骨軟骨置換材料を合わせる段階を含む、生体材料または骨軟骨置換物の製造方法。
６７．合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、式Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｂ２
（式中、Ｘ８は、存在するか、または存在せず、
式中、Ｂ１は塩基性アミノ酸であり、
式中、Ｂ２は塩基性アミノ酸であり、そして、
式中、Ｘ１−Ｘ８は、非酸性アミノ酸である）
のアミノ酸配列を含む、第６６項の方法。
【００３３】
６８．合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、
ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧ；
ＧＤＲＲＲＲＲＭＷＨＲＱ；
ＧＫＨＬＧＧＫＨＲＲＳＲ；
ＲＧＴＨＨＡＱＫＲＲＳ；
ＲＲＨＫＳＧＨＩＱＧＳＫ；
ＳＲＭＨＧＲＶＲＧＲＨＥ；
ＲＲＲＡＧＬＴＡＧＲＰＲ；
ＲＹＧＧＨＲＴＳＲＫＷＶ；
ＲＳＡＲＹＧＨＲＲＧＶＧ；
ＧＬＲＧＮＲＲＶＦＡＲＰ；
ＳＲＧＱＲＧＲＬＧＫＴＲ；
ＤＲＲＧＲＳＳＬＰＫＬＡＧＰＶＥＦＰＤＲＫＩＫＧＲＲ；
ＲＭＲＲＫＧＲＶＫＨＷＧ；
ＲＧＧＡＲＧＲＨＫＴＧＲ；
ＴＧＡＲＱＲＧＬＱＧＧＷＧＰＲＨＬＲＧＫＤＱＰＰＧＲ；
ＲＱＲＲＲＤＬＴＲＶＥＧ；
ＳＴＫＤＨＮＲＧＲＲＮＶＧＰＶＳＲＳＴＬＲＤＰＩＲＲ；
ＲＲＩＧＨＱＶＧＧＲＲＮ；
ＲＬＥＳＲＡＡＧＱＲＲＡ；
ＧＧＰＲＲＨＬＧＲＲＧＨ；
ＶＳＫＲＧＨＲＲＴＡＨＥ；
ＲＧＴＲＳＧＳＴＲ；
ＲＲＲＫＫＩＱＧＲＳＫＲ；
ＲＫＳＹＧＫＹＱＧＲ；
ＫＮＧＲＹＳＩＳＲ；
ＲＲＲＣＧＱＫＫＫ；
ＫＱＫＩＫＨＶＶＫＬＫ；
ＫＬＫＳＱＬＶＫＲＫ；
ＲＹＰＩＳＲＰＲＫＲ；
ＫＶＧＫＳＰＰＶＲ；
ＫＴＦＧＫＭＫＰＲ；
ＲＩＫＷＳＲＶＳＫ；および
ＫＲＴＭＲＰＴＲＲ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、第６６項または第６７項の方法。
上記のペプチドの実施態様の各々において、ペプチドは、ペプチドのＣ末端に結合したグリシン−システイン（ＧＣ）またはＮ末端に結合したグリシン−システイン−グリシン（ＧＣＧ）を有してもよい。
【００３４】
６９．合成ペプチドグリカンのグリカン成分が、デキストラン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパリン、ケラチン、ケラタン硫酸およびヒアルロン酸からなる群から選択される、第６６項ないし第６８項のいずれかの方法。
７０．グリカンが、コンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸からなる群から選択される、第６６項ないし第６９項のいずれかの方法。
７１．合成ペプチドグリカンがアグリカナーゼに抵抗性である、第６６項ないし第７０項のいずれかの方法。
【００３５】
７２．患者にヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを投与することを含む、患者におけるヒアルロン酸の分解を低減または防止する方法。
７３．合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、式Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｂ２
（式中、Ｘ８は、存在するか、または存在せず、
式中、Ｂ１は塩基性アミノ酸であり、
式中、Ｂ２は塩基性アミノ酸であり、そして、
式中、Ｘ１−Ｘ８は、非酸性アミノ酸である）
のアミノ酸配列を含む、第７２項の方法。
【００３６】
７４．合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、
ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧ；
ＧＤＲＲＲＲＲＭＷＨＲＱ；
ＧＫＨＬＧＧＫＨＲＲＳＲ；
ＲＧＴＨＨＡＱＫＲＲＳ；
ＲＲＨＫＳＧＨＩＱＧＳＫ；
ＳＲＭＨＧＲＶＲＧＲＨＥ；
ＲＲＲＡＧＬＴＡＧＲＰＲ；
ＲＹＧＧＨＲＴＳＲＫＷＶ；
ＲＳＡＲＹＧＨＲＲＧＶＧ；
ＧＬＲＧＮＲＲＶＦＡＲＰ；
ＳＲＧＱＲＧＲＬＧＫＴＲ；
ＤＲＲＧＲＳＳＬＰＫＬＡＧＰＶＥＦＰＤＲＫＩＫＧＲＲ；
ＲＭＲＲＫＧＲＶＫＨＷＧ；
ＲＧＧＡＲＧＲＨＫＴＧＲ；
ＴＧＡＲＱＲＧＬＱＧＧＷＧＰＲＨＬＲＧＫＤＱＰＰＧＲ；
ＲＱＲＲＲＤＬＴＲＶＥＧ；
ＳＴＫＤＨＮＲＧＲＲＮＶＧＰＶＳＲＳＴＬＲＤＰＩＲＲ；
ＲＲＩＧＨＱＶＧＧＲＲＮ；
ＲＬＥＳＲＡＡＧＱＲＲＡ；
ＧＧＰＲＲＨＬＧＲＲＧＨ；
ＶＳＫＲＧＨＲＲＴＡＨＥ；
ＲＧＴＲＳＧＳＴＲ；
ＲＲＲＫＫＩＱＧＲＳＫＲ；
ＲＫＳＹＧＫＹＱＧＲ；
ＫＮＧＲＹＳＩＳＲ；
ＲＲＲＣＧＱＫＫＫ；
ＫＱＫＩＫＨＶＶＫＬＫ；
ＫＬＫＳＱＬＶＫＲＫ；
ＲＹＰＩＳＲＰＲＫＲ；
ＫＶＧＫＳＰＰＶＲ；
ＫＴＦＧＫＭＫＰＲ；
ＲＩＫＷＳＲＶＳＫ；および
ＫＲＴＭＲＰＴＲＲ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、第７２項または第７３項の方法。
上記のペプチドの実施態様の各々において、ペプチドは、ペプチドのＣ末端に結合したグリシン−システイン（ＧＣ）またはＮ末端に結合したグリシン−システイン−グリシン（ＧＣＧ）を有してもよい。
【００３７】
７５．合成ペプチドグリカンのグリカン成分が、デキストラン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパリン、ケラチン、ケラタン硫酸およびヒアルロン酸からなる群から選択される、第７２項ないし第７４項のいずれかの方法。
７６．グリカンが、コンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸からなる群から選択される、第７２項ないし第７５項のいずれかの方法。
７７．合成ペプチドグリカンがアグリカナーゼに抵抗性である、第７２項ないし第７６項のいずれかの方法。
７８．合成ペプチドグリカンが注入により患者に投与される、第７２項ないし第７７項のいずれかの方法。
７９．注入が関節内注入である、第７８項の方法。
８０．注入が患者の関節包へのものである、第７８項の方法。
８１．ヒアルロン酸の分解速度が低減される、第７２項ないし第８８項のいずれかの方法。
【００３８】
８２．組織欠損にヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを投与することを含み、欠損が矯正または修正される、患者の組織欠損を矯正または修正する方法。
８３．合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、式Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｂ２
（式中、Ｘ８は、存在するか、または存在せず、
式中、Ｂ１は塩基性アミノ酸であり、
式中、Ｂ２は塩基性アミノ酸であり、そして、
式中、Ｘ１−Ｘ８は、非酸性アミノ酸である）
のアミノ酸配列を含む、第８２項の方法。
【００３９】
８４．合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、
ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧ；
ＧＤＲＲＲＲＲＭＷＨＲＱ；
ＧＫＨＬＧＧＫＨＲＲＳＲ；
ＲＧＴＨＨＡＱＫＲＲＳ；
ＲＲＨＫＳＧＨＩＱＧＳＫ；
ＳＲＭＨＧＲＶＲＧＲＨＥ；
ＲＲＲＡＧＬＴＡＧＲＰＲ；
ＲＹＧＧＨＲＴＳＲＫＷＶ；
ＲＳＡＲＹＧＨＲＲＧＶＧ；
ＧＬＲＧＮＲＲＶＦＡＲＰ；
ＳＲＧＱＲＧＲＬＧＫＴＲ；
ＤＲＲＧＲＳＳＬＰＫＬＡＧＰＶＥＦＰＤＲＫＩＫＧＲＲ；
ＲＭＲＲＫＧＲＶＫＨＷＧ；
ＲＧＧＡＲＧＲＨＫＴＧＲ；
ＴＧＡＲＱＲＧＬＱＧＧＷＧＰＲＨＬＲＧＫＤＱＰＰＧＲ；
ＲＱＲＲＲＤＬＴＲＶＥＧ；
ＳＴＫＤＨＮＲＧＲＲＮＶＧＰＶＳＲＳＴＬＲＤＰＩＲＲ；
ＲＲＩＧＨＱＶＧＧＲＲＮ；
ＲＬＥＳＲＡＡＧＱＲＲＡ；
ＧＧＰＲＲＨＬＧＲＲＧＨ；
ＶＳＫＲＧＨＲＲＴＡＨＥ；
ＲＧＴＲＳＧＳＴＲ；
ＲＲＲＫＫＩＱＧＲＳＫＲ；
ＲＫＳＹＧＫＹＱＧＲ；
ＫＮＧＲＹＳＩＳＲ；
ＲＲＲＣＧＱＫＫＫ；
ＫＱＫＩＫＨＶＶＫＬＫ；
ＫＬＫＳＱＬＶＫＲＫ；
ＲＹＰＩＳＲＰＲＫＲ；
ＫＶＧＫＳＰＰＶＲ；
ＫＴＦＧＫＭＫＰＲ；
ＲＩＫＷＳＲＶＳＫ；および
ＫＲＴＭＲＰＴＲＲ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、第８２項または第８３項の方法。
上記のペプチドの実施態様の各々において、ペプチドは、ペプチドのＣ末端に結合したグリシン−システイン（ＧＣ）またはＮ末端に結合したグリシン−システイン−グリシン（ＧＣＧ）を有してもよい。
【００４０】
８５．合成ペプチドグリカンのグリカン成分が、デキストラン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパリン、ケラチン、ケラタン硫酸およびヒアルロン酸からなる群から選択される、第８２項ないし第８４項のいずれかの方法。
８６．グリカンが、コンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸からなる群から選択される、第８２項ないし第８５項のいずれかの方法。
８７．合成ペプチドグリカンがアグリカナーゼに抵抗性である、第８２項ないし第８６項のいずれかの方法。
８８．合成ペプチドグリカンが注入により患者に投与される、第８２項ないし第８７項のいずれかの方法。
８９．注入が皮下である、第８８項の方法。
９０．欠損が美容的欠損である、第８２項ないし第８９項のいずれかの方法。
【００４１】
９１．ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを含む皮膚注入剤。
９２．合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、式Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｂ２
（式中、Ｘ８は、存在するか、または存在せず、
式中、Ｂ１は塩基性アミノ酸であり、
式中、Ｂ２は塩基性アミノ酸であり、そして、
式中、Ｘ１−Ｘ８は、非酸性アミノ酸である）
のアミノ酸配列を含む、第９１項の皮膚注入剤。
【００４２】
９３．合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、
ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧ；
ＧＤＲＲＲＲＲＭＷＨＲＱ；
ＧＫＨＬＧＧＫＨＲＲＳＲ；
ＲＧＴＨＨＡＱＫＲＲＳ；
ＲＲＨＫＳＧＨＩＱＧＳＫ；
ＳＲＭＨＧＲＶＲＧＲＨＥ；
ＲＲＲＡＧＬＴＡＧＲＰＲ；
ＲＹＧＧＨＲＴＳＲＫＷＶ；
ＲＳＡＲＹＧＨＲＲＧＶＧ；
ＧＬＲＧＮＲＲＶＦＡＲＰ；
ＳＲＧＱＲＧＲＬＧＫＴＲ；
ＤＲＲＧＲＳＳＬＰＫＬＡＧＰＶＥＦＰＤＲＫＩＫＧＲＲ；
ＲＭＲＲＫＧＲＶＫＨＷＧ；
ＲＧＧＡＲＧＲＨＫＴＧＲ；
ＴＧＡＲＱＲＧＬＱＧＧＷＧＰＲＨＬＲＧＫＤＱＰＰＧＲ；
ＲＱＲＲＲＤＬＴＲＶＥＧ；
ＳＴＫＤＨＮＲＧＲＲＮＶＧＰＶＳＲＳＴＬＲＤＰＩＲＲ；
ＲＲＩＧＨＱＶＧＧＲＲＮ；
ＲＬＥＳＲＡＡＧＱＲＲＡ；
ＧＧＰＲＲＨＬＧＲＲＧＨ；
ＶＳＫＲＧＨＲＲＴＡＨＥ；
ＲＧＴＲＳＧＳＴＲ；
ＲＲＲＫＫＩＱＧＲＳＫＲ；
ＲＫＳＹＧＫＹＱＧＲ；
ＫＮＧＲＹＳＩＳＲ；
ＲＲＲＣＧＱＫＫＫ；
ＫＱＫＩＫＨＶＶＫＬＫ；
ＫＬＫＳＱＬＶＫＲＫ；
ＲＹＰＩＳＲＰＲＫＲ；
ＫＶＧＫＳＰＰＶＲ；
ＫＴＦＧＫＭＫＰＲ；
ＲＩＫＷＳＲＶＳＫ；および
ＫＲＴＭＲＰＴＲＲ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、第９１項または第９２項の皮膚注入剤。
上記のペプチドの実施態様の各々において、ペプチドは、ペプチドのＣ末端に結合したグリシン−システイン（ＧＣ）またはＮ末端に結合したグリシン−システイン−グリシン（ＧＣＧ）を有してもよい。
９４．さらにヒアルロン酸を含む、第９１項ないし第９３項のいずれかの皮膚注入剤。
【００４３】
９５．ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを、コラーゲンの存在下でヒアルロン酸と接触させる段階、および、
コラーゲンの分解を低減または防止する段階
を含む、コラーゲンの分解を低減または防止する方法。
９６．合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、式Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｂ２
（式中、Ｘ８は、存在するか、または存在せず、
式中、Ｂ１は塩基性アミノ酸であり、
式中、Ｂ２は塩基性アミノ酸であり、そして、
式中、Ｘ１−Ｘ８は、非酸性アミノ酸である）
のアミノ酸配列を含む、第９５項の方法。
【００４４】
９７．合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、
ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧ；
ＧＤＲＲＲＲＲＭＷＨＲＱ；
ＧＫＨＬＧＧＫＨＲＲＳＲ；
ＲＧＴＨＨＡＱＫＲＲＳ；
ＲＲＨＫＳＧＨＩＱＧＳＫ；
ＳＲＭＨＧＲＶＲＧＲＨＥ；
ＲＲＲＡＧＬＴＡＧＲＰＲ；
ＲＹＧＧＨＲＴＳＲＫＷＶ；
ＲＳＡＲＹＧＨＲＲＧＶＧ；
ＧＬＲＧＮＲＲＶＦＡＲＰ；
ＳＲＧＱＲＧＲＬＧＫＴＲ；
ＤＲＲＧＲＳＳＬＰＫＬＡＧＰＶＥＦＰＤＲＫＩＫＧＲＲ；
ＲＭＲＲＫＧＲＶＫＨＷＧ；
ＲＧＧＡＲＧＲＨＫＴＧＲ；
ＴＧＡＲＱＲＧＬＱＧＧＷＧＰＲＨＬＲＧＫＤＱＰＰＧＲ；
ＲＱＲＲＲＤＬＴＲＶＥＧ；
ＳＴＫＤＨＮＲＧＲＲＮＶＧＰＶＳＲＳＴＬＲＤＰＩＲＲ；
ＲＲＩＧＨＱＶＧＧＲＲＮ；
ＲＬＥＳＲＡＡＧＱＲＲＡ；
ＧＧＰＲＲＨＬＧＲＲＧＨ；
ＶＳＫＲＧＨＲＲＴＡＨＥ；
ＲＧＴＲＳＧＳＴＲ；
ＲＲＲＫＫＩＱＧＲＳＫＲ；
ＲＫＳＹＧＫＹＱＧＲ；
ＫＮＧＲＹＳＩＳＲ；
ＲＲＲＣＧＱＫＫＫ；
ＫＱＫＩＫＨＶＶＫＬＫ；
ＫＬＫＳＱＬＶＫＲＫ；
ＲＹＰＩＳＲＰＲＫＲ；
ＫＶＧＫＳＰＰＶＲ；
ＫＴＦＧＫＭＫＰＲ；
ＲＩＫＷＳＲＶＳＫ；および
ＫＲＴＭＲＰＴＲＲ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、第９５項または第９６項の方法。
【００４５】
９８．合成ペプチドグリカンのグリカン成分が、デキストラン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパリン、ケラチン、ケラタン硫酸およびヒアルロン酸からなる群から選択される、第９５項ないし第９７項のいずれかの方法。
９９．グリカンが、コンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸からなる群から選択される、第９５項ないし第９８項のいずれかの方法。
１００．合成ペプチドグリカンがアグリカナーゼに抵抗性である、第９５項ないし第９９項のいずれかの方法。
１０１．ヒアルロン酸の分解速度が低減される、第９５項ないし第１００項のいずれかの方法。
【００４６】
１０２．コラーゲン、ヒアルロン酸、および、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを合わせる段階、および、
マトリックスの孔のサイズを大きくする段階、
を含む、人工コラーゲンマトリックスの孔のサイズを大きくする方法。
１０３．合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、式Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｂ２
（式中、Ｘ８は、存在するか、または存在せず、
式中、Ｂ１は塩基性アミノ酸であり、
式中、Ｂ２は塩基性アミノ酸であり、そして、
式中、Ｘ１−Ｘ８は、非酸性アミノ酸である）
のアミノ酸配列を含む、第１０２項の方法。
【００４７】
１０４．合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、
ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧ；
ＧＤＲＲＲＲＲＭＷＨＲＱ；
ＧＫＨＬＧＧＫＨＲＲＳＲ；
ＲＧＴＨＨＡＱＫＲＲＳ；
ＲＲＨＫＳＧＨＩＱＧＳＫ；
ＳＲＭＨＧＲＶＲＧＲＨＥ；
ＲＲＲＡＧＬＴＡＧＲＰＲ；
ＲＹＧＧＨＲＴＳＲＫＷＶ；
ＲＳＡＲＹＧＨＲＲＧＶＧ；
ＧＬＲＧＮＲＲＶＦＡＲＰ；
ＳＲＧＱＲＧＲＬＧＫＴＲ；
ＤＲＲＧＲＳＳＬＰＫＬＡＧＰＶＥＦＰＤＲＫＩＫＧＲＲ；
ＲＭＲＲＫＧＲＶＫＨＷＧ；
ＲＧＧＡＲＧＲＨＫＴＧＲ；
ＴＧＡＲＱＲＧＬＱＧＧＷＧＰＲＨＬＲＧＫＤＱＰＰＧＲ；
ＲＱＲＲＲＤＬＴＲＶＥＧ；
ＳＴＫＤＨＮＲＧＲＲＮＶＧＰＶＳＲＳＴＬＲＤＰＩＲＲ；
ＲＲＩＧＨＱＶＧＧＲＲＮ；
ＲＬＥＳＲＡＡＧＱＲＲＡ；
ＧＧＰＲＲＨＬＧＲＲＧＨ；
ＶＳＫＲＧＨＲＲＴＡＨＥ；
ＲＧＴＲＳＧＳＴＲ；
ＲＲＲＫＫＩＱＧＲＳＫＲ；
ＲＫＳＹＧＫＹＱＧＲ；
ＫＮＧＲＹＳＩＳＲ；
ＲＲＲＣＧＱＫＫＫ；
ＫＱＫＩＫＨＶＶＫＬＫ；
ＫＬＫＳＱＬＶＫＲＫ；
ＲＹＰＩＳＲＰＲＫＲ；
ＫＶＧＫＳＰＰＶＲ；
ＫＴＦＧＫＭＫＰＲ；
ＲＩＫＷＳＲＶＳＫ；および
ＫＲＴＭＲＰＴＲＲ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、第１０２項または第１０３項の方法。
【００４８】
１０５．合成ペプチドグリカンのグリカン成分が、デキストラン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパリン、ケラチン、ケラタン硫酸およびヒアルロン酸からなる群から選択される、第１０２項ないし第１０４項のいずれかの方法。
１０６．グリカンが、コンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸からなる群から選択される、第１０２項ないし第１０５項のいずれかの方法。
１０７．合成ペプチドグリカンがアグリカナーゼに抵抗性である、第１０２項ないし第１０６項のいずれかの方法。
１０８．マトリックスが滅菌されている、第１０２項ないし第１０７項のいずれかの方法。
１０９．マトリックスが軟骨細胞または幹細胞をさらに含む、第１０２項ないし第１０８項のいずれかの方法。
１１０．幹細胞が、骨芽細胞、骨原性細胞および間葉性幹細胞からなる群から選択される、第１０９項の方法。
１１１．マトリックスが１種またはそれ以上の栄養分をさらに含む、第１０２項ないし第１１０項のいずれかの方法。
１１２．マトリックスが１種またはそれ以上の増殖因子をさらに含む、第１０２項ないし第１１１項のいずれかの方法。
【００４９】
１１３．ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを、コラーゲンの存在下でヒアルロン酸と接触させる段階、および、
コンドロイチン硫酸の分解を低減または防止する段階
を含む、コンドロイチン硫酸の分解を低減または防止する方法。
１１４．合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、式Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｂ２
（式中、Ｘ８は、存在するか、または存在せず、
式中、Ｂ１は塩基性アミノ酸であり、
式中、Ｂ２は塩基性アミノ酸であり、そして、
式中、Ｘ１−Ｘ８は、非酸性アミノ酸である）
のアミノ酸配列を含む、第１１３項の方法。
【００５０】
１１５．合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、
ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧ；
ＧＤＲＲＲＲＲＭＷＨＲＱ；
ＧＫＨＬＧＧＫＨＲＲＳＲ；
ＲＧＴＨＨＡＱＫＲＲＳ；
ＲＲＨＫＳＧＨＩＱＧＳＫ；
ＳＲＭＨＧＲＶＲＧＲＨＥ；
ＲＲＲＡＧＬＴＡＧＲＰＲ；
ＲＹＧＧＨＲＴＳＲＫＷＶ；
ＲＳＡＲＹＧＨＲＲＧＶＧ；
ＧＬＲＧＮＲＲＶＦＡＲＰ；
ＳＲＧＱＲＧＲＬＧＫＴＲ；
ＤＲＲＧＲＳＳＬＰＫＬＡＧＰＶＥＦＰＤＲＫＩＫＧＲＲ；
ＲＭＲＲＫＧＲＶＫＨＷＧ；
ＲＧＧＡＲＧＲＨＫＴＧＲ；
ＴＧＡＲＱＲＧＬＱＧＧＷＧＰＲＨＬＲＧＫＤＱＰＰＧＲ；
ＲＱＲＲＲＤＬＴＲＶＥＧ；
ＳＴＫＤＨＮＲＧＲＲＮＶＧＰＶＳＲＳＴＬＲＤＰＩＲＲ；
ＲＲＩＧＨＱＶＧＧＲＲＮ；
ＲＬＥＳＲＡＡＧＱＲＲＡ；
ＧＧＰＲＲＨＬＧＲＲＧＨ；
ＶＳＫＲＧＨＲＲＴＡＨＥ；
ＲＧＴＲＳＧＳＴＲ；
ＲＲＲＫＫＩＱＧＲＳＫＲ；
ＲＫＳＹＧＫＹＱＧＲ；
ＫＮＧＲＹＳＩＳＲ；
ＲＲＲＣＧＱＫＫＫ；
ＫＱＫＩＫＨＶＶＫＬＫ；
ＫＬＫＳＱＬＶＫＲＫ；
ＲＹＰＩＳＲＰＲＫＲ；
ＫＶＧＫＳＰＰＶＲ；
ＫＴＦＧＫＭＫＰＲ；
ＲＩＫＷＳＲＶＳＫ；および
ＫＲＴＭＲＰＴＲＲ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、第１１３項または第１１４項の方法。
【００５１】
１１６．合成ペプチドグリカンのグリカン成分が、デキストラン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパリン、ケラチン、ケラタン硫酸およびヒアルロン酸からなる群から選択される、第１１３項ないし第１１５項のいずれかの方法。
１１７．グリカンが、コンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸からなる群から選択される、第１１３項ないし第１１６項のいずれかの方法。
１１８．合成ペプチドグリカンがアグリカナーゼに抵抗性である、第１１３項ないし第１１７項のいずれかの方法。
１１９．コンドロイチン硫酸の分解速度が低減される、第１１３項ないし第１１８項のいずれかの方法。
【００５２】
１２０．合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、ペプチドのＣ末端に結合したグリシン−システイン（ＧＣ）を有する、先行する項目のいずれかの合成ペプチドグリカン、化合物、人工コラーゲンマトリックス、組成物、添加物、方法または皮膚注入剤。
１２１．合成ペプチドグリカンのペプチド成分が、ペプチドのＮ末端に結合したグリシン−システイン−グリシン（ＧＣＧ）を有する、先行する項目のいずれかの合成ペプチドグリカン、化合物、人工コラーゲンマトリックス、組成物、添加物、方法または皮膚注入剤。
１２２．合成ペプチドグリカンがマトリックスメタロプロテアーゼに抵抗性である、先行する項目のいずれかの合成ペプチドグリカン、化合物、人工コラーゲンマトリックス、組成物、添加物、方法または皮膚注入剤。
１２３．マトリックスメタロプロテアーゼがアグリカナーゼである、第１２２項の合成ペプチドグリカン、化合物、人工コラーゲンマトリックス、組成物、添加物、方法または皮膚注入剤。
１２４．合成ペプチドグリカンの用量が、約０.０１ｕＭないし約１００ｕＭの濃度範囲にある、先行する項目のいずれかの合成ペプチドグリカン、化合物、人工コラーゲンマトリックス、組成物、添加物、方法または皮膚注入剤。
１２５．合成ペプチドグリカンの用量が、約０.１ｕＭないし約１０ｕＭの濃度範囲にある、先行する項目のいずれかの合成ペプチドグリカン、化合物、人工コラーゲンマトリックス、組成物、添加物、方法または皮膚注入剤。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
図面の簡単な説明
【図１】図１は、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの実施態様を製造するための反応スキームを示す。反応段階を太字で詳細に示す。
【図２】図２は、注入されたＢＭＰＨの量（ｍｇ）に基づく、Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジドトリフルオロ酢酸塩（以後、「ＢＭＰＨ」）の吸光度（２１５ｎｍ）の標準曲線を示す。この標準曲線を、カップリング反応中に消費されたＢＭＰＨの量を測定するのに使用した。
【図３】図３は、固定化されたヒアルロン酸（ＨＡ）への、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの結合を示す。９種のＨＡ結合ペプチド（例えば、ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧＧＣ；以後「ＧＡＨ」または「ｍＡＧＣ」）を、官能化されたグリコサミノグリカン（例えば、コンドロイチン硫酸、以後「ＣＳ」）主鎖に結合させた。合成ペプチドグリカンの濃度を、０.０１μＭから１００μＭへ高めた。
【図４】図４は、レオロジー的周波数掃引（rheological frequency sweep）により測定した合成ペプチドグリカンのＨＡ結合を示す（パネルＡ）。ＨＡ混合物の貯蔵弾性率を５.０１２Ｈｚの発振周波数で分析した。この周波数で、ＨＡ鎖の完全性を維持したまま、注目すべき負荷が与えられた。統計学的分析（α＝０.０５）は、ＨＡ＋ＣＳおよびＨＡが有意に異なること（＊で示す）、および、ＨＡ＋１０.５ＧＡＨ−ＣＳおよびＨＡ＋ＣＳが有意に異なることを示した（＊＊で示す）。パネルＢは、パネルＡに示した同じデータの別の表示である。
【図５】図５は、コラーゲン原線維形成中のＩ型コラーゲン＋処置群の濁度の定量を示す。３１３ｎｍでの吸光度を３分毎に測定した。１時間（即ち、時点数２０）後、全ての処置群は完全にネットワークを形成した。最大吸光度または最大半量吸光度までの時間に関して、処置群間に有意差（α＝０.０５）はなかった。
【図６】図６は、１％／秒の工学ひずみ（engineering strain）の適用に基づき、コラーゲンゲルによって耐えられる工学的圧縮応力（compressive engineering stress）を示す。統計学的分析（α＝０.０５）は、１０.５ＧＡＨ−ＣＳの添加が、５％、７.５％および１０％の工学ひずみで分析された工学的応力に加えて、ピークの工学的応力に有意差をもたらすことを立証した。
【図７】図７は、０.５０１２Ｈｚの発振周波数で測定したコラーゲン混合物の貯蔵弾性率を示す。統計学的分析（α＝０.０５）は、１０.５ＧＡＨ−ＣＳの添加が、コラーゲンゲルの貯蔵弾性率の有意な増加をもたらすことを立証した（＊で示す）。
【図８】図８は、混合物にヒアルロニダーゼを添加することによる、ＨＡ混合物の分解割合を示す（パネルＡ）。ＨＡ混合物の動粘性の変化により、分解割合を測定した。動粘性の測定は、最初に混合物で行い、分解割合を算出するベースラインとして供した。０時間の時点は、ヒアルロニダーゼの添加、サンプルの十分な混合およびレオメータのステージへのピペットによる添加の後とし、ヒアルロニダーゼの添加と動粘性の測定の間に約２分間が経過した。統計学的分析は、１０.５ＧＡＨ−ＣＳサンプルの分解割合に、０時間および２時間の両時点で有意差（α＝０.０５）を立証した。パネルＢは、ヒアルロニダーゼの添加によるＨＡ混合物の動粘性を標準化して表した同じデータを示す（平均±ＳＥ、ｎ＝３）。動粘性測定は、最初に、ヒアルロニダーゼを添加する前の混合物で行い、これらの値を、標準化された動粘性を算出するベースラインとして供した。標準化された動粘性は、ヒアルロニダーゼの添加後に動粘性を各々測定し、この値をそのサンプルの最初の動粘性で割ることにより決定した。統計学的分析（α＝０.０５）を実施した。１０.５ＧＡＨ−ＣＳサンプルにつき、０時間および２時間の両時点で、標準化された分解に有意差が見られた。
【図９】図９は、各軟骨ＥＣＭ複製物を伴うＣＩ足場の代表的な凍結ＳＥＭ画像（倍率１０,０００ｘ、５μｍのスケールバー）。パネルＡは、ＣＩ対照を表す。パネルＢは、ＣＩ＋ＨＡ＋ＣＳを表す。パネルＣは、ＣＩ＋ＨＡ＋１０.５ＧＡＨ−ＣＳを表す。
【図１０】図１０は、５０時間の期間にわたりＭＭＰ−Ｉに曝されたＥＣＭ複製物におけるＣＩの分解割合（平均±ＳＥ、ｎ＝３）を示す。様々な処理の統計学的分析（ｐ＜０.０５）は、３種すべての処理（ＣＩ対照、ＣＩ＋ＨＡ＋ＣＳおよびＣＩ＋ＨＡ＋１０.５ＧＡＨ−ＣＳ）が相互に有意に異なることを解明した。
【図１１】図１１は、ＩＬ−１βで刺激した／しなかった培地中での８日間の培養期間にわたる、累積的なコンドロイチン硫酸（ＣＳ）の損失を示す。ＣＳ損失は、ＤＭＭＢアッセイにより測定した。ｍＡＧＣの添加は、足場からのＣＳの損失に有意な影響を与えた（ｐ＜０.００１）。＊＊は、アグリカン模倣物を用いずに調製された足場と、ｍＡＧＣを用いて調製されたものとの間の統計学的有意性を示す。＋は、ＩＬ−１βで処理した／しなかった足場間の統計学的有意性を示す（ｐ＜０.０５）。バーは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）を示す。
【図１２】図１２は、ＩＬ−１βで刺激した／しなかった培地中での８日間の培養期間にわたる、累積的なコラーゲンの崩壊を示す。コラーゲンの崩壊は、Sircol アッセイで測定した。アグリカン模倣物の添加は、足場からのコラーゲンの損失に有意な影響を与えた（ｐ＜０.０２）。＊＊は、アグリカン模倣物を用いずに調製された足場と、ｍＡＧＣを用いて調製されたものとの間の統計学的有意性を示す。＋は、ＩＬ−１βで処理した／しなかった足場間の統計学的有意性を示す（ｐ＜０.０５）。バーは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）を示す。
【図１３】図１３は、ペプチドグリカンのエクスビボでの効力を調べるための基盤を表す。０.５％トリプシンを使用して、ウシ軟骨外植片から天然のアグリカンを除去した。アグリカンの除去は、ＤＭＭＢアッセイにより確認した。グラフは、正の対照と比較して、除去されたアグリカンの量を表す。
【図１４】図１４は、軟骨マトリックスを介するペプチドグリカンの拡散をモニターするアッセイを示す。Ｙ軸は、ペプチドグリカンで処理した／しなかったアグリカン枯渇軟骨プラグから読み取られる、ＤＭＭＢアッセイの吸光度の差異を表す。Ｘ軸は、軟骨の関節表面から、肋軟骨下の骨までの距離を表す。バーは、平均の差±ＳＥＭ（ｎ＝３）を示す。
【図１５】図１５は、ウシ軟骨外植片のサフラニンＯおよびアビジン−ビオチン染色を示す。マトリックスを介して正中矢状切開を行い、各々、残りのアグリカン（上のパネル、濃い染色）およびビオチン（下のパネル、濃い染色）を調べた。ＩＩ型コラーゲンに結合するペプチドグリカン［ＷＹＲＧＲＬＧＣ；「ｍＡＧ（ＩＩ）Ｃ」］は、外植片を介して拡散した。この組織切片をさらに拡大すると（２０Ｘ）、ｍＡＧ（ＩＩ）Ｃが約２００ｕｍにわたり組織に浸透することを示した。
【図１６】図１６は、軟骨外植片のアビジン−ビオチン染色を示す。ペプチドグリカン（ｍＡＧ（ＩＩ）ＣおよびｍＡＧＣ）は、軟骨外植片を介して拡散した。画像は、各々の浸透の深さを示す（濃い染色）。
【図１７】図１７は、アグリカン枯渇（ＡＤ）外植片におけるペプチドグリカンの添加が圧縮剛性を高めることを示す。ＨＡに結合するペプチドグリカン（ｍＡＧＣ）の添加は、軟骨外植片の剛性を、ＩＩ型コラーゲンに結合するペプチドグリカン（ｍＡＧ（ＩＩ）Ｃ）と匹敵するほど高く、有意に回復させた。＊で示される有意性は、ＡＤおよびＡＤ＋ｍＡＣＧで増強された外植片の間に、圧縮剛性の増加を特定した（ｐ＜０.００５）。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）として提示する。
【図１８Ａ】図１８（Ａ）は、ＭＭＰ−１３に結合したプローブの図解による描写を示す。ＢＨＱ−３ブラックホールクエンチャー３およびＣＹ５.５は、各々、６９５ｎｍで吸光および発光する。矢印およびイタリックは、切断部位を示す。
【図１８Ｂ】図１８（Ｂ）は、ＭＭＰ−１３が有る場合／無い場合で、プローブ活性の濃度プロファイルを示す：左、９６ウェルマイクロプレートの蛍光イメージングセクション；右、蛍光発光強度の回復（６９５ｎｍ）。
【図１９】図１９は、ペプチドグリカンで処理した／しなかった Sprague-Dawley ラットにおける、手術の４、６および８週間後の、ＭＭＰ−１３プローブにより示される炎症の程度を示す。
【図２０】図２０は、Sprague-Dawley ラットの膝関節のｘ線画像を示し、ＯＡ誘導の６週および８週間後に、傷害された膝（各々パネルＡおよびＤ）、ペプチドグリカン処置の傷害された膝（各々パネルＢおよびＥ）、および、骨関節症誘導手術の６週間後の正常な膝（パネルＣ）を示す。
【図２１】図２１は、ＯＡ誘導手術の６および８週間後の新しい軟骨の再成長を示す Sprague-Dawley ラットのマイクロＣＴを示す。ＯＡ誘導の６週および８週間後の傷害された膝を、各々パネルＡおよびＤに示す。ペプチドグリカン処置後の傷害された膝を、各々パネルＢおよびＥに示す。正常な膝をパネルＣに示す。
【図２２】図２２は、コラーゲン足場へのｍＡＧＣの添加が貯蔵弾性率および圧縮剛性を高めることを示す。コラーゲン足場の周波数掃引（Ａ）は、０.１−２.０Ｈｚの範囲にわたる貯蔵弾性率の増加を示した。同様に、圧縮剛性（Ｂ）は、ｍＡＧＣを添加して足場を調製したときに値の増加を示した。有意性を＊と示す（ｐ＜０.０００１）。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）で提示する。
【図２３】図２３は、ＩＬ−１βで刺激した／しなかった培地中での８日間の培養期間にわたる、累積的なコンドロイチン硫酸（ＣＳ）の損失を示す。ＣＳの損失は、ＤＭＭＢアッセイで測定した。足場の組成（Ａ−Ｈ）を表３に記載する。ｍＡＧＣの添加は、足場からのＣＳの損失に有意な影響を有した（ｐ＜０.００１）。＊は、足場ＡとＣの間、および、足場ＥとＧの間の統計学的有意性を示す（ｐ＜０.０５）。バーは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）を示す。
【図２４】図２４は、ＩＬ−１βで刺激した／しなかった培地中での８日間の培養期間にわたる、累積的なコラーゲンの崩壊を示す。コラーゲンの崩壊は、Sircol アッセイで測定した。足場の組成（Ａ−Ｈ）を表３に示す。アグリカン模倣物の添加は、足場からのコラーゲンの損失に有意な影響を有した（ｐ＜０.０２）。＊は、足場ＡとＣの間、および、足場ＥとＧの間の統計学的有意性を示す（ｐ＜０.０５）。バーは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）を示す。
【図２５】図２５は、整列していない（Ａ）および整列した（Ｂ）コラーゲン足場で培養されるウシ軟骨細胞により発現されるアグリカンおよびＩＩ型コラーゲンのリアルタイムＰＣＲ分析を示す。内在性ＧＡＰＤＨの発現で値を標準化した。ｍＡＧＣの添加は、アグリカンおよびＩＩ型コラーゲンの発現を、各々統計学的に変化させた（ｐアグリカン＜０.０２およびｐコラーゲン＜０.００１）。整列していない／整列した足場の間にも、アグリカンおよびＩＩ型コラーゲンの発現の統計学的差異があった（ｐ＜０.００１）。同様に、アグリカンおよびＩＩ型コラーゲンの発現は、ＩＬ−１βで処理した／しなかった足場間で異なった（ｐ＜０.０１）。足場の組成（Ａ−Ｈ）を表３に示す。バーは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
例示的実施態様の詳細な説明
本明細書で使用するとき、「ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカン」は、グリカンに結合した合成ペプチドであって、ペプチドがヒアルロン酸結合配列を含むものを意味する。
【００５５】
本発明の様々な実施態様を以下の通り本明細書で説明する。本明細書に記載するある実施態様では、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンが提供される。ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンは、グリカンに結合した合成ペプチドであって、ペプチドがヒアルロン酸結合配列を含むものを含む。
【００５６】
他の実施態様では、式ＰｎＧｘの化合物が記載され、式中、ｎは１ないし２０であり；式中、ｘは１ないし２０であり；式中、Ｐは、ヒアルロン酸結合配列を含む約５個ないし約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；そして、式中、Ｇはグリカンである。
【００５７】
また他の実施態様では、式（ＰｎＬ）ｘＧの化合物が記載され、
式中、ｎは１ないし２０であり；
式中、ｘは１ないし２０であり；
式中、Ｐは、ヒアルロン酸結合配列を含む約５個ないし約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
式中、Ｌはリンカーであり；そして、
式中、Ｇはグリカンである。
【００５８】
他の実施態様では、式Ｐ（ＬＧｎ）ｘの化合物が記載され、
式中、ｎは１ないし２０であり；
式中、ｘは１ないし２０であり；
式中、Ｐは、ヒアルロン酸結合配列を含む約５個ないし約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
式中、Ｌはリンカーであり；そして、式中、Ｇはグリカンである。
【００５９】
また他の実施態様では、式ＰｎＧｘの化合物が記載され、
式中、ｎはＭＷＧ／１０００であり；
式中、ＭＷＧは、最も近い１ｋＤａに端数処理したＧの分子量であり；
式中、ｘは１ないし２０であり；
式中、Ｐは、ヒアルロン酸結合配列を含む約５個ないし約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；そして、
式中、Ｇはグリカンである。
【００６０】
他の実施態様では、式（ＰｎＬ）ｘＧの化合物が記載され、
式中、ｎはＭＷＧ／１０００であり；
式中、ＭＷＧは、最も近い１ｋＤａに端数処理したＧの分子量であり；
式中、ｘは１ないし２０であり；
式中、Ｐは、ヒアルロン酸結合配列を含む約５個ないし約４０個のアミノ酸の合成ペプチドであり；
式中、Ｌはリンカーであり；そして、
式中、Ｇはグリカンである。
【００６１】
この開示のために、先行する段落に記載したヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンおよび化合物は、集合的に「ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカン」または「合成ペプチドグリカン」と呼ばれる。
【００６２】
上記のペプチド実施態様の各々において、合成ペプチドグリカンは、５−１５個のペプチド分子（ｎは５−１５である）、５−２０個のペプチド分子（ｎは５−２０である）、１−２０個のペプチド分子（ｎは１−２０である）、または１−２５個のペプチド分子（ｎは１−２５である）を含み得る。ある実施態様では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５個のペプチド分子からなる群から選択される。
【００６３】
本明細書に記載する他の例示的実施態様では、人工コラーゲンマトリックスが提供される。マトリックスは、重合したコラーゲン、ヒアルロン酸およびヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを含む。他の実施態様では、軟骨細胞または幹細胞のインビトロ培養用の組成物が提供される。組成物は、この開示に記載するヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンのいずれかを含む。
【００６４】
本明細書に記載する他の実施態様では、人工コラーゲンマトリックスの孔のサイズを大きくする方法が提供される。この方法は、コラーゲン、ヒアルロン酸およびヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを合わせる段階、および、マトリックスの孔のサイズを大きくする段階を含む。
【００６５】
また他の例示的実施態様では、患者の軟骨の摩耗または糜爛を低減する方法が提供される。この方法は、患者にヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを投与する段階を含み、合成ペプチドグリカンは軟骨の摩耗または糜爛を低減する。ある実施態様では、軟骨の糜爛または摩耗は、関節炎に起因し得る。ある実施態様では、軟骨の糜爛または摩耗は、加齢、肥満、外傷または傷害、解剖学的異常、遺伝学的疾患、代謝の不均衡、炎症などに起因し得る。
【００６６】
また他の例示的実施態様では、患者の関節炎の処置方法が提供される。この方法は、患者にヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを投与する段階を含み、合成ペプチドグリカンは関節炎に関連する症状を低減する。
【００６７】
他の例示的実施態様では、患者におけるヒアルロン酸の分解を低減または防止する方法が提供される。この方法は、患者にヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを投与することを含む。
【００６８】
他の例示的実施態様では、コラーゲンの分解を低減または防止する方法が提供される。この方法は、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを、コラーゲンの存在下でヒアルロン酸と接触させる段階、および、コラーゲンの分解を低減または防止する段階を含む。
【００６９】
また他の例示的実施態様では、患者の組織欠損を矯正または修正する方法が提供される。この方法は、組織欠損にヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを投与することを含み、欠損が矯正または修正される。本明細書に記載の他の例示的実施態様では、皮膚注入剤が提供される。この注入剤は、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを含む。ある実施態様では、注入剤は、さらにヒアルロン酸を含む。
【００７０】
また他の実施態様では、生体材料の軟骨または骨置換組成物用の添加物が提供される。この添加物は、既存の生体材料の軟骨または骨置換材料に添加するためのヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを含む。本明細書に記載の他の実施態様では、生体材料または骨軟骨置換の製造方法が提供される。この方法は、合成ペプチドグリカンおよび既存の生体材料または骨軟骨置換材料を合わせる段階を含む。
【００７１】
様々な実施態様において、合成ペプチドグリカンのペプチド成分は、式Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｂ２
（式中、Ｘ８は、存在するか、または存在せず、
式中、Ｂ１は塩基性アミノ酸であり、
式中、Ｂ２は塩基性アミノ酸であり、そして、
式中、Ｘ１−Ｘ８は、非酸性アミノ酸である）
のアミノ酸配列を含む。
【００７２】
他の実施態様において、合成ペプチドグリカンのペプチド成分は、式Ｂ１−Ｘ１−Ｂ２−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｂ３
（式中、Ｘ９は、存在するか、または存在せず、
式中、Ｂ１は塩基性アミノ酸であり、
式中、Ｂ２は塩基性アミノ酸であり、
式中、Ｂ３は塩基性アミノ酸であり、そして、
式中、Ｘ１−Ｘ９は、非酸性アミノ酸である）
のアミノ酸配列を含み得るか、または、これであり得る。
【００７３】
他の実施態様において、合成ペプチドは、式Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｂ２−Ｘ９−Ｂ３
（式中、Ｘ８は、存在するか、または存在せず、
式中、Ｂ１は塩基性アミノ酸であり、
式中、Ｂ２は塩基性アミノ酸であり、
式中、Ｂ３は塩基性アミノ酸であり、そして、
式中、Ｘ１−Ｘ９は、非酸性アミノ酸である）
のアミノ酸配列を含み得るか、または、これであり得る。
【００７４】
本明細書で使用するとき、「塩基性アミノ酸」は、リシン、アルギニンまたはヒスチジンからなる群から選択される。本明細書で使用するとき、「非酸性アミノ酸」は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択される。
【００７５】
本明細書に記載の様々な例示的実施態様において、合成ペプチドグリカンのペプチド成分は、
ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧ；
ＧＤＲＲＲＲＲＭＷＨＲＱ；
ＧＫＨＬＧＧＫＨＲＲＳＲ；
ＲＧＴＨＨＡＱＫＲＲＳ；
ＲＲＨＫＳＧＨＩＱＧＳＫ；
ＳＲＭＨＧＲＶＲＧＲＨＥ；
ＲＲＲＡＧＬＴＡＧＲＰＲ；
ＲＹＧＧＨＲＴＳＲＫＷＶ；
ＲＳＡＲＹＧＨＲＲＧＶＧ；
ＧＬＲＧＮＲＲＶＦＡＲＰ；
ＳＲＧＱＲＧＲＬＧＫＴＲ；
ＤＲＲＧＲＳＳＬＰＫＬＡＧＰＶＥＦＰＤＲＫＩＫＧＲＲ；
ＲＭＲＲＫＧＲＶＫＨＷＧ；
ＲＧＧＡＲＧＲＨＫＴＧＲ；
ＴＧＡＲＱＲＧＬＱＧＧＷＧＰＲＨＬＲＧＫＤＱＰＰＧＲ；
ＲＱＲＲＲＤＬＴＲＶＥＧ；
ＳＴＫＤＨＮＲＧＲＲＮＶＧＰＶＳＲＳＴＬＲＤＰＩＲＲ；
ＲＲＩＧＨＱＶＧＧＲＲＮ；
ＲＬＥＳＲＡＡＧＱＲＲＡ；
ＧＧＰＲＲＨＬＧＲＲＧＨ；
ＶＳＫＲＧＨＲＲＴＡＨＥ；
ＲＧＴＲＳＧＳＴＲ；
ＲＲＲＫＫＩＱＧＲＳＫＲ；
ＲＫＳＹＧＫＹＱＧＲ；
ＫＮＧＲＹＳＩＳＲ；
ＲＲＲＣＧＱＫＫＫ；
ＫＱＫＩＫＨＶＶＫＬＫ；
ＫＬＫＳＱＬＶＫＲＫ；
ＲＹＰＩＳＲＰＲＫＲ；
ＫＶＧＫＳＰＰＶＲ；
ＫＴＦＧＫＭＫＰＲ；
ＲＩＫＷＳＲＶＳＫ；および
ＫＲＴＭＲＰＴＲＲ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
【００７６】
上記のペプチドの実施態様の各々において、ペプチドは、ペプチドのＣ末端に結合したグリシン−システインおよび／または、ペプチドのＮ末端に結合したグリシン−システイン−グリシン（ＧＣＧ）を有してもよい。本明細書に記載の様々な実施態様において、合成ペプチドグリカンのペプチド成分は、前の段落に記載のいずれかのアミノ酸配列、または、これらのアミノ酸配列に８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７７】
ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンのペプチド成分として含まれ得るさらなるペプチドには、出典明示により本明細書の一部とする Amemiya et al., Biochem. Biophys. Acta, vol. 1724, pp. 94-99 (2005) に記載のペプチドが含まれる。これらのペプチドは、Ａｒｇ−Ａｒｇモチーフを有し、
ＲＲＡＳＲＳＲＧＱＶＧＬ；
ＧＲＧＴＨＨＡＱＫＲＲＳ；
ＱＰＶＲＲＬＧＴＰＶＶＧ；
ＡＲＲＡＥＧＫＴＲＭＬＱ；
ＰＫＶＲＧＲＲＨＱＡＳＧ；
ＳＤＲＨＲＲＲＲＥＡＤＧ；
ＮＱＲＶＲＲＶＫＨＰＰＧ；
ＲＥＲＲＥＲＨＡＶＡＲＨＧＰＧＬＥＲＤＡＲＮＬＡＲＲ；
ＴＶＲＰＧＧＫＲＧＧＱＶＧＰＰＡＧＶＬＨＧＲＲＡＲＳ；
ＮＶＲＳＲＲＧＨＲＭＮＳ；
ＤＲＲＲＧＲＴＲＮＩＧＮ；
ＫＴＡＧＨＧＲＲＷＳＲＮ；
ＡＫＲＧＥＧＲＲＥＷＰＲ；
ＧＧＤＲＲＫＡＨＫＬＱＡ；
ＲＲＧＧＲＫＷＧＳＦＥＧ；および、
ＲＱＲＲＲＤＬＴＲＶＥＧ
からなる群から選択されるペプチドを含む。
【００７８】
上記のペプチドの実施態様の各々において、ペプチドは、ペプチドのＣ末端に結合したグリシン−システインを有してもよい。上記のペプチドの実施態様の各々において、ペプチドは、ペプチドのＮ末端に結合したグリシン−システイン−グリシン（ＧＣＧ）を有してもよい。本明細書に記載の様々な実施態様において、合成ペプチドグリカンのペプチド成分は、前の段落に記載のいずれかのアミノ酸配列、または、これらのアミノ酸配列に８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７９】
他の実施態様では、出典明示により本明細書の一部とする Yang et al., EMBO Journal, vol. 13, pp. 286-296 (1994)、および、出典明示により本明細書の一部とする Goetinck et al., J. Cell. Biol., vol. 105, pp. 2403-2408 (1987) に記載のペプチドを、本明細書に記載のヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンにおいて使用でき、これには、ＲＤＧＴＲＹＶＱＫＧＥＹＲ、ＨＲＥＡＲＳＧＫＹＫ、ＰＤＫＫＨＫＬＹＧＶおよびＷＤＫＥＲＳＲＹＤＶからなる群から選択されるペプチドが含まれる。これらの実施態様の各々において、ペプチドは、ペプチドのＣ末端に結合したグリシン−システインを有してもよい。これらの実施態様の各々において、ペプチドは、ペプチドのＮ末端に結合したグリシン−システイン−グリシン（ＧＣＧ）を有してもよい。他の実施態様では、合成ペプチドグリカンのペプチド成分は、これらのアミノ酸配列のいずれかに、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８０】
様々な実施態様において、本明細書に記載の合成ペプチドグリカンのペプチド成分は、１個またはそれ以上の保存的アミノ酸置換の包含により改変され得る。当業者に周知の通り、ペプチドの決定的ではない任意のアミノ酸を保存的置換により変更することは、置換アミノ酸の側鎖が置換前のアミノ酸の側鎖と同様の結合および接触を形成し得るので、そのペプチドの活性を有意に変更しない。非保存的置換は、ペプチドのヒアルロン酸結合活性に過剰に影響しない限り、可能である。
【００８１】
当分野で周知の通り、アミノ酸の「保存的置換」またはペプチドの「保存的置換変異体」は、１）ペプチドの二次構造；２）アミノ酸の電荷または疎水性；および３）側鎖のかさ高さ、または、これらの特徴の１つまたはそれ以上を維持するアミノ酸置換を表す。例示的には、周知の用語法「親水性残基」は、セリンまたはスレオニンに関する。「疎水性残基」は、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンまたはアラニンなどを表す。「正荷電残基」は、リシン、アルギニン、オルニチンまたはヒスチジンに関する。「負荷電残基」は、アスパラギン酸またはグルタミン酸を表す。「かさ高い側鎖」を有する残基は、フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシンなどを表す。例示的な保存的アミノ酸置換のリストを、表１に示す。
【００８２】
表１
【表１】
2019142877.tif 000002
【００８３】
ある実施態様では、本明細書に記載の分子に適用できる保存的アミノ酸置換は、Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｂ２の式、Ｂ１−Ｘ１−Ｂ２−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｂ３の式、Ｂ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｂ２−Ｘ９−Ｂ３の式またはＡｒｇ−Ａｒｇモチーフからなるモチーフを変更しない。
【００８４】
本明細書に記載の様々な実施態様において、本明細書に記載の合成ペプチドグリカンのグリカン（例えばＧＡＧと略されるグリコサミノグリカン、または多糖類）成分は、デキストラン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン、デルマタン硫酸、ヘパラン、ヘパリン、ケラチン、ケラタン硫酸およびヒアルロン酸からなる群から選択され得る。ある実施態様では、グリカンは、コンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸からなる群から選択される。他の例示的実施態様では、グリカンはコンドロイチン硫酸である。
【００８５】
本明細書に記載のある実施態様では、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンは、コンドロイチン硫酸に結合した（ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧ）１０を含み、ペプチドグリカン分子の各ペプチドは、別々にコンドロイチン硫酸に連結している。本明細書に記載の他の実施態様では、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンは、コンドロイチン硫酸に結合した（ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧＧＣ）１１を含み、ペプチドグリカン分子の各ペプチドは、別々にコンドロイチン硫酸に連結している。上記のペプチドの実施態様の各々では、ペプチドの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５個のペプチド分子からなる群から選択され得る。
【００８６】
本明細書に記載の様々な実施態様では、合成ペプチドグリカンは、アグリカナーゼに抵抗性である。アグリカナーゼは、アグリカンを切断すると知られている任意の酵素として当分野で特徴付けられている。
【００８７】
ある例示的な態様では、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンは、滅菌されていてよい。本明細書で使用するとき「滅菌」または「滅菌する」または「滅菌された」は、内毒素および感染性物質を含むがこれらに限定されない望まれない混入物を除去することにより、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを殺菌することを意味する。
【００８８】
様々な例示的実施態様では、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンは、プロピレンオキシドまたはエチレンオキシド処理、気体プラズマ滅菌、ガンマ線照射（例えば、１−４Ｍｒａｄのガンマ線照射または１−２.５Ｍｒａｄのガンマ線照射）、電子ビーム、および／または、過酢酸などの過酸による滅菌を含む常套の滅菌技法を使用して、殺菌および／または滅菌できる。ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの構造および生体栄養的（biotropic）特性に悪影響を与えない滅菌技法を使用できる。ある実施態様では、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを、１つまたはそれ以上の滅菌過程に付すことができる。他の例示的実施態様では、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを滅菌濾過に付す。ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンは、プラスチック包装またはホイル包装を含む任意の種類の容器に包装し、さらに滅菌し得る。ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンは、当業者に周知の標準的技法を使用して容易に達成し得る滅菌条件下で、例えば、凍結乾燥により、製造し得る。
【００８９】
本明細書に記載の様々な実施態様では、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを、ミネラル、アミノ酸、糖、ペプチド、タンパク質、ビタミン（アスコルビン酸など）またはラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、フィブリン、エラスチンまたはアグリカン、または増殖因子、例えば、上皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子ベータまたは線維芽細胞増殖因子、および、グルココルチコイド、例えば、デキサメサゾン、または、粘弾性を変更する物質、例えば、イオン性および非イオン性水溶性ポリマー；アクリル酸ポリマー；親水性ポリマー、例えば、ポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、およびポリビニルアルコール；セルロース由来ポリマーおよびセルロース由来ポリマー誘導体、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよびエーテル化セルロース；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸とグリコール酸のコポリマー、または天然および合成の他の重合性物質と組み合わせることができる。
【００９０】
本明細書に記載の様々な実施態様では、合成ペプチドグリカンのペプチド成分を、当業者に周知の固相ペプチド合成プロトコールに従って合成する。ある実施態様では、ペプチド前駆体を周知のＦｍｏｃプロトコールに従って固体支持体上で合成し、トリフルオロ酢酸により支持体から切り離し、当業者に公知の方法に従ってクロマトグラフィーにより精製する。
【００９１】
本明細書に記載の様々な実施態様では、合成ペプチドグリカンのペプチド成分を、当業者に周知のバイオテクノロジーの方法を利用して合成する。ある実施態様では、所望のペプチドのアミノ酸配列情報をコードするＤＮＡ配列を、当業者に公知の組み換えＤＮＡ技法により発現プラスミド（例えば、ペプチドの親和性精製用の親和性タグを組み込むプラスミド）に連結し、プラスミドを発現用の宿主生物に形質移入し、次いで、当業者に公知の方法に従って（例えば、親和性精製により）ペプチドを宿主生物または培養培地から単離する。組み換えＤＮＡ技術の方法は、出典明示により本明細書の一部とする Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001) に記載されており、当業者に周知である。
【００９２】
本明細書に記載の様々な実施態様では、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンのペプチド成分を、当業者に公知の方法を利用して、ペプチドの遊離アミノ基をグリカンのアルデヒド官能基と還元剤の存在下で反応させることによりグリカンに結合させ、ペプチドグリカン結合体（conjugate）を得る。ある実施態様では、グリカン（例えば、多糖類またはグリコサミノグリカン）のアルデヒド官能基は、当業者に公知の方法に従って、グリカンをメタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応させることにより形成する。
【００９３】
ある実施態様では、合成ペプチドグリカンのペプチド成分を、グリカンのアルデヒド官能基を３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）と反応させて中間体のグリカンを形成させ、さらに、中間体のグリカンを、遊離チオール基を含むペプチドと反応させることによりグリカンに結合させ、ペプチドグリカン結合体を得る。また他の実施態様では、合成ペプチドグリカンのペプチド成分の配列を、グリシン−システインセグメントを含むように改変し、グリカンまたはグリカン−リンカー結合体への結合点を提供し得る。本明細書に記載の任意の実施態様において、架橋剤は、Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド（ＢＭＰＨ）であり得る。
【００９４】
特定の実施態様を先行する段落に記載したが、本明細書に記載のヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンは、ペプチドのグリカン（例えば、多糖類またはグリコサミノグリカン）への結合のために当分野で認識されている任意の方法を使用して作成できる。これには、直接的な、または、二価リンカーなどの連結する基を介する間接的な、共有、イオンまたは水素結合が含まれ得る。結合体は、典型的には、結合体の各成分上にある酸、アルデヒド、ヒドロキシ、アミノまたはヒドラゾ基の間のアミド、エステルまたはイミノ結合の形成を介して、ペプチドのグリカンへの共有結合により形成される。これらの方法のすべては、当分野で公知であるか、または、本願の実施例のセクション、もしくは、出典明示により本明細書の一部とする Hermanson G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, pp.169-186 (1996) にさらに記載されている。リンカーは、典型的には約１個ないし約３０個の炭素原子を、より典型的には約２個ないし約２０個の炭素原子を含む。典型的には、低分子量のリンカー（即ち、概算で約２０ないし約５００の分子量を有するもの）を用いる。
【００９５】
加えて、結合体のリンカー部分の構造的改変が、本発明において企図されている。例えば、リンカーにアミノ酸が含まれ得、数々のアミノ酸置換を結合体のリンカー部分に行い得る。これには、天然産生のアミノ酸並びに常套の合成方法から入手できるものが含まれるが、これらに限定されない。他の態様では、ベータ、ガンマおよび長鎖アミノ酸を、１個またはそれ以上のアルファアミノ酸の代わりに使用し得る。他の態様では、リンカーは、含まれるアミノ酸の数を変更することにより、または、ベータ、ガンマまたは長鎖アミノ酸をより多くまたは少なく含めることにより、短くしても長くしてもよい。同様に、本明細書に記載のリンカーの他の化学的フラグメントの長さおよび形状を、改変し得る。
【００９６】
本明細書に記載の様々な実施態様では、リンカーは、各々置換されていることもあるアルキレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、シクロヘテロアルキレン、アリーレンおよびヘテロアリーレンからなる群から各例で独立して選択される１個またはそれ以上の二価のフラグメントを含み得る。本明細書で使用するとき、ヘテロアルキレンは、直鎖または分枝鎖のアルキレン基中の１個またはそれ以上の炭素原子を、酸素、窒素、リンおよび硫黄からなる群から各例で独立して選択される原子で置き換えることから生じる基を表す。代替的実施態様では、リンカーは存在しない。
【００９７】
本明細書に記載のある実施態様では、人工コラーゲンマトリックスが提供される。先に記載したヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの実施態様を、本明細書に記載の人工コラーゲンマトリックスに適用できる。ある実施態様では、人工コラーゲンマトリックスは、重合したコラーゲン、ヒアルロン酸およびヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを含む。ある実施態様では、人工コラーゲンマトリックスは、重合したコラーゲンおよびヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを含む。様々な例示的実施態様では、カルボジイミド、アルデヒド、ｌｙｓｌ−オキシダーゼ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジドおよびマレイミドなどの架橋剤、並びに、ゲニピンなどを含む様々な天然の架橋剤を、溶液中のコラーゲンの重合の前、間、または後に添加できる。
【００９８】
様々な例示的実施態様では、人工コラーゲンマトリックスを製造するために本発明で使用するコラーゲンは、いかなる種類のコラーゲンでもよく、ＩないしＸＸＶＩＩＩ型コラーゲンを、単独で、または、任意の組合せで含み、例えば、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよび／またはＩＶ型コラーゲンを使用し得る。いくつかの実施態様では、人工コラーゲンマトリックスの製造に使用するコラーゲンは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲンおよびこれらの組合せからなる群から選択される。ある実施態様では、人工コラーゲンマトリックスは、購入できるコラーゲン（例えば、Sigma, St. Louis, MO）を使用して形成される。代替的な実施態様では、コラーゲンは、腸、膀胱または胃組織などの粘膜下層を含有する組織材料から精製できる。さらなる実施態様では、コラーゲンは尾腱から精製できる。さらなる実施態様では、コラーゲンは皮膚から精製できる。様々な態様では、コラーゲンは、また、コラーゲンに結合する合成ペプチドグリカンに加えて、内在性または外来性に添加された非コラーゲンタンパク質、例えば、フィブロネクチンまたはシルクタンパク質、ポリタンパク質、および、多糖類なども含有できる。本明細書に記載の方法で製造された人工コラーゲンマトリックスは、移植または注入の部位で関連する組織の特徴をとり得る組織移植片（例えば、ゲルの形態で）の形態であり得る。ある実施態様では、人工コラーゲンマトリックスは、患者に移植できる組織移植片である。他の実施態様では、人工コラーゲンマトリックスは、注入により患者に投与できる。いずれの実施態様でも、マトリックスは、例えば、ゲルまたは粉末の形態であり得る。
【００９９】
ある実施態様では、人工コラーゲンマトリックス中のコラーゲンは、マトリックスの約４０ないし約９０乾燥重量（ｗｔ）％、マトリックスの約４０ないし約８０乾燥重量％、マトリックスの約４０ないし約７０乾燥重量％、マトリックスの約４０ないし約６０乾燥重量％、マトリックスの約５０ないし約９０乾燥重量％、約５０ないし約８０乾燥重量％、マトリックスの約５０ないし約７５乾燥重量％、マトリックスの約５０ないし約７０乾燥重量％、または、マトリックスの約６０ないし約７５乾燥重量％を占める。他の実施態様では、人工コラーゲンマトリックス中のコラーゲンは、マトリックスの約９０乾燥重量％、約８５乾燥重量％、約８０乾燥重量％、約７５乾燥重量％、約７０乾燥重量％、約６５乾燥重量％、約６０乾燥重量％、約５０乾燥重量％、約４５乾燥重量％、約４０乾燥重量％または約３０乾燥重量％を占める。
【０１００】
ある実施態様では、ゲル形態のマトリックス中の最終コラーゲン濃度は、約０.５ないし約６ｍｇ／ｍＬ、約０.５ないし約５ｍｇ／ｍＬ、約０.５ないし約４ｍｇ／ｍＬ、約１ないし約６ｍｇ／ｍＬ、約１ないし約５ｍｇ／ｍＬまたは約１ないし約４ｍｇ／ｍＬである。ある実施態様では、マトリックスの最終コラーゲン濃度は、約０.５ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬまたは約５ｍｇ／ｍＬである。
【０１０１】
ある実施態様では、人工コラーゲンマトリックス中のヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンは、マトリックスの約２ないし約６０乾燥重量（ｗｔ）％、マトリックスの約２ないし約５０乾燥重量％、マトリックスの約５ないし約５０乾燥重量％、マトリックスの約１０ないし約５０乾燥重量％、マトリックスの約１０ないし約２０乾燥重量％、マトリックスの約１０ないし約３０乾燥重量％、マトリックスの約１０ないし約２５乾燥重量％、マトリックスの約１５ないし約３０乾燥重量％またはマトリックスの約１５ないし約４５乾燥重量％を占める。他の実施態様では、人工コラーゲンマトリックス中のヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンは、マトリックスの約２乾燥重量％、約５乾燥重量％、約１０乾燥重量％、約１５乾燥重量％、約２０乾燥重量％、約２５乾燥重量％、約３０乾燥重量％、約３５乾燥重量％、約４０乾燥重量％、約４５乾燥重量％または約５０乾燥重量％を占める。
【０１０２】
他の実施態様では、人工コラーゲンマトリックスはヒアルロン酸を含み、人工コラーゲンマトリックス中のヒアルロン酸は、マトリックスの約２ないし約６０乾燥重量（ｗｔ）％、マトリックスの約２ないし約５０乾燥重量％、マトリックスの約５ないし約５０乾燥重量％、マトリックスの約１０ないし約５０乾燥重量％、マトリックスの約１０ないし約２０乾燥重量％、マトリックスの約１０ないし約３０乾燥重量％、マトリックスの約１０ないし約２５乾燥重量％、マトリックスの約１５ないし約３０乾燥重量％、または、マトリックスの約１５ないし約４５乾燥重量％を占める。他の実施態様では、人工コラーゲンマトリックス中のヒアルロン酸は、マトリックスの約２乾燥重量％、約５乾燥重量％、約１０乾燥重量％、約１５乾燥重量％、約２０乾燥重量％、約２５乾燥重量％、約３０乾燥重量％、約３５乾燥重量％、約４０乾燥重量％、約４５乾燥重量％または約５０乾燥重量％を占める。
【０１０３】
ある実施態様では、人工コラーゲンマトリックスはヒアルロン酸およびヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを含む。人工コラーゲンマトリックス中のヒアルロン酸およびヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンは、マトリックスの約１０ないし約６０乾燥重量（ｗｔ）％、マトリックスの約２０ないし約６０乾燥重量％、マトリックスの約３０ないし約６０乾燥重量％、マトリックスの約４０ないし約６０乾燥重量％、マトリックスの約１０ないし約５０乾燥重量％、マトリックスの約２０ないし約５０乾燥重量％、マトリックスの約２５ないし約５０乾燥重量％、マトリックスの約３０ないし約５０乾燥重量％、または、マトリックスの約２５ないし約４０乾燥重量％を占める。他の実施態様では、人工コラーゲンマトリックス中のヒアルロン酸およびヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンは、マトリックスの約１０乾燥重量％、約１５乾燥重量％、約２０乾燥重量％、約２５乾燥重量％、約３０乾燥重量％、約３５乾燥重量％、約４０乾燥重量％、約５０乾燥重量％、約５５乾燥重量％、約６０乾燥重量％または約７０乾燥重量％を占める。
【０１０４】
ある例示的な態様では、人工コラーゲンマトリックスは、滅菌されていてよい。本明細書で使用するとき「滅菌」または「滅菌する」または「滅菌された」は、内毒素、核酸混入物および感染性物質を含むがこれらに限定されない望まれない混入物を除去することにより、マトリックスを殺菌することを意味する。
【０１０５】
様々な例示的実施態様では、人工コラーゲンマトリックスは、グルタルアルデヒドなめし（tanning）、酸性ｐＨでのホルムアルデヒドなめし、プロピレンオキシドまたはエチレンオキシド処理、気体プラズマ滅菌、ガンマ線照射（例えば、１−４Ｍｒａｄのガンマ線照射または１−２.５Ｍｒａｄのガンマ線照射）、電子ビーム、および／または、過酢酸などの過酸による滅菌を含む常套の滅菌技法を使用して、殺菌および／または滅菌できる。マトリックスの構造および生体栄養的特性に悪影響を与えない滅菌技法を使用できる。ある実施態様では、人工コラーゲンマトリックスを、１つまたはそれ以上の滅菌過程に付すことができる。例示的な実施態様では、溶液中のコラーゲンを、重合に先立ち、滅菌または殺菌することもできる。人工コラーゲンマトリックスは、プラスチック包装またはホイル包装を含む任意の種類の容器に包装し、さらに滅菌し得る。
【０１０６】
これらの実施態様のいずれでも、人工コラーゲンマトリックスは、外来性の細胞集団をさらに含み得る。加えられる細胞集団は、１種またはそれ以上の細胞集団を含み得る。様々な実施態様において、細胞集団は、非角質化または角質化上皮性細胞の集団、または、内皮細胞、中胚葉由来の細胞、中皮細胞、滑膜細胞、神経細胞、グリア細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、腱細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、多能性前駆細胞（例えば、骨髄前駆細胞を含む幹細胞）、および、骨原性細胞からなる群から選択される細胞集団を含む。いくつかの実施態様では、細胞集団は、軟骨細胞および幹細胞からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、幹細胞は、骨芽細胞、骨原性細胞および間葉性幹細胞からなる群から選択される。様々な実施態様において、人工コラーゲンマトリックスは、１種またはそれ以上の細胞タイプと組み合わせて播種できる。
【０１０７】
様々な態様では、本発明の人工コラーゲンマトリックスまたは人工移植片構築物を、ミネラル、アミノ酸、糖、ペプチド、タンパク質、ビタミン（アスコルビン酸など）またはラミニンを含む栄養分、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、フィブリン、エラスチンまたはアグリカン、または増殖因子、例えば、上皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子ベータ、または線維芽細胞増殖因子、および、グルココルチコイド、例えば、デキサメサゾン、または、粘弾性を変更する物質、例えば、イオン性および非イオン性水溶性ポリマー；アクリル酸ポリマー；親水性ポリマー、例えば、ポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、およびポリビニルアルコール；セルロース由来ポリマーおよびセルロース由来ポリマー誘導体、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよびエーテル化セルロース；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸とグリコール酸のコポリマー、または天然および合成の他の重合性物質と組み合わせることができる。他の例示的実施態様では、カルボジイミド、アルデヒド、ｌｙｓｌ−オキシダーゼ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジドおよびマレイミドなどの架橋剤、並びに、ゲニピンなどを含む天然の架橋剤を、細胞添加の前、同時、または後に添加できる。
【０１０８】
上記の通り、ある実施態様によると、コラーゲンの重合後またはコラーゲンの重合中に、人工コラーゲンマトリックスまたは人工移植片構築物に細胞を添加できる。その後、細胞を含む人工コラーゲンマトリックスを、人工移植片構築物として使用するために、宿主に注入または移植できる。他の実施態様では、患者への移植または注入に先立ち、細胞数を増やすか、または、所望のリモデリングを誘導するために、人工コラーゲンマトリックス上または内の細胞を予め定めた期間にわたりインビトロで培養できる。
【０１０９】
本明細書に記載のある実施態様では、軟骨細胞または幹細胞のインビトロ培養用（即ち、後に患者に移植または注入しない細胞のインビトロ培養用）の組成物が提供される。インビトロ培養用の組成物は、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを含む。先に記載したヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの実施態様を、本明細書に記載のインビトロ培養用の組成物に適用できる。
【０１１０】
様々な態様では、本発明のインビトロ培養用の組成物を、ミネラル、アミノ酸、糖、ペプチド、タンパク質、ビタミン（アスコルビン酸など）またはラミニンを含む栄養分、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、フィブリン、エラスチンまたはアグリカン、または増殖因子、例えば、上皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子ベータ、または線維芽細胞増殖因子、および、グルココルチコイド、例えば、デキサメサゾンと組み合わせることができる。
【０１１１】
いくつかの実施態様では、インビトロ培養用の組成物は、骨芽細胞、骨原性細胞および間葉性幹細胞からなる群から選択される幹細胞を含む。様々な実施態様では、インビトロ培養用の組成物を、１種またはそれ以上の細胞タイプと組み合わせて播種できる。
【０１１２】
ある例示的な態様では、インビトロ培養用の組成物は、滅菌されていてよい。本明細書で使用するとき、「滅菌」または「滅菌する」または「滅菌された」は、内毒素、核酸混入物および感染性物質を含むがこれらに限定されない望まれない混入物を除去することにより、組成物を殺菌することを意味する。先行する段落で提供された滅菌手法、方法および実施態様を、本明細書に記載のインビトロ培養用の組成物にも適用できる。インビトロ培養の組成物は、患者への移植または注入用の細胞集団を拡大するために使用し得る。
【０１１３】
本明細書に記載のある実施態様では、生体材料の軟骨置換組成物用の添加物が提供される。添加物は、既存の生体材料の軟骨置換材料に添加するための、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを含む。先に記載したヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの実施態様を、本明細書に記載の添加物に適用できる。
【０１１４】
本明細書で使用するとき、「既存の生体材料の軟骨置換材料」という語句は、体内の損傷した、欠損した、または失われている軟骨の置換に利用できる生物学的に適合する組成物を意味する。様々なタイプの既存の生体材料の軟骨置換組成物が当分野で周知であり、企図されている。例えば、既存の生体材料の軟骨または骨の置換組成物には、DeNovo（登録商標） NT Natural Tissue Graft (Zimmer)、MaioRegen（商標）(JRI Limited)、または、Biomet により生産されている、凍結保存された骨関節組織のコレクションが含まれる。
【０１１５】
ある実施態様では、生体材料または骨軟骨置換物の製造方法が提供される。この方法は、合成ペプチドグリカンおよび既存の生体材料または骨軟骨置換材料を合わせる段階を含む。先に記載したヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの実施態様を、本明細書に記載の方法に適用できる。
【０１１６】
ある実施態様では、患者の関節炎の処置方法が提供される。この方法は、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを患者に投与する段階を含み、合成ペプチドグリカンが関節炎に関連する１つまたはそれ以上の症状を低減する。先に記載したヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの実施態様を、本明細書に記載の方法に適用できる。
【０１１７】
様々な実施態様において、関節炎の処置方法で使用される合成ペプチドグリカンは、関節炎に関連する１つまたはそれ以上の症状を低減する。様々な症状が関節炎と関連すると当分野で知られており、疼痛、硬直、圧痛、炎症、膨潤、発赤、温感および易動度の低下が含まれるがこれらに限定されない。関節炎の症状は、関節、腱または身体の他の部分に存在し得る。本明細書で使用するとき、「低減する」は、関節炎の症状を予防するか、または、完全または部分的に軽減することを意味する。
【０１１８】
様々な実施態様において、関節炎は骨関節症またはリウマチ性関節炎である。骨関節症およびリウマチ性関節炎の病因および臨床症状は、当分野で周知である。この方法のある実施態様では、合成ペプチドグリカンは、投与後に潤滑剤として作用するか、または、軟骨の損失を防止する。他の実施態様では、合成ペプチドグリカンは、患者における骨の関節を防止する。例えば、合成ペプチドグリカンは、軟骨の減少または損傷を伴う、患者における骨が接触する関節を阻害する。
【０１１９】
ある実施態様では、患者におけるＥＣＭ成分の分解を低減または防止する方法が提供される。例えば、患者の軟骨におけるＥＣＭ成分の分解を低減または防止する方法が提供される。この方法は、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを患者に投与することを含む。先に記載したヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの実施態様を、本明細書に記載の方法に適用できる。ある実施態様では、合成ペプチドグリカンは、マトリックスメタロプロテアーゼ、例えばアグリカナーゼに抵抗性である。
【０１２０】
他の実施態様では、患者におけるヒアルロン酸の分解を低減または防止する方法が提供される。この方法は、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを患者に投与することを含む。先に記載したヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの実施態様を、本明細書に記載の方法に適用できる。
【０１２１】
他の実施態様では、コラーゲンの分解を低減または防止する方法が提供される。この方法は、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを、コラーゲンの存在下でヒアルロン酸と接触させ、コラーゲンの分解を低減または防止することを含む。先に記載したヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの実施態様を、本明細書に記載の方法に適用できる。
【０１２２】
他の実施態様では、コンドロイチン硫酸の分解を低減または防止する方法が提供される。この方法は、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを、コラーゲンの存在下でヒアルロン酸と接触させ、コンドロイチン硫酸の分解を低減または防止することを含む。先に記載したヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの実施態様を、本明細書に記載の方法に適用できる。
【０１２３】
ＥＣＭ成分の分解、例えば、ヒアルロン酸、コラーゲンまたはコンドロイチン硫酸の分解を「低減する」は、各々、ヒアルロン酸、コラーゲンまたはコンドロイチン硫酸の分解を完全または部分的に低減することを意味する。
【０１２４】
ある実施態様では、患者におけるヒアルロン酸の分解を低減することは、ヒアルロン酸の分解速度を低減することを意味する。例えば、本願の実施例のセクションに記載の図８は、ヒアルロン酸およびヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの混合物におけるヒアルロン酸の分解速度が、合成ペプチドグリカンの添加により有意に低減されることを示す。
【０１２５】
ある実施態様では、コラーゲンの分解を低減することは、コラーゲンの分解速度を低減することを意味する。例えば、本願の実施例のセクションに記載の図１０は、ヒアルロン酸およびヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの存在下でのコラーゲンの分解速度が、合成ペプチドグリカンの添加により有意に低減されることを示す。
【０１２６】
ある実施態様では、コンドロイチン硫酸の分解を低減することは、コンドロイチン硫酸の分解速度を低減することを意味する。例えば、本願の実施例のセクションに記載の図１１は、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの存在下で、コンドロイチン硫酸の分解速度が、合成ペプチドグリカンの添加により有意に低減されることを示す。
【０１２７】
本明細書に記載のある実施態様では、患者の組織欠損を矯正または修正する方法が提供される。この方法は、組織欠損にヒアルロン酸およびヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを投与することを含み、欠損が矯正または修正される。先に記載したヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの実施態様を、本明細書に記載の方法に適用できる。ある実施態様では、組織欠損は美容的欠損である。
【０１２８】
以下の実施態様は、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを患者に投与する本明細書に記載の方法に適用できる。様々な実施態様において、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンは、注入または移植できる（例えば、軟骨修復組成物または装置に組み込まれる）。本明細書に記載のいくつかの実施態様では、注入は、関節内注入である。他の本明細書に記載の実施態様では、注入は、患者の関節包へのものである。他の実施態様では、注入は、皮膚注入剤の場合のように、皮下注入である。適する注入手段には、針（マイクロニードルを含む）の注射器または点滴用装置が含まれる。
【０１２９】
例示的な実施態様では、患者に投与するためのヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンと共に使用するための医薬製剤は：ａ）医薬的に活性な量のヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカン；ｂ）約ｐＨ４.５ないし約ｐＨ９の範囲のｐＨをもたらす医薬的に許容されるｐＨ緩衝化剤；ｃ）約０ないし約３００ミリモル濃度の濃度範囲の、イオン強度を改変する物質；および、ｄ）製剤の総重量の約０.２５％ないし約１０％の濃度範囲の、水溶性の粘性を改変する物質、または、任意の個別の成分ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）、または、ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の任意の組合せを含む。
【０１３０】
本明細書に記載の様々な実施態様では、ｐＨ緩衝化剤は当業者に公知の物質であり、例えば、酢酸、ホウ酸、炭酸、クエン酸およびリン酸バッファー、並びに、塩酸、水酸化ナトリウム、酸化マグネシウム、リン酸一カリウム、重炭酸塩、アンモニア、炭酸、塩酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酢酸、リン酸水素二ナトリウム、ホウ砂、ホウ酸、水酸化ナトリウム、ジエチルバルビツール酸およびタンパク質、並びに、様々な生物学的バッファー、例えば、ＴＡＰＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸またはＭＥＳが含まれる。
【０１３１】
本明細書に記載の様々な実施態様では、イオン強度を改変する物質には、当分野で知られている物質、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、マンニトール、グルコース、デキストロース、ソルビトール、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび他の電解質が含まれる。
【０１３２】
有用な粘性を改変する物質には、イオン性および非イオン性水溶性ポリマー；架橋アクリル酸ポリマー、例えば「カルボマー（carbomer）」ファミリーのポリマー、例えば、Carbopol（登録商標）の商標で購入し得るカルボキシポリアルキレン；親水性ポリマー、例えば、ポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーおよびポリビニルアルコール；セルロース由来ポリマーおよびセルロース由来ポリマー誘導体、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよびエーテル化セルロース；ガム、例えば、トラガカントおよびキサンタンガム；アルギン酸ナトリウム；ゼラチン、ヒアルロン酸およびこれらの塩、キトサン類、ジェラン（gellan）類またはこれらの任意の組合せが含まれるが、これらに限定されない。典型的には、製剤の所望のｐＨの達成を助長するために、非酸性の粘性増強剤、例えば、中性または塩基性の物質を用いる。
【０１３３】
本明細書に記載の様々な実施態様では、注入用の製剤は、適する媒体、例えば、無菌のパイロジェンを含まない水と共に使用するために、滅菌非水性溶液として、または、乾燥形態（例えば、凍結乾燥）として、適切に製剤化し得る。無菌条件下での注入用の製剤の製造は、例えば、凍結乾燥により、当業者に周知の標準的な医薬の技法を使用して、容易に達成し得る。ある実施態様では、ヒアルロン酸を含有する溶液の粘性は、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの添加により高められる。
【０１３４】
本明細書に記載の様々な実施態様では、注入により投与するための製剤の製造において使用するヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの溶解度は、適当な製剤技法の使用により、例えば、可溶性を増強する組成物、例えば、マンニトール、エタノール、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリキサマーおよび当業者に知られている他のものを導入することにより、高められ得る。
【０１３５】
本明細書に記載の様々な実施態様では、注入により投与するための製剤は、即時放出および／または改変された放出用に製剤化され得る。改変された放出の製剤には、遅延、持続、パルス化、制御、標的化およびプログラムされた放出の製剤が含まれる。従って、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンは、固体、半固体またはチキソトロピーの液体として、移植されたデポーとして投与するために製剤化し得、活性化合物の改変された放出を提供する。そのような製剤の例示的な例には、薬物で被覆されたステントおよびコポリマー（ｄｌ−乳酸、グリコール酸）酸（ＰＧＬＡ）ミクロスフェアが含まれる。他の実施態様では、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンまたはヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを含む組成物は、適するならば、継続的に投与され得る。
【０１３６】
本明細書に記載の実施態様のいずれにおいても、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンは、単独で、または、適する医薬的担体または希釈剤と組み合わせて投与し得る。ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの製剤において使用される希釈剤または担体成分は、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの所望の効果を減少させないように選択できる。ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカン製剤は、任意の適する形態であり得る。適する投与形態の例には、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの水性液剤、例えば、等張塩水、５％グルコースまたは他の周知の医薬的に許容される液体担体、例えば、アルコール、グリコール、エステルおよびアミド中の液剤が含まれる。
【０１３７】
ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの適する投与量は、標準的な方法により、例えば、実験動物モデルまたは臨床試験で用量応答曲線を確立することにより、決定できる。本明細書に記載の様々な実施態様では、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの投与量は、患者の状態、処置される疾患の状態、投与経路および組織分布、並びに、他の治療的処置の同時利用の可能性によって、有意に変動し得る。例示的には、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの適する投与量（単回のボーラスで、または時間をかけて、投与される）には、約１ｎｇ／ｋｇないし約１０ｍｇ／ｋｇ、約１００ｎｇ／ｋｇないし約１ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇないし約５００μｇ／ｋｇ、または、約１００μｇ／ｋｇないし約４００μｇ／ｋｇが含まれる。これらの実施態様の各々で、用量／ｋｇは、患者の質量または体重１ｋｇ当たりの用量を表す。他の例示的態様では、有効用量は、約０.０１μｇないし約１０００ｍｇ／投与、約１μｇないし約１００ｍｇ／投与、または、約１００μｇないし約５０ｍｇ／投与、または、約５００μｇないし約１０ｍｇ／投与、または、約１ｍｇないし１０ｍｇ／投与、または、約１ないし約１００ｍｇ／投与、または、約１ｍｇないし５０００ｍｇ／投与、または、約１ｍｇないし３０００ｍｇ／投与、または、約１００ｍｇないし３０００ｍｇ／投与、または、約１０００ｍｇないし３０００ｍｇ／投与の範囲にあり得る。ある実施態様では、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの適する投与量には、約０.０１ｕＭないし約１００ｕＭ、約０.０５ないし約１００ｕＭ、約０.１ｕＭないし約１００ｕＭ、約０.１ｕＭないし約５０ｕＭ、約０.１ｕＭないし約２０ｕＭ、約０.１ｕＭないし約１０ｕＭ、約０.５ｕＭないし約１０ｕＭ、約０.５ｕＭないし約５０ｕＭおよび約０.５ｕＭないし約１００ｕＭの範囲の濃度が含まれる。他の実施態様では、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの適する投与量には、約０.０１ｕＭ、０.１ｕＭ、０.２ｕＭ、０.５ｕＭ、１ｕＭ、２ｕＭ、５ｕＭ、１０ｕＭ、２０ｕＭ、５０ｕＭおよび１００ｕＭの濃度が含まれる。
【０１３８】
ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンは、賦形剤中で製剤化できる。本明細書に記載のいずれの実施態様においても、賦形剤は、約０.４ｍｇ／ｍｌないし約６ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有し得る。様々な実施態様において、賦形剤の濃度は、約０.５ｍｇ／ｍｌないし約１０ｍｇ／ｍｌ、約０.１ｍｇ／ｍｌないし約６ｍｇ／ｍｌ、約０.５ｍｇ／ｍｌないし約３ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌないし約３ｍｇ／ｍｌ、約０.０１ｍｇ／ｍｌないし約１０ｍｇ／ｍｌおよび約２ｍｇ／ｍｌないし約４ｍｇ／ｍｌの範囲にあり得る。
【０１３９】
ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを軟骨修復組成物または装置（例えば、移植用ゲル）の一部として移植する実施態様では、上記のいかなる適当な製剤も使用し得る。
【０１４０】
ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを投与するためのいかなる有効なレジメンも使用できる。例えば、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンは、単回投与として、または、複数回投与する毎日のレジメンとして投与できる。さらに、ずらしたレジメン、例えば、週に１日ないし５日を、毎日の処置の代わりに使用できる。
【０１４１】
本明細書に記載の様々な実施態様では、患者は、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの複数回の注入で処置される。ある実施態様では、患者は、ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンを、複数回（例えば、約２回から約５０回まで）、例えば、１２−７２時間の間隔または４８−７２時間の間隔で、注入される。ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンのさらなる注入を、最初の注入後、数日または数ヶ月の間隔で患者に行うことができる。
【０１４２】
本明細書に記載の実施態様のいずれでも、ペプチド部分、グリカン部分または両方が異なる２種またはそれ以上のヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの組合せを、単一のヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカンの代わりに使用できることが理解される。
【０１４３】
先行する実施態様において、化合物、組成物および方法の一定の態様は、選択的に列挙で、例えば、例示的には、ＧおよびＰの１つまたはそれ以上についての選択で、示されていることも認識される。従って、本発明の様々な代替的実施態様には、それらの列挙の個々の構成員、並びに、それらの列挙の様々な部分が含まれると理解される。それらの組合せの各々は、列挙により本明細書に記載されていると理解される。
【０１４４】
以下の例示的実施例では、用語「アグリカン模倣物」および「模倣物」を、用語「ヒアルロン酸結合合成ペプチドグリカン」と同義に使用する。
【実施例】
【０１４５】
実施例１
ペプチド合成
すべてのペプチドは、Symphony ペプチド合成機 (Protein Technologies, Tucson, AZ) を使用し、ＦＭＯＣプロトコールを Knorr レジンで利用して合成した。粗製のペプチドをＴＦＡでレジンから離し、AKTAexplorer (GE Healthcare, Piscataway, NJ) での逆相クロマトグラフィーにより、Grace-Vydac 218TP C-18 逆相カラムおよび水／アセトニトリル０.１％ＴＦＡの勾配を利用して精製した。Dansyl で修飾されたペプチドは、レジンから解離する前に、dansyl-Gly (Sigma) とのさらなるカップリング段階を加えることにより製造した。ペプチド構造を質量分析により確認した。以下のペプチドを上記の通り製造した：ＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧＧＣ、ＫＱＫＩＫＨＶＶＫＬＫＧＣおよびＫＬＫＳＱＬＶＫＲＫＧＣ。
【０１４６】
実施例２
コンドロイチン硫酸の官能化および合成ペプチドグリカンの形成
アグリカン模倣物（即ち、ＧＡＨ）の創製のための反応スキームを、図１に見ることができる。コンドロイチン硫酸（ＣＳ）（Sigma, St. Louis, MO）の官能化は、過ヨウ素酸ナトリウム（Thermo Scientific, Waltham, MA）を使用してＣＳを酸化することにより達成された。反応期間および過ヨウ素酸ナトリウムの濃度を変えることにより、酸化反応により産生されるアルデヒド基の数を制御した。値を表２に示す。表２は、ＣＳ鎖１本当たり所望の数のアルデヒド基を得るのに必要な過ヨウ素酸ナトリウム濃度および反応期間を詳細に示す。図１に図解する連続的な化学反応により、ＣＳ鎖１本当たりの結合するＢＭＰＨの数は、産生されるアルデヒドの数および結合するヒアルロン酸（ＨＡ）結合ペプチドの数と等しいと想定される。反応期間および過ヨウ素酸ナトリウムの濃度に基づき、ＣＳ鎖１本当たりのペプチドの数（平均）を表２に示す。
【０１４７】
表２
【表２】
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【０１４８】
ＣＳの濃度は、すべての酸化反応において２０ｍｇ／ｍＬで一定に維持した。測定したＣＳおよび過ヨウ素酸ナトリウムの量を、０.１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５.５）中で、特定された期間にわたり反応させ、光から保護した。反応の完了は、ポリアクリルアミドビーズを詰めた Bio-Scale Mini Bio-Gel カラム (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) で、AKTA Purifier FPLC (GE Healthcare, Piscataway, NJ) を使用してゲル濾過クロマトグラフィーを実施することによって、過ヨウ素酸ナトリウムを除去することにより達成された。脱塩過程に使用したバッファーは、１ｘリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７.４、Invitrogen, Carlsbad, CA) であった。
【０１４９】
Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド、トリフルオロ酢酸塩（BMPH, Pierce, Rockford, IL）を、５０Ｍ過剰で、脱塩および酸化されたＣＳと、１ｘＰＢＳ中で反応させた。ＢＭＰＨのヒドラジド末端が反応して、新たに創製されたアルデヒドを介して官能化ＣＳに共有結合し、シッフ塩基中間体を形成する。ナトリウムシアノボロハイドライド（５Ｍ、Pierce）を反応に添加し、シッフ塩基中間体イミンをより安定なアミンに還元した。過剰のＢＭＰＨを、脱イオン水中でのＦＰＬＣ脱塩により溶液から除去した。AKTA Purifier FPLC の吸光検出能力のために、過剰のＢＭＰＨの量が測定された。小さいサイズおよび低分子量のＢＭＰＨ（２９７.１９ｇ／ｍｏｌ）は、分離したかなり遅い時点でカラムから溶出された。多数の単結合および時折の二重結合の存在により、ＢＭＰＨは、２１５ｎｍ波長（単結合に特徴的）および２５４ｎｍ波長（二重結合に特徴的）の両方で、強い吸光スペクトルをもたらした。従って、既知のＢＭＰＨの質量を２１５ｎｍの吸光スペクトルの統合面積に相関させて、標準曲線を作成した（図２）。この標準曲線を用いて、過剰のＢＭＰＨの質量を決定した。過剰のＢＭＰＨの質量を元の反応質量から差し引くことで、反応で消費されたＢＭＰＨの質量を決定できる。消費された質量を使用して、酸化されたＣＳに結合したＢＭＰＨの数を算出した。集めたＣＳ−ＢＭＰＨ生成物を凍結し、凍結乾燥し、−８０℃で保存した。
【０１５０】
ＨＡ結合ペプチドの配列を、Mummert により同定した。同定された配列のわずかな改変は、この研究で使用した特異的なＨＡ結合配列であるＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧＧＣ（ＧＡＨと表記）をもたらした。このペプチドは、Genscript (Piscataway, NJ) により産生され、そこから購入された。チオエーテル結合形成によるＢＭＰＨのマレイミド基へのカップリングを可能にするために、システインアミノ酸を含めた。この反応は１：１の比で起こり、官能化ＣＳに結合したＢＭＰＨの数は結合したＧＡＨペプチドの数と等しいとの仮定を可能にする。カップリングしたＢＭＰＨの数／鎖に対して１モル濃度過剰でＧＡＨペプチドをジメチルスルホキシド（DMSO, Sigma）に溶解し、全量の４分の１ずつをＣＳ−ＢＭＰＨ溶液に１５分間隔で添加した。最後のＧＡＨペプチドの添加後に、反応を２時間進行させた。この間に、過剰のＧＡＨペプチドは微粒子を形成した。溶液を精製してＧＡＨで官能化されたＣＳを得る前に、溶液をAcrodisc ０.８μｍ孔直径フィルター（Pall, Port Washington, NY）に通し、過剰のペプチド微粒子を除去した。次いで、溶液を脱イオン水と共に AKTA Purifier FPLC に通し、ＧＡＨ−ＣＳ化合物を精製した。次いで、集めた化合物を−８０℃で凍結し、凍結乾燥し、所望のアグリカン模倣物を得た。実験室の慣例により、アグリカン模倣物は（結合したペプチドの＃）（ペプチド配列の最初の３文字）−（官能化されたＧＡＧの略号）により命名された。即ちアグリカン模倣物の３ＧＡＨ−ＣＳは、コンドロイチン硫酸ＧＡＧ主鎖に官能化した３個のＧＡＨ ＨＡ結合ペプチドを表す。
【０１５１】
実施例３
ヒアルロン酸への合成ペプチドグリカンの結合
固定化されたヒアルロン酸への合成ペプチドグリカンの結合
４ｍｇ／ｍＬの濃度でヒアルロン酸（HA, Streptococcus equi, Sigmaより）を９６ウェルプレート（Costar, blk/clr, Corning, Corning, New York）に終夜４℃で固定した。ビオチン標識ＧＡＨペプチドを、ＢＭＰＨを利用して、官能化ＣＳに１個のビオチン−ＧＡＨ／ＣＳ鎖の濃度で結合させた。非標識のＧＡＨペプチドを、ＣＳの残りの未反応のアルデヒドに結合させた。標準的なビオチン−ストレプトアビジン検出方法を利用して、固定化されたＨＡへのアグリカン模倣物の結合の程度を測定した。ＨＡ表面のブロッキングを、１時間、１ｘＰＢＳ溶液中の１％ウシ血清アルブミン（BSA, Sera Care Life Sciences, Milford, MA）で行った。１ｘＰＢＳで洗浄した後、ビオチンで標識されたアグリカン模倣物をウェル中で３０分間インキュベートし、次いで、１ｘＰＢＳで洗浄した。ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（R&D Systems, Minneapolis, MN）溶液を各ウェルに添加し、２０分間反応させた。反応の完了および洗浄の後、色素原溶液を添加し（Substrate Reagent Pack, R&D Systems）、１５分間発色させた。１５分後に、硫酸（Sigma）を直接各ウェルに添加し、反応を停止させた。次いで、ウェルプレートを M5 SpetraMax Plate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA）で、４５０および５４０ｎｍの波長で読み取った。得られた２つの吸光度の読み取り値を差し引き、結合したビオチン標識化アグリカン模倣物による吸光度を決定した。
【０１５２】
ＧＡＨペプチド１個／アグリカン模倣物を、ビオチンで標識されたＧＡＨペプチドおよび現在標識されたアグリカン模倣物で置き換え、固定化されたＨＡとインキュベートした。購入できるビオチン検出製品（ストレプトアビジンおよびＨＲＰによる）は、固定化されたＨＡへの模倣物結合の程度を示した（図３参照）。１μＭの濃度で出発して、アグリカン模倣物は、固定化されたＨＡの存在下で用量依存的増加を示し、模倣物がＨＡに結合していたことを証明した。しかしながら、模倣物の結合親和性の測定は、固定化されたＨＡの量が不確かであるため、行わなかった。
【０１５３】
レオメータで導かれる合成ペプチドグリカンのヒアルロン酸への結合
より生理学的に意味のある状況でアグリカン模倣物のＨＡへの結合能力を試験するために、ＨＡ溶液を創製した。アグリカン模倣物のＨＡに結合する能力は、ＨＡ架橋を示す溶液の貯蔵弾性率の模倣物による改善により推定した。アグリカン模倣物のＨＡに結合する能力を試験するために、１ｘＰＢＳ ｐＨ７.４中で複数の処理を行った：２.５ｗｔ％ＨＡ対照、ＣＳ：ＨＡモル比２５：１のＨＡ＋ＣＳ、２５：１のＨＡ＋３ＧＡＨ−ＣＳ、２５：１のＨＡ＋７.２ＧＡＨ−ＣＳ、２５：１のＨＡ＋１０.５ＧＡＨ−ＣＳ。
【０１５４】
AR-G2 Rheometer (TA Instruments, New Castle, DE）を使用して、周波数（０.１−１００Ｈｚ、２.５１２Ｐａ）および応力（０.１−１００Ｐａ、１.０Ｈｚ）掃引を実施し、各溶液の貯蔵弾性率を測定した。
【０１５５】
レオロジーは、力の適用に応じた物質の流動を研究するものであり、粘弾性材料を測定するときにしばしば使用される。特に、レオメータは、適用された力に対する物質のフィードバックに基づき、貯蔵弾性率および損失弾性率を測定する。貯蔵弾性率は、物質により弾力的に吸収されるエネルギー量の尺度であり、損失弾性率は、熱により失われるエネルギー量を示す。高い貯蔵弾性率は、より堅く、弾力のある構造を有するゲル様の物質を示す；一方、低い貯蔵弾性率および高い損失弾性率は、適用された負荷を弾力的に保持しない粘性の物質を示す。高分子量のＨＡ（約１.５ＭＤａ）は、ＨＡ鎖の絡み合いにより形成される偽性ゲルにより、適用された負荷の一部を弾力的に保持する、非常に粘性のある物質である。創製されたアグリカン模倣物は複数のＨＡ結合ペプチドを含み、それらは、適切な模倣物のＨＡへの結合をとる一種のＨＡ鎖架橋剤として作用できる。高分子量のＨＡを含む溶液中で、アグリカン模倣物は溶液の剛性を高め、より高い貯蔵弾性率をもたらし得るという仮説が設けられる。より高い貯蔵弾性率は、長いＨＡ架橋を示すものであり、混合物中に存在するアグリカン模倣物とＨＡ鎖の間に強い結合親和性をもたらす。複数のバージョンのアグリカン模倣物を試験し、官能化されたＣＳ鎖当たりの結合したＧＡＨペプチドの数（平均で３、７.２または１０.５）で区別した。
【０１５６】
図４に示す実験結果は、ＣＳの付加はＨＡ溶液の貯蔵弾性率を有意に（α＝０.０５）下げることを示した。ＣＳに伴う高密度の負電荷の付加は、ＨＡ鎖の拡散を助け、ＨＡの絡み合いの程度を和らげ、適用されたエネルギーを貯蔵する偽性ゲルを除去する。この仮説に合致して、ＣＳ当たりのＧＡＨペプチドの数が３から１０.５に増加するにつれて、混合物の貯蔵弾性率も上昇した。この上昇は、アグリカン模倣物当たり、より多数のＧＡＨペプチドを有することの、２つの有益な性質に起因し得る。第１に、ＣＳ１個につきより多くのＧＡＨペプチドが結合し、模倣物の結合力がより高いほど、より強い模倣物のＨＡ分子への結合をもたらす。第２に、ＣＳ１個につきより多くのＧＡＨペプチドが結合するほど、模倣物がＨＡ分子間の架橋剤として作用する見込みが高まる。両方の効果が、よりゲル様の混合物に貢献し、より高い貯蔵弾性率の測定をもたらす。より弱い模倣物とＨＡとの間の結合は、偽性ゲルを回復せず、レオメータから適用されるエネルギーを貯蔵できないであろう。貯蔵弾性率の上昇は、図３に示す通り、固定化されたＨＡへの模倣物の強い結合を裏付ける。特に、ＣＳ鎖当たり１０.５個のＧＡＨペプチドで、貯蔵弾性率はＨＡ＋ＣＳ対照より有意に（α＝０.０５）高く、ＨＡ対照に近い平均貯蔵弾性率に達した。
【０１５７】
実施例４
合成ペプチドグリカンの圧縮の研究
コラーゲンゲルの形成と濁度
天然の軟骨細胞外マトリックスを模倣するために、コラーゲンを利用して、ＨＡおよびアグリカン模倣物の凝集物を天然の足場内に封入した。ＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）を２つの異なる商業的供給源（Affymetrix, Santa Clara, CA および Sigma）から得た。天然の成分の分析に従って、軟骨ＥＣＭ成分の混合物をＴＥＳバッファー（６０ｍＭ ＴＥＳ、２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、０.５６Ｍ ＮａＣｌ、Sigma の化学物質）ｐＨ７.６中で調製した。ここで、ＣＩＩは７０乾燥重量％を占め、ＨＡおよびアグリカン模倣物／ＣＳ対照は、混合物の残りの３０乾燥重量％を形成した。ゲル中のＣＩＩの最終濃度は、２ｍｇ／ｍｌであった。サンプルは、ＣＩＩ対照、ＣＩＩ＋ＨＡ＋ＣＳ対照およびＣＩＩ＋ＨＡ＋アグリカン模倣物（１０.５ＧＡＨ−ＣＳ）からなった。成熟前の原線維形成およびゲル形成を防止するために、溶液を氷中で、酸性ｐＨで維持した。成分の溶液混合物を３８４ウェルプレート（Greinier blk/clr, Monroe, NC）に入れ、３７℃および生理学的ｐＨに置き、原線維形成を開始させ、M5 SpectraMax で３１３ｎｍでモニターし、ゲル形成を測定した。ＣＩＩは、処理を変えて含めても、ゲルを形成できなかった（補足情報参照）。従って、Ｉ型コラーゲン（ＣＩ、High Concentration Rat Tail Collagen Type 1, BD Biosciences, Bedford, MA）をゲル形成に利用した。成分の質量をＣＩ最終濃度４ｍｇ／ｍＬに移動したこと以外は、同じ処理および手法をＣＩで使用した。ＣＩをすべての以下の実験に使用した。
【０１５８】
ＣＩでの濁度測定を実施し、軟骨複製物の形成を測定した。結果を図５に示す。立証される通り、ＨＡ＋１０.５ＧＡＨ−ＣＳの添加は、コラーゲン線維の原線維形成に影響を与えなかった。すべての処理は類似の曲線に従い、類似の吸光度ピークにほぼ同時に到達した。ＨＡ＋１０.５ＧＡＨ−ＣＳ処理は、成熟前のＣＩ線維形成のためではなく、アグリカン模倣物が１ｘＰＢＳ溶液中で自己凝集体を形成する傾向のために、高い初期吸光度を有した。１０.５ＧＡＨ−ＣＳの凝集は、最初のＨＡレオメータ試験中に認識されたが、凝集はアグリカン模倣物がＨＡに結合する能力を阻害しなかった。
【０１５９】
コラーゲンゲルの特性試験
２０ミリメートルのパラレルプレートジオメトリーを使用する AR-G2 Rheometer を使用して（TA Instruments）、コラーゲンをベースとするゲルの圧縮試験および周波数掃引を実施した。３７５μＬのゲル混合物を氷上で調製し、レオメータベースプレートにピペットで移した。このジオメトリーを１ｍｍの間隙距離まで下げ、溶液を３７℃に加熱した。湿気のトラップを利用してゲルの脱水を防止しながら、混合物を２時間にわたりゲル化させた。この２時間の値は、濁度データから示されたゲル化にかかる時間のデータにより決定した。この２時間の期間の後、試験に応じてゲルを圧縮するか、または振動させた。圧縮試験は、１％（１０μｍ）／秒の工学ひずみ速度で行った。ジオメトリーヘッドで間隙距離および垂直抗力を測定した。周波数掃引は、０.１から１Ｈｚへの対数ベースで１０の周波数の増加中に、創製されたゲルの貯蔵弾性率を測定した。
【０１６０】
垂直抗力および変位を同時に測定し、各処理について工学的応力およびひずみを算出した。図６に示す通り、アグリカン模倣物の包含は、ゲル複合体の圧縮強度を有意に（α＝０.０５）高めた。コラーゲン＋ＨＡ＋ＡＧＧ模倣物のピークの工学的応力は、９％の工学ひずみで７.５ｋＰａに達し、コラーゲン＋ＨＡ＋ＣＳ対照は、４％で４.８ｋＰａのピークに達し、コラーゲン対照は１５％のひずみで４.２ｋＰａのピークに達した。
【０１６１】
２つの要素がＣＩ＋ＨＡ＋１０.５ゲルの圧縮強度の増加に貢献した。第１は、模倣物の水を引きつける能力であり、第２は、アグリカン模倣物のＨＡ架橋能力である。天然の軟骨では、ＨＡおよびＣＳにより提供される支配的な封入された負電荷が水を引きつけ、その軟骨からの拡散を妨げる。圧縮力を軟骨に適用すると、この水は滑液包に拡散できない。この圧縮できない水を保持していることが、この構造の圧縮強度を高める。試験したゲル複合体でも同様に、ＣＳに伴う負電荷がゲルに含まれることは、同じ引力を提供する。図６に見られる通り、ＣＳおよび１０.５ＧＡＨ−ＣＳの両方の処理が、圧縮強度の増加を伴う。ＣＳ処理は、ＣＩ複合体（ＨＡに結合していない）内に固定されず、従って、小さい圧縮変形の後に、ＣＳおよびその引きつけられた水は複合体から周りの液体に拡散する。複合体からのＣＳおよび水の拡散は、複合体の圧縮強度を低下させ、結果的にゲルの圧縮プロファイルをコラーゲン足場の対照と似たものにする。対照的に、１０.５ＧＡＨ−ＣＳは、絡み合ったＨＡに結合している。従って、模倣物のＨＡへの結合を克服し、ＣＳおよび引きつけられた水を複合体から拡散させるには、大幅に高い圧縮応力が必要とされる。
【０１６２】
第２に、アグリカン模倣物がＨＡ架橋剤として作用する能力は、より高いＨＡおよび模倣物の封入の程度をもたらす。効果的に、ＨＡ架橋の性質は、コラーゲン複合体内に、天然のアグリカン／ＨＡ凝集体と同様の大きい凝集体を創製する。アグリカン模倣物と天然アグリカンの主な違いは、分子の大きさである。アグリカンのタンパク質主鎖は単独で約２２０ｋＤａであるが、アグリカン模倣物は、全体で約３０ｋＤａでしかない。従って、１００個以上のアグリカン分子がＨＡに結合した天然の凝集複合体は、アグリカン模倣物がもたらし得るものよりも大幅に大きい凝集体をもたらす。しかしながら、ＨＡ鎖間の架橋剤として作用することにより、アグリカン模倣物は、その独自の形態の凝集体を産生でき、それはまた、天然の凝集体の主な特徴、即ち、かさばる負荷電の構造も描く。アグリカン模倣物のＨＡ架橋剤としての役割を、上記のＣＩゲルのレオロジー試験により、剪断負荷を適用することにより、さらに調べた。これらの実験の結果を、図７に見ることができる。
【０１６３】
１０.５ＧＡＨ−ＣＳを含めることは、形成されるゲルの貯蔵弾性率を有意に（α＝０.０５）高めた。模倣物のＨＡへの結合により創製されるネットワークは、ＣＩマトリックスの既存の剛性を補い、剪断負荷により適用されたエネルギーの弾性吸収を増加させた。この研究は、１０.５ＧＡＨ−ＣＳの架橋能力および代替的凝集形態の創製を立証したので、重要であった。
【０１６４】
実施例５
ヒアルロン酸分解の合成ペプチドグリカン保護
ＡＲ−Ｇ２を使用して、ＨＡ溶液の動粘性の値を測定した。高分子量ＨＡ溶液は、長い鎖の長さに起因する大規模な鎖の絡み合いのために、高い粘性を有する。ヒアルロニダーゼ（ヒツジ精巣由来のＩＩ型、Sigma）はＨＡ鎖を切断し、絡み合いの少ない短い鎖を創製する。短いＨＡ鎖は、測定可能な低い粘性を有する。ＨＡ溶液を１００ユニット／ｍＬのヒアルロニダーゼとインキュベートした。一定の角周波数および振動応力で時間掃引を使用して、開始時並びに２および４時間の時点で動粘性を測定した。サンプル（０.５ｗｔ％のＨＡ）は、ＨＡ、ＨＡ＋ＣＳおよびＨＡ＋１０.５ＧＡＨ−ＣＳからなった。処理の値を、７５：１の処理対ＨＡのモル比で加えた。最初の粘性を、測定された粘性から最初の粘性を引いた差と分けることにより、分解の割合を各測定について算出した。
【０１６５】
Pratta et al. および Little et al. の仕事は、軟骨成分の分解の防止におけるアグリカンの重要性を示した。骨関節症における軟骨マトリックスの解体は、アグリカンプロテオグリカン類の切断で始まる。プロテオグリカンのＧＡＧに富む領域の除去は、残りの成分、即ちＣＩＩおよびＨＡを、分解酵素に露出させる。分解の防止におけるアグリカンの重要性の知識を得て、ＨＡ分解の防止におけるアグリカン模倣物の能力を測定する研究を行った。
【０１６６】
ＨＡ溶液の粘性は、ＨＡ鎖の大きさに依存する。絡み合いのために、より大きいＨＡ鎖はより高い粘性をもたらす。ヒアルロニダーゼにさらされたとき、ＨＡ鎖は小さい単位に切断される。従って、ＨＡの大きさおよびＨＡの絡み合いの量は減少する。この減少は、測定される粘性に同様の減少を促す。ヒアルロニダーゼの存在下でのＨＡ溶液の粘性の変化の割合は、ＨＡが受けた分解の量に重要な情報を与える。図８は、ＨＡ対照、対、関連する処理の分解の割合を示す。理解できるように、ＡＧＧ模倣物のＧＡＨは、有意にＨＡの分解速度を低下させ、それがＥＣＭ成分の保護において、天然ＡＧＧと同様に振る舞うことを示す。
【０１６７】
ヒアルロニダーゼを用いない各処理（ＴＥＳバッファーがヒアルロニダーゼの体積を置き換えた）の粘度を最初に測定し、分解割合を算出するためのベースラインとして供した。０時間の時点は、ヒアルロニダーゼの添加、溶液の混合、レオメータへのピペットによる移動、開始時の機械の平衡化操作を含んだ。従って、０時間の時点は、ヒアルロニダーゼ添加の約２分後であった。高濃度のヒアルロニダーゼ（２５ユニット／ｍＬ）を利用して、起こり得る最悪のシナリオを再現した。加えて、ＨＡ分子を、コラーゲンネットワークに密に織り込むよりも、溶液中に分散させた。図８から理解できるように、ＨＡ対照およびＨＡ＋ＣＳ処理は、０時間の時点でほぼ完全なＨＡ溶液の分解をもたらした。対照的に、１０.５ＧＡＨ−ＣＳの添加は、ＨＡ分解の量を有意に（α＝０.０５）減少させた。実際に、１０.５ＧＡＨ−ＣＳの存在は、粘性をベースライン値より高く増加させた。ヒアルロニダーゼの添加はいくらかの過剰のＨＡを切断すると考えられる。これは、１０.５ＧＡＨ−ＣＳがより良好に残りの無傷の鎖を架橋し、より高い粘性をもたらすより濃厚なゲルを創製することを可能にする。
【０１６８】
２時間の時点で、ＨＡ対照とＨＡ＋ＣＳは両方とも９０％を超える分解割合で完全に分解されたが、１０.５ＧＡＨ−ＣＳを含むＨＡ溶液は有意に（α＝０.０５）低い分解割合であった。最後に、４時間の時点で、すべての処理は、すべて９０％を超える分解割合で分解された。３つの時点の中で、１０.５ＧＡＨ−ＣＳはＨＡ分解を完全に防止できなかったが、ＨＡ対照およびＨＡ＋ＣＳの分解と比較すると、分解速度を大幅に低下させた。この速度の低下は、１０.５ＧＡＨ−ＣＳがＨＡ鎖の分解を防止することを立証する。この防止は、ＨＡ鎖上のヒアルロニダーゼ切断点の競合阻害により達成されると考えられる。模倣物のＨＡ鎖への非共有結合は、ＨＡ鎖の穏やかな分解速度と共に、この考えを裏付けると思われる。加えて、１０.５ＧＡＨ−ＣＳ溶液の分解速度は、依然として人為的に高いと考えられる。ＨＡ溶液中での模倣物のインキュベーションの際に、ＨＡ＋１０.５ＧＡＨ−ＣＳ凝集物が形成された。しかしながら、これらの凝集物は、溶液の体積全体に均一に拡散しなかった。従って、他のサンプルと同様に、測定を行う前に溶液を混合した。溶液の混合は凝集物を崩壊させ、１０.５ＧＡＨ−ＣＳを追い出し、ヒアルロニダーゼ切断点を露出させる。完全な分解が起こったと推定される４時間の時点の後でさえ、実質的なＨＡ＋１０.５ＧＡＨ−ＣＳの凝集は依然として起こった。軟骨のＥＣＭのような緻密なマトリックス中では、１０.５ＧＡＨ−ＣＳは有意に分解速度を低減させるのみならず、ＨＡの分解を抑制することが可能である。
【０１６９】
実施例６
凍結走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）
ＥＣＭをベースとする構築物を、濁度測定について記載した通りに、ＳＥＭプレート上に３７℃で終夜形成させた。ＳＥＭプレートをホルダーに固定し、半解けの液体窒素に埋めた。サンプルを Gatan Alto 2500 プレ−チャンバーに移す際に、サンプルに減圧をかけた。−１７０℃に冷却したチャンバー内で、冷却したメスを使用して、サンプル上に自由な破壊された表面を創製した。サンプルを−８５℃で１５分間昇華させ、続いて白金で１２０秒間スパッター被覆した。スパッター被覆の後、サンプルを顕微鏡のステージに移し、−１３０℃で画像を得た。
【０１７０】
図９に示す通り、代表的な画像を１０,０００ｘの倍率で得た。パネルＡは、ＣＩ対照を示し、主要な原線維間の大規模な架橋および比較的小さいマトリックスの孔サイズを特徴とする。パネルＢはＣＩ＋ＨＡ＋ＣＳを示し、大規模な架橋を含むが、大きいＨＡ鎖の存在により、孔サイズはより大きい。パネルＣはＣＩ＋ＨＡ＋１０.５ＧＡＨ−ＣＳを示し、非常に大きい孔サイズに加えて、顕著に小さい架橋の程度を例示する。ＡＧＧ模倣物はＨＡに結合でき、ＣＩの架橋を妨げる、比較的大きい厄介な複合体を創製する。
【０１７１】
代表的な画像で認識できるように、ＨＡ＋ＣＳの添加は、コラーゲン原線維の直径の多様性に効果がなかったが、ＨＡ＋ＣＳサンプルはより大きい代表的な空隙空間を有した。対照の群との比較では、ＨＡを伴うＡＧＧ模倣物の添加は、限定された数の小さい原線維の直径のために、コラーゲン原線維の直径の小さい変動をもたらし、全体的なサンプルの空隙空間の増加をもたらす。ＨＡ分子へのＡＧＧ模倣物の結合は、コラーゲン足場内に捕らえられる凝集複合体を創製し、立体障害により、より大きい原線維間でのより小さい原線維の形成を排除した。
【０１７２】
実施例７
コラーゲンの保護
コラーゲン単独、コラーゲン＋ＨＡ＋ＣＳまたはコラーゲン＋ＨＡ＋１０.５ＧＡＨ−ＣＳを含有するＥＣＭをベースとする構築物を、以前に記載された通りに、８個のウェルのあるチャンバースライド中で創製した。最終サンプル体積は２００μＬであり、０.８ｍｇのＩ型コラーゲンからなる。マトリックスメタロプロテアーゼ−Ｉ（MMP-I, R&D Systems, Minneapolis, MN）を、０.１３３ｍｇ／ｍＬの濃度で、製造業者の指示書に詳述されるプロトコールに従って活性化した。簡単に述べると、製造業者のバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０.０５％Ｂｒｉｊ−３５、ｐＨ７.５）に既に溶解したＭＭＰ−１を、等体積のＤＭＳＯ中の２５ｍＭ ＡＰＭＡ（Sigma）と３７℃で２時間合わせ、酵素を活性化した。活性化の際に、ＭＭＰ−１溶液を水で２倍に希釈し、１００μＬの上清としてサンプルに添加した。サンプルを３７℃で穏やかに振盪しながらインキュベートした。最初の酵素溶液の添加の２５時間後に、上清を除去し、新鮮な酵素のバッチで置き換えた。全部で５０時間の酵素とのインキュベーションの後、残っているゲルをチャンバースライドから除去し、脱イオン水で洗浄して酵素溶液または分解産物を除去し、１２Ｍ ＨＣｌ中に再溶解した。サンプルを水中で希釈し、６Ｍ ＨＣｌの最終濃度に到達させ、終夜１１０℃で加水分解した。加水分解に続き、Reddy, et al. (Clin Biochem, 1996, 29: 225-9) により開発されたプロトコールに従って、ヒドロキシプロリン（ｈｙｐ）の量を分析した。簡単に述べると、加水分解したサンプルをクロラミンＴ溶液（０.５６Ｍ）と２５分間室温でインキュベートし、その後、エールリッヒ試薬を添加し、続いてクロロフォア（chlorophore）を２０分間６５℃で発色させた。クロロフォアの発色後、サンプルを分光光度計で、５５０ｎｍの波長で読み取った。吸光度の読み取り値を、既知濃度のコラーゲンから得られたものと比較し、各サンプル中に残っているコラーゲンの量を測定した。
【０１７３】
０.８ｍｇのＣＩを用いて各々の複製サンプルを構築し、分解後、Reddy et al. により開発されたプロトコールにより、残っているＣＩ量を測定し、それをＣＩ標準によりＣＩの量に変換した。残っているＣＩを最初のＣＩから引き、最初のＣＩにより割り、１００を掛けることにより、分解割合を決定した。３種の処理の分解割合を図１０に示す。すべての処理は、相互に有意に異なった（ｐ＜０.０５）。特に、ＡＧＧ模倣物サンプルの分解割合（ＣＩ＋ＨＡ＋１０.５ＧＡＨ−ＣＳ＝４１.０％）は、他の２種の処理（ＣＩ＝６４.５％およびＣＩ＋ＨＡ＋ＣＳ＝７４.７％）に比べて有意に低かった（ｐ＜０.０５）。ＡＧＧ模倣物の存在は、有意にＣＩ分解を低減した。ＡＧＧ模倣物の存在は、分解酵素の切断部位への妨害物として作用できる。コラーゲン足場内に密に捕らわれたＨＡを含む大きい凝集体を創製することにより、ＡＧＧ模倣物は、コラーゲンに近い空間を占めることができ、分解位置への酵素の接近を防止する。
【０１７４】
実施例８
軟骨マトリックスを介するペプチドグリカンの拡散
３ヶ月齢のウシの膝関節の荷重負荷領域から軟骨外植片を得た。回収した軟骨外植片から天然アグリカンを除去し、主にＩＩ型コラーゲンおよび残りのＧＡＧからなるマトリックスを残した。これは、外植片を、０.５％（ｗ／ｖ）トリプシンで、ＨＢＳＳ中、３時間、３７℃で処理することにより達成された（図１３）。トリプシン処理の後、外植片をＨＢＳＳ中で３回洗浄し、２０％ＦＢＳとインキュベートして残りのトリプシン活性を不活性化した。ペプチドグリカンを蒸留水に１０μＭの濃度で溶解し、溶液１０μＬを１０分毎に１時間、室温で表面に置くことにより、軟骨外植片の関節表面を介して拡散させた（図１４）。正常な軟骨およびアグリカン枯渇軟骨を、各々正および負の対照として、１ＸＰＢＳで処理した。拡散後、外植片を１ＸＰＢＳで３回洗浄し、さらに試験するまで−２０℃で保存した。組織の正中矢状切開をストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ染色で染色することにより、ペプチドグリカンの拡散を確認した。ストレプトアビジン染色はビオチン標識分子に結合し、茶色を呈する（図１５および１６）。
【０１７５】
実施例９
バルクの圧縮試験
０.０１−５０Ｎの範囲の垂直抗力を検出できるフォーストランスデューサーを備えたＡＲ Ｇ２レオメータ（TA Instruments）で、変位制御された非拘束圧縮を実施した。疎水性印刷スライドガラス（Tekdon）の底に外植片を接着し、１ＸＰＢＳ浴で覆った。直径２０ｍｍのステンレス鋼のパラレルプレートジオメトリーのヘッドを、最初の接触がなされるまで下げた。デジタルのマイクロメータ（Duratool）を使用して、外植片の高さを測定した。公称ひずみ０−３０％（５％間隔）からの圧縮負荷を、５秒間の勾配期間（即ち、１.０％／秒のひずみ速度）および３０秒間の保持時間を含む段階的な負荷で外植片に適用した。各保持セクション中にコンピュータで算出した平衡応力値の傾きを、各ひずみ値に対して、線形フィットモデルに基づいて使用することにより、圧縮剛性の値を得た。バルクの圧縮について試験した足場には：１）正常な軟骨、２）アグリカン枯渇軟骨（ＡＤ）、および３）ＡＤ＋ｍＡＧＣが含まれた（図１７）。ＨＡに結合するペプチドグリカン（ｍＡＧＣ）の添加は、ＩＩ型コラーゲンに結合するペプチドグリカン（ｍＡＧ（ＩＩ）Ｃ）に匹敵するほど高く、軟骨外植片の硬度を有意に回復させた。
【０１７６】
実施例１０
動物モデル
Sprague-Dawley ラット（２５０〜３００ｇ）を外科手術に使用した。膝蓋腱、前および後十字靱帯、並びに、内側、外側側副靱帯を横切した。内側および外側半月を、全体的に半月板切除した。吸収性の縫合糸で膝の関節包を修復し、４−０モノフィラメントナイロンで皮膚を閉じた。４週で開始し、１０μｌの１μｍ ｍＡＧＣを毎週投与した。
【０１７７】
外科手術の４、６および８週間後にペプチドグリカンで処置した／しなかった Sprague-Dawley ラットにおいて、炎症の程度を、ＭＭＰ−１３のプローブ（図１８）により示した（図１９）。Sprague-Dawley ラットの膝関節のＸ線画像は、骨関節症誘導手術の６週間後に、ＯＡ誘導の６週および８週間後の傷害された膝（図２０、各々パネルＡおよびＤ）、ペプチドグリカン処置を伴う傷害された膝（図２０、各々パネルＢおよびＥ）、および、正常な膝（図２０、パネルＣ）を示した。Sprague-Dawley ラットのマイクロＣＴは、ＯＡ誘導手術の６および８週間後に、新しい軟骨の再成長を示した。ＯＡ誘導の６および８週間後の傷害された膝（図２１、各々パネルＡおよびＤ）、ペプチドグリカン処置後の傷害された膝（図２１、各々パネルＢおよびＥ）、並びに、正常な膝（図２１、パネルＣ）を示す。
【０１７８】
実施例１１
試薬
ペプチドＧＡＨＷＱＦＮＡＬＴＶＲＧＧＧＣ（ＧＡＨ）を、Genscript (Piscataway, NJ) から購入した。Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド、トリフルオロ酢酸塩（ＢＭＰＨ）を、Pierce (Rockford, IL) から購入した。ラット尾のＩ型コラーゲンを、BD Biosciences (Bedford, MA) から購入した。ヒト組み換えインターロイキン−１βを、Peprotech (Rocky Hill, NJ) から購入した。すべての他の必需品を、特記しない限り、VWR (West Chester, PA) または Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) から購入した。
【０１７９】
実施例１２
コラーゲン足場の合成
コラーゲン足場を、ＴＥＳバッファー（６０ｍＭ ＴＥＳ、２０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４、０.５６Ｍ ＮａＣｌ）中、ｐＨ７.６で調製した。機械的試験およびインビトロ炎症性モデル研究のための足場の組成は、各々のセクションで説明されている。３７℃で原線維形成が開始されるまで、すべての溶液を氷上に維持した。コラーゲン溶液を９.４テスラの磁石（Chemagnetics CMX400）のアイソセンタに３７℃で１時間置くことにより、整列したコラーゲン足場を創製した。同様に、しかし磁気暴露なしで、整列していないゲルを調製した。コラーゲン溶液を含有するスライドを磁場と平行に置き、コラーゲン線維をスライドの底に対して垂直の方向へ向けた。次いで、蒸発を防ぐ湿度制御されたチャンバー中で、３７℃で２４時間ゲルを維持した。
【０１８０】
実施例１３
レオロジーの機械的試験
応力制御型ＡＲ Ｇ２レオメータ (TA Instruments) で、直径２０ｍｍのステンレス鋼のパラレルプレートジオメトリーヘッドを使用して、剪断および圧縮の試験を実施した。コラーゲン足場を、直径２０ｍｍの疎水性印刷スライドガラス (Tekdon) 上に調製した。剪断試験には、隙間高さ９５０μｍで接触が為されるまで、ジオメトリーヘッドを下げた。予備的な周波数および応力掃引を実施し、線形かつ応力に依存しない貯蔵弾性率の範囲を決定した。次いで、０.２Ｐａの振動応力で、０.１ないし２Ｈｚにわたる周波数の範囲で、すべてのゲルに周波数掃引を実施した。圧縮試験には、隙間高さ１０００μｍで足場との接触が為されるまで、ジオメトリーヘッドを下げた。公称ひずみ０−３０％（５％間隔）からの圧縮負荷を、５秒間の勾配期間（即ち、１.０％／秒のひずみ速度）および３０秒間の保持時間を含む段階的な負荷でコラーゲン足場に適用した。各保持セクション中にコンピュータで算出した平衡応力値の傾きを、各ひずみ値に対して、線形フィットモデルに基づいて使用することにより、圧縮剛性の値を得た。機械的試験用のコラーゲン足場組成物は、１）整列していないコラーゲン、２）整列したコラーゲン、３）整列していないコラーゲン＋ｍＡＧＣ、および４）整列したコラーゲン＋ｍＡＧＣであった。
【０１８１】
バルクの機械的分析：アグリカン模倣物のｍＡＧＣは、線維の整列に関係なく、足場のバルクの機械的特性を高めた（図２２）。剪断試験では、０.５Ｈｚでの貯蔵弾性率は、整列していない／整列したコラーゲンゲルについて、各々１０４.１±３.６Ｐａおよび４９.９±５.４Ｐａであった。コラーゲン足場へのｍＡＧＣの添加は、整列していない／整列したゲルの貯蔵弾性率に、１１３.９±４.６Ｐａおよび７６.６±３.６Ｐａへの有意な増加を示した（ｐ＜０.００１）。整列していないゲルは、整列したゲルよりも高い貯蔵弾性率を示した（ｐ＜０.０００１）。圧縮試験では、整列した足場の圧縮剛性（２４７８±２５０Ｐａ）は、整列していない足場（３５６４±３１５Ｐａ）よりも低かった（ｐ＜０.００１）。これらの足場システムへのｍＡＧＣの添加は、整列した／整列していない足場の圧縮剛性を、各々４６２６±３８５Ｐａおよび５７４７±３０６Ｐａに高めた（ｐ＜０.０００１）。
【０１８２】
実施例１４
インビトロ炎症モデル
軟骨細胞を播いたコラーゲン足場を、ＩＬ−１βで刺激し、分解産物について評価した。
軟骨細胞の単離：初代軟骨細胞を、屠殺場から屠殺後２４時間以内に得た３ヶ月齢のウシの膝関節から回収した（Dutch Valley Veal）。厚さ１５０−２００μｍの軟骨切片を、外側大腿骨顆部から削ぎ取り、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸２−ホスフェート、１００μｇ／ｍＬピルビン酸ナトリウム、０.１％ウシ血清アルブミン、１００ユニット／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ）で３回洗浄し、その後、３％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および０.２％コラゲナーゼ−Ｐ（Roche Pharmaceuticals）で、３７℃で６時間切断した。解放された軟骨細胞を、７０μｍ細胞濾過器で濾過し、１０００ｒｐｍで３回、各５分間、１０％ＦＢＳを添加した上記の培地中で、遠心分離した。１０％ＦＢＳを添加した培地で細胞のペレットを再懸濁し、１０ｃｍディッシュに、細胞１０,０００個／ｍＬで、３７℃で、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中に、コンフルエントまで置いた。
【０１８３】
足場の製作：コンフルエントに達したら、細胞をトリプシン処理し、細胞１０,０００個／ｍＬでコラーゲン足場内に包み（表３）、処置前に３日間平衡化させた。
表３：インビトロ試験用の足場組成物
【表３】
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【０１８４】
炎症モデル：５％ＦＢＳおよび抗生物質（１００ユニット／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）を添加した化学的に定義された培地中、２０ｎｇ／ｍＬＩＬ−１βを含めて、または、含めずに、構築物をインキュベートした。培養培地を２日毎に交換した。取り出した培地の抽出物を、さらに試験するまで、−８０℃で保存した。
【０１８５】
分解アッセイ：ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）染色アッセイを使用して細胞培養培地中に放出されたＣＳを測定することにより、ＧＡＧの分解をモニターし、コンドロイチン−６−サルフェート標準曲線を用いてコンピュータ計算した。同様に、細胞培養培地におけるＩ型コラーゲンの分解を、製造業者が指定するプロトコール（Bio-Color）を使用する Sircol コラーゲンアッセイを使用してモニターした。ＧＡＧおよびコラーゲン分解を、８日間の培養期間にわたる累積的放出として報告した。
【０１８６】
タンパク質分解の分析：細胞培養培地に放出されるＣＳおよびコラーゲンの量は、足場がｍＡＧＣを含有する場合に有意に減少した（図１１、１２、２３および２４）（各々ｐＣＳ＜０.００１およびｐコラーゲン＜０.０２）。整列したコラーゲンゲルは、整列していないコラーゲン線維と比較して、統計学的に高い培地へのＣＳおよびコラーゲンの放出を示した（ｐ＜０.００１）。
【０１８７】
本明細書に記載の通り、ヒアルロン結合合成ペプチドグリカンは、足場中のＨＡおよび根底にあるコラーゲン線維をタンパク質分解的切断から保護できる。ヒアルロン結合合成ペプチドグリカンの合成は、ＣＳの軟骨保護的利点を利用した。ＣＳは、マトリックスメタロプロテアーゼの産生を下方調節すると示された。我々の本明細書に記載する合成ペプチドグリカンの設計は、ＣＳ鎖がＨＡに結合し、両分子の分解を防止することを可能にした。合成ペプチドグリカンをタンパク質分解酵素に富む環境に置くことにより、ＥＣＭ成分の過剰な損失を防止する能力が立証された。
【０１８８】
実施例１５
リアルタイムＰＣＲ
細胞培養研究に続き、構築物を RNAlater 溶液 (Ambion) 中、４℃で１週間未満保存した。Nucleospin RNA II (Clontech) を製造業者のプロトコールに従って使用して、総ｍＲＮＡを抽出した。すべてのサンプルから抽出されたｍＲＮＡを、Nanodrop 2000 分光光度計 (Thermo Scientific) を使用して定量し、High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit (Applied Biosystems) を使用してｃＤＮＡに逆転写した。Taqman Gene Expression Assays (Applied Biosystems) を以下のプライマー：ＧＡＰＤＨ（Ｂｔ０３２１０９１３＿ｇ１）、アグリカン（Ｂｔ０３２１２１８６＿ｍ１）およびＩＩ型コラーゲン（Ｂｔ０３２５１８６１＿ｍ１）で使用して、リアルタイムＰＣＲを実施した。関心のある２つの遺伝子および内在性遺伝子について、２０μＬの反応毎に、ｃＤＮＡテンプレート６０ｎｇを調製した。Taqman PCR Master Mix および 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) を使用してリアルタイムＰＣＲ分析を実施した。報告されたデータを、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現で標準化した。
【０１８９】
ｍＲＮＡ発現の分析：コラーゲン整列は、アグリカン模倣物およびＩＬ−１βによる刺激の存在下で、有意にアグリカン（ｐａｌｉｇｎｍｅｎｔ＜０.００１、ｐペプチドグリカン＜０.０２およびｐＩＬ−１β＜０.００１）およびＩＩ型コラーゲン（ｐａｌｉｇｎｍｅｎｔ＜０.０１、ｐペプチドグリカン＜０.００１およびｐＩＬ−１β＜０.０１５）の発現をもたらした。ｍＡＧＣの存在は、足場からのＣＳの過剰な損失を制限し、低いアグリカン発現をもたらした（ｐ＜０.０２）（図２５）。ｍＡＧＣの存在は、コラーゲン分解も制限した。しかしながら、ＩＩ型コラーゲンの発現は、分解中に失われたコラーゲンの程度に依存した（図２５）。整列していない足場では、ＩＩ型コラーゲンの発現レベルはｍＡＧＣを用いずに調製された足場で高く、一方、整列したコラーゲン足場では、ＩＩ型コラーゲンのレベルは、ｍＡＧＣを用いて調製した足場で高かった（ｐ＜０.０５）。
【０１９０】
実施例１６
統計学的分析
各実験を、各データセットにおいて少なくともｎ＝３で、２回繰り返した。機械的試験のデータの統計学的有意性は、整列およびペプチドグリカンの添加を要因として、２要因のＡＮＯＶＡで分析した。細胞培養のデータは、整列、ペプチドグリカンの添加およびＩＬ−１β処理を要因として、３要因のＡＮＯＶＡを使用して分析した。事後のテューキーの一対比較（α＝０.０５）を使用して、各システムで、アグリカン模倣物で調製した／しなかった足場を直接比較した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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