(57)【要約】      （修正有）【課題】より簡便に且つ非特異的シグナルをより低減した状態で被検物質を検出する方法を提供する。【解決手段】被検物質と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ基板に固定されている捕捉体と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体とを液中で接触させ、前記捕捉体を基板上に配置した後に、前記捕捉体を含む物質の基板上からの解離と基板上への接触とを繰り返し、特定の工程と特定の工程とで、基板上の標識由来シグナル配置パターンを比較し、実質的に同位置のシグナルを被検物質を示すシグナルとして検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質を検出する方法であって、
前記被検物質と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ基板に固定されている捕捉体1と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置する第1接触工程、
前記第1接触工程の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させる第1解離工程、
前記第1解離工程の後、前記被検物質と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ基板に固定されている捕捉体1と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置する第2接触工程、
前記第2接触工程の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させる第2解離工程、及び
前記第1解離工程における解離後の基板上の標識由来シグナル配置パターンと前記第2解離工程における解離後の基板上の標識由来シグナル配置パターンとを比較し、実質的に同位置のシグナルを、被検物質を示すシグナルとして検出する検出工程、
を含む方法。
【請求項２】
被検物質を検出する方法であって、
前記被検物質と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ基板に固定されている捕捉体1と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置する第1接触工程、
前記第1接触工程の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させる第1解離工程、
前記第1解離工程の後、前記被検物質と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ基板に固定されている捕捉体1と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置する第2接触工程、及び
前記第1接触工程における接触後の基板上の標識由来シグナル配置パターンと前記第2接触工程における接触後の基板上の標識由来シグナル配置パターンとを比較し、実質的に同位置のシグナルを、被検物質を示すシグナルとして検出する検出工程、
を含む方法。
【請求項３】
前記解離工程において、基板上に配置された前記捕捉体2に対する外力の強さを調整することにより、前記捕捉体2を基板から解離させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記外力が引力であり、且つ前記解離工程において、基板上に配置された前記捕捉体2に対して引力を付与することにより、前記捕捉体2を基板から解離させる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記接触工程においては、前記解離工程で付与される引力よりも弱い引力が付与された状態、又は引力が付与されていない状態である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記外力が、磁力、クーロン力、遠心力、流体力、光、及び音波からなる群より選択される少なくとも1種により引き起こされる外力である、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記外力が、磁力、クーロン力、及び音波からなる群より選択される少なくとも1種により引き起こされる外力である、請求項３〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記捕捉体2が、前記被検物質と結合する抗体、抗原、核酸、受容体、リガンド、及びアプタマーからなる群より選択される少なくとも1種と、担体粒子とを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記担体粒子が磁性粒子、及び荷電粒子からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記捕捉体1が、前記被検物質と結合する抗体、抗原、核酸、受容体、リガンド、及びアプタマーからなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記第1接触工程と前記第1解離工程の間にB/F分離工程を含まない、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記第2接触工程と前記第2解離工程の間にB/F分離工程を含まない、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記第1解離工程において捕捉体2を基板から解離した後に、基板上の前記標識由来シグナル配置パターンを示す画像Pを撮影し、
前記第2解離工程において捕捉体2を基板から解離した後に、基板上の前記標識由来シグナル配置パターンを示す画像Qを撮影し、且つ
前記検出工程において、前記画像P内の前記標識由来シグナルの位置と前記画像Q内の前記標識由来シグナルの位置とを比較して、前記画像Q内の前記標識由来シグナルの内、前記画像P内の前記標識由来シグナルと実質的に同位置の前記標識由来シグナルを、被検物質を示すシグナルとして検出する、
請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第1解離工程及び前記第2解離工程における基板上の前記標識由来シグナル配置パターンを示す動画を撮影し、
前記検出工程において、前記動画内で、前記第1解離工程から前記第2解離工程まで実質的に同位置であり続ける前記標識由来シグナルを、被検物質を示すシグナルとして検出する、
請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第1接触工程において捕捉体2を基板上に配置した後に、基板上の前記標識由来シグナル配置パターンを示す画像Xを撮影し、
前記第2接触工程において捕捉体2を基板上に配置した後に、基板上の前記標識由来シグナル配置パターンを示す画像Yを撮影し、且つ
前記検出工程において、前記画像X内の前記標識由来シグナルの位置と前記画像Y内の前記標識由来シグナルの位置とを比較して、前記画像Y内の前記標識由来シグナルの内、前記画像X内の前記標識由来シグナルと実質的に同位置のシグナルを、被検物質を示すシグナルとして検出する、
請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記第1接触工程及び前記第2接触工程における基板上の前記標識由来シグナル配置パターンを示す動画を撮影し、
前記検出工程において、前記動画内で、前記第1接触工程から前記第2接触工程まで実質的に同位置であり続ける前記標識由来シグナルを、被検物質を示すシグナルとして検出する、
請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
被検物質を検出する装置であって、
反応液を収容する反応部と、前記反応液は、前記被検物質と前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを含み、前記反応部の底部は前記被検物質に対する結合性を有する捕捉体1が固定化された基板であり、
前記捕捉体2に対する外力を付与する外力付与部と、
基板上の標識由来シグナル配置パターンを撮像する撮像部と、
前記被検物質と、前記捕捉体1と、前記捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置するよう前記外力付与部からの外力を調整し、前記接触の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させるよう前記外力付与部からの外力を調整し、且つ
前記接触時及び前記解離時の標識由来シグナル配置パターンを比較し、前記接触時及び前記解離時で実質的に同位置のシグナルを、被検物質を示すシグナルとして判定する
処理部と、
を備える装置。
【請求項１８】
被検物質を検出する装置であって、
前記被検物質に対する結合性を有する捕捉体1が底部に固定化された基板を有し、前記被検物質と前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを含む反応液を収容する反応部と、
前記捕捉体2に対する外力を付与する外力付与部と、
基板上の標識由来シグナル配置パターンを撮像する撮像部と、
前記被検物質と、前記捕捉体1と、前記捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置するよう前記外力付与部からの外力を調整し、前記接触の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させるよう前記外力付与部からの外力を調整する制御部と、
前記接触時及び前記解離時の標識由来シグナル配置パターンを比較し、前記接触時及び前記解離時で実質的に同位置のシグナルを、被検物質を示すシグナルとして判定する処理部と、
を備える装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質を検出する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、被検物質との特異的な結合反応を利用した検出技術が知られている。例えば、ELISA法と呼ばれる検出技術においては、被検物質と特異的に結合する抗体を固定化した基板により被検物質を基板に捕捉し、さらに被検物質と特異的に結合する抗体を反応させて被検物質を2つの抗体で挟んだ後、標識として酵素を結合させることで免疫複合体を形成し、酵素及びその基質の反応に基づくシグナルにより被検物質を検出することを行っている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許出願公開第2006／0188932号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ただ、このような検出手法は、通常、基板に固定化された物質と、基板に固定化されていない物質とを分離する（B/F分離）という煩雑な作業を要する。また、B/F分離を行っても、非特異的吸着が残り、これがシグナルのバックグラウンドとなるので、被検物質を特異的に検出できないという問題があった。
【０００５】
そこで、本発明では、より簡便に且つ非特異的シグナルをより低減した状態で被検物質を検出する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、被検物質と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ基板に固定されている捕捉体1と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを液中で接触させ、前記捕捉体2を基板上に配置した後に、前記捕捉体2を含む物質の基板上からの解離と基板上への接触とを繰り返し、特定の工程と特定の工程とで、基板上の標識由来シグナル配置パターンを比較し、実質的に同位置のシグナルを被検物質を示すシグナル（特異シグナル）として検出することにより、上記課題を解決できることを見出した。本発明者は、この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。
【０００７】
即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
【０００８】
項Ａ
被検物質を検出する方法であって、
前記被検物質と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ基板に固定されている捕捉体1と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置する第1接触工程、
前記第1接触工程の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させる第1解離工程、
前記第1解離工程の後、前記被検物質と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ基板に固定されている捕捉体1と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置する第2接触工程、
前記第2接触工程の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させる第2解離工程、及び
前記第1解離工程における解離後の基板上の標識由来シグナル配置パターンと前記第2解離工程における解離後の基板上の標識由来シグナル配置パターンとを比較し、実質的に同位置のシグナルを、被検物質を示すシグナルとして検出する検出工程、
を含む方法。
【０００９】
項Ｂ
被検物質を検出する方法であって、
前記被検物質と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ基板に固定されている捕捉体1と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置する第1接触工程、
前記第1接触工程の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させる第1解離工程、
前記第1解離工程の後、前記被検物質と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ基板に固定されている捕捉体1と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置する第2接触工程、及び
前記第1接触工程における接触後の基板上の標識由来シグナル配置パターンと前記第2接触工程における接触後の基板上の標識由来シグナル配置パターンとを比較し、実質的に同位置のシグナルを、被検物質を示すシグナルとして検出する検出工程、
を含む方法。
【００１０】
項Ｃ
被検物質を検出する装置であって、
反応液を収容する反応部と、前記反応液は、前記被検物質と前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを含み、前記反応部の底部は前記被検物質に対する結合性を有する捕捉体1が固定化された基板であり、
前記捕捉体2に対する外力を付与する外力付与部と、
基板上の標識由来シグナル配置パターンを撮像する撮像部と、
前記被検物質と、前記捕捉体1と、前記捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置するよう前記外力付与部からの外力を調整し、前記接触の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させるよう前記外力付与部からの外力を調整し、且つ
前記接触時及び前記解離時の標識由来シグナル配置パターンを比較し、前記接触時及び前記解離時で実質的に同位置のシグナルを、被検物質を示すシグナルとして判定する
処理部と、
を備える装置。
【００１１】
項Ｄ
被検物質を検出する装置であって、
前記被検物質に対する結合性を有する捕捉体1が底部に固定化された基板を有し、前記被検物質と前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを含む反応液を収容する反応部と、
前記捕捉体2に対する外力を付与する外力付与部と、
基板上の標識由来シグナル配置パターンを撮像する撮像部と、
前記被検物質と、前記捕捉体1と、前記捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置するよう前記外力付与部からの外力を調整し、前記接触の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させるよう前記外力付与部からの外力を調整する制御部と、
前記接触時及び前記解離時の標識由来シグナル配置パターンを比較し、前記接触時及び前記解離時で実質的に同位置のシグナルを、被検物質を示すシグナルとして判定する処理部と、
を備える装置。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、より簡便に且つ非特異的シグナルをより低減した状態で被検物質を検出する方法を提供することができる。さらに、本発明によれば、より簡便に且つ非特異的シグナルをより低減した状態で被検物質を検出できる装置を提供することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】引力の方向の例を示す模式図である。
【図２】標識由来シグナル配置パターンが、ウェルプレート上に形成される、標識由来シグナルが検出されるウェル（陽性ウェル）の配置パターンである場合の一例を示す、模式図である。
【図３】実質的に同位置のシグナルを、座標系による区画に基づいて判定する方法の一例を示す、模式図である。
【図４】実質的に同位置のシグナルを、輝度重心からの所定範囲に基づいて判定する方法の一例を示す、模式図である。
【図５】同位置のシグナルを、陽性ウェル（シグナルが観察されたウェル）のプレート上の位置に基づいて判定する方法の一例を示す、模式図である。
【図６】本発明の検出方法1の実施形態の一例（担体粒子として磁性粒子を用いる場合の例）を示す、模式図である。
【図７】本発明の検出方法1の実施形態の一例（担体粒子として荷電粒子を用いる場合の例）を示す、模式図である。
【図８】本発明の検出装置の一実施形態の構成を示す概略図である。
【図９】図８に示された検出装置のハードウェア構成を示すブロック図である。
【図１０】処理部の動作を示す図である。
【図１１】実施例1の結果（解離工程同士の比較結果）を示す、明視野像である。矢印は輝点を示し、グレー矢印はいずれの解離工程間を比較しても位置が不変の輝点を示し、白色矢印は異なる解離工程間で位置が変化している輝点を示す。
【図１２】実施例1の結果（解離工程同士の比較結果）を示す、輝点数のグラフである。■はサンプル溶液を用いた場合（被検物質 有の場合）を示し、□はバックグラウンド溶液を用いた場合（被検物質 無の場合）を示す。横軸中、解離工程1は、解離工程1の輝点の数を示し、解離工程2は、解離工程1〜2を通じて位置が不変の輝点の数を示し、解離工程3は、解離工程1〜3を通じて位置が不変の輝点の数を示し、解離工程4は、解離工程1〜4を通じて位置が不変の輝点の数を示す。
【図１３】比較例1の結果を示す、明視野像である。矢印は輝点を示す。
【図１４】比較例1の結果を示す、輝点数のグラフである。■はサンプル溶液を用いた場合（被検物質 有の場合）を示し、□はバックグラウンド溶液を用いた場合（被検物質 無の場合）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
1．被検物質を検出する方法1
本発明は、その一態様として、被検物質を検出する方法であって、第1接触工程、第1解離工程、第2接触工程、及び第2解離工程、及び検出工程1を含む方法（本明細書において「本発明の検出方法1」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
【００１５】
1-1．第1接触工程
第1接触工程は、被検物質と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ基板に固定されている捕捉体1と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置する工程である。
【００１６】
被検物質は、本発明の検出方法1の検出対象の物質であり、被検物質に対する結合親和性を有する物質（本明細書において、「結合性物質」と示すこともある）が存在するか、又は結合性物質を製造できる限り、特に限定されない。結合性物質が抗体である場合は、抗原性を有する物質であれば、いかなる物質であっても被検物質となり得る。被検物質の具体例としては、例えば抗体、タンパク質、核酸、生理活性物質、ベシクル、細菌、ウイルス、ポリペプチド、ハプテン、治療薬剤、治療薬剤の代謝物などが挙げられる。
【００１７】
ポリペプチドは、そのアミノ酸残基数は特に制限されず、アミノ酸残基数が比較的多いタンパク質のみならず、一般的にペプチド又はオリゴペプチドと称されるアミノ酸残基数の比較的少ないポリペプチドも包含する。
【００１８】
多糖類は、糖鎖のみからなるもののみならず、他の分子に結合した状態のもの、例えば細胞又はタンパク質の表面に存在する糖鎖、細菌の外膜成分であるリポ多糖等も包含する。
【００１９】
生理活性物質としては、例えば、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子、酵素、サイトカイン、ホルモン、糖鎖、脂質等が挙げられる。
【００２０】
ベシクルは、膜で構成された小胞であれば特に限定されず、内部に液相を含まないもの、内部に液相を含むもの、内部に液相と油相の混合相を含むもの、内部により微小な小胞を含むもの等を包含する。ベシクルとしては、例えば、エクソソーム、マイクロベシクル、アポトーシス小体等の細胞外小胞や、リポソームなどの人工のベシクル等が挙げられる。
【００２１】
被検物質は、1種のみであってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００２２】
捕捉体1は、被検物質に対する結合性を有し且つ基板に固定されているものである限り特に制限されず、単一の分子からなるものであってもよいし、複数の分子からなる複合体であってもよい。捕捉体1は、被検物質に対する特異的な結合性を有することが好ましい。
【００２３】
「結合性を有する」とは、被検物質と可逆的に又は不可逆的に結合可能であることを意味する。結合させる力は、特に制限されず、例えば水素結合、静電気力、ファンデルワールス力、疎水結合、共有結合、配位結合等が挙げられる。結合性の程度は、特に制限されないが、例えば被検物質と捕捉体1との解離定数が、例えば1×10-4M〜1×10-16M、1×10-6M〜1×10-14M、1×10-8M〜1×10-13M、1×10-9M〜1×10-12Mである。
【００２４】
捕捉体1が結合する部位は、後述の捕捉体2が結合する被検物質の部位と、同じ部位であってもよいし、異なる部位（重複する場合、及び重複しない場合を包含する）であってもよい。両者の部位は、異なる部位であることが好ましく、重複しない異なる部位であることがより好ましい。例えば、捕捉体1及び捕捉体2が抗体そのもの又は抗体を含み、且つ被検物質が抗原である場合、捕捉体1が結合する被検物質のエピトープと、捕捉体2が結合する被検物質のエピトープとは異なっていることが好ましい。また、別の例として、捕捉体1及び捕捉体2が核酸そのもの又は核酸を含み、且つ被検物質も核酸である場合、捕捉体1が結合する被検物質の塩基配列と、捕捉体2が結合する被検物質の塩基配列とは異なっていることが好ましい。
【００２５】
なお、本明細書において、「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体等の免疫グロブリンのみならず、その可変領域を有する断片、例えばFabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fvフラグメント、ミニボディ、scFv‐Fc、scFv、ディアボディ、トリアボディ、及びテトラボディも包含する。
【００２６】
また、本明細書において、「核酸」には、DNA、RNAのみならず、これらに、次に例示するように、公知の化学修飾が施されたものも包含する。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の2位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2´-O-Me）、CH2CH2OCH3（2´-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これに限定されない。また、ヌクレオチドの糖部の2´酸素と4´炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したものであるBNA（LNA）等もまた、好ましく用いられ得る。
【００２７】
捕捉体1は、好ましくは、単体で被検物質に対する結合性を有する、「結合性物質1」を含む。結合性物質1は、被検物質の種類に応じて異なり、同じ被検物質であっても種々の態様であり得る。例えば、被検物質が抗原性を有する物質である場合であれば結合性物質1としては該物質に対する抗体が挙げられる。被検物質が抗体である場合は、結合性物質1として抗原を用いることができる。被検物質が核酸である場合であれば結合性物質1としては該核酸に対して相補鎖形成可能な核酸が挙げられる。被検物質が受容体又はリガンドである場合であれば結合性物質1としてはリガンド又は受容体が挙げられる。したがって、結合性物質1の具体例としては、抗体、抗原、核酸、受容体、受容体に結合するリガンド、アプタマー等が挙げられる。また、その他にも、特定の分子に結合性を有する低分子化合物（例えばビオチン等）も、結合性物質1として採用できる。結合性物質1は、1種のみであってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００２８】
捕捉体1は、結合性物質1以外に、基板への固定に使用される物質を含むことができる。このような物質としては、例えばタンパク質、抗体、抗原、核酸、受容体、受容体に結合するリガンド、アプタマー、低分子化合物等が挙げられる。該物質は、1種のみであってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００２９】
基板は、捕捉体1を固定可能なものである限り特に制限されない。基板としては、例えばポリスチレン等のプラスチック、ガラス、ニトロセルロースなどを主成分として含む基板が挙げられる。基板の形態は、被検物質、捕捉体1、及び捕捉体2が相互に接触する場（＝液体）を保持できる形態である限り特に制限されない。基板の具体例としては、ウェルプレートの各ウェルの底部、シャーレの底部等が挙げられる。ウェルのサイズは、特に制限されず、被検物質、捕捉体1、及び捕捉体2の複合体が1つ又は数個入る程度のサイズから、通常のマイクロプレートのサイズまで包含する。
【００３０】
「基板に固定されている」とは、基板に直接又は間接的に結合することにより、固定されていることを意味する。捕捉体1の基板への固定は、定法に従って又は準じて行うことができる。固定の具体的態様としては、特に制限されないが、例えば共有結合を介した固定、アビジンまたはストレプトアビジンとビオチンとの結合を介した固定、物理吸着による固定等が挙げられる。また、基板は、通常はBSA等によりブロッキングされているので、捕捉体1は、このブロッキング剤を介して基板に個体されていてもよい。
【００３１】
捕捉体1は、1種のみであってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００３２】
捕捉体2は、被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含むものである限り特に制限されず、単一の分子からなるものであってもよいし、複数の分子からなる複合体であってもよい。捕捉体2は、被検物質に対する特異的な結合性を有することが好ましい。
【００３３】
「結合性を有する」については、捕捉体1に関する上記説明と同様である。
【００３４】
捕捉体2は、好ましくは、単体で被検物質に対する結合親和性を有する、「結合性物質2」を含む。結合性物質2については、結合性物質1に関する上記説明と同様である。
【００３５】
標識は、一定の手段により、捕捉体2の1つ1つを認識できるように可視化ならしめるものである限り特に制限されない。標識としては、例えば、顕微鏡で拡大することにより可視化可能な程度の大きさを有する担体粒子、自身がシグナル（例えば、蛍光等の光）を発する物質、他の物質と反応することによりシグナルを発する物質、自身がシグナルを発する物質、他の物質と反応することによりシグナルを発する物質（たとえば、酵素など）と結合可能な物質等が挙げられる。
【００３６】
担体粒子の平均粒子径は特に限定されないが、好ましくは、顕微鏡で拡大することにより可視化可能な程度の大きさである。例えば1 nm〜10μm、好ましくは10 nm〜1μm、より好ましくは50 nm〜500 nmである。担体粒子の平均粒子径は、レーザー回折・散乱法による粒度分布測定装置により測定される体積基準のメジアン径である。このような粒度分布測定装置としては、日機装株式会社製「マイクロトラックMT3000II」等が挙げられる。本明細書において、「粒子径」とは、直径を意味する。
【００３７】
担体粒子の材質としては、特に限定されず、例えば金、銀、銅、鉄、アルミ、ニッケル、マンガン、チタン、これらの酸化物等の金属製粒子；  ポリスチレン、ラテックス等の樹脂製粒子；  シリカ粒子等が挙げられる。担体粒子の形状としては、特に制限されないが、例えば球体、直方体、立方体、三角錐等、又はこれらに近い形状が挙げられる。担体粒子は、好ましくは、他の物質（例えば、結合性物質2等）の結合をより容易に及び／又はより強固にするための物質を表面に有する。このような物質としては、例えば、エポキシ基、アミノ基、カルボキシ基、アジド基等の反応性基を有する物質；  アビジン、プロテインA、プロテインB等の、他の分子に親和性を有する物質等が挙げられる。担体粒子は、後述の外力の付与がより容易になるという観点から、磁性粒子、荷電粒子等であることが好ましい。荷電粒子とは、電荷を帯びた担体粒子である。粒子の材質としては、上記した材質のうち電荷を付与できるものであれば特に限定されない。また、担体粒子は、下記蛍光物質をさらに含むものであってもよい。担体粒子は、1種のみであってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００３８】
蛍光物質としては、特に制限されず、例えばフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、フィコエリスリン、６-FAM（商標）、Cy（登録商標）3、Cy（登録商標）5、Alexa Fluor（登録商標）のシリーズ等が挙げられる。蛍光物質は、1種のみであってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００３９】
酵素としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ等が挙げられるが、特に限定されない。酵素は、1種のみであってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００４０】
標識は、1種のみであってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。たとえば、蛍光物質を含む担体粒子、酵素を固定した担体粒子などが用いられ得る。
【００４１】
捕捉体2は、標識として、或いは標識とは別に、上記したような担体粒子を含むことが好ましい。該担体粒子としても、上記と同様に、後述の外力の付与がより容易になるという観点から、好ましくは、磁性粒子、荷電粒子等が挙げられる。
【００４２】
捕捉体2の構造は、特に制限されない。例えば、捕捉体2が結合性分子2及び担体粒子を含む場合であれば、例えば担体粒子の表面に1つ又は複数の結合性分子2が直接又は間接的に結合してなる構造が挙げられる。
【００４３】
被検物質、捕捉体1、及び捕捉体2との接触は、通常溶液中で行われる。たとえば、被検物質を含む試料と、捕捉体１を含む試薬とを、捕捉体２を固定化した基板上に添加することにより行うことができる。溶液は、通常は水を主な溶媒とする液である。液は、例えば緩衝液であることができる。緩衝液としては、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝液、HEPES緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液等が挙げられる。液には、被検物質1と捕捉体1及び2との結合を著しく阻害しない限りにおいて、各種添加剤が含まれていてもよい。
【００４４】
「液中で接触」させる態様は、第1接触工程が1回目の接触工程である場合であれば、例えば、捕捉体1と被検物質とを最初に接触させた後に、捕捉体1に結合した被検物質と捕捉体2を接触させるように順次接触させる態様であってもよいし、捕捉体1、被検物質、及び捕捉体2を同時に接触させる態様であってもよい。前者（順次接触態様）の具体例としては、捕捉体1が固定されているウェルに、被検物質を含む液を添加して被検物質の少なくとも一部が捕捉体1に結合した後、捕捉体2を含む液を添加するという態様が挙げられる。また、後者（同時接触態様）の具体例としては、捕捉体1が固定されているウェルに、被検物質及び捕捉体2を含む液（該液中、被検物質と捕捉体2とは、結合していない状態であってもよいし、少なくとも一部が結合した状態であってもよい）を添加するという態様が挙げられる。順次接触態様及び同時接触態様のいずれにおいても、接触時間は十分にあること、例えば10分間〜3時間、好ましくは30分間〜2時間程度であることが望ましい。
【００４５】
「液中で接触」させる態様は、第1接触工程が2回目以降の接触工程である場合であれば、例えば、直前の解離工程において捕捉体2を含む物質の一部を基板上から解離させている要因（例えば、外力）を除去する或いは弱めるという態様が挙げられる。つまり、接触工程においては、解離工程で付与される外力よりも弱い外力が付与された状態、又は外力が付与されていない状態である。この場合、外力等を除去する或いは弱める時間は、例えば1〜30分間、好ましくは2〜10分間程度である。
【００４６】
「捕捉体2を基板上に配置」とは、捕捉体2が基板上に直接、及び／又は間接的に（例えば、捕捉体1、被検物質、又はこれらの複合体を介して）結合していることを意味する。つまり、捕捉体2が被検物質への特異的結合に基づいて基板上に配置される場合のみならず、捕捉体2が非特異的結合（又は吸着）に基づいて基板上に配置される場合も包含する。
【００４７】
1-2．第1解離工程
第1解離工程は、前記第1接触工程の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させる工程である。
【００４８】
本工程で基板上から解離する「捕捉体2を含む物質」は、捕捉体2のみであってもよいし、捕捉体2と他の物質との複合体であってもよい。該複合体としては、例えば、捕捉体2と、捕捉体2と非特異的結合をしている物質との複合体等が挙げられる。
【００４９】
捕捉体2を含む物質の「一部」とは、基板上に存在する複数の「捕捉体2を含む物質」の内の一部の捕捉体2という意味である。捕捉体2を含む物質を全て解離してしまうと、第2接触工程を経ても、捕捉体2全ての位置が変わってしまい、後述の検出工程において、同位置のシグナルが検出できない。
【００５０】
解離方法は、捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させることができる方法である限り特に制限されない。解離方法としては、好ましくは、基板上に配置された捕捉体2に対する外力の強さを調整する、又は該外力を付与する方法が挙げられる。ここで、外力とは、基板に対して溶液側に捕捉体２を引きつける力である。例えば基板の底部に捕捉体１が固定化されており、基板上に溶液が存在する場合、捕捉体2を、基板の上側に引っ張る外力（引力）が付与される。これにより、捕捉体2を含む物質を基板表面から解離することができる。付与される力の方向は、基板表面から捕捉体２が解離して溶液中に遊離されれば特に限定されない。図１に例示するように、引力の方向は、基板と水平方向を0度とした場合に、捕捉体2が存在している側へ向かって、例えば0度より大きく180度より小さい方向であれば特に制限されない。該方向は、好ましくは30〜150度の方向、より好ましくは60〜120度の方向、さらに好ましくは80〜100度の方向である。
【００５１】
外力の種類は、特に制限されず、捕捉体2の種類に関わらず、或いは捕捉体2の種類に応じて、適切な外力を選択することができる。外力としては、例えば、磁力、クーロン力、遠心力、流体力、光、音波等が挙げられ、好ましくは磁力、クーロン力、音波等が挙げられる。捕捉体2の種類と外力の組合せとしては、例えば捕捉体2が磁性粒子を含む場合であれば、磁力を採用することが好ましく、例えば捕捉体2が荷電粒子を含む場合であれば、クーロン力を採用することが好ましい。外力は、1種のみであってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００５２】
外力の強さの調整は、比較的弱い外力が既に付与されている状態からの調整であれば、その外力を強めることにより行うことができ、外力が付与されていない状態からの調整であれば、一定以上の外力を付与することにより行うことができる。外力の強さの調整方法の具体例として、磁力の場合は、例えば磁石を基板に近づける方法、基板上側に固定された磁石の磁力を調整する方法が挙げられ、クーロン力の場合は、例えば基板上側及び下側に配置された電極の電位を調整する方法が挙げられる。なお、クーロン力の場合、印加する電界は一方向であってもよいし交流であってもよい。交流の場合（Dielectrophoresis, DEP）は粒子が電荷をもっていない非荷電粒子であってもよい。
【００５３】
磁石を用いる場合、磁石の強さは特に制限されず、捕捉体2及び被検物質の種類や結合性の程度等に応じて、適切な磁力の磁石を採用することができる。一例として、磁石としては、磁束密度が、例えば1mT〜1000T、好ましくは10mT〜100T、より好ましくは100mT〜10T、さらに好ましくは200mT〜1Tの磁石が挙げられる。
【００５４】
解離させるための外力の付与の時間は、捕捉体2を含む物質の一部が基板上から解離する程度の時間である限り特に制限されないが、例えば5秒間〜5分間、好ましくは10秒間〜3分間、より好ましくは20秒間〜1分間である。
【００５５】
「基板上から解離」とは、捕捉体2を含む物質が基板上に固定している結合が解離することを意味する。「基板上から解離して液中に遊離させる」とは、「捕捉体2を含む物質」が解離後に基板上に容易に再結合できるような状態ではないことを意味する。具体的には、例えば、解離を起こした外力を付与し続けることにより、捕捉体2を含む物質が基板上に再結合することを防ぐことができる。
【００５６】
遊離した「捕捉体2を含む物質」は、基板からできるだけ離れた位置に存在していることが好ましい。基板付近に「捕捉体2を含む物質」が存在していると、後述の検出工程において基板上のシグナルパターンを取得するべく、例えば基板付近に焦点を合わせた際に、遊離している「捕捉体2を含む物質」由来のシグナルも検出される可能性があるので、好ましくない。
【００５７】
捕捉体2を含む物質の一部が液中に遊離した後に、基板上のシグナル配置パターンを取得する。このパターンは、後述の検出工程1で使用される。
【００５８】
「シグナル」は、捕捉体２の標識に由来する。該シグナルは、標識の種類に対応した光学的シグナルである。標識が一定程度の大きさを有する担体粒子である場合は、例えば拡大像（明視野像又は暗視野像のいずれでもよい）で観察される点である。標識が蛍光物質である場合は、例えば拡大像で観察される蛍光輝点である。標識が酵素である場合は、例えば該酵素の基質を添加後に拡大像で観察される発光や蛍光などの輝点である。
【００５９】
「シグナル配置パターン」とは、それぞれのシグナルが基板上のどこに位置するかについての情報を含む。基板が多数の微小区画を有する場合は、どの区画がシグナルを生じるかについての情報を含む。図2に、複数のマイクロウェルを有するプレートを用いた場合のシグナル配置パターンの例を示す。図中、黒丸で示されるウェルがシグナルが検出された「陽性ウェル」であり、白丸で示されるウェルがシグナルが検出されない「陰性ウェル」である。この陽性ウェルの配置パターンが、この例におけるシグナル配置パターンである。
【００６０】
標識由来シグナル配置パターンは、標識由来のシグナルが観察可能な条件下で、適当な撮像手段により画像（静止画）及び／又は動画を撮像することにより取得することができる。撮像手段としては、静止画又は動画を撮像可能なものである限り特に制限されず、例えばＣＣＤ、ＣＭＯＳ等が挙げられる。
【００６１】
別の実施形態では、画像や動画を撮影せず、シグナル配置パターンとしてシグナルの位置情報のみを取得してもよい。たとえば、シグナル配置パターンは基板上のシグナルの個数および各シグナルの位置（たとえば座標情報）を含む情報であってもよい。
【００６２】
1-3．第2接触工程
第2接触工程は、前記第1解離工程の後、前記被検物質と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ基板に固定されている捕捉体1と、前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置する工程である。
【００６３】
以下に記載する内容以外、第2接触工程に関する説明は、第1接触工程の説明と同様である。
【００６４】
「液中で接触」させる態様としては、例えば、直前の解離工程において捕捉体2を含む物質の一部を基板上から解離させている要因（例えば、外力）を除去する或いは弱めるという態様が挙げられる。この場合、外力等を除去する或いは弱める時間は、例えば1〜30分間、好ましくは2〜10分間程度である。
【００６５】
1-4．第2解離工程
第2解離工程は、前記第2接触工程の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させる工程である。
【００６６】
第2解離工程に関する説明は、第1解離工程の説明と同様である。
【００６７】
1-5．他の接触工程及び解離工程のセット
本発明の検出方法1は、第1接触工程の前に、接触工程および解離工程を含んでいてもよい。また、第1解離工程と第2接触工程との間に１又は複数の接触工程および解離工程を含んでいてもよい。また、第2解離工程と検出工程との間に１又は複数の接触工程および解離工程を含んでいてもよい。
【００６８】
1-6．検出工程1
本発明の検出方法1における検出工程（本明細書において、「検出工程1」と示すこともある。）は、前記第1解離工程における解離後の基板上の標識由来シグナル配置パターンと前記第2解離工程における解離後の基板上の標識由来シグナル配置パターンとを比較し、実質的に同位置のシグナルを、特異シグナルとして検出する工程である。
【００６９】
特異シグナルの検出は、特に制限されず、目視で行ってもよいし、CPUによる処理を介して行ってもよい。
【００７０】
画像（静止画）に基づいて比較する場合、検出工程1は、より具体的には、例えば以下のように実施することができる。
【００７１】
前記第1解離工程における解離後のシグナル配置パターンを示す画像P、及び前記第2解離工程における解離後のシグナル配置パターンを示す画像Qを取得する。
【００７２】
前記画像P内の前記標識由来シグナルの位置と前記画像Q内の前記標識由来シグナルの位置とを比較して、前記画像Q内の前記標識由来シグナルの内、前記画像P内の前記標識由来シグナルと実質的に同位置の前記標識由来シグナルを、特異すシグナルとして検出する。
【００７３】
実質的に同位置のシグナルの判定は、例えば次のように行うこともできる。一方の標識由来シグナル配置パターンを示す画像（画像1）と、他方の標識由来シグナル配置パターンを示す画像1と同一視野の画像（画像2）とを、座標系に基づいて複数の区画に分割し、画像1のあるシグナルと画像2のあるシグナルが同じ区画内に存在するか否かを比較する。その結果、両者のシグナルが同じ区画内に存在すれば、両者は実質的に同位置のシグナルであると判定することができる。例えば、図３に示される例であれば、シグナル1-1とシグナル2-1とは実質的に同位置のシグナルであると判定することができるが、シグナル1-2とシグナル2-2及びシグナル2-3とは実質的に同位置のシグナルではないと判定される。
【００７４】
また、該判定は、別の例として、次のように行うこともできる。一方の標識由来シグナル配置パターンを示す画像（画像A）において、シグナルの輝度分布に基づいて輝度重心を決定する。そして、他方の標識由来シグナル配置パターンを示す画像1と同一視野の画像（画像B）におけるシグナルが、画像A中のシグナルの該輝度重心から所定範囲内に存在するか否かを比較する。その結果、画像Bにおけるシグナルが、画像A中のシグナルの該輝度重心から所定範囲内に存在すれば、両者は実質的に同位置のシグナルであると判定することができる。例えば、図４に示される例であれば、シグナルAとシグナルB-1とは実質的に同位置のシグナルであると判定することができるが、シグナルAとシグナルB-2とは実質的に同位置のシグナルではないとは判定される。
【００７５】
捕捉体１および２と被検物質の様に、分子の複合体は、複合体の一部（分子間結合部分など）が回転すること等により、同じ複合体であっても撮像する度に位置が僅かに変化することがある。このため、図3や図4で示したように、画像１や画像Ａで検出されたシグナルと全く同位置ではなく、その近傍のシグナルも同位置のシグナルとして判定することが好ましい。
【００７６】
また、マイクロウェルを用いる場合、同位置の陽性ウェルを、同位置のシグナルとして判定することができる。
例えば、図５に示される例であれば、第1解離工程後のウェルプレート及び第2解離工程後のウェルプレートにおける2列B行の陽性ウェルを、同位置のシグナルとして判定することができる。
【００７７】
前記第1解離工程における解離後の基板上の標識由来シグナル配置パターンと前記第2解離工程における解離後の基板上の標識由来シグナル配置パターンとで実質的に同位置のシグナルは、特異シグナルとして検出（或いは、判定）することができる。本発明の検出方法1が、接触−解離を3回以上繰り返す場合、2以上の解離工程において同位置のシグナルを、被検物質を示すシグナル（特異シグナル）と判定することができる。別の実施形態においては、接触−解離を3回以上繰り返す場合、すべての解離工程において同位置のシグナルを、特異シグナルと判定してもよい。
【００７８】
一方、特異シグナル以外のシグナルを、非特異シグナルと検出することができる。
【００７９】
また、動画に基づいて比較する場合、検出工程1は、より具体的には、例えば以下のようにして特異シグナルの検出を行うことができる。
【００８０】
少なくとも前記第1解離工程及び前記第2解離工程における基板のシグナル配置パターンを撮像する。
【００８１】
前記動画内で、前記第1解離工程から前記第2解離工程まで実質的に同位置であり続けるシグナルを、特異シグナルとして検出する工程である。この場合の「実質的に同位置」の判定も、上記した例に従って又は準じて行うことができる。
【００８２】
さらに、特異シグナルの数又は強度を積算し、得られた積算値を、被検物質の量とすることもできる。また、この際、検量線に基づいて濃度判定することもできる。
【００８３】
また、全体のシグナル（特異シグナルおよび非特異シグナルの合計）のうちの特異シグナルの割合に基づき、被検物質の含有量の指標としてもよい。
【００８４】
1-7．本発明の検出方法1の実施形態の例
本発明の検出方法1の実施形態の一例を図６を用いて、本発明の検出方法1の原理を説明する。図６は捕捉体2を有する担体粒子として磁性粒子を用いた場合である。
【００８５】
第1接触工程において、基板に固定された捕捉体1と、抗体及び磁性粒子からなる捕捉体2と被検物質とを接触させる。これにより、基板上に、捕捉体2が、被検物質への特異的結合を介して配置される。一方で、一部の捕捉体２は、被検物質以外の物質（基板表面や捕捉体１など）へ非特異的に結合する。
【００８６】
続いて、第1解離工程において、基板の上側に磁石を配置することにより捕捉体2（磁性粒子を含む）に対して引力を付与する。これにより、比較的弱い結合（通常は、被検物質以外の物質への非特異的結合）により基板上に配置された捕捉体2が、基板上から解離して液中に遊離する。この時点で、基板付近に焦点を当てて、捕捉体2の標識に由来するシグナル（図６の各工程の画像中の黒点）の配置パターンを撮像する。
【００８７】
続いて、第2接触工程において、基板の上側から磁石を除くことにより、捕捉体2（磁性粒子を含む）に対する引力を除去する。これにより、遊離していた捕捉体2は、再度基板上の物質等に接触可能になる。捕捉体2は遊離中に移動（例えば、ブラウン運動等により移動）していると考えられ、一部の捕捉体２が非特異的に結合する場合は、確率的に第1接触工程時の基板上の位置とは異なる位置に配置される。
【００８８】
続いて、第2解離工程において、再度、基板の上側に磁石を配置することにより捕捉体2（磁性粒子を含む）に対して引力を付与する。これにより、比較的弱い結合（通常は、被検物質以外の物質への非特異的結合）により基板上に配置された捕捉体2が、基板上から解離して液中に遊離する。この時点で、基板付近に焦点を当てて、捕捉体2の標識に由来するシグナル（図６の各工程の画像中の黒点）の配置パターンを撮像する。
【００８９】
第1解離工程で遊離した捕捉体2は、比較的弱い結合、すなわち非特異的結合により基板上に配置されていたと考えられる。また、第1解離工程で遊離しなかったとしても、第2解離工程で遊離した捕捉体2も、比較的弱い結合、すなわち非特異的結合により基板上に配置されていたと考えられる。よって、第1解離工程及び第2解離工程の両方で遊離しなかった捕捉体2の標識に由来するシグナル、すなわち、第1解離工程と第2解離工程とで実質的に同位置のシグナルを、被検物質を示すシグナルとして検出することができる。
【００９０】
本発明の検出方法1の実施形態の別の例として図７を示す。図７は捕捉体2が含む担体粒子として荷電粒子を用いた場合である。本実施形態においては、基板の上側及び下側に電極を設ける。上下の電極は、少なくともその一部において、捕捉体2を含む液に接している。解離工程において、例えば荷電粒子が正の電荷を有する粒子である場合は、電極に電位をかけることにより、基板の上側の電極を負電位に、基板下側の電極を正電位に設定する。これにより、捕捉体2に対して、基板の上側に向かわせる引力及び斥力を付与する。一方、荷電粒子が負の電位を有する粒子である場合は、２つの電極の正負を逆にすることにより、捕捉体2に対して、基板の上側に向かわせる引力及び斥力を付与する。接触工程においては、電極への電位付与を停止することにより、遊離していた捕捉体2は、再度基板上の物質等に接触可能になる。上記以外については、図７の説明は図６の説明と同様である。なお、印加する電界は一方向であってもよいし交流であってもよい。交流の場合（Dielectrophoresis, DEP）は、担体粒子として荷電粒子を採用する図７の実施形態とは異なり、担体粒子として電荷をもっていない非荷電粒子を採用する実施形態であってもよい。
【００９１】
2．被検物質を検出する方法2
本発明は、その一態様として、被検物質を検出する方法であって、第1接触工程、第1解離工程、第2接触工程、及び検出工程2を含む方法（本明細書において「本発明の検出方法2」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
【００９２】
以下に記載する内容以外、本発明の検出方法2に関する説明は、本発明の検出方法1の説明と同様である。
【００９３】
第1接触工程及び第2接触工程において、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置した後、基板上の標識由来シグナル配置パターンを取得する。このパターンは、後述の検出工程2で使用される。本発明の検出方法2においては、本発明の検出方法1と異なり、第1解離工程における配置パターンの取得は必須ではない。
【００９４】
本発明の検出方法2における検出工程（本明細書において、「検出工程2」と示すこともある。）は、前記第1接触工程における接触後の基板上の標識由来シグナル配置パターンと前記第2接触工程における接触後の基板上の標識由来シグナル配置パターンとを比較し、実質的に同位置のシグナルを、被検物質を示すシグナルとして検出する工程である。配置パターンの比較、実質的に同位置のシグナルの判定については、検出方法1と同様の方法で行うことができる。
【００９５】
本発明の検出方法2の原理は次の通りである。第1解離工程で遊離した捕捉体2は、比較的弱い結合、すなわち非特異的結合により基板上に配置されていたと考えられる。また、第1解離工程で遊離した捕捉体2は、第2接触工程において再度基板上の物質等に接触可能になるが、捕捉体2は遊離中に移動（例えば、ブラウン運動等により移動）していると考えられ、このため第1接触工程時の基板上の位置とは異なる位置に、特異的結合又は非特異的結合を介して配置される。よって、第1解離工程で遊離しなかった捕捉体2の標識に由来するシグナル、すなわち、第1接触工程と第2接触工程とで実質的に同位置のシグナルを、被検物質を示すシグナルとして検出することができる。
【００９６】
3．被検物質を検出する装置
本発明は、その一態様において、被検物質を検出する装置であって、反応部と、外力付与部と、撮像部と、処理部と、を備える装置（本明細書において、「本発明の検出装置」と示すこともある。）に関する。本発明の検出方法1及び2は、例えば、本発明の検出装置によって行うことができる。以下に、本発明の検出装置について添付の図面を参照しながら説明するが、本発明の検出装置は、かかる実施形態のみに限定されるものではない。なお、本発明の検出装置において、本発明の検出方法1及び2について既に説明されている用語については、説明を省略するが、本発明の検出方法1及び2における各用語についての説明は、本発明の検出装置にも援用される。
【００９７】
3-1．装置の構成
図８は、本発明の検出装置の一実施形態（検出装置1）の構成を示す概略図である。
【００９８】
図８に示された検出装置1は、反応部、外力付与部、及び撮像部を備える測定装置2を含んでいる。反応部は、前記被検物質に対する結合性を有する捕捉体1が底部に固定化された基板を有し、前記被検物質と前記被検物質に対する結合性を有し且つ標識を含む捕捉体2とを含む反応液を収容する。外力付与部は、前記捕捉体2に対する外力を付与する。撮像部は、基板上の標識由来シグナル配置パターンを撮像する。標識由来シグナル配置パターンを示す画像等の光学的情報は、コンピュータシステム3に送信される。
【００９９】
測定装置2としては、例えば、外力付与部及び撮像部を備える顕微鏡を用いることができる。この場合、顕微鏡のステージに設置するウェルプレートの各ウェル、シャーレ等が反応部となる。
【０１００】
顕微鏡としては、標識由来シグナルの1つ1つを認識できる程度の分解能を有する限り特に制限されず、標識の種類及び該標識由来シグナルの検出方法に応じて、適切な顕微鏡を採用することができる。顕微鏡の具体例としては、実体顕微鏡、蛍光顕微鏡、レータ−走査顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡等の光学顕微鏡；  透過型電子顕微鏡、走査型電子顕微鏡等の電子顕微鏡；  原子力間顕微鏡、走査型トンネル顕微鏡、走査型近接場光顕微鏡等の走査型プローブ顕微鏡；  X線顕微鏡；  超音波顕微鏡；  等が挙げられる。
【０１０１】
撮像部は、顕微鏡の観察像を撮像できる箇所、例えば接眼レンズ部、写真直筒、Cマウント等に配置されている。撮像部としては、静止画又は動画を撮像可能なものである限り特に制限されず、例えばデジタルカメラ、アナログカメラ、デジタルビデオカメラ、アナログビデオカメラ等が挙げられる。
【０１０２】
外力付与部は、外力により捕捉体2を基板上から解離できる部位に配置される。その態様は、外力の調整方法によって、適切な態様を適宜選択することができる。例えば、磁石と基板とが近づくことにより外力が調整される場合であれば、基板上側に、必要に応じて稼働可能な（例えば、垂直方向及び／又は水平方向に稼働可能な）磁石が配置される。別の例として、基板上側に固定された磁石の磁力が調整されることにより外力が調整される場合であれば、基板上側に、電流により磁力を調整可能な磁石が配置される。別の例として、電極の電位が調整されることにより外力が調整される場合であれば、基板上側及び下側に、電流により電位を調整可能な電極が、補足体2を含む液に接触可能な状態で配置される。
【０１０３】
図８に示された検出装置1は、測定装置2と直接又はネットワークを介して接続された、処理部を備えるコンピュータシステム3を含んでいる。
【０１０４】
処理部は、
前記被検物質と、前記捕捉体1と、前記捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置するよう前記外力付与部からの外力を調整し、前記接触の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させるよう前記外力付与部からの外力を調整し、且つ
前記接触時及び前記解離時の標識由来シグナル配置パターンを比較し、前記接触時及び前記解離時で実質的に同位置のシグナルを、被検物質を示すシグナルとして判定する。
【０１０５】
コンピュータシステム3は、コンピュータ本体3aと、入力デバイス3bと、検体情報、結果などを表示する表示部3cとを含む。コンピュータシステム3は、測定装置2から、標識由来シグナル配置パターンが示されている画像等の光学的情報を受信する。そして、コンピュータシステム3のプロセッサは、前記光学的情報に基づいて、被検物質を示すシグナルを判定するプログラムを実行する。
【０１０６】
図９は、図８に示された検出装置のハードウェア構成を示すブロック図である。
【０１０７】
図９に示されるように、コンピュータ本体3aは、処理部（CPU（Central  Processing  Unit））30と、ROM（Read  Only  Memory）31と、RAM（Random  Access  Memory）32と、ハードディスク33と、入出力インターフェイス34と、読出装置35と、通信インターフェイス36と、画像出力インターフェイス37とを備えている。処理部（CPU）30、ROM31、RAM32、ハードディスク33、入出力インターフェイス34、読出装置35、通信インターフェイス36及び画像出力インターフェイス37は、バス38によってデータ通信可能に接続されている。
【０１０８】
処理部（CPU）30は、ROM31に記憶されているコンピュータプログラム及びRAM32にロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。処理部（CPU）30がアプリケーションプログラムを実行することにより、被検物質を示すシグナルの判定装置としての端末として機能する。
【０１０９】
ROM31は、マスクROM、PROM、EPROM、EEPROMなどによって構成されている。ROM31には、処理部（CPU）30によって実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータが記録されている。
【０１１０】
RAM32は、SRAM、DRAMなどによって構成されている。RAM32は、ROM31及びハードディスク33に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。RAM32はまた、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、処理部（CPU）30の作業領域として利用される。
【０１１１】
ハードディスク33は、処理部（CPU）30に実行させるためのオペレーティングシステム、アプリケーションプログラム（被検物質を示すシグナルの判定のためのコンピュータプログラム）などのコンピュータプログラム及び当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。
【０１１２】
読出装置35は、フレキシブルディスクドライブ、CD−ROMドライブ、DVD−ROMドライブなどによって構成されている。読出装置35は、可搬型記録媒体40に記録されたコンピュータプログラム又はデータを読み出すことができる。
【０１１３】
入出力インターフェイス34は、例えば、USB、IEEE1394、RS−232Cなどのシリアルインターフェイスと、SCSI、IDE、IEEE1284などのパラレルインターフェイスと、D／A変換器、A／D変換器などからなるアナログインターフェイスとから構成されている。入出力インターフェイス34には、キーボード、マウスなどの入力デバイス3bが接続されている。操作者は、当該入力デバイス3bを使用することにより、コンピュータ本体3aにデータを入力することが可能である。
【０１１４】
通信インターフェイス36は、例えば、Ethernet（登録商標）インターフェイスなどである。コンピュータシステム3は、通信インターフェイス36により、プリンタへの印刷データの送信が可能である。
【０１１５】
画像出力インターフェイス37は、LCD、CRTなどで構成される表示部3cに接続されている。これにより、表示部3cは、処理部（CPU）30から与えられた画像データに応じた映像信号を出力することができる。表示部3cは、入力された映像信号にしたがって画像（画面）を表示する。
【０１１６】
3-2．装置の動作
次に図１０を用いて、本発明の検出装置の動作を説明する。本発明の検出装置の動作は、コンピュータシステム3の処理部（CPU）30が制御する。
【０１１７】
初めに、処理部30は、前記被検物質と、前記捕捉体1と、前記捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置するよう前記外力付与部からの外力を調整し、前記接触の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させるよう前記外力付与部からの外力を調整する。この接触及び解離からなるセットは、必要に応じて複数回行われる。
【０１１８】
次に、処理部30は、検査者が入力デバイス3bから行う、コンピュータ本体3aに対する、測定装置2によって生成された標識由来シグナル配置パターンを示す画像等の光学的情報の取得を開始するための入力を受け付ける（ステップS0）。
【０１１９】
続いて、処理部30は、測定装置2によって生成された標識由来シグナル配置パターンを示す画像等の光学的情報を取得する（ステップS1）。この際、2種の標識由来シグナル配置パターン、具体的には、第1解離工程の配置パターン及び第2解離工程の配置パターン、又は第1接触工程及び第2接触工程の配置パターンが取得されるが、これらは同時に取得されてもよいし、別々に取得されてもよい。
【０１２０】
続いて、処理部30は、ステップS1で取得された2種の標識由来シグナル配置パターンを比較する（ステップS2）。具体的には、2種の標識由来シグナル配置パターン間で、それぞれのシグナルの位置を比較する。比較した結果、2種の標識由来シグナル配置パターンで、実質的に同位置のシグナルは、被検物質を示すシグナルとして判定し（ステップS3）、実質的に同位置ではないシグナルは、被検物質を示さないシグナルとして判定する（ステップS4）。
【０１２１】
この比較及び判定のより具体的な態様は、例えば次のとおりである。一方の標識由来シグナル配置パターンを示す画像（画像1）と、他方の標識由来シグナル配置パターンを示す画像1と同一視野の画像（画像2）とを、座標系に基づいて複数の区画に分割し、画像1のあるシグナルと画像2のあるシグナルが同じ区画内に存在するか否かを比較する。その結果、両者のシグナルが同じ区画内に存在すれば、両者は実質的に同位置のシグナルであると判定することができる。
【０１２２】
この比較及び判定のより具体的な態様の別の例は、次のとおりである。一方の標識由来シグナル配置パターンを示す画像（画像A）において、シグナルの輝度分布に基づいて輝度重心を決定する。そして、他方の標識由来シグナル配置パターンを示す画像1と同一視野の画像（画像B）におけるシグナルが、画像A中のシグナルの該輝度重心から所定範囲内に存在するか否かを比較する。その結果、画像Bにおけるシグナルが、画像A中のシグナルの該輝度重心から所定範囲内に存在すれば、両者は実質的に同位置のシグナルであると判定することができる。
【０１２３】
この比較及び判定のより具体的な態様の別の例は、次のとおりである。この例は、被検物質、捕捉体1、及び捕捉体2の複合体が1つ入る程度のサイズのウェルを複数有するウェルプレートを用いる場合の例である。この例においては、標識由来シグナルが検出されるウェル（陽性ウェル）が標識由来シグナルそのものであるといえる。このため、一方の標識由来シグナル配置パターンにおける陽性ウェル（シグナルが観察されたウェル）のプレート上の位置と、一方の標識由来シグナル配置パターンにおける陽性ウェル（シグナルが観察されたウェル）のプレート上の位置とを比較し、その結果、両者がプレート上の同じ位置であれば、両者は同位置のシグナルであると判定することができる。
【０１２４】
被検物質を示すと判定されたシグナルは、被検物質として検出する（ステップS5）。
【０１２５】
処理部30は、ステップS1〜S5の情報を、画像出力インターフェイス37を介して、表示部3cから出力することができる。また、処理部30は、これらの情報を、記録媒体40等に記録してもよい。
【０１２６】
ステップS1〜S5はコンピュータプログラムによって実行される。コンピュータプログラムは、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等の記憶媒体に記憶されていてもよい。前記記憶媒体へのプログラムの記憶形式は、前記提示装置が前記プログラムを読み取り可能である限り制限されない。前記記憶媒体への記憶は、不揮発性であることが好ましい。
【０１２７】
3-3．被検物質を検出する装置のその他の態様
本発明は、その一態様において、反応部と、外力付与部と、撮像部と、制御部と、処理部と、を備える装置にも関する。
【０１２８】
本態様において、制御部は、前記被検物質と、前記捕捉体1と、前記捕捉体2とを液中で接触させ、少なくとも一部の前記捕捉体2を基板上に配置するよう前記外力付与部からの外力を調整し、前記接触の後、前記捕捉体2を含む物質の一部を、基板上から解離して液中に遊離させるよう前記外力付与部からの外力を調整する。制御部は、測定装置2内に備えられるものであり、その構成はコンピュータシステム3と同様の構成を採ることができる。
【０１２９】
本態様において、処理部は、前記接触時及び前記解離時の標識由来シグナル配置パターンを比較し、前記接触時及び前記解離時で実質的に同位置のシグナルを、被検物質を示すシグナルとして判定する。処理部の構成については、上記2-1における説明が援用される。
【実施例】
【０１３０】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【０１３１】
実施例1．ApoA1の検出
1-1．接触工程1
1-1-1．捕捉体1の調製
シリコンゴムシート（タイガースポリマー社製、SR-50、厚み5 mm）に直径5 mmの貫通孔を開け、得られたシートをMASコートガラス（松浪硝子工業株式会社製）に貼り付けて、ガラス基板上にウェルを作製した。BSA（Proliant biologicals社製、#68700）に定法に従ってビオチンを結合させ、ビオチン結合BSAを得た。30μg/mLビオチン結合BSA/PBS溶液  0.5μLをウェルに滴下して、室温で1時間静置した。HISCL洗浄液（シスメックス社製）  50μLをウェルに滴下後、ピペッティングによりウェルを洗浄した。この洗浄操作を計3回行った（以下、この3回の洗浄を、単に「洗浄操作」と示す。）。1%BSA/PBS溶液  50μLをウェルに滴下し、4℃で一晩静置した後、洗浄操作を行った。10μg/mLストレプトアビジン/1%BSA/PBST溶液  20μLをウェルに滴下し、室温で1時間静置した後、洗浄操作を行った。一方で、ビオチン標識したAnti ApoA1 Antibody P1A5（Sysmex社製）をStartingBloc（登録商標） (PBS) Blocking Buffer（Thermo Fisher Scientific社製）で10μg/mLに希釈して、被検物質に対する抗体溶液を作製した。該抗体溶液  10μLをウェルに添加し、室温で1時間静置した後、洗浄操作を行った。上記操作により、被検物質（ApoA1）に対する結合性を有し且つ基板（ウェル底面）に固定されている捕捉体1を得た。
【０１３２】
1-1-2．被検物質の基板上への配置
ApoA1, human recombinant（Sigma Aldrich製）をStartingBloc（登録商標） (PBS) Blocking Buffer（Thermo Fisher Scientific製）で1μg/mLに希釈して、サンプル溶液を作製した。一方で、ApoA1を含まないBlocking Bufferのみの液を準備し、これをバックグラウンド溶液とした。実施例1-1-1で得られたウェルに、サンプル溶液  20μL又はバックグラウンド溶液  20μLを添加し、室温で1時間静置した。上記操作により、被検物質を基板上に配置した。
【０１３３】
1-1-3．捕捉体2の調製
Anti ApoA1 Antibody P1A5（Sysmex製）と磁性ビーズ（多摩川精機製、COOH FG beads、TAS8848N1140、直径180 nm）を、N-ヒドロキシスクシイミド（キシダ化学株式会社、010-38472）及び1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（同仁化学研究所、W001）と混合し、抗体にビーズを結合した。この操作により、被検物質（ApoA1）に対する結合性を有し且つ標識（ビーズ）を含む捕捉体2を得た。
【０１３４】
1-1-4．捕捉体2の基板上への配置
実施例1-1-2の操作後のウェルに、捕捉体2溶液  40μLを添加し、室温で1時間静置した。この操作により、捕捉体2を基板上に配置した。操作終了後に、顕微鏡（BZX710、KEYENCE製）のステージ上に、ウェルを含む基板を設置し、焦点をウェル底面付近に設定し、×40, NA=0.95のレンズを用いて明視野像（接触工程1の明視野像）を取得した。
【０１３５】
1-2．解離工程1
実施例1-1-4の操作後のウェルを、カバーガラス（松浪硝子株式会社製）で封止した。磁石（株式会社二六製作所製、N40、表面磁束密度400mT）をウェル底面から5mmの高さまで近づけることにより、捕捉体2（中の磁性ビーズ）を上方に引っ張る外力を、30秒間付与した。この操作により、捕捉体2を含む物質を基板上から解離して液中に遊離させた。なお、この間、磁石は、水平方向に僅かに揺らし続けた。外力付与直後に、実施例1-1-4と同様にして明視野像（解離工程1の明視野像）を取得した。
【０１３６】
1-3．接触工程2及び解離工程2
実施例1-2の操作後、ウェルに磁力が完全に及ばない位置まで磁石を離し、その状態で5分間静置した。この操作により、再度、捕捉体2を基板上に配置した。静置後に、実施例1-1-4と同様にして明視野像（接触工程2の明視野像）を取得した。
【０１３７】
その後、実施例1-2と同様にして、外力を付与し、その直後に明視野像（解離工程2の明視野像）を取得した。
【０１３８】
1-4．接触工程3及び解離工程3
実施例1-3の操作後、実施例1-3と同様にして、接触工程3及び解離工程3を行い、それぞれの明視野像（接触工程3の明視野像及び解離工程3の明視野像）を取得した。
【０１３９】
1-5．接触工程4及び解離工程4
実施例1-4の操作後、実施例1-3と同様にして、接触工程4及び解離工程4を行い、それぞれの明視野像（接触工程4の明視野像及び解離工程4の明視野像）を取得した。
【０１４０】
1-6．基板上の標識由来シグナル配置パターンの比較1（解離工程同士の比較）
上記実施例で取得された明視野像は、標識（磁性ビーズ）が拡大され輝点シグナルとして判別可能な像である。明視野像の一部を図１１に示す。図１１中、矢印は輝点を示し、グレー矢印はいずれの解離工程同士を比較しても位置が不変の輝点を示し、白色矢印は異なる解離工程間で位置が変化している輝点を示す。また、複数の視野における輝点の数を積算した結果を、図１２に示す。
【０１４１】
図１１に示されるように、解離工程1〜4のいずれの解離工程間でも位置が不変の輝点が存在することが分かった。これらの輝点は、外力を加えた後でも基板上に固定されている捕捉体2に由来するシグナルであり、被検物質をより特異的に示すシグナルであることが示唆された。また、このことから、接触工程間で位置が不変の輝点も、外力を加えた後でも基板上に固定されている捕捉体2に由来するシグナルであるといえ、被検物質をより特異的に示すシグナルとして判定できることが示唆された。
【０１４２】
図１２に示されるように、バックグラウンド溶液を使用した場合（被検物質 無の場合）の輝点、すなわち非特異的吸着に基づくシグナルは、解離工程により減少することが分かった。特に、解離工程を2回行った後（解離工程2〜4）では、非特異的シグナルは0であった。
【０１４３】
比較例1．従来法によるApoA1の検出
従来から通常に実施されている、B/F分離によるELISA法に準じて、被検物質（ApoA1）を検出した。具体的には次のようにして行った。実施例1-1と同様にして捕捉体2を基板上へ配置した。続いて、上清を除去して、PBS 20μLを添加した。その後、焦点をウェル底面付近とした明視野像を取得した。
【０１４４】
明視野像を図１３に示す。また、複数の視野における輝点の数を積算した結果を、図１４に示す。
【０１４５】
図１３に示されるように、B/F分離による従来法では、バックグラウンド溶液を使用した場合（被検物質無の場合）でも、輝点、すなわち非特異的吸着に基づくシグナルがある程度残ってしまう。
【符号の説明】
【０１４６】
１．  検出装置
２．  測定装置
３．  コンピュータシステム
３ａ．コンピュータ本体
３ｂ．入力デバイス
３ｃ．表示部
３０．処理部（CPU）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2019020297.tif 000009
【図９】
2019020297.tif 000010
【図１０】
2019020297.tif 000011
【図１１】
2019020297.tif 000012
【図１２】
2019020297.tif 000013
【図１３】
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【図１４】
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