(57)【要約】      （修正有）【課題】腸の炎症の危険性を予防又は低減するための方法の提供。【解決手段】動物において腸の炎症の危険性を予防又は低減するための組成物の使用であって、該組成物が、ベータカゼインを含有し、ベータカゼインが、少なくとも５０重量％のベータカゼインＡ２を含む、前記使用。ベータカゼインは、好ましくは少なくとも９０重量％、より好ましくは少なくとも９９重量％のベータカゼインＡ２を含み、好ましくは５０重量％未満、より好ましくは１０重量％未満、更に好ましくは１重量％未満のベータカゼインＡ１を含む。組成物は、乳又は乳製品とすることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物において腸の炎症の危険性を予防または低減するための組成物の使用であって、該組成物がベータカゼインを含有し、そして該ベータカゼインが少なくとも５０重量％のベータカゼインＡ２を含む、前記使用。
【請求項２】
該ベータカゼインが、少なくとも９０重量％のベータカゼインＡ２を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
該ベータカゼインが、少なくとも９９重量％のベータカゼインＡ２を含む、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項４】
該ベータカゼインが、５０重量％未満のベータカゼインＡ１を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
該ベータカゼインが、１０重量％未満のベータカゼインＡ１を含む、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
該ベータカゼインが、１重量％未満のベータカゼインＡ１を含む、請求項３または請求項４に記載の使用。
【請求項７】
該組成物が、乳または乳製品である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
該乳が、新鮮な乳、粉乳、粉末から再構成された液乳、脱脂乳、ホモジナイズされた乳、練乳、無糖練乳、低温殺菌乳、非低温殺菌乳、またはＵＨＴ乳である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
該乳製品が、クリーム、ヨーグルト、乳餅、チーズ、バター、またはアイスクリームである、請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
該腸の炎症が炎症性腸疾患である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
該炎症性腸疾患がクローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
該腸の炎症が過敏性腸症候群である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
該動物がヒト、イヌ、またはネコである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
動物において腸の炎症の危険性を予防または低減するための組成物であって、該組成物がベータカゼインを含有し、そして該ベータカゼインが少なくとも５０重量％のベータカゼインＡ２を含む、前記組成物。
【請求項１５】
動物において腸の炎症の危険性を予防または低減するための組成物の製造における乳の使用であって、該乳がベータカゼインを含有し、そして該ベータカゼインが少なくとも５０重量％のベータカゼインＡ２を含む、前記使用。
【請求項１６】
動物において腸の炎症の危険性を予防または低減する方法であって、該動物によるベータカゼインを含有する組成物の消費、または該組成物の該動物への消費のための提供を含み、該ベータカゼインが少なくとも５０重量％のベータカゼインＡ２を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳タンパク質ベータカゼインＡ２の、腸の炎症の危険性を予防または低減するための使用に関する。特に、本発明は、乳および乳由来食物製品ならびに腸の即時および進行中の（ongoing）炎症の両方を引き起こすことが示されている高レベルのタンパク
質ベータカゼインＡ１を含有する乳および乳製品の消費の回避に関する。本発明は、一般的な腸の過敏（irritation）ならびに炎症性腸疾患および過敏性腸症候群を含む腸炎症の予防に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸の炎症は、結腸および小腸の炎症を特徴とする様々な障害または病気の結果もたらされ得る。そのような障害または病気は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および過敏性腸症候群（ＩＢＳ）を含む。ＩＢＤは、一般に臨床的に定義された持続性の病気、主にクローン病および潰瘍性大腸炎を指す。ＩＢＤは、一般に体自身の免疫系が消化系の要素を攻撃する自己免疫疾患であると考えられている。ＩＢＳは、腹痛または腹部不快感ならびに変化した腸の習慣（通常は慢性または再発性の下痢、便秘、または両方）を特徴とする障害である。ＩＢＳは、米国だけで２５００〜４５００万人の人々を冒していると言われている。ＩＢＳ罹患者３人ごとにおおよそ２人が女性である。ＩＢＳは、子供を含め全ての年齢の人々を冒す。世界人口のおおよそ１０〜２５％がＩＢＳを患っていると推定されている。ＩＢＳの影響は、軽度の不便から重症の衰弱にまで及び得る。中程度〜重症のＩＢＳを有する人々は、しばしば彼らの身体的、感情的、経済的、教育的および社会的幸福を損なう症状で苦労する。
【０００３】
腸炎症の正確な原因は、十分に理解されていない。しかし、特にＩＢＳの場合は食事が重要であるようである。乳および特に乳脂は、１つの寄与因子であると考えられている。多くの腸炎症状態は、治療されるというよりむしろ管理されている。しばしば、その処置は、食事ケア、ストレス管理、および薬物療法の組み合わせを含む。
【０００４】
世界中の人々に消費されている乳、主に牛乳は、ヒトの食事におけるタンパク質の主な源である。牛乳は、典型的には１リットルあたり約３０グラムのタンパク質を含む。カゼインは、そのタンパク質の最大の構成要素（８０％）を構成する。過去２０年間に、カゼインタンパク質、特にベータカゼインがいくつかの健康障害に関与していることを示すますます増える証拠が存在している。
【０００５】
ベータカゼインは、ベータカゼインＡ１およびベータカゼインＡ２として分類され得る。これらの２種類のタンパク質は、ほとんどのヒトの集団において消費される乳中の主なベータカゼインである。ベータカゼインＡ１は、ベータカゼインＡ２と１個のアミノ酸が異なる。ヒスチジンアミノ酸がベータカゼインＡ１の２０９アミノ酸配列の６７位に位置しており、一方でプロリンがベータカゼインＡ２の同じ位置に位置している。しかし、この１個のアミノ酸の違いは、腸中でのベータカゼインの酵素消化に決定的に重要である。６７位におけるヒスチジンの存在は、ベータカゾモルフィン−７（ＢＣＭ−７）として知られる７アミノ酸を含むタンパク質断片が酵素消化で生成されることを可能にする。従って、ＢＣＭ−７は、ベータカゼインＡ１の消化産物である。ベータカゼインＡ２の場合、６７位はプロリンで占められており、それはその位置におけるアミノ酸結合の切断を妨げる。従って、ＢＣＭ−７はベータカゼインＡ２の消化産物ではない。
【０００６】
他のベータカゼインのバリアント、例えばベータカゼインＢおよびＣも、６７位においてヒスチジンを有し、他のバリアント、例えばＡ３、ＤおよびＥは、６７位においてプロ
リンを有する。しかし、これらのバリアントは、欧州起源の雌ウシからの乳中に非常に低いレベルでしか存在しないか、または全く存在しない。従って、本発明の文脈において、ベータカゼインＡ１という用語は、６７位においてヒスチジンを有するあらゆるベータカゼインを指し、ベータカゼインＡ２という用語は、６７位においてプロリンを有するあらゆるベータカゼインを指す。
【０００７】
ＢＣＭ−７は、オピオイドペプチドであり、体全体でオピオイド受容体を強力に活性化することができる。ＢＣＭ−７は、胃腸壁を越えて循環に入る能力を有し、これはそれがオピオイド受容体を介して全身および細胞性活性に影響を及ぼすことを可能にする。出願者らは、以前に、乳および乳製品中のベータカゼインＡ１の消費ならびにＩ型糖尿病（国際公開第１９９６／０１４５７７号）、冠動脈性心疾患（国際公開第１９９６／０３６２３９号）および神経障害（国際公開第２００２／０１９８３２号）を含む特定の健康状態の発生率の間の関連を決定している。
【０００８】
ＢＣＭ−７は消化機能にも影響を及ぼし得るという推測が存在してきた。オピオイド受容体は、胃腸運動性、粘液産生およびホルモン産生の制御を含む胃腸機能の調節において役割を果たしていることが報告されている（例えば、Mihatsch, W.A, et al., Biol. Neonate, 2005, 87(3):160-3）。乳中にあるカゼインは、腸運動性の阻害と関係していると
考えられており、それは便秘をもたらす可能性があり(Gunn T.R. and Stunzer D., NZ Med. J., 1986, 99(813):843-6)、便秘および合成カゾモルフィン誘導体に関する研究は、
ＢＣＭ−７がこのオピオイド受容体に媒介される作用に寄与していることを示している(Charlin V. et al., Rev. Med. Chil., 1992, 120(6):666-9)。しかし、カゾモルフィンおよび腸における通過時間の間の関連に関するいくらかのインビトロの証拠は存在するが、その作用は必ずしもヒトにおけるインビボの作用に外挿され得るわけではないことは明らかである。例えば、少なくとも１つの研究は、ベータカゼインＡ１またはベータカゼインＡ２の消費および便秘の間の関係を実証することができなかった(Crowley, E.T., Nutrients, 2013, 5, 253-266)。ＢＣＭ−７は、ミュー−オピエート受容体に媒介される経路を介して粘液の産生を刺激し(Zoghbi, S., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 2006, 290(6):G1105-13)、免疫系と関係する細胞である粘膜固有層リンパ球の増殖を
調節する(Elitsur, Y. and Luk, G.D., Clin. Exp. Immunol., 1991, 85(3):493-7)こと
が示されている。
【０００９】
上記の報告は、カゼインおよびカゾモルフィン（ＢＣＭ−７を含む）ならびに胃腸機能の間の関連を示している。これらの報告は、乳タンパク質もしくは一般にカゼインを用いる研究またはＢＣＭ−７自体を用いる研究に基づいている。しかし、今までに、ベータカゼインＡ１の消費を腸炎症に直接関連付ける報告は存在しなかった。加えて、ベータカゼインＡ２の含有率が高い（そして逆にベータカゼインＡ１の含有率が低い）乳を飲んだ後の胃腸機能の改善に言及する消費者からの逸話的な報告が存在してきたが、これらは非科学的な報告であり、それらは機能におけるあらゆる改善の原因に関して非特異的である。さらに、そのような乳の消費において改善作用がないことの多くの逸話的な報告も存在する。これらの報告は、それらが便秘から下痢までの消化作用の連続体（continuum）にわ
たる報告を含む点で、矛盾している。結論は、特に潜在的に結果に影響を及ぼし得る変数の数が非常に大きい食物製品および生理機能の場合には、逸話的な報告から確信をもって出されることはできない。
【００１０】
出願者は、ここで、ベータカゼインＡ２の消費と比較した、ベータカゼインＡ１の消費および腸の炎症の間の直接的な関連に関する決定的な科学的証拠を見出した。腸の健康に影響を及ぼし得るヒトの食事における無数の要因、ならびに乳および乳製品が多岐にわたるタンパク質構成要素および他の構成要素を含有することを考慮すると、出願者のベータカゼインＡ１の消費および腸の炎症状態の間の明確な直接的関係の発見は、驚くべきもの
である。特に、出願者は、ベータカゼインＡ１の摂取への急性腸炎症応答の証拠だけでなく、ベータカゼインＡ１への短期曝露の結果としてもたらされる腸の長期の進行中の炎症の証拠も見出している。
【００１１】
従って、腸の炎症の危険性を予防もしくは低減するための方法を提供すること、または少なくとも既存の予防もしくは処置療法に対する有用な代替案を提供することが、本発明の目的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第１９９６／０１４５７７号
【特許文献２】国際公開第１９９６／０３６２３９号
【特許文献３】国際公開第２００２／０１９８３２号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Mihatsch, W.A, et al., Biol. Neonate, 2005, 87(3):160-3
【非特許文献２】Gunn T.R. and Stunzer D., NZ Med. J., 1986, 99(813):843-6
【非特許文献３】Charlin V. et al., Rev. Med. Chil., 1992, 120(6):666-9
【非特許文献４】Crowley, E.T., Nutrients, 2013, 5, 253-266
【非特許文献５】Zoghbi, S., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 2006, 290(6):G1105-13
【非特許文献６】Elitsur, Y. and Luk, G.D., Clin. Exp. Immunol., 1991, 85(3):493-7
【発明の概要】
【００１４】
本発明の第１観点において、動物において腸の炎症の危険性を予防または低減するための組成物の使用が提供され、ここで、その組成物は、ベータカゼインを含有し、ここで、そのベータカゼインは、少なくとも５０重量％のベータカゼインＡ２を含む。
【００１５】
本発明の第２観点において、動物において腸の炎症の危険性を予防または低減するための組成物が提供され、ここで、その組成物は、ベータカゼインを含有し、ここで、そのベータカゼインは、少なくとも５０重量％のベータカゼインＡ２を含む。
【００１６】
本発明の別の観点において、動物の腸の炎症の危険性を予防または低減するための組成物の製造における乳の使用が提供され、ここで、その乳は、ベータカゼインを含有し、ここで、そのベータカゼインは、少なくとも５０重量％のベータカゼインＡ２を含む。
【００１７】
本発明のさらなる観点において、動物において腸の炎症の危険性を予防もしくは低減する方法であって、その動物によるベータカゼインを含有する組成物の消費、またはその組成物のその動物への消費のための提供を含む方法が提供され、ここで、そのベータカゼインは、少なくとも５０重量％のベータカゼインＡ２を含む。
【００１８】
ベータカゼインＡ２の量は、ベータカゼインの５０重量％〜１００重量％の範囲のあらゆる量、例えば少なくとも９０％、少なくとも９９％、またはさらには１００％であることができる。
【００１９】
本発明の特定の態様において、組成物は、乳または乳製品である。乳は、粉乳または液乳であることができる。液乳は、新鮮な乳、粉末から再構成された液乳、脱脂乳、ホモジナイズされた乳、練乳、無糖練乳、低温殺菌乳もしくは非低温殺菌乳、ＵＨＴ乳の形態、または乳のあらゆる他の形態であることができる。乳製品は、クリーム、ヨーグルト、乳
餅、チーズ、バター、アイスクリーム、またはあらゆる他の乳製品であることができる。
【００２０】
腸の炎症は、炎症性腸疾患または過敏性腸症候群であることができるが、それらに限定されない。炎症性腸疾患は、クローン病または潰瘍性大腸炎であることができるが、それらに限定されない。
【００２１】
本発明のほとんどの態様において、動物はヒトである。しかし、他の態様において、動物は、イヌ、ネコ、または飼料に乳が補われるあらゆる他の飼育動物であることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、実施例１の飼料を与えられたラットにおける結腸ミエロペルオキシダーゼ活性を示す。
【図２】図２は、実施例１の飼料を与えられたラットにおける空腸ミエロペルオキシダーゼ活性を示す。
【図３】図３は、実施例１の飼料を与えられたラットにおける血漿中の血清アミロイドＡのレベルを示す。
【図４】図４は、実施例１の飼料を与えられたラットから採取された腸切片に関する組織学スコアを示す。
【図５】図５は、神経細胞およびＧＩ上皮細胞における、モルヒネおよびＢＣＭ−７濃度依存性のシステインの取り込みを示す。
【図６】図６は、時間の経過にわたる神経細胞およびＧＩ上皮細胞におけるシステインの取り込みを示す。
【図７】図７は、時間の経過にわたるＢＣＭ−７およびモルヒネのシステイン、ＧＳＨ／ＧＳＳＧおよびＳＡＭ／ＳＡＨへの作用を示す。
【図８】図８は、ＢＣＭ−７の影響下での炎症反応に関与していることが示されている遺伝子（ＮＦカッパＢおよびＩＬ１０）におけるＣｐＧメチル化の変化を示す。
【図９】図９は、炎症反応に関与していることが示されている遺伝子（ＭＰＯ）および免疫応答に関与していることが示されている遺伝子（ＩＬ１Ｒ）におけるＣｐＧメチル化の変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、タンパク質ベータカゼインを含有する組成物および腸の炎症を予防する、または少なくとも腸の炎症の発現の危険性を低減するためのその使用に関する。重要なことだが、そのベータカゼインは、ベータカゼインのＡ２バリアントであり、またはその組成物中に存在する総ベータカゼインバリアントの少なくとも５０重量％を構成する。その組成物中のＡ２バリアントの優勢（predminance）の重要性は、出願者がＡ１バリアントお
よびヒトにおける腸の炎症に関する生物学的マーカーの間の直接的な関連が存在することを示してきたという事実による。従って、Ａ１バリアントの消費が回避される場合、腸の健康における向上が予想され得る。
【００２４】
用語“腸の炎症”は、本明細書において用いられる際、結腸および／または小腸の急性、移行期または慢性および進行中の炎症を特徴とするあらゆる疾患、障害または病気を意味することが意図されている。そのような疾患、障害または病気は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および過敏性腸症候群（ＩＢＳ）を、腸の非特異的過敏に加えて含むが、それらに限定されない。ＩＢＤは、一般に臨床的に定義された持続性の病気、主にクローン病および潰瘍性大腸炎を指す。
【００２５】
用語“Ａ１乳”は、本明細書において用いられる際、ベータカゼインを含有する乳を意味することが意図されており、ここで、そのベータカゼインは、主にベータカゼインＡ１
（またはその２０９アミノ酸配列の６７位においてヒスチジンを有するあらゆる他のベータカゼインバリアント）の形態である。Ａ１乳は、５０％より多い、典型的には９０％より多い（理想的には１００％である）ベータカゼイン構成要素ベータカゼインＡ１を有し得る。
【００２６】
用語“Ａ２乳”は、本明細書において用いられる際、ベータカゼインを含有する乳を意味することが意図されており、ここで、そのベータカゼインは、主にベータカゼインＡ２（またはその２０９アミノ酸配列の６７位においてプロリンを有するあらゆる他のベータカゼインバリアント）の形態である。Ａ２乳は、５０％より多い、典型的には９０％より多い（理想的には１００％である）ベータカゼイン構成要素ベータカゼインＡ２を有し得る。
【００２７】
ほとんどのヒト集団の食事におけるベータカゼインの主な（それのみではないとしても）源は、乳または乳に由来する製品であるため、そして消費されるほとんどの乳はベータカゼインのＡ１およびＡ２バリアントの混合物のみを含有するため、高含有率のＡ２バリアントを有する乳（またはそのような乳から作られた製品）の消費は、必然的に、Ａ１バリアントの消費が低いことを意味するであろう。この分析をさらに進めると、ベータカゼインの唯一の食事での源がＡ２バリアントを含有し、他のバリアントを含有しない場合、Ａ１バリアントの食事での摂取は排除され、従ってベータカゼインＡ１の消費に起因する腸炎症の有害な健康の結果も排除されることが予想され得る。
【００２８】
従って、本出願の発明は、動物（特にヒト）の食事におけるベータカゼインＡ１の低減または排除に基づいており、これは、ベータカゼインを含有する食物組成物、特に乳および乳製品中のベータカゼインが、主に、さらには排他的にベータカゼインＡ２であることを確実にすることにより達成される。
【００２９】
理想的には、組成物中のベータカゼインは、１００％ベータカゼインＡ２である。従って、ベータカゼインＡ１の完全な排除は、ベータカゼインＡ１（およびＢＣＭ−７）により引き起こされる腸の炎症の危険性を低減または完全に排除することにより、関係する健康の利益を最大化する。しかし、危険性は、ベータカゼインが主にベータカゼインＡ２である、すなわち、５０重量％〜１００％のあらゆる量であるあらゆる組成物において低減される可能性があり、それには６０重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、９８重量％および９９重量％が含まれるが、それらに限定されない。
【００３０】
本発明は、ベータカゼインを含有する組成物の使用に関し、ここでそのベータカゼインは、少なくとも５０重量％のベータカゼインＡ２を含み、上記で説明されたように、ベータカゼインＡ１およびベータカゼインＡ２は、本質的にほとんどの人々により消費される乳中に存在する唯一のベータカゼインバリアントであるため、本発明は、ベータカゼインを含有する組成物の使用にも関し、ここでそのベータカゼインは、５０重量％未満のベータカゼインＡ１を含む。好ましくは、その組成物は、６０重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、９８重量％または９９重量％未満のベータカゼインＡ１を含有し、理想的にはベータカゼインＡ１を全く含有しない。
【００３１】
本発明の組成物は、典型的には乳であるが、あらゆる乳由来の製品、例えばクリーム、ヨーグルト、乳餅、チーズ、バター、またはアイスクリームであることもできる。組成物は、乳から得られたベータカゼインを含有する非乳製品であることもできる。組成物は、ベータカゼイン自体であることができ、またはベータカゼインから調製されることができ、そのベータカゼインは、粉末もしくは顆粒のような固体形態、または固体のケーキの形態であることができる。
【００３２】
乳は、ヒト、ヤギ、ブタおよびバッファローを含むあらゆる哺乳類から得ることができ、本発明の好ましい態様において、その乳は牛乳である。
【００３３】
乳は、新鮮な乳、粉乳、粉末から再構成された液乳、脱脂乳、ホモジナイズされた乳、練乳、無糖練乳、低温殺菌乳もしくは非低温殺菌乳、ＵＨＴ乳の形態、または乳のあらゆる他の形態であることができる。
【００３４】
本発明の組成物は、主にヒトによる消費に適用可能であるが、健康の利益は一部の他の動物、例えばネコ、イヌおよび他の飼育動物にも関連していることは、理解されるべきである。
【００３５】
本発明に関する支持は、実施例において記載される実験において見出される。
【００３６】
特に、実施例２は、ベータカゼインＡ１およびベータカゼインＡ２飼料のラットの結腸におけるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性への作用に関する。ＭＰＯ活性は、炎症に関するマーカーである(Krawisz, et al., Gastroenterology, 1984, 87(6):1344-1350 and Dommels, Y.E.M., et al., Genes Nutr., 2007, 2(2):209-223)。結腸のＭＰＯ活性
は、ベータカゼインＡ１を与えられたラットにおいて、ベータカゼインＡ２を与えられたラットと比較して増大することが分かり、これはベータカゼインＡ１を与えられたラットにおける好中球の増大したレベルを示しており、それは今度は炎症反応の指標である。その作用は、ナロキソン（既知のオピオイド受容体拮抗薬）で処置されたラットでは観察されず、これは、その作用がＢＣＭ−７のμ−オピエート受容体との相互作用により媒介されていることを示している。
【００３７】
実施例３は、空腸におけるＭＰＯ活性への作用に関する。その結果は、ベータカゼインＡ１の消費において小腸における炎症の観察可能な増大はなかったことを示している。これは、結腸における炎症を示した実施例２とは対照的である。実施例３の結果は、ベータカゼインＡ１の消費により誘導される炎症は、結腸に局在しており、腸全体にわたるものではないことを確証している。
【００３８】
実施例４は、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）の濃度に関し、それは、主に肝臓により、炎症の急性期の間に分泌されるタンパク質である(Uhlar, C.M. and Whitehead, A.S., Eur.
J. Biochem., 1999, 265(2):501-523)。ＳＡＡのレベルは、全身性炎症の指標である。
実施例４は、処置群の全ての間に血漿ＳＡＡ濃度において有意差がなかったことを示している。換言すると、この研究からは全身性炎症の明確な証拠がなかった。
【００３９】
組織学研究に関する実施例５は、結腸における炎症がわずかであり、その見え方（how it presents）において無症候性であり得ることを反映している。組織の炎症反応を確証
するＭＰＯデータにもかかわらず、これは、広範囲にわたるデータセットに由来する有意性の欠如により証明されるように、視覚的に明らかではなかった。
【００４０】
ＳＡＡおよび小腸ＭＰＯ実験の重要性は、どちらの全身性炎症の研究においても証拠が観察されなかったことである。これは、ＢＣＭ−７に媒介される炎症反応と一致している。理論により束縛されることを望むわけでは一切ないが、これは、ＢＣＭ−７により媒介される腸の炎症が局在する炎症反応であるため、説明され得る。換言すると、全身性炎症の証拠の欠如（ＳＡＡおよび組織学研究）は、局在する炎症の証拠（ＭＰＯ研究）と合わせて、ベータカゼインＡ１を含有する食物の摂取に由来するＢＣＭ−７は腸の炎症を引き起こすが、全身性の作用も小腸への作用も有しないことの強い指標である。
【００４１】
その発見は、ＢＣＭ−７が炎症に対抗し得るという公開された証拠を考慮すると、さらに驚くべきものである。例えば、ＢＣＭ−７は腎臓における酸化的ストレスを低減することが報告されている(Zhang, W., et al., http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23658831)。酸化的ストレスは、炎症性作用である。従って、ＢＣＭ−７がこの炎症性作用を低減するという報告された発見は、ＢＣＭ−７の健康に関連する生理的プロセスにおける因子としての予測不可能性を指し示している。
【００４２】
実施例６は、ベータカゼインＡ１を含有する乳が、ベータカゼインＡ２を含有する乳と比較して、胃腸症状への作用を有するかどうかを調べるための試験を記載している。重要な発見は、１００％ベータカゼインＡ１乳および１００％ベータカゼインＡ２乳の消費後の便の硬度における統計的有意差（ｐ＝０．０３８）である。これに関する統計的証拠は、女性のみを考えた場合にさらに強い（ｐ＝０．０１３）。その証拠は、自身が乳に不耐性であると考えていた人を分析から除いた場合でも、強いままである（ｐ＝０．０４４）。ベータカゼインＡ２乳の投与計画と比較したベータカゼインＡ１乳の投与計画は、全体的により軟らかい便（faeces）をもたらしたすことは明らかである。より軟らかい便（faeces）をもたらす弱められた水吸収機能は、ベータカゼインＡ１が消費された際のベータカゼインＡ２と比較してより高いレベルの腸炎症の証拠である。
【００４３】
出願者は、（ベータカゼインＡ１からの）ＢＣＭ−７および炎症の指標、例えばシステインおよびグルタチオン（ＧＳＨ）レベルの間の直接的な関係も調べ、見出した。
【００４４】
酸素を含有する化学的に反応性の分子である活性酸素種（ＲＯＳ）、例えば酸素イオンおよび過酸化物ならびにＩＢＤの間の関係は、増大したＲＯＳレベルおよび低下した抗酸化物質レベルはＩＢＤ、クローン病および潰瘍性大腸炎における発症機序への主な寄与因子であるという証拠から推測され得る。ＲＯＳはまた、ＩＢＤにおける免疫反応を、炎症性白血球を増加させることにより増強し得る。さらに、炎症および炎症性疾患の進行は、粘膜抗酸化防御、特に粘膜のＧＳＨレベルにおける欠陥とも関係している。抗酸化特性を有する薬物は、ＩＢＤの処置において有益な作用を示すことが報告されている。
【００４５】
システインおよびセレンの血中レベルは、ＧＳＨ合成の支持および維持のために決定的に重要であり、これらは、今度は、食物由来の硫黄含有アミノ酸であるシステインおよびメチオニンの胃腸（ＧＩ）管からの腸上皮境界表面上の異なるトランスポーターを介する吸収に依存している。
【００４６】
必須微量元素であるセレン（Ｓｅ）における欠乏は、クローン病を含むヒトにおける酸化的ストレスおよび炎症と関係するいくつかの慢性疾患に関する危険因子であると考えられている。Ｓｅは、グルタチオンペルオキシダーゼＧＰＸ２またはＧＰＸ１の活性に必須であり、その両方が、脳および粘膜におけるＧＳＨのレベルの制御に関わる重要な酵素である。ＧＰＸ１は、ＩＢＤと関係していることが知られており、その活性は、Ｓｅの存在に依存する。
【００４７】
ＧＩ上皮細胞における様々なアミノ酸トランスポーターの中で、ＥＡＡＴ３（興奮性アミノ酸トランスポーター３、ＥＡＡＣ１）は、システイン輸送に選択的であり、最初にＧＩ上皮細胞からクローニングされた。ＥＡＡＴ３は、小腸において、特に末端回腸において最も顕著に発現しており、最高レベルは腺窩細胞およびより低い絨毛領域（lower villus regions）においてである。これは、腸の上皮内層を支持する多能性幹細胞に関する主要な部位である。従って、低下したＥＡＡＴ３依存性のシステインの吸収が、より低いＧＳＨレベルの局所的および全身性の結果と共に存在する。
【００４８】
上記で記載された作用は、特にＧＩ管におけるＥＡＡＴ３のあらゆる調節因子により媒
介される変化の急性の作用である。しかし、必須のＧＳＨ前駆体であるシステインの損なわれたＧＩ吸収は、結果として局所的および全身性の酸化的ストレスをもたらすだけでなく、それに続く遺伝子発現の正常な後成的制御の混乱も誘導するであろう。これは、メチオニンシンターゼ酵素活性およびＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）レベルの制御により行われる。ＳＡＭは、ＤＮＡおよびヒストンのメチル化に関するメチル供与体として作用し、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）に変わる。細胞のメチル化能力は、ＳＡＭ／ＳＡＨとして言及される。酸化還元状態における変化への適応性の後成的応答は、様々な疾患、特に抗酸化恒常性への干渉に由来し得る疾患、例えば一般にＧＩ管の炎症、より具体的にはＩＢＤおよびクローン病において重要な役割を果たしているようである。
【００４９】
実施例７は、ＢＣＭ−７は、システインの取り込みを濃度依存性の様式で阻害することができ、有効性の順序は、モルヒネがＢＣＭ−７より大きく、ＩＣ５０値は、それぞれ神経細胞において０．１６および１．３１ｎＭ、ＧＩ上皮細胞において６．３８および１５．９５ｎＭであることを示している（図５）。システイン取り込みの阻害は、３０分の時点で完全に発現され、４８時間のモルヒネまたはＢＣＭ−７曝露を通して持続し（図６）、これは、ＢＣＭ−７への１回の曝露後のシステイン取り込みへの長期の慢性作用を示している。これらの作用は、選択的μ−拮抗薬の存在下での遮断により示されるように、μ−オピオイド受容体により媒介され、デルタオピオイド受容体によっては媒介されなかった。
【００５０】
実施例８は、ＢＣＭ−７およびモルヒネが、システインおよびＧＳＨレベルにおける時間依存性の低下を引き起こしたことを示している。神経細胞におけるシステインの細胞内レベル、細胞の酸化還元状態（グルタチオン（ＧＳＨ）の、その酸化型であるグルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）に対するＧＳＨ／ＧＳＳＧ比により反映される）も低下し（図７）、これは、酸化的ストレス状態を示している可能性がある。さらに、ＳＡＭ／ＳＡＨ（メチル化能力）の比率も、ＢＣＭ−７処理により、異なる時点において影響を受けた（図７）。従って、ＢＣＭ−７は、主な細胞内抗酸化物質レベル、特にＧＳＨレベルにおける低減を誘導し、酸化的ストレスシグナル伝達経路を介して炎症性変化をもたらす可能性を有する。さらに、ＳＡＭレベルにおいて媒介される変化は、炎症経路の原因である遺伝子における後成的変化を誘導し得る。
【００５１】
実施例９は、原型的オピオイドであるモルヒネが、結果として７，５９２種類の差次的に発現された転写産物（ＤＥＴ）をもたらし、一方でＢＣＭ−７処置は、１，４６７種類のＤＥＴをもたらしたことを説明している。５０１種類のＤＥＴが、モルヒネおよびＢＣＭ−７の両方により共有されていた。加えて、この結果は、全体的なＤＮＡメチル化における観察された変化と有意に関係していることが分かった疾患および障害を示している。ＢＣＭ−７で差次的にメチル化されたプロモーターの転写産物（ＤＭＴ）は、炎症性疾患と関係していた（表５）。従って、ＢＣＭ−７のＧＳＨ抗酸化レベルおよび酸化的ストレスへの急性作用は、本質的に、慢性の適応性遺伝子発現変化に変換される。ＢＣＭ−７の影響下で後成的に変化した遺伝子は、細胞機能ならびに炎症性疾患経路の制御に直接関わっており、転写的に制御された遺伝子は、細胞機能および酸化還元恒常性にも関わっている（表５）。
【００５２】
実施例１０は、ＢＣＭ−７の影響下での炎症反応の媒介の原因である遺伝子におけるＤＮＡメチル化の変化を示している。サイトカイン、例えばＮＦカッパＢおよびインターロイキン、例えばＩＬ１（図８）は、ＢＣＭ−７曝露後にそれらの後成的状態において変化している。従って、酸化還元状態における変化は、サイトカインの後成的状態における長期の変化を媒介した。これは、分子的損傷（molecular insults）の記憶の役目を果たす
と考えられ、それは疾患、例えばＩＢＤにおける長期の慢性的変化および炎症反応に寄与している可能性がある。加えて、変化した後成的状態は、実施例１０から明らかである。
従って、ＢＣＭ−７は、ベータカゼインＡ１を与えた研究から明らかであるように、ＭＰＯ活性を変化させるだけでなく、それは、ＭＰＯ遺伝子の後成的状態も変化させる（図９）。
【００５３】
これらの研究は、ベータカゼインＡ１の消費および腸の炎症の間の関連の最初の明確な科学的証拠である。以前に、（ベータカゼインＡ１自体ではなく）ＢＣＭ−７に関連する非決定的かつ矛盾する逸話的報告が、当業者の間で混乱をもたらしており、多くがそのような関連はなかったと信じている。出願者の発見により、長年世界中で多くの人々が患ってきた様々な炎症性の腸の病気により引き起こされる問題に対する代替の可能性のある解決策、すなわち、食事におけるベータカゼインＡ１の回避が、ここで提供される。これは、腸の炎症に関連する病気または症状の危険性を処置、回避または低減するために利用可能な、主にベータカゼインＡ２を含有する（そしてベータカゼインＡ１を含有しない）そのベータカゼイン含有率を有する乳を生産し、そのような乳およびその乳に由来する製品を作製することにより達成され得る。雌ウシの乳は、ベータカゼインＡ１およびベータカゼインＡ２の相対的割合に関して試験されることができる。あるいは、雌ウシは、ベータカゼインＡ１またはベータカゼインＡ２または両方の組み合わせを含有する乳を生産するそれらの能力に関して遺伝学的に試験されることができる。これらの技法は、周知である。
【００５４】
本発明は、炎症性の腸の病気を処置または予防するための既存の技法または方法を超える明確な利点を有する。ほとんどの既存の技法または方法は、医薬、ストレス管理または食事の修正による医療介入に頼っており、その多くは、しばしば限られた実際の成功しか有さず、または実際の成功を有しない。本発明は、比較的管理するのが容易である解決策、すなわち、食事における“通常の”（ベータカゼインＡ１を含有する）乳を、ベータカゼインＡ２の含有率が高いことが知られている、好ましくは存在する全てのベータカゼインがベータカゼインＡ２である乳で置き換えることにより、ベータカゼインＡ１を含有しない食事に変えることを提供する。本発明は、医薬的介入よりもかかる費用がかなり少なく、大規模な食事の修正、例えば乳製品または他の一般的な食物製品の回避に関するあらゆる必要性も回避する。
【００５５】
本明細書における先行技術文書へのあらゆる参照は、そのような先行技術が広く知られている、またはその分野における共通の一般的な知識の一部を形成するという自認と考えられるべきではない。
【００５６】
本明細書で用いられる際、単語“含む”、“含むこと”、および類似の単語は、排他的または包括的な意味で解釈されるべきではない。換言すると、それらは、“含んでいるが、それに限定されない”を意味することが意図されている。
【００５７】
本発明は、以下の実施例への参照によりさらに記載される。特許請求されるような本発明が、これらの実施例により限定されることは決して意図されていないことは、理解されるであろう。
【実施例】
【００５８】
実施例１：給餌方法論
７２匹の離乳させた（４週齢）オスのウィスターラットを用いた。対照試料での７日間の順化期間の後、ラットに、１２または６０時間のどちらかの間、３種類の飼料：１００％Ａ１飼料、１００％Ａ２飼料、対照試料の１種類を与えた（処置あたりｎ＝６）。飼料のタンパク質構成要素は、（Ａ１およびＡ２飼料に関して）脱脂乳および（非乳タンパク質対照試料に関して）卵白に由来し、エネルギーおよび多量栄養素の組成に関して釣り合いが取られた（表１参照）。期間の終了の１５分前に、ラットにナロキソンまたは生理食
塩水（対照）のどちらかを腹腔内注射により与え、次いで非消化性トレーサーである二酸化チタンを経口強制摂取させた。便および尿試料を、その後の２４時間にわたって７つの時点で採取し、それらが分析されるまで−２０℃（便）または−８０℃（尿）で保管した。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
実施例２：結腸ＭＰＯ活性
実施例１に従って給餌したラットからの結腸組織を、ミエロペプチダーゼ（ＭＰＯ）活性に関して、確立された方法(Grisham, M.B., et al., Methods Enzymol., 1990, 186:729-742)に基づいて定量化した。結腸組織（５０ｍｇ）をホモジナイズし、遠心分離により分配し、超音波プローブにより破壊し、凍結融解サイクルを施した。内在性ＭＰＯは、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質のＨ２Ｏ２依存性の酸化を触媒し、それは５６２ｎｍにおいて比色測定で測定される。活性は、同じホモジネートに関するビシンコニン酸（ＢＣＡ）(Smith, P.K., et al., Anal. Biochem., 1985, 150(1):76-85)タン
パク質決定により標準化された。結果を図１において示す。
【００６１】
実施例３：空腸ＭＰＯ活性
この実施例では、空腸から採取した組織試料を分析した。用いた方法論は、実施例２に関するものと同じであった。結果を表２および図２において示す。
【００６２】
【表２】
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【００６３】
実施例４：血清アミロイドＡレベル
ＳＡＡレベルを、実施例１に従って給餌したラットから採取した血漿において測定した。測定は、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（Tridelta Development Limited、メイヌース、アイルランド）を用いて行われた。結果を表３および図３において示す。
【００６４】
【表３】
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【００６５】
実施例５：腸の組織学
ラットの胃腸管における形態における変化を測定するために用いられた手順は、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色された組織切片の、光学顕微鏡下での組織学的評価に基づく(Knoch, B. et al., J. Nutrigenet. Nutrigenomics, 2009, 2(1):9-28 and Barnett, M.P., BMC Immunol., 2010, 11:39)。この方法を、１００％Ａ１または１００％Ａ２のどちらかを与えられたラットの結腸組織由来の切片に適用し、ベータカゼインバリアントの腸炎症への作用を決定した。結果を図４において示す。データ（平均±ＳＥＭ）は、６０時間ナロキソン群中のベータカゼインＡ１を与えられたラットおよびベータカゼインＡ２を与えられたラットの間で有意（Ｐ＜０．０５）差が存在し、ベータカゼインＡ２を与えられたラットは有意に高いスコアを有することを示した。しかし、これらの組織学スコアの大きさは、炎症を示しておらず、全体的な分析は、飼料、時間、またはナロキソン処置の組織学スコアへの作用の証拠を示していない。
【００６６】
実施例６：胃腸症状
この８週間のランダム化されたクロスオーバー試験において、参加者（ｎ＝４１）を、２週間の乳系のウォッシュアウト（dairy washout）の後、２つの群の１つへとランダム
化した：１）Ａ１乳（ｎ＝２１）；または２）Ａ２乳（ｎ＝２０）。参加者は、２回目の２週間の乳系のウォッシュアウトを受け、次いで、８週間の試験の終了時に全ての参加者（ｎ＝３７）が両方の乳介入を完了しているように、もう一方の介入乳アーム（ａｒｍ）にクロスオーバーされた。１９〜６８才の男性（１２人）および２９人の女性（２９人）が募集された。除外基準は以下のものであった：（１）乳アレルギー；２）医学的に診断されたラクトース不耐性；３）妊娠および授乳期；４）過去６ヶ月間における心血管事象；５）オピオイドの消費；６）前の８週間における抗生物質処置；ならびに７）スクリーニングの前４週間における免疫抑制薬物療法または抗炎症薬。参加者は、Ａ１乳またはＡ
２乳のどちらかにおける２週間にランダム化される前に、（酪農乳が供給されたライスミルクで置き換えられた）１４日間の乳系のウォッシュアウト期間を開始した。試験の第１アームを完了した後、参加者は、他方の乳介入へのクロスオーバーの前に、２回目の２週間のウォッシュアウトを完了した。
【００６７】
ウォッシュアウト用ライスミルク−参加者は、１４日間のウォッシュアウト期間の間全ての酪農乳を供給されたライスミルクで置き換え、試験の期間の間全ての他の乳系食品を避けるように指導された。彼らは、乳系の隠れた源、例えばビスケットおよびチョコレートに関する情報を提供され、乳系を含まない代替物のリストを提供された。参加者は、１４日間のウォッシュアウト期間のそれぞれに関して、７５０ｍＬのライスミルク／日を消費するために十分なライスミルク（So Natural Rice Milk,Freedom Foods，オーストラリア）も供給された。ライスミルクは、１リットルの超高温（ＵＨＴ）パッケージで供給され、１００ｍＬあたり以下の栄養プロフィールを有していた：エネルギー２１２ｋＪ、総タンパク質０．３ｇ、総脂肪１．０ｇおよび炭水化物１０．４ｇ。
【００６８】
Ａ１乳−参加者は、全ての酪農乳を、供給されたＡ１乳で置き換え、全ての他の乳系食品および乳系の隠れた源を避けるように指導された。２週間のＡ１乳介入の間、参加者は、７５０ｍＬ／日（約７．５ｇのベータカゼインＡ１）のＡ１乳を、１日にわたって分散させて消費するように指導された。Ａ１乳のＮａｎｏ−ＬＣ  ＥＳＩ  ＭＳ分析（ＡＰＡＦ、シドニー）は、総ベータカゼインのＡ１比率はＡ１乳において９９％より大きいことを見出した。
【００６９】
Ａ２乳−参加者は、全ての酪農乳を、供給されたＡ２乳で置き換え、全ての他の乳系食品および全ての乳系の隠れた源を避けるように指導された。２週間のＡ２乳介入の間、参加者は、７５０ｍＬ／日（約７．５ｇのベータカゼインＡ２）のＡ２乳を、１日にわたって分散させて消費するように指導された。Ａ２乳のＮａｎｏ−ＬＣ  ＥＳＩ  ＭＳ分析（ＡＰＡＦ、シドニー）は、総ベータカゼインのＡ１比率は０．１〜０．５％であることを見出した。
【００７０】
Ａ１乳およびＡ２乳は両方とも、参加者に１リットルＵＨＴパッケージで供給され、１００ｍＬあたり以下の栄養プロフィールを有していた：エネルギー１８９ｋＪ、総タンパク質３．１ｇ、総脂肪２．５ｇおよび炭水化物（ラクトースを含む）５．２ｇ。参加者は、１日あたりに消費した乳の量を、コンプライアンスカレンダーに記録した。コンプライアンスは、消費された乳の量を、毎日の期待される乳の消費量で割り、１００を掛けることにより、百分率として計算された。Ａ１乳およびＡ２乳は、同一の無地の包装で提供され、従って参加者は、彼らが受けている乳介入に関して分からなくされた。
【００７１】
ブリストル便スケール(Lewis S.J. and Heaton K.W., Scand. J. Gastroenterol. 1997, 32(9):920-4)を、結腸通過時間の代用尺度として用いた。結果を表４において示す。
【００７２】
【表４】
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【００７３】
実施例７：ＢＣＭ−７のシステインの取り込みへの作用
放射能標識された［３５Ｓ］−システインの取り込みアッセイを、Ｃａｃｏ−２−ＧＩ上皮細胞および神経細胞において、Ａ１乳から放出されたＢＣＭ−７の存在下で実施し、未処理の対照ならびにモルヒネ（原型的オピオイド受容体作動薬）に対して比較した。細胞における前処理を、以前に記載されたように(Trivedi M., et al.; Mol. Pharm., 2014)、３０分、４、２４および４８時間の異なる時点に関して実施した。簡潔には、ＳＨ−
ＳＹ５Ｙヒト神経細胞およびＣａｃｏ−２腸上皮細胞を、６ウェルプレートに蒔き、薬物で前処理し、取り込みを測定する前に様々な時間の間インキュベートした。培地を吸引し、細胞を６００μＬのＨＢＳＳで３７℃において洗浄した。非放射活性ＨＢＳＳを吸引し、６００μＬの、［３５Ｓ］−システイン（１μＣｉ／１ｍＬ）、１０μＭの未標識のシステインおよび１００μＭのＤＴＴを含有する３７℃のＨＢＳＳで置き換え、細胞を５分間インキュベートした。その［３５Ｓ］−システイン／ＨＢＳＳ混合物を吸引し、氷冷ＨＢＳＳによる２回の洗浄により処理を終了した。次いで、細胞を６００μＬのｄＨ２Ｏで溶解させ、剥がし、１．５ｍＬの微量遠心チューブ中に集め、１０秒間超音波処理した。それぞれの試料の１００μＬを、タンパク質アッセイのために取り分けた。それぞれの試料の２００μＬ（三つ組で（in triplicate））を、４ｍＬのシンチレーション流体を含
むシンチレーションバイアル中に取り分け、ボルテックスし、放射活性に関して計数し、タンパク質含有量に対して標準化した。加えて、モルヒネおよびＢＣＭ−７のシステイン取り込み作用を、選択的μ−拮抗薬であるＤ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｅｎ−Ｔｈｒ（ＣＴＡＰ）、およびデルタ拮抗薬ナルトリンドール（ＮＴＩ）の存在下でも特性付けた。結果を図５および６において示す。これらの図中のそれぞれの＊記号は、未処理の対照に対して比較した統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示し、それぞれの＃記号は、未処理の対照に対して比較した統計的有意差（ｐ＜０．００５）を示す。
【００７４】
実施例８：ＢＣＭ−７のＧＳＨレベルへの作用
この実施例は、実施例７において観察されたようなシステイン取り込みにおける低下が、潜在的にＧＳＨの変化に変換され、抗酸化レベルに影響を及ぼし得るかどうかを調べた。ＧＳＨの細胞内レベルを、ＢＣＭ−７ならびにモルヒネを用いて、異なる時間（３０分間、４時間、および２４時間）の間、ＨＰＬＣおよび以前に用いられた電気化学勾配検出法(Hodgson et al., J. Alzh. Dis. 2013, Trivedi M., et al., Mol. Pharm. 2014)の使
用により測定した。簡潔には、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経細胞を、α−ＭＥＭ中でコンフルエントまで増殖させた。培地を吸引し、細胞を１ｍＬの氷冷ＨＢＳＳで２回洗浄した。ＨＢＳＳを吸引し、０．６ｍＬの氷冷ｄＨ２Ｏを細胞に添加した。細胞を、フラスコ／ディッシュから剥がし、ｄＨ２Ｏ中で懸濁した。細胞懸濁液を、氷上で１５秒間超音波処理し、懸濁液の１００μＬを、タンパク質含有量を決定するために用いた。残りの溶解物を、微量遠心チューブに入れ、等量の０．４Ｎ過塩素酸を添加し、続いて氷上で５分間インキュベートした。試料を５，０００×ｇで遠心分離し、上清を新しい微量遠心チューブに移した。１００μＬの試料を、円錐形のマイクロオートサンプラーバイアルに入れ、オートサンプラーの冷却トレー中で４℃で維持した。この試料の１０μＬを、ＨＰＬＣシステム中に注入した。
【００７５】
酸化還元およびメチル化経路の代謝産物の分離を、Agilent Eclipse XDB-C8分析カラム（３×１５０ｍｍ；３．５μｍ）およびAgilent Eclipse XDB-C8（４．６×１２．５ｍｍ；５μｍ）ガードカラムを用いて成し遂げた。２つの移動層を用いた：移動層Ａは、０％アセトニトリル、２５ｍＭリン酸ナトリウム、１．４ｍＭ  １−オクタンスルホン酸であり、リン酸によりｐＨ２．６５に調節した。移動層Ｂは、５０％アセトニトリルであった。流速は、最初０．６ｍＬ／分に設定し、段階的な勾配を用いた：０〜９分０％Ｂ、９〜１９分５０％Ｂ、１９〜３０分５０％Ｂ。次いで、カラムを、次の運転の前に５％Ｂで１２分間平衡化した。温度を２７℃で維持した。電気化学検出器は、BDD Analytical cell Model 5040を有するESA CoulArrayであり、作動電位は１５００ｍＶに設定した。試料濃
度を、代謝産物のピーク面積から、標準的な較正曲線およびＥＳＡに供給されたＨＰＬＣソフトウェアを用いて決定した。試料濃度を、タンパク質含有量に対して標準化した。一部の場合において、試料を必要に応じて移動相中で希釈し、または５０μｌまでの試料を注入して、チオールレベルが標準曲線の範囲内であることを確実にした。結果を図７において示す。
【００７６】
実施例９：ＢＣＭ−７のＤＮＡメチル化および遺伝子発現レベルへの作用
ＳＡＭ／ＳＡＨにおける変化は、全体的なＤＮＡメチル化に影響を及ぼし、様々な機能に関わる遺伝子に影響を与える可能性がある。ＢＣＭ−７により誘導される全体的なＤＮＡメチル化のレベルを、以前に記載された(Trivedi M., et al., Mol. Pharm. 2014)ようなメチル−ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）タンパク質富化ゲノム配列決定（ＭＢＤ−ｓｅｑ）を用いて調べ、一方で、未処理の対照ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞および１μＭのＢＣＭ−７で４時間処理した細胞からのｍＲＮＡ翻訳マイクロアレイデータを、Agilent V3マイクロアレイチップを用いて得た。
【００７７】
簡潔には、ゲノムＤＮＡを、試料から、Easy DNAキット（Invitrogen K1800-01）によ
り、細胞株に関する適切なプロトコルを用いて抽出した。断片化を、Covaris S2上で、以下の設定を用いて実施した：衝撃周期１０％、強度５、２００秒の間にバーストあたり２００サイクル。２００ｂｐの平均の長さを有する断片を得た。パワーモードは周波数掃引、温度は６〜８℃、水位は１２である。最大で５μｇを、マイクロチューブ中の１３０μｌのトリス−ＥＤＴＡ中に、ＡＦＡ増感剤（AFA intensifier）と共に装填した。より少
ないＤＮＡ入力（５００ｎｇまで）を有する試料に関して、ＤＮＡをトリスＥＤＴＡ中で１：５希釈した。５〜３μｇの入力を有するＤＮＡを、Agilent2100上で、DNA1000チップを用いて分析した。３μｇより少ない入力を有するＤＮＡを、ロータリーエバポレータ中で２５μｌまで濃縮し、断片の分布を高感度ＤＮＡチップ上でチェックした。メチル化されたＤＮＡを、MethylCapキット（Diagenode，ベルギー）を用いて捕捉した。収量は、典型的には捕捉されたＤＮＡ全体で０．５〜８ｎｇであった。続いて、断片を、Illumina Genome Analyzer IIを用いて配列決定した。断片化され、捕捉されたＤＮＡの濃度を、Quant-iT PicoGreen dsDNAアッセイキット（Invitrogen P7589）を用いて、Fluostar Optimaプレートリーダー上で４８０／５２０ｎｍにおいて決定した。
【００７８】
ＤＮＡライブラリーを調製するため、DNA Sample Prep Master Mix Set 1（NEB E6040
）を、Multiplexing Sample Preparation Oligo Kit（９６試料，Illumina PE-400-1001
）との組み合わせで用いた。全部の断片化されたＤＮＡを利用し、Multiplexing Sample Preparation Oligo Kitにおいて提供されたmultiplexing配列決定アダプターを用いて、
ＮＥＢのプロトコルに従った。ライブラリーのサイズ選択を、２％アガロースゲル（Low Range Ultra Agarose Biorad 161-3107）上で実施した。１Ｋｂ  Ｐｌｕｓラダー（Invitrogen 10787-018）を用いて、ゲルを１２０Ｖで２時間運転した。３００ｂｐ＋／−５０
ｂｐの断片を切り出し、Qiagen Gel Extraction Kitカラム（Qiagen 28704）上で溶離し
、２３μｌＥＢ中に溶離した。
【００７９】
Illuminaライブラリー増幅指標プロトコルを、以下の変更を加えて用いた：２２μｌのＤＮＡを用いて、２１サイクルの運転を実施した。試料を、Qiaquick PCR Purification
カラム（Qiagen 28101）上で精製し、５０μｌのＥＢ中で溶離し、１：５希釈し、ロータリーエバポレーター中で１０μｌに濃縮した。１μｌをAgilent 2100 HS DNAチップに適
用し、Agilent 2100上でのスメア分析により濃度を決定した。試料を１０ｎＭに希釈した。ＮａＯＨによる変性後、試料を１６ｐＭまで希釈した。Paired-Endフローセルを、Cluster Stationユーザーガイドに従って調製した。配列決定を、ＨｉＳｅｑユーザーガイド
（Multiplexed PE Runの実施）に従って、paired end運転に関して２×５１サイクルで実施した。
【００８０】
全ゲノムマイクロアレイハイブリダイゼーションに関して、それぞれの試料からの総ＲＮＡ５００ｎｇを、蛍光色素（Ｃｙ３；Amersham Biosciences Corp，ニュージャージー
州ピスカタウェイ）で、Low RNA Input Linear Amplification Labellingキット（Agilent Technologies，カリフォルニア州パロアルト）を製造業者のプロトコルに従って用いて標識した。蛍光標識されたｃＲＮＡの量および質を、NanoDrop ND-1000分光光度計およびAgilent Bioanalyzerを用いて評価した。製造業者の指定に従って、１．６ｍｇのＣｙ３
標識したｃＲＮＡを、Agilent Human Whole Genome Oligo Microarray（Agilent Technologies,Inc.，カリフォルニア州パロアルト）に１７時間ハイブリダイズさせた後、洗浄し、走査した。データを、走査された画像から、Feature Extraction Software（Agilent Technologies,Inc.，カリフォルニア州パロアルト）を用いて抽出した。
【００８１】
全ゲノムＤＮＡのＭＢＤ−ｓｅｑは、偽発見率（ＦＤＲ）＜０．１およびｍＲＮＡマイクロアレイデータにより定められるような、差次的にメチル化されたプロモーターの転写産物（ＤＭＴ）を明らかにし、ＦＤＲ＜０．１により定められる差次的に発現された転写産物（ＤＥＴ）を明らかにした。転写産物は、差次的にメチル化／転写された遺伝子および非コードＲＮＡの両方を含んでいた。ＢＣＭ−７により特定の生物学的または機能的に関連する経路において誘導された後成的変化ならびに転写変化を、Ingenuity Pathway Analysis（ＩＰＡ）ツールを用いて評価し、最高の影響を示す経路を同定した。結果を表５において示す。
【００８２】
【表５】
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【００８３】
実施例１０：ＢＣＭ−７のサイトカインの後成的状態への作用
いくつかの個々のサイトカインは、ＩＢＤおよびクローン病のような疾患における炎症反応の媒介に関わっていることが報告されている。ＮＦカッパＢが１つの例である。同様に、インターロイキン、例えばＩＬ１、ＩＬ１０、ＩＬ３３等も、ＩＢＤにおける炎症応答の媒介に関わっていることが報告されている。ＢＣＭ−７のインターロイキンおよびＮＦカッパＢへの後成的作用を、上記で実施例９において記載した方法を用いて調べた。図８および９は、ＢＣＭ−７の、これらの遺伝子、すなわちＭＰＯ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ１０およびＮＦカッパＢ活性化タンパク質の遺伝子内またはプロモーター領域付近のＤＮＡメチル化の変化への作用を示す。“ＣｐＧ”は、その特定の遺伝子座において記述されたＣｐＧアイランド（シトシン−グアニンが高頻度である部位）の正常なレベルを意味する。“対照”は、未処置の対照を示す。
【００８４】
本発明は、例として記載されてきたが、特許請求の範囲において定義されるような本発明の範囲から逸脱することなく変更および修正を行うことができることは、理解されるべきである。さらに、特定の特徴に対して既知の均等物が存在する場合、そのような均等物は、あたかも本明細書において具体的に言及されたかのように、組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年6月10日(2019.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物において炎症性応答を媒介する原因となる１またはそれより多くの遺伝子に対する後成的変化を予防または最小化するための組成物であって、該組成物はベータカゼインを含有し、そしてここで当該ベータカゼインは、ベータカゼインのアミノ酸配列の６７位にプロリンを有するベータカゼインのバリアントを少なくとも５０重量％含む、前記組成物。
【請求項２】
ベータカゼインが、少なくとも５０重量％のベータカゼインＡ２を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ベータカゼインが、動物の消化管における酵素消化によりベータカゾモルフィン−７を生成することができるベータカゼインのバリアントを５０重量％より少なく含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
１またはそれより多くの遺伝子に対する後成的変化を予防または最小化することが、腸炎症を生じる危険性を低減する、請求項１〜３のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項５】
腸炎症が、炎症性腸疾患である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
炎症性腸疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
腸炎症が、過敏性腸症候群である、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
１またはそれより多くの遺伝子が、ＭＰＯ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ１０、およびＮＦカッパＢからなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
該ベータカゼインが、少なくとも９０重量％のベータカゼインＡ２を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
ベータカゼインが、少なくとも９９重量％のベータカゼインＡ２を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ベータカゼインが、５０重量％未満のベータカゼインＡ１を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
ベータカゼインが、１０重量％未満のベータカゼインＡ１を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ベータカゼインが、１重量％未満のベータカゼインＡ１を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
組成物が、乳または乳製品である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
乳または乳製品が、ベータカゼインＡ２Ａ２遺伝子型を有することが知られている雌ウシから得られるものである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
乳が、新鮮な乳、粉乳、粉末から再構成された液乳、脱脂乳、ホモジナイズされた乳
、練乳、無糖練乳、低温殺菌乳、非低温殺菌乳、またはＵＨＴ乳である、請求項１４または１５に記載の組成物。
【請求項１７】
乳製品が、クリーム、ヨーグルト、乳餅、チーズ、バター、またはアイスクリームで
ある、請求項１４または１５に記載の組成物。
【請求項１８】
動物が、ヒト、イヌ、またはネコである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
動物において炎症性応答を媒介する原因となる１またはそれより多くの遺伝子に対する後成的変化を予防または最小化するための組成物の製造における乳の使用であって、当該乳はベータカゼインを含有し、そしてここで当該ベータカゼインは、ベータカゼインのアミノ酸配列の６７位にプロリンを有するベータカゼインのバリアントを少なくとも５０重量％含む、前記使用。
【外国語明細書】
2019165746000001.pdf