(57)【要約】【課題】CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集を高効率で行うことが可能なゲノム編集用キット、ゲノム編集用組成物、ゲノム編集方法、及びゲノム編集された細胞又は生物の製造方法を提供する。【解決手段】ウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、界面活性剤、並びに硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質を含むゲノム編集用キット、ウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、ガイドRNA、及び正電荷物質を含むゲノム編集用組成物、並びにウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、ガイドRNA、及び正電荷物質を細胞又は生物に接触させる工程を含む、ゲノム編集方法及びゲノム編集された細胞又は生物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、界面活性剤、並びに硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質を含むゲノム編集用キット。
【請求項２】
前記正電荷物質が硫酸プロタミンである、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
ガイドRNAを更に含む、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項４】
ドナーDNAを更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５】
ウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、ガイドRNA、並びに硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質を含むゲノム編集用組成物。
【請求項６】
ドナーDNAを更に含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
ウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、ガイドRNA、並びに硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質を細胞又は生物に接触させる工程を含む、ゲノム編集方法。
【請求項８】
（１）ウイルスエンベロープとCas9タンパク質とを接触させる工程、
（２）工程（１）で得られたウイルスエンベロープ及びCas9タンパク質を含む混合物と界面活性剤とを接触させる工程、
（３）工程（２）で得られたウイルスエンベロープ及びCas9タンパク質を含む混合物とガイドRNAとを接触させる工程、
（４）工程（３）で得られたウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質及びガイドRNAを含む混合物と、硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質とを接触させる工程、及び
（５）工程（４）で得られたウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、ガイドRNA及び正電荷物質を含む混合物を細胞又は生物に接触させる工程
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記工程において、更にドナーDNAを細胞又は生物に接触させる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（３）において、Cas9タンパク質、ウイルスエンベロープ及びガイドRNAを含む混合物を更にドナーDNAと接触させる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物が非ヒト生物である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞又は生物が浮遊細胞である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、ガイドRNA、並びに硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質を細胞又は生物に接触させる工程を含む、ゲノム編集された細胞又は生物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノム編集用キット、ゲノム編集用組成物、ゲノム編集方法、及びゲノム編集された細胞又は生物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ZFN、TALENに続く第3世代のゲノム編集ツールのCRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集技術は、多くの研究者に利用されており、ライフサイエンス研究に必要不可欠な技術になっている。しかし、免疫細胞などゲノム編集効率が低い細胞も数多く存在する。
【０００３】
HVJ-Eはトランスフェクション試薬の一つである。HVJ-Eは、センダイウイルス(Sendai virus ; Hemagglutinating virus of Japan)の細胞膜融合能を保持したまま、ゲノムを完全に不活化した粒子で、特殊な操作や設備を必要とせず、通常の実験室レベルで安全に使用できる非ウイルス性のトランスフェクションツールである。DNA、タンパク質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA/miRNAなどを封入したHVJ-Eベクターは、標的細胞に接触させると、エンベロープ表面のNHタンパク質が標的細胞膜上のシアル酸と結合し、Fタンパク質が膜融合を引き起こすことで、標的細胞に封入分子を導入できる。
【０００４】
このようなHVJ-Eを使用した技術としては、例えば、不活性化ウイルスエンベロープと外来物質とを混合する工程に先立ち、不活性化ウイルスエンベロープと界面活性剤とを接触させることにより、外来物質の導入が高効率となることが特許文献１において報告されている。また、不活性化エンベロープと外来物質とを接触させる工程以降に、遠心分離の工程がないことも特徴としており、操作性が改善されたことにより、外来物質導入のための組成物の調製が容易に実施できることも特許文献１において報告されている。
【０００５】
また、特許文献２では、HVJ-Eを含む溶液に、界面活性剤、硫酸プロタミン及びタンパク質を添加し、該溶液を攪拌してHVJ-Eへタンパク質を封入し、それを細胞に接触させることにより、1チューブ内でHVJ-Eとタンパク質を混合するだけで、簡便且つ効率的にタンパク質を細胞へ導入できることが報告されている。
【０００６】
特許文献３では、（Ａ）ソルビタンセスキオレエート等の脂質と、（Ｂ）アルブミン等のタンパク質と、（Ｃ）硫酸プロタミン等の正電荷物質とを混合するのみの簡便な作業により、優れた安全性及び遺伝子導入効率を備えた細胞内への遺伝子導入用組成物が得られることが報告されている。また、当該遺伝子導入用組成物には、更に（Ｆ）HVJなどのウイルスエンベロープが含まれていてもよいことが述べられている。
【０００７】
しかしながら、特許文献１〜３のいずれにも、HVJ-Eをゲノム編集に応用することについて具体的に言及された記載は存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−３４３８７４号公報
【特許文献２】特開２００８−２１２０２３号公報
【特許文献３】国際公開第２０１５／００５４３１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集を高効率で行うことが可能なゲノム編集用キット、ゲノム編集用組成物、ゲノム編集方法、及びゲノム編集された細胞又は生物の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、HVJ-Eを用いてCas9タンパク質及びガイドRNAを標的細胞に導入することにより従来の手法と比べて高い効率でCRISPR/Cas9システムによるゲノム編集が可能であるという知見を得た。
【００１１】
本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次のゲノム編集用キット、ゲノム編集用組成物、ゲノム編集方法、及びゲノム編集された細胞又は生物の製造方法を提供するものである。
【００１２】
(I) ゲノム編集用キット
(I-1) ウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、界面活性剤、並びに硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質を含むゲノム編集用キット。
(I-2) 前記正電荷物質が硫酸プロタミンである、(I-1)に記載のキット。
(I-3) ガイドRNAを更に含む、(I-1)又は(I-2)に記載のキット。
(I-4) ドナーDNAを更に含む、(I-1)〜(I-3)のいずれか一項に記載のキット。
【００１３】
(II) ゲノム編集用組成物
(II-1) ウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、ガイドRNA、並びに硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質を含むゲノム編集用組成物。
(II-2) ドナーDNAを更に含む、(II-1)に記載の組成物。
(II-3) 前記正電荷物質が硫酸プロタミンである、(II-1)又は(II-2)に記載の組成物。
【００１４】
(III) ゲノム編集方法
(III-1) ウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、ガイドRNA、並びに硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質を細胞又は生物に接触させる工程を含む、ゲノム編集方法。
(III-2) （１）ウイルスエンベロープとCas9タンパク質とを接触させる工程、
（２）工程（１）で得られたウイルスエンベロープ及びCas9タンパク質を含む混合物と界面活性剤とを接触させる工程、
（３）工程（２）で得られたウイルスエンベロープ及びCas9タンパク質を含む混合物とガイドRNAとを接触させる工程、
（４）工程（３）で得られたウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質及びガイドRNAを含む混合物と、硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質とを接触させる工程、及び
（５）工程（４）で得られたウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、ガイドRNA及び正電荷物質を含む混合物を細胞又は生物に接触させる工程
を含む、(III-1)に記載の方法。
(III-3) 前記工程において、更にドナーDNAを細胞又は生物に接触させる、(III-1)に記載の方法。
(III-4) 前記工程（３）において、Cas9タンパク質、ウイルスエンベロープ及びガイドRNAを含む混合物を更にドナーDNAと接触させる、(III-2)に記載の方法。
(III-5) 前記生物が非ヒト生物である、(III-1)〜(III-4)のいずれか一項に記載の方法。
(III-6) 前記細胞又は生物が浮遊細胞である、(III-1)〜(III-4)のいずれか一項に記載の方法。
(III-7) 前記正電荷物質が硫酸プロタミンである、(III-1)〜(III-6)のいずれか一項に記載の方法。
【００１５】
(IV) ゲノム編集された細胞又は生物の製造方法
(IV-1) ウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、ガイドRNA、並びに硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質を細胞又は生物に接触させる工程を含む、ゲノム編集された細胞又は生物の製造方法。
(IV-2) （１）ウイルスエンベロープとCas9タンパク質とを接触させる工程、
（２）工程（１）で得られたウイルスエンベロープ及びCas9タンパク質を含む混合物と界面活性剤とを接触させる工程、
（３）工程（２）で得られたウイルスエンベロープ及びCas9タンパク質を含む混合物とガイドRNAとを接触させる工程、
（４）工程（３）で得られたウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質及びガイドRNAを含む混合物と、硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質とを接触させる工程、及び
（５）工程（４）で得られたウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、ガイドRNA及び正電荷物質を含む混合物を細胞又は生物に接触させる工程
を含む、(IV-1)に記載の方法。
(IV-3) 前記工程において、更にドナーDNAを細胞又は生物に接触させる、(IV-1)に記載の方法。
(IV-4) 前記工程（３）において、Cas9タンパク質、ウイルスエンベロープ及びガイドRNAを含む混合物を更にドナーDNAと接触させる、(IV-2)に記載の方法。
(IV-5) 前記生物が非ヒト生物である、(IV-1)〜(IV-4)のいずれか一項に記載の方法。
(IV-6) 前記細胞又は生物が浮遊細胞である、(IV-1)〜(IV-4)のいずれか一項に記載の方法。
(IV-7) 前記正電荷物質が硫酸プロタミンである、(IV-1)〜(IV-6)のいずれか一項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集を高効率で行うことが可能なゲノム編集用キット及びゲノム編集用組成物を提供することができる。また、当該キット及び組成物は、従来はゲノム編集が困難であった浮遊細胞についても高い効率でゲノム編集を行うことが可能である。さらに、Cas9タンパク質とガイドRNAを別々に一定の手順でウイルスエンベロープと混合することで更にゲノム編集の効率を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】試験例１のJurkat細胞の試験結果を示す図である。
【図２】試験例２のJurkat細胞の試験結果を示す図である。
【図３】試験例３のHeLa細胞の試験結果を示す図である。
【図４】試験例４のHeLa細胞の試験結果を示す図である。
【図５】試験例５のJurkat細胞(gRNAターゲット：HPRT1)の試験結果を示す図である。
【図６】試験例５のK-562細胞(gRNAターゲット：PPIB)の試験結果を示す図である。
【図７】試験例５のU-937細胞(gRNAターゲット：PPIB)の試験結果を示す図である。
【図８】試験例６のHeLa細胞の試験結果を示す図である。6区は、50μM Scr71)溶液(ノックインエンハンサー、NHEJ阻害剤)をプレート内細胞に5μL/well添加後に、HVJ-Eベクター懸濁液組成物6を添加した。1)  Maruyama T, et al : Nat Biotechnol, 33 : 538-542, 2015
【図９】試験例６のHeLa細胞の試験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１９】
なお、本明細書において「含む(comprise)」とは、「本質的にからなる(essentially consist of)」という意味と、「のみからなる(consist of)」という意味をも包含する。
【００２０】
本発明における細胞又は非ヒト生物のゲノム編集方法及びゲノム編集された細胞又は非ヒト生物の製造方法は、ヒトの治療方法を含まないことを明示するものである。本明細書において、「封入」とは、ウイルスエンベロープの中にCas9タンパク質及びガイドRNA、並びに必要に応じてドナーDNAを入れることをいう。本明細書において「HAU」とは、ニワトリ赤血球0.5%を凝集可能なウイルスの活性を意味する。1HAUは、ほぼ2400万ウイルス粒子に相当する。
【００２１】
本発明のゲノム編集用キットは、ウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、界面活性剤、並びに硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質を含むことを特徴とする。
【００２２】
本発明のゲノム編集用組成物は、ウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、ガイドRNA、並びに硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質を含むことを特徴とする。
【００２３】
本発明のゲノム編集方法及びゲノム編集された細胞又は生物の製造方法(以下、これらの両方の方法を合わせて「本発明の方法」と称することがある)は、ウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、ガイドRNA、並びに硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質を細胞又は生物に接触させる工程を含むことを特徴とする。
【００２４】
本明細書において、ウイルスエンベロープは、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科及びヘパドナウイルス科に属するウイルス由来のエンベロープが挙げられるが、好ましくはパラミクソウイルス科に属するウイルス由来のエンベロープ、更に好ましくはセンダイウイルス由来エンベロープ(HVJ-E)である。より更に好ましくは、不活性化したHVJ-Eである。
【００２５】
本明細書において、「不活性化」とはゲノムが不活性化されることを意味し、不活性化したウイルスとはゲノムの複製が行われず増殖及び感染能を失った物を意味する。ウイルスの不活性化の方法としては、UV照射、放射線照射、アルキル化剤による処理などが挙げられるが、UV照射、アルキル化剤による処理が好ましく、アルキル化剤による処理がより好ましい。
【００２６】
本明細書において、ウイルスの「エンベロープ」とは、エンベロープを有する特定のウイルスに存在するヌクレオキャプシドの周囲を取り囲む脂質二重膜を基本とする膜構造のことをいう。
【００２７】
Cas9タンパク質としては、CRISPR/Cas9システムにおいて用いられる物であれば特に制限されず、ガイドRNAと複合体を形成した状態でゲノムDNAの標的部位に結合し、該標的部位を2本鎖又は1本鎖切断できる物を各種使用することができる。Cas9タンパク質としては、野生型及び変異体のいずれであってもよく、変異体の例としては切断に関与する2つのドメインのいずれかのドメインにおいて切断活性を損なわせる変異を有する物が挙げられる。Cas9タンパク質としては、各種生物由来の物が知られている。Cas9タンパク質のアミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコードする塩基配列の情報はNCBI等の公共のデータベースに登録されているので、公知の配列の情報を利用し、Cas9タンパク質をコードする核酸を導入した形質転換体を作製することでCas9タンパク質を製造することができる。また、Cas9タンパク質としては、各種市販品、例えば、Guide-it Recombinant Cas9、Alt-R S.p. Cas9 Nuclease 3NLS、Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS、Alt-R S.p. Cas9 D10A Nickase 3NLS、GeneArt Platinum Cas9 Nuclease、TrueCut Cas9 Protein v2、Cas9 Nuclease GFP NLS Protein、Alt-R A.s. Cpf1 Nuclease 2NLS、dCas9 protein NLSも存在するため、それらを使用することもできる。
【００２８】
ガイドRNA (gRNA)としては、CRISPR/Cas9システムにおいて用いられる物であれば特に制限されず、ゲノムDNAの標的部位に結合し且つCas9タンパク質と結合することにより、Cas9タンパク質をゲノムDNAの標的部位に誘導可能な物を各種使用することができる。
【００２９】
Cas9タンパク質がゲノムDNAに結合するためには、ゲノムDNAの標的配列は、標的配列の直後にPAM (Proto-spacer Adjacent Motif)配列を有する必要がある。
【００３０】
ガイドRNAは、crRNA (CRISPR RNA)(ゲノムDNAの標的部位への結合に関与する配列)を有しており、このcrRNAが、非標的鎖のPAM配列相補配列を除いてなる配列に相補的に結合することにより、ガイドRNAはゲノムDNAの標的部位に結合することができる。crRNAは、標的部位と結合するために、標的部位と、例えば、90%、93%、95%、98%、99%又は100%の同一性を有する配列を含んでいる。
【００３１】
塩基配列の同一性は、市販の又は電気通信回線(インターネット)を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。塩基配列の同一性(%)は、当該分野で慣用のプログラム(例えば、BLAST、FASTA等)を初期設定で用いて決定することができる。
【００３２】
また、ガイドRNAは、tracrRNA (trans-activating crRNA)(Cas9タンパク質との結合に関与する配列)を有しており、このtracrRNA配列が、Cas9タンパク質に結合することにより、Cas9タンパク質をゲノムDNAの標的部位に誘導することができる。
【００３３】
ガイドRNAは、通常、上記のcrRNA及びtracrRNAを含み、crRNA及びtracrRNAを含む一本鎖RNA、crRNAとtracrRNAとが相補的に結合してなるRNA複合体などのいずれの形態であってもよい。
【００３４】
標的配列の選択及びガイドRNAの設計は各種の公知の手法を採用することにより実施することができる。ガイドRNAは、化学合成(固相合成、液相合成等)、生化学的切断／再結合などの常法により調製することができる。
【００３５】
ドナーDNAは、Cas9タンパク質に切断された部位にて生じる相同組換え修復(Homology directed repair: HDR)を利用して、標的部位に所望の塩基配列を挿入(ノックイン)するための物である。ドナーDNAは、標的領域内の塩基配列と高い同一性を有する2つの塩基配列(相同性アーム)とそれらの間に配置された挿入する塩基配列を含む。ノックインする塩基配列は特に制限されない。ドナーDNAの鎖長は、特に制限されず、好ましくは50b〜500kb、より好ましくは50b〜5kbである。
【００３６】
ドナーDNAとしては、1本鎖DNA及び2本鎖DNAのいずれも使用でき、ゲノム編集効率の観点から、ドナーDNAは2本鎖DNAであることが好ましい。ドナーDNAは、鎖状DNA及び環状DNAのいずれも使用でき、ゲノム編集において、DNAのランダムな削り込み、付加等の意図しない変異の頻度をより低減できるという観点から、ドナーDNAは環状DNAであることが好ましい。
【００３７】
ドナーDNAは、PCR法、化学合成(固相合成、液相合成等)、生化学的切断／再結合などの常法により調製することができる。
【００３８】
界面活性剤としては、特に制限されず、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤のいずれも特に制限なく使用することができ、好ましくは非イオン性界面活性剤及び両性界面活性剤である。中でも、オクチルフェノールエトキシレート(Triton (登録商標) X-100など)、ノニルフェノールエトキシレート(NP40など)、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート(CHAPS)及びオクチルグルコシドがより好ましく、オクチルフェノールエトキシレート(Triton X-100など)が更に好ましい。界面活性剤は、1種単独又は2種以上を組み合わせて使用することができる。
【００３９】
正電荷物質としては、硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種が挙げられ、これらの中でも、硫酸プロタミンが好ましい。正電荷物質は、1種単独又は2種以上を組み合わせて使用することができる。
【００４０】
本発明のゲノム編集用キットは、ウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、界面活性剤、及び上記正電荷物質を含み、必要に応じてガイドRNA及び／又はドナーDNAを含み得る。本発明のキットは、アルコール類(例えば、エタノール)、緩衝液(例えば、リン酸緩衝生理食塩液(PBS)、HEPES緩衝液、Tris塩酸緩衝液、TE緩衝液)、細胞培養液(例えば、DMEM培地、RPMI培地)等を更に含み得る。
【００４１】
本発明のキットを構成する各成分は、それぞれ別の容器に収容されていてもよいし、任意の2以上の成分が1つの容器に収容されていてもよい。
【００４２】
本発明の組成物としては、例えば、Cas9タンパク質及びガイドRNA、並びに必要に応じてドナーDNAがウイルスエンベロープに封入されており、該ウイルスエンベロープの表面に硫酸プロタミンが存在している形態を有している。本発明の組成物における各成分の混合比及び濃度としては、ゲノム編集が行える範囲で適宜選択でき、例えば、後述する本発明の方法で得られる組成物における各成分の混合質量比及び濃度が挙げられる。
【００４３】
本発明の組成物は、ウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、ガイドRNA、及び上記正電荷物質、並びに必要に応じてドナーDNAの他に、水、アルコール類(例えば、エタノール)、緩衝液(例えば、リン酸緩衝生理食塩液、HEPES緩衝液、Tris塩酸緩衝液、TE緩衝液)、細胞培養液(例えば、DMEM培地、RPMI培地)等の添加物を含んでいてもよい。これら添加物の濃度は特に限定されない。本発明の組成物のpHは、6〜10が好ましい。
【００４４】
本発明の方法は、任意の条件下で行うことができる。ウイルスエンベロープへのCas9タンパク質及びガイドRNAの封入は、Cas9タンパク質及びガイドRNAの複合体を用いて一度に行うか、又はCas9タンパク質及びガイドRNAを各々別々に用いて連続的に行うことができる。中でも、後述するように、Cas9タンパク質及びガイドRNAを各々別々に封入することが好ましい。
【００４５】
本発明の方法は、以下の工程（１）〜（５）を含む手順により実施することが好ましい。
（１）ウイルスエンベロープとCas9タンパク質とを接触させる工程、
（２）工程（１）で得られたウイルスエンベロープ及びCas9タンパク質を含む混合物と界面活性剤とを接触させる工程、
（３）工程（２）で得られたウイルスエンベロープ及びCas9タンパク質を含む混合物とガイドRNAとを接触させる工程、
（４）工程（３）で得られたウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、及びガイドRNAを含む混合物と、硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質とを接触させる工程、及び
（５）工程（４）で得られたウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、ガイドRNA及び正電荷物質を含む混合物を細胞又は生物に接触させる工程
【００４６】
工程（１）において、ウイルスエンベロープ100 HAUに対して接触させるCas9タンパク質の量は、特に制限されず、好ましくは0.0001〜2 nmol、より好ましくは0.0002〜0.5 nmolである。工程（１）で使用するウイルスエンベロープを含む溶液の濃度は、特に制限されず、好ましくは10〜100 HAU/μl、より好ましくは15〜82 HAU/μlである。工程（１）は、低温度下で処理することが望ましく、温度は好ましくは0〜25℃であり、更に好ましくは0〜4℃である。接触させる時間は、通常1秒〜15分程度である。工程（１）によりCas9タンパク質をウイルスエンベロープに封入させることが可能となる。
【００４７】
工程（２）において、ウイルスエンベロープ及びCas9タンパク質を含む混合物と界面活性剤とを接触させる際、界面活性剤の最終濃度は好ましくは0.001〜0.5v/v%、より好ましくは0.02〜0.2v/v%である。工程（２）は、低温度下で処理することが望ましく、温度は好ましくは0〜25℃であり、更に好ましくは0〜4℃である。接触させる時間は、通常1秒〜15分程度である。工程（２）により、Cas9タンパク、ガイドRNA及びドナーDNAのウイルスエンベロープへの封入の効率を向上させることができる。
【００４８】
工程（２）の後、界面活性剤の濃度を下げるための処理を行ってもよく、そのような処理としては遠心分離による上清の除去及び交換、水、緩衝液などの添加による希釈などが挙げられる。遠心分離は、遠心後、上清を除去し、得られた沈殿に界面活性剤を含まないPBSなどの液体に再懸濁することにより行うことができる。
【００４９】
工程（３）において、ウイルスエンベロープ100 HAUに対して接触させるガイドRNAの量は、特に制限されず、好ましくは0.0001〜2 nmol、より好ましくは0.0002〜0.5 nmolである。工程（３）は、低温度下で処理することが望ましく、温度は好ましくは0〜25℃であり、更に好ましくは0〜4℃である。接触させる時間は、通常1秒〜15分程度である。工程（３）によりガイドRNAをウイルスエンベロープに封入させることができる。
【００５０】
HDRを行う場合は、工程（３）において、ウイルスエンベロープ及びCas9タンパク質を含む混合物を更にドナーDNAと接触させる。ウイルスエンベロープ100 HAUに対して接触させるドナーDNAの量は、特に制限されず、好ましくは0.0001〜2 nmol、より好ましくは0.0002〜0.5 nmolである。ドナーDNAとの接触は、ガイドRNAとの接触の後に行うことが好ましい。Cas9タンパク質が封入されたウイルスエンベロープを更にドナーDNAと接触させることで、ガイドRNAをウイルスエンベロープに封入させることができる。
【００５１】
工程（４）において、工程（３）で得られたウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質及びガイドRNAを含む混合物と正電荷物質とを接触させる際、正電荷物質の最終濃度は好ましくは0.01〜5000μg/ml、より好ましくは0.1〜3000μg/mlである。工程（４）は、低温度下で処理することが望ましく、温度は好ましくは0〜25℃であり、更に好ましくは0〜4℃である。接触させる時間は、通常1秒〜15分程度である。正電荷物質を添加する際には、必要により、工程（３）の後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)などにより希釈を行う。このように正電荷物質と接触させることでウイルスエンベロープの表面に正電荷物質が存在することになり、ゲノム編集の効率をより高めることができる。
【００５２】
工程（５）において、Cas9タンパク質、ウイルスエンベロープ、ガイドRNA及び正電荷物質を含む混合物を接触させる細胞としては、インビトロ培養細胞、生体から抽出した細胞、生体内に存在する細胞等が挙げられる。当該細胞は、接着細胞及び浮遊細胞のいずれであってもよい。中でも、浮遊細胞は従来技術と比べて、本発明の方法は高い効率でゲノム編集が可能である。一般には導入の困難な細胞系である初期細胞系、幹細胞系、線維芽細胞系、マクロファージ細胞系等を含め、広範囲な細胞を使用することができる。また、本発明で使用する細胞及び生物としては、好ましくは哺乳動物及びその細胞であり、哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギなどが挙げられる。
【００５３】
培養細胞又は生体から取り出した細胞に本発明の組成物を接触させる場合、例えば、細胞懸濁液又は培養上清中に本発明の組成物を添加することにより行うことができる。この場合、ウイルスエンベロープを添加する量は特に制限されず、好ましくは細胞5000〜100,000 cells当たり20〜60 HAUである。その後、例えば、細胞を37℃で約1時間インキュベート後、細胞の至適温度で20時間〜74時間インキュベートし、ゲノム編集が行われる。また、本発明の組成物は生体にin vivo法での投与又は全身的な投与を行うことも可能である。また、ex vivo法も可能であり、この場合には、常法に従い、対象個体の細胞を採取し、本発明の組成物で処理を行い、その後に当該細胞を対象個体へ戻すことにより行うことができる。
【００５４】
本発明のキット及びゲノム編集用組成物により、CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集を高効率で行うことが可能となる。また、当該キット及び組成物は、従来はゲノム編集が困難であった浮遊細胞についても高い効率でゲノム編集を行うことができる。さらに、本発明の方法では、Cas9タンパク質とガイドRNAを別々に一定の手順でウイルスエンベロープに封入することで更にゲノム編集の効率を高めることができる。
【００５５】
本発明により、これまでゲノムの破壊、修復などの編集(ノックアウト/ノックイン)が困難であった動物及び動物細胞において、短期間・低コストでゲノム編集が可能となり、疾患モデル細胞及び動物を作製し、それらを用いての治療研究、がん細胞及び多能性幹細胞でのスクリーニングによる機能解析などが可能となる。
【実施例】
【００５６】
以下に実施例を記載し、本発明を具体的に説明するが、これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであって、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限するものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。以下、実験で使用したHVJ-Eは商品名「GenomOne (登録商標)-Si」(石原産業株式会社製)に梱包されているHVJ-Eを使用した。当該HVJ-Eの濃度は1μlあたり34.1 HAUである。
【００５７】
試験例１
シクロフィリンＢ(PPIB)をターゲットとしたガイドRNA (gRNA、Dharmacon製)を用いて、周囲を氷で囲み0℃〜10℃程度に保ちながら、図１に示す試薬を上から順に、記載された分量で使用した。始めにHVJ-EにTriton X-100溶液(MP Biomedicals, Inc.製)を加え混合後、遠心分離(100000g、5分間、4℃)を行って上清除去し、バッファー(リン酸緩衝生理食塩水(PBS、Sigma-Aldrich製)：1リットル中の成分は、8 gのNaCl、0.2 gのKH2PO4、1.15 gのNa2HPO4、及び0.2 gのKClである。)で再懸濁した。その後、分注し、Cas9/gRNA複合体(Cas9RNPs、予め、18.4μM Cas9タンパク溶液 3.66μlと 50μM gRNA 5.44μlを混合した液)を添加及び混合後、硫酸プロタミン(PS)(ナカライテスク株式会社製)を加えた組成物を細胞に添加しゲノム編集を行った。編集によって生じたゲノム配列ミスマッチをT7 Endonuclease I (NEB製)アッセイ(T7E1アッセイ)で検出した。
【００５８】
ゲノム編集のためのCas9タンパク質(Clontech製)及びガイドRNAのトランスフェクションを行った後、2日間培養後、ゲノムを抽出した。ターゲット部分を含む約500bpをPCRで増幅後、精製したPCR断片を、再アニーリングし、ミスマッチを含むDNAのみを認識して切断するT7E1と反応させた。導入したガイドRNAでゲノム編集が起きていた場合にはアガロースゲル電気泳動で約330bpと約174bpの断片が観察される(図中の矢印の部分)。
【００５９】
図１に結果を示す。上記の試験方法に基づいたサンプルはlane 3に対応する。lane 2はHVJ-E、Triton X-100等の試薬の処理を行わず細胞をそのまま測定したもの、lane 4はHVJ-Eの代わりにLipofectamine (登録商標) CRISPRMAX (Invitrogen製)を製品プロトコル通りに用いたものである。一般にトランスフェクションが難しいとされている浮遊系免疫細胞のJurkat細胞ではLipofectamine CRISPRMAXではゲノム編集が認められず、HVJ-EでCas9タンパク質及びガイドRNAをトランスフェクションした区にゲノム編集効果が認められた。
【００６０】
試験例２
図２に示す試薬を上から順に、記載された分量で使用し、試験例１と同様の方法でゲノム編集を行った。
【００６１】
結果を図２に示す。上記の試験方法に基づいたサンプルはlane 3及び5に対応する。lane 2はHVJ-E、Triton X-100等の試薬の処理を行わず細胞をそのまま測定したもの、lane 4はTriton X-100を使用しないこと以外はlane 3及び5と同じ方法で行ったもの、lane 6はHVJ-Eの代わりにCRISPRMAXを用いたものである。HVJ-Eベクター懸濁液の形成において、HVJ-Eに界面活性剤を添加することで、Cas9RNPsが細胞に導入されることが分かる。
【００６２】
試験例３
図３に示す試薬を上から順に、記載された分量で使用し、条件2は試験例１と同様の方法でゲノム編集を行った。条件1はHVJ-EにCas9タンパク質を加えて混合後、Triton X-100の所定濃度の溶液を加え混合し、遠心及び上清除去後、バッファー(試験例１と同じ)で再懸濁した。その後、ガイドRNAを添加及び混合後、硫酸プロタミンを加えた組成物を細胞に添加した。
【００６３】
結果を図３に示す。左のlaneから順に、「分子量マーカー」、「HVJ-E、Triton X-100等の試薬の処理を行わず細胞をそのまま測定したもの(無処理)」、「条件2のもの」、「条件1のものでガイドRNAが順に600 nM、400 nM、200 nM、100 nMのもの」である。HVJ-EにCas9タンパク質を添加後、Triton X-100を添加し、遠心分離(100000g、5分間、4℃)及び上清除去後、バッファー(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、試験例1と同様)で再懸濁し、ガイドRNA、(PBSを添加)硫酸プロタミンを添加した組成物を細胞に添加すると、図３からわかるように高いゲノム編集が得られた。調製方法条件1でガイドRNA 100 nMは条件2よりもゲノム編集効果が高かった。条件2のようにCas9RNPsでHVJ-Eベクター懸濁液を形成する調製方法よりも、条件1の調製方法によるHVJ-Eベクター懸濁液をトランスフェクションした方がゲノム編集の効果が高い。
【００６４】
試験例４
図４に示す試薬を上から順に、記載された分量で使用し、ゲノム編集を行った。具体的には、HVJ-EにCas9タンパク質を添加後、Triton X-100を添加し、遠心及び上清除去後、バッファーで再懸濁し、ガイドRNA、硫酸プロタミンを添加した組成物を細胞に添加(トランスフェクション)した。
【００６５】
結果を図４に示す。図４からわかる通り、高いゲノム編集が得られた。Lipofectamine CRISPRMAX及びTransIT-X2試薬(Mirus製)よりも、HVJ-EベクターによってCas9タンパク質及びガイドRNAを細胞にトランスフェクションした方が高いゲノム編集効果が得られた。
【００６６】
試験例５
図５〜７に示す試薬を上から順に、記載された分量で使用し、試験例３の条件1と同様の方法でゲノム編集を行った。なお、図５の実験ではHPRT1をターゲットとしたガイドRNAを用いた。
【００６７】
結果を図５〜７に示す。Lipofectamine CRISPRMAX及びTransIT-X2試薬ではゲノム編集が難しい浮遊系免疫細胞のJurkat細胞、K-562細胞及びU-937細胞において、HVJ-EベクターによってCas9タンパク質及びガイドRNAを細胞にトランスフェクションするとゲノム編集効果が得られた。
【００６８】
試験例６
本発明の組成物にssDNA (ドナーDNA)を添加することで、ガイドRNAがターゲットとする箇所に組換え(ノックイン)ゲノム編集が可能である。図８及び９に示す試薬を上から順に、記載された分量で使用して、ゲノム編集を試みた。具体的には、BamHIサイトを持たせたドナーDNA (ノックインされる塩基配列GGATCCの上流と下流にそれぞれ30塩基のホモロジーアームを付加したドナーDNA、Dharmacon製)、並びにCas9タンパク質及びガイドRNAを含むHVJ-Eベクター懸濁液を細胞に添加してトランスフェクション後、37℃ CO2インキュベーターで2日間培養し、細胞からゲノムを抽出した。ターゲット部分を含む約500bpをPCRで増幅後、精製したPCR断片を、制限酵素BamHI (タカラバイオ株式会社製)と反応させた。ゲノム編集のターゲットとなるゲノムに組換え(ノックイン)が起きていた場合にはアガロースゲル電気泳動で約330bpと約174bpの断片が観察される(図中の矢印の部分)。
【００６９】
結果を図８及び９に示す。HeLa細胞でノックインが観察された。また、硫酸プロタミンの添加量を増量するとノックイン効果は高まった。一般にノックイン効果を高めるとされるエンハンサー効果よりも硫酸プロタミンの添加量を増やした方がその効果は高かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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