(57)【要約】      （修正有）【課題】胚の品質を決定するための非侵襲方法及びキットの提供。【解決手段】胚の品質を決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ非侵襲方法であって、胚を成長させる培養培地のサンプルを提供すること、サンプルから無細胞核酸を抽出すること、並びに核酸抽出物における該無細胞核酸のレベルを決定すること、並びに／又は核酸抽出物における少なくとも１つの特定の核酸配列の存在及び／若しくは発現レベルを決定することからなる工程を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ非侵襲方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚の品質を決定するためのin vitro非侵襲方法であって、ｉ）該胚を成長させる培養培地のサンプルを提供すること、ｉｉ）該サンプルから無細胞核酸を抽出すること、並びにｉｉｉ）核酸抽出物における該無細胞核酸のレベルを決定すること、並びに／又は核酸抽出物における少なくとも１つの特定の核酸配列の存在及び／若しくは発現レベルを決定することからなる工程を含む、in vitro非侵襲方法。
【請求項２】
ｉ）核酸抽出物における核酸のレベルを決定すること、ｉｉ）工程ｉ）で決定したレベルを基準値と比較すること、及びｉｉｉ）工程ｉ）で決定したレベルが該基準値よりも低い場合、胚がコンピテントであると結論することからなる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
胚が、胚発生の５日目又は６日目に対応する胚盤胞期に達したときに、サンプルを調製する、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
基準値が、胚発生の３日目の培養培地で決定した核酸のレベルにある、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ｉ）核酸抽出物における少なくとも１つの突然変異を検出すること、及びｉｉ）該突然変異が検出された場合、胚が遺伝的異常を有すると結論することからなる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ｉ）少なくとも１つの特定の核酸配列のレベルを決定すること、ｉｉ）工程ｉ）で決定したレベルを基準値と比較すること、及びｉｉｉ）工程ｉ）で決定したレベルが該基準値と異なる場合、胚が遺伝的異常を有すると結論することからなる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は一般に、生殖医療の分野に関する。より具体的には、本発明は、胚の品質を決定するための方法及びキットに関する。
【０００２】
発明の背景：
現在、生殖補助技術（ＡＲＴ）中に胚の品質を決定するための信頼性の高い市販の遺伝的又は非遺伝的な手法はない。特に、適切な子宮環境に移植した場合に、胚が生存可能な子孫を生じることができるかを決定するという本質的な問題が依然としてある。別の重要な問題は、胎児及びさらに後の小児の発育を生存可能にする胚の遺伝的プロファイリングを決定することである。
【０００３】
着床の可能性が高い胚の選択は、生殖補助技術（ＡＲＴ）の主要な課題の１つである。当初は、妊娠率を最大化するために、複数胚移植（ＭＥＴ）が使用されていた。しかしながら、胚の品質の改善及び多胎妊娠率の上昇は、代替用の胚の数の減少をもたらした。したがって、「最良の」胚の選択が重要になっており、特に、選択的単一胚移植（ＳＥＴ）が強く推奨されている。したがって、新たな客観的な胚選択アプローチを開発する必要性がある。ＩＶＦ及びＩＣＳＩ条件下で健全な胚を選択するための古典的な方法は、断片化の程度及び多核生成の存在、割球の数及びサイズ、初期胚の分裂などの主観的な形態学的基準に基づくものである（Ebner et al., 2003; Fenwick et al., 2002）。しかしながら、ほとんどの研究において、胚が適切な形態学的外観を有することのみでは、着床の成功を予測するのに十分ではないことが示唆されている。形態学的評価及び細胞遺伝学的スクリーニング方法の限界を考慮して、現在、より洗練された高性能な技術及び新たな「オミクス」科学、例えばトランスクリプトミクス及びメタボロミクスに向けた動きがある。これらのアプローチは、様々な体細胞及び胚培養培地に注目している。卵丘細胞（ＣＣＳ）遺伝子発現のトランスクリプトームデータを使用して、本発明者らのチームは、胚及び妊娠転帰を予測するための間接的で魅力的なアプローチを報告した（Assou et al., 2011; Assou et al., 2008）。本発明者らは、胚の形態学的側面とＣＣ遺伝子発現プロファイルとの間には関係がなかったことを観察した（Assou et al., 2010）。他の研究では、ラマン又は近赤外（ＮＩＲ）分光法による使用済み培養培地のメタボロームプロファイルは、個々の胚の生殖能力と相関することが報告された（Seli et al., 2007; Vergouw et al., 2008）。胚の培養培地のメタボロームプロファイリングは、形態と無関係であったことも示された。
【０００４】
着床率の減少の別の主な原因は、着床胚の遺伝的品質不良である。例えば、胚の消耗及び損失のほとんどは、全ての自然流産及び死産の約６０％で発生する致死的な異数性（染色体数異常）によって引き起こされる。他の遺伝的異常としては、染色体異数性、増幅、転座、挿入／欠失、逆位、ショートタンデムリピート多型、マイクロサテライト多型、一塩基多型（ＳＮＰ）及び他の構造的異常が挙げられる。遺伝的異常は、多くの表現型疾患を引き起こし得、いくつかは致死的でさえある。遺伝的異常が胚で発生した場合、多くの種類の出生前症状及び先天性疾患が発症する可能性がある。着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）によってこれらの異常をスクリーニングすることは、構造的に正常な胚の選択及び生存可能な着床を確実にするために非常に重要である。しかしながら、現在の方法は侵襲的であり、胚への不利益をもたらし得る。
【０００５】
血液、腹水、尿、羊水、糞便、唾液又は脳脊髄液などの生体液中で無細胞ＤＮＡを検出し得ることが報告された。ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどの様々な核酸が、無細胞形態で実際に単離及び検出された。ｃｆＤＮＡは、健常被験者では検出可能な量であることが見出され、いくつかの病理学的障害（ガン、心筋梗塞、自己免疫疾患、敗血症、外傷、．．．）又は特定の生理学的状態（懸命な努力、．．．）ではより多量であることが見出された。ｃｆＤＮＡの放出機構はあまり知られていないが、壊死、アポトーシス、食作用又は積極的放出に関与し得ることが示唆されている。ｃｆＤＮＡ分析は、診断分野における活発な研究領域であり、現時点では特に２つの領域において精査されている。しかしながら、胚の品質の決定では、ｃｆＤＮＡの検出はまだ調査されていない。
【０００６】
発明の概要：
本発明は、体外受精条件下で胚を成長させる培養培地中に無細胞核酸が存在するという劇的な発見に基づくものである。本発明者らは、培養培地中の前記無細胞核酸のレベルが、妊娠を生じさせる胚の能力に関する情報であることを実証する。また、本発明者らは、前記無細胞核酸の分析が、特定の配列の遺伝子の発現の検出及び発現を可能にし、胚の非侵襲的な遺伝子プロファイリング方法の開発への道を開くことを実証する。
【０００７】
発明の詳細な説明：
本発明は、胚の品質を決定するためのin vitro非侵襲的方法であって、ｉ）該胚を成長させる培養培地のサンプルを提供すること、ｉｉ）該サンプルから無細胞核酸を抽出すること、並びにｉｉｉ）核酸抽出物における該無細胞核酸のレベルを決定すること、並びに／又は核酸抽出物における少なくとも１つの特定の核酸配列の存在及び／若しくは発現レベルを決定することからなる工程を含むin vitro非侵襲方法に関する。
【０００８】
本明細書で使用される用語「胚」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、受精卵母細胞又は接合体を指す。用語「胚」はまた、受精卵母細胞又は接合体から５日又は６日（胚盤胞期）までの全ての発生段階にある細胞を指す。前記受精は、古典的な体外受精（ｃＩＶＦ）条件下、又は細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）法下で起こり得る。本発明の方法によって評価され得る胚の例としては、１細胞胚（また接合体とも称される）、２細胞胚、３細胞胚、４細胞胚、５細胞胚、６細胞胚、８細胞胚など（典型的には、最大で１６細胞胚を含む）が挙げられ、これらはいずれも、任意の便利な方法によって、例えばin vivoで成熟した卵母細胞から、又はin vitroで成熟した卵母細胞から生じ得る。本明細書で使用される用語「胚盤胞」は、桑実胚の形成後に、哺乳動物の初期胚発生で形成された構造を指す。それは、内部細胞塊（ＩＣＭ）又は胚結節（その後、これは胚を形成する）と、外側細胞層又はトロホブラスト（後に、これは胎盤を形成する）とを有する。トロホブラストは、内部細胞塊と、液体で満たされた胚盤胞腔（これは、胞胚腔として公知である）とを取り囲んでいる。ヒト胚盤胞は７０〜１００個の細胞を含む。ヒトでは、胚盤胞形成は、受精後５／６日目から始まる。
【０００９】
本発明によれば、卵母細胞は、天然サイクル、改変された天然サイクル、又はｃＩＶＦ若しくはＩＣＳＩのために刺激されたサイクルから生じ得る。用語「天然サイクル」は、雌又は女性が卵母細胞を産生する天然サイクルを指す。用語「改変された天然サイクル」は、リコンビナントＦＳＨ又はｈＭＧと併せてＧｎＲＨアンタゴニストによる穏やかな卵巣刺激の下で、雌又は女性が１つ又は２つの卵母細胞を産生する過程を指す。用語「刺激されたサイクル」は、リコンビナントＦＳＨ又はｈＭＧと併せてＧｎＲＨアゴニスト又はアンタゴニストによる刺激の下で、雌又は女性が１つ以上の卵母細胞を産生する過程を指す。
【００１０】
用語「古典的な体外受精」すなわち「ｃＩＶＦ」は、卵母細胞が体外（すなわち、in vitro）で精子と受精する過程を指す。ＩＶＦは、in vivoにおける受胎が失敗した場合の主な不妊処置である。用語「細胞質内精子注入」すなわち「ＩＣＳＩ」は、１つの精子を卵母細胞に直接注入する体外受精法を指す。この手法は、男性不妊要因を克服するために最も一般に使用されるが、精子が卵母細胞に容易に侵入し得ない場合にも使用され得、時には、精子提供に特に関連する体外受精方法として使用され得る。
【００１１】
「胚の品質の決定」は、胚がコンピテントであり、及び／又は体外受精との関連で遺伝的異常又は特定の配列を有するかを本発明の方法により決定しようとすることを意味する。本発明の方法は、高い妊娠率を付与し、及び／又は健常者をもたらすという観点のいずれか又は両方において、胚が上手く機能する能力の評価を可能にする。したがって、本発明の方法は、妊娠を生じさせることができる最良の胚の着床前遺伝子検査及び選択を組み合わせることができる。
【００１２】
用語「コンピテントな胚」は、妊娠につながる高い着床率を有する胚を指す。用語「高い着床率」は、子宮に移植した場合に、子宮環境に着床して、生存可能な胎児（そして今度はこれが、前記妊娠を終わらせる手順又は事象を伴わずに生存可能な子孫になる）を生じさせる胚の能力を意味する。
【００１３】
本明細書で使用される用語「遺伝的異常」は、個体（すなわち、胚）のゲノム中に存在し得る任意の事象であって、表現型疾患及び致死性を生じさせ得るものを指す。遺伝的異常としては、限定されないが、異数性、転座、遺伝子／遺伝子座の増幅、挿入、欠失、復帰、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）多型、マイクロサテライト多型、一塩基多型（ＳＮＰ）、遺伝性疾患に関与する単一遺伝子突然変異、又はそれらの組み合わせが挙げられる。特に、本発明の方法にしたがって、任意の遺伝的に伝達可能な疾患を検出し得る。例えば、遺伝子変化としては、遺伝子：ＣＦＴＲ、第ＶＩＩＩ因子（Ｆ８遺伝子）、ベータグロビン、血色素症、Ｇ６ＰＤ、神経線維腫症、ＧＡＰＤＨ、ベータアミロイド及びピルビン酸キナーゼの１つ以上に公知の変化が挙げられ得る。遺伝子の配列及び共通の突然変異（例えば、一塩基多型、すなわちＳＮＰ）は公知である。ヒト染色体で欠失している配列、転座若しくは逆位で移動している配列、又は染色体重複で重複している配列が関与するもの（前記配列は、公知の遺伝性障害の胎児遺伝物質において特徴付けられている）などの他の遺伝的異常を検出し得る。例えば、染色体異数性、例えばダウン症候群（又は２１トリソミー）、エドワーズ症候群（トリソミー１８）、パトー症候群（１３トリソミー）、ターナー症候群（４５Ｘ０）、クラインフェルター症候群（２本のＸ染色体を有する男性）、プラダー・ウィリー症候群及びディジョージ症候群。公知の遺伝的異常のリストは、OMIMデータベース（http://omim.org/）に見られ得る。
【００１４】
本発明の方法は、好ましくは、女性に適用可能であるが、理論的には他の哺乳動物（例えば、霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、マウス．．．）に適用可能であり得る。
【００１５】
本明細書で使用される用語「核酸」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、コード核酸配列又は非コード核酸配列を指す。核酸としては、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）及びＲＮＡ（リボ核酸）が挙げられる。したがって、核酸の例としては、限定されないが、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ及びｓｎＲＮＡが挙げられる。本発明によれば、核酸は、胚の核、又は胚のミトコンドリア区画に由来し得る。「無細胞核酸」は、核酸が胚によって放出され、体外受精又は細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）後に胚を成長させる培養培地中に存在することを意味する。
【００１６】
特定の実施態様では、胚が、胚発生の５日目又は６日目に対応する胚盤胞期に達したときに、サンプルを調製する。体外受精又は細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）後に胚を成長させた培養培地のサンプルを調製するために、当技術分野で周知の任意の方法を使用し得る。本発明の１つの本質的な特徴は、サンプルの調製中に、胚が生存可能であり続けることである。胚の完全性を維持するために、溶解酵素及び化学試薬系溶解溶液を使用しない。本発明の方法は、完全な非侵襲方法であり、胚が、未解明の機構によって核酸を培養培地中に放出することができるという事実にのみ依拠する。
【００１７】
当業者であれば、調製したサンプルから無細胞核酸を抽出するために、当技術分野で周知の任意の方法を使用し得る。例えば、実施例に記載されている方法を使用し得る。
【００１８】
特定の実施態様では、本発明の方法は、ｉ）核酸抽出物における核酸のレベルを決定すること、ｉｉ）工程ｉ）で決定したレベルを基準値と比較すること、及びｉｉｉ）工程ｉ）で決定したレベルが該基準値よりも低い場合、胚がコンピテントであると結論することからなる工程を含む。
【００１９】
核酸のレベルの決定は、当技術分野で周知の様々な技術によって実施され得る。特定の実施態様では、ＤＮＡのレベルを決定するために、例えば、El Messaoudi et al., 2013; Mouliere et al., 2013; Thierry et al., 2013及び国際公開公報第２０１２／０２８７４６号に記載されているように、定量ＰＣＲを実施し得る。特に、核酸のレベルの決定は、実施例に記載されているように実施され得る。
【００２０】
特定の実施態様では、基準値は、胚発生の３日目の胚培養培地で決定した核酸のレベルにある。したがって、胚発生の３日目−５日目又は６日目（胚盤胞期）におけるレベルの低下は、胚がコンピテントであることを示す。
【００２１】
特定の実施態様では、基準値は、実験的、経験的又は理論的に決定され得る閾値又はカットオフ値である。当業者であれば認識するように、閾値はまた、既存の実験条件及び／又は臨床状態に基づいて任意に選択され得る。試験及びベネフィット／リスクバランス（偽陽性及び偽陰性の臨床結果）に応じた最適な感度及び特異性を得るために、閾値を決定しなければならない。典型的には、最適な感度及び特異性（したがって、閾値）は、実験データに基づいて、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して決定され得る。好ましくは、当業者であれば、（本発明の方法にしたがって得られた）核酸レベルを規定の閾値と比較し得る。本発明の一実施態様では、ＩＶＦ又はＩＳＣＩを受けている１人以上の患者由来の胚培養培地で決定された核酸レベル（又は比若しくはスコア）から、閾値を求める。さらに、ＩＶＦ又はＩＳＣＩを受けている患者の適切に保存された歴史的な胚培養培地中の核酸レベル（又は比若しくはスコア）のレトロスペクティブ測定を、これらの閾値を確立するのに使用し得る。
【００２２】
特定の実施態様では、本発明の方法は、ｉ）核酸抽出物における少なくとも１つの突然変異を検出すること、及びｉｉ）該突然変異が検出された場合、胚が遺伝的異常を有すると結論することからなる工程を含む。
【００２３】
核酸、特にＤＮＡ又はｍＲＮＡ中の突然変異を検出するための典型的な技術としては、限定されないが、制限フラグメント長多型、ハイブリダイゼーション技術、シークエンシング、エキソヌクレアーゼ耐性、マイクロシークエンシング、ｄｄＮＴＰを使用する固相伸長、ｄｄＮＴＰを使用する溶液中での伸長、オリゴヌクレオチドアッセイ、一塩基多型を検出するための方法、例えば動的アレル特異的ハイブリダイゼーション、ライゲーション連鎖反応、ミニシークエンシング、ＤＮＡ「チップ」、ＰＣＲ又は分子ビーコンと併せて一重又は二重標識プローブを用いるアレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションなどが挙げられる。
【００２４】
典型的には、増幅後に突然変異を検出する。例えば、突然変異部位に対して特異的であるか、又は突然変異部位を含有する領域の増幅を可能にする特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用する共役型の逆転写及び増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応による逆転写及び増幅（ＲＴ−ＰＣＲ））に、単離したＲＮＡを供し得る。第１の代替手段によれば、増幅産物の出現が特定の突然変異の存在の診断になるように、プライマーのアニーリング条件は、特異的な逆転写（適切な場合）及び増幅を確実にするように選択され得る。そうでなければ、ＲＮＡを逆転写及び増幅し得るか、又はＤＮＡを増幅し得、その後、適切なプローブを用いてハイブリダイゼーションによって、又は直接的なシークエンシングによって、又は当技術分野で公知の任意の他の適切な方法によって、増幅配列中の突然変異部位を検出し得る。例えば、ＲＮＡから得られたｃＤＮＡをクローニング及びシークエンシングして、突然変異を同定し得る。
【００２５】
特に、シークエンシングは、本発明との関連で使用され得る理想的な技術の代表的なものである。当業者であれば、ポリヌクレオチドをシークエンシングするためのいくつかの方法を熟知している。これらとしては、限定されないが、サンガーシークエンシング（ジデオキシシークエンシングとも称される）及びMetzger (Metzger ML 2005, Genome Research 1767)によって概説されている様々なsequencing-by-synthesis (SBS)法、ハイブリダイゼーションによる、ライゲーションによる（例えば、国際公開公報第２００５／０２１７８６号）、分解による（例えば、米国特許第５，６２２，８２４号及び米国特許第６，１４０，０５３号）シークエンシング、ナノポアシークエンシングが挙げられる。好ましくは、多重アッセイでは、ディープシークエンシングが好ましい。用語「ディープシークエンシング」は、並行して複数の核酸をシークエンシングする方法を指す。例えば、Bentley et al, Nature 2008, 456:53-59を参照のこと。Roche/454 (Margulies et al., 2005a)、Illumina/Solexa (Bentley et al., 2008)、Life/APG (SOLiD) (McKernan et al., 2009)及びPacific Biosciences (Eid et al., 2009)が生産している主要な市販のプラットフォームをディープシークエンシングに使用し得る。例えば、４５４法では、シークエンシングすべきＤＮＡを分画してアダプターに供給するか、又はアダプター含有プライマーを使用して、ＤＮＡのセグメントをＰＣＲ増幅し得る。アダプターは、ＤＮＡ捕捉ビーズに対する結合、並びにエマルジョンＰＣＲ増幅プライマー及びシークエンシングプライマーのアニーリングに必要な２５ｍｅｒのヌクレオチドである。ＤＮＡフラグメントを一本鎖にし、１本のＤＮＡフラグメントのみが１個のビーズに結合するようにＤＮＡ捕捉ビーズに結合させる。次に、油中水型混合物でＤＮＡ含有ビーズを乳化して、１個のビーズのみを含有するマイクロリアクターを得る。マイクロリアクター内でフラグメントをＰＣＲ増幅して、ビーズ当たり数百万のコピー数を得る。ＰＣＲ後、エマルジョンを破壊し、ビーズをピコタイタープレートにロードする。ピコタイタープレートの各ウェルは、１個のビーズのみを含有し得る。シークエンシング酵素をウェルに追加し、ヌクレオチドを一定順序でウェルに流す。ヌクレオチドが取り込まれると、化学発光シグナルをもたらす反応を触媒するピロリン酸塩が放出される。ＣＣＤカメラによってこのシグナルを記録し、ソフトウェアを使用してシグナルをＤＮＡ配列に翻訳する。イルミナ法（Bentley (2008)）では、アダプターに供給する一本鎖フラグメントを光学的に透明な表面に結合させ、「ブリッジ増幅」に供する。この手法は、ユニークなＤＮＡフラグメントのコピーをそれぞれ含有する数百万個のクラスタをもたらす。ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー及び４つの標識された可逆的ターミネーターヌクレオチドを追加し、レーザー蛍光によって表面をイメージングして、標識の位置及び性質を決定する。次いで、保護基を除去し、このプロセスを数サイクル繰り返す。SOLiDプロセス（Shendure (2005)）は４５４シークエンシングと類似しており、ビーズの表面上でＤＮＡフラグメントを増幅する。シークエンシングは、標識プローブのライゲーション及び検出のサイクルを含む。現在、いくつかの他のハイスループットシークエンシング技術��開発中である。このような技術の例は、Helicosシステム（Harris (2008))、Complete Genomics (Drmanac (2010))及びPacific Biosciences (Lundquist (2008)）である。これは、極めて急速に発達している技術分野であるので、様々なハイスループットシークエンシング方法を本発明に適用可能であることは、当業者には自明であろう。
【００２６】
特定の実施態様では、本発明の方法は、ｉ）少なくとも１つの特定の核酸配列のレベルを決定すること、ｉｉ）工程ｉ）で決定したレベルを基準値と比較すること、及びｉｉｉ）工程ｉ）で決定したレベルが該基準値と異なる場合（すなわち、ロックド核酸に応じて低くなるか又は高くなる）、胚が遺伝的異常を有すると結論することからなる工程を含む。
【００２７】
核酸（特に、遺伝子、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ及びｓｎｏＲＮＡ）の発現レベルの決定は、多種多様な周知の方法のいずれかによって評価され得る。典型的には、調製された核酸は、限定されないが、サザン分析又はノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析、例えば定量ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）及びプローブアッセイ、例えばGeneChip(商標)ＤＮＡアレイ（AFF YMETRIX）を含むハイブリダイゼーションアッセイ又は増幅アッセイに使用され得る。有利には、核酸の発現レベルの分析は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，２０２号に記載されている実験の実施態様）、リガーゼ連鎖反応（BARANY, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.88, p: 189-193, 1991）、自己持続配列複製（GUATELLI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.57, p: 1874-1878, 1990）、転写増幅システム（KWOH et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.86, p: 1173-1177, 1989）、Ｑ−βレプリカーゼ（LIZARDI et al., Biol. Technology, vol.6, p: 1197, 1988）、ローリングサークル複製（米国特許第５，８５４，０３３号）又は任意の他の核酸増幅方法による核酸増幅、次いで、当業者に周知の技術を使用する増幅分子の検出のプロセスを含む。リアルタイム定量又は半定量ＲＴ−ＰＣＲが好ましい。特定の実施態様では、決定は、サンプルを選択試薬、例えばプローブ又はプライマーとハイブリダイゼーションさせ、それにより、核酸の存在を検出すること又は核酸の量を測定することを含む。ハイブリダイゼーションは、プレート、マイクロタイターディッシュ、試験管、ウェル、ガラス、カラムなどの任意の適切なデバイスによって実施され得る。関心対象の核酸に対して配列相補性又は相同性を示す核酸は、本明細書では、ハイブリダイゼーションプローブ又は増幅プライマーとして有用である。このような核酸は同一である必要はないが、典型的には、比較可能なサイズの相同領域と少なくとも約８０％同一、より好ましくは８５％同一、さらにより好ましくは９０〜９５％同一であると理解される。特定の実施態様では、ハイブリダイゼーションを検出するために、検出可能な標識などの適切な手段と組み合わせて核酸を使用することが有利であろう。蛍光、放射能、酵素又は他のリガンド（例えば、アビジン／ビオチン）を含む多種多様な適切な指示薬が当技術分野で公知である。プローブ及びプライマーは、それらがハイブリダイゼーションする核酸に対して「特異的」である（すなわち、それらは、好ましくは、高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件（最高融解温度Ｔｍ、例えば５０％ホルムアミド、５×又は６×ＳＣＣに対応する。１×ＳＣＣは、０．１５M ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）下でハイブリダイゼーションする。Qiagen (S.A. Courtaboeuf, France)又はApplied Biosystems (Foster City, USA)から、多くの定量アッセイが市販されている。核酸の発現レベルは、絶対発現プロファイル又は正規化発現プロファイルとして表され得る。典型的には、関心対象の核酸の発現を、無関係な核酸（例えば、恒常的に発現しているハウスキーピングｍＲＮＡ）の発現と比較することにより、関心対象の核酸の絶対発現プロファイルを補正することによって、発現プロファイルを正規化する。正規化に適切なｍＲＮＡとしては、ハウスキーピングｍＲＮＡ、例えばＵ６、Ｕ２４、Ｕ４８及びＳ１���が挙げられる。この正規化は、あるサンプル（例えば、患者サンプル）における発現プロファイルと別のサンプルとの比較、又は異なる供給源由来のサンプル間の比較を可能にする。
【００２８】
プローブ及び又はプライマーは、典型的には、検出可能な分子又は物質、例えば蛍光分子、放射性分子又は当技術分野で公知の任意の他の標識で標識される。シグナルを（直接的又は間接的に）一般に提供する標識が、当技術分野で公知である。用語「標識」は、検出可能な物質をカップリング（すなわち、物理的に連結）することによるプローブ及びプライマーの直接的な標識、並びに直接的に標識される別の試薬との反応性による間接的な標識を包含することを意図する。検出可能な物質の例としては、限定されないが、放射性薬剤又はフルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はフィコエリトリン（ＰＥ）又はインドシアニン（Ｃｙ５））が挙げられる。
【００２９】
基準値は、上記のように決定され得、胚が遺伝的異常又は特定の核酸配列を有すると結論するために発現レベルの決定が必要な核酸に依存するであろう。
【００３０】
本発明の方法は、臨床判断を下すのに特に適切である。本明細書で使用される用語「臨床判断」は、胚の健康又は生存に影響を与える転帰をもたらす措置を取る又は取らないという任意の判断を指す。特に、本発明との関連では、臨床判断は、胚を患者の子宮内に移植するか否かの判断を指す。臨床判断はまた、さらなる試験を行うという判断、望ましくない表現型を緩和するための措置を取るという判断、又は異常を有する子供の誕生について準備するために措置を取るという判断を指し得る。したがって、特に、上記方法は、発生学者が、妊娠転帰の可能性が低い胚を子宮内に移植するのを回避するのに役立つであろう。上記方法はまた、着床及び妊娠をもたらすことができるコンピテントな胚を選択することによって、多胎妊娠を回避するのに特に適切であるので、各サイクルで移植可能な胚はより少なくなり、その結果、多胎妊娠の発生率が低下する。
【００３１】
本発明の方法は、遺伝的異常を有するリスクが最小の子供の妊娠転帰を高めるのに特に適切である。したがって、本発明はまた、患者の妊娠転帰を高めるための方法であって、ｉ）複数の胚を提供すること、ｉｉ）本発明による方法によって、該胚の品質を決定すること、及びｉｉｉ）遺伝的異常を有するリスクが最小の最もコンピテントな胚を選択すること、及びｉｖ）工程ｉｉｉ）で選択した胚を前記患者の子宮内に移植することからなる工程を含む方法に関する。
【００３２】
本発明はまた、上記方法を実施するためのキットであって、無細胞核酸のレベルを決定するための手段、及び／又は少なくとも１つの特定の核酸の発現レベルを決定するための手段、及び／又は核酸抽出物における少なくとも１つの突然変異、１つのＳＮＰ若しくは特定の配列を検出するための手段を含むキットに関する。典型的には、前記キットは、上記プローブ、プライマー、マクロアレイ又はマイクロアレイを含む。例えば、前記キットは、予め標識され得る上に定義したプローブのセットを含み得る。あるいは、プローブを標識しなくてもよいし、又は標識のための成分を別個の容器でキットに含めてもよい。前記キットは、ハイブリダイゼーション試薬又は特定のハイブリダイゼーションプロトコールに必要な他の適切にパッケージングされた試薬及び材料（固相マトリックスを含み、場合によっては標準物質を含む）をさらに含み得る。あるいは、本発明のキットは、予め標識され得るか、又はアフィニティ精製部分若しくは付着部分を含有し得る増幅プライマー（例えば、ステムループプライマー）を含み得る。前記キットは、増幅試薬と、さらには特定の増幅プロトコールに必要な他の適切にパッケージングされた試薬及び材料とをさらに含み得る。
【００３３】
以下の図面及び実施例によって、本発明をさらに例証する。しかしながら、これらの実施例及び図面は、決して本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】３日目における２人の患者由来のいくつかの胚の培養培地中のｃｆＤＮＡ濃度。
【図２】５／６日目における９人の患者由来のいくつかの胚の培養培地中のｃｆＤＮＡ濃度。
【図３】３日目及び５日目における２人の患者由来のいくつかの胚の培養培地中のｃｆＤＮＡ濃度。黒色のヒストグラム、５／６日目の濃度。白色のヒストグラム、３日目の濃度。
【図４Ａ】各胚グレードの３日目と５／６日目との間のｃｆＤＮＡ濃度の差。シリーズ１のヒストグラム、３日目−５／６日目の濃度（ng/mL ｃｆＤＮＡ）；シリーズ２のヒストグラム、各成長グレード（１〜１０）のランキング。ＨＳＣ患者の胚のシリーズにおいて、ｃｆＤＮＡ濃度値を求めた。
【図４Ｂ】各胚グレードのｃｆＤＮＡ濃度。シリーズ１のヒストグラム、５／６日目の濃度（ng/mL ｃｆＤＮＡ）；シリーズ２のヒストグラム、各成長グレード（１〜１０）のランキング。ＨＳＣ患者の胚のシリーズにおいて、ｃｆＤＮＡ濃度値を求めた。
【図５】培養培地中のｃｆＤＮＡと妊娠転帰との間の関係。陽性妊娠患者及び陰性妊娠患者に由来する５／６日目の胚培養培地中の平均ｃｆＤＮＡ量を比較するヒストグラム。
【図６Ａ】ヒストグラムは、卵巣、精巣、ＭＩＩ卵母細胞、３日目胚、５／６日目胚盤胞、栄養外胚葉及び子宮内膜サンプルにおける遺伝子のマイクロアレイシグナル値を示す。ＭＩＩ卵母細胞、３日目胚、５／６日目胚盤胞、栄養外胚葉及び子宮内膜サンプルからのマイクロアレイデータは、本発明者らのチームから入手し、卵巣及び精巣サンプルのものは、仮アクセッションナンバー（ＧＰＬ５７０）によってGene Expression Omnibus (GEO)から入手した。
【図６Ｂ】ヒストグラムは、卵巣、精巣、ＭＩＩ卵母細胞、３日目胚、５／６日目胚盤胞、栄養外胚葉及び子宮内膜サンプルにおける遺伝子のマイクロアレイシグナル値を示す。ＭＩＩ卵母細胞、３日目胚、５／６日目胚盤胞、栄養外胚葉及び子宮内膜サンプルからのマイクロアレイデータは、本発明者らのチームから入手し、卵巣及び精巣サンプルのものは、仮アクセッションナンバー（ＧＰＬ５７０）によってGene Expression Omnibus (GEO)から入手した。
【００３５】
実施例
材料及び方法
ＩＶＦ法
女性は、ゴナドトロピン放出ホルモン（Ｇｎ−ＲＨ）の長期処置又はアンタゴニストプロトコール処置を受け、次いで、ｈＭＧ（ヒト閉経ゴナドトロピン）又はリコンビナント卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）による卵巣刺激を受けた。経膣超音波検査において、少なくとも３つの卵胞が平均直径１７mmに達したら、ｈＣＧ ５０００IUを投与した。次いで、３６時間後に、超音波経膣穿刺によって、卵母細胞を回収した。示されているように、通常のＩＶＦ又はＩＣＳＩを使用した。卵母細胞受精又はマイクロインジェクションの１６〜２０時間後に、倒立顕微鏡下における２つの異なる前核＋２つの極体の存在によって、受精を確認した。次いで、接合体を培養培地（G1.5, Vitolife, Sweden）の新鮮な液滴 ３０μlに個別に入れて鉱油でカバーし、５％酸素環境を提供するトリガスインキュベーター内で維持した。常に、全ての胚を個別の液滴で培養した。胚を拡大培養培地中に入れ、５日目まで継続した。Ｇ２．５培地（Vitolife, Sweden）を拡大培養に使用した。
【００３６】
本発明の培養培地中のｃｆＤＮＡの定量
胚培養培地のサンプリング
胚を取り出した後、ラベルしたクライオバイアルに培養培地を個別に入れ、次いで、ランダムに割り当てたアクセッションナンバーで再度ラベルした。収集した試料を急速凍結し、−８０℃で保存した。胚を含まない同じ条件下でインキュベーションしたコントロールサンプルも収集した。最大５０μLを培養培地からサンプリングし得る。
【００３７】
ｃｆＤＮＡの抽出
３日目又は５／６日目のサンプルの場合、初期容量３０μLをＰＢＳ １×１７０μLで２００μLにした。５日目のサンプルの場合、初期容量１０μLをＰＢＳ １×１９０μLで２００μLにした。続いて、ＤＮＡ抽出のために、サンプルをどちらか直ぐに処理した。「血液及び体液プロトコール」にしたがって、QIAmp DNA Mini Blood Kit (Qiagen, Hilden, Germany)を使用して、サンプル ２００μLからＣｃｆＤＮＡを抽出した。ＤＮＡサンプルを使用まで−２０℃で保存した。
【００３８】
Ｑ−ＰＣＲによるｃｆＤＮＡの定量
MIQEガイドラインにしたがって、前記方法及びデータ記述を行った。CFXマネージャ（商標）ソフトウェア（Bio-Rad, Hercules, CA）を使用してCFX 96（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システムによって、ｑ−ＰＣＲ増幅を反応容量２５μlで少なくとも２回反復で行った。各ＰＣＲ混合物は、ＰＣＲミックス（Bio-Rad Supermix SYBR Green）１２．５μl、各増幅プライマー（０．３pmol/μl）２．５μl、ＰＣＲ分析水 ２．５μl及びＤＮＡ抽出物 ５μlから構成されていた。熱サイクリングは、３回繰り返す工程から構成されていた：ホットスタートポリメラーゼの活性化−変性工程を９５℃で３分間、次いで、９５℃で１０秒間を４０サイクル繰り返し、次いで、６０℃で３０秒間。０．２℃ごとのプレートリーディングで、温度を５５℃から９０℃に増加させることによって、融解曲線を求めた。ヒト胎盤細胞（Sigma, Munich, Germany）由来のゲノムＤＮＡの系列希釈物を定量用の標準として使用し、それらの濃度及び品質を、Qubit（登録商標）２．０蛍光光度計（Life Technologies）を使用して評価した。全てのＱ−ＰＣＲのランには、ルーチンな品質のネガティブコントロール及びポジティブコントロールが含まれていた。各サンプルを３回反復で分析し、各アッセイを少なくとも１回繰り返した。得られたｃｆＤＮＡ濃度を、標準曲線を使用して正確な濃度に対して正規化した。２回の実験（ｎ＝１２）から、ｃｆＤＮＡ抽出及びＱ−ＰＣＲ分析による濃度値の変動係数を２４％と計算した。表１に記載されているプライマーシステム（KRAS B1 inv kセンス：配列番号：１；及び KRAS B2 inv kアンチセンス：配列番号：２）を使用することによって、サンプル中のｃｆＤＮＡの定量及び標準曲線の作成を実施した。試験によって決定した濃度値は、２４％の変動係数を示す。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
プライマーの設計
選択したプライマーの配列及び特徴を表１に示す。プライマー３ソフトウェアを使用してプライマーを設計し、核酸フォールディングソフトウェア（mfold and oligoAnalyzer 1.2）を用いて、自己分子アニーリング又は分子間アニーリングについて、全ての配列を検査した。本発明者らは、設計したプライマーの特異性を確認するために、ＢＬＡＳＴプログラムによるローカルアライメント分析を実施した。オリゴヌクレオチドを合成し、Eurofins (Ebersberg, Germany)によって高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）によってオリゴヌクレオチドの品質コントロールを実施した。
【００４１】
２コピーのヒトゲノム中に存在する配列を定量することができるように、Ｑ−ＰＣＲシステムを設計した。それは、１つのアレル中のこの配列を高特異的かつ高感度に定量することを可能にする。同じプライマーを用いてAllele Specific with Blocker PCRを使用することによって、より高い特異性が得られる（Mouliere, 2011）。この方法は、０．００５の突然変異体／ＷＴ比で、わずか１つのヌクレオチド差異を有する２つの配列を区別することを可能にする。したがって、特定の配列の検出及び定量は、ＷＴ配列に対して、数個のヌクレオチド差異からわずか１つのヌクレオチド差異を有する配列（例えば、点突然変異又はＳＮＰを有する配列）とを区別することに相当し得る。したがって、本明細書に示されている胚培養培地中のｃｆＤＮＡの定量の実証は、この方法が、単一ヌクレオチド突然変異、ＳＮＰ又は他の遺伝子変化の存在を検出する可能性を示す。
【００４２】
核ゲノム中の反復配列、例えばｌｙｎｅ配列又はミトコンドリア配列をターゲティングすると、より高い濃度値が得られ得る。
【００４３】
結果
胚培養培地中のｃｆＤＮＡの検出
ターゲティング配列は、二倍体細胞の核の１ゲノム当たり２コピーを有する。３日目又は５／６日目の胚培養培地中で、ｃｆＤＮＡを有意に検出することができた（図１）。この試験は、最小で１．５ng/ml培地を検出することができ、例えば、最小２ＧＥコピーが培養培地中に見られた。最大２７ng/ml ｃｆＤＮＡ又は３６ＧＥが、５／６日目の培養培地中で観察された（図２）。これらの数は胚発生に関係し得ることに留意する。このデータはそれ自体として、特定のＤＮＡ配列（二倍体細胞１個当たり最大２コピー）の存在の検出の可能性、したがってホモ接合性又はヘテロ接合性の遺伝的又は後成的な変化の存在可能性を示している。各患者について、全てのサンプルにおいて、ｃｆＤＮＡを有意に検出することができた（図２）。
【００４４】
サンプル間には有意な（１Ｌｏｇ）内変動及び間変動があるが、これは、ダイナミクス測定がサンプル間の比較を可能にするという考えを支持している。
【００４５】
ｃｆＤＮＡとin vitro胚転帰との間の関係
胚培養培地のｃｆＤＮＡ含量とin vitro胚発生との間の関係も調査した：
【００４６】
１１個の胚の培養培地中で、３日目及び５／６日目に決定したｃｆＤＮＡ濃度を比較することができた。（図４Ａ）に示されているように、形態学的基準によって評価したところ、３日目と５／６日目との間のｃｆＤＮＡ濃度の差の値は、良好な胚発生ではそれぞれ大きくなっている。（図４Ｂ）に示されているように、ｃｆＤＮＡ濃度値は、良好な胚発生に反比例している。したがって、５／６日目のｃｆＤＮＡ濃度及び３日目−５／６日目の濃度の減少は両方とも、in vitro胚発生のマーカーであると思われる。
【００４７】
３日目に良い品質の８細胞胚に発生し、５／６日目に胚盤胞期になった胚培養培地から単離したｃｆＤＮＡを選択し、３つの群に分けた：ｉ）５／６日目に良い品質の胚盤胞に発生し（グレード４ＡＡ、４ＡＢ又は４ＢＡ、５ＡＡ、５ＡＢ又は５ＢＡ）、妊娠をもたらした３日目の胚由来のｃｆＤＮＡ、（ｉｉ）５／６日目に中間品質の胚盤胞に発生した３日目の胚由来のｃｆＤＮＡ（グレード４ＢＢ又は５ＢＢ）、（ｉｉｉ）５／６日目に悪い品質の胚盤胞に発生した３日目の胚由来のｃｆＤＮＡ（グレード４ＣＣ又は５ＣＣ）（患者ＨＳＣについては、表２を参照のこと）。５／６日目に良い品質の胚盤胞に発生し（グレード４ＡＡ、４ＡＢ、４ＢＡ）、妊娠をもたらした３日目の胚由来の培養培地中のｃｆＤＮＡの量は、３日目及び５／６日目においてそれぞれ２２．１６ng/ml及び２．７５ng/mlであった（８８％、減少）。３日目と５／６日目との間のｃｆＤＮＡ値の変動は、中間グレードでは７．５５ng/ml及び１．８０ng/mlに減少し（７６％、減少）、悪いグレードの胚盤胞では６．４６ng/ml（３日目）及び３．７８（５／６日目）に減少した（４１％、減少）（表３）。興味深いことに、溶解した胚（lyzed embryo）では、この変動は非常に小さく、８．３６ng/ml（３日目）及び５．５７（５／６日目）である（３３％、減少）。加えて、患者の転帰にしたがって、５／６日目の胚培養培地中のｃｆＤＮＡ量を評価した。本発明者らは、非妊娠患者由来の５／６日目の胚培養培地中のｃｆＤＮＡが、妊娠患者のものよりも多かったことを示す（図５）。
【００４８】
胚培養培地中ｃｆＤＮＡを使用して男性胚を検出することができた
TSPY1(Testis specific protein, Y-linked 1)及びRPS4Y1(Ribosomal protein S4, Y-linked 1)などの遺伝子を使用して、胚の性別を明らかにすることができた。これは、Ｘ連鎖性疾患のリスクを有することが既知のカップル由来の胚をスクリーニングするための適切な戦略への道を開く。高密度オリゴヌクレオチドAffymetrix HG-U133Pマイクロアレイチップを使用して、ＸＸサンプル及びＸＹサンプルにおけるＴＳＰＹ１及びＲＰＳ４Ｙ１の発現を調査した。本発明者らの結果は、胚培養培地中のこれらの多コピー遺伝子（ｃｆＤＮＡ）を増幅することによって、ＴＳＰＹ１及びＲＰＳ４Ｙ１が、胚の性別判定のバイオマーカーとして有益であり得ることを明らかにしている（図６Ａ及び６Ｂ）。この方法は、Ｙ染色体上に位置する他の遺伝子：ＤＤＸ３Ｙ(DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 3, Y-linked)、ＥＩＦ１ＡＹ(Eukaryotic translation)及びY染色体遺伝子(SRY)に適用でき得る。
【００４９】
表２：胚培養培地中で検出されたｃｆＤＮＡに関する患者（ＨＳＣ）のＩＣＳＩ転帰。各成熟ＭＩＩ卵母細胞（受精、胚分割及び胚盤胞発生）から作成したデータを、発生学者が、Gardner and Schoolcraft 1999の形態学的基準にしたがって記録した。
【表２】
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【００５０】
表３：培養培地中のｃｆＤＮＡとin vitro胚発生との間の関係。５／６日目の胚盤胞の３つのグレード（良い（ＡＡ）、中間（ＢＢ）又は悪い品質（ＣＣ））を、３日目の良好な８細胞胚から求めた。結果は、３日目と５／６日目との間の培養培地中のｃｆＤＮＡ変動が、胚盤胞のグレードに応じて異なることを示している。
【表３】
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【００５１】
参考文献：
本出願を通して、本発明が関係する現状技術を様々な参考文献によって説明している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年5月22日(2019.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
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