(57)【要約】      （修正有）【課題】メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の関節内送達の方法の提供。【解決手段】メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の関節内送達の方法であって、その送達を必要としている対象の関節に、１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上のｍＲＮＡを含む組成物を投与し、これにより、前記組成物の投与が、前記関節において１つ以上のｍＲＮＡによってコードされた前記１つ以上のポリペプチドの発現をもたらすことを含む、前記方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１２月５日に出願された米国仮出願シリアル番号６２／０８８，１４１号に対する優先権を主張するものであり、この開示は、本明細書に参考として組み込まれる。
【０００２】
配列表
本明細書は、配列表（２０１５年１２月４日に「２００６８５−１２９１＿ＳＬ．ｔｘｔ」と命名された．ｔｘｔファイルとして電子提出されたもの）を参照する。この．ｔｘｔファイルは、２０１５年１２月３日に生成され、４，１１５バイトのサイズである。この配列表の内容全体は、参考として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
関節に関連するかまたは関節内に位置するタンパク質の損失、異常な発現、異常調節または過剰産生に直接的もしくは間接的に起因するものなどの関節疾患、障害または病状の治療に対して、有効な治療法が依然として必要とされている。関節疾患に対して有効な治療戦略を実現する上でいくつかのハードルが存在し、これは主として、関節の特有な解剖学及び生理学によるものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、とりわけ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）治療法に基づく、関節疾患、障害または病状の治療のための有効な方法及び組成物を提供する。本発明は、一部分は、ｍＲＮＡが、関節の複雑かつ特有な解剖学及び生理学にもかかわらず、関節に効果的に送達され得るとの予期せぬ観察に基づいている。実施例を含む本明細書に記載されるように、本発明者は、ｍＲＮＡを首尾よく送達させ、膝関節全体にわたって強い発現をもたらした。したがって、本発明者は、ｍＲＮＡに基づく送達を、関節疾患、障害または病状の治療のために、治療用タンパク質を関節内に効果的に送達するために用いることが可能であることを初めて立証した。
【０００５】
したがって、一態様において、本発明は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の関節内送達の方法を提供し、方法は、その送達を必要としている対象の関節に、１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上のｍＲＮＡを含む組成物を投与し、これにより、この組成物の投与が、関節において１つ以上のｍＲＮＡによってコードされた１つ以上のポリペプチドの発現をもたらすことを含む。
【０００６】
いくつかの実施形態において、この組成物は関節に局所的に投与される。いくつかの実施形態において、この関節は、線維性関節、軟骨性関節、または滑膜関節である。ある特定の実施形態において、この関節は滑膜関節である。いくつかの実施形態において、この組成物は、滑膜腔に直接投与される。
【０００７】
いくつかの実施形態において、１つ以上のポリペプチドの発現及び／または活性は、軟骨、靭帯、筋肉、滑膜内膜細胞、軟骨細胞、及び／または関節滑液において検出される。
【０００８】
いくつかの実施形態において、１つ以上のポリペプチドの発現及び／または活性は、投与後、少なくとも約６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、４週、または１ヶ月で検出可能である。
【０００９】
いくつかの実施形態において、１つ以上のｍＲＮＡのそれぞれは、約０．５ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、または１５ｋｂを超える長さを有する。
【００１０】
いくつかの実施形態において、１つ以上のｍＲＮＡによってコードされる１つ以上のポリペプチドは、関節内で正常に機能する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、１つ以上のｍＲＮＡによってコードされる１つ以上のポリペプチドは、抗炎症性である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、１つ以上のｍＲＮＡは、抗体をコードする。いくつかの実施形態において、この抗体は、完全型免疫グロブリン、（Ｆａｂ）２、（Ｆａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはｓｃＦｖである。いくつかの実施形態において、１つ以上のｍＲＮＡは、抗体重鎖、軽鎖、またはそれらの断片をコードする。いくつかの実施形態において、この組成物は、それぞれ抗体重鎖及び軽鎖をコードする２つの別個のｍＲＮＡを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、１つ以上のｍＲＮＡによってコードされる抗体は、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−１β抗体、抗ｓＴＮＦＲ−Ｉ抗体、抗−ｓＴＮＦＲ−ＩＩ抗体、抗ＩＬ−２抗体、抗ＩＦＮ−γ抗体、抗ＩＬ−１８抗体、抗ＩＬ−１２抗体、または抗ＩＬ−１２ｐ４０抗体である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、１つ以上のｍＲＮＡは、可溶性受容体をコードする。
【００１５】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される方法を用いて１つ以上のｍＲＮＡを送達することを含む、関節疾患、障害、または病状を治療する方法を提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、関節疾患、障害、または病状は、炎症性疾患、障害、または病状である。いくつかの実施形態において、この炎症性疾患、障害、または病状は、関節炎である。いくつかの実施形態において、この炎症性疾患、障害、または病状は、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、痛風、偽性痛風、腱炎、滑液包炎、手根管症候群、骨関節炎、滑膜炎、脊椎炎、アミロイドーシス、腰部脊椎管狭窄症、及び／または仙腸関節機能障害からなる群から選択される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、この組成物は、１週間に１回投与される。いくつかの実施形態において、この組成物は、１ヶ月に２回投与される。いくつかの実施形態において、この組成物は、１ヶ月に１回投与される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、１つ以上のｍＲＮＡは、１つ以上のナノ粒子内に封入される。いくつかの実施形態において、１つ以上のナノ粒子は、脂質またはポリマーベースのナノ粒子である。いくつかの実施形態において、１つ以上のナノ粒子は、リポソームを含む。いくつかの実施形態において、リポソームは、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、１つ以上のコレステロールベースの脂質、及び１つ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、１つ以上のカチオン性脂質は、Ｃ１２−２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＩＣＥ（イミダゾールベースの）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ及びＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ、ＨＧＴ４００３、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２０】
いくつかの実施形態において、１つ以上のカチオン性脂質は、ｃＫＫ−Ｅ１２：
【化１】
2019014742.tif 000002
を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、１つ以上の非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチジルコリン）、ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））から選択される。
【００２２】
いくつかの実施形態において、１つ以上のコレステロールベースの脂質は、コレステロールまたはペグ（ＰＥＧ）化コレステロールである。
【００２３】
いくつかの実施形態において、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質は、Ｃ６〜Ｃ２０の長さのアルキル鎖（複数可）を有する脂質に共有結合された最大５ｋＤａの長さのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、カチオン性脂質は、モル比でリポソームの約３０〜７０％を構成する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、リポソームは、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを含む。いくつかの実施形態において、リポソームは、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを、約５０：２５：２０：５、５０：２０：２５：５、５０：２７：２０：３、４０：３０：２０：１０、４０：３０：２５：５、または４０：３２：２５：３の比で含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、リポソームは、Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを含む。いくつかの実施形態において、リポソームは、Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを、約５０：２５：２０：５、５０：２０：２５：５、５０：２７：２０：３、４０：３０：２０：１０、４０：３０：２５：５、または４０：３２：２５：３の比で含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、リポソームは、ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを含む。いくつかの実施形態において、リポソームは、ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを、約５０：２５：２０：５、５０：２０：２５：５、５０：２７：２０：３、４０：３０：２０：１０、４０：３０：２５：５、または４０：３２：２５：３の比で含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、ポリマーベースのナノ粒子を含む。いくつかの実施形態において、ポリマーベースのナノ粒子は、ＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＩは、分岐鎖ＰＥＩである。
【００２９】
いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、約４０〜１００ｎｍ未満のサイズを有する。本明細書で使用されるナノ粒子のサイズは、粒子の最大直径によって定義される。
【００３０】
いくつかの実施形態において、１つ以上のｍＲＮＡは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾ヌクレオチドは、プソイドウリジン、Ｎ−１−メチル−プソイドウリジン、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、及び／または２−チオシチジンを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、１つ以上のｍＲＮＡは、非修飾である。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の関節内送達の方法であって、その送達を必要としている対象の関節に、１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上のｍＲＮＡを含む組成物を投与し、これにより、前記組成物の投与が、前記関節において１つ以上のｍＲＮＡによってコードされた前記１つ以上のポリペプチドの発現をもたらすことを含む、前記方法。
（項目２）
前記組成物が、前記関節に局所的に投与される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記関節が、線維性関節、軟骨性関節、または滑膜関節である、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記関節が、滑膜関節である、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
前記組成物が、前記滑膜腔に直接投与される、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記１つ以上のポリペプチドの前記発現及び／または活性が、軟骨、靭帯、筋肉、滑膜内膜細胞、軟骨細胞、及び／または前記関節の滑液において検出される、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記１つ以上のポリペプチドの前記発現及び／または活性が、投与後、少なくとも約６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、４週、または１ヶ月で検出可能である、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記１つ以上のｍＲＮＡのそれぞれが、約０．５ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、または１５ｋｂを超える長さを有する、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記１つ以上のｍＲＮＡによってコードされる前記１つ以上のポリペプチドが、関節内で正常に機能する、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記１つ以上のｍＲＮＡによってコードされる前記１つ以上のポリペプチドが、抗炎症性である、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記１つ以上のｍＲＮＡが、抗体をコードする、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記抗体が、完全型免疫グロブリン、（Ｆａｂ）２、（Ｆａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはｓｃＦｖである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記１つ以上のｍＲＮＡが、抗体重鎖、軽鎖、またはそれらの断片をコードする、項目１１または１２に記載の方法。
（項目１４）
前記組成物が、それぞれ抗体重鎖及び軽鎖をコードする２つの別個のｍＲＮＡを含む、項目１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記１つ以上のｍＲＮＡによってコードされる前記抗体が、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−１β抗体、抗ｓＴＮＦＲ−Ｉ抗体、抗−ｓＴＮＦＲ−ＩＩ抗体、抗ＩＬ−２抗体、抗ＩＦＮ−γ抗体、抗ＩＬ−１８抗体、抗ＩＬ−１２抗体、または抗ＩＬ−１２ｐ４０抗体である、項目１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記１つ以上のｍＲＮＡが、可溶性受容体をコードする、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
関節疾患、障害、または病状を治療する方法であって、先行項目のいずれか１項に記載の方法を用いて、１つ以上のｍＲＮＡを送達することを含む、前記方法。
（項目１８）
前記関節疾患、障害、または病状は、炎症性疾患、障害、または病状である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記炎症性疾患、障害、または病状が、関節炎である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記炎症性疾患、障害、または病状が、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、痛風、偽性痛風、腱炎、滑液包炎、手根管症候群、骨関節炎、滑膜炎、脊椎炎、アミロイドーシス、腰部脊椎管狭窄症、及び／または仙腸関節機能障害からなる群から選択される、項目１８または１９に記載の方法。
（項目２１）
前記組成物が、１週間に１回投与される、項目１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記組成物が、１ヶ月に２回投与される、項目１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記組成物が、１ヶ月に１回投与される、項目１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
前記１つ以上のｍＲＮＡが、１つ以上のナノ粒子内に封入される、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
前記１つ以上のナノ粒子が、脂質またはポリマーベースのナノ粒子である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記１つ以上のナノ粒子が、リポソームを含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記リポソームが、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、１つ以上のコレステロールベースの脂質、及び１つ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記１つ以上のカチオン性脂質が、Ｃ１２−２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＩＣＥ（イミダゾールベースの）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡならびにＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ、ＨＧＴ４００３、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記１つ以上のカチオン性脂質は、ｃＫＫ−Ｅ１２：
【化５】
2019014742.tif 000003
を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記１つ以上の非カチオン性脂質が、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチジルコリン）、ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、及びこれらの組み合わせから選択される、項目２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記１つ以上のコレステロールベースの脂質が、コレステロールまたはペグ（ＰＥＧ）化コレステロールである、項目２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記１つ以上のＰＥＧ修飾脂質が、Ｃ６〜Ｃ２０の長さのアルキル鎖（複数可）を有する脂質に共有結合された最大５ｋＤａの長さのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む、項目２７〜３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記カチオン性脂質が、モル比で前記リポソームの約３０〜７０％を構成する、項目２７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
前記リポソームが、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを含む、項目２７〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記リポソームが、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを、約５０：２５：２０：５、５０：２０：２５：５、５０：２７：２０：３、４０：３０：２０：１０、４０：３０：２５：５、または４０：３２：２５：３の比で含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記リポソームが、Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを含む、項目２７〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記リポソームが、Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを、約５０：２５：２０：５、５０：２０：２５：５、５０：２７：２０：３、４０：３０：２０：１０、４０：３０：２５：５、または４０：３２：２５：３の比で含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記リポソームが、ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを含む、項目２７〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
前記リポソームが、ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを、約５０：２５：２０：５、５０：２０：２５：５、５０：２７：２０：３、４０：３０：２０：１０、４０：３０：２５：５、または４０：３２：２５：３の比で含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記ナノ粒子が、ポリマーベースのナノ粒子を含む、項目２５に記載の方法。
（項目４１）
前記ポリマーベースのナノ粒子が、ＰＥＩを含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記ＰＥＩが、分岐鎖ＰＥＩである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記ナノ粒子が、約４０〜１００ｎｍ未満のサイズを有する、項目２４〜４２のいずれか１項に記載の方法。
（項目４４）
前記１つ以上のｍＲＮＡが、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目４５）
前記１つ以上の修飾ヌクレオチドが、プソイドウリジン、Ｎ−１−メチル−プソイドウリジン、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、及び／または２−チオシチジンを含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記１つ以上のｍＲＮＡが、非修飾である、項目１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【００３２】
本発明のその他の特徴、目的、及び利点は、詳細な説明、図面、及びそれらに続く特許請求の範囲において明らかである。しかしながら、詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲は、本発明の実施形態を表示してはいるが、例示の手段として提供されたものにすぎず、限定するものではないことを理解されたい。本発明の範囲内の様々な変更及び修正は、当業者には明らかとなるであろう。
【００３３】
これらの図面は例示の目的のものにすぎず、限定することを目的としない。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ−Ｂ】ＩＶＩＳイメージングを介して測定されたホタルルシフェラーゼ発光の例示的な可視化を示す。検出されたタンパク質は、ｃＫＫ−Ｅ１２ベースの脂質ナノ粒子（封入されたｍＲＮＡに基づいて５．０マイクログラム）を用いる関節内投与を介して送達されたＦＦＬのｍＲＮＡからのその産生の結果である。
【図１Ｃ】ＩＶＩＳイメージングを介して測定されたホタルルシフェラーゼ発光の例示的な可視化を示す。検出されたタンパク質は、ｃＫＫ−Ｅ１２ベースの脂質ナノ粒子（封入されたｍＲＮＡに基づいて５．０マイクログラム）を用いる関節内投与を介して送達されたＦＦＬのｍＲＮＡからのその産生の結果である。
【図２Ａ−Ｂ】ＩＶＩＳイメージングを介して測定された野生型マウスにおけるホタルルシフェラーゼ発光の例示的な可視化を示す。検出されたタンパク質は、Ｃ１２−２００ベースの脂質ナノ粒子（封入されたｍＲＮＡに基づいて５．０マイクログラム）を用いる関節内投与を介して送達されたＦＦＬのｍＲＮＡからのその産生の結果である。
【図２Ｃ】ＩＶＩＳイメージングを介して測定された野生型マウスにおけるホタルルシフェラーゼ発光の例示的な可視化を示す。検出されたタンパク質は、Ｃ１２−２００ベースの脂質ナノ粒子（封入されたｍＲＮＡに基づいて５．０マイクログラム）を用いる関節内投与を介して送達されたＦＦＬのｍＲＮＡからのその産生の結果である。
【図３Ａ−Ｂ】ＩＶＩＳイメージングを介して測定された野生型マウスにおけるホタルルシフェラーゼ発光の例示的な可視化を示す。検出されたタンパク質は、ＨＧＴ５００１ベースの脂質ナノ粒子（封入されたｍＲＮＡに基づいて２．５マイクログラム）を用いる関節内投与を介して送達されたＦＦＬのｍＲＮＡからのその産生の結果である。
【図３Ｃ】ＩＶＩＳイメージングを介して測定された野生型マウスにおけるホタルルシフェラーゼ発光の例示的な可視化を示す。検出されたタンパク質は、ＨＧＴ５００１ベースの脂質ナノ粒子（封入されたｍＲＮＡに基づいて２．５マイクログラム）を用いる関節内投与を介して送達されたＦＦＬのｍＲＮＡからのその産生の結果である。
【図４Ａ−Ｂ】ＩＶＩＳイメージングを介して測定された野生型マウスにおけるホタルルシフェラーゼ発光の例示的な可視化を示す。検出されたタンパク質は、２５ｋＤａの分岐ＰＥＩベースの脂質ナノ粒子（封入されたｍＲＮＡに基づいて２．５マイクログラム）を用いる関節内投与を介して送達されたＦＦＬのｍＲＮＡからのその産生の結果である。
【図４Ｃ】ＩＶＩＳイメージングを介して測定された野生型マウスにおけるホタルルシフェラーゼ発光の例示的な可視化を示す。検出されたタンパク質は、２５ｋＤａの分岐ＰＥＩベースの脂質ナノ粒子（封入されたｍＲＮＡに基づいて２．５マイクログラム）を用いる関節内投与を介して送達されたＦＦＬのｍＲＮＡからのその産生の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
定義
本発明がより容易に理解されるために、特定の用語が先ず以下に定義される。以下の用語及びその他の用語についての追加の定義は、明細書全体を通して記載される。
【００３６】
アルキル：本明細書で使用される「アルキル」とは、１〜１５個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素基（「Ｃ１〜１５アルキル」）を指す。いくつかの実施形態では、アルキル基は１〜３個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜３アルキル」）。Ｃ１〜３アルキル基の例としては、メチル（Ｃ１）、エチル（Ｃ２）、ｎ−プロピル（Ｃ３）、及びイソプロピル（Ｃ３）が挙げられる。いくつかの実施形態において、アルキル基は、８〜１２個の炭素原子を有する（「Ｃ８〜１２アルキル」）。Ｃ８〜１２アルキル基の例としては、ｎ−オクチル（Ｃ８）、ｎ−ノニル（Ｃ９）、ｎ−デシル（Ｃ１０）、ｎ−ウンデシル（Ｃ１１）、ｎ−ドデシル（Ｃ１２）などが挙げられるが、これらに限定されない。接頭語「ｎ−」（ノルマル）とは、非分岐アルキル基を指す。例えば、ｎ−Ｃ８アルキルは、−（ＣＨ２）７ＣＨ３を指し、ｎ−Ｃ１０アルキルは、−（ＣＨ２）９ＣＨ３などを指す。
【００３７】
改善：本明細書で使用される、用語「改善」は、病態の予防、低減もしくは緩和、または対象の病態の向上を意味する。改善としては、病状の完全な回復または完全な予防が含まれるが、これらが必ずしも必要ではない。いくつかの実施形態において、改善は、関連する疾患組織において不十分である関連するタンパク質のレベルまたはその活性を増加させることを含む。
【００３８】
アミノ酸：本明細書で使用される、用語「アミノ酸」とは、その広い意味では、ポリペプチド鎖中に組み込まれ得るあらゆる化合物及び／または物質を指す。いくつかの実施形態において、アミノ酸は、一般構造Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。いくつかの実施形態において、アミノ酸は、天然起源のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、アミノ酸は合成アミノ酸であり、いくつかの実施形態において、アミノ酸はｄ−アミノ酸であり、いくつかの実施形態において、アミノ酸はｌ−アミノ酸である。「標準アミノ酸」とは、天然起源のペプチド中に一般に見出される２０個の標準ｌ−アミノ酸のいずれかを指す。「非標準アミノ酸」とは、それが合成的に調製されるか、または天然供給源から得られるかに無関係に、標準アミノ酸以外のあらゆるアミノ酸を指す。本明細書で使用される「合成アミノ酸」は、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）、及び／または置換が含まれるが、これらに限定されない化学修飾アミノ酸を包含する。ペプチド中のカルボキシ−及び／またはアミノ−末端アミノ酸を含むアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基によって、及び／またはペプチドの活性に悪影響を及ぼすことなく、ペプチドの循環半減期を変更させることができる他の化学基による置換によって修飾され得る。アミノ酸は、ジスルフィド結合を伴ってもよい。アミノ酸は、１つ以上の化学成分（例えば、メチル基、アセテート基、アセチル基、リン酸基、ホルミル部分、イソプレノイド基、スルフェート基、ポリエチレングリコール部分、脂質部分、炭水化物部分、ビオチン部分など）に関連するものなどの、１つ以上の翻訳後修飾を含んでもよい。用語「アミノ酸」は、「アミノ酸残基」とほとんど同じ意味で使用され、遊離アミノ酸及び／またはペプチドのアミノ酸残基を指してもよい。それが遊離アミノ酸を指すのかまたはペプチドのアミノ酸残基を指すのかは、用語が使用されている文脈から明らかとなろう。
【００３９】
動物：本明細書で使用される、用語「動物」とは、動物界のあらゆる構成員を指す。いくつかの実施形態において、「動物」とは、発達のあらゆる段階におけるヒトを指す。いくつかの実施形態において、「動物」は、発達のあらゆる段階における非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態において、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／またはブタ）である。いくつかの実施形態において、動物としては、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫、及び／または寄生虫が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、動物は、遺伝子導入動物、遺伝子操作した動物、及び／またはクローンであってもよい。
【００４０】
およそまたは約：本明細書で使用される、用語「およそ」または「約」は、対象の値に適用されるとき、定められた基準値と同様である値を指す。ある特定の実施形態において、「およそ」または「約」は、特に明記しない限りまたは文脈上他の意味が明らかでない限り、定められた基準値のいずれかの方向で（それを超えるか、またはそれ未満で）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の範囲内に入る値の範囲を指す（このような数値が、可能な値の１００％を超える場合は除く）。
【００４１】
関節疾患、障害または病状：本明細書で使用される、用語「関節疾患、障害または病状」とは、関節、関節の構造及び／または関節運動を冒す疾患、障害または病状を指す。したがって関節疾患、障害または病状は、関節（ｊｏｉｎｔ）疾患、障害または病状とも称される。
【００４２】
生理活性：本明細書で使用される、フレーズ「生理活性」とは、生体系、特に生物において活性を有するあらゆる作用剤の特性を指す。例えば、生物に投与されるとき、生物学的効果をその生物に対して有する作用剤は、生理活性であるとみなされる。タンパク質またはポリペプチドが生理活性である特定の実施形態において、タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生理活性を共有するそのタンパク質またはポリペプチドの一部は、通常、「生理活性」部分と称される。
【００４３】
送達：本明細書で使用される、用語「送達」は、局所的及び全身的送達のどちらも包含する。例えば、ｍＲＮＡの送達は、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、コード化タンパク質が発現され、標的組織内に保持される状況（「局所分布」または「局所送達」とも称される）、及びｍＲＮＡが標的組織に送達され、コード化タンパク質が発現され、患者の循環系（例えば、血清）中に分泌され、全身に分布されかつ他の組織によって取り込まれる状況（「全身分布」または「全身送達」とも称される）を包含する。
【００４４】
発現：本明細書で使用される核酸配列の「発現」とは、以下の事象のうちの１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の産生（例えば、転写による）；（２）ＲＮＡ転写物の処理（例えば、スプライシング、エディティング、５’キャップ形成、及び／または３’末端形成による）；（３）ＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳；及び／または（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。本出願において、用語「発現」及び「産生」、ならびに文法上の等価物は、ほぼ同じ意味で用いられる。
【００４５】
断片：本明細書で使用される用語「断片」とは、ポリペプチドを指し、そのポリペプチドに特有または特徴的である、所定のポリペプチドの任意の個別的な部分として定義される。本明細書で使用されるこの用語はまた、全長ポリペプチドの少なくとも活性のフラクションを保持する所定のポリペプチドの任意の別々な部分も指す。好ましくは、保持される活性の一部分は、全長ポリペプチドの活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％である。さらにより好ましくは、保持される活性の一部分は、全長ポリペプチドの活性の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。最も好ましくは、保持される活性の一部分は、全長ポリペプチドの活性の１００％である。本明細書で使用されるこの用語は、全長ポリペプチドにおいて見出される少なくとも確立された配列要素を含む所定のポリペプチドの任意の部分も指す。好ましくは、配列要素は、全長ポリペプチドの少なくとも４〜５個の、より好ましくは、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０個またはそれ以上のアミノ酸に及ぶ。
【００４６】
機能的：本明細書で使用される「機能的」生体分子は、その分子が特徴付けられる特性及び／または活性をその分子が呈する形態の生体分子である。
【００４７】
半減期：本明細書で使用される、用語「半減期」は、核酸またはタンパク質の濃度もしくは活性が、期間の開始時に測定されたその値の半分に入るために必要な時間量である。
【００４８】
向上する、増加する、または低減する：本明細書で使用される、用語「向上する」、「増加する」または「低減する」、もしくは文法上の等価物は、本明細書に記載される治療の開始前の同一の個体における測定値などのベースライン測定値、または本明細書に記載される治療の不在下における１人の対照被験者（もしくは複数の対照被験者）に対する値を指す。「対照被験者」は、処置される被験者と同様な疾患の形態を患っている被験者であり、処置される被験者とほぼ同じ年齢である被検者である。
【００４９】
インビトロ：本明細書で使用される、用語「インビトロ」とは、多細胞生物中よりはむしろ人工的な環境、例えば、試験管または反応容器、細胞培養などにおいて発生する事象を指す。
【００５０】
インビボ：本明細書で使用される、用語「インビボ」とは、ヒト及び非ヒト動物などの多細胞生物中で発生する事象を指す。細胞ベースの系に関連して、この用語は、生細胞中で発生する事象を指す（例えば、インビトロの系に対立するものとして）。
【００５１】
単離された：本明細書で使用される、用語「単離された」とは、（１）自然界であろうと、及び／または実験的設定であろうと）初期産生時に、物質及び／または実体が結びついていた成分の少なくとも一部から分離されている、ならびに／または（２）人の手によって産生、調製、及び／もしくは製造された物質及び／もしくは実体を指す。単離された物質及び／または実体は、これらが初期に結びついていたその他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％を超えて分離されてもよい。いくつかの実施形態において、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％を超えて純粋である。本明細書で使用される物質は、その他の成分を実質的に含まない場合、「純粋」である。本明細書で使用される、単離物質及び／または実体の純度％の計算は、賦形剤（例えば、緩衝液、溶媒、水など）を含むべきではない。
【００５２】
関節：本明細書で使用される、用語「関節」とは、骨が接続する構造または場所を指す。関節は、関節接合（ａｒｔｉｃｕｌａｔｉｏｎ）（または関節面（ａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ）も指す。
【００５３】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書で使用される、用語「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用されるｍＲＮＡは、修飾及び非修飾ＲＮＡのどちらも包含する。ｍＲＮＡは、１つ以上のコード及び非コード領域を含有してもよい。ｍＲＮＡは、天然供給源から精製されることが可能であり、組換え発現系を用いて産生されてもよく、任意選択的に、精製され、化学的に合成されることなども可能である。必要に応じて、例えば、化学的に合成された分子の場合には、ｍＲＮＡは、化学修飾された塩基または糖類、骨格修飾などを有する類似体などのヌクレオシド類似体を含むことができる。ｍＲＮＡ配列は、特に断りのない限り、５’から３’の方向で存在する。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、及び２−チオシチジン）；化学修飾塩基；生物学的修飾塩基（例えば、メチル化塩基）；介在塩基；修飾糖類（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）；及び／もしくは修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエート及び５’−Ｎ−ホスホルアミダイト結合）であるか、またはこれらを含む。
【００５４】
核酸：本明細書で使用される、用語「核酸」は、その広い意味で、ポリヌクレオチド鎖に組み込まれるかまたは組み込むことができるあらゆる化合物及び／もしくは物質を指す。いくつかの実施形態において、核酸は、ホスホジエステル結合を介してポリヌクレオチド鎖に組み込まれるかまたは組み込むことができるあらゆる化合物及び／もしくは物質である。いくつかの実施形態において、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシド）を指す。いくつかの実施形態において、「核酸」は、個々の核酸残基を含むポリヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態において、「核酸」は、ＲＮＡならびに一本鎖及び／もしくは二本鎖ＤＮＡ及び／またはｃＤＮＡを包含する。
【００５５】
患者：本明細書で使用される、用語「患者」または「対象」は、例えば、実験用、診断用、予防用、化粧用、及び／または治療用に、提供された組成物が投与され得るあらゆる生物を指す。典型的な患者としては、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及び／またはヒトなどの哺乳動物）が含まれる。ヒトは、出生前または出生後の形態を含む。
【００５６】
薬学的に許容し得る：本明細書で使用される「薬学的に許容し得る」とは、合理的な効果／リスク比に相応して、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、もしくはその他の問題または合併症なく、ヒト及び動物の組織と接触する使用に好適である物質を指す。
【００５７】
薬学的に許容し得る塩：薬学的に許容し得る塩は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７）６６：１−１９において薬学的に許容し得る塩を記載している。本発明の化合物の薬学的に許容し得る塩としては、好適な無機及び有機酸ならびに塩基に由来するものが含まれる。薬学的に許容し得る、非毒性酸添加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸及び過塩素酸などの無機酸で、または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸もしくはマロン酸で形成された、あるいはイオン交換などの当該技術分野において用いられるその他の方法を用いることによって形成されたアミノ酸の塩である。他の薬学的に許容し得る塩としては、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオネート、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。適切な塩基に由来する塩としては、アルカリ金属、アルカリ度類金属、アンモニウム及びＮ＋（Ｃ１〜４アルキル）４塩が含まれる。代表的なアルカリまたはアルカリ度類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが挙げられる。さらに、薬学的に許容し得る塩としては、適切な場合、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、スルホン酸塩、及びアリールスルホン酸塩などの対イオンを用いて形成された非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、及びアミンカチオンが挙げられる。さらなる薬学的に許容し得る塩としては、四級化アルキル化アミノ塩を形成するために適切な求電子試薬、例えばハロゲン化アルキルを用いるアミンの四級化から形成される塩が含まれる。
【００５８】
対象：本明細書で使用される、用語「対象」とは、ヒトまたはあらゆる非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウシ、または霊長類）を指す。ヒトは、出生前及び出生後の形態を含む。多くの実施形態において、対象はヒトである。対象は、疾患の診断または治療のために医療提供者に病状を提示するヒトを指す患者とすることができる。用語「対象」は、本明細書においては「個体」または「患者」とほぼ同じ意味で使用される。対象は、疾患または障害に冒され得るかまたはかかりやすいが、疾患または障害の症状が現れていてもまたは現れていなくともよい。
【００５９】
実質的に：本明細書で使用される、用語「実質的に」とは、関心の特徴または特性の全範囲またはほぼ全範囲もしくは程度を示す定量的条件を指す。生物学分野における当業者であれば、生物学的及び化学的現象が、あるとしても、完成にたどり着き及び／または完成もしくは達成に向かうことがまれであり、絶対的な結果を避けることを理解するであろう。したがって、用語「実質的に」は、生物学的及び化学的現象に固有の完全性の潜在的欠如を捕えるために、本明細書で使用される。
【００６０】
治療的に有効な量：本明細書で使用される、治療薬の用語「治療的に有効な量」は、疾患、障害、及び／もしくは病状に冒されているまたはこれらにかかりやすい対象に投与されるとき、疾患、障害、及び／または病状の症状（複数可）を治療し、予防し、及び／または発症を遅延させるために十分である量を意味する。当業者であれば、治療的に有効な量が、通常、少なくとも１つの単位服用量を含む投与計画を介して投与されることを理解されるであろう。
【００６１】
治療：本明細書で使用される、用語「治療」（さらに「治療する」または「治療すること」）は、特定の疾患、障害、及び／または病状（例えば、インフルエンザ）の１つ以上の症状、特徴、及び／または原因を、部分的もしくは完全に軽減し、改善し、緩和し、阻害し、発症を遅延させ、重症度を低減し、及び／または発生を低減する物質（例えば提供された組成物）のあらゆる投与を指す。このような治療は、関連する疾患、障害、及び／または病状の徴候を示していない対象ならびに／または疾患、障害、及び／もしくは病状の初期徴候のみを示す対象のためのものであってもよい。代替的にまたは追加的に、このような治療は、関連する疾患、障害、及び／または病状の１つ以上の確立された徴候を示す対象のためのものであってもよい。いくつかの実施形態において、治療は、関連する疾患、障害、及び／または病状に冒されていると診断された対象ためのものであってもよい。いくつかの実施形態において、治療は、関連する疾患、障害、及び／または病状の発症のリスクと統計的に相関する１つ以上の感受性因子を有することが既知である対象のためのものであってもよい。
【００６２】
詳細な説明
本発明は、とりわけ、ｍＲＮＡ治療法に基づく、関節疾患、障害及び病状を治療するための方法及び組成物を提供する。特に、本発明は、治療を必要とする対象に、関節疾患、障害及び病状の治療に好適な１つ以上のポリペプチド（例えば、治療用ポリペプチド）をコードする１つ以上のｍＲＮＡを含む組成物を投与することによって、関節疾患、障害及び病状を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、１つ以上のｍＲＮＡは、１つ以上の脂質及び／またはポリマーベースのナノ粒子内に封入される。いくつかの実施形態において、１つ以上のｍＲＮＡは、１つ以上のリポソーム内に封入される。本明細書で使用される、用語「リポソーム」とは、あらゆるラメラ小胞、多重ラメラ小胞、または固体ナノ粒子小胞を指す。通常、本明細書で使用されるリポソームは、１つ以上の脂質を混合することによって、または１つ以上の脂質及びポリマー（複数可）を混合することによって形成することができる。いくつかの実施形態において、本発明に適したリポソームは、カチオン性脂質（複数可）、非カチオン性脂質（複数可）、コレステロール系脂質（複数可）、及びＰＥＧ修飾脂質（複数可）を含有する。
【００６３】
本発明の様々な態様が以下のセクションにおいて詳細に記載される。セクションの使用は、本発明を限定することを意味するものではない。各セクションは、本発明のあらゆる態様に適用することができる。本出願において、「または」の使用は、特に明記しない限り、「及び／または」を意味する。
【００６４】
関節疾患、障害または病状
本発明は、関節疾患、障害または病状に冒されているかまたは感受性のある対象を治療するために用いることができる。本明細書で使用される「関節疾患、障害または病状」とは、関節、関節の構造及び／または関節運動に影響を及ぼす疾患、障害もしくは病状を指す。したがって、関節疾患、障害または病状は、関節（ｊｏｉｎｔ）疾患、障害または病状とも称される。関節疾患、障害または病状は、あらゆる種類の関節または関節のあらゆる構造を冒し得る。いくつかの実施形態において、関節の構造は、骨、靭帯、腱、軟骨、筋肉、滑液包、及び／または滑膜を含む。通常、本明細書に記載される関節疾患、障害または病状は、線維性関節、軟骨性関節、または滑膜関節を冒し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される関節疾患、障害または病状は、滑膜関節を冒す。
【００６５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される関節疾患、障害または病状は、腋窩関節、胸骨心室関節、椎関節、顎関節、仙腸関節、股関節、膝関節及び／または足の関節として分類される関節を冒し得る。
【００６６】
いくつかの実施形態において、関節疾患、障害または病状は、関節または関節の構造におけるタンパク質の欠乏または機能不全によって起こり得る。いくつかの実施形態において、関節疾患、障害または病状は、関節または関節の構造におけるタンパク質の過剰、過剰発現、及び／または過剰活性化によって起こり得る。
【００６７】
例示的な関節疾患、障害または病状としては、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、痛風、偽性痛風、腱炎、滑液包炎、手根管症候群、骨関節炎、滑膜炎、脊椎炎、アミロイドーシス、腰部脊椎管狭窄症、及び／または仙腸関節機能障害が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
関節疾患、障害または病状を治療するためのｍＲＮＡ
本発明は、関節疾患、障害または病状を治療するために適切であるあらゆるｍＲＮＡを送達するために用いることができる。様々な実施形態において、本発明は、関節疾患、障害または病状のいずれかにおいて欠乏しているタンパク質をコードするｍＲＮＡを送達するために用いることができる。このような実施形態において、ｍＲＮＡの送達は、通常、タンパク質欠乏を治療するのに十分な関節におけるタンパク質発現及び／または活性の増加をもたらす。いくつかの実施形態において、本発明に好適なｍＲＮＡは、健康な関節中に通常存在する野生型または天然起源のタンパク質配列をコードすることができる。いくつかの実施形態において、本発明に好適なｍＲＮＡは、野生型または天然起源の配列であってもよい。いくつかの実施形態において、本発明に好適なｍＲＮＡは、コドン最適化配列であってもよい。本発明に好適なｍＲＮＡは、野生型または天然起源のアミノ酸のタンパク質配列と実質的に相同性または同一性を有する（例えば、野生型または天然起源の配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％の配列同一性を有する）アミノ酸配列をコードしてもよい。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本発明は、その過剰なレベルが関節疾患、障害または病状に関連するタンパク質の発現及び／または活性を阻害し、ダウンレギュレートし、低減する治療薬をコードするｍＲＮＡを送達するために用いられてもよい。このような治療薬は、ペプチド、抗体、または他のポリペプチドもしくはタンパク質であり得る。
【００７０】
いくつかの実施形態において、本発明は、抗体、可溶性受容体、または他の結合タンパク質をコードするｍＲＮＡを送達するために用いられてもよい。通常、好適なｍＲＮＡは、関節疾患、障害または病状において量及び／または活性が過剰な状態で存在するタンパク質を阻害し、ダウンレギュレートし、または低減する抗体をコードする。いくつかの実施形態において、好適なｍＲＮＡは、関節疾患、障害または病状において欠乏しているタンパク質活性を活性化し、アップレギュレートし、または増加させる抗体をコードする。本発明によるｍＲＮＡによってコードされる好適な例示的な抗体としては、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ｓＴＮＦＲ−Ｉ、ｓＴＮＦＲ−ＩＩ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２ｐ４０に対する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本発明は、それぞれが、少なくとも１つのポリペプチドをコードする別個のｍＲＮＡである、複数の別個のｍＲＮＡを送達するために用いられてもよい。例えば、それぞれの別個のｍＲＮＡは、抗体の重鎖、軽鎖、またはその断片（例えば、可変領域、Ｆｃ領域など）をコードしてもよい。
【００７２】
本明細書で使用される、用語「抗体」は、完全抗体及び抗体断片のどちらも包含する。通常、完全「抗体」は、特定の抗原に特異的に結合する免疫グロブリンである。抗体は、ヒト部類のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、及びＩｇＤのいずれかを含む、あらゆる免疫グロブリンの部類の一員であってもよい。通常、完全抗体は、四量体である。各四量体は、ポリペプチドの２つの同一の対であり、各対が１つの「軽」鎖（およそ２５ｋＤ）及び１つの「重」鎖（およそ５０〜７０ｋＤ）を有するものからなる。各鎖のＮ末端は、主として抗原認識を担当する約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を画定する。用語「可変軽鎖」（ＶＬ）及び「可変重鎖」（ＶＨ）とは、それぞれ、軽鎖及び重鎖に関するこれらの対応する領域を指す。超可変領域は、ベータ−シート構造を形成し、ＨＶ領域を定位置に保持するスキャホールドとして機能する、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ２、及びＦＲ４）によって分離された相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と呼ばれる超可変配列の３つの区域を含む。各重鎖及び軽鎖のＣ末端は、軽鎖のための１つのドメイン（ＣＬ）及び重鎖のための３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）からなる定常領域を画定する。免疫グロブリンの軽鎖は、アイソタイプカッパー及びラムダにさらに分化され得る。
【００７３】
いくつかの実施形態において、用語「完全抗体」または「完全組立抗体」は、任意に天然で産生された抗体で起こるようなジスルフィド結合によって結び付けられた、２つの重鎖と２つの軽鎖とを含有する抗体に関して使用される。いくつかの実施形態において、本発明による抗体は、抗体断片である。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本発明は、「抗体断片」を送達するために使用することができる。本明細書で使用される「抗体断片」は、例えば、抗体の抗原結合または可変領域などの完全抗体の一部を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦＶ断片；トリアボディ；テトラボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。例えば、抗体断片は、単離断片、すなわち、重鎖及び軽鎖の可変領域、軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカー（「ＳｃＦｖタンパク質」）によって連結されている組換え体一本鎖ポリペプチド分子、及び超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位からなる「Ｆｖ」断片を含む。多くの実施形態において、抗体断片は、親抗体が結合するものと同じ抗原に断片が結合するのに十分な親抗体の配列を含有し、いくつかの実施形態において、断片は親抗体のものに匹敵する親和性で抗原に結合し、及び／またはその抗原に対する結合に関して、親抗原と競合する。抗体の抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。好適な抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体混合物もしくはカクテル、ヒトもしくはヒト化抗体、キメラ抗体、または二重特性抗体が挙げられる。
【００７５】
ｍＲＮＡ合成
本発明に好適なｍＲＮＡは、様々な既知の方法のうちのいずれかに従って合成することができる。例えば、本発明に好適なｍＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）を介して合成されてもよい。簡単に言うと、ＩＶＴは、通常、プロモーター、リボヌクレオチド三リン酸のプール、ＤＴＴ及びマグネシウムイオンを含み得る緩衝系、ならびに適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡｓｅ  Ｉ、プロホスファターゼ、及び／またはＲＮＡｓｅ阻害薬を含有する線状または環状ＤＮＡ鋳型を用いて行われる。正確な条件は、特定の用途に準じて変化するであろう。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本発明によるｍＲＮＡの調製については、ＤＮＡ鋳型がインビトロで転写される。好適なＤＮＡ鋳型は、通常、インビトロ転写に関しては、プロモーター、例えば、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６プロモーターを有し、所望のｍＲＮＡ及び終結シグナルのための所望のヌクレオチドが続く。
【００７７】
本発明による所望のｍＲＮＡ配列（複数可）が決定され、標準法を用いてＤＮＡ鋳型中に組み込まれ得る。例えば、所望のアミノ酸配列（例えば、酵素配列）から出発し、事実上の逆転写が、縮重された遺伝暗号に基づいて行われる。次いで、最適化アルゴリズムが、好適なコドンの選択のために用いられてもよい。通常、Ｇ／Ｃ含有量は、一方では可能な限り高いＧ／Ｃ含有量を達成し、他方では、コドン使用頻度に従ってｔＲＮＡの頻度を可能な限り最適に考慮に入れるように、最適化される。最適化されたＲＮＡ配列は、確立され、例えば、適切な表示装置の助けを借りて表示され、元の（野生型）配列と比較され得る。安定化及び不安定化特性、または個々にＲＮＡの領域を算出するために、二次構造も分析することができる。
【００７８】
修飾ｍＲＮＡ
いくつかの実施形態において、本発明によるｍＲＮＡは、非修飾または修飾ｍＲＮＡとして合成されてもよい。通常、ｍＲＮＡは、安定性を増強させるために修飾される。ｍＲＮＡの修飾は、例えば、ＲＮＡのヌクレオチドの修飾を含むことができる。したがって、本発明による修飾ｍＲＮＡは、例えば、骨格修飾、糖修飾、または塩基修飾を含むことができる。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、天然起源のヌクレオチド及び／またはヌクレオチド類似体（修飾ヌクレオチド）から合成することができ、これらとしては、プリン（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））またはピリミジン（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））、ならびに修飾ヌクレオチド類似体またはプリン及びピリミジンの誘導体として（例えば、１−メチル−アデニン、２−メチル−アデニン、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニル−アデニン、Ｎ６−メチル−アデニン、Ｎ６−イソペンテニル−アデニン、２−チオ−シトシン、３−メチル−シトシン、４−アセチル−シトシン、５−メチル−シトシン、２，６−ジアミノプリン、１−メチル−グアニン、２−メチル−グアニン、２，２−ジメチル−グアニン、７−メチル−グアニン、イノシン、１−メチル−イノシン、プソイドウラシル（５−ウラシル）、ジヒドロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、４−チオ−ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−ウラシル、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル、５−メチル−２−チオ−ウラシル、５−メチル−ウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、５−メチルアミノメチル−ウラシル、５−メトキシアミノエチル−２−チオ−ウラシル、５’−メトキシカルボニルメチル−ウラシル、５−メトキシ−ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、１−メチル−プソイドウラシル、クエオシン、ベータ−Ｄ−マンノシル−クエオシン、ワイブトシン、ならびにホスホルアミデート、ホスホロチオエート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホネート、７−デアザグアノシン、５−メチルシトシン及びイノシンなど）が挙げられるが、これらに限定されない。このような類似体の調製は、例えば、米国特許第４，３７３，０７１号、米国特許第４，４０１，７９６号、米国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７号、米国特許第４，６６８，７７７号、米国特許第４，９７３，６７９号、米国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第５，１３２，４１８号、米国特許第５，１５３，３１９号、米国特許第５，２６２，５３０号、及び同第５，７００，６４２号から、当業者に既知であり、これらの開示は、それらの全体が参考として本明細書に組み込まれる。
【００７９】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、ＲＮＡ骨格修飾を含有してもよい。通常、骨格修飾は、ＲＮＡ中二含まれるヌクレオチドの骨格のリン酸が、化学的に修飾される修飾である。例示的な骨格修飾としては、通常、メチルホスホネート、メチルホスホルアミデート、ホスホルアミダイト、ホスホロチオエート（例えば、シチジン５’−Ｏ−（１−チオホスフェート））、ボラノホスフェート、正荷電グアニジニウム基（これは、ホスホジエステル結合を他のアニオン性、カチオン性または中性基によって置き換えることを意味する）などからなる群からの修飾が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、糖修飾を含有してもよい。典型的な糖修飾は、ヌクレオチドの糖の化学修飾であり、これは、例えば、限定されないが、２’−デオキシ−２’−フルオロ−オリゴリボヌクレオチド（２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸、２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）、２’−デオキシ−２’−デアミン−オリゴリボヌクレオチド（２’−アミノ−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）、２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルシチジン５’−三リン酸、２’−メチルウリジン５’−三リン酸）、２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、ならびにそれらの異性体（２’−アラシチジン５’−三リン酸、２’−アラウリジン５’−三リン酸）、またはアジド三リン酸（２’−アジド−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸、２’−アジド−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）からなる群から選択される糖修飾を含む。
【００８１】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、ヌクレオチドの塩基の修飾（塩基修飾）を含有してもよい。塩基修飾を含有する修飾ヌクレオチドは、塩基修飾ヌクレオチドとも称される。このような塩基修飾ヌクレオチドの例としては、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド５’−三リン酸、２−アミノアデノシン５’−三リン酸、２−チオシチジン５’−三リン酸、２−チオウリジン５’−三リン酸、４−チオウリジン５’−三リン酸、５−アミノアリルシチジン５’−三リン酸、５−アミノアリルウリジン５’−三リン酸、５−ブロモシチジン５’−三リン酸、５−ブロモウリジン５’−三リン酸、５−ヨードシチジン５’−三リン酸、５−ヨードウリジン５’−三リン酸、５−メチルシチジン５’−三リン酸、５−メチルウリジン５’−三リン酸、６−アザシチジン５’−三リン酸、６−アザウリジン５’−三リン酸、６−クロロプリンリボシド５’−三リン酸、７−デアザアデノシン５’−三リン酸、７−アザグアノシン５’−三リン酸、８−アザアデノシン５’−三リン酸、８−アジドアデノシン５’−三リン酸、ベンズイミダゾールリボシド５’−三リン酸、Ｎ１−メチルアデノシン５’−三リン酸、Ｎ１−メチルグアノシン５’−三リン酸、Ｎ６−メチルアデノシン５’−三リン酸、Ｏ６−メチルグアノシン５’−三リン酸、プソイドウリジン５’−三リン酸、ピューロマイシン５’−三リン酸またはキサントシン５’−三リン酸が含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
通常、ｍＲＮＡ合成は、Ｎ（５’）末端への「キャップ」の付加、及び「テール」のＣ（３’）末端への付加を含む。キャップの存在は、大部分の真核細胞において見出されるヌクレアーゼに対して耐性を提供する上で重要である。「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護するよう機能する。
【００８３】
キャップ構造
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、５’キャップ構造を含む。５’キャップは、通常、以下のように付加される：最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが、２つの末端リン酸をそのまま残しながら、末端リン酸基を５’ヌクレオチドから除去し；次いでグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）が、グアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸塩に付加され、５’５’５三リン酸結合を生成し；次いで、グアニンの７−窒素が、メチルトランスフェラーゼによってメチル化される。キャップ構造の例としては、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ及びＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
天然起源のキャップ構造は、ジヌクレオチドキャップｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎをもたらす（このＮは、あらゆるヌクレオシドである）、三リン酸架橋を介して第１の転写されたヌクレオチドの５’末端に結合する７−メチルグアノシンを含む。インビボでは、キャップは、酵素的に付加される。このキャップは、核内に付加され、酵素グアニリルトランスフェラーゼによって触媒される。キャップのＲＮＡの５’末端への付加は、転写の開始直後に起こる。末端ヌクレオシドは、通常、グアノシンであり、全ての他のヌクレオチド、すなわちＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧｐＮｐＮｐに対して逆の向きにある。
【００８５】
インビトロ転写によって生成されるｍＲＮＡのための一般的なキャップは、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇであり、これは、それらの５’末端においてキャップ構造を有するＲＮＡを得るために、インビトロでＴ７またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼによる転写においてジヌクレオチドキャップとして用いられたものである。キャップｍＲＮＡのインビトロ合成のための主要な方法は、前もって形作られたｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（「ｍ７ＧｐｐｐＧ」）を転写の開始剤として使用する。
【００８６】
現在まで、インビトロ転写において用いられる合成ジヌクレオチドキャップの通常の形は、アンチリバースキャップアナログ（「ＡＲＣＡ」）または修飾ＡＲＣＡであり、これは、２’または３’のＯＨ基が−ＯＣＨ３で置き換えられている修飾キャップである。
【００８７】
追加のキャップアナログとしては、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣからなる群から選択される化学構造；非メチル化キャップアナログ（例えば、ＧｐｐｐＧ）；ジメチル化キャップアナログ（例えば、ｍ２，７ＧｐｐｐＧ）、トリメチル化キャップアナログ（例えば、ｍ２，２，７ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化対称的キャップアナログ（例えば、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ）、またはａｎｔｉリバースキャップアナログ（例えば、ＡＲＣＡ；ｍ７，２’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７２’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ｄＧｐｐｐＧ、及びこれらの四リン酸誘導体）（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ‘ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ’ｃａｐ  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”，ＲＮＡ，９：１１０８−１１２２（２００３）を参照）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８８】
いくつかの実施形態において、好適なキャップは、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎをもたらす（このＮは、あらゆるヌクレオシドである）、第１の転写ヌクレオチドの５’末端に三リン酸架橋を介して結合された７−メチルグアニレート（「ｍ７Ｇ」）である。本発明の実施形態において利用されるｍ７Ｇキャップの好ましい実施形態は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇである。
【００８９】
いくつかの実施形態において、このキャップはＣａｐ０構造である。Ｃａｐ０構造は、塩基１及び２に連結したリボースの２’−Ｏ−メチル残基を欠如する。いくつかの実施形態において、このキャップはＣａｐ１構造である。Ｃａｐ１構造は、塩基２において２’−Ｏ−メチル残基を有する。Ｃａｐ２構造は、塩基２及び３のどちらにも連結された２’−Ｏ−メチル残基を有する。
【００９０】
様々なｍ７Ｇキャップアナログが当該技術分野において既知であり、これらの多くは市販されている。これらとしては、上述のｍ７ＧｐｐｐＧ、ならびにＡＲＣＡ３’−ＯＣＨ３及び２’−ＯＣＨ３キャップアナログ（Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，  ９：１１０８−１１２２（２００３））が挙げられる。本発明の実施形態において使用するための追加のキャップアナログとしては、Ｎ７−ベンジル化ジヌクレオシド四リン酸アナログ（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，１０：１４７９−１４８７（２００４）に記載）、ホスホルチオエートキャップアナログ（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ−Ｎｏｇａｌｓｋａ，Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，１３：１７４５−１７５５（２００７）に記載）、及び参考として本明細書に組み込まれる米国特許第８，０９３，３６７号ならびに同第８，３０４，５２９号に記載されたキャップアナログ（ビオチン化キャップアナログを含む）が挙げられる。
【００９１】
テール構造
通常、「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護するように機能する。ポリＡテールは、天然のメッセンジャーＲＮＡ及び合成センスＲＮＡを安定化すると考えられている。したがって、ある特定の実施形態において、長いポリＡテールがｍＲＮＡに付加され、これにより、ＲＮＡをより安定化させることが可能である。ポリＡテールは、様々な当該技術分野で認識された技術を用いて付加することができる。例えば、長いポリＡテールは、合成ＲＮＡに、またはポリＡポリメラーゼを用いてインビトロで転写されたＲＮＡに付加することができる（Ｙｏｋｏｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９６；１４：１２５２−１２５６）。転写ベクターは、長いポリＡテールをコードすることができる。加えて、ポリＡテールは、ＰＣＲ生成物からの転写によって直接的に付加することも可能である。ポリＡは、ＲＮＡリガーゼによってセンスＲＮＡの３’末端に連結されてもよい（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ編集（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９９１  ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照）。
【００９２】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）テール構造を含む。通常、ポリＡテールの長さは、少なくとも約１０、５０、１００、２００、３００、４００、少なくとも５００個のヌクレオチドとすることができる。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡの３’末端上のポリＡテールは、典型的には、約１０〜３００個のアデノシンヌクレオチド（例えば、約１０〜２００個のアデノシンヌクレオチド、約１０〜１５０個のアデノシンヌクレオチド、約１０〜１００個のアデノシンヌクレオチド、約２０〜７０個のアデノシンヌクレオチド、または約２０〜６０個のアデノシンヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態において、ポリ（Ｕ）テールが、本明細書に記載されるポリ（Ａ）テールの代わりに用いられてもよい。いくつかの実施形態において、ポリ（Ｕ）テールが、本明細書に記載されるポリ（Ａ）テールに付加されてもよい。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、３’ポリ（Ｃ）テール構造を含む。ｍＲＮＡの３’末端上の好適なポリ（Ｃ）テールは、通常、約１０〜２００個のシトシンヌクレオチド（例えば、約１０〜１５０個のシトシンヌクレオチド、約１０〜１００個のシトシンヌクレオチド、約２０〜７０個のシトシンヌクレオチド、約２０〜６０個のシトシンヌクレオチド、または約１０〜４０個のシトシンヌクレオチド）を含む。ポリ（Ｃ）テールは、ポリ（Ａ）及び／もしくはポリ（Ｕ）テールに付加されてもよく、またはポリ（Ａ）及び／もしくはポリ（Ｕ）テールを置き換えてもよい。
【００９３】
いくつかの実施形態において、ポリ（Ａ）、ポリ（Ｕ）またはポリ（Ｃ）テールの長さは、本発明の修飾センスｍＲＮＡ分子の安定性、したがってタンパク質の転写の安定性を制御するように調整される。例えば、テール構造の長さがセンスｍＲＮＡの半減期に影響を及ぼし得るために、テールの長さは、ｍＲＮＡのヌクレアーゼに対する耐性のレベルを修正するように調整することができ、これによって、標的細胞におけるポリヌクレオチド発現及び／ポリペプチド産生の時間経過を制御することができる。
【００９４】
５’及び３’非翻訳領域
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、５’及び／または３’非翻訳領域を含む。いくつかの実施形態において、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を及ぼす１つ以上の要素、例えば鉄応答要素を含む。いくつかの実施形態において、５’非翻訳領域は、約５０〜５００個のヌクレオチドの長さであってもよい。
【００９５】
いくつかの実施形態において、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞中のｍＲＮＡの位置の安定性に影響を及ぼすタンパク質についての結合部位、またはｍｉＲＮＡについての１つ以上の結合部位のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、３’非翻訳領域は、約５０〜５００個のまたはそれ以上のヌクレオチドの長さであってもよい。
【００９６】
例示的な３’及び／または５’ＵＴＲ配列は、センスｍＲＮＡ分子の安定性を増加させるために安定であるｍＲＮＡ分子から由来するものであり得る（例えば、グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、またはクエン酸環状酵素）。例えば、５’ＵＴＲ配列は、ヌクレアーゼ耐性を改善するために、及び／またはポリヌクレオチドの半減期を増加させるために、ＣＭＶ最初期１（ＩＥ１）遺伝子の部分的配列、またはその断片を含む。さらに考慮されることは、ポリヌクレオチドをさらに安定化させるために、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする配列、またはその断片の、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’末端もしくは非翻訳領域への封入である。一般的に、これらの修飾は、非修飾の対応物に比較して、ポリヌクレオチドの安定性及び／または薬物動態特性（例えば、半減期）を増加させ、例えば、このようなポリヌクレオチドのインビボのヌクレアーゼ消化に対する耐性を改善するようになされた修飾を含む。
【００９７】
送達担体
本発明によると、本明細書に記載されるｍＲＮＡは、裸の（ｎａｋｅｄ）ＲＮＡ（非パッケージ化）として、または送達担体を介して送達され得る。本明細書で使用される、用語「送達担体」、「移送担体」、「ナノ粒子」または文法上の等価物は、ほぼ同じ意味で用いられる。
【００９８】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、単一の送達担体を介して送達されてもよい。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、それぞれが異なる組成の１つ以上の送達担体を介して送達されてもよい。様々な実施形態によると、好適な送達担体としては、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのポリマーベースのキャリア、脂質ナノ粒子及びリポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、天然及び合成由来のエキソソーム、天然、合成及び半合成ラメラ体、ナノ粒子、カルシウムケイ酸蛍光体ナノ粒子、リン酸カルシウムナノ粒子、二酸化ケイ素ナノ粒子、ナノ結晶粒子、半導体ナノ粒子、ポリ（Ｄ−アルギニン）、ゾル−ゲル、ナノデンドリマー、デンプンベースの送達系、ミセル、エマルジョン、ニオソーム、マルチドメインブロックポリマー（ビニルポリマー、ポリプロピルアクリル酸ポリマー、動的ポリコンジュゲート）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９９】
リポソーム送達担体
いくつかの実施形態において、好適な送達担体は、リポソーム送達担体、例えば、脂質ナノ粒子である。本明細書で使用されるリポソーム送達担体、例えば脂質ナノ粒子は、通常、１つ以上の二層の膜によって外部の媒質から隔離された内部の水空間を有するごく小さい小胞である。リポソームの二層膜は、通常は、空間的に分離された親水性及び疎水性ドメインを含む、合成または天然起源の脂質などの両親媒性分子によって形成される（Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：３０７−３２１，１９９８）。リポソームの二層膜は、両親媒性ポリマー及び界面活性剤によっても形成され得る（例えば、ポリマーソーム、ニオソームなど）。本発明の文脈において、リポソーム送達担体は、通常、所望のｍＲＮＡを標的細胞または組織に輸送するよう機能する。所望のｍＲＮＡをリポソーム中に組み込むプロセスは、しばしば「ローディング」と称される。例示的な方法は、参考として本明細書に組み込まれる、Ｌａｓｉｃ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３１２：２５５−２５８，１９９２に記載されている。リポソームに組み込まれた核酸は、二層膜内のリポソームの内部空間中に完全にもしくは部分的に位置することができるか、またはリポソーム膜の外表面と結合することができる。核酸のリポソームへの組み込みは、核酸がリポソームの内部空間内に完全に封じ込められている「封入」とも称される。ｍＲＮＡを、リポソームなどの移送担体中に組み込む目的は、多くの場合、核酸を、核酸の急激な排出を引き起こす、核酸及び／もしくは系または受容体を分解する酵素もしくは化学物質を含有し得る環境から保護するためである。したがって、いくつかの実施形態において、好適な送達担体は、その中に封じ込められたｍＲＮＡの安定性を増強することができ、及び／またはｍＲＮＡの標的細胞または組織への送達を容易にする。
【０１００】
カチオン性脂質
いくつかの実施形態において、リポソームは、１つ以上のカチオン性脂質を含んでもよい。本明細書で使用される、フレーズ「カチオン性脂質」とは、生理的ｐＨなどの選択されたｐＨにおいて正味の正電荷を有する多くの脂質種のうちのいずれかを指す。数種のカチオン性脂質が、文献に記載されており、それらの多くは市販されている。本発明の組成物及び方法において使用するために特に好適なカチオン性脂質としては、国際特許公開第ＷＯ２０１０／０５３５７２号（特に、段落［００２２５］に記載されたＣＩ２−２００）及び同第ＷＯ２０１２／１７０９３０号に記載されており、これらのどちらも参考として本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態において、本発明宇の組成物及び方法は、２０１２年３月２９出願の米国仮特許出願第６１／６１７，４６８号（参考として本明細書に組み込まれる）に記載されたイオン化可能なカチオン性脂質を含有する脂質ナノ粒子を使用し、このイオン化可能なカチオン性脂質は、例えば、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−１５，１８−ジエン−１−アミン（ＨＧＴ５０００）、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−４，１５，１８−トリエン−１−アミン（ＨＧＴ５００１）、及び（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−５，１５，１８−トリエン−１−アミン（ＨＧＴ５００２）などである。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、提供されたリポソームは、ＷＯ２０１３０６３４６８号及び本出願と同日に同時出願された、「Ｌｉｐｉｄ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｓｓｅｒｎｇｅｒ  ＲＮＡ」と題された米国仮出願に記載されたカチオン性脂質を含み、どちらの特許文献も参考として本明細書に込み込まれる。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質は、式Ｉ−ｃ１−ａの化合物またはその薬学的に許容し得る塩を含む：
【化２】
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式中、
各Ｒ２は、独立して、水素またはＣ１〜３アルキルであり；
各ｑは、独立して、２〜６であり；
各Ｒ’は、独立して、水素またはＣ１〜３アルキルであり；
各ＲＬは、独立して、Ｃ８〜１２アルキルである。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、各Ｒ２は、独立して、水素、メチルまたはエチルである。いくつかの実施形態において、各Ｒ２は、独立して、水素またはメチルである。いくつかの実施形態において、各Ｒ２は水素である。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、各ｑは、独立して、３〜６である。いくつかの実施形態において、各ｑは、独立して、３〜５である。いくつかの実施形態において、各ｑは４である。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、各Ｒ’は、独立して、水素、メチルまたはエチルである。いくつかの実施形態において、各Ｒ’は、独立して、水素またはメチルである。いくつかの実施形態において、各Ｒ’は、独立して水素である。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、各ＲＬは、独立して、Ｃ８〜１２アルキルである。いくつかの実施形態において、各ＲＬは、独立して、ｎ−Ｃ８〜１２アルキルである。いくつかの実施形態において、各ＲＬは、独立して、Ｃ９〜１１アルキルである。いくつかの実施形態において、各ＲＬは、独立して、ｎ−Ｃ９〜１１アルキルである。いくつかの実施形態において、各ＲＬは、独立して、Ｃ１０アルキルである。いくつかの実施形態において、各ＲＬは、独立して、ｎ−Ｃ１０アルキルである。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、各Ｒ２は、独立して、水素またはメチルであり；各ｑは、独立して、３〜５であり；各Ｒ’は、独立して、水素またはメチルであり；各ＲＬは、独立して、Ｃ８〜１２アルキルである。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、各Ｒ２は、水素であり；各ｑは、独立して、３〜５であり；各Ｒ’は、水素であり；各ＲＬは、独立して、Ｃ８〜１２アルキルである。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、各Ｒ２は、水素であり；各ｑは、４であり；各Ｒ’は、水素であり；各ＲＬは、独立して、Ｃ８〜１２アルキルである。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、カチオン性脂質は、式Ｉ−ｇの化合物またはその薬学的に許容し得る塩であり、
【化３】
2019014742.tif 000005
式中、各ＲＬは、独立して、Ｃ８〜１２アルキルである。いくつかの実施形態において、各ＲＬは、独立して、ｎ−Ｃ８〜１２アルキルである。いくつかの実施形態において、各ＲＬは、独立して、Ｃ９〜１１アルキルである。いくつかの実施形態において、各ＲＬは、独立して、ｎ−Ｃ９〜１１アルキルである。いくつかの実施形態において、各ＲＬは、独立して、Ｃ１０アルキルである。いくつかの実施形態において、各ＲＬは、ｎ−Ｃ１０アルキルである。
【０１１０】
特定の実施形態において、提供されたリポソームは、カチオン性脂質ｃＫＫ−Ｅ１２、または（３，６−ビス（４−ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン−２，５−ジオン）を含む。ｃＫＫ−Ｅ１２の構造を以下に示す：
【化４】
2019014742.tif 000006
【０１１１】
以下の実施例のセクションに記載されるように、本発明者は、本明細書に記載される式Ｉ−ｃ１−ａまたは式Ｉ−ｇの構造を有するもの（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２）などの、この特定の部類のカチオン性脂質に基づくリポソームが、インビボでｍＲＮＡを送達し、コード化タンパク質を産生する上で思いがけず有効であることを観察した。ＰＡＨタンパク質をコードするｍＲＮＡが、本出願の例として用いられてはいるが、本明細書に記載される式Ｉ−ｃ１−ａまたは式Ｉ−ｇの構造を有するこの部類のカチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２）が、インビボでの高効率かつ持続的なタンパク質（例えば、治療用タンパク質）の産生のためにあらゆるｍＲＮＡを送達する上で有用であり得ると考えられる。例えば、本明細書に記載される式Ｉ−ｃ１−ａまたは式Ｉ−ｇの構造を有するカチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２）は、１つ以上の天然起源のペプチドまたは１つ以上の修飾されたもしくは非天然ペプチドをコードするｍＲＮＡを送達するために使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される式Ｉ−ｃ１−ａまたは式Ｉ−ｇの構造を有するカチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２）は、細胞質タンパク質（例えば、シャペロンタンパク質、細胞内酵素（例えば、尿素サイクルまたはリソソーム貯蔵障害に関連する酵素をコードするｍＲＮＡ））、アクチン細胞骨格に関連するタンパク質、形質膜に関連するタンパク質、核周囲タンパク質、核タンパク質（例えば、転写因子）、及び細胞代謝、ＤＮＡ修復、転写ならびに／または翻訳に関与するあらゆる他のタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない細胞内タンパク質をコードするｍＲＮＡを送達するために使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される式Ｉ−ｃ１−ａまたは式Ｉ−ｇの構造を有するカチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２）は、イオンチャネルタンパク質などの膜貫通タンパク質をコードするｍＲＮＡを送達するために使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される式Ｉ−ｃ１−ａまたは式Ｉ−ｇの構造を有するカチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２）は、細胞外マトリックスに関連するタンパク質、分泌タンパク質（例えば、ホルモン及び／または神経伝達物質）が挙げられるが、これらに限定されない、細胞外タンパク質をコードするｍＲＮＡを送達するために使用することができる。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、本発明に好適な１つ以上のカチオン性脂質は、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリドまたは「ＤＯＴＭＡ」（Ｆｅｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号）であり得る。ＤＯＴＭＡは、単独で、または中性脂質、ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミンまたは「ＤＯＰＥ」もしくは他のカチオン性または非カチオン性脂質と組み合わせて、リポソーム移送担体または脂質ナノ粒子中に配合することができ、このようなリポソームは、核酸の標的細胞への送達を増強するために使用することができる。他の好適なカチオン性脂質としては、例えば、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミドまたは「ＤＯＧＳ」、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムまたは「ＤＯＳＰＡ」（Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）；米国特許第５，１７１，６７８号；米国特許第５，３３４，７６１号）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパンまたは「ＤＯＤＡＰ」、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパンまたは「ＤＯＴＡＰ」が挙げられる。
【０１１３】
追加の例示的なカチオン性脂質としては、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＳＤＭＡ」、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＯＤＭＡ」、１，２−リノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＬｉｎＤＭＡ」、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＬｅｎＤＭＡ」、Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリドまたは「ＤＯＤＡＣ」、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミドまたは「ＤＤＡＢ」、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミドまたは「ＤＭＲＩＥ」、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパンまたは「ＣＬｉｎＤＭＡ」、２−［５’−（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３’−オキサペントキシ］−３−ジメチル−１−（シス，シス−９’，１−２’−オクタデカジエンオキシ）プロパンまたは「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミンまたは「ＤＭＯＢＡ」、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」、２，３−ジリノレオイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピルアミンまたは「ＤＬｉｎＤＡＰ」、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジリノレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」、１，２−ジリノレオイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソランまたは「ＤＬｉｎ−ＤＭＡ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランまたは「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ」、及び２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ））（ＷＯ２０１０／０４２８７７；Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２−１７６（２０１０）を参照）、またはこれらの混合物（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７：２７６−２８７（２００５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.２３（８）：１００３−１００７（２００５）；ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／１２１３４８  Ａ１）も挙げられる。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質のうちの１つ以上は、イミダゾール、ジアルキルアミノ、またはグアニジニウム部分のうちの少なくとも１つを含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、１つ以上のカチオン性脂質は、ＸＴＣ（２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン）、ＭＣ３（（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート）、ＡＬＮＹ−１００（（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン））、ＮＣ９８−５（４，７，１３−トリス（３−オキソ−３−（ウンデシルアミノ）プロピル）−Ｎ１，Ｎ１６−ジウンデシル−４，７，１０，１３−テトラアザヘキサデカン−１，１６−ジアミド）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ＨＧＴ４００３（ＷＯ２０１２／１７０８８９、この教示内容は、それらの全体が参考として本明細書に組み込まれる）、ＩＣＥ（ＷＯ２０１１／０６８８１０、この教示内容は、それらの全体が参考として本明細書に組み込まれる）、ＨＧＴ５０００（米国仮特許出願第６１／６１７，４６８号、この教示内容は、それらの全体が参考として本明細書に組み込まれる）もしくはＨＧＴ５００１（シスまたはトランス）（米国仮特許出願第６１／６１７，４６８号）、ＷＯ２０１０／０５３５７２に開示されるものなどのアミノアルコールリピドイド、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．；Ｐａｌｍｅｒ，ｌ．；  Ｂｒｅｍｎｅｒ，Ｋ．；ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｉ．“Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ”Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２００５，１０７，２７６−２８７）、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（Ｓｅｍｐｌｅ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．“Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０，２８，１７２−１７６）、Ｃ１２−２００  （Ｌｏｖｅ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．“Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｉｎ  ｖｉｏ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ”  ＰＮＡＳ  ２０１０，１０７，１８６４−１８６９）から選択されてもよい。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、リポソーム中のカチオン脂質の割合は、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、または７０％超であってもよい。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質（複数可）は、リポソームの重量の約３０〜５０％（例えば、約３０〜４５％、約３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４０％）を構成する。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質（例えばｃＫＫ−Ｅ１２）は、リポソームのモル比の約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％を構成する。
【０１１６】
非カチオン性／ヘルパー脂質
いくつかの実施形態において、提供されるリポソームは、１つ以上の非カチオン性（「ヘルパー」）脂質を含有する。本明細書で使用される、フレーズ「非カチオン性脂質」とは、あらゆる中性、両性イオン性、またはアニオン性脂質を指す。本明細書で使用される、フレーズ「アニオン性脂質」とは、生理的ｐＨなどの選択されたｐＨにおいて正味の負電荷を担持する多くの脂質種のうちのいずれかを指す。非カチオン性脂質としては、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、このような非カチオン性脂質は、単独で使用されてもよいが、好ましくは、他の賦形剤、例えば、カチオン性脂質と組み合わせて用いられる。いくつかの実施形態において、非カチオン性脂質は、リポソーム中に存在する全脂質の約５％〜約９０％、または約１０％〜７０％のモル比を含んでもよい。いくつかの実施形態において、非カチオン性脂質は、中性脂質、すなわち、組成物が製剤化及び／または投与される条件下において正味の電荷を担持しない脂質である。いくつかの実施形態において、リポソーム中の非カチオン性脂質の割合は、５％超、１０％超、２０％超、３０％超、または４０％超であってもよい。
【０１１８】
コレステロールベースの脂質
いくつかの実施形態において、提供されるリポソームは、１つ以上のコレステロールベースの脂質を含む。例えば、好適なコレステロールベースのカチオン性脂質としては、例えば、ＤＣ−Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−エチルカルボキサミドコレステロール）、１，４−ビス（３−Ｎ−オレイルアミノ−プロピル）ピペラジン（Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）；Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３，１３９（１９９７）；米国特許第５，７４４，３３５号）、またはＩＣＥが挙げられる。いくつかの実施形態において、コレステロールベースの脂質は、リポソーム中に存在する全脂質の約２％〜約３０％、または約５％〜約２０％のモル比を含む。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子中のコレステロールベースの脂質の割合は、５％超、１０％超、２０％超、３０％超、または４０％超であってもよい。
【０１１９】
ＰＥＧ化脂質
いくつかの実施形態において、提供されるリポソームは、１つ以上のＰＥＧ化脂質を含む。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質、及びＮ−オクタノイル−スフィンゴシン−１−［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）−２０００］（Ｃ８  ＰＥＧ−２０００セラミド）を含む誘導体化セラミド（ＰＥＧ−ＣＥＲ）などの誘導体化脂質の使用も、カチオン性脂質の１つ以上、いくつかの実施形態においては、リポソームを構成する他の脂質と共に組み合わせて、本発明により企図される。考えられるＰＥＧ−修飾脂質としては、Ｃ６〜Ｃ２０の長さのアルキル鎖（複数可）を有する脂質に共有結合された最大５ｋＤａの長さのポリエチレングリコール鎖が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ修飾またはＰＥＧ化脂質は、ペグ化コレステロールまたはＰＥＧ−２Ｋである。このような成分の付加は、複合体の凝集を予防することができ、循環寿命を増加させ、脂質−核酸組成物の標的細胞への送達を増大させるための手段も提供することができ（Ｋｌｉｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６８（１）：２３５−２３７）、あるいはこれらの成分は、インビボでの製剤からの迅速な交換を行うよう選択されてもよい（米国特許第５，８８５，６１３号を参照）。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、特に有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖を有する（例えば、Ｃ１４またはＣ１８）ＰＥＧ−セラミドである。本発明のＰＥＧ修飾リン脂質及び誘導体化脂質は、リポソーム中に存在する全脂質の約０％〜約１５％、約０．５％〜約１５％、約１％〜約１５％、約４％〜約１０％、または約２％のモル比を含んでもよい。
【０１２１】
ポリマー
いくつかの実施形態において、好適な送達担体は、ポリマーをキャリアとして、単独でまたは本明細書に記載される様々な脂質を含む他のキャリアと組み合わせて用いて製剤化される。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書で使用されるリポソーム送達担体は、ポリマー含有ナノ粒子も包含する。好適なポリマーとしては、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリラクチド、ポリラクチド−ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルジネート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、プロタミン、ＰＥＧ化プロタミン、ＰＬＬ、ＰＥＧ化ＰＬＬ、及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を挙げることができる。ＰＥＩが存在するとき、これは、１０〜４０ｋＤＡの範囲の分子量の分岐鎖ＰＥＩ、例えば、２５ｋＤａの分岐鎖ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ＃４０８７２７）であってもよい。
【０１２２】
様々な実施形態によると、脂質ナノ粒子を構成するカチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質及び／またはポリマーの選択、ならびにこのような脂質の互いに対する相対的モル比は、選択された脂質（複数可）／ポリマーの特性、意図される標的細胞の性質、送達されるｍＲＮＡの特性に基づく。さらに考慮しなければならないこととしては、例えば、選択された脂質（複数可）のアルキル鎖の飽和度、ならびに選択された脂質サイズ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、融合性、及び毒性が挙げられる。したがって、モル比は、それに応じて調整されてもよい。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール、及び／またはｐＥＧ修飾脂質は、様々な相対的モル比で組み合わせることができる。例えば、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２、Ｃ１２−２００、ＨＧＴ５００１など）対非カチオン性脂質（例えば、ＤＯＰＥなど）対コレステロールベースの脂質（例えば、コレステロール）対ペグ化脂質（例えば、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ）の比は、それぞれ、約３０〜６０：２０〜３５：２０〜３０：１〜１５であってもよい。いくつかの実施形態リポソームは、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを含む。いくつかの実施形態において、リポソームは、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを、５０：２５：２０：５、５０：２０：２５：５、５０：２７：２０：３、４０：３０：２０：１０、４０：３０：２５：５、または４０：３２：２５：３の比で含む。いくつかの実施形態において、リポソームは、Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを含む。いくつかの実施形態において、リポソームは、Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを、５０：２５：２０：５、５０：２０：２５：５、５０：２７：２０：３、４０：３０：２０：１０、４０：３０：２５：５、または４０：３２：２５：３の比で含む。いくつかの実施形態において、リポソームは、ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを含む。いくつかの実施形態において、リポソームは、Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを、５０：２５：２０：５、５０：２０：２５：５、５０：２７：２０：３、４０：３０：２０：１０、４０：３０：２５：５、または４０：３２：２５：３の比で含む。
【０１２４】
リポソームの形成
本発明において使用するためのリポソーム移送担体は、現在、当該技術分野において既知である様々な技術によって調製することができる。提供される組成物において使用するためのリポソームは、現在、当該技術分野において既知である様々な技術によって調製することができる。例えば、多層ラメラ小胞（ＭＬＶ）は、選択された脂質を、脂質を適切な溶媒中に溶解することによって、好適なコンテナまたは容器の内壁上に堆積させ、次いで溶媒を蒸発させ、容器の内側に薄膜を残すことによって、またはスプレー乾燥によってなど、従来の技術に従って調製されてもよい。次いで、水相が、渦運動を用いて容器に添加され、これにより、ＭＬＶの形成をもたらすことができる。次いで、多層ラメラ小胞のホモジナイゼ―ションョン、超音波処理または押出によって、単層ラメラ小胞（ＵＬＶ）を形成することができる。加えて、単層ラメラ小胞は、洗浄剤除去技術によって形成することも可能である。
【０１２５】
ある特定の実施形態において、提供される組成物は、リポソームを含み、ここでは、ｍＲＮＡが、リポソームの両面と一体化され、かつ同じリポソーム内に封入されている。例えば、本発明の組成物の調製中に、カチオン性リポソームが、静電気的相互作用を通してｍＲＮＡと一体化してもよい。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物及び方法は、リポソーム内に封入されたｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のｍＲＮＡ種が、同一のリポソーム内に封入されてもよい。いくつかの実施形態において、１つ以上のｍＲＮＡ種が、異なるリポソーム内に封入されてもよい。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、１つ以上のリポソーム内に封入され、これらのリポソームは、それらの脂質組成、脂質成分のモル比、サイズ、電荷（ゼータ電位）、標的化リガンド及び／またはこれらの組み合わせで異なっている。いくつかの実施形態において、１つ以上のリポソームは、カチオン性脂質、中性脂質、ＰＥＧ修飾脂質及び／またはこれらの組み合わせの異なる組成を有してもよい。いくつかの実施形態において、１つ以上のリポソームは、リポソームを作成するために用いられるカチオン性脂質、中性脂質、コレステロール、及びＰＥＧ修飾脂質の異なるモル比を有してもよい。
【０１２７】
所望のｍＲＮＡのリポソームへの封入のプロセスは、しばしば「ローディング」と称される。例示的な方法が、参考として本明細書に組み込まれる、Ｌａｓｉｃ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３１２：２５５−２５８，１９９２に記載されている。リポソームに組み込まれた核酸は、リポソームの二層膜内のリポソームの内部空間に完全にまたは部分的に位置してもよく、あるいはリポソーム膜の外面と一体化してもよい。核酸のリポソームへの組み込みは、本明細書においては「封入」とも称され、ここでは、核酸は、リポソームの内部空間内に完全に封じ込まれている。ｍＲＮＡを、リポソームなどの移送担体中に組み込むことの目的は、多くの場合、核酸及び／または系を分解する酵素または化学物質を含有する場合がある環境から、あるいは核酸の急速な排出を引き起こす受容体から核酸を保護することである。したがって、いくつかの実施形態において、好適な送達担体は、その中に封じ込められたｍＲＮＡの安定性を増強させ、及び／またはｍＲＮＡの標的細胞または組織への送達を容易にすることができる。
【０１２８】
ナノ粒子サイズ
本発明による好適なリポソームまたは他のナノ粒子は、様々なサイズに作製されてもよい。本明細書で使用される、用語「サイズ」は、ナノ粒子と関連付けて使用される場合、ナノ粒子の最大直径を意味する。いくつかの実施形態において、好適なナノ粒子は、約１００ｎｍ以下のサイズ（例えば、約９０ｎｍ以下、８０ｎｍ以下、７０ｎｍ以下、６０ｎｍ以下、５０ｎｍ以下、４０ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、または２０ｎｍ以下のサイズ）を有する。いくつかの実施形態ナノ粒子は、約６０ｎｍ以下のサイズ（例えば、約５５ｎｍ以下の、約５０ｎｍ以下の、約４５ｎｍ以下の、約４０ｎｍ以下の、約３５ｎｍ以下の、約３０ｎｍ以下の、または２５ｎｍ以下のサイズ）を有する。いくつかの実施形態において、好適なナノ粒子は、約１０〜１００ｎｍの範囲の（例えば、約１０〜９０ｎｍ、１０〜８０ｎｍ、１０〜７０ｎｍ、１０〜６０ｎｍ、１０〜５０ｎｍ、１０〜４０ｎｍ、または１０〜３０ｎｍの範囲の）サイズを有する。
【０１２９】
当該技術分野において既知の様々な代替的方法が、リポソームの集団のサイズ測定のために利用可能である。１つのこのようなサイズ測定法は、参考として本明細書に組み込まれる、米国特許第４，７３７，３２３号に記載されている。リポソーム懸濁液を、バス型またはプローブ型超音波処理装置のいずれかによって超音波処理することは、直径が約０．０５ミクロン未満の小さなＵＬＶへの漸進的なサイズ減少をもたらす。ホモジナイゼ―ションは、大きなリポソームをより小さなリポソームにフラグメント化するためにせん断エネルギーに依存する別の方法である。典型的なホモジナイゼ―ション処理において、ＭＬＶは、選択されたリポソームサイズ、通常は、約０．１〜０．５ミクロンが観察されるまで、標準エマルジョンホモジナイザーを通して再循環される。リポソームのサイズは、参考として本明細書に組み込まれる、Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０：４２１−１５０（１９８１）に記載されるような、準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）によって決定されてもよい。平均リポソーム直径は、形成されたリポソームの超音波処理によって低減されてもよい。効率的なリポソーム合成に導くために、断続的な超音波処理サイクルが、ＱＥＬＳ評価と交互に行われてもよい。
【０１３０】
医薬組成物及び投与
インビボにおけるｍＲＮＡの発現を容易にするために、リポソームなどの送達担体は、１つ以上の核酸、キャリア、標的化リガンドまたは安定化剤と組み合わせて、あるいは送達担体が好適な賦形剤と混合されている医薬組成物で製剤化することができる。薬物の製造か及び投与のための技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎで見ることができる。
【０１３１】
特に、提供されるｍＲＮＡ（裸のまたはナノ粒子に封入されるかもしくは一体化された）及びそれを含有する組成物は、関節内投与を介して対象の関節に投与され得る。本明細書で使用される、用語「関節内注射」、「関節内投与」、「関節内送達」または文法上の等価物は、関節への直接または局所投与を指す。例えば、提供されるｍＲＮＡ（裸のまたはナノ粒子に封入されるかもしくは一体化された）及びそれを含有する組成物は、関節痛または炎症を緩和する目的で関節空間内に注射され得る。
【０１３２】
通常、提供されるｍＲＮＡ（裸のまたはナノ粒子に封入されるかもしくは一体化された）及びそれを含有する組成物は、有効量または用量で投与される。本明細書で使用される「有効量」とは、一度投与されるかまたは投与計画に従って投与される場合、症状及び当業者によって疾患の進行、退行または向上の適切な尺度として選択される他の指標の少なくともいくらかの安定化、向上または排除を達成するために有効な量である。いくつかの実施形態において、好適な量及び投与計画は、関節におけるタンパク質（例えば、抗体）発現または活性をもたらすものである。いくつかの実施形態において、タンパク質の発現及び／または活性は、軟骨、靭帯、筋肉、滑膜内膜細胞、軟骨細胞、及び／または関節滑液において検出される。いくつかの実施形態において、タンパク質の発現及び／または活性は、単回投与後、少なくとも約６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、４週、１ヶ月、またはそれ以上の期間で検出可能である。
【０１３３】
本発明で提供される方法は、投与計画に従って、本明細書に記載されるｍＲＮＡまたは組成物の治療的有効量の単回ならびに複数回投与を企図する。本明細書に記載されるｍＲＮＡまたは組成物は、対象の病状の性質、重症度及び程度に応じて、規則的間隔で投与することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるｍＲＮＡまたは組成物の治療的有効量は、規則的間隔で周期的に投与されてもよい（例えば、毎年１回、６ヶ月毎に１回、５ヶ月毎に１回、４ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、隔月（２ヶ月毎に１回）、毎月（１ヶ月毎に１回）、３週間毎に１回、隔週（２週間毎に１回）、毎週、３日毎に１回、２日毎に１回、毎日または連続投与）。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるｍＲＮＡまたは組成物は、変動時間間隔で投与されてもよい。
【実施例】
【０１３４】
本発明の特定の化合物、組成物及び方法が、ある特定の実施形態に従って特定性を伴い説明してきたが、以下の実施例は、本発明の化合物を単に例示するために役立つものであり、それらを限定することを意図するものではない。
【０１３５】
実施例１：ｍＲＮＡ送達及び発現のための例示的なリポソーム製剤
本実施例は、インビボでのｍＲＮＡの有効な送達及び発現のための例示的なリポソーム製剤を提供する。
【０１３６】
脂質材料
本明細書に記載される製剤は、様々な核酸ベースの材料を封入するように設計された、１つ以上の脂質、ヘルパー脂質及びペグ化脂質を使用する、様々な比率の多成分脂質混合物に基づく。カチオン性脂質としては、（ここに列記されるものに限られるものではないが）ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．；Ｐａｌｍｅｒ，ｌ．；Ｂｒｅｍｎｅｒ，Ｋ．；ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｉ．“Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｉｎｔｒａｓｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ”Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２００５，１０７，２７６−２８７）、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（Ｓｅｍｐｌｅ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．“Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０，２８，１７２−１７６）、Ｃ１２−２００（Ｌｏｖｅ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．“Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ”ＰＮＡＳ  ２０１０，  １０７，１８６４−１８６９）、ｃＫＫ−Ｅ１２（３，６−ビス（４−ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン−２，５−ジオン）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＨＧＴ４００３、ＩＣＥ、ジアルキルアミノベース、イミダゾールベース、グアニジンベースなどを挙げることができる。ヘルパー脂質としては、（ここに列記されるものに限られるものではないが）ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフホコリン、ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、コレステロールなどを挙げることができる。ＰＥＧ化脂質としては、（これに限られるものではないが）Ｃ６〜Ｃ２０の長さのアルキル鎖（複数可）を有する脂質に共有結合された最大５ｋＤａの長さのポリ（エチレン）グリコール鎖を挙げることができる。ポリエチレンイミンは、直鎖または分岐鎖であり得る。分岐鎖ＰＥＩについては、２５ｋＤａが好ましいが、これに限られるものではない。
【０１３７】
メッセンジャーＲＮＡ材料
コドン最適化ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）のメッセンジャーＲＮＡを、この遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって合成し、その後、５’キャップ構造の付加（Ｆｅｃｈｔｅｒ，Ｐ．；  Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ｇ．Ｇ．“Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｃａｐ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００５，  ８６，１２３９−１２４９）及びゲル電気泳動によって決定されるおよそ２５０個のヌクレオチドの長さの３’ポリ（Ａ）テールの付加を行った。各ｍＲＮＡ生成物中に存在する５’及び３’非翻訳領域を、それぞれＸ及びＹと表し、記載したように定義した（下記参照）。
コドン最適化ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡ：
ＸＡＵＧＧＡＡＧＡＵＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＵＵＡＡＧＡＡＧＧＧＣＣＣＡＧＣＧＣＣＡＵＵＣＵＡＣＣＣＡＣＵＣＧＡＡＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＡＧＣＵＧＣＡＣＡＡＡＧＣＣＡＵＧＡＡＧＣＧＣＵＡＣＧＣＣＣＵＧＧＵＧＣＣＣＧＧＣＡＣＣＡＵＣＧＣＣＵＵＵＡＣＣＧＡＣＧＣＡＣＡＵＡＵＣＧＡＧＧＵＧＧＡＣＡＵＵＡＣＣＵＡＣＧＣＣＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＧＡＵＧＡＧＣＧＵＵＣＧＧＣＵＧＧＣＡＧＡＡＧＣＵＡＵＧＡＡＧＣＧＣＵＡＵＧＧＧＣＵＧＡＡＵＡＣＡＡＡＣＣＡＵＣＧＧＡＵＣＧＵＧＧＵＧＵＧＣＡＧＣＧＡＧＡＡＵＡＧＣＵＵＧＣＡＧＵＵＣＵＵＣＡＵＧＣＣＣＧＵＧＵＵＧＧＧＵＧＣＣＣＵＧＵＵＣＡＵＣＧＧＵＧＵＧＧＣＵＧＵＧＧＣＣＣＣＡＧＣＵＡＡＣＧＡＣＡＵＣＵＡＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＧＡＧＣＵＧＣＵＧＡＡＣＡＧＣＡＵＧＧＧＣＡＵＣＡＧＣＣＡＧＣＣＣＡＣＣＧＵＣＧＵＡＵＵＣＧＵＧＡＧＣＡＡＧＡＡＡＧＧＧＣＵＧＣＡＡＡＡＧＡＵＣＣＵＣＡＡＣＧＵＧＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＵＡＣＣＧＡＵＣＡＵＡＣＡＡＡＡＧＡＵＣＡＵＣＡＵＣＡＵＧＧＡＵＡＧＣＡＡＧＡＣＣＧＡＣＵＡＣＣＡＧＧＧＣＵＵＣＣＡＡＡＧＣＡＵＧＵＡＣＡＣＣＵＵＣＧＵＧＡＣＵＵＣＣＣＡＵＵＵＧＣＣＡＣＣＣＧＧＣＵＵＣＡＡＣＧＡＧＵＡＣＧＡＣＵＵＣＧＵＧＣＣＣＧＡＧＡＧＣＵＵＣＧＡＣＣＧＧＧＡＣＡＡＡＡＣＣＡＵＣＧＣＣＣＵＧＡＵＣＡＵＧＡＡＣＡＧＵＡＧＵＧＧＣＡＧＵＡＣＣＧＧＡＵＵＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＧＵＡＧＣＣＣＵＡＣＣＧＣＡＣＣＧＣＡＣＣＧＣＵＵＧＵＧＵＣＣＧＡＵＵＣＡＧＵＣＡＵＧＣＣＣＧＣＧＡＣＣＣＣＡＵＣＵＵＣＧＧＣＡＡＣＣＡＧＡＵＣＡＵＣＣＣＣＧＡＣＡＣＣＧＣＵＡＵＣＣＵＣＡＧＣＧＵＧＧＵＧＣＣＡＵＵＵＣＡＣＣＡＣＧＧＣＵＵＣＧＧＣＡＵＧＵＵＣＡＣＣＡＣＧＣＵＧＧＧＣＵＡＣＵＵＧＡＵＣＵＧＣＧＧＣＵＵＵＣＧＧＧＵＣＧＵＧＣＵＣＡＵＧＵＡＣＣＧＣＵＵＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＵＡＵＵＣＵＵＧＣＧＣＡＧＣＵＵＧＣＡＡＧＡＣＵＡＵＡＡＧＡＵＵＣＡＡＵＣＵＧＣＣＣＵＧＣＵＧＧＵＧＣＣＣＡＣＡＣＵＡＵＵＵＡＧＣＵＵＣＵＵＣＧＣＵＡＡＧＡＧＣＡＣＵＣＵＣＡＵＣＧＡＣＡＡＧＵＡＣＧＡＣＣＵＡＡＧＣＡＡＣＵＵＧＣＡＣＧＡＧＡＵＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＣＧＣＣＧＣＵＣＡＧＣＡＡＧＧＡＧＧＵＡＧＧＵＧＡＧＧＣＣＧＵＧＧＣＣＡＡＡＣＧＣＵＵＣＣＡＣＣＵＡＣＣＡＧＧＣＡＵＣＣＧＣＣＡＧＧＧＣＵＡＣＧＧＣＣＵＧＡＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＣＡＧＣＧＣＣＡＵＵＣＵＧＡＵＣＡＣＣＣＣＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＧＡＣＡＡＧＣＣＵＧＧＣＧＣＡＧＵＡＧＧＣＡＡＧＧＵＧＧＵＧＣＣＣＵＵＣＵＵＣＧＡＧＧＣＵＡＡＧＧＵＧＧＵＧＧＡＣＵＵＧＧＡＣＡＣＣＧＧＵＡＡＧＡＣＡＣＵＧＧＧＵＧＵＧＡＡＣＣＡＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＵＧＵＧＣＧＵＣＣＧＵＧＧＣＣＣＣＡＵＧＡＵＣＡＵＧＡＧＣＧＧＣＵＡＣＧＵＵＡＡＣＡＡＣＣＣＣＧＡＧＧＣＵＡＣＡＡＡＣＧＣＵＣＵＣＡＵＣＧＡＣＡＡＧＧＡＣＧＧＣＵＧＧＣＵＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＧＡＣＡＵＣＧＣＣＵＡＣＵＧＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＣＡＣＵＵＣＵＵＣＡＵＣＧＵＧＧＡＣＣＧＧＣＵＧＡＡＧＡＧＣＣＵＧＡＵＣＡＡＡＵＡＣＡＡＧＧＧＣＵＡＣＣＡＧＧＵＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＡＡＣＵＧＧＡＧＡＧＣＡＵＣＣＵＧＣＵＧＣＡＡＣＡＣＣＣＣＡＡＣＡＵＣＵＵＣＧＡＣＧＣＣＧＧＧＧＵＣＧＣＣＧＧＣＣＵＧＣＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＵＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＵＧＣＣＣＧＣＣＧＣＡＧＵＣＧＵＣＧＵＧＣＵＧＧＡＡＣＡＣＧＧＵＡＡＡＡＣＣＡＵＧＡＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＣＧＵＧＧＡＣＵＡＵＧＵＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＵＵＡＣＡＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＵＧＣＧＣＧＧＵＧＧＵＧＵＵＧＵＧＵＵＣＧＵＧＧＡＣＧＡＧＧＵＧＣＣＵＡＡＡＧＧＡＣＵＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＵＵＧＧＡＣＧＣＣＣＧＣＡＡＧＡＵＣＣＧＣＧＡＧＡＵＵＣＵＣＡＵＵＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＡＵＣＧＣＣＧＵＧＵＡＡＹ［配列番号１］
５’及び３’ＵＴＲ配列
Ｘ（５’ＵＴＲ配列）＝
ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧ［配列番号２］
Ｙ（３’ＵＴＲ配列）＝
ＣＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＧＣＵ［配列番号３］
または
ＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＡＧＣＵ（配列番号４）
【０１３８】
例示の製剤プロトコール
Ａ．ｃＫＫ−Ｅ１２
ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの５０ｍｇ／ｍＬのエタノール溶液のアリコートを混合し、エタノールで希釈し、３ｍＬの最終容量にした。別に、ＦＦＬ  ｍＲＮＡの水性緩衝溶液（１０ｍＭのクエン酸／１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を、１ｍｇ／ｍＬの保存液から調製した。脂質溶液を、水性ｍＲＮＡ溶液に迅速に注入し、振盪して、２０％エタノール中の最終懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析し、濃縮して、２〜８℃で保存した。最終濃度＝１．０ｍｇ／ｍＬのＦＦＬ  ｍＲＮＡ（封入された）。Ｚａｖｅ＝７８ｎｍ；ＰＤＩ：０．１３。
【０１３９】
Ｂ．Ｃ１２−２００
Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの５０ｍｇ／ｍＬのエタノール溶液のアリコートを混合し、エタノールで希釈し、３ｍＬの最終容量にした。別に、ＦＦＬ  ｍＲＮＡの水性緩衝溶液（１０ｍＭのクエン酸／１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を、１ｍｇ／ｍＬの保存液から調製した。脂質溶液を、水性ｍＲＮＡ溶液に迅速に注入し、振盪して、２０％エタノール中の最終懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析し、濃縮して、２〜８℃で保存した。最終濃度＝０．８２ｍｇ／ｍＬのＦＦＬ  ｍＲＮＡ（封入された）。Ｚａｖｅ＝８３ｎｍ；ＰＤＩ：０．１３。
【０１４０】
Ｃ．ＨＧＴ５００１
ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの５０ｍｇ／ｍＬのエタノール溶液のアリコートを混合し、エタノールで希釈し、３ｍＬの最終容量にした。別に、ＦＦＬ  ｍＲＮＡの水性緩衝溶液（１０ｍＭのクエン酸／１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を、１ｍｇ／ｍＬの保存液から調製した。脂質溶液を、水性ｍＲＮＡ溶液に迅速に注入し、振盪して、２０％エタノール中の最終懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析し、濃縮して、２〜８℃で保存した。最終濃度＝１．０ｍｇ／ｍＬのＦＦＬ  ｍＲＮＡ（封入された）。Ｚａｖｅ＝８０ｎｍ；ＰＤＩ：０．１３。
【０１４１】
Ｄ．ＰＥＩ
１．３４ｍｇ／ｍＬ（ｐＨ５．０）の濃度の２５ｋＤａの分岐鎖ＰＥＩ溶液を、等量のＦＦＬ  ｍＲＮＡ（１．０ｍｇ／ｍｌ）と混合した。得られた製剤を２〜８℃で保存した。最終濃度＝０．５０ｍｇ／ｍＬのＦＦＬ  ｍＲＮＡ。
【０１４２】
実施例２．有効なインビボでのタンパク質産生
本実施例は、ＦＦＬ  ｍＲＮＡの投与が、インビボでタンパク質産生を成功裏にもたらすことを立証する。
【０１４３】
インビボでのホタルルシフェラーゼタンパク質の産生結果
コドン最適化ＦＦＬ  ｍＲＮＡをローディングした脂質を介してのホタルルシフェラーゼタンパク質の産生を、単回ボーラス関節内注射として、ＣＤ−１マウスで試験した。図１Ａ〜４Ｃは、ＩＶＩＳイメージャを用いて、インビボ生物発光イメージングを介して検出された発光を表す。このような発光は、ＦＦＬ  ｍＲＮＡナノ粒子の野生型マウスにおける注射後２４時間で測定した。表１は、ルシフェリン投与後の発光値を表す（全発光束（光子数／秒）、ルシフェリン後１０分）。注射後２４時間でマウスをトサツし、臓器を回収した（上記記載の通りに）。
【表１】
2019014742.tif 000007
表１．ＦＦＬ  ｍＲＮＡでローディング下ナノ粒子の関節内投与に由来する、活性ホタルルシフェラーゼタンパク質から産生された全発光束（光子数／秒）の定量化。値は、被験物質の投与後２４時間で産生されたタンパク質を反映している。全光束は、ルシフェリン基質の投与後１０分で測定される。
【０１４４】
等価物
当業者であれば、日常的な実験を用いるだけで、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識し、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記説明に限定するように意図されておらず、むしろ、以下の特許請求の範囲に記載されている。
【図１Ａ−Ｂ】
2019014742.tif 000008
【図１Ｃ】
2019014742.tif 000009
【図２Ａ−Ｂ】
2019014742.tif 000010
【図２Ｃ】
2019014742.tif 000011
【図３Ａ−Ｂ】
2019014742.tif 000012
【図３Ｃ】
2019014742.tif 000013
【図４Ａ−Ｂ】
2019014742.tif 000014
【図４Ｃ】
2019014742.tif 000015
【配列表】
2019014742000001.app
【外国語明細書】
2019014742000001.pdf