(57)【要約】      （修正有）【課題】αＶβ６を過剰発現する癌並びにαＶβ６及びＨＥＲ２を過剰発現する癌を治療及び診断する方法の提供。【解決手段】αＶβ６に特異的に結合して、αＶβ６へのリガンドの結合を阻害するαＶβ６標的化結合剤、及び併用療法薬を治療有効用量で投与するステップを含む、悪性腫瘍を治療する方法。前記αＶβ６標的化結合剤、及びＨＥＲ２に特異的に結合して、ＨＥＲ２へのリガンドの結合を阻害するＨＥＲ２標的化結合剤を治療有効用量で投与するステップを含む、トラスツズマブ耐性腫瘍細胞の増殖を抑制する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物における悪性腫瘍を治療する方法であって、それを必要とする前記動物に、以下：  ａ．αＶβ６に特異的に結合して、αＶβ６へのリガンドの結合を阻害するαＶβ６標的化結合剤；及び
ｂ．任意選択で、併用療法薬
を治療有効用量で投与するステップを含む方法。
【請求項２】
腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、前記腫瘍細胞に、以下：
ａ．αＶβ６に特異的に結合して、αＶβ６へのリガンドの結合を阻害するαＶβ６標的化結合剤；及び
ｂ．任意選択で、併用療法薬
を治療有効用量で投与するステップを含む方法。
【請求項３】
αＶβ６が過剰発現される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記併用療法薬が投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記αＶβ６標的化結合剤及び前記併用療法薬が、同時に投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記αＶβ６標的化結合剤及び前記併用療法薬が、順次投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記悪性腫瘍が、乳癌細胞、卵巣癌細胞、膵臓癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、頭頸部癌細胞、食道癌細胞、胃癌細胞、及び肝細胞癌細胞から選択される腫瘍細胞を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記動物が、ヒトである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記併用療法薬が、ＨＥＲ２に特異的に結合して、ＨＥＲ２へのリガンドの結合を阻害するＨＥＲ２標的化結合剤である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記併用療法薬が、トラスツズマブ、ＨＥＲ−２阻害剤、トラスツズマブ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、ゲムシタビン、アブラキサン、フォルフィリノクッス、ドセタキセル、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ゲフィチニブ、ＡＺＤ９２９１、エルロチニブ、プラチナ系細胞傷害剤、プラチナ系トリプレット、トリプレット化学療法薬、ソラファニブ、ＴＮＦα変換酵素阻害剤、放射線照射、５−フルオロウラシル、セツキシマブ、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＡＴＫ阻害剤、ＡＺＤ５３６３、ＭＫ２２０６、ラパログ、エベロリムスＡＺＤ２０１４、ＰＩ３Ｋα阻害剤、ＰＩ３Ｋβ阻害剤、ＡＺＤ８１８６、ＧＳＫ２６３６７７１、ＳＡＲ２６０３０１、ＰａｎＰＩ３Ｋ阻害剤、ＧＤＣ０９４１、ＧＤＣ０９４２、ＭＥＫ／ＲＡＦ阻害剤、ベムラファニブ、ＲＡＦ阻害剤、セルエメチニブ、ＭＥＫ阻害剤、トラメチニブ、ＭＥＫ阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ１阻害剤、又はＣＴＬＡ４阻害剤から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記腫瘍細胞が、乳癌細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記併用療法薬が、トラスツズマブ、ＨＥＲ−２阻害剤、トラスツズマブ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、ゲムシタビン、アブラキサン、フォルフィリノクッス、ドセタキセル、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ゲフィチニブ、ＡＺＤ９２９１、エルロチニブ、プラチナ系細胞傷害剤、プラチナ系トリプレット、トリプレット化学療法薬、ソラファニブ、ＴＮＦα変換酵素阻害剤、放射線照射、５−フルオロウラシル、セツキシマブ、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＡＴＫ阻害剤、ＡＺＤ５３６３、ＭＫ２２０６、ラパログ、エベロリムスＡＺＤ２０１４、ＰＩ３Ｋα阻害剤、ＰＩ３Ｋβ阻害剤、ＡＺＤ８１８６、ＧＳＫ２６３６７７１、ＳＡＲ２６０３０１、ＰａｎＰＩ３Ｋ阻害剤、ＧＤＣ０９４１、ＧＤＣ０９４２、ＭＥＫ／ＲＡＦ阻害剤、ベムラファニブ、ＲＡＦ阻害剤、セルエメチニブ、ＭＥＫ阻害剤、トラメチニブ、ＭＥＫ阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ１阻害剤、又はＣＴＬＡ４阻害剤から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍細胞が、卵巣癌細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記併用療法薬が、トラスツズマブ、ＨＥＲ−２阻害剤、トラスツズマブ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、ゲムシタビン、アブラキサン、フォルフィリノクッス、ドセタキセル、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ゲフィチニブ、ＡＺＤ９２９１、エルロチニブ、プラチナ系細胞傷害剤、プラチナ系トリプレット、トリプレット化学療法薬、ソラファニブ、ＴＮＦα変換酵素阻害剤、放射線照射、５−フルオロウラシル、セツキシマブ、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＡＴＫ阻害剤、ＡＺＤ５３６３、ＭＫ２２０６、ラパログ、エベロリムスＡＺＤ２０１４、ＰＩ３Ｋα阻害剤、ＰＩ３Ｋβ阻害剤、ＡＺＤ８１８６、ＧＳＫ２６３６７７１、ＳＡＲ２６０３０１、ＰａｎＰＩ３Ｋ阻害剤、ＧＤＣ０９４１、ＧＤＣ０９４２、ＭＥＫ／ＲＡＦ阻害剤、ベムラファニブ、ＲＡＦ阻害剤、セルエメチニブ、ＭＥＫ阻害剤、トラメチニブ、ＭＥＫ阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ１阻害剤、又はＣＴＬＡ４阻害剤から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記乳癌細胞が、トラスツズマブ治療に対して耐性である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記卵巣癌細胞が、トラスツズマブ治療に対して耐性である、請求項１〜１０、１３又は１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＨＥＲ２標的化結合剤が、トラスツズマブである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記αＶβ６標的化結合剤が、ｓｃ２６４ＲＡＤである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
αＶβ６及びＨＥＲ２を阻害する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
αＶβ６、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＢ６の少なくとも１つのレベルが下方制御される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
αＶβ６及び／又はＨＥＲ２の少なくとも１つの下流標的のレベルが下方制御される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
Ａｋｔ２及びＳｍａｄ２の少なくとも１つのレベルが下方制御される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的の全レベルが下方制御される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記標的のホスホレベルが下方制御される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
２種以上のαＶβ６標的化結合剤が使用される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
２種以上の併用療法薬が使用される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記腫瘍細胞が、膵臓癌細胞である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記併用療法薬が、トラスツズマブ、ＨＥＲ−２阻害剤、トラスツズマブ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、ゲムシタビン、アブラキサン、フォルフィリノクッス、ドセタキセル、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ゲフィチニブ、ＡＺＤ９２９１、エルロチニブ、プラチナ系細胞傷害剤、プラチナ系トリプレット、トリプレット化学療法薬、ソラファニブ、ＴＮＦα変換酵素阻害剤、放射線照射、５−フルオロウラシル、セツキシマブ、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＡＴＫ阻害剤、ＡＺＤ５３６３、ＭＫ２２０６、ラパログ、エベロリムスＡＺＤ２０１４、ＰＩ３Ｋα阻害剤、ＰＩ３Ｋβ阻害剤、ＡＺＤ８１８６、ＧＳＫ２６３６７７１、ＳＡＲ２６０３０１、ＰａｎＰＩ３Ｋ阻害剤、ＧＤＣ０９４１、ＧＤＣ０９４２、ＭＥＫ／ＲＡＦ阻害剤、ベムラファニブ、ＲＡＦ阻害剤、セルエメチニブ、ＭＥＫ阻害剤、トラメチニブ、ＭＥＫ阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ１阻害剤、又はＣＴＬＡ４阻害剤から選択される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記腫瘍細胞が、肺癌細胞である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記肺癌細胞が、腺癌細胞、扁平上皮癌細胞、又は小細胞肺癌細胞である、請求項１〜２６又は２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記併用療法薬が、トラスツズマブ、ＨＥＲ−２阻害剤、トラスツズマブ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、ゲムシタビン、アブラキサン、フォルフィリノクッス、ドセタキセル、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ゲフィチニブ、ＡＺＤ９２９１、エルロチニブ、プラチナ系細胞傷害剤、プラチナ系トリプレット、トリプレット化学療法薬、ソラファニブ、ＴＮＦα変換酵素阻害剤、放射線照射、５−フルオロウラシル、セツキシマブ、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＡＴＫ阻害剤、ＡＺＤ５３６３、ＭＫ２２０６、ラパログ、エベロリムスＡＺＤ２０１４、ＰＩ３Ｋα阻害剤、ＰＩ３Ｋβ阻害剤、ＡＺＤ８１８６、ＧＳＫ２６３６７７１、ＳＡＲ２６０３０１、ＰａｎＰＩ３Ｋ阻害剤、ＧＤＣ０９４１、ＧＤＣ０９４２、ＭＥＫ／ＲＡＦ阻害剤、ベムラファニブ、ＲＡＦ阻害剤、セルエメチニブ、ＭＥＫ阻害剤、トラメチニブ、ＭＥＫ阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ１阻害剤、又はＣＴＬＡ４阻害剤から選択される、請求項１〜２６、２９又は３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記腫瘍細胞が、大腸癌細胞である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記併用療法薬が、トラスツズマブ、ＨＥＲ−２阻害剤、トラスツズマブ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、ゲムシタビン、アブラキサン、フォルフィリノクッス、ドセタキセル、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ゲフィチニブ、ＡＺＤ９２９１、エルロチニブ、プラチナ系細胞傷害剤、プラチナ系トリプレット、トリプレット化学療法薬、ソラファニブ、ＴＮＦα変換酵素阻害剤、放射線照射、５−フルオロウラシル、セツキシマブ、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＡＴＫ阻害剤、ＡＺＤ５３６３、ＭＫ２２０６、ラパログ、エベロリムスＡＺＤ２０１４、ＰＩ３Ｋα阻害剤、ＰＩ３Ｋβ阻害剤、ＡＺＤ８１８６、ＧＳＫ２６３６７７１、ＳＡＲ２６０３０１、ＰａｎＰＩ３Ｋ阻害剤、ＧＤＣ０９４１、ＧＤＣ０９４２、ＭＥＫ／ＲＡＦ阻害剤、ベムラファニブ、ＲＡＦ阻害剤、セルエメチニブ、ＭＥＫ阻害剤、トラメチニブ、ＭＥＫ阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ１阻害剤、又はＣＴＬＡ４阻害剤から選択される、請求項１〜２６又は３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記腫瘍細胞が、頭頸部癌細胞である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記併用療法薬が、トラスツズマブ、ＨＥＲ−２阻害剤、トラスツズマブ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、ゲムシタビン、アブラキサン、フォルフィリノクッス、ドセタキセル、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ゲフィチニブ、ＡＺＤ９２９１、エルロチニブ、プラチナ系細胞傷害剤、プラチナ系トリプレット、トリプレット化学療法薬、ソラファニブ、ＴＮＦα変換酵素阻害剤、放射線照射、５−フルオロウラシル、セツキシマブ、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＡＴＫ阻害剤、ＡＺＤ５３６３、ＭＫ２２０６、ラパログ、エベロリムスＡＺＤ２０１４、ＰＩ３Ｋα阻害剤、ＰＩ３Ｋβ阻害剤、ＡＺＤ８１８６、ＧＳＫ２６３６７７１、ＳＡＲ２６０３０１、ＰａｎＰＩ３Ｋ阻害剤、ＧＤＣ０９４１、ＧＤＣ０９４２、ＭＥＫ／ＲＡＦ阻害剤、ベムラファニブ、ＲＡＦ阻害剤、セルエメチニブ、ＭＥＫ阻害剤、トラメチニブ、ＭＥＫ阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ１阻害剤、又はＣＴＬＡ４阻害剤から選択される、請求項１〜２６又は３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記腫瘍細胞が、食道癌細胞である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記併用療法薬が、放射線照射又は化学療法薬から選択される、請求項１〜２６又は３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記腫瘍細胞が、胃癌細胞である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記併用療法薬が、トリプレット化学療法薬である、請求項１〜２６又は３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記腫瘍細胞が、肝細胞癌細胞である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記併用療法薬が、ソラファニブ及びＴＡＣＥ（ＴＮＦα変換酵素）阻害剤から選択される、請求項１〜２６又は４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
トラスツズマブ耐性腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、前記細胞に、以下：
ａ．αＶβ６に特異的に結合して、αＶβ６へのリガンドの結合を阻害するαＶβ６標的化結合剤；及び
ｂ．ＨＥＲ２に特異的に結合して、ＨＥＲ２へのリガンドの結合を阻害するＨＥＲ２標的化結合剤
を治療有効用量で投与するステップを含む方法。
【請求項４３】
前記ＨＥＲ２標的化結合剤が、トラスツズマブである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記αＶβ６標的化結合剤が、ｓｃ２６４ＲＡＤである、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記αＶβ６標的化結合剤が、モノクローナル抗体である、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記αＶβ６標的化結合剤が、完全ヒトモノクローナル抗体である、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記αＶβ６標的化結合剤が、ＨＴ２９細胞のＴＧＦβ−ＬＡＰ媒介性接着の９９％超を阻害する、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記αＶβ６標的化結合剤が、０．０７０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０で、ＨＴ２９細胞のＴＧＦβ−ＬＡＰ媒介性接着を阻害する、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記αＶβ６標的化結合剤が、３５ナノモル（ｎＭ）未満のＫｄで、αＶβ６に結合する、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記αＶβ６標的化結合剤が、２５ナノモル（ｎＭ）未満のＫｄで、αＶβ６に結合する、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記αＶβ６標的化結合剤が、１０ナノモル（ｎＭ）未満のＫｄで、αＶβ６に結合する、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記αＶβ６標的化結合剤が、６０ピコモル（ｐＭ）未満のＫｄで、αＶβ６に結合する、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記αＶβ６標的化結合剤が、モノクローナル抗体ｓｃ２６４ＲＡＤ、ｓｃ２６４ＲＡＤ／ＡＤＹ、ｓｃ１８８ＳＤＭ、ｓｃ１３３、ｓｃ１３３ＴＭＴ、ｓｃ１３３ＷＤＳ、ｓｃ１３３ＴＭＴ／ＷＤＳ、ｓｃ１８８、ｓｃ２５４、ｓｃ２６４又はｓｃ２９８である、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記αＶβ６標的化結合剤が、配列番号１４のアミノ酸９８〜１０２を有する少なくともＶＨ  ＣＤＲ３を含む、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記αＶβ６標的化結合剤が、配列番号２２のアミノ酸９９〜１１３を有する少なくともＶＨ  ＣＤＲ３を含む、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記αＶβ６標的化結合剤が、配列番号２６のアミノ酸９９〜１１７を有する少なくともＶＨ  ＣＤＲ３を含む、請求項１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記αＶβ６標的化結合剤が、配列番号３０のアミノ酸９９〜１１４を有する少なくともＶＨ  ＣＤＲ３を含む、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記αＶβ６標的化結合剤が、配列番号３８のアミノ酸９７〜１１３を有する少なくともＶＨ  ＣＤＲ３を含む、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記αＶβ６標的化結合剤が、配列番号１４の配列を有する重鎖ポリペプチドを含む、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記αＶβ６標的化結合剤が、配列番号２２の配列を有する重鎖ポリペプチドを含む、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記αＶβ６標的化結合剤が、配列番号２６の配列を有する重鎖ポリペプチドを含む、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記αＶβ６標的化結合剤が、配列番号３０の配列を有する重鎖ポリペプチドを含む、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記αＶβ６標的化結合剤が、配列番号３８の配列を有する重鎖ポリペプチドを含む、請求項１〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記αＶβ６標的化結合剤が、配列番号７１の配列を有する重鎖ポリペプチドを含む、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記αＶβ６標的化結合剤が、配列番号７５の配列を有する重鎖ポリペプチドを含む、請求項１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記αＶβ６標的化結合剤が、以下：
ａ．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と；
ｂ．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域と
を含む単離されたヒトモノクローナル抗体を含み、
前記重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号１４、配列番号２２、配列番号２６、配列番号３０又は配列番号３８、配列番号７１、配列番号７６、配列番号７９及びこれらの保存的配列修飾物から選択されるアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号１６、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３２又は配列番号４０、配列番号８５、配列番号９３、及びこれらの保存的配列修飾物から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記αＶβ６標的化結合剤が、αＶβ６に結合する単離された抗体を含み、前記抗体は、以下：
ａ．配列番号７７の配列を含む軽鎖配列、
ｂ．配列番号２４の配列を含む軽鎖配列、
ｃ．配列番号４０の配列を含む軽鎖配列；及び
ｄ．配列番号２８の配列を含む軽鎖配列
から選択される軽鎖可変領域を含む、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記αＶβ６標的化結合剤が、αＶβ６に結合する単離された抗体を含み、前記抗体は、配列番号７７を含む前記軽鎖配列を含む、請求項１〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記αＶβ６標的化結合剤が、αＶβ６に結合する単離された抗体を含み、前記抗体は、配列番号２４を含む前記軽鎖配列を含む、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記αＶβ６標的化結合剤が、αＶβ６に結合する単離された抗体を含み、前記抗体は、以下：
ａ．配列番号７５の配列を含む重鎖配列、
ｂ．配列番号２２の配列を含む重鎖配列、
ｃ．配列番号３８の配列を含む重鎖配列；及び
ｄ．配列番号２６の配列を含む重鎖配列
から選択される重鎖可変領域を含む、請求項１〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記αＶβ６標的化結合剤が、αＶβ６に結合する単離された抗体を含み、前記抗体は、配列番号７５を含む軽鎖配列を含む、請求項１〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記αＶβ６標的化結合剤が、αＶβ６に結合する単離された抗体を含み、前記抗体は、配列番号２２を含む軽鎖配列を含む、請求項１〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記αＶβ６標的化結合剤が、αＶβ６に結合する単離された抗体を含み、前記抗体は、以下：
ａ．配列番号７７の配列を含む軽鎖配列及び配列番号７５の配列を含む重鎖配列、
ｂ．配列番号２４の配列を含む軽鎖配列及び配列番号２２の配列を含む重鎖配列、
ｃ．配列番号４０の配列を含む軽鎖配列及び配列番号３８の配列を含む重鎖配列；並びに
ｄ．配列番号２８の配列を含む軽鎖配列及び配列番号２６の配列を含む重鎖配列
から選択される重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む、請求項１〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記αＶβ６標的化結合剤が、αＶβ６に結合する単離された抗体を含み、前記抗体は、以下：
ａ．配列番号７５の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列と；
ｂ．配列番号７７の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列と
を含む、請求項１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
患者におけるαＶβ６及びＨＥＲ２阻害に対して感受性の乳癌を診断する方法であって、αＶβ６及びＨＥＲ２の発現レベルを測定することにより、αＶβ６及びＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍細胞の存在又は非存在について、患者試料を分析するステップを含み、αＶβ６及びＨＥＲ２がいずれも過剰発現されていれば、前記患者は、αＶβ６及びＨＥＲ２阻害に対して感受性の乳癌を有すると診断される方法。
【請求項７６】
患者におけるαＶβ６阻害に対して感受性の癌を診断及び治療する方法であって、αＶβ６のレベルを測定することにより、αＶβ６を過剰発現する癌細胞の存在又は非存在について、患者試料を分析するステップであって、αＶβ６が過剰発現されていれば、前記患者は、αＶβ６阻害に対して感受性の癌を有すると診断されるステップと、前記診断された患者に、以下：
ａ．αＶβ６に特異的に結合して、αＶβ６へのリガンドの結合を阻害するαＶβ６標的化結合剤
を治療有効用量で投与するステップとを含む方法。
【請求項７７】
ＨＥＲ２のレベルを測定するステップも含み、ＨＥＲ２が過剰発現されていれば、前記患者は、ＨＥＲ２阻害に対して感受性の癌を有すると診断される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
患者におけるＨＥＲ２阻害に対して感受性の乳癌を診断及び治療する方法であって、αＶβ６及びＨＥＲ２のレベルを測定することにより、αＶβ６及びＨＥＲ２を過剰発現する乳癌細胞の存在又は非存在について、患者試料を分析するステップであって、αＶβ６及びＨＥＲ２がいずれも過剰発現されていれば、前記患者は、αＶβ６及びＨＥＲ２阻害に対して感受性の乳癌を有すると診断されるステップと、前記診断された患者に、以下：  ａ．ＨＥＲ２に特異的に結合して、ＨＥＲ２へのリガンドの結合を阻害するＨＥＲ２標的化結合剤
を治療有効用量で投与するステップとを含む方法。
【請求項７９】
患者におけるαＶβ６及びＨＥＲ２阻害に対して感受性の乳癌を診断及び治療する方法であって、αＶβ６及びＨＥＲ２のレベルを測定することにより、αＶβ６及びＨＥＲ２を過剰発現する乳癌細胞の存在又は非存在について、患者試料を分析するステップであって、αＶβ６及びＨＥＲ２がいずれも過剰発現されていれば、前記患者は、αＶβ６及びＨＥＲ２阻害に対して感受性の乳癌を有すると診断されるステップと、前記診断された患者に、以下：
ａ．αＶβ６に特異的に結合して、αＶβ６へのリガンドの結合を阻害するαＶβ６標的化結合剤；及び
ｂ．ＨＥＲ２に特異的に結合して、ＨＥＲ２へのリガンドの結合を阻害するＨＥＲ２標的化結合剤
を治療有効用量で投与するステップとを含む方法。
【請求項８０】
患者試料におけるαＶβ６阻害に対して感受性の癌を治療する方法であって、患者試料が、αＶβ６を過剰発現する癌細胞を含有するか否かを決定するための試験を要請するステップと、前記患者試料が、αＶβ６を過剰発現する癌細胞を含有していれば、以下：
ａ．αＶβ６に特異的に結合して、αＶβ６へのリガンドの結合を阻害するαＶβ６標的化結合剤
を治療有効用量で投与するステップとを含む方法。
【請求項８１】
患者試料におけるαＶβ６及びＨＥＲ２阻害に対して感受性の乳癌を治療する方法であって、患者試料が、αＶβ６及びＨＥＲ２を過剰発現する癌細胞を含有するか否かを決定するための試験を要請するステップと、前記患者試料が、αＶβ６及びＨＥＲ２を過剰発現する癌細胞を含有していれば、以下：
ａ．αＶβ６に特異的に結合して、αＶβ６へのリガンドの結合を阻害するαＶβ６標的化結合剤；及び
ｂ．ＨＥＲ２に特異的に結合して、ＨＥＲ２へのリガンドの結合を阻害するＨＥＲ２標的化結合剤
を治療有効用量で投与するステップとを含む方法。
【請求項８２】
前記発現レベルが、タンパク質発現を測定することにより測定される、請求項７５〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記発現レベルが、ｍＲＮＡ発現を測定することにより測定される、請求項７５〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記αＶβ６発現レベルが、ＩＴＧＢ６のｍＲＮＡ発現を測定することにより測定される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記αＶβ６発現レベルが増大する、請求項８３又は８４に記載の方法。
【請求項８６】
αＶβ６を阻害することにより治療することができる患者において、αＶβ６阻害に対して感受性の癌を診断する方法であって、以下：
ａ．対象からの生体試料を取得するステップ；
ｂ．前記試料に、αＶβ６に特異的に結合するαＶβ６標的化結合剤を適用するステップであって、αＶβ６の存在によって、αＶβ６標的化結合剤−αＶβ６複合体が形成されるステップ；
ｃ．ステップｂ）の前記複合体が、αＶβ６過剰発現を示すレベルで検出される場合、侵襲性形態の乳癌を診断するステップ
を含む方法。
【請求項８７】
αＶβ６及びＨＥＲ２を阻害することによって治療することができる患者において、αＶβ６及びＨＥＲ２阻害に対して感受性の乳癌を診断する方法であって、以下：
ａ．対象からの生体試料を取得するステップ；
ｂ．前記試料に、αＶβ６に特異的に結合するαＶβ６標的化結合剤を適用するステップであって、αＶβ６の存在によって、αＶβ６標的化結合剤−αＶβ６複合体が形成されるステップ；
ｃ．任意選択で、前記試料に、ＨＥＲ２に特異的に結合するＨＥＲ２標的化結合剤を適用するステップであって、ＨＥＲ２の存在によって、ＨＥＲ２結合剤−ＨＥＲ２複合体が形成されるステップ；並びに
ｄ．ステップｂ）及びｃ）の前記複合体が、αＶβ６及びＨＥＲ２過剰発現を示すレベルで検出される場合、侵襲性形態の乳癌を診断するステップ
を含む方法。
【請求項８８】
αＶβ６及び／又はＨＥＲ２が、腫瘍細胞染色の程度及び／又は腫瘍細胞染色の強度により検出される、請求項７５〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
αＶβ６及び／又はＨＥＲ２が、０＝０％、１＝＜２５％、２＝２５〜５０％、３＝＞５０％〜７５％、及び４＝＞７５％であるスコアリングシステムを用いて、前記腫瘍細胞染色の程度により検出される、請求項７５〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
αＶβ６及び／又はＨＥＲ２が、０＝陰性、１＝弱、２＝中、３＝強の腫瘍細胞染色スコアの強度により検出される、請求項７５〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
スコアリングにおいて、前記腫瘍細胞染色の程度のスコアと前記染色の強度のスコアとが合計されるとき、前記αＶβ６は、それが≧５の最終スコアを有する場合に、過剰発現されると判定される、請求項７５〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
スコアリングにおいて、前記腫瘍細胞染色の程度のスコアと前記染色の強度のスコアとが合計されるとき、前記ＨＥＲ２は、それが≧５の最終スコアを有する場合に、過剰発現されると判定される、請求項７５〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
各サンプルが、２人以上の病理学者によってスコアリングされ、且つ前記スコアが平均される、請求項７５〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
当該技術分野は、一部の態様において、αＶβ６を過剰発現する癌を治療及び診断する方法に関する。一部の実施形態では、当該技術分野は、αＶβ６及びＨＥＲ２を過剰発現する癌を治療及び診断する方法に関する。一部の実施形態では、併用療法戦略が使用される。
【背景技術】
【０００２】
乳癌の最も侵襲性且つ浸潤性のサブタイプの一部は、ＨＥＲ１〜ＨＥＲ４を含む受容体の受容体チロシンキナーゼファミリーのメンバーである、ヒト表皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）を過剰発現するものである。ＨＥＲ２は、乳癌の２５〜３０％において過剰発現され、より浸潤性の表現型を乳癌細胞に付与することを担うが、実際の機構は十分にわかっていない。ＨＥＲ２からの下流シグナル伝達を阻止するヒト化抗体トラスツズマブの導入によって、ＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２＋）乳癌患者の再発及び致死率が減少した。残念ながら、患者の７０％超が、デノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）を有するか、又はトラスツズマブに対する耐性を発生し、そのため、これらの患者は、分子特異的治療の選択肢がないままになっている。従って、ＨＥＲ２＋乳癌を有する女性患者のための改善された療法を見出すことが早急に求められている。
【０００３】
いくつかの研究は、ＨＥＲ２＋乳癌における耐性機構としてＰ１３Ｋ／Ａｋｔ経路の異常調節を示している。しかし、Ａｋｔは、多くの非癌関連経路に関与していることから、阻害は、多くのオフターゲット及び恐らく望ましくない作用を招く恐れがあり、そのため、より癌特異的な標的が要望される。従って、どのようにしてＨＥＲ２が実際に侵入を促進し、且つどのようにしてＰＩ３Ｋシグナル伝達の上方制御がトラスツズマブ耐性を促進するかについての別の機構をみいださなければならない。
【０００４】
インテグリンは、一部の細胞表面タンパク質を含む細胞外タンパク質のαβヘテロ二量体膜貫通細胞表面受容体である。これらは、細胞外環境を、細胞内細胞骨格及びシグナル伝達機構と一体化し、細胞挙動を調節する時空間メッセージを伝達する。従って、インテグリンは、接着、移動、増殖、生存及び分化を含むほとんどの正常な細胞プロセスの中心的要素である。インテグリン発現及び又はシグナル伝達の異常調節は、上皮細胞のみによるプロセスの不適切な調節を通した癌の発生と相関しており、通常、創傷治癒、発生、慢性炎症及び癌に起こるように、組織リモデリングを受ける細胞上にしか検出することができない。しかし、特定の癌、特に乳癌への、αＶβ６などのインテグリンの関与はまだ解明されていない。
【０００５】
αＶβ６は、乳癌においてより侵襲性の表現型を促進し得るため、トラスツズマブ耐性を有する患者についての一部の実施形態では、新たな治療標的を提供することが現在明らかにされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、限定はされないが、乳癌及びトラスツズマブに対して耐性の乳癌を含む、αＶβ６阻害に対して感受性の癌細胞を検出及び治療することが１つの目的である。また、限定はされないが、乳癌及びトラスツズマブに対して耐性の乳癌を含む、αＶβ６及びＨＥＲ２阻害に対して感受性の癌細胞を検出及び治療することも目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様は、動物における悪性腫瘍を治療する方法であり、この方法は、それを必要とする前記動物に、以下：
ａ．αＶβ６に特異的に結合して、αＶβ６へのリガンドの結合を阻害するαＶβ６標的化結合剤；及び
ｂ．任意選択で、併用療法薬
を治療有効用量で投与するステップを含む。
【０００８】
別の態様は、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であり、この方法は、腫瘍細胞に、以下：  ａ．αＶβ６に特異的に結合して、αＶβ６へのリガンドの結合を阻害するαＶβ６標的化結合剤；及び
ｂ．任意選択で、併用療法薬
を治療有効用量で投与するステップを含む。
【０００９】
さらに別の態様は、トラスツズマブ耐性腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であり、この方法は、前記細胞に、以下：
ａ．αＶβ６に特異的に結合して、αＶβ６へのリガンドの結合を阻害するαＶβ６標的化結合剤；及び
ｂ．ＨＥＲ２に特異的に結合して、ＨＥＲ２へのリガンドの結合を阻害するＨＥＲ２標的化結合剤
を治療有効用量で投与するステップを含む。
【００１０】
また別の態様は、患者におけるαＶβ６及びＨＥＲ２阻害に対して感受性の乳癌を診断する方法を包含し、この方法は、αＶβ６及びＨＥＲ２の発現レベルを測定することにより、αＶβ６及びＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍細胞の存在又は非存在について、患者試料を分析するステップを含み、αＶβ６及びＨＥＲ２がいずれも過剰発現されていれば、患者は、αＶβ６及びＨＥＲ２阻害に対して感受性の乳癌を有すると診断される。
【００１１】
さらに別の実施形態は、患者におけるαＶβ６阻害に対して感受性の癌を診断及び治療する方法を包含し、この方法は、αＶβ６レベルを測定することにより、αＶβ６を過剰発現する癌細胞の存在又は非存在について、患者試料を分析するステップであって、αＶβ６が過剰発現されていれば、患者は、αＶβ６阻害に対して感受性の癌を有すると診断されるステップと、診断された患者に、以下：
ａ．αＶβ６に特異的に結合して、αＶβ６へのリガンドの結合を阻害するαＶβ６標的化結合剤
を治療有効用量で投与するステップとを含む。
【００１２】
さらに、一実施形態は、患者におけるＨＥＲ２阻害に対して感受性の乳癌を診断及び治療する方法を包含し、この方法は、αＶβ６及びＨＥＲ２のレベルを測定することにより、αＶβ６及びＨＥＲ２を過剰発現する乳癌細胞の存在又は非存在について、患者試料を分析するステップであって、αＶβ６及びＨＥＲ２がいずれも過剰発現されていれば、患者は、αＶβ６及びＨＥＲ２阻害に対して感受性の乳癌を有すると診断されるステップと、診断された患者に、以下：
ａ．ＨＥＲ２に特異的に結合して、ＨＥＲ２へのリガンドの結合を阻害するＨＥＲ２標的化結合剤
を治療有効用量で投与するステップとを含む。
【００１３】
別の実施形態は、患者におけるαＶβ６及びＨＥＲ２阻害に対して感受性の乳癌を診断及び治療する方法を包含し、この方法は、αＶβ６及びＨＥＲ２のレベルを測定することにより、αＶβ６及びＨＥＲ２を過剰発現する乳癌細胞の存在又は非存在について、患者試料を分析するステップであって、αＶβ６及びＨＥＲ２がいずれも過剰発現されていれば、患者は、αＶβ６及びＨＥＲ２阻害に対して感受性の乳癌を有すると診断されるステップと、診断された患者に、以下：
ａ．αＶβ６に特異的に結合して、αＶβ６へのリガンドの結合を阻害するαＶβ６標的化結合剤；及び
ｂ．ＨＥＲ２に特異的に結合して、ＨＥＲ２へのリガンドの結合を阻害するＨＥＲ２標的化結合剤
を治療有効用量で投与するステップとを含む。
【００１４】
さらに別の態様は、患者試料におけるαＶβ６阻害に対して感受性の癌を治療する方法を包含し、この方法は、患者試料が、αＶβ６を過剰発現する癌細胞を含有するか否かを決定するための試験を要請するステップと、患者試料が、αＶβ６を過剰発現する癌細胞を含有していれば、以下：
ａ．αＶβ６に特異的に結合して、αＶβ６へのリガンドの結合を阻害するαＶβ６標的化結合剤
を治療有効用量で投与するステップとを含む。
【００１５】
また別の態様は、患者試料におけるαＶβ６及びＨＥＲ２阻害に対して感受性の乳癌を治療する方法を包含し、この方法は、患者試料が、αＶβ６及びＨＥＲ２を過剰発現する癌細胞を含有するか否かを決定するための試験を要請するステップと、患者試料が、αＶβ６及びＨＥＲ２を過剰発現する癌細胞を含有していれば、以下：
ａ．αＶβ６に特異的に結合して、αＶβ６へのリガンドの結合を阻害するαＶβ６標的化結合剤；及び
ｂ．ＨＥＲ２に特異的に結合して、ＨＥＲ２へのリガンドの結合を阻害するＨＥＲ２標的化結合剤
を治療有効用量で投与するステップとを含む。
【００１６】
別の実施形態は、αＶβ６を阻害することにより治療することができる患者において、αＶβ６阻害に対して感受性の癌を診断する方法を包含し、この方法は、以下：
ａ．対象からの生体試料を取得するステップ；
ｂ．試料に、αＶβ６に特異的に結合するαＶβ６標的化結合剤を適用するステップであって、αＶβ６の存在によって、αＶβ６標的化結合剤−αＶβ６複合体が形成されるステップ；
ｃ．ステップｂ）の複合体が、αＶβ６過剰発現を示すレベルで検出される場合、侵襲性形態の乳癌を診断するステップ
を含む。
【００１７】
別の態様は、αＶβ６及びＨＥＲ２を阻害することによって治療することができる患者において、αＶβ６及びＨＥＲ２阻害に対して感受性の乳癌を診断する方法を包含し、この方法は、以下：
ａ．対象からの生体試料を取得するステップ；
ｂ．試料に、αＶβ６に特異的に結合するαＶβ６標的化結合剤を適用するステップであって、αＶβ６の存在によって、αＶβ６標的化結合剤−αＶβ６複合体が形成されるステップ；
ｃ．任意選択で、試料に、ＨＥＲ２に特異的に結合するＨＥＲ２標的化結合剤を適用するステップであって、ＨＥＲ２の存在によって、ＨＥＲ２結合剤−ＨＥＲ２複合体が形成されるステップ；並びに
ｄ．ステップｂ）及びｃ）の複合体が、αＶβ６及びＨＥＲ２過剰発現を示すレベルで検出される場合、侵襲性形態の乳癌を診断するステップ
を含む。
【００１８】
別の目的及び利点は、以下に行う説明に一部を記載し、一部は、その説明から明らかになるか、又は実施によって理解され得る。これらの目的及び利点は、添付する特許請求の範囲で具体的に指摘される要素及び組み合わせを用いて、実現及び達成されるであろう。
【００１９】
以上の概要及び以下の詳細な説明はいずれも、例示及び説明のために過ぎず、特許請求の範囲を限定するものではないことを理解すべきである。
【００２０】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、１つ（複数）の実施形態を例示し、説明と一緒に、本明細書に記載する原理を説明する上で役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】「インテグリンαＶβ６及びＨＥＲ２の高度共発現によって、乳癌患者における低い生存率が予測される」と題される。インテグリンαＶβ６発現状態によるカプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）曲線。チェックマークは、分析の時点でまだ生存していた患者又は打ち切られた患者を示す。Ｐ値は全てログランク検定を指す。６．２Ｇ２抗体（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）を用いて、インテグリンαＶβ６について免疫組織化学的に染色した（茶色の染色）（Ａ）正常組織及び（Ｂ）癌性乳癌組織切片。インテグリンαＶβ６状態（高い発現は赤色、低い発現は黒色）によるロンドン（Ｃ）及びノッティンガム（Ｄ）からの乳癌患者の２つのコホートにおける全生存率。腫瘍において低発現に対する、高インテグリンαＶβ６を有する患者のＰ値は＜０．００００１である。（Ｅ）インテグリンαＶβ６状態による総合ロンドン及びノッティンガム患者コホートからのＨＥＲ２＋患者の全生存率。低腫瘍に対する、高インテグリンαＶβ６状態を有する患者のＰ値は＜０．００１である。（Ｆ）インテグリンαＶβ６状態によるＭＥＴＡＢＲＩＣコホートからのＨＥＲ２＋患者の全生存率。高いＩＴＧＢ６を発現する腫瘍を有する患者の生存率は、低い発現の腫瘍に対して、有意に低い（Ｐ値＝０．００３）。図１０及び１１も参照されたい。
【図２Ａ】「乳癌細胞株浸潤は、インテグリンαＶβ６及びＨＥＲ２の両方に依存性である」と題される。（Ａ）フローサイトメトリーにより評価される乳癌細胞株パネルにおけるインテグリンαＶβ６及びＨＥＲ２の発現。アイソタイプ対照は黒、インテグリンαＶβ６は青、ＨＥＲ２発現は赤でそれぞれ示す（分析した細胞株の全パネルについては図１２を参照のこと）。
【図２Ｂ−Ｄ】「乳癌細胞株浸潤は、インテグリンαＶβ６及びＨＥＲ２の両方に依存性である」と題される。（Ｂ）様々なレベルのインテグリンαＶβ６及びＨＥＲ２を発現する乳癌細胞株のトランスウェル浸潤アッセイ。５×１０4細胞／ウェルを接種し、７２時間後に、浸潤した細胞の数を計数した。（Ｃ）及び（Ｄ）乳癌細胞株浸潤は、インテグリンαＶβ６依存性である。細胞をＩｇＧ若しくはαＶβ６遮断抗体（β６抗体）（１０１Ｊｇ／ｍｌ）のいずれかを用いた３０分間のインキュベーション（Ｃ）か、又は対照若しくはＪ３６ｓｉＲＮＡ（２０１ＪＭ）による７２時間のトランスフェクション（Ｄ）のいずれかに供した後、前述のようにトランスウェル浸潤アッセイに付した。＊Ｐ＝０．０５、＊＊Ｐ＝０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。図７も参照されたい。
【図２Ｅ−Ｆ】「乳癌細胞株浸潤は、インテグリンαＶβ６及びＨＥＲ２の両方に依存性である」と題される。（Ｅ）及び（Ｆ）乳癌細胞株浸潤はＨＥＲ２依存性である。細胞を、ＩｇＧ若しくはトラスツズマブ（ＴＲＡ）（１０１Ｊｇ／ｍｌ）で３０分間前処置する（Ｅ）か、又は対照若しくはＨＥＲ２ｓｉＲＮＡ（２０１ＪＭ）により７２時間トランスフェクトした（Ｆ）後、トランスウェル浸潤アッセイに付した。＊Ｐ＝０．０５、＊＊Ｐ＝０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。図７も参照されたい。
【図２Ｇ】「乳癌細胞株浸潤は、インテグリンαＶβ６及びＨＥＲ２の両方に依存性である」と題される。（Ｇ）細胞を、ＩｇＧ、Ｐ６Ａｂ、ＴＲＡ（全て１０１Ｊｇ／ｍｌ）、又は遮断抗体の組み合わせで３０分間前処置した後、トランスウェル浸潤アッセイに付した。全ての実験は、３回反復で実施し、代表的実験を表示する（ｎ＝６±ＳＤ）。＊Ｐ＝０．０５、＊＊Ｐ＝０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。図７も参照されたい。
【図３Ａ−Ｂ】「ＨＥＲ２駆動浸潤は、インテグリンαＶβ６依存性である。インテグリンαＶβ６及びＨＥＲ２を過剰発現する細胞株のトランスウェル浸潤アッセイ」と題される。αＶβ６遮断抗体（１０μｇ／ｍｌ）（Ａ）又はトラスツズマブ（ＴＲＡ）（１０μｇ／ｍｌ）（Ｂ）の存在及び非存在下、ＩｇＧ、ＨＲＧβ（１μＭ）で細胞を３０分間前処置した後、５×１０4細胞／ウェルをトランスウェル浸潤アッセイに接種した。７２時間後に、浸潤した細胞の数を計数した。全ての実験は、３回反復で実施し、代表的実験を表示する（ｎ＝６±ＳＤ）。＊Ｐ＝０．０５、＊＊Ｐ＝０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３Ｃ】「ＨＥＲ２駆動浸潤は、インテグリンαＶβ６依存性である。インテグリンαＶβ６及びＨＥＲ２を過剰発現する細胞株のトランスウェル浸潤アッセイ」と題される。（Ｃ）ＭＣＦ１０．ＣＡ１ａ（ＣＡ１ａ）細胞株の器官型浸潤。ＩｇＧ、αＶβ６遮断抗体若しくはＴＲＡ（１０μｇ／ｍｌ）で細胞を３０分間前処置するか、又はαＶβ６若しくはＨＥＲ２に対するｓｉＲＮＡで７２時間トランスフェクト（２０μＭ）した後、接種した。５×１０4細胞をコラーゲン：ＭＲＣ５／ｈＴＥＲＴ線維芽細胞を含有するマトリゲルのゲルの上部に接種した。５〜７日のインキュベーション後、ゲルを生理食塩水中に固定した。ゲルをパラフィン包埋し、切断してから、切片をＨ＆Ｅ染色に付した。倍率バー＝１０μＭ。ヒストグラムによって、前述の処置による各細胞の浸潤を浸潤指数として定量する。実験は、３回反復で実施し（ｎ＝２／実験）、代表的実験を表示する。＊Ｐ＝０．０５、＊＊Ｐ＝０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図４Ａ−Ｃ】「乳癌異種移植片成長は、αＶβ６依存性である」と題される。（Ａ）ヒトＢＴ−４７４腫瘍を有するマウスをＩｇＧ（黒）、２６４ＲＡＤ（青）、トラスツズマブ（ＴＲＡ）（赤）又は２６４ＲＡＤ＋ＴＲＡ（緑）（１０ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｐ．）で、連続２週間にわたり週２回処置した。データは、平均腫瘍体積±ＳＥＭ（ｎ≧４マウス／群）として表示する。腫瘍が１００ｍｍ3に達したら、処置を開始した。（Ｂ）ヒトＨＥＲ２−１８腫瘍を有するマウスを（Ａ）のように処置した。（Ｃ）（Ａ）に概説した処置後の代表的ＢＴ−４７４及びＨＥＲ２−１８異種移植片の写真画像。倍率バー＝５ｍｍ。＊Ｐ＝０．０５、＊＊Ｐ＝０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図４Ｄ】「乳癌異種移植片成長は、αＶβ６依存性である」と題される。（Ｄ）ＢＴ−４７４異種移植片タンパク質発現。異種移植片を（Ａ）のように処置してから、採取し、タンパク質を抽出した後、免疫ブロッティングに付した。ブロットを、表示タンパク質についてプローブした。
【図４Ｅ】「乳癌異種移植片成長は、αＶβ６依存性である」と題される。（Ｅ）光学密度（ｎ＝３つの個別の腫瘍±ＳＥＭ）により決定した（Ｄ）に示すブロットからの相対タンパク質発現のヒストグラム。＊Ｐ＝０．０５、＊＊Ｐ＝０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図４Ｆ】「乳癌異種移植片成長は、αＶβ６依存性である」と題される。（Ｆ及びＧ）（Ｄ及びＥ）に概説したとおりのＨＥＲ２−１８異種移植片タンパク質発現及び定量。
【図４Ｇ】「乳癌異種移植片成長は、αＶβ６依存性である」と題される。（Ｆ及びＧ）（Ｄ及びＥ）に概説したとおりのＨＥＲ２−１８異種移植片タンパク質発現及び定量。
【図５Ａ−Ｄ】「２６４ＲＡＤは、トラスツズマブの抗腫瘍性を増強すると共に、ヒト異種移植片ＭＣＦ−７／ＨＥＲ２−１８細胞増殖を阻害し、生存を延長して、ＳＣＩＤマウスにおけるαＶβ６、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、Ａｋｔ２及びＳｍａｄ２を低減する」と題される。ヒトＭＣＦ−７／ＨＥＲ２−１８腫瘍を有するマウスをＩｇＧ（黒）、２６４ＲＡＤ（青）、トラスツズマブ（ＴＲＡ）（赤）又は２６４ＲＡＤ＋ＴＲＡ（緑）（１０ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｐ．）で、連続６週間にわたり週２回処置した。データは、平均腫瘍体積±ＳＥＭ（ｎ＞５マウス／群）として表示する。いずれか１つの寸法で腫瘍が４ｍｍに達したとき（Ａ）、及び腫瘍が２００ｍｍ3に達したとき（ｎ＞６マウス／群）（Ｂ）、処置を開始した。（Ｃ）カプラン・マイヤー生存プロットは、（Ｂ）に示すより大きな腫瘍の試験からのマウスの生存率を示す。（Ｄ）（Ａ）での処置マウスからの腫瘍を表示の標的についての免疫ブロッティングにより分析した（併用療法で処置した異種移植片は根絶されたため、分析のために入手できなかった）。アクチン免疫ブロットは、等しいタンパク質投入を示す。
【図５Ｅ】「２６４ＲＡＤは、トラスツズマブの抗腫瘍性を増強すると共に、ヒト異種移植片ＭＣＦ−７／ＨＥＲ２−１８細胞増殖を阻害し、生存を延長して、ＳＣＩＤマウスにおけるαＶβ６、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、Ａｋｔ２及びＳｍａｄ２を低減する」と題される。（Ｅ）（Ｄ）からのタンパク質発現レベルの変化を定量するヒストグラム（βアクチン補正）。
【図５Ｆ】「２６４ＲＡＤは、トラスツズマブの抗腫瘍性を増強すると共に、ヒト異種移植片ＭＣＦ−７／ＨＥＲ２−１８細胞増殖を阻害し、生存を延長して、ＳＣＩＤマウスにおけるαＶβ６、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、Ａｋｔ２及びＳｍａｄ２を低減する」と題される。（Ｆ）ＨＥＲ２−１８腫瘍異種移植片におけるαＶβ６発現の免疫組織化学的分析。異種移植片を固定し、切断した後、（Ａ）に概説した６週間の処置後、又は２６４ＲＡＤ＋トラスツズマブ（２６４ＲＡＤ＋ＴＲＡ）による２週間の処置後に、Ｐ６発現について染色した。倍率バー＝１０１ＪＭ。
【図６Ａ−Ｄ】「インテグリンαＶβ６及びＨＥＲ２の高度共発現によって、乳癌患者の低い長期生存率が予測される」と題される。インテグリンαＶβ６発現状態によるカプラン・マイヤー曲線。チェックマークは、分析の時点でまだ生存していた患者又は打ち切られた患者を示す。Ｐ値は全てログランク検定を指す。インテグリンαＶβ６状態によるロンドン（Ａ）及びノッティンガム（Ｂ）コホートからの乳癌患者の１５年全生存率。腫瘍における低発現（黒）に対する、高いインテグリンαＶβ６（赤）を有する患者のＰ値は、それぞれ、Ｐ＝０．００６及びＰ＝０．００２である。（Ｃ）インテグリンαＶβ６状態による総合ロンドン及びノッティンガム患者コホートからのＨＥＲ２陽性患者の１５年全生存率。低腫瘍に対する、高インテグリンαＶβ６状態を有する患者のＰ値は＜０．００１である。（Ｄ）ＩＴＧＢ６遺伝子状態によるＭＥＴＡＢＲＩＣコホートからのＨＥＲ２陽性患者の１５年全生存率。低発現腫瘍に対する、高インテグリンαＶβ６状態を有する患者のＰ値は、Ｐ＝０．０４８である。
【図７Ａ−Ｃ】（Ａ）２６４ＲＡＤは、ＨＥＲ２−１８及びＣＡ１ａ細胞において浸潤を阻害する上で、１００５αＶβ６遮断抗体と同程度に有効である。インテグリンαＶβ６及びＨＥＲ２を過剰発現する細胞を、ＩｇＧ、又はαＶβ６遮断抗体１００５又は２６４ＲＡＤ（１０μｇ／ｍｌ）で３０分間前処置した後、５×１０4細胞／ウェルをトランスウェル浸潤アッセイに接種した。７２時間後、浸潤した細胞を計数した。全ての実験は、３回反復で実施し、代表的実験を表示する（ｎ＝６±ＳＤ）。＊Ｐ＝０．０５、＊＊Ｐ＝０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｂ）増殖は、７日間にわたり、αＶβ６及び／又はＨＥＲ抗体遮断により影響されなかった。０．５〜２×１０3細胞／ウェルを接種してから２４時間後に、二重チャコール処理済ＦＣＳ培地中で４８時間増殖させた。４８時間後、ＩｇＧ、又はαＶβ６遮断抗体２６４ＲＡＤ、トラスツズマブ（ＴＲＡ）（全て１０μｇ／ｍｌ）又は遮断抗体の組み合わせで細胞を７日間処置した。７日後、細胞をＭＴＳアッセイに付し、「増殖」（ミトコンドリア活性を表す）を７日目のＩｇＧ処置細胞と比較してプロットした。全ての実験は、３回反復で実施し、代表的実験を表示する（ｎ＝６±ＳＤ）。（Ｃ）αＶβ６及びＨＥＲ２は、細胞膜に共局在化する。ＭＣＦ−７／ＨＥＲ２−１８（ＨＥＲ２−１８）及びＭＣＦ１０．ＣＡ１ａ（ＣＡ１ａ）細胞をαＶβ６（赤）（１００５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及びＨＥＲ２（緑）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）抗体で、それぞれＡｌｅｘａ−４８８及びＡｌｅｘａ６４７の二次コンジュゲートと共に標識した。ＤＡＰＩ（青）を用いて、核染色を実施した。試料をＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡で画像化した。倍率バー＝１０μＭ。
【図８】「浸潤は、ＴＧＦβ依存性であり、αＶβ６の遮断が、ＴＧＦβリガンド又はＴＧＦβＲＩＩの存在又は非存在下、浸潤をインビトロで阻害する」と題される。インテグリンαＶβ６及びＨＥＲ２を過剰発現する細胞株のトランスウェルマトリゲル浸潤アッセイ。細胞を７２時間ＴＧＦβＲＩＩｓｉＲＮＡ処置に付した後、ＴＧＦβ（５ｎｇ／ｍｌ）の存在又は非存在下、２６４ＲＡＤ（１０μｇ／ｍｌ）で処置し、５×１０4細胞／ウェルをトランスウェル浸潤アッセイに接種した。７２時間後、浸潤した細胞を計数した。全ての実験は、３回反復で実施し、代表的実験を表示する（ｎ＝６±ＳＤ）。＊Ｐ＝０．０５、＊＊Ｐ＝０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図９】「インテグリンαＶβ６依存性浸潤はＡｋｔ２を介する」と題される。インテグリンαＶβ６及びＨＥＲ２を過剰発現する細胞株のトランスウェル浸潤アッセイ。対照又はＡｋｔ１、Ａｋｔ２若しくはＡｋｔ１＋２ｓｉＲＮＡ（２０ｎＭ）で７２時間のトランスフェクションのために細胞を前処置した（Ａ）後、５×１０4細胞／ウェルをトランスウェル浸潤アッセイに接種した。７２時間後に、浸潤した細胞の数を計数した。全ての実験は、３回反復で実施し、代表的実験を表示する（ｎ＝６±ＳＤ）。ｓｉＲＮＡタンパク質ノックダウンの代表的免疫ブロットを挿入。＊Ｐ＝０．０５、＊＊Ｐ＝０．０１。（Ｂ）ＭＣＦ１０．ＣＡ１ａ（ＣＡ１ａ）細胞株の器官型浸潤。細胞を（Ａ）と同様に前処置した後、接種した。５×１０4細胞をコラーゲン：ＭＲＣ５／ｈＴＥＲＴ線維芽細胞を含有するマトリゲルのゲルの上部に接種した。５〜７日のインキュベーション後、ゲルを生理食塩水中に固定した。ゲルをパラフィン包埋し、切断してから、切片をＨ＆Ｅ染色に付した。倍率バー＝１０μＭ。ヒストグラムによって、前述の処置による浸潤を浸潤指数として定量する。実験は、３回反復で実施し（ｎ＝２／実験）、代表的実験を表示する。＊Ｐ＝０．０５、＊＊Ｐ＝０．０１。
【図１０】「乳癌患者のロンドン及びノッティンガムコホートの臨床病理学的特徴」と題される表である。
【図１１】「乳癌における従来の予後指標とαＶβ６との関連」と題される表である。
【図１２】「乳癌細胞株のパネルにおけるαＶβ６及びＨＥＲ２発現及び受容体状態」と題される表である。Ｎｅｖｅ  ｅｔ  ａｌ（２００６）及びＳｕｂｉｋ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）により定義される分子サブタイプ及び受容体状態。マトリゲルを通した浸潤によって決定される浸潤性向。平均蛍光強度（ＭＦＩ）としてフローサイトメトリーにより決定される発現：０〜１０＝−、１１〜２５＝＋、２６〜５０＝＋＋、５１〜１００＝＋＋＋、＞１００＝＋＋＋＋、ＮＤ、未確定。
【図１３】乳癌におけるαＶβ６及びＨＥＲ２発現の試験で使用される抗体のリストである。
【図１４】精製済モノクローナル抗体が、αＶβ６に結合して、それとＧＳＴ−ＬＡＰペプチドとの結合を阻止し得る能力を示す線グラフである。
【図１５Ａ−Ｂ】分子ｍＡｂ濃度の関数としての平均した幾何平均蛍光（ＧＭＦ）のプロットを示す線グラフであり、ヒトαＶβ６抗原を安定して発現するＫ５６２細胞への１つの抗体の結合親和性を推定するために用いた。図１５Ａには、ｍＡｂ１８８についての親和性データを示す。図１５Ｂは、ｍＡｂ２６４ＲＡＤについての親和性データを示す。
【図１６Ａ−Ｂ】精製済モノクローナル抗体が、αＶβ６インテグリンを安定して発現する２９３細胞において補体依存性細胞傷害を媒介する能力を示す棒グラフである。
【図１６Ｃ−Ｅ】精製済モノクローナル抗体が、αＶβ６インテグリンを安定して発現する２９３細胞において補体依存性細胞傷害を媒介する能力を示す棒グラフである。
【図１７】Ｄｅｔｒｏｉｔ−５６２鼻咽頭細胞株を用いて、抗体２６４ＲＡＤ、１３３及び１８８ＳＤＭが腫瘍増殖を阻害する能力を示す棒グラフである。
【図１８】２６４ＲＡＤと２６４ＲＡＤ／ＡＤＹとの活性の比較を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
配列表
実施形態は、表１に列挙する具体的抗αＶβ６抗体を包含する。この表は、対応する重鎖及び軽鎖遺伝子の可変ドメインの配列番号と共に、各抗αＶβ６抗体の識別番号を記載する。各抗体には、識別番号が付与され、これは、「ｓｃ」の文字と、これに続く数字を含む。
【００２３】
【表１】
2019142876.tif 000003
2019142876.tif 000004
2019142876.tif 000005
【００２４】
これから、本実施形態（例示的実施形態）を詳細に参照するが、その例を添付の図面に示す。可能である場合には、同じ又は類似部分を示すために図面全体を通じて同じ参照番号を使用する。
【００２５】
Ｉ．定義
別に定義されない限り、本明細書で使用する科学及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上他の意味に解釈すべき場合を除いて、単数形の用語は、複数形を包含し、複数形の用語は、単数形を包含するものとする。一般に、本明細書に記載する細胞組織培養、分子生物学、タンパク質及びオリゴ若しくはポリヌクレオチド化学及びハイブリダイゼーションに関して、並びにそれらの技術において使用される名称は、当該技術分野において公知であり、且つ一般に用いられるものである。
【００２６】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、並びに組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために、標準的技術が使用される。酵素反応及び精製技術は、製造者の仕様書に従い、又は当該技術分野において一般に達成されるように、又は本明細書に記載されるように実施する。前述の技術及び手順は、一般に、当該技術分野において公知の従来の方法に従い、且つ、本明細書全体を通じて引用及び論述する様々な概略的及び具体的参照文献に記載されているように、実施する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１））（これは、本明細書によって参照により援用される）を参照されたい。本明細書に記載する分析化学、合成有機化学、並びに医学及び薬化学に関して、並びにその実験手順及び技術において使用される名称は、当該技術分野において公知であり、且つ一般に用いられるものである。化学的合成、化学的分析、医薬調製、製剤化、及び送達、並びに患者の治療のために、標準的技術が使用される。
【００２７】
本開示に従い使用されるように、下記の用語は、別に指示されない限り、以下の意味を有すると理解される。
【００２８】
本明細書で使用されるとき、用語「及び／又は」は、２つの指定される特徴又は成分の各々を他方と共に、又は他方なしで具体的に開示するものとして理解すべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、及び（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々が、本明細書において個別に記載されているのと全く同様に、各々の具体的開示として理解すべきである。
【００２９】
アンタゴニストは、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、低分子量化合物、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、アンチセンス、組換えタンパク質、抗体、又はこれらのコンジュゲート若しくは融合タンパク質であってよい。ＲＮＡｉについて詳しくは、Ｍｉｌｈａｖｅｔ  Ｏ，Ｇａｒｙ  ＤＳ，Ｍａｔｔｓｏｎ  ＭＰ．（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．２００３  Ｄｅｃ；５５（４）：６２９−４８．Ｒｅｖｉｅｗ．）を、またアンチセンスについては、Ｏｐａｌｉｎｓｋａ  ＪＢ，Ｇｅｗｉｒｔｚ  ＡＭ．（Ｓｃｉ  ＳＴＫＥ．２００３  Ｏｃｔ  ２８；２００３（２０６）：ｐｅ４７．）を参照されたい。
【００３０】
「αＶβ６」の疾患関連異常活性化又は発現は、任意の異常な、望ましくない、又は病的細胞接着、例えば、腫瘍関連細胞接着であってよい。細胞接着関連疾患としては、限定はされないが、白血病、多発性骨髄腫又はリンパ腫などの非固形腫瘍、並びにまた、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、膠芽腫、甲状腺、胆管、骨、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）、脳／ＣＮＳ、頭頸部、肝臓系、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）、前立腺、乳房、腎臓、精巣、卵巣、皮膚、子宮頸部、肺、筋肉、ニューロン、食道、膀胱、肺、子宮、陰門、内膜、腎臓、大腸、膵臓、胸膜／腹膜、唾液腺、及び表皮の癌腫などの固形腫瘍が挙げられる。
【００３１】
化合物とは、約２０００ダルトン未満の分子量を有する任意の低分子量化合物を指す。
【００３２】
用語「αＶβ６」は、αＶ鎖及びβ６鎖から構成されるヘテロ二量体インテグリン分子を指す。
【００３３】
用語「中和する」は、抗体などの標的化結合剤に関して述べるとき、標的抗原の活性を消失させるか、又は有意に低下させる前記標的化結合剤の能力に関する。従って、「中和」抗αＶβ６抗体は、αＶβ６の活性を消失させるか、又は有意に低下させることができる。中和αＶβ６抗体は、例えば、ＴＧＦβＬＡＰがインテグリンαＶβ６に結合するのを阻止することにより作用し得る。この結合の阻止により、αＶβ６媒介性細胞接着が有意に、又は完全に消失する。理想的には、αＶβ６に対する中和抗体は、細胞接着を阻害する。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、用語「単離されたポリヌクレオチド」は、その天然に存在する環境から単離されたポリヌクレオチドを意味する。かかるポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、又は合成のいずれであってもよい。一部の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、それらが天然で結合するポリヌクレオチドの全部又は一部と結合していない。単離されたポリヌクレオチドは、天然で連結していない別のポリヌクレオチドと作動可能に連結していてもよい。さらに、単離されたポリヌクレオチドは、より大きな配列の一部として天然に存在しないものでもよい。
【００３５】
本明細書で言及されるとき、用語「単離されたタンパク質」は、その天然に存在する環境から単離されたタンパク質を意味する。かかるタンパク質は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えＤＮＡ、組換えＲＮＡ、若しくは合成起原又はこれらのいくつかの組み合わせのいずれに由来するものであってもよく、その起原、又は供給源のために、「単離されたタンパク質」は、（１）天然に存在するタンパク質と結合していない、（２）同じ供給源由来の他のタンパク質を含まない、例えば、マウスタンパク質を含まない、（３）異なる種由来の細胞によって発現される、又は（４）天然に存在しない。
【００３６】
用語「ポリペプチド」は、本明細書において、或るポリペプチド配列の天然タンパク質、断片、又は類似体を指す一般名称として用いられる。従って、天然タンパク質、断片、又は類似体は、ポリペプチド属の種である。ポリペプチドは、ヒト重鎖免疫グロブリン分子及びヒトκ軽鎖免疫グロブリン分子、並びに軽鎖免疫グロブリン分子（例えば、κ若しくはλ軽鎖免疫グロブリン分子）を有する重鎖免疫グロブリン分子、及びその逆を含む組み合わせにより形成される抗体分子、並びにその断片及び類似体を含んでよい。ポリペプチドはまた、単独でヒト重鎖免疫グロブリン分子又はその断片を含んでもよい。
【００３７】
用語「天然に存在する」は、本明細書において或る対象物に適用して使用されるとき、対象物を天然に見出すことができることを指す。例えば、天然の供給源から単離することができる生物（ウイルスを含む）中に存在し、実験室又はその他において人間により意図的に修飾されていないポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、用語「作動可能に連結した」は、そのように表現される要素の位置を指し、かかる位置は、これらの要素が、その意図される様式で機能することを可能にする関係にある。例えば、コード配列に「作動可能に連結した」制御配列は、コード配列の発現が、制御配列と適合可能な条件下で達成されるように連結される。
【００３９】
用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書において言及されるとき、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチド、リボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドのいずれか又はいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態、又はＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二本鎖のポリマー形態を意味する。この用語は、ＤＮＡの一本鎖及び二本鎖形態を包含する。
【００４０】
本明細書において言及される用語「オリゴヌクレオチド」は、天然、及び非天然の連結により互いに連結された天然に存在するヌクレオチド、並びに修飾されたヌクレオチドを包含する。オリゴヌクレオチドは、一般に２００塩基以下の長さを有するポリヌクレオチドサブセットである。オリゴヌクレオチドは、長さが１０〜６０塩基であってもよく、別の実施形態では、これらは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０〜４０塩基の長さであってよい。オリゴヌクレオチドは、通常、例えば、プローブの場合、一本鎖であるが；オリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝子突然変異体の構築に使用する場合、二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれであってもよい。
【００４１】
本明細書において言及される用語「天然に存在するヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを包含する。本明細書で言及される用語「修飾されたヌクレオチド」は、修飾又は置換された糖類などを有するヌクレオチドを包含する。本明細書で言及される用語「オリゴヌクレオチド連結」は、本明細書において、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、ホスホロアミデートなどのオリゴヌクレオチド連結を包含する。例えば、以下を参照されたい：ＬａＰｌａｎｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９０８１（１９８６）；Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７（１９８４）；Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８）；Ｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ６：５３９（１９９１）；Ｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｐｐ．８７−１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１））；Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，１５１，５１０号明細書；Ｕｈｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３（１９９０）（これらの開示内容は、本明細書によって参照により援用される）。オリゴヌクレオチドは、必要に応じて、検出のための標識を含むことができる。
【００４２】
本明細書において言及される用語「選択的にハイブリダイズする」は、検出可能に、且つ特異的に結合することを意味する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、及びそれらの断片は、非特異的な核酸との検出可能な結合の感知できる量を最小にする、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で核酸の鎖に選択的にハイブリダイズする。高いストリジェンシー条件を用いて、当技術分野では公知であり、本明細書で論じられる選択的なハイブリダイゼーション条件を達成することができる。一般に、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、又は抗体断片と、目的の核酸配列との間の核酸配列の相同性は、少なくとも８０％であり、より典型的には、相同性は少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、及び１００％と増加する。
【００４３】
用語「ＣＤＲ領域」又は「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）及びその後の版により定義されるように、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の高頻度可変領域を示すことを意図する。抗体は、典型的に、３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲを含む。ＣＤＲ又は複数のＣＤＲという用語は、場合に応じて、抗体が認識する抗原又はエピトープに対する抗体の親和性による結合を担うアミノ酸残基の大部分を含有するこれらの領域の１つ若しくはいくつか、又は全部を示すために用いられる。
【００４４】
６つの短いＣＤＲ配列のうち、重鎖の第３ＣＤＲ（ＨＣＤＲ３）は、より大きな可変性（主として、それをもたらす遺伝子の配置の機構に起因する、より大きな多様性）を有する。これは、２アミノ酸ほどの短いものでもよいが、知られている最長サイズは２６である。また、ＣＤＲ長さは、特定の基本的フレームワークにより収容され得る長さによっても変動し得る。機能に関して、ＨＣＤＲ３は、抗体の特異性の決定において部分的に役割を果たす（Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，７１：４２９８−４３０２，１９７４，Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：７４７−７５３，１９８６，Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７，１９８７，Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８８３，１９８９，Ｃａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４：１９６５−１９６８，１９９０，Ｓｈａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，８７：４８１４−４８１７，１９９０，Ｓｈａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４：４８６３−４８６９，１９９０，Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：１７０９−１７１９，１９９１）。
【００４５】
本明細書で言及する用語「ＣＤＲのセット」は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。従って、ＨＣＤＲのセットは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３（ＨＣＤＲは、可変重鎖ＣＤＲを指す）を指し、ＬＣＤＲのセットは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３（ＬＣＤＲは、可変軽鎖ＣＤＲを指す）を指す。別に記載のない限り、「ＣＤＲのセット」は、ＨＣＤＲ及びＬＣＤＲを包含する。
【００４６】
２つのアミノ酸配列は、両配列間に、部分的又は完全な同一性がある場合、「相同的」である。例えば、８５％相同性は、２つの配列が最大マッチングでアラインメントされたとき、８５％のアミノ酸が同一であることを意味する。ギャップ（マッチしている２つの配列のいずれかにおける）が、マッチングを最大化するために許容され；一部の実施形態では、５以下のギャップ長さが使用され、他の実施形態では、２以下のギャップ長さが使用される。或いは、この用語が本明細書において使用されるとき、２つのタンパク質配列（又は長さが少なくとも約３０アミノ酸の、これら配列に由来するポリペプチド配列）は、これらが、突然変異データマトリックス及び６以上のギャップペナルティと共にプログラムＡＬＩＧＮを用いて、５を超える（標準偏差単位で）アラインメントスコアを有する場合には、相同的である。Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｐ．１０１−１１０（Ｖｏｌｕｍｅ  ５，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（１９７２））ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２  ｔｏ  ｔｈｉｓ  ｖｏｌｕｍｅ，ｐｐ．１−１０を参照されたい。２つの配列又はそれらの部分は、ＡＬＩＧＮプログラムを用いて最適にアラインメントされるとき、それらのアミノ酸が５０％以上同一である場合、相同的である。２つのオルソロガスな配列内における相同性の異なる領域があり得ることは認識されるべきである。例えば、マウス及びヒトオルソログの機能性部位は、非機能性領域より高度な相同性を有し得る。
【００４７】
用語「〜に対応する」は、本明細書において、ポリヌクレオチド配列が、参照ポリヌクレオチド配列の全部又は一部分と相同的（すなわち、同一であり、進化的に厳密には関連していない）であること、又はポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味するために用いられる。
【００４８】
対比として、用語「〜に相補的な」は、本明細書において、相補的な配列が、参照ポリヌクレオチド配列の全部又は一部分と相同的であることを意味するために用いられる。例示のために、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応すると共に、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に対して相補的である。
【００４９】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド又はアミノ酸配列が、比較ウィンドウにわたって同一である（すなわち、ヌクレオチドごとに、又は残基ごとに）ことを意味する。用語「配列相同性の割合（％）」は、比較のウィンドウにわたって、最適にアラインメントされた２つの配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、若しくはＩ）又はアミノ酸残基が両配列に存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を取得し、一致した位置の数を、比較ウィンドウ（すなわちウィンドウサイズ）内の位置の総数で割り、得られた商に１００を掛けて、配列同一性の割合（％）を得ることにより算出される。本明細書で使用されるとき、用語「実質的な同一性」は、ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列の特徴を表し、ここで、ポリヌクレオチド又はアミノ酸は、少なくとも１８ヌクレオチド（６アミノ酸）位置の比較ウィンドウにわたり、多くの場合、少なくとも２４〜４８ヌクレオチド（８〜１６アミノ酸）位置のウィンドウにわたり、参照配列と比較して、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０〜９５％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み、ここで、配列相同性の割合（％）は、参照配列を、比較ウィンドウにわたって参照配列の総計２０％以下になる欠失又は付加を含み得る配列と比較することにより算出される。参照配列は、より大きい配列のサブセットであってよい。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、２０種の一般的アミノ酸及びそれらの略語は、従来の使用法に従う。本明細書によって参照により援用される、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  −  Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照されたい。２０種の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）（α−、α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、及び他の特殊なアミノ酸などの非天然アミノ酸）もまた、本発明のポリペプチドの好適な成分であり得る。特殊なアミノ酸の例としては、以下：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、並びに他の類似のアミノ酸及びイミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で使用するポリペプチド表記において、標準用法及び慣例に従い、左側方向がアミノ末端方向であり、右側方向がカルボキシ−末端方向である。
【００５１】
同様に、他に明記されていない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５’末端であり；二重鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’への付加の方向は転写方向と称され；ＲＮＡと同一の配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域で、ＲＮＡ転写物の５’末端の５’側は「上流配列」と称され、ＲＮＡと同一の配列を有するＤＮＡストランド上の配列領域で、ＲＮＡ転写物の３’末端の３’側は「下流配列」と称される。
【００５２】
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的な同一性」とは、２つのペプチド配列が、プログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴなどにより最適にアラインメントされたとき、デフォルトギャップ重量を用いて、少なくとも８０％配列同一性、少なくとも９０％配列同一性、少なくとも９５％配列同一性、又は少なくとも９９％配列同一性を共有することを意味する。同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の可換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びトレオニンであり；アミド−含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リシン、アルギニン、及びヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。保存的アミノ酸置換基は、以下：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン−アスパラギン、及びアスパラギン−グルタミンである。
【００５３】
本明細書において論述される場合、抗体又は免疫グロブリン分子のアミノ酸配列におけるわずかな変化が考慮されるが、但し、アミノ酸配列の変化は、本明細書に記載の抗体又は免疫グロブリン分子と少なくとも約７５％、少なくとも８０％、９０％、９５％、又は約９９％配列同一性を維持する。特に、保存的アミノ酸置換が考慮される。保存的置換は、関連する側鎖を有するアミノ酸のファミリー内で起こるものである。遺伝的にコードされたアミノ酸は、大まかに以下：（１）酸性＝アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンのファミリーに区分される。一実施形態では、ファミリーは、以下：セリン及びトレオニンは、脂肪族−ヒドロキシファミリーであり；アスパラギン及びグルタミンは、アミド含有ファミリーであり；アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンは、脂肪族ファミリーであり；また、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは芳香族ファミリーである。例えば、イソロイシン又はバリンによるロイシンの、グルタミン酸塩によるアスパラギン酸塩の、セリンによるトレオニンの独立した置換、又は構造的に関連したアミノ酸によるアミノ酸の類似の置換は、とりわけ、置換がフレームワーク部位内のアミノ酸を含まない場合、結合機能又は得られる分子の特性に大きな作用を及ぼさないであろうと予想することは理にかなっている。
【００５４】
アミノ酸の変化が機能性ペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド誘導体の特定の活性をアッセイすることにより、容易に決定することができる。アッセイは、本明細書に詳細に記載されている。抗体又は免疫グロブリン分子の断片又は類似体は、当業者によって容易に調製することができる。一実施形態において、断片又は類似体の好ましいアミノ−及びカルボキシ−末端は、機能性ドメインの境界付近に生じる。構造的及び機能的ドメインは、ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列データを、公開又はプロプライエタリ配列データベースと比較することにより、同定することができる。公知の構造及び／又は機能の他のタンパク質中に生じる配列モチーフ又は推定タンパク質コンフォメーションドメインを同定するために、コンピュータ計算比較方法が用いられる。公知の三次元構造に折り畳まれるタンパク質配列を同定する方法は公知である。Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４。従って、前述の例は、当業者が、本明細書に記載の抗体に基づいて構造的及び機能性ドメインを定義するために用いられ得る配列モチーフ及び構造的コンフォメーションを認識することができることを示している。
【００５５】
別の態様は、添付の配列表である表１に示す抗体、本明細書に記載の抗体のいずれかのＶＨドメイン、又は表８若しくは表２９に示すＨＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、又はＨＣＤＲ３）と、少なくとも約６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８若しくは約９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインを含む、ターゲティング結合剤又は抗体分子である。ターゲティング結合剤又は抗体分子はまた、任意選択で、添付の配列表である表１に示す抗体、本明細書に記載の抗体のいずれかのＶＬドメイン、又は表９若しくは表３０に示すＬＣＤＲ（例えば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、又はＬＣＤＲ３）と、少なくとも約６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８若しくは約９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインも含み得る。２つのアミノ酸配列の同一性（％）を算出するために用いることができるアルゴリズムは、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０５−４１０）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８）、又はＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）を含み、例えば、デフォルトパラメータを使用する。一部の実施形態では、前述のようなアミノ酸配列同一性を有するターゲティング結合剤又は抗体は、参照される抗体と実質的に同じ活性を呈示する。例えば、実質的に同じ活性は、参照抗体の活性と、約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％又はそれ未満しか違わない少なくとも１つの活性を含む。
【００５６】
抗原結合部位は、一般に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる６つの表面ポリペプチドループにより形成される抗原結合インターフェースと共に、可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）免疫グロブリンドメインによって形成される。フレームワーク領域（ＦＲ）と共に、各ＶＨ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及び各ＶＬ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）に３つのＣＤＲがある。
【００５７】
典型的に、ＶＨドメインは、ＶＬドメインと対を成して、抗体抗原結合部位を付与するが、抗原に結合させるために、ＶＨ又はＶＬドメインを単独で用いてもよい。ＶＨドメイン（例えば、表１からの）がＶＬドメイン（例えば、表１からの）と対を成して、ＶＨ及びＶＬドメインの両方を含む抗体抗原結合部位を形成するようにしてもよい。本明細書に開示する他のＶＨ及びＶＬドメインについても、同様の実施形態が提供される。他の実施形態では、表８又は表２９に示すＶＨ鎖は、異種ＶＬドメインと対を成す。軽鎖混雑（ｌｉｇｈｔ−ｃｈａｉｎ  ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）が当該技術分野において十分に確立されている。やはり、同様の実施形態が、本明細書に開示する他のＶＨ及びＶＬドメインについても提供される。従って、親抗体又は表９若しくは表３０の抗体鎖のいずれかのＶＨは、親抗体又は表１の抗体若しくは他の抗体のいずれかのＶＬと対を成し得る。
【００５８】
抗原結合部位は、開示するＨ及び／又はＬＣＤＲのセット内に２０、１６、１０、９以下、例えば、１、２、３、４若しくは５つものアミノ酸付加、置換、欠失、及び／又は挿入を有する、親抗体又は表１中の抗体のいずれかのＨ及び／又はＬＣＤＲのセットを含んでもよい。或いは、抗原結合部位は、開示するＨ及び／又はＬＣＤＲのセット内に２０、１６、１０、９以下、例えば、１、２、３、４若しくは５つものアミノ酸置換を有する、親抗体若しくは表１の抗体のいずれかのＨ及び／又はＬＣＤＲのセットを含んでもよい。かかる修飾は、ＣＤＲのセット内の任意の残基で実施され得る。
【００５９】
一実施形態では、アミノ酸置換は：（１）タンパク質分解に対する感受性を低減させ、（２）酸化に対する感受性を低減させ、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させ、（４）結合親和性を変化させると共に、（４）かかる類似体の他の物理化学的若しくは機能的特性を付与又は修飾するものである。類似体は、天然に存在するペプチド配列以外の配列の様々なムテインを含み得る。例えば、単一又は多重アミノ酸置換（一実施形態では、保存的アミノ酸置換）を、天然に存在する配列において（一実施形態では、分子間接触を形成するドメイン外部のポリペプチドの部分において実施してもよい。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させるべきではない（例えば、置換アミノ酸は、親配列に存在するヘリックスを破壊、又は親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を崩壊させる傾向があってはならない）。当該技術分野において認識されているポリペプチド二次及び三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））；及びＴｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｔ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５（１９９１）に記載されており、これらは各々、本明細書によって参照により援用される。
【００６０】
別の態様は、添付の配列表である表１に列挙する抗体、若しくは本明細書に記載する抗体のいずれかのＶＨドメイン、又は表８若しくは表２９に示すＨＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、又はＨＣＤＲ３）と、少なくとも約６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８若しくは約９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインを含む、抗体分子である。抗体分子はまた、任意選択で、添付の配列表である表１に示す抗体、若しくは本明細書に記載する抗体のいずれかのＶＬドメイン、又は表９若しくは表３０に示すＬＣＤＲ（例えば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、又はＬＣＤＲ３）と、少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインも含み得る。２つのアミノ酸配列の同一性（％）を算出するために用いることができるアルゴリズムは、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０５−４１０）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８）、又はＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）を含み、例えば、デフォルトパラメータを使用する。
【００６１】
アミノ酸配列が本明細書に記載され、αＶβ６のターゲティング剤及び抗体に使用することができるものを含むＶＨ及びＶＬドメイン並びにＣＤＲの変異体は、配列改変又は突然変異の方法、並びに所望の特徴を有する抗原ターゲティングのスクリーニング方法により、取得することができる。所望の特徴の例として、限定はされないが、以下のものが挙げられる：抗原に特異的な既知抗体に対する抗原の結合親和性の増大；活性がわかっていれば、抗原に特異的な既知抗体に対する抗原活性の中和の増大；特定のモル比で抗原に対する既知抗体若しくはリガンドとの指定競合能力；複合体を免疫沈降させる能力；指定エピトープに結合する能力；本明細書に記載するペプチド結合スキャンを用いて、例えば、線状及び／又は制約コンフォメーションにおいてスクリーニングされたペプチドを用いて、同定される線状エピトープ、例えば、ペプチド配列；非連続的残基によって形成される立体構造エピトープ；αＶβ６、又は下流分子の新たな生物活性を調節する能力。かかる方法は、本明細書にも記載される。
【００６２】
本明細書において、本明細書に開示される抗体分子の変異体を生成及び使用してもよい。構造／特性−活性関係への多変量データ分析技術の適用における計算化学に倣って（Ｗｏｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ  −  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｅｄ．：Ｂ．Ｋｏｗａｌｓｋｉ），Ｄ．Ｒｅｉｄｅｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｈｏｌｌａｎｄ，１９８４）、抗体の定量的活性−特性関係を、公知の数学的技法、例えば、統計学的回帰、パターン認識及び分類などを用いて導き出すことができる（Ｎｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｗｉｌｅｙ−ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｐｒｉｌ  １９９８）；Ｋａｎｄｅｌ，Ａｂｒａｈａｍ＆Ｂａｃｋｅｒ，Ｅｒｉｃ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｒｅａｓｏｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ  ＰＴＲ，（Ｍａｙ  １１，１９９５）；Ｋｒｚａｎｏｗｓｋｉ，Ｗｏｊｔｅｋ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｏ  ２２（Ｐａｐｅｒ））。Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０００）；Ｗｉｔｔｅｎ，Ｉａｎ  Ｈ．＆Ｆｒａｎｋ，Ｅｉｂｅ．Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｊａｖａ  Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ．Ｍｏｒｇａｎ  Ｋａｕｆｍａｎｎ；（Ｏｃｔｏｂｅｒ  １１，１９９９）；Ｄｅｎｉｓｏｎ  Ｄａｖｉｄ  Ｇ．Ｔ．（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｃ．Ｈｏｌｍｅｓ，Ｂａｎｉ  Ｋ．Ｍａｌｌｉｃｋ，Ａｄｒｉａｎ  Ｆ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ．Ｂａｙｅｓｉａｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）。Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；（Ｊｕｌｙ  ２００２）；Ｇｈｏｓｅ，Ａｒｕｐ  Ｋ．＆Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｎ，Ｖｅｌｌａｒｋａｄ  Ｎ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｔｏｏｌｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）。抗体の特性は、抗体配列、機能性及び三次元構造の経験及び理論モデル（例えば、予測接触残基又は計算物理化学的特性の分析）から導き出すことができ、これらの特性は、単独又は組み合わせて考えることができる。
【００６３】
ＶＨドメイン及びＶＬドメインから構成される抗体抗原結合部位は、典型的に、ポリペプチドの６つのループによって形成される：３つは軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）から、３つは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）から。既知原子構造の抗体の分析によって、抗体の結合部位の配列及び三次元構造の間の関係が解明されている。これらの関係は、ＶＨドメインにおける第３領域（ループ）を除いて、結合部位ループが、少数の主鎖コンフォメーション：標準構造の１つを有することを示している。特定のループ内に形成される標準構造は、そのサイズと、ループ及びフレームワーク領域の両方における重要な部位での特定の残基の存在によって決定されることがわかっている。
【００６４】
配列はわかっているが、三次元構造が未知の抗体において、そのＣＤＲループの三次元構造を維持する上で重要な、従って、結合特異性を維持する残基の予測に、こうした配列−構造関係の研究を用いることができる。これらの予測は、リード最適化実験からのアウトプットと、上記予測を比較することにより、確認することができる。構造的アプローチでは、任意の無料で入手可能な又は市販のパッケージ（ＷＡＭなど）を用いて、抗体分子のモデルを作製することができる。次に、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．）又はＤｅｅｐ  Ｖｉｅｗなどのタンパク質視覚化及び分析ソフトウェアパッケージを用いて、ＣＤＲの各位置で可能な置換を評価することができる。そして、この情報を用いて、活性に最小又は有益な作用をもたらす可能性がある置換を実施することができる。
【００６５】
ＣＤＲ、抗体ＶＨ若しくはＶＬドメイン及び／又は結合剤のアミノ酸配列内に置換を実施するために必要な技術は、当該技術分野において一般に入手可能である。活性に最小又は有益な作用をもたらすと予測され得る、又は予測され得ない置換を用いて、変異型配列を作製して、これらを結合及び／若しくは中和する能力並びに／又は任意の他の要望される特性について試験することができる。
【００６６】
配列が本明細書に具体的に開示されるＶＨ及びＶＬドメインのいずれかの可変ドメインアミノ酸配列変異体を、記載されるように使用してもよい。
【００６７】
本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド断片」は、アミノ−末端及び／又はカルボキシ−末端欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が、例えば、完全長ｃＤＮＡ配列から推定される天然に存在する配列における対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。断片は、典型的には、少なくとも約５、６、８又は１０アミノ酸長、一実施形態では、少なくとも約１４アミノ酸長、少なくとも約２０アミノ酸長、少なくとも約５０アミノ酸長、又は少なくとも約７０アミノ酸長である。本明細書で使用されるとき、用語「類似体」は、推定アミノ酸配列の一部分と実質的な同一性を有すると共に、以下の特性の少なくとも１つを有する、少なくとも約２５アミノ酸のセグメントからなるポリペプチドを指す：（１）好適な結合条件下でのαＶβ６に対する特異的結合、（２）適切なリガンド／αＶβ６結合を阻止する能力、又は（３）αＶβ６活性を阻害する能力。典型的には、ポリペプチド類似体は、天然に存在する配列に関して保存的アミノ酸置換（又は付加若しくは欠失）を含む。類似体は、典型的には、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長以上であり、また、多くの場合、天然に存在する完全長ポリペプチドと均等な長さを有し得る。
【００６８】
ペプチド類似体は、通常、鋳型ペプチドのものと類似の特性を備える非ペプチド薬として、医薬品産業で用いられる。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチドミメティクス（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」又は「ペプチド模倣薬（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と呼ばれる。本明細書によって参照により援用される、Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，ＴＩＮＳ  ｐ．３９２（１９８５）；並びにＥｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）。かかる化合物が、多くの場合、コンピュータ化分子モデリングの支援により開発されている。治療的に有用なペプチドに構造的に類似するペプチドミメティクスは、均等な治療又は予防効果をもたらすために用いることができる。一般に、ペプチド模倣薬は、ヒト抗体などのパラダイムポリペプチド（すなわち、生化学的特性又は薬理学的活性を有するポリペプチド）に構造的に類似しているが、当該技術分野で公知の方法によって、−ＣＨ2ＮＨ−、−ＣＨ2Ｓ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ2−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−、及びＣＨ2ＳＯ−から選択される連結によって任意選択で置換される１つ又は複数のペプチド連結を有する。同じタイプのＤ−アミノ酸を有する共通配列の１つ又は複数のアミノ酸の系統的な置換（例えば、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシン）を、より安定なペプチドを生成するために用いることができる。さらに、共有配列又は実質的に同一である共通配列変化を含む制約ペプチドは、当該技術分野において公知である方法（本明細書によって参照により援用される、Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２））；例えば、ペプチドを環化させる分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加することにより、生成することができる。
【００６９】
本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、少なくとも１つの結合ドメインから構成され、結合ドメインを形成するポリペプチド鎖の折り畳みが、抗原の抗原決定基の特徴と相補的な内表面形状及び電荷分布の三次元結合空間を備えるポリペプチド又は一群のポリペプチドを指す。抗体は、典型的には四量体形態で、２つの同一のポリペプチド鎖対を含み、各対は１つの「軽」鎖と１つの「重」鎖とを有する。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。
【００７０】
本明細書で使用されるとき、「標的化結合剤」とは、標的部位に結合し得る物質、例えば、抗体、又はその結合断片である。一実施形態において、標的化結合剤は、１つの標的部位にのみ特異的である。他の実施形態において、標的化結合剤は、２つ以上の標的部位に特異的である。一実施形態において、標的化結合剤はモノクローナル抗体であってもよく、標的部位は、エピトープであってもよい。以下に記載するように、標的化結合剤は、抗体の少なくとも１つの抗原結合部位を含んでもよく、その場合、前記ドメインは、異種タンパク質内に融合又は含有される。
【００７１】
抗体の「結合断片」は、組換えＤＮＡ技術により、又はインタクトな抗体の酵素的又は化学的開裂により生成される。結合断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、及び一本鎖抗体が挙げられる。「二重特異性」又は「二官能性」抗体以外の抗体は、同一のその結合部位の各々を有すると考えられている。抗体は、過剰量の抗体が、対抗受容体に結合した受容体の量を少なくとも約２０％、４０％、６０％若しくは８０％、及びより一般的には約８５％超（インビトロ競合的結合アッセイで計測される）低減させる場合に、受容体の対抗受容体に対する接着を実質的に阻害する。
【００７２】
抗体は、単独で又は公知の技術によって提供される他のアミノ酸配列との組み合わせのいずれかで、オリゴクローナル、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ−グラフト化抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、触媒抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、抗イディオタイプ抗体及び可溶性形態又は結合形態で標識化され得る抗体、並びにそれらの断片、変異体又は誘導体であってよい。抗体は、任意の種に由来するものであってよい。抗体という用語はまた、本明細書に記載の抗体の結合断片を含み；例示的な断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｖＦＣ）、二量体可変領域（ダイアボディ）及びジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）が挙げられる。
【００７３】
全抗体の断片が、抗原に結合する機能を果たすことができることがわかっている。結合断片の例として、以下のものがある：（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから構成されるＦａｂ断片；（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８，５５２−５５４）；ＶＨ及びＣＨ１ドメインから構成されるＦｄ断片；（Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１，４８４−４９０）；単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインから構成されるＦｖ断片；（ｉｖ）ＶＬ又はＶＨドメインから構成されるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９），ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８，５５２−５５４，Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１，４８４−４９０］；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、すなわち、２つの連結したＦａｂ断片を含む二価断片；（ｖｉｉ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、ペプチドリンカーによって連結され、これにより、２つのドメインが結合して、抗原結合部位を形成することが可能になる、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６，，Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３）；（ｖｉｉｉ）二重特異的一本鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）及び（ｉｘ）「ダイアボディ」、すなわち、遺伝子融合により構築される多価若しくは多重特異性断片（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．（１９９３）ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  ６４４４−６４４８，）。Ｆｖ、ｓｃＦｖ又はダイアボディ分子は、ＶＨ及びＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組込みによって安定化することができる（Ｒｅｉｔｅｒ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４，１２３９−１２４５，１９９６）。また、ＣＨ３ドメインに結合したｓｃＦｖを含むミニボディも作製することができる（Ｈｕ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，３０５５−３０６１）。結合断片の他の例は、Ｆａｂ’であり、これは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端での数個の残基の添加によってＦａｂ断片とは異なり、抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステイン、及びＦａｂ’−ＳＨ（定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持するＦａｂ断片である）などがある。
【００７４】
用語「エピトープ」は、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定因子を含む。エピトープ決定因子は、通常は、アミノ酸又は糖質側鎖などの分子の化学的に活性な表面集団からなり、また、常にではないが、特定の三次元構造的特徴、並びに特定の電荷特徴を有し得る。抗体は、解離定数が≦１μＭ、≦１００ｎＭ、又は≦１０ｎＭであるとき、抗原に特異的に結合すると言われている。
【００７５】
用語「薬剤」は、本明細書では、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的な巨大分子、又は生物学的材料から作られた抽出物を意味するために使用される。
【００７６】
αＶβ６ヘテロ二量体ポリペプチドに関連して「活性な」又は「活性」は、天然αＶβ６ポリペプチドの生物学的又は免疫学的活性を有するαＶβ６ヘテロ二量体ポリペプチドの一部分を指す。「生物学的」は、本明細書で使用されるとき、天然αＶβ６ポリペプチドの活性によりもたらされる生物学的機能を指す。αＶβ６生物活性は、例えば、αＶβ６誘導性細胞接着を含む。
【００７７】
「哺乳動物」は、本明細書で使用されるとき、哺乳動物と見なされる任意の動物を指す。一実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００７８】
酵素、パパインでの抗体の消化は、抗原結合活性はないが、結晶化能力を有する「Ｆａｂ」断片、及び「Ｆｃ」断片としても知られる、２つの同一の抗原−結合断片をもたらす。酵素、ペプシンでの抗体の消化は、抗体分子の２つのアームが連結されたままであり、２抗原結合部位を含む、Ｆ（ａｂ’）2断片をもたらす。Ｆ（ａｂ’）2断片は、抗原を架橋する能力を有する。
【００７９】
「Ｆｖ」は、本明細書で使用されるとき、抗原認識部位及び抗原−結合部位の両方を維持する抗体の最小断片を指す。
【００８０】
「Ｆａｂ」は、本明細書で使用されるとき、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖のＣＨ１ドメインを含む抗体の断片を指す。
【００８１】
用語「ｍＡｂ」は、モノクローナル抗体を指す。
【００８２】
「リポソーム」は、本明細書で使用されるとき、αＶβ６ポリペプチド又はかかるαＶβ６ポリペプチドに対する抗体を含み得る薬物の哺乳動物への送達に有用であり得る小さい媒体を指す。
【００８３】
「標識」又は「標識された」は、本明細書で使用されるとき、ポリペプチドに対する検出可能な部分、例えば、放射標識、蛍光標識、酵素標識、化学発光標識（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌｅｄ）又はビオチニル基の付加を指す。放射性同位元素又は放射性核種としては、3Ｈ、14Ｃ、15Ｎ、35Ｓ、90Ｙ、99Ｔｃ、111Ｉｎ、125Ｉ、131Ｉを挙げることができ、蛍光標識としては、ローダミン、ランタニド蛍光体又はＦＩＴＣを挙げることができ、及び酵素標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼを挙げることができる。
【００８４】
別の標識は、例示として、限定はしないが、以下：酵素、例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（「Ｇ６ＰＤＨ」）、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びペルオキシダーゼ；色素が挙げられ；別の蛍光標識又は蛍光剤としては、フルオレセイン及びその誘導体、フルオロクロム、ＧＦＰ（ＧＦＰは「緑色蛍光タンパク質」を表す）、ダンシル、ウンベリフェロン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド、及びフルオレスカミン；発蛍光団、例えば、ランタニドクリプテート及びキレート、例えば、ユウロピウムなど（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ａｎｄ  Ｃｉｓ  Ｂｉｏｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；化学発光標識又は化学発光剤、例えば、イソルミノール、ルミノール及びジオキセタン；増感剤；補酵素；酵素基質；粒子、例えば、ラテックス又は炭素粒子；金属ゾル；晶子；リポソーム；色素、触媒若しくは他の検出可能な基でさらに標識され得る細胞など；分子、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン又は５−ブロモデオキシウリジン；毒素部分、例えば、以下：シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＰＥ又はその細胞傷害性断片若しくは突然変異体）、ジプテリア（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒素又はその細胞傷害性断片若しくは突然変異体、ボツリヌス毒素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ若しくはＦ、リシン若しくはその細胞傷害性断片、例えば、リシンＡ、アブリン若しくはその細胞傷害性断片、サポリン若しくはその細胞傷害性断片、ヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）抗ウイルス毒素若しくはその細胞傷害性断片、及びブリオジン１若しくはその細胞傷害性断片の群から選択される毒素部分が挙げられる。
【００８５】
用語「医薬品又は薬物」は、本明細書で使用されるとき、患者に適切に投与されたときに所望の治療効果を誘導することが可能な化学的化合物又は組成物を指す。他の化学用語は、Ｔｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．，Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５））（本明細書によって参照により援用される）に例示されているように、当該技術分野における一般的使用法に従って使用される。
【００８６】
本明細書で使用されるとき、「実質的に純粋な」は、目的の種が主として存在する種である（すなわち、モル基準で、組成物中の他のいかなる個々の種よりも豊富にある）ことを意味し、しかも、実質的に純粋な画分は、目的の種が、存在する全巨大分子種の少なくとも約５０パーセント（モル基準）を占める組成物であってもよい。概して、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全巨大分子種の約８０パーセント超、又は少なくとも約８５％、９０％、９５％、及び９９％超を含み得る。一態様において、目的の種は、ほぼ均質性（従来の検出方法では組成物中の混入種を検出することができない）まで精製され、ここで、組成物は、単一の巨大分子種からほぼ構成される。
【００８７】
用語「患者」は、ヒト及び獣医学対象を含む。
【００８８】
ＩＩ．治療方法
Ａ．αＶβ６過剰発現癌細胞の治療方法の概略
特定の癌におけるαＶβ６の役割が理解されているため、αＶβ６は、αＶβ６標的化結合剤を患者又は癌細胞に投与することによって、αＶβ６を阻害することが可能になり、これは、癌を治療するために、又は腫瘍細胞（限定はされないが、αＶβ６を過剰発現する癌細胞など）の増殖を阻害するために用いることができる。
【００８９】
αＶβ６に特異的に結合して、αＶβ６へのリガンドの結合を阻害するαＶβ６標的化結合剤は、動物の悪性腫瘍（限定はされないが、乳癌など）を治療する方法に用いることができる。或いは、悪性腫瘍は、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、及び肝細胞癌であってもよい。別の実施形態では、αＶβ６標的化結合剤は、限定はされないが、本パラグラフに記載する癌のタイプからの腫瘍細胞などの腫瘍細胞の増殖を阻害するために用いることができる。
【００９０】
一実施形態では、動物は、哺乳動物であってよい。別の実施形態では、動物はヒトであってよい。
【００９１】
かかる治療において、１つ又は複数のαＶβ６標的化結合剤を用いることができる。このように、単数形「１つの（ａ）」の使用は、複数形を包含する。
【００９２】
かかる方法は、単独で用いてもよく、或いは、悪性腫瘍又は腫瘍細胞がαＶβ６を過剰発現するという診断と組み合わせて用いてもよい。
【００９３】
一実施形態では、かかる方法は、記載の用量範囲内で、セクションＩＶに記載するαＶβ６標的化結合剤を使用する。一実施形態では、αＶβ６標的化結合剤は、モノクローナル抗体である。別の実施形態では、これは、完全ヒトモノクローナル実施形態である。また別の実施形態では、これは、ｓｃ２６４ＲＡＤである。
【００９４】
一実施形態では、αＶβ６の少なくとも１つの下流標的のレベルが下方制御される。一実施形態では、Ａｋｔ２及びＳｍａｄ２の少なくとも１つのレベルが下方制御される。一実施形態では、標的の総レベルが下方制御される。別の実施形態では、標的のホスホレベルが下方制御される。下方制御は、タンパク質のレベルを決定することにより測定され得るか、又は下方制御は、ｍＲＮＡのレベルを決定することにより測定され得る。下方制御及び／又は阻害は、治療前と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、若しくは１００％の低減を含む。
【００９５】
一実施形態では、乳癌細胞は、トラスツズマブに対して耐性である。従って、一実施形態は、トラスツズマブ耐性腫瘍細胞の増殖を抑制する方法を包含し、この方法は、前記細胞に、αＶβ６に特異的に結合して、αＶβ６へのリガンドの結合を阻害するαＶβ６標的化結合剤を治療有効用量で投与するステップを含む。
【００９６】
Ｂ．併用療法
悪性腫瘍を治療するために、又は腫瘍細胞の増殖を阻害するために、αＶβ６阻害剤を用いる場合、αＶβ６標的化結合剤は、単独療法として投与してもよく、或いは、従来の外科手術又は放射線療法若しくは化学療法との併用療法において投与してもよい。かかる併用治療は、治療の個々の要素の同時、連続的、又は個別の投与方法により達成することができる。投与が連続的又は個別である場合、第２要素を投与する時間差は、併用の有益な効果を喪失しないようにすべきである。
【００９７】
αＶβ６標的化結合剤に加えて、１種又は複数の併用療法薬を用いてもよく；同様に、１種又は複数のαＶβ６標的化結合剤を用いてもよい。このように、単数形「１つの（ａ）」の使用は、複数形を包含する。かかる併用製剤は、記載の投薬量範囲内の本明細書に記載されるαＶβ６標的化結合剤と、承認された投薬量範囲内の併用療法薬を使用する。
【００９８】
１．乳癌の併用療法
併用療法は、乳癌腫瘍の治療において、又は乳癌腫瘍細胞の増殖を阻害するために使用することができる。
【００９９】
かかる方法は、単独で用いてもよく、或いは、方法は、悪性腫瘍又は腫瘍細胞が、αＶβ６を過剰発現する、ＨＥＲ２を過剰発現する、又はαＶβ６及びＨＥＲ２を過剰発現するという診断と組み合わせて用いてもよい。
【０１００】
かかる方法は、単独で用いてもよく、或いは、方法は、悪性腫瘍又は腫瘍細胞が、αＶβ６を過剰発現するという診断と組み合わせて用いてもよい。
【０１０１】
一実施形態では、乳癌細胞は、トラスツズマブに対して耐性である。従って、一実施形態は、トラスツズマブ耐性腫瘍細胞の増殖を抑制する方法を含み、この方法は、前記細胞に、αＶβ６に特異的に結合して、αＶβ６へのリガンドの結合を阻害するαＶβ６標的化結合剤と、ＨＥＲ２に特異的に結合して、ＨＥＲ２へのリガンドの結合を阻害するＨＥＲ２標的化結合剤とを治療有効用量で投与するステップを含む。
【０１０２】
一実施形態では、併用療法薬は、トラスツズマブであってよい。別の実施形態では、併用療法薬は、ＨＥＲ２に特異的に結合して、ＨＥＲ２へのリガンドの結合を阻害するＨＥＲ２標的化結合剤である。
【０１０３】
別の実施形態では、併用療法薬は、ゲムシタビン、ドセタキセル、ＥＧＦＲ阻害剤、ＨＥＲ−２阻害剤（限定はされないが、トラスツズマブ又はＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、ＰＩ３Ｋ阻害剤（ＡＴＫ阻害剤（例えば、ＡＺＤ５３６３、ＭＫ２２０６など）、ラパログ（例えば、エベロリムス）、ＡＺＤ２０１４、ＰＩ３Ｋα阻害剤、ＰＩ３Ｋβ阻害剤（ＡＺＤ８１８６、ＧＳＫ２６３６７７１、ＳＡＲ２６０３０１）、ＰａｎＰＩ３Ｋ阻害剤（ＧＤＣ０９４１、ＧＤＣ０９４２））、ＭＥＫ／ＲＡＦ阻害剤（例えば、ベムラファニブ（ＲＡＦ阻害剤）、セルエメチニブ（ＭＥＫ阻害剤）、トラメチニブ（ＭＥＫ阻害剤）など）、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ１阻害剤、又はＣＴＬＡ４阻害剤であってもよい。
【０１０４】
一実施形態では、αＶβ６及び／又はＨＥＲ２の少なくとも１つの下流標的のレベルが下方制御される。一実施形態では、Ａｋｔ２及びＳｍａｄ２の少なくとも１つのレベルが下方制御される。一実施形態では、標的の総レベルが下方制御される。別の実施形態では、標的のホスホレベルが下方制御される。下方制御は、タンパク質のレベルを決定することにより測定され得るか、又は下方制御は、ｍＲＮＡのレベルを決定することにより測定され得る。下方制御は、治療前と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、若しくは１００％の低減を含む。
【０１０５】
２．卵巣癌の併用療法
併用療法は、卵巣癌腫瘍の治療において、又は卵巣癌腫瘍細胞の増殖を阻害するために使用することができる。
【０１０６】
かかる方法は、単独で用いてもよく、或いは、方法は、悪性腫瘍又は腫瘍細胞が、αＶβ６を過剰発現する、ＨＥＲ２を過剰発現する、又はαＶβ６及びＨＥＲ２を過剰発現するという診断と組み合わせて用いてもよい。
【０１０７】
かかる方法は、単独で用いてもよく、或いは、方法は、悪性腫瘍又は腫瘍細胞が、αＶβ６を過剰発現するという診断と組み合わせて用いてもよい。
【０１０８】
一実施形態では、卵巣癌細胞は、トラスツズマブに対して耐性である。従って、一実施形態は、トラスツズマブ耐性腫瘍細胞の増殖を抑制する方法を含み、この方法は、前記細胞に、αＶβ６に特異的に結合して、αＶβ６へのリガンドの結合を阻害するαＶβ６標的化結合剤と、ＨＥＲ２に特異的に結合して、ＨＥＲ２へのリガンドの結合を阻害するＨＥＲ２標的化結合剤とを治療有効用量で投与するステップを含む。
【０１０９】
一実施形態では、併用療法薬は、トラスツズマブであってよい。
【０１１０】
別の実施形態では、併用療法薬は、ゲムシタビン、ドセタキセル、ＥＧＦＲ阻害剤、ＨＥＲ−２阻害剤（限定はされないが、トラスツズマブ又はＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）など）、ＰＩ３Ｋ阻害剤（ＡＴＫ阻害剤（例えば、ＡＺＤ５３６３、ＭＫ２２０６など）、ラパログ（例えば、エベロリムス）、ＡＺＤ２０１４、ＰＩ３Ｋα阻害剤、ＰＩ３Ｋβ阻害剤（ＡＺＤ８１８６、ＧＳＫ２６３６７７１、ＳＡＲ２６０３０１）、ＰａｎＰＩ３Ｋ阻害剤（ＧＤＣ０９４１、ＧＤＣ０９４２））、ＭＥＫ／ＲＡＦ阻害剤（例えば、ベムラファニブ（ＲＡＦ阻害剤）、セルエメチニブ（ＭＥＫ阻害剤）、トラメチニブ（ＭＥＫ阻害剤）など）、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ１阻害剤、又はＣＴＬＡ４阻害剤であってもよい。
【０１１１】
３．膵臓癌の併用療法
併用療法は、膵臓癌腫瘍の治療において、又は膵臓癌細胞の増殖を阻害するために使用することができる。
【０１１２】
一実施形態では、併用療法薬は、ゲムシタビン、アブラキサン、フォルフィリノックス（５−フルオロウラシル、オキサリプラチン、イリノテカン、及びロイコボリンを用いる併用療法アプローチ）、ＥＧＦＲ阻害剤、ＨＥＲ−２阻害剤（限定はされないが、トラスツズマブ又はＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）など）、ＰＩ３Ｋ阻害剤（ＡＴＫ阻害剤（例えば、ＡＺＤ５３６３、ＭＫ２２０６など）、ラパログ（例えば、エベロリムスなど）、ＡＺＤ２０１４、ＰＩ３Ｋα阻害剤、ＰＩ３Ｋβ阻害剤（ＡＺＤ８１８６、ＧＳＫ２６３６７７１、ＳＡＲ２６０３０１）、ＰａｎＰＩ３Ｋ阻害剤（ＧＤＣ０９４１、ＧＤＣ０９４２））、ＭＥＫ／ＲＡＦ阻害剤（例えば、ベムラファニブ（ＲＡＦ阻害剤）、セルエメチニブ（ＭＥＫ阻害剤）、トラメチニブ（ＭＥＫ阻害剤））、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ１阻害剤、又はＣＴＬＡ４阻害剤であってもよい。
【０１１３】
４．肺癌の併用療法
併用療法は、肺癌腫瘍の治療において、又は肺癌細胞の増殖を阻害するために使用することができる。一実施形態では、癌は、腺癌、扁平上皮癌、又は小細胞肺癌であってよい。
【０１１４】
一実施形態では、併用療法薬は、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））、ＡＺＤ９２９１、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、プラチナ系細胞傷害剤、ドセタキセル、ＰＩ３Ｋ阻害剤（ＡＴＫ阻害剤（例えば、ＡＺＤ５３６３、ＭＫ２２０６など）、ラパログ（例えば、エベロリムスなど）、ＡＺＤ２０１４、ＰＩ３Ｋα阻害剤、ＰＩ３Ｋβ阻害剤（ＡＺＤ８１８６、ＧＳＫ２６３６７７１、ＳＡＲ２６０３０１）、ＰａｎＰＩ３Ｋ阻害剤（ＧＤＣ０９４１、ＧＤＣ０９４２））、ＭＥＫ／ＲＡＦ阻害剤（ベムラファニブ（ＲＡＦ阻害剤）、セルエメチニブ（ＭＥＫ阻害剤）、トラメチニブ（ＭＥＫ阻害剤））、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ１阻害剤、又はＣＴＬＡ４阻害剤であってもよい。
【０１１５】
５．大腸癌の併用療法
併用療法は、大腸癌腫瘍の治療において、又は大腸癌細胞の増殖を阻害するために使用することができる。
【０１１６】
一実施形態では、併用療法薬は、ゲムシタビン、フォルフィリノックス、ドセタキセル、プラチナ系トリプレット、５−フルオロウラシル、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、ラパログ（例えば、エベロリムスなど）、ＡＴＫ阻害剤（例えば、ＡＺＤ５３６３、ＭＫ２２０６など）、ラパログ（例えば、エベロリムスなど）、ＡＺＤ２０１４、ＰＩ３Ｋα阻害剤、ＰＩ３Ｋβ阻害剤（ＡＺＤ８１８６、ＧＳＫ２６３６７７１、ＳＡＲ２６０３０１）、ＰａｎＰＩ３Ｋ阻害剤（ＧＤＣ０９４１、ＧＤＣ０９４２））、ＭＥＫ／ＲＡＦ阻害剤（ベムラファニブ（ＲＡＦ阻害剤）、セルエメチニブ（ＭＥＫ阻害剤）、トラメチニブ（ＭＥＫ阻害剤））、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ１阻害剤、又はＣＴＬＡ４阻害剤であってもよい。
【０１１７】
６．頭頸部癌の併用療法
併用療法は、頭頸部癌の治療において、又は頭頸部癌細胞の増殖を阻害するために使用することができる。
【０１１８】
一実施形態では、併用療法薬は、ゲムシタビン、プラチナ系細胞傷害剤、ドセタキセル、放射線照射、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、ＰＩ３Ｋ阻害剤（ＡＴＫ阻害剤（例えば、ＡＺＤ５３６３、ＭＫ２２０６など）、ラパログ（例えば、エベロリムスＡＴＫ阻害剤（例えば、ＡＺＤ５３６３、ＭＫ２２０６）など、ラパログ（例えば、エベロリムスなど）、ＡＺＤ２０１４、ＰＩ３Ｋα阻害剤、ＰＩ３Ｋβ阻害剤（ＡＺＤ８１８６、ＧＳＫ２６３６７７１、ＳＡＲ２６０３０１）、ＰａｎＰＩ３Ｋ阻害剤（ＧＤＣ０９４１、ＧＤＣ０９４２））、ＭＥＫ／ＲＡＦ阻害剤（例えば、ベムラファニブ（ＲＡＦ阻害剤）、セルエメチニブ（ＭＥＫ阻害剤）、トラメチニブ（ＭＥＫ阻害剤））、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ１阻害剤、又はＣＴＬＡ４阻害剤であってもよい。
【０１１９】
７．食道癌の併用療法
併用療法は、食道癌の治療において、又は食道癌細胞の増殖を阻害するために使用することができる。
【０１２０】
一実施形態では、併用療法薬は、放射線又は標準的化学療法薬であってよく、これらは、以下のセクションＩＩ．Ｂ．１０にさらに詳しく記載する。
【０１２１】
８．胃癌の併用療法
併用療法は、胃癌の治療において、又は胃癌細胞の増殖を阻害するために使用することができる。
【０１２２】
一実施形態では、併用療法薬は、トリプレット化学療法薬（パクリタキセル、シスプラチン、及びＳ−１）であってよい。
【０１２３】
９．肝細胞癌の併用療法
併用療法は、肝細胞癌の治療において、又は肝細胞癌細胞の増殖を阻害するために使用することができる。
【０１２４】
一実施形態では、併用療法薬は、ソラファニブ又はＴＡＣＥ（ＴＮＦα変換酵素）阻害剤であってよい。
【０１２５】
１０．併用療法一般
本明細書に定義する抗腫瘍治療は、単独療法として適用してもよく、或いは、本明細書に記載する化合物に加えて、従来の外科手術又は放射線療法若しくは化学療法を含んでもよい。
【０１２６】
化合物は、それのみの単剤として、又は他の臨床的に関連する薬剤若しくは技術と併用のいずれかで本明細書に記載の方法に用いることができる。例えば、本明細書に定義する抗癌治療は、単独療法として投与してもよく、或いは、本明細書に記載する化合物に加えて、従来の外科手術又は放射線療法若しくは化学療法との併用療法を含んでもよい。かかる放射線療法は、以下の放射線のカテゴリーの１つ又は複数を含み得る：
（ｉ）電磁放射を用いた外照射療法、及び電磁放射を用いた術中放射線療法；
（ｉｉ）内部照射療法若しくは小線源治療；例えば、組織内放射線療法若しくは管腔内放射線療法；又は
（ｉｉｉ）限定はされないが、ヨウ素１３１及びストロンチウム８９を含む、全身照射療法。
【０１２７】
かかる化学療法薬は、以下の抗腫瘍剤のカテゴリーの１つ又は複数を含み得る。
【０１２８】
腫瘍内科学で用いられる抗増殖／抗腫瘍薬及びこれらの組み合わせ、例えば、ＤＮＡアルキル化剤（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、テモゾラミド及びニトロソ尿素）；抗代謝物（例えば、ゲムシタビン、フルダラビン、カペシタビン並びに抗葉酸剤、例えば、５−フルオロウラシル及びペメトレキセドのようなフルオロピリミジン、テガフル、ラルチトレキセド、メトトレキセド、シトシンアラビノシド、及びヒドロキシ尿素）；抗腫瘍抗生物質（例えば、アドリアマイシンのようなアントラシクリン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシン及びミトラマイシン）；並びにトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド及びテニポシドのようなエピポドフィロトキシン、アムサクリン、トポテカン、カンプトテシン及びイリノテカン）；ＤＮＡ修復機構の阻害剤、例えば、ＣＨＫキナーゼ；ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ阻害剤；ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの阻害剤（ＰＡＲＰ阻害剤、例えば、オラパリブなど）；並びにＨｓｐ９０阻害剤、例えば、タネスピマイシン及びレタスピマイシン。
【０１２９】
細胞周期を通じた進行を阻害する化合物、例えば、抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン及びビノレルビンのようなビンカアルカロイド；イキサベピロン及びパツピロンのようなエポチロン；タキソール及びドセタキセルのようなタキソイド；ポロ様キナーゼ阻害剤；Ｅｇ５タンパク質阻害剤のようなキネシンモータタンパク質の阻害剤）；オーロラキナーゼ阻害剤（例えば、ＡＺＤ１１５２、ＰＨ７３９３５８、ＶＸ−６８０、ＭＬＮ８０５４、Ｒ７６３、ＭＰ２３５、ＭＰ５２９、ＶＸ−５２８及びＡＸ３９４５９）；ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ４阻害剤などのサイクリン依存性キナーゼ阻害剤；並びにＣＥＮＰ−Ｅ阻害剤などのセントロメアタンパク質の阻害剤。
【０１３０】
ホルモン依存性増殖を改変する細胞増殖抑制剤、例えば、抗エストロゲン薬（例えば、タモキシフェン、フルベストラント、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン及びヨードキシフェン）、抗アンドロゲン薬（例えば、エンザルタミド、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド及び酢酸シプロテロン）；ＬＨＲＨアンタゴニスト若しくはＬＨＲＨアンタゴニスト（例えば、ゴセレリン、ロイプロレリド及びブセレリン）；プロゲストゲン（例えば、酢酸メゲストロール）；アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ボラゾール及びエキセメスタン）；並びにフィナステリドなどの５α−レダクターゼの阻害剤；酢酸アビラテロンなどのＣＹＰ１７Ａ１阻害剤。
【０１３１】
抗浸潤薬、例えば、ＡＺＤ０５３０、ダサチニブ若しくはＢＭＳ−３５４８２５のようなｃ−Ｓｒｃキナーゼファミリー阻害剤；ボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）、マリマスタットのようなメタロプロテイナーゼ阻害剤；ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体機能の阻害剤；ヘパラナーゼに対する抗体、ＦＡＫ、すなわち接着斑キナーゼの阻害剤；ＭＥＴ受容体キナーゼの低分子阻害剤（例えば、ボリチニブ）；ＭＥＴ受容体キナーゼ又はＭＥＴリガンド肝細胞増殖因子に対する抗体（例えば、オナルツズマブ）。
【０１３２】
腫瘍、腫瘍幹細胞、及び上皮細胞前駆体遊走（ケモカイン及びケモカイン受容体を含む）の阻害剤、例えば、ＳＤＦ１、ＭＣＰ−１、ＣＸＣＲ２及びＣＸＣＲ４。
【０１３３】
増殖因子シグナル伝達の阻害剤：例えば、かかる阻害剤は、増殖因子抗体及び増殖因子受容体抗体（例えば、抗ｅｒｂＢ２抗体トラスツズマブ［Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）］、抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブ及びセツキシマブ［Ｅｒｂｉｔｕｘ、Ｃ２５５］並びにＳｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ／ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００５，Ｖｏｌ．５４，ｐｐ１１−２９に開示されている任意の増殖因子若しくは増殖因子受容体抗体）を含む；かかる阻害剤はまた、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、表皮増殖因子ファミリー及びそれらの受容体の阻害剤（例えば、ゲフィチニブ、すなわちＺＤ１８３９、エルロチニブ、すなわちＯＳＩ−７７４、及びＣＩ１０３３などのＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤を含む；ラパチニブのような複合型ＥＧＦＲ及びｅｒｂＢ２チロシンキナーゼ阻害剤；アファタニブのような混合型ｅｒｂＢ１／２阻害剤；並びにＨＫＩ−２７２のようなＥＧＦＲ及びＨｅｒ２の不可逆的阻害剤、ＡＺＤ９２９１のようなＥＧＦＲの不可逆的阻害剤；肝細胞増殖因子ファミリー及びそれらの受容体の阻害剤；低分子キナーゼ阻害剤、並びにインスリン様増殖因子及びインスリン様増殖因子受容体に対する抗体などの、インスリン増殖因子ファミリーの阻害剤；イマチニブ及び／又はニロチニブ（ＡＭＮ１０７）などの血小板由来増殖因子ファミリー及びそれらの受容体の阻害剤；ｃ−ｋｉｔ阻害剤、ＡｎＬＫ阻害剤、Ｆｌｔ３キナーゼ阻害剤、ｃ−ａｂ１キナーゼ阻害剤、及びＣＳＦ−１Ｒ若しくはＴＲＫキナーゼの阻害剤。
【０１３４】
シグナル伝達キナーゼ、例えば、ＦＧＦＲ（例えば、ＡＺＤ４５４７）、ＰＩＭ（例えば、ＡＺＤ１２０８）、ＭＥＫ（例えば、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）、ＡＫＴ（例えば、ＡＺＤ５３６３）の阻害剤、ＴＯＲキナーゼ（ＴＯＲＣ１及びＴＯＲＣ２など、例えば、ＡＺＤ２０１４）の阻害剤；並びにＰＩ３Ｋ−α、ＰＩ３Ｋ−β若しくはＰＩ３Ｋ−δなどのアイソフォームを含むＰＩ３キナーゼの阻害剤（例えば、ＡＺＤ８１８６）；Ｒａｓ若しくはＲａｆキナーゼなどのセリン／トレオニンキナーゼの阻害剤（例えば、ソラフェニブ若しくはベムラフェニブ）；ＰＤＫ、ＳＧＫ、ＰＩ４Ｋ若しくはＰＩＰ５Ｋ、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ（その阻害剤がＡＺＤ９１５０であるＳＴＡＴ３を含む）及びＩＲＡＫ４の阻害剤；ＡＴＲ阻害剤（例えば、ＡＺＤ６７３８）又はＡＴＭ阻害剤；イマチニブ若しくはニロチニブのようなＡＢＬ阻害剤、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤、フォスタマチニブのようなＳＹＫ阻害剤、及びサイクリン依存性キナーゼ阻害剤；チピファルニブ（Ｒ１１５７７７）及びロナファルニブ（ＳＣＨ６６３３６）のようなファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤。
【０１３５】
抗血管新生薬、例えば、血管内皮細胞増殖因子の作用を阻害するもの［例えば、抗血管内皮細胞増殖因子抗体ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標））並びに、例えば、バンデタニブ（ＺＤ６４７４）、ソラフェニブ、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、スニチニブ（ＳＵ１１２４８）、アキシチニブ（ＡＧ−０１３７３６）、パゾパニブ（ＧＷ７８６０３４）及びセジラニブ（ＡＺＤ２１７１）などのＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤；国際特許出願国際公開第９７／２２５９６号パンフレット、同第９７／３００３５号パンフレット、同第９７／３２８５６号パンフレット、及び同第９８／１３３５４号パンフレットに開示されるものなどの化合物；並びに他の機構により作用する化合物（例えば、リノミド、インテグリンαｖβ３機能の阻害剤及びアンギオスタチン）］、又はアンジオポエチン及びそれらの受容体（Ｔｉｅ−１及びＴｉｅ−２）の阻害剤、ＰＬＧＦの阻害剤、デルタ様リガンド（ＤＬＬ−４）の阻害剤。
【０１３６】
血管障害剤、例えば、コンブレスタチンＡ４並びに国際特許出願国際公開第９９／０２１６６号パンフレット、同第００／４０５２９号パンフレット、同第００／４１６６９号パンフレット、同第０１／９２２２４号パンフレット、同第０２／０４４３４号パンフレット、及び同第０２／０８２１３号パンフレットに開示されている化合物。
【０１３７】
エンドセリン受容体アンタゴニスト、例えば、ジボテンタン（ＺＤ４０５４）若しくはアトラセンタン。
【０１３８】
アンチセンス療法薬、例えば、上に挙げた標的に対するもの、例えば、ＩＳＩＳ２５０３、抗ｒａｓアンチセンス、オブリメルソン（ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎ）ナトリウム、抗２アンチセンス、又はＸＩＡＰに対するアンチセンス、例えば、ＡＥＧ３５１５６。
【０１３９】
遺伝子療法アプローチ、例えば、異常ｐ５３又は異常ＢＲＣＡ１若しくはＢＲＣＡ２のような異常遺伝子を置換するアプローチ、ＧＤＥＰＴ（遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法）；シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ若しくは細菌性ニトロレダクターゼ酵素を用いたものなどのアプローチ；並びに、多剤耐性遺伝子療法などの化学療法又は放射線療法に対する患者の忍容性を高めるためのアプローチ。
【０１４０】
免疫療法アプローチ、例えば、患者の腫瘍細胞の免疫原性を高めるためのエクスビボ及びインビボアプローチ、例えば、インターロイキン２、インターロイキン４若しくは顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子などのサイトカインによるトランスフェクション；Ｔ細胞アネルギー若しくは調節Ｔ細胞機能を低減するアプローチ；腫瘍に対するＴ細胞応答を増強するアプローチ、例えば、ＣＴＬＡ４（例えば、イピリムマブ及びトレメリムマブ）、Ｂ７Ｈ１、ＰＤ−１（例えば、ＢＭＳ−９３６５５８）に対する阻止抗体、並びにＣＤ１３７に対するアゴニスト抗体；サイトカイントランスフェクト樹状細胞のようなトランスフェクト免疫細胞を用いたアプローチ；サイトカイントランスフェクト腫瘍細胞株を用いたアプローチ、腫瘍関連抗原に対する抗体を用いたアプローチ、並びに標的細胞型を欠失させる抗体（例えば、リツキシマブのような非結合抗ＣＤ２０抗体、放射標識抗ＣＤ２０抗体ベキサール及びゼバリン、及び抗ＣＤ５４抗体キャンパス（Ｃａｍｐａｔｈ））；抗イディオタイプ抗体を用いたアプローチ；ナチュラルキラー細胞機能を増強するアプローチ；並びに抗体−毒素コンジュゲート（例：抗ＣＤ３３抗体マイロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ））を使用するアプローチ；モキセツムマブパスドトクスのような免疫毒素；トール様受容体７若しくはトール様受容体９のアゴニスト。
【０１４１】
アポトーシス誘導アプローチ、例えば、細胞死受容体４若しくは細胞死受容体５に対する抗体、又は細胞死受容体４及び細胞死受容体５の両方に結合する交差反応性抗体；並びにＸＩＡＰ及びｃＩＡＰ１及びｃＩＡＰ２の阻害剤；ＦＡＳに対する抗体。
【０１４２】
サイトカイン治療、例えば、腫瘍壊死因子α、並びに組換えＴｒａｉｌタンパク質、及びＴｒａｉｌタンパク質の低分子若しくはタンパク質ミメティクス；ＦＡＳ若しくはＴｗｅａｋリガンド、又はこれらのリガンドの模倣物。
【０１４３】
プロテオソーム媒介タンパク質分解の阻害剤、例えば、限定はされないが、Ｖｅｌｃａｄｅ（商標）のようなプロテオソーム阻害剤、ユビキチンリガーゼの阻害剤、ユビキチンプロテアーゼの阻害剤、タンパク質ＮＥＤＤ化（Ｎｅｄｄｙｌａｔｉｏｎ）の阻害剤、及びタンパク質ＳＵＭＯ化の阻害剤；或いは、
【０１４４】
ロイコボリンのような効力増強剤。
【０１４５】
別の実施形態によれば、上に挙げたものから選択される抗腫瘍薬と組み合わせてαｖβ６結合剤を含むキットが提供される。特定の実施形態では、キットはさらに、癌の治療又は腫瘍細胞の増殖の阻害における前記化合物の使用についての説明も含む。
【０１４６】
さらに別の実施形態によれば、以下：
ａ）第１単位用量形態でのαＶβ６標的化結合剤；
ｂ）第２単位用量形態の前述したものから選択される抗腫瘍薬；及び
ｃ）前記第１及び第２用量形態を含有する容器手段
を含むキットが提供される。
【０１４７】
ＩＩＩ．診断方法
一実施形態では、患者において、αＶβ６及びＨＥＲ２阻害に感受性の乳癌を診断する方法は、αＶβ６及びＨＥＲ２の発現レベルを測定することにより、αＶβ６及びＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍細胞の存在又は非存在について、患者試料を分析するステップを含み、αＶβ６及びＨＥＲ２がいずれも過剰発現されていれば、患者は、αＶβ６及びＨＥＲ２阻害に対して感受性の乳癌を有すると診断される。阻害に対して感受性とは、腫瘍又は癌細胞進行の任意のパラメータの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、若しくは１００％の改善を包含し、これは、限定はされないが、患者及び／若しくは実験室での実験のいずれかにおける腫瘍増殖、腫瘍サイズ、腫瘍侵襲、若しくは腫瘍浸潤の低減、並びに／又は患者及び／若しくは実験モデルのいずれかにおける生存の延長；並びに／又は下流分子メッセンジャーからのシグナル伝達の減少を含む。
【０１４８】
別の実施形態では、患者におけるαＶβ６阻害に対して感受性の癌を診断及び治療する方法は、αＶβ６のレベルを測定することにより、αＶβ６を過剰発現する癌細胞の存在又は非存在について、患者試料を分析するステップであって、αＶβ６が過剰発現されていれば、患者は、αＶβ６阻害に対して感受性の癌を有すると診断されるステップと、診断された患者に、αＶβ６に特異的に結合して、αＶβ６へのリガンドの結合を阻害するαＶβ６標的化結合剤を治療有効用量で投与するステップとを含む。
【０１４９】
別の態様では、本方法はまた、ＨＥＲ２のレベルを測定するステップを含み、ＨＥＲ２が過剰発現されていれば、患者は、ＨＥＲ２阻害に対して感受性の癌を有すると診断される。
【０１５０】
別の実施形態では、患者におけるＨＥＲ２阻害に対して感受性の乳癌を診断及び治療する方法は、αＶβ６及びＨＥＲ２のレベルを測定することにより、αＶβ６及びＨＥＲ２を過剰発現する乳癌細胞の存在又は非存在について、患者試料を分析するステップであって、αＶβ６及びＨＥＲ２がいずれも過剰発現されていれば、患者は、αＶβ６及びＨＥＲ２阻害に対して感受性の乳癌を有すると診断されるステップと、診断された患者に、ＨＥＲ２に特異的に結合して、ＨＥＲ２へのリガンドの結合を阻害するＨＥＲ２標的化結合剤を治療有効用量で投与するステップとを含む。
【０１５１】
別の実施形態は、患者におけるαＶβ６及びＨＥＲ２阻害に対して感受性の乳癌を診断及び治療する方法を包含し、この方法は、αＶβ６及びＨＥＲ２のレベルを測定することにより、αＶβ６及びＨＥＲ２を過剰発現する乳癌細胞の存在又は非存在について、患者試料を分析するステップであって、αＶβ６及びＨＥＲ２がいずれも過剰発現されていれば、患者は、αＶβ６及びＨＥＲ２阻害に対して感受性の乳癌を有すると診断されるステップと、診断された患者に、αＶβ６に特異的に結合して、αＶβ６へのリガンドの結合を阻害するαＶβ６標的化結合剤と、ＨＥＲ２に特異的に結合して、ＨＥＲ２へのリガンドの結合を阻害するＨＥＲ２標的化結合剤とを治療有効用量で投与するステップとを含む。
【０１５２】
一実施形態は、患者試料中のαＶβ６阻害に対して感受性の癌を治療する方法をさらに包含し、この方法は、患者試料が、αＶβ６を過剰発現する癌細胞を含有するか否かを決定するための試験を要請するステップと、患者試料が、αＶβ６を過剰発現する癌細胞を含有していれば、αＶβ６に特異的に結合して、αＶβ６へのリガンドの結合を阻害するαＶβ６標的化結合剤を治療有効用量で投与するステップとを含む。
【０１５３】
一実施形態は、患者試料中のαＶβ６及びＨＥＲ２阻害に対して感受性の乳癌を治療する方法を包含し、この方法は、患者試料が、αＶβ６及びＨＥＲ２を過剰発現する癌細胞を含有するか否かを決定するための試験を要請するステップと、患者試料が、αＶβ６及びＨＥＲ２を過剰発現する癌細胞を含有していれば、以下：
ａ．αＶβ６に特異的に結合して、αＶβ６へのリガンドの結合を阻害するαＶβ６標的化結合剤；及び
ｂ．ＨＥＲ２に特異的に結合して、ＨＥＲ２へのリガンドの結合を阻害するＨＥＲ２標的化結合剤
を治療有効用量で投与するステップとを含む。
【０１５４】
一実施形態では、発現レベルは、タンパク質発現を測定することによって測定する。一方法では、αＶβ６及び／又はＨＥＲ２は、腫瘍細胞染色の程度及び／又は腫瘍細胞染色の強度により検出される。一実施形態では、αＶβ６及び／又はＨＥＲ２は、０＝０％、１＝＜２５％、２＝２５〜５０％、３＝＞５０％〜７５％、及び４＝＞７５％であるスコアリングシステムを用いて、腫瘍細胞染色の程度により検出される。別の実施形態では、αＶβ６及び／又はＨＥＲ２は、０＝陰性、１＝弱、２＝中、３＝強の腫瘍細胞染色スコアの強度により検出される。一実施形態では、スコアリングにおいて、腫瘍細胞染色の程度のスコアと染色の強度のスコアを合計されるとき、αＶβ６は、それが≧５の最終スコアを有する場合に、過剰発現されると判定される。別の実施形態では、スコアリングにおいて、腫瘍細胞染色の程度のスコアと染色の強度のスコアを合計されるとき、ＨＥＲ２は、それが≧５の最終スコアを有する場合に、過剰発現されると判定される。一実施形態では、各サンプルは、２人以上の病理学者によってスコアリングし、スコアを平均する。
【０１５５】
一方法では、ＩＨＣ試料をαＶβ６について染色した後、独立した病理学者スコアリングシステムを用いて、腫瘍を０〜７の染色強度等級（陽性パーセンテージについての０〜４、続いて強度パーセンテージについての０〜３から構成）で腫瘍を分類することにより、αＶβ６陽性について分類することができる。この等級から、５、６、７のスコアは、強度にａｖｂ６陽性と見なされた（２つの腫瘍コホート全体の総サンプルの約１５．１％及び１６％）。これは、２人の独立した病理学者によって実施された。ａｖｂ６インテグリンを過剰発現する腫瘍は、強度及び細胞陽性パーセンテージの両方を組み込んだ等級化病理スコアリングシステムを用いて、決定することができる。内部対照と比較して各スコアリング強度を代表する参照試料を用いて、スコアリングシステムを試料セットから試料セットへと移していく。或いは、閾値を設定するために、参照試料を用いて自動化イメージング技術を使用することもできる。これらのプラットフォームは、一般に、パターン認識ソフトウェアと組み合わせた、カラーデコンボリューションアルゴリズム、ポジティブピクセルカウントを含む。かかるプラットフォームの例として、Ａｐｅｒｉｏ  Ｇｅｎｉｅ（商標）及びＤｅｆｉｎｉｅｎｓ（商標）自動化画像定量パッケージがある。
【０１５６】
別の実施形態では、発現レベルは、ｍＲＮＡ発現を測定することによって測定する。例えば、αＶβ６発現レベルは、β６サブユニットの遺伝子であるＩＴＧＢ６のｍＲＮＡ発現を測定することによって測定する。ｑＲＴ−ＰＣＲ、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ、ＲＮＡｓｅｑ（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子プロファイリングなどの様々な技術は、当業者が、ＲＮＡレベルを測定するその一般的知識を用いて使用することができ、これらは、好適なスコアリングレベルを確立するために、ＩＨＣ分析に対して較正してよい。
【０１５７】
αＶβ６を阻害することにより治療することができる患者においてαＶβ６阻害に対して感受性の癌を診断する方法であって、以下：
ａ．対象からの生体試料を取得するステップ；
ｂ．試料に、αＶβ６に特異的に結合するαＶβ６標的化結合剤を適用するステップであって、αＶβ６の存在によって、αＶβ６標的化結合剤−αＶβ６複合体が形成されるステップ；
ｃ．ステップｂ）の複合体が、αＶβ６過剰発現を示すレベルで検出される場合、侵襲性形態の乳癌を診断するステップ
を含む方法。
【０１５８】
αＶβ６及びＨＥＲ２を阻害することにより治療することができる患者においてαＶβ６及びＨＥＲ２阻害に対して感受性の乳癌を診断する方法であって、以下：
ａ．対象からの生体試料を取得するステップ；
ｂ．試料に、αＶβ６に特異的に結合するαＶβ６標的化結合剤を適用するステップであって、αＶβ６の存在によって、αＶβ６標的化結合剤−αＶβ６複合体が形成されるステップ；
ｃ．任意選択で、試料に、ＨＥＲ２に特異的に結合するＨＥＲ２標的化結合剤を適用するステップであって、ＨＥＲ２の存在によって、ＨＥＲ２標的化結合剤−ＨＥＲ２複合体が形成されるステップ；並びに
ｄ．ステップｂ）及びｃ）の複合体が、αＶβ６及びＨＥＲ２過剰発現を示すレベルで検出される場合、侵襲性形態の乳癌を診断するステップ
を含む方法。
【０１５９】
αＶβ６標的化結合剤とαＶβ６の複合体又はＨＥＲ２標的化結合剤とＨＥＲ２の複合体は、当該技術分野において公知の方法により検出することができる。一実施形態では、前述したように、腫瘍細胞染色の程度及び／又は強度を用いてよい。別の実施形態では、標的化結合剤が抗体であれば、過剰発現を測定するためにＥＬＩＳＡアッセイを用いてよい。或いは、免疫組織化学分析を用いてもよい。或いはまた、複合体を検出するために、ＦＭＡＴ大共焦点（ｍａｃｒｏｃｏｎｆｏｃａｌ）スキャニングを用いてもよい。
【０１６０】
ＩＶ．αＶβ６標的化結合剤のさらに詳細な説明
いくつかの実施形態は、αＶβ６インテグリン（αＶβ６）に結合する標的化結合剤に関する。一部の実施形態では、結合剤は、αＶβ６に結合して、αＶβ６へのリガンドの結合を阻害する。一実施形態では、標的化結合剤は、モノクローナル抗体、又はその結合断片である。別の実施形態では、抗体は、β６鎖にのみ結合し、しかも、αＶβ６へのリガンドの結合を阻害することができる。
【０１６１】
別の実施形態は、完全ヒト抗αＶβ６抗体、及び治療に有用な抗体製剤を含む。一実施形態では、抗αＶβ６抗体製剤は、望ましい治療特性、例えば、αＶβ６に対する強力な結合親和性、ＴＧＦβＬＡＰ媒介細胞接着をインビトロで阻害する能力などを有する。
【０１６２】
いくつかの実施形態は、抗αＶβ６抗体の完全にヒトの単離された結合断片も含む。一実施形態では、結合断片は、完全ヒト抗αＶβ６抗体に由来する。例示的断片として、以下により詳しく記載するように、Ｆｖ、Ｆａｂ’又は他の公知の抗体断片が挙げられる。いくつかの実施形態はまた、αＶβ６に対する完全ヒト抗体を発現する細胞も含む。細胞の例として、ハイブリドーマ、又は組換えにより作製された細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ細胞の変異体（例えば、ＤＧ４４）及びαＶβ６に対する抗体を産生するＮＳ０細胞が挙げられる。ＣＨＯ細胞の変異体に関するさらなる情報は、Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ｒｅｉｌｌｙ（２００４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５，４５６−４６２に見出すことができ、これは、その全体が本明細書によって参照により援用される。
【０１６３】
さらに、いくつかの実施形態は、αＶβ６関連疾患又は障害を治療するためにこれらの抗体を使用する方法を含む。αＶβ６関連疾患又は障害は、αＶβ６の異常活性化又は発現のために起こるあらゆる状態であってよい。かかる疾患の例として、αＶβ６が、そのリガンドと異常に相互作用して、これにより、細胞接着又は細胞シグナル伝達特性を改変するものがある。この細胞接着又は細胞シグナル伝達特性における改変は、腫瘍性疾患を招き得る。他のαＶβ６関連疾患又は障害としては、炎症性障害、肺疾患、線維症に関連する疾患、及び調節異常ＴＧＦ−βに関連するあらゆる疾患が挙げられる。
【０１６４】
一例では、αＶβ６関連疾患は、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）（胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ））、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽腫、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、食道癌、頭頸部癌、中皮腫、肉腫、胆管（胆管癌）、小腸腺癌、小児悪性疾患及び類表皮癌などの腫瘍性疾患である。
【０１６５】
別の例では、αＶβ６関連疾患は、炎症性疾患、例えば、炎症性腸疾患；全身性エリテマトーデス；関節リウマチ；若年性慢性関節炎；脊椎関節症；全身性硬化症、例えば、強皮症；特発性炎症性筋疾患、例えば、皮膚筋炎、多発筋炎；シェーグレン症候群；全身性脈管炎；類肉腫症；甲状腺炎、例えば、グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎；免疫媒介性腎疾患、例えば、糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎；中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、例えば、多発性硬化症、特発性神経障害；肝胆道系疾患、例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎及び他の非肝炎性（ｎｏｎｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｃ）ウイルスなどの感染性肝炎；自己免疫性慢性活性肝炎；原発性胆汁性肝硬変症；肉芽腫性肝炎及び硬化性胆管炎；炎症性及び線維形成性肺疾患（例：嚢胞性線維症）；グルテン過敏性腸疾患；自己免疫又は免疫媒介性皮膚疾患、例えば、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎、乾癬；肺のアレルギー性疾患、例えば、好球性肺炎、特発性肺線維症、アレルギー性結膜炎及び過敏性肺炎、移植片拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患である。
【０１６６】
また別の例では、αＶβ６関連疾患は、腎臓又は肺線維症などの線維症である。
【０１６７】
さらに別の例では、αＶβ６関連疾患は、異常調節ＴＧＦ−βに関連し、癌及び結合組織（線維形成）障害が挙げられる。
【０１６８】
他の実施形態は、とりわけ、生体試料中のαＶβ６の量を定量するための診断アッセイを含む。アッセイキットは、かかる抗体を検出するための標識と共に、抗αＶβ６抗体を含むことができる。これらの診断アッセイは、αＶ関連疾患又はβ６障害をスクリーニングするのに有用であり、かかる疾患として、限定はされないが、腫瘍性疾患、例えば、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肝細胞（肝臓）癌、膠芽腫、並びに、甲状腺、胃、前立腺、乳房、卵巣、膀胱、肺、子宮、腎臓、結腸、及び膵臓、唾液腺、及び大腸の癌腫が挙げられる。
【０１６９】
別の態様は、アンタゴニストがαＶβ６に結合するαＶβ６の生物活性のアンタゴニストである。一実施形態では、アンタゴニストは、抗体などの標的化結合剤である。アンタゴニストは、以下：
ｉ）β６のみ；
ｉｉ）αＶβ６；若しくは
ｉｉｉ）αＶβ６／リガンド複合体、
又はこれらの組み合わせに結合し得る。一実施形態では、抗体は、インビトロ及びインビボでαＶβ６の生物活性に拮抗することができる。抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体、例えば、ｓｃ２６４ＲＡＤ、ｓｃ２６４ＲＡＤ／ＡＤＹ、ｓｃ１８８ＳＤＭ、ｓｃ１３３、ｓｃ１３３ＴＭＴ、ｓｃ１３３ＷＤＳ、ｓｃ１３３ＴＭＴ／ＷＤＳ、ｓｃ１８８、ｓｃ２５４、ｓｃ２６４若しくはｓｃ２９８又はこれらの変異体から選択することができる。
【０１７０】
一実施形態では、αＶβ６の生物活性のアンタゴニストは、αＶβ６に結合して、これにより、ＴＧＦβＬＡＰ媒介性細胞接着を防止し得る。
【０１７１】
一実施形態は、完全ヒトモノクローナル抗体：ｃ２６４ＲＡＤ、ｓｃ２６４ＲＡＤ／ＡＤＹ、ｓｃ１８８ＳＤＭ、ｓｃ１３３、ｓｃ１３３ＴＭＴ、ｓｃ１３３ＷＤＳ、ｓｃ１３３ＴＭＴ／ＷＤＳ、ｓｃ１８８、ｓｃ２５４、ｓｃ２６４又はｓｃ２９８と同じ１つ又は複数のエピトープに結合する抗体である。
【０１７２】
一実施形態では、標的化結合剤は、１００ナノモル（ｎＭ）未満のＫdでαＶβ６に結合する。標的化結合剤は、約３５ナノモル（ｎＭ）未満のＫdで結合し得る。標的化結合剤は、約２５ナノモル（ｎＭ）未満のＫdで結合し得る。標的化結合剤は、約１０ナノモル（ｎＭ）未満のＫdで結合し得る。別の実施形態では、標的化結合剤は、約６０ピコモル（ｐＭ）未満のＫdで結合する。
【０１７３】
一実施形態は、本明細書において前述した抗体の軽鎖及び／又は重鎖を産生する抗体分泌形質細胞である。一実施形態では、形質細胞は、完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖及び／又は重鎖を産生する。別の実施形態では、形質細胞は、完全ヒトモノクローナル抗体：ｃ２６４ＲＡＤ、ｓｃ２６４ＲＡＤ／ＡＤＹ、ｓｃ１８８ＳＤＭ、ｓｃ１３３、ｓｃ１３３ＴＭＴ、ｓｃ１３３ＷＤＳ、ｓｃ１３３ＴＭＴ／ＷＤＳ、ｓｃ１８８、ｓｃ２５４、ｓｃ２６４又はｓｃ２９８の軽鎖及び／又は重鎖を産生する。或いは、形質細胞は、完全ヒトモノクローナル抗体：ｓｃ  ｃ２６４ＲＡＤ、ｓｃ２６４ＲＡＤ／ＡＤＹ、ｓｃ１８８ＳＤＭ、ｓｃ１３３、ｓｃ１３３ＴＭＴ、ｓｃ１３３ＷＤＳ、ｓｃ１３３ＴＭＴ／ＷＤＳ、ｓｃ１８８、ｓｃ２５４、ｓｃ２６４又はｓｃ２９８と同じ１つ又は複数のエピトープに結合する抗体を産生し得る。
【０１７４】
別の実施形態は、前述したような抗体の軽鎖又は重鎖をコードする核酸分子である。一実施形態では、核酸分子は、完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖又は重鎖をコードする。また別の実施形態は、抗体：ｃ２６４ＲＡＤ、ｓｃ２６４ＲＡＤ／ＡＤＹ、ｓｃ１８８ＳＤＭ、ｓｃ１３３、ｓｃ１３３ＴＭＴ、ｓｃ１３３ＷＤＳ、ｓｃ１３３  ＴＭＴ／ＷＤＳ、ｓｃ１８８、ｓｃ２５４、ｓｃ２６４又はｓｃ２９８から選択される完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖又は重鎖をコードする核酸分子である。
【０１７５】
別の実施形態は、前述したような１つ又は複数の核酸分子を含むベクターであり、このベクターは、上に定義した抗体の軽鎖及び／又は重鎖をコードする。
【０１７６】
また別の実施形態は、前述したようなベクターを含む宿主細胞である。或いは、宿主細胞は、２つ以上のベクターを含んでもよい。
【０１７７】
さらに、一実施形態は、核酸分子が、抗体を産生するように発現される条件下で、宿主細胞を培養した後、抗体を回収することにより、抗体を生産する方法である。
【０１７８】
一実施形態は、前述したような抗体をコードする少なくとも１つの核酸分子で、少なくとも１つの宿主細胞をトランスフェクトし、核酸分子を宿主細胞において発現させるステップ、及び抗体を単離するステップを含む。
【０１７９】
別の態様は、αＶβ６の生物活性に拮抗する方法であって、本明細書に記載するアンタゴニストを投与するステップを含む方法を包含する。本方法は、αＶβ６関連疾患又は障害の治療を必要とする動物を選択するステップ、及び動物に、αＶβ６の生物活性のアンタゴニストを治療有効用量で投与するステップを含み得る。
【０１８０】
別の態様は、αＶβ６の生物活性に拮抗する方法であって、本明細書に記載する抗体を投与するステップを含む方法を包含する。本方法は、αＶβ６関連疾患又は障害の治療を必要とする動物を選択するステップ、及び前記動物に、αＶβ６の生物活性に拮抗する抗体を治療有効用量で投与するステップを含み得る。
【０１８１】
別の態様によれば、哺乳動物におけるαＶβ６関連疾患又は障害を治療する方法であって、αＶβ６の生物活性のアンタゴニストを治療有効用量で投与するステップを含む方法が提供される。本方法は、αＶβ６関連疾患又は障害の治療を必要とする動物を選択するステップ、及び前記動物に、αＶβ６の生物活性のアンタゴニストを治療有効用量で投与するステップを含み得る。
【０１８２】
別の態様によれば、哺乳動物におけるαＶβ６関連疾患又は障害を治療する方法であって、αＶβ６の生物活性に拮抗する抗体を治療有効用量で投与するステップを含む方法が提供される。本方法は、αＶβ６関連疾患又は障害の治療を必要とする動物を選択するステップ、及び前記動物に、αＶβ６の生物活性に拮抗する抗体を治療有効用量で投与するステップを含み得る。抗体は、単独で投与することもでき、又は別の抗体又は化学療法薬若しくは放射線療法と組み合わせて投与することができる。
【０１８３】
別の態様によれば、哺乳動物における癌を治療する方法であって、αＶβ６の生物活性のアンタゴニストを治療有効用量で投与するステップを含む方法が提供される。本方法は、癌の治療を必要とする動物を選択するステップ、及び前記動物に、αＶβ６の生物活性に拮抗するアンタゴニストを治療有効用量で投与するステップを含み得る。アンタゴニストは、単独で投与することもでき、又は別の抗体又は化学療法薬若しくは放射線療法と組み合わせて投与することができる。
【０１８４】
別の態様によれば、哺乳動物における癌を治療する方法であって、αＶβ６の生物活性に拮抗する抗体を治療有効用量で投与するステップを含む方法が提供される。本方法は、癌の治療を必要とする動物を選択するステップ、及び前記動物に、αＶβ６の生物活性に拮抗する抗体を治療有効用量で投与するステップを含み得る。抗体は、単独で投与することもでき、又は別の抗体又は化学療法薬若しくは放射線療法と組み合わせて投与することができる。
【０１８５】
別の態様によれば、αＶβ６関連疾患又は障害の治療のための薬剤の製造のためのαＶβ６の生物活性のアンタゴニストの使用が提供される。
【０１８６】
別の態様によれば、αＶβ６関連疾患又は障害の治療のための薬剤の製造のためのαＶβ６の生物活性に拮抗する抗体の使用が提供される。
【０１８７】
一実施形態は、αＶβ６インテグリンのみに、又はそれに一部依存する腫瘍を有する患者におけるαＶβ６に拮抗する上での使用に特に好適である。
【０１８８】
別の実施形態は、αＶβ６関連疾患又は障害をスクリーニングするために哺乳動物組織、細胞、又は体液中のαＶβ６を検出するアッセイキットを包含する。このキットは、αＶβ６に結合する抗体と、存在する場合は、αＶβ６と抗体との反応を示す手段とを含む。抗体は、モノクローナル抗体であってよい。一実施形態では、αＶβ６に結合する抗体を標識する。別の実施形態では、抗体は、非標識一次抗体であり、キットはさらに、一次抗体を検出する手段も含む。一実施形態では、この手段は、抗免疫グロブリンである標識二次抗体を含む。一態様では、抗体は、フルオロクロム、酵素、放射性核種及び放射線不透過性材料から選択されるマーカで標識する。
【０１８９】
抗αＶβ６抗体に関するさらに別の実施形態、特徴などを以下にさらに詳しく記載する。
【０１９０】
Ａ．ヒト抗体及び抗体のヒト化
ヒト抗体では、マウス又はラットの可変領域及び／又は定常領域を有する抗体に関連する問題のいくつかが回避される。かかるマウス又はラット由来のタンパク質の存在は抗体の急速なクリアランスをもたらすことがあり、又は患者による抗体に対する免疫応答の発生をもたらすことがある。マウス又はラット由来の抗体の利用を避けるため、機能的ヒト抗体遺伝子座をげっ歯類、他の哺乳動物又は動物に導入して、そのげっ歯類、他の哺乳動物又は動物に完全ヒト抗体を産生させることにより、完全ヒト抗体を生成することができる。
【０１９１】
完全ヒト抗体を生成する１つの方法は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統のマウスを使用することによるもので、これは、ヒト重鎖遺伝子座とκ軽鎖遺伝子座との最大でも１０００ｋｂサイズ未満の生殖系列配置の断片を含むように操作されたマウスである。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）及びＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５（１９９８）を参照のこと。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株はＡｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から入手可能である。
【０１９２】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統のマウスの産生については、１９９０年１月１２日に出願された米国特許出願第０７／４６６，００８号明細書、１９９０年１１月８日に出願された同第０７／６１０，５１５号明細書、１９９２年７月２４日に出願された同第０７／９１９，２９７号明細書、１９９２年７月３０日に出願された同第０７／９２２，６４９号明細書、１９９３年３月１５日に出願された同第０８／０３１，８０１号明細書、１９９３年８月２７日に出願された同第０８／１１２，８４８号明細書、１９９４年４月２８日に出願された同第０８／２３４，１４５号明細書、１９９５年１月２０日に出願された同第０８／３７６，２７９号明細書、１９９５年４月２７日に出願された同第０８／４３０、９３８号明細書、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６４，５８４号明細書、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６４，５８２号明細書、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６３，１９１号明細書、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６２，８３７号明細書、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４８６，８５３号明細書、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４８６，８５７号明細書、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４８６，８５９号明細書、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６２，５１３号明細書、１９９６年１０月２日に出願された同第０８／７２４，７５２号明細書、１９９６年１２月３日に出願された同第０８／７５９，６２０号明細書、２００１年１１月３０日に出願された米国特許出願公開第２００３／００９３８２０号明細書、並びに米国特許第６，１６２，９６３号明細書、同第６，１５０，５８４号明細書、同第６，１１４，５９８号明細書、同第６，０７５，１８１号明細書、及び同第５，９３９，５９８号明細書、並びに日本特許第３  ０６８  １８０  Ｂ２号公報、同第３  ０６８  ５０６  Ｂ２号公報、及び同第３  ０６８  ５０７  Ｂ２号公報においてさらに考察及び詳述されている。また、１９９６年６月１２日に付与公開された欧州特許第０  ４６３  １５１  Ｂ１号明細書、１９９４年２月３日に公開された国際公開第９４／０２６０２号パンフレット、１９９６年１０月３１日に公開された国際公開第９６／３４０９６号パンフレット、１９９８年６月１１日に公開された国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、２０００年１２月２１日に公開された国際公開第００／７６３１０号パンフレットも参照のこと。上記に列挙される特許、出願、及び文献の各々の開示は、本明細書によって全体として参照により援用される。
【０１９３】
代替的な手法では、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．を含む他の者らが、「ミニ遺伝子座」の手法を利用している。このミニ遺伝子座手法では、外因性Ｉｇ遺伝子座が、Ｉｇ遺伝子座の部分片（個々の遺伝子）を包含することにより模倣される。従って、１つ以上のＶH遺伝子、１つ以上のＤH遺伝子、１つ以上のＪH遺伝子、μ定常領域、及び通常第２の定常領域（任意選択でγ定常領域）が、動物に挿入されるコンストラクト中に形成される。この手法については、Ｓｕｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第５，５４５，８０７号明細書、並びに各々がＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｋａｙに対する米国特許第５，５４５，８０６号明細書、同第５，６２５，８２５号明細書、同第５，６２５，１２６号明細書、同第５，６３３，４２５号明細書、同第５，６６１，０１６号明細書、同第５，７７０，４２９号明細書、同第５，７８９，６５０号明細書、同第５，８１４，３１８号明細書、同第５，８７７，３９７号明細書、同第５，８７４，２９９号明細書、及び同第６，２５５，４５８号明細書、Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ  ａｎｄ  Ｂｅｒｎｓに対する米国特許第５，５９１，６６９号明細書及び同第６，０２３．０１０号明細書、Ｂｅｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第５，６１２，２０５号明細書、同第５，７２１，３６７号明細書、及び同第５，７８９，２１５号明細書、並びにＣｈｏｉ  ａｎｄ  Ｄｕｎｎに対する米国特許第５，６４３，７６３号明細書、及びＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社の１９９０年８月２９日に出願された米国特許出願第０７／５７４，７４８号明細書、１９９０年８月３１日に出願された同第０７／５７５，９６２号明細書、１９９１年１２月１７日に出願された同第０７／８１０，２７９号明細書、１９９２年３月１８日に出願された同第０７／８５３，４０８号明細書、１９９２年６月２３日に出願された同第０７／９０４，０６８号明細書、１９９２年１２月１６日に出願された同第０７／９９０，８６０号明細書、１９９３年４月２６日に出願された同第０８／０５３，１３１号明細書、１９９３年７月２２日に出願された同第０８／０９６，７６２号明細書、１９９３年１１月１８日に出願された同第０８／１５５，３０１号明細書、１９９３年１２月３日に出願された同第０８／１６１，７３９号明細書、１９９３年１２月１０日に出願された同第０８／１６５，６９９号明細書、１９９４年３月９日に出願された同第０８／２０９，７４１号明細書（これらの開示は本明細書によって参照により援用される）に記載されている。また、欧州特許第０  ５４６  ０７３  Ｂ１号明細書、国際公開第９２／０３９１８号パンフレット、国際公開第９２／２２６４５号パンフレット、国際公開第９２／２２６４７号パンフレット、国際公開第９２／２２６７０号パンフレット、国際公開第９３／１２２２７号パンフレット、国際公開第９４／００５６９号パンフレット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９６／１４４３６号パンフレット、国際公開第９７／１３８５２号パンフレット、及び国際公開第９８／２４８８４号パンフレット及び米国特許第５，９８１，１７５号明細書（これらの開示は本明細書によって全��として参照により援用される）も参照のこと。さらに、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）、及びＴｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）（これらの開示は本明細書によって全体として参照により援用される）を参照のこと。
【０１９４】
Ｋｉｒｉｎはまた、マウスからのヒト抗体の生成も実証しており、ここではマイクロセル融合を用いて大きい染色体片、又は染色体全体が導入されている。欧州特許第７７３  ２８８号明細書及び同第８４３  ９６１号明細書（これらの開示は本明細書によって参照により援用される）を参照のこと。加えて、ＫｉｒｉｎのＴｃマウスをＭｅｄａｒｅｘのミニ遺伝子座（Ｈｕｍａｂ）マウスと異種交配して生まれたＫＭ（商標）マウスが生成されている。このようなマウスは、ＫｉｒｉｎマウスのヒトＩｇＨトランスクロモソームとＧｅｎｐｈａｒｍマウスのκ鎖トランスジーンとを有する（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，（２００２）４：９１−１０２）。
【０１９５】
ヒト抗体はまた、インビトロ方法によって得られてもよい。好適な例としては、限定はされないが、ファージディスプレイ（ＣＡＴ、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、Ｄｙａｘ、Ｂｉｏｓｉｔｅ／Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｘｏｍａ、Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ、Ａｌｅｘｉｏｎ（旧Ｐｒｏｌｉｆｅｒｏｎ）、Ａｆｆｉｍｅｄ）、リボソームディスプレイ（ＣＡＴ）、酵母ディスプレイなどが挙げられる。
【０１９６】
Ｂ．抗体の調製
本明細書に記載するとおりの抗体は、以下に記載するとおり、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を利用して調製した。ここで、かかるマウスはヒト免疫グロブリン分子及び抗体の産生能を有し、マウス免疫グロブリン分子及び抗体の産生が欠損している。これを実現するために利用される技術は、本明細書の背景技術の節に開示される特許、出願、及び文献に開示されている。しかしながら、特に、マウス及びそこからの抗体のトランスジェニック産生の実施形態が、１９９６年１２月３日に出願された米国特許出願第０８／７５９，６２０号明細書及び１９９８年６月１１日に公開された国際公開第９８／２４８９３号パンフレット及び２０００年１２月２１日に公開された国際公開第００／７６３１０号パンフレット（これらの開示は本明細書によって参照により援用される）に開示されている。また、Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）（この開示は本明細書によって参照により援用される）も参照のこと。
【０１９７】
かかる技術を用いることで、様々な抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体が産生されている。本質的に、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統のマウスを目的の抗原（例えばαＶβ６）で免疫し、過免疫マウスからリンパ細胞（Ｂ細胞など）を回収し、回収したリンパ球を骨髄系細胞株と融合して不死化ハイブリドーマ細胞株を調製する。これらのハイブリドーマ細胞株をスクリーニング及び選択することにより、目的の抗原に特異的な抗体を産生したハイブリドーマ細胞株を同定する。本明細書には、αＶβ６に特異的な抗体を産生する複数のハイブリドーマ細胞株の産生方法が提供される。さらに、本明細書には、かかる細胞株によって産生される抗体の特性決定が、かかる抗体の重鎖及び軽鎖のヌクレオチド及びアミノ酸配列解析を含めて提供される。
【０１９８】
或いは、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを生成するのではなく、Ｂ細胞を直接アッセイしてもよい。例えば、過免疫ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウスからＣＤ１９＋  Ｂ細胞を単離し、増殖させて抗体分泌形質細胞に分化させることができる。次に細胞上清からの抗体を、ＥＬＩＳＡにより、αＶβ６免疫原に対する反応性についてスクリーニングする。この上清はまた、αＶβ６上の機能的に関連性のあるドメインに結合する異なる抗体をさらにマッピングするため、αＶβ６の断片に対する免疫活性についてスクリーニングされてもよい。抗体はまた、他の関連するヒトインテグリンに対してスクリーニングされても、並びに種間交差反応性を決定するため、ラット、マウス、及び非ヒト霊長類、例えばカニクイザルのαＶβ６オルソログに対してスクリーニングされてもよい。目的の抗体が入ったウェルからのＢ細胞の不死化は、個別的なウェル又はプールされたウェルのいずれかから融合によりハイブリドーマを作製することによるか、又はＥＢＶを感染させるか、若しくは公知の不死化遺伝子でトランスフェクトし、次に好適な培地に播くことによるなど、様々な方法で行われ得る。或いは、次に所望の特異性で単一の形質細胞を分泌する抗体が、αＶβ６特異的溶血プラークアッセイを用いて単離される（例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８４３−４８（１９９６）を参照）。溶解の標的とされる細胞は、αＶβ６抗原で被覆されたヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）であってもよい。
【０１９９】
目的の免疫グロブリンを分泌する形質細胞を含むＢ細胞培養物及び補体の存在下では、プラーク形成が、特異的αＶβ６の媒介による目的の形質細胞を取り囲むヒツジ赤血球の溶解の指標となる。プラークの中心にある単一の抗原特異的形質細胞を単離することができ、その単一の形質細胞から、抗体の特異性をコードする遺伝情報が単離される。逆転写とそれに続くＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡをクローニングすることができる。次に、かかるクローニングされたＤＮＡを、好適な発現ベクター、ｐｃＤＮＡなどのベクターカセット、又は免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｇｌｏｂｕｌｉｎ）重鎖及び軽鎖の定常ドメインを含むｐｃＤＮＡベクターに、さらに挿入することができる。次に生成されたベクターを宿主細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトして、転写の誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切となるように修飾された従来の栄養培地で培養することができる。
【０２００】
一般に、融合したハイブリドーマによって産生される抗体は、完全ヒトκ又はλ軽鎖を伴うヒトＩｇＧ２重鎖であった。本明細書に記載される抗体は、ヒトＩｇＧ４重鎖並びにＩｇＧ２重鎖を有する。抗体はまた、ＩｇＧ１を含めた他のヒトアイソタイプの抗体であってもよい。抗体は高い親和性を有し、固相及び溶相の技法によって計測したとき典型的には約１０-6〜約１０-12Ｍ以下のＫｄを有した。少なくとも１０-11ＭのＫｄを有する抗体がαＶβ６の活性を阻害し得る。
【０２０１】
理解されるであろうとおり、抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株で発現することができる。特定の抗体をコードする配列を使用して好適な哺乳動物宿主細胞を形質転換することができる。形質転換は、例えばウイルスにおける（又はウイルスベクター中への）ポリヌクレオチドのパッケージング、及びそのウイルス（又はベクター）による宿主細胞の形質導入を含めた、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の公知の方法によるか、又は米国特許第４，３９９，２１６号明細書、同第４，９１２，０４０号明細書、同第４，７４０，４６１号明細書、及び同第４，９５９，４５５号明細書（これらの特許は本明細書によって参照により本明細書に援用される）により例示されるとおりの、当該技術分野において公知のトランスフェクション手順によってもよい。用いられる形質転換手順は、形質転換する宿主に依存する。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入する方法は当該技術分野において公知であり、デキストランの媒介によるトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレンの媒介によるトランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、１つ又は複数のポリヌクレオチドのリポソーム封入、及び核へのＤＮＡの直接的なマイクロインジェクションが含まれる。
【０２０２】
発現用の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当該技術分野において公知であり、限定はされないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、ヒト上皮腎２９３細胞、及び多数の他の細胞株を含め、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。細胞株の選択は、どの細胞株が高度に発現し、且つ構成的なαＶβ６結合特性で抗体を産生するかを決定することによって行われ得る。
【０２０３】
ｍＡｂが、αＶβ６活性（以下の実施例に示すとおり）を有意に中和する能力に基づいて、これらの抗体は、αＶβ６発現によって起こる症状及び状態を治療するのに治療効果を有する。具体的実施形態において、本明細書に記載する抗体及び方法は、αＶβ６誘導性細胞接着、又はαＶβ６とそのリガンドの相互作用の結果として誘導されるシグナル伝達によって起こる症状の治療に関する。
【０２０４】
別の態様によれば、αＶβ６の生物活性のアンタゴニストと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物が提供される。一実施形態では、アンタゴニストは、抗体を含む。別の態様によれば、αＶβ６の生物活性のアンタゴニストと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物が提供される。一実施形態では、アンタゴニストは、抗体を含む。
【０２０５】
抗αＶβ６抗体は、患者試料中のαＶβ６の検出に有用であり、従って、本明細書に記載する病態の診断薬として有用である。加えて、αＶβ６活性（以下の実施例に示すとおり）を有意に阻害する能力に基づいて、抗αＶβ６抗体は、αＶβ６発現によって起こる症状及び状態を治療するのに治療効果を有する。具体的実施形態において、本明細書における抗体及び方法は、αＶβ６誘導性細胞接着によって起こる症状の治療に関する。さらに別の実施形態は、αＶβ６関連疾患又は障害の治療を目的とする、本明細書に記載の抗体及び方法の使用を含み、かかる疾患又は障害として、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）（胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ））、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽腫、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌などの腫瘍性疾患が挙げられる。
【０２０６】
Ｃ．治療的投与及び製剤
実施形態は、疾患の治療薬として有用な抗αＶβ６抗体の無菌医薬製剤を含む。かかる製剤は、αＶβ６インテグリンへのリガンドの結合を阻害し、これにより、例えば、組織αＶβ６が異常に増加した病態を有効に治療するであろう。抗αＶβ６抗体は、αＶβ６活性を強力に阻害する適切な親和性を有し得ると共に、ヒトにおける低頻度の投与を可能にする適切な作用の持続時間を有し得る。長時間にわたる作用の持続は、皮下又は筋肉内注射などの代替的非経口経路による低頻度で、しかもより好都合な投与スケジュールを可能にする。
【０２０７】
抗ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩ抗体の無菌医薬製剤が、本明細書に開示される方法において有用である。無菌製剤は、例えば、抗体を凍結乾燥及び再構成する前又はその後に無菌ろ過膜でろ過することにより作成することができる。抗体は通常、凍結乾燥形態で、又は溶液中に保存され得る。治療用抗体組成物は、概して、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって穿刺可能な栓などの、製剤の取り出しを可能にするアダプターを有する静脈内注射液バッグ又はバイアルに入れられる。
【０２０８】
抗体投与経路は、公知の方法、例えば、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、髄腔内、吸入又は病巣内経路、腫瘍部位への直接注入による、又は以下に記載するとおりの徐放システムによる注射又は注入に従う。抗体は、注入によって連続的に、又はボーラス注入により投与することができる。
【０２０９】
治療に使用する抗体の有効な量は、例えば、治療目的、投与経路、及び患者の状態に応じて変動し得る。従って、治療者は、最適な治療効果を達成するために、投薬量を滴定し、投与経路を修正することができる。一態様では、臨床医は、所望の効果を達成する投薬量に到達するまで、抗体を投与する。この療法の進行は、従来のアッセイ又は本明細書に記載するアッセイによって容易にモニターされる。
【０２１０】
本明細書に記載されるとおりの抗体は、薬学的に許容可能な担体と共に混合物中に調製することができる。この治療組成物は、静脈内投与するか、又は任意選択で液体若しくは粉末エアロゾル（凍結乾燥）として、経鼻的若しくは経肺的に投与することができる。この組成物はまた、所望に応じて非経口的に又は皮下に投与されてもよい。全身投与される場合、治療組成物は、無菌、パイロジェンフリーで、且つｐＨ、等張性、及び安定性について妥当な考慮がなされた非経口的に許容可能な溶液中になければならない。これらの条件は当業者に公知である。簡潔に言えば、本明細書に記載される化合物の投薬製剤は、所望の純度を有する化合物を薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤と混合することにより、保管用又は投与用に調製される。かかる材料は、用いられる投薬量及び濃度で被投与者に非毒性であり、ＴＲＩＳ  ＨＣｌ、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩及び他の有機酸塩などの緩衝剤；アスコルビン酸などの抗酸化剤；ポリアルギニンなどの低分子量（約１０残基未満）ペプチド、タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなど；ポリビニルピロリジノンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、又はアルギニンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びその他の、セルロース又はその誘導体、グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの対イオン及び／又はＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ又はポリエチレングリコールなどの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０２１１】
注射用無菌組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０th  ｅｄ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｅｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（２００３））に記載されるとおりの従来の薬務に従い製剤化することができる。例えば、水又はゴマ油、ピーナッツ油、若しくは綿実油のような天然に存在する植物油などの薬学的に許容可能な担体、又はオレイン酸エチルなどのような合成脂肪媒体に活性化合物を溶解又は懸濁することが望ましい場合もある。認められている薬務に従い緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤などが組み込まれてもよい。
【０２１２】
徐放性製剤の好適な例としては、ポリペプチドを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形品、フィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，（１９８１）１５：１６７−２７７及びＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，（１９８２）１２：９８−１０５により記載されるとおりのポリ（２−メタクリル酸ヒドロキシエチル）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書、欧州特許第５８，４８１号明細書）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸との共重合体（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，（１９８３）２２：５４７−５５６）、非分解性エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、前掲）、ＬＵＰＲＯＮ  Ｄｅｐｏｔ（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドから構成される注射用マイクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸共重合体、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号明細書）が挙げられる。
【０２１３】
エチレン酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは１００日間以上にわたり分子を放出することが可能であるが、特定のハイドロゲルはそれより短い期間にわたりタンパク質を放出する。タンパク質は封入されると体内に長期間留まり、３７℃の水分に曝露される結果として変性又は凝集すると、それにより生物活性が失われ、場合により免疫原性が変化し得る。関与する機構に応じてタンパク質安定化のための合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集機構がジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが見出される場合、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、含水量の制御、適切な添加剤の使用、及び特定のポリマーマトリックス組成物の開発により、安定化を実現することができる。
【０２１４】
抗体はまた、哺乳動物、任意選択でヒトにおいて、非修飾抗体のそれより長い半減期（例えば、血清半減期）を有する抗体をも包含する。一実施形態では、前記抗体の抗体半減期は、１５日超、２０日超、２５日超、３０日超、３５日超、４０日超、４５日超、２ヵ月超、３ヵ月超、４ヵ月超、又は５ヵ月超である。哺乳動物、任意選択でヒトにおける本明細書に記載の抗体若しくはその断片の半減期の増加は、哺乳動物において前記抗体若しくは抗体断片のより高い血清力価をもたらし、従って、前記抗体若しくは抗体断片の投与の頻度を減じる、及び／又は投与する前記抗体若しくは抗体断片の濃度を低減する。インビボ半減期が増加した抗体又はその断片は、当業者には周知の技術により生成することができる。例えば、インビボ半減期が増加した抗体又はその断片は、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との相互作用に関与するアミノ酸残基を修飾（例えば、置換、欠失又は付加）することにより、生成することができる（例えば、国際公開第９７／３４６３１号パンフレット及び同第０２／０６０９１９号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）を参照されたい）。インビボ半減期が増加した抗体又はその断片は、前記抗体又は抗体断片に、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー分子を結合させることにより、生成することができる。ＰＥＧは、前記抗体又は抗体断片のＮ若しくはＣ末端へのＰＥＧの部位特異的結合によって、又はリシン残基に存在するεアミノ基を介したいずれかで、多機能リンカーと共に、又はなしで前記抗体又は抗体断片に結合させることができる。生物活性の喪失を最小限にする直鎖又は分岐状ポリマー誘導体化を使用する。ＰＥＧ分子と抗体の適正な結合を確実にするために、結合の度合いをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析により綿密にモニターする。非反応ＰＥＧは、例えば、サイズ排除又はイオン交換クロマトグラフィーにより抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離することができる。
【０２１５】
徐放性組成物にはまた、懸濁液中に結晶を維持することが可能な好適な製剤中に懸濁された抗体の結晶の配合物も含まれる。このような配合物は、皮下注入又は腹腔内注入されると徐放性の効果を生じ得る。他の組成物にはまた、リポソームに捕捉された抗体も含まれる。かかる抗体を含むリポソームは、それ自体公知の方法により調製される：米国特許第ＤＥ３，２１８，１２１号明細書；Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８５）８２：３６８８−３６９２；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８０）７７：４０３０−４０３４；欧州特許第５２，３２２号明細書；欧州特許第３６，６７６号明細書；欧州特許第８８，０４６号明細書；欧州特許第１４３，９４９号明細書；１４２，６４１号明細書；日本国特許出願第８３−１１８００８号明細書；米国特許第４，４８５，０４５号明細書及び同第４，５４４，５４５号明細書；及び欧州特許第１０２，３２４号明細書。
【０２１６】
所与の患者のための抗体製剤の投薬量は、担当医師により、薬物の作用を変化させることがわかっている様々な因子、例えば、疾患の重症度及び種類、体重、性別、食事、投与時間及び経路、他の薬剤及びその他の関連する臨床的因子を考慮に入れて、決定される。治療に有効な投薬量は、インビトロ又はインビボ方法のいずれによって決定してもよい。
【０２１７】
治療に使用する本明細書に記載の抗体の有効な量は、例えば、治療目的、投与経路、及び患者の状態に応じて変動し得る。従って、治療者は、最適な治療効果を達成するために、投薬量を滴定し、必要に応じて投与経路を修正することができる。典型的な１日投薬量は、前述した因子に応じて、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上までであってよい。典型的に、臨床医は、所望の効果を達成する投薬量に到達するまで、治療用抗体を投与する。この療法の進行は、従来のアッセイ又は本明細書に記載するアッセイによって容易にモニターされる。
【０２１８】
本明細書における組成物及び方法に従う治療用エンティティの投与は、移動、送達、耐性などの向上をもたらすため製剤中に組み込まれる好適な担体、賦形剤、及び他の薬剤と共に投与され得ることは理解されるであろう。これらの製剤としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性又はアニオン性）を含有する媒体（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）など）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油及び油中水エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及びカーボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。前述の混合物のいずれも治療及び療法に適切であり得るが、但し、製剤中の活性成分がその製剤により不活性化されないこと、及び製剤が投与経路に関して生理学的に適合性及び忍容性を有することを条件とする。製薬化学者に公知の製剤、賦形剤及び担体に関するさらなる情報については、Ｂａｌｄｒｉｃｋ  Ｐ．“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｔｈｅ  ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｇｕｉｄａｎｃｅ．”Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２（２）：２１０−８（２０００）、Ｗａｎｇ  Ｗ．“Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０３（１−２）：１−６０（２０００）、Ｃｈａｒｍａｎ  ＷＮ“Ｌｉｐｉｄｓ，ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ  ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｓｏｍｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ．”Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．８９（８）：９６７−７８（２０００）、Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８−３１１（１９９８）及びこれらの文献中の引用も参照のこと。
【０２１９】
Ｄ．他の治療薬の設計及び生成
本発明の実施形態に従い、且つαＶβ６に関して本明細書において産生され、特性決定される抗体の活性に基づいて、抗体部分以外の他の治療法の設計が促進される。かかる治療法として、限定はされないが、高度抗体治療薬、例えば、二重特異性抗体、免疫毒素、及び放射性標識治療薬、単一ドメイン抗体、ペプチド治療薬の生成、新規スカフォールド中のαＶβ６結合ドメイン、遺伝子療法、特にイントラボディ、アンチセンス治療薬、及び小分子が挙げられる。
【０２２０】
補体結合が望ましい属性である高度抗体治療薬の生成に関して、例えば、二重特異性抗体、免疫毒素、放射性標識の使用による細胞の殺傷のための補体への依存を回避することが可能である。
【０２２１】
以下：（ｉ）１つはαＶβ６に対する特異性を有し、もう１つは第２分子に対する特異性を有し、互いに結合した２つの抗体、（ｉｉ）αＶβ６に対して特異的な１つの鎖と、第２分子に対して特異的な第２鎖を有する単一抗体、又は（ｉｉｉ）αＶβ６及び他方の分子に対する特異性を有する単一抗体を含む、二重特異性抗体を生成することができる。かかる二重特異性抗体は、公知の技術；例えば、（ｉ）及び（ｉｉ）に関しては、例えば、Ｆａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４：７２−８１（１９９４）並びにＷｒｉｇｈｔ及びＨａｒｒｉｓ（前掲）を、また、（ｉｉｉ）に関しては、例えば、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（Ｓｕｐｐｌ．）７：５１−５２（１９９２）をそれぞれ参照されたい。いずれの場合も、第２の特異性は、限定はされないが、ＣＤ１６若しくはＣＤ６４（例えば、Ｄｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １８：１２７（１９９７）を参照）又はＣＤ８９（例えば、Ｖａｌｅｒｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９０：４４８５−４４９２（１９９７））などの重鎖活性化受容体に対してもたらすことができる。
【０２２２】
免疫毒素に関して、抗体は、当該技術分野において公知の技術を使用して、免疫毒素として作用するように修飾することができる。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １４：２５２（１９９３）を参照されたい。また、米国特許第５，１９４，５９４号明細書も参照されたい。また、放射性標識抗体の調製に関しても、かかる修飾抗体は、当該技術分野において公知の技術を使用して容易に調製することができる。例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６５５−６８６（２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｆｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｏ，ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｒａｖｅｎ（１９９６））を参照されたい。また、米国特許第４，６８１，５８１号明細書、同第４，７３５，２１０号明細書、同第５，１０１，８２７号明細書、同第５，１０２，９９０号明細書（ＲＥ３５，５００）、同第５，６４８，４７１号明細書、及び同第５，６９７，９０２号明細書も参照されたい。
【０２２３】
抗原結合部位は、フィブロネクチン若しくはシトクロムＢなどの非抗体タンパク質スカフォールド上のＣＤＲの配置によって（Ｈａａｎ＆Ｍａｇｇｏｓ（２００４）ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，１２（５）：Ａ１−Ａ６；Ｋｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２８４：１１４１−１１５１；Ｎｙｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７：４６３−４６９）、又はタンパク質スカフォールド内のループのアミノ酸残基を無作為化若しくは突然変異させることにより付与することができる。タンパク質に新規の結合部位を作製するためのスカフォールドについては、Ｎｙｇｒｅｎらにより詳しく論述されている（Ｎｙｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７：４６３−４６９）。抗体ミメティクスのためのタンパク質スカフォールドは、国際公開第００３４７８４号パンフレット（その全体が、本明細書によって参照により援用される）に記載されており、ここで、本発明者らは、少なくとも１つの無作為化ループを有するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含むタンパク質（抗体ミメティクス）を記載している。１つ又は複数のＣＤＲ、例えば、ＨＣＤＲのセットを移植するために好適なスカフォールドは、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの任意のドメインメンバーによって提供され得る。スカフォールドは、ヒト又は非ヒトタンパク質のいずれであってもよい。非抗体タンパク質スカフォールドの利点は、少なくとも一部の抗体分子より小さく、及び／又は製造しやすいスカフォールド分子中に抗原結合部位を提供することができる点である。小サイズの結合剤は、細胞に進入する、組織の深部まで浸透する、又は他の構造内の標的に到達することができる、或いは、標的抗原のタンパク質空洞内に結合することができるなどの有用な生理学的特性を付与し得る。非抗体タンパク質スカフォールド中の抗原結合部位の使用については、Ｗｅｓｓ、２００４年（Ｗｅｓｓ，Ｌ．Ｉｎ：ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，Ｔｈｅ  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ＢｉｏＢｕｓｉｎｅｓｓ，１２（４２），Ａ１−Ａ７，２００４）に論述されている。典型的なのは、安定な骨格と１つ又は複数の可変ループを有するタンパク質であり、その場合、１つ又は複数のループのアミノ酸配列は、標的抗原に結合する抗原結合部位を形成するように特異的又は無作為に突然変異している。かかるタンパク質としては、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡのＩｇＧ結合ドメイン、トランスフェリン、アルブミン、テトラネクチン、フィブロネクチン（例えば、第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン）、リポカリン並びにγ結晶性及びその他のＡｆｆｉｌｉｎ（商標）スカフォールド（Ｓｃｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）が挙げられる。他のアプローチの例として、シクロチドを基材とする「ミクロボディ（Ｍｉｃｒｏｂｏｄｉｅｓ）」−分子内ジスルフィド結合を有する低分子量タンパク質、ミクロプロテイン（Ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）（Ｖｅｒｓａｂｏｄｉｅｓ（商標）、Ａｍｕｎｉ��）及びアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ）が挙げられる。
【０２２４】
抗体配列及び／又は抗原結合部位に加えて、結合剤は、他のアミノ酸、例えば、折り畳まれたドメインなどのペプチド若しくはポリペプチドを形成するアミノ酸、又は抗原に結合する能力以外の別の機能的特徴を分子に付与するアミノ酸を含んでもよい。結合剤は、検出可能な標識を担持してもよく、或いは、毒素又はターゲティング部分若しくは酵素と結合してもよい（例えば、ペプチジル結合若しくはリンカーを介して）。例えば、結合剤は、抗原結合部位と共に、触媒部位（例えば、酵素ドメイン中に）を含んでもよく、この場合、抗原結合部位は、抗原に結合し、これにより、触媒部位を抗原にターゲティングする。触媒部位は、例えば、切断によって、抗原の生物学的機能を阻害し得る。
【０２２５】
その他の実施形態は、ここに開示する本明細書及び実施の考察から当業者には明らかになるであろう。本明細書及び例は、あくまで例示として考慮すべきであり、真の範囲及び趣旨は、以下の特許請求の範囲によって示される。
【実施例】
【０２２６】
実施例１．材料及び方法
臨床試料
以下のＲＥＭＡＲＫ指針（２３）に従い、２つの独立したコホートの乳癌試料を分析した。１つは、１９８６〜１９９８年に、年齢が＜７０歳の女性のノッティンガム・テノブス乳癌系列（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ｔｅｎｏｖｕｓ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｓｅｒｉｅｓ）からの１，７９５の連続ケースを含んだ（ノッティンガムコホート（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ｃｏｈｏｒｔ））（２４、２５）。腫瘍タイプ、組織学的グレード、サイズ、リンパ節（ＬＮ）状態、ＥＲ−、ＰＲ−及びＨＥＲ２状態、シトケラチン（ＣＫ）プロフィール、再発（局部、局所及び遠位）並びに生存に関するデータが入手可能であった。第２コホートは、ガイズアンドセントトーマス乳房組織バンク（Ｇｕｙ’ｓ  ａｎｄ  Ｓｔ．Ｔｈｏｍａｓ’Ｂｒｅａｓｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋ）、ロンドンからの１，１９７の浸潤性症例であった（ロンドンコホート（Ｌｏｎｄｏｎ  Ｃｏｈｏｒｔ））。患者は、１９６０年〜１９９８年に手術を受けた（９８％が１９７５年以降）。腫瘍タイプ、グレード、ＬＮ状態、ＥＲ−、ＰＲ−及びＨＥＲ２状態、無病及び全生存期間についてのデータが入手可能であった。臨床病理学的データの概要を示す（図１０）。全ての試験は、ノースイーストロンドン研究倫理委員会（Ｎｏｒｔｈ  Ｅａｓｔ  Ｌｏｎｄｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認された。
【０２２７】
免疫組織化学的分析
免疫組織化学では、組織マクロアレイ（ＴＭＡ）の４μｍのホルマリン固定、パラフィン包埋連続切片を使用した。各試料は、最小２×０．６ｍｍ腫瘍コアの形態を呈した。標準的アビジン−ビオチン複合体技術（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  Ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ）を、シトケラチン５／６（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）及びシトケラチン１４（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）のためのクエン酸緩衝液マイクロウェーブ抗原賦活化と共に使用した。αｖβ６インテグリンのために用いるプロトコル（ｍＡｂ  ６．２Ｇ２、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）は、以前記載されている（１６）。正常乳房（ｎ＝１５）をシトケラチン抗体の正の対照とし、マウスＩｇＧは、負の対照とした。インテグリンαｖβ６染色を、腫瘍細胞染色の程度（０、＜２５％＝１、２５〜５０％＝２、５０％〜７５％＝３、＞７５％＝４）及び強度（０＝陰性、１＝弱、２＝中、３＝強）の和としてスコアリングし；０〜７の最終スコアを付与する。強力なαｖβ６染色の例を図１Ｂに示す。各腫瘍コアを２人の独立した病理学者によってスコアリングし；最終スコアは、２つの読み取り値の平均を表す。強力な発現（スコア≧５）を示す患者と、中度又は陰性染色（スコア＜５）を示す患者との間に予め定めたカットオフを全ての分析で用いた。ＣＫ５／６及びＣＫ１４発現について、＞１０％の染色が起これば、患者を陽性と見なした（２５）。
【０２２８】
ＭＥＴＡＢＲＩＣコホート前処置
この試験は、乳癌国際協会の分子分類学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）（２６）によって作成されたＭＥＴＡＢＲＩＣデータを使用する。本プロジェクトの資金は、英国癌研究（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＵＫ）及びブリティッシュコロンビア癌研究所支部（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｃｙ  Ｂｒａｎｃｈ）により提供された。乳癌ＭＥＴＡＢＲＩＣデータセットを前処理し、まとめた後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏにより作成された生（ｒａｗ）エクスプレッション（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）ファイルからクオンタイル正規化した。（Ｒ  ｐａｃｋａｇｅｓ：ｂｅａｄａｒｒａｙ  ｖ２．４．２  ａｎｄ  ｉｌｌｕｍｉｎａＨｕｍａｎ  ｖ３．ｄｂ＿１．１２．２）。生ＭＥＴＡＢＲＩＣファイルを欧州ゲノム−フェノムアーカイブ（ＥＧＡ）からダウンロードした（試験識別番号：ＥＧＡＳ０００００００００８３）。１つのＭＥＴＡＢＲＩＣ試料の生データファイルは、本発明者らの分析の時点で入手できなかったため、それは除外した。前処理は全てＲ統計的環境（ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）ｖ２．１４．１において実施した。
【０２２９】
生存分析
ロンドン及びノッティンガム臨床コホートにおけるＨＥＲ２＋患者を、αｖβ６タンパク質発現を用いて、低リスク群及び高リスク群に二分した（低リスクαｖβ６＜５、高リスクαｖβ６≧５）。生存分析をＲ統計的環境ｖ２．１４．１（Ｒパッケージ：生存ｖ２．３６〜１４）において実施した。単変量Ｃｏｘ比例ハザードモデルをあてはめることによってハザード比を推定し、リスク群の生存の差の有意性を、Ｌｏｇｒａｎｋ検定を用いて計算した。同様に、ＭＥＴＡＢＲＩＣコホートにおける遺伝子発現由来のＨＥＲ２＋患者を、ＩＴＧＢ６発現プロフィールを用いて分析した。ＭＥＴＡＢＲＩＣにおけるＩＴＧＢ６発現についてのリスク群二分化閾値は、ロンドン／ノッティンガム臨床コホートの抗体試験によって決定された低及び高リスクＨＥＲ２＋患者の割合を用いることにより設定した。Ｒ統計的環境ｖ２．１４．１において、カプラン・マイヤー生存曲線を作成した。
【０２３０】
細胞株及び薬物供給源
２０のヒト乳癌細胞株をαｖβ６発現について分析した。全ての株の遺伝学的アイデンティティ（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）をＬＧＣ  ＳＴＲプロファイリングによって確認した（データは示していない）。１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）及びＬ−グルタミンを含有するＤＭＥＭにおいて、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７及びＭＤＡ  ＭＢ−４６８細胞を増殖させた。ＭＣＦ−７／ｎｅｏ−１及びＭＣＦ−７／ＨＥＲ２−１８は、Ｈｕｎｇ教授（Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）からの好意による寄贈品である（３７）。細胞供給源及び培地要件については、記載されているとおりである（３７、３８、３９、４０）。１０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン及びインスリン（１０μｇ／ｍｌ）を含有するＲＰＭＩにおいて、ＢＴ−４７４細胞を増殖させた。
【０２３１】
マウスモノクローナル抗体６．２Ｇ２は、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）からの寛大な寄贈品であった。ＩｇＧ及びαｖβ６−阻止抗体２６４ＲＡＤは、  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｉＭＥＤ，ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（Ｍａｃｃｅｌｓｆｉｅｌｄ，Ｕ．Ｋ）からの寛大な寄贈品であった。トラスツズマブは、Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからの寛大な寄贈品であった。ｓｉＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ｓｉＧＥＮＯＭＥ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から供給された。増殖因子は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから供給された。
【０２３２】
トランスウェル及びミニ器官型浸潤アッセイ
トランスウェル浸潤アッセイのために、７０μｌのＢＤマトリゲル基底膜（Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ）マトリックス（マトリゲル）：培地（１：２比）でコーティングした直径６．５ｍｍ、細孔径８μｍのトランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＢＶ）中に、処理後、１ウェル当たり５×１０4個の細胞を接種した。マトリゲルを介して浸潤した細胞を、７２時間後に、ＣＡＳＹ計数器（Ｓｃｈａｒｆｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて計数した。器官型アッセイのために、５×１０4個のＭＲＣ５／ｈＴＥＲＴ線維芽細胞を含有する１２０μｌのコラーゲン（ラットテイルコラーゲン（Ｒａｔ  ｔａｉｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ）Ｉ、Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）：マトリゲル混合物（７０：３０）を含む、直径６．５ｍｍ、細孔径４μｍのトランスウェル上に、処理後、１ウェル当たり５×１０4個の細胞を接種した。培地を５〜６日にわたって２日置きに交換し、ゲルを通常生理食塩水中に固定し、パラフィン包埋して、切片をヘマトキシリン及びエオシン染色した。各ゲル上の５地点での平均深さに、浸潤細胞が占める面積を掛けることによって、浸潤指数を算出した。ＩｍａｇｅＪ１  ６４ソフトウェアを用いて、分析を実施した。
【０２３３】
免疫ブロッティング
処理後、細胞をＮＰ−４０バッファー中に溶解させてから、ウエスタンブロッッティングに付した。手短には、定量後、１レーン当たり１０〜５０μｇのタンパク質をロードし、ゲル泳動させ、膜に移した。０．１％ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０中の５％脱脂乳において、室温で１時間のインキュベーションにより、非特異的結合を阻止した。膜を所望の一次抗体と一緒に、一晩４℃でインキュベートした。図１３に、抗体及び供給業者の一覧を記載する。ＩｍａｇｅＪ１  ６４ソフトウェアを用いて、分析を実施した。
【０２３４】
ヒト腫瘍異種移植片モデル
全ての動物実験は、Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅにより承認され、これらを遵守した。全ての動物試験のために、２６４ＲＡＤ及びトラスツズマブを最終濃度１０ｍｇ／ｋｇで、１×ＰＢＳに溶解させた。腫瘍細胞注射の２４時間前に、エストロゲンペレット（０．２５ｍｇを６０日放出、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）をマウスに皮下移植した。ＳＣＩＤマウス（Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｉＭＥＤ，ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ，Ｍａｃｃｅｌｓｆｉｅｌｄ，Ｕ．Ｋからの寛大な寄贈品）又はＣＤ１  ｎｕ／ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、２００μｌのＰＢＳ中の１×１０6ＭＣＦ−７／ＨＥＲ２−１８細胞又は１：１のＰＢＳ／マトリゲル中の１×１０7ＢＴ−４７４細胞のいずれかと一緒に、皮下接種した。腫瘍が触知可能（３〜４ｍｍ3）になるか、又は１００若しくは２００ｍｍ3に達したら、マウスを無作為に処置群に分けた。マウスは、２週間毎に、ヒトＩｇＧ、２６４ＲＡＤ、トラスツズマブ又は２６４ＲＡＤとトラスツズマブの両方の腹腔内注射（２００μｌのＰＢＳ中１０ｍｇ／ｋｇ）を受けた。２週間毎に、カリパスを用いて、腫瘍を２方向で測定し、式（幅2×長さ）／２を用いて、腫瘍体積を計算した。
【０２３５】
統計分析
対照インビトロ培養物に対する薬物処置培養物の統計的有意性を、２つの変数についてのスチューデントｔ検定を用いて決定した。３つ以上の変数の場合、Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いたＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｔｅｓｔと共に、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を用いて決定した。腫瘍異種移植片モデルについては、個別の増殖曲線をプロットした後、線形混合モデル（２７）を用いて、処置間の差を検定した。これを、統計ソフトウェアＲ（Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ，２０１０）２．１１．１におけるｎｌｍｅパッケージを用いて、最大尤度によりあてはめた。Ｐ値は、ウォールド（Ｗａｌｄ）検定から得たものである。Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄのＬｏｇ−Ｒａｎｋ検定を用いて、マウスの生存率を測定した。統計検定は全て両側検定であった。
【０２３６】
実施例２．インテグリンαＶβ６及びＨＥＲ２の高度共発現により、乳癌からの低生存率が予測される。
乳癌を有する女性総計２０００人超の２つの個別のコホート（ロンドン及びノッティンガム）からの組織ミクロアレイ（ＴＭＡ）上のαＶβ６発現について染色した（染色例、図１Ａ）。これら２コホートの臨床病理学的パラメータ、及びこれらのパラメータとαＶβ６発現の相関を図１０及び１１にそれぞれ示す。正常乳房組織（ｎ＞１５）は、αＶβ６発現がないのに対し、αＶβ６の高度発現は、浸潤性乳管癌の１５％〜１６％に観察された（図１Ａ、１Ｂ、及び１１）。αＶβ６の高度発現と低生存率との間に有意な相関があった（図１Ｃ及び１Ｄ）。そのため、５年生存率は、ロンドンコホートでは７１．３％から５７％に（図１Ｃ；Ｐ＝２．９×１０-6）、ノッティンガムコホートでは７３．５％から５３．２％に（図１Ｄ；Ｐ＝４．７３×１０-5）低下し、低生存率とαＶβ６の高度発現との有意な関連は、少なくとも１５年続いた（図６）。腫瘍病期について調節した後でも、サイズ及びグレードαＶβ６は、生存率の独立した予測因子のままであった（Ｐ＝０．０３；総合コホートデータ）。腫瘍播種に関するデータは、ノッティンガム系列についてしか入手できなかったが、この系列では、αＶβ６発現は、遠位拡散と有意に関連していた（Ｐ＝０．０２）。１０２６人のαＶβ６陰性患者のうち、３１７（３１％）が、遠隔転移を有したのに対し、対応する２０５人のαＶβ６陽性患者のうち、８１（４０％）が、遠隔転移を有した。さらに、αＶβ６陽性癌は、骨への拡散を有する可能性が有意に高かった（Ｐ＝０．０４）。
【０２３７】
また、いずれのコホートについても、ＨＥＲ２と高度αＶβ６発現との間に強力な相関があったことも認めた（Ｐ＝０．００１；図１１）。高度αＶβ６及びＨＥＲ２タンパク質の共発現は、総合ロンドン及びノッティンガムコホートにおいて生存率を有意に低下させた（図１Ｅ：ハザード比（ＨＲ）３．４３；Ｐ＝３．９８×１０-12）。ＭＥＴＡＢＲＩＣ乳癌発現データベース（＞２０００患者（２６））の分析によって、高度ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）及びＩＴＧＢ６（インテグリンβ６サブユニット）遺伝子発現を有した患者が、生存率を有意に低下した（図１Ｆ；ＨＲ＝１．９４、Ｐ＝０．００３）ことが確認されたことから、増大したリスクは、転写レベルで制御されると思われた。このように、タンパク質及びｍＲＮＡレベルの両方でＨＥＲ２とαＶβ６との間に相関があると思われ、乳癌からの低い生存率が予測されるため、本発明者らは、これら２つの受容体が、協同して浸潤及び癌を促進するのかどうかを調べた。
【０２３８】
実施例３．インテグリンαＶβ６及びＨＥＲ２はいずれも、乳癌浸潤を促進する。
フローサイトメトリーを用いて、αＶβ６及びＨＥＲ２の発現、並びにマトリゲルを通じて浸潤するそれらの能力について、２０の乳癌細胞株をスクリーニングした（図２Ａ、２Ｂ、及び１２）。細胞株の８０％が、αＶβ６を発現したことが見出され、これらのうち、αＶβ６／ＨＥＲ２二重陽性細胞株ＢＴ−４７４、ＭＣＦ１０Ａ．ＣＡ１ａ（ＣＡ１ａ）及びトラスツズマブ耐性ＭＣＦ−７／ＨＥＲ２−１８（ＨＥＲ２−１８）をさらに詳しく調べた。αＶβ６（２６４ＲＡＤ）又はＨＥＲ２（トラスツズマブ、ＴＲＡ）の抗体遮断は、浸潤を有意に阻止した（図２Ｃ及び２Ｄ）。同様に、ＩＴＧＢ６（図２Ｅ）又はＥＲＢＢ２（図２Ｆ）に対するｓｉＲＮＡも、浸潤を有意に阻止した。２６４ＲＡＤは、αＶβ８に対してある程度の活性も有することから、これらの実験をαＶβ６特異的抗体、１０Ｄ５を用いて反復し、同様の結果を得た（図７Ａ）。αＶβ６及びＨＥＲ２の組み合わせ抗体遮断は、単一抗体遮断によって得られたもの以上に浸潤を低減しなかった（図２Ｇ）が、恐らくこれは、これらの受容体が、同じ経路を介して機能したことを示唆している。ＨＥＲ２−１８又はＣＡ１ａ細胞の増殖は、マトリゲルアッセイの工程中、又は処理の７日後に、２６４ＲＡＤ、トラスツズマブ若しくは両抗体の組み合わせでの処置によって有意に変化しなかった（図７Ｂ）。３日にわたるいずれの処置によっても、トラスツズマブ感受性ＢＴ−４７４細胞において増殖は有意に低減しなかったが、トラスツズマブは、７日にわたって増殖を約３０％低減し；２６４ＲＡＤは、３又は７日にわたりＢＴ−４７４増殖に有意に作用しなかった（データは示していない）。
【０２３９】
共焦点顕微鏡検査によって、αＶβ６及びＨＥＲ２が、乳癌細胞に共局在化したことが明らかにされた（図７Ｃ）。しかし、２つのタンパク質は、ヘレグリンβ１（ＨＲＧβ）と共に、又はなしで、いずれかの弱い会合を強化するためにタンパク質−タンパク質架橋剤を添加した場合でも、共免疫沈降しなかった（データは示していない）。
【０２４０】
実施例４．インテグリンαＶβ６は、ＨＥＲ２駆動の浸潤を媒介する。
αＶβ６及びＨＥＲ２機能同士の関係を確認するため、ＨＥＲ２／３ヘテロ二量体化及び下流シグナル伝達活性化を誘導するために、ＨＲＧβの添加によりＨＥＲ２浸潤を刺激した。ＨＥＲ３は、乳癌におけるＨＥＲ２の優先的な二量体化のパートナーであり（２８）、低生存率をもたらす。ＨＲＧβは、ＨＥＲ４のリガンドでもあるが、シグナル伝達の大部分は、ＨＥＲ２／３を介して起こる（データは示していない）。これは、Ｐ−ＨＥＲ４発現が、ＨＲＧβ有り又はなしのいずれの場合でも、無視できる程度であった腫瘍異種移植片において確認された。
【０２４１】
図３Ａ及び３Ｂは、ＨＲＧβが、ＨＥＲ２−１８及びＣＡ１ａ細胞両方の浸潤性向を有意に高めたこと、並びにこの浸潤の増大が、ＨＥＲ２（トラスツズマブ）又はαＶβ６（２６４ＲＡＤ）の抗体遮断によって阻害され得ることを示す。これらのデータは、ＨＥＲ２促進の浸潤が、αＶβ６により媒介されることを示唆している。対照的に、ＢＴ−４７４細胞へのＨＲＧβの添加は浸潤能力を増強せず、これは、それらのＨＥＲ２促進浸潤性向が、最大であったことを示唆している。しかし、αＶβ６又はＨＥＲ２の遮断は、やはりそれらの内因性浸潤性向を抑制した（図３Ａ及びＢ）。
【０２４２】
より生理学的に重要なアッセイにおいて浸潤を試験するために、腫瘍細胞が線維芽豊富なリッチコラーゲンゲルに浸潤することを可能にする器官型浸潤アッセイを用いて、細胞株を試験した。ＨＥＲ２−１８及びＢＴ−４７４細胞は、器官型システムに適合させることができないことが判明したため、ＣＡ１ａ細胞を試験した。図３Ｃは、β６又はＨＥＲ２の抗体遮断及びｓｉＲＮＡノックダウンの両方が、浸潤を有意に抑制することを示す。浸潤は、αＶβ６遮断によって６７．４５±１２．５３％、またＨＥＲ２遮断によって６９．８１±９．８５％低減した（ヒストグラムに示される「浸潤指数（Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）」として定量される浸潤）。これらのデータは、マトリゲル浸潤データを支持するものである（図２）。まとめると、これらのインビトロデータは、乳癌において、αＶβ６が、ＨＥＲ２と協同して、浸潤に必要な細胞内シグナルを生成することを示唆し、さらには、αＶβ６機能の遮断が、ＨＥＲ２標的化抗体療法を改善し得ることも示唆している。２６４ＲＡＤもまたαＶβ８に対してある程度の活性を有する（２９）が、ＭＣＦ−／Ｈｅｒ２−１８、ＭＣＦ１０Ａ．ＣＡ１ａ及びＢＴ−４７４は、このインテグリンを発現しないため、この抗体の作用は、これらの細胞において特異的にαＶβ６に対することに留意されたい。
【０２４３】
実施例５．αＶβ６の抗体遮断は、インビボでトラスツズマブ効力を改善する
αＶβ６遮断が、トラスツズマブ抗体療法を改善することができるかどうかを試験するために、トラスツズマブ感受性ＢＴ−４７４細胞株の増殖に対する２６４ＲＡＤの作用をインビボで試験した。図４Ａは、１００ｍｍ3のＢＴ−４７４腫瘍を有するマウスの２６４ＲＡＤによる２週間の処置が、ＩｇＧと比較して（Ｐ＜０．０００１）腫瘍増殖を停止し、また、トラスツズマブ（ＴＲＡ）は、腫瘍の成長を７７．８％と有意に低減した（Ｐ＜０．０００１）ことを示す。しかし、２６４ＲＡＤ及びトラスツズマブの併用は、１４日の処置後、ＩｇＧと比較して（Ｐ＜０．０００１）、９４．８％の体積縮小と、トラスツズマブ単独より有効であった。
【０２４４】
αＶβ６遮断が、トラスツズマブ耐性腫瘍におけるトラスツズマブの効力を改善することができるかどうかを評価するために、インビボでトラスツズマブ耐性ＭＣＦ−７／ＨＥＲ２−１８（ＨＥＲ２−１８）細胞株による抗体療法を反復した。腫瘍を１００ｍｍ3に到達させた後、療法を開始した。図４Ｂは、急速に進行したＩｇＧ対照と比較して、２６４ＲＡＤ又はトラスツズマブいずれかによる単独療法は、同等程度で増殖を緩徐にした（ＩｇＧと比較して、それぞれ最終体積の５３．９％（Ｐ＝０．０００６）及び５２．１％（Ｐ＝０．０００４）縮小）ことを示す。併用療法は、いずれかの抗体単独より有意に高い程度まで腫瘍体積を縮小し、トラスツズマブ単独と比較して腫瘍体積はさらに２４．１４％縮小し（Ｐ＜０．０００１）、またＩｇＧと比較して７６．２％の腫瘍の全体的体積縮小を示した（Ｐ＜０．０００１）。抗体による処置後のＢＴ−４７４及びＨＥＲ２−１８異種移植片の代表的画像を図４Ｃに示す。
【０２４５】
次に、処置後の異種移植片におけるタンパク質発現を分析することにより、この抗腫瘍形成効果を支持する分子機構を調べた。
【０２４６】
実施例６．２６４ＲＡＤ及びトラスツズマブ療法に対する癌腫瘍の分子応答。
２週間の処置後にＢＴ−４７４及びＨＥＲ２−１８異種移植片からの残留腫瘍組織を溶解させ、２週間の処置計画からの様々なシグナル伝達分子について分析した。各抗体の直接標的、αＶβ６、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３のタンパク質発現を、これらの経路（全（Ｔｏｔａｌ）（Ｔ）−Ａｋｔ２）及びαＶβ６関連ＴＧＦβシグナル伝達経路（全（Ｔｏｔａｌ）（Ｔ）及びホスホ（Ｐ）−Ｓｍａｄ２）の下流標的と共に、評価した。図４Ｄの免疫ブロット（図４Ｅにおいて定量）は、２６４ＲＡＤ又はトラスツズマブ（ＴＲＡ）による３つの代表的なＢＴ−４７４異種移植片の処置が、有意にβ６の発現を低減し；併用療法は、β６の発現をほぼなくしたことを示す。併用療法はまた、トラスツズマブ単独で観察されたＨＥＲ２、ＨＥＲ３、Ｔ−Ｓｍａｄ２、ＰＳｍａｄ２及びＴ−Ａｋｔ２の発現の低減も増強し、これは、併用処置で認められた抗腫瘍性の増強と一致している。
【０２４７】
ＨＥＲ２−１８異種移植片を同じ分析に付した（図４Ｆ及びＧ）。やはり、β６レベルは、αＶβ６遮断抗体２６４ＲＡＤ及び併用処置によって有意に低下した。Ｐ−ＨＥＲ２、Ｔ−ＨＥＲ３、Ｐ−ＨＥＲ３、Ｔ−Ｓｍａｄ２及びＴ−Ａｋｔ２における統計的に有意な低減は、併用療法後にしか認められなかった。以前観察されたように、トラスツズマブで処置したＨＥＲ２−１８腫瘍においてＴ−ＨＥＲ２レベルは増加した。２６４ＲＡＤによるαＶβ６の遮断もまた、ＨＥＲ２発現を増大したことを観察した。しかし、併用抗体療法は、低下したＰ−ＨＥＲ２レベルによって認められるように、ＨＥＲ２を介したシグナル伝達を有意に阻害した。
【０２４８】
実施例７．αＶβ６の抗体遮断は、トラスツズマブの効力を改善し、トラスツズマブ耐性モデルにおいて生存を延長する。
トラスツズマブ耐性は、重要な臨床上の障害を呈することから、さらにＨＥＲ２−１８トラスツズマブ耐性モデルにおいて、併用療法の抗腫瘍性の増強を調べた。初期の実験では、小さな腫瘍に対する療法の効果を評価した。皮下異種移植片を触知可能な大きさ（１０〜２０ｍｍ3）に到達させた後、６週間にわたる抗体療法を開始した。２６４ＲＡＤはＩｇＧと比較して増殖を７０％超低減し、これは、トラスツズマブを用いて認められた低減と均等であった（いずれもＰ＜０．００１）（図５Ａ）。さらに印象的なことには、αＶβ６とＨＥＲ２の組み合わせ遮断によって、全処置マウスにおけるＨＥＲ２−１８腫瘍が根絶された。
【０２４９】
次に、併用療法が、より大きな異種移植片に対しても同様に有効であるか否かを決定した。腫瘍を２００ｍｍ３に到達させた後、療法を開始した。図５Ｂは、急速に進行したＩｇＧと比較して、２６４ＲＡＤ又はトラスツズマブのいずれかによる単独療法が、この場合も同等程度で増殖を緩徐にし（それぞれＰ＝０．００１９及びＰ＝０．００２２）、これもまた、併用療法によって有意に低減された（それぞれＰ＝０．０１３５及びＰ＝０．０２２３）。併用療法は、腫瘍の成長を完全に抑制し（ＩｇＧと比較して、Ｐ＜０．０００１）、そのサイズは５０日間不変のままであった。これらのマウスを、それらの腫瘍が許容される（Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ規定に従い）最大サイズに達するまで進行させ、その時点で死なせた。図５Ｃは、ＩｇＧと比較して、２６４ＲＡＤ又はトラスツズマブによる単独療法が、生存率を有意に高め（それぞれＰ＝０．０００７及びＰ＝０．０１８）、併用療法は、さらに有効であった（Ｐ＜０．０００１）ことを示す。実際に、併用療法は、単独療法より有意に優れていた（２６４ＲＡＤ及びトラスツズマブと比較して、それぞれＰ＝０．００３９及びＰ＝０．０３９３）。このように、αＶβ６の２６４ＲＡＤ遮断は、乳癌増殖を抑制し、トラスツズマブ感受性及び耐性乳癌異種移植片の両方でトラスツズマブの治療能力を増強した。
【０２５０】
実施例８．長期２６４ＲＡＤ及びトラスツズマブ療法に対する乳房腫瘍の分子応答。
単独療法が、併用療法に類似の分子機構を介して作動していることを確認するために、６週間の処置後に腫瘍組織を採取し、溶解させ（図５Ａから）、同じパネルのタンパク質について免疫ブロッティングした。併用処置した異種移植片は、この試験の早期に根絶されたため、併用療法の分析は一切実施することができなかった。図５Ｄ及びＥは、６週間にわたる２６４ＲＡＤ及びトラスツズマブ単独療法が、β６タンパク質、Ｔ−ＨＥＲ２、Ｐ−ＨＥＲ２、Ｔ−ＨＥＲ３、Ｐ−ＨＥＲ３、及びＴ−Ａｋｔ２の発現を有意に低減し、２週間の併用療法の応答に類似していた（図４Ｄ〜Ｇ）。
【０２５１】
Ｔ−Ｓｍａｄ２及びＰ−Ｓｍａｄ２の低下によって測定されるＴＧＦβシグナル伝達の抑制は、２６４ＲＡＤ又はトラスツズマブいずれかによる２週間の単独療法後に（トラスツズマブ感受性）ＢＴ−４７４細胞に起こり、この低下は、併用療法によってさらに低減された（図４Ｄ）。対照的に、ＨＥＲ２−１８の２週間の抗体療法後のＴ−Ｓｍａｄ２及びＰ−Ｓｍａｄ２には、限定的な変化があるか、又は全く変化はなかった。しかし、６週間の単独療法の後、Ｔ−Ｓｍａｄ２及びＰＳｍａｄ２レベルは、ＨＥＲ２−１８腫瘍において有意に低下した（図５Ｄ及びＥ）。
【０２５２】
これらのデータを支持して、ＨＥＲ２−１８異種移植片におけるβ６発現の免疫組織化学的分析（図５Ｆ）もまた、β６発現がほとんど根絶された２週間の併用療法と比較して、単独療法によって６週間後、β６発現の低減を示した。
【０２５３】
さらに、このことは、ＨＥＲ２−１８、ＣＡ１ａ及びＢＴ−４７４細胞におけるマトリゲル浸潤アッセイによって支持され、ここで、ＴＧＦ（３ＲＩＩに対するｓｉＲＮＡ又はＴＧＦβに対する抗体（結果が類似のため、抗体データは示していない）で処置した細胞は、浸潤を抑制することができず、また２６４ＲＡＤは、ＴＧＦβの存在及び非存在下で、同様の程度まで浸潤を阻害することができた（図８）。
【０２５４】
実施例９．考察
この試験は、結論として、以下のことを示している：１）乳癌におけるインテグリンαｖβ６の上方制御は、患者の低生存率を予測させる予後因子であり、これは、遠隔転移の発生と関連している（Ｐ＝０．０３）こと、２）αｖβ６及びＨＥＲ２の同時上方制御は、現在まで見出されている、より不良な予後の乳癌の亜群の１つを呈示すること、並びに３）これらの臨床的知見についての生物学的解釈は、αｖβ６及びＨＥＲ２が協同し、インテグリンαｖβ６が、ＨＥＲ２促進癌の浸潤挙動を媒介することである。従って、本発明者らのデータは、αｖβ６発現のための生検の試験が、乳癌を有する女性をこの新たな「非常に高い」リスクαｖβ６陽性／ＨＥＲ２＋亜群に階層化する常用的な免疫病理学的手順となるはずであるという提案を支持する。この階層化が重要であるのは、本発明者らの試験もまた、この非常に高いリスク亜群のための有望な治療戦略を示唆するからである。
【０２５５】
１９８８年のその導入以来、抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブは、早期乳癌の補助療法として、又は転移乳癌の化学療法との併用のいずれかで、ＨＥＲ２＋乳癌を有する女性のための第一選択療法となっている（５、３０）。このように、２２５，０００人を超える女性が米国で乳癌を発症した２０１２年に、２０〜２５％が、ＨＥＲ２過剰発現を有したと考えられ（ＮＩＨ統計）、トラスツズマブ療法を受けた可能性がある。しかし、これらの女性の７０％は、トラスツズマブに対して耐性を発生することになるか、又は既存の耐性を有しており（７）、これは、最大３９，３７５人の米国女性が、具体的な治療法が存在しないＨＥＲ２＋乳癌を発症し得ることを意味する。本発明者らのデータは、トラスツズマブ耐性疾患を有する女性の４０％超が、高レベルのαｖβ６も発現する可能性があることを示している。本発明者らは、これらの女性のαｖβ６の抗体ターゲティングが、治療の一選択肢を提供し得ることを示し、本発明者らの前臨床試験がこの提案を支持している。本発明者らのデータは、トラスツズマブ感受性及びトラスツズマブ耐性ＨＥＲ２＋過剰発現ヒト乳癌異種移植片の両方において、αｖβ６及びＨＥＲ２の同時抗体ターゲティング（トラスツズマブによる）が、トラスツズマブ単独の治療効果を有意に改善すると共に、生存期間を有意に延長することを明らかにしている。かかる応答を臨床的に早急に達成する必要がある。
【０２５６】
抗体遮断が、いかにして乳癌増殖を抑制するか、又はさらに低減することができるかについての分子機構は、一部に、腫瘍表現型をより低いリスク亜群に変更することを含む。このように、抗体で処置した腫瘍には、αｖβ６、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３（それらの上方制御が、乳癌を促進し、生存率を低下させ、従って、転移を駆動する３つの受容体）の発現の一貫した下方制御がある。αｖβ６又はＨＥＲ２いずれかをターゲティングする単独療法であってもαｖβ６発現を抑制することができ、これは、上記２つの分子が、乳癌において同時調節されていることをさらに証明するものである。ＨＥＲ２の下方制御は、トラスツズマブ感受性株ＢＴ−４７４における２週間の単独抗体療法によって達成されたが、トラスツズマブ耐性株ＨＥＲ２−１８では達成されなかった。しかし、６週間の単独療法は、ＨＥＲ２−１８トラスツズマブ耐性腫瘍においてαＶβ６  ＨＥＲ２及びＨＥＲ３の発現を排除した。
【０２５７】
ＢＴ−４７４又はＨＥＲ２−１８腫瘍モデルのいずれかで、αｖβ６又はＨＥＲ２を抗体ターゲティング後、αｖβ６及び／又はＨＥＲ２の消失は、腫瘍増殖を有意に緩徐にしたが、αｖβ６／ＨＥＲ２組み合わせターゲティングが達成したように、腫瘍増殖を停止若しくは低減しなかった。そのため、本発明者らは、αｖβ６及びＨＥＲ２挙動に関与するシグナル伝達経路を調べた。
【０２５８】
試験から、トラスツズマブが、ＨＥＲ２分解（３１）及びＰＩ３−Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達の下方制御（３２）を促進することによって、ＨＥＲ２＋細胞における抗増殖作用を媒介することが判明し、データは、ここで、ＨＥＲ２のトラスツズマブ遮断だけではなく、２６４ＲＡＤを用いたαＶβ６遮断によっても、インビボで観察されたものと一致する。本発明者らは、その細胞株が、Ａｋｔ１及びＡｋｔ２を発現したが、Ａｋｔ３は発現しなかったことを見出した（データは示していない）。さらに、インビトロで、Ａｋｔ２のｓｉＲＮＡ下方制御が、ＢＴ−４７４、ＨＥＲ２−１８及びＣＡ１ａ細胞株の浸潤を抑制したが、Ａｋｔ１の場合は抑制しなかった（図９）。従って、Ａｋｔ２タンパク質について抗体処置した腫瘍を分析し、２週間の併用療法が、Ａｋｔ２発現を有意に低減したのに対し、単独療法は、ほとんど効果がなかったことを明らかにした。このように、３／３乳癌細胞株における浸潤に不可欠なＡｋｔアイソフォームであるＡｋｔ２の消失は、単独療法と比較して、αｖβ６及びＨＥＲ２組み合わせターゲティングのインビボ効力の改善と相関している。
【０２５９】
本発明者らは、αｖβ６が潜伏ＴＧＦβを活性化し得ることから、ＴＧＦβも調べた（１６）。さらに、活性化ＴＧＦβは、遊走、浸潤及び転移を増大することによって、ＨＥＲ２腫瘍形成能を促進する（１０、１１、１２、３３）。この場合も、併用療法のみが、ＢＴ−４７４腫瘍における全（Ｔ）及び活性化（Ｐ）−Ｓｍａｄ２を有意に低減したのに対し、単独療法は有意に有効ではなかった。対照的に、トラスツズマブ耐性腫瘍の場合には、併用療法後に、ＴＧＦβシグナル伝達の低減は中程度であったか、又はＴ−Ｓｍａｄ２の最低限の有意な低減しか観察されなかった。従って、２週間の抗体療法後、ＴＧＦβシグナル伝達の下方制御よりもむしろＡｋｔ２の下方制御の方が、併用療法で認められる腫瘍抑制の増強と、より強力に相関している。しかし、これは、αｖβ６の抗体遮断によるＴＧＦβシグナル伝達の消失が、腫瘍療法、及び６週間の療法後に認められた全生存率に寄与する可能性を否定するものではない。
【０２６０】
まとめると、本発明者らは、αｖβ６の高い発現によって、有意に危険なタイプの疾患を有する女性が識別されるため、αｖβ６発現に関する乳癌の検査が標準慣行になるべきであると提案する。これは、特に、現在までに見出されている予後の不良な乳癌群の１つであるＨＥＲ２／αｖβ６二重陽性癌を有する女性の４０％について言えることである。乳癌に関してαｖβ６発現の常用的な決定では、治療介入を必要とする高リスクカテゴリーに女性を階層化する。さらに、本発明者らのデータは、αｖβ６の抗体遮断が、かかる女性に（恐らく、トラスツズマブ耐性疾患を有する女性であっても）有効な別の療法を提供し得ることも明らかにしている。ヒト（２６４ＲＡＤ（２９）及びヒト化（ＳＴＸ−１００（３６））αｖβ６遮断抗体が、ヒトへの用途のために開発中であるという事実は、乳癌のαｖβ６標的化療法が実現可能であり、近い将来重要な検討事項とすべきであることを示している。
【０２６１】
実施例１０．αＶβ６結合剤：免疫及び力価決定
免疫
可溶性αＶβ６及び細胞結合αＶβ６（細胞表面にヒトαＶβ６を発現するＣＨＯ形質転換体）をそれぞれ用いて、免疫を実施することができた。ＣＨＯ形質転換体の作製のために、ヒト完全長αＶβ６ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３発現ベクターに挿入した。ＣＨＯ細胞をエレクトロポレーションにより一過的にトランスフェクトした。免疫原として好適なレベルの細胞表面上のヒトαＶβ６の発現を蛍光活性化セルソータ（ＦＡＣＳ）分析により確認した。キャンペーン（Ｃａｍｐａｉｇｎ）１については１０μｇ／マウスの可溶性タンパク質を、また、キャンペーン２については３×１０6細胞／マウスのトランスフェクトＣＨＯ細胞を、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）における初回免疫に使用した。これは、以下に開示されている方法に従った：１９９６年１２月３日に出願された米国特許出願第０８／７５９，６２０号明細書、並びに１９９８年６月１１日に公開された国際特許出願国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、及び２０００年１２月２１日に公開された国際公開第００／７６３１０号パンフレット（これらの開示内容は、本明細書によって参照により援用される）。初回免疫に続いて、５μｇ／マウスの１３回の追加免疫を群１及び２に投与し（可溶性抗原）、１．５×１０6細胞／マウスの９回の追加免疫を群３及び４に投与した（細胞結合抗原）。免疫プログラムを表２にまとめる。
【０２６２】
【表２】
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【０２６３】
力価による採取のための動物の選択
可溶性抗原で免疫したマウスについて、ヒトαＶβ６に対する抗体の力価をＥＬＩＳＡアッセイにより試験した。天然（細胞結合）抗原で免疫したマウスについての抗体の力価をＦＡＣＳにより試験した。ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析から、αＶβ６に特異的であると思われるマウスが何匹かいたことがわかった。そのため、免疫プログラムの終了時に、２０匹のマウスを採取のために選択して、次の実施例に記載するように、免疫したマウスの脾臓及びリンパ節からリンパ球を単離した。
【０２６４】
実施例１１．リンパ球の回収とＢ細胞単離
免疫マウスを頚椎脱臼により死なせ、各コホートから流入領域リンパ節を採取して、プールした。ＤＭＥＭ中での粉砕によりリンパ球を解離させて、組織から細胞を放出させ、細胞をＤＭＥＭ中に懸濁させた。ＩｇＭ中での負の選択とＩｇＧに対する正の選択によってＢ細胞を濃縮した。細胞を培養して、Ｂ細胞を増殖させ、抗体分泌形質細胞に分化させる。
【０２６５】
抗体分泌形質細胞を選択培地中で常用的に増殖させた。ヒトαＶβ６抗体を産生する可能性がある細胞から収集した完全な上清を、以下の実施例に詳述する次のスクリーニングアッセイに付した。
【０２６６】
実施例１２．細胞結合αＶβ６との結合
分泌した抗体とαＶβ６の結合を評価した。以下に説明するように、細胞結合αＶβ６との結合は、ＦＭＡＴマクロ共焦点スキャナーを用いて評価し、可溶性αＶβ６との結合は、ＥＬＩＳＡにより分析した。
【０２６７】
採取した細胞から収集した上清を試験して、αＶβ６を安定に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞に対する分泌抗体の結合を評価した。親２９３Ｆ細胞株を負の対照として用いた。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の細胞を、安定な形質転換体の場合には２５００細胞／ウェルの密度で、また親細胞の場合には２２，５００細胞／ウェルの密度で、３８４ウェルＦＭＡＴプレート中に５０μＬ／ウェルの容量で接種した後、細胞を３７℃で一晩インキュベートした。次に、１０μＬ／ウェルの上清を添加し、プレートを４℃で約１時間インキュベートした後、１０μＬ／ウェルの抗ヒトＩｇＧ−Ｃｙ５二次抗体を２．８μｇ／ｍｌの濃度（４００ｎｇ／ｍｌの最終濃度）で添加した。次に、プレートを４℃で約１時間インキュベートしてから、ＦＭＡＴマクロ共焦点スキャナー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて蛍光を読み取った。１１の抗体のＦＭＡＴ結果を表３にまとめる。
【０２６８】
さらに、可溶性αＶβ６への抗体の結合をＥＬＩＳＡにより分析した。Ｃｏｓｔａｒ培地結合９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒカタログ＃３３６８）を、総量５０μＬ／ウェルで、ＴＢＳ／１ｍＭ  ＭｇＣｌ2緩衝液中の濃度５μｇ／ｍｌのαＶβ６と一緒に、４℃で一晩インキュベートすることによりコーティングした。次に、プレートをＴＢＳ／１ｍＭ  ＭｇＣｌ2緩衝液で洗浄した後、２５０μＬの１×ＰＢＳ／１％ミルクを用い、室温で３０分間ブロックした。１０μＬの上清を４０μＬのＴＢＳ／１ｍＭ  ＭｇＣｌ2／１％ミルクに添加して、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ＴＢＳ／１ｍＭ  ＭｇＣｌ2／１％ミルク中０．４００ｎｇ／ｍｌのヤギ−抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃペルオキシダーゼと一緒にインキュベートし、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、１−Ｓｔｅｐ  ＴＭＢ基質を用いて展開させた。抗体の１つについてのＥＬＩＳＡ結果を表３に示す。
【０２６９】
【表３】
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【０２７０】
実施例１３．細胞接着の阻害
様々な抗体を含有する上清の相対効力を決定するために、αＶβ６陽性ＨＴ２９細胞のＴＧＦβＬＡＰ媒介接着を阻害する能力について抗体を評価した。プレートを１０μｇ／ｍｌのＴＧＦβＬＡＰで一晩コーティングした後、アッセイ前の１時間にわたり３％のＢＳＡ／ＰＢＳでプレブロックした。次に、細胞をペレット化してからＨＢＢＳで２回洗浄した後、細胞を適切な濃度のＨＢＳＳ中に再懸濁させた。Ｖ字底プレートにおいて、適切な抗体の存在下、細胞を４℃で３０分間インキュベートした。抗原コーティング溶液を除去した後、１００μＬの３％ＢＳＡを用い、プレートを室温で１時間ブロックした。プレートをＰＢＳ又はＨＢＳＳで２回洗浄した後、細胞−抗体混合物を、コーティング済プレートに移してから、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、コーティング済プレート上の細胞を温ＨＢＳＳで４回洗浄した後、細胞を−８０℃で１時間凍結させた。細胞を室温で１時間解凍させた後、１００μＬのＣｙＱｕａｎｔ色素／溶解バッファー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を各ウェルに製造者の指示に従い添加した。４８５ｎｍの励起波長及び５３０ｎｍの発光波長で蛍光を読み取った。１２の抗体についての結果を表４にまとめる。表示する抗体の効力は、アッセイにおいて得ることができる最大及び最小接着値を表すのに用いたプレートのコーティング及び非コーティング対照に対し、６２％阻害から１００％超阻害までの範囲であった。
【０２７１】
【表４】
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【０２７２】
実施例１４．マカク（ｍａｃａｑｕｅ）αＶβ６及びヒトαＶとの交差反応性
マカクαＶβ６に対する抗体含有上清の交差反応性を、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｕｌｇｕｓ）αＶ及びカニクイザルβ６で一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞のＦＡＣＳ分析を用いて、上清について試験した。
【０２７３】
また、ヒトαＶに対する交差反応性も試験した。このアッセイの場合、αＶβ３及びαＶβ５を発現するが、αＶβ６は発現しない親Ａ３７５Ｍ細胞のＦＡＣＳ分析を用いて、上清について試験した。このスクリーンは、抗体が、β６鎖又はαＶと組み合わせたβ６鎖のいずれかを特異的に認識していることを示すように設計した。ヒトαＶアッセイは、マカクαＶβ６交差反応性スクリーンと同時に実施した。
【０２７４】
アッセイは、以下のように実施した。約７５％密集のＡ３７５Ｍ細胞を次のようにＣＦＳＥ細胞内色素で標識した：ファルコンチューブ中で細胞（１ウェル当たり２５０，０００〜３００，０００細胞に相当）を解離させてペレット化し、次いで、２５０，０００細胞につき１００μＬの最終容量までＦＡＣＳ緩衝液中の０．１２５μＭ  ＣＦＳＥ中に再懸濁させた後、３７℃で５分間インキュベートする。次に、細胞をペレット化し、上清を廃棄して、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた後、３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、１ウェル当たり最終容量１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。
【０２７５】
ＨＥＫ２９３細胞をカニクイザルαＶ及びカニクイザルβ６で一過的にトランスフェクトした。４８時間後、細胞を収集し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させて、１００μＬ中約５０，０００細胞の最終濃度を達成した。
【０２７６】
総計約１００，０００個の細胞（ＣＦＳＥ標識Ａ３７５Ｍ細胞とトランスフェクト済２９３細胞との５０：５０混合物を含む）を以下のような各反応に使用した。１００μＬのＣＦＳＥ標識Ａ３７５Ｍ細胞と１００μＬの２９３細胞をＶ字底プレート中に分配した。プレート内の細胞を１５００ｒｐｍで３分間ペレット化した後、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。ペレット化ステップを反復し、ＦＡＣＳ緩衝液上清を除去した。採取した抗体含有上清、又は対照一次抗体を５０μＬの容量に添加し、細胞を再懸濁させた。一次抗体対照は、マウスαＶβ６（Ｃａｔ♯ＭＡＢ２０７７ｚ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）及び抗αＶ組換え体であった。プレートを氷上で４５分間インキュベートした後、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加して一次抗体を希釈した。次に、１５００ｒｐｍで３分間遠心分離することにより、細胞をペレット化した後、ペレットを１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。ペレット化ステップを反復し、ＦＡＣＳ緩衝液上清を除去した。続いて、細胞を適切な二次抗体（５μｇ／ｍｌ）中に７ＡＡＤ色素（１０μｇ／ｍｌ）と一緒に再懸濁させて、氷上で７分間染色した。次に、１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加して、細胞を１５００ｒｐｍで３分間ペレット化した後、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄して、ペレット化し、次いで、２５０μＬの緩衝液中に再懸濁させてから、ＦＡＣＳチューブに添加した。ハイスループットＦＡＣＳ機で試料を分析し、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェアを用いて分析した。
【０２７７】
１２の抗体についての結果を表５にまとめるが、これらの結果は、表示した抗体が、マカクαＶβ６に特異的に結合することができたが、親Ａ３７５Ｍ細胞上のヒトαＶには非特異的に結合することができなかったことを明らかにしている。
【０２７８】
【表５】
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【０２７９】
実施例１５．αＶβ６特異的溶血プラークアッセイ
組換え抗体の生産のために、各採取物から抗体分泌形質細胞を選択した。ここでは、αＶβ６に対する抗体を発現する単一形質細胞を見出すために、蛍光プラークアッセイを使用した。続いて、次の実施例に説明するように、単一細胞を逆転写及びポリメラーゼ連鎖反応に付して、初期抗体特異性をコードした可変重鎖及び可変軽鎖をレスキュー及び増幅した。αＶβ６特異的溶血プラークアッセイを実施するのに必要ないくつかの専用試薬及び材料の調製について以下に記載する。
【０２８０】
ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）のビオチン標識。ＳＲＢＣは、２５％ストックとしてＲＭＰＩ培地中に保存した。ストックの１．０ｍＬを１５ｍＬファルコンチューブ中に等分し、細胞を沈降させた後、上清を除去することにより、２５０μｌのＳＲＢＣ沈渣（ｐａｃｋｅｄ  ｃｅｌｌ）ペレットを取得した。次に、細胞ペレットを５０ｍＬチューブ中の４．７５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ８．６）に再懸濁させた。個別の５０ｍＬチューブ中で、２．５ｍｇのＳｕｌｆｏ−ＮＨＳビオチンを４５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ８．６）に添加した。ビオチンが完全に溶解したら、５ｍＬのＳＲＢＣを添加し、チューブを室温で１時間回転させた。ＳＲＢＣを３０００ｇで５分間遠心分離した。上清を取り除き、２５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を洗浄液として添加した。洗浄サイクルを３回反復した後、４．７５ｍＬの免疫細胞培地（１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０）を２５０μｌのビオチン標識ＳＲＢＣ（Ｂ−ＳＲＢＣ）ペレットに添加して、Ｂ−ＳＲＢＣ（５％Ｂ−ＳＲＢＣストック）を穏やかに再懸濁させた。ストックは、必要になるまで４℃で保存した。
【０２８１】
Ｂ−ＳＲＢＣのストレプトアビジン（ＳＡ）コーティング。１ｍＬの５％Ｂ−ＳＲＢＣストックを新しいエッペンドルフチューブ中に移した。Ｂ−ＳＲＢＣ細胞を微量遠心管中で、８０００ｒｐｍ（６８００ｒｃｆ）のパルススピンによりペレット化した。続いて、上清を取り除き、ペレットを１．０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に再懸濁させ、遠心分離を反復した。洗浄サイクルを２回反復した後、Ｂ−ＳＲＢＣペレットを１．０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に再懸濁させて、５％（ｖ／ｖ）の最終濃度をもたらした。１０μｌの１０ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）ストック溶液を添加した。チューブを混合してから室温で２０分間回転させた。洗浄ステップを反復し、ＳＡ−ＳＲＢＣを１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）（５％（ｖ／ｖ））中に再懸濁させた。
【０２８２】
ＳＡ−ＳＲＢＣのヒトαＶβ６コーティング。可溶性抗原（膜貫通ドメインを欠失する）をＳＲＢＣのコーティングに用いた。αＶβ６は、細胞表面上に二量体としてしか提示されないため、両方の鎖を使用した。ＳＡ−ＳＲＢＣを５０μｇ／ｍＬのビオチン標識αＶβ６でコーティングし、混合してから室温で２０分間回転した。前述のように、１．０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回ＳＲＢＣを洗浄した。ＡｇコーティングしたＳＲＢＣを、最終濃度５％（ｖ／ｖ）までＲＰＭＩ（＋１０％ＦＣＳ）中で再懸濁させた。
【０２８３】
免疫蛍光（ＩＦ）によるαＶβ６−ＳＲＢＣの品質の決定。１０μｌの５％ＳＡ−ＳＲＢＣと１０μｌの５％ＡｇコーティングＳＲＢＣを各々、４０μｌのＰＢＳを含有する個別の新しい１．５ｍＬエッペドルフチューブに添加した。ヒト抗αＶβ６抗体をＳＲＢＣの各資料に５０μｇ／ｍＬで添加した。チューブを室温で２５分間回転させた後、細胞を１００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。細胞を５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁させてから、光安定性蛍光色素Ａｌｅｘａ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）に結合した２μｇ／ｍＬのＧｔ−抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体とインキュベートした。チューブを室温で２５分間回転させた後、１００μＬのＰＢＳで洗浄してから、１０μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。１０μｌの染色細胞を清浄な顕微鏡ガラススライド上に滴下し、ガラスカバーで覆い、蛍光の下で観察して、０〜４の任意の等級でスコアを付けることにより、単離した細胞の品質を評価した。
【０２８４】
形質細胞の調製。αＶβ６活性を中和するものとして事前に見出された単一Ｂ細胞培養ウェルの内容物（従って、目的の免疫グロブリンを分泌するＢ細胞クローンを含有する）を採取した。ウェル内に存在するＢ細胞培養物を３７℃のＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳの添加により回収した。細胞をピペットで再懸濁させ、新しい１．５ｍＬエッペドルフチューブに移した（最終容量約５００〜７００μｌ）。細胞を微量遠心管において１５００ｒｐｍ（２４０ｒｃｆ）で、室温にて２分間遠心分離した後、チューブを１８０°回転させてから、１５００ｒｐｍでさらに２分間遠心分離した。凍結培地を取り除いてから、免疫細胞を１００μＬのＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ）中で再懸濁させた後、遠心分離した。ＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ）による洗浄を反復し、６０μＬのＲＰＭＩ（ＦＣＳ）中で再懸濁させた後、使用の準備が整うまで氷上で保存した。
【０２８５】
溶血プラークアッセイの実施。６０μｌの免疫細胞の試料に、各々６０μｌのαＶβ６コーティングＳＲＢＣ（５％（ｖ／ｖ）ストック）、ＲＰＭＩ（ＦＣＳ）中に調製した４×モルモット補体（Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）ストック、及び４×増強血清ストック（ＲＰＭＩ（ＦＣＳ）中１：９００）を添加した。この混合物（３〜５μｌ）を１００ｎｍＦａｌｃｏｎ組織培養プレートからプラスチック製蓋に滴下し、その液滴を非希釈パラフィン油で被覆した。このスライドを３７℃で最小４５分間インキュベートした。
【０２８６】
プラークアッセイ結果の分析。ヒトαＶβ６の触媒ドメインによるヒツジ赤血球のコーティングは成功した。次に、これらのＡｇコーティングされた赤血球を用いて、以下の表６に示すウェルからの抗原特異的形質細胞を同定した。次に、顕微操作により、これらの細胞を単離した。抗原特異的形質細胞をレスキューする顕微操作の後、可変領域遺伝子をコード化する遺伝子を、次の実施例にさらに詳しく説明するように、単一形質細胞でのＲＴ−ＰＣＲによりレスキューした。
【０２８７】
【表６】
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【０２８８】
実施例１６．組換えタンパク質の単離
所望の単一形質細胞の単離後、ｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素ＰＣＲを実施して、各細胞により分泌された抗体の可変重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡを生成した。ヒト可変重鎖ｃＤＮＡを、ＰＣＲ中に添加した制限酵素で消化し、この反応の産物を、クローニングのための適合性オーバーハングを有するＩｇＧ２発現ベクター中にクローニングした。このベクターは、ヒトＩｇＧ２の定常ドメインをｐｃＤＮＡ３．１＋／Ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）の多重クローニング部位中にクローニングすることによって作製した。ヒト可変軽鎖ｃＤＮＡは、ＰＣＲ反応中に添加した制限酵素で消化し、この反応の産物を、クローニングのための適合性オーバーハングを有するＩｇκ又はＩｇλ発現ベクター中にクローニングした。このベクターは、ヒトＩｇＫ又はＩｇＬの定常ドメインをｐｃＤＮＡ３．１＋／Ｎｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の多重クローニング部位中にクローニングすることによって作製した。
【０２８９】
次に、重鎖及び軽鎖発現ベクターを、リポフェクタミンを用いて、７０％密集ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞の６０ｍｍディッシュ中にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞は、オリジナル形質細胞と同一の特異性を有する組換え抗体を２４〜７２時間にわたり分泌した。上清（３ｍＬ）をＨＥＫ２９３細胞から採取し、インタクトな抗体の分泌が、ヒトＩｇＧを特異的に検出するサンドイッチＥＬＩＳＡにより立証された。特異性は、ＥＬＩＳＡを用いて、αＶβ６への組換え抗体の結合により確認した。標的抗原に結合することができるレスキューされた抗体分泌クローンを表７にまとめる。
【０２９０】
【表７】
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【０２９１】
実施例１７．組換え抗体の精製
抗αＶβ６抗体のより大きなスケールの生産のために、重鎖及び軽鎖発現ベクター（各鎖２．５μｇ／ディッシュ）を、７０％密集のＨＥＫ２９３細胞を含む１０個の１００ｍｍディッシュ中にリポフェクトした。トランスフェクトした細胞を３７℃で４日間インキュベートし、上清（６ｍＬ）を採取し、６ｍＬの新鮮な培地に取り換えた。７日目に、上清を除去し、初期採取物（１０プレートから総計１２０ｍＬ）と一緒にプールした。Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）アフィニティクロマトグラフィーを用いて、抗体を上清から精製した（１ｍＬ）。抗体を５００μｌの０．１ＭグリシンｐＨ２．５を含むＰｒｏｔｅｉｎ−Ａカラムから溶離した。溶離物をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で透析した後、濾過滅菌した。抗体を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析することによって、純度及び収率を評価した。２８０ｎｍでの光学密度を測定することにより、タンパク質濃度を決定した。
【０２９２】
実施例１８．αＶβ６抗体の構造分析
抗体の可変重鎖及び可変軽鎖をシークエンシングして、それらのＤＮＡ配列を決定した。抗αＶβ６抗体についての完全な配列情報は、各γ及びκ／λ鎖組み合わせについて、ヌクレオチド及びアミノ酸の配列表に記載する。可変重鎖配列を分析して、ＶＨファミリー、Ｄ領域配列及びＪ領域配列を決定した。次に、一次アミノ酸配列を決定するために配列を翻訳して、生殖系列ＶＨ、Ｄ及びＪ領域配列と比較することにより、体細胞高頻度突然変異を評価した。
【０２９３】
表８は、抗体重鎖領域をそのコグネイト生殖系列重鎖領域と比較する表である。表９は、抗体κ又はλ軽鎖領域をそのコグネイト生殖系列軽鎖領域と比較する表である。
【０２９４】
免疫グロブリン鎖の可変（Ｖ）領域は、複数の生殖系列ＤＮＡセグメントによりコードされ、これらのセグメントは、Ｂ細胞固体発生中に機能性可変領域（ＶHＤＪH又はＶKＪK）に結合する。αＶβ６に対する抗体応答の分子及び遺伝子多様性を詳細に試験した。これらのアッセイは、抗αＶβ６抗体に特異的ないくつかの点を明らかにした。
【０２９５】
シークエンシングデータによれば、ｓｃ２９８及びｓｃ３７４の重鎖の一次構造は、類似しているが、同一ではない。ｓｃ２５４は、他の２つと構造的に異なる。また、特定の抗体が、そのそれぞれの生殖系列配列とはアミノ酸レベルで異なる場合、抗体配列を突然変異させて生殖系列配列に戻すことができることも認識すべきである。かかる補正的突然変異は、標準的分子生物学的技術を用いて、１、２、３つ若しくはそれを超える位置、又は突然変異位置のいずれかの組み合わせで実施することができる。非限定的例として、表９は、ｓｃ２９８の軽鎖配列（配列番号４０）が、対応する生殖系列配列（配列番号６８）とは、ＦＲ１領域でＶａｌからＡｌａへの突然変異（突然変異１）により、ＣＤＲ１領域でＬｅｕからＡｌａへの突然変異（突然変異２）により、並びにＦＲ３領域でＡｓｎからＳｅｒへの突然変異により、異なることを示す。従って、突然変異１の部位に生殖系列配列を得るために、突然変異１を変更するように、ｓｃ２９８の軽鎖をコードするアミノ酸又はヌクレオチド配列を修飾することができる。さらに、突然変異２の部位に生殖系列配列を得るために、突然変異２を変更するように、ｍＡｂ  ｓｃ２９８の軽鎖をコードするアミノ酸又はヌクレオチド配列を修飾することができる。さらにまた、突然変異３の部位に生殖系列配列を得るために、突然変異３を変更するように、ｍＡｂ  ｓｃ２９８の軽鎖をコードするアミノ酸又はヌクレオチド配列を修飾することもできる。さらには、突然変異１、２及び３の部位に生殖系列配列を得るために、突然変異１、突然変異２及び突然変異３を変更するように、ｓｃ２９８の軽鎖をコードするアミノ酸又はヌクレオチド配列を修飾することもできる。またさらに、突然変異１、突然変異２及び突然変異３の任意の組み合わせを変更するように、ｓｃ２９８の軽鎖をコードするアミノ酸又はヌクレオチド配列を修飾することもできる。別の例では、ｓｃ２６４の重鎖配列（配列番号３０）は、その生殖系列配列（配列番号５５）と６１位で異なる。従って、生殖系列配列を得るために、ｓｃ２６４の重鎖をコードするアミノ酸又はヌクレオチド配列を、ＮからＹへと修飾することができる。以下の表１０〜１３は、ｓｃ１３３、ｓｃ１８８及びｓｃ２６４について、生殖系列からのかかる変異の位置を示す。各行は、太字で示す位置に生殖系列と非生殖系列残基のユニークな組み合わせを表示する。突然変異により生殖系列配列に戻すことができる抗体配列の具体的例として、以下のものが挙げられる：ｓｃ１３３（重鎖のアミノ酸７０のＬを突然変異により生殖系列アミノ酸Ｍに戻す）（本明細書では、ｓｃ１３３ＴＭＴと称する）；ｓｃ１３３（軽鎖のアミノ酸９３のＮを突然変異により生殖系列アミノ酸Ｄに戻す）（本明細書では、ｓｃ１３３ＷＤＳと称する）；及びｓｃ２６４（軽鎖のアミノ酸８４のＡを突然変異により生殖系列アミノ酸Ｄに戻す）（本明細書では、ｓｃ２６４ＡＤＹと称する）。
【０２９６】
一実施形態は、ＣＤＲ領域、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３におけるアミノ酸の１つ又は複数を修飾することを含む。一例では、本明細書に記載する抗体の重鎖のＣＤＲ３を修飾する。典型的に、アミノ酸は、類似の側鎖を有するアミノ酸で置換する（保存的アミノ酸置換）か、又はアラニン若しくはロイシンなどの任意の適切なアミノ酸で置換することもできる。一実施形態では、ｓｃ２６４ＣＤＲ３、ＶＡＴＧＲＧＤＹＨＦＹＡＭＤＶ（配列番号３０のアミノ酸残基１００〜１１４）を１つ又は複数のアミノ酸において修飾することができる。本出願人は、活性に有害な影響を及ぼすことなく、ＣＤＲ３領域を修飾することができることを既に立証している。すなわち、ＣＤＲ３領域の第２ＧがＡに対して置換されたｓｃ２６４ＲＡＤを参照されたい。ＣＤＲ３領域内の他の修飾も考慮される。別の実施形態では、ｓｃ１３３ＣＤＲ３領域、ＲＬＤＶを１つ又は複数のアミノ酸で修飾することができ、ＡをＬ及び／又はＡをＶに置換することを含む。アミノ酸を置換する手段は、当該技術分野において公知であり、部位指定突然変異誘発がある。
【０２９７】
別の実施形態は、抗体の異質性又はその結合の特異性に影響を与え得る配列の任意の構造的特質を置換することを含む。一例では、ｓｃ２６４の抗体は、ＣＤＲ３領域にＲＧＤ配列を有し、これは、交差反応性結合を引き起こし得る。従って、ＲＧＤ内のグリシン残基をアラニンで置換することができる（ｓｃ２６４ＲＡＤ）。
【０２９８】
【表８】
2019142876.tif 000012
2019142876.tif 000013
2019142876.tif 000014
【０２９９】
【表９】
2019142876.tif 000015
2019142876.tif 000016
2019142876.tif 000017
2019142876.tif 000018
【０３００】
【表１０】
2019142876.tif 000019
【０３０１】
【表１１】
2019142876.tif 000020
【０３０２】
【表１２】
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2019142876.tif 000023
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【０３０３】
【表１３】
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【０３０４】
実施例１９．αＶβ６抗体の効力決定
ＴＧＦβＬＡＰに対するＨＴ２９細胞の接着を阻止する能力に基づいて抗体を識別するために、次の接着アッセイを実施した。
【０３０５】
Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ（Ｎｕｎｃ）プレートを５０μＬの１０μｇ／ｍｌＴＧＦベータ１ＬＡＰ（ＴＧＦβＬＡＰ）で一晩コーティングした後、アッセイ前の１時間にわたり３％ＢＳＡ／ＰＢＳでプレブロックした。続いて、最適密度まで増殖したＨＴ２９細胞をペレット化し、ＨＢＢＳ（１％ＢＳＡを含み、且つＭｎ2+を含まない）で２回洗浄した後、細胞を１ウェル当たり３０，０００細胞でＨＢＢＳ中に再懸濁させた。コーティング液をプレートから除去してから、プレートを１００μＬの３％ＢＳＡで室温において１時間ブロックした後、ＰＢＳ中で２回洗浄した。
【０３０６】
抗体滴定物を最終容量３０μＬ中及び最終濃度の２倍の１：３段階希釈物において調製した。対照ウェル中のＰＢＳ濃度が、最も希薄な抗体ウェル中のＰＢＳ濃度と一致することを確実にするように注意した。３０μＬの細胞を各ウェルに添加し、Ｖ字底プレートにおいて、細胞を抗体の存在下、４℃で４０分間インキュベートした。細胞抗体混合物をコーティング済プレートに移して、プレートを３７℃で４０分間インキュベートした。続いて、コーティング済プレート上の細胞を温ＨＢＳＳで４回洗浄した後、細胞を−８０℃で１５分間凍結した。細胞を室温で解凍させた後、１００μＬのＣｙＱｕａｎｔ色素／溶解緩衝液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を製造者の指示に従って各ウェルに添加した。励起波長４８５ｎｍ及び発光波長５３０ｎｍで蛍光を読み取った。正及び負の対照ウェルにより決定される、アッセイにおいて可能な細胞接着の最大及び最小量に基づき、各ｍＡｂについての推定ＩＣ50値を計算した。１２の抗体についての結果を表１４にまとめる。
【０３０７】
【表１４】
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【０３０８】
実施例２０．競合アッセイ
抗体が、可溶性ＴＧＦβＬＡＰへのαＶβ６インテグリンの結合を特異的に阻止することができることを証明するために、精製済抗体を用いて、競合アッセイを実施することにより、抗体がαＶβ６に結合して、ＧＳＴ−ＬＡＰペプチドとのその結合を阻止する能力を測定した。
【０３０９】
培地結合９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ＃３３６８）を５０μＬ／ウェルのＰＢＳ及び０．０５％アジ化ナトリウム中の１０μｇ／ｍｌのＧＳＴ−ＬＡＰでコーティングしてから、４℃で一晩インキュベートした。続いて、プレートを３００μＬ／ウェルのアッセイ希釈剤（ＴＢＳ（５０ｍＭトリス、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭＧＣｌ2及び１ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ６．９中の１％ミルク）を用いて３回洗浄した後、３００μＬ／ウェルのＴＢＳ中の５％ミルクを用いて、プレートをブロックしてから、室温で３０分間インキュベートした。次に、ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ〜０．０１μｇ／ｍｌの範囲の１：３段階希釈物）をαＶβ６（０．０５％アジ化ナトリウムを含有するアッセイ希釈剤中の２５０ｎｇ／ｍｌ）と一緒に一晩インキュベートした。翌日、５０μＬ／ウェルのプレインキュベート一次抗体をＧＳＴ−ＬＡＰペプチドコーティング済プレートに移し、室温で１時間インキュベートした。続いて、３００μＬ／ウェルのアッセイ希釈剤を用いて、ウェルを３回洗浄した。次に、プレートに結合したαＶβ６の量を検出するために、ｍＡｂ２０７５（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）をアッセイ希釈剤（５０μＬ／ウェル）中濃度１μｇ／ｍｌで添加した後、室温で１時間インキュベートした。次いで、ウェルを３００μＬ／ウェルのアッセイ希釈剤を用いて３回洗浄した後、アッセイ希釈剤（５０μＬ／ウェル）中４００ｎｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧＦｃ−ペルオキシダーゼと一緒に室温で１時間インキュベートした。次に、ウェルを３００μＬ／ウェルのアッセイ希釈剤を用いて３回洗浄した後、総量５０μＬ／ウェルの１ステップＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ）を用いて展開させた。１５分後、展開反応を５０μＬ／ウェルの１Ｎ塩酸でクエンチングした。プレートを４５０ｎｍで読み取り、抗体の５つについての結果を図１４にまとめる。これは、抗体が、ＧＳＴ−ＬＡＰへのαＶβ６の結合を阻害することができたことを示している。
【０３１０】
実施例２１．αＶβ３又はαＶβ５インテグリンに対する交差反応性
抗体が、αＶβ６インテグリンのみに対して機能性であり、αＶβ３又はαＶβ５インテグリンに対してはそうではないことを証明するために、次のアッセイを実施して、これらの抗体が、オステオポンチンペプチドへのＡ３７５Ｍ細胞の接着を阻害する能力を試験した。
【０３１１】
アッセイプレートをオステオポンチンでコーティングした。オステオポンチンの２つの断片：ＯＰＮ１７−１６８及びＯＰＮ１７−３１４を用いた。アッセイプレートを３％ＢＳＡ／ＰＢＳでアッセイ前の１時間にわたりプレブロックした。Ａ３７５Ｍ細胞を培養フラスコから取り除き、ペレット化してから、１％ＢＳＡ並びに１ｍＭ  Ｃａ2+及び１ｍＭ  Ｍｎ2+を含有するＨＢＳＳで２回洗浄した。続いて、細胞を１ウェル当たり３０，０００細胞でＨＢＳＳ中に再懸濁させた。オステオポンチン断片を含有するコーティング液を除去してから、プレートを１００μＬの３％ＢＳＡで室温にて１時間ブロックした。コーティング済プレートを、１％ＢＳＡを含有するＨＢＳＳで２回洗浄した。抗体滴定物を最終容量３０μＬ中及び最終濃度の２倍の１：４段階希釈物において調製した。再懸濁させた細胞を、Ｖ字底プレート内の滴定した抗体を含むウェルに添加し、細胞及び抗体を４℃で４０分間コインキュベートした。次に、細胞−抗体混合物をコーティング済プレートに移した後、プレートを３７℃で４０分間インキュベートした。続いて、コーティング済プレート上の細胞を温ＨＢＳＳで４回洗浄した後、プレート内の細胞を−８０℃で１５分間凍結した。細胞を室温で解凍させた後、１００μＬのＣｙＱｕａｎｔ色素／溶解緩衝液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を製造者の指示に従って各ウェルに添加した。励起波長４８５ｎｍ及び発光波長５３０ｎｍで蛍光を読み取った。
【０３１２】
抗体の５つについての結果を表１５にまとめる。市販のαＶインテグリン特異的抗体をこのアッセイの正の対照として使用したところ、接着の約９０％阻害を呈示した。市販のαＶβ６抗体は、αＶβ３又はαＶβ５インテグリンに対する接着についての本アッセイで負の対照として使用した。抗体は全て濃度５μｇ／ｍｌで試験したが、いずれの試験抗体もαＶβ３又はαＶβ５インテグリンへの接着を阻止することはできなかった。
【０３１３】
【表１５】
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【０３１４】
実施例２２．α４β１インテグリンに対する交差反応性
抗体が、αＶβ６インテグリンのみに対して機能性であり、α４β１インテグリンに対してはそうではないことを証明するために、アッセイを実施して、これらの抗体が、フィブロネクチンのＣＳ−１ペプチドへのＪ６．７７細胞の接着を阻害する能力を試験した。Ｊ６．７７細胞を結合のために使用し、アッセイプレートをコーティングするためにフィブロネクチンのＣＳ−１ペプチドを用いた以外は、実施例２１に記載のようにアッセイを実施した。
【０３１５】
抗体の１１についての結果を表１６にまとめる。市販のβ１インテグリン特異的抗体をこのアッセイの正の対照として使用したところ、接着の９７％阻害を呈示した。市販のαＶβ６特異的抗体は、α４β１に対する接着についての本アッセイで負の対照として使用した。抗体は全て濃度５μｇ／ｍｌで使用したが、いずれの試験抗体もα４β１への接着を阻止することはできなかった。
【０３１６】
【表１６】
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【０３１７】
実施例２３．α５β１インテグリンに対する交差反応性
抗体が、αＶβ６インテグリンのみに対して機能性であり、α５β１インテグリンに対してはそうではないことを証明するために、接着アッセイを実施して、これらの抗体が、フィブロネクチンへのＫ５６２細胞の接着を阻害する能力を試験した。
【０３１８】
濃度１２．５μｇ／ｍＬのフィブロネクチンのＦＮ９−１０ペプチドでアッセイプレートをコーティングした。アッセイプレートを３％ＢＳＡ／ＰＢＳでアッセイ前の１時間にわたりプレブロックした。Ｋ５６２細胞を培養フラスコから取り除き、ペレット化してから、１％ＢＳＡ及び１ｍＭ  Ｍｎ2+を含有するＨＢＳＳで２回洗浄した。続いて、細胞を１ウェル当たり３０，０００細胞の濃度でＨＢＳＳ中に再懸濁させた。オステオポンチン断片を含有するコーティング液を除去してから、プレートを１００μＬの３％ＢＳＡで室温にて１時間ブロックした。コーティング済プレートを、１％ＢＳＡを含有するＨＢＳＳで２回洗浄した。抗体滴定物を最終容量３０μＬ中及び最終濃度の２倍の１：４段階希釈物において調製した。再懸濁させた細胞を、Ｖ字底プレート内の滴定抗体を含むウェルに添加し、細胞及び抗体を４℃で６０分間コインキュベートした。次に、細胞−抗体混合物をコーティング済プレートに移した後、プレートを３７℃で４０分間インキュベートした。続いて、コーティング済プレート上の細胞を温ＨＢＳＳで４回洗浄した後、プレート内の細胞を−８０℃で１５分間凍結した。細胞を室温で解凍させた後、１００μＬのＣｙＱｕａｎｔ色素／溶解緩衝液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を製造者の指示に従って各ウェルに添加した。励起波長４８５ｎｍ及び発光波長５３０ｎｍで蛍光を読み取った。
【０３１９】
抗体の５つについての結果を表１７にまとめる。試験抗体を正の対照としての市販のα５β１抗体、及び負の対照としてのαＶβ６特異的抗体と比較した。このアッセイで用いた５μｇ／ｍｌ濃度では、いずれの試験抗体も本アッセイでの接着を阻止することはできなかった。
【０３２０】
【表１７】
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【０３２１】
実施例２４．マウス及びカニクイザルαＶβ６インテグリンに対する交差反応性
抗体が、マウスαＶβ６又はカニクイザルαＶβ６に対する交差反応性を呈示するか否かを決定するために、次のアッセイを実施した。
【０３２２】
カニクイザル又はマウスαＶ、β６、若しくはαＶβ６で一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞についてのＦＡＣＳ分析を用いて、マカク及びマウスαＶβ６に対するｍＡｂの交差反応性を精製ｍＡｂについて試験した。形質転換から約４８時間後、細胞を収集し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させて、１００μＬ中約５０，０００細胞の最終濃度を達成した。
【０３２３】
総計約１００，０００個の細胞を以下のような各反応に使用した。２００μＬの２９３細胞をＶ字底プレート内に分配した。プレート内の細胞を１５００ｒｐｍで３分間ペレット化した後、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。ペレット化ステップを反復し、ＦＡＣＳ緩衝液の上清を除去した。精製済ｍＡｂ、又は対照一次抗体を５０μＬの容量に添加し、細胞を再懸濁させた。一次抗体対照は、マウスαＶβ６（Ｃａｔ♯ＭＡＢ２０７７ｚ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）及び抗αＶ及び抗β６組換え体であった。プレートを氷上で４５分間インキュベートした後、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加して一次抗体を希釈した。次に、１５００ｒｐｍで３分間遠心分離することにより、細胞をペレット化した後、ペレットを１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。ペレット化ステップを反復し、ＦＡＣＳ緩衝液の上清を除去した。続いて、細胞を適切な二次抗体（５μｇ／ｍｌ）中に７ＡＡＤ色素（１０μｇ／ｍｌ）と一緒に再懸濁させて、氷上で７分間染色した。次に、１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加して、細胞を１５００ｒｐｍで３分間ペレット化した後、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄して、ペレット化し、次いで、２５０μＬの緩衝液中に再懸濁させてから、ＦＡＣＳチューブに添加した。ハイスループットＦＡＣＳ機で試料を分析し、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェアを用いて分析した。
【０３２４】
結果を表１８にまとめるが、これらの結果は、ｍＡｂｓｃ１３３及びｍＡｂｓｃ１８８が、マウス及びカニクイザルαＶβ６及びβ６と明らかに交差反応性であることを示している。ｍＡｂｓｃ２５４は、明らかにβ６、αＶ及びαＶβ６と交差反応した。ｍＡｂｓｃ２６４及び２９８は、親細胞に対して高レベルの結合を有したため、種交差反応性を認めるのが困難であった。
【０３２５】
【表１８】
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【０３２６】
実施例２５．内在化アッセイ
ヒトαＶβ６を安定して発現したＫ５６２細胞株を用いて、抗体の内在化を試験した。精製抗体の内在化を、本アッセイでは内在化しなかった市販のαＶβ６と比較した。
【０３２７】
結果を表１９にまとめる。
【０３２８】
【表１９】
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【０３２９】
実施例２６．高解像能Ｂｉａｃｏｒｅ分析
ＣＭ５チップに固定化した抗体に結合する可溶性αＶβ６タンパク質を用いて、αＶβ６抗体の５つについて高解像能Ｂｉａｃｏｒｅ分析を実施することにより、可溶性抗原に対するそれらの親和性を推定した。
【０３３０】
Ｂｉａｃｏｒｅ分析は以下のように実施した。常用的アミンカップリングを用いて、２つのＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅチップに対する高密度ヤギαヒトＩｇＧ抗体表面を調製した。各ｍＡｂは、１００μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、及び１ｍＭ  ＣａＣｌ2を含有するガス抜きＨＢＳ−Ｐ泳動用緩衝液中に、約１μｇ／ｍＬの濃度まで希釈した。より正確には、ｍＡｂｓｃ１３３を０．９８μｇ／ｍＬまで、ｍＡｂｓｃ１８８を０．９６μｇ／ｍＬまで、ｍＡｂｓｃ２６４を０．９４μｇ／ｍＬまで、ｍＡｂｓｃ２５４．２を０．８７μｇ／ｍＬまで、ｍＡｂｓｃ２９８を１．６μｇ／ｍＬまで希釈した。次に、上に記載する濃度で、流速１０μＬ／分の個別のフローセルにわたって各ｍＡｂを捕獲することにより、捕獲レベルプロトコルを各ｍＡｂについて展開した。ｍＡｂｓｃ１３３、ｓｃ２９８、及びｓｃ２５４．２を３０秒間捕獲し、ｍＡｂｓｃ１８８及びｓｃ２６４は１分間捕獲した。続いて、５０μＬ／分で４分の洗浄ステップを実施することにより、ｍＡｂベースラインを安定化した。
【０３３１】
ｍＡｂｓｃ１３３、ｓｃ１８８、ｓｃ２６４、及びｓｃ２９８の場合、１１６〜３．６ｎＭ、またｍＡｂｓｃ２５４．２の場合には、２３３〜３．６ｎＭの濃度範囲で、各濃度範囲について２×段階希釈を用い、可溶性αＶβ６を４分間注射した。各抗原注射の後、１０分の解離を行った。抗原試料は、前述したようにＨＢＳ−Ｐランニングで調製した。試料は全て二重参照のために点在する複数のｍＡｂ捕獲／緩衝液注射サイクルを用いて、３回反復で無作為に注射した。流速１００μＬ／分での各サイクルの後、１つの１８秒パルスの１４６ｍＭリン酸（ｐＨ１．５）で、高密度ヤギαマウス抗体表面を再生した。全ての抗原注射サイクルについて、５０μＬ／分の流速を使用した。
【０３３２】
次に、データを、ＣＬＡＭＰを用いた質量移動の項を包含する１：１相互作用モデルにあてはめた。得られた結合定数を表２０に一覧で示す。ｍＡｂは、最も高い親和性から最も低い親和性の順に掲載する。
【０３３３】
【表２０】
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【０３３４】
実施例２７．ＦＡＣＳを用いた結合親和性分析
Ｂｉａｃｏｒｅに代わり、ＦＡＣＳ分析も用いて、ヒトαＶβ６抗原を安定して発現するＫ５６２細胞に対する抗体の１つの結合親和性を推定した。抗原の量を滴定して、結合曲線を作成し、抗原に対する結合親和性を推定した。
【０３３５】
αＶβ６を発現するＫ５６２細胞を、１ｍＭのＭｇＣｌ2及び１ｍＭのＣａＣｌ2を含有する濾過済ＨＢＳ緩衝液中に、濃度約６百万細胞／ｍＬで再懸濁させた。細胞を氷上に維持した。精製済ｍＡｂｓｃ１８８を、９６ウェルプレート内の１１ウェルにわたってＨＢＳ中に１：２の希釈係数により段階的に希釈した。各列の第１２ウェルは、緩衝液のみを含有した。滴定は３回反復して行った。最終容量が３００μＬ／ウェルとなり、各ウェルが約１２０，０００個の細胞を含有するように、追加のＨＢＳ及び細胞を各ウェルに添加した。ｍＡｂｓｃ１８８の最終分子濃度は、４．９〜０．０１９ｎＭであった。プレートをプレートシェーカ内に４℃で５時間配置して、プレートをスピンし、ＨＢＳで３回洗浄した後、２００μＬの１３１ｎＭＣｙ５ヤギα−ヒトポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、♯１０９−１７５−００８）を各ウェルに添加した。次に、プレートを４℃で４０分間振盪した後、再度ＨＢＳで３回スピン及び洗浄を行った。各ｍＡｂ濃度について２０，０００「イベント」の幾何平均蛍光（ＧＭＦ）を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ計器を用いて記録し、対応する３回反復滴定点を平均することにより、各ｍＡｂ濃度について１つのＧＭＦ点を取得した。Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔソフトウェアによる、分子ｍＡｂ濃度の関数としての平均ＧＭＦのプロットを、式：
【数１】
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を用いて非線形的にフィッティングした。
【０３３６】
前述の式において、Ｆ＝幾何平均蛍光、ＬT＝合計分子ｍＡｂ濃度、Ｐ’＝任意の蛍光単位を結合されたｍＡｂと関連付ける比例定数、Ｍ＝細胞のモル濃度、ｎ＝１細胞当たりの受容体の数、Ｂ＝バックグラウンドシグナル、及びＫD＝平衡解離定数である。ｍＡｂｓｃ１８８の場合、Ｐ’、ｎ、Ｂ、及びＫDは、非線形分析において自由に変動させるため、ＫDの推定値を取得した。
【０３３７】
得られたプロットをその非線形フィット（赤色の線）と共に図１５に示す。表２１は、ｍＡｂｓｃ１８８について得られたＫDを、フィットの９５％信頼区間と一緒に記載する。ｍＡｂｓｃ１８８に関するこれらの結果は、１タイプの受容体への結合を示している。
【０３３８】
ＦＡＣＳにより決定されるｓｃ１８８に対する結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅによって決定されたものより有意に堅固であった（実施例２６）。ｓｃ１８８のＫD値の差について少なくとも２つの解釈がある。第１の理由は、２つのアッセイが、測定に異なる形態の抗体を使用したことである。すなわち、Ｂｉａｃｏｒｅでは、可溶性抗体を使用し、ＦＡＣＳ分析では、細胞に結合した形態の抗体を使用した。第２の理由は、試験した抗体が、抗原の細胞結合形態に対して増殖したため、細胞結合抗体に結合するほど高い親和性で可溶性抗体に結合しない可能性があることである。
【０３３９】
【表２１】
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【０３４０】
実施例２８．ＣＤＣアッセイ
前述の実施例に記載した精製済抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプであり、エフェクター機能を有し得る。これらの抗体が、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介する能力を決定するために、αＶβ６を安定して発現する２９３細胞（２９３−１０Ａ１１）及び親２９３細胞（２９３Ｆ）を用いて、次のアッセイを実施した。
【０３４１】
細胞のカルセイン染色のために、ＨＴ２９、２９３−１０Ａ１１、及び２９３Ｆ細胞の各々約２５×１０ｅ６のアリコートを個別に３ｍｌの無血清ＲＰＭＩ培地中に再懸濁させた。次に、４５μＬの１ｍＭカルセインを各々３ｍｌの細胞試料に添加した後、試料を３７℃で４５分間インキュベートした。細胞を１２００×ＲＰＭで３分間遠心分離した後、上清を廃棄し、細胞をそれぞれの細胞株の培地に再懸濁させた。遠心分離ステップを反復し、細胞を再懸濁させることにより、５０μＬの培地中約１００，０００細胞の最終濃度を達成した。
【０３４２】
各抗体の段階的１：２希釈物をＶ字底９６ウェルプレートにおいて、５０μＬの容量中２０μｇ／ｍＬ〜０．６２５μｇ／ｍｌの範囲の濃度で調製した。次に、前述のように調製した１００，０００個の細胞を５０μＬの容量で抗体含有プレートに添加し、得られた混合物を氷上で２時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をペレット化し、上清を廃棄した。細胞を、１０％ヒト血清（ＡＢＩドナー＃２７）を含有する１００μＬのそれぞれの培地に再懸濁させてから、３７℃で３０分間インキュベートした。次に、細胞を遠心分離し、８０μＬの上清をＦＭＡＴプレートに移した。励起波長４８５ｎｍ及び発光波長５３０ｎｍを用いて、Ｔｅｃａｎリーダでプレートの読み取りを行った。
【０３４３】
結果を表１６Ａ〜３Ｅにまとめるが、これらの結果は、試験した各精製済抗体が、αＶβ６インテグリンを安定して発現する２９３細胞においてＣＤＣを媒介することができることを示している。
【０３４４】
実施例２９．部位指定突然変異誘発
免疫化（実施例１）から調製した抗体の１つ（ｓｃ２６４）は、ＴＧＦβＬＡＰ結合阻害アッセイにおいて、強力な機能性遮断活性をインビトロで示した（実施例４を参照）が、非αＶβ６発現細胞株に対する交差反応性を呈示した（実施例２４を参照）。この抗体、ｓｃ２６４は、ＣＤＲ３領域にＲＧＤ配列を有し、この配列が、交差反応性結合の原因であると推定される。従って、部位指定突然変異誘発を用いて、ＲＧＤ内のグリシン残基をアラニンで置換した（ｓｃ２６４ＲＡＤ）。
【０３４５】
二次抗体（ｓｃ１８８）は、ＦＲ３領域内にグリコシル化部位を有する。この部位を、ＮＬＴからＫＬＴへの置換を含む部位指定突然変異誘発によって排除した（ｓｃ１８８ＳＤＭ）。次に、実施例７及び８に記載するように、これら２つの抗体の突然変異形態を発現させて、精製した後、以下の実施例に説明するように、精製済抗体を分析した。
【０３４６】
実施例３０．突然変異型抗体の交差反応性結合を試験するための結合アッセイ
実施例２４で観察された交差反応性結合が、ｓｃ２６４の部位指定突然変異誘発によって低減したか否かを試験するために、結合アッセイを実施した。ｓｃ２６４からＲＧＤ部位を除去することにより、オリジナルの抗体と比較して、結合が低減するか否かを試験するために、抗体の結合を２９３Ｔ及び２９３Ｆ細胞株について分析した。
【０３４７】
２９３Ｔ及び２９３Ｆ細胞を収集後に沈降させてから、１％ＢＳＡと１ｍＭのＭｇＣｌ2及び１ｍＭのＣａＣｌ2を含有するＨＢＳＳ（洗浄緩衝液）中に再懸濁させて、少なくとも１５０，０００個の細胞が各反応で用いられるようにした。細胞をＶ字底９６ウェルプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）内の反応物の間で分割し、プレート内の細胞を１５００ｒｐｍで３分間ペレット化した後、ＨＢＳＳ上清を除去した。一次抗体を、５０μＬの容量中に、表１９に表示する濃度で添加した後、細胞を再懸濁させてから、氷上で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を１５００ｒｐｍで３分間の遠心分離によりペレット化し、１００μＬの洗浄緩衝液中に再懸濁させてから、再度ペレット化した。次に、細胞を１０μｇ／ｍｌの７ＡＡＤと一緒に２μｇ／ｍｌの適切な二次抗体中に再懸濁させてから、氷上で７分間染色した後、１５０μＬの洗浄緩衝液を添加し、細胞を１５００ｒｐｍで３分間ペレット化して、１％ＢＳＡを含む１００μＬのＨＢＳＳ中に再懸濁させた。ＨＴＳアタッチメント付きのＦＡＣＳ機で試料を読み取り、データをＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェアを用いて分析した。結果を表２２にまとめるが、データは、任意単位の幾何平均シフト値として表される。これらのデータは、試験した全ての濃度で、ｓｃ２６４ＲＡＤが、オリジナルｍＡｂｓｃ２６４と比較して、親２９３Ｔ細胞との有意に低い結合を有したことを明らかにしている。
【０３４８】
【表２２】
2019142876.tif 000035
【０３４９】
実施例３１．突然変異型抗体の効力分析
ＨＴ−２９細胞のＴＧＦβＬＡＰ媒介接着を阻害するのに必要な突然変異型αＶβ６抗体の濃度（ＩＣ50）を決定するために、以下のアッセイを実施した。
【０３５０】
Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ（Ｎｕｎｃ）プレートを５０μＬの１０μｇ／ｍｌのＴＧＦベータ１ＬＡＰ（ＴＧＦβＬＡＰ）で一晩コーティングした後、アッセイ前の１時間にわたり３％ＢＳＡ／ＰＢＳでプレブロックした。続いて、最適密度まで増殖させたＨＴ２９細胞をペレット化し、ＨＢＢＳ（１％ＢＳＡと１ｍＭのＭｇＣｌ2及び１ｍＭのＣａＣｌ2を含有）で２回洗浄した後、１ウェル当たり３０，０００細胞で、ＨＢＳＳに再懸濁させた。コーティング液をプレートから除去し、これらのプレートを１００μＬの３％ＢＳＡで室温にて１時間ブロックした後、ＰＢＳで２回洗浄した。
【０３５１】
抗体滴定物を最終容量３０μＬ中及び最終濃度の２倍で、１：４段階希釈物において調製した。対照ウェル中のＰＢＳ濃度が、最も希薄な抗体ウェル中のＰＢＳ濃度と一致することを確実にするように注意した。３０μＬの細胞を各ウェルに添加し、Ｖ字底プレートにおいて、細胞を抗体の存在下、４℃で４０分間インキュベートした。細胞抗体混合物をコーティング済プレートに移して、プレートを３７℃で４０分間インキュベートした。続いて、コーティング済プレート上の細胞を温ＨＢＳＳで４回洗浄した後、細胞を−８０℃で１５分間凍結した。細胞を室温で解凍させた後、１００μＬのＣｙＱｕａｎｔ色素／溶解緩衝液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を製造者の指示に従って各ウェルに添加した。励起波長４８５ｎｍ及び発光波長５３０ｎｍで蛍光を読み取った。１２の抗体についての結果を表２３にまとめるが、これらの結果は、突然変異型抗体のＩＣ50が、各オリジナル抗体のそれよりも一貫して低いことを明らかにしている。
【０３５２】
【表２３】
2019142876.tif 000036
【０３５３】
実施例３２．α４β１インテグリンに対する突然変異型抗体の交差反応性
変異型抗体が、αＶβ６インテグリンのみに対して機能性であり、α４β１インテグリンに対してはそうではないことを証明するために、アッセイを実施して、これらの抗体が、フィブロネクチンのＣＳ−１ペプチドへのＪ６．７７細胞の接着を阻害する能力を試験した。以下に説明するように、アッセイを実施した。
【０３５４】
アッセイプレートをフィブロネクチンのＣＳ−１ペプチドでコーティングした。アッセイプレートを３％ＢＳＡ／ＰＢＳでアッセイ前の１時間にわたりプレブロックした。Ｊ６．７７細胞を密集まで増殖させた後、培養フラスコから取り除き、ペレット化してから、ＨＢＳＳで３回洗浄した。続いて、細胞を１ウェル当たり３０，０００細胞の濃度でＨＢＳＳに再懸濁させた。フィブロネクチン断片を含有するコーティング液を除去してから、プレートを１００μＬの３％ＢＳＡで室温にて１時間ブロックした。コーティング済プレートをＨＢＳＳで３回洗浄した。抗体滴定物を最終容量３０μＬ中及び最終濃度の２倍で、１：４段階希釈物において調製した。再懸濁させた細胞を、Ｖ字底プレート内の滴定抗体を含有するウェルに添加し、細胞及び抗体を４℃で４０分間コインキュベートした。次に、細胞−抗体混合物をコーティング済プレートに移した後、プレートを３７℃で４０分間インキュベートした。続いて、コーティング済プレート上の細胞を温ＨＢＳＳで４回洗浄した後、プレート内の細胞を−８０℃で１５分間凍結した。細胞を室温で解凍させた後、１００μＬのＣｙＱｕａｎｔ色素／溶解緩衝液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を製造者の指示に従って各ウェルに添加した。励起波長４８５ｎｍ及び発光波長５３０ｎｍで蛍光を読み取った。
【０３５５】
２つの突然変異型抗体及びそれらの標識突然変異対応物についての結果を表２４にまとめる。市販のβ１インテグリン特異的抗体をこのアッセイの正の対照として使用したところ、接着の９５％阻害を呈示した。α４β１への接着についての本アッセイにおいて、市販のαＶβ６特異的抗体を負の対照として使用した。抗体は全て５μｇ／ｍｌで用いたが、いずれの試験抗体も、α４β１への接着を阻止することはできなかった。
【０３５６】
【表２４】
2019142876.tif 000037
【０３５７】
実施例３３．α５β１インテグリンに対する突然変異型抗体の交差反応性
変異型抗体が、αＶβ６インテグリンのみに対して機能性であり、α５β１インテグリンに対してはそうではないことを証明するために、アッセイを実施して、これらの抗体が、フィブロネクチンへのＫ５６２細胞の接着を阻害する能力を試験した。アッセイは、実施例１４に記載のように記載のように実施した。結果を表２５にまとめるが、これらの結果は、いずれの試験抗体も、α５β１への接着を阻止することはできなかったことを示している。
【０３５８】
【表２５】
2019142876.tif 000038
【０３５９】
実施例３４．マウス及びカニクイザルαＶβ６インテグリンに対する突然変異型抗体の交差反応性
突然変異型αＶβ６特異的抗体が、マウスαＶβ６又はカニクイザルαＶβ６に対する交差反応性を呈示するか否かを決定するために、次のアッセイを実施した。
【０３６０】
Ｋ５６２親細胞、又はカニクイザル又はマウスαＶβ６を発現するＫ５６２細胞を収集後に沈降させてから、１％ＢＳＡと１ｍＭのＣａＣｌ2及び１ｍＭのＭｇＣｌ2を含有するＨＢＳＳ（洗浄緩衝液）に再懸濁させて、少なくとも１５０，０００個の細胞が各反応で用いられるようにした。細胞をＶ字底９６ウェルプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）内の反応物の間で分割し、プレート内の細胞を１５００ｒｐｍで３分間ペレット化した後、ＨＢＳＳ上清を除去した。一次抗体を、５０μＬの容量中に添加した後、細胞を再懸濁させてから、氷上で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を１５００ｒｐｍで３分間の遠心分離によりペレット化し、１００μＬの洗浄緩衝液中に再懸濁させてから、再度ペレット化した。次に、細胞を１０μｇ／ｍｌの７ＡＡＡＤと一緒に、２μｇ／ｍｌの適切な二次抗体中に再懸濁させてから、氷上で７分間染色した後、１５０μＬの洗浄緩衝液を添加し、細胞を１５００ｒｐｍで３分間ペレット化して、１％ＢＳＡを含む１００μＬのＨＢＳＳに再懸濁させた。ＨＴＳアタッチメント付きＦＡＣＳ機で試料を読み取り、データをＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェアを用いて分析した。結果を表２６にまとめるが、データは、任意単位の幾何平均シフト値として表される。これらのデータは、試験した濃度で、ｓｃ２６４ＲＡＤ及びｓｃ１８８ＳＤＭが、マウスαＶβ６及びカニクイザルαＶβ６に対する交差反応性を呈示することを明らかにしている。
【０３６１】
【表２６】
2019142876.tif 000039
【０３６２】
実施例３５．内在化アッセイ
ヒトαＶβ６を安定して発現したＫ５６２細胞株を用いて、突然変異型抗体の内在化を試験した。アッセイは、実施例２４に記載したように実施した。精製抗体の内在化を、本アッセイでは内在化しなかった市販のαＶβ６と比較した。
【０３６３】
結果を表２７にまとめるが、これらの結果は、ｓｃ２６４ＲＡＤ突然変異型抗体が、非突然変異ｓｃ２６４よりも有意に低く内在化されることを明らかにしている。
【０３６４】
【表２７】
2019142876.tif 000040
【０３６５】
実施例３６．ＦＡＣＳを用いたｓｃ２６４ＲＡＤの結合親和性アッセイ
αＶβ６へのｓｃ２６４ＲＡＤの結合親和性アッセイを実施例１８に記載のように測定した。このアッセイの結果を表２８にまとめるが、これらの結果は、ｓｃ２６４ＲＡＤ抗体が、親和性＜５０ｐＭを有することを明らかにしている。
【０３６６】
【表２８】
2019142876.tif 000041
【０３６７】
実施例３７．ｓｃ２６４ＲＡＤとｓｃ２６４ＲＡＤ／ＡＤＹの活性の比較
ｓｃ２６４ＲＡＤ抗体及び２６４ＲＡＤの生殖系列（ＧＬ）形態（軽鎖に突然変異Ａ８４Ｄを含む）、ｓｃ２６４ＲＡＤ／ＡＤＹの活性をＤｅｔｒｏｉｔ−５６２接着アッセイで比較した。
【０３６８】
プレートを０．５μｇ／ｍｌのＧＳＴ−ＴＧＦ−ｂＬＡＰ融合タンパク質で、４℃にて一晩コーティングし、翌朝洗浄してから、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間ブロックした。続いて、Ｄｅｔｒｏｉｔ−５６２細胞（１ウェル当たり２５０００細胞）を、２ｍＭのＭｇＣｌ2を含有するＨＢＳＳにおいて３７℃で４５分間にわたりプレートに接着させた。４５分後、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、エタノール中に固定した。Ｈｏｅｓｃｈｔでの染色により細胞を視覚化し、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙｓｃａｎ  ＩＩで、１ウェル当たり結合した細胞の数を計数することにより定量した。
【０３６９】
図１８に示すデータから、ｓｃ２６４ＲＡＤ及びｓｃ２６４ＲＡＤ／ＡＤＹのいずれも、同様の活性を有すること、並びにαＶβ６機能を阻止する能力は修飾抗体においても維持されることがわかる。
【０３７０】
実施例３８．増殖試験
抗体２６４ＲＡＤ、１３３及び１８８ＳＤＭが、ａｖｂ６機能をインビボで阻止することを証明するために、各々をαＶβ６陽性腫瘍異種移植片の成長を阻害する能力について試験した。かかるモデルの１つは、αＶβ６を発現し、しかも皮下腫瘍異種移植片として増殖するＤｅｔｒｏｉｔ−５６２鼻咽頭細胞株である。
【０３７１】
Ｄｅｔｒｏｉｔ−５６２細胞を、Ｅａｒｌｅ’ｓ  ＢＳＳ及び２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕ＋１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ＋１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム＋１０％ＦＢＳを含むＥＭＥＭ中で培養した。細胞を採取し、５０％ＰＢＳ＋５０％マトリゲルに再懸濁させた。次に、懸濁液を、０．１ｍｌの容量中マウス１匹当たり５×１０-6で右脇腹に移植した。マウスは、６〜８週齢のＮＣＲ雌ヌードマウスであった。投与は、腫瘍が０．１ｃｍ３に達したとき開始し、試験期間中、週１回２０ｍｇ／ｋｇで投与した。
【０３７２】
３つの抗体は全て腫瘍増殖を阻害した（図１７を参照）。２６４ＲＡＤが最も有効であり、次に１３３、そして１８８であった。このデータは、抗体２６４ＲＡＤ、１３３及び１８８が、インビボで活性であり、増殖のためにαＶβ６シグナル伝達に依存的な腫瘍の成長を低減することができることをはっきりと示している。
【０３７３】
【表２９】
2019142876.tif 000042
【０３７４】
【表３０】
2019142876.tif 000043
【０３７５】
参考文献
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１６．Ｂａｔｅｓ  ＲＣ，Ｂｅｌｌｏｖｉｎ  Ｄｌ，Ｂｒｏｗｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｂｅｔａ６  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｏｆ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００５；１１５：３３９−３４７．
１７．Ｅｌａｙａｄｉ  ＡＮ，Ｓａｍｌｉ  ＫＮ，Ｐｒｕｄｋｉｎ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａｖｂｅｔａ６  ａｓ  ａ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｎｏｎｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；６７：５８８９−５８９５．
１８．Ｂｒｅｕｓｓ  ＪＭ，Ｇａｌｌｏ  Ｊ，Ｄｅｌｉｓｓｅｒ  ＨＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ  ６  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｐａｉｒ  ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ａ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１９９５；１０８（Ｐｔ  ６）：２２４１−２２５１．
１９．Ｖａｎ  Ａａｒｓｅｎ  ＬＡ，Ｌｅｏｎｅ  ＤＲ，Ｈｏ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａ  ｖ  ｂｅｔａ  ６  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ａ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８；６８：５６１−５７０．
２０．Ｈｕ  Ｍ，Ｙａｏ  Ｊ，Ｃａｒｒｏｌｌ  ＤＫ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｔｏ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２００８；１３：３９４−４０６．
２１．Ｈｙｎｅｓ  ＲＯ．ｌｎｔｅｇｒｉｎｓ：ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ，ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍａｃｈｉｎｅｓ．Ｃｅｌｌ．２００２；１１０：６７３−６８７．
２２．Ｋｕｍａｒ  ＣＣ．Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９８；１７：１３６５−１３７３．
２３．ＭｃＳｈａｎｅ  ＬＭ，Ａｌｔｍａｎ  ＤＧ，Ｓａｕｅｒｂｒｅｉ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｕｒ  ＭＡＲＫｅｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ（ＲＥＭＡＲＫ）．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００５；４１：１６９０−１６９６．
２４．Ｒａｋｈａ  ＥＡ，ＥＩ−Ｒｅｈｉｍ  ＤＡ，Ｐａｉｓｈ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｂａｓａｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｐｏｏｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｕｂｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００６；４２：３１４９−３１５６．
２５．Ａｂｄ  ＥＩ−Ｒｅｈｉｍ  ＯＭ，Ｐｉｎｄｅｒ  ＳＥ，Ｐａｉｓｈ  ＣＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｕｍｉｎａｌ  ａｎｄ  ｂａｓａｌ  ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２００４；２０３：６６１−６７１．
２６．Ｃｕｒｔｉｓ  Ｃ，Ｓｈａｈ  ＳＰ，Ｃｈｉｎ  ＳＦ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ２，０００  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｎｏｖｅｌ  ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１２；４８６：３４６−３５２．
２７．Ｃｒｏｗｄｅｒ  ＭＪ  ＨＤ．Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ  ｏｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ．１，Ｅｄｉｔｏｒ，ｅｄｉｔｏｒ”ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；１９９０．
２８．Ｌｅｗｉｓ  ＧＯ，Ｌｏｆｇｒｅｎ  ＪＡ，ＭｃＭｕｒｔｒｅｙ  ＡＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  ｏｖａｒｉａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＥｒｂＢ２  ａｓ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｉｎ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９６；５６：１４５７−１４６５．
２９．Ｅｂｅｒｌｅｉｎ  Ｃ，Ｋｅｎｄｒｅｗ  Ｊ，ＭｃＤａｉｄ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ２６４ＲＡＤ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｌｐｈａｖｂｅｔａ６  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｔｕｍｏｕｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｋｅｙ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０１２．
３０．Ｓｌａｍｏｎ  ＯＪ，Ｌｅｙｌａｎｄ−Ｊａｎｅｓ  Ｂ，Ｓｈａｋ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｕｓｅ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｐｌｕｓ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＥＲ２  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈａｔ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｓ  ＨＥＲ２．Ｎ  Ｅｎｇ／Ｊ  Ｍｅｄ．２００１；３４４：７８３−７９２．
３１．Ｖａｒｄｅｎ  Ｖ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＨＥＲ２  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２００１；６１  Ｓｕｐｐｌ２：１−１３．
３２．Ｃｌａｒｋ  ＡＳ，Ｗｅｓｔ  Ｋ，Ｓｔｒｅｉｃｈｅｒ  Ｓ，Ｄｅｎｎｉｓ  ＰＡ．Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ａｋｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ，ｏｒ  ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２００２；１：７０７−７１７．
３３．Ｍｕｒａｏｋａ−Ｃｏｏｋ  ＲＳ，Ｓｈｉｎ  Ｉ  Ｖｉ  ＪＶ，ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ＴＧＦｂｅｔａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｉｎａｓｅ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｍａｍｍａｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００６；２５：３４０８−３４２３．
３４．Ｆａｌｃｉｏｎｉ  Ｒ，Ａｎｔｏｎｉｎｉ  Ａ，Ｎｉｓｔｉｃｏ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ａｌｐｈａ  ６  ｂｅｔａ  ４  ａｎｄ  ａｌｐｈａ  ６  ｂｅｔａ  １  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅ  ｗｉｔｈ  ＥｒｂＢ−２  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９９７；２３６：７６−８５．
３５．Ｇｕｏ  Ｗ，Ｐｙｌａｙｅｖａ  Ｙ，Ｐｅｐｅ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｅｔａ  ４  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｍｐｌｉｆｉｅｓ  ＥｒｂＢ２  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｏ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｅｌｌ．２００６；１２６：４８９−５０２．
３６．Ｖｉｏｌｅｔｔｅ  Ｓ，Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｄ，Ｒｏｓａｓ，１０，Ａｒｊｏｍａｎｄｉ，Ｍ，Ｒｉｃｅ，Ｔ，Ｇｉｌｍａｎ，Ｍ，Ｋａｍｉｎｓｋｉ，Ｎ，Ｐｒａｓｓｅ，Ａ，Ｍａｒｏｎｉ，Ｂ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｔｏ  Ｍｏｎｉｔｏｒ  Ｔｈｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｏｆ  ＳＴＸ−１００，Ａ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ａｎｔｉ−αＶβ６  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｎ  Ａ  Ｐｈａｓｅ  ２ａ  Ｔｒｉａｌ  Ｉｎ  Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２０１２；１８５．
３７．Ｂｅｎｚ  ＣＣ，Ｓｃｏｔｔ  ＧＫ，Ｓａｒｕｐ  ＪＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ＭＣＦ−７  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ．１９９２；２４｛２）：８５−９５．
３８．Ｍｅｙｅｒ  Ｔ，Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＪＦ，Ｈａｒｔ  ＩＲ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａｖ  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  ａｎｄ  ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９８；７７（４）：５３０−６．
３９．Ｓａｎｔｎｅｒ  ＳＪ，Ｄａｗｓｏｎ  ＰＪ，Ｔａｉｔ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ＭＣＦ１０ＣＡ１  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐｒｅｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ＭＣＦ１０ＡＴ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ．２００１；６５（２）：１０１−１０．
４０．Ｎａｈｔａ  Ｒ，Ｅｓｔｅｖａ  ＦＪ．Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２００６；２３２（２）：２３−３８．
４１．Ｎｅｖｅ  ＲＭ，Ｃｈｉｎ  Ｋ，Ｆｒｉｄｌｙａｎｄ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２００６；１  ０（６）：５１５−２７．
４２．Ｓｕｂｉｋ  Ｋ，Ｌｅｅ  ＪＦ，Ｂａｘｔｅｒ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ＥＲ，ＰＲ，ＨＥＲ２，ＣＫ５／６，ＥＧＦＲ，Ｋｉ−６７  ａｎｄ  ＡＲ  ｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ（Ａｕｃｋｌ）．２０１  ０；４：３５−４１．
【０３７６】
参照による援用
特許、特許出願、論文、教科書などを含む、本明細書に引用する全ての参照文献、並びにそこに引用される参照文献は、既に引用されていない範囲まで、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。
【０３７７】
均等物
上に記載した明細書は、当業者が実施形態を実施することができる上で十分であると見なされる。以上の記載及び実施例は、特定の実施形態を詳述し、本発明者らによって考慮される最良の形態を記載する。しかしながら、以上の記載がいかに詳細に文章で表され得るかにかかわらず、これらの実施形態は、様々な方法で実施されることができ、従って、本発明は、添付の特許請求の範囲及びいずれかのそれらの均等物に従って解釈すべきであることが理解されるであろう。
【図１】
2019142876.tif 000044
【図２Ａ】
2019142876.tif 000045
【図２Ｂ−Ｄ】
2019142876.tif 000046
【図２Ｅ−Ｆ】
2019142876.tif 000047
【図２Ｇ】
2019142876.tif 000048
【図３Ａ−Ｂ】
2019142876.tif 000049
【図３Ｃ】
2019142876.tif 000050
【図４Ａ−Ｃ】
2019142876.tif 000051
【図４Ｄ】
2019142876.tif 000052
【図４Ｅ】
2019142876.tif 000053
【図４Ｆ】
2019142876.tif 000054
【図４Ｇ】
2019142876.tif 000055
【図５Ａ−Ｄ】
2019142876.tif 000056
【図５Ｅ】
2019142876.tif 000057
【図５Ｆ】
2019142876.tif 000058
【図６Ａ−Ｄ】
2019142876.tif 000059
【図７Ａ−Ｃ】
2019142876.tif 000060
【図８】
2019142876.tif 000061
【図９】
2019142876.tif 000062
【図１０】
2019142876.tif 000063
【図１１】
2019142876.tif 000064
【図１２】
2019142876.tif 000065
【図１３】
2019142876.tif 000066
【図１４】
2019142876.tif 000067
【図１５Ａ−Ｂ】
2019142876.tif 000068
【図１６Ａ−Ｂ】
2019142876.tif 000069
【図１６Ｃ−Ｅ】
2019142876.tif 000070
【図１７】
2019142876.tif 000071
【図１８】
2019142876.tif 000072
【配列表】
2019142876000001.app
【外国語明細書】
2019142876000001.pdf