(57)【要約】      （修正有）【課題】ランチオニンシンテターゼＣ様タンパク質２経路を標的とする化合物を提供する。【解決手段】化合物は、以下の式で示される。2019142873.tif 000066Ｑは、例えば、ピペラジン−１，４−ジイルやベンゼン−１，４−ジアミン−Ｎ1，Ｎ4−ジイルなどであり、Ａ1及びＡ1’は、Ｎ又はＣＲ6であり、Ａ2及びＡ2’は、Ｎ又はＣＲ7であり、Ａ3は、ＮＲ8、Ｏ、又はＳであり、Ａ4は、Ｎ又はＣＲ9であり、Ａ5は、Ｎ又はＣＲ10であり、Ａ6は、Ｎ又はＣＲ11であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ3'、Ｒ4、Ｒ4'、Ｒ5'、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、及びＲ11は、水素やアルキルなどである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｚ−Ｙ−Ｑ−Ｙ’−Ｚ’を含む化合物であって、
式中、
Ｚが、
2019142873.tif 000053
Ｙが、
2019142873.tif 000054
Ｑが、ピペラジン−１，４−ジイル；２，５−ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，５−ジイル；２，５−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン−２，５−ジイル；１，４−ジアゼパン−１，４−ジイル；ベンゼン−１，４−ジアミン−Ｎ1，Ｎ4−ジイル；エタン−１，２−ジアミン−Ｎ1，Ｎ2−ジイル；Ｎ1，Ｎ2−ジアルキルエタン−１，２−ジアミン−Ｎ1，Ｎ2−ジイル；プロパン−１，３−ジアミン−Ｎ1，Ｎ3−ジイル；Ｎ1，Ｎ3−ジアルキルプロパン−１，３−ジアミン−Ｎ1，Ｎ3−ジイル；１，４−ジアミノアントラセン−９，１０−ジオン−１，４−ジイル；Ｃ6アレーン−１，４−ジアミン−Ｎ1，Ｎ4−ジイル（前記アレーンが、２、３、５、または６位で１〜４個の置換基で置換され、前記置換基が独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、ＯＨ、Ｏ（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、ＣＦ3、Ｆ、Ｃｌ、及びＢｒからなる群から選択される）；または置換ピペラジン−１，４−ジイル（前記ピペラジンが、２、３、５、または６位で１〜８個の置換基で置換され、前記置換基が独立して、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、アリール、アリール（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、及びＣ（Ｏ）Ｏ（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルからなる群から選択される）であり、
Ｙ’が、
2019142873.tif 000055
Ｚ’が、
2019142873.tif 000056
式中、
Ｚ’がＲ5である場合のみ、Ｙ’が単結合であり、
Ａ1及びＡ1’が各々独立して、Ｎ、Ｎ（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ6であり、
Ａ2及びＡ2’が各々独立して、ＮまたはＣＲ7であり、
Ａ3及びＡ3’が各々独立して、ＮＲ8、Ｏ、またはＳであり、
Ａ4及びＡ4’が各々独立して、ＮまたはＣＲ9であり、
Ａ5及びＡ5’が各々独立して、ＮまたはＣＲ10であり、
Ａ6及びＡ6’が各々独立して、ＮまたはＣＲ11であり、
Ｒ1、Ｒ1'、Ｒ2、Ｒ2'、Ｒ3、Ｒ3'、Ｒ4、Ｒ4'、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、及びＲ11が各々独立して、水素；アルキル；ハロ；トリフルオロメチル；ジアルキルアミノ（各アルキルが独立して選択される）；−ＮＨ2；アルキルアミノ；アリールアルキル；ヘテロアリールアルキル；ヘテロシクロアルキル；置換ヘテロシクロアルキル（前記置換ヘテロシクロアルキルが、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、−ＣＦ3、Ｆ、Ｃｌ、及びＢｒからなる群から独立して選択される１〜２個の置換基で置換される）；及び置換ヘテロアリールアルキルからなる群から選択され、
前記置換ヘテロアリールアルキルが、−ＮＨ2；−ＮＨ（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル；−Ｎ（（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル）2（各アルキルが独立して選択される）；アルキル；ハロ；アリール；置換アリール（前記置換アリールが、−ＳＯ2Ｒ12、−ＯＲ13、−ハロ、−ＣＮ、−ＣＦ3、アミノアルキル−、−Ｓ（Ｏ）Ｒ14、及びアルキルからなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換される）；ヘテロシクロアルキル；ヘテロアリール；置換アリール（前記置換アリールが、アルキル、−ＣＦ3、Ｆ、Ｃｌ、及びＢｒからなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換される）；アルキルアミノ−；ヘテロシクロアルキル−アルキル−アミノ−；アルキルアミノアルキルアミノ−；−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ15；−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＲ16Ｒ17；−Ｃ（Ｏ）ＮＲ16Ｒ17；及び置換ヘテロアリール（前記置換ヘテロアリールが、アルキル、ハロ、ＣＮ、ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜Ｃ6アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜Ｃ6アルキル）2（各アルキルが独立して選択される）、−ＣＦ3、及び置換アリール（前記置換アリールが、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ15及び−ＣＮからなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換される）からなる群から選択される１〜３個の置換基で置換される）からなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換され、
Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、及びＲ17が各々独立して、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、独立して選択されたＣ1〜Ｃ6アルキルを含むジアルキルアミノ、−ＮＨ2、アルキルアミノ、ヘテロシクロアルキル、及び置換ヘテロシクロアルキル（前記置換ヘテロシクロアルキルが、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ1〜Ｃ6アルキル）及びＣ1〜Ｃ6アルキルからなる群から独立して選択される１〜２個の置換基で置換される）からなる群から選択される、前記化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステル。
【請求項２】
前記式Ｚ−Ｙ−Ｑ−Ｙ’−Ｚ’が、
2019142873.tif 000057
またはその塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ａ1及びＡ1’、Ａ2及びＡ2’、Ａ3及びＡ3’、Ａ4及びＡ4’、Ａ5及びＡ5’、Ａ6及びＡ6’、Ｒ1及びＲ1’、Ｒ2及びＲ2’、Ｒ3及びＲ3’、ならびにＲ4及びＲ4’からなる群から選択される１つ以上の対のメンバーが同じである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ａ1及びＡ1’、Ａ2及びＡ2’、Ａ3及びＡ3’、Ａ4及びＡ4’、Ａ5及びＡ5’、Ａ6及びＡ6’、Ｒ1及びＲ1’、Ｒ2及びＲ2’、Ｒ3及びＲ3’、ならびにＲ4及びＲ4’からなる群から選択される１つ以上の対のメンバーが異なる、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
Ａ1及びＡ1’、Ａ2及びＡ2’、Ａ3及びＡ3’、Ａ4及びＡ4’、Ａ5及びＡ5’、Ａ6及びＡ6’、Ｒ1及びＲ1’、Ｒ2及びＲ2’、Ｒ3及びＲ3’、ならびにＲ4及びＲ4’からなる群から選択される各対のメンバーが同じである、請求項２に記載の化合物。
【請求項６】
Ａ1及びＡ1’、Ａ2及びＡ2’、Ａ3及びＡ3’、Ａ4及びＡ4’、Ａ5及びＡ5’、Ａ6及びＡ6’、Ｒ1及びＲ1’、Ｒ2及びＲ2’、Ｒ3及びＲ3’、ならびにＲ4及びＲ4’からなる群から選択される各対のメンバーが異なる、請求項２に記載の化合物。
【請求項７】
前記式Ｚ−Ｙ−Ｑ−Ｙ’−Ｚ’が、
2019142873.tif 000058
載の化合物。
【請求項８】
Ａ3及びＡ3’の少なくとも一方がＯまたはＳである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
Ａ1及びＡ1’の一方または両方がＮである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ａ2及びＡ2’の一方または両方がＣＨであり、Ａ3がＮＨであり、Ａ4がＮであり、Ａ5がＣＨであり、Ａ6がＣＨである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
Ａ2及びＡ2’の一方または両方がＣＨであり、Ａ3及びＡ3’の一方または両方がＮＨであり、Ａ4及びＡ4’の一方または両方がＮであり、Ａ5及びＡ5’の一方または両方がＣＨであり、Ａ6及びＡ6’の一方または両方がＣＨである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｑが、ピペラジン−１，４−ジイル；２，５−ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，５−ジイル；２，５−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン−２，５−ジイル；１，４−ジアゼパン−１，４−ジイル；Ｎ1，Ｎ2−ジアルキルエタン−１，２−ジアミン−Ｎ1，Ｎ2−ジイル；Ｎ1，Ｎ3−ジアルキルプロパン−１，３−ジアミン−Ｎ1，Ｎ3−ジイル；１，４−ジアミノアントラセン−９，１０−ジオン−１，４−ジイル；Ｃ6アレーン−１，４−ジアミン−Ｎ1，Ｎ4−ジイル（前記アレーンが、２、３、５、または６位で１〜４個の置換基で置換され、各置換基が独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、ＯＨ、Ｏ（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、ＣＦ3、Ｆ、Ｃｌ、及びＢｒからなる群から選択される）；または置換ピペラジン−１，４−ジイル（前記ピペラジンが、２、３、５、または６位で１〜８個の置換基で置換され、各置換基が独立して、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、アリール、アリール（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、及びＣ（Ｏ）Ｏ（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルからなる群から選択される）である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
前記化合物が、以下の構造、
2019142873.tif 000059
2019142873.tif 000060
【請求項１４】
動物における状態を請求項１に記載の化合物で治療する方法であって、前記方法が、前記動物に有効量の前記化合物を投与することを含み、前記状態が、感染性疾患、自己免疫疾患、糖尿病、及び慢性炎症性疾患からなる群から選択される、前記方法。
【請求項１５】
前記感染性疾患が、ウイルス性疾患を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ウイルス性疾患が、インフルエンザ感染を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記自己免疫疾患が、自己免疫炎症性疾患を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記自己免疫炎症性疾患が、炎症性腸疾患を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎及びクローン病からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記糖尿病が、１型糖尿病及び２型糖尿病からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記慢性炎症性疾患が、メタボリックシンドロームを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
式Ａ−Ｂ−Ｃを含む化合物であって、
式中、
Ａが、
2019142873.tif 000061
Ｂが、
2019142873.tif 000062
Ｃが、
2019142873.tif 000063
式中、
Ａ7、Ａ8、Ａ9、Ａ10、Ａ11、Ａ12、Ａ13、及びＡ14が各々独立して、ＣＨ、ＣＲ18、及びＮから選択され、
Ａ15、Ａ16、Ａ17、Ａ18、Ａ19、及びＡ20が各々独立して、ＣＨ、ＣＲ19、Ｎ、ＮＲ20、Ｏ、及びＳから選択されるが、但し、Ａ15、Ａ16、及びＡ17のうちの１つのみが、Ｎ、ＮＲ20、Ｏ、またはＳであってもよく、Ａ18、Ａ19、及びＡ20のうちの１つのみが、Ｎ、ＮＲ20、Ｏ、またはＳであってもよいことを条件とし、
Ｒ18及びＲ19が各々独立して、Ｃ1〜Ｃ6アルキル；Ｃ1〜Ｃ6ジアルキルアミノ（各Ｃ1〜Ｃ6アルキルが独立して選択される）；−ＮＨ2；アルキルアミノ；ヘテロシクロアルキル；及び置換ヘテロシクロアルキル（前記置換ヘテロシクロアルキルが、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ1〜Ｃ6アルキル）及びＣ1〜Ｃ6アルキルからなる群から独立して選択される１〜２個の置換基で置換される）から選択され、１つより多くのＣＲ18を有する化合物において、各Ｒ18が独立して選択され、１つより多くのＣＲ19を有する化合物において、各Ｒ19が独立して選択され、
Ｒ20が、Ｃ1〜Ｃ6アルキルである、前記化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステル。
【請求項２３】
Ｂが、
2019142873.tif 000064
【請求項２４】
前記化合物が、以下の構造、
2019142873.tif 000065
【請求項２５】
動物における状態を請求項２２に記載の化合物で治療する方法であって、前記方法が、前記動物に有効量の前記化合物を投与することを含み、前記状態が、感染性疾患、自己免疫疾患、糖尿病、及び慢性炎症性疾患からなる群から選択される、前記方法。
【請求項２６】
前記感染性疾患が、ウイルス性疾患を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ウイルス性疾患が、インフルエンザ感染を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記自己免疫疾患が、自己免疫炎症性疾患を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記自己免疫炎症性疾患が、炎症性腸疾患を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎及びクローン病からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記糖尿病が、１型糖尿病及び２型糖尿病からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記慢性炎症性疾患が、メタボリックシンドロームを含む、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、各々の全体が参照により本明細書に援用される２０１４年１０月２４日に出願された米国仮特許出願６２／０６８，３２２及び２０１５年１月８日に出願された米国仮特許出願６２／１０１，１６４に対する優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府支援の研究に関する声明
本発明は、ＢｉｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．に授与されたＳＢＩＲ助成金１Ｒ４３ＤＫ０９７９４０−０１Ａ１及びＳＴＴＲ助成金１Ｒ４１ＤＫ０９９０２７−０１Ａ１の下で、米国国立衛生研究所からの米国政府の支援を一部受けてなされた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、疾患及び障害の医学的治療の分野に関する。より具体的には、本発明は、とりわけ、炎症性腸疾患、リウマチ性関節炎、乾癬、多発性硬化症、及び１型糖尿病等の炎症性及び免疫媒介性疾患、ならびにインスリン抵抗性、グルコース耐性異常、前糖尿病、２型糖尿病、及び肥満関連炎症等の慢性炎症性疾患及び障害を治療及び予防する生物学的に活性な化合物のクラスに関する。
【背景技術】
【０００４】
ランチオニンＣ様タンパク質２（ＬＡＮＣＬ２）（「ランチオニンシンテターゼＣ様タンパク質２」または「ランチオニンシンテターゼ成分Ｃ様タンパク質２」とも呼ばれる）は、発現された免疫細胞、胃腸管、ニューロン、精巣、及び膵臓であるシグナル伝達経路タンパク質である［１］。ＬＡＮＣＬ２経路の活性化は、インスリン感受性を増加させ、種々の自己免疫性、炎症性、及び代謝性状態に関連する炎症を低減する。マウスにおけるインビボ及びインビトロ試験の結果は、この経路を標的とする化合物の使用が、グルコース耐性試験においてグルコースレベルを対照と比較して２倍低減することを示し、有効な治療ではあるが著しい副作用を伴う処方薬ＡＶＡＮＤＩＡ（登録商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  ｐｌｃ、Ｂｒｅｎｔｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）と同等のレベルを提供した。ＬＡＮＣＬ２経路の標的により、腸の炎症も９０％低減し、それに対応して病変の数が４倍低減する。この試験の結果及びこの経路の他の検証は、１２の同業者によって審査された学術論文に公開されている［２〜１３］。
【０００５】
自己免疫に関連する炎症の分類の中には、現在、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ性関節炎、１型糖尿病、乾癬、多発性硬化症等の自己免疫障害の世界的流行がある。同様に、メタボリックシンドローム、肥満、前糖尿病、心血管疾患、及び２型糖尿病を含む慢性代謝性炎症性疾患の流行もある。現行の治療は適度に有効ではあるが、高価であり、深刻な副作用を有する。抗ＴＮＦ抗体等の自己免疫疾患に対する最も有効な治療の投与経路は、静脈注射または皮下注射によるものであり、診療所／手術室への訪問や頻繁な監視を必要とする。ＬＡＮＣＬ２の特有の作用様式は、抗ＴＮＦ抗体と同程度に有効であるが副作用及び高額な費用を伴わない経口投与用治療薬を提供する。概して炎症性及び自己免疫疾患の流行を考えると、ＬＡＮＣＬ２経路は、数百万人の患者に著しく影響を及ぼす可能性を有する。
【０００６】
アブシジン酸（「ＡＢＡ」）は、ＬＡＮＣＬ２に結合するオリジナルスクリーニングプロセスにおいて見出される天然化合物のうちの１つである。
【０００７】
合成有機化学の分野において説明される莫大な数の化合物が存在する。種々の化合物は、次の参考文献によって提供される：Ｄｉａｎａらに対するＷＯ１９９７／０３６８６６、Ｓｕｎらに対するＷＯ２００６／０５３１０９、Ｋｉｍらに対するＷＯ２００６／０８０８２１、Ｎｕｎｅｓらに対するＷＯ２００７／０１９４１７、Ｓｉｎｇｈらに対するＷＯ２００９／０６７６００及びＷＯ２００９／０６７６２１、Ａｄａｍｓらに対するＷＯ２００８／０７９２７７、Ｕｒａｓｏｅらに対するＪＰ２００８／０５６６１５、Ｓｔｏｅｓｓｅｌらに対するＷＯ２０１１／０６６８９８、Ｂａｓｓａｇａｎｙａ−Ｒｉｅｒａらに対するＵＳ２０１３／０１４２８２５、ならびにＢａｓｓａｇａｎｙａ−Ｒｉｅｒａらに対する米国特許第７，７４１，３６７号。これらの参考文献に説明される化合物のうちのいくつかは、ＬＡＮＣＬ２経路を活性化することが知られており、そうではないものもある。
【０００８】
治療を個々の疾患に特異的に適合させ、その効能を潜在的に最大化する、ＬＡＮＣＬ２経路の新規のリガンドを開発する必要が存在する。
【０００９】
したがって、本出願は、新規の医療化学アプローチによって開発され、コンピュータ、インビトロ、及びインビボ技術を使用してＬＡＮＣＬ２タンパク質に結合するそれらの能力を最大化し、したがって自己免疫、慢性炎症性、代謝性、及び感染性疾患を含むがこれらに限定されない種々の疾患状態において有益な応答をもたらすようにスクリーニングされた、一連の化合物のクラスを説明する。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、式Ｚ−Ｙ−Ｑ−Ｙ’−Ｚ’を含む化合物であって、
式中、
Ｚが、
2019142873.tif 000002
Ｙが、
2019142873.tif 000003
Ｑが、ピペラジン−１，４−ジイル；２，５−ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，５−ジイル；２，５−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン−２，５−ジイル；１，４−ジアゼパン−１，４−ジイル；ベンゼン−１，４−ジアミン−Ｎ1，Ｎ4−ジイル；エタン−１，２−ジアミン−Ｎ1，Ｎ2−ジイル；Ｎ1，Ｎ2−ジアルキルエタン−１，２−ジアミン−Ｎ1，Ｎ2−ジイル；プロパン−１，３−ジアミン−Ｎ1，Ｎ3−ジイル；Ｎ1，Ｎ3−ジアルキルプロパン−１，３−ジアミン−Ｎ1，Ｎ3−ジイル；１，４−ジアミノアントラセン−９，１０−ジオン−１，４−ジイル；Ｃ6アレーン−１，４−ジアミン−Ｎ1，Ｎ4−ジイル（該アレーンが、２、３、５、または６位で１〜４個の置換基で置換され、該置換基が独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、ＯＨ、Ｏ（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、ＣＦ3、Ｆ、Ｃｌ、及びＢｒからなる群から選択される）；または置換ピペラジン−１，４−ジイル（該ピペラジンが、２、３、５、または６位で１〜８個の置換基で置換され、該置換基が独立して、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、アリール、アリール（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、及びＣ（Ｏ）Ｏ（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルからなる群から選択される）であり、
Ｙ’が、
2019142873.tif 000004
Ｚ’が、
2019142873.tif 000005
式中、
Ｚ’がＲ5である場合のみ、Ｙ’が単結合であり、
Ａ1及びＡ1’が各々独立して、Ｎ、Ｎ（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ6であり、
Ａ2及びＡ2’が各々独立して、ＮまたはＣＲ7であり、
Ａ3及びＡ3’が各々独立して、ＮＲ8、Ｏ、またはＳであり、
Ａ4及びＡ4’が各々独立して、ＮまたはＣＲ9であり、
Ａ5及びＡ5’が各々独立して、ＮまたはＣＲ10であり、
Ａ6及びＡ6’が各々独立して、ＮまたはＣＲ11であり、
Ｒ1、Ｒ1’、Ｒ2、Ｒ2’、Ｒ3、Ｒ3’、Ｒ4、Ｒ4’、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、及びＲ11が各々独立して、水素；アルキル；ハロ；トリフルオロメチル；ジアルキルアミノ（各アルキルが独立して選択される）；−ＮＨ2；アルキルアミノ；アリールアルキル；ヘテロアリールアルキル；ヘテロシクロアルキル；置換ヘテロシクロアルキル（該置換ヘテロシクロアルキルが、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、−ＣＦＣＦ3、Ｆ、Ｃｌ、及びＢｒからなる群から独立して選択される１〜２個の置換基で置換される）；及び置換ヘテロアリールアルキルからなる群から選択され、
該置換ヘテロアリールアルキルが、−ＮＨ2；−ＮＨ（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル；−Ｎ（（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル）2（各アルキルが独立して選択される）；アルキル；ハロ；アリール；置換アリール（該置換アリールが、−ＳＯ2Ｒ12、−ＯＲ13、−ハロ、−ＣＮ、−ＣＦ3、アミノアルキル−、−Ｓ（Ｏ）Ｒ14、及びアルキルからなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換される）；ヘテロシクロアルキル；ヘテロアリール；置換アリール（該置換アリールが、アルキル、−ＣＦ3、Ｆ、Ｃｌ、及びＢｒからなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換される）；アルキルアミノ−；ヘテロシクロアルキル−アルキル−アミノ−；アルキルアミノアルキルアミノ−；−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ15；−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＲ16Ｒ17；−Ｃ（Ｏ）ＮＲ16Ｒ17；及び置換ヘテロアリール（該置換ヘテロアリールが、アルキル、ハロ、ＣＮ、ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜Ｃ6アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜Ｃ6アルキル）2（各アルキルが独立して選択される）、−ＣＦ3、及び置換アリール（該置換アリールが、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ15及び−ＣＮからなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換される）からなる群から選択される１〜３個の置換基で置換される）からなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換され、
Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、及びＲ17が各々独立して、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、独立して選択されたＣ1〜Ｃ6アルキルを含むジアルキルアミノ、−ＮＨ2、アルキルアミノ、ヘテロシクロアルキル、及び置換ヘテロシクロアルキル（該置換ヘテロシクロアルキルが、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ1〜Ｃ6アルキル）及びＣ1〜Ｃ6アルキルからなる群から独立して選択される１〜２個の置換基で置換される）からなる群から選択される、化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルを提供する。
【００１１】
いくつかの化合物では、Ａ3及びＡ3’の少なくとも一方は、ＯまたはＳである。いくつかの化合物では、Ａ1及びＡ1’の一方または両方は、Ｎである。いくつかの化合物では、Ａ2及びＡ2’の一方または両方はＣＨであり、Ａ3はＮＨであり、Ａ4はＮであり、Ａ5はＣＨであり、Ａ6はＣＨである。いくつかの化合物では、Ａ2及びＡ2’の一方または両方はＣＨであり、Ａ3及びＡ3’の一方または両方はＮＨであり、Ａ4及びＡ4’の一方または両方はＮであり、Ａ5及びＡ5’の一方または両方はＣＨであり、Ａ6及びＡ6’の一方または両方はＣＨである。いくつかの化合物では、Ｑは、ピペラジン−１，４−ジイル；２，５−ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，５−ジイル；２，５−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン−２，５−ジイル；１，４−ジアゼパン−１，４−ジイル；Ｎ1，Ｎ2−ジアルキルエタン−１，２−ジアミン−Ｎ1，Ｎ2−ジイル；Ｎ1，Ｎ3−ジアルキルプロパン−１，３−ジアミン−Ｎ1，Ｎ3−ジイル；１，４−ジアミノアントラセン−９，１０−ジオン−１，４−ジイル；Ｃ6アレーン−１，４−ジアミン−Ｎ1，Ｎ4−ジイル（該アレーンが、２、３、５、または６位で１〜４個の置換基で置換され、各置換基が独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、ＯＨ、Ｏ（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、ＣＦ3、Ｆ、Ｃｌ、及びＢｒからなる群から選択される）；または置換ピペラジン−１，４−ジイル（該ピペラジンが、２、３、５、または６位で１〜８個の置換基で置換され、各置換基が独立して、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、アリール、アリール（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、及びＣ（Ｏ）Ｏ（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルからなる群から選択される）である。
【００１２】
いくつかの化合物では、式Ｚ−Ｙ−Ｑ−Ｙ’−Ｚ’は、
2019142873.tif 000006
【００１３】
いくつかの化合物では、Ａ1及びＡ1’、Ａ2及びＡ2’、Ａ3及びＡ3’、Ａ4及びＡ4’、Ａ5及びＡ5’、Ａ6及びＡ6’、Ｒ1及びＲ1’、Ｒ2及びＲ2’、Ｒ3及びＲ3’、ならびにＲ4及びＲ4’からなる群から選択される１つ以上の対のメンバーは、同じである。いくつかの化合物では、Ａ1及びＡ1’、Ａ2及びＡ2’、Ａ3及びＡ3’、Ａ4及びＡ4’、Ａ5及びＡ5’、Ａ6及びＡ6’、Ｒ1及びＲ1’、Ｒ2及びＲ2’、Ｒ3及びＲ3’、ならびにＲ4及びＲ4’からなる群から選択される１つ以上の対のメンバーは、異なる。いくつかの化合物では、Ａ1及びＡ1’、Ａ2及びＡ2’、Ａ3及びＡ3’、Ａ4及びＡ4’、Ａ5及びＡ5’、Ａ6及びＡ6’、Ｒ1及びＲ1’、Ｒ2及びＲ2’、Ｒ3及びＲ3’、ならびにＲ4及びＲ4’からなる群から選択される各対のメンバーは、同じである。いくつかの化合物では、Ａ1及びＡ1’、Ａ2及びＡ2’、Ａ3及びＡ3’、Ａ4及びＡ4’、Ａ5及びＡ5’、Ａ6及びＡ6’、Ｒ1及びＲ1’、Ｒ2及びＲ2’、Ｒ3及びＲ3’、ならびにＲ4及びＲ4’からなる群から選択される各対のメンバーは、異なる。
【００１４】
いくつかの化合物では、式Ｚ−Ｙ−Ｑ−Ｙ’−Ｚ’は、
2019142873.tif 000007
【００１５】
いくつかの本発明の化合物は、以下の構造、
2019142873.tif 000008
2019142873.tif 000009
【００１６】
本発明はまた、式Ａ−Ｂ−Ｃを含む化合物であって、
式中、
Ａが、
2019142873.tif 000010
Ｂが、
2019142873.tif 000011
Ｃが、
2019142873.tif 000012
式中、
Ａ7、Ａ8、Ａ9、Ａ10、Ａ11、Ａ12、Ａ13、及びＡ14が各々独立して、ＣＨ、ＣＲ18、及びＮから選択され、
Ａ15、Ａ16、Ａ17、Ａ18、Ａ19、及びＡ20が各々独立して、ＣＨ、ＣＲ19、Ｎ、ＮＲ20、Ｏ、及びＳから選択されるが、但し、Ａ15、Ａ16、及びＡ17のうちの１つのみが、Ｎ、ＮＲ20、Ｏ、またはＳであってもよく、Ａ18、Ａ19、及びＡ20のうちの１つのみが、Ｎ、ＮＲ20、Ｏ、またはＳであってもよいことを条件とし、
Ｒ18及びＲ19が各々独立して、Ｃ1〜Ｃ6アルキル；Ｃ1〜Ｃ6ジアルキルアミノ（各Ｃ1〜Ｃ6アルキルが独立して選択される）；−ＮＨ2；アルキルアミノ；ヘテロシクロアルキル；及び置換ヘテロシクロアルキル（該置換ヘテロシクロアルキルが、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ1〜Ｃ6アルキル）及びＣ1〜Ｃ6アルキルからなる群から独立して選択される１〜２個の置換基で置換される）から選択され、１つより多くのＣＲ18を有する化合物において、各Ｒ18が独立して選択され、１つより多くのＣＲ19を有する化合物において、各Ｒ19が独立して選択され、
Ｒ20がＣ1〜Ｃ6アルキルである、化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルも提供する。
【００１７】
いくつかの化合物では、Ｂは、
2019142873.tif 000013
【００１８】
いくつかの化合物は、以下の構造、
2019142873.tif 000014
【００１９】
本発明はまた、動物における状態を、本明細書に説明される化合物のうちのいずれか１つ以上で治療する方法も提供する。本方法は、有効量の本明細書に説明される化合物のうちの１つ以上を動物に投与することを含む。状態は、感染性疾患、自己免疫疾患、糖尿病、及び慢性炎症性疾患からなる群から選択されてもよい。いくつかの方法では、感染性疾患は、インフルエンザ感染等のウイルス性疾患を含む。いくつかの方法では、自己免疫疾患は、潰瘍性大腸炎及び／またはクローン病を含む炎症性腸疾患等の自己免疫炎症性疾患を含む。いくつかの方法では、糖尿病は、１型糖尿病及び２型糖尿病からなる群から選択される。いくつかの方法では、慢性炎症性疾患は、メタボリックシンドロームを含む。いくつかの方法では、本方法は、ＬＡＮＣＬ２の活性を増加させる、炎症を減少させる、及び／または抗炎症効果を増加させるのに有効な量の化合物を投与することを含む。
【００２０】
本発明はまた、動物における状態を、本明細書に説明される化合物のうちのいずれか１つ以上での治療における使用のための化合物も提供する。かかる使用のための化合物としては、本明細書に説明される任意の化合物が挙げられる。使用は、有効量の本明細書に説明される化合物のうちの１つ以上を動物に投与することを含んでもよく、状態は、感染性疾患、自己免疫疾患、糖尿病、及び慢性炎症性疾患からなる群から選択される。いくつかの変形では、感染性疾患は、インフルエンザ感染等のウイルス性疾患を含む。いくつかの変形では、自己免疫疾患は、潰瘍性大腸炎及び／またはクローン病を含む炎症性腸疾患等の自己免疫炎症性疾患を含む。いくつかの変形では、糖尿病は、１型糖尿病及び２型糖尿病からなる群から選択される。いくつかの変形では、慢性炎症性疾患は、メタボリックシンドロームを含む。いくつかの変形では、化合物は、ＬＡＮＣＬ２の活性を増加させる、炎症を減少させる、及び／または抗炎症効果を増加させるのに有効である。
【００２１】
本発明の目的及び利点は、添付の図面とともになされる本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明から、より完全に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】ＳＰＲを使用したＬＡＮＣＬ２への化合物の結合の計算による予測及び生化学的実験検証。
【図１Ｂ】ＳＰＲを使用したＬＡＮＣＬ２への化合物の結合の計算による予測及び生化学的実験検証。
【図２】ＮＳＣ６１６０の上位５クラスターのクラスタリングヒストグラム。ＡｕｔｏＤｏｃｋ  Ｔｏｏｌｓを使用して、ＬＡＮＣＬ２にドッキングされたＮＳＣ６１６０を用いて１００回のドッキング実行を実施した。ＲＭＳＤクラスター許容値は、２Åであった。結合エネルギーをｋＪ／ｍｏｌで列記する。
【図３】ＡＢＡの上位５クラスターのクラスタリングヒストグラム。ＡｕｔｏＤｏｃｋ  Ｔｏｏｌｓを使用して、ＬＡＮＣＬ２にドッキングされたＡＢＡを用いて１００回のドッキング実行を実施した。ＲＭＳＤクラスター許容値は、２Åであった。結合エネルギーをｋＪ／ｍｏｌで列記する。
【図４】ＢＴ−１１の上位５クラスターのクラスタリングヒストグラム。ＡｕｔｏＤｏｃｋ  Ｔｏｏｌｓを使用して、ＬＡＮＣＬ２にドッキングされたＢＴ−１１を用いて１００回のドッキング実行を実施した。ＲＭＳＤクラスター許容値は、２Åであった。結合エネルギーをｋＪ／ｍｏｌで列記する。
【図５】ＢＴ−６の上位５クラスターのクラスタリングヒストグラム。ＡｕｔｏＤｏｃｋ  Ｔｏｏｌｓを使用して、ＬＡＮＣＬ２にドッキングされたＢＴ−６を用いて１００回のドッキング実行を実施した。ＲＭＳＤクラスター許容値は、２Åであった。結合エネルギーをｋＪ／ｍｏｌで列記する。
【図６】ＢＴ−１５の上位５クラスターのクラスタリングヒストグラム。ＡｕｔｏＤｏｃｋ  Ｔｏｏｌｓを使用して、ＬＡＮＣＬ２にドッキングされたＢＴ−１５を用いて１００回のドッキング実行を実施した。ＲＭＳＤクラスター許容値は、２Åであった。結合エネルギーをｋＪ／ｍｏｌで列記する。
【図７】ＢＴ−ＡＢＡ−５ａの上位５クラスターのクラスタリングヒストグラム。ＡｕｔｏＤｏｃｋ  Ｔｏｏｌｓを使用して、ＬＡＮＣＬ２にドッキングされたＢＴ−ＡＢＡ−５ａを用いて１００回のドッキング実行を実施した。ＲＭＳＤクラスター許容値は、２Åであった。結合エネルギーをｋＪ／ｍｏｌで列記する。
【図８】ＢＴ−１１及びＢＴ−１５とのランチオニンシンテターゼＣ様タンパク質２（ＬＡＮＣＬ２）の結合反応速度。パネルＡ及びＣは、固定化したＬＡＮＣＬ２への多様な濃度のＢＴ−１１（Ａ）及びＢＴ−１５（Ｃ）の結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラムを示す。パネルＢ及びＤは、最大共鳴単位（ＲＵ）対ＢＴ−１１（Ｂ）及びＢＴ−１５（Ｄ）の濃度のプロットを示す。１：１結合モデルを利用した定常状態解離定数（ＫD）が示される。
【図９Ａ】ＢＴ−６（図９Ａ）及びＢＴ−ＡＢＡ−５ａ（図９Ｂ）とのランチオニンシンテターゼＣ様タンパク質２（ＬＡＮＣＬ２）の結合反応速度。固定化したＬＡＮＣＬ２への多様な濃度のＢＴ−６及びＢＴ−ＡＢＡ−５ａの結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラムが示される。
【図９Ｂ】ＢＴ−６（図９Ａ）及びＢＴ−ＡＢＡ−５ａ（図９Ｂ）とのランチオニンシンテターゼＣ様タンパク質２（ＬＡＮＣＬ２）の結合反応速度。固定化したＬＡＮＣＬ２への多様な濃度のＢＴ−６及びＢＴ−ＡＢＡ−５ａの結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラムが示される。
【図１０】デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）大腸炎を有するマウスの疾患活性及び肉眼的病理に対する経口投与の効果。パネルＡは、ＢＴ−１１またはビヒクルのみのいずれかで処置されたマウスにおける疾患活性指数スコアを示す。パネルＢ〜Ｃは、ビヒクルまたはＢＴ−１１のいずれかで処置されたマウスにおける（Ｂ）脾臓、（Ｃ）腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）、及び（Ｄ）結腸からの肉眼的病理スコアを示す。統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される（ｎ＝１０）。
【図１１】ＤＳＳ大腸炎を有するマウスにおける結腸の炎症性病変に対する経口ＢＴ−１１投与の効果。（Ａ、Ｄ）対照、（Ｂ、Ｅ）ＤＳＳ、及び（Ｃ、Ｆ）ＢＴ−１１処置ＤＳＳマウスの代表的な顕微鏡写真が示される。病理組織学的病変を、（Ｇ）白血球浸潤、（Ｈ）上皮侵食、及び（Ｉ）粘膜肥厚に基づいて評価した。統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される（ｎ＝１０）。
【図１２】ＤＳＳ大腸炎を有するマウスにおける結腸炎症性病変に対する経口ＢＴ−１１投与の用量応答効果。病理組織学的病変を、（Ａ）白血球浸潤、（Ｂ）粘膜肥厚、及び（Ｃ）上皮侵食に基づいて評価した。統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される（ｎ＝１０）。
【図１３】ＴＮＦα、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、及びＬＡＮＣＬ２の結腸遺伝子発現分析。（Ａ）炎症誘発性ＴＮＦα、（Ｂ）ＩＬ−１０、及び（Ｃ）ＬＡＮＣＬ２のレベルを評定するための結腸遺伝子発現が示される。統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される（ｎ＝１０）。
【図１４】ＤＳＳ大腸炎を有するマウスにおける結腸の炎症誘発性及び抗炎症性免疫細胞サブセットに対するＢＴ−１１の経口投与の用量応答効果。フローサイトメトリー分析を使用して、結腸粘膜における（Ａ）ＴＮＦａ＋細胞、（Ｂ）ＩＬ−１０＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、及び（Ｃ）ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を測定した。
【図１５】ＤＳＳ大腸炎を有する野生型及びＬＡＮＣＬ２−／−マウスにおける組織肉眼的病理病変に対する経口ＢＴ−１１投与の効果。パネルＡは、ＢＴ−１１またはビヒクルのみのいずれかで処置された野生型対ＬＡＮＣＬ２−／−マウスにおける疾患活性指数スコアを示す。パネルＢ〜Ｄは、ビヒクルまたはＢＴ−１１のいずれかで処置された野生型及びＬＡＮＣＬ２−／−マウスにおける（Ｂ）結腸、（Ｃ）腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）、及び（Ｄ）脾臓からの肉眼的病理スコアを示す。統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される（ｎ＝１０）。
【図１６】ＤＳＳ大腸炎を有する野生型及びＬＡＮＣＬ２−／−マウスにおける結腸炎症性病変に対する経口ＢＴ−１１投与の効果。病理組織学的病変を、（Ａ）白血球浸潤、（Ｂ）粘膜肥厚、及び（Ｃ）上皮侵食に基づいて評価した。群間の統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される。
【図１７】慢性大腸炎を有する野生型及びＬＡＮＣＬ２−／−マウスの結腸固有層、脾臓、及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）に浸潤する免疫細胞サブセットに対する経口ＢＴ−１１投与の効果。フローサイトメトリーを使用して、ＢＴ−１１による処置後の（Ａ）結腸ＭＣＰ１＋ＣＤ４５＋細胞、（Ｂ）ＭＬＮにおけるＭＣＰ１＋ＣＤ４５＋細胞、（Ｃ）結腸ＴＮＦａ＋ＣＤ４５＋細胞、（Ｄ）結腸ＭＨＣ−ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋顆粒球、（Ｅ）結腸ＩＬ−１０＋ＣＤ４５＋細胞、及び（Ｆ）ＩＬ−１０＋ＣＤ４５＋脾細胞のレベルをアッセイした。群間の統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される。
【図１８】慢性大腸炎を有するＩＬ−１０−／−マウスにおける疾患活性指数（ＤＡＩ）スコアに対する経口ＢＴ−１１投与の効果。自発的な大腸炎を発症し、ビヒクル単独、または２０、４０、及び８０ｍｇのＢＴ−１１／Ｋｇ体重のいずれかで毎日処置されたＩＬ−１０ヌルマウスにおけるＤＡＩスコア（ｎ＝１０）。群間の統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される。
【図１９】ＢＴ−１１による処置後の大腸炎の慢性モデルにおける巨視的組織スコア化に対する経口ＢＴ−１１投与の効果。ビヒクルまたは３つの異なる濃度（２０、４０、及び８０ｍｇ／Ｋｇ）のＢＴ−１１のいずれかで処置されたマウスの（Ａ）脾臓、（Ｂ）腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）、及び（Ｃ）結腸における巨視的スコア。群間の統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される。
【図２０】ＩＢＤの慢性ＩＬ−１０−／−モデルにおける結腸の病理組織学的病変に対する経口ＢＴ−１１投与の効果。病理組織学的病変を、（Ａ）白血球浸潤、（Ｂ）上皮侵食、及び（Ｃ）粘膜肥厚に基づいて評価した。群間の統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される。
【図２１】慢性大腸炎を有するＩＬ−１０−／−の結腸固有層に浸潤する免疫細胞サブセットに対する経口ＢＴ−１１投与の効果。フローサイトメトリーを使用して、ＢＴ−１１による処置後の結腸ＬＰにおける（Ａ）Ｆ４／８０＋マクロファージ、（Ｂ）ＭＨＣ−ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋樹枝状細胞（ＤＣ）、（Ｃ）ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋調節Ｔ細胞、及び（Ｄ）Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞のレベルをアッセイした。群間の統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される。
【図２２】慢性大腸炎を有するＩＬ−１０−／−の脾臓及び腸間膜リンパ節に浸潤する免疫細胞サブセットに対する経口ＢＴ−１１投与の効果。フローサイトメトリーを使用して、ＢＴ−１１による処置後の（Ａ）ＣＤ４＋ＲＯＲｇｔ＋Ｔ細胞、（Ｂ）ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞、（Ｃ）ＣＤ４＋ＣＤ４５＋ＦＯＸＰ３＋調節Ｔ細胞、及び（Ｄ）Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞のレベルをアッセイした。群間の統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される。
【図２３】ＬＡＮＣＬ２及びＴＮＦαの結腸発現に対するＢＴ−１１による経口処置の効果。結腸遺伝子発現を使用して、（Ａ）ＬＡＮＣＬ２及び（Ｂ）ＴＮＦαのレベルを評定した。群間の統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される。
【図２４】慢性大腸炎の養子移入モデルにおける、ビヒクル対処置されたマウスにおける疾患活性指数スコアに対する経口ＢＴ−１１投与の効果。ＲＡＧ２−／−マウスに４００，０００個のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を腹腔内移入した後、ビヒクルまたはＢＴ−１１で処置した。群間の統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される。
【図２５】慢性大腸炎の養子移入モデルにおける、ビヒクル対処置野生型対ＬＡＮＣＬ２−／−移入マウスにおける疾患活性指数スコアに対する経口ＢＴ−１１投与の効果。ＲＡＧ２−／−マウスに野生型またはＬＡＮＣＬ２−／−ドナーのいずれかに由来する４００，０００個のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を腹腔内移入した後、ビヒクルまたはＢＴ−１１で処置した。群間の統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される。
【図２６】ＣＤ４＋誘発性大腸炎の慢性ＩＢＤモデルにおける体重損失に対する経口ＢＴ−１１投与の効果。マウスの体重を測定し、体重損失のパーセンテージを算出した。群間の統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される。
【図２７】ＢＴ−１１による処置後のＣＤ４＋Ｔ細胞誘発性大腸炎の慢性モデルにおける巨視的組織スコア化に対する経口ＢＴ−１１投与の効果。ビヒクルまたは８０ｍｇ／ＫｇのＢＴ−１１のいずれかで処置されたマウスの（Ａ）脾臓、（Ｂ）ＭＬＮ、（Ｃ）結腸、及び（Ｄ）回腸における巨視的スコアが示される。群間の統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される。
【図２８】ＢＴ−１１による処置後の野生型及びＬＡＮＣＬ２−／−マウスを用いたＣＤ４＋Ｔ細胞誘発性大腸炎の慢性モデルにおける巨視的組織スコア化に対する経口ＢＴ−１１投与の効果。ビヒクルまたは８０ｍｇ／ＫｇのＢＴ−１１のいずれかで処置された野生型及びＬＡＮＣＬ２−／−マウスの（Ａ）結腸、（Ｂ）ＭＬＮ、及び（Ｃ）脾臓における巨視的スコアが示される。群間の統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される。
【図２９】慢性大腸炎の養子移入モデルにおけるビヒクル対処置マウスにおける結腸及び回腸病理組織に対する経口ＢＴ−１１投与の効果。結腸（Ａ、Ｃ、Ｅ）及び回腸（Ｂ、Ｄ、Ｆ）における病理組織学的病変を、（Ａ、Ｂ）白血球浸潤、（Ｃ、Ｄ）上皮侵食、及び（Ｅ、Ｆ）粘膜肥厚に基づいて評価した。群間の統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される。
【図３０】慢性大腸炎の養子移入モデルにおける、野生型またはＬＡＮＣＬ２−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞のいずれかを移入したビヒクル対処置マウスにおける結腸病理組織に対する経口ＢＴ−１１投与の効果。病理組織学的病変を、（Ａ）白血球浸潤、（Ｂ）粘膜肥厚、及び（Ｃ）上皮侵食に基づいて評価した。群間の統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される。
【図３１】慢性大腸炎の養子移入モデルにおける、ビヒクル対処置マウスにおける疾患活性指数スコアに対する経口ＢＴ−１１投与の効果。フローサイトメトリーを使用して、ＢＴ−１１による処置後の（Ａ）Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋マクロファージ、（Ｂ）ＣＤ４５＋ＩＦＮｇ＋細胞、（Ｃ）ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋調節Ｔ細胞、及び（Ｄ）ＣＤ４＋ＩＬ−１０＋抗炎症性細胞のレベルをアッセイした。群間の統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される。
【図３２】慢性大腸炎の養子移入モデルにおける、ビヒクル対処置マウスにおける疾患活性指数スコアに対する経口ＢＴ−１１投与の効果。フローサイトメトリーを使用して、ＢＴ−１１による処置後のＭＬＮにおける（Ａ）ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞、（Ｂ）ＣＤ４＋ＩＬ−１０＋Ｔ細胞、（Ｃ）ＣＤ４５＋ＩＦＮｇ＋細胞、及び脾臓における（Ｄ）ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞、（Ｅ）ＣＤ４＋ＩＬ−１０＋Ｔ細胞、（Ｆ）ＣＤ４５＋ＩＦＮｇ＋細胞のレベルをアッセイした。群間の統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される。
【図３３】慢性大腸炎の養子移入モデルにおける、ビヒクル対処置野生型対ＰＰＡＲγ−／−移入マウスにおける疾患活性指数スコアに対する経口ＢＴ−１１投与の効果。ＲＡＧ２−／−マウスに野生型またはＰＰＡＲγ−／−ドナーのいずれかに由来する４００，０００個のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を腹腔内移入した後、ビヒクルまたはＢＴ−１１で処置した。（Ａ）疾患活性指数スコア対移入後の時間が示される。結腸における病理組織学的病変を、（Ｂ）白血球浸潤、（Ｃ）粘膜肥厚、及び（Ｄ）上皮侵食に基づいて評価した。群間の統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される。
【図３４】糖尿病を有するＮＯＤマウスにおける空腹時血中グルコース及びインスリンレベルに対する経口ＢＴ−１１投与の効果。（Ａ）空腹時血中グルコースレベルを、ビヒクルまたはＢＴ−１１（８０ｍｇ／ｋｇ／ｄ）による処置の０、１、３、４、５、１０、及び１１週目に評定した。（Ｂ）空腹時血清インスリンレベルを、ビヒクルまたはＢＴ−１１（８０ｍｇ／ｋｇ／ｄ）かのいずれかによる処置の５週目に評定した。統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される（ｎ＝１０）。
【図３５】１型糖尿病マウスの膵臓内の病変形成における経口ＢＴ−１１投与の効果。病理組織学的病変を、白血球浸潤、病変形成、及び組織侵食に基づいて評価した。群間の統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される。
【図３６】（Ａ）空腹時血中グルコースレベル及び（Ｂ）グルコース耐性試験に対する経口ＢＴ−１１投与の効果。（Ａ）マウスを１２時間絶食させ、実験開始後２及び１２週目に血中グルコースレベルを評定した。（Ｂ）また、マウスをＩＰグルコース注射（２ｇ／Ｋｇ）でチャレンジし、グルコースを測定した。統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される。
【図３７】白色脂肪組織（ＷＡＴ）内に浸潤する炎症促進性集団に対する経口ＢＴ−１１投与の効果。ＷＡＴを切除し、消化し、免疫表現型検査の結果をフローサイトメトリーによって評定した。（Ａ）浸潤マクロファージ及び（Ｂ）Ｌｙ６ｃ高ＧＲ１＋浸潤細胞のレベルが示される。統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される。
【図３８】糖尿病のｄｂ／ｄｂモデルにおけるグルコースホメオスタシスに対する経口ＢＴ−１１投与の効果。（Ａ）実験開始後１及び３週目の、ＢＴ−１１またはビヒクルのいずれかで処置されたレプチン受容体欠損（ｄｂ／ｄｂ）マウスの空腹時血中グルコース（ＦＢＧ）濃度が示される。（Ｂ）腹腔内グルコースチャレンジ（１ｇ／Ｋｇ体重）後の血漿グルコースレベルが示される。グルコース負荷の前（０）、次にその１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、２２０、及び２６５分間後に血液を採取した。群間の統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される。
【図３９】食事誘発性肥満を有するマウスに由来する白色脂肪組織（ＷＡＴ）におけるＬＡＮＣＬ２、ＴＮＦα、及びＭＣＰ−１の発現に対する経口ＢＴ−１１投与の効果。ＬＡＮＣＬ２、ＴＮＦα、及びＭＣＰ−１の遺伝子発現分析を、未処置マウスと比較して評価した。ゼロの線は、ビヒクルのみを受けたマウスのベースラインを表す。
【図４０】インフルエンザウイルスに感染したマウスの臨床スコア及び罹患率に対する経口ＢＴ−１１投与の効果。マウスをインフルエンザウイルスに感染させ、実験を通して臨床的にスコア化した。臨床スコアは、（Ａ）活性及び（Ｂ）身体的外観について記した。（Ｃ）罹患率の変化を示すために、体重の１５％を損失したマウスのパーセンテージをプロットした。群間の統計的有意差（Ｐ＜０．０５）は、アスタリスクで示される。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
一般定義
別途明記されない限り、以下の定義は本出願を通して使用される。
【００２４】
分散分析（ＡＮＯＶＡ）：データセットの全体的な変動を変動要因に基づいて特定の成分に分割する算術方法。これは、治療群間の数値的差異が統計的に有意であるか否かを決定するために使用されている。
【００２５】
脂肪生成：新しい脂肪細胞または脂肪蓄積細胞が生成されるプロセス。
【００２６】
対立遺伝子：同じ遺伝子をコードするいくつかの生存可能なＤＮＡのうちの１つ。
【００２７】
共役ジエン：単結合によって分離された２つの二重結合を含む分子。
【００２８】
Ｄｂ／ｄｂマウス：レプチン受容体の長いアイソフォームの両方の対立遺伝子を欠いているタイプのマウスを定義するために使用される用語。この欠乏により、２型糖尿病を発症する傾向が高くなる。Ｄｂ／ｄｂマウスの詳細については、以下の例を参照のこと。
【００２９】
エナンチオマー：光学異性体；偏光の平面を時計回り（＋）または反時計回り（−）に回転させるそれらの能力に基づく分子の化学的分類。
【００３０】
グリセミア：血液中のグルコース濃度。
【００３１】
高血糖：正常範囲を超える血液中のグルコース濃度の増加。
【００３２】
高インスリン血症：正常範囲を超える血液中のインスリン濃度の増加。
【００３３】
インスリン血症：血液中のインスリン濃度。
インスリン抵抗性：インスリンに応答することも血液からグルコースを取り込むこともできない組織の能力。
【００３４】
実質的に純粋な：少なくとも９０重量％、好ましくは、９８重量％、９９重量％、または約１００重量％のような少なくとも９５重量％の純度を有すること。
【００３５】
２型糖尿病または非インスリン依存性糖尿病：インスリンの作用に対する細胞の無応答によって引き起こされる一般的なタイプの糖尿病を指す用語。細胞がインスリンに応答しない場合、細胞は血液からグルコースを取り込むことができず、その結果、グルコトキシ毒性が生じる。さらに、細胞はグルコース酸化に由来するエネルギーから奪われている。
【００３６】
ＩＢＤ：炎症性腸疾患（ＩＢＤ）には、あなた達の消化管のすべてまたは一部の慢性炎症が含まれる。ＩＢＤには主に潰瘍性大腸炎及びクローン病が含まれる。両方とも通常、重度の下痢、痛み、疲労、及び体重減少を伴う。ＩＢＤは衰弱させる可能性があり、時には生命を脅かす合併症を引き起こす可能性がある。
【００３７】
潰瘍性大腸炎（ＵＣ）：ＵＣは、あなた達の大腸（結腸）及び直腸の最も内側の内層に持続性の炎症及び潰瘍（潰瘍）を引き起こすＩＢＤである。
【００３８】
クローン病：クローン病は、あなた達の消化管の内層の炎症を引き起こすＩＢＤである。クローン病では、炎症はしばしば罹患組織の深部に広がる。炎症は、消化管の様々な領域（大腸、小腸、またはこれらの両方）に関与し得る。
【００３９】
ＩＬ−１０：ヒトサイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）としても知られるインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は、抗炎症性サイトカインである。ヒトにおいて、ＩＬ−１０は、ＩＬ１０遺伝子によってコードされる。
【００４０】
ＦＯＸＰ３：ｓｃｕｒｆｉｎとも呼ばれるＦＯＸＰ３（フォークヘッドボックスＰ３）は、免疫系応答に関与するタンパク質である。ＦＯＸタンパク質ファミリーのメンバーであるＦＯＸＰ３は、調節性Ｔ細胞の発達及び機能におけるマスター調節体（転写因子）として機能するようである。
【００４１】
ＴＮＦ−アルファ：腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、カキシキシン、またはカケクチン、及び以前は腫瘍壊死因子アルファまたはＴＮＦαとしても知られていた）は、全身性炎症に関与するサイトカインであり、急性期反応を刺激するサイトカイン群のメンバーである。
【００４２】
ＭＣＰ１：単細胞化学誘引物質タンパク質−１。内皮細胞、マクロファージに見られ、及び冠状動脈バイパス手術を受けている患者の血管平滑筋細胞における、アテローム性動脈硬化症病変の発症に重要なＣＣサイトカインのより古い用語。公式に好ましい用語は、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２である。
【００４３】
インターフェロンガンマ：インターフェロンガンマは、炎症性二量体化可溶性サイトカインであり、インターフェロンのＩＩ型クラスの唯一のメンバーである。
【００４４】
１型糖尿病：１型糖尿病は、かつては若年性糖尿病またはインスリン依存性糖尿病として知られていたが、膵臓がインスリンをほとんどまたはまったく産生しない慢性状態であり、糖（グルコース）が細胞に入ってエネルギーを生成するのに必要なホルモンである。
【００４５】
白血球浸潤：白血球浸潤とは、修復プロセスを開始するために傷ついた組織に白血球を移動または浸透させるプロセスを指す。
【００４６】
化学定義
用語「アルキル」は、それ自体または別の置換基の一部として、別途明記されない限り、完全に飽和した直鎖状、分枝鎖状、または環状の炭化水素ラジカルもしくはそれらの組み合わせを意味し、及び多価ラジカルを含み得、指定された炭素原子の数を有する（例えば、Ｃ1〜Ｃ10は、包括的に、１〜１０個の炭素原子を意味する）。アルキル基の例としては、限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）エチル、シクロプロピルメチル、ならびにそれらの同族体及び異性体、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル等が挙げられる。別段の記載がない限り、「アルキル」という用語には、「ヘテロアルキル」及び「シクロアルキル」として以下でより詳細に定義されるアルキルの誘導体も含まれる。
【００４７】
「アルケニル」という用語は、１つ以上の二重結合を含むことを除いて、上で定義したアルキル基を意味する。アルケニル基の例には、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）等の高級同族体及び異性体が含まれる。
【００４８】
「アルキニル」という用語は、１つ以上の三重結合を含むことを除いて、上で定義したアルキルまたはアルケニル基を意味する。アルキニル基の例には、エチニル、１−及び３−プロピニル、３−ブチニルなどの高級同族体及び異性体が含まれる。
「アルキルレン」、「アルケニレン」、及び「アルキニレン」という用語は、単独でまたは別の置換基の一部として、それぞれ、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−で例示されるアルキル基、アルケニル基、またはアルキニル基由来の二価ラジカルを意味する。
【００４９】
典型的には、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、アルケニレン、及びアルキニレン基は、１〜２４個の炭素原子を有する。本発明においては、炭素数１０以下を有するこれらの基が好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」におけるように、これらの基のいずれかに適用した場合の「低級」という用語は、炭素原子の数が１０個以下の基を示す。
【００５０】
「置換された」とは、１つ以上の置換基をさらに含む本明細書に記載の化学基を指し、低級アルキル、アリール、アシル、ハロゲン（例えば、ＣＦ3のようなアルキルハロ）、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アシルアミノ、チオアミド、アシルオキシ、アリールオキシ、アリールオキシアルキル、メルカプト、チア、アザ、オキソ、飽和及び不飽和の両方の環状炭化水素、複素環などである。これらの基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキルレン、アルケニレン、及びアルキニレン部分のあらゆる炭素または置換基に結合していてもよい。さらに、これらの基は、炭素鎖自体から垂れ下がっていても、それと一体であってもよい。
【００５１】
「アリール」という用語は、本明細書では、芳香族置換基を指すために使用され、それは、一緒に縮合し、共有結合し、またはジアゾ、メチレン、もしくはエチレン部分のような共通の基と結合する。一般的な連結基は、ベンゾフェノンのようにカルボニルであってもよい。芳香環（複数可）には、例えば、とりわけ、フェニル、ナフチル、ビフェニル、ジフェニルメチル、及びベンゾフェノンが含まれ得る。「アリール」という用語は、「アリールアルカリ」及び「置換アリール」を包含する。フェニル基の場合、アリール環は、一置換、二置換、三置換、四置換、または五置換されてもよい。より大きな環は、置換されていないか、または１つ以上の置換基を持っていてもよい。
【００５２】
「置換アリール」とは、上記のアリールを指し、１つ以上の官能基を含み、例えば、低級アルキル、アシル、アルキルハロ（例えば、ＣＦ3）、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、フェノキシ、メルカプト、及び芳香族環（複数可）と融合し、ジアゾ、メチレン、またはエチレン部分のような共通基に共有結合または結合した飽和及び不飽和の両方の環状炭化水素である。連結基はまた、シクロヘキシルフェニルケトンなどのカルボニルであってもよい。用語「置換アリール」は、「置換アリールアルキル」を包含する。
【００５３】
「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、本明細書では、フッ素、臭素、塩素、及びヨウ素原子を指すために使用される。
【００５４】
用語「ヒドロキシ」は、本明細書では基−ＯＨを指すために使用される。
【００５５】
「アミノ」という用語は、Ｒ及びＲ’が独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、またはそれらの置換類似体であるＮＲＲ’を示すために使用される。「アミノ」は、第二級アミン及び第三級アミンを示す「アルキルアミノ」及び基ＲＣ（Ｏ）ＮＲ’を示す「アシルアミノ」を包含する。
【００５６】
投与
本発明の方法の過程において、本発明の治療的に有効な量の化合物は、多くの方法で、哺乳類及びヒトを含む動物に投与することができる。好ましい実施形態では、本発明の化合物は、経口投与または非経口投与され、他の形態の投与、例えば、医療用化合物によるものもまたはエアゾールが考慮される。
【００５７】
経口投与の場合、有効量の化合物は、例えば、固体、半固体、液体、または気体の状態で投与することができる。特定の例は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、溶液、懸濁液、シロップ、及びエリキシル剤を含む。しかしながら、化合物は、これらの形態に限定されるものではない。
【００５８】
本発明の化合物を錠剤、カプセル、粉末、顆粒、溶液、または懸濁液へ製剤化するために、化合物は、好ましくは結合剤、崩壊剤、及び／または滑沢剤と混合される。必要に応じて、得られた組成物を、希釈剤、緩衝剤、浸透剤、防腐剤、及び／または香味剤と、既知の方法を用いて混合することができる。結合剤の例としては、結晶性セルロース、セルロース誘導体、コーンスターチ、シクロデキストリン、及びゼラチンが挙げられる。崩壊剤の例としては、コーンスターチ、ポテトデンプン、及びカルボキシメチルセルロースナトリウムが挙げられる。潤滑剤の例としては、タルク及びステアリン酸マグネシウムが挙げられる。また、従来から使用されているラクトースやマンニトールなどの添加剤を使用することもできる。
【００５９】
非経口投与の場合、本発明の化合物は、直腸投与または注射によって投与することができる。直腸投与には、坐剤を使用することができる。坐剤は、本発明の化合物を、体温で融解するが、室温では固体のままである薬学的に好適な賦形剤と混合することによって調製することができる。例としては、カカオバター、カーボンワックス、及びポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。得られた組成物は、本分野で既知の方法を用いて任意の所望の形態に成形することができる。
【００６０】
注射による投与の場合、本発明の化合物は、皮下、皮内、静脈内、または筋肉内注射することができる。このような注射用の医薬品は、本発明の化合物を、公知の方法で植物油、合成樹脂酸のグリセリド、高級脂肪酸のエステル、またはプロピレングリコールなどの水性または非水性溶媒に溶解、懸濁、または乳化させることによって調製され得る。また、必要に応じて、慣用される可溶化剤、浸透圧調整剤、乳化剤、安定剤または防腐剤などの添加剤を添加することもできる。必要ではないが、組成物を殺菌または滅菌することが好ましい。
【００６１】
本発明の化合物を製剤化して、懸濁液、シロップ、またはエリキシル剤にするために、薬学的に好適な溶媒を使用することができる。これらの中には、水の非限定的な例が含まれる。
【００６２】
本発明の化合物は、医薬を調製するための他の薬学的に好適な活性を有する追加の化合物と一緒に使用することもできる。本発明の化合物をスタンドアロン化合物としてまたは組成物の一部として含有する薬物のいずれかを、それを必要とする対象の治療に使用することができる。
【００６３】
本発明の化合物はまた、気体状または液体状の噴霧剤と一緒に、液体または微粉体の形態で化合物を充填することによって調製されたエアロゾルまたは吸入剤の形態で投与されてもよく、エアロゾル容器または噴霧器などの非加圧容器に、必要に応じて膨張剤などの公知の補助剤を充填してもよい。、例えば、ジクロロフルオロエタン、プロパン、または窒素の加圧ガスが、噴霧剤として使用されてもよい。
【００６４】
本発明の化合物は、錠剤、カプセル、溶液、またはエマルジョンなどの医薬組成物として、それを必要とする哺乳類及びヒトを含む動物に投与することができる。単一投与または複数投与において、限定されないが、それらのエステル、その薬学的に好適な塩、それらの代謝産物、その構造的に関連する化合物、それらの類似体、及びそれらの組み合わせを含む、本発明に記載の他の形態の化合物の投与もまた本発明によって意図される。
【００６５】
本発明の化合物はまた、食品または栄養補助食品として、栄養添加物として必要とする動物に投与することができる。
【００６６】
「予防する」、「治療する」、または「改善する」及び本明細書中で使用される同様の用語は、予防及び完全または部分治療を含む。この用語には、症状の軽減、症状の改善、症状の重症度の低下、疾患の発生率の低下、または治療結果を改善する患者の状態のその他の変化も含まれ得る。
【００６７】
本発明に記載された化合物は、好ましくは、組成物の形態で使用される及び／または投与される。好適な組成物は、好ましくは、医薬組成物、食料品、または食品補助剤である。これらの組成物は、化合物を送達するのに便利な形態を提供する。本発明の組成物は、酸化または溶解度に対する化合物の安定性を増大させるのに有効な量の酸化防止剤を含み得る。
【００６８】
本発明の方法において投与される化合物の量または本発明の使用における投与のための化合物の量は、任意の好適な量である。好ましくは、それは、１日あたり約０．０００１ｇ〜約２０ｇ（より好ましくは０．０１ｇ〜１ｇ、例えば０．０５ｇ〜０．５ｇ）の化合物である。好適な組成物をそれに応じて製剤化することができる。生物学的に活性な薬剤を投与する当業者は、知られまたはよく理解されているパラメータに基づいて、様々な対象のための特定の投薬レジメンを開発することができるであろう。
【００６９】
本発明による好ましい組成物は、医薬組成物であり、例えば、カプセル、ピル、カプレット、多粒子（顆粒、ビーズ、ペレット及びマイクロカプセル化粒子を含む）、粉末、エリキシル剤、シロップ、懸濁液、及び溶液である。医薬組成物は、典型的には薬学的に許容される希釈剤または担体を含むだろう。医薬組成物は、好ましくは、経口投与または非経口投与するために適合される。経口投与可能な組成物は、個体または液体形態であり得、とりわけ、錠剤、粉末、懸濁液、及びシロップの形態を取ってもよい。必要に応じて、組成物は、１つ以上の香味剤及び／または着色剤を含む。一般に、治療用及び栄養組成物は、化合物の作用により対象に対して著しく妨害しない任意の物質を含むことができる。
【００７０】
そのような組成物における使用に適した薬学的に許容される担体は、薬学の分野において周知である。本発明の組成物は、０．０１〜９９重量％の本発明の化合物を含有することができる。本発明の組成物は概して、単位剤形で調製される。好ましくは、本発明に記載の化合物の単位用量は、１ｍｇ〜１０００ｍｇ（より好ましくは５０ｍｇ〜５００ｍｇ）である。これらの組成物の調製に使用される賦形剤は、当該分野で公知の賦形剤である。
【００７１】
組成物のための製品形態のさらなる例は、食品栄養補助剤であり、例えば、ゼラチン、デンプン、加工デンプン、グルコース、スクロース、ラクトース、及びフルクトースのようなデンプン誘導体からなる群から選択されるカプセル化材料を有する軟質ゲルまたは硬質カプセルの形態である。カプセル化材料は、必要に応じて架橋剤、または重合剤、安定剤、酸化防止剤、感光性充填剤を保護するための光吸収剤、防腐剤などを含んでもよい。好ましくは、食品栄養補助剤の化合物の単位用量は、１ｍｇ〜１０００ｍｇ（より好ましくは５０ｍｇ〜５００ｍｇ）である。
【００７２】
一般に、担体という用語は、記載された化合物と混合することができる組成物を表すために、本出願を通じて使用されてもよく、それは、医薬担体、食料品、栄養補助食品、または食事補助剤であってもよい。上記の材料は、本発明の目的のための担体とみなすことができる。本発明の特定の実施形態では、担体は、本発明の化合物に対してほとんどまたはまったく生物活性を有さない。
【００７３】
投与量：本発明の方法は、それを必要とする動物に対して治療有効量の化合物を投与することを含み得る。化合物の有効量は、投与される化合物の形態、投与期間、投与経路（例えば、経口または非経口）、動物の年齢、及び動物またはヒトを含む動物の状態に依存する。
【００７４】
例えば、動物において、２型糖尿病、前糖尿病、１型糖尿病、耐糖能障害、インスリン抵抗性、潰瘍性大腸炎、もしくはクローン病、または本明細書に記載の他の状態を治療または予防するために有効な化合物の量は、０．１〜１０，０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり得る。好ましい化合物の有効量は、１〜５，０００ｍｇ／ｋｇ／日であり、より好ましい投与量は２〜１００ｍｇ／ｋｇ／日である。我々の毒物学データが示すように、化合物は比較的毒性がないので、投与量の上限は重要ではない。約７〜１００日の期間、より好ましくは１５〜５０日の期間、及び最も好ましい３０〜４２日の期間の範囲の間、動物に投与される場合、化合物の有効量は、腫瘍性大腸炎、クローン病、２型糖尿病、１型糖尿病、前糖尿病、メタボリックシンドローム、耐糖能障害、及び動物のインスリン抵抗性を治療または予防することにおいて最も有効である。
【００７５】
免疫系の過活性化を防止するのに最も有効な量の化合物は、０．１〜５００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり、好ましい用量は１〜１５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり得る。
【００７６】
有効量の本発明の化合物が、栄養的、治療的、医学的、または獣医学的組成物において投与される場合、好ましい用量は、食品または栄養補給食品に対して約０．０１〜２．０重量％の範囲である。
特定の他の実施形態では、本発明は、ＩＢＤ及び胃腸管炎症の治療及び予防におけるＬＡＮＣＬ２結合性化合物及び構造的に関連する化合物、例えば、化合物、そのエステル、その薬学的に好適な塩、その代謝産物、その構造的に関連する化合物、またはその組み合わせからなる群から選択される化合物の使用のために提供する。
【００７７】
さらに、概して、本発明は、関連する成分が胃、小腸、大腸及び直腸を含む消化管における炎症の阻害に関する。この効果は、生物学的効果を誘発する体内の様々な細胞タイプへの、化合物の曝露に起因する。細胞は、胃腸管組織、免疫細胞（すなわち、マクロファージ、単球、リンパ球）、または上皮細胞由来のものを含むことができる。特定の実施形態では、本発明は、炎症性腸疾患、クローン病、または潰瘍性大腸炎に関連する炎症を軽減または予防するために、本発明の化合物、例えば栄養補助食品で対象を治療することを提供する。本発明はまた、腸における細胞接着分子の発現を抑制するために、本発明の化合物を消化管に投与することを企図する。
【００７８】
実施される場合、本発明の方法は、上記のような任意の許容可能な形態を使用して任意の許容される投与経路を介して対象に化合物を投与する方法、及び対象の身体が自然プロセスを介して標的細胞に化合物を分配することを可能にする方法によるものである。上述のように、投与は、同様に、標的細胞（すなわち、治療される細胞）を含む部位（例えば、器官、組織）への直接注射による投与であってもよい。
【００７９】
さらに、投与することは任意の数のレジメンに従い得る。したがって、これは、実験的化合物の単回投与もしくは投薬、または、一定期間にわたる複数回の投与もしくは投薬を含み得る。したがって、治療は、所望の結果が達成されるまでステップを１回以上繰り返すことを含み得る。特定の実施形態において、治療は、数週間、数ヶ月または数年などの長期間にわたって継続することができる。当業者は、当該技術分野における既知のパラメータに基づいて、個体のための好適な投薬レジメンを容易に十分に開発することができる。本発明の化合物の投与量は、本発明のこれらの実施形態の方法において使用することができる。ＩＢＤの治療、消化管炎症の治療または腸内の細胞接着分子の発現を抑制することに関して、化合物を約１ｍｇ／日〜９，０００ｍｇ／日の量で投与することが好ましい。
【００８０】
投与される量は、対象、疾患または障害のステージ、対象の年齢、対象の一般的健康状態、及び医学分野の当業者にとって既知の日常的に考慮される種々の他のパラメータに依存して変化するだろう。一般的には、胃腸管における炎症の量の検出可能な変化を生じさせるために十分な量の化合物が投与され、ＩＢＤはしばしば個体が苦しんでいる痛みの量に関連する。現在ＩＢＤ症状を経験していない患者では、誰かが探すかもしれない変化は、免疫細胞上のＴＮＦα発現または血中の調節性Ｔ細胞の百分率のような免疫細胞パラメータを含み得る。好適な量が本明細書に開示されており、追加の好適な量は、本明細書に開示された量に基づいて、過度の実験もなしに、当業者によって特定され得る。
【００８１】
１つの態様において、本発明は、ＩＢＤに罹患している対象、またはさもなくば、おそらくＩＢＤを発症することによる、クローン病または潰瘍性大腸炎の遺伝的素因を備えた健康な個体を治療または予防する方法を提供する。この方法は、ＩＢＤの寛解型のものを治療することも含む。本発明によれば、用語「ＩＢＤに罹患している対象」は、ＩＢＤに典型的な１つ以上の臨床的徴候を示す疾患または障害を有する対象（例えば、動物、ヒト）を意味するために使用される。一般に、本発明のこの態様による治療または予防方法は、ＩＢＤの１つ以上の症状もしくは臨床発症を治療もしくは予防する上で、またはそのような症状（複数可）もしくは発症（複数可）の発展を予防する上で有効である化合物治療剤の量を対象に投与することを含む。
【００８２】
したがって、本発明の方法によれば、本発明は、ＩＢＤ、腸内感染に関連する炎症及び自己免疫疾患に関連する炎症の治療方法を提供し得る。治療の方法は、予防的方法であり得る。特定の実施形態では、方法は、ＩＢＤ、腸内感染に関連する炎症及び自己免疫疾患に関連する炎症を治療する方法である。他の実施形態では、方法は、ＩＢＤを予防する方法である。実施形態では、方法は、ＩＢＤの寛解型が活性になるのを防ぐ方法である。さらに他の実施形態では、方法は、ＩＢＤに罹患している対象の健康状態、腸内感染に関連する炎症及び自己免疫疾患に関連する炎症を改善する方法である。胃腸感染症を引き起こす生物には、以下が含まれるが、これらに限定されない：エシェリヒア・コリ、シゲラ、サルモネラ、病原性ビブリオス、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ、トキソプラズマ・ゴンディイ、エンテロモバヒストリチカ及びジアルジア・ランブリア。したがって、特定の実施形態では、本発明は、ＩＢＤに罹患している対象の健康、器官、及び／または組織、腸内感染に関連する炎症及び自己免疫疾患に関連する炎症、またはＩＢＤの発症リスクでの腸内感染に関連する炎症及び自己免疫疾患に関連する炎症を保護する方法を提供する。
【００８３】
本発明の一実施形態において、ＩＢＤを治療する方法は、例えば、有意な体重増加、全身免疫抑制、クッシング様外観、骨減少症／骨粗鬆症、現在利用可能なＩＢＤ治療（すなわち、コルチコステロイド、腫瘍壊死因子アルファインヒビター）に共通する膵炎のような識別可能な副作用を引き起こすことなくＩＢＤを治療することを含む。すなわち、いくつかの細胞においてＬＡＮＣＬ２の発現及び／または活性化に影響を及ぼすことによって、少なくとも部分的に治療効果を提供する本発明による治療の方法は、例えば、治療を受けていない他の同様の対象と比較して、治療されている対象における流体保持により体重の有意な増加を引き起こさずに有益な効果を提供することが見出された。
【００８４】
このように、本発明の方法は、炎症を軽減する方法を提供することができる。方法は、全身的に（すなわち被験体の体全体に）または局所的に（例えば、投与部位またはＴ細胞及びマクロファージを含むがこれに限定されない炎症細胞の部位における）炎症を軽減することができる。本発明の方法による炎症を予防または治療する場合、見ることのできる１つの効果は、腸に浸透する血液単球またはマクロファージ及びリンパ球の和の減少である。もう１つは、ＣＤ４+ＣＤ２５+ＦｏｘＰ３+調節性Ｔ細胞などの調節性免疫細胞集団の増加、またはリンパ球もしくはマクロファージ（例えば、インターロイキン４（ＩＬ−４）もしくはＩＬ−１０の増加またはＴＮＦ−α及びＩＬ−６の減少）の調節特性の増加であり得る。もう１つは、炎症性遺伝子及び／または接着分子の存在の減少であり得る。したがって、方法はまた、化合物治療剤が投与される対象の免疫応答に影響するまたはその免疫応答を変化させる方法を意図し得る。対象は、炎症性腸疾患またはＴ細胞の免疫調節もしくは細胞接着分子のダウンレギュレーションが望ましい結果である別の状態であってもよい。
【００８５】
本発明はまた、本明細書に記載の化合物で感染症を治療する方法を提供する。そのような感染性疾患の非限定的な例には、ウイルス感染、細菌感染、及び真菌感染が含まれる。
【００８６】
ウイルス感染の非限定的な例としては、アデノウイルス科のウイルス由来の感染、例えばとりわけ、アデノウイルス；単純ヘルペスのようなヘルペスウイルス科のウイルス、１型、単純ヘルペス、２型、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス、及び８型；ヒトパピローマウイルスのようなパピローマウイルス科のウイルス；ＢＫウイルス及びＪＣウイルスのようなポリオーマウイルス科のウイルス；天然痘のようなポックスウイルス科のウイルス；Ｂ型肝炎ウイルスのようなヘパドナウイルス科のウイルス；ヒトボカウイルス及びパルボウイルスＢ１９のようなパルボウイルス科のウイルス；ヒトアストロウイルスのようなアストロウイルス科のウイルス；ノーウォークウイルスのようなカリシウイルス科のウイルス；コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、及びライノウイルスのようなピコルナウイルス科のウイルス；急性呼吸器症候群ウイルスのようなコロナウイルス科のウイルス；Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス及びウエストナイルウイルスのようなフラビウイルス科のウイルス、風疹ウイルスのようなトガウイルス科のウイルス；Ｅ型肝炎ウイルスのようなヘペスウイルス科のウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のようなレトロウイルス科のウイルス；インフルエンザウイルスのようなオルトミクソウイルス科のウイルス；グアナリトウイルス、ジュニアウイルス、ラッサウイルス、マッポウイルス、及びサビアウイルスのようなアレナウイルス科のウイルス；クリミア・コンゴ出血熱ウイルスのようなブンヤウイルス科のウイルス；エボラウイルス及びマールブルグウイルスのようなフィロウイルス科のウイルス；麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ヘンドラウイルス、及びニパウイルスのようなパラミクソウイルス科のウイルス；狂犬病ウイルスのようなラブドウイルス科のウイルス；Ｄ型肝炎ウイルスのような未割り当てウイルス；ならびにロビウイルス、オルビウイルス、コルチウイルス、及びバンナウイルスのようなレオウイルス科のウイルス由来の感染を含む。
【００８７】
細菌感染症の非限定的な例としては、炭疽菌、バチルスセレウス、百日咳菌、ボレリア・ブルグドルフェリ、ブルセラ・アボタス、ブルセラ・カニス、ブルセラ・メリテンシス、ブルセラ・スイスカンピロバクター・ジェジュニクラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマチス、クラミドフィラ・シッタタシ、ボツリヌス菌、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）クロストリジウム・テタニ、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、フランシスセルラ・トラレンシス、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ、レジオネラ・ニューモフィラ、レプトスピラ・インタログ、リステリアモノサイトゲネス、マイコバクテリウム・レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・ウルセランス、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、リケッチア・リケッツィ、サルモネラ・チフィ、サルモネラ・ティフィムリウム、赤痢菌、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ、肺炎連鎖球菌、ストレプトコッカス・ピオゲネス、トレポネーマ・パリダム、ビブリオコレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、エルシニア・ペスティス、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、エルシニア偽結核症、及び上記生物の属に由来する他の種に加えて、上述した細菌による感染を含む。
【００８８】
真菌感染の非限定的な例には、アスペルギルス症の原因となるアスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）のようなアスペルギルス属の真菌；ブラストミセス症を引き起こすブラストミセス・デルマチチディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）のようなブラストミセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）属の真菌；カンジダ症を引き起こすカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）のようなキャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ属）の真菌；コクシジオイデス菌症（谷熱）を引き起こすコクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属の真菌；クリプトコッカス症を引き起こす（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）及びクリプトコッカス・ガッティ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｔｔｉｉ）のようなクリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の真菌；線虫を引き起こす皮膚糸状菌；フザリウム種、アスペルギルス種、カンジダ種のような真菌性角膜炎を引き起こす真菌；ヒストプラスマ症を引き起こすヒストプラスマ・カプスラツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）のようなヒストプラスマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）属の真菌；ムコール症を引き起こすムコール属の真菌；サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のようなサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の真菌；ニューモシスチス肺炎を引き起こすニューモシスチス・ジロベイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）のようなニューモシスティス（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）属の真菌；ならびにスポロトリコーシスを引き起こすスポロトリックス・シェンキィのようなスポロトリックス属の真菌での感染を含む。
【００８９】
本発明はまた、本明細書に記載の化合物で自己免疫炎症性疾患を治療する方法を提供する。自己免疫炎症性疾患の非限定的な例としては、とりわけ炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性狼瘡、関節リウマチ、１型糖尿病、乾癬、及び多発性硬化症が挙げられる。
【００９０】
本発明はまた、本明細書に記載の化合物で慢性炎症性疾患を治療する方法を提供する。慢性炎症性疾患の非限定的な例には、とりわけメタボリックシンドローム、肥満、前糖尿病、心血管疾患、及び２型糖尿病が含まれる。
【００９１】
本発明はまた、１型糖尿病、２型糖尿病、及び他のタイプの糖尿病を含む、本明細書に記載の化合物で糖尿病を治療する方法を提供する。用語「糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ）」または「糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ）」は、対象が高血糖（すなわち、高血糖（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ））を有する代謝障害を包含するために使用される。高血糖状態は、膵臓が十分なインスリンを産生しないまたは細胞が産生されるインスリンに応答しないなどの様々な病因を有する。糖尿病のいくつかの認識されたサブタイプがある。１型糖尿病は、身体がインスリンをまったく産生しない、または身体が十分なインスリンを産生しないということで特徴づけられる。２型糖尿病は概して、細胞がインスリンを適切に使用できない状態であるインスリン抵抗性に起因する。２型糖尿病は時にはインスリン欠乏を併発する。妊娠中の糖尿病は、糖尿病の診断を受けていない妊婦が高血糖を発症したときに起こる。あまり一般的でない糖尿病は、先天性糖尿病（インスリン分泌に関連する遺伝的欠陥による）、嚢胞性線維症関連糖尿病、高用量のグルココルチコイドによって誘導されるステロイド糖尿病、及び（若者の成熟発症糖尿病を含む）一遺伝子的糖尿病のいくつかの形態を含む。一遺伝子的糖尿病は、単一の常染色体優性遺伝子における突然変異（高血糖症をもたらすより複雑な多遺伝子病因と対照的に）に起因する糖尿病のいくつかの遺伝型を包含する。
【００９２】
上記の方法を考慮すると、本発明は、対象の細胞を処置する場合など、細胞を接触させる場合に使用するためのＬＡＮＣＬ２結合性化合物療法を提供することは明らかである。上記の議論は、概して医薬品または医療設定とみなされ得るものにおける使用のための組成物の一部としての本発明の化合物の使用に焦点を当てている。
【００９３】
ＩＢＤ、胃腸管炎症及び記載された他の状態の治療のために本発明に記載の化合物は、上記により詳細に記載したように、医薬品、栄養組成物、機能性食品組成物、または食事補助剤として製剤化することができる。
【００９４】
本明細書に記載されている要素及び方法ステップは、明示的に記載されていなくても、任意の組み合わせで使用することができる。
【００９５】
本明細書で使用される方法ステップの全ての組み合わせは、他に特定されない限り、参照された組み合わせがなされる文脈によって反対と明らかに示唆されない限り、任意の順序で実行され得る。
【００９６】
本明細書で使用するように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。
【００９７】
本明細書で使用される数値範囲は、具体的に開示されているか否かにかかわらず、その範囲内に含まれる全ての数及びサブセットの数値を含むことが意図されている。さらに、これらの数値範囲は、その範囲内の任意の数または数字のサブセットに向けられた特許請求の範囲のためのサポートを提供するものと解釈されるべきである。例えば、１〜１０の開示は、２〜８、３〜７、５〜６、１〜９、３．６〜４．６、３．５〜９．９などの範囲を支持すると解釈されるべきである。
【００９８】
本明細書で引用した全ての特許、特許公報、及びピアレビューされた刊行物（すなわち、「参考文献」）は、それぞれの個々の参考文献が具体的かつ個別に参照により組み入れられるように示されているのと同じ程度に、参照により明示的に組み込まれる。本開示と組み込まれた参考文献との間に矛盾がある場合、本開示は制御する。
【００９９】
本発明は、本明細書に示され及び説明された部分の特定の構造及び配置に限定されるものではなく、特許請求の範囲内に含まれるそのような変更形態を包含すると理解される。
【０１００】
分子モデリングの例
実施例１：ＬＡＮＣＬ２リガンド結合の分子モデリング
前書き
アブシジン酸（ＡＢＡ）及びＮＳＣ６１６１０などの確立されたＬＡＮＣＬ２アゴニストは、ＩＢＤから糖尿病及びインフルエンザまでの広範な疾患モデルにおいて抗炎症活性を発揮する。新たな治療標的としてのＬＡＮＣＬ２の価値は、慢性代謝、免疫介在性、及び感染性疾患の治療ための新しいクラスの経口活性薬物の発見及び開発の努力に値する。
本実施例で論じたように、追加のＬＡＮＣＬ２アゴニストは、計算モデリング及び実験的検証を反復的に組み合わせた合理的薬物設計によって開発された。本実施例は、溶解度を増大させ、ＬＡＮＣＬ２への結合を増加させ、コストを低減し、及びＬＡＮＣＬ２タンパク質そのものを理解するための合理的薬物設計及び医薬化学的努力を増加させるアプローチを示す。
【０１０１】
方法
ＬＡＮＣＬ２の構造ＬＡＮＣＬ２の結晶構造は存在しない。したがって、ＬＡＮＣＬ２の構造及び機能を理解するために、ＬＡＮＣＬ１の結晶構造を鋳型として用いて、ヒトＬＡＮＣＬ２の相同性モデリングを行った。モデルの品質を評価し、改善をエネルギー最小化手順によって行った。相同性モデリングは、構造が実験的に解決されたタンパク質ファミリーの他のメンバーからの相同タンパク質を同定することによって、タンパク質の３Ｄ構造を予測する［５２］。タンパク質が３５％を超える配列同一性を有する場合、それらは相同である可能性が高い。ＬＡＮＣＬ１は、ＬＡＮＣＬ２と５４％の配列同一性を共有する［１５］。
【０１０２】
化合物生成及びリガンド構造。ＬＡＮＣＬ２アゴニストの構造が生成された（図１Ａ及び１Ｂ）。これらのアゴニストのＳＭＩＬＥＳは、ＮＩＨのオンラインＳＭＩＬＥＳ  Ｔｒａｎｓｌａｔｏｒ  ａｎｄ  Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ［５３］を用いて作製した。同時に、個々の構造．ｐｄｂファイルが生成され、ダウンロードされた。ＡｕｔｏＤｏｃｋ  Ｔｏｏｌｓは、ｐｄｂファイルを仮想スクリーニングに必要な．ｐｄｂｑｔに変換するために使用していた。
【０１０３】
バーチャルスクリーニング。生成された派生ファイルのドッキングは、ＡｕｔｏＤｏｃｋツールを使用して実行された。グリッドボックス中心とｘ、ｙ、及びｚ次元とを含む探索空間が定義された。タンパク質のターゲット全体にドッキングを施し、タンパク質の表面全体を覆うグリッドを付けた。格子は、格子点が０．６０８Å離れた規則的な直方体（７７．８Å×７７．８Å×７７．８Å）であった。このグリッドはタンパク質の中心に位置していた。これらの寸法及び間隔は、グリッドがＬＡＮＣＬ２の全表面を覆うことを可能にした。遺伝的アルゴリズムは、確率的大域的最適化に用いられた。１００個の結合コンフォメーションが、各複合体のＡｕｔｏＤｏｃｋ  Ｔｏｏｌｓによって生成された。得られた各誘導体の１００個のポーズは、２．０ÅのＲＭＳＤクラスター公差でクラスター化された。
【０１０４】
バーチャルスクリーニング結果の分析。ＡｕｔｏＤｏｃｋ  Ｖｉｎａを使用して各化合物をＬＡＮＣＬ２に適合させる最善の方法の探求は、ドッキングの記録を含むログファイルをドッキングすることをもたらした、すべての化合物についての各予測された結合モードの結合エネルギーを含む。結合エネルギーは、総分子間エネルギー、総内部エネルギー及びねじり自由エネルギーから非結合系のエネルギーを差し引いた合計を表す。化合物は最も負のエネルギー値でランク付けされた。第１のクラスターにおける最も低い結合エネルギーポーズは、最も好ましいドッキングポーズと考えられた。結合自由エネルギーが低いほど、より安定なタンパク質リガンド系及びタンパク質とリガンドとの間のより高い親和性を示す。例示的な化合物は、ヒト疾患のマウスモデルを用いたインビトロ試験及び前臨床試験によってさらに検証される。
【０１０５】
結果
ＮＳＣ６１６１０ドッキング要約。最低エネルギー位置のエネルギーを有するＮＳＣ６１６１０の上位５つのクラスターのヒストグラムを図２に示す。ＮＳＣ６１６１０は、「中央裂け目」の親和性が非常に高い。上位２つのクラスターは、合計実行の７％を表し、それぞれがこの部位に向いている。２オングストロームの公差のために、他のクラスターがこの部位に向いている可能性がある。次の２つのクラスターは、青色のランダムコイルの近くの「アロステリック部位」に向かう。
【０１０６】
ＡＢＡドッキング要約。最低エネルギー位置のエネルギーを有するＡＢＡの上位５つのクラスターのヒストグラムを図３に示す。ＡＢＡは中程度の親和性を有するが、薄緑色ヘリックス及び薄緑色ランダムコイルの間の「アロステリック」部位に対して非常に高い特異性を有する。実行の２９％がこのトップクラスターに向けられている。第２のクラスターもこの部位に向けられている。２オングストロームの公差のために、他のクラスターがこの部位に向いている可能性がある。第４のクラスターは「中央の裂け目」にあるように見える。これはＡＢＡの真の治療部位の問題を開けたままにする。
【０１０７】
ＢＴ−１１ドッキング要約。最低エネルギー位置のエネルギーを有するＢＴ−１１の上位５つのクラスターのヒストグラムを図４に示す。ＢＴ−１１の上位２つのクラスターは「中央割れ目」に向いているが、実行の２％しか表していない。しかしながら、２オングストロームの公差のために、他のクラスターがこの部位に向いている可能性がある。ＢＴ−１１は、ＮＳＣ６１６１０より僅かに低いがＡＢＡよりも高いこの部位についての親和性を有する。ＢＴ−１１は、治療有効性を示している（下記の実施例参照）。
【０１０８】
ＢＴ−６ドッキング要約。最低エネルギー位置のエネルギーを有するＢＴ−６の上位５つのクラスターのヒストグラムを図５に示す。ＢＴ−６は、ドッキングされたどの化合物よりも親和性が高い。上位２つ、おそらく３つのクラスターは、「中央の裂け目」に向いている。２オングストロームの公差のために、他のクラスターがこの部位に向いている可能性がある。クラスター４は、青色ランダムコイルに沿って「アロステリック」部位に向けられる。
【０１０９】
ＢＴ−１５ドッキング要約。最低エネルギー位置のエネルギーを有するＢＴ−１５の上位６つのクラスターのヒストグラムを図５に示す。ＢＴ−１５は、ＮＳＣ６１６１０またはＢＴ−１１のいずれかの結合親和性を有さない。「中央の裂け目」に向かっているように見えるが、この効果はＮＳＣ６１６１０またはＢＴ−１１ほど顕著ではないようである。
【０１１０】
ＢＴ−ＡＢＡ−５ａドッキング要約。最低エネルギー位置のエネルギーを有するＢＴ−ＡＢＡ−５ａの上位７つのクラスターのヒストグラムを図５に示す。ＢＴ−ＡＢＡ−５ａの最も高い親和性は、以前に調査されたいずれのドッキングでは見られなかった場所にある。しかしながら、クラスター２及び３は３２％の大部分の実行を表す。クラスター２は、右後部のアロステリック部位に向かう。クラスター３は、ＡＢＡの「アロステリック」部位に向かう。クラスター４はまた、この部位２向かう。２オングストロームの公差のために、他のクラスターがこの部位に向いている可能性がある。
【０１１１】
考察
ＡＢＡ及びＮＳＣ６１６１０の両方は、ＬＡＮＣＬ２依存性の免疫調節、抗炎症ならびに抗糖尿病効果を発揮するが、計算上の予測はそれらがＬＡＮＣＬ２の異なる部位で結合することを示唆する。予想通り、合理的に設計されたリガンドは、主にＡＢＡ及びＮＳＣ６１６１０の一次結合部位に向けられる。ＢＴ−ＡＢＡ化合物は、サイズがより小さく、−ＣＯＯＨ官能基を有し、それらが親水性の表面ポケットに向かう直感的な意味を持つ。
ＢＴ化合物ははるかに疎水性であり、それゆえ、アルファヘリックスに囲まれたより疎水性の中央の裂け目に導く直感的な意味を持つ。
【０１１２】
結合親和性は、ＳＰＲデータと適度な相関を有する（図１Ａ及び１Ｂ；以下の実施例を参照のこと）。ＳＰＲデータ（ＫD値を有する）は、ＮＳＣ６１６１０（２．３＆６．３）、ＢＴ−１１（６．３＆７．７）、ＢＴ−１５（１１．４＆２１．４）、ＢＴ−６（１８．２）の結合強度の順序を示唆する。データのモデリング（最も低いＢＥを有する）は、ＢＴ−６（−１０．４７）、ＮＳＣ６１６１０（−１０．２７）、ＢＴ−１１（−９．３９）、ＢＴ−１５（−８．８７）の拘束力の順序を示唆する。ＢＴ−６の最低から第１番目への反転の他に、ＳＰＲデータ及びモデリングデータは、結合強度の同じ順序を示唆する。合理的な薬物設計と組み合わせた分子モデリングデータは、強力な抗糖尿病及び抗炎症特性を利用するためにＬＡＮＣＬ２経路を標的及び活性化する類似体のさらなる開発を可能にするＬＡＮＣＬ２タンパク質のより良い理解をもたらす可能性がある。
【０１１３】
医薬品化学実施例
実施例２：ＢＴ−１１及び塩
スキーム２−１に示されるように、ＤＭＦ（１００ｍＬ）中６−（１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル）ピリジン−２−カルボン酸（１２ｇ）の溶液を０℃に冷却し、その後、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１．５当量）、ＨＯＢｔ（１．５当量）、及びＤＩＰＥＡ（１．２当量、推定密度の体積での取り込み）を連続して添加した。混合物を０℃で１０分間撹拌した。ピペラジン（０．５当量）を添加し、反応混合物を室温になるまで徐々に加温させ、１６時間撹拌した。反応が完了した後（ＴＬＣにより監視、溶出剤：ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ）、反応混合物を氷冷水（約３００ｍＬ）に注ぎ、沈殿した固体を濾過し、氷冷水で洗浄し、乾燥させて、淡茶色の固体としてＢＴ−１１（１０ｇ、７５％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6），δ１３．０（ｓ，１Ｈ），１２．８（ｓ，１Ｈ），８．３８（ｄｄ，２Ｈ），８．１３（ｄｔ，２Ｈ），７．７３（ｄｄ，２Ｈ），７．６７（ｄ，２Ｈ），７．５７（ｄｄ，２Ｈ），７．２５（ｍ，４Ｈ），３．９０（ｂｓ，２Ｈ），３．８０（ｂｄｄ，２Ｈ），３．６５（ｂｄｄ，２Ｈ），３．５６（ｂｓ，２Ｈ）。ＬＣＭＳ−ＥＳ  ５２９．４４［Ｍ＋Ｈ］+、２６５．４６［（Ｍ＋２Ｈ）／２］++。
2019142873.tif 000015
【０１１４】
スキーム２−２に示されるように、最小量のＭｅＯＨ（５ｍＬ）中ＢＴ−１１（１．０当量）の懸濁液を０℃に冷却し、４Ｍのメタノール性ＨＣｌ（過剰、１５ｍＬ／１ｇ）を１５〜２０分間にわたって滴加した。混合物を室温になるまで３時間にわたって徐々に加温させた。反応が完了した後（ＴＬＣによる監視、溶出剤：ＣＨ2Ｃｌ2中１０％ＭｅＯＨ）、揮発物を減圧下で蒸発させた。粗物質をＣＨ2Ｃｌ2中１０％ＭｅＯＨで洗浄し、凍結乾燥させて、灰色がかった白色の固体（８５０ｍｇ、７５％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6），δ８．５８（ｄｄ，２Ｈ），８．２９（ｄｔ，２Ｈ），７．８３（ｍ，６Ｈ），７．４４（ｂｄ，４Ｈ），３．９１（ｂｓ，２Ｈ），３．８１（ｂｍ，２Ｈ），３．６４（ｂｍ，２Ｈ），３．５５（ｂｓ，２Ｈ）。ＬＣＭＳ−ＥＳ  ５２９．５６［Ｍ＋Ｈ］+。
2019142873.tif 000016
実施例３：ＢＴ−１２
【０１１５】
スキーム３−１に示されるように、ＣＨ2Ｃｌ2中１０％ＤＭＦ中６−（ベンゾオキサゾール−２−イル）ピリジン−２−カルボン酸の溶液（４．０５ｇ）を、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１．５当量）、ＨＯＢｔ（１．５当量）、及びＤＩＰＥＡ（１．２当量、推定密度の体積での取り込み）、及び０．５当量のピペラジン（０℃）で処理した。混合物を室温になるまで１６時間にわたって加温させた。薄茶色の固体が生じ、これを焼結ガラス漏斗で濾過し、水で洗浄し、凍結乾燥させて、薄茶色の固体（３．２ｇ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3），δ８．４５（ｄｄ，２Ｈ），８．０５（ｍ，２Ｈ），７．９（ｄ，２Ｈ），７．８（ｄｄ，２Ｈ），７．６（ｄｄ，２Ｈ），７．４（ｍ，２Ｈ），７．３５（ｍ，２Ｈ），４．０（ｂｍ，８Ｈ）。
2019142873.tif 000017
実施例４：ＢＴ−１４及び塩
【０１１６】
スキーム４−１に示されるように、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中６−（ベンゾオキサゾール−２−イル）ピリジン−２−カルボン酸（５００ｍｇ）の溶液を、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１．５当量）、ＨＯＢｔ（１．５当量）、ＤＩＰＥＡ（３当量）、及びピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１．１当量）（０℃）で処理した。混合物を室温になるまで１６時間にわたって加温させた。溶媒を蒸発させた後、残渣をＥｔＯＡｃで抽出し、水で洗浄した。有機層を真空下で蒸発させ、粗残渣をペンタンで洗浄して、薄茶色の固体（１２０ｍｇ、４８％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6），δ８．４（ｄ，１Ｈ），８．２（ｔ，１Ｈ），７．９（ｔ，２Ｈ），７．８（ｄ，１Ｈ），７．５（ｄｔ，２Ｈ），３．７（ｂｍ，２Ｈ），３．５（ｂｍ，４Ｈ），３．４（ｂｍ，２Ｈ），１．４（ｓ，９Ｈ）。ＬＣＭＳ−ＥＳ  ４０９．４９［Ｍ＋Ｈ］+、４３１．３７［Ｍ＋Ｎａ］+、４４７．３６［Ｍ＋Ｋ］+。
2019142873.tif 000018
【０１１７】
スキーム４−２に示されるように、スキーム４−１から結果として生じた化合物（２００ｍｇ）を、メタノール性ＨＣｌ（６ｍＬ）（０℃）で処理した。混合物を室温になるまで３時間にわたって加温させた。溶媒を蒸発させ、ペンタン及びエーテルで洗浄して、薄茶色の固体（１６０ｍｇ、定量）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6），δ９．３０（ｂｓ，２Ｈ），８．４５（ｄ，１Ｈ），８．２５（ｔ，１Ｈ），７．９（ｍ，３Ｈ），７．５（ｑｕｉｎ，２Ｈ），３．７（ｂｍ，２Ｈ），３．５（ｂｍ，２Ｈ），３．３（ｂｍ，４Ｈ），１．４（ｓ，９Ｈ）。ＬＣＭＳ−ＥＳ  ３０９．２６［Ｍ＋Ｈ］+。
2019142873.tif 000019
【０１１８】
スキーム４−３に示されるように、スキーム４−２から結果として生じた塩（２５ｍｇ）を飽和ＮａＨＣＯ3水溶液で中和し、その後、凍結乾燥機内で乾燥させて、２０ｍｇ／９６％のＢＴ−１４を得た。収率は、９０％であった。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6），δ８．４（ｄ，１Ｈ），８．２（ｔ，１Ｈ），７．９０（ｔ，２Ｈ），７．７５（ｄ，１Ｈ），７．５（ｑｕｉｎ，２Ｈ），３．９５（ｂｍ，２Ｈ），３．８（ｂｍ，２Ｈ），３．３（ｂｍ，２Ｈ），３．２（ｂｍ，２Ｈ）；３０９．３７  ＬＣＭＳ−ＥＳ［Ｍ＋Ｈ］+。
2019142873.tif 000020
実施例５：ＢＴ−１５
【０１１９】
スキーム５−１に示されるように、ＤＭＦ（５ｍＬ）中６−（１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル）ピリジン−２−カルボン酸（５０ｍｇ）を、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１．５当量）、ＨＯＢｔ（１．５当量）、ＤＩＰＥＡ（３当量）、及び０．９当量のＢＴ−１４  ＨＣｌ塩（０℃）で処理した。混合物を室温になるまで１６時間にわたって加温させた。焼結漏斗で濾過し、その後、水で洗浄し、凍結乾燥させて水分を除去して、２０ｍｇのＢＴ−１５を得た。1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6），δ１２．９３（ｄ，１Ｈ），８．４４（ｄｄ，１Ｈ），８．３６（ｔ，１Ｈ）８．２５（ｔ，１Ｈ），８．１７（ｍ，２Ｈ），７．８７（ｍ，３Ｈ），７．７２（ｍ，２Ｈ），７．５４（ｍ，２Ｈ），７．３１（ｍ，３Ｈ），３．９０（ｓ，２Ｈ），３．８２（ｂｍ，２Ｈ），３．６７（ｂｍ，２Ｈ），３．５８（ｂｍ，２Ｈ）。ＬＣＭＳ−ＥＳ  ５３０．４８［Ｍ＋Ｈ］+、２６５．９４［（Ｍ＋２Ｈ）／２］++。
2019142873.tif 000021
【０１２０】
ＢＴ−１５は、ＬＡＮＣＬ２結合を示した（図１Ａ）。そのＬＡＮＣＬ２への予測結合親和性は、−９．９であり、ＳＰＲにより確認された親和性は、２１．４のＫｄ値を有した。
実施例６：ＢＴ−１３塩
【０１２１】
スキーム６−１に示されるように、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中６−（１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル）ピリジン−２−カルボン酸（５００ｍｇ）を、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１．５当量）、ＨＯＢｔ（１．５当量）、ＤＩＰＥＡ（３当量）、及びピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１．１当量）（０℃）で処理した。混合物を室温になるまで１６時間にわたって加温させた。反応混合物を氷冷水に注いだ後、沈殿物を濾過し、乾燥させて、淡茶色の固体（６００ｍｇ、７０％）を得た。ＴＬＣ（１００％酢酸エチル）。ＨＮＭＲ及びＬＣＭＳ準拠。（収率７０％）。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6），δ１２．９０（ｓ，１Ｈ），８．４（ｄ，１Ｈ），８．１５（ｔ，１Ｈ），７．６５（ｔｄ、３Ｈ），７．２５（ｑｕｉｎ，２Ｈ），３．７（ｂｍ，２Ｈ），３．５（ｂｍ，２Ｈ），３．３（ｂｍ，４Ｈ），１．４（ｓ，９Ｈ）。ＬＣＭＳ−ＥＳ  ４０８．３５［Ｍ＋Ｈ］+。
2019142873.tif 000022
【０１２２】
スキーム６−２に示されるように、スキーム６−１から結果として生じた化合物（６００ｍｇ）を、メタノール性ＨＣｌ（６ｍＬ）（０℃）で３時間処理した。混合物を室温になるまで３時間にわたって徐々に加温させた。過剰メタノール性ＨＣｌを蒸発させて、薄茶色の固体としてＢＴ−１３  ＨＣｌ（５００ｍｇ）を得た。
2019142873.tif 000023
実施例７：ＢＴ−４及び塩
【０１２３】
スキーム７−１に示されるように、ＤＭＦ（６ｍＬ）中３−（１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル）安息香酸（１００ｍｇ）を、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１．５当量）、ＨＯＢｔ（１．５当量）、ＤＩＰＥＡ（１当量）、及び０．５当量のピペラジン（０℃）で処理した。混合物を室温になるまで１６時間にわたって加温させた。ＴＬＣ（１０％メタノール：ＤＣＭ）は、非極性スポットの形成及び出発物質の不在を示す。後処理し、エーテルで洗浄した後、３０ｍｇ／９５％のＢＴ−４を単離した。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6），δ１３．０（ｓ，２Ｈ），８．３（ｂｍ，４Ｈ），７．７５（ｂｍ，４Ｈ），７．６０（ｂｍ，４Ｈ），７．２（ｂｍ，４Ｈ），３．６５（ｂｍ，８Ｈ）。ＬＣＭＳ−ＥＳ  ５２７．３６［Ｍ＋Ｈ］+、２６４．５０［（Ｍ＋２Ｈ）／２］++。
2019142873.tif 000024
【０１２４】
７−２に示されるようにスキーム、３０ｍｇ／９５％のＢＴ−４を、ジオキサン中４ＭのＨＣｌで３時間処理した。溶媒を蒸発させ、エーテルで洗浄して、１０ｍｇ／９７％のＢＴ−４  ＨＣｌ塩を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6），δ８．４５（ｂｍ，４Ｈ），７．８０（ｂｍ，８Ｈ），７．５０（ｂｍ，４Ｈ），３．６５（ｂｍ，８Ｈ）。ＬＣＭＳ−ＥＳ  ５２７．４４［Ｍ＋Ｈ］+、２６４．５０［（Ｍ＋２Ｈ）／２］++。
2019142873.tif 000025
実施例８：ＢＴ−６及び塩
【０１２５】
スキーム８−１に示されるように、ＤＭＦ（６ｍＬ）中３−（１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル）安息香酸（１００ｍｇ）を、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１．５当量）、ＨＯＢｔ（１．５当量）、ＤＩＰＥＡ（１当量）、及びベンゼン−１，４−ジアミン（０．５当量）（０℃）で処理した。混合物を室温になるまで１６時間にわたって加温させた。ＴＬＣ（１０％メタノール：ＤＣＭ）は、非極性スポットの形成及び出発物質の不在を示す。後処理し、エーテルで洗浄した後、薄茶色の固体（６０ｍｇ）を単離した。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6），δ１３．１（ｓ，２Ｈ），１０．４５（ｓ，２Ｈ），８．７５（ｓ，２Ｈ），８．４０（ｄ，２Ｈ），８．０５（ｄ，２Ｈ），７．８５（ｓ，４Ｈ），７．７０（ｔ，４Ｈ），７．５５（ｄ，２Ｈ）７．２５（ｑｕｉｎ，４Ｈ）。ＬＣＭＳ−ＥＳ  ５４９．０［Ｍ＋Ｈ］+  ２７５．１［（Ｍ＋２Ｈ）／２］++。
2019142873.tif 000026
【０１２６】
スキーム８−２に示されるように、６０ｍｇ／９８％のＢＴ−６を、ジオキサン中４ＭのＨＣｌで３時間処理した。溶媒を蒸発させ、エーテルで洗浄した後に、５０ｍｇ／９６％のＢＴ−６  ＨＣｌ塩を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6），δ１０．６０（ｓ，２Ｈ），９．００（ｓ，２Ｈ），８．５５（ｄ，２Ｈ），８．３０（ｄ，２Ｈ），７．９０（ｓ，４Ｈ），７．８５ｍ，６Ｈ），７．５０（ｍ，４Ｈ）。ＬＣＭＳ−ＥＳ  ５４９．３［Ｍ＋Ｈ］+  ２７５．３［（Ｍ＋２Ｈ）／２］++。
2019142873.tif 000027
実施例９：ＢＴ−１６及び塩
【０１２７】
スキーム９−１に示されるように、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中６−（１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル）ピリジン−２−カルボン酸（１００ｍｇ）を、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１．５当量）、ＨＯＢｔ（１．５当量）、ＤＩＰＥＡ（３当量）、及びベンゼン−１，４−ジアミン（０．５当量）（０℃）で処理した。混合物を室温になるまで１６時間にわたって加温させた。反応混合物を氷冷水に注いだ後、沈殿物を濾過し、乾燥させて、淡茶色の固体（６０ｍｇ）を得た。
2019142873.tif 000028
【０１２８】
スキーム９−２に示されるように、化合物ＢＴ−１６（５０ｍｇ）を、ジオキサン（３ｍＬ）中ＨＣｌ（０℃）で処理した。混合物を室温になるまで４にわたって加温させた。
過剰ジオキサンＨＣｌを蒸発させて、３０ｍｇの茶色の固体（３０ｍｇ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6），δ１１．００（ｓ，２Ｈ），８．６（ｂｍ，２Ｈ），８．３５（ｂｍ，４Ｈ），８．０５（ｓ，４Ｈ），７．８５（ｂｍ，４Ｈ），７．４０（ｂｍ，４Ｈ）。ＬＣＭＳ−ＥＳ  ５５１．８４［Ｍ＋Ｈ］+。
2019142873.tif 000029
実施例１０：ＢＴ−３及び塩
【０１２９】
スキーム１０−１に示されるように、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中３−（２−ベンゾオキサゾリル）安息香酸（５０ｍｇ）を、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１．２５当量）、ＨＯＢｔ（１．２５当量）、ＤＩＰＥＡ（１当量）、及びピペラジン（１当量）（０℃）で処理した。混合物を室温になるまで１６時間にわたって加温させた。反応混合物を氷冷水で希釈した後、結果として生じた固体を廃棄し、濾過し、その後、乾燥させて、３０ｍｇのＢＴ−３を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6），δ８．２（ｂｍ，４Ｈ），７．８（ｂｍ，４Ｈ），７．７（ｂｍ，４Ｈ），７．４５（ｂｍ，４Ｈ），３．６（ｂｍ，８Ｈ）。
ＬＣＭＳ−ＥＳ  ５２９．３２［Ｍ＋Ｈ］+。
2019142873.tif 000030
【０１３０】
スキーム１０−２に示されるように、ＢＴ−３（３０ｍｇ）を、メタノール性ＨＣｌ（５ｍＬ）（０℃）中で処理した。混合物を室温になるまで４時間にわたって加温させた。
過剰メタノール性ＨＣｌを真空で蒸発させた後、茶色の固体（１５ｍｇ）が生じた。
2019142873.tif 000031
実施例１１：ＢＴ−５及び塩
【０１３１】
スキーム１１−１に示されるように、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中３−（２−ベンゾオキサゾリル）安息香酸（５０ｍｇ）を、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１．２５当量）、ＨＯＢｔ（１．２５当量）、ＤＩＰＥＡ（１当量）、及びベンゼン−１，４−ジアミン（０．５当量）（０℃）で処理した。混合物を室温になるまで１６時間にわたって加温させた。反応混合物を氷冷水で希釈し、固体を廃棄し、濾過し、その後、乾燥させて、薄茶色の固体（３０ｍｇ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＴＦＡ），δ９．２（ｂｓ，２Ｈ），８．８（ｂｍ，２Ｈ），８．６（ｂｍ，２Ｈ），７．９（ｂｍ，１４Ｈ）。
2019142873.tif 000032
【０１３２】
スキーム１１−２に示されるように、３５ｍｇのＢＴ−５を、ＨＣｌジオキサン（５ｍＬ）（０℃）中で処理した。混合物を室温になるまで４時間にわたって加温させた。過剰ジオキサンを真空で蒸発させた後、薄茶色の固体（１５ｍｇ）が生じた。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＴＦＡ），δ９．３（ｂｓ，２Ｈ），８．８（ｂｍ，２Ｈ），８．６（ｂｍ，２Ｈ），７．９（ｂｍ，１４Ｈ）。
2019142873.tif 000033
実施例１２：ＢＴ−１７及び塩
【０１３３】
スキーム１２−１に示されるように、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中６−（ベンゾオキサゾール−２−イル）ピリジン−２−カルボン酸（１００ｍｇ）を、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１．５当量）、ＨＯＢｔ（１．５当量）、ＤＩＰＥＡ（１．２当量）、及びベンゼン−１，４−ジアミン（０．５当量）（０℃）で処理した。混合物を室温になるまで１６時間にわたって加温させた。反応混合物を氷冷水で希釈し、固体を廃棄し、濾過し、その後、乾燥させて、薄茶色の固体（７０ｍｇ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＴＦＡ），δ８．８５（ｄｄ，４Ｈ），８．５５（ｔ，２Ｈ），８．１（ｂｍ，４Ｈ），７．９５（ｍ，４Ｈ），７．８５（ｓ，４Ｈ）。ＬＣＭＳ−ＥＳ  ５５３．２８［Ｍ＋Ｈ］+。
2019142873.tif 000034
【０１３４】
スキーム１２−２に示されるように、ＢＴ−１７（６０ｍｇ）を、ジオキサンＨＣｌ（１０ｍＬ）（０℃）中で室温になるまで４時間にわたって処理した。凍結乾燥機を使用して溶媒を蒸発させた後、薄茶色の固体（４５ｍｇ）が生じた。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＴＦＡ），δ８．９０（ｂｍ，４Ｈ），８．６（ｂｍ，２Ｈ），８．０（ｂｍ，１０Ｈ）。
2019142873.tif 000035
実施例１３：ＢＴ−ＡＢＡ−２５
【０１３５】
ＢＴ−ＡＢＡ−２５の構造をスキーム１３−１に示す。ＢＴ−ＡＢＡ−２５は、ＬＡＮＣＬ２のリガンドである（図１Ｂ）。そのＬＡＮＣＬ２への予測結合親和性は、−７．５であり、ＳＰＲにより確認された親和性は、１．７７ｅ−０４のＫｄ値を有した。
2019142873.tif 000036
実施例１４：ＢＴ−ＡＢＡ−５ａ
【０１３６】
スキーム１４−１に示されるように、Ｅｔ３Ｎ（２ｍＬ）中８−ビニル−１，４−ジオキサスピロ［４．５］デカン−８−オール（２００ｍｇ、１当量）及び５−ブロモフラン−２−カルボン酸メチル（１．５当量）の溶液をアルゴンで１０分間脱気した。その後、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（０．０２５当量）、ＤＰＰＦ（０．０５当量）を添加し、再度１０分間脱気した。結果として生じた反応混合物を１００℃で１６時間加熱した。薄茶色の固体（１３０ｍｇ）をカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｘ／ヘキサン３：７）により単離した。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6），δ７．３０（ｄ  １Ｈ），６．６０（ｄ  １Ｈ），６．４５（ｄｄ，２Ｈ），４．７５（ｓ，１Ｈ），３．８５（ｓ，４Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），１．８５（ｍ，２Ｈ），１．６５（ｍ，２Ｈ），１．５０（ｍ，４Ｈ），ＬＣＭＳ−ＥＳ  ２９１．３４［Ｍ＋Ｈ］+。
2019142873.tif 000037
【０１３７】
スキーム１４−２に示されるように、ＬｉＯＨ（３当量）を、ＴＨＦＨ2Ｏ：ＭｅＯＨ（２：１：０．５ｍＬ）中スキーム１４−１から結果として生じた化合物（化合物４）（１００ｍｇ）の溶液に添加し、混合物を室温で１６時間撹拌した。その後、混合物を減圧下で濃縮し、粗物を最小量の水中に溶解し、２Ｎ  ＨＣｌでｐＨ４になるまで酸性化した。化合物をＥｔＯＡｃで抽出し、濃縮して、薄茶色の固体（５４ｍｇ）を得て、これをさらに精製することなく次の反応（スキーム１４−３）で使用した。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6），δ７．５０（ｄ  １Ｈ），６．６０（ｄ  １Ｈ），６．４５（ｄｄ，２Ｈ），４．７５（ｓ，１Ｈ），３．８５（ｓ，４Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），１．８５（ｍ，２Ｈ），１．６５（ｍ，２Ｈ），１．５０（ｍ，４Ｈ）。ＬＣＭＳ−ＥＳ  ２７７．２６［Ｍ＋Ｈ］+。
2019142873.tif 000038
【０１３８】
スキーム１４−３に示されるように、０．１ｍＬの３Ｎ  ＨＣｌを、０℃のＴＨＦ中化合物５（５０ｍｇ）に撹拌しながら添加した。混合物を室温になるまで６時間にわたって加温させた。ＴＬＣは、ＳＭの不在及び非極性スポットを示す。混合物を減圧下で濃縮し、水で希釈、ＥｔＯＡｃで抽出し、再濃縮して、茶色の固体（２０ｍｇ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6），δ１３．００（ｂｓ  １Ｈ），７．２０（ｄ  １Ｈ），６．９５（ｄ  １Ｈ），６．６０（ｄ  １Ｈ），６．４５（ｄ，１Ｈ），６．１０（ｔ，１Ｈ），３．０５（ｍ，２Ｈ），２．６５（ｔ，２Ｈ），２．５，（２Ｈ）。
ＬＣＭＳ−ＥＳ  ２３３．２１［Ｍ＋Ｈ］+  ＬＣＭＳ−ＥＳ  ２３１．２７［Ｍ−Ｈ］-  ４６３．１５［２Ｍ−Ｈ］-。
2019142873.tif 000039
実施例１５：ＢＴ−ＡＢＡ−６
【０１３９】
スキーム１５−１に示されるように、Ｅｔ3Ｎ（８ｍＬ）中８−ビニル−１，４−ジオキサスピロ［４．５］デカン−８−オール（５００ｍｇ、１当量）、３−ヨード安息香酸エチル（０．８当量）、及びＰＰｈ3（０．０２当量）の溶液をアルゴンで１０分間脱気した。その後、Ｐｄ（ＯＡｃ）2（０．０２当量）を添加し、再度１０分間脱気した。結果として生じた反応混合物を９５℃で１６時間加熱した。後処理後、淡茶色の固体（５００ｍｇ）をカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン３：７）により単離した。
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6），δ７．９５（ｓ  １Ｈ），７．８０（ｄ  １Ｈ），７．７１（ｄ  １Ｈ），７．４７（ｔ  １Ｈ），６．６５（ｄ  １Ｈ），６．４９（ｄ，１Ｈ），４．６５（ｂｓ  １Ｈ），４．３２（ｑ、２Ｈ），３．６８（ｓ，４Ｈ），１．９９−１．６８（ｍ，４Ｈ），１．５５−１．５０（ｍ，４Ｈ），１．３３（ｔ  ３Ｈ）。ＬＣＭＳ−ＥＳ  ３１５．３８［Ｍ−１７］+。
2019142873.tif 000040
【０１４０】
スキーム１５−２に示されるように、ＴＨＦ／Ｈ2Ｏ／ＥｔＯＨ（４：２：１、１７．５ｍＬ）中化合物４（５００ｍｇ）の溶液を０℃に冷却し、ＬｉＯＨ（２．５当量）を添加し、混合物を撹拌しながら１６時間にわたって室温に上昇させた。混合物を減圧下で濃縮し、粗物を最小量の水中に溶解し、１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ３〜４になるまで酸性化した。精製カラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：１）により、淡黄色の固体（２２０ｍｇ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6），δ１３．００（ｂｓ  １Ｈ），７．９５（ｓ  １Ｈ），７．７８（ｄ  １Ｈ），７．６７（ｄ  １Ｈ），７．４４（ｔ  １Ｈ），６．６４（ｄ  １Ｈ），６．４８（ｄ，１Ｈ），４．６５（ｓ  １Ｈ），３．８６（ｓ，４Ｈ），１．８７−１．６１（ｍ，４Ｈ），１．５５−１．５０（ｍ，４Ｈ）。ＬＣＭＳ−ＥＳ  ２８７．３４［Ｍ−１７］+。
2019142873.tif 000041
【０１４１】
スキーム１５−３に示されるように、２Ｎ  ＨＣｌ（１．５ｍＬ）を、０℃のＴＨＦ中１００ｍｇの化合物５（１００ｍｇ）の混合物に撹拌しながら添加した。混合物を室温になるまで６時間にわたって加温させた。その後、溶液を減圧下で濃縮し、水で希釈、ＥｔＯＡｃで抽出し、再濃縮して、淡黄色の固体（２０ｍｇ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6），δ１３．００（ｂｓ  １Ｈ），８．００（ｓ，１Ｈ），７．８０（ｄ  １Ｈ），７．６５（ｄ  １Ｈ），７．４５（ｔ  １Ｈ），６．７５（ｄ  １Ｈ），６．４５（ｄ，１Ｈ），６．１０（ｔ，１Ｈ），５．１５（ｓ  １Ｈ），２．６５（ｍ，２Ｈ），２．１５（ｍ，２Ｈ），１．９０（ｍ，４Ｈ），ＬＣＭＳ−ＥＳ  ２５９．３７［Ｍ−Ｈ］-  ５１９．４８［２Ｍ−Ｈ］-。
2019142873.tif 000042
実施例１６：ＢＴ−ＡＢＡ−１３
【０１４２】
スキーム１６−１に示されるように、ジヒドロピラン（１．３当量）及びＴｓＯＨ（０．１当量）を、０℃のＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍＬ）中化合物２（２．５ｇ、１当量）の溶液に撹拌しながら添加した。結果として生じた溶液室温になるまで１４時間にわたって徐々に加温させた。淡黄色の液体をカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：９）により単離した。この化合物をさらに精製することなく次のステップで使用した。
2019142873.tif 000043
【０１４３】
スキーム１６−２に示されるように、化合物３（２．５ｇ、１．０当量）、４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボロラン（１．２当量）、及びビス（シクロペンタジエニル）塩化水素化ジルコニウム（０．１５当量）をＥｔ3Ｎに添加した。結果として生じた反応混合物を６０〜７０℃で１６時間加熱した。反応混合物をヘキサンで希釈した。沈殿物を短いシリカゲルパッドで濾去し、ヘキサンで洗浄した。ヘキサン溶液を濃縮して、無色の油性液体（１．３ｇ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３），δ６．６０（ｄ  １Ｈ），５．６０（ｄ  １Ｈ），６．３５（ｄ，１Ｈ），４．７５（ｓ，１Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ），２．８０（ｍ，２Ｈ），２．３５（ｍ，２Ｈ），２．０５（ｍ，４Ｈ）。
2019142873.tif 000044
【０１４４】
スキーム１６−３に示されるように、９：１のＤＭＥ／Ｈ2Ｏ混合物（８ｍＬ）中化合物４（５５０ｍｇ、１．１当量）、６−ブロモピコリン酸メチル（１．０当量）、Ｋ2ＣＯ3（２．０当量）の溶液をアルゴンで１０分間脱気した。その後、Ｐｄ［（Ｐ（Ｐｈ）3］4（０．０４当量）を添加した。結果として生じた反応混合物を１００℃で１６時間加熱した。反応溶液を濃縮し、その後、カラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：３）にかけて、淡黄色の固体（２３０ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳ−ＥＳ  ４０４．３９［Ｍ＋Ｈ］+、３０２．２６［Ｍ−１０１］+。
2019142873.tif 000045
【０１４５】
スキーム１６−５に示されるように、ＴｓＯＨ（０．１当量）を、１：１のアセトン／Ｈ2Ｏ（６ｍＬ）中化合物５（２３０ｍｇ、１．０当量）の溶液に添加した。結果として生じた反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、その後、カラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン７：３）にかけて、淡黄色の液体（１１０ｍｇ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３），δ８．００（ｄ  １Ｈ），７．８０（ｔ，１Ｈ），７．５０（ｄ，１Ｈ），６．９０（ｍ  ２Ｈ），４．００（ｓ，３Ｈ），２．８０（ｍ，２Ｈ），２．３５（ｍ，２Ｈ），２．１０（ｍ，４Ｈ），ＬＣＭＳ−ＥＳ  ２７６．３８［Ｍ＋Ｈ］+。
2019142873.tif 000046
【０１４６】
スキーム１６−６に示されるように、ＬｉＯＨ（２．５当量）を、０℃の３：１のＴＨＦ／Ｈ2Ｏ（３ｍＬ）中化合物６（７５ｍｇ）の溶液に撹拌しながら添加した。混合物を室温になるまで６時間にわたって加温させた。反応混合物をクエン酸で酸性化し、ＴＨＦとＥｔＯＡｃの混合物で抽出した。有機溶液を濃縮して、灰色がかった白色の固体（１０ｍｇ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6），δ１３．０５（ｂｓ，１Ｈ），７．９０（ｍ，２Ｈ），７．６５（ｄ，１Ｈ），７．０５（ｄ，１Ｈ），６．８０（ｄ，１Ｈ），５．２０（ｓ，１Ｈ），２．６５（ｍ，２Ｈ），２．２０（ｂｄ  ２Ｈ），２．１０−１．９０（ｍ，４Ｈ），ＬＣＭＳ−ＥＳ  ２６２．２７［Ｍ＋Ｈ］+。
2019142873.tif 000047
実施例１７：ＢＴ−ＡＢＡ−１６
【０１４７】
スキーム１７−１に示されるように、９：１のＤＭＥ／Ｈ2Ｏ混合物（８ｍＬ）中化合物４（４３７ｍｇ、１．２当量）、２−ブロモイソニコチン酸メチル（１．０当量）、Ｋ2ＣＯ3（２．０当量）の溶液をアルゴンで１０分間脱気した。その後、Ｐｄ［（Ｐ（Ｐｈ）3］4（０．０４当量）を添加した。結果として生じた反応混合物を９０℃で１２時間加熱した。反応溶液を濃縮し、その後、カラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：３）にかけて、淡黄色の液体（３００ｍｇ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3），δ８．７０（ｄ，１Ｈ），７．８５（ｓ，１Ｈ），７．６５（ｄ，１Ｈ），６．８５（ｄ，１Ｈ），６．６５（ｄ，１Ｈ），４．７０（ｍ，１Ｈ），３．９５（ｍ，４Ｈ），２．２０−１．４０（ｍ，１６Ｈ），ＬＣＭＳ−ＥＳ  ４０４．５４［Ｍ＋Ｈ］+、３０２．５３［Ｍ−１０１］+。
2019142873.tif 000048
【０１４８】
スキーム１７−２に示されるように、ＴｓＯＨ（０．１当量）を、１：１のアセトン／Ｈ2Ｏ（６ｍＬ）中５（３００ｍｇ、１．０当量）の溶液に添加した。結果として生じた反応混合物を室温で４８時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、その後、カラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン７：３）にかけて、灰色がかった白色の固体（１６０ｍｇ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６），δ８．７０（ｄ，１Ｈ），７．８５（ｓ，１Ｈ），７．６５（ｄ，１Ｈ），７．０５（ｄ，１Ｈ），６．８５（ｄ，１Ｈ），５．２０（ｓ，１Ｈ），３．９０（ｓ，３Ｈ），２．６５（ｔｄ、２Ｈ），２．１５（ｂｄ，２Ｈ），２．００（ｍ，２Ｈ），１．８５（ｍ，２Ｈ），ＬＣＭＳ−ＥＳ  ２７６．２２［Ｍ＋Ｈ］+。
2019142873.tif 000049
【０１４９】
スキーム１７−３に示されるように、ＬｉＯＨ（２．５当量）を、０℃の３：１のＴＨＦ／Ｈ2Ｏ（３ｍＬ）中化合物６（１００ｍｇ）の溶液に撹拌しながら添加した。混合物を室温になるまで１６時間にわたって加温させた。反応混合物をクエン酸で酸性化し、ＴＨＦとＥｔＯＡｃの混合物で抽出した。減圧下で濃縮して、灰色がかった白色の固体（２０ｍｇ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６），δ１３．６０（ｂｓ，１Ｈ），８．７０（ｄ，１Ｈ），７．８５（ｓ，１Ｈ），７．６０（ｄ，１Ｈ），７．００（ｄ，１Ｈ），６．８５（ｄ，１Ｈ），５．２０（ｓ，１Ｈ），２．６５（ｍ，２Ｈ），２．２０−１．８０（ｍ，６Ｈ），ＬＣＭＳ−ＥＳ  ２６２．２８［Ｍ＋Ｈ］+。
2019142873.tif 000050
実施例１８：ＢＴ−ＡＢＡ−１４
【０１５０】
スキーム１８−１に示されるように、９：１のＤＭＥ／Ｈ2Ｏ混合物（８ｍＬ）中化合物４（３００ｍｇ、１．２当量）、４−ブロモピコリン酸メチル（１．０当量）、Ｋ2ＣＯ3（２．０当量）の溶液をアルゴンで１０分間脱気した。その後、Ｐｄ［（Ｐ（Ｐｈ）3］4（０．０４当量）を添加した。結果として生じた反応混合物を９０℃で１２時間加熱した。反応溶液を濃縮し、その後、カラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：３）にかけて、淡黄色の液体（２００ｍｇ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3），δ８．５０（ｄ，１Ｈ），８．２０（ｂｓ，１Ｈ），７．４５（ｄ，１Ｈ），６．７０（ｄ，１Ｈ），６．５０（ｄ，１Ｈ），４．６０（ｍ，１Ｈ），３．９５（ｍ，４Ｈ），２．２０−１．４０（ｍ，１６Ｈ），ＬＣＭＳ−ＥＳ  ３９０．３５［Ｍ＋Ｈ］+。
2019142873.tif 000051
【０１５１】
スキーム１８−２に示されるように、ＴｓＯＨ（０．１当量）を、１：１のアセトン／Ｈ2Ｏ（６ｍＬ）中５（２００ｍｇ、１．０当量）の溶液に添加した。結果として生じた反応混合物を室温で４８時間撹拌した。反応混合物をクエン酸で酸性化し、ＴＨＦとＥｔＯＡｃの混合物で抽出した。溶液を濃縮して、灰色がかった白色の固体（１８ｍｇ）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6），δ８．６０（ｄ，１Ｈ），８．０５（ｓ，１Ｈ），７．６０（ｄ，１Ｈ），６．９０（ｄ，１Ｈ），６．７０（ｄ，１Ｈ），５．２０（ｂｓ，１Ｈ），２．６５（ｍ，２Ｈ），２．１５（ｂｄ，２Ｈ），２．０５−１．８０（ｍ，４Ｈ），ＬＣＭＳ−ＥＳ  ２６２．２７［Ｍ＋Ｈ］  +。
2019142873.tif 000052
受容体結合実施例
実施例１９：ＬＡＮＣＬ２結合実施例
【０１５２】
ＬＡＮＣＬ２に結合する化合物の選択を導くため、計算モデル化研究及び生化学的検証を組み合わせた。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術の最新の反復は、標識を持たないタンパク質と小分子（＞２５Ｄａ）との間の即時の分子相互作用を決定するためのインビトロ、ハイスループットの定量的な手段を提供する。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）技術は、ＧＭＰ／ＧＬＰコンプライアンスのさらなる利益、及び２４時間未満の期間内のスクリーンまたは詳細な滴定のいずれかの自律的な大規模データ取得をさらに提供する。関心の分子相互作用を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００  ＳＰＲ技術によって定期的に検証する。
【０１５３】
方法
ＬＡＮＣＬ２−化合物の相互作用の分子モデル化によるハイスループットスクリーニング。Ａｕｔｏ−Ｄｏｃ  Ｖｉｎａ［１４］は、ＬＡＮＣＬ２−植物化合物の結合を確認するためのハイスループットの並列計算が可能な最先端のソフトウェア一式である。このソフトウェア一式は、まず（ｉ）結合した複合体に関連する自由エネルギーの力を、その後（ｉｉ）標的とリガンドとの間の複合体形成に利用可能な立体配座空間を計算する。これらの方法は確率論的な性質であり、したがって全パラメータ空間を徹底的に検索し、予測に信頼を提供するために反復した独立のスクリーンを必要とする。現在ＬＡＮＣＬ２のモデルは、ＬＡＮＣＬ１の相同性モデル化を通じて利用可能である［１５］。ＡｕｔｏＤｏｃｋ及びＡｕｔｏＧｒｉｄに関するグラフィカルフロントエンドであるＡｕｔｏＤｏｃｋＴｏｏｌｓを使用して、グリッドボックス中心及びｘ、ｙ、ｚ次元を含む検索空間を定義した［１６］。ＡｕｔｏＤｏｃｋ  Ｖｉｎａは、各化合物について５つの結合配座を生成した。グリッドがタンパク質の表面全体を覆う状態で、ドッキングをタンパク質標的全体に適用する。全表面に関する全化合物に関して、各予測される結合モードの結合エネルギーからなるドッキングログファイルを生成した。
【０１５４】
ＬＡＮＣＬ２−小分子の相互作用の反応速度決定。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００を使用して、小分子  ＢＴ−１１、ＢＴ−ＡＢＡ−５ａ、ＢＴ−６、及びＢＴ−１５（被検物質）のＬＡＮＣＬ２（リガンド）への結合に関して、反応速度論的パラメータを決定した。データを用量依存的（５〜８滴定点）様式にて三連で生成し、分析して、結合モデル（ラングミュア、立体配座シフト等）、即時の会合及び解離定数、ならびに平衡解離定数を決定した。ＳＰＲ技により、特異的なＬＡＮＣＬ２−植物化学物質相互作用の検証、及び結合の機構及び速度に関する信頼性の高い洞察の獲得が可能となった。アミンカップリングによってＬＡＮＣＬ２を共有結合させることにより、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭ５）センサーチップ上で実験を実施した。センサーチップのフローセル１及び２を、０．１ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及び０．５Ｍの１−エチル−３−（−３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド硫酸塩（ＥＤＣ）の１：１混合物で、１０μＬ／分にて７２０秒間活性化した。ＬＡＮＣＬ２（０．４１ｍｇ／ｍＬ）のストックを、ｐＨ５．０の１０ｍＭの酢酸ナトリウム中で８．２μｇ／ｍＬ（１：５０希釈）に希釈し、活性化フローセル２表面上に１０μＬ／分の流速で１０００秒間注入した。フローセル２（１１０００ＲＵ）上でＬＡＮＣＬ２を捕捉した後、フローセル１及び２の表面を１Ｍのエタノールアミンを１０μＬ／分で７２０秒間注入することによって不活性化した。ランニング緩衝液は、０．０５％のＴ−２０及び０．１５ＭのＮａＣｌを含有する２５ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ６．５であった。反応速度研究を、異なる濃度のＢＴ−１１（２５μＭ、１２．５μＭ、６．２５μＭ、３．１３μＭ、１．５６μＭ、及び０．７６μＭ）、ＢＴ−ＡＢＡ−５ａ（４０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、５μＭ、２．５μＭ、及び１．２５μＭ）、及びＢＴ−１５／ＢＴ−６（２０μＭ、１０μＭ、５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ、０．６２５μＭ、及び０．３１３μＭ）を三連で注入することによって実施した。各試料を、６０秒間（接触時間）注入した後、１００μＬ／分の流速で６０秒間の解離時間にかけた。次の注入の前に、１８０秒間の安定化時間を使用した。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン１）を用いてデータを分析し、１：１結合モデルを使用して親和性結合定数（ＫＤ）を決定した。
【０１５５】
結果
ＢＴ−１１及びＢＴ−１５の両方とも、ＬＡＮＣＬ２に強く結合する。ＬＡＮＣＬ２タンパク質へのＢＴ−１１及びＢＴ−１５の結合を確認するため、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ−２００機器内でＳＰＲ分析を実施した。分子相互作用を検出するために利用される光学技術であるＳＰＲを使用して、ＬＡＮＣＬ２とそのリガンド（すなわち、ＢＴ−１１とＢＴ−１５）との間の結合親和性を測定した。精製された組み換えＬＡＮＣＬ２タンパク質をＢＩＡＣＯＲＥ（商標）センサーチップ上に固定し、機器のマイクロ流体システムを使用して小分子をタンパク質表面上に注入した。タンパク質への小結合に対応するチップ表面上の総質量の変化を測定した。一連の小分子濃度を注入することによって、ＬＡＮＣＬ２に結合するＢＴ−１１及びＬＡＮＣＬ２に結合するＢＴ−１５の定常状態結合親和性を算出し得た。結合センサーグラムは、非常に高速のオン速度及び非常に高速のオフ速度を伴う典型的な小分子タンパク質相互作用を示した（図８、パネルＡ及びＣ）。これらの高速の相互作用は、機器の技術的能力を超えている。したがって、信頼性のある会合速度定数（ｋa）及び解離速度定数（ｋd）は決定されなかった。平衡解離定数（ＫD）は、例えば、リガンドが特定のタンパク質にどの程度しっかりと結合するか等、リガンドとタンパク質との間の親和性を説明するために一般的に使用される。リガンド−タンパク質の親和性は、水素結合、静電相互作用、疎水性力、及びファンデルワールス力等の２つの分子間の非共有的な分子間相互作用の影響を受ける。化合物濃度に対する平衡結合レベルをプロットすることによって、各相互作用に関する定常状態親和性（ＫD）を測定し得た（図８、パネルＢ及びＤ）。両小分子は、ＬＡＮＣＬ２に関して類似の結合親和性を示した（ＢＴ−１１：７．７ｕＭ、ＢＴ−１５  １１．４ｕＭ）。
【０１５６】
ＢＴ−ＡＢＡ−５ａ及びＢＴ−６は、ＬＡＮＣＬ２に強く結合する。上に説明される結果と同様に、ＢＴ−６及びＢＴ−ＡＢＡ−５ａのＬＡＮＣＬ２への結合を確認するために、ＳＰＲ分析をＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ−２００機器内で実施した。この場合も、精製された組み換えＬＡＮＣＬ２タンパク質をＢＩＡＣＯＲＥ（商標）センサーチップ上に固定し、機器のマイクロ流体システムを使用してタンパク質表面上に小分子を注入した。タンパク質への小結合に対応するチップ表面上の総質量の変化を測定した。結合センサーグラム（図９Ａ及び９Ｂ）をより詳細に見ると、我々の結果は、オン速度で非常に高速であり、オフ速度でも非常に高速であるＢＴ−１１／ＢＴ−１５と比較して、ＢＴ−６及びＢＴ−ＡＢＡ−５ａが非常に高速に結合するが、オフ速度ほどには高速ではないことを示している。ＢＴ−ＡＢＡ−５ａの占有時間は最も低速のオフ速度を示し、これはＢＴ−ＡＢＡ−５ａがＬＡＮＣＬ２の結合ポケット内に最も長く滞留することを意味することに留意されたい。このより長い結合は、より有効な抗炎症性及び抗糖尿病性及び他の治療応答を引き起こすことによって、ＬＡＮＣＬ２経路の活性化に潜在的に影響を与え得る。
【０１５７】
他の化合物はＳＰＲを介して試験されており、その結果は図１Ａ及び１Ｂに分かりやすく示される。
【０１５８】
実験研究実施例
実施例２０：ＩＢＤの急性モデルにおけるＢＴ−１１の使用
導入
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、胃腸管の慢性再発性疾患であり、米国内で１４０万人を超える人々を悩ませている。ＩＢＤは、潰瘍性大腸炎及びクローン病の２つの異なる所見を含む。現在のＩＢＤの療法は、やや成功しており、疾患の長期管理に関して顕著な有害な副作用を有する［１７］。クローン病はこの疾患の慢性期を表すのに対し、急性潰瘍性大腸炎（ＵＣ）は、結腸組織に影響を及ぼす早期の病理として現れる。ＵＣは、結腸を通じて連続的ではあるが可変的範囲に近位に延在する直腸の粘膜炎症を特徴とする胃腸管の慢性の特発性炎症性障害である。この障害は、変動する重症度のぶり返し及び寛解の経過を特徴とする。患者の大多数は、軽度から中等度の重症度の左側または遠位の疾患を示す。大部分は、維持医学療法により長期の寛解に留まる。しかしながら、自然史研究は、１０〜４０％が疾患の経過中のある時点で結腸切除を受けることを示唆している。
【０１５９】
ステロイド不応性の重度のＵＣの医学的治療は近年、シクロスポリン及びインフリキシマブの両方の救済剤としての利用可能性に伴い多少拡大しているが、外科手術は依然として、唯一の「治癒的な」選択肢である。本発明は、ＬＡＮＣＬ２と呼ばれる新規の受容体を標的とすることによるＵＣの治療のための新規の製剤を提供する。我々のトップリード化合物であるＢＴ−１１は、経口投与され、全身に分布され、腸免疫細胞内でＬＡＮＣＬ２を標的とすることによってＵＣにおける免疫修飾効果を発揮する。マウスにおける急性ＵＣの我々の前臨床効能研究は、ＢＴ−１１による投与が、腸粘膜内の白血球浸潤を著しく減少させ、粘膜肥厚及び上皮侵食を減少させることによって、いかに疾患活性指数を低減し、腸炎症を改善するかを示した。遺伝子発現分析は、ＢＴ−１１の経口投与が、マウスにおける急性ＤＳＳ誘発性潰瘍性大腸炎のモデルにおいてＩＬ−１０及びＬＡＮＣＬ２の発現を上方調節し、ＴＮＦα  ｍＲＮＡの発現を下方調節することを確認した。
【０１６０】
方法
マウスＣ５７ＢＬ／６をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、換気ラック内に特定の病原体のない条件下で収容した。ＬＡＮＣＬ２−／−マウスを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＤａｖｉｓにてＫＯＭＰリポジトリから購入した。全てのマウスは、動物施設内に維持した。全ての実験プロトコルは、機関の動物実験委員会によって承認され、国立衛生研究所実験動物福祉部門及び公衆衛生局規範のガイドラインに合致するか、またはそれを上回っていた。
【０１６１】
ＤＳＳ誘発性大腸炎。大腸炎を、飲料水に添加した５％（重量／体積）デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ；分子量４２ｋＤａ；ＩＣＮ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ａｕｒｏｒａ、ＯＨ）の投与によってＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて誘発した。結腸炎症を、ＤＳＳ処置の７日後に評定した。ＤＳＳ研究における群は、ｉ．非ＤＳＳ、ビヒクル処置マウス、ｉｉ．非ＤＳＳ、ＢＴ−１１（８０ｍｇ／Ｋｇ）処置マウス、ｉｉｉ．ＤＳＳ処置、ビヒクル処置マウス、及びｉｖ．ＤＳＳ処置、ＢＴ−１１（８０ｍｇ／Ｋｇ）処置マウスから構成された。各群、１２匹のマウスが含まれた。
【０１６２】
病理組織。マウスにおけるＩＢＤ研究からの結腸切片を、１０％緩衝中性ホルマリン中に固定し、その後パラフィンに包埋し、次に切開し（５μｍ）、組織学的検査のためにＨ＆Ｅ染料で染色した。結腸を、（１）白血球浸潤、（２）粘膜肥厚、及び（３）上皮細胞侵食の程度を含む複合組織学的スコアで等級付けした。切片を、前述の分類の各々について０〜４のスコアで等級付けし、データを正規化された複合スコアとして分析した。
【０１６３】
定量的即時ＰＣＲ。総ＲＮＡを、ＲＮＥＡＳＹ  ＰＬＵＳ  ＭＩＮＩ  ＫＩＴ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して、製造者の指示に従ってマウス結腸から単離した。総ＲＮＡ（１μｇ）を使用し、ＩＳＣＲＩＰＴ（商標）ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用してｃＤＮＡテンプレートを生成した。総反応体積は２０μＬであり、反応を、ＭＪ  ＭＩＮＩ（商標）サーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）内で以下の通り培養した：２５℃で５分間、５２℃で３０分間、８５℃で５分間、及び４℃で保持。ＰＣＲを、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用してｃＤＮＡ上で実施した。各遺伝子アンプリコンを、ＭＩＮＥＬＵＴＥ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、ＤＮＡ質量ラダー（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用してアガロースゲル上で、及びナノドロップを用いての両方で定量化した。これらの精製アンプリコンを使用して、即時ＰＣＲ条件を最適化し、即時ＰＣＲアッセイにおいて標準曲線を生成した。Ｏｌｉｇｏ  ６ソフトウェアを使用して、プライマーを設計した。プライマー濃度及び焼鈍温度を、ＩＣＹＣＬＥＲ  ＩＱ（商標）システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に対して、システムの勾配プロトコルを使用して各プライマーセットについて最適化した。最適化中また試料ＤＮＡの即時ＰＣＲ中、各プライマーセットに関してＰＣＲ効率を９２〜１０５％に、相関係数を０．９８超に維持した。関心の遺伝子のｃＤＮＡ濃度を、ＩＣＹＣＬＥＲ  ＩＱ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ及びＩＱ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して即時ｑＰＣＲによって検査した。標準曲線を、各遺伝子について、５ｐｇのｃＤＮＡから開始する精製アンプリコンの１０倍希釈を使用して生成し、その後、未知の試料中の標的ｃＤＮＡの開始量を算出するために使用した。ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩは、一般的な二本鎖ＤＮＡ挿入色素であり、したがって、関心のアンプリコンに加えて非特異的生成物及びプライマー／ダイマーを検出し得る。即時ＰＣＲ中に合成された生成物の数を決定するために、各生成物に対して融解曲線分析を実施した。即時ＰＣＲを使用して、同じ９６ウェルプレート上のｃＤＮＡの各未知試料の核酸の開始量を測定した。
【０１６４】
統計分析。パラメトリックデータを、ＡＮＯＶＡに続いてシェッフェの多重比較法を使用して分析した。ノンパラメトリックデータを、マンホイットニーのＵ検定に続いてダンの多重比較検定を使用して分析した。ＳＡＳの一般的な線形モデル手順、リリース６．０．３（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して、ＡＮＯＶＡを実施した。統計的有意性を、Ｐ≦０．０５にて評定した。
結果
【０１６５】
ＢＴ−１１は、大腸炎のＤＳＳモデルにおける疾患及び組織病理を改善する。この研究の目的は、ＢＴ−１１の投与が、ＬＡＮＣＬ２を活性化し、ＩＢＤの文脈において抗炎症特性を発揮するか否かを調査することであった。ＩＢＤの急性モデルにおける我々の例示的化合物ＢＴ−１１の効能を評定するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを７日間のチャレンジにて５％ＤＳＳで処置した。チャレンジ期間を通して、ＢＴ−１１による処置は、疾患活性のスコアを有意に改善した（図１０、パネルＡ）。さらに、脾臓（図１０、パネルＢ）、ＭＬＮ（図１０、パネルＣ）、及び結腸（図１０、パネルＤ）における巨視的病変も、チャレンジ後７日目にＢＴ−１１を使用することによって、ＬＡＮＣＬ２経路の活性化後に有意に減少された。
【０１６６】
ＢＴ−１１は、急性炎症性大腸炎を有するマウスにおける結腸病理組織を用量応答様式で改善する。次に、病理組織学的結腸炎症性病変に対するＢＴ−１１の効果を検査した。
疾患活性及び肉眼的病変の観察に従って、病理組織学的分析により、ＢＴ−１１による処置は、白血球浸潤（図１１、パネルＧ）、上皮侵食（図１１、パネルＨ）、及び粘膜肥厚（図１１、パネルＩ）の評定に基づいて、腸粘膜における炎症を有意に５倍減少させたことが確認された。代表的な結腸の顕微鏡写真は、マウスにおけるＤＳＳ誘発性大腸炎中のＢＴ−１１による処置が、上皮細胞の統合性の改善、腸構造の破壊の低減、及びいくつかの免疫サブセットの浸潤によって、腸粘膜の状態をいかに著しく改善するかを示す（図１１、パネルＡ〜Ｆ）。ＢＴ−１１を用いて用量応答研究を実施し、大腸炎を有するマウスにおいて、ＢＴ−１１の用量が１０〜８０ｍｇ／Ｋｇに増加するのに伴い結腸炎症の３つの特質（白血球浸潤、粘膜肥厚、及び上皮侵食）がいかに減少されたかを興味深く観察した（図１２、パネルＡ〜Ｃ）。
【０１６７】
ＢＴ−１１による経口処置は、ＴＮＦαの発現を低減し、ＬＡＮＣＬ２及びＩＬ−１０を上方調節する。免疫系の修飾に対するＢＴ−１１の効果をより詳しく調査するために、ＩＬ−１０、ＬＡＮＣＬ２、及びＴＮＦαの遺伝子発現を評定した。結果は、ＢＴ−１１による処置が、いかに腫瘍ネクロプシス因子アルファ（ＴＮＦα）の発現を下方調節するか（図１３、パネルＡ）、ならびにインターロイキン１０（ＩＬ−１０）（図１３、パネルＢ）及びＬＡＮＣＬ２受容体（図１３、パネルＣ）のレベルを上方調節するかを、したがって、抗炎症効果を促進し、ＴＮＦαによって引き起こされる炎症応答を下方調節する正のフィードバックループを作り出すかを示す。用量応答研究を実施することによって、我々のリガンドＢＴ−１１及びそれに続くＬＡＮＣＬ２経路の活性化は、フローサイトメトリーよって評定されたその発現がＢＴ−１１による用量応答動態に従うため、結腸ＩＬ−１０の生成を直接増加させると仮定し得た（図１４、パネルＢ）。結腸ＴＮＦα発現細胞の低減は、４０及び８０ｍｇ／ＫｇのＢＴ−１１の両方において有意に異なるが、１０または２０ｍｇ／Ｋｇ等のより低い用量においてはそうではないことが観察された（図１４、パネルＡ）。また、ＭＬＮにおけるＦＯＸＰ３発現がいかに用量依存性であるかも観察された（図１４、パネルＣ）。
【０１６８】
急性大腸炎中のＢＴ−１１の効果は、ＬＡＮＣＬ２に依存する。ＢＴ−１１による投与の有益な効果が、マウスにおける急性大腸炎中にいかに発揮されるかを実証するために、野生型及びＬＡＮＣＬ２ノックアウト（ＬＡＮＣＬ２−／−）マウスにおいてかかる効果を比較する研究を実施した。我々の結果は、ＬＡＮＣＬ２の損失はマウスの急性ＤＳＳ誘発性大腸炎からの回復を妨げたため、ＢＴ−１１がその抗炎症性利益を発揮するためにＬＡＮＣＬ２が必要であることを実証している（図１５、パネルＡ）。同様に、野生型及びＬＡＮＣＬ２−／−の同腹仔を比較した際に、ＬＡＮＣＬ２の損失は、結腸（図１５、パネルＢ）、ＭＬＮ（図１５、パネルＣ）、及び脾臓（図１５、パネルＤ）における巨視的スコアの減少を無効にした。さらに、ビヒクルまたはＢＴ−１１のいずれかで処置されたＬＡＮＣＬ２−／−マウスにおける病理組織学的分析を評定し、ＬＡＮＣＬ２の損失が、ＢＴ−１１の効果をいかに完全に無効にするかが観察されたため、結腸粘膜内の病変形成におけるＢＴ−１１の効果もＬＡＮＣＬ２依存性である（図１６）。
【０１６９】
ＢＴ−１１による処置後の細胞応答をさらに特徴付けるために、さらにＬＡＮＣＬ２ノックアウト研究を実施して、炎症促進性タンパク質の減少及び抗炎症性因子の増加が除去されたかを判定した。ＬＡＮＣＬ２遺伝子の損失はＢＴ−１１の効果を無効にするため、本フローサイトメトリーの結果は、炎症促進性因子ＭＣＰ１の低減が、結腸（図１７、パネルＡ）及びＭＬＮ（図１７、パネルＢ）の両方においてＬＡＮＣＬ２依存性であることを実証している。また、結腸内のＴＮＦαの分泌は、ＬＡＮＣＬ２依存性であり（図１７、パネルＣ）、顆粒球のＭＨＣ−ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋集団の上方調節（図１７、パネルＤ）も同様であることも見出された。これらの結果に従って、ＢＴ−１１処置後のＩＬ−１０分泌の上方調節は、結腸（図１７、パネルＥ）及び脾臓（図１７、パネルＦ）の両方にて、ＬＡＮＣＬ２ノックアウトマウスにおいて完全に無効にされることが見出され、ここでも、我々の関心の対象に伴う我々のトップリード化合物の依存性を示している。
【０１７０】
考察
ＬＡＮＣＬ２は、炎症性及び免疫媒介性疾患のための新規の治療標的として浮上している［１８］。我々のインビボの結果は、ＬＡＮＣＬ２リガンドＢＴ−１１を用いた経口処置が、炎症を抑制することによってＩＢＤのマウスモデルにおいて腸の免疫病理を和らげることを初めて実証している。ＬＡＮＣＬ２は近年、ＡＢＡ結合及びシグナル伝達に関連するその機能［１９］、ならびにＰＰＡＲγ活性化の代替的な膜系機構の近年の発見［８］のため、潜在的な治療標的として注目を集めている。さらに我々は、ＬＡＮＣＬ２が、脳及び精巣に加えて胸腺、脾臓、結腸、及びパイエル板等の他の組織においても発現されることを示した一連のマウス組織におけるＬＡＮＣＬ２発現を決定し、これは、ＬＡＮＣＬ２と免疫応答との間の可能な関係性を示し、治療標的としてのＬＡＮＣＬ２のより広範な可能性を示唆している。
【０１７１】
我々は以前、ＡＢＡがＰＰＡＲγをインビトロで転写活性化し、他のＰＰＡＲγアゴニストと同様に全身性の炎症を抑制することを報告している。ＡＢＡ及びＮＳＣ６１６１０はどちらもＬＡＮＣＬ２を標的とするため、ＮＳＣ６１６１０もまた、ＰＰＡＲγ活性化を介して作用し得る。実験結果は、ＮＳＣ６１６１０処置が、生マクロファージにおいてＰＰＡＲγを活性化し、それによって、ＬＡＮＣＬ２とＰＰＡＲγとの間の潜在的なシグナル伝達関係の証拠を提供し、ＮＳＣ６１６１０がＬＡＮＣＬ２−ＰＰＡＲγ軸をインビトロで標的とし得ることを示していることを示す。ＰＰＡＲγのＮＳＣ６１６１０媒介性活性化におけるＬＡＮＣＬ２の重要性を調査するために、ｓｉＲＮＡを使用した生マクロファージにおけるＬＡＮＣＬ２のノックダウンが、ＰＰＡＲγレポーター活性に対するＮＳＣ６１６１０の効果を損なうまたは無効にするか否かを判定した。我々の所見は、ＬＡＮＣＬ２のノックダウンがＰＰＡＲγ活性に対するＮＳＣ６１６１０の効果を著しく弱めることを示している［１２］。本実施例では、我々は、ＢＴ−１１の投与が、疾患活性指数のスコアならびに脾臓、ＭＬＮ、及び結腸の巨視的スコアを減少させる（図１０）だけでなく、病理組織学的病変を著しく低減する（図１１）ことによって、抗炎症特性をいかに発揮するかを実証している。我々は、これらの２つの特定の効果がＬＡＮＣＬ２にいかに依存するかを実証した（図１５及び図１６）。我々はまた、ＢＴ−１１が、ＴＮＦａのレベルを低減し、ＬＡＮＣＬ２及びＩＬ−１０の両方を上方調節することも実証した（図１３）。我々はまた、ＬＡＮＣＬ２−／−マウスにおいてこれらの傾向が観察されなかったため、これらの効果はＬＡＮＣＬ２依存性であることも実証した（図１７）。これらの結果は、ＬＡＮＣＬ２は炎症性疾患のための新規の治療標的であり、ＢＴ−１１は、それを標的とする化合物であることを確認する。
【０１７２】
実施例２１：クローン病の慢性モデルにおけるＢＴ−１１の使用
導入
上述の通り、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、潰瘍性大腸炎及びクローン病のその２つの所見を有し、胃腸管の広範囲にわたる炎症及び免疫細胞浸潤を特徴とする免疫媒介性疾患である。ＩＢＤの病因は多因性であり、遺伝子的素因、環境因子、及び腸内微生物叢間の相互作用を伴う。
【０１７３】
本実施例は、ＩＢＤの慢性所見であるクローン病に着目することとする。潰瘍性大腸炎における炎症は、表面粘膜及び粘膜下層に関与するが結腸に限定される連続的なパターンを特徴とするのに対し、クローン病では、この炎症は貫壁性及び非連続的であり、最も影響を受ける回腸以外に腸の任意の領域が影響を受け得る。クローン病の病原体は、複雑であり、遺伝子的及び環境的な因子、ならびに膜免疫系の長期の活性化によってもたらされる腸粘膜への免疫媒介性損傷によって影響を受ける。
【０１７４】
例えば、コルチコステロイドプレドニゾンまたは抗腫瘍壊死因子−α抗体ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｈｏｒｓｈａｍ、ＰＡ）（インフリキシマブ）等の免疫及び炎症応答を下方修飾するように標的とされる治療は、疾患の重症度及び再発の低減に効果を発揮している。しかしながら、これらの治療はまた、クッシング様外観、体重増加、及び全身性免疫抑制等の種々の有害な副作用に関連し、したがってＩＢＤの長期的管理のためのより安全な代替物の開発の必要が強調される［２０］。
【０１７５】
本発明は、ＬＡＮＣＬ２と呼ばれる新規の受容体を標的とすることによるクローン病の治療のための新規の製剤を提供する。例示的化合物であるＢＴ−１１は、経口投与され、全身に分布され、腸免疫細胞内でＬＡＮＣＬ２を標的とすることによって、ＵＣのみでなくクローン病においても免疫修飾効果を発揮する。マウスにおけるクローン病の慢性モデルにおける我々の前臨床効能研究は、ＢＴ−１１による投与が、腸粘膜内の白血球浸潤を著しく減少させ、粘膜肥厚及び上皮侵食を減少させることによって、いかに疾患活性指数を低減し、腸炎症を改善するかを示した。遺伝子発現分析は、ＢＴ−１１の経口投与が、マウスにおけるＩＢＤの慢性モデルにおいてＬＡＮＣＬ２の発現を上方調節し、ＴＮＦα  ｍＲＮＡの発現を下方調節することを認した。さらに、ＢＴ−１１の投与は、炎症促進性マクロファージ及び結腸固有層への樹枝状細胞浸潤を低減し、ＦＯＸＰ３発現ＣＤ４＋Ｔ細胞を上方調節し、結腸内のエフェクターＴｈ１細胞の数を下方調節した。我々はまた、これらの効果がＬＡＮＣＬ２依存性であることを確認するためにノックアウト研究を実施した。最後に、誘導部位において、ＢＴ−１１は、Ｔｈ１７細胞の生成を下方調節すること、及びＦＯＸＰ３発現の上方調節を介して調節ＣＤ４＋Ｔ細胞区画を上方調節することが可能である。
【０１７６】
方法
マウス。Ｃ５７ＢＬ／６及びＩＬ−１０ノックアウトマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、換気ラック内に特定の病原体のない条件下で収容した。ＬＡＮＣＬ２−／−マウスを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＤａｖｉｓにてＫＯＭＰリポジトリから購入した。全てのマウスは、動物施設内に維持した。全ての実験プロトコルは、機関の動物実験委員会によって承認され、国立衛生研究所実験動物福祉部門及び公衆衛生局規範のガイドラインに合致するか、またはそれを上回っていた。
【０１７７】
ＣＤ４＋Ｔ細胞の富化及び選別。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（野生型）マウスから得た脾細胞を、Ｉ−Ｍａｇ細胞分離システム（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して磁気陰性選別によってＣＤ４＋Ｔ細胞中で富化した。細胞をビオチン化Ａｂの混合物と共に培養した後、ストレプトアビジン粒子と共に２回目の培養を行い、磁石に曝露して不要な細胞を除去した。ＣＤ４＋富化細胞懸濁液の純度は、９３〜９６％であった。ＣＤ４富化細胞は、養子移入に使用するか、またはＦＡＣＳによってさらに精製した。ＦＡＣＳ選別のために、細胞をＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４、及びＣＤ２５で標識し、ＦＡＣＳＡＲＩＡ（商標）細胞選別機（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）内でＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢ高ＣＤ２５−細胞（すなわち、エフェクターＴ細胞）に分離した。ＦＡＣＳで選別したＣＤ４＋サブセットの純度は、９８％以上であった。
【０１７８】
養子移入。６週齢のＳＣＩＤ及びＲＡＧ２−／−マウスに、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（野生型）またはＬＡＮＣＬ２−／−マウス由来の４×１０5ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢ高ＣＤ２５−を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。マウスの体重を毎週測定し、疾患の兆候を１４週間毎日記録した。消耗性疾患の重度の兆候を発症したマウスを屠殺した。そうでない場合は、移入の９０日後にマウスを屠殺した。養子移入研究のための群は、以下の通りであった：ｉ．非移入ビヒクル処置、ｉｉ．非移入ＢＴ−１１（８０ｍｇ／Ｋｇ）処理、ｉｉｉ．移入ビヒクル処置、ｉｖ．移入ＢＴ−１１（８０ｍｇ／Ｋｇ）処置。各群、１２匹のマウスを使用した。
【０１７９】
病理組織。マウスにおけるＩＢＤ研究からの結腸切片を、１０％緩衝中性ホルマリン中に固定し、その後パラフィンに包埋し、次に切開し（５μｍ）、組織学的検査のためにＨ＆Ｅ染料で染色した。結腸を、（１）白血球浸潤、（２）粘膜肥厚、及び（３）上皮細胞侵食の程度を含む複合組織学的スコアで等級付けした。切片を、前述の分類の各々について０〜４のスコアで等級付けし、データを正規化された複合スコアとして分析した。
【０１８０】
細胞単離。脾臓及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）を切除し、２枚の滅菌顕微鏡スライドの凍らせた端を使用して１×ＰＢＳ／５％ＦＢＳ中で粉砕した。単一細胞懸濁液を３００×ｇで１０分間遠心分離し、１×ＰＢＳで１回洗浄した。洗浄ステップの前に、浸透圧溶解によって赤血球を除去した。全ての細胞ペレットをＦＡＣＳ緩衝液（５％ＦＢＳ及び０．０９％アジ化ナトリウムを補充した１×ＰＢＳ）中に再懸濁し、フローサイトメトリー分析に供した。同時に、結腸を切除し、固有層白血球（ＬＰＬ）を単離した。組織片をＣＭＦ（１×ＨＢＳＳ／１０％ＦＢＳ／２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ）中で洗浄し、組織を、ＣＭＦ／５ｍＭのＥＤＴＡと共に３７℃で１５分間、撹拌しながら２回培養した。１×ＰＢＳで洗浄した後、組織を、３００Ｕ／ｍＬのＶＩＩＩ型コラゲナーゼ及び５０Ｕ／ｍＬのＤＮＡｓｅ  Ｉ（どちらもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＣＭＦ中で３７℃にて１．５時間、撹拌しながらさらに消化した。上清を濾過した後、細胞を１×ＰＢＳ中で１回洗浄し、ペレットをＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁し、フローサイトメトリー分析に供した。
【０１８１】
フローサイトメトリーによる免疫表現型検査及びサイトカイン分析。免疫細胞サブセットの蛍光染色のために、４〜６×１０5個の細胞を、蛍光色素共役一次マウス特異的抗体：抗ＣＤ３  ＰＥ−Ｃｙ５クローン１４５−２Ｃ１１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、抗ＣＤ４  ＰＥ−Ｃｙ７クローン  ＧＫ１．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＣＤ４  ＡＰＣクローンＲＭ４−５、及び抗ＣＤ２５ビオチンクローン７Ｄ４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に２０分間培養した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（５％ＦＢＳ及び０．０９％アジ化ナトリウムを補充した１×ＰＢＳ）で洗浄した。転写因子及びサイトカインの細胞内染色のために、細胞を固定し、市販のキットを使用して製造者の指示に従って透過処理した（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。手短に述べると、細胞を固定子、２０分間透過処理し、Ｆｃ受容体をマウス抗ＣＤ１６／ＣＤ３２  ＦｃＢｌｏｃｋ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で遮断し、細胞を、抗マウス、ＦＯＸＰ３  ＦＩＴＣクローンＦＪＫ−１６ｓ、抗マウスＲＯＲガンマ（ｔ）ＰＥ、クローンＢ２Ｂ及び抗マウスＩＬ１７−Ａ  ＡＰＣ、クローンｅＢｉｏ１７Ｂ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に対して蛍光色素共役抗体で染色した。全ての試料を、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａフローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上での取得まで、４℃の暗所で固定して保管した。生細胞ゲート（ＦＳＣ−Ａ、ＳＳＣ−Ａ）を全試料に適用した後、単一細胞ゲーティング（ＦＳＣ−Ｈ、ＦＳＣ−Ｗ）を行い、その後、特定のマーカーの発現について細胞を分析した。データ分析を、ＦＡＣＳ  ＤＩＶＡ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＦｌｏｗ  Ｊｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）を用いて分析した。
【０１８２】
定量的即時ＰＣＲ。総ＲＮＡを、ＲＮＥＡＳＹ  ＰＬＵＳ  ＭＩＮＩ  ＫＩＴ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造者の指示に従ってマウス結腸から単離した。総ＲＮＡ（１μｇ）を使用し、ＩＳＣＲＩＰＴ（商標）ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してｃＤＮＡテンプレートを生成した。総反応体積は２０μＬであり、反応を、ＭＪ  ＭＩＮＩ（商標）サーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）内で以下の通り培養した：２５℃で５分間、５２℃で３０分間、８５℃で５分間、及び４℃で保持。ＰＣＲを、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡ上で実施した。各遺伝子アンプリコンを、ＭＩＮＥＬＵＴＥ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、ＤＮＡ質量ラダー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してアガロースゲル上で、及びナノドロップを用いての両方で定量化した。これらの精製アンプリコンを使用して、即時ＰＣＲ条件を最適化し、即時ＰＣＲアッセイにおいて標準曲線を生成した。Ｏｌｉｇｏ  ６ソフトウェアを使用して、プライマーを設計した。プライマー濃度及び焼鈍温度を、ＩＣＹＣＬＥＲ  ＩＱ（商標）システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に対して、システムの勾配プロトコルを使用して各プライマーセットについて最適化した。最適化中また試料ＤＮＡの即時ＰＣＲ中、各プライマーセットに関してＰＣＲ効率を９２〜１０５％に、相関係数を０．９８超に維持した。関心の遺伝子のｃＤＮＡ濃度を、ＩＣＹＣＬＥＲ  ＩＱ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ及びＩＱ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して即時ｑＰＣＲによって検査した。標準曲線を、各遺伝子について、５ｐｇのｃＤＮＡから開始する精製アンプリコンの１０倍希釈を使用して生成し、その後、未知の試料中の標的ｃＤＮＡの開始量を算出するために使用した。ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩは、一般的な二本鎖ＤＮＡ挿入色素であり、したがって、関心のアンプリコンに加えて非特異的生成物及びプライマー／ダイマーを検出し得る。即時ＰＣＲ中に合成された生成物の数を決定するために、各生成物に対して融解曲線分析を実施した。即時ＰＣＲを使用して、同じ９６ウェルプレート上のｃＤＮＡの各未知試料の核酸の開始量を測定した。
【０１８３】
統計分析。パラメトリックデータを、ＡＮＯＶＡに続いてシェッフェの多重比較法を使用して分析した。ノンパラメトリックデータを、マンホイットニーのＵ検定に続いてダンの多重比較検定を使用して分析した。ＳＡＳの一般的な線形モデル手順、リリース６．０．３（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して、ＡＮＯＶＡを実施した。統計的有意性を、Ｐ≦０．０５にて評定した。
【０１８４】
結果
ＢＴ−１１は、ＩＢＤの慢性ＩＬ−１０−／−モデルにおける疾患活性を改善する。クローン病の慢性化を研究する多数の動物研究は、ＩＬ−１０が多数の炎症促進性サイトカインの分泌を抑制することが知られているため、インターロイキン−１０欠損マウス（ＩＬ−１０−／−）マウスモデルを用いている［２１］。大腸炎の急性モデルのみではなく、慢性モデルにおいてもＢＴ−１１の効能を評定するために、大腸炎研究のＩＬ−１０ヌルマウスモデルを設定し、増加する用量のＢＴ−１１（２０、４０、及び８０ｍｇ／Ｋｇ）でマウスを処置した。ＢＴ−１１による処置は、処置マウスにおいて、ビヒクル処置された同腹仔と比較して疾患活性指数スコアを有意に減少させた（図１８）。さらに、最高用量のＢＴ−１１（８０ｍｇ／Ｋｇ）で処置されたマウスは、２０または４０ｍｇ／ＫｇのＢＴ−１１化合物のいずれかで処置されたマウスと比較して１３週目から実験の終了まで有意にスコアを低減した。
【０１８５】
ＢＴ−１１は、ＩＢＤのＩＬ１０−／−慢性モデルにおいて脾臓、ＭＬＮ、及び結腸における巨視的病変を低減した。最初に臨床効能を判定するために、ＢＴ−１１による処置後に巨視的組織病変を評定し、その後のＬＡＮＣＬ２経路の活性化を評定した。研究の開始後１９週目に、安楽死及び組織採取の直後に脾臓（図１９、パネルＡ）、ＭＬＮ（図１９、パネルＢ）、及び結腸（図１９、パネルＣ）を巨視的にスコア化した。２０ｍｇ／Ｋｇの低い濃度でのＢＴ−１１による処置は、これらの組織において巨視的スコアを大いに及び有意に低減し、その有力な効能を実証している。
【０１８６】
ＢＴ−１１は、ＩＢＤのＩＬ−１０−／−慢性モデルにおける病理組織学的病変及び炎症を改善する。腸粘膜における病理組織学的病変及び一般病理を評定するために、結腸切片をＨ＆Ｅで染色し、顕微鏡下で観察した。我々の結果は、白血球浸潤（図２０、パネルＡ）、上皮侵食（図２０、パネルＢ）、及び粘膜肥厚（図２０、パネルＣ）の低減に基づいて、ＢＴ−１１による処置が炎症をいかに有意に低減したかを示している。また、粘膜の肥厚に相関した腸粘膜における浸潤の量について用量依存性機構も観察した。
【０１８７】
ＢＴ−１１による処置は、有力な抗炎症応答を誘発し、結腸固有層、脾臓、及びＭＬＮにおける炎症促進性サブセットを減少させる。免疫細胞サブセットに対するＢＴ−１１の効果を判定するために、結腸、脾臓、及びＭＬＮから単離した細胞を表現型的に特徴付けた。我々の分析は、ＢＴ−１１が、結腸固有層における炎症促進性Ｆ４／８０＋マクロファージ（図２１、パネルＡ）、ＭＨＣ−ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋樹枝状細胞（図２１、パネルＢ）、及びエフェクターＴｈ１細胞（図２１、パネルＤ）のパーセンテージを有意に減少させたことを示した。さらに、ＢＴ−１１は、結腸ＬＰにおけるＦＯＸＰ３発現ＣＤ４＋Ｔ細胞の上方調節を介して抗炎症特性を発揮した（図２１、パネルＣ）。
【０１８８】
ＦＯＸＰ３発現ＣＤ４＋Ｔ細胞の上方調節はまた、ＭＬＮ（図２２、パネルＢ）及び脾臓（図２２、パネルＣ）の両方においても見られ、ＢＴ−１１がいかに全身性効果も有するかを示し、実証している。炎症促進性Ｔｈ１細胞の下方調節もまた、脾臓において用量応答様式で観察された（図２２、パネルＤ）。最後に、ＲＯＲγｔのその発現を特徴とするエフェクターＴｈ１７細胞は、ＭＬＮにおいて下方調節された（図２２、パネルＡ）。
【０１８９】
さらに、遺伝子発現分析は、ＢＴ−１１による処置がＬＡＮＣＬ２の結腸発現を上方調節し（図２３、パネルＡ）、ＴＮＦαの発現を下方調節する（図２３、パネルＢ）ことを確認した。これらの発現効果は、投与されるＢＴ−１１の量に関して用量依存性であった。
【０１９０】
ＢＴ−１１は、ＩＢＤの大腸炎モデルのＣＤ４＋Ｔ細胞誘導における疾患活性の改善を実証した。ＩＢＤの別の慢性モデルにおけるＢＴ−１１の効能をさらに検証するために、野生型及びＬＡＮＣＬ２−／−マウス由来のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＲＡＧ２−／−レシピエントに養子移入した。ＲＡＧ２−／−マウスを、実験設計に基づいてビヒクルまたはＢＴ−１１のいずれかで処置した。我々のトップリード化合物ＢＴ−１１による処置は、処置マウスにおける疾患活性指数スコアを野生型同腹仔と比較したときに有意に低減した（図２４）。ＢＴ−１１の効果はＬＡＮＣＬ２の損失によって完全に無効にされたため、これらの結果はＬＡＮＣＬ２依存性であることが見出された（図２５）。
【０１９１】
興味深いことに、ＢＴ−１１処置マウスにおける体重損失は、ビヒクル処置マウスと比較したときに、７週目から実験の終了まで有意に改善された（図２６）。
【０１９２】
ＢＴ−１１は、ＩＢＤの養子移入慢性モデルにおいて脾臓、ＭＬＮ、及び結腸における巨視的病変を低減した。慢性大腸炎の第２のモデルにおける臨床効能を確認するために、野生型またはＬＡＮＣＬ２−／−細胞で養子移入され、ビヒクルまたはＢＴ−１１のいずれかで処置されたマウスにおいて、ＢＴ−１１による処置後に巨視的組織病変を評定し、その後のＬＡＮＣＬ２経路の活性化を評定した。研究の開始後１１週目に、安楽死及び組織採取の直後に脾臓（図２７、パネルＡ）、ＭＬＮ（図２７、パネルＢ）、及び結腸（図２７、パネルＣ）、及び回腸（図２７、パネルＤ）を巨視的にスコア化した。８０ｍｇ／Ｋｇの濃度でのＢＴ−１１による処置は、４つの組織において巨視的スコアを大いに及び有意に低減し、その有力な効能を実証している。これらの観察はＬＡＮＣＬ２依存性であり、またＬＡＮＣＬ２の損失はＢＴ−１１の効果を完全に無効にしたことが見出された（図２８）。
【０１９３】
ＢＴ−１１はまた、慢性大腸炎の養子移入モデルにおける病理組織学的病変及び炎症も改善する。ＩＬ−１０−／−誘発性大腸炎実験と同様に、ＩＢＤの第２のマウスモデルによる腸粘膜における病理組織学的病変及び一般病理を確認するために、結腸切片をＨ＆Ｅで染色し、顕微鏡下で観察した。我々の結果は、結腸及び回腸（図２９、パネルＡ及びＢ）ならびに粘膜肥厚（図２９、パネルＥ及びＦ）の両方における白血球浸潤の低減に基づいて、ＢＴ−１１による処置が、炎症をいかに有意に低減したかを確認する。回腸は、上皮侵食における影響がより少ない（図２９、パネルＤ）が、結腸におけるその侵食は、我々のトップリード化合物ＢＴ−１１で処置されたマウスにおいては有意により低いことが見出された（図２９、パネルＣ）ことに留意されたい。ＬＡＮＣＬ２に対するＢＴ−１１の依存性を確認するために、養子移入研究を実施し、ＬＡＮＣＬ２−／−ドナーに由来するＣＤ４＋Ｔ細胞を移入した。我々の結果は、白血球浸潤、上皮侵食、及び粘膜肥厚の減少が、ＬＡＮＣＬ２−／−を移入されたレシピエントにおいていかに大いに無効にされるかを示している（図３０）。
【０１９４】
ＢＴ−１１は、マウスにおいて一貫して大きな抗炎症応答を誘発し、炎症促進性メディエーターを下方調節する。ＢＴ−１１対ビヒクルで処置されたマウスにおける免疫細胞プロフィールを特徴付けるために、結腸、脾臓、及び腸間膜リンパ節から単離された細胞においてフローサイトメトリー分析を実施した。我々は、ＩＢＤの第２の慢性マウスモデルにおいて、１１週間の期間ＢＴ−１１で処置されたレシピエントマウスは、有意により低いレベルの浸潤Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋炎症促進性マクロファージ（図３１、パネルＡ）と、結腸内の総ＣＤ４５＋白血球について行われた分析に基づいてＩＦＮγレベルの減少（図３１、パネルＢ）とを有することを確認した。さらに、ＢＴ−１１による処置は一貫して、炎症の局所部位、この場合では結腸粘膜においてＦＯＸＰ３（図３１、パネルＣ）及び有力な抗炎症性サイトカインＩＬ−１０（図３１、パネルＤ）の発現を促進することによって、調節ＣＤ４＋Ｔ細胞を上方調節した。
【０１９５】
結腸固有層細胞において観察されたプロフィールと同様に、脾臓及びＭＬＮ等の誘導部位においてこれらの集団を特徴付けた。免疫表現型検査の結果は、ＢＴ−１１による処置が脾臓及びＭＬＮ等の誘導部位においてもＦＯＸＰ３及びＩＬ−１０のレベルをいかに増加させるかを示す（図３２、パネルＡ、Ｂ、Ｄ、及びＥ）。ＢＴ−１１の処置は、ＭＬＮ及び脾臓の両方にてＣＤ４５＋集団においてＩＦＮγの発現を減少させたことに留意されたい（図３２、パネルＣ及びＦ）。
【０１９６】
ＬＡＮＣＬ２を標的とするＢＴ−１１の効果は、ＰＰＡＲγ非依存性である。我々の実験結果に基づき、ＬＡＮＣＬ２の活性化は、炎症を全身レベルで調節するＩＬ−１０系の抗炎症応答を最終的に調節する多量の経路を活性化する。ＬＡＮＣＬ２の１つの活性化される下流経路は、ＰＰＡＲγ経路である。この核因子及び転写因子の二次的活性化に関する潜在的毒性の懸念の克服を助けるために、ＲＡＧ２−／−マウスにＰＰＡＲγ−／−ドナー由来のＣＤ４＋Ｔ細胞も移入した。次に、これらのマウスをビヒクルまたは８０ｍｇ／ＫｇのＢＴ−１１のいずれかで処置した。我々の結果は、疾患活性及び病理組織に対するＬＡＮＣＬ２の活性化を介したＢＴ−１１の有益な効果は、ＰＰＡＲγ非依存性様式で発生することを明確に実証している（図３３、パネルＡ〜Ｄ）。これらの結果は、ＬＡＮＣＬ２の活性化はまた、ＬＡＮＣＬ２活性化の抗炎症効果を修飾する他の経路も調節することを実証している。
【０１９７】
考察
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の現在の療法は、やや成功しており、疾患の長期管理に関して顕著な有害な副作用を有する［１７］。植物化合物アブシジン酸（ＡＢＡ）は、大腸炎のマウスモデルにおいて有力な抗炎症効果を発揮する［２２、２３］。ランチオニンシンテターゼ成分Ｃ様タンパク質２（ＬＡＮＣＬ２）は、ＡＢＡの結合及びシグナル伝達の標的である［１５、１９、２４］。したがって、ＬＡＮＣＬ２は、炎症に対する有望な新規の治療標的として浮上している［１８］。化合物６１６１０、ビス（ベンズイミダゾイル）テレフタルアニリド（ＢＴＴ）は、数百万個の化学物質のライブラリの中で最も高い親和性でＬＡＮＣＬ２に結合するとして同定された。それに加え、６１６１０は、腸炎症のマウスモデルにおいて有力な抗炎症効果を発揮した［２５］。２０の６１６１０由来ＢＴＴの主題ライブラリを作成し、ＢＴ−１１を最高の例示的化合物として同定した。ＢＴ−１１は、ＬＡＮＣＬ２に結合し、経口で活性であり、大腸炎の３つのマウスモデルにおける実証された抗炎症性効能及び際立った安全性プロフィールを有する。
【０１９８】
米国クローン病大腸炎財団によると、ＩＢＤは、北米で１００万人、全世界で４００万人を超える人々を悩ませている。この広域に及ぶ衰弱性の病気は、減少された生活の質及び著しい医療関連費用をもたらす［２６］。ＩＢＤの単一のエピソードを治療するための平均医療費は、患者１名あたり５５，０００ドルを超え［２７］、総支出額は米国内で年間１５０億ドルを超える。それに加え、間接的な支出として、再発性膵炎［２８］または膿瘍、腸閉塞、貧血、血栓症、肛門周囲病変、関節炎、ブドウ膜炎、虹彩炎、もしくは皮膚病変等の他のＩＢＤ合併症［２９］を治療するための費用が挙げられる。ＩＢＤは、患者に多大な負担をもたらし、彼らを社会的に孤立させ、家族関係に影響を及ぼし、専門職に就く機会を制限することが多い［１７］。この点に関して、ＩＢＤを有する患者はより高い非就労率を有し、この高い比率は長期間持続する［３０］。それに加え、腸炎症（潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ））は、特に若年時（３０歳未満）において、結腸癌の発症の危険性を増加させる［３１］。Ｇｌｏｂａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｓｔｓによる新たな報告によると、ＩＢＤ治療薬の世界市場は、２０１５年までに４３億ドルに達すると予想される。
【０１９９】
現在のＩＢＤの治療は改善されているが［１７、３２］、それらは疾患の慢性的な管理についてはあまり成功しておらず、病原体または悪性腫瘍に対する防御免疫応答を高めるための免疫系の能力低下を含む著しい副作用をもたらす。患者のための治療選択肢としては、炎症の症状への対処が挙げられる。今日市場で使用されている薬理学的治療の大多数は、アミノサリシクレート（ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｃｌａｔｅ）、コルチコステロイド、免疫修飾剤、抗生物質、生物製剤（抗腫瘍壊死因子−アルファ抗体）を含む。アミノサリシクレート（ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｃｌａｔｅ）は、非常に有効であり、一般的に耐容性が高い。しかしながら、再発またはより中等度の疾患を有する患者は、症状を制御するための短期間の短期用量のコルチコステリオド（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｉｏｄ）を含む、より積極的な治療を必要とする場合がある。この種類の即効性の療法は、長期間耐え得ない。状態を維持するために、免疫修飾剤もまたＣＤ及びＵＣにおいて一般的に使用されるが、これらは、作用の開始が遅い（完全な効果のためには３〜６カ月）。これらの薬物は、膵炎、糖尿病、瘢痕肝、及び肺炎症にわたる潜在的に著しい有害な副作用を有する。他の療法による管理に失敗した中等度〜重度の症例について、患者は、６〜８週毎に制御された環境内で静脈内に供与される抗ＴＮＦ−αを受けることになる。この非常に高価な療法は、有効ではあるが、投与に熟練した人材及び臨床環境が必要であるため利用が困難である。さらに、クッシング症候群、躁病、不眠症、高血圧、高血中グルコース、骨粗鬆症、悪性腫瘍、感染、及び阻血性長骨壊死等の著しい副作用が存在する。
【０２００】
例示的化合物ＢＴ−１１は、非常に安全な毒性プロフィールを示している。ＩＢＤの慢性モデルにおける我々の効能データは、ＢＴ−１１による処置が、慢性ＩＢＤ２つのモデルにおける疾患活性スコア（図１８及び２４）ならびに体重損失（図２６）をいかに改善するかを示している。我々のデータは、これらの効果がいかにＬＡＮＣＬ２依存性であるかを実証している（図２５）。我々の効能データはまた、ＢＴ−１１によるＬＡＮＣＬ２経路の活性化が、ＩＬ−１０産生及びＦＯＸＰ３発現ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２１、２２、３１、及び３２）、ならびに炎症性マクロファージ、樹枝状細胞、及びＩＦＮγ等の炎症促進性因子の有意な減少（図２２、２３、３１、及び３２）を主に特徴とする抗炎症応答をいかに促進するかを実証している。さらに、遺伝子発現分析は、ＢＴ−１１による処置が結腸におけるＴＮＦαレベルをいかに低減するかを示すことによって、これらの細胞に基づく所見を確認する（図２３）。全てのこれらの所見は総じて、慢性ＩＢＤの２つのモデルにおける白血球浸潤、上皮侵食、及び粘膜肥厚（図２０、２９、及び３０）の観点から、結腸粘膜における劇的なＬＡＮＣＬ２依存性の改善に関与する。我々はまた、ＬＡＮＣＬ２への結合後のＢＴ−１１の効果はＰＰＡＲγ非依存性であることも実証した（図３３）。これらの結果は、ＬＡＮＣＬ２の活性化は、ＰＰＡＲγ非依存性機構を介して炎症を調節する多量の下流活性化因子を活性化することを確認する。これらの結果は総じて、ＬＡＮＣＬ２が炎症性疾患のための新規の治療標的であり、ＢＴ−１１が新たな薬物として有用であるという事実を強く支持する。
【０２０１】
実施例２２：１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を治療するためのＢＴ−１１の使用
導入
真性糖尿病（ＤＭ）は、単に糖尿病としても知られており、長期間にわたり高い血糖レベルが存在する一群の代謝性疾患である。糖尿病の２つの種類は、１型及び２型と呼ばれる。これらの状態に関する以前の名称は、インスリン依存性及び非インスリン依存性糖尿病、または若年発症及び成人発症糖尿病であった。Ｔ１Ｄでは、身体はインスリンを産生しない。Ｔ２Ｄに関して、Ｔ１Ｄは、Ｔ２Ｄと比べて一般的ではない。実際、糖尿病の全症例のおよそ１０％が１型である。Ｔ１Ｄは、３００万人の米国人を悩ませている。毎年、米国内で１５，０００人を超える小児及び１５，０００を超える成人がＴ１Ｄと診断されている。１４歳未満の小児におけるＴ１Ｄの発生率は、全世界で年間３％増加すると概算される。Ｔ１Ｄ患者は、生存のためにインスリン注射を必要とするが、それらは疾患を治癒しないか、またはその深刻な副作用を予防しない。現在の抗糖尿病性薬物は、インスリン感受性の改善においては有効であるが、それらの慢性投与は、心血管合併症、肝毒性、体重増加、体液鬱滞、及び膀胱腫瘍等の著しい副作用を有する。ランチオニンシンテターゼ成分Ｃ様２（ＬＡＮＣＬ２）経路は、副作用を伴わずに抗糖尿病性作用を発揮する［１８］。ＢＴ−１１は、ＬＡＮＣＬ２に結合し、経口で活性であり、マウスにおける実証された抗糖尿病性効能及び際立った安全性プロフィールを有する。
方法
【０２０２】
マウス。ＮＯＤマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、換気ラック内に特定の病原体のない条件下で収容した。マウスは、動物施設内に維持した。全ての実験プロトコルは、機関の動物実験委員会によって承認され、国立衛生研究所実験動物福祉部門及び公衆衛生局規範のガイドラインに合致するか、またはそれを上回っていた。
【０２０３】
体重及びグルコース耐性の評定。全てのマウスは、研究の開始前に正常血糖（２５０ｍｇ／ｄｌ未満の空腹時血中グルコースレベル）であり、類似の体重（２０±１．５ｇ）を有すると判定された。マウスの体重を毎週測定し、疾患の臨床兆候を盲検法により検査した。標準的な１２時間の絶食の後、ＡＣＣＵ−ＣＨＥＫ（登録商標）グルコメータ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用してグルコースを測定した。尾側部静脈を介して血液を採取し、末梢血採取管上に定置した。
【０２０４】
病理組織。マウスにおけるＮＯＤ研究からの膵臓切片を、１０％緩衝中性ホルマリン中に固定し、その後パラフィンに包埋し、次に切開し（５μｍ）、組織学的検査のためにＨ＆Ｅ染料で染色した。切片を、リンパ球浸潤、細胞傷害、及び組織侵食に応じて０〜４のスコアで等級付けし、データを正規化された複合スコアとして分析した。
【０２０５】
統計分析。パラメトリックデータを、ＡＮＯＶＡに続いてシェッフェの多重比較法を使用して分析した。ノンパラメトリックデータを、マンホイットニーのＵ検定に続いてダンの多重比較検定を使用して分析した。ＳＡＳの一般的な線形モデル手順、リリース６．０．３（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して、ＡＮＯＶＡを実施した。統計的有意性を、Ｐ≦０．０５にて評定した。
【０２０６】
結果
ＢＴ−１１は、１型糖尿病のマウスモデルにおいて空腹時血中グルコースレベルを低下させ、インスリンを増加させる。
【０２０７】
Ｔ１Ｄのマウスモデルにおける血糖レベルの修飾におけるＢＴ−１１の効果を判定するために、空腹時血中グルコース試験を実験開始後０、１、３、４、５、１０、及び１１週目に実施した。我々の結果は、我々の化合物ＢＴ−１１で処置されたマウスが、１２時間の絶食の期間後により低い血中グルコースレベルをいかに有するかを示している（図３４、パネルＡ）。同時に、インスリンレベルが５週目に評定され、我々の結果は、ＢＴ−１１で処置されたマウスが有意に増加されたレベルの血漿中インスリンをいかに有するかを示している（図３４、パネルＢ）。
【０２０８】
ＢＴ−１１は、マウスＮＯＤモデルにおける臨床病理組織学的膵臓病変及び炎症を改善する。Ｔ１Ｄのマウスモデルにおける病理組織学的病変を評定するために、膵臓を採取し、１０％ホルマリンで固定した。次に、膵臓切片をＨ＆Ｅで染色し、顕微鏡下で観察した。我々の結果は、ＢＴ−１１による処置が、ビヒクル処置マウスと比較したときにマウスにおける膵臓内の臨床病理組織学的病変をいかに有意に低減するかを示している（図３５）。
【０２０９】
考察
３００万人を超える米国人を悩ませている疾患である１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）のための、有効でより安全な経口薬物の必要が存在する。ＡＢＡ治療は、抗糖尿病性効果を発揮する［２］。ランチオニンシンテターゼ成分Ｃ様タンパク質２（ＬＡＮＣＬ２）は、ＡＢＡの結合及びシグナル伝達の標的である［１５、１９、２４］。したがって、ＬＡＮＣＬ２は、炎症に対する有望な新規の治療標的として浮上している［１８］。ＡＢＡは、糖尿病［２、３３］及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）等の免疫媒介性疾患［２２、２３］の改善において有効である。化合物６１６１０、ビス（ベンズイミダゾイル）テレフタルアニリド（ＢＴＴ）は、数百万個の化学物質のライブラリの中で最も高い親和性でＬＡＮＣＬ２に結合する。それに加え、６１６１０は、腸炎症のマウスモデルにおいて有力な免疫修飾効果を発揮した［２５］。ＢＴ−１１は、ＮＯＤマウスにおいて抗糖尿病性効果を発揮する（図３４及び３５）。さらに、ＡＢＡはヒト膵臓ベータ細胞におけるインスリン分泌を増加させ［３４］、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の治療としてのＡＢＡの潜在的用途を示唆している。
【０２１０】
免疫細胞内で、ＡＢＡは、ミリストイル化後に細胞膜に会合するＧタンパク質共役受容体であるＬＡＮＣＬ２によって認識される［１９、３５］。ＬＡＮＣＬ２に結合するＡＢＡは、ｃＡＭＰを増加させ、ＰＫＡを通じたシグナル伝達を開始し、マクロファージ及びＴ細胞における免疫応答を修飾する［８］。ＬＡＮＣＬ１の結晶構造をテンプレートとして使用することによって、ＬＡＮＣＬ２の３次元構造を構築するために相同性モデル化を実施した。分子ドッキングを使用して、まずコンピュータによって、次にインビトロでＡＢＡがＬＡＮＣＬ２に結合することを実証した。この計算による予測を、ＳＰＲ結果及びヒトＬＡＮＣＬ２による結合アッセイによって検証した［３５］。新たなＬＡＮＣＬ２リガンドを見出すために、相同性モデル化を通して得られたＬＡＮＣＬ２の構造を使用して、ＬＡＮＣＬ２に基づく仮想スクリーニングを実施した。ＮＣＩ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｅｔ  ＩＩからの化合物、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ、及びＺＩＮＣ天然物データベースを、Ａｕｔｏ  Ｄｏｃｋを用いてＬＡＮＣＬ２モデルにドッキングし、算出された親和性によってランク付けした。ＡＢＡはＬＡＮＣＬ２に対して高い親和性を有するが、６１６１０等の他のジエン含有天然化合物もまた同一領域内に結合すると予測され、またＬＡＮＣＬ２結合薬として追及され得る［１２］。ＢＴ−１１はまた、ＬＡＮＣＬ２に対する実証された強い結合、及びＴ１ＤのＮＯＤマウスモデルにおける治療効能を有する（図３４）。このデータは、ＬＡＮＣＬ２経路及び他の本発明の化合物が、Ｔ１Ｄのための免疫修飾薬として有用であるであるといういくつかの確証を提供している。免疫応答を修飾し、自己免疫疾患を和らげる手段としてのＬＡＮＣＬ２経路の役割を支持するさらなる証拠としては、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のマウスモデルにおけるＡＢＡ［２２、２３］、６１６１０［１２、１８］、及びＢＴ−１１のＬＡＮＣＬ２結合及び保護効果が挙げられる。
【０２１１】
Ｔ１Ｄの発生は、全世界で概算年間３％の速度で増加している［３６〜３８］。膵島の移植の成功はＴ１Ｄを治療し得るものの、十分な膵島の不足、移植された膵島の進行中の免疫媒介性破壊、及び免疫抑制薬の副作用は、このアプローチの広範な使用を大きく制限している［３９］。したがって、膵臓β細胞の機能及び免疫修飾を促進する能力を安全に組み合わせた療法は、Ｔ１Ｄを治療するための基礎的戦略である。我々のデータは、ＢＴ−１１によるＬＡＮＣＬ２の活性化が、血中グルコースレベルを改善するだけでなく、グルコースチャレンジ後のその正規化も改善することを実証している（図３４）。さらに、Ｔ１ｄの発症中のＢＴ−１１による処置は、膵臓における病理組織を改善する（図３５）。実に、ＡＢＡは予防的及び治療的に炎症を抑制し、グルコース耐性を改善する［２、３］。したがって、ＬＡＮＣＬ２の天然の活性化は、ＩＢＤにおけるその治療的効果［１２、１８、２２、２３］によって例証されるような免疫修飾、ならびに抑制された炎症及び強化されたインスリン感受性によるグルコースホメオスタシスの調節［２、３］の両方をもたらす。この背景ならびに図３４及び３５に提示されるデータに基づいて、Ｔ１Ｄのための治療標的としてのＬＡＮＣＬ２の役割の調査は重要である。
【０２１２】
実施例２３：２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）を治療するためのＢＴ−１１の使用
導入
真性糖尿病（ＤＭ）は、身体がインスリンを十分に産生し得ないか、またはインスリンを有効に使用し得ないときに起こる慢性の状態であり、環境因子に結び付けられる遺伝子的素因によって誘発される。１型糖尿病を有する人々と異なり、２型糖尿病患者は、インスリンを産生することができる。しかしながら、かかる患者の膵臓は十分なインスリンを作らないか、または身体はインスリンを十分に使用することができない。この現象は、インスリン抵抗性と呼ばれる。そうあるべき十分なインスリンがないか、またはインスリンが使用されていない場合、グルコースは処理及び使用され得ない。その結果、グルコースが、細胞内に入り代謝される代わりに血流内に蓄積されると、全身の他の細胞は適切に機能し得ない。実に、高血糖及び糖尿病は、心血管疾患（ＣＶＤ）、腎症、神経障害、足部潰瘍、及び網膜症のため罹患率及び死亡率の重要な原因である。
【０２１３】
約２，８３０万人の米国人が、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）を有しており、中高年の４０．１％超が、グルコース耐性異常、全身性炎症、及びインスリン抵抗性を特徴とする状態である前糖尿病を有している。世界保健機関は、Ｔ２Ｄ患者の数が２０３０年までに３億６，６００万人に増加すると推定している。
【０２１４】
上述の通り、現在の抗糖尿病性薬物は、インスリン感受性の改善においては有効であるが、それらの慢性投与は、心血管合併症、肝毒性、体重増加、体液鬱滞、及び膀胱腫瘍等の著しい副作用を有する。ランチオニンシンテターゼ成分Ｃ様２（ＬＡＮＣＬ２）経路は、副作用を伴わずに抗糖尿病性作用を発揮する［１８］。ＢＴ−１１は、ＬＡＮＣＬ２に結合し、経口で活性であり、マウスにおける実証された抗糖尿病性効能及び際立った安全性プロフィールを有する。
【０２１５】
方法
マウス及び食事処置。Ｃ５７ＢＬ／６及びｄｂ／ｄｂマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、換気ラック内に特定の病原体のない条件下で収容した。食事誘発性肥満糖尿病モデル（ＤＩＯ）におけるマウスに、高脂肪食（４０Ｋｃａｌ％脂肪）を与えた。マウスは、動物施設内に維持した。全ての実験プロトコルは、機関の動物実験委員会によって承認され、国立衛生研究所実験動物福祉部門及び公衆衛生局規範のガイドラインに合致するか、またはそれを上回っていた。
【０２１６】
体重及びグルコース耐性の評定。全てのマウスは、研究の開始前に正常血糖（２５０ｍｇ／ｄｌ未満の空腹時血中グルコースレベル）であり、類似の体重（体重±１．５ｇ）を有すると判定された。マウスの体重を毎週測定し、疾患の臨床兆候を盲検法により検査した。標準的な１２時間の絶食の後、グルコースを異なる日に判定した。手短に述べると、尾側部静脈を介して血液を採取し、末梢血採取管上に定置した。次に、Ｄ−グルコースの腹腔内注射（２ｇ／ｋｇ体重）によってグルコース耐性試験マウスに投与し、血液試料を、注射前（時間０）（午前６時に開始する１２時間の絶食後のベースラインＦＢＧレベルに対応）、ならびにグルコース注射後１５、６０、及び９０分間（ｄｂ／ｄｂモデル）または１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、２２０、及び２６５分間（ＤＩＯモデル）に採取した。次に、腹部（精巣上体）白色脂肪組織（ＷＡＴ）、皮下ＷＡＴ、及び肝臓を切除し、重量を測定した。次に、腹部（精巣上体）ＷＡＴを消化し、断片化した。
【０２１７】
白色脂肪組織の消化。腹部ＷＡＴを切除し、重量を測定し、１０ｍｇ未満の小片に刻み、消化媒体（ＩＩ型コラゲナーゼ（０．２％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する、２．５％のＨＥＰＥＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）及び１０％のウシ胎仔血清を補充した１ＸＨＢＳＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ））内に定置した。試料を３７℃の培養器内で３０分間培養し、１００μｍナイロンセル濾過器を通して濾過して未消化粒子を除去し、４℃、１０００×ｇで１０分間遠心分離した。間質血管細胞（ＳＶＣ）からなるペレットを１×ＨＢＳＳで洗浄し、４℃、１０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、２ｍＬの赤血球溶解緩衝液中でＳＶＣを２分間培養することによって赤血球を溶解させた後、９ｍＬの１×ＰＢＳで反応を停止した。次に、細胞を４℃、１０００×ｇで１０分間再び回転させ、１ｍＬの１×ＰＢＳ中に懸濁し、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を用いて計数した。
【０２１８】
間質血管細胞の免疫表現型検査。免疫表現型検査のために、ＳＶＣを９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に２×１０５細胞／ウェルで播種した。非特異的結合を阻害するために初めに２０分間ＦｃＢｌｏｃｋ（２０μｇ／ｍＬ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に培養した後、細胞を、５％血清及び０．０９％アジ化ナトリウム（ＦＡＣＳ緩衝液）を含有するＰＢＳ中で洗浄し、特異性一次抗マウス抗体で染色した。フローサイトメータを用いてフロー結果を計算し、ＦＡＣＳ  ＤＩＶＡ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いてデータ分析を実施した。
【０２１９】
即時定量的ＰＣＲ。総ＲＮＡを、製造者の指示に従って、ＲＮＥＡＳＹ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して脂肪組織から、及びＲＮＥＡＳＹ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して細胞から単離した。総ＲＮＡを使用し、ＱＳＣＲＩＰＴ（商標）ｃＤＮＡ合成キット（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）テンプレートを生成した。総反応体積は２０μＬであり、反応を、ＭＪ  ＭＩＮＩ（商標）サーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）内で以下の通り培養した：２５℃で５分間、５２°で３０分間、８５℃で５分間、及び４℃で保持。各遺伝子アンプリコンを、ＭＩＮＥＬＵＴＥ  ＰＣＲ  精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、ＤＮＡ質量ラダー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用することによってアガロースゲル上で定量化した。これらの精製アンプリコンを使用して、即時ＰＣＲアッセイにおいて即時ＰＣＲ条件を最適化した。プライマー濃度及び焼鈍温度を、ＣＦＸシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に対して、システムの勾配プロトコルを使用して各プライマーセットについて最適化した。最適化中または試料ＤＮＡの即時ＰＣＲ中、各プライマーセットに関してＰＣＲ効率を９２〜１０５％に、相関係数を０．９８超に維持した。データは、ΔΔＣｔ定量化法を使用して示される。
【０２２０】
結果
ＢＴ−１１は、Ｔ２ＤのマウスＤＩＯモデルにおける空腹時血中グルコースレベルを低減した。Ｔ２Ｄのモデルにおける例示的化合物ＢＴ−１１の効能を評定するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに高脂肪食を与えた（ＤＩＯモデル）。経口ＢＴ−１１投与は、ＢＴ−１１処置マウスにおいて、ビヒクル処置された同腹仔と比較して高脂肪食給餌の１２週目において血中グルコースレベルを有意に減少させた（図３６、パネルＡ）。さらに、１２時間の絶食及びＩＰによる２ｇ／Ｋｇ体重のグルコースチャレンジの後、ＢＴ−１１で処置されたマウスは、未処置マウスよりも有意に速く血中グルコースレベルを正常化することができた（図３６、パネルＢ）。
【０２２１】
ＢＴ−１１処置は、白色脂肪組織における炎症促進性マクロファージ浸潤及び炎症促進性顆粒球を減少させた。白色脂肪組織に浸潤する細胞を特徴付けるために、腹部ＷＡＴを、方法の章に記載される通りに採取し、消化した。ＷＡＴにおける異なる炎症促進性集団を評価するフローサイトメトリー分析を実施した。我々の結果は、ＢＴ−１１による処置が、Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋炎症促進性マクロファージのレベル（図３７、パネルＡ）及び高レベルのＬｙ６ｃを有する炎症促進性顆粒球（ＧＲ１＋Ｌｙ６ｃ高）の数（図３７、パネルＢ）をいかに有意に低減したかを示している。
【０２２２】
ＢＴ−１１は、Ｔ２Ｄのマウスｄｂ／ｄｂモデルにおける空腹時血中グルコースレベルを低減した。糖尿病の２つのマウスモデルにおける経口ＢＴ−１１処置の治療効能を評価するために、レプチン受容体内の突然変異により自発的なＴ２Ｄを発症するｄｂ／ｄｂマウスも使用した。Ｄｂ／ｄｂマウスに、８０ｍｇ／Ｋｇの日用量のＢＴ−１１を強制経口給餌によって投与した。空腹時血中グルコース濃度を測定することによって、グルコースホメオスタシスにおけるＢＴ−１１の効果を判定した。ＢＴ−１１による処置は、ビヒクル処置された同腹仔と比較して早くも１週目に血中グルコースレベルを有意に減少させ、時間とともに３週目にはその差を際立たせている（図３８、パネルＡ）。動物がいかにグルコースホメオスタシスを開始するかを経口ＢＴ−１１処置が修飾するか否かを判定するために、実験動物に腹腔内グルコースチャレンジを与え、血漿グルコースの反応速度をグルコース注射後０〜２６５分間評価した。血液試料は、注射前に採取した（時間０）（１２時間の絶食後のベースラインＦＢＧレベルに対応）。我々の結果は、ＢＴ−１１による経口処置が、ＩＰグルコースチャレンジ前にグルコースのレベルをいかに有意に減少させるかを示している（時間０、図３８、パネルＢ）。ｄｂ／ｄｂモデルにおけるグルコースチャレンジ後、我々の結果は、我々のトップリード化合物ＢＴ−１１で処置されたマウスにおけるグルコースレベルが、いかにビヒクル処置マウスよりも素早く正常なレベルに向かって降下するかを示している（図３８、パネルＢ）。
【０２２３】
ＢＴ−１１は、ＴＮＦα及びＭＣＰ−１のｍＲＮＡレベルを低減し、ＬＡＮＣＬ２を上方調節した。ＢＴ−１１の抗炎症性効力をさらに確認するために、方法の章に示される通りにＷＡＴ上の遺伝子発現を評定した。我々の結果は、未処置マウスと比較して、ＢＴ−１１で処置されたマウスが、ＬＡＮＣＬ２のより高い発現レベルならびに炎症促進性因子ＴＮＦα及びＭＣＰ−１の有意に低いｍＲＮＡレベルをいかに有するかを示している（図３９）。
【０２２４】
考察
米国における肥満及び２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）の割合は上昇し続けており、ますます多くの人々が経口抗糖尿病性薬に依存するようになってきている。約２，８３０万人（人口の８．３％）の米国人がＴ２Ｄを有しており、中高年の４０．１％超が、グルコース耐性異常及びインスリン抵抗性を特徴とする状態である前糖尿病を有している［４０］。米国内でのＴ２Ｄに起因する直接及び間接的な費用は、１，３２０億ドルを超える［４０］。この高まる問題にもかかわらず、薬剤製造者は安全かつ有効な薬物を開発できていない。最も人気があり有効な経口抗糖尿病性薬の１つは、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）クラスのインスリン増感薬である。ＴＺＤはインスリン感受性を強化するが、体重増加、鬱血性心不全、膀胱癌、肝毒性、及び体液鬱滞を含む、その利用可能性を制限している著しく有害な副作用を有する［４１、４２］。例えば、ＴＺＤを使用している患者のおよそ１０〜１５％は、浮腫のために治療を中断せざるを得ず、過剰体液鬱滞による細胞外容積の増加もまた、既存の鬱血性心不全を有する個人に主要な問題を提示する。２０００年には、トログリタゾン（ＲＥＺＵＬＩＮ（登録商標））が、その開始から３年後に深刻な肝臓損傷及び死亡の報告によって市場から除去された［４３］。他のＴＺＤに関する安全上の懸念から、義務的なブラックボックスラベル及びその後の使用制限がもたらされた。
【０２２５】
ＬＡＮＣＬ２は、同定されるＬａｎＣ様タンパク質ファミリーの第２のメンバーであった。第１のメンバーＬＡＮＣＬ１は、ヒト赤血球膜から単離された［４４］。その後、ＬＡＮＣＬ２が同定され、免疫細胞、膵臓、肺、及び腸［１、４４］を含む全身にわたり発現された［１、１８］。ランチオニンシンテターゼＣ様２（ＬＡＮＣＬ２）経路は、Ｔ２Ｄのための新規の治療標的として浮上している［１８］。大規模な前臨床試験は、糖尿病及び慢性炎症性疾患におけるアブシジン酸（ＡＢＡ）等のＬＡＮＣＬ２リガンドに関する治療的可能性の十分な証拠を提供した［２、３、２２、２３、４５］。化合物６１６１０、ビス（ベンズイミダゾイル）テレフタルアニリド（ＢＴＴ）は、数百万個の化学物質のライブラリの中で最も高い親和性でＬＡＮＣＬ２に結合する。
【０２２６】
Ｔ２Ｄのための現在の薬物が、副作用を伴わない血糖管理である患者の第一の必要性を満たし得ないという事実をふまえると、ＢＴ−１１は、非常に魅力的な潜在的代用品を代表する。我々の結果は、Ｔ２Ｄの異なるマウスモデルにおけるＢＴ−１１の投与が、絶食期間後の血中グルコースレベルをいかに有意に低下させるかを示している（図３６及び３８）。さらに、この化合物の投与はまた、グルコースチャレンジ後にグルコースレベルを正常にするのを助ける（図３６及び３８）。ＢＴ−１１の抗炎症特性はまた、我々の免疫表現型検査の結果にも反映されている。実に、ＢＴ−１１の投与は、腹部のＷＡＴにおける炎症促進性マクロファージ及び炎症促進性顆粒球のより少ない浸潤をもたらした（図３７）。これらの結果は、ＢＴ−１１で処置されたマウスにおいて有意に低減することが見出された２つの非常に重要な炎症促進性因子ＴＮＦα及びＭＣＰ−１の遺伝子発現データによって支持された（図３９）。
【０２２７】
実施例２４：インフルエンザ感染中のＢＴ−１１の使用
導入
肺炎を引き起こす呼吸器病原体は、先進国における感染性疾患関連死の主要原因である。有効なワクチン及び抗ウイルス剤の不在は、抗ウイルス耐性の出現に関する高まる懸念とともに、宿主を標的とする免疫療法アプローチの開発の必要性を強調している。呼吸器感染に関連する肺病原体及び臨床疾患は、ウイルスの細胞変性効果と宿主免疫応答の組み合わせから生じることが多い。この点に関して、先天的免疫応答の修飾に関する療法が、インフルエンザの治療に考慮される［４６］。
【０２２８】
インフルエンザは依然として、全世界で主要な公衆衛生問題である。季節性インフルエンザは、しばしば体の自由を奪い、数日の活動制限を要する上気道の作用に関連する。米国内だけで、毎年のインフルエンザの流行は３，０００万人の外来患者訪問及び３００，０００人の入院をもたらすと概算されている。特定の集団（例えば、幼児、高齢者、及び素因となる医学的状態を有する人々）は、ウイルス性肺炎の発症の危険性がより高い。専門家は、米国内で季節性インフルエンザにより毎年２５，０００〜３５，０００人が死亡していると概算しており、世界的な財政負担は数千億ドルであると算出されている［４７］。流行性インフルエンザの周期は、３０〜５０年毎に生じ、その予測不能な表現及び既存の免疫力の欠失のために複雑さが加わり、高い死亡率に関連している［４８］。インフルエンザは、著しい罹患率及び死亡率に関連するが、有効で安全な薬物治療が不足している。
【０２２９】
ランチオニンシンテターゼ成分Ｃ様タンパク質２（ＬＡＮＣＬ２）が、ＡＢＡの結合及びシグナル伝達の標的であることを示唆するデータ［１５、１９、２４］。したがって、ＬＡＮＣＬ２は、免疫修飾のための有望な新規の治療標的として浮上している。分子モデル化及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、ＢＴＩは、高い親和性でＬＡＮＣＬ２に結合する化合物ＢＴ−１１、ビス（ベンズイミダゾイル）テレフタルアニリド（ＢＴＴ）を同定した。また、ＢＴ−１１は、肺において有力な前消散（ｐｒｏ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｖｅ）効果を発揮し、インフルエンザのマウスモデルにおける死亡率及び罹患率を減少させた。
【０２３０】
方法
マウスＣ５７ＢＬ／６マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、換気ラック内に特定の病原体のない条件下で収容した。全ての実験プロトコルは、機関の動物実験委員会によって承認され、国立衛生研究所実験動物福祉部門及び公衆衛生局規範のガイドラインに合致するか、またはそれを上回っていた。
【０２３１】
インフルエンザウイルスによるマウスの鼻内感染。吸入器ステーションを使用してマウスに２〜５％イソフルオランで麻酔をかけ、５０μＬのウイルス希釈物１０3  ＴＣＩＤ５０で鼻孔を通じて投与した（各２５μＬ）。次に、マウスをケージに入れ、麻酔からの回復を待った。
【０２３２】
強制経口胃管給餌によるＢＴ−１１の経口投与。ＢＴ−１１を、制経口胃管給餌によって、市販の先端がボール上の安全強制給餌針（１８〜２４ゲージ、動物の体重による）を使用してマウスに投与した。この手順は、苦痛を伴わなかった。マウスを、８０ｍｇ／Ｋｇの用量のＢＴ−１１で実験期間中２４時間毎に処置した。
【０２３３】
マウスの監視及び疾患活性及び体重測定。マウスを、感染後１日１回（または疾患スコア２に等しい重度の臨床疾患兆候を発症した場合は４時間毎に）監視し、体重損失（すなわち初期体重の２５％の段階的損失）、脱水症、運動機能の喪失、痛みのある箇所の防御／保護、毛皮の逆立ち（立毛）によって測定するときに顕著な病気の兆候を発症した場合は、予定の終点より前に安楽死させた。実験期間中、マウスの体重を１日１回測定した。
【０２３４】
結果
ＢＴ−１１の経口投与は、インフルエンザウイルスを有するマウスにおける臨床スコア及び罹患率を低減した。
【０２３５】
ＢＴ−１１の治療効能を評価するために、マウスにおけるインフルエンザ感染のマウスモデルを使用した。手短に述べると、マウスを、５％イソフルオランでの麻酔後に鼻内感染させた。マウスを、ＢＴ−１１の経口懸濁液で８０または４０ｍｇ／Ｋｇにて毎日処置した。マウスの体重を測定し、実験期間中スコア化した（１６日目）。結果は、ＢＴ−１１の投与が、３日目から実験全体を通して活性臨床スコアをいかに有意に低減したかを示している（図４０、パネルＡ）。さらに、身体的外観の臨床スコアは、４０及び８０ｍｇ／ＫｇのＢＴ−１１による処置を受けたマウスにおいてどちらも有意に低減した（図４０、パネルＢ）。
【０２３６】
疾患罹患率における処置の効果を評価するために、体重損失のパーセンテージを算出し、各実験群内で１５％超損失したマウスの数をさらに評価した。感染後６日目から、８０ｍｇ／ＫｇのＢＴ−１１による処置は、ビヒクル群と比較してより低い罹患率をもたらした。差は、１０日目から１２日目に際立った（図４０、パネルＣ）。
考察
【０２３７】
インフルエンザの蔓延及び疾患を制御するための伝統的アプローチは、ワクチン接種及び抗ウイルス治療を通じてウイルス側に重点が置かれている。ワクチンは、その前のシーズンの流行株に基づいて毎年製剤化される必要がある。しかしながら、新たなワクチンを製造し、認可し、効能を試験するためには、それが季節性インフルエンザのためのものであれ流行性インフルエンザのためのものであれ、約４〜６カ月を要する［４９］。抗ウイルス剤の主な欠点は、耐性株の非常に頻繁な出現及び選択である。ウイルスに重点を置いた治療に加えて、悪化した宿主応答の制御に基づいた療法の開発は、抗菌及び予防的戦略を補うために採用される可能性が非常に高い。宿主を標的とした治療薬は、異なるリアソータント間での交差防御を提供するという利点を有し、したがって季節を通して有効であり、製造及び貯蔵することができ、ウイルス曝露後に疾患を治療するために使用することができる［４６、５０、５１］。
【０２３８】
インフルエンザのための新規の治療標的としてのＬＡＮＣＬ２の同定は、宿主を標的とした治療薬の新たな道を開く。我々は、ＢＴ−１１によるＬＡＮＣＬ２の活性化が、活性及び臨床スコアを改善するだけでなく、インフルエンザウイルスによって引き起こされる罹患率を減少させ、インフルエンザ感染からの回復を加速することを実証した（図３３）。これらの結果は、ＬＡＮＣＬ２がインフルエンザのための新規の治療標的であり、ＢＴ−１１が潜在的な新たな宿主を標的とした薬物であることを強く支持している。
参考文献
１．Ｍａｙｅｒ，Ｈ．，Ｍ．Ｐｏｎｇｒａｔｚ，ａｎｄ  Ｒ．Ｐｒｏｈａｓｋａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＬＡＮＣＬ２，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＬａｎＣ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｙ．ＤＮＡ  Ｓｅｑ，２００１．１２（３）：ページ１６１〜６。
２．Ｇｕｒｉ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｅｔａｒｙ  ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ａｎｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｂ／ｄｂ  ｍｉｃｅ  ｆｅｄ  ｈｉｇｈ−ｆａｔ  ｄｉｅｔｓ．Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ，２００７．２６（１）：ページ１０７〜１６。
３．Ｇｕｒｉ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ＰＰＡＲ  ｇａｍｍａ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｍｐａｉｒｓ  ｔｈｅ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｗｈｉｔｅ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ．Ｊ  Ｎｕｔｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００８．１９（４）：ページ２１６〜２８。
４．Ｂａｓｓａｇａｎｙａ−Ｒｉｅｒａ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｂｓｃｉｓｉｃ  Ａｃｉｄ．Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，２０１０．１７（５）：ページ４６７〜７８。
５．Ｇｕｒｉ，Ａ．Ｊ．，Ｒ．Ｈｏｎｔｅｃｉｌｌａｓ，ａｎｄ  Ｊ．Ｂａｓｓａｇａｎｙａ−Ｒｉｅｒａ，Ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｅｒｇｉｚｅｓ  ｗｉｔｈ  ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ａｎｄ  ｄｏｗｎ−ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ：ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃＡＭＰ／ＰＫＡ／ＰＰＡＲ  ｇａｍｍａ  ａｘｉｓ．Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ，２０１０．２９（５）：ページ６４６〜５３。
６．Ｇｕｒｉ，Ａ．Ｊ．，Ｒ．Ｈｏｎｔｅｃｉｌｌａｓ，ａｎｄ  Ｊ．Ｂａｓｓａｇａｎｙａ−Ｒｉｅｒａ，Ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ＩＢＤ  ｂｙ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ，２０１０．２９（６）：ページ８２４〜３１。
７．Ｇｕｒｉ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｂｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｎｄ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ａｏｒｔｉｃ  ｗａｌｌ．Ｊ  Ｎｕｔｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０１０．２１（１２）：ページ１１７８〜８５。
８．Ｂａｓｓａｇａｎｙａ−Ｒｉｅｒａ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２０１１．２８６（４）：ページ２５０４〜１６。
９．Ｇｕｒｉ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔ  ｃｅｌｌ  ＰＰＡＲｇａｍｍａ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ＩＢＤ．Ｊ  Ｎｕｔｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０１１．２２（９）：ページ８１２〜９。
１０．Ｌｕ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｌａｎｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｃ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２：ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｏｄｅｌ，２０１１．１７（３）：ページ５４３〜５３。
１１．Ｈｏｎｔｅｃｉｌｌａｓ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｅｔａｒｙ  ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ−ｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ＰＰＡＲｇａｍｍａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｊ  Ｎｕｔｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０１３．２４（６）：ページ１０１９〜２７。
１２．Ｌｕ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ−ｂａｓｅｄ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃｌａｓｓｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇｓ  ｔｈａｔ  ｔａｒｇｅｔ  ｌａｎｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  Ｃ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１２．７（４）：ページｅ３４６４３。
１３．Ｌｕ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｃ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２：ａ  ｎｅｗ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，２０１４．１５（６）：ページ５６５〜７２。
１４．Ｔｒｏｔｔ，Ｏ．ａｎｄ  Ａ．Ｊ．Ｏｌｓｏｎ，ＡｕｔｏＤｏｃｋ  Ｖｉｎａ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｐｅｅｄ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ｏｆ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｅｗ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｔｈｒｅａｄｉｎｇ．Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｃｈｅｍ，２０１０．３１（２）：ページ４５５〜６１。
１５．Ｌｕ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｌａｎｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｃ−ｌｉｋｅ  ２：ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，２０１１．１７（３）：ページ５４３〜５３。
１６．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，ＡｕｔｏＤｏｃｋ４  ａｎｄ  ＡｕｔｏＤｏｃｋＴｏｏｌｓ４：Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ．Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｃｈｅｍ，２００９．３０（１６）：ページ２７８５〜９１。
１７．Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ｇ．Ｒ．，Ｍ．Ａｂｒｅｕ，ａｎｄ  Ｄ．Ｐｒｅｓｅｎｔ，Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｃｏｌｉｔｉｓ，２００３，Ｔｈｅ  ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ｈｅａｌｔｈ  ｃａｒｅ  ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，ＬＬＣ．
１８．Ｌｕ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｔｈｉｏｎｉｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｃ−ｌｉｋｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，２０１４．
１９．Ｓｔｕｒｌａ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，ＬＡＮＣＬ２  ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｒａｔ  ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００９．２８４（４１）：ページ２８０４５−５７。
２０．Ｈａｎａｕｅｒ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ  Ｄ．Ｈ．Ｐｒｅｓｅｎｔ，Ｔｈｅ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｒｅｖ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｄｉｓｏｒｄ，２００３．３（２）：ページ８１〜９２。
２１．Ｌｉｎｄｓａｙ，Ｊ．Ｏ．ａｎｄ  Ｈ．Ｊ．Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｒｅｖｉｅｗ  ａｒｔｉｃｌｅ：ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０−−ａ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ？  Ａｌｉｍｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ，２００１．１５（１１）：ページ１７０９〜１６。
２２．Ｇｕｒｉ，Ａ．Ｊ．，Ｒ．Ｈｏｎｔｅｃｉｌｌａｓ，ａｎｄ  Ｊ．Ｂａｓｓａｇａｎｙａ−Ｒｉｅｒａ，Ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ＩＢＤ  ｂｙ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０１０．２９（６）：ページ８２４〜３１。
２３．Ｇｕｒｉ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔ  ｃｅｌｌ  ＰＰＡＲ  ｇａｍｍａ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１．２２（９）：ページ８１２〜９。
２４．Ｂａｓｓａｇａｎｙａ−Ｒｉｅｒａ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＰＡＲ  ｇａｍｍａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１．２８６（４）：ページ２５０４〜１６。
２５．Ｌｕ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ−ｂａｓｅｄ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃｌａｓｓｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇｓ  ｔｈａｔ  ｔａｒｇｅｔ  ＬＡＮＣＬ２．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１２．Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ．
２６．Ｓｔｅｎｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４  ｈｙｐｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｅｃｔ  ｏｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ？  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１９９５．１０８（１）：ページ２８４〜６。
２７．Ｃｏｈｅｎ，Ｒ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｃｏｓｔ  ｏｆ  ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２０００．９５（２）：ページ５２４〜３０。
２８．Ｂａｒｂａ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ  ｒｅｖｅａｌｉｎｇ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｒｃｈ  Ｐｅｄｉａｔｒ，２００２．９（１０）：ページ１０５３〜５。
２９．Ｂｒａｖｅｒｍａｎ，Ｉ．Ｍ．，Ｓｋｉｎ  ｓｉｇｎｓ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２００３．１２４（６）：ページ１５９５〜６１４。
３０．Ｍａｒｒｉ，Ｓ．Ｒ．ａｎｄ  Ａ．Ｌ．Ｂｕｃｈｍａｎ，Ｔｈｅ  ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｍｐｌｏｙｍｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ，２００５．１１（２）：ページ１７１〜７。
３１．Ｓｐｕｎｔ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｏｌｄｅｒ  Ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ  Ａｄｕｌｔｓ  １５  ｔｏ  ２９  Ｙｅａｒｓ  ｏｆ  Ａｇｅ，ｉｎ  ＳＥＥＲ  ＡＹＡ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ．２００８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．ページ１２３〜１３３。
３２．Ｃａｍｉｌｌｅｒｉ，Ｍ．，ＧＩ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００２−２００３：Ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ｉｎ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００３．１：ページ４１５〜４２０。
３３．Ｇｕｒｉ，Ａ．Ｊ．，Ｒ．Ｈｏｎｔｅｃｉｌｌａｓ，ａｎｄ  Ｊ．Ｂａｓｓａｇａｎｙａ−Ｒｉｅｒａ，Ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｅｒｇｉｚｅｓ  ｗｉｔｈ  ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ａｎｄ  ｄｏｗｎ−ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ：ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃＡＭＰ／ＰＫＡ／ＰＰＡＲ  ｇａｍｍａ  ａｘｉｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０１０．２９（５）：ページ６４６〜６５３。
３４．Ｂｒｕｚｚｏｎｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｓｃｉｓｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓ  ａｎ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｉｓｌｅｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｙｃｌｉｃ  ＡＤＰ  Ｒｉｂｏｓｅ  ａｓ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００８．２８３（４７）：ページ３２１８８〜３２１９７。
３５．Ｓｔｕｒｌａ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ＬＡＮＣＬ２．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，２０１１．４１５（２）：ページ３９０〜５。
３６．Ｓｐａｒｒｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｎｒａｖｅｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００５．４（４）：ページ４４１〜５７。
３７．Ｖｅｈｉｋ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎ  ０−  ｔｏ  １７−ｙｅａｒ−ｏｌｄ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ  ｙｏｕｔｈ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，２００７．３０（３）：ページ５０３〜９。
３８．Ｍａ，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｃｈａｎ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ：ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ：ａ  ｗｏｒｒｙｉｎｇ  ｔｒｅｎｄ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，２００９．５（１０）：ページ５２９〜３０。
３９．Ｓｕａｒｅｚ−Ｐｉｎｚｏｎ，Ｗ．Ｌ．，Ｊ．Ｒ．Ｌａｋｅｙ，ａｎｄ  Ａ．Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ，Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１  ａｎｄ  ｇａｓｔｒｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｂｅｔａ−ｃｅｌｌ  ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｓｌｅｔｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｍｉｃｅ．Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２００８．１７（６）：ページ６３１〜４０。
４０．ＣＤＣ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｆａｃｔ  Ｓｈｅｅｔ：ｇｅｎｅｒａｌ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎａｔｉｏｎａｌ  ｅｓｔｉｍａｔｅｓ  ｏｎ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，２００５．ｉｎ  Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，２００５．２００５．Ａｔｌａｎｔａ，Ｇｅｏｒｇｉａ．
４１．Ｂａｓｓａｇａｎｙａ−Ｒｉｅｒａ，Ｊ．，Ａ．Ｇｕｒｉ，Ｊ．Ｋｉｎｇ，ａｎｄ  Ｒ．Ｈｏｎｔｅｃｉｌｌａｓ，Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｔｈｅ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｔｈａｔ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ＆  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．，２００５．１：ページ１７９〜１８７。
４２．Ｎｅｓｔｏ，Ｒ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ  ｕｓｅ，ｆｌｕｉｄ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ：ａ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．Ｏｃｔｏｂｅｒ  ７，２００３．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００３．１０８（２３）：ページ２９４１〜８。
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【図１Ａ】
2019142873.tif 000067
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年4月15日(2019.4.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩もしくはエステル。
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（式中、
Ｑは、ピペラジン−１，４−ジイル；２，５−ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，５−ジイル；２，５−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン−２，５−ジイル；１，４−ジアゼパン−１，４−ジイル；ベンゼン−１，４−ジアミン−Ｎ1，Ｎ4−ジイル；エタン−１，２−ジアミン−Ｎ1，Ｎ2−ジイル；Ｎ1，Ｎ2−ジアルキルエタン−１，２−ジアミン−Ｎ1，Ｎ2−ジイル；プロパン−１，３−ジアミン−Ｎ1，Ｎ3−ジイル；Ｎ1，Ｎ3−ジアルキルプロパン−１，３−ジアミン−Ｎ1，Ｎ3−ジイル；１，４−ジアミノアントラセン−９，１０−ジオン−１，４−ジイル；Ｃ6アレーン−１，４−ジアミン−Ｎ1，Ｎ4−ジイル（前記アレーンが、２、３、５、又は６位で１〜４個の置換基で置換され、前記置換基が独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、ＯＨ、Ｏ（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、ＣＦ3、Ｆ、Ｃｌ、及びＢｒからなる群から選択される）；又は置換ピペラジン−１，４−ジイル（前記ピペラジンが、２、３、５、又は６位で１〜８個の置換基で置換され、前記置換基が独立して、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、アリール、アリール（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、及びＣ（Ｏ）Ｏ（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルからなる群から選択される）であり、
Ａ1及びＡ1’は、各々独立して、Ｎ又はＣＲ6であり、
Ａ2及びＡ2’は、各々独立して、Ｎ又はＣＲ7であり、
Ａ3は、ＮＲ8、Ｏ、又はＳであり、
Ａ4は、Ｎ又はＣＲ9であり、
Ａ5は、Ｎ又はＣＲ10であり、
Ａ6は、Ｎ又はＣＲ11であり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ3'、Ｒ4、Ｒ4'、Ｒ5'、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、及びＲ11は、存在する場合、各々独立して、水素；アルキル；ハロ；トリフルオロメチル；ジアルキルアミノ（各アルキルが独立して選択される）；−ＮＨ2；アルキルアミノ；アリールアルキル；ヘテロアリールアルキル；ヘテロシクロアルキル；置換ヘテロシクロアルキル（前記置換ヘテロシクロアルキルが、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、−ＣＦ3、Ｆ、Ｃｌ、及びＢｒからなる群から独立して選択される１〜２個の置換基で置換される）；及び置換ヘテロアリールアルキルからなる群から選択され、
前記置換ヘテロアリールアルキルが、−ＮＨ2；−ＮＨ（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル；−Ｎ（（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル）2（各アルキルが独立して選択される）；アルキル；ハロ；アリール；置換アリール（前記置換アリールが、−ＳＯ2Ｒ12、−ＯＲ13、−ハロ、−ＣＮ、−ＣＦ3、アミノアルキル−、−Ｓ（Ｏ）Ｒ14、及びアルキルからなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換される）；ヘテロシクロアルキル；ヘテロアリール；置換アリール（前記置換アリールが、アルキル、−ＣＦ3、Ｆ、Ｃｌ、及びＢｒからなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換される）；アルキルアミノ−；ヘテロシクロアルキル−アルキル−アミノ−；アルキルアミノアルキルアミノ−；−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ15；−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＲ16Ｒ17；−Ｃ（Ｏ）ＮＲ16Ｒ17；及び置換ヘテロアリール（前記置換ヘテロアリールが、アルキル、ハロ、ＣＮ、ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜Ｃ6アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜Ｃ6アルキル）2（各アルキルが独立して選択される）、−ＣＦ3、及び置換アリール（前記置換アリールが、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ15及び−ＣＮからなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換される）からなる群から選択される１〜３個の置換基で置換される）からなる群から独立して選択される１〜３個の置換基で置換され、
Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、及びＲ17が各々独立して、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、独立して選択されたＣ1〜Ｃ6アルキルを含むジアルキルアミノ、−ＮＨ2、アルキルアミノ、ヘテロシクロアルキル、及び置換ヘテロシクロアルキル（前記置換ヘテロシクロアルキルが、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ1〜Ｃ6アルキル）及びＣ1〜Ｃ6アルキルからなる群から独立して選択される１〜２個の置換基で置換される）からなる群から選択される。）
【請求項２】
Qが、ピペラジン−１，４−ジイル又はベンゼン−１，４−ジアミン−Ｎ1，Ｎ4−ジイルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Qが、ピペラジン−１，４−ジイルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ａ1が、Ｎである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
Ａ2が、ＣＲ7である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
Ａ3が、ＮＲ8である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
Ａ4が、Ｎである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
Ａ5が、ＣＲ10である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
Ａ6が、ＣＲ11である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ3'、Ｒ4、Ｒ4'、Ｒ5'、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、及びＲ11は、存在する場合、各々独立して、水素；アルキル；ハロ；トリフルオロメチル；ジアルキルアミノ（各アルキルは同一であるか、異なる）；−ＮＨ2；アルキルアミノ；及びアリールアルキルからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ3'、Ｒ4、Ｒ4'、Ｒ5'、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、及びＲ11は、存在する場合、各々独立して、水素；アルキル；ハロ；及びトリフルオロメチルからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
各アルキルが、直鎖状炭化水素基及び分枝鎖状炭化水素基からなる群から独立して選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物を含む、動物における状態を治療するための医薬組成物であって、前記状態が、感染性疾患、自己免疫疾患、糖尿病、及び慢性炎症性疾患からなる群から選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１４】
前記状態が、感染性疾患であり、該感染性疾患が、インフルエンザ感染を含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記状態が、自己免疫疾患であり、該自己免疫疾患が、自己免疫炎症性疾患を含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記自己免疫炎症性疾患が、炎症性腸疾患を含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎及びクローン病からなる群から選択される、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記状態が、糖尿病であり、該糖尿病が、１型糖尿病及び２型糖尿病からなる群から選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記状態が、慢性炎症性疾患であり、該慢性炎症性疾患が、メタボリックシンドロームを含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【外国語明細書】
2019142873000001.pdf