(57)【要約】【課題】アルカリによる中和を必要とせずに高い生産性で３−ＨＰを産生できるＳ．ポンベの形質転換体、および該形質転換体を培養して３−ＨＰを産生する方法の提供。【解決手段】シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とする形質転換体であって、マロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子、ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子、およびアセチルＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子が導入されている、またはマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子、およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体を形成しうる遺伝子群が導入されており、前記ピルビン酸オキシダーゼが、ピルビン酸と水から酢酸を生成する反応を触媒する酵素であることを特徴とする形質転換体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）を宿主とする形質転換体であって、
マロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子、ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子、およびアセチルＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子がそれらの発現産物を細胞質に発現させるように導入されている、または
マロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子、およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体を形成しうる遺伝子群がそれらの発現産物を細胞質に発現させるように導入されており、
前記ピルビン酸オキシダーゼが、ピルビン酸と水から酢酸を生成する反応を触媒する酵素であることを特徴とする形質転換体。
【請求項２】
前記導入されたアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子が、宿主が本来有するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子である、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
前記導入されたアセチルＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子が、宿主が本来有するアセチルＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子である、請求項１または２に記載の形質転換体。
【請求項４】
前記ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子がｐｏｘＢである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項５】
前記導入されたマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子が、クロロフレクサス・オーランティアカス（Chloroflexus aurantiacus）由来のマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項６】
前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体が、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／デカルボキシラーゼ（Ｅ１）、ジヒドロリポイルアセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２）、およびデヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（Ｅ３）からなる複合体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項７】
前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体を形成しうる遺伝子群が、原核細胞由来の遺伝子群である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項８】
前記宿主が本来有する少なくとも１種のプロテアーゼをコードする遺伝子が削除または不活性化されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項９】
前記プロテアーゼをコードする遺伝子が、メタロプロテアーゼをコードする遺伝子、セリンプロテアーゼをコードする遺伝子、システインプロテアーゼをコードする遺伝子、およびアスパラギン酸プロテアーゼをコードする遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子である、請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の形質転換体を、液体培地中で培養し、該液体培地から３−ヒドロキシプロピオン酸を取得することを特徴とする、３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法。
【請求項１１】
前記液体培地が、グルコースまたはスクロースを含み、それらの合計の濃度が１〜５０質量％である、請求項１０に記載の３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法。
【請求項１２】
前記液体培地中の３−ヒドロキシプロピオン酸を中和することなく培養を継続する、請求項１０または１１に記載の３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）の製造に好適な、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe、以下、「Ｓ．ポンベ」ということがある。）を宿主とし外来遺伝子等を組込んだ形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
３−ＨＰは、アクリル酸エステルなど様々な化学製品の原料として非常に有用な化合物である。３−ＨＰは、微生物による発酵工程を経て製造できる。たとえば、マロニルＣｏＡレダクターゼ（ＭＣＲ）をコードする遺伝子を導入した微生物では、マロニルＣｏＡから３−ＨＰが産生される。また、グリセロールデヒドラターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ等をコードする遺伝子を導入した微生物では、グリセリンから３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰＡ）を介して３−ＨＰが産生される。
【０００３】
微生物に３−ＨＰを産生させた場合、産生された３−ＨＰにより、培養培地が酸性となる。該微生物の耐酸性が低い場合には、培養培地のｐＨ低下に伴い微生物自体の生育が抑制される結果、３−ＨＰの産生量も低下してしまうため、一般的には、培養培地のｐＨを中和しながら培養する必要がある。しかし、中和した場合には、３−ＨＰは塩として回収されるため、３−ＨＰに変換するための工程が必要になる。そこで、中和を必要とせずに３−ＨＰ生産が可能になることから、３−ＨＰを産生させる微生物としては、耐酸性の高いものが好ましい。たとえば、特許文献１および２には、耐酸性の高いＳ．ポンベに、ＭＣＲをコードする遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）をコードする遺伝子を導入した形質転換体を、中和をせずに培養することにより、３−ＨＰが産生されたことが記載されている。
【０００４】
一方で、酵母などの真核細胞微生物を用いた異種タンパク質生産系においては、目的の異種タンパク質の生産効率を向上させるべく、異種タンパク質生産に不要または有害な宿主のゲノム部分の一部または全部を削除または不活性化した改良宿主を用いることが知られている。たとえば、特許文献３には、Ｓ．ポンベにおいて、特定のプロテアーゼをコードする遺伝子（プロテアーゼ遺伝子）から選ばれる少なくとも１種の遺伝子を削除または不活性化した改良宿主を用いることにより、異種タンパク質の生産効率を向上させられることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１３７２７７号
【特許文献２】国際公開第２０１６／０８４８５７号
【特許文献３】国際公開第２００７／０１５４７０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明では、アルカリによる中和を必要とせずに高い生産性で３−ＨＰを産生できるＳ．ポンベの形質転換体、および該形質転換体を培養して３−ＨＰを産生する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る形質転換体は、Ｓ．ポンベを宿主とする形質転換体であって、ＭＣＲをコードする遺伝子、ＡＣＣをコードする遺伝子、ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子、およびアセチルＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）をコードする遺伝子がそれらの発現産物を細胞質に発現させるように導入されている、またはＭＣＲをコードする遺伝子、ＡＣＣをコードする遺伝子、およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＨ）を形成しうる遺伝子群がそれらの発現産物を細胞質に発現させるように導入されており、前記ピルビン酸オキシダーゼが、ピルビン酸と水から酢酸を生成する反応を触媒する酵素であることを特徴とする。
本発明に係る形質転換体においては、前記導入されたＡＣＣをコードする遺伝子は、宿主が本来有するＡＣＣをコードする遺伝子であることが好ましく、前記導入されたＡＣＳをコードする遺伝子は、宿主が本来有するＡＣＳをコードする遺伝子であることが好ましい。
また、本発明に係る形質転換体においては、前記ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子はｐｏｘＢであることが好ましく、前記導入されたＭＣＲをコードする遺伝子が、クロロフレクサス・オーランティアカス（Chloroflexus aurantiacus）由来のＭＣＲをコードする遺伝子であることが好ましい。
また、本発明に係る形質転換体においては、前記ＰＤＨが、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／デカルボキシラーゼ（Ｅ１）、ジヒドロリポイルアセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２）、およびデヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（Ｅ３）からなる複合体であることが好ましく、前記ＰＤＨを形成しうる遺伝子群が、原核細胞由来の遺伝子群であることも好ましい。
また、本発明に係る形質転換体においては、前記宿主が本来有する少なくとも１種のプロテアーゼをコードする遺伝子が削除または不活性化されていることが好ましく、前記プロテアーゼをコードする遺伝子は、メタロプロテアーゼをコードする遺伝子、セリンプロテアーゼをコードする遺伝子、システインプロテアーゼをコードする遺伝子、およびアスパラギン酸プロテアーゼをコードする遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子であることが好ましい。
【０００８】
本発明に係る３−ＨＰの製造方法は、前記形質転換体を、液体培地中で培養し、該液体培地から３−ヒドロキシプロピオン酸を取得することを特徴とする。
本発明に係る３−ＨＰの製造方法においては、前記液体培地が、グルコースまたはスクロースを含み、それらの合計の濃度が１〜５０質量％であることが好ましい。
また、本発明に係る３−ＨＰの製造方法においては、前記液体培地中の３−ヒドロキシプロピオン酸を中和することなく培養を継続することが好ましい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る形質転換体を培養することにより、中和処理を要することなく、効率よく３−ＨＰを製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ｐＪＫ１４８−ｈｓｐ９ｐ−ｃｕｔ６−ＬＰＩｔベクターの構造の模式図である。
【図２】ｐＭＬ７ａ−ｈｓｐ９ｐ−ＣａＭＣＲ−ｉｎｖ１ｔベクターの構造の模式図である。
【図３】ｐＳＭ−ｕ４ｐＡｄｅベクターの構造の模式図である。
【図４】ｐＳＮ−ｕ４ｐＡｄｅベクターの構造の模式図である。
【図５】ｐＳＭ−ｕ４ｐＡｄｅ−ｐｏｘＢ−ａｃｓ１ベクターの構造の模式図である。
【図６】実施例１において、ｍｃｒ／ｃｕｔ６−２発現株（破線：コントロール）とｍｃｒ／ｃｕｔ６／ｐｏｘＢ／ａｃｓ１発現株（実線）の各培養液のＯＤ６００値を経時的に測定した結果を示した図である。
【図７】実施例１において、ｍｃｒ／ｃｕｔ６−２発現株（破線：コントロール）とｍｃｒ／ｃｕｔ６／ｐｏｘＢ／ａｃｓ１発現株（実線）の各培養液の３−ＨＰ濃度（ｇ／Ｌ）を経時的に測定した結果を示した図である。
【図８】ｐＳＮ−ｕ４ｐＡｄｅ−ＰＤＨベクターの構造の模式図である。
【図９】実施例２において、ｍｃｒ／ｃｕｔ６−３発現株（破線：コントロール）とｍｃｒ／ｃｕｔ６／ａｃｅＥ／ａｃｅＦ／ｌｐｄ発現株（実線）の各培養液のＯＤ６００値を経時的に測定した結果を示した図である。
【図１０】実施例２において、ｍｃｒ／ｃｕｔ６−３発現株（破線：コントロール）とｍｃｒ／ｃｕｔ６／ａｃｅＥ／ａｃｅＦ／ｌｐｄ発現株（実線）の各培養液の３−ＨＰ濃度（ｇ／Ｌ）を経時的に測定した結果を示した図である。
【図１１】実施例３において、ｍｃｒ／ｃｕｔ６−２発現株（破線白抜き丸：コントロール）、ｍｃｒ／ｃｕｔ６／ｐｏｘＢ／ａｃｓ１発現株（実線黒丸）、ｍｃｒ／ｃｕｔ６−３発現株（破線白抜き三角：コントロール）、およびｍｃｒ／ｃｕｔ６／ａｃｅＥ／ａｃｅＦ／ｌｐｄ発現株（実線黒三角）の各培養液の３−ＨＰ濃度（ｇ／Ｌ）を経時的に測定した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明および本願明細書において、「外来の」遺伝子とは、宿主が本来有している構造遺伝子（形質転換前の天然型の宿主に含まれている構造遺伝子）ではなく、形質転換操作等により導入された構造遺伝子を意味する。また、「導入された」遺伝子とは、形質転換操作等により導入された構造遺伝子を意味し、宿主以外の生物由来の遺伝子や人工遺伝子は勿論、宿主が本来有している遺伝子と同一の遺伝子であってもよい。
本発明において、ＭＣＲをコードする遺伝子（ｍｃｒ）、および、ピルビン酸と水から酢酸を生成する反応を触媒する酵素であるピルビン酸オキシダーゼ（ＰｏｘＢ）をコードする遺伝子（ｐｏｘＢ）は外来の遺伝子である。本発明において、ＡＣＣをコードする遺伝子、ＡＣＳをコードする遺伝子、および、ＰＤＨを形成しうる遺伝子は、外来の遺伝子であってもよく、宿主が本来有している遺伝子であってもよい。
なお、以下、酵素等のタンパク質をコードする遺伝子を「タンパク質名＋遺伝子」で記すことがある。たとえば、ＭＣＲをコードする遺伝子を「ＭＣＲ遺伝子」とも記す。
【００１２】
［形質転換体］
本発明に係る形質転換体は、Ｓ．ポンベを宿主とし、ＭＣＲをコードする遺伝子（ＭＣＲ遺伝子）およびＡＣＣをコードする遺伝子（ＡＣＣ遺伝子）を有しており、かつ細胞質におけるピルビン酸からのアセチルＣｏＡの産生量を増大させた形質転換体である。野生型のＳ．ポンベでは、アセチルＣｏＡから３−ＨＰを産生することはできないが、ＭＣＲ遺伝子およびＡＣＣ遺伝子を導入した形質転換体では、ＡＣＣによってアセチルＣｏＡからマロニルＣｏＡが産生され、ＭＣＲによってマロニルＣｏＡから３−ＨＰが産生される。つまり、ＭＣＲ遺伝子およびＡＣＣ遺伝子を導入したＳ．ポンベの形質転換体では、アセチルＣｏＡは３−ＨＰの前駆体であり、細胞質におけるアセチルＣｏＡの量を増大させることにより、産生される３−ＨＰ量を増大させられる。
【００１３】
本発明に係る形質転換体は、さらに、ＰｏｘＢをコードする遺伝子（ＰｏｘＢ遺伝子）およびＡＣＳをコードする遺伝子（ＡＣＳ遺伝子）を有するか、または、ＰＤＨを形成しうる遺伝子群（ＰＤＨ遺伝子群）を有する。ＰＤＨ遺伝子群は、ＰＤＨを形成する複数の酵素をそれぞれコードした複数の遺伝子をいう。
【００１４】
本発明に係る形質転換体は、具体的には、Ｓ．ポンベを宿主とする形質転換体であって、細胞質に、ＭＣＲとＡＣＣに加えて、ＰｏｘＢおよびＡＣＳ、またはＰＤＨが発現しうる。ＰｏｘＢおよびＡＣＳを発現させた形質転換体では、細胞質において、ＰｏｘＢによってピルビン酸から酢酸が産生され、この酢酸がＡＣＳによりアセチルＣｏＡに変換される。一方で、ＰＤＨを発現させた形質転換体では、細胞質において、ＰＤＨによってピルビン酸からアセチルＣｏＡが産生される。
【００１５】
野生型のＳ．ポンベでは、ピルビン酸からのアセチルＣｏＡの産生は、ミトコンドリア内で行われるため、ＭＣＲ遺伝子とＡＣＣ遺伝子のみを導入した形質転換体では、３−ＨＰの産生効率を上げるためには、酢酸濃度の高い液体培地で培養することによって細胞内の酢酸濃度を上昇させる必要がある。細胞外から取り込まれた酢酸がＡＣＳによりアセチルＣｏＡに変換されることにより、細胞質中でのアセチルＣｏＡ量が増大し、これによりＡＣＣおよびＭＣＲによって産生される３−ＨＰ量が増大する。しかし、酢酸を含有する液体培地中で形質転換体の培養を行った場合には、形質転換体から液体培地中に分泌された３−ＨＰを、酢酸から分離する工程が必要となる。これに対して、本発明に係る形質転換体は、細胞質に元々存在しているピルビン酸からアセチルＣｏＡを産生できるため、３−ＨＰ産生に用いる培養培地に酢酸を含有させる必要がなく、産生された３−ＨＰを酢酸から分離精製する必要がない。
【００１６】
＜Ｓ．ポンベ＞
宿主であるＳ．ポンベは、シゾサッカロミセス属に属する酵母（分裂酵母）であり、他の酵母に比べて特に耐酸性に優れる微生物である。また、Ｓ．ポンベは、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の他の酵母に比べ、高濃度のグルコース下における３−ＨＰの生産性に優れ、高密度培養（大量の酵母を用いた培養）にも適していることがわかった。そのため、Ｓ．ポンベの形質転換体を用いることにより、極めて高い生産性で３−ＨＰを製造できる。
【００１７】
なお、Ｓ．ポンベの染色体の全塩基配列は、サンガー研究所のデータベース「ＧｅｎｅＤＢ」に「Schizosaccharomyces pombe Gene DB （http://www.genedb.org/genedb/pombe/）」として、収録され、公開されている。本明細書記載のＳ．ポンベの遺伝子の配列データは前記データベースから遺伝子名や前記系統名で検索して、入手できる。
【００１８】
＜ＰｏｘＢ＞
ＰｏｘＢは、ピルビン酸と水から酢酸を生成する反応を触媒する酵素である。Ｓ．ポンベの細胞質では、本来ＰｏｘＢは発現していない。このため、本発明に係る形質転換体のうち細胞質内でＰｏｘＢを発現させた形質転換体は、ＰｏｘＢ遺伝子を遺伝子工学的方法でＳ．ポンベに導入することにより得られる。本発明に係る形質転換体に導入されるＰｏｘＢ遺伝子としては、Ｓ．ポンベに導入した場合にＰｏｘＢ活性（ピルビン酸と水から酢酸を生成する反応を触媒する酵素活性）を発揮するタンパク質を発現させ得る構造遺伝子であればよく、いずれの生物種由来のＰｏｘＢ遺伝子であってもよい。また、該形質転換体が有するＰｏｘＢ遺伝子は、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。
【００１９】
外来遺伝子として導入されるＰｏｘＢ遺伝子がコードするＰｏｘＢとしては、たとえば、大腸菌（エシュケリキア・コリ（Escherichia coli））、またはコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に由来のＰｏｘＢ等が挙げられる。また、これらのＰｏｘＢの改変体であってもよい。ＰｏｘＢの改変体としては、たとえば、これらのＰｏｘＢのアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、または欠失したアミノ酸配列からなり、かつＰｏｘＢ活性を有するポリペプチドが挙げられる。置換等するアミノ酸の数は、ＰｏｘＢ活性を損なわない範囲であれば特に限定されるものではないが、２０個以下が好ましく、１０個以下がより好ましく、５個以下がさらに好ましい。ＰｏｘＢの改変体としては、これらのＰｏｘＢのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＰｏｘＢ活性を有するポリペプチドも挙げられる。本発明に係る形質転換体が有するＰｏｘＢ遺伝子としては、大腸菌由来のｐｏｘＢが好ましく、大腸菌由来のｐｏｘＢを発現させるのに最適化させた配列（配列番号１）が好ましい。
【００２０】
＜ＡＣＳ＞
本発明に係る形質転換体のうち、細胞質内でＰｏｘＢを発現させた形質転換体は、細胞質内においてＡＣＳも発現しうる。本発明に係る形質転換体は、導入したＡＣＳ遺伝子を有し、細胞質中に充分量のＡＣＳが発現しうる。これにより、酢酸から変換されるアセチルＣｏＡ量が多くなり、結果として３−ＨＰの生産量も多くなる。
【００２１】
導入されるＡＣＳ遺伝子がコードするＡＣＳとしては、たとえば、Ｓ．ポンベ、サッカロミセス・セレビシエに由来のＡＣＳ等が挙げられる。また、これらのＡＣＳの改変体であってもよい。ＡＣＳの改変体としては、たとえば、これらのＡＣＳのアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、または欠失したアミノ酸配列からなり、かつＡＣＳ活性を有するポリペプチドが挙げられる。置換等するアミノ酸の数は、ＡＣＳ活性を損なわない範囲であれば特に限定されるものではないが、２０個以下が好ましく、１０個以下がより好ましく、５個以下がさらに好ましい。ＡＣＳの改変体としては、これらのＡＣＳのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡＣＳ活性を有するポリペプチドも挙げられる。本発明に係る形質転換体が有するＡＣＳ遺伝子としては、サッカロミセス・セレビシエ由来のＡＣＳ２（配列番号２）またはＳ．ポンベ由来のａｃｓ１（配列番号３）が好ましい。
【００２２】
＜ＰＤＨ（Pyruvate dehydrogenase complex）＞
ＰＤＨは、ピルビン酸をアセチルＣｏＡに変換する反応（ピルビン酸脱炭酸反応）を触媒する酵素活性を有する複合酵素である。本発明に係る形質転換体としては、細胞質において、ＰｏｘＢとＡＣＳに代えて、ＰＤＨが発現していてもよい。ＰＤＨはＳ．ポンベにおいて本来はミトコンドリアのマトリックスに局在している。したがって、ＰＤＨを形成しうる各酵素をコードする遺伝子群を、遺伝子工学的方法でＳ．ポンベに導入することによって、ＰＤＨが細胞質において発現しうる形質転換体が得られる。
【００２３】
ＰＤＨは、たとえば、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／デカルボキシラーゼ（Ｅ１）、ジヒドロリポイルアセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２）、およびデヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（Ｅ３）からなる複合体を用いることができる。Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３からなるＰＤＨとしては、細胞質で安定して発現可能な点から、大腸菌等の原核細胞に由来するＰＤＨが好ましい。大腸菌由来のＰＤＨは、ＡｃｅＥ（Ｅ１に相当）、ＡｃｅＦ（Ｅ２に相当）、およびＬｐｄ（Ｅ３に相当）の３つの酵素からなる。たとえば、ＡｃｅＥをコードするａｃｅＥ（配列番号４）、ＡｃｅＦをコードするａｃｅＦ（配列番号５）、およびＬｐｄをコードするｌｐｄ（配列番号６）を遺伝子工学的方法でＳ．ポンベに導入することによって、ＡｃｅＥ／ＡｃｅＦ／Ｌｐｄ複合酵素が細胞質で発現しうる形質転換体が得られる。
【００２４】
本発明において、細胞質に発現させるＥ１、Ｅ２およびＥ３としては、原核細胞が本来有しているタンパク質であってもよく、これらの改変体であってもよい。該改変体としては、たとえば、原核細胞が本来有しているＥ１のアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、または欠失したアミノ酸配列からなり、かつＥ１酵素活性を有するポリペプチドが挙げられる。置換等するアミノ酸の数は、Ｅ１酵素活性を損なわない範囲であれば特に限定されるものではないが、２０個以下が好ましく、１０個以下がより好ましく、５個以下がさらに好ましい。Ｅ１の改変体としては、原核細胞が本来有しているＥ１のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＥ１酵素活性を有するポリペプチドも挙げられる。Ｅ２およびＥ３も同様である。
【００２５】
＜ＭＣＲ＞
本発明に係る形質転換体は、ＭＣＲ遺伝子を有する。Ｓ．ポンベは本来ＭＣＲ遺伝子を有していない。したがって、Ｓ．ポンベ以外の生物由来のＭＣＲ遺伝子を遺伝子工学的方法でＳ．ポンベに導入して形質転換体を得る。該形質転換体に導入されるＭＣＲ遺伝子としては、Ｓ．ポンベに導入した場合にＭＣＲ活性を発揮するタンパク質を発現させ得る構造遺伝子であればよく、いずれの生物種由来のＭＣＲ遺伝子であってもよい。また、該形質転換体が有するＭＣＲ遺伝子は、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。
【００２６】
導入されるＭＣＲ遺伝子がコードするＭＣＲとしては、たとえば、クロロフレクサス・オーランティアカス（Chloroflexus aurantiacus）、クロロフレクサス・アグレガンス（Chloroflexus aggregans）、ロセイフレクサス・カステンホルジイ（Roseiflexus castenholzii）、ロセイフレクサス・エスピー（Roseiflexus sp.）、ロセイフレクサスエスピー・ストレインＲＳ−１（Roseiflexussp. Strain RS-1）、エリスロバクター・エスピー（Erythrobacter sp.）、エリスロバクターエスピー・ストレインＮＡＰ１（Erythrobactersp. Strain NAP1）、ガンマ・プロテオバクテリウム（gamma proteobacterium）、メタロスファエラ・セデュラ（Metallosphaera sedula）、スルフォロバス・トコダイ（Sulfolobus tokodaii）、スルフォロバス・メタリカス（Sulfolobus metallicus）、スルフォロバス・エスピー（Sulfolobus sp.）、アシディアヌス・ブリーエリイ（Acidianus brierleyi）、アシディアヌス・インフェルノス（Acidianus infernos）、アシディアヌス・アンビバレンス（Acidianus ambivalens）、スティギオロバス・アソリカス（Stygiolobus azoricus）、およびピロロバス・フマリ（Pyrolobus fumarii）に由来のＭＣＲ等が挙げられる。また、これらのＭＣＲの改変体であってもよい。ＭＣＲの改変体としては、たとえば、これらのＭＣＲのアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、または欠失したアミノ酸配列からなり、かつＭＣＲ活性を有するポリペプチドが挙げられる。これらのＭＣＲのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＭＣＲ活性を有するポリペプチドが挙げられる。本発明に係る形質転換体が有するＭＣＲ遺伝子としては、クロロフレクサス・オーランティアカス由来のｍｃｒが好ましく、クロロフレクサス・オーランティアカス由来のｍｃｒを発現させるのに最適化させた配列（配列番号７）がより好ましい。
【００２７】
＜ＡＣＣ＞
本発明に係る形質転換体は、導入されたＡＣＣ遺伝子を有する。該形質転換体に導入されるＡＣＣ遺伝子としては、Ｓ．ポンベに導入した場合にＡＣＣ活性を発揮するタンパク質を発現させ得る構造遺伝子であればよく、いずれの生物種由来のＡＣＣ遺伝子であってもよい。また、該形質転換体が有するＡＣＣ遺伝子は、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。
【００２８】
導入されるＡＣＣ遺伝子がコードするＡＣＣとしては、たとえば、Ｓ．ポンベ、サッカロミセス・セレビシエ、バチラス・セレウス（Bacillus cereus）、バチラス・サブチリス（Bacillus subtilis）、ボス・タウラス（Bos taurus）、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Brevibacterium thiogenitalis）、ラクトバチラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、キャンディダ・リポリチカ（Candida lipolytica）、キャンディダ・カテヌラタ（Candida catenulata）、キャンディダ・グロペンギエセリ（Candida gropengiesseri）、キャンディダ・ルゴサ（Candida rugosa）、キャンディダ・ソノレンシス（Candida sonorensis）、キャンディダ・メタノソルボサ（Candida methanosorbosa）、キャンディダ・カルバタ（Candida curvata）、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クリベロマイセス・サーモトレランス（Kluyveromyces thermotolerans）、イタッツェンキア・オリエンタリス（Ittatchenkia orientalis）、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）、ピキア・ハプロフィラ（Pichia haplophila）、アスペルギルス・クレバタス（Aspergillus clavatus）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・オケラセウス（Aspergillus ochraceus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、クリプトスポリディウム・パルバム（Cryptosporidium parvum）、ドロソフィラ・メラノガスター（Drosophila melanogaster）、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）、エシュケリキア・コリ（Escherichia coli）、エシュケリキア・ブラッタエ（Escherichia blattae）、ホルデウム・バルガレ（Hordeum vulgare）、マイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium）、マイコバクテリウム・フレイ（Mycobacterium phlei）、セタリア・ビリヂス（Setaria  viridis）、ソラナム・ツベロサム（Solanum tuberosum）、スピナシア・オレラセア（Spinacia oleracea）、スタフィロコッカス・オーレウス（Staphylococcus aureus）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）、スルフォロバス・メタリカス、タキフグ・エスピー（Takifugu sp.）、プロピオニバクテリウム・シェラマニ（Propionibacterium shermanii）、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・フルオレスセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）、クロロフレクサス・オーランティアカス、クロロフレクサス・アグレガンス、メタロスファエラ・セデュラ、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）、クリプトコッカス・カルバタス（Cryptococcus curvatus）、トリコスポラン・クタネウム（Trichosporon cutaneum）、リポマイセス・スタルケイ（Lipomyces starkeyi）、およびコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に由来のＡＣＣ等が挙げられる。また、これらのＡＣＣの改変体であってもよい。ＡＣＣの改変体としては、たとえば、これらのＡＣＣのアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、または欠失したアミノ酸配列からなり、かつＡＣＣ活性を有するポリペプチドが挙げられる。これらのＡＣＣのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からな���、かつＡＣＣ活性を有するポリペプチドが挙げられる。本発明に係る形質転換体が有するＡＣＣ遺伝子としては、ｃｕｔ６（配列番号８）が好ましい。なお、ｃｕｔ６は、Ｓ．ポンベが本来有するＡＣＣをコードする遺伝子である。
【００２９】
＜プロテアーゼ＞
本発明に係る形質転換体としては、プロテアーゼをコードする遺伝子（プロテアーゼ遺伝子）のうちの少なくとも１種が削除または不活性化されているものが好ましい。形質転換体内においてＳ．ポンベが本来有する少なくとも１種のプロテアーゼ遺伝子のプロテアーゼ活性が阻害されていることにより、ＰｏｘＢ、ＡＣＳ、ＰＤＨ、ＭＣＲ、およびＡＣＣの生産効率が向上し、３−ＨＰの生産量がより高まる。本発明に係る形質転換体としては、セリンプロテアーゼをコードする遺伝子（セリンプロテアーゼ遺伝子）、アミノペプチダーゼをコードする遺伝子（アミノペプチダーゼ遺伝子）、カルボキシペプチダーゼをコードする遺伝子（カルボキシペプチダーゼ遺伝子）およびジペプチダーゼをコードする遺伝子（ジペプチダーゼ遺伝子）からなる群から選ばれる１種以上の遺伝子が削除または不活性化されているものが好ましい。
【００３０】
本発明に係る形質転換体としては、１種類のプロテアーゼ遺伝子のみが削除等されたものであってもよく、２種類以上のプロテアーゼ遺伝子が削除等されたものであってもよい。なかでも、メタロプロテアーゼをコードする遺伝子（メタロプロテアーゼ遺伝子）、セリンプロテアーゼ遺伝子、システインプロテアーゼをコードする遺伝子（システインプロテアーゼ遺伝子）、およびアスパラギン酸プロテアーゼをコードする遺伝子（アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子）からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子が削除等された形質転換体が好ましく、メタロプロテアーゼ遺伝子およびセリンプロテアーゼ遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子とシステインプロテアーゼ遺伝子およびアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子内からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子とが削除等された形質転換体も好ましい。
【００３１】
Ｓ．ポンベの該４種のプロテアーゼ遺伝子としては、たとえば以下のものが挙げられる。
メタロプロテアーゼ遺伝子：ｃｄｂ４（SPAC23H4.09）、ｍａｓ２（SPBC18E5.12c）、ｐｇｐ１（SPCC1259.10）、ｐｐｐ２０（SPAC4F10.02）、ｐｐｐ２２（SPBC14C8.03）、ｐｐｐ５１（SPAC22G7.01c）、ｐｐｐ５２（SPBC18A7.01）、ｐｐｐ５３（SPAP14E8.04）。
セリンプロテアーゼ遺伝子：ｉｓｐ６（SPAC4A8.04）、ｐｐｐ１６（SPBC1711.12）、ｐｓｐ３（SPAC1006.01）、ｓｘａ２（SPAC1296.03c）。
システインプロテアーゼ遺伝子：ｐｐｐ８０（SPAC19B12.08）、ｐｃａ１（SPCC1840.04）、ｃｕｔ１（SPCC5E4.04）、ｇｐｉ８（SPCC11E10.02c）。
アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子：ｓｘａ１（SPAC26A3.01）、ｙｐｓ１（SPCC1795.09）、ｐｐｐ８１（SPAC25B8.17）。
【００３２】
本発明に係る形質転換体において削除等されているメタロプロテアーゼ遺伝子としては、ｃｄｂ４、ｐｇｐ１、ｐｐｐ２０、ｐｐｐ２２、ｐｐｐ５２、またはｐｐｐ５３の少なくとも１種が好ましく、ｃｄｂ４、ｐｐｐ２２、またはｐｐｐ５３の少なくとも１種がより好ましい。
本発明に係る形質転換体において削除等されているセリンプロテアーゼ遺伝子としては、ｉｓｐ６、ｐｐｐ１６、ｐｓｐ３、またはｓｘａ２の少なくとも１種が好ましい。
本発明に係る形質転換体において削除等されているシステインプロテアーゼ遺伝子としては、ｐｐｐ８０が好ましい。
【００３３】
本発明に係る形質転換体としては、ｃｄｂ４、ｐｐｐ２２、およびｐｐｐ５３からなる群から選ばれる１種以上の遺伝子と、ｉｓｐ６、ｐｐｐ１６、ｐｓｐ３、およびｓｘａ２からなる群から選ばれる２種以上の遺伝子の合計３種以上の遺伝子が削除等されているものが好ましく、ｐｐｐ５３およびｃｄｂ４からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子とｉｓｐ６とｐｓｐ３とを含む合計３種以上の遺伝子が削除等されているものがより好ましい。たとえば、ｐｓｐ３、ｉｓｐ６、ｐｐｐ５３の少なくとも３種の遺伝子が削除等されているものがさらに好ましい。
【００３４】
本発明に係る形質転換体としては、さらに、ｐｐｐ５３、ｉｓｐ６、ｐｓｐ３、およびｐｐｐ１６を含む４種以上の遺伝子が削除等されているものが好ましく、ｐｐｐ５３、ｉｓｐ６、ｐｓｐ３、ｐｐｐ１６、およびｐｐｐ２２を含む５種以上の遺伝子が削除等されているものがより好ましく、ｐｐｐ５３、ｉｓｐ６、ｐｓｐ３、ｐｐｐ１６、ｐｐｐ２２、およびｓｘａ２を含む６種以上の遺伝子が削除等されているものがさらに好ましく、ｐｓｐ３、ｉｓｐ６、ｐｐｐ５３、ｐｐｐ１６、ｐｐｐ２２、ｓｘａ２、ｐｐｐ８０、およびｐｐｐ２０が削除等されているものがよりさらに好ましい。
【００３５】
＜形質転換体の製造＞
本発明に係る形質転換体のうち細胞質内でＰｏｘＢおよびＡＣＳを発現させた形質転換体は、宿主となるＳ．ポンベに、ＰｏｘＢ遺伝子、ＡＣＳ遺伝子、ＭＣＲ遺伝子、およびＡＣＣ遺伝子を遺伝子工学的方法で導入することにより製造できる。また、本発明に係る形質転換体のうち細胞質内でＰＤＨを発現しうる形質転換体は、宿主となるＳ．ポンベに、Ｅ１遺伝子、Ｅ２遺伝子、Ｅ３遺伝子、ＭＣＲ遺伝子、およびＡＣＣ遺伝子を遺伝子工学的方法で導入することにより製造できる。
【００３６】
複数の遺伝子を導入する場合、全てを同時に宿主に導入してもよく、順次（順不同）導入してもよい。酵母を宿主として用いた遺伝子組換え法に関しては、タンパク質をより安定に効率よく発現させるために種々の発現システム、特に発現ベクター、分泌シグナル遺伝子導入発現ベクター等が開発されており、本発明に係る形質転換体の製造においては、これらを広く応用可能である。たとえば、Ｓ．ポンベを宿主とした発現システムとしては、特許２７７６０８５号公報、特開平０７−１６３３７３号公報、特開平１０−２１５８６７号公報、特開平１０−２１５８６７号公報、特開平１１−１９２０９４号公報、特開１１−１９２０９４号公報、特開２０００−２６２２８４号公報、国際公開第９６／０２３８９０号等が知られており、本発明に係る形質転換体を製造する方法には広くこれら発現システムが利用できる。
【００３７】
宿主とするＳ．ポンベは、野生型であってもよく、用途に応じて特定の遺伝子を欠失または失活させた変異型であってもよい。特定の遺伝子を欠失または失活させる方法としては、公知の方法を用いられる。具体的には、Ｌａｔｏｕｒ法（Ｎｕｃｒｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ誌、２００６年、３４巻、ｅ１１頁、国際公開第２００７／０６３９１９号に記載）を用いることにより遺伝子を欠失させられる。また、変異剤を用いた突然変異分離法（酵母分子遺伝学実験法、１９９６年、学会出版センター）や、ＰＣＲを利用したランダム変異法（PCR  Methods  Application誌、第2巻、28-33ページ、1992年）等により遺伝子の一部に変異を導入することにより該遺伝子を失活させられる。また、特定の遺伝子の削除または不活性化を行う部分はＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）部分であってもよく、発現調節配列部分であってもよい。特に好ましい方法は、構造遺伝子のＯＲＦ部分をマーカー遺伝子に置換するＰＣＲ媒介相同組換え法（Yeast誌、第14巻、943-951ページ、1998年）による削除または不活性化の方法である。
【００３８】
特定遺伝子を欠失または失活させたシゾサッカロミセス属酵母宿主としては、たとえば、国際公開第２００２／１０１０３８号、国際公開第２００７／０１５４７０号、国際公開第２０１３／１３７２７７号等に記載されている。本発明において用いられる宿主としては、Ｓ．ポンベが本来有する少なくとも１種のプロテアーゼ遺伝子が削除または不活性化されているものが好ましく、セリンプロテアーゼ遺伝子、アミノペプチダーゼ遺伝子、カルボキシペプチダーゼ遺伝子およびジペプチダーゼ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子が削除または不活性化されているものがより好ましく、メタロプロテアーゼ遺伝子、セリンプロテアーゼ遺伝子、システインプロテアーゼ遺伝子、およびアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子が削除または不活性化されているものがさらに好ましく、ｐｓｐ３、ｉｓｐ６、ｐｐｐ５３、ｐｐｐ１６、ｐｐｐ２２、ｓｘａ２、ｐｐｐ８０、およびｐｐｐ２０が削除または不活性化されているものがよりさらに好ましい。
【００３９】
さらに宿主として使用するＳ．ポンベには、形質転換体を選択するためのマーカーを有するものを用いることが好ましい。たとえば、ある遺伝子が欠落していることにより特定の栄養成分が生育に必須である宿主を使用することが好ましい。目的遺伝子配列を含むベクターにより形質転換をして形質転換体を作製する場合、ベクターにこの欠落している遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を組み込んでおくことにより、形質転換体では宿主の栄養要求性が消失する。宿主と形質転換体の栄養要求性の相違により、両者を区別して形質転換体を得られる。
【００４０】
たとえば、オロチジンリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｕｒａ４）が欠失または失活してウラシル要求性となっているＳ．ポンベを宿主とし、ｕｒａ４（栄養要求性相補マーカー）を有するベクターにより形質転換した後、ウラシル要求性が消失したものを選択することにより、ベクターが組み込まれた形質転換体を得られる。宿主において欠落により栄養要求性となる遺伝子は、形質転換体の選択に用いられるものであればｕｒａ４には限定されず、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１）等であってもよい。
【００４１】
＜遺伝子導入方法＞
導入する各遺伝子はＳ．ポンベの染色体に導入することが好ましい。染色体に遺伝子を導入することにより継代の維持安定性に優れた形質転換体が得られる。また、遺伝子は染色体に複数導入することもできる。
【００４２】
遺伝子工学的方法で宿主に遺伝子を導入する方法としては、公知の方法を使用できる。遺伝子をＳ．ポンベの染色体に導入する方法としては、遺伝子を有する発現カセットと組換え部位とを有するベクターを用い、相同組換え法により導入する方法が好ましい。
【００４３】
＜発現カセット＞
発現カセットとは、目的のタンパク質を発現するために必要なＤＮＡの組み合わせであり、目的のタンパク質をコードする構造遺伝子と宿主内で機能するプロモーターとターミネーターを含む。本発明に係る形質転換体の製造において用いられる発現カセットは、導入する構造遺伝子と、Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとＳ．ポンベ内で機能するターミネーターとを含む。該発現カセットは、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよい。さらに、前記栄養要求性相補マーカーが含まれていてもよい。１の発現カセットには複数の構造遺伝子が存在していてもよい。一つの発現カセット中の構造遺伝子の数は１〜８が好ましく、１〜５がより好ましい。また、一つの発現カセット中に複数の構造遺伝子が含まれている場合、２種類以上の構造遺伝子を含んでいてもよい。具体的には、該形質転換体の製造において、ＭＣＲ遺伝子およびＡＣＣ遺伝子は、それぞれ別個の発現カセットにより宿主に導入してもよく、両遺伝子を一つの発現カセットにより宿主に導入してもよい。ＰＤＨを細胞質に発現させる場合には、Ｅ１遺伝子とＥ２遺伝子とＥ３遺伝子は、それぞれ別個の発現カセットにより宿主に導入してもよく、各遺伝子を一つの発現カセットとして宿主に導入してもよい。
【００４４】
発現カセットに含める構造遺伝子の遺伝子配列としては、野生型がコードする遺伝子をそのまま用いてもよいが、宿主として用いるＳ．ポンベ内での発現量を増大させるために、野生型の遺伝子配列を、Ｓ．ポンベにおいて使用頻度の高いコドンに改変してもよい。
【００４５】
Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとしては、Ｓ．ポンベが本来有するプロモーター（転写開始活性が高いものが好ましい）やＳ．ポンベが本来有しないプロモーター（ウイルス由来のプロモーターなど）を使用できる。なお、プロモーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。本発明に係る形質転換体に導入される発現カセットのプロモーターとターミネーターとしては、３−ＨＰが蓄積して酸性になっても（ｐＨ６以下になっても）、形質転換体内で機能して構造遺伝子がコードするタンパク質の発現を維持できるものが好ましい。
【００４６】
Ｓ．ポンベが本来有するプロモーターとしては、たとえば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、チアミンの代謝に関与するｎｍｔ１遺伝子プロモーター、グルコースの代謝に関与するフルクトース−１、６−ビスホスファターゼ遺伝子プロモーター、カタボライト抑制に関与するインベルターゼ遺伝子のプロモーター（国際公開第９９／２３２２３号参照）、熱ショックタンパク質遺伝子プロモーター（国際公開第２００７／２６６１７号参照、国際公開第２０１４／０３０６４４号）などが挙げられる。
Ｓ．ポンベが本来有しないプロモーターとしては、たとえば、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、特開平１０−２３４３７５号公報に記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモーターが挙げられ、ｈＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターが好ましい。
【００４７】
Ｓ．ポンベ内で機能するターミネーターとしては、Ｓ．ポンベが本来有するターミネーターやＳ．ポンベが本来有しないターミネーターを使用できる。なお、ターミネーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
ターミネーターとしては、たとえば、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、特開平１０−２３４３７５号公報に記載されているヒト由来のターミネーターが挙げられ、ヒトリポコルチンＩのターミネーターが好ましい。
【００４８】
＜ベクター＞
本発明に係る形質転換体は、導入する構造遺伝子を含む発現カセットを、染色体中に有するか、または染色体外遺伝子として有する。発現カセットを染色体中に有するとは、宿主細胞の染色体中の１カ所以上に発現カセットが組み込まれていることであり、染色体外遺伝子として有するとは、発現カセットを含むプラスミドを細胞内に有するということである。各発現カセットを含む形質転換体は、各発現カセットを含むベクターを用いて宿主であるＳ．ポンベを形質転換することにより得られる。
【００４９】
該ベクターは、環状ＤＮＡ構造または線状ＤＮＡ構造を有するベクターに、該発現カセットを組み込むことにより製造できる。該発現カセットが、宿主の細胞内で染色体外遺伝子として保持される形質転換体を作製する場合には、該ベクターは、宿主細胞内で複製されるための配列、即ち、自律複製配列（Autonomously Replicating Sequence:ARS）を含むプラスミドであることが好ましい。一方で、該発現カセットが、宿主細胞の染色体中に組み込まれた形質転換体を作製する場合には、該ベクターは、線状ＤＮＡ構造であり、かつＡＲＳを有していないものとして、宿主細胞へ導入されることが好ましい。たとえば、該ベクターは、線状ＤＮＡからなるベクターであってもよく、宿主への導入時に、線状ＤＮＡに切り開くための制限酵素認識配列を備える環状ＤＮＡ構造のベクターであってもよい。該ベクターがＡＲＳを有するプラスミドの場合、ＡＲＳ部分を削除して線状ＤＮＡ構造、またはＡＲＳ部分を開裂させることによりＡＲＳの機能を失活させた線状ＤＮＡ構造とした後、宿主へ導入できる。
【００５０】
該ベクターは、形質転換体を選択するためのマーカーを有することが好ましい。該マーカーとしては、たとえば、ｕｒａ４、ｌｅｕ１が挙げられる。
【００５１】
該ベクターをＳ．ポンベの染色体に導入する場合、該ベクターの組換え部位は、Ｓ．ポンベの染色体における相同組換えの標的部位に対して相同組換えを行わせることのできる塩基配列を有する部位である。また、標的部位は、Ｓ．ポンベの染色体内で発現カセットを組み込む標的となる部位である。標的部位は、ベクターの組換え部位を該標的部位に対して相同組換えを行わせる塩基配列とすることにより自由に設定できる。
前記組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は７０％以上とすることが必要である。また、組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は、相同組換えが起きやすくなる点から、９０％以上とすることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。該組換え部位を有するベクターを用いることにより、発現カセットが相同組換えにより標的部位に組み込まれる。
組換え部位の長さ（塩基数）は、２０〜２０００ｂｐであることが好ましい。組換え部位の長さが２０ｂｐ以上であれば、相同組換えが起きやすくなる。また、組換え部位の長さが２０００ｂｐ以下であれば、ベクターが長くなりすぎて相同組換えが起き難くなることを防ぎやすい。組換え部位の長さは１００ｂｐ以上であることがより好ましく、２００ｂｐ以上であることがさらに好ましい。また、組換え部位の長さは８００ｂｐ以下であることがより好ましく、４００ｂｐ以下であることがさらに好ましい。
【００５２】
ベクターは、前記発現カセットと組換え部位以外に他のＤＮＡ領域を有していてもよい。たとえば、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域や抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子等）が挙げられる。これらは大腸菌を使用してベクターを構築する場合に通常必要とされる遺伝子である。ただし、前記複製開始領域は後述のようにベクターを宿主の染色体に組み込む際には除去されることが好ましい。
【００５３】
染色体に遺伝子を組み込む場合、ベクターは、Ｓ．ポンベの細胞に導入する際には線状ＤＮＡ構造で導入することが好ましい。すなわち、通常用いられるプラスミドＤＮＡ等の環状ＤＮＡ構造を有するベクターである場合には、制限酵素でベクターを線状に切り開いた後にＳ．ポンベの細胞に導入することが好ましい。
この場合、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く位置は、組換え部位内とする。これにより、切り開かれたベクターの両端にそれぞれ組換え部位が部分的に存在することとなり、相同組換えによりベクター全体が染色体の標的部位に組み込まれる。
ベクターは、両端それぞれに組換え部位の一部が存在するような線状ＤＮＡ構造とすることができれば、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く方法以外の方法で構築してもよい。
【００５４】
ベクターとしては、たとえば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等の大腸菌由来のプラスミドを好適に用いられる。
この場合、相同組換えに用いる際のプラスミドベクターは、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域が除去されていることが好ましい。これにより、上述したベクターを染色体に組み込む際に、その組み込み効率を向上させられる。
複製開始領域が除去されたベクターの構築方法は特に限定されないが、特開２０００−２６２２８４号公報に記載されている方法を用いることが好ましい。すなわち、組換え部位内の切断箇所に複製開始領域が挿入された前駆体ベクターを構築しておき、前述のように線状ＤＮＡ構造とすると同時に複製開始領域が切り出されるようにする方法が好ましい。これにより、簡便に複製開始領域が除去されたベクターを得られる。
また、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、国際公開第９６／２３８９０号、特開平１０−２３４３７５号公報等に記載された発現ベクターやその構築方法を適用して、発現カセットおよび組換え部位を有する前駆体ベクターを構築し、さらに通常の遺伝子工学的手法で該前駆体ベクターから複製開始領域を除去して相同組換えに用いるベクターを得る方法であってもよい。
【００５５】
＜標的部位＞
ベクターを組み込む標的部位は、Ｓ．ポンベの染色体中の１箇所のみに存在していてもよく、２箇所以上に存在していてもよい。標的部位が２箇所以上存在している場合、Ｓ．ポンベの染色体の２箇所以上に該ベクターを組み込める。また、１の発現カセット中の遺伝子を複数とした場合には、標的部位の１箇所に複数の遺伝子を組み込める。さらに、２種以上の標的部位に、それぞれの標的部位に対応する組換え部位を有する２種以上のベクターを用いて、発現カセットを組み込むこともできる。
【００５６】
＜形質転換方法＞
形質転換方法は、公知の形質転換方法がいずれも用いられる。該形質転換方法としては、たとえば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、ガラスビーズ法など従来周知の方法や、特開２００５−１９８６１２号公報記載の方法が挙げられる。また、市販の酵母形質転換用キットを用いてもよい。
【００５７】
形質転換体の製造では、通常、相同組換えを行った後、得られた形質転換体を選択する。選択する方法としては、たとえば、以下に示す方法が挙げられる。前記栄養要求性マーカーにより形質転換体を選択できる培地によりスクリーニングし、得られたコロニーから複数を選択する。次に、それらを別々に液体培養した後、それぞれの液体培地における異種タンパク質の発現量を調べ、該異種タンパク質の発現量がより多い形質転換体を選択する。それら選択した形質転換体に対してパルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム解析を行うことにより、染色体に組み込まれたベクターの数や発現カセットの数を調べられる。
染色体に組み込まれるベクターの数は組み込み条件などを調整することによりある程度は調整できる。ベクターの大きさ（塩基数）や構造により、組み込み効率や組み込み数も変化すると考えられる。
【００５８】
［３−ＨＰの製造］
本発明に係る３−ＨＰの製造方法は、本発明に係る形質転換体を、液体培地中で培養し、該液体培地から３−ＨＰを取得する方法である。該形質転換体を液体培地中で培養すると、該形質転換体の細胞質において３−ＨＰが産生される。産生された３−ＨＰは、液体培地に分泌されるため、該形質転換体を培養した後の液体培地から、３−ＨＰを回収できる。
【００５９】
３−ＨＰの製造に用いる液体培地としては、糖を含有する公知の酵母培養培地を用いることができる。該液体培地としては、さらにＳ．ポンベが資化しうる窒素源、無機塩類等を含有し、Ｓ．ポンベの培養を効率良く行えるものが好ましい。該液体培地としては、天然培地を用いてもよく、合成培地を用いてもよい。
【００６０】
炭素源である糖としては、たとえば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース等の糖が挙げられる。窒素源としては、たとえば、アンモニア、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または無機酸のアンモニウム塩、ペプトン、カザミノ酸、イーストエキス等が挙げられる。無機塩類としては、たとえば、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。さらには、プロテオリピド等の発酵促進因子などを含ませられる。
【００６１】
本発明に係る３−ＨＰの製造方法では、糖として特にグルコースまたはスクロースを含有する液体培地を用いることが好ましい。培養初期の液体培地（１００質量％）中のグルコースまたはスクロースの濃度は１質量％以上が好ましく、１〜５０質量％がより好ましく、２〜２０質量％がさらに好ましい。培養によりグルコース濃度が低下することより、必要によりグルコースを添加して培養を継続することが好ましい。培養終期のグルコース濃度は１質量％以下となってもよい。また、３−ＨＰを分離しながら液体培地を循環させて連続的に培養を行う場合には、前記グルコース濃度を維持することが好ましい。グルコース濃度を２質量％以上とすることにより、３−ＨＰの生産性がより向上する。また、液体培地中のグルコースを２０質量％以下とすることにより、３−ＨＰの生産効率がより向上する。
【００６２】
また、３−ＨＰ製造の生産性を高くするために、高密度培養を行うことが好ましい。高密度培養では、液体培地中の形質転換体の初発菌体濃度を乾燥菌体重量換算値で表して０．１〜５ｇ／Ｌとすることが好ましい。液体培地中の形質転換体の初発菌体濃度を乾燥菌体重量換算値で表して０．２〜２ｇ／Ｌとすることがより好ましい。初発菌体濃度を高くすることにより短時間で高い生産性を達成できる。また、初発菌体濃度があまりに高すぎると菌体の凝集および精製効率の低下等の問題が生じるおそれがある。
【００６３】
なお、後述の実施例等で示す菌体濃度は、島津製作所製紫外可視分光光度計UVmini-1240によって測定した波長６００ｎｍの光の吸光度（ＯＤ６００）値である。
【００６４】
培養には公知の酵母培養方法を用いることができ、たとえば振とう培養、攪拌培養等により行える。
また、培養温度は、２３〜３７℃であることが好ましい。また、培養時間は適宜決定できる。
また、培養は、回分培養であってもよく、連続培養であってもよい。たとえば、回分培養で培養を行った後、菌体を液体培地から分離して、３−ＨＰを含む液体培地を取得できる。また、連続培養法では、たとえば、培養中の培養槽から液体培地の一部を抜き出し、抜き出した液体培地から３−ＨＰを分離するとともに、培養上清を回収し、該培養上清にグルコースおよび新たな液体培地等を加えて培養槽に戻すことを繰り返して、連続的に培養する方法が挙げられる。連続培養を行うことにより、３−ＨＰの生産性がより向上する。
【００６５】
本発明に係る３−ＨＰの製造方法では、耐酸性に特に優れたＳ．ポンベの形質転換体を用いているため、３−ＨＰの蓄積により低ｐＨ（ｐＨ２〜４程度）となっても中和を行わずに３−ＨＰを生産できる。そのため、液体培地のｐＨが３．５以下になった後も、さらに培養を継続する連続培養により３−ＨＰを製造できる。培養終期のｐＨおよび連続培養におけるｐＨは、３．５以下が好ましく、特に２．３〜３．５が好ましい。３−ＨＰの生産性を高くするために、液体培地のｐＨが３．５以下になった後にさらに培養を継続することが好ましい。本発明に係る形質転換体は耐酸性が優れているため、該形質転換体により産生された液体培地中の３−ＨＰを中和することなく培養を継続できる。
【００６６】
液体培地からの３−ＨＰの取得は、公知の方法を用いられる。特に、液体培地中の３−ＨＰを中和することなく、液体培地と３−ＨＰを分離して、３−ＨＰを取得することが好ましい。たとえば、培養終了後の液体培地から遠心分離により菌体を分離し、ｐＨ１以下にした後にジエチルエーテルや酢酸エチル等により抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着させて洗浄した後に溶出させる方法、活性炭を用いて不純物を除去する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させた後に蒸留する方法、分離膜を用いて分離する方法が挙げられる。また、場合によっては液体培地中の３−ＨＰを中和した後液体培地と３−ＨＰ塩を分離して、３−ＨＰを取得することもできる。たとえば、液体培地中の３−ＨＰをカルシウム塩またはリチウム塩に変換し、該中和塩を晶析する方法で３−ＨＰを取得することもできる。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例および比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。また、本実施例においては特に断りのない限り「％」は「質量％」を意味する。
【００６８】
［実施例１］
Ｓ．ポンベのうち、ｐｓｐ３、ｉｓｐ６、ｐｐｐ５３、ｐｐｐ１６、ｐｐｐ２２、ｓｘａ２、ｐｐｐ８０、およびｐｐｐ２０が削除されているＭＧＦ４３８株（遺伝子型：ｈ−  ｌｅｕ１−３２  ｕｒａ４−Ｄ１８  ｐｓｐ３−Ｄ１３  ｉｓｐ６−Ｄ１４  ｏｍａ１−Ｄ１０  ｐｐｐ１６−Ｄ２０  ｆｍａ２−Ｄ１３  ｓｘａ２−Ｄ１５  ａａｐ１−Ｄ１７  ｐｐｐ８０−Ｄ１１）のａｄｅ７を破壊してアデニン要求性を付与した株に、クロロフレクサス・オーランティアカス由来のｍｃｒとＳ．ポンベ由来のｃｕｔ６とを導入した形質転換体と、クロロフレクサス・オーランティアカス由来のｍｃｒとＳ．ポンベ由来のｃｕｔ６と大腸菌由来のｐｏｘＢとＳ．ポンベ由来のａｃｓ１とを導入した形質転換体の３−ＨＰ産生量を比較した。
【００６９】
＜ｍｃｒ／ｃｕｔ６−１発現株（Ｎｏ．３９５）の作製＞
まず、ｈｓｐ９プロモーターとＬＰＩターミネーターの間にＳ．ポンベ由来のｃｕｔ６が組み込まれている組換えベクターｐＪＫ１４８−ｈｓｐ９ｐ−ｃｕｔ６−ＬＰＩｔ（１２９２５ｂｐ、図１、配列番号９）と、ｈｓｐ９プロモーターとｉｎｖ１ターミネーターの間にクロロフレクサス・オーランティアカス由来のｍｃｒが組み込まれている組換えベクターｐＭＬ７ａ−ｈｓｐ９ｐ−ＣａＭＣＲ−ｉｎｖ１ｔ（９６７８ｂｐ、図２、配列番号１０）とを、ＤＮＡ合成により作製した。
次いで、ＭＧＦ４３８株のａｄｅ７を破壊してアデニン要求性を付与した株を、制限酵素ＮｒｕＩで切断したｐＪＫ１４８−ｈｓｐ９ｐ−ｃｕｔ６−ＬＰＩｔベクターで形質転換し、該ベクターを染色体のｌｅｕ１遺伝子座に導入した形質転換体を選抜した。
次いで、該形質転換体を、制限酵素ＮｏｔＩで切断したｐＭＬ７ａ−ｈｓｐ９ｐ−ＣａＭＣＲ−ｉｎｖ１ｔで形質転換し、該ベクターの５’−Ｔｆ２（ａ）−ＳＶ４０  プロモーター−ＵＲＡ３−ｈｓｐ９  プロモーター−ｍｃｒ−ｉｎｖ１  ターミネーター−３’−ＴＦ２（ｂ）遺伝子を染色体のＴｆ２遺伝子座に導入した形質転換体を選抜した。該形質転換体をｍｃｒ／ｃｕｔ６−１発現株（Ｎｏ．３９５）とした。
【００７０】
＜ｍｃｒ／ｃｕｔ６−２発現株（Ｎｏ．４０８）の作製＞
まず、プライマーＧｐｍ１  ｕｐ  Ｆｗ（２５ｍｅｒ、配列番号１１）とプライマーＧｐｍ１  ｄｗ  Ｒｖ（３１ｍｅｒ、配列番号１２）とを用いたＰＣＲで、ｐＳＭ−ｕ４ｐＡｄｅベクター（６２５９ｂｐ、図３、配列番号１３）のＧｐｍ１  ｕｐ−ｌｏｘＰ−ｕｒａ４  プロモーター−ａｄｅ７−ｕｒａ４  ターミネーター−ｌｏｘＰ−Ｇｐｍ１  Ｄｗ遺伝子を増幅した。次いで、ＭＧＦ４３８株のａｄｅ７を破壊してアデニン要求性を付与した株を該増幅遺伝子で形質転換し、該増幅遺伝子を染色体のＧｐｍ１遺伝子座下流に導入した形質転換体を選抜した。該形質転換体をｍｃｒ／ｃｕｔ６−２発現株（Ｎｏ．４０８）とした。
【００７１】
＜ｍｃｒ／ｃｕｔ６−３発現株（Ｎｏ．４０９）の作製＞
まず、プライマーＥｎｏ１０１  ｕｐ  Ｆｗ（２５ｍｅｒ、配列番号１４）とプライマーＥｎｏ１０１  ｄｗ  Ｒｖ（３３ｍｅｒ、配列番号１５）とを用いたＰＣＲで、ｐＳＮ−ｕ４ｐＡｄｅベクター（６２４６ｂｐ、図４、配列番号１６）のＥｎｏ１０１  ｕｐ−ｌｏｘＰ−ｕｒａ４  プロモーター−ａｄｅ７−ｕｒａ４  ターミネーター−ｌｏｘＰ−Ｅｎｏ１０１  Ｄｗ遺伝子を増幅した。次いで、ＭＧＦ４３８株のａｄｅ７を破壊してアデニン要求性を付与した株を該増幅遺伝子で形質転換し、該増幅遺伝子を染色体のＥｎｏ１０１遺伝子座下流に導入した形質転換体を選抜した。該形質転換体をｍｃｒ／ｃｕｔ６−３発現株（Ｎｏ．４０９）とした。
【００７２】
＜ｍｃｒ／ｃｕｔ６／ｐｏｘＢ／ａｃｓ１発現株の作製＞
まず、ｈｓｐ９プロモーターとｉｎｖ１ターミネーターの間にｐｏｘＢが組み込まれており、ｈＣＭＶプロモーターとＬＰＩターミネーターの間にａｃｓ１が組み込まれている組換えベクターｐＳＭ−ｕ４ｐＡｄｅ−ｐｏｘＢ−ａｃｓ１（１１９３３ｂｐ、図５、配列番号１７）をＤＮＡ合成により作製した。次いでプライマーＧｐｍ１  ｕｐ  ＦｗとプライマーＧｐｍ１  ｄｗ  Ｒｖとを用いたＰＣＲで、ｐＳＭ−ｕ４ｐＡｄｅ−ｐｏｘＢ−ａｃｓ１ベクターのＧｐｍ１  ｕｐ−ｌｏｘＰ−ｕｒａ４  プロモーター−ａｄｅ７−ｕｒａ４  ターミネーター−ｌｏｘＰ−ＬＰＩ  ターミネーター−ａｃｓ１−ｈＣＭＶ  プロモーター−ｉｎｖ１  ターミネーター−ｐｏｘＢ−ｈｓｐ９  プロモーター−Ｇｐｍ１  Ｄｗ遺伝子を増幅した。次いで、ｍｃｒ／ｃｕｔ６−１発現株を該増幅遺伝子で形質転換し、該増幅遺伝子を染色体のＧｐｍ１遺伝子座下流に導入した形質転換体を選抜した。該形質転換体をｍｃｒ／ｃｕｔ６／ｐｏｘＢ／ａｃｓ１発現株とした。
【００７３】
＜３−ＨＰ産生＞
ｍｃｒ／ｃｕｔ６−２発現株とｍｃｒ／ｃｕｔ６／ｐｏｘＢ／ａｃｓ１発現株を培養し、産生された３−ＨＰ量を測定して比較した。
【００７４】
具体的には、ｍｃｒ／ｃｕｔ６−２発現株を、グルコース濃度２０％のＭＭ−ｌｅｕ−ｕｒａ−ａｄｅｎｉｎｅ培地（ＭＭ培地からロイシンとウラシルとアデニンを除いた培地）に植菌して、温度３０℃、振盪速度２００ｒｐｍの条件下で４８時間培養を行った。
次いで、培養終了後の液体培地から遠心分離処理により菌体を分離し、該菌体をグルコース濃度２０％のＭＭ−ｌｅｕ−ｕｒａ−ａｄｅｎｉｎｅ培地に、初発菌体濃度がＯＤ６００＝０．０５になるように接種し、温度３０℃、振盪速度２５０ｒｐｍの条件下で１８４時間培養した。培養開始から２４時間毎と培養終了後の培養液の３−ＨＰ濃度（ｇ／Ｌ）を以下に示すＨＰＬＣ条件で測定した。
【００７５】
使用カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８  ５μｍ、４．６ Ｉ.Ｄ.×２５０ ｍｍ      （ＧＬサイエンス社製）
溶離液：１０ｍＭ  ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４  （ｐＨ２．６、リン酸で調製）
注入量：１０μＬ
流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：３０℃
検出：ＵＶ（波長２１０ｎｍ）
【００７６】
同様に、ｍｃｒ／ｃｕｔ６／ｐｏｘＢ／ａｃｓ１発現株を、グルコース濃度２０％のＭＭ−ｌｅｕ−ｕｒａ−ａｄｅｎｉｎｅ培地に植菌して、温度３０℃、振盪速度２００ｒｐｍの条件下で４８時間培養を行った。
次いで、培養終了後の液体培地から遠心分離処理により菌体を分離し、該菌体をグルコース濃度２０％のＭＭ−ｌｅｕ−ｕｒａ−ａｄｅｎｉｎｅ培地に、初発菌体濃度がＯＤ６００＝０．０５になるように接種し、温度３０℃、振盪速度２５０ｒｐｍの条件下で１８４時間培養した。培養開始から２４時間毎と培養終了後の培養液の３−ＨＰ濃度（ｇ／Ｌ）を前記と同様にして測定した。
【００７７】
＜生育性＞
ｍｃｒ／ｃｕｔ６−２発現株とｍｃｒ／ｃｕｔ６／ｐｏｘＢ／ａｃｓ１発現株の生育を比較した。
具体的には、ｍｃｒ／ｃｕｔ６−２発現株およびｍｃｒ／ｃｕｔ６／ｐｏｘＢ／ａｃｓ１発現株を、それぞれ、グルコース濃度２０％のＭＭ−ｌｅｕ−ｕｒａ−ａｄｅｎｉｎｅ培地に植菌して、温度３０℃、振盪速度２００ｒｐｍの条件下で４８時間培養を行った。
次いで、培養終了後の液体培地から遠心分離処理により菌体を分離し、該菌体をグルコース濃度２０％のＭＭ−ｌｅｕ−ｕｒａ−ａｄｅｎｉｎｅ培地に、初発菌体濃度がＯＤ６００＝０．０５になるように接種し、温度３０℃、振盪速度２５０ｒｐｍの条件下で１８４時間培養した。培養開始から２４時間毎と培養終了後の培養液のＯＤ６００値を吸光光度計で測定した。
【００７８】
各培養液の生育（ＯＤ６００値）の測定結果を図６に示す。この結果、両株とも、培養開始から７０時間で定常期に達した。７０時間におけるｍｃｒ／ｃｕｔ６−２発現株（破線）のＯＤ６００値は６．３、ｍｃｒ／ｃｕｔ６／ｐｏｘＢ／ａｃｓ１発現株（実線）のＯＤ６００値は６．８であった。
【００７９】
各培養液の３−ＨＰ濃度（ｇ／Ｌ）の測定結果を図７に示す。この結果、両株とも、生育が定常期に達した後も３−ＨＰ生産量は増加し続けた。培養終了後のｍｃｒ／ｃｕｔ６−２発現株（破線）の３−ＨＰ生産量は０．５２ｇ、ｍｃｒ／ｃｕｔ６／ｐｏｘＢ／ａｃｓ１発現株（実線）の３−ＨＰ生産量は３．３１ｇ／Ｌであり、ｍｃｒ／ｃｕｔ６−２発現株よりもｍｃｒ／ｃｕｔ６／ｐｏｘＢ／ａｃｓ１発現株のほうが、３−ＨＰ生産量が６．４倍向上した。これらの結果から、ＭＣＲ遺伝子とｃｕｔ６を導入したＳ．ポンベの形質転換体では、ｐｏｘＢとａｃｓ１を過剰発現させることにより、３−ＨＰ生産量を増大させられることがわかった。
【００８０】
［実施例２］
ＭＧＦ４３８株のａｄｅ７を破壊してアデニン要求性を付与した株にクロロフレクサス・オーランティアカス由来のｍｃｒとＳ．ポンベ由来のｃｕｔ６とを導入した形質転換体と、ｍｃｒとＳ．ポンベ由来のｃｕｔ６と大腸菌由来のａｃｅＥと大腸菌由来のａｃｅＦと大腸菌由来のｌｐｄとを導入した形質転換体の３−ＨＰ産生量を比較した。
【００８１】
＜ｍｃｒ／ｃｕｔ６／ａｃｅＥ／ａｃｅＦ／ｌｐｄの作製＞
まず、ｈｓｐ９プロモーターとｉｎｖ１ターミネーターの間にａｃｅＥが組み込まれており、ｈＣＭＶプロモーターとＬＰＩターミネーターの間にａｃｅＦが組み込まれており、ａｄｈ１プロモーターとａｄｈ１ターミネーターの間にｌｐｄが組み込まれている組換えベクターｐＳＮ−ｕ４ｐＡｄｅ−ＰＤＨ（１５５８６ｂｐ、図８、配列番号１８）をＤＮＡ合成により作製した。次いでプライマーＥｎｏ１０１  ｕｐ  ＦｗとプライマーＥｎｏ１０１  ｄｗ  Ｒｖとを用いたＰＣＲで、ｐＳＮ−ｕ４ｐＡｄｅ−ＰＤＨベクターのＥｎｏ１０１  ｕｐ−ｌｏｘＰ−ｕｒａ４  プロモーター−ａｄｅ７−ｕｒａ４  ターミネーター−ｌｏｘＰ−ＬＰＩ  ターミネーター−ａｃｅＦ−ｈＣＭＶ  プロモーター−ｉｎｖ１  ターミネーター−ａｃｅＥ−ｈｓｐ９  プロモーター−ａｄｈ１プロモーター−ｌｐｄ−ａｄｈ１ターミネーター−Ｅｎｏ１０１  Ｄｗ遺伝子を増幅した。次いで、ｍｃｒ／ｃｕｔ６−１発現株を該増幅遺伝子で形質転換し、該増幅遺伝子を染色体のＥｎｏ１０１遺伝子座下流に導入した形質転換体を選抜した。該形質転換体をｍｃｒ／ｃｕｔ６／ａｃｅＥ／ａｃｅＦ／ｌｐｄ発現株とした。
【００８２】
＜３−ＨＰ産生＞
ｍｃｒ／ｃｕｔ６−３発現株とｍｃｒ／ｃｕｔ６／ａｃｅＥ／ａｃｅＦ／ｌｐｄ発現株の３−ＨＰ産生量を比較した。
ｍｃｒ／ｃｕｔ６−３発現株およびｍｃｒ／ｃｕｔ６／ａｃｅＥ／ａｃｅＦ／ｌｐｄ発現株の培養と培養液の３−ＨＰ濃度（ｇ／Ｌ）の測定は、実施例１におけるｍｃｒ／ｃｕｔ６−２発現株と同様にして行った。
【００８３】
＜生育＞
ｍｃｒ／ｃｕｔ６−３発現株とｍｃｒ／ｃｕｔ６／ａｃｅＥ／ａｃｅＦ／ｌｐｄ発現株の生育を比較した。
ｍｃｒ／ｃｕｔ６−３発現株およびｍｃｒ／ｃｕｔ６／ａｃｅＥ／ａｃｅＦ／ｌｐｄ発現株の培養と培養液のＯＤ６００値の測定は、実施例１におけるｍｃｒ／ｃｕｔ６−２発現株と同様にして行った。
【００８４】
各培養液の生育（ＯＤ６００値）の測定結果を図９に示す。この結果、両株とも、培養開始から７０時間で定常期に達した。７０時間におけるｍｃｒ／ｃｕｔ６−３発現株（破線）のＯＤ６００値は７．１、７０時間におけるｍｃｒ／ｃｕｔ６／ａｃｅＥ／ａｃｅＦ／ｌｐｄ発現株（実線）のＯＤ６００値が６．９であった。
【００８５】
各培養液の３−ＨＰ濃度（ｇ／Ｌ）の測定結果を図１０に示す。この結果、両株とも、生育が定常期に達した後も３−ＨＰ生産量は増加し続けた。培養終了後のｍｃｒ／ｃｕｔ６−３発現株（破線）の３−ＨＰ生産量は０．３１ｇ、ｍｃｒ／ｃｕｔ６／ａｃｅＥ／ａｃｅＦ／ｌｐｄ発現株（実線）の３−ＨＰ生産量は４．３５ｇ／Ｌであり、ｍｃｒ／ｃｕｔ６−３発現株よりもｍｃｒ／ｃｕｔ６／ａｃｅＥ／ａｃｅＦ／ｌｐｄ発現株のほうが、３−ＨＰ生産量が１４．０倍向上した。これらの結果から、ＭＣＲ遺伝子とｃｕｔ６を導入したＳ．ポンベの形質転換体では、ａｃｅＥとａｃｅＦとｌｐｄを過剰発現させることにより、３−ＨＰ生産量を増大させられることがわかった。
【００８６】
［実施例３］
ＭＧＦ４３８株のａｄｅ７を破壊してアデニン要求性を付与した株にクロロフレクサス・オーランティアカス由来のｍｃｒとＳ．ポンベ由来のｃｕｔ６とを導入した形質転換体と、クロロフレクサス・オーランティアカス由来のｍｃｒとＳ．ポンベ由来のｃｕｔ６と大腸菌由来のｐｏｘＢとＳ．ポンベ由来のａｃｓ１とを導入した形質転換体と、ｍｃｒとＳ．ポンベ由来のｃｕｔ６と大腸菌由来のａｃｅＥと大腸菌由来のａｃｅＦと大腸菌由来のｌｐｄとを導入した形質転換体の高密度培養による３−ＨＰ産生量を比較した。
【００８７】
＜高密度培養による３−ＨＰ産生＞
ｍｃｒ／ｃｕｔ６−２発現株、ｍｃｒ／ｃｕｔ６／ｐｏｘＢ／ａｃｓ１発現株、ｍｃｒ／ｃｕｔ６−３発現株、およびｍｃｒ／ｃｕｔ６／ａｃｅＥ／ａｃｅＦ／ｌｐｄ発現株の高密度培養による３−ＨＰ産生量を比較した。
具体的には、各株を、それぞれ、グルコース濃度２０％のＭＭ−ｌｅｕ−ｕｒａ−ａｄｅｎｉｎｅ培地に植菌して、温度３０℃、振盪速度２００ｒｐｍの条件下で４８時間培養を行った。
次いで、培養終了後の液体培地から遠心分離処理により菌体を分離し、該菌体をグルコース濃度２０％のＭＭ−ｌｅｕ−ｕｒａ−ａｄｅｎｉｎｅ培地に、初発菌体濃度がＯＤ６００＝１００になるように接種し、温度３０℃、振盪速度２５０ｒｐｍの条件下で９時間培養した。培養開始から１時間毎に培養液の３−ＨＰ濃度（ｇ／Ｌ）をＨＰＬＣで測定した。培養液の３−ＨＰ濃度の測定は、実施例１と同様にして行った。
【００８８】
各培養液の３−ＨＰ濃度（ｇ／Ｌ）の測定結果を図１１に示す。この結果、培養終了後のｍｃｒ／ｃｕｔ６−２発現株（破線白抜き丸）の３−ＨＰ生産量は１．４１ｇ、ｍｃｒ／ｃｕｔ６／ｐｏｘＢ／ａｃｓ１発現株（実線黒丸）の３−ＨＰ生産量は１０．７９ｇ／Ｌであり、ｍｃｒ／ｃｕｔ６−２発現株よりもｍｃｒ／ｃｕｔ６／ｐｏｘＢ／ａｃｓ１発現株のほうが、３−ＨＰ生産量が７．７倍向上した。また、培養終了後のｍｃｒ／ｃｕｔ６−３発現株（破線白抜き三角）の３‐ＨＰ生産量は１．３４ｇ、ｍｃｒ／ｃｕｔ６／ａｃｅＥ／ａｃｅＦ／ｌｐｄ発現株（実線黒三角）の３‐ＨＰ生産量は９．８２ｇ／Ｌであり、ｍｃｒ／ｃｕｔ６−３発現株よりもｍｃｒ／ｃｕｔ６／ａｃｅＥ／ａｃｅＦ／ｌｐｄ発現株のほうが、３−ＨＰ生産量が７．３倍向上した。これらの結果から、ＭＣＲ遺伝子とｃｕｔ６を導入したＳ．ポンベの形質転換体では、ｐｏｘＢとａｃｓ１を過剰発現させ、高密度培養することにより、３−ＨＰ生産量を増大させられることがわかった。また、同様に、該形質転換体では、ａｃｅＥとａｃｅＦとｌｐｄを過剰発現させ、高密度培養することにより、３−ＨＰ生産量を増大させられることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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