(57)【要約】【課題】新規な土壌伝染性病害軽減材を提案する。【解決手段】担体資材に特性の異なる３種類のBacillus属細菌を含ませてなる土壌伝染性病害軽減材。特性の異なる３種類のBacillus属細菌は、Bacillus amyloliquefaciens（受託番号：NITE P‐02337）、Bacillus subtilis（受託番号：NITE P‐02338）、Bacillus subtilis（受託番号：NITE P‐02354）である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体資材に特性の異なる３種類のBacillus属細菌を含ませてなる土壌伝染性病害軽減材。
【請求項２】
前記担体資材はμm単位以上の孔径を有する多孔質の担体資材である請求項１記載の土壌伝染性病害軽減材。
【請求項３】
水分量５〜１０％に乾燥処理されている請求項１又は２記載の土壌伝染性病害軽減材。
【請求項４】
菌濃度が１．０×１０４cfu/g〜９．０×１０７cfu/gである請求項１〜３のいずれか一項に記載の土壌伝染性病害軽減材。
【請求項５】
あらかじめ成型されている担体資材に特性の異なる３種類のBacillus属細菌を含ませてなる土壌伝染性病害軽減材。
【請求項６】
あらかじめ成型されている前記担体資材は粒径２ｍｍ〜１０ｍｍの粒状に成型されている請求項５記載の土壌伝染性病害軽減材。
【請求項７】
前記担体資材はμm単位以上の孔径を有する多孔質の担体資材である請求項５又は６記載の土壌伝染性病害軽減材。
【請求項８】
水分量５〜１０％に乾燥処理されている請求項５〜７のいずれか一項に記載の土壌伝染性病害軽減材。
【請求項９】
菌濃度が１．０×１０４cfu/g〜９．０×１０７cfu/gである請求項５〜８のいずれか一項に記載の土壌伝染性病害軽減材。
【請求項１０】
担体資材に特性の異なる３種類のBacillus属細菌を含ませたものを成型してなる土壌伝染性病害軽減材。
【請求項１１】
粒径２ｍｍ〜１０ｍｍの粒状に成型されている請求項１０記載の土壌伝染性病害軽減材。
【請求項１２】
前記担体資材はμm単位以上の孔径を有する多孔質の担体資材である請求項１０又は１１記載の土壌伝染性病害軽減材。
【請求項１３】
水分量５〜１０％に乾燥処理されている請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の土壌伝染性病害軽減材。
【請求項１４】
菌濃度が１．０×１０４cfu/g〜９．０×１０７cfu/gである請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の土壌伝染性病害軽減材。
【請求項１５】
前記担体資材は、乾燥鶏ふん、発酵鶏ふん、発酵牛ふん、発酵豚ぷん、ケイソウ土、ゼオライト、軽量気泡コンクリート、緑色擬灰岩のいずれか一種又は複数種の組み合わせからなる請求項１〜１４のいずれか一項に記載の土壌伝染性病害軽減材。
【請求項１６】
前記担体資材は、発酵牛ふん、発酵豚ぷん、ケイソウ土、ゼオライト、軽量気泡コンクリート、緑色擬灰岩のいずれか一種又は複数種と、乾燥鶏ふん及び／又は発酵鶏ふんとの組み合わせからなる、又は、乾燥鶏ふん及び／又は発酵鶏ふんからなる請求項１〜１４のいずれか一項に記載の土壌伝染性病害軽減材。
【請求項１７】
特性の異なる３種類のBacillus属細菌は、Bacillus amyloliquefaciens（受託番号：NITE P‐02337）、Bacillus subtilis（受託番号：NITE P‐02338）、Bacillus subtilis（受託番号：NITE P‐02354）である請求項１〜１６のいずれか一項に記載の土壌伝染性病害軽減材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は土壌伝染性病害軽減材に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から土壌伝染性病害を防除する目的で種々の提案が行われている。
【０００３】
例えば、特許文献１では、各種植物の根部に感染、共生可能で、土壌伝染性病害を防除する能力を持つとする新規糸状菌株、当該菌株の菌体または培養物を含む土壌伝染性病害防除資材、これを利用した植物の土壌伝染性病害防除法が提案されている。
【０００４】
特許文献２では、光合成細菌とバチルス属（Bacillus）細菌を有効成分として含む植物病原糸状菌を原因とする土壌伝染性病害に対して高い防除効果を有し、環境に対する負荷が少なく、安全で薬害のないとする微生物農薬、及びその微生物農薬を用いて土壌伝染性病害を効果的に防除できるとする方法が提案されている。
【０００５】
特許文献３では、作物生長促進を伴う土壌伝染性病害防除法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−６７６６７号公報
【特許文献２】特開２０１５−３９３５９号号公報
【特許文献３】特開２０１５−６１８２６号号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
この発明は、新規な土壌伝染性病害軽減材を提案することを目的にしている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
［１］
担体資材に特性の異なる３種類のBacillus属細菌を含ませてなる土壌伝染性病害軽減材。
【０００９】
［２］
前記担体資材はμm単位以上の孔径を有する多孔質の担体資材である［１］の土壌伝染性病害軽減材。
【００１０】
［３］
水分量５〜１０％に乾燥処理されている［１］又は［２］の土壌伝染性病害軽減材。
【００１１】
［４］
菌濃度が１．０×１０４cfu/g〜９．０×１０７cfu/gである［１］〜［３］のいずれかの土壌伝染性病害軽減材。
【００１２】
［５］
あらかじめ成型されている担体資材に特性の異なる３種類のBacillus属細菌を含ませてなる土壌伝染性病害軽減材。
【００１３】
［６］
あらかじめ成型されている前記担体資材は粒径２ｍｍ〜１０ｍｍの粒状に成型されている［５］の土壌伝染性病害軽減材。
【００１４】
［７］
前記担体資材はμm単位以上の孔径を有する多孔質の担体資材である［５］又は［６］の土壌伝染性病害軽減材。
【００１５】
［８］
水分量５〜１０％に乾燥処理されている［５］〜［７］のいずれかの土壌伝染性病害軽減材。
【００１６】
［９］
菌濃度が１．０×１０４cfu/g〜９．０×１０７cfu/gである［５］〜［８］のいずれかの土壌伝染性病害軽減材。
【００１７】
［１０］
担体資材に特性の異なる３種類のBacillus属細菌を含ませたものを成型してなる土壌伝染性病害軽減材。
【００１８】
［１１］
粒径２ｍｍ〜１０ｍｍの粒状に成型されている［１０］の土壌伝染性病害軽減材。
【００１９】
［１２］
前記担体資材はμm単位以上の孔径を有する多孔質の担体資材である［１０］又は［１１］の土壌伝染性病害軽減材。
【００２０】
［１３］
水分量５〜１０％に乾燥処理されている［１０］〜［１２］のいずれかの土壌伝染性病害軽減材。
【００２１】
［１４］
菌濃度が１．０×１０４cfu/g〜９．０×１０７cfu/gである［１０］〜［１３］のいずれかの土壌伝染性病害軽減材。
【００２２】
［１５］
前記担体資材は、乾燥鶏ふん、発酵鶏ふん、発酵牛ふん、発酵豚ぷん、ケイソウ土、ゼオライト、軽量気泡コンクリート、緑色擬灰岩のいずれか一種又は複数種の組み合わせからなる［１］〜［１４］のいずれかの土壌伝染性病害軽減材。
【００２３】
［１６］
前記担体資材は、発酵牛ふん、発酵豚ぷん、ケイソウ土、ゼオライト、軽量気泡コンクリート、緑色擬灰岩のいずれか一種又は複数種と、乾燥鶏ふん及び／又は発酵鶏ふんとの組み合わせからなる、又は、乾燥鶏ふん及び／又は発酵鶏ふんからなる［１］〜［１４］のいずれかの土壌伝染性病害軽減材。
【００２４】
［１７］
特性の異なる３種類のBacillus属細菌は、Bacillus amyloliquefaciens（受託番号：NITE P‐02337）、Bacillus subtilis（受託番号：NITE P‐02338）、Bacillus subtilis（受託番号：NITE P‐02354）である［１］〜［１６］のいずれかの土壌伝染性病害軽減材。
【発明の効果】
【００２５】
この発明によれば新規な土壌伝染性病害軽減材を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明に使用されるBacillus属細菌についての16S-rＲＮＡ遺伝子による分子系統樹を示す図。
【図２】Bacillus amyloliquefaciens（APU-W01）、Bacillus subtilis(APU-O02) 、Bacillus subtilis(APU-T03)の黒根腐病原因菌Calonectria licicolaとの対峙培養を検討した結果を表す参考写真。
【図３】Bacillus amyloliquefaciens（APU-W01）菌株、Bacillus subtilis(APU-O02) 菌株のキチンに対する応答を検討した結果を表す参考写真。
【図４】Ｐｏｔ試験による黒根腐病に対する抑制菌液の影響を検討した結果を表す参考写真。
【図５】土壌伝染性病害軽減材施用の有無がダイズの黒根腐病感染に及ぼす影響を検討した結果を表す参考写真。
【図６】土壌伝染性病害軽減材施用によるダイズ地下部の黒根腐病感染の有無を検討した結果を表す図。
【図７】各生育期における土壌伝染性病害軽減材施用によるダイズの黒根腐病発病度を検討した結果を表す図。
【図８】土壌伝染性病害軽減材施用によるエダマメの黒根腐病発病度を検討した結果を表す図。
【図９】土壌伝染性病害軽減材施用の有無がダイズの乾物重の推移に及ぼす影響を検討した結果を表す図。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
従来からBacillus属細菌は植物生育促進、病害抑制、臭気低減などの特性を有する有用菌であることが知られていた。
【００２８】
本願の発明者等はこのBacillus属細菌の中から特性の異なる３種のBacillus属細菌を選抜し、植物に施用した場合の土壌伝染性病害への応答に関して検討を行った。
【００２９】
この検討により、特性の異なる３種類のBacillus属細菌を同時に使用することで土壌伝染性病害を軽減する効果が発揮されることを見出した。
【００３０】
また、この特性の異なる３種類のBacillus属細菌を担体資材に含ませて土壌伝染性病害軽減材とすることで土壌伝染性病害を軽減する効果を安定化することができ、土壌伝染性病害軽減材における菌数とその活性の安定化を図ることができることを見出した。
【００３１】
更に、前記特性の異なる３種類のBacillus属細菌を担体資材に含ませて成型して土壌伝染性病害軽減材とする、あるいは、あらかじめ成型されている担体資材に前記特性の異なる３種類のBacillus属細菌を含ませて土壌伝染性病害軽減材とすることで、土壌伝染性病害を軽減する効果を安定化することができ、土壌伝染性病害軽減材における菌数とその活性の安定化を図ることができることを見出した。
【００３２】
前記特性の異なる３種類のBacillus属細菌を含ませる担体資材としては、微小な孔径を有する多孔質の担体資材を使用することができる。特性の異なる３種類のBacillus属細菌を担持する上で微小な孔径を有する多孔質であることが望ましい。前記微小な孔径としてμm単位の孔径を有する多孔質の担体資材や、μm単位以上の孔径を有する多孔質の担体資材などを採用することができる。
【００３３】
前記において、土壌伝染性病害軽減材は、水分量５〜１０％に乾燥処理されているものにすることができる。他の菌の増殖を抑制し、土壌伝染性病害軽減材における菌数とその活性の安定化を図るという観点からこの水分量が望ましい。
【００３４】
前記担体資材は、乾燥鶏ふん、発酵鶏ふん、発酵牛ふん、発酵豚ぷん、ケイソウ土、ゼオライト、軽量気泡コンクリート、緑色擬灰岩のいずれか一種又は複数種の組み合わせからなるものにすることができる。
【００３５】
あるいは、発酵牛ふん、発酵豚ぷん、ケイソウ土、ゼオライト、軽量気泡コンクリート、緑色擬灰岩のいずれか一種又は複数種と、乾燥鶏ふん及び／又は発酵鶏ふんとの組み合わせから、又は、乾燥鶏ふん及び／又は発酵鶏ふんから前記担体資材を構成することもできる。
【００３６】
なお、担体資材として上述したように、微小な孔径を有する多孔質の担体資材、例えば、μm単位の孔径を有する多孔質の担体資材や、μm単位以上の孔径を有する多孔質の担体資材などを採用する場合には、このような微小な孔径を有する多孔質体であるケイソウ土、ゼオライト、軽量気泡コンクリート、緑色擬灰岩の中のいずれか一種または複数種を、担体資材を構成する材料の中の一つに含ませておくことができる。
【００３７】
また、後述するように、特性の異なる３種類のBacillus属細菌として乾燥鶏糞から分離したBacillus属細菌が使用される場合には、土壌伝染性病害軽減材における前記３種類のBacillus属細菌の増殖率、製造ストレス耐性の高さという観点から、乾燥鶏ふん及び／又は発酵鶏ふんから担体資材を構成する、あるいは、少なくとも乾燥鶏ふん及び／又は発酵鶏ふんが含まれている担体資材とすることができる。
【００３８】
前述した担体資材を用いて成型したものを成型されている担体資材（＝成型資材）として用いることができる。例えば、粒径２ｍｍ〜１０ｍｍの粒状に成型されている担体資材（＝成型資材）を用いることができる。
【００３９】
上述したように成型されている担体資材（＝成型資材）を用いる他に、前述した担体資材に特性の異なる３種類のBacillus属細菌を含ませ、これを成型して土壌伝染性病害軽減材とすることもできる。例えば、粒径２ｍｍ〜１０ｍｍの粒状に成型することができる。
【００４０】
この場合も、水分量５〜１０％に乾燥処理して土壌伝染性病害軽減材とすることができる。例えば、水分量５〜１０％に乾燥処理してから成型処理する、あるいは、成型処理した後に水分量５〜１０％に乾燥処理する。
【００４１】
前述した担体資材に特性の異なる３種類のBacillus属細菌を含ませることで、あるいは、前述した担体資材を成型してなる担体資材、すなわち、成型されている担体資材（＝成型資材）に特性の異なる３種類のBacillus属細菌を含ませることで、若しくは、前述した担体資材に特性の異なる３種類のBacillus属細菌を含ませ、それを成型することで、本発明の土壌伝染性病害軽減材とすることができる。
【００４２】
前記において、土壌伝染性病害軽減材における菌濃度は１．０×１０４cfu/g〜９．０×１０７cfu/gであることが望ましい。
【００４３】
上述したように、特性の異なる３種類のBacillus属細菌を担体資材に含ませることにより土壌伝染性病害を軽減する効果を安定化することができる。また、土壌伝染性病害軽減材における菌数とその活性の安定化を図ることができる。
【００４４】
担体資材に特性の異なる３種類のBacillus属細菌を含ませるにあたっては、例えば、特性の異なる３種類のBacillus属細菌をそれぞれ培養し、これを担体資材に含ませることができる。
【００４５】
例えば、特性の異なる３種類のBacillus属細菌をそれぞれ培養し、これら３種を混合した混合液とし、これを質量比２〜４０％の範囲で担体資材に添加し、その後、水分が５〜１０％になるまで乾燥処理して土壌伝染性病害軽減材とすることができる。
【００４６】
土壌伝染性病害軽減材はこれによる土壌伝染性病害軽減効果を発揮させる観点から、特性の異なる３種類のBacillus属細菌の菌濃度が１．０×１０４cfu/g〜９．０×１０７cfu/gであることが望ましい。
【００４７】
そこで、特性の異なる３種類のBacillus属細菌をそれぞれ培養し、これら３種を混合した混合液とし、これを質量比２〜４０％の範囲で担体資材に添加する際には、最終製品の土壌伝染性病害軽減材において特性の異なる３種類のBacillus属細菌の菌濃度が１．０×１０４cfu/g〜９．０×１０７cfu/gになるように調整しながら行う。
【００４８】
また、それぞれ培養した特性の異なる３種類のBacillus属細菌を混合して混合液にする際にも、最終製品の土壌伝染性病害軽減材において特性の異なる３種類のBacillus属細菌の菌濃度が１．０×１０４cfu/g〜９．０×１０７cfu/gになるように考慮しながら混合を行う。例えば、前記培養した特性の異なる３種類のBacillus属細菌を所定の質量比で混合することができる。所定の質量比での混合としては、例えば、前記培養した特性の異なる３種類のBacillus属細菌を均等の質量比で混合することができる。
【００４９】
土壌伝染性病害の一つとしてCalonectria ilicicolaによって引き起こされる土壌伝染性の立枯性病害であるダイズ黒根腐病が知られている。ダイズ黒根腐病は防除技術が確立されていないため深刻な問題になっている。
【００５０】
秋田県大館市に２７年間ダイズを連作していながら高収量を維持し、ダイズ黒根腐病などの病害がほとんど発生していない圃場が存在している。この圃場では特定の乾燥鶏糞が毎年施用されていた。
【００５１】
そこで、本願の発明者等は、この乾燥鶏糞中にダイズ黒根腐病を抑制する微生物が存在するのではないかと推察し、当該乾燥鶏糞からダイズ黒根腐病を抑制する微生物の分離を試み、その分離株の利用について検討することで、特性の異なる３種類のBacillus属細菌を同時に使用することにより土壌伝染性病害を軽減することができ、これを土壌伝染性病害軽減材として使用できるという本願発明を完成させたものである。
【００５２】
このようにして、本願の発明者等が分離、選抜した特性の異なる３種のBacillus属細菌は、Bacillus amyloliquefaciens１菌株、Bacillus subtilis２菌株である。いずれも、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託しており、次のような受託番号を受けている。Bacillus amyloliquefaciens（受託番号：NITE P‐02337）、Bacillus subtilis（受託番号：NITE P‐02338）、Bacillus subtilis（受託番号：NITE P‐02354）。
【００５３】
また、これらの３種のBacillus属細菌については、既に、関連する特許出願が行われている（特許出願番号： 特願２０１６−１９１５８１）。
【００５４】
（菌株の分類）
上記のようにBacillus属細菌の中から選抜した特性の異なる３種のBacillus属細菌の菌株について、それぞれ16S-rRNA遺伝子の塩基配列を解読して同定を行ったところ図１の結果を得た。
【００５５】
この16sRNA解析の結果、表１のように、土壌伝染性病害に対して効果を有する前記３種類の菌株（Bacillus amyloliquefaciens（受託番号：NITE P‐02337）、Bacillus subtilis（受託番号：NITE P‐02338）、Bacillus subtilis（受託番号：NITE P‐02354））が、それぞれ、Bacillus amyloliquefaciens（APU-W01、以下、本明細書、図面においてW-01と示す）、Bacillus subtilis （APU-O02、以下、本明細書、図面においてO-02と示す)、Bacillus subtilis (APU-T03、以下、本明細書、図面においてT-03 と示す)であることが示された。
【表１】
2019147757.tif 000002
【００５６】
（供試菌株および接種剤の調整）
供試菌株はW-01、O-02、T-03を使用した。菌液の調整はＬＢ培地を蒸留水に溶解後、オートクレーブ滅菌した液体培地にそれぞれの単一の菌株を接種し、スターラーで攪拌しながら、インキュベーターを用いて３５℃の条件で３日間培養することで行った。接種剤の調整は単一で培養した３種類の菌液を同一の重量比で混合し、調整した。
【００５７】
（培地pHの影響）
ＬＢ培地と寒天を蒸留水に溶解後、塩酸と水酸化ナトリウムでｐＨを５．０〜９．０に調整し、オートクレーブ滅菌した後、プレートを調製した。調製されたプレートに菌株をそれぞれ塗布し、３５℃、１２時間の培養を行った。培養後のコロニー数を計数し、増殖性（実測値／理論値）を評価した。増殖性については、コロニー形成がないものを−、＜０．５であるものを＋、０．５≦ｘ<１であるものを＋＋、１＝であるものを＋＋＋と示した。
【００５８】
評価結果（３種類の菌株の異なるｐＨにおける増殖性）は表２の通りであった。
【表２】
2019147757.tif 000003
【００５９】
（結果）
培地ｐＨの影響を評価した結果（表２）、３菌株ともｐＨごとの増殖性は異なることが示された。特にW-01はｐＨ７．０〜９．０とアルカリ側で増殖性が高く、T-03はｐＨ６．０と７．０と特定のｐＨで増殖性が高くなっていた。また、O-02はｐＨが６．０〜９．０と適性範囲が広い特徴を有していた。一方、いずれの菌もｐＨが６．０以下では増殖性が低い結果が示された。以上の結果から、ダイズの生育至適ｐＨである６．０〜６．５の範囲では増殖性が高いことが示唆され、３菌株の培地ｐＨへの応答は異なることが明らかになった。
【００６０】
（低温条件下の増殖性）
ＬＢ培地と寒天を蒸留水に溶解後（ｐＨ７．８）、オートクレーブ滅菌した後、プレートを調製した。調製されたプレートに菌株をそれぞれ塗布し、暗所、２５℃、１５℃、１０℃の条件で培養し、コロニーが検出される日数を評価した。低温条件での増殖性については、コロニー形成がないものを−、培養２日以内にコロニーを形成したものを＋＋＋、５日以内にコロニーを形成したものを＋＋、６日以内にコロニーを形成したものを＋と示した。
【００６１】
評価結果（３種類の菌株の低温時における増殖性）は表３の通りであった。
【表３】
2019147757.tif 000004
【００６２】
（結果）
低温条件による増殖性を検討した結果（表３）、いずれの株も１５℃の条件では６日以内の培養でコロニーが検出された。特に、O-02とT-03は５日以内で検出され、低温感受性が高い可能性が示された。また、２５℃の条件ではすべての菌株が２日以内に検出され、増殖性が高いことが示された。３種類の菌株を用いた土壌伝染性病害軽減材を低温時に土壌に鋤き込んだ場合でも、土壌中で３種類の菌株が増殖できる可能性が示された。
【００６３】
（対峙培養法）
それぞれの菌株をＰＤＡ培地上にダイズ黒根腐病菌と接種し、インキュベーターを用いて、２５℃の条件で５日間対峙培養し、分離したそれぞれの菌株のダイズ黒根腐病に対する増殖抑制効果を検討した。検討結果は図２の参考写真の通りであった。写真中のシャーレは左側に黒根腐病菌、右側に抑制菌あるいは非抑制菌を接種した。
【００６４】
（結果）
３菌株とダイズ黒根腐病菌を対峙培養した結果、いずれの株も黒根腐病菌に対して増殖抑制効果を有することが示された。その程度はO-02＞W-01＞T-03であると推定された。以上の結果から、３菌株は黒根腐病菌に対して増殖抑制効果が有し、その程度に強弱があることから異なる機構で黒根腐病菌の増殖を抑制している可能性が示された。
【００６５】
（機構の解明：キチンへの応答）
ＬＢ培地と寒天を蒸留水に溶解後（ｐＨ７．８）、オートクレーブ滅菌した後、プレートを調製した。調製されたプレートにキチン粉末を添加し、菌株をそれぞれ塗布した。それぞれの菌株が培地に添加したキチンを分解するかを観察することによって、キチナーゼ活性を推定した。接種した菌株が白色のキチンを透明化する程度を評価した。検討結果は図３の参考写真の通りであった。
【００６６】
（結果）
菌株のキチナーゼ活性を推定した結果（図３）、いずれの菌株も培地中のキチンを分解することが示された。特にW-01株の活性が著しく高く、O-02には活性は有するがゆるやかに活性が維持される可能性（Date not shown）が示された。以上の結果から、いずれの菌株もキチナーゼ活性を有することが黒根腐病菌の増殖を抑制する要因の一つである可能性が示された。
【００６７】
（Ｐｏｔ試験）
供試植物はダイズ(Glycine max（L.）Merr )、品種はリュウホウを用いた。土壌は青森県の砂質壌土を用い、黒根腐病菌を１０の８乗の濃度で添加し、感染区を設定した。
【００６８】
調製された培地に３種類の菌を混合した抑制菌液の接種の有無で処理区を設け（接種濃度：１０の８条 cfu／ml）、７０％エタノールと次亜塩素酸で表面殺菌した種子を播種した。播種後、植物培養機の中で、適宜蒸留水を添加し、明期／暗期：２８℃／１８℃（１６ｈ／８ｈ）の条件で培養した。培養後、観察により、黒根腐病の影響を評価した。検討結果は図４の参考写真の通りであった。
【００６９】
（結果）
Ｐｏｔ試験において、３菌株の接種が黒根腐病に及ぼす影響を評価した結果（図４）、３菌株を混合した抑制菌を添加した区ではダイズの発芽、初期生育に影響しないことが示された。抑制菌液を添加しない区では黒根腐病菌の感染濃度が高い条件であるが、発芽、初期生育に著しく影響することが示された。
【００７０】
（資材化に関する検討）
担体資材として、発酵鶏ふんおよび軽量気泡コンクリート（ＡＬＣ）、鶏ふん炭化物の検討を行った。３種類のBacillus amyloliquefaciens（APU-W01）、Bacillus subtilis(APU-O02)、Bacillus subtilis(APU-T03) 培養後、発酵鶏ふん単独、発酵鶏ふんおよびＡＬＣ、発酵鶏ふんおよび鶏ふん炭化物を混合物に重量比で40％添加し、成型後、約60℃の条件で10時間の加熱処理を行った（７kg／バッチ）。
【００７１】
得られた成型資材の菌数を計数し、担体資材の組み合わせによる影響を評価したところ表４（担体資材の組み合わせに関する検討１）、表５（担体資材の組み合わせに関する検討２）の通りであった。
【表４】
2019147757.tif 000005
【表５】
2019147757.tif 000006
【００７２】
（結果）
検討の結果（表４、表５）、資材の組み合わせの影響はほとんど認められなかったが、発酵鶏ふん単独で成型するよりも、他の資材を組み合わせことにより菌数が増加する傾向が認められた。この結果は得られた成型資材の物性評価の値から(date not shown)、ALCや緑色擬灰岩を添加することにより、菌液の分散性が良化したためと考えられる。
【００７３】
（長期保管の検討）
３種類のBacillus amyloliquefaciens（APU-W01）、Bacillus subtilis(APU-O02)、Bacillus subtilis(APU-T03) を培養後、発酵鶏ふん単独に重量比で４０％添加し、成型・加熱処理を行った。得られた成型資材を恒温培養機で培養し、６０日目の菌数を評価したところ表６（長期保管試験の検討結果）の通りであった。
【表６】
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【００７４】
（結果）
検討の結果（表６）、６０日間の培養試験で菌数は約３５％の減少が認められたが、軽減効果を示す１０の4乗を上回っており、品質に与える影響は認めらないことが明らかになった。
【００７５】
（大規模製造機による製造ストレスの検討）
３種類のBacillus amyloliquefaciens（APU-W01）、Bacillus subtilis(APU-O02)、Bacillus subtilis(APU-T03) を培養後、発酵鶏ふん単独に質量比で２−１０％添加し、大規模製造機器によって成型後、熱風温度約100℃の条件で30分間の加熱処理を行った（800ｋｇ／バッチ）。得られた成型資材の菌数を評価し、大規模製造機による製造ストレスの影響を評価したところ表７（大規模製造機による製造ストレスの影響）の通りであった。
【表７】
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【００７６】
（結果）
検討の結果（表７）、熱や圧力等、非常に大きなストレスがかかる造粒機、加熱処理は菌液の添加量（質量比の１０％程度）を考慮すると初期菌数は１０倍程度低下するが、いずれの処理区も１０の４乗以上の菌数を維持することができることが示された。
【００７７】
以上の結果から、乾燥鶏ふん、発酵鶏ふんの担体とする菌株のストレス耐性は著しく高いと考えられる。
【実施例１】
【００７８】
植物が栽培される圃場に土壌伝染性病害軽減材を施用し、効果を確認した。
【００７９】
供試植物はダイズ(Glycine max（L.）Merr )、品種はリュウホウを用いた。供試圃場は青森県の水田転換畑で、本年がダイズ２作目の圃場で行った。土壌タイプは砂質壌土で、土壌化学性（供試圃場の化学性）は表８に示した通りであった。
【表８】
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【００８０】
処理区については慣行区として化成肥料を施用(N-P２O５-K２O(%):14-18-14)、担体区として発酵鶏ふんを２００ｋｇ施用、資材区として土壌伝染性病害軽減材を２００ｋｇ施用した。
【００８１】
抑制菌３菌株（W-01、O-02、T-03)をそれぞれＬＢ液体培地で大量培養した後、混合した。得られた混合液を発酵鶏ふんの質量比の４０％を添加し、成型したものを土壌伝染性病害軽減材として用いた。微生物成型資材は粒状形状、大きさ２−４mmサイズに成型した。抑制菌３菌株の菌濃度は１０の5乗〜6乗cfu/gであった。以下、この実施例では成型した土壌伝染性病害軽減材であるので「微生物成型資材」と表す。
【００８２】
耕種概要は４月２５日に担体区に発酵鶏ふん、資材区に微生物成型資材、６月６日に慣行区に化成肥料を施用した。
【００８３】
播種は６月７日に畝間７２ｃｍ、株間１４ｃｍ、２粒播きで行った。
【００８４】
調査項目としてはダイズ地下部の土壌伝染性病害の病徴調査およびダイズ黒根腐病菌の感染率、生育および収量を調査した。
【００８５】
土壌伝染性の病徴調査については三葉期(７月８日)、開花期(７月２９日)、最大繁茂期（以下最繁期とする）(９月２日)に採取した植物体の地下部の土壌伝染性病害(ダイズ黒根腐病、ダイズ茎疫病等)の病徴調査を行い、発病度を算出した。
【００８６】
感染率についてはダイズ根からＤＮＡを抽出し、糸状菌のβ-tubulin遺伝子をターゲットしたダイズ黒根腐病菌に特異的なプライマーでＰＣＲを行った。その後、アガロースゲル電気泳動でバンドの有無を確認することでダイズ黒根腐病菌の感染を評価した。
【００８７】
生育および収量については三葉期、開花期、最繁期に植物体を採取し、乾物重を測定した。
【００８８】
１０月１４日にダイズの坪刈りを行い、収量及び収量構成要素を調査した。
【００８９】
（結果）
ダイズ地下部の土壌伝染性病害の発病度を評価した結果、三葉期から最繁期まで資材区が他の２試験区よりも発病度が低く推移し、病害による被害が抑制していることが示された(図５、図７)。
【００９０】
ダイズ黒根腐病菌の感染について検討した結果、資材区では三葉期においてダイズ黒根腐病菌に感染が認められないことが示され(図６)、開花期、最繁期においてもその感染が他の２試験区と比較して感染率が低いことが示された(表９「異なる生育期におけるダイズ黒根腐病菌の感染率」)。
【表９】
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【００９１】
以上のことから、微生物成型資材（土壌伝染性病害軽減材）がダイズ黒根腐病の軽減効果を有することが明らかになった。また、三葉期ではどの試験区においてもダイズ黒根腐病菌の感染は認められなかったが、資材区では慣行区、担体区と比べて顕著に病害の抑制が見られた（図７）。したがって、微生物成型資材はダイズ黒根腐病以外の土壌伝染性病害に対しても抑制効果を有することが推定された。
【００９２】
参考データとして、エダマメの試験結果を示す。晩酌茶豆とあきたさやかに微生物成型資材を施用した（２００ｋｇ／１０ａ）結果、資材を施用しない慣行区と比較して発病度が低い結果が示された(図８)。
【００９３】
生育を調査した結果、乾物重は開花期まで試験区間の差は認められなかったが、最繁期になると資材区で慣行区よりも有意に増加していることが示唆された(図９)。収量を調査した結果、微生物成型資材区は慣行区と比較して、百粒重が増加し、収量が増加することが示された（表１０「土壌伝染性病害軽減材施用の有無がダイズの収量に及ぼす影響を検討した結果」）。
【表１０】
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【００９４】
以上の結果から、微生物成型資材（土壌伝染性病害軽減材）はダイズ黒根腐病菌に対する抑制効果を有し、病気の発病を軽減することで、ダイズの生育や収量を増加ないし安定化することができることが示された。また、他の土壌伝染性の病害に対しても軽減効果を有することが推定された。
【００９５】
以上、本発明の実施形態、実施例を説明したが本発明はこれらに限られることなく特許請求の範囲の記載から把握される技術的範囲において種々に変更可能である。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
この発明によれば、土壌伝染性病害の軽減効果を有する微生物の成型資材化についての新しい提案を行うことができる。特に、土壌伝染性病害の軽減効果を有する微生物の成型資材化について、その効果を安定化させる技術を提案することができる。
【００９７】
特性の異なる３種類のBacillus属細菌を培養した後、所定の質量比、例えば、均等の質量比で混合し、担体資材（例えば、乾燥鶏ふんおよび発酵鶏ふんを主体とする担体資材）に質量比２〜４０％の割合で封入後、水分が５〜１０％になるまで乾燥処理して土壌伝染性病害軽減材にすることができる。
【００９８】
本発明が提案する土壌伝染性病害軽減材は、２５℃以上の保管条件であっても、菌数やその活性を６ヶ月以上維持することが可能であり、実際の農業現場での使用では土壌伝染性の病害軽減効果を安定化させる技術を提供することができる。例えば、ダイズの黒根腐病に対して、その病害を軽減する効果を安定化させることができる。
【００９９】
ダイズ黒根腐病の原因菌は土壌伝染性であり、その残存性が高いことが報告されている。その対策は行われているが、常に化学農薬を処理することができない又は処理しても効果が少ない状況にある。そこで、本発明のように継続的に使用する菌株の効果を安定化させることは重要であり、この技術を提供できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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