(57)【要約】【課題】尿中プロスタグランジンＥ主要代謝物（ＰＧＥ−ＭＵＭ）を、イムノクロマト法を用いて、迅速、簡便に測定する方法、及びＰＧＥ−ＭＵＭをイムノクロマト法を用いて迅速、簡便に測定可能なキットを提供すること。【解決手段】尿中プロスタグランジンＥ主要代謝物（ＰＧＥ−ＭＵＭ）をイムノクロマト法により測定する方法は、ａ）尿検体をアルカリ水溶液と混和する工程と、ｂ）ａ）の混和液を中和液と混和する工程と、ｃ）ｂ）の混和液をイムノクロマト用ストリップに供して展開させる工程と、を具える。中和液は、酸性化剤と、塩基性領域で緩衝能を発揮するｐＨ緩衝剤と、陽イオン性界面活性剤とを含む。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿中プロスタグランジンＥ主要代謝物（ＰＧＥ−ＭＵＭ）をイムノクロマト法により測定する方法であって、
ａ）尿検体をアルカリ水溶液と混和する工程と、
ｂ）ａ）の混和液を中和液と混和する工程と、
ｃ）ｂ）の混和液をイムノクロマト用ストリップに滴下し展開させる工程と、を具え、
前記中和液は、酸性化剤と、塩基性領域で緩衝能を発揮するｐＨ緩衝剤と、陽イオン性界面活性剤とを含む、
方法。
【請求項２】
前記ｐＨ緩衝剤のｐＫａが６．０〜１０．０である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記陽イオン性界面活性剤が、ハロゲン化アルキルトリメチルアンモニウムである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ハロゲン化アルキルトリメチルアンモニウム中のアルキル基の炭素数が１２〜２０である請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記中和液が両性界面活性剤をさらに含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記両性界面活性剤のモル濃度が、前記陽イオン界面活性剤のモル濃度を１００として１０〜９０である請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記イムノクロマト用ストリップは、ビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭが固定化された抗原固定部を１つ以上具え、
前記ｃ）工程の前または直後に、前記ｂ）の混和液と標識抗ビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭ抗体とを反応させる工程を具える、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記イムノクロマト用ストリップは、前記抗原固定部を２つ以上具え、２つ以上の抗原固定部に固定化されるビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭ濃度はそれぞれ異なる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ｂ）工程後に希釈操作を含まない請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭを固定化した抗原固定部を１つ以上具えるイムノクロマト用ストリップと、
酸性化剤と、塩基性領域で緩衝能を発揮するｐＨ緩衝剤と、陽イオン性界面活性剤とを含む中和液とを含む、ＰＧＥ−ＭＵＭをイムノクロマト法で測定するためのキット。
【請求項１１】
前記中和液が両性界面活性剤をさらに含む請求項１０記載のキット。
【請求項１２】
前記イムノクロマト用ストリップが、ビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭ濃度の異なる２つ以上の抗原固定部を具える、請求項１０または１１に記載のキット。
【請求項１３】
ＰＧＥ−ＭＵＭをイムノクロマト法により測定する方法であって、
ａ）尿検体をアルカリ水溶液と混和する工程と、
ｂ）ａ）の混和液をイムノクロマト用ストリップに滴下し展開させる工程と、を具え
前記イムノクロマト用ストリップは、酸性化剤と、塩基性領域で緩衝能を発揮するｐＨ緩衝剤と、陽イオン性界面活性剤とを含む中和剤を含む、
方法。
【請求項１４】
中和剤を含み、ビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭを固定化した抗原固定部を１つ以上具えるイムノクロマト用ストリップを含み、
前記中和剤は、酸性化剤と、塩基性領域で緩衝能を発揮するｐＨ緩衝剤と、陽イオン性界面活性剤とを含む、ＰＧＥ−ＭＵＭをイムノクロマト法で測定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿中プロスタグランジンＥ主要代謝物を測定する方法、及び尿中プロスタグランジンＥ主要代謝物を測定するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
プロスタグランジン類（以下ＰＧｓという）やその誘導体は、生体内でさまざまな炎症を伴う病態との関連性が報告され、簡便な操作で微量のＰＧｓを定量する方法が知られている。この測定方法としては、ガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）などである。プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ）は、生体内の炎症反応に関与する重要なケミカルメディエーターとして知られ、その尿中の主要代謝物（ＰＧＥ Ｍａｉｎ Ｕｒｉｎａｒｙ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ、以下「ＰＧＥ−ＭＵＭ」という。）を競合法によって酵素免疫法で測定する方法が報告されている（特許文献２）。
【０００３】
このＰＧＥ−ＭＵＭについて、潰瘍性大腸炎患者から得た尿検体のＰＧＥ−ＭＵＭ測定値と同患者の複数の臨床症状（臨床疾患活性）を数値化したスコアの合計スコア（改訂タルスタッドスコア）とを関係づけようとする試みがなされた（非特許文献１）。潰瘍性大腸炎患者の尿中のＰＧＥ−ＭＵＭを測定することにより、潰瘍性大腸炎の寛解直前期と寛解期との病期判定が可能となることが見いだされ、投薬治療の中止時期のより適切な判断が可能になった（特許文献３）。また、間質性肺炎について、間質性肺炎患者の尿中に含まれるＰＧＥ−ＭＵＭを測定することにより、間質性肺炎の活動期と非活動期との病期判定が可能となることが見いだされた（特許文献３）。
【０００４】
さらに、低出生体重児に多く発症する壊死性腸炎における炎症マーカーとして、ＰＧＥ−ＭＵＭの測定が有用であることが見いだされた（非特許文献２）。低出生体重児は、腹部所見や血液検査データ・画像検査所見の変化に乏しいことが多く、必ずしも臨床像を反映しないため、病勢を正確に把握することが困難であったが、ＰＧＥ−ＭＵＭの測定により、壊死性腸炎の早期診断、早期治療の可能性がより高くなった。
【０００５】
上記した通り、ＰＧＥ−ＭＵＭの測定方法には、質量分析法、免疫測定法が挙げられるが、操作の簡便性や再現性から、特に免疫測定法がより適しているといえる。ＰＧＥ−ＭＵＭは、主にｔｅｔｒａｎｏｒＰＧＥ−Ｍ（下記式（Ｉ））とｔｅｔｒａｎｏｒＰＧＡ−Ｍ（下記式（ＩＩ））で構成されるが、いずれも、水溶液中で不安定な物質である。特許文献１、３に示されるように、通常、ＰＧＥ−ＭＵＭを免疫測定法で測定する際には、尿検体をアルカリ処理して、ＰＧＥ−ＭＵＭを安定的な構造を有するビシクロ体に変換した後に行われる。下記式に示す通り、ｔｅｔｒａｎｏｒＰＧＥ−Ｍ及びｔｅｔｒａｎｏｒＰＧＡ−Ｍは、アルカリ処理を行うことにより、安定的な構造を有するビシクロ体（下記式（ＩＩＩ））に変換することができ、結果的にｔｅｔｒａｎｏｒＰＧＥ−Ｍ及びｔｅｔｒａｎｏｒＰＧＡ−Ｍを合わせたＰＧＥ−ＭＵＭ濃度を測定することが可能である。
【０００６】
【化１】
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【０００７】
特許文献１等の従来の方法によると、尿を強アルカリ水溶液（例えば１Ｎ水酸化ナトリウム）と混和処理するため、混和液を酸（例えば１Ｎ塩酸）で中和し、後の抗原抗体反応に適したｐＨとする必要がある。さらに、中和により生じる塩（例えば塩化ナトリウム）の濃度上昇により、後の抗原抗体反応が阻害されるおそれがあることから、さらに緩衝液等で例えば１０〜２０倍に希釈する必要がある。これらの方法は、検体測定前に中和に加えて希釈を必要とするために操作が煩雑であり、また、希釈により測定感度が低下し得る、という課題が残されていた。
【０００８】
さらに、壊死性腸炎のように、早期の診断、治療を要する疾患においては、従来法のように特殊な装置を用いて数時間かかる検査では、その有用性は必ずしも高くない。特に壊死性腸炎は、検査対象の患者が低出生体重児であることから、得られる検体量は少ないため、少量の検体でも測定可能な感度が求められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００５−０３０８５２号公報
【特許文献２】特開昭６１−１１６６４号公報
【特許文献３】特許第４９１４３４７号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ２０００；  ６１：  ２０１−２０６
【非特許文献２】日本小児外科学会誌  第５１巻３号  ２０１５年３月  ４４８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、尿中プロスタグランジンＥ主要代謝物（ＰＧＥ−ＭＵＭ）を、イムノクロマト法を用いて、迅速、簡便に測定する方法、及びＰＧＥ−ＭＵＭをイムノクロマト法を用いて迅速、簡便に測定可能なキットを提供することにある。特に、尿検体のアルカリ処理後の混和液について、中和後の希釈を行うことなく、直接イムノクロマト用ストリップに滴下することができ、かつ尿夾雑物等の影響を受けにくいＰＧＥ−ＭＵＭのイムノアッセイ法による測定方法及びキットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは鋭意研究した結果、尿検体のアルカリ処理後の混和液について、イムノアッセイ用ストリップに滴下する前に、酸性化剤と、塩基性領域で緩衝能を発揮するｐＨ緩衝剤とを含む中和液で中和することにより、希釈工程なしでＰＧＥ−ＭＵＭを測定可能であることを見出した。また、希釈工程を省略することで生じ得る尿夾雑物等の影響についても、さらに陽イオン性界面活性剤を測定系に加えることにより、これを回避してＰＧＥ−ＭＵＭをイムノアッセイ法で測定することが可能となることを見出した。
【００１３】
本発明は、尿中プロスタグランジンＥ主要代謝物（ＰＧＥ−ＭＵＭ）をイムノクロマト法により測定する方法であって、
ａ）尿検体をアルカリ水溶液と混和する工程と、
ｂ）ａ）の混和液を中和液と混和する工程と、
ｃ）ｂ）の混和液をイムノクロマト用ストリップに供して展開させる工程と、を具え、
前記中和液は、酸性化剤と、塩基性領域で緩衝能を発揮するｐＨ緩衝剤と、陽イオン性界面活性剤とを含む、ことを特徴とする方法、を提供する。
【００１４】
また、本発明は、ビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭを固定化した抗原固定部を１つ以上具えるイムノクロマト用ストリップと、酸性化剤と、塩基性領域で緩衝能を発揮するｐＨ緩衝剤と、陽イオン性界面活性剤とを含む中和液とを含む、ことを特徴とするＰＧＥ−ＭＵＭをイムノクロマト法で測定するためのキットを提供する。
【００１５】
さらに本発明は、ＰＧＥ−ＭＵＭをイムノクロマト法により測定する方法であって、
ａ）尿検体をアルカリ水溶液と混和する工程と、
ｂ）ａ）の混和液をイムノクロマト用ストリップに滴下し展開させる工程と、を具え
前記イムノクロマト用ストリップは、酸性化剤と、塩基性領域で緩衝能を発揮するｐＨ緩衝剤と、陽イオン性界面活性剤とを含む中和剤を含む、
方法を提供する。
【００１６】
さらに本発明は、中和剤を含み、ビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭを固定化した抗原固定部を１つ以上具えるイムノクロマト用ストリップを含み、
前記中和剤は、酸性化剤と、塩基性領域で緩衝能を発揮するｐＨ緩衝剤と、陽イオン性界面活性剤とを含む、ＰＧＥ−ＭＵＭをイムノクロマト法で測定するためのキットを提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の方法及びキットは、ＰＧＥ−ＭＵＭのイムノクロマト法による免疫測定において、尿検体のアルカリ処理後の混和液について、中和後の希釈を行うことなく、直接抗原抗体反応系に供することを可能とする。イムノクロマト法を用いることにより、特殊な装置等を用いることなく、少量の検体で迅速、簡便にＰＧＥ−ＭＵＭを測定することが可能である。また、中和後の希釈工程が省略可能となることにより、イムノクロマト法の簡便性を維持することができ、かつ、分注回数が多いことによる精度低下を低減することが可能となる。さらに、希釈工程を含まないため、ＰＧＥ−ＭＵＭの高感度での検査を可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明に係るイムノクロマト用ストリップ検査器の一例の内部主要部の断面図である。
【図２】本発明に係るイムノクロマト用ストリップ検査器の一例の外部上面図である。
【図３】図２のＡ−Ａ’切断部端面図である。
【図４】本発明の一例の原理を示す概略図である。
【図５】本発明の別の例に係るイムノクロマト用ストリップ検査器の内部主要部の断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜第１の実施形態＞
本発明の第１の実施形態のＰＧＥ−ＭＵＭの測定方法は、イムノクロマト法によりＰＧＥ−ＭＵＭを測定する方法であって、
ａ）尿検体をアルカリ水溶液と混和する工程と、
ｂ）ａ）の混和液を中和液と混和する工程と、
ｃ）ｂ）の混和液をイムノクロマト用ストリップに滴下し展開させる工程と、を具え、
前記中和液は、酸性化剤と、塩基性領域で緩衝能を発揮するｐＨ緩衝剤と、陽イオン性界面活性剤とを含む、ことを特徴とする。
【００２０】
上記アルカリ処理工程ａ）自体は特許文献１に記載されているように公知である。アルカリ処理は、尿検体とアルカリ水溶液を混和することによって行う。ここで使用するアルカリ水溶液としては、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液、水酸化カルシウム、または水酸化バリウムを用いることができるが、強アルカリの水溶液であれば、これらに限定されるものではない。アルカリ水溶液の規定度は、０．０５〜５規定（Ｎ）、好ましくは０．１〜４Ｎ、より好ましくは０．２〜２Ｎとすることができる。アルカリ処理時の尿検体と強アルカリ水溶液の混和比率は、１：０．１〜１：１０、好ましくは１：０．５〜１：５、より好ましくは１：１〜１：４とすることができる。
【００２１】
アルカリ処理は、強アルカリ水溶液と尿検体を混和し、５〜４０℃、好ましくは２５〜４０℃で３〜６０分間、好ましくは５〜１０分間静置することによって行うことができる。アルカリ処理温度を１５〜３０℃の室温で行うと、恒温槽等の装置を要しないため操作が簡便となるが、この場合、静置時間を２０〜３０分間以上とすることが好ましい。
【００２２】
続くｂ）工程では、ａ）の混和液を、中和液と混和する。中和液は、酸性化剤、塩基性領域で緩衝能を発揮するｐＨ緩衝剤、及び陽イオン性界面活性剤が少なくとも含まれる。酸性化剤としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、クエン酸、マレイン酸、リンゴ酸、コハク酸等を使用でき、特に低濃度で高い規定度を呈するリン酸、クエン酸を好適に使用できる。中和液中の酸性化剤の規定度は、ａ）の混和液を中和可能な濃度であればよく、０．０５〜５Ｎ、好ましくは０．１〜４Ｎ、より好ましくは０．２〜２Ｎとすることができる。
【００２３】
前記ｐＨ緩衝剤としては、ｐＫａ（解離定数）が６．０〜１０．０、好ましくは６．５〜９．５、より好ましくは８．０〜９．０のものを使用できる。具体的には、トリシン、ビシン、トリス、イミダゾール、トリエチルアミン、グリシルグリシン等が挙げられる。ｐＫａが上記範囲内の緩衝剤を使用することで、強アルカリ水溶液と混和した尿検体を、後の抗原抗体反応を阻害しないｐＨ範囲内に維持することができる。第２の緩衝剤の濃度は、特に限定されず、緩衝剤の種類に応じて適宜設定されるが、ｂ）工程の混和液の終濃度として、１０〜４００ｍＭ程度、特に５０〜２００ｍＭとすることが好ましい。
【００２４】
中和液の溶媒は、ベース緩衝液で構成されてもよい。ベース緩衝液としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液、コハク酸緩衝液等、ｐＨ４．０〜７．５周辺で緩衝能を有するものを好適に使用できる。
【００２５】
陽イオン性界面活性剤としては、ハロゲン化アルキルトリメチルアンモニウム（塩化アルキルトリメチルアンモニウム、臭化アルキルトリメチルアンモニウム）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化アルキルピリジニウム等が挙げられるが、臭化アルキルトリメチルアンモニウムまたは塩化アルキルトリメチルアンモニウム、特に臭化アルキルトリメチルアンモニウムを好適に使用できる。また、ハロゲン化アルキルトリメチルアンモニウムの「アルキル」は、炭素数１２〜２０、特に炭素数１４〜１８の直鎖とすることが好ましい。
【００２６】
陽イオン界面活性剤の濃度は、０．５〜１０ｍＭ、特に２〜６ｍＭとすると、水に十分に溶解し、かつ、尿夾雑物による測定値のバックグラウンドの上昇抑制という効果を十分に得ることができる。
【００２７】
前記中和液は、さらに両性界面活性剤を含むことが好ましい。陽イオン性界面活性剤のうち、特に炭素数の大きな物質は、クラフトポイントが高く、限界ミセル濃度も高いため、クラフトポイントより低温での保管により析出する。このことにより、保存安定性及び効果に影響を与えることが危惧されるが、両性界面活性剤を中和液に添加し、陽イオン性界面活性剤と両性界面活性剤との混合ミセルを形成することにより、陽イオン性界面活性剤の析出を抑制することができる。両性界面活性剤としては、ＣＨＡＰＳ（3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルフォネート）、ＣＨＡＰＳＯ（3-[(3-コラミドプロピル) ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシプロパンスルフォネート）、Ｎアルキルスルフォベタイン、アルキルアミノスルフォベタイン等が挙げられる。両性界面活性剤は、偽高値の要因となり得るアニオン基を有し、また、過剰に加えると陽イオン性界面活性剤の効果を相殺するため、陽イオン性界面活性剤の等モル量未満の濃度を有することが好ましい。両性界面活性剤のモル濃度は、陽イオン性界面活性剤のモル濃度を１００として、１０〜９０、特に２０〜８０、さらに２５〜５０とすることが好ましい。
【００２８】
工程ｃ）では、工程ｂ）で生じた混和液をイムノクロマト用ストリップに滴下し、展開させる。本発明において、イムノクロマトとは、イムノクロマトグラフィーとも称される周知の免疫測定を指す。
【００２９】
図１は、本発明に係るイムノクロマト用ストリップ検査器の一具体例の内部主要部の断面図、図２は、その外部上面図、図３は、図２のＡ−Ａ’切断部端面図である。イムノクロマト用ストリップ検査器１は、ニトロセルロース膜のような多孔性素材からなる通常は帯状のマトリクス２の表面の一部に、抗体又は抗原が固定化された検出ゾーン６（図１〜３中では６ａ、６ｂと複数存在するが、単数であってもよい）が設けられた構成を有する。マトリクス２の検出ゾーン６よりも展開方向下流には、後述のコントロール物質と反応し得る物質（例えば、抗体若しくは抗原、またはビオチン若しくはアビジン）を固定化した展開確認ゾーン１０が設けられる。検出ゾーン６及び展開確認ゾーン１０の形状は、通常は、マトリクス２の長軸方向に垂直なライン状であるが、ドット状等、他の形状であってもよい。マトリクス２上の、検出ゾーン６よりも展開方向上流に離間した部位に、試料を含む被験液９を滴下するための滴下ゾーン８が設けられる。滴下ゾーン８上または滴下ゾーン８下流近傍には、ビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭに特異的に反応し得る酵素標識抗体を点着乾燥させた多孔性素材からなる、標識試薬パッド４を設けてもよい。標識試薬パッド４を設けない場合は、被験液９を滴下する前に被験液９と標識試薬と混和する工程を要する。展開確認ゾーン１０を設ける場合、標識試薬パッドまたは標識試薬には、展開確認用のコントロール物質を添加してもよい。コントロール物質としては、例えば、標識した抗原若しくは抗体（いずれもビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭ又はこれに対する抗体とは異なる）、または標識したアビジン若しくはビオチンを用いることができる。あるいは、余剰の酵素標識抗体をコントロール物質と兼ねて使用してもよい。
【００３０】
マトリクス２の長軸方向一端には、展開液パッド３が、他端には吸収パッド５が設けられる。滴下ゾーン８よりも検出ゾーン６側に近い端部（下流端）に吸収パッド５を設け、反対側端部（上流端）に展開液パッド３を設ける。展開液パッド３及び吸収パッド５は、いずれもセルロース濾紙等の吸水性の高い素材が使用される。展開液パッド３には、酵素基質を固定化した基質ゾーン７が、マトリクス２の長軸方向に垂直なライン状に設けられてもよい。前記イムノクロマト用ストリップ検査器１は、前記マトリクス２、前記展開液パッド３、前記標識試薬パッド４及び前記吸収パッド５が、図２、３に示すようなプラスチックケース内に固定されて構成されていてもよい。図２、３の例では、プラスチックケースには、展開液槽１１、押し込み部１２及び突起部１３が設けられている。
【００３１】
図１〜３に示すイムノクロマト用ストリップ検査器１において、試料測定は下記の通り行われる。まず、被験液９が滴下部８に滴下される。その際、試料にビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭが存在すれば、標識試薬パッド４中に含まれる酵素標識抗体がビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭと複合体を形成する。次いで、プラスチックケース上の押し込み１２が下方に押し込まれて変形する。押し込み部１２の変形に連動して突起部１３が展開液パッド３を下方の展開液槽１１に挿入させることで、展開液が毛細管現象により展開液パッド３を通ってマトリクス２に展開される。展開液が展開液パッド３から吸収パッド５の方向に展開する過程で、標識試薬パッド４中の前記複合体、未反応の酵素標識抗体、及び前記コントロール物質が、検出ゾーン６及び展開確認ゾーン１０を通り、次いで、基質ゾーン７中の基質が展開され、検出ゾーン６及び展開確認ゾーン１０を通る。
【００３２】
本発明に係る方法の一例の原理概略を図４に示す。本発明の方法では、検出ゾーンにビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭを固定化させ（抗原固定部）、競合イムノクロマト法とすることが好ましい。測定対象物質であるビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭは、タンパク質等と比較して低分子であり、２つの特異的抗体を１分子に反応させるサンドイッチイムノアッセイには適さないことから、１つの特異的抗体を１分子に反応させる競合イムノアッセイ等とすることが望ましいためである。ビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭは、そのまま固定化してもよいが、マウスＩｇＧ（ＫＬＧ）、ＢＳＡ、カゼイン等の安定化剤とともに結合させてもよい。図示例では、ビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭ結合ＫＬＧ４１が２つの検出ゾーン６ａ、６ｂにそれぞれ濃度を変えて固相化されている。
【００３３】
図４の例では、競合イムノクロマト法を用いているため、被験液９中にビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭ４２が存在すれば、標識抗体パッド４中に含まれる酵素標識抗ビシクロＰＧＥ−ＭＵＭ抗体４３の一部又は全部は、これと複合体を形成し、検出ゾーン６上の固定化されたビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭ結合ＫＬＧ４１とは反応しないこととなる。被験液９中のビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭ量が多いほど、検出ゾーン６ａ、６ｂの発色は抑えられることとなる。
【００３４】
図４の例では、標識抗体パッド４中に含まれる酵素標識抗体は、酵素標識抗ビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭ抗体４３であるが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び抗原結合性断片のいずれで構成されていてもよい。好ましくは、特異性、製造安定性の観点から、モノクローナル抗体又は抗原結合性断片が使用される。標識酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ等、通常使用されるものをいずれも使用できる。図４の例においては、酵素標識抗体として、アルカリホスファターゼ標識マウス抗ビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭ抗体が使用されている。なお、図４の例では酵素標識抗体を用いているが、金属コロイド、親和性物質（例、ストレプトアビジン、ビオチン）、蛍光物質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）、発光又は吸光物質（例、ルシフェリン、エクオリン、アクリジニウム）、放射性物質（例、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ）等、通常使用される標識をいずれも用いることができる。
【００３５】
検出ゾーンに固定化させるビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭ量を一定量とすることで、検出ゾーンの発色度を目視、イメージアナライザ等で判定し、これに基づいて被験液中のＰＧＥ−ＭＵＭ量を算出する、半定量法とすることができる。さらに、図４に示す例のように、検出ゾーンを複数設け（６ａ、６ｂ）、それぞれの検出ゾーンに固定化させるビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭ量を異なる濃度とし、例えば、高濃度のビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭ結合ＫＬＧ４１を固定化した検出ゾーン６ａを高濃度判定用、より低濃度を固定化した検出ゾーン６ｂを中濃度判定用等とすれば、各検出ゾーンの発色度を比較することにより、目視のみでもより確実な半定量検査を行うことが可能となる。ＰＧＥ−ＭＵＭ濃度は、壊死性腸炎等の特定の疾患で顕著な高値を示すが、他の炎症性疾患でも健常人と比して高い値となることが知られている。そのため、本発明では、他の炎症性疾患と特定の疾患とを判別するため、ＰＧＥ−ＭＵＭの高濃度領域での半定量検査が可能であることが好ましい。
【００３６】
展開確認ゾーン１０に固定化させる物質としては、標識試薬パッド４中に含まれる展開確認用の標識化したコントロール物質と抗原抗体反応を生じる物質が好ましい。すなわち、コントロール物質が抗体であれば、該抗体が特異的に結合する抗原とし、コントロール物質が抗原であれば、該抗原を特異的に認識する抗体とすることができる。酵素標識抗ビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭ抗体をコントロール物質と兼ねる場合は、展開確認ゾーン１０には、標識酵素を特異的に認識する抗体（例えば、抗アルカリホスファターゼ抗体）、またはイムノグロブリンを特異的に認識する抗体（例えば、抗マウスＩｇＧ抗体）を固定化させることができる。図４に示す例においては、コントロール物質として、アルカリホスファターゼ標識抗ヤギＩｇＧ抗体４４が使用され、展開確認ゾーン１０には、ヤギＩｇＧ４５が固相化されている。
【００３７】
基質ゾーン７には、標識として酵素が用いられる場合に、該酵素の基質が含まれる。含まれる基質は、使用される酵素によって異なるが、例えばアルカリホスファターゼが酵素として使用される場合は、５−ブロモ−４−クロロ−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）等を好適に使用できる。また、展開液としては、２−アミノー２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）緩衝液等の既知の緩衝液を用いることができる。
【００３８】
本実施形態の方法において、抗体の標識は、上記の酵素標識に代えて、他の標識、例えば金属コロイド標識としてもよい。本実施形態の別の実施形態の内部主要部の断面図を図５に示す。金属コロイド標識抗体を用いる場合においては、基質等を用いなくとも検出ゾーンの着色を視認可能であるため、基質ゾーンを設ける必要がない。そのため、図５に示すように、展開液パッド３と標識試薬パッド４を重ねて配置し、被験液９と展開液１６をいずれも滴下ゾーン８に滴下することも可能である。
【００３９】
本発明の第１の実施形態のキットは、ビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭを固定化した抗原固定部を１つ以上具えるイムノクロマト用ストリップと、酸性化剤と、塩基性領域で緩衝能を発揮するｐＨ緩衝剤と、陽イオン性界面活性剤とを含む中和液とを含む、ことを特徴とする、ＰＧＥ−ＭＵＭをイムノクロマト法で測定するためのキットである。イムノクロマト用ストリップ及び中和液の詳細については、本実施形態の方法と同様である。本実施形態のキットは、イムノクロマト用ストリップ及び中和液に加えて、上記したアルカリ処理用のアルカリ水溶液、及び標準液が備えられていてもよい。
【００４０】
検定を行う際に用いる標準液としては、既知量のビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭを、Ｔｒｉｓ、リン酸緩衝液等の既知の緩衝液に溶解して調製することができる。標準液は、０〜３００ｎｇ／ｍＬの範囲で、２〜１０種類の濃度で調製することができるが、これらの条件に限定されるものではない。
【００４１】
＜第２の実施形態＞
本発明の第２の実施形態のＰＧＥ−ＭＵＭの測定方法は、イムノクロマト法により測定する方法であって、
ａ）尿検体をアルカリ水溶液と混和する工程と、
ｂ）ａ）の混和液をイムノクロマト用ストリップに滴下し展開させる工程と、を具え
前記イムノクロマト用ストリップは、酸性化剤と、塩基性領域で緩衝能を発揮するｐＨ緩衝剤と、陽イオン性界面活性剤とを含む中和剤を含む、ことを特徴とする。
【００４２】
本実施形態における中和剤は、第１の実施形態における中和液と同様にして調製した試液を、含浸、点着、塗布等によりイムノクロマト用ストリップ検査器１（図１）のマトリクス２に添加した後、乾燥させることにより、予めマトリクス２に含ませたものをいう。中和剤を予めマトリクスに含ませることにより、アルカリ処理後の混和液を中和液と混和することなく、そのまま滴下ゾーン８に滴下しても、展開の過程で中和させることができる。これにより、より簡便な手技による検査が可能となる。
【００４３】
本実施形態において、検出ゾーン６ａ、６ｂ及び展開確認ゾーン１０への抗原または抗体の点着等は、マトリクス２に中和剤を含ませた後に行うことが好ましい。さらに、中和剤は、マトリクス２上の検出ゾーン６ａ、６ｂよりも上流の領域にのみ含ませることがより好ましい。
【００４４】
本実施形態においては、ＰＧＥ−ＭＵＭは、尿検体とアルカリ水溶液を混和した混和液を、中和液との混和なしで直接的滴下ゾーン８に滴下する以外は、第１の実施形態と同様にして測定される。
【００４５】
本発明の第２の実施形態のキットは、中和剤を含み、ビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭを固定化した抗原固定部を１つ以上具えるイムノクロマト用ストリップを含み、前記中和剤は、酸性化剤と、塩基性領域で緩衝能を発揮するｐＨ緩衝剤と、陽イオン性界面活性剤とを含む、ことを特徴とするＰＧＥ−ＭＵＭをイムノクロマト法で測定するためのキットである。イムノクロマト用ストリップがあらかじめ中和剤を含むこと以外は、第１の実施形態と同様の構成である。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４７】
１．イムノクロマト用ストリップ検査器の調製
図１〜３に示すイムノクロマト用ストリップ検査器を調製した。巾５ｍｍ、長さ５０ｍｍのニトロセルロース膜（ミリポア社製）のマトリクス２上の吸収パッド５末端から１６ｍｍ、１３．５ｍｍの位置に、ビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭ結合ＫＬＧをそれぞれ１５０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ含む抗原液を０．７μＬずつライン状に点着乾燥させ、検出ゾーン６ａ、６ｂを形成し、検出ゾーン６ａを高濃度用、検出ゾーン６ｂを中濃度用とした。さらに、マトリクス２上の吸収パッド５末端から１１ｍｍの位置にヤギイムノグロブリンを１００μｇ／ｍＬ含むリファレンス液０．７μＬを点着乾燥させ、展開確認ゾーン１０を形成した。次いで、ニトロセルロース膜に、アルカリホスファターゼ標識抗ビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭ抗体  ２０μｇ／ｍＬとアルカリホスファターゼ標識抗ヤギＩｇＧ抗体  ３μｇ／ｍＬとを含む標識試薬液５μＬを点着乾燥させ、標識試薬パッド４を形成し、マトリクス２上に配した。
【００４８】
巾６ｍｍ、長さ２０ｍｍのろ紙（ミリポア社製）上に、ＢＣＩＰ  １００μｇを巾６．０ｍｍのライン状に点着乾燥させた基質ゾーン７を形成し、展開液パッド３を作成した。前記マトリクス２、展開液パッド３、標識試薬パッド４及び吸収パッド５（巾１０ｍｍ、長さ１５ｍｍ、厚さ１ｍｍのろ紙（ワットマン社製））を、展開液槽１１、押し込み部１２及び突起部１３を有するプラスチックケースに固定した。
【００４９】
２．検体のアルカリ処理・中和処理
ＰＧＥ−ＭＵＭ濃度既知の尿４検体を、実施例及び比較例１〜４のアルカリ水溶液とそれぞれ混和して、３７℃で８分間静置した後、実施例及び比較例１〜３の中和液をそれぞれ加えて混和した。中和処理後の混和液３０μＬを後のイムノクロマト工程に供した。実施例及び比較例１〜４の検体量、アルカリ水溶液、中和液の量、及び中和液の組成は、表１に示す通りである。
【００５０】
【表１】
2019045286.tif 000004
【００５１】
併せて、０、３、１０、３０、１００、２００ｎｇ／ｍＬのＰＧＥ−ＭＵＭに相当するビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭをそれぞれ含む標準液について、実施例及び比較例１の条件で、尿検体と同様にアルカリ処理、中和処理を行った。
【００５２】
３．イムノクロマト展開
尿検体及び標準液の中和処理後の混和液各３０μＬを、それぞれ１．で調製したイムノクロマト用ストリップ検査器１の滴下ゾーンに滴下した。次いで、押し込み部１２を押下して、展開液を展開させた。押下１５分後の各検出ゾーン、展開確認ゾーンの発色度を目視で判定した。実施例及び比較例１、２における、検体及び標準液の発色度を表２に示す。
【００５３】
【表２】
2019045286.tif 000005
【００５４】
４．結果
比較例３は、中和液中に酸性化剤を含まない系であるが、被験液のｐＨが高すぎたためか、展開確認ゾーンも含め、イムノクロマトでの発色が見られなかった。これにより、中和液には、確実にアルカリを中和するための酸性化剤を要することが確認された。一方、酸性化剤としてクエン酸を含む中和液を用いた比較例１については、展開確認ゾーンの発色はみられたものの、検体測定時の検出ゾーンの発色が全体的に低い傾向が見られた。比較例１では、例えば、標準液では３０ｎｇ／ｍＬでも２つの検出ゾーンの発色が充分視認できるのに対し、尿検体では５８．０ｎｇ／ｍＬで高濃度用検出ゾーンの発色もわずかにみられる程度であり、標準液と検体との発色度に差異があることが示唆された。これは、サンプルが尿検体であることが要因と考えられる（例えば尿夾雑物の影響等）。比較例２及び４においても、全体的に検体における発色度が低く、実施例と比較して高濃度領域の検査に適さない条件であることが分かった。
【００５５】
実施例の条件では、検体における発色度が高く、標準液の同等濃度の発色度とほぼ同等となった。これにより、既知濃度の標準液との発色度の差異を目視で確認することにより、十分にＰＧＥ−ＭＵＭの定量性のある検査が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の方法及びキットは、ヒトの尿中プロスタグランジンＥ主要代謝物の測定に使用され、潰瘍性大腸炎の寛解期の病期判定、間質性肺炎の病期判定、壊死性腸炎の早期診断等、医療分野において広く利用可能である。
【符号の説明】
【００５７】
１  イムノクロマト用ストリップ検査器
２  マトリクス
３  展開液パッド
４  標識試薬パッド
５  吸収パッド
６  検出ゾーン
７  基質ゾーン
８  滴下ゾーン
９  被験液
１０  展開確認ゾーン
１１  展開液槽
１２  押し込み部
１３  突起部
１６  展開液
４２  ビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭ
４３  酵素標識抗ビシクロ体ＰＧＥ−ＭＵＭ抗体
４４  アルカリホスファターゼ標識抗ヤギＩｇＧ抗体
４５  ヤギＩｇＧ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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