(57)【要約】      （修正有）【課題】麹菌等の微生物のポリケタイド類化合物生産性を制御する新規な手段の提供。【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質：（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、又は（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ポリケタイド類化合物の生合成に関与する蛋白質、及び、該蛋白質又はそれをコードするＤＮＡの発現を阻害又は抑制する工程、又は、該ＤＮＡの少なくとも一部を破壊若しくは欠失させ、又はその機能を阻害・抑制する工程を含む、糸状菌により生合成されるポリケタイド類化合物の産生を増大させる方法等。麹菌として、Ｋｕ遺伝子が破壊された株菌を用いる、方法。【選択図】図７
2019071834.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、又は
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ポリケタイド類化合物の生合成に関与する蛋白質。
【請求項２】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡ：
（ａ）上記の蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）（ｂ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ポリケタイド類化合物の生合成に関与する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は
（ｄ）（ｂ）の塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の配列相同性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、ポリケタイド類化合物の生合成に関与する蛋白質をコードするＤＮＡ。  
【請求項３】
糸状菌における請求項１又は２記載の蛋白質又はＤＮＡの発現を阻害又は抑制する工程を含む、該糸状菌により生合成されるポリケタイド類化合物の産生を増大させる方法。
【請求項４】
糸状菌における請求項２記載のＤＮＡの少なくとも一部を破壊若しくは欠失させ、又はその機能を阻害・抑制する工程を含む、該糸状菌により生合成されるポリケタイド類化合物の産生を増大させる方法。
【請求項５】
麹菌としてＫｕ遺伝子が破壊された菌株を用いる、請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
糸状菌に於いてポリケタイド類化合物が異種発現されている、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ポリケタイド類化合物がクルクミンである、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
請求項２記載のＤＮＡの少なくとも一部が破壊若しくは欠失又はその機能が阻害若しくは抑制されていることを特徴とする糸状菌形質転換体。
【請求項９】
更に、ポリケタイド合成酵素遺伝子が導入されている、請求項８記載の形質転換体。
【請求項１０】
麹菌である請求項８又は９記載の形質転換体。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からポリケタイド類化合物を回収することを特徴とする、ポリケタイド類化合物の製造方法。
【請求項１２】
ポリケタイド類化合物がクルクミンである、請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状菌、特に、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）及びアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）等の麹菌の二次代謝産物産生に関与する蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子、及び麹菌の該二次代謝産物産生を制御する方法等に関する。より詳細には、二次代謝産物であるクルクミン等のポリケタイド類化合物の生合成に関与する蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子の発現を制御等することにより当該二次代謝産物産生を増大させる方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
糸状菌、特に、麹菌は様々な酵素類（蛋白質加水分解酵素、アミラーゼ類等）を産生・分泌し、その優れた澱粉糖化能力及び蛋白質分解力等により、醤油、酒、味噌などの醸造食品の製造に工業的に用いられている。
【０００３】
近年の麹菌（アスペルギルス・オリゼ）の全ゲノム配列の決定やマイクロアレイを用いた網羅的な遺伝子発現解析などの進展に伴い、遺伝子工学的な改変、特に、染色体レベルの改変により酵素等の生産性や増殖速度の改良などの効果が期待される糸状菌である。また、麹菌には、二次代謝産物生合成の基本骨格を形成する遺伝子（バックボーン遺伝子）が多く存在することが明らかになっている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
実際に、アスペルギルス・オリゼは、上記のような醸造食品の製造に用いられるのみならず、フェリクロームなど産業的にも非常に重要な低分子化合物の生産能を有することが知られている（例えば、特許文献１参照）。また、アスペルギルス・オリゼを用いて、これら低分子化合物の産生を増大させる方法が報告されている（例えば、特許文献２参照）。
【０００５】
ここで、ポリケタイド （ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ）類とは、アセチルＣｏＡを出発物質とし、マロニルＣｏＡを伸張物質としてポリケトン鎖を合成した後、様々な修飾を受けて生合成された化合物の総称であって、マクロライド、ポリエン、アセトゲニン、ポリエーテル、芳香族ポリケチド（ポリフェノール）等が含まれる。
【０００６】
この中で、クルクミン （ｃｕｒｃｕｍｉｎ） は、ウコン（ターメリック、学名Ｃｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａ）などに含まれる黄色のポリフェノール化合物であり、クルクミノイドに分類される。スパイスや食品領域の着色剤として利用され、法規上は食品添加物(着色料）に分類される。例えば、ウコン中でクルクミンが作られるときには、ＤＣＳ（Ｄｉｋｅｔｉｄｅ  ＣｏＡ  ｓｙｎｔｈａｓｅ:ジケイドＣｏＡ生合成酵素）と、ＣＵＳ（Ｃｕｒｃｕｍｉｎ  ｓｙｎｔｈｅａｓｅ:クルクミン生合成酵素）の２種類の酵素が働いて、クルクミンを作っている可能性が高いことが報告されている。クルクミンの生理作用として抗腫瘍作用や抗酸化作用、抗アミロイド作用、抗炎症作用などが知られている。
【０００７】
商業ベースでのクルクミンは、伝統的な生薬原料の製作と同様に、栽培されたウコン等を原材料にし、有機溶媒抽出法やアルコール抽出法などによって、分離および抽出を行い、生産することが現在は主とされている。また下記のように生合成の正確な経路の探索および生化学的な（酵素利用による）合成法の研究もさかんに検討されている。
【０００８】
一方で、ポリケタイド合成酵素（ＰＫＳ）の一種である、クルクミンを合成する酵素は、現在までにＤＣＳで1つ、ＣＵＲＳで３つの遺伝子が単離されている。これは、当初、全ゲノム解析の行われていたイネゲノム中で、機能未知なカルコン合成酵素様遺伝子を網羅的に解析していた過程で、クルクミノイド合成酵素として報告されてきた遺伝子である（非特許文献２、３）。
【０００９】
このようなポリケタイド類化合物の生合成に関する遺伝子を利用した技術に関して、例えば、マロニルＣｏＡ由来化合物を産生するためのアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ変種及び該酵素の遺伝子による組み換え微生物を利用したマロニルＣｏＡ由来化合物の生産方法等に関する発明が公開されている（特許文献４）。
【００１０】
また、アスペルギルス属等の糸状真菌におけるポリケタイド合成酵素等のシンテターゼの異種発現を含む、微生物二次代謝物の製造方法等に関する発明が公開されている（特許文献５）。
【００１１】
更に、ポリケタイド合成酵素遺伝子をレポーター遺伝子として利用する技術に関する発明が公開されている（特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｋｈａｌｄｉ ｅｔ ａｌ.  （２０１０）  Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｂｉｏｌ.  ４７,  ７３６−７４１
【非特許文献２】Ｋａｔｓｕｙａｍａ，  Ｙ．；  Ｋｉｔａ，  Ｔ．；  Ｆｕｎａ，  Ｎ．；  Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ，  Ｓ．  （２００９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８４  （１７）：  １１１６０−１１１７０
【非特許文献３】Ｋａｔｓｕｙａｍａ，  Ｙ．；  Ｋｉｔａ，  Ｔ．；  Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ，  Ｓ．  （２００９）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ５８３  （１７）：  ２７９９−２８０３
【非特許文献４】Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｔ，ｅｔ ａｌ. （２００６）  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２７５：４６０−４７０
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００２−３６０２６２号公報
【特許文献２】特開２０１３−０１７４０８号公報
【特許文献３】特開２００６−１５８２６９号公報
【特許文献４】特表２０１６−５２９９１７号公報
【特許文献５】特表２０１７−５０８４８１号公報
【特許文献６】特許第５７５７３８０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ポリケタイド類化合物等の二次代謝産物の生産に関与する新たな遺伝子を同定し、麹菌等の微生物の該二次代謝産物生産性を制御する新規な手段等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記目的の達成のために、種々の検討を行った結果、アスペルギルス・オリゼのゲノム情報、及び遺伝子組み換え技術を活用することで、ポリケタイド類化合物の生合成に関与する遺伝子として、遺伝子（ＡＯ０９０７０１０００７６７、以下、「ＡＯｓｎｆ１」という場合がある）を同定し、該遺伝子又はそれにコードされる蛋白質の発現を阻害又は抑制する等によってポリケタイド類化合物の産生を増大することが出来ることを見出し、本発明を完成した。
【００１６】
すなわち、本発明は、以下の各態様に係わる。
［態様１］
以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、又は
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ポリケタイド類化合物の生合成に関与する蛋白質。
［態様２］
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡ：
（ａ）上記の蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）（ｂ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ポリケタイド類化合物の生合成に関与する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は
（ｄ）（ｂ）の塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の配列相同性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、ポリケタイド類化合物の生合成に関与する蛋白質をコードするＤＮＡ。  
［態様３］
糸状菌における態様１又は２記載の蛋白質又はＤＮＡの発現を阻害又は抑制する工程を含む、該糸状菌により生合成されるポリケタイド類化合物の産生を増大させる方法。
［態様４］
糸状菌における態様２記載のＤＮＡの少なくとも一部を破壊若しくは欠失させ、又はその機能を阻害・抑制する工程を含む、該糸状菌により生合成されるポリケタイド類化合物の産生を増大させる方法。
［態様５］
麹菌としてＫｕ遺伝子が破壊された菌株を用いる、態様３又は４記載の方法。
［態様６］
糸状菌に於いてポリケタイド類化合物が異種発現されている、態様３〜５のいずれか一項に記載の方法。
［態様７］
ポリケタイド類化合物がクルクミンである、態様３〜６のいずれか一項に記載の方法。
［態様８］
態様２記載のＤＮＡの少なくとも一部が破壊若しくは欠失又はその機能が阻害若しくは抑制されていることを特徴とする糸状菌形質転換体。
［態様９］
更に、ポリケタイド合成酵素遺伝子が導入されている、態様８記載の形質転換体。
［態様１０］
麹菌である態様８又は９記載の形質転換体。
［態様１１］
態様８〜１０のいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からポリケタイド類化合物を回収することを特徴とする、ポリケタイド類化合物の製造方法。
［態様１２］
ポリケタイド類化合物がクルクミンである、請求項１１記載の方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によって、麹菌に於けるポリケタイド類化合物の生合成に関与する蛋白質をコードする遺伝子の発現を阻害又は抑制する等によって、ポリケタイド類化合物の生産を増大させる等ポリケタイド類化合物の産生を人為的に制御することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１に於いて、クルクミン標品（和光純薬工業社製）、ｃｏｎｔｒｏｌ−１株（対照株）及びＣＵＳ導入株から調製した試料のＵＶクロマトグラムの結果を示す。
【図２】図１で示されたＵＶクロマトグラムにおいて検出されたピークのマススペクトルの結果を示す。
【図３】図１で示されたＵＶクロマトグラムにおいて検出されたピークのプロダクトイオンスペクトルの結果を示す。
【図４】図１で示されたＵＶクロマトグラムにおいて検出されたピークのＵＶスペクトルの結果を示す。
【図５】実施例２における、ＡＯｓｎｆ１破壊株（ΔＡＯｓｎｆ１株）及びｃｏｎｔｒｏｌ―２株（対照株）から調製した試料のｍ／ｚ＝３６９におけるマスクロマトグラムの結果を示す。
【図６】実施例２における、ＡＯｓｎｆ１破壊株（ΔＡＯｓｎｆ１株）及びｃｏｎｔｒｏｌ−２株（対照株）から調製した試料のＵＶクロマトグラムの結果を示す。
【図７】図６で示されたＵＶクロマトグラムから得られたクルクミン由来のピーク面積を算出した結果を示す。
【図８】標品のクルクミンを用いて、クルクミン濃度とＵＶクロマトグラムから得られたクルクミン由来のピーク面積の関係を表す検量線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
１．ポリケタイド類化合物の生合成に関連する蛋白質及びＤＮＡ
本発明は、ポリケタイド類化合物の生合成に関与する蛋白質及び当該蛋白質をコードするＤＮＡを提供する。
より具体的には、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、又は
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１個若しくは数個（例えば、２〜５個）のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ポリケタイド類化合物の生合成に関与する蛋白質；及び、
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡ：
（ａ）上記の蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）（ｂ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ポリケタイド類化合物の生合成に関与する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は
（ｄ）（ｂ）の塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の配列相同性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、ポリケタイド類化合物の生合成に関与する蛋白質をコードするＤＮＡ、に係る。尚、本発明の蛋白質の一例として、以下の実施例に示されるように、遺伝子ＡＯ０９０７０１０００７６７にコードされた、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を挙げることが出来る。
【００２０】
本明細書において「ポリケタイド類化合物の生合成に関与する蛋白質」とは、糸状菌、特に麹菌において生合成されるポリケタイド類化合物の産生量に影響を与え得る蛋白質である。
【００２１】
ここで、「ポリケタイド類化合物の産生量に影響を与え得る」とは、例えば、当該蛋白質又はＤＮＡの発現が阻害若しくは抑制されるか、又は、当該ＤＮＡの少なくとも一部が破壊若しくは欠失する又はその機能が阻害若しくは抑制されることによって、宿主である糸状菌に於いて生合成されるポリケタイド類化合物の産生が増大すること（及び／又は細胞内マロニルＣｏＡ量が増加すること）等を意味する。
【００２２】
ポリケタイド類化合物が生合成される宿主微生物に関して特に制限はないが、例えば、アスペルギルス属及びトリコデルマ属を含むトリコモナス科糸状菌を挙げることが出来る。
【００２３】
本発明のＤＮＡは本発明の蛋白質をコードＤＮＡである。従って、配列番号１で表されるＤＮＡのようなイントロンを含むゲノム由来のＤＮＡに加えて、アミノ酸をコードする領域のみからなる塩基配列（すなわち、エクソン部分のみが結合された塩基配列）からなるｃＤＮＡも含まれる。
【００２４】
このようなｃＤＮＡは、当業者に公知の任意の方法によって、本明細書に開示の塩基配列情報に基づき調製した適当なプライマーを用いて、麹菌等の適当な微生物のｍＲＮＡを鋳型としたＰＣＲ等により取得することが可能である。また、本発明のＤＮＡは当業者に公知の任意の方法によって化学合成することも可能である。
【００２５】
さらに、本発明のＤＮＡには、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、それぞれポリケタイド類化合物の生合成に関与する蛋白質をコードするＤＮＡが含まれる。
【００２６】
ここで、ハイブリダイゼーションは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｎｇ  ｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）、又はカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００２７】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度１５〜９００ｍＭ、好ましくは１５〜６００ｍＭ、さらに好ましくは１５〜１５０ｍＭ、ｐＨ６〜８であるような条件を挙げることができる。
【００２８】
従って、配列番号１で表される塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、該ＤＮＡの全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で、約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上である塩基配列を含有するＤＮＡ等を挙げることができる。
【００２９】
一方、本発明の蛋白質には、上記の蛋白質に加えて、更に、配列番号２で表されるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上である配列相同性を示すアミノ酸配列からなる、ポリケタイド類化合物の生合成に関与する蛋白質も含まれる。
【００３０】
２つの塩基配列又はアミノ酸配列における配列相同性を決定するために、配列は、比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行う。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。第一の配列におけるある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における配列相同性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸又は全塩基）数に対する百分率で示される。
【００３１】
上記の原理に従い、２つの塩基配列又はアミノ酸配列における配列相同性は、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８、１９９０及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７、１９９３）により決定される。このようなアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムやＦＡＳＴＡプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い配列相同性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。
【００３２】
上記のような塩基配列の配列相同性又はコードするアミノ酸配列の配列相同性を示すようなＤＮＡは、上記のようにハイブリダイゼーションを指標に得ることもでき、ゲノム塩基配列解析等によって得られた機能未知のＤＮＡ群又は公共データベースの中から、当業者が通常用いている方法により、例えば、前述のＢＬＡＳＴソフトウェアを用いた検索により発見することも容易である。さらに、本発明遺伝子は種々の公知の変異導入方法によって得ることもできる。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「相同性」は同一性を指す場合がある。「同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つの塩基配列又はアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメントにおける、オーバーラップする全塩基又は全アミノ酸残基に対する、同一塩基又はアミノ酸残基の割合（％）を意味する。好ましくは、当該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方若しくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである。
【００３４】
２．ポリケタイド類化合物の産生を増大させる方法
本発明は更に、糸状菌、特に、麹菌における上記の蛋白質又はＤＮＡの発現を阻害又は抑制する工程、又は、麹菌における上記のＤＮＡの少なくとも一部を破壊若しくは欠失させ、又はその機能を阻害・抑制する工程を含む、該麹菌により生合成されるポリケタイド類化合物の産生を増大させる方法に係る。
【００３５】
例えば、本明細書の実施例２で示されるように、ＡＯｓｎｆ１遺伝子（配列番号１）を相同組み換えにより破壊した麹菌を作製したところ、ＡＯｓｎｆ１の発現が消失又は著しく低下し、その結果、ポリケタイド類化合物の一種であるクルクミンが高生産される。
【００３６】
更に、本明細書の実施例２に記載したＡＯｓｎｆ１遺伝子の探索経緯に鑑みて、当該遺伝子の少なくとも一部を破壊若しくは欠失させ、又はその機能を阻害・抑制することによって、細胞内のマロニルＣｏＡが高蓄積されるものと考えられる。又、既に述べたように、ポリケタイド類化合物はアセチルＣｏＡを出発物質とし、マロニルＣｏＡを伸張物質としてポリケトン鎖が合成される過程を経て生合成される。従って、本発明方法によって、クルクミンに限らず、他の種類のポリケタイド類化合物の生合成産生量も有意に増大されるものと考えられる。
【００３７】
本発明方法に於いて、ポリケタイド類化合物が生合成される宿主である糸状菌の好適例として麹菌等を挙げることが出来る。麹菌としては、本発明に係るポリケタイド類化合物等の生産能を有するものであれば、特に限定されないが、例えば、アスペルギルス・オリゼ  ＲＩＢ４０株及びその変異株を好適に用いることができる。
【００３８】
ウコン及びイネ等の他種生物（植物）由来のクルクミン合成酵素（ＣＵＳ）遺伝子等のポリケタイド合成酵素遺伝子(塩基配列)は既に数多く知られている。
そこで、係る宿主である糸状菌に対する異種遺伝子として、例えば、本明細書の実施例１に記載されているようなアジアイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）等の他種生物（植物）由来のクルクミン合成酵素（ＣＵＳ）遺伝子等のポリケタイド合成酵素遺伝子（群）の少なくとも一種が導入され、該遺伝子が宿主である糸状菌に於いて発現されている（異種発現）形質転換体を使用することも可能である。
【００３９】
このような異種遺伝子であるポリケタイド合成酵素遺伝子が導入された形質転換体である「ポリケタイド類化合物生産変異体」は、当業者に公知の任意の遺伝子工学的技術、例えば、下記に示すような相同組み換え等の技術を利用して容易に作製することができる。
【００４０】
このような相同組み換えには、例えば、本明細書の実施例１に記載されているように、異種遺伝子であるポリケタイド合成酵素遺伝子の他に、プロモーター、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等の各種の制御配列、ｐｙｒＧ、ｕｒａ３及びｎｉａＤのような栄養要求性を相補する遺伝子や、アンピシリンやカナマイシン、オリゴマイシンなどの薬剤に対する抵抗遺伝子等のマーカー遺伝子等を適宜含むＤＮＡ(遺伝子)導入（又は、破壊）断片をＰＣＲ等により作製し使用することが出来る。
【００４１】
尚、アスペルギルス菌は相同組み換え頻度が低いため、相同組み換えで本発明の変異体を作製する場合には、非相同組み換えに関与するＫｕ７０及びＫｕ８０等のＫｕ遺伝子が抑制された形質転換菌を使用することが好ましい。
【００４２】
このようなＫｕ遺伝子の抑制は、当業者に公知の任意の方法で実施することができる。例えば、Ｋｕ遺伝子破壊ベクターを使用したＫｕ遺伝子を破壊又は、Ｋｕ遺伝子のアンチセンス発現ベクターを利用するアンチセンスＲＮＡ法によって、Ｋｕ遺伝子を不活化することが可能である。こうして得られる形質転換菌は、このようなＫｕ遺伝子の抑制に関する遺伝子操作が施される前の元の菌と比較して、相同組み換え頻度が顕著に上昇している。具体的には、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも約６０倍上昇している。
【００４３】
このような相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌の例として、アスペルギルス・ソーヤ  ＡＳＫＵＰＴＲ８株（ｗｈ，  ΔｐｙｒＧ，  ｋｕ７０：：ｐｔｒＡ）、及び、アスペルギルス・オリゼ  ＲｋｕＮ１６ｐｔｒ１株（特許文献３又は非特許文献４等）を挙げることができる。なお、アスペルギルス・ソーヤ  ＡＳＫＵＰＴＲ８株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６に所在の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに平成１６年１２月２日付で寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３１１が付されている。その後、平成１７年１１月１７日付で特許手続上の微生物の寄託等の国際的承認に関するブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４５３が付与されている。
【００４４】
糸状菌における上記の蛋白質又はＤＮＡの発現を阻害若しくは抑制する工程、又は、麹菌における上記のＤＮＡの少なくとも一部を破壊若しくは欠失させる、又はその機能を阻害・抑制する工程は、糸状菌を培養する任意の時点及び期間に於いて、当業者に公知の任意の遺伝子工学的手段・方法で行うことが出来る。
【００４５】
例えば、蛋白質又はＤＮＡ（遺伝子）レベルでの発現を阻害又は抑制する方法の例としては、アンチセンスＲＮＡ法及びＲＮＡ干渉法等によって、当該ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡから蛋白質への翻訳を阻止する方法を挙げることが出来る。
【００４６】
又、糸状菌における上記のＤＮＡ（遺伝子）の少なくとも一部を破壊又は欠失させる、又はその機能を阻害・抑制する方法の例としては、本明細書の実施例２に記載されているように相同組み換えによる当該遺伝子の破壊、及び、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに代表されるゲノム編集を利用して、ゲノム上の任意の部位をヌクレアーゼで切断することにより、切断部位での変異の導入や相同組み換えを誘発する方法を挙げることが出来る。ゲノム編集については、これまでに複数の糸状菌においてこのシステムを応用した技術が確立されている。特に、アスペルギルス・オリゼにおいてＣａｓ９とガイドＲＮＡを発現するプラスミドを導入することで標的とする遺伝子に変異導入が可能であることを示し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いたアスペルギルス・オリゼにおけるゲノム編集技術も確立されている（Ｋａｔａｙａｍａ  Ｔ，  Ｔａｎａｋａ  Ｙ，  Ｏｋａｂｅ  Ｔ，  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｈ，  Ｆｕｊｉｉ  Ｗ，  Ｋｉｔａｍｏｔｏ  Ｋ，  ＆  Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｊ  （２０１６）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ３８：  ６３７−６４２）。このような方法に於いて相同組み換えを利用する場合にも、上記のような相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌を使用することが好ましい。
【００４７】
３．ポリケタイド類化合物高生産形質転換体及びその用途
更に、本発明は、本発明ＤＮＡの少なくとも一部が破壊若しくは欠失又はその機能が阻害若しくは抑制されていることを特徴とする上記糸状菌の形質転換体に係る、その結果、該形質転換体は、かかるＤＮＡの欠失又はその機能の阻害若しくは抑制前（対照株）と比較して、生合成されるポリケタイド類化合物の産生が有意に増大しており（例えば、同条件下で培養した場合に約２倍以上）、即ち、「ポリケタイド類化合物高生産形質転換体」となる。
【００４８】
このような形質転換体は、既に述べたような、当業者に公知の任意の遺伝子工学的手段・方法で容易に作製することが出来る。更に、上記のポリケタイド類化合物生産変異体と同様に、該形質転換体には予め異種遺伝子としてポリケタイド合成酵素遺伝子（群）の少なくとも一種が導入されていることが好ましい。
【００４９】
更に本発明は、上記形質転換体を培養し、得られる培養物からポリケタイド類化合物を回収することを特徴とする、ポリケタイド類化合物を製造する方法にも係る。例えば、本発明の麹菌形質転換体を固体培地若しくは液体培地で培養した培養物からポリケタイド類化合物を取得することが可能である。
尚、ポリケタイド類化合物は、例えば、培養物（菌体）を適当な手段で粉砕後、酢酸エチル等の適当な有機溶剤による抽出等の、当業者に公知の任意の手段によって、容易に回収することができる。
その結果、本発明のＤＮＡが欠失又はその機能が阻害若しくは抑制されていない菌株を培養した場合と比較して、より多量のポリケタイド類化合物を回収することが可能となる。
【００５０】
尚、ポリケタイド類化合物の生産量の増大の割合は、本明細書の実施例に記載されているように、ＵＶクロマトグラムで得られた該化合物由来のピーク面積を比較することによって算出される。
【００５１】
本発明の各方法における、培養系・培地の選択、培養温度・時間等の培養条件及び、ポリケタイド類化合物の抽出方法は、以下の実施例等を参考に、当業者が適宜設定することができる。
【００５２】
以下、実施例に則して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの記載によって何等制限されるものではない。
【００５３】
なお、以下の実施例における各遺伝子操作の手段・条件等は、特に断わりがない限り、例えば、特開平０８−８０１９６号公報等に記載されている当業者に公知の一般的な方法に従い実施した。
【実施例１】
【００５４】
ポリケタイド類化合物生産変異体の作製
アスペルギルス・オリゼ  ＲＩＢ４０（ＲｋｕＮ１６ｐｔｒ１株）のａｍｙｌａｓｅＢ遺伝子領域にクルクミン合成酵素（ＣＵＳ）をコードする遺伝子を導入し、該遺伝子を異種発現するポリケタイド類化合物生産変異体を作製した。
【００５５】
<アスペルギルス・オリゼへのクルクミン合成遺伝子の導入>
以下、ＣＵＳ遺伝子断片を作製した方法を具体的に挙げる。
アスペルギルス・オリゼ  ＲＩＢ４０（寄託機関:独立行政法人酒類総合研究所、寄託番号ＩＤ:ＲＩＢ４０）のゲノムを鋳型として、Ｐｒｉｍｅｒ  ａｍｙＰＵ（配列番号３）及びａｍｙＰＬ（配列番号４）を用いて、ａｍｙｌａｓｅＢのプロモーター領域を含む断片をＰＣＲにより増幅した。
同様に、Ｐｒｉｍｅｒ  ａｍｙＴＵ（配列番号５）及びａｍｙＴＬ（配列番号６）を用いて、ａｍｙｌａｓｅＢのターミネーター領域を含む断片を増幅した。
【００５６】
尚、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株のゲノム配列は、２００５年に決定されており（Ｎａｔｕｒｅ，４３８：１１５７，２００５）、その情報はＤＯＧＡＮのデータベースから入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｂｉｏ.ｎｉｔｅ.ｇｏ.ｊｐ／ｄｏｇａｎ／ＭｉｃｒｏＴｏｐ?ＧＥＮＯＭＥ＿ＩＤ＝ａｏ）。
【００５７】
さらに、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ由来のｃＤＮＡ（完全長ｃＤＮＡが国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 遺伝資源センターのイネゲノムリソースセンター(rgrc)から提供されている）を鋳型としてＣＵＳ遺伝子をＰｒｉｍｅｒ  ＣＵ（配列番号７）及びＣＬ（配列番号８）を用いてＰＣＲにより増幅した。尚、ＣＵＳ遺伝子はイネゲノムＤＮＡにおけるＯＳ０７ｇ１７０１０遺伝子（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ＡＫ１０９５５８）に相当し、その配列情報は特開２００８−２２８６８６号公報にも記載されている。
また、プラスミドｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）を制限酵素ｐｓｔI（タカラバイオ社製）により反応させた。
ＰＣＲ反応液及び制限酵素反応液をＦａｓｔＧｅｎｅ  Ｇｅｌ／ＰＣＲ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社製）で精製した。
【００５８】
Ｐｒｉｍｅｒ  ａｍｙＰＬ及びａｍｙＴＵは、上記で増幅したＣＵＳ遺伝子断片に相補的な配列を有しており、また、Ｐｒｉｍｅｒ  ａｍｙＰＵ及びａｍｙＴＬは、プラスミドｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）のｐｓｔI部位に相補的な配列を有しているため、３断片をＩｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニングキット（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションし、ａｍｙｌａｓｅＢのプロモーター領域、ＣＵＳ遺伝子及びａｍｙｌａｓｅＢのターミネーター領域をこの順で含む、プラスミドｐＵＣ−ＣＵＳを得た。ライゲーションは、キットの所定のプロトコールに従って行った。
【００５９】
以下、ＣＵＳ遺伝子をａｍｙｌａｓｅＢ遺伝子領域に導入するための遺伝子断片を調製した方法を具体的に挙げる。
【００６０】
アスペルギルス・オリゼ  ＲＩＢ４０のゲノムを鋳型として、Ｐｒｉｍｅｒ  ａｍｙＬＵ（配列番号９）及びａｍｙＬＬ（配列番号１０）を用いて、ａｍｙｌａｓｅＢ遺伝子プロモーターの上流側配列を含む断片をＰＣＲにより増幅した。
同様に、Ｐｒｉｍｅｒ  ａｍｙＴＵ（配列番号５）及びａｍｙＲＬ（配列番号１１）を用いて、ａｍｙｌａｓｅＢの下流側配列を含む断片を増幅した。
さらに、Ｐｒｉｍｅｒ ＧＵ（配列番号１２）及びＧＬ（配列番号１３）を用いて、選択マーカーｐｙｒＧ遺伝子の断片を増幅した。
また、上記のプラスミドｐＵＣ−ＣＵＳを鋳型として、Ｐｒｉｍｅｒ  ａｍｙＰＵ−Ｇ（配列番号１４）及びＣＬ（配列番号８）を用いて、上記のａｍｙｌａｓｅＢのプロモーター領域、ＣＵＳ遺伝子及びａｍｙｌａｓｅＢのターミネーター領域を含む断片を増幅した。
ＰＣＲ反応液をＦａｓｔＧｅｎｅ  Ｇｅｌ／ＰＣＲ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社製）で精製した。
【００６１】
上記で精製した各断片を混合したものを鋳型とし、Ｐｒｉｍｅｒ  ａｍｙＬＵ−２（配列番号１５）及びａｍｙＲＬ−２（配列番号１６）のプライマーを用いたＰＣＲ反応を行うことにより、上記の４つの断片が融合した１つの断片を得た。
【００６２】
上記で融合した断片とプラスミドｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）のｐｓｔIの制限酵素反応液をＦａｓｔＧｅｎｅ  Ｇｅｌ／ＰＣＲ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社製）で精製し、各断片をＩｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニングキット（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションし、ｐＵＣ−ｐｙｒＧＣＵＳを得た。
【００６３】
プラスミドｐＵＣ−ｐｙｒＧＣＵＳを鋳型として、Ｐｒｉｍｅｒ  ｐＵＣＬＵ（配列番号１７）及びｐＵＣＲＬ（配列番号１８）を用いて断片を増幅した。
この断片は、ａｍｙｌａｓｅＢ遺伝子の上流及び下流の部分の配列を両端に有した構造をしているため、相同組み換えによる置換導入を行うＣＵＳ遺伝子導入断片となる。
【００６４】
こうして得られたＣＵＳ遺伝子導入断片を用いて、アスペルギルス・オリゼ  ＲｋｕＮ１６ｐｔｒ１株を宿主とした形質転換を行い、ＣＵＳ遺伝子導入株を取得した。
ＣＵＳ遺伝子導入の確認は、ＣＵＳ遺伝子のＣＵ−２（配列番号１９）及びＣＬ−２（配列番号２０）のプライマーを用いたＰＣＲにより行った。
【００６５】
＜アスペルギルス・オリゼにおけるクルクミンの生産＞
ＭＰＹ寒天プレート（ｍａｌｔｏｓｅ  ３．０％，ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ  １．０％，ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ０．５％，ＫＨ２ＰＯ４  ０．５％，ＮａＮＯ３  ０．１％，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０５％，ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ０．１％，寒天  ２％，ｐＨ６．０）に、ＣＵＳの基質アナログであるｆｅｒｕｌｏｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ（ｆｅｒｕｌｏｙｌ−ＮＡＣ）７．４ｍｇをジメチルスルホキシドに溶解させて塗布し、ＲｋｕＮ１６ｐｔｒ１株のｐｙｒＧ遺伝子のみを相補した株（ｃｏｎｔｒｏｌ−１株）を対照とし、得られたＣＵＳ導入株（ΔａｍｙＢ：：ＣＵＳ）を２．０×１０７ 胞子／ｍｌに調整した胞子懸濁液１０ μlを５箇所植菌し３０℃で３日間培養した。
【００６６】
培養終了後、菌体を含む寒天プレートを液体窒素で凍らせ、乳鉢及び乳棒を用いて破砕し、５０ｍｌ容プラスチックチューブに移した。次に、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファーを５ｍｌ加え、６Ｎ  ＨＣｌを１００μｌ加えて、ｐＨ試験紙によりｐＨ３〜４であることを確認した。酢酸エチル溶液２５ｍｌを加え、１５分間超音波処理し、酢酸エチル層を回収した。この操作を２回行い、得られた酢酸エチル層を遠心濃縮機に供し濃縮乾固させ、１ｍｌのメタノールに再溶解させたものをサンプルとした。
【００６７】
検出は、ＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー／質量分析装置）（アジレント社製１１００シリーズ高速液体クロマトグラフィー、及びブルカー・ダルトニクス社製ＨＣＴ  ｐｌｕｓ質量分析装置）を用いて行った。
【００６８】
分離カラムは、ＯＤＳカラム（ナカライテスク社製  コスモコア（Ｒ）  内径２．１ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）を用い、溶離液は、０．１％ｖｏｌ％蟻酸−蒸留水をＡ液、０．１％ｖｏｌ％蟻酸−アセトニトリルをＢ液とし、０分から２分までをＡ液９５％、Ｂ液５％で流し、３０分までにＡ液が５％、Ｂ液が９５％に達するように濃度勾配をかけ、その後３２分から３３分でＡ液が９５％、Ｂ液が５％とする方法でサンプル５μｌを分離した。流速は、毎分０．３ｍｌで行った。
【００６９】
質量分析は、Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＥＳＩ）をイオン化法として用い、ヒーターガス温度は３５０℃、ネブライザーガスは５０ｐｓｉ、窒素ガス流速４ｌ／ｍｉｎとし、正イオン検出モードより検出した。
【００７０】
その結果、クルクミンの極大吸収波長である４２０ｎｍにおいて、クルクミン標品（和光純薬工業社製）を用いて同様の測定をしたスタンダードと対比し、ｃｏｎｔｒｏｌ−１株(対照株)ではクルクミンのピークが確認できないものの、ＣＵＳ導入株はクルクミン由来のピークが検出できることが明らかとなった。
【００７１】
ＵＶクロマトグラムを図１に示す。ＵＶクロマトグラムにおいて検出されたピークのマススペクトル、プロダクトイオンスペクトル及びＵＶスペクトルを図２、３、４に示す。
【実施例２】
【００７２】
ポリケタイド類化合物高生産形質転換体の作製
実施例１の結果から、アスペルギルス・オリゼ  ＲＩＢ４０（ＲｋｕＮ１６ｐｔｒ１株）を用いてクルクミンを異種生産できることが明らかになった。次に、この菌株を用いて、ポリケタイド類化合物高生産形質転換体を作製した。
【００７３】
＜ポリケタイド類化合物の生合成に関与する蛋白質の候補の探索＞
次に、クルクミンの基質となるマロニルＣｏＡを高蓄積させる関連遺伝子の探索を行った。酵母サッカロマイセス・セレビシエにおいてアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをリン酸化するＳｎｆ１を欠失させることで、細胞内マロニルＣｏＡ量が増加したという報告がある（ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ. ２０１３ Ｄｅｃ;３３（２３）：４７０１-１７）。そこで、上記のゲノムデータベースの情報に基づき、当業者に公知の方法によって、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株におけるＳｎｆ１のアミノ酸配列相同性検索を行ったところ、相同性５１．６％の蛋白質を見出した。そこで、本蛋白質をコードする遺伝子ＡＯ０９０７０１０００７６７（「ＡＯｓｎｆ１」という場合がある）をポリケタイド類化合物の生合成に関与する蛋白質をコードする遺伝子の候補であると考えて、該遺伝子を破壊した株を作製し、クルクミンの生産量を評価した。
【００７４】
＜ｐｙｒＧマーカーを除いたＣＵＳ導入株（ΔｐｙｒＧ、ΔａｍｙＢ：：ＣＵＳ）の作製＞
以下、ＣＵＳ遺伝子を導入後に選択マーカーｐｙｒＧ遺伝子を再利用するため、ｐｙｒＧマーカーを除いたＣＵＳ導入株を作製した方法を具体的に挙げる。
【００７５】
ｐｙｒＧ遺伝子領域内に相同組み換えを生じるようにするため、アスペルギルス・オリゼ  ＲＩＢ４０のゲノムを鋳型として、Ｐｒｉｍｅｒ  ＧＵ（配列番号１２）及びＧ１（配列番号２１）、Ｇ２（配列番号２２）及びＧ３（配列番号２３）、Ｇ４及（配列番号２４）びＧＬ（配列番号１３）を用いて増幅した。
また、プラスミドｐＵＣ−ｐｙｒＧＣＵＳを鋳型として、Ｐｒｉｍｅｒ  ａｍｙＬＬ（配列番号１０）及びａｍｙＰＵ−Ｇ（配列番号１４）を用いて増幅した。
【００７６】
上記のＰＣＲ反応液をＦａｓｔＧｅｎｅ  Ｇｅｌ／ＰＣＲ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社製）で精製し、各断片をＩｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニングキット（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションして、ｐＵＣ−ＲｐｙｒＧＣＵＳを得た。
ｐＵＣ−ＲｐｙｒＧＣＵＳを鋳型として、Ｐｒｉｍｅｒ  ｐＵＣＬＵ（配列番号１７）及びｐＵＣＲＬ（配列番号１８）を用いて増幅した。
こうして得られた遺伝子導入断片を用いて、アスペルギルス・オリゼ  ＲｋｕＮ１６ｐｔｒ１株を宿主とした形質転換を行い、遺伝子導入株を取得した。
【００７７】
遺伝子導入した株を１．０×１０７ 胞子／ｍｌに調整した胞子懸濁液１０μlを、２ｍｇ／ｍｌ  ５ｆｌｕｏｒｏｏｒｔｉｃ  ａｃｉｄ（シグマ社製）及び１５ｍＭ  ウリジンを含むＣｚａｐｅｋＤｏｘ寒天プレートに植菌し、３０℃で５日間培養した。
【００７８】
得られたｐｙｒＧ遺伝子欠損株の確認は、ｐｙｒＧ遺伝子領域が増幅されるＰｒｉｍｅｒ  ＧＵ（配列番号１２）及びＧＬ（配列番号１３）を用いてＰＣＲを行い、ｐｙｒＧ遺伝子に相当する増幅断片長の変化を指標に行った。
【００７９】
＜ポリケタイド類化合物高生産形質転換体の作製＞
こうして得られた、ｐｙｒＧマーカーを除いたＣＵＳ導入株（ΔｐｙｒＧ、ΔａｍｙＢ：：ＣＵＳ）を宿主として、ＡＯｓｎｆ１を破壊する株を作製した。
【００８０】
以下、ＡＯｓｎｆ１の遺伝子破壊断片を作製した方法を具体的に挙げる。
アスペルギルス・オリゼ  ＲＩＢ４０のゲノムを鋳型として、Ｐｒｉｍｅｒ  ｓｎｆ１ＬＵ（配列番号２５）及びｓｎｆ１ＬＬ（配列番号２６）を用いて、ＡＯｓｎｆ１の上流側配列を含む断片をＰＣＲにより増幅した。
同様に、ＡＯｓｎｆ１の下流側配列を含む断片をＰｒｉｍｅｒ  ｓｎｆ１ＲＵ（配列番号２７）及びｓｎｆ１ＲＬ（配列番号２８）を用いて増幅した。
さらに、選択マーカーｐｙｒＧ遺伝子の断片をＰｒｉｍｅｒＧＵ（配列番号１２）及びＧＬ（配列番号１３）で増幅した。
【００８１】
得られたＰＣＲ反応液を精製し、これら３つの断片を混合したものを鋳型とし、ｓｎｆ１ＬＵ−２（配列番号２９）及びｓｎｆ１ＲＬ−２（配列番号３０）のプライマーを用いたＰＣＲ反応を行い、これら３つの断片が融合した１つの断片を得た。
【００８２】
この断片は、ＡＯｓｎｆ１の上流及び下流の部分配列がｐｙｒＧ遺伝子の両端に存在する構造を有しているため、相同組み換えによるＡＯｓｎｆ１の置換破壊を行う遺伝子断片となる。
こうして得られた遺伝子破壊断片を用いて、アスペルギルス・オリゼΔｐｙｒＧ、ΔａｍｙＢ：：ＣＵＳ株を宿主とした形質転換を行い、遺伝子破壊株を取得した。
【００８３】
遺伝子破壊の確認は、ｓｎｆ１ＬＵ−２（配列番号２９）及びｓｎｆ１ＲＬ−２（配列番号３０）のプライマーを用いたＰＣＲにより挿入断片を増幅し、制限酵素ＸｂａI（タカラバイオ社製）を反応させることで、目的サイズのＤＮＡ断片が検出されることにより行った。
【００８４】
＜クルクミン生産量の比較＞
上記のＣＵＳ遺伝子を導入した株（ΔｐｙｒＧ、ΔａｍｙＢ：：ＣＵＳ）（ｃｏｎｔｒｏｌ−２株）及び該株でＡＯｓｎｆ１を破壊した株を実施例１と同様の方法で培養、抽出を行いＬＣ／ＭＳによるクルクミン生産量の検討を行った。
【００８５】
マスクロマトグラム、ＵＶクロマトグラム、及びＵＶクロマトグラムで得られたクルクミン由来のピーク面積を算出し、ｃｏｎｔｒｏｌ−２株のピーク面積（クルクミン生産量）を１としたときの相対値を図５、６及び７にそれぞれ示す。また、標品のクルクミンを用いて検量線を作成し、図８に示す。その結果、ＡＯｓｎｆ１破壊株（ΔＡＯｓｎｆ１株）は、ｃｏｎｔｒｏｌ―２株（対照株）に比べてクルクミン生産量が２倍以上に増加していることが確認された。
【００８６】
以上の結果から、ＡＯＳｎｆ１蛋白質は、ポリケタイド類化合物であるクルクミンの産生を制御していることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
糸状菌、特に、アスペルギルス・オリゼ等の麹菌の代謝物から単離された、又はアスペルギルス・オリゼ等の麹菌を宿主として用い生産された二次代謝産物を有効成分とする医薬品、飲食品、化粧品等の提供を実現することができる。
【００８８】
本明細書中に記載した各種プライマー（配列番号３〜３０）の塩基配列を以下の表１に示す。
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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