(57)【要約】      （修正有）【課題】産業用途または研究用途で使用される条件下での有利な表現型を与える変異を選択するよう設計された定向進化実験に基づいた、改変ＤＮＡポリメラーゼの提供。【解決手段】特定の位置で少なくとも１つの変化を含むバリアントポリメラーゼ、及びそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、前記改変ＤＮＡポリメラーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する改変ＤＮＡポリメラーゼであって、配列番号１または２に記載するアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、Ｈ２２３、Ｎ２２４、Ｙ２２５、Ｈ２２７、Ｉ２９５、Ｙ３４２、Ｔ３４３、Ｉ３５７、Ｓ３６０、Ｌ３６１、Ｉ３６３、Ｓ３６５、Ｓ３６６、Ｙ３６７、Ｐ３６８、Ｄ４１７、Ｅ４７５、Ｙ４７６、Ｆ４７８、Ｋ５１８、Ｈ５２７、Ｔ５２９、Ｍ５３１、Ｎ５３５、Ｇ５３９、Ｐ５４２、Ｎ５４５、Ｑ５４６、Ａ５４７、Ｌ５４９、Ｉ５５０、Ｎ５５２、Ｇ５５３、Ｆ５５８、Ａ５９６、Ｇ６０３、Ａ６１０、Ｖ６１５、Ｙ６２２、Ｃ６２３、Ｄ６２４、Ｉ６２８、Ｙ６２９、Ｒ６３２、Ｎ６３５、Ｍ６４１、Ａ６４３、Ｉ６４４、Ｔ６４７、Ｉ６４８、Ｔ６５１、Ｉ６５２、Ｋ６５５、Ｗ６５６、Ｄ６５７、Ｖ６５８、Ｈ６６０、Ｆ６６２、Ｌ６９０、およびそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、前記改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
前記置換が、Ｈ２２３Ａ、Ｎ２２４Ｙ／Ｌ／Ｑ／Ｍ／Ｒ／Ｋ、Ｙ２２５Ｌ／Ｔ／Ｉ／Ｆ／Ａ／Ｍ、Ｈ２２７Ｐ／Ｅ／Ｆ／Ｙ、Ｉ２９５Ｗ／Ｆ／Ｍ／Ｅ、Ｙ３４２Ｌ／Ｆ、Ｔ３４３Ｎ／Ｆ、Ｉ３５７Ｇ／Ｌ／Ｑ／Ｈ／Ｗ／Ｍ／Ａ／Ｅ／Ｙ／Ｐ、Ｓ３６０Ｇ／Ｅ／Ｙ、Ｌ３６１Ｍ／Ｗ／Ｖ／Ｆ、Ｉ３６３Ｖ／Ａ／Ｒ／Ｍ／Ｗ、Ｓ３６５Ｑ／Ｗ／Ｍ／Ａ／Ｇ、Ｓ３６６Ａ／Ｌ、Ｙ３６７Ｌ／Ｅ／Ｍ／Ｐ／Ｎ／Ｆ、Ｐ３６８Ｇ、Ｄ４１７Ｐ、Ｅ４７５Ｄ、Ｙ４７６Ｖ、Ｆ４７８Ｌ、Ｋ５１８Ｑ、Ｈ５２７Ｗ／Ｒ／Ｌ／Ｙ／Ｔ／Ｍ、Ｔ５２９Ｍ／Ｆ、Ｍ５３１Ｈ／Ｙ／Ａ／Ｋ／Ｒ／Ｗ／Ｔ／Ｌ／Ｖ／Ｇ、Ｎ５３５Ｌ／Ｙ／Ｍ／Ｋ／Ｉ／Ｒ／Ｗ／Ｑ、Ｇ５３９Ｙ／Ｆ、Ｐ５４２Ｅ／Ｓ／Ｇ、Ｎ５４５Ｋ／Ｄ／Ｓ／Ｌ／Ｒ／Ｑ／Ｗ、Ｑ５４６Ｗ／Ｆ、Ａ５４７Ｍ／Ｙ／Ｗ／Ｆ／Ｖ／Ｓ、Ｌ５４９Ｑ／Ｙ／Ｈ／Ｇ／Ｒ／Ｋ、Ｉ５５０Ａ／Ｗ／Ｔ／Ｇ／Ｆ／Ｓ、Ｎ５５２Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｇ５５３Ｓ／Ｔ／Ｅ／Ｑ／Ｋ／Ｒ／Ｍ、Ｆ５５８Ｐ／Ｔ、Ａ５９６Ｓ、Ｇ６０３Ｔ／Ａ／Ｌ、Ａ６１０Ｔ／Ｅ、Ｖ６１５Ａ／Ｔ、Ｙ６２２Ａ／Ｍ、Ｃ６２３Ｇ／Ｓ／Ｙ／Ｆ、Ｄ６２４Ｆ／Ｋ、Ｉ６２８Ｙ／Ｖ／Ｆ／Ｌ／Ｍ、Ｙ６２９Ｗ／Ｈ／Ｍ／Ｋ、Ｒ６３２Ｌ／Ｃ、Ｎ６３５Ｄ、Ｍ６４１Ｌ／Ｙ、Ａ６４３Ｌ、Ｉ６４４Ｈ／Ｍ／Ｙ、Ｔ６４７Ｇ／Ａ／Ｅ／Ｋ／Ｓ／Ｙ、Ｉ６４８Ｋ／Ｒ／Ｖ／Ｎ／Ｔ／Ｌ、Ｔ６５１Ｙ／Ｆ／Ｍ、Ｉ６５２Ｑ／Ｇ／Ｓ／Ｎ／Ｆ／Ｔ／Ａ／Ｌ／Ｅ／Ｋ／Ｍ、Ｋ６５５Ｇ／Ｆ／Ｅ／Ｎ／Ｑ／Ｍ／Ａ、Ｗ６５６Ｅ、Ｄ６５７Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｅ、Ｖ６５８Ｌ、Ｈ６６０Ａ／Ｙ、Ｆ６６２Ｉ／Ｌ、Ｌ６９０Ｍおよびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
前記改変ポリメラーゼが、親ポリメラーゼと比較して変化した特性を有する、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】
変化した特性が、忠実度、処理能力、伸長速度、安定性、溶解性、ならびに、ヌクレオチド四リン酸、ヌクレオチド五リン酸、ヌクレオチド六リン酸、ヌクレオチド七リン酸、またはヌクレオチド八リン酸のようなヌクレオチドポリリン酸に結合する能力、および／またはヌクレオチドポリリン酸を組み込む能力から選択される、請求項３に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】
変化した特性が、４、５、６、７、または８個のリン酸を有するヌクレオチドポリリン酸を、成長しているＤＮＡ鎖に組み込む能力である、請求項３に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】
ヌクレオチドポリリン酸がタグ付きのものである、請求項５に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】
前記改変ポリメラーゼが、Ｓ３６６Ａ／Ｌに一致した置換を有する、請求項１に記載の
改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
前記改変ポリメラーゼが、Ｅ４７５Ｄに一致した置換を有する、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項９】
前記改変ポリメラーゼが、Ｆ４７８Ｌに一致した置換を有する、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１０】
前記改変ポリメラーゼが、Ｋ５１８Ｑに一致した置換を有する、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１１】
前記改変ポリメラーゼが、Ｔ５２９Ｍに一致した置換を有する、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１２】
前記改変ポリメラーゼが、Ｎ５３５Ｌに一致した置換を有する、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１３】
前記改変ポリメラーゼが、Ｎ５４５Ｋ／Ｌに一致した置換を有する、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１４】
前記改変ポリメラーゼが、Ａ５４７Ｆに一致した置換を有する、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１５】
前記改変ポリメラーゼが、Ｇ５５３Ｓに一致した置換を有する、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１６】
前記改変ポリメラーゼが、Ｔ６４７Ｇ／Ｙに一致した置換を有する、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１７】
前記改変ポリメラーゼが、Ｔ６５１Ｙに一致した置換を有する、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１８】
前記改変ポリメラーゼが、Ｉ６５２Ｑ／Ａ／Ｌ／Ｅ／Ｋ／Ｍに一致した置換を有する、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１９】
Ｈ２２３Ａ；
Ｎ２２４Ｙ／Ｌ／Ｑ／Ｍ／Ｒ／Ｋ；
Ｙ２２５Ｌ／Ｉ／Ｔ／Ｆ／Ａ／Ｍ；
Ｈ２２７Ｐ／Ｅ／Ｆ／Ｙ；
Ｉ２９５Ｆ／Ｅ／Ｍ／Ｗ；
Ｙ３４２Ｌ／Ｆ；
Ｔ３４３Ｎ／Ｆ；
Ｉ３５７Ｇ／Ｌ／Ｑ／Ｈ／Ｗ／Ｍ／Ａ／Ｅ／Ｙ／Ｐ；
Ｓ３６０Ｇ／Ｅ／Ｙ；
Ｌ３６１Ｍ／Ｗ／Ｖ／Ｆ；
Ｉ３６３Ｖ／Ａ／Ｒ／Ｍ／Ｗ；
Ｓ３６５Ｑ／Ｗ／Ｍ／Ａ／Ｇ；
Ｓ３６６Ａ／Ｌ；
Ｙ３６７Ｌ／Ｅ／Ｍ／Ｐ／Ｎ／Ｆ；
Ｐ３６８Ｇ；
Ｄ４１７Ｐ；
Ｅ４７５Ｄ；
Ｙ４７６Ｖ；
Ｆ４７８Ｌ；
Ｋ５１８Ｑ；
Ｈ５２７Ｗ／Ｒ／Ｌ／Ｙ／Ｔ／Ｍ；
Ｔ５２９Ｍ／Ｆ；
Ｍ５３１Ｈ／Ｙ／Ａ／Ｋ／Ｒ／Ｗ／Ｔ／Ｌ／Ｖ／Ｇ；
Ｎ５３５Ｌ／Ｙ／Ｍ／Ｋ／Ｉ／Ｒ／Ｗ／Ｑ；
Ｐ５４２Ｅ／Ｓ／Ｇ；
Ｎ５４５Ｄ／Ｋ／Ｓ／Ｌ／Ｒ／Ｑ／Ｗ；
Ｑ５４６Ｗ／Ｆ；
Ａ５４７Ｆ／Ｍ／Ｗ／Ｙ／Ｖ／Ｓ；
Ｌ５４９Ｈ／Ｙ／Ｑ／Ｇ／Ｒ／Ｋ；
Ｉ５５０Ａ／Ｗ；
Ｉ５５０Ｔ／Ｇ／Ｆ／Ｓ；
Ｎ５５２Ｌ／Ｍ／Ｔ；
Ｇ５５３Ｓ／Ｔ／Ｅ／Ｑ／Ｋ／Ｒ／Ｍ；
Ｆ５５８Ｐ／Ｔ；
Ａ５９６Ｓ；
Ｇ６０３Ｔ／Ａ／Ｌ；
Ａ６１０Ｔ／Ｅ；
Ｖ６１５Ａ／Ｔ；
Ｙ６２２Ａ／Ｍ；
Ｃ６２３Ｇ／Ｓ／Ｙ／Ａ／Ｆ；
Ｄ６２４Ｆ／Ｋ；
Ｉ６２８Ｙ／Ｖ／Ｆ／Ｌ／Ｍ；
Ｙ６２９Ｗ／Ｈ／Ｍ／Ｋ；
Ｒ６３２Ｌ／Ｃ；
Ｎ６３５Ｄ；
Ｍ６４１Ｌ／Ｙ；
Ａ６４３Ｌ；
Ｉ６４４Ｈ／Ｍ／Ｙ；
Ｔ６４７Ｇ／Ａ／Ｅ／Ｋ／Ｓ／Ｙ；
Ｉ６４８Ｋ／Ｒ／Ｖ／Ｎ／Ｔ／Ｌ；
Ｔ６５１Ｙ／Ｆ／Ｍ；
Ｉ６５２Ｑ／Ｇ／Ｓ／Ｎ／Ｆ／Ｔ／Ａ／Ｌ／Ｅ／Ｋ／Ｍ；
Ｋ６５５Ｇ／Ｆ／Ｅ／Ｎ／Ｑ／Ｍ／Ａ；
Ｗ６５６Ｅ；
Ｄ６５７Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｅ；
Ｖ６５８Ｌ；
Ｈ６６０Ａ／Ｙ；
Ｆ６６２Ｉ／Ｌ；
Ｌ６９０Ｍ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ；
Ｔ６５１Ｙ＋Ｎ５３５Ｌ；
Ｙ３４２Ｌ＋Ｅ４７５Ｄ＋Ｆ４７８Ｌ；
Ｔ３４３Ｎ＋Ｄ４１７Ｐ＋Ｋ５１８Ｑ；
Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ；
Ｉ３６３Ｖ＋Ｅ４７５Ｄ＋Ｙ４７６Ｖ；
Ｓ３６６Ｌ＋Ｇ５５３Ｓ＋Ｆ５５８Ｐ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ａ５４７Ｍ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｐ５４２Ｅ＋Ｎ５４５Ｋ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｐ５４２Ｅ＋Ｉ６５２Ｑ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｔ５２９Ｍ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ；
Ｔ６５１Ｙ＋Ｐ５４２Ｅ＋Ｎ５４５Ｋ；
Ｔ６５１Ｙ＋Ｐ５４２Ｅ＋Ｑ５４６Ｗ；
Ｔ６５１Ｙ＋Ｐ５４２Ｅ＋Ｓ３６６Ａ；
Ｔ６５１Ｙ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｉ＋Ｉ６５２Ｑ；
Ｔ６５１Ｙ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ；
Ｔ６４７Ｇ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｙ２２５Ｔ；
Ａ５４７Ｆ＋Ａ６１０Ｔ＋Ｓ３６６Ａ；
Ａ５４７Ｆ＋Ａ６１０Ｔ＋Ｙ２２５Ｉ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ａ５４７Ｆ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ；
Ｔ６４７Ｅ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ａ５４７Ｆ；
Ｎ５４５Ｋ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ；
Ｔ６４７Ｇ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｔ５２９Ｍ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ａ６１０Ｔ＋Ａ５４７Ｆ；
Ｍ６４１Ｙ＋Ｔ５２９Ｍ＋Ａ５４７Ｆ；
Ｔ６４７Ｇ＋Ｃ６２３Ｇ＋Ａ５４７Ｆ；
Ａ６１０Ｔ＋Ｉ２９５Ｗ＋Ｔ６５１Ｙ；
Ｖ６１５Ａ＋Ｍ５３１Ｙ＋Ｔ６４７Ｇ；
Ｓ３６６Ｌ＋Ｆ４７８Ｌ＋Ａ５９６Ｓ＋Ｌ６９０Ｍ；
Ｈ２２３Ａ＋Ｇ５５３Ｓ＋Ａ６４３Ｌ＋Ｆ６６２Ｉ；
Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ５２９Ｍ；
Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｎ６３５Ｄ；
Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｉ６５２Ｑ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ＋Ｔ５２９Ｍ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｓ３６５Ａ＋Ｐ３６８Ｇ＋Ｇ６０３Ｔ；
Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ６４７Ｇ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ＋Ａ５４７Ｙ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ａ５４７Ｍ＋Ｔ６４７Ｇ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｋ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｒ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５５２Ｌ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｙ６２９Ｗ；
Ｎ５３５Ｉ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ５２９Ｍ；
Ｎ５３５Ｉ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｎ６３５Ｄ；
Ｎ５３５Ｉ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｉ６５２Ｑ；
Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ｃ６２３Ｇ；
Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ｉ６２８Ｙ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ａ５４７Ｍ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ｓ３６０Ｇ；
Ｎ５３５Ｉ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｉ６５２Ｑ＋Ｙ２２５Ｉ；
Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ｋ６５５Ｇ；
Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ｌ５４９Ｑ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ＋Ａ５４７Ｙ＋Ｋ６５５Ｇ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ６２９Ｗ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｆ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｋ６５５Ｆ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｎ５５２Ｌ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｒ＋Ｍ５３１Ａ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｒ＋Ｇ５３９Ｙ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｒ＋Ｖ６５８Ｌ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｎ５５２Ｌ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｉ６５２Ｇ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｎ５５２Ｍ
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｎ２２４Ｒ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｉ６２８Ｍ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ６５５Ａ；および
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｙ６２９Ｗ
から選択される、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２０】
Ｓ３６６Ａ＋Ｔ５２９Ｍ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ａ５４７Ｆを含む、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２１】
ａ．  Ｙ２２５Ｌ／Ｆ／Ａ／Ｍ；
ｂ．  Ｍ５３１Ａ／Ｇ；
ｃ．  Ｇ５３９Ｙ；
ｄ．  Ｎ５５２Ｌ／Ｔ；
ｅ．  Ｙ６２９Ｗ／Ｋ；
ｆ．  Ｋ６５５Ｆ／Ｑ／Ｍ／Ａ；および
ｇ．  Ｄ６５７Ｒ／Ｅ／Ｐ／Ａ
から選択される少なくとも１つの変異をさらに含む、請求項２０に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２２】
Ｓ３６５Ａ＋Ｓ３６６Ａ＋Ｐ３６８Ｇ＋Ｇ６０３Ｔを含む、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２３】
前記ポリメラーゼが１０個未満の変異を含む、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
[001]本出願は、２０１６年２月１日に出願された「Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｖａｒｉ
ａｎｔｓ」と題する米国特許出願第１５／０１２，３１７号の一部継続出願であり、２０１５年５月１４日に出願された「Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｖａｒｉａｎｔｓ」と題する米国仮特許出願第６２／１６１，５７１号、２０１５年８月９日に出願された「Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｖａｒｉａｎｔｓ」と題する米国仮特許出願第６２／２０２，８９５号、および２０１６年５月１０日に出願された「Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｖａｒｉａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題する米国特許出願第１５／１５１，３６４号に基づく優先権を主張する。
配列表
[002]本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子出願された配列表を含み、参照により
その全体が本明細書に組み込まれる。２０１６年５月１０日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、２０−０４３３８．５２１ＷＯ２＿ＳＬ．ｔｘｔという名前であり、１７，９８９バイトのサイズである。
【技術分野】
【０００２】
[003]本明細書においては、特に、組換えＤＮＡ技術における適用のために、より適す
る酵素を選択するよう設計された定向進化実験において同定される変異に基づくアミノ酸変化を含有する改変ＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【背景技術】
【０００３】
[004]ＤＮＡポリメラーゼは、１本鎖ＤＮＡを鋳型として使用して相補的なＤＮＡ鎖を
合成する酵素のファミリーである。特に、ＤＮＡポリメラーゼは、新たに形成する鎖の３’末端に遊離のヌクレオチドを添加し、その結果、新しい鎖を５’から３’への方向に伸長させることができる。ほとんどのＤＮＡポリメラーゼは、重合活性とエキソヌクレアーゼ活性の両方を有する多機能タンパク質である。例えば、多くのＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。これらのポリメラーゼは、誤って組み込まれたヌクレオチドを認識することができ、酵素の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性により、その間違ったヌクレオチドが除去される（この活性は、プルーフリーディングとして知られる）。ヌクレオチドの除去後、ポリメラーゼは正しいヌクレオチドを再挿入することができ、複製が継続できる。多くのＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性も有する。
【０００４】
[005]ポリメラーゼには、ナノポアシーケンシングを含めた組換えＤＮＡの応用例にお
ける用途が見出されている。しかしながら、ＤＮＡ鎖は、１塩基あたり１μｓ〜５μｓの速度で急速にナノポアを通過する。これにより記録は困難になり、またバックグラウンドノイズを受けやすくなり、単一ヌクレオチドの分解能を得ることができなくなる。したがって、ＤＮＡ鎖またはその断片のシーケンシングでは、検出可能なタグをヌクレオチドに使用することがある。よって、シーケンシングするＤＮＡの速度を制御する必要性だけでなく、改変ヌクレオチド、例えばタグを有するか、または有しないヌクレオチドポリリン酸を組み込むことなどの、（野生型酵素と比較して）改良された特性を有するポリメラーゼを提供する必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
[006]本発明は、産業用途または研究用途で使用される条件下での有利な表現型、例え
ば高い塩濃度で例えばタグ付きヌクレオチドなどの改変ヌクレオチドポリリン酸の組み込
みを触媒することなどを与える変異を選択するよう設計された定向進化実験に基づいた、改変ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、変異体）を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
[007]一態様においては、配列番号２（Ｐｏｌ６（Ｈｉｓタグ付き））のＨ２２３、Ｎ
２２４、Ｙ２２５、Ｈ２２７、Ｉ２９５、Ｙ３４２、Ｔ３４３、Ｉ３５７、Ｓ３６０、Ｌ３６１、Ｉ３６３、Ｓ３６５、Ｓ３６６、Ｙ３６７、Ｐ３６８、Ｄ４１７、Ｅ４７５、Ｙ４７６、Ｆ４７８、Ｋ５１８、Ｈ５２７、Ｔ５２９、Ｍ５３１、Ｎ５３５、Ｇ５３９、Ｐ５４２、Ｎ５４５、Ｑ５４６、Ａ５４７、Ｌ５４９、Ｉ５５０、Ｎ５５２、Ｇ５５３、Ｆ５５８、Ａ５９６、Ｇ６０３、Ａ６１０、Ｖ６１５、Ｙ６２２、Ｃ６２３、Ｄ６２４、Ｉ６２８、Ｙ６２９、Ｒ６３２、Ｎ６３５、Ｍ６４１、Ａ６４３、Ｉ６４４、Ｔ６４７、Ｉ６４８、Ｔ６５１、Ｉ６５２、Ｋ６５５、Ｗ６５６、Ｄ６５７、Ｖ６５８、Ｈ６６０、Ｆ６６２、およびＬ６９０に対応する位置で少なくとも１つの変化を含むバリアントポリメラーゼがある。
【０００７】
[008]一実施形態においては、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する改変ＤＮＡポリメラー
ゼであって、配列番号１または２に記載するアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する改変ＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【０００８】
[009]第２の実施形態においては、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する改変ＤＮＡポリメ
ラーゼであって、Ｈ２２３、Ｎ２２４、Ｙ２２５、Ｈ２２７、Ｉ２９５、Ｙ３４２、Ｔ３４３、Ｉ３５７、Ｓ３６０、Ｌ３６１、Ｉ３６３、Ｓ３６５、Ｓ３６６、Ｙ３６７、Ｐ３６８、Ｄ４１７、Ｅ４７５、Ｙ４７６、Ｆ４７８、Ｋ５１８、Ｈ５２７、Ｔ５２９、Ｍ５３１、Ｎ５３５、Ｇ５３９、Ｐ５４２、Ｎ５４５、Ｑ５４６、Ａ５４７、Ｌ５４９、Ｉ５５０、Ｎ５５２、Ｇ５５３、Ｆ５５８、Ａ５９６、Ｇ６０３、Ａ６１０、Ｖ６１５、Ｙ６２２、Ｃ６２３、Ｄ６２４、Ｉ６２８、Ｙ６２９、Ｒ６３２、Ｎ６３５、Ｍ６４１、Ａ６４３、Ｉ６４４、Ｔ６４７、Ｉ６４８、Ｔ６５１、Ｉ６５２、Ｋ６５５、Ｗ６５６、Ｄ６５７、Ｖ６５８、Ｈ６６０、Ｆ６６２、およびＬ６９０、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を有する配列番号１または２に記載するアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する改変ＤＮＡポリメラーゼを提供する。さらなる実施形態においては、１つまたは複数のアミノ酸置換は、Ｈ２２３Ａ、Ｎ２２４Ｙ／Ｌ／Ｑ／Ｍ／Ｒ／Ｋ、Ｙ２２５Ｌ／Ｔ／Ｉ／Ｆ／Ａ／Ｍ、Ｈ２２７Ｐ／Ｅ／Ｆ／Ｙ、Ｉ２９５Ｗ／Ｆ／Ｍ／Ｅ、Ｙ３４２Ｌ／Ｆ、Ｔ３４３Ｎ／Ｆ、Ｉ３５７Ｇ／Ｌ／Ｑ／Ｈ／Ｗ／Ｍ／Ａ／Ｅ／Ｙ／Ｐ、Ｓ３６０Ｇ／Ｅ／Ｙ、Ｌ３６１Ｍ／Ｗ／Ｖ／Ｆ、Ｉ３６３Ｖ／Ａ／Ｒ／Ｍ／Ｗ、Ｓ３６５Ｑ／Ｗ／Ｍ／Ａ／Ｇ、Ｓ３６６Ａ／Ｌ、Ｙ３６７Ｌ／Ｅ／Ｍ／Ｐ／Ｎ／Ｆ、Ｐ３６８Ｇ、Ｄ４１７Ｐ、Ｅ４７５Ｄ、Ｙ４７６Ｖ、Ｆ４７８Ｌ、Ｋ５１８Ｑ、Ｈ５２７Ｗ／Ｒ／Ｌ／Ｙ／Ｔ／Ｍ、Ｔ５２９Ｍ／Ｆ、Ｍ５３１Ｈ／Ｙ／Ａ／Ｋ／Ｒ／Ｗ／Ｔ／Ｌ／Ｖ／Ｇ、Ｎ５３５Ｌ／Ｙ／Ｍ／Ｋ／Ｉ／Ｒ／Ｗ／Ｑ、Ｇ５３９Ｙ／Ｆ、Ｐ５４２Ｅ／Ｓ／Ｇ、Ｎ５４５Ｋ／Ｄ／Ｓ／Ｌ／Ｒ／Ｑ／Ｗ、Ｑ５４６Ｗ／Ｆ、Ａ５４７Ｍ／Ｙ／Ｗ／Ｆ／Ｖ／Ｓ、Ｌ５４９Ｑ／Ｙ／Ｈ／Ｇ／Ｒ／Ｋ、Ｉ５５０Ａ／Ｗ／Ｔ／Ｇ／Ｆ／Ｓ、Ｎ５５２Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｇ５５３Ｓ／Ｔ／Ｅ／Ｑ／Ｋ／Ｒ／Ｍ、Ｆ５５８Ｐ／Ｔ、Ａ５９６Ｓ、Ｇ６０３Ｔ／Ａ／Ｌ、Ａ６１０Ｔ／Ｅ、Ｖ６１５Ａ／Ｔ、Ｙ６２２Ａ／Ｍ、Ｃ６２３Ｇ／Ｓ／Ｙ／Ｆ、Ｄ６２４Ｆ／Ｋ、Ｉ６２８Ｙ／Ｖ／Ｆ／Ｌ／Ｍ、Ｙ６２９Ｗ／Ｈ／Ｍ／Ｋ、Ｒ６３２Ｌ／Ｃ、Ｎ６３５Ｄ、Ｍ６４１Ｌ／Ｙ、Ａ６４３Ｌ、Ｉ６４４Ｈ／Ｍ／Ｙ、Ｔ６４７Ｇ／Ａ／Ｅ／Ｋ／Ｓ／Ｙ、Ｉ６４８Ｋ／Ｒ／Ｖ／Ｎ／Ｔ／Ｌ、Ｔ６５１Ｙ／Ｆ／Ｍ、Ｉ６５２Ｑ／Ｇ／Ｓ／Ｎ／Ｆ／Ｔ／Ａ／Ｌ／Ｅ／Ｋ／Ｍ、Ｋ６５５Ｇ／Ｆ／Ｅ／Ｎ／Ｑ／Ｍ／Ａ、Ｗ６５６Ｅ、Ｄ６５７Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｅ、Ｖ６５８Ｌ、Ｈ６６０Ａ／Ｙ、Ｆ６６２Ｉ／Ｌ、Ｌ６９０Ｍおよびそれらの組合せから選択される。１つまたは複数のアミノ酸置換を有する改変ＤＮＡポリメラーゼは、親ポリメラーゼと比較して、酵素活性、忠実度、処理能力、伸長速度、シーケンシング精度、長時間連続性解読能、安定性、および溶解性から選択される変化した特性を有する。一実施形態においては、変化した特性は酵素活性である。一実施形態においては、変化した特性は忠実度である。一実施形態においては、変化した特性は処理能力である。一実施形態においては、変化した特性は伸長速度である。一実施形態においては、変化した特性は安定性である。一実施形態においては、変化した特性は溶解性である。一実施形態においては、変化した特性は、ヌクレオチドポリリン酸に結合する能力、および／またはヌクレオチドポリリン酸を組み込む能力である。ヌクレオチドポリリン酸は、例えばヌクレオチド四リン酸、ヌクレオチド五リン酸、ヌクレオチド六リン酸、ヌクレオチド七リン酸、またはヌクレオチド八リン酸である。
【０００９】
[0010]第３の実施形態においては、配列番号１または２と比較した場合に、酵素活性、忠実度、処理能力、伸長速度、安定性、または溶解性から選択される変化した特性を有する改変ＤＮＡポリメラーゼを提供する。一実施形態においては、変化した特性は酵素活性である。一実施形態においては、変化した特性は忠実度である。一実施形態においては、変化した特性は処理能力である。一実施形態においては、変化した特性は伸長速度である。一実施形態においては、変化した特性は安定性である。一実施形態においては、変化した特性は溶解性である。
【００１０】
[0011]第４の実施形態においては、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する改変ＤＮＡポリメラーゼであって、Ｈ２２３Ａ、Ｎ２２４Ｙ／Ｌ／Ｑ／Ｍ／Ｒ／Ｋ、Ｙ２２５Ｌ／Ｔ／Ｉ／Ｆ／Ａ、Ｈ２２７Ｐ／Ｅ／Ｆ／Ｙ、Ｉ２９５Ｗ／Ｆ／Ｍ／Ｅ、Ｙ３４２Ｌ／Ｆ、Ｔ３４３Ｎ／Ｆ、Ｉ３５７Ｇ／Ｌ／Ｑ／Ｈ／Ｗ／Ｍ／Ａ／Ｅ／Ｙ／Ｐ、Ｓ３６０Ｇ／Ｅ／Ｙ、Ｌ３６１Ｍ／Ｗ／Ｖ／Ｆ、Ｉ３６３Ｖ／Ａ／Ｒ／Ｍ／Ｗ、Ｓ３６５Ｑ／Ｗ／Ｍ／Ａ／Ｇ、Ｓ３６６Ａ／Ｌ、Ｙ３６７Ｌ／Ｅ／Ｍ／Ｐ／Ｎ／Ｆ、Ｐ３６８Ｇ、Ｄ４１７Ｐ、Ｅ４７５Ｄ、Ｙ４７６Ｖ、Ｆ４７８Ｌ、Ｋ５１８Ｑ、Ｈ５２７Ｗ／Ｒ／Ｌ／Ｙ／Ｔ／Ｍ、Ｔ５２９Ｍ／Ｆ、Ｍ５３１Ｈ／Ｙ／Ａ／Ｋ／Ｒ／Ｗ／Ｔ／Ｌ／Ｖ／Ｇ、Ｎ５３５Ｌ／Ｙ／Ｍ／Ｋ／Ｉ／Ｒ／Ｗ／Ｑ、Ｇ５３９Ｙ／Ｆ、Ｐ５４２Ｅ／Ｓ／Ｇ、Ｎ５４５Ｋ／Ｄ／Ｓ／Ｌ／Ｒ／Ｑ／Ｗ、Ｑ５４６Ｗ／Ｆ、Ａ５４７Ｍ／Ｙ／Ｗ／Ｆ／Ｖ／Ｓ、Ｌ５４９Ｑ／Ｙ／Ｈ／Ｇ／Ｒ／Ｋ、Ｉ５５０Ａ／Ｗ／Ｔ／Ｇ／Ｆ／Ｓ、Ｎ５５２Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｇ５５３Ｓ／Ｔ／Ｅ／Ｑ／Ｋ／Ｒ／Ｍ、Ｆ５５８Ｐ／Ｔ、Ａ５９６Ｓ、Ｇ６０３Ｔ／Ａ／Ｌ、Ａ６１０Ｔ／Ｅ、Ｖ６１５Ａ／Ｔ、Ｙ６２２Ａ／Ｍ、Ｃ６２３Ｇ／Ｓ／Ｙ／Ｆ、Ｄ６２４Ｆ／Ｋ、Ｉ６２８Ｙ／Ｖ／Ｆ／Ｌ／Ｍ、Ｙ６２９Ｗ／Ｈ／Ｍ／Ｋ、Ｒ６３２Ｌ／Ｃ、Ｎ６３５Ｄ、Ｍ６４１Ｌ／Ｙ、Ａ６４３Ｌ、Ｉ６４４Ｈ／Ｍ／Ｙ、Ｔ６４７Ｇ／Ａ／Ｅ／Ｋ／Ｓ／Ｙ、Ｉ６４８Ｋ／Ｒ／Ｖ／Ｎ／Ｔ／Ｌ、Ｔ６５１Ｙ／Ｆ／Ｍ、Ｉ６５２Ｑ／Ｇ／Ｓ／Ｎ／Ｆ／Ｔ／Ａ／Ｌ／Ｅ／Ｋ／Ｍ、Ｋ６５５Ｇ／Ｆ／Ｅ／Ｎ／Ｑ／Ｍ／Ａ、Ｗ６５６Ｅ、Ｄ６５７Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｅ、Ｖ６５８Ｌ、Ｈ６６０Ａ／Ｙ、Ｆ６６２Ｉ／Ｌ、Ｌ６９０Ｍおよびその組合せからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む配列番号１に記載するアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、１つまたは複数のアミノ酸置換が、親ポリメラーゼと比較して、酵素活性、忠実度、処理能力、伸長速度、シーケンシング精度、長時間連続性解読能、安定性、または溶解性を変化させる、改変ＤＮＡポリメラーゼを提供する。一実施形態においては、変化した特性は酵素活性である。一実施形態においては、変化した特性は忠実度である。一実施形態においては、変化した特性は処理能力である。一実施形態においては、変化した特性は伸長速度である。一実施形態においては、変化した特性は安定性である。一実施形態においては、変化した特性は溶解性である。一実施形態においては、変化した特性は、ヌクレオチドポリリン酸に結合する能力、および／またはヌクレオチドポリリン酸を組み込む能力である。ヌクレオチドポリリン酸は、例えばヌクレオチド四リン酸、ヌクレオチド五リン酸、ヌクレオチド六リン酸、ヌクレオチド七リン酸、またはヌクレオチド八リン酸である。
【００１１】
[0012]一実施形態においては、配列番号１または２と比較して変化した酵素活性を有するバリアントポリメラーゼは、
ａ．  Ｈ２２３Ａ；
ｂ．  Ｎ２２４Ｙ／Ｌ／Ｑ／Ｍ／Ｒ／Ｋ；
ｃ．  Ｙ２２５Ｌ／Ｉ／Ｔ／Ｆ／Ａ／Ｍ；
ｄ．  Ｈ２２７Ｐ／Ｅ／Ｆ／Ｙ；
ｅ．  Ｉ２９５Ｆ／Ｅ／Ｍ／Ｗ；
ｆ．  Ｙ３４２Ｌ／Ｆ；
ｇ．  Ｔ３４３Ｎ／Ｆ；
ｈ．  Ｉ３５７Ｇ／Ｌ／Ｑ／Ｈ／Ｗ／Ｍ／Ａ／Ｅ／Ｙ／Ｐ；
ｉ．  Ｓ３６０Ｇ／Ｅ／Ｙ；
ｊ．  Ｌ３６１Ｍ／Ｗ／Ｖ／Ｆ；
ｋ．  Ｉ３６３Ｖ／Ａ／Ｒ／Ｍ／Ｗ；
ｌ．  Ｓ３６５Ｑ／Ｗ／Ｍ／Ａ／Ｇ；
ｍ．  Ｓ３６６Ａ／Ｌ；
ｎ．  Ｙ３６７Ｌ／Ｅ／Ｍ／Ｐ／Ｎ／Ｆ；
ｏ．  Ｐ３６８Ｇ；
ｐ．  Ｄ４１７Ｐ；
ｑ．  Ｅ４７５Ｄ；
ｒ．  Ｙ４７６Ｖ；
ｓ．  Ｆ４７８Ｌ；
ｔ．  Ｋ５１８Ｑ；
ｕ．  Ｈ５２７Ｗ／Ｒ／Ｌ／Ｙ／Ｔ／Ｍ；
ｖ．  Ｔ５２９Ｍ／Ｆ；
ｗ．  Ｍ５３１Ｈ／Ｙ／Ａ／Ｋ／Ｒ／Ｗ／Ｔ／Ｌ／Ｖ／Ｇ；
ｘ．  Ｎ５３５Ｌ／Ｙ／Ｍ／Ｋ／Ｉ／Ｒ／Ｗ／Ｑ；
ｙ．  Ｐ５４２Ｅ／Ｓ／Ｇ；
ｚ．  Ｎ５４５Ｄ／Ｋ／Ｓ／Ｌ／Ｒ／Ｑ／Ｗ；
ａａ．  Ｑ５４６Ｗ／Ｆ；
ｂｂ．  Ａ５４７Ｆ／Ｍ／Ｗ／Ｙ／Ｖ／Ｓ；
ｃｃ．  Ｌ５４９Ｈ／Ｙ／Ｑ／Ｇ／Ｒ／Ｋ；
ｄｄ．  Ｉ５５０Ａ／Ｗ；
ｅｅ．  Ｉ５５０Ｔ／Ｇ／Ｆ／Ｓ；
ｆｆ．  Ｎ５５２Ｌ／Ｍ／Ｔ；
ｇｇ．  Ｇ５５３Ｓ／Ｔ／Ｅ／Ｑ／Ｋ／Ｒ／Ｍ；
ｈｈ．  Ｆ５５８Ｐ／Ｔ；
ｉｉ．  Ａ５９６Ｓ；
ｊｊ．  Ｇ６０３Ｔ／Ａ／Ｌ；
ｋｋ．  Ａ６１０Ｔ／Ｅ；
ｌｌ．  Ｖ６１５Ａ／Ｔ；
ｍｍ．  Ｙ６２２Ａ／Ｍ；
ｎｎ．  Ｃ６２３Ｇ／Ｓ／Ｙ／Ａ／Ｆ；
ｏｏ．  Ｄ６２４Ｆ／Ｋ；
ｐｐ．  Ｉ６２８Ｙ／Ｖ／Ｆ／Ｌ／Ｍ；
ｑｑ．  Ｙ６２９Ｗ／Ｈ／Ｍ／Ｋ；
ｒｒ．  Ｒ６３２Ｌ／Ｃ；
ｓｓ．  Ｎ６３５Ｄ；
ｔｔ．  Ｍ６４１Ｌ／Ｙ；
ｕｕ．  Ａ６４３Ｌ；
ｖｖ．  Ｉ６４４Ｈ／Ｍ／Ｙ；
ｗｗ．  Ｔ６４７Ｇ／Ａ／Ｅ／Ｋ／Ｓ／Ｙ；
ｘｘ．  Ｉ６４８Ｋ／Ｒ／Ｖ／Ｎ／Ｔ／Ｌ；
ｙｙ．  Ｔ６５１Ｙ／Ｆ／Ｍ；
ｚｚ．  Ｉ６５２Ｑ／Ｇ／Ｓ／Ｎ／Ｆ／Ｔ／Ａ／Ｌ／Ｅ／Ｋ／Ｍ；
ａａａ．  Ｋ６５５Ｇ／Ｆ／Ｅ／Ｎ／Ｑ／Ｍ／Ａ；
ｂｂｂ．  Ｗ６５６Ｅ；
ｃｃｃ．  Ｄ６５７Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｅ；
ｄｄｄ．  Ｖ６５８Ｌ；
ｅｅｅ．  Ｈ６６０Ａ／Ｙ；
ｆｆｆ．  Ｆ６６２Ｉ／Ｌ；
ｇｇｇ．  Ｌ６９０Ｍ；
ｈｈｈ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ；
ｉｉｉ．  Ｔ６５１Ｙ＋Ｎ５３５Ｌ；
ｊｊｊ．  Ｙ３４２Ｌ＋Ｅ４７５Ｄ＋Ｆ４７８Ｌ；
ｋｋｋ．  Ｔ３４３Ｎ＋Ｄ４１７Ｐ＋Ｋ５１８Ｑ；
ｌｌｌ．  Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ；
ｍｍｍ．  Ｉ３６３Ｖ＋Ｅ４７５Ｄ＋Ｙ４７６Ｖ；
ｎｎｎ．  Ｓ３６６Ｌ＋Ｇ５５３Ｓ＋Ｆ５５８Ｐ；
ｏｏｏ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ａ５４７Ｍ；
ｐｐｐ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｐ５４２Ｅ＋Ｎ５４５Ｋ；
ｑｑｑ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｐ５４２Ｅ＋Ｉ６５２Ｑ；
ｒｒｒ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｔ５２９Ｍ；
ｓｓｓ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ；
ｔｔｔ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ；
ｕｕｕ．  Ｔ６５１Ｙ＋Ｐ５４２Ｅ＋Ｎ５４５Ｋ；
ｖｖｖ．  Ｔ６５１Ｙ＋Ｐ５４２Ｅ＋Ｑ５４６Ｗ；
ｗｗｗ．  Ｔ６５１Ｙ＋Ｐ５４２Ｅ＋Ｓ３６６Ａ；
ｘｘｘ．  Ｔ６５１Ｙ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ；
ｙｙｙ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｉ＋Ｉ６５２Ｑ；
ｚｚｚ．  Ｔ６５１Ｙ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ；
ａａａａ．  Ｔ６４７Ｇ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｙ２２５Ｔ；
ｂｂｂｂ．  Ａ５４７Ｆ＋Ａ６１０Ｔ＋Ｓ３６６Ａ；
ｃｃｃｃ．  Ａ５４７Ｆ＋Ａ６１０Ｔ＋Ｙ２２５Ｉ；
ｄｄｄｄ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ａ５４７Ｆ；
ｅｅｅｅ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ；
ｆｆｆｆ．  Ｔ６４７Ｅ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ；
ｇｇｇｇ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ａ５４７Ｆ；
ｈｈｈｈ．  Ｎ５４５Ｋ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ；
ｉｉｉｉ．  Ｔ６４７Ｇ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｔ５２９Ｍ；
ｊｊｊｊ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ａ６１０Ｔ＋Ａ５４７Ｆ；
ｋｋｋｋ．  Ｍ６４１Ｙ＋Ｔ５２９Ｍ＋Ａ５４７Ｆ；
ｌｌｌｌ．  Ｔ６４７Ｇ＋Ｃ６２３Ｇ＋Ａ５４７Ｆ；
ｍｍｍｍ．  Ａ６１０Ｔ＋Ｉ２９５Ｗ＋Ｔ６５１Ｙ；
ｎｎｎｎ．  Ｖ６１５Ａ＋Ｍ５３１Ｙ＋Ｔ６４７Ｇ；
ｏｏｏｏ．  Ｓ３６６Ｌ＋Ｆ４７８Ｌ＋Ａ５９６Ｓ＋Ｌ６９０Ｍ；
ｐｐｐｐ．  Ｈ２２３Ａ＋Ｇ５５３Ｓ＋Ａ６４３Ｌ＋Ｆ６６２Ｉ；
ｑｑｑｑ．  Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ５２９Ｍ；
ｒｒｒｒ．  Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｎ６３５Ｄ；
ｓｓｓｓ．  Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｉ６５２Ｑ；
ｔｔｔｔ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ＋Ｔ５２９Ｍ；
ｕｕｕｕ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｓ３６５Ａ＋Ｐ３６８Ｇ＋Ｇ６０３Ｔ；
ｖｖｖｖ．  Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ６４７Ｇ；
ｗｗｗｗ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ＋Ａ５４７Ｙ；
ｘｘｘｘ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ａ５４７Ｍ＋Ｔ６４７Ｇ；
ｙｙｙｙ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｋ；
ｚｚｚｚ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｒ；
ａａａａａ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５５２Ｌ；
ｂｂｂｂｂ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｙ６２９Ｗ；
ｃｃｃｃｃ．  Ｎ５３５Ｉ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ５２９Ｍ；
ｄｄｄｄｄ．  Ｎ５３５Ｉ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｎ６３５Ｄ；
ｅｅｅｅｅ．  Ｎ５３５Ｉ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｉ６５２Ｑ；
ｆｆｆｆｆ．  Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ｃ６２３Ｇ；
ｇｇｇｇｇ．  Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ｉ６２８Ｙ；
ｈｈｈｈｈ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ａ５４７Ｍ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ｓ３６０Ｇ；
ｉｉｉｉｉ．  Ｎ５３５Ｉ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｉ６５２Ｑ＋Ｙ２２５Ｉ；
ｊｊｊｊｊ．  Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ｋ６５５Ｇ；
ｋｋｋｋｋ．  Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ｌ５４９Ｑ；
ｌｌｌｌｌ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ＋Ａ５４７Ｙ＋Ｋ６５５Ｇ；
ｍｍｍｍｍ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ６２９Ｗ；
ｎｎｎｎｎ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ；
ｏｏｏｏｏ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｆ；
ｐｐｐｐｐ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｋ６５５Ｆ；
ｑｑｑｑｑ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｎ５５２Ｌ；
ｒｒｒｒｒ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｒ＋Ｍ５３１Ａ；
ｓｓｓｓｓ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｒ＋Ｇ５３９Ｙ；
ｔｔｔｔｔ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｒ＋Ｖ６５８Ｌ；
ｕｕｕｕｕ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ；
ｖｖｖｖｖ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｎ５５２Ｌ；
ｗｗｗｗｗ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｉ６５２Ｇ；
ｘｘｘｘｘ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ；
ｙｙｙｙｙ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｎ５５２Ｍ
ｚｚｚｚｚ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｎ２２４Ｒ；
ａａａａａａ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｉ６２８Ｍ；
ｂｂｂｂｂｂ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ６５５Ａ；および
ｃｃｃｃｃｃ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｙ６２９Ｗ
から選択される。一実施形態においては、変化した特性は酵素活性である。一実施形態においては、変化した特性は忠実度である。一実施形態においては、変化した特性は処理能力である。一実施形態においては、変化した特性は伸長速度である。一実施形態においては、変化した特性は安定性である。一実施形態においては、変化した特性は溶解性である
。一実施形態においては、変化した特性は、ヌクレオチドポリリン酸に結合する能力、および／またはヌクレオチドポリリン酸を組み込む能力である。ヌクレオチドポリリン酸は、例えばヌクレオチド四リン酸、ヌクレオチド五リン酸、ヌクレオチド六リン酸、ヌクレオチド七リン酸、またはヌクレオチド八リン酸である。
【００１２】
[0013]一部の実施形態においては、Ｎ５３５Ｉ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｎ６３５Ｄ変異を有する配列番号２、または配列番号１もしくは２と比較して変化した酵素活性を有するバリアントポリメラーゼは、
ａ．  Ａ５４７Ｆ＋Ａ６１０Ｔ＋Ｙ２２５Ｉ；
ｂ．  Ｙ２２５Ｔ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ａ５４７Ｆ；
ｃ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ａ５４７Ｆ；
ｄ．  Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ａ６１０Ｔ；
ｅ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ；
ｆ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ａ５４７Ｆ；
ｇ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ａ６１０Ｔ＋Ａ５４７Ｆ；
ｈ．  Ｎ５４５Ｋ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ；
ｉ．  Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ａ５４７Ｆ；
ｊ．  Ａ６１０Ｔ＋Ｉ２９５Ｗ＋Ｔ６５１Ｙ；
ｋ．  Ｖ６１５Ａ＋Ｍ５３１Ｙ＋Ｔ６４７Ｇ；
ｌ．  Ｍ６４１Ｙ＋Ｔ５２９Ｍ＋Ａ５４７Ｆ；
ｍ．  Ｔ６４７Ｅ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ；
ｎ．  Ｔ６４７Ｇ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｔ５２９Ｍ；
ｏ．  Ｔ６４７Ｇ＋Ｃ６２３Ｇ＋Ａ５４７Ｆ；および
ｐ．  Ｔ６５１Ｙ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ。
から選択される。
【００１３】
[0014]一部の実施形態においては、バリアントポリメラーゼは、
ａ．  Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ；
ｂ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ；
ｃ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｔ５２９Ｍ＋Ｎ５３５Ｌ；
ｄ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ；
ｅ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ａ５４７Ｍ；
ｆ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｐ５４２Ｅ＋Ｉ６５２Ｑ；
ｇ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｐ５４２Ｅ＋Ｎ５４５Ｋ；
ｈ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｐ５４２Ｅ＋Ｔ６５１Ｙ；
ｉ．  Ｐ５４２Ｅ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ；
ｊ．  Ｐ５４２Ｅ＋Ｑ５４６Ｗ＋Ｔ６５１Ｙ；
ｋ．  Ｎ５３５Ｌ＋Ｔ６５１Ｙ；
ｌ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ；
ｍ．  Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ５２９Ｍ；
ｎ．  Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｎ６３５Ｄ；
ｏ．  Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｉ６５２Ｑ；
ｐ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ＋Ｔ５２９Ｍ；
ｑ．  Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ６４７Ｇ；
ｒ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ＋Ａ５４７Ｙ；
ｓ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ａ５４７Ｍ＋Ｔ６４７Ｇ；
ｔ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｉ＋Ｉ６５２Ｑ；
ｕ．  Ｎ５３５Ｉ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ５２９Ｍ；
ｖ．  Ｎ５３５Ｉ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｎ６３５Ｄ；
ｗ．  Ｎ５３５Ｉ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｉ６５２Ｑ；
ｘ．  Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ｃ６２３Ｇ；
ｙ．  Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ｉ６２８Ｙ；
ｚ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ａ５４７Ｍ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ｓ３６０Ｇ；
ａａ．  Ｎ５３５Ｉ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｉ６５２Ｑ＋Ｙ２２５Ｉ；
ｂｂ．  Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ｋ６５５Ｇ；
ｃｃ．  Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ｌ５４９Ｑ；
ｄｄ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ＋Ａ５４７Ｙ＋Ｋ６５５Ｇ；
ｅｅ．  Ｔ６４７Ｇ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｙ２２５Ｔ；
ｆｆ．  Ａ５４７Ｆ＋Ａ６１０Ｔ＋Ｓ３６６Ａ；
ｇｇ．  Ａ５４７Ｆ＋Ａ６１０Ｔ＋Ｙ２２５Ｉ；
ｈｈ．  Ｓ３６６Ａ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ａ５４７Ｆ；
ｉｉ．  Ｔ６５１Ｙ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ；
ｊｊ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ；
ｋｋ．  Ｔ６４７Ｅ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ；
ｌｌ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ａ５４７Ｆ；
ｍｍ．  Ｎ５４５Ｋ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ；
ｎｎ．  Ｔ６４７Ｇ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｔ５２９Ｍ；
ｏｏ．  Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ａ５４７Ｆ；
ｐｐ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ａ６１０Ｔ＋Ａ５４７Ｆ；
ｑｑ．  Ｍ６４１Ｙ＋Ｔ５２９Ｍ＋Ａ５４７Ｆ；
ｒｒ．  Ｔ６４７Ｇ＋Ｃ６２３Ｇ＋Ａ５４７Ｆ；
ｓｓ．  Ａ６１０Ｔ＋Ｉ２９５Ｗ＋Ｔ６５１Ｙ；
ｔｔ．  Ｖ６１５Ａ＋Ｍ５３１Ｙ＋Ｔ６４７Ｇ；
ｕｕ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｋ；
ｖｖ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｒ；
ｗｗ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５５２Ｌ；
ｘｘ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｙ６２９Ｗ；
ｙｙ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ６２９Ｗ；
ｚｚ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ；
ａａａ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｆ；
ｂｂｂ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｋ６５５Ｆ；
ｃｃｃ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｎ５５２Ｌ；
ｄｄｄ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｒ＋Ｍ５３１Ａ；
ｅｅｅ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｒ＋Ｇ５３９Ｙ；
ｆｆｆ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｒ＋Ｖ６５８Ｌ；
ｇｇｇ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ；
ｈｈｈ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｎ５５２Ｌ；
ｉｉｉ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｉ６５２Ｇ；
ｊｊｊ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ；
ｋｋｋ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｎ５５２Ｍｌｌｌ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｎ２２４Ｒ；
ｍｍｍ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｉ６２８Ｍ；
ｎｎｎ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ６５５Ａ；および
ｏｏｏ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｙ６２９Ｗ
から選択される。一部の実施形態においては、バリアントポリメラーゼは、配列番号１もしくは２、または親ポリメラーゼと比較して変化した酵素活性を有する。
【００１４】
[0015]一部の実施形態においては、Ｓ３６６Ａ＋Ｔ５２９Ｍ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ａ５４７Ｆ変異を有する配列番号２、または配列番号１もしくは２と比較して変化した酵素活性を有するバリアントポリメラーゼは、
ａ．  Ｙ２２５Ｌ／Ｆ／Ａ／Ｍ；
ｂ．  Ｍ５３１Ａ／Ｇ；
ｃ．  Ｇ５３９Ｙ；
ｄ．  Ｎ５５２Ｌ／Ｔ；
ｅ．  Ｙ６２９Ｗ／Ｋ；
ｆ．  Ｋ６５５Ｆ
から選択される。一実施形態においては、変化した特性は酵素活性である。一実施形態においては、変化した特性は忠実度である。一実施形態においては、変化した特性は処理能力である。一実施形態においては、変化した特性は伸長速度である。一実施形態においては、変化した特性は安定性である。一実施形態においては、変化した特性は溶解性である。一実施形態においては、変化した特性は、ヌクレオチドポリリン酸に結合する能力、および／またはヌクレオチドポリリン酸を組み込む能力である。ヌクレオチドポリリン酸は、例えばヌクレオチド四リン酸、ヌクレオチド五リン酸、ヌクレオチド六リン酸、ヌクレオチド七リン酸、またはヌクレオチド八リン酸である。
【００１５】
[0016]一部の実施形態においては、親ポリメラーゼは野生型Ｐｏｌ６（配列番号１）である。一部の実施形態においては、親ポリメラーゼは、Ｈｉｓタグを含むＰｏｌ６（配列番号２）である。一部の実施形態においては、親ポリメラーゼは、Ｓ３６６Ａ＋Ｔ５２９Ｍ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ／Ｒ変異を含む。一部の実施形態においては、親ポリメラーゼは、１つまたは複数の変異を含む配列番号１としてもよい。例えば、Ｓ３６６Ａ＋Ｔ５２９Ｍ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｒは、Ｓ３６６Ａ＋Ｔ５２９Ｍ＋Ａ５４７Ｆを親ポリメラーゼとして使用し、その後Ｎ５４５Ｒを加えたものである。
【００１６】
[0017]一部の実施形態においては、改変ポリメラーゼは、親ポリメラーゼよりも大きいｋｃｈｅｍを有する。一部の実施形態においては、改変ポリメラーゼは、親ポリメラーゼよりも小さいｋｏｆｆを有する。一部の実施形態においては、改変ポリメラーゼは、親ポリメラーゼよりも少なくとも１．５倍、２．０倍、または２．５倍大きいｋｃｈｅｍ／ｋｏｆｆ（すなわち、比）を有する。
【００１７】
[0018]本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体例は本発明の好ましい実施形態を示すが、この詳細な説明から本発明の範囲および趣旨内の様々な変化および改変が当業者に明らかになるので、詳細な説明および具体例は単に説明として提供するものであることを理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】[0019]置換アッセイにおいて使用する例示的な鋳型を示す図である。実施例３に関するものである。
【図２】[0020]本明細書においてポリリン酸の組み込み速度の測定に使用するｋｃｈｅｍアッセイの模式図である。実施例６に関するものである。
【図３】[0021]本明細書においてバリアントポリメラーゼの速度特性の測定に使用する、蛍光消光に基づくｋｏｆｆアッセイの概要を示す図である。実施例４に関するものである。
【図４】[0022]蛍光偏光に基づくｋｏｆｆアッセイの図示、および例示的なデータトレースを示す図である。実施例５に関するものである。
【図５】[0023]置換アッセイからのバリアントポリメラーゼの代表的なデータを示すグラフである。実施例３に関するものである。
【図６】[0024]蛍光偏光に基づくｋｏｆｆアッセイからの、２種のバリアントポリメラーゼの代表的なデータのグラフである。実施例５に関するものである。
【図７】[0025]二重層の上下のＨｅｐｅｓ７．５  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ３００ｍＭ、ＣａＣｌ２  ３ｍＭ、およびＴＣＥＰ５ｍＭにおける、アルファ溶血素ナノポアに連結したＰｏｌ６（Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ）−ＤＮＡ複合体による、１００ｍＶでのタグ付きチミンヌクレオチドの静的捕獲のトレースを示す図である。縦軸は、％開口チャネル電流（正規化）であり、横軸は秒単位の時間である。実施例８に関するものである。
【図８】[0026]二重層の上下のＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．５  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ３００ｍＭ、ＣａＣｌ２  ３ｍＭ、およびＴＣＥＰ５ｍＭにおける、アルファ溶血素ナノポアに連結したＰｏｌ６（Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ）−ＤＮＡ複合体を用いた、１００ｍＶでの静的捕獲実験の滞留時間対電流のプロットのグラフである。ｄＴＮＰタグ付きヌクレオチドの各捕獲の平均滞留時間は、１．２秒である。実施例８に関するものである。
【図９】[0027]蛍光消光に基づくｋｃｈｅｍアッセイ（図２を参照のこと）からの、バリアントポリメラーゼの代表的なデータのグラフである。あらかじめ形成させたポリメラーゼとフルオレセイン−ＤＮＡ鋳型の二元複合体を、Ｍｇ２＋の存在下で、Ｋｉｎｔｅｋストップトフローデバイスを使用して、飽和濃度のｄＣｎＰ−Ａｌｅｘａ５５５と急速に混合する。フルオレセインの蛍光をある時間にわたってモニターする。律速段階から見積もったｋｃｈｅｍは０．２ｓ−１である。ｘ軸は秒単位の時間（Ｔ）であり、ｙ軸は相対蛍光単位（ＲＦＵ）である。
【図１０】[0028]蛍光消光に基づくｋｏｆｆアッセイ（図３を参照のこと）からの、バリアントポリメラーゼの代表的なデータのグラフである。ポリメラーゼ、フルオレセイン−ＤＮＡ鋳型、およびｄＣｎＰ−Ａｌｅｘａ５５５のあらかじめ形成した三元複合体を、Ｃａ２＋存在下でプレインキュベートし、過剰な未変性ｄＣＴＰを用いて追跡した。フルオレセインの蛍光をある時間にわたってモニターした。これより測定したｋｏｆｆは０．０２８ｓ−１である。ｘ軸は秒単位の時間（Ｔ）であり、ｙ軸は相対蛍光単位（ＲＦＵ）である。
【図１１】[0029]ローリングサークルアッセイの増副産物を示すゲルの写真である。左端および右端のレーンは分子ラダーである。左から２番目のレーンはゼロ時点のものである。他の全てのレーンは、様々なポリメラーゼヒットの４０分時点のものである。実施例９に関するものである。
【図１２】[0030]成長しているＤＮＡ鎖にタグ付きヌクレオチドが組み込まれたときのタグ付きヌクレオチドの記録を与える電流変化を示すシーケンシングトレースを示す図である。鋳型ＤＮＡ配列、および、＞７０％の精度を示す新生鎖の召集配列も示されている（登場順に、それぞれ配列番号６〜８）。実施例１０に関するものである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
[0031]これより、以下の定義および例を使用して、単なる参照として本発明を詳細に説明する。本明細書において参照するあらゆる特許および刊行物は、このような特許および刊行物で開示されているあらゆる配列を含めて、参照によって本明細書に明示的に組み入れられる。
【００２０】
[0032]本明細書において別段の定めがない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と
同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、およびＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ、ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、ＮＹ（１９９１）により、本発明で使用する用語の多くの一般的な辞書が当業者に与えられる。本明細書において説明する方法および材料と類似または等価である任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を説明する。当技術分野の定義および用語について、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら、１９９３年が実施者らに特に向くものである。方法、プロトコールおよび試薬は様々であり得るので、本発明は、記載する特定の方法、プロトコールおよび試薬に限定されないことを理解するべきである。
【００２１】
[0033]数の範囲は、範囲を定める数を含める。約という用語は、本明細書においては、値のプラスまたはマイナス１０パーセント（１０％）を意味するよう使用する。例えば「約１００」は、９０〜１１０の間の任意の数を指す。
【００２２】
[0034]別段に示されていない限り、核酸は５’〜３’の方向でそれぞれ左から右に書き、アミノ酸配列はアミノからカルボキシの方向でそれぞれ左から右に書く。
[0035]本明細書において示している見出しは、本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではなく、本発明は、明細書を全体として参照によって理解され得る。したがって、直下で定義する用語は、明細書を全体として参照によってより充分に定義される。定義：
[0036]アミノ酸：本明細書において使用する場合、「アミノ酸」という用語は、広義には、ポリペプチド鎖に組み込まれ得る任意の化合物および／または物質を指す。一部の実施形態においては、アミノ酸は、一般構造Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。一部の実施形態においては、アミノ酸は、天然由来のアミノ酸である。一部の実施形態においては、アミノ酸は合成アミノ酸であり、一部の実施形態においては、アミノ酸はＤ−アミノ酸であり、一部の実施形態においては、アミノ酸はＬ−アミノ酸である。「標準アミノ酸」は、天然由来のペプチドにおいて一般に見出される２０種の標準的なＬ−アミノ酸のいずれかを指す。「非標準アミノ酸」は、合成により調製されるものであるか天然源から得られるものであるかにかかわらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。本明細書において使用する場合、「合成アミノ酸」は化学修飾アミノ酸を包含し、化学修飾アミノ酸としては、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）、および／または置換体が含まれるが、これらに限定されない。ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸および／またはアミノ末端アミノ酸を含めたアミノ酸は、それらの活性に悪影響を及ぼすことなく、メチル化、アミド化、アセチル化、および／または、他の化学物質での置換によって修飾することができる。アミノ酸は、ジスルフィド結合に関与することができる。「アミノ酸」という用語は、「アミノ酸残基」と互換的に使用され、遊離アミノ酸、および／またはペプチドのアミノ酸残基を指すことができる。その用語が遊離アミノ酸、またはペプチドの残基のいずれを指すかは、その用語が使用される文脈から明らかになる。本明細書においては、全てのアミノ酸残基配列は、左右の方向が、アミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向になっている式によって示していることに留意するべきである。
【００２３】
[0037]塩基対（ｂｐ）：本明細書において使用する場合、塩基対は、２本鎖ＤＮＡ分子におけるアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、またはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との結び付きを指す。
【００２４】
[0038]相補的：本明細書において使用する場合、「相補的」という用語は、塩基対形成による２本のポリヌクレオチド鎖の領域間、または２つのヌクレオチド間の配列相補性の
広範な概念を指す。アデニンヌクレオチドが、チミンまたはウラシルであるヌクレオチドと特異的な水素結合を形成（「塩基対形成」）することができることは公知である。同様に、シトシンヌクレオチドがグアニンヌクレオチドと塩基対形成することができることは公知である。
【００２５】
[0039]ＤＮＡ結合親和性：本明細書において使用する場合、「ＤＮＡ結合親和性」という用語は、典型的には、ＤＮＡ核酸に結合することにおけるＤＮＡポリメラーゼの活性を指す。一部の実施形態においては、ＤＮＡ結合活性は、２バンドシフトアッセイにおいて測定することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）の９．６３〜９．７５（核酸の末端標識について記載）を参照のこと。結合バッファー（リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）５０ｍＭ、グリセロール１０％、ＫＣｌ２５ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２５ｍＭ）約１０μｌ中に少なくとも約０．５μｇのポリペプチドを含有する反応混合物を調製する。反応混合物を１０分間、３７℃に加熱する。標識した２本鎖核酸約１×１０４〜５×１０４ｃｐｍ（または約０．５〜２ｎｇ）を反応混合物に加え、さらに１０分間インキュベートする。反応混合物を、０．５倍トリスホウ酸バッファー中の未変性ポリアクリルアミドゲルに載せる。反応混合物を室温で電気泳動に付す。ゲルを乾燥させ、標準的な方法を使用してオートラジオグラフィーに付す。標識した２本鎖核酸の移動度において検出可能な減少がある場合は、ポリペプチドと２本鎖核酸の間に結合複合体が形成していることを示す。このような核酸結合活性は、標準的な濃度測定法を使用して、最初の反応混合物における放射能の総量と比較した結合複合体における放射能の量を測定することにより、定量することができる。ＤＮＡ結合親和性を測定する他の方法は、当技術分野において公知である（例えば、Ｋｏｎｇら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３）：１９６５〜１９７５を参照のこと）。
【００２６】
[0040]伸長速度：本明細書において使用する場合、「伸長速度」という用語は、ＤＮＡポリメラーゼがポリマー鎖を伸ばす平均速度を指す。本明細書において使用する場合、高伸長速度は、２ｎｔ／ｓより大きい（例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０ｎｔ／ｓより大きい）伸長速度を指す。本出願において使用する場合、「伸長速度」、「延長速度」、および「組み込み速度」という用語は互換的に使用する。
【００２７】
[0041]酵素活性：本明細書において使用する場合、「酵素活性」という用語は、ＤＮＡポリメラーゼの特異性および効率を指す。ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性は「ポリメラーゼ活性」とも呼ばれ、典型的には、ポリヌクレオチドの鋳型特異的合成を触媒することにおけるＤＮＡポリメラーゼの活性を指す。ポリメラーゼの酵素活性は、当技術分野で公知の様々な技術および方法を用いて測定することができる。例えば、ポリメラーゼの段階希釈物を、希釈バッファー（例えば、Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、ｐＨ８．０  ２０ｍＭ、ＫＣｌ５０ｍＭ、ＮＰ４０  ０．５％、およびＴｗｅｅｎ−２０  ０．５％）中で調製することができる。各希釈物について５μｌを取り出し、ＴＡＰＳ（ｐＨ９．２５）２５ｍＭ、ＫＣｌ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ｄＡＴＰ０．２ｍＭ、ｄＧＴＰ０．２ｍＭ、ｄＴＴＰ０．２ｍＭ、ｄＣＴＰ０．１ｍＭ、活性化ＤＮＡ１２．５μｇ、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（０．０５μＣｉ／ｎｍｏｌ）１００μＭ、および滅菌脱イオン水を含有する反応混合物４５μｌに加えることができる。反応混合物を３７℃（または、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼでは７４℃）で１０分間インキュベートし、次いで反応物を４℃に急冷して、氷冷した６０ｍＭ  ＥＤＴＡ１０μｌを加えることによって停止させることができる。各反応混合物からアリコート２５μｌを取り出すことができる。組み込まれなかった放射能標識ｄＣＴＰを、ゲルろ過（Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ａｄｅｌｐｈｉａ、Ｎ．Ｊ．）によって各アリコートから取り出すことができる。カラム溶離液を、シンチレーション液（１ｍｌ）と混合することができる。シンチレーションカウンターを用いてカラム溶離液中の放射能を定量化して、ポリメラーゼによって合成された産物の量を決定する。ポリメラーゼ活性の１単位は、３０分間に１０ｎモルの産物を合成するために必要なポリメラーゼの量として定義することができる（Ｌａｗｙｅｒら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６４２７〜６４７）。ポリメラーゼ活性を測定する他の方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）を参照のこと）。
【００２８】
[0042]精製された：本明細書において使用する場合、「精製された」は、分子が、含有されている試料の少なくとも９０重量％、または少なくとも９５重量％、または少なくとも９８重量％の濃度で試料中に存在することを意味する。
【００２９】
[0043]単離された：「単離された」分子は、通常、例えば分子の自然環境で会合している少なくとも１種の他の分子から分離されている核酸分子である。単離された核酸分子としては、その核酸分子を通常発現する細胞に含有された核酸分子が挙げられるが、その核酸分子は、染色体外、またはその自然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【００３０】
[0044]相同性％：本明細書においては、「相同性％」という用語は、本明細書の「同一性％」という用語と互換的に使用し、本発明のポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸配列、または本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の間での、配列アライメントプログラムを使用して整列させた場合の核酸またはアミノ酸配列の同一性のレベルを指す。
【００３１】
[0045]例えば、本明細書において使用する場合、相同性８０％は、定義済みのアルゴリズムによって決定される配列同一性８０％と同じことを意味し、したがって所与の配列の相同体は、所与の配列ある長さにわたって８０％超の配列同一性を有する。配列同一性の例示的なレベルとしては、所与の配列、例えば本明細書に記載する本発明のポリペプチドのいずれか１つのコード配列との８０、８５、９０、９５、９８％以上の配列同一性が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
[0046]２つの配列間の同一性を決定するのに使用することができる例示的なコンピュータープログラムとしては、インターネット上で公開されている一連のＢＬＡＳＴプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、およびＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰ、およびＴＢＬＡＳＴＮが挙げられるが、これらに限定されない。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年、およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年、も参照のこと。
【００３３】
[0047]配列検索は、ＧｅｎＢａｎｋのＤＮＡ配列および他の公開データベースの核酸配列と比較して所与の核酸配列を評価する場合には、典型的にはＢＬＡＳＴＮプログラムを使用して行う。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＧｅｎＢａｎｋのタンパク質配列および他の公開データベースのアミノ酸配列に対して、全ての読み枠で翻訳されている核酸配列を検索することに好ましい。ＢＬＡＳＴＮとＢＬＡＳＴＸの両方は、１１．０のオープンギャップペナルティー、および１．０のエクステンディッドギャップペナルティーのデフォルトパラメーターを使用し、ＢＬＯＳＵＭ−６２マトリックスを利用して走らせる。（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２、１９９７年を参照のこと。）
[0048]２つ以上の配列間での「同一性％」を決定するための、選択された配列の好ましいアライメントは、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒバージョン１３．０．７のＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗプログラムを使用し、１０．０のオープンギャップペナルティー、０．１のエクス
テンディッドギャップペナルティーを含むデフォルトパラメーター、およびＢＬＯＳＵＭ３０類似度マトリックスを用いて動作させて行う。
【００３４】
[0049]改変ＤＮＡポリメラーゼ：本明細書において使用する場合、「改変ＤＮＡポリメラーゼ」という用語は、別の（すなわち、親）ＤＮＡポリメラーゼから生じ、親ＤＮＡポリメラーゼと比較して１つまたは複数のアミノ酸の変化（例えば、アミノ酸の置換、欠失または挿入）を含有するＤＮＡポリメラーゼを指す。一部の実施形態においては、本発明の改変ＤＮＡポリメラーゼは、天然由来のＤＮＡポリメラーゼ、または野生型ＤＮＡポリメラーゼから生じるか、またはそれから改変されている。一部の実施形態においては、本発明の改変ＤＮＡポリメラーゼは、組換えＤＮＡポリメラーゼまたは操作されたＤＮＡポリメラーゼから生じるか、またはそれから改変されている。組換えＤＮＡポリメラーゼまたは操作されたＤＮＡポリメラーゼとしては、キメラＤＮＡポリメラーゼ、融合ＤＮＡポリメラーゼ、または別の改変ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、改変ＤＮＡポリメラーゼは、親ポリメラーゼと比較して変更された表現型を少なくとも１つ有する。
【００３５】
[0050]変異：本明細書において使用する場合、「変異」という用語は、親配列に導入された変更を指し、その変更としては、置換、挿入、欠失（切り詰めを含める）が挙げられるが、これらに限定されない。変異の結果としては、親配列によってコードされるタンパク質では見出されない新しい特性、特質、機能、表現型、または形質の創造が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
[0051]変異体：本明細書において使用する場合、「変異体」という用語は、親タンパク質と比較した場合に変化した特性を示す改変タンパク質を指す。「バリアント」および「変異体」という用語は、本明細書において互換的に使用する。
【００３７】
[0052]野生型：本明細書において使用する場合、「野生型」という用語は、天然由来の供給源から単離された際に、その遺伝子または遺伝子産物の特性を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。
【００３８】
[0053]忠実度：本明細書において使用する場合、「忠実度」という用語は、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ重合の精度、または、鋳型ＤＮＡに結合している誤ったヌクレオチドに対する正しいヌクレオチドのｋｏｆｆの測定差異のいずれかを指す。ＤＮＡポリメラーゼの忠実度は、典型的には、エラー率（不正確なヌクレオチド、すなわち、鋳型依存的な方式で組み込まれていないヌクレオチドを組み込む頻度）によって測定する。ＤＮＡ重合の精度または忠実度は、ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性と３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の両方によって維持される。「高忠実度」という用語は、４．４５×１０−６変異／ｎｔ／倍加未満（例えば、４．０×１０−６、３．５×１０−６、３．０×１０−６、２．５×１０−６、２．０×１０−６、１．５×１０−６、１．０×１０−６、０．５×１０−６変異／ｎｔ／倍加未満）のエラー率を指す。ＤＮＡポリメラーゼの忠実度またはエラー率は、当技術分野で公知のアッセイを使用して測定することができる。例えば、ＤＮＡポリメラーゼのエラー率は、本明細書に記載するように試験するか、またはＪｏｈｎｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２０１０年５月；１８０４（５）：１０４１〜１０４８において記載されているように試験することができる。
【００３９】
[0054]ナノポア：本明細書において使用する場合、「ナノポア」という用語は概して、膜に形成された、または他の方法で膜に与えられた細孔、チャネル、または通路を指す。膜は、脂質二重層などの有機膜であっても、ポリマー材料で形成された膜などの合成膜であってもよい。膜はポリマー材料としてもよい。ナノポアは、例えば相補型金属酸化膜半
導体（ＣＭＯＳ）回路または電界効果トランジスター（ＦＥＴ）回路などの検出回路、または検出回路に連結された電極に隣接して、またはその近傍に配置してもよい。一部の例においては、ナノポアは、０．１ナノメートル（ｎｍ）〜約１０００ｎｍの桁の特徴的な幅または直径を有する。一部のナノポアはタンパク質である。アルファ溶血素、ＭｓｐＡは、タンパク質ナノポアの例である。
【００４０】
[0055]ヌクレオチド：本明細書において使用する場合、ＤＮＡまたはＲＮＡの単量体ユニットは、糖部分（ペントース）、リン酸、および窒素含有複素環塩基からなる。塩基はグリコシドの炭素（ペントースの１’炭素）を介して糖部分に連結され、その塩基と糖の組合せがヌクレオシドである。ヌクレオシドが、ペントースの３’位または５’位に結合したリン酸基を含有する場合、それはヌクレオチドと呼ばれる。作用的に連結されたヌクレオチドの配列は、本明細書においては典型的に「塩基配列」または「ヌクレオチド配列」と呼び、本明細書においては、左から右への方向が、５’末端から３’末端への従来の方向になっている式によって表す。本明細書において使用する場合、「改変ヌクレオチド」は、ヌクレオチドポリリン酸、例えば、ヌクレオチド３、４、５、６、７、または８リン酸を指す。
【００４１】
[0056]オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド：本明細書において使用する場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上、好ましくは３つ超のデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを含む分子として定義される。その正確なサイズは多くの因子に依存し、その因子はさらにはオリゴヌクレオチドの最終的な機能または用途に依存することになる。オリゴヌクレオチドは、合成によって、またはクローニングによって得ることができる。本明細書において使用する場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、鎖内で共有結合したヌクレオチド単量体で構成されたポリマー分子を指す。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）は、ポリヌクレオチドの例である。
【００４２】
[0057]ポリメラーゼ：本明細書において使用する場合、「ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドの重合を触媒する（すなわち、ポリメラーゼ活性）酵素を指す。通常、その酵素は、ポリヌクレオチドの鋳型配列にアニーリングしたプライマーの３’末端で合成を開始し、鋳型鎖の５’末端へ進行することになる。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシヌクレオチドの重合を触媒する。
【００４３】
[0058]プライマー：本明細書において使用する場合、「プライマー」という用語は、核酸鎖に相補的なプライマー延長産物の合成が誘導される条件下に置かれた場合、例えば、好適な温度における適切なバッファー（「バッファー」は、ｐＨ、イオン強度、補助因子などを含む）中の４種の異なるヌクレオチド三リン酸および熱安定性酵素の存在下で、核酸合成の開始点の役割を果たすことができる、天然に存在しているものであっても合成によって生成されたものであってもよいオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、増幅効率を最大にするために１本鎖であることが好ましいが、代替的に２本鎖であってもよい。２本鎖の場合、プライマーは、まず、その鎖が分離するよう処理し、その後、延長産物の調製に使用する。プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドであることが好ましい。プライマーは、熱安定性酵素の存在下での延長産物の合成の出発物質となるのに充分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源、および方法の用途を含めた多くの因子に依存することになる。例えば、標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的には１５〜２５ヌクレオチドを含有するが、それよりも多いか、または少ないヌクレオチドを含有することができる。短いプライマー分子は概して、鋳型と充分に安定なハイブリッド複合体を形成するにはより低い温度を必要とする。
【００４４】
[0059]処理能力：本明細書において使用する場合、「処理能力」は、鋳型に付いてとど
まり、複数の改変反応を行うポリメラーゼの能力を指す。「改変反応」としては、重合、およびエキソヌクレアーゼ的切断が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態においては、「処理能力」は、成長しているＤＮＡ鎖から酵素が途中で解離することなく一連の重合工程を行うＤＮＡポリメラーゼの能力を指す。典型的には、ＤＮＡポリメラーゼの「処理能力」は、成長しているＤＮＡ鎖からＤＮＡポリメラーゼが途中で解離することなく重合または改変されるヌクレオチドの長さ（例えば、２０ｎｔ、３００ｎｔ、０．５〜１ｋｂ以上）によって測定する。「処理能力」は、ポリメラーゼの性質、ＤＮＡ鋳型の配列、および反応条件、例えば、塩濃度、温度、または特定のタンパク質の存在に依存し得る。本明細書において使用する場合、「高処理能力」という用語は、鋳型との１会合／解離当たり２０ｎｔ超（例えば、４０ｎｔ超、６０ｎｔ超、８０ｎｔ超、１００ｎｔ超、１２０ｎｔ超、１４０ｎｔ超、１６０ｎｔ超、１８０ｎｔ超、２００ｎｔ超、２２０ｎｔ超、２４０ｎｔ、２６０ｎｔ超、２８０ｎｔ超、３００ｎｔ超、３２０ｎｔ超、３４０ｎｔ超、３６０ｎｔ超、３８０ｎｔ超、４００ｎｔ超、またはそれ以上）の処理能力を指す。処理能力は、本明細書およびＷＯ０１／９２５０１Ａ１（ＭＪ  Ｂｉｏｗｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、２００１年１２月０６日公開）において定義された方法に従って測定することができる。
【００４５】
[0060]合成：本明細書において使用する場合、「合成」という用語は、鋳型依存的な方式で、新しいポリヌクレオチド鎖を作製するか、または現存するポリヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を伸長する任意のインビトロ方法を指す。本発明による合成には、ポリメラーゼを使用してポリヌクレオチド鋳型配列の複製物の数を増加させる増幅が含まれる。ポリヌクレオチドの合成（例えば、増幅）の結果、ヌクレオチドがポリヌクレオチド（すなわちプライマー）に組み込まれ、それによってポリヌクレオチド鋳型に相補的な新しいポリヌクレオチド分子が形成される。形成されたポリヌクレオチド分子およびその鋳型は、さらなるポリヌクレオチド分子を合成するための鋳型として使用することができる。本明細書において使用する場合、「ＤＮＡ合成」には、ＰＣＲ、ポリヌクレオチドの標識（すなわち、プローブおよびオリゴヌクレオチドプライマーに対して）、ポリヌクレオチドシーケンシングが含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
[0061]鋳型ＤＮＡ分子：本明細書において使用する場合、「鋳型ＤＮＡ分子」という用語は、例えばプライマー延長反応において、ＤＮＡポリメラーゼによって相補的な核酸鎖が合成される核酸鎖を指す。
【００４７】
[0062]鋳型依存的な方式：本明細書において使用する場合、「鋳型依存的な方式」という用語は、鋳型依存的なプライマー分子の延長（例えば、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成）を含むプロセスを指す。「鋳型依存的な方式」という用語は、典型的には、新たに合成されるポリヌクレオチド鎖の配列が、相補的な塩基対形成の周知の規則によって規定される、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリヌクレオチドの合成を指す（例えば、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ、第４版、Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．（１９８７）を参照のこと）。
【００４８】
[0063]タグ：本明細書において使用する場合、「タグ」という用語は、原子もしくは分子、または、原子もしくは分子の集団としてもよい検出可能な部分を指す。タグは、光学的、電気化学的、磁気的、または静電的（例えば、誘導的、容量的）性状を示すことができ、その性質は、ナノポアを利用して検出することができる。
【００４９】
[0064]タグ付きヌクレオチド：本明細書において使用する場合、「タグ付きヌクレオチド」という用語は、タグが付けられたヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドを指す。タグ
は、糖、リン酸（もしくはポリリン酸）、または塩基に共有結合で付けてもよい。タグは、末端リン酸上にあってもよい。
【００５０】
[0065]ベクター：本明細書において使用する場合、「ベクター」という用語は、異なる宿主細胞間の移動用に設計された核酸構造物を指す。「発現ベクター」は、外来性細胞において異種ＤＮＡ断片を組み込んで発現する能力を有するベクターを指す。多くの原核生物発現ベクターおよび真核生物発現ベクターが市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者に知られている。
【００５１】
[0066]本明細書において示すポリメラーゼバリアントは、ＷＯ２０１３／１８８８４１（Ｇｅｎｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｐ  Ｓｅｔ−Ｕｐ  ａｎｄ
Ｈｉｇｈ−Ａｃｃｕｒａｃｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、２０１３年１２月１９日公開）において記載されている、チップを用いたポリヌクレオチドシーケンシングに有用である。
【００５２】
[0067]ＤＮＡのシーケンシングに用いられるポリメラーゼの望ましい特性は、以下のとおりである。
ａ．遅いｋｏｆｆ（改変ヌクレオチドに対して）
ｂ．速いｋｏｎ（改変ヌクレオチドに対して）
ｃ．高忠実度
ｄ．低エキソヌクレアーゼ活性
ｅ．ＤＮＡ鎖置換
ｆ．より速いｋｃｈｅｍ（改変ヌクレオチド基質に対して）
ｇ．向上した安定性
ｈ．処理能力
ｉ．塩耐性
ｊ．ナノポアへの取付けの適合性
ｋ．４、５、６、７、または８個のリン酸を有するヌクレオチドポリリン酸、例えばヌクレオチド四リン酸、ヌクレオチド五リン酸、ヌクレオチド六リン酸、ヌクレオチド七リン酸、またはヌクレオチド八リン酸を組み込む能力
ｌ．シーケンシング精度
ｍ．長いリード長、すなわち長時間連続性解読。
命名法
[0068]本明細書および特許請求の範囲において、アミノ酸残基の従来の１文字表記および３文字表記を使用する。
【００５３】
[0069]参照を容易にするため、本出願のポリメラーゼバリアントは、以下の命名法を使用して記載する。
[0070]元のアミノ酸（１つまたは複数）：位置（１つまたは複数）：置換したアミノ酸（１つまたは複数）。この命名法によれば、例えば、位置２４２におけるセリンのアラニンによる置換は、
Ｓｅｒ２４２ＡｌａまたはＳ２４２Ａ
として示す。
【００５４】
[0071]複数の変異はプラス記号によって分ける。すなわち、
Ａｌａ３０Ａｓｐ＋Ｇｌｕ３４ＳｅｒまたはＡ３０Ｎ＋Ｅ３４Ｓ
は、位置３０および３４における、アラニンとグルタミン酸をそれぞれアスパラギンとセリンに置換する変異を表す。
【００５５】
[0072]１つまたは複数の代替アミノ酸残基を所与の位置に挿入することができる場合は
、Ａ３０Ｎ／Ｅ、またはＡ３０ＮもしくはＡ３０Ｅとして示す。
[0073]別段に述べられていない限り、残基の番号は、配列番号２の残基の番号付けに対応する。
ポリメラーゼの部位特異的突然変異誘発
[0074]クロストリジウムファージｐｈｉＣＰＶ４野生型配列は、本明細書において示しており（配列番号３、核酸コード領域およびＨｉｓタグ；配列番号１、タンパク質コード領域）、他の場所で入手可能である（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓまたはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦＨ２７１１３）。
【００５６】
[0075]点変異は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ２キット（Ｓｔａｔｅｇｅｎｅ／Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、製造業者の指示書に従って導入することができる。
【００５７】
[0076]プライマーは、営利会社、例えばＩＤＴ  ＤＮＡに注文することができる。
ナノポア構築および挿入
[0077]本明細書において記載する方法は、ポリメラーゼがナノポアに付いたナノポアを使用することができる。一部の場合においては、（例えば、各ナノポアで１つのみの核酸分子がシーケンシングされるように）ナノポア１つ当たりただ１つのポリメラーゼを有することが望ましい。しかしながら、例えばアルファ溶血素（ａＨＬ）を含めた多くのナノポアは、複数のサブユニット（例えば、ａＨＬでは７サブユニット）を有する多量体タンパク質であり得る。サブユニットは、同じポリペプチドの同一複製物であり得る。本明細書においては、無改変サブユニット（例えば、ａ−ＨＬ）に対する改変サブユニット（例えば、ａ−ＨＬバリアント）の規定された比を有する多量体タンパク質（例えば、ナノポア）を提供する。本明細書においては、無改変サブユニットに対する改変サブユニットの規定された比を有する多量体タンパク質（例えば、ナノポア）を作製する方法も提供する。
【００５８】
[0078]ＷＯ２０１４／０７４７２７（Ｇｅｎｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の図２７を参照すると、複数のサブユニットを有するタンパク質を構築する方法は、複数の第１のサブユニット２７０５を用意すること、および複数の第２のサブユニット２７１０を用意することを含み、第２のサブユニットは第１のサブユニットと比較すると改変されている。一部の場合においては、第１のサブユニットは野生型（例えば、天然源から精製したもの、または組換えで作製したもの）である。第２のサブユニットは、任意の好適な方法で改変することができる。一部の場合においては、第２のサブユニットは、（例えば、融合タンパク質として）付けられたタンパク質（例えば、ポリメラーゼ）を有する。
【００５９】
[0079]改変サブユニットは、化学反応性部分（例えば、連結の形成に好適なアジド基またはアルキン基）を含むことができる。一部の場合においては、当該方法は、反応（例えば、Ｃｌｉｃｋ化学付加環化）を行って、実在物（例えば、ポリメラーゼ）を化学反応性部分に付けることをさらに含む。
【００６０】
[0080]当該方法は、第１のサブユニットを第２のサブユニット２７１５と第１の比で接触させて、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを有する複数のタンパク質２７２０を形成させることをさらに含むことができる。例えば、ポリメラーゼを付けるのに好適な反応基を有する改変ａＨＬサブユニット１部を、野生型ａＨＬサブユニット６部と混合することができる（すなわち、第１の比は１：６である）。複数のタンパク質は、第２のサブユニットに対する第１のサブユニットの複数の比を有することができる。例えば、混合したサブユニットは、改変サブユニット：無改変サブユニットの化学量論比（例えば、１：６、２：５、３：４）の分布を有するいくつかのナノポアを形成させることができる。
【００６１】
[0081]一部の場合においては、タンパク質は、サブユニットを単純に混合することによって形成させる。例えばａＨＬナノポアの場合においては、界面活性剤（例えば、デオキシコール酸）は、ａＨＬ単量体が細孔構造をとることを引き起こすことができる。ナノポアは、脂質（例えば、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）または１，２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤｏＰｈＰＣ））、および中温（例えば、約１００℃未満）を用いて形成させることもできる。一部の場合においては、ＤＰｈＰＣを緩衝溶液と混合すると、大きな多重膜ベシクル（ＬＭＶ）が生じ、この溶液にａＨＬサブユニットを加えて、混合物を４０℃で３０分間インキュベートすると、細孔が形成する。
【００６２】
[0082]異なる２種類のサブユニット（例えば、天然野生型タンパク質と、単一点変異を含有することができる第２のａＨＬ単量体）を使用する場合、得られるタンパク質は、（例えば野生型と変異体タンパク質の）混合化学量論比を有することができる。これらのタンパク質の化学量論比は、細孔形成反応において使用する２種のタンパク質の濃度比に依存した式に従うことができる。この式は以下のとおりである。
１００Ｐｍ＝１００［ｎ！／ｍ！（ｎ−ｍ）！］・ｆｍｕｔｍ・ｆｗｔｎ〜ｍ、式中
Ｐｍ＝ｍ個の変異体サブユニットを有する細孔の確率
ｎ＝サブユニットの総数（例えば、ａＨＬでは７個）
ｍ＝「変異体」サブユニットの数
ｆｍｕｔ＝一緒に混合した変異体サブユニットの割合または比
ｆｗｔ＝一緒に混合した野生型サブユニットの割合または比
[0083]当該方法は、複数のタンパク質を分画して、第２のサブユニット２７２５に対する第１のサブユニットの第２の比を有するタンパク質の割合を増やすことをさらに含むことができる。例えば、ただ１つの改変サブユニットを有するナノポアタンパク質を単離することができる（例えば、第２の比は１：６）。しかしながら、いずれの第２の比も好適である。第２の比の分布も分画することができ、例えば、１つまたは２つのいずれかの改変サブユニット有するタンパク質の割合を増やすことができる。ＷＯ２０１４／０７４７２７の図２７に示されているように、タンパク質を形成するサブユニットの総数は７個であるとは限らない（例えば、異なるナノポアを使用することができ、または６個のサブユニットを有するアルファ溶血素ナノポアが形成し得る）。一部の場合においては、１つのみの改変サブユニットを有するタンパク質の割合を増やす。このような場合においては、第２の比は、第１のサブユニット（ｎ−１）個当たり、第２のサブユニット１個であり、ｎはタンパク質を構成するサブユニットの数である。
【００６３】
[0084]第１の比は、第２の比と同じものとすることができるが、必要とされるものではない。一部の場合においては、変異単量体を有するタンパク質は、変異サブユニットを有しないタンパク質よりも低い効率で形成し得る。この場合は、第１の比は、第２の比よりも大きいものとすることができる（例えば、変異サブユニット１：無変異サブユニット６の第２の比がナノポアで所望される場合、好適な数の１：６タンパク質を形成させるには、１：６よりも大きい比でサブユニットを混合することが必要とされてもよい）。
【００６４】
[0085]異なる第２のサブユニット比を有するタンパク質は、分離において、異なる挙動を示す（例えば、異なる保持時間を有する）ことができる。一部の場合においては、タンパク質は、イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを使用して分画する。第１および第２のサブユニットは、改変を除いては同一とすることができるので、タンパク質における改変の数は、分離の根拠として役割を果たすことができる。一部の場合においては、第１または第２のサブユニットのいずれかは、分画を可能にするか、または分画の効率を改良するよう、（例えば、改変に加
えて）精製タグを有する。一部の場合においては、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、ストレプトアビジンタグ（Ｓｔｒｅｐタグ）、または他のペプチドタグを使用する。一部の例においては、第１および第２のサブユニットはそれぞれ異なるタグを含み、分画工程では、各タグに基づき分画される。Ｈｉｓタグの場合には、低いｐＨでタグに電荷を生じさせる（ヒスチジン残基は、側鎖のｐＫａ未満で正に荷電する）。他のものと比較してａＨＬ分子の１つにおいて電荷が有意に異なることにより、イオン交換クロマトグラフィーを使用して、０、１、２、３、４、５、６、または７個の「電荷タグ付き」ａＨＬサブユニットを有するオリゴマーを分離することができる。原則的に、この電荷タグは、一定の電荷を運ぶ任意のアミノ酸が糸状に連なるものとすることができる。図２８および図２９では、Ｈｉｓタグに基づくナノポアの分画の例が示されている。図２８では、２８０ナノメートルにおける紫外吸光度、２６０ナノメートルにおける紫外吸光度、および伝導率のプロットが示されている。ピークは、改変サブユニットと無改変サブユニットの様々な比を有するナノポアに対応する。ＷＯ２０１４／０７４７２７の図２９では、ＨｉｓタグとＳｔｒｅｐタグの両方を使用した、ａＨＬナノポアおよびその変異体の分画が示されている。
【００６５】
[0086]一部の場合においては、分画後に、実在物（例えば、ポリメラーゼ）をタンパク質に付ける。タンパク質はナノポアとすることができ、実在物はポリメラーゼとすることができる。一部の例においては、当該方法は、第２の比のサブユニットを有するタンパク質を二重層に挿入することをさらに含む。
【００６６】
[0087]一部の状況においては、ナノポアは、複数のサブユニットを含むことができる。ポリメラーゼは、サブユニットの１つに付けることができ、サブユニットの少なくとも１つかつ全部未満が、第１の精製タグを含む。一部の例においては、ナノポアはアルファ溶血素またはそのバリアントである。一部の例においては、サブユニットの全てが第１の精製タグまたは第２の精製タグを含む。第１の精製タグは、（例えば、ポリメラーゼが付いたサブユニットにおける）ポリヒスチジンタグとすることができる。
ナノポアに付けられたポリメラーゼ
[0088]一部の場合においては、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、ナノポアに付けられ、かつ／または、ナノポアの近傍に配置される。ポリメラーゼは、ナノポアが膜に組み込まれる前または後に、ナノポアに付けることができる。一部の例においては、ナノポアおよびポリメラーゼは融合タンパク質（すなわち、単一のポリペプチド鎖）である。
【００６７】
[0089]ポリメラーゼは、任意の好適な方法でナノポアに付けることができる。一部の場合においては、ポリメラーゼは、ナノポア（例えば、溶血素）タンパク質単量体に付け、その後、（例えば、ポリメラーゼが付いていないナノポア（例えば、溶血素）単量体６つに対し、ポリメラーゼが付いた単量体１つの比で）全体のナノポア七量体を構築する。次いでナノポア七量体を膜に挿入することができる。
【００６８】
[0090]ポリメラーゼをナノポアに付ける別の方法は、溶血素単量体にリンカー分子を付けるか、または溶血素単量体を、取付け部位を有するよう変異させること、ならびに、その後、（例えば、リンカーおよび／または取付け部位を有しない溶血素単量体６つに対し、リンカーおよび／または取付け部位を有する単量体１つの比で）全体のナノポア七量体を構築することを含む。次いでポリメラーゼを、（例えば、膜への挿入前に、大量で）取付け部位または取付けリンカーに付けることができる。ポリメラーゼは、（例えば、七量体の）ナノポアを膜に形成させた後で、取付け部位または取付けリンカーに付けることもできる。一部の場合においては、複数のナノポア−ポリメラーゼペアを、バイオチップの（例えば、ウェルおよび／または電極に配置した）複数の膜に挿入する。一部の例においては、ポリメラーゼのナノポア複合体への取付けは、各電極上のバイオチップにおいて行う。
【００６９】
[0091]ポリメラーゼは、任意の好適な化学作用（例えば、共有結合および／またはリンカー）を用いてナノポアに付けることができる。一部の場合においては、ポリメラーゼは、分子ステープル（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔａｐｌｅ）を用いてナノポアに付ける。一部の例においては、分子ステープルは、３種のアミノ酸配列（リンカーＡ、Ｂ、およびＣで示す）を含む。リンカーＡは溶血素単量体から延びることができ、リンカーＢはポリメラーゼから延びることができ、その場合にリンカーＣは、リンカーＡとリンカーＢを（例えば、リンカーＡとリンカーＢの両方に巻き付くことによって）つなぐことができ、したがってポリメラーゼをナノポアとつなぐことができる。リンカーＣは、リンカーＡまたはリンカーＢの一部分となるよう構築することもでき、したがってリンカー分子の数は減る。
【００７０】
[0092]一部の例においては、ポリメラーゼは、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ（商標）化学を用いてナノポアに連結する。Ｓｏｌｕｌｉｎｋ（商標）は、ＨｙＮｉｃ（６−ヒドラジノ−ニコチン酸、芳香族ヒドラジン）と４ＦＢ（４−ホルミル安息香酸エステル、芳香族アルデヒド）の間の反応とすることができる。一部の例においては、ポリメラーゼは、Ｃｌｉｃｋ化学（例えば、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）を用いてナノポアに連結する。一部の場合においては、溶血素分子にジンクフィンガー変異を導入し、次に分子（例えば、ＤＮＡ中間体分子）を使用してポリメラーゼを溶血素のジンクフィンガー部位に連結する。
【００７１】
[0093]ポリメラーゼをナノポアに付けることにおいて使用することができる他のリンカーは、直接の遺伝子連結（例えば、（ＧＧＧＧＳ）１−３（配列番号４）アミノ酸リンカー）、トランスグルタミナーゼ媒介連結（例えば、ＲＳＫＬＧ（配列番号５））、ソルターゼ媒介連結、およびシステイン修飾による化学連結である。本明細書において有用であると考えられる具体的なリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）１−３（配列番号４）、Ｎ末端のＫタグ（ＲＳＫＬＧ（配列番号５））、ΔＴＥＶ部位（１２〜２５）、ΔＴＥＶ部位＋ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのＮ末端（１２〜４９）である。
装置のセットアップ
[0094]ナノポアは、集積回路などの検出回路の検出電極に隣接して配置された膜に形成するか、または他の方法で埋め込んでもよい。集積回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）としてもよい。一部の例においては、集積回路は電界効果トランジスターまたは相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）である。検出回路は、ナノポアを有するチップもしくは他のデバイスに位置するか、または、チップもしくはデバイスの外部に、例えばオフチップ配置などで位置することができる。半導体は任意の半導体とすることができ、ＩＶ族半導体（例えば、ケイ素）、およびＩＩＩ−Ｖ族半導体（例えば、ヒ化ガリウム）が含まれるが、これらに限定されない。ヌクレオチドまたはタグを検出するための装置およびデバイスのセットアップについては、例えば、ＷＯ２０１３／１２３４５０を参照のこと。
【００７２】
[0095]細孔を用いたセンサー（例えば、バイオチップ）は、単一分子の電子照合に使用することができる。細孔を用いたセンサーは、検出電極に隣接して、またはその近傍に配置された膜に形成された本開示のナノポアを含むことができる。センサーは対電極を含むことができる。膜は、トランス側（すなわち、検出電極に面する側）およびシス側（すなわち、対電極に面する側）を含む。
【００７３】
[0096]この後の実験に関する開示においては、以下の略記が適用される：ｅｑ（当量）；Ｍ（モル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；Ｎ（規定）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｋｇ（キログラム）；μｇ（マイクログラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；℃（摂氏度）；ｈ（時間）；ｍｉｎ（分）；ｓｅｃ（秒）；ｍｓｅｃ（ミリ秒）。
【実施例】
【００７４】
[0097]本発明を以下の実施例においてさらに説明する。実施例は、いかなる方法でも、特許請求する本発明の範囲を限定することを意図するものではない。添付の図は、本発明の明細書および説明の一部をなす部分としてみなされることを意図している。全ての参考文献は、そこに記載されている全てが参照によって本明細書に明確に組み込まれる。以下の実施例は、説明するために提供するものであり、特許請求する本発明を限定するために提供するものではない。
【実施例１】
【００７５】
定方向突然変異誘発
[0098]この実施例では、ｐｏｌ６ポリメラーゼへの所望の位置での変異導入を説明している。
【００７６】
[0099]Ｈｉｓタグ付き野生型ｐｏｌ６をコードするＤＮＡを、商業的供給源（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入した。配列は、シーケンシングによって確かめた。
【００７７】
[00100]変異体スクリーニング用に、ポリメラーゼをそのまま発現させた（Ｎ末端Ｈｉ
ｓ−Ｐｏｌ６）。ｐｏｌがチップに付くことを試験するため、ｐｏｌ６のＮ末端またはＣ末端にＳｐｙＣａｔｃｈｅｒドメインを操作して入れた。
【００７８】
[00101]Ｐｏｌ６−ヌクレオチド結合に影響を与える合理的位置は、公知の結晶構造の
ホモロジーモデリングに基づいて同定した。
[00102]最初のスクリーニング用に、合理的位置の各々を、Ｑ５突然変異誘発プロトコ
ールを用いて、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、またはＭｅｔに変異させた。
【００７９】
[00103]各突然変異誘発反応用のプライマーは、ＮＥＢ塩基チェンジャープロトコール
を用いて設計し、ＩＤＴに９６ウェルプレートフォーマットで注文した。
[00104]順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、ＮＥＢから購入したＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）を使用して、ハイスループット（ＨＴＰ）フォーマットで５’リン酸化した。典型的な２５μｌ反応物は、１０μＭのプライマー１５μｌ、５倍反応バッファー（ＮＥＢより）５μｌ、ＰＮＫ酵素１．２５μｌ、水３．７５μｌを含有した。反応は３７℃で３０分間行い、酵素は６５℃で２０分間熱失活させた。
【００８０】
[00105]ＰＣＲ突然変異誘発は、ＮＥＢからのＱ５ＤＮＡポリメラーゼを使用して行っ
た。典型的な２５μｌ反応物は、Ｑ５バッファー５μｌ、ＧＣエンハンサー５μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ０．５μｌ、１０μＭリン酸化突然変異誘発順方向プライマーおよび逆方向プライマー１．２５μｌ、Ｑ５ポリメラーゼ０．２５μｌ、および５ｎｇ／ｍｌ野生型Ｐｏｌ６鋳型、すなわちＨｉｓ−Ｐｏｌ６  １μｌ、およびＨ２Ｏ１０．７５μｌを含有した。
【００８１】
[00106]ＰＣＲが完了したら、Ｄｐｎ１  ０．５μｌをＰＣＲミックス２５μｌに加え
、３７℃で１時間インキュベートした。
[00107]Ｄｐｎ１で処理したＰＣＲ産物２．５μｌをＢｌｕｎｔ／ＴＡリガーゼマスタ
ーミックス２．５μｌに加える。室温で１時間インキュベートした。
【００８２】
[00108]ライゲーションミックス１μｌを、９６ウェルＢＬ２１ＤＥ３細胞（ＥＭＤ  
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）２０μｌに加え、氷上で５分間インキュベートする。
[00109]ＰＣＲデバイスを使用して、正確に３０秒間、４２℃で熱ショックを与え、氷
上に２分間置く。
【００８３】
[00110]ＳＯＣ８０μｌを加え、３７℃のインキュベーターで１時間、振盪せずにイン
キュベートする。
[00111]ＳＯＣまたは超純水１００μｌを加え、カナマイシン５０〜１００μｇ／ｍｌ
を含む４８ウェルＬＢ寒天プレートに蒔く。
【実施例２】
【００８４】
発現および精製
[00112]以下の実施例では、ｐｏｌ６バリアントをハイスループット法を用いてどのよ
うに発現させて精製したかを詳しく述べる。
【００８５】
[00113]ｐＤ４４１ベクター（発現プラスミド）中のバリアントをコードするＤＮＡを
、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）コンピテント細胞に形質転換し、グリセロールストックを作製した。グリセロールストックから取った微量から開始し、グルコース０．２％およびカナマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢでスターター培養物１ｍｌを約８時間増殖させた。対数期のスターター培養物２５μｌを、９６ディープウェルプレートの発現培地１ｍｌ（グルコース０．２％、リン酸カリウム５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ、およびカナマイシン１００μｇ／ｍｌを追加したＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）自己誘導培地）に移す。プレートを、２５０〜３００ｒｐｍで振盪しながら２８℃で３６〜４０時間インキュベートした。
【００８６】
[00114]次に細胞を、４℃で３０分間、３２００×ｇにて遠心分離して収集した。デカ
ントして培地を除き、細胞ペレットをあらかじめ冷却した溶解バッファー２００μｌ（リン酸カリウム２０ｍＭ  ｐＨ７．５、ＮａＣｌ１００ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．５％、ＴＣＥＰ５ｍＭ、イミダゾール１０ｍＭ、ＰＭＳＦ１ｍＭ、１×Ｂｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒ、リゾチーム１００μｇ／ｍｌ、およびプロテアーゼ阻害剤）中で再懸濁させ、穏やかに撹拌しながら室温で２０分間インキュベートした。次いで１０倍ストックからの２０μｌを、最終濃度１００μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ  Ｉに加え、氷上で５〜１０分間インキュベートして溶解液を生成させる。溶解液に、１Ｍリン酸カリウム２００μｌ、ｐＨ７．５（最終濃度は、溶解液４００μｌ中の約０．５Ｍリン酸カリウムとなる）を追加し、４℃で１０分間、約１５００ｒｐｍにて遠心分離することによりＰａｌｌフィルタープレート（部品番号５０５３、３ミクロンフィルター）でろ過する。次いで、澄んだ溶解液を、平衡化した９６ウェルＨｉｓ−Ｐｕｒコバルトプレート（Ｐｉｅｒｃｅ部品番号９００９５）に入れ、１５〜３０分間結合させた。
【００８７】
[00115]流出液（ＦＴ）を、５００×Ｇにて３分間遠心分離することによって収集した
。次いでＦＴを４００μｌの洗浄バッファー１（リン酸カリウム０．５Ｍ  ｐＨ７．５、ＮａＣｌ１Ｍ、ＴＣＥＰ５ｍＭ、イミダゾール２０ｍＭ、およびＴｗｅｅｎ２０  ０．５％）で３回洗浄した。次いでＦＴを４００μｌの洗浄バッファー２（トリス５０ｍＭ  ｐＨ７．４、ＫＣｌ２００ｍＭ、ＴＣＥＰ５ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．５％、イミダゾール２０ｍＭ）で２回洗浄した。
【００８８】
[00116]Ｐｏｌを、溶出バッファー２００μｌ（トリス５０ｍＭ  ｐＨ７．４、ＫＣｌ
２００ｍＭ、ＴＣＥＰ５ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．５％、イミダゾール３００ｍＭ、グ
リセロール２５％）を使用して溶出させ、１〜２分のインキュベーション後に収集した。溶離液を２〜３回、同じＨｉｓ−Ｐｕｒプレートに再び入れて、溶離液中に濃縮したＰｏｌ６を得る。精製したポリメラーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した場合に９５％超の純度である。タンパク質濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐによって評価した場合に約３ｕＭ（０．３５ｍｇ／ｍｌ）であり、２６０／２８０比は０．６である。
【００８９】
[00117]ポリメラーゼ活性は、蛍光置換アッセイによって確認する（実施例３を参照の
こと）。
【実施例３】
【００９０】
活性の測定
[00118]この実施例では、バリアントポリメラーゼの活性を測定する方法を示す。
置換アッセイプロトコール
[00119]このアッセイでは、ＤＮＡ鎖にヌクレオチドポリリン酸を組み込む変異体ポリ
メラーゼの能力、および２本鎖ＤＮＡをほどいて置換する変異体ポリメラーゼの能力を特性決定する。
【００９１】
[00120]ストック試薬は以下のとおりである。
低塩
【００９２】
【表１】
2019187424.tif 000002
【００９３】
高塩
【００９４】
【表２】
2019187424.tif 000003
【００９５】
[00121]単一変異体および二重変異体のスクリーニング用：
[00122]試薬Ａを希釈液として使用して、１．４２倍にて４種の異なるヌクレオチド条
件を作製する。
【００９６】
【表３】
2019187424.tif 000004
【００９７】
[00123]三重変異体のスクリーニング用：
[00124]試薬Ａを希釈液として使用して、１．４２倍にて４種の異なるヌクレオチド条
件を作製する。
【００９８】
【表４】
2019187424.tif 000005
【００９９】
[00125]ヌクレオチド条件１では、高濃度の六リン酸での活性について試験する。
[00126]ヌクレオチド条件２では、低濃度の六リン酸での活性について試験する。
[00127]ヌクレオチド条件３では、誤組み込み率（すなわち、忠実度）について試験す
る。変異体ポリメラーゼが、必要な４種のヌクレオチドのうちの３種のみでの有意な活性を示す場合には、変異体ポリメラーゼは、ＤＮＡ鎖の延長中に正しいヌクレオチドまたは誤ったヌクレオチドを識別しないと結論する。
【０１００】
[00128]ヌクレオチド条件４では、エキソヌクレアーゼ活性について試験する。ヌクレ
オチドが存在しないときにポリメラーゼが有意な活性を示す場合には、ポリメラーゼはエキソヌクレアーゼ活性を示していると結論する。
【０１０１】
[00129]９６ウェルハーフエリア透明プレートの各反応ウェルに、
試薬Ａ／ヌクレオチドミックス２３μｌ
ポリメラーゼ（１〜１０μＭ）２μｌ
を加える。
【０１０２】
[00130]プレート振盪機で８００ＲＰＭにて１０分間振盪する。
[00131]各ウェルに１．４Ｍ  ＮａＣｌ５μｌを加えてＮａＣｌ濃度を３００ｍＭに上
げるか、または各ウェルに５２５ｍＭ  ＮａＣｌ５μｌを加えてＮａＣｌ濃度を１５０ｍＭに上げる。
【０１０３】
[00132]３０分間インキュベートする。
[00133]ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨプレートリーダーにおいて、試薬Ｂ１０μｌを注入し
て、蛍光シグナルを２〜１０分間読み取る。
【０１０４】
[00134]バリアントポリメラーゼの置換アッセイからの代表的なデータを図５に示す。
ポリメラーゼの活性は、Ａ．ｄＴｎＰ２０μＭ＋ｄＡ、Ｃ、Ｇ３Ｐ１５μＭ（赤色四角形
；■）、Ｂ．ｄＴｎＰ５μＭ＋ｄＡ、Ｃ、Ｇ３Ｐ１５μＭ（青色ダイヤモンド形；◆）、Ｃ．ｄＡ、Ｃ、Ｇ３Ｐ１５μＭ（緑色三角形；▲）の存在下、またはＤ．ヌクレオチドの非存在下（紫色×）での置換アッセイを用いて測定した。ＡおよびＢは、変異体バリアントがヌクレオチドポリリン酸を組み込み、ヌクレオチドポリリン酸を用いてＤＮＡ鋳型に沿って延長することができることを示している。Ｃは、バリアントが忠実度を失っておらず、Ｔヌクレオチドの非存在下で無秩序なヌクレオチドを誤って組み込んでいないことを示している。Ｄ．は、発生したシグナルが、全てのヌクレオチドの非存在下でのポリメラーゼエキソヌクレアーゼ活性の結果ではないことを示している。４つの全ての曲線は、ポリメラーゼスクリーニングの一部分として４つの異なるアッセイプレートで試験した単一バリアントの代表である。
【実施例４】
【０１０５】
ｋｏｆｆの測定
[00135]下記のストップトフローアッセイを使用して、バリアントポリメラーゼのｋｏ
ｆｆ速度を測定した。
【０１０６】
[00136]試薬Ａでは、ポリメラーゼは、Ｃａ２＋のような非触媒性２価金属の存在下で
、フルオレセイン標識ＤＮＡ鋳型−プライマーに、Ｃｙ３（またはＡｌｅｘａ５５５）連結ヌクレオチドポリリン酸と共に結合している。これはＦＲＥＴペアを形成し、フルオレセインはドナーフルオロフォアであり、Ｃｙ３はアクセプターフルオロフォアである。試薬Ｂは追跡ヌクレオチドを含有する。このアッセイでは、鋳型／プライマーに組み込まれる１番目のヌクレオチドはシトシンである。
【０１０７】
[00137]試薬Ａ（ＮａＣｌ７５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ２５ｍＭ（ｐＨ７．５）、ＣａＣｌ２
２ｍＭ、フルオレセイン−鋳型／プライマー２５０ｎＭ、ｄＣｎＰ−Ｃｙ３  ２０ｕＭ、およびポリメラーゼ＞２５０ｎＭ）は、ポリメラーゼを確実に最後に加えながら成分を混合することによって新しく調製した。試薬Ａ中でポリメラーゼを１０分間インキュベートした。
【０１０８】
[00138]試薬Ｂ（ＮａＣｌ７５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ２５ｍＭ（ｐＨ７．５）、ＣａＣｌ２
２ｍＭ、およびｄＣＴＰ２００ｕＭ）を調製した。
[00139]試薬ＡとＢを混合すると、ｄＣＴＰはｄＣｎＰ−Ｃｙ３と会合を競合し、ｄＣ
ＴＰ濃度が過剰であるならば蛍光の増加が観測される。アッセイは、ストップフローデバイス（Ｋｉｎｔｅｋ  Ｃｏｒｐ）または蛍光プレートリーダーのいずれかを用いて行うことができる。時間に対する蛍光の増加を一次または二次指数関数にフィッティングして、その特定のポリメラーゼの速度定数ｋｏｆｆを得る。
【０１０９】
[00140]選択したバリアントの精製収量およびｋｏｆｆを表１に示す。
【０１１０】
【表５】
2019187424.tif 000006
【０１１１】
[00141]アッセイの模式図、および例示的な反応のグラフについては、図３を参照のこ
と。代表的なデータについては、図１０を参照のこと。
【実施例５】
【０１１２】
ｋｏｆｆの測定
[00142]この実施例では、蛍光偏光を用いる、ｋｏｆｆを測定する代替方法を示す。
[00143]トリス２５ｍＭ  ｐＨ７．０、ＫＣｌ７５ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００  ０
．０１％、１×ＢＳＡ（１００ｕｇ／ｍｌ）、ＥＤＴＡ０．５ｍＭ、ＣａＣｌ２  ２ｍＭ、ＤＴＴ２ｍＭを含むアッセイバッファーを使用して、ヘアピンフルオレセイン標識ＤＮＡ鋳型およびｄＣ６Ｐ−Ｃ６−Ｃｙ３タグ付きヌクレオチド２５０ｎＭを含有するアッセイマスターミックスを調製した。マスターミックス５５μｌを黒色９６ウェルＣｏｓｔａｒプレートのウェルの各々に加え、培養物１ｍｌから精製したポリメラーゼ変異体２０μｌをハイスループット（ＨＴＰ）フォーマットで加えた。プレートは、プレート振盪機で１分間振盪し、ポリメラーゼ−ＤＮＡ鋳型−ヌクレオチドの均一な三元複合体を形成させ
た。プレートをＢＭＧ  Ｐｏｌａｒｓｔａｒプレートリーダー（ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ
Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）に置き、２０００周辺でのゲインを有するよう標的ミリ偏光を２００ｍＰおよび１０％に調節した。励起フィルターは４８５ｎＭに設定し、発光フィルターは５９０〜２０ｎＭに設定した。注射器に、１ｍＭ  ｄＣＴＰ追跡ヌクレオチド溶液１ｍｌを詰めた。データは、１インターバルにつき１ウェル当たり最低３０フラッシュで、開始の合計読取り時間６０秒で収集した。遅い解離を示したヒット変異体では、フラッシュを５０以上に増加させ、より長い読取り時間を取った。データ収集は、１ｍＭ  ｄＣＴＰ２５μｌの注入で開始した。
【０１１３】
[00144]アッセイの模式図、および例示的な反応のグラフについては、図４を参照のこ
と。
[00145]蛍光偏光に基づくｋｏｆｆアッセイからの、２種のバリアントポリメラーゼ（
Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ（Ｂ６）およびＳ３６６Ａ＋Ｐ５４２Ｅ＋Ｉ６５２Ｑ（Ｃ６））の代表的なデータについては、図６を参照のこと。ｍＰはミリ偏光である。あらかじめ形成させた、ポリメラーゼ−ＤＮＡ鋳型−ｄＣｎＰ−Ａｌｅｘａ５５５の三元複合体を、未変性ｄＣＴＰを用いて追跡し、偏光ｄＣｎＰ−Ａｌｅｘａ５５５をある時間にわたってモニターした。
【実施例６】
【０１１４】
ｋｃｈｅｍの測定
[00146]この実施例では、バリアントポリメラーゼのｋｃｈｅｍを測定するためのＦＲ
ＥＴに基づくアッセイを示す。
【０１１５】
[00147]試薬Ａでは、ポリメラーゼはフルオレセイン標識ＤＮＡ鋳型−プライマーに結
合している。試薬Ｂは、Ｍｇ２＋のような触媒性２価金属の存在下で、Ｃｙ３（またはＡｌｅｘａ５５５）連結ヌクレオチドポリリン酸を含有する。このプロトコールでは、鋳型／プライマーに組み込まれる１番目のヌクレオチドはシトシンである。
【０１１６】
[00148]試薬Ａ（ＮａＣｌ７５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ２５ｍＭ（ｐＨ７．５）、フルオレセ
イン−鋳型／プライマー２５０ｎＭ、ポリメラーゼ＞２５０ｎＭ）を調製した。ポリメラーゼは、試薬Ａ中で１０分間インキュベートした。
【０１１７】
[00149]試薬Ｂ（ＮａＣｌ７５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ２５ｍＭ（ｐＨ７．５）、ＭｇＣｌ２
１０ｍＭ、およびｄＣｎＰ−Ｃｙ３  ２０ｕＭ）を調製した。
[00150]試薬ＡとＢを混合すると、ポリメラーゼ−フルオレセイン−鋳型−プライマー
複合体はｄＣｎＰ−Ｃｙ３に結合し、蛍光が消光する。Ｍｇ２＋は、ポリメラーゼがヌクレオチドを組み込むことを可能にし、ヌクレオチドは切断産物である、Ｃｙ３が付いたピロリン酸、ｎＰ−Ｃｙ３を放出する。消光剤が放出されるので、蛍光は増加する。アッセイは、ストップフローデバイス（Ｋｉｎｔｅｋ  Ｃｏｒｐ）または蛍光プレートリーダーのいずれかを用いて行うことができる。
【０１１８】
[00151]アッセイの模式図、および例示的な反応のグラフについては、図２を参照のこ
と。代表的なデータについては、図９を参照のこと。
【実施例７】
【０１１９】
ナノポアへの取付け
[00152]この実施例では、バリアントポリメラーゼをナノポア、例えばα−溶血素に付
ける方法を示す。
【０１２０】
[00153]ポリメラーゼは、任意の好適な手段によってナノポアに連結してもよい。例え
ば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６８９６７（ＷＯ２０１４／０７４７２７として公開；Ｇｅｎｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００９７０２（ＷＯ２００６／０２８５０８として公開；Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｅｌｌｏｗｓ  ｏｆ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｃｏｌｌｅｇｅ）、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６５６４０（ＷＯ２０１２／０８３２４９として公開；Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を参照のこと。
【０１２１】
[00154]ポリメラーゼ、例えばバリアントｐｏｌ６ＤＮＡポリメラーゼを、リンカー分
子を介してタンパク質ナノポア（例えば、アルファ溶血素）に連結させた。詳細には、生理的条件下で共有結合性イソペプチド連結を自発的に形成するＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムを使用した。例えば、Ｌｉら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１４年１月２３；４２６（２）：３０９〜１７を参照のこと。
【０１２２】
[00155]ｐｏｌ６バリアントＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ  Ｈｉｓタグを実施例２に従って発
現させ、コバルトアフィニティーカラムを使用して精製した。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリメラーゼおよびＳｐｙＴａｇオリゴマー化ナノポアタンパク質を、３ｍＭ  ＳｒＣｌ２中で、４℃にて終夜インキュベートした。次に１：６−ポリメラーゼ−鋳型複合体を、分子ふるいクロマトグラフィーを使用して精製した。
【０１２３】
[00156]ｐｏｌ６バリアントのＮ末端またはＣ末端のいずれかに、リンカーを付けた。
Ｎ末端で付けられたバリアントはより頑強、例えばより安定であることが見出された。したがって、Ｎ末端に付けられたリンカーを使用した。
【実施例８】
【０１２４】
バイオチップにおける活性
[00157]この実施例では、ナノポアに結合したバリアントポリメラーゼがタグ付きヌク
レオチドに結合して、それによりポリメラーゼが付いたナノポアで閉鎖チャネル電流の検出を可能にさせる、バリアントポリメラーゼの能力を示す。
【０１２５】
[00158]ポリメラーゼをナノポアに付け、バイオチップとも呼ばれる半導体センサーチ
ップのウェル上の脂質二重層に埋め込んだ。脂質二重層は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６１８５３（「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｌａｙｅｒｓ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｉｐｓ」という題名で、２０１４年１０月２２日に出願された）において記載されているように形成させて、ポリメラーゼが付いたナノポアを挿入した。
【０１２６】
[00159]バリアントポリメラーゼは、低塩条件下で鋳型ＤＮＡと複合化した。
[00160]ナノポアに結合したバリアントポリメラーゼのタグ付きヌクレオチドに結合す
る能力は、静的捕獲実験において測定した。静的捕獲実験では、タグ付きヌクレオチドがポリメラーゼに結合し、タグ付きヌクレオチドがナノポアに呈示されたときに閉鎖チャネル電流を測定する。静的捕獲実験はＣａ２＋の存在下で行い、Ｃａ２＋は、ＤＮＡの触媒作用および伸長を妨げ、また同じ種類のタグ付きヌクレオチドの繰り返しの捕獲を検出することを可能にする。この実験においては、使用したタグ付きヌクレオチドはｄＴｎＰ−タグであった。
【０１２７】
[00161]バイオチップのアルファ溶血素ナノポアに連結した例示的なポリメラーゼバリ
アントＰｏｌ６（Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ）を、鋳型ＤＮＡと複合化した。
[00162]Ｐｏｌ６（Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ）−ＤＮＡ複合体によるタグ
付きチミジンヌクレオチド（タグはＴ３０である（配列番号９））の静的捕獲は、二重層の上下でのＨｅｐｅｓ７．５  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ３００ｍＭ、ＣａＣｌ２  ３ｍＭ、およびＴＣＥＰ５ｍＭの存在下で、１００ｍＶで記録した。
【０１２８】
[00163]結果を図７および図８に示す。図７におけるトレースでは、時間の関数として
、細孔をわたって１００ｍＶで測定した電解電流が示されている。この電圧における開口細孔電流は約１ｎＡであり（一番上のトレース）、同じ電圧における閉鎖細孔電流は約０．３３ｎＡであった（中央のトレース）。システムのソフトウェアに従って、開口チャネル電流を１に対し正規化した。閉鎖チャネル電流は、ｄＴｎＰ−Ｔ３０（配列番号９）によって開口チャネル電流の３３％に減少した。このトレースで示されている電流遮断は、ナノポアの近傍で生じるバリアントＰｏｌ６−ＤＮＡ複合体によるチミジンポリリン酸の結合に関連している。図７（右）における、対応する一番上のヒストグラムでは、１００ｍＶにて、同じ細孔での開口細孔電流に対し正規化された電流の変化で観測された電流遮断の頻度が示されており、中央のトレースに対応するヒストグラム（右）では、１００ｍＶにて、同じ細孔での閉鎖細孔電流に対し正規化された電流の変化で観測された電流遮断の頻度が示されている。
【０１２９】
[00164]図８では、図７に示されているタグ付きチミジンの静的捕獲の滞留時間が示さ
れている。図８（左）では、開口チャネル電流に対し正規化された電流の関数としての、タグ付きｄＴＮＰがバリアントＰｏｌ６に結合することの発生回数のヒストグラムが示されている。ｄＴＮＰタグ付きヌクレオチドの各捕獲の平均滞留時間は、１．２秒と測定された。細孔におけるタグのバックグラウンド捕獲（すなわち、ポリメラーゼが媒介していないもの）は、数ミリ秒の範囲の滞留時間を有する（データ示さず）。酵素進化のゴールは、タグ付きヌクレオチドポリリン酸の解離速度を改良することであったので、バックグラウンドからはっきりと区別されるポリメラーゼ媒介捕獲を記録するのに充分長い滞留時間が理解され得る。図８に示されているように、１．２秒の平均滞留時間は、バックグラウンドよりもかなり上である。セルインデックスは、この実験において使用するチップに存在する約８０００個のセルの、色に基づくスキームである。
【０１３０】
[00165]データにより、例示的なバリアントポリメラーゼＰｏｌ６（Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５
３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ）は、タグ付きヌクレオチドに結合することができ、ポリメラーゼが付けられたナノポアによる電流変化の検出を可能にすることが示されている。
【０１３１】
[00166]この結果は、バイオチップのナノポアに付けられたバリアントポリメラーゼが
、高忠実度でタグ付きヌクレオチドに結合し、そのタグ付きヌクレオチドを、ヌクレオチド組み込みの検出に充分な時間、また場合によっては例えばナノポアシーケンシング中の挿入、欠失などのシーケンシングエラーの確率を減らすのに充分な時間を与える滞留時間でナノポアに呈示することができる証拠を示している。
【実施例９】
【０１３２】
ローリングサークル増幅アッセイ
[00167]この実施例では、ローリングサークル型アッセイにおけるポリヌクレオチド鋳
型の増幅を説明する。
【０１３３】
[00168]使用した鋳型は、社内製の鋳型ＨＦｃｉｒｃ１０であった。その鋳型は、長さ
約１５０ｂｐの単純環状鋳型である。
[00169]合計反応容量４０μｌ（試薬Ａ２８μｌ＋２μＭポリメラーゼ２μｌ＋試薬Ｂ
１０μｌ）でアッセイを行った。
【０１３４】
[00170]試薬Ａ：
【０１３５】
【表６】
2019187424.tif 000007
【０１３６】
[00171]試薬Ｂ：
【０１３７】
【表７】
2019187424.tif 000008
【０１３８】
[00172]２μＭポリメラーゼ２μｌを試薬Ａ２８μｌに加えて、最終アッセイミックス
４０μｌ中でのＤＮＡ：ポリメラーゼ（それぞれ１００ｎＭ）のモル比を１：１にした。試薬Ａ／ポリメラーゼミックスを、この７５ｍＭの塩条件において１０分間インキュベートして、ポリメラーゼをＤＮＡに結合させた。
【０１３９】
[00173]次に、試薬Ｂ１０μｌを試薬Ａ／ポリメラーゼ混合物に加えて、反応を開始さ
せた。
[00174]所定の時点にて試料１０μｌを反応物から取り出し、ＥＤＴＡ５０ｍＭを含む
ホルムアミド１０μｌに加えて反応を失活させた。試料は、０分、１０分、３０分、および４０分の時点で取った。
【０１４０】
[00175]ホルムアミド試料を約３分間、９４℃に加熱して、タンパク質と、ＤＮＡの二
次構造とを変性させた。試料は４℃に放冷しなかった。１００×ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮまたはＧＯＬＤ色素２μｌを加えた。
【０１４１】
[00176]各試料の１５μｌを、１．２％アガロースゲルにおいて、１００Ｖで１時間１
５分間泳動させた。
[00177]Ｂｉｏｒａｄ  ＧＥＬ  ＤＯＣ  ＥＺ撮像装置の青色トレーを使用して、ゲル
の画像を取得した。
【０１４２】
[00178]図１１では、アッセイの４０分時点の結果が示されている。左から右に数えて
レーン１および１９において分子ラダーが示されている。レーン２はｔ＝０の試料を有し、産物は見えない。レーン３〜１８の各々は、異なるバリアントｐｏｌ６ポリメラーゼである。
【０１４３】
[00179]示されている全てのバリアントは鎖置換を行うことができ、長いキロベースの
ＤＮＡ産物を、全てヌクレオチド六リン酸を用いて産生することができる。
【実施例１０】
【０１４４】
タグ付きヌクレオチドを使用した鋳型ＤＮＡのシーケンシング
[00180]この実施例では、バリアントポリメラーゼが、バイオチップでの合成法による
シーケンシングにおいて機能的であることを示す。
【０１４５】
[00181]Ｐｏｌ６−２６ｉ−Ｄ４４Ａポリメラーゼを使用したヘテロポリマー鋳型のＡ
Ｃシーケンシングを、Ｈｅｐｅｓ２０ｍＭ、ｐＨ８、グルタミン酸カリウム５００ｍＭ、およびＭｇＣｌ２  ３ｍＭにおいて、室温で行った。ポリメラーゼが付いたナノポアを、本明細書において記載したように脂質二重層に埋め込んだ。プライマーが付いたＤＮＡを加え、ポリメラーゼと複合化させた。４種の異なるタグ付きヌクレオチドを２５μＭの濃度で加えた。合成によるシーケンシングは、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔａｇｓ」という題名のＷＯ２０１４／０７４７２７において記載されているように進めてもよい。図１２におけるトレースでは、ヘテロポリマー鋳型に対する７６％のシーケンシング精度、および９６ｂｐのリード長が示されている。
【０１４６】
[00182]本明細書において記載される実施例および実施形態は、単なる例示目的のもの
であり、またその実施例および実施形態を考慮した様々な改変または変化が当業者に提案されることになり、本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることになることが理解されよう。本明細書において引用されるあらゆる刊行物、特許、および特許出願は、参照によりその全体があらゆる目的で本明細書に組み込まれる。
【配列表フリーテキスト】
【０１４７】
配列番号１−野生型Ｐｏｌ６（ＤＮＡポリメラーゼ［クロストリジウムファージｐｈｉＣＰＶ４］；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＨ２７１１３．１）
1 mdkhtqyvke hsfnydeykk anfdkiecli fdtesctnye ndntgarvyg wglgvtrnhn           
061 miygqnlnqf wevcqnifnd wyhdnkhtik itktkkgfpk rkyikfpiav hnlgwdvefl
121 kyslvengfn ydkgllktvf skgapyqtvt dveepktfhi vqnnnivygc nvymdkffev    
181 enkdgsttei glcldffdsy kiitcaesqf hnyvhdvdpm fykmgeeydy dtwrspthkq       241 ttlelryqyn diymlrevie qfyidglcgg elpltgmrta ssiafnvlkk mtfgeektee       301 gyinyfeldk ktkfeflrkr iemesytggy thanhkavgk tinkigcsld inssypsqma       361 ykvfpygkpv rktwgrkpkt eknevyliev gfdfvepkhe eyaldifkig avnskalspi       421 tgavsgqeyf ctnikdgkai pvykelkdtk lttnynvvlt sveyefwikh fnfgvfkkde       481 ydcfevdnle ftglkigsil yykaekgkfk pyvdhftkmk venkklgnkp ltnqakliln       541 gaygkfgtkq nkeekdlimd knglltftgs vteyegkefy rpyasfvtay grlqlwnaii       601 yavgvenfly cdtdsiycnr
evnsliedmn aigetidkti lgkwdvehvf dkfkvlgqkk       661 ymyhdckedk tdlkccglps darkiiigqg fdefylgknv egkkqrkkvi ggcllldtlf       721 tikkimf
配列番号２−Ｐｏｌ６（Ｈｉｓタグ付き）
MHHHHHHHHS GGSDKHTQYV KEHSFNYDEY KKANFDKIEC LIFDTESCTN    50
YENDNTGARV YGWGLGVTRN HNMIYGQNLN QFWEVCQNIF NDWYHDNKHT     100
IKITKTKKGF PKRKYIKFPI AVHNLGWDVE FLKYSLVENG FNYDKGLLKT     150
VFSKGAPYQT VTDVEEPKTF HIVQNNNIVY GCNVYMDKFF EVENKDGSTT     200
EIGLCLDFFD SYKIITCAES QFHNYVHDVD PMFYKMGEEY DYDTWRSPTH     250
KQTTLELRYQ YNDIYMLREV IEQFYIDGLC GGELPLTGMR TASSIAFNVL     300
KKMTFGEEKT EEGYINYFEL DKKTKFEFLR KRIEMESYTG GYTHANHKAV     350
GKTINKIGCS LDINSSYPSQ MAYKVFPYGK PVRKTWGRKP KTEKNEVYLI     400
EVGFDFVEPK HEEYALDIFK IGAVNSKALS PITGAVSGQE YFCTNIKDGK     450
AIPVYKELKD TKLTTNYNVV LTSVEYEFWI KHFNFGVFKK DEYDCFEVDN     500
LEFTGLKIGS ILYYKAEKGK FKPYVDHFTK MKVENKKLGN KPLTNQAKLI     550
LNGAYGKFGT KQNKEEKDLI MDKNGLLTFT GSVTEYEGKE FYRPYASFVT     600
AYGRLQLWNA IIYAVGVENF LYCDTDSIYC NREVNSLIED MNAIGETIDK     650
TILGKWDVEH VFDKFKVLGQ KKYMYHDCKE DKTDLKCCGL PSDARKIIIG     700
QGFDEFYLGK NVEGKKQRKK VIGGCLLLDT LFTIKKIMF*                739
配列番号３−Ｈｉｓタグ付きＰｏｌ６（ＤＮＡ配列）
ATGCATCACC ATCATCATCA CCACCACAGC GGCGGTTCCG ACAAACACAC     50
GCAGTACGTC AAAGAGCATA GCTTCAATTA TGACGAGTAT AAGAAAGCGA     100
ATTTCGACAA GATCGAGTGC CTGATCTTTG ACACCGAGAG CTGCACGAAT     150
TATGAGAACG ATAATACCGG TGCACGTGTT TACGGTTGGG GTCTTGGCGT     200
CACCCGCAAC CACAATATGA TCTACGGCCA AAATCTGAAT CAGTTTTGGG     250
AAGTATGCCA GAACATTTTC AATGATTGGT ATCACGACAA CAAACATACC     300
ATTAAGATTA CCAAGACCAA GAAAGGCTTC CCGAAACGTA AGTACATTAA     350
GTTTCCGATT GCAGTTCACA ATTTGGGCTG GGATGTTGAA TTCCTGAAGT     400
ATAGCCTGGT GGAGAATGGT TTCAATTACG ACAAGGGTCT GCTGAAAACT     450
GTTTTTAGCA AGGGTGCGCC GTACCAAACC GTGACCGATG TTGAGGAACC     500
GAAAACGTTC CATATCGTCC AGAATAACAA CATCGTTTAT GGTTGTAACG     550
TGTATATGGA CAAATTCTTT GAGGTCGAGA ACAAAGACGG CTCTACCACC     600
GAGATTGGCC TGTGCTTGGA TTTCTTCGAT AGCTATAAGA TCATCACGTG     650
TGCTGAGAGC CAGTTCCACA ATTACGTTCA TGATGTGGAT CCAATGTTCT     700
ACAAAATGGG TGAAGAGTAT GATTACGATA CTTGGCGTAG CCCGACGCAC     750
AAGCAGACCA CCCTGGAGCT GCGCTACCAA TACAATGATA TCTATATGCT     800
GCGTGAAGTC ATCGAACAGT TTTACATTGA CGGTTTATGT GGCGGCGAGC     850
TGCCGCTGAC CGGCATGCGC ACCGCTTCCA GCATTGCGTT CAACGTGCTG     900
AAAAAGATGA CCTTTGGTGA GGAAAAGACG GAAGAGGGCT ACATCAACTA     950
TTTTGAATTG GACAAGAAAA CCAAATTCGA GTTTCTGCGT AAGCGCATTG     1000
AAATGGAATC GTACACCGGT GGCTATACGC ACGCAAATCA CAAAGCCGTT     1050
GGTAAGACTA TTAACAAGAT CGGTTGCTCT TTGGACATTA ACAGCTCATA     1100
CCCTTCGCAG ATGGCGTACA AGGTCTTTCC GTATGGCAAA CCGGTTCGTA     1150
AGACCTGGGG TCGTAAACCA AAGACCGAGA AGAACGAAGT TTATCTGATT     1200
GAAGTTGGCT TTGACTTCGT GGAGCCGAAA CACGAAGAAT ACGCGCTGGA     1250
TATCTTTAAG ATTGGTGCGG TGAACTCTAA AGCGCTGAGC CCGATCACCG     1300
GCGCTGTCAG CGGTCAAGAG TATTTCTGTA CGAACATTAA AGACGGCAAA     1350
GCAATCCCGG TTTACAAAGA ACTGAAGGAC ACCAAATTGA CCACTAACTA     1400
CAATGTCGTG CTGACCAGCG TGGAGTACGA GTTCTGGATC AAACACTTCA     1450
ATTTTGGTGT GTTTAAGAAA GACGAGTACG ACTGTTTCGA AGTTGACAAT     1500
CTGGAGTTTA CGGGTCTGAA GATTGGTTCC ATTCTGTACT ACAAGGCAGA     1550
GAAAGGCAAG TTTAAACCTT ACGTGGATCA CTTCACGAAA ATGAAAGTGG     1600
AGAACAAGAA ACTGGGTAAT AAGCCGCTGA CGAATCAGGC AAAGCTGATT     1650
CTGAACGGTG CGTACGGCAA ATTCGGCACC AAACAAAACA AAGAAGAGAA     1700
AGATTTGATC ATGGATAAGA ACGGTTTGCT GACCTTCACG GGTAGCGTCA     1750
CGGAATACGA GGGTAAAGAA TTCTATCGTC CGTATGCGAG CTTCGTTACT     1800
GCCTATGGTC GCCTGCAACT GTGGAACGCG ATTATCTACG CGGTTGGTGT     1850
GGAGAATTTT CTGTACTGCG ACACCGACAG CATCTATTGT AACCGTGAAG     1900
TTAACAGCCT CATTGAGGAT ATGAACGCCA TTGGTGAAAC CATCGATAAA     1950
ACGATTCTGG GTAAATGGGA CGTGGAGCAT GTCTTTGATA AGTTTAAGGT     2000
CCTGGGCCAG AAGAAGTACA TGTATCATGA TTGCAAAGAA GATAAAACGG     2050
ACCTGAAGTG TTGCGGTCTG CCGAGCGATG CCCGTAAGAT TATCATTGGT     2100
CAAGGTTTCG ACGAGTTTTA TCTGGGCAAA AATGTCGAAG GTAAGAAGCA     2150
ACGCAAAAAA GTGATCGGCG GTTGCCTGCT GCTGGACACC CTGTTTACGA     2200
TCAAGAAAAT CATGTTCTAA                                      2220
先行技術文献
特許文献
[1]  PCT/US2005/009702 (published as WO2006/028508 on 16 March 2006; President and Fellows of Harvard College; entitled METHODS AND APPARATUS FOR CHARACTERIZING
POLYNUCLEOTIDES).
[2]  PCT/US2011/065640 (published as WO2012/083249 on 21 June 2012; Columbia University; entitled DNA SEQUENCING BY SYNTHESIS USING MODIFIED NUCLEOTIDES AND NANOPORE DETECTION).
[3]  PCT/US2013/068967 (published as WO2014/074727 on 15 May 2014; Genia Technologies; entitled NUCLEIC ACID SEQUENCING USING TAGS).
[4]  PCT/US2013/046012 (Genia Technologies, Inc., entitled CHIP SET-UP AND HIGH-ACCURACY NUCLEIC ACID SEQUENCING, published 19 Dec 2013 as WO2013/188841).
[5]  US 2013/0053544 (Isis Innovation Limited) entitled Peptide Tag Systems That
Spontaneously Form an Irreversible Link to Protein Partners via Isopeptide Bonds, published 28 February 2013.
非特許文献
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【図１】
2019187424.tif 000009
【図２】
2019187424.tif 000010
【図３】
2019187424.tif 000011
【図４】
2019187424.tif 000012
【図５】
2019187424.tif 000013
【図６】
2019187424.tif 000014
【図７】
2019187424.tif 000015
【図８】
2019187424.tif 000016
【図９】
2019187424.tif 000017
【図１０】
2019187424.tif 000018
【図１１】
2019187424.tif 000019
【図１２】
2019187424.tif 000020
【配列表】
2019187424000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年7月4日(2019.7.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する改変ＤＮＡポリメラーゼであって、配列番号２に記載するアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、Ｓ３６６のアミノ酸置換を含む、前記改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
前記Ｓ３６６のアミノ酸置換が、Ｓ３６６Ａ／Ｌである、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
さらに、Ｈ２２３、Ｎ２２４、Ｙ２２５、Ｈ２２７、Ｉ２９５、Ｙ３４２、Ｔ３４３、Ｉ３５７、Ｓ３６０、Ｌ３６１、Ｉ３６３、Ｓ３６５、Ｙ３６７、Ｐ３６８、Ｄ４１７、Ｅ４７５、Ｙ４７６、Ｆ４７８、Ｋ５１８、Ｈ５２７、Ｔ５２９、Ｍ５３１、Ｎ５３５、Ｇ５３９、Ｐ５４２、Ｎ５４５、Ｑ５４６、Ａ５４７、Ｌ５４９、Ｉ５５０、Ｎ５５２、Ｇ５５３、Ｆ５５８、Ａ５９６、Ｇ６０３、Ａ６１０、Ｖ６１５、Ｙ６２２、Ｃ６２３、Ｄ６２４、Ｉ６２８、Ｙ６２９、Ｒ６３２、Ｎ６３５、Ｍ６４１、Ａ６４３、Ｉ６４４、Ｔ６４７、Ｉ６４８、Ｔ６５１、Ｉ６５２、Ｋ６５５、Ｗ６５６、Ｄ６５７、Ｖ６５８、Ｈ６６０、Ｆ６６２、Ｌ６９０、およびそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項１または２に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】
前記置換が、Ｈ２２３Ａ、Ｎ２２４Ｙ／Ｌ／Ｑ／Ｍ／Ｒ／Ｋ、Ｙ２２５Ｌ／Ｔ／Ｉ／Ｆ／Ａ／Ｍ、Ｈ２２７Ｐ／Ｅ／Ｆ／Ｙ、Ｉ２９５Ｗ／Ｆ／Ｍ／Ｅ、Ｙ３４２Ｌ／Ｆ、Ｔ３４３Ｎ／Ｆ、Ｉ３５７Ｇ／Ｌ／Ｑ／Ｈ／Ｗ／Ｍ／Ａ／Ｅ／Ｙ／Ｐ、Ｓ３６０Ｇ／Ｅ／Ｙ、Ｌ３６１Ｍ／Ｗ／Ｖ／Ｆ、Ｉ３６３Ｖ／Ａ／Ｒ／Ｍ／Ｗ、Ｓ３６５Ｑ／Ｗ／Ｍ／Ａ／Ｇ、Ｙ３６７Ｌ／Ｅ／Ｍ／Ｐ／Ｎ／Ｆ、Ｐ３６８Ｇ、Ｄ４１７Ｐ、Ｅ４７５Ｄ、Ｙ４７６Ｖ、Ｆ４７８Ｌ、Ｋ５１８Ｑ、Ｈ５２７Ｗ／Ｒ／Ｌ／Ｙ／Ｔ／Ｍ、Ｔ５２９Ｍ／Ｆ、Ｍ５３１Ｈ／Ｙ／Ａ／Ｋ／Ｒ／Ｗ／Ｔ／Ｌ／Ｖ／Ｇ、Ｎ５３５Ｌ／Ｙ／Ｍ／Ｋ／Ｉ／Ｒ／Ｗ／Ｑ、Ｇ５３９Ｙ／Ｆ、Ｐ５４２Ｅ／Ｓ／Ｇ、Ｎ５４５Ｋ／Ｄ／Ｓ／Ｌ／Ｒ／Ｑ／Ｗ、Ｑ５４６Ｗ／Ｆ、Ａ５４７Ｍ／Ｙ／Ｗ／Ｆ／Ｖ／Ｓ、Ｌ５４９Ｑ／Ｙ／Ｈ／Ｇ／Ｒ／Ｋ、Ｉ５５０Ａ／Ｗ／Ｔ／Ｇ／Ｆ／Ｓ、Ｎ５５２Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｇ５５３Ｓ／Ｔ／Ｅ／Ｑ／Ｋ／Ｒ／Ｍ、Ｆ５５８Ｐ／Ｔ、Ａ５９６Ｓ、Ｇ６０３Ｔ／Ａ／Ｌ、Ａ６１０Ｔ／Ｅ、Ｖ６１５Ａ／Ｔ、Ｙ６２２Ａ／Ｍ、Ｃ６２３Ｇ／Ｓ／Ｙ／Ｆ、Ｄ６２４Ｆ／Ｋ、Ｉ６２８Ｙ／Ｖ／Ｆ／Ｌ／Ｍ、Ｙ６２９Ｗ／Ｈ／Ｍ／Ｋ、Ｒ６３２Ｌ／Ｃ、Ｎ６３５Ｄ、Ｍ６４１Ｌ／Ｙ、Ａ６４３Ｌ、Ｉ６４４Ｈ／Ｍ／Ｙ、Ｔ６４７Ｇ／Ａ／Ｅ／Ｋ／Ｓ／Ｙ、Ｉ６４８Ｋ／Ｒ／Ｖ／Ｎ／Ｔ／Ｌ、Ｔ６５１Ｙ／Ｆ／Ｍ、Ｉ６５２Ｑ／Ｇ／Ｓ／Ｎ／Ｆ／Ｔ／Ａ／Ｌ／Ｅ／Ｋ／Ｍ、Ｋ６５５Ｇ／Ｆ／Ｅ／Ｎ／Ｑ／Ｍ／Ａ、Ｗ６５６Ｅ、Ｄ６５７Ｒ／Ｐ／Ａ／Ｅ、Ｖ６５８Ｌ、Ｈ６６０Ａ／Ｙ、Ｆ６６２Ｉ／Ｌ、Ｌ６９０Ｍおよびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】
前記改変ポリメラーゼが、親ポリメラーゼと比較して変化した特性を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】
変化した特性が、忠実度、処理能力、伸長速度、安定性、溶解性、ならびに、ヌクレオチド四リン酸、ヌクレオチド五リン酸、ヌクレオチド六リン酸、ヌクレオチド七リン酸、またはヌクレオチド八リン酸のようなヌクレオチドポリリン酸に結合する能力、および／またはヌクレオチドポリリン酸を組み込む能力から選択される、請求項５に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】
変化した特性が、４、５、６、７、または８個のリン酸を有するヌクレオチドポリリン酸を、成長しているＤＮＡ鎖に組み込む能力である、請求項５に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
ヌクレオチドポリリン酸がタグ付きのものである、請求項７に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項９】
前記改変ポリメラーゼが、Ｅ４７５Ｄに一致した置換を有する、請求項４に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１０】
前記改変ポリメラーゼが、Ｆ４７８Ｌに一致した置換を有する、請求項４に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１１】
前記改変ポリメラーゼが、Ｋ５１８Ｑに一致した置換を有する、請求項４に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１２】
前記改変ポリメラーゼが、Ｔ５２９Ｍに一致した置換を有する、請求項４に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１３】
前記改変ポリメラーゼが、Ｎ５３５Ｌに一致した置換を有する、請求項４に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１４】
前記改変ポリメラーゼが、Ｎ５４５Ｋ／Ｌに一致した置換を有する、請求項４に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１５】
前記改変ポリメラーゼが、Ａ５４７Ｆに一致した置換を有する、請求項４に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１６】
前記改変ポリメラーゼが、Ｇ５５３Ｓに一致した置換を有する、請求項４に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１７】
前記改変ポリメラーゼが、Ｔ６４７Ｇ／Ｙに一致した置換を有する、請求項４に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１８】
前記改変ポリメラーゼが、Ｔ６５１Ｙに一致した置換を有する、請求項４に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１９】
前記改変ポリメラーゼが、Ｉ６５２Ｑ／Ａ／Ｌ／Ｅ／Ｋ／Ｍに一致した置換を有する、請求項４に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２０】
Ｓ３６６Ａ／Ｌ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ；
Ｓ３６６Ｌ＋Ｇ５５３Ｓ＋Ｆ５５８Ｐ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ａ５４７Ｍ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｐ５４２Ｅ＋Ｎ５４５Ｋ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｐ５４２Ｅ＋Ｉ６５２Ｑ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｔ５２９Ｍ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ；
Ｔ６５１Ｙ＋Ｐ５４２Ｅ＋Ｓ３６６Ａ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｉ＋Ｉ６５２Ｑ；
Ｔ６５１Ｙ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ；
Ａ５４７Ｆ＋Ａ６１０Ｔ＋Ｓ３６６Ａ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ａ５４７Ｆ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ；
Ｔ６４７Ｅ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ；
Ｎ５４５Ｋ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ；
Ｓ３６６Ｌ＋Ｆ４７８Ｌ＋Ａ５９６Ｓ＋Ｌ６９０Ｍ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ＋Ｔ５２９Ｍ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｓ３６５Ａ＋Ｐ３６８Ｇ＋Ｇ６０３Ｔ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ＋Ａ５４７Ｙ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ａ５４７Ｍ＋Ｔ６４７Ｇ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｋ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｒ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５５２Ｌ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｙ６２９Ｗ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ａ５４７Ｍ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ｓ３６０Ｇ；
Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ＋Ａ５４７Ｙ＋Ｋ６５５Ｇ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ６２９Ｗ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｆ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｋ６５５Ｆ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｎ５５２Ｌ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｒ＋Ｍ５３１Ａ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｒ＋Ｇ５３９Ｙ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｒ＋Ｖ６５８Ｌ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｎ５５２Ｌ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｉ６５２Ｇ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｎ５５２Ｍ
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｎ２２４Ｒ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｉ６２８Ｍ；
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ６５５Ａ；および
Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｙ６２９Ｗ
から選択される、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２１】
Ｓ３６６Ａ＋Ｔ５２９Ｍ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ａ５４７Ｆを含む、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２２】
ａ．  Ｙ２２５Ｌ／Ｆ／Ａ／Ｍ；
ｂ．  Ｍ５３１Ａ／Ｇ；
ｃ．  Ｇ５３９Ｙ；
ｄ．  Ｎ５５２Ｌ／Ｔ；
ｅ．  Ｙ６２９Ｗ／Ｋ；
ｆ．  Ｋ６５５Ｆ／Ｑ／Ｍ／Ａ；および
ｇ．  Ｄ６５７Ｒ／Ｅ／Ｐ／Ａ
から選択される少なくとも１つの変異をさらに含む、請求項２１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２３】
Ｓ３６５Ａ＋Ｓ３６６Ａ＋Ｐ３６８Ｇ＋Ｇ６０３Ｔを含む、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２４】
前記ポリメラーゼが１０個未満の変異を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【外国語明細書】
2019187424000001.pdf