(57)【要約】【課題】所定数の粒子を繰り返し安定に吐出できる液滴吐出手段の提供。【解決手段】液を保持する液保持部と、前記液保持部に設けられる液滴吐出口と、前記液保持部を振動させる第一の振動部材と、前記第一の振動部材を支持する固定部と、を有し、前記液保持部は、大気開放部を有し、かつ前記液滴吐出口の吐出方向に対して、垂直に切断したときの前記液保持部の内壁で形成される断面が、前記大気開放部側から前記液滴吐出口へ向けて小さくなる構造を有する液滴吐出手段である。【選択図】図１
2019155269.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液を保持する液保持部と、
前記液保持部に設けられる液滴吐出口と、
前記液保持部を振動させる第一の振動部材と、
前記第一の振動部材を支持する固定部と、を有し、
前記液保持部は、大気開放部を有し、かつ前記液滴吐出口の吐出方向に対して、垂直に切断したときの前記液保持部の内壁で形成される断面が、前記大気開放部側から前記液滴吐出口へ向けて小さくなる構造を有することを特徴とする液滴吐出手段。
【請求項２】
前記液保持部は、前記液滴吐出口の吐出方向に対して、垂直に切断したときの前記液保持部の内壁で形成される断面が、前記大気開放部側から前記液滴吐出口へ向けて漸減する構造を有する請求項１に記載の液滴吐出手段。
【請求項３】
前記液滴保持部の内壁面は、前記液滴吐出口の吐出方向に対して、垂直に切断したときの前記液保持部の内壁で形成される断面が前記大気開放部側から前記液滴吐出口へ向けて漸減するテーパー面を有し、テーパー面からなる傾斜線と前記液滴吐出口を通る垂線とのなす角度が、５度以上６０度以下である請求項２に記載の液滴吐出手段。
【請求項４】
更に、第二の振動部材を有し、
前記第二の振動部材が、前記液保持部を重力方向と垂直な方向に振動させる請求項１から３のいずれかに記載の液滴吐出手段。
【請求項５】
前記第二の振動部材が、前記固定部に設けられる請求項４に記載の液滴吐出手段。
【請求項６】
前記第二の振動部材が、前記液保持部に設けられる請求項４に記載の液滴吐出手段。
【請求項７】
前記第一の振動部材による第一の振動の位相と、前記第二の振動部材による第二の振動の位相とが異なり、前記第一の振動と前記第二の振動とが交互に行われる請求項４から６のいずれかに記載の液滴吐出手段。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の液滴吐出手段を備えることを特徴とする液滴形成装置。
【請求項９】
液滴に含まれる粒子を計数する粒子数計数手段を有する請求項８に記載の液滴形成装置。
【請求項１０】
請求項８から９のいずれかに記載の液滴形成装置と、
液滴吐出手段から吐出された液滴が着滴する複数の凹部が形成された被着対象物と、
を有することを特徴とする分注装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液滴吐出手段、液滴形成装置及び分注装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、幹細胞技術の進展に伴い、複数の細胞をインクジェット方式で吐出し組織体を形成する技術開発が行われている。このようなインクジェット方式としては、圧電素子を用いた圧電加圧方式、ヒータを用いたサーマル方式、静電引力によって液を引っ張る静電方式などが挙げられる。これらの中でも、圧電加圧方式は、他の方式と比べて熱や電場によるダメージを細胞に与え難いため、細胞溶液の液滴形成に用いるのに好適である。
【０００３】
一般的な圧電加圧方式のインクジェットヘッドは、加圧液室における液の圧縮を利用して液滴を形成するが、加圧液室内に気泡が混入した際には液を圧縮することができず、不吐出になるという問題がある。また、細胞溶液は溶媒が水であり、一般的なインクジェットインクで用いられる界面活性剤は細胞へのダメージがあることから用いることができず、水は高い表面張力を持つために気泡を巻き込みやすいという大きな問題がある。
【０００４】
更に、一般的なインクジェットヘッドでは気泡が混入した状態から通常の状態に復帰させるためには、液室を加圧する、又はノズル部から液を吸引することによって、ノズル部から多量の液を排出し気泡を同時に取り除くことを実施している。しかし、細胞溶液は通常のインクジェットインクよりも高価で貴重なため、この手法で気泡を排除することは望ましくない。
【０００５】
一方、膜を屈曲モードのアクチュエータによって振動させることにより、細胞溶液を吐出する液滴形成装置が開示されている。この装置では、液室における加圧力を用いることなく、膜の上に保持された液を直接飛翔させることが可能である。そのため、一般的なインクジェットヘッドに比べて気泡の影響を低減することができる（例えば、特許文献１参照）。
また、液滴形成装置の膜に撹拌振動を付与することにより、細胞溶液の細胞数濃度を均一にし、吐出する細胞数のバラツキを軽減させることが提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、所定数の粒子を繰り返し安定に吐出できる液滴吐出手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するための手段としての本発明の液滴吐出手段は、液を保持する液保持部と、前記液保持部に設けられる液滴吐出口と、前記液保持部を振動させる第一の振動部材と、前記第一の振動部材を支持する固定部と、を有し、前記液保持部は、大気開放部を有し、かつ前記液滴吐出口の吐出方向に対して、垂直に切断したときの前記液保持部の内壁で形成される断面が、前記大気開放部側から前記液滴吐出口へ向けて小さくなる構造を有する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、所定数の粒子を繰り返し安定に吐出できる液滴吐出手段を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、第１の実施形態に係る液滴形成装置の一例を示す概略断面図である。
【図２】図２は、第２の実施形態に係る液滴形成装置の一例を示す概略断面図である。
【図３Ａ】図３Ａは、ノズル詰まりの解消方法の一例を示す概略断面図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ノズル詰まりの解消方法の他の一例を示す概略断面図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ノズル詰まりの解消方法の他の一例を示す概略断面図である。
【図４】図４は、液滴形成装置における第一の振動と第二の振動の波形の一例を示すグラフである。
【図５】図５は、液滴形成装置における第一の振動と第二の振動の波形の一例を示すグラフである。
【図６】図６は、第３の実施形態に係る液滴形成装置の一例を示す概略断面図である。
【図７】図７は、第４の実施形態に係る液滴形成装置の一例を示す概略図である。
【図８】図８は、図７の制御手段のハードウェアブロックを例示する図である。
【図９】図９は、図７の制御手段の機能ブロックを例示する図である。
【図１０】図１０は、液滴形成装置の動作の一例を示すフローチャートである。
【図１１】図１１は、第５の実施形態に係る液滴形成装置の一例を示す概略図である。
【図１２】図１２は、第６の実施形態に係る液滴形成装置の一例を示す概略図である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、飛翔する液滴に２個の蛍光粒子が含まれる場合を例示する図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、飛翔する液滴に２個の蛍光粒子が含まれる場合を例示する図である。
【図１４】図１４は、粒子同士の重なりが生じない場合の輝度値Ｌｉと、実測される輝度値Ｌｅとの関係を例示する図である。
【図１５】図１５は、本発明の分注装置の一例を示す概略図である。
【図１６】図１６は、本発明の分注装置の動作の一例を示すフローチャートである。
【図１７】図１７は、本発明の分注装置の動作の他の一例を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（液滴吐出手段）
本発明の液滴吐出手段は、液を保持する液保持部と、液保持部に設けられる液滴吐出口と、液保持部を振動させる第一の振動部材と、第一の振動部材を支持する固定部と、を有し、液保持部は、大気開放部を有し、かつ液滴吐出口の吐出方向に対して、垂直に切断したときの液保持部の内壁で形成される断面が、大気開放部側から液滴吐出口へ向けて小さくなる構造を有し、更に必要に応じてその他の部材を有する。
【００１１】
本発明の液滴吐出手段は、従来技術では、液滴吐出口付近の細胞数がランダムに変化するため、吐出細胞数のバラツキ抑制には限界がある。一般に、撹拌のような所定時間間隔で行われる離散的な事象の発生確率は、統計学及び確率論におけるポアソン分布で表せる。吐出細胞数のバラツキもまたポアソン分布で表され、一定量のバラツキを持っている。一方、組織体を形成する技術開発においては、所定細胞数の繰り返し安定吐出が要求され、更なるバラツキ抑制が望まれているという知見に基づくものである。
【００１２】
本発明においては、液を保持する液保持部と、液保持部に設けられる液滴吐出口と、液保持部を振動させる第一の振動部材と、第一の振動部材を支持する固定部と、を有し、液保持部は、大気開放部を有し、かつ液滴吐出口の吐出方向に対して、垂直に切断したときの液保持部の内壁で形成される断面（断面積）が、大気開放部側から液滴吐出口へ向けて小さくなる構造を有することにより、液保持部に充填した溶液中の粒子（細胞）は、液保持部の内壁で形成される傾斜面に沿って液滴吐出口へと向かって沈降する。所定時間経過後、ノズル直上には、運動が抑制された一定密度の細胞が滞留した状態となっており、所定数の粒子を繰り返し安定に吐出できる。
【００１３】
＜液保持部＞
液保持部は、液を保持する部材である。
液保持部に設けられる液滴吐出口と、該液滴吐出口とは反対側に大気開放部を有する。これにより、液体中に混入した気泡は大気開放部から排出可能である。
液保持部は、大気開放部を有し、かつ液滴吐出口の吐出方向に対して、垂直に切断したときの液保持部の内壁で形成される断面（断面積）が、大気開放部側から液滴吐出口へ向けて小さくなる構造を有し、液保持部の内壁で形成される断面（断面積）連続的に狭くなる構造であっても、非連続的に狭くなる構造であってもよく、平面だけでなく曲面を含んでいてもよい。これにより、液保持部に充填した溶液中の粒子（細胞）を、液保持部の内壁で形成される傾斜面に沿って液滴吐出口へと向かって沈降させることができる。
中でも、液保持部は、液滴吐出口の吐出方向に対して、垂直に切断したときの液保持部の内壁で形成される断面が、大気開放部側から液滴吐出口へ向けて漸減する構造を有することが、粒子の沈降効果により優れている点から好ましい。
液滴保持部の内壁面は、液滴吐出口の吐出方向に対して、垂直に切断したときの液保持部の内壁で形成される断面が大気開放部側から液滴吐出口へ向けて漸減するテーパー面を有し、テーパー面からなる傾斜線と液滴吐出口を通る垂線とのなす角度は、５度以上６０度以下が好ましく、１０度以上４０度以下がより好ましい。
【００１４】
液保持部の形状、大きさ、材質、及び構造については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
液保持部の材質としては、例えば、ステンレス鋼、ニッケル、アルミニウム等の金属、ＡＢＳ、ポリカーボネート、フッ素樹脂等のプラスチックス、二酸化ケイ素、アルミナ、ジルコニア等のセラミックスなどが挙げられる。
これらの中でも、粒子として細胞やタンパク質を用いる際には、細胞やタンパク質に対する付着性の低い材料を用いることが好ましい。
細胞の付着性は一般的に材質の水との接触角に依存性があると言われており、材質の親水性が高い又は疎水性が高いときには細胞の付着性が低い。親水性の高い材料としては各種金属材料やセラミックス（金属酸化物）を用いることが可能であり、疎水性が高い材料としてはフッ素樹脂等を用いることが可能である。
これら以外にも、材料表面をコーティングすることで細胞接着性を低下させることも考えられる。例えば、材料表面を前述の金属又は金属酸化物材料でコーティングすることや、細胞膜を模した合成リン脂質ポリマー（例えば、日油株式会社製、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ）によってコーティングすることが可能である。
【００１５】
−液滴吐出口−
液滴吐出口としては、その配列数、配列態様、間隔（ピッチ）、開口形状、開口の大きさなどについては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
液滴吐出口の配列数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、液滴吐出手段の吐出面の長さ方向に沿って１列配設されていることが好ましい。
液滴吐出口の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択されるが、２個以上１００個以下が好ましく、２個以上５０個以下がより好ましく、２個以上１２個以下が更に好ましい。液滴吐出口の数が２個以上１００個以下であると、単位時間当りの吐出する液滴数を増加させることができる高い生産性を有する液滴形成装置を提供することができる。
液滴吐出口は、等間隔に並んで配列されていることが好ましく、隣接する液滴吐出口の中心間の最短距離である間隔（ピッチ）Ｐとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、５０μｍ以上１,０００μｍ以下が好ましい。
液滴吐出口の開口形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、円形、楕円形、四角形などが挙げられる。
液滴吐出口の平均径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、粒子が液滴吐出口に詰まることを避けるため、粒子の大きさの２倍以上とすることが好ましい。
粒子が、例えば、動物細胞、特にヒトの細胞である場合、ヒトの細胞の大きさは、一般的に、５μｍ以上５０μｍ以下であるため、液滴吐出口の平均径は、使用する細胞に合わせて、１０μｍ以上１００μｍ以下が好ましい。
一方で、液滴が大きくなり過ぎると、微小液滴を形成するという目的の達成が困難となるため、液滴吐出口の平均径は、２００μｍ以下であることが好ましい。したがって、液滴吐出口の平均径は、１０μｍ以上２００μｍ以下がより好ましい。
【００１６】
−第一の振動部材及び第二の振動部材−
第一の振動部材は、液保持部を略重力方向に振動させ、固定部に支持されている。
第二の振動部材は、液保持部を略重力方向に垂直な方向に振動させ、固定部又は液保持部に設けられることが好ましい。
第一の振動部材による第一の振動の位相と、第二の振動部材による第二の振動の位相とが異なり、第一の振動と第二の振動とが交互に行われることが、ノズル詰まり解消効果を最大限に高めつつ液滴吐出を行える点から好ましい。
【００１７】
第一の振動部材及び第二の振動部材の形状、大きさ、材質、及び構造については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
第一の振動部材及び第二の振動部材の形状及び大きさとしては、特に制限はなく、液保持部や固定部の形状に合わせて適宜設計することができる。
【００１８】
第一の振動部材及び第二の振動部材としては、圧電素子が好適に用いられる。
圧電素子としては、例えば、圧電材料の上面及び下面に電圧を印加するための電極を設けた構造とすることができる。この場合、駆動手段から圧電素子の上下電極間に電圧を印加することによって膜の面横方向に圧縮応力が加わり、液保持部を振動させることができる。
圧電材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジルコン酸チタン酸鉛（ＰＺＴ）、ビスマス鉄酸化物、ニオブ酸金属物、チタン酸バリウム、又はこれらの材料に金属や異なる酸化物を加えたものなどが挙げられる。これらの中でも、ジルコン酸チタン酸鉛（ＰＺＴ）が好ましい。
【００１９】
液保持部は、粒子を含む液体を保持し、液滴吐出口から液滴として吐出する。
【００２０】
＜液滴＞
液滴は、粒子を含むことが好ましい。
液滴中に含まれる粒子の個数は、１個以上が好ましく、１個以上５個以下がより好ましい。
液滴の直径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２５μｍ以上１５０μｍ以下が好ましい。液滴の直径が２５μｍ以上であると、内包する粒子の直径が適正となり、適用できる粒子の種類が多くなる。また、液滴の直径が１５０μｍ以下であると、液滴の吐出が安定となる。
また、液滴の直径をＲとし、粒子の直径をｒとすると、Ｒ＞３ｒであることが好ましい。Ｒ＞３ｒであると、粒子の直径と液滴の直径との関係が適正であり、液滴の縁の影響を受けることがないため、粒子の計数精度が向上する。
液滴の液量は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１,０００ｐＬ以下が好ましく、１００ｐＬ以下がより好ましい。
液滴の液量は、例えば、液滴の画像から液滴の大きさを求め、液量を算出する方法などにより測定することができる。
【００２１】
液滴に含まれる粒子としては、例えば、金属微粒子、無機微粒子、細胞などが挙げられる。これらの中でも、細胞が好ましい。
【００２２】
細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞を問わず、すべての細胞について使用することができる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２３】
真核細胞としては、特に制限はなく、目的応じて適宜選択することができ、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌、藻類、原生動物などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、動物細胞、真菌が好ましく、ヒト由来の細胞がより好ましい。
【００２４】
接着性細胞としては、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、組織や器官から直接採取した初代細胞を何代か継代させたものでもよく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分化した細胞、未分化の細胞などが挙げられる。
【００２５】
分化した細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞；星細胞；クッパー細胞；血管内皮細胞；類道内皮細胞、角膜内皮細胞等の内皮細胞；繊維芽細胞；骨芽細胞；砕骨細胞；歯根膜由来細胞；表皮角化細胞等の表皮細胞；気管上皮細胞；消化管上皮細胞；子宮頸部上皮細胞；角膜上皮細胞等の上皮細胞；乳腺細胞；ペリサイト；平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞；腎細胞；膵ランゲルハンス島細胞；末梢神経細胞、視神経細胞等の神経細胞；軟骨細胞；骨細胞などが挙げられる。
【００２６】
未分化の細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞；単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞；ｉＰＳ細胞などが挙げられる。
【００２７】
真菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カビ、酵母菌などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞周期を調節することができ、１倍体を使用することができる点から、酵母菌が好ましい。
細胞周期とは、細胞が増えるとき、細胞分裂が生じ、細胞分裂で生じた細胞（娘細胞）が再び細胞分裂を行う細胞（母細胞）となって新しい娘細胞を生み出す過程を意味する。
【００２８】
酵母菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞周期をＧ１期に制御するフェロモン（性ホルモン）の感受性が増加したＢａｒ−１欠損酵母が好ましい。酵母菌がＢａｒ−１欠損酵母であると、細胞周期が制御できていない酵母菌の存在比率を低くすることができるため、容器内に収容された細胞の特定の核酸の数の増加等を防ぐことができる。
【００２９】
原核細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真正細菌、古細菌などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００３０】
細胞としては、死細胞が好ましい。死細胞であると、分取後に細胞分裂が起こることを防ぐことができる。
【００３１】
細胞としては、光を受光したときに発光可能な細胞であることが好ましい。光を受光したときに発光可能な細胞であると、細胞の数を高精度に制御して被着対象物に着弾させることができる。
受光とは、光を受けることを意味する。
光学センサとは、人間の目で見ることができる可視光線と、それより波長の長い近赤外線や短波長赤外線、熱赤外線領域までの光のいずれかの光をレンズで集め、対象物である細胞の形状などを画像データとして取得する受動型センサを意味する。
【００３２】
−−光を受光したときに発光可能な細胞−−
光を受光したときに発光可能な細胞としては、光を受光したときに発光可能であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、蛍光色素によって染色された細胞、蛍光タンパク質を発現した細胞、蛍光標識抗体により標識された細胞などが挙げられる。
細胞における蛍光色素による染色部位、蛍光タンパク質の発現部位、又は蛍光標識抗体による標識部位としては、特に制限はなく、細胞全体、細胞核、細胞膜などが挙げられる。
【００３３】
−−−蛍光色素−−−
蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類が好ましく、エオシン、エバンスブルー、トリパンブルー、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミン１２３がより好ましい。
【００３４】
蛍光色素としては、市販品を用いることができ、市販品としては、例えば、商品名：ＥｏｓｉｎＹ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：エバンスブルー（和光純薬工業株式会社製）、商品名：トリパンブルー（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミン６Ｇ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミンＢ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミン１２３（和光純薬工業株式会社製）などが挙げられる。
【００３５】
−−−蛍光タンパク質−−−
蛍光タンパク質としては、例えば、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＦＰ１、ＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉＣｙａｎ、ＣＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ２、ＨｙＰｅｒ、ＴａｇＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ＰＳ−ＣＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ２、Ｋａｅｄｅ、ＥｏｓＦＰ、ＫｉｋｕｍｅＧＲなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００３６】
−−−蛍光標識抗体−−−
蛍光標識抗体としては、蛍光標識されていれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−ＰＥなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００３７】
細胞は、特定の核酸を有することが好ましい。特定の核酸を有する細胞の細胞数は、複数であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３８】
−−−特定の核酸−−−
特定の核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、感染症検査に用いられる塩基配列、自然界には存在しない核酸、動物細胞由来の塩基配列、植物細胞由来の塩基配列などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。また、特定の核酸としては、プラスミドも好適に使用することができる。
核酸とは、プリン又はピリミジンから導かれる含窒素塩基、糖、及びリン酸が規則的に結合した高分子の有機化合物を意味する。
【００３９】
特定の核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが挙げられる。これらの中でも、ノロウイルスなどの感染症固定領域に由来するＲＮＡに対応するＤＮＡ、自然界に存在しないＤＮＡなどが好適に用いることができる。
【００４０】
特定の核酸を有する複数の細胞は、使用する細胞由来の特定の核酸であってもよく、遺伝子導入により導入された特定の核酸であってもよい。特定の核酸として、遺伝子導入により導入された特定の核酸、及びプラスミドを使用する場合は、１細胞に１コピーの特定の核酸が導入されていることを確認することが好ましい。１コピーの特定の核酸が導入されていることの確認方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シーケンサー、ＰＣＲ法、サザンブロット法などを用いて確認することができる。
【００４１】
遺伝子導入の方法としては、特定の核酸配列が狙いの場所に狙いの分子数導入できれば特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｆｌｉｐ−ｉｎ、Ｊｕｍｐ−ｉｎなどが挙げられる。特に、酵母菌の場合は、効率の高さ、及び制御のしやすさの点から、相同組換えが好ましい。
【００４２】
金属微粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、銀粒子、銅粒子などが挙げられる。これらは吐出した液滴によって配線を描画する用途に用いることができる。
【００４３】
無機微粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化ケイ素等が白色インクとしての用途やスペーサ材料の塗布用途等で用いられる。
【００４４】
粒子が凝集する場合には、粒子を含む液体の粒子の濃度を調整することにより、液体中の粒子の濃度と、液体中の粒子の個数とがポアソン分布に従う理論から、液体中の粒子の個数を適宜調整することができる。
液体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イオン交換水、蒸留水、純水、生理食塩水、アルコール、鉱物油、植物油等の様々な有機溶媒を用いることができる。
溶媒として水を使用する際には、水分の蒸発を抑えるための湿潤剤や、表面張力を下げるための界面活性剤が含まれていることが好ましい。これらの処方には、インクジェットインクに用いられるごく一般的な材料を用いることができる。
【００４５】
＜固定部＞
固定部は、第一の振動部材を支持する。更に、第二の振動部材を設けることが好ましい。
固定部の形状、大きさ、材質、及び構造については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
固定部の材質としては、例えば、ステンレス鋼、ニッケル、アルミニウム等の金属、ＡＢＳ、ポリカーボネート、フッ素樹脂等のプラスチックス、二酸化ケイ素、アルミナ、ジルコニア等のセラミックスなどが挙げられる。
【００４６】
＜その他の部材＞
その他の部材としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、制御部材を有することが好ましい。
【００４７】
（液滴形成装置）
本発明の液滴形成装置は、本発明の液滴吐出手段を備え、駆動手段及び粒子数計数手段を有することが好ましく、更に必要に応じてその他の手段を備える。
【００４８】
＜駆動手段＞
駆動手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液滴吐出手段が圧電加圧方式によるインクジェットヘッドである場合、液滴吐出手段に駆動電圧を入力する手段などが挙げられる。この場合、駆動手段が圧電素子を変形させることにより微小な液滴を吐出させることができる。
【００４９】
＜粒子数計数手段＞
粒子数計数手段は、液滴に含まれる粒子を計数する手段であり、液滴の吐出後、かつ液滴の被着対象物への着弾前に、液滴に含まれる粒子数をセンサによって計数する手段であることが好ましい。
センサとは、自然現象や人工物の機械的・電磁気的、熱的、音響的、又は化学的性質、或いはそれらにより示される空間情報・時間情報を、何らかの科学的原理を応用して、人間や機械が扱い易い別媒体の信号に置き換える装置を意味する。
【００５０】
粒子数計数手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、吐出前に粒子を観測する処理、着弾後の粒子をカウントする処理を含んでもよい。
【００５１】
液滴の吐出後、かつ液滴の被着対象物への着弾前に、液滴に含まれる粒子数の計数としては、液滴が被着対象物としてのプレートのウェルに確実に入ることが予測されるウェル開口部の直上の位置にあるタイミングにて液滴中の粒子を観測することが好ましい。
【００５２】
プレートとしては、特に制限はなく、バイオ分野において一般的に用いられる穴が形成されたものを用いることが可能である。
プレートにおけるウェルの数は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、単数であってもよく、複数であってもよい。
ウェルの数が複数であるプレートとしては、ウェルの数が２４個、９６個、３８４個など業界において一般的な個数及び寸法で穴が形成されたものを用いることが好ましい。
プレートの材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、後の処理のために、細胞や核酸の壁面への付着が抑制されているものを用いることが好ましい。
【００５３】
液滴中の粒子を観測する方法としては、例えば、光学的に検出する方法、電気的・磁気的に検出する方法などが挙げられる。
【００５４】
＜その他の手段＞
その他の手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、制御手段、表示手段、記録手段などを有することが好ましい。
【００５５】
ここで、本発明の液滴形成装置の実施形態について、図面を参照して詳細に説明する。
本発明の液滴形成装置は、液滴吐出手段として本発明の液滴吐出手段を用いており、本発明の液滴吐出手段は本発明の液滴形成装置に含まれるため、以下の本発明の液滴形成装置の実施形態の説明を通じて、本発明の液滴吐出手段の実施形態についても説明する。
なお、各図面において、同一構成部分には同一符号を付し、重複した説明を省略する場合がある。また、下記構成部材の数、位置、形状等は本実施形態に限定されず、本発明を実施する上で好ましい数、位置、形状等にすることができる。
また、以下の説明では、粒子としての細胞を懸濁した細胞溶液の吐出を対象として例示するが、その他の分野の粒子を懸濁した粒子懸濁液の吐出に適用するのでも構わない。
【００５６】
＜第１の実施形態＞
図１は、第１の実施形態に係る液滴形成装置２００の一例を示す図である。図１を参照すると、液滴形成装置２００は、液滴吐出手段１００と、駆動手段４０とを有する。
【００５７】
液滴吐出手段１００は、内部に三角錐形状の空間を有し、その先端部に液滴吐出口２を有する液保持部３、液保持部３内部に充填される溶液３００、液保持部３を支持する支持板５、支持板５を振動する第一の振動部材６、これらを支持する固定部７を有する。なお、各部材は接着剤で接着固定されている。
液保持部３は、液滴吐出口２と反対側に大気開放部５５を有する。液保持部１は、大気開放部５５有することにより、溶液３００中に混入した気泡を大気開放部から排出可能である。
液保持部３は、液滴吐出口２の吐出方向に対して、垂直に切断したときの液保持部の内壁で形成される断面（断面積）が、大気開放部５５側から液滴吐出口２へ向けて小さくなる構造を有する。図１では、液滴吐出口の吐出方向に対して、垂直に切断したときの内壁で形成される断面（断面積）が、大気開放部側から液滴吐出口へ向けて漸減する構造（テーパー構造）を有している。
液滴保持部３の内壁面は、液滴吐出口２の吐出方向に対して、垂直に切断したときの液保持部の内壁で形成される断面が大気開放部５５側から液滴吐出口２へ向けて漸減するテーパー面を有し、テーパー面からなる傾斜線と液滴吐出口を通る垂線とのなす角度は、２０度である。
【００５８】
液滴吐出手段１００において、液保持部１は、粒子３５０を含有する（粒子３５０が分散された）溶液３００を保持しており、例えば、金属、樹脂、シリコン、セラミック等から形成されている。
粒子３５０を含有する溶液３００において、粒子３５０としては、例えば、金属微粒子、無機微粒子、細胞などが挙げられる。これらの中でも、細胞が好ましい。
【００５９】
液滴吐出口（ノズル）２は、液保持部３の先端部に実質的に真円状の貫通孔として形成されていることが好ましい。この場合、ノズル２の径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、粒子３５０がノズル２に詰まることを避けるため、粒子３５０の大きさの２倍以上とすることが好ましい。
【００６０】
第一の振動部材６は、圧電素子から構成される。圧電素子としては、図１中の８に示す運動を行うベンド型タイプが用いられる。第一の振動部材６の駆動信号は、駆動手段４０より命令される。
溶液３００の充填後、粒子３５０としての細胞は、液保持部３のテーパー面に沿って１１の矢印の向きに沈降し、液滴吐出口２付近に集まり互いに隙間を埋めるように堆積する。その結果、液滴吐出口２付近には、密度が均一かつ運動が抑制された状態の粒子（細胞）３５０が滞留する。この状態で、第一の振動部材６により８の運動を起こすと、振動は支持板５を伝達し先端部では増幅され１２の上下動を起こし、粒子数（細胞数）の安定した吐出液滴３１０を吐出することができる。
【００６１】
＜第２の実施形態＞
図２は、第２の実施形態の液滴形成装置を示す。この第２の実施形態の液滴形成装置２００は、液滴吐出手段固定部１４に取り付けた第二の振動部材１５を固定部７に接着固定している点が、第１の実施形態と異なる。なお、既に説明した第１の実施形態と同一構成についての説明は省略する場合がある。
【００６２】
第二の振動部材１５は、積層型の圧電素子から構成される。第二の振動部材１５の駆動信号は、駆動手段４０より命令され、図２中１６で示す左右方向の第二の振動を固定部７に付与する。これにより、液保持部３を左右に揺動させてノズル詰まりの解消ができる。
【００６３】
図３Ａ〜図３Ｃは、液保持部３を切り出し、ノズル詰まり解消方法を説明する図である。粒子の種類や溶媒等の条件によっては、ノズル詰まりが発生し液滴吐出困難となる場合がある。
図３Ａは、粒子３５０としての細胞自体がノズル内に詰まった状態を示す。その場合に、第二の振動１６により液保持部を右方向に振動すると、図３Ｂに示すように粒子３５０としての細胞は矢印の方向に動く。左側内壁面に接した細胞はテーパーに沿って上方に移動し、右側内壁面に接した細胞は内壁面から離れる。
次に、図３Ｃに示すように左方向へ振動すると、右側内壁面に接した細胞は上方に移動し、左側内壁面に接した細胞は内壁面から離れる。このように、粒子３５０としての細胞を上方へ移動させかつ壁面から離反させることで、１７に示す細胞が少ない領域ができて詰まりを解消できる。なお、図３Ｃは、説明のために１７を大きく描いており、細胞密度が変化しているように見えるが、実際の詰まり解消動作では、１７は極めて小さくても詰まりを解消できる。その結果、ノズル詰まりの解消と粒子数（細胞数）の安定した吐出を両立できる。
【００６４】
図４は、第一の振動８と第二の振動１６の波形を重ねて示したものである。実線は第一の振動８を示し、破線は第二の振動１６を示す。第二の振動１６の矢印１７は、図３Ｂ及び図３Ｃの１６で示す左右の運動に相当する。
第一の振動８と第二の振動１６によるノズル詰まり解消を交互に行うことにより、ノズル詰まりを防止しながら、粒子数（細胞数）の安定した連続安定吐出を行うことが可能となる。
【００６５】
図５は、第一の振動８と第二の振動１６の入力方法の別の実施形態を示す。図５に示すように、第二の振動１６を小振幅かつ高周波で常時行うことで、詰まり防止効果を連続的に得ることができ、より安定的な吐出が可能となる。
【００６６】
＜第３の実施形態＞
図６は、第３の実施形態の液滴形成装置を示す。この第３の実施形態の液滴形成装置２００は、液保持部３に第二の振動部材１５を直接１つ取り付けた液滴吐出手段１０１を有する点が、第１の実施形態と異なる。なお、既に説明した第１の実施形態と同一構成についての説明は省略する場合がある。
この第３の実施形態の場合には、積層型の圧電素子で構成される第二の振動部材１５による振動を直接ノズル付近へと伝達することが可能となり、小さなエネルギーでも大きな揺動を発生することができる。
なお、第３の実施形態の場合には、第一の振動部材１８も積層型の圧電素子で構成する。
【００６７】
＜第４の実施形態＞
−光学的に検出する方法−
図７、図１１、及び図１２を用いて、光学的に検出する方法に関して以下に説明する。
図７は、液滴形成装置の一例を示す模式図である。図１１、及び図１２は、液滴形成装置の他の一例を示す模式図である。
図７に示すように、第４の実施形態の液滴形成装置２００Ａは、液滴吐出手段１００と、駆動手段４０と、光源５０と、受光素子６０と、制御手段７０とを有する。液滴吐出手段１００としては、第１の実施形態と同様である。
【００６８】
図７では、細胞懸濁液として細胞を特定の色素によって蛍光染色した後に所定の溶液に分散した液を用いており、液滴吐出手段１００から形成した液滴３１０に光源５０から発せられる特定の波長を有する光Ｌを照射し細胞から発せられる蛍光を受光素子６０によって検出することによって計数を行う。このとき、蛍光色素によって細胞を染色する方法に加え、細胞中に元々含まれる分子が発する自家蛍光を利用してもよいし、細胞に蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ））を生産するための遺伝子を予め導入しておき細胞が蛍光を発するようにしておいてもよい。
【００６９】
光源５０は、飛翔中の液滴３１０に光Ｌを照射する。なお、飛翔中とは、液滴３１０が液滴吐出手段１００から吐出されてから、着滴対象物に着滴するまでの状態を意味する。飛翔中の液滴３１０は、光Ｌが照射される位置では略球状となっている。また、光Ｌのビーム形状は略円形状である。
【００７０】
ここで、液滴３１０の直径に対し、光Ｌのビーム直径が１０倍〜１００倍程度であることが好ましい。これは、液滴３１０の位置ばらつきが存在する場合においても、光源５０からの光Ｌを確実に液滴３１０に照射するためである。
ただし、液滴３１０の直径に対し、光Ｌのビーム直径が１００倍を大きく超えることは好ましくない。これは、液滴３１０に照射される光のエネルギー密度が下がるため、光Ｌを励起光として発する蛍光Ｌｆの光量が低下し、受光素子６０で検出し難くなるからである。
【００７１】
光源５０から発せられる光Ｌはパルス光であることが好ましく、例えば、固体レーザー、半導体レーザー、色素レーザー等が好適に用いられる。光Ｌがパルス光である場合のパルス幅は１０μｓ以下が好ましく、１μｓ以下がより好ましい。単位パルス当たりのエネルギーとしては、集光の有無等、光学系に大きく依存するが、概ね０．１μＪ以上が好ましく、１μＪ以上がより好ましい。
【００７２】
受光素子６０は、飛翔中の液滴３１０に蛍光染色細胞３５０が含有されていた場合に、蛍光染色細胞３５０が光Ｌを励起光として吸収して発する蛍光Ｌｆを受光する。蛍光Ｌｆは、蛍光染色細胞３５０から四方八方に発せられるため、受光素子６０は蛍光Ｌｆを受光可能な任意の位置に配置することができる。この際、コントラストを向上するため、光源５０から出射される光Ｌが直接入射しない位置に受光素子６０を配置することが好ましい。
【００７３】
受光素子６０は、蛍光染色細胞３５０から発せられる蛍光Ｌｆを受光できる素子であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、液滴に特定の波長を有する光を照射して液滴内の細胞からの蛍光を受光する光学センサが好ましい。
受光素子６０としては、例えば、フォトダイオード、フォトセンサ等の１次元素子が挙げられるが、高感度な測定が必要な場合には、光電子増倍管やアバランシェフォトダイオードを用いることが好ましい。受光素子６０として、例えば、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、ゲートＣＣＤ等の２次元素子を用いてもよい。
【００７４】
なお、光源５０が発する光Ｌと比較して蛍光染色細胞３５０の発する蛍光Ｌｆが弱いため、受光素子６０の前段（受光面側）に光Ｌの波長域を減衰させるフィルタを設置してもよい。これにより、受光素子６０において、非常にコントラストの高い蛍光染色細胞３５０の画像を得ることができる。フィルタとしては、例えば、光Ｌの波長を含む特定波長域を減衰させるノッチフィルタ等を用いることができる。
【００７５】
また、前述のように、光源５０から発せられる光Ｌはパルス光であることが好ましいが、光源５０から発せられる光Ｌを連続発振の光としてもよい。この場合には、連続発振の光が飛翔中の液滴３１０に照射されるタイミングで受光素子６０が光を取り込み可能となるように制御し、受光素子６０に蛍光Ｌｆを受光させることが好ましい。
【００７６】
制御手段７０は、駆動手段４０及び光源５０を制御する機能を有している。また、制御手段７０は、受光素子６０が受光した光量に基づく情報を入手し、液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数（ゼロである場合も含む）を計数する機能を有している。
以下、図８〜図１０を参照し、制御手段７０の動作を含む液滴形成装置２００Ａの動作について説明する。
【００７７】
図８は、図７の制御手段７０のハードウェアブロックを例示する図である。図９は、図７の制御手段７０の機能ブロックを例示する図である。図１０は、液滴形成装置２００Ａの動作の一例を示すフローチャートである。
【００７８】
図８に示すように、制御手段７０は、ＣＰＵ７１と、ＲＯＭ７２と、ＲＡＭ７３と、Ｉ／Ｆ７４と、バスライン７５とを有している。ＣＰＵ７１、ＲＯＭ７２、ＲＡＭ７３、及びＩ／Ｆ７４は、バスライン７５を介して相互に接続されている。
【００７９】
ＣＰＵ７１は、制御手段７０の各機能を制御する。記憶手段であるＲＯＭ７２は、ＣＰＵ７１が制御手段７０の各機能を制御するために実行するプログラムや、各種情報を記憶している。記憶手段であるＲＡＭ７３は、ＣＰＵ７１のワークエリア等として使用される。また、ＲＡＭ７３は、所定の情報を一時的に記憶することができる。Ｉ／Ｆ７４は、液滴形成装置２００Ａを他の機器等と接続するためのインターフェイスである。液滴形成装置２００Ａは、Ｉ／Ｆ７４を介して、外部ネットワーク等と接続されてもよい。
【００８０】
図９に示すように、制御手段７０は、機能ブロックとして、吐出制御手段７０１と、光源制御手段７０２と、細胞数計数手段（細胞数検知手段）７０３とを有している。
【００８１】
図９及び図１０を参照しながら、液滴形成装置２００Ａの粒子数計数について説明する。
まず、ステップＳ１１において、制御手段７０の吐出制御手段７０１は、駆動手段４０に吐出の指令を出す。吐出制御手段７０１から吐出の指令を受けた駆動手段４０は、第一の振動部材６に駆動信号を供給して液保持部３を振動させる。液保持部３の振動により、蛍光染色細胞３５０を含有する液滴３１０が、ノズル１３１から吐出される。
【００８２】
次に、ステップＳ１２において、制御手段７０の光源制御手段７０２は、液滴３１０の吐出に同期して（駆動手段４０から液滴吐出手段１００に供給される駆動信号に同期して）光源５０に点灯の指令を出す。これにより、光源５０が点灯し、飛翔中の液滴３１０に光Ｌを照射する。
【００８３】
なお、ここで、同期するとは、液滴吐出手段１００による液滴３１０の吐出と同時に（駆動手段４０が液滴吐出手段１００に駆動信号を供給するのと同時に）発光することではなく、液滴３１０が飛翔して所定位置に達したときに液滴３１０に光Ｌが照射されるタイミングで、光源５０が発光することを意味する。つまり、光源制御手段７０２は、液滴吐出手段１００による液滴３１０の吐出（駆動手段４０から液滴吐出手段１００に供給される駆動信号）に対して、所定時間だけ遅延して発光するように光源５０を制御する。
【００８４】
例えば、液滴吐出手段１００に駆動信号を供給した際に吐出する液滴３１０の速度ｖを予め測定する。そして、測定した速度ｖに基づいて液滴３１０が吐出されてから所定位置まで到達する時間ｔを算出し、液滴吐出手段１００に駆動信号を供給するタイミングに対して、光源５０が光を照射するタイミングをｔだけ遅延させる。これにより、良好な発光制御が可能となり、光源５０からの光を確実に液滴３１０に照射することができる。
【００８５】
次に、ステップＳ１３において、制御手段７０の細胞数計数手段７０３は、受光素子６０からの情報に基づいて、液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数（ゼロである場合も含む）を計数する。ここで、受光素子６０からの情報とは、蛍光染色細胞３５０の輝度値（光量）や面積値である。
【００８６】
細胞数計数手段７０３は、例えば、受光素子６０が受光した光量と予め設定された閾値とを比較して、蛍光染色細胞３５０の個数を計数することができる。この場合には、受光素子６０として１次元素子を用いても２次元素子を用いても構わない。
【００８７】
受光素子６０として２次元素子を用いる場合は、細胞数計数手段７０３は、受光素子６０から得られた２次元画像に基づいて、蛍光染色細胞３５０の輝度値或いは面積を算出するための画像処理を行う手法を用いてもよい。この場合、細胞数計数手段７０３は、画像処理により蛍光染色細胞３５０の輝度値或いは面積値を算出し、算出された輝度値或いは面積値と、予め設定された閾値とを比較することにより、蛍光染色細胞３５０の個数を計数することができる。
【００８８】
なお、蛍光染色細胞３５０は、細胞や染色細胞であってもよい。染色細胞とは、蛍光色素によって染色された細胞、又は蛍光タンパク質を発現可能な細胞を意味する。
【００８９】
このように、液滴形成装置２００Ａでは、蛍光染色細胞３５０を縣濁した細胞懸濁液３００を保持する液滴吐出手段１００に、駆動手段４０から駆動信号を供給して、蛍光染色細胞３５０を含有する液滴３１０を吐出させ、飛翔中の液滴３１０に光源５０から光Ｌを照射する。そして、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０が光Ｌを励起光として蛍光Ｌｆを発し、蛍光Ｌｆを受光素子６０が受光する。更に、受光素子６０からの情報に基づいて、細胞数計数手段７０３が、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数を計数（カウント）する。
【００９０】
つまり、液滴形成装置２００Ａでは、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数を実際にその場で観察するため、蛍光染色細胞３５０の個数の計数精度を従来よりも向上することが可能となる。また、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０に光Ｌを照射して蛍光Ｌｆを発光させて蛍光Ｌｆを受光素子６０で受光するため、高いコントラストで蛍光染色細胞３５０の画像を得ることが可能となり、蛍光染色細胞３５０の個数の誤計数の発生頻度を低減できる。
【００９１】
＜第５の実施形態＞
図１１は、図７の液滴形成装置２００Ａの変形例を示す模式図である。図１１に示すように、液滴形成装置２００Ｂは、受光素子６０の前段にミラー４５を配置した点が、液滴形成装置２００Ａ（図７参照）と相違する。なお、既に説明した実施形態と同一構成についての説明は省略する場合がある。
【００９２】
このように、第５の実施形態の液滴形成装置２００Ｂでは、受光素子６０の前段にミラー４５を配置したことにより、受光素子６０のレイアウトの自由度を向上することができる。
【００９３】
例えば、ノズル１３１と着滴対象物を近づけた際に、図７のレイアウトでは着滴対象物と液滴形成装置２００Ａの光学系（特に受光素子６０）との干渉が発生するおそれがあるが、図１１のレイアウトにすることで、干渉の発生を回避することができる。
即ち、図１１のように受光素子６０のレイアウトを変更することにより、液滴３１０が着滴する着滴対象物とノズル１３１との距離（ギャップ）を縮めることが可能となり、着滴位置のばらつきを抑制することができる。その結果、分注の精度を向上することが可能となる。
【００９４】
＜第６の実施形態＞
図１２は、図７の液滴形成装置２００Ａの他の変形例を示す模式図である。図１２に示すように、第６の実施形態の液滴形成装置２００Ｃは、蛍光染色細胞３５０から発せられる蛍光Ｌｆ１を受光する受光素子６０に加え、蛍光染色細胞３５０から発せられる蛍光Ｌｆ２を受光する受光素子６１を設けた点が、液滴形成装置２００Ａ（図７参照）と相違する。なお、既に説明した実施形態と同一構成についての説明は省略する場合がある。
【００９５】
ここで、蛍光Ｌｆ１及びＬｆ２は、蛍光染色細胞３５０から四方八方に発せられる蛍光の一部を示している。受光素子６０及び６１は、蛍光染色細胞３５０から異なる方向に発せられる蛍光を受光できる任意の位置に配置することができる。なお、蛍光染色細胞３５０から異なる方向に発せられる蛍光を受光できる位置に３つ以上の受光素子を配置してもよい。また、各受光素子は同一仕様としてもよいし、異なる仕様としてもよい。
【００９６】
受光素子が１つであると、飛翔する液滴３１０に複数個の蛍光染色細胞３５０が含まれる場合に、蛍光染色細胞３５０同士が重なることに起因して、細胞数計数手段７０３が液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数を誤計数する（カウントエラーが発生する）おそれがある。
【００９７】
図１３Ａ及び図１３Ｂは、飛翔する液滴に２個の蛍光染色細胞が含まれる場合を例示する図である。例えば、図１３Ａに示すように、蛍光染色細胞３５０１と３５０２とに重なりが発生する場合や、図１３Ｂに示すように、蛍光染色細胞３５０１と３５０２とに重なりが発生しない場合があり得る。受光素子を２つ以上設けることで、蛍光染色細胞が重なる影響を低減することが可能である。
【００９８】
前述のように、細胞数計数手段７０３は、画像処理により蛍光粒子の輝度値或いは面積値を算出し、算出された輝度値或いは面積値と、予め設定された閾値とを比較することにより、蛍光粒子の個数を計数することができる。
【００９９】
受光素子を２つ以上設置する場合、それぞれの受光素子から得られる輝度値或いは面積値のうち、最大値を示すデータを採択することで、カウントエラーの発生を抑制することが可能である。これに関して、図１４を参照して、より詳しく説明する。
【０１００】
図１４は、粒子同士の重なりが生じない場合の輝度値Ｌｉと、実測される輝度値Ｌｅとの関係を例示する図である。図１４に示すように、液滴内の粒子同士の重なりがない場合には、Ｌｅ＝Ｌｉとなる。例えば、細胞１個の輝度値をＬｕとすると、細胞数／滴＝１個の場合には、Ｌｅ＝Ｌｕであり、粒子数／滴＝ｎ個の場合はＬｅ＝ｎＬｕである（ｎ：自然数）。
【０１０１】
しかし、実際には、ｎが２以上の場合には粒子同士の重なりが発生し得るため、実測される輝度値はＬｕ≦Ｌｅ≦ｎＬｕ（図１４の網掛部分）となる。そこで、細胞数／滴＝ｎ個の場合、例えば、閾値を（ｎＬｕ−Ｌｕ／２）≦閾値＜（ｎＬｕ＋Ｌｕ／２）と設定することができる。そして、複数の受光素子を設置する場合、それぞれの受光素子から得られたデータのうち最大値を示すものを採択することで、カウントエラーの発生を抑制することが可能となる。なお、輝度値に代えて面積値を用いてもよい。
【０１０２】
また、受光素子を複数設置する場合、得られる複数の形状データを基に、細胞数を推定するアルゴリズムにより粒子数を決定づけてもよい。
このように、液滴形成装置２００Ｃでは、蛍光染色細胞３５０が異なる方向に発した蛍光を受光する複数の受光素子を有しているため、蛍光染色細胞３５０の個数の誤計数の発生頻度を更に低減できる。
【０１０３】
本発明の液滴形成装置は、所定数の粒子を繰り返し安定に吐出できるので、各種分野に好適に用いられるが、以下に説明する本発明の分注装置に特に好適に用いられる。
【０１０４】
（分注装置）
本発明の分注装置は、本発明の上記液滴形成装置と、被着対象物とを有し、制御手段を有することが好ましく、更に必要に応じてその他の手段を有する。
液滴形成装置の粒子数計数手段が、液滴に含まれる粒子の数が０個であると判定したとき、液滴吐出手段が、同じ凹部に対して液滴を再度吐出することが、凹部に確実に粒子を分注することができる点から好ましい。
【０１０５】
＜被着対象物＞
被着対象物は、液滴形成装置の液滴吐出手段から吐出された液滴が着滴する複数の凹部が形成された部材である。
被着対象物としては、吐出された液滴が付着することができれば、その材質、形状、大きさ、構造などについては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
被着対象物の材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、半導体、セラミックス、金属、ガラス、石英ガラス、プラスチックスなどで形成されたものが好適に挙げられる。
被着対象物の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、板状、プレート状などが好ましい。
被着対象物の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、単層構造であっても複数層構造であっても構わない。
被着対象物に設ける凹部の数は、複数であり、２つ以上が好ましく、５つ以上がより好ましく、５０つ以上が更に好ましい。
【０１０６】
＜制御手段＞
制御手段は、液滴吐出手段と複数の凹部との相対的な位置関係を制御する手段であり、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）ＲＯＭ（Ｒｅａｄ  Ｏｎｌｙ  Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｍｅｍｏｒｙ）、メインメモリなどを有し、分注装置全体の動作を制御するための制御プログラムに基づいて各種処理を実行する。
【０１０７】
＜その他の手段＞
その他の手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、記録手段、培養手段、加熱手段、攪拌手段、洗浄手段などを有することが好ましい。
【０１０８】
本発明の分注装置は、吐出された液滴に含まれる粒子の検知精度が向上すると共に、単位時間当りの吐出する液滴数を増加させることができる高い生産性を有する本発明の粒子計数装置を有しているので、再生医療、医薬、化粧品、化学物質の安全性や効能の評価などの各種分野に幅広く用いることができる組織体、特に三次元組織体の作製に好適に用いられる。
【０１０９】
ここで、本発明の分注装置の実施形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【０１１０】
＜分注装置の第１の実施形態＞
図１５は、第１の実施形態の分注装置の一例を示す概略図である。第１の実施形態の分注装置では、本発明の液滴形成装置を、被着対象物の凹部に粒子を分注する分注装置として用いる形態である。なお、第１の実施形態の分注装置において、既に説明した実施の形態と同一の構成については、同じ参照符号を付してその説明を省略する。
【０１１１】
図１５に示す分注装置２２０は、液滴形成装置２００と、被着対象物３０１と、ステージ４００と、制御手段５００とを有している。
液滴形成装置２００としては、図１に示す第１の実施形態の液滴形成装置２００を用いている。
なお、液滴形成装置２００に代えて、図７、図１１、及び図１２に示す液滴形成装置２００Ａから２００Ｃのいずれかを用いてもよい。
【０１１２】
被着対象物３０１は、移動可能に構成されたステージ４００上に配置されている。被着対象物３０１には、液滴形成装置２００の液滴吐出手段１００から吐出された液滴３１０が着滴する複数の凹部（ウェル）３３０が形成されている。
制御手段５００は、ステージ４００を移動させ、液滴形成装置２００の液滴吐出手段１００とそれぞれの凹部３３０との相対的な位置関係を制御する。これにより、液滴形成装置２００の液滴吐出手段１００からそれぞれの凹部３３０中に順次粒子３５０を含む液滴３１０を吐出することができる。
【０１１３】
制御手段５００は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、メインメモリ等を含む構成とすることができる。この場合、制御手段５００の各種機能は、ＲＯＭ等に記録されたプログラムがメインメモリに読み出されてＣＰＵにより実行されることによって実現できる。但し、制御手段５００の一部又は全部は、ハードウェアのみにより実現されてもよい。また、制御手段５００は、物理的に複数の装置等により構成されてもよい。
【０１１４】
図１６は、第１の実施の形態に係る分注装置の動作を示すフローチャートの例である。まず、ステップＳ１０１では、液滴形成装置２００の液滴吐出手段１００は、所定の凹部３３０に向けて液滴３１０を吐出する。
【０１１５】
次に、ステップＳ１０２では、液滴形成装置２００の粒子数計数手段６２は、飛翔する液滴３１０に含有された粒子３５０の個数を検知し、検知結果を制御手段５００に送る。粒子数計数手段６２の検知結果が『１個以上』でない場合（ゼロ個の場合）には、ステップＳ１０１の動作を繰り返す。
【０１１６】
ステップＳ１０２で粒子数計数手段６２の検知結果が『１個以上』である場合には、ステップＳ１０３に移行する。ステップＳ１０３では、制御手段５００はステージ４００を制御し、液滴形成装置２００の液滴吐出手段１００と次の凹部３３０とが対向する位置になるように被着対象物３０１を移動する。その後、ステップＳ１０１に移行して同様の動作を繰り返す。
【０１１７】
これにより、凹部３３０に向けて飛翔する液滴３１０に含有された粒子３５０の個数がゼロ個である場合には同じ凹部３３０に向けて液滴３１０を再度吐出するため、複数の凹部３３０中に確実に粒子３５０を分注することが可能となる。
【０１１８】
また、飛翔する液滴３１０に含有された粒子３５０の有無ではなく、図１７に示すように飛翔する液滴３１０に含有された粒子３５０の個数を検知することも可能である。
図１７は、第１の実施形態に係る分注装置の動作を示すフローチャートの他の例である。
【０１１９】
図１７では、まず、図１６と同様のステップＳ１０１を実施後、ステップＳ２０２において、液滴形成装置２００の粒子数計数手段６２は、飛翔する液滴３１０に含有された粒子３５０の個数を検知し、検知結果を制御手段５００に送る。粒子数計数手段６２の検知結果が『３個』となるまで、ステップＳ１０１の動作を繰り返す。
【０１２０】
なお、液滴３１０に含有された粒子３５０の個数が増えると粒子数計数手段６２の検知精度が低下するおそれがあるため、必ずしも１回に吐出する液滴３１０に含有された粒子３５０の個数が３個になるように設定する必要はない。例えば、１回に吐出する液滴３１０に含有された粒子３５０の個数が０個又は１個になるように設定してもよい。この場合、液滴３１０に含有された粒子３５０の個数の合計が３個となるまで、ステップＳ１０１の動作を繰り返す。
【０１２１】
ステップＳ２０２で粒子数計数手段６２の検知結果が『３個』である場合には、ステップＳ１０３に移行し、図１６と同様のステップＳ１０３を実施する。その後、ステップＳ１０１に移行して同様の動作を繰り返す。これにより、各凹部３３０内の粒子３５０の個数が３個となるように分注することが可能になる。
【０１２２】
なお、図１６及び図１７の処理において、ステージ４００に沿って液滴形成装置２００を所定の位置に移動させる機能は、例えば、制御手段５００にプログラムとして組み込むことができる。
【０１２３】
本発明の態様としては、例えば、以下のとおりである。
＜１＞  液を保持する液保持部と、
前記液保持部に設けられる液滴吐出口と、
前記液保持部を振動させる第一の振動部材と、
前記第一の振動部材を支持する固定部と、を有し、
前記液保持部は、大気開放部を有し、かつ前記液滴吐出口の吐出方向に対して、垂直に切断したときの前記液保持部の内壁で形成される断面が、前記大気開放部側から前記液滴吐出口へ向けて小さくなる構造を有することを特徴とする液滴吐出手段である。
＜２＞  前記液保持部は、前記液滴吐出口の吐出方向に対して、垂直に切断したときの前記液保持部の内壁で形成される断面が、前記大気開放部側から前記液滴吐出口へ向けて漸減する構造を有する前記＜１＞に記載の液滴吐出手段である。
＜３＞  前記液滴保持部の内壁面は、前記液滴吐出口の吐出方向に対して、垂直に切断したときの前記液保持部の内壁で形成される断面が前記大気開放部側から前記液滴吐出口へ向けて漸減するテーパー面を有し、テーパー面からなる傾斜線と前記液滴吐出口を通る垂線とのなす角度が、５度以上６０度以下である前記＜２＞に記載の液滴吐出手段である。
＜４＞  更に、第二の振動部材を有し、
前記第二の振動部材が、前記液保持部を略重力方向に垂直な方向に振動する前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の液滴吐出手段である。
＜５＞  前記第二の振動部材が、前記固定部に設けられる前記＜４＞に記載の液滴吐出手段である。
＜６＞  前記第二の振動部材が、前記液保持部に設けられる前記＜４＞に記載の液滴吐出手段である。
＜７＞  前記第一の振動部材による第一の振動の位相と、前記第二の振動部材による第二の振動の位相とが異なり、前記第一の振動と前記第二の振動とが交互に行われる前記＜４＞から＜６＞のいずれかに記載の液滴吐出手段である。
＜８＞  前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の液滴吐出手段を備えることを特徴とする液滴形成装置である。
＜９＞  液滴に含まれる粒子を計数する粒子数計数手段を有する前記＜８＞に記載の液滴形成装置である。
＜１０＞  前記液滴が、光を照射されたときに発光可能な粒子を含む前記＜８＞から＜９＞のいずれかに記載の液滴形成装置である。
＜１１＞  前記光を照射されたときに発光可能な粒子が、細胞である前記＜１０＞に記載の液滴形成装置である。
＜１２＞  前記光を照射されたときに発光可能な粒子が、蛍光色素によって染色された細胞及び蛍光タンパク質を発現可能な細胞の少なくともいずれかである前記＜１０＞から＜１１＞のいずれかに記載の液滴形成装置である。
＜１３＞  前記＜８＞から＜１２＞のいずれかに記載の液滴形成装置と、
液滴吐出手段から吐出された液滴が着滴する複数の凹部が形成された被着対象物と、
を有することを特徴とする分注装置である。
＜１４＞  前記液滴吐出手段と前記複数の凹部との相対的な位置関係を制御する制御手段を有する前記＜１３＞に記載の分注装置である。
＜１５＞  前記液滴形成装置における粒子計数装置が、前記液滴に含まれる粒子の数が０個であると判定したとき、
前記液滴吐出手段が、同じ前記凹部に対して前記液滴を再度吐出する前記＜１３＞から＜１４＞のいずれかに記載の分注装置である。
【０１２４】
前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の液滴吐出手段、前記＜８＞から＜１２＞のいずれかに記載の液滴形成装置、及び前記＜１３＞から＜１５＞のいずれかに記載の分注装置によると、従来における前記諸問題を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０１２５】
【特許文献１】特許第２８４９６４７号公報
【特許文献２】特開２０１６−２０３１５７号公報
【符号の説明】
【０１２６】
２      液滴吐出口
３      液保持部
５      支持板
６      第一の振動部材
７      固定部
８      第一の振動
１１      沈降
１２      支持板の上下動
１３      吐出液滴
１４      液滴吐出手段固定部
１５      第二の振動部材
１６      第二の振動
１７      粒子が少ない領域
１８      第３の実施形態における第一の振動部材
４０      駆動手段
１００      液滴吐出手段
２００      液滴形成装置
３００      溶液
３５０      粒子
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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