(57)【要約】【課題】反応空間のコーナーやエッジ領域でエアポケットの発生を防止することができるデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジを提供する。【解決手段】デジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジは、微小流体チャンバ、ウェルアレイ、ＣＭＯＳフォトセンサアレイ及びＰＣＢを含む。微小流体チャンバは、液体試料の投入のために形成されたインレットを含み、射出成形が可能である。ウェルアレイは、微小流体チャンバの下部面に付着される。ＣＭＯＳフォトセンサアレイは、ウェルアレイの下に配置され、ウェルアレイのマイクロウェルに充填された試料の反応映像をリアルタイムで撮影する。ＰＣＢには、インレットから液体試料が投入されることによって微小流体チャンバに形成されたマイクロ流路と、ウェルアレイと微小流体チャンバと間に形成された空間と、ウェルアレイに形成されたマイクロウェルの真空処理のための通気口（ｖｅｎｔ）とが形成される。【選択図】      図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料の投入のために形成されたインレットを含み、射出成形が可能な微小流体チャンバと、
上下部が貫通した複数のマイクロウェルを含み、前記微小流体チャンバの下部面に付着されたウェルアレイと、
前記ウェルアレイの下に配置され、前記ウェルアレイのマイクロウェルに充填された試料の反応映像をリアルタイムで撮影するＣＭＯＳフォトセンサアレイと、
前記インレットから液体試料が投入されることによって前記微小流体チャンバに形成されたマイクロ流路、前記ウェルアレイと前記微小流体チャンバと間に形成された空間、及び前記ウェルアレイに形成されたマイクロウェルの真空処理のための通気口が形成されたＰＣＢと、を含むことを特徴とするデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジ。
【請求項２】
前記微小流体チャンバが、
四角形状の第１フラット部、前記第１フラット部の中心領域に形成された四角形状の支持ホール、前記第１フラット部の角領域に形成された円形状のホールを含む四角形状のベース部材と、
四角形状の第２フラット部、皿形状のメンブレインスイッチ及び閉ループ形状のインレット部を含み、前記ベース部材の上に配置される四角形状のトップ部材を含むことを特徴とする請求項１に記載のデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジ。
【請求項３】
前記微小流体チャンバは、ＰＤＭＳ材質、透明プラスチック、透明ゴム材質のうち少なくとも一つ以上を含むことを特徴とする請求項１に記載のデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジ。
【請求項４】
前記微小流体チャンバが、低い自己蛍光性を有することを特徴とする請求項１に記載のデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジ。
【請求項５】
前記微小流体チャンバに付着され、前記微小流体チャンバに形成されたマイクロ流路の底を形成するステッカーをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジ。
【請求項６】
前記ウェルアレイが、エッチングされたシリコーン材質、金属、セラミック、プラスチック、エポキシ、フォトレジストレジンのうち少なくとも一つ以上を含むことを特徴とする請求項１に記載のデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジ。
【請求項７】
前記ＣＭＯＳイメージセンサの上部面には、密封後にウェルの底を形成するために薄い層がコーティングされたことを特徴とする請求項１に記載のデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジ。
【請求項８】
前記薄い層が、ＰＤＭＳ材質を含むことを特徴とする請求項７に記載のデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジ。
【請求項９】
前記ウェルアレイが、親水性コーティング処理されたことを特徴とする請求項１に記載のデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジ。
【請求項１０】
前記ウェルアレイが、プラズマまたは熱またはＵＶ硬化接着剤によって前記微小流体チャンバに付着されることを特徴とする請求項１に記載のデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジ。
【請求項１１】
前記ウェルアレイが、７００μｍ未満の厚さを有することを特徴とする請求項１に記載のデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジ。
【請求項１２】
前記ウェルアレイには六角形状のマイクロウェルが形成され、前記マイクロウェルのピッチは１５０μｍ未満であることを特徴とする請求項１に記載のデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジ。
【請求項１３】
前記微小流体チャンバの上に配置され、前記インレットに対応するように形成されたホールを有する上部ケースと、
前記上部ケースに締結され、前記微小流体チャンバ、前記ウェルアレイ、前記ＣＭＯＳフォトセンサアレイ及び前記ＰＣＢを収容し、前記通気口に対応するように形成されたホールを有する下部ケースと、をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジ。
【請求項１４】
前記メンブレインスイッチの上に配置されたウィンドウ部材をさらに含み、
前記ウィンドウ部材は、前記上部ケースの中央領域に形成されたホールに対応して配置されたことを特徴とする請求項１３に記載のデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジ。
【請求項１５】
前記ウィンドウ部材が、透明な材質を含むことを特徴とする請求項１４に記載のデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジ。
【請求項１６】
前記ウィンドウ部材が、ＰＤＭＳ材質を含むことを特徴とする請求項１４に記載のデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジに関し、より詳しくは、反応空間のコーナーやエッジ領域におけるエアポケットの発生を防止するとともに、リアルタイムで反応を測定できるデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子増幅技術とは、分子診断における必須過程であって、試料内における微量のデオキシリボ核酸（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ；ＤＮＡ）またはリボ核酸（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ；ＲＮＡ）の特定の塩基配列を反復的に複製して増幅する技術である。その中で、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）は、代表的な遺伝子増幅技術であって、ＤＮＡ変性段階（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）、プライマー（Ｐｒｉｍｅｒ）結合段階（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、ＤＮＡ複製段階（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）の３段階から構成されているし各段階は、試料の温度に依存することから、試料の温度を反復的に変えることでＤＮＡを増幅させることができる。
【０００３】
従来、ＰＣＲは通常、９６または３８４ウェルマイクロプレートで行われた。より高い処理量が要求される場合、従来のマイクロプレートにおけるＰＣＲ方法は費用面から効果的または効率的でない。一方、ＰＣＲ反応容積を減少させれば、試薬の消費を減らし、反応容積の減少した熱質量で増幅時間を減らすこともできる。この戦略は、行列形式（ｍ×ｎ）で具現することもできるので、その結果、多数のさらに小さい反応容積を具現することもできる。また、ある行列を使えば、増加した定量感度、動的範囲と特異性を有する拡張可能な高処理量分析が許容される。
【０００４】
今まで行列形式を用いてデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）を行った。デジタルＰＣＲからの結果を用いてレアアレル（ｒａｒｅ  ａｌｌｅｌｅｓ）の濃度を検出及び定量化し、核酸試料の絶対定量化を提供し、また、核酸濃度が低い折り畳み式の変化を測定することができる。通常、複製の数を増加させれば、デジタルＰＣＲ結果の正確度及び再現性が増加する。
【０００５】
多くの定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）プラットフォームの行列形式は、試料別に分析実験のために設計され、ここで、ＰＣＲ結果は、事後分析のためにアドレス可能でなければならない。しかし、デジタルＰＣＲに対し、各々のＰＣＲ結果の特定位置またはウェルは重要ではなく、ただ試料当たりの陽性及び陰性複製の数のみが分析され得る。
【０００６】
デジタルＰＣＲにおいて、ターゲットポリヌクレオチドまたは核酸配列の相対的に少ない数を含む溶液を小さいテスト試料に分けることもでき、それによって各々の試料は、一般的にターゲットヌクレオチド配列の一分子を含むか、またはターゲットヌクレオチド配列の分子を含まない。続いて、試料が、ＰＣＲプロトコール、手順または実験において熱的に循環する場合、ターゲットヌクレオチド配列を含む試料は増幅し、陽性検出信号を生成する一方、如何なるターゲットヌクレオチド配列も含まない試料は増幅せず、検出信号を生成しない。
【０００７】
このようなデジタルＰＣＲの場合、反応空間の大きさが非常に小さく、その数が非常に多いため、反応空間の各々に試料を投入しにくい。
また、試料が反応空間のコーナーやエッジ領域にまで注入されないため、反応空間のコーナーやエッジ領域にエアポケットが生じ得る。エアポケットは、ＰＣＲ過程中の温度変化によって膨脹または収縮し、試験結果に誤りを発生させる。
【０００８】
既存の主なデジタルＰＣＲ方式は、試料を反応空間へ投入する過程と、塩基配列を増幅させる過程とが分けられるエンドポイント（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）ＰＣＲを用いるため、各反応空間でリアルタイムで塩基配列が増幅する反応を測定できない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】韓国公開特許第１０−２０１７−００２４８２７号公報
【特許文献２】韓国公開特許第１０−２０１６−００８６９３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、本発明は、反応空間のコーナーやエッジ領域におけるエアポケットの発生を防止すると共に、リアルタイムでＰＣＲ測定が可能なデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の課題を達成するため、一実施例によるデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジは、微小流体チャンバ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃｈａｍｂｅｒ）、ウェルアレイ、ＣＭＯＳイメージセンサ及びＰＣＢを含む。前記微小流体チャンバは、液体試料の投入のために形成されたインレットを含み、射出成形が可能である。前記ウェルアレイは、前記微小流体チャンバの下部面に付着される。前記ＣＭＯＳイメージセンサは、前記ウェルアレイの下に配置され、前記ウェルアレイのマイクロウェルに充填された試料の反応映像をリアルタイムで撮影する。前記ＰＣＢには、前記インレットから液体試料が投入されることによって前記微小流体チャンバに形成されたマイクロ流路、前記ウェルアレイと前記微小流体チャンバと間に形成された空間、前記ウェルアレイに形成されたマイクロウェルの真空処理のための通気口（ｖｅｎｔ）が形成される。
【００１２】
一実施例において、前記微小流体チャンバは、四角形状のベース部材及び四角形状のトップ部材を含み得る。前記ベース部材は、四角形状の第１フラット部と、前記第１フラット部の中心領域に形成された四角形状の支持ホールと、前記第１フラット部の角領域に形成された円形状のホールと、を含む。前記トップ部材は、四角形状の第２フラット部と、皿形状のメンブレインスイッチと、閉ループ形状のインレット部と、を含み、前記ベース部材の上に配置される。
【００１３】
一実施例において、前記微小流体チャンバは、ＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）材質、透明プラスチック、透明ゴム材質のうち少なくとも一つ以上を含み得る。
【００１４】
一実施例において、前記微小流体チャンバは、低い自己蛍光性（Ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を有し得る。
一実施例において、デジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジは、前記微小流体チャンバに付着され、前記微小流体チャンバに形成されたマイクロ流路の底を形成するステッカーをさらに含み得る。
【００１５】
一実施例において、前記ウェルアレイは、エッチングされたシリコーン材質、金属材質、セラミック材質、プラスチック材質のうち少なくとも一つ以上を含み得る。
一実施例において、前記ＣＭＯＳイメージセンサの上部面には、密封後にウェルの底を形成するために薄い層がコーティングされ得る。
【００１６】
一実施例において、前記薄い層は、ＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）材質、柔軟性を有する透明プラスチック、透明ゴム材質のうち少なくとも一つ以上を含み得る。
【００１７】
一実施例において、前記ウェルアレイは、親水性コーティング処理され得る。
一実施例において、前記ウェルアレイは、プラズマまたは熱またはＵＶ硬化接着剤によって前記微小流体チャンバに付着され得る。
【００１８】
一実施例において、前記ウェルアレイは、７００μｍ未満の厚さを有し得る。
一実施例において、前記ウェルアレイにはマイクロウェルが形成され、前記マイクロウェルのピッチは１５０μｍ未満であり得る。
【００１９】
一実施例において、デジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジは、上部ケース及び下部ケースをさらに含み得る。上記上部ケースは、前記微小流体チャンバの上に配置され、前記インレットに対応するように形成されたホールを有する。前記下部ケースは、前記下部ケースに締結され、前記微小流体チャンバ、前記ウェルアレイ、前記ＣＭＯＳフォトセンサアレイ及び前記ＰＣＢを収容し、前記通気口に対応するように形成されたホールを有する。
【００２０】
一実施例において、前記メンブレインスイッチの上に配置されたウィンドウ部材をさらに含み、前記ウィンドウ部材は、前記上部ケースの中央領域に形成されたホールに対応して配置され得る。
【００２１】
一実施例において、前記ウィンドウ部材は、透明な材質を含み得る。
一実施例において、前記ウィンドウ部材は、ＰＤＭＳ材質を含み得る。
【発明の効果】
【００２２】
このようなデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジによれば、真空装置のポンピングによってＰＣＲ溶液を移動させ、その溶液が反応空間を満たすとき、反応空間であるウェルアレイのコーナーやエッジ領域にエアポケットが生成されることを遮断することができる。これによって、ＰＣＲ試験結果において、エアポケットによる誤りの発生を防止することができる。また、ＣＭＯＳフォトセンサアレイの上にウェルアレイが位置するため、リアルタイムでＰＣＲ反応を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の一実施例によるデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジを概略的に説明するための斜視図である。
【図２】図１に示したデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジの分解斜視図である。
【図３】図２に示したウェルアレイ形状の一例を概略的に説明するための斜視図である。
【図４ａ】デジタルリアルタイムＰＣＲ結果を示す図である。
【図４ｂ】デジタルリアルタイムＰＣＲ結果を示す図である。
【図５ａ】図２に示した微小流体チャンバを概略的に説明するための正面斜視図である。
【図５ｂ】図２に示した微小流体チャンバを概略的に説明するための背面斜視図である。
【図５ｃ】図２に示した微小流体チャンバの分解斜視図である。
【図６】図２に示したＰＣＲモジュールを概略的に説明するための断面図である。
【図７】図６に示したＰＣＲモジュールを概略的に説明するための分解断面図である。
【図８】図６に示したＰＣＲモジュールを用いたＰＣＲ過程の第１段階を概略的に説明するための断面図である。
【図９】図６に示したＰＣＲモジュールを用いたＰＣＲ過程の第２段階を概略的に説明するための断面図である。
【図１０】図６に示したＰＣＲモジュールを用いたＰＣＲ過程の第３段階を概略的に説明するための断面図である。
【図１１】図６に示したＰＣＲモジュールを用いたＰＣＲ過程の第３段階を概略的に説明するための断面図である。
【図１２】図６に示したＰＣＲモジュールを用いたＰＣＲ過程の第３段階を概略的に説明するための断面図である。
【図１３】図６に示したＰＣＲモジュールを用いたＰＣＲ過程の第３段階を概略的に説明するための断面図である。
【図１４】図６に示したＰＣＲモジュールを用いたＰＣＲ過程の第４段階を概略的に説明するための断面図である。
【図１５】図６に示したＰＣＲモジュールを用いたＰＣＲ過程の第４段階を概略的に説明するための断面図である。
【図１６】図６に示したＰＣＲモジュールを用いたＰＣＲ過程の第４段階を概略的に説明するための断面図である。
【図１７】図６に示したＰＣＲモジュールを用いたＰＣＲ過程の第５段階を概略的に説明するための断面図である。
【図１８】図６に示したＰＣＲモジュールを用いたＰＣＲ過程の第５段階を概略的に説明するための断面図である。
【図１９】図６に示したＰＣＲモジュールを用いたＰＣＲ過程の第５段階を概略的に説明するための断面図である。
【図２０】図６に示したＰＣＲモジュールを用いたＰＣＲ過程の第５段階を概略的に説明するための断面図である。
【図２１】図６に示したＰＣＲモジュールを用いたＰＣＲ過程の第５段階を概略的に説明するための断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、添付された図面を参照して本発明の実施例による接地クランプユニット及び基板支持アセンブリについて詳しく説明する。本発明は多様に変更することができ、多様な形態を有することができるところ、特定の実施例を図面に例示して本文に詳細に説明する。しかし、これは、本発明を特定の開示形態に限定することではなく、本発明の思想及び技術範囲に含まれる全ての変更、均等物、乃至代替物を含むことを理解すべきである。
【００２５】
各図面を説明において、類似の参照符号を類似の構成要素に対して付与した。添付の図面において、構造物の寸法は本発明の明確性のために実際よりも拡大して示した。
第１、第２等の用語は、多様な構成要素を説明するために使用することができるが、構成要素は用語によって限定されない。用語は一つの構成要素を他の構成要素から区別する目的としてのみ使用される。例えば、本発明の権利範囲から外れることなく、第１構成要素は第２構成要素と称され、同様に第２構成要素も第１構成要素と称され得る。単数の表現は、文脈上、明白に異ならせて表現しない限り、複数の表現を含む。
【００２６】
本明細書において、「含む」または「有する」等の用語は、明細書上に記載された特徴、数字、段階、動作、構成要素、部品、又はこれらを組み合わせたものが存在することを意図するものであって、一つまたはそれ以上の他の特徴や数字、段階、動作、構成要素、部品、又はこれらの組合せの存在または付加の可能性を予め排除しないことを理解すべきである。
【００２７】
なお、異なるものとして定義しない限り、技術的であるか科学的な用語を含めてここで用いられる全ての用語は、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有している。一般的に用いられる辞典に定義されているもののような用語は、関連技術の文脈上で有する意味と一致する意味を有することと解釈すべきであり、本出願で明白に定義されない限り、理想的であるか過度に形式的な意味に解釈されない。
【００２８】
以下、添付した図面を参照して、本発明をより詳細に説明する。図面上の同一の構成要素に対しては同一の参照符号を付け、同一の構成要素についての重複する説明は省略する。
【００２９】
本発明は、基板に一定の行列に、試料、試料容積または反応容積を載置するための構造であり、より具体的には、基板内における各々の反応位置に一定な行列に試料を載置することに関する。
【００３０】
多様な実施例において、大量の小容積試料からターゲットを検出するために使用される物品内に試料を搭載するための装置、器機、システム及び方法が提供される。このようなターゲットは、任意の適切な生物学的ターゲットであってもよいが、ＤＮＡ配列（無細胞ＤＮＡを含む）、ＲＮＡ配列、遺伝子、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、分子、タンパク質、生体指標（ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ）、細胞（例えば、循環腫瘍細胞）または他の適切なターゲット生体分子を含むものであり得、これらに限定されない。多様な実施例において、このような生物学的成分は、胎児診断、多重化デジタルＰＣＲ、ウイルスの検出、定量標準化、遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）、配列検証、突然変異の検出、遺伝子生物、レアアレルの検出及び複製数変化の検出などの応用において、多様なＰＣＲ、定量ＰＣＲ及び／またはデジタルＰＣＲ方法及びシステムと関連して使われ得る。
【００３１】
一般的に、大量の試料が処理される定量ＰＣＲに適用可能であるが、任意の適切なＰＣＲ方法は、本明細書に記載の多様な実施例によって使われ得ることを認識しなければならない。適切なＰＣＲ方法は、例えば、デジタルＰＣＲ、アレル特異的ＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、ライゲーション媒介（ｌｉｇａｔｉｏｎｍｅｄｉａｔｅｄ）ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、キャスティングＰＣＲ、ゲノムウォーキング（ｇｅｎｏｍｅ  ｗａｌｋｉｎｇ）、ブリッジ（ｂｒｉｄｇｅ）ＰＣＲを含むが、これらに制限されない。
【００３２】
本願に開示の多様な実施例によって後述するように、反応位置は、例えば、貫通孔、試料保有領域、ウェル、凹溝（ｉｎｄｅｎｔａｔｉｏｎｓ）、地点（ｓｐｏｔｓ）、空洞及び反応チャンバを含むが、これらに制限されない。
【００３３】
ここに説明される多様な実施例は、特に、デジタルＰＣＲに適している。デジタルＰＣＲにおいて、ターゲットポリヌクレオチドまたは核酸配列の相対的に少ない数を含む溶液からなる各々の試料を、大量の小さい試料にさらに分けることができ、それによって各試料は、一般的にターゲットヌクレオチド配列の一分子を含んでもよく、または、ターゲットヌクレオチド配列を含まなくてもよい。続いて、試料が、ＰＣＲプロトコール、手順または実験において熱的に循環する場合、ターゲットヌクレオチド配列を含む試料は増幅し、陽性検出信号を生成する一方、如何なるターゲットヌクレオチド配列も含まない試料は増幅せず、検出信号を生成しない。ポアソン統計（Ｐｏｉｓｓｏｎ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）を用いて、原溶液でターゲットヌクレオチド配列の数を、陽の検出信号を生成する試料の個数と相関させることもできる。
【００３４】
典型的なデジタルＰＣＲプロトコール、手順または実験のために、簡単かつ費用効率的な方法で、数万または数十万の試料に、即ち、各々数ナノリットル、１または略１ナノリットル、または１ナノリットル未満の容積を有する試料に、初期の試料溶液を分割できる利点がある。ターゲットヌクレオチド配列の数を非常に小さくすることができるため、初期溶液の全体内容物が複数の反応位置を考慮して内蔵されるような環境においても重要となり得る。
【００３５】
本願で説明される実施例は、これら及びその他のデジタルＰＣＲ設計制約を、初期の試料溶液を複数の反応位置に試料溶液の全部、または必須なものをすべて考慮する方式で分配することで解決する。
【００３６】
高い処理量のＰＣＲ分析及びデジタルＰＣＲ方法のため、一度に行われる反応の数を増加させると共に、液体試料の反応容積を減少させるために、行列形式を使用する戦略を適用することもできる。液体試料の反応容積の行列は、複数の反応位置を有する基板であり得る。反応位置は、貫通孔、ウェル、凹部、空洞及び反応チャンバ、または本明細書に開示の多様な実施例による試料を保有できる任意の構造であり得るが、これらに制限されない。一部の実施例において、貫通孔またはウェルは、直径がテーパーになり得る。
【００３７】
与えられた領域内でさらに多い反応が行われるように、液体試料の反応容積を減らせば、反応容積の密度をさらに高めることもできる。例えば、基板内の貫通孔を通して３００μｍの直径として構成される一定行列の反応位置は、約３０ｎＬの反応容積を含み得る。例えば、行列内の各貫通孔のサイズを直径６０〜７０μｍに減らすことで、例えば、各反応容積は１００ｐＬの液体試料であり得る。本願に開示の多様な実施例による反応容積は、約１ｐＬ〜３０ｎＬまでの液体試料であり得る。さらに、動的範囲は、液体試料の希釈液を１以上使用して増加させることもできる。
【００３８】
図１は、本発明の一実施例によるデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジを概略的に説明するための斜視図である。図２は、図１に示したデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジの分解斜視図である。
【００３９】
図１及び図２を参照すれば、本発明の一実施例によるデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジは、カートリッジタイプの検査モジュールであって、上部ケース１１０、下部ケース１２０、微小流体チャンバ１３０、ウェルアレイ１４０、ＣＭＯＳフォトセンサアレイ１５０及びＰＣＢ１６０を含む。本実施例において、デジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジは、デジタルリアルタイムＰＣＲ装備のリーダーシステムに脱着可能に結合し得る。本実施例において、微小流体チャンバ１３０、ウェルアレイ１４０、ＣＭＯＳイメージセンサ１５０及びＰＣＢ１６０は、ＰＣＲモジュールを定義し得る。
【００４０】
上部ケース１１０は、中心領域に形成された上部ホールを含むドーナツ形状のカバー本体及び前記上部ホールに配置されたウィンドウ部材を含む。上部ケース１１０は、下部ケース１２０に締結される。本実施例において、上部ケース１１０及び下部ケース１２０は、平たい円筒状として図示したが、多様な形状が可能である。前記ウィンドウ部材は、透明材質を含み得る。前記ウィンドウ部材は、ＰＤＭＳ材質を含み得る。
【００４１】
下部ケース１２０は、微小流体チャンバ１３０、ウェルアレイ１４０、ＣＭＯＳフォトセンサアレイ１５０及びＰＣＢ１６０を収容し、上部ケース１１０に締結される。下部ケース１２０と上部ケース１１０とは、フック方式で締結し得る。
【００４２】
微小流体チャンバ１３０は、上向きに突出したメンブレインスイッチ、前記メンブレインスイッチの一側に形成され、液体試料の注入のためのインレットを含む。微小流体チャンバ１３０の下部エッジ領域は、ＰＣＢ１６０のエッジ領域に接する。微小流体チャンバ１３０の下部中央領域には、ＰＣＢ１６０に搭載されたＣＭＯＳフォトセンサアレイ１５０及びウェルアレイ１４０を収容するために、後退した形状の空間が形成される。微小流体チャンバ１３０は、ＰＤＭＳのような材質から構成され得る。微小流体チャンバ１３０は、柔軟性、透明性、ＰＣＲ互換性及び低い自己蛍光性を有し、射出成形が可能である。
【００４３】
ウェルアレイ１４０は、微小流体チャンバ１３０の下部面に付着され、ＣＭＯＳフォトセンサアレイ１５０の上に配置される。ウェルアレイ１４０は、エッチングされたシリコーン材質から構成され得る。ウェルアレイ１４０は、ＰＣＲ反応位置の役割を果たす複数のマイクロウェル（約１，０００〜１００，０００個）を含む。
【００４４】
図３は、図２に示したウェルアレイ形状の一例を概略的に説明するための斜視図である。図３において、マイクロウェルの形状を円形状として示したが、六角形、四角形などのように多様な形状であり得る。
【００４５】
図３を参照すれば、前記マイクロウェルの形態、大きさ及び体積は、調節可能である。前記マイクロウェルは、上下部が貫通した形状を有する。本実施例において、前記マイクロウェルは、７００μｍ未満の厚さと１５０μｍ未満のピッチを有し得る。前記マイクロウェルは、六角形状、円形状などのような多様な形状を有し得る。ウェルアレイ１４０は、親水性コーティングで処理され得る。ウェルアレイ１４０は、プラズマまたは熱またはＵＶ硬化接着剤によって微小流体チャンバ１３０に付着され得る。
【００４６】
図１及び図２をさらに参照すれば、ＣＭＯＳフォトセンサアレイ１５０は、ウェルアレイ１４０の下に配置され、ウェルアレイ１４０のマイクロウェルでＰＣＲ反応産物をリアルタイムで撮影する。具体的に、ＣＭＯＳフォトセンサアレイ１５０は、ＰＣＢ１６０に形成された基板ホールに対応するように配置され、ウェルアレイ１４０から放出される光を収容し、ＰＣＲ装置で行われるＰＣＲ反応産物を図４ａに示したように測定する。測定されたＰＣＲ反応産物は、図４ｂに示したように、グラフなどの方式で分析され得る。
【００４７】
図４ａ及び図４ｂは、デジタルリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。特に、図４ａは、ウェルアレイでＰＣＲ陽性／陰性結果を示した写真であり、図４ｂは、各マイクロウェルでリアルタイムで蛍光を測定して、該当のウェルが陽性であるか、または陰性であるかを判別できるグラフである。
【００４８】
図１及び図２をさらに参照すれば、ＣＭＯＳフォトセンサアレイ１５０の上部面には、密封後、マイクロウェルの底を形成するためにＰＤＭＳのような物質の薄層がコーティングされ得る。
【００４９】
ＰＣＢ１６０は、ＣＭＯＳイメージセンサ１５０を収容する。前記インレットから投入された液体試料が、ウェルアレイ１４０に迅速に提供されるように、ＰＣＢ１６０には、真空処理のための通気口１５２が形成され得る。通気口１５２は、ＣＭＯＳフォトセンサアレイ１５０とウェルアレイ１４０との間の空間と連通する。
【００５０】
本実施例において、デジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジは、熱循環のためにヒーター１７０をさらに含み得る。本願において使われるように、熱循環は、サーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ）、等温増幅、サーマルコンベンション（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）、赤外線媒介熱サイクリング（ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｉｎｇ）、またはヘリカーゼ依存性増幅（ｈｅｌｉｃａｓｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を用いる段階を含み得る。一部の実施例において、チップが内蔵された加熱素子と統合することもある。多様な実施例において、チップは半導体と統合され得る。多様な実施例によるターゲットの検出は、例えば、蛍光検出、陽イオンまたは院イオン検出、酸度（ｐＨ）検出、電圧検出、または電流検出を単独または組み合わせて用い得るが、これらに限定されない。
【００５１】
図５ａは、図２に示した微小流体チャンバ１３０を概略的に説明するための正面斜視図であり、図５ｂは、図２に示した微小流体チャンバ１３０を概略的に説明するための背面斜視図であり、図５ｃは、図２に示した微小流体チャンバ１３０の分解斜視図である。
【００５２】
図２〜図５ｃを参照すれば、本実施例による微小流体チャンバ１３０は、四角形状のベース部材１３２と、ベース部材１３２の上に配置される四角形状のトップ部材１３４と、を含む。本実施例において、ベース部材１３２とトップ部材１３４とは、物理的に分離したように示したが、一体型で構成してもよい。
【００５３】
ベース部材１３２は、四角形状の第１フラット部１３２ａと、第１フラット部１３２ａの中心領域に形成された四角形状の支持ホール１３２ｂと、第１フラット部１３２ａの角領域に形成された円形状のフラットホール１３２ｃと、を含む。支持ホール１３２ｂには、中心領域へ突出したガイド突起が形成され、四角の歯車形状を定義し得る。
【００５４】
トップ部材１３４は、四角形状の第２フラット部１３４ａと、皿形状のメンブレインスイッチ１３４ｂと、閉ループ形状のインレット部１３４ｃと、を含む。第２フラット部１３４ａは、第１フラット部１３２ａの上部面に密着する。メンブレインスイッチ１３４ｂは、第２フラット部１３４ａの中心領域に配置されて上向きへ突出する。メンブレインスイッチ１３４ｂの下部領域は、ベース部材１３２の支持ホール１３２ｂに対応する。これによって微小流体チャンバ１３０の底部には、後退した形状の空間が形成される。後退空間には、ＣＭＯＳイメージセンサ１５０及びウェルアレイ１４０が収容され得る。
【００５５】
インレット部１３４ｃは、フェンス形状（ｆｅｎｃｅ  ｓｈａｐｅ）を有し、メンブレインスイッチ１３４ｂの一側に上向きへ突出し、液体試料の外部への流出を遮断する。インレット部１３４ｃの中心領域には、ベース部材１３２の垂直方向へインレット１３４ｄが形成される。
【００５６】
インレット部１３４ｃのインレット１３４ｄとメンブレインスイッチ１３４ｂの底のエッジ領域とを連結する領域には、マイクロ流路１３４ｅが形成される。インレット部１３４ｃのインレット１３４ｄに投入された液体試料は、マイクロ流路１３４ｅを通してメンブレインスイッチ１３４ｂの底のエッジ領域まで到達する。
【００５７】
トップ部材１３４は、メンブレインスイッチ１３４ｂの他側に、観察者の観点で上向きへ突出したグリップ部１３４ｆをさらに含み得る。グリップ部１３４ｆは、メンブレインスイッチ１３４ｂを基準でインレット部１３４ｃと向い合うように配置される。グリップ部１３４ｆの高さは、インレット部１３４ｃの高さよりも高くてもよい。インレット部１３４ｃの高さとメンブレインスイッチ１３４ｂの高さとは同一である。
【００５８】
以上で説明したように、微小流体チャンバ１３０からインレット１３４ｄとマイクロ流路１３４ｅとは相互連通する。インレット１３４ｄから液体試料が投入されれば、液体試料は、マイクロ流路１３４ｅを通してメンブレインスイッチ１３４ｂの下に形成された空間へ落下する。また、メンブレインスイッチ１３４ｂが押される場合、マイクロ流路１３４ｅによって露出したウェルアレイ１４０のマイクロウェル各々に液体試料が完全充填され得る。
【００５９】
図６は、図２に示したＰＣＲモジュールを概略的に説明するための断面図である。図７は、図６に示したＰＣＲモジュールを概略的に説明するための分解断面図である。
図２〜図７を参照すれば、本発明の一実施例によるＰＣＲモジュールは、微小流体チャンバ１３０、ウェルアレイ１４０、ＣＭＯＳフォトセンサアレイ１５０及びＰＣＢ１５０を含む。
【００６０】
微小流体チャンバ１３０の底の領域には、ＰＣＢ１５０に配置されたＣＭＯＳ  フォトセンサアレイ１５０及びウェルアレイ１４０を収容するように後退した形状の空間が形成される。微小流体チャンバ１３０は、図５ａ〜図５ｃで説明したので、その説明は省略する。
【００６１】
ウェルアレイ１４０は、微小流体チャンバ１３０の下部面に付着される。ウェルアレイ１４０は、ＣＭＯＳフォトセンサアレイ１５０の上に配置され、ＰＣＢ１５０に形成された基板ホールに挿入されて配置される。ウェルアレイ１４０は、複数のマイクロウェル１４２を含む。マイクロウェル１４２の形状や、寸法、個数などは、多様であり得る。マイクロウェル１４２各々には、粉末試料または液体試料のような分析試料が収容され得る。前記分析試料は、生物学的物質分析のための特異成分である。即ち、前記分析試料とは、特定の生物学的物質、例えば、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの定量または定性分析のための成分であって、プライマー、プローブ、抗体、アプタマー、ＤＮＡまたはＲＮＡ重合酵素などを意味し、特に、リアルタイムＰＣＲ、定温酵素反応またはＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）などを行うために必要な成分を意味する。
【００６２】
ＣＭＯＳフォトセンサアレイ１５０は、ウェルアレイ１４０の下に配置され、ウェルアレイ１４０のマイクロウェル１４２で行われるＰＣＲ反応産物の映像をリアルタイムで撮影する。ＣＭＯＳフォトセンサアレイ１５０は、ＰＣＢ１５０に形成された基板ホールに挿入されて配置される。ＣＭＯＳフォトセンサアレイ１５０は、放出される光を収容してＰＣＲ装置で行われるＰＣＲ反応産物をリアルタイムで撮影する。即ち、ＣＭＯＳフォトセンサアレイ１５０は、励起光線によって複数のプローブで発生する蛍光（ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｌｉｇｈｔ）を検出する。前記蛍光の検出は、時間分離方式によって行ってもよく、波長分離方式によって行ってもよい。
【００６３】
前記の時間分離方式の場合、蛍光物質が励起光に応じて放出光を発現することによって、蛍光センサアレイまたはアレイを構成する単一センサは、エミッションフィルターを通過する放出光を検出し、検出された放出光の視像数を求めて蛍光を感知する。
【００６４】
前記波長分離方式の場合、蛍光物質が励起光に応じて放出光を発現することによって、蛍光センサアレイまたはアレイを構成する単一センサは、エミッションフィルターを通過する放出光を検出し、検出された放出光のスペクトル分析によって蛍光を感知する。
【００６５】
ＰＣＢ１５０は、微小流体チャンバ１３０の下に配置され、搭載されるＣＭＯＳフォトセンサアレイ１５０を収納する。ＰＣＢ１５０は、微小流体チャンバ１３０の底のエッジ領域に接するように配置される。微小流体チャンバ１３０の底のエッジ領域に接するＰＣＢ１５０の一部領域には、通気口（ｖｅｎｔ  ｈｏｌｅ）１５２が形成される。通気口１５２は、ＣＭＯＳフォトセンサアレイ１５０とウェルアレイ１４０との間の空間と連通する。
【００６６】
液体試料がインレット１３４ｄに投入されれば、通気口１５２に連結された真空装置（図示せず）によって空気がポンピングされる。空気のポンピングによって、インレット１３４ｄに投入された液体試料は、微小流体チャンバ１３０に形成されたマイクロ流路１３４ｅを経由してウェルアレイ１４０の一部領域、前記一部領域の上部領域及び前記一部領域の下部領域へ提供される。
【００６７】
本実施例において、微小流体チャンバ１３０に形成されたマイクロ流路１３４ｅの底を形成するステッカー１８０をさらに含み得る。ステッカー１８０の付着によってマイクロ流路１３４ｅへ流入した液体試料は、他の領域へ流出されず、ウェルアレイ１４０に完全に提供され得る。ステッカー１８０の厚さは、ウェルアレイ１４０の厚さと同一であってもよい。
【００６８】
本実施例において、前記ＰＣＲモジュールは、ウェルアレイ１４０のマイクロウェル１４２の各々に収容されたプローブに向けて励起光線（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｌｉｇｈｔ）を照射するように配置された光提供部（図示せず）をさらに含み得る。一実施例において、前記光提供部は、ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ  Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ）光源、レーザー光源などのように光を放出する光源を含み得る。光源から放出した光は、ウェルアレイ１４０のマイクロウェル１４２を通過または反射し、この場合、核酸増幅によって発生する光信号を  ＣＭＯＳフォトセンサアレイ１５０が検出できる。
【００６９】
本実施例において、前記ＰＣＲモジュールは、予め決定された波長を有する光を選択する役割を果たすエミッションフィルター（図示せず）をさらに含み得る。前記エミッションフィルターは、ＣＭＯＳフォトセンサアレイ１５０の上に配置され得る。
【００７０】
以下、本発明の実施例によるデジタルリアルタイムＰＣＲ用のカートリッジの使用方法を順次図示した図面を用いて説明する。説明の便宜のために、上部ケース１１０（図２に図示）及び下部ケース１２０（図２に図示）の図示は、省略する。
【００７１】
図８は、図６に示したＰＣＲモジュールを用いたＰＣＲ過程の第１段階を概略的に説明するための断面図である。
図８を参照すれば、ＰＣＲ過程の第１段階として、空き状態のＰＣＲモジュールを扁平な位置に配置する。
【００７２】
図９は、図６に示したＰＣＲモジュールを用いたＰＣＲ過程の第２段階を概略的に説明するための断面図である。
図９を参照すれば、ＰＣＲ過程の第２段階として、液体試料を微小流体チャンバ１３０のインレット１３４ｄにピペッティングする。インレット１３４ｄにピペッティングされる液体試料の量は、ウェルアレイ１４０と微小流体チャンバ１３０との間の空間及びウェルアレイ１４０のマイクロウェル１４２に満たされ得る量であることが望ましい。インレット１３４ｄにピペッティングされた液体試料は、マイクロ流路１３４ｅ（図５ｂに図示）に存在する空気の抵抗によってマイクロ流路１３４ｅに流れられない。
【００７３】
図１０、図１１、図１２及び図１３は、図６に示したＰＣＲモジュールを用いたＰＣＲ過程の第３段階を概略的に説明するための断面図である。
図１０、図１１、図１２及び図１３を参照すれば、ＰＣＲ過程の第３段階として、インレット１３４ｅに液体試料がピペッティングされた後、通気口１５２に連結した真空装置（図示せず）をオンする。
【００７４】
これによって、空気は、通気口１５２によってポンピングされ、インレット１３４ｅにピペッティングされた液体試料は、マイクロ流路１３４ｅに沿ってウェルアレイ１４０に提供される。ウェルアレイ１４０に提供された液体試料は、マイクロ流路１３４ｅの縦断部に近接したマイクロウェル１４２を通してＣＭＯＳフォトセンサアレイ１５０の上まで到逹する。このような真空装置のポンピングによってマイクロウェルに液体試料がより速く提供され得る。また、真空装置のポンピングによってウェルアレイのコーナーやエッジ領域に存在し得る空気をより容易に除去することができる。
【００７５】
図１４、図１５及び図１６は、図６に示したＰＣＲモジュールを用いたＰＣＲ過程の第４段階を概略的に説明するための断面図である。
図１４、図１５及び図１６を参照すれば、ＰＣＲ過程の第４段階として、通気口１５２に連結された真空装置をオフする。前記真空装置がオフされることによって、ウェルアレイ１４０の下部空間に到達した液体試料は、毛細管の力によってウェルアレイ１４０の上部空間まで漸進的に引き上げられる。
【００７６】
これによって、液体試料は、ウェルアレイ１４０と微小流体チャンバ１３０との間の空間及びウェルアレイ１４０のマイクロウェル１４２に満たされる。
図１７、図１８、図１９、図２０及び図２１は、図６に示したＰＣＲモジュールを用いたＰＣＲ過程の第５段階を概略的に説明するための断面図である。特に、封止によるＰＣＲ過程が図示される。
【００７７】
図１７、図１８、図１９、図２０及び図２１を参照すれば、ＰＣＲ過程の第５段階として、使用者の加圧または機械類の加圧によって上部ケース１１０の中心領域に配置されたウィンドウ部材が押されれば、マイクロウェル１４２の各々に満たされた液体試料を有するウェルアレイ１４０は、ＣＭＯＳフォトセンサアレイ１５０に押される。
【００７８】
これによって、ウェルアレイ１４０のコーナーやエッジ領域にエアポケットが生成されることを遮断することができる。前記エアポケットは、ＰＣＲ過程中の温度変化によって膨脹または収縮することで試験結果に誤りを発生させる。しかし、本発明によれば、真空装置のポンピングによってＰＣＲ溶液を移動させてその溶液が反応空間を満たすとき、反応空間であるウェルアレイのコーナーやエッジ領域でエアポケットの生成が遮断されるため、ＰＣＲ試験結果においてエアポケットによる試験結果に誤りが発生することを防止することができる。また、ＣＭＯＳフォトセンサアレイの上にウェルアレイが位置するため、リアルタイムＰＣＲ反応を測定することができる。
【００７９】
以上で説明したように、本発明によれば、ＰＣＲモジュールのウェルアレイに試薬が内蔵した状態で発売されるため、試薬をセッティングするための別の手順が不要となることから汚染可能性が画期的に低下し、検査準備のための更なる手順が不要となる。
【００８０】
また、デジタルリアルタイムＰＣＲの場合、反応空間であるウェルアレイのマイクロウェルの大きさが非常に小さく、その数が非常に多くても、反応空間各々に試料を投入することが可能である。
【００８１】
また、試料がウェルアレイのコーナーやエッジ領域にまで注入され、反応空間であるウェルアレイのコーナーやエッジ領域にエアポケットが生成されることが防止され、テスト結果の信頼性が向上する。
【００８２】
以上、実施例を参照して説明したが、該当の技術分野における熟練された当業者は、下記の特許請求の範囲に記載した本発明の思想及び領域から脱しない範囲内で本発明を多様に修正及び変形可能であることを理解できるであろう。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明の生化学物質の検査を行う装置、血液検査装置、疾病検査装置などとして、研究用、災難防止用、医療用、畜産用、ペット治療用などとして使用可能な産業上の利用可能性を有する。
【符号の説明】
【００８４】
１１０    上部ケース
１２０    下部ケース
１３０    微小流体チャンバ
１３２    ベース部材
１３４    トップ部材
１３２ａ    第１フラット部
１３２ｂ    支持ホール
１３２ｃ    フラットホール
１３４ａ    第２フラット部
１３４ｂ    メンブレインスイッチ
１３４ｃ    インレット部
１３４ｄ    インレット
１３４ｅ    マイクロ流路
１３４ｆ    グリップ部
１４０    ウェルアレイ
１５０    ＣＭＯＳフォトセンサアレイ
１５２    通気口
１６０    ＰＣＢ
１７０    ヒーター
１８０    ステッカー
【図１】
2019187414.tif 000003
【図２】
2019187414.tif 000004
【図３】
2019187414.tif 000005
【図４ａ】
2019187414.tif 000006
【図４ｂ】
2019187414.tif 000007
【図５ａ】
2019187414.tif 000008
【図５ｂ】
2019187414.tif 000009
【図５ｃ】
2019187414.tif 000010
【図６】
2019187414.tif 000011
【図７】
2019187414.tif 000012
【図８】
2019187414.tif 000013
【図９】
2019187414.tif 000014
【図１０】
2019187414.tif 000015
【図１１】
2019187414.tif 000016
【図１２】
2019187414.tif 000017
【図１３】
2019187414.tif 000018
【図１４】
2019187414.tif 000019
【図１５】
2019187414.tif 000020
【図１６】
2019187414.tif 000021
【図１７】
2019187414.tif 000022
【図１８】
2019187414.tif 000023
【図１９】
2019187414.tif 000024
【図２０】
2019187414.tif 000025
【図２１】
2019187414.tif 000026