(57)【要約】      （修正有）【課題】細菌汚染を検出するための組成物、反応混合物、キット、及び、システムの提供。【解決手段】少なくとも８種の細菌種のいずれかによる血小板試料の細菌汚染を検出する方法であって、約８００塩基以下のアンプリコンを生じる条件下で、前記試料又はその一部分を核酸増幅反応に供するステップであって、前記反応混合物が、単一のプライマー対及び単一の検出可能プローブを含み、前記プライマー対が、前記アンプリコンを挟み、前記アンプリコンは、前記検出可能プローブがハイブリダイズする保存配列を含み、前記保存配列が、前記少なくとも８種の細菌種の間で同一であるステップと、前記プローブによる前記アンプリコンへのハイブリダイゼーションを検出するステップであって、前記プローブによる前記ハイブリダイゼーションが、前記少なくとも８種の細菌種のいずれかによる前記血小板試料の細菌汚染を示す検出可能シグナルを生じるステップとを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本願は、２０１４年７月２５日に出願された米国仮出願第６１／８５８，４９５号の利益を主張する。この出願は、その全体が本明細書に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
移植組織および輸血製品の微生物汚染は、主要な医学的問題である。血液銀行は、患者への注入のための発売に先立つ、微生物汚染に関する各血小板バッグ（bag）の検査における大きな課題に直面している。この課題の一部は、典型的に５〜７日間、場合によってはさらに短い、血小板試料の相対的に短い有効期間に関する。血小板に関する課題は、標準貯蔵条件によってさらに複雑化される。血小板は、他の移植可能な組織の大部分とは異なり、冷蔵に耐容性を示さず、非常に短い期間であっても寒冷化に付された場合、レシピエントの循環から迅速に消失する。血小板生存におけるこの冷却効果は、不可逆的であると考えられ、血小板を輸注に不適なものとする。血小板は、２０Ｃよりも低い温度に曝露されると、損壊を示す形状の修飾を迅速に行う。輸注に先立ち室温（例えば、２２〜２５Ｃ）に血小板を維持する必要は、血小板貯蔵のためにコストのかかる複雑なロジスティック要件の特有のセットを課した。血小板は、室温で代謝的に活性を有するため、典型的には、ガス透過性容器内で一定の揺動に付されてガス交換を可能にして、代謝性アシドーシスの毒性結果を防止する。このような貯蔵条件は、細菌の成長を奨励し、これにより、細菌感染のより高いリスクを生じる。培養による検出に頼るスクリーニング方法は、汚染を検出するために、使用可能な有効期間よりも長い時間を要する可能性があるため、汚染された血小板が患者に注入されてから、その後培養結果が利用できるようになったときに、血小板が汚染されていたことが医師に知らされることも多い。米国血液銀行協会（American  Association  of  Blood  Banks）（Ａ．Ａ．Ｂ．Ｂ．）標準５．１．５．１の下、血液銀行または輸注業務は、あらゆる血小板濃縮物における細菌汚染を限定および検出するための方法を有するよう指導されている。にもかかわらず、細菌汚染された血小板による輸注のリスクは、１，０００単位における１もの高さになり、おそらく、斯かる出来事の１０〜２５が、患者に有害作用をもたらし得る。一部の汚染は、ドナー菌血症に由来し得るが、皮膚上または血液パック内に存在する細菌による採取時の汚染は、ドナー診断スクリーニングにより対処することのできない主な汚染源である。
【０００３】
汚染を軽減するための一般的な方法は、予防的方策（例えば、腕のクレンジング、採取した血液の最初の部分の転用および濾過）および培養方法論を含む。現在の汚染率によって証明される通り、これらの手順は依然として不適切である。さらに、培養に基づく検出方法は、相当なインキュベーション期間（数日間の場合もある）を要するため、試料は、その有用寿命の相当な部分にわたり使用されないこともあり、使用されるときに、検出が完了していないこともある。これは、成長が相対的に遅い細菌による汚染に特に当てはまる。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ、Ｋｏｃｕｒｉａ  ｖａｒｉａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．およびＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．の平均検出時間は、標準培養方法を使用して、それぞれ２４時間、２７時間、３４時間、４７時間、５６時間、８７時間および９７時間と推定された。
【０００４】
市販の検査の１つは、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ検査（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｉｎｃ．、Ｄｕｒｈａｍ、Ｎ．Ｃ．）と称される。細菌検出は、増殖中の細菌による二酸化炭素の放出（evolution）に基づく。培養ビンの底にある二酸化炭素に高感度な液体エマルションセンサーが色を変え、センサーに反射される光の変更により検出される。細菌検出のための別の方法は、血小板調製試料における酸素含量の測定に関与する。一例として、Ｐａｌｌ  ｅＢＤＳ検査（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｎ．Ｙ．）が挙げられる。検出するためのアプローチは、細菌の代理マーカーとして、試料パウチ内の空気の酸素含量を測定する。酸素分析機器を使用して、血小板の入ったパウチまたはバッグのヘッドスペースガスにおける酸素のパーセントを測定する。細菌が、採取した血小板試料に存在する場合、インキュベーションの際の試料中の細菌の代謝活性および増殖により、増加する量の酸素が消費され、試料パウチ内の空気と共に血漿の酸素含量の測定可能な減少をもたらす。細菌成長の非特異的測定は、多くの種類の細菌の検出を可能にするが、感度は相対的に低く、長いインキュベーション時間を要する。
【０００５】
標準培養に基づくスクリーニングの代替方法は、細菌抗原検出および核酸に基づくスクリーニングを含む。抗原に基づく方法における主要な限界は、細菌病原体の範囲が未知である場合に試料の検査に直接的に適用することができないことである。１６Ｓ  ｒＲＮＡ等、共通細菌核酸配列の検出が提案されて、より広範囲の検出を達成してきたが、斯かる方法は、現在のところ、現在の培養による方法よりも感度および特異性が低いと考慮されており、血小板試料の早期検査に適切ではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、広い範囲ならびに高い特異性および感度の両方の検出により、血小板試料等、生物試料の汚染を検出するための方法、組成物、反応混合物、キットおよびシステムを提供する。本開示に係る汚染の検出は、また、培養に基づくスクリーニング方法論よりも有意に迅速である。
【０００７】
一態様において、本開示は、少なくとも８種の細菌種等、複数の細菌種のいずれかによる試料の細菌汚染を検出する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、単一の反応混合物において約８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１５０または１００塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じる条件下で、前記試料またはその部分を核酸増幅反応に供するステップであって、前記反応混合物が、単一のプライマー対および単一の検出可能プローブを含み、前記プライマー対が、前記アンプリコンを挟み（flank）、前記アンプリコンが、前記検出可能プローブがハイブリダイズする保存配列
（conserved  sequence）を含み、前記保存配列が、前記少なくとも８種の細菌種の間で同一であるステップと、前記プローブによる前記アンプリコンへのハイブリダイゼーションを検出するステップであって、前記プローブによる前記ハイブリダイゼーションが、前記少なくとも８種の細菌種のいずれかによる前記試料の細菌汚染を示す検出可能シグナルを生じるステップとを含む。一部の実施形態において、前記試料は、血液試料またはバフィーコート試料であり、前記汚染は、前記被験体における敗血症を予測または診断する。一部の実施形態において、前記試料は、血小板試料である。一部の実施形態において、前記血小板試料は、アフェレーシス（aphaeresis）により単離された血小板濃縮物である。一部の実施形態において、前記血小板濃縮物の５ｍＬ未満から単離された核酸は、前記核酸増幅反応に付される。一部の実施形態において、前記アンプリコンは、細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチド鋳型から作製される。一部の実施形態において、前記細菌汚染検出は、レシピエントへの輸注に先立ち完了される。一部の実施形態において、前記増幅反応は、３００塩基以下または１５０塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じる。一部の実施形態において、前記増幅反応は、１００〜２００塩基のアンプリコンの検出可能量を生じる。一部の実施形態において、前記細菌種の全ては、異なる検出可能標識を有するプローブにより同じ反応において検出される、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌または両者の組合せである。一部の実施形態において、前記少なくとも８種の細菌種は、複数のグラム陽性細菌種および複数のグラム陰性細菌種を含む。一部の実施形態において、前記細菌種は、Staphylococcus  aureus、Staphylococcus  aureus  Mu3;  Staphylococcus  epidermidis、Streptococcus  agalactiae、Streptococcus  pyogenes、Streptococcus  pneumonia、Escherichia  coli、Citrobacter  koseri、Clostridium  perfringens、Enterococcus  faecalis、Klebsiella  pneumonia、Lactobacillus  acidophilus、Listeria  monocytogenes、Propionibacterium  granulosum、Pseudomonas  aeruginosa、Serratia  marcescens、Bacillus  cereus、Staphylococcus  aureus  Mu50、Yersinia  enterocolitica、Staphylococcus  simulans、Micrococcus  luteusおよびEnterobacter  aerogenesからなる群から選択される。一部の実施形態において、本方法は、試料における少なくとも１０または１５種の細菌種のいずれかによる細菌汚染を検出するステップを含む。一部の実施形態において、前記単一のプライマー対は、表２に示されている配列（例えば、配列番号４、７または９）の少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含む第１のプライマーと、表２に示されている配列（例えば、配列番号５、６、８または１０）の少なくとも１０個のヌクレオチドを含む第２のプライマーとを含む。一部の実施形態において、前記第１および第２のプライマーは、表１５に開示されているプライマーセットまたはこれらのいずれかの組合せから選択される。一部の実施形態において、前記第１および第２のプライマーの対は、最適にアラインメントされた場合、表２または表１５に開示されているプライマーまたはそれらの相補体のいずれかに対し、少なくとも８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９配列相同性を示す。一部の実施形態において、前記プローブは、表３に示されている配列またはその相補体の少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、前記核酸増幅反応は、前記細菌汚染由来の５ｐｇ未満の出発核酸を含有する。一部の実施形態において、前記核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、等温増幅、鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、リガーゼ連鎖反応、転写媒介性増幅、固相増幅、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）および線形増幅からなる群から選択される方法を使用して行われる。一部の実施形態において、前記核酸増幅反応は、ウェルにおいて、プレートにおいて、チューブにおいて、チャンバーにおいて、液滴において、フローセルにおいて、スライドにおいて、チップにおいて、固体基板に取り付けて、ビーズに取り付けて、またはエマルションにおいて行われる。一部の実施形態において、前記検出可能シグナルは、少なくとも５ｌｏｇにわたる線形検出範囲（linear  range  of  detection）を有する。一部の実施形態において、本方法は、前記プローブシグナルに基づき細菌汚染の量を決定するステップをさらに含む。
【０００８】
別の態様において、本開示は、試料の細菌汚染を検出する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、単一の反応混合物において約８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１５０または１００塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じる条件下で、前記試料またはその部分を核酸増幅反応に供するステップであって、前記反応混合物が、単一のプライマー対および単一の検出可能プローブを含み、前記プライマー対が、前記アンプリコンを挟み、前記アンプリコンが、前記検出可能プローブがハイブリダイズする保存配列を含み、前記試料またはその部分が、増幅に先立ち３５Ｃを上回る温度で培養されたことがないステップと、前記プローブによる前記アンプリコンへのハイブリダイゼーションを検出するステップであって、前記プローブによる前記ハイブリダイゼーションが、前記試料の細菌汚染を示す検出可能シグナルを生じるステップとを含む。一部の実施形態において、前記試料は、血液試料またはバフィーコート試料であり、前記汚染は、前記被験体における敗血症を予測または診断する。一部の実施形態において、前記試料は、血小板試料である。一部の実施形態において、前記血小板試料は、アフェレーシスにより単離された血小板濃縮物である。一部の実施形態において、前記血小板濃縮物の５ｍＬ未満から単離された核酸は、前記核酸増幅反応に付される。一部の実施形態において、前記血小板濃縮物の５ｍＬ未満から単離された核酸は、前記核酸増幅反応に付される。一部の実施形態において、前記アンプリコンは、細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチド鋳型から作製される。一部の実施形態において、前記細菌汚染検出は、レシピエントへの輸注に先立ち完了される。一部の実施形態において、前記増幅反応は、３００塩基以下または１５０塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じる。一部の実施形態において、前記増幅反応は、１００〜２００塩基のアンプリコンの検出可能量を生じる。一部の実施形態において、本方法は、試料における少なくとも１０または１５種の細菌種のいずれかによる細菌汚染を検出するステップを含む。一部の実施形態において、前記単一のプライマー対は、配列番号４、７または９に示されている配列の少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含む第１のプライマーと、配列番号５、６、８または１０に示されている配列の少なくとも１０個のヌクレオチドを含む第２のプライマーとを含む。一部の実施形態において、前記プローブは、表３に示されている配列またはその相補体の少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、前記核酸増幅反応は、前記細菌汚染由来の５ｐｇ未満の出発核酸を含有する。一部の実施形態において、前記核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、等温増幅、鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、リガーゼ連鎖反応、転写媒介性増幅、固相増幅、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）および線形増幅からなる群から選択される方法を使用して行われる。一部の実施形態において、前記核酸増幅反応は、ウェルにおいて、プレートにおいて、チューブにおいて、チャンバーにおいて、液滴において、フローセルにおいて、スライドにおい���、チップにおいて、固体基板に取り付けて、ビーズに取り付けて、またはエマルションにおいて行われる。一部の実施形態において、前記検出可能シグナルは、少なくとも５ｌｏｇにわたる線形検出範囲を有する。一部の実施形態において、本方法は、前記プローブシグナルに基づき細菌汚染の量を決定するステップをさらに含む。
【０００９】
一態様において、本開示は、試料を得てから２４時間以内に試料における細菌汚染を迅速に検出する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、約８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１５０または１００塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じる条件下で、前記試料またはその部分を、単一の反応混合物において単一のプライマー対および単一の検出可能プローブによる核酸増幅反応に供するステップであって、前記プライマー対が、前記アンプリコンを挟み、前記アンプリコンが、前記検出可能プローブがハイブリダイズする保存配列を含み、前記種のうちいずれか１種由来の約１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡの増幅が、３０未満のサイクル閾値（ＣＴ）を有するステップと、前記試料を得てから約２４時間以内に、前記プローブによる前記アンプリコンへのハイブリダイゼーションを検出するステップであって、前記プローブによる前記ハイブリダイゼーションが、前記試料の細菌汚染を示す検出可能シグナルを生じ、これにより、前記試料を得てから約２４時間以内に前記汚染を検出するステップとを含む。一部の実施形態において、前記試料は、血液試料またはバフィーコート試料であり、前記汚染は、前記被験体における敗血症を予測または診断する。一部の実施形態において、前記試料は、血小板試料である。一部の実施形態において、前記血小板試料は、アフェレーシスにより単離された血小板濃縮物である。一部の実施形態において、前記血小板濃縮物の５ｍＬ未満から単離された核酸は、前記核酸増幅反応に付される。一部の実施形態において、前記検出は、１ｍＬ当たり約１．０のコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）の細菌量（bacterial  load）を有する血小板試料の細菌汚染を示す検出可能シグナルを生じる。一部の実施形態において、前記血小板濃縮物の５ｍＬ未満から単離された核酸は、前記核酸増幅反応に付される。一部の実施形態において、前記アンプリコンは、細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチド鋳型から作製される。一部の実施形態において、前記細菌汚染検出は、レシピエントへの輸注に先立ち完了される。一部の実施形態において、前記増幅反応は、３００塩基以下または１５０塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じる。一部の実施形態において、前記増幅反応は、１００〜２００塩基のアンプリコンの検出可能量を生じる。一部の実施形態において、本方法は、試料における少なくとも１０または１５種の細菌種のいずれかによる細菌汚染を検出するステップを含む。一部の実施形態において、前記単一のプライマー対は、配列番号４、７または９に示されている配列の少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含む第１のプライマーと、配列番号５、６、８または１０に示されている配列の少なくとも１０個のヌクレオチドを含む第２のプライマーとを含む。一部の実施形態において、前記プローブは、表３に示されている配列またはその相補体の少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、前記核酸増幅反応は、前記細菌汚染由来の５ｐｇ未満の出発核酸を含有する。一部の実施形態において、前記核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、等温増幅、鎖置換増幅、ローリングサ���クル増幅、リガーゼ連鎖反応、転写媒介性増幅、固相増幅、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）および線形増幅からなる群から選択される方法を使用して行われる。一部の実施形態において、前記核酸増幅反応は、ウェルにおいて、プレートにおいて、チューブにおいて、チャンバーにおいて、液滴において、フローセルにおいて、スライドにおいて、チップにおいて、固体基板に取り付けて、ビーズに取り付けて、またはエマルションにおいて行われる。一部の実施形態において、前記検出可能シグナルは、少なくとも５ｌｏｇにわたる線形検出範囲を有する。一部の実施形態において、本方法は、前記プローブシグナルに基づき細菌汚染の量を決定するステップをさらに含む。
【００１０】
別の態様において、本開示は、試料（例えば、被験体の生物試料）における異なる属由来の複数の細菌種のいずれかによる細菌汚染を検出する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、前記試料またはその部分において単一のプライマー対による核酸増幅反応を行って、１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドの約８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１５０または１００塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じるステップであって、前記種のうちいずれか１種由来の約１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡの増幅が、３０未満のサイクル閾値（ＣＴ）を有するステップと、１種または複数種の検出可能プローブにより前記アンプリコンを検出するステップであって、前記１種または複数種の検出可能プローブのそれぞれが、保存配列に特異的にハイブリダイズし、前記保存配列が、異なる属由来の複数の細菌種の間で同一であるステップとを含む。一部の実施形態において、前記試料は、血液試料またはバフィーコート試料であり、前記汚染は、前記被験体における敗血症を予測または診断する。一部の実施形態において、前記試料は、血小板試料である。一部の実施形態において、陰性対照試料のＣＴは、前記少なくとも５種の細菌種のうちいずれか１種に由来する１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡを含有する試料のＣＴよりも少なくとも５サイクル高い。一部の実施形態において、前記１種または複数種の検出可能プローブは、５種以下の異なるプローブまたは２種以下の異なるプローブを含む。一部の実施形態において、前記１種または複数種の検出可能プローブは、１種のプローブからなる。一部の実施形態において、前記細菌汚染検出は、レシピエントへの輸注に先立ち完了される。一部の実施形態において、前記増幅反応は、３００塩基以下または１５０塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じる。一部の実施形態において、前記増幅反応は、１００〜２００塩基のアンプリコンの検出可能量を生じる。一部の実施形態において、前記細菌種の全ては、異なる検出可能標識を有するプローブにより同じ反応において検出される、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌または両者の組合せである。一部の実施形態において、前記複数の細菌種は、異なる属由来の複数のグラム陽性細菌種と、異なる属由来の複数のグラム陰性細菌種とを含む。一部の実施形態において、前記１種または複数種の検出可能プローブは、前記グラム陰性種の少なくとも一部に存在しない、前記グラム陽性細菌種の間で共通の保存配列に特異的にハイブリダイズする第１のプローブと、前記グラム陽性種の少なくとも一部に存在しない、前記グラム陰性細菌種の間で共通の保存配列に特異的にハイブリダイズする第２のプローブとを含む。一部の実施形態において、前記細菌種は、Staphylococcus  aureus、Staphylococcus  aureus  Mu3;  Staphylococcus  epidermidis、Streptococcus  agalactiae、Streptococcus  pyogenes、Streptococcus  pneumonia、Escherichia  coli、Citrobacter  koseri、Clostridium  perfringens、Enterococcus  faecalis、Klebsiella  pneumonia、Lactobacillus  acidophilus、Listeria  monocytogenes、Propionibacterium  granulosum、Pseudomonas  aeruginosa、Serratia  marcescens、Bacillus  cereus、Staphylococcus  aureus  Mu50、Yersinia  enterocolitica、Staphylococcus  simulans、Micrococcus  luteusおよびEnterobacter  aerogenesからなる群から選択される��一部の実施形態において、本方法は、試料における少なくとも１０または１５種の細菌種のいずれかによる細菌汚染を検出するステップを含む。一部の実施形態において、前記単一のプライマー対は、配列番号４、７または９に示されている配列の少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含む第１のプライマーと、配列番号５、６、８または１０に示されている配列の少なくとも１０個のヌクレオチドを含む第２のプライマーとを含む。一部の実施形態において、前記プローブは、表３に示されている配列またはその相補体の少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、前記核酸増幅反応は、前記細菌汚染由来の５ｐｇ未満の出発核酸を含有する。一部の実施形態において、前記核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、等温増幅、鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、リガーゼ連鎖反応、転写媒介性増幅、固相増幅、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）および線形増幅からなる群から選択される方法を使用して行われる。一部の実施形態において、前記核酸増幅反応は、ウェルにおいて、プレートにおいて、チューブにおいて、チャンバーにおいて、液滴において、フローセルにおいて、スライドにおいて、チップにおいて、固体基板に取り付けて、ビーズに取り付けて、またはエマルションにおいて行われる。一部の実施形態において、前記プローブは、少なくとも５ｌｏｇにわたる線形検出範囲を有するシグナルを生じる。一部の実施形態において、本方法は、前記プローブシグナルに基づき前記複数の細菌種の存在量を決定するステップをさらに含む。
【００１１】
一態様において、本開示は、１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドの部分の増幅および検出のための組成物を提供する。一部の実施形態において、前記部分は、約８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１５０または１００ヌクレオチド未満の長さである。一実施形態において、本組成物は、配列番号９等が挙げられるがこれに限定されない、表２または表１５に示されている配列の少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含む第１のプライマーと、配列番号１０等が挙げられるがこれに限定されない、表２または表１５に示されている配列の少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含む第２のプライマーと、配列番号１６等が挙げられるがこれに限定されない、表３に示されている配列またはその相補体の少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含むプローブを含む。一実施形態において、本組成物は、標的１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドによる増幅反応において、少なくとも５０個のヌクレオチドの長さのアンプリコンを増幅するプライマーであって、前記アンプリコンが、最適にアラインメントされた場合、配列番号１〜３等が挙げられるがこれらに限定されない、表１に収載されている配列のいずれかと９０配列同一性を有するプライマーと、前記アンプリコンのいずれかの鎖に特異的にハイブリダイズする１種または複数種のプローブとを含む。一部の実施形態において、本組成物は、ウェル、プレート、チューブ、チャンバー、フローセルまたはチップ等、容器内に存在する。一部の実施形態において、本組成物は、脱水型である。一部の実施形態において、標的１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドによる増幅反応において、前記プライマーおよびプローブによる複数の標的種のうちいずれか１種に由来する約１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡの増幅は、３０未満のサイクル閾値（ＣＴ）を有する。
【００１２】
別の態様において、本開示は、少なくとも５種の細菌種のいずれかによる血小板試料の細菌汚染を検出する方法を提供する。本方法は、反応混合物において約８００塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じる条件下で、前記試料またはその部分を核酸増幅反応に供するステップであって、前記反応混合物が、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーを含み、前記第１のフォワードプライマーおよび前記第１のリバースプライマーがそれぞれ、少なくとも５種の異なる細菌ゲノムの間で保存された別々の領域にハイブリダイズするステップと、前記反応混合物から、前記量のアンプリコンの存在を示すシグナルを検出し、これにより、前記少なくとも５種の細菌種のいずれかによる血小板試料の細菌汚染を検出するステップとを含む。一実施形態において、前記第１のフォワードおよび第１のリバースプライマーはそれぞれ、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５種またはさらに多くの異なる細菌ゲノムの間で保存された別々の領域にハイブリダイズする。保存された領域は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００７６２２）の１６Ｓ  ｒＲＮＡの９〜２８、３２〜４８、５２２〜５４５、８８８〜９０３、９１６〜９３７、９３９〜９７３、９７５〜９９４、９５７〜９８１、１０９３〜１１２５、１１８４〜１２０６、１２３１〜１２５２、１３７８〜１３９６、１３９８〜１４２２もしくは１４９６〜１５１６の領域、または細菌ゲノム：Staphylococcus  aureus  Mu3;  Staphylococcus  epidermidis、Streptococcus  agalactiae、Streptococcus  pyogenes、Streptococcus  pneumonia、Escherichia  coli、Citrobacter  koseri、Clostridium  perfringens、Enterococcus  faecalis、Klebsiella  pneumonia、Lactobacillus  acidophilus、Listeria  monocytogenes、Serratia  marcescens、Bacillus  cereus、Propionibacterium  sp.、Staphylococcus  aureus  Mu50、Yersinia  enterocolitica、Staphylococcus  simulans、Micrococcus  luteusおよびEnterobacter  aerogenesのうちいずれか１種における相当する領域を包含することができる。表１５に収載されているプライマーセットを含む、本明細書に開示されているプライマーのいずれかは、本明細書に開示されている上述および他の方法の実施に利用することができる。一部の実施形態において、前記第１のフォワードプライマーおよび前記第１のリバースプライマーはそれぞれ、最適にアラインメントされた場合、標的細菌配列の別々の領域と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００の配列相同性を示す。一部の実施形態において、前記反応混合物は、前記少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５種またはそれを超える細菌種のうちいずれかまたは全てと最適にアラインメントされた場合、少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００の配列相同性を示す第２のフォワードプライマーをさらに含む。一部の実施形態において、前記反応混合物は、前記少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５種���たはそれを超える細菌種のうちいずれかまたは全てと最適にアラインメントされた場合、少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００の配列相同性を示す第２のリバースプライマーをさらに含む。相同性の領域として、本明細書に開示されているいずれかの保存された領域、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００７６２２）の１６Ｓ  ｒＲＮＡの９〜２８、３２〜４８、５２２〜５４５、８８８〜９０３、９１６〜９３７、９３９〜９７３、９７５〜９９４、９５７〜９８１、１０９３〜１１２５、１１８４〜１２０６、１２３１〜１２５２、１３７８〜１３９６、１３９８〜１４２２もしくは１４９６〜１５１６、または本明細書に参照されている細菌ゲノムのうちいずれか１種における相当する領域を挙げることができるがこれらに限定されない。適宜、前記反応混合物は、本明細書に開示されているＤＮＡ結合色素または他の標識分子等が挙げられるがこれらに限定されない、検出可能標識をさらに含む。一部の実施形態において、前記核酸増幅は、前記少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５種またはそれを超える細菌種のうちいずれか１種に由来する約１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡが、３０未満のサイクル閾値（ＣＴ）を有するような条件下で行われる。
【００１３】
一態様において、本開示は、１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドの部分の増幅および検出のための反応混合物を提供する。一部の実施形態において、前記部分は、約８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１５０または１００ヌクレオチド未満の長さである。一部の実施形態において、本反応混合物は、試料核酸と、標的１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドによる増幅反応において、少なくとも５０個のヌクレオチドの長さのアンプリコンを増幅するプライマーであって、前記アンプリコンが、最適にアラインメントされた場合、配列番号１〜３のいずれかと９０の配列同一性を有するプライマーと、前記アンプリコンのいずれかの鎖に特異的にハイブリダイズするプローブと、ポリメラーゼとを含み、本反応混合物は、反応サイトに存在する。一部の実施形態において、前記反応サイトは、液滴、ウェル、プレート、チューブ、チャンバー、フローセルまたはチップである。一部の実施形態において、標的１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドによる増幅反応において、前記プライマーおよびプローブによる複数の標的種のうちいずれか１種に由来する約１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡの増幅は、３０未満のサイクル閾値（ＣＴ）を有する。
【００１４】
一態様において、本開示は、血小板試料等、試料における細菌汚染の検出のためのキットを提供する。一実施形態において、本キットは、配列番号９等が挙げられるがこれに限定されない、表２または表１５に示されている配列の少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含む第１のプライマーと、配列番号１０等が挙げられるがこれに限定されない、表２または表１５に示されている配列の少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含む第２のプライマーと、配列番号１６等が挙げられるがこれに限定されない、表３に示されている配列またはその相補体の少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含むプローブを含む。
【００１５】
一態様において、本開示は、本開示のキットを使用するための方法を提供する。一実施形態において、本方法は、単一のプライマー対により試料またはその部分において核酸増幅反応を行って、１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドの約８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１５０または１００塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じるステップであって、異なる属由来の複数の細菌種のうちいずれか１種に由来する約１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡの増幅が、３０未満のサイクル閾値（ＣＴ）を有するステップと、１種または複数種の検出可能プローブによりアンプリコンを検出するステップであって、前記１種または複数種の検出可能プローブのそれぞれが、保存配列に特異的にハイブリダイズし、前記保存配列が、異なる属由来の複数の細菌種の間で同一であるステップとを含む。
【００１６】
一態様において、本開示は、異なる属由来の複数の細菌種のいずれかによる試料（例えば、血小板試料、血液試料またはバフィーコート試料）の細菌汚染を検出するためのシステムを提供する。一実施形態において、本システムは、顧客の要求を受け取って、試料における検出反応を行うよう構成されたコンピューターと、前記顧客の要求に応じて、前記試料またはその部分において核酸増幅反応を行う増幅システムであって、前記増幅反応が、単一のプライマー対および単一のプローブを使用して、１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドの約８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１５０または１００塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じ、さらに、前記少なくとも５属のうちいずれか１つに由来する１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡの増幅が、３０未満のＣＴを有する増幅システムと、レポートをレシピエントに送るレポートジェネレーターであって、前記レポートが、前記プローブによって産生されたシグナル強度の検出の結果を含有するレポートジェネレーターとを含む。一部の実施形態において、前記レポートジェネレーターは、前記プローブによって産生された前記シグナル強度に基づき、前記試料を汚染されているまたは汚染されていないと同定する。一部の実施形態において、前記レシピエントは、前記顧客である。
【００１７】
一態様において、本開示は、コンピューター可読媒体を提供する。一部の実施形態において、本コンピューター可読媒体は、１個または複数のプロセッサによる実行によって、異なる属由来の複数の細菌種のいずれかによる血小板試料の細菌汚染を検出する方法を実施するコードを含む。一実施形態において、前記コードの実行により実施される前記方法は、顧客の要求を受け取って、試料における検出反応を行うステップと、前記顧客の要求に応じて前記試料またはその部分における核酸増幅反応を行うステップであって、前記増幅反応が、単一のプライマー対および単一のプローブを使用して、１６Ｓ  ｒＲＮＡの約８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１５０または１００塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じ、さらに、前記少なくとも５属のうちいずれか１つに由来する１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡの増幅が、３０未満のＣＴを有するステップと、前記プローブによって産生されたシグナル強度の検出の結果を含有するレポートを作成するステップとを含む。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
少なくとも８種の細菌種のいずれかによる血小板試料の細菌汚染を検出する方法であって、
単一の反応混合物において約８００塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じる条件下で、前記試料またはその一部分を核酸増幅反応に供するステップであって、前記反応混合物が、単一のプライマー対および単一の検出可能プローブを含み、前記プライマー対が、前記アンプリコンを挟み、前記アンプリコンが、前記検出可能プローブがハイブリダイズする保存配列を含み、前記保存配列が、前記少なくとも８種の細菌種の間で同一であるステップと、
前記プローブによる前記アンプリコンへのハイブリダイゼーションを検出するステップであって、前記プローブによる前記ハイブリダイゼーションが、前記少なくとも８種の細菌種のいずれかによる前記血小板試料の細菌汚染を示す検出可能シグナルを生じるステップと
を含む方法。
（項目２）
血小板試料の細菌汚染を検出する方法であって、
単一の反応混合物において約８００塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じる条件下で、前記試料またはその一部分を核酸増幅反応に供するステップであって、前記反応混合物が、単一のプライマー対および単一の検出可能プローブを含み、前記プライマー対が、前記アンプリコンを挟み、前記アンプリコンが、前記検出可能プローブがハイブリダイズする保存配列を含み、前記試料またはその部分が、増幅に先立ち３５Ｃを上回る温度で培養されたことがないステップと、
前記プローブによる前記アンプリコンへのハイブリダイゼーションを検出するステップであって、前記プローブによる前記ハイブリダイゼーションが、前記血小板試料の細菌汚染を示す検出可能シグナルを生じるステップと
を含む方法。
（項目３）
血小板試料における細菌汚染を、前記試料を得てから２４時間以内に迅速に検出する方法であって、
約８００塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じる条件下で、前記試料またはその部分を、単一の反応混合物において単一のプライマー対および単一の検出可能プローブを用いる核酸増幅反応に供するステップであって、前記プライマー対が、前記アンプリコンを挟み、前記アンプリコンが、前記検出可能プローブがハイブリダイズする保存配列を含み、種のうちいずれか１種に由来する約１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡの増幅が、３０未満のサイクル閾値（ＣＴ）を有するステップと、
前記試料を得てから約２４時間以内に、前記プローブによる前記アンプリコンへのハイブリダイゼーションを検出するステップであって、前記プローブによる前記ハイブリダイゼーションが、前記血小板試料の細菌汚染を示す検出可能シグナルを生じ、これにより、前記試料を得てから約２４時間以内に前記汚染を検出するステップと
を含む方法。
（項目４）
被験体の生物試料における異なる属由来の複数の細菌種のいずれかによる細菌汚染を検出する方法であって、
前記試料またはその部分において単一のプライマー対を用いる核酸増幅反応を行って、１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドの約８００塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じるステップであって、前記種のうちいずれか１種に由来する約１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡの増幅が、３０未満のサイクル閾値（ＣＴ）を有するステップと、
１種または複数種の検出可能プローブにより前記アンプリコンを検出するステップであって、前記１種または複数種の検出可能プローブのそれぞれが、保存配列に特異的にハイブリダイズし、前記保存配列が、異なる属由来の複数の細菌種の間で同一であるステップと
を含む方法。
（項目５）
前記血小板試料が、アフェレーシスにより単離された血小板濃縮物である、項目１〜３に記載の方法。
（項目６）
前記血小板濃縮物の５ｍＬ未満から単離された核酸が、前記核酸増幅反応に供される、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記検出が、１ｍＬ当たり約１．０のコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）の細菌量を有する血小板試料の細菌汚染を示す検出可能シグナルを生じる、項目３に記載の方法。
（項目８）
（ａ）陰性対照試料のＣＴが、前記複数の細菌種のうちいずれか１種に由来する１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡを含有する試料のＣＴよりも少なくとも５サイクル高い、
（ｂ）前記生物試料が、血小板試料である、
（ｃ）前記１種または複数種の検出可能プローブが、５種以下の異なるプローブまたは２種以下の異なるプローブを含む、
（ｄ）前記１種または複数種の検出可能プローブが、２種以下の異なるプローブを含む
のうち１種または複数種を特徴とする、項目４に記載の方法。
（項目９）
前記アンプリコンが、細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチド鋳型から作製される、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
（ａ）前記細菌汚染を検出することが、レシピエントへの輸注に先立ち完了される、
（ｂ）前記増幅反応が、３００塩基以下または１５０塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じる、
（ｃ）前記増幅反応が、１００〜２００塩基のアンプリコンの検出可能量を生じる、
（ｄ）前記単一のプライマー対が、配列番号４、７または９に示されている配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含む第１のプライマーと、配列番号５、６、８または１０に示されている配列の少なくとも１０個のヌクレオチドを含む第２のプライマーとを含む、
（ｅ）前記プローブが、表３に示されている配列またはその相補体の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含む、
（ｆ）前記核酸増幅反応が、前記細菌汚染由来の５ｐｇ未満の出発核酸を含有する、
（ｇ）前記核酸増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、等温増幅、鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、リガーゼ連鎖反応、転写媒介性増幅、固相増幅、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）および線形増幅からなる群から選択される方法を使用して行われる、
（ｈ）前記核酸増幅反応が、ウェルにおいて、プレートにおいて、チューブにおいて、チャンバーにおいて、液滴において、フローセルにおいて、スライドにおいて、チップにおいて、固体基板に取り付けて、ビーズに取り付けて、またはエマルションにおいて行われる
のうち１種または複数種を特徴とする、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
前記細菌種が全てグラム陽性細菌である、項目１または４のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記細菌種が全てグラム陰性細菌である、項目１または４のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記少なくとも８種の細菌種が、複数のグラム陽性細菌種および複数のグラム陰性細菌種を含む、１に記載の方法。
（項目１４）
前記複数の細菌種が、異なる属に由来する複数のグラム陽性細菌種および異なる属に由来する複数のグラム陰性細菌種を含む、４に記載の方法。
（項目１５）
前記１種または複数種の検出可能プローブが、前記グラム陰性種に存在しない、前記グラム陽性細菌種の間で共通の保存配列に特異的にハイブリダイズする第１のプローブと、前記グラム陽性種に存在しない、前記グラム陰性細菌種の間で共通の保存配列に特異的にハイブリダイズする第２のプローブとを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記細菌種が、Staphylococcus  aureus、Staphylococcus  aureus  Mu3;  Staphylococcus  epidermidis、Streptococcus  agalactiae、Streptococcus  pyogenes、Streptococcus  pneumonia、Escherichia  coli、Citrobacter  koseri、Clostridium  perfringens、Enterococcus  faecalis、Klebsiella  pneumonia、Lactobacillus  acidophilus、Listeria  monocytogenes、Propionibacterium  granulosum、Pseudomonas  aeruginosa、Serratia  marcescens、Bacillus  cereus、Staphylococcus  aureus  Mu50、Yersinia  enterocolitica、Staphylococcus  simulans、Micrococcus  luteusおよびEnterobacter  aerogenesからなる群から選択される、項目１または４に記載の方法。
（項目１７）
試料における少なくとも１０種の細菌種または試料における少なくとも１５種の細菌種のいずれかによる細菌汚染を検出するステップを含む、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目１８）
前記検出可能シグナルが、少なくとも５ｌｏｇにわたる線形検出範囲を有する、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目１９）
前記プローブシグナルに基づき細菌汚染の量を決定するステップをさらに含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記プローブが、少なくとも５ｌｏｇにわたる線形検出範囲を有するシグナルを生じる、項目４に記載の方法。
（項目２１）
前記プローブシグナルに基づき前記複数の細菌種の存在量を決定するステップをさらに含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドの一部分の増幅および検出のための組成物であって、前記部分の長さが、約８００ヌクレオチド未満であり、前記組成物が、
配列番号９に示されている配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含む第１のプライマーと、
配列番号１０に示されている配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含む第２のプライマーと、
配列番号１６に示されている配列またはその相補体の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含むプローブと
を含む組成物。
（項目２３）
容器内に存在する、項目２２に記載の組成物。
（項目２４）
１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドの一部分の増幅および検出のための組成物であって、前記部分の長さが、約８００ヌクレオチド未満であり、前記組成物が、
標的１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドを用いる増幅反応において、少なくとも５０ヌクレオチドの長さのアンプリコンを増幅するプライマーであって、前記アンプリコンが、最適にアラインメントされた場合、配列番号１〜３のいずれかと９０の配列同一性を有するプライマーと、
前記アンプリコンのいずれかの鎖に特異的にハイブリダイズするプローブと
を含む組成物。
（項目２５）
容器内に存在する、項目２４に記載の組成物。
（項目２６）
標的１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドを用いる増幅反応において、前記プライマーおよびプローブによる複数の標的種のうちいずれか１種に由来する約１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡの増幅が、３０未満のサイクル閾値（ＣＴ）を有する、項目２４に記載の組成物。
（項目２７）
１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドの一部分の増幅および検出のための反応混合物であって、前記部分の長さが、約８００ヌクレオチド未満であり、前記組成物が、
試料核酸と、
標的１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドを用いる増幅反応において、少なくとも５０ヌクレオチドの長さのアンプリコンを増幅するプライマーであって、前記アンプリコンが、最適にアラインメントされた場合、配列番号１〜３のいずれかと９０の配列同一性を有するプライマーと、
前記アンプリコンのいずれかの鎖に特異的にハイブリダイズするプローブと、
ポリメラーゼと
を含み、
前記反応混合物が反応サイトに存在する、反応混合物。
（項目２８）
前記反応サイトが、液滴、ウェル、プレート、チューブ、チャンバー、フローセルまたはチップである、項目２７に記載の反応混合物。
（項目２９）
標的１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドを用いる増幅反応において、前記プライマーおよびプローブによる複数の標的種のうちいずれか１種に由来する約１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡの増幅が、３０未満のサイクル閾値（ＣＴ）を有する、項目２７に記載の反応混合物。
（項目３０）
血小板試料の細菌汚染の検出のためのキットであって、
配列番号９に示されている配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含む第１のプライマーと、
配列番号１０に示されている配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含む第２のプライマーと、
配列番号１６に示されている配列またはその相補体の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含むプローブと
を含むキット。
（項目３１）
項目３０に記載のキットを使用する方法であって、
単一のプライマー対を用いて試料またはその一部分において核酸増幅反応を行って、１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドの約８００塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じるステップであって、異なる属由来の複数の細菌種のうちいずれか１種に由来する約１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡの増幅が、３０未満のサイクル閾値（ＣＴ）を有するステップと、
１種または複数種の検出可能プローブを用いて前記アンプリコンを検出するステップであって、前記１種または複数種の検出可能プローブのそれぞれが、保存配列に特異的にハイブリダイズし、前記保存配列が、異なる属由来の複数の細菌種の間で同一であるステップと
を含む方法。
（項目３２）
異なる属に由来する複数の細菌種のいずれかによる血小板試料の細菌汚染を検出するためのシステムであって、
顧客の要求を受け取って、試料における検出反応を行うよう構成されたコンピューターと、
前記顧客の要求に応じて、前記試料またはその一部分において核酸増幅反応を行う増幅システムであって、前記増幅反応が、単一のプライマー対および単一のプローブを使用して、１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドの約８００塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じ、さらに、少なくとも５属のうちいずれか１つに由来する１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡの増幅が、３０未満のＣＴを有する増幅システムと、
レポートをレシピエントに送るレポートジェネレーターであって、前記レポートが、前記プローブによって産生されたシグナル強度の検出の結果を含有する、レポートジェネレーターと
を含むシステム。
（項目３３）
前記レポートジェネレーターが、前記プローブによって産生された前記シグナル強度に基づき、前記試料を汚染されているまたは汚染されていないと同定する、項目３２に記載のシステム。
（項目３４）
前記レシピエントが、前記顧客である、項目３２に記載のシステム。
（項目３５）
少なくとも５種の細菌種のいずれかによる血小板試料の細菌汚染を検出する方法であって、
反応混合物において約８００塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じる条件下で、前記試料またはその部分を核酸増幅反応に供するステップであって、前記反応混合物が、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーを含み、前記第１のフォワードプライマーおよび前記第１のリバースプライマーがそれぞれ、少なくとも５種の異なる細菌ゲノムの間で保存された別々の領域にハイブリダイズする、ステップと、
前記反応混合物から、前記量のアンプリコンの存在を示すシグナルを検出し、これにより、前記少なくとも５種の細菌種のいずれかによる血小板試料の細菌汚染を検出する、ステップと
を含む方法。
（項目３６）
前記第１のフォワードおよび第１のリバースプライマーがそれぞれ、少なくとも１５種の異なる細菌ゲノムの間で保存された別々の領域にハイブリダイズする、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記第１のフォワードプライマーおよび前記第１のリバースプライマーがそれぞれ、最適にアラインメントされた場合、前記別々の領域と少なくとも８０の配列相同性を示す、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
反応混合物が、前記少なくとも５種の細菌ゲノムのうちいずれかまたは全てと最適にアラインメントされた場合少なくとも８０の配列相同性を示す第２のフォワードプライマーをさらに含む、項目３５に記載の方法。
（項目３９）
反応混合物が、前記少なくとも５種の細菌ゲノムのうちいずれかまたは全てと最適にアラインメントされた場合少なくとも８０の配列相同性を示す第２のリバースプライマーをさらに含む、項目３５に記載の方法。
（項目４０）
前記反応混合物が、検出可能標識をさらに含む、項目３５に記載の方法。
（項目４１）
前記検出可能標識が、ＤＮＡ結合色素である、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記アンプリコンが、標的１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドを含む、項目３５に記載の方法。
（項目４３）
前記少なくとも５種の細菌種が、Staphylococcus  aureus、Staphylococcus  aureus  Mu3;  Staphylococcus  epidermidis、Streptococcus  agalactiae、Streptococcus  pyogenes、Streptococcus  pneumonia、Escherichia  coli、Citrobacter  koseri、Clostridium  perfringens、Enterococcus  faecalis、Klebsiella  pneumonia、Lactobacillus  acidophilus、Listeria  monocytogenes、Propionibacterium  granulosum、Pseudomonas  aeruginosa、Serratia  marcescens、Bacillus  cereus、Staphylococcus  aureus  Mu50、Yersinia  enterocolitica、Staphylococcus  simulans、Micrococcus  luteusおよびEnterobacter  aerogenesからなる群から選択される、項目３５に記載の方法。
（項目４４）
前記少なくとも５種の細菌種のうちいずれか１種に由来する約１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡが、３０未満のサイクル閾値（ＣＴ）を有するような条件下で、前記核酸増幅が行われる、項目３５に記載の方法。
（項目４５）
細菌汚染の前記検出することが、レシピエントへの前記血小板試料の輸注に先立ち完了される、項目３に記載の方法。
（項目４６）
細菌汚染の前記検出することが、レシピエントへの前記血小板試料の輸注に先立ち完了される、項目３５に記載の方法。
（項目４７）
コンピューター可読媒体であって、１個または複数個のプロセッサによって実行されると、異なる属由来の複数の細菌種のいずれかによる血小板試料の細菌汚染を検出する方法を実施するコードを含み、
前記方法は、
顧客の要求を受け取って、試料における検出反応を行うステップと、
前記顧客の要求に応じて前記試料またはその部分における核酸増幅反応を行うステップであって、前記増幅反応が、単一のプライマー対および単一のプローブを使用して、１６Ｓ  ｒＲＮＡの約８００塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じ、さらに、少なくとも５属のうちいずれか１つに由来する１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡの増幅が、３０未満のＣＴを有するステップと、
前記プローブによって産生されたシグナル強度の検出の結果を含有するレポートを作成するステップと
を含む、コンピューター可読媒体。
【００１８】
参照による援用
本明細書に言及されているあらゆる刊行物、特許および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが、参照により組み込まれると特にかつ個々に示されているのと同じ程度まで、本明細書に参照により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
本発明の新規特色は、添付の特許請求の範囲に詳細に記されている。本発明の原理が利用されている説明的実施形態を記す次の詳細な説明および次の添付の図面を参照することにより、本発明の特色および利点をより良く理解することができるであろう。
【００２０】
【図１】図１は、核酸増幅反応の結果を図解するグラフである。
【００２１】
【図２】図２は、核酸増幅アッセイの検出範囲を図解するグラフである。
【００２２】
【図３Ａ】図３Ａおよび図３Ｂは、核酸増幅反応の結果を図解するグラフである。
【図３Ｂ】図３Ａおよび図３Ｂは、核酸増幅反応の結果を図解するグラフである。
【００２３】
【図４Ａ】図４Ａおよび図４Ｂは、核酸増幅反応の結果を図解するグラフである。
【図４Ｂ】図４Ａおよび図４Ｂは、核酸増幅反応の結果を図解するグラフである。
【００２４】
【図５】図５は、例としての試料解析システムを描写する図解である。
【００２５】
【図６Ａ】図６Ａおよび図６Ｂは、Ｌｉｕらによって記載されるプライマーおよびプローブの間のハイブリダイゼーションの試料解析の結果を図解する。
【図６Ｂ】図６Ａおよび図６Ｂは、Ｌｉｕらによって記載されるプライマーおよびプローブの間のハイブリダイゼーションの試料解析の結果を図解する。
【００２６】
【図７Ａ】図７Ａは、核酸増幅反応の結果を図解するグラフである。
【００２７】
【図７Ｂ】図７Ｂは、核酸増幅アッセイの検出範囲を図解するグラフである。
【００２８】
【図８Ａ】図８Ａ〜図８Ｇは、核酸増幅反応の結果を図解するグラフである。
【図８Ｂ】図８Ａ〜図８Ｇは、核酸増幅反応の結果を図解するグラフである。
【図８Ｃ】図８Ａ〜図８Ｇは、核酸増幅反応の結果を図解するグラフである。
【図８Ｄ】図８Ａ〜図８Ｇは、核酸増幅反応の結果を図解するグラフである。
【図８Ｅ】図８Ａ〜図８Ｇは、核酸増幅反応の結果を図解するグラフである。
【図８Ｆ】図８Ａ〜図８Ｇは、核酸増幅反応の結果を図解するグラフである。
【図８Ｇ】図８Ａ〜図８Ｇは、核酸増幅反応の結果を図解するグラフである。
【００２９】
【図９】図９は、核酸増幅反応の結果を図解するグラフである。
【００３０】
【図１０Ａ】図１０Ａは、３連で行われた核酸増幅反応の結果を図解するグラフである。
【００３１】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、その結果得られた増幅された核酸の融解曲線解析の結果を図解するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
本明細書に開示されている一部の実施形態の実施は、他に断りがなければ、当業者の技能範囲内で、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの従来技法を用いる。例えば、Sambrook  and  Green、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第4版(2012);シリーズCurrent  Protocols  in  Molecular  Biology  (F.  M.  Ausubelら編);シリーズMethods  In  Enzymology  (Academic  Press，Inc.)、PCR  2:  A  Practical  Approach  (M.J.  MacPherson、B.D.  Hames  and  G.R.  Taylor編(1995))、Harlow  and  Lane編(1988)  Antibodies、A  Laboratory  Manual、およびCulture  of  Animal  Cells:  A  Manual  of  Basic  Technique  and  Specialized  Applications、第6版(R.I.  Freshney編(2010))を参照されたい。
【００３３】
本明細書および特許請求の範囲に使用されている通り、単数形（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈が明らかにそれ以外を指示しない限り、複数形の参照を含む。例えば、用語「（単数の）細胞（a  cell）」は、複数の細胞を含み、これらの混合物を含む。
【００３４】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用される。これらは、デオキシリボヌクレオチドであれリボヌクレオチドであれ、これらのアナログであれ、いずれかの長さのヌクレオチドのポリマー型を指す。ポリヌクレオチドは、いずれかの三次元構造を有することができ、公知または未知のいずれかの機能を行うことができる。ポリヌクレオチドの非限定例を次に示す：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖解析から規定される遺伝子座（単数または複数）、エクソン、イントロン、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いずれかの配列の単離されたＤＮＡ、いずれかの配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ等、１個または複数の修飾されたヌクレオチドを含むことができる。存在するのであれば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリの前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーション等により、重合後にさらに修飾することができる。
【００３５】
一般に、用語「標的ポリヌクレオチド」は、その存在、量および／またはヌクレオチド配列、またはこれらのうち１種もしくは複数の変化の決定が望まれる標的配列を有する核酸分子の出発集団における、核酸分子またはポリヌクレオチドを指す。一般に、用語「標的配列」は、核酸の一本鎖における核酸配列を指す。標的配列は、遺伝子、調節配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡや、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡを含むＲＮＡまたはその他の部分となり得る。標的配列は、増幅反応の産物等、試料由来の標的配列または二次標的となり得る。
【００３６】
一般に、「ヌクレオチドプローブ」、「プローブ」または「タグオリゴヌクレオチド」は、相当する標的配列とのハイブリダイゼーションによるハイブリダイゼーション反応における、その相当する標的ポリヌクレオチドの検出または同定に使用されるポリヌクレオチドを指す。よって、ヌクレオチドプローブは、１種または複数種の標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能である。タグオリゴヌクレオチドは、試料における１種または複数種の標的ポリヌクレオチドと完全に相補的となり得る、あるいは試料における１種または複数種の標的ポリヌクレオチドにおける相当するヌクレオチドによって相補されない１種または複数種のヌクレオチドを含有することができる。
【００３７】
「ハイブリダイゼーション」は、１種または複数種のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対形成、フーグスティーン（Hoogstein）結合によって、または他のいずれかの配列特異的様式で起こり得る。複合体は、二重鎖構造を形成する２本の鎖、多鎖複合体を形成する３本もしくはそれを超える鎖、単一の自己ハイブリダイズする鎖、またはこれらのいずれかの組合せを含むことができる。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲの開始またはエンドヌクレアーゼによるポリヌクレオチドの酵素切断等、より広範なプロセスにおけるステップを構成することができる。所定の配列とハイブリダイズすることができる配列は、該所定の配列の「相補体」と称される。
【００３８】
ポリヌクレオチドに適用される用語「ハイブリダイズ可能」は、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定化される複合体を形成するポリヌクレオチドの能力を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対形成、フーグスティーン結合により、または他のいずれかの配列特異的様式で起こり得る。複合体は、二重鎖構造を形成する２本の鎖、多鎖複合体を形成する３本もしくはそれを超える鎖、単一の自己ハイブリダイズする鎖、またはこれらのいずれかの組合せを含むことができる。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素切断等、より広範なプロセスにおけるステップを構成することができる。所定の配列とハイブリダイズされる配列は、前記所定の配列の「相補体」と称される。
【００３９】
「相補性」は、伝統的ワトソン・クリックまたは他の非伝統的な型のいずれかにより別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成する核酸の能力を指す。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン・クリック塩基対形成）を形成することができる、核酸分子における残基のパーセンテージを示す（例えば、１０個のうち５、６、７、８、９、１０個は、５０、６０、７０、８０、９０および１００の相補的である）。「完全に相補的」は、核酸配列の連続した残基の全てが、第２の核酸配列における同数の連続した残基と水素結合することを意味する。「実質的に相補的」は、本明細書において、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれを超えるヌクレオチドの領域にわたり、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９または１００である相補性の度合いを指す、あるいはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２種の核酸を指す。
【００４０】
本明細書において、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」は、標的配列に対する相補性を有する核酸が、標的配列と主にハイブリダイズし、非標的配列と実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、一般に、配列依存的であり、多数の因子に応じて変動する。一般に、配列が長いほど、配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度は高くなる。ストリンジェントな条件の非限定例は、Tijssen（１９９３年）Laboratory  Techniques  In  Biochemistry  And  Molecular  Biology-Hybridization  With  Nucleic  Acid  Probes、第Ｉ部、第２章「Overview
of  principles  of  hybridization  and  the  strategy  of  nucleic  acid  probe  assay」Elsevier,  N.Y.に詳細に記載されている。
【００４１】
用語「被験体」、「個体」および「患者」は、本明細書において、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指すよう互換的に使用される。哺乳動物として、マウス、サル、ヒト、家畜、競技用動物（sport  animal）およびペットが挙げられるがこれらに限定されない。ｉｎ  ｖｉｖｏで得られるまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される生物学的実体の組織、細胞およびこれらの後代も包含される。
【００４２】
本明細書において、「発現」は、ＤＮＡ鋳型からポリヌクレオチドが（ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物等へと）転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡがその後にペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質へと翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされたポリペプチドは、「遺伝子産物」とまとめて称することができる。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含むことができる。
【００４３】
本明細書において、「血小板試料」および「血小板濃縮物」は、血小板精製プロセスに由来する血小板を含む被験体の生物試料を指すよう互換的に使用される。血小板は、遠心分離またはアフェレーシス等、種々の方法によって１種または複数種の他の血液成分から精製することができる。斯かる精製された血小板は、その後、組み合わせる、希釈する、分割するまたはさらに精製することができ、その全てが、血小板精製プロセスに由来する血小板を含む試料を産生する。
【００４４】
一態様において、本開示は、少なくとも８種の細菌種等、複数の細菌種のいずれかによる血小板試料の細菌汚染を検出する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、単一の反応混合物において約８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１５０または１００塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じる条件下で、前記試料またはその部分を核酸増幅反応に供するステップであって、前記反応混合物が、単一のプライマー対および単一の検出可能プローブを含み、前記プライマー対が、前記アンプリコンを挟み、前記アンプリコンが、前記検出可能プローブがハイブリダイズする保存配列を含み、前記保存配列が、前記少なくとも８種の細菌種の間で同一であるステップと、前記プローブによる前記アンプリコンへのハイブリダイゼーションを検出するステップであって、前記プローブによる前記ハイブリダイゼーションが、前記少なくとも８種の細菌種のいずれかによる前記血小板試料の細菌汚染を示す検出可能シグナルを生じるステップとを含む。
【００４５】
別の態様において、本開示は、血小板試料の細菌汚染を検出する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、単一の反応混合物において約８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１５０または１００塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じる条件下で、前記試料またはその部分を核酸増幅反応に供するステップであって、前記反応混合物が、単一のプライマー対および単一の検出可能プローブを含み、前記プライマー対が、前記アンプリコンを挟み、前記アンプリコンが、前記検出可能プローブがハイブリダイズする保存配列を含み、前記試料またはその部分が、増幅に先立ち３５Ｃを上回る温度で培養されたことがないステップと、前記プローブによる前記アンプリコンへのハイブリダイゼーションを検出するステップであって、前記プローブによる前記ハイブリダイゼーションが、前記血小板試料の細菌汚染を示す検出可能シグナルを生じるステップとを含む。
【００４６】
一態様において、本開示は、試料を得てから２４時間以内に血小板試料における細菌汚染を迅速に検出する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、約８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１５０または１００塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じる条件下で、前記試料またはその部分を、単一の反応混合物において単一のプライマー対および単一の検出可能プローブによる核酸増幅反応に供するステップであって、前記プライマー対が、前記アンプリコンを挟み、前記アンプリコンが、前記検出可能プローブがハイブリダイズする保存配列を含み、前記種のうちいずれか１種由来の約１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡの増幅が、３０未満のサイクル閾値（ＣＴ）を有するステップと、前記試料を得てから約２４時間以内に、前記プローブによる前記アンプリコンへのハイブリダイゼーションを検出するステップであって、前記プローブによる前記ハイブリダイゼーションが、前記血小板試料の細菌汚染を示す検出可能シグナルを生じ、これにより、前記試料を得てから約２４時間以内に前記汚染を検出するステップとを含む。
【００４７】
別の態様において、本開示は、被験体の生物試料における異なる属由来の複数の細菌種のいずれかによる細菌汚染を検出する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、前記試料またはその部分において単一のプライマー対による核酸増幅反応を行って、１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドの約８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１５０または１００塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じるステップであって、前記種のうちいずれか１種由来の約１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡの増幅が、３０未満のサイクル閾値（ＣＴ）を有するステップと、１種または複数種の検出可能プローブにより前記アンプリコンを検出するステップであって、前記１種または複数種の検出可能プローブのそれぞれが、保存配列に特異的にハイブリダイズし、前記保存配列が、異なる属由来の複数の細菌種の間で同一であるステップとを含む。
【００４８】
様々な態様のいずれかにおいて、核酸は、種々の試料供給源に由来することができる。核酸は、必要に応じて、核酸増幅反応における等、さらなる操作の前に単離および／または精製することができるが、ただし必ずしもそうである必要はない。例えば、生物試料は、無細胞核酸が未精製試料から増幅されるように、別々の抽出ステップなしでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順に供することができる。さらに別の例として、試料は、他の細胞成分から核酸を精製することなく、核酸増幅反応の直前またはその最中のいずれかに、細胞溶解条件に供することができる。一部の実施形態において、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその両方）は、核酸を増幅反応に供する前に生物試料から精製する。核酸精製の様々な方法は、当技術分野において公知であり、生物試料の種類によって変動し得る。例えば、生物試料は、被験体由来の組織および／または流体を含むことができる。一般に、生体液は、生命体に関連するいずれかの処理されたまたは処理されていない流体を含み、その例として、全血、温いまたは冷たい（warm  or  cold）血液および貯蔵または新鮮血；生理食塩水、栄養および／または抗凝固薬溶液等が挙げられるがこれらに限定されない、少なくとも１種の生理的溶液で希釈された血液等の処理された血液；血小板濃縮物（ＰＣ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）、乏血小板血漿（ＰＰＰ）、無血小板血漿、血漿、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）、血漿から得られる成分、濃縮赤血球（ＰＲＣ）、移行帯（transition  zone）材料またはバフィーコート（ＢＣ）等、血液成分；血液もしくは血液成分に由来するまたは骨髄に由来する類似の血液産物；血漿から分離され、生理的流体または凍結保護流体に再懸濁された赤血球；ならびに血漿から分離され、生理的流体または凍結保護流体に再懸濁された血小板を含む血液等が挙げられるがこれらに限定されない。生物試料の他の非限定例として、皮膚、心臓、肺、腎臓、骨髄、乳房、膵臓、肝臓、筋肉、平滑筋、膀胱、胆嚢、結腸、腸、脳、前立腺、食道、甲状腺、血清、唾液、尿、胃および消化液、涙、糞便、精液、腟液、腫瘍組織に由来する間質液、眼液、汗、粘液、耳垢、油、腺性分泌物、脊髄液、毛髪、爪、皮膚細胞、血漿、鼻スワブまたは鼻咽頭洗浄液、脊髄液、脳脊髄液、組織、咽喉スワブ、生検、胎盤液、羊水、臍帯血、リンパ（emphatic）液、腔液、痰、膿汁、微生物叢（micropiota）、胎便、母乳および／または他の排泄物もしくは身体組織が挙げられる。一部の実施形態において、検査するべき試料は、全血である。一部の実施形態において、検査するべき試料は、バフィーコートである。一部の実施形態において、解析される組織は、臓器（例えば、心臓、腎臓、肝臓、肺等）、皮膚、骨、神経組織、腱、血管、脂肪、角膜、血液または血液成分等、移植または外科的にグラフトしようとする組織の部分である。一部の実施形態において、試料は、哺乳動物等、被験体に由来し、その例として、マウス、サル、ヒト、家畜、競技用動物またはペット等が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、試料における汚染の検出は、被験体の診断または処置等、医療行為の基盤である。例えば、汚染は、被験体における敗血症を診断または予測するものとなり得る。治療剤の投与等、補正的医療介入を為すこともできる。
【００４９】
一部の実施形態において、検査するべき試料は、血小板試料である。全血の他の成分から血小板を精製するための方法は、当技術分野において公知であり、遠心分離および／または濾過（例えば、アフェレーシス）を利用する方法を含む。全血の成分として分離される場合、血小板は、濃縮する、血漿および／または血小板添加物溶液に再懸濁する、濾過装置の通過により白血球除去（leukoreduced）する、および／または約２２℃の温度の平台に維持される血小板貯蔵バッグにおいて貯蔵することができる。血小板試料は、別々の精製手順由来の血小板試料のプールまたはその部分を含むことができる。一部の実施形態において、血小板試料は、遠心分離等により血小板が除去された、精製された血小板の試料の部分である。
【００５０】
核酸は、当技術分野において公知のいずれか適した方法を使用して、生物試料から抽出することができる。例えば、核酸は、フェノール、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、またはＴＲＩｚｏｌおよびＴｒｉＲｅａｇｅｎｔを含む同様の製剤による有機抽出によって精製することができる。抽出技法の他の非限定例として、（１）自動核酸抽出器、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）から入手できるＭｏｄｅｌ  ３４１  ＤＮＡ抽出器の使用ありまたはなしで、例えば、フェノール／クロロホルム有機試薬（Ausubelら、１９９３年）を使用した
、有機抽出と続くエタノール沈殿；（２）固定相吸着方法（米国特許第５，２３４，８０９号；Walshら、１９９１年）；および（３）塩誘導性核酸沈殿方法（Millerら（１９８８年）、斯かる沈殿方法は、典型的には「塩析」方法と称される）が挙げられる。核酸単離および／または精製の別の例として、核酸が特異的にまたは非特異的に結合することができる磁性粒子（例えば、ビーズ）の使用と、続く磁石を使用した該粒子の単離と、該粒子からの核酸の洗浄および溶出が挙げられる（例えば、米国特許第５，７０５，６２８号を参照）。一部の実施形態において、上述の単離方法に先立ち、酵素消化ステップを行って、試料からの望まれないタンパク質の排除を助けることができ、例えば、プロテイナーゼＫまたは他の同様のプロテアーゼによる消化が挙げられる。例えば、米国特許第７，００１，７２４号を参照されたい。必要に応じて、ＲＮａｓｅ阻害剤を溶解バッファーに添加することができる。ある特定の細胞または試料型のため、プロトコールにタンパク質変性／消化ステップを加えることが望ましくなり得る。精製方法は、ＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ等が挙げられるがこれらに限定されない）またはその両方の単離に向けることができる。抽出手順の際にまたはその後に、ＤＮＡおよびＲＮＡが両者共に単離される場合、さらに別のステップを用いて、その他から一方または両方を別々に精製することができる。抽出された核酸の細画分を作製することもでき、例えば、サイズ、配列または他の物理的もしくは化学的特徴による精製が挙げられる。初期核酸単離ステップに加えて、その後の操作の後に核酸の精製を行って、過剰なまたは望まれない試薬、反応物または産物の除去等をすることができる。
【００５１】
様々な態様のいずれかにおいて、核酸増幅反応は、核酸増幅のための種々の方法のいずれかに関与し得る。一般に、「増幅」は、標的配列のコピー数が増加されるいずれかのプロセスを指す。標的核酸の検出および定量化のための多数の増幅に基づく方法は、当技術分野において公知である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、変性、反対の鎖へのプライマー対のアニーリングおよびプライマー伸長の複数サイクルを使用して、標的配列のコピー数を指数関数的に増加させる。ＲＴ−ＰＣＲと呼ばれる変種において、逆転写酵素（ＲＴ）が使用されて、ＲＮＡから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製し、続いてＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅して、複数コピーのＤＮＡを産生する（例えば、米国特許第５，３２２，７７０号および同第５，３１０，６５２号を参照）。
【００５２】
増幅方法は、温度の変化に関与し得る（熱変性ステップにおける等）、あるいは熱変性ステップを含まない等温プロセスとなり得る。等温増幅方法の例は、ＳＤＡと一般的に称される鎖置換増幅であり、これは、標的配列の反対の鎖へのプライマー配列対のアニーリング、二重鎖ヘミホスホロチオエート化プライマー伸長産物を産生するためのｄＮＴＰの存在下におけるプライマー伸長、ヘミ修飾された制限エンドヌクレアーゼ認識部位のエンドヌクレアーゼ媒介性ニッキング、ならびに現存する鎖を代え、次のラウンドのプライマーアニーリング、ニッキングおよび鎖置換のための鎖を産生するためのニックの３’端からのポリメラーゼ媒介性プライマー伸長のサイクルを使用して、産物の幾何学的増幅をもたらす（例えば、米国特許第５，２７０，１８４号および米国特許第５，４５５，１６６号を参照）。好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）は、より高温で、基本的に同じ方法において好熱性エンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼを使用する（欧州特許第０６８４３１５号）。
【００５３】
増幅方法の他の例として、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（例えば、Lizardi、「Rolling  Circle  Replication  Reporter  Systems」、米国特許第５，８５４，０３３号）；ヘリカーゼ依存的増幅（ＨＤＡ）（例えば、米国特許出願公開第２００４００５８３７８号）およびループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）（例えば、Notomiら、「Process  for  Synthesizing  Nucleic  Acid」、米国特許第６，４１０，２７８号）が挙げられる。
【００５４】
核酸増幅反応のさらに別の例として、ＮＡＳＢＡとも称される核酸配列に基づく増幅（例えば、Malekら、米国特許第５，１３０，２３８号）；Ｑβレプリカーゼと一般的に称される、プローブ分子それ自体を増幅するためのＲＮＡレプリカーゼの使用に頼る方法（例えば、Lizardi,  P.ら（１９８８年）BioTechnol.６巻、１１９７〜１２０２頁）；および自家持続配列複製法（例えば、Guatelli,  J.ら（１９９０年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８７巻、１８７４〜１８７８頁；Landgren（１９９３年）Trends  in  Genetics  ９巻、１９９〜２０２頁；およびHELEN  H.  LEEら、NUCLEIC  ACID  AMPLIFICATION  TECHNOLOGIES（１９９７年））等、転写に基づく増幅方法が挙げられる。別の転写に基づく増幅方法は、ＴＭＡと一般的に称される転写媒介性増幅であり、これは、実質的に一定の温度、イオン強度およびｐＨの条件下で、複数コピーの標的核酸配列を自己触媒的に合成し、標的配列の複数ＲＮＡコピーが、追加的なコピーを自己触媒的に作製する（例えば、米国特許第５，４８０，７８４号；および米国特許第５，３９９，４９１号を参照）。核酸増幅方法の追加的な例として、リガーゼ連鎖反応（例えば、米国特許第５，４９４，８１０号および同第５，８３０，７１１号を参照）および固相増幅方法（例えば、スライドまたはビーズ等、固体表面に取り付けられたプライマーによるブリッジ増幅；例えば、米国特許第５，６４１，６５８号および同第７，９８５，５６５号を参照）が挙げられる。
【００５５】
一般に、ＳＤＡは、次の通りに説明することができる。通常はＤＮＡ標的配列である一本鎖標的核酸を、ＳＤＡプライマーと接触させる。「ＳＤＡプライマー」は一般に、２５〜１００ヌクレオチドの長さを有し、およそ３５ヌクレオチドのＳＤＡプライマーが好まれる。ＳＤＡプライマーは、標的配列の３’端における領域と実質的に相補的であり、このプライマーは、その５’端（標的と相補的な領域の外側）に、「ニッキング酵素」または「ニッキングエンドヌクレアーゼ」と称されることもある制限エンドヌクレアーゼのための認識配列である配列を有する。続いて、ＳＤＡプライマーは、標的配列にハイブリダイズする。ＳＤＡ反応混合物は、ポリメラーゼ（「ＳＤＡポリメラーゼ」）およびそのうち少なくとも１種が置換または修飾されたｄＮＴＰである、全４種のデオキシヌクレオシド−三リン酸の混合物（デオキシヌクレオチドまたはｄＮＴＰ、即ち、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰとも呼ばれ、プライマー伸長反応において一般的に使用されている）も含有する；よって、ＳＤＡプライマーが伸長されて、「新たに合成された鎖」と称されることもある修飾されたプライマーを形成する。置換されたｄＮＴＰは、置換されたｄＮＴＰを含有する鎖における切断を阻害するが、他方の鎖における切断を阻害しないように修飾される。適した置換されたｄＮＴＰの例として、２’デオキシアデノシン５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸）、５−メチルデオキシシチジン５’−三リン酸、２’−デオキシウリジン５’−三リン酸および７−デアザ−２’−デオキシグアノシン５’−三リン酸が挙げられるがこれらに限定されない。加えて、ｄＮＴＰの置換は、新たに合成された鎖への取り込み後に起こり得る；例えば、メチラーゼを使用して、合成された鎖にメチル基を付加することができる。加えて、全てのヌクレオチドが置換される場合、ポリメラーゼは、５’  ３’エキソヌクレアーゼ活性を有することができる。しかし、全てのヌクレオチドが置換される訳ではない場合、ポリメラーゼは、好ましくは、５’  ３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。当業者であれば認めるであろうが、認識部位／エンドヌクレアーゼ対は、多種多様な公知の組合せのいずれかとなり得る。エンドヌクレアーゼは、酵素が一方の鎖のみを切断するため、または置換されたヌクレオチドの取り込みのため、相補的配列を切断することなく、認識部位でまたはそれに対し３’もしくは５’のいずれかで鎖を切断するよう選ばれる。適した認識部位／エンドヌクレアーゼ対は、当技術分野において公知であり、その例として、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＡｖａＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＴｔｈＩＩＩＩ、ＮｃＩＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢａｍＨＩ等が挙げられるがこれらに限定されない。使用に適した酵素およびその相当する認識部位ならびに修飾されたｄＮＴＰを描写するチャートは、これにより参照により組み込まれる、米国特許第５，４５５，１６６号に見出される。ニックが入れられたら、ポリメラーゼ（「ＳＤＡポリメラーゼ」）を使用して、新たにニックが入った鎖を５’  ３’伸長させ、これにより、別の新たに合成された鎖を作製する。選ばれたポリメラーゼは、ニック部位における５’  ３’重合を開始することができ���べきであり、また、ニック下流の重合された鎖を代えるべきであり、５’  ３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くべきである（これはその上、遮断薬の添加によって達成することができる）。ＳＤＡにおける適したポリメラーゼとして、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、シーケナーゼ（SEQUENASE）１．０およびシーケナーゼ２．０（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるがこれらに限定されない。一般に、ＳＤＡは、熱サイクル（thermocycling）を必要としない。反応の温度は一般に、非特異的ハイブリダイゼーションを防止するほど十分に高く、ただし特異的ハイブリダイゼーションを可能にするほど十分に低くなるよう設定される；これは典型的に、酵素に応じて約３７Ｃ〜約４２Ｃである。一部の実施形態において、本明細書に記載されている他の増幅技法に関して、第２のプライマー伸長反応は、相補的標的配列を使用して行って、設定期間における増幅の実質的な増加をもたらすことができる。すなわち、第２のプライマー核酸を、第１の標的配列と実質的に相補的な第２の標的配列にハイブリダイズさせて、第２のハイブリダイゼーション複合体を形成させる。酵素の添加と、続く第２のハイブリダイゼーション複合体の解離は、多数の新たに合成された第２の鎖の作製をもたらす。したがって、増幅は、線形または非線形（例えば、指数関数的）となり得る。
【００５６】
ＮＡＳＢＡは、これら全てが参照により組み込まれる、米国特許第５，４０９，８１８号；Sooknananら、Nucleic  Acid  Sequence-Based  Amplification、第１２章（２６１〜２８５頁）、Molecular  Methods  for  Virus  Detection内、Academic  Press、１９９５年；および「Profiting  from  Gene-based  Diagnostics」、CTB  International  Publishing  Inc.、N.J.、１９９６年に全般的に記載されている。ＮＡＳＢＡは、ＴＭＡおよびＱＢＲの両方と非常に類似している。転写媒介性増幅（ＴＭＡ）は、これら全てが参照により組み込まれる、米国特許第５，３９９，４９１号、同第５，８８８，７７９号、同第５，７０５，３６５号、同第５，７１０，０２９号に全般的に記載されている。ＮＡＳＢＡおよびＴＭＡの間の主な差は、ＮＡＳＢＡが、ＲＮＡｓｅ  Ｈの添加を利用してＲＮＡ分解をもたらし、ＴＭＡが、逆転写酵素の固有のＲＮＡｓｅ  Ｈ活性に頼ることである。一般に、これらの技法は、次の通りに説明することができる。通常ＲＮＡ標的配列（「第１の標的配列」または「第１の鋳型」と称されることもある）である一本鎖標的核酸を、本明細書において、「ＮＡＳＢＡプライマー」（「ＴＭＡプライマー」も適しているが）と一般に称される第１のプライマーと接触させる。ＤＮＡ標的配列から始める方法は後述する。これらのプライマーは、一般に、２５〜１００ヌクレオチドの長さを有し、およそ５０〜７５ヌクレオチドのＮＡＳＢＡプライマーが好まれる。第１のプライマーは、好ましくは、その３’端に、第１の鋳型の３’端と実質的に相補的な配列を有するＤＮＡプライマーである。第１のプライマーは、その５’端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター（またはシステムの構成に応じてその相補体（アンチセンス））も有する。次に、第１のプライマーを第１の鋳型にハイブリダイズさせて、第１のハイブリダイゼーション複合体を形成する。第１のＮＡＳＢＡプライマーが伸長されて、ＲＮＡ（第１の鋳型）およびＤＮＡ（新たに合成された鎖）のハイブリダイゼーション複合体を含む、修飾された第１のプライマーを形成するように、この反応混合物は、逆転写酵素酵素（「ＮＡＳＢＡ逆転写酵素」）および４種のｄＮＴＰの混合物も含む。本明細書における「逆転写酵素」または「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡプライマーおよびＲＮＡ鋳型からＤＮＡを合成することができる酵素を意味する。適したＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとして、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（「ＡＭＶ  ＲＴ」）およびモロニーマウス白血病ウイルスＲＴが挙げられるがこれらに限定されない。増幅反応がＴＭＡである場合、逆転写酵素は、ＲＮＡ分解活性をさらに含む。上に収載されている成分に加えて、ＮＡＳＢＡ反応は、本明細書において、リボヌクレアーゼと称されることもあるＲＮＡ分解酵素も含み、これは、一本または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡを加水分解することなく、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを加水分解するであろう。適したリボヌクレアーゼとして、Ｅ．ｃｏｌｉおよび仔ウシ胸腺由来のＲＮａｓｅ  Ｈが挙げられるがこれらに限定されない。リボヌクレアーゼ活性は、ハイブリダイゼーション複合体における第１のＲＮＡ鋳型を分解し、ハイブリダイゼーション複合体の解離をもたらし、「第２の鋳型」と称され���こともある、第１の一本鎖の新たに合成されたＤＮＡ鎖を後に残す。加えて、ＮＡＳＢＡ反応は、ＤＮＡを一般に含む第２のＮＡＳＢＡプライマーも含む（本明細書における全プローブおよびプライマーに関して、核酸アナログを使用することもできるが）。この第２のＮＡＳＢＡプライマーは、その３’端に、第２の鋳型の３’端と実質的に相補的な配列を有し、機能的プロモーターのアンチセンス配列および転写開始部位のアンチセンス配列も含有する。よって、このプライマー配列は、第３のＤＮＡ鋳型の合成のための鋳型として使用される場合、所望の部位におけるＲＮＡポリメラーゼの特異的かつ効率的な結合および転写開始を可能にするために十分な情報を含有する。アンチセンスプロモーターおよび転写開始部位は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのものとなり得るが、他のＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよび開始部位も同様に使用することができる。第２のプライマーは、第２の鋳型にハイブリダイズし、同様に反応物中に存在する「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」とも命名されるＤＮＡポリメラーゼは、第３の鋳型（第２の新たに合成されたＤＮＡ鎖）を合成し、２本の新たに合成されたＤＮＡ鎖を含む第２のハイブリダイゼーション複合体をもたらす。最後に、ＲＮＡポリメラーゼおよび要求される４種のリボヌクレオシド三リン酸（リボヌクレオチドまたはＮＴＰ）の包接は、ＲＮＡ鎖（第１の鋳型と基本的に同じである、第３の新たに合成された鎖）の合成をもたらす。本明細書において、「ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」と称されることがあるＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターを認識し、開始部位においてＲＮＡ合成を特異的に開始する。加えて、ＲＮＡポリメラーゼは、好ましくは、ＤＮＡ二重鎖当たり数コピーのＲＮＡを合成する。好まれるＲＮＡポリメラーゼとして、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、およびファージＴ３、ファージφＩＩ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａファージｓｐ６またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓファージｇｈ−１を含む他のバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、ＴＭＡおよびＮＡＳＢＡは、出発ＤＮＡ標的配列、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む第１のプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼ酵素と共に使用されて、プロモーター配列を含む新たに合成された鎖による二本鎖ＤＮＡハイブリッドを作製する。続いて、ハイブリッドは変性され、第２のプライマーが添加される。
【００５７】
等温増幅反応の別の例は、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）である。この増幅技法は、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００１０２００３５および米国特許第６，２５１，６３９号に開示されている。一般に、この方法は、キメラＲＮＡ／ＤＮＡ増幅プライマーをプローブまたは標的にハイブリダイズさせるステップを含む。好ましくは、このプローブのＤＮＡ部分は、ＲＮＡに対し３’である。必要に応じて、この方法は、終結ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを、鋳型への複合プライマーのハイブリダイゼーションに関して５’である鋳型の領域にハイブリダイズさせるステップを含む。鋳型へのプライマーのハイブリダイゼーション後に、ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーを伸長させる。その後、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素により、複合プライマーからＲＮＡを切断する。その後、第１の伸長されたプライマーが標的プローブから動かされるように、追加的なＲＮＡ／ＤＮＡキメラプライマーを鋳型にハイブリダイズさせる。伸長反応を反復し、それにより、複数コピーのプローブ配列が作製される。１種のみのＳＰＩＡプライマーが使用される場合、増幅反応は線形に進む。第１のプライマー伸長産物に対し相補性を有するリバースＳＰＩＡプライマーも使用される場合、増幅反応は非線形である。
【００５８】
一部の実施形態において、核酸増幅反応は、ＰＣＲ反応である。ＰＣＲによる標的配列の増幅に都合よい条件は、当技術分野において公知の方法により決定することができ、プロセスの種々のステップにおいて最適化することができ、標的種類、標的濃度、増幅しようとする配列の長さ、標的および／または１種もしくは複数のプライマーの配列、プライマーの長さ、プライマー濃度、使用されるポリメラーゼ、反応容量、１種または複数種の要素の１種または複数種の他の要素に対する比その他（このうち一部または全部は変更することができる）等、反応における要素の特徴に依存する。一般に、ＰＣＲは、増幅しようとする標的の変性（二本鎖の場合）、標的への１種または複数種のプライマーのハイブリダイゼーションおよびＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長のステップに関与し、これらのステップは、標的配列を増幅するために反復される（または「サイクルに付される」）。このプロセスにおけるステップは、収量を増強するため、疑似産物の形成を減少させるため、および／またはプライマーアニーリングの特異性を増加もしくは減少させるため等、様々な成果のために最適化することができる。最適化方法は、当技術分野において公知であり、増幅反応における要素の種類もしくは量、および／または特定のステップにおける温度、特定のステップの持続時間および／またはサイクル数等、プロセスにおける所定のステップの条件に対する調整を含む。一部の実施形態において、増幅反応は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、５０またはそれを超えるサイクルを含む。一部の実施形態において、増幅反応は、５、１０、１５、２０、２５、３５、５０以下またはそれを超えるサイクルを含む。サイクルは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超えるステップ等、いずれかの数のステップを含有することができ、サイクルに付されるステップは、サイクルに付されるこれらのステップに含まれていない１または複数のステップによって先行および／または後行され得る（例えば、初期融解ステップまたは最終インキュベーションステップ）。ステップは、プライマーアニーリング、プライマー伸長および鎖変性等が挙げられるがこれらに限定されない、所定のステップの目的の達成に適したいずれかの温度または温度勾配を含むことができる。ステップは、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１８０、２４０、３００、３６０、４２０、４８０、５４０、６００秒間もしくはそれ超、約前記数値未満または約前記数値超等が挙げられるがこれらに限定されない、いずれかの持続時間のものとなることができ、手動で中断されるまで無制限を含む。異なるステップを含むいずれかの数のサイクルは、いずれかの順序で組み合わせることができる。一部の実施形態において、異なるステップを含む異なるサイクルは、組合せにおけるサイクルの総数が、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、５０もしくはそれを超えるサイクル、約前記数値未満または約前記数値超となるように、組み合わされる。
【００５９】
様々な態様のいずれかの一部の実施形態において、核酸増幅反応は、１種または複数種のプライマー、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ超、約前記数値超または約前記数値未満のプライマーの３’端伸長を含む。一部の実施形態において、核酸増幅反応におけるプライマー伸長は、一対のみのプライマーに関与する。他の実施形態において、核酸増幅反応におけるプライマー伸長は、２、３、４、５またはそれを超えるプライマー対等、複数対のプライマーに関与する。一部の実施形態において、一対のプライマーは、第１のプライマーおよび第２のプライマーからなり、第１のプライマーは、１種または複数種の標的ポリヌクレオチドの少なくとも部分にハイブリダイズ可能な配列を含み、さらに、第２のプライマーは、第１のプライマー伸長産物の相補体の少なくとも部分にハイブリダイズ可能な配列を含む。標的ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、第１のプライマー伸長産物の相補体の少なくとも部分にハイブリダイズ可能な第２のプライマーの配列は、標的ポリヌクレオチドの相補鎖の少なくとも部分にハイブリダイズ可能となることもできる。増幅反応が、複数のプライマー対を含有する場合、この複数のプライマー対は、別個（対毎に２種の異なるプライマー等）、重複（２種またはそれを超える異なるリバースプライマーと対形成する１種のフォワードプライマー等）または別個対および重複対の組合せとなり得る。増幅プライマーは、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００もしくはそれ超、約前記数値未満または約前記数値超のヌクレオチド等、いずれか適した長さのものとなることができ、そのいずれかの部分または全ては、相当する標的配列と相補的となり得る（例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０もしくはそれ超、約前記数値未満または約前記数値超のヌクレオチド）。典型的には、プライマーが、相補的部分および非相補的部分を含む場合、標的配列と相補的な部分は、プライマーの３’端に位置する。プライマー対は、いずれか所望の長さの標的配列を増幅するように設計することができる。本明細書において、「アンプリコン」は、一本または二本鎖型の、核酸増幅反応において標的ポリヌクレオチドから増幅される標的配列を指す。一対のプライマーによってアンプリコンが増幅される場合、アンプリコンは、一般に、一方のプライマーが標的配列の５’端にハイブリダイズし、他方のプライマーが標的配列の３’端の相補体にハイブリダイズするように、プライマー対に挟まれる。一部の実施形態において、アンプリコンは、約１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２５０、２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５またはそれより少ないまたは約前記数値未満のヌクレオチドの長さである。一部の実施形態において、アンプリコンは、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００またはそれを超えるまたは約前記数値超のヌクレオチドの長さである。一部の実施形態において、アンプリコンの長さは、２５〜１０００、３０〜５００、５０〜４００、５０〜２５０、５０〜１５０または１００〜２００ヌクレオチドの長さ等、前記終点のうちいずれか２種の間である。プライマーは、種々の設計検討のいずれかに対する適合性に基づき選択することができ、これは、単独で、または本明細書に開示されているもしくは当技術分野において公知の他のいずれかの設計検討と組み合わせて使用することができる。プライマーの任意選択の設計検討の追加的な非限定例として、同じヌクレオチド（例えば、一列に並ぶ同じヌクレオチドのうち３、４、５またはそれ超）の実行の回避；プローブハイブリダイゼーション部位に重複することなくプローブに近接（例えば、同じ鎖に沿ったプライマーの３’端およびプローブの５’端の間に約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２５、３０、４０、５０、７５、１００もしくはそれ超または約前記数値未満のヌクレオチド）；約２０〜８０以内のＧ−Ｃ含量、選択された範囲内の融解温度（Ｔｍ）（例えば、約５５〜６５Ｃ、５８〜６２Ｃまたは５８〜６０Ｃ）；３’端の最後の５ヌクレオチド内に２個以下のＧおよび／またはＣ塩基を有すること；同様のＴｍを有する対のプライマー（例えば、同じＴｍまたは互いに約１〜２Ｃ以内のＴｍ）；最小の二次構造（例えば、ｍＦｏｌｄによる解析（例えば、Zukerら、Nucl.  Acid  Res、２００３年、３１巻：３４０６〜３４１５頁を参照）等、最適にフォールドされた場合、約５、４、３、２もしくは１個または約前記数値より少ないワトソン・クリック対形成する塩基）；ホモ二量体またはヘテロ二量体としての、反応におけるプライマー間の最小のハイブリダイゼーション（例えば、最適にアラインメントされた場合、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１個または約前記数値より少ないワトソン・クリック対形成する塩基）；ならびにプライマーおよび相当するプローブ間の最小のハイブリダイゼーション（例えば、最適にアラインメントされた場合、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１個または約前記数値より少ないワトソン・クリック対形成する塩基）が挙げられる。一部の実施形態において、約または少なくとも約２５、５０、７５、１００、１２５、１５０または１７５ヌクレオチドの長さであるアンプリコンを特異的に増幅するプライマーは、最適にアラインメントされた場合、表１における配列（またはその相補体）と約または少なくとも約８０、８５、９０、９５、９７．５、９９、９９．５またはそれを超える配列同一性を有する。最適な配列アラインメントを決定するための方法およびアルゴリズムは、当技術分野において公知であり、そのいずれかを使用して、パーセント配列同一性を決定することができる。２配列間の配列同一性を決定するためのアルゴリズムの一例として、国立バイオテクノロジー情報センター（National  Center  for  Biotechnology  Information）によりblast.ncbi.nlm.nih.govに維持されている、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）が挙げられる。
【００６０】
一部の実施形態において、プライマー対は、固体支持体に固定化される。固体支持体の例として、シリカベースの基板（例えば、ガラス、水晶、融解石英、シリコンその他）、他の半導体材料等、無機材料およびポリマー材料（例えば、ポリメタクリル酸メチル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、セルロース、アガロースまたは反応性媒体の支持体として従来使用されてきた種々の有機基板材料のいずれか）等、有機材料が挙げられるがこれらに限定されない。固体支持体として有用な種々の材料に加えて、固体支持体構造は、マイクロ粒子、ビーズ、ナノ粒子、ナノ結晶、ファイバー、マイクロファイバー、ナノファイバー、ナノワイヤー、ナノチューブ、マット、平面状シート、平面状ウエハまたはスライド、マルチウェルプレート、追加的な構造を含む光学的スライド、キャピラリー、マイクロ流体チャネルその他等が挙げられるがこれらに限定されない、種々の物理的構成のいずれかとなり得る。一部の実施形態において、固体支持体における増幅は、ブリッジ増幅を含む。ブリッジ増幅の一般方法は、当技術分野において公知である。例えば、ＷＯ／１９９８／０４４１５１およびＷＯ／２０００／０１８９５７を参照されたい。
【００６１】
少なくとも５、１０、１５、２０種またはそれを超える異なる細菌ゲノムの間で保存された領域に特異的ハイブリダイゼーションすることができるプライマー配列が特に興味深い。例えば、それぞれ少なくとも５、１０、１５、２０種またはそれを超える異なる細菌ゲノムの間で保存された別々の領域にハイブリダイズするフォワードおよびリバースプライマーが選択される。このような保存された領域として、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００７６２２）の１６Ｓ  ｒＲＮＡの９〜２８、３２〜４８、５２２〜５４５、８８８〜９０３、９１６〜９３７、９３９〜９７３、９７５〜９９４、９５７〜９８１、１０９３〜１１２５、１１８４〜１２０６、１２３１〜１２５２、１３７８〜１３９６、１３９８〜１４２２もしくは１４９６〜１５１６、または次の細菌ゲノムのうちいずれか１種における相当する領域が挙げられるがこれらに限定されない：Staphylococcus  aureus  Mu3;  Staphylococcus  epidermidis、Streptococcus  agalactiae、Streptococcus  pyogenes、Streptococcus  pneumonia、Escherichia  coli、Citrobacter  koseri、Clostridium  perfringens、Enterococcus  faecalis、Klebsiella  pneumonia、Lactobacillus  acidophilus、Listeria  monocytogenes、Serratia  marcescens、Bacillus  cereus、Propionibacterium  sp.、Staphylococcus  aureus  Mu50、Yersinia  enterocolitica、Staphylococcus  simulans、Micrococcus  luteusおよびEnterobacter  aerogenes。
【００６２】
一部の実施形態において、対象プライマーは、少なくとも５、１０、１５、２０種またはそれを超える異なる細菌ゲノムの保存された領域に特異的ハイブリダイゼーションすることができ、したがって、少なくとも５、１０、１５、２０種またはそれを超える異なる細菌ゲノムのいずれかの種類の特異的増幅および検出を可能にする。斯かるプライマーおよびそのセットの設計は、広範なセットの細菌株にわたる細菌感染の同時決定を可能にする。一部の実施形態において、斯かる検出は、単一対のプライマーによる、また必要に応じて、追加的な細菌適用範囲をもたらす１種または複数種の任意選択のプライマーによる単一の増幅反応において行われる。これらのプライマーおよびそのセットは、本明細書に開示されているプローブまたはＤＮＡ結合色素（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ）その他等の他の標識分子と併せて使用することができる。
【００６３】
核酸増幅反応におけるプライマー伸長は、その多くが市販されているＤＮＡポリメラーゼ等、当技術分野において公知のいずれか適したポリメラーゼにより行うことができる。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ活性またはＤＮＡ依存的およびＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ活性を含むことができる。ＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性または非熱安定性となり得る。ＤＮＡポリメラーゼの例として、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｌｉポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｆｕｔｕｂｏポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、Ｓｓｏポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、Ｐｈｏポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、ＶＥＮＴポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴポリメラーゼ、ＥＸ−Ｔａｑポリメラーゼ、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ、Ｅｘｐａｎｄポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ、Ｈｉ−Ｆｉポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、クレノウ断片ならびにこれらのバリアント、修飾産物および誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、鋳型なし対照増幅反応が、約２５、３０、３５、４０、４５もしくはそれ超または約前記数値超のサイクルのＰＣＲ反応後にバックグラウンドレベルを上回る増幅シグナルを産生しないように、細菌を使用して産生される酵素は、高度に精製されている。
【００６４】
様々な態様のいずれかの一部の実施形態において、核酸増幅産物は、増幅プロセスの最中および／または完了時に検出される。増幅産物検出は、増幅アッセイにおいてリアルタイムで行うことができる。一部の実施形態において、増幅された産物は、ＤＮＡインターカレート剤およびＤＮＡ溝結合因子等が挙げられるがこれらに限定されない、蛍光ＤＮＡ結合剤により直接的に可視化することができる。二本鎖ＤＮＡ分子に取り込まれるインターカレート剤の量は、増幅されたＤＮＡ産物の量に典型的に比例するため、従来の光学的システムを使用してインターカレートされた色素の蛍光を定量化することにより、増幅された産物の量を簡便に決定することができる。ＤＮＡ結合色素の非限定例として、ＳＹＢＲ（登録商標）ｇｒｅｅｎ、ＳＹＢＲ  ｂｌｕｅ、ＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム（propidium  iodine）、ヘキスト、ＳＹＢＲ  ｇｏｌｄ、エチジウムブロマイド、アクリジン、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、フルオロクマニン（fluorcoumanin）、エリプチシン、ダウノマイシン、クロロキン、ディスタマイシンＤ、クロモマイシン、ホミジウム（homidium）、ミスラマイシン、ルテニウムポリピリジル、アントラマイシンその他が挙げられる。
【００６５】
一部の実施形態において、配列特異的オリゴヌクレオチドプローブが核酸増幅反応において用いられて、増幅された産物の検出および／または定量化を容易にする。プローブに基づく定量的増幅は、プローブおよび増幅産物内の標的配列の間の特異的ハイブリダイゼーションによる等、所望の増幅された産物の配列特異的検出に頼る。標的特異的プローブの例として、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよび分子ビーコンを限定することなく挙げられる。プローブに基づく定量的増幅を行うための一般的方法は、当技術分野において公知である（例えば、米国特許第５，２１０，０１５号を参照）。ハイブリダイゼーションは、様々なストリンジェンシー下で行うことができる。適したハイブリダイゼーション条件は、一般に、プローブおよび標的ポリヌクレオチドの間の認識相互作用が、オリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーならびに企図される標的配列の間に優先的ハイブリダイゼーションをもたらすように十分に特異的および十分に安定的の両方であるようなものである。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増加させる条件は、当技術分野において公知であり、アニーリング温度および／または塩濃度の最適化を含む。オリゴヌクレオチドプローブは、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００もしくはそれ超、約前記数値未満または約前記数値超のヌクレオチド等、いずれか適した長さのものとなることができ、そのいずれかの部分または全体は、相当する標的配列と相補的となることができる（例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０もしくはそれ超、約前記数値未満または約前記数値超のヌクレオチド）。一部の実施形態において、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５種もしくはそれ超または約前記数値未満のプローブ等、複数のプローブが単一の核酸増幅反応において使用される。一部の実施形態において、単一の核酸増幅反応は、２種のみのプローブを含有し、例えば、一方は、１種または複数種のグラム陽性細菌（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種もしくはそれ超または約前記数値超）由来の配列に特異的にハイブリダイズし、第２のプローブは、１種または複数種のグラム陰性細菌（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種もしくはそれ超または約前記数値超）由来の配列に特異的にハイブリダイズする。一部の実施形態において、単一の核酸増幅反応は、複数の異なる細菌種（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０もしくはそれ超または約前記数値超の種）の間で同一の、および／または複数の異なる属（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０もしくはそれ超または約前記数値超の属）由来の細菌の間で同一の配列に特異的にハイブリダイズするプローブ等、１種のみのプローブを含有する。プローブは、単独で、または本明細書に開示されているもしくは当技術分野において公知の他のいずれかの設計検討と組み合わせて使用することができる、種々の設計検討のいずれかに対する適合性に基づき選択することができる。プローブの任意選択の設計検討の追加的な非限定例として、同じヌクレオチド（例えば、一列に並ぶ同じヌクレオチドのうち３、４、５またはそれを超える）の実行の回避；重複することのない増幅プライマーハイブリダイゼーション部位への近接（例えば、同じ鎖に沿ったプライマーの３’端およびプローブの５’端の間に約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２５、３０、４０、５０、７５、１００もしくはそれ超または約前記数値未満のヌクレオチド）；約２０〜８０以内のＧ−Ｃ含量、選択された範囲内の融解温度（Ｔｍ）（例えば、相当するプライマーＴｍよりも約８〜１０Ｃ高い）；ならびにＧよりも多いＣを有すること；５’端にＧがないことが挙げられる。一部の実施形態において、プローブは、約または少なくとも約２５、５０、７５、１００、１２５、１５０または１７５ヌクレオチドの長さであり、最適にアラインメントされた場合、表１における配列と約または少なくとも約８０、８５、９０、９５、９７．５、９９、９９．５またはそれを超える配列同一性を有するアンプリコンに特異的にハイブリダイズする。最適な配列アラインメントを決定するための方法およびアルゴリズムは、当技術分野において公知であり、そのいずれかを使用して、パーセント配列同一性を決定することもできる。２配列間の配列同一性を決定するためのアルゴリズムの一例として、国立バイオテクノロジー情報センターによってblast.ncbi.nlm.nih.govに維持されているＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）が挙げられる。
【００６６】
ハイブリダイゼーションアッセイにおいて形成されたプローブ−標的複合体の簡便な検出のため、ヌクレオチドプローブは、検出可能標識にコンジュゲートすることができる。適した検出可能標識は、光化学的、生化学的、分光学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能ないずれかの組成物を含むことができる。多種多様な適切な検出可能標識は、当技術分野において公知であり、蛍光標識、化学発光標識、放射性同位元素標識、酵素標識およびリガンドを含む。ハイブリダイゼーション強度の検出または定量化に使用される検出方法は、典型的に、上で選択された標識に依存するであろう。例えば、放射標識は、写真用フィルムまたはホスフォイメージャーを使用して検出することができる。蛍光マーカーは、放射光を検出するための光検出器を使用して検出および定量化することができる。一部の実施形態において、単一の反応における複数のプローブのそれぞれは、異なる標的の増幅に相当するシグナルが区別され得るように、異なる検出可能標識（例えば、異なる発光スペクトルを有する蛍光色素）にコンジュゲートされる。酵素標識は、酵素に基質を与え、該基質における該酵素の作用により産生された反応産物を測定することにより典型的に検出され；最後に、比色分析標識は、発色した標識を単純に可視化することにより検出される。
【００６７】
一部の実施形態において、結合したプローブのハイブリダイゼーションは、ＴａｑＭａｎアッセイ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．；例えば、これらそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９６２，２３３号および同第５，５３８，８４８号を参照）を使用して検出される。このアッセイは、ＰＣＲ反応において行われる。ＴａｑＭａｎアッセイは、ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ等、ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を活用する。配列特異的プローブが、ＰＣＲ反応に含まれる。典型的ＴａｑＭａｎプローブは、５’−レポーター色素（例えば、蛍光色素）および３’−クエンチャー色素を有するオリゴヌクレオチドである。ＰＣＲにおいて、プローブがその標的に結合される場合、ＡＭＰＬＩＴＡＱポリメラーゼの５’−３’核酸分解活性は、レポーターおよびクエンチャー色素の間でプローブを切断する。クエンチャー色素からのレポーター色素の分離は、蛍光の増加をもたらす。シグナルは、各ＰＣＲサイクルと共に蓄積し、蛍光光度計によりモニターすることができる。種々のレポーター−クエンチャー対は、当技術分野において公知である。いくつかの対は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により相互作用する。レポーターまたはクエンチャーとしてＦＲＥＴにおいて一般的に使用される分子として、フルオレセイン色素（例えば、ＦＡＭ、ＪＯＥおよびＨＥＸ）、ローダミン色素（例えば、Ｒ６Ｇ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ）、シアニン色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７）、ＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳが挙げられるがこれらに限定されない。蛍光色素が、レポーターまたはクエンチャーとして作用するか否かは、その励起および発光スペクトルによって、ならびにそれと対形成する蛍光色素によって規定される。例えば、ＦＡＭは、４８８ｎｍの波長を有する光によって最も効率的に励起され、５００〜６５０ｎｍのスペクトルおよび５２５ｎｍの発光最大を有する光を放射する。ＦＡＭは、例えば、５１４ｎｍにおけるその励起最大を有する、クエンチャーとしてのＴＡＭＲＡによる使用に適したレポーター標識である。蛍光色素から吸収されたエネルギーを消散する非蛍光またはダーククエンチャーの例として、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ（Ｎｏｖａｔｏ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）から販売されるＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）が挙げられる。Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）は、置換または非置換アリールもしくはヘテロアリール化合物またはこれらの組合せから選択される少なくとも３個のラジカルを含む構造であり、この残基のうち少なくとも２個は、環外ジアゾ結合により連結される（例えば、国際公開第ＷＯ２００１０８６００１号を参照）。他のダーククエンチャーは、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋクエンチャー（例えば、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＦＱ（商標）およびＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＲＱ（商標））、Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）ダーククエンチャー（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、Ｗａｓｈ．）およびＺｅｎ（商標）クエンチャー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）を含む。クエンチャーの追加的な非限定例は、米国特許第６，４６５，１７５号にも提供されている。
【００６８】
一部の実施形態において、結合したプローブのハイブリダイゼーションは、米国特許第５，９２５，５１７号、ＰＣＴ出願第ＷＯ１９９５０１３３９９および米国特許第６，１５０，０９７号の記載等、分子ビーコンオリゴヌクレオチドプローブを使用して検出される。典型的な分子ビーコンにおいて、プローブが標的鎖にハイブリダイズされない場合、中心の標的認識配列は、互いにハイブリダイズするアーム同士に挟まれ、ヘアピン構造を形成し、標的認識配列は、このヘアピン構造の一本鎖ループに存在し、アーム配列は、二本鎖ステムハイブリッドを形成する。プローブが、標的にハイブリダイズする場合、相対的に強固なヘリックスが形成され、ステムハイブリッドを巻き戻し、アームを引き離す。フルオロフォアＥＤＡＮＳおよびクエンチャーＤＡＢＣＹＬ（または本明細書に記載されているもしくは当技術分野において公知の他の対）等、ＦＲＥＴ対は、アルキルスペーサーによってアームに取り付けることができる。分子ビーコンが、標的鎖にハイブリダイズされない場合、フルオロフォアの発光はクエンチされる。分子ビーコンが、標的鎖にハイブリダイズされる場合、ＦＲＥＴ対は分離され、フルオロフォアの発光はクエンチされない。放射された蛍光は、標的鎖の存在のシグナルである。シグナルは、ＰＣＲ反応における各サイクルの終わりに蛍光光度計等により、核酸増幅反応において検出することができる。シグナル強度は、標的配列の増加する量と共に増加する。
【００６９】
Whitcombeら、Detection  Of  PCR  Products  Using  Self-probing  Amplicons  and  Fluorescence、Nature  Biotechnology  １７巻：８０４〜８０７頁（１９９９年８月）に開示されている通り、ＰＣＲ産物の検出は、自己プローブ化（probing）アンプリコンにより達成することができる。Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーは、プローブ要素を含む５’伸長、自己相補的ステム配列の対およびフルオロフォア／クエンチャー対を保有する。伸長は、ブロッキングヘキサエチレン（hexethylene）グリコール（ＨＥＧ）単量体の包接によりコピーから「保護」されている。プライマーからの１ラウンドのＰＣＲ伸長の後に、新たに合成された標的領域を次に、プローブと同じ鎖に取り付ける。第２ラウンドの変性およびアニーリングの後に、プローブおよび標的は、ハイブリダイズし、プローブはその後に蛍光を発する。したがって、本明細書に記載されている「プローブ」は、プライマーの部分として存在することができる。
【００７０】
様々な態様のいずれかの一部の実施形態において、核酸増幅反応において増幅された標的配列は、保存された細菌ポリヌクレオチドの部分の配列である。一部の実施形態において、保存されたポリヌクレオチドの増幅された部分は、異なる細菌属にわたり約８０、８５、９０、９５、９７．５もしくはそれより高いまたは約前記数値超の相同性を示す。保存されたポリヌクレオチド配列の例として、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、５Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、１２Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、２８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子、ｆｕｓＡ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、ｃｏｘ１遺伝子およびｎｉｆＤ遺伝子に存在するヌクレオチド配列が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、保存されたポリヌクレオチドは、１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、ｒＲＮＡ、ｒＤＮＡ、増幅産物またはこれらの組合せ）の部分である。１２５０ヌクレオチドを超える長さのほぼ４０，０００種のアラインメントされた１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列の一覧表は、ローレンス・バークレー国立研究所（Lawrence  Berkeley  National  Laboratory）によって運営される公的にアクセス可能なデータベースである、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅｓウェブ・アプリケーションに見出すことができる。他の公的にアクセス可能なデータベースは、ＧｅｎＢａｎｋ、ミシガン州立大学（Michigan  State  University）のリボソームデータベースプロジェクト、マックス・プランク海洋微生物学研究所（Max  Planck  Institute  for  Marine  Microbiology）のＳｉｌｖａデータベースおよび国立衛生研究所（National  Institute  of  Health）のＮＣＢＩを含む。増幅標的配列の非限定例を表１に示す。一部の実施形態において、アンプリコンは、約または少なくとも約２５、５０、７５、１００、１２５、１５０または１７５ヌクレオチドの長さであり、最適にアラインメントされた場合、表１における配列と約または少なくとも約８０、８５、９０、９５、９７．５、９９、９９．５またはそれを超える配列同一性を有する。最適な配列アラインメントを決定するための方法およびアルゴリズムは、当技術分野において公知であり、そのいずれかを使用して、パーセント配列同一性を決定することもできる。２配列間の配列同一性を決定するためのアルゴリズムの一例として、国立バイオテクノロジー情報センターによってblast.ncbi.nlm.nih.govに維持されている、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）が挙げられる。
【００７１】
一部の実施形態において、保存されたポリヌクレオチドの部分は、複数の異なる細菌種（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０もしくはそれ超または約前記数値超）の間で同一、および／または複数の異なる属（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０もしくはそれ超または約前記数値超）由来の細菌の間で同一である配列に特異的にハイブリダイズ可能な、第１のプライマーおよび第２のプライマーからなるプライマーの対により特異的に増幅される。よって、単一の対のユニバーサルプライマーによる増幅は、単一の反応において複数の異なる生物からポリヌクレオチドを増幅することができる。一部の実施形態において、プライマー対は、その３’端における表１における配列由来の少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５個またはそれを超えて連続するヌクレオチドを含む第１のプライマーと、その３’端における同じ表１配列由来の前記少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５個またはそれを超えて連続するヌクレオチドの相補体とを含む第２のプライマーを含む。一部の実施形態において、核酸増幅反応における１種または複数種のプライマーは、その３’端における表２から選択される配列の少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５個または全ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、その３’端における配列番号４由来の少なくとも約１０ヌクレオチドを含む第１のプライマーは、その３’端における配列番号５または６由来の少なくとも約１０ヌクレオチドを含む第２のプライマーと組み合わせて使用される。一部の実施形態において、その３’端における配列番号７由来の少なくとも約１０ヌクレオチドを含む第１のプライマーは、その３’端における配列番号８由来の少なくとも約１０ヌクレオチドを含む第２のプライマーと組み合わせて使用される。一部の実施形態において、その３’端における配列番号９由来の少なくとも約１０ヌクレオチドを含む第１のプライマーが、その３’端における配列番号１０由来の少なくとも約１０ヌクレオチドを含む第２のプライマーと組み合わせて使用される。
【００７２】
様々な態様の一部の実施形態において、複数の生物の存在、非存在および／または量は、単一の反応において検出される。一部の実施形態において、検出される生物は、微生物であり、その非限定例として、ウイルス、ウイロイド、細菌、古細菌、真菌および原生動物が挙げられる。一部の実施形態において、微生物は、細菌である。検出される細菌は、グラム陽性、グラム陰性またはグラム陽性およびグラム陰性細菌の組合せとなり得る。単一の反応において検出することができる細菌の非限定例として、Staphylococcus  aureus、Staphylococcus  aureus  Mu3;  Staphylococcus  epidermidis、Streptococcus  agalactiae、Streptococcus  pyogenes、Streptococcus  pneumonia、Escherichia  coli、Citrobacter  koseri、Clostridium  perfringens、Enterococcus  faecalis、Klebsiella  pneumonia、Lactobacillus  acidophilus、Listeria  monocytogenes、Propionibacterium  granulosum、Pseudomonas  aeruginosa、Serratia  marcescens、Bacillus  cereus、Staphylococcus  aureus  Mu50、Yersinia  enterocolitica、Staphylococcus  simulans、Micrococcus  luteusおよびEnterobacter  aerogenesのうち２種またはそれ超（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ超）が挙げられる。一部の実施形態において、検出される全細菌は、検出しようとする全細菌の間で共有される配列に相補的な単一のプローブにより検出される。ユニバーサルプライマー対に挟まれて増幅される標的配列は、保存されたポリヌクレオチドを有する複数の異なる生物の間で異なることができる（例えば、１個または複数の挿入、欠失、置換またはこれらの組合せを有する）、保存されたポリヌクレオチドを有する複数の異なる生物の間で同一となることができる、あるいはこれらの組合せとなることができる。典型的には、ユニバーサルプライマー対に挟まれて増幅される標的配列は、複数の異なる細菌種（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０もしくはそれ超または約前記数値超）の間で同一である、および／または複数の異なる属（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０もしくはそれ超または約前記数値超）由来の細菌の間で同一であるヌクレオチド配列の１種または複数種の保存された内部領域を含み、この保存された内部領域は、プローブ標的として使用することができる。一部の実施形態において、保存された内部領域は、複数のグラム陽性細菌の間で同一であり、グラム陰性細菌の間で同一ではない、または逆もまた同様である。一部の実施形態において、保存された内部領域は、約または少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００個またはそれを超えるヌクレオチドの長さである。一部の実施形態において、プライマーは、検出しようとする種および／または属の間のアンプリコン配列が、検出しようとする種および／または属にわたり約または少なくとも約８０、８５、９０、９５、９７．５、９８、９９、９９．５またはそれより高い配列同一性となるように選択される。一部の実施形態において、プライマーは、本明細書に記載されているいずれかのアンプリコンの長さ等、検���しようとする種および／または属にわたる標的の長さ以内のアンプリコンを産生するよう選択される。
【００７３】
一部の実施形態において、複数の細菌種および／または属は、増幅された保存された内部領域およびプローブオリゴヌクレオチドの間のハイブリダイゼーションにより検出（および必要に応じて定量化）される。一般に、保存された内部領域に特異的にハイブリダイズするプローブ由来の陽性シグナルは、標的配列の存在を示し、該標的配列を有する少なくとも１種の生物が、核酸が由来する試料に存在したことを示す。このようにして、複数の種および／または属の存在、非存在および／または量は、共通プローブにより検出することができる。一部の実施形態において、プローブは、表１における配列またはこれと相補的な配列由来の少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５個またはそれを超えて連続するヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、核酸増幅反応における１種または複数種のプローブは、表３から選択される配列またはその相補体の少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５個または全ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、配列番号１１、１２または１３（またはその相補体）由来の少なくとも１０個のヌクレオチドを含む１種または複数種のプローブを使用して、配列番号４〜６に基づくプライマーにより増幅された増幅産物を検出する。一部の実施形態において、配列番号１４または１５（またはその相補体）由来の少なくとも１０個のヌクレオチドを含む１種または複数種のプローブを使用して、配列番号７〜８に基づくプライマーにより増幅された増幅産物を検出する。一部の実施形態において、配列番号１６（またはその相補体）由来の少なくとも１０個のヌクレオチドを含むプローブを使用して、配列番号９〜１０に基づくプライマーにより増幅された増幅産物を検出する。
【００７４】
様々な態様のいずれかの一部の実施形態において、プライマーおよびプローブは、標的ポリヌクレオチド検出の感度を最大化するように選択される。一部の実施形態において、感度は、サイクル閾値（ＣＴ）の値を単位として測定される。ＰＣＲの初期サイクルにおいて、蛍光シグナルはほとんど変化しない。これは、増幅プロット（サイクル数にわたる蛍光強度のプロット）のベースラインを規定する。ベースラインを上回る蛍光の増加は、蓄積されたＰＣＲ産物の検出を示す。固定された蛍光閾値は、ベースラインを上回るよう設定することができる。パラメータＣＴは、蛍光が固定された閾値を追い越すサイクル数分率、典型的には、ベースラインまたはバックグラウンドを統計的に有意に上回る、増幅の対数線形期である強度として規定される。所定の反応または反応セットにおける蛍光の閾値レベルを計算するためのソフトウェアは、典型的に、リアルタイムＰＣＲ解析ソフトウェアパッケージに含まれる。閾値を設定するための一般的な一方法は、ベースライン（バックグラウンド）平均シグナルを決定し、ベースライン平均シグナルよりも１０倍高い閾値を設定することである。あるいは、閾値は、ベースライン発光の標準偏差の約１０倍に設定することができる。標準のセットの初期標的コピー数のｌｏｇ対ＣＴのプロットは、典型的に直線である。未知試料における標的の量の定量化は、ＣＴを測定し、検量線を使用して、出発コピー数を決定することにより達成される。一部の実施形態において、検出は、約３、４、５、６、７、８もしくはそれ超または約前記数値超のｌｏｇにわたる線形検出範囲を有する。一部の実施形態において、増幅反応においてプローブにより検出可能な細菌種のうちいずれか１種に由来する、約１０ｐｇ、５ｐｇ、４ｐｇ、３ｐｇ、２ｐｇ、１ｐｇ、０．５ｐｇ、０．１ｐｇもしくは約前記数値未満またはこれらのいずれかの間の範囲（例えば、０．５〜４ｐｇ、１ｐｇ〜５ｐｇ、１ｐｇ〜３ｐｇ等）のゲノムＤＮＡの増幅は、３０未満のＣＴを有する。一部の実施形態において、増幅反応においてプローブにより検出可能な、約１５０００、１００００、５０００、２５００、１５００、１０００、５００、２００、１００、５０もしくはそれより少ないまたは約前記数値未満の出発コピーの標的配列の増幅は、３０未満のＣＴを有する。一部の実施形態において、増幅反応においてプローブにより検出可能な細菌種のうちいずれか１種に由来する約１ｐｇのゲノムＤＮＡの増幅は、約３０、２９、２８、２７、２６、２５もしくはそれより低いまたは約前記数値未満のＣＴを有する。一部の実施形態において、陰性対照試料のＣＴは、増幅反応においてプローブにより検出可能な細菌種のうちいずれか１種に由来する、約１００ｐｇ、１０ｐｇ、５ｐｇ、４ｐｇ、３ｐｇ、２ｐｇ、１ｐｇ、０．５ｐｇ、０．１ｐｇまたはこれらのいずれかの間の範囲（例えば、０．５〜４ｐｇ、１ｐｇ〜５ｐｇ、１ｐｇ〜３ｐｇ、５ｐｇ〜１０ｐｇ等）のゲノムＤＮＡを含有する試料のＣＴよりも少なくとも２サイクル（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超えるサイクル）高い。典型的には、陰性対照は、あらゆる反応試薬を有するが、鋳型が添加されていない増幅反応である（例えば、鋳型の代わりに水、または細菌特異的アンプリコンの場合はヒトゲノムＤＮＡ等、標的アンプリコンを欠くことが公知のポリヌクレオチドを添加する）。一部の実施形態において、細菌汚染は、約２５ｍＬ、２０ｍＬ、１５ｍＬ、１０ｍＬ、５ｍＬ、４ｍＬ、３ｍＬ、２ｍＬ、１ｍＬ、０．１ｍＬもしくはそれに満たないまたは約前記数値未満の血小板濃縮物由来の核酸において検出される。一部の実施形態において、増幅は、約３０Ｃ、３５Ｃまたは３７Ｃを上回る温度における等、先ず試料をインキュベートして細菌成長を促進することなく、血小板試料またはその部分において行われる。一部の実施形態において、検出は、血小板試料における約５０、２５、１０、５、４、３、２、１、０．１もしくはそれより少ないまたは約前記数値未満の１ｍＬ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）の細菌量を有する、血小板試料の細菌汚染を示す検出可能シグナルを生じる。一部の実施形態において、５００００、４００００、３００００、２５０００、２００００、１５０００、１００００、７５００、５０００、２５００、１２５０、１０００、７５０、５００、２５０、１００、５０、２５、１０、５またはそれより少ないＣＦＵ未満に由来する核酸が、検出反応に存在する場合、検出は、血小板試料の細菌汚染を示す検出可能シグナルを生じる。一部の実施形態において、５〜５００００ＣＦＵ、５００〜２５０００ＣＦＵ、１０００〜１００００ＣＦＵまたは２５〜２５００ＣＦＵに由来する核酸を含有する反応のため、検出可能シグナルが得られる。一部の実施形態において、検出は、提供された血小板試料の輸注に先立ち完了され、陽性シグナルが検出される場合（細菌汚染を示す）、この提供された血小板は、レシピエントに輸注されない。一部の実施形態において、開示されている検出閾値のいずれかのまたはそれを上回る汚染を有する試料の陽性シグナルは、被験体から試料を得てから（例えば、被験体から採血してから）約４８、２４、１２、６、４、２またはそれより少ない時間以内に検出される。
【００７５】
本明細書に記載されている態様のいずれかの一部の実施形態において、検出手順は、生物試料の使用直前に（例えば、被験体への血液試料または血小板試料等の血液由来の試料の投与に先立ち）開始され、試料が採取された時間に関係なく、斯かる使用に先立ち結果を生じる。例えば、生物試料は、生物試料の計画された使用の約１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１時間または約前記数値未満の前に、汚染に関して検査することができ、検出結果は、斯かる計画された使用時より前（例えば、使用１、２、３、４、５またはそれを超える時間前）に得られる。一部の実施形態において、試料は、計画された使用の約５時間以内に検査され、結果は、斯かる計画された使用に先立ち得られる。一部の実施形態において、試料は、計画された使用の約２時間以内に検査され、結果は、斯かる計画された使用に先立ち得られる。一部の実施形態において、試料は、計画された使用の約１時間以内に検査され、結果は、斯かる計画された使用に先立ち得られる。一部の実施形態において、細菌汚染が検出方法により検出された場合、生物試料は、使用することなく廃棄される。一部の実施形態において、細菌汚染が検出されない場合、生物試料の計画された使用は進められる。一部の実施形態において、使用に先立ち検査される試料は、計画された使用の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日前もしくはそれ超または約前記数値超に採取された。一部の実施形態において、使用に先立ち検査される試料は、計画された使用の約５日前または約前記数値超に採取された。
【００７６】
一態様において、本開示は、本明細書に開示されている方法のいずれかにおける使用のためのシステムを提供する。一部の実施形態において、本システムは、異なる属に由来する複数の細菌種のいずれかによる、血小板試料等、試料の細菌汚染を検出するために使用される。一実施形態において、本システムは、顧客の要求を受け取って、試料における検出反応を行うよう構成されたコンピューターと、前記顧客の要求に応じて、前記試料またはその部分において核酸増幅反応を行う増幅システムであって、前記増幅反応が、単一のプライマー対および単一のプローブを使用して、１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドの約５００塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じ、さらに、少なくとも５属のうちいずれか１つに由来する１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡの増幅が、３０未満のＣＴを有する増幅システムと、レポートをレシピエントに送るレポートジェネレーターであって、前記レポートが、前記プローブによって産生されたシグナル強度の検出の結果を含有するレポートジェネレーターとを含む。
【００７７】
一部の実施形態において、前記コンピューターは、１個または複数のプロセッサを含む。プロセッサは、１個または複数のコントローラ、計算ユニット、および／またはコンピューターシステムの他のユニットに関連することができる、あるいは要望通りにファームウェアに埋め込まれることができる。ソフトウェアにおいて実施される場合、ルーチンは、ＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュメモリー、磁気ディスク、レーザーディスク（登録商標）または他の記憶媒体等、いずれかのコンピューター可読メモリーにおいて記憶され得る。同様に、このソフトウェアは、例えば、電話回線、インターネット、無線接続等の通信チャネルを含むいずれか公知の送達方法によって、あるいはコンピューター可読ディスク、フラッシュドライブ等の可搬型媒体によってコンピューティング装置に送達することができる。様々なステップは、様々なブロック、演算、ツール、モジュールまたは技法として実施することができ、次いでこれは、ハードウェア、ファームウェア、ソフトウェアまたはこれらのいずれかの組合せにおいて実施することができる。ハードウェアにおいて実施される場合、ブロック、演算、技法等の一部または全ては、例えば、カスタム集積回路（ＩＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブル論理アレー（ＦＰＧＡ）、プログラマブル論理アレー（ＰＬＡ）等において実施することができる。一部の実施形態において、コンピューターは、顧客の要求を受け取って、試料における検出反応を行うように構成される。コンピューターは、顧客の要求を直接的に（例えば、顧客または顧客の要求を入力する使用者によって操作されるキーボード、マウスまたはタッチスクリーン等、入力装置を経由して）または間接的に（例えば、インターネット上を含む、有線または無線接続を介して）受け取ることができる。顧客の非限定例として、試料を提供する被験体、医療従事者、臨床医、検査職員、保険会社職員または保健医療産業におけるその他の者が挙げられる。
【００７８】
一部の実施形態において、本システムは、コンピューターによる顧客の要求の受け取りに応答して、試料またはその部分において核酸増幅反応を行うための増幅システムを含む。増幅システムは、液体ハンドラー、熱サイクラー、光学的検出器および／または検出データを解析するためのプロセッサを含むことができる。一部の実施形態において、試料処理、核酸単離、増幅および／または解析における１または複数のステップは、増幅システムによって自動化される。一部の実施形態において、自動化は、１個または複数の液体ハンドラーおよび関連するソフトウェアの使用を含むことができる。いくつかの市販の液体ハンドリングシステムを利用して、斯かるプロセスの自動化を実行することができる（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｔｅｃａｎ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ａｐｒｉｃｏｔ  Ｄｅｓｉｇｎ、Ｖｅｌｏｃｉｔｙ  １１製の液体ハンドラーを参照）。一部の実施形態において、検出は、リアルタイム検出機器を含む。例示的なリアルタイム機器として、ABI  PRISM（登録商標）  7000  Sequence  Detection  System、ABI  PRISM（登録商標）  7700  Sequence  Detection  System、Applied  Biosystems  7300  Real-Time  PCR  System、Applied  Biosystems  7500  Real-Time  PCR  System、Applied  Biosystems  7900  HT  Fast  Real-Time  PCR  System(すべてApplied  Biosystems製);  LightCycler（商標）System(Roche  Diagnostics  GmbH);Mx3000P（商標）Real-Time  PCR  System、Mx3005P（商標）Real-Time  PCR  System、およびMx4000（登録商標）Multiplex  Quantitative  PCR  System(Stratagene、La  Jolla、Calif.);ならびにSmart  Cycler  System(Cepheid、  Fisher  Scientificによって配布される)が挙げられるがこれらに限定されない。試料を処理および／またはアッセイするための自動システムの追加的な非限定例として、COBAS（登録商標）AmpliPrep/COBAS（登録商標）TaqMan（登録商標）システム(Roche  Molecular  Systems)、TIGRIS  DTSシステム(Hologic  Gen-Probe、San  Diego、CA)、PANTHERシステム(Hologic  Gen-Probe、San  Diego、CA)、BD  MAX（商標）システム(Becton  Dickinson)、GeneXpert  System(Cepheid)、Filmarray（登録商標）(BioFire  Diagnostics)、iCubateシステム、IDBoxシステム(Luminex)、EncompassMDx（商標）(Rheonix)、Liat（商標）Aanlyzer(IQuum)、BiocartisのMolecular  Diagnostic  Platform、Enigma（登録商標）MLシステム(Enigma  Diagnosstics)、T2Dx（登録商標）システム(T2  Biosystems)、Verigene（登録商標）システム(NanoSphere)、Great  BasinのDiagnostic  System、Unyvero（商標）System(Curetis)、PanNATシステム(Micronics)、Spartan（商標）RXシステム(Spartan  Bioscience)、Atlas  ioシステム(Atlas  Genetics)、Idyllaプラットフォーム(Biocartis)、ARIES(Luminex)、GenMarkの自動化PCRプラットフォーム(例えば、eSensorシステム)、3M  Integrated  Cycler(Focus  Diagnostics)およびAlere  i自動化PCRプラットフォーム(Alere)が挙げられる。リアルタイム機器の記載は、とりわけ、これらそれぞれのメーカーの使用者マニュアルに見出すことができる；McPherson；DNA  Amplification:  Current  Technologies  and  Applications、DemidovおよびBroude編、Horizon  Bioscience、２００４年；および米国特許第６，８１４，９３４号。
【００７９】
一部の実施形態において、本システムは、レポートをレシピエントに送るレポートジェネレーターを含み、前記レポートは、前記プローブによって産生されたシグナル強度の検出の結果を含有する。レポートジェネレーターは、リアルタイムＰＣＲ解析ソフトウェアによって行われるデータ解析の形態等、増幅システムによる蛍光強度データの産生に応答してレポートを自動的に送ることができる。あるいは、レポートジェネレーターは、オペレーターからの命令に応答してレポートを送ることができる。レポートは、生のシグナル強度データ、加工されたシグナル強度データ（例えば、図示、ＣＴ値の同定、鋳型ポリヌクレオチドの出発量の計算）、細菌汚染が検出されたもしくは検出されなかったという結論、および／または供給源試料における汚染の量の定量化（ＣＦＵ／ｍＬ単位等）を含有することができる。レポートは、いずれか適した通信媒体を使用して、ローカルまたは遠隔位置におけるレシピエントに伝達することができる。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、無線接続またはインターネット接続となり得る。レポートは、レシピエントによる受信および／または点検のための斯かるネットワークまたは接続（またはプリントアウト等、物理的レポートの郵送等が挙げられるがこれらに限定されない、情報を伝達するための他のいずれかの適した手段）により伝達することができる。レシピエントは、顧客、個体、保健医療提供者、保健医療マネージャーまたは電子システム（例えば、１個もしくは複数のコンピューターおよび／または１個もしくは複数のサーバ）となることができるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、レポートジェネレーターは、パーソナルコンピューター、電話機、タブレットまたは他の装置等、レシピエントの装置にレポートを送る。レポートは、オンラインで見る、レシピエントの装置に保存する、あるいは印刷することができる。
【００８０】
図５は、試料の細菌汚染を検出するための例としてのシステムを図解する。本システムは、固定された媒体を有するサーバに必要に応じて接続することができる、媒体（例えば、ソフトウェア）および／またはネットワークポート（例えば、インターネットからの）からの命令を読むことができる論理的器具として理解することができる。コンピューターシステムは、ＣＰＵ、ディスクドライブ、キーボードおよび／またはマウス等の入力装置、ならびにディスプレイ（例えば、モニタ）のうち１種または複数種を含むことができる。命令またはレポートの伝達等、データ通信は、ローカルまたは遠隔位置におけるサーバへの通信媒体により達成することができる。通信媒体は、データを伝達および／または受け取るいずれかの手段を含むことができる。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、無線接続またはインターネット接続となり得る。斯かる接続は、ワールドワイドウェブによる通信のために提供することができる。
【００８１】
一態様において、本開示は、１個または複数のプロセッサによる実行によって、本明細書に開示されている方法のいずれかに係る方法を実施するコードを含むコンピューター可読媒体を提供する。一部の実施形態において、コンピューター可読媒体の実行は、異なる属に由来する複数の細菌種のいずれかによる血小板試料等、生物試料の細菌汚染を検出する方法を実施する。一実施形態において、本コンピューター可読媒体の実行は、試料において検出反応を行うための顧客の要求に応答して、前記顧客の要求に応じて前記試料またはその部分における核酸増幅反応を行うステップであって、前記増幅反応が、単一のプライマー対および単一のプローブを使用して、１６Ｓ  ｒＲＮＡの約５００塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じ、さらに、前記少なくとも５属のうちいずれか１つに由来する１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡの増幅が、３０未満のＣＴを有するステップと、前記プローブによって産生されたシグナル強度の検出の結果を含有するレポートを作成するステップとを含む方法を実施する。
【００８２】
コンピューター可読媒体は、有形記憶媒体、搬送波媒体または物理的伝達媒体等が挙げられるがこれらに限定されない、多くの形態を採ることができる。不揮発性記憶媒体は、例えば、計算ステップ、処理ステップ等の実施に使用できる等、いずれかのコンピューター（複数可）その他における記憶装置のいずれか等、光または磁気ディスクを含む。揮発性記憶媒体は、コンピューターのメインメモリー等、ダイナミックメモリーを含む。有形伝達媒体は、同軸ケーブル；コンピューターシステム内にバスを含むワイヤーを含む銅線および光ファイバーを含む。搬送波伝達媒体は、高周波（ＲＦ）および赤外線（ＩＲ）データ通信の際に生成されるもの等、電気もしくは電磁シグナルまたは音響または光波の形態を採ることができる。したがって、コンピューター可読媒体の一般的形態は、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、他のいずれかの磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤまたはＤＶＤ−ＲＯＭ、他のいずれかの光学的媒体、パンチカード紙テープ、孔のパターンによる他のいずれかの物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、他のいずれかのメモリーチップまたはカートリッジ、搬送波輸送データまたは命令、斯かる搬送波を輸送するケーブルまたはリンク、あるいはコンピューターがプログラミングコードおよび／またはデータを読むことができる他のいずれかの媒体を含む。コンピューター可読媒体のこれらの形態の多くは、実行のためのプロセッサへの１種または複数種の命令の１種または複数種のシーケンスの保有に関与することができる。
【００８３】
一態様において、本開示は、保存されたポリヌクレオチドの少なくとも部分を増幅および検出するための組成物を提供する。組成物は、様々な態様のいずれかに関して本明細書に開示されている１種または複数種の要素を、いずれかの組合せで含むことができる。一部の実施形態において、保存されたポリヌクレオチドは、１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含有するＤＮＡ、１６Ｓ  ｒＲＮＡおよび／またはｒＤＮＡ増幅産物、またはこれらの組合せ）である。一部の実施形態において、増幅される１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドの部分は、約１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２５０、２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０個もしくはそれより少ないまたは約前記数値未満のヌクレオチドの長さである。一部の実施形態において、本組成物は、配列番号９の少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５個または全ヌクレオチドを含む第１のプライマーと、配列番号１０の少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５個または全ヌクレオチドを含む第２のプライマーと、配列番号１６の少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５個または全ヌクレオチドを含むプローブとを含む。一部の実施形態において、本組成物は、標的１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドによる増幅反応において、最適にアラインメントされた場合、配列番号１〜３のいずれかと９０の配列同一性を有する少なくとも５０個のヌクレオチドの長さのアンプリコンを増幅するプライマーと、前記アンプリコンのいずれかの鎖に特異的にハイブリダイズするプローブとを含む。一部の実施形態において、プライマーおよびプローブは、本明細書に開示されている１種または複数種のパラメータに従って選択される。例えば、プライマーおよびプローブは、複数の標的種のうちいずれか１種に由来する約１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡの増幅が、３０未満のサイクル閾値（ＣＴ）を有するように選択することができる。組成物は、マルチウェルプレートのウェル、プレート、チューブ、チャンバー、フローセル、マイクロ流体装置のチャンバーもしくはチャネル、またはチップ等、いずれか適した容器に含有され得る。一部の実施形態において、本組成物は、容器の表面に接着されたビーズまたはフィルム等、脱水型である。
【００８４】
一態様において、本開示は、保存されたポリヌクレオチドの増幅および検出のための反応混合物を提供する。反応混合物は、様々な態様のいずれかに関して本明細書に開示されている１種または複数種の要素を、いずれかの組合せで含むことができる。一部の実施形態において、保存されたポリヌクレオチドは、１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含有するＤＮＡ、１６Ｓ  ｒＲＮＡおよび／またはｒＤＮＡ増幅産物、またはこれらの組合せ）である。一部の実施形態において、増幅される１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドの部分は、約１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２５０、２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０個もしくはそれより少ないまたは約前記数値未満のヌクレオチドの長さである。一部の実施形態において、本反応混合物は、配列番号９の少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５個または全ヌクレオチドを含む第１のプライマーと、配列番号１０の少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５個または全ヌクレオチドを含む第２のプライマーと、配列番号１６の少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５個または全ヌクレオチドを含むプローブとを含む。一部の実施形態において、本反応混合物は、標的１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドによる増幅反応において、最適にアラインメントされた場合、配列番号１〜３のいずれかと９０の配列同一性を有する少なくとも５０個のヌクレオチドの長さのアンプリコンを増幅するプライマーと、前記アンプリコンのいずれかの鎖に特異的にハイブリダイズするプローブとを含む。一部の実施形態において、プライマーおよびプローブは、本明細書に開示されている１種または複数種のパラメータに従って選択される。例えば、プライマーおよびプローブは、複数の標的種のうちいずれか１種に由来する約１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡの増幅が、３０未満のサイクル閾値（ＣＴ）を有するように選択することができる。反応混合物は、いずれか適した反応サイトに含有され得る。反応サイトは、マルチウェルプレートのウェル、プレート、チューブ、チャンバー、フローセル、マイクロ流体装置のチャンバーもしくはチャネル、またはチップ等、容器となり得る。反応サイトは、液滴（例えば、エマルション混合物内の）等、溶液内の区画となり得る。一部の実施形態において、本組成物は、容器の表面に接着されたビーズまたはフィルム等、脱水型である。
【００８５】
一態様において、本開示は、血小板試料等、生物試料の細菌汚染の検出のためのキットを提供する。キットは、様々な態様のいずれかに関して本明細書に開示されている１種または複数種の要素を、いずれかの組合せで含むことができる。一部の実施形態において、本キットは、配列番号９の少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５個または全ヌクレオチドを含む第１のプライマーと、配列番号１０の少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５個または全ヌクレオチドを含む第２のプライマーと、配列番号１６の少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５個または全ヌクレオチドを含むプローブとを含む。キットにおける試薬および他の材料は、いずれか適した容器に含有されてよく、直ちに使用可能な形態となり得る、あるいは本キットにおける他の試薬または使用者によって供給される試薬との組合せを要求し得る（例えば、濃縮された組成物の希釈または凍結乾燥された組成物の再構成）。キットは、バッファーを提供することができ、その非限定例として、炭酸ナトリウムバッファー、炭酸水素ナトリウムバッファー、ホウ酸塩バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＭＯＰＳバッファー、ＨＥＰＥＳバッファーおよびこれらの組合せが挙げられる。キットは、対照試料、例えば、ＤＮＡ抽出手順の対照のための公知の細菌、および／または陽性対照もしくは定量化標準としての使用のための精製されたＤＮＡを含むことができる。一部の実施形態において、本キットは、本明細書に開示されている１種または複数種の方法に従った本キットの使用のための説明書を含む。一部の実施形態において、本キットを使用するための方法は、単一のプライマー対により試料またはその部分において核酸増幅反応を行って、１６Ｓ  ｒＲＮＡポリヌクレオチドの約５００塩基以下のアンプリコンの検出可能量を生じるステップであって、異なる属由来の複数の細菌種のうちいずれか１種に由来する約１ｐｇ〜５ｐｇのＤＮＡの増幅が、３０未満のサイクル閾値（ＣＴ）を有するステップと、１種または複数種の検出可能プローブにより前記アンプリコンを検出するステップであって、前記１種または複数種の検出可能プローブのそれぞれが、保存配列に特異的にハイブリダイズし、前記保存配列が、異なる属由来の複数の細菌種の間で同一であるステップとを含む。
【００８６】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【００８７】
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【００８８】
【表３−１】
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【表３−２】
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【００８９】
【表１５−１】
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【表１５−２】
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【表１５−３】
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【表１５−４】
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【表１５−５】
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【表１５−６】
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【表１５−７】
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【表１５−８】
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【表１５−９】
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【表１５−１０】
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【表１５−１１】
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【表１５−１２】
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【表１５−１３】
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【表１５−１４】
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【表１５−１５】
2019187431.tif 000025
【表１５−１６】
2019187431.tif 000026
【表１５−１７】
2019187431.tif 000027
【実施例】
【００９０】
次の実施例は、本発明の様々な実施形態を図解する目的で提示されており、決して本発明の限定を目的とするものではない。本実施例は、本明細書に記載されている方法と共に、現在、好まれる実施形態を代表し、例示的であり、本発明の範囲における限定として企図されない。特許請求の範囲によって規定される本発明の精神の内に包含されるその変更および他の使用は、当業者に想定されるであろう。
【００９１】
（実施例１）
相当するアンプリコンのための例としてのプライマー対および例としてのプローブを、特異性、検出範囲および複数の異なる属由来の種々の細菌種を検出する能力に関して評価した。本実施例において、配列、配列番号９を有するプライマー、配列、配列番号１０を有するプライマーおよび配列、配列番号１６を有するプローブを使用して、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の保存された部分を増幅および検出した。配列、配列番号３に対し、プライマーおよびプローブを設計した。表示量の細菌ゲノムＤＮＡ、ならびにプライマー、プローブ、酵素、ｄＮＴＰおよび他の標準試薬により、リアルタイムＰＣＲ反応を調製した。
【００９２】
プライマー−プローブ組合せの感度を評価するため、１０ｎｇ、１ｎｇ、１００ｐｇ、１０ｐｇ、１ｐｇおよび０．１ｐｇのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ抽出物を含有する増幅反応を２連で調製した。あらゆる共通試薬を含有するが、ＤＮＡ抽出物を水に置き換えた鋳型なし対照を４連で調製した。リアルタイムＰＣＲ増幅の結果の図示を図１に示す。ｙ軸に沿った任意蛍光強度の対数目盛り（０〜１０）を、ｘ軸に沿ったサイクル数（０〜４０）に対しプロットする。左から右に、第１の対の曲線は、１０ｎｇ試料（約１４．５の平均ＣＴ）に相当し、続く重複対の曲線は、１ｎｇ、１００ｐｇ、１０ｐｇ、１ｐｇおよび０．１ｐｇ試料（約１７．５、２１、２４．５、２７．５および３１のＣＴ）に相当する。理論に制約されることは望まないが、４種の鋳型なし対照試料のＣＴ３６前後の増幅シグナルは、商業的に入手できる酵素における残渣細菌ポリヌクレオチドに起因し得る可能性がある。にもかかわらず、プライマーおよびプローブのこの組合せによる特異的増幅シグナルは、検出の６−ｌｏｇ範囲をもたらし、０．１ｐｇの出発鋳型は、陰性対照からのシグナルよりも、少なくとも５回前の完全サイクルで検出された。実際に、図２に示す通り、この範囲にわたる検出は、線形であり（この範囲にわたる約０．９９９のＲ２および約９５．５の増幅効率）、したがって、未知試料における出発材料の量の定量化に使用することができる。
【００９３】
同様の一連の増幅反応において、比較のための１０ｐｇのＥ．ｃｏｌｉおよび鋳型なし対照（ＮＴＣ）と並行して、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｍｕ３（メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓとしても公知）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する１００ｐｇのＤＮＡを全て２連で増幅および検出するために、このセットのプライマーおよびプローブを検査した。検査された細菌が、グラム陽性およびグラム陰性細菌の両方を含むことが注記されている。リアルタイム増幅結果を表４に示す（「ＥＰ」は終点を指す）。
【００９４】
【表４】
2019187431.tif 000028
【００９５】
さらに別の一連の増幅反応において、鋳型なし対照（ＮＴＣ）と比較して、Staphylococcus  aureus  Mu3、Staphylococcus  aureus、Staphylococcus  epidermidis、Streptococcus  agalactiae、Streptococcus  pyogenes、Streptococcus  pneumoniae、Citrobacter  koseri、Clostridium  perfringens、Enterococcus  faecalis、Klebsiella  pneumoniae、Lactobacillus  acidophilus、Listeria  monocytogenes、Propionibacterium  granulosum、Pseudomonas  aeruginosa、Serratia  marcescensおよびEscherichia  coliに由来する１ｐｇまたは１０ｐｇのＤＮＡ（表示の通り）を増幅および検出するために、同じセットのプライマーおよびプローブの感度を検査した。リアルタイム増幅結果を表５Ａに示す（アステリスクは、平均および標準偏差（ＳＤ）の計算から除外される異常値を表示する；「反応」は、「ｒｘｎ」と省略）。
【００９６】
【表５Ａ−１】
2019187431.tif 000029
【表５Ａ−２】
2019187431.tif 000030
【表５Ａ−３】
2019187431.tif 000031
【表５Ａ−４】
2019187431.tif 000032
【００９７】
同様の反応を調製して、鋳型としてＢ．ｃｅｒｅｕｓ由来のＤＮＡ（１００ｐｇ）の増幅を検査し、比較のためにＥ．ｃｏｌｉ鋳型（１００ｐｇ）および鋳型なし対照の別々の反応も調製した。リアルタイム増幅結果を表５Ｂに示す。
【００９８】
【表５Ｂ】
2019187431.tif 000033
【００９９】
（実施例２）
プローブおよびプライマーセットの比較
下に示す３種のプライマーセットのうち１種および相当するプローブ（複数可）を使用して、実施例１と同様に、１００ｐｇのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、１００ｐｇのＥ．ｃｏｌｉまたは鋳型なし対照（ＮＴＣ）に対し、リアルタイムＰＣＲ反応を調製した。プライマーセット１は、配列、配列番号４を有するフォワードプライマーおよび一方が配列、配列番号５を有し、他方が配列、配列番号６を有する２種のリバースプライマーからなった。それぞれ異なるレポーターとの関連に基づき非依存的に検出される、配列番号１１〜１３の配列を有する３種のプローブの混合物により、プライマーセット１の増幅産物を検出した。プライマーセット１プローブを設計して、広範囲の細菌をまとめて検出した。例えば、配列番号１２を設計して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＥ．ｃｏｌｉ以外の種を検出した。プライマーセット１増幅反応毎の最終試薬濃度は次の通りであった：１×Ｔａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＩＩ；５００ｎＭの各プライマー；および５００ｎｍの各プローブ。プライマーセット２は、配列、配列番号７を有するプライマーおよび配列、配列番号８を有するプライマーからなった。それぞれ異なるレポーターとの関連に基づき非依存的に検出される、配列、配列番号１４〜１５を有する２種のプローブの混合物により、プライマーセット２の増幅産物を検出した。プライマーセット２プローブを設計して、広範囲の細菌をまとめて検出し、配列番号１４を設計して、複数のグラム陰性細菌を（排他的にではないが）検出し、配列番号１５を設計して、複数のグラム陽性細菌を（排他的にであるが）検出した。プライマーセット２増幅反応毎の最終試薬濃度は次の通りであった：１×Ｔａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＩＩ；５００ｎＭの各プライマー；および５００ｎｍの各プローブ。プライマーセット３は、実施例１に詳述されるプライマー対からなり、配列、配列番号１６を有するプローブによりその増幅産物を検出した。プライマーセット３プローブを設計して、複数の細菌を検出した。プライマーセット３増幅反応毎の最終試薬濃度は次の通りであった：１×Ｔａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＩＩ；５００ｎＭの各プライマー；５００ｎｍのプローブ。ＴａｑＭａｎキットのメーカー推奨（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に従ってＰＣＲ増幅を行った。鋳型毎に２連で各増幅を行い、各（ＣＴ１およびＣＴ２）ＣＴを表６に示す。表６に示す通り、複数のプローブは、実施例１に記載されているプローブ−プライマーセットのために得られる結果と同様の結果を生じた。プローブ配列番号１２の結果は、これを設計した元の配列に基づき予想される通りであった。配列番号１４〜１５の結果は、これらを設計した元の配列に基づき予想される通りであった。例えば、配列番号１４は、グラム陰性細菌であるＥ．ｃｏｌｉの早いＣＴを産生した。また、配列番号１５は、グラム陽性細菌であるＳ．ａｕｒｅｕｓの最も早いＣＴを産生したが、より後のＣＴであったがＥ．ｃｏｌｉを検出することもできた。
【０１００】
【表６】
2019187431.tif 000034
【０１０１】
（実施例３）
シミュレートされた血小板試料  −  ヒトＤＮＡからのシグナルなし
血小板試料等、患者試料から抽出されたＤＮＡは、ヒトゲノムＤＮＡを典型的に含むであろう。したがって、ヒトゲノムＤＮＡの存在下の増幅反応において、プライマーおよびプローブの試料セットを検査した。同じプライマーおよびプローブを含む、実施例１の通りにリアルタイムＰＣＲ反応を調製した。しかし、細菌ＤＮＡの代わりに、増幅反応は、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡまたは鋳型なし対照としての水を含み、両者共に２連であった。ヒトＤＮＡおよび鋳型なし対照のリアルタイムＰＣＲ増幅の結果の図示をそれぞれ図３Ａおよび図３Ｂに示す。サイクル３９前後までヒトＤＮＡ試料の増幅シグナルは得られず（ＦＡＭ）、このプライマーおよびプローブが、細菌配列に特異的であり、ヒトＤＮＡを含有する混合試料における配列を特異的に増幅することを示す。さらに、ヒトＤＮＡ試料の終点シグナル強度は、鋳型なし対照よりも実際に低く、試料におけるヒトＤＮＡが、後期サイクルにおいて潜在的に非特異的な増幅産物の生成を実際に低下し得ることを示唆する。
【０１０２】
（実施例４）
プローブセット比較
実施例１〜３は、本開示に従ったプライマーおよびプローブの細菌ポリヌクレオチド検出の特異性および感度を実証する。本実施例において、実施例１に記載されているプライマーおよびプローブ（まとめて「セット３」）の感度を、Liuら（Chin.  J.  Blood  Transfusion、２００８年９月、２１巻、９号）およびNadkarniら（Microbiology（２００２年）、１４８巻、２５７〜２６６頁）に記載されているプライマーおよびプローブと比較した。ＬｉｕおよびＮａｄｋａｒｎｉは、配列、配列番号１７（ＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ）および配列番号１８（ＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴ）を有するプライマーを使用して、配列、配列番号１９（ＣＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣ）を有するプローブにより検出される細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡの４６６ｂｐ領域を増幅することについて記載し、これらをまとめて「Ｌｉｕセット」とする。Ｎａｄｋａｒｎｉは、複数の細菌にわたり十分に保存された相当するプライマーおよびプローブ標的配列を有するアンプリコンを同定できないため、この大型のアンプリコンの手動選択について記載する。第１の比較において、１００ｐｇのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、１００ｐｇのＥ．ｃｏｌｉまたは鋳型なし対照（ＮＴＣ）のリアルタイムＰＣＲ増幅に関する検出効率を比較する。１００ｐｇのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの増幅および検出の結果を図表により図４Ａに図解し、上にセット３、下にＬｉｕセットの結果を示す。１００ｐｇのＥ．ｃｏｌｉの増幅および検出の結果を図表により図４Ｂに図解し、上にセット３、下にＬｉｕセットの結果を示す。本図は、セット３を使用した検出が、一貫し、頑強であることを図解する。Ｌｉｕセットによる１００ｐｇの検出であってもより弱く、より後のＣＴに起こる。
【０１０３】
第２の比較は、より少量の標的ＤＮＡを使用して、Ｌｉｕセットに対するセット３の比較のための上述の条件を反復した。この第２の比較において、１０ｐｇのみのＥ  ｃｏｌｉ  ＤＮＡが反応に含まれ、鋳型なし対照反応と並行して実行した。各反応条件を２連で実行した。リアルタイム増幅結果を表７に示す。
【０１０４】
【表７】
2019187431.tif 000035
【０１０５】
表７の第２の比較における結果は、Ｌｉｕセットが、鋳型なし対照から１０ｐｇの細菌ＤＮＡを鑑別するために十分に高感度ではなく、したがって、斯かる低レベルにおける汚染の検出に不適切であることを図解する。対照的に、セット３を使用した１０ｐｇのＤＮＡのＣＴは、鋳型なし対照よりも約７サイクル早く、細菌ＤＮＡに対する実質的に増加した感度を示す。理論に制約されることは望まないが、セット３のためのアンプリコン内のより短いアンプリコン（セット３のための約１４３ｂｐ、配列番号３に相当；Ｌｉｕセットのための約４６６ｂｐと比較して）および／またはより低い可変性が、アッセイの感度を改善した可能性がある。Ｌｉｕセットのより低い感度に寄与する可能性のある他の因子は、配列番号１７プライマー（図６Ａ）の相対的に安定的なホモ二量体形成、ならびにこのプライマーおよび配列番号１９プローブ（図６Ｂ）の間のハイブリダイゼーションを含む。プライマー−プライマーおよびプライマー−プローブハイブリダイゼーションを評価するために、デフォルト設定（標的型−ＤＮＡ；オリゴ濃度−０．２５μＭ；Ｎａ＋濃度−５０ｍＭ；Ｍｇ＋＋濃度−０ｍＭ；ｄＮＴＰ濃度−０ｍＭ）を使用したＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ  ３．１（www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/）を使
用して二量体形成を検査した。Ｎａｄｋａｒｎｉの結果を考慮すると、１６Ｓ  ｒＲＮＡ標的配列に対するプライマーおよびプローブが、複数の細菌種および属にわたる斯かる感度および特異性をもたらし得ることは、驚くべきかつ予想外の両方であった。
【０１０６】
（実施例４）
異なるクエンチャーの効果
実施例４において使用される反応条件およびＬｉｕにおいて使用される反応条件は匹敵したため、異なるクエンチャーの使用から可能な効果を検査した。実施例３におけるセット３プローブは、Ｚｅｎ（商標）内部クエンチャー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）を使用したが、Ｌｉｕセットプローブは、Ｌｉｕらにより使用された本来のポジションである、３’末端Ｉｏｗａ  ＢｌａｃｋＲクエンチャー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）を使用した。異なるクエンチャーの効果を検査するために、セット３プライマーおよび相当するＦＡＭ標識プローブと、Ｚｅｎクエンチャーまたは３’末端Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋクエンチャーのいずれかを使用して、実施例１の通りにリアルタイムＰＣＲ反応を調製した。下に示す通り、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡの量の範囲の検出に関して、これらのプライマー−プローブ組合せを検査した。鋳型毎の反応を２連で調製した。リアルタイム増幅結果を表８に示す。クエンチャーにわたり匹敵する結果によって示される通り、使用されるクエンチャーの差は、感度の差を説明しない。
【０１０７】
【表８】
2019187431.tif 000036
【０１０８】
（実施例５）
血小板試料におけるＳ．ｓｉｍｕｌａｎｓの検出
ＡＴＣＣ栄養ブロスにおいて３７℃で一晩、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓを培養した。培養物を純水で希釈し、栄養寒天プレートにプレーティングし、コロニー形成単位（ｃｆｕ）の濃度を決定するために、３７℃インキュベーション一晩の後に生きているコロニーを計数した。Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓ培養物を力価測定（titrate）し、５μＬの純水において正規化して、１０００００、１００００、１０００、１００、５０、２５または０ｃｆｕを有する５μＬ試料を産生した。０ｃｆｕ試料は水のみであり、陰性対照として使用した。次に、これらの５μＬ細菌試料のそれぞれを、６日前にアフェレーシスにより採取された１９５μＬのサルベージされたヒト血小板に加えた。これらに有効なｃｆｕ／ｍＬは、それぞれ５０００００、５００００、５０００、５００、２５０、１２５および０であった。ＧｅｎｅＪＥＴゲノムＤＮＡ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、２００μＬ試料からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡを４５μＬ溶出バッファーに溶出させた。反応当たりのｃｆｕの数が、それぞれ約３１２５０、３１２５、３１２．５、３１．３、１５．６、７．６および０となるように、実施例１と同様のプローブおよびプライマーならびにおよそ１４ｕＬの各溶出物を使用して、３０サイクル、リアルタイムＰＣＲ反応を３連で調製および実行した。反応は、ＧｏＴａｑ  ＭＤｘ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）も含有し、Ｓｔｅｐ  Ｏｎｅ  ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲ機械（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行われた。得られた増幅曲線のグラフを図７Ａに示し、ｘ軸に沿った各四角は、２サイクルを表す。曲線の群は、左から右に、３１２５０、３１２５０、３１２５、３１２．５、３１．３および１５．６に相当し、７．６および０は右端である。よって、本実験の検出限界は、少なくとも１５．６ｃｆｕまで下がり、平均ＣＴは約２６．９である。図７Ａは、これらの条件下における定量的直線性を図表により図解する。反応当たり３１２５０、３１２５０、３１２５、３１２．５、３１．３、１５．６、７．６および０ｃｆｕのための別々の増幅曲線をそれぞれ図８Ａ〜図８Ｇに図解する。リアルタイム増幅結果は、表９にも要約されている。Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓ力価測定の結果は、ＤＮＡスパイクイン手順を使用した上述の実施例において得られる結果と同様であった。ＰＣＲ増幅効率は高く、非特異的増幅結果は観察されなかった。
【０１０９】
【表９−１】
2019187431.tif 000037
【表９−２】
2019187431.tif 000038
【０１１０】
（実施例６）
血小板試料における複数の異なる生きている細菌の検出
表１０に収載されている１８種の細菌種のために細菌試料を調製し、実施例５と同様にサルベージされた血小板と組み合わせた。表１０における細菌１〜１２を含有する試料のため、また、１２種の血小板のみ試料のため、Ｍａｘｗｅｌｌ  １６  ＭＤｘ機器（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＭａｘｗｅｌｌ  １６  ＬＥＶ血液ＤＮＡキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＤＮＡを抽出した。表１０における細菌１３〜１８を含有する試料のため、また、６種の血小板のみ試料のため、ＧｅｎｅＪＥＴゲノムＤＮＡ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＤＮＡを手動で抽出した。３０サイクル、リアルタイムＰＣＲ反応を３連で調製し、実施例５と同様に実行した（実施例１と同様のプローブおよびプライマーを使用）。反応当たりのｃｆｕ数を含む結果を表１１に示す。合計７２種の血小板試料を検査した。細菌を含有する全試料のため、陽性シグナルを検出したが、血小板のみ対照の陽性シグナルは検出されなかった。よって、このアッセイは、これらの複合混合物条件下で１００  高感度かつ１００  特異的であった。
【０１１１】
【表１０】
2019187431.tif 000039
【０１１２】
【表１１−１】
2019187431.tif 000040
【表１１−２】
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【表１１−３】
2019187431.tif 000042
【０１１３】
（実施例７）
全血およびバフィーコートにおける生きている細菌による汚染の検出
サルベージされた全血およびバフィーコート試料を、スタンフォード血液センター（Stanford  Blood  Center）から得た。試料に、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌（実施例５と同様）またはＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡのいずれかをスパイクした。ＤＮｅａｓｙ血液＆組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、スパイクした試料からＤＮＡを抽出した。反応当たり１０４ｃｆｕまたは反応当たり１０ｐｇ細菌ＤＮＡのいずれかにより、実施例１と同様のプローブおよびプライマーを使用して、４０サイクル、リアルタイムＰＣＲ反応を３連で調製および実行した。Ｓｔｅｐ  Ｏｎｅ  ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲ機械（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、実施例５と同様に（実施例１と同様のプローブおよびプライマーを使用）リアルタイムＰＣＲを行った。スパイクした全血試料およびスパイクしたバフィーコート試料の結果をそれぞれ表１２および１３に示す。このような低レベルであっても汚染を検出し、敗血症の早期検出のためにこの方法を使用することができることを示す。
【表１２】
2019187431.tif 000043
【表１３】
2019187431.tif 000044
【０１１４】
（実施例８）
血小板試料におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＤＮＡのＤＮＡ力価測定および検出
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｍｕ３ゲノムＤＮＡをＡＴＣＣから得た（品目番号７００６９８Ｄ−５）。ＤＮＡを力価測定し、５μＬ純水において正規化して、１００００．０ｐｇ、３３３３．３ｐｇ、１１１１．１ｐｇ、３７０．４ｐｇ、１２３．５ｐｇまたは０ｐｇ細菌ＤＮＡを有する５μＬ試料を産生した。０ｐｇ試料は、水のみであり、陰性対照として使用した。次に、このような５μＬ細菌ＤＮＡ試料のそれぞれを、１０日前にアフェレーシスによって採取した２００μＬのサルベージされたヒト血小板に加えた。これらの試料に有効なｐｇ／ｍＬは、それぞれ４８７８０．５、１６２６０．２、５４２０．１、１８０６．７、６０２．２および０であった。Ｍａｘｗｅｌｌ  １６  ＭＤｘ機器（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＭａｘｗｅｌｌ  １６  ＬＥＶ血液ＤＮＡキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した自動手順により、これらの２０５μＬ試料からＤＮＡを抽出した。３０サイクル、リアルタイムＰＣＲ反応を３連で調製し（陰性対照に対し６複製物）、実施例５と同様に実行した（実施例１と同様のプローブおよびプライマーを使用）。各反応は、反応当たりそれぞれおよそ４００ｐｇ、１３３．３ｐｇ、４４．４ｐｇ、１４．８ｐｇ、４．９ｐｇおよび０ｐｇの出発ＤＮＡを表す（１００効率的な回収を仮定）、２μＬのＤＮＡ抽出溶出液（合計５０μＬから）を含有した。得られた増幅曲線のグラフを図９に示し、ｘ軸に沿った各四角は、２サイクルを表す。曲線の群は、左から右に、４００ｐｇ、１３３．３ｐｇ、４４．４ｐｇ、１４．８ｐｇ、４．９ｐｇおよび０ｐｇを含有する反応に相当する。定量的結果を表１４に要約する。血小板試料における細菌ＤＮＡ力価測定に関して得られた結果は、バッファーにおける希釈に関して得られた結果（実施例１における等）と同様であった。検出の感度は高く、試料のＣＴ約２７．５における陽性検出シグナルは、約４．９ｐｇまたはそれに満たない出発材料を表す。６種の陰性対照試料のいずれに対しても陽性シグナルが検出されなかったことから、特異性も高かった。自動抽出が、手順上の汚染から生じる偽陽性を最小化させるであろうことが予想される。
【表１４−１】
2019187431.tif 000045
【表１４−２】
2019187431.tif 000046
【０１１５】
（実施例９）
対象プライマーおよびＤＮＡ結合剤を使用した細菌汚染の検出
２５０ｐｇのＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｍｕ３  ＤＮＡ（ＡＴＣＣ７００６９８Ｄ−５）、配列番号５１および５２のプライマー対、ならびにＤＮＡ結合色素（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ）をＦａｓｔ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＡＢ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に提供される他の試薬と共に含有する反応混合物を使用して、リアルタイムＰＣＲを行った。図１０Ａは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＤＮＡの指数関数的増幅を示すリアルタイム増幅プロットを描写する。結果は、３連の実験を表す。次に、得られたＰＲＣ反応を融解曲線解析に供する。図１０Ｂは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＤＮＡの特異的増幅を示すことが予想される温度における単一のピークを描写する。本実験は、対象プライマー対が、増幅された細菌核酸の色素に基づく検出に受け入れられることを実証する。
【０１１６】
（実施例１０）
対象プライマーを使用した多くの異なる種類の細菌株の検出
生物試料における汚染源として一般的に見出される２０数種の細菌株由来のいずれかの種類の細菌を検出することができる多くのプライマー対が本明細書に開示されている。特に、表２および表３に記載されているプライマーおよびプローブを全て検査したところ、本明細書に開示されているまたは当技術分野において公知の方法を利用して、表１における１種または複数種の標的細菌配列を特異的に増幅することができることを示した。加えて、表１５は、上述の実施例に開示されている方法を使用して、収載されている細菌株を特異的に増幅することができる有効なプライマーであることが検査されたおよび／または配列相同性により示された配列の例示的な対形成を収載する。特に、２種のプライマー（配列番号９および１０）を含有するプライマーセット３が検査され、単一の増幅反応において、Staphylococcus  aureus、Staphylococcus  aureus  Mu3;  Staphylococcus  epidermidis、Streptococcus  agalactiae、Streptococcus  pyogenes、Streptococcus  pneumonia、Escherichia  coli、Citrobacter  koseri、Clostridium  perfringens、Enterococcus  faecalis、Klebsiella  pneumonia、Lactobacillus  acidophilus、Listeria  monocytogenes、Propionibacterium  granulosum、Pseudomonas  aeruginosa、Serratia  marcescens、Bacillus  cereus、Staphylococcus  aureus  Mu50、Yersinia  enterocolitica、Staphylococcus  simulans、Micrococcus  luteusおよびEnterobacter  aerogenesを網羅する２０数種の細菌株を特異的に増幅し、したがって検出することを実証した。
【０１１７】
このプライマーセットにおける他の配列番号（即ち、配列番号４７および４８）は、単一の反応における上述の細菌株の増幅に要求されないという点において、必要に応じてである。配列番号４７および／または配列番号４８は、配列番号９および１０と共に同じ反応混合物において使用される場合、増幅感度を増加させ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．の検出を増強することができる。
【０１１８】
同様に、プライマーセット１〜２および４〜２５はそれぞれ、収載された細菌株を増幅することができることが検査されたおよび／または配列相同性により示された。「含まれる」と注記されたプライマーは、段「細菌標的適用範囲」の下に収載された、収載された細菌株の保存された領域に対する少なくとも８５、９０または９５の配列相同性を示す。「必要に応じて」と命名されたプライマーは、「含まれる」プライマーの１種または複数種と共に使用される場合、収載された細菌ゲノムのより特異的な増幅をもたらすことが検査されたおよび／または配列相同性により予測された。「必要に応じて」の配列は典型的に、最適にアラインメントされた場合、標的細菌ゲノムと少なくとも９９または１００の配列相同性を示す。この一連の知見は、これらのプライマーセットが特異的であると共に、生物試料において一般的に生じる広範囲の細菌株を網羅できるため、これらのプライマーセットの技術的利点を実証する。
【０１１９】
本発明の好まれる実施形態を本明細書に示し、記載してきたが、当業者であれば、斯かる実施形態が単なる一例として示されていることは明らかであろう。そこで、本発明から逸脱することなく、多数の変種、変更および置換が当業者に想定されるであろう。本発明の実施において、本明細書に記載されている本発明の実施形態の様々な代替物を用いることができることを理解されたい。次の特許請求の範囲が、本発明の範囲を規定し、このような特許請求の範囲内の方法および構造ならびにこれらの均等物が、これによって網羅されていることが企図される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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