(57)【要約】【課題】本発明は、免疫応答に関与するタンパク質を調節するための方法及び組成物に関する。本発明はさらに、このようなタンパク質の発現及び活性を調節することによる自己免疫疾患及び癌の治療のための方法及び組成物を提供する。【解決手段】本発明は、一態様において、癌の治療のための方法を提供し、当該方法は、癌の治療を必要とする対象へ、医薬有効量の（ｉ）少なくとも１つの免疫確認箇所阻害薬及び（ｉｉ）Ｔｏｓｏ活性の阻害薬からなる組み合わせを投与することを含む。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療を必要とする対象へ、医薬有効量の（ｉ）少なくとも１つの免疫確認箇所阻害薬及び（ｉｉ）Ｔｏｓｏ活性阻害薬の組み合わせを投与することを含む、癌の治療方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの免疫確認箇所阻害薬は、ＰＤ−１阻害薬、ＣＴＬＡ−４阻害薬、ＬＡＧ３阻害薬、及びＴＩＭ３阻害薬からなる群から選択されるメンバーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｔｏｓｏ活性阻害薬は、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質である、請求項１〜２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｔｏｓｏ活性阻害薬は、Ｔｏｓｏに対する抗体である、請求項１〜２に記載の方法。
【請求項５】
前記組み合わせは、ＰＤ−１阻害薬、ＣＴＬＡ−４阻害薬、及び可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を含む、請求項１〜２に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＤ−１阻害薬は抗ＰＤ−１抗体であり、かつ前記ＣＴＬＡ−４阻害薬は抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
腫瘍を可溶性Ｔｏｓｏタンパク質で治療することを含む、前記腫瘍における浸潤リンパ球のレベルの亢進方法であって、前記治療から結果として生じる浸潤リンパ球のレベルは、治療を有さないレベルよりも高い、前記方法。
【請求項８】
前記浸潤リンパ球は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ８＋細胞、またはＣＤ３＋細胞及びＣＤ８＋細胞の組み合わせを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記方法はさらに、ＰＤ−１阻害薬、ＣＴＬＡ−４阻害薬、及びＰＤＬ−１阻害薬から選択されるメンバーの１つ以上を用いて前記腫瘍を治療することを含む、請求項７〜８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｔｏｓｏの発現及び／または活性を低下させることを含む、前記免疫応答の減弱方法。
【請求項１１】
ＩｇＭの発現及び／または活性を亢進させることをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＰＡＭＰ及び／またはＤＡＭＰの発現及び／または活性を低下させることをさらに含む、請求項１０〜１１に記載の方法。
【請求項１３】
以下の工程、
（ａ）Ｔｏｓｏの発現及び／または活性を低下させること、
（ｂ）ＩｇＭの発現及び／または活性を亢進させること、ならびに
（ｃ）ＰＡＭＰ及び／またはＤＡＭＰの発現及び／または活性を低下させること
の１つ以上を含む、自己免疫疾患の治療方法。
【請求項１４】
Ｔｏｓｏの発現及び／または活性を亢進させることを含む、前記免疫応答の誘導方法。
【請求項１５】
ＩｇＭの発現及び／または活性を低下させることをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＡＭＰ及び／またはＤＡＭＰの発現及び／または活性を亢進させることをさらに含む、請求項１４〜１５に記載の方法。
【請求項１７】
スクランブラーゼタンパク質の活性を調節することをさらに含む、請求項１４〜１８に記載の方法。
【請求項１８】
以下の工程、
（ａ）Ｔｏｓｏの発現及び／または活性を亢進させること、
（ｂ）ＩｇＭの発現及び／または活性を低下させること、
（ｃ）ＰＡＭＰ及び／またはＤＡＭＰの発現及び／または活性を亢進させること、
（ｄ）スクランブラーゼタンパク質の活性を調節すること
の１つ以上を含む、癌の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、その内容が全体としてすべての目的のために参照により本明細書に明確に組み込まれる２０１４年３月７日出願の米国仮出願第６１／９４９，９２７号に対する優先権の利益を請求する。
【背景技術】
【０００２】
免疫応答の調整は、自己免疫疾患または癌の治療において使用することができる。免疫応答の駆動因子を下方制御することによって、自己免疫疾患の症状は寛解しまたは完全に抑止することができる。免疫応答の駆動因子の操作は、癌細胞を攻撃するよう身体自体の免疫系を誘導することによって癌を治療するためにも使用してもよい。
【０００３】
自己免疫疾患及び癌の両方に対する治療薬についての標的を識別するために、免疫応答における異なる経路を特徴づける必要性がある。
【発明の概要】
【０００４】
したがって、本発明は、炎症応答を減弱させ、それにより自己免疫疾患を治療するため、または癌細胞を攻撃するために身体自体の免疫系を誘導するためのいずれかで、免疫応答を調節するための方法及び組成物を提供する。
【０００５】
一態様において、本発明は、癌の治療のための方法を提供し、当該方法は、癌の治療を必要とする対象へ、医薬有効量の（ｉ）少なくとも１つの免疫確認箇所阻害薬及び（ｉｉ）Ｔｏｓｏ活性の阻害薬からなる組み合わせを投与することを含む。例示的な実施形態において、当該少なくとも１つの免疫確認箇所阻害薬は、ＰＤ−１阻害薬、ＣＴＬＡ−４阻害薬、ＬＡＧ３阻害薬、及びＴＩＭ３阻害薬からなる群から選択されるメンバーである。
【０００６】
さらなる実施形態において及び上記にしたがって、Ｔｏｓｏ活性の阻害薬は、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質またはＴｏｓｏに対する抗体である。
【０００７】
なおもさらなる実施形態において及び上記のうちのいずれかにしたがって、癌治療のための併用療法は、ＰＤ−１阻害薬、ＣＴＬＡ−４阻害薬、及び可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を含む。さらにさらなる実施形態において、当該ＰＤ−１阻害薬は抗ＰＤ−１抗体であり、当該ＣＴＬＡ−４阻害薬は抗ＣＴＬＡ−４抗体である。
【０００８】
一態様において、本発明は、腫瘍における浸潤リンパ球のレベルの亢進方法を提供し、当該方法は、腫瘍を可溶性Ｔｏｓｏタンパク質で治療することを含み、この中で、当該治療することから結果として生じる浸潤リンパ球のレベルは、当該治療することを有さないレベルよりも高い。一実施形態において、当該浸潤リンパ球は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ８＋細胞、またはＣＤ３＋細胞及びＣＤ８＋細胞からなる組み合わせを含む。さらなる実施形態において、当該方法はさらに、ＰＤ−１阻害薬、ＣＴＬＡ−４阻害薬、及びＰＤＬ−１阻害薬から選択されるメンバーの１つ以上を用いて当該腫瘍を治療することを含む。
【０００９】
一態様において、本発明は、免疫応答の減衰方法を提供し、本方法は、Ｔｏｓｏの発現及び／または活性を低下させることを含む。一実施形態において、当該免疫応答の減衰方法はさらに、ＩｇＭの発現及び／または活性を亢進させることを含む。さらなる実施形態において、当該方法はさらに、ＰＡＭＰ及び／またはＤＡＭＰの発現及び／または活性を低下させることを含む。
【００１０】
一態様において、本発明は、自己免疫疾患の治療方法を提供し、当該方法はさらに、次の工程、すなわち（ａ）Ｔｏｓｏの発現及び／または活性を低下させること、（ｂ）ＩｇＭの発現及び／または活性を亢進させること、及び（ｃ）ＰＡＭＰ及び／またはＤＡＭＰの発現及び／または活性を低下させることのうちの１つ以上を含む。
【００１１】
一態様において、本発明は、免疫応答の誘導方法を提供し、当該方法は、Ｔｏｓｏの発現及び／または活性を亢進させることを含む。一実施形態において、当該方法はさらに、ＩｇＭの発現及び／または活性を低下させることを含む。さらなる実施形態において、当該方法はさらに、ＰＡＭＰ及び／またはＤＡＭＰの発現及び／または活性を亢進させることを含む。なおもさらなる実施形態において、当該方法はさらに、スクランブラーゼタンパク質の活性を調節することを含む。
【００１２】
一態様において、本発明は、癌の治療方法を提供し、当該方法は、次の工程、すなわち（ａ）Ｔｏｓｏの発現及び／または活性を亢進させること、（ｂ）ＩｇＭの発現及び／または活性を低下させること、（ｃ）ＰＡＭＰ及び／またはＤＡＭＰの発現及び／または活性を亢進させること、ならびに（ｄ）スクランブラーゼタンパク質の活性を調節することのうちの１つ以上を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】本明細書に説明する配列を提供する。
【図１−２】本明細書に説明する配列を提供する。
【図１−３】本明細書に説明する配列を提供する。
【図１−４】本明細書に説明する配列を提供する。
【図１−５】本明細書に説明する配列を提供する。
【図１−６】本明細書に説明する配列を提供する。
【図１−７】本明細書に説明する配列を提供する。
【図１−８】本明細書に説明する配列を提供する。
【図１−９】本明細書に説明する配列を提供する。
【図１−１０】本明細書に説明する配列を提供する。
【図１−１１】本明細書に説明する配列を提供する。
【図１−１２】本明細書に説明する配列を提供する。
【図１−１３】本明細書に説明する配列を提供する。
【図１−１４】本明細書に説明する配列を提供する。
【図１−１５】本明細書に説明する配列を提供する。
【図１−１６】本明細書に説明する配列を提供する。
【図１−１７】本明細書に説明する配列を提供する。
【図１−１８】本明細書に説明する配列を提供する。
【図１−１９】本明細書に説明する配列を提供する。
【図１−２０】本明細書に説明する配列を提供する。
【図２】Ｔｏｓｏタンパク質のトランケーション変異体の実施形態を図示する。
【図３】本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質の効果に関するＢ細胞増殖試験からのデータを示す。
【図４】本発明の可溶性及び全長Ｔｏｓｏタンパク質の効果に関するＢ細胞増殖試験からのデータを示す。
【図５】可溶性ｈＴｏｓｏの切り詰めた形態を用いたＢ細胞増殖アッセイからのデータを示す。
【図６】ＩｇＭ結合アッセイからのデータを示す。
【図７】ＩｇＭ結合アッセイからのデータを示す。
【図８】慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞増殖のインビトロアッセイからのデータを示す。
【図９】対照と比較した場合の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を用いた治療における腫瘍面積に関する試験からのデータを示す。
【図１０】可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を用いて治療したマウスにおける試験からの生存データを示す。
【図１１】可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を用いた治療の後の腫瘍におけるリンパ球浸潤試験からのデータを示す。
【図１２】可溶性Ｔｏｓｏタンパク質及び抗ＰＤ−１抗体の両方を含む併用療法の試験からのデータを示す。
【図１３】可溶性Ｔｏｓｏタンパク質及び抗ＰＤ−１抗体の両方を含む併用療法の試験からのデータを示す。
【図１４】可溶性Ｔｏｓｏタンパク質及び抗ＣＴＬＡ−４抗体の両方を含む併用療法の試験からのデータを示す。
【図１５】可溶性Ｔｏｓｏタンパク質、抗ＰＤ−１抗体及び抗ＣＴＬＡ−４抗体を含む併用療法の試験からのデータを示す。
【図１６】可溶性Ｔｏｓｏタンパク質、抗ＰＤ−１抗体及び抗ＣＴＬＡ−４抗体を含む併用療法の試験からのデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の実施は、別段の記載がない限り、有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学、及び免疫学に関する従来の技術および説明を採用し得、これらは当該技術分野の技術内にある。このような従来技術には、ポリマーアレイ合成、ハイブリッド形成、ライゲーション、ファージディスプレイ、及び標識を用いたハイブリッド形成の検出を含む。適切な技術の具体的な説明は、後述の本明細書における実施例に対する参照によりなすことができる。しかしながら、他の等価の従来の手順ももちろん使用することができる。このような従来の技術および説明は、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ（第Ｉ〜ＩＶ巻）、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（すべてＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに由来）、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版）Ｆｒｅｅｍａｎ，ニューヨーク、Ｇａｉｔ，“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”１９８４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，ロンドン、Ｎｅｌｓｏｎ及びＣｏｘ（２０００），Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  第３版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．，ニューヨーク州ニューヨーク市ならびにＢｅｒｇら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第５版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．，ニューヨーク州ニューヨーク市のような標準的な実験マニュアルにおいて認めることができ、これらのすべては全体として、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【００１５】
本明細書において及び添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈が別段に明確に記さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ポリメラーゼ」に対する参照は、ある作用因子または当該作用因子からなる混合物を指し、「当該（または前記）方法」に対する参照には、当業者などに公知の等価の工程及び方法に対する参照を含む。
【００１６】
別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はすべて、本発明の属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載する公開物はすべて、当該公開物において説明する、及び現に説明する本発明とともに使用され得る装置、組成物、処方及び方法論を説明及び開示する目的のための参照により本明細書に組み込まれる。
【００１７】
ある範囲の値を提供する場合、文脈が別段に明確に記載しない限り、当該範囲の上限値と下限値の間にある下限値の単位の１０分の１までの各介入値、または当該記載した範囲における任意の他の記載値または介入値が本発明内に包含されることは理解される。これらのより小さな範囲の上限値及び下限値は独立して、記載した範囲における任意の具体的な除外限界値に対して供される本発明内に包含されるより小さな範囲に含まれることがある。記載した範囲が当該限界値のうちの１つまたは両方を含む場合、当該含まれる限界値のいずれか両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
【００１８】
以下の説明において、数多くの具体的な詳細は、本発明のより完全な理解を提供するよう明らかにされている。しかしながら、本発明が、これらの具体的な詳細の１つ以上を有することなく実施され得ることは当業者に明らかである。他の場合において、当業者に周知の、周知の特長及び手順は、本発明を不明瞭にすることを回避するために説明されていない。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（を含む）」という用語は、当該組成物及び方法に、引用した要素を含むがその他のものを除外するのではないことを意味するよう企図されている。「Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（から本質的になる）」は、組成物及び方法を定義するために使用する場合、当該組成物または方法に対する任意の必須の有意性に関する他の要素を排除することを意味することになっている。「Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（からなる）」は、請求する組成物及び実質的な方法工程についての他の成分の微量を超える要素を除外することを意味することになっている。これらの接続用語の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。したがって、当該方法及び組成物には、追加の工程及び構成要素を含むことができる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、またはそれに代わるものとして、有意性のない工程及び組成物を含む（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）またはそれに代わるものとして、記載した方法工程若しくは組成物のみを企図する（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）を含むことができることが企図される。
【００２０】
数的指定、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、及び分子量（複数の範囲を含む）はすべて、０．１の増分だけ（＋）または（−）に変化する近似値である。常に明白に記載されているとは限らないが、数的指定がすべて用語「約」によって先行されることは理解されることになっている。用語「約」には、「Ｘ＋０．１」または「Ｘ−０．１」のような「Ｘ」のわずかな増分に加えて、実際の値「Ｘ」も含む。常に明白に記載されているとは限らないが、本明細書に説明する試薬が単に例示的であり、かつこのようなものの等価物が当該技術分野で公知であることも理解されることになっている。
【００２１】
「組成物」には、作用因子または化合物を含む任意の物質を含んでもよく、作用因子または化合物及び他の物質（担体を含む）からなる任意の組み合わせ、例えば、不活性の（例えば、検出可能な作用因子若しくは標識）あるいはアジュバント、希釈剤、結合剤、安定化剤、緩衝剤、塩類、親油性溶媒、保存料、アジュバントまたはこれらに類するもののような活性のある化合物あるいは組成物を包含するようにも企図される。担体には、医薬賦形剤ならびに添加剤タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、及び炭水化物（例えば、単糖類、二糖類、三糖類、四糖類、及びオリゴ糖を含む糖類、アルジトール、アルドン酸、エステル化糖及びこれらの組み合わせのような誘導体化糖類、ならびに多糖類または糖ポリマー）も含み、それらは、単一であるいは、単独でまたは１〜９９．９９重量％若しくは９９．９９容積％を含む組み合わせ中に存在することができる。例示的なタンパク質賦形剤には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼイン、及びこれらに類するもののような血清アルブミンを含む。緩衝能において機能することもできる代表的なアミノ酸／抗体構成要素には、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパラギン、及びこれらに類するものを含む。炭水化物賦形剤も本発明の範囲内に企図され、これらの例としては、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボース、及びこれらに類するもののような単糖類、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース、及びこれらに類するもののような二糖類、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン、及びこれらに類するもののような多糖類、ならびにマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）及びミオイノシトールのようなアルジトール類が挙げられるが、それらに限定しない。
【００２２】
生物学的に適合性のある担体または媒体という用語と相互交換可能に使用され得る、医薬として許容され得る担体（または媒体）という用語は、治療上投与されることになっている細胞及び他の作用因子と適合性があるだけでなく、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の合理的な損益比と釣り合った他の合併症なしでヒト及び動物の組織と接触して使用するのに適してもいる、試薬、細胞、化合物、材料、組成物、及び／または剤形を指す。本発明における使用に適している医薬として許容され得る担体には、液体、半固体（例えば、ゲル）及び固体の材料（例えば、細胞足場及びマトリックス、チューブシート及び当該技術分野で公知のかつ本明細書でより詳細に説明する他のこのような材料）を含む。これらの半固体及び固体の材料は、体内での分解に抵抗するよう設計してもよく（非生分解性）、または当該材料は、体内で分解するよう設計してもよい（生分解性、生侵食性）。生分解性材料はさらに、生体吸収性（ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ）若しくは生体吸収性（ｂｉｏａｂｓｏｒｂａｂｌｅ）であってもよく、すなわち、当該材料は、体液中へ溶解及び吸収されてもよく（水溶性インプラントは一例である）、または他の材料への転換若しくは分解及び天然の経路を通じての排除のいずれかによって、分解され、究極的には身体から排除されてもよい。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「患者」または「対象」という用語は、動物、哺乳類またはさらにさらにはヒト患者を企図する。説明のみの目的のために、哺乳類には、ヒト、サル、ネズミ、ウシ、ウマ、ブタまたはヒツジを含むがこれらに限定しない。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはこれらの任意の組み合わせから構成される短鎖ポリマーを指す。オリゴヌクレオチドは概して、長さ少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれより多数のヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、プライマーとしてまたはプローブとして使用してもよい。
【００２５】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸及び合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と類似の様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるもの、ならびに後に修飾されるそれらのアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ塩基性化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基へ結合する炭素、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然並みの酸と同じ塩基性化学構造を保有する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と類似の様式で機能する化合物を指す。
【００２６】
本明細書で使用する「単離した」という用語は、他の材料が実質的にない、例えば７０％、または８０％、または８５％、または９０％、または９５％、または９８％よりも多量の分子または生物学的な若しくは細胞性の材料を指す。一態様において、「単離した」という用語は、天然源中に存在しかつ当該材料の未変性のまたは天然の状態にある場合に達成できない結果に到達するよう当該材料の操作、例えば組換え複製または突然変異による操作を許容する他のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、またはタンパク質若しくはポリペプチド、または細胞若しくは細胞内小器官、または組織若しくは器官からそれぞれ分離したＤＮＡ若しくはＲＮＡのような核酸、またはタンパク質若しくはポリペプチド、または細胞若しくは細胞内小器官、または組織若しくは器官を指す。「単離した」という用語は、組換えＤＮＡ技術によって作製した場合に細胞性材料、ウイルス性材料、または培地が実質的にない核酸またはペプチド、あるいは化学的に合成した場合の化学的前駆体または他の化学物質も指す。その上、「単離した核酸」は、断片として天然ではなく、天然の状態で認められないであろう核酸断片を含むよう意味する。「単離した」という用語は、他の細胞性のタンパク質から単離され、かつ例えば７０％、または８０％、または８５％、または９０％、または９５％、９８％、または９９％よりも大きな純度で精製されたポリペプチド及び組換えポリペプチドの両方を包含するよう意味する。「単離された」という用語は、他の細胞または組織から単離された細胞または組織を指すためにも本明細書で使用され、培養及び操作の両方をした細胞または組織を包含するよう意味する。
【００２７】
「組換え」核酸は、互いに正常には生じないであろう２つ以上の配列を組み合わせることによって作製した人工核酸を指す。一実施形態において、当該組換え核酸は、抗生物質耐性のような特定の目的のために異なる形質をコードまたは変化させるために、細菌のプラスミドのような既存の生命体ＤＮＡへの関連ＤＮＡの導入を通じて作製される。「組換え」ポリペプチドは、組換え核酸に由来するポリペプチドである。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「プロモーター」という用語は、遺伝子の転写を方向付けるのに十分な核酸配列を指す。プロモーター依存的遺伝子発現を細胞タイプ特異的、組織特異的について制御可能にするのに、または外部のシグナル若しくは作用因子によって誘導可能にするのに十分な当該プロモーター領域も本発明に含まれる。
【００２９】
いくつかの実施形態において、プロモーターは、誘導性プロモーターまたは離散性プロモーターである。誘導性プロモーターは、温度または光のような化学的または物理的条件によってオンになることができる。化学的プロモーターの例としては、アルコール調節型、テトラサイクリン調節型、ステロイド調節型、金属調節型及び病因関連プロモーターが挙げられるが、これらに限定しない。離散性プロモーターの例は、例えば、Ｗｏｌｆｅら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １６（３）：４３５〜４４９において認めることができる。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「調節エレメント」という用語は、遺伝子の転写を調節することのできる核酸配列を指す。調節エレメントの非限定例としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列が挙げられる。調節エレメントは、未変性の遺伝子の本５’領域若しくは３’領域またはイントロン内にあってもよい。
【００３１】
種々のタンパク質も、それらのヒトタンパク質及びコード配列についてＧｅｎＢａｎｋ受入番号を用いて本明細書で開示されている。しかしながら、当該タンパク質は、開示したＧｅｎＢａｎｋ受入番号によって表されるアミノ酸配列を有するヒト由来のタンパク質に限定するのではなくて、他の動物、特に温血動物（例えば、ラット、モルモット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）に由来するアミノ酸配列を有してもよい。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「Ｔｏｓｏ」、「ＦＡＩＭ３」または「Ｆａｓアポトーシス阻害分子３」という用語は、代表的なＴｏｓｏ配列のいずれかと実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質を指し、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１１３５９４５（ヒトアイソフォームｂ）、ＮＰ＿００１１８０２６７（ヒトアイソフォームｃ）、ＮＰ＿００５４４０（ヒトアイソフォームａ）、ＮＰ＿０８１２５２（マウス）またはＮＰ＿００１０１４８４３（ラット）のいずれか及びすべての版を含む。Ｔｏｓｏをコードする適切なｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１１４２４７３、ＮＭ＿００１１９３３３８、ＮＭ＿００５４４９、ＮＭ＿０２６９７６、及びＮＭ＿００１０１４８４３に提供されている。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「Ｔｏｓｏの生物活性」または「Ｔｏｓｏ活性」という用語は、全長の天然のＴｏｓｏタンパク質と関係する任意の生物活性を指す。いくつかの実施形態において、Ｔｏｓｏの生物活性は、ＩｇＭ抗体への結合を指す。さらなる実施形態において、Ｔｏｓｏの生物活性は、ＣＤ１１ｂまたはＣＤ１８の活性を阻害することを指す。さらにさらなる実施形態において、Ｔｏｓｏの生物活性は、顆粒球の活性化閾値を亢進することを指す。活性化閾値は、骨髄由来の活性化顆粒球の数によって測定することができる。さらなる実施形態において、Ｔｏｓｏの生物活性には、樹状細胞の活性化及びＴ細胞に対する抗原を提示する当該樹状細胞の能力を含む。さらなる実施形態において、Ｔｏｓｏの生物活性には、アポトーシスの阻害またはＴＮＦシグナル伝達の亢進を含む。いくつかの実施形態において、Ｔｏｓｏ生物活性は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１１３５９４５、ＮＰ＿００１１８０２６７、ＮＰ＿００５４４０、ＮＰ＿０８１２５２またはＮＰ＿００１０１４８４３（これらの受入番号のいずれか及びすべての版を含む）によって表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性と等価である。認識されるであろうように、他の形態のＴｏｓｏも、Ｔｏｓｏ生物活性を示すことがある。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「治療すること」という用語は、疾患または障害の少なくとも１つの有害作用または症状を低下、緩和、逆転、または予防することによって、患者の容態を改善する目的のために医薬組成物を投与することを指す。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「予防すること」という用語は、疾患または障害に対する罹患率の上昇を有する対象（すなわち、患者）を識別すること、及び本開示の原理による療法を投与することを指す。予防療法は、感受性のある対象が後に症候性となるであろう、または当該疾患が当該予防療法の非存在下であろうよりも緩徐に発症若しくは進行するであろう尤度を低下させるよう設計される。対象は、例えば、当該疾患／障害の家族歴を識別すること、または疾患／障害若しくは疾患／障害に対する感受性を示す１つ以上の診断マーカーを有することによることを含む任意の適切な方法によって、当該疾患／障害を発症させる尤度上昇を有するものとして識別してもよい。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「試料」または「検査試料」という用語は、核酸を含有する任意の液体または固体の材料を指す。適切な実施形態において、検査試料は、培養物中の細胞または動物、最も好ましくはヒト由来の組織試料のような生物源（すなわち、「生物試料」）から得られる。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「実質的に同一の」という用語は、タンパク質またはポリペプチドを指す場合、基準アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有するものを意味する。比較の長さは好ましくは、ポリぺプチドまたはタンパク質の全長であるが、概して少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、８０、または１００またはそれより多数の連続したアミノ酸である。「実質的に同一の」核酸は、基準核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するものである。比較の長さは好ましくは、当該核酸の全長であるが、概して少なくとも２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１２５ヌクレオチド、またはそれより長い。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「アミノ酸置換」または「置換」は、出発するポリペプチド配列における特定の位置にあるアミノ酸の、別のアミノ酸との置き換えを指す。例えば、置換Ｍ２３Ｙは、位置２３におけるメチオニンがチロシンと置き換えられたバリアントポリペプチドを指す。
【００３９】
タンパク質または核酸の「生物学的等価の」は、アミノ酸配列若しくは核酸配列によって当該タンパク質若しくは核酸と実質的に同一である、または等価の生物活性を有する、タンパク質または核酸を指す。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、患者に対して医学的有益性を提供するのに十分な頻度で送達する化合物（例えば、Ｔｏｓｏタンパク質またはその生物活性のある断片）の量を指す。一実施形態において、タンパク質の有効量とは、疾患の症状を治療または寛解させるのに十分な量である。
【００４１】
細胞の集団は、表現型及び／または遺伝子型において同一である（クローンの）または非同一である１つを超える細胞からなる収集物を意図する。
【００４２】
「実質的に均質な」は、細胞の約５０％超、またはそれに代わるものとして約６０％超、またはそれに代わるものとして約７０％超、またはそれに代わるものとして約７５％超、またはそれに代わるものとして約８０％超、またはそれに代わるものとして約８５％超、またはそれに代わるものとして約９０％超、またはそれに代わるものとして約９５％超が同じまたは類似の表現型である当該細胞の集団を説明する。表現型は、事前に選択しておいた細胞表面マーカーまたは他のマーカーによって判定することができる。
【００４３】
自家移植（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）、自家移植（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、自家移植片という用語及びこれらに類するものは、当該細胞ドナーが、細胞置き換え療法の受け手である治療を指す。同種移植（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）、同種移植（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、同種移植片という用語及びこれらに類するものは、細胞ドナーが、細胞置き換え療法の受け手と同じ種であるが同じ個体ではない治療を指す。ドナーの細胞及び受け手と組織適合性上調和した細胞移植は、時には同質遺伝子移植と呼ぶ。異種移植（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）、異種移植（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、異種移植片という用語及びこれらに類するものは、細胞ドナーが細胞置き換え療法の受け手とは異なる種である治療を指す。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「抗体」には、抗体全体及びその任意の抗原結合フラグメントまたは一本鎖を含む。したがって、「抗体」という用語には、免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む分子を含有する任意のタンパク質またはペプチドを含む。このようなものの例としては、重鎖若しくは軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそのリガンド結合部分、重鎖若しくは軽鎖可変部、重鎖若しくは軽鎖定常部、フレームワーク（ＦＲ）領域、またはこれらの任意の部分、あるいは結合タンパク質の少なくとも一部が挙げられるが、それらに限定しない。概して、「抗体」という用語には、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＬを含むがこれらに限定しない少なくとも１つの定常部を含む任意のポリペプチドを含む。本発明における使用を認める抗体は、従来の抗体及び抗体誘導体、フラグメント及び模倣体を含む、本明細書に説明する多くのフォーマットを取ることができる。
【００４５】
当該抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであることができ、任意の適切な生物源、例えば、マウス、ラット、ヒツジ及びイヌから単離することができる。
【００４６】
モノクローナル抗体とは、細胞またはハイブリドーマの単一のクローンによって産生される抗体であり、それゆえ、単一の純粋な均質なタイプの抗体である。
【００４７】
ハイブリドーマとは、実験室において抗体産生リンパ球と非抗体産生癌細胞、通常黒色腫またはリンパ腫との融合から作製される細胞である。ハイブリドーマは、増殖して、特異的なモノクローナル抗体の連続的な供給を生じる。
【００４８】
「ヒト抗体」という用語は本明細書で使用する場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変部及び定常部を有する抗体を含むよう意図する。本発明のヒト抗体には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基を含んでもよい（例えば、インビトロでのランダム突然変異誘発若しくは部位特異的突然変異誘発によってまたはインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は本明細書で使用する場合、マウスのような別の哺乳類動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列へと移植された抗体を含むよう意図してはいない。したがって、本明細書で使用する場合、「ヒト抗体」という用語は、当該タンパク質の実質的にあらゆる部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク、ＣＬ部、ＣＨ部（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒンジ、（ＶＬ、ＶＨ））が、わずかな配列の変更または変化を有しながらヒトにおいて実質的に非免疫原性である、抗体を指す。同様に、霊長類（サル、ヒヒ、チンパンジーなど）、齧歯類（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、及びこれらに類するもの）及び他の哺乳類動物を指示された抗体は、このような種、亜属、属、亜科、科特異的抗体を示す。さらに、キメラ抗体には、上記の任意の組み合わせを含む。このような変更または変化は任意に及び好ましくは、非修飾の抗体に対するヒトまたは他の種における免疫原性を保有または低下させる。したがって、ヒト抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体とは異なる。ヒト抗体は、機能的に再編成されたヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖及び／または軽鎖）遺伝子を発現することのできる非ヒト動物または原核細胞もしくは真核細胞によって産生することができることは指摘されている。さらに、ヒト抗体が一本鎖抗体である場合、天然のヒト抗体において認められないリンカーペプチドを含むことができる。例えば、Ｆｖは、２〜約８のグリシン残基または他のアミノ酸残基のようなリンカーペプチドを含むことができ、当該リンカーペプチドは、重鎖の可変部及び軽鎖の可変部を結合する。このようなリンカーペプチドは、ヒト起源であるとみなす。
【００４９】
本明細書で使用する場合、ヒト抗体は、当該抗体がヒト免疫グロブリン配列を用いて、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを免疫化することによってまたはヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリをスクリーニングすることによって、系から得られる場合、特定の生殖系列配列「に由来する」。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較することによってこのようなものとして識別することができる。選択したヒト抗体は典型的には、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、他の種（例えば、ネズミ生殖系列配列）の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列と比較した場合、ヒト抗体をヒトであると識別するアミノ酸残基を含有している。ある場合において、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも９５％、またはさらには少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一であってもよい。典型的には、特定のヒト生殖系列配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とは１０個以下のアミノ酸の差を示すであろう。ある場合において、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とは５個以下、またはさらには４個以下、３個以下、２個以下、若しくは１個以下のアミノ酸の違いを示すことがある。
【００５０】
「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルである動物（例えば、マウス）または当該動物から調製したハイブリドーマから単離した抗体、例えばトランスフェクトーマから抗体を発現させるよう形質転換した宿主細胞から単離した当該抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離した抗体、及び他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを包含する任意の他の手段によって調製、発現、作製または単離した抗体のような、組換え手段によって調製、発現、作製または単離したヒト抗体をすべて含む。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変部及び定常部を有する。しかしながら、ある実施形態において、このような組換えヒト抗体は、インビトロでの突然変異誘発（またはヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物を使用する場合、インビボ体細胞性突然変異誘発）へ供することができ、したがって、当該組換え抗体のＶＨ部及びＶＬ部のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列免疫ＶＨ配列及びＶＬ配列に由来し及び関連しながら、インビボでのヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在しないかもしれない配列である。これらの抗体の作製方法は本明細書に説明する。
【００５１】
本明細書で使用する場合の「アイソタイプ」は、定常部の化学的特徴及び抗原特徴によって定義される免疫グロブリンのサブクラスのいずれかを意味する。治療用抗体がアイソタイプ及び／またはサブクラスからなる複合体も含むことができることは理解されるべきである。
【００５２】
「ポリクローナル抗体」または「ポリクローナル抗体組成物」という用語は本明細書で使用する場合、異なるＢ細胞株由来の抗体の調製物を指す。これらは、異なるエピトップを各々認識する特異的抗原に対して分泌される免疫グロブリン分子の混合物である。
【００５３】
「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は本明細書で使用する場合、単一の分子組成からなる抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「標識」という用語は、検出されることになっている組成物に対して直接的にまたは間接的に結合する直接的にまたは間接的に検出可能な化合物または組成物、例えば、Ｎ末端ヒスチジンタグ（Ｎ−Ｈｉｓ）、磁気活性のある同位体、例えば、１１５Ｓｎ、１１７Ｓｎ及び１１９Ｓｎ、１３Ｃ及び１５Ｎのような非放射性同位体、「標識した」組成物を生じるようなポリヌクレオチドまたは抗体のようなタンパク質を意図する。当該用語には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びこれらに類するもののような挿入された配列の発現の際にシグナルを提供するであろうポリヌクレオチドへ結合した配列も含む。当該標識は、それ自体検出可能であってもよく（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）または、酵素標識の場合、基質となる検出可能な化合物または組成物の化学的変化を触媒してもよい。当該標識は、小規模検出に適していることができ、または高処理量スクリーニングにより適していることができる。このように、適切な標識には、磁気活性のある同位体、非放射性同位体、放射性同位体、蛍光色素、化学発光化合物、色素、及びタンパク質（酵素を含む）を含むが、これらに限定しない。当該標識は単純に検出されてもよく、または定量化されてもよい。単純に検出される応答は概して、強度、極性、及び／または他の特性のような定量可能な（例えば、数値として報告可能な）値を有する応答を含む。発光アッセイまたは蛍光アッセイにおいて、検出可能な応答は、結合に実際に関与するアッセイ構成要素と結合している発光団または蛍光体を用いて直接的に、あるいは別の（例えばリポーターまたは指示薬）構成要素と結合した発光団または蛍光体を用いて間接的に生じてもよい。
【００５５】
シグナルを生じる発光標識の例としては、生物発光及び化学発光が挙げられるが、これらに限定しない。検出可能な発光応答は概して、発光シグナルの変化、または発光シグナルの発生を含む。アッセイ構成要素を発光標識するための適切な方法及び発光団は、当該技術分野で公知であり、例えばＨａｕｇｌａｎｄ，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．（１９９６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（第６版）において説明されている。発光プローブの例としては、エクオリン及びルシフェラーゼが挙げられるが、これらに限定しない。
【００５６】
適切な蛍光標識の例としては、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリトロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルー（商標）、及びテキサスレッドが挙げられるが、これらに限定しない。他の適切な光学色素は、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．（１９９６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（第６版）において説明されている。
【００５７】
別の態様において、蛍光標識は、細胞表面マーカーのような細胞または組織の表面の中または上に存在する細胞構成要素への共有結合を促進するよう官能基化されている。適切な官能基には、イソチオシアナート基、アミノ基、ハロアセチル基、マレイミド、スクシンイミジルエステル、及びハロゲン化スルホニルを含むがこれらに限定せず、当該官能基はすべて、当該蛍光標識を第二の分子へ結合するために使用してもよい。蛍光標識の官能基の選択は、リンカー、作用因子、マーカー、または第二の標識作用因子に対する結合部位によるであろう。
【００５８】
本発明は、主として具体的な実施形態に関して説明しているが、他の実施形態が本開示を読んでいる当業者に明らかとなるであろうことも想定しており、このような実施形態が本発明の方法内に含有されるべきであることは意図している。
【００５９】
（Ｉ．本発明の概要）
本発明は、免疫系経路、特にＴｏｓｏタンパク質（本明細書では「Ｔｏｓｏ」または「Ｔｏｓｏ受容体」または「Ｆａｉｍ３」または「ＦＣＭＲ」とも相互交換可能に呼ぶ）を包含する任意の経路を調節するための方法及び組成物に向けられる。「免疫系経路」及び「免疫経路」という用語は本明細書で使用する場合、病原体、不活性材料による損傷及び癌を撲滅する組織及び循環系のネットワークにおける細胞性及び可溶性構成要素による協調した作用を指す。免疫系経路の調節は、当該経路の１つ以上の構成要素における発現または機能的活性を変化させて、それにより免疫系による応答（「免疫応答」）を調節することを包含してもよい。本発明は、これらの免疫系経路の構成要素の活性または発現を調整して当該免疫応答に減弱または亢進のいずれかをなすための方法及び組成物を提供する。ある例示的な実施形態において、免疫応答を減弱させることは、自己免疫疾患の症状を治療または寛解させるよう機能する。他の例示的な実施形態において、免疫応答を亢進させることは、癌を治療、寛解または予防するよう機能する。
【００６０】
一態様において、本発明は、Ｔｏｓｏ発現及び／または機能を低下させるための方法及び組成物を提供する。この疾患は、Ｔｏｓｏへ結合する抗体の投与、１つ以上の結合パートナーと相互作用するＴｏｓｏの能力に干渉するための可溶性Ｔｏｓｏタンパク質（本明細書で「ｓＴｏｓｏ」とも呼ぶ）の投与、及びタンパク質発現を阻害する組成物、つまりこのようなｓｉＲＮＡの投与を含むがこれらに限定しない、当該技術分野で公知の及び本明細書に説明する任意の方法によって達成してもよい。Ｔｏｓｏ発現及び／または機能はまた、他のタンパク質、特にそれら自体がＴｏｓｏへ直接結合するまたはさもなくばＴｏｓｏと相互作用するタンパク質の発現または機能を調節することによって間接的に低下してもよい。本明細書で使用する場合、「可溶性Ｔｏｓｏタンパク質」及びすべての文法的等価物は概して、膜結合型ではないタンパク質を指すことに留意されたい。
【００６１】
いくつかの実施形態において、Ｔｏｓｏの発現または活性の低下には、Ｔｏｓｏが直接的な結合または他の会合（物理的及び／または機能的）を通じて相互作用する痰タンパク質の発現または機能的活性の亢進が伴う。活性または発現レベルがＴｏｓｏの発現または活性の低下によって影響されるかもしれない例示的なタンパク質には、ＩｇＭ、ＴＳＧ６及びＢ７Ｈ３を含むがこれらに限定しない。
【００６２】
ある態様において、本発明は、Ｔｏｓｏ活性及び免疫確認箇所阻害薬の活性を調節することによって免疫経路を変化させるための方法及び組成物を提供する。特定の実施形態において、本発明は、Ｔｏｓｏ活性調節因子及び免疫確認箇所タンパク質の阻害薬を含む併用療法の使用を通じて免疫応答を亢進させるための方法及び組成物を提供する。ある実施例において、併用療法には、免疫確認箇所阻害薬と組み合わせた可溶性Ｔｏｓｏ受容体の使用を含む。さらなる実施例において、併用療法には、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質ならびにＣＴＬＡ−４阻害薬、ＰＤ−１阻害薬、ＴＩＭ３阻害薬、ＬＡＧ３阻害薬、ＰＤ−１リガンド（ＰＤＬ−１のような）、ＰＤ−１リガンドの阻害薬、Ｂ７−Ｈ３タンパク質、Ｂ７−Ｈ３タンパク質の阻害薬、Ｂ７−Ｈ４タンパク質、及びＢ７−Ｈ４タンパク質の阻害薬の１つ以上の使用を含む。ある実施例において、併用療法には、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質＋ＰＤ−１阻害薬または可溶性Ｔｏｓｏタンパク質＋ＰＤ−１阻害薬＋ＣＴＬＡ−４阻害薬を含む。さらなる実施例において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号１〜２５の任意の１つによるアミノ酸配列と、すべての目的のために、特に可溶性Ｔｏｓｏタンパク質に向けられたすべての教示、記載された説明、配列、及び図面についてその全体が参照により本明細書により組み込まれる２０１３年３月１４日出願のＵＳＳＮ１３／８３１，０３１において説明される可溶性Ｔｏｓｏタンパク質のいずれかとを含む。さらにさらなる実施例において、ＰＤ−１阻害薬は、ニボルマブまたはランブロリズマブのような抗ＰＤ−１抗体であり、ＣＴＬＡ−４阻害薬は、イピリムマブまたはトレメリムマブのような抗体である。
【００６３】
さらなる実施形態において及び上記のいずれかにしたがって、Ｔｏｓｏの発現または活性の低下は、炎症応答と関係する分子の発現または活性の低下を結果的に生じる（本明細書では、病原体関連分子パターまたは「ＰＡＭＰ」及び損傷関連分子パターンまたは「ＤＡＭＰ」とも呼ぶ）。このような分子は、当該技術分野で公知であり、本明細書で論議されている。このようなＰＡＭＰまたはＤＡＭＰの低下は結果的に、Ｔｏｓｏの発現または活性の低下から直接または、ＩｇＭ及び／若しくはＢ７Ｈ３の発現若しくは活性の亢進のような中間のタンパク質に及ぼす効果を通じて生じることがある。
【００６４】
なおもさらなる実施形態において及び上記のうちのいずれかにしたがって、本発明は、経路における１つ以上のタンパク質の発現または機能を変化させることによって、免疫応答を減弱させ、それにより自己免疫疾患を治療するための方法及び組成物を提供する。例示的な実施形態において、Ｔｏｓｏの発現または機能を低下させ、それによりＩｇＭ及び／またはＢ７Ｈ３の発現または機能を亢進させ、次に、このことがＰＡＭＰ及び／またはＤＡＭＰの発現または機能を低下させ、究極的には免疫応答を減弱させ、自己免疫疾患の症状を治療または寛解させる。さらなる例示的な実施形態において、Ｔｏｓｏの発現は変化しないが、ＩｇＭ及び／またはＢ７Ｈ３の発現または機能は、代替的な方法において亢進し、それによりＰＡＭＰ及び／またはＤＡＭＰの発現または機能を低下させる。なおもさらなる例示的な実施形態において、ＰＡＭＰ及び／またはＤＡＭＰは、直接的な作用を通じて直接的に、またはＩｇＭ、ＴＳＧ６及び／またはＢ７Ｈ３のような他の中間タンパク質の発現を変化させることなくＴｏｓｏの発現若しくは機能に及ぼす作用を通じて減衰する。
【００６５】
別の態様において、Ｔｏｓｏの発現及び／または機能は亢進する。この亢進は、Ｔｏｓｏに対するアゴニストの投与及びタンパク質発現を亢進させる組成物の投与を含むがこれらに限定しない、当該技術分野で公知の及び本明細書に説明する任意の方法によって達成されることがある。
【００６６】
いくつかの実施形態において、Ｔｏｓｏの発現または活性の亢進には、Ｔｏｓｏが直接的な結合または他の会合（物理的及び／または機能的）を通じて相互作用する他のタンパク質の発現または機能的活性の低下が伴う。活性または発現のレベルがＴｏｓｏの発現または活性の亢進によって影響されるかもしれない例示的なタンパク質には、ＩｇＭ、ＴＳＧ６及び／またはＢ７Ｈ３を含むが、これらに限定しない。
【００６７】
さらなる実施形態において及び上記のうちのいずれかにしたがって、Ｔｏｓｏの発現及び／または活性の亢進には、ＩｇＭの発現または機能的活性の低下が伴い、次にこのことがＰＡＭＰ及び／またはＤＡＭＰの機能または活性の亢進を結果的に生じる。他の実施形態において、Ｔｏｓｏの発現及び／または活性の亢進は、ＩｇＭの関与を有することなく、直接的な作用を通じてまたは別のタンパク質を通じて間接的のいずれかで、ＰＡＭＰ及び／またはＤＡＭＰの機能または活性の亢進を結果的に生じる。
【００６８】
さらにさらなる実施形態において及び上記のうちのいずれかにしたがって、本発明は、経路における１つ以上のタンパク質の発現または機能を変化させることによって、免疫応答を亢進させるための方法及び組成物を提供する。この亢進は、１つ以上の癌細胞の死滅をもたらすよう実施される。例示的な実施形態において、Ｔｏｓｏの発現または機能は亢進し、それによりＩｇＭ及び／またはＢ７Ｈ３の発現または機能を低下させ、次にこのことがＰＡＭＰ及び／またはＤＡＭＰの発現または機能を亢進させ、究極的には免疫応答を亢進させ、癌の症状を治療または寛解させる。さらなる例示的な実施形態において、Ｔｏｓｏ発現は変化しないが、ＩｇＭ及び／またはＢ７Ｈ３の発現または機能は大体的な方法において低下し、それによりＰＡＭＰ及び／またはＤＡＭＰの発現または機能を亢進させる。なおもさらなる例示的な実施形態において、ＰＡＭＰ及び／またはＤＡＭＰは、直接的な作用を通じて直接的に、またはＩｇＭ、ＴＳＧ６及び／若しくはＢ７Ｈ３のような他のタンパク質の発現を変化させることなく、Ｔｏｓｏの発現または機能に及ぼす作用を通じて亢進する。これらのタンパク質の１つ以上の操作は、免疫応答を亢進するよう機能し、それにより腫瘍細胞を含む癌関連細胞の死滅をもたらす。
【００６９】
なおもさらなる態様において及び上記のうちのいずれかにしたがって、本発明の方法及び組成物はさらに、細胞膜の脂質二重層の２つの単層間のリン脂質の転位を生じる１つ以上のスクランブラーゼタンパク質を包含する。ある実施形態において、本発明の方法及び組成物は直接的にまたは間接的に、スクランブラーゼ活性を調節し、標的となった癌細胞のアポトーシスをもたらす。
【００７０】
ある態様において、免疫応答を減弱させるのに使用することのできるタンパク質は、１つ以上のスクリーンを通じて識別される。このようなスクリーンにおいて識別されるタンパク質は、いくつかの実施形態において、先に識別したタンパク質の１つ以上、特にＴｏｓｏと直接的にまたは間接的に相互作用して、免疫応答に影響することがある。
【００７１】
（ＩＩ．免疫応答駆動因子のための活性及び発現を調節するための方法及び組成物）
本明細書でさらに詳細に論議するであろうように、本発明は、Ｔｏｓｏ、Ｂ７Ｈ３、ＰＡＭＰ及びＤＡＭＰ、スクランブラーゼ、ならびにＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４のような免疫確認箇所阻害薬を含む、免疫応答に関与するタンパク質の活性を調節するための方法及び組成物を提供する。
【００７２】
本発明の組成物はある実施形態において、Ｔｏｓｏ活性を調節する作用因子を含んでもよい。このような組成物には、後にさらに詳細に論議するであろうように、Ｔｏｓｏタンパク質の可溶性形態またはＴｏｓｏに対する抗体を含むが、これらに限定しない。Ｔｏｓｏ活性を調節するための組成物及び方法は、すべての目的のために、特に任意の記載された説明、実施例、図面、及び図面の凡例を含む、Ｔｏｓｏ活性を調節するための方法及び組成物に関するすべての教示について、その全体が参照により本明細書により組み込まれる２０１３年３月１４日出願のＰＣＴ／ＩＢ１３／０１１７９においても説明されている。
【００７３】
これらのタンパク質の任意の組み合わせの活性または発現を調節することには、抗体、アプタマー、結合パートナー、小分子または大分子アゴニスト、小分子または大分子阻害薬の使用、ならびに阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡを含む）のような遺伝子発現の操作、あるいは標的タンパク質の遺伝子発現を阻害または上方制御するための当該技術分野で公知の任意の他の方法または組成物を含んでもよい。
【００７４】
本明細書でさらに詳細に論議する場合、これらのタンパク質の異なる組み合わせは、異なる組み合わせにおける活性及び／または発現を亢進または低下させるよう操作してもよい。例えば、Ｔｏｓｏの活性及び／または発現を低下させるための方法及び組成物は、ＩｇＭの活性及び／または発現の上昇を亢進させるための方法及び組成物と組み合わせてもよく、このことは、ある実施形態において、ＰＡＭＰ及び／またはＤＡＭＰの活性及び／または発現を低下させるための方法及び組成物とさらに組み合わされてもよい。別の実施形態において、Ｔｏｓｏの活性及び／または発現を低下させるための方法及び組成物のみが使用され、この活性の低下には、ＩｇＭ、Ｂ７Ｈ３、ＰＡＭＰ、ＤＡＭＰ、スクランブラーゼ、ならびにＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４のような免疫確認箇所阻害薬のうちの１つ以上を含むがこれらに限定しない他のタンパク質の活性及び／または発現の変化が伴う。
【００７５】
（ＩＩＡ．発現の阻害）
本発明のある態様において、免疫応答に関与する１つ以上のタンパク質の発現が阻害される。このようなタンパク質には、Ｔｏｓｏ、ＩｇＭ、Ｂ７Ｈ３、ＰＡＭＰ、ＤＡＭＰ、スクランブラーゼ、ならびにＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４のような免疫確認箇所阻害薬を含んでもよいが、これらに限定しない。
【００７６】
ある実施形態において、本発明は、標的ｍＲＮＡの発現を阻害し、したがって標的ｍＲＮＡ関連障害に罹患している患者における標的ｍＲＮＡレベルを低下させる、干渉ＲＮＡの送達方法を提供する。
【００７７】
本明細書で使用する場合の遺伝子またはｍＲＮＡに関する「発現を減弱させる」という句は、ある量の干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を投与または発現させて、ｍＲＮＡの切断を通じてまたは翻訳の直接的な阻害を通じてのいずれかで、標的ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を低下させることを意味する。本明細書で使用する場合の「阻害する」、「発現停止させること」、及び「減弱させること」という用語は、本発明の干渉ＲＮＡの非存在下での標的ｍＲＮＡまたは対応するタンパク質の発現と比較して、標的ｍＲＮＡまたは対応するタンパク質の発現の測定可能な低下を指す。標的ｍＲＮＡまたは対応するタンパク質の発現の低下は通常、「ノックダウン」と呼ばれ、非標的対照ＲＮＡ（例えば、非標的対照ｓｉＲＮＡ）の投与または発現後に存在するレベルと比較して報告される。５０％及び１００％を含むならびにこれらの間の量の発現のノックダウンは、本明細書で実施形態によって熟慮されている。しかしながら、このようなノックダウンレベルが本発明の目的のために達成されるべきであることは必要ではない。
【００７８】
ノックダウンは通常、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）増幅を用いてｍＲＮＡレベルを測定することによって、またはウェスタンブロット若しくは酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によってタンパク質レベルを測定することによって評価される。タンパク質レベルを分析することは、ｍＲＮＡ切断及び翻訳阻害の両方の評価を提供する。ノックダウンを測定するための更なる技術には、ＲＮＡ溶液ハイブリッド形成、ヌクレアーゼ保護、ノザンハイブリッド形成、マイクロアレイを用いた遺伝子発現モニタリング、抗体結合、放射性イムノアッセイ、及び蛍光標識細胞分析を含む。
【００７９】
本発明の干渉ＲＮＡ分子による標的遺伝子の発現を減弱させることは、障害の症状の改善を観察することによって及び／または、特徴が行動的であろうと生理的（別のタンパク質の発現レベルの変化を含む）であろうと、当該特徴の変化を観察することによって、ヒトまたは他の哺乳類動物に干渉することができる。
【００８０】
一実施形態において、一本鎖干渉ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡレベルを低下させるために送達される。他の実施形態において、当該ｍＲＮＡを標的とする２つ以上の干渉ＲＮＡを投与して、標的ｍＲＮＡレベルを低下させる。
【００８１】
本明細書で使用する場合、「干渉ＲＮＡ」及び「干渉ＲＮＡ分子」という用語は、ＲＩＳＣと相互作用することのできる、及び遺伝子発現におけるＲＩＳＣ仲介性変化に関与することのできるＲＮＡまたはＲＮＡ様分子をすべて指す。ＲＩＳＣと相互作用することのできる他の干渉ＲＮＡ分子の例としては、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、一本鎖ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ピコＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、及びダイサー・基質２７マー二重鎖が挙げられる。ＲＩＳＣと相互作用することのできる「ＲＮＡ様」分子の例としては、１つ以上の化学的に修飾されたヌクレオチド、１つ以上の非ヌクレオチド、１つ以上のデオキシリボヌクレオチド、及び／または１つ以上の非ホスホジエステル結合を含有するｓｉＲＮＡ分子、一本鎖ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ｐｉＲＮＡ分子、及びｓｈＲＮＡ分子が挙げられる。したがって、ｓｉＲＮＡ、一本鎖ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、及びダイサー・基質２７マー二重鎖は、「干渉ＲＮＡ」または「干渉ＲＮＡ分子」のサブセットである。
【００８２】
本明細書で使用する場合の「ｓｉＲＮＡ」という用語は、別段の記載がない限り、二本鎖干渉ＲＮＡを指す。典型的には、本発明の方法において使用するｓｉＲＮＡは、各鎖が約１９〜約２８ヌクレオチド（すなわち、約１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８ヌクレオチド）を有する２つのヌクレオチド鎖を含む二本鎖核酸分子である。典型的には、本発明の方法において使用する干渉ＲＮＡは、約１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する。二本鎖干渉ＲＮＡを指す場合の「１９〜４９ヌクレオチドの長さ」という句は、センス鎖及びアンチセンス鎖がリンカー分子によって結合している干渉ＲＮＡ分子を含むアンチセンス鎖及びセンス鎖が約１９〜約４９ヌクレオチドの長さを独立して有することを意味する。
【００８３】
本発明の送達系及び方法において使用する干渉ＲＮＡは、非修飾であることができ、またはリソソーム若しくはエンドサイトーシス経路における他の区画における分解を防止するために化学的に安定化させることができる。
【００８４】
一本鎖干渉ＲＮＡは、ｍＲＮＡサイレンシングをもたらすことがわかってきた。それゆえ、本発明の実施形態は、一本鎖干渉ＲＮＡの投与も規定する。一本鎖干渉ＲＮＡは、先に列挙した二本鎖干渉ＲＮＡについての場合に約１９〜約４９ヌクレオチドの長さを有する。一本鎖干渉ＲＮＡは、５’リン酸を有しており、またはインサイツで若しくはインビボで５’位でリン酸化されている。「５’リン酸化した」という用語は、例えば、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’末端で糖（例えば、リボース、デオキシリボース、またはこれらの類似体）のＣ５ヒドロキシルへのエステル結合を介して結合したリン酸基を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを説明するために使用する。
【００８５】
一本鎖干渉ＲＮＡは、化学的にまたはインビトロ転写によって合成することができ、あるいは二本鎖干渉ＲＮＡに関して本明細書に説明するベクターまたは発現カセットから内在的に発現することができる。５’リン酸基は、キナーゼを介して付加してもよく、または５’リン酸は、ＲＮＡのヌクレアーゼ切断の結果であってもよい。ヘアピン干渉ＲＮＡは、ステムループ構造またはヘアピン構造（例えば、ｓｈＲＮＡ）における干渉ＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含む単一分子（例えば、単一のオリゴヌクレオチド鎖）である。例えば、ｓｈＲＮＡは、センス干渉ＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドが、短いスペーサーによって逆の相補的アンチセンス干渉ＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドへ連結したＤＮＡベクターから発現することができる。選択した発現ベクターについて必要とされる場合、３’末端Ｔ及び制限部位を形成するヌクレオチドを付加してもよい。結果として生じるＲＮＡ転写産物は、それ自体へと折り戻され、ステムループ構造を形成する。
【００８６】
干渉ＲＮＡは、１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換または修飾によって、天然ＲＮＡとは異なっていることがある。非ヌクレオチド材料は、５’末端、３’末端または内部のいずれかで、干渉ＲＮＡへ結合していることがある。このような修飾は通常、干渉ＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を亢進させ、細胞内取り込みを改善し、細胞ターゲティングを亢進させ、またはインターフェロン経路の活性化のための可能性を低下させるよう設計されている。例えば、干渉ＲＮＡは、オーバーハングの両端にあるプリンヌクレオチドを含んでもよい。例えば、ピロリジンリンカーによるｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端へのコレステロールの結合も、ｓｉＲＮＡに対する安定性を提供する。
【００８７】
さらなる修飾には、例えば、ビオチン分子、ペプチド模倣体、蛍光色素、またはデンドリマーを含む。
【００８８】
ヌクレオチドは、これらの塩基部分上で、またはこれらの糖部分上で、または本発明の実施形態における分子及び機能のリン酸部分上で修飾してもよい。修飾には、例えば、アルキル基、アルコキシ基、アミノ基、デアザ基、ハロ基、ヒドロキシル基、チオール基、またはこれらの組み合わせを用いた置換を含む。ヌクレオチドは、リボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドと置き換えること、または２’アミノ基、２’Ｏ−メチル基、２’メトキシエチル基、若しくは２’−Ｏ，４’−Ｃメチレン架橋によって置き換えられた２’ＯＨ基のような糖修飾を有することのようなより大きな安定性を有する類似体と置換してもよい。ヌクレオチドのプリン類似体またはピリミジン類似体の例としては、キサンチン、ヒポキサンチン、アザプリン、メチルチオアデニン、７−デアザ−アデノシンならびにＯ修飾及びＮ修飾したヌクレオチドが挙げられる。ヌクレオチドのリン酸基は、リン酸基の酸素の１つ以上を窒素とまたは硫黄と（ホスホロチオアート）置換することによって修飾してもよい。修飾は、例えば、機能を亢進させ、安定性若しくは透過性を改善し、オフターゲット効果を低下させ、または直接的な局在化若しくはターゲティングを方向付けるのに有用である。
【００８９】
ある実施形態において、本発明の干渉分子は、先に説明したような修飾の少なくとも１つを含む。
【００９０】
本明細書で使用する場合の「標的配列」及び「標的ｍＲＮＡ」という句は、本発明の方法において使用する干渉ＲＮＡによって認識することができ、それにより干渉ＲＮＡが本明細書で論議するような遺伝子発現を発現停止させることができるｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ配列の部分を指す。ｓｉＲＮＡについて標的配列を選択するための技術は、例えば、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ら，「Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ」（２００４年５月６日改訂，ロックフェラー大学ウェブサイトにおいて入手可能）によって、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃５０６，「ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ」（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．Ａｍｂｉｏｎのウェブサイトにおいて）によって、及び他のウェブ系設計ツール、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、またはＧｅｎｓｃｒｉｐｔのウェブサイトによって提供される。初期の検索パラメータには、３５％と５５％の間のＧ／Ｃ含有量及び１９ヌクレオチドと２７ヌクレオチドの間のｓｉＲＮＡ長を含むことができる。標的配列は、コード領域において、あるいはｍＲＮＡの５’または３’非翻訳領域において位置していてもよい。標的配列は、本明細書に説明するもののような、干渉ＲＮＡ分子を得るために使用することができる。
【００９１】
標的ｍＲＮＡ配列内の干渉ＲＮＡ標的配列（例えば、ｓｉＲＮＡ標的配列）は、先に論議した入手可能な設計ツールを用いて選択することができる。標的配列に対応する干渉ＲＮＡは次に、標的ｍＲＮＡを発現する細胞のトランスフェクションによってインビトロで検査された後、本明細書に説明するノックダウンの評価が行われる。干渉ＲＮＡは、本明細書に説明する動物モデルを用いてインビボでさらに評価することができる。
【００９２】
ある実施形態において、干渉ＲＮＡ送達系は、Ｔｏｓｏ、ＩｇＭ、Ｂ７Ｈ３、ＰＡＭＰ、ＤＡＭＰ、スクランブラーゼを含む免疫応答と関係する遺伝子を標的とする干渉ＲＮＡ分子と、ＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４のような免疫確認箇所阻害薬とを含む。
【００９３】
（ＩＩＢ．抗体）
一態様において、本発明は、Ｔｏｓｏ、ＩｇＭ、Ｂ７Ｈ３、ＰＡＭＰ、ＤＡＭＰ、スクランブラーゼ、ならびにＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４のような免疫確認箇所阻害薬を含むがこれらに限定しない、免疫応答に関与する１つ以上のタンパク質へ結合する抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、これらのタンパク質の活性を亢進させる。他の実施形態において、本発明の抗体は、当該タンパク質の活性を低下させる。
【００９４】
抗体の調製方法は概して、当該技術分野で公知である。例えば、米国特許第６，７２７，３５０号は、Ｔｏｓｏに対する抗体を開示しており、このことは、その全体が、すべての目的のために、特に本明細書で論議するタンパク質に対する抗体に関連する教示すべてについて、参照により本明細書により組み込まれる。
【００９５】
免疫系経路の他の構成要素に対する抗体も当該技術分野において公知であり、単独でまたは本明細書に説明する他の分子のいずれかとの組み合わせで使用する。ＰＤ−１に対する抗体には、例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ＭＫ−３４７５（ランブロリズマブ）、及びＢＭＳ−９３６５５８（例えば、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１２；３６６：２４４３〜２４５４において説明）を含むが、これらに限定しない。ＣＴＬＡ−４に対する抗体には、イピリムマブ及びトレメリムマブを含むが、これらに限定しない。
【００９６】
本発明の方法における使用に関する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または後述に定義するこれらの誘導体若しくはフラグメントであってもよい。一態様において、フラグメントは、抗体のＣＤＲを含み、またはそれに代わるものとして当該ＣＤＲから本質的になり、またはさらにさらには当該ＣＤＲからなる。一態様において、本発明の抗体は、検出可能に標識され、またはさらには、当該抗体へ結合した検出可能な標識を含む。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株も提供される。先の実施形態の１つ以上を含む組成物は、本明細書でさらに提供される。
【００９７】
当該抗体及び担体を含む組成物も提供される。当該抗体の生物活性フラグメント、または当該抗体フラグメントを含む組成物はさらに提供される。適切な担体は上述に定義する。
【００９８】
当該抗体へ特異的に結合する抗体及びポリペプチドを含む、またはそれに代わるものとして当該抗体及びポリペプチドから本質的になる、またはさらにそれに代わるものとして当該抗体及びポリペプチドからなる抗体・ペプチド複合体はさらに提供される。一態様において、当該ポリペプチドは、対抗して当該抗体が生じるキメラポリペプチドである。
【００９９】
本発明は、本発明の治療用方法において有用な、Ｔｏｓｏとの複合体を特異的に形成することのできる抗体も提供する。本発明の抗体には、マウス、ラット、及びウサギ、またはヒト抗体を含むが、これらに限定しない。抗体は、細胞培養物中で、ファージ中で、またはウシ、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、類人猿などを含むがこれらに限定しない種々の動物において産生することができる。当該抗体は、治療用ポリペプチドを識別及び精製するためにも有用である。
【０１００】
本発明は、先に説明した抗体及び当該抗体へ特異的に結合する抗原（または抗原の一部）を含む、またはそれに代わるものとして当該抗体及び当該抗原から本質的になる、またはさらにそれに代わるものとして当該抗体及び当該抗原からなる、抗体・ペプチド複合体も提供する。当該抗原には、ポリペプチド（全長及び全長タンパク質の複数部分を含む）、脂質抗原、及び炭水化物抗原を含んでもよいが、これに限定しない。一態様において、当該複合体は、単離した複合体である。さらなる態様において、当該複合体の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体または本明細書に説明する抗体誘導体であるが、これらに限定しない。当該抗体・故応現複合体の抗体または抗原のいずれかまたは両方は、検出可能に標識することができ、あるいは当該抗体または抗原へ結合した検出可能な標識をさらに含む。一態様において、本発明の抗体・抗原複合体は、診断用またはスクリーニング用アッセイにおける対照試料または基準試料として使用することができる。
【０１０１】
本発明のポリクローナル抗体は、当該技術分野で公知の従来技術を用いて作製することができ、文献中で十分に説明されている。いくつかの方法論が、ポリクローナル抗体の作製について存在する。例えば、ポリクローナル抗体は典型的には、ニワトリ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ウマ、ラマ、マウス、ラット、及びウサギのような、しかしこれらに限定しない適切な脊椎動物の免疫化によって作製することができる。抗体は、当該哺乳類動物へ注射され、このことがＢリンパ球を誘導して、抗原に特異的なＩｇＧ免疫グロブリンを産生する。このＩｇＧは哺乳類の血清から精製される。この方法論の変法には、アジュバント、投与の経路及び部位、最適な作製のための部位あたりの注射容積及び個体あたりの部位数ならびに当該動物の人道的な処置の修正を含む。例えば、アジュバントは典型的には、抗原に対する免疫応答を改善または亢進するために使用する。ほとんどのアジュバントは注射部位抗原デポーを準備し、このことは、排水するリンパ節への抗原の緩徐な放出を可能にする。他のアジュバントには、大きな表面積にわたるタンパク質抗原分子の及び免疫刺激分子の濃度を促進する界面活性剤を含む。ポリクローナル抗体の作製のためのアジュバントの非限定例としては、フロイントアジュバント、リビアジュバント系、及びＴｉｔｅｒｍａｘが挙げられる。ポリクローナル抗体は、それらが全体として参照により、すべての目的のために、及び特に抗体に関連する教示すべてについて本明細書により組み込まれる米国特許第７，２７９，５５９号、第７，１１９，１７９号、第７，０６０，８００号、第６，７０９，６５９号、第６，６５６，７４６号、第６，３２２，７８８号、第５，６８６，０７３号、及び第５，６７０，１５３号に説明される方法を用いて作製することができる。
【０１０２】
本発明のモノクローナル抗体は、当該技術分野で公知の及び文献において十分に説明されている従来のハイブリドーマ技術を用いて作製することができる。例えば、ハイブリドーマは、適切な不死性細胞株（例えば、Ｓｐ２／０、Ｓｐ２／０−ＡＧ１４、ＮＳＯ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＡＥ−１、Ｌ．５、＞２４３、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２  ＳＡ３、Ｓｐ２  ＭＡＩ、Ｓｐ２  ＳＳ１、Ｓｐ２  ＳＡ５、Ｕ３９７、ＭＬＡ  １４４、ＡＣＴ  ＩＶ、ＭＯＬＴ４、ＤＡ−１、ＪＵＲＫＡＴ、ＷＥＨＩ、Ｋ−５６２、ＣＯＳ、ＲＡＪＩ、ＮＩＨ  ３Ｔ３、ＨＬ−６０、ＭＬＡ  １４４、ＮＡＭＡＩＷＡ、ＮＥＵＲＯ  ２Ａ、ＣＨＯ、ＰｅｒＣ．６、ＹＢ２／Ｏのような骨髄腫細胞株）若しくはこれに類するもの、あるいはヘテロミエローマ、その融合産物、またはそこから派生する任意の細胞若しくは融合細胞、あるいは当該技術分野で公知の任意の他の適切な細胞株（例えば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ、ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ（２００７年１１月２６に最新アクセス）、及びこれらに類するものを参照されたい）を、単離若しくはクローン化した脾臓、末梢血、リンパ、トンスル、または他の免疫若しくはＢ細胞を含有する細胞、または重鎖若しくは軽鎖の定常部若しくは可変部若しくはフレームワーク若しくはＣＤＲの配列を内在性若しくは異種性の核酸として、組換え若しくは内在性の、ウイルス、細菌、藻類、原核生物、両生類、昆虫、爬虫類、魚類、哺乳類、齧歯類、ウマ、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、ヤギ、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）、霊長類、真核生物、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ若しくはＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、一本鎖、二本鎖若しくは三本鎖、ハイブリッド形成型、及びこれらに類するものあるいはそれらの組み合わせのいずれかとして発現する任意の他の細胞のような、しかしこれらに限定しない抗体産生細胞と融合することによって作製する。抗体産生細胞は、関心対象の抗原で免疫化したヒトまたは他の適切な動物の末梢血または、好ましくは脾臓若しくはリンパ節から得ることもできる。任意の他の適切な宿主細胞は、本発明の抗体、その特異的フラグメント若しくはバリアントをコードする異種性または内在性核酸を発現するために使用することもできる。融合した細胞（ハイブリドーマ）または組換え細胞は、選択的培養条件または他の適切な公知の方法を用いて単離することができ、限界希釈または細胞選別、あるいは他の公知の方法によってクローン化することができる。
【０１０３】
一実施形態において、本発明に説明する抗体は、多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）系を用いて作製することができる。ＭＡＰ系は、３つまたは７つの放射状に分岐したリジン残基からなるペプチジル中心を利用し、この上に、関心対象の抗原ペプチドを標準的な固相化学を用いて構築することができる。当該リジン中心は、総分子量の１０％未満を概して占める内部中心に応じてペプチドエピトープの約４〜８コピーを保有するＭＡＰを生じる。当該ＭＡＰ系は、結合のための担体タンパク質を必要としない。ＭＡＰにおける抗原性エピトープの複数コピーの高いモル比及び密なパッキングは、強い免疫原性応答を生じることが示されてきた。この方法は、米国特許第５，２２９，４９０において説明されており、その全体が参照により、すべての目的のために及び特に当該ＭＡＰ系に関連したすべての教示について、本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
ペプチドまたはペプチドライブラリ（例えば、バクテリオファージ、リボソーム、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはこれらに類するもの、例えば、当該技術分野で公知の方法を用いた、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（英国ケンブリッジシャー州）、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ（デラウェア州プラネック地方自治体マルティンスリート地区）、Ｂｉｏｖａｔｉｏｎ（英国スコットランド地方アバディーン市）ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ（スウェーデン国ルンド市）のような種々の商業的供給元から入手可能なディスプレイライブラリ）から組換え抗体を選択する方法を含むがこれらに限定しない必要な特異性に関する抗体を作製または単離する他の適切な方法を使用することができる。それらが全体としてすべての目的のために及び特に抗体と関連する方法と関連するすべての教示について参照により本明細書により組み込まれる米国特許第４，７０４，６９２号、第５，７２３，３２３号、第５，７６３，１９２号、第５，８１４，４７６号、第５，８１７，４８３号、第５，８２４，５１４号、第５，９７６，８６２号を参照されたい。代替的な方法は、当該技術分野で公知のように及び／または本明細書に説明するように、トランスジェニック動物（例えば、ヒト抗体のレパートリーを産生することのできるＳＣＩＤマウス（Ｎｇｕｙｅｎら（１９９７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：９０１〜９０７、Ｓａｎｄｈｕら（１９９６）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：９５〜１１８、Ｅｒｅｎら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．９３：１５４〜１６１））の免疫化による。このような技術には、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４９３７〜４９４２、Ｈａｎｅｓら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１４１３０〜１４１３５）、単細胞抗体産生技術（例えば、選択リンパ球抗体法（「ＳＬＡＭ」）（米国特許第５，６２７，０５２号、Ｗｅｎら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：８８７〜８９２、Ｂａｂｃｏｏｋら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８４３〜７８４８））、ゲル微小滴及びフローサイトメトリー（Ｐｏｗｅｌｌら（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：３３３〜３３７、Ｏｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，（マサチューセッツ州ケンブリッジ市）、Ｇｒａｙら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．１８２：１５５〜１６３、及びＫｅｎｎｙら（１９９５）Ｂｉｏ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：７８７〜７９０）、Ｂ細胞選別（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓら（１９９４）Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｓ  １９：１２５〜１３４）を含むが、これらに限定せず、それらが全体としてすべての目的のために及び特に抗体産生方法と関連するすべての教示について参照により本明細書により組み込まれる。
【０１０５】
本発明の抗体誘導体は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを適切な宿主へ送達して、齧歯類、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びこれらに類するもののような、トランスジェニック動物または哺乳類動物の乳または血清中にこのような抗体を産生する当該トランスジェニック動物または哺乳類動物を提供することによって調製することもできる。これらの方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、それらが全体としてすべての目的のために及び特に抗体を作製することと関連したすべての教示について参照により本明細書により組み込まれる米国特許第５，８２７，６９０号、第５，８４９，９９２号、第４，８７３，３１６号、第５，８４９，９９２号、第５，９９４，６１６号、第５，５６５，３６２号、及び第５，３０４，４８９号において説明されている。
【０１０６】
「抗体誘導体」という用語には、当該抗体またはフラグメントの直鎖ポリペプチド配列に対する翻訳後修飾を含む。例えば、その全体がすべての目的のために及び特に抗体の修飾と関連したすべての教示について参照により本明細書により組み込まれる米国特許第６，６０２，６８４  Ｂ１号は、抗体全体の分子、抗体フラグメント、または高いＦｃ仲介性細胞毒性を有する免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質を含む、抗体の修飾されたグリコール形態の作製方法、及びそのように作製された糖タンパク質を説明している。
【０１０７】
抗体誘導体は、本発明のポリヌクレオチドを送達して、このような抗体、指定した部分またはバリアントをトランスジェニック植物の複数の部分またはそこから培養した細胞（例えば、タバコ、トウモロコシ、及びアオウキクサ）において産生する当該トランスジェニック植物及び培養植物細胞を提供することによって調製することもできる。例えば、Ｃｒａｍｅｒら（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０：９５〜１１８及びそこに引用されている参考文献は、例えば誘導性プロモーターを使用して多量の組換えタンパク質を発現するトランスジェニックタバコ葉の作出を説明している。トランスジェニックトウモロコシは、商業的産生レベルで、他の組換え系において作出されたものまたは天然源から精製されたものと等価の生物活性を有する哺乳類タンパク質を発現させるために使用されてきた。例えば、Ｈｏｏｄら（１９９９）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４６４：１２７〜１４７及びそこに引用されている参考文献を参照されたい。抗体誘導体は、タバコ種子及びジャガイモ塊茎を含む、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）のような抗体フラグメントを含むトランスジェニック植物種子からも多量に産生されてきた。例えば、Ｃｏｎｒａｄら（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：１０１〜１０９及びそこに引用されている参考文献を参照されたい。したがって、本発明の抗体は、公知の方法により、トランスジェニック植物を用いて産生することもできる。
【０１０８】
抗体誘導体は、例えば、外来性配列を付加して免疫原性を修飾し、または結合、親和性、オンレート、オフレート、結合活性、特異性、半減期、若しくは任意の他の適切な特徴を低下、亢進若しくは修飾することによって作製することもできる。概して、非ヒトまたはヒトＣＤＲ配列の部分または全部は、可変部及び定常部の非ヒト配列がヒトまたは他のアミノ酸と置き換えられながらも維持される。
【０１０９】
概して、ＣＤＲ残基（抗体フラグメントの一例）は、影響する抗原結合に直接的にかつ最も実質的に関与する。本発明の抗体のヒト化または工学は、それらが全体としてすべての目的のために及び特に抗体のヒト化または工学と関連したすべての教示について参照により本明細書により組み込まれる米国特許第５，７２３，３２３号、第５，９７６，８６２号、第５，８２４，５１４号、第５，８１７，４８３号、第５，８１４，４７６号、第５，７６３，１９２号、第５，７２３，３２３号、第５，７６６，８８６号、第５，７１４，３５２号、第６，２０４，０２３号、第６，１８０，３７０号、第５，６９３，７６２号、第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，２２５，５３９号、及び第４，８１６，５６７号において説明されるもののような任意の公知の方法を用いて実施することができるが、これらに限定しない。
【０１１０】
ヒト抗体を部分的にから完全にまで作製するための技術は、当該技術分野で公知であり、任意のこのような技術は使用することができる。一実施形態によると、完全ヒト抗体配列は、ヒト重鎖及び軽鎖抗体遺伝子を発現するよう操作した、マウスのようなトランスジェニック齧歯類動物において作製される。異なるクラスの抗体を産生することのできるこのようなトランスジェニックマウスの複数の系統は作出されてきた。所望の抗体を産生するトランスジェニックマウス由来のＢ細胞は、所望の抗体の持続的な産生のためにハイブリドーマ細胞株を作製するよう融合させることができる（例えば、Ｒｕｓｓｅｌら（２０００）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６８（４）：１８２０〜１８２６、Ｇａｌｌｏら（２０００）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎ．３０：５３４〜５４０、Ｇｒｅｅｎ（１９９９）Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１〜２３、Ｙａｎｇら（１９９９Ａ）Ｊ．ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６６：４０１〜４１０、Ｙａｎｇ（１９９９Ｂ）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９（６）：１２３６〜１２４３、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９８）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３１：３３〜４２、Ｇｒｅｅｎ及びＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８（３）：４８３〜４９５、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９８）Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ  ７（４）：６０７〜６１４、Ｔｓｕｄａら（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４２：４１３〜４２１、Ｓｈｅｒｍａｎ−Ｇｏｌｄ（１９９７）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ  １７（１４）、Ｍｅｎｄｅｚら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６〜１５６、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９６）Ｗｅｉｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  第ＩＶ巻，１９４．１〜１９４．７、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：５６１〜５６６、Ｍｅｎｄｅｚら（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２６：２９４〜３０７、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４（８）：７６１〜７６３、Ａｒｂｏｎｅｓら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １（４）：２４７〜２６０、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６２（６４１７）：２５５〜２５８、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（６）：２５５１〜２５５５、ならびに米国特許第６，０７５，１８１号を参照されたい）。
【０１１１】
本発明の抗体は、キメラ抗体を作製するために修飾することもできる。キメラ抗体とは、抗体の重鎖及び軽鎖の種々のドメインンが１つを超える種由来のＤＮＡによってコードされたものである。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい。
【０１１２】
あるいは、本発明の抗体は、覆い隠した抗体を作製するために修飾することもできる。覆い隠した抗体とは、１つの種の抗体の外部のアミノ酸残基が、第二の種のものと思慮深く置き換えられまたは「覆い隠され」、それにより第一の種の抗体が第二の種において免疫原性ではなくなり、それにより抗体の免疫原性を低下させたものである。タンパク質の抗原性は主として、その表面の性質に依存しているので、抗体の免疫原性は、別の哺乳類種の抗体において通常認められるものとは異なる露出した残基を置き換えることによって低下し得る。外部残基のこの思慮深い置き換えは、内部ドメインまたはドメイン間結合にほとんどまたはまったく効果を及ぼさない。したがって、リガンド結合特性は、可変部フレームワーク残基に限定された変化の結果として影響されないべきである。当該過程は、抗体の外側表面または皮膚が変化するのみで、支持している残基は邪魔されないままであるので、「覆い隠し（ベニヤリング）」と呼ぶ。
【０１１３】
「覆い隠し（ベニヤリング）」のための手順には、Ｋａｂａｔら（１９８７）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第４版によって編集されたヒト抗体可変部についての入手可能な配列データ、メリーランド州ベセスダ地区にある米国国立衛生研究所、このデータベースに対する更新、ならびに他のアクセス可能な米国及び他国のデータベース（核酸及びタンパク質の両方）が使用される。覆い隠された抗体を作製するのに使用する方法に関する非限定例としては、欧州特許第５１９５９６号、米国特許第６，７９７，４９２号及びＰａｄｌａｎら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８（４〜５）：４８９〜４９８において説明されたものが挙げられる。
【０１１４】
「抗体誘導体」という用語には、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントである「ダイアボディ」も含み、この中で、フラグメントは、同じポリペプチド鎖において軽鎖可変部（ＶＬ）へ結合した重鎖可変部（ＶＨ）を含む（例えば、欧州特許第４０４，０９７号、ＷＯ９３／１１１６１、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８を参照されたい）。同じ鎖における２つのドメイン間で対形成を許容するには短すぎるリンカーを用いることによって、ドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対形成して２つの抗原結合部位を作らざるを得ない（親抗体の超可変部へ挿入された１つ以上のアミノ酸を有する抗体バリアント及び抗原に対する親抗体の結合親和性よりも少なくとも約２倍強い標的抗原に対する結合親和性を開示している、Ｃｈｅｎらに対する米国特許第６，６３２，９２６号も参照されたい）。
【０１１５】
「抗体誘導体」という用語にはさらに、「線形抗体」を含む。線形抗体を作るための手順は、当該技術分野で公知であり、Ｚａｐａｔａら（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７〜１０６２において説明されている。簡潔には、これらの抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対の直列のＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ  １−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線形抗体は、二重特異的または単一特異的であることができる。
【０１１６】
本発明の抗体は、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム若しくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含むがこれらに限定しない公知の方法によって、組換え細胞培養物から収集及び精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）も精製に使用することができる。
【０１１７】
本発明の抗体には、天然に精製された生成物、化学合成手順の生成物、ならびに例えば、酵母、より高等の植物、昆虫及び哺乳類細胞を含む真核宿主から、またはそれに代わるものとして先に説明した原核細胞から組換え技術によって作製された生成物を含む。
【０１１８】
検査中のモノクローナル抗体がタンパク質またはポリペプチドと結合している場合、検査中の抗体及び本発明のハイブリドーマによって提供される抗体は等価である。抗体が本発明のモノクローナル抗体と同じ特異性を有しているかどうかは、検査中の抗体が本発明のモノクローナル抗体を、当該モノクローナル抗体が通常反応するタンパク質またはポリペプチドを結合することを防止するかどうかを検討することによって、過度の実験なしで判定することもできる。検査中の抗体が、本発明のモノクローナル抗体による結合の低下によって示されるように本発明のモノクローナル抗体と競合する場合、当該２つの抗体は、同じまたは密接に関連するエピトープへ結合するらしい。あるいは、本発明のモノクローナル抗体を当該抗体が通常反応するタンパク質とプレインキュベートして、検査中のモノクローナル抗体が抗原を結合する能力において阻害されるかどうかを判定することができる。検査中のモノクローナル抗体が阻害される場合、当該抗体は、すべての尤度において、本発明のモノクローナル抗体と同じまたは密接に関連したエピトープ特異性を有している。
【０１１９】
「抗体」という用語は、すべてのアイソタイプの抗体を含むよう企図される。特定のアイソタイプのモノクローナル抗体は、初期融合から選択することによって直接的に調製し、同胞選択技術を用いることによって異なるアイソタイプのモノクローナル抗体を分泌する親ハイブリドーマから二次的に調製して、Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：８６５３またはＳｐｉｒａら（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７４：３０７において説明される手順を用いてクラス転換バリアントを単離することができる。
【０１２０】
本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を分泌する他のハイブリドーマの単離は、抗イディオタイプ抗体を作製することによって当業者によって達成することもできる（Ｈｅｒｌｙｎら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：１００）。抗イディオタイプ抗体とは、関心対象のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体上に存在する独特な決定因子を認識する抗体である。
【０１２１】
２つのハイブリドーマのモノクローナル抗体間のイディオタイプの識別は、当該２つのモノクローナル抗体が、同じエピトープ決定因子の認識に関して同じであることを判定する。したがって、モノクローナル抗体上のエピトープ性決定因子に対して抗体を用いることによって、同じエピトープ特異性のモノクローナル抗体を発現する他のハイブリドーマを識別することが可能である。
【０１２２】
エピトープを模倣するモノクローナル抗体を作製するために抗イディオタイプ技術を使用することも可能である。例えば、第一のモノクローナル抗体に対して作製された抗イディオタイプモノクローナル抗体は、当該第一のモノクローナル抗体によって結合されるエピトープの鏡像である超可変部における結合ドメインを有するであろう。したがって、この場合において、抗イディオタイプモノクローナル抗体は、これらの抗体の作製のための免疫化に使用され得る。
【０１２３】
本発明のいくつかの態様において、当該抗体を検出可能にまたは治療用に標識することは有用であろう。これらの作用因子に対する抗体の結合方法は、当該技術分野で公知である。説明目的のみのため、抗体は、放射性原子、発色団、フルオロフォア、またはこれらに類するもののような検出可能な部分を用いて標識することができる。このような標識した抗体は、インビボで、または単離した検査試料中のいずれかで、診断技術のために使用することができる。
【０１２４】
低分子量ハプテンに対する抗体のカップリングは、アッセイにおける抗体の感度を高めることができる。次に、当該ハプテンは、第二の反応によって特異的に検出することができる。例えば、アビジンと反応するビオチン、またはジニトロフェノール、ピリドキサル、及びフルオレセインのようなハプテンを使用することは普遍的であり、これらは、特異的抗ハプテン抗体と反応することができる。Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）上述を参照されたい。
【０１２５】
本発明の抗体は、多くの異なる担体へ結合することもできる。したがって、本発明は、抗体及び活性のあるまたは不活性の別の物質を含有する組成物も提供する。周知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースならびにマグネタイトが挙げられる。当該担体の性質は、本発明の目的のために可溶性または不溶性であることができる。当業者は、モノクローナル抗体を結合するための他の適切な担体を知っているであろうし、または所定の実験を用いて当該担体を確認することができるであろう。
【０１２６】
ある実施形態において、本発明の抗体には、当該抗体の薬物動態特性を改良する定常部における突然変異を有さない抗体と比較して、当該突然変異を含む。このような抗体にはある実施形態において、Ｃ末端でヒトＩｇＧ１に由来するＦｃドメインを含み、さらにさらなる実施形態において、当該抗体には、抗体依存的及び補体依存的細胞毒性を減弱または欠失させる突然変異を含む。なおもさらなる実施形態において、このような突然変異には、次の突然変異、すなわち、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、ΔＧ２３６、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓの１つ以上を単一でまたは任意の組み合わせで含む。さらにさらなる実施形態において、Ｆｃドメインは、図１０に示す配列番号３による配列を含む。なおもさらなる実施形態において、Ｆｃドメインは、配列番号３と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％の同一性の配列同一性を有する配列を含む。
【０１２７】
さらなる実施形態において、１つ以上のアミノ酸修飾は、当該抗体のＣＤＲの１つ以上においてなされる。概して、１または２または３のアミノ酸しか、任意の単一のＣＤＲにおいて置換されず、概して、４、５、６、７、８  ９、または１０以下の変化が１セットのＣＤＲ内でなされる。しかしながら、任意のＣＤＲにおける置換無し、１、２または３の置換の任意の組み合わせが独立してかつ任意の他の置換と任意に組み合わされることができることは認識されるべきである。
【０１２８】
いくつかの場合において、ＣＤＲにおけるアミノ酸修飾は、「親和性成熟」と呼ばれる。「親和性の成熟した」抗体とは、抗原に対する抗体の親和性における改良を結果として生じる１つ以上のＣＤＲにおける１つ以上の変化を有さない親抗体と比較して、当該変化を有するものである。いくつかの場合において、まれではあるが、抗体の抗原に対する親和性を低下させることは望ましくあるかもしれないが、このことは概して好ましくはない。
【０１２９】
親和性成熟は、「親抗体」と比較して少なくとも約１０％から５０〜１００〜１５０％またはそれより多く、または１〜５倍抗原に対する抗体の結合親和性を高めるよう実施することができる。好ましい親和性成熟した抗体は、標的抗原に対してナノモルのまたはさらにはピコモルの親和性を有するであろう。親和性成熟した抗体は、公知の手順によって作製される。例えば、重鎖可変部（ＶＨ）及び軽鎖可変部（ＶＬ）シャッフリングによる親和性成熟を説明するＭａｒｋｓら，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９〜７８３を参照されたい。ＣＤＲ及び／またはフレームワークの残基に関する無作為突然変異誘発は、例えば、Ｂａｒｂａｓら  １９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ９１：３８０９〜３８１３、Ｓｈｉｅｒら，１９９５，Ｇｅｎｅ  １６９：１４７〜１５５、Ｙｅｌｔｏｎら，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４〜２００４、Ｊａｃｋｓｏｎら，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０〜３３１９、及びＨａｗｋｉｎｓら，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９〜８９６において説明されている。
【０１３０】
あるいは、アミノ酸修飾は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を有意に変化させない「サイレント」である本発明の抗体のＣＤＲの１つ以上において実施することができる。これらは、（本発明の抗体をコードする核酸について実施することができるように）発現を最適化することを含むいくつかの理由のために実施することができる。
【０１３１】
したがって、本発明のＣＤＲ及び抗体の定義内に含まれるのは、バリアントＣＤＲ及びバリアント抗体であり、すなわち、本発明の抗体には、Ａｂ７９及びＡｂ１９のＣＤＲの１つ以上におけるアミノ酸修飾を含むことができる。加えて、後で概略するように、アミノ酸修飾は、フレームワーク及び定常部を含む、ＣＤＲの外側の任意の領域において独立してかつ任意に実施することもできる。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、抗体・薬剤複合体（ＡＤＣ）を形成するよう薬剤と結合する。概して、ＡＤＣは、癌の応用において使用されており、当該応用において、細胞毒性薬または細胞分裂阻害薬の局所送達のための抗体・薬剤複合体の使用は、腫瘍に対する薬剤部分の標的化送達を可能にし、そのことは、より高い効能、より低い毒性などを可能にすることができる。この技術に関する概略は、それらのすべてが全体としてすべての目的のために及び特に抗体・薬剤複合体に関連したすべての教示について参照により本明細書により組み込まれるＤｕｃｒｙら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２１：５〜１３（２０１０）、Ｃａｒｔｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．１４（３）：１５４（２００８）及びＳｅｎｔｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３：２３５〜２４４（２００９）において提供されている。
【０１３３】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、薬剤と共役したＴｏｓｏ抗体を提供する。概して、共役は、当該抗体への共有結合によってなされ、概して、リンカー、しばしばペプチド結合（当該技術分野で公知のように、標的部位におけるプロテアーゼによる分解に対して感受性があるよう設計されることがあり、またはそうでないことがある）による。加えて、先に説明したように、リンカー・薬剤単位（ＬＵ−Ｄ）の結合は、抗体内でのシステインへの結合によってなされることができる。当業者によって認識されるであろうように、抗体あたりの薬剤部分の数は、反応条件に応じて変更することができ、１：１〜１０：１の薬剤：抗体に変化させることができる。当業者によって認識されるであろうように、実際の数は平均値である。
【０１３４】
ＡＤＣの薬剤は、任意の数の作用因子であることができ、これには、化学療法薬、増殖阻害薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の酵素活性のある毒素、あるいはこれらの断片）のような細胞毒性薬を含むがこれらに限定せず、または放射性同位体（すなわち、放射性共役体）が提供される。他の実施形態において、本発明はさらに、ＡＤＣの使用方法を提供する。
【０１３５】
本発明の抗体・薬剤共役体の使用のための薬剤には、細胞毒性薬、特に癌療法に使用するものを含む。このような薬剤には概して、ＤＮＡ損傷薬、代謝拮抗薬、天然産物及びこれらの類似体を含む。細胞毒性薬の例示的なクラスとしては、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害薬のような酵素阻害薬、及びチミジル酸シンターゼ阻害薬、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ切断薬、トポイソメラーゼ阻害薬、薬剤のアントラサイクリンファミリー、ビンカ薬、マイトマイシン、ブレオマイシン細胞毒性ヌクレオシド、薬剤のプテリジンファミリー、ジサイネン（ｄｉｃｙｎｅｎｅ）、ポドフィロトキシン、ドラスタチン、マイタンシノイド、分化誘導薬、及びタキソールが挙げられる。
【０１３６】
これらのクラスのメンバーには例えば、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、ロイロシン、ロイロシデイン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトマイシンＣ、ミトマイシンＡ、カルニノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシンならびにエトポシドまたはリン酸エトポシドのようなポドフィロトキシン誘導体、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソールを含むタキサン、タキソテレレチノイン酸、酪酸、Ｎ８−アセチルスペルミジン、カンプトテシン、カリケアマイシン、エスペラマイシン、エンジイン、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、カリケアマイシン、カンプトテシン、マイタンシノイド（ＤＭ１を含む）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、ならびにマイタンシノイド（ＤＭ４）、ならびにこれらの類似体を含む。
【０１３７】
毒素は、酵素・毒素共役体として使用してもよく、ジフテリア毒素、リシンのような植物毒素、ゲルダナマイシンのような小分子毒素（Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００）Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３〜１５８１、Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：１０２５〜１０２８、Ｍａｎｄｌｅｒら（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：７８６〜７９１）、マイタンシノイド（欧州特許第１３９１２１３号、Ｌｉｕら，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８６１８〜８６２３）、及びカリケアマイシン（Ｌｏｄｅら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２８、Ｈｉｎｍａｎら（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６〜３３４２）を含む。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、またはトポイソメラーゼ阻害を含む機序によって当該毒素の細胞毒性効果および細胞分裂停止効果を発揮し得る。
【０１３８】
Ｔｏｓｏ抗体及び、マイタンシノイド、ドラスタチン、オーリスタチン、トリコテセン、カリケアマイシン、及びＣＣ１０６５、ならびに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体のような１つ以上の小分子毒素からなる共役体は熟慮される。
【０１３９】
先のいずれかにしたがって、本発明の抗体に対してなすことのできる別のタイプの修飾は、グリコシル化における変化である。別の実施形態において、本明細書に開示する抗体は、１つ以上の操作した糖形態を含むよう修飾することができる。本明細書で使用する「操作した糖形態」によって意味するのは、抗体へ共有結合した炭水化物組成物であり、この中で、当該炭水化物組成物は、親抗体のものとは化学的に異なっている。操作した糖形態は、エフェクター機能を亢進させることまたは低下させることを含むがこれらに限定しない種々の目的に有用であり得る。操作した糖形態の例示的な形態は、アフコシル化であり、これは、おそらくＦｃγＲＩＩＩａ受容体へのより密な結合を通じて、ＡＤＣＣ機能の亢進と相関しているように示されてきた。この脈絡で、「アフコシル化」は、宿主細胞において産生される抗体の大部分がフコースを実質的に欠いていること、例えば、産生された抗体の９０〜９５〜９８％が、（概してＦｃ領域におけるＮ２９７において結合した）抗体の炭水化物部分の構成要素として適切なフコースを有していないことを意味している。機能的に定義されるように、アフコシル化抗体は概して、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体への少なくとも５０％以上の高い親和性を呈する。
【０１４０】
操作した糖形態は、当該技術分野で公知の種々の方法によって作製してもよい（それらがすべて全体としてすべての目的のために及び特に操作した糖形態と関連したすべての教示について参照により完全に組み込まれるＵｍａｎａら，１９９９，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：１７６〜１８０、Ｄａｖｉｅｓら，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７４：２８８〜２９４、Ｓｈｉｅｌｄｓら，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３〜２６７４０、Ｓｈｉｎｋａｗａら，２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６〜３４７３、米国特許第６，６０２，６８４号、米国出願番号第１０／２７７，３７０号、米国出願番号第１０／１１３，９２９号、ＰＣＴ  ＷＯ００／６１７３９Ａ１、ＰＣＴ  ＷＯ０１／２９２４６Ａ１、ＰＣＴ  ＷＯ０２／３１１４０Ａ１、ＰＣＴ  ＷＯ０２／３０９５４Ａ１）。これらの技術の多くは、例えば、操作したまたはさもなくば種々の生体または細胞株（例えば、Ｌｅｃ−１３ＣＨＯ細胞またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞）においてＩｇＧを発現させることによって、グリコシル化経路（例えば、ＦＵＴ８［□１，６−フコシルトランスフェラーゼ］及び／またはβ１−４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ［ＧｎＴＩＩＩ］）に関与する酵素を調節することによって、あるいはＩｇＧが発現した後に炭水化物（類）を修飾することによって、Ｆｃ領域へ共有結合したフコシル化した及び／または二分するオリゴ糖のレベルを制御することに基づいている。例えば、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓの「糖操作した抗体」または「ＳＥＡ技術」は、産生中にフコシル化を阻害する修飾した糖類を添加することによって機能し、例えば、その全体が参照により本明細書により組み込まれる２００９０３１７８６９を参照されたい。操作した糖形態は典型的には、異なる炭水化物またはオリゴ糖を指し、したがって、抗体は、操作した糖形態を含むことができる。
【０１４１】
あるいは、操作した糖形態は、異なる炭水化物またはオリゴ糖を含むバリアントを指すことがある。当該技術分野で公知のように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在または非存在であり、以下に論議）、またはタンパク質が産生される宿主細胞若しくは生体の両方によることができる。特定の発現系は、当該技術分野で公知であり、本明細書で論議される。
【０１４２】
ポリペプチドのグリコシル化は典型的には、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作る。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も普遍的にはセリンまたはトレオニンへの、糖類の１つであるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用してもよい。
【０１４３】
抗体に対する（または先に論議した可溶性Ｔｏｓｏタンパク質のような任意の他のポリペプチドに対する）グリコシル化部位の付加は、（Ｎ結合グリコシル化部位について）上記のトリペプチド配列の１つ以上を含有するようアミノ酸配列を変化させることによって簡便に達成される。当該変化は、（Ｏ結合グリコシル化部位について）出発配列に対する１つ以上のセリン残基またはトレオニン残基の付加またはこれによる置換によっても実施してもよい。簡便さのため、抗体アミノ酸配列は好ましくは、ＤＮＡにおける変化を通じて、特に所望のアミノ酸へと翻訳されるであろうコドンが生じるような事前に選択しておいた塩基における標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを突然変異させることによって変化する。
【０１４４】
抗体または別のタンパク質に関する炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、当該タンパク質のグリコシドの化学的または酵素によるカップリングによる。これらの手順は、Ｎ結合及びＯ結合グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞におけるタンパク質の産生を必要としない点で有利である。使用するカップリング様式に応じて、糖（類）は、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのそれのような遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン、またはヒドロキシプロリンのそれのような遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンのそれのような芳香族残基、あるいは（ｆ）グルタミンのアミド基へ結合することがある。これらの方法は、ＷＯ８７／０５３３０において、ならびにＡｐｌｉｎ及びＷｒｉｓｔｏｎ，１９８１，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５９〜３０６頁において説明されており、両方ともそれらのすべてが全体としてすべての目的のために及び特にタンパク質へ炭水化物部分をカップリングさせることに関連するすべての教示について参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【０１４５】
出発抗体に存在する炭水化物部分の除去（例えば、翻訳後に）は、化学的にまたは酵素により達成してもよい。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価の化合物への当該タンパク質の曝露を必要とする。この処置は結果的に、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外のほとんどまたはすべての糖類の切除を生じ、その間ポリペプチドは無処置のままである。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら，１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２によって、及びにＥｄｇｅら，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１よって説明されており、両方とも参照により完全に組み込まれる。ポリペプチドにおける炭水化物部分の酵素による切断は、参照により完全に組み込まれるＴｈｏｔａｋｕｒａら，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０によって説明される種々のエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用によって達成することができる。潜在的なグリコシル化部位におけるグリコシル化は、参照により完全に組み込まれるＤｕｓｋｉｎら，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５によって説明される化合物ツニカマイシンの使用によって防止してもよい。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成を遮断する。
【０１４６】
当該抗体の別のタイプの共有結合修飾は、そのすべてが全体としてすべての目的のために及び特に抗体をポリマーへ結合させることに関連するすべての教示について参照により完全に組み込まれるＮｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ製の２００５〜２００６年ＰＥＧカタログ（Ｎｅｋｔａｒのウェブサイトで入手可能）、米国特許第４，６４０，８３５号、第４，４９６，６８９号、第４，３０１，１４４号、第４，６７０，４１７号、第４，７９１，１９２号または第４，１７９，３３７号において示される様式で、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンのような種々のポリオールを含むがこれらに限定しない種々の非タンパク質性ポリマーへ抗体を結合させることを含む。加えて、当該技術分野で公知のように、アミノ酸置換は、抗体内の種々の一において実施され、ＰＥＧのようなポリマーの付加を容易にすることがある。例えば、参照により完全に組み込まれる米国公開第２００５／０１１４０３７Ａ１号を参照されたい。
【０１４７】
本発明にはさらに、本発明のＴｏｓｏ抗体をコードする核酸を含む。重鎖及び軽鎖の両定常部が抗体の中に含まれる場合、概して当該定常部は、各々をコードする核酸を用いて作製され、当該核酸は標準的な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞など）へ組み込まれ、当該抗体の四量体構造を作製する。唯一の定常部が作製中の場合、単一の核酸のみが使用されるであろう。
【０１４８】
本発明にしたがって使用する抗体の製剤は、所望の純度を有する抗体を、凍結乾燥した製剤または水溶液の形態で、任意の医薬として許容され得る担体、賦形剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編［１９８０］）と混合することによって、保存のために調製することができる。許容され得る担体、賦形剤、または安定化剤は、採用する薬用量及び濃度で受け手に対して非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸のような緩衝液、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化物質、保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール、メチルパラベン若しくはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールのような）、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリンのようなタンパク質、ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンのようなアミノ酸、単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールのような糖、ナトリウムのような塩形成対イオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）、ならびに／あるいはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を含む。
【０１４９】
本発明の製剤は、治療中の特定の徴候に必要な１つを越える活性化合物も含有してもよく、好ましくは、互いに有害に影響しない相補的な活性を有するものである。例えば、他の特異性を有する抗体を提供することは望ましいかもしれない。あるいは、または加えて、当該組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン、増殖阻害薬及び／または小分子アンタゴニストを含んでもよい。このような複数の分子は、意図する目的に有効な量で組み合わせで適切に存在する。
【０１５０】
有効成分は、例えば、コアセルベーション技術によってまたは界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリラート）マイクロカプセルの中にそれぞれ、コロイド状薬送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中にまたはマクロエマルション中にも封入されてもよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）において開示されている。
【０１５１】
インビボでの投与に使用することになっている製剤は、滅菌済みであるべきでありまたはほぼそれであるべきである。このことは、濾過滅菌膜を通じての濾過によって容易に達成される。
【０１５２】
徐放性調製物は調製されてもよい。徐放性調製物の適切な例としては、成形した物品の形態、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態にある。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ型グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ型グルタミン酸からなるコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）のような分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸のようなポリマーが１００日間にわたって分子の放出を可能にする一方で、あるヒドロゲルは、より短い期間、タンパク質を放出する。
【０１５３】
封入した抗体が体内に長時間残留する場合、当該抗体は、３７℃での湿気への曝露の結果として変性または凝集することがあり、結果的に、生物活性の喪失及び免疫原性の起こり得る変化を生じる。合理的な戦略は、包含される機序による安定化を考案することができる。例えば、凝集機序がチオ−ジスルフィド相互交換を通じての分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが示された場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥させること、湿気含有量を制御すること、適切な添加剤を用いること及び特異的ポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成されてもよい。
【０１５４】
（ＩＩＣ．可溶性Ｔｏｓｏタンパク質）
本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質（本明細書では相互交換可能に「可溶性Ｔｏｓｏ受容体」、「Ｔｏｓｏ−Ｆｃ」、及び「可溶性Ｔｏｓｏポリペプチド」とも呼ぶ）には、Ｔｏｓｏ受容体の細胞外ドメインの全部または部分を含む。本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質には、さらなる実施形態において、シグナルドメイン及び／またはＦｃドメインを含む。本明細書でさらに詳細に論議するように、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質のこれらの構成要素は、追加の構成要素及び／または修飾を有するまたは有さない任意の方法で組み合わされて、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を提供してもよい。
【０１５５】
一態様において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、Ｔｏｓｏの細胞外ドメインを含む。なおもさらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、ヒトＴｏｓｏアイソフォームａの細胞外ドメインを含む。ヒトＴｏｓｏの細胞外ドメインは、ヒトＴｏｓｏアイソフォームａであるＮＰ＿００５４４０．１のアミノ酸Ｐ２１〜Ｇ２５１に及ぶと推定される（全体としてすべての目的のために及び特にＴｏｓｏの細胞外ドメインに関連したすべての教示について本明細書により組み込まれるＳｈｉｍａら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１０を参照されたい）。明確にする目的のために、本明細書での論議の大部分は、ヒトＴｏｓｏタンパク質の細胞外ドメインの全部または部分を含む可溶性Ｔｏｓｏタンパク質に方向づけられる。しかしながら、任意の種由来のＴｏｓｏタンパク質の細胞外ドメインが本明細書の説明にしたがって可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を作製するために使用することができることは認識されるであろうし、本明細書で論議したヒトＴｏｓｏタンパク質の複数の領域に対応する別の種由来のＴｏｓｏタンパク質の複数の領域を識別することは、当業者の能力内に十分あるであろう。
【０１５６】
一実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号１による細胞外ドメイン配列を含み、これは図１に示す。さらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号１と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％の配列同一性を有する。なおもさらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号１における１〜７５、２〜７０、３〜６５、４〜６０、５〜５５、６〜５０、７〜４５、８〜４０、９〜３５、１０〜３０、１１〜２５、１２〜２０、１３〜１５、５〜２０、６〜１８、８〜１６、１０〜１４のアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。さらにさらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号１における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０のアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。
【０１５７】
一実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号８による細胞外ドメイン配列を含み、これは図１に示す。さらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号８と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％の同一性の配列同一性を有する。なおもさらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号８における１〜７５、２〜７０、３〜６５、４〜６０、５〜５５、６〜５０、７〜４５、８〜４０、９〜３５、１０〜３０、１１〜２５、１２〜２０、１３〜１５、５〜２０、６〜１８、８〜１６、１０〜１４のアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。さらにさらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号８における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０のアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。
【０１５８】
さらなる実施形態において及び先のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質には、配列番号７のアミノ酸１８〜２５３を含む。なおもさらなる実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質には、配列番号７のアミノ酸２１〜２５３を含む。なおもさらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質には、配列番号７のアミノ酸２１〜２５１を含む。さらにさらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質には、配列番号７に由来するアミノ酸の次の範囲、すなわち１〜２５５、５〜２４５、１０〜２３５、１５〜２２５、２０〜２１５、２５〜２０５、３０〜１９５、３５〜１８５、４０〜１７５、４５〜１６５、５０〜１５５、４５〜１４５、４０〜１３５、３５〜１２５、３０〜１１５、３５〜１０５、４０〜９５、４５〜８５、５０〜７５、５５〜６５のいずれかを含む。なおもさらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質には、配列番号７のアミノ酸１８〜２５３または２１〜２５３と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％の同一性の配列同一性を有する配列を含む。
【０１５９】
なおもさらなる実施形態において及び先のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質には、図１に示す配列番号８の全部または部分を含む。なおもさらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質には、配列番号８のアミノ酸１〜２３１、６〜２２１、１１〜２１１、１６〜２０１、２１〜１９１、２６〜１８１、３１〜１７１、３６〜１６１、４１〜１５１、４６〜１４１、５１〜１３１、５６〜１２１、６１〜１１１、６６〜１０１、７１〜９１、７６〜８１を含む。さらにさらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質には、配列番号８のアミノ酸領域１〜２３１、６〜２２１、１１〜２１１、１６〜２０１、２１〜１９１、２６〜１８１、３１〜１７１、３６〜１６１、４１〜１５１、４６〜１４１、５１〜１３１、５６〜１２１、６１〜１１１、６６〜１０１、７１〜９１、７６〜８１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１６０】
さらにさらなる実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号８、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、及び２３の任意の１つを含む。なおもさらなる実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質には、配列番号８、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、及び２３と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％の同一性の配列同一性を有する配列を含む。これらの配列には、Ｔｏｓｏ受容体の細胞外ドメインの欠失バリアントを含む。
【０１６１】
なおもさらなる実施形態において及び先のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、Ｔｏｓｏタンパク質の完全な細胞外ドメインの欠失バリアントを含む。例示的な実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質の構成要素である欠失バリアントには、次のアミノ酸、すなわち１〜２１、１〜３５、１〜８７、１〜２１及び２１１〜２３１、１〜２１及び２１１〜２３１、１〜２１及び１５４〜２３１、１〜２１及び１０５〜２３１、ならびに１〜２１及び９３〜２３１の両方の領域の１つ以上が配列番号８から欠失したポリペプチドを含む。さらなる例示的な実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質の構成要素である欠失バリアントには、次のアミノ酸領域、すなわち１〜２１、１〜３５、１〜８７、１〜２１及び２１１〜２３１、１〜２１及び２１１〜２３１、１〜２１及び１５４〜２３１、１〜２１及び１０５〜２３１、ならびに１〜２１及び９３〜２３１の両方の領域の１つ以上が欠失した配列番号８によるポリペプチドに対する約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１６２】
さらなる実施形態において及び先のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質には、Ｔｏｓｏ受容体のリガンドへ結合する領域を含む細胞外ドメイン構成要素を含む。例示的な実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質には、ＩｇＭへ結合する細胞外ドメイン構成要素を含む。なおもさらなる実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質には、配列番号８のアミノ酸３５〜８７を含む。さらなる例示的な実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質には、配列番号８のアミノ酸２５〜１００、２９〜９５、３３〜９０、３７〜８５、４１〜８０、４５〜７５、４９〜７０、５３〜６５、または５７〜６０を含む。
【０１６３】
さらなる態様において及び先のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質には、先に論議した細胞外ドメイン構成要素を含み、さらにはシグナル配列を含む。例示的な実施形態において、シグナル配列は、宿主細胞からの分泌を亢進させる。なおもさらなる実施形態において、シグナル配列には、ＩＬ−２シグナル配列、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のα接合因子のプレ配列、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のα−アミラーゼシグナル配列、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）由来のグルコアミラーゼシグナル配列、ヒト由来の血清アルブミンシグナル配列、クルイベロミセス・マキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｘｉａｎｕｓ）由来のイヌリナーゼシグナル配列、サッカロミセス・セレビシアエ由来のインベルターゼシグナル配列、サッカロミセス・セレビシアエ由来のキラータンパク質シグナル配列、ニワトリ由来のリゾチームシグナル配列から選択されるメンバーを含むがこれらに限定しない。なおもさらなる実施形態において、シグナル配列は、図１に示す配列番号２による配列を含む。なおもさらなる実施形態において、シグナル配列は、配列番号２と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％の同一性の配列同一性を有する配列を含む。具体的な実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号１、８、９、１１、１３、１５、１７、２１及び２３の任意の１つまたは当該配列のバリアントを配列番号２を有する融合タンパク質として、あるいは配列番号２と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％の同一性の同一性を有する配列を有する融合タンパク質として含む。
【０１６４】
さらなる態様において及び先のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、Ｔｏｓｏ受容体の細胞外ドメイン及びＦｃドメインを含む。例示的な実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、ヒトＴｏｓｏタンパク質のアイソフォームＡの細胞外ドメイン及びＦｃドメインを含む融合タンパク質である。さらなる実施形態において、Ｆｃドメインには、Ｆｃドメインを有さないタンパク質と比較して、タンパク質の半減期を延長する任意のドメインを含む。なおもさらなる実施形態において、Ｆｃドメインには、Ｆｃドメインを有さないタンパク質と比較して、当該タンパク質の薬物動態特性を改良する任意のドメインを含む。なおもさらなる実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｃ末端のヒトＩｇＧ１に由来し、それはさらにさらなる実施形態においては、抗体依存性及び補体依存性細胞毒性を減弱または欠失させる突然変異を含む。なおもさらなる実施形態において、このような突然変異には、次の突然変異、すなわち、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、ΔＧ２３６、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓの１つ以上を単一でまたは任意の組み合わせで含む。さらにさらなる実施形態において、Ｆｃドメインは、図１に示す配列番号３による配列を含む。なおもさらなる実施形態において、Ｆｃドメインは、配列番号３と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４ ％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％の同一性の配列同一性を有する配列を含む。
【０１６５】
さらなる例示的な実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、細胞外ドメイン構成要素及びＦｃドメイン構成要素の両方を含む融合タンパク質を含む。なおもさらなる例示的な実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号１、８、９、１１、１３、１５、１７、２１及び２３または当該配列のバリアントを、配列番号３を有する融合タンパク質として、または配列番号３と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％の同一性の同一性を有する配列を有する融合タンパク質として含む。
【０１６６】
一態様において及び先のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、細胞外Ｔｏｓｏドメイン、シグナル配列及びＦｃドメインを含み、当該構成要素の各々は、任意の組み合わせでこれらの構成要素に関する上記のバージョンのいずれかを含んでもよい。なおもさらなる実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、図１に示す配列番号５による配列を含む。なおもさらなる実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号５と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％の同一性の配列同一性を有する配列を含む。
【０１６７】
さらなる実施形態において及び先のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、細胞外ドメイン構成要素、シグナル配列、及びＦｃドメインを含む、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４の任意の１つによる配列を含む。さらなる実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４の任意の１つと約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【０１６８】
さらなる態様において及び先のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質にはさらに、Ｔｏｓｏ細胞外ドメイン構成要素とＦｃドメインの間に、Ｔｏｓｏ細胞外ドメイン構成要素とシグナル配列の間に、またはＴｏｓｏ細胞外ドメイン構成要素とＦｃドメインの間、及びＴｏｓｏ細胞外ドメイン構成要素とシグナル配列の間の両方に、リンカーを含んでもよい。例示的な実施形態において、このようなリンカーは、アミノ酸リンカー、ポリマーリンカー、または２つのアミノ酸配列を互いに結合するのに有効であるための当該技術分野で公知の任意の他のリンカーであってもよい。さらなる例示的な実施形態において、リンカーは、アミノ酸リンカーである。なおもさらなる実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列ＩＳＡＭＶＲＳ（配列番号２５）である。さらにさらなる実施形態において、リンカーは、１、２、３、４、５、または６のアミノ酸置換を含有する配列番号２５のバリアントである。
【０１６９】
さらなる実施形態において及び先のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質のバリアントは、配列番号５、６、または８〜２４を含む、本明細書で論議する可溶性Ｔｏｓｏタンパク質のいずれかのアミノ酸配列の修飾を通じて作製することができる。このような修飾は、当該技術分野における任意の公知の技術、例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ系突然変異誘発を用いて達成することができる。このような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州プレインビュー地区，１９８９及びＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ニューヨーク州ニューヨーク市，１９８９において説明されており、これらの各々は全体としてすべての目的のために及び特にタンパク質バリアントを形成することと関連したすべての教示について参照により組み込まれる。
【０１７０】
なおもさらなる実施形態において及び先のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、単量体形態または多量体形態にあってもよく、この中で、多量体の各単量体は、単一の細胞外ドメイン配列を含む。さらなる実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多数の単量体からなる多量体である。具体的な実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、６つの単量体からなる多量体である。さらなる実施形態において、六量体Ｔｏｓｏ多量体は、六量体化タグを含む単量体から形成される。さらなる実施形態において、六量体化タグは、それがすべての目的のために及び特に六量体化タグまたは他の多量体化タグと関連したすべての教示について参照により本明細書により組み込まれるＨｉｒａｎｏら，Ｂｌｏｏｄ（２００６）において説明されるヒトＩｇＡアルファ重鎖定常部由来の２１個のアミノ酸尾部を含む。さらにさらなる実施形態において、本発明の六量体化タグには、図１に示す配列番号４による配列を含む。
【０１７１】
さらなる実施形態において及び先のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は当該タンパク質の１つ以上の機能的特性を変化させるよう修飾される。例示的な実施形態において、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は化学的に修飾される。例えば、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、そのインビボでの安定性を改良し及び／またはその薬物動態特性を変化させるために、１つ以上のポリマーを用いて修飾してもよい。このようなポリマーには、それらのすべてが全体としてすべての目的のために及び特にポリマーへタンパク質を結合させることと関連したすべての教示について参照により本明細書により組み込まれる米国特許第４，６４０，８３５号、第４，４９６，６８９号、第４，３０１，１４４号、第４，６７０，４１７号、第４，７９１，１９２号、または第４，１７９，３３７号に示す様式で、種々の非タンパク質性ポリマーの１つ以上、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンを含むが、これらに限定しない。
【０１７２】
本発明の範囲内に含まれるＴｏｓｏ可溶性タンパク質の修飾には、当該配列のいずれかにしたがったＴｏｓｏポリぺプチドの標的となったアミノ酸残基及び先に論議した可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を、Ｔｏｓｏポリペプチドの選択した側鎖またはＮ末端残基若しくはＣ末端残基と反応することのできる有機誘導体化剤と反応させることを含む。普遍的に使用される架橋剤には、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸を有するエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオン酸）のようなジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミド及びメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミダートのような作用因子を含む。
【０１７３】
他の修飾には、対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基それぞれへのグルタミニル残基及びアスパラギニル残基の脱アミド化、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル残基またはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン側鎖、アルギニン側鎖、ヒスチジン側鎖の「−アミノ基」のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，７９〜８６頁（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０１７４】
本発明の範囲内に含まれる可溶性Ｔｏｓｏタンパク質の別のタイプの修飾は、当該ポリペプチドの天然グリコシル化パターンを変化させることを含む。「天然グリコシル化パターンを変化させること」は、天然配列Ｔｏｓｏポリペプチドにおいて認められる１つ以上の炭水化物を欠失すること、及び／または天然配列Ｔｏｓｏポリペプチドには存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味するよう、本明細書において目的のために企図される。
【０１７５】
Ｔｏｓｏ可溶性タンパク質へのグリコシル化部位の付加は、祖のアミノ酸配列を変化させることによって達成してもよい。当該変化は、例えば、（Ｏ連結型グリコシル化部位についての）天然配列可溶性Ｔｏｓｏタンパク質に対する１つ以上のセリン残基またはトレオニン残基の付加または当該残基による置換によって実行してもよい。可溶性Ｔｏｓｏタンパク質アミノ酸配列は、特に所望のアミノ酸へと翻訳されるであろうコドンが生じるように、事前に選択しておいた塩基においてＴｏｓｏ可溶性タンパク質をコードするＤＮＡを突然変異させることによって、ＤＮＡレベルでの変化を通じて任意に変化させてもよい。
【０１７６】
Ｔｏｓｏ可溶性タンパク質における炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的なまたは酵素によるカップリングによるものである。このような方法は、当該技術分野において、例えば、１９８７年９月１１日公開のＷＯ８７／０５３３０において、ならびにＡｐｌｉｎ及びＷｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５９〜３０６頁（１９８１）において説明されており、これらはそれらのすべてが全体としてすべての目的のために及び特にタンパク質における炭水化物部分を変化させることと関連したすべての教示について、参照により本明細書により組み込まれる。
【０１７７】
可溶性Ｔｏｓｏタンパク質に存在する炭水化物部分の除去は、化学的に、または酵素により、またはグリコシル化のための標的として機能するアミノ酸残基をコードするコドンの突然変異による置換によって達成してもよい。化学的脱グリコシル化技術は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２（１９８７）によって、及びＥｄｇｅら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）によって説明されている。ポリペプチドにおける炭水化物部分の酵素による切断は、そのすべての内容が全体としてすべての目的のために及び特にタンパク質における炭水化物部分を変化させることと関連したすべての教示について参照により本明細書により組み込まれるＴｈｏｔａｋｕｒａら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１３８：３５０（１９８７）によって説明される種々のエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用によって達成することができる。
【０１７８】
本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は別の異種性ポリペプチドまたはアミノ酸配列と融合したタンパク質を含むキメラ分子を形成する方法でも修飾してもよい。一実施形態において、このようなキメラ分子は、可溶性Ｔｏｓｏポリペプチドの、抗タグ抗体が選択的に結合することのできるエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは概して、Ｔｏｓｏポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に位置する。Ｔｏｓｏポリペプチドのこのようなエピトープタグの付いた形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体またはエピトープタグへ結合する別のタイプの親和性マトリックスを用いたアフィニティ精製によってＴｏｓｏポリペプチドを容易に精製することができる。代替的な実施形態において、キメラ分子は、Ｔｏｓｏポリペプチドと免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定領域との融合を含んでもよい。キメラ分子の二価形態のために、このような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域またはＧＳＴ融合物に対してであり得る。
【０１７９】
種々のタグポリペプチド及び当該タグポリペプチドの個々の抗体は、当該技術分野において周知である。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）タグまたはポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ、ｆｌｕ  ＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，８：２１５９〜２１６５（１９８８））、ｃ−ｍｙｃタグならびにそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７、及び９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎら，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３６１０〜３６１６（１９８５））。ならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）：５４７〜５５３（１９９０））が挙げられる。他のタグポリペプチドには、フラッグ−ペプチド（Ｈｏｐｐら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４〜１２１０（１９８８））、ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１９２〜１９４（１９９２））、チューブリンエピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１５１６３〜１５１６６（１９９１））、及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ（Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７；６３９３〜６３９７（１９９０））が挙げられる。
【０１８０】
さらなる実施形態において及び先のいずれかにしたがって、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、細胞貫通ペプチドと融合する。
【０１８１】
さらなる態様において、本発明は、１つ以上の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質をコードする核酸、及びこのような核酸を含む宿主細胞を包含する。ある実施形態において、本発明にしたがって使用する宿主細胞には、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９８Ｔ、Ｃｏｓ７、ＨｅＬａ、及びＣＨＯ−ＤＨＦＲ欠乏性細胞を含むが、これらに限定しない。なおもさらなる実施形態において、本発明の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は無血清懸濁液中で増殖するよう修飾された細胞株において安定して発現する。
【０１８２】
さらなる態様において、本発明の組成物には、添加剤及び医薬として許容され得る担体とともに、本発明で論議する可溶性Ｔｏｓｏタンパク質のいずれかを含んでもよい。本明細書で使用する場合、「医薬として許容され得る担体」には、当該共役体と組み合わせた場合、共役体の活性を保有しかつ対象の免疫系と非反応性である任意の材料を含む。例としては、リン酸緩衝塩類溶液、水、油／水エマルションのようなエマルション、及び種々のタイプの湿潤剤が挙げられるが、これらに限定しない。他の担体には、滅菌溶液、コート錠を含む錠剤、及びカプセル剤を含む。典型的にはこのような担体は、デンプン、乳、糖、あるタイプの灰分、ゼラチン、ステアリン酸若しくはその塩、ステアリン酸マグネシウム若しくはステアリン酸カルシウム、タルク、植物性油脂、ガム、グリコールのような賦形剤、または他の公知の賦形剤を含有する。このような担体には、香料及び着色添加剤または他の成分も含んでもよい。このような担体を含む組成物は、周知の従来法によって製剤化される。
【０１８３】
一態様において、本発明は、Ｔｏｓｏ活性の調節方法に方向づけられる。一実施形態において、Ｔｏｓｏ活性の調節方法は、Ｔｏｓｏ活性を阻害することを含む。他の実施形態において、Ｔｏｓｏ活性の調節方法は、Ｔｏｓｏ活性を亢進させることを含む。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、Ｔｏｓｏ活性を直接的に調節することを包含する。例示的な実施形態において、このような方法には、抗体のような、Ｔｏｓｏへ結合する作用因子を適用することを含む。
【０１８５】
他の実施形態において、Ｔｏｓｏ活性は、例えば、Ｔｏｓｏの同族リガンドを結合することによって、間接的に調節される。例示的な実施形態において、Ｔｏｓｏ活性は、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を投与することによって調節される。
【０１８６】
さらなる実施形態において、Ｔｏｓｏ活性は、機序の組み合わせによって、例えば、Ｔｏｓｏの同族リガンドへ結合する作用因子を含む組成物と組み合わせてＴｏｓｏへ結合する作用因子を含む組成物を投与することによって調節される。例示的な実施形態において、このような組み合わせは、Ｔｏｓｏ抗体及び可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を含んでもよいが、これらに限定しない。
【０１８７】
認識されるであろうように、Ｔｏｓｏ活性の調節方法には、配列番号１〜２５の任意の１つ以上及び本明細書に説明する任意のバリアントまたはその修飾物を含む、任意の組み合わせにおける本明細書に説明する組成物のいずれかの使用を含むことができる。
【０１８８】
（ＩＩＤ．併用療法）
先のいずれかにしたがって、本発明の方法には、癌または自己免疫疾患を治療することを必要とする対象を、免疫系経路の構成要素を調節する分子の組み合わせで治療することによる、癌または自己免疫疾患の治療方法を含む。概して、これらの併用療法には、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を免疫系経路の１つ以上の他の調節因子とともに投与することを含む。可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、免疫系経路の１つ以上の他の調節因子の投与の前に、当該投与と同時に、または当該投与の後に投与してもよい。ある態様において、免疫系経路の１つ以上の他の調節因子には、ＩｇＭ、Ｂ７Ｈ３、ＰＡＭＰ、ＤＡＭＰ、スクランブラーゼ、及び免疫確認箇所阻害薬を含むが、これらに限定しない。
【０１８９】
さらなる態様において、併用療法は、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を１つ以上の免疫確認箇所阻害薬とともに投与することを含む。ある実施形態において、併用療法は、Ｔｏｓｏタンパク質をＰＤ−１の阻害薬、ＣＴＬＡ−４の阻害薬、またはＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４の両方の阻害薬とともに投与することを含む。さらなる実施形態において、併用療法は、Ｔｏｓｏタンパク質を抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体とともに投与することを含む。さらにさらなる実施形態において、併用療法は、Ｔｏｓｏタンパク質を抗ＰＤ−１抗体及び抗ＣＴＬＡ−４抗体の両方とともに投与することを含む。なおもさらなる実施形態において、併用療法は、配列番号１〜２５の任意の１つを含むＴｏｓｏタンパク質を１つ以上の免疫確認箇所阻害薬とともに投与することを含む。
【０１９０】
本発明の好ましい実施形態が本明細書で示され説明されてきたが、このような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者に明白であろう。数多くの変法、変更、及び置換は今や、本発明を逸脱することなく当業者に対して生じるであろう。本明細書に説明する本発明の実施形態に対する種々の代替物が、本発明を実施する上で採用されてもよいことは理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、かつこれらの特許請求の範囲及びそれらの等価物に関する範囲内の方法及び構造が当該特許請求の範囲及び当該等価物により網羅されるべきであることは企図される。
【実施例】
【０１９１】
（実施例１：可溶性Ｔｏｓｏタンパク質によるＢ細胞増殖の阻害）
図３は、Ｂ細胞増殖のアッセイの結果を示す。標的細胞は、精製された野生型Ｂ細胞とした。刺激は、抗マウスＩｇＭとのＢＣＲ架橋またはＬＰＳによるＴＬＲ刺激とした。本アッセイは、ヒトまたはマウス可溶性Ｔｏｓｏタンパク質によって増殖が修飾されるかどうかを判定することとした。図３に示すように、ｈＴｏｓｏ−Ｆｃ及びｍＴｏｓｏ−Ｆｃの両方は、培養物中のマウスＢ細胞の増殖を阻害する。Ｆｃタンパク質単独（対照）は、増殖に影響しない。
【０１９２】
図４は、全長のｈＴｏｓｏの阻害活性がＷＴ及びＴｏｓｏ  ＫＯ  Ｂ細胞において等価であることを示しており、それゆえ、ｓＴｏｓｏ−Ｆｃと内在性ｍＴｏｓｏとの相互作用は、抗増殖効果に必要とされない。全長のＴｏｓｏから推定Ｉｇドメインを除去することは、このモデルにおける阻害活性を抑止し、本モデルにおけるＴｏｓｏの子の特異的活性についてＩｇドメインが重要であることを示唆している。
【０１９３】
図５は、Ｉｇドメインを含有する可溶性ｈＴｏｓｏの切り詰められた形態が、種々の程度までマウスＢ細胞増殖を阻害することを示している。本アッセイにおいて、全長のｈＴｏｓｏは、最大の効果を示した。
【０１９４】
（実施例２：ＩｇＭ結合アッセイ）
図６は、ＩｇＭ結合アッセイの結果を示す。本アッセイについて、可溶性ＴＯＳＯタンパク質は、９６ウエルプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ）において固定した。洗浄及びブロッキング後、マウスＩｇＭはプレート上でインキュベートした。洗浄後、結合ＩｇＭを、抗マウスＩｇＭ−ＨＲＰを用いたインキュベーション、次いで、洗浄及びＨＲＰ基質の添加によって検出した。図６に示すように、固定した全長のｈＴｏｓｏは、用量依存的様式でマウスＩｇＭを結合する。
【０１９５】
図７は、ＩｇＭに対する突然変異体ｈＴＯＳＯの結合を示し、ｈＴＯＳＯの切り詰められた突然変異体／欠失突然変異体を先に説明した通り固定し、ＩｇＭ結合を評価した。突然変異体形態Ｍ１、Ｍ３、Ｍ４及びＭ７（Ｍ７は、−Ｉｇドメインである）は、ＩｇＭを結合し損ねているのに対し、突然変異体Ｍ２（１〜１０４）は、ＩｇＭをより強く結合するように見える。
【０１９６】
（実施例３：ＣＬＬ細胞増殖のＴｏｓｏ阻害）
図８は、４つの独立した患者の試料からのＣＬＬ活性化のインビトロでの試験の結果を示す。本アッセイは、ＣＬＬリンパ系器官において認められる増殖中心のインビトロモデルを提供する。末梢血ＣＤ１９＋細胞は、ＣＬＬ患者から精製し、無血清系においてＲｅｓｉｎｑｕｉｍｏｄ（ＴＬＲ７／８アゴニストであるＲ−８４８）＋ＩＬ−２を用いてインビトロで活性化した。これらの細胞は、「２Ｓ」と命名した。増殖に及ぼす可溶性ｈＴＯＳＯ及び外来性ヒトＩｇＭの効果を評価した。ｈＴＯＳＯ及びｈＩｇＭはより少ない程度まで、３Ｈ  Ｔｈｙ組み込みによって概算されるように、ＣＬＬ増殖に及ぼす阻害効果を有するように見える。
【０１９７】
（実施例４：可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を用いた処置は、腫瘍形成を減衰させ、生存を高める）
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。Ｂ１６Ｆ１０ネズミ黒色腫細胞株は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び抗生物質（５０Ｕ／ｍｌのペニシリン及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）を補充したイスコフ変法ダルベッコ培地中で増殖させた。
【０１９８】
８〜１４週齢のマウス（ｎ＝５〜１０）に２×１０５個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞を皮下接種した。完全な注射を受けなかったマウス、または注射が結果的に漏逸なしで可視的皮下小疱を生じなかったマウスは、本実験に使用せず、即時屠殺した。腫瘍測定はデジタルカリスパを用いて隔日測定した。
【０１９９】
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、Ｔｏｓｏ−Ｆｃ単独で処置した。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫の処置のために、マウスは、５０μｇのＴｏｓｏ−Ｆｃまたは対照Ｆｃタンパク質、またはＰＢＳ（ビヒクル対照）の腹腔内注射（ｉ．ｐ．）をＢ１６Ｆ１０接種の１０日後から出発して隔日受けた。
【０２００】
図９は、可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を用いたマウスの処置が結果的に、腫瘍面積の有意な減少とともに腫瘍形成の減衰を生じたことを示す（ｎ＝１０Ｆｃ、１０ＰＢＳ、及び１５Ｔｏｓｏ−Ｆｃ）。
【０２０１】
図１０は、Ｔｏｓｏ−Ｆｃ処置したマウスが長期間の生存も示したことを示す。
【０２０２】
（実施例５：可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を用いた治療は、腫瘍浸潤リンパ球を増加させる）
図１１は、Ｔｏｓｏ−Ｆｃ治療が、腫瘍浸潤リンパ球を含有する腫瘍の割合を増大させることを示す。マウスに先に説明した通りＢ１６Ｆ１０を摂取した。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫接種の１５日後、マウスを屠殺氏、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）分析を実施した。皮下黒色腫腫瘍は、外科的に摘出して秤量した。腫瘍は次に、メスで１ｍｍ３片へと切り出し、消化培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、抗生物質（５０Ｕ／ｍｌペニシリン及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン）、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ型、及び２０μｇ／ｍｌ  ＤＮアーゼＩ）を補充したＲＰＭＩ）中に置いた。消化培地中の腫瘍試料はその後、３７℃における３０分間のインキュベーション中に１０分ごとにボルテックスした。単細胞懸濁液を得るために、腫瘍は次に、７０μｍナイロンフィルターを通過し、１％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩを用いて３回洗浄した。全腫瘍単細胞懸濁液を計数し、６×１０６個をＴ細胞マーカー（ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４）についてのＭＡｂで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０２０３】
（実施例６：可溶性Ｔｏｓｏタンパク質及び免疫確認箇所阻害薬を用いた併用療法は、腫瘍形成減衰及び生存に及ぼす高い効果を示す）
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。Ｂ１６Ｆ１０ネズミ黒色腫細胞株は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び酷性物質（５０Ｕ／ｍｌペニシリン及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を補充したイスコフ変法ダルベッコ培地中で増殖させた。
【０２０４】
８〜１４週齢のマウス（ｎ＝５〜１０）に２×１０５個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞を皮下接種した。完全な注射を受けなかったマウスまたは注射が結果的に漏逸なく可視的皮下小疱を生じなかったマウスは、本実験に使用せず、即時屠殺した。腫瘍の測定は、デジタルカリスパを用いて隔日実施した。
【０２０５】
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、Ｔｏｓｏ−Ｆｃ単独でまたは免疫確認箇所遮断抗体との併用で治療した。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫の処置のために、マウスは、５０μｇのＴｏｓｏ−Ｆｃ、または対照Ｆｃタンパク質、またはＰＢＳ（ビヒクル対照）の腹腔内注射（ｉ．ｐ．）をＢ１６Ｆ１０接種の１０日後に出発して隔日受けた。免疫確認箇所遮断抗体であるαＣＴＬＡ−４（９Ｄ９）及びαＰＤ−１（ＰＲＭ１−１４）は、Ｔｏｓｏ−Ｆｃ処置との併用で使用した。αＣＴＬＡ−４（１００μｇ）及びαＰＤ−１（２５０μｇ）の抗体も１０日後に出発してｉ．ｐ．投与した。確認箇所遮断抗体の３つの処置を付与し、処置は、３日ごとに投与した（１０日後、１３日後、及び１６日後）。
【０２０６】
図１２は、Ｔｏｓｏ−Ｆｃ及び抗ＰＤ−１抗体を用いた組み合わせ処置が、ＰＤ−１抗体またはＴｏｓｏ−Ｆｃ単独よりも大きな程度まで腫瘍形成を示す、つまり減衰させることを示している。図１３はこの併用療法が、個々の構成要素単独の適用を上回って生存も延長することを示す。
【０２０７】
Ｔｏｓｏ−Ｆｃ及び抗ＣＴＬＡ−４抗体の併用が、生存を延長させるようには見えなかった（図１４）が、Ｔｏｓｏ−Ｆｃと抗ＰＤ−１及び抗ＣＴＬＡ−４との三重療法は、Ｔｏｓｏ単独を用いたまたは免疫確認箇所阻害薬のみを包含する二重療法（抗ＰＤ−１抗体及び抗ＣＴＬＡ−４抗体）を用いた処置を上回って腫瘍形成を減衰させ（図１５）、生存を延長させた（図１６）。
【０２０８】
本出願は、現に説明した技術の例となる態様において、方法論、系及び／または構造ならびにこれらの使用に関する完全な説明を提供している。本技術の種々の態様は、ある程度の詳細を用いて、または１つ以上の個々の態様に関して先に説明してきたが、当業者は、本発明の技術の精神または範囲から逸脱することなく、開示した態様に対する数多くの変更を実施し得る。多くの態様は、現に説明した技術の精神及び範囲から逸脱することなく実施することができるので、適切な範囲は、以後に添付する特許請求の範囲に存する。他の態様はそれゆえ熟慮される。さらに、別段の明白な請求がない限り、または具体的な順序が特許請求の範囲の言語によって本質的に必要とされない限り、任意の操作が、任意の順序で実施してもよいことは理解されるべきである。先の説明において含有され添付の図面に示される事項がすべて、特定の態様を説明するのみであるとして解釈されるべきでありかつ、示される実施形態に限定されるものではないことは企図される。脈絡から別段に明確にまたは明白に記載されない限り、本明細書に提供される任意の濃度の値は概して、混合物の特定の構成要素の添加の際にまたは添加後に生じる任意の転換に関することなく、混合物の値または割合の点で付与される。本明細書にまだ明白に組み込まれていない程度まで、本開示において言及される公開された参考文献および特許文書はすべて、その内容が全体としてすべての目的のために参照に鎧本明細書に組み込まれる。詳細または構造の変更は、以下の特許請求の範囲において定義するように、本技術の基礎的要素から逸脱することなく実施してもよい。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【図１−１６】
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【図１−１７】
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【図１−１８】
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【図１−１９】
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【図１−２０】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年7月4日(2019.7.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＡＭＰ及び／またはＤＡＭＰの発現及び／又は活性を低下させるための医薬組成物であって、医薬有効量の可溶性Ｔｏｓｏタンパク質を含む、医薬組成物。
【請求項２】
ＩｇＭの発現及び／又は活性を増加させる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列若しくは配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
（ｂ）配列番号８に記載のアミノ酸配列若しくは配列番号８に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を有する細胞外ドメイン配列を含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、配列番号５に記載のアミノ酸配列又は配列番号５に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記可溶性Ｔｏｓｏタンパク質は、
（ａ）配列番号７に記載のアミノ酸１８〜２５３若しくは配列番号７に記載のアミノ酸１８〜２５３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
（ｂ）配列番号７に記載のアミノ酸２１〜２５３若しくは配列番号７に記載のアミノ酸２１〜２５３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【外国語明細書】
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