(57)【要約】      （修正有）【課題】サーマス・サーモフィラスと酵母菌との組合せの発酵方法の提供を目的とする。【解決手段】該方法は、まず、サッカロマイセス・セレビシエを、中温、酸性条件において１回または複数回発酵させ、酵母菌を増殖させるステップ（１）と、酵母菌が対数増殖期後期になってから温度を昇温させた後、サーマス・サーモフィラスを接種し、アルカリ条件において第２回発酵を行い、発酵生成物を得るステップ（２）と、を含む、サーマス・サーモフィラスと酵母菌との組合せの発酵方法を開示する。前記方法を利用することにより、サーマス・サーモフィラスの一部の活性成分を顕著に向上させることができ、特に、一部の化粧品に応用されている活性成分の含有量が増加または活性が向上される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サーマス・サーモフィラスと酵母菌との組合せの発酵方法であって、
まず、サッカロマイセス・セレビシエを中温、酸性条件において１回または複数回発酵させ、酵母菌を増殖させるステップ（１）と、
酵母菌が対数増殖期後期になってからさらに温度を昇温させた後、サーマス・サーモフィラスを接種し、アルカリ条件において第２回発酵させ、発酵生成物を得るステップ（２）と、
を含むことを特徴とするサーマス・サーモフィラスと酵母菌との組合せの発酵方法。
【請求項２】
ステップ（１）において、酵母に対し少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、５回または６回の増殖培養を行うことにより、酵母を対数増殖期にさせることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（２）において、酵母培養液にサーマス・サーモフィラスを接種する前に、サーマス・サーモフィラスに対し１回または複数回の増殖培養を行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（２）の発酵液に対し除菌、脱色および脱臭、濾過による不純物除去を行い、サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵生成物を得るステップ（３）をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記サッカロマイセス・セレビシエの菌株はＣＩＣＣ１５９６であり、中国工業微生物菌種保存管理センターから購入されたもので、保存番号はＣＩＣＣ１５９６であり、使用されるサーマス・サーモフィラスＨＢ２７はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から購入されたもので、保存番号はＢＡＡ−１６３である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
酵母に対し低温培養を行い、温度は２０℃〜３０℃であり、酵母に対し酸性培養を行い、ｐＨ値は４．０〜５．０であり、酵母菌が対数増殖期後期になって０〜１日から温度は昇温させるが、温度は５５℃〜７０℃に昇温される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
温度を０または１日昇温させた後、好熱性細菌を接種し、同時または接種後１日から培養のｐＨ値をアルカリ性に調整し、ｐＨ値は７．０〜８．５である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
サーマス・サーモフィラスと酵母菌との組合せの発酵方法であって、
サッカロマイセス・セレビシエおよびサーマス・サーモフィラスに対しそれぞれ増殖培養を行うステップ１と、
ここで、前記サッカロマイセス・セレビシエの増殖方法は、
（１）クリーンベンチに試験管斜面上のサッカロマイセス・セレビシエＣＩＣＣ１５９６を１ループ取り、５０ｍｌの培養液（ｐＨは４．８±０．２）が入った２５０ｍｌの三角フラスコに接種し、２００ｒｐｍ（１分ごとに２００回転）、３０℃で１０ｈほど培養し、菌体は対数増殖期にある；
（２）対数増殖期にある菌体を２Ｌ（ｐＨは４．８±０．２）が入った２．５Ｌの三角フラスコに接種し、接種量を１０％（体積百分率、２００ミリリットルのステップ（１）の対数増殖期にある酵母培養液）とし、２００ｒｐｍ、３０℃で１０ｈほど培養する；
（３）ステップ（２）で培養した３Ｌの菌種を３０Ｌの発酵液（ｐＨは４．８±０．２）が入った一級種の５０Ｌタンクに接種し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持させ、２００ｒｐｍ、３０℃で１０ｈほど培養する；
（４）３０Ｌの菌液を３００Ｌが入った二級種の５００Ｌのタンクに移し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持させ、２００ｒｐｍ、３０℃で１０ｈほど培養する；
であり、
ここで、サーマス・サーモフィラスの増殖方法は、クリーンベンチにサーマス・サーモフィラスＨＢ２７の凍結溶液を２ｍｌ取り、２Ｌの培養液（ｐＨは７．８±０．２）が入った２．５Ｌの三角フラスコに接種し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持させ、１５０ｒｐｍ、６５℃で１２ｈほど培養し、菌体が対数増殖期になってから、３０Ｌの菌液を３００Ｌの培養液が入った二級種の５００Ｌのタンクに接種し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持させ、１５０ｒｐｍ、６５℃で１２ｈほど培養する；
次のように一次発酵方法により酵母を一次発酵させるステップ２と、
すなわち、３００Ｌの二級種タンク内の前記（４）の後の酵母菌培養液を２４００Ｌの培養液（ｐＨは４．８±０．２）が入った５０００Ｌの発酵タンクに移し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持させ、２００ｒｐｍ、３０℃で１４ｈほど培養することであり、
次のように二次発酵方法を実施するステップ３と、
すなわち、一次発酵であるステップ２の培養液の温度を３０℃から６５℃に昇温させてから０日〜１日後、３００Ｌのサーマス・サーモフィラス増殖液をこの発酵タンクに移し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持させ、１５０ｒｐｍで撹拌し、アルカリ液でｐＨ値を７．８±０．２に調整し、１５０ｒｐｍ、６５℃で１８ｈほど培養する、
ここで、前記培養液の配合成分は、２０Ｌの培養液の配合が６０ｇのペプトン、４ｇの麦芽汁、７ｇの無水硫酸マグネシウム、２．４ｇのリン酸二水素カリウム、４０ｇの硫酸アンモニウム、１ｇの無水塩化鉄、５ｇの塩化ナトリウムであり、ｐＨ値は酸またはアルカリで調整し制御され、残りは水である、
を含むことを特徴とするサーマス・サーモフィラスと酵母菌との組合せの発酵方法。
【請求項９】
前記サッカロマイセス・セレビシエの菌株は、中国工業微生物菌種保存管理センターから購入されたもので、保存番号がＣＩＣＣ１５９６である菌株であり、使用されるサーマス・サーモフィラスはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から購入されたもので、保存番号がＢＡＡ−１６３である菌株である、ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
サッカロマイセス・セレビシエの菌株は、中国工業微生物菌種保存管理センターから購入されたもので、保存番号がＣＩＣＣ１５９６である菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）の保存番号がＢＡＡ−１６３であるサーマス・サーモフィラス菌株がＢ群微生物を生成することを促進する活性物質としての用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧品発酵原材料分野に属し、特にサーマス・サーモフィラスと酵母菌との組合せの発酵方法および応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物発酵原材料は、化粧品分野における応用が日々増えており、ここ数年、酵素化粧品は消費者から高い人気を集めている。発酵は純粋な生物的過程であり、如何なる化学成分も添加されていない。発酵は生理活性物質をさらに溶出しやすくし、発酵によって全ての活性成分を抽出することは、新しい栄養素を生成し、栄養成分のバランスを一層良くし、栄養成分を低分子化し、活性をさらに強くさせ、皮膚に迅速に吸収されることができる。発酵微生物自身には様々な酵素や微量元素が含まれており、補充および相乗効果を有する。そのため、消費者の「天然、健康、高効率」スキンケア用品に対する期待に合致している。
【０００３】
酵母菌は、現在、化粧品発酵原材料分野において最も応用されている菌株であり、酵母抽出物は天然、安全、強力な保湿効果を有する。酵母細胞には豊富な天然保湿因子（ＮＭＦ）、例えば、アミノ酸、ペプチド系、ナトリウム、カリウム、マグネシウムなどの無機成分が含有されている。ここで、アミノ酸は天然保湿因子（ＮＭＦ）の４０％を占め、ナトリウム、カリウム、マグネシウムなどの無機成分は天然保湿因子（ＮＭＦ）の１２％を占める。酵母細胞壁の主要成分は、酵母β−（１，３）／（１，６）−グルカンおよびマンナンＭ６０を含む。酵母β−（１，３）／（１，６）−グルカンは、大量の親水基を含み、水分を吸収かまたは皮膚角質層の水分を保持することができる。酵母マンナンＭ６０の固有の分子構造は水分子を保持することができ、長時間保湿する作用を果たす。例えば、中国の特許出願公開番号ＣＮ１０５４３４３１９Ａ、ＣＮ１０７１８４４１１Ａ、ＣＮ１０６５５１８２Ａの特許文献には、酵母発酵生成物を化粧品の原材料として化粧品を製造することが開示されている。
【０００４】
サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）は好熱性細菌であり、熱安定性のあるスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）およびビタミンＢ群を生成することができる。スーパーオキシドディスムターゼは、Ｏ２−をＨ２Ｏ２に酸化し、生体が酸化により損傷されることを回避することができ、皮膚に対する遊離基の侵害を防止ぐことで、老化を防止する効力を果たす。ビタミンＢ群は、皮膚の炎症反応を軽減し、日光によるダメージを防止し、細胞の再生を促進することができる。ビタミンＢ群は、さらに、様々な酵素や補酵素の分子構造の一部分であり、皮膚の健康を維持するためにアミノ酸代謝を促進することができる。中国の特許出願番号２０１７１０７３２９３６７の特許文献にも、サーマス・サーモフィラスの発酵生成物をスキンケア成分として採用することが開示されているが、該スキンケア成分は、サーマス・サーモフィラスの発酵生成物以外に、組み換えヒトコラーゲンをさらに含んでいる。しかしながら、該特許文献ではサーマス・サーモフィラスの発酵生成物しか言及されておらず、いかに発酵するかについては開示していない。また、例えば、中国の特許出願、出願番号２００７１００３１３８７の特許文献にも生体酵素による日焼け止め組成物が開示され、該組成物はサーマス・サーモフィラスの生体酵素を含み、また、その割合が提供されている。しかしながら、一般的なサーマス・サーモフィラスはいずれも発酵によって生成されており、酵素の活性または酵素の産出量については開示されておらず、さらにこのような酵素が他の成分と組み合わせる際、安定性も重要な要因の１つである。日焼け止め製品には酵素が含まれているため、酵素が紫外線の影響を受けて不活性化になるか否か、酵素の活性を有するか否かについても不確定である。
【０００５】
従来技術では、いずれも単一菌種をそれぞれ発酵させた後、２種類の発酵液を混合している。異なる菌叢や酵素類がともに溶解されて中和反応を引き起こすことにより、大量の菌叢や酵素の活性が損失されるため、実際の効果は好ましくないことが多い。よって、従来の発酵方法および生成物を改良しなければならず、更なる生理活性物質を取得し、単一発酵生成物の混合による相互作用および中和効果の減少が期待されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記問題を解決するために、本発明はサーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せの発酵工程を提供することによってサーマス・サーモフィラス発酵生成物の生理活性を向上させ、サーマス・サーモフィラス発酵生成物の適用効果を豊富にする目的を達成し、特に、サーマス・サーモフィラス発酵生成物の穏やかな抗炎症における効果を向上させ、化粧品の「天然、健康、高効率」に対する追及を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の発明者らは、複数菌共生発酵により複数種類の菌を制御可能に発酵させれば、さらに多種類の有益な酵素を発酵させることができるだけでなく、各種類の酵素の産出量を一般的な単一菌種の発酵量の数倍にさせることができることを見出した。酵素が多いほど、人体に対する触媒健康管理機能は強い。市場においては酵母抽出物およびサーマス・サーモフィラス発酵生成物が市販されているが、いずれも単一製品として化粧品に添加されており、酵母菌およびサーマス・サーモフィラスの組合せによる発酵を開拓して化粧品に用いることは新しい課題である。
【０００８】
また、本発明の発明者らは、酵母および好熱性細菌を共培養させ、特別な培養工程によれば、酵母の好熱性細菌に対する培養に活性化誘発性作用を果すようにすることができ、単独で好熱性細菌を培養することによって得られる生成物の活性に比べて顕著に向上され、一方で酵母自身の培養製品の活性にはそれほど大きな影響を与えていないことを見出した。よって、好熱性細菌の生理活性物質の放出を強化させ、または生理活性物質の活性を強化している。
【０００９】
好熱性細菌を単独で培養することにより一部の有益な生理活性物質を生成することができるが、このような生理活性物質の量は非常に少なく、活性も高くない。酵母および好熱性細菌を共培養させる場合、特別な培養方法によれば、好熱性細菌の生理活性物質を顕著に向上させることができる製品を見出し、特に一部の生理活性物質の活性が顕著に強化されていることを見出した。
【００１０】
また、本発明は好熱性細菌の発酵生成物を培養する方法を提供し、該方法は、
サッカロマイセス・セレビシエを中温、酸性条件において１回または複数回発酵させ、酵母菌を増殖させるステップ（１）と、酵母菌が後期対数増殖期になってから温度を昇温させた後の０日または１日後に、サーマス・サーモフィラスを接種し、アルカリ条件において第２回発酵を行い、発酵生成物を得るステップ（２）と、を含む。
【００１１】
一部の好ましい形態において、酵母に対して、少なくとも２回の増殖培養、または少なくとも３回、または少なくとも４回、５回、６回の増殖培養を行うことにより、酵母を対数増殖期にさせる。
【００１２】
一部の好ましい形態において、サーマス・サーモフィラスに対して、混合発酵させる前にも１回または複数回の増殖培養を行う。
【００１３】
一部の好ましい形態において、該方法は、ステップ（２）の発酵液に対して除菌、脱色、脱臭、濾過による不純物除去を行い、サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵生成物を得るステップ（３）をさらに含む。
【００１４】
一部の好ましい形態において、前記サッカロマイセス・セレビシエの菌株はＣＩＣＣ１５９６であり、中国工業微生物菌種保存管理センターから購入され、保存番号はＣＩＣＣ１５９６である。
【００１５】
一部の好ましい形態において、本発明において使用されるサーマス・サーモフィラスＨＢ２７はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から購入され、保存番号はＢＡＡ−１６３である。
【００１６】
一部の形態において、酵母に対して低温培養を行い、温度は２０℃〜３０℃である。
【００１７】
一部の形態において、酵母に対して酸性領域で培養を行い、ｐＨ値は４．０〜５．０である。
【００１８】
一部の形態において、酵母菌が後期対数増殖期になってから０日または１日後に昇温させ始める。好ましくは、温度を５５℃〜７５℃、または６０℃〜６５℃まで昇温させる。または６０℃、６５℃、７０℃、５８℃、６１℃まで昇温させる。低温から高温まで昇温させる時間は、一般的に数分間かかり、例えば、電気加熱の方法により昇温させる。
【００１９】
一部の形態において、温度を昇温させてから０日または１日後に、好熱性細菌を接種し始め、同時にまたは接種後１日から培地のｐＨ値をアルカリ性に調整し、ｐＨ値は７．０〜８．５である。
【００２０】
一部の形態において、二次発酵の条件は、通気量が５ｍ３／ｈ／５０Ｌ〜１０ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持され、１００ｒｐｍ〜２００ｒｐｍ、発酵日数は１〜３日である。
【００２１】
一部の形態において、前記酵母の拡大培養方法は、クリーンベンチに試験管斜面上のサッカロマイセス・セレビシエＣＩＣＣ１５９６を１ループ（接種ループを使用し１回で採取できる菌液の量）を取り、５０ｍｌの培養液（ｐＨ４．８±０．２）が入った２５０ｍｌの三角フラスコに入れ、２００ｒｐｍ（１分間ごとに２００回転）、３０℃で１０ｈほど培養し、菌体を対数増殖期にさせるステップ（１）と、対数増殖期にある菌体を２Ｌ（ｐＨ４．８±０．２）が入った２．５Ｌの三角フラスコに接種し、接種量を１０％（体積百分率、２００ミリリットルのステップ（１）の対数増殖期にある酵母培養液）とし、２００ｒｐｍ、３０℃で１０ｈほど培養するステップ（２）と、ステップ（２）で培養された３Ｌの菌種を３０Ｌの発酵液（ｐＨ４．８±０．２）が入った一級種の５０Ｌタンクに接種し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持し、２００ｒｐｍ、３０℃で１０ｈほど培養するステップ（３）と、３０Ｌの菌液を３００Ｌが入った二級種の５００Ｌタンクに移し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持し、２００ｒｐｍ、３０℃で１０ｈほど培養するステップ（４）と、を含む。
【００２２】
さらに、本発明は下記のステップを含む方法を提供する。
（ステップ１）
サッカロマイセス・セレビシエおよびサーマス・サーモフィラスに対してそれぞれ増殖培養を行う。
ここで、サッカロマイセス・セレビシエの増殖方法は下記の通りである。
（１）クリーンベンチに試験管斜面上のサッカロマイセス・セレビシエＣＩＣＣ１５９６を１ループ取り、５０ｍｌの培養液（ｐＨ４．８±０．２）が入った２５０ｍｌの三角フラスコに入れ、２００ｒｐｍ（１分間ごとに２００回転）、３０℃で１０ｈほど培養し、菌体を対数増殖期にさせる；
（２）対数増殖期にある菌体を２Ｌ（ｐＨ４．８±０．２）が入った２．５Ｌの三角フラスコに接種し、接種量を１０％（体積百分率、２００ミリリットルのステップ（１）の対数増殖期にある酵母培養液）とし、２００ｒｐｍ、３０℃で１０ｈほど培養する；
（３）ステップ（２）で培養された３Ｌの菌種を３０Ｌの発酵液（ｐＨ４．８±０．２）が入った一級種の５０Ｌタンクに接種し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持し、２００ｒｐｍ、３０℃で１０ｈほど培養する；
（４）３０Ｌの菌液を３００Ｌが入った二級種の５００Ｌタンクに移し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持し、２００ｒｐｍ、３０℃で１０ｈほど培養する。
また、サーマス・サーモフィラスの増殖方法は下記の通りである。
クリーンベンチにサーマス・サーモフィラスＨＢ２７の凍結溶液を２ｍｌ取り、２Ｌの培養液（ｐＨ７．８±０．２）が入った２．５Ｌ三角フラスコに接種し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持し、１５０ｒｐｍ、６５℃で１２ｈほど培養し、菌体が対数増殖期になってから、３０Ｌの菌液を３００Ｌの培養液が入った二級種の５００Ｌタンクに接種する。
（ステップ２）
酵母に対する一次発酵方法は下記の通りである。
３００Ｌの二級種タンク内の（ステップ（４）の後の）酵母菌培養液を２４００Ｌの培養液（ｐＨ４．８±０．２）が入った５０００Ｌの発酵タンクに移し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持し、２００ｒｐｍ、３０℃で１４ｈほど培養する。
（ステップ３）
２次発酵として、一次発酵（ステップ２）の培養液の温度を３０℃から６５℃に昇温させた後、温度が６５℃に昇温した後（０日）、すぐ３００Ｌのサーマス・サーモフィラス増殖液をこの発酵タンクに移し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持し、１５０ｒｐｍで撹拌し、アルカリ液でｐＨ値を７．８±０．２に調整し、１５０ｒｐｍ、６５℃で１８ｈほど培養する。
【００２３】
一部の好ましい形態において、培養液の配合成分は、２０Ｌの培養液の配合が６０ｇのペプトン、４ｇの麦芽汁、７ｇの無水硫酸マグネシウム、２．４ｇのリン酸二水素カリウム、４０ｇの硫酸アンモニウム、１ｇの無水塩化鉄、５ｇの塩化ナトリウムについて、ｐＨ値を酸またはアルカリで調整および制御し、水を２０Ｌまで補充する。異なる量の培養液は、配合例に従って増減する。
【００２４】
また、好熱性細菌および酵母の共生発酵培養による発酵生成物の皮膚の消炎または皮膚の保湿の試薬の製造における用途であって、前記好熱性細菌および酵母の共生発酵の方法は、まず、低温、酸性において、酵母に対して１回または複数回の液体増殖発酵を行い、対数増殖期になるようにし、その後、発酵液の温度を低温から高温に変化させた後の０日または１日後に、サーマス・サーモフィラスを添加して二次発酵を行い、発酵条件をアルカリ条件にする、ことを含む。
【００２５】
好ましくは、前記発酵方法は上述したいずれかの発酵方法である。
【００２６】
一部の好ましい形態において、前記試薬は化粧品試薬であり、用途は例えば、スキンケア試薬における用途である。
【００２７】
また、本発明に係る試薬であって、該試薬は皮膚の経皮水分の流出を低下させることができ、該試薬は本発明に係る方法により得られる発酵生成物の混合物を含む。
【００２８】
一部の好ましい形態において、前記用途または試薬において、好熱性細菌はサーマス・サーモフィラスＨＢ２７であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から購入され、保存番号はＢＡＡ−１６３である。
【００２９】
一部の好ましい形態において、前記酵母はＣＩＣＣ１５９６であり、中国工業微生物菌種保存管理センターから購入され、保存番号はＣＩＣＣ１５９６である。
【００３０】
他の一部の好ましい形態において、上記試薬は、発酵生成物以外に、他の成分をさらに含むことができ、例えば、その他の化粧試薬の成分、例えば、フルーツオイル、シリコーンオイル、ステアリン酸グリセリル、キサンタンガム、純水などその他の成分を添加してもよい。さらに例えば、純水、Ｔｗｅｅｎ−８０、プロパンジオール、防腐剤などを含む配合されたセラムを添加してもよい。本発明の発酵生成物の混合物に対する一部の体外および人体試験によって、本発明の発酵生成物は、単一の酵母発酵生成物、好熱性細菌発酵生成物および発酵混合した後の試薬に対して顕著な改善作用を有し、これは、２種類の菌の共培養は互いに促進作用を有し、生理活性物質の活性の含有量または活性はいずれも大幅に向上されることを説明しているようである。
【００３１】
また、本発明は、酵母およびサーマス・サーモフィラスを共同で培養させる際、サーマス・サーモフィラスによるビタミンＢ群の生成量を実質的に変えていないが、一部の生理活性物質の生成が促進され、このような生理活性物質はビタミンＢ群の活性を向上させることができることを見出した。そのため、本発明は、酵母をサーマス・サーモフィラスによりビタミンＢ群を生成することを促進する生理活性物質とする新しい用途を提供する。そのため、本発明は、菌株がＣＩＣＣ１５９６であるサッカロマイセス・セレビシエをＨＢ２７菌株のサーマス・サーモフィラスが、Ｂ群微生物を強化する生理活性物質を生成する発酵の共力剤とする用途を提供する。
【発明の効果】
【００３２】
生体外実験結果によれば、サーマス・サーモフィラスおよびサッカロマイセス・セレビシエの組合せによる発酵生成物は単一のサーマス・サーモフィラスの発酵生成物に比べて皮膚線維芽細胞の成長を促進する能力がさらに強く、３％の濃度で皮膚線維芽細胞の成長率を２０％ほど向上させることができることが明らかになった。
【００３３】
サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵生成物は単一のサーマス・サーモフィラスの発酵生成物に比べて消炎効果がさらに強く、皮膚角質細胞は炎症作用の刺激を受ける場合、１０％のサーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵生成物を添加すると、炎症因子ＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦ−αの分泌が明らかに減少し、１００ｐｐｍのデキサメタゾンの消炎効果に相当するが、デキサメタゾンより穏やかであり、消炎効果は１０％の単一のサーマス・サーモフィラスの発酵生成物または単一の酵母発酵より明らかに優れている。
【００３４】
人体臨床試験の結果によれば、１％のサーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵生成物を含有するセラムを、７日間使用した後、経皮水分の流出を低下させるのに対して顕著な効果があり、該サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵生成物は皮膚バリア機能を修復し強化する作用を有することが明らかになった。１０％のサーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵生成物を含有するセラムを、７日間使用した後、皮膚の黄みを顕著に低下させることができ、該サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵生成物は皮膚色を改善し、黄みを取り除く作用を有することが明らかになった。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下、具体的な実施形態によって本発明が如何に実現されるのかを説明するが、これらの説明は本発明の技術的思想を説明するためのものであり、本発明を限定するためのものではない。具体的な保護範囲は特許請求の範囲に準ずる。
【００３６】
（実施例１）
〔サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵方法（１）〕
材料は以下のとおりである。
＜培養液の調製および成分＞
２０Ｌの培養液の配合は６０ｇのペプトン、４ｇの麦芽汁、７ｇの無水硫酸マグネシウム、２．４ｇのリン酸二水素カリウム、４０ｇの硫酸アンモニウム、１ｇの無水塩化鉄、５ｇの塩化ナトリウムであり、ｐＨ値は酸またはアルカリ（塩酸または水酸化ナトリウム溶液）で調整および制御し、水で２０Ｌまで補充し、異なる量の培養液は上記配合に応じて増減する。本発明は、特に指定されない限り、全ての実施例はいずれも上記配合の培地成分を採用して菌培養の培養液とする。当然ながら、実際の工業生産においては、異なる要求に応じて配合することができるが、このような配合成分はいずれも酵母および／またはサーマス・サーモフィラスを培養する一般的な配合成分である。
【００３７】
サッカロマイセス・セレビシエはＣＩＣＣ１５９６であり、中国工業微生物菌種保存管理センターから購入され、保存番号はＣＩＣＣ１５９６（商業的な購入により取得）である。
【００３８】
サーマス・サーモフィラスＨＢ２７は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から購入され、保存番号はＢＡＡ−１６３（商業的な購入により取得）である。
【００３９】
１.  菌種拡大培養
（ステップ１）
＜１．１  サッカロマイセス・セレビシエの増殖＞
（１）クリーンベンチにおいて試験管斜面上のサッカロマイセス・セレビシエＣＩＣＣ１５９６を１ループ取り、５０ｍｌの培養液（ｐＨ４．８±０．２）が入った２５０ｍｌの三角フラスコに接種し、２００ｒｐｍ（１分ごとに２００回転）、３０℃で１０ｈほど培養し、菌体は対数増殖期にある；
（２）対数増殖期にある菌体を２Ｌ（ｐＨ４．８±０．２）が入った２．５Ｌの三角フラスコに接種し、接種量を１０％（体積百分率、２００ミリリットルのステップ（１）の対数増殖期にある酵母培養液）とし、２００ｒｐｍ、３０℃で１０ｈほど培養する；
（３）ステップ（２）で培養した３Ｌの菌種を３０Ｌの発酵液（ｐＨ４．８±０．２）が入った一級種の５０Ｌタンクに接種し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持し、２００ｒｐｍ、３０℃で１０ｈほど培養する；
（４）３０Ｌの菌液を３００Ｌが入った二級種の５００Ｌのタンクに移し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持し、２００ｒｐｍ、３０℃で１０ｈほど培養する。
【００４０】
＜１．２  サーマス・サーモフィラスの増殖＞
クリーンベンチにおいてサーマス・サーモフィラスＨＢ２７の凍結溶液を２ｍｌ取り、２Ｌの培養液（ｐＨ７．８±０．２）が入った２．５Ｌの三角フラスコに接種し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持し、１５０ｒｐｍ、６５℃で１２ｈほど培養し、菌体が対数増殖期になってから、３０Ｌの菌液を３００Ｌの培養液が入った二級種の５００Ｌタンクに接種する。
【００４１】
ここにおける培養液の配合成分は、２０Ｌの培養液の配合が６０ｇのペプトン、４ｇの麦芽汁、７ｇの無水硫酸マグネシウム、２．４ｇのリン酸二水素カリウム、４０ｇの硫酸アンモニウム、１ｇの無水塩化鉄、５ｇの塩化ナトリウムであり、ｐＨ値は酸またはアルカリで調整し制御され、水で２０Ｌまで補充する。異なる量の培養液は、上記配合に応じて増減する。
【００４２】
２.  （ステップ２）
＜一次発酵＞
３００Ｌの二級種タンク内の（ステップ（４）の後の）酵母菌培養液を２４００Ｌの培養液（ｐＨ４．８±０．２）が入った５０００Ｌの発酵タンクに移し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持し、２００ｒｐｍ、３０℃で１４ｈほど培養する。
【００４３】
この際の培養液の配合成分は、２０Ｌの培養液の配合が６０ｇのペプトン、４ｇの麦芽汁、７ｇの無水硫酸マグネシウム、２．４ｇのリン酸二水素カリウム、４０ｇの硫酸アンモニウム、１ｇの無水塩化鉄、５ｇの塩化ナトリウムであり、ｐＨ値は酸またはアルカリで調整し制御され、水で２０Ｌまで補充する。異なる量の培養液は、上記配合に応じて増減する。
【００４４】
３.  （ステップ３）
＜二次発酵＞
一次発酵（ステップ２）培養液の温度を３０℃から６５℃に昇温させた後、温度が６５℃達した後、すぐ３００Ｌのサーマス・サーモフィラス増殖液をこの発酵タンクに移し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持し、１５０ｒｐｍで撹拌し、アルカリ液でｐＨ値を７．８±０．２に調整し、１５０ｒｐｍ、６５℃で１８ｈほど培養する。
【００４５】
この際の培養液の配合成分は、２０Ｌの培養液の配合が６０ｇのペプトン、４ｇの麦芽汁、７ｇの無水硫酸マグネシウム、２．４ｇのリン酸二水素カリウム、４０ｇの硫酸アンモニウム、１ｇの無水塩化鉄、５ｇの塩化ナトリウムであり、ｐＨ値は酸またはアルカリで調整し制御され、水で２０Ｌまで補充する。異なる量の培養液は、上記配合に応じて増減する。
【００４６】
４.  分離精製
＜遠心による除菌＞
ステップ３の二次発酵を経た培養液に対し、プレートフレーム濾過を経て、菌体を濾過膜（０．２２ｕｍ）にブロックし、発酵上清を得る。
【００４７】
＜浄化＞
発酵上清を活性炭に加え不純物を吸着させ、悪臭を除去し、複数層の脱脂ガーゼおよび珪藻土を利用しシンダを濾過する（活性炭の添加比率は６％であり、活性炭は環宇炭業から購入）。
【００４８】
＜濾過＞
浄化された発酵液を０．２２ｕｍの濾過膜によって濾過し、サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵生成物を得る。
【００４９】
（実施例２）
〔単独で酵母発酵する方法〕
単独で酵母発酵することによる生成物の具体的な実施形態は以下のとおりである。
【００５０】
＜培養液の調製＞
２０Ｌの培養液の配合が６０ｇのペプトン、４ｇの麦芽汁、７ｇの無水硫酸マグネシウム、２．４ｇのリン酸二水素カリウム、４０ｇの硫酸アンモニウム、１ｇの無水塩化鉄、５ｇの塩化ナトリウムであるものについて、ｐＨ値を酸またはアルカリで調整および制御し、水を２０Ｌまで補充し、異なる量の培養液は、上記配合に応じて増減する。
【００５１】
１.  菌種拡大培養
（１）クリーンベンチににおいて試験管斜面上のサッカロマイセス・セレビシエＣＩＣＣ１５９６を１ループ取り、５０ｍｌの培養液（ｐＨ４．８±０．２）が入った２５０ｍｌの三角フラスコに接種し、２００ｒｐｍ（１分ごとに２００回転）、３０℃で１０ｈほど培養し、菌体は対数増殖期にある；
（２）対数増殖期にある菌体を２Ｌ（ｐＨ４．８±０．２）が入った２．５Ｌの三角フラスコに接種し、接種量を１０％（体積百分率、２００ミリリットルのステップ（１）の対数増殖期にある酵母培養液）とし、２００ｒｐｍ、３０℃で１０ｈほど培養する；
（３）ステップ（２）で培養した３Ｌの菌種を３０Ｌの発酵液（ｐＨ４．８±０．２）が入った一級種の５０Ｌタンクに接種し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持し、２００ｒｐｍ、３０℃で１０ｈほど培養する；
（４）３０Ｌの菌液を３００Ｌが入った二級種の５００Ｌのタンクに移し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持し、２００ｒｐｍ、３０℃で１０ｈほど培養する。
【００５２】
２.  発酵
３００Ｌの二級種タンク内の酵母菌培養液を２７００Ｌの培養液（ｐＨ４．８±０．２）が入った５０００Ｌの発酵タンクに移し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持し、２００ｒｐｍ、３０℃で１４ｈほど培養する。
【００５３】
＜培養液の調製＞
２０Ｌの培養液の配合が６０ｇのペプトン、４ｇの麦芽汁、７ｇの無水硫酸マグネシウム、２．４ｇのリン酸二水素カリウム、４０ｇの硫酸アンモニウム、１ｇの無水塩化鉄、５ｇの塩化ナトリウムであるものについて、ｐＨ値は酸またはアルカリで調整および制御し、水を２０Ｌ補充し、異なる量の培養液は、上記配合に応じて増減する。
【００５４】
３.  分離精製
＜遠心による除菌＞
ステップ２の発酵を経た培養液に対し、プレートフレーム濾過を経て、菌体を濾過膜（０．２２ｕｍ）にブロックし、発酵上清を得る。
【００５５】
＜浄化＞
発酵上清を活性炭に加え不純物を吸着させ、悪臭を除去し、複数層の脱脂ガーゼおよび珪藻土を利用してシンダを濾過する（活性炭の添加比率は６％であり、活性炭は環宇炭業から購入）。
【００５６】
＜濾過＞
浄化した発酵液を０．２２ｕｍの濾過膜によって濾過し、単一の酵母菌発酵生成物を得る。
【００５７】
（実施例３）
〔単独で好熱性細菌を発酵させる方法〕
単一のサーマス・サーモフィラス発酵生成物の具体的な実施形態は以下のとおりである。
【００５８】
＜培養液の調製＞
２０Ｌの培養液の配合が６０ｇのペプトン、４ｇの麦芽汁、７ｇの無水硫酸マグネシウム、２．４ｇのリン酸二水素カリウム、４０ｇの硫酸アンモニウム、１ｇの無水塩化鉄、５ｇの塩化ナトリウムであるものについて、ｐＨ値は酸またはアルカリで調整および制御し、水を２０Ｌまで補充し、異なる量の培養液は、上記配合に応じて増減する。
【００５９】
１.  菌種拡大培養
クリーンベンチにおいてサーマス・サーモフィラスＨＢ２７の凍結溶液を２ｍｌ取り、２Ｌの培養液（ｐＨ７．８±０．２）が入った２．５Ｌの三角フラスコに接種し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持し、１５０ｒｐｍ、６５℃で１２ｈほど培養し、菌体が対数増殖期になってから、３０Ｌの菌液を３００Ｌの培養液が入った二級種の５００Ｌタンクに接種する。
【００６０】
２.  発酵
３００Ｌのサーマス・サーモフィラスの増殖液を２７００Ｌの培養液を含有する発酵タンクに移し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持し、１５０ｒｐｍで撹拌し、ｐＨ値を７．８±０．２に調整し、１５０ｒｐｍ、６５℃で１８ｈほど培養する。
【００６１】
３.  分離精製
＜遠心による除菌＞
ステップ２の発酵を経た培養液に対し、プレートフレーム濾過を経て、菌体を濾過膜（０．２２ｕｍ）にブロックし、発酵上清を得る。
【００６２】
＜浄化＞
発酵上清を活性炭に加え不純物を吸着させ、悪臭を除去し、複数層の脱脂ガーゼおよび珪藻土を利用してシンダを濾過する（活性炭の添加比率は６％であり、活性炭は環宇炭業から購入）。
【００６３】
＜濾過＞
浄化した発酵液は０．２２ｕｍの濾過膜によって濾過し、単一のサーマス・サーモフィラス発酵生成物を得る。
【００６４】
（実施例４）
〔実施例２および３の発酵生成物を混合して得られた試薬〕
実施例２および３の発酵生成物を取り、重量比１：１で混合して複合試薬を得る。
【００６５】
（実施例５）
〔酵母および好熱性細菌の共培養方法（２）〕
サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵生成物の具体的な実施形態は以下のとおりである。
【００６６】
＜培養液の調製＞
２０Ｌの培養液の配合が６０ｇのペプトン、４ｇの麦芽汁、７ｇの無水硫酸マグネシウム、２．４ｇのリン酸二水素カリウム、４０ｇの硫酸アンモニウム、１ｇの無水塩化鉄、５ｇの塩化ナトリウムであるものについて、ｐＨ値は酸またはアルカリで調整および制御し、水を２０Ｌまで補充し、異なる量の培養液は、上記配合に応じて増減する。
【００６７】
１.  菌種拡大培養
＜酵母菌の増殖＞
クリーンベンチにおいて試験管斜面上のサッカロマイセス・セレビシエＣＩＣＣ１５９６を１ループ取り、５０ｍｌの培養液（ｐＨ４．８±０．２）が入った２５０ｍｌの三角フラスコに接種し、２００ｒｐｍ、３０℃で１０ｈほど培養し、菌体は対数増殖期にある。２Ｌ（ｐＨ４．８±０．２）が入った２．５Ｌの三角フラスコに接種し、接種量を１０％（体積比、ここで、対数増殖期にある２００ミリリットルの酵母培養液を接種する）とし、２００ｒｐｍ、３０℃で１０ｈほど培養する。３Ｌの菌種を３０Ｌの発酵液（ｐＨ４．８±０．２）が入った一級種の５０Ｌタンクに接種し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持し、２００ｒｐｍ、３０℃で１０ｈほど培養する。３０Ｌの菌液を３００Ｌの培養液が入った二級種の５００Ｌタンクに移す。通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持させ、２００ｒｐｍ、３０℃で１０ｈほど培養する。
【００６８】
＜サーマス・サーモフィラスの増殖＞
クリーンベンチにおいてサーマス・サーモフィラスＨＢ２７の凍結溶液を２ｍｌ取り、２Ｌの培養液（ｐＨ７．８±０．２）が入った２．５Ｌの三角フラスコに接種し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持させ、１５０ｒｐｍ、６５℃で１２ｈほど培養し、菌体が対数増殖期になってから、３０Ｌの菌液を３００Ｌの培養液が入った二級種の５００Ｌタンクに接種して培養し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持させ、１５０ｒｐｍ、６５℃で１２ｈほど培養する。
【００６９】
２.  発酵
３００Ｌの二級種タンク内の酵母菌および３００Ｌの二級種タンク内のサーマス・サーモフィラス培養液を２４００Ｌの培養液（ｐＨ４．８±０．２）が入った５０００Ｌの発酵タンクに移し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持させ、２００ｒｐｍ、３０℃で１４ｈほど培養する。さらに、発酵液の温度を６５℃まで昇温させ、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持させ、１５０ｒｐｍで撹拌し、アルカリ液でｐＨ値を７．８±０．２に調整し、６５℃で１８ｈほど培養する。
【００７０】
３.  分離精製
＜遠心による除菌＞
ステップ２の発酵を経た培養液に対し、プレートフレーム濾過を経て、菌体を濾過膜（０．２２ｕｍ）にブロックし、発酵上清を得る。
【００７１】
＜浄化＞
発酵上清を活性炭に加え不純物を吸着させ、悪臭を除去し、さらに複数層の脱脂ガーゼおよび珪藻土を利用してシンダを濾過する（活性炭の添加比率は６％であり、活性炭は環宇炭業から購入）。
【００７２】
＜濾過＞
浄化した発酵液を０．２２ｕｍの濾過膜によって濾過し、サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵生成物を得る。
【００７３】
（実施例６）
〔酵母および好熱性細菌の共培養方法（３）〕
サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵生成物の具体的な実施形態は以下のとおりである。
【００７４】
＜培養液の調製＞
２０Ｌの培養液の配合が６０ｇのペプトン、４ｇの麦芽汁、７ｇの無水硫酸マグネシウム、２．４ｇのリン酸二水素カリウム、４０ｇの硫酸アンモニウム、１ｇの無水塩化鉄、５ｇの塩化ナトリウムであるものについて、ｐＨ値は酸またはアルカリで調整および制御し、水を２０Ｌまで補充し、異なる量の培養液は、上記配合に応じて増減する。
【００７５】
１.  菌種拡大培養
＜酵母菌の増殖＞
クリーンベンチにおいて試験管斜面上のサッカロマイセス・セレビシエＣＩＣＣ１５９６を１ループ取り、５０ｍｌの培養液（ｐＨ４．８±０．２）が入った２５０ｍｌの三角フラスコに接種し、２００ｒｐｍ、３０℃で１０ｈほど培養し、菌体は対数増殖期にあり、２Ｌ（ｐＨ４．８±０．２）が入った２．５Ｌの三角フラスコに接種し、接種量を１０％（体積比）であり、２００ｒｐｍ、３０℃で１０ｈほど培養し、３Ｌの菌種を３０Ｌの発酵液（ｐＨ４．８±０．２）が入った一級種の５０Ｌタンクに接種し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持させ、２００ｒｐｍ、３０℃で１０ｈほど培養する。３０Ｌの菌液を３００Ｌが入った二級種の５００Ｌタンクに移し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持させ、２００ｒｐｍ、３０℃で１０ｈほど培養する。
【００７６】
＜サーマス・サーモフィラスの増殖＞
クリーンベンチにおいてサーマス・サーモフィラスＨＢ２７の凍結溶液を２ｍｌ取り、２Ｌの培養液（ｐＨ７．８±０．２）が入った２．５Ｌの三角フラスコに接種し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持させ、１５０ｒｐｍ、６５℃で１２ｈほど培養し、菌体が対数増殖期になってから、３０Ｌの菌液を３００Ｌの培養液が入った二級種の５００Ｌタンクに接種する。さらに、発酵液の温度を６５℃に昇温させ、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持し、１５０ｒｐｍで撹拌し、アルカリ液でｐＨ値を７．８±０．２に調整し、１５０ｒｐｍ、６５℃で１８ｈほど培養する。
【００７７】
２．  発酵
３００Ｌの二級種タンク内の酵母菌および３００Ｌの二級種タンク内のサーマス・サーモフィラス培養液を同時に２４００Ｌの培養液（ｐＨ７．８±０．２）が入った５０００Ｌの発酵タンクに移し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持させ、１５０ｒｐｍ、６５℃で１８ｈほど培養する。発酵液の温度を３０℃に低下させ、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持し、２００ｒｐｍで撹拌し、酸液でｐＨ値を４．８±０．２に調整し、２００ｒｐｍ、３０℃で１４ｈほど培養する。
【００７８】
３．  分離精製
＜遠心による除菌＞
ステップ２の二次発酵を経た培養液に対し、プレートフレーム濾過を経て、菌体を濾過膜（０．２２ｕｍ）にブロックし、発酵上清を得る。
【００７９】
＜浄化＞
発酵上清を活性炭に加え不純物を吸着させ、悪臭を除去し、さらに複数層の脱脂ガーゼおよび珪藻土を利用してシンダを濾過する（活性炭の添加比率は６％であり、活性炭は環宇炭業から購入）。
【００８０】
＜濾過＞
浄化した発酵液を０．２２ｕｍの濾過膜によって濾過し、サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵生成物を得る。
【００８１】
（実施例７）
〔サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵方法（４）〕
実施例１との相違点は、二次発酵において、一次発酵（ステップ２）の培養液の温度を３０℃から６５℃に昇温させた後、６５℃に達してから１日後に、３００Ｌのサーマス・サーモフィラス増殖液をこの発酵タンクに移し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持させ、１５０ｒｐｍで撹拌し、アルカリ液でｐＨ値を７．８±０．２に調整し、１５０ｒｐｍ、６５℃で１８ｈほど培養することにある。
【００８２】
（実施例８）
〔サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵方法（５）〕
実施例１との相違点は、二次発酵において、一次発酵（ステップ２）の培養液の温度を３０℃から６５℃に昇温させた後、６５℃に達してから２日後に、３００Ｌのサーマス・サーモフィラス増殖液をこの発酵タンクに移し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持させ、１５０ｒｐｍで撹拌し、アルカリ液でｐＨ値を７．８±０．２に調整し、１５０ｒｐｍ、６５℃で１８ｈほど培養することにある。
【００８３】
（実施例９）
〔サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵方法（６）〕
実施例１との相違点は、二次発酵において、一次発酵（ステップ２）の培養液の温度を３０℃から７５℃に昇温させた後、７５℃に達してから３日後に、３００Ｌのサーマス・サーモフィラス増殖液をこの発酵タンクに移し、通気量を５ｍ３／ｈ／５０Ｌに維持させ、１５０ｒｐｍで撹拌し、アルカリ液でｐＨ値を７．８±０．２に調整し、１５０ｒｐｍ、６５℃で１８ｈほど培養することにある。
【００８４】
（実施例１０）
＜細胞毒性試験＞
対数期細胞（ヒト皮膚線維芽細胞およびヒト皮膚角質細胞）を収集し、培養液で単一の細胞懸濁液を製造し、最終的な細胞濃度を４００００ｃｅｌｌ／ｍＬに調整し、９６ウェルプレートに１００ｕＬの細胞懸濁液を加え、５％ＣＯ２、３７℃で孵化し、細胞が壁に接着した後、試験物質を加え（実施例１〜９の各発酵生成物を含む細胞培養液）、８０％〜９０％に培養し融合させた後、各ウェルにＭＴＴ溶液２０ｕＬを加え３ｈ孵化し続け、培養を終了する。慎重にウェル内の培地を吸い取り、各ウェルに１００ｕＬのＤＭＳＯを加え、１０ｍｉｎ振動することにより、結晶物を十分に融解させる。マイクロプレートリーダで各ウェルの吸光度の値を測定し、４９０ｎｍの波長を選択し、６３０ｎｍを参照波長とする。各処理を５回繰り返す。
【００８５】
実施例１〜９の各発酵生成物を含む高糖質のＤＭＥＭ細胞培養液を加え、細胞培養液は３％の発酵生成物を含む高糖質のＤＭＥＭ細胞培養液であり、３％の実施例１（サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵生成物）のヒト皮膚線維芽細胞の成長率は１３１％であり、３％の実施例３（単一のサーマス・サーモフィラス発酵生成物）に比べて２０％向上されており、具体的には以下の表１を参照する。
【００８６】
１０％の実施例１（サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵生成物）が添加されたヒト皮膚角質細胞の成長率は１０１％であり、１００ｐｐｍのデキサメタゾンが添加されたヒト皮膚角質細胞の成長率は８９％である。１０％の実施例１（サーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵生成物）は１００ｐｐｍのデキサメタゾンに比べてさらに穏やかである。結果は以下の表１のとおりである。
【００８７】
【表１】
2019187409.tif 000002
【００８８】
分散分析によれば、実施例１および７と実施例２〜６および８〜９との差はそれぞれＰ＜０．０１であり、極めて顕著な差に達し、実施例２〜６および８〜９の間は顕著な差がない。これは、本発明の実施例１の組合せによる培養方法は、ヒト皮膚線維芽細胞の成長率を顕著に促進することができ、ヒト皮膚角質細胞に対しても顕著な促進作用があり、混合培養の効果が最もよく、実施例１または実施例７の混合作用の効果が最もよいことを説明する。同時に、混合培養を行う際、混合するタイミングも非常に重要であり、温度が昇温した後すぐに混合しまたは１日後に混合すると、効果が最もよいが、２日超えて混合する効果は繊維芽細胞に対する効果が急激に低下することも説明する。類似する効果は細胞のヒト皮膚角質細胞の成長率に対する影響と類似している。
【００８９】
（実施例１１）
＜消炎効果試験＞
対数期のヒト皮膚角質細胞を収集し、培養液で単一の細胞懸濁液を製造し、最終的な細胞濃度を４００００ｃｅｌｌ／ｍＬに調整し、９６ウェルプレートに１００ｕＬの細胞懸濁液を加え、５％ＣＯ２、３７℃で２４時間孵化し、培養液を吸出し、ＰＢＳで１回洗い、吸出し、さらに２０ｕＬのＰＢＳを加え、ＵＶＢを照射し、輻射量を６０  ｍＪ／ｃｍ２に制御し、試験物質に入れ替え（実施例１〜９の各発酵生成物を、高糖質のＤＭＥＭ細胞培養液で希釈し、濃度が１０％である各発酵生成物）、２４ｈ培養した後、培養液の上清を収集する。炎症因子（ＩＬ−１ａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−ａ）の含有量（完成品試薬キットの説明書に従って検出する）を検出する。試験を５回繰り返す。
【００９０】
結果によると、１０％のサーマス・サーモフィラスおよび酵母菌の組合せによる発酵生成物（実施例１）を含む高糖質のＤＭＥＭ細胞培養液を加える場合、炎症因子の含有量ＩＬ−１αは１１０．１２ｐｇ／ｍＬであり、ＩＬ−６は１６．２３ｐｇ／ｍＬであり、ＩＬ−８は１３００．２０ｐｇ／ｍＬおよびＴＮＦ−αは４２．２５ｐｇ／ｍＬであり、分泌量は１０％の単一のサーマス・サーモフィラス発酵生成物に比べて明らかに減少され、消炎効果が明らかであり（分析をよると、炎症因子の含有量が顕著に低下されている）、１００ｐｐｍのデキサメタゾンの消炎効果に相当する。
【００９１】
【表２】
2019187409.tif 000003
【００９２】
これは、本発明の培養方法により得られた活性生成物は炎症因子の生成を顕著に低下させることができ、単一の発酵または発酵の混合物に比べて、分散分析によると、実施例１、７とその他の処理とはいずれも高い有意差（具体的な試験データは省略する）に達していることを説明する。これは、酵母およびサーマス・サーモフィラスの共培養は、酵母を採用して一次培養し、その後二次混合培養を行うことにより、２種類の菌の生理活性物質に対していずれも促進作用を果たし、活性も顕著に向上されていることを説明する。逆に、単独培養することや単独培養後混合すること、およびその他の方式で混合培養することは、このような効果を得ることができない。これは、サーマス・サーモフィラスにビタミンＢ群が含有されていることに起因すると考えられるが、ビタミンＢ群の主要作用はおそらく皮膚の消炎であり、これは、２種類の異なる菌を共培養した後、サーマス・サーモフィラス内のビタミンＢ群の活性を向上させることができ、またはその他の不明な物質によりビタミンＢ群により大きな活性を持たせることを説明することができる。
【００９３】
また、本発明は、９つの処理におけるビタミンＢ群に対して同時に通常の方法で測定した結果、各処理における１００グラムごとの発酵生成物のビタミンＢ群は明らかな変化がないことを発見した。これは、組合せによる発酵は一部のビタミンＢ群にさらなる活性を有する因子を生成させることによって、ビタミンＢ群の活性を向上させ、さらに優れた消炎作用を有することを説明している。これらの具体的な活性因子の生成メカニズムは、さらに検討する必要がある。
【００９４】
（実施例１２）
＜皮膚のバリア修復試験＞
皮膚角質層は優れたバリア機能を有するが、温度、風、太陽光などの外部要因の影響を受けて損傷するため、適時にバリア修復を行うことは非常に重要である。本試験では、ＴＥＷＬ（Ｔｒａｎｓ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｗａｔｅｒ  Ｌｏｓｓ、ＴＥＷＬ）を指標として採用し、ＴＥＷＬが低いほど皮膚のバリア修復能力が高い。ここで、試験機器は、ドイツＣＫ社の皮膚水分流出（ＴＥＷＬ）試験プローブＴＭ３００であり、試験条件は、被験者が温度２２℃±１℃、湿度５０％±５％の室内で２０ｍｉｎ間静座することである。
【００９５】
＜試験方法＞
年齢が２２〜５５歳、無皮膚疾患または過去ある薬物、化粧品または一部の化学物質に対し深刻なアレルギーがあった２０名のボランティアを選ぶ。朝晩２回連続して、顔の半分に対照群および１０％の実施例１〜９の発酵生成物を含有するセラム（セラムの主要成分には、脱イオン水、Ｔｗｅｅｎ−８０、プロピレングリコール、防腐剤および１０％の本発明の実施例１〜９の発酵生成物があり、１０％の発酵生成物に採用された溶媒はＰＢＳを溶媒として調製されており、ｐＨは７．１である）を使用し、製品を７日間ほど使用した後ＴＥＷＬ試験を行い、ＴＥＷＬの変化率を計算する。ＴＥＷＬの変化率の計算方式は、  ［（７日後のＴＥＷＬ値−７日前のＴＥＷＬ値）／７日前のＴＥＷＬ値］＊１００％であり、ＴＥＷＬの変化率が低いほど、皮膚に対するバリア作用がよい（各実施例において５回繰り返す）。結果は表３のとおりである。
【００９６】
【表３】
2019187409.tif 000004
【００９７】
有意差異分析によれば、実施例１、７〜８と実施例２〜６、９とはバリアに対する修復効果が高い有意差に達し（具体的な試験データは省略する）、これは、本発明の実施例１の方法によって培養して得られた共培養生成物は皮膚角質層に対して顕著な修復機能を有することができ、皮膚角質層細胞を修復する生理活性物質の活性または産出量、またはその他の補助因子の産出量または活性を向上させた可能性がある。
【００９８】
（実施例１３）
＜皮膚黄み消去試験＞
ＣＩＥＸＹＺシステムを利用し、数学的方法によって変換しＣＩＥＬ＊ａ＊ｂ＊色空間を得る。該空間は１つの輝度（Ｌ）および２つの色相（ａ、ｂ）軸により構成される。輝度はグレースケールを表示する尺度であり、その値は０〜１００の間であり、０は黒を表示し、１００は白を表示する。ａ＊は赤から緑の間の彩度であり、その変化範囲は＋６０〜−６０であり、正の値は赤の強さの変化を表示する。ｂ＊は黄色から藍の間の彩度を示し、その変化範囲は＋６０〜−６０であり、正の値は黄色の強さの変化を表示する。皮膚の色もＬ＊ａ＊ｂ＊で表示し、ｂ＊値が低いほど黄み消去の効果が明らかであり、Δｂ＊が低いほど、黄み消去の効果がよい。
【００９９】
＜試験方法＞
年齢が２２〜５５歳であるボランティア２０人を選び、朝晩２回連続して、顔の半分に対照群および１０％の実施例１〜６の発酵生成物を含有するセラム（セラムの主要成分には、脱イオン水、Ｔｗｅｅｎ−８０、プロピレングリコール、防腐剤がある）を使用し、連続に７日間使用する（試験を５回繰り返す）。製品を使用する前に、製品を７日間使用した後ＶＩＳＩＡ撮影を行い、各群の平均Δｂ＊値を計算する。
【０１００】
ここで、試験機器は、ＬＡＢ試験機器のｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  ＣＭ２６００ｄ（Ｍｉｎｏｌｔａ、Ｏｓａｋａ、日本）であり、試験前に被験者は顔を徹底的に洗顔した後ティッシュで拭き取り、温度２２℃±１℃、湿度５０％±５％の部屋内で２０ｍｉｎ静座する。
【０１０１】
【表４】
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【０１０２】
我々の分散分析によれば、実施例１の試薬および実施例７の試薬はその他の各処理と高い有意差が認められ、本発明の共培養は、老化および色素沈着を取り消す生理活性物質の増加に有益であることを説明する。また、特に、共培養に対して適切な添加時間があることが比較的に重要である。実施例２〜６、８〜９の間は有意差が認められない（図１）。
【０１０３】
我々はヒト皮膚細胞試験から、該原材料（実施例１または７）の添加量の増加に伴い細胞の生存能力が増加し（濃度１．２５％〜１２％）、従って該原材料は皮膚細胞の増殖再生能力を向上させることが分かった。逆に、同様な実施例２〜６、８〜９の原材料に対して同じく濃度を添加することは、細胞の生存能力を増加させず、一部は、例えば、実施例８〜９では逆に細胞の生存能力を低下させている。これに対する合理的な解釈は以下の通りである。皮膚の正常な再生サイクルは３〜４週間であり、細胞の増殖再生を促進することは皮膚の表皮層の新陳代謝を促進することによって、老化および色素沈着の角質を消去し、皮膚の外観に黄み消去の効果を持たせることができる。皮膚細胞の増殖再生能力を向上させる原因については、分析および試験によれば、該原材料には大量の多糖体、多価フェノール、アミノ酸などの細胞栄養成分が含有され、これらの栄養成分は細胞の増殖および再生に役立ち、細胞の生存能力を向上させる。これは、さらに、共培養発酵方法において、２種類の菌の混合のタイミングは特に重要であり、適切なタイミングの選択は一部の有益な生理活性物質の生産に役立ち、逆の場合、一部の有害物質が生成され、またはある症状に対して有害の物質を生成する可能性がある。
【０１０４】
（実施例１４）
〔皮膚製剤の消炎試験〕
＜消炎効果試験＞
年齢１５〜３５歳のにきび（にきびレベル３〜４）がある患者３×１６０＝４８０名（各グループに男女それぞれ８０名）を選んで試験し、実施例１、８により得られた発酵生成物に対して試験を行った。
【０１０５】
＜使用方法＞
洗顔後、毎朝晩２回に分けて実施例１、８の発酵生成物を使用し（滅菌水で調製した１５％の発酵生成物の皮膚製剤）、滅菌水を対照として、１０日間連続して使用し、患部の発赤、腫れ、皮膚損傷の度合いを観察し、専門家の採点を基準として（０〜４点でにきびの深刻程度をつけ、０−にきびが認められない、１−軽いにきびがあり、ブラックヘッドが散在且つ多発し、散在性炎症性にきびがある；２−中間程度のにきびがあり、表在膿疱、炎症性にきびの箇所が多く、顔に限られている；３−重度、深在性炎症性にきびが認められる；４−重度、嚢胞、瘢痕が形成されやすい）評価した。
【０１０６】
具体的なデータは下記の通りである。実施例１の発酵生成物は、にきびのレベルを顕著に低下させることができ、ここで、７５名の女性は使用前のレベル３または４から１０日間使用した後のレベル０〜１に変化され、５０名の女性はレベル０に変化し、男性患者は、６８人が使用前のレベル４から使用後のレベル１に変化した。明らかな変化がない人は、その他の原因によるにきびであるか効果がない。しかし、同じ方法を採用する場合、実施例２〜６の発酵生成物の消炎効果から見て、使用前および使用後、にきびレベルには明らかな変化がなく、実施例３および４を使用した患者は、女性の６名のみがレベル３からレベル１に変化し、男性は４名のみがレベル４からレベル１に変化した。実施例８の発酵生成物を採用した消炎効果から見て、一定の消炎効果を有するが、効果は明らかでなく、８０名の女性患者のうち７名のみがレベル３からレベル１に変化し、８０名の男性患者は６名のみがレベル４からレベル１に変化した。人体実験の結果から、実施例１は比較例２〜６、８〜９に比べてにきびに対する抑制および消炎効果がよりよく、効果はさらに明らかであり、実施例８における消炎効果と互いに適合し、滅菌水にも明らかな変化がないことが明らかになった。
【０１０７】
本明細書における方法を説明するための用語および表現方式は唯一且つ一定のものではなく、これらの用語および表現方式を使用して本発明または特徴を説明する如何なる同じ意味の表現方式を排除しようとする意図がなく、本発明が指定の範囲内の様々な表現方式を認める。従って、我々は本明細書において本発明が様々な具体的な解決手段および任意の特徴に対する説明によって明瞭に展開されたと考えるが、本明細書に開示された設計の表現方式を変更するにはさらに経験のある専門技術者に頼らなければならず、これらの変更は本発明に付属する声明と一致しなければならない。文章、特許、特許の適用はすべてのその他のテキストの内容および本明細書に言及され引証された有用な電子情報と結合されたものであり、必ず完全な内容として参考すべきであり、そのうちの如何なる部分を発表する時は特別にこの点を明示しなければならない。出願人は如何なるまたは全てのこれらの文章、特許、特許の適用またはその他のテキストの情報および材料を該出願書類に編入し本明細書が開示された一部とする権利を有する。