(57)【要約】【課題】ステロールの製造法を提供する。【解決手段】２４−デヒドロコレステロールレダクターゼ（DHCR24）またはステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼ（SMT1）の活性が低下するように改変されたステロール生産能を有するラビリンチュラ類微生物を培養し、培養物からステロールを回収することにより、ステロールを製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステロールの製造方法であって、
ステロール生産能を有するラビリンチュラ類微生物を培地で培養すること、
前記培養により生成した菌体からステロールを回収すること、
を含み、
前記微生物が、２４−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されており、
前記ステロールが、植物ステロールおよび真菌ステロールから選択される少なくとも１種のステロールであり、
ただし、前記微生物がオーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）sp.1である場合を除く、方法。
【請求項２】
前記２４−デヒドロコレステロールレダクターゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１に記載の方法：
（ａ）配列番号１８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１８に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、２４−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１８に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、２４−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
２４−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、２４−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が低下した、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
２４−デヒドロコレステロールレダクターゼのアミノ酸配列の一部または全部の欠失により、２４−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が低下した、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ステロールが、７−デヒドロポリフェラステロール、スティグマステロール、４−メチル−７，２２−スティグマスタジエノール、エルゴステロール、および７−ジヒドロエルゴステロールから選択される少なくとも１種のステロールである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステロールの製造方法であって、
ステロール生産能を有するラビリンチュラ類微生物を培地で培養すること、
前記培養により生成した菌体からステロールを回収すること、
を含み、
前記微生物が、ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されており、
前記ステロールが、コレステロールであり、
ただし、前記微生物がオーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）sp.1である場合を除く、方法。
【請求項７】
前記ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項６に記載の方法：
（ａ）配列番号２０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２０に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、ステロール２４−Ｃ−
メチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項８】
ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼの活性が低下した、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列の一部または全部の欠失により、ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼの活性が低下した、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステロールが、遊離型のステロール、ステロールエステル、ステリルグルコシド、アシルステリルグルコシド、またはそれらの混合物である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物が、オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属、シゾキトリウム（Schizochytrium）属、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）属、またはパリエティキトリウム（Parietichytrium）属に属する微生物である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物が、オーランチオキトリウム・リマシナム（Aurantiochytrium limacinum）である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラビリンチュラ類微生物を利用したステロールの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステロールは、動物、植物、真菌等の各種生物において見出されるステロイド誘導体である。ステロールは、例えば、それらステロールを有する生物資源からの抽出により製造されている。また、従属栄養微生物であるラビリンチュラ類の中にはコレステロール等のステロールを生産するものが知られている（非特許文献１）。また、ラビリンチュラ類微生物の改変株を用いたステロールの製造法も報告されている。
【０００３】
例えば、７−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性を低下させたオーランチオキトリウム・リマシナム（Aurantiochytrium limacinum）等のラビリンチュラ類微生物を用いた７−デヒドロコレステロールの製造法が報告されている（特許文献１）。
【０００４】
また、例えば、ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼ（Sterol 24-C-methyltransferase；「SMT1」ともいう）の活性を低下させたオーランチオキトリウム・リマシナム等のラビリンチュラ類微生物を用いた７−デヒドロコレステロールの製造法が報告されている（特許文献２）。特許文献２によれば、SMT1の活性の低下により、７−デヒドロコレステロールの蓄積は増大するが、コレステロールの蓄積は減少することが示されている。
【０００５】
SMT1は、ステロールのＣ２４位にメチル基を導入する酵素である（EC 2.1.1.41）。SMT1は、ステロールの生合成に関与する酵素の１つであり、具体的には、植物ステロールおよび真菌ステロールの生合成に関与する。SMT1の活性を低下させたラビリンチュラ類微生物を用いたコレステロールの製造法は知られていない。
【０００６】
２４−デヒドロコレステロールレダクターゼ（24-dehydrocholesterol reductase；「DHCR24」ともいう）は、ステロールのＣ２４位の二重結合を還元する酵素である（EC 1.3.1.72）。DHCR24は、ステロールの生合成に関与する酵素の１つであり、具体的には、コレステロールや７−デヒドロコレステロール等の動物ステロールの生合成に関与する。DHCR24の活性を低下させたラビリンチュラ類微生物を用いた植物ステロールまたは真菌ステロールの製造法は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO2015/108058
【特許文献２】WO2016/056610
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Weete JD, et al., Lipids and ultrastructure of Thraustochytrium sp. ATCC 26185., Lipids. 1997 Aug;32(8):839-45.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ステロールの製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、DHCR24またはSMT1の活性が低下するようにラビリンチュラ類微生物を改変することにより同微生物のステロール生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
ステロールの製造方法であって、
ステロール生産能を有するラビリンチュラ類微生物を培地で培養すること、
前記培養により生成した菌体からステロールを回収すること、
を含み、
前記微生物が、２４−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されており、
前記ステロールが、植物ステロールおよび真菌ステロールから選択される少なくとも１種のステロールであり、
ただし、前記微生物がオーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）sp.1である場合を除く、方法。
［２］
前記２４−デヒドロコレステロールレダクターゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（ａ）配列番号１８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１８に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、２４−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１８に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、２４−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質。［３］
２４−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、２４−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が低下した、前記方法。
［４］
２４−デヒドロコレステロールレダクターゼのアミノ酸配列の一部または全部の欠失により、２４−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が低下した、前記方法。
［５］
前記ステロールが、７−デヒドロポリフェラステロール、スティグマステロール、４−メチル−７，２２−スティグマスタジエノール、エルゴステロール、および７−ジヒドロエルゴステロールから選択される少なくとも１種のステロールである、前記方法。
［６］
ステロールの製造方法であって、
ステロール生産能を有するラビリンチュラ類微生物を培地で培養すること、
前記培養により生成した菌体からステロールを回収すること、
を含み、
前記微生物が、ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されており、
前記ステロールが、コレステロールであり、
ただし、前記微生物がオーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）sp.1である場合を除く、方法。
［７］
前記ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（ａ）配列番号２０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２０に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
［８］
ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼの活性が低下した、前記方法。
［９］
ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列の一部または全部の欠失により、ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼの活性が低下した、前記方法。
［１０］
前記ステロールが、遊離型のステロール、ステロールエステル、ステリルグルコシド、アシルステリルグルコシド、またはそれらの混合物である、前記方法。
［１１］
前記微生物が、オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属、シゾキトリウム（Schizochytrium）属、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）属、またはパリエティキトリウム（Parietichytrium）属に属する微生物である、前記方法。
［１２］
前記微生物が、オーランチオキトリウム・リマシナム（Aurantiochytrium limacinum）である、前記方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、ラビリンチュラ類微生物のステロール生産能を向上させることができ、ステロールを効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（Ａ）DHCR24遺伝子欠損コンストラクトの概略図。（Ｂ）PCRによるDHCR24遺伝子欠損確認の概略図。
【図２】（Ａ）SMT1遺伝子欠損コンストラクトの概略図。（Ｂ）PCRによるSMT1遺伝子欠損確認の概略図。
【図３】野生株とDHCR24遺伝子欠損株のステロール解析の結果を示す図。（Ａ）遊離ステロール、（Ｂ）ステロール派生物。縦軸はPeak Areaを表す。棒グラフ左が野生株、棒グラフ中央と右が２株のDHCR24遺伝子欠損株を表す。結果はMean±SD(n=3)で示す。
【図４】野生株とSMT1遺伝子欠損株のステロール解析の結果を示す図。（Ａ）遊離ステロール、（Ｂ）ステロール派生物。縦軸はPeak Areaを表す。棒グラフ左が野生株、棒グラフ右がSMT1遺伝子欠損株を表す。結果はMean±SD(n=3)で示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
＜１＞本発明の微生物
本発明の微生物は、DHCR24またはSMT1の活性が低下するように改変された、ステロール生産能を有するラビリンチュラ類微生物である。
【００１６】
＜１−１＞ラビリンチュラ類微生物
「ラビリンチュラ類微生物」とは、ラビリンチュラ類に分類される微生物をいう。ラビ
リンチュラ類微生物としては、オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属、シゾキトリウム（Schizochytrium）属、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）属、パリエティキトリウム（Parietichytrium）属、ラビリンチュラ（Labyrinthula）属、アルトルニア（Althornia）属、アプラノキトリウム（Aplanochytrium）属、イァポノキトリウム（Japonochytrium）属、ラビリンチュロイデス（Labyrinthuloides）属、ウルケニア（Ulkenia）属、オブロンギキトリウム（Oblongichytrium）属、ボトリオキトリウム（Botryochytrium）属、およびシクヨイドキトリウム（Sicyoidochytrium）属等の属に属する微生物が挙げられる。ラビリンチュラ類微生物としては、特に、Aurantiochytrium属微生物、Schizochytrium属微生物、Thraustochytrium属微生物、Parietichytrium属微生物が挙げられる。ラビリンチュラ類微生物としては、さらに特には、Aurantiochytrium属微生物が挙げられる。Aurantiochytrium属微生物としては、例えば、Aurantiochytrium limacinumやAurantiochytrium sp.2が挙げられる。Schizochytrium属微生物としては、例えば、Schizochytrium aggregatumが挙げられる。Thraustochytrium属微生物としては、例えば、Thraustochytrium aureumが挙げられる。Parietichytrium属微生物としては、例えば、Parietichytrium sarkarianumが挙げられる。Botryochytrium属微生物としては、例えば、Botryochytrium radiatumが挙げられる。ラビリンチュラ類微生物として、具体的には、例えば、Aurantiochytrium limacinum mh0186（FERM BP-11311）、Aurantiochytrium limacinum ATCC MYA-1381、Thraustochytrium aureum ATCC34304、Thraustochytrium sp. ATCC26185、Schizochytrium aggregatum ATCC28209、Schizochytrium sp. AL1Ac、Schizochytrium sp. SEK210（NBRC 102615）、Schizochytrium sp. SEK345（NBRC 102616）、Parietichytrium sarkarianum SEK364（FERM BP-11298）、Ulkenia sp. ATCC 28207、Botryochytrium radiatum SEK353（NBRC 104107）が挙げられる。
【００１７】
Aurantiochytrium limacinum mh0186は、従来Schizochytrium sp. M-8と呼ばれていた株である。従来Schizochytrium属と呼ばれていた属は、Schizochytrium属、Aurantiochytrium属、およびOblongichytrium属へと再編成されている（Rinka Yokoyama, Daiske Honda (2007) MycoscienceTaxonomic rearrangement of the genus Schizochytrium sensu lato based on morphology, chemotaxonomic characteristics, and 18S rRNA gene phylogeny (Thraustochytriaceae, Labyrinthulomycetes): emendation for Schizochytrium and erection of Aurantiochytrium and Oblongichytrium gen. nov. Mycoscience, 48, 199-21）。Aurantiochytrium limacinum mh0186は、2004年3月29日に、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に、受託番号FERM P-19755として原寄託された後、国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-11311が付与されている。
【００１８】
これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることができる。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることができる（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、これらの菌株は、例えば、各菌株が寄託された寄託機関から入手することができる。
【００１９】
本発明の微生物は、上記例示したようなラビリンチュラ類微生物を適宜改変することにより得ることができる。すなわち、本発明の微生物は、上記例示したようなラビリンチュラ類微生物に由来する改変株であってよい。なお、一態様において、本発明からは、本発明の微生物がAurantiochytrium limacinum ATCC MYA-1381に由来する改変株である場合が除かれてもよい。具体的には、例えば、本発明からは、本発明の微生物がAurantiochytrium limacinum ATCC MYA-1381のSMT1遺伝子の破壊株（例えば欠損株）である場合が除かれ
てもよい。
【００２０】
本発明において、ラビリンチュラ類微生物は、Aurantiochytrium sp.1以外のラビリンチュラ類微生物から選択されるものとする。すなわち、本発明からは、ラビリンチュラ類微生物がAurantiochytrium sp.1である場合が除かれるものとする。「Aurantiochytrium sp.1」とは、Aurantiochytrium属の特定の１種をいい、具体的には、Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株（FERM P-22342）が属する種をいう。言い換えると、「Aurantiochytrium sp.1」とは、具体的には、Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株と同株と同種に属する株で構成される一群の微生物をいう。Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株と同種に属する株としては、18S rDNAの塩基配列が、Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株の18S rDNAの塩基配列（配列番号２１）に対して９７％以上の同一性を有する株が挙げられる。Aurantiochytrium sp.1として、具体的には、例えば、AJ7869株に加えて、AJ7867株（FERM BP-22304）、AJ7868株（FERM BP-22290）、BURABG162株、SKE217株、SKE218株が挙げられる。また、上記例示したAurantiochytrium sp.1の株に由来する株（例えば改変株）は、いずれも、Aurantiochytrium sp.1に包含される。
【００２１】
＜１−２＞ステロール生産能
本発明の微生物は、ステロール生産能を有する。「ステロール生産能を有する微生物」とは、培地で培養したときに、目的とするステロールを生成し、回収できる程度に菌体内に蓄積する能力を有する微生物をいう。
【００２２】
本発明の微生物は、本来的にステロール生産能を有するものであってもよく、ステロール生産能を有するように改変されたものであってもよい。例えば、上記例示したようなラビリンチュラ類微生物を、そのまま、あるいはステロール生産能を付与または増強して、ステロール生産能を有する微生物として用いることができる。ステロール生産能を付与または増強する方法は特に制限されない。例えば、後述するように、DHCR24またはSMT1の活性が低下するようにラビリンチュラ類微生物を改変することにより、ステロール生産能を付与または増強することができる。また、例えば、コレステロールの生合成に関与する酵素の発現を増強すること等により、コレステロールの生産能を付与または増強することができる（WO2016/056610）。
【００２３】
本発明の微生物がDHCR24の活性が低下するように改変されている場合の目的とするステロールとしては、植物ステロールや真菌ステロールが挙げられる。本発明の微生物がDHCR24の活性が低下するように改変されている場合の目的とするステロールとしては、特に、植物ステロールが挙げられる。生産されるステロールの総量に対する生産される植物ステロールおよび真菌ステロールの総量は、例えば、９０％（ｗ／ｗ）以上、９５％（ｗ／ｗ）以上、９７％（ｗ／ｗ）以上、または９９％（ｗ／ｗ）以上であってよい。生産されるステロールの総量に対する生産される植物ステロールの量は、例えば、５０％（ｗ／ｗ）以上、７０％（ｗ／ｗ）以上、８０％（ｗ／ｗ）以上、または８５％（ｗ／ｗ）以上であってよい。「植物ステロール」および「真菌ステロール」とは、それぞれ、植物および真菌において見出されるステロールをいう。植物ステロールとしては、７−デヒドロポリフェラステロール、スティグマステロール、４−メチル−７，２２−スティグマスタジエノール、β−シトステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、ジオスゲニン、オレアノール酸、ベツリン酸、ウルソール酸、ヘコゲニン、サルササポゲニン、イソフコステロール、アベナステロール、Δ７−スティグマステノール、Δ７−カンペステノール、フコステロール、サルガステロールが挙げられる。植物ステロールとしては、特に、７−デヒドロポリフェラステロール、スティグマステロール、４−メチル−７，２２−スティグマスタジエノールが挙げられる。真菌ステロールとしては、エルゴステロールや７−ジヒドロエルゴステロールが挙げられる。真菌ステロールとしては、特に、エルゴステロールが挙げられる。
【００２４】
本発明の微生物がSMT1の活性が低下するように改変されている場合の目的とするステロールとしては、コレステロールが挙げられる。生産されるステロールの総量に対する生産されるコレステロールの量は、例えば、９０％（ｗ／ｗ）以上、９５％（ｗ／ｗ）以上、９７％（ｗ／ｗ）以上、または９９％（ｗ／ｗ）以上であってよい。
【００２５】
本発明の微生物は、１種のステロールの生産能を有していてもよく、２種またはそれ以上のステロールの生産能を有していてもよい。
【００２６】
「ステロール」とは、特記しない限り、遊離型のステロールおよびその派生物を総称する。すなわち、「ステロール」とは、特記しない限り、遊離型のステロール、その派生物、またはそれらの混合物を意味してよい。ステロールの派生物としては、ステロールエステル、ステリルグルコシド、アシルステリルグルコシドが挙げられる。すなわち、「ステロール」とは、具体的には、例えば、遊離型のステロール、ステロールエステル、ステリルグルコシド、アシルステリルグルコシド、またはそれらの混合物を意味してもよい。ステロールエステルやアシルステリルグルコシドを構成する脂肪酸（アシル基）の種類は、特に制限されない。脂肪酸（アシル基）としては、例えば、ドコサヘキサエン酸（DHA, 22:6）が挙げられる。
【００２７】
＜１−３＞DHCR24またはSMT1の活性低下
本発明の微生物は、DHCR24またはSMT1の活性が低下するように改変されている。本発明の微生物は、具体的には、DHCR24またはSMT1の活性が非改変株と比較して低下するように改変されている。DHCR24またはSMT1の活性が低下するようにラビリンチュラ類微生物を改変することにより、同微生物のステロール生産能を向上させることができる、すなわち、同微生物によるステロールの生産を増大させることができる。具体的には、DHCR24の活性低下により、植物ステロールおよび／または真菌ステロールの生産を増大させることができる。また、具体的には、SMT1の活性低下により、コレステロールの生産を増大させることができる。
【００２８】
本発明の微生物は、ステロール生産能を有するラビリンチュラ類微生物を、DHCR24またはSMT1の活性が低下するように改変することによって得ることができる。また、本発明の微生物は、DHCR24またはSMT1の活性が低下するようにラビリンチュラ類微生物を改変した後に、ステロール生産能を付与することによっても得ることができる。あるいは、本発明の微生物は、DHCR24またはSMT1の活性が低下するように改変されたことにより、ステロール生産能が付与されたものであってもよい。また、DHCR24またはSMT1の活性が低下するように改変される前の株は、目的のステロール以外のステロールの生産能を有していてもよい。すなわち、例えば、動物ステロールの生産能を有するラビリンチュラ類微生物をDHCR24の活性が低下するように改変してもよい。「動物ステロール」とは、動物において見出されるステロールをいう。動物ステロールとしては、コレステロールや７−デヒドロコレステロールが挙げられる。また、例えば、植物ステロールおよび／または真菌ステロールの生産能を有するラビリンチュラ類微生物をSMT1の活性が低下するように改変してもよい。本発明において、本発明の微生物を構築するための改変は、任意の順番で行うことができる。
【００２９】
以下、DHCR24およびSMT1、並びにそれらをコードする遺伝子について説明する。
【００３０】
「２４−デヒドロコレステロールレダクターゼ（DHCR24）」とは、ステロールのＣ２４位の二重結合を還元する反応を触媒する活性を有するタンパク質（酵素）をいう。同活性を、「２４−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性（DHCR24活性）」ともいう。また、DHCR24をコードする遺伝子を「２４−デヒドロコレステロールレダクターゼ遺伝子（DH
CR24遺伝子）」ともいう。
【００３１】
DHCR24活性は、例えば、電子供与体の存在下で酵素を基質（Ｃ２４位に二重結合を有するステロール）とインキュベートし、酵素および基質依存的な産物（Ｃ２４位の二重結合が還元されたステロール）の生成を測定することにより、測定できる。電子供与体としては、例えば、NADPHが挙げられる。基質および産物としては、例えば、それぞれ、ザイモステロール（Zymosterol）および５ａ−コレスタ−８−エン−３ｂ−オール（5a-Cholest-8-en-3b-ol）が挙げられる。
【００３２】
「ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼ（SMT1）」とは、ステロールのＣ２４位にメチル基を導入する反応を触媒する活性を有するタンパク質（酵素）をいう。同活性を、「ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼ活性（SMT1活性）」ともいう。また、SMT1をコードする遺伝子を「ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子（SMT1遺伝子）」ともいう。
【００３３】
SMT1活性は、例えば、メチル基供与体の存在下で酵素を基質（ステロール）とインキュベートし、酵素および基質依存的な産物（Ｃ２４位にメチル基が導入されたステロール）の生成を測定することにより、測定できる。メチル基供与体としては、例えば、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（S-adenosyl-L-methionine）が挙げられる。基質および産物としては、例えば、それぞれ、ザイモステロール（Zymosterol）およびフェコステロール（fecosterol）が挙げられる。
【００３４】
DHCR24またはSMT1の活性が低下したことは、後述するように、それらの活性を測定すること等により、確認することができる。また、DHCR24またはSMT1の活性が低下したことは、目的のステロールの生産の増大を指標として確認することもできる。また、DHCR24またはSMT1の活性が低下したことは、目的のステロール以外のステロールの生産の低下を指標としてすることもできる。
【００３５】
ラビリンチュラ類微生物が有するDHCR24遺伝子およびSMT1遺伝子の塩基配列、並びにそれらにコードされるDHCR24およびSMT1のアミノ酸配列は、例えば、NCBI（National Center for Biotechnology Information）等の公開データベースから取得できる。Aurantiochytrium limacinum mh0186のDHCR24遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするDHCR24のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１７および１８に示す。すなわち、DHCR24遺伝子は、例えば、配列番号１７に示す塩基配列を有する遺伝子であってよい。また、DHCR24は、例えば、配列番号１８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、Aurantiochytrium limacinum mh0186のSMT1遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするSMT1のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１９および２０に示す。すなわち、SMT1遺伝子は、例えば、配列番号１９に示す塩基配列を有する遺伝子であってよい。また、SMT1は、例えば、配列番号２０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。なお、「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、特記しない限り、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」ことを意味し、当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合も包含する。
【００３６】
DHCR24遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したDHCR24遺伝子（例えば配列番号１７に示す塩基配列を有する遺伝子）のバリアントであってもよい。同様に、DHCR24は、元の機能が維持されている限り、上記例示したDHCR24（例えば配列番号１８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質）のバリアントであってもよい。また、SMT1遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したSMT1遺伝子（例えば配列番号１９に示す塩基配列を有する遺伝子）のバリアントであってもよい。同様に、SMT1は、元の機能が維持されている限り、上記例示したSMT1（例えば配列番号２０に示すアミノ酸配列を有する
タンパク質）のバリアントであってもよい。なお、そのような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。「DHCR24遺伝子」および「SMT1遺伝子」という用語は、それぞれ、上記例示したDHCR24遺伝子およびSMT1遺伝子に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。同様に、「DHCR24」および「SMT1」という用語は、それぞれ、上記例示したDHCR24およびSMT1に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示したDHCR24遺伝子やSMT1遺伝子およびDHCR24やSMT1のホモログが挙げられる。
【００３７】
「元の機能が維持されている」とは、遺伝子またはタンパク質のバリアントが、元の遺伝子またはタンパク質の機能（活性や性質）に対応する機能（活性や性質）を有することをいう。遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質をコードすることをいう。すなわち、DHCR24遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントがDHCR24活性を有するタンパク質をコードすることをいう。また、DHCR24についての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントがDHCR24活性を有することをいう。また、SMT1遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントがSMT1活性を有するタンパク質をコードすることをいう。また、SMT1についての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントがSMT1活性を有することをいう。
【００３８】
以下、保存的バリアントについて例示する。
【００３９】
DHCR24遺伝子もしくはSMT1遺伝子のホモログまたはDHCR24もしくはSMT1のホモログは、例えば、上記例示したDHCR24遺伝子もしくはSMT1遺伝子の塩基配列または上記例示したDHCR24もしくはSMT1のアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に同定することができる。また、DHCR24遺伝子またはSMT1遺伝子のホモログは、例えば、ラビリンチュラ類微生物の染色体を鋳型にして、これら公知のDHCR24遺伝子またはSMT1遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより取得し同定することができる。
【００４０】
DHCR24遺伝子またはSMT1遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列（例えば、DHCR24について配列番号１８に示すアミノ酸配列、SMT1について配列番号２０に示すアミノ酸配列）において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。例えば、コードされるタンパク質は、そのＮ末端および／またはＣ末端が、延長または短縮されていてもよい。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００４１】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置
換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００４２】
また、DHCR24遺伝子またはSMT1遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、例えば、50%以上、65%以上、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を意味する。
【００４３】
また、DHCR24遺伝子またはSMT1遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記塩基配列（例えば、DHCR24遺伝子について配列番号１７に示す塩基配列、SMT1遺伝子について配列番号１９に示す塩基配列）から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば、50%以上、65%以上、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。
【００４４】
上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、上述の遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとしては、300 bp程度の長さのDNA断片を用いることができる。プローブとして300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【００４５】
また、DHCR24遺伝子またはSMT1遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。すなわち、DHCR24遺伝子またはSMT1遺伝子は、遺伝コードの縮重による上記例示したDHCR24遺伝子またはSMT1遺伝子のバリアントであってもよい。
【００４６】
２つの配列間の配列同一性のパーセンテージは、例えば、数学的アルゴリズムを用いて決定できる。このような数学的アルゴリズムの限定されない例としては、Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17のアルゴリズム、Smith et al (1981) Adv. Appl. Math. 2:482の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453のホモロジーアライメントアルゴリズム、Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448の類似性を検索する方法、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877に記載されているような、改良された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264のアルゴリズムが挙げられる。
【００４７】
これらの数学的アルゴリズムに基づくプログラムを利用して、配列同一性を決定するための配列比較（アラインメント）を行うことができる。プログラムは、適宜、コンピュータにより実行することができる。このようなプログラムとしては、特に限定されないが、
PC/GeneプログラムのCLUSTAL（Intelligenetics, Mountain View, Calif.から入手可能）、ALIGNプログラム（Version 2.0）、並びにWisconsin Genetics Software Package, Version 8（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USAから入手可能）のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、及びTFASTAが挙げられる。これらのプログラムを用いたアライメントは、例えば、初期パラメーターを用いて行うことができる。CLUSTALプログラムについては、Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244、Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153、Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90、Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65、及びPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331によく記載されている。
【００４８】
対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同性があるヌクレオチド配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTヌクレオチド検索を、BLASTNプログラム、スコア＝100、ワード長＝12にて行うことができる。対象のタンパク質と相同性があるアミノ酸配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTタンパク質検索を、BLASTXプログラム、スコア＝50、ワード長＝3にて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索やBLASTタンパク質検索については、http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。また、比較を目的としてギャップを加えたアライメントを得るために、Gapped BLAST（BLAST 2.0）を利用できる。また、PSI-BLAST（BLAST 2.0）を、配列間の離間した関係を検出する反復検索を行うのに利用できる。Gapped BLASTおよびPSI-BLASTについては、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389を参照されたい。BLAST、Gapped BLAST、またはPSI-BLASTを利用する場合、例えば、各プログラム（例えば、ヌクレオチド配列に対してBLASTN、アミノ酸配列に対してBLASTX）の初期パラメーターが用いられ得る。アライメントは、手動にて行われてもよい。
【００４９】
２つの配列間の配列同一性は、２つの配列を最大一致となるように整列したときに２つの配列間で一致する残基の比率として算出される。
【００５０】
なお、上記の遺伝子やタンパク質のバリアントに関する記載は、任意のタンパク質およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。
【００５１】
＜１−４＞タンパク質の活性を低下させる手法
以下に、DHCR24やSMT1等のタンパク質の活性を低下させる手法について説明する。
【００５２】
「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の活性が非改変株と比較して低下することを意味する。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、同タンパク質の細胞当たりの活性が非改変株と比較して低下することを意味する。ここでいう「非改変株」とは、標的のタンパク質の活性が低下するように改変されていない対照株を意味する。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。非改変株として、具体的には、ラビリンチュラ類微生物の説明において例示した菌株が挙げられる。すなわち、一態様において、タンパク質の活性は、Aurantiochytrium limacinum mh0186と比較して低下してよい。なお、「タンパク質の活性が低下する」ことには、同タンパク質の活性が完全に消失している場合も包含される。「タンパク質の活性が低下する」とは、より具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることを意味してよい。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合も包含される。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合も包含される。タンパク質の活性の低下の程度は、タンパク質の活性が非改
変株と比較して低下していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００５３】
タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成できる。「遺伝子の発現が低下する」とは、同遺伝子の発現が非改変株と比較して低下することを意味する。「遺伝子の発現が低下する」とは、具体的には、同遺伝子の細胞当たりの発現量が非改変株と比較して低下することを意味する。「遺伝子の発現が低下する」とは、より具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が低下すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が低下することを意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合も包含される。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００５４】
遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子の発現調節配列を改変することにより達成できる。「発現調節配列」とは、プロモーター等の、遺伝子の発現に影響する部位の総称である。発現調節配列は、例えば、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。遺伝子の転写効率の低下は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより弱いプロモーターに置換することにより達成できる。「より弱いプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも弱化するプロモーターを意味する。より弱いプロモーターとしては、例えば、誘導型のプロモーターが挙げられる。すなわち、誘導型のプロモーターは、非誘導条件下（例えば、誘導物質の非存在下）でより弱いプロモーターとして機能し得る。また、発現調節配列の一部または全部の領域を欠失（欠損）させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のコード領域に遺伝子の発現が低下するような変異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、後述するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。
【００５５】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。「遺伝子が破壊される」とは、正常に機能するタンパク質を産生しないように同遺伝子が改変されることを意味する。「正常に機能するタンパク質を産生しない」ことには、同遺伝子からタンパク質が全く産生されない場合や、同遺伝子から分子当たりの機能（活性や性質）が低下又は消失したタンパク質が産生される場合が包含される。
【００５６】
遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子を欠失（欠損）させることにより達成できる。「遺伝子の欠失」とは、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域の欠失をいう。さらには、染色体上の遺伝子のコード領域の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。遺伝子のコード領域の前後の配列には、例えば、遺伝子の発現調節配列が含まれてよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域（タンパク質のＮ末端側をコードする領域）、内部領域、Ｃ末端領域（タンパク質のＣ末端側をコードする領域）等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が
確実に遺伝子を不活化することができる。欠失させる領域は、例えば、遺伝子のコード領域全長の１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の長さの領域であってよい。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。リーディングフレームの不一致により、欠失させる領域の下流でフレームシフトが生じ得る。
【００５７】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドン（ナンセンス変異）を導入すること、または１〜２塩基の付加または欠失（フレームシフト変異）を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。
【００５８】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の塩基配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する塩基配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。リーディングフレームの不一致により、挿入部位の下流でフレームシフトが生じ得る。他の塩基配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
【００５９】
遺伝子の破壊は、特に、コードされるタンパク質のアミノ酸配列が欠失（欠損）するように実施してよい。言い換えると、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、タンパク質のアミノ酸配列（アミノ酸配列の一部または全部の領域）を欠失させることにより、具体的には、アミノ酸配列（アミノ酸配列の一部または全部の領域）を欠失したタンパク質をコードするように遺伝子を改変することにより、達成できる。なお、「タンパク質のアミノ酸配列の欠失」とは、タンパク質のアミノ酸配列の一部または全部の領域の欠失をいう。また、「タンパク質のアミノ酸配列の欠失」とは、タンパク質において元のアミノ酸配列が存在しなくなることをいい、元のアミノ酸配列が別のアミノ酸配列に変化する場合も包含される。すなわち、例えば、フレームシフトにより別のアミノ酸配列に変化した領域は、欠失した領域とみなしてよい。タンパク質のアミノ酸配列の欠失により、典型的にはタンパク質の全長が短縮されるが、タンパク質の全長が変化しないか、あるいは延長される場合もあり得る。例えば、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域の欠失により、コードされるタンパク質のアミノ酸配列において、当該欠失した領域がコードする領域を欠失させることができる。また、例えば、遺伝子のコード領域への終止コドンの導入により、コードされるタンパク質のアミノ酸配列において、当該導入部位より下流の領域がコードする領域を欠失させることができる。また、例えば、遺伝子のコード領域におけるフレームシフトにより、当該フレームシフト部位がコードする領域を欠失させることができる。アミノ酸配列の欠失における欠失させる領域の位置および長さについては、遺伝子の欠失における欠失させる領域の位置および長さの説明を準用できる。
【００６０】
染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した破壊型遺伝子を作製し、該破壊型遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換して、破壊型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を破壊型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。破壊型遺伝子としては、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域を欠失した遺伝子、ミスセンス変異を導入した遺伝子、ナンセンス変異
を導入した遺伝子、フレームシフト変異を導入した遺伝子、トランスポゾンやマーカー遺伝子等の挿入配列を挿入した遺伝子が挙げられる。破壊型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。相同組換えに用いる組換えＤＮＡの構造は、所望の態様で相同組換えが起こるものであれば特に制限されない。例えば、破壊型遺伝子を含む線状ＤＮＡであって、両端に染色体上の野生型遺伝子の上流および下流の配列をそれぞれ備える線状ＤＮＡで宿主を形質転換して、野生型遺伝子の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こさせることにより、１ステップで野生型遺伝子を破壊型遺伝子に置換することができる。
【００６１】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
【００６２】
上記のようなタンパク質の活性を低下させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
【００６３】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【００６４】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
【００６５】
遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００６６】
タンパク質の量が低下したことの確認は、SDS-PAGEを行い、分離されたタンパク質バンドの強度を確認することによって行うことができる。また、タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Molecular cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００６７】
遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。
【００６８】
形質転換は、例えば、ラビリンチュラ類微生物の形質転換に通常用いられる手法により行うことができる。そのような手法としては、エレクトロポレーション法が挙げられる。
【００６９】
＜２＞ステロールの製造法
本発明の方法は、本発明の微生物を培地で培養すること、および前記培養により生成した菌体からステロールを回収すること、を含む、ステロールの製造方法である。本発明の方法においては、１種のステロールが製造されてもよく、２種またはそれ以上のステロールが製造されてもよい。活性を低下させる酵素と製造されるステロールの組み合わせは、
ステロール生産能の説明において上述した通りである。
【００７０】
使用する培地は、本発明の微生物が増殖でき、ステロールが生産される限り、特に制限されない。培地としては、例えば、ラビリンチュラ類等の従属栄養微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。培地は、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有してよい。培地として、具体的には、例えば、0〜1×人工海水で調製したGY培地が挙げられる。
【００７１】
炭素源として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸やクエン酸等の有機酸類、エタノール、グリセロール、粗グリセロール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の炭素源を組み合わせて用いてもよい。
【００７２】
窒素源として、具体的には、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆タンパク質分解物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。pH調整に用いられるアンモニアガスやアンモニア水を窒素源として利用してもよい。窒素源としては、１種の窒素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の窒素源を組み合わせて用いてもよい。
【００７３】
リン酸源として、具体的には、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。リン酸源としては、１種のリン酸源を用いてもよく、２種またはそれ以上のリン酸源を組み合わせて用いてもよい。
【００７４】
硫黄源として、具体的には、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。硫黄源としては、１種の硫黄源を用いてもよく、２種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせて用いてもよい。
【００７５】
その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類；ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等のビタミン類；アミノ酸類；核酸類；これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
【００７６】
培養条件は、本発明の微生物が増殖でき、ステロールが生産される限り、特に制限されない。培養は、例えば、ラビリンチュラ類等の従属栄養微生物の培養に用いられる通常の条件で行うことができる。
【００７７】
培養は、液体培地を用いて行うことができる。培養の際には、本発明の微生物を寒天培地等の固体培地で培養したものを直接液体培地に接種してもよく、本発明の微生物を液体培地で種培養したものを本培養用の液体培地に接種してもよい。すなわち、培養は、種培養と本培養とに分けて行われてもよい。その場合、種培養と本培養の培養条件は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。培養開始時に培地に含有される本発明の微生物の量は特に制限されない。本培養は、例えば、本培養の培地に、種培養液を1〜50％（v/v）植菌することにより行ってよい。
【００７８】
培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（co
ntinuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。なお、培養開始時の培地を、「初発培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系（発酵槽）に供給する培地を、「流加培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系に流加培地を供給することを、「流加」ともいう。なお、培養が種培養と本培養とに分けて行われる場合、例えば、種培養と本培養を、共に回分培養で行ってもよい。また、例えば、種培養を回分培養で行い、本培養を流加培養または連続培養で行ってもよい。
【００７９】
培養は、例えば、好気条件で行うことができる。好気条件とは、液体培地中の溶存酸素濃度が、酸素膜電極による検出限界である0.33ppm以上であることをいい、好ましくは1.5ppm以上であることであってよい。酸素濃度は、例えば、飽和酸素濃度の5〜50％、好ましくは10％程度に制御されてもよい。好気条件での培養は、具体的には、通気培養、振盪培養、撹拌培養、またはそれらの組み合わせで行うことができる。培地のpHは、例えば、pH3〜10、好ましくはpH4.0〜9.5であってよい。培養中、必要に応じて培地のpHを調整することができる。培地のpHは、アンモニアガス、アンモニア水、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、塩酸、硫酸等の各種アルカリ性または酸性物質を用いて調整することができる。培養温度は、例えば、20℃〜35℃、好ましくは25℃〜35℃であってよい。培養期間は、例えば、10時間〜120時間であってよい。培養は、例えば、培地中の炭素源が消費されるまで、あるいは本発明の微生物の活性がなくなるまで、継続してもよい。このような条件下で本発明の微生物を培養することにより、ステロールを含有する菌体が生成する。
【００８０】
ステロールは菌体から適宜回収することができる。すなわち、菌体からステロールを抽出して回収することができる。菌体は、培養液に含有されたままステロールの抽出に供してもよく、培養液から回収してからステロールの抽出に供してもよい。また、菌体（例えば、菌体を含有する培養液や培養液から回収された菌体）は、適宜、希釈、濃縮、凍結、融解、乾燥等の処理に供してから、ステロールの抽出に供してもよい。これらの処理は、単独で、あるいは適宜組み合わせて行ってもよい。これらの処理は、ステロールの抽出法の種類等の諸条件に応じて適宜選択することができる。
【００８１】
菌体を培養液から回収する手法は特に制限されず、例えば公知の手法（Grima, E. M. et al. 2003. Biotechnol. Advances 20: 491-515）を利用できる。具体的には、例えば、自然沈降、遠心分離、濾過等の手法により、菌体を培養液から回収することができる。また、その際、凝集剤（flocculant）を利用してもよい。回収した菌体は、適当な媒体を用いて適宜洗浄することができる。また、回収した菌体は、適当な媒体を用いて適宜再懸濁することができる。洗浄や懸濁に利用できる媒体としては、例えば、水や水性緩衝液等の水性媒体（水性溶媒）、メタノール等の有機媒体（有機溶媒）、およびそれらの混合物が挙げられる。媒体は、ステロールの抽出法の種類等の諸条件に応じて適宜選択することができる。
【００８２】
ステロールを抽出する手法は特に制限されず、例えば公知の手法を利用できる。そのような手法としては、例えば、一般的な藻類等の微生物の菌体から脂質を抽出する手法が挙げられる。そのような手法として、具体的には、例えば、有機溶剤処理、超音波処理、ビーズ破砕処理、酸処理、アルカリ処理、酵素処理、水熱処理、超臨界処理、マイクロ波処理、電磁場処理、圧搾処理が挙げられる。これらの手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて利用することができる。
【００８３】
有機溶剤処理に用いられる有機溶剤は、菌体からステロールを抽出できるものであれば特に制限されない。有機溶剤としては、例えば、メタノール、エタノール、２−プロパノ
ール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール等のアルコール類、アセトン等のケトン類、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、ｎ−ヘキサン等のアルカン類、クロロホルムが挙げられる。有機溶剤による脂質の抽出法としては、Bligh-Dyer法やFolch法が挙げられる。有機溶剤としては、１種の有機溶剤を用いてもよく、２種またはそれ以上の有機溶剤を組み合わせて用いてもよい。
【００８４】
アルカリ処理のpHは、菌体からステロールを抽出できるpHであれば特に制限されない。アルカリ処理のpHは、通常にはpH 8.5以上、好ましくはpH 10.5以上、さらに好ましくはpH 11.5以上であってよく、pH 14以下であってよい。アルカリ処理の温度は、通常には30℃以上、好ましくは50℃以上、さらに好ましくは70℃以上であってよい。アルカリ処理の温度は、好ましくは120℃以下であってよい。アルカリ処理の時間は、通常には10分以上、好ましくは30分以上、さらに好ましくは50分以上であってよい。アルカリ処理の時間は、好ましくは150分以下であってよい。アルカリ処理には、NaOHやKOH等のアルカリ性物質を利用することができる。
【００８５】
抽出したステロールの回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法や膜処理法が挙げられる。これらの手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。
【００８６】
回収されたステロールは、ステロール以外に、菌体、培地成分、水分、抽出処理に用いられた成分、本発明の微生物の代謝副産物等の成分を含んでいてよい。ステロールは、所望の程度に精製されていてよい。ステロールの純度は、例えば、1％（w/w）以上、2％（w/w）以上、5％（w/w）以上、10％（w/w）以上、30％（w/w）以上、50％（w/w）以上、70％（w/w）以上、90％（w/w）以上、または95％（w/w）以上であってよい。
【００８７】
ステロールの種類および量は、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により決定することができる。そのような手法としては、例えば、HPLC、LC/MS、GC/MS、NMRが挙げられる。これらの手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。
【００８８】
回収されるステロールは、例えば、遊離型のステロール、その派生物（ステロールエステル、ステリルグルコシド、アシルステリルグルコシド、等）、またはそれらの混合物であってよい。また、これら派生物の形態で存在する場合、加水分解により遊離型のステロールを生成することもできる。加水分解は常法により実施できる。例えば、ステロールエステルはエステラーゼにより、ステリルグルコシドやアシルステリルグルコシドはグリコシダーゼにより、それぞれ酵素的に加水分解できる。
【００８９】
ステロールは、種々の用途に利用できる。ステロールの用途は特に制限されない。ステロールは、例えば、そのまま単独で、あるいは他の成分と配合して、あるいは他の成分の原料として、利用できる。ステロールの用途としては、食品添加物、飼料添加物、健康食品、医薬品、化成品、化粧品成分、それらの原料が挙げられる。飼料としては、畜産飼料や水産飼料が挙げられる。
【実施例】
【００９０】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
【００９１】
＜１＞Aurantiochytrium limacinumの遺伝子欠損株の作製
＜１−１＞DHCR24遺伝子欠損株の作製
Aurantiochytrium limacinum mh0186（FERM BP-11311）を親株として、DHCR24遺伝子をハイグロマイシン耐性遺伝子に置換することにより、DHCR24遺伝子欠損株を作製した（図
１Ａ）。手順を以下に示す。
【００９２】
Aurantiochytrium limacinum mh0186のゲノムDNAをテンプレートとしたPCRで、DHCR24遺伝子の開始コドンの1,158 bp上流からDHCR24遺伝子途中までの3,878 bpのフラグメントを増幅した。PCRは、プライマー1と2（表１）、Tks Gflex DNA polymerase（TakaraBio）を用いて行い、PCRプログラムは94℃1 min、（98℃10 sec、55℃15 sec、68℃2.5 min）x
35 cycles、68℃ 4 minとした。増幅したフラグメントとpUC19 linearized vectorをIn-Fusion HD Cloning Kit（Clontech）を用いてIn-Fusion反応させ、Escherichia coli JM109に形質転換した。アンピシリンを50 μg/mlで含むLB寒天培地で形質転換体をセレクションし、プラスミド抽出によりDHCR24 KO pUC19ベクターを得た。
【００９３】
続いて、DHCR24 KO pUC19ベクターをテンプレートとして、プライマー3と4（表１）を使用したPCRで、DHCR24 KO pUC19 linearized vectorを増幅した。PCR酵素はTks Gflex DNA polymeraseを用い、PCRプログラムは94℃ 1 min、（98℃10 sec、55℃15 sec、68℃2.5 min）x 35 cycles、68℃ 2 minとした。Thraustochytrium aureum ATCC 34304に由来するユビキチンプロモーター（UbiP）およびSV40ターミネーター（SV40T）（pcDNA3.1 Myc-His由来）の制御下でハイグロマイシン耐性遺伝子（pcDNA3.1/Hygro(+)に由来）を発現するベクター（Matsuda, T., et al. (2012) Analysis of Delta12-fatty acid desaturase
function revealed that two distinct pathways are active for the synthesis of PUFAs in T. aureum ATCC 34304. J. Lipid Res. 53, 1210-1222）をテンプレートとして、プライマー5と6（表１）を使用したPCRで、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを増幅した。PCR酵素はTks Gflex DNA polymeraseを用い、PCRプログラムは94℃1 min、（98℃10 sec、55℃15 sec、68℃1.5 min）x 35 cycles、68℃ 2 minとした。ゲル精製後、DHCR24 KO pUC19 linearized vectorとハイグロマイシン耐性遺伝子カセットのフラグメントをIn-Fusion HD Cloning Kit を用いてIn-Fusion反応させ、Escherichia coli JM109に形質転換した。アンピシリン耐性を利用して形質転換体を単離し、プラスミド抽出でDHCR24 KOベクターを得た。
【００９４】
続いて、DHCR24 KOベクターをテンプレートとして、プライマー1と2（表１）を使用したPCRによって、DHCR24遺伝子欠損コンストラクトを増幅した。PCR酵素はTks Gflex DNA polymeraseを用い、PCRプログラムは94℃ 1 min、（98℃10 sec、55℃15 sec、68℃3 min）x 35 cycles、68℃ 2 minとした。得られたDHCR24遺伝子欠損コンストラクトをエタノール沈殿により精製し、エレクトロポレーション法を用いてAurantiochytrium limacinum
mh0186に導入した。エレクトロポレーションは、1 mm gapキュベットで、750 V、25 μF、200 Ωのパルスを2回印加して実施した。ハイグロマイシン耐性を利用してDHCR24遺伝子欠損候補株を単離した。DHCR24遺伝子欠損候補株のコロニーをピックアップし、3 mlのGY培地で2日間培養後、細胞を回収し、20 mM NaOH溶液に懸濁して、37℃で10分間処理することでゲノムを抽出した。このゲノムをテンプレートとして、プライマー7と10、8と9（表１）を用いたPCRによって、DHCR24遺伝子の欠損を確認した。PCR酵素はTks Gflex DNA polymeraseを用い、PCRプログラムは94℃1 min、（98℃10 sec、55℃15 sec、68℃1.5 min）x 35 cycles、68℃ 2 minとした。これらのプライマーセットは、いずれも、DHCR24遺伝子欠損株でのみフラグメントが増幅するように構成されている（図１Ｂ）。その結果、２株の候補株で目的のサイズのフラグメントの増幅が認められた。さらに、プライマー9と10（表１）を用いたPCRによって、DHCR24遺伝子の欠損を確認した。PCR酵素はTks Gflex DNA polymeraseを用い、PCRプログラムは94℃ 1 min、（98℃10 sec、55℃15 sec、68℃3 min）x 35 cycles、68℃ 2 minとした。このプライマーセットは、DHCR24遺伝子欠損株（4,940 bp）で野生株（親株；4,359 bp）よりもサイズの大きなフラグメントが増幅するように構成されている（図１Ｂ）。その結果、上記２株の候補株で目的のサイズのフラグメントの増幅が認められた。すなわち、DHCR24遺伝子欠損株が２株得られた。
【００９５】
【表１】
2019071860.tif 000002
【００９６】
＜１−２＞SMT1遺伝子欠損株の作製
Aurantiochytrium limacinum mh0186を親株として、SMT1遺伝子をハイグロマイシン耐性遺伝子に置換することにより、SMT1遺伝子欠損株を作製した（図２Ａ）。手順を以下に示す。
【００９７】
Aurantiochytrium limacinum mh0186のゲノムDNAをテンプレートとしたPCRで、SMT1遺伝子の開始コドンの1,010 bp上流からSMT1遺伝子途中までの3,006 bpのフラグメントを増幅した。PCRは、プライマー1と2（表２）、Tks Gflex DNA polymeraseを用いて行い、PCRプログラムは94℃ 1 min、（98℃10 sec、55℃15 sec、68℃2 min）x 35 cycles、68℃ 2
minとした。増幅したフラグメントとpUC19 linearized vectorをIn-Fusion HD Cloning Kitを用いてIn-Fusion反応させ、Escherichia coli JM109に形質転換した。アンピシリンを50 μg/mlで含むLB寒天培地で形質転換体をセレクションし、プラスミド抽出によりSMT1 KO pUC19ベクターを得た。
【００９８】
続いて、SMT1 KO pUC19ベクターをテンプレートとして、プライマー3と4（表２）を使用したPCRで、SMT1KO pUC19 linearized vectorを増幅した。PCR酵素はTks Gflex DNA polymeraseを用い、PCRプログラムは94℃ 1 min、（98℃10 sec、55℃15 sec、68℃2.5 min）x 35 cycles、68℃ 2 minとした。Thraustochytrium aureum ATCC 34304に由来するユビキチンプロモーター（UbiP）およびSV40ターミネーター（SV40T）（pcDNA3.1 Myc-His由来）の制御下でハイグロマイシン耐性遺伝子（pcDNA3.1/Hygro(+)に由来）を発現するベクター（Matsuda, T., et al. (2012) Analysis of Delta12-fatty acid desaturase function revealed that two distinct pathways are active for the synthesis of PUFAs in T. aureum ATCC 34304. J. Lipid Res. 53, 1210-1222）をテンプレートとして、プライマー5と6（表２）を使用したPCRで、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを増幅した。PCR酵素はTks Gflex DNA polymeraseを用い、PCRプログラムは94℃1 min、（98℃10 sec、55℃15 sec、68℃1.5 min）x 35 cycles、68℃ 2 minとした。ゲル精製後、SMT1KO pUC19 linearized vectorとハイグロマイシン耐性遺伝子カセットのフラグメントをIn-Fusion HD Cloning Kitを用いてIn-Fusion反応させ、Escherichia coli JM109に形質転換した。アンピシリン耐性を利用して形質転換体を単離し、プラスミド抽出でSMT1 KOベクターを得た。
【００９９】
続いて、SMT1 KOベクターをテンプレートとして、プライマー5と6（表２）を使用したPCRによって、SMT1遺伝子欠損コンストラクトを増幅した。PCR酵素はTks Gflex DNA polymeraseを用い、PCRプログラムは94℃ 1 min、（98℃10 sec、55℃15 sec、68℃2.25 min）x 35 cycles、68℃ 2 minとした。得られたSMT1遺伝子欠損コンストラクトをエタノール
沈殿により精製し、エレクトロポレーション法を用いてAurantiochytrium limacinum mh0186に導入した。エレクトロポレーションは、1 mm gapキュベットで、750 V、25 μF、200 Ωの条件でパルスを2回印加して実施した。ハイグロマイシン耐性を利用してSMT1遺伝子欠損候補株を単離した。SMT1遺伝子欠損候補株のコロニーをピックアップし、3 mlのGY培地で2日間培養後、細胞を回収、20 mM NaOH溶液に懸濁し、37℃で10分間処理することでゲノムDNAを抽出した。このゲノムをテンプレートとして、プライマー7と10、8と9（表２）を用いたPCRによって、SMT1遺伝子の欠損を確認した。PCR酵素はTks Gflex DNA polymeraseを用い、PCRプログラムは94℃1 min、（98℃10 sec、55℃15 sec、68℃1.5 min）x
35 cycles、68℃ 2 minとした。これらのプライマーセットは、いずれも、SMT1遺伝子欠損株でのみフラグメントが増幅するように構成されている（図２Ｂ）。その結果、２株の候補株で目的のサイズのフラグメントの増幅が認められた。さらに、プライマー9と10（表２）を用いたPCRによって、SMT1遺伝子の欠損を確認した。PCR酵素はTks Gflex DNA polymeraseを用い、PCRプログラムは94℃ 1 min、（98℃10 sec、55℃15 sec、68℃3.0 min）x 35 cycles、68℃ 2 minとした。このプライマーセットは、SMT1遺伝子欠損株（4,484
bp）で野生株（親株；3,339 bp）よりもサイズの大きなフラグメントが増幅するように構成されている（図２Ｂ）。その結果、上記２株の候補株で目的のサイズのフラグメントの増幅が認められた。すなわち、SMT1遺伝子欠損株が２株得られた。その一方をSMT1遺伝子欠損株として以下の実験に用いた。
【０１００】
【表２】
2019071860.tif 000003
【０１０１】
＜２＞Aurantiochytrium limacinumの遺伝子欠損株を用いたステロール生産
＜２−１＞DHCR24遺伝子欠損株のステロール解析
DHCR24遺伝子欠損株および野生株を、3 mLのGY培地で前培養した。得られた前培養液を、200 mLフラスコ内の50 mLのGY培地に培養開始時OD600が0.02となるように植菌し、培養温度25℃、撹拌速度150 rpmにて、10日間培養した。培養液から菌体を回収し、脂質抽出に供した。
【０１０２】
脂質抽出により作成したサンプルをLC-MS（LC-APCI MS）に供し、遊離ステロールの解析を行った。結果を図３Ａに示す。DHCR24遺伝子欠損株では、コレステロールが消失していた。一方で、DHCR24遺伝子欠損株では、植物ステロール（7-デヒドロポリフェラステロール）は野生株と同程度、真菌ステロール（エルゴステロール）は野生株に比べ多量に蓄積していた。
【０１０３】
また、脂質抽出により作成したサンプルをLC-MS（LC-ESI MS）に供し、ステロール派生物であるステロールエステル（SE）、ステリルグルコシド（SG）、およびアシルステリルグルコシド（ASG）の解析を行った。結果（SEおよびASGについては脂肪酸（アシル基）が
DHA（22:6）のもの）を図３Ｂに示す。DHCR24遺伝子欠損株では、コレステロールの派生物であるコレステリルエステル（CE）、コレステリルグルコシド（CG）、およびアシルコレステリルグルコシド（ACG）が消失していた。一方で、DHCR24遺伝子欠損株では、植物ステロール（7-デヒドロポリフェラステロール）の派生物である7-デヒドロポリフェラステロールエステル、7-デヒドロポリフェラステリルグルコシド、およびアシル-7-デヒドロポリフェラステリルグルコシド、並びに真菌ステロール（エルゴステロール）の派生物であるエルゴステロールエステルは、いずれも、野生株に比べ多量に蓄積していた。
【０１０４】
以上より、DHCR24の活性低下によりラビリンチュラ類微生物の植物ステロールまたは真菌ステロール（派生物も含む）の生産能が向上することが明らかとなった。
【０１０５】
＜２−２＞SMT1遺伝子欠損株のステロール解析
SMT1遺伝子欠損株および野生株を、3 mLのGY培地で前培養した。得られた前培養液を、200 mLフラスコ内の50 mLのGY培地に培養開始時OD600が0.02となるように植菌し、培養温度25℃、撹拌速度150 rpmにて、10日間培養した。培養液から菌体を回収し、脂質抽出に供した。
【０１０６】
脂質抽出により作成したサンプルをLC-MS（LC-APCI MS）に供し、遊離ステロールの解析を行った。結果を図４Ａに示す。SMT1遺伝子欠損株では、コレステロールは野生株に比べ多量に蓄積していたが、植物ステロール（7-デヒドロポリフェラステロール）および真菌ステロール（エルゴステロール）は消失していた。
【０１０７】
また、脂質抽出により作成したサンプルをLC-MS（LC-ESI MS）に供し、ステロール派生物であるステロールエステル（SE）、ステリルグルコシド（SG）、およびアシルステリルグルコシド（ASG）の解析を行った。結果（SEおよびASGについては脂肪酸（アシル基）がDHA（22:6）のもの）を図４Ｂに示す。SMT1遺伝子欠損株では、コレステロールの派生物であるコレステリルエステル（CE）、コレステリルグルコシド（CG）、およびアシルコレステリルグルコシド（ACG）は野生株に比べ多量に蓄積していた。一方で、SMT1遺伝子欠損株では、植物ステロール（7-デヒドロポリフェラステロール）の派生物である7-デヒドロポリフェラステロールエステル、7-デヒドロポリフェラステリルグルコシド、およびアシル-7-デヒドロポリフェラステリルグルコシド、並びに真菌ステロール（エルゴステロール）の派生物であるエルゴステロールエステルは、いずれも消失していた。
【０１０８】
以上より、SMT1の活性低下によりラビリンチュラ類微生物のコレステロール（派生物も含む）の生産能が向上することが明らかとなった。
【０１０９】
＜３＞材料と方法
実施例に用いたその他の材料および方法は以下の通りである。
【０１１０】
＜GY培地の組成＞
（Ａ区）
グルコース            30 g/L
酵母エキス            10 g/L
ＳＥＡ  ＬＩＦＥ      17.5 g/L
（Ｂ区）
ビタミンB1             2 mg/L
ビタミンB2             0.01 mg/L
ビタミンB12            0.01 mg/L
（Ｃ区）
EDTA                  60 mg/L
FeCl3・6H2O            2.9 mg/L
H3BO3                 68.4 mg/L
MnCl2・4H2O            8.6 mg/L
ZnSO4・7H2O            2.6 mg/L
CoCl2・6H2O            0.26 mg/L
NiSO4・6H2O            0.52 mg/L
CuSO4・5H2O            0.02 mg/L
Na2MoO4・2H2O          0.05 mg/L
A区は120℃で10分オートクレーブした。Ｂ区およびＣ区はフィルター濾過を行った。A区を室温に冷却後、Ａ区、Ｂ区、およびＣ区を混合した。
【０１１１】
＜脂質抽出＞
回収した細胞を500 μlの超純水に懸濁し、200 μlのガラスビーズ（0.5 mm 径）を加えてBEADS CRUSHER μT-12（TAITEC）で3分間破砕した。15,000 ×g、3分間、4℃で遠心し、上層を回収して細胞破砕液とした。細胞破砕液から200 μlとり800 μlのクロロホルム/メタノール(C/M)=2/1に加えた。37℃で90分間インキュベートし、脂質を抽出した。遠心（20℃、15,000 rpm、1 min）し、下層から200 μlとり窒素乾固した。脂質重量を測定し、2 mg/mlになるようにIPA（isopropyl alcohol）で調製した。ソニケーション後に、遠心（20℃、15,000 rpm、5 min ）して、上清をバイアルに移し、これをサンプルとした。
【０１１２】
＜高速液体クロマトグラフ質量分析計（LC-ESI MS）による脂質解析＞
脂質抽出により作成したサンプルをLC-MSに供試した。測定は、脂肪酸組成の異なるリン脂質、中性脂質、ステロールエステル（SE）、ステリルグルコシド（SG）、アシルステリルグルコシド（ASG）を検出する各種Q1/Q3の組み合わせによるMultiple Reaction Monitoring（MRM）によって行った。LC-MSは、質量分析計に三連四重極型の3200 QTRAP（SCIEX）をポジティブイオンモードで使用し、カラムにInertSustain C18（2.1 x 150 mm、5 μm、GL Sciences）を用いた。溶媒は、溶媒 A : methanol/water = 19/19/2 (v/v/v)（0.1% Formic acid、0.025% Ammonia）と溶媒 B : isopropyl alcohol（0.1% Formic acid、0.025% Ammonia）を用いた。
【０１１３】
＜高速液体クロマトグラフ質量分析計（LC-APCI MS）によるステロール解析＞
脂質抽出により作成したサンプルをLC-MSに供試した。測定は、構造の異なるステロールを検出する各種Q1/Q3の組み合わせによるMultiple Reaction Monitoring（MRM）によって行った。LC-MSは、質量分析計に三連四重極型の3200 QTRAP（AB SCIEX）をポジティブイオンモードで使用し、カラムにInertSustain C18（2.1 x 150 mm、5 μm、GL Sciences）を用いた。溶媒は、溶媒 A : acetonitrile/methanol/water = 96/4 (v/v)（0.1% Acetic acid）と溶媒 B : methanol（0.1% Acetic acid）を用いた。
【０１１４】
＜配列表の説明＞
配列番号１〜１６：プライマー
配列番号１７：Aurantiochytrium limacinum mh0186のDHCR24遺伝子の塩基配列
配列番号１８：Aurantiochytrium limacinum mh0186のDHCR24のアミノ酸配列
配列番号１９：Aurantiochytrium limacinum mh0186のSMT1遺伝子の塩基配列
配列番号２０：Aurantiochytrium limacinum mh0186のSMT1のアミノ酸配列
配列番号２１：Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株の18S rDNA領域の塩基配列
【図１】
2019071860.tif 000004
【図２】
2019071860.tif 000005
【図３】
2019071860.tif 000006
【図４】
2019071860.tif 000007
【配列表】
2019071860000001.app