(57)【要約】【課題】細胞内においてシグナル伝達物質として重要な役割を果たす環状ヌクレオチド濃度を、光照射によって迅速に抑制させることが可能なロドプシンホスホジエステラーゼを提供することである。【解決手段】本発明の襟べん毛虫が持つ連続した遺伝子コードから発現された光スイッチ型ホスホジエステラーゼであるロドプシンホスホジエステラーゼ（Ｒｈ−ＰＤＥ）は、光が当たると環状ヌクレオチドであるｃＡＭＰやｃＧＭＰを分解する機能を持つ。このＲｈ−ＰＤＥをヒトなどの哺乳類細胞へ導入することで、その細胞内の環状ヌクレオチド濃度を光照射によって迅速に低下させる効果がある。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１のアミノ酸配列を有するロドプシンホスホジエステラーゼ。
【請求項２】
請求項１において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ光照射によって、ｃＧＭＰ及び／又はｃＡＭＰ分解活性を有するロドプシンホスホジエステラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光スイッチ型ホスホジエステラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
生命現象を光で操作する技術は光遺伝学（オプトジェネティクス）と呼ばれ、近年飛躍的な発展を遂げている。例えばチャネルロドプシンと呼ばれる光スイッチタンパク質を神経細胞へ導入することで、その神経細胞の興奮を光照射で瞬時に誘起することが可能になった。このような光スイッチ型分子を用いた神経活動の光操作技術は、記憶形成メカニズムといった脳神経機能の解明に大きく貢献している。
【０００３】
一方、細胞内シグナル伝達物質濃度を光操作するための酵素活性を示す光スイッチ分子は限られている。その分子として非特許文献１に、ミドリムシ由来の光スイッチ型アデニル酸シクラーゼ（ＰＡＣ）が開示されている。また、非特許文献２に菌類由来の光スイッチ型グアニルサンシクラーゼ（ＢｅＧＣ１）が知られている。
【０００４】
これらタンパク質分子は、細胞内シグナル伝達物質であるサイクリックＡＭＰ、サイクリックＧＭＰ等の環状ヌクレオチド（以下、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰと言う場合がある）を合成することができる光スイッチ型酵素分子である。これら分子をヒトなどの細胞や組織へ導入することにより、光照射によって細胞内のｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ量を高めることができる。
【０００５】
ところが、細胞内のｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ量を下げるための光スイッチ分子は自然界から発見されておらず、現状では薬剤添加による方法が一般的である。しかしながら薬剤を使用した場合、その薬剤は標的細胞以外にも効果を及ぼしてしまうという点が第１の問題である。第２の問題として薬剤投与後、その効果が奏するまでに時間を要すること、また１度薬剤を投与すると、それを除去して投与前の状態に戻すのにも長時間を要する。このように薬剤を用いた研究では限界がある。従って、標的細胞特異的、かつ短時間での細胞内のｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ量の抑制効果の検証が困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１１−２９５９９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Stierl M, Stumpf P, Udwari D, Gueta R, Hagedorn R, Losi A, et al. Light modulation of cellular cAMP by a small bacterial photoactivated adenylyl cyclase, bPAC, of the soil bacterium Beggiatoa. J Biol Chem. 2011;286: 1181−1188. doi:10.1074/jbc.M110.185496
【非特許文献２】Scheib U, Stehfest K, Gee CE, K▲oe▼rschen HG, Fudim R, Oertner TG, et al. The rhodopsin−guanylyl cyclase of the aquatic fungus Blastocladiella emersonii enables fast optical control of cGMP signaling. Sci Signal. 2015;8: 1−9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は上記のような従来の問題を解決し、ヒトの細胞や組織内の環状ヌクレオチド濃度を光によって迅速に抑制する光スイッチ分子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
光照射によってｃＡＭＰ、ｃＧＭＰを分解するロドプシンホスホジエステラーゼ（以下、Ｒｈ−ＰＤＥと言う場合がある）をヒトなどの哺乳類細胞、組織へ導入する。
【発明の効果】
【００１０】
薬剤ではなく、光照射されたＲｈ−ＰＤＥによって、人などの哺乳類細胞内の環状ヌクレオチド濃度を迅速に抑制するという効果を奏する。細胞内の環状ヌクレオチド濃度の低下は、様々な疾患の原因となることが知られている。従って例えば、Ｒｈ−ＰＤＥを健常な動物の細胞や組織に導入すれば、光照射で環状ヌクレオチド濃度を低下させることでその動物を疾患状態に一過的に陥らせることが可能となり、革新的な疾患研究手法となる可能性がある。
【００１１】
本発明者らは、襟べん毛虫（襟べん毛虫門、カラエリヒゲムシ属  学名Salpingoeca rosetta）という微生物において、光受容体であるロドプシンと、ホスホジエステラーゼが連続した遺伝子コードをゲノム中に持つことに着目して本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、その遺伝子がコードするたんぱく質（Ｒｈ−ＰＤＥ）が、光に反応して環状ヌクレオチド分解活性を示すこと見出した。そして、このたんぱく質を人の培養細胞に導入したところ、光照射によって細胞内の環状ヌクレオチド濃度を抑制することができた。
【００１３】
ここで、襟べん毛虫（Ｃｈｏａｎｏｍｏｎａｄａ、コアノモナダ）とは、体長数ミクロンの単細胞生物で１本のべん毛を持つ。単細胞生物ではあるが、進化的には多細胞生物に最も近いとされる。ロドプシンとは、発色団としてレチナールを結合しており、光が当たるとイオン輸送などの機能を発揮する光受容型膜たんぱく質である。また、ホスホジエステラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ）とは、環状ヌクレオチド加水分解酵素のことであり、人では１１種類のファミリーが知られており、その基質特異性や、活性調節の仕組みが異なっている。ヒトなどの哺乳類がもつホスホジエステラーゼは光で直接働くことはできない。
【００１４】
ここで、環状ヌクレオチドとは、サイクリックＡＭＰ、サイクリックＧＭＰ（以下、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰと言う場合がる）などの環状エステル結合を持つヌクレオチドのことであり、細胞内シグナル情報伝達においてセカンドメッセンジャー（二次情報伝達物質）として働いている。なお、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰは環状アデノシン一リン酸、および環状グアノシン一リン酸の略称である。
【００１５】
ｃＡＭＰやｃＧＭＰは、細胞内シグナル情報伝達物質であり、細胞内で働くさまざまな酵素の機能を調節している。環状ヌクレオチドは必要に応じて合成され、ＰＤＥにより分解されることで、細胞内での濃度が適切に保たれている。
【００１６】
環状ヌクレオチドは呼吸器系疾患や認知症、網膜色素変性症などの疾患にも深く関与するため、Ｒｈ−ＰＤＥを応用した細胞内シグナル伝達の光操作法を確立することによって、これら疾患メカニズムの解明にも貢献することができる。
【００１７】
例えば、気管支喘息は気道が狭くなることで粘膜泌物がたまり、軌道に炎症がおこることで発症する。気道が狭くなるのは気道を構成する気管支平滑筋内のｃＡＭＰ量が減少することで平滑筋が収縮するためである。ゆえに例えばＲｈ−ＰＤＥを健常マウスの平滑筋に導入した場合、光照射でｃＡＭＰが分解され、人為的かつ迅速に気管支喘息の状態を発現することが可能となる。このように疾患状態を光照射で自在に作り出すことができれば、疾患メカニズムの解明、さらには治療法の確立に貢献すると期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明に係るＲｈ−ＰＤＥの機能を示す模式図である。
【図２】試験管内のＲｈ−ＰＤＥにｃＧＭＰを混合し、光を照射したとき（ｌｉｇｈｔ）と、光を照射しなかったとき（ｄａｒｋ）の各時間での試験管内のｃＧＭＰの残存率の変化を示した図である。
【図３】図２に基づいた光を照射したとき、及び照射しなかったときでのｃＧＭＰの分解量を示した図である。
【図４】試験管内のＲｈ−ＰＤＥにｃＡＭＰを混合し、光を照射したとき（ｌｉｇｈｔ）と、光を照射しなかったとき（ｄａｒｋ）の各時間でのｃＡＭＰの残存率の変化を示した図である。
【図５】図４に基づいた光を照射したとき、及び照射しなかったときでのｃＡＭＰの分解量を示した図である。
【図６】マウス由来の培養細胞の一種であるＮＤ７／２３細胞へ導入されたＲｈ−ＰＤＥについて、（ａ）透過光像、（ｂ）緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）による蛍光像である。
【図７】ヒト由来の培養細胞の一種であるＨＥＫ２９３細胞にＲｈ−ＰＤＥを導入し、細胞に光を照射したとき（Ｌｉｇｈｔ、２分間（縦帯で示した時間）と、光を照射しなかったとき(Ｄａｒｋ)の細胞内のｃＡＭＰ量の継時変化の様子を相対ルミネセンスの変化として示した図である。
【図８】図７同様、ＨＥＫ２９３細胞に導入されたＲｈ−ＰＤＥについて、細胞への光照射を繰り返したとき（縦細帯で示した時間、１１回）の細胞内のｃＡＭＰ量の継時変化の様子を相対ルミネセンスの変化として示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、図面を参照しつつ本発明の実施の形態について説明する。本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、発明の範囲を逸脱しない限りにおいて、変更、修正、改良を加え得るものである。なお、説明が重複する箇所については、適宜説明を省略する場合があるが、発明の要旨を限定するものではない。
【００２０】
本発明で使用されるＲｈ−ＰＤＥタンパク質の調製は、例えば、Ｒｈ−ＰＤＥタンパク質をコードする遺伝子配列を含む発現ベクターが導入された形質転換体を使用することで行うことができる。例えば、まず、この形質転換体を適宜の条件で培養し、遺伝子配列がコードするＲｈ−ＰＤＥタンパク質を合成させる。そして、合成されたタンパク質を形質転換体又は培養液から回収することにより、本発明のＲｈ−ＰＤＥタンパク質を得ることができる。
【００２１】
より具体的に説明すると、適当な発現ベクターに上述のＲｈ−ＰＤＥタンパク質をコードする遺伝子配列を挿入することにより、作製できる。「適当なベクター」とは、原核生物及び真核生物の各種の宿主内で複製保持又は自己増殖できるものであればよく、使用の目的に応じて適宜選択できるものである。その具体例としては、特に限定されず、例えば、特開平１１−２９５９９号公報に記載された公知のベクターが挙げられる。
【００２２】
また、発現ベクターは、培養細胞に導入してタンパク質を調整するのみならず、ヒトやマウス個体に直接導入することで、標的とする生体組織に発現することができる。この場合におけるベクターは、ヒトやマウスに導入可能なベクターを用いる。かかるベクターとしては、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）、レンチウイルスベクターが好適でありこれらを、例えばマウスの気管支細胞に注射することで導入することができる。
【００２３】
発現ベクターを導入する宿主は、発現ベクターに適合し形質転換され得るものであれば
よく、その具体例としては、特に限定されないが、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等の
、公知の天然細胞もしくは人工的に樹立された細胞（特開平１１−２９５９９号公報参照）、あるいは、ヒト、マウス等の動物が挙げられる。形質転換体の培養は、Ｒｈ−ＰＤＥタンパク質が大量にかつ容易に取得できるように、形質転換体の種類等に応じて、公知の栄養培地から適宜選択し、温度、栄養培地のｐＨ、培養時間等を適宜調整して行うことができる（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）。
【００２４】
Ｒｈ−ＰＤＥタンパク質の単離方法及び精製方法としては、特に限定されず、溶解度を利用する方法、分子量の差を利用する方法、荷電を利用する方法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。
【００２５】
（Ｒｈ−ＰＤＥのアミノ酸配列）
発現されたＲｈ−ＰＤＥの１文字表記のアミノ酸配列（配列番号：１）は以下のようであった。７０４個のアミノ酸が配列したものであった。
【００２６】
（配列番号：１）
ＭＧＲＫＮＡＡＮＳＳＭＬＱＥＡＳＭＮＮＹＳＭＴＳＡＡＳＧＡＳＳＳＧＲＧＫＲＲＡＫＴＲＮＩＡＩＡＳＴＫＥＶＱＷＱＧＩＦＭＩＩＶＷＬＣＶＭＧＳＬＩＦＦＡＮＰＥＡＳＲＲＶＦＡＫＦＳＨＬＱＳＦＹＧＡＴＳＶＡＦＡＦＡＴＧＬＤＩＬＡＹＶＮＡＶＳＤＥＫＲＶＬＳＧＩＬＡＹＶＤＧＶＡＣＩＳＹＬＳＭＡＴＬＮＬＹＦＬＶＤＳＴＱＧＮＰＶＷＬＭＲＹＡＥＷＩＩＴＣＰＴＬＬＹＷＣＧＬＡＳＲＡＤＲＳＳＶＳＤＩＡＴＡＤＡＬＬＬＡＧＧＡＬＳＳＩＬＰＳＷＰＡＦＦＶＦＡＧＳＦＡＴＹＩＹＶＭＬＨＭＷＧＭＦＧＫＡＭＱＰＤＦＱＰＰＰＰＬＰＲＨＡＬＨＬＬＲＣＥＩＶＭＳＷＳＩＦＰＬＶＥＦＬＲＲＱＧＹＩＤＦＱＶＧＥＡＭＮＣＶＡＤＹＡＡＫＶＧＬＡＭＩＭＶＮＣＮＬＥＱＩＮＡＬＲＶＱＱＭＨＳＡＬＴＧＭＬＫＶＭＲＫＴＮＬＳＳＳＲＭＡＱＬＤＧＶＤＤＤＶＫＳＷＩＭＮＥＦＳＧＳＴＤＧＫＧＧＤＤＡＫＡＱＱＲＡＲＧＲＫＧＨＳＡＡＭＤＡＥＫＬＡＡＳＳＬＦＴＷＤＦＤＡＬＤＫＳＤＥＤＬＴＡＶＣＶＲＶＦＱＥＬＨＶＩＥＱＦＮＩＤＥＫＫＬＲＫＷＬＱＫＶＲＴＱＹＮＫＮＰＦＨＮＷＲＨＡＶＭＶＬＨＴＴＹＬＬＬＴＳＶＡＴＥＦＩＴＥＶＥＬＬＡＭＬＩＡＡＬＳＨＤＬＤＨＮＧＬＴＮＡＦＨＩＮＳＲＳＥＬＡＬＶＹＮＤＱＳＶＬＥＮＨＨＳＨＬＡＦＥＩＬＬＥＫＧＣＮＶＶＥＮＬＤＥＤＥＦＫＲＬＲＡＶＩＩＮＣＩＬＮＴＤＭＡＴＨＨＴＫＬＳＫＭＥＥＶＮＲＬＧＧＦＩＮＬＡＥＮＮＤＱＲＬＦＶＬＡＶＬＬＨＴＡＤＬＨＮＰＩＫＰＦＥＳＮＫＲＷＳＡＲＬＱＫＥＦＮＮＱＶＥＬＥＡＫＭＮＬＰＳＬＰＦＭＲＧＮＤＥＥＳＬＡＫＧＥＩＧＦＩＮＦＶＶＫＰＷＨＱＱＬＳＱＡＦＰＫＬＤＦＬＬＤＴＩＤＡＮＬＡＥＷＫＡＩＡＥＳＹＲＱＭＨ
【実施例】
【００２７】
（Ｒｈ−ＰＤＥタンパク質の発現）
Ｓａｌｐｉｎｇｏｅｃａ  ｒｏｓｅｔｔａ（ＡＴＣＣ５０８１８株）のゲノム配列中のＲｈ−ＰＤＥをコードする遺伝子配列をＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  １６０７８６０６から入手した。
【００２８】
入手された遺伝子配列をもとに、ヒトの細胞での発現用に遺伝子配列の最適化をおこない、その遺伝子配列を合成した。合成遺伝子を哺乳類細胞発現用プラスミドであるｐＥＧＦＰ−Ｎ１およびｐｃＤＮＡ３．１にライゲーション法を用いて挿入した。この産物をｐＥＧＦＰ−Ｒｈ−ＰＤＥおよびｐｃＤＮＡ３．１−Ｒｈ−ＰＤＥと呼ぶ。
ｐＥＧＦＰ−Ｒｈ−ＰＤＥおよびｐｃＤＮＡ３．１−Ｒｈ−ＰＤＥをリポフェクション法、又はリン酸カルシウム法によりにＨＥＫ２９３細胞およびＮＤ７／２３細胞に導入し、Ｒｈ−ＰＤＥタンパク質の発現を行った。発現後細胞を回収し、カラムクロマトグラフィー法によりＲｈ−ＰＤＥタンパク質を精製した。
【００２９】
（Ｒｈ−ＰＤＥの光による活性化メカニズム）
光による活性化メカニズムを調べるために、精製したＲｈ−ＰＤＥタンパク質の光受容部位であるロドプシン部位の光反応特性を分光学的に検証した。試験管内にＲｈ−ＰＤＥを静置して５２０ナノメートルの青緑色の光を照射した。その結果、図１に示すように、Ｒｈ−ＰＤＥは光照射の約７秒後に完全に活性化され、光照射を終えるとその活性は数分かけて減衰し、元の状態に戻ることが分かった。Ｒｈ−ＰＤＥの活性化とは、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰを分解する反応を示すことである。分解産物はそれぞれ５´ＡＭＰ、５´ＧＭＰである。
【００３０】
試験管内で精製Ｒｈ−ＰＤＥタンパク質とｃＧＭＰを混合し静置して５２０ナノメートルの青緑色の光を、２０分間照射したとき（Ｌｉｇｈｔ）と、しないとき（Ｄａｒｋ）における各時間におけるｃＧＭＰの残存率は、図２のようになった。図２から２０分間の間、ｃＧＭＰの残存率は、両者の場合に共に低下した。光照射をした場合、しない場合よりさらに低下した。
【００３１】
図２に基づいて、光照射をしたときと光照射をしなかったときのｃＧＭＰの分解量（ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ）を算出して図３に示した。図３から、ｃＧＭＰについて、光依存的に１４０％の分解活性の上昇を示すことが判明した。
【００３２】
試験管内でＲｈ−ＰＤＥタンパク質とｃＡＭＰを混合し静置して５２０ナノメートルの青緑色の光を、２０分間照射したとき（Ｌｉｇｈｔ）と、しなかったとき（Ｄａｒｋ）における各時間でのｃＡＭＰの残存率は、図４のようになった。図４から２０分間の間、ｃＡＭＰの残存率は、両者の場合に共に低下した。光照射をした場合、しない場合よりさらに低下した。
【００３３】
図４に基づいて、光照射をしたときと光照射をしなかったときのｃＡＭＰの分解量（ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ）を算出して図５を示した。図５から、ｃＧＭＰについて、光依存的に１６０％の分解活性の上昇があることが分かった。
【００３４】
（ＮＤ７／２３細胞へのＲｈ−ＰＤＥの導入）
上述した哺乳類細胞発現用プラスミドであるｐＥＧＦＰ−Ｒｈ−ＰＤＥを、リポフェクション法によりマウス由来の培養細胞に導入した。なお、ｐＥＧＦＰ−Ｒｈ−ＰＤＥには緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子も含まれており、Ｒｈ−ＰＤＥタンパク質の発現を緑色蛍光により検出することができる。遺伝子導入後の細胞を、蛍光顕微鏡を用いて観察したところ細胞内に緑色蛍光が観察されたため（図６（ｂ））、Ｒｈ−ＰＤＥが発現したと結論付けた。
【００３５】
（ＨＥＫ２９３細胞へのＲｈ−ＰＤＥの導入）
ヒトの細胞の中でも同じようにＲｈ−ＰＤＥが働くかを検証するために、Ｒｈ−ＰＤＥをヒトの培養細胞での一種であるＨＥＫ２９３細胞に導入した。このために、ｐＥＧＦＰ−Ｒｈ−ＰＤＥをリポフェクション法を用いて導入した。
【００３６】
（ｃＡＭＰ濃度の経時的検出）
Ｒｈ−ＰＤＥを導入したＨＥＫ２９３細胞に青緑光（５１０ナノメートル）を照射して、細胞内のｃＡＭＰ濃度を経時的に検出することで、青緑色光照射に応じたｃＡＭＰ濃度の減少を観察した。
【００３７】
図７に示すように、２分間青緑光を照射すると、細胞内ｃＡＭＰ量を示す相対ルミネセンスは一旦減少し、その後漸増して約６分後には減少前の値に戻った。減少前の値は、青緑光を照射しなかったときのｃＡＭＰの相対ルミネセンスであるから、Ｒｈ−ＰＤＥは人の細胞内に導入されても、試験管内と同様な光による活性化メカニズムを有することが判明した。
なお、図７中のＡＴＲはａｌｌ−ｔｒａｎｓ−ｒｅｔｉｎａｌ（全トランスレチナール）の略称であって、ビタミンＡの誘導体でヒトの生体内にも存在するが、ｃＡＭＰの相対ルミネセンスの感度を向上させるため、添加されたものである。図７において＋ＡＴＲのときが−ＡＴＲのときよりもｃＡＭＰの相対ルミネセンスが減少していた。
【００３８】
図７の青緑光照射を１１回繰り返した結果を図８に示す。図８から、図７のｃＡＭＰの相対ルミネセンスの挙動が１１回繰り返されていたため、ＨＥＫ２９３細胞に導入されたＲｈ−ＰＤＥについて、可逆的、繰り返しの光操作が可能であることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
細胞内環状ヌクレオチド濃度の光操作がＲｈ−ＰＤＥを用いることで可能であり、Ｒｈ−ＰＤＥを応用した細胞内シグナル伝達の光操作法を確立する。これにより環状ヌクレオチドが関わる疾患メカニズムの解明に貢献する。環状ヌクレオチドの欠乏は気管支喘息、アルツハイマー病、網膜色素変性症等の原因である。Ｒｈ−ＰＤＥを健常な動物組織に導入することで、環状ヌクレオチド濃度を光照射により低下させることが可能になるため、疾患状態を迅速に作り出すことが可能となる。これは疾患メカニズムの解明、さらには治療法の開発に貢献する画期的な手法となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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