(57)【要約】      （修正有）【課題】バイオファブリケートレザーまたは皮革様特性を有する物質を製造するために用いる組換えコラーゲンの製造方法の提供。【解決手段】非水酸化コラーゲンを産生する遺伝子改変酵母株であって：（ｉ）酵母株；ならびに（ｉｉ）コラーゲンのＤＮＡ配列；コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；コラーゲンターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列、前記選択マーカー用のプロモーターのＤＮＡ配列；前記選択マーカー用のターミネーターのＤＮＡ配列；細菌用のもの及び酵母用のものから選択される複製起点のＤＮＡ配列；及び前記酵母のゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列を含むベクターを含み、前記ベクターが前記酵母株に挿入されている、前記遺伝子改変酵母株。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非水酸化コラーゲンを産生する遺伝子改変酵母株であって：
（ｉ）酵母株；ならびに
（ｉｉ）コラーゲンのＤＮＡ配列；コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；コラーゲンターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列、前記選択マーカー用のプロモーターのＤＮＡ配列；前記選択マーカー用のターミネーターのＤＮＡ配列；細菌用のもの及び酵母用のものから選択される複製起点のＤＮＡ配列；及び前記酵母のゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列を含むベクター
を含み、前記ベクターが前記酵母株に挿入されている、前記遺伝子改変酵母株。
【請求項２】
前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、請求項１に記載の酵母株。
【請求項３】
前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の酵母株。
【請求項４】
前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、天然コラーゲンＤＮＡ、改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）コラーゲンＤＮＡ及びコドン改変コラーゲンＤＮＡから選択される、請求項３に記載の酵母株。
【請求項５】
前記プロモーターのＤＮＡ配列が、ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーターのＤＮＡ、ｐＤＦ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、ｐＣＡＴ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、Ｄａｓ１−Ｄａｓ２メタノール誘導性二方向性プロモーターのＤＮＡ、ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ、ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の酵母株。
【請求項６】
前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、抗生物質耐性のＤＮＡ及び栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、請求項１に記載の酵母株。
【請求項７】
前記抗生物質耐性マーカーが、ハイグロマイシン耐性、ゼオシン耐性、ジェネテシン耐性及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載の酵母株。
【請求項８】
前記ベクターを、電気穿孔法、化学的形質転換、及び接合からなる群から選択される方法によって前記酵母に挿入する、請求項１に記載の酵母株。
【請求項９】
非水酸化コラーゲンの製造方法であって：
（ｉ）請求項１の酵母株を提供し；及び
（ｉｉ）コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で前記株を増殖させることを含む、前記製造方法。
【請求項１０】
前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記培地が、緩衝グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）、緩衝メタノール複合培地（ＢＭＭＹ）、及び酵母抽出ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記期間が、２４時間〜７２時間である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記酵母が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記プロモーターのＤＮＡ配列が、前記ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、前記抗生物質耐性ＤＮＡのＤＮＡ及び前記栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
水酸化コラーゲンを産生する遺伝子改変酵母株であって：
（ｉ）酵母株；
（ｉｉ）コラーゲンのＤＮＡ配列；コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；ターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列；前記選択マーカー用のプロモーターのＤＮＡ配列；前記選択マーカー用のターミネーターのＤＮＡ配列；細菌及び／または酵母の複製起点のＤＮＡ配列；前記酵母のゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列を含むベクターであって；前記ベクターが前記酵母株に挿入されている、前記ベクター；ならびに
（ｉｉｉ）Ｐ４ＨＡ１のＤＮＡ配列；Ｐ４ＨＢのＤＮＡ配列；及びプロモーター用の少なくとも１つのＤＮＡ配列を含む第二のベクターであって；前記ベクターが前記酵母株に挿入されている、前記第二のベクター
を含む、前記遺伝子改変酵母株。
【請求項１８】
前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、請求項１７に記載の酵母株。
【請求項１９】
前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載の酵母株。
【請求項２０】
前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、天然コラーゲンＤＮＡ、改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）コラーゲンＤＮＡ及び改変（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）コラーゲンＤＮＡから選択される、請求項１７に記載の酵母株。
【請求項２１】
前記プロモーターのＤＮＡ配列が、前記ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーターのＤＮＡ、前記ｐＤＦ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、前記ｐＣＡＴ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、前記Ｄａｓ１−Ｄａｓ２メタノール誘導性二方向性プロモーターのＤＮＡ、前記ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ、前記ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載の酵母株。
【請求項２２】
前記プロモーターのＤＮＡ配列が、前記ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、請求項１７に記載の酵母株。
【請求項２３】
前記選択マーカーの前記ＤＮＡ配列が、前記抗生物質耐性ＤＮＡのＤＮＡ及び前記栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、請求項１７に記載の酵母株。
【請求項２４】
前記選択マーカーが、ハイグロマイシン耐性、ゼオシン耐性、ジェネテシン耐性及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗生物質耐性の選択マーカーである、請求項２３に記載の酵母株。
【請求項２５】
前記ベクターを、電気穿孔法、化学的形質転換、及び接合からなる群から選択される方法によって前記酵母に挿入する、請求項１７に記載の酵母株。
【請求項２６】
水酸化コラーゲンの製造方法であって：
（ｉ）請求項１７の酵母株を提供し；及び
（ｉｉ）コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で前記株を増殖させることを含む、前記製造方法。
【請求項２７】
前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記培地が、ＢＭＧＹ、ＢＭＭＹ、及びＹＰＤからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記期間が、２４時間〜７２時間である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記酵母が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記コラーゲンのＤＮＡが、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記プロモーターのＤＮＡが、前記ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記選択マーカーのＤＮＡが、前記抗生物質耐性ＤＮＡのＤＮＡ及び前記栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
（ｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、コラーゲン産生に必要なＤＮＡ；
（ｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＢからなる群から選択される水酸化酵素のＤＮＡ；
（ｉｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、選択マーカーのＤＮＡ；
（ｉｖ）酵母及び細菌の複製起点のＤＮＡ；
（ｖ）ゲノムに組み込むために前記酵母のゲノムに対して相同性を有するＤＮＡ；ならびに
（ｖｉ）モジュラー式クローニングを可能にする、上記のＤＮＡ内の５’、３’、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される位置の制限酵素部位
を有する、オールインワンベクター。
【請求項３５】
コラーゲン産生に必要な前記ＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３４に記載のオールインワンベクター。
【請求項３６】
前記プロモーターのＤＮＡ配列が、前記ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、請求項３４に記載のオールインワンベクター。
【請求項３７】
前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、前記抗生物質耐性のＤＮＡ及び前記栄養要求性マーカーのＤＮＡである、請求項３４に記載のオールインワンベクター。
【請求項３８】
前記選択マーカーが、ハイグロマイシン、ゼオシン、ジェネテシン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗生物質に対する抗生物質耐性の選択マーカーである、請求項３７に記載のオールインワンベクター。
【請求項３９】
最適化したＤＮＡを、キメラコラーゲンＤＮＡの全長に基づいて１０〜４０％または６０〜９０％含む、キメラコラーゲンＤＮＡ配列。
【請求項４０】
前記最適化したＤＮＡが、Ｃ末端から始まる、請求項３９に記載のキメラコラーゲンＤＮＡ配列。
【請求項４１】
前記最適化したＤＮＡが、Ｎ末端から始まる、請求項３９に記載のキメラコラーゲンＤＮＡ配列。
【請求項４２】
請求項３９に記載のキメラコラーゲンのＤＮＡ配列；
コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；
ターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列；
前記選択マーカー用のプロモーターのＤＮＡ配列；
前記選択マーカー用のターミネーターのＤＮＡ配列；
細菌及び／または酵母の複製起点のＤＮＡ配列；及び
前記酵母のゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列
を含むベクターを保有する、コラーゲン産生酵母株。
【請求項４３】
前記プロモーターのＤＮＡが、前記ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、請求項４２に記載の酵母株。
【請求項４４】
前記選択マーカーのＤＮＡが、前記少なくとも１つの抗生物質耐性をコードするＤＮＡ及び少なくとも１つの栄養要求性マーカーをコードするＤＮＡからなる群から選択される、請求項４２に記載の酵母株。
【請求項４５】
水酸化コラーゲンの製造方法であって：
（ｉ）請求項４２のコラーゲン産生酵母株を提供し；及び
（ｉｉ）コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で前記株を増殖させることを含む、前記製造方法。
【請求項４６】
前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記培地が、緩衝グリセロール複合培地、緩衝メタノール複合培地、及び酵母抽出ペプトンデキストロースからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記期間が、２４時間〜７２時間の範囲である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記酵母株が、前記ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記酵母株が、抗生物質耐性をコードするＤＮＡ及び栄養要求性マーカーをコードするＤＮＡからなる群から選択される少なくとも１つの選択マーカーを含む、請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年７月３１日に出願された米国仮出願第６２／５３９，２１３号の優先権を主張し、前記文献はその全体を参照として本明細書に援用される。
【０００２】
本出願は、タイトル名Ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｆｉｂｒｉｌｓの米国特許出願第１５／４３３，５６６号及びタイトル名Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｍａｋｉｎｇ  ａ  Ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｆｉｂｒｉｌｓの第１５／４３３，６５０号に関連し、これらの文献は参照として本明細書に援用される。
【０００３】
発明の分野
本発明は、遺伝子組換え酵母株、及び組換えまたは人工コラーゲンを含有するバイオファブリケートレザーまたは皮革様特性を有する物質を製造するために用いる組換えコラーゲンの製造方法に関する。酵母株を改変し、酵母株が、特定の組換えコラーゲン水酸化度を選択することによって組換えコラーゲンの構造的及び質感上の特性を調節できるようにする。これにより、例えば様々な異なる動物試験を行っていない及び環境保護的なバイオファブリケートレザー及び同様の素材に組み込むために、特定の最終用途に組換えコラーゲンの特性を適合させることが可能になる。
【０００４】
関連技術の説明
皮革は、家具の室内装飾品、衣類、靴、荷物、ハンドバッグ及びアクセサリー、ならびに自動車用途など、広範囲の用途に使用されている。皮革の世界貿易推定額は、年間およそ１０００億ドルであり（Ｆｕｔｕｒｅ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｌｅａｔｈｅｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｒａｄｅ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｎａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、ウィーン、２０１０）、皮革製品の需要は継続してますます高まっている。皮革を製造する経済的、環境的、社会的コストの観点から、この需要を満たす新規方法が必要とされている。皮革製品の生産者及びユーザーは、技術的及び審美的トレンドに追いつくために、優れた強度、均一性、加工性及び天然成分を組み込んだファッショナブルかつ魅力的な審美的特性を示す新規素材を探求している。
【０００５】
人口増加と地球環境を考慮すると、皮革様の審美性を備え、機能性が向上した代替素材が必要となるだろう。皮革は、動物の皮であり、ほぼすべてがコラーゲンからなる。バイオファブリケートレザー素材に組込み可能な新規コラーゲン供給源が必要である。
【０００６】
組換え発現コラーゲンを用いたバイオファブリケートレザーの製造は、多様な商業的用途に必要とされる形態及び量のコラーゲンを効率的に製造する方法が必要であることをはじめとして、多くの課題に直面している。いくつかの用途では、より柔らかくより浸透性の高いコラーゲン成分が望ましく；他の用途では、より硬く、より耐久性が高く丈夫なコラーゲン成分が必要である。
【０００７】
いくつかのコラーゲン及びコラーゲン様タンパク質の組換え発現が公知であり；Ｂｅｌｌ，ＥＰ１２３２１８２Ｂ１，Ｂｏｖｉｎｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｅｌａｔｉｎ；Ｏｌｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，４２８，９７８号，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｌａｔｉｎ  ａｎｄ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｔｒｉｐｌｅ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃｅｌｌｓ；ＶａｎＨｅｅｒｄｅ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第８，１８８，２３０号，Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｌｉｋｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓを参照されたく、これらの開示は参照として本明細書に援用される。こうした組換えコラーゲンは、皮革製品またはバイオファブリケートレザー製品を製造するためには使用されてこなかった。
【０００８】
酵母でのタンパク質発現に有用なベクターは公知であり；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｃｈａｐｔｅｒ  １３  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．  ＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８；Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｙｅａｓｔ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ｗｕ  ＆  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．１５３：５１６−５４４；Ｇｌｏｖｅｒ（１９８６）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．ＩＩ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．，Ｃｈ．３；Ｂｉｔｔｅｒ（１９８７），Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｂｅｒｇｅｒ  ＆  Ｋｉｍｍｅｌ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．１５２：６７３−６８４；及びＴｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｅｄｓ．Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｖｏｌｓ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（１９８２）を参照されたく、これらの開示は参照として本明細書に援用される。酵母発現ベクターは、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ｗｗｗ．＿ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ）；ＡＴＵＭ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．＿ａｔｕｍ．ｂｉｏ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｖｅｃｔｏｒｓ／ｙｅａｓｔ）；またはＩＢＡ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．＿ｉｂａ−ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｃｌｏｎｉｎｇ−ｙｅａｓｔ−ｖｅｃｔｏｒｓ．ｈｔｍｌ）のカタログに記載されているように、市販されている（それぞれ、最終アクセス日は２０１８年７月１６日であり、これらを参照として援用する）。
【０００９】
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは、ヒトインターフェロンγなどの生体治療用タンパク質を組換え発現するために使用されている酵母種である（Ｒａｚａｇｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ４５：５２−６０（２０１７）参照）。この酵母種は、ＩＩＩ型コラーゲン及びプロリル−４−ヒドロキシラーゼを発現するために使用されている（Ｖｕｏｒｅｌａ，  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：６７０２−６７１２（１９９７）参照）。コラーゲン及びプロリル−４−ヒドロキシラーゼもまた、コラーゲン性物質を産生するためにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ内で発現されている（Ｐｉｎｋａｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６（４）：３２０−３２４（２０１１）参照）。
【００１０】
コドン改変を用いて、選択した水酸化度を有するトロポコラーゲンを提供し、したがって、生物工学による皮革の製造に使用するための、ある範囲の異なるコラーゲン素材を提供することは、従前には検討されてこなかった。
【００１１】
本発明者らは、選択した水酸化度を特徴とする様々な形態のコラーゲンを豊富に発現可能な組換え酵母を設計することにより、これらの課題に取り組むことを試みた。
【００１２】
発明の概要
本発明の一態様は、コラーゲンを効率的に発現させ、発現するコラーゲン中のリジン残基及びプロリン残基の水酸化度を調節するように改変した組換え酵母株に関する。本発明のこの態様は、コラーゲン中のリジン、プロリン、またはリジンとプロリン残基の数に基づいて、選択した水酸化度のリジン、プロリン、またはリジンとプロリン残基を有する組換えコラーゲンを発現することができる組換え酵母を提供する。コラーゲンの水酸化度は、コラーゲン三重らせんまたはトロポコラーゲンの弛緩度または緊密度、ならびに組換えコラーゲンで作製したバイオファブリケートレザーなどの製品の機能的及び審美的特性と相関する。
【００１３】
本発明の他の実施形態は、コラーゲンまたはヒドロキシラーゼをコードするコドン改変核酸配列、コラーゲン及びヒドロキシラーゼ（複数可）をコードする「オールインワンベクター」などのベクター、及び組換えコラーゲンの産生方法及び使用方法を含む。別の実施形態では、本発明は、水酸化及び非水酸化コラーゲンの製造に有用な酵母宿主内のキメラＤＮＡ配列を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】非水酸化コラーゲンを産生するように設計したＭＭＶ−６３ベクターの図を示す。
【図２】非水酸化コラーゲンを産生するように設計したＭＭＶ−７７ベクターの図を示す。
【図３】非水酸化コラーゲンを産生するように設計されたＭＭＶ−１２９ベクターの図を示す。
【図４】非水酸化コラーゲンを産生するように設計されたＭＭＶ−１３０ベクターの図を示す。
【図５】水酸化コラーゲンを産生するように設計されたＭＭＶ−７８ベクターの図を示す。
【図６】水酸化コラーゲンを産生するように設計されたＭＭＶ−９４ベクターの図を示す。
【図７】水酸化コラーゲンを産生するように設計されたＭＭＶ−１５６ベクターの図を示す。
【図８】水酸化コラーゲンを産生するように設計されたＭＭＶ−１９１ベクターの図を示す。
【図９】非水酸化または水酸化コラーゲンを産生するように設計されたオールインワンベクターＭＭＶ−２０８を示す。
【図１０】ＭＭＶ−８４ベクターの図を示す。
【図１１】ＭＭＶ−１５０ベクターの図を示す。
【図１２】ＭＭＶ−１４０ベクターの図を示す。
【図１３】ＭＭＶ−１３２ベクターの図を示す。
【図１４】ＭＭＶ−１９３ベクターの図を示す。
【図１５】ＭＭＶ−１９４ベクターの図を示す。
【図１６】ＭＭＶ−１９５ベクターの図を示す。
【図１７】ＭＭＶ−１９７ベクターの図を示す。
【図１８】ＭＭＶ−１９８ベクターの図を示す。
【図１９】ＭＭＶ−１９９ベクターの図を示す。
【図２０】ＭＭＶ−２００ベクターの図を示す。
【図２１】ＭＭＶ−１２８ベクターの図を示す。
【図２２】Ｃｏｌ３Ａ１キメラ分子を記載する。
【００１５】
発明の詳細な説明
本明細書に例示するように、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを用いて、異なる水酸化度を有する組換えＩＩＩ型ウシコラーゲンを発現させた。組換えコラーゲンの水酸化は、ウシプロリル−４−ヒドロキシラーゼの、それぞれα及びβサブユニットをコードするウシＰ４ＨＡ及びウシＰ４ＨＢの同時発現によって達成される。しかしながら、本発明は、ＩＩＩ型コラーゲンの産物及び発現に限定されず、他の種類のコラーゲンのサブユニットをコードするポリヌクレオチドならびにプロリン残基、リジン残基、またはプロリン残基とリジン残基の両方を水酸化する酵素で実施することができる。ＩＩＩ型トロポコラーゲンはホモ三量体である。しかしながら、いくつかの実施形態では、コラーゲンは、最初に２つのプロα１（Ｉ）鎖及び１つのプロα２（Ｉ）鎖から構成されるＩ型コラーゲンなどの異なるポリペプチド鎖から構成されるヘテロ三量体を形成する。
【００１６】
コラーゲン。コラーゲンは皮革の主成分である。皮膚、または動物の皮は、繊維状タンパク質であるコラーゲンを相当量含有する。コラーゲンは、少なくとも２８の異なるコラーゲン型のファミリーの総称であり；動物の皮膚は一般的にはＩ型コラーゲンであるが、ＩＩＩ型コラーゲンを含有する皮革の形成に他の型のコラーゲンを使用することができる。用語「コラーゲン」は、未処理（例えば、プロコラーゲン）ならびに三重らせん構造を有する翻訳後修飾及びタンパク質分解を受けたコラーゲンを包含する。
【００１７】
コラーゲンは、アミノ酸トリプレットの反復である−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−を特徴とし、コラーゲン中のアミノ酸残基のおよそ３分の１はグリシンである。Ｘは多くの場合プロリンであり、Ｙは多くの場合ヒドロキシプロリンであるが、最大４００の可能なＧｌｙ−Ｘ−Ｙトリプレットが存在し得る。異なる動物が異なるアミノ酸組成を有するコラーゲンを産生し、コラーゲン上に異なる特性を付与し、異なる特性または外観を有するレザーを産生することができる。
【００１８】
コラーゲンの構造は、長さの異なる３つの絡み合ったペプチド鎖からなり得る。コラーゲン三重らせん（または単量体）は、約１，０５０アミノ酸長のα鎖から生成される場合があり、その結果、三重らせんはおよそ３００ｎｍの長さの棒状の形態をとっており、直径はおよそ１．５ｎｍである。
【００１９】
コラーゲン繊維は、動物の皮の種類に応じて、ある範囲の直径を有し得る。Ｉ型コラーゲンに加えて、皮膚（皮）には、ＩＩＩ型コラーゲン（レティキュリン）、ＩＶ型コラーゲン、及びＶＩＩ型コラーゲンを含む他の型のコラーゲンも含まれ得る。
【００２０】
哺乳類の体には様々な型のコラーゲンが存在する。例えば、Ｉ型コラーゲンは、皮膚及び動物の皮の主成分であるだけでなく、軟骨、腱、血管結紮部、器官、筋肉、及び骨の有機部分にも存在する。動物の皮膚または皮に加えて、哺乳類の体の様々な領域からコラーゲンを単離する試みが成果を収めている。数十年前、研究者らは、中性ｐＨでは、酸可溶化コラーゲンが、天然組織において観察されるものと同じ横縞模様から構成されるフィブリルに自己集合したことを見出した；Ｓｃｈｍｉｔｔ  Ｆ．Ｏ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９４２；２０：１１。これにより、組織工学及び様々な生物医学的用途においてコラーゲンが使用されるようになった。より近年においては、組換え技術を用いて細菌及び酵母からコラーゲンが回収されるようになった。
【００２１】
水素結合、ファンデルワールス相互作用、双極子間力、分極力、疎水性相互作用、及び多くの場合に酵素反応によって触媒される共有結合などの静電相互作用を含む物理的及び化学的相互作用の組合せによって、コラーゲンが形成及び安定化される。ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、及びヒトを含む脊椎動物のコラーゲンにおいて、様々な異なるコラーゲン型が同定されている。
【００２２】
本発明は、１つ以上の型のコラーゲンをコードするポリヌクレオチドで実施してもよい。通常、コラーゲン型はローマ数字で番号付けし、各コラーゲン型で見出される鎖はアラビア数字で識別される。天然に存在するコラーゲンの様々な異なる型の構造及び生物学的機能の詳細な説明は、当該技術分野で利用可能であり；例えば、Ａｙａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｂｕｒｇｅｓｏｎ，Ｒ  Ｅ．，ａｎｄ  Ｎｉｍｍｉ（１９９２）“Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ”ｉｎ  Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．２８２：２５０−２７２；Ｋｉｅｌｔｙ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）“Ｔｈｅ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｆａｍｉｌｙ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ，”Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ，Ｒｏｙｃｅ，Ｐ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｂ．Ｓｔｅｉｎｍａｎｎ  ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．１０３−１４７；及びＰｒｏｃｋｏｐ，Ｄ．Ｊ−  ａｎｄ  Ｋ．Ｉ．Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ（１９９５）“Ｃｏｌｌａｇｅｎｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｄｉｓｅａｓｅｓ，ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４：４０３−４３４．）参照。
【００２３】
Ｉ型コラーゲンは、生物の総コラーゲンのおよそ８０〜９０％を含有する骨及び皮膚の主要な線維性コラーゲンである。Ｉ型コラーゲンは、多細胞生物の細胞外マトリックスに存在する主要な構造高分子であり、全タンパク質の質量のおよそ２０％を含有する。Ｉ型コラーゲンは、ＣＯＬ１Ａ１及びＣＯＬ１Ａ２遺伝子によってそれぞれコードされる２つのα１（Ｉ）鎖及び１つのα２（Ｉ）鎖を有するヘテロ三量体分子である。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいては、Ｉ型コラーゲンのフィブリル、繊維、及び繊維束の組み立てが発生中に起こり、組織に機械的支持を提供する一方で、細胞運動性及び栄養素輸送を可能にする。他のコラーゲン型は、Ｉ型コラーゲンほど豊富ではなく、異なる分布パターンを示す。例えば、ＩＩ型コラーゲンは、軟骨及び硝子体液中で優勢なコラーゲンであり、一方、ＩＩＩ型コラーゲンは、血管内においては高レベルに、皮膚においては低レベルに見出される。
【００２４】
ＩＩ型コラーゲンは、ＣＯＬ２Ａ１遺伝子によってコードされる３つの同一のａｌ（ＩＩ）鎖を有するホモ三量体コラーゲンである。精製ＩＩ型コラーゲンは、例えば、Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｈｏｄｅｓ（１９８２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ８２：３３−６４に記載されている手順により、当該分野で公知の方法により、組織から調製してもよい。
【００２５】
ＩＩＩ型コラーゲンは、皮膚及び血管組織に認められる主要な線維性コラーゲンである。ＩＩＩ型コラーゲンは、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子によってコードされる３つの同一のα１（ＩＩＩ）鎖を含むホモ三量体コラーゲンである。ＩＩＩ型コラーゲンを組織から精製する方法は、例えば、Ｂｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：５２４３−５２４８；及び上記のＭｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｈｏｄｅｓに見出すことができ、本発明の方法によって発現させるコラーゲンと併用してもよい。
【００２６】
ＩＶ型コラーゲンは、基底膜においてフィブリルよりもむしろシートの形態で見出される。最も一般的には、ＩＶ型コラーゲンは２つのα１（ＩＶ）鎖及び１つのα２（ＩＶ）鎖を有する。特定の鎖を有するＩＶ型コラーゲンは組織特異的である。ＩＶ型コラーゲンは、例えば、Ｆｕｒｕｔｏ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１４４：４１−６１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに記載の手順を用いて精製してもよい。
【００２７】
Ｖ型コラーゲンは、主として、骨、腱、角膜、皮膚、及び血管に見出される線維状コラーゲンである。Ｖ型コラーゲンは、ホモ三量体及びヘテロ三量体の両方の形態で存在する。Ｖ型コラーゲンの一形態は、２つのα１（Ｖ）鎖及び１つのα２（Ｖ）鎖のヘテロ三量体である。Ｖ型コラーゲンの別の形態は、α１（Ｖ）、α２（Ｖ）及びα３（Ｖ）鎖のヘテロ三量体である。Ｖ型コラーゲンのさらなる形態は、α１（Ｖ）のホモ三量体である。天然源からＶ型コラーゲンを単離する方法は、例えば、Ｅｌｓｔｏｗ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ（１９８３）Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．３：１８１−１９３，及びＡｂｅｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．２：４９３−５０２に見出すことができる。
【００２８】
ＶＩ型コラーゲンは、小さな三重らせん領域及び２つの大きな非コラーゲン性残余部分を有する。ＶＩ型コラーゲンは、α１（ＶＩ）、α２（ＶＩ）、及びα３（ＶＩ）鎖を有するヘテロ三量体である。ＶＩ型コラーゲンは、多くの結合組織に認められる。天然源からのＶＩ型コラーゲンの精製方法の説明は、例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４８：３７３−３８１，及びＫｉｅｌｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．９９：７９７−８０７に見出すことができる。
【００２９】
ＶＩＩ型コラーゲンは、特定の上皮組織に見出される原線維性コラーゲンである。ＶＩＩ型コラーゲンは、３つのα１（ＶＩＩ）鎖のホモ三量体分子である。組織からＶＩＩ型コラーゲンを精製する方法の説明は、例えば、Ｌｕｎｓｔｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：９０４２−９０４８，及びＢｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：３１６８−３１７２に見出すことができる。ＶＩＩＩ型コラーゲンは、角膜のデスメ膜に見出すことができる。ＶＩＩＩ型コラーゲンは、２つのα１（ＶＩＩＩ）鎖及び１つのα２（ＶＩＩＩ）鎖を有するヘテロ三量体であるが、他の鎖組成も報告されている。天然由来のＶＩＩＩ型コラーゲンの精製方法は、例えば、Ｂｅｎｙａ  ａｎｄ  Ｐａｄｉｌｌａ（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：４１６０−４１６９，及びＫａｐｏｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：３９３０−３９３７に見出すことができる。
【００３０】
ＩＸ型コラーゲンは、軟骨及び硝子体液中に見出される繊維付随性コラーゲンである。ＩＸ型コラーゲンは、α１（ＩＸ）、α２（ＩＸ）、及びα３（ＩＸ）鎖を有するヘテロ三量体分子である。ＩＸ型コラーゲンは、非三重らせんドメインによって分離されたいくつかの三重らせんドメインを有する、ＦＡＣＩＴ（断続性三重らせんを有する線維付随性コラーゲン）コラーゲンとして分類されている。ＩＸ型コラーゲンを精製するための手順は、例えば、Ｄｕａｎｃｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２１：８８５−８８９；Ａｙａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６２：７５３−７６１；及びＧｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄａｍａｇｅ，Ｇｌａｕｅｒｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｐｐ．３−２８に見出すことができる。
【００３１】
Ｘ型コラーゲンは、α１（Ｘ）鎖のホモ三量体化合物である。Ｘ型コラーゲンは、例えば、成長板中に見出される肥大軟骨から単離されている；例えば、Ａｐｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０６（１）：２１７−２４参照。
【００３２】
ＸＩ型コラーゲンは、ＩＩ型及びＩＸ型コラーゲンに関連する軟骨組織、及び体内の他の場所に見出すことができる。ＸＩ型コラーゲンは、α１（ＸＩ）、α２（ＸＩ）、及びα３（ＸＩ）鎖を有するヘテロ三量体分子である。ＸＩ型コラーゲンを精製する方法は、例えば、上記のＧｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．において見出すことができる。
【００３３】
ＸＩＩ型コラーゲンは、主にＩ型コラーゲンと関連して見出されるＦＡＣＩＴコラーゲンである。ＸＩＩ型コラーゲンは、３つのα１（ＸＩＩ）鎖を有するホモ三量体分子である。ＸＩＩ型コラーゲン及びその変異体の精製方法は、例えば、Ｄｕｂｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１３１５０−１３１５６；Ｌｕｎｓｔｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２００８７−２００９２；及びＷａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２００９３−２００９９に見出すことができる。
【００３４】
ＸＩＩＩ型は、例えば、皮膚、腸、骨、軟骨、及び横紋筋に見出される非原線維性コラーゲンである。ＸＩＩＩ型コラーゲンの詳細な説明は、例えば、Ｊｕｖｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２４７００−２４７０７に見出し得る。
【００３５】
ＸＩＶ型は、α１（ＸＩＶ）鎖を有するホモ三量体分子として特徴付けられるＦＡＣＩＴコラーゲンである。ＸＩＶ型コラーゲンの単離方法は、例えば、Ａｕｂｅｒｔ−Ｆｏｕｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５７５９−１５７６４、及び上記のＷａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．に見出すことができる。
【００３６】
ＸＶ型コラーゲンは、構造上、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンに相同である。天然型ＸＶコラーゲンの構造及び単離に関する情報は、例えば、Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０１４４−１０１４８；Ｈｕｅｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １４：２２０−２２４；Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：４７７３−４７７９；及びＭｕｒａｇａｋｉ，Ｊ．（１９９４）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：４０４２−４０４６に見出すことができる。
【００３７】
ＸＶＩ型コラーゲンは、例えば、皮膚、肺線維芽細胞、及びケラチノサイトにおいて見出される繊維付随性コラーゲンである。ＸＶＩ型コラーゲンの構造及びＸＶＩ型コラーゲンをコードする遺伝子に関する情報は、例えば、Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６５６５−６５６９；及びＹａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１２：８５６−８６３に見出すことができる。
【００３８】
ＸＶＩＩ型コラーゲンは、水疱性類天疱瘡抗原でも知られている、半接着斑膜貫通型コラーゲンである。ＸＶＩＩ型コラーゲンの構造及びＸＶＩＩ型コラーゲンをコードする遺伝子に関する情報は、例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１２）：８８２５−８８３４；及びＭｃＧｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１１（１）：８３−８６に見出すことができる。
【００３９】
ＸＶＩＩＩ型コラーゲンは、ＸＶ型コラーゲンと構造が類似しており、肝臓から単離することができる。天然源由来のＸＶＩＩＩ型コラーゲンの構造及び単離の説明は、例えば、Ｒｅｈｎ  ａｎｄ  Ｐｉｈｌａｊａｎｉｅｍｉ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：４２３４−４２３８；Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：４２２９−４２３３；Ｒｅｈｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３９２４−１３９３５；及びＯｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９：４９４−４９９に見出すことができる。
【００４０】
ＸＩＸ型コラーゲンは、ＦＡＣＩＴコラーゲンファミリーの別のメンバーであると考えられており、横紋筋肉腫細胞から単離されたｍＲＮＡにおいて見出されている。ＸＩＸ型コラーゲンの構造及び単離の説明は、例えば、Ｉｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７：１３７−１４６；Ｙｏｓｈｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３：８８４−８８６；及びＭｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９：１８５４９−１８５５７（１９９４）に見出すことができる。
【００４１】
ＸＸ型コラーゲンは、ＦＡＣＩＴコラーゲンファミリーの新規に見出されたメンバーであり、ニワトリ角膜において同定されている；例えば、Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １３：Ａ１１１９；及びＧｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），ＩＯＶＳ  ３９：Ｓ１１２８参照。
【００４２】
本発明の方法を用いて１種類以上のコラーゲンを発現させ、発現したコラーゲンを、あるゆる目的のために参照として援用する上記引用文献に記載されているように、さらに処理または精製してもよい。
【００４３】
用語「コラーゲン」とは、上記のコラーゲン型Ｉ〜ＸＸを含む公知のコラーゲン型のいずれか１つ、ならびに天然、合成、半合成、または組換え型の任意の他のコラーゲンを指す。これには、本明細書に記載されるすべてのコラーゲン、修飾コラーゲン及びコラーゲン様タンパク質が含まれる。本用語はまた、モチーフ（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ（ｎは整数）を有するプロコラーゲン及びコラーゲン様タンパク質またはコラーゲン性タンパク質を包含する。本用語は、コラーゲン及びコラーゲン様タンパク質の分子、コラーゲン分子の三量体、コラーゲンのフィブリル、ならびにコラーゲンフィブリルの繊維を包含する。本用語はまた、フィブリル化することができる、化学的、酵素的、または組換え改変した（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）コラーゲンまたはコラーゲン様分子、ならびにコラーゲンの断片、コラーゲン様分子及びナノファイバーに集合可能なコラーゲン分子を指す。天然または改変した（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）組換えコラーゲン分子は、一般的に、本明細書に記載される反復−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−配列を有する。
【００４４】
コラーゲン中のプロリン及びリジン残基の水酸化。コラーゲンのポリペプチドの主な翻訳後修飾は、４−ヒドロキシプロリン、３−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）及び／またはヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）を生成するためのプロリン及び／またはリジン残基の水酸化、及びヒドロキシリジル残基のグリコシル化である。これらの修飾は、３つのヒドロキシラーゼ、すなわちプロリル４−ヒドロキシラーゼ、プロリル３−ヒドロキシラーゼ、及びリシルヒドロキシラーゼ、ならびに２つのグリコシルトランスフェラーゼによって触媒される。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、これらの反応は、ポリペプチドが三重らせんコラーゲン構造を形成するまで起こり、この構造は、さらなる修飾を阻害する。
【００４５】
プロリル−４−ヒドロキシラーゼ。本酵素は、プロリン残基から（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）への水酸化を触媒する。Ｇｏｒｒｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４５（２）：（２０１０）（参照として援用する）。以下の実施例は、Ｐ４ＨＡ（配列番号５４）及びＰ４ＨＢ（配列番号５２）によってコードされる四量体ウシプロリル−４−ヒドロキシラーゼ（２α及び２β鎖）を使用するが、アイソフォーム、オーソログ、変異体、断片及び非ウシ起源由来プロリル−４−ヒドロキシラーゼもまた、それらが酵母宿主細胞中でヒドロキシラーゼ活性を保持する限り、使用してもよい。Ｐ４ＨＡ１は、http://_www.omim.org/entry/176710に、Ｐ４ＨＢ１及びＰ４ＨＢ１は、http://www.omim.org/entry/176790にさらに記載されており、いずれも参照として援用する。
【００４６】
プロリル３−ヒドロキシラーゼ。本酵素は、プロリン残基の水酸化を触媒する。プロリル３−ヒドロキシラーゼ１前駆体［Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ］は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１０９６７６１．１またはＮＭ＿００１１０３２９１．１（配列番号４８）に記載されている。さらなる説明については、Ｖｒａｎｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：２３６１５−２３６２１（２００４）またはhhttp://_www.omim.org/entry/610339（最終アクセス日２０１７年７月１４日）に記載されており、これらを参照により援用する。本酵素は、その天然形態で使用してもよい。しかしながら、アイソフォーム、オーソログ、変異体、断片及び非ウシ起源由来プロリル−３−ヒドロキシラーゼもまた、酵母宿主細胞内でヒドロキシラーゼ活性を保持する限り、使用してもよい。
【００４７】
リジルヒドロキシラーゼ。リジルヒドロキシラーゼ（ＥＣ１．１４．１１．４）は、Ｘ−ｌｙｓ−ｇｌｙ配列中のリジン残基の水酸化によって、コラーゲン及びコラーゲン様アミノ酸配列を有する他のタンパク質中のヒドロキシリジンの形成を触媒する。この酵素は、約８５ｋＤの分子量を有するサブユニットからなるホモ二量体である。リジルヒドロキシラーゼの一次構造とプロリル−４−ヒドロキシラーゼの２つのタイプのサブユニット（１７６７１０，１７６７９０）との間には、これらの２つのコラーゲンヒドロキシラーゼ間の動力学的特性に著しい類似性があるにもかかわらず、有意な相同性は見出されなかった。リジルヒドロキシラーゼ反応において形成されるヒドロキシリジン残基は、２つの重要な機能を有する：第一に、それらのヒドロキシ基は、単糖類ガラクトースまたは二糖類グルコシルガラクトースのいずれかの炭水化物ユニットの結合部位として機能し；第二に、それらは分子間コラーゲン架橋を安定化させる。
【００４８】
ＰＬＯＤ１プロコラーゲン−リジン，２−オキソグルタル酸５−ジオキシゲナーゼ１［Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ（ウシ）］は、遺伝子ＩＤ：２８１４０９（２０１７年５月２５日更新）に記載されており、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/281409（最後アクセス日２０１７年７月１４日）を参照として援用する。別の例は、配列番号５０に記載されており、これはＢｏｓ  ｔａｕｒｕｓリジルオキシダーゼ（ＬＯＸ）を記載したものである。この酵素は、その天然形態で使用してもよい。しかしながら、アイソフォーム、オーソログ、変異体、断片及び非ウシ起源由来リジルヒドロキシラーゼもまた、それらが酵母宿主細胞中でヒドロキシラーゼ活性を保持する限り、使用してもよい。
【００４９】
組換えコラーゲン中のプロリン残基の水酸化度のアッセイ。組換えコラーゲン中のプロリン残基の水酸化度は、Ｃｈａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：５１  （２０１２）（参照として援用する）に記載される液体クロマトグラフィー質量分析法を含む公知の方法によってアッセイしてもよい。
【００５０】
組換えコラーゲン中のリジン残基の水酸化度のアッセイ。リジン水酸化及びコラーゲンの架橋は、Ｙａｍａｕｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４４６，ｐａｇｅｓ  ９５−１０８．；Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００８）（参照として援用する）に記載されている。組換えコラーゲン中のリジン残基の水酸化度は、Ｈａｕｓｍａｎｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １３３（３）：５９１−５９３（１９６７）（参照として援用する）に記載される方法を含む公知の方法によってアッセイしてもよい。
【００５１】
コラーゲンの融点。コラーゲン中のプロリン、リジン、またはプロリン及びリジン残基の水酸化度は、水酸化アミノ酸残基を既知の含有量で含む対照コラーゲンと比較したヒドロゲルなどの水和コラーゲンの融解温度によって評価してもよい。コラーゲンの融解温度は、２５〜４０℃の範囲であり、通常、より高度に水酸化したコラーゲンはより高い融解温度を有する。この範囲は、２５、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９及び４０を含むすべての中間的な部分範囲及び値を含む。
【００５２】
コドン改変。このプロセスは、コラーゲンをコードするポリヌクレオチド配列、例えば、天然に見出されるコラーゲンＤＮＡ配列などを改変して、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどの酵母で発現する組換えコラーゲンの量を改変するか、組換え酵母が分泌する組換えコラーゲンの量を改変するか、組換え酵母中の組換えコラーゲンの発現速度を改変するか、または組換えコラーゲン中のリジンまたはプロリン残基の水酸化度を改変することを含む。コドン改変はまた、同様の目的のためのヒドロキシラーゼなどの他のタンパク質に適用するか、または特定の細胞内もしくは細胞外区画にヒドロキシラーゼを標的化、例えば、組換えコラーゲン分子としてプロリンヒドロキシラーゼを同じ区画、例えば小胞体に標的化してもよい。
【００５３】
コドン選択は、ＲＮＡ二次構造への影響、転写及び遺伝子発現への影響、翻訳伸長速度への影響、及び／またはタンパク質フォールディングへの影響に基づいて行ってもよい。
【００５４】
コラーゲンまたはヒドロキシラーゼをコードするコドンは、組換えコラーゲンもしくはヒドロキシラーゼをコードするｍＲＮＡの二次構造を減少もしくは増加させるように改変してもよく、または冗長コドンを、酵母中のすべてのタンパク質コード配列に基づいて（例えば、コドンサンプリング）酵母宿主細胞が平均的に最も頻繁に使用するか、酵母中のすべてのタンパク質コード配列に基づいて（例えば、コドンサンプリング）、酵母宿主細胞が平均的に最も頻繁に使用しないコドンに、または酵母宿主細胞が豊富に発現するタンパク質に現れるか、もしくは酵母宿主細胞が分泌するタンパク質に現れる冗長コドンに置換する（例えば、その遺伝子を、高度に発現する遺伝子または発現宿主からの分泌性タンパク質をコードする遺伝子「のよう」にさせる高いコドン適合指数に基づくコドン選択）ように改変してもよい。
【００５５】
コドン改変は、タンパク質をコードする配列の全部または一部、例えば、コード配列の１０％の部分の、第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九または第十の部分、またはそれらの組み合わせの少なくとも１つに適用してもよい。これはまた、特定のアミノ酸をコードするコドン、または冗長コドンによってコードされるアミノ酸のすべてではないが一部をコードするコドンに選択的に適用してもよい。例えば、ロイシン及びフェニルアラニンのコドンのみを上記のようにコドン改変してもよい。２つ以上のコドンによってコードされるアミノ酸は、コドン表に記載されており、これは当該技術分野で周知であり、https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_codon_table（最終アクセス日２０１７年７月１３日）を参照として援用する。
【００５６】
コドン改変には、https://www.atum.bio/services/genegps（最終アクセス日２０１７年７月１３日）、https://www.idtdna.com/CodonOpt；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1523223/、またはhttps://en.wikipedia.org/wiki/DNA2.0Algorithm（それぞれを参照として援用する）に記載される、いわゆるコドン最適化法が含まれる。
【００５７】
コドン改変はまた、ｍＲＮＡ二次構造の形成を可能にするか、または二次構造を最小化または排除するようにコドンを選択することを含む。この一例は、リボソーム結合部位もしくは開始コドンにおける、またはその周辺における強い二次構造に、二次構造を排除、減少または弱めるようにコドン選択を行うことである。
【００５８】
コラーゲン断片。組換えコラーゲン分子には、トロポコラーゲン（三量体コラーゲン）を形成することができる天然コラーゲン分子のアミノ酸配列の断片、または天然のコラーゲンアミノ酸配列（もしくはそのフィブリル形成領域もしくは実質的に［Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ］ｎを含むセグメント）と少なくとも７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一もしくは類似のアミノ酸配列、例えば、登録番号ＮＰ＿００１０２９２１１．１（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/77404252、最終アクセス日２０１７年２月９日）、ＮＰ＿７７６９４５．１（https://_www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/27806257、最終アクセス日２０１７年２月９日）及びＮＰ＿００１０７０２９９．１  （https://_www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/116003881、最終アクセス日２０１７年２月９日）（参照として援用する）に記載されるＣｏｌ１Ａ１、Ｃｏｌ１Ａ２、及びＣｏｌ３Ａ１のアミノ酸配列を有する改変コラーゲン分子もしくはトランケート型コラーゲン分子が含まれ得る。
【００５９】
コラーゲンまたはヒドロキシラーゼをコードする遺伝子を短縮または改変して、配列を付加または除去してもよい。そのような改変を施して、ポリヌクレオチドまたはベクターのサイズをカスタマイズするか、発現させたタンパク質を小胞体または他の細胞内もしくは細胞外区画に標的化するか、またはコードするタンパク質の長さを調節してもよい。例えば、本発明者らは、プレ配列のみを含む構築物は、多くの場合、プレプロ配列全体を含む構築物よりも良好に機能することを見出した。同様に、プレ配列をＰ４ＨＢに融合させて、コラーゲンが局在化するＥＲにＰ４ＨＢを局在化させた。
【００６０】
コラーゲン及びヒドロキシラーゼのコード配列の改変。コラーゲンもしくはヒドロキシラーゼ、または他のタンパク質のポリヌクレオチドコード配列を、公知のアミノ酸配列に少なくとも７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、または１００％同一または類似し、未改変分子の本質的な特性、例えば、トロポコラーゲンを形成する能力、またはコラーゲン中のプロリンもしくはリジン残基を水酸化する能力を保持するタンパク質をコードするように改変してもよい。コラーゲン分子中のグリコシル化部位を、除去または付加してもよい。改変を施して、コラーゲン収量または酵母宿主細胞によるその分泌を促進するか、またはその構造的、機能的もしくは審美的特性を変化させてもよい。改変したコラーゲンまたはヒドロキシラーゼコード配列もまた、本明細書に記載のようにコドン改変してもよい。
【００６１】
用語「天然コラーゲン」、「天然ポリペプチド」または「天然ポリヌクレオチド」とは、例えば、アミノ酸残基の欠失、付加もしくは置換を伴わないか、またはポリヌクレオチドに関しては、例えば、コドン改変による変更のような、ヌクレオチドの欠失、挿入または置換による天然配列の改変を伴わない、自然界に見出されるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を指す。本明細書中に記載されるコラーゲン及び酵素のタイプには、それらの天然の形態ならびに天然コラーゲンまたは酵素の生物学的活性を保持する改変形態が含まれる。改変形態のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、対応する天然配列に対して、特定の程度の配列同一性または類似性を有することに基づいて同定してもよい。改変ポリヌクレオチド配列はまた、例えば、図１〜２０に図示するように、本明細書に記載するベクターのいずれか、またはこれらのベクターを構成するポリヌクレオチドエレメントのいずれかと７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性または類似性を有する配列を有する。
【００６２】
ＢＬＡＳＴＮを使用して、参照ポリヌクレオチド、例えば、コラーゲンをコードするポリヌクレオチド、本明細書に記載する１つ以上のヒドロキシラーゼ、またはシグナル、リーダーもしくは分泌ペプチドまたは本明細書に開示する任意の他のタンパク質に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、９９％または＜１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を同定してもよい。類似性が非常に高い配列を見出すために改変した代表的なＢＬＡＳＴＮ設定は、期待閾値１０及びワードサイズ２８、クエリー範囲での最大マッチ０、マッチ／ミスマッチスコア１／−２、ならびに線形のギャップコストを使用する。低複雑度領域は、フィルタリングまたはマスクしてもよい。標準ヌクレオチドＢＬＡＳＴのデフォルト設定は、https://_blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome（最終アクセス日２０１７年７月１３日）に記載されるとともに、これを参照として援用する。
【００６３】
ＢＬＡＳＴＰを用いて、参照アミノ酸配列、例えばコラーゲンのアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、９９％または＜１００％の配列同一性、または類似性を有するアミノ酸配列を、ＢＬＯＳＵＭ４５、ＢＬＯＳＵＭ６２またはＢＬＯＳＵＭ８０などの類似性マトリックスを用いて同定することができ、その場合、ＢＬＯＳＵＭ４５は密接に関連する配列に、ＢＬＯＳＵＭ６２は中範囲の配列に、及びＢＬＯＳＵＭ８０はより関連性の低い配列に対して使用することができる。別段の指示がない限り、類似性スコアはＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づくものとする。ＢＬＡＳＴＰを使用する場合、類似性の割合はＢＬＡＳＴＰ陽性スコアに基づき、配列同一性の割合はＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰ「同一性」は、同一の高スコア配列ペアにおける全残基の数及び割合を示し；ＢＬＡＳＴＰ「陽性」は、アラインメントスコアが正の値を有し、互いに類似している残基の数及び割合を示す。本明細書中に開示するアミノ酸配列との、これらの同一性もしくは類似性の程度、または同一性もしくは類似性の任意の中間の程度を有するアミノ酸配列は、本開示によって意図され、包含される。代表的なＢＬＡＳＴＰ設定は、期待閾値１０、ワードサイズ３、マトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２、及びギャップペナルティ１１（存在）及び１（エクステンション）ならびに条件付き組成スコアマトリックス補正を使用する。ＢＬＡＳＴＰのその他のデフォルト設定については、https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome（最終アクセス日２０１７年７月１３日）に記載されるとともに、これを利用可能な開示に参照として援用する。
【００６４】
本明細書に開示するポリペプチドに対して用いる用語「その誘導体」、「改変した配列」または「類似体」とは、生物学的に活性な分子のアミノ酸配列に対し、少なくとも７０、８０、９０、９５、または９９％同一であるか類似であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、誘導体は、天然の配列または以前に改変した配列のアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。誘導体は、天然の分子または以前に改変した分子のアミノ酸配列に対する付加、欠失、置換、またはそれらの組み合わせを含み得る。例えば、天然のコラーゲン配列に比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のプロリンまたはリジン残基を、誘導体に組み込むか、または欠失させてもよい。そのような選択を行って、組換えトロポコラーゲンまたはフィブリル化コラーゲンの弛緩度または緊密度を改変してもよい。
【００６５】
誘導体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜２５、または２６〜３０個のアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を有する変異ポリペプチドを含み得る。付加または置換には、非天然アミノ酸または修飾アミノ酸の使用も含まれる。誘導体には、ポリペプチドに対する化学修飾、例えば、システイン残基間の架橋または水酸化もしくはグリコシル化残基も含まれ得る。誘導体には、本明細書に開示するコラーゲン及び酵素を含むすべてのポリペプチドの誘導体が含まれる。一般的に、誘導体は、未修飾の親分子の少なくとも１つの生物学的活性を有し、したがって、酵素誘導体は、通常、親酵素の酵素活性を有し、コラーゲン誘導体は、親コラーゲンの少なくとも１つの構造的、化学的または生物学的特性を有するであろう。
【００６６】
バイオファブリケートレザー。本明細書に記載する方法によってフィブリル化及び架橋することができる任意の型のコラーゲン、トランケート型コラーゲン、未修飾または翻訳後修飾、またはアミノ酸配列改変コラーゲンを用いて、バイオファブリケート素材またはバイオファブリケートレザーを製造することができる。バイオファブリケートレザーは、実質的に均質なコラーゲン、例えばＩ型またはＩＩＩ型コラーゲンのみを含有してもよく、または２、３、４またはそれ以上の異なる種類のコラーゲンの混合物を含有してもよい。いくつかの実施形態では、組換えコラーゲン、例えばバイオファブリケートレザーの成分は、そのリジン、プロリン、またはリジン及びプロリン残基が水酸化されていない。他の実施形態では、組換えコラーゲン中のリジン、プロリン、またはリジン及びプロリン残基の少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５％または１００％（または部分範囲の任意の中間値）が水酸化される。
【００６７】
酵母株。本発明は、コラーゲンを産生するために酵母を利用する。好適な酵母としては、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせの酵母が挙げられるが、これらに限定されない。酵母は、改変または交雑してもよい。交雑酵母は、同じ種の異なる株、同じ属の異なる種、または異なる属の株の混合育種によって産生される。本発明に従って使用し得るいくつかの酵母株として、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｃｅｐｈａｌｏｃｅｒｅａｎａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｅｒｅｍｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｙａｎｍａｒｅｎｓｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｎａｋａｓｅｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｉａｍｅｎｓｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｈｅｅｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｂａｒｋｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｎｏｒｖｅｇｅｎｓｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｕｂｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｅｘｉｇｕａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、及びＰｉｃｈｉａ  ｃａｃｔｏｐｈｉｌａが挙げられる。
【００６８】
一実施形態では、本発明は、コラーゲン及び／またはヒドロキシラーゼ（複数可）をコードするコドン改変ポリヌクレオチドを発現するように改変した（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株を対象とする。有用なＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主株として、ＢＧ１０（野生型）（ＰＰＳ−９０１０株）；ＰＰＳ−９０１０のメタノール資化遅延型誘導体であるＢＧ１１，ａｏｘ１Δ（ＭｕｔＳ）（ＰＰＳ−９０１１株）、及びプロテアーゼ欠損株であるＢＧ１６，ｐｅｐ４Δ，ｐｒｂ４Δ（ＰＰＳ−９０１６株）が挙げられる。これらの株は公的に入手可能であり、https://www._atum.bio/products/cell-strainsのＡＴＵＭから入手してもよい。
【００６９】
酵母のポリペプチド分泌配列。いくつかの実施形態では、酵母宿主細胞によってコードされるポリペプチドを、酵母からのその分泌を促進するポリペプチド配列に融合する。例えば、ベクターは、分泌ペプチドをコードする配列に融合したコラーゲンのコード配列を含むキメラ遺伝子をコードし得る。この目的のために使用し得る分泌配列として、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  α接合因子プレプロ配列、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  α接合因子プレ配列、ＰＨＯ１分泌シグナル、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来α−アミラーゼシグナル配列、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ由来グルコアミラーゼシグナル配列、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来血清アルブミンシグナル配列、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｃｙｅｓ  ｍａｘｉａｎｕｓ由来イヌリナーゼシグナル配列、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来インベルターゼシグナル配列、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来キラータンパク質シグナル配列及びＧａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ由来リゾチームシグナル配列が挙げられる。当該分野で公知の他の分泌配列もまた、使用してもよい。
【００７０】
酵母プロモーター及びターミネーター。いくつかの実施形態では、コラーゲンまたはヒドロキシラーゼをコードするｍＲＮＡのプロモーター転写用のベクターに、以下の１つ以上の酵母プロモーターを組み込んでもよい。プロモーターは、当該技術分野で公知であり、ｐＡＯＸ１、ｐＤａｓ１、ｐＤａｓ２、ｐＰＭＰ２０、ｐＣＡＴ、ｐＤＦ、ｐＧＡＰ、ｐＦＤＨ１、ｐＦＬＤ１、ｐＴＡＬ１、ｐＦＢＡ２、ｐＡＯＸ２、ｐＲＫＩ１、ｐＲＰＥ２、ｐＰＥＸ５、ｐＤＡＫ１、ｐＦＧＨ１、ｐＡＤＨ２、ｐＴＰＩ１、ｐＦＢＰ１、ｐＴＡＬ１、ｐＰＦＫ１、ｐＧＰＭ１、及びｐＧＣＷ１４が挙げられる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、コラーゲンまたはヒドロキシラーゼをコードするｍＲＮＡの転写を終結させるために、酵母ターミネーター配列をベクターに組み込む。ターミネーターとして、ＡＯＸ１  ＴＴ、Ｄａｓ１  ＴＴ、Ｄａｓ２  ＴＴ、ＡＯＤ  ＴＴ、ＰＭＰ  ＴＴ、Ｃａｔ１  ＴＴ、ＴＰＩ  ＴＴ、ＦＤＨ１  ＴＴ、ＴＥＦ１  ＴＴ、ＦＬＤ１  ＴＴ、ＧＣＷ１４  ＴＴ、ＦＢＡ２  ＴＴ、ＡＤＨ２  ＴＴ、ＦＢＰ１  ＴＴ、及びＧＡＰ  ＴＴが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
ペプシン以外のペプチダーゼ。ペプシンを使用して、Ｎ末端及びＣ末端配列を除去することによって、コラーゲンからトロポコラーゲンへプロセシングしてもよい。コラゲナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、フィカイン、及びブロメラインを含むがこれらに限定されない他のプロテアーゼも、この目的のために使用してもよい。本明細書中で使用する場合、「安定なコラーゲン」とは、特定の濃度のペプシンまたは他のプロテアーゼへの曝露後に、コラーゲンの初期濃度の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％（または任意の中間値もしくは部分範囲）が依然として存在することを意味する。好ましくは、安定なコラーゲンの少なくとも７５％が、同じ条件下で同じ時間、処理した不安定なコラーゲンに比べて、ペプシンまたは別のプロテアーゼによる処理後に残存する。翻訳後修飾の前に、コラーゲンは水酸化されておらず、高濃度ペプシン（例えば、ペプシン：タンパク質比が１：２００以上）の存在下で分解する。
【００７３】
翻訳後修飾した後、コラーゲンをペプシンまたは別のプロテアーゼと接触させて、コラーゲンのＮ末端及びＣ末端プロペプチドを切断し、コラーゲンをフィブリル化することができる。水酸化コラーゲンは、非水酸化コラーゲンに比べてより良好な熱安定性を有し、高濃度ペプシン、例えばペプシン：総タンパク質比１：２５、１：２０、１：１５、１：１０、１：５〜１：１（または任意の中間値）のペプシンによる消化に耐性である。したがって、組換えコラーゲンの早発性のタンパク質分解を避けるために、水酸化コラーゲンを提供することが有用である。
【００７４】
別の発現系。コラーゲンはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ以外の他の種類の酵母細胞内で発現させることができ、例えば、別の酵母、メチロトローフ酵母または他の生物内で発現させてもよい。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、多数の発現ベクターのいずれかとともに使用することができる。一般的に使用される発現ベクターは、外来遺伝子を効率的に転写するために、酵母内での増殖のための２Ｐ複製起点及びＥ．ｃｏｌｉのＣｏｌ  Ｅ１起点を有するシャトルベクターである。そのような２Ｐプラスミドに基づくベクターの一般的な例はｐＷＹＧ４であり、このベクターは、２Ｐ  ＯＲＩ−ＳＴＢエレメント、ＧＡＬ１−１０プロモーター、及び２Ｐ  Ｄ遺伝子ターミネーターを有する。このベクターでは、発現させるポリペプチドの遺伝子を挿入するとともにＡＴＧ開始コドンを提供するためにＮｃｏｌクローニング部位を用いる。
【００７５】
別の発現ベクターはｐＷＹＧ７Ｌであり、このベクターは、インタクトな２αＯＲＩ、ＳＴＢ、ＲＥＰ１及びＲＥＰ２、ならびにＧＡＬ１−１０プロモーターを有し、ＦＬＰターミネーターを使用する。このベクターでは、コードされるポリヌクレオチドを、その５’末端をＢａｍＨＩまたはＮｃｏｌ部位に合わせてポリリンカーに挿入する。細胞壁を除去してカルシウム及びポリエチレングリコールによる処理の際にＤＮＡを取り込むスフェロプラストを生成するか、またはインタクトな細胞をリチウムイオンで処理することにより、挿入されたポリヌクレオチドを含むベクターをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに形質転換する。
【００７６】
あるいは、電気穿孔法によってＤＮＡを導入することができる。例えば、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、またはＬＥＵ２−Ｄなどの選択マーカー遺伝子とともに、ロイシン、トリプトファン、ウラシル、またはヒスチジンに対して栄養要求性である宿主酵母細胞を用いて、形質転換体を選択することができる。
【００７７】
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどのメチロトローフ酵母には多数のメタノール応答性遺伝子が存在し、それぞれの発現は、プロモーターとも呼ばれるメタノール応答調節領域によって調節される。そのようなメタノール応答性プロモーターのいずれも、本発明の実施に使用するのに適している。特定の調節領域の例として、ＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳ）、Ｐ４０プロモーター、及びＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のカタラーゼ遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
【００７８】
メチロトローフ酵母Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａもまた、使用してもよい。メタノールでの増殖は、メタノール代謝の重要な酵素、例えばＭＯＸ（メタノールオキシダーゼ）、ＤＡＳ（ジヒドロキシアセトンシンターゼ）、及びＦＭＨＤ（ギ酸脱水素酵素）の誘発をもたらす。これらの酵素は、全細胞タンパク質の最大３０〜４０％を構成し得る。ＭＯＸ、ＤＡＳ及びＦＭＤＨ産生をコードする遺伝子は、メタノール上での増殖によって誘導され、グルコース上での増殖によって抑制される強力なプロモーターによって調節される。これらのプロモーターのいずれかまたは３つすべてを用いて、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにおいて異種遺伝子を高レベルに発現させてもよい。したがって、一態様では、動物コラーゲンまたはその断片もしくは変異体をコードするポリヌクレオチドを、誘導性Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａプロモーターの調節下で発現ベクターにクローニングする。産物の分泌を所望する場合、そのポリヌクレオチドに、酵母内での分泌用シグナル配列をコードするポリヌクレオチドをインフレームで融合する。さらなる実施形態では、発現ベクターに、好ましくは、栄養要求性マーカー遺伝子、例えばＵＲＡ３またはＬＥＵ２を含ませ、これを用いて栄養要求性宿主の欠損を補完してもよい。
【００７９】
次いで、発現ベクターを使用して、当業者に公知の技術を用いてＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ宿主細胞を形質転換する。Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ形質転換の有用な特徴は、最大１００コピーの発現ベクターがゲノムへ自発的に組み込まれることである。ほとんどの場合、組み込まれたポリヌクレオチドは、ヘッドトゥーテール配置を示す多量体を形成する。組み込まれた外来ポリヌクレオチドは、非選択的条件下でさえ、いくつかの組換え株において有糸分裂的に安定であることが示されている。この高コピー数での組み込み現象は、このシステムの高い生産能力にさらに寄与するものである。
【００８０】
外来ＤＮＡを酵母ゲノムに挿入するか、またはエピソームを維持してコラーゲンを産生する。コラーゲンのＤＮＡ配列を、ベクターを介して酵母に導入する。外来ＤＮＡは、任意の非酵母宿主ＤＮＡであり、例えば、哺乳類、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ及び細菌由来のものが挙げられるが、これらに限定されない。酵母内でのコラーゲン産生に適切な哺乳類ＤＮＡとして、ウシ、ウマ、ブタ、カンガルー、ゾウ、サイ、カバ、クジラ、イルカ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、ヤギ、及びヒツジ（子ヒツジ）が挙げられるが、これらに限定されない。コラーゲン産生のための他のＤＮＡとして、爬虫類（例えば、ワニ、クロコダイル、カメ、イグアナ、トカゲ、ヘビ）、鳥類（例えば、ダチョウ、エミュー、モア）、恐竜、両生類、及び魚類（例えば、ティラピア、バス、サケ、マス、サメ、ウナギコラーゲン）及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【００８１】
ＤＮＡをベクター上に挿入するが、適切なベクターとして、ｐＨＴＸ１−ＢｉＤｉ−Ｐ４ＨＡ−Ｐｒｅ−Ｐ４ＨＢ  ｈｙｇｒｏ、ｐＨＴＸ１−ＢｉＤｉ−Ｐ４ＨＡ−ＰＨＯ１−Ｐ４ＨＢ  ｈｙｇｒｏ、ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１−ＢｉＤｉ−Ｐ４ＨＡ−Ｐｒｅｐｒｏ−Ｐ４ＨＢ  Ｇ４１８、ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１−ＢｉＤｉ−Ｐ４ＨＡ−ＰＨＯ１−Ｐ４ＨＢ  Ｈｙｇｒｏ、ｐＤＦ−Ｃｏｌ３Ａ１  改変ゼオシン、ｐＣＡＴ−Ｃｏｌ３Ａ１  改変ゼオシン、ｐＤＦ−Ｃｏｌ３Ａ１  改変ゼオシン及びＡＯＸ１ランディングパッド、ｐＨＴＸ１−ＢｉＤｉ−Ｐ４ＨＡ−Ｐｒｅ−Ｐｒｏ−Ｐ４ＨＢ  ｈｙｇｒｏが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、通常、ＤＮＡを直鎖状化するための少なくとも１つの制限酵素部位を含んでいた。
【００８２】
選択プロモーターは、組換えタンパク質の産生を向上させる場合があり、これをコラーゲンまたはヒドロキシレートをコードする配列を有するベクターに含めてもよい。本発明での使用に適したプロモーターとして、ＡＯＸ１メタノール誘導プロモーター、ｐＤＦ抑制解除プロモーター、ｐＣＡＴ抑制解除プロモーター、Ｄａｓ１−Ｄａｓ２メタノール誘導性二方向性プロモーター、ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーター、ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーター及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。適切なメタノール誘導性プロモーターとして、ＡＯＸ２、Ｄａｓ１、Ｄａｓ２、ｐＤＦ、ｐＣＡＴ、ｐＰＭＰ２０、ｐＦＤＨ１、ｐＦＬＤ１、ｐＴＡＬ２、ｐＦＢＡ２、ｐＰＥＸ５、ｐＤＡＫ１、ｐＦＧＨ１、ｐＲＫＩ１、ｐＲＥＰ２及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
オールインワンベクターを含む本発明によるベクターでは、酵母に組み込んだベクター中で利用する各オープンリーディングフレームの末端にターミネーターを配置してもよい。ターミネーターのＤＮＡ配列をベクターに挿入する。ベクターを複製するためには、複製を開始するための複製起点が必要である。複製起点のＤＮＡ配列をベクターに挿入する。酵母ゲノムとの相同性を有する１つ以上のＤＮＡ配列をベクターに組み込んで、酵母ゲノムへの組換え及び組み込みを促進するか、または酵母細胞に形質転換したベクターを安定化することができる。
【００８４】
本発明によるベクターはまた、通常、形質転換に成功した酵母細胞を選択するために使用する少なくとも１つの選択マーカーを含む。マーカーは、抗生物質耐性に関連している場合があり、マーカーはまた、特定のアミノ酸（栄養要求性マーカー）の存在下または非存在下での増殖能力に関連している場合がある。適切な栄養要求性マーカーには、ＡＤＥ、ＨＩＳ、ＵＲＡ、ＬＥＵ、ＬＹＳ、ＴＲＰ及びそれらの組み合わせが含まれていたが、これらに限定されない。組換えベクターを含む酵母細胞の選択を提供するために、選択マーカー用の少なくとも１つのＤＮＡ配列をベクターに組み込む。
【００８５】
本発明のいくつかの実施形態では、組換え酵母で発現するコラーゲンもしくはコラーゲン様タンパク質中のリジン及びプロリンなどのアミノ酸残基は、水酸化されていない場合があるか、または対応する天然もしくは未修飾コラーゲンもしくはコラーゲン様タンパク質に比べて水酸化度が低いか、もしくは高い場合がある。他の実施形態では、コラーゲンまたはコラーゲン様タンパク質のアミノ酸残基は、グリコシル化されていない場合があるか、または対応する天然もしくは未修飾コラーゲンもしくはコラーゲン様タンパク質に比べてグリコシル化度が低いか、もしくは高い場合がある。
【００８６】
水酸化コラーゲンは、非水酸化または過少水酸化コラーゲン（＜３２℃）よりも高い融解温度（＞３７℃）を有し、また、非水酸化または過少水酸化コラーゲンに比べて良好にフィブリル化し、素材としての使用に関してより強力でより耐久性の高い構造を形成する。コラーゲン調製物の融解温度を利用してその水酸化度を評価してもよく、融解温度は、例えば、３０〜４０℃の範囲、ならびにすべての中間値、例えば、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、及び４０℃であり得る。過少水酸化コラーゲンは、靴やバッグなどの高耐久性の物品には適さないゼリーまたはゼラチン様素材のみを形成し得るが、より軟質性の、またはより吸収性の製品に配合することができる。
【００８７】
コラーゲン組成物中のコラーゲンは均質であってもよく、１００％ウシＩ型コラーゲンまたは１００％ＩＩＩ型ウシコラーゲンなどの単一タイプのコラーゲン分子を含有してもよく、または異なる種類のコラーゲン分子もしくはコラーゲン様分子、例えば、ウシＩ型及びＩＩＩ型分子の混合物を含有してもよい。そのような混合物は、個々のコラーゲンまたはコラーゲン様タンパク質の成分の＞０％、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９または＜１００％（または任意の中間値もしくは部分範囲）を含み得る。この範囲にはすべての中間値が含まれる。例えば、コラーゲン組成物は、３０％のＩ型コラーゲンと７０％のＩＩＩ型コラーゲンを含有してもよく、または３３．３％のＩ型コラーゲン、３３．３％のＩＩ型コラーゲン、及び３３．３％のＩＩＩ型コラーゲンを含有してもよく、その場合、コラーゲンの割合は、組成物中のコラーゲンの全質量またはコラーゲン分子の分子の割合に基づく。
【００８８】
上記の改変した（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）酵母細胞を利用して、コラーゲンを産生することができる。そのために、細胞を発酵室内の培地に入れ、１２時間〜１週間の範囲の期間、調節されたｐＨ条件下で溶存酸素及び炭素源を供給する。適切な培地として、限定するものではないが、緩衝グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）、緩衝メタノール複合培地（ＢＭＭＹ）、及び酵母抽出ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）が挙げられる。酵母細胞内でコラーゲンを産生することから、コラーゲンを単離するために、分泌性酵母株を使用するか、酵母細胞を溶解してコラーゲンを遊離させる必要がある。その後、遠心分離、沈殿、濾過、クロマトグラフィーなどの従来技術によってコラーゲンを精製してもよい。
【００８９】
別の実施形態では、本発明は、水酸化及び非水酸化コラーゲンの製造に有用な酵母宿主中のキメラＤＮＡ配列を提供する。キメラＤＮＡ配列は、未改変ＤＮＡ配列と改変ＤＮＡ配列を組み合わせることによって生成する。様々な塩基対の位置で未改変ＤＮＡ配列を切断してもよい。改変ＤＮＡ配列もまた、対応する塩基対の位置で切断してもよい。未改変の切断と修飾の切断を、前方から後方へ、及び後方から前方へ組み合わせてもよい。キメラＤＮＡ配列を、プロモーター、ベクター、ターミネーター及び上記の選択マーカーと組み合わせて宿主に挿入し、水酸化及び非水酸化コラーゲンを産生することができる酵母を生成してもよい。
【００９０】
最適化及び非最適化ＤＮＡの割合を、配列の全長に基づいて計算してもよい。キメラ株は、Ｎ末端での最適化ＤＮＡとＣ末端での非最適化ＤＮＡとの組み合わせであってもよい。最適化ＤＮＡの割合は、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０〜９９％の範囲（または任意の中間値もしくは部分範囲）であってもよく、例えば、１０〜４０％及び６０〜９０％の範囲であってもよい。あるいは、キメラ株は、Ｎ末端の非最適化ＤＮＡとＣ末端の最適化ＤＮＡとの組み合わせであってもよい。非最適化ＤＮＡの割合は、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０〜９９％の範囲（または任意の中間値もしくは部分範囲）であってもよく、例えば、１０〜４０％及び６０〜９０％の範囲であってもよい。例えば、１３３１位で切断した１４８６塩基対を有するＤＮＡ配列は、０〜１３３１の最適化ＤＮＡ及び１３３２〜１４８６の非最適化ＤＮＡを提供し、そのキメラは９０％が最適化されている。最適化されたポリヌクレオチド配列は、コラーゲン分子内のＣ末端、Ｎ末端、または他の場所でコラーゲンのセグメントをコードしてもよく、例えば、コラーゲン分子の最初の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、もしくは９０％を、またはコラーゲン分子の最後の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、もしくは９０％をコードしてもよい。
【００９１】
あるいは、キメラ株は、ともに融合した最適化及び非最適化ＤＮＡの２つ、３つまたは４つ以上のセクションから構成されてもよい。例えば、１，５００塩基対を有するＤＮＡ配列は、０〜５００までの最適化ＤＮＡセクション、５０１〜１，０００までの非最適化ＤＮＡセクション、及び１００１〜１５００までの最適化ＤＮＡセクションを有していてもよい。
【００９２】
本明細書に開示するコラーゲンにより、バイオファブリケートレザーを製造することができる。コラーゲンをバイオファブリケートレザーに変換する方法は、同時係属中の特許出願である米国特許出願第１５／４３３５６６号、第１５／４３３６５０号、第１５／４３３６３２号、第１５／４３３６９３号、第１５／４３３７７７号、第１５／４３３６７５号、第１５／４３３６７６号及び第１５／４３３８７７号に記載されており、それらの開示内容は参照として本明細書に援用される。
【００９３】
発明の実施形態
本発明の非限定的な実施形態として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
ウシコラーゲン、例えばＩ型もしくはＩＩＩ型コラーゲン、またはコラーゲン変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチド、ならびにコードされたコラーゲン中のプロリン、リジン、またはリジン及びプロリン残基を水酸化する少なくとも１つの酵素をコードするポリヌクレオチド。いくつかの実施形態では、天然コラーゲンもしくはヒドロキシラーゼポリヌクレオチド配列の全部もしくは一部について、ポリヌクレオチドをコドン改変するか、または酵母プロモーター配列などの発現調節エレメントを組み込んで宿主酵母細胞内でのコラーゲンまたはヒドロキシラーゼの発現を促進する。酵母内で発現する場合、改変したポリヌクレオチドは、同一の条件下で発現させた同じコラーゲン配列をコードする未改変ポリペプチドに比べて、コラーゲンの発現を１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００または＞１００重量％高め得る。
【００９４】
いくつかの実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５倍またはそれ以上のコラーゲンまたはヒドロキシラーゼタンパク質の発現を達成し得る。いくつかの実施形態では、ＩＩＩ型コラーゲンまたはコラーゲン変異体を発現させ、その場合、変異体は、配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一のアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、ウシコラーゲンは、Ｉ型ウシコラーゲン、またはα１（Ｉ）鎖及びα２（Ｉ）鎖の両方をコードするか、または天然のＩ型コラーゲン鎖と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一である１つ以上のコラーゲン鎖をコードするコラーゲン変異体である。
【００９５】
上記のウシコラーゲンをコードするポリヌクレオチドは、プロリル４−ヒドロキシラーゼのＰ４ＨＡ及びＰ４ＨＢサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列もしくはセグメント、またはそれらと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一である酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、プロリル−３−ヒドロキシラーゼ、リジルヒドロキシラーゼ、及び／またはリジルオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列もしくはセグメント、またはそれらと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一である酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２のＩＩＩ型ウシコラーゲンアミノ酸配列と少なくとも７５〜９９％同一であるポリペプチド、及びそれぞれ配列番号５４及び５２と少なくとも７５〜９９％同一であるＰ４ＨＡ及びＰ４ＨＢサブユニットを有するヒドロキシラーゼをコードするセグメントをコードし得る。
【００９６】
本発明のポリヌクレオチド配列は、酵母で機能するポリペプチド分泌配列をさらにコードしてもよく、それは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲンまたは本明細書に記載の他のいくつかのコラーゲンであってもよいコラーゲンをコードするポリヌクレオチド配列に、通常、隣接して配置される。
【００９７】
本発明のポリヌクレオチド配列に、さらに、コラーゲン、またはヒドロキシラーゼなどの酵素の発現を促進または調節するプロモーターまたは他の配列を含めてもよく、例えば、ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーター、ＤＮ  ｐＤＦ抑制解除プロモーター、ｐＣＡＴ抑制解除プロモーター、Ｄａｓ１−Ｄａｓ２メタノール誘導性二方向性プロモーター、ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーター、ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーター、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含めてもよい。
【００９８】
本発明のポリヌクレオチドにはまた、配列番号２３及び２４によってそれぞれコードされるようなαファクタープレ配列またはαファクタープレプロ配列などの他の要素を含めてもよい。いくつかの実施形態では、そのような配列を、酵素、例えば、Ｐ４ＨＡ（配列番号５４）もしくはＰ４ＨＢ（配列番号５２）などの本明細書に記載するヒドロキシラーゼまたは他の酵素を発現するポリヌクレオチド配列か、またはそれらと少なくとも７５、８０、９０、もしくは９５〜１００％同一である変異型酵素に作動可能に連結してもよい。
【００９９】
上記に開示したポリヌクレオチド配列を有するベクターは、本発明のさらなる実施形態を表す。これらには、本明細書に開示する任意のポリヌクレオチド配列、例えば、コラーゲン、トランケート型コラーゲン、コラーゲン変異体、及び酵素、例えば、本明細書に記載するヒドロキシラーゼまたは他の酵素をコードするキメラポリヌクレオチド配列を有するベクターが含まれる。いくつかの実施形態では、コラーゲンをコードする配列及びヒドロキシラーゼまたは他の酵素をコードする配列は、同じベクター上に存在し；他の実施形態では異なるベクター上に存在し得る。
【０１００】
本発明はまた、本明細書に記載するベクターを保有する宿主細胞、例えば酵母宿主細胞を企図する。いくつかの実施形態では、これらのベクターを、非酵母細胞、例えば細菌宿主細胞などで産生し、その後に、コラーゲンまたは水酸化コラーゲンを発現させる酵母宿主細胞、例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｕｓ宿主細胞に形質転換してもよい。
【０１０１】
本発明の別の態様は、プロリン残基の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０％未満が水酸化された組換えコラーゲンの製造方法に関する。本方法は、コラーゲンを産生するのに適した時間及び条件下で、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｕｓまたは他の適切な酵母宿主細胞（または真核生物宿主細胞）を培養し、コラーゲンを回収することを含み；前記ベクターは、プロリン残基の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０％以下を水酸化する量もしくは形態のプロリル−４−ヒドロキシラーゼを発現するように構成されている。本発明の別の実施形態は、プロリン残基の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０％未満が水酸化された組換えＩＩＩ型コラーゲンの製造方法であって、ＩＩＩ型コラーゲンを産生するのに適した時間及び条件下で、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｕｓまたは他の適切な酵母宿主細胞を培養し、コラーゲンを回収することを含み；前記ベクターは、プロリン残基の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０％以下を水酸化する量のプロリル−４−ヒドロキシラーゼを発現するように構成される。コラーゲン及びヒドロキシラーゼの両方をコードするオールインワンベクターは、例えば、ヒドロキシラーゼに誘導性または温度感受性プロモーターを用いることによって機能性ヒドロキシラーゼがほとんどまたはまったく発現しないように構成してもよい。
【０１０２】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書に記載するベクターを保有するＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｕｓまたは他の適切な酵母宿主細胞を、コラーゲンを産生するのに適した時間及び条件下で培養し、コラーゲンを回収することによって、プロリン残基の＞１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５または＞９５％を水酸化した組換えコラーゲンを製造する方法であり；前記ベクターは、コラーゲン中のプロリン残基の＞１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは＞９０％またはそれ以上を水酸化する量または形態のプロリル−４−ヒドロキシラーゼを発現するように構成される。培養時間及び条件ならびにヒドロキシラーゼの量または活性を用いて、水酸化の量を調節してもよい。本発明の別の実施形態は、プロリン残基の５０、６０、７０、８０、９０、９５、または＞９５％を水酸化した組換えＩＩＩ型コラーゲンの製造方法であって、本発明によるベクターを保有するＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｕｓ宿主細胞を、ＩＩＩ型コラーゲンを産生するのに適した時間及び条件下で培養し、ＩＩＩ型コラーゲンを回収することを含み；前記ベクターは、プロリン残基の５０、６０、７０、８０、９０もしくは＞９０％またはそれ以上を水酸化する量または形態のプロリル−４−ヒドロキシラーゼを発現するように構成される。培養時間及び条件ならびにヒドロキシラーゼの量または活性を用いて、水酸化の量を調節してもよい。
【０１０３】
本発明の別の実施形態は、プロリン残基の５０、６０、７０、８０、９０、９５もしくは＞９５％またはそれ以上を水酸化した組換えコラーゲンの製造方法に関し、本方法は、本発明のベクターを保有するＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｕｓまたは他の適切な酵母宿主細胞を、コラーゲンを産生するのに適した時間及び条件下で培養し、コラーゲンを回収することを含み；前記ベクターは、プロリン残基の５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは＞９５％またはそれ以上を水酸化する量のプロリル−４−ヒドロキシラーゼを発現するように構成される。培養時間及び条件ならびにヒドロキシラーゼの量または活性を用いて、水酸化の量を調節してもよい。
【０１０４】
本発明の別の実施形態は、プロリン残基の５０、６０、７０、８０、９０、９５、または＞９５％を水酸化した組換え型ＩＩＩ型コラーゲンの製造方法に関し、本方法は、本発明のベクターを保有するＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｕｓまたは他の酵母宿主細胞を、コラーゲンを産生するのに適した時間及び条件下で培養し、コラーゲンを回収することを含み；前記ベクターは、プロリン残基の５０、６０、７０、８０、９０、９５、または＞９５％を水酸化する量のプロリル−４−ヒドロキシラーゼを発現するように構成される。培養時間及び条件ならびにヒドロキシラーゼの量または活性を用いて、水酸化の量を調節してもよい。
【０１０５】
本発明の別の実施形態は、プロリン残基の７５、８０、９０、９５、または＞９５％を水酸化した組換えコラーゲンの製造方法に関し、本発明のベクターを保有するＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｕｓまたは他の酵母宿主細胞を、コラーゲンを産生するのに適した時間及び条件下で培養し、コラーゲンを回収することを含み；前記ベクターは、プロリン残基の７５、８０、９０、９５、または＞９５％を水酸化する量のプロリル−４−ヒドロキシラーゼを発現するように構成される。
【０１０６】
本発明のさらなる実施形態は、プロリン残基の７５、８０、９０、９５、または＞９５％を水酸化した組換えＩＩＩ型コラーゲンの製造方法であって、本方法は、本発明のベクターを保有するＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｕｓまたは他の酵母宿主細胞を、コラーゲンを産生するのに適した時間及び条件下で培養し、コラーゲンを回収することを含み；前記ベクターは、プロリン残基の７５、８０、９０、９５、もしくは＞９５％またはそれ以上を水酸化する量のプロリル−４−ヒドロキシラーゼを発現するように構成される。
【０１０７】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載の方法のいずれか１つによって作製した組換えコラーゲンである。そのような組換えコラーゲンは、プロリンまたはリジン残基のいずれも水酸化されていなくてもよく、またはプロリン残基、リジン残基、もしくはプロリン及びリジン残基の＞０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％が水酸化されていてもよい。
【０１０８】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書に記載する組換えコラーゲンを含むか、または本明細書に記載する方法によって作製する、バイオファブリケートレザーまたは他の素材である。
【０１０９】
別の実施形態では、本発明は、水酸化及び非水酸化コラーゲンの製造に有用な酵母宿主細胞中のキメラＤＮＡ配列を提供する。キメラＤＮＡ配列は、未改変ＤＮＡ配列と改変ＤＮＡ配列を組み合わせることによって生成する。様々な塩基対の位置で未改変ＤＮＡ配列を切断してもよい。改変ＤＮＡ配列もまた、対応する塩基対の位置で切断してもよい。未改変の切断と修飾の切断を、前方から後方へ、及び後方から前方へ組み合わせてもよい。キメラＤＮＡ配列を、プロモーター、ベクター、ターミネーター及び上記の選択マーカーと組み合わせて宿主に挿入し、水酸化及び非水酸化コラーゲンを産生することができる酵母を生成してもよい。
【０１１０】
本発明の他の実施形態には、以下が含まれるが、これらに限定されない：
非水酸化コラーゲンを産生するための遺伝子改変酵母株であって、（ｉ）酵母株；及び（ｉｉ）コラーゲンのＤＮＡ配列；コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；コラーゲンターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列、選択マーカー用のプロモーターのＤＮＡ配列；選択マーカー用のターミネーターのＤＮＡ配列；細菌用のもの、及び酵母用のものから選択される複製起点のＤＮＡ配列；及び酵母ゲノムに対して相同性を有するＤＮＡ配列を有するベクターを含み、ベクターは酵母株に挿入されている、前記遺伝子改変酵母株。本実施形態では、酵母株は、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択してもよい。上記の実施形態では、ベクターは、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるコラーゲンのＤＮＡ配列を有し得る。本実施形態では、コラーゲンのＤＮＡ配列は、天然コラーゲンＤＮＡ、改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）コラーゲンＤＮＡ、及びコドン改変コラーゲンＤＮＡから選択してもよい。
【０１１１】
本実施形態では、プロモーターのＤＮＡ配列は、ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーターのＤＮＡ、ｐＤＦ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、ｐＣＡＴ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、Ｄａｓ１−Ｄａｓ２メタノール誘導性二方向性プロモーターのＤＮＡ、ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ、ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及びそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。本実施形態における選択マーカーは、抗生物質耐性用のＤＮＡ及び栄養要求性マーカー用のＤＮＡからなる群から選択してもよく、例えば、抗生物質耐性は、ハイグロマイシン、ゼオシン、ジェネテシン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗生物質に対しての耐性である。
【０１１２】
上記の実施形態に記載する酵母株に、電気穿孔法、化学的形質転換、及び接合からなる群から選択される方法によって酵母に挿入したベクターを保有させてもよい。
【０１１３】
本発明の別の実施形態は、非水酸化コラーゲンの製造方法に関し、本方法は、（ｉ）上記の実施形態に記載する酵母株を提供し；（ｉｉ）その株を、コラーゲンを産生するのに十分な時間、培地中で増殖させることを含む。本方法では、酵母を、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択してもよく、及び／または培地を、緩衝グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）、緩衝メタノール複合培地（ＢＭＭＹ）、及び酵母抽出ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）からなる群から選択してもよい。酵母株を、２４、４８、もしくは７２の範囲または任意の中間時間の期間、培養または育成してもよい。本方法では、酵母株は、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるコラーゲンのＤＮＡ配列を発現し得る。本方法では、酵母株におけるプロモーターのＤＮＡ配列は、ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及びｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択してもよく；及び／または選択マーカーは、抗生物質耐性ＤＮＡ用のＤＮＡ及び栄養要求性マーカー用のＤＮＡからなる群から選択してもよい。
【０１１４】
本発明の別の実施形態は、水酸化コラーゲンを産生する遺伝子改変酵母株であって、（ｉ）酵母株及び（ｉｉ）コラーゲンのＤＮＡ配列；コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；ターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列、選択マーカーのプロモーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのターミネーターのＤＮＡ配列；細菌及び／または酵母の複製起点のＤＮＡ配列；酵母ゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列を有するベクターであって；ベクターは酵母株に挿入されている、前記ベクター；ならびに（ｉｉｉ）Ｐ４ＨＡ１のＤＮＡ配列；Ｐ４ＨＢのＤＮＡ配列；及びプロモーターの少なくとも１つのＤＮＡ配列を有する第二のベクターを有し、ベクターは酵母株に挿入されている、前記第二のベクターを含む、前記遺伝子改変酵母株である。本実施形態では、酵母株を、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択してもよく；及び／または酵母株は、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるコラーゲンのＤＮＡ配列を発現し得る。本方法のいくつかの実施形態では、コラーゲンのＤＮＡ配列は、天然のコラーゲンＤＮＡ、改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）コラーゲンＤＮＡ及び改変（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）コラーゲンＤＮＡから選択され；及び／またはプロモーターのＤＮＡ配列は、ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーターのＤＮＡ、ｐＤＦ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、ｐＣＡＴ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、Ｄａｓ１−Ｄａｓ２メタノール誘導性二方向性プロモーターのＤＮＡ、ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ、ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。酵母株において、プロモーターのＤＮＡ配列は、ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及びｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択することができ；及び／または選択マーカーのＤＮＡ配列は、抗生物質耐性ＤＮＡ用のＤＮＡ及び栄養要求性マーカー用のＤＮＡからなる群から選択することができる。抗生物質耐性遺伝子またはＤＮＡのいくつかの例として、ハイグロマイシン、ゼオシン、ジェネテシン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗生物質に対する耐性が挙げられるが、他の公知の抗生物質耐性遺伝子もまた使用してよい。ベクターを、電気穿孔法、化学的形質転換、及び接合からなる群から選択される方法によって酵母株に挿入してもよい。
【０１１５】
本発明の別の実施形態は、（ｉ）本明細書に記載する酵母株を提供し、（ｉｉ）その株を、コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で増殖させることを含む、水酸化コラーゲンの製造方法である。酵母株は、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択することができ；酵母株で発現するコラーゲンＤＮＡは、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲンまたはそれらの組み合わせをコードするＤＮＡからなる群から選択してもよく；及び／または培地は、ＢＭＧＹ、ＢＭＭＹ、及びＹＰＤからなる群から選択される。酵母株は、約２４、４８または７２時間の範囲の期間、培養または育成してもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターのＤＮＡは、ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及びｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択され；及び／または選択マーカー用のＤＮＡは、抗生物質耐性ＤＮＡ用のＤＮＡ及び栄養要求性マーカー用のＤＮＡからなる群から選択される。
【０１１６】
本発明の別の実施形態は、（ｉ）発現した場合にコラーゲンを産生するＤＮＡ、プロモーター、及びターミネーター；（ｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＢからなる群から選択される１つ以上の水酸化酵素の少なくとも１つのＤＮＡ；（ｉｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、選択マーカー用の少なくとも１つのＤＮＡ；（ｉｖ）酵母及び細菌用の複製起点の少なくとも１つのＤＮＡ；（ｖ）ゲノムへの組込みのために酵母ゲノムと相同性を有する１つ以上のＤＮＡ；ならびに（ｉｖ）上記のＤＮＡ内の５’、３’、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される位置にモジュラー式のクローニングを可能にする１つ以上の制限酵素部位を含む、オールインワンベクターに関する。いくつかの実施形態では、オールインワンベクターは、発現した場合に、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるコラーゲンを産生する１つ以上のＤＮＡ配列を有する。
【０１１７】
オールインワンベクターは、ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及びｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択されるプロモーターを有してもよく；抗生物質耐性及び／または栄養要求性マーカーなどの選択マーカーの１つ以上のＤＮＡ配列を含み得る。抗生物質耐性マーカーとして、ハイグロマイシン、ゼオシン、ジェネテシン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗生物質に対する耐性が挙げられる。
【０１１８】
本発明の別の実施形態は、キメラコラーゲンＤＮＡの全長に基づいて１０、２０、３０〜４０％または６０、７０、８０〜９０％の最適化されたＤＮＡを含むキメラコラーゲンＤＮＡ配列に関する。本キメラコラーゲンＤＮＡ配列では、最適化されたＤＮＡをＣ末端から始めることができ、または最適化されたＤＮＡをＮ末端から始めることができる。
【０１１９】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載するキメラコラーゲンのＤＮＡ配列；コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；ターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列；選択マーカーのプロモーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのターミネーターのＤＮＡ配列；細菌及び／または酵母用の複製起点のＤＮＡ配列；及び酵母ゲノムとの相同性を有するＤＮＡ配列を有するベクターを保有するコラーゲン産生酵母株に関する。本実施形態において、酵母株は、ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及びｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択されるプロモーターのＤＮＡを含み得る。酵母株は、少なくとも１つの抗生物質耐性をコードするＤＮＡ及び少なくとも１つの栄養要求性マーカーをコードするＤＮＡからなる群から選択される選択マーカーを含み得る。
【０１２０】
本発明の別の実施形態は、（ｉ）本明細書に記載する酵母株を提供し；（ｉｉ）その株を、コラーゲンを産生するのに十分な時間、培地中で増殖させることを含む、水酸化コラーゲンの製造方法に関する。本実施形態では、酵母株を、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択することができ；培地は、緩衝グリセロール複合培地、緩衝メタノール複合培地、及び酵母抽出ペプトンデキストロースからなる群から選択してもよく；培養または育成時間は、２４、４８または７２時間の範囲であり得る。本方法のいくつかの実施形態では、酵母株は、ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及びｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択されるプロモーターを含む。本方法の他の実施形態では、酵母株は、抗生物質耐性をコードするＤＮＡ及び栄養要求性マーカーをコードするＤＮＡからなる群から選択される少なくとも１つの選択マーカーを含む。
【実施例】
【０１２１】
以下の非限定的な実施例は、本発明の例示である。本発明の範囲は、これらの実施例に記載する詳細に限定されない。
【０１２２】
実施例１
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＢＧ１０（野生型）はＡＴＵＭ（以前のＤＮＡ２．０）から入手した。コラーゲン配列を含むＭＭＶ６３（配列番号１１）（「配列番号９」）ＤＮＡ配列及びベクターを野生型Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓに挿入し、ＰＰ２８株を生成した。ＭＭＶ６３をＰｍｅＩで消化し、ＰＰ１（野生型Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株）に形質転換してＰＰ２８を生成した。ベクターＭＭＶ６３を図１に示す。
【０１２３】
天然型ＩＩＩウシコラーゲンをコードするＤＮＡを配列決定し（配列番号１）、配列を、ポリメラーゼ連鎖反応「ＰＣＲ」プロトコールにより増幅して直鎖状ＤＮＡ配列を作製した。
【０１２４】
Ｐｉｃｈｉａ電気穿孔法プロトコール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（商標）Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ＃１６５２６６０）を用いてＤＮＡ２．０由来の野生型Ｐｉｃｈｉａ酵母細胞（ＰＰ１）にＤＮＡを形質転換した。酵母細胞をＰ４ＨＡ／Ｂ同時発現プラスミドで形質転換し、形質転換体（例えば、クローン＃４）をＨｙｇｒｏプレート（２００ｕｇ／ｍｌ）上で選択した。
【０１２５】
クローン＃４の単一コロニーを１００ｍｌのＹＰＤ培地に播種し、２１５ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。翌日、培養物のＯＤ６００が約３．５（約３〜５×１０７細胞／ＯＤ６００）に達した時点で、新鮮なＹＰＤでＯＤ６００が約１．７になるように希釈し、２１５ｒｐｍで振盪しながら３０℃でさらに１時間増殖させた。
【０１２６】
次いで、細胞を３，５００ｇで５分間遠心分離し；水で１回洗浄し、１０ｍｌの、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＬｉＡｃ、１０ｍＭ  ＤＴＴ（新鮮なものを添加）、及び０．６Ｍソルビトール中に再懸濁した。
【０１２７】
各形質転換について、８×１０８個の細胞のアリコートを、８ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＬｉＡｃ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．６Ｍソルビトールに入れ、室温で３０分間インキュベートした。
【０１２８】
細胞を５０００ｇで５分間スピンダウンし、１．５ｍｌの氷冷した１Ｍソルビトールで３回洗浄し、８０ｕｌの氷冷した１Ｍソルビトール中に再懸濁した。
【０１２９】
様々な量（約５ｕｇ）の直鎖状化ＤＮＡを細胞に添加し、ピペッティングにより混合した。
【０１３０】
細胞及びＤＮＡ混合物（８０〜１００ｕｌ）を０．２ｃｍキュベットに加え、Ｐｉｃｈｉａのプロトコールに従って１５００ｖ、２５ｕＦ、及び２００Ωでパルスした。
【０１３１】
次いで、それらを直ちにＹＰＤ及び１Ｍソルビトール（１：１）の１ｍｌ混合物に移し、３０℃で＞２時間インキュベートした。
【０１３２】
細胞を異なる密度でプレーティングした。
【０１３３】
単一のコロニーを２４ディープウェルプレート中の２ｍＬのＢＭＧＹ培地に播種し、９００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で少なくとも４８時間増殖させた。得られた細胞を、以下の手順に従って、細胞溶解、ＳＤＳ−ｐａｇｅ及びペプシンアッセイを用いてコラーゲンについて試験した。
【０１３４】
酵母細胞を、Ｑｉａｇｅｎ  ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒを用いて３０Ｈｚの速度で連続的に１分間、１×溶解緩衝液中で溶解した。溶解緩衝液は、２．５ｍｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（終濃度５０ｍＭ）；４３８．３ｍｇのＮａＣｌ；終濃度１５０ｍＭ；５ｍｌのグリセロール；終濃度１０％；０．５ｍｌのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；終濃度１％；及び４２ｍｌのＭｉｌｌｉｐｕｒｅ水から作製した。
【０１３５】
溶解した細胞を、卓上遠心分離機で、２，５００ｒｐｍ、１５分間、遠心分離した。上清を残し、ペレットを捨てた。
【０１３６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。上清、分子量マーカー、陰性対照及び陽性対照に対し、２−メルカプトエタノール存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。電気泳動後、ゲルを除去し、クーマシーブルーで染色し、次いで水中で脱染した。
【０１３７】
ペプシンアッセイ。ペプシンアッセイを以下の手順で実施した：
ペプシン処理の前に、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのプロトコールに従って各試料の全タンパク質を得るためのＢＣＡアッセイを実施した。すべての試料について、全タンパク質量を、０．５ｍｇ／ｍｌまたはそれを上回る最低濃度に正規化した。
１００ｕＬの試料の溶解物をマイクロ遠心チューブに入れた。以下を含有するマスターミックスを作製した：３７％ＨＣ１（１００μＬ当たり０．６μＬの酸）、及び
脱イオン水中の１ｍｇ／ｍＬのペプシンストック。添加したペプシンの量は、ペプシン：全タンパク質の比で１：２５（重量：重量）であった。
【０１３８】
ペプシンを添加した後、試料をピペットで３回混合し、ペプシン反応を生じさせるために室温で１時間インキュベートした。１時間後、β−メルカプトエタノールを含有するＬＤＳローディングバッファーを１：１容量で各試料に添加し、７０℃で７分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を１４，０００ｒｐｍで１分間遠心し、濁りを除去した。
【０１３９】
次に、試料の上部から１８ｕＬを、ＴＡＥ緩衝液を用いて３〜８％ＴＡＥに添加し、１５０Ｖで１時間１０分の間、ゲル上に流した。下記の表１はその結果を報告する。
【０１４０】
実施例２
以下の変更を加えたうえで、実施例１を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した：Ｐｉｃｈｉａにおける発現を高めるように改変したウシコラーゲン配列（配列番号３）（「配列２」）を含むＤＮＡ  ＭＭＶ７７（配列番号１２）（「配列１０」）配列を酵母に挿入した。ｐＡＯＸ１プロモーター（配列番号５）（「配列３」）を用いて、コラーゲン配列を発現させた。５００ｕｇ／ｍｌのゼオシンを含有するＹＰＤプレートを用いて、成功した形質転換体を選択した。得られた株はＰＰ８であった。ベクターＭＭＶ７７を図２に示す。制限酵素消化は、ＰｍｅＩを用いて行った。株をＢＭＭＹ培地で増殖させ、コラーゲンについて試験した。結果を以下の表１に示す。
【０１４１】
実施例３
以下の変更を加えたうえで、実施例１を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した：Ｐｉｃｈｉａでの発現を高めるように改変したウシコラーゲン配列を含むＤＮＡ  ＭＭＶ−１２９（配列番号１３）（「配列１１」）配列を、酵母に挿入した。ｐＣＡＴプロモーター（配列番号９）（「配列７」）を使用してコラーゲン配列を発現させた。５００ｕｇ／ｍｌのゼオシンを含有するＹＰＤプレートを用いて、成功した形質転換体を選択した。得られた株はＰＰ１２３であった。ＭＭＶ１２９をＳｗａＩで消化し、ＰＰ１に形質転換してＰＰ１２３を生成した。ベクターＭＭＶ１２９を図３に示す。株をＢＭＧＹ培地で増殖させ、コラーゲンについて試験した。結果を以下の表１に示す。
【０１４２】
実施例４
以下の変更を加えたうえで、実施例１を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した：
Ｐｉｃｈｉａでの発現を高めるように改変したウシＣｏｌ３Ａ１（ＩＩＩ型）コラーゲン配列（配列番号３）（「配列２」）を含む、ＤＮＡ  ＭＭＶ−１３０（配列番号１４）（「配列１２」）配列を酵母に挿入した。配列番号８（「配列６」）に示すｐＤＦプロモーターを使用してコラーゲン配列を発現させた。ＰｍｅＩによって切断されるＡＯＸ１ランディングパッド（配列番号１０）（「配列８」）を使用してＰｉｃｈｉａゲノムへのベクターの部位特異的組込みを促進した。５００ｕｇ／ｍｌのゼオシンを含有するＹＰＤプレートを用いて、成功した形質転換体を選択した。得られた株をＰＰ１５３と命名した。ＭＭＶ１３０をＰｍｅＩで消化し、ＰＰ１に形質転換してＰＰ１５３を生成した。改変ウシｃｏｌ３Ａ１配列は、配列番号３（「配列２」）によって与えられる。
【０１４３】
フェノール抽出の代わりにＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＰＣＲ精製キットを用いて、直鎖状化したＤＮＡを回収した。株をＢＭＧＹ培地で増殖させ、コラーゲンについて試験した。結果を以下の表１に示す。
【０１４４】
実施例５
以下の変更を加えたうえで、実施例２を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した：最適化したウシＰ４ＨＡ（配列番号６）（「配列４」）及びウシＰ４ＨＢ（配列番号７）（「配列５」）配列を有する１つのＤＮＡベクターＭＭＶ−７８（配列番号１５）（「配列１３」）を酵母に挿入した。ＭＭＶ７８をＰｍｅＩで消化し、ＰＰ１に形質転換してＰＰ８を生成した。Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢはいずれも、その内在性シグナルペプチドを含み、Ｄａｓ１−Ｄａｓ２二方向性プロモーター（配列番号２７）（「配列２４」）によって駆動される。ＤＮＡをＫｐｎＩで消化し、ＰＰ８に形質転換してＰＰ３を生成した。ベクターＭＭＶ７８を図５に示す。株をＢＭＭＹ培地で増殖させ、コラーゲン及び水酸化について試験した。結果を以下の表１に示す。
【０１４５】
実施例６
以下の変更を加えたうえで、実施例２を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した：ウシＰ４ＨＡ配列及びウシＰ４ＨＢ配列の両方を有する１つのＤＮＡベクター、ＭＭＶ−７８を酵母に挿入した。Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢはいずれも、それらの内在性シグナルペプチドを含み、Ｄａｓ１−Ｄａｓ２二方向性プロモーターによって駆動した。ＤＮＡをＫｐｎＩで消化し、ＰＰ８に形質転換してＰＰ３を生成した。
【０１４６】
ｐＡＯＸ１プロモーターにより駆動されるＰ４ＨＢを有する別のベクター、ＭＭＶ−９４（配列番号１６）（「配列１４」）を使用し、また、これを酵母に挿入した。Ｐ４ＨＢの内在性シグナルペプチドを、ＰＨＯ１シグナルペプチドで置換した。得られた株はＰＰ３８であった。ＭＭＶ９４をＡｖｒＩＩで消化し、ＰＰ３に形質転換してＰＰ３８を生成した。ベクターＭＭＶ９４を図６に示す。株をＢＭＭＹ培地で増殖させ、コラーゲン及び水酸化について試験した。結果を以下の表１に示す。
【０１４７】
実施例７
以下の変更を加えたうえで、実施例４を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した：ウシＰ４ＨＡ及びウシＰ４ＨＢ配列の両方を含む１つのＤＮＡベクター、ＭＭＶ−１５６（配列番号１７）（「配列１５」）を酵母に挿入した。Ｐ４ＨＡは、その内在性シグナルペプチドを含み、Ｐ４ＨＢシグナル配列はαファクタープレ（配列番号２３）（「配列２１」）配列で置換した。両方の遺伝子をｐＨＴＸ１二方向性プロモーター（配列番号２６）（「配列２５」）によって駆動した。ＭＭＶ１５６をＢａｍＨＩで消化し、ＰＰ１５３に形質転換してＰＰ１５４を生成した。ベクターＭＭＶ１５６を図７に示す。株をＢＭＧＹ培地で増殖させ、コラーゲン及び水酸化について試験した。結果を以下の表１に示す。
【０１４８】
実施例８
以下の変更を加えたうえで、実施例４を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した：ウシＰ４ＨＡ配列及びウシＰ４ＨＢ配列の両方を有する１つのＤＮＡベクターＭＭＶ−１５６を酵母に挿入した。Ｐ４ＨＡはその内在性シグナルペプチドを含み、Ｐ４ＨＢシグナル配列はαファクタープレ配列で置換した。両方の遺伝子を、ｐＨＴＸ１二方向プロモーターによって駆動した。ＤＮＡをＳｗａＩで消化し、ＰＰ１５３に形質転換してＰＰ１５４を生成した。
【０１４９】
Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢの両方を含む別のベクター、ＭＭＶ−１９１（配列番号１８）（「配列１６」）もまた、酵母に挿入した。余剰コピーのＰ４ＨＡは、その内在性シグナルペプチドを含み、余剰コピーのＰ４ＨＢのシグナル配列は、αファクタープレプロ（配列番号２４）（「配列２２」）配列で置換した。余剰コピーのＰ４ＨＡ及びＰ４ＨＢは、ｐＧＣＷ１４−ＧＡＰ１二方向性プロモーター（配列番号２５）（「配列２３」）によって駆動した。ＭＭＶ１９１をＢａｍＨＩで消化し、ＰＰ１５４に形質転換してＰＰ２６８を生成した。ベクターＭＭＶ１９１を図８に示す。株をＢＭＧＹ培地で増殖させ、コラーゲン及び水酸化について試験した。結果を以下の表１に示す。
【０１５０】
実施例９
実施例１の方法及び手順を利用してオールインワンベクターを作製した。オールインワンベクターは、コラーゲンのＤＮＡならびに付随するプロモーター及びターミネーター、コラーゲンを水酸化する酵素のＤＮＡならびに付随するプロモーター及びターミネーター、マーカー発現用のＤＮＡならびに付随するプロモーター及びターミネーター、細菌及び酵母の複製起点（複数可）のＤＮＡ、及び組み込むために酵母ゲノムに対して相同性を有するＤＮＡ（複数可）を含む。オールインワンベクターは、５’、３’、または上記の構成要素内に戦略的に配置された固有の制限酵素部位を有する。コラーゲン発現または他のベクター構成要素の改変を所望する場合、選択した構成要素のＤＮＡを、制限酵素で容易に切除し、ユーザーが選択するクローニング方法を用いて置換することができる。オールインワンベクターの最も単純なバージョン、ＭＭＶ２０８（配列番号１９）（「配列１７」）は、ヒドロキシラーゼ酵素のプロモーター（複数可）を除いて、上記のすべての構成要素を含む。ベクターＭＭＶ２０８は、以下の構成要素を用いて作製する：ＭＭＶ８４（配列番号２０）（「配列１８」）由来のＡＯＸ相同性、ＭＭＶ１５０（配列番号２１）（「配列１９」）由来のリボソーム相同性、ＭＭＶ１４０（配列番号２２）（「配列２０」）由来の細菌及び酵母起源の複製起点、ＭＭＶ１４０由来のゼオシンマーカー、ならびにＭＭＶ１２９由来のＣｏｌ３Ａ１。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔにより、以下の各制限酵素部位を除去したＰ４ＨＡ及びＢならびに関連するターミネーターの改変バージョンを合成した：ＡｖｒＩＩ、ＮｏｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｍｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩＩ、ＳｗａＩ、ＸｂａＩ、ＳｐｅＩ。ベクターをＰＰ１株に形質転換した。
【０１５１】
株をＢＭＧＹ培地で増殖させ、コラーゲン及び水酸化について試験した。結果を以下の表１に示す。
【０１５２】
表１は、ｇ／Ｌでのコラーゲン産生量及び水酸化コラーゲンの割合を記載する。コラーゲン発現量は、クーマシーブルー色素でゲルを染色し、その結果をコラーゲン含量についての標準曲線と比較することによって定量化した。水酸化コラーゲンの量は、１：２５のペプシン処理後の試料バンドと標準バンドとを比較することによって決定した。水酸化コラーゲンは、コラーゲンポリペプチドをさらに処理するのに必要な高濃度ペプシン中で安定であるため、Ｐｉｃｈｉａによる水酸化コラーゲンの発現には利点がある。
表１
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【０１５３】
実施例１及び２のデータは、ＩＩＩ型ウシコラーゲン配列のコドン改変により、Ｐｉｃｈｉａで発現するコラーゲンの量が２倍になったことを示す。実施例２及び３のデータの比較は、ｐＣＡＴプロモーターを用いてＩＩＩ型コラーゲンコード配列の転写を駆動することによって、ＩＩＩ型ウシコラーゲンの発現がさらに５倍増加することを示す。実施例２及び４のデータの比較は、ｐＤＦプロモーターを用いてＩＩＩ型コラーゲンコード配列の転写を駆動し、ＡＯＸ１ランディングパッドを提供してＰｉｃｈｉａゲノムＤＮＡへのベクターの組み込みを促進することによって、ウシＩＩＩ型コラーゲンの発現が１０〜１５倍増加することを示す。実施例２ならびに５及び６のデータの比較は、プロリンヒドロキシラーゼ（Ｐ４ＨＡ＋Ｐ４ＨＢ）のコード配列をＰｉｃｈｉａに形質転換することにより、水酸化コラーゲンを産生し、プロリンヒドロキシラーゼの発現をさらに調節することによって、水酸化コラーゲンの量を高めることができることを示す。実施例７〜９は、コラーゲン発現を５〜１５倍増強することができること、ならびに２つのベクターを導入することによって、またはコラーゲン及びヒドロキシラーゼ配列の両方を同じベクターにコードするオールインワンベクターアプローチによって、水酸化コラーゲンの量が増大することを示す。
【０１５４】
実施例１０
実施例１の方法及び手順を利用して、キメラＣｏｌ３Ａ１ベクターを作製した。ベクターＭＭＶ１３２を、キメラコラーゲンのＤＮＡならびに付随するプロモーターＰＤＦ及びターミネーターＡＯＸ１ＴＴ、マーカー発現用のＤＮＡならびに付随するプロモーター及びターミネーター、細菌及び酵母の複製起点（複数可）のＤＮＡ、ならびに組み込むために酵母ゲノムに対して相同性を有するＤＮＡ（複数可）を含むように改変した。ベクターＭＭＶ６３は、未改変Ｃｏｌ３Ａ１ドメインの供給源のＤＮＡであった。ベクターＭＭＶ１２８（図２１）は、改変Ｃｏｌ３Ａ１ドメインの供給源のＤＮＡであった。Ｃｏｌ３Ａ１ポリペプチドの全長は１４６５アミノ酸（ａａ）である。プラスミドは、天然ウシＤＮＡ配列（未修飾）及びＰｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓコドン改変ＤＮＡ配列を組み込むように設計した。Ｃｏｌ３Ａ１の改変配列と未改変配列との間の移行がａａ  ７１０、１，２００、及び１，３３１位になるようにプラスミドを設計した。これらの方法を使用して、プラスミドＭＭＶ１９３、ＭＭＶ１９４、ＭＭＶ１９５、ＭＭＶ１９７、ＭＭＶ１９８、及びＭＭＶ１９９を作製した。得られたプラスミドベクターを、比較のために完全に最適化したプラスミドＭＭＶ１３０及び完全に最適化していないプラスミドＭＭＶ２００（図２０）を用いて以下の表２に示す。
表２
【表２】
2019047774.tif 000005
【０１５５】
実施例１１
以下の変更を加えたうえで、実施例２を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した：ＰＰ１及びＰＰ９７が得られた。ＰＰ９７は、２つのプロテアーゼ遺伝子（ＰＥＰ４及びＰＲＢ１）を宿主株からノックアウトした株であった。Ｐｉｃｈｉａ発現用の改変及び未改変ウシコラーゲン配列ＤＮＡの異なる組合せを含むＤＮＡ  ＭＭＶ１９４、ＭＭＶ１９５、ＭＭＶ１３０及びＭＭＶ２００配列を酵母に挿入した。ｐＤＦプロモーターを用いてコラーゲン配列を発現させた。５００ｕｇ／ｍｌのゼオシンを含有するＹＰＤプレートを用いて、成功した形質転換体を選択した。ベクターに対し、ＳｗａＩを用いて制限酵素消化を行い、組み込むためにＤＮＡを直鎖状化し、Ｐｍｅ１で消化して２００ｎｇのＤＮＡを形質転換したＭＭＶ１３０を除いて、３〜５ｕｇの切断ＤＮＡを形質転換した。得られた株を以下の表３に示す。
表３
【表３】
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【０１５６】
実施例１２
以下の変更を加えたうえで、実施例７を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した：ウシＰ４ＨＡ配列及びウシＰ４ＨＢ配列の両方を有する１つのＤＮＡベクター、ＭＭＶ−１５６を酵母に挿入した。Ｐ４ＨＡはその内在性シグナルペプチドを含み、Ｐ４ＨＢシグナル配列はαファクタープレ配列で置換した。両方の遺伝子を、ｐＨＴＸ１二方向性プロモーターによって駆動した。ＤＮＡをＢａｍＨ１で消化し、形質転換した。株及び形質転換の情報については、表４を参照されたい。
表４
【表４】
2019047774.tif 000007
【０１５７】
実施例１３
以下の変更を加えたうえで、実施例８を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した：溶解緩衝液を、５０ｍＭ  Ｎａ２ＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％グリセロールで作製し、ｐＨを酢酸で７．４に調整した。Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢの両方を含む別のベクター、ＭＭＶ−１９１もまた、酵母に挿入した。余剰コピーのＰ４ＨＡは、その内在性シグナルペプチドを含み、余剰コピーのＰ４ＨＢのシグナル配列は、αファクタープレプロ配列で置換した。余剰コピーのＰ４ＨＡ及びＰ４ＨＢを、ｐＧＣＷ１４−ＧＡＰ１二方向性プロモーターによって駆動した。ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、形質転換した。形質転換及び新規株の情報については、表５を参照されたい。株をＢＭＧＹ培地で増殖させ、コラーゲンについて試験した。
表５
【表５】
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【０１５８】
実施例１４
以下の変更を加えたうえで、実施例２を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した：ウシＰ４ＨＡ配列及びウシＰ４ＨＢ配列の両方を有する１つのＤＮＡベクター、ＭＭＶ−７８を酵母に挿入した。Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢを、Ｄａｓ１−Ｄａｓ２二方向性プロモーターによって駆動する。ＤＮＡをＫｐｎＩで消化し、ＰＰ８に形質転換して、配列番号３（「配列２」）のコラーゲン配列を保有するＰＰ３を生成した。ｐＡＯＸ１プロモーターにより駆動されるＰ４ＨＢを有する別のベクター、ＭＭＶ−９４（配列番号１６）（「配列１４」）を使用し、同様に酵母に挿入した。Ｐ４ＨＢの内在性シグナルペプチドを、ＰＨＯ１シグナルペプチドで置換した。得られた株はＰＰ３８であった。
【０１５９】
２４ディープウェルプレートに対し、２ｍｌのＹＰＤを各ウェルに充填し、ＰＰ３８株の単一コロニーを播種した。コロニーを、９００ｒｐｍの振盪下で２４時間、ＹＰＤ中で増殖させた。細胞を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した。メタノールフリーの誘導については、上清を２ｍＬのＢＭＧＹ（１％）で置換し、さらに４８時間増殖させた。メタノール誘導については、メタノールを終濃度０．５％になるように添加し、細胞を２４時間増殖させた。メタノールを再び添加し、細胞をさらに２４時間増殖させた。誘導終了時に、１ｍｌの試料を分析用に取り出した。
【０１６０】
実施例１に記載したＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー染色を用いて、試料をコラーゲンについて試験した。メタノールフリー誘導の試料のバンドは、メタノール誘導の試料のバンドよりも暗く、このことは、メタノールフリー誘導の試料のほうがコラーゲンを高濃度で発現していたことを示している。
【０１６１】
本明細書中で使用する用語「最適化した」または「最適化する」などは、キメラＤＮＡ構築物または他の重要なプロセス変数の特徴を慎重に選択することによって実現される値または特徴を含み、既知の結果有効変数の使用を意味しない。
【０１６２】
本明細書中で使用する用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明を限定することを意図するものではない。
【０１６３】
本明細書中で使用する見出し（「背景技術」及び「概要」など）及び小見出しは、単に本発明内のトピックの一般的な編成を意図したものに過ぎず、本発明の開示またはそのいずれかの態様を制限することを意図したものではない。特に、「背景技術」に開示する主題は、新規技術を包含する場合があり、先行技術の引用を構成しない場合がある。「概要」に開示する主題は、技術またはそのいずれかの実施形態の全範囲の網羅的または完全な開示ではない。本明細書のセクション内の物質を、便宜上、特定の有用性を有するものとして分類または議論し、また、所与の組成物中でその物質を使用する場合、その物質が、必ずまたは単独で、その物質の本明細書中での分類に従って機能する必要があるという推論をすべきではない。
【０１６４】
本明細書中で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、そうでないことが文脈上で明確に示されない限り、複数形も含むことが意図される。
【０１６５】
本明細書中で使用する場合、用語「及び／または」は、関連する列挙した項目の１つ以上の任意の及びすべての組み合わせを含み、「／」と省略してもよい。
【０１６６】
「ｗｗｗ」の前にスペースまたはアンダーラインのスペースを挿入することによってリンクを使用不能にし、それは、スペースを除去することによって再活性化し得る。
【０１６７】
実施例で使用するものを含めて、本明細書中及び特許請求の範囲で使用する場合、特に明記しない限り、すべての数字は、あたかも単語「実質的に」、「約」または「およそ」が、たとえその単語が明示的に示されていなくても、それらが前置されているかのように読み取ってよい。大きさ及び／または位置を記載する場合に、語句「約」または「およそ」を使用して、記載する値及び／または位置が値及び／または位置の合理的な予想範囲内にあることを示してもよい。例えば、数値は、指定する値（または値の範囲）の±０．１％、指定する値（または値の範囲）の±１％、指定する値（または値の範囲）の±２％、指定する値（または値の範囲）の±５％、指定する値（または値の範囲）の±１０％、指定する値（または値の範囲）の±１５％、指定する値（または値の範囲）の±２０％などの値を有し得る。本明細書中に列挙する数値範囲は、その範囲内に包含されるすべての部分範囲を含むことが意図される。
【０１６８】
本明細書中で使用する場合、用語「好ましい」及び「好ましくは」とは、特定の状況下で特定の利益をもたらす技術の実施形態を指す。しかしながら、同じまたは他の状況下で、他の実施形態もまた、好ましい場合がある。さらに、１つ以上の好ましい実施形態の列挙は、他の実施形態が有用ではないことを意図するものではなく、他の実施形態を技術の範囲から除外することを意図するものでもない。
本明細書中で言及するように、すべての組成割合は、特に明記しない限り、全組成物に対する重量百分率である。本明細書中で使用する場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及びその変形は非限定的であることを意図しており、したがって、リスト内の項目の列挙は、本技術の素材、組成物、装置、及び方法においても有用であり得る他の同様の項目を除外するものではない。同様に、用語「できる（ｃａｎ）」及び「してもよい（ｍａｙ）」ならびにその変形は非限定的であることを意図しており、したがって、一実施形態が特定の要素または特徴を含むことができるか、またはそれらを含んでもよいことについての列挙は、それらの要素または特徴を含まない本発明の他の実施形態を除外するものではない。
【０１６９】
用語「第一」及び「第二」は、様々な特徴／要素（工程を含む）を記述するために本明細書中で使用され得るが、文脈上、そうではないと示されない限り、これらの特徴／要素はこれらの用語によって限定されるべきではない。これらの用語は、ある特徴／要素を別の特徴／要素と区別するために使用してもよい。したがって、以降で説明する第一の特徴／要素を第二の特徴／要素と表現することは可能であり、同様に、以降で説明する第二の特徴／要素を、本発明の教示から逸脱することなく第一の特徴／要素と表現することも可能である。
【０１７０】
空間的に相対的な用語、例えば、図面に示される、「下（ｕｎｄｅｒ）」、「下（ｂｅｌｏｗ）」、「下（ｌｏｗｅｒ）」、「上（ｏｖｅｒ）」、「上（ｕｐｐｅｒ）」などは、ある要素または特徴と他の要素（複数可）または特徴（複数可）との関係性を記載するうえで、説明を容易にするために、本明細書中において使用してもよい。空間的に相対的な用語は、図中に描かれている向きに加えて、使用中または動作中の装置の異なる向きを包含することが意図されていることは理解されよう。例えば、図中の装置が反転している場合、他の要素または特徴の「下（ｕｎｄｅｒ）」または「下（ｂｅｎｅａｔｈ）」と記載される要素は、他の要素または特徴の「上（ｏｖｅｒ）」を向くであろう。したがって、例示的な用語「下（ｕｎｄｅｒ）」は、上（ｏｖｅｒ）及び下（ｕｎｄｅｒ）の向きの両方を包含し得る。装置は、他の方向を向いていてもよく（９０°または他の向きに回転していてもよい）、本明細書中で使用する空間的に相対的な記述子は、それに応じて解釈される。同様に、特段の断りがない限り、用語「上向きに（ｕｐｗａｒｄｌｙ）」、「下向きに（ｄｏｗｎｗａｒｄｌｙ）」、「垂直」、「水平」などは、単に説明の目的でのみ使用される。
【０１７１】
特徴または要素が、本明細書中で、別の特徴または要素の「上（ｏｎ）」にあると言及される場合、それは他の特徴もしくは要素の上に直接存在し得るか、または介在する特徴及び／または要素が存在する場合もある。対照的に、ある特徴または要素が別の特徴または要素の「直上（ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｏｎ）」にあると言及される場合、介在する特徴または要素は存在しない。また、ある特徴または要素が他の特徴または要素に「接続」、「付着」または「結合」していると言及される場合、それは他の特徴または要素に直接的に接続、付着または結合可能であるか、または介在する特徴または要素が存在してもよいことも理解されるであろう。対照的に、ある特徴または要素が別の特徴または要素に「直接接続」、「直接付着」または「直接結合」していると言及される場合、介在する特徴または要素は存在しない。一実施形態に関して記載または図示しているが、そのように記載または図示した特徴及び要素は、他の実施形態に適用することができる。当業者であれば、別の特徴に「隣接して」配置された構造または特徴への言及は、隣接する特徴にオーバーラップするかまたはその下部に存在する部分を有し得ることも理解されよう。
【０１７２】
本明細書中で言及するすべての刊行物及び特許出願は、あたかも個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照として援用されているかのように、その全体を参照として本明細書に援用し、参照として援用することを示す本明細書の同じ文章、段落、ページまたは節に記載する開示を特に参照する。本明細書中における参考文献の引用は、それらの参考文献が先行技術であるか、または本明細書に開示する技術の特許性に関連するものであることを認めるものではない。引用する参考文献の内容の議論は、単にその参考文献の著者の主張の一般的な概要を提供することを意図しているに過ぎず、そのような参考文献の内容の正確性について承認するものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年11月20日(2018.11.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非水酸化コラーゲンを産生する遺伝子改変酵母株であって：
（ｉ）酵母株；ならびに
（ｉｉ）コラーゲンのＤＮＡ配列；コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；コラーゲンターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列、前記選択マーカー用のプロモーターのＤＮＡ配列；前記選択マーカー用のターミネーターのＤＮＡ配列；細菌用のもの及び酵母用のものから選択される複製起点のＤＮＡ配列；及び前記酵母のゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列を含むベクター
を含み、前記ベクターが前記酵母株に挿入されている、前記遺伝子改変酵母株。
【請求項２】
前記酵母株が、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、請求項１に記載の酵母株。
【請求項３】
前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の酵母株。
【請求項４】
前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、天然コラーゲンＤＮＡ、改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）コラーゲンＤＮＡ及びコドン改変コラーゲンＤＮＡから選択される、請求項３に記載の酵母株。
【請求項５】
前記プロモーターのＤＮＡ配列が、ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーターのＤＮＡ、ｐＤＦ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、ｐＣＡＴ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、Ｄａｓ１−Ｄａｓ２メタノール誘導性二方向性プロモーターのＤＮＡ、ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ、ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の酵母株。
【請求項６】
前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、抗生物質耐性のＤＮＡ及び栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、請求項１に記載の酵母株。
【請求項７】
前記抗生物質耐性マーカーが、ハイグロマイシン耐性、ゼオシン耐性、ジェネテシン耐性及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載の酵母株。
【請求項８】
前記ベクターを、電気穿孔法、化学的形質転換、及び接合からなる群から選択される方法によって前記酵母に挿入する、請求項１に記載の酵母株。
【請求項９】
非水酸化コラーゲンの製造方法であって：
（ｉ）請求項１の酵母株を提供し；及び
（ｉｉ）コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で前記株を増殖させることを含む、前記製造方法。
【請求項１０】
前記酵母株が、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記培地が、緩衝グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）、緩衝メタノール複合培地（ＢＭＭＹ）、及び酵母抽出ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記期間が、２４時間〜７２時間である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記酵母が、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記プロモーターのＤＮＡ配列が、前記ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、前記抗生物質耐性ＤＮＡのＤＮＡ及び前記栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
水酸化コラーゲンを産生する遺伝子改変酵母株であって：
（ｉ）酵母株；
（ｉｉ）コラーゲンのＤＮＡ配列；コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；ターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列；前記選択マーカー用のプロモーターのＤＮＡ配列；前記選択マーカー用のターミネーターのＤＮＡ配列；細菌及び／または酵母の複製起点のＤＮＡ配列；前記酵母のゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列を含むベクターであって；前記ベクターが前記酵母株に挿入されている、前記ベクター；ならびに
（ｉｉｉ）Ｐ４ＨＡ１のＤＮＡ配列；Ｐ４ＨＢのＤＮＡ配列；及びプロモーター用の少なくとも１つのＤＮＡ配列を含む第二のベクターであって；前記ベクターが前記酵母株に挿入されている、前記第二のベクター
を含む、前記遺伝子改変酵母株。
【請求項１８】
前記酵母株が、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、請求項１７に記載の酵母株。
【請求項１９】
前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載の酵母株。
【請求項２０】
前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、天然コラーゲンＤＮＡ、改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）コラーゲンＤＮＡ及び改変（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）コラーゲンＤＮＡから選択される、請求項１７に記載の酵母株。
【請求項２１】
前記プロモーターのＤＮＡ配列が、前記ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーターのＤＮＡ、前記ｐＤＦ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、前記ｐＣＡＴ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、前記Ｄａｓ１−Ｄａｓ２メタノール誘導性二方向性プロモーターのＤＮＡ、前記ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ、前記ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載の酵母株。
【請求項２２】
前記プロモーターのＤＮＡ配列が、前記ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、請求項１７に記載の酵母株。
【請求項２３】
前記選択マーカーの前記ＤＮＡ配列が、前記抗生物質耐性ＤＮＡのＤＮＡ及び前記栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、請求項１７に記載の酵母株。
【請求項２４】
前記選択マーカーが、ハイグロマイシン耐性、ゼオシン耐性、ジェネテシン耐性及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗生物質耐性の選択マーカーである、請求項２３に記載の酵母株。
【請求項２５】
前記ベクターを、電気穿孔法、化学的形質転換、及び接合からなる群から選択される方法によって前記酵母に挿入する、請求項１７に記載の酵母株。
【請求項２６】
水酸化コラーゲンの製造方法であって：
（ｉ）請求項１７の酵母株を提供し；及び
（ｉｉ）コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で前記株を増殖させることを含む、前記製造方法。
【請求項２７】
前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記培地が、ＢＭＧＹ、ＢＭＭＹ、及びＹＰＤからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記期間が、２４時間〜７２時間である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記酵母が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記コラーゲンのＤＮＡが、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記プロモーターのＤＮＡが、前記ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記選択マーカーのＤＮＡが、前記抗生物質耐性ＤＮＡのＤＮＡ及び前記栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
（ｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、コラーゲン産生に必要なＤＮＡ；
（ｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＢからなる群から選択される水酸化酵素のＤＮＡ；
（ｉｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、選択マーカーのＤＮＡ；
（ｉｖ）酵母及び細菌の複製起点のＤＮＡ；
（ｖ）ゲノムに組み込むために前記酵母のゲノムに対して相同性を有するＤＮＡ；ならびに
（ｖｉ）モジュラー式クローニングを可能にする、上記のＤＮＡ内の５’、３’、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される位置の制限酵素部位
を有する、オールインワンベクター。
【請求項３５】
コラーゲン産生に必要な前記ＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３４に記載のオールインワンベクター。
【請求項３６】
前記プロモーターのＤＮＡ配列が、前記ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、請求項３４に記載のオールインワンベクター。
【請求項３７】
前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、前記抗生物質耐性のＤＮＡ及び前記栄養要求性マーカーのＤＮＡである、請求項３４に記載のオールインワンベクター。
【請求項３８】
前記選択マーカーが、ハイグロマイシン、ゼオシン、ジェネテシン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗生物質に対する抗生物質耐性の選択マーカーである、請求項３７に記載のオールインワンベクター。
【請求項３９】
最適化したＤＮＡを、キメラコラーゲンＤＮＡの全長に基づいて１０〜４０％または６０〜９０％含む、キメラコラーゲンＤＮＡ配列。
【請求項４０】
前記最適化したＤＮＡが、Ｃ末端から始まる、請求項３９に記載のキメラコラーゲンＤＮＡ配列。
【請求項４１】
前記最適化したＤＮＡが、Ｎ末端から始まる、請求項３９に記載のキメラコラーゲンＤＮＡ配列。
【請求項４２】
請求項３９に記載のキメラコラーゲンのＤＮＡ配列；
コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；
ターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列；
前記選択マーカー用のプロモーターのＤＮＡ配列；
前記選択マーカー用のターミネーターのＤＮＡ配列；
細菌及び／または酵母の複製起点のＤＮＡ配列；及び
前記酵母のゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列
を含むベクターを保有する、コラーゲン産生酵母株。
【請求項４３】
前記プロモーターのＤＮＡが、前記ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、請求項４２に記載の酵母株。
【請求項４４】
前記選択マーカーのＤＮＡが、前記少なくとも１つの抗生物質耐性をコードするＤＮＡ及び少なくとも１つの栄養要求性マーカーをコードするＤＮＡからなる群から選択される、請求項４２に記載の酵母株。
【請求項４５】
水酸化コラーゲンの製造方法であって：
（ｉ）請求項４２のコラーゲン産生酵母株を提供し；及び
（ｉｉ）コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で前記株を増殖させることを含む、前記製造方法。
【請求項４６】
前記酵母株が、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記培地が、緩衝グリセロール複合培地、緩衝メタノール複合培地、及び酵母抽出ペプトンデキストロースからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記期間が、２４時間〜７２時間の範囲である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記酵母株が、前記ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記酵母株が、抗生物質耐性をコードするＤＮＡ及び栄養要求性マーカーをコードするＤＮＡからなる群から選択される少なくとも１つの選択マーカーを含む、請求項４５に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７２】
本明細書中で言及するすべての刊行物及び特許出願は、あたかも個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照として援用されているかのように、その全体を参照として本明細書に援用し、参照として援用することを示す本明細書の同じ文章、段落、ページまたは節に記載する開示を特に参照する。本明細書中における参考文献の引用は、それらの参考文献が先行技術であるか、または本明細書に開示する技術の特許性に関連するものであることを認めるものではない。引用する参考文献の内容の議論は、単にその参考文献の著者の主張の一般的な概要を提供することを意図しているに過ぎず、そのような参考文献の内容の正確性について承認するものではない。
以下の態様が包含され得る。
［１］  非水酸化コラーゲンを産生する遺伝子改変酵母株であって：
（ｉ）酵母株；ならびに
（ｉｉ）コラーゲンのＤＮＡ配列；コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；コラーゲンターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列、前記選択マーカー用のプロモーターのＤＮＡ配列；前記選択マーカー用のターミネーターのＤＮＡ配列；細菌用のもの及び酵母用のものから選択される複製起点のＤＮＡ配列；及び前記酵母のゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列を含むベクター
を含み、前記ベクターが前記酵母株に挿入されている、前記遺伝子改変酵母株。
［２］  前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記［１］に記載の酵母株。
［３］  前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［１］に記載の酵母株。
［４］  前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、天然コラーゲンＤＮＡ、改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）コラーゲンＤＮＡ及びコドン改変コラーゲンＤＮＡから選択される、上記［３］に記載の酵母株。
［５］  前記プロモーターのＤＮＡ配列が、ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーターのＤＮＡ、ｐＤＦ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、ｐＣＡＴ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、Ｄａｓ１−Ｄａｓ２メタノール誘導性二方向性プロモーターのＤＮＡ、ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ、ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［１］に記載の酵母株。
［６］  前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、抗生物質耐性のＤＮＡ及び栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、上記［１］に記載の酵母株。
［７］  前記抗生物質耐性マーカーが、ハイグロマイシン耐性、ゼオシン耐性、ジェネテシン耐性及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［６］に記載の酵母株。
［８］  前記ベクターを、電気穿孔法、化学的形質転換、及び接合からなる群から選択される方法によって前記酵母に挿入する、上記［１］に記載の酵母株。
［９］  非水酸化コラーゲンの製造方法であって：
（ｉ）上記［１］の酵母株を提供し；及び
（ｉｉ）コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で前記株を増殖させることを含む、前記製造方法。
［１０］  前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記［９］に記載の方法。
［１１］  前記培地が、緩衝グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）、緩衝メタノール複合培地（ＢＭＭＹ）、及び酵母抽出ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）からなる群から選択される、上記［９］に記載の方法。
［１２］  前記期間が、２４時間〜７２時間である、上記［９］に記載の方法。
［１３］  前記酵母が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記［９］に記載の方法。
［１４］  前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［９］に記載の方法。
［１５］  前記プロモーターのＤＮＡ配列が、前記ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、上記［９］に記載の方法。
［１６］  前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、前記抗生物質耐性ＤＮＡのＤＮＡ及び前記栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、上記［９］に記載の方法。
［１７］  水酸化コラーゲンを産生する遺伝子改変酵母株であって：
（ｉ）酵母株；
（ｉｉ）コラーゲンのＤＮＡ配列；コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；ターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列；前記選択マーカー用のプロモーターのＤＮＡ配列；前記選択マーカー用のターミネーターのＤＮＡ配列；細菌及び／または酵母の複製起点のＤＮＡ配列；前記酵母のゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列を含むベクターであって；前記ベクターが前記酵母株に挿入されている、前記ベクター；ならびに
（ｉｉｉ）Ｐ４ＨＡ１のＤＮＡ配列；Ｐ４ＨＢのＤＮＡ配列；及びプロモーター用の少なくとも１つのＤＮＡ配列を含む第二のベクターであって；前記ベクターが前記酵母株に挿入されている、前記第二のベクター
を含む、前記遺伝子改変酵母株。
［１８］  前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記［１７］に記載の酵母株。
［１９］  前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［１７］に記載の酵母株。
［２０］  前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、天然コラーゲンＤＮＡ、改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）コラーゲンＤＮＡ及び改変（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）コラーゲンＤＮＡから選択される、上記［１７］に記載の酵母株。
［２１］  前記プロモーターのＤＮＡ配列が、前記ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーターのＤＮＡ、前記ｐＤＦ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、前記ｐＣＡＴ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、前記Ｄａｓ１−Ｄａｓ２メタノール誘導性二方向性プロモーターのＤＮＡ、前記ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ、前記ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［１７］に記載の酵母株。
［２２］  前記プロモーターのＤＮＡ配列が、前記ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、上記［１７］に記載の酵母株。
［２３］  前記選択マーカーの前記ＤＮＡ配列が、前記抗生物質耐性ＤＮＡのＤＮＡ及び前記栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、上記［１７］に記載の酵母株。
［２４］  前記選択マーカーが、ハイグロマイシン耐性、ゼオシン耐性、ジェネテシン耐性及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗生物質耐性の選択マーカーである、上記［２３］に記載の酵母株。
［２５］  前記ベクターを、電気穿孔法、化学的形質転換、及び接合からなる群から選択される方法によって前記酵母に挿入する、上記［１７］に記載の酵母株。
［２６］  水酸化コラーゲンの製造方法であって：
（ｉ）上記［１７］の酵母株を提供し；及び
（ｉｉ）コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で前記株を増殖させることを含む、前記製造方法。
［２７］  前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記［２６］に記載の方法。
［２８］  前記培地が、ＢＭＧＹ、ＢＭＭＹ、及びＹＰＤからなる群から選択される、上記［２６］に記載の方法。
［２９］  前記期間が、２４時間〜７２時間である、上記［２６］に記載の方法。
［３０］  前記酵母が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記［２６］に記載の方法。
［３１］  前記コラーゲンのＤＮＡが、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［２６］に記載の方法。
［３２］  前記プロモーターのＤＮＡが、前記ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、上記［２６］に記載の方法。
［３３］  前記選択マーカーのＤＮＡが、前記抗生物質耐性ＤＮＡのＤＮＡ及び前記栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、上記［２６］に記載の方法。
［３４］  （ｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、コラーゲン産生に必要なＤＮＡ；
（ｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＢからなる群から選択される水酸化酵素のＤＮＡ；
（ｉｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、選択マーカーのＤＮＡ；
（ｉｖ）酵母及び細菌の複製起点のＤＮＡ；
（ｖ）ゲノムに組み込むために前記酵母のゲノムに対して相同性を有するＤＮＡ；ならびに
（ｖｉ）モジュラー式クローニングを可能にする、上記のＤＮＡ内の５’、３’、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される位置の制限酵素部位
を有する、オールインワンベクター。
［３５］  コラーゲン産生に必要な前記ＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［３４］に記載のオールインワンベクター。
［３６］  前記プロモーターのＤＮＡ配列が、前記ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、上記［３４］に記載のオールインワンベクター。
［３７］  前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、前記抗生物質耐性のＤＮＡ及び前記栄養要求性マーカーのＤＮＡである、上記［３４］に記載のオールインワンベクター。
［３８］  前記選択マーカーが、ハイグロマイシン、ゼオシン、ジェネテシン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗生物質に対する抗生物質耐性の選択マーカーである、上記［３７］に記載のオールインワンベクター。
［３９］  最適化したＤＮＡを、キメラコラーゲンＤＮＡの全長に基づいて１０〜４０％または６０〜９０％含む、キメラコラーゲンＤＮＡ配列。
［４０］  前記最適化したＤＮＡが、Ｃ末端から始まる、上記［３９］に記載のキメラコラーゲンＤＮＡ配列。
［４１］  前記最適化したＤＮＡが、Ｎ末端から始まる、上記［３９］に記載のキメラコラーゲンＤＮＡ配列。
［４２］  上記［３９］に記載のキメラコラーゲンのＤＮＡ配列；
コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；
ターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列；
前記選択マーカー用のプロモーターのＤＮＡ配列；
前記選択マーカー用のターミネーターのＤＮＡ配列；
細菌及び／または酵母の複製起点のＤＮＡ配列；及び
前記酵母のゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列
を含むベクターを保有する、コラーゲン産生酵母株。
［４３］  前記プロモーターのＤＮＡが、前記ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、上記［４２］に記載の酵母株。
［４４］  前記選択マーカーのＤＮＡが、前記少なくとも１つの抗生物質耐性をコードするＤＮＡ及び少なくとも１つの栄養要求性マーカーをコードするＤＮＡからなる群から選択される、上記［４２］に記載の酵母株。
［４５］  水酸化コラーゲンの製造方法であって：
（ｉ）上記［４２］のコラーゲン産生酵母株を提供し；及び
（ｉｉ）コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で前記株を増殖させることを含む、前記製造方法。
［４６］  前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記［４５］に記載の方法。
［４７］  前記培地が、緩衝グリセロール複合培地、緩衝メタノール複合培地、及び酵母抽出ペプトンデキストロースからなる群から選択される、上記［４５］に記載の方法。
［４８］  前記期間が、２４時間〜７２時間の範囲である、上記［４５］に記載の方法。
［４９］  前記酵母株が、前記ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択されるプロモーターを含む、上記［４５］に記載の方法。
［５０］  前記酵母株が、抗生物質耐性をコードするＤＮＡ及び栄養要求性マーカーをコードするＤＮＡからなる群から選択される少なくとも１つの選択マーカーを含む、上記［４５］に記載の方法。
【外国語明細書】
2019047774000001.pdf