(57)【要約】      （修正有）【課題】性成熟選択的神経内分泌遺伝子の不活性化を含むゲノムを含む遺伝子改変家畜動物の作製方法の提供。【解決手段】性的に成熟できない、遺伝子編集された非ヒト家畜動物を作製する方法であって、家畜細胞又は家畜胚に、性成熟に関与するリガンドについての遺伝子を不活性化する薬剤を導入するステップを含む方法を提供する。さらに、対象遺伝子が、Ｋｉｓｓ１、又はＧｎＲＨ１１であり、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、薬剤がＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ及びリコンビナーゼ融合タンパク質からなる群から選択されることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
家畜動物を作製する方法であって、
家畜細胞及び家畜胚からなる群から選択される生命体に、性成熟選択的神経内分泌遺伝子を不活性化する薬剤を導入するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記性成熟遺伝子に選択的な神経内分泌遺伝子が、Ｇｐｒ５４、Ｋｉｓｓ１、及びＧｎＲＨ１１からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記薬剤が前記細胞の染色体標的部位に特異的に結合して二本鎖ＤＮＡ切断を生じさせ、それにより前記性成熟選択的神経内分泌遺伝子が不活性化される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記薬剤が、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ及びリコンビナーゼ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記薬剤がＴＡＬＥＮを含み、前記方法が、前記生命体にリコンビナーゼを前記ＴＡＬＥＮと共導入するステップをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記薬剤を発現する導入遺伝子が前記生命体のゲノムに置かれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記薬剤が前記リコンビナーゼ融合タンパク質であり、前記方法が、標的化核酸配列を前記融合タンパク質と共に導入するステップを含み、前記標的化核酸配列が前記染色体部位に対する特異的結合のため前記リコンビナーゼとフィラメントを形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ある配列を有する核酸鋳型を前記生命体に導入するステップであって、前記生命体の前記ゲノムが前記二本鎖切断の部位で前記配列を受け取るステップをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記生命体から前記動物をクローニングするステップをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記動物が、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、ヤギ、ウサギ、及び魚からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子の前記不活性化が誘導性システムの制御下にある、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法により作製される遺伝子改変家畜動物。
【請求項１３】
性成熟選択的神経内分泌遺伝子の不活性化を含むゲノムを含む遺伝子改変家畜動物であって、前記遺伝子の前記不活性化により前記動物が性的に成熟することが阻止されている、家畜動物。
【請求項１４】
前記遺伝子の前記不活性化が、
前記性成熟遺伝子をコードする配列及び／又はそのシス調節エレメント
における１つ以上の塩基の挿入、欠失、又は置換
を含む、請求項１３に記載の家畜動物。
【請求項１５】
前記遺伝子がトランス作用因子により不活性化され、前記トランス作用因子が干渉性ＲＮＡ及びドミナントネガティブ因子からなる群から選択され、前記トランス作用因子が外来遺伝子又は内在性遺伝子により発現する、請求項１３又は１４に記載の家畜動物。
【請求項１６】
前記遺伝子の前記不活性化が誘導性システムの制御下にある、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項１７】
前記動物が、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、ヤギ、及び魚からなる群から選択される、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項１８】
前記性成熟遺伝子が、Ｇｐｒ５４、Ｋｉｓｓ１、及びＧｎＲＨ１１からなる群から選択される、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項１９】
前記動物が、外因性組換えタンパク質をさらに発現する、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項２０】
処理なしには遺伝的に成熟不能である、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項２１】
細胞、胚、胚盤胞、体細胞、初代細胞、及び始原生殖細胞からなる群から選択される生命体に神経内分泌遺伝子のノックアウトを調製するステップを含む、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の家畜動物を作製する方法。
【請求項２２】
性成熟選択的神経内分泌遺伝子の不活性化に関してヘテロ接合であるゲノムを含む遺伝子改変家畜動物であって、前記不活化遺伝子がホモ接合の子孫は性的に成熟することが阻止される、動物。
【請求項２３】
前記神経内分泌遺伝子が、Ｇｐｒ５４、Ｋｉｓｓ１、及びＧｎＲＨ１１からなる群から選択される、請求項２２に記載の動物。
【請求項２４】
動物の性成熟のため前記動物に薬剤を投与するステップであって、前記薬剤が前記動物の遺伝的性成熟不能を補償する、ステップ
を含む、家畜動物を飼育する方法。
【請求項２５】
前記薬剤がゴナドトロピン又はゴナドトロピン類似体を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記動物の前記遺伝的成熟不能が、性成熟選択的神経内分泌遺伝子を遺伝的に不活性化した結果である、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記不活化遺伝子が、Ｇｐｒ５４、Ｋｉｓｓ１、及びＧｎＲＨ１１からなる群から選択される、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
細胞又は動物胚盤胞からなる群から選択されるインビトロ生命体であって、性成熟遺伝子の不活性化を含むゲノムを含むインビトロ生命体。
【請求項２９】
ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、ヤギ、ウサギ、及び魚からなる群から選択される細胞又は胚である、請求項２８に記載の生命体。
【請求項３０】
前記細胞が、体細胞、初代細胞、又は始原生殖細胞からなる群から選択される、請求項２８又は２９に記載の生命体。
【請求項３１】
性成熟選択的神経内分泌遺伝子の不活性化に関してヘテロ接合であるゲノムを有する、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の生命体。
【請求項３２】
前記神経内分泌遺伝子が、Ｇｐｒ５４、Ｋｉｓｓ１、及びＧｎＲＨ１１からなる群から選択される、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の生命体。
【請求項３３】
前記遺伝子の前記不活性化が
前記性成熟遺伝子をコードする配列及び／又はそのシス調節エレメント
における１つ以上の塩基の挿入、欠失、又は置換
を含む、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の生命体。
【請求項３４】
前記遺伝子がトランス作用因子により不活性化され、前記トランス作用因子が干渉性ＲＮＡ及びドミナントネガティブ因子からなる群から選択され、前記トランス作用因子が外来遺伝子又は内在性遺伝子により発現する、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の生命体。
【請求項３５】
家畜細胞及び家畜胚からなる群から選択される生命体に、前記細胞の染色体標的部位に特異的に結合する薬剤を導入するステップであって、それにより性成熟選択的神経内分泌遺伝子を不活性化するステップ
を含む、インビトロ生命体を作製する方法。
【請求項３６】
前記薬剤が、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ及びリコンビナーゼ融合タンパク質からなる群から選択され；及び場合により前記生命体にリコンビナーゼを共導入するステップを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記薬剤を発現する導入遺伝子が前記生命体のゲノムに置かれる、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記薬剤が前記リコンビナーゼ融合タンパク質であり、前記方法が、標的化核酸配列を前記融合タンパク質と共に導入するステップを含み、前記標的化核酸配列が前記染色体部位に対する特異的結合のため前記リコンビナーゼとフィラメントを形成する、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ある配列を有する核酸鋳型を前記生命体に導入するステップであって、前記生命体の前記ゲノムが前記二本鎖切断の部位で前記配列を受け取るステップをさらに含む、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記性成熟遺伝子が、Ｇｐｒ５４、Ｋｉｓｓ１、及びＧｎＲＨ１１からなる群から選択される、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記遺伝子の前記不活性化が誘導性システムの制御下にある、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１２年１０月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／７２０，１８７号明細書及び２０１３年８月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／８７０，５１０号明細書に対する優先権を主張するものであり、これらの仮特許出願の各々は、本明細書によって参照により本明細書に援用される。
【０００２】
連邦政府支援研究に関する記載事項
本明細書に記載される研究の諸側面は、国立衛生研究所の補助金交付第１Ｒ４３ＲＲ０３３１４９−０１Ａ１号及び農務省（ＵＳＤＡ）−国立食品・農業研究所のバイオテクノロジーリスク評価プログラム競争的補助金交付番号第２０１２−３３５２２−１９７６６号による支援を受けた。米国政府は本発明に一定の権利を有し得る。
【０００３】
本技術分野は、家畜を含む動物を作製及び飼育する方法に関し、ここで家畜は、成熟するよう処理されない限り性的に未熟なままであるように遺伝子改変されている。
【背景技術】
【０００４】
従来の畜産実践は、繁殖及び分娩を最適化する観点から家畜における性的成熟の役割に重点を置いている。例えば、乳牛の群れでは、性成熟期の雌子ウシの管理がその生涯生産性に大きく影響することが知られ、慎重に計画されなければならない。最適な性的発育プロセスは多くの研究の対象となっており、従来の見識は、雌子ウシがその１年目の初期に繁殖して出産すると生涯生産が良好になるとともに初回分娩までの全生産コストも低下するという考えである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書には、従来の実践とは対照的に、家畜の性的成熟を無期限に、永久に、又は性的に成熟するように処理される時点まで遅延させる方法が提供される。これらの方法で魚及びブタが処理されており、生きた動物、クローン動物、ファウンダー動物を含め、これらの処理の結果が本明細書に示される。特定の商業的に重要な遺伝子座における高効率の且つ正確な遺伝子編集が実現した。効率は、連結された選択マーカーなしにこれらの変化を生じさせることができる程十分に高い。
【０００６】
本発明の実施形態は、性成熟選択的神経内分泌遺伝子の不活性化を含むゲノムを含む遺伝子改変家畜動物であって、遺伝子の不活性化により動物が性的に成熟することが阻止されている家畜動物である。
【０００７】
本発明の実施形態は、性成熟選択的神経内分泌遺伝子の不活性化に関してヘテロ接合であるゲノムを含む遺伝子改変家畜動物であり、従って不活化遺伝子がホモ接合の子孫は性的に成熟することが阻止される。
【０００８】
本発明の実施形態は、家畜動物を作製する方法であり、この方法は、家畜細胞及び家畜胚からなる群から選択される生命体に対し、細胞の染色体標的部位に特異的に結合して二本鎖ＤＮＡ切断を生じさせることにより性成熟選択的神経内分泌遺伝子を不活性化する薬剤であって、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、及びリコンビナーゼ融合タンパク質からなる群から選択される薬剤を導入するステップを含む。
【０００９】
本発明の実施形態は、家畜動物を飼育する方法であり、この方法は、動物の性成熟のため動物に薬剤を投与するステップであって、薬剤が動物の遺伝的性成熟不能を補償するステップを含む。
【００１０】
以下の特許出願は本明細書によってあらゆる目的から参照により本明細書に援用される；矛盾が生じた場合、本明細書が優先する：米国特許出願公開第２０１０／０１４６６５５号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０１０５１４０号明細書、米国特許出願公開第２０１１／００５９１６０号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０１９７２９０号明細書、及び米国特許出願公開第２０１３／０１１７８７０号明細書。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】成熟制御のため遺伝子改変された動物の作製及び使用方法の説明図である。
【図２】塩基配列決定によるベルジャンブルー遺伝子移入の確認。和牛野生型ＧＤＦ８及びベルジャンブルー鋳型（ＢＢ−ＨＤＲ）の概略図を示す。５つのＰＣＲ陽性コロニーに対して相同性アームの外側に位置するプライマー（ｃ及びｄ）を使用してＰＣＲを実施し、続いてプライマーｂ’でクローニング及び配列決定を行った。野生型配列との比較から、５つのコロニー中４つにおいてベルジャンブルー対立遺伝子（ヘテロ接合）に特有の予想された１１塩基対欠失が明らかとなった。
【図３】ｍＲＮＡによりコードされるＴＡＬＥＮ及びｓｓＯＤＮを使用したある種から別の種への天然に存在する対立遺伝子の遺伝子移入。ピエモンテーゼミオスタチン対立遺伝子Ｃ３１３Ｙをオッサバウに遺伝子移入した。
【図４】標的遺伝子の改変。図は各々、線維芽細胞における特定の遺伝子座（例えば、ｓｓＩＬ２ＲＧ；「ｓｓ」はイノシシ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）、及び「ｂｔ」はウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ））を標的化した結果を示す。（挿入図）オリゴ鋳型の図、図中、陰影付きのボックスがＴＡＬＥＮ結合部位を表し、スペーサーは白色で示す。３日目及び１０日目にＲＦＬＰ分析によりＨＤＲを計測した（３日目％ＨＤＲ及び１０日目％ＨＤＲ）。各棒は３レプリケートの平均値及びＳＥＭを表す。
【図５】ＴＡＬＥＮ刺激性ＨＤＲ対立遺伝子の配列分析。ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ及びオリゴをトランスフェクトした細胞集団から得られた標的部位に隣接するＰＣＲアンプリコン（合計２００〜２５０ｂｐ）をＩＬＬＵＭＩＮＡシーケンシングにより配列決定した。総リード数は試料当たり１０，０００〜４００，０００の範囲であった。挿入（パネルａ）及びＳＮＰ対立遺伝子（パネルｂ）について、野生型リード数に対する意図した完全なＨＲリード数をプロットする。標的遺伝子座、時間点及びオリゴにＢＭが含まれたか否かを下に示す。パネルｃ）ｂｔＧＤＦ８及びｐ６５からのリードを標的ＳＮＰの組み込みに関してソートし、次に意図したもの（ｉＳＮＰ）とさらなる突然変異を有するもの（ｉＳＮＰ＋Ｍｕｔ）とに分類し、リード総数に対してプロットした。
【図６】ＤＡＺＬ及びＡＰＣのＨＤＲ対立遺伝子を有するクローンブタ。（Ａ）それぞれＤＡＺＬ改変及びＡＰＣ改変ランドレース及びオッサバウ線維芽細胞から得られたクローン子ブタのＲＦＬＰ分析。予想ＲＦＬＰ産物はＤＡＺＬファウンダーが３１２、２４２、及び７０ｂｐであり（白三角）、ＡＰＣが３１０、２２１、及び８９ｂｐである（黒三角）。ＷＴとＤＡＺＬファウンダーとの間の３１２−ｂｐバンドのサイズの違いが予想された欠失対立遺伝子を反映している。（Ｂ）８匹中３匹のＤＡＺＬファウンダー、及び６匹中６匹のＡＰＣファウンダーにおけるＨＤＲ対立遺伝子の存在を確認する配列分析。ドナー鋳型（ＨＤＲ）におけるＢＭを矢印で示し、挿入された塩基を四角で囲んだ。最上部のＷＴ配列中の太字テキストがＴＡＬＥＮ結合部位を示す。
【図７】ブタＧＰＲ５４の概略図及びノックアウトのための遺伝子ターゲティング戦略をパネルａに図示する。エクソン３を結合するように設計されたＴＡＬＥＮ（下線テキスト）を、未成熟終止コドン及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を導入するように設計されたオリゴヌクレオチド相同性鋳型（ＨＤＲ）とコトランスフェクトした。パネルｂ：２マイクログラムのＴＡＬＥＮコードｍＲＮＡ＋０．２ｎＭｏｌのＨＤＲ鋳型をブタ線維芽細胞にトランスフェクトし、細胞をコロニーとして成長させ、ＨｉｎｄＩＩＩ  ＲＦＬＰアッセイにより相同性依存性修復について分析した。ＰＣＲ結果を示す；各レーンが１つのコロニーを表す。２３１及び１５８ｂｐの切断産物が相同性依存性修復を示している。ＨＤＲ、ノックアウト対立遺伝子に関して、３８９ｂｐの親バンドを有するコロニーがヘテロ接合に分類され（白三角）、それを有しないコロニーがホモ接合に分類される（黒三角）。
【図８】パネルａ：テラピアキスペプチンをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド及び推定翻訳アミノ酸配列。ｋｉｓｓ遺伝子の構造上の構成は保存されており、一方がシグナルペプチドとキスペプチン前駆体の一部との両方をコードし、他方がキスペプチン−１０配列を含む前駆体の残りの部分をコードする２つのコードエクソンを含む。イントロンの位置を三角形グリフで示す。標的領域（４４２ｂｐ）のＰＣＲ増幅用フォワード及びリバースプライマーの位置を示す。２つの操作されたＴＡＬＥＮ対、Ｋｉｓｓ１．１ａ及びＫｉｓｓ１．１ｂに対する結合部位を黒色及び灰色のボックスで示す。パネルｂはキスペプチン−１０生物活性ペプチドの位置並びに各ｋｉｓｓ１．１ａ及び１ｂ  ＴＡＬＥＮ認識部位を示す標的ｋｉｓｓゲノム領域の概略図を示す。インデルの分析に使用されるＰＣＲ（４４２ｂｐ）及びｑＰＣＲプライマー対（１３８ｂｐアンプリコン）も同様に示す。
【図９】パネルａ：テラピアＧＰＲ−２４ｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド及び推定翻訳アミノ酸配列。ｋｉｓｓｒ遺伝子の構造上の構成は保存されており、５つのコードエクソンを含む。４つ全てのイントロンの位置を三角形グリフで示す。ＫｉｓｓＲＥ２及びＫｉｓｓＲＥ３  ＴＡＬＥＮ標的遺伝子座は、それぞれコードエクソン２（白色のボックス）及び３（灰色のボックス）に位置する。センス左及びアンチセンス右ＴＡＬＥＮ認識部位の位置をボックスで示す。パネルｂは、イントロン（ストローク付きゴールポスト）、ｋｉｓｓＲＥ２及びＲＥ３遺伝子座（白色のボックス）を含むコードエクソン２及び３（黒色の矢印）の位置を示すテラピアＧＰＲ−２４ゲノム領域の概略図を示す。ＰＣＲ及びｑＰＣＲ分析に使用したプライマーの位置及び対応するアンプリコンのサイズも同様に示す。
【図１０】ｋｉｓｓ及びｋｉｓｓＲＥ３遺伝子座を含む１００〜１２０ｂｐ  ｑＰＣＲ産物の融解分析。パネルａ及びｂは、ｋｉｓｓ１．１ａ及びｋｉｓｓＲＥ３  ＴＡＬＥＮ対で処理した魚の鰭から抽出したｇＤＮＡから生じたアンプリコンの融解曲線を示す。実線の矢印は、未処理の魚から得られた融解プロファイル（点線の矢印）と比べて有意に異なった融解プロファイルを指し（パネルａ）又は（パネルｂ）、候補突然変異魚ｋｉｓｓ＃４１、ＲＥ３＃１、４、６及び１１に対応する。パネルｃ：標的Ｋｉｓｓ遺伝子座を含む４４２ｂｐゲノム分節をＴＡＬＥＮ処理魚＃４１からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＴＯＰＯ  ２．１  ＴＡベクターにクローニングし、ダイレクトＱＰＣＲ分析用に形質転換体コロニーをハンドピッキングした。実線の矢印は、ｋｉｓｓ遺伝子座に異なる欠失を含むコロニーから得られた選択の融解プロファイルを指す。パネルｄ：クローニングした様々な突然変異をより分かり易く視覚化するため、本発明者らのＱＰＣＲコロニースクリーニングをＣｔ対融解温度の散布図にグラフ化した。ここで各クローンはデータプロット（ｘ，ｙ）により表され、ｘがそのＣｔを表し、且つｙがその融解温度を表す。このグラフは、魚ＲＥ３＃４から増幅した７０２ｂｐ  ＰＣＲ断片を含むコロニーを表す。野生型配列未満の融解温度は全て、標的部位に様々な欠失を有するｋｉｓｓＲＥ３アンプリコンを含んだ。Ｃｔ：サイクル閾値。
【図１１】ｋｉｓｓ遺伝子部位（ｋｉｓｓ１．１ａ）（パネルａ）及びｋｉｓｓＲ遺伝子部位（ＫｉｓｓＲＥ３）（パネルｂ）における操作されたＴＡＬＥＮにより誘導される体細胞突然変異の説明。各パネルの最上部に野生型配列が示され、センス左及びアンチセンス右ＴＡＬＥＮ認識エレメント部位を濃い灰色で強調した太字で示し、センススペーサーを下線テキストとして強調している。欠失はダッシュ記号として示し、挿入は薄い灰色で強調した小文字として示す。各インデル突然変異により生じた長さの正味の変化が各配列の右側にある（＋、挿入；−、欠失）。いくつかの変化は配列の欠失及び挿入の両方を有する。各突然変異対立遺伝子が単離された回数を括弧内に示す。
【図１２】パネルａ：系統ＫｉｓｓＲＥ３＃１１における２匹の同胞子孫由来のＰＣＲ産物の選択した塩基配列決定クロマトグラフィー。これらのグラフは、ｋｉｓｓＲＥ３突然変異体及びＷＴ対立遺伝子を同時に読み取る突然変異の存在を示している。ボックスは、突然変異体及びＷＴ対立遺伝子上の一致するヌクレオチドを示し、矢印は、配列が不一致となる位置、従ってこれらの欠失が始まる位置を指す。突然変異を特徴付けるため、本発明者らは、配列中のユニークなヌクレオチドリードのパターンを分析した（クロマトグラフがバックグラウンドより上に重複しないヌクレオチドリードを示すところ）。ＷＴ配列及び漸増されるサイズの欠失配列をシフトすることにより、本発明者らは、７ｐｂ及び５ｂｐの欠失がこれらのクロマトグラフ上の単一ヌクレオチドリードのパターンを再現することを見出した。パネルｂ：ｋｉｓｓ遺伝子（ｋｉｓｓ１．１ａ部位、上）及びｋｉｓｓｒ遺伝子（ＫｉｓｓＲＥ３部位、下）における操作されたＴＡＬＥＮにより誘導される全ての遺伝したインデル突然変異の説明。最上部に野生型配列が示され、センス左及びアンチセンス右ＴＡＬＥＮ認識エレメントを濃い灰色で強調した太字文字で示し、センススペーサーを下線テキストとして強調している。欠失はダッシュ記号として示す。各インデル突然変異により生じた長さの正味の変化が各配列の右側にある（−、欠失）。各突然変異対立遺伝子が単離された回数を括弧内に示す。パネルｃ：ｋｉｓｓ及びｋｉｓｓＲＥ３部位に認められた最も重大な傷害の説明。ｋｉｓｓ１．１ａ遺伝子座における１８ｎｔの欠失により６個のＡＡ（下線）が欠損し、そのうち３個がキスペプチン−１０活性ペプチドのコア配列（灰色で強調）由来である。ｋｉｓｓＲＥ３遺伝子座における７ｎｔの欠失（下線テキスト）により、直後に終止コドンが続く２個のＡＡ置換を伴い遺伝子産物が大幅に変化する。得られるタンパク質は、Ｃ末端が２１５ＡＡだけトランケートされている。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
環境及びエネルギー資源を保全する方法で家畜を生産することが望ましい。性的に未熟な動物は、概して成熟動物又は成熟中の動物と比べて体重１ポンド当たりに消費する食物が少ない。一般には、家畜は成熟するまで望ましいサイズに達しない。しかしながら、本明細書には、成熟前に望ましいサイズに成長することのできる動物が示される。
【００１３】
実際、本明細書には、動物が全く性的に成熟しない方法が記載される。この動物は春機発動期を経ることなしに通常の成熟年齢を超えて成長することができる。性的に未熟な動物は生殖不能である。それ故、有性生殖が費用対効果に優れ、また生殖補助技術（ＡＲＴ）さえも卵子及び精子の提供に成熟動物を必要とすることから、生殖不能動物の効率的な産生は大きな難題である。一部の実施形態では、家畜動物は春機発動期に入らず、動物を性的成熟期に入らせるよう特別に処理しない限り永久に性的に未熟なままである。かかる動物は、成熟を誘導する処理後に、ひいては繁殖させることができる。
【００１４】
成熟能を有しない家畜を作製する利点は、そうした家畜が生殖不可能なことにある。例えば、有性的に繁殖させた又は遺伝子改変された魚の場合、それが偶発的に野生に放たれる懸念が払拭される。同様に改変される他の動物もまた生殖不可能ということになるため、購入者によって動物が無制御に繁殖される懸念なしに価値のある遺伝形質を有する動物を販売することができる。さらに、多くの農業動物（例えば、乳牛、家禽、及び魚）において、不妊化により生産性とともに肉品質も増し、脂質含量、色素沈着及び肉質が改善し得る。乳牛という用語はウシの俗称である；ウシは大型の有蹄類であり、ウシ属（Ｂｏｓ）の中で最も広く普及している種である。乳牛又はウシは、オーロックス（Ｂｏｓ  ｐｒｉｍｉｇｅｎｉｕｓ）のメンバーを指す。また、魚の場合、生殖不能の魚は生殖腺発育や性分化よりむしろ成長のためにエネルギーを温存することにより、培養下でより高いパフォーマンスを示すはずである。現在、倍数性の操作（特に三倍性、一組の余分な染色体を加えるもの）による不妊化が、水産養殖生産者に利用可能な唯一つの商業的拡張性のある技術である。しかしながら、結果に一貫性がなく、この技術の有効性に関しては疑問視されている。加えて、一般に三倍体の誘導は処理された集団の生存及び／又はパフォーマンスに悪影響を及ぼすことが多い。また、この技術の適用は労働集約的であり、物流が複雑で、且つ高コストである。
【００１５】
本発明の実施形態は、性成熟選択的神経内分泌遺伝子の不活性化を含むゲノムを含む遺伝子改変家畜動物であって、この遺伝子の不活性化により動物が性的に成熟することが阻止されている家畜動物である。この遺伝子は性成熟プロセスを選択的に対象とし、動物がノックアウトされる場合、その動物は野生型動物と比べて、野生型動物が性成熟を経る時点まではサイズ及び体重で計測するときその生育の点で同等となる。遺伝子という用語は、遺伝の単位に対応した、位置を特定可能なゲノム配列領域であって、調節領域、転写領域、及び／又は他の機能性配列領域に関連するものを意味する。遺伝子という用語は、本明細書で使用されるとき、機能性配列領域及びタンパク質又は他の因子をコードする部分を含む。ノックアウトという用語は、本明細書で使用されるとき、得られるタンパク質の機能を不活性化するか、或いはタンパク質産物の産生をなくす直接的又は間接的な遺伝子破壊を指す。
【００１６】
遺伝子改変は特定の遺伝子又は遺伝子産物を標的とすることにより性成熟を阻止するものであるため、成熟に必要な因子は既知であり、概して供給することができる。
【００１７】
性成熟選択的神経内分泌遺伝子
動物の性的発育は、性成熟選択的神経内分泌遺伝子を遮断することにより阻止され得る。性的発育、加速成長、及び副腎成熟は、視床下部によりゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ１）が分泌され始めると惹起される。遺伝子ＧｎＲＨ１はＧｎＲＨ１１前駆体をコードする。哺乳動物では、概して９２アミノ酸プレプロホルモンから線状デカペプチド最終産物が合成される。ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ１）は、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）及びルリベリンとしても知られ、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）の放出に関与する。ＧｎＲＨ１はゴナドトロピン放出ホルモンファミリーに属する。本発明の実施形態は、家畜動物においてＧｎＲＨ１を不活性化することを含む。ゴナドトロピン放出ホルモン又は類似体を動物に投与することにより、動物を性的成熟に至らせ得る。複数の種にわたるＧｎＲＨ１の配列が知られており、例えば、ウシ（Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ）は遺伝子ＩＤ７６８３２５、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）は７７０１３４、又はイノシシ（ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）は３９７５１６である。ＧＰＲ５４は、キスペプチン受容体としても知られ（ＧｐＲ５４、ＫｉｓｓＲ、Ｋｉｓｓ１Ｒ、ｋｉｓｓＲなどとも称される）、ホルモンキスペプチン（旧称メタスチン）に結合する。キスペプチンは、ＫｉＳＳ１遺伝子（Ｋｉｓｓ、Ｋｉｓｓ１、ＫｉＳＳ、ｋｉｓｓ１などとも称される）から生じる産物である。キスペプチン−ＧＰＲ５４シグナル伝達は、ＧｎＲＨ１分泌の惹起において役割を担う。キスペプチンは、複数の機能を有するＲＦアミドニューロペプチドであり、様々な全身生理系に関与し、且つ生殖軸−脳、下垂体、生殖腺（ＢＰＧ）、及び副器官のあらゆるレベルで作用する。キスペプチンはＧｎＲＨ放出を直接刺激することができ（Ｍｅｓｓａｇｅｒら，２００５）、ステロイドホルモンの負及び正のフィードバックシグナルをＧｎＲＨニューロンに中継し、春機発動開始のゲートキーパーとして働き、且つ光周情報を中継し得る。
【００１８】
本発明の実施形態は、家畜動物において遺伝子ＧＰＲ５４及び／又はＫｉＳＳ１を不活性化することを含む。キスペプチンを投与することによりＫｉＳＳ１の欠損を補い、それにより性的成熟を達成し得る。或いは、ＫｉＳＳ１及び／又はＧＰＲ５４は抑制され、ゴナドトロピン放出ホルモンを動物に投与することにより動物を性的成熟に至らせ得る。別の実施形態は、ドミナントネガティブＧＰＲ５４を家畜動物のゲノムに挿入することによるキスペプチン−ＧＰＲ５４相互作用の不活性化である。ドミナントネガティブＧＰＲ５４の発現が性成熟の惹起を阻止する。ドミナントネガティブＧＰＲ５４の発現が受容体の下流のシグナル伝達を妨げ、シグナルの伝播及びＧｎＲＨ１の放出を阻止する。ＧＰＲ５４の配列は複数の種にわたり知られており、例えば、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）は８４６３４、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）は５６１８９８、又はイノシシ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）は７３３７０４である。Ｋｉｓｓ１の配列は複数の種にわたり知られており、例えば、ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）は６１５６１３、イノシシ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）は７３３７０４、又はヒツジ（Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ）は１００２９４５６２である。
【００１９】
Ｇｐｒ５４／Ｋｉｓｓ経路は多くの脊椎動物種の間で高度に保存されており、ヒト及びマウスにおいて春機発動期のゲートキーパーであることが分かっている（Ｓｅｍｉｎａｒａら，２００３）。ヒト及びマウスにおけるＧｐｒ５４及び／又はＫｉｓｓ遺伝子の不活性化に起因する不妊症が、異所性ＧｎＲＨ投与により回復している。マウス及びヒトにおける研究から、不活性化Ｇｐｒ５４が低ゴナドトロピン性性腺機能低下に起因して両性の不妊症を有効に引き起こすことが実証されている（ｄ’Ａｎｇｌｅｍｏｎｔ  ｄｅ  Ｔａｓｓｉｇｎｙら，２００７；ｄｅ  Ｒｏｕｘら，２００３）。Ｋｉｓｓ−Ｇｐｒ５４系は脊椎動物（Ｔｅｎａ−Ｓｅｍｐｅｒｅら，２０１２）、特に哺乳動物で１つのＫｉｓｓ及びＧｐｒ５４遺伝子のみが存在し、高度に保存されている。魚では複数の個別的なＫｉｓｓ遺伝子が同定されているが、受容体Ｇｐｒ５４は、調査された種の１つを除く全てにおいて１つの遺伝子によりコードされる。Ｇｐｒ５４突然変異を有するヒト及びマウスは正常レベルの視床下部ＧｎＲＨを示したことから、Ｋｉｓｓ／Ｇｐｒ５４シグナル伝達が血流中へのＧｎＲＨの放出に関与したことが示唆される（Ｓｅｍｉｎａｒａら，２００３）。これにより、Ｇｐｒ５４欠損対象にＧｎＲＨ又はゴナドトロピンを直接注射することでＫｉｓｓ／Ｇｐｒ５４シグナル伝達を迂回できる可能性が提示された。実際、Ｇｐｒ５４欠損ヒトの両方がＧｎＲＨ注射に反応しており（Ｓｅｍｉｎａｒａら，２００３）、下流の春機発動期シグナル伝達成分がインタクトなままであることを示している。
【００２０】
現在、生殖生物学文献に魚キスペプチンの役割の直接的なエビデンスはない。しかしながら、ｋｉｓｓペプチドの投与が、性的に成熟した雌ゼブラフィッシュ（Ｋｉｔａｈａｓｈｉら２００８）及びオレンジグルーパーの下垂体におけるゴナドトロピン遺伝子発現、又はヨーロピアンシーバス（Ｆｅｌｉｐら，２００８）及びキンギョにおけるＬＨ及びＦＳＨの分泌を刺激することが示されている。従って、理論上、ＧＰＲ５４及び／又はＫｉＳＳ１のノックアウトを有する性的に未熟で生殖不能な魚の妊孕性は、キスペプチン類似体（例えばキスペプチン１０）又はゴナドトロピン類似体（ＬＨ又はＦＳＨ）を外因的に送達することにより救出することができる。この考えによれば、ホモ接合ｋｉｓｓ又はｋｉｓｓ受容体ノックアウト種親は矯正ホルモンを投与すれば飼育下で繁殖させることができ、妊孕性の可逆的な制御を確実にし得る。このＫＯ種親からの子孫はこの改変を受け継ぐ。これは経済上及び環境上の利益を提供し得る。
【００２１】
性成熟選択的神経内分泌遺伝子は、いくつかの方法により不活性化することができる。遺伝子の不活性化は、タンパク質又はＲＮＡなど、遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を阻止する。ある種の不活性化には、性成熟因子をコードする配列及び／又は動物におけるその因子の発現に必要なプロモーター及び／又はオペレーターにおける１つ以上の塩基の挿入、欠失、又は置換が含まれる。不活性化は遺伝子のノックアウトであってもよい。遺伝子は、動物のゲノムからの遺伝子の少なくとも一部分の除去、その遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を阻止するような遺伝子の改変、干渉性ＲＮＡ（動物のゲノム中又は動物の複数の細胞中の遺伝子により発現する）、又は外来遺伝子によるドミナントネガティブ因子の発現によって不活性化され得る。
【００２２】
回復可能な不妊の別の系はＴａｃ３／ＴａｃＲ３（Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．，Ｂｏｕｌｉｇａｎｄ，Ｊ．，Ｆｒａｎｃｏｕ，Ｂ．，Ｒａｆｆｉｎ−Ｓａｎｓｏｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｇａｉｌｌｅｚ，Ｓ．，Ｊｅａｎｐｉｅｒｒｅ，Ｍ．，Ｇｒｙｎｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｋａｍｅｎｉｃｋｙ，Ｐ．，Ｃｈａｎｓｏｎ，Ｐ．，Ｂｒａｉｌｌｙ−Ｔａｂａｒｄ，Ｓ．，ら（２０１０）である。ＴＡＣ３及びＴＡＣＲ３欠損は、ヒトにおいて視床下部先天性低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を引き起こす。Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ９５，２２８７−２２９５。Ｋｉｓｓ／Ｇｐｒ５４と同様に、これらの遺伝子が欠損したヒトは低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を呈し、これは律動的ＧｎＲＨ治療により回復可能であった（Ｙｏｕｎｇら，２０１０）。Ｔａｃ及び／又はＴａｃ３は、本明細書に記載又は参照される方法を用いて不活性化し得る。
【００２３】
本発明の実施形態は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ヤギ、ヒツジ、魚、スイギュウ、エミュー、ウサギ、有蹄類、トリ、げっ歯類、及び家畜からなる群から選択される動物において、ＧｎＲＨ１、ＧＰＲ５４、ＫｉＳＳ１、Ｔａｃ及びＴａｃ３からなる群から選択される１つ以上の遺伝子を不活性化する方法を含む。遺伝子は、細胞及び／又は胚において、及びそれから生じる動物において不活性化され得る。本明細書には、様々な方法、例えば、ＴＡＬＥＮ又はジンクフィンガーヌクレアーゼを使用した細胞又は胚における遺伝子のノックアウト、及び代理母に細胞／胚をクローニング及び／又は移植することによるファウンダー動物の作製が記載される。
【００２４】
図１は本発明の実施形態を示し、ここではウシ細胞がインビトロで改変され、それを使用して子ウシがクローニングされる。子ウシは屠殺に好適な体重まで飼育されるか、又は子ウシを成熟期に入らせる因子、例えばゴナドトロピン類似体又はノックアウトされた遺伝因子を直接供給する因子によって処理され得る。
【００２５】
実施例１は、ＴＡＬＥＮシステムによって細胞に変化を作り出すための技術を記載する。実施例２は、表１の結果に用いた希釈クローン技術を記載する。実施例３は、突然変異検出技法及びＲＦＬＰ分析を記載する。実施例４（図２）は、ウシＧＤＦ８のエクソン−３に対する１１塩基対欠失の遺伝子移入を記載する（ベルジャンブルー突然変異）。図３は、ある種から別の種に対立遺伝子を遺伝子移入した同様の手法の結果を示す。実施例５は、その試験並びにオリゴＨＤＲを使用した雌ウシ細胞に対する対立遺伝子の遺伝子移入を示す。実施例５では、ＴＡＬＥＮ誘導性相同組換えにより、連結した選択マーカーの必要性がなくなった。単独でトランスフェクトしたとき、ｂｔＧＤＦ８．１  ＴＡＬＥＮ対は染色体の最大１６％を標的遺伝子座で切断した。１１ｂｐの欠失を有するスーパーコイル相同ＤＮＡ修復鋳型とのコトランスフェクションは、所望のイベントに関する選択なしに、３日目に０．５〜５％の遺伝子変換頻度（ＨＤＲ）をもたらした。ＰＣＲによりスクリーニングした単離コロニーの１．４％に遺伝子変換が同定された（ＰＣＲは成功した改変を同定する迅速な方法であった）。実施例６（図４）は、ブタ及びウシ線維芽細胞における４つの意図した遺伝子座の改変を示す。実施例７（図５）は、遺伝子ＡＰＣ、ＬＤＬＲ、ｐ５３、ｐ６５、及びｂｔＧＤＦ８に対して行った改変の分析を示す。実施例８（表１）は１０〜６４％（平均４５％）の意図したインデルの回復率を示し、コロニーの最大３２％が改変に関してホモ接合である。実施例９（図６）は、改変された欠失させた無精子症様（ＤＡＺＬ）及び改変された大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子を伴い作製したクローンブタを示す。実施例１０（図７）は、指示する遺伝子ターゲティング戦略に従い作製したＧＰＲ５４ノックアウトを示す；実施例１１は、ＧＰＲ５４ノックアウトを有する改変動物の作製方法を詳説する。実施例１２は、特注のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼで行った改変を記載する。
【００２６】
これらの結果から、連結された選択マーカーの助けなしに意図した遺伝子に改変を有効に作製する技術が実証された。改変を有する細胞は、動物のクローニングに使用することができる。意図した遺伝子改変は、例えば対立遺伝子の遺伝子移入のため、又は遺伝子を改変するために、特異性をもって制御することができる。改変は、例えば、遺伝子を破壊し又はそれをノックアウトするか、又は遺伝子の一部を置き換えて非機能性の遺伝子産物又は代替的な産物を作り出す欠失又は挿入であってもよい。
【００２７】
ＫｉＳＳ１及びＧｐＲ５４（ＧＰＲ５４、Ｋｉｓｓ受容体、ＫｉｓｓＲ、Ｋｉｓｓ１Ｒとも称される）のノックアウトを有する魚（テラピア）が作製されている。図８及び図９はＫＩＳＳ及びＧｐＲ５４の標的領域を示す。Ｋｉｓｓ遺伝子の構造上の構成は保存されており、一方がシグナルペプチドとキスペプチン前駆体の一部との両方をコードし、他方がキスペプチン−１０配列を含む前駆体の残りの部分をコードする２つのコードエクソンを含む。実施例１４は、Ｋｉｓｓ又はＫｉｓｓＲノックアウトを有するファウンダー魚の作製に使用したステップを詳説する。ＴＡＬＥＮに基づく技術を用いて遺伝子をノックアウトし、融解分析を用いてインデルを検出した（図１０）。９つの異なるヌクレオチド欠失、２つの挿入、及びヌクレオチド挿入と欠失との３つの組み合わせを含め、標的遺伝子の様々な改変が確認された（図１１）。塩基配列決定から、ノックアウトがこれらの改変の少なくとも一部によって生じ得ることが示された。生殖系列突然変異が確認された（図１２を参照）。Ｋｉｓｓ又はＫｉｓｓＲノックアウトを有するＦ１ヘテロ接合突然変異体を作出し、繁殖させた。現在、不活性化表現型を示すと予想されるＦ２世代を成長させているところである。
【００２８】
本明細書には、意図した部位にのみ変化を有するトランスジェニック動物を作製する方法が開示される。加えて、これらの方法は、意図した部位に特別に意図した変化を作り出すことができる。連結されたレポーター遺伝子の使用、又は連結されたポジティブ及びネガティブ選択遺伝子などの問題がもたらす他の変化を取り除く必要がなく、又はランダムな導入遺伝子の組込みが回避される。さらに、これらの方法をファウンダー世代で使用して、意図した部位に意図した変化のみを有する遺伝子改変動物を作製することができる。連結されていないマーカー遺伝子などが関わる他の方法もまた開示される。
【００２９】
標的ヌクレアーゼシステム
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）などのゲノム編集ツールは、多くの生物におけるバイオテクノロジー、遺伝子療法及び機能ゲノム研究の分野に影響を与えてきた。最近では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）が、相補的ＲＮＡ分子によってその標的部位に向けられている。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムはＲＥＧＥＮである。ｔｒａｃｒＲＮＡは別のかかるツールである。これらは標的ヌクレアーゼシステムの例である：これらのシステムは、ヌクレアーゼを標的部位に局在させるＤＮＡ結合メンバーを有する。次にこの部位がヌクレアーゼにより切断される。ＴＡＬＥＮ及びＺＦＮは、ＤＮＡ結合メンバーに融合したヌクレアーゼを有する。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲは標的ＤＮＡ上で互いを見つけ出すコグネイトである。ＤＮＡ結合メンバーは染色体ＤＮＡにコグネイト配列を有する。ＤＮＡ結合メンバーは典型的には、意図したコグネイト配列を考慮して、意図した部位又はその近傍で核酸分解作用を達成するように設計される。特定の実施形態は、限定なしに、ヌクレアーゼ再切断を最小限に抑える実施形態、正確に意図した残基でインデルを作製するための実施形態、及びＤＮＡ結合部位に遺伝子移入される対立遺伝子を置くことを含め、あらゆるかかるシステムを適用することが可能である。
【００３０】
ＴＡＬＥＮ
ＴＡＬＥＮは遺伝子操作ツールである。遺伝子の不活性化は、ＴＡＬＥＮの多くの使用法のうちの一つである。用語ＴＡＬＥＮは、本明細書で使用されるとき、広義であり、別のＴＡＬＥＮの助けを借りることなしに二本鎖ＤＮＡを切断することのできる単量体ＴＡＬＥＮを含む。用語ＴＡＬＥＮはまた、共同して同じ部位のＤＮＡを切断する働きをするように操作される一対のＴＡＬＥＮの一方又は両方のメンバーを指しても使用される。共同して働くＴＡＬＥＮは、ＤＮＡの利き手を参照して、左ＴＡＬＥＮ（ｌｅｆｔ−ＴＡＬＥＮ）及び右ＴＡＬＥＮ（ｒｉｇｈｔ−ＴＡＬＥＮ）と称され得る。
【００３１】
ＴＡＬＥＮ改変家畜を作製することの障壁の一つは、動物細胞に対する改変の作製効率が従来の最良事例でも僅か数パーセントに過ぎないことである。意図した部位における欠失又は挿入の達成は、実際には、外因性タンパク質を発現する又は内因性タンパク質の発現を停止させるなどの意図した効果を生じないこともあるため、必ずしも成功を意味するわけではない。低い効率であっても、遺伝子改変された下等動物、例えばショウジョウバエ又はマウスなどの作出には有用となり得る、なぜなら、こうした下等動物は生殖周期が短く多産であり、何百匹もの動物を作出、試験、及びスクリーニングして改変が成功した数匹があるかどうかを判定することができるためである。しかしながら、従来法で達成されるこうした効率レベルは、妊娠期間がはるかに長く且つ妊娠当たりの子孫数が比較的少ない家畜偶蹄類には適さない。本明細書によってあらゆる目的から参照により本明細書に援用される２０１２年２月２４日に出願された米国特許出願第１３／４０４，６６２号明細書「Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｎｉｍａｌｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍａｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ」（矛盾が生じた場合、本明細書が優先する）は、これらの従来法の制約に対処するある種の方法を提供している。
【００３２】
ＴＡＬＥＮを使用して家畜を改変することの別の障壁は、初代細胞でＴＡＬＥＮの媒介によりＤＮＡを改変することが、細胞の不安定性に起因して困難なことである。２０１１年２月１１日に出願された米国特許出願公開第２０１１／０１９７２９０号明細書は、こうした細胞の改変に有用な方法を提供しており、本明細書によってあらゆる目的から参照により本明細書に援用される；矛盾が生じた場合、本明細書が優先する。初代細胞という用語は、生きている動物から単離された細胞であって、組織から単離されて以来０〜１０回の複製を経た細胞を意味する。ＴＡＬＥＮを使用して遺伝子改変された偶蹄類初代細胞を作製し得る。このような改変は、クローニングによる遺伝子改変動物系統のファウンダーの作製に適している。本明細書にはまた、接合子又は胚の改変に用いられ得る直接的な胚注入も記載され、ここで改変された接合子又は胚は、ファウンダー動物系統の妊娠及び出産用代理母雌動物への移植に適している。
【００３３】
Ｍｉｌｌｅｒら（Ｍｉｌｌｅｒら（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９：１４３）は、ＴＡＬトランケーション変異体をＦｏｋＩヌクレアーゼの触媒ドメインに連結することによる部位特異的ヌクレアーゼ構成用のＴＡＬＥＮの作製を報告した。得られたＴＡＬＥＮは、不死化ヒト細胞において２つの主要な真核生物ＤＮＡ修復経路である非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同性指向型修復を介して遺伝子改変を誘導することが示された。ＴＡＬＥＮは特異的結合用に操作することができる。ＭｉｌｌｅｒらのＴＡＬＥＮの改良が、２０１２年８月２４日に出願された米国特許出願第１３／５９４，６９４号明細書に記載されている。特異的結合とは、この用語が生物学の技術分野で一般に用いられるとおり、非標的と比べて比較的高親和性で標的に結合する分子であって、概して複数の非共有結合性の相互作用、例えば、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などに関わる分子を指す。特異的結合相互作用は、抗体−抗原結合、酵素−基質結合、及び特異的に結合するタンパク質−受容体相互作用を特徴付ける。
【００３４】
ＴＡＬの暗号が報告されており（国際公開第２０１１／０７２２４６号パンフレット）、ここでは各ＤＮＡ結合リピートが標的ＤＮＡ配列における１つの塩基対の認識に関与する。残基が組み合わさってＤＮＡ配列を標的化し得る：（ａ）Ｃ／Ｇの認識にはＨＤ；（ｂ）Ａ／Ｔの認識にはＮＩ；（ｃ）Ｔ／Ａの認識にはＮＧ；（ｄ）Ｃ／Ｇ又はＡ／Ｔ又はＴ／Ａ又はＧ／Ｃの認識にはＮＳ；（ｅ）Ｇ／Ｃ又はＡ／Ｔの３０認識にはＮＮ；（ｆ）Ｔ／Ａの認識にはＩＧ；（ｇ）Ｃ／Ｇの認識にはＮ；（ｈ）Ｃ／Ｇ又はＴ／Ａの認識にはＨＧ；（ｉ）Ｔ／Ａの認識にはＨ；及び（ｊ）Ｇ／Ｃの認識にはＮＫ。端的には、ＴＡＬＥＮが結合する標的部位が決定され、ヌクレアーゼと標的部位を認識する一連のＲＶＤとを含む融合分子が作成される。結合すると、ヌクレアーゼがＤＮＡを切断し、細胞修復機構が切断末端に遺伝子改変を作製するよう働くことができるようになる。用語ＴＡＬＥＮは、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター結合ドメインとヌクレアーゼドメインとを含むタンパク質を意味し、それ自体機能性である単量体ＴＡＬＥＮ並びに別の単量体ＴＡＬＥＮとの二量体化が必要なその他の単量体ＴＡＬＥＮが含まれる。二量体化は、両方の単量体ＴＡＬＥＮが同じであるときホモ二量体ＴＡＬＥＮをもたらすことができ、又は単量体ＴＡＬＥＮが異なるときヘテロ二量体ＴＡＬＥＮをもたらすことができる。
【００３５】
一部の実施形態では、単量体ＴＡＬＥＮが使用され得る。ＴＡＬＥＮは、典型的にはスペーサーを含む二分の認識部位にわたる二量体として機能し、ここでは２つのＴＡＬエフェクタードメインが各々ＦｏｋＩ制限酵素の触媒ドメインに融合し、得られた各ＴＡＬＥＮに対するＤＮＡ認識部位はスペーサー配列によって分かれており、各ＴＡＬＥＮ単量体が認識部位に結合することによりＦｏｋＩが二量体化し、スペーサー内に二本鎖切断を作り出すことが可能になる。しかしながら単量体ＴＡＬＥＮもまた構築することができ、ここでは単一のＴＡＬエフェクターが、機能するのに二量体化する必要のないヌクレアーゼと融合する。一つのかかるヌクレアーゼは、例えば、２つの単量体が単一のポリペプチドとして発現するＦｏｋＩの単鎖変異体である。他の天然に存在する又は操作された単量体ヌクレアーゼもまた、この役割を果たすことができる。単量体ＴＡＬＥＮに使用されるＤＮＡ認識ドメインは、天然に存在するＴＡＬエフェクターに由来してもよい。或いは、ＤＮＡ認識ドメインは、特定のＤＮＡ標的を認識するように操作されてもよい。操作された単鎖ＴＡＬＥＮは、操作されたＤＮＡ認識ドメインを１つしか必要としないため、構築及び展開がより容易であり得る。二量体ＤＮＡ配列特異的ヌクレアーゼは、２つの異なるＤＮＡ結合ドメイン（例えば、１つがＴＡＬエフェクター結合ドメイン、及び１つが別の種類の分子に由来する結合ドメイン）を使用して生成することができる。ＴＡＬＥＮは、スペーサーを含む二分の認識部位にわたる二量体として機能し得る。このヌクレアーゼ構成もまた、例えば１つのＴＡＬＥＮ単量体と１つのジンクフィンガーヌクレアーゼ単量体とから生成された標的特異的ヌクレアーゼに用いることができる。そのような場合、ＴＡＬＥＮ及びジンクフィンガーヌクレアーゼ単量体のＤＮＡ認識部位は、適切な長さのスペーサーによって隔てられ得る。２つの単量体が結合することにより、ＦｏｋＩが二量体化し、スペーサー配列内に二本鎖切断を作り出すことが可能となり得る。ジンクフィンガー以外のＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ホメオドメイン、ｍｙｂリピート又はロイシンジッパーもまた、ＦｏｋＩと融合し、ＴＡＬＥＮ単量体と共に機能性ヌクレアーゼを作り出すパートナーとして働くことができる。
【００３６】
一部の実施形態では、ＴＡＬエフェクターを使用して他のタンパク質ドメイン（例えば非ヌクレアーゼタンパク質ドメイン）を特定のヌクレオチド配列に標的化させることができる。例えば、ＴＡＬエフェクターを、限定なしに、ＤＮＡ２０相互作用酵素（例えば、メチラーゼ、トポイソメラーゼ、インテグラーゼ、トランスポザーゼ、又はリガーゼ）、転写活性化因子若しくはリプレッサー、又はヒストンなどの他のタンパク質と相互作用するか若しくはそれを改変するタンパク質のタンパク質ドメインに連結することができる。かかるＴＡＬエフェクター融合物の応用には、例えば、エピジェネティック調節エレメントの作成又は改変、ＤＮＡにおける部位特異的挿入、欠失、又は修復の作製、遺伝子発現の制御、及びクロマチン構造の改変が含まれる。
【００３７】
標的配列のスペーサーを選択し、又は変化させて、ＴＡＬＥＮの特異性及び活性を調節することができる。スペーサー長さの柔軟性は、スペーサー長さを選択することにより特定の配列を高い特異性で標的化し得ることを示している。さらに、異なるスペーサー長さについて活性にばらつきがあることが観察されており、スペーサー長さを選択することにより所望のレベルのＴＡＬＥＮ活性を達成し得ることが示される。
【００３８】
用語ヌクレアーゼには、エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼが含まれる。用語エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子、好ましくはＤＮＡ分子内の核酸間における結合の加水分解（切断）の触媒能を有する任意の野生型又は変異型酵素を指す。エンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、ＦｏｋＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄｌＩＩ、ＮｏｔＩ、ＢｂｖＣｌ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、及びＡｌｗＩなどのＩＩ型制限エンドヌクレアーゼが挙げられる。エンドヌクレアーゼは、長さ約１２〜４５塩基対（ｂｐ）、より好ましくは１４〜４５ｂｐのポリヌクレオチド認識部位を典型的に有するとき、レアカットエンドヌクレアーゼもまた含む。レアカットエンドヌクレアーゼは規定の遺伝子座でＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導する。レアカットエンドヌクレアーゼは、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ、操作されたジンクフィンガードメインとＦｏｋＩなどの制限酵素の触媒ドメインとの融合により得られるキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）又は化学的エンドヌクレアーゼであってもよい。化学的エンドヌクレアーゼでは、化学的な又はペプチド性の切断因子が核酸のポリマーか、或いは特定の標的配列を認識する別のＤＮＡにコンジュゲートし、それにより切断活性を特定の配列に標的化する。化学的エンドヌクレアーゼには、特定のＤＮＡ配列と結合することが知られる、オルトフェナントロリン、ＤＮＡ切断分子、及び三本鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）のコンジュゲートのような合成ヌクレアーゼも包含される。かかる化学的エンドヌクレアーゼは、本発明に係る用語「エンドヌクレアーゼ」に含まれる。かかるエンドヌクレアーゼの例としては、Ｉ−Ｓｅｅ  Ｉ、Ｉ−Ｃｈｕ  Ｌ  Ｉ−Ｃｒｅ  Ｉ、Ｉ−Ｃｓｍ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｅｅ  Ｌ  ＰＩ−Ｔｔｉ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｔｕ  Ｉ、Ｉ−Ｃｅｕ  Ｉ、Ｉ−Ｓｅｅ  ＩＬ  １−Ｓｅｅ  ＩＩＩ、ＨＯ、ＰＩ−Ｃｉｖ  Ｉ、ＰＩ−Ｃｔｒ  Ｌ  ＰＩ−Ａａｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｂｓｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｄｈａ  Ｉ、ＰＩ−Ｄｒａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍａｖ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｅｈ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｆｕ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｆｌ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｇａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｇｏ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｉｎ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｋａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｌｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｍａ  Ｉ、ＰＩ−３０  Ｍｓｈ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｓｍ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｈ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｘｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｎｐｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｐｆｕ  Ｌ  ＰＩ−Ｒｍａ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｐｂ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｓｐ  Ｌ  ＰＩ−Ｆａｅ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｊａ  Ｉ、ＰＩ−Ｐｈｏ  Ｌ  ＰＩ−Ｔａｇ  Ｌ  ＰＩ−Ｔｈｙ  Ｉ、ＰＩ−Ｔｋｏ  Ｉ、ＰＩ−Ｔｓｐ  Ｉ、Ｉ−ＭｓｏＩが挙げられる。
【００３９】
ＴＡＬＥＮ又は他のツールによって作製される遺伝子改変は、例えば、挿入、欠失、外来核酸断片の挿入、及び置換からなるリストから選択され得る。用語「挿入」は、染色体への文字通りの挿入又は修復用鋳型としての外来配列の使用のいずれも意味して広義に使用される。一般には、標的ＤＮＡ部位が同定され、その部位に特異的に結合し得るＴＡＬＥＮ対が作成される。ＴＡＬＥＮは細胞又は胚へと、例えばタンパク質、ｍＲＮＡとして、又はＴＡＬＥＮをコードするベクターにより送達される。ＴＡＬＥＮがＤＮＡを切断して二本鎖切断が作製され、次にこれが修復されることで、多くの場合にインデルが作り出され、又は染色体に挿入されるか、或いは改変配列による切断の修復用鋳型として働く同伴する外来核酸に含まれる配列又は多型が組み込まれる。この鋳型駆動型の修復は染色体を変化させるのに有用なプロセスであり、細胞染色体に有効な変化をもたらす。
【００４０】
外来核酸という用語は、その核酸が天然で細胞中にある核酸配列と同じであるか、それとも異なるかに関わらず、細胞又は胚に加えられる核酸を意味する。核酸断片という用語は広義であり、染色体、発現カセット、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はそれらの一部分が含まれる。細胞又は胚は、例えば、家畜、偶蹄類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ウサギ、及び魚からなる群から選択され得る。家畜という用語は、食品又は生物学的材料用の商品として育てられる家畜化された動物を意味する。偶蹄類という用語は、各足に通常２本又は時に４本のこともある偶数の指を有する偶蹄目（Ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）の有蹄の哺乳動物を意味し、ウシ、シカ、ラクダ、カバ、ヒツジ、及びヤギが含まれる。
【００４１】
一部の実施形態は、遺伝子改変された家畜及び／又は偶蹄類を作製する組成物又は方法を含み、これは、家畜及び／又は偶蹄類の細胞又は胚にＴＡＬＥＮ対を導入するステップであって、ＴＡＬＥＮ対により細胞又は胚のＤＮＡに対しＴＡＬＥＮ対が特異的に結合する部位に遺伝子改変が作製されるステップと、その細胞から家畜動物／偶蹄類を産生するステップとを含む。細胞又は胚に対しては、例えば接合子、胚盤胞、又は胚への直接注入が用いられ得る。或いは、タンパク質、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、又はベクターを導入するための多くの公知の技法のいずれかを用いてＴＡＬＥＮ及び／又は他の因子を細胞に導入してもよい。遺伝子改変動物は胚又は細胞から公知の方法、例えば妊娠宿主への胚の移植、又は様々なクローニング法によって作製され得る。語句「細胞のＤＮＡに対する、ＴＡＬＥＮが特異的に結合する部位での遺伝子改変」などは、ＴＡＬＥＮがその標的部位に特異的に結合するときＴＡＬＥＮ上のヌクレアーゼによって切断される部位に遺伝子改変が作製されることを意味する。ヌクレアーゼはＴＡＬＥＮ対が結合するところを正確に切断するのでなく、むしろ２つの結合部位の間にある決められた部位で切断する。
【００４２】
一部の実施形態は、動物のクローニングに使用される細胞の組成物又は処理を含む。細胞は、家畜及び／又は偶蹄類細胞、培養細胞、初代細胞、初代体細胞、接合子、生殖細胞、始原生殖細胞、又は幹細胞であってもよい。例えば、実施形態は、遺伝子改変を生じさせる組成物又は方法であり、これは、培養物中の複数の初代細胞をＴＡＬＥＮタンパク質又は１つ若しくは複数のＴＡＬＥＮをコードする核酸に曝露するステップを含む。ＴＡＬＥＮはタンパク質として導入されるか、又は核酸断片として導入され、例えばベクター中のｍＲＮＡ又はＤＮＡ配列によりコードされ得る。
【００４３】
細胞の遺伝子改変にはレポーターの挿入も含まれ得る。レポーターは、例えば、蛍光マーカー、例えば緑色蛍光タンパク質及び黄色蛍光タンパク質であってもよい。レポーターは、選択マーカー、例えば、ピューロマイシン、ガンシクロビル、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ、Ｇ４１８、ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、又はキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）であってもよい。レポーター、選択マーカー、及び／又は１つ以上のＴＡＬＥＮ用のベクターは、プラスミド、トランスポゾン、トランスポザーゼ、ウイルス、又は例えば本明細書に詳述されるとおりの、他のベクターであってもよい。
【００４４】
ＴＡＬＥＮは複数のＤＮＡ部位を指向し得る。これらの部位は、数千個又は何千個もの塩基対によって隔てられていることもあり得る。ＤＮＡは細胞機構により再結合することができ、それにより、それらの部位の間にある領域全体の欠失が生じ得る。実施形態は、例えば、１〜５メガベース又は染色体の５０％〜８０％、又は約１００〜約１，０００，０００塩基対の距離を隔たっている部位を含む；当業者は、明示的に記載される範囲内にあるあらゆる範囲及び値、例えば、約１，０００〜約１０，０００塩基対又は約５００〜約５００，０００塩基対が企図されることを直ちに理解するであろう。或いは、外来性ＤＮＡの挿入のため、又は部位間のＤＮＡの鋳型駆動型修復のため、外来性ＤＮＡが細胞又は胚に加えられてもよい。複数の部位における改変を用いて、遺伝子改変された細胞、胚、偶蹄類、及び家畜を作製し得る。性成熟遺伝子又はそのシス作用因子を含め、完全な又は少なくとも部分的な欠失用の１つ以上の遺伝子を選択し得る。
【００４５】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインと融合することにより生成される人工的制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、所望のＤＮＡ配列を標的化するように操作することができ、これによりジンクフィンガーヌクレアーゼが複雑なゲノム内にあるユニーク配列を標的化することが可能になる。内在性ＤＮＡ修復機構を利用することにより、これらの試薬を使用して高等生物のゲノムを変化させることができる。ＺＦＮは、遺伝子を不活性化させる方法において用いられ得る。
【００４６】
ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは約３０アミノ酸を有し、安定な構造に折り畳まれている。各フィンガーは主としてＤＮＡ基質内のトリプレットに結合する。鍵となる位置にあるアミノ酸残基が、ＤＮＡ部位との配列特異的相互作用の大部分に寄与する。これらのアミノ酸を、残りのアミノ酸を維持して必要な構造を保ちながら変化させることができる。いくつかのドメインをタンデムに連結することにより、さらに長いＤＮＡ配列との結合が達成される。非特異的ＦｏｋＩ切断ドメイン（Ｎ）、転写活性化因子ドメイン（Ａ）、転写リプレッサードメイン（Ｒ）及びメチラーゼ（Ｍ）などの他の機能をＺＦＰと融合させて、それぞれＺＦＮ、ジンクフィンガー転写活性化因子（ＺＦＡ）、ジンクフィンガー転写リプレッサー（ＺＦＲ、及びジンクフィンガーメチラーゼ（ＺＦＭ）を形成することができる。遺伝子改変動物の作製にジンクフィンガー及びジンクフィンガーヌクレアーゼを使用するための材料及び方法は、例えば、米国特許第８，１０６，２５５号明細書、米国特許出願公開第２０１２０１９２２９８号明細書、米国特許出願公開第２０１１００２３１５９号明細書、及び米国特許出願公開第２０１１０２８１３０６号明細書に記載される。
【００４７】
鋳型有り及び鋳型無し修復
ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ及びリコンビナーゼ融合タンパク質は鋳型有り又は鋳型無しで用いられ得る。鋳型は、細胞修復機構のため細胞に付加される外来性ＤＮＡであり、ＤＮＡにおける二本鎖切断（ＤＳＢ）を修復するためのガイド（鋳型）として使用される。このプロセスは、概してＨＤＲ相同性指向型修復（ＨＤＲ）と称される。鋳型無しのプロセスには、ＤＳＢを作製し、且つ完全ではない修復を行う細胞機構を提供し、そのようにして挿入又は欠失（インデル）を作製することが関わる。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）と称される細胞経路は、典型的にはＤＳＢの鋳型無し修復を媒介する。用語ＮＨＥＪは、ＮＨＥＪが関わるか、それとも代替的な細胞経路が関わるかを問わず、一般にあらゆるかかる鋳型無し修復を指して用いられている。
【００４８】
ベクター及び核酸
ノックアウトを目的として、遺伝子の不活性化のため、遺伝子の発現を得るため、又は他の目的で、様々な核酸が偶蹄類細胞又は他の細胞に導入され得る。本明細書で使用されるとき、用語の核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び核酸類似体、及び二本鎖又は一本鎖（即ち、センス又はアンチセンス一本鎖）である核酸が含まれる。核酸類似体を塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格で改変することにより、例えば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、又は溶解度を向上させることができる。塩基部分の改変には、デオキシチミジンに対するデオキシウリジン、並びにデオキシシチジンに対する５−メチル−２’−デオキシシチジン及び５−ブロモ−２’−デオキシシチジンが含まれる。糖部分の改変には、２’−Ｏ−メチル糖又は２’−Ｏ−アリル糖を形成するリボース糖の２’ヒドロキシルの改変が含まれる。デオキシリボースリン酸骨格は、各塩基部分が６員モルホリノ環に連結されているモルホリノ核酸か、又はデオキシリン酸骨格が擬ペプチド骨格によって置換されており、且つ４塩基が維持されているペプチド核酸を生じるように改変することができる。Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｅｒ（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．７（３）：１８７；及びＨｙｒｕｐら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４：５を参照のこと。加えて、デオキシリン酸骨格は、例えば、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエート骨格、ホスホロアミダイト、又はアルキルリン酸トリエステル骨格で置換することができる。
【００４９】
標的核酸配列は、プロモーターなどの調節領域に作動可能に連結され得る。調節領域はブタ調節領域であってもよく、又は他の種由来であってもよい。本明細書で使用されるとき、作動可能に連結されるとは、標的核酸の転写を可能にし又は促進するような形で調節領域を核酸配列に対して位置させることを指す。
【００５０】
任意の種類のプロモーターを標的核酸配列に作動可能に連結させることができる。プロモーターの例としては、限定なしに、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、及び特定の刺激に応答性又は非応答性のプロモーターが挙げられる。好適な組織特異的プロモーターは、β細胞における核酸転写産物の選択的発現をもたらすことができ、例えばヒトインスリンプロモーターが挙げられる。他の組織特異的プロモーターは、例えば、肝実質細胞又は心臓組織における選択的発現をもたらすことができ、それぞれアルブミン又はαミオシン重鎖プロモーターを挙げることができる。他の実施形態では、顕著な組織特異性又は時間特異性のない核酸分子の発現を促進するプロモーターが用いられ得る（即ち、構成的プロモーター）。例えば、β−アクチンプロモーター、例えばニワトリβ−アクチン遺伝子プロモーター、ユビキチンプロモーター、ミニＣＡＧプロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、又は３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、並びにウイルスプロモーター、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターも使用し得る。一部の実施形態では、ニワトリβアクチン遺伝子プロモーターとＣＭＶエンハンサーとの融合物がプロモーターとして使用される。例えば、Ｘｕら（２００１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：５６３；及びＫｉｗａｋｉら（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：８２１を参照のこと。
【００５１】
核酸コンストラクトにおいて有用となり得るさらなる調節領域としては、限定はされないが、ポリアデニル化配列、翻訳制御配列（例えば、配列内リボソーム進入セグメント、ＩＲＥＳ）、エンハンサー、誘導性エレメント、又はイントロンが挙げられる。かかる調節領域は必須ではないが、転写、ｍＲＮＡの安定性、翻訳効率などに影響を及ぼすことにより発現を増加させ得る。かかる調節領域を必要に応じて核酸コンストラクトに含めることで、細胞における核酸の最適な発現を達成することができる。しかしながら、かかる追加的なエレメントなしに十分な発現が達成されることもある。
【００５２】
シグナルペプチド又は選択可能なマーカーをコードする核酸コンストラクトが用いられ得る。シグナルペプチドを使用して、コードされるポリペプチドを特定の細胞部位（例えば細胞表面）に仕向けることができる。選択可能なマーカーの非限定的な例としては、ピューロマイシン、ガンシクロビル、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ、Ｇ４１８、ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、及びキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が挙げられる。かかるマーカーは、培養下で安定な形質転換体を選択するのに有用である。他の選択可能なマーカーとしては、蛍光ポリペプチド、例えば緑色蛍光タンパク質又は黄色蛍光タンパク質が挙げられる。
【００５３】
一部の実施形態では、選択可能なマーカーをコードする配列には、例えばＣｒｅ又はＦｌｐなどのリコンビナーゼ認識配列が隣接し得る。例えば、選択可能なマーカーにはｌｏｘＰ認識部位（Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識される３４−ｂｐの認識部位）又はＦＲＴ認識部位が隣接してもよく、これによりコンストラクトからその選択可能なマーカーを切り出すことができる。Ｃｒｅ／ｌｏｘ技術のレビューに関するＯｒｂａｎ，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９２）８９：６８６１、及びＢｒａｎｄ  ａｎｄ  Ｄｙｍｅｃｋｉ，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ（２００４）６：７を参照のこと。選択可能なマーカー遺伝子によって分断されたＣｒｅ又はＦｌｐ活性化が可能な導入遺伝子を含むトランスポゾンを使用して、導入遺伝子の条件付き発現を含むトランスジェニック動物を得ることもできる。例えば、マーカー／導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターは、遍在性であっても、或いは組織特異的であってもよく、これがＦ０動物（例えばブタ）においてマーカーの遍在的又は組織特異的発現をもたらし得る。導入遺伝子の組織特異的活性化は、例えば、マーカーで分断された導入遺伝子を遍在的に発現するブタを、Ｃｒｅ又はＦｌｐを組織特異的な形で発現するブタと交配することによるか、又はマーカーで分断された導入遺伝子を組織特異的な形で発現するブタを、Ｃｒｅ又はＦｌｐリコンビナーゼを遍在的に発現するブタと交配することにより達成され得る。導入遺伝子の制御された発現又はマーカーの制御された切り出しにより、導入遺伝子の発現が可能となる。
【００５４】
一部の実施形態では、外来核酸はポリペプチドをコードする。ポリペプチドをコードする核酸配列は、続くコードされたポリペプチドの操作を容易にするように（例えば位置特定又は検出を容易にするように）設計された「タグ」をコードするタグ配列を含み得る。タグ配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列において、コードされたタグがポリペプチドのカルボキシル末端又はアミノ末端のいずれかに位置するように挿入することができる。コードされるタグの非限定的な例としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及びＦＬＡＧ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）が挙げられる。
【００５５】
核酸コンストラクトは、ＳｓｓＩ  ＣｐＧメチラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用してメチル化することができる。一般には、核酸コンストラクトが緩衝液中３７℃でＳ−アデノシルメチオニン及びＳｓｓＩ  ＣｐＧ−メチラーゼと共にインキュベートされ得る。コンストラクトを１単位のＨｉｎＰ１Ｉエンドヌクレアーゼと共に３７℃で１時間インキュベートし、アガロースゲル電気泳動によってアッセイすることにより、過剰メチル化を確認することができる。
【００５６】
核酸コンストラクトは、例えば、卵母細胞又は卵などの生殖細胞、前駆細胞、成体又は胚性幹細胞、始原生殖細胞、ＰＫ−１５細胞などの腎細胞、膵島細胞、β細胞、肝細胞、又は皮膚線維芽細胞などの線維芽細胞を含めた任意の種類の胚、胎仔、又は成体偶蹄類細胞に、様々な技術を使用して導入することができる。技術の非限定的な例としては、トランスポゾンシステム、細胞を感染させることのできる組換えウイルス、又はリポソームの使用、又は核酸を細胞に送達することが可能な他の非ウイルス性の方法、例えば、電気穿孔、マイクロインジェクション、若しくはリン酸カルシウム沈殿が挙げられる。
【００５７】
トランスポゾンシステムでは、核酸コンストラクトの転写単位、即ち外来核酸配列に作動可能に連結された調節領域に、トランスポゾンの逆向き反復配列が隣接する。いくつかのトランスポゾンシステム、例えば、スリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）（米国特許第６，６１３，７５２号明細書及び米国特許出願公開第２００５／０００３５４２号明細書を参照）；フロッグプリンス（Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ）（Ｍｉｓｋｅｙら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：６８７３）；Ｔｏｌ２（Ｋａｗａｋａｍｉ（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ７；ミノス（Ｍｉｎｏｓ）（Ｐａｖｌｏｐｏｕｌｏｓら（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ２）；Ｈｓｍａｒ１（Ｍｉｓｋｅｙら（２００７））Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２７：４５８９）；及びパスポート（Ｐａｓｓｐｏｒｔ）が、マウス、ヒト、及びブタ細胞を含め、細胞に核酸を導入するために開発されている。スリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）トランスポゾンは特に有用である。トランスポザーゼは、外来核酸と同じ核酸コンストラクトでコードされるタンパク質として送達されてもよく、別個の核酸コンストラクトで導入されてもよく、又はｍＲＮＡ（例えば、インビトロで転写及びキャッピングされるｍＲＮＡ）として提供されてもよい。
【００５８】
外来核酸の発現を維持し、且つ宿主遺伝子の望ましくない転写を阻害するため、インスレーターエレメントもまた核酸コンストラクトに含めることができる。例えば、米国特許出願公開第２００４／０２０３１５８号明細書を参照のこと。典型的には、インスレーターエレメントは転写単位の両側に隣接し、トランスポゾンの逆向き反復配列に対して内側にある。インスレーターエレメントの非限定的な例としては、マトリクス付着領域（ＭＡＲ）型インスレーターエレメント及び境界型インスレーターエレメントが挙げられる。例えば、米国特許第６，３９５，５４９号明細書、同第５，７３１，１７８号明細書、同第６，１００，４４８号明細書、及び同第５，６１０，０５３号明細書、及び米国特許出願公開第２００４／０２０３１５８号明細書を参照のこと。
【００５９】
核酸はベクターに組み込むことができる。ベクターは、担体から標的ＤＮＡに移動するように設計された任意の特定のＤＮＡセグメントを含む広義の用語である。ベクターは、発現ベクター、又はベクターシステムと称されることもあり、これは、ゲノム又は他の標的とされるＤＮＡ配列、例えばエピソーム、プラスミド、又はさらにはウイルス／ファージＤＮＡセグメントへのＤＮＡ挿入をもたらすのに必要な一組の構成要素である。動物における遺伝子デリバリーに使用されるベクターシステム、例えば、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス及び組込みファージウイルス）、及び非ウイルスベクター（例えばトランスポゾン）は、２つの基本的な構成要素を有する：１）ＤＮＡ（又はｃＤＮＡに逆転写されるＲＮＡ）を含むベクター、及び２）トランスポザーゼ、リコンビナーゼ、又はその他の、ベクター及びＤＮＡ標的配列の両方を認識し且つベクターを標的ＤＮＡ配列に挿入するインテグラーゼ酵素。ベクターは、ほとんどの場合に、１つ以上の発現制御配列を含む１つ以上の発現カセットを含み、ここで発現制御配列は、別のＤＮＡ配列又はｍＲＮＡのそれぞれ転写及び／又は翻訳を制御及び調節するＤＮＡ配列である。
【００６０】
多くの異なる種類のベクターが知られている。例えば、プラスミド及びウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターが知られている。哺乳類発現プラスミドは、典型的には複製起点、好適なプロモーター及び任意選択のエンハンサーを有し、また任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与・受容部位、転写終結配列、及び５’フランキング非転写配列も有する。ベクターの例としては、プラスミド（これはまた、別の種類のベクターの担体にもなり得る）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（例えば、改変ＨＩＶ−１、ＳＩＶ又はＦＩＶ）、レトロウイルス（例えば、ＡＳＶ、ＡＬＶ又はＭｏＭＬＶ）、及びトランスポゾン（例えば、スリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）、Ｐ−エレメント、Ｔｏｌ−２、フロッグプリンス（Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ）、ピギーバック（ｐｉｇｇｙＢａｃ））が挙げられる。
【００６１】
本明細書で使用されるとき、核酸という用語は、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成の（例えば、化学的に合成された）ＤＮＡ、並びに天然に存在する及び化学的に改変された核酸、例えば、合成塩基又は代替的な骨格を含めた、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方を指す。核酸分子は二本鎖又は一本鎖（即ち、センス又はアンチセンス一本鎖）であってよい。トランスジェニックという用語は、本明細書では広義に使用され、遺伝子操作技術を使用して遺伝物質が変化している遺伝子改変された生物又は遺伝子操作された生物を指す。従って、ノックアウト偶蹄類は、外来性の遺伝子又は核酸が動物又はその子孫で発現するか否かに関わらず、トランスジェニックである。
【００６２】
遺伝子改変動物
動物は、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、又は公知の種々のベクターを含む他の遺伝子操作ツールを使用して改変され得る。かかるツールによって作製された遺伝子改変には、遺伝子の不活性化が含まれ得る。遺伝子の不活性化という用語は、機能性遺伝子産物の形成を阻止することを指す。遺伝子産物は、それがその正常な（野生型の）機能を果たす場合に限り機能性である。動物を遺伝的に改変する材料及び方法は、２０１２年２月２４日に出願された米国特許出願第１３／４０４，６６２号明細書、２０１２年５月９日に出願された同第１３／４６７，５８８号明細書、及び２００９年１１月１０日に出願された同第１２／６２２，８８６号明細書（これらは本明細書によってあらゆる目的から参照により本明細書に援用される；矛盾が生じた場合、本明細書が優先する）にさらに詳述される。トランス作用性という用語は、異なる分子から標的遺伝子に（即ち分子間で）作用する過程を指す。トランス作用エレメントは、通常、遺伝子を含むＤＮＡ配列である。この遺伝子は、標的遺伝子の調節において使用されるタンパク質（又はマイクロＲＮＡ又は他の拡散性分子）をコードする。トランス作用遺伝子は標的遺伝子と同じ染色体上にあってもよいが、活性は中間タンパク質又はそれをコードするＲＮＡを介する。ドミナントネガティブを用いた遺伝子の不活性化に、概してトランス作用エレメントが関わる。シス調節又はシス作用という用語は、タンパク質又はＲＮＡをコードしない作用を意味する；遺伝子不活性化との関連において、これは概して、遺伝子のコード部分、又は機能性遺伝子の発現に必要なプロモーター及び／又はオペレーターの不活性化を意味する。
【００６３】
当該技術分野において公知の様々な技法を用いて遺伝子を不活性化することでノックアウト動物を作製し及び／又は動物に核酸コンストラクトを導入することにより、ファウンダー動物を産生して動物系統を作製することができ、ここでノックアウト又は核酸コンストラクトはゲノムに組み込まれる。かかる技法には、限定なしに、前核マイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号明細書）、生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子導入（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，６１４８−１６５２）、胚性幹細胞への遺伝子ターゲティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５６，３１３−３２１）、胚の電気穿孔（Ｌｏ（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，１８０３−１８１４）、精子媒介遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９，１４２３０−１４２３５；Ｌａｖｉｔｒａｎｏら（２００６）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．１８，１９−２３）、及び体細胞、例えば卵丘若しくは乳腺細胞、又は成体、胎仔、若しくは胚性幹細胞のインビトロ形質転換と、続く核移植（Ｗｉｌｍｕｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５，８１０−８１３；及びＷａｋａｙａｍａら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９４，３６９−３７４）が含まれる。前核マイクロインジェクション、精子媒介遺伝子導入、及び体細胞核移植が特に有用な技術である。ゲノム改変されている動物は、その生殖系列細胞を含め、その細胞の全てが遺伝子改変を有する動物である。その遺伝子改変がモザイクである動物を産生する方法が用いられる場合、動物は同系交配されてもよく、ゲノム改変されている子孫が選択され得る。例えば、その細胞が胚盤胞期に改変される場合、モザイク動物の作製にクローニングが用いられてもよく、又はゲノム改変は単一の細胞が改変されるときに起こり得る。改変されており、従って性的に成熟しない動物は、用いられる具体的な手法に応じて、改変に関してホモ接合又はヘテロ接合であってよい。特定の遺伝子がノックアウト改変により不活性化される場合、通常はホモ接合が必要となり得る。特定の遺伝子がＲＮＡ干渉又はドミナントネガティブ戦略により不活性化される場合、ヘテロ接合が適していることが多い。
【００６４】
典型的には、胚／接合子マイクロインジェクションでは、核酸コンストラクト又はｍＲＮＡが受精卵に導入される；精子頭部及び卵からの遺伝物質を含む前核が原形質内に見えることに伴い、１又は２細胞受精卵が使用される。前核期受精卵はインビトロ又はインビボで得る（即ち、ドナー動物の卵管から外科的に回収される）ことができる。インビトロ受精卵は、以下のとおり産生することができる。例えば、屠殺場でブタ卵巣を収集し、輸送中は２２〜２８℃に維持することができる。卵胞吸引のため卵巣を洗浄して単離することができ、４〜８ｍｍの範囲の卵胞を、１８ゲージ針を使用して真空下で５０ｍＬコニカル遠心管に吸引することができる。卵胞液及び吸引された卵母細胞を、市販のＴＬ−ＨＥＰＥＳ（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）を含むプレフィルターに通してリンスすることができる。卵丘塊に取り囲まれた卵母細胞を選択し、０．１ｍｇ／ｍＬシステイン、１０ｎｇ／ｍＬ上皮成長因子、１０％ブタ卵胞液、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、０．５ｍｇ／ｍｌ  ｃＡＭＰ、各１０ＩＵ／ｍＬの妊馬血清性ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）及びヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を補足したＴＣＭ−１９９卵母細胞成熟培地（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）に、３８．７℃及び５％ＣＯ２の加湿空気中約２２時間置くことができる。続いて、卵母細胞を新鮮なＴＣＭ−１９９成熟培地に移し（この培地はｃＡＭＰ、ＰＭＳＧ又はｈＣＧを含まない）、さらに２２時間インキュベートすることができる。０．１％ヒアルロニダーゼで１分間ボルテックスすることにより、成熟卵母細胞をその卵丘細胞から剥がし取ることができる。
【００６５】
ブタについては、成熟卵母細胞は、Ｍｉｎｉｔｕｂｅ  ５ウェル受精用ディッシュ中の５００μｌ  Ｍｉｎｉｔｕｂｅ  ＰＯＲＣＰＲＯ  ＩＶＦ培地システム（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）において受精させることができる。インビトロ受精（ＩＶＦ）に備え、収集したばかりの又は凍結された雄ブタ精液を洗浄し、４×１０５精子となるようにＰＯＲＣＰＲＯ  ＩＶＦ培地に再懸濁することができる。コンピュータ支援精液分析（ＳＰＥＲＭＶＩＳＩＯＮ，Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）によって精子濃度を分析することができる。最終的なインビトロ授精は、雄ブタに応じて、１０μｌ容量において約４０運動精子／卵母細胞の終濃度で実施することができる。全ての受精卵母細胞を５．０％ＣＯ２雰囲気下３８．７℃で６時間インキュベートする。授精６時間後、予定接合子をＮＣＳＵ−２３中で２回洗浄し、０．５ｍＬの同じ培地中に移すことができる。このシステムは、１０〜３０％の多精子受精率で、ほとんどの雄ブタにわたり常に２０〜３０％の胚盤胞を産生することができる。
【００６６】
線状化した核酸コンストラクト又はｍＲＮＡを前核の１つ又は細胞質に注入することができる。次に、注入された卵をレシピエント雌に（例えばレシピエント雌の卵管内に）移植し、そのレシピエント雌において発育させてトランスジェニック動物を産生することができる。詳細には、インビトロ受精胚を１５，０００×ｇで５分間遠心して脂質を沈降させ、前核の可視化を可能にすることができる。胚は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＦＥＭＴＯＪＥＴ注入器を使用して注入することができ、胚盤胞形成まで培養することができる。胚分割及び胚盤胞形成速度及び質を記録することができる。
【００６７】
胚は、非同期レシピエントの子宮に外科的に移植することができる。典型的には、１００〜２００個（例えば１５０〜２００個）の胚を、５．５インチＴＯＭＣＡＴ（登録商標）カテーテルを使用して卵管の膨大部−峡部接合部に置くことができる。手術後、妊娠のリアルタイム超音波検査を実施することができる。
【００６８】
体細胞核移植では、上記に記載する核酸コンストラクトを含むトランスジェニック偶蹄類細胞（例えば、トランスジェニックブタ細胞又はウシ細胞）、例えば、胚割球、胎仔線維芽細胞、成体耳線維芽細胞、又は顆粒膜細胞を除核卵母細胞に導入し、複合細胞を樹立することができる。卵母細胞は、極体近傍で部分的に透明帯を切開し、次に切開範囲で細胞質を押し出すことにより除核することができる。典型的には、鋭く面取りされた先端を有する注入ピペットを使用して、第２減数分裂で停止した除核卵母細胞にトランスジェニック細胞を注入する。ある種の慣例では、第２減数分裂で停止した卵母細胞が卵と呼ばれる。ブタ又はウシ胚を発生させた後（例えば、卵母細胞を融合して活性化させることによる）、活性化から約２０〜２４時間後、胚をレシピエント雌の卵管に移植する。例えば、Ｃｉｂｅｌｌｉら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０，１２５６−１２５８及び米国特許第６，５４８，７４１号明細書を参照のこと。ブタについては、レシピエント雌は、胚移植後約２０〜２１日で妊娠を検査することができる。
【００６９】
標準的な繁殖技法を用いることにより、最初のヘテロ接合体ファウンダー動物から、外来核酸に関してホモ接合の動物を作出することができる。しかしながらホモ接合である必要はないこともある。本明細書に記載されるトランスジェニックブタを、目的の他のブタと繁殖させることができる。
【００７０】
一部の実施形態では、目的の核酸及び選択可能なマーカーを別個のトランスポゾンに提供し、胚又は細胞のいずれかに等量ではなしに提供することができ、ここで選択可能なマーカーを含むトランスポゾンの量は、目的の核酸を含むトランスポゾンよりはるかに過剰（５〜１０倍過剰）である。目的の核酸を発現するトランスジェニック細胞又は動物は、選択可能なマーカーの存在及び発現に基づき単離することができる。トランスポゾンは正確な且つ関係付けのない形でゲノムに組み込まれるため（独立した転移イベント）、目的の核酸と選択可能なマーカーとが遺伝的に関係付けられることはなく、標準的な繁殖を通じた遺伝的分離によって容易に分けることができる。従って、公衆安全の観点からある種懸念される問題である、後続の世代における選択可能なマーカーの保持に制約されないトランスジェニック動物を産生することができる。
【００７１】
トランスジェニック動物の生成後、標準的な技法を用いて外来核酸の発現を評価することができる。初期スクリーニングは、サザンブロット解析によってコンストラクトの組込みが起こったかどうかを決定することにより達成できる。サザン解析の説明は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ；ＮＹの第９．３７〜９．５２節を参照のこと。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法もまた初期スクリーニングに用いることができる。ＰＣＲは、標的核酸を増幅する手法又は技法を指す。一般には、目的の領域の末端又はその外側からの配列情報を用いることにより、増幅しようとする鋳型の逆ストランドと同一の又は類似した配列のオリゴヌクレオチドプライマーが設計される。ＰＣＲを使用すると、全ゲノムＤＮＡ又は全細胞ＲＮＡの配列を含め、ＤＮＡ並びにＲＮＡの特定の配列を増幅することができる。プライマーは、典型的には１４〜４０ヌクレオチド長であるが、１０ヌクレオチド長から数百ヌクレオチド長の範囲に及び得る。ＰＣＲについては、例えばＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５に記載される。核酸はまた、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、自己持続配列複製法、又は核酸配列ベースの増幅によって増幅することもできる。例えば、Ｌｅｗｉｓ（１９９２）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ  １２，１；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４；及びＷｅｉｓｓ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１２９２を参照のこと。胚盤胞期には、ＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション及びスプリンカレットＰＣＲによる分析のため胚を個々に処理することができる（例えば、ＤｕｐｕｙらＰｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００２）９９：４４９５を参照のこと）。
【００７２】
トランスジェニックブタの組織においてポリペプチドをコードする核酸配列の発現は、例えば、動物から採取した組織試料のノーザンブロット解析、インサイチュハイブリダイゼーション分析、ウエスタン分析、酵素結合免疫吸着アッセイなどのイムノアッセイ、及び逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む技法を用いて評価することができる。
【００７３】
干渉性ＲＮＡ
様々な干渉性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）が公知である。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は相同遺伝子転写産物の配列特異的分解を誘導する。ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）はｄｓＲＮＡを小型の２１〜２３ヌクレオチドの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に代謝する。ＲＩＳＣは二本鎖ＲＮアーゼ（ｄｓＲＮアーゼ、例えばダイサー）及びｓｓＲＮアーゼ（例えば、アルゴノート２又はＡｇｏ２）を含む。ＲＩＳＣはアンチセンス鎖をガイドとして利用して切断可能な標的を見つけ出す。ｓｉＲＮＡ及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の両方が公知である。遺伝子改変動物において遺伝子を不活性化する方法は、標的遺伝子及び／又は核酸の発現が低下するような標的遺伝子及び／又は核酸に対するＲＮＡ干渉を誘導することを含む。
【００７４】
例えば、外来核酸配列は、ポリペプチドをコードする核酸に対してＲＮＡ干渉を誘導することができる。例えば、標的ＤＮＡと相同な二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用して当該ＤＮＡの発現を低下させることができる。ｓｉＲＮＡ用のコンストラクトは、例えば、Ｆｉｒｅら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６；Ｒｏｍａｎｏ  ａｎｄ  Ｍａｓｉｎｏ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：３３４３；Ｃｏｇｏｎｉら（１９９６）ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：３１５３；Ｃｏｇｏｎｉ  ａｎｄ  Ｍａｓｉｎｏ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ３９９：１６６；Ｍｉｓｑｕｉｔｔａ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１４５１；及びＫｅｎｎｅｒｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｈｅｗ（１９９８）Ｃｅｌｌ  ９５：１０１７に記載されるとおり作製することができる。ｓｈＲＮＡ用のコンストラクトは、ＭｃＩｎｔｙｒｅ  ａｎｄ  Ｆａｎｎｉｎｇ（２００６）ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１によって記載されるとおり作製することができる。一般に、ｓｈＲＮＡは相補領域を含む一本鎖ＲＮＡ分子として転写され、この相補領域がアニールして短鎖ヘアピンを形成し得る。
【００７５】
特定の遺伝子を標的とする単一の個々の機能性ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡが見つかる可能性は高い。例えば、ｓｉＲＮＡの特定の配列の予測可能性は約５０％であるが、多くの干渉性ＲＮＡを高い信頼性で作製することができ、そのうち少なくとも１つが有効であり得る。
【００７６】
実施形態は、性成熟選択的神経内分泌遺伝子を標的とするＲＮＡｉを発現するインビトロ細胞、インビボ細胞、及び遺伝子改変動物、例えば家畜動物を含む。ある実施形態は、Ｇｐｒ５４、Ｋｉｓｓ１、及びＧｎＲＨ１からなる群における遺伝子を標的とするＲＮＡｉである。ＲＮＡｉは、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＲＩＳＣ及びｍｉＲＮＡからなる群から選択され得る。
【００７７】
誘導性システム
誘導性システムを使用して性成熟遺伝子の発現を制御し得る。遺伝子の発現の時空間的制御を可能にする様々な誘導性システムが公知である。いくつかは、トランスジェニック動物においてインビボで機能性であることが分かっている。
【００７８】
誘導性システムの例は、核酸の転写調節に使用することのできるテトラサイクリン（ｔｅｔ）−オンプロモーターシステムである。このシステムでは、変異Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）が単純ヘルペスウイルスＶＰ１６トランス活性化因子タンパク質の活性化ドメインと融合してテトラサイクリン制御性転写活性化因子（ｔＴＡ）が作り出され、これはｔｅｔ又はドキシサイクリン（ｄｏｘ）によって調節される。抗生物質の非存在下では転写は最小限である一方、ｔｅｔ又はｄｏｘの存在下では転写が誘導される。代替的な誘導性システムとしては、エクジソン又はラパマイシンシステムが挙げられる。エクジソンは、エクジソン受容体とウルトラスピラクル遺伝子（ＵＳＰ）の産物とのヘテロ二量体により産生が制御される昆虫脱皮ホルモンである。発現は、エクジソン又はムリステロンＡなどのエクジソン類似体で処理することにより誘導される。誘導性システムを惹起するために動物に投与される薬剤は、誘導剤と称される。
【００７９】
より一般的に用いられている誘導性システムの中には、テトラサイクリン誘導性システム及びＣｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステム（構成的或いは誘導性）がある。テトラサイクリン誘導性システムには、テトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）／逆ｔＴＡ（ｒｔＴＡ）が関わる。これらのシステムをインビボで使用する方法には、２つの系統の遺伝子改変動物を作成することが関わる。一つの動物系統は、選択されたプロモーターの制御下で活性化因子（ｔＴＡ、ｒｔＴＡ、又はＣｒｅリコンビナーゼ）を発現する。もう一組のトランスジェニック動物はアクセプターを発現し、ここでは目的の遺伝子（又は改変しようとする遺伝子）の発現がｔＴＡ／ｒｔＴＡトランス活性化因子の標的配列の制御下にある（又はｌｏｘＰ配列が隣接している）。２つのマウス系を交配させると、遺伝子発現の制御が提供される。
【００８０】
テトラサイクリン依存性調節システム（ｔｅｔシステム）は、２つの成分、即ちテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ又はｒｔＴＡ）及び下流ｃＤＮＡの発現を制御するｔＴＡ／ｒｔＴＡ依存性プロモーターにテトラサイクリン依存的に頼る。テトラサイクリン又はその誘導体（ドキシサイクリンなど）が存在しない場合、ｔＴＡはｔｅｔＯ配列に結合し、ｔＴＡ依存性プロモーターの転写活性化を可能にする。しかしながら、ドキシサイクリンの存在下では、ｔＴＡはその標的と相互作用することができず、転写は起こらない。ｔＴＡを使用するｔｅｔシステムは、テトラサイクリン又はドキシサイクリンが転写下方制御を可能にするため、ｔｅｔ−ＯＦＦと呼ばれる。テトラサイクリン又はその誘導体の投与により、インビボで導入遺伝子発現を時間的に制御することが可能になる。ｒｔＴＡは、ドキシサイクリンの非存在下では機能しないが、トランス活性化にリガンドの存在を必要とするｔＴＡの変種である。従ってこのｔｅｔシステムはｔｅｔ−ＯＮと呼ばれる。ｔｅｔシステムは、例えば、レポーター遺伝子、癌遺伝子、又はシグナル伝達カスケードに関与するタンパク質をコードするいくつかの導入遺伝子の誘導性発現にインビボで使用されている。
【００８１】
Ｃｒｅ／ｌｏｘシステムはＣｒｅリコンビナーゼを使用し、Ｃｒｅリコンビナーゼは、２つの個別のＣｒｅ認識配列、即ちｌｏｘＰ部位の間で入れ換わることによる部位特異的組換えを触媒する。２つのｌｏｘＰ配列の間に導入されたＤＮＡ配列（フロックスされたＤＮＡと称される）がＣｒｅ媒介組換えにより切り出される。空間的制御（組織特異的又は細胞特異的プロモーターによる）又は時間的制御（誘導性システムによる）のいずれかを使用したトランスジェニック動物におけるＣｒｅ発現の制御により、２つのｌｏｘＰ部位間にあるＤＮＡの切り出しの制御がもたらされる。一つの応用は、条件的遺伝子不活性化（条件的ノックアウト）である。別の応用はタンパク質過剰発現であり、ここではフロックスされた終止コドンがプロモーター配列と目的のＤＮＡとの間に挿入される。遺伝子改変動物はＣｒｅが発現してフロックスされた終止コドンの切り出しが生じるまで導入遺伝子を発現しない。このシステムは組織特異的発癌及びＢリンパ球における制御された抗原（ａｎｔｉｇｅｎｅ）受容体発現に応用されている。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼもまた開発されている。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼは外因性リガンドの投与によってのみ活性化される。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼは、元のＣｒｅリコンビナーゼと特異的リガンド結合ドメインとを含む融合タンパク質である。Ｃｒｅリコンビナーゼの機能的活性は、融合タンパク質においてこの特異的ドメインに結合することが可能な外部リガンドに依存する。
【００８２】
実施形態は、誘導性システムの制御下にある性成熟選択的神経内分泌遺伝子を含むインビトロ細胞、インビボ細胞、及び遺伝子改変動物、例えば家畜動物を含む。動物の遺伝子改変はゲノム的又はモザイク的であり得る。ある実施形態は、誘導性システムの制御下にあるＧｐｒ５４、Ｋｉｓｓ１、及びＧｎＲＨ１からなる群の中の遺伝子である。誘導性システムは、例えば、Ｔｅｔ−Ｏｎ、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、Ｃｒｅ−ｌｏｘ、及びＨｉｆ１αからなる群から選択され得る。
【００８３】
ドミナントネガティブ
従って遺伝子は除去又はＲＮＡｉ抑制により不活性化されるのみならず、ドミナントネガティブ表現型の作成によっても不活性化され得る。ドミナントネガティブバージョンの遺伝子産物は、野生型表現型の１つ以上の機能を欠いており、同じ細胞で発現する正常な遺伝子産物の機能を優勢に妨げ、その結果、ドミナントネガティブ表現型が、通常遺伝子の正常な機能によって誘発されると予想される生理学的結果を有効に低下させ又は不活性化させる。例えば、多くのタンパク質の機能が他のタンパク質とのその相互作用を必要とする。かかる相互作用は多くの場合に、適切なタンパク質局在化、リガンド結合、タンパク質活性化、又は上流シグナルの下流伝達に必要とされる。多タンパク質複合体の成分の１つ以上の突然変異が、一つのこれらのプロセスを妨げ得る。従って、突然変異体形態のタンパク質の発現は、正常な遺伝子産物の存在下であってもタンパク質の機能を妨げ、ポイズン「ピル」又はギヤボックスに投げ込まれる「モンキーレンチ」として働き得る。ＧＰＣＲは７回膜貫通型（７ＴＭ）ドメイン受容体であり、これは、複数のステップ及びストリンジェントな品質管理システムで正しいＧＰＣＲの折り畳み及びターゲティングを確実にする厳密に調節された機構の中、生合成経路を通じて細胞表面に輸送される。ＧＰＣＲとアクセサリータンパク質又はシャペロンとの会合が、小胞体（ＥＲ）及びゴルジを通じた順方向の輸送に重要なステップである。ＧＰＣＲの生涯はＥＲで始まり、そこでＧＰＣＲが合成され、折り畳まれ、及び構築される。細胞表面に移動する間にＧＰＣＲは翻訳後修飾を受けて成熟した状態に達する。ＥＲは細胞の品質管理機構の一部を形成し、ここでは機能的に不活性な突然変異体ＧＰＣＲが細胞表面での発現を阻止され得る。
【００８４】
Ｘ連鎖性腎性尿崩症、家族性低カルシウム尿性高カルシウム血症、家族性グルココルチコイド欠損症又は低ゴナドトロピン性（ｈｙｐｏｇｏｎａｄｏｄｏｔｒｏｐｉｃ）性腺機能低下症などの病態は、ＥＲ又はゴルジ区画における細胞内貯留をもたらすＧＰＣＲの突然変異と関連付けられている。多くの場合に、細胞表面膜発現の欠損は、誤って折り畳まれた受容体がその野生型対応物に及ぼすドミナントネガティブ（ＤＮ）効果による、受容体の細胞内会合に起因する；このＤＮ効果は正常な受容体の細胞膜発現を制限し、又はさらには抑止し、ひいては機能喪失型疾患を引き起こし得る（Ｕｌｌｏａ−Ａｇｕｉｒｒｅら，２００４ａ）。
【００８５】
ＧｎＲＨＲにおける機能喪失型突然変異は、部分的又は完全な低ゴナドトロピン性性腺機能低下症（ＨＨ）、ＧｎＲＨに対する下垂体性腺刺激ホルモン産生細胞の応答不全（これは低下した又は無拍動性のゴナドトロピン放出をもたらす）及び生殖障害を引き起こし得る。受容体の誤った折り畳み及び結果として生じるゴナドトロピンホルモン放出ホルモン受容体（ＧｎＲＨＲ）の誤った経路輸送をＨＨ患者に引き起こす多数の突然変異が記載されている（Ｊａｎｏｖｉｃｋら，２００２；Ｌｅａｎｏｓ−Ｍｉｒａｎｄａら，２００２；Ｕｌｌｏａ−Ａｇｕｉｒｒｅら，２００４ｂ）。これらの突然変異の多くはＧｎＲＨＲ機能のドミナントネガティブとして働く（Ｐａｓｋ  ＡＪ  ｅｔ  ａｌ，２００５  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ；Ｂｒｏｔｈｅｒｓ  ＳＰ  ｅｔ  ａｌ，２００４  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ；Ｌｅａｎｏｓ−Ｍｉｒａｎｄａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，２００３  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ）。従って、ＤＮ  ＧｎＲＨＲ遺伝子の意図的な発現は、トランスジェニック動物に生殖不能を生じさせると予想される。
【００８６】
考察したとおり、ＧＰＲ５４は、春機発動期を惹起する生殖カスケードのゲートキーパーである。種々の動物試験から、キスペプチンと呼ばれる内因性ペプチドリガンドによるＧＰＲ５４の会合が視床下部ニューロンからのゴナドトロピン放出ホルモン放出を強力に刺激し、視床下部−下垂体−性腺軸を活性化することが実証されている。さらに、特発性低ゴナドトロピン性性腺機能低下症のヒト病態を表現型模写するＧＰＲ５４  ＫＯマウスを特徴付けることにより、生殖機能に対するＧＰＲ５４の重要な役割が確認された。現在ＧＰＣＲは、発現、輸送、リガンド結合、及びシグナル伝達の正確な時空間的調節を付与するＧＰＣＲ相互作用タンパク質（ＧＩＰ）で構成される多タンパク質複合体として存在すると認識されている。ＧＰＲ５４はこれらのＧＩＰと特異的に相互作用することが分かっている。トランケート型ＧＰＣＲスプライス変異体の大部分はドミナントネガティブ突然変異として働くため（Ｗｉｓｅ  ２０１２，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｉｇｎａｌ）、１つ以上の膜貫通ドメインが欠損したＧＰＲ５４の発現は内因性ＧＰＲ５４のプロセシング／輸送を破壊し、ひいてはその機能を妨げるものと予想される。従って、ＤＮ  ＧＰＲ５４遺伝子の意図的な発現は、トランスジェニック動物において生殖不能を生じさせるものと予想される。
【００８７】
ファウンダー動物、動物系統、形質、及び繁殖
ファウンダー動物は、クローニング及び本明細書に記載される他の方法により産生され得る。ファウンダーは、接合子又は初代細胞がホモ接合性の改変を受ける場合のように、遺伝子改変に関してホモ接合であり得る。同様に、ヘテロ接合のファウンダーもまた作製され得る。ファウンダーはゲノム改変されていてもよく、即ち、そのゲノムにおける細胞の全てが改変を受けていてもよい。ファウンダーは、ベクターが胚における複数の細胞のうちの１つに、典型的には胚盤胞期に導入されたときに起こり得るように、改変に関してモザイクであってもよい。モザイク動物の子孫を試験することにより、ゲノム改変されている子孫を同定し得る。有性生殖することができる、又は生殖補助技術により生殖できる動物であって、異種又はホモ接合体の子孫が一貫して改変を発現する動物のプールが作り出されたとき、動物系統が樹立される。
【００８８】
家畜においては、多くの対立遺伝子が、生産形質、体型形質、作業性形質、及び他の機能的形質などの様々な形質に関係付けられることが知られている。当業者はこれらの形質を観察し及び定量化することに慣れている、例えば、Ｖｉｓｓｃｈｅｒら，Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４０（１９９４）１２３−１３７、米国特許第７，７０９，２０６号明細書、米国特許出願公開第２００１／００１６３１５号明細書、米国特許出願公開第２０１１／００２３１４０号明細書、及び米国特許出願公開第２００５／０１５３３１７号明細書。動物系統は、生産形質、体型形質、作業性形質、繁殖形質、母性形質、及び耐病性形質からなる群の形質から選択される形質を含み得る。さらなる形質には、組換え遺伝子産物の発現が含まれる。
【００８９】
所望の１つ又は複数の形質を有する動物を改変してその性成熟を阻止し得る。動物は成熟するまでは生殖不能であるため、動物の伝播を制御する手段として性的成熟を調節することが可能である。従って、１つ以上の形質を有するように繁殖又は改変されている動物を、被提供者がその動物を繁殖させるリスクを減じて被提供者に提供し、その形質の価値を独占することができる。本発明の実施形態は、不活性化された性成熟遺伝子を含む改変によって動物のゲノムを遺伝的に改変することを含み、ここで野生型動物におけるその性成熟遺伝子は、性成熟選択的因子を発現する。実施形態は、化合物を投与することにより、遺伝子発現の喪失に起因する欠損を修復して動物における性成熟を誘導するように動物を処理することを含む。
【００９０】
性的成熟を誘導するために化合物の投与を必要とする動物の繁殖は、有利には処理施設で達成され得る。処理施設は、一貫した動物を効率的に産生するため十分に管理されるストックに対し標準化されたプロトコルを実現し得る。動物子孫は複数の飼育場所に供給され得る。従って農場及び農家（牧場及び牧場主を含む用語）は、特定の範囲の年齢及び／又は体重及び／又は形質を有する所望の数の子孫を注文し、所望の時期及び／又は場所に届けてもらうことができる。被提供者、例えば農家は、次にその動物を飼育し、所望に応じて市場に出すことができる。
【００９１】
実施形態は、不活性化された性成熟選択的神経内分泌遺伝子を有する遺伝子改変家畜動物を（例えば、１つ以上の場所に、複数の農場に）供給することを含む。実施形態は、約１日齢〜約１８０日齢の動物を含む。動物は１つ以上の形質（例えば所望の形質又は高価値の形質又は新規形質又は組換え形質を発現するもの）を有し得る。実施形態は、前記動物を提供すること及び／又は前記動物を繁殖させることをさらに含む。
【００９２】
リコンビナーゼ
本発明の実施形態は、１つ又は複数のＴＡＬＥＮ又はジンクフィンガーヌクレアーゼをリコンビナーゼ又はＤＮＡ組換えに関連する他のＤＮＡ結合タンパク質と共に投与することを含むリコンビナーゼは核酸断片とフィラメントを形成し、事実上、細胞ＤＮＡを探してその配列と実質的に相同なＤＮＡ配列を見つけ出す。ＴＡＬＥＮ−リコンビナーゼ実施形態の実施形態は、リコンビナーゼを、ＨＤＲ鋳型として働く核酸配列と組み合わせることを含む。ＨＤＲ鋳型配列は、ＴＡＬＥＮ／ＴＡＬＥＮ対による切断の標的となる部位と実質的な相同性を有する。本明細書に記載されるとおり、ＨＤＲ鋳型は、対立遺伝子の配置、インデルの作成、外来性ＤＮＡの挿入によるか又は他の変化によって、天然ＤＮＡに変化をもたらす。ＴＡＬＥＮは細胞又は胚に、本明細書に記載される方法によってタンパク質、ｍＲＮＡとして置かれるか、又はベクターを使用することにより置かれる。リコンビナーゼはＨＤＲ鋳型と組み合わさってフィラメントを形成し、細胞内に置かれる。リコンビナーゼ及び／又はリコンビナーゼと組み合わされるＨＤＲ鋳型は、細胞又は胚に、タンパク質、ｍＲＮＡとして置かれても、又はリコンビナーゼをコードするベクターで置かれてもよい。米国特許出願公開第２０１１／００５９１６０号明細書（米国特許出願第１２／８６９，２３２号明細書）の開示が、本明細書によってあらゆる目的から参照により本明細書に援用される；矛盾が生じた場合、本明細書が優先する。リコンビナーゼという用語は、細胞において、２つの比較的長いＤＮＡ鎖の間にある比較的短いＤＮＡ断片の接合を酵素的に触媒する遺伝子組換え酵素を指す。リコンビナーゼには、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、ＲｅｃＡ、ＲＡＤ５１、Ｃｒｅ、及びＦＬＰが含まれる。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位間のＤＮＡの部位特異的組換えを触媒するＰ１バクテリオファージ由来のＩ型トポイソメラーゼである。Ｈｉｎリコンビナーゼは、細菌のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）に見出される１９８アミノ酸から構成される２１ｋＤのタンパク質である。Ｈｉｎは、ＤＮＡ切断及び組換えの惹起を活性部位セリンに頼るＤＮＡインベルターゼのセリンリコンビナーゼファミリーに属する。ＲＡＤ５１はヒト遺伝子である。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、ＤＮＡ二本鎖切断の修復を助けるＲＡＤ５１タンパク質ファミリーのメンバーである。ＲＡＤ５１ファミリーメンバーは、細菌ＲｅｃＡ及び酵母Ｒａｄ５１遺伝子と相同である。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位が隣接する特定の配列を欠失させるため実験で使用される酵素である。ＦＬＰは、パン酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２μプラスミドから誘導されるフリッパーゼ組換え酵素（ＦＬＰ又はＦｌｐ）を指す。
【００９３】
ＲｅｃＡは、相同組換えによる二本鎖切断の修復中に鎖交換を触媒するそのリコンビナーゼ活性で知られている（ＭｃＧｒｅｗ，２００３）Ｒａｄｄｉｎｇら，１９８１；Ｓｅｉｔｚら，１９９８）。ＲｅｃＡはまた、例えばＬｅｘＡ及びλリプレッサータンパク質のタンパク質分解を触媒し、且つＤＮＡ依存性ＡＴＰアーゼ活性を有することも示されている。電離放射線又は他の何らかの傷害により二本鎖切断が起こった後、エキソヌクレアーゼがＤＮＡ末端５’から３’にチューバックし、それによりＤＮＡの一方の鎖が露出する（ＭｃＧｒｅｗ，２００３；Ｃｏｘ，１９９９）。一本鎖ＤＮＡは一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）により安定した状態になる。ＳＳＢの結合後、ＲｅｃＡが一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡを結合し、らせん状核タンパク質フィラメント（フィラメント又はシナプス前フィラメントと称される）を形成する。ＤＮＡ修復中、ＲｅｃＡの相同性検索機能がフィラメントを相同ＤＮＡに向かわせ、相同塩基対合及び鎖交換を触媒する。この結果、ＤＮＡヘテロ二重鎖が形成される。鎖の侵入後、ＤＮＡポリメラーゼが相同ＤＮＡ鋳型に基づきｓｓＤＮＡを伸長させてＤＮＡ切断を修復し、クロスオーバー構造又はホリデイジャンクションが形成される。ＲｅｃＡはまた、クロスオーバー構造の移動に関与する運動機能も示す（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，１９９９）。
【００９４】
リコンビナーゼ活性は複数の異なる機能を含む。例えば、リコンビナーゼ活性を有するポリペプチド配列は、一本鎖ＤＮＡに非配列特異的に結合して核タンパク質フィラメントを形成することができる。かかるリコンビナーゼ結合核タンパク質フィラメントは、二本鎖ＤＮＡ分子と非配列特異的な形で相互作用することができ、二本鎖分子においてフィラメントの配列と相同な配列を探し、かかる配列が見つかると、その二本鎖分子の一方の鎖を移動させてフィラメント内の配列と二本鎖分子の一方の鎖の相補配列との間の塩基対合を可能にする。かかるステップは、まとめて「シナプシス」と称される。
【００９５】
ＲｅｃＡ及びＲｅｃＡ様タンパク質（多くの真核生物種でＲａｄ５１と呼ばれる）は、様々な真核細胞系で遺伝子ターゲティング及び相同組換えを刺激することに関して研究されている。タバコ細胞では、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む細菌ＲｅｃＡの発現が相同組換え及び体細胞染色体内組換え（相同染色体間の組換え）によるマイトマイシンＣ誘発ＤＮＡ損傷の修復を３〜１０倍増加させる（Ｒｅｉｓｓ，１９９６）。タバコにおけるＮＬＳＲｅｃＡの発現はまた、姉妹染色分体交換も野生型レベルと比べて２．４倍刺激することができる（Ｒｅｉｓｓ，２０００）。体細胞哺乳類細胞では、ＮＬＳＲｅｃＡの過剰発現が相同組換えによる遺伝子ターゲティングを１０倍刺激する（Ｓｈｃｈｅｒｂａｋｏｖａ，２０００）。しかしながら、ヒト細胞では、ＲｅｃＡのヒト相同体ｈＲＡＤ５１の過剰発現は、抗生物質選択下で組換えを野生型レベルと比べて２〜３倍刺激するに過ぎない（Ｙａｎｅｚ，１９９９）。ゼブラフィッシュでは、ｓｓＤＮＡ−ＲｅｃＡフィラメントを直接注入することにより突然変異体形態の高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）が低頻度で修正された（Ｃｕｉ，２００３）。Ｒａｄ５１エピスタシス群のメンバーであるＲａｄ５２もまた、突然変異オリゴヌクレオチドを使用したゼブラフィッシュにおける一本鎖アニーリング及び低レベルの遺伝子不活性化を促進する（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，２００５）。まとめると、これらの研究は、ＲｅｃＡ又はＲａｄ５１の異所性発現が相同組換えの中程度の刺激をもたらすが、遺伝子ターゲティングに有用となるのに十分にレベルを増加させるものではないことを示している。
【００９６】
従ってリコンビナーゼ活性としては、限定はされないが、一本鎖ＤＮＡ結合、シナプシス、相同性検索、一本鎖ＤＮＡによる二重鎖侵入、ヘテロ二重鎖形成、ＡＴＰ加水分解及びタンパク質分解が挙げられる。原型リコンビナーゼは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＲｅｃＡタンパク質である。例えば、米国特許第４，８８８，２７４号明細書を参照のこと。原核生物ＲｅｃＡ様タンパク質もまた、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）及びプロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）の種で記載されている。サーマス・アクアチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来の耐熱性ＲｅｃＡタンパク質が、米国特許第５，５１０，４７３号明細書に記載されている。ＲｅｃＡのバクテリオファージＴ４相同体であるＵｖｓＸタンパク質が記載されている。変化したリコンビナーゼ活性を有するＲｅｃＡ突然変異体が、例えば米国特許第６，７７４，２１３号明細書；同第７，１７６，００７号明細書及び同第７，２９４，４９４号明細書に記載されている。植物ＲｅｃＡ相同体が、例えば米国特許第５，６７４，９９２号明細書；同第６，３８８，１６９号明細書及び同第６，８０９，１８３号明細書に記載されている。リコンビナーゼ活性を含むＲｅｃＡ断片が、例えば米国特許第５，７３１，４１１号明細書に記載されている。増強されたリコンビナーゼ活性を有する突然変異ＲｅｃＡタンパク質、例えばＲｅｃＡ８０３などが記載されている。例えば、Ｍａｄｉｒａｊｕら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：６５９２−６５９６を参照のこと。
【００９７】
同様にリコンビナーゼ活性を有するＲｅｃＡの真核生物相同体が、当初酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において同定されたＲａｄ５１タンパク質である。Ｂｉｓｈｏｐら，（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：４３９−５６及びＳｈｉｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ，（１９９２）Ｃｅｌｌ：４５７−７０  Ａｂｏｕｓｓｅｋｈｒａら，（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７２，３２２４−３２３４．  Ｂａｓｉｌｅら，（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，３２３５−３２４６を参照のこと。植物Ｒａｄ５１配列については、米国特許第６，５４１，６８４号明細書；同第６，７２０，４７８号明細書；同第６，９０５，８５７号明細書及び同第７，０３４，１１７号明細書に記載される。ＲｅｃＡと相同な別の酵母タンパク質は、Ｄｍｃ１タンパク質である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）以外の生物におけるＲｅｃＡ／Ｒａｄ５１相同体について記載されている。Ｍｏｒｉｔａら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６５７７−６５８０；Ｓｈｉｎｏｈａｒａら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．４：２３９−２４３；Ｈｅｙｅｒ（１９９４）Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ５０：２２３−２３３；Ｍａｅｓｈｉｍａら（１９９５）Ｇｅｎｅ  １６０：１９５−２００；米国特許第６，５４１，６８４号明細書及び同第６，９０５，８５７号明細書。
【００９８】
本明細書では、「ＲｅｃＡ」又は「ＲｅｃＡタンパク質」は、同じ機能、特に：（ｉ）続くＤＮＡポリメラーゼによる伸長のため、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをその相同標的上に適切に位置決めする能力；（ｉｉ）ＤＮＡ合成のため、トポロジー的に二重鎖核酸を調製する能力；及び、（ｉｉｉ）ＲｅｃＡ／オリゴヌクレオチド又はＲｅｃＡ／ポリヌクレオチド複合体が効率的に相補配列を見つけ出してそれと結合する能力のうち本質的に全て又はほとんどを有するＲｅｃＡ様組換えタンパク質のファミリーを指す。最も良く特徴付けられているＲｅｃＡタンパク質は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のものである；このタンパク質の元の対立形質に加え、いくつかの変異ＲｅｃＡ様タンパク質、例えばＲｅｃＡ８０３が同定されている。さらに、多くの生物が、例えば、酵母、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ヒトを含む哺乳動物、及び植物を含め、ＲｅｃＡ様鎖転移タンパク質を有する。これらのタンパク質には、例えば、Ｒｅｃ１、Ｒｅｃ２、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｒａｄ５１Ｅ、ＸＲＣＣ２及びＤＭＣ１が含まれる。組換えタンパク質の実施形態は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質である。或いは、ＲｅｃＡタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の変異ＲｅｃＡ−８０３タンパク質、別の細菌源由来のＲｅｃＡタンパク質又は別の生物由来の相同組換えタンパク質であってもよい。
【００９９】
リコンビナーゼ活性を有するタンパク質のさらなる記載は、例えば、Ｆｕｇｉｓａｗａら（１９８５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：７４７３；Ｈｓｉｅｈら（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４４：８８５；Ｈｓｉｅｈら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５０８９；Ｆｉｓｈｅｌら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３６８３；Ｃａｓｓｕｔｏら（１９８７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０８：１０；Ｇａｎｅａら（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：３１２４；Ｍｏｏｒｅら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．：１１１０８；Ｋｅｅｎｅら（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３０５７；Ｋｉｍｉｅｃ（１９８４）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．４８：６７５；Ｋｉｍｅｉｃ（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４４：５４５；Ｋｏｌｏｄｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：５５６０；Ｓｕｇｉｎｏら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３６８３；Ｈａｌｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２１４０３；Ｅｉｓｅｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：７４８１；ＭｃＣａｒｔｈｙら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８５４；及びＬｏｗｅｎｈａｕｐｔら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２０５６８（これらは参照により本明細書に援用される）に見出される。Ｂｒｅｎｄｅｌら（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．４４：５２８もまた参照のこと。
【０１００】
リコンビナーゼ活性を有するタンパク質の例には、ｒｅｃＡ、ｒｅｃＡ８０３、ｕｖｓＸ、及び他のｒｅｃＡ突然変異体及びｒｅｃＡ様リコンビナーゼ（Ｒｏｃａ（１９９０）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２５：４１５）、（Ｋｏｌｏｄｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：５５６０；Ｔｉｓｈｋｏｆｆら（１９９１）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２５９３）、ＲｕｖＣ（Ｄｕｎｄｅｒｄａｌｅら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：５０６）、ＤＳＴ２、ＫＥＭ１及びＸＲＮ１（Ｄｙｋｓｔｒａら（１９９１）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２５８３）、ＳＴＰａ／ＤＳＴ１（Ｃｌａｒｋら（１９９１）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２５７６）、ＨＰＰ−１（Ｍｏｏｒｅら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：９０６７）、他の真核生物リコンビナーゼ（Ｂｉｓｈｏｐら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：４３９；及びＳｈｉｎｏｈａｒａら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：４５７）（参照により本明細書に援用される）が含まれる。
【０１０１】
リコンビナーゼ活性を有するインビトロ進化タンパク質が、米国特許第６，６８６，５１５号明細書に記載されている。リコンビナーゼに関するさらなる文献としては、例えば、米国特許第７，７３２，５８５号明細書、同第７，３６１，６４１号明細書、同第７，１４４，７３４号明細書が挙げられる。リコンビナーゼのレビューについては、Ｃｏｘ（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：８１７３−８１８０を参照のこと。
【０１０２】
核タンパク質フィラメント、又は「フィラメント」が形成されてもよい。フィラメントという用語は、リコンビナーゼとの構造の形成に関連して、これらの分野の当業者には知られている用語である。次にそのように形成された核タンパク質フィラメントを、例えば、別の核酸と接触させるか又は細胞に導入することができる。核タンパク質フィラメントであって、リコンビナーゼ活性を有するポリペプチド配列と核酸とを含むフィラメントの形成方法は、当該技術分野において周知されている。例えば、Ｃｕｉら（２００３）Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：１７４−１８４及び米国特許第４，８８８，２７４号明細書；同第５，７６３，２４０号明細書；同第５，９４８，６５３号明細書及び同第７，１９９，２８１号明細書を参照のこと（これらの開示は、リコンビナーゼを核酸と結合させて核タンパク質フィラメントを形成する例示的な技法を開示する目的から参照により援用される）。
【０１０３】
一般に、リコンビナーゼ活性を有する分子を線状の一本鎖核酸に接触させる。線状の一本鎖核酸はプローブであってもよい。かかる一本鎖核酸の調製方法は公知である。反応混合物は、典型的にはマグネシウムイオンを含有する。場合により、反応混合物は緩衝され、場合によりまたＡＴＰ、ｄＡＴＰ又は非加水分解性ＡＴＰ類似体、例えばγ−チオ−ＡＴＰ（ＡＴＰ−γ−Ｓ）又はγ−チオ−ＧＴＰ（ＧＴＰ−γ−Ｓ）も含有する。反応混合物はまた、場合によりＡＴＰ生成系も含有する。二本鎖ＤＮＡ分子を、フィラメント形成の前に、或いはその最中に、（例えば熱又はアルカリによって）変性させることができる。リコンビナーゼと核酸とのモル比の最適化は、当該分野の技術の範囲内である。例えば、種々のリコンビナーゼ濃度の系列を一定量の核酸に添加し、アガロース又はアクリルアミドゲルにおける移動度によってフィラメント形成をアッセイすることができる。結合したタンパク質がポリヌクレオチドの電気泳動移動度を減速させるため、核酸の移動度の減速によってフィラメント形成が明らかとなる。移動度の減速に伴う最大減速度、又は最大核酸移動量のいずれかを使用して、最適なリコンビナーゼ：核酸比を指示することができる。タンパク質−ＤＮＡ会合はまた、ポリヌクレオチドがニトロセルロースに結合する能力を測定することによっても定量化できる。
【０１０４】
本明細書に示される特許出願、特許、刊行物、及び学術論文は、本明細書によってあらゆる目的から参照により本明細書に援用される；矛盾が生じた場合、本明細書が優先する。
【実施例】
【０１０５】
ＴＡＬＥＮの作製を含む一般的技法は、特に指示されない限り、概して米国特許出願公開第２０１３／０１１７８７０号明細書に記載される。これらの一般的技法の一部は本明細書にさらに記載される。また、実施例のうちのいくつかは詳細な実験データ及び結果を提供する。
【０１０６】
実施例１
ＴＡＬＥＮの設計及び生成；一般的条件。候補ＴＡＬＥＮ標的ＤＮＡ配列及びＲＶＤ配列を、オンラインツール「ＴＡＬエフェクターヌクレオチドターゲッター（ＴＡＬ  ＥＦＦＥＣＴＯＲ  ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＴＡＲＧＥＴＥＲ）」を使用して同定した。次にＴＡＬＥＮ  ＤＮＡトランスフェクション又はインビトロＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ転写用のプラスミドを、ｐＣＧＯＬＤＹＴＡＬＥＮ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ  ３８１４３）及びＲＣＩｓｃｒｉｐｔ−ＧＯＬＤＹＴＡＬＥＮ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ  ３８１４３）を最終送り先ベクターとして使用するゴールデンゲート（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ）構築プロトコルに従うことにより作製した（Ｃａｒｌｓｏｎ  ２０１２）。最終的なｐＣ−ＧｏｌｄｙＴＡＬＥＮベクターを、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＨＩＰＵＲＥ  ＰＬＡＳＭＩＤ  ＭＩＤＩＰＲＥＰキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用することにより調製し、使用前に配列決定した。ＱＩＡＰＲＥＰ  ＳＰＩＮ  ＭＩＮＩＰＲＥＰキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して調製した構築されたＲＣＩｓｃｒｉｐｔベクターをＳａｃＩにより線状化し、先に示したとおりｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）Ｔ３キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用したインビトロＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ転写の鋳型として使用した。以前記載されたとおりＣａｒｌｓｏｎ  ２０１２）、３’−０−Ｍｅｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ  ＲＮＡキャップ類似体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、５−メチルシチジン三リン酸  プソイドウリジン三リン酸（ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及びアデノシン三リン酸  グアノシン三リン酸からなるリボヌクレオチドカクテルを代用して改変ｍＲＮＡをＲＣＩＳｃｒｉｐｔ−ＧＯＬＤＹＴＡＬＥＮベクターから合成した。最終的なヌクレオチド反応濃度はキャップ類似体について６ｍＭ、グアノシン三リン酸について１．５ｍＭ、及び他のヌクレオチドについて７．５ｍＭである。得られたｍＲＮＡはＤＮアーゼ処理した後、ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ反応クリーンアップキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製した。
【０１０７】
組織培養及びトランスフェクション；一般的条件。ブタ又はウシ線維芽細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｉ．Ｕ．／ｍｌペニシリン及びストレプトマイシン、及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補足したＤＭＥＭ中に５％ＣＯ２において３７℃又は３０℃（指示するとおり）で維持した。トランスフェクションに関して、ＴＡＬＥＮ及びＨＤＲ鋳型は全て、特に指定されない限りＮｅｏｎトランスフェクションシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したトランスフェクションによって送達した。簡潔に言えば、１００％コンフルエンスに達した低継代オッサバウ、ランドレース、和牛、又はホルスタイン線維芽細胞を１：２に分け、翌日７０〜８０％コンフルエンスで回収した。各トランスフェクションには、プラスミドＤＮＡ又はｍＲＮＡ及びオリゴと混合した緩衝液「Ｒ」に懸濁された５００，０００〜６００，０００細胞が含まれ、以下のパラメータに従うことにより１００μｌティップを使用して電気穿孔した：入力電圧；１８００Ｖ；パルス幅；２０ｍｓ；及びパルス数；１。典型的には、各トランスフェクションにおいて２〜４μｇのＴＡＬＥＮ発現プラスミド又は１〜２μｇのＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ及び目的の遺伝子に特異的な２〜３μＭのオリゴをインキュベートした。それらの量からのずれは、図の脚注に示す。トランスフェクション後、細胞を６０：４０に分割して６ウェルディッシュの２つの別個のウェルに入れ、それぞれ３０℃又は３７℃のいずれかで３日間培養した。３日後、細胞集団を３７℃で少なくとも１０日目まで拡大し、編集の安定性を評価した。
【０１０８】
実施例２  希釈クローニング
指示するとおり、ある場合には希釈クローニングを使用した。トランスフェクションの３日後、５０〜２５０細胞を１０ｃｍディッシュに播種し、個々のコロニーが直径約５ｍｍに達するまで培養した。達した時点で、ＰＢＳ中に１：５（ｖｏｌ／ｖｏｌ）希釈した６ｍｌのＴｒｙｐＬＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加し、コロニーを吸引して２４ウェルディッシュウェルのウェルに移し、同じ条件下で培養した。コンフルエンスに達したコロニーを収集し、凍結保存用及び遺伝子タイピング用に分割した。試料調製：６ウェルディッシュのウェルから３日目及び１０日目のトランスフェクト細胞集団を収集し、１０〜３０％を、５０μｌの１×ＰＣＲ適合溶解緩衝液：２００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを補足したばかりの１０ｍＭ  トリス−Ｃｌ  ｐＨ８．０、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．４５％Ｔｒｙｔｏｎ  Ｘ−１００（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、０．４５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）中に再懸濁した。ライセートをサーマルサイクラーで以下のプログラムを使用して処理した：５５℃で６０分、９５℃で１５分。希釈クローニングからのコロニー試料を、２０〜３０μｌの溶解緩衝液を使用して上記のとおり処理した。
【０１０９】
実施例３  突然変異検出及びＲＦＬＰ分析
意図した部位に隣接したＰＣＲを、製造者の推奨に従い１μｌの細胞ライセートでＰＬＡＴＩＮＵＭ  ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼＨＩＦＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。集団における突然変異の頻度を、ＳＵＲＶＥＹＯＲ突然変異検出キット（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）で製造者の推奨に従い上記に記載したとおりのＰＣＲ産物１０ｕｌを使用して分析した。１０μｌの上記ＰＣＲ反応物に対し、指示する制限酵素を使用してＲＦＬＰ分析を実施した。ＳＵＲＶＥＹＯＲ及びＲＦＬＰ反応物を１０％ＴＢＥポリアクリルアミドゲル上で分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。バンドのデンシトメトリー計測を、ＩｍａｇｅＪを使用して実施し；及びＳＵＲＶＥＹＯＲ反応物の突然変異率をＧｕｓｃｈｉｎら２０１０に記載されるとおり計算した。ＲＦＬＰ断片の合計強度を親バンド＋ＲＦＬＰ断片の合計強度で除すことによりパーセントＨＤＲを計算した。ｍｌｏｘＰ挿入の分析のため、挿入部位に跨る小さいＰＣＲ産物を１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、挿入と野生型対立遺伝子をサイズで区別することができ、定量化した。コロニーのＲＦＬＰ分析も同様に処理し、但しＰＣＲ産物は１×ＭＹＴＡＱ  ＲＥＤ  Ｍｉｘ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）により増幅し、２．５％アガロースゲル上で分離させた。ＧＤＦ８  Ｇ９３８Ａのみの遺伝子移入についてクローンを分析するため（オリゴは新規ＲＦＬＰを欠いていた）、初めにヘテロ接合性遺伝子移入とホモ接合性遺伝子移入とを区別することができる３プライマーアッセイによりコロニーをスクリーニングした；簡潔に言えば、以下のプライマー及びプログラムを使用して、ブタ又はウシコロニーからのライセートを１×ＭＹＴＡＱ  ＲＥＤ  ＭＩＸ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を使用したＰＣＲにより分析した。ウシＧＤＦ８（外側Ｆ１：５’−ＣＣＴＴＧＡＧＧＴＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＴＴＴＧＧＧ（配列番号３）、外側Ｒ１：５’−ＴＴＣＡＣＣＡＧＡＡＧＡＣＡＡＧＧＡＧＡＡＴＴＧＣ（配列番号１）、内側Ｆ１：５’−ＴＡＡＧＧＣＣＡＡＴＴＡＣＴＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＣＴＡ（配列番号２）；及び３５サイクルの（９５℃、２０秒；６２℃、２０秒；７２℃、６０秒）。ブタＧＤＦ８：外側Ｆ１：５’−ＣＣＴＴＴＴＴＡＧＡＡＧＴＣＡＡＧＧＴＡＡＣＡＧＡＣＡＣ（配列番号４）、外側Ｒ１：５’−ＴＴＧＡＴＴＧＧＡＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＴＧＧＧＡＧ（配列番号５）、内側Ｆ１：５’−ＴＡＡＧＧＣＣＡＡＴＴＡＣＴＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＴＴＡ（配列番号６）；及び３５サイクルの（９５℃、２０秒；５８℃、２０秒；７２℃、６０秒）。候補からのアンプリコンを直接配列決定し及び／又はＴＯＰＯクローニング（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）してサンガー塩基配列決定法により配列決定した。ＴＡＬＥＮ媒介性ＨＤＲをＢＢ−ＨＤＲ鋳型で検出するため、１μｌ又は１：１０希釈の１μｌのいずれかのＰＣＲライセート（１，０００細胞／ｕｌ）をＰＣＲ反応物にＰＣＲプライマーｂｔ  ＧＤＦ８  ＢＢ  ５−１（プライマー「ｃ」）及びプライマー「ｃ」（ＢＢ−検出３−１−５’−ＧＣＡＴＣＧＡＧＡＴＴＣＴＧＴＣＡＣＡＡＴＣＡＡ（配列番号７））と共に添加し、１×ＭＹＴＡＱ  ＲＥＤ  ＭＩＸ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を使用して４０サイクル（９  ４５９  ５℃、２０秒；６６℃、２０秒；７２℃、６０秒）のＰＣＲに供した。上記のＰＣＲにより同定されたコロニー中のＨＤＲを確認するため、遺伝子座全体の増幅をプライマーｂｔ  ＧＤＦ８  ＢＢ  ５−１及びｂｔ  ＧＤＦ８  ＢＢ  ３−１で実施し、続いてＴＯＰＯクローニング（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び塩基配列決定法を行った。
【０１１０】
実施例４  塩基配列決定法によるベルジャンブルー遺伝子移入の確認
和牛野生型ＧＤＦ８及びベルジャンブルー鋳型（ＢＢ−ＨＤＲ）の概略図を図２に示す。５つのＰＣＲ陽性コロニーに対して相同性アーム（ｃ及びｄ）の外側に位置するプライマーを使用してＰＣＲを実施し、続いてプライマーｂ’でクローニング及び塩基配列決定を行った。野生型配列との比較から、５つのコロニー中４つにおいてベルジャンブルー対立遺伝子（ヘテロ接合）に特有の予想された１１塩基対欠失が明らかになる。ＴＡＬＥＮ（ｂｔＧＤＦ８３．１）及びｄｓＤＮＡ鋳型（ＢＢ−ＨＤＲ）を、１１塩基対欠失が二本鎖切断誘導性相同組換えによりウシＧＤＦ８のエクソン−３に導入されるように設計した（ベルジャンブルー突然変異）。ＢＢ−ＨＤＲ鋳型において左ＴＡＬＥＮの結合部位の半分は欠けており、従ってＴＡＬＥＮ切断に抵抗するはずである。ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイは、３７℃及び３０℃の両方でｂｔＧＤＦ８３．１  ＴＡＬＥＮの活性を実証した。対立遺伝子特異的ＰＣＲから、ＨＤＲ誘導がＴＡＬＥＮ及びＢＢ−ＨＤＲ鋳型のコトランスフェクションに依存したことが実証された。プライマーｃ及びｃ’を使用してＨＤＲ改変ＧＤＦ８対立遺伝子を特異的に検出するためＰＣＲアッセイを開発した。プライマーｃ’の３’末端は１１塩基対欠失にわたり、野生型対立遺伝子（ｗｔ）を増幅することができない。各ＰＣＲ反応には、陽性対照を含め、５００細胞当量を含めた。実験反応と対照反応との比較デンシトメトリーによりパーセントＨＤＲを決定した。
【０１１１】
実施例５  野生型和牛ウシにおける意図した遺伝子の正確な改変
野生型和牛ウシの遺伝子を、その遺伝子の標的領域に欠失を作製することにより改変した（１１ｂｐ欠失）。この改変により、和牛ウシはベルジャンブルーウシの対立遺伝子を有するようになった。単独でトランスフェクトしたとき、ｂｔＧＤＦ８．１  ＴＡＬＥＮ対は染色体の最大１６％を標的遺伝子座で切断した。ＴＡＬＥＮ（ｂｔＧＤＦ８３．１）及びｄｓＤＮＡ鋳型（ＢＢ−ＨＤＲ）を、ＤＳＢ誘導性相同組換えによりウシＧＤＦ８のエクソン−３に１１ｂｐ欠失が導入されるように設計した（ベルジャンブルー突然変異）。ＢＢ−ＨＤＲ鋳型において左ＴＡＬＥＮの結合部位の半分は欠けており、それがＢＢ−ＨＤＲ鋳型をＴＡＬＥＮ切断に対し抵抗性にした。ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイから、３７℃及び３０℃の両方におけるｂｔＧＤＦ８３．１  ＴＡＬＥＮの活性が実証された。このアッセイに使用したＰＣＲ産物は、プライマーｂ及びｂ’（図示せず）を使用して産生した。ＢＢ−ＨＤＲ鋳型はｂｔＧＤＦ８３．１活性の予想を混乱させ得るため、これらのレプリケートにＢＢ−ＨＤＲ鋳型は含めなかった。対立遺伝子特異的ＰＣＲから、ＨＤＲ誘導がＴＡＬＥＮ及びＢＢ−ＨＤＲ鋳型のコトランスフェクションに依存したことが実証された。プライマーｃ及びｃ’（図示せず）を使用してＨＤＲ改変ＧＤＦ８対立遺伝子を特異的に検出するためＰＣＲアッセイを開発した。プライマーｃ’の３’末端は１１ｂｐ欠失に跨ったため野生型対立遺伝子「ｗｔ」を増幅することができなかった。各ＰＣＲ反応には、陽性対照「Ｃ」を含め、５００細胞当量を含めた。実験反応と対照反応との比較デンシトメトリーによりパーセントＨＤＲを決定した。ベルジャンブルーウシ由来の１６２３ｂｐのＤＮＡ断片を有するスーパーコイルＤＮＡ鋳型とのコトランスフェクションは、所望イベントに関する選択なしに、３日目の半定量的ＰＣＲにより示唆されるとおり０．５％〜５％の遺伝子変換頻度（ＨＤＲ）をもたらした。これらの結果から、ＴＡＬＥＮを使用して家畜に外来核酸配列を、対立遺伝子を含め−及びマーカーなしに−有効に置くことができることが実証された。個々のコロニーに置かれた頻度を評価するため、トランスポゾン共選択戦略を実施してＤＮＡ配列決定用の個々のコロニーを単離及び拡大した。ベルジャンブルーウシ由来の鋳型を使用した遺伝子変換が、ＰＣＲにより調べた３６６個中５個のコロニーで検出された。ベルジャンブルーＨＤＲ鋳型の外側のプライマーによる増幅及び塩基配列決定により、コロニーのうち４個で予想された１１ｂｐ欠失の存在が確認された。
【０１１２】
第２の反復実験を実施したところ一貫した結果となり、試験した全コロニーの約１％が二対立遺伝子変換に関して陽性であり、且つ試験した全コロニーの約０．５％〜約１％が対立遺伝子変換に関してヘテロ接合であった。
【０１１３】
同様に、オリゴＨＤＲを使用して対立遺伝子をブタ（オッサバウ）細胞にも導入した。ｍＲＮＡによりコードされるＴＡＬＥＮと一本鎖オリゴヌクレオチドとの組み合わせで細胞を改変し、ある種で天然に存在する対立遺伝子を別の種に置いた（種間移動）。ピエモンテーゼＧＤＦ８  ＳＮＰ  Ｃ３１３Ｙを例として選択し、オッサバウ（Ｏｓｓａｂｏｗ）ブタ細胞に導入した。いずれの段階においても、これらの細胞にマーカーは使用しなかった。ブタ細胞とウシ細胞との間に０．４ｎｍｏｌ  ｓｓＯＤＮでＨＤＲの同様のピークが観察された（図示せず）が、しかしながらオッサバウ線維芽細胞では、より高濃度のｓｓＯＤＮによってもＨＤＲは消失しなかった。
【０１１４】
実施例６  意図した標的における改変
一貫した標的遺伝子改変を作製した。図４を参照すると、各図が、プラスミドＤＮＡ又はｍＲＮＡとして送達されるオリゴドナー鋳型及びＴＡＬＥＮを使用して線維芽細胞における特定の遺伝子座（例えば、ｓｓＩＬ２ＲＧ；「ｓｓ」はイノシシ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）、及び「ｂｔ」はウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ））を標的化した結果を示す。（挿入図）オリゴ鋳型の図、図中、陰影付きのボックスがＴＡＬＥＮ結合部位を表し、スペーサーは白色で示す。各オリゴは、ＲＦＬＰ分析用の新規制限部位を導入する４ｂｐの挿入（ｉｎｓ４）又は欠失（ｄｅｌ４）のいずれかを含む。推定的な遮断突然変異（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ：ＢＭ）が、保存されている−１チミジン（ＴＡＬＥＮ結合部位に対して）を指示されるヌクレオチドに置換する。線維芽細胞にＴＡＬＥＮコードプラスミド（３μｇ）又はｍＲＮＡ（１μｇ）のいずれかを３μＭのそのコグネイトオリゴ相同鋳型と共にトランスフェクトした。次に細胞を３７℃又は３０℃で３日間インキュベートした後、３７℃で１０日目まで拡大した。３日目にＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイによりＴＡＬＥＮ活性を計測し（３日目Ｓｕｒｖｅｙｏｒ）、３日目及び１０日目にＲＦＬＰ分析によりＨＤＲを計測した（３日目％ＨＤＲ及び１０日目％ＨＤＲ）。各棒は３レプリケートの平均値及びＳＥＭを表す。標的化した遺伝子座の各々は成功裏に改変された。
【０１１５】
実施例７  遺伝子に意図した変化を作製するための高い効率
図５は、遺伝子ＡＰＣ、ＬＤＬＲ、ｐ５３、ｐ６５、及びｂｔＧＤＦ８に作製された変化の分析を示す。ある場合には挿入が意図された一方、他の場合にはＳＮＰが意図された。変化は、上記に記載したとおり、ＴＡＬＥＮ及びＨＤＲ鋳型で作製した。野生型リード数に対する意図した完全なＨＲリード数をプロットする：挿入（パネルａ）及びＳＮＰ対立遺伝子（パネルｂ）。ＴＡＬＥＮ刺激性ＨＤＲ対立遺伝子の配列分析を行った。ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ及びオリゴをトランスフェクトした細胞集団から得られた標的部位に隣接するＰＣＲアンプリコン（合計２００〜２５０ｂｐ）をＩＬＬＵＭＩＮＡシーケンシングにより配列決定した。総リード数は試料当たり１０，０００〜４００，０００の範囲であった。標的遺伝子座、時間点及びオリゴにＢＭが含まれたか否かを下に示す。パネルｃは、標的ＳＮＰの組み込みに関してソートし、次に意図したもの（ｉＳＮＰ）とさらなる突然変異を有するもの（ｉＳＮＰ＋Ｍｕｔ）とに分類し、リード総数に対してプロットしたときの、ｂｔＧＤＦ８及びｐ６５のリードを示す。従って、単一のＳＮＰのみが意図された場合、指示するとおり、さらなる変化もまた存在した。
【０１１６】
実施例８  ＨＤＲ対立遺伝子を有するコロニーの回復頻度
ＨＤＲ対立遺伝子を有するコロニーの回復頻度と題される表１は、８個の別個の遺伝子座における意図したインデル対立遺伝子に関する細胞の約６５０個のコロニーの分析結果を掲載する。この分析から１０〜６４％（平均４５％）の回復率が明らかとなり、最大３２％のコロニーが編集に関してホモ接合であった。変化は、上記に記載したとおり、ＴＡＬＥＮ及びＨＤＲ鋳型で作製した。コロニーは薬物選択なしに希釈クローニングによって得た。
【０１１７】
実施例９  ＤＡＺＬ及びＡＰＣのＨＤＲ対立遺伝子を有するクローンブタ
図６は、クローン動物の遺伝子解析を示す。無精子症様（ＤＡＺＬ）及び大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）において欠失させた、ブタゲノムにおける２つの遺伝子編集された遺伝子座を選択した。ＤＡＺＬ又はＡＰＣのＨＤＲ又はＮＨＥＪ編集対立遺伝子で処理した培養細胞のコロニーを、クロマチントランスファー（ＣＴ）によるクローニング用にプールした。各プールが３つのトランスファーから２つの妊娠を生じ、そのうち各１つの妊娠を出産に至らせた。ＤＡＺＬ改変細胞から合計８匹の子ブタが生まれ、その各々が、ＨＤＲ対立遺伝子（ファウンダー１６５０、１６５１、及び１６５７）又はＮＨＥＪから生じた欠失のいずれか（図５Ａ）と一致する選択コロニーの遺伝子型を反映した。ＤＡＺＬ子ブタ（ファウンダー１６５５〜１６５７）のうち３匹は死産であった。ＡＰＣ改変細胞からの６匹の子ブタのうち１匹は死産であり、３匹は１週間以内に死亡し、もう１匹は３週間以降に死亡し、ファウンダー１６６１のみが生き残った。遺伝子型と生存との間に相関がないことから、早期死亡が遺伝子編集よりむしろクローニングに関係したことが示唆される。６匹全てのＡＰＣ子ブタが意図したＨＤＲ編集対立遺伝子に関してヘテロ接合であり、１匹を除く全ての子ブタが第２の対立遺伝子に３ｂｐのインフレーム挿入又は欠失のいずれかを有した（図６ａ及び図６ｂ）。残りの動物は、精子形成停止（ＤＡＺＬ−／−ファウンダー）又は結腸癌の発生（ＡＰＣ＋／−ファウンダー）の表現型分析のため飼育されている。図６を参照すると、（ａ）それぞれＤＡＺＬ改変及びＡＰＣ改変ランドレース及びオッサバウ線維芽細胞から得られたクローン子ブタのＲＦＬＰ分析。予想ＲＦＬＰ産物はＤＡＺＬファウンダーが３１２、２４２、及び７０ｂｐであり（白三角）、ＡＰＣが３１０、２２１、及び８９ｂｐである（黒三角）。ＷＴとＤＡＺＬファウンダーとの間の３１２ｂｐバンドのサイズの違いが、予想された欠失対立遺伝子を反映している。（ｂ）８匹中３匹のＤＡＺＬファウンダー、及び６匹中６匹のＡＰＣファウンダーにおけるＨＤＲ対立遺伝子の存在を確認する配列分析。ドナー鋳型（ＨＤＲ）におけるＢＭを矢印で示し、挿入された塩基を四角で囲んだ。最上部のＷＴ配列中の太字テキストがＴＡＬＥＮ結合部位を示す。
【０１１８】
実施例１０  ＧＰＲ５４ノックアウト
図７は、指示される遺伝子ターゲティング戦略に従い作製されたＧＰＲ５４ノックアウトを示す。ブタエクソン３を結合するように設計されたＴＡＬＥＮ（下線テキスト）を、未成熟終止コドン（ボックス）及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を導入するように設計されたオリゴヌクレオチド相同性鋳型（ＨＤＲ）とコトランスフェクトした。パネルｂに示す実験結果について、２マイクログラムのＴＡＬＥＮコードｍＲＮＡ＋０．２ｎＭｏｌ（２ｕＭ）のＨＤＲ鋳型を、ＮＥＯＮヌクレオフェクションシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を以下の設定で使用してブタ線維芽細胞５００，０００ブタ線維芽細胞にトランスフェクトした：１パルス、１８００ｖ；２０ｍｓ幅及び１００ｕｌティップ。ＴＡＬＥＮに曝露した後、細胞を３０℃で３日間成長させ、細胞を計数し、密度１〜２０細胞／ｃｍ２の範囲で１０ｃｍディッシュに播いた。直径３〜４ｍｍの個々のコロニーが観察できるようになるまで細胞を１０〜１５日間培養した。コロニーをｐ−２００ピペッターで穏やかな吸引下に吸引し、５００ｕｌの成長培地を含む２４ウェルプレートのウェルに吐き出した（Ｃａｒｌｓｏｎ，２０１１）。特徴がはっきりしたコロニー（約１０〜３０／プレート）を有するプレートをコロニー吸引に選択し、複数のコロニーから細胞を吸引する可能性を抑えた。コロニーが２４ウェルディッシュにおいて７０〜９０パーセントコンフルエントに達した時点で、一部分をＲＦＬＰ分析用に回収し、残りは凍結保存した。パネルｂ）合計９６個のコロニーを、ＨｉｎｄＩＩＩ  ＲＦＬＰアッセイにより相同性依存性修復について分析した。各コロニーからのＤＮＡを、標的部位に隣接するＰＣＲプライマー；フォワード（５’−ａａｇｇａｔｇｔｃａｇｃａｃｃｔｃｔｃｔｇｇｇ（配列番号８））及びリバース（５’−ＡＣＣＣＡＣＣＣＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＴＡＣＣＡ（配列番号９））を含むＰＣＲ反応物に加えた。ＰＣＲ産物（３８９ｂｐ）をＨｉｎｄＩＩＩ制限消化に加え、２．５％アガロースゲル上で分離した。各レーンが１つのコロニーを表す。２３１及び１５８ｂｐの切断産物が相同性依存性修復を示している。ＨＤＲ、ノックアウト対立遺伝子に関して、３８９ｂｐの親バンドを有するコロニーがヘテロ接合に分類され（白三角）、それを有しないコロニーがホモ接合に分類される（黒三角）。こうした細胞、又はこの技術により調製された細胞は、従来技術を使用した動物のクローニングに使用され得る。
【０１１９】
実施例１１  処理なしには成熟しない家畜の作出
ウシ、ブタ、及びニワトリを含め、１つ又は複数のＧＰＲ５４ノックアウトを有する家畜を調製する。前述の例は、一つのかかる方法を詳述する。以下の具体的な方法はブタについて記載する；当業者は、本願を読んだ後、これらの実験を他の家畜に応用することができるであろう。Ｇｐｒ５４用のＴＡＬＥＮを開発し、それを使用してヘテロ接合及びホモ接合ノックアウト細胞株を生成する。雄及び雌Ｇｐｒ５４−／−及び／又はＧｐｒ５４＋／−に関してヘテロ接合の細胞株を異種交配により生じたＧｐｒ５４−／−動物と使用して妊娠を確立する。Ｇｐｒ５４−／−動物の発育及び妊孕性を評価する。Ｇｐｒ５４−／−動物が春機発動期に進まず、実際に生殖不能であることが確定した後、ゴナドトロピン又はＧｎＲＨ１処理により妊孕性を復元する実験を実施する。効率的なＴＡＬＥＮを生成し、突然変異体コロニーを単離し、細胞又は接合子からトランスジェニック動物を産生するという既に実証された能力は、本明細書において十分に裏付けられており、またＴａｎら，ＰＮＡＳ，１１０（４１）：１６５２６−１６５３１，２０１３も参照されたい。
【０１２０】
Ｇｐｒ５４−／−雄及び雌ブタの生成。実施例１１で生成したとおりの、両方の対立遺伝子のフレームシフト突然変異を有する１０匹の二対立遺伝子ＫＯ雄及び雌クローンを、ＳＣＮＴによるクローニング用にプールする。２ラウンドのクローニング（各３つのトランスファー）を実施する。第１ラウンドでＧｐｒ５４−／−によって妊娠が確立されない場合、ラウンド２のクローニングをＧｐｒ５４＋／−細胞で実施する。Ｇｐｒ５４の標的領域の塩基配列を決定することにより、得られた動物の遺伝子型を特徴付ける。クローニングにＧｐｒ５４＋／−細胞が使用された場合、異種交配によってＧｐｒ５４−／−動物を生成する。
【０１２１】
Ｇｐｒ５４−／−ブタの表現型評価。テストステロン及びＦＳＨの血清レベル（性別当たり≧３）を、Ｇｐｒ５４−／−動物及び年齢適合対照について５ヶ月齢から始めて９ヶ月齢まで、２週間毎に定量化する。雄は精巣サイズを計測し、体重及び年齢に対してプロットする。９ヶ月齢で、Ｇｐｒ５４−／−ブタが野生型対照動物から外れ、春機発動期を示す血清学又は挙動形質（即ちマウンティング）を示さない場合、適格な病理学者による生殖器の解剖学的及び組織学的評価のため少なくとも１匹の雄及び雌を犠牲にする。
【０１２２】
Ｇｐｒ５４−／−ブタにおける妊孕性を回復するための手段としてのＧｎＲＨ１注入の評価。ゴナドトロピン又は律動的ＧｎＲＨ１療法は、ＨＨを有するヒトにおいて妊孕性を回復するのに有効な治療である（Ｂｕｃｈｔｅｒ，Ｄ．，Ｂｅｈｒｅ，Ｈ．Ｍ．，Ｋｌｉｅｓｃｈ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｎｉｅｓｃｈｌａｇ，Ｅ．（１９９８）．「低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有する男性に対する有効な治療としての律動的ＧｎＲＨ１又はヒト絨毛性ゴナドトロピン／ヒト閉経期ゴナドトロピン：４２症例のレビュー（Ｐｕｌｓａｔｉｌｅ  ＧｎＲＨ１  ｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ／ｈｕｍａｎ  ｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ  ａｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｍｅｎ  ｗｉｔｈ  ｈｙｐｏｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｃ  ｈｙｐｏｇｏｎａｄｉｓｍ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ４２  ｃａｓｅｓ）」．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １３９，２９８−３０３。いずれの療法も、成功させるには、血清ＬＨ及びテストステロンのレベルに陽性反応が現れなければならない。従って、本発明者らは、不妊のＧｐｒ５４−／−がＧｎＲＨ１注入に応答してＬＨ又はテストステロンに典型的なスパイクを示すかどうかを決定しようと試みる（Ｗｉｓｅ，Ｔ．，Ｚａｎｅｌｌａ，Ｅ．Ｌ．，Ｌｕｎｓｔｒａ，Ｄ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｆｏｒｄ，Ｊ．Ｊ．（２０００）．「高値及び低値の卵胞刺激ホルモンレベルに関して選択される雄ブタにおけるＧｎＲＨ１及びＧｎＲＨ１アンタゴニストに応答したゴナドトロピン、テストステロン、及びコルチゾールの関係（Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎｓ，ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ，ａｎｄ  ｃｏｒｔｉｓｏｌ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＧｎＲＨ１  ａｎｄ  ＧｎＲＨ１  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｉｎ  ｂｏａｒｓ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ  ａｎｄ  ｌｏｗ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｌｅｖｅｌｓ）」Ｊ  Ａｎｉｍ  Ｓｃｉ  ７８，１５７７−１５９０）。繰り返し血液採取するため、対象の雄ブタ（ｎ＞３）に頸静脈カテーテルを留置する。試料は２０分おきに採り、１２０分目にＧｎＲＨ１（１００ｎｇ／ｋｇ体重）の単一のボーラスを投与する。ＧｎＲＨ１注入後、試料採取頻度は１０分おきに３０分間行ってＬＨサージをモニタし、続いてさらに４時間、２０分おきに試料採取する。
【０１２３】
ドミナントネガティブによる遺伝子不活性化。同様のプロセスを用いて、遺伝子の１つ以上を不活性化させるドミナントネガティブを発現させ得る。また、例えば、ドミナントネガティブをコードするトランスポゾンが好適なトランスポザーゼにより染色体に挿入されてもよい。妊孕性を回復する処理は、例えば妊孕性救出のためのファーマコペロンによる食餌療法であってもよい。
【０１２４】
実施例１２
ｐ６５のＴ１５９１Ｃ部位に重複するＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡを作製し、遺伝子移入に関して評価した。意図した部位における二本鎖切断（ＤＳＢ）の効率的な生成が観察された。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ＨＤＲは３日目に＜６％、１０日目に検出限界未満であった。ＴＡＬＥＮはＳＮＰ部位から３５ｂｐ離れたところを切断するにしても、改変クローンの回復はＴＡＬＥＮによる場合と比べてＣＲＩＳＰＲ媒介性ＨＤＲで低かった（表１）。第２の遺伝子座ｓＡＰＣ１４．２におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導性ターゲティングはより効率的であったが、この部位でＴＡＬＥＮにより誘導されるＨＤＲレベルに達しなかった（６０％に対して約３０％）。Ｔａｎら，ＰＮＡＳ，１１０（４１）：１６５２６−１６５３１，２０１３）もまた参照のこと。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｃｈｕｒｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙシステム及び方法、Ｍａｌｉ  Ｐ，ら（２０１３）「Ｃａｓ９によるＲＮＡ誘導ヒトゲノム操作（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｉａ  Ｃａｓ９）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９（６１２１）：８２３−８２６に基づき産生した。
【０１２５】
実施例１３
図８に関連して、ｋｉｓｓ遺伝子の構造上の構成は保存されており、一方がシグナルペプチドとキスペプチン前駆体の一部との両方をコードし、他方がキスペプチン−１０配列を含む前駆体の残りの部分をコードする２つのコードエクソンを含む。テラピアＫｉｓｓ  ｍＲＮＡ上のイントロンの位置は、三角形グリフで示される。標的領域（４４２ｂｐ）のＰＣＲ増幅用フォワード及びリバースプライマーの位置。２つの操作されたＴＡＬＥＮ対、Ｋｉｓｓ１．１ａ及びＫｉｓｓ１．１ｂに対する結合部位を黒色及び灰色のボックスで示す。パネルｂはキスペプチン−１０生物活性ペプチドの位置並びに各ｋｉｓｓ１．１ａ及び１ｂ  ＴＡＬＥＮ認識部位を示す標的ｋｉｓｓゲノム領域の概略図を示す。インデル分析用のＰＣＲ（４４２ｂｐ）及びｑＰＣＲプライマー対（１３８ｂｐアンプリコン）も同様に示す。
【０１２６】
実施例１４  魚におけるＫｉｓｓ及びＫｉｓｓＲノックアウト
Ａ．ＴＡＬＥＮ発現ベクターの構築
【０１２７】
【表１】
2019047794.tif 000002
【０１２８】
【表２】
2019047794.tif 000003
【０１２９】
Ｂ．ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ合成
ｐＴ３Ｔｓ−ＴＡＬＥＮのＭＩＮＩＰＲＥＰ  ＤＮＡを２００μＬ反応物において５〜１０×単位のＳａｃＩ−ハイフィデリティで２時間消化した。８μＬ  ＲＮＡｓｅｃｕｒｅ（Ａｍｂｉｏｎ）で制限消化を処理し、６０℃で１０分間インキュベートした。ＲＮＡｓｅｃｕｒｅ処理したＤＮＡを、ＱｉａｇｅｎからのＭＩＮＩＥＬＵＴＥ  ＰＣＲクリーンアップキットを使用して精製し、１０μＬのＲＮアーゼ不含注射緩衝液（５ｍＭトリスＣｌ、ｐＨ７．５；０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶出した。ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ＭＡＣＨＩＮＥ  Ｔ３キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用し、１ｕｇの線状化した鋳型を使用して合成ｍＲＮＡを産生し、３７℃で１．５時間インキュベートした。Ｔｕｒｂｏ  ＤＮアーゼで１５分間処理した後、Ａｍｂｉｏｎ  ＭＥＧＡＣＬＥＡＲキットを使用してｍＲＮＡを精製し、５０μＬの加熱Ｈ２Ｏで２回溶出した。
【０１３０】
Ｃ．ＴＡＬＥＮ対のマイクロインジェクション
各ＴＡＬＥＮアームをコードするＲＮＡを組み合わせ、１０〜２００ｎｇ／μＬの濃度のヌクレアーゼ不含水に再懸濁した。５〜２０ｐＬを１細胞期のテラピア胚に注入した。受精後６日目に非注入対照群に対する注入胚の生存を計測した。５０％生存率を与えるＲＮＡ濃度を反復／標準注入に使用してノックアウトを生成した。注入胚がＴＡＬＥＮの導入による突然変異生成によって死亡したことを確認するため、変形した胚を収集し、標的部位の突然変異を、ＱＰＣＲ融解プロファイル解析を用いて調べた。
【０１３１】
Ｄ．対照及びＲＮＡ処理テラピアの組織採取及びＤＮＡ抽出
６日齢のＲＮＡ処理胚（変形）を絨毛膜除去処理して麻酔し、カミソリの刃を使用して卵黄嚢を取り除いた。胚組織を溶解緩衝液（１０ｍＭトリス、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ＳＤＳ、１００ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）中で一晩消化し、自動Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｘ−ｔｒａｃｔｏｒ、Ｃｏｒｂｅｔｔロボットシステムでｗｈａｔｍａｎ（商標）ユニフィルター８００、９６ウェルプレート（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国）を使用して抽出した。マイクロインジェクションを生き残り且つ正常に発達した胚（約５０％の生存率を有する群のもの）を１ヶ月齢まで育て、麻酔した；鰭を切り取って個別のジャーに入れ、一方でその鰭ＤＮＡを分析した（上記に記載したとおり溶解緩衝液中で一晩消化し、続いてＤＮＡ抽出）。ｋｉｓｓ又はｋｉｓｓＲ遺伝子座に体細胞突然変異を有するＧ０雄から精子を搾出し、ＤＮＡｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ）を使用して標準的手順に従いｇＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを３０μｌのＭＱ  Ｈ２Ｏに再懸濁した。
【０１３２】
Ｅ．ＱＰＣＲによる突然変異の同定
ＲＯＴＯＲ−ＧＥＮＥ  ＲＧ−３０００リアルタイムＰＣＲシステム（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）でリアルタイムｑＰＣＲを実施した。各０．４μＭ濃度のフォワード及びリバースプライマー及び７．５μＬの２×Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ＩＩ  ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  ＱＰＣＲマスターミックス（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する総容積１５μＬ中、６μＬのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）鋳型（１ｎｇ／μｌに希釈）を使用した。ＤＮＡｓｔａｒソフトウェアを使用してｑＰＣＲプライマーを設計した（表１）。９５℃で１５秒、６０℃で６０秒の４０サイクルを使用してｑＰＣＲを実施し、続いて融解曲線分析によりアッセイの特異性を確認した（６７℃から９７℃）。この手法では、標的とするｋｉｓｓ及びｋｉｓｓｒ遺伝子座におけるＤＮＡ多型の発生を検出するため、目的の領域を含む短いＰＣＲアンプリコン（約１００〜１４０ｂｐ）をｇＤＮＡ試料から生成し、温度依存性解離に供する（融解曲線）。鋳型ｇＤＮＡにＴＡＬＥＮ誘導性多型が存在する場合、ヘテロ二重鎖並びに種々のホモ二重鎖分子が形成される。融解プロファイルにより複数の形態の二重鎖分子の存在が検出され、二重鎖の融解が単一種として働くのか、それとも２つ以上の種として働くのかが示される。概して、融解曲線及び融解温度の対称性からｄｓＤＮＡ配列の均質性及びその長さが推測される。例えば、ＮＨＥＪによるＴＡＬＥＮ誘導性ＤＳＢの修復で生じる小さい挿入又は欠失が生成される場合、その融解温度は、塩基間の水素結合を切断するのに要するエネルギーに比例して、欠失又は挿入の長さと正の相関を有する。複数の形態の二重鎖分子が存在する場合、温度依存的変性によって最も不安定なヘテロ二重鎖及び最も安定したホモ二重鎖が共に検出され、変化した（非対称な）融解プロファイルをもたらす。並行して同じマスターミックス反応物で増幅される基準ＤＮＡ試料（非注入テラピア対照由来又は目的のゲノム領域を含有するプラスミド）との比較により、融解分析を実施する。簡単に言えば、融解プロファイルの差異によってＴＡＬＥＮ誘導性突然変異を有する配列が野生型配列と区別され、従ってスクリーニングが促進される。
【０１３３】
Ｆ．マイクロインジェクションしたテラピアの体細胞又は生殖細胞における突然変異率の計算及びＴＡＬＥＮ誘導性突然変異の特徴付け
体細胞又は生殖細胞ｇＤＮＡが非対称のｑＰＣＲ融解プロファイルを生じた魚（候補突然変異体）をさらに分析し、突然変異誘発頻度を計測した。標的部位（Ｋｉｓｓについては４４２ｂｐ及びＫｉｓｓＲについては７２０ｂｐ）を含有するゲノムＰＣＲ産物を鰭ＤＮＡ又は精子ＤＮＡから得た。１２０〜１８０ｎｇの鋳型ｇＤＮＡ、０．１μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１×Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、２ｍＭ  Ｍｇ２＋、及び０．２μＭの各プライマーを含有する２５μＬ反応混合物でＰＣＲを実行した。ＤＮＡ増幅を以下の条件下で行った：９５℃で５分、続いて９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で４５秒を３５サイクルと、最終伸長７２℃で２分。ＰＣＲ産物をＴＯＰＯ  ２．１  ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（ＯＮＥ  ＳＨＯＴ、Ｔｏｐ  １０Ｆ’、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。滅菌ピペットの先端で形質転換体コロニーをランダムにピッキングし、個々のｑＰＣＲ反応チューブに直接移した後、再び選択的寒天培地に播いた。目的のＴＡＬＥＮ標的部位に跨るプライマーを使用してｑＰＣＲを実施した（１００〜１４０ｂｐアンプリコン）。特異的な産物増幅を示すＱＰＣＲ反応物を基準ＤＮＡ試料対照（野生型配列）と比較して融解プロファイル変異体を同定した（図１０パネルｃ及びｄ）。ＤＮＡ突然変異率を、突然変異配列の数（変異融解を有するコロニー）を分析した配列の総数で除して１００を乗じたものとして計算した。標的遺伝子座に存在する突然変異を可視化するため、個々の体細胞又は精細胞を表すクローンを、Ｃｔ対融解温度の散布図に表示した（例えば図１０パネルｄを参照こと）。これらのグラフでは、各大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーがデータ点（ｘ，ｙ）によって表され、ｘがそのＣｔを表し、ｙがその融解を表す。同一の配列を有する個々のコロニーは同程度の融解温度を示すはずである。変異融解温度を示すコロニーを一晩成長させ、そのプラスミドを抽出して精製した（ＭＩＮＩＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮキット、ＱＵＩＡＧＥＮ）。次にＴＡＬＥＮ標的部位を含有する領域を、指示するとおり、ｋｉｓｓ及びｋｉｓｓＲ領域用に選択したプライマーを使用して配列決定した。Ｆ１及びＦ２魚において突然変異を特徴付けるため、標的ｋｉｓｓ１．１ａ及びＫｉｓｓＲＥ３遺伝子座を含む４４２ｂｐ及び７０２ｂｐアンプリコンをシリカ膜ベースのスピンカラム（ＱＩＡＱＵＩＣＫ  ＰＣＲ精製キット、ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。精製したＰＣＲを、内部プライマー（ＫｉｓｓＲＦ）を使用して直接配列決定した。
【０１３４】
Ｇ．ファウンダースクリーニング
全ての推定上のファウンダーから配偶子を搾出し、ＷＴストックから回収した配偶子との体外受精からＦ１胚を産生した。受精３週間後、Ｆ１子孫の鰭を切り取り、個別のジャーに別々に保存した。先述のとおり鰭ＤＮＡを抽出し（上記の組織採取及びＤＮＡ抽出の節を参照）、分光光度計ＮＡＮＯＤＲＯＰ  ＮＤ１０００）を使用して１ｎｇ／μｌに調整した。一般に、各潜在的ファウンダーから１０〜２０匹の幼魚を、上記に記載した融解分析戦略を用いてＱＰＣＲによりスクリーニングした。配列の確認には、単一の胚／幼魚のゲノムＤＮＡを増幅し、ＰＣＲ産物を精製後に塩基配列決定にかけた。
【０１３５】
２つの同時読み取りを示すＰＣＲの塩基配列決定クロマトグラフィーは、インデルの存在を示す。欠失又は挿入の始端は、典型的には配列読み取りが一致しなくなるときに始まる。次に二重配列の慎重な分析によりユニークなヌクレオチドリードが検出される（図１２パネルａを参照）。次に、ユニークなヌクレオチドリードのパターンを、野生型配列がそれ自体に対して増分的にシフトすることから生じる人工的な単一のリードパターンの連続に対して分析する。
【０１３６】
Ｈ．操作されたＴＡＬＥＮの突然変異誘発能
操作されたＴＡＬＥＮ及び各ヘテロ二量体ＴＡＬＥＮをコードする合成のキャッピングされたｍＲＮＡを共に１０〜２５０ｎｇ／μｌの種々の濃度で１細胞期テラピア胚に注入した。次に本発明者らは、受精後６日目（ｄｐｆ）に注入胚を観察した。１０ｎｇ未満のＴＡＬＥＮを注入した胚は正常に発育した一方、２００ｎｇ（Ｋｉｓｓ１ａ）及び１００ｎｇ（ＫｉｓｓＲＥ３）の用量は最大５０％の死亡又は変形胚を生じた。ｋｉｓｓ１．１ｂ及びｋｉｓｓＲＥ２についての２５０ｎｇの用量は３０％未満の死亡率を生じた。５日目、注入胚を正常に発育したものと、形態学的変形を有するものとに分けた。突然変異のエビデンスを確かめるため、ゲノムＤＮＡを各ＴＡＬＥＮ処理群については３つの変形胚のプールから、及び非注入対照群からは３つの正常胚から単離した。ゲノムＤＮＡは標的遺伝子座のＱＰＣＲ融解分析に使用した。ｋｉｓｓ１．１ａ及びｋｉｓｓＲＥ３遺伝子座（データは示さず）を標的化するＴＡＬＥＮで処理した胚のプールにおいて非対称の融解プロファイルが認められたが、他の２つのＴＡＬＥＮ対で処理した胚では認められなかった。
【０１３７】
突然変異の存在を確認するため、各群２０〜４０匹の正常に発育した幼魚をＱＰＣＲ融解分析によりアッセイした。ＴＡＬＥＮ  ＫｉｓｓＲ−Ｅ２及びＫｉｓｓ１．１ｂ  ｍＲＮＡを注入した魚はいずれも変異融解を生じなかったことから、突然変異が作成されなかったか、或いは突然変異が検出可能な融解変異を生じなかったことが示唆される。それにも関わらず、ｋｉｓｓ１．１ａ及びＫｉｓｓＲＥ３遺伝子座の各々につき４匹ずつの、合計８匹の変異融解プロファイルを生じる魚が認められた（図１０パネルａ及びパネルｂ）。観察された融解変異が野生型と標的部位に微小挿入又は欠失を有するＮＨＥＪ産物との混合物から生じることを確認するため、各標的領域（Ｋｉｓｓについては４４２ｂｐ及びＫｉｓｓＲについては７０２ｂｐ）をＰＣＲ反応で増幅した。得られたＰＣＲ断片をＴｏｐｏ  ＴＡベクターにクローニングし、形質転換体コロニーをダイレクトリアルタイムＰＣＲによりスクリーニングした。試験した各魚につき１４〜２１個の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体コロニーを（ランダムに）ハンドピッキングし、Ｑ−ＰＣＲ反応混合物に直接（ＤＮＡ精製なしに）加えた。
【０１３８】
突然変異対立遺伝子を有するコロニーを、野生型非改変配列と比較することにより同定した。変異融解プロファイルを有するコロニーが５０〜９１％の範囲の高頻度で検出された（図１０パネルｃ及びｄ）。
【０１３９】
これらの傷害の一部を特徴付けるため、変異アンプリコンを産生したクローン由来のプラスミドを抽出し、ＰＣＲインサートを配列決定した。各ＴＡＬＥＮ処理群につき４〜７個のクローンを配列決定し、１個を除く全てが変異対立遺伝子を有した。全８匹のＴＡＬＥＮ処理魚からｋｉｓｓ及びｋｉｓｓｒ遺伝子における合計１４個の異なる体細胞突然変異が検出された（Ｋｉｓｓ１．１ａ遺伝子座に８個及びＫｉｓｓＲＥ３遺伝子座に６個）。９個の異なるヌクレオチド欠失、２個の挿入、及び３個のヌクレオチド挿入と欠失との組み合わせが観察された（図１１パネルａ及びｂ）。ＲＴ−ＰＣＲ融解分析により、３ｂｐ程の小さい欠失／挿入が検出可能であった。ＴＡＬＥＮ誘導性突然変異はＲＮＡ処理魚では複数回起こり、モザイク体細胞突然変異をもたらすことが観察された（下表参照）。
【０１４０】
融解変異を示すコロニーからの配列の９５％超が突然変異を有することが見出されたことから、変異融解を生じるクローンの頻度を計測することによりＤＮＡ突然変異率を近似し得ることが示される。従って、突然変異率は魚に応じて３５％〜９１％であると計算された。この結果は、予想したゲノム位置への標的インデルの極めて効率的な導入を示している。
【０１４１】
表「体細胞突然変異スクリーニング結果の概要」は、ＴＡＬＥＮ注入テラピアに関する結果を示す。第２列は、インデルのサイズを含め、体細胞において同定された突然変異配列を示し（＋、挿入；−、欠失）、得られたタンパク質配列改変を括弧内に示す。最終列に、変異融解温度を生じるコロニーの頻度から各魚の推定体細胞突然変異率を計算した。
【０１４２】
【表３】
2019047794.tif 000004
【０１４３】
Ｉ．ＴＡＬＥＮ突然変異の配列分析
異なるタイプのヌクレオチド突然変異のうち、５つ及び６つがフレームシフトを引き起こし、それぞれｋｉｓｓ及びｋｉｓｓｒ遺伝子における未成熟終止コドンの生成をもたらした。また、全４匹のＴＡＬＥＮ処理魚で独立して起こったＫｉｓｓ１．１ａ遺伝子座における１２ｎｔ欠失も高頻度にあった。この突然変異は４アミノ酸（ＡＡ）の欠損をもたらす。
【０１４４】
Ｆ０  ＴＡＬＥＮ変異テラピアを性的に成熟するまで育て、その性別を決定した。ＴＡＬＥＮ処理魚が遺伝的突然変異を誘導し得ることを示すため；各排精動物の精液からゲノムＤＮＡを抽出し、スクリーニングした。先述のとおり、変異融解プロファイルを示すクローンの頻度によって、突然変異を有する精子の頻度を決定した。精子に関連する傷害を特徴付けるため、変異融解を有するコロニーからプラスミドを抽出し、配列決定した。５０％〜９１％の範囲の生殖系列突然変異頻度が観察された。配列から、各魚生殖系列に複数のインデルが存在することが明らかになった。
【０１４５】
【表４】
2019047794.tif 000005
【０１４６】
Ｊ．ｋｉｓｓ及びｋｉｓｓＲ遺伝子座における生殖系列突然変異の分析
Ｋｉｓｓ及びｋｉｓｓＲ  ＴＡＬＥＮが生殖系列に突然変異を有効に誘導したことをさらに実証するため、８匹のファウンダーを野生型ストックと異種交配させた。８匹のＴＡＬＥＮ処理魚全てが繁殖能を有し、生存可能な胚のクラッチを産生した。これらの子孫を育て、変異対立遺伝子の存在についてスクリーニングした。８匹のファウンダー全てが遺伝的突然変異を伝達することができた。分析は初め、推定突然変異を有する子孫の割合が、Ｆ１鰭ＤＮＡ抽出物のＱＰＣＲ融解プロファイル分析によって測るとき、１６％〜９０％の範囲であったことを示した。予想どおり、ＴＡＬＥＮ処理親におけるモザイク現象の程度と突然変異を有する子孫の頻度との間には正の相関があった。変形融解プロファイルを生じる選択された遺伝子配列の分析は全て、種々の誘導されたインデル突然変異を明らかにし、その一部は以前ファウンダーの体細胞組織に認められたものであった（図１２パネルｂ）。さらに、野生型融解を生じるＦ１魚の塩基配列決定は全て、野生型配列を明らかにした。単一のファウンダーから２種以上の遺伝的突然変異が多く観察されたことから、それらの突然変異が同じ動物内の異なる生殖細胞で独立して起こったことが示唆される。遺伝した突然変異には、サイズが３〜１８ｂｐの範囲の欠失が含まれた（図１２パネルｂ）。全４匹のｋｉｓｓ突然変異体ファウンダーの子孫では、遺伝した突然変異は、４個及び６個のＡＡの欠損をもたらした１２ｎｔ及び１８ｎｔの欠失のみであった。しかしながらこれらの欠失はフレームシフト突然変異をもたらしておらず、ｋｉｓｓ−１０ペプチドの最もＣ末端側の領域において１個又は３個のいずれかのＡＡを取り除く（図１２パネルｃ）。このコア配列は脊椎動物全体にわたるｋｉｓｓＲシグナル伝達経路の活性化に必須且つ十分であることが分かったため、それらの突然変異は機能喪失表現型を生じるものと思われた。また、これまでファウンダーでは単離されなかったｋｉｓｓＲＥ３遺伝子座にフレームシフト突然変異が同定された。全てのフレームシフト突然変異が未成熟終止コドンをもたらし、ＫｉｓｓＲタンパク質のＣ末端部分から１７２ＡＡ〜最大２１５ＡＡ（Δ７ｎｔ、図１２パネルｃ）が取り除かれた。タンパク質配列の実に５７％を取り除くこれらの突然変異は遺伝子機能を不活性化し得る。幼魚Ｆ１子孫の間で同定された全てのｋｉｓｓ及びｋｉｓｓｒ突然変異が、ヘテロ接合状態で生存可能であった。
【０１４７】
【表５】
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【０１４８】
【表６】
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【０１４９】
Ｋ．Ｆ１及びＦ２世代
Ｆ１ヘテロ接合突然変異体は、発育させ続けたときにも形態異常を示さず、全て両性の繁殖能を有する成体に分化した。性的に成熟したＦ１世代に生殖表現型が存在しないことは、選択した突然変異体の全ての体細胞に各標的遺伝子の野生型対立遺伝子が存在することを考えれば予想外というわけではない。不活性化表現型の特徴付けは、ホモ接合状態（又は化合物ヘテロ接合状態）の関連する機能喪失型突然変異を有する魚ではＦ２世代においてのみ可能である。ホモ接合突然変異を生成するため、Ｆ１ヘテロ接合突然変異体から収集した精子及び卵を使用してＦ２世代を産生し、それらは成長させているところである；これらのＦ２世代は、出願時点では、通常予想される性的成熟時期以前の年齢である。
【０１５０】
さらなる説明
１．性成熟選択的神経内分泌遺伝子の不活性化を含むゲノムを含む遺伝子改変家畜動物であって、遺伝子の不活性化により動物が性的に成熟することが阻止されている遺伝子改変家畜動物。２．遺伝子の不活性化が、性成熟遺伝子をコードする配列及び／又はそのシス調節エレメントにおける１つ以上の塩基の挿入、欠失、又は置換を含む、１の家畜動物。３．不活化遺伝子が、動物のゲノムからのその遺伝子の少なくとも一部分の除去、その遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を阻止するような遺伝子の改変、又はトランス作用因子により不活性化される、１の家畜動物。４．遺伝子がトランス作用因子により不活性化され、前記トランス作用因子が干渉性ＲＮＡ及びドミナントネガティブ因子からなる群から選択され、前記トランス作用因子が外来遺伝子又は内在性遺伝子により発現する、３の家畜動物。５．トランス作用因子がＧＰＲ５４のドミナントネガティブを含む、４の家畜動物。６．遺伝子の不活性化が誘導性システムの制御下にある、１〜５の家畜動物。７．誘導性システムが、Ｔｅｔ−Ｏｎ、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、Ｃｒｅ−ｌｏｘ、及びＨｉｆ１αからなる群のメンバーを含む、６の家畜動物。８．動物が、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、ヤギ、及び魚からなる群から選択される、１〜７の家畜動物。９．性成熟遺伝子が、Ｇｐｒ５４、Ｋｉｓｓ１、及びＧｎＲＨ１１からなる群から選択される、１〜８の家畜動物。１０．動物が組換えタンパク質の発現の結果としてある形質をさらに発現する、１〜９の家畜動物。１０ａ．動物が外因性組換えタンパク質をさらに発現する、１〜１０の家畜動物。１１．形質が、生産形質、体型形質、及び作業性形質からなる群から選択される、１０の家畜動物。１２ａ．同じ種の野生型動物が性的に成熟する年齢で性的に未熟である、１〜１１の家畜動物。１２ｂ．処理なしには遺伝的に成熟することができない、１〜１１の家畜動物。
【０１５１】
１３．性成熟選択的神経内分泌遺伝子の不活性化に関してヘテロ接合であるゲノムを含む遺伝子改変家畜動物であって、従って不活化遺伝子がホモ接合の子孫は性的に成熟することが阻止される、動物。１４．性成熟遺伝子が、Ｇｐｒ５４、Ｋｉｓｓ１、及びＧｎＲＨ１１からなる群から選択される、１３の動物。
【０１５２】
１５．細胞又は胚からなる群から選択されるインビトロ生命体であって、性成熟遺伝子の不活性化を含むゲノムを含むインビトロ生命体。１６．ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、ヤギ、ウサギ、及び魚からなる群から選択される細胞又は胚である、１５の生命体。１７．不活性化が、Ｇｐｒ５４、ＫｉＳＳ１、及びＧｎＲＨ１１からなる群から選択される遺伝子にある、１５〜１６の生命体。
【０１５３】
１８．家畜細胞及び家畜胚からなる群から選択される生命体に、細胞の染色体標的部位に特異的に結合して二本鎖ＤＮＡ切断を生じさせることにより性成熟選択的神経内分泌遺伝子を不活性化する薬剤であって、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ及びリコンビナーゼ融合タンパク質からなる群から選択される薬剤を導入するステップを含む、家畜動物を作製する方法。１９．薬剤が、染色体標的部位に特異的に結合する配列を含むＴＡＬＥＮ又はＴＡＬＥＮ対であって、第２の二本鎖切断を生じさせるさらなるＴＡＬＥＮと組み合わさって遺伝子に二本鎖切断を生じさせるか又は染色体に二本鎖切断を生じさせるＴＡＬＥＮ又はＴＡＬＥＮ対であり、遺伝子の少なくとも一部分が第１の切断と第２の切断との間に配置される、１８の方法。２０．生命体にリコンビナーゼを１つ又は複数のＴＡＬＥＮと共導入するステップをさらに含む、１８〜１９の方法。２１．薬剤を発現する導入遺伝子が生命体のゲノムに置かれる、１９の方法。２２．生命体に薬剤を導入するステップが、ペプチドとしての薬剤の直接注入、薬剤をコードするｍＲＮＡの注入、薬剤をコードするベクターへの生命体の曝露、及び薬剤をコードするプラスミドの生命体への導入からなる群から選択される方法を含む、１８〜２１の方法。２３．薬剤がリコンビナーゼ融合タンパク質であり、方法が、標的化核酸配列を融合タンパク質と共に導入するステップを含み、標的化核酸配列が染色体部位に対する特異的結合のためリコンビナーゼとフィラメントを形成する、１８〜２２の方法。２４．リコンビナーゼ融合タンパク質がリコンビナーゼ及びＧａｌ４を含む、１８〜２３の方法。２５．生命体に核酸を導入するステップをさらに含む、１８〜２４の方法であって、核酸が生命体のゲノムにおいて二本鎖切断の部位又は第１の切断と第２の切断との間に挿入される、方法。２５ａ．ある配列を有する外来核酸鋳型を生命体に導入するステップをさらに含む、１８〜２４の方法であって、生命体のゲノムが二本鎖切断の部位でその配列を受け取る、方法。外来鋳型がコピーされても又は実際にゲノムに挿入されてもよく、結果は、それに関する理論がいずれの機構であるかに関係なく同じとなる。この結果は、ゲノムが鋳型の配列を有するというものである。２６．核酸が、終止コドン、レポーター遺伝子、及びレポーター遺伝子カセットからなる群のメンバーを含む、１８〜２５の方法。２７．生命体から動物をクローニングするステップをさらに含む、１８〜２６の方法。２８．動物が、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、ヤギ、ウサギ、及び魚からなる群から選択される、１８〜２７の方法。２９．性成熟遺伝子が、Ｇｐｒ５４、Ｋｉｓｓ１、及びＧｎＲＨ１１からなる群から選択される、１８〜２８の方法。３０．遺伝子の不活性化が誘導性システムの制御下にある、１８〜２９の家畜動物。
【０１５４】
３１．動物の性成熟のため動物に薬剤を投与するステップであって、薬剤が動物の遺伝的性成熟不能を補償する、ステップを含む、家畜動物を飼育する方法。３２．薬剤がゴナドトロピン又はゴナドトロピン類似体を含む、３１の方法。３３．性的に成熟した動物を繁殖させて子孫を産生するステップをさらに含む、３１〜３２の方法。３４．動物の遺伝的成熟不能が、性成熟選択的神経内分泌遺伝子を遺伝的に不活性化した結果である、請求項３１〜３３の方法。３５．不活化遺伝子が、Ｇｐｒ５４、Ｋｉｓｓ１、及びＧｎＲＨ１１からなる群から選択される、３４の方法。３６．不活化遺伝子が、動物のゲノムからのその遺伝子の少なくとも一部分の除去、その遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を阻止するような遺伝子の改変、又はトランス作用因子により不活性化される、３４の方法。３７．動物が、ウシ、ブタ、ニワトリ、ヒツジ、魚、ウサギ、及びヤギからなる群から選択され、動物への薬剤の投与が処理施設で行われ、及び子孫が処理施設から複数の飼育場所に供給される、３１〜３６の方法。
【０１５５】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年11月20日(2018.11.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
性的に成熟できない、遺伝子編集された非ヒト家畜動物を作製する方法であって、
家畜細胞又は家畜胚に、性成熟に関与するリガンドについての遺伝子を不活性化する薬剤を導入するステップ
を含む方法。
【請求項２】
遺伝子が、Ｋｉｓｓ１、又はＧｎＲＨ１１である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記薬剤が前記細胞の染色体標的部位に特異的に結合して二本鎖ＤＮＡ切断を生じさせ、それにより前記性成熟選択的神経内分泌遺伝子が不活性化される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記薬剤が、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ及びリコンビナーゼ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記薬剤がＴＡＬＥＮを含み、前記方法が、前記生命体にリコンビナーゼを前記ＴＡＬＥＮと共導入するステップをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記薬剤を発現する導入遺伝子が前記生命体のゲノムに置かれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記薬剤が前記リコンビナーゼ融合タンパク質であり、前記方法が、標的化核酸配列を前記融合タンパク質と共に導入するステップを含み、前記標的化核酸配列が前記染色体部位に対する特異的結合のため前記リコンビナーゼとフィラメントを形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ある配列を有する核酸鋳型を前記生命体に導入するステップであって、前記生命体の前記ゲノムが前記二本鎖切断の部位で前記配列を受け取るステップをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記生命体から前記動物をクローニングするステップをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記動物が、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、ヤギ、ウサギ、及び魚からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子の前記不活性化が誘導性システムの制御下にある、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法により作製される遺伝子改変非ヒト家畜動物。
【請求項１３】
性成熟選択的リガンドをコードする遺伝子を不活性化するよう編集されたゲノムを含む遺伝子改変非ヒト家畜動物であって、前記遺伝子の前記不活性化により前記動物が性的に成熟することが阻止されている、家畜動物。
【請求項１４】
前記遺伝子の前記不活性化が、            
前記性成熟遺伝子をコードする配列
における１つ以上の塩基の挿入、欠失、又は置換
を含む、請求項１３に記載の家畜動物。
【請求項１５】
前記遺伝子の前記不活性化が誘導性システムの制御下にある、請求項１３または１４に記載の家畜動物。
【請求項１６】
前記動物が、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、ヤギ、及び魚からなる群から選択される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項１７】
前記性成熟遺伝子が、Ｋｉｓｓ１、又はＧｎＲＨ１１である、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項１８】
前記動物が、外因性組換えタンパク質をさらに発現する、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項１９】
処理なしには遺伝的に成熟不能である、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の家畜動物。
【請求項２０】
細胞、胚、胚盤胞、体細胞、初代細胞、及び始原生殖細胞からなる群から選択される、生命体に、ゲノムへの選択マーカーの組み込み無く神経内分泌遺伝子のノックアウトを調製するステップを含む、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の家畜動物を作製する方法。
【請求項２１】
性成熟選択的神経内分泌遺伝子の不活性化に関してヘテロ接合であるゲノムを含む遺伝子改変非ヒト家畜動物であって、神経内分泌遺伝子が、性成熟に関与する神経内分泌軸におけるリガンドをコードし、かつ前記不活化遺伝子がホモ接合の子孫は性的に成熟することが阻止され、ここで、前記家畜動物がそのゲノム中に組み込まれた選択マーカーを有しない、動物。
【請求項２２】
前記神経内分泌遺伝子が、Ｋｉｓｓ１、又はＧｎＲＨ１１から選択される、請求項２１に記載の動物。
【請求項２３】
動物の性成熟のため前記動物に薬剤を投与するステップであって、前記薬剤がゲノムへの選択マーカーの組み込みの無い前記動物の遺伝的性成熟不能を補償する、ステップ
を含む、非ヒト家畜動物を飼育する方法。
【請求項２４】
前記薬剤がゴナドトロピン又はゴナドトロピン類似体を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記動物の前記遺伝的成熟不能が、性成熟選択的神経内分泌リガンドの遺伝子を遺伝的に不活性化した結果である、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記不活化遺伝子が、Ｋｉｓｓ１、又はＧｎＲＨ１１から選択される、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
細胞又は動物胚盤胞からなる群から選択される非ヒトインビトロ家畜生命体であって、ゲノム中に選択マーカーの組み込みの無く性成熟に関与する神経内分泌リガンドについての遺伝子の不活性化を含むゲノムを含む非ヒトインビトロ家畜生命体。
【請求項２８】
ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、ヤギ、ウサギ、及び魚からなる群から選択される細胞又は胚である、請求項２７に記載の生命体。
【請求項２９】
前記細胞が、体細胞、初代細胞、又は始原生殖細胞からなる群から選択される、請求項２７又は２８に記載の生命体。
【請求項３０】
性成熟選択的神経内分泌遺伝子の不活性化に関してヘテロ接合であるゲノムを有する、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の生命体。
【請求項３１】
前記神経内分泌遺伝子が、Ｋｉｓｓ１又はＧｎＲＨ１１から選択される、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の生命体。
【請求項３２】
前記遺伝子の前記不活性化が
前記性成熟遺伝子をコードする配列
における１つ以上の塩基の挿入、欠失、又は置換
を含む、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の生命体。
【請求項３３】
家畜細胞及び家畜胚からなる群から選択される生命体に、前記細胞の染色体標的部位に特異的に結合する薬剤を導入するステップであって、それによりそのゲノム中に選択マーカーの組み込み無く性成熟選択的神経内分泌リガンドについての遺伝子を不活性化するステップ
を含む、非ヒトインビトロ生命体を作製する方法。
【請求項３４】
前記薬剤が、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ及びリコンビナーゼ融合タンパク質からなる群から選択され；及び場合により前記生命体にリコンビナーゼを共導入するステップを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記薬剤を発現する導入遺伝子が前記生命体のゲノムに置かれる、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記薬剤が前記リコンビナーゼ融合タンパク質であり、前記方法が、標的化核酸配列を前記融合タンパク質と共に導入するステップを含み、前記標的化核酸配列が前記染色体部位に対する特異的結合のため前記リコンビナーゼとフィラメントを形成する、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ある配列を有する核酸鋳型を前記生命体に導入するステップであって、前記生命体の前記ゲノムが前記二本鎖切断の部位で前記配列を受け取るステップをさらに含む、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記性成熟遺伝子が、Ｋｉｓｓ１、又はＧｎＲＨ１１である、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記遺伝子の前記不活性化が誘導性システムの制御下にある、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記家畜細胞が、体細胞、初代細胞、又は始原生殖細胞を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ゲノムへの選択マーカーの組み込みの無く性成熟に関与する神経内分泌リガンドについての遺伝子の不活性化を含む、非ヒト家畜動物細胞。
【請求項４２】
前記不活性化遺伝子が、Ｋｉｓｓ１及び／又はＧｎＲＨ１１である、請求項４１に記載の非ヒト家畜動物細胞。
【請求項４３】
前記細胞が、胚、胚盤胞、体細胞、初代細胞及び／又は始原生殖細胞を含む、請求項４１または４２に記載の非ヒト家畜動物細胞。
【請求項４４】
ゲノム編集ツールを使用して前記神経内分泌遺伝子の不活性化が達成される、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の非ヒト家畜動物細胞。
【請求項４５】
前記ゲノム編集ツールが、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ及びリコンビナーゼ融合タンパク質を含む、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の非ヒト家畜動物細胞。
【請求項４６】
前記ゲノム編集ツールが、ＴＡＬＥＮを含み、かつ前記細胞にリコンビナーゼを前記ＴＡＬＥＮと共導入することをさらに含む、請求項４５に記載の非ヒト家畜動物細胞。
【請求項４７】
前記不活性化が、前記細胞に、ある配列を有する核酸鋳型を導入することによりさらに達成される、請求項４１〜４６のいずれか一項に記載の非ヒト家畜動物細胞。
【請求項４８】
前記ゲノム編集ツール及び前記核酸鋳型が、同じ遺伝子座に標的化される、請求項４７に記載の非ヒト家畜動物細胞。
【外国語明細書】
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