(57)【要約】【課題】一本鎖Ｆｃ融合タンパク質の提供。【解決手段】本発明は、改善された特性を有する新規の一本鎖Ｆｃ融合タンパク質を提供する。本発明は、免疫グロブリン重鎖のＣＨ１定常領域に連結された免疫グロブリン軽鎖の定常領域を含む新規のリンカーを介して免疫グロブリンのＦｃ領域に融合されている可溶性タンパク質の一本鎖融合物を提供する。この新規のリンカーは、本発明のＦｃ融合タンパク質に、非Ｆｃ融合対応物と比べた場合または先行技術のＦｃ融合タンパク質と比べた場合、改善された生物活性および増加した半減期などの好ましい特性を与える。本明細書に記載される新規のＦｃ融合タンパク質スキャフォールドは、目的の任意の標的と結合するまたは相互作用することができる目的の可溶性タンパク質を含むように設計することができる。好ましくは、本発明のＦｃ融合タンパク質は二量体である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１４年１２月１９日に出願された米国仮出願第６２／０９４，２４２号の利益を主張する。上記出願の全体の教示は、参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
治療タンパク質の血清半減期を増加させるための１つの戦略は、タンパク質を抗体のＦｃ（結晶化可能な断片）ドメインに付着させることである。多くのそのような融合タンパク質はホモ二量体またはヘテロ二量体を形成し、それによって抗体様融合タンパク質分子を形成することができる。しかし、Ｆｃ融合タンパク質工学への多くの先行技術アプローチには、免疫原性および不十分な薬物動態特性を含むがこれらに限定されない限界がある。
【０００３】
本発明は、一本鎖定常軽鎖（ＣＬ）および定常重鎖（ＣＨ１）免疫グロブリンドメインを有する新規のリンカーを含むＦｃ融合タンパク質の単量体および二量体を提供する。そのような新規のリンカーは本明細書ではｓｃＣＬＣＨ１リンカーとも呼ばれる。
【０００４】
特定の理論に限定されることなく、本発明の新規のリンカーは、一本鎖Ｆｃ融合タンパク質分子のそれぞれのタンパク質「ペイロード」間の立体障害を、そのような分子が二量体を形成する場合、減少させる。立体障害は、例えば、ＦｃＲｎへの結合が減少するため、生物活性の喪失、非効率的二量体化または二量体分子の半減期の減少をもたらすことがある。したがって、本発明の新規のリンカーを組み込むと、生物活性が改善され、二量体形成が増加し、半減期が増加し、以前のＦｃ融合タンパク質で可能であったペイロードよりも大きなタンパク質ペイロードを組み込む能力をもたらす可能性がある。さらに、本発明の一部のＦｃタンパク質では、ＦｃＲｎ受容体への二量体分子の結合を改善し、したがって、先行技術の融合タンパク質と比べた場合、本発明の新規のＦｃ融合タンパク質の循環半減期を増加させることができるさらに天然の抗体構造をＦｃドメイン周辺に提供する二量体を形成することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、改善された特性を有する新規の一本鎖Ｆｃ融合タンパク質を提供する。本発明は、免疫グロブリン重鎖のＣＨ１定常領域に連結された免疫グロブリン軽鎖（ＣＬ）の定常領域を含む新規のリンカー（ｓｃＣＬＣＨ１またはｓｃＣＨ１ＣＬリンカー）を介して免疫グロブリンのＦｃ領域に融合されている可溶性タンパク質の一本鎖融合物を提供する。この新規のリンカーは、本発明のＦｃ融合タンパク質に、非Ｆｃ融合対応物と比べた場合または先行技術Ｆｃ融合タンパク質と比べた場合、改善された生物活性および増加した半減期などの好ましい特性を与える。本明細書に記載される新規のＦｃ融合タンパク質は、目的の任意の標的と高い特異性および親和性で結合するまたは相互作用することができる目的の可溶性タンパク質を含むように設計することができる。
【０００６】
好ましくは、本発明のＦｃ融合タンパク質は二量体である。二量体は、本発明の一本鎖融合タンパク質間の共有結合（例えば、ジスルフィド連結）または非共有結合相互作用を介して形成され、治療分子として使用するための抗体分子の有利な特性を保持するホモ二量体またはヘテロ二量体タンパク質複合体をもたらすことができる。
【０００７】
別の態様では、本発明は、本明細書に提供されるＦｃ融合タンパク質をコードする核酸を提供する。発現ベクターを含む、本明細書に提供されるＦｃ融合タンパク質のいずれかをコードする核酸を含むベクターも提供される。そのような発現ベクターを含有する宿主細胞および宿主細胞において本明細書に記載されるＦｃ融合タンパク質を産生するための方法も提供される。
【０００８】
添付の図面において例示されるように、本発明の、上記およびその他の目的、特性および利点が、以下の、本発明の好ましい実施形態についてのより詳細な記載から明らかとなるであろう。図面では、類似の参照文字が様々な図を通して同じ部分を指す。図面は必ずしも寸法通りではないが、その代わりに本発明の原理を例示することに重点が置かれている。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明による、新規のｓｃＣＬＣＨ１リンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されているＸを含む、Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の線図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明による２本のポリペプチド鎖のＦｃ融合タンパク質ヘテロ二量体の線図であり、第１のポリペプチド鎖は、新規のｓｃＣＬＣＨ１リンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されているＸを含み、第２のポリペプチド鎖は、新規のｓｃＣＬＣＨ１リンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されている、Ｘとは異なるＹを含む。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本発明による、新規のｓｃＣＨ１ＣＬリンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されているＸを含む、Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の線図である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、本発明による２本のポリペプチド鎖のＦｃ融合タンパク質ヘテロ二量体の線図であり、第１のポリペプチド鎖は、新規のｓｃＣＨ１ＣＬリンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されているＸを含み、第２のポリペプチド鎖は、新規のｓｃＣＨ１ＣＬリンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されている、Ｘとは異なるＹを含む。
【図２】図２は、本発明による、新規のｓｃＣＬＣＨ１リンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されている第ＩＸ因子を含むＦｃ融合タンパク質の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図３】図３は、本発明による、新規のｓｃＣＬＣＨ１リンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されている第ＩＸ因子を含むＦｃ融合タンパク質の凝固活性を示すグラフである。
【図４】図４は、新規のｓｃＣＬＣＨ１リンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されている第ＩＸ因子を含むＦｃ融合タンパク質を静脈内投与されたときの、ラットにおけるｉｎ  ｖｉｖｏの半減期を示すグラフである。
【図５】図５Ａは、還元条件下での、新規のｓｃＣＬＣＨ１リンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されているＴＮＦＲ２を含むＦｃ融合タンパク質の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。図５Ｂは、非還元条件下での、新規のｓｃＣＬＣＨ１リンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されているＴＮＦＲ２を含むＦｃ融合タンパク質の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図６】図６は、標準的なＴＮＦ直接融合タンパク質と比較した、本発明のＴＮＦＲ２融合タンパク質によるレポーター遺伝子活性化の阻害を示すグラフである。
【図７】図７は、標準的なＴＮＦ直接融合タンパク質と比較した、新規のｓｃＣＬＣＨ１リンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されているＴＮＦＲ２を含むＦｃ融合タンパク質を静脈内投与されたときの、ラットにおけるｉｎ  ｖｉｖｏの半減期を示すグラフである。
【図８】図８Ａは、還元条件下での、新規のｓｃＣＬＣＨ１リンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されているＩＬ１Ｒａを含むＦｃ融合タンパク質の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。図８Ｂは、非還元条件下での、新規のｓｃＣＬＣＨ１リンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されているＩＬ１Ｒａを含むＦｃ融合タンパク質の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図９】図９は、本発明のＩＬ１Ｒａ融合タンパク質による、レポーター遺伝子活性化の阻害を示すグラフである。
【図１０】図１０は、新規のｓｃＣＬＣＨ１リンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されているＩＬ１Ｒａを含むＦｃ融合タンパク質を静脈内投与されたときの、ラットにおけるｉｎ  ｖｉｖｏの半減期を示すグラフである。
【図１１】図１１は、新規のｓｃＣＬＣＨ１リンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されているＩＬ１Ｒａを含むＦｃ融合タンパク質を眼内投与されたときの、ラットにおけるｉｎ  ｖｉｖｏの半減期を示すグラフである。
【図１２】図１２Ａは、２本のポリペプチド鎖のＦｃ融合タンパク質ホモ二量体の線図であり、各ポリペプチド鎖はＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαの融合物をＸとして含み、次いでＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαの融合物は新規のｓｃＣＬＣＨ１リンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合される。図１２Ｂは、２本のポリペプチド鎖のＦｃ融合タンパク質ホモ二量体の線図であり、各ポリペプチド鎖はＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαの融合物をＸとして含み、次いでＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαの融合物は新規のｓｃＣＨ１ＣＬリンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合される。
【図１３】図１３は、還元および非還元条件下での、新規のｓｃＣＬＣＨ１リンカー（左）または新規のｓｃＣＨ１ＣＬリンカー（右）を介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されているＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαを含むＦｃ融合タンパク質の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図１４】図１４Ａは、分析的ゲル濾過による、新規のｓｃＣＬＣＨ１リンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されているＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαの特徴付けを示すクロマトグラムである。図１４Ｂは、分析的ゲル濾過による、新規のｓｃＣＨ１ＣＬリンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されているＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαの特徴付けを示すクロマトグラムである。
【図１５】図１５は、ｒｈＩＬ−２と比較した、本発明のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα一本鎖融合タンパク質によるｐＳＴＡＴ５の活性化を示すグラフである。
【図１６】図１６は、本発明のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα一本鎖融合タンパク質を静脈内および皮下投与されたときの、ラットにおけるｉｎ  ｖｉｖｏの半減期を示すグラフである。
【図１７】図１７は、２本のポリペプチド鎖のＦｃ融合タンパク質ホモ二量体の線図であり、各ポリペプチド鎖はＩＦＮβをＸとして含み、次いでＩＦＮβは本発明の新規のｓｃＣＬＣＨ１リンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合される。
【図１８】図１８は、還元および非還元条件下での、新規のｓｃＣＬＣＨ１リンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されているＩＦＮβを含むＦｃ融合タンパク質の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図１９】図１９は、分析的ゲル濾過による、新規のｓｃＣＬＣＨ１リンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されているＩＦＮβの特徴付けを示すクロマトグラムである。
【図２０】図２０は、本発明のＩＦＮβ融合タンパク質によるレポーター遺伝子の活性化を示すグラフである。
【図２１】図２１は、本発明のＩＦＮβ融合タンパク質をＩＶ（１．４ｎモル／Ｋｇ）およびＳＣ（３．６ｎモル／Ｋｇ）投与した後の、平均濃度−時間プロファイルを示すグラフである。
【図２２】図２２Ａは、２本のポリペプチド鎖のＦｃ融合タンパク質ホモ二量体の線図であり、各ポリペプチド鎖はＩＬ−１０をＸとして含み、次いでＩＬ−１０は新規のｓｃＣＬＣＨ１リンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合される。図２２Ｂは、２本のポリペプチド鎖のＦｃ融合タンパク質ホモ二量体の線図であり、各ポリペプチド鎖はＩＬ−１０をＸとして含み、次いでＩＬ−１０は新規のｓｃＣＨ１ＣＬリンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合される。
【図２３】図２３は、還元および非還元条件下での、新規のｓｃＣＬＣＨ１リンカー（左）または新規のｓｃＣＨ１ＣＬリンカー（右）を介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されているＩＬ−１０を含むＦｃ融合タンパク質の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図２４】図２４Ａは、分析的ゲル濾過による、新規のｓｃＣＬＣＨ１リンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されているＩＬ−１０の特徴付けを示すクロマトグラムである。図２４Ｂは、分析的ゲル濾過による、新規のｓｃＣＨ１ＣＬリンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されているＩＬ−１０の特徴付けを示すクロマトグラムである。
【図２５】図２５は、対照として使用されるｓｃＩＬ−１０直接Ｆｃ融合タンパク質と比較した、本発明のＩＬ−１０一本鎖融合タンパク質によるマウス肥満細胞株ＭＣ／９の刺激を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
定義
「ポリペプチド」とは、長さ、翻訳後修飾、または機能とは無関係に、２つまたはそれよりも多いアミノ酸の任意の配列のことである。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は本明細書では互換的に使用される。ポリペプチドは天然のアミノ酸および非天然のアミノ酸を含むことが可能である。ポリペプチドは種々の標準化学法のいずれにおいても改変することが可能である（例えば、アミノ酸は保護基を用いて改変することが可能である；カルボキシ末端アミノ酸を末端アミド基にすることが可能である；アミノ末端残基は、例えば、親油性を増強する基を用いて改変することが可能である；またはポリペプチドは化学的にグリコシル化するもしくは他の方法で改変して安定性もしくはｉｎ
ｖｉｖｏ半減期を増加することが可能である）。ポリペプチド改変は、環状化合物もしくは他の分子などの別の構造をポリペプチドに付着させることを含むことが可能であり、１つまたは複数のアミノ酸を変化した立体配置で（すなわち、ＲもしくはＳ；またはＬもしくはＤ）含有するポリペプチドも含むことが可能である。
【００１１】
本明細書で使用されるように、「抗体」および「免疫グロブリン」は互換的に使用され、免疫グロブリン遺伝子（単数または複数）により実質的にコードされ、抗原に特異的に結合して認識するポリペプチドまたはその断片を指す。同定された免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに種々の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類され、これらは次にそれぞれ免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを定義する。抗体技術の分野の当業者が理解している用語はそれぞれが、本明細書ではっきりと別に定義されていなければ、当技術分野で持つ意味が与えられている。抗体は可変領域、ヒンジ領域、および定常ドメインを有することが公知である。免疫グロブリン構造および機能は、例えば、Ｈａｒｌｏｗら編、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第１４章（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８８年）に概説されている。
【００１２】
本明細書の「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、最大パーセント配列同一性を達成するために配列を整列させ、必要ならば、ギャップを導入した後、選択された配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義され、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するための整列は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの一般に公表されているコンピュータソフトウェアを使用して当技術分野の能力の範囲内である種々の方法で達成することが可能である。当業者であれば、比較中の配列の全長にわたり最大整列を達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【００１３】
表示法「ｍｇ／ｋｇ」、または「ｋｇ当たりのｍｇ」とはキログラム当たりのミリグラムを指す。全ての表示法は本開示全体を通じて互換的に使用される。
【００１４】
ポリペプチドの「半減期」は一般に、例えば、天然の機序によるポリペプチドの分解および／またはポリペプチドのクリアランスもしくは隔離により、ポリペプチドの血清濃度がｉｎ  ｖｉｖｏで５０％減少するのにかかる時間と定義することが可能である。半減期は薬物動態解析によるなどのそれ自体公知のいかなる様式でも決定することが可能である。適切な技法は当業者には明らかであり、例えば、一般に、適切な用量のポリペプチドを齧歯類または霊長類に投与するステップ；齧歯類または霊長類から一定の間隔で血液試料または他の試料を収集するステップ；前記血液試料中のポリペプチドのレベルまたは濃度を決定するステップ；およびこうして得られたデータ（のプロット）から、投薬する際の最初のレベルと比べてポリペプチドのレベルまたは濃度が５０％減少するまでの時間を計算するステップを含むことができる。半減期を決定するための方法は、例えば、Ｋｅｎｎｅｔｈら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：  Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ（１９８６年）；Ｐｅｔｅｒｓら、Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９６年）；および「Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」、Ｍ  ＧｉｂａｌｄｉおよびＤ  Ｐｅｒｒｏｎ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ出版、改訂２版（１９８２年）に見出すことができる。
【００１５】
融合ポリペプチドの半減期は、生体マトリックス（血液、血清、血漿、組織）中での存在が適切な対照よりも長い期間ｉｎ  ｖｉｖｏで持続する場合は増加している。半減期は適切な対照と比べて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれよりも多く増加することができる。
【００１６】
半減期は、ｔ１／２−アルファ、ｔ１／２−ベータ、およびＨＬ＿ラムダ＿ｚなどのパラメータを使用して表すことが可能である。本明細書では、「半減期の増加」とは、これらのパラメータのうちのいずれか１つ、これらのパラメータのうちのいずれか２つ、またはこれらのパラメータのうちの３つ全ての増加を指す。「半減期の増加」は特に、ｔ１／２−ベータおよび／またはＨＬ＿ラムダ＿ｚの増加、ｔ１／２−アルファが増加または増加していないことを指す。評価することが可能である他のＰＫパラメータには、分布容積（ＶＤ）、クリアランス（ＣＬ）、および平均滞留時間（ＭＲＴ）、ならびに曲線下面積（ＡＵＣ）が含まれる。本明細書では、「薬物動態の変化」とは、上に収載されている半減期パラメータの変化の存在または非存在下での、これらのパラメータのうちのいずれか１つ、これらのパラメータのうちのいずれか２つ、これらのパラメータのうちのいずれか３つ、またはこれらのパラメータのうちの４つ全ての変化を指す。
【００１７】
本明細書の目的のための「活性」とは、対応する天然の活性タンパク質の作用または効果と一致するが必ずしも同一ではない融合タンパク質の成分の作用または効果のことを指し、「生物学的活性（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」または「生物活性（ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ）」とは、受容体結合、アンタゴニスト活性、アゴニスト活性、または細胞もしくは生理学的応答を含むがこれらに限定されないｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ生体機能または効果を指す。
【００１８】
本明細書で使用されるように、「二量体複合体」は、本発明の２つの一本鎖Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質を含み、２つの一本鎖ポリペプチドは非共有結合または、例えば、ジスルフィド架橋による共有結合を介して、適切な条件下で互いに会合する。本明細書で互換的に使用される「ヘテロ二量体タンパク質」、「ヘテロ二量体化複合体」、または「ヘテロ二量体」とは、二量体複合体を形成する２つの一本鎖Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃポリペプチドで構成されているタンパク質を指し、前記２つの一本鎖ポリペプチドは異なるアミノ酸配列を有し、特に、Ｘは異なる可溶性タンパク質または同じ可溶性タンパク質の異なる部分を表す。本明細書で互換的に使用される「ホモ二量体タンパク質」、「ホモ二量体化複合体」、または「ホモ二量体」とは、二量体複合体を形成する２つの同一のまたは実質的に同一のポリペプチドで構成されているタンパク質を指し、前記２つの一本鎖ポリペプチドは、１００％同一性、または少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％同一性を共有し、アミノ酸の違いはホモ二量体のもう一方のポリペプチドと比べてポリペプチドの機能的および物理的特性に影響を与えないアミノ酸置換、付加または欠失、例えば、保存的アミノ酸置換からなる。
【００１９】
本明細書で使用されるように、タンパク質は、それがポリペプチドをそのようなポリペプチドを発現している細胞の膜に係留させるまたは一体化させる任意の膜貫通ドメインまたはタンパク質ドメインを欠く場合「可溶性」である。
【００２０】
本明細書で使用されるように、「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ領域」または「Ｆｃ部分」は、それらの用語が本発明のＸ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質を記述するために本明細書で互換的に使用することができるが、定常領域の断片、類似物、改変体、変異体または誘導体を含む、免疫グロブリン、好ましくは、ヒト免疫グロブリンの定常領域由来のドメインを包含する。適切な免疫グロブリンにはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ならびにＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭなどの他のクラスが含まれる。免疫グロブリンの定常領域は、免疫グロブリンＣ末端領域に相同な天然に存在するか、または合成的に産生されるポリペプチドと定義され、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはＣＨ４ドメインを別々にまたは組み合わせて含むことが可能である。
【００２１】
本明細書で使用されるように、「処置」もしくは「処置する」、または「緩和する」もしくは「回復する」は本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、治療的有益性および／または予防的有益性を含むがこれらに限定されない有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療的有益性とは、処置中の根底にある障害の根絶または回復のことである。さらに、治療的有益性は、被験体が根底にある障害にまだ罹患している可能性があるにもかかわらず被験体において改善が観察されるように、根底にある障害と関連する生理学的症状のうちの１つまたは複数の根絶または回復で達成される。
【００２２】
予防的有益性では、組成物を特定の疾患を発症するリスクのある被験体に、または疾患の生理学的症状のうちの１つもしくは複数を報告する被験体に、たとえこの疾患の診断がまだ下されていないにしても、投与することができる。
【００２３】
本明細書で使用される「治療効果」とは、本発明の融合タンパク質により引き起こされる、ヒトもしくは他の動物における疾患の治癒、軽減、回復、もしくは予防を含むがこれらに限定されない、またはヒトもしくは動物の身体的もしくは精神的幸福を他の方法で増強する生理学的効果を指す。
【００２４】
本明細書で使用される用語「治療有効量」および「治療有効用量」とは、単回用量でまたは繰り返し用量で被験体に投与された場合、疾患状態または状態の任意の症状、側面、測定されたパラメータまたは特徴に対して任意の検出可能で有益な効果を有することができる、単独でのまたは融合タンパク質組成物の一部としての活性タンパク質の量を指す。そのような効果は有益であるためには絶対的である必要はない。
【００２５】
本明細書で使用される用語「治療有効用量レジメン」とは、単独でのまたは融合タンパク質組成物の一部としての活性タンパク質の継続的に投与される用量のためのスケジュールを指し、用量は治療有効量で与えられて、疾患状態または状態の任意の症状、側面、測定されたパラメータまたは特徴に対して持続性の有益な効果をもたらす。
【００２６】
一本鎖Ｆｃ融合タンパク質
本発明の一本鎖Ｆｃ融合タンパク質は、アミノ末端（Ｎ末端）からカルボキシ末端（Ｃ末端）まで以下の配置：
Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃ
を有し、
Ｘは、可溶性タンパク質であり；
Ｌ１は、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の配置：
Ｌ２−ＣＬ−Ｌ３−ＣＨ１−Ｌ４またはＬ２−ＣＨ１−Ｌ３−ＣＬ−Ｌ４
を有するリンカーであり、
Ｌ２とＬ４は、独立してポリペプチドリンカーであるか、または独立して存在せず、
Ｌ３は、ポリペプチドリンカーであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖由来の定常領域ポリペプチドであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリン重鎖のＣＨ１ドメイン由来の定常領域ポリペプチドであり；ＨＩＮＧＥは、免疫グロブリンのヒンジ配列であるか、または存在せず、ただし、ＨＩＮＧＥが存在しない場合はＬ４が存在し、
Ｆｃは、免疫グロブリンのカルボキシ末端またはその任意の活性断片もしくは誘導体である。
【００２７】
本発明に従えば、目的の可溶性タンパク質は、本明細書では「ｓｃＣＬＣＨ１リンカー」とも呼ばれる一本鎖（ｓｃ）として配置された免疫グロブリンのＣＬおよびＣＨ１ドメインに由来する新規のリンカー（Ｌ１）を介して免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端領域に融合されている。
【００２８】
ＣＬ領域のＣ末端はポリペプチドリンカーＬ３を介してＣＨ１領域のＮ末端領域に連結させることができる。ＣＬ領域のＮ末端は、任意選択のポリペプチドリンカーＬ２を介して目的のタンパク質（Ｘ）のＣ末端に融合させることができる。ＣＨ１ドメインのＣ末端は、免疫グロブリンヒンジ領域（ＨＩＮＧＥ）もしくはポリペプチドリンカー（Ｌ４）またはヒンジ（ＨＩＮＧＥ）とポリペプチドリンカー（Ｌ４）の両方を介してＦｃドメインに連結されている。
【００２９】
ＣＨ１ドメインのＣ末端はポリペプチドリンカーＬ３を介してＣＬ領域のＮ末端にも連結させることができる。ＣＨ１領域のＮ末端は、任意選択のポリペプチドリンカーＬ２を介して目的のタンパク質（Ｘ）のＣ末端に融合させることができる。ＣＬ領域のＣ末端は、免疫グロブリンヒンジ領域（ＨＩＮＧＥ）もしくはポリペプチドリンカー（Ｌ４）またはヒンジ（ＨＩＮＧＥ）とポリペプチドリンカー（Ｌ４）の両方を介してＦｃ領域に連結されている。
【００３０】
好ましくは、Ｌ３はＧｌｙ（Ｇ）、および／またはＳｅｒ（Ｓ）から選択されるアミノ酸を含む人工の柔軟なドメインから選択される。好ましくは、リンカーは一般式（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２１））ｎまたは（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２２））ｎであり、ｎは１から１０までの整数であるポリペプチドで構成されている。好ましくは、それぞれのリンカーは約１から約１００アミノ酸、好ましくは約１〜５０アミノ酸、好ましくは約１〜２５アミノ酸、好ましくは約１〜１５アミノ酸、好ましくは約１〜１０アミノ酸、好ましくは約４〜２４アミノ酸、好ましくは約５〜２０アミノ酸、好ましくは約５〜１５アミノ酸および好ましくは約５〜１０アミノ酸を含むポリペプチドである。好ましくは、リンカーは（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２２））ｎであり、ｎは２または４である。
【００３１】
Ｌ２およびＬ４は、例えば、Ｇｌｙ（Ｇ）、およびＳｅｒ（Ｓ）から選択されるアミノ酸を含む人工の柔軟なドメインから独立して選択される。好ましくは、リンカーは一般式（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２１））ｎまたは（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２２））ｎであり、ｎは１から１０までの整数であるポリペプチドで構成されている。好ましくは、それぞれのリンカーは約１から約１００アミノ酸、好ましくは約１〜５０アミノ酸、好ましくは約１〜２５アミノ酸、好ましくは約１〜１５アミノ酸、好ましくは約１〜１０アミノ酸、好ましくは約４〜２４アミノ酸、好ましくは約５〜２０アミノ酸、好ましくは約５〜１５アミノ酸および好ましくは約５〜１０アミノ酸を含むポリペプチドである。好ましくは、リンカーは（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２２））ｎであり、ｎは２または４である。
【００３２】
Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、例えば、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、およびＡｓｐ（Ｄ）などのアミノ酸をさらに含むことができる。
【００３３】
新規のｓｃＣＬＣＨ１リンカー（Ｌ１）のＣＬ領域は、免疫グロブリンクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、もしくはＩｇＭのいずれかまたはＩｇＧ抗体サブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のいずれかに属する天然の免疫グロブリンの対応するＣＬ領域と実質的に同一であってよい。ＣＬ領域（Ｌ１）は免疫グロブリンクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、もしくはＩｇＭのいずれかまたはＩｇＧ抗体サブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のいずれかに属する天然の免疫グロブリンの対応するＣＬ領域と少なくとも５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有することができる。Ｌ１のＣＬ領域が天然のＣＬ領域の改変された誘導体または改変体である場合、そのような改変にはアミノ酸挿入、欠失、置換および再配置が含まれるがこれらに限定されない。好ましくは、本発明に従ったＣＬ領域のアミノ酸配列は免疫グロブリンクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、もしくはＩｇＭのいずれかまたはＩｇＧ抗体サブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のいずれかに属する天然の免疫グロブリンの対応するＣＬ領域と少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％同一である。
【００３４】
新規のｓｃＣＬＣＨ１リンカー（Ｌ１）のＣＨ１領域は免疫グロブリンクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、もしくはＩｇＭのいずれかまたはＩｇＧ抗体サブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のいずれかに属する天然の免疫グロブリンの対応するＣＨ１領域と実質的に同一であってよい。Ｌ１のＣＨ１領域は免疫グロブリンクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、もしくはＩｇＭのいずれかまたはＩｇＧ抗体サブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のいずれかに属する天然の免疫グロブリンの対応するＣＨ１領域と少なくとも５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有することができる。Ｌ１リンカーのＣＨ１領域が天然のＣＨ１免疫グロブリン領域の改変された誘導体または改変体である場合、そのような改変にはアミノ酸挿入、欠失、置換および再配置が含まれるがこれらに限定されない。好ましくは、ＣＨ１領域のアミノ酸配列は免疫グロブリンクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、もしくはＩｇＭのいずれかまたはＩｇＧ抗体サブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のいずれかに属する天然の免疫グロブリンの対応するＣＨ１領域と少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％同一である。
【００３５】
Ｌ１のＣＨ１領域およびＣＬ領域は同じ免疫グロブリンクラスの対応する領域と同一であるか、または改変体である必要はない。例えば、ＣＬ領域はＩｇＥの対応する領域由来でもよく、ＣＨ１領域はＩｇＧの対応する領域由来でもよい。
【００３６】
好ましくは、ｓｃＣＬＣＨ１リンカーのＣＬおよびＣＨ１は、ＩｇＧ１、好ましくはヒトＩｇＧ１の対応するＣＬおよびＣＨ１領域由来である。
【００３７】
ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）のＣＬ領域に対応する例となるＣＬ領域は、
【化１】
2019047828.tif 000002
を含む。
【００３８】
ｈＩｇＧ１のＣＨ１領域に対応する例となるＣＨ１領域は、
【化２】
2019047828.tif 000003
を含む。
【００３９】
本明細書に開示される一本鎖Ｆｃ融合タンパク質は、免疫グロブリン重鎖のカルボキシ末端の少なくとも一部を含むＦｃ領域を含む。例えば、Ｆｃ部分は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２−ＣＨ４ドメイン、ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４ドメイン、ヒンジ−ＣＨ２ドメイン、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ４ドメイン、またはヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４ドメインを含むことができる。Ｆｃドメインは免疫グロブリンクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、もしくはＩｇＭのいずれかまたはＩｇＧ抗体サブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のいずれかに属する抗体に由来することができる。好ましくは、Ｆｃ領域はＩｇＧ１、好ましくはヒトＩｇＧ１に由来する。
【００４０】
Ｆｃドメインは、天然の対立遺伝子またはスプライス改変体を含む、免疫グロブリンクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、もしくはＩｇＭのいずれかまたはＩｇＧ抗体サブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のいずれかに属する天然に存在するＦｃ配列であってよい。代わりに、Ｆｃドメインは、２つまたはそれよりも多い異なるＩｇアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４ハイブリッドＦｃドメイン由来のＦｃドメインの一部を含むハイブリッドドメインであってよい。好ましくは、Ｆｃドメインはヒト免疫グロブリン分子由来である。代わりに、Ｆｃドメインは、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むがこれらに限定されない非ヒト動物由来のＦｃドメインのヒト化または脱免疫化（ヘルパーＴ細胞を活性化することが可能であるＴ細胞エピトープの除去）バージョンであってよい。
【００４１】
Ｆｃドメインは改変体Ｆｃ配列、例えば、望ましい構造特長および／または生物学的活性を提供するために、親Ｆｃ配列（例えば、その後に改変されて改変体を生み出す非改変Ｆｃポリペプチド）と比較して改変されているＦｃ配列（例えば、アミノ酸置換、欠失および／または挿入により）であってよい。例えば、（ａ）増加したもしくは減少した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有する、（ｂ）増加したもしくは減少した補体媒介細胞傷害（ＣＤＣ）を有する、（ｃ）Ｃ１ｑに対する増加したもしくは減少した親和性を有するおよび／または（ｄ）親Ｆｃと比較してＦｃ受容体に対して増加したもしくは減少した親和性を有するＦｃ改変体を生み出すためにＦｃ領域に改変を作製することができる。そのようなＦｃ領域改変体は一般に、Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸改変を含むことになる。アミノ酸改変を組み合わせることは特に望ましいと考えられている。例えば、改変体Ｆｃ領域はその中に、例えば、本明細書で同定される特定のＦｃ領域位置の２つ、３つ、４つ、５つ、等の置換を含むことができる。
【００４２】
本発明のＦｃ融合タンパク質のヒンジ領域は免疫グロブリンクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭのいずれかに属する抗体由来であってよい。ヒンジ領域はＩｇＧ抗体サブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のいずれか由来であってよい。ヒンジ領域はシステイン残基を天然に含有していてもよくまたは１つもしくは複数のシステイン残基を含有するように操作してもよい。
【００４３】
好ましくは、ヒンジ領域は免疫グロブリンクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、もしくはＩｇＭのいずれかまたはＩｇＧ抗体サブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のいずれかに属する天然の免疫グロブリンの対応するヒンジ領域と少なくとも５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有することができる。好ましくは、ヒンジ領域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１の対応するヒンジ領域と少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％同一である。
【００４４】
ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン定常領域の配列は下に示されており、ヒンジ領域の相対的位置は実線下線により示されている。
【化３】
2019047828.tif 000004
ＣＨ１領域は点線の下線により示され、ＣＨ２およびＣＨ３は太字で示されている。ＩｇＧ配列のＣ末端リジンは、Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期をさらに増加させるためには、取り除くまたはアラニンなどの非リジンアミノ酸で置き換えることができる。
【００４５】
ヒンジ配列は望ましい薬物動態、生物物理学的、および／または生物学的特性を与える置換を含むことができる。本発明の例となるヒンジ領域は以下のＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号４）と少なくとも５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００４６】
Ｆｃドメインおよびヒンジ領域は１つの抗体クラスまたはサブクラスに由来していてよい。例えば、ヒンジ領域およびＦｃドメインはＩｇＧ１に由来していてよい。Ｆｃドメインおよびヒンジ領域は異なる抗体クラスまたはサブクラスに対応していてよい。例えば、ＦｃドメインはＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＦｃ領域に対応していてよく、ヒンジ領域はＩｇＧ１に対応していてよい。
【００４７】
好ましくは、本発明のＦｃ融合タンパク質の免疫グロブリンドメイン全てがＩｇＧ１、好ましくはヒトＩｇＧ１由来である。好ましくは、本発明の融合タンパク質の組み合わせたヒンジ領域とＦｃ領域は、
【化４】
2019047828.tif 000005
と少なくとも５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、本発明の融合タンパク質の組み合わせたヒンジ領域とＦｃ領域は、
【化５】
2019047828.tif 000006
と少なくとも５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００４８】
ヒンジおよび／またはＦｃ領域間のジスルフィド結合の形成を可能にし、それによって本発明のＦｃ融合タンパク質の二量体を形成するために、遊離のシステイン残基を含む本発明の一本鎖融合タンパク質のヒンジ配列および／またはＦｃ領域を有することが望ましい場合がある。例えば、リンカー中の１つまたは複数のシステイン残基をセリン、アラニンまたはグリシンなどの別の残基に変異することにより、ヒンジおよび／またはＦｃ領域配列を変えて遊離のシステイン残基を取り除くことが望ましい場合がある。本発明の一本鎖融合タンパク質のヒンジ領域は、本発明の第２の一本鎖融合タンパク質と１つまたは複数のジスルフィド結合を形成して、それによって二量体複合体を形成することができる１つまたは複数の遊離のシステイン残基を含むことができる。
【００４９】
本明細書に記載されるＸ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質は、目的の任意の可溶性タンパク質またはその任意の活性断片またはその任意の活性誘導体でもよいＸ部分を含有する。本発明に従って一本鎖Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃスキャフォールドに融合させることができる目的の可溶性タンパク質（Ｘ）には、標的分子、細胞、複合体および／または組織に結合するもしくはこれと相互作用をすることが可能なタンパク質またはその部分もしくは断片が含まれるがこれらに限定されず、そのような標的には酵素基質、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、低分子量化合物、およびそれらの断片が含まれる。
【００５０】
目的の可溶性結合タンパク質（Ｘ）には、以下のタンパク質のリスト、ならびに以下のタンパク質のリストに属する活性誘導体、活性断片、サブユニット、ドメイン、モチーフおよびエピトープが含まれるがこれらに限定されない：レニン；ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ−１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）、およびフォンビルブランド因子などの凝固因子；プロテインＣなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子アルファおよびベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌｌｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミューラー管抑制因子；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；ベータラクタマーゼなどの微生物タンパク質；デオキシリボヌクレアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ−４などの細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；例えば、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲなどのホルモンまたは増殖因子の受容体；アルファインターフェロン（α−ＩＦＮ）、ベータインターフェロン（β−ＩＦＮ）およびガンマインターフェロン（γ−ＩＦＮ）などのインターフェロン；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）、または神経成長因子などの神経栄養因子；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；ＡＦＧＦおよびＰＦＧＦなどの線維芽細胞増殖因子；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−１、ＴＧＦ−２、ＴＧＦ−３、ＴＧＦ−４、またはＴＧＦ−５を含むＴＧＦアルファおよびＴＧＦベータなどのトランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；デス（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５２、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ８０およびＣＤ１４７などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−アルファ、−ベータ、および−ガンマなどのインターフェロン；Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１���、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５；ＩＬ１Ｒａなどのインターロイキン受容体アンタゴニスト；ＴＮＦα、スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部、例えば、ｇｐ１２０などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；ＬＦＡ−１、Ｍａｃ  １、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３およびＶＣＡＭなどの細胞接着分子、ａまたはそのサブユニットを含むａ４／ｐ７インテグリンおよびＸｖ／ｐ３インテグリン、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、アルファ７、アルファ８、アルファ９、アルファＤ、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ５１、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４１、アルファＩＩｂ、アルファＩＥＬｂなどのインテグリンアルファサブユニット；ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、ベータ５、ベータ６、ベータ７およびベータ８などのインテグリンベータサブユニット；αＶβ３、αＶβ５およびα４β７を含むがこれらに限定されないインテグリンサブユニット組合せ；アポトーシス経路のメンバー；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐ１受容体；ＣＴＬＡ−４；プロテインＣ；ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＢ２、等などのＥｐｈ受容体；ＨＬＡ−ＤＲなどのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）；補体受容体ＣＲ１、Ｃ１Ｒｑなどの補体タンパク質ならびにＣ３およびＣ５などの他の補体因子；ＧｐＩｂα、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａおよびＣＤ２００などの糖タンパク質受容体；ＴＮＦＲ２などの可溶性受容体。
【００５１】
好ましくは、目的の可溶性タンパク質（Ｘ）は第ＩＸ因子、ＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂとしても公知である）またはＩＬ１Ｒａである。好ましくは、目的の可溶性タンパク質（Ｘ）はＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒαもしくはそれらの融合物、またはＩＦＮβである。好ましくは、目的の可溶性タンパク質（Ｘ）はＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒα（またはそれらの融合物）、ＩＦＮβ、第ＩＸ因子、ＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂとしても公知である）またはＩＬ１Ｒａである。
【００５２】
好ましくは、融合タンパク質は図１Ａに示されるホモ二量体の構造を有し、Ｘは第ＩＸ因子、ＴＮＦ−Ｒ２、もしくはＩＬ−１Ｒａまたは前述のタンパク質のいずれかの任意の活性断片もしくはその誘導体である。好ましくは、融合タンパク質は図１Ａに示されるホモ二量体の構造を有し、ＸはＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒα（またはそれらの融合物）、もしくはＩＦＮβまたは前述のタンパク質のいずれかの任意の活性断片もしくは誘導体である。好ましくは、融合タンパク質は図１Ｂに示されるヘテロ二量体の構造を有し、Ｘは第ＩＸ因子、ＴＮＦ−Ｒ２、またはＩＬ−１Ｒａであり、ＹはＸとは異なり第ＩＸ因子、ＴＮＦ−Ｒ２、またはＩＬ−１Ｒａである。好ましくは、融合タンパク質は図１Ｂに示されるヘテロ二量体の構造を有し、ＸはＩＬ−１０、第ＩＸ因子、ＴＮＦＲ、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒα（またはそれらの融合物）、ＩＦＮβまたはＩＬ−１Ｒａであり、ＹはＸとは異なりＩＬ−１０、第ＩＸ因子、ＴＮＦ−Ｒ２、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒα（またはそれらの融合物）、ＩＦＮβまたはＩＬ−１Ｒａである。好ましくは、融合タンパク質は図１Ｃに示されるホモ二量体の構造を有し、Ｘは第ＩＸ因子、ＴＮＦ−Ｒ２、またはＩＬ−１Ｒａである。好ましくは、融合タンパク質は図１Ｃに示されるホモ二量体の構造を有し、ＸはＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒα（またはそれらの融合物）、またはＩＦＮβである。好ましくは、融合タンパク質は図１Ｄに示されるヘテロ二量体の構造を有し、Ｘは第ＩＸ因子、ＴＮＦ−Ｒ２、またはＩＬ−１Ｒａであり、ＹはＸとは異なり第ＩＸ因子、ＴＮＦ−Ｒ２、またはＩＬ−１Ｒａである。好ましくは、融合タンパク質は図１Ｄに示されるヘテロ二量体の構造を有し、ＸはＩＬ−１０、第ＩＸ因子、ＴＮＦ−Ｒ２、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒα（またはそれらの融合物）、ＩＦＮβまたはＩＬ−１Ｒａであり、ＹはＸとは異なりＩＬ−１０、第ＩＸ因子、ＴＮＦ−Ｒ２、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒα（またはそれらの融合物）、ＩＦＮβまたはＩＬ−１Ｒａである。
【００５３】
好ましくは、式Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃの可溶性タンパク質Ｘは第ＩＸ因子であり、式Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃを有する本発明の一本鎖融合タンパク質は、
【化６】
2019047828.tif 000007
と５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００５４】
好ましくは、式Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃの可溶性タンパク質ＸはＴＮＦＲ２であり、式Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃを有する本発明の一本鎖融合タンパク質は、
【化７】
2019047828.tif 000008
と５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００５５】
好ましくは、式Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃの可溶性タンパク質ＸはＩＬ１Ｒａであり、式Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃを有する本発明の一本鎖融合タンパク質は、
【化８】
2019047828.tif 000009
と５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００５６】
好ましくは、式Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃの可溶性タンパク質ＸはＩＦＮβであり、式Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃを有する本発明の一本鎖融合タンパク質は、
【化９】
2019047828.tif 000010
と５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００５７】
好ましくは、式Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃの可溶性タンパク質Ｘは、国際公開第２０１３／１８４９４２号に記載されている円順列変異（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）により改変されているタンパク質を含む。円順列変異は、二次構造（および活性）は保持されたままで、得られるタンパク質の一次配列が再配列（ｒｅｏｒｄｅｒ）されるように、タンパク質の天然のアミノおよびカルボキシ端を一般にはリンカーと連結させ、タンパク質配列内の新たな部位、一般にはループで切断することにより新しいアミノおよびカルボキシ末端を作り出すことを含む。このように、新しい末端の創造は天然の末端と比較して融合パートナーの付着のためにより優れた位置を提供することができる。タンパク質リガンドの円順列変異は、その天然の形態と比較してその標的に対する変化したタンパク質リガンドの特異性および結合親和性を減弱させることなく新しいカルボキシルおよびアミノ末端を生み出すようにタンパク質を変化させることができる手段を提供する。さらに、新しい末端は、円順列変異されたリガンドを融合ポリペプチド内に組み込むのに優先的な位置に優先的に移動させることが可能であり、天然の（円順列変異を受けていない）リガンドを含有する融合ポリペプチドと比較してよりぐれた活性を示す。
【００５８】
好ましくは、式Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃの可溶性タンパク質Ｘは、Ｑ−Ｒと名付けられた２つの異なるタンパク質の融合物を含み、ＱとＲは任意選択のリンカーＬ５を介して融合することができる。好ましくは、Ｑは膜結合受容体とシグナル伝達複合体を形成することができる可溶性リガンドであり、Ｒは膜結合受容体由来の１つの受容体鎖の細胞外ドメインである。好ましくは、Ｑ−Ｌ５−Ｒは、任意選択のリンカーを介してＩＬ−２Ｒαの細胞外ドメインに融合されているＩＬ−２または円順列変異されたＩＬ−２である。
【００５９】
好ましくは、式Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃの可溶性タンパク質ＸはＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαの融合物であり、一本鎖タンパク質は
【化１０】
2019047828.tif 000011
と５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００６０】
好ましくは、式Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃの可溶性タンパク質ＸはＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαの融合物であり、一本鎖タンパク質は    
【化１１】
2019047828.tif 000012
と５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００６１】
好ましくは、式Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃの可溶性タンパク質ＸはＩＬ−１０であり、一本鎖タンパク質は
【００６２】
【化１２】
2019047828.tif 000013
と５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００６３】
好ましくは、式Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃの可溶性タンパク質ＸはＩＬ−１０であり、一本鎖タンパク質は
【００６４】
【化１３】
2019047828.tif 000014
と５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００６５】
好ましくは、本発明のＸ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質は、ジスルフィド結合を介してもう一方の単量体のヒンジ領域にまたはＦｃ領域で連結されている本発明の２つの単量体一本鎖Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質を含む二量体複合体である。二量体複合体はホモ二量体（例えば、両方の単量体融合タンパク質が同一である）でもヘテロ二量体（例えば、目的のタンパク質（Ｘ）は単量体融合タンパク質ごとに異なり得る）でもよい。好ましくは、二量体複合体はホモ二量体であり、それによって、天然の抗体の構成に類似する抗体構成を提供するホモ二量体複合体を形成する。
【００６６】
いかなる１つの理論にも限定されることなく、本発明のホモ二量体融合タンパク質は、従来のＦｃ融合タンパク質と比べた場合天然の抗体構造にさらに密接に類似する二量体化Ｆｃ領域の存在のため半減期を増加させると考えられている。さらに天然のＦｃドメイン抗体構成はＦｃＲｎ受容体へのもっと優れた結合を可能にし、したがって、Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃ二量体複合体の循環半減期を増加させると考えられる。
【００６７】
Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃ二量体複合体に関連する別の改善された特性は、ヒンジ領域におけるＦｃを通じた二量体化により引き起こされる立体障害を緩和する柔軟性を付与するｓｃＣＬＣＨ１リンカーの使用に基づいて従来のＦｃ融合タンパク質に対して生物活性を増加させることである。
【００６８】
Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質の組換え産生
本発明は、本明細書に開示される種々のＦｃ融合タンパク質のいずれかをコードする核酸も提供する。コドン使用は、細胞における発現を改善するように選択することができる。そのようなコドン使用は選択される細胞型に依存することになる。Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞については特殊なコドン使用パターンが開発されている。例えば、Ｍａｙｆｉｅｌｄら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１００巻（２号）：４３８〜４４２頁（２００３年１月２１日）；Ｓｉｎｃｌａｉｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．、２６巻（Ｉ号）：９６〜１０５頁（２００２年１０月）；Ｃｏｎｎｅｌｌ，  Ｎ．Ｄ．、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１２巻（５号）：４４６〜４４９頁（２００１年１０月）；Ｍａｋｒｉｄｅｓら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．、６０巻（３号）：５１２〜５３８頁（１９９６年９月）；およびＳｈａｒｐら、Ｙｅａｓｔ、７巻（７号）：６５７〜６７８頁（１９９１年１０月）を参照されたい。
【００６９】
核酸操作のための一般的技法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）、またはＡｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７年）および定期的最新版に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。一般には、ポリペプチドをコードするＤＮＡは、哺乳動物、ウイルス、または昆虫遺伝子由来の適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結されている。そのような調節エレメントには、転写プロモーター、転写を制御する任意選択のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が含まれる。通常、複製起点および形質転換体の識別を促進する選択遺伝子により与えられる宿主での複製能力がさらに組み込まれる。
【００７０】
本明細書に記載されるＦｃ融合タンパク質は、直接的にだけでなく、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換え的に産生することができ、異種ポリペプチドは、好ましくはシグナル配列または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端に特定の切断部位を有する他のポリペプチドである。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞により認識されプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）配列である。哺乳動物系におけるポリペプチドの産生のための例となるＮ末端リーダー配列は、ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号１０）であり、これは発現に続いて宿主細胞により取り除かれる。
【００７１】
天然のシグナル配列を認識してプロセシングすることがない原核宿主細胞では、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または耐熱性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列で置換される。
【００７２】
酵母分泌では、天然のシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、ファクターリーダー（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓアルファファクターリーダーを含む）、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー、または米国特許第５，６３１，１４４号に記載されているシグナルで置換されてもよい。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌型リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。そのような前駆体領域についてのＤＮＡはリーディングフレームにおいてタンパク質をコードするＤＮＡにライゲートすることができる。
【００７３】
発現ベクターとクローニングベクターの両方が、ベクターが１つまたは複数の選択された宿主細胞において複製するのを可能にする核酸配列を含有する。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列はベクターが宿主染色体ＤＮＡとは独立して複製することを可能にする配列であり、複製起点または自己複製配列を含む。そのような配列は種々の細菌、酵母、およびウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は大半のグラム陰性菌に適し、２ミクロンプラスミド起点は酵母に適し、種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は哺乳動物細胞においてクローニングベクターにとって有用である。一般に、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターにとって必要ではない（ＳＶ４０起点は典型的にはそれが初期プロモーターを含有するというだけで使用されることがある）。
【００７４】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含有することができる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリン（ｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）に対する耐性を与える、（ｂ）栄養要求性欠損を補完する、または（ｃ）複合培地からは入手できない極めて重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする、例えば、桿菌にとってのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子。
【００７５】
発現ベクターおよびクローニングベクターは通常、宿主生物により認識され、本明細書に開示されるタンパク質、例えば、フィブロネクチンベースのスキャフォールドタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されているプロモーターを含有する。原核宿主と共に使用するのに適したプロモーターには、ｐｈｏＡプロモーター、ベータラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにｔａｎプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。しかし、他の公知の細菌プロモーターは適切である。細菌系で使用するためのプロモーターは、本明細書に開示されるタンパク質をコードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン・ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含有することになる。プロモーター配列は真核生物について公知である。ほぼ全ての真核生物遺伝子が、転写が開始される部位からおおよそ２５から３０塩基上流に位置するＡＴリッチな領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始から７０から８０塩基上流に見られる別の配列はＣＮＣＡＡＴ（配列番号１６）領域でありＮは任意のヌクレオチドでよい。大半の真核生物遺伝子の３’端には、コード配列の３’端にポリＡテイルを付加するためのシグナルになることができるＡＡＴＡＡＡ（配列番号１７）配列がある。これらの配列の全てが真核生物発現ベクター内に適切に挿入されている。
【００７６】
酵母宿主と共に使用するための適切なプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ）配列には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸脱炭酸酵素、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどの他の解糖酵素に対するプロモーターが含まれる。
【００７７】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびもっとも好ましくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるプロモーターにより、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから、そのようなプロモーターが宿主細胞系と適合する限り、制御することが可能である。
【００７８】
本明細書に開示されるタンパク質をコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、ベクター内にエンハンサー配列を挿入することにより増大させることが多い。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテイン、およびインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が現在では公知である。しかし、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用することになる。例には、複製起点の後期側（ｂｐ１００〜２７０）上のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメント（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ）についてはＹａｎｉｖ、Ｎａｔｕｒｅ、２９７巻：１７〜１８頁（１９８２年）も参照されたい。エンハンサーはペプチドコード配列の５’位でも３’位でもベクター内にスプライスすることができるが、プロモーターから５’部位に位置するのが好ましい。
【００７９】
真核宿主細胞（例えば、酵母、真菌、昆虫、植物、動物、または他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターは、転写の終結におよびｍＲＮＡを安定化するために必要な配列も含有することになる。そのような配列は、真核またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’非翻訳領域および、時折、３’非翻訳領域から一般に入手可能である。これらの領域は、本明細書に開示されるタンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６およびそこに開示されている発現ベクターを参照されたい。
【００８０】
組換えＤＮＡは、タンパク質を精製するのに有用になり得るいかなるタイプのタンパク質タグ配列でも含むことが可能である。タンパク質タグの例には、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、またはＧＳＴタグが含まれるがこれらに限定されない。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主と共に使用するのに適切なクローニングおよび発現ベクターはＣｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５年））に見出すことが可能であり、これに関連する開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００８１】
当業者には明らかであるように、発現構築物は宿主細胞に適した方法を使用して宿主細胞内に導入される。エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を用いるトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（ここでベクターが感染因子である）を含むがこれらに限定されない、核酸を宿主細胞内に導入するための種々の方法が当技術分野では公知である。
【００８２】
適切な宿主細胞には、原核生物、酵母、哺乳動物細胞、または細菌細胞が含まれる。適切な細菌には、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．が含まれる。好ましくは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種由来の酵母も、ポリペプチドの産生に使用することができる。種々の哺乳動物または昆虫細胞培養系も組換えタンパク質を発現するのに用いることが可能である。昆虫細胞における異種タンパク質の産生のためのバキュロウイルス系はＬｕｃｋｏｗら、（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻：４７頁（１９８８年））により概説されている。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、内皮細胞、ＣＯＳ−７サル腎細胞、ＣＶ−１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胎児性腎細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３Ｔ、およびＢＨＫ細胞株が含まれる。精製されたポリペプチドは、適切な宿主／ベクター系を培養して組換えタンパク質を発現させることにより調製される。多くの適用では、本明細書に開示されるポリペプチドの多くの小サイズが発現のための好ましい方法としてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現すると考えられる。次に、タンパク質は培養培地または細胞抽出物から精製される。
【００８３】
他の態様では、本発明は、本明細書に記載されるＦｃ融合タンパク質をコードするベクターを含有する宿主細胞、ならびに本明細書に記載されるＦｃ融合タンパク質を産生するための方法を提供する。宿主細胞はタンパク質産生のために本明細書に記載される発現またはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように改変された従来の栄養培地において培養することができる。ハイスループットタンパク質産生（ＨＴＰＰ）および中規模産生に有用な宿主細胞には、ＨＭＳ１７４細菌株が含まれる。本明細書に開示されるタンパク質を産生するのに使用される宿主細胞は、種々の培地で培養することができる。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ））、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ））などの市販の培地は宿主細胞を培養するのに適している。さらに、種々の科学文献に記載されている培地の多くが宿主細胞用の培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれでも、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩など）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン薬など）、微量元素（通常、マイクロモル濃度範囲で最終濃度に存在する無機化合物として定義される）、ならびにグルコースまたは等価なエネルギー供給源を補充することができる。他のいかなる必要な栄養補助剤でも当業者には公知であると考えられる適切な濃度で含むこともできる。温度、ｐＨ、および同類のものなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞ですでに使用された条件であり、当業者には明らかであろう。
【００８４】
本明細書に提供されるＦｃ融合タンパク質は細胞翻訳系を使用して産生することも可能である。そのような目的のため、融合タンパク質をコードする核酸は、利用されている特定の無細胞系（哺乳動物もしくは酵母などの真核生物無細胞翻訳系または細菌などの原核生物無細胞翻訳系）においてｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写にｍＲＮＡを産生させるおよびｍＲＮＡの無細胞翻訳を可能にするように改変させなければならない。
【００８５】
本明細書に開示されるＦｃ融合タンパク質は化学合成により（例えば、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｔｈｅ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．（１９８４年）に記載される方法により）産生することも可能である。Ｆｃ融合タンパク質の改変も化学合成により作り出すことが可能である。
【００８６】
本明細書に開示されるＦｃ融合タンパク質は、タンパク質化学の分野で一般に公知であるタンパク質の単離／精製法により精製することが可能である。非限定的例には、抽出、再結晶化、塩析（例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムを用いて）、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過（ｇｅｔ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、ゲル浸透クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、電気泳動、向流分配法またはこれらの任意の組合せが含まれる。精製後、ポリペプチドは異なる緩衝液に交換されおよび／または濾過および透析を含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の種々の方法のいずれかにより濃縮されることができる。
【００８７】
精製されたＦｃ融合タンパク質は、好ましくは、少なくとも８５％純粋、または好ましくは少なくとも９５％純粋、もっとも好ましくは少なくとも９８％純粋である。純度の正確な数値とは無関係に、Ｆｃ融合タンパク質は医薬品として使用するには十分純粋である。
【００８８】
Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質の使用
一態様では、本発明は診断剤または治療剤として有用であるＦｃ融合タンパク質を提供する。一態様では、本発明は障害の処置において有用であるＦｃ融合タンパク質を提供する。処置することができる疾患または障害は、本発明の新規のＬ１リンカーを介して、Ｆｃドメインに融合されているタンパク質（Ｘ）の正体により指定され、がん、炎症性疾患、関節炎、骨粗鬆症、感染症、特に肝炎、細菌感染症、ウイルス感染症、遺伝病、肺疾患、糖尿病、ホルモン関連疾患、アルツハイマー病、心疾患、心筋梗塞、深部静脈血栓症、循環系の疾患、高血圧、低血圧、アレルギー、疼痛緩和、低身長症および他の成長障害、中毒、凝血疾患（ｂｌｏｔ  ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ）、自然免疫系の疾患、塞栓症、創傷治癒、火傷の治癒、クローン病、喘息、潰瘍、敗血症、緑内障、脳血管虚血、呼吸促迫症候群、角膜潰瘍、腎疾患、糖尿病性足潰瘍、貧血、第ＩＸ因子欠乏症、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、第ＶＩＩ因子欠乏症、粘膜炎、嚥下障害、栓球障害、肺塞栓症、不妊症、性腺機能低下症、白血球減少症、好中球減少症、子宮内膜症、ゴーシュ病、肥満、リソソーム蓄積症、エイズ、月経前症候群、ターナー症候群、悪液質、筋ジストロフィー、ハンチントン病、大腸炎、重症急性呼吸器症候群、カポジ肉腫、肝腫瘍、乳房腫瘍、神経膠腫、非ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病、ヘアリーセル白血病、腎細胞癌、肝腫瘍、リンパ腫、黒色腫、多発性硬化症、カポジ肉腫、パピローマウイルス、肺気腫、気管支炎、歯周疾患、認知症、分娩、非小細胞肺がん、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、先端巨大症、乾癬、卵巣腫瘍、ファブリー病、リソソーム蓄積症を含むがこれらに限定されない。
【００８９】
Ｆｃドメインに結合させることができる例となる治療可溶性タンパク質（Ｘ）には、例えば、第ＩＸ因子、ＩＬ１Ｒａ、およびＴＮＦＲが含まれる。Ｆｃドメインに結合させることができる例となる治療可溶性タンパク質（Ｘ）には、例えば、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒαもしくはそれらの融合物、またはＩＦＮβが含まれる。Ｆｃドメインに結合させることができる例となる治療可溶性タンパク質（Ｘ）には、例えば、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒαまたはそれらの融合物、ＩＦＮβ、第ＩＸ因子、ＩＬ１Ｒａ、およびＴＮＦＲ２が含まれる。
【００９０】
本発明は、被験体において有益な効果を達成するための方法であって、被験体に治療または予防有効量の融合タンパク質を投与するステップを含む方法も提供する。有効量は疾患または障害を処置するのを助ける有益な効果を生じることが可能である。いくつかの場合、有益な効果を達成するための方法は、治療タンパク質またはペプチドが存在しない疾患および疾患範疇について被験体を処置するために治療有効量の融合タンパク質組成物を投与することを含むことが可能である。
【００９１】
好ましくは、本発明は、Ｘが第ＩＸ因子である融合タンパク質Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃを提供する。好ましくは、本発明は、Ｘが第ＩＸ因子であるＸ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃの二量体複合体を提供する。好ましくは、二量体複合体はホモ二量体複合体である。本発明に従った第ＩＸ因子融合タンパク質を使用して、第ＩＸ因子が欠損し血友病Ｂに罹っている患者を、例えば、出血エピソードの制御および予防、出血エピソードの発生頻度を防ぐまたは減少させる慣用的な予防法、ならびに周術期管理（外科的予防法）のために処置することができる。
【００９２】
出血または出血エピソードの制御または予防を必要とする患者はヒト患者であることが好ましい。患者は投与時に出血しているもしくは出血していると予測され得る、またはわずかな出血、関節出血（ｈｅｍａｒｔｈｒｏｓｅｓ）、表在筋肉出血、軟組織出血、中程度の出血、切開による筋肉内もしくは軟組織出血、粘膜出血、血尿、大出血、咽頭の出血、咽頭後部の出血、後腹膜腔（ｒｅｔｒｏｐｅｒｉｔｏｎｉｕｍ）の出血、中枢神経系の出血、挫傷、切り傷、擦り傷、関節出血、鼻血、口腔内出血、歯肉出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、わずかな特発性出血、重度損傷後の出血、中程度の皮膚挫傷、または関節、筋肉、内臓もしくは脳内への特発性出血で出血の影響を受けやすいことがある。そのような患者には、手術または抜歯に関連する出血の管理などの周術期管理を必要とする患者も含まれる。患者は好ましくは、１つまたは複数の出血エピソードの予防法を必要とする。患者は好ましくは、個別化間隔予防法を必要とする。患者は好ましくは、１つまたは複数の出血エピソードのオンデマンド処置を必要とする。患者は好ましくは、１つまたは複数の出血エピソードの周術期管理を必要とする。
【００９３】
第ＩＸ因子を含む本発明の融合タンパク質を用いて血友病を処置すると、「有効用量」は、出血または出血障害の発生頻度を下げるまたは減少させる。「有効用量」は、好ましくは進行中の制御不能な出血または出血エピソードを止める。好ましくは、「有効用量」は、特発性出血または出血エピソードの影響を受けやすい被験体においてそのような特発性出血または出血エピソードを予防する。「治療用量」は、血友病を治癒する必要はない。
【００９４】
好ましくは、本発明は、ＸがＩＬ−１０である融合タンパク質Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃを提供する。好ましくは、本発明は、ＸがＩＬ−１０であるＸ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃの二量体複合体を提供する。好ましくは、二量体複合体はホモ二量体複合体である。本発明に従ったＩＬ−１０融合タンパク質および／またはその二量体化複合体を使用して、例えば、自己免疫障害、線維症性疾患、炎症性疾患、虚血性疾患、神経変性疾患、神経障害性疾患、疼痛性障害、聴覚障害、精神障害、がんならびに外傷および損傷に罹っている患者を処置することができる。
【００９５】
本発明のＩＬ−１０融合タンパク質により処置することができる自己免疫障害の例には、急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アディソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫血管浮腫、自己免疫再生不良性貧血、自己免疫自律神経障害、自己免疫肝炎、自己免疫高脂血症、自己免疫免疫不全、自己免疫内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫心筋炎、自己免疫卵巣炎、自己免疫膵炎、自己免疫網膜症、自己免疫血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫甲状腺炎、自己免疫蕁麻疹、軸索型およびニューロン型ニューロパチー、バロー病、ベーチェット病、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多病巣性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ病、クローン病、脱髄性ニューロパチー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン症、エヴァンス症候群、実験的アレルギー性脳脊髄炎、線維筋痛症、線維化肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）（以前はウェゲナー肉芽腫症と呼ばれていた）、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性皮膚筋炎、川崎病、ランバート・イートン症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス（全身性エリテマトーデス）、ライム病、慢性メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック病）、好中球減少症、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌関連小児自己免疫精神神経障害）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンバーグ症候群、毛様体扁平部炎（周辺性ブドウ膜炎）、パーソネージ・ターナー症候群、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発軟骨炎、不穏下肢症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ（ＲＡ）、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子および精巣自己免疫、全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、１型糖尿病、多腺性自己免疫症候群Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、水疱性皮膚炎、白斑、およびウェゲナー肉芽腫症が含まれるがこれらに限定されない。
【００９６】
本発明のＩＬ−１０融合タンパク質により処置することができる線維症性疾患の例には、癒着性関節包炎、関節線維性癒着（ａｒｔｈｒｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心房線維症、慢性腎疾患、肝臓の硬変、嚢胞性線維症（ＣＦ）、デュピュイトラン拘縮、心内膜心筋線維症、神経膠瘢痕、特発性肺線維症、ケロイド、黄斑変性症、縦隔線維症、骨髄線維症、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ、腎性全身性線維症、ペロニー病、進行性塊状線維症（肺）、増殖性硝子体網膜症、肺線維症、後腹膜線維症、脳卒中から生じる瘢痕組織形成、強皮症、全身性硬化症、組織接着が含まれるがこれらに限定されない。
【００９７】
本発明のＩＬ−１０融合タンパク質により処置することができる炎症性疾患の例には、アレルギー性腸炎、アルファ−１−抗トリプシン欠乏症、強直性脊椎炎、喘息、バレット食道、ベーチェット病、慢性疲労症候群（ＣＦＳ／ＣＦＩＤＳ／ＭＥ）、慢性ライム病（ボレリア症）、コカイン関連血管炎、クローン病、インターロイキン−１受容体アンタゴニストの欠損（ＤＩＲＡ）、うつ病、糖尿病、家族性地中海熱（ＦＭＦ）、線維筋痛症（ＦＭ）、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）、糸球体腎炎、移植片対宿主病、肉芽腫性血管炎、橋本甲状腺炎、高血圧、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、炎症性ミオパシー（多発性筋炎、封入体筋炎、皮膚筋炎）、間質性膀胱炎（ＩＣ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、虚血性大腸炎、腎結石、レーフグレン症候群、紅斑性狼瘡、メタンフェタミン関連血管炎、片頭痛、モルジェロンズ病、多種化学物質過敏症（ＭＣＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、新生児期発症多臓器性炎症性疾患（ＮＯＭＩＤ）、視神経炎、変形性関節炎、尋常性天疱瘡、リウマチ性多発筋痛症、前立腺炎、乾癬、乾癬性関節炎、放射線大腸炎（ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｃｏｌｉｔｉｓ）、レイノー症候群／現象、反応性関節炎（ライター症候群）、反射性交感神経性ジストロフィー（ＲＳＤ）、不穏下肢症候群、関節リウマチ（ＲＡ）、サルコイドーシス、強皮症、季節性感情障害（ＳＡＤ）、敗血症性ショック、副鼻腔炎、シェーグレン症候群、側頭動脈炎、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連周期熱症候群（ＴＲＡＰＳ）、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、およびめまいが含まれるがこれらに限定されない。
【００９８】
本発明のＩＬ−１０融合タンパク質により処置することができる虚血性疾患の例には、急性冠動脈症候群、狭心症、生命苦悶、コペプチン、冠動脈疾患、冠虚血、冬眠心筋、虚血性脳卒中、急性冠動脈症候群の管理、メルドニウム、心筋梗塞、心筋梗塞合併症、心筋梗塞診断、筋細胞融解、無酸素後脳症、プリンツメタル狭心症、スガルボッサ基準、脳卒中、ＴＩＭＩ、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）および不安定狭心症が含まれるがこれらに限定されない。
【００９９】
本発明のＩＬ−１０融合タンパク質により処置することができる神経変性疾患の例には、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体優性小脳性運動失調症、バッジョ・ヨシナリ症候群、バッテン病、エストロゲン神経変性疾患、近位優位の遺伝性運動感覚性ニューロパチー、乳児レフスム病、ＪＵＮＱおよびＩＰＯＤ、歩行性運動失調、ライム病、マシャド・ジョセフ病、脳橋および小脳発育不全の精神遅延および小頭症、多系統萎縮症、神経有棘赤血球症、神経セロイドリポフスチン症、ニーマン・ピック病、橋小脳形成不全、タンパク質凝集、ピルビン酸脱水素酵素欠損症、放射線ミエロパシー、レフサム病、網膜色素変性症、サンドホフ病、シャイ・ドレーガー症候群、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症、脊髄の亜急性連合変性症、亜急性硬化性全脳炎、脊髄癆、テイ・サックス病、中毒性脳症、中毒性白質脳症ならびにウォブリー・ヘッジホッグ症候群が含まれるがこれらに限定されない。
【０１００】
本発明のＩＬ−１０融合タンパク質により処置することができる神経障害疾患の例には、ベル麻痺、カンピロバクター関連運動軸索障害、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、糖尿病性筋萎縮症裂離（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｙ  ａｖｕｌｓｉｏｎ）、糖尿病性神経障害、ギラン・バレー症候群および血管炎が含まれるがこれらに限定されない。
【０１０１】
本発明のＩＬ−１０融合タンパク質により処置することができる疼痛性障害の例には、増幅筋骨格痛症候群、前皮神経絞扼症候群（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｎｅｒｖｅ  ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、中枢痛症候群、慢性機能性腹痛、慢性疼痛、慢性前立腺炎／慢性骨盤痛症候群、慢性創傷痛、変性椎間板疾患、歯下顎感覚運動機能不全（ｄｅｎｔｏｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ｓｅｎｓｏｒｉｍｏｔｏｒ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）、脊椎手術後症候群（ｆａｉｌｅｄ  ｂａｃｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、線維筋痛症、間質性膀胱炎、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、筋筋膜性疼痛症候群、骨盤痛、精管切除後疼痛症候群、反射性神経血管性ジストロフィー、鎌状赤血球症、テラミン（ｔｈｅｒａｍｉｎｅ）、および外陰部痛が含まれるがこれらに限定されない。
【０１０２】
本発明のＩＬ−１０融合タンパク質により処置することができる聴覚障害の例には、伝音難聴、感音難聴（ＳＮＨＬ）、混合性難聴が含まれるがこれらに限定されない。
【０１０３】
本発明のＩＬ−１０融合タンパク質により処置することができる精神障害の例には、大うつ病性障害、処置無反応性うつ病、処置抵抗性うつ病が含まれるがこれらに限定されない。
【０１０４】
本発明のＩＬ−１０融合タンパク質により処置することができる外傷および損傷の例には、中枢神経系（ＣＮＳ）損傷、外傷性脳損傷、脊髄損傷、圧挫損傷、ショック、腱損傷、角膜への創傷、眼への創傷、皮膚創傷が含まれるがこれらに限定されない。
【０１０５】
好ましくは、本発明に従ったＩＬ−１０二量体化複合体を使用すれば、例えば、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性甲状腺炎、クローン病、グレーヴズ病、橋本甲状腺炎、川崎病、ループス（全身性エリテマトーデス）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、乾癬、関節リウマチ、シェーグレン症候群、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎を含む自己免疫障害；慢性腎疾患、肝臓の硬変、黄斑変性症、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ、増殖性硝子体網膜症、肺線維症、脳卒中から生じる瘢痕組織形成、組織接着を含む線維症性疾患；アレルギー性腸炎、アルファ−１−抗トリプシン欠乏症、喘息、ベーチェット病、コカイン関連血管炎、糸球体腎炎、移植片対宿主病、肉芽腫性血管炎、炎症性腸疾患、炎症性ミオパシー（多発性筋炎、封入体筋炎、皮膚筋炎）、虚血性大腸炎、メタンフェタミン関連血管炎、視神経炎、尋常性天疱瘡、放射線大腸炎、サルコイドーシス、敗血症性ショック、側頭動脈炎、血管炎を含む炎症性疾患；心筋梗塞、無酸素後脳症、脳卒中を含む虚血性疾患；神経セロイドリポフスチン症、放射線ミエロパシー、網膜色素変性症、脊髄性筋萎縮症を含む神経変性疾患；カンピロバクター関連運動軸索障害、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、糖尿病性筋萎縮症裂離、糖尿病性神経障害、ギラン・バレー症候群を含む神経障害疾患；伝音難聴、感音難聴（ＳＮＨＬ）、混合性難聴を含む聴覚障害；大うつ病性障害、処置無反応性うつ病、処置抵抗性うつ病を含む精神障害；中枢神経系（ＣＮＳ）損傷、外傷性脳損傷、脊髄損傷、圧挫損傷、ショック、腱損傷、角膜への創傷、眼への創傷、皮膚創傷を含む外傷および損傷に罹っている患者を処置することができる。
【０１０６】
もっとも好ましくは、本発明に従ったＩＬ−１０二量体化複合体は、例えば、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性甲状腺炎、クローン病、グレーヴズ病、橋本甲状腺炎、川崎病、ループス（全身性エリテマトーデス）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、乾癬、関節リウマチ、シェーグレン症候群、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎を含む自己免疫障害；慢性腎疾患、肝臓の硬変、黄斑変性症、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ、増殖性硝子体網膜症、肺線維症、脳卒中から生じる瘢痕組織形成、組織接着を含む線維症性疾患；アレルギー性腸炎、アルファ−１−抗トリプシン欠乏症、喘息、ベーチェット病、コカイン関連血管炎、糸球体腎炎、移植片対宿主病、肉芽腫性血管炎、炎症性腸疾患、炎症性ミオパシー（多発性筋炎、封入体筋炎、皮膚筋炎）、虚血性大腸炎、メタンフェタミン関連血管炎、視神経炎、尋常性天疱瘡、放射線大腸炎、サルコイドーシス、敗血症性ショック、側頭動脈炎、血管炎を含む炎症性疾患；心筋梗塞、無酸素後脳症、脳卒中を含む虚血性疾患；神経セロイドリポフスチン症、放射線ミエロパシー、網膜色素変性症、脊髄性筋萎縮症を含む神経変性疾患；カンピロバクター関連運動軸索障害、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、糖尿病性筋萎縮症裂離、糖尿病性神経障害、ギラン・バレー症候群を含む神経障害疾患；伝音難聴、感音難聴（ＳＮＨＬ）、混合性難聴を含む聴覚障害；大うつ病性障害、処置無反応性うつ病、処置抵抗性うつ病を含む精神障害；中枢神経系（ＣＮＳ）損傷、外傷性脳損傷、脊髄損傷、圧挫損傷、ショック、腱損傷、角膜への創傷、眼への創傷、皮膚創傷を含む外傷および損傷に罹っている患者を処置するのに使用することができる。
【０１０７】
好ましくは、本発明に従ったＩＬ−１０融合タンパク質またはその二量体化複合体は、例えば、子宮、子宮頸部（ｃｅｒｖｉｘ）、乳房、卵巣、前立腺、精巣、陰茎、胃腸管、食道、中咽頭、胃、小または大腸、結腸または直腸、腎臓、腎細胞、膀胱、骨、骨髄、皮膚、頭頸部、皮膚、肝臓、胆嚢、心臓、肺、膵臓、唾液腺、副腎、甲状腺、脳、神経膠腫、神経節、中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）、および免疫系、脾臓または胸腺のがん、パピローマウイルス誘導がん、上皮細胞がん、内皮細胞がん、扁平上皮癌、腺癌、癌腫、黒色腫、肉腫、奇形癌、免疫原性腫瘍、非免疫原性腫瘍、休眠腫瘍（ｄｏｒｍａｎｔ  ｔｕｍｏｒ）、リンパ腫、白血病、骨髄腫、化学的誘導がん、転移、および血管新生ならびに結節性硬化症に罹っている患者を処置するのに使用することができる。
【０１０８】
好ましくは、本発明に従ったＩＬ−１０融合タンパク質またはその二量体化複合体は、例えば、子宮、子宮頸部、乳房、卵巣、前立腺、精巣、陰茎、胃腸管、食道、中咽頭、胃、小または大腸、結腸または直腸、腎臓、腎細胞、膀胱、骨、骨髄、皮膚、頭頸部、皮膚、肝臓、胆嚢、心臓、肺、膵臓、唾液腺、副腎、甲状腺、脳、神経膠腫、神経節、中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）、および免疫系、脾臓または胸腺のがん、パピローマウイルス誘導がん、上皮細胞がん、内皮細胞がん、扁平上皮癌、腺癌、癌腫、黒色腫、肉腫、奇形癌、免疫原性腫瘍、非免疫原性腫瘍、休眠腫瘍、リンパ腫、白血病、骨髄腫、化学的誘導がん、転移、および血管新生ならびに結節性硬化症に罹っている患者を処置するのに使用することができる。
【０１０９】
好ましくは、本発明に従ったＩＬ−１０融合タンパク質またはその二量体化複合体は、例えば、子宮、子宮頸部、乳房、卵巣、前立腺、精巣、陰茎、胃腸管、食道、中咽頭、胃、小または大腸、結腸または直腸、腎臓、腎細胞、膀胱、骨、骨髄、皮膚、頭頸部、皮膚、肝臓、胆嚢、心臓、肺、膵臓、唾液腺、副腎、甲状腺、脳、神経膠腫、神経節、中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）、および免疫系、脾臓または胸腺のがん、パピローマウイルス誘導がん、上皮細胞がん、内皮細胞がん、扁平上皮癌、腺癌、癌腫、黒色腫、肉腫、奇形癌、免疫原性腫瘍、非免疫原性腫瘍、休眠腫瘍、リンパ腫、白血病、骨髄腫、化学的誘導がん、転移、および血管新生ならびに結節性硬化症に罹っている患者を処置するのに使用することができる。
【０１１０】
好ましくは、本発明に従ったＩＬ−１０融合タンパク質またはその二量体化複合体は、聴覚障害、腎細胞癌、黒色腫、乾癬、線維症、うつ病、および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に罹っている患者を処置するのに使用することができる。
【０１１１】
本発明は、医薬として使用するための本発明のＦｃ融合タンパク質も提供する。好ましくは、本発明は、Ｘが医薬として使用するために以前に記載されている目的の可溶性タンパク質である融合タンパク質Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃを提供する。好ましくは、Ｘは第ＩＸ因子、ＩＬ１Ｒａ、またはＴＮＦＲである。好ましくは、Ｘは医薬として使用するためのＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒα（またはそれらの融合物）、またはＩＦＮβである。好ましくは、本発明は、Ｘが医薬として使用するために以前に記載されている目的の可溶性タンパク質であるＸ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃの二量体複合体を提供する。
【０１１２】
本発明は、疾患を処置する医薬として使用するための本発明のＦｃ融合タンパク質も提供する。好ましくは、本発明は、Ｘが以前に記載されている疾患を処置する医薬として使用するための以前に記載されている目的の可溶性タンパク質である融合タンパク質Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃを提供する。好ましくは、Ｘは、出血を処置する医薬として使用するための第ＩＸ因子である。好ましくは、Ｘは、クローン病（ＣＤ）、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、慢性Ｃ型肝炎および自己免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などのウイルス感染症の処置のためのＩＬ−１０である。
【０１１３】
好ましくは、本発明は、Ｘが疾患を処置する医薬として使用するための以前に記載されている目的の可溶性タンパク質であるＸ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃの二量体複合体を提供する。好ましくは、Ｘはがん、自己免疫疾患および出血障害を処置する医薬として使用するための第ＩＸ因子、ＩＬ１Ｒａ、またはＴＮＦＲである。好ましくは、Ｘは、例えば、聴覚障害、腎細胞癌、黒色腫、乾癬、線維症、うつ病、および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置するのに使用するためのＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒαもしくはそれらの融合物、またはＩＦＮβである。
【０１１４】
本発明に従った第ＩＸ因子二量体化融合タンパク質複合体は、例えば、出血エピソードの制御および予防、出血エピソードの発生頻度を防ぐまたは減少させる慣用的な予防法、ならびに周術期管理（外科的予防法）のために、第ＩＸ因子が欠損していて血友病Ｂに罹っている患者を処置する医薬の製造において使用することもできる。
【０１１５】
本発明に従ったＩＬ−１０融合タンパク質またはその二量体化複合体は、上に記載された疾患、聴覚障害、聴覚障害、腎細胞癌、黒色腫、乾癬、線維症、うつ病、および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の患者を処置する医薬の製造において使用することもできる。
【０１１６】
本出願は、本明細書に記載されるＦｃ融合タンパク質を含む薬学的に許容される組成物をさらに提供する。Ｆｃ融合タンパク質を含む治療製剤は、水溶液、凍結乾燥されたまたは他の乾燥製剤の形態で、所望の純度を有する記載されているタンパク質を任意選択の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版、Ｏｓｏｌ，  Ａ．編（１９８０年））と混合することにより貯蔵のために調製される。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、用いられる投与量および濃度でレシピエントにとって無毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストランを含む単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、亜鉛タンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【０１１７】
本明細書の製剤は、処置中の特定の適応症のために必要に応じて１つよりも多い活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する化合物も含有することができる。そのような分子は意図されている目的に有効である量で組み合わせて適切に存在する。
【０１１８】
Ｆｃ融合タンパク質は、例えば、コアセルベーション技法によりまたは界面重合により調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、コロイド薬送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）に、またはマクロエマルジョンに捕捉することもできる。そのような技法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版、Ｏｓｏｌ，  Ａ．編（１９８０年）に開示されている。
【０１１９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために使用される製剤は無菌でなければならない。これは無菌濾過膜を通す濾過により容易に達成される。
【０１２０】
徐放性調製物を調製することができる。徐放性調製物の適切な例は、本明細書に記載されるフィブロネクチンベースのスキャフォールドタンパク質を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、このマトリックスは造形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸、ラクチドとグリコリドのコポリマー、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グルコール酸コポリマーが含まれる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グルコール酸などのポリマーは徐放を可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をもっと短期間で放出する。被包されたタンパク質が身体内に長時間残る場合、タンパク質は３７℃で水分に曝露される結果変性するまたは凝集し、生物学的活性を失い免疫原性が変化する可能性がある。関与する機序に応じて安定化のための合理的な戦略を考案することが可能である。例えば、凝集機序がチオ−ジスルフィド相互交換を通じた分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基を改変する、酸性溶液から凍結乾燥する、含水量を制御する、適切な添加剤を使用する、および特異的なポリマーマトリックス組成物を開発することにより達成することができる。
【０１２１】
当業者であれば、それぞれのＦｃ融合タンパク質の投与量が可溶性タンパク質（Ｘ）の正体に依存することは理解するであろうが、投与量は宿主体重１ｋｇあたり約０．０００１から１００ｍｇ、さらに通常では０．０１から５ｍｇに及ぶ。例えば、投与量は０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重または１〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲内であることが可能である。例となる処置レジメンは、週１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、月１回、３ヶ月毎に１回または３から６ヶ月毎に１回投与を必要とする。投与レジメンは静脈内投与による１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重を含み、タンパク質は以下の投薬スケジュール：４週間毎に６投与、次に３ヶ月毎に；３週間毎に；３ｍｇ／ｋｇ体重１回続いて３週間毎に１ｍｇ／ｋｇ体重のうちの１つを使用して与えられる。本発明の融合タンパク質は通常、複数回投与される。単回投与間の間隔は、例えば、毎週、毎月、３ヶ月毎にまたは毎年であることが可能である。間隔は、患者における可溶性タンパク質の血液レベルを測定することにより示される通りに不規則であっても可能である。いくつかの方法では、投与量は約０．１〜１０００ｐｇ／ｍｌ、およびいくつかの方法では約５〜３００ｍｇ／ｍｌの可溶性タンパク質の血漿濃度を達成するように調整される。
【０１２２】
治療適用では、Ｆｃ融合タンパク質は薬学的に許容される剤形で被験体に投与される。Ｆｃ融合タンパク質はボーラスとしてまたは一定期間にわたる連続注入により静脈内に、筋肉内、皮下、眼内、関節内、滑液包内、髄腔内、経口、局所、または吸入経路により投与することが可能である。前記タンパク質は、局所的ならびに全身的治療効果を発揮するために、腫瘍内に、腫瘍周囲に、病巣内に、または病変周囲経路により投与することもできる。適切な薬学的に許容される担体、希釈剤、および賦形剤は周知であり、臨床状況が保証する場合、当業者が決定することが可能である。適切な担体、希釈剤および／または賦形剤の例には、（１）約１ｍｇ／ｍｌから２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含有するダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ約７．４、（２）０．９％生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ  ＮａＣｌ）、および（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロースが含まれる。本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでも、ｉｎ  ｖｉｖｏでも、ｅｘ  ｖｉｖｏでも実行することが可能である。
【０１２３】
Ｆｃ融合タンパク質および１つまたは複数の追加の治療薬の投与は、同時投与であれ逐次投与であれ、治療適用のために上記の通りに起こることができる。同時投与のための適切な薬学的に許容される担体、希釈剤、および賦形剤は、同時投与されている特定の治療薬の正体に依存することは当業者であれば理解するであろう。
【０１２４】
凍結乾燥されているのではなく、水性剤形で存在する場合、Ｆｃ融合タンパク質は、典型的には約０．１ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化されることになるが、これらの範囲外の広い変動が許容される。疾患の処置では、Ｆｃ融合タンパク質の適切な投与量は、処置される疾患の種類、疾患の重症度および経過、Ｆｃ融合タンパク質が予防目的で投与されるのか治療目的かどうか、以前の治療の経過、患者の臨床歴およびＦｃ融合タンパク質への応答、ならびに主治医の裁量に依存することになる。Ｆｃ融合タンパク質は１回でまたは一連の処置にわたって患者に適切に投与される。
【実施例】
【０１２５】
（実施例１：第ＩＸ因子）
第ＩＸ因子ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃの設計
一本鎖第ＩＸ因子分子は、第ＩＸ因子配列、その後に、アミノ酸配列：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１）を有する１０残基のリンカー、ＩｇＧ１のＣＬドメイン、その後に、アミノ酸配列：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２）を有する２０残基のリンカー、その後にヒトＩｇＧ１のＣＨ１、ヒンジおよびＦｃ部分を含有する。
【０１２６】
第ＩＸ因子ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃの発現および特徴付け
以下のＤＮＡ配列：
【化１４】
2019047828.tif 000015
【化１５】
2019047828.tif 000016
を有する遺伝子を合成し（Ｇｅｎｅｗｉｚ）、ｐｃＤＮＡ／ＵＣＯＥにクローニングし、Ｅｘｐｉ２９３発現系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＨＥＫ２９３細胞で一過的に発現させた。まずタンパク質を、プロテインＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、低ｐＨでの溶出により精製し、２５ｍＭトリスｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ２Ｌで３回透析した。透析後、タンパク質をＱセファロースＦＦカラムにローディングし、２５ｍＭトリスｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中の段階的勾配のＣａＣｌ２により溶出させた。もっとも活性な画分をプールし、さらなる分析のために１×ＰＢＳで透析した。
【０１２７】
還元および非還元条件下で、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルにより分子を分析した（図２）。非還元条件では、精製タンパク質５μｇを、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＮＯＶＥＸ（登録商標）３〜８％トリス−アセテートゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、ＨＩＭＡＲＫ（商標）プレステインドタンパク質標準物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＭＷ範囲３１ｋＤ〜４６０ｋＤ）とともにローディングした。還元条件では、タンパク質５μｇを、ａｎｙ  ｋＤ（商標）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、ＰＲＥＣＩＳＩＯＮ  ＰＬＵＳ  ＰＲＯＴＥＩＮ（商標）Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ標準物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＭＷ範囲１０ｋＤ〜２５０ｋＤ）とともにローディングした。
【０１２８】
第ＩＸ因子ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃの生物活性（ＡＰＴＴアッセイ）
ＫＣ−１  Ｄｅｌｔａ（商標）装置（Ｔｃｏａｇ、Ｗｉｃｋｌｏｗ、ＩＲＥ）を使用して自動第ＩＸ因子活性アッセイを行い、第ＩＸ因子ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃタンパク質のＦＩＸ成分がＦＩＸ欠乏血漿の凝固活性を回復させる能力を定量した。試験試料を、等体積のヒトＦＩＸ欠乏血漿（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ、Ｏｖｅｒｌａｎｄ  Ｐａｒｋ、ＫＳ）およびセファリン含有エラグ酸活性化剤（ａＰＴＴ−可溶性活性化剤、Ｈｅｌｅｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｃａｔ．＃５３８９）と混合し、４分間のインキュベーション後、５ｍＭ塩化カルシウム（２５ｍＭストック、ＶＷＲ）を添加して凝固時間を測定した。凝固時間  対  精製タンパク質に対するｒヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．  Ｅｓｓｅｘ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ、ＶＴ）標準物質の段階希釈物の活性単位濃度（ＩＵ／ｍＬ）の較正曲線に基づいて活性を算出した。固有の凝血系の因子は、血漿を、最適量のリン脂質および界面活性剤とともに３７℃でインキュベートすることにより活性化される。カルシウムイオンを添加すると凝血プロセスが引き起こされ、次いで凝固時間が測定される。ＡＰＴＴは、フィブリン血栓が形成されるのに要する時間である（図３）。
【０１２９】
第ＩＸ因子ｓｃＣＬＣＨ１−ＦｃのラットＰＫ
第ＩＸ因子ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃを、単回静脈内用量５１ＩＵ／ｋｇでラット３匹の外側尾静脈に投与した。第ＩＸ因子ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃを投与した０．２５、４、８、２４、４８、７２、９６、および１６８時間後に血液試料を収集し、クエン酸塩加血漿（最終０．３２％）を調製した。ヤギ抗ヒト第ＩＸ因子アフィニティー精製ＩｇＧ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｏｕｔｈ  Ｂｅｎｄ、ＩＮ）を捕捉抗体として、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ交差吸着ビオチン化抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＴＸ）を検出抗体として用いる、標準的なＭＳＤ技術を使用して濃度を測定した。ＷＩＮＮＯＮＬＩＮ（登録商標）ソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によるノンコンパートメントモデリングを使用して、薬物動態分析を行った。ＭＳＤデータ由来の薬物動態パラメータ推定値には、最高濃度（Ｃｍａｘ）、時間対濃度曲線下面積（ＡＵＣ）、および排泄半減期（ｔ１／２）が含まれていた（図４および表１）。
【表１】
2019047828.tif 000017
【０１３０】
（実施例２：ＴＮＦ−Ｒ２）
ＴＮＦ−Ｒ２  ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃの設計
一本鎖ＴＮＦＲ２分子は、ＴＮＦＲ２配列、その後に、１０残基のリンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１）、ＩｇＧ１のＣＬドメイン、その後に、２０残基のリンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、その後にヒトＩｇＧ１のＣＨ１、ヒンジおよびＦｃ部分を含有する。
【０１３１】
ＴＮＦ−Ｒ２  ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃの発現
以下のＤＮＡ配列：
【化１６】
2019047828.tif 000018
【化１７】
2019047828.tif 000019
【化１８】
2019047828.tif 000020
を有する遺伝子を合成し（Ｇｅｎｅｗｉｚ）、ｐｃＤＮＡ／ＵＣＯＥにクローニングし、Ｅｘｐｉ２９３発現系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＨＥＫ２９３細胞で一過的に発現させた。まずタンパク質を、プロテインＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、低ｐＨでの溶出により精製し、１×ＰＢＳ  ２Ｌで３回透析した。
【０１３２】
還元および非還元条件下で、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルにより分子を分析した（図５Ａおよび５Ｂ）。非還元条件では、精製タンパク質５μｇを、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）３〜８％トリス−アセテートゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、ＨｉＭａｒｋ（商標）プレステインドタンパク質標準物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＭＷ範囲３１ｋＤ〜４６０ｋＤ）とともにローディングした。還元条件では、タンパク質５μｇを、Ａｎｙ  ｋＤ（商標）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、ＰＲＥＣＩＳＩＯＮ  ＰＬＵＳ  ＰＲＯＴＥＩＮ（商標）Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ標準物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＭＷ範囲１０ｋＤ〜２５０ｋＤ）とともにローディングした。
【０１３３】
ＴＮＦ−Ｒ２  ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃの生物活性
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＮＦ−α細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）は、ＮＦ−κＢ／ＡＰ−１経路の活性化を監視することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生物活性ＴＮＦ−αを検出するために特に設計された、ヒト胎児腎臓細胞である。この細胞株は、５つのＮＦκｂおよび５つのＡＰ−１結合部位に融合されているＩＦＮ−β最小プロモーターの制御下で、誘導性分泌型胎児性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を発現する。ＴＮＦ−αアンタゴニストアッセイでは、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、４．５ｇ／ｌグルコースおよび１０％熱失活ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）ならびに２３５ｐＭ  ＴＮＦ−α１ａ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を含有するＤＭＥＭ培地に、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＴＮＦ−α細胞を５０，０００細胞／ウェルでプレーティングした。様々な濃度のＴＮＦ−Ｒ２直接融合物またはＴＮＦ−Ｒ２一本鎖融合体（ＴＮＦ−Ｒ２  ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃ）とともに、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした。ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅを添加して３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートすることによりＳＥＡＰ産生を検出し、プレートリーダーで６３０ｎｍで読み取った。ＳＥＡＰ遺伝子の活性化は、ＴＮＦ−αアンタゴニストＴＮＦ−Ｒ２により用量に依存した形で阻害され得る。ＴＮＦ−Ｒ２一本鎖融合体分子がＩＣ５０  ５１ｐＭでＳＥＡＰ遺伝子の活性化を阻害したのに対し、ＴＮＦ−Ｒ２の直接融合物はＩＣ５０  １１２ｐＭで阻害した（図６）。
【０１３４】
ＴＮＦ−Ｒ２  ｓｃＣＬＣＨ１−ＦｃのラットＰＫ
ＴＮＦ−Ｒ２  ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃを、単回静脈内用量５ｍｇ／ｋｇでラット３匹の外側尾静脈に投与した。ＴＮＦ−Ｒ２  ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃを投与した０．０８３、１、６、２４、４８時間後、５、７、９、１２、１５、２１、２８日後に血液試料を収集した。ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２  ＩｇＧ  Ｆｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を捕捉抗体として、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ交差吸着ビオチン化抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＴＸ）を検出抗体として用いる、標準的なＭＳＤ技術を使用して濃度を測定した。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）ソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によるノンコンパートメントモデリングを使用して、薬物動態分析を行った。ＭＳＤデータ由来の薬物動態パラメータ推定値には、最高濃度（Ｃｍａｘ）、時間対濃度曲線下面積（ＡＵＣ）、および排泄半減期（ｔ１／２）が含まれていた（図７および表２）。
【表２】
2019047828.tif 000021
【０１３５】
（実施例３：ＩＬ１Ｒａ）
ＩＬ１Ｒａ  ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃの設計
一本鎖ＩＬ１Ｒａ分子は、ＩＬ１Ｒａ配列、その後に、１０残基のリンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１）、ＩｇＧ１のＣＬドメイン、その後に、２０残基のリンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、その後にヒトＩｇＧ１のＣＨ１、ヒンジおよびＦｃ部分を含有する。
【０１３６】
ＩＬ１Ｒａ  ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃの発現
以下のＤＮＡ配列：
【化１９】
2019047828.tif 000022
【化２０】
2019047828.tif 000023
を有する遺伝子を合成し（Ｇｅｎｅｗｉｚ，Ｉｎｃ．）、ｐｃＤＮＡ／ＵＣＯＥにクローニングし、Ｅｘｐｉ２９３発現系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＨＥＫ２９３細胞で一過的に発現させた。まずタンパク質を、プロテインＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、低ｐＨでの溶出により精製し、１×ＰＢＳ  ２Ｌで３回透析した。還元および非還元条件下で、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルにより分子を分析した（図８Ａおよび８Ｂ）。非還元条件では、精製タンパク質５μｇを、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＮＯＶＥＸ（登録商標）３〜８％トリス−アセテートゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、ＨＩＭＡＲＫ（商標）プレステインドタンパク質標準物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＭＷ範囲３１ｋＤ〜４６０ｋＤ）とともにローディングした。還元条件では、タンパク質５μｇを、Ａｎｙ  ｋＤ（商標）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、ＰＲＥＣＩＳＩＯＮ  ＰＬＵＳ  ＰＲＯＴＥＩＮ（商標）Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ標準物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＭＷ範囲１０ｋＤ〜２５０ｋＤ）とともにローディングした。
【０１３７】
ＩＬ１Ｒａ  ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃの生物活性
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１β細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）は、ＩＬ−１βにより誘導されるＮＦ−κＢ／ＡＰ−１経路の活性化を監視することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生物活性ＩＬ−１βを検出するために特に設計された、ヒト胎児腎臓細胞である。この細胞株は、５つのＮＦκｂおよび５つのＡＰ−１結合部位に融合されているＩＦＮ−β最小プロモーターの制御下で、誘導性分泌型胎児性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を発現する。ＩＬ−１βアンタゴニストアッセイでは、２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕおよび１０％熱失活ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）ならびに５７ｐＭ  ＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄ
ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有するＤＭＥＭ培地に、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１β細胞を５０，０００細胞／ウェルでプレーティングした。様々な濃度のＩＬ１ＲａｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃとともに、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした。ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅを添加して３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートすることによりＳＥＡＰ産生を検出し、プレートリーダーで６３０ｎｍで読み取った。ＩＬ−１βによるＳＥＡＰ遺伝子の活性化は、ＩＬ−１βアンタゴニストＩＬ−１Ｒａにより用量に依存した形で阻害され得る。ＩＬ−１Ｒａ一本鎖分子は、ＩＣ５０  １２．５ＮｍでＩＬ−１βによるＳＥＡＰ遺伝子の活性化を阻害した（図９）。
【０１３８】
ＩＬ１Ｒａ  ｓｃＣＬＣＨ１−ＦｃのラットＰＫ
ＩＬ１Ｒａ  ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃを、単回静脈内用量２ｍｇ／ｋｇでラット３匹の頚静脈カテーテルに投与した。ＩＬ１Ｒａ  ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃを投与した０．０８３、０．２５、１、２、６、２４、４８、７２、９６および１６８時間後に血液試料を収集した。ＩＬ１Ｒａ  ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃを、単回皮下用量５ｍｇ／ｋｇでラット３匹の肩甲間部に投与した。ＩＬ１Ｒａ  ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃを投与した０．２５、１、２、４、６、２４、４８、７２、９６および１６８時間後に血液試料を収集した。ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２  ＩｇＧ  Ｆｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を捕捉抗体として、マウス抗ヒトＩＬ１Ｒａビオチンコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を検出抗体として用いる、標準的なＭＳＤ技術を使用して濃度を測定した。ＷＩＮＮＯＮＬＩＮ（登録商標）ソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によるノンコンパートメントモデリングを使用して、薬物動態分析を行った。ＭＳＤデータ由来の薬物動態パラメータ推定値には、最高濃度（Ｃｍａｘ）、時間対濃度曲線下面積（ＡＵＣ）、および排泄半減期（ｔ１／２）が含まれていた（図１０および表３）。
【表３】
2019047828.tif 000024
【０１３９】
ＩＬ１Ｒａ  ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃの眼内ＰＫ
ＩＬ１Ｒａ  ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃのボーラス硝子体内注射剤０．５ｍｇを、オスのウサギ８匹の各眼に投与した。ＩＬ１Ｒａ  ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃを投与した４、９６、１６８および３３６時間後に動物２匹から血液試料を収集した。屠殺時、各動物から両方の眼を収集し液体窒素中で急速冷凍した。標準的なＭＳＤ技術を使用して濃度を測定した。ＷＩＮＮＯＮＬＩＮ（登録商標）ソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によるノンコンパートメントモデリングを使用して、薬物動態分析を行った。ＭＳＤデータ由来の薬物動態パラメータ推定値には、最高濃度（Ｃｍａｘ）、時間対濃度曲線下面積（ＡＵＣ）、および排泄半減期（ｔ１／２）が含まれていた（表４および図１１）。
【表４】
2019047828.tif 000025
【０１４０】
（実施例４：ＩＬ−２／ＩＬ２Ｒα）
ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα  ｓｃＣＬＣＨ１−ＦｃおよびＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα  ｓｃＣＨ１ＣＬ−Ｆｃの設計
ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα一本鎖融合体分子は、ＩｇＧ１重鎖のＣＬ−ＣＨ１−Ｆｃドメイン（配列番号１９）またはＣＨ１−ＣＬ−Ｆｃ（配列番号２０）に結合されているＩＬ−２Ｒα融合タンパク質の細胞外ドメインに結合されている円順列変異されたヒトＩＬ−２を含有し（図１２Ａおよび１２Ｂ）、本明細書ではそれぞれ、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα
ｓｃＣＬＣＨ１−ＦｃおよびＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα  ｓｃＣＨ１ＣＬ−Ｆｃと呼ばれる。哺乳動物細胞での発現のため、配列番号１０のＮ末端リーダー配列を配列番号１９および配列番号２０のタンパク質に添加した。
【０１４１】
ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα  ｓｃＣＬＣＨ１−ＦｃおよびＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα  ｓｃＣＨ１ＣＬ−Ｆｃの発現
遺伝子を合成により合成し、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターとして供給し（ＧｅｎｅＡｒｔ）、Ｅｘｐｉ２９３発現系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＨＥＫ２９３細胞で一過的に発現させた。タンパク質を、プロテインＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、低ｐＨでの溶出により精製し、１×ＰＢＳ  ２Ｌで２回透析した。
【０１４２】
還元および非還元条件下で、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルにより分子を分析した（図１３）。還元および非還元条件で、タンパク質５μｇを、Ａｎｙ  ｋＤゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ標準物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＭＷ範囲１０ｋＤ〜２５０ｋＤ）とともにローディングした。ＢｉｏＳｕｉｔｅ  Ｕｌｔｒａ  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＳＥＣカラム、２５０Å、４μｍ、４．６ｍｍ×３００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）での分析的ゲル濾過により分子を特徴付けた。全ての分析において、ランニング緩衝液としての１５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０によりカラムを平衡化し、０．３ｍｌ／分で流した。精製試料（０．５ｍｇ／ｍｌ）を注入し（１５μｌ）、実行時間２５分で溶出させた（図１４Ａおよび１４Ｂ）。
【０１４３】
ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα  ｓｃＣＬＣＨ１−ＦｃおよびＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα  ｓｃＣＨ１ＣＬ−Ｆｃの生物活性
ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのホスホ−ＳＴＡＴ５Ａ／Ｂ（Ｔｙｒ６９４／Ｔｙｒ６９９）ＩｎｓｔａｎｔＯｎｅ（商標）ＥＬＩＳＡキットを使用して、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα  ｓｃＣＬＣＨ１−ＦｃおよびＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα  ｓｃＣＨ１ＣＬ−Ｆｃが、ヒトＨＨ  Ｔ細胞リンパ腫細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２１０５）においてｐＳＴＡＴ５を活性化する能力を評価することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生物活性を評価した。アッセイでは、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に、ＨＨ細胞を２×１０５細胞／ウェルでプレーティングした。約５０ｎＭから減少する濃度の野生型ＩＬ−２（ｗｔＩＬ−２）、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒａ  ｓｃＣｌＣＨ１  ＦｃもしくはＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒａ
ｓｃＣＨ２Ｃｌ  Ｆｃとともに、または刺激なしで、試料を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で約２５±５分間インキュベートした。細胞溶解混合物（キットで供給される）２５μＬを迅速に添加することにより刺激反応を終結させ、タイタープレート振とう機において３００ｒｐｍで絶えず振とうしながら室温で１０分間インキュベートした。生じた溶解産物の５０μＬアリコートを、アッセイプレート（キットで供給される）の各ウェルに添加した。各ウェルに抗体カクテル５０μＬを添加した後、プレートに蓋をし、タイタープレート振とう機において３００ｒｐｍで絶えず振とうしながら室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを１×洗浄緩衝液３００μＬ／ウェルで３回洗浄した。検出試薬１００μＬを各ウェルに添加し、３００ｒｐｍで絶えず振とうしながら室温で３０分間インキュベートした。停止液１００μＬを添加することにより検出反応を停止させ、ＳｙｎｅｒｇｙＭｘプレートリーダーを使用して４５０ｎＭでの吸光度を測定した。ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒａ  ｓｃＣｌＣＨ１  Ｆｃ（ＥＣ５０＝０．９７ｎＭ）、またはＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒａ  ｓｃＣＨ２Ｃｌ  Ｆｃ（ＥＣ５０＝１．１ｎＭ）およびｗｔＩＬ−２（ＥＣ５０＝０．８０ｎＭ）が、用量に依存した形で活性であった（図１５）。
【０１４４】
ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα  ｓｃＣＬＣＨ１−ＦｃおよびＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα  ｓｃＣＨ１ＣＬ−ＦｃのラットＰＫ
ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα  ｓｃＣＬＣＨ１−ＦｃおよびＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα  ｓｃＣＨ１ＣＬ−Ｆｃを、単回静脈内用量１ｍｇ／ｋｇでラット３匹の尾静脈に投与した。ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα  ｓｃＣＬＣＨ１−ＦｃおよびＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα  ｓｃＣＨ１ＣＬ−Ｆｃを投与した０．０８３、０．２５、０．５、１、３、８、２４、４８、７２、９６および１６８時間後に血液試料を収集した。ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα  ｓｃＣＬＣＨ１−ＦｃおよびＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα  ｓｃＣＨ１ＣＬ−Ｆｃを、単回皮下用量２ｍｇ／ｋｇでラット３匹の肩甲間部に投与した。ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα  ｓｃＣＬＣＨ１−ＦｃおよびＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα  ｓｃＣＨ１ＣＬ−Ｆｃを投与した０．２５、０．５、１、２、６、８、２４、４８、７２、９６および１６８時間後に血液試料を収集した。標準的なＭＳＤ技術を使用して濃度を測定した。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によるノンコンパートメントモデリングを使用して、薬物動態分析を行った。ＭＳＤデータ由来の薬物動態パラメータ推定値には、最高濃度（Ｃｍａｘ）、時間対濃度曲線下面積（ＡＵＣ）、および排泄半減期（ｔ１／２）が含まれていた（図１６および表５）。
【表５】
2019047828.tif 000026
【０１４５】
（実施例５：ＩＦＮβ）
ＩＦＮβ  ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃの設計
ＩＦＮβ一本鎖融合体分子は、ＩｇＧ１重鎖のＣＬ−ＣＨ１−Ｆｃドメインに結合されているＩＦＮβ（Ｃ１７Ｓ）を含有する（図１７）。哺乳動物細胞での発現のため、配列番号１０のＮ末端リーダー配列を配列番号１８のタンパク質に添加した。
【０１４６】
ＩＦＮβ  ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃの発現
遺伝子を合成により合成し、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターとして供給し（ＧｅｎｅＡｒｔ）、Ｅｘｐｉ２９３発現系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＨＥＫ２９３細胞で一過的に発現させた。タンパク質を、プロテインＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、低ｐＨでの溶出により精製し、１×ＰＢＳ  ２Ｌで２回透析した。
【０１４７】
還元および非還元条件下で、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルにより分子を分析した（図１８）。還元および非還元条件で、タンパク質５μｇを、Ａｎｙ  ｋＤゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ標準物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＭＷ範囲１０ｋＤ〜２５０ｋＤ）とともにローディングした。ＢｉｏＳｕｉｔｅ  Ｕｌｔｒａ  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＳＥＣカラム、２５０Å、４μｍ、４．６ｍｍ×３００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）での分析的ゲル濾過により分子を特徴付けた。全ての分析において、ランニング緩衝液としての１５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０によりカラムを平衡化し、０．３ｍｌ／分で流した。精製試料（０．５ｍｇ／ｍｌ）を注入し（１５μｌ）、実行時間６０分で溶出させた（図１９）。
【０１４８】
ＩＦＮβ  ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃの生物活性
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮα／β細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）は、ＩＳＧＦ３経路の活性化を監視することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生物活性タイプＩ  ＩＦＮを検出するために特に設計された、ヒト胎児腎臓細胞である。この細胞株は、ＩＦＮα／β誘導性ＩＳＧ５４プロモーターの制御下で、誘導性分泌型胎児性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を発現する。ＩＦＮβアゴニストアッセイでは、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、４．５ｇ／ｌグルコースおよび１０％熱失活ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＤＭＥＭ培地に、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＦＮα／β細胞を５０，０００細胞／ウェルでプレーティングした。様々な濃度のＩＦＮβ  ｓｃＣＬＣＨ１−ＦｃまたはｗｔＩＦＮβ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）とともに、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした。ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅを添加して３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートすることによりＳＥＡＰ産生を検出し、プレートリーダーで６３０ｎｍで読み取った。ＩＦＮβ  ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃ（ＥＣ５０＝０．９ｐＭ）およびｗｔＩＦＮβ（ＥＣ５０＝０．６ｐＭ）が、用量に依存した形で活性であった（図２０）。
【０１４９】
ＩＦＮβ  ｓｃＣＬＣＨ１−ＦｃのラットＰＫ
ＩＦＮβ  ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃを、単回静脈内用量０．５ｍｇ／ｋｇでラット３匹の外科的に埋め込まれた頚静脈カテーテルに投与した。ＩＦＮβ  ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃを投与した０．０８３、０．２５、０．５、１、３、８、２４、４８、７２、９６および１６８時間後に血液試料を収集した。ＩＦＮβ  ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃを、単回皮下用量１ｍｇ／ｋｇでラット３匹の肩甲間部に投与した。ＩＦＮβ  ｓｃＣＬＣＨ１−Ｆｃを投与した０．２５、０．５、１、２、６、８、２４、４８、７２、９６および１６８時間後に血液試料を収集した。標準的なＭＳＤ技術を使用して濃度を測定した。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によるノンコンパートメントモデリングを使用して、薬物動態分析を行った。ＭＳＤデータ由来の薬物動態パラメータ推定値には、最高濃度（Ｃｍａｘ）、時間対濃度曲線下面積（ＡＵＣ）、および排泄半減期（ｔ１／２）が含まれていた（図２１および表６）。
【表６】
2019047828.tif 000027
【０１５０】
（実施例６：ＩＬ−１０）
ｓｃＩＬ−１０：ＣＬ：ＣＨ１：ＦｃおよびｓｃＩＬ−１０：ＣＨ１：ＣＬ：Ｆｃの設計
ｓｃＩＬ−１０一本鎖融合体分子は、ＩｇＧ１重鎖のＣＬ−ＣＨ１−ＦｃドメインまたはＣＨ１−ＣＬ−Ｆｃに結合されている、共有結合したＩＬ−１０ホモ二量体融合タンパク質を含有する（図２２Ａおよび２２Ｂ）。合成された各分子のアミノ酸配列を表７に記載する。
【表７】
2019047828.tif 000028
【０１５１】
ｓｃＩＬ−１０：ＣＬ：ＣＨ１：ＦｃおよびｓｃＩＬ−１０：ＣＨ１：ＣＬ：Ｆｃの発現
遺伝子を合成により合成し、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターとして供給し（ＧｅｎｅＡｒｔ）、Ｅｘｐｉ２９３発現系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＨＥＫ２９３細胞で一過的に発現させた。タンパク質を、プロテインＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、低ｐＨでの溶出により精製し、１×ＰＢＳ  ２Ｌで２回透析した。
【０１５２】
還元および非還元条件下で、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルにより分子を分析した（図２３）。還元および非還元条件で、タンパク質２．５μｇを、Ａｎｙ  ｋＤゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ標準物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＭＷ範囲１０ｋＤ〜２５０ｋＤ）とともにローディングした。ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＥＨ  ＳＥＣカラム、２００Å、３．５μｍ、７．８ｍｍ×１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）での分析的ゲル濾過により分子を特徴付けた。全ての分析において、ランニング緩衝液としての１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０によりカラムを平衡化し、０．９ｍｌ／分で流した。精製試料（０．５ｍｇ／ｍｌ）を注入し（１５μｌ）、実行時間１５分で溶出させた（図２４Ａおよび２４Ｂ）。
【０１５３】
ｓｃＩＬ−１０：ＣＬ：ＣＨ１：ＦｃおよびｓｃＩＬ−１０：ＣＨ１：ＣＬ：Ｆｃの生物活性
ｓｃＩＬ−１０：ＣＬ：ＣＨ１：ＦｃおよびｓｃＩＬ−１０：ＣＨ１：ＣＬ：Ｆｃが、マウス肥満細胞株ＭＣ／９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８３０６）の増殖を刺激する能力を評価することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生物活性を評価した。ｓｃＩＬ−１０直接Ｆｃ融合タンパク質（ｓｃＩＬ−１０：Ｆｃ）を対照として使用した。アッセイでは、１０％熱失活ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミンおよび０．０５ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含有するＤＭＥＭ培地に、ＭＣ／９細胞を１０，０００細胞／ウェルでプレーティングした。様々な濃度のヒトＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ｓｃＩＬ−１０：ＣＬ：ＣＨ１：Ｆｃ、ｓｃＩＬ−１０：ＣＨ１：ＣＬ：ＦｃまたはｓｃＩＬ−１０：Ｆｃとともに、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。７２時間後、製造業者のプロトコールに従って、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４時間、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で染色した。蛍光測定を５６０／５９０ｎｍで行った。ＩＬ−１０（ＥＣ５０＝７５ｐＭ）、ｓｃＩＬ−１０：ＣＬ：ＣＨ１：Ｆｃ（ＥＣ５０＝７９ｐＭ）、ｓｃＩＬ−１０：ＣＨ１：ＣＬ：Ｆｃ（ＥＣ５０＝９３ｐＭ）およびｓｃＩＬ−１０：Ｆｃ（ＥＣ５０＝４９３ｐＭ）が、用量に依存した形で活性であった（図２５）。
【０１５４】
ｓｃＩＬ−１０：ＣＬ：ＣＨ１：ＦｃおよびｓｃＩＬ−１０：ＣＨ１：ＣＬ：ＦｃのマウスＰＫ
マウスにおけるｓｃＩＬ−１０：ＣＬ：ＣＨ１：Ｆｃ、ｓｃＩＬ−１０：ＣＨ１：ＣＬ：Ｆｃ、およびｓｃＩＬ−１０：Ｆｃの薬物動態を、尾静脈に投与される単回静脈内用量０．５ｍｇ／ｋｇおよび肩甲間部に投与される単回皮下用量２．５ｍｇ／ｋｇで評価した。ｓｃＩＬ−１０：ＣＬ：ＣＨ１：Ｆｃ、ｓｃＩＬ−１０：ＣＨ１：ＣＬ：ＦｃおよびｓｃＩＬ−１０：Ｆｃを投与した０．０８３、０．５、１、４、６、２４、４８、９６、１６８、１９２および２１６時間後に血液試料（ｎ＝３試料／時点／融合タンパク質）を収集した。各時点／融合タンパク質／投与経路で血清をプールし、標準的なＭＳＤ技術を使用して濃度を測定した。生物学的分析データを、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ６．４ソフトウェアを使用するノンコンパートメント薬物動態分析にかけた。標準的な薬物動態パラメータである、最高濃度（Ｃｍａｘ）、最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）、時間対濃度曲線下面積（ＡＵＣ）、平均滞留時間（ＭＲＴ）、排泄半減期（ｔ１／２）、クリアランス（ＣＬ）、定常状態での分布容積（Ｖｓｓ）、およびバイオアベイラビリティ（％Ｆ）を含む薬物動態パラメータを決定し、表８および９に報告した。
【表８】
2019047828.tif 000029
【表９】
2019047828.tif 000030
【０１５５】
本明細書で言及される特許および科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立する。本明細書で引用される米国特許および公開済みのまたは未公開の米国特許出願は全て、参照により組み込まれる。本明細書で引用される公開済みの外国特許および特許出願は全て、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用される、その他の出版済みの参考文献、文書、原稿および科学文献は全て、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５６】
本発明は、その好ましい特性に関して特に示され、記載されているが、添付の特許請求の範囲が包含する本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細の各種変更がそこになされてよいことを、当業者は理解するものである。本明細書に記載される本発明の各種特性が互いに排反せず、本発明に従って、特性が全体的または部分的に組み合わされてよいことも理解されるべきである。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の配置：
Ｘ−Ｌ１−ＨＩＮＧＥ−Ｆｃ
を有する一本鎖融合タンパク質であって、
Ｘは、可溶性タンパク質またはその任意の活性断片もしくは誘導体であり；
Ｌ１は、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の配置：
Ｌ２−ＣＬ−Ｌ３−ＣＨ１−Ｌ４またはＬ２−ＣＨ１−Ｌ３−ＣＬ−Ｌ４
を有するリンカーであり、
Ｌ２とＬ４は、独立してポリペプチドリンカーであるか、または独立して存在せず；Ｌ３は、ポリペプチドリンカーであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖の定常領域ポリペプチドであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリン重鎖のＣＨ１ドメイン由来の定常領域ポリペプチドであり；
ＨＩＮＧＥは、免疫グロブリンのヒンジ配列であるか、または存在せず、ただし、ＨＩＮＧＥが存在しない場合はＬ４が存在し；
Ｆｃは、免疫グロブリンのカルボキシ末端またはその任意の活性断片もしくは誘導体である、
一本鎖融合タンパク質。
（項目２）
ＣＬ、ＣＨ１、ＨＩＮＧＥおよびＦｃが、それぞれヒトＩｇＧ１のＣＬ、ＣＨ１、ヒンジおよびＦｃ領域と少なくとも９０％同一である、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目３）
Ｘが、第ＩＸ因子、ＴＮＦＲ２もしくはＩＬ１Ｒａまたはそれらの任意の活性断片もしくは誘導体である、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目４）
Ｌ３が、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）ｎを有しｎが１〜５であるポリペプチドリンカーである、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目５）
Ｌ２が、存在し、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）ｎを有しｎが１〜５であるポリペプチドリンカーである、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目６）
Ｌ４が、存在し、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）ｎを有しｎが１〜５であるポリペプチドリンカーである、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目７）
ＨＩＮＧＥおよびＬ２が存在し、Ｌ４が存在しない、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目８）
ＨＩＮＧＥ、Ｌ２およびＬ４が存在する、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目９）
ＨＩＮＧＥが存在せず、Ｌ４が存在する、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目１０）
ＨＩＮＧＥが存在せず、Ｌ２およびＬ４が存在する、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目１１）
項目１に記載の融合タンパク質を含む二量体化複合体。
（項目１２）
前記二量体化複合体がホモ二量体複合体である、項目１１に記載の二量体化複合体。
（項目１３）
Ｘが、円順列変異によって改変されている可溶性タンパク質を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目１４）
Ｘが、円順列変異されたＩＬ−２を含む、項目１３に記載の融合タンパク質。
（項目１５）
Ｘが、任意選択のリンカーを介してＩＬ−２Ｒαに融合されている円順列変異されたＩＬ−２を含む、項目１３に記載の融合タンパク質。
（項目１６）
ＸがＩＦＮβである、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目１７）
Ｘが、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒαまたはそれらの融合物、あるいはＩＦＮβまたはその任意の活性断片もしくは誘導体である、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目１８）
ＸがＩＬ−１０である、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目１９）
項目１８に記載の融合タンパク質のホモ二量体複合体。
（項目２０）
患者において聴覚障害、腎細胞癌、黒色腫、乾癬、線維症、うつ病、または炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置する方法であって、前記患者に治療有効量の項目１８に記載の融合タンパク質またはそのホモ二量体複合体を投与することを含む、方法。
（項目２１）
聴覚障害、腎細胞癌、黒色腫、乾癬、線維症、うつ病、および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置するための医薬の製造において使用するための、項目１８または１９に記載の融合タンパク質。
（項目２２）
がん、自己免疫疾患または出血性障害の処置において使用するための、項目３に記載の融合タンパク質またはそのホモ二量体複合体。
【図１Ａ】
2019047828.tif 000031
【図１Ｂ】
2019047828.tif 000032
【図１Ｃ】
2019047828.tif 000033
【図１Ｄ】
2019047828.tif 000034
【図２】
2019047828.tif 000035
【図３】
2019047828.tif 000036
【図４】
2019047828.tif 000037
【図５】
2019047828.tif 000038
【図６】
2019047828.tif 000039
【図７】
2019047828.tif 000040
【図８】
2019047828.tif 000041
【図９】
2019047828.tif 000042
【図１０】
2019047828.tif 000043
【図１１】
2019047828.tif 000044
【図１２】
2019047828.tif 000045
【図１３】
2019047828.tif 000046
【図１４】
2019047828.tif 000047
【図１５】
2019047828.tif 000048
【図１６】
2019047828.tif 000049
【図１７】
2019047828.tif 000050
【図１８】
2019047828.tif 000051
【図１９】
2019047828.tif 000052
【図２０】
2019047828.tif 000053
【図２１】
2019047828.tif 000054
【図２２】
2019047828.tif 000055
【図２３】
2019047828.tif 000056
【図２４】
2019047828.tif 000057
【図２５】
2019047828.tif 000058
【配列表】
2019047828000001.app
【外国語明細書】
2019047828000001.pdf