(57)【要約】【課題】高効率でインビボクローニング可能な細胞株のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】本発明は、インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法であって、細胞株について、ｒｐｏＺ遺伝子、ｙｆａＨ遺伝子、ｒｓｘＣ遺伝子、ｙｅａＥ遺伝子、ｓｌｙＡ遺伝子、及びｓａｐＣ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の有無を評価し、前記遺伝子の少なくとも一部の機能が失われた細胞株を選択する選択工程を備える。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法であって、
細胞株について、ｒｐｏＺ遺伝子、ｙｆａＨ遺伝子、ｒｓｘＣ遺伝子、ｙｅａＥ遺伝子、ｓｌｙＡ遺伝子、及びｓａｐＣ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の有無を評価し、評価された前記遺伝子の少なくとも一部の機能が失われた細胞株を選択する第１の選択工程を備えることを特徴とする方法。
【請求項２】
さらに、前記第１の選択工程の後に、ｘｔｈＡ遺伝子の有無を評価し、ｘｔｈＡ遺伝子を有する細胞株を選択する第２の選択工程、及び／又は、ｈｓｄＲ遺伝子の有無を評価し、ｈｓｄＲ遺伝子の少なくとも一部の機能が失われた細胞株を選択する第３の選択工程を備える請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞株が大腸菌又は哺乳動物細胞に由来するものである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
インビボクローニング可能な細胞株の製造方法であって、
前記細胞株がｒｐｏＺ遺伝子、ｙｆａＨ遺伝子、ｒｓｘＣ遺伝子、ｙｅａＥ遺伝子、ｓｌｙＡ遺伝子、及びｓａｐＣ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子を有する場合に、前記遺伝子の少なくとも一部の機能を失わせる工程Ａを備える細胞株の製造方法。
【請求項５】
さらに、前記細胞株がｘｔｈＡ遺伝子を有しない場合に、前記ｘｔｈＡ遺伝子を細胞株の染色体に挿入し、ｘｔｈＡ遺伝子を発現させる工程Ｃ、及び／又は、前記細胞株がｈｓｄＲ遺伝子を有する場合に、前記ｈｓｄＲ遺伝子の少なくとも一部の機能を失わせる工程Ｂを備える請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記細胞株が大腸菌又は哺乳動物細胞に由来するものである請求項４又は５に記載の製造方法。
【請求項７】
ｒｐｏＺ遺伝子、ｙｆａＨ遺伝子、ｒｓｘＣ遺伝子、ｙｅａＥ遺伝子、ｓｌｙＡ遺伝子、及びｓａｐＣ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の少なくとも一部の機能が失われたことを特徴とする細胞株。
【請求項８】
さらに、ｘｔｈＡ遺伝子を有し、及び／又は、ｈｓｄＲ遺伝子の少なくとも一部の機能が失われた請求項７に記載の細胞株。
【請求項９】
前記細胞株が、大腸菌又は哺乳動物細胞に由来するものである請求項７又は８に記載の細胞株。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法、又は請求項４〜６のいずれか一項に記載の製造方法を用いて、インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニング、又は製造した後、得られた細胞株に、ベクターと、５’末端領域及び３’末端領域に前記ベクター上の挿入を行う部位と相同な塩基配列を有する目的の二本鎖ＤＮＡとを導入する導入工程と、
前記導入工程後、前記細胞株を培養し、前記目的の二本鎖ＤＮＡを相同組換えにより前記ベクターに挿入する挿入工程と、
を備えることを特徴とするインビボクローニング方法。
【請求項１１】
インビボクローニングを行うためのキットであって、請求項７〜９のいずれか一項に記載の細胞株を備えることを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法、インビボクローニング可能な細胞株の製造方法、細胞株、インビボクローニング方法、及びインビボクローニングを行うためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のＤＮＡクローニング技術では、目的のＤＮＡを制限酵素及びＤＮＡリガーゼ等を用いてベクターに組み込み、目的のＤＮＡを挿入したベクターを大腸菌等の宿主細胞に導入し発現させる（形質転換させる）ことで、目的のＤＮＡをクローニングすることが一般的であった。
【０００３】
近年、相同な配列間の組換え反応を利用して目的のＤＮＡをベクターへクローニングする方法、いわゆる、シームレスクローニングが活用されている（例えば、特許文献１参照。）。シームレスクローニングでは、まず、２０ｂｐ程度の相同な配列を付加したプライマーを合成し、目的のＤＮＡ及びベクターをそれぞれＰＣＲ法により増幅させる。次いで、出芽酵母、又はＲｅｃＥＴシステムが構築された大腸菌株に相同配列を有する目的のＤＮＡ及びベクターを導入し発現させることで、目的のＤＮＡをクローニングすることができる。このように、酵母や大腸菌等の細胞内で目的のＤＮＡをクローニングさせることをインビボクローニングと呼ぶ。
出芽酵母では、細胞内で相同組換えの活性が非常に高いため、容易にシームレスクローニングを行うことができる（例えば、非特許文献１参照。）。
また、ＲｅｃＥＴシステムが構築された大腸菌株では、Ｒａｃプロファージ領域のＲｅｃＥ、ＲｅｃＴレコンビナーゼが過剰発現しており、このＲｅｃＥ、ＲｅｃＴレコンビナーゼにより大腸菌細胞内で相同組換えの効率が高まり、シームレスクローニングを行うことができる（例えば、特許文献２、特許文献３、及び非特許文献２参照。）。
【０００４】
最近では、相同配列を有する複数の目的のＤＮＡ及びベクターを大腸菌ＤＨ５α株に直接導入し発現させることで、目的のＤＮＡをクローニングできることが報告されている（例えば、非特許文献３参照。）。
【０００５】
非特許文献１に記載の方法では、出芽酵母の細胞内において、クローニングされた目的のＤＮＡが挿入されたベクターが不安定であるため、さらに大腸菌等の細胞株に導入し、クローニングする必要がある。
また、特許文献２、特許文献３、及び非特許文献２に記載の方法では、ＲｅｃＥＴシステムを有する大腸菌株を用いる必要があり、さらに、プラスミドＤＮＡ同士で相同組換えが起こり、ダイマー、又はマルチマーを形成されるという課題を有する。
さらに、非特許文献３に記載の方法では、大腸菌ＤＨ５α株を用いて直接目的のＤＮＡをクローニングできることは報告されているが、そのメカニズムは明らかにされていない。また、非特許文献３に記載の方法では、クローニング効率が低く、よりクローニング効率の高い細胞株が求められていた。
【０００６】
このような課題に対して、本発明者は、ｘｔｈＡ遺伝子の有無が、インビボクローニングの効率に関係していることを見出した（例えば、特許文献４参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／０１６５１７５号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１０／０３１７０６１号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１３／０２１０６８１号明細書
【特許文献４】特開２０１８−７５８９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ma, H., et al., “Plasmid construction by homologous recombination in yeast”, GENE, vol.58, p201-216, 1987.
【非特許文献２】Oliner, J. D., et al., “In vivo cloning of PCR products in E.coli”, NUCLEIC. ACIDS. RES., vol.21, no.22, p5192-5197, 1993.
【非特許文献３】Kostylev, M., et al., “Cloning Should Be Simple: Escherichia coli DH5α-Mediated Assembly of Multiple DNA Fragments with Short End Homologies”, PLOS ONE, 2015, DOI: 10.1371/journal.pone.0137466.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献４で見出した遺伝子以外に、インビボクローニング効率に関与する遺伝子を同定できれば、同定した遺伝子の発現を調節することにより、更にインビボクローニング効率を上げることができる。例えば、欠失変異により、インビボクローニング効率が５０％上昇する遺伝子を６個同定できれば、これら遺伝子の６重変異株を得ることにより効率を１１．４倍に上昇させることができる。
【００１０】
本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、高効率でインビボクローニング可能な細胞株のスクリーニング方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ｒｐｏＺ遺伝子、ｙｆａＨ遺伝子、ｒｓｘＣ遺伝子、ｙｅａＥ遺伝子、ｓｌｙＡ遺伝子、又はｓａｐＣ遺伝子の欠失変異が、インビボクローニングの効率に影響を及ぼしていることを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の態様を含む。
［１］インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法であって、
細胞株について、ｒｐｏＺ遺伝子、ｙｆａＨ遺伝子、ｒｓｘＣ遺伝子、ｙｅａＥ遺伝子、ｓｌｙＡ遺伝子、及びｓａｐＣ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の有無を評価し、評価された前記遺伝子の少なくとも一部の機能が失われた細胞株を選択する第１の選択工程を備えることを特徴とする方法。
［２］さらに、前記第１の選択工程の後に、ｘｔｈＡ遺伝子の有無を評価し、ｘｔｈＡ遺伝子を有する細胞株を選択する第２の選択工程、及び／又は、ｈｓｄＲ遺伝子の有無を評価し、ｈｓｄＲ遺伝子の少なくとも一部の機能が失われた細胞株を選択する第３の選択工程を備える［１］に記載の方法。
［３］前記細胞株が大腸菌又は哺乳動物細胞に由来するものである［１］又は［２］に記載の方法。
［４］インビボクローニング可能な細胞株の製造方法であって、前記細胞株がｒｐｏＺ遺伝子、ｙｆａＨ遺伝子、ｒｓｘＣ遺伝子、ｙｅａＥ遺伝子、ｓｌｙＡ遺伝子、及びｓａｐＣ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子を有する場合に、前記遺伝子の少なくとも一部の機能を失わせる工程Ａを備える細胞株の製造方法。
［５］さらに、前記細胞株がｘｔｈＡ遺伝子を有しない場合に、前記ｘｔｈＡ遺伝子を細胞株の染色体に挿入し、ｘｔｈＡ遺伝子を発現させる工程Ｃ、及び／又は、前記細胞株がｈｓｄＲ遺伝子を有する場合に、前記ｈｓｄＲ遺伝子の少なくとも一部の機能を失わせる工程Ｂを備える［４］に記載の製造方法。
［６］前記細胞株が大腸菌又は哺乳動物細胞に由来するものである［４］又は［５］に記載の製造方法。
［７］ｒｐｏＺ遺伝子、ｙｆａＨ遺伝子、ｒｓｘＣ遺伝子、ｙｅａＥ遺伝子、ｓｌｙＡ遺伝子、及びｓａｐＣ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の少なくとも一部の機能が失われたことを特徴とする細胞株。
［８］さらに、ｘｔｈＡ遺伝子を有し、及び／又は、ｈｓｄＲ遺伝子の少なくとも一部の機能が失われた［７］に記載の細胞株。
［９］前記細胞株が、大腸菌又は哺乳動物細胞に由来するものである［７］又は［８］に記載の細胞株。
［１０］［１］〜［３］のいずれか一つに記載の方法、又は［４］〜［６］のいずれか一つに記載の製造方法を用いて、インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニング、又は製造した後、得られた細胞株に、ベクターと、５’末端領域及び３’末端領域に前記ベクター上の挿入を行う部位と相同な塩基配列を有する目的の二本鎖ＤＮＡとを導入する導入工程と、前記導入工程後、前記細胞株を培養し、前記目的の二本鎖ＤＮＡを相同組換えにより前記ベクターに挿入する挿入工程と、を備えることを特徴とするインビボクローニング方法。
［１１］インビボクローニングを行うためのキットであって、［７］〜［９］のいずれか一つ記載の細胞株を備えることを特徴とするキット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、高効率でインビボクローニング可能な細胞株のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ｘｔｈＡ遺伝子を有する細胞内での相同組換えのメカニズムを模式的に示す図である。
【図２】ｉＶＥＣ（ｉｎ ｖｉｖｏ Ｅ. ｃｏｌｉ Ｃｌｏｎｉｎｇ）活性の高い大腸菌株の探索方法のスキームを示す図である。
【図３】ｉＶＥＣ３株を用いた特定の遺伝子欠損変異株におけるｉＶＥＣ活性のコンファメーション実験の結果である。
【図４】ｉＶＥＣ３株を用いた特定の遺伝子欠損変異株におけるｉＶＥＣ活性のコンファメーション実験の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
＜＜インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法＞＞
本発明のスクリーニング方法について、以下に詳細を説明する。
［第１の選択工程］
本発明のスクリーニング方法は、細胞株について、ｒｐｏＺ遺伝子、ｙｆａＨ遺伝子、ｒｓｘＣ遺伝子、ｙｅａＥ遺伝子、ｓｌｙＡ遺伝子、及びｓａｐＣ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の有無を評価し、評価された前記遺伝子の少なくとも一部の機能が失われた細胞株を選択する第１の選択工程を備える。
【００１６】
本発明におけるスクリーニング対象となる細胞株としては、通常、宿主細胞としてＤＮＡクローニング及びタンパク質発現系として用いられるものであればよく、その由来となる生物種は限定されない。細胞株の由来となる生物種としては、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞（特に、哺乳動物細胞）等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、細胞株の由来となる生物種としては、取扱いの容易さから、大腸菌又は哺乳動物細胞であることが好ましく、大腸菌であることがより好ましい。
また、細胞株として、大腸菌株以外の株を用いる場合、存在の有無を評価する遺伝子は、対応する生物のホモログ遺伝子となる。例えば、細胞株としてヒト培養細胞株を用いる場合、ｒｐｏＺ遺伝子、ｙｆａＨ遺伝子、ｒｓｘＣ遺伝子、ｙｅａＥ遺伝子、ｓｌｙＡ遺伝子、及びｓａｐＣ遺伝子のそれぞれのヒトホモログの存在の有無を評価する。
なお、本明細書において、「インビボクローニング」とは、細胞内で目的のＤＮＡをクローニングする技術を意味する。
【００１７】
ｒｐｏＺ遺伝子は、ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ωをコードする遺伝子であり、ｙｆａＨ遺伝子は、ｃｏｎｓｅｒｅｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎをコードする遺伝子であり、ｒｓｘＣ遺伝子は、ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ＳｏｘＲ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘをコードする遺伝子であり、ｙｅａＥ遺伝子は、ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｏｘａｌ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅをコードする遺伝子であり、ｓｌｙＡ遺伝子は、ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｄｕａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ＳｌｙＡをコードする遺伝子であり、ｓａｐＣ遺伝子は、ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ  ＡＢＣ  ｅｘｐｏｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳａｐＣをコードする遺伝子である。
【００１８】
実施例で後述するように、発明者は、これらの遺伝子に欠損変異を有する大腸菌株が、ｉＶＥＣ（ｉｎ ｖｉｖｏ Ｅ. ｃｏｌｉ Ｃｌｏｎｉｎｇ）活性が高いことを見出した。
なお、本明細書において、「ｉＶＥＣ活性」とは、ＰＣＲ増幅した挿入ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡを同時にトランスフォームするだけでクローニングできる、大腸菌株の能力を意味し、例えば、挿入ＤＮＡ断片が導入された大腸菌株のコロニー数で表される。
【００１９】
これらの遺伝子の有無を評価する方法としては、公知の方法を用いて行えばよく、例えば、細胞株からＤＮＡを抽出し、これらの遺伝子に対するプライマーセットを用いたＰＣＲ法により、これらの遺伝子を増幅し、アガロースゲルにより分離し、エチジウムブロマイド等のインターカレーターによる染色を行い、紫外線を照射して検出する方法が挙げられる。
または、例えば、細胞株からＤＮＡを抽出し、これらの遺伝子に対するプライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲ法により、反応液に予め蛍光プローブ又は蛍光色素を添加し、リアルタイムでこれらの遺伝子の増幅をモニタリングしながら定量的に検出する方法が挙げられる。
【００２０】
または、例えば、細胞株からＲＮＡを抽出し、これらの遺伝子から転写されたｍＲＮＡを逆転写酵素及びこれらの遺伝子に対するプライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲ法により、ｍＲＮＡから変換されたｃＤＮＡを増幅し、上述の検出法（アガロースゲル分離後のインターカレーターによる染色法、又は蛍光プローブ又は蛍光色素を用いたリアルタイムでの検出法）により、検出する方法も挙げられる。
【００２１】
本明細書において、「機能の少なくとも一部が失われた」とは、標的遺伝子が、欠失、置換、挿入等されることにより、標的遺伝子がコードするタンパク質の生理的機能の少なくとも一部を果たすことができない状態を意味する。相同染色体上の片方の標的遺伝子が、欠失、置換、挿入等されていてもよく、両方の標的遺伝子が、欠失、置換、挿入等されていてもよい。
【００２２】
［第２の選択工程］
本発明のスクリーニング方法は、さらに、前記第１の選択工程の後に、ｘｔｈＡ遺伝子の有無を評価し、ｘｔｈＡ遺伝子を有する細胞株を選択する第２の選択工程を備えることが好ましい。
【００２３】
一般に、ｘｔｈＡ遺伝子は、二本鎖ＤＮＡの３’−ＯＨ末端から５’−モノヌクレオチドを遊離させる３’→５’エキソヌクレアーゼをコードする遺伝子であり、遺伝子産物である３’→５’エキソヌクレアーゼは、損傷を受けて、ＤＮＡグリコシラーゼの活性により除去された塩基を有するＤＮＡや、自然に塩基が欠損したＤＮＡを修復する機能を有する。
【００２４】
本発明のスクリーニング対象となる細胞株において、ｘｔｈＡ遺伝子を有することにより、３’→５’エキソヌクレアーゼを発現することができる。
図１は、ｘｔｈＡ遺伝子を有する細胞内での相同組換えのメカニズムを模式的に示す図である。図１において、相同配列を有する部位３ａ及び３ｂのうち、相同配列を有する部位３ｂにおける相同組換えのメカニズムを示している。また、相同配列を有する部位３ｂにおける相同配列を配列Ｘとした場合、目的の二本鎖ＤＮＡ１（以下、「ｄｓＤＮＡ」と称する場合がある。）及びベクターにおいて、相同配列を有する部位３ｂは、配列Ｘを有する部位３ｂ−１と、配列Ｘと相補的な配列を有する部位３ｂ−２とからなる。
まず、発現した３’→５’エキソヌクレアーゼ４は、目的のｄｓＤＮＡ１及びベクター２が導入された細胞内において、目的のｄｓＤＮＡ１の３’末端から内側へ向かって配列Ｘを有する部位３ｂ−１を分解し、配列Ｘと相補的な配列を有する部位３ｂ−２を含む末端部に１本鎖領域を生成する。また、３’→５’エキソヌクレアーゼ４は、ベクター２の３’末端から内側へ向かって配列Ｘと相補的な配列を有する部位３ｂ−２を分解し、配列Ｘを有する部位３ｂ−１を含む末端部に１本鎖領域を生成する。その結果、目的のｄｓＤＮＡ１の配列Ｘと相補的な配列を有する部位３ｂ−２を含む末端部と、ベクター２の配列Ｘを有する部位３ｂ−１を含む末端部とがアニールする。次いで、細胞内に存在するＤＮＡポリメラーゼ５によりニックが埋められ、ＤＮＡリガーゼ６により結合される。逆側の相同配列を有する部位３ａを含む末端部でも同様のメカニズムで相同組換えが行われているため、その結果、目的の二本鎖ＤＮＡがベクターに挿入される。
よって、ｘｔｈＡ遺伝子を有する細胞株を選択することで、高効率で相同組換えが行われ、目的の二本鎖ＤＮＡが挿入されたベクターを得ることができ、高効率でインビボクローニングを行うことができる。
【００２５】
ｘｔｈＡ遺伝子の有無を評価する方法としては、上述の［第１の選択工程］において、標的遺伝子の有無を評価する方法として例示された方法と同様の方法が挙げられる。
【００２６】
［第３の選択工程］
本発明のスクリーニング方法は、第２の選択工程に代えて、又は第２の選択工程とともに、ｈｓｄＲ遺伝子の有無を評価し、ｈｓｄＲ遺伝子の少なくとも一部の機能が失われた細胞株を選択する第３の選択工程を備えることが好ましい。
【００２７】
一般に、ｈｓｄＲ遺伝子は、特定の塩基配列を切断する制限酵素をコードする遺伝子であって、ｈｓｄＭ遺伝子がコードするメチル化修飾酵素、及びｈｓｄＳ遺伝子がコードするメチル化認識タンパク質と共に、制限−修飾システムを担う。この制限−修飾システムでは、細胞内において、特定の塩基配列の片側のみがメチル化されている（宿主細胞中の染色体のＤＮＡ複製の間に起こるように片側だけがメチル化されている）場合、制限−修飾システムにおけるメチル化修飾酵素が働き、特定の塩基配列を切断から守る。一方、その特定の塩基配列がいずれの鎖においてもメチル化されていない場合、制限−修飾システムにおける制限酵素が働き、特定の塩基配列を切断する。
通常、外来ＤＮＡである目的の二本鎖ＤＮＡ及びベクターは、特定の塩基配列を有する場合、いずれの鎖においても該配列はメチル化されていないため、上記制限−修飾システムにより切断される。
よって、ｈｓｄＲ遺伝子の機能が失われた細胞株を選択することで、外来ＤＮＡである目的の二本鎖ＤＮＡ及びベクターが上記制限−修飾システムによる切断を受けないため、高効率で相同組換えが行われ、目的の二本鎖ＤＮＡが挿入されたベクターを得ることができ、高効率でインビボクローニングを行うことができる。
【００２８】
ｈｓｄＲ遺伝子の有無を評価する方法としては、上述の［第１の選択工程］において、標的遺伝子の有無を評価する方法として例示された方法と同様の方法が挙げられる。
【００２９】
＜＜インビボクローニング可能な細胞株の製造方法＞＞
本発明のインビボクローニング可能な細胞株の製造方法は、前記細胞株がｒｐｏＺ遺伝子、ｙｆａＨ遺伝子、ｒｓｘＣ遺伝子、ｙｅａＥ遺伝子、ｓｌｙＡ遺伝子、及びｓａｐＣ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子を有する場合に、前記遺伝子の少なくとも一部の機能を失わせる工程Ａを備える。
【００３０】
本発明において用いられる細胞株としては、通常、宿主細胞としてＤＮＡクローニング及びタンパク質発現系として用いられるものであればよく、その由来となる生物種は限定されない。細胞株の由来となる生物種としては、上述の＜＜インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、細胞株の由来となる生物種としては、取扱いの容易さから、大腸菌又は哺乳動物細胞であることが好ましく、大腸菌であることがより好ましい。また、細胞株として、大腸菌株以外の株を用いる場合、存在の有無を評価する遺伝子は、対応する生物のホモログ遺伝子となる。
本発明の製造方法について、以下に詳細を説明する。
【００３１】
［工程Ａ］
ｒｐｏＺ遺伝子、ｙｆａＨ遺伝子、ｒｓｘＣ遺伝子、ｙｅａＥ遺伝子、ｓｌｙＡ遺伝子、及びｓａｐＣ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の少なくとも一部の機能を失わせる方法としては、これらの標的遺伝子をノックアウトする方法、又はこれらの標的遺伝子をノックダウンする方法が挙げられる。
細胞株として大腸菌株を用い、これらの遺伝子をノックアウトする場合、λＲｅｄレコンビナーゼを利用した相同組み換え方法（参考文献：Datsenko and Wanner, “One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products”, PNAS, vol.97, no.12, p6640-6645, 2000.）が挙げられる。
また、これらの標的遺伝子をノックアウトする技術として、ゲノム編集技術が挙げられる。ゲノム編集技術としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム、ＴＡＬＥＮシステム、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼシステム等が挙げられる。
また、これらの標的遺伝子をノックダウンする方法としては、ＲＮＡｉ誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）を用いる方法が挙げられる。
これらの標的遺伝子が欠損したかを確認する方法としては、上述の［第１の選択工程］において標的遺伝子の有無を評価する方法として例示された方法と同様の方法が挙げられる。
【００３２】
［工程Ｂ］
本発明のインビボクローニング可能な細胞株の製造方法は、前記細胞株がｈｓｄＲ遺伝子を有する場合に、前記ｈｓｄＲ遺伝子の少なくとも一部の機能を失わせる工程Ｂを備えることが好ましい。
ｈｓｄＲ遺伝子を有する場合に、前記ｈｓｄＲ遺伝子の少なくとも一部の機能を失わせる方法、及びｈｓｄＲ遺伝子が欠損したかを確認する方法としては、上述の［第１の選択工程］において標的遺伝子の有無を評価する方法として例示された方法と同様の方法が挙げられる。
【００３３】
［工程Ｃ］
本発明のインビボクローニング可能な細胞株の製造方法は、工程Ｂに代えて、又は工程Ｂとともに、ｘｔｈＡ遺伝子を細胞株の染色体に挿入し、ｘｔｈＡ遺伝子を発現させる工程Ｃを備えることが好ましい。
特に、細胞株がｘｔｈＡ遺伝子を有しない場合に、ｘｔｈＡ遺伝子を細胞株の染色体に挿入し、ｘｔｈＡ遺伝子を発現させることが好ましい。また、既にｘｔｈＡ遺伝子を有する細胞株においても、さらにｘｔｈＡ遺伝子を挿入することにより、ｘｔｈＡ遺伝子を高発現させてもよい。
【００３４】
ｘｔｈＡ遺伝子の染色体上の挿入する遺伝子領域としては、恒常的且つ安定的に発現が行われている遺伝子領域であり、当該領域に本来コードされている遺伝子が欠損又は改変された場合であっても、生命の維持が可能な領域であればよい。
【００３５】
また、ｘｔｈＡ遺伝子の染色体への挿入方法としては、相同組換えによる方法が好ましく、ゲノム編集技術を用いた相同組換えによる方法がより好ましい。ゲノム編集技術としては、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム、ＴＡＬＥＮシステム、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼシステム等が挙げられ、操作が簡便であり、高い選択性で目的部位に標的遺伝子を挿入できることから、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを用いることが好ましい。
【００３６】
ｘｔｈＡ遺伝子は、タグ配列、プロモーター配列、転写終結配列、及び薬剤選択マーカー遺伝子の組み合わせとともに導入してもよい。ここで、タグの中には、蛍光タグ（ＧＦＰなど）、アフィニティータグ、デグロンタグ、局在タグ等が挙げられる。
薬剤選択マーカー遺伝子は、ｘｔｈＡ遺伝子の上流（５’側）又は下流（３’側）に、作動可能に連結されていればよい。薬剤選択マーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ヒスティディノール耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等が挙げられ、これらに限定されない。薬剤選択マーカー遺伝子を挿入することにより、該薬物を含む培地を用いて細胞を培養することで、ｘｔｈＡ遺伝子が導入された細胞を選択することができる。
【００３７】
工程Ｃにおいて、ｘｔｈＡ遺伝子の転写を制御するプロモーター配列がｘｔｈＡ遺伝子に上流（５’側）に作動可能に連結されていることが好ましい。
なお、本明細書において、「作動可能に連結」とは、遺伝子発現制御配列（例えば、プロモーター又は一連の転写因子結合部位）と発現させたい遺伝子（本発明においては、ｘｔｈＡ遺伝子）との間の機能的連結を意味する。ここで、「発現制御配列」とは、その発現させたい遺伝子（本発明においては、ｘｔｈＡ遺伝子）の転写を指向するものを意味する。
【００３８】
ｘｔｈＡ遺伝子の細胞株への導入方法としては、公知の遺伝子導入手法（例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等）を用いることができる。
【００３９】
ｘｔｈＡ遺伝子が挿入されたか否かの確認方法としては、公知の方法を用いればよく、例えば、薬剤選択マーカー遺伝子をｘｔｈＡ遺伝子と共に挿入することにより、薬剤を含む培地にて、細胞株を培養し、生育可能な細胞を選択する方法が挙げられる。
または、［第１の選択工程］において標的遺伝子の有無を評価する方法として例示された方法と同様の方法が挙げられる。
【００４０】
＜＜細胞株＞＞
本発明の細胞株は、ｒｐｏＺ遺伝子、ｙｆａＨ遺伝子、ｒｓｘＣ遺伝子、ｙｅａＥ遺伝子、ｓｌｙＡ遺伝子、及びｓａｐＣ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の少なくとも一部の機能が失われた細胞株である。
【００４１】
本発明の細胞株は、ｒｐｏＺ遺伝子、ｙｆａＨ遺伝子、ｒｓｘＣ遺伝子、ｙｅａＥ遺伝子、ｓｌｙＡ遺伝子、及びｓａｐＣ遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子の多重変異株であることが好ましい。多重変異により、インビボクローニング効率を劇的に上昇させることができる。
【００４２】
また、本発明の細胞株は、さらに、ｘｔｈＡ遺伝子を有することが好ましい。ｘｔｈＡ遺伝子を有することにより、エキソヌクレアーゼ活性により、高効率で相同組換えが行われる。
また、本発明の細胞株は、ｘｔｈＡ遺伝子を有することに代えて、又はｘｔｈＡ遺伝子を有することに加えて、ｈｓｄＲ遺伝子の少なくとも一部の機能が失われた細胞株であることが好ましい。ｈｓｄＲ遺伝子の少なくとも一部の機能が失わることにより、外来ＤＮＡが、制限−修飾システムによる切断を受けず、高効率で相同組換えが行われる。
【００４３】
本発明の細胞株としては、通常、宿主細胞としてＤＮＡクローニング系及びタンパク質発現系として用いられるものであればよく、その由来となる生物種は限定されない。細胞株の由来となる生物種としては、上述の＜＜インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、細胞株の由来となる生物種としては、取扱いの容易さから、大腸菌又は哺乳動物細胞であることが好ましく、大腸菌であることがより好ましい。
【００４４】
＜＜インビボクローニング方法＞＞
本発明のインビボクローニング方法は、上述のスクリーニング方法、又は上述の製造方法を用いて、インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニング、又は製造した後、得られた細胞株に、ベクターと、５’末端領域及び３’末端領域に前記ベクター上の挿入を行う部位と相同な塩基配列を有する目的の二本鎖ＤＮＡとを導入する導入工程と、前記導入工程後、前記細胞株を培養し、前記目的の二本鎖ＤＮＡを相同組換えにより前記ベクターに挿入する挿入工程と、を備えるインビボクローニング方法を提供する。
【００４５】
本発明のインビボクローニング方法において用いられる細胞株は、上述のスクリーニング方法、又は上述の製造方法で得られたインビボクローニング可能な細胞株である。また、細胞株の由来となる生物種は限定されない。細胞株の由来となる生物種としては、上述の＜＜インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、細胞株の由来となる生物種としては、取扱いの容易さから、大腸菌又は哺乳動物細胞であることが好ましく、大腸菌であることがより好ましい。
本発明のインビボクローニング方法において用いられる細胞株は、導入工程で用いられるのに適した細胞数となるように、予め培養しておけばよい。
本発明のインビボクローニング方法について、以下に詳細に説明する。
【００４６】
［導入工程］
まず、上述のスクリーニング方法、又は上述の製造方法で得られた細胞株に、ベクターと、５’末端領域及び３’末端領域に前記ベクター上の挿入を行う部位と相同な塩基配列を有する目的の二本鎖ＤＮＡとを導入する。
【００４７】
導入工程において用いられるベクターは、直鎖状であることが好ましい。係るベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ５７等の大腸菌由来のプラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のプラスミド；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来プラスミド；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルス；これらを改変したベクター等が挙げられる。
ベクターは、タグ配列、プロモーター配列、転写終結配列、及び薬剤選択マーカー遺伝子の組み合わせを含んでいてもよい。ここで、タグの中には、蛍光タグ（ＧＦＰなど）、アフィニティータグ、デグロンタグ、局在タグ等が挙げられる。
【００４８】
導入工程において用いられる目的の二本鎖ＤＮＡは、５’末端領域及び３’末端領域にベクター上の挿入を行う部位と相同な塩基配列を有し、該相同な塩基配列の長さは、例えば１０ｂｐ以上３０ｂｐ以下であればよく、例えば１５ｂｐ以上２５ｂｐ以下であればよい。
【００４９】
ベクターと、５’末端領域及び３’末端領域に前記ベクター上の挿入を行う部位と相同な塩基配列を有する外来ＤＮＡとの細胞株への導入方法としては、公知の遺伝子導入手法（例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等）等が挙げられる。
【００５０】
［挿入工程］
次いで、導入工程後の細胞株を培養し、目的の二本鎖ＤＮＡを相同組換えによりベクターに挿入する。
【００５１】
細胞株の培養条件としては、培養する細胞の種類により適宜選択することができる。
培養温度としては、例えば２５℃以上４０℃以下であってもよく、例えば３０℃以上３９℃以下であってもよく、例えば３５℃以上３９℃以下であってもよい。
また、培養環境は、例えば約５％のＣＯ２条件下であってもよい。
培養時間としては、細胞の種類、細胞数等により適宜選択することができ、例えば１日以上１５日以下であってもよく、例えば１日以上１０日以下であってもよく、例えば１日以上７日以下であってもよい。
【００５２】
また、使用する細胞培養用培地としては、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）等を含む基本培地であればよく、細胞の種類により適宜選択することができる。
細胞培養用培地としては、例えば、ＬＢ培地、大腸菌用最少培地（Ｄａｖｉｓ培地）、大腸菌用最少塩培地（ＭＳ）等の大腸菌培養用培地；枯草菌用最少培地（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ最少培地）、枯草菌用最少塩培地、枯草菌形質転換用培地Ｉ、枯草菌形質転換用培地ＩＩ等の枯草菌培養用培地；酵母用最少培地（ＹＰＤ培地）、酵母用完全培地（ＹＰＡＤ培地）等の酵母培養用培地；ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地（ＭＳ培地）、Ｂ５培地、ハイポネックス培地等の植物培養用培地；グレース昆虫培地、シュナイダー昆虫培地等の昆虫細胞培養用培地；ＤＭＥＭ、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）等の動物細胞培養用培地等が挙げられ、これらに限定されない。
【００５３】
さらに、挿入工程の後に、目的の二本鎖ＤＮＡが挿入されたベクターが形成されているか否かを確認する確認工程を有していてもよい。
確認工程において、目的の二本鎖ＤＮＡが挿入されたベクターが形成されているか否かを確認する方法としては、公知の方法を用いればよく、例えば、薬剤選択マーカー遺伝子を目的の二本鎖ＤＮＡと共に挿入することにより、薬剤を含む培地にて、細胞株を培養し、生育可能な細胞を選択する方法が挙げられる。
ベクターにおいても薬剤選択マーカー遺伝子を有する場合は、目的の二本鎖ＤＮＡと共に挿入される薬剤選択マーカー遺伝子と、ベクターが有する薬剤選択マーカー遺伝子とは異なる種類のものであることが好ましい。
【００５４】
または、目的の二本鎖ＤＮＡが挿入されたベクターが形成されているか否かを確認する方法としては、例えば、上述の＜＜インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法＞＞の［第１の選択工程］においてｘｔｈＡ遺伝子の有無を評価する方法として例示された方法と同様の方法が挙げられる。
【００５５】
＜＜キット＞＞
本発明のキットは、インビボクローニングを行うためのキットであって、上述した細胞株を備えるキットを提供する。
【００５６】
本発明のキットに備えられた細胞株の由来となる生物種としては、上述の＜＜インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、細胞株の由来となる生物種としては、取扱いの容易さから、大腸菌又は哺乳動物細胞であることが好ましく、大腸菌であることがより好ましい。
【００５７】
本発明のキットは、さらに、ベクターを備えていてもよい。
本発明のキットに備えられたベクターとしては、特別な限定はなく、上述の＜＜インビボクローニング方法＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００５８】
本発明のキットは、５’末端領域及び３’末端領域に前記ベクター上の挿入を行う部位と相同な塩基配列を有する目的の二本鎖ＤＮＡを準備することで、目的の二本鎖ＤＮＡを容易かつ高効率でインビボクローニングすることができる。
【００５９】
本発明のキットは、さらに、細胞株を培養するための細胞培養用培地を備えていてもよい。細胞培養用培地としては、キットに備えられた細胞株の種類に応じて、適宜選択することができ、上述の＜＜インビボクローニング方法＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００６０】
また、本発明のキットは、さらに、目的の二本鎖ＤＮＡ及びベクターを細胞株へ導入するためのトランスフェクション試薬を備えていてもよい。トランスフェクション試薬としては、例えば、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬及びリン酸カルシウムからなる群より選択される。このようなトランスフェクション試薬としては、例えば、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ｃａｔ．ｎｏ．３０１４２５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２４３１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）、ＴｆｘＴＭ−２０  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２３９１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１３０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）、ＰｏｌｙＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１１０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（１１６６８−０１９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣＡ）、ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．（１０１−３０，Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｘＧｅｎ  ５００（Ｒ０５１１，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．，ＭＤ）等が挙げられる。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６２】
［実施例１］ｉＶＥＣ（ｉｎ ｖｉｖｏ Ｅ. ｃｏｌｉ Ｃｌｏｎｉｎｇ）活性の高い大腸菌株の探索
（１）インサートＤＮＡ及びベクターの作製
図２は、ｉＶＥＣ活性の高い大腸菌株の探索方法のスキームを示す。
インサートＤＮＡとして、ｐＡＣＹＣ１８４由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子を有し、かつ５’末端側及び３’ 末端側それぞれにベクターに対して相同な配列（２０ｂｐ）を有するＤＮＡ（９９２ｂｐ）を用いた（インサートＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示した）。
また、ベクターとして、アンピシリン耐性遺伝子を有するｐＵＣ１９ベクター（２．６ｋｂ）を用いた（ｐＵＣ１９ベクターの塩基配列を配列番号２に示した）。
まず、インサートＤＮＡ及びベクターを以下の表１に示すＰＣＲでの増幅用プライマーの塩基配列を用いて、ＰＣＲを行い、反応液を得た。
ＰＣＲ反応液を精製してその後のスクリーニングに用いた。
【００６３】
【表１】
2019187368.tif 000002
【００６４】
（２）ｉＶＥＣ活性に関与する遺伝子のスクリーニング
次いで、３９０９種の大腸菌株を備えたＫｅｉｏ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（参考文献：Baba et al., (2006) Molecular Systems Biology, doi:10.1038/msb4100050）を用いて、ｉＶＥＣ活性の高い株をスクリーニングした。具体的には、１ｍｌのＬ倍地中で、３７℃で一晩静置培養した培養液を氷上で１０分間静置した後に、５，０００ｇ、４℃で１分間遠心して、上清を除いた。沈殿した大腸菌株を、（１）で増幅したベクター及びインサートＤＮＡをそれぞれ０．０５ｐｍｏｌ, ０．１５ｐｍｏｌを加えたＴＳＳ溶液(１０％ＰＥＧ８０００，１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，５０ｍＭ  ＭｇＳＯ４，１０％ＤＭＳＯ ｉｎ  Ｌ培地)に懸濁して、液体窒素を用いて凍結させた。これを氷上で１０分間静置して溶かした後、軽く混ぜて、さらに１０分間氷上で静置した。これにＬ培地を１ｍＬ加えて３７℃で４５分間培養した。次いで、５，０００ｇで１分間遠心し、培地の大半を捨て、培地を１００μＬ程度残した。次いで、各大腸菌株のペレットを懸濁し、クロラムフェニコール及びアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗り広げ、大腸菌を植菌したこのＬＢ寒天培地を３７℃で１６時間培養し、１枚のＬＢ寒天培地プレートに出現したコロニー数を計測した。ＢＷ２５１１３株を用いて同様の操作を行い、１枚のＬＢ寒天培地プレートに出現したコロニー数を計測し、コントロールとした。ＢＷ２５１１３株のコロニー数を１としたときに、２．５倍以上のコロニー数を有する（ｉＶＥＣ活性を有する）株として、ΔｒｐｏＺ：：ｋａｎ株、ΔｙｆａＨ：：ｋａｎ株、ΔｒｓｘＣ：：ｋａｎ株、ΔｙｅａＥ：：ｋａｎ株、ΔｓｌｙＡ：：ｋａｎ株、及びΔｓａｐＣ：：ｋａｎ株を見出した。
【００６５】
（３）ｉＶＥＣ３株を用いた特定の遺伝子欠損変異株におけるｉＶＥＣ活性のコンファメーション
ｒｐｏＺ欠失株の作製では、まずプラスミドベクターｐＫＨ５００２ＳＢを鋳型にしてプライマーセット[pKH_F, pKH_R]を用いてＰＣＲすることにより線状化した。大腸菌野生株であるＭＧ１６５５株のゲノムより、ｒｐｏＺ遺伝子の上流部分と下流部分の約１．５ｋｂの領域を、それぞれプライマーセット[rpoZ_up_F, rpoZ_up_R],[rpoZ_down_F, rpoZ_down_R]を用いてＰＣＲにより増幅して、得られたＤＮＡ断片をそれぞれrpoZ_up, rpoZ_downとした。rpoZ_up_F及びrpoZ_down_RはそれぞれpKH_R及びpKH_Fと相補的な２０ｂｐの塩基配列が付加されている。また、rpoZ_up_RとrpoZ_down_Fは相補的な配列である。線状化したｐＫＨ５００２ＳＢとrpoZ_up, rpoZ_downはＫｅｉｏコレクションのΔｒｎｈＡ::ｋａｎ株を用いてｉＶＥＣ法によりアッセンブルすることで環状プラスミドｐＫＨ５００２ＳＢΔｒｐｏＺを得た。このプラスミドをｉＶＥＣ３（ｒｅｃＡ＋）株 [MG1655 ΔhsdR ΔendA]に導入することで、北川らの方法(Genes Dev. 1998 Oct 1; 12(19): 3032-3043. )を用いて２回の相同組換えを経ることでｒｐｏＺ遺伝子を欠失させた。ｙｆａＨ, ｒｓｘＣ, ｙｅａＥ, ｓｌｙＡ, ｓａｐＣ遺伝子についても同様の方法で欠失株を作製した。各プライマーの塩基配列は、表２に示す通りである。
【００６６】
【表２】
2019187368.tif 000003
【００６７】
次いで、ｒｐｏＺ遺伝子、ｙｆａＨ遺伝子、ｒｓｘＣ遺伝子、ｙｅａＥ遺伝子、ｓｌｙＡ遺伝子、及びｓａｐＣ遺伝子のそれぞれをノックアウトしたｉＶＥＣ３（ｒｅｃＡ＋）株、並びに野生型のｉＶＥＣ３（ｒｅｃＡ＋）株を１ｍｌのＬ培地に植菌し、３７℃で２０時間静置培養した。次いで、培養を止めて、培養液をそれぞれ氷中で１０分間冷やした。また、以降の操作は全て氷中の冷やした状態で行った。次いで、５，０００ｇ、４℃で１分間遠心し、上清を捨てた。
【００６８】
沈殿した大腸菌株を、（１）で増幅したベクター及びインサートＤＮＡをそれぞれ０．０５ｐｍｏｌ, ０．１５ｐｍｏｌを加えたＴＳＳ溶液(１０％ＰＥＧ８０００,１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ, ５０ ｍＭ ＭｇＳＯ４,１０％ ＤＭＳＯ ｉｎ Ｌ培地)に懸濁して、液体窒素を用いて凍結させた。これを氷上で１０分間静置して溶かした後、軽く混ぜて、さらに１０分間氷上で静置した。これにＬ培地を１ｍＬ加えて３７℃で４５分間培養した。次いで、５，０００ｇで１分間遠心し、培地の大半を捨て、培地を１００μＬ程度残した。次いで、各大腸菌株のペレットを懸濁し、クロラムフェニコール及びアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗り拡げ、大腸菌を植菌したＬＢ寒天培地を３７℃で１６時間培養し、１枚のＬＢ寒天培地プレートに出現したコロニー数を計測した。結果を図３〜４に示す。
【００６９】
図３に示すように、ΔｒｐｏＺのｉＶＥＣ活性は、野生型と比較して１２０％上昇していた。ΔｙｆａＨのｉＶＥＣ活性は、野生型と比較して５０％上昇していた。ΔｒｓｘＣのｉＶＥＣ活性は、野生型と比較して３０％上昇していた。ΔｙｅａＥのｉＶＥＣ活性は、野生型と比較して７０％上昇していた。
図４に示すように、ΔｓｌｙＡのｉＶＥＣ活性は、野生型と比較して３０％上昇していた。ΔｓａｐＣのｉＶＥＣ活性は、野生型と比較して３０％上昇していた。
これらのことから、ｒｐｏＺ遺伝子、ｙｆａＨ遺伝子、ｒｓｘＣ遺伝子、ｙｅａＥ遺伝子、ｓｌｙＡ遺伝子、及びｓａｐＣ遺伝子の欠損変異は、ｉＶＥＣ活性を上昇させることが確かめられた。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明によれば、高効率でインビボクローニング可能な細胞株のスクリーニング方法を提供することができる。さらに、本発明のスクリーニング方法によって得られた細胞株によれば、目的の二本鎖ＤＮＡ又は該ＤＮＡの遺伝子産物を高収率で得ることができる。
【符号の説明】
【００７１】
１…目的の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、１ａ，１ｂ…目的の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、２…ベクター、３ａ，３ｂ…相同配列を有する部位、３ｂ−１…配列Ｘを有する部位、３ｂ−２…配列Ｘと相補的な配列を有する部位
【図１】
2019187368.tif 000004
【図２】
2019187368.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【配列表】
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