(57)【要約】【課題】ラビリンチュラ類微生物の形質転換法を提供する。【解決手段】少なくとも１種の成分の濃度が人工海水における該成分の濃度の３５％以下に制限された培地でラビリンチュラ類微生物を培養すること、および前記培養により生成した菌体を形質転換に供すること、によりラビリンチュラ類微生物を効率的に形質転換する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
形質転換されたラビリンチュラ類微生物の製造方法であって、
ラビリンチュラ類微生物を培地で培養すること、および
前記培養により生成した菌体を形質転換に供すること、
を含み、
前記微生物が、オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属微生物であり、
前記培地における少なくとも１種の成分の濃度が、人工海水における該成分の濃度の３５％以下であり、
前記人工海水の組成が、30 g/L NaCl、0.7 g/L KCl、10.8 g/L MgCl2・6H2O、5.4 g/L MgSO4・7H2O、および1 g/L CaCl2・2H2Oである、方法。
【請求項２】
前記成分が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、塩化物イオン、および硫酸イオンから選択される少なくとも１種の成分である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記成分が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、および塩化カルシウムである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記成分が、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、塩化物イオン、および硫酸イオンである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記培地における塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、および塩化カルシウムの総濃度が、前記人工海水におけるこれらの成分の総濃度の３５％以下である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記培地におけるナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、塩化物イオン、および硫酸イオンの総濃度が、前記人工海水におけるこれらの成分の総濃度の３５％以下である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記培養が、１２時間〜１２０時間実施される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記形質転換が、エレクトロポレーション法により実施される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記形質転換により、核酸が前記菌体に導入される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸と前記微生物の染色体との間で相同組み換えが起こる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記形質転換により、前記微生物の染色体上の遺伝子が破壊される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラビリンチュラ類微生物の形質転換法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属微生物等のラビリンチュラ類微生物は、例えば、コレステロールや７−デヒドロコレステロール等のステロールの生産に用いられている（特許文献１〜２、非特許文献１）。ラビリンチュラ類微生物の形質転換は、例えば、エレクトロポレーション法により実施されている（特許文献１〜２、非特許文献２）。しかしながら、ラビリンチュラ類微生物の形質転換効率に影響する因子は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】WO2015/108058
【特許文献２】WO2016/056610
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Weete JD, et al., Lipids and ultrastructure of Thraustochytrium sp. ATCC 26185., Lipids. 1997 Aug;32(8):839-45.
【非特許文献２】Keishi Sakaguchi, et al., Versatile Transformation system that is Applicable to both multiple transgene expression and gene targeting for thraustochytrids., Applied and Environmental Microbiology. 2012 ;78(9):3193-3202.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ラビリンチュラ類微生物の形質転換法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、塩濃度を制限した培地でラビリンチュラ類微生物を培養してから形質転換を実施することにより相同組換え効率を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
形質転換されたラビリンチュラ類微生物の製造方法であって、
ラビリンチュラ類微生物を培地で培養すること、および
前記培養により生成した菌体を形質転換に供すること、
を含み、
前記微生物が、オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属微生物であり、
前記培地における少なくとも１種の成分の濃度が、人工海水における該成分の濃度の３５％以下であり、
前記人工海水の組成が、30 g/L NaCl、0.7 g/L KCl、10.8 g/L MgCl2・6H2O、5.4 g/L MgSO4・7H2O、および1 g/L CaCl2・2H2Oである、方法。
［２］
前記成分が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、塩化物イオン、および硫酸イオンから選択される少なくとも１種の成分である、
前記方法。
［３］
前記成分が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、および塩化カルシウムである、前記方法。
［４］
前記成分が、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、塩化物イオン、および硫酸イオンである、前記方法。
［５］
前記培地における塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、および塩化カルシウムの総濃度が、前記人工海水におけるこれらの成分の総濃度の３５％以下である、前記方法。
［６］
前記培地におけるナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、塩化物イオン、および硫酸イオンの総濃度が、前記人工海水におけるこれらの成分の総濃度の３５％以下である、前記方法。
［７］
前記培養が、１２時間〜１２０時間実施される、前記方法。
［８］
前記形質転換が、エレクトロポレーション法により実施される、前記方法。
［９］
前記形質転換により、核酸が前記菌体に導入される、前記方法。
［１０］
前記核酸と前記微生物の染色体との間で相同組み換えが起こる、前記方法。
［１１］
前記形質転換により、前記微生物の染色体上の遺伝子が破壊される、前記方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、ラビリンチュラ類微生物の形質転換を効率よく実施することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明の方法は、特定の成分の濃度が制限された培地でラビリンチュラ類微生物を培養すること、および前記培養により生成した菌体を形質転換に供することを含む、ラビリンチュラ類微生物の形質転換方法である。本発明の方法により、形質転換されたラビリンチュラ類微生物が得られる。よって、ラビリンチュラ類微生物の形質転換方法とは、言い換えると、形質転換されたラビリンチュラ類微生物の製造方法である。
【００１１】
本発明において用いられるラビリンチュラ類微生物は、オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属微生物である。Aurantiochytrium属微生物としては、例えば、Aurantiochytrium limacinum、Aurantiochytrium sp.1、Aurantiochytrium sp.2が挙げられる。「Aurantiochytrium sp.1」とは、Aurantiochytrium属の特定の１種をいい、具体的には、Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株（FERM P-22342）が属する種をいう。言い換えると、「Aurantiochytrium sp.1」とは、具体的には、Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株と同株と同種に属する株で構成される一群の微生物をいう。Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株と同種に属する株としては、18S rDNAの塩基配列が、Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株の18S rDNAの塩基配列（配列番号３）に対して９７％以上の同一性を有する株が挙げられる。Aurantiochytrium sp.1として、具体的には、例えば、AJ7869株に加えて、AJ7867株（FERM BP-22304）、AJ7868株（FERM BP-22290）、BURABG162株、SKE217株、SKE218株が挙げられる。また、上記例示したAurantiochytrium sp.1の株に由来する株（例えば改変株）は、い
ずれも、Aurantiochytrium sp.1に包含される。
【００１２】
AJ7869株は、2017年8月8日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津かずさ鎌足2-5-8  120号室）に寄託され、受託番号FERM P-22342が付与されている。
【００１３】
これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることができる。すなわち各菌株に対応する
登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることができる（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、これらの菌株は、例えば、各菌株が寄託された寄託機関から入手することができる。
【００１４】
本発明において用いられる培地は、特定の成分の濃度が制限された培地である。培地における特定の成分の濃度は、人工海水における該成分の濃度の３５％以下である。培地における特定の成分の濃度は、例えば、人工海水における該成分の濃度の、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、または０％であってもよい。培地における特定の成分の濃度は、例えば、人工海水における該成分の濃度の、０％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、または３０％以上であってもよい。また、培地における特定の成分の濃度は、例えば、上記例示した範囲の矛盾しない組み合わせで規定される範囲であってもよい。培地における特定の成分の濃度は、具体的には、例えば、人工海水における該成分の濃度の０％〜３５％、５％〜３５％、または１０％〜３５％であってもよい。
【００１５】
特定の成分は、１種の成分であってもよく、２種またはそれ以上の成分の組み合わせであってもよい。特定の成分が２種またはそれ以上の成分の組み合わせである場合、当該２種またはそれ以上の成分の濃度がそれぞれ上記例示したような特定の範囲に制限される。特定の成分は、人工海水を構成する成分（水は除く）から選択される。培地の組成を特定するために参照される人工海水の組成は、30 g/L NaCl、0.7 g/L KCl、10.8 g/L MgCl2・6H2O、5.4 g/L MgSO4・7H2O、および1 g/L CaCl2・2H2Oとする。該人工海水の分散媒は水である。よって、人工海水を構成する成分としては、塩化ナトリウム（NaCl）、塩化カリウム（KCl）、塩化マグネシウム（MgCl2）、硫酸マグネシウム（MgSO4）、および塩化カ
ルシウム（CaCl2）が挙げられる。これらの塩は、いずれも、無水物であってもよく、水
和物であってもよい。なお、培地と人工海水における成分の濃度の比率は、該成分の無水物の重量に基づいて算出されるものとする。また、これらの塩は、いずれも、イオン化していてよい。よって、人工海水を構成する成分としては、これらの塩から生じるイオンも挙げられる。そのようなイオンとしては、ナトリウムイオン（Na+）、カリウムイオン（K+）、マグネシウムイオン（Mg2+）、カルシウムイオン（Ca2+）、塩化物イオン（Cl-）、および硫酸イオン（SO42-）が挙げられる。人工海水中のこれらのイオンの濃度は、人工
海水の組成から算出できる。すなわち、特定の成分は、例えば、上記成分（塩やイオン）から選択される１種またはそれ以上の成分であってよい。特定の成分は、具体的には、例えば、上記塩から選択される１種またはそれ以上、例えば全て、の塩であってもよい。また、特定の成分は、具体的には、例えば、上記イオンから選択される１種またはそれ以上、例えば全て、のイオンであってもよい。
【００１６】
人工海水を構成する成分の内、特定の成分として選択されなかったものを「非選択成分」ともいう。培地における非選択成分の濃度は、形質転換効率の向上効果を損なわない限り、特に制限されない。培地における非選択成分の濃度は、例えば、人工海水における該成分の濃度の、２００％以下、１５０％以下、１００％以下、７０％以下、５０％以下、
４０％以下であってもよく、０％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、７０％以上、１００％以上、または１５０％以上であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせで規定される範囲であってもよい。
【００１７】
培地においては、さらに、人工海水を構成する成分から選択される２種またはそれ以上の成分の総濃度が制限されていてもよい。例えば、培地においては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、および塩化カルシウムの総濃度が制限されていてもよい。また、例えば、培地においては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、塩化物イオン、および硫酸イオンの総濃度が制限されていてもよい。培地におけるこれらの成分の総濃度は、例えば、人工海水における該成分の総濃度の、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、または０％であってもよく、０％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、または３０％以上であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせで規定される範囲であってもよい。
【００１８】
培地は、特定の成分の濃度が制限されており、且つラビリンチュラ類微生物が増殖できる限り、特に制限されない。培地としては、例えば、ラビリンチュラ類等の従属栄養微生物の培養に用いられる通常の培地を特定の成分の濃度を制限して用いることができる。培地は、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有してよい。培地として、具体的には、例えば、0〜0.35×人
工海水で調製した希釈GY培地が挙げられる。なお、以下に例示する培地成分には、人工海水を構成する成分やそれらを生じる成分も含まれ得るが、それらの成分は、いずれも、特定の成分の濃度が制限される範囲で使用すればよい。
【００１９】
炭素源として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸やクエン酸等の有機酸類、エタノール、グリセロール、粗グリセロール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の炭素源を組み合わせて用いてもよい。
【００２０】
窒素源として、具体的には、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆タンパク質分解物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。pH調整に用いられるアンモニアガスやアンモニア水を窒素源として利用してもよい。窒素源としては、１種の窒素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の窒素源を組み合わせて用いてもよい。
【００２１】
リン酸源として、具体的には、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。リン酸源としては、１種のリン酸源を用いてもよく、２種またはそれ以上のリン酸源を組み合わせて用いてもよい。
【００２２】
硫黄源として、具体的には、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。硫黄源としては、１種の硫黄源を用いてもよく、２種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせて用いてもよい。
【００２３】
その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類；ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等のビ
タミン類；アミノ酸類；核酸類；これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、
大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
【００２４】
培養条件は、ラビリンチュラ類微生物が増殖できる限り、特に制限されない。培養は、例えば、ラビリンチュラ類等の従属栄養微生物の培養に用いられる通常の条件で行うことができる。
【００２５】
培養は、液体培地を用いて行うことができる。培養の際には、例えば、ラビリンチュラ類微生物を寒天培地等の固体培地で培養したものを直接液体培地に接種してもよく、ラビリンチュラ類微生物を液体培地で種培養したものを本培養用の液体培地に接種してもよい。すなわち、培養は、種培養と本培養とに分けて行われてもよい。その場合、種培養と本培養の培養条件は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。少なくとも、本培養の際に、特定の成分の濃度が制限された培地を用いる。培養開始時に培地に含有されるラビリンチュラ類微生物の量は、形質転換効率の向上効果を損なわない限り、特に制限されない。
【００２６】
培養は、例えば、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。培養は、通常、回分培養により実施すればよい。培養は、例えば、好気条件で行うことができる。好気条件とは、液体培地中の溶存酸素濃度が、酸素膜電極による検出限界である0.33ppm以上であることをいい、好ましくは1.5ppm以上であることであってよい。酸素濃
度は、例えば、飽和酸素濃度の5〜50％、好ましくは10％程度に制御されてもよい。好気
条件での培養は、具体的には、通気培養、振盪培養、撹拌培養、またはそれらの組み合わせで行うことができる。培地のpHは、例えば、pH3〜10、好ましくはpH4.0〜9.5であって
よい。培養中、必要に応じて培地のpHを調整することができる。培地のpHは、アンモニアガス、アンモニア水、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、塩酸、硫酸等の各種アルカリ性または酸性物質を用いて調整することができる。培養温度は、例えば、20℃〜35℃、好ましくは25℃〜35℃であってよい。培養期間は、例えば、１２時間以上、１６時間以上、２０時間以上、２５時間以上、３０時間以上、３５時間以上、または４０時間以上であってもよく、１２０時間以下、１００時間以下、８０時間以下、６０時間以下、５０時間以下、４０時間以下、３５時間以下、または３０時間以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせで規定される範囲であってもよい。培養期間は、具体的には、例えば、１２時間〜１２０時間、１２時間〜６０時間、または１６時間〜４０時間であってもよい。培養は、例えば、対数増殖期になるまで実施してもよい。また、培養は、例えば、培養液のＯＤ６６０が1〜50になるまで実施してもよい。このような
条件下でラビリンチュラ類微生物を培養することにより、菌体が生成する。
【００２７】
次いで、生成した菌体を形質転換に供する。
【００２８】
菌体は、培養液に含まれたまま、あるいは適宜回収してから、形質転換に供することができる。菌体を培養液から回収する手法は特に制限されず、例えば公知の手法（Grima, E. M. et al. 2003. Biotechnol. Advances 20: 491-515）を利用できる。具体的には、例えば、自然沈降、遠心分離、濾過等の手法により、菌体を培養液から回収することができる。また、その際、凝集剤（flocculant）を利用してもよい。回収した菌体は、適当な媒体を用いて適宜洗浄することができる。また、回収した菌体は、適当な媒体を用いて適宜再懸濁することができる。洗浄や懸濁に利用する媒体は、形質転換効率の向上効果を損なわない限り、特に制限されない。洗浄や懸濁に利用できる媒体としては、例えば、水が挙げられる。媒体は、形質転換法の種類等の諸条件に応じて適宜選択することができる。
【００２９】
形質転換法は特に制限されず、例えば公知の手法を利用できる。そのような手法としては、エレクトロポレーション法が挙げられる。エレクトロポレーション法は、例えば、ラビリンチュラ類等の微生物に用いられる通常の条件で行うことができる（Keishi Sakaguchi, et al., Versatile Transformation system that is Applicable to both multiple transgene expression and gene targeting for thraustochytrids., Applied and Environmental Microbiology. 2012 ;78(9):3193-3202）。
【００３０】
形質転換により、核酸が菌体に導入される。核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、その組み合わせであってもよい。核酸は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。核酸は、一本鎖ＤＮＡであってもよく、一本鎖ＲＮＡであってもよい。核酸は、二本鎖ＤＮＡであってもよく、二本鎖ＲＮＡであってもよく、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖からなる二本鎖であってもよい。核酸は、一本鎖の領域と二本鎖の領域の両方を含んでいてもよい。核酸は、単一の鎖中に、ＤＮＡ残基とＲＮＡ残基の両方を含んでいてもよい。核酸は、環状の核酸であってもよく、線状の核酸であってもよい。核酸の態様は、形質転換の目的等の諸条件に応じて適宜選択できる。
【００３１】
核酸は、例えば、ラビリンチュラ類微生物の染色体の改変に用いられてよい。具体的には、例えば、核酸とラビリンチュラ類微生物の染色体との間で相同組み換えが起こってよい。核酸とラビリンチュラ類微生物の染色体との間での相同組み換えにより、該染色体を改変することができる。すなわち、核酸は、例えば、核酸とラビリンチュラ類微生物の染色体との間で相同組み換えが起こるように構成することができる。そのように構成された核酸としては、任意の塩基配列を含む線状ＤＮＡであって、当該任意の塩基配列の両端に染色体上の置換対象部位の上流および下流の塩基配列をそれぞれ備える線状ＤＮＡが挙げられる。当該線状ＤＮＡを菌体に導入することにより、染色体上の置換対象部位の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こすことができ、以て、当該置換対象部位を当該任意の塩基配列に置換することができる。当該置換対象部位と当該任意の塩基配列の組み合わせは、形質転換の目的等の諸条件に応じて適宜選択できる。当該任意の塩基配列としては、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を含む塩基配列を用いることができる。
【００３２】
形質転換により、具体的には相同組み換えにより、例えば、ラビリンチュラ類微生物の染色体上の遺伝子を破壊することができる。「遺伝子が破壊される」とは、正常に機能するタンパク質を産生しないように同遺伝子が改変されることを意味する。「正常に機能するタンパク質を産生しない」ことには、同遺伝子からタンパク質が全く産生されない場合や、同遺伝子から分子当たりの機能（活性や性質）が低下又は消失したタンパク質が産生される場合が包含される。
【００３３】
遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子を欠失（欠損）させることにより達成できる。「遺伝子の欠失」とは、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域の欠失をいう。さらには、染色体上の遺伝子のコード領域の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。遺伝子のコード領域の前後の配列には、例えば、遺伝子の発現調節配列が含まれてよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域（タンパク質のＮ末端側をコードする領域）、内部領域、Ｃ末端領域（タンパク質のＣ末端側をコードする領域）等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。欠失させる領域は、例えば、遺伝子のコード領域全長の１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の長さの領域であってよい。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。リーディングフレームの不一致により、欠失させる領域の下流でフレームシフトが生じ
得る。
【００３４】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドン（ナンセンス変異）を導入すること、または１〜２塩基の付加または欠失（フレームシフト変異）を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。
【００３５】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の塩基配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する塩基配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。リーディングフレームの不一致により、挿入部位の下流でフレームシフトが生じ得る。他の塩基配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
【００３６】
遺伝子の破壊は、特に、コードされるタンパク質のアミノ酸配列が欠失（欠損）するように実施してよい。言い換えると、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、タンパク質のアミノ酸配列（アミノ酸配列の一部または全部の領域）を欠失させることにより、具体的には、アミノ酸配列（アミノ酸配列の一部または全部の領域）を欠失したタンパク質をコードするように遺伝子を改変することにより、達成できる。なお、「タンパク質のアミノ酸配列の欠失」とは、タンパク質のアミノ酸配列の一部または全部の領域の欠失をいう。また、「タンパク質のアミノ酸配列の欠失」とは、タンパク質において元のアミノ酸配列が存在しなくなることをいい、元のアミノ酸配列が別のアミノ酸配列に変化する場合も包含される。すなわち、例えば、フレームシフトにより別のアミノ酸配列に変化した領域は、欠失した領域とみなしてよい。タンパク質のアミノ酸配列の欠失により、典型的にはタンパク質の全長が短縮されるが、タンパク質の全長が変化しないか、あるいは延長される場合もあり得る。例えば、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域の欠失により、コードされるタンパク質のアミノ酸配列において、当該欠失した領域がコードする領域を欠失させることができる。また、例えば、遺伝子のコード領域への終止コドンの導入により、コードされるタンパク質のアミノ酸配列において、当該導入部位より下流の領域がコードする領域を欠失させることができる。また、例えば、遺伝子のコード領域におけるフレームシフトにより、当該フレームシフト部位がコードする領域を欠失させることができる。アミノ酸配列の欠失における欠失させる領域の位置および長さについては、遺伝子の欠失における欠失させる領域の位置および長さの説明を準用できる。
【００３７】
遺伝子の破壊は、染色体上の遺伝子（野生型遺伝子）を正常に機能するタンパク質を産生しない破壊型遺伝子で置換することにより達成できる。具体的には、例えば、破壊型遺伝子を含む線状ＤＮＡであって、破壊型遺伝子の両端に染色体上の野生型遺伝子の上流および下流の塩基配列をそれぞれ備える線状ＤＮＡを菌体に導入することにより、染色体上の野生型遺伝子の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こすことができ、以て、野生型遺伝子を破壊型遺伝子に置換することができる。破壊型遺伝子としては、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域を欠失した遺伝子、ミスセンス変異を導入した遺伝子、ナンセンス変異を導入した遺伝子、フレームシフト変異を導入した遺伝子、トランスポゾンやマーカー遺伝子等の挿入配列を挿入した遺伝子、それらの組み合わせの改変を含む遺伝子が挙げられる。破壊型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。
【００３８】
相同組み換えは、その他、染色体の任意の改変に利用できる。例えば、染色体上の遺伝子の発現調節配列の改変により、該遺伝子の発現を増強または弱化することができる。また、例えば、染色体上に遺伝子を導入することにより、該遺伝子のコピー数を増大させることができ、以て、該遺伝子の発現を増強することができる。
【００３９】
染色体が改変されたことは、改変の内容に応じて、適宜確認できる。例えば、遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。また、遺伝子が破壊されたことは、同遺伝子の発現量、同遺伝子がコードするタンパク質の量、または同遺伝子がコードするタンパク質の活性を測定することでも確認できる。
【００４０】
形質転換の後、適宜、菌体を培養し、形質転換体（形質転換されたラビリンチュラ類微生物）を選抜することができる。選抜は、例えば、形質転換体が有する抗生物質耐性遺伝子等のマーカーを指標として実施することができる。
【００４１】
得られた形質転換体の用途は特に制限されない。形質転換体は、例えば、ステロール等の目的物質の生産に利用できる。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
【００４３】
〔実施例１〕ラビリンチュラのステロール蓄積株の取得
沖縄県の川の水を含んだ葉の腐敗物のサンプルを採取した。サンプルに松の花粉（宮崎県で採取）を適量添加し、室温で８日間静置した。0.5×人工海水で調製した0.1×ライヒマニ保存用培地（ニッスイ）に終濃度がそれぞれ50mg/LとなるようにペニシリンGカルシ
ウムやストレプトマイシン硫酸塩を加え、さらに終濃度がそれぞれ2mg/L、0.01mg/L、0.01mg/LとなるようにビタミンB1（ナカライ）、ビタミンB2（ナカライ）、及びビタミンB12（ナカライ）を加えた培地のプレートに、前記静置後のサンプルを100μl播種した。各々のプレートを、28℃で4日間培養し、得られたコロニーを同培地で画線分離し、コロニー
の純化を実施した。このようにして取得した株をAJ7869株と命名した。尚、1×ライヒマ
ニ保存用培地（ニッスイ）と1×人工海水の組成は以下のとおりである。
【００４４】
＜1×ライヒマニ保存用培地（ニッスイ）の組成＞
酵母エキス             8.5 g
ペプトン               8.5 g
グルコース            11 g
リン酸二水素カリウム   2.0 g
トマトジュース末       3.7 g
ポリソルベート80       1.0 g
寒天                  15 g
超純水              1000 ml
【００４５】
＜1×人工海水の組成＞
NaCl                   30 g
KCl                     0.7 g
MgCl2・6H2O            10.8 g
MgSO4・7H2O             5.4 g
CaCl2・2H2O             1 g
超純水               1000 ml
【００４６】
〔実施例２〕ステロール蓄積株の18S rDNA解析
上記のようにして単離されたAJ7869株について、ラビリンチュラの18S rDNA領域増幅用ユニバーサルプライマー（配列番号１、２）を用いて、18S rDNA領域の塩基配列を決定した。その18S rDNA領域の塩基配列を、配列番号３に示す。AJ7869株の18S rDNAは、Aurantiochytrium sp. BURABG162株（配列番号４）、Aurantiochytrium sp. SKE217株（配列番
号５）、及びAurantiochytrium sp. SKE218株（配列番号６）の18S rDNAの塩基配列とそ
れぞれ99%、98%、及び99%の高い同一性を示した。上記の3株は上田らの報告でAurantiochytrium sp.1に属することが報告されている（Mayumi Ueda, et al., Seasonal dynamics of culturable thraustochytrids (Labyrinthulomycetes, Stramenopile) in estuarine and coastal waters., Aquatic Microbial Ecology. 2015 ;74:187-204）。この結果、AJ7869株はAurantiochytrium sp.1と類縁関係にあることが明らかになったため、同株をAurantiochytrium sp.1 AJ7869株と命名した。
【００４７】
〔実施例３〕相同組換え効率に対する培養時の海水濃度の影響の評価
AJ7869株を親株として、以下の手順で、smt1遺伝子（配列番号７）の破壊株を構築し、相同組換え効率に対する培養時の海水濃度の影響を評価した。smt1遺伝子は、ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼ（Ssterol 24-C-methyltransferase；「SMT1」ともいう）をコードする遺伝子である。SMT1は、ステロールのＣ２４位にメチル基を導入する酵素である（EC 2.1.1.41）。SMT1は、ステロールの生合成に関与する酵素の１つであり
、具体的には、植物ステロールおよび真菌ステロールの生合成に関与する。
【００４８】
AJ7869株を、0.5×人工海水で調製した0.2×ライヒマニ保存用培地（ニッスイ）に終濃度がそれぞれ2mg/L、0.01mg/L、0.01mg/LとなるようにビタミンB1（ナカライ）、ビタミ
ンB2（ナカライ）、及びビタミンB12（ナカライ）を加えた培地のプレートに播種し、28.5℃で60時間培養した。そのプレート培地上の細胞を1白金耳分掻き取り、下記組成の0.1
、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、および0.7×人工海水でそれぞれ調製した希釈GY培地10mLを入れた50ml容量バッフル付の三角フラスコに植菌し、培養温度28.5℃、撹拌120rpm（ロータリー）にて、45時間培養を行った。菌体を回収して滅菌水で洗浄および懸濁し、エレクトロポレーション用の菌体とした。
【００４９】
＜希釈GY培地の組成＞
（Ａ区）
グルコース             6 g/L
（Ｂ区）
酵母エキス             2 g/L
（Ｃ区）
ビタミンB1             2 mg/L
ビタミンB2             0.01 mg/L
ビタミンB12            0.01 mg/L
（Ｄ区）
MES                    8.79 g/L
Ｂ区はHClを用いてpH6.0に調整した後、A区はpH無調整にて、それぞれ120℃で10分オートクレーブした。D区はNaOHを用いてpH6.0に調整した後、C区はpH無調整にて、それぞれ
フィルター濾過を行った。A区とB区を室温に冷却後、４区を混合した。
【００５０】
AJ7869株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号８と９のプライマーを用いてＰＣＲを行い、smt1遺伝子の上流領域を含むＤＮＡ断片を増幅した。AJ7869株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１０と１１のプライマーを用いてＰＣＲを行い、smt1遺伝子の下流領域を含むＤＮＡ断片を増幅した。ネオマイシン耐性遺伝子発現カセット（Keishi Sakaguchi, et al., Versatile Transformation system that is Applicable to both multiple 
transgene expression and gene targeting for thraustochytrids., Applied and Environmental Microbiology. 2012 ;78(9):3193-3202.）を鋳型として、配列番号１２と１３
のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。プラスミドpUC19を鋳型として、配列番号１４と１５のプライマーを用いてＰ
ＣＲを行い、pUC19の直鎖ＤＮＡ断片を増幅した。それらＤＮＡ断片をIn-fusion（タカラ社）を用いて結合させ、得られたプラスミドをpUC19smt1-Neoと名付けた。pUC19smt1-neoを鋳型として配列番号１６と１７のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ネオマイシン耐性遺伝子が挿入されたsmt1遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。当該ＤＮＡ断片をエレクトロポレーション法（Keishi Sakaguchi, et al., Versatile Transformation system that is Applicable to both multiple transgene expression and gene targeting for thraustochytrids., Applied and Environmental Microbiology. 2012 ;78(9):3193-3202）でAJ7869株に導入した。
【００５１】
出現したネオマイシン耐性株のコロニーをランダムに選抜し、KOD-FX（Takara社）と配列番号１８と１９のプライマーを用いてPCRを行った。増幅産物をアガロースゲル電気泳
動で分離して相同組み換えの成否（すなわちsmt1遺伝子へのネオマイシン耐性遺伝子の挿入の成否）を確認し、相同組み換え効率を算出した。結果を表１に示す。0.4〜0.7×人工海水で調製した培地で培養した場合よりも、0.1〜0.3×人工海水で調製した培地で培養した場合に、相同組換え効率が増加した。
【００５２】
【表１】
2019071859.tif 000002
【００５３】
〔実施例４〕相同組換え効率に対する培養時間の影響の評価
AJ7869株を親株として、以下の手順で、smt1遺伝子（配列番号７）の破壊株を構築し、相同組換え効率に対する培養時間の影響を評価した。
【００５４】
AJ7869株を、0.5×人工海水で調製した0.2×ライヒマニ保存用培地（ニッスイ）に終濃度がそれぞれ2mg/L、0.01mg/L、0.01mg/LとなるようにビタミンB1（ナカライ）、ビタミ
ンB2（ナカライ）、及びビタミンB12（ナカライ）を加えた培地のプレートに播種し、28.5℃で60時間培養した。そのプレート培地上の細胞を1白金耳分掻き取り、下記組成の0.25×人工海水で調製した希釈GY培地10mLを入れた50ml容量バッフル付の三角フラスコに植菌し、培養温度28.5℃、撹拌120rpm（ロータリー）にて、10、16、20、25、及び40時間培養を行った。菌体を回収して滅菌水で洗浄および懸濁し、エレクトロポレーション用の菌体とした。
【００５５】
実施例３で構築したpUC19smt1-neoを鋳型として配列番号１６と１７のプライマーを用
いてＰＣＲを行い、ネオマイシン耐性遺伝子が挿入されたsmt1遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。当該ＤＮＡ断片をエレクトロポレーション法（Keishi Sakaguchi, et al., Versatile Transformation system that is Applicable to both multiple transgene expression and gene targeting for thraustochytrids., Applied and Environmental Microbiology. 2012 ;78(9):3193-3202）でAJ7869株に導入した。
【００５６】
出現したネオマイシン耐性株のコロニーをランダムに選抜し、KOD-FX（Takara社）と配列番号１８と１９のプライマーを用いてPCRを行った。増幅産物をアガロースゲル電気泳
動で分離して相同組み換えの成否（すなわちsmt1遺伝子へのネオマイシン耐性遺伝子の挿
入の成否）を確認し、相同組み換え効率を算出した。結果を表２に示す。培養10時間では相同組換えが確認されなかったが、培養16時間以上で相同組み換えが確認され、特に培養25時間以上でその効率が増加した。
【００５７】
【表２】
2019071859.tif 000003
【００５８】
＜配列表の説明＞
配列番号１〜２：プライマー
配列番号３：Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株の18S rDNA領域の塩基配列
配列番号４：Aurantiochytrium sp.1 BURABG162株の18S rDNA領域の塩基配列
配列番号５：Aurantiochytrium sp.1 SKE217株の18S rDNA領域の塩基配列
配列番号６：Aurantiochytrium sp.1 SKE218株の18S rDNA領域の塩基配列
配列番号７：Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株のSMT1遺伝子の塩基配列
配列番号８〜１９：プライマー
【配列表】
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