(57)【要約】【課題】グルコースセンサー用のＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを提供すること。【解決手段】本発明は、特定の位置のアミノ酸残基がリシン以外のアミノ酸残基に置換されたＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ変異体、およびこれを有するグルコースセンサーを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）変異体であって、当該ＦＡＤ−ＧＤＨ変異体の由来する野生型ＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列においてリシン残基である位置のうち７つ以上の位置のアミノ酸が、リシン以外のアミノ酸残基に置換されている、ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）変異体、又は
ＦＡＤ−ＧＤＨ変異体であって、当該ＦＡＤ−ＧＤＨ変異体の全長アミノ酸配列中の合計リシン残基数が、当該ＦＡＤ−ＧＤＨ変異体の由来する野生型ＦＡＤ−ＧＤＨの全長アミノ酸配列中の合計リシン残基数と比較して、リシン残基数が７以上少ない、ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）変異体。
【請求項２】
ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）変異体であって、配列番号１の５４位、１２９位、１４９位、１５２位、１５３位、１７３位、１７８位、１７９位、２６７位、２７４位、２８６位、２８９位、２９３位、３０９位、３１９位、３８０位、４０９位、４１４位、４３８位、４３９位、４７６位、５２５位、５８０位、６２４位、６３０位、６３４位及び６３８位に対応する位置からなる群より選択される位置のうち、当該ＦＡＤ−ＧＤＨ変異体の由来する野生型のＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列においてリシン残基である位置のうちの７つ以上の位置のアミノ酸が、リシン以外のアミノ酸に置換されている、ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）変異体。
【請求項３】
置換される位置が、配列番号１の５４位、１２９位、１５２位、１５３位、１７８位、１７９位、２８６位、４０９位、４１４位、５８０位、及び６３０位に対応する位置からなる群より選択される、請求項２に記載のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体。
【請求項４】
前記位置のうち、１１以上の位置のアミノ酸がリシン以外のアミノ酸残基に置換されている、請求項２又は３に記載のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体。
【請求項５】
前記位置のうち、２１以上の位置のアミノ酸がリシン以外のアミノ酸残基に置換されている、請求項２に記載のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体。
【請求項６】
ＦＡＤ−ＧＤＨ変異体が、配列番号１と７５％以上のアミノ酸配列同一性を有するＦＡＤ−ＧＤＨ、配列番号３と７５％以上のアミノ酸配列同一性を有するＦＡＤ−ＧＤＨ又は配列番号４と７５％以上のアミノ酸配列同一性を有するＦＡＤ−ＧＤＨ、及び、配列番号１４と７５％以上のアミノ酸配列同一性を有するＦＡＤ−ＧＤＨからなる群より選択されるものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体をコードするＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子。
【請求項８】
請求項７に記載のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を含むベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターが導入されている宿主細胞。
【請求項１０】
以下の工程を含むＦＡＤ−ＧＤＨを製造する方法：
請求項９に記載の宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞中に含まれるＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を発現させる工程、及び
前記培養物からＦＡＤ−ＧＤＨを単離する工程。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体を含むグルコースアッセイキット。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体を含む電極。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体を含むグルコースセンサー。
【請求項１４】
請求項１３に記載のグルコースセンサーを有する、持続血糖測定装置。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体、請求項１１に記載のキット、請求項１２に記載の電極、請求項１３に記載のセンサー、又は請求項１４に記載の装置を用いるグルコース測定方法。
【請求項１６】
グルコース測定が持続血糖測定装置による測定である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコースデヒドロゲナーゼの変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
血中グルコース濃度（血糖値）は、糖尿病の重要なマーカーである。グルコースの検出には種々の方法が用いられるが、中でもグルコースセンサーを用いた方法が着目されている。グルコースセンサーに用いる酵素としては、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱ−ＧＤＨ）、或いはＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）等が挙げられる。持続血糖測定装置やバイオ燃料電池におけるセンサーでは通常、酵素は固定化されて使用される。
【０００３】
ＧＯＤはグルコースを酸化する際に、酸素を電子受容体とする。これは測定サンプル中に存在する溶存酸素の影響を受けうる。ＰＱＱ−ＧＤＨは、マルトースなど他の基質も認識しうる。これは測定誤差の原因ともなりうる。
【０００４】
特許文献１は、ムコール属由来のＧＤＨを開示している。非特許文献３はＭｕｃｏｒ  ｐｒａｉｎｉｉ由来のＦＡＤ−ＧＤＨを開示している。
【０００５】
特許文献２は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ由来のＧＤＨを開示している。開示されているＧＤＨは膜結合性タンパク質であり、シトクロムドメインを有する。Ｂ．  ｃｅｐａｃｉａ由来のＧＤＨのアミノ酸配列はムコール属由来のＦＡＤ依存性ＧＤＨと類似していない。Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ由来のＧＤＨを用いたグルコース検出デバイスの構築が検討されている（非特許文献２）。
【０００６】
特許文献３はＭｕｃｏｒ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ  （ＭｇＧＤＨ）由来のＧＤＨを開示している。特許文献４はＭｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ  （ＭｈＧＤＨ）  由来のＧＤＨを開示している。特許文献５はＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｓｉｍｐｌｅｘ由来のＣｓＧＤＨ及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｓｐ．由来のＣＲＧＤＨを開示している。特許文献６はＭｕｃｏｒ  ＲＤ０５６８６０由来のＭｒｄＧＤＨを開示している。特許文献７はＭｕｃｏｒ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ由来のＭｓＧＤＨを開示している。特許文献８及び特許文献９は、それぞれ、Ｍ．  ｐｒａｉｎｉｉ由来のＧＤＨを開示している。
【０００７】
特許文献１０は、ビス活性化ポリエチレングリコールを架橋剤として使用し、グルコース脱水素酵素を架橋し高容量にて固定化する方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１５／０９９１１２号（ＵＳ２０１６／０３１９２４６）
【特許文献２】国際公開第２００２／０３６７７９号（ＵＳ２００４／００２３３３０）
【特許文献３】国際公開第２０１３／０５１６８２号
【特許文献４】特開２０１３−１１６１０２号
【特許文献５】国際公開第２０１３／０２２０７４号（ＵＳ２０１４／０１５４７７７）
【特許文献６】特開２０１３−１７６３６３号
【特許文献７】特開２０１３−１７６３６４号
【特許文献８】国際公開第２０１２／１６９５１２号（ＵＳ２０１４／０２８７４４５）
【特許文献９】国際公開第２０１５／１２９４７５号（ＥＰ３１１２４６１）
【特許文献１０】特表２０１７−５１２４７８（ＷＯ  ２０１５／１５０２６３）
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  Ｖｏｌ．  ２７８，  Ｎｏ．  ２７，  Ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ｊｕｌｙ  ４，  ｐｐ．  ２４３２４−２４３３３，  ２００３
【非特許文献２】Ｓｅｋｉｍｏｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，  ７６ｔｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｅｓｓｉｏｎｓ，  ２０１６，  ８８１−Ｐ−２０１６
【非特許文献３】Ｓａｔａｋｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２０１５  Ｎｏｖ；１２０（５）：４９８−５０３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、架橋反応に適したグルコースデヒドロゲナーゼを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、グルコースセンサー用のグルコースデヒドロゲナーゼについて種々の検討を行ったところ、架橋剤の種類、ｐＨや温度などの架橋反応条件、用いるタンパク質量といった要因以外にも、グルコースデヒドロゲナーゼそのものが特定の架橋反応において望まれる反応性を示さないことをつきとめ、すなわち重要な要因であることを見出した。そしてこの問題について鋭意研究した結果、架橋反応に適したＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの変異体を作製し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の実施形態を包含する。    
［１］  ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）変異体であって、当該ＦＡＤ−ＧＤＨ変異体の由来する野生型ＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列においてリシン残基である位置のうち７つ以上の位置のアミノ酸が、リシン以外のアミノ酸残基に置換されている、ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）変異体、又は
ＦＡＤ−ＧＤＨ変異体であって、当該ＦＡＤ−ＧＤＨ変異体の全長アミノ酸配列中の合計リシン残基数が、当該ＦＡＤ−ＧＤＨ変異体の由来する野生型ＦＡＤ−ＧＤＨの全長アミノ酸配列中の合計リシン残基数と比較して、リシン残基数が７以上少ない、ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）変異体。
［２］  ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）変異体であって、配列番号１の５４位、１２９位、１４９位、１５２位、１５３位、１７３位、１７８位、１７９位、２６７位、２７４位、２８６位、２８９位、２９３位、３０９位、３１９位、３８０位、４０９位、４１４位、４３８位、４３９位、４７６位、５２５位、５８０位、６２４位、６３０位、６３４位及び６３８位に対応する位置からなる群より選択される位置のうち、当該ＦＡＤ−ＧＤＨ変異体の由来する野生型のＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列においてリシン残基である位置のうちの７つ以上の位置のアミノ酸が、リシン以外のアミノ酸に置換されている、ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）変異体。
［３］  置換される位置が、配列番号１の５４位、１２９位、１５２位、１５３位、１７８位、１７９位、２８６位、４０９位、４１４位、５８０位、及び６３０位に対応する位置からなる群より選択される、２に記載のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体。
［４］  前記位置のうち、１１以上の位置のアミノ酸がリシン以外のアミノ酸残基に置換されている、２又は３に記載のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体。
［５］  前記位置のうち、２１以上の位置のアミノ酸がリシン以外のアミノ酸残基に置換されている、２に記載のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体。
［６］  ＦＡＤ−ＧＤＨ変異体が、配列番号１と７５％以上のアミノ酸配列同一性を有するＦＡＤ−ＧＤＨ、配列番号３と７５％以上のアミノ酸配列同一性を有するＦＡＤ−ＧＤＨ又は配列番号４と７５％以上のアミノ酸配列同一性を有するＦＡＤ−ＧＤＨ、及び、配列番号１４と７５％以上のアミノ酸配列同一性を有するＦＡＤ−ＧＤＨからなる群より選択されるものである、１〜５のいずれかに記載のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体。
［７］  １〜６のいずれかに記載のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体をコードするＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子。
［８］  ７に記載のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を含むベクター。
［９］  ８に記載のベクターが導入されている宿主細胞。
［１０］  以下の工程を含むＦＡＤ−ＧＤＨを製造する方法：
９に記載の宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞中に含まれるＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を発現させる工程、及び
前記培養物からＦＡＤ−ＧＤＨを単離する工程。
［１１］  １〜６のいずれかに記載のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体を含むグルコースアッセイキット。
［１２］  １〜６のいずれかに記載のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体を含む電極。
［１３］  １〜６のいずれか１項に記載のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体を含むグルコースセンサー。
［１４］  １３に記載のグルコースセンサーを有する、持続血糖測定装置。
［１５］  １〜６のいずれかに記載のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体、１１に記載のキット、１２に記載の電極、１３に記載のセンサー、又は１４に記載の装置を用いるグルコース測定方法。
［１６］  グルコース測定が持続血糖測定装置による測定である、１５に記載の方法。
【００１３】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１７−２００５２１号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、架橋反応に適したＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ変異体が提供される。これは例えば固定化してグルコースセンサーに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１−１】各種由来のＧＤＨのマルチプルアライメントを示す。ＭｐＧＤＨはＭｕｃｏｒ  ｐｒａｉｎｉｉ由来ＧＤＨ（配列番号１）であり、ＭｈＧＤＨはＭｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ由来ＧＤＨ（配列番号３）であり、ＭｒｄＧＤＨはＭｕｃｏｒ  ＲＤ０５６８６０由来ＧＤＨ（配列番号４）であり、ＭｓＧＤＨはＭｕｃｏｒ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ由来ＧＤＨ（配列番号５）であり、ＭｇＧＤＨはＭｕｃｏｒ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ由来ＧＤＨ（配列番号６）であり、ＣｓＧＤＨはＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｓｉｍｐｌｅｘ由来ＧＤＨ（配列番号７）であり、ＣｒＧＤＨはＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ属由来ＧＤＨ（配列番号８）であり、ＭｃＧＤＨはＭｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ由来ＧＤＨ（配列番号９）である。
【図１−２】図１−１のつづきである。
【図１−３】図１−２のつづきである。
【図１−４】図１−３のつづきである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（ＦＡＤ−ＧＤＨの作用原理および活性測定法）
ＦＡＤ−ＧＤＨは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。
【００１７】
ＦＡＤ−ＧＤＨの活性は、この作用原理を利用し、例えば、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）および２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を用いた以下の系を用いて測定することができる。
（反応１）  Ｄ−グルコ−ス  ＋  ＰＭＳ（酸化型）
→  Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン  ＋  ＰＭＳ（還元型）
（反応２）  ＰＭＳ（還元型）  ＋  ＤＣＩＰ（酸化型）
→  ＰＭＳ（酸化型）  ＋  ＤＣＩＰ（還元型）
【００１８】
（反応１）において、グルコースの酸化に伴い、ＰＭＳ（還元型）が生成する。続いて進行する（反応２）により、ＰＭＳ（還元型）が酸化されるのに伴ってＤＣＩＰが還元される。この「ＤＣＩＰ（酸化型）」の消失度合を波長６００ｎｍにおける吸光度の変化量として検知し、この変化量に基づいて酵素活性を求めることができる。
【００１９】
ＦＡＤ−ＧＤＨの活性は、以下の手順に従って測定する。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）  ２．０５ｍＬ、１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液  ０．６ｍＬおよび２ｍＭ  ＤＣＩＰ溶液  ０．１５ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温する。次いで、１５ｍＭ  ＰＭＳ溶液  ０．１ｍＬおよび酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始する。反応開始時、および経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を求め、次式に従いＧＤＨ活性を算出する。この際、ＧＤＨ活性は、３７℃において濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。
【００２０】
【数１】
2019071880.tif 000002
【００２１】
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは酵素の希釈に用いた緩衝液を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍数を表す。
【００２２】
（ＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列）
ＦＡＤ−ＧＤＨは、配列番号１、３、４、１４、１６若しくは配列番号１８、２７で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と同一性の高い、例えば７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上同一なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個（例えば１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個又は２個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものであり得る。
【００２３】
天然のＦＡＤ−ＧＤＨや、それに由来する改変ＦＡＤ−ＧＤＨは、通常、アミノ酸配列中に複数のリシン残基を有する。特定の架橋剤は、タンパク質のリシン残基と反応する。したがって、ある実施形態において、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体は、そのアミノ酸配列中の、置換前にリシン残基であった残基が、置換後にリシン以外のアミノ酸残基、例えばアルギニン、アスパラギン、フェニルアラニン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン、プロリン、セリン、スレオニン、メチオニン、システイン、又はヒスチジンに置換されていてもよい。好ましくは、アルギニン、アスパラギン、フェニルアラニン、又はグルタミンに置換されていてもよい。置換残基数は、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、例えば７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、例えば１２以上、例えば２２以上であり得る。これにより、該架橋剤と反応しうるリシン残基の数が低減され、したがって単位タンパク質当たりの架橋剤との反応可能箇所が低減される。これによりＦＡＤ−ＧＤＨ変異体の架橋特性を改変することができる。ある実施形態において、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体は、未変異のＦＡＤ−ＧＤＨと比較して、架橋剤との反応性が低減されている。ある実施形態において、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体は、未変異のＦＡＤ−ＧＤＨと比較して、架橋剤と反応したときに生じる多量体（２量体、３量体、・・・ｎ量体、ただしｎは自然数）が増大している。別の実施形態において、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体は、未変異のＦＡＤ−ＧＤＨと比較して、架橋剤と反応したときに生じる多量体（２量体、３量体、・・・ｎ量体）が低減されている。
【００２４】
酵素の固定化には、大きく分けて、１）担体結合法、２）架橋法、３）包括法が挙げられる。例えば固定化酵素と固定化微生物の利用、有機合成化学第３２巻第４号（１９７４年）２８６−２９６頁を参照のこと。２）架橋法では、分子内に２以上の反応性官能基を有する架橋剤が使用され、これで複数の酵素を架橋する。酵素内に、架橋可能な部位が多いと、分子間架橋（酵素−架橋剤−酵素が生じる）ではなく、分子内架橋が生じうる（例えば酵素＝架橋剤が生じ得る。ここで「＝」は、異なるアミノ酸残基での架橋剤との２つの結合を示す）。ある実施形態において、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体は、アミノ酸配列中の、置換前にリシン残基であった１以上の残基が、置換後にリシン以外のアミノ酸残基に置換されている。これにより、単位タンパク質当たりの架橋剤との反応可能箇所が低減され、望ましくない分子内架橋を低減しうる。分子内架橋は特に、２以上の架橋可能な部位（例えばリシン残基）が立体的に近接している場合に生じうる。したがってある実施形態において、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体は、立体的に近接している可能性のある２つの架橋可能な部位（例えばリシン残基）がある場合、そのいずれか一方または両方が置換されていてもよい。
【００２５】
図１に各種由来のＧＤＨのアミノ酸配列を示す。ここから、アミノ酸配列中のリシン残基を特定することができ、またリシン以外の残基を特定することができる。
【００２６】
ＭｐＧＤＨのリシンの位置及びそれに対応する位置
ある実施形態において、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体は、配列番号１又は１４のアミノ酸配列に基づくもの、またはこれと同一性の高い、例えば７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上同一なアミノ酸配列に基づくもの（ＭｐＧＤＨ等ともいう）であり得る。配列番号１の５４位、１２９位、１４９位、１５２位、１５３位、１７３位、１７８位、１７９位、２６７位、２７４位、２８６位、２８９位、２９３位、３０９位、３１９位、３８０位、４０９位、４１４位、４３８位、４３９位、４７６位、５２５位、５８０位、６２４位、６３０位、６３４位及び６３８位はリシンである。配列番号１４では、これらに加え、５５９位がリシンである。ＭｐＧＤＨ等に基づくＦＡＤ−ＧＤＨ変異体は、これらの位置又はこれらの位置に対応する位置が１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、例えば７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、２１以上、例えば２２以上、リシン以外のアミノ酸残基（例えばＲ、Ｎ、Ｆ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｗ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｃ、Ｈ）に置換されていてもよい。場合によりさらに配列番号１又は１４のアミノ酸配列における５５９位に対応する位置のアミノ酸が野生型配列においてリシンであるとき（例えば配列番号４、５、７、８が該当する）は、当該リシンは、本発明の変異体においてリシン以外のアミノ酸残基に置換されていてもよい。また、ＭｐＧＤＨ等に基づくＦＡＤ−ＧＤＨ変異体は、全長アミノ酸配列中の合計リシン残基数が２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６又は５となるようにリシン残基を置換し得る。
【００２７】
ＭｒｄＧＤＨのリシンの位置及びそれに対応する位置
ある実施形態において、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体は、配列番号４のアミノ酸配列に基づくもの、またはこれと同一性の高い、例えば７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上同一なアミノ酸配列に基づくもの（ＭｒｄＧＤＨ等ともいう）であり得る。配列番号４の５０位、６６位、１２５位、１４５位、１４８位、１４９位、１６９位、２７０位、２８３位、２８６位、２９０位、３０６位、３１６位、３７０位、３７７位、４０３位、４０６位、４１８位、４３５位、４３６位、４７２位、４７３位、５４６位、５５５位、５７７位、５８５位、５８７位、６３０位及び６３１位はリシンである。ＭｒｄＧＤＨ等に基づくＦＡＤ−ＧＤＨ変異体は、これらの位置又はこれらの位置に対応する位置が１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、例えば７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、２１以上、例えば２２以上、リシン以外のアミノ酸残基（例えばＲ、Ｎ、Ｆ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｗ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｃ、Ｈ）に置換されていてもよい。また、ＭｒｄＧＤＨ等に基づくＦＡＤ−ＧＤＨ変異体は、全長アミノ酸配列中の合計リシン残基数が、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、又は７となるようにリシン残基を置換し得る。
【００２８】
ＭｈＧＤＨのリシンの位置及びそれに対応する位置
ある実施形態において、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体は、配列番号３のアミノ酸配列に基づくもの、またはこれと同一性の高い、例えば７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上同一なアミノ酸配列に基づくもの（ＭｈＧＤＨ等ともいう）であり得る。配列番号３の２２位、５１位、１０７位、１２６位、１４６位、１４９位、１５０位、１５９位、１７０位、１７５位、２２７位、２４６位、２６２位、２６４位、２７１位、２８６位、２９０位、３０６位、３１６位、３７７位、４３５位、４３６位、４７０位、４７３位、５２２位、５５５位、６２１位、６２７位及び６３１位はリシンである。ＭｈＧＤＨ等に基づくＦＡＤ−ＧＤＨ変異体は、これらの位置又はこれらの位置に対応する位置が１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、例えば７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、２１以上、例えば２２以上、リシン以外のアミノ酸残基（例えばＲ、Ｎ、Ｆ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｗ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｃ、Ｈ）に置換されていてもよい。また、ＭｈＧＤＨ等に基づくＦＡＤ−ＧＤＨ変異体は、全長アミノ酸配列中の合計リシン残基数が、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、又は７となるようにリシン残基を置換し得る。
【００２９】
なお、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体を作製するに当たり、野生型ＦＡＤ−ＧＤＨから出発して、野生型配列においてリシンである位置をリシン以外のアミノ酸残基とした中間的変異体を作製し、当該中間的変異体の当該位置にさらに（リシン以外の別のアミノ酸への）アミノ酸置換を導入し、最終的なＦＡＤ−ＧＤＨ変異体の全長アミノ酸配列中の合計リシン残基数を低減することも可能である。この場合、重要となるのは、最終的なＦＡＤ−ＧＤＨ変異体の全長アミノ酸配列中の合計リシン残基数であって、中間的変異体のリシン残基数ではない。本明細書では、疑義が生じた場合、全長アミノ酸配列中の合計リシン残基数は、野生型（天然ＦＡＤ−ＧＤＨ）と、最終変異体とで比較するものとする。
【００３０】
ある実施形態において、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体は、アミノ酸置換の結果、当該変異体の由来する野生型と比較して、全長アミノ酸配列中の合計リシン残基数が１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、例えば７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、例えば２２以上少ない。
【００３１】
本明細書にいう、配列番号１のアミノ酸配列におけるある位置に「対応する位置」とは、配列番号１のアミノ酸配列と、他のアミノ酸配列とをアラインさせた場合に、そのアラインメントにおける同一の位置を意味する。他のアミノ酸配列としては、配列番号１と高いアミノ酸配列同一性（例えば７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、例えば９９％以上）を有するアミノ酸配列が挙げられる。なお、アミノ酸配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．１１（ゼネティックス社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、又はＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（日立ソフト社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。
【００３２】
上記の配列番号１のアミノ酸配列におけるある位置に「対応する位置」を特定する方法としては、例えば、リップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、ＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行うことができる。ＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、対応するアミノ酸残基の各ＦＡＤ−ＧＤＨ配列における配列中の位置を決めることが可能である。特にアミノ酸配列同一性が７５％以上のアミノ酸配列を比較する場合に決めることが可能である。対応する位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるＦＡＤ−ＧＤＨの保存安定性に関して類似した効果を有することが合理的に推定できる。なお、ＧＤＨによっては、アライメントの結果、特定のドメインやループが欠失している等により配列番号１の所定の位置に対応する位置が存在しない場合もあり得るが、そのような場合には当該対応する位置の存在ない位置はアミノ酸置換するに及ばず、対応する位置を決定できる他の位置にアミノ酸置換を導入すればよい。また対応する位置のアミノ酸が既にリシン以外のアミノ酸である場合には、当該位置は考慮から除くことができるか、またはリシン以外の別のアミノ酸に置換してもよい。
【００３３】
配列番号１のアミノ酸配列における所定の位置に対応する位置は、下記表のとおりである。
【００３４】
【表１】
2019071880.tif 000003
【００３５】
上記の表においてＭｐＧＤＨ（配列番号１）の５５９位はリシンではない。しかしながら、当該位置に対応する位置のアミノ酸が、野生型ＧＤＨにおいてリシンであるＧＤＨは複数種存在し（配列番号４、５、７、８等）、これらは配列番号１とアミノ酸配列同一性が高い。ある実施形態において、そのような野生型ＧＤＨに基づき本発明の変異体を作製する場合、配列番号１の５５９位に対応する位置のリシンを、リシン以外のアミノ酸に置換しうる。また、上記の表においてＭｐＧＤＨ（配列番号１）の６３８位に対応する位置のアミノ酸がリシンであるＧＤＨはＭｐＧＤＨ（配列番号１）のみである。しかしながら、天然のＧＤＨが見出され、それが配列番号１と高い配列同一性（例えば７５％以上、９０％以上、例えば９５％以上）を有し、かつ配列番号１の６３８位に対応する位置のアミノ酸がリシンであれば、当該リシンを本発明の変異体においてリシン以外のアミノ酸に置換し得る。上記の表に関し、ある野生型ＧＤＨの、配列番号１の特定の位置に対応する位置におけるアミノ酸がリシンでない場合（例えば配列番号８の２９２位）、当該アミノ酸は置換せずともよい。またはリシン以外のアミノ酸に置換してもよい。
【００３６】
また、ＦＡＤ−ＧＤＨには、熱安定性を向上させる変異、マルトースへの反応性を低減させる変異、温度依存性を改善させる変異や、ｐＨや特定の物質などへの耐性を向上させる変異のような変異、例えばそのような効果を奏する各種公知の変異を任意に組み合わせてもよい。
【００３７】
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体は、例えば、まず任意の方法で、配列番号１、３、又は４のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列をコードする遺伝子を入手し、当該配列の所定の位置に対応する位置におけるいずれかの位置にアミノ酸置換を導入することにより得ることもできる。配列番号５〜９についても同様である。
【００３８】
アミノ酸置換の導入方法としては、例えばランダムに変異を導入する方法あるいは想定した位置に部位特異的変異を導入する方法が挙げられる。前者としては、エラープローンＰＣＲ法（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１，１１−１５，（１９８９））や、増殖の際、プラスミドの複製にエラーを起こしやすく、改変を生じやすいＸＬ１−Ｒｅｄコンピテントセル（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いる方法等がある。また、後者として、目的タンパク質の結晶構造解析により立体構造を構築し、その情報をもとに目的の効果を付与すると予想されるアミノ酸を選択し、市販のＱｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等により部位特異的変異を導入する方法がある。あるいは、目的タンパク質と相同性の高い公知のタンパク質の立体構造を用いてモデリングを行い、目的の効果を付与すると予想されるアミノ酸を選択し、部位特異的変異を導入することもできる。
【００３９】
ＦＡＤ−ＧＤＨには、上記の同一性の範囲内で各種のバリエーションが想定されるが、各種ＦＡＤ−ＧＤＨの酵素科学的性質が本明細書に記載するＦＡＤ−ＧＤＨと同様である限り、それらは全て本発明に含まれ得る。
【００４０】
また、ＦＡＤ−ＧＤＨにおいて、アミノ酸配列が配列番号１、３、４、１４、１６、若しくは１８、２７又はこれと７５％以上、例えば８０％以上のアミノ酸配列同一性を有することが重要であり、それが天然から取得されたものか、人工合成による配列であるかを問わない。例えばＧＤＨは、発現宿主に応じてコドン最適化された遺伝子によりコードされるものであり得る。
【００４１】
（ＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子の取得）
ある実施形態において、ＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子は、例えば特許文献４又は６の開示に基づき取得することができる。これとアミノ酸配列同一性の高いＦＡＤ−ＧＤＨを取得するには、遺伝子工学的手法を利用することができる。ＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子（以下、ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子）を取得するには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法を用いればよい。ＦＡＤ−ＧＤＨを取得するには、ＦＡＤ−ＧＤＨ生産能を有する公知の微生物菌体や種々の細胞から、常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ＷＩＬＥＹ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡ又はｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
【００４２】
ついで、公知のＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列情報に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーから基質特異性の高いＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、基質特異性の高いＦＡＤ−ＧＤＨをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。
【００４３】
取得されたＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子に変異を導入し、各種の変異遺伝子から発現されるＦＡＤ−ＧＤＨの酵素科学的性質を指標に選択を行う方法を採用し得る。
出発物質であるＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；又は蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。  
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若しくは５−ブロモウラシル等を挙げることができる。
【００４４】
この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異をＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５〜１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０〜８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０〜１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、ｐ２４〜３０、１９８９年６月号）。
【００４５】
蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法  （Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３５０（１９８７）：Ｇｅｎｅ，３７，７３（１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，８７４９（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，８７６５（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１４，９６７９（１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，４８８（１９８５）：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７（１９８７））等が挙げられる。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社、ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の利用が挙げられる。
【００４６】
また、一般的なポリメラーゼチェインリアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）として知られる手法を用いることもできる（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１，１１（１９８９））。なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法又は酵素合成法により、直接所望のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を合成することもできる。
【００４７】
上記のような任意の方法により選択されたＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定又は確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）等を用いれば良い。
【００４８】
（ＦＡＤ−ＧＤＨの由来となる天然型ＦＡＤ−ＧＤＨの例）
ＦＡＤ−ＧＤＨは、他の公知のＦＡＤ−ＧＤＨより取得することもできる。公知のＦＡＤ−ＧＤＨの由来微生物の好適な例としては、ケカビ亜門、好ましくはケカビ綱、より好ましくはケカビ目、さらに好ましくはケカビ科に分類される微生物を挙げることができる。具体的には、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属、シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属由来のＦＡＤ−ＧＤＨ等が挙げられる。
【００４９】
Ｍｕｃｏｒ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ｍｕｃｏｒ  ｐｒａｉｎｉｉ、Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ、Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ  ｆ．  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｍｕｃｏｒ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ  ｆ．  ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ、Ｍｕｃｏｒ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ、Ｍｕｃｏｒ  ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｓ等が挙げられる。より具体的には、Ｍｕｃｏｒ  ｐｒａｉｎｉｉ、Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ、Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ  ｆ．  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｍｕｃｏｒ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ  ＮＢＲＣ９４０３、特許文献４に記載のＭｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ、Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ  ｆ．  ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ  ＮＢＲＣ６７５４、Ｍｕｃｏｒ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ  ＮＢＲＣ６３３８、特許文献６に記載のＭｕｃｏｒ  ＲＤ０５６８６０、Ｍｕｃｏｒ  ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｓ  ＮＢＲＣ５３９５等が挙げられる。Ａｂｓｉｄｉａ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ａｂｓｉｄｉａ  ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ、Ａｂｓｉｄｉａ  ｈｙａｌｏｓｐｏｒａを挙げることができる。より具体的には、特許文献５に記載のＡｂｓｉｄｉａ  ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ、Ａｂｓｉｄｉａ  ｈｙａｌｏｓｐｏｒａを挙げることができる。Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ  ｅｌｅｇａｎｓを挙げることができる。より具体的には、特許文献５に記載のＡｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ  ｅｌｅｇａｎｓを挙げることができる。Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｍｉｎｏｒ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｍｕｓｃａｅ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｒｉｇｉｄａ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｓｉｍｐｌｅｘ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｕｍｂｅｌｌａｔａを挙げることができる。より具体的には、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｍｉｎｏｒ  ＮＢＲＣ６４４８、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ  ＮＢＲＣ４４５３、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｍｕｓｃａｅ  ＮＢＲＣ６４１０、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｒｉｇｉｄａ  ＮＢＲＣ６４１１、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ＮＢＲＣ６４１２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｕｍｂｅｌｌａｔａ  ＮＢＲＣ４４５２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｕｍｂｅｌｌａｔａ  ＮＢＲＣ５８４２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ＲＤ０５５４２３及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ＲＤ０５５４２２を挙げることができる。なお、ＮＢＲＣ菌株およびＲＤ菌株はＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター）の保管菌株である。
【００５０】
（ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子が挿入されたベクターおよび宿主細胞）
上述のように得られたＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主細胞を常法により、形質転換又は形質導入をすることができる。
【００５１】
原核宿主細胞の一例としては、エシェリヒア属に属する微生物、例えば大腸菌Ｋ−１２株、エシェリヒア・コリーＢＬ２１（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５α、エシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００等（いずれもタカラバイオ社製）が挙げられる。それらを形質転換し、又は、それらに形質導入して、ＤＮＡが導入された宿主細胞（形質転換体）を得る。こうした宿主細胞に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主細胞がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えＤＮＡの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えばＥＣＯＳ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  エシェリヒア・コリーＢＬ２１（ＤＥ３）；ニッポンジーン製）を用いても良い。
【００５２】
真核宿主細胞の一例としては、酵母が挙げられる。酵母に分類される微生物としては、例えば、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属する酵母が挙げられる。挿入遺伝子には、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１のような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子等が挙げられる。また、挿入遺伝子は、宿主細胞中で目的遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列（例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター等が挙げられる。酵母への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、酢酸リチウムを用いる方法（ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５，  ２５５−２６９（１９９５））やエレクトロポレーション（Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５５  （２００３）４８１−４８４）等を好適に用いることができるが、これに限定されず、スフェロプラスト法やガラスビーズ法等を含む各種任意の手法を用いて形質転換を行えばよい。
【００５３】
また、例えば、真核宿主細胞の他の例としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属やトリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属のようなカビ細胞が挙げられる。カビ細胞の形質転換体の作製方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、ＧＤＨをコードする遺伝子が発現する態様で宿主糸状菌に挿入する方法が挙げられる。具体的には、ＧＤＨをコードする遺伝子を発現誘導プロモーター及びターミネーターの間に挿入したＤＮＡコンストラクトを作製し、次いでＧＤＨをコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトで宿主糸状菌を形質転換することにより、ＧＤＨをコードする遺伝子を過剰発現する形質転換体が得られる。本明細書では、宿主糸状菌を形質転換するために作製された、発現誘導プロモーター−ＧＤＨをコードする遺伝子−ターミネーターからなるＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を含む組換えベクターをＤＮＡコンストラクトと総称してよぶ。
【００５４】
ＧＤＨをコードする遺伝子が発現する態様で宿主糸状菌に挿入する方法は特に限定されないが、例えば、相同組換えを利用することにより宿主生物の染色体上に直接的に挿入する手法；プラスミドベクター上に連結することにより宿主糸状菌内に導入する手法などが挙げられる。
【００５５】
相同組換えを利用する方法では、染色体上の組換え部位の上流領域及び下流領域と相同な配列の間に、ＤＮＡコンストラクトを連結し、宿主糸状菌のゲノム中に挿入することができる。自身の高発現プロモーター制御下で宿主糸状菌内で過剰発現することにより、セルフクローニングによる形質転換体を得ることができる。高発現プロモーターは特に限定されないが、例えば、翻訳伸長因子であるＴＥＦ１遺伝子（ｔｅｆ１）のプロモーター領域、α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）のプロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ）プロモーター領域などが挙げられる。
【００５６】
ベクターを利用する方法では、ＤＮＡコンストラクトを、常法により、糸状菌の形質転換に用いられるプラスミドベクターに組み込み、対応する宿主糸状菌を常法により形質転換することができる。
【００５７】
そのような、好適なベクター−宿主系としては、宿主糸状菌中でＧＤＨを生産させ得る系であれば特に限定されず、例えば、ｐＵＣ１９及び糸状菌の系、ｐＳＴＡ１４（Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２１８，  ９９−１０４，  １９８９）及び糸状菌の系などが挙げられる。
【００５８】
ＤＮＡコンストラクトは宿主糸状菌の染色体に導入して用いることが好ましいが、この他の方法として、自律複製型のベクター（Ｏｚｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５９，  １１３３  （１９９５））にＤＮＡコンストラクトを組み込むことにより、染色体に導入しない形で用いることもできる。
【００５９】
ＤＮＡコンストラクトには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は特に限定されず、例えば、ｐｙｒＧ、ｎｉａＤ、ａｄｅＡのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子；ピリチアミン、ハイグロマイシンＢオリゴマイシンなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、ＤＮＡコンストラクトは、宿主細胞中でＧＤＨをコードする遺伝子を過剰発現することを可能にするプロモーター、ターミネーターその他の制御配列（例えば、エンハンサー、ポリアデニル化配列など）を含むことが好ましい。プロモーターは特に限定されないが、適当な発現誘導プロモーターや構成的プロモーターが挙げられ、例えば、ｔｅｆ１プロモーター、ａｌｐプロモーター、ａｍｙプロモーターなどが挙げられる。ターミネーターもまた特に限定されないが、例えば、ａｌｐターミネーター、ａｍｙターミネーター、ｔｅｆ１ターミネーターなどが挙げられる。
【００６０】
ＤＮＡコンストラクトにおいて、ＧＤＨをコードする遺伝子の発現制御配列は、挿入するＧＤＨをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が、発現制御機能を有している配列を含む場合は必ずしも必要ではない。また、共形質転換法により形質転換を行う場合には、ＤＮＡコンストラクトはマーカー遺伝子を有しなくてもよい場合がある。
【００６１】
ＤＮＡコンストラクトの一実施態様は、例えば、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅに、ｔｅｆ１遺伝子プロモーター、ＧＤＨをコードする遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター及びｐｙｒＧマーカー遺伝子を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
【００６２】
糸状菌への形質転換方法としては、当業者に知られる方法を適宜選択することができ、例えば、宿主糸状菌のプロトプラストを調製した後に、ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるプロトプラストＰＥＧ法（例えば、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２１８，  ９９−１０４，  １９８９、特開２００７−２２２０５５号公報などを参照）を用いることができる。形質転換糸状菌を再生させるための培地は、用いる宿主糸状菌と形質転換マーカー遺伝子とに応じて適切なものを用いる。例えば、宿主糸状菌としてアスペルギルス・ソーヤを用い、形質転換マーカー遺伝子としてｐｙｒＧ遺伝子を用いた場合は、形質転換糸状菌の再生は、例えば、０．５％寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社）で行うことができる。
【００６３】
また、例えば、本発明の形質転換糸状菌を得るために、相同組換えを利用して、宿主糸状菌が本来染色体上に有するＧＤＨをコードする遺伝子のプロモーターをｔｅｆ１などの高発現プロモーターへ置換してもよい。この際も、高発現プロモーターに加えて、ｐｙｒＧなどの形質転換マーカー遺伝子を挿入することが好ましい。例えば、この目的のために、特開２０１１−２３９６８１に記載の実施例１や図１を参照して、ＧＤＨをコードする遺伝子の上流領域−形質転換マーカー遺伝子−高発現プロモーター−ＧＤＨをコードする遺伝子の全部又は部分からなる形質転換用カセットなどが利用できる。この場合、ＧＤＨをコードする遺伝子の上流領域及びＧＤＨをコードする遺伝子の全部又は部分が相同組換えのために利用される。ＧＤＨをコードする遺伝子の全部又は部分は、開始コドンから途中の領域を含むものが使用できる。相同組換えに適した領域の長さは０．５ｋｂ以上あることが好ましい。
【００６４】
本発明の形質転換糸状菌が作製されたことの確認は、ＧＤＨの酵素活性が認められる条件下で本発明の形質転換糸状菌を培養し、次いで培養後に得られた培養物におけるＧＤＨの活性を確認することにより行うことができる。
【００６５】
また、本発明の形質転換糸状菌が作製されたことの確認は、形質転換糸状菌から染色体ＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行い、形質転換が起きた場合に増幅が可能なＰＣＲ産物が生じることを確認することにより行ってもよい。
【００６６】
例えば、用いたプロモーターの塩基配列に対するフォワードプライマーと、形質転換マーカー遺伝子の塩基配列に対するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想定の長さの産物が生じることを確認する。
【００６７】
（ハイスループットスクリーニング）
ＧＤＨはさらに、機能性ＧＤＨ変異体を取得するためにハイスループットスクリーニングに供することができる。例えば変異導入したＧＤＨ遺伝子を有する形質転換又は形質導入株のライブラリーを作製し、これをマイクロタイタープレートに基づくハイスループットスクリーニングに供してもよく、又は液滴型マイクロ流体に基づく超ハイスループットスクリーニングに供してもよい。例としてはバリアントをコードする変異遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築し、次いでファージディスプレイ（例えばＣｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  １０５  （１１）：  ４０５６−７２，  ２００５）、イーストディスプレイ（例えばＣｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．  ２００８；１１（２）：  １２７−３４）、バクテリアルディスプレイ（例えばＣｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １７：  ４７４−８０，  ２００７）等を用いて、変異ＧＤＨの大きな集団をスクリーニングする方法が挙げられる。またＡｇｒｅｓｔｉ  ｅｔ  ａｌ，  ”Ｕｌｔｒａｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｉｎ  ｄｒｏｐ−ｂａｓｅｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０７  （９）：  ４００４−４００９  （Ｍａｒ，  ２０１０）を参照のこと。ＧＤＨバリアントのスクリーニングに使用しうる超ハイスループットスクリーニング手法についての同文献の記載を参照により本明細書に組み入れる。例えばエラープローンＰＣＲ法によりライブラリーを構築することができる。また飽和突然変異誘発を用いて、本明細書に記載の領域や位置又はそれらに対応する領域や位置を標的として変異導入しライブラリーを構築してもよい。ライブラリーを用いて電気コンピテントＥＢＹ−１００細胞等の適当な細胞を形質転換し、約１０の７乗の変異体を取得しうる。該ライブラリーで形質転換した酵母細胞を次いでセルソーティングに供しうる。標準ソフトリトグラフィー法を用いて作製したポリジメトキシルシロキサン（ＰＤＭＳ）マイクロ流体デバイスを用いてもよい。フローフォーカスデバイスを用いて単分散の液滴を形成することができる。個別の変異体を含有する形成された液滴を適当なソーティングデバイスに供しうる。細胞を選別する際にはＧＤＨ活性の有無を利用しうる。これには例えば上記のＧＤＨが作用すれば発色する組成とした反応液を用いてもよい。例えばＤＣＩＰを用いる場合は、９６ウェルプレート、１９２ウェルプレート、３８４ウェルプレート、９６００ウェルプレート等及びプレートリーダーを用いて６００ｎｍの吸光度を測定してもよい。変異導入と選別は複数回反復してもよい。
【００６８】
（ＦＡＤ−ＧＤＨ酵素の製造方法）
ＦＡＤ−ＧＤＨ酵素は、上述のように取得したＦＡＤ−ＧＤＨを生産する宿主細胞を培養し、前記宿主細胞中に含まれるＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を発現させ、次いで、前記培養物からＦＡＤ−ＧＤＨを単離することにより製造すればよい。
【００６９】
上記宿主細胞を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
【００７０】
培地の初発ｐＨは、限定されないが、例えば、ｐＨ６〜９に調整することができる。培養は、１０〜４２℃の培養温度、好ましくは２５℃前後の培養温度で４〜２４時間、さらに好ましくは２５℃前後の培養温度で４〜８時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施すればよい。
【００７１】
培養終了後、該培養物よりＦＡＤ−ＧＤＨ酵素を採取する。これには、通常の公知の酵素採取手段を用いればよい。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、もしくはリゾチームやヤタラーゼ等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、又はトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、ＦＡＤ−ＧＤＨの粗酵素を得る。
【００７２】
ＦＡＤ−ＧＤＨの粗酵素を、公知の任意の手段を用いてさらに精製することもできる。精製された酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、ウルトロゲル若しくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、又はこれらを組み合わせて実施することにより、精製されたＦＡＤ−ＧＤＨ酵素標品を得ることができる。
【００７３】
（ＦＡＤ−ＧＤＨを用いたグルコース測定方法）
本発明はまた、ＦＡＤ−ＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを提供する。ＦＡＤ−ＧＤＨを用いて血中のグルコース（血糖値）を測定することができる。
【００７４】
グルコースアッセイキットには、少なくとも１回のアッセイに十分な量のＦＡＤ−ＧＤＨを含む。典型的には、グルコースアッセイキットは、ＦＡＤ−ＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液を含む。グルコース測定法やグルコースアッセイキットに用いるＦＡＤ−ＧＤＨは、種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、又は適切な保存溶液中に溶解されて提供することができる。
【００７５】
グルコース濃度の測定は、比色式グルコースアッセイキットの場合は、例えば、以下のよう行うことができる。グルコースアッセイキットの反応層にはＦＡＤ−ＧＤＨ、電子受容体、そして反応促進剤としてＮ−（２−アセトアミド）イミド２酢酸（ＡＤＡ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールからなる群より選ばれる１以上の物質を含む液状もしくは固体状の組成物を保持させておく。ここで、必要に応じてｐＨ緩衝剤、発色試薬を添加する。ここにグルコースを含む試料を加え、一定時間反応させる。この間、還元により退色する電子受容体もしくは電子受容体より電子を受け取ることによって重合し生成する色素の最大吸収波長に相当する吸光度をモニタリングする。レート法であれば、吸光度の時間あたりの変化率から、エンドポイント法であれば、試料中のグルコースがすべて酸化された時点までの吸光度変化から、予め標準濃度のグルコース溶液を用いて作成したキャリブレーションカーブを元にして、試料中のグルコース濃度を算出することができる。
【００７６】
この方法において使用できるメディエーター及び発色試薬としては、例えば、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）を電子受容体として添加し、６００ｎｍにおける吸光度の減少をモニタリングすることでグルコースの定量が可能である。また、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）を、さらに発色試薬としてニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）を加え、５７０ｎｍ吸光度を測定することにより生成するジホルマザンの量を決定し、グルコース濃度を算出することが可能である。なお、いうまでもなく、使用する電子受容体および発色試薬はこれらに限定されない。
【００７７】
（ＦＡＤ−ＧＤＨを含むグルコースセンサー、電極）
ある実施形態において本発明は、ＦＡＤ−ＧＤＨを用いるグルコースセンサーを提供する。また、ある実施形態において本発明は、ＦＡＤ−ＧＤＨを含む電極を提供する。ある実施形態においてグルコースセンサーは、ＦＡＤ−ＧＤＨを含む作用電極、参照電極及び対極を有する。作用電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上にＦＡＤ−ＧＤＨを固定化することができる。さらに、又はこれとは別に、作用電極上に電子メディエーターを固定化してもよい。対極は白金電極やＰｔ／Ｃ等の慣用の電極でありうる。参照電極はＡｇ／ＡｇＣｌ電極などの慣用の電極でありうる。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いてＦＡＤ−ＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００７８】
グルコースセンサーの製造方法は公知文献にあり、例えばＬｉｕ，  ｅｔ．  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２０１２，  ８４，  ３４０３−３４０９及びＴｓｕｊｉｍｕｒａ，  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２０１４，  １３６，  １４４３２−１４４３７が挙げられる（参照によりいずれもその全内容を本明細書に組み入れるものとする。）。公知の方法においてＧＯＤの代わりにＧＤＨを用いることができる。
【００７９】
例えば、オスミウム錯体を含むポリマーなどのレドックスポリマーを、ＨＥＰＥＳ緩衝液などの適切な緩衝液中のポリエチレングリコールなどの別のポリマー中に存在するＧＤＨと混合して、グルコースセンシング試薬を調製することができる。オスミウム錯体は、２，２’−ビピリジンのようなビピリジン分子、２，２’−ビイミダゾールのようなビイミダゾール分子、２−（２−ピリジル）イミダゾールのようなピリジン−イミダゾール化合物またはそれらの組み合わせを含む１以上の化合物と錯体形成したオスミウム錯体であり得る。錯体を形成する有機分子は、必要に応じて、メチル基またはエチル基などのＣ１〜Ｃ６アルキルなどのアルキル基で置換されていてもよい。一実施形態では、オスミウム錯体は、以下のとおりであり得る：
［Ｏｓ有機分子複合体］−［ポリマー］
錯体を形成する有機分子の１つは、場合により、リンカーを介してポリマーに結合されてもよい。したがって、別の実施形態では、オスミウム錯体は以下の通りであり得る：
［Ｏｓ有機分子複合体］−［リンカー］−［ポリマー］
例示的な分子は、Ｏｈａｒａら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．  １９９３  Ｄｅｃ  １；  ６５（２３）：３５１２−７及びＡｎｔｉｏｃｈｉａら、Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｖｏｌ．４  Ｎｏ．７  Ａ２（２０１３）（両方とも参考として全内容を本明細書に組み入れる）にある。オスミウム錯体を含むポリマーの例には、ポリ（１−ビニルイミダゾール）で錯体化されたオスミウムビス（２，２’−ビピリジン）クロライド、ポリ（４−ビニルピリジン）錯体化オスミウムビス（２，２’−ビピリジン）クロライド、ポリ（１−ビニルイミダゾール）ｎ−［オスミウム（４，４’−ジメチル−２，２’−ビピリジル）２Ｃｌ２］２＋／＋およびそれらの誘導体が挙げられる。
【００８０】
溶液をカーボンセンサ上に堆積して、レドックスポリマーワイヤードＧＤＨを含む作用電極として機能する活性電極領域を形成することができる。膜ポリマーおよび架橋剤溶液の混合物を添加して、センサー上に膜を形成することができる。膜は、ポリ（１−ビニルイミダゾール）、ポリ（４−ビニルピリジン）、それらの誘導体または組み合わせなどのポリマーを含みうる。上記のオスミウム錯体を含有するポリマーは、かかる膜ポリマーと組み合わせて用いて、ヒドロゲルフィルムを形成しうる。
【００８１】
一実施形態では、グルコースセンサーは印刷電極を含みうる。この場合、絶縁基板上に電極を形成しうる。具体的には、電極は、フォトリソグラフィ又はスクリーン印刷、グラビア印刷またはフレキソ印刷などの印刷技術によって基板上に形成しうる。絶縁基板を構成する材料としては、例えば、シリコン、ガラス、セラミック、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル等が挙げられる。様々な溶媒または化学物質に対して高い耐性を示す材料を使用しうる。
【００８２】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極としてＦＡＤ−ＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作成したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００８３】
具体的な一例としては、グラッシーカーボン（ＧＣ）電極に１．５ＵのＦＡＤ−ＧＤＨを固定化し、グルコース濃度に対する応答電流値を測定する。電解セル中に、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．８ｍｌ、及び、１Ｍ  ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム（フェリシアン化カリウム）水溶液０．２ｍｌを添加する。ＧＣ電極をポテンショスタットＢＡＳ１００Ｂ／Ｗ（ＢＡＳ製）に接続し、３７℃で溶液を撹拌し、銀塩化銀（飽和ＫＣｌ）参照電極に対して＋５００ｍＶを印加する。これらの系に１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液を終濃度が１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭになるよう添加し、添加ごとに定常状態の電流値を測定する。この電流値を既知のグルコース濃度（１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭ）に対してプロットし、検量線が作成する。これよりＦＡＤ結合型グルコース脱水素酵素を使用した酵素固定化電極でグルコースの定量が可能となる。
【００８４】
ある実施形態において、本発明は、上記のＦＡＤ−ＧＤＨを含むグルコースセンサーを有する持続血糖測定装置を提供する。持続血糖測定装置は、２４時間を通した血糖値の変動を把握することが可能となるＣＧＭ（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）デバイスやＦＧＭ（Ｆｌａｓｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）デバイスを含みうる。またある実施形態において、本発明は、ＦＡＤ−ＧＤＨを用いる連続グルコースモニタリング方法を提供する。
【００８５】
ある実施形態において、ＣＧＭは、再キャリブレーション有りで又は無しで行うことができる。ある実施形態において再キャリブレーション頻度を従来法よりも低く設定することができ、例えば再キャリブレーションを２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４日毎に行うことができる。
【００８６】
ある実施形態において、本発明のＣＧＭデバイスは、皮膚の下に配置するためのグルコースセンサーを有しうる。センサーは一定期間、例えば１日〜３週間、装着されうる。センサーは使い捨て型であってもよく、再利用可能であってもよい。センサーは、組織と酵素の直接接触を防ぐためのセンサーメンブレン層を有し得る。センサーは、アプリケーターを用いて腹部に挿入するよう設計しうる。ある実施形態において、本発明は発信機及びセンサーから発信機への連結部をさらに有するＣＧＭデバイスを提供する。発信機はインプラントせずともよい。好ましくは発信機は、電波受信機と通信可能である。ＣＧＭデバイスはさらに、グルコースレベルを連続的に表示する電気的受信機を有し得る。ＣＧＭデバイスは場合により、キャリブレーション用のフィンガースティック（指先穿刺部材）を有し得る。ＣＧＭデバイスは使用説明書を有し得る。
【００８７】
（架橋及び架橋剤）
本明細書において「架橋する」とは、架橋剤を介して、２つのポリペプチド分子を共有結合により互に連結することを指す。本明細書においてポリペプチド分子は典型的にはＦＡＤ−ＧＤＨである。ある実施形態では、架橋剤を介して、同一のポリペプチド分子２つが連結されうる。これは、架橋剤をＣＬ、ポリペプチド分子をＰと表記すると、Ｐ−ＣＬ−Ｐと表されうる（便宜上、２量体という）。このとき、架橋剤がポリペプチド分子に結合する位置は、同一でも異なってもよい。また、架橋された分子、Ｐ−ＣＬ−Ｐが、さらに架橋されてもよい。３量体であるＰ−ＣＬ−Ｐ−ＣＬ−Ｐや、４量体であるＰ−ＣＬ−Ｐ−ＣＬ−Ｐが例示されるが、架橋の分岐パターンはこれに限らない。
【００８８】
本明細書において「架橋剤」は、架橋対象のポリペプチド分子と共有結合を形成することのできる反応性官能基を有する分子をいう。ある実施形態において、架橋剤は２以上、例えば２つの反応性官能基を有する。架橋剤としては、少なくとも１つの反応性官能基を各末端に含む分子が挙げられる。本明細書において反応性官能基は、ポリペプチド中に存在するアミノ酸側鎖またはポリペプチドの末端アミノ酸残基と反応し、共有結合を形成することのできる官能基をいう。反応性官能基としては、シアン酸エステル、エポキシド、イソシアネート、イミダート、チオイミダート、スクシンイミド、アルデヒド基等が挙げられるがこれに限らない。反応性官能基と反応性官能基との間に介在する分子としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリエーテルが挙げられる。具体的には、架橋剤としてはポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン二酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）、４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８−ノナオキサヘントリアコンタン二酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）、オクタン二酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）、デカン二酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル等が挙げられるがこれに限らない。
【００８９】
架橋剤の分子量は、０．１ｋＤａ〜３０ｋＤａ、０．５ｋＤａ〜３０ｋＤａ、０．６ｋＤａ〜２０ｋＤａ、０．９ｋＤａ〜１０ｋＤａ、１ｋＤａ〜５ｋＤａであり得るがこれに限らない。
【００９０】
当業者であれば架橋反応の条件、例えば架橋剤濃度やＦＡＤ−ＧＤＨの量、反応ｐＨ、反応温度などは、用いる架橋剤に応じて適宜決定することができる。反応後の架橋分子は、公知の手法により、多量体生成パターンを分析することができる。そのような手法として、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、限外ろ過、透析等が挙げられるがこれに限らない。また、アミノ基を含有する化合物、例えばトリスヒドロキシメチルアミノメタン等を多量に添加することで、架橋反応を停止させることができる。
【００９１】
ある実施形態において、ＦＡＤ−ＧＤＨは、脱糖鎖処理されたものであり得る。脱糖鎖処理は、例えばＮ−グリカナーゼ、エンドグリコシダーゼ等、例えばＥｎｄｏＨ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社製）やＰＮＧａｓｅ  Ｆ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社製）等により行うことができ、脱糖鎖キット（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＰＺＭ製）等を用いることもできる。脱糖鎖処理されたＦＡＤ−ＧＤＨは、脱糖鎖処理されていないものと比較して、センサーに用いた場合の感度向上が期待される。
【００９２】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明のＧＤＨ変異体において置換されるリシン（置換前のアミノ酸リシン）は、架橋剤の反応性官能基と反応しうるアミノ酸残基である。このことから、当該リシンを、リシン以外のアミノ酸（例えばＲ、Ｎ、Ｆ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｗ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｃ、Ｈ）に置換することで、当該位置のアミノ酸残基は架橋剤と反応しなくなると考えられる。このようなリシンは、主として、ＧＤＨのタンパク質表面に存在するリシン残基であると考えられる。しかしながら、タンパク質に部分的に埋没しているリシン残基もまた、架橋剤の反応性官能基と反応しうる場合があり得る。そうした位置で架橋反応が生じると、得られる架橋ＧＤＨは不安定化され得る。この場合、そうした位置のリシンをリシン以外のアミノ酸に置換することにより、架橋ＧＤＨの安定性を増大させることができると考えられる。このような安定性の増大したＧＤＨまたは安定性を増大させることのできるＧＤＨもまた、本明細書にいう架橋反応に適したグルコースデヒドロゲナーゼに包含されるものとする。
【００９３】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００９４】
１．Ｍｕｃｏｒ属由来ＧＤＨ遺伝子の宿主への導入とＧＤＨ活性の確認
大まかに説明すると、まずＭｕｃｏｒ属由来ＧＤＨ（ＭｐＧＤＨ、配列番号１）にＮ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ／Ｃ８８Ａ／Ｑ２３３Ｒ／Ｔ３８７Ｃ／Ｅ５５４Ｄ／Ｌ５５７Ｖ／Ｓ５５９Ｋの各変異を導入した改変ＧＤＨ（ＭｐＧＤＨ−Ｍ１）をコードする遺伝子を取得した。ＭｐＧＤＨ−Ｍ１のアミノ酸配列は配列番号１２に示し、その遺伝子の塩基配列は配列番号１３に示す。プラスミドｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトに対象遺伝子であるＭｐＧＤＨ−Ｍ１遺伝子を常法により挿入させたＤＮＡコンストラクトを作製した。具体的には、ｐＵＣ１９は、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社）に付属されているｐＵＣ１９  ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒを用いた。ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅにて、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１遺伝子を、上記したＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用して、キットに添付されたプロトコールに従って連結して、コンストラクト用プラスミド（ｐＵＣ１９−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１）を得た。
【００９５】
得られた組換え体プラスミドｐＵＣ１９−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１を鋳型として、配列番号２０−２５の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
【００９６】
すなわち、１０×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるＭｐＧＤＨ−Ｍ１遺伝子を連結させたＤＮＡコンストラクトを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」−「５０℃、３０秒」−「６８℃、８分」のサイクルを３０回繰り返した。
【００９７】
反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約８，０００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ培地［１％（Ｗ／Ｖ）  バクトトリプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ）  ペプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ）  ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ  Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ］２．５ｍｌに接種して、３７℃で２０時間振とう培養し、培養物を得た。この培養物を７，０００ｒｐｍで、５分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。次いで、この菌体よりＱＩＡＧＥＮ  ｔｉｐ−１００（キアゲン社製）を用いて組換え体プラスミドを抽出して精製し、ＤＮＡ２．５μｇを得た。該プラスミド中のＭｐＧＤＨ−Ｍ１をコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて決定し、その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１７５位のアラニンをシステインに、２１４位のアスパラギンをシステインに、及び４６６位のグリシンをアスパラギン酸に置換した変異体であるＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ（配列番号１４）をコードするＤＮＡコンストラクトを得た（ｐＵＣ１９−ＭｐＧＤＨ−Ｍ２）（配列番号１５）。この遺伝子をコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ；  アスペルギルス・ソーヤ）で発現させ、そのＧＤＨ活性を評価した。さらにＭｐＧＤＨ−Ｍ２にＳ１９２Ｐ／Ｓ１９６Ｎ／Ｉ２１２Ｌ／Ａ２１８Ｈ／Ｉ２２６Ｔ／Ｄ２２８Ｎ／Ｋ１７８Ｆ／Ｋ１７９Ｎ／Ｋ２８６Ｎ／Ｋ４０９Ｑ／Ｋ４１４Ｒ／Ｋ５５９Ｑ／Ｋ５８０Ｒの各変異を導入した改変ＧＤＨ（ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−１）をコードする遺伝子を取得した。ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−１のアミノ酸配列は配列番号１６に示し、その遺伝子の塩基配列は配列番号１７に示す。同様にＭｐＧＤＨ−Ｍ２−１にＫ５４Ｒ／Ｋ１２９Ｒ／Ｋ１５２Ｎ／Ｋ１５３Ｒ／Ｋ６３０Ｒの各変異を導入した改変ＧＤＨ（ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−２）をコードする遺伝子を取得した。ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−２のアミノ酸配列は配列番号１８に示し、その遺伝子の塩基配列は配列番号１９に示す。さらにＭｐＧＤＨ−Ｍ２にＳ１９２Ｐ／Ｓ１９６Ｎ／Ｉ２１２Ｌ／Ａ２１８Ｈ／Ｉ２２６Ｔ／Ｄ２２８Ｎの各変異を導入した改変ＧＤＨ（ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−０）をコードする遺伝子を取得した。ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−０のアミノ酸配列は配列番号２６に示し、その遺伝子の塩基配列は配列番号２７に示す。上記と同様に、プラスミドｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトに対象遺伝子であるＭｐＧＤＨ−Ｍ２−１、ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−２、又はＭｐＧＤＨ−Ｍ２−０遺伝子をそれぞれ常法により挿入させたＤＮＡコンストラクト用プラスミド（ｐＵＣ１９−ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−１、ｐＵＣ１９−ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−２、及びｐＵＣ１９−ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−０）を得た。
【００９８】
２．ＭｐＧＤＨ−Ｍ２、ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−１、ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−２、及びＭｐＧＤＨ−Ｍ２−０の製造
Ｄｏｕｂｌｅ−ｊｏｉｎｔ  ＰＣＲ（Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００４年，第４１巻，ｐ９７３−９８１）を行い、５’アーム領域〜ＰｙｒＧ遺伝子（ウラシル栄養要求性マーカー）〜ＴＥＦ１プロモーター遺伝子〜フラビン結合型ＧＤＨ遺伝子〜３’アーム領域から成るカセットを構築し、下記の手順でアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株（ｐｙｒＧ遺伝子の上流４８ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ、下流２４０ｂｐ欠損株）の形質転換に用いた。５００ｍｌ容三角フラスコ中の２０ｍＭウリジンを含むポリペプトンデキストリン液体培地１００ｍｌに、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株の分生子を接種し、３０℃で約２０時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト及び２０μｇの対象遺伝子挿入ＤＮＡコンストラクトを用いて、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行い、次いで０．５％（ｗ／ｖ）寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社；ｐＨ６）を用いて、３０℃、５日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換アスペルギルス・ソーヤを得た。
【００９９】
得られた形質転換アスペルギルス・ソーヤは、ウリジン要求性を相補する遺伝子であるｐｙｒＧが導入されることにより、ウリジン無添加培地に生育できるようになることで、目的の遺伝子が導入された株として選択できた。得られた菌株の中から目的の形質転換体を、ＰＣＲで確認して選抜した。ＭｐＧＤＨ−Ｍ２、ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−１、ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−２、又はＭｐＧＤＨ−Ｍ２−０の遺伝子により形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤを用いて、それぞれのＧＤＨ生産を行った。
【０１００】
２００ｍｌ容三角フラスコ中のＤＰＹ液体培地（１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、２％（ｗ／ｖ）デキストリン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０；ｐＨ未調整）４０ｍｌに、各菌株の分生子を接種し、３０℃で４日間、１６０ｒｐｍで振とう培養を行った。次いで、培養後の培養物から菌体をろ過し、得られた培地上清画分をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５，  ３０Ｋ  ＮＭＷＬ（ミリポア社製）で１０ｍＬまで濃縮し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、同緩衝液で溶出させ、ＧＤＨ活性を示す画分を回収し、ＭｐＧＤＨ−Ｍ２、ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−１、ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−２、及びＭｐＧＤＨ−Ｍ２−０の精製標品を得た。
【０１０１】
ＭｐＧＤＨ−Ｍ２、ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−１、ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−２を終濃度２０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、４％  ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（平均分子量５００、シグマ社製）を混合した１００μｌ溶液を５５℃、２時間処理し、架橋反応させた。２時間反応後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）を５０μｌ添加し、架橋反応を停止させた。続いて、反応処理前後の酵素溶液を５０μｌとり、５００μｌまで、２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で希釈し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、多量体形成を確認した。反応処理前の酵素溶液では単量体画分にしかピークは見られず、全ピーク面積に対する単量体画分のピーク面積は１００％であった。架橋反応後のＭｐＧＤＨ−Ｍ２は単量体を示すピークより大きい分子量を示すピークが見られ、多量体が形成されたといえる。この全ピーク面積に対する多量体画分のピーク面積は４％であった。
【０１０２】
同様に、ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−１を架橋反応させた際に、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００による解析を行ったところ、全ピーク面積に対する多量体画分（２量体、３量体若しくは４量体以上）のピーク面積は８％であった。したがって、リシン残基を減らした方が、分子間架橋反応が促進されたといえる（本発明）。同様に、ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−２を架橋反応させた際に、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００による解析を行ったところ、単量体を示すピークより大きい分子量を示すピークが見られ、多量体が形成されたといえる（本発明）。
【０１０３】
また、同様の手順でＭｐＧＤＨ−Ｍ２−０を架橋反応させた際に、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００による解析を行ったところ、単量体のピークのみ検出され、全く多量体は形成されなかった（比較例１）。
【０１０４】
本発明と比較例１の関係について
ＭｐＧＤＨ−Ｍ２にＳ１９２Ｐ／Ｓ１９６Ｎ／Ｉ２１２Ｌ／Ａ２１８Ｈ／Ｉ２２６Ｔ／Ｄ２２８Ｎの各変異を導入した改変ＧＤＨがＭｐＧＤＨ−Ｍ２−０である。ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−１はこれ以外にもさらにＫ１７８Ｆ／Ｋ１７９Ｎ／Ｋ２８６Ｎ／Ｋ４０９Ｑ／Ｋ４１４Ｒ／Ｋ５５９Ｑ／Ｋ５８０Ｒを有し、リシン残基数が低減されている。また、ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−２は、ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−１の有する各変異以外にもさらにＫ５４Ｒ／Ｋ１２９Ｒ／Ｋ１５２Ｎ／Ｋ１５３Ｒ／Ｋ６３０Ｒを有し、リシン残基数が低減されている。
【０１０５】
考察
特定の理論に拘束されることを望むものではないが本発明について、以下のように考えられる。グルコースデヒドロゲナーゼは複数のリシン残基を有する。多量体を形成するためにグルコースデヒドロゲナーゼに架橋剤を作用させると、架橋剤は通常、グルコースデヒドロゲナーゼ中のＮ末端アミノ基若しくはリシン残基の側鎖と反応する。したがって、グルコースデヒドロゲナーゼにおけるリシン残基の数を低減することは、架橋剤と反応することのできる部位の数を減らすことを意味し、総じてグルコースデヒドロゲナーゼと架橋剤との反応性が低くなる可能性があった。また、説明の便宜上、ここでは２つの反応性官能基を有する架橋剤について例示的に考察するが、グルコースデヒドロゲナーゼと架橋剤とを反応させると、第１のグルコースデヒドロゲナーゼと架橋剤とが２箇所で連結される分子内反応が生じる可能性があり、また、第１のグルコースデヒドロゲナーゼと架橋剤とが１箇所で連結され第２のグルコースデヒドロゲナーゼと該架橋剤とが１箇所で連結される分子間反応が生じる可能性がある。また、分子内反応及び分子間反応は、リシン残基数を低減したグルコースデヒドロゲナーゼについても、リシン残基数を低減する前の未改変のグルコースデヒドロゲナーゼについても、それぞれ生じる可能性がある。そのため、リシン残基数を低減したグルコースデヒドロゲナーゼを架橋反応に用いた場合、リシン残基数を低減する前のグルコースデヒドロゲナーゼと比較して、多量体がより多く形成されるか、さほど多く形成されないか、予測することは困難であった。今回、リシン残基数を低減したグルコースデヒドロゲナーゼ変異体を用いたところ、驚くべきことに、より多くの多量体が形成された。
【０１０６】
グルタルアルデヒドについて
次に、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテルの代わりにグルタルアルデヒドを用いて架橋反応を行った。    
ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−０、ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−２を終濃度２０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１％  グルタルアルデヒド（和光純薬社製）を混合した１００μｌ溶液を４０℃、１時間処理し、架橋反応させた。１時間反応後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を５０μｌ添加し、架橋反応を停止させた。    
上記と同様にゲルろ過クロマトグラフィーで解析を行ったところ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−０は全て２量体を形成した。一方で、ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−２は２４％が２量体となり、７５％が単量体となり、グルタルアルデヒドとの反応効率は低下した。ただし、いずれのＧＤＨにおいても３量体以上の多量体は形成されず、多量体形成を行う架橋剤としてグルタルアルデヒドは不適であると示唆された。
【０１０７】
以上のように、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ変異体は、架橋反応により良好に多量体を生じた。これは酵素を固定化して用いるグルコースセンサーに有用である。
【０１０８】
本発明を例示により説明したが、本発明の精神から逸脱することなく、種々の変法を行うことができる。
【０１０９】
配列の簡単な説明
配列番号１  Ｍｕｃｏｒ  ｐｒａｉｎｉｉ  ＧＤＨ（ＭｐＧＤＨ）  ａａ  
配列番号２  ＭｐＧＤＨ遺伝子  ＤＮＡ  
配列番号３  Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ  ＧＤＨ（ＭｈＧＤＨ）  ａａ  
配列番号４  Ｍｕｃｏｒ  ＲＤ０５６８６０  ＧＤＨ（ＭｒｄＧＤＨ）  ａａ  
配列番号５  Ｍｕｃｏｒ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ  ＧＤＨ（ＭｓＧＤＨ）  ａａ  
配列番号６  Ｍｕｃｏｒ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ  ＧＤＨ（ＭｇＧＤＨ）  ａａ
配列番号７  Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ＧＤＨ（ＣｓＧＤＨ）  ａａ  
配列番号８  Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ属  ＧＤＨ（ＣｒＧＤＨ）  ａａ  
配列番号９  Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ  ＧＤＨ（ＭｃＧＤＨ）  ａａ
配列番号１０  ＭｒｄＧＤＨ遺伝子  ＤＮＡ
配列番号１１  ＭｈＧＤＨ遺伝子  ＤＮＡ
配列番号１２  ＭｐＧＤＨ−Ｍ１  ａａ  （Ｍ１）
配列番号１３  ＭｐＧＤＨ−Ｍ１遺伝子ＤＮＡ
配列番号１４  ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ａ１７５Ｃ／Ｎ２１４Ｃ／Ｇ４６６Ｄ  ａａ  （Ｍ２）
配列番号１５  ＭｐＧＤＨ−Ｍ２遺伝子ＤＮＡ
配列番号１６  ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−１
配列番号１７  ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−１遺伝子ＤＮＡ
配列番号１８  ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−２
配列番号１９  ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−２遺伝子ＤＮＡ
配列番号２０−２５  プライマー
配列番号２６  ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−０遺伝子ＤＮＡ
配列番号２７  ＭｐＧＤＨ−Ｍ２−０
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【配列表】
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