(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞を用いた感作性物質のインビトロ評価系において、これまで検出できなかった植物エキスの皮膚感作性を評価することができる方法を提供する。【解決手段】細胞に感作性物質を含有すると予想される被験物質を添加して曝露し、細胞の表面に発現された分子を検出する感作性物質のインビトロ評価方法又はスクリーニング方法において、感作性物質を含有すると予想される被験物質が植物エキスであり、添加する植物エキスの濃度が５０００μｇ／ｍｌ〜５０００００μｇ／ｍｌであり、かつ、曝露時間が１〜３０分であることを特徴とする、これまで困難であった植物エキスの動物を用いない皮膚感作性評価法の工程を含む。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に感作性物質を含有すると予想される被験物質を添加して曝露し、該細胞の表面に発現された分子を検出する感作性物質のインビトロ評価方法又はスクリーニング方法において、前記感作性物質を含有すると予想される被験物質が植物エキスであり、前記添加する植物エキスの濃度が５０００μｇ／ｍｌ〜５０００００μｇ／ｍｌであり、かつ、曝露時間が１〜３０分であることを特徴とする、植物エキス中の感作性物質のインビトロ評価方法又はスクリーニング方法。
【請求項２】
細胞表面に発現される分子がCD86である、請求項１に記載の植物エキス中の感作性物質のインビトロ評価方法又はスクリーニング方法。
【請求項３】
細胞がヒト単核球細胞THP-1細胞である、請求項１に記載の植物エキス中の感作性物質のインビトロ評価方法又はスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物エキスの皮膚感作性インビトロ評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚感作性は化学物質の安全性評価において重要な評価項目であり、従来、モルモットやマウスを用いた動物実験によって評価されてきた。2013年3月にEUにおいて、動物実験により安全性が評価された成分を含む化粧品の販売が禁止されたことを受け、in silicoやin vitro代替法の動物を用いない試験法の開発が強く望まれている。
human Cell Line ActivationTest（h-CLAT）は、多くの皮膚感作性物質が樹状細胞を活性化することに着目した試験法であり、2016年7月にOECDのガイドライン化がなされた（OECD TG422E）。ヒト単核球細胞であるTHP-1細胞を用いて、細胞表面上のCD86とCD54を測定することにより皮膚感作性の有無を判定する試験法である（非特許文献１）。
一方で、h-CLATには試験に適用できない物質がある。例えば、香粧品原料の中には植物エキスをはじめとする天然由来の混合物が多く存在し、これら混合物の成分には感作性物質が含まれる可能性がある。しかしながら植物エキス中の感作性物質は非常に微量であるため、OECDのガイドラインに収載されたh-CLATでは検出できない事例が多い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００１−２２１７９６号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】JaCVAM 皮膚感作性試験試料編纂委員会（2016）皮膚感作性試験報告書  human Cell Line Activation Test（h-CLAT）
【非特許文献２】OECD 442E（2016） OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明はこれまで検出できなかった植物エキスの皮膚感作性を評価することができる方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の目的を達成するため、鋭意検討した結果、植物エキスの皮膚感作性を評価する場合、細胞と植物エキスを曝露する際の曝露時間を短時間にし、植物エキスを高濃度で曝露し、該細胞表面に発現される、感作性物質の量や特性を反映する分子を測定することにより、これまで困難であった植物エキスの動物を用いない皮膚感作性を評価することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
（１）細胞に感作性物質を含有すると予想される被験物質を添加して曝露し、該細胞の表面に発現された分子を検出する感作性物質のインビトロ評価方法又はスクリーニング方法において、前記感作性物質を含有すると予想される被験物質が植物エキスであり、前記添加する植物エキスの濃度が５０００μｇ／ｍｌ〜５０００００μｇ／ｍｌであり、かつ、曝露時間が１〜３０分であることを特徴とする、植物エキス中の感作性物質のインビトロ評価方法又はスクリーニング方法、
（２）細胞表面に発現される分子がCD86である、（１）に記載の植物エキス中の感作性物質のインビトロ評価方法又はスクリーニング方法、
（３）細胞がヒト単核球細胞THP-1細胞である、（１）に記載の植物エキス中の感作性物質のインビトロ評価方法又はスクリーニング方法、
である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の植物エキスの皮膚感作性インビトロ評価法は、香粧品原料に含まれる植物エキスの皮膚感作性の予測ができる効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】試験例２における、OECD TG422Eの手順通りに皮膚感作性を評価したときのCD86の発現量と細胞毒性（細胞生存率）を示したグラフである。
【図２】実施例１における、短時間曝露法を用いて皮膚感作性を評価したときのCD86の発現量と細胞毒性（細胞生存率）を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明において用いる細胞としては、感作性物質の特性を反映してその表面にCD86物質を発現するものであれば特に限定されないが、具体例としてヒト単核球細胞であるTHP-1が挙げられる。この細胞は樹立した培養細胞であって、当業界の研究者により広く用いられており、容易に入手することができる。具体的にはTHP-1細胞は、公的な細胞バンク又は民間企業より入手することができる。
【００１１】
本発明の細胞を培養するための培地としては、これらの細胞を培養することができる常用の任意の培地を使用することができるが、例えば具体例としてRPMI 1640 Mediumが挙げられる。これらの培地にはおよそ10%程度のウシ胎児血清を添加することが必要である。
【００１２】
本発明に関する植物エキスは各種溶媒、例えば水、エタノール、多価アルコール等により抽出されたものが好ましい。
【００１３】
本発明の植物エキスのインビトロ評価又はスクリーニングにおいては、上記細胞に植物エキスを加え、例えば室温にて5分間曝露を行い、その後CO2インキュベーター中で、約37℃にて後培養を行う。曝露時間は、好ましくは１〜３０分、より好ましくは１〜１０分、さらに好ましくは１〜５分である。従来のOECD TG422E（非特許文献2）の試験法では、曝露時間は２４時間必要なため、本発明により短時間で評価できる。
【００１４】
上記細胞の初期濃度は1×105〜5×105細胞／mLが好ましい。この場合、好ましくは、生理食塩水を同量加えて、上記の同様の培養を行い、対照とする。また、植物エキスの評価を行う場合は、培地中の細胞に、既知の感作性物質と植物エキスとを加えて、上記の条件で培養を行う。この際の植物エキスの濃度は５０００μｇ／ｍｌ〜５０００００μｇ／ｍｌ、より好ましくは５００００μｇ／ｍｌ〜２５００００μｇ／ｍｌが好ましい。対照とする場合も、好ましくは、生理食塩水を同量加えて上記と同様の培養を行い、対照とする。
【００１５】
後培養まで終了した後、培養した細胞の表面に発現されたCD86分子を検出又は測定する。CD86の検出または測定方法は特に限定されないが、抗−ヒトCD86抗体を用いた免疫測定が好ましく、フローサイトメトリー法が特に好ましい。抗−ヒトCD86抗体はモノクロナール抗体でもポリクロナール抗体でもよく、CD86を表面に発現している細胞を免疫原として用いて常法に従って調製することができる。フローサイトメトリー法も常法に従って行うことができる。
【実施例】
【００１６】
以下に実施例および試験例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されない。
【００１７】
（試験例１）従来の動物での皮膚感作性試験による評価
Ａｄｊｕｖａｎｔを用いた試験は、白色モルモットを試験動物とし、１群５匹以上の例数を確保した。投与経路は皮内及び経皮とし、第１回目の感作処置では除毛した頸部背部皮膚にフロイント・コンプリート・アジュバント（ＦＣＡ）、各種植物エキス（いずれも原液）、ＦＣＡと植物エキスの乳化物の皮内注射を行った。第２回目の感作処置では第１回感作処置の１週間後、同部位に４８時間閉塞貼付を施した。さらに、惹起処置として第２回感作処置の２週間後、除毛した背部又は側腹部に２４時間閉塞貼付を行った。皮膚感作性の判定は、貼付除去後２４時間及び４８時間目に投与部位を肉眼にて観察した。Ａｄｊｕｖａｎｔを用いない試験法は、白色モルモットを試験動物とし、１群５匹以上の例数を確保した。投与経路は経皮とし、感作処置は１回／週、合計３回行い、除毛した背部皮膚に植物エキスを６時間閉塞貼付した。惹起処置として、３回目の貼付終了２週間後、側腹部に６時間の閉塞貼付を施した。皮膚感作性の判定は、貼付除去後２４時間及び４８時間目に投与部位を肉眼にて観察した。
なお、植物エキスは緑茶エキス（市販品の緑茶リキッド）、セージエキス（市販品のファルコレックスセージＥ）、ボタンピエキス（市販品のファルコレックス ボタンピE）を使用した。
結果を以下表１に示す。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
（試験例２）OECD TG422E（非特許文献2）の試験法による評価
試験例１と同じ植物エキスを使用して評価を行った
THP-1細胞（ATCCより購入）をRPMI1640（含10%FBS）培地を用いて2×106 細胞／mLに調製し、24wellプレートに500μL/wellずつ播種した。被験物質である植物エキスはTG422Eに基づきCV75決定試験を行った。いずれも最高濃度の5000μg/mLでも細胞毒性を示さなかったため、5000μg/mLから公比1.2で7濃度振り、細胞を播種したプレートにそれぞれ500μLずつ加えた。
処理した細胞はCO2インキュベーター中で24時間曝露した。曝露後の細胞をFACS 
buffer（0.1%w/v BSA）を用いて洗浄し、Blocking buffer（含1%w/v globulin ）でブロッキング後、FITCで蛍光標識した抗ヒトCD86抗体を用いて氷上で30分間染色した。染色した細胞をFACS bufferを用いて2度洗浄し，FACS buffer 200μLに再懸濁した。この細胞懸濁液を用いてフローサイトメトリーにより生細胞1×104 cellsの蛍光強度を測定し、生理食塩水を作用させたコントロールと比較した。生細胞の検出はPI染色により行った。
【００２０】
＜試験結果＞
結果を図１に示す。OECD TG422Eの試験法どおりに試験を行った結果、植物エキス3種すべてで皮膚感作性が認められなかった（RFIの値がCD86≧150を満たさない）。このことから、この試験法では植物エキスの皮膚感作性を予測するには感度が不足しているということが明らかとなった。
【００２１】
（実施例１）本発明の短時間曝露法（ＳＴＥ法（短時間、高濃度で曝露する試験法））による評価
試験例１と同じ植物エキスを用いて評価を行った。
THP-1細胞（ATCCより購入）をRPMI1640（含10%FBS）培地を用いて1×106 細胞／mLに調製し、1.5mLチューブに1mLずつ分注後、遠心し培地を除去した。被験物質である植物エキスはCV75決定試験を行い、緑茶：122785μg/mL、セージ：52761μg/mL、ボタンピ：257305μg/mLとなった。それぞれのCV75に従い、生理食塩水を用いて濃度を適宜決定し、500μLずつ培地を除去した細胞に5分間曝露した。曝露後、PBSで2度洗浄し、培地を1mL加え、24wellプレートに播種し、後培養を24時間行った。
後培養後の細胞をFACS buffer（0.1%w/v BSA）を用いて洗浄し、Blocking buffer（含1%w/v globulin ）でブロッキング後、FITCで蛍光標識した抗ヒトCD86抗体を用いて氷上で30分間染色した。染色した細胞をFACS bufferを用いて2度洗浄し，FACS buffer 200μLに再懸濁した。この細胞懸濁液を用いてフローサイトメトリーにより生細胞1×104 cellsの蛍光強度を測定し、生理食塩水を作用させたコントロールと比較した。生細胞の検出はPI染色により行った。
【００２２】
＜試験結果＞
結果を図２に示す。短時間曝露法で試験を行った結果、動物（＋Adjuvant）で陽性となっているエキス2種（緑茶エキス、セージエキス）については皮膚感作性が認められた（RFIの値がCD86≧150を満たしている）。しかし、動物（＋Adjuvant）で陰性と判定がなされているボタンピエキスでは、皮膚感作性が認められなかった。
このことから、本発明の評価法を用いた試験では、植物エキスの皮膚感作性を予測し得ることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明の評価方法により、これまで検出できなかった植物エキスの皮膚感作性を評価することが可能となるので、化粧品、香料などの香粧品分野において、動物を用いずに植物エキスの感作性の有無及び強弱の評価が可能となる。
【図１】
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【図２】
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