(57)【要約】      （修正有）【課題】広域中和抗ＨＩＶ抗体の提供。【解決手段】相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３が特定のアミノ酸配列からなる群より選択されるＣＤＲセットのそれぞれの配列を含む、抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３が、配列番号６９〜７４のアミノ酸配列、配列番号３９〜４４のアミノ酸配列、配列番号５１〜５６のアミノ酸配列、配列番号５７〜６２のアミノ酸配列、配列番号６３〜６８のアミノ酸配列、配列番号７５〜８０のアミノ酸配列、配列番号８１〜８６のアミノ酸配列、配列番号８７〜９２のアミノ酸配列、配列番号９３〜９８のアミノ酸配列、配列番号９９〜１０４のアミノ酸配列、および配列番号１３１〜１３６のアミノ酸配列から成る群より選択されるＣＤＲセットのそれぞれの配列を含む、単離された抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項２】
重鎖および軽鎖が、配列番号１３〜１４のアミノ酸配列、配列番号３〜４のアミノ酸配列、配列番号７〜８のアミノ酸配列、配列番号９〜１０のアミノ酸配列、配列番号１１〜１２のアミノ酸配列、配列番号１５〜１６のアミノ酸配列、配列番号１７〜１８のアミノ酸配列、配列番号１９〜２０のアミノ酸配列、配列番号２１〜２２のアミノ酸配列、配列番号２３〜２４のアミノ酸配列、および配列番号１２９〜１３０のアミノ酸配列のそれぞれの配列を含む、請求項１に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項３】
前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１または２に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分のＣＤＲ、重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードする配列を含む、単離された核酸。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸を含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターを含む培養細胞。
【請求項７】
（ｉ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の少なくとも１つの抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分と（ｉｉ）医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項８】
ＨＩＶ感染症またはＨＩＶ関連疾患を予防または治療する方法において使用するための医薬組成物であって、
前記方法が、
かかる予防または治療を必要とする患者を同定する工程；および
治療有効量の請求項１〜３のいずれか１項に記載の少なくとも１つの抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分、を含む第一の治療薬を前記患者に投与する工程
を含む、医薬組成物。
【請求項９】
第二の治療薬を投与する工程をさらに含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記第二の治療薬が、抗ウイルス薬である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項６に記載の培養細胞を得る工程、
前記細胞を、前記ベクターによってコードされているポリペプチドを発現できる条件下および抗体またはその断片の構築する条件下、培地中で培養する工程、ならびに
前記抗体またはその断片を前記培養細胞または前記細胞の培地から精製する工程
を含む、抗ＨＩＶ抗体またはその断片の作製方法。
【請求項１２】
医薬的有効量の請求項１〜３のいずれか一項に記載の少なくとも１つの単離された抗ＨＩＶ抗体の医薬的に許容される投与単位と、
医薬的有効量の抗ＨＩＶ剤の医薬的に許容される投与単位と
を含み、
前記２つの医薬的に許容される投与単位が、単一の医薬的に許容される投与単位の形態を任意にとることができる、キット。
【請求項１３】
前記抗ＨＩＶ剤が、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、侵入または融合阻害剤、およびインテグラーゼ阻害剤から成る群より選択されるものである、請求項１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に従って、２０１２年１０月１８日出願の米国
特許仮出願第６１／７１５，６４２号の優先権を主張し、その全体を参照により本明細書
に援用する。
【０００２】
連邦政府支援の研究または開発に関する陳述
本明細書に開示する発明は、少なくとも一部は、アメリカ国立衛生研究所からの助成番
号Ｐ０１  ＡＩ０８１６７７のもと政府支援によりなされた。したがって、アメリカ合衆
国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）に対する広域かつ強力な抗体に関する
。
【背景技術】
【０００４】
ＨＩＶは、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こし、生命を危うくする日和見
感染および悪性疾患をもたらす、消耗症候群、中枢神経系変性および強い免疫抑制をはじ
めとする臨床像を特徴とする、ヒトにおける状態である。１９８１年のその発見以来、Ｈ
ＩＶ１型（ＨＩＶ−１）により、世界中で少なくとも２千５００万人が死亡している。Ｈ
ＩＶ感染がたとえ毎年２．５％減少したとしても、今後２０年にわたって２〜６千万人が
感染することになると予測される。ＨＩＶ感染の治療または抑制のための治療薬および方
法が必要とされている。
【０００５】
一部のＨＩＶ感染者は、彼らの血清中に広域中和ＩｇＧ抗体を見せる。しかし、これら
の抗体の特異性および活性に関しては、有効なワクチンを設計する上でのそれらの潜在的
重要性にもかかわらず、殆ど判っていない。動物モデルにおいて、中和抗体の受動伝達は
、ウイルス攻撃に対する防御の一因となり得る。中和抗体応答は、ＨＩＶ感染者において
も発現され得るが、血清応答の詳細な構成は、まだ十分に明らかにされていない。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、広域中和抗ＨＩＶ抗体の新規カテゴリーに関する。前記抗体のコンセンサス
重および軽鎖アミノ酸配列を下に列挙するとともに、図３ａおよび３ｂに示す：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＳＶＳＧＸ１ＳＸ２Ｘ３ＤＸ４ＹＷＳ
ＷＩＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＶＨＤＳＧＤＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＸ５Ｘ６ＳＬＤＴ
ＳＫＮＱＶＳＬＫＬＸ７Ｘ８ＶＴＡＡＤＳＡＸ９ＹＹＣＡＲＡＸ１０ＨＧＸ１１ＲＩＹＧ
ＩＶＡＦＧＥＸ１２ＦＴＹＦＹＭＤＶＷＧＫＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１）
ＳＸ１ＶＲＰＱＰＰＳＬＳＶＡＰＧＥＴＡＲＩＸ２ＣＧＥＸ３ＳＬＧＳＲＡＶＱＷＹＱ
ＱＲＰＧＱＡＰＳＬＩＩＹＮＮＱＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＰＤＸ４Ｘ５ＦＧＴＴＡＴ
ＬＴＩＴＸ６ＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＨＩＷＤＳＲＸ７ＰＴＸ８ＷＶＦＧＧＧＴＴＬＴＶ
Ｌ（配列番号２）。
【０００７】
配列番号１または２の配列において、各「Ｘ」は、いずれのアミノ酸残基であってもよ
く、またはアミノ酸がなくてもよい。好ましくは、各Ｘは、図３ａおよび３ｂに示すよう
なクローナル変異体１０−２５９、１０−３０３、１０−４１０、１０−８４７、１０−
９９６、１０−１０７４、１０−１１２１、１０−１１３０、１０−１１４６、１０−１
３４１および１０−１３６９、ならびに１０−１０７４抗体の人工修飾バージョン、１０
−１０７４ＧＭ、の対応する位置の残基であり得る。
【０００８】
したがって、本発明の１つの態様は、配列番号３３〜３８から成る群より選択される配
列を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する、単離された抗ＨＩＶ抗
体、またはその抗原結合部分を特徴とするが、ただし、前記抗体が、抗体ＰＧＴ−１２１
、１２２または１２３でないことを条件とする。配列番号３３〜３８は、図３ａおよび３
ｂに示すようなＫａｂａｔシステムによる重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ）１〜３および軽鎖ＣＤ
Ｒ（ＣＤＲＬ）１〜３の配列を指す。１つの実施形態において、前記ＣＤＲは、配列番号
３９〜１０４から成る群より選択される配列、すなわち、下記表１に示すようなＫＡＢＡ
ＴシステムによるＣＤＲ配列を含有することができる。あるいは、前記ＣＤＲは、下記表
１に示すようなＩＭＧＴシステムによる、それらの対応する抗体のＣＤＲ配列から選択さ
れる配列を含有することができる。
【０００９】
１つの実施形態において、前記単離された抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分は、
ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含有し、この際前記ＣＤ
ＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、配列番号３３〜３５のそれぞれの配列を含む。
前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、配列番号３９〜４１、配列番号４５〜
４７、配列番号５１〜５３、配列番号５７〜５９、配列番号６３〜６５、配列番号６９〜
７１、配列番号７５〜７７、配列番号８１〜８３、配列番号８７〜８９、配列番号９３〜
９５、配列番号９９〜１０１、および配列番号１３１〜１３３から成る群より選択される
ＣＤＲＨセットのそれぞれの配列も含むことができる。あるいは、前記ＣＤＲＨは、下記
表１に示すようなＩＭＧＴシステムによる、それらの対応する抗体のＣＤＲ配列から選択
されるそれぞれの配列を含有することができる。
【００１０】
別の実施形態において、前記単離された抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分は、Ｃ
ＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含有し、この際前記ＣＤＲ
Ｌ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、配列番号３６〜３８のそれぞれの配列を含む。例
えば、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、配列番号４２〜４４、配列番号
４８〜５０、配列番号５４〜５６、配列番号６０〜６２、配列番号６６〜６８、配列番号
７２〜７４、配列番号７８〜８０、配列番号８４〜８６、配列番号９０〜９２、配列番号
９６〜９８、配列番号１０２〜１０４、および配列番号１３４〜１３６から成る群より選
択されるＣＤＲＬセットのそれぞれの配列を含むことができる。あるいは、前記ＣＤＲＬ
は、下記表１に示すようなＩＭＧＴシステムによる、それらの対応する抗体のＣＤＲ配列
から選択されるそれぞれの配列を含有することができる。
【００１１】
さらにもう１つの実施形態において、上述の単離された抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原
結合部分は、（ｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、（
ｉｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む。前記ＣＤ
ＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、配列番
号３９〜４４、配列番号４５〜５０、配列番号５１〜５６、配列番号５７〜６２、配列番
号６３〜６８、配列番号６９〜７４、配列番号７５〜７９、配列番号８１〜８６、配列番
号８７〜９２、配列番号９３〜９８、配列番号９９〜１０４、および配列番号１３１〜１
３６から成る群より選択されるＣＤＲセットのそれぞれの配列を含むことができる。ある
いは、前記ＣＤＲＨおよびＣＤＲＬは、下記表１に示すようなＩＭＧＴシステムによる、
それらの対応する抗体のＣＤＲ配列から選択されるそれぞれの配列を含有することができ
る。
【００１２】
さらなる実施形態において、前記単離された抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分は
、（ｉ）配列番号１のコンセンサスアミノ酸配列を有する重鎖および（ｉｉ）配列番号２
のコンセンサスアミノ酸配列を有する軽鎖の、一方または両方を含有する。前記重鎖は、
配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３および１２９から
成る群より選択される配列を含有することができ、および前記軽鎖は、配列番号４、６、
８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および１３０から成る群より選択
される配列を含有することができる。例えば、前記重鎖および前記軽鎖は、配列番号３〜
４、配列番号５〜６、配列番号７〜８、配列番号９〜１０、配列番号１１〜１２、配列番
号１３〜１４、配列番号１５〜１６、配列番号１７〜１８、配列番号１９〜２０、配列番
号２１〜２２、配列番号２３〜２４、および１２９〜１３０のそれぞれの配列を含むこと
ができる。
【００１３】
好ましい実施形態において、前記単離された抗ＨＩＶ抗体は、１０−２５９、１０−３
０３、１０−４１０、１０−８４７、１０−９９６、１０−１０７４、１０−１０７４Ｇ
Ｍ、１０−１１２１、１０−１１３０、１０−１１４６、１０−１３４１、および１０−
１３６９から成る群より選択されるものである。それらの対応する重鎖可変領域、軽鎖可
変領域、ＣＤＲＨ１〜３およびＣＤＲＬ１〜３を図３ａおよび３ｂに示す。さらに好まし
い実施形態において、前記単離された抗ＨＩＶ抗体は、１０−１０７４様抗体、すなわち
、１０−８４７、１０−９９６、１０−１０７４、１０−１０７４ＧＭ、１０−１１４６
、および１０−１３４１からなる群より選択されるものである。この群の抗体は、現在の
ウイルスを中和する点でＰＧＴ１２１より強力である。上で論じた抗体は、ヒト抗体、ヒ
ト化抗体、またはキメラ抗体であることができる。
【００１４】
第二の態様において、本発明は、上で論じた抗ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分、
のＣＤＲ、重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードする配列を有する、単離された核酸
を提供する。前記核酸を有するベクター、および前記ベクターを有する培養細胞も特徴と
する。
【００１５】
前記核酸、ベクターおよび培養細胞を、抗ＨＩＶ抗体またはその断片を作るための方法
に用いることができる。この方法は、数ある中でも、上述の培養細胞を得る工程、前記細
胞を、そのベクターによってコードされているポリペプチドの発現および抗体またはその
断片の構築を可能にする条件下で培地において培養する工程、および前記抗体または断片
を前記培養細胞または前記細胞の培地から精製する工程を含む。
【００１６】
第三の態様において、本発明は、（ｉ）上述の少なくとも１つの抗ＨＩＶ抗体、または
その抗原結合部分と（ｉｉ）医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を特徴とする。
【００１７】
第四の態様において、本発明は、ＨＩＶ感染またはＨＩＶ関連疾患を予防または処置す
る方法を提供する。この方法は、数ある中でも、かかる予防または治療を必要とする患者
を特定するステップ；および治療有効量の上述の少なくとも１つの抗ＨＩＶ抗体、または
その抗原結合部分、を含有する第一の治療薬を前記患者に投与するステップを含む。前記
方法は、第二の治療薬、例えば、抗ウイルス薬を投与するステップをさらに含むことがで
きる。
【００１８】
第五の態様において、本発明は、医薬的有効量の上述の少なくとも１つの単離された抗
ＨＩＶ抗体、またはその抗原結合部分、の医薬的に許容される投与単位と、医薬的有効量
の抗ＨＩＶ薬の医薬的に許容される投与単位とを有するキットを提供する。前記２つの医
薬的に許容される投与単位は、単一の医薬的に許容される投与単位の形態を場合によって
はとることができる。例示的抗ＨＩＶ薬は、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテア
ーゼ阻害剤、侵入または融合阻害剤、およびインテグラーゼ阻害剤から成る群より選択さ
れるものであることができる。
【００１９】
第六の態様において、本発明は、被検体におけるＨＩＶ感染の診断、予後または治療モ
ニタリング用のキットを提供する。前記キットは、被検体からの生体試料中の抗ＨＩＶ中
和抗体に特異的に結合する１つ以上の検出試薬を含有する。前記キットは、ＰＣＲまたは
質量分析を行うための試薬をさらに含むことができる。
【００２０】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を下の説明の中で述べる。本発明の他の特徴、目的
および利点は、その説明およびクレームからはっきりするであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１−１】ＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様変異体の中和活性を示す図である。（Ａ）ＴＺＭ−ｂｌアッセイにおけるＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様抗体の中和効力を比較するヒートマップ。より濃い色＝より強力な中和；白色＝中和なし。（Ｂ）９ウイルスに対する平均ＩＣ８０（ｙ軸）とｇｐ１２０およびｇｐ１４０への結合についての見かけのＫＤ値（ｘ軸）の間の相関関係。
【図１−２】ＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様変異体の中和活性を示す図である。（Ｃ）１１９ウイルスの拡張パネルに対するＴＺＭ−ｂｌアッセイにおけるＰＧＴ１２１、１０−９９６および１０−１０７４抗体の中和幅および効力を比較するグラフ。ｙ軸は、ｘ軸上に示されている濃度までのＩＣ５０値の累積度数を示す。クモの巣グラフ（左上角）は、ＨＩＶ−１クレードによる中和されたウイルスの度数分布を示す。（Ｄ）モル中和率（ＭＮＲ；ＦａｂとＩｇＧのＩＣ５０濃度比）を示すドットプロット。水平のバーは、全ウイルスの平均ＩＣ５０を表す。
【図１−３】ＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様変異体の中和活性を示す図である。（Ｅ）過去（Ｈｉｓｔ．）および現在（Ｃｏｎｔ．）の抗体陽転者から単離したウイルスに対するＰＧＴ１２１（濃い灰色）および１０−１０７４（薄い灰色）の中和効力を比較する棒グラフ。ｎｓ、有意でない；＊＊、ｐ＜０．００５。ＰＧＴ１２１および１０−１０７４による現在のウイルスの中和についての中央値ＩＣ５０間の倍数での差（ｆｏｌｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を示す。
【図２】ＰＧＴ１２１ＧＭおよび１０−１０７４ＧＭ突然変異体抗体の結合および中和活性を示す図である。（Ａ）１０−１０７４、ＰＧＴ１２１、ＰＧＴ１２１ＧＭおよび１０−１０７４ＧＭ抗体とｇｐ１２０およびｇｐ１４０との結合についての見かけのＫＤ値を比較する棒グラフ。エラーバーは、３回の独立した実験から得たＫＤ値のＳＥＭを示す。「野生型」対「グリコミュータント（ｇｌｙｃｏｍｕｔａｎｔ）」抗体のＫＤ値間の倍数での差を示す。（Ｂ）グリカン（図７Ａ）のＰＧＴ１２１および１０−１０７４による結合と突然変異体抗体（ＰＧＴ１２１ＧＭおよび１０−１０７４ＧＭ）による結合とを比較する棒グラフ。結合の数値スコアを、１スポットにつき５ｆｍｏｌで整列させたプローブについての蛍光強度（２反復スポットでの平均）として測定する。（Ｃ）４０ウイルスのパネルに対するＴＺＭ−ｂｌアッセイにおけるＰＧＴ１２１、ＰＧＴ１２１ＧＭ、１０−１０７４および１０−１０７４ＧＭ抗体の中和幅および効力を比較するカバレッジグラフ。
【図３−１】ＰＧＴ１２１および１０−１０７４クローナル変異体の配列アラインメントを示す図である。（Ａ）ＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様抗体の重鎖（ＩｇＨ）ならびにすべてのクローナル変異体についての推定生殖細胞系（ＧＬ）ＶＨのアミノ酸アラインメント。Ｋａｂａｔ（．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １３２（２）：２１１−２５０）およびＩＭＧＴ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３７（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ１００６−１０１２）により定義された、結晶構造、フレームワーク（ＦＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）に基づくアミノ酸番号付けを示す。カラー陰影は、酸性（赤色）、塩基性（青色）およびチロシン（緑色）アミノ酸を示す。
【図３−２】ＰＧＴ１２１および１０−１０７４クローン変異体の配列アラインメントを示す図である。（Ｂ）Ａと同じだが、軽鎖（ＩｇＬ）についてのもの。
【図４】ＰＧＴ１２１および１０−１０７４クローナル変異体の結合親和性を示す図である。（Ａ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定したＰＧＴ１２１  ＩｇＧ抗体変異体とＹＵ−２  ｇｐ１４０およびｇｐ１２０リガンドとの相互作用の結合親和性。Ｍ、ｍｏｌ／Ｌ；ｓ、秒；ＲＵ、応答単位；／、検出された結合なし。カイ２値（Χ２）＜１０は、曲線へのフィッティングに用いた１：１結合モデルが実験データを十分に説明することを示す。示されている平衡および速度定数は、ＩｇＧの二価結合の結果として生ずる結合活性効果を説明するための「見かけの」定数と考えられる。（Ｂ）ＰＧＴ１２１様（青色陰影）および１０−１０７４様（緑色陰影）についての会合（ｋａ）および解離（ｋｄ）速度定数を示すドットプロット。（Ｃ）ＩｇＧ抗体のｇｐ１２０およびｇｐ１４０へのそれらの結合についてのｋａおよびｋｄ値（ｘ軸）を、表４に示す９ウイルスに対するそれらの中和効力（平均ＩＣ８０値）（ｙ軸）に対して比較する線形回帰グラフ。
【図５−１】ｇｐ１２０「コア」タンパク質、ｇｐ１２０ＧＤ３２４−５ＡＡ突然変異体および線状ｇｐ１２０Ｖ３ペプチドへのＰＧＴ１２１変異体の結合を示す図である。（Ａ）無傷のＹＵ−２  ｇｐ１２０と比較したＨＸＢ２  ｇｐ１２０コアおよび２ＣＣ−コアタンパク質へのＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様抗体のＥＬＩＳＡベースの結合分析。ｘ軸は、ｙ軸上に示されているＥＬＩＳＡ値（ＯＤ４０５ｎｍ）を得るために要した抗体濃度（Ｍ）を示す。抗ＣＤ４ｂｓ抗体ＶＲＣ０１（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９（５９９３）：８５６−８６１）、抗Ｖ３ループ抗体１０−１８８（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６（９）：ｅ２４０７８）および非ＨＩＶ反応性抗体ｍＧＯ５３（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１（５６３８）：１３７４−１３７７）を対照として使用した。すべての実験を少なくとも２反復で行った。代表データを示す。
【図５−２】ｇｐ１２０「コア」タンパク質、ｇｐ１２０ＧＤ３２４−５ＡＡ突然変異体および線状ｇｐ１２０Ｖ３ペプチドへのＰＧＴ１２１変異体の結合を示す図である。（Ｂ）（Ａ）と同じだが、ｇｐ１２０ＧＤ３２４−５ＡＡ突然変異体タンパク質への結合についてのもの。すべての実験を少なくとも２回行った。代表データを示す。
【図５−３】ｇｐ１２０「コア」タンパク質、ｇｐ１２０ＧＤ３２４−５ＡＡ突然変異体および線状ｇｐ１２０Ｖ３ペプチドへのＰＧＴ１２１変異体の結合を示す図である。（ｃ）ｇｐ１２０Ｖ３−Ｃ３オーバーラッピングペプチドに対するＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様抗体ならびに対照抗体（陽性対照、１０−１８８、１−７９、２−５９および２−１２６１（Ｎａｔｕｒｅ  ４５８（７２３８）：６３６−６４０））および陰性対照、ｍＧＯ５３）のＥＬＩＳＡ反応性を比較する棒グラフ。ｙ軸は、２μｇ／ｍＬのＩｇＧ抗体を試験することによって得たＥＬＩＳＡ値（ＯＤ４０５ｎｍ）を示す。個々のペプチドのアミノ酸配列を右下に示す。すべての実験を少なくとも２回行った。代表データを示す。
【図６−１】ｇｐ１２０グリコシル化突然変異体および脱グリコシル化ｇｐ１２０へのＰＧＴ１２１の結合を示す図である。（Ａ）ｇｐ１２０、ｇｐ１２０ＮＮＴ３０１−３０３ＡＡＡ、ｇｐ１２０Ｎ３３２Ａおよびｇｐ１２０Ｎ３３２Ａ／ＮＮＴ３０１−３０３ＡＡＡへのＰＧＴ１２１および１０−１０７４抗体変異体のＥＬＩＳＡベースの結合分析。ｘ軸は、ｙ軸上に示されているＥＬＩＳＡ値（ＯＤ４０５ｎｍ）を得るために要した抗体濃度（Ｍ）を示す。黒色断続線および連続線は、陽性（１０−１８８）および陰性（ｍＧＯ５３）抗体対照群の４つの抗原に対する平均反応性を示す。すべての実験を少なくとも２回行った。
【図６−２】ｇｐ１２０グリコシル化突然変異体および脱グリコシル化ｇｐ１２０へのＰＧＴ１２１の結合を示す図である。（Ｂ）未処理ｇｐ１２０（ＷＴ、野生型）、ＰＮＧａｓｅＦ消化ｇｐ１２０およびＥｎｄｏＨ消化ｇｐ１２０を比較する銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ｌ、プロテインラダー。すべての実験を少なくとも２回行った。
【図６−３】ｇｐ１２０グリコシル化突然変異体および脱グリコシル化ｇｐ１２０へのＰＧＴ１２１の結合を示す図である。（Ｃ）（Ａ）と同じだが、未処理ｇｐ１２０とＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理ｇｐ１２０を比較するもの。すべての実験を少なくとも２回行った。
【図６−４】ｇｐ１２０グリコシル化突然変異体および脱グリコシル化ｇｐ１２０へのＰＧＴ１２１の結合を示す図である。（Ｄ）（Ａ）と同じだが、未処理ｇｐ１２０とＥｎｄｏＨ処理ｇｐ１２０を比較するもの。すべての実験を少なくとも２回行った。
【図７−１】グリカンへのＰＧＴ１２１および１０−１０７４クローナル変異体の結合を示す図である。（Ａ）Ｎ−グリカンへの直接結合をＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様抗体について調査するためのグリカンマイクロアレイ分析において使用した１５  Ｎ−グリカンプローブのセットの単糖類配列。ＤＨは、Ｎ−グリカンが還元アミノ化によって結合された脂質タグ１，２−ジヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＨＰＥ）を示す。注目すべき重要な特徴は、（ｉ）ＰＧＴ１２１群抗体は、１−３結合によってコアマンノースに連結されたガラクトース末端アンテナを有するモノアンテナＮ−グリカンプローブ１０（Ｎ２）を結合したが、コアマンノースに１−６結合されたアンテナを有する異性体Ｎ−グリカンプローブ１１（指定Ｎ４）を結合しなかったこと；（ｉｉ）バイアンテナプローブ１３（ＮＡ２）の場合と同様に、このガラクトース末端１−６結合アンテナの存在は、結合を許容し、（α２−３結合ではなく）α２−６結合シアル酸の存在も許容したこと、（ｉｉｉ）ガラクトースがなく、Ｎ−アセチルグルコサミンで終わる、バイアンテナプローブ１２（ＮＧＡ２）は、結合されなかった、ことである。
【図７−２】グリカンへのＰＧＴ１２１および１０−１０７４クローン変異体の結合を示す図である。（Ｂ）ＰＧＴ１２１様、１０−１０７４様および生殖細胞系列型（ＧＬ）抗体によるグリカン結合を比較する棒グラフ。１０−１８８、すなわち抗Ｖ３ループ抗体、を陰性対照として使用した。結合の数値スコアを１スポットにつき２ｆｍｏｌ（白色）および５ｆｍｏｌ（灰色）で配列したプローブについての蛍光強度（２回のスポットでの平均）として測定した。
【図８−１】高マンノースのみの（ｈｉｇｈ−ｍａｎｎｏｓｅ−ｏｎｌｙ）ｇｐ１２０およびウイルスに対する抗体結合および中和活性を示す図である。（Ａ）キフネンシンで処理した細胞において生産されたＹＵ−２  ｇｐ１２０（ｇｐ１２０ｋｉｆ）と未処理細胞において生産されたｇｐ１２０（ＷＴ、野生型）を比較する銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ｌ、プロテインラダー。（Ｂ）ＹＵ−２  ｇｐ１２０（ｇｐ１２０ＷＴ）およびｇｐ１２０ｋｉｆへのＰＧＴ１２１様（青色ラベル）および１０−１０７４様（緑色ラベル）抗体の結合のＥＬＩＳＡ比較。ｘ軸は、ｙ軸に示されているＥＬＩＳＡ値（ＯＤ４０５ｎｍ）を得るために要した抗体濃度（Ｍ）を示す。
【図８−２】高マンノースのみの（ｈｉｇｈ−ｍａｎｎｏｓｅ−ｏｎｌｙ）ｇｐ１２０およびウイルスに対する抗体結合および中和活性を示す図である。（Ｃ）キフネンシンの存在（ウイルスｋｉｆ）または不在（ウイルスＷＴ）下で生産された選択ＰＧＴ１２１感受性／１０−１０７４耐性シュードウイルスに対して評価したＰＧＴ１２１についての中和曲線。水平断続線は５０％中和を示し、ＩＣ５０値をｘ軸上の抗体濃度から得ることができる。実験を３回行った。エラーバーは、３回測定のＳＤを示す。（Ｄ）ＨＥＫ２９３Ｓ  ＧｎＴＩ−／−細胞（ウイルスＧｎＴ−／−）においてまたは野生型細胞（ウイルスＷＴ）において生産されたＹＵ−２およびＰＶＯ．４シュードウイルスに対する選択抗体の中和活性を比較する棒グラフ。ｙ軸は、ｘ軸上に示されているウイルスの中和についての平均ＩＣ５０値（μｇ／ｍＬ）を示す。エラーバーは、２回の独立した実験から得たＩＣ５０値のＳＥＭを示す。
【図９−１】ＰＧＴ１２１、１０−９９６および１０−１０７４の中和活性を示す図である。（Ａ）示されているＨＩＶ−１クレードのウイルスに対するＰＧＴ１２１、１０−９９６および１０−７４の（ＴＺＭ−ｂｌアッセイおよび１１９シュードウイルスのパネルを使用して決定した）中和効力を比較するグラフ。ｘ軸は、５０％中和（ＩＣ５０）を達成するために要した抗体濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。ｙ軸は、ｘ軸上に示されている濃度までのＩＣ５０値の累積度数を示す。
【図９−２】ＰＧＴ１２１、１０−９９６および１０−１０７４の中和活性を示す図である。（Ｂ）ＴＺＭ−ｂｌ中和アッセイによって決定したときの１１９ウイルスの拡張パネルに対するＰＧＴ１２１、１０−９９６および１０−１０７４の中和幅および効力を比較するグラフ。ｙ軸は、ｘ軸上に示されている濃度までのＩＣ８０値の累積度数を示す。
【図９−３】ＰＧＴ１２１、１０−９９６および１０−１０７４の中和活性を示す図である。（Ｃ）グラフは、ＰＧＴ１２１および１０−１０７４による選択ウイルスの中和曲線を示す。水平断続線は５０％中和を示し、ＩＣ５０値をｘ軸上の抗体濃度から得ることができる。実験を３回行った。エラーバーは、３回測定のＳＤを示す。
【図１０】過去対現在のクレードＢウイルスに対する中和活性を示す図である。選択ｂＮＡｂについての過去（Ｈｉｓｔ．）と、現在（Ｃｏｎｔ．）の抗体陽転者から単離したクレードＢウイルスに対する中和効力とを比較するドットプロット。水平バーは、患者１人あたりの全ウイルスについての中央値ＩＣ５０を表す。群間差をマン・ホイットニー検定を用いて評価した。ｎｓ、有意でない。
【図１１】１１広域作用性抗ＨＩＶ−１  ｍＡｂのパネルでの２つのＲ５指向性ＳＨＩＶの中和を示す表である。ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯ（Ａ）およびＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８（Ｂ）を中和するための算出ＩＣ５０値。
【図１２】受身投与された中和ｍＡｂの血漿濃度とマカクの２つの異なるＲ５ＳＨＩＶの後のウイルス獲得との関係を示す図である。黒丸は、防御された（無獲得）サルを示し；白丸は、感染した動物を指す。
【図１３−１】ｂＮＡｂの血漿濃度を示す表である。血漿試料における中和活性を測定することによりｍＡｂの濃度を決定した。（Ａ）あるｂＮＡｂに対しては感受性であるが、他のｂＮＡｂに対しては感受性でないＨＩＶ−１株（すなわち、ＨＩＶ−１株Ｘ２０８８＿９（１０−１０７４感受性）；ＨＩＶ−１株Ｑ７６９＿ｄ２２（３ＢＮＣ１１７感受性））に対する１０−１０７４および３ＢＮＣ１１７のＴＺＭ．ｂｌ中和アッセイにおいて測定されたＩＤ５０値。（Ｂ）抗体投与前（ｐｒｅＰ）の、しかし０．０１、０．１、１、１０および１００μｇ／ｍＬの抗体１０−１０７４（青色）または３ＢＮＣ１１７（緑色）でスパイクした血漿の中和活性。（Ａ）における測定ＩＤ５０値に基づき、血漿ＩＤ５０力価として報告する（左カラム）および抗体濃度に変換した（右カラム）中和活性。
【図１３−２】ｂＮＡｂの血漿濃度を示す表である。血漿試料における中和活性を測定することによりｍＡｂの濃度を決定した。（Ｃ）示されているマカク血漿試料においてｂＮＡｂ投与前（プレ採血）および後（日数）に測定したＩＤ５０力価（左カラム）およびｂＮＡｂの濃度（右カラム）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、ｇｐ１２０上の、複合型Ｎ−グリカンを含む、炭水化物依存性エピトープを
認識することができる、ＨＩＶに対する広域中和抗体（ｂＮＡｂ）の新規カテゴリーの予
想外の発見に少なくとも一部は基づく。
【００２３】
抗体は、殆どのワクチンの成功に不可欠であり、ＨＩＶに対する抗体は、最近のＲＶ１
４４抗ＨＩＶワクチン試験では防御に唯一相関するものであるようである。一部のＨＩＶ
−１感染患者は、感染の２〜４年後、ｇｐ１６０ウイルススパイクに対して広域中和血清
活性を発現するが、突然変異による自己ウイルス脱出のため、これらの抗体は、感染した
ヒトを一般に防御しない。それにもかかわらず、広域中和活性は、ウイルスに対して選択
圧をかけ、広域中和抗体（ｂＮＡｂ）のマカクへの受動伝達は、ＳＨＩＶ感染に対する防
御になる。それ故、かかる抗体を惹起するワクチンは、ヒトにおけるＨＩＶ感染に対して
防御性であり得ると提案されている。
【００２４】
単個細胞抗体クローニング法の開発により、ｂＮＡｂはＨＩＶ−１  ｇｐ１６０スパイ
ク上のいくつかの異なるエピトープを標的にすることが明らかになった。大部分の強力な
ＨＩＶ−１  ｂＮＡｂは、ＣＤ４結合部位（ＣＤ４ｂｓ）を認識し（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３
３３（６０４９）：１６３３−１６３７；Ｎａｔｕｒｅ  ４７７（７３６５）：４６６−
４７０；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３４（６０６０）：１２８９−１２９３）、かつＶ１／Ｖ２
（ＰＧ９／ＰＧ１６）（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６（５９５０）：２８５−２８９）および
Ｖ３ループ（ＰＧＴ）（Ｎａｔｕｒｅ  ４７７（７３６５）：４６６−４７０）を含む、
可変ループを伴う炭水化物依存性エピトープを認識する（Ｎａｔｕｒｅ  ４７７（７３６
５）：４６６−４７０；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６（５９５０）：２８５−２８９；Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ  ３３４（６０５９）：１０９７−１１０３；Ｎａｔｕｒｅ  ４８０（７３７７
）：３３６−３４３）。今までに研究された抗体は小さなクローンファミリーの固有の例
またはメンバーであるので、炭水化物依存性エピトープについては殆ど判っていない。
【００２５】
ＰＧＴ抗体により標的にされるＨＩＶ−１およびエピトープに対する中和抗体応答をよ
りよく理解するために、我々は、ＰＧＴ１２１を生産したクレードＡ感染患者から、ｇｐ
１６０特異的ＩｇＧメモリー応答を支配する大きいクローンファミリーのメンバーを単離
した。本明細書に開示するように、ＰＧＴ１２１抗体は、配列、結合親和性、中和活性な
らびに炭水化物およびＶ３ループの認識に従って、２つの群、すなわちＰＧＴ１２１様群
および１０−１０７４様群に分かれる。１０−１０７４および関連ファミリーメンバーは
、新規伝播ウイルスに対する広域反応性を含む、珍しい強力な中和を呈示する。以前に特
性付けられた炭水化物依存性ｂＮＡｂとは異なり、ＰＧＴ１２１は、グリカンマイクロア
ッセイ実験において、高マンノースではなく複合型Ｎ−グリカンに結合する。ＰＧＴ１２
１および１０−１０７４の、それらの生殖細胞系前駆体の構造および複合型Ｎ−グリカン
に結合したＰＧＴ１２１の構造と比較した、結晶構造により、それらの独特な特性が合理
的に説明される。
【００２６】
１つの例では、高マンノースではなく複合型Ｎ−グリカンを認識する点でグリカン依存
性ｂＮａｂの中でもユニークである、ＰＧＴ１２１をコードするＢ細胞クローンを単離す
るためにアッセイを行った。ＰＧＴ１２１クローンは、ＰＧＴ１２１様群および１０−１
０７４様群に分かれ、これらは、配列、結合親和性、炭水化物認識および中和活性によっ
て区別される。１０−１０７４群は、無タンパク質のグリカンに検出可能な程度に結合し
ないにもかかわらず、顕著な効力および幅を呈示する。リガンドを持たないＰＧＴ１２１
、１０−１０７４およびそれらの生殖細胞系前駆体の結晶構造は、炭水化物認識差がＣＤ
ＲＨ２とＣＤＲＨ３間のクレフトにマッピングされることを明示し、前記クレフトは、離
れたＰＧＴ１２１構造では複合型Ｎ−グリカンによって占有されていた。ＰＧＴ１２１と
１０−１０７４間のグリカン接触残基の交換により、中和活性におけるこれらの残基の重
要性が確認された。ＨＩＶエンベロープは、高マンノースＮ−グリカンおよび複合型Ｎ−
グリカンの様々な特性を呈示し、したがって、抗ＨＩＶ  ｂＮＡｂによる複合型Ｎ−グリ
カン認識の最初の構造特性付けを含むこれらの結果は、抗体および最終的にはワクチンが
広域中和活性をいかにして実現し得るのかを理解するために重要である。
【００２７】
本明細書において用いる場合の用語「抗体」（Ａｂ）は、モノクローナル抗体、ポリク
ローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体および多反応性抗体）、および
抗体断片を含む。したがって、用語「抗体」は、本明細書におけるいずれの文脈で用いる
場合も、任意の特異的結合メンバー、免疫グロブリンクラスおよび／またはアイソタイプ
（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ
およびＩｇＭ）；ならびにそれらの生物学的に関連した断片または特異的結合メンバー（
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ（一本鎖または関連エンティティ）を、
これらに限定されないが、含む）を、これらに限定されないが、含むことを意図したもの
である。抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖
および２つの軽（Ｌ）鎖を有する糖タンパク質、またはその抗原結合部分であると、当該
技術分野では理解されている。重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ
１、ＣＨ２およびＣＨ３）で構成されている。軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖
定常領域（ＣＬ）で構成されている。重鎖および軽鎖両方の可変領域は、フレームワーク
領域（ＦＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。それら４つのＦＷＲ領域は相対
的に保存される一方で、ＣＤＲ領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）は超可変領域
に相当し、ＮＨ２末端からＣＯＯＨ末端へと次のように配列される：ＦＷＲ１、ＣＤＲ１
、ＦＷＲ２、ＣＤＲ２、ＦＷＲ３、ＣＤＲ３およびＦＷＲ４。重および軽鎖の可変領域は
、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する一方で、そのアイソタイプに依存して、定
常領域（単数または複数）は、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得
る。
【００２８】
本明細書において用いる場合の「抗体」の定義には、キメラ抗体、ヒト化抗体および組
換え抗体、トランスジェニック非ヒト動物から産生されたヒト抗体、ならびに当業者に利
用可能な濃縮技術を用いてライブラリーから選択された抗体も含まれる。
【００２９】
用語「可変」は、可変（Ｖ）ドメインのある一定のセグメントが抗体間で配列の点で大
幅に異なることを指す。Ｖドメインは、抗原結合を媒介し、特定の抗体のその特定の抗原
に対する特異性を規定する。しかし、その可変性は、可変領域の１１０アミノ酸スパン全
体にわたって均一に分布していない。それよりむしろ、Ｖ領域は、各々が９〜１２アミノ
酸長である「超可変領域」と呼ばれる超可変性のより短い領域によって隔てられた、１５
〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチから成
る。天然重鎖のおよび軽鎖の可変領域は、各々、３つの超可変領域によって接続された、
主としてβシート構造をとる、４つのＦＲを含み、前記超可変領域は、前記βシート構造
を接続する、および場合によっては前記βシート構造の一部を形成する、ループを形成す
る。各鎖内の超可変領域は、ＦＲにより極めて互いに近接して互い保持され、他の鎖から
の超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅ
ｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉ
ｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい）。
【００３０】
本明細書において用いる場合の用語「超可変領域」は、抗原結合に関与する、抗体のア
ミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）からのアミノ
酸残基を含む。
【００３１】
本明細書において用いる場合の用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の
集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、少量存在す
ることがある、起こり得る自然発生突然変異を除いて、同一である。用語「ポリクローナ
ル抗体」は、異なる決定基（「エピトープ」）に対して配向した異なる抗体を含む調製物
を指す。
【００３２】
本明細書におけるモノクローナル抗体は、重および／または軽鎖の一部分が、特定の種
に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応す
る配列と同一または相同であるが、前記鎖（単数または複数）の残部は、別の種に由来す
る抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体ならびにかかる抗体の断片
（ただし、それらの断片が所望の生物活性を呈示する場合に限る）における対応する配列
と同一または相同である、「キメラ」抗体を含む（例えば、米国特許第４，８１６，５６
７号明細書；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）を参照されたい）。本記載発明
は、ヒト抗体に由来する可変領域抗原結合配列を提供する。したがって、ここで主に対象
となるキメラ抗体は、１つ以上のヒト抗原結合配列（例えば、ＣＤＲ）を有するとともに
、非ヒト抗体に由来する１つ以上の配列、例えばＦＲまたはＣ領域配列、を含有する抗体
を含む。加えて、ここに含まれるキメラ抗体は、ある抗体クラスまたはサブクラスのヒト
可変領域抗原結合配列と、別の抗体クラスまたはサブクラスに由来する別の配列、例えば
ＦＲまたはＣ領域配列とを含むものである。
【００３３】
「ヒト化抗体」は、一般に、非ヒトであるソースから導入された１つ以上のアミノ酸残
基を有するヒト抗体であると考えられる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基
と呼ばれることが多く、この移入残基は、典型的に、「移入」可変領域から得られる。ヒ
ト化は、ヒト抗体の対応する配列を移入超可変配列で置換することにより、Ｗｉｎｔｅｒ
および共同研究者の方法に従って行ってもよい（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ
ａｔｕｒｅ，  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ
．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  
ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）を参照されたい）。
したがって、かかる「ヒト化」抗体は、インタクトヒト可変領域より実質的に少ない可変
領域が非ヒト種からの対応する配列によって置換されているキメラ抗体（例えば、米国特
許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）である。
【００３４】
「抗体断片」は、インタクト抗体の一部分、例えば、インタクト抗体の抗原結合または
可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ
断片；ダイアボディ；線状抗体（例えば、米国特許第５，６４１，８７０号明細書；Ｚａ
ｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２［
１９９５］を参照されたい）；一本鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成された多重特
異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
「Ｆｖ」は、完全抗原認識および抗原結合部位を含有する最小抗体断片である。この断
片は、緊密な、非共有結合で会合している１重鎖および１軽鎖可変領域ドメインの二量体
を含有する。これらの２つのドメインのフォールディングから、６つの超可変ループ（Ｈ
およびＬ鎖から各々３ループ）が生まれ、前記ループは、アミノ酸残基を抗原結合に与え
、抗原結合特異性を抗体に付与する。しかし、単一可変領域（または抗原に特異的なＣＤ
Ｒを３つだけ含む、Ｆｖの半分）であっても、全結合部位より低い親和性でではあるが、
抗原を認識および結合する能力を有する。
【００３６】
「一本鎖Ｆｖ」（「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」）は、単一ポリペプチド鎖へと接続さ
れたＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨド
メインとＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含むことができ、そのポリペプ
チドリンカーにより、ｓＦｖは抗原結合に望ましい構造を形成することが可能になる。ｓ
Ｆｖの総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏ
ｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ
ｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  １９９５
，ｉｎｆｒａを参照されたい。
【００３７】
用語「ダイアボディ」は、Ｖドメインの鎖内対合ではなく鎖間の対合が実現され、その
結果、二価断片、すなわち、２つの抗原結合部位を有する断片になるように、ＶＨドメイ
ンとＶＬドメイン間に短いリンカー（約５〜１０残基）を有するｓＦｖ断片を構築するこ
とによって調製された、小さい抗体断片を指す。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体
のＶＨおよびＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する２つの「交差」ｓＦｖ断
片のヘテロ二量体である。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書
；国際公開第９３／１１１６１号パンフレット；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ
．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９
９３）に、より十分に記載されている。
【００３８】
完全ヒト形態で生産することができるドメイン抗体（ｄＡｂ）は、約１１ｋＤａから約
１５ｋＤａの範囲の、抗体の最小の公知抗原結合断片である。ｄＡｂは、免疫グロブリン
の重および軽鎖（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）の頑強な可変領域である。それらは、微生
物細胞培養で高度に発現され、例えば溶解度および温度安定性を含む（しかしこれらに限
定されない）好適な生物物理学的特性を示し、ならびに例えばファージディスプレイなど
のインビトロ選択システムによる選択および親和性成熟によく適している。ｄＡｂは、単
量体として生物活性であり、それらの小さいサイズおよび固有の安定性のおかげで、より
大きい分子にフォーマットして、長期血清半減期または他の薬理活性を有する薬物を作る
ことができる。これらの技術の例は、例えば、ラクダ重鎖Ｉｇに由来する抗体について国
際公開第９４２５５９１号パンフレットに記載されており、加えて、米国特許出願公開第
２００３０１３０４９６号明細書にはファージライブラリーからの単一ドメイン完全ヒト
抗体の単離が記載されている。
【００３９】
ＦｖおよびｓＦｖは、定常領域が全くないインタクト結合部位を有する唯一の種である
。したがって、それらは、インビボ使用中の非特異的結合低減に適している。ｓＦｖ融合
タンパク質を、ｓＦｖのアミノまたはカルボキシ末端いずれかでエフェクタータンパク質
の融合を生じさせるように構築することができる。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，上掲を参照されたい。前記抗体断片は、
例えば米国特許第５，６４１，８７０号明細書に記載されているような、例えば「線状抗
体」であることもできる。かかる線状抗体断片は、単一特異性または二重特異性であるこ
とができる。
【００４０】
ある実施形態において、本記載発明の抗体は、二重特異性または多重特異性である。二
重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体で
ある。例として、二重特異性抗体は、単一の抗原の２つの異なるエピトープに結合するこ
とができる。他のかかる抗体は、第一の抗原結合部位と第二の抗原のための結合部位を組
み合わせることができる。あるいは、抗ＨＩＶアームを、白血球上のトリガー分子、例え
ばＴ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ３）、またはＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃガンマＲ）、
例えばＦｃガンマＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃガンマＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃガンマＲ
ＩＩＩ（ＣＤ１６）、に結合するアームと組み合わせて、細胞防御メカニズムを感染細胞
に集中および局在させることができる。二重特異性抗体を使用して、殺細胞剤を感染細胞
に局在させることもできる。二重特異性抗体を、完全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ
（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。例えば、国際公開第９６／
１６６７３号パンフレットには二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃガンマＲＩＩＩ抗体が記
載されており、米国特許第５，８３７，２３４号明細書には二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗
ＦｃガンマＲＩ抗体が開示されている。例えば、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗Ｆｃアルフ
ァ抗体は、国際公開第９８／０２４６３号パンフレットにおいて報告されており；米国特
許第５，８２１，３３７号明細書には二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体が教示され
ている。例えば、Ｍｏｕｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌｙｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎ
ｃｒｅａｓｅｓ  Ｔｈｅ  Ａｐｐａｒｅｎｔ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｏｆ  Ａｎｔｉ−ＨＩ
Ｖ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｂｙ  Ｈｅｔｅｒｏｌｉｇａｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ．４
６７，５９１−５（２０１０）、およびＭｏｕｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅ
ｄ  ＨＩＶ−１  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈｅｔｅｒ
ｏｌｉｇａｔｉｏｎ”  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１２
Ｊａｎ  １７；１０９（３）：８７５−８０も参照されたい。
【００４１】
二重特異性抗体の作製方法は、当該技術分野において公知である。完全長二重特異性抗
体の旧来の生産は、２つの免疫グロブリン重−軽鎖対の共発現に基づき、この場合、前記
２本の鎖は異なる特異性を有する（例えば、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ
ｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３）を参照されたい）。類似の手順が、例えば
、国際公開第９３／０８８２９号パンフレット、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，
ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。Ｍｏｕｑｕ
ｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＨＩＶ−１  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  
ｂｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈｅｔｅｒｏｌｉｇａｔｉｏｎ”  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃ
ａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１２  Ｊａｎ  １７；１０９（３）：８７５−８０も参
照されたい。
【００４２】
あるいは、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変領域を免疫グロ
ブリン定常ドメイン配列に融合させる。この融合は、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の
少なくとも一部を含む、Ｉｇ重鎖定常領域とのものである。いくつかの実施形態によると
、軽鎖結合に必要な部位を含有する第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、融合体の少なくと
も１つに存在する。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするおよび所望される場合には免
疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、別個の発現ベクターに挿入し、適する宿主細胞
にコトランスフェクトする。これは、その構築に用いられる不等比の３つのポリペプチド
鎖が所望の二重特異性抗体の最適な収量を与える実施形態では、３つのポリペプチド断片
の相互比率の調整に、より大きい自由度を持たせる。しかし、等比の少なくとも２つのポ
リペプチド鎖の発現が高収量をもたらすとき、または前記比が所望の鎖の組み合わせの収
量に有意な影響を及ぼさないときには、２つのまたは３つすべてのポリペプチド鎖のコー
ド配列を単一の発現ベクターに挿入することが可能である。
【００４３】
抗体断片から二重特異性抗体を生成するための技法も文献に記載されている。例えば、
化学結合を用いて二重特異性抗体を調製することができる。例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅ
ｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）には、インタクト抗体をタンパ
ク質分解切断して、Ｆ（ａｂ’）２断片を生成する手順が記載されている。これらの断片
をジチオール錯化剤、亜ヒ酸ナトリウム、の存在下で還元して、ビシナルジチオールを安
定させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。次いで、生成されたＦａｂ’断片をチオニ
トロ安息香酸塩（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一方を
メルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再変換し、等モル量の他
方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。生成された二重特異
性抗体を、酵素の選択的固定のための薬剤として使用することができる。
【００４４】
抗体の他の修飾を本明細書では企図している。例えば、様々な非タンパク質様ポリマー
の１つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキ
レン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーに、抗体
を結合させることができる。例えばコアセルベーション法によりもしくは界面重合により
調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース、もしく
はゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）
内に、コロイドドラッグデリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロ
スフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）内に、またはマクロエ
マルジョン内に抗体を捕捉することもできる。かかる技法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏ
ｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ
，Ｏｓｌｏ，Ａ．，Ｅｄ．，（１９８０）に開示されている。
【００４５】
典型的には、本記載発明の抗体を、当該技術分野において利用可能なベクターおよび方
法を用いて組換え生産する。インビトロ活性化Ｂ細胞によってヒト抗体を産生することも
できる（例えば、米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号明細
書を参照されたい）。本発明において有用な分子遺伝学および遺伝子工学の一般的方法は
、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，ｅｄｉｔｅｄ
ｂｙ  Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９１．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉ
ｅｇｏ，ＣＡ），“Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”ｉ
ｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ，ｅｄ
．，（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉ
ｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．１９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ
，ＣＡ），Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ
Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９
８７．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、およびＧｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅ
ｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１０９−１２８，ｅｄ
．Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏ
ｎ，Ｎ．Ｊ．）の現行版に記載されている。遺伝子操作のための試薬、クローニングベク
ターおよびキットは、商業ベンダー、例えば、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎＴｅｃｈおよびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．から
入手可能である。
【００４６】
内因性免疫グロブリン生産が不在の状態でヒト抗体の全レパートリーを生産できるトラ
ンスジェニック動物（例えば、マウス）においてヒト抗体を生産することもできる。例え
ば、キメラおよび生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子
のホモ接合型欠失は、内因性抗体生産の完全阻害をもたらすことが記載されている。ヒト
生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイのかかる生殖細胞系突然変異体マウスへの移入は
、抗原チャレンジ時にヒト抗体の生産をもたらす。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３
）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１
９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７
：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同
第５，５９１，６６９号明細書（すべてＧｅｎＰｈａｒｍ）；米国特許第５，５４５，８
０７号明細書；ならびに国際公開第９７／１７８５２号パンフレットを参照されたい。か
かる動物を、本記載発明のポリペプチドを含むヒト抗体を生産するように遺伝子操作する
ことができる。
【００４７】
抗体断片の生産のために様々な技法が開発されている。旧来、これらの断片は、インタ
クト抗体のタンパク質分解消化によって得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａ
ｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ
ｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７  （１９９２）；およびＢｒｅｎｎａｎ  ｅ
ｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。しかし、今
はこれらの断片を遺伝子組換えの宿主細胞によって直接生産することができる。Ｆａｂ、
ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体断片は、すべて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現および大
腸菌から分泌させることができ、このことから大量のこれらの断片の容易な生産が可能で
ある。Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングしてＦ（ａｂ
’）２断片を形成することができる（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）を参照されたい）。別のアプロ
ーチによると、Ｆ（ａｂ’）２断片を遺伝子組換えの宿主細胞培養物から直接単離するこ
とができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む、インビボ半減期が増加された
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、米国特許第５，８６９，０４６号明細書に記載され
ている。抗体断片の他の生産法は、当業者には明白であろう。
【００４８】
ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔ
ｈｕｎ，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：４９３７−４９４２）
、細菌ディスプレイ（Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：２９−３４）および／または酵母ディスプレイ（Ｋｉｅ
ｋｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：  １
３０３−１３１０）を含む（しかしこれらに限定されない）濃縮法を用いてライブラリー
から抗体断片を選択するための当該技術分野において公知である他の技法を前に論じた技
法の代案として用いて、一本鎖抗体を選択してもよい。一本鎖抗体は、糸状ファージ技術
を直接用いて生産された一本鎖抗体のライブラリーから選択される。ファージディスプレ
イ技術は当該技術分野において公知である（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号、
同第５，７３３，７４３号、同第５，８７１，９０７号、同第５，８７２，２１５号、同
第５，８８５，７９３号、同第５，９６２，２５５号、同第６，１４０，４７１号、同第
６，２２５，４４７号、同第６，２９１６５０号、同第６，４９２，１６０号、同第６，
５２１，４０４号、同第６，５４４，７３１号、同第６，５５５，３１３号、同第６，５
８２，９１５号、同第６，５９３，０８１号明細書、ならびに他の米国特許ファミリーメ
ンバー、または１９９２年５月２４日に出願された英国特許第９２０６３１８号に基づく
優先権出願の願書に開示されているようなＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＡＴ）からの技術を参照されたい；Ｖａｕｇｈｎ，ｅｔ  ａｌ．１
９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０９−３１４も参照され
たい）。利用可能な組換えＤＮＡ技術、例えば、ＤＮＡ増幅法（例えば、ＰＣＲ）を用い
て、またはことによるとそれぞれのハイブリドーマｃＤＮＡをテンプレートとして使用す
ることにより、一本鎖抗体を設計し、構築してもよい。
【００４９】
変異体抗体も本発明の範囲に含まれる。したがって、本出願に記載の配列の変異体も本
発明の範囲に含まれる。親和性が向上された抗体配列のさらなる変異体を、当該技術分野
において公知の方法を用いて得ることができ、それらの変異体は本発明の範囲内である。
例えば、アミノ酸置換を用いて、親和性がさらに向上された抗体を得ることができる。あ
るいは、ヌクレオチド配列のコドン最適化を用いて、抗体生産のための発現系における翻
訳効率を向上させることができる。
【００５０】
かかる変異体抗体配列は、本出願に記載の配列と７０％以上の（すなわち、８０％、８
５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の）配列同一性を共有す
ることになる。かかる配列同一性は、基準配列（すなわち、本出願に記載の配列）の完全
長に対して算定される。本明細書において言及するときの同一率は、ＮＣＢＩ（国立生物
工学情報センター；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）により指定されたデ
フォルトパラメータ［Ｂｌｏｓｕｍ  ６２行列；ギャップ開始ペナルティ＝１１およびギ
ャップ伸長ペナルティ＝１］を用いてＢＬＡＳＴバージョン２．１．３を使用して決定し
たときのものである。例えば、本明細書に開示する配列の１つ以上についての少なくとも
約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０以上の近接するペプ
チドおよびこれらの間のすべての中間長のペプチドを含むペプチド配列が本発明によって
提供される。本明細書において用いる場合、用語「中間長」は、引用値間の任意の長さ、
例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９な
ど；２１、２２、２３など；３０、３１、３２など；５０、５１、５２、５３など；１０
０、１０１、１０２、１０３など、１５０、１５１、１５２、１５３などを記述すること
を意図したものである。
【００５１】
本発明は、血清中で広域中和活性を有する抗体を、単独で、または他の抗体、例えば、
ＶＲＣ０１、抗Ｖ３ループ、ＣＤ４ｂｓおよびＣＤ４ｉ抗体ならびにＰＧ９／ＰＧ１６様
抗体（しかしこれらに限定されない）との組み合わせで提供する。
【００５２】
別の実施形態によると、本発明は、ＨＩＶに感染しているまたはＨＩＶ感染の危険があ
るヒトまたは非ヒト霊長類患者に、ヒトにおけるＨＩＶに対する防御免疫応答またはＨＩ
Ｖウイルスの低減の誘導に十分な量およびスケジュールによる投与に適したＨＩＶ抗体組
成物の調製および投与方法を提供する。
【００５３】
別の実施形態によると、本発明は、本発明の少なくとも１つの抗体と医薬的に許容され
る担体とを含むワクチンを提供する。１つの実施形態によると、前記ワクチンは、本明細
書に記載する少なくとも１つの抗体と医薬的に許容される担体とを含むワクチンである。
前記ワクチンは、本明細書に記載する特性を有する複数の抗体を任意の組み合わせで含む
ことができ、および当該技術分野において公知であるようなＨＩＶを中和する抗体をさら
に含むことができる。
【００５４】
組成物が、ワクチン接種後の様々な亜型のＨＩＶ感染の進行を予防的にまたは治療的に
処置するために、本明細書に開示する単一の抗体である場合があり、または同じであるま
たは異なる本明細書に開示する抗体の組み合わせである場合もあることを理解されたい。
かかる組み合わせは、所望の免疫性に従って選択することができる。抗体を動物またはヒ
トに投与するとき、それを、通常の当業者に公知であるような１つ以上の医薬的に許容さ
れる担体、賦形剤またはアジュバントと併用することができる。前記組成物は、ＶＲＣ０
１、ｂ１２、抗Ｖ３ループ、ＣＤ４ｂｓおよびＣＤ４ｉ抗体ならびにＰＧ９／ＰＧ１６様
抗体を含む（しかしこれらに限定されない）、当該技術分野において公知の広域中和抗体
をさらに含むことができる。
【００５５】
さらに、ＨＩＶの治療についての患者における効果レベルの判定に関しては、特に、適
切な動物モデルを利用でき、様々な遺伝子療法プロトコルのＨＩＶに対するインビボ有効
性を評価するために幅広く実施されている（Ｓａｒｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３ｂ）
，上掲）。これらのモデルとしては、マウス、サルおよびネコが挙げられる。これらの動
物がＨＩＶ疾患に自然にかかりやすくなくても、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、リン
パ節、胎児肝臓／胸腺または他の組織を用いて再構成されたキメラマウスモデル（例えば
、ＳＣＩＤ、ｂｇ／ｎｕ／ｘｉｄ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ、ＳＣＩＤ−ｈｕ、免疫適格ＳＣＩ
Ｄ−ｈｕ、骨髄切除ＢＡＬＢ／ｃ）をレンチウイルスベクターまたはＨＩＶに感染させ、
ＨＩＶ病因モデルとして利用することができる。同様に、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ
）／サルモデルを利用することができ、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）／ネコモデルを
利用することもできる。前記医薬組成物は、ＡＩＤＳの治療的処置に使用するとき、本発
明によるベクターと共に他の医薬を含有することができる。これらの他の医薬をそれらの
旧来の様式で（すなわち、ＨＩＶ感染を処置するための薬剤として）使用することができ
る。
【００５６】
別の実施形態によると、本発明は、有効量の単離されたＨＩＶ抗体、または親和性成熟
バージョン、を含む抗体ベースの医薬組成物を提供し、これは、ＨＩＶウイルスの感染を
低下させるための予防的または治療的処置の選択肢をもたらす。本発明の抗体ベースの医
薬組成物を、当該技術分野において公知の任意の数の戦略（例えば、ＭｃＧｏｆｆ  ａｎ
ｄ  Ｓｃｈｅｒ，２０００，Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ／Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｉｎ  ＭｃＮａｌｌｙ，Ｅ．Ｊ．，ｅｄ．Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｍ
ａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ；ｐｐ．１３９−１５８；Ａｋｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｆｉｌｉ
ｐｐｉｓ，２０００，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  Ｐａｒｅｎ
ｔｅｒａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｉｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌ
ａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｔａｌｙｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ；ｐｐ
．１４５−１７７；Ａｋｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．１４：４７−１２７を参照されたい）によって製剤化してよい。患者への投与に
適する医薬的に許容される組成物は、許容される温度範囲内での保管中に生物活性を保持
する上に最大安定性を促進しもする製剤中に有効量の抗体を含有することになる。前記医
薬組成物は、所望される製剤に依存して、医薬的に許容される希釈剤、医薬的に許容され
る担体および／または医薬的に許容される賦形剤、もしくは動物またはヒトへの投与用の
医薬組成物の製剤化に一般に用いられる、そのようなビヒクルも含むことができる。前記
希釈剤は、前記組み合わせの生物活性に影響を及ぼさないように選択される。かかる希釈
剤の例は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、および
ハンクス溶液である。本発明の医薬組成物または製剤において有用である賦形剤の量は、
それを必要とする被検体に投与すべきときにその組成物を均一に分散させることができる
ようにその組成物全体にわたって抗体を均一に分配するのに役立つ量である。それは、所
望の有益な緩和または治癒結果もたらすと同時に高すぎる濃度から起こるであろう一切の
有害副作用を最少にする濃度に抗体を希釈するのに役立つことがある。それは、保存効果
を有することもある。したがって、高い生理活性を有する抗体については、いっそう多く
の賦形剤を利用することになる。その一方で、より低い生理活性を呈示するいずれの活性
成分（単数または複数）についても、より少ない量の賦形剤を利用することになる。
【００５７】
上記抗体を、および本明細書に記載する抗体の少なくとも１つまたは組み合わせを含む
抗体組成物またはワクチン組成物を、ＨＩＶウイルス感染の予防的および治療的処置のた
めに投与することができる。
【００５８】
本発明は、軽鎖および重鎖の新規アミノ酸配列、ならびに図３に収載するような配列番
号１および２の重および軽鎖についてのコンセンサス配列を含む、単離されたポリペプチ
ドにも関する。
【００５９】
他の関連した実施形態において、本発明は、図３に収載するＨＩＶ抗体のアミノ酸配列
；配列番号１および２の重および軽鎖についてのコンセンサス配列、をコードするポリペ
プチド変異体を提供する。これらのポリペプチド変異体は、本明細書に記載する方法（例
えば、標準パラメータを用いるＢＬＡＳＴ解析）を用いて決定したときに本発明のポリペ
プチド配列と比較して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９
６％、９７％、９８％または９９％あるいはそれ以上の配列同一性を有する。アミノ酸の
類似性などに考慮することにより、これらの値を適切に調整して、コードされたタンパク
質の対応する同一性を決定することができることは、当業者には理解されるであろう。
【００６０】
用語「ポリペプチド」は、その従来の意味で、すなわち、アミノ酸の配列として用いて
いる。ポリペプチドは、特定の長さの生成物に限定されない。ペプチド、オリゴペプチド
およびタンパク質は、ポリペプチドの定義に含まれ、かかる用語は、特に別段の指示がな
い限り、本明細書では交互に用いることができる。この用語は、自然に発生するものおよ
び自然に発生しないもの両方の、ポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、アセ
チル化、リン酸化など、および当該技術分野において公知の他の修飾も含む。ポリペプチ
ドは、タンパク質全体である場合もあり、またはその部分配列である場合もある。本発明
に関連して対象となる特定のポリペプチドは、抗原またはＨＩＶ感染細胞に結合できる、
ＣＤＲ、ＶＨおよびＶＬを含むアミノ酸部分配列である。
【００６１】
ポリペプチド「変異体」は、この用語を本明細書において用いる場合、本明細書に具体
的に開示するポリペプチドとは１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入の点で典
型的に異なるポリペプチドである。かかる変異体は、天然起源である場合もあり、または
例えば、本発明の上記ポリペプチド配列の１つ以上の修飾、および本明細書に記載のポリ
ペプチドの１つ以上の生物活性の評価、および／もしくは当該技術分野において周知の多
数の技法のうちのいずれかの使用によって、合成的に生成される場合もある。
【００６２】
例えば、あるアミノ酸を、タンパク質構造内の他のアミノ酸と、他のポリペプチド（例
えば、抗原）または細胞に結合する能力のかなりの喪失を伴うことなく置換することがで
きる。タンパク質の結合能力および性質は、そのタンパク質の生物学的機能活性を規定す
るので、あるアミノ酸配列置換をタンパク質配列、したがってその基礎となるＤＮＡコー
ド配列に起こすことができ、それにより同様の特性を有するタンパク質を得られる。した
がって、本開示組成物のペプチド配列、または前記ペプチドをコードする対応ＤＮＡ配列
に、それらの生物学的有用性または活性を著しく喪失することなく、様々な変更を加える
ことができることが考えられる。
【００６３】
多くの場合、ポリペプチド変異体は、１つ以上の保存的置換を含有することになる。「
保存的置換」は、ペプチド化学の当業者によりそのポリペプチドの二次構造およびヒドロ
パシー性が実質的に不変であると予想されるような、あるアミノ酸が類似の特性を有する
別のアミノ酸に置換されることである。
【００６４】
アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の、例えば、それらの疎水性、親水性、
電荷、サイズなどの、相対的類似性に基づく。例えば、様々な前述の特性を考慮に入れる
置換は、当業者に周知であり、アルギニンとリシン；グルタミン酸塩とアスパラギン酸塩
；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；およびバリンとロイシンとイソロイ
シンを含む。
【００６５】
「相同性」または「配列同一性」は、配列をアラインし、必要に応じて、最大相同率を
達成するためにギャップを挿入した後に非変異体配列と同一であるポリヌクレオチドまた
はポリペプチド配列変化での残基の百分率を指す。特定の実施形態において、ポリヌクレ
オチドおよびポリペプチド変異体は、本明細書に記載するポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドとの少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも
約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチド相同性を有する。
【００６６】
かかる変異体ポリペプチド配列は、本出願に記載の配列と７０％以上（すなわち、８０
％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の）配列同一性を
共有することになる。さらなる実施形態において、本記載発明は、本明細書に開示するア
ミノ酸配列の様々な長さの連続ストレッチを含むポリペプチド断片を提供する。例えば、
本明細書に開示する配列の１つ以上についての連続する少なくとも約５、１０、１５、２
０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０またはそれ以上のペプチドおよびそれらの
間のすべての中間長のペプチドを含むペプチド配列が本発明によって提供される。
【００６７】
本発明は、本記載発明抗体の軽および重鎖の一部またはすべてをコードする核酸配列、
およびそれらの断片も含む。遺伝子コードの冗長性のため、同じアミノ酸配列をコードす
るこれらの配列の変異体が存在することになる。
【００６８】
本発明は、図３に収載するＨＩＶ抗体の重および軽鎖のペプチドをコードする単離され
た核酸配列、ならびに配列番号１および２の重および軽鎖のコンセンサス配列も含む。
【００６９】
他の関連実施形態において、本記載発明は、図３に収載するＨＩＶ抗体の重および軽鎖
のポリペプチド配列；配列番号１および２の重および軽鎖のコンセンサス配列、をコード
するポリヌクレオチド変異体を提供する。これらのポリヌクレオチド変異体は、本明細書
に記載する方法（例えば、標準パラメータを用いるＢＬＡＳＴ解析）を用いて決定したと
きに本発明のポリヌクレオチド配列と比較して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少
なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも
９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％またはそれ以上の
配列同一性を有する。コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレーム配置などを考
慮に入れることにより、これらの値を適切に調整して、２つのヌクレオチド配列によって
コードされたタンパク質の対応する同一性を決定することができることは、当業者には理
解されるであろう。
【００７０】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ、ま
たは混合ポリマーを指すために本明細書では交互に用いられる。ポリヌクレオチドは、ゲ
ノム配列、追加のゲノムおよびプラスミド配列、ならびにより小さい操作された遺伝子セ
グメントであって、ポリペプチドを発現するまたは発現するように適応され得るセグメン
トを含むことができる。
【００７１】
「単離された核酸」は、他のゲノムＤＮＡからはもちろん、天然に天然配列を伴う、タ
ンパク質または複合体、例えばリボソームおよびポリメラーゼからも実質的に分離されて
いる核酸である。この用語は、その天然に存在する環境から除去された核酸配列を包含し
、組換体またはクローン化ＤＮＡ単離体、および化学合成類似体、または異種のシステム
によって生合成された類似体を含む。実質的に純粋な核酸は、単離された形態の前記核酸
を含む。したがって、これは、初めから単離されているような核酸を指し、人間の手で単
離された核酸に後で加えられた遺伝子または配列を除外しない。
【００７２】
ポリヌクレオチド「変異体」は、この用語を本明細書において用いる場合、本明細書に
具体的に開示するポリヌクレオチドとは、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿
入の点で典型的に異なるポリヌクレオチドを指す。かかる変異体は、天然起源である場合
もあり、または例えば、本発明のポリヌクレオチド配列の１つ以上の修飾、および本明細
書に記載のコードされたポリペプチドの１つ以上の生物活性の評価、および／もしくは当
該技術分野において周知の多数の技法のうちのいずれかの使用によって、合成的に生成さ
れる場合もある。
【００７３】
本記載発明のポリヌクレオチドの構造に修飾を施すことができ、所望の特性を有する変
異体または誘導体ポリペプチドをコードする機能性分子をなお得ることができる。本発明
のポリペプチドの等価のまたはさらには改善された変異体または部分を作り出すためにポ
リペプチドのアミノ酸配列を改変することが所望されるとき、典型的に、当業者は、コー
ドするＤＮＡ配列のコドンの１つ以上を変更することになる。
【００７４】
典型的に、ポリヌクレオチド変異体は、その変異体ポリヌクレオチドによってコードさ
れたポリペプチドの免疫原性の結合特性が、本明細書に具体的に示すポリヌクレオチド配
列によってコードされたポリペプチドに比べて実質的に減少されないような、１つ以上の
置換、付加、欠失および／または挿入を含有する。
【００７５】
さらなる実施形態において、本記載発明は、本明細書に開示する配列の１つ以上と同一
のまたは相補的な配列の様々な長さの連続ストレッチを含むポリヌクレオチド断片を提供
する。例えば、本明細書に開示する配列の１つ以上についての連続する少なくとも約１０
、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５
００または１０００あるいはそれ以上のヌクレオチドおよびそれらの間のすべての中間長
のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであって、引用値間の、例えば、１６、１７、１
８、１９など、２１、２２、２３など、３０、３１、３２など、５０、５１、５２、５３
など、１００、１０１、１０２、１０３など、１５０、１５１、１５２、１５３などの、
および２００〜５００、５００〜１０００中のすべての整数を含む、任意の長さを包含す
るポリヌクレオチドが、本発明によって提供される。
【００７６】
本発明の別の実施形態において、本明細書が提供するポリヌクレオチド配列、またはそ
の断片、またはその相補配列に、中から高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズ
できるポリヌクレオチド組成物を提供する。ハイブリダイゼーション法は、分子生物学技
術分野において周知である。例証のために、本発明のポリヌクレオチドと他のポリヌクレ
オチドのハイブリダイゼーションを試験するための適切な中等度のストリンジェントな条
件は、５ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での
予備洗浄；５０〜６０℃、５ｘＳＳＣで一晩のハイブリダイゼーション；続いて２回の６
５℃で２０分間の、各々、０．１％ＳＤＳを含有する２ｘ、０．５ｘおよび０．２ｘＳＳ
Ｃでの洗浄を含む。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを、例えば、ハイブリ
ダイゼーション溶液の塩含量および／またはハイブリダイゼーションを行う温度を変える
ことによって容易に操作することができることは、当業者には理解されるであろう。例え
ば、別の実施形態において、適切な高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件は、ハイブリダイゼーションの温度を例えば６０〜６５℃または６５〜７０℃に上昇さ
せることを除いて、上に記載したものを含む。
【００７７】
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド変異体または断片によってコード
されたポリペプチドは、天然ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドと同じ
結合特異性を有する（すなわち、同じエピトープまたはＨＩＶ株に特異的にまたは優先的
に結合する）。いくつかの実施形態において、本記載ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチ
ド変異体、断片およびハイブリダイゼーション配列は、本明細書に具体的に示すポリペプ
チド配列についてのものの少なくとも約５０％、少なくとも約７０％および少なくとも約
９０％のレベルの結合活性を有するポリペプチドをコードする。
【００７８】
本記載発明のポリヌクレオチド、またはそれらの断片を、それ自体のコード配列の長さ
に関係なく、他のＤＮＡ配列、例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加の
制限酵素部位、複数のクローニング部位、他のコードセグメントなどと組み合わせること
ができるので、それらの全長は、かなり変動し得る。ほぼあらゆる長さの核酸断片が用い
られる。例えば、長さ約１００００、約５０００、約３０００、約２０００、約１０００
、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対などの全長（すべての中間長を含む）を
持つ例示的なポリヌクレオチドセグメントが本発明の多くの実施に含まれる。
【００７９】
本発明による核酸配列を含むベクター、例えば発現ベクターが、さらに本発明の範囲に
含まれる。かかるベクターで形質転換された細胞も本発明の範囲に含まれる。
【００８０】
本発明は、本発明の核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに本発明のポリペプチ
ドの生産のための組換え法も提供する。本発明のベクターは、例えばプラスミド、ファー
ジ、コスミドおよびミニ染色体を含む、任意のタイプの細胞または生物において複製でき
るものを含む。いくつかの実施形態において、本記載発明のポリヌクレオチドを含むベク
ターは、そのポリヌクレオチドの成長もしくは複製に適したベクターであるか、または本
記載発明のポリペプチドの発現に適したベクターである。かかるベクターは、当該技術分
野において公知であり、市販されている。
【００８１】
「ベクター」は、シャトルベクターおよび発現ベクターを含む。典型的に、プラスミド
構築は、細菌のプラスミドの、それぞれ複製および選択のために、複製起点（例えば、Ｃ
ｏｌＥ１複製起点）および選択マーカー（例えば、アンピシリンまたはテトラサイクリン
耐性）も含むことになる。「発現ベクター」は、細菌細胞または真核細胞中の、本発明の
抗体断片を含む抗体の発現に必要な制御配列または調節要素を含有するベクターを指す。
【００８２】
本明細書において用いる場合、用語「細胞」は、哺乳動物細胞またはヒト細胞など（し
かしこれらに限定されない）の真核、多細胞種のものを（例えば、単細胞の酵母細胞とは
対照的に）含むが、これらに限定されない、任意の細胞であることができる。細胞は、単
一エンティティとして存在する場合もあり、または細胞のより大きなコレクションの一部
である場合もある。かかる「細胞のより大きなコレクション」は、例えば、細胞培養物（
混合されたものか純粋なもの）、組織（例えば、内皮、上皮、粘膜もしくは他の組織）、
器官（例えば、肺、肝臓、筋肉および他の器官）、器官系（例えば、循環器系、呼吸器系
、胃腸系、泌尿器系、神経系、外皮系もしくは他の器官系）、または生物（例えば、鳥類
、哺乳類など）を含むことができる。
【００８３】
本発明のポリヌクレオチドを全体として合成してもよく、または少しずつ合成して組み
合わせてもよく、そして、例えば、適切な制限部位および制限酵素を用いる線状ベクター
への前記ポリヌクレオチドのサブクローニングを含む、ルーチンの分子生物学および細胞
生物学法を用いて、ベクターに挿入してもよい。本記載発明のポリヌクレオチドを、その
ポリヌクレオチドの各鎖に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用してポリメラー
ゼ連鎖反応により増幅する。これらのプライマーは、ベクターへのサブクローニングを助
長するための制限酵素切断部位も含む。複製可能なベクター成分は、一般に、次のものの
１つ以上を含むがこれらに限定されない：シグナル配列、複製起点、および１つ以上の、
マーカーまたは選択可能な遺伝子。
【００８４】
本発明のポリペプチドを発現するために、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列、または機能的等価物を、適切な発現ベクター、すなわち、挿入したコード配列の転
写および翻訳に必要な要素を含有するベクターに挿入してよい。対象となるポリペプチド
ならびに適切な転写および翻訳制御要素をコードする配列を含有する発現ベクターを構築
するために、当業者に周知の方法を用いてよい。これらの方法としては、インビトロ組換
えＤＮＡ法、合成法、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。かかる技法は、例えば
、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏ
ｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ
ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．Ｎ．Ｙ．
に記載されている。
【００８５】
本発明は、本発明の抗体、ポリペプチドおよび核酸を使用して診断および予後アッセイ
を実施する際に有用なキットも提供する。本発明のキットは、本発明のＨＩＶ抗体、ポリ
ペプチドまたは核酸を標識された形態または未標識の形態いずれかで含む、適切な容器を
含む。加えて、前記抗体、ポリペプチドまたは核酸を間接結合アッセイに適する標識され
た形態で供給するとき、そのキットは、適切な間接アッセイを行うための試薬をさらに含
む。例えば、前記キットは、標識の性質に依存して酵素基質または誘導体化剤を含む、１
つ以上の適する容器を含むことがある。対照試料および／または説明書も含むことがある
。本発明は、ＰＣＲまたは質量分析によって生体試料中の本発明のＨＩＶ抗体の存在また
はＨＩＶ抗体のヌクレオチド配列を検出するためのキットも提供する。
【００８６】
本明細書において用いる場合の「標識」は、「標識された」抗体を生成するために抗体
に直接または間接的に結合される検出可能な化合物または組成物を指す。標識を本明細書
に開示するポリペプチドおよび／または核酸配列に結合することもできる。前記標識は、
単独で検出可能であることができ（例えば、放射性同位元素標識もしくは蛍光標識）、ま
たは酵素標識の場合は、検出可能である基質化合物もしくは組成物の化学的変成を触媒す
ることができる。本記載発明の抗体およびポリペプチドを、例えば、精製または診断応用
に用いるために、エピトープタグまたは標識を含むように修飾することもできる。適する
検出手段としては、標識、例えば、これらに限定されないが、放射性ヌクレオチド、酵素
、補酵素、蛍光剤、化学発光剤、色素原、酵素基質または補因子、酵素阻害剤、補欠分子
族複合体、フリーラジカル、粒子、色素などの使用を含む。
【００８７】
別の実施形態によると、本発明は、診断方法を提供する。診断方法は、一般に、患者か
ら採取した生体試料、例えば、血液、血清、唾液、尿、痰、細胞スワブ試料または組織生
検材料などをＨＩＶ抗体と接触させること、および前記抗体が前記試料に、対照試料また
は所定のカットオフ値と比較して、選択的に結合するかどうかを判定し、それによってＨ
ＩＶウイルスの存在を示すことを含む。
【００８８】
別の実施形態によると、本発明は、患者からの生体試料中の本発明のＨＩＶ抗体の存在
を検出するための方法を提供する。検出方法は、一般に、患者から生体試料、例えば、血
液、血清、唾液、尿、痰、細胞スワブ試料または組織生検材料などを採取し、ＨＩＶ抗体
またはそれらの断片、もしくはＨＩＶ抗体をコードする核酸を単離すること、および前記
生体試料中のＨＩＶ抗体の存在について検査することを含む。また、本発明は、細胞にお
けるＨＩＶ抗体のヌクレオチド配列を検出するための方法を提供する。ＨＩＶ抗体のヌク
レオチド配列を、本明細書に開示するプライマーを使用して検出してもよい。患者からの
生体試料中のＨＩＶ抗体の存在を、公知の組換え法および／または質量分析装置の使用に
より決定してもよい。
【００８９】
別の実施形態において、本発明は、生体試料において高度に保存されたコンセンサス配
列を含む重鎖と高度に保存されたコンセンサス配列を含む軽鎖とを含むＨＩＶ抗体を検出
するための方法を提供し、この方法は、哺乳動物被検体から免疫グロブリン含有生体試料
を採取すること、前記試料からＨＩＶ抗体を単離すること、および前記重鎖および軽鎖の
高度に保存されたコンセンサス配列を同定することを含む。前記生体試料は、血液、血清
、唾液、尿、痰、細胞スワブ試料または組織生検材料であってよい。前記アミノ酸配列を
、例えばＰＣＲおよび質量分析を含む、当該技術分野において公知の方法によって決定し
てよい。
【００９０】
用語「評価」（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）は、任意の形態の測定を含み、およびある要素が
存在するか否かを決定することを含む。用語「判定」（ｄｅｔｅｒｍｉｎｇ）、「測定」
（ｍｅａｓｕｒｉｎｇ）、「評価」（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）、「評価」（ａｓｓｅｓｓ
ｉｎｇ）および「分析」（ａｓｓａｙｉｎｇ）は、交互に用いられ、定量的および定性的
決定を含む。評価は、相対的であることもあり、または絶対的であることもある。「の存
在を評価」は、存在する何かの量を判定すること、および／またはそれが存在するのか、
または不在であるのかを判定することを含む。本明細書において用いる場合、用語「判定
」、「測定」および「評価」（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）および「分析」は、交互に用いられ
、定量的決定と定性的判定の両方を含む。
【００９１】
ＩＩ．ウイルス複製を低減させる方法
被検体におけるＨＩＶウイルス力価、ウイルス複製、ウイルス増殖またはＨＩＶウイル
スタンパク質の量の増加を低減させるための方法をさらに提供する。別の態様によると、
ある方法は、被検体における１つ以上のＨＩＶ株または単離体のＨＩＶ力価、ウイルス複
製またはＨＩＶタンパク質の量の増加を低減させるのに有効な量のＨＩＶ抗体を被検体に
投与することを含む。
【００９２】
別の実施形態によると、本発明は、ウイルス複製を低減させる、またはさらなる宿主細
胞または組織へのＨＩＶ感染の拡大を低減させる方法を提供し、この方法は、ｇｐ１２０
上の抗原エピトープに結合する抗体またはその一部分と哺乳動物細胞を接触させることを
含む。
【００９３】
ＩＩＩ．治療方法
別の実施形態によると、本発明は、ウイルス感染症に感染した、例えばＨＩＶなどに感
染した、哺乳動物を治療するための方法を提供し、この方法は、本明細書に開示するＨＩ
Ｖ抗体を含む医薬組成物を前記哺乳動物に投与することを含む。１つの実施形態によると
、ＨＩＶに感染した哺乳動物を治療するための前記方法は、本発明の抗体またはその断片
を含む医薬組成物を前記哺乳動物に投与することを含む。本発明の前記組成物は、開示す
る特性を有する１つより多くの抗体（例えば、複数の抗体または抗体のプール）を含むこ
とができる。前記組成物は、当該技術分野において公知であるような他のＨＩＶ中和抗体
、例えば、これらに限定されないが、ＶＲＣ０１、ＰＧ９およびｂ１２も含むことができ
る。
【００９４】
受動免疫がウイルス性疾患の予防および治療のための有効で安全な戦略であることは証
明されている。（例えば、Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｒｅｖ．１３：６０２−１４（２０００）；Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１１４（２００２）；Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．
Ｍｅｄ．５：２０４−１０（１９９９）；およびＩｇａｒａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａ
ｔ．Ｍｅｄ．５：２１１−１６（１９９９）を参照されたい）。ヒトモノクローナル抗体
を使用する受動免疫は、ＨＩＶの救急予防および治療のための緊急治療戦略を実現する。
【００９５】
ＨＩＶ関連疾患または障害の危険がある被検体としては、感染者と接触した患者、また
は何らかの他の方法でＨＩＶに曝露された患者を含む。疾患または障害を予防するか、あ
るいはその進行を遅らせるために、ＨＩＶ関連疾患または障害に特有の症状の兆候の前に
予防薬の投与を行うことができる。
【００９６】
ヒトおよび非ヒト患者のインビボでの治療のために、本発明のＨＩＶ抗体を含む医薬製
剤を前記患者に投与または提供する。インビボ療法に使用するとき、本発明の抗体を前記
患者に治療有効量（すなわち、患者のウイルス負荷量を無くすまたは低減させる量）で投
与する。前記抗体を、公知の方法に従って、例えば、静脈内投与により、例えばボーラス
としてもしくはある期間にわたっての持続注入により、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（ｉｎ
ｔｒａｃｅｒｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ）、皮下、関節内、関節滑液嚢内、クモ膜下、経口、
局所または吸入経路により、ヒト患者に投与する。前記抗体を非経口投与することができ
、可能な場合には標的細胞部位に投与することができ、または静脈内投与することができ
る。いくつかの実施形態では、抗体を静脈内または皮下投与によって投与する。本発明の
治療用組成物を患者または被検体に全身投与してもよいし、非経口投与してもよいし、ま
たは局所投与してもよい。治療成功および疾患の改善を評価するための上記パラメータは
、医師には周知のルーチン手順によって容易に測定される。
【００９７】
非経口投与のために、前記抗体を、医薬的に許容される非経口ビヒクルを伴う注射用単
位剤形（溶液、懸濁液、エマルジョン）で製剤化してもよい。かかるビヒクルの例として
は、水、食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが
挙げられるが、これらに限定されない。非水性ビヒクルとしては、不揮発性油およびオレ
イン酸エチルが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームを担体として使用する
ことができる。前記ビヒクルは、少量の添加剤、例えば、等張性および化学的安定性を向
上させる物質、例えば緩衝液および保存薬などを含有することもある。前記抗体をかかる
ビヒクル中、約１ｍｇ／ｍＬから１０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化することができる。
【００９８】
用量および薬剤投与計画は、医師によって容易に決定される様々な因子、例えば、感染
の性質、例えばその治療指数、患者、および患者の病歴に依存する。一般に、治療有効量
の抗体を患者に投与する。いくつかの実施形態において、投与される抗体の量は、患者体
重の約０．１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの範囲である。感染のタイプおよび重症度
に依存して、体重の約０．１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．１〜１５
ｍｇ／ｋｇ／用量）の抗体が、例えば１回以上の別々の投与によるか、または連続注入に
よる、患者への投与のための初期候補の投与量である。この治療の経過は、従来の方法お
よび分析によって、および医師もしくは他の当業者に公知の基準に基づいて、容易にモニ
ターされる。処置成功および疾患の改善を評価するための上記パラメータは、医師には公
知のルーチン手順によって容易に測定可能である。
【００９９】
他の治療法を本発明のＨＩＶ抗体の投与と併用してもよい。併用投与は、別々の製剤ま
たは単一の医薬製剤を使用する同時投与、およびいずれかの順序での逐次投与を含み、こ
の際、好ましくは両方（またはすべての）活性薬剤がそれらの生物活性を同時に発揮する
期間がある。かかる併用療法は、相乗治療効果をもたらすことができる。処置成功および
疾患の改善を評価するための上記パラメータは、医師には周知のルーチン手順によって容
易に測定可能である。
【０１００】
用語「治療する」または「治療」もしくは「緩和」は、交互に用いられ、治療的処置と
、予防的または予防対策との両方を指し、この際目的は、標的とされる病的状態または障
害を予防するまたは遅らせる（和らげる）ことである。治療を必要とする者は、障害を既
に有する者、ならびに、障害に罹患しやすい者または障害を予防しなければならない者も
含む。被検体または哺乳動物は、本発明の方法に従って治療量の抗体を受けた後、その患
者が、次の１つ以上に関して観察可能なおよび／または測定可能な低減もしくは次の１つ
以上の不在：感染細胞数の低減または感染細胞の不在；感染している全細胞のパーセント
の低減；および／もしくは特定の感染に付随する症状の１つ以上のある程度の軽減；罹患
率および死亡率低減、ならびに生活の質の問題の向上を示す場合、感染がうまく「治療さ
れる」。疾患の治療成功および疾患の改善を評価するための上記パラメータは、医師に公
知のルーチン手順によって容易に測定可能である。
【０１０１】
用語「治療有効量」は、被検体または哺乳動物における疾患または障害の治療に有効な
抗体または薬物の量を指す。
【０１０２】
１つ以上のさらなる治療薬と「併用での」投与は、同時（同時に行う）投与および任意
の順序での逐次投与を含む。
【０１０３】
本明細書において用いる場合の「担体」は、用いられる投与量および濃度で、曝露され
る細胞または哺乳動物に対して非毒性である、医薬的に許容される担体、賦形剤または安
定剤を含む。多くの場合、生理的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。生理的に
許容される担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝液；ア
スコルビン酸を含むがこれに限定されない抗酸化物質；低分子量（約１０残基未満）ポリ
ペプチド；タンパク質、例えば、これらに限定されないが、血清アルブミン、ゼラチンま
たは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、これに限定されないが、ポリビニルピロ
リドン；アミノ酸、例えば、これらに限定されないが、グリシン、グルタミン、アスパラ
ギン、アルギニンまたはリシン；単糖類、二糖類および他の炭水化物（グルコース、マン
ノースまたはデキストリンを含むが、これらに限定されない）；キレート剤、例えば、こ
れに限定されないが、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、これらに限定されないが、マン
ニトールまたはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、これに限定されないが、ナト
リウム；ならびに／または非イオン界面活性剤、例えば、これらに限定されないが、ＴＷ
ＥＥＮ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳが挙げられるが、
これらに限定されない。
【０１０４】
範囲の値が与えられている場合、文脈による別段の明確な指図がない限り下限の単位の
十分の一までの、その範囲の上限と下限の間の各介在値、および表示範囲内の任意の他の
表示または介在値が本発明に包含されると解される。これらのより小範囲に独立して含ま
れることがある、これらのより小範囲の上限および下限も、表示範囲内の一切の特別に除
外される限度次第だが、本発明に包含される。表示範囲が、一方または両方の限度を含む
場合、含まれるこれらの両方の限度のいずれかを除外する範囲も本発明に含まれる。
【実施例】
【０１０５】
実施例１
この実施例は、下の実施例２〜５において用いる材料および方法を記載する。
【０１０６】
ＨＩＶ抗体は、以前に記載されているようなｇｐ１４０特異的単一Ｂ細胞捕捉（Ｍｏｕ
ｑｕｅｔ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６，ｅ２４０７８（２０１１）；Ｔｉｌ
ｌｅｒ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２９，１１２−２４
（２００８）；およびＳｃｈｅｉｄ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４５８，６３
６−４０（２００９））に従ってクローニングし、生成した。ＰＧＴ１２１ＧＭおよび１
０−１０７４ＧＭ「グリコミュータント」抗体は、ＨＣ位置３２、５３、５４、５８、９
７、１００ｌにおける１０−１０７４残基をＰＧＴ１２１に置換することによっておよび
その逆によって産生させた。抗ｇｐ１４０−抗体のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質への結合特
性は、以前に記載されている（Ｓｃｈｅｉｄ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３
３３，１６３３−７（２０１１）；Ｗａｌｋｅｒ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  
４７７，４６６−７０（２０１１）；およびＭｏｕｑｕｅｔ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ
Ｏｎｅ  ６，ｅ２４０７８（２０１１））ようにＥＬＩＳＡ、ＳＰＲおよびグリカンマ
イクロアレイアッセイによって分析された。中和は、（ｉ）ＴＺＭ．ｂｌ細胞におけるル
シフェラーゼベースの分析、および（ｉｉ）以前に記載されている（Ｌｉ，Ｍ．ｅｔ  ａ
ｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９，１０１０８−２５（２００５）；Ｅｕｌｅｒ，Ｚ．ｅｔ  ａ
ｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８５，７２３６−４５（２０１１）；お
よびＢｕｎｎｉｋ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６，９９
５−７（２０１０））ような一次ＨＩＶ−１変異体での感染を用いるＰＢＭＣベースの分
析を用いて評価した。ＰＧＴ１２１（「リガンドを持たない」および「リガンドを持つ」
）、１０−１０７４およびＧＬ  Ｆａｂ断片の構造を、それぞれ２．８Å、２．３Å、１
．８Åおよび２．４Å分解能への分子置換によって解明した。
【０１０７】
単一Ｂ細胞ＲＴ−ＰＣＲおよびＩｇ遺伝子分析
患者１０（ｐｔ１０；Ｎａｔｕｒｅ  ４７７（７３６５）：４６６−４７０では患者１
７と呼ばれている）ＰＢＭＣからのｇｐ１４０＋ＣＤ１９＋ＩｇＧ＋Ｂ細胞の単一細胞選
別、ｃＤＮＡ合成およびＩｇ遺伝子のネステッドＰＣＲ増幅は、以前の研究（ＰＬｏＳ  
Ｏｎｅ  ６（９）：ｅ２４０７８）で行った。ＰＧＴ１２１クローナル変異体によって発
現されたＩｇλ遺伝子を、突然変異を受ける可能性のある領域（３１）を避けるためにリ
ーダー領域内のさらに上流のフォワードプライマー（Ｌ−Ｖλ３−２１＊０２：５’ＣＴ
ＧＧＡＣＣＧＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＧ  ３’）を使用してＰＣＲ増幅した。すべてのＰ
ＣＲ産物をシークエンシングし、Ｉｇ遺伝子使用、ＣＤＲ３分析およびＶＨ／Ｖκ体細胞
超変異数について分析した（ＩｇＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ
．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔおよびＩＭＧＴ（登録商標）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ
．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）。ＣｌｕｓｔａｌＷ分析機能（デフォルトパラメータ）を有するＭ
ａｃＶｅｃｔｏｒプログラム（ｖ．１２．５．０）を用いて多重配列アラインメントを行
い、また、それらを用いて、隣接結合法によって（ベストツリーモードおよび外群付根法
で）系統樹を生成した。あるいは、ＵＰＧＭＡ法を（ベストツリーモードで）用いて系統
樹を生成した。
【０１０８】
ＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様抗体の生殖細胞系（ＧＬ）前駆体遺伝子セグメ
ントを、ＩｇＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
ｉｇｂｌａｓｔ）およびＩＭＧＴ（登録商標）／Ｖ−ＱＵＥＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ
．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｓｈａｒｅ／ｔｅｘｔｅｓ／）を使用し
てＶＨ４−５９＊０１、ＪＨ６＊０３、ＶＬ３−２１＊０２およびＪＬ３＊０２として同
定した。（これらの遺伝子セグメントは、ヒト抗体のレパートリーの中で最も頻繁に使用
されるものである（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６（８）：ｅ２２３６５；Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ  ６４（５）：３３７−３５０）。代表ＧＬ祖先配列を構築するために、我々は
、ＩｇＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂ
ｌａｓｔ）を使用して、１０−９９６（最少体細胞超変異を含有する抗体）のＩｇＨおよ
びＩｇＬ配列をＧＬ配列にアラインした。ＧＬ  ＩｇＨ配列は、成熟ＶＨおよびＪＨ遺伝
子セグメントをそれらのＧＬ対応部分で置換し、Ｎ領域ヌクレオチドおよびＤＨ遺伝子セ
グメントを含むＣＤＲＨ３領域のために１０−９９６配列を使用することによって構築し
た。ＧＬ  ＩｇＬ配列は、ＶＬ３−２１＊０２およびＪＬ３＊０２遺伝子セグメント配列
から構築した。
【０１０９】
抗体のクローニングおよび生産
精製され消化されたＰＣＲ産物をヒトＩｇγ１発現またはＩｇλ発現ベクター（Ｊ  Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２９（１−２）：１１２−１２４）にクローニングし
た。その後、ＩｇＨおよびＩｇλ遺伝子を含有するベクターをシークエンシングし、元の
ＰＣＲ産物配列と比較した。ＰＧＴ１２１および１０−３０３は、同じＩｇλ遺伝子を共
有し、ＩｇＨ遺伝子の位置２での１つのアミノ酸の違いを有した（図４）；それ故、ＰＧ
Ｔ１２１  ＩｇＧを生産するために、我々は、部位特異的突然変異（ＱｕｉｋＣｈａｎｇ
ｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）により１０−３０３ＩｇＨ遺伝子に単一置換（Ｖ２Ｍ）を導入することによって生
成した１０−３０３ＩｇλおよびＰＧＴ１２１  ＩｇＨ遺伝子を使用した。Ｈｉｓタグ付
きＦａｂを生成するために、ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン、続いて６ｘ−Ｈｉｓタグをコー
ドするために我々の標準Ｉｇγ１ベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１（５６３８）：１３
７４−１３７７）を修飾することにより、ＰＧＴ１２１および１０−１０７４  ＶＨ遺伝
子を６ｘＨｉｓ−ＩｇＣγ１発現ベクターにサブクローニングした。ＰＧＴ１２１ＧＭ（
Ｓ３２Ｙ、Ｋ５３Ｄ、Ｓ５４Ｒ、Ｎ５８Ｔ、Ｈ９７Ｒ、Ｔ１００ｌＹ）および１０−１０
７４ＧＭ（Ｙ３２Ｓ、Ｄ５３Ｋ、Ｒ５４Ｓ、Ｔ５８Ｎ、Ｒ９７Ｈ、Ｙ１００ｌＴ）突然変
異体抗体をコードするＩｇＨ  ＤＮＡ断片を、合成ミニ遺伝子（ＩＤＴ）として得、Ｉｇ
γ１発現ベクターにサブクローニングした。
【０１１０】
１０−１０７４ＧＭについての重鎖配列を下に列挙し、突然変異に下線を引く。１０−
１０７４ＧＭの軽鎖配列は、１０−１０７４と同じである。
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＶＴＣＳＶＳＧＤＳＭＮＮＳＹＷＴＷＩＲＱＳ
ＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＳＫＳＥＳＡＮＹＮＰＳＬＮＳＲＶＶＩＳＲＤＴＳＫＮＱＬＳＬ
ＫＬＮＳＶＴＰＡＤＴＡＶＹＹＣＡＴＡＲＨＧＱＲＩＹＧＶＶＳＦＧＥＦＦＴＹＹＳＭＤ
ＶＷＧＫＧＴＴＶＴＶＳＳ。
【０１１１】
抗体およびＦａｂ断片は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）−沈殿法（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ
６（９）：ｅ２４０７８）を用いてＩｇＨおよびＩｇＬ発現プラスミドの指数成長ＨＥ
Ｋ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１１２６８）への一過性トランスフェクションによ
り生産した。プロテインＧセファロースビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をその製
造業者の説明書に従って使用してＩｇＧ抗体を親和性精製した。下で説明するようにＨｉ
ｓＰｕｒ（商標）コバルト樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＦａ
ｂ断片を親和性精製した。
【０１１２】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をその製造業者の説明書に従って使用して、アラニン突然変異
をｐＹＵ−２  ｇｐ１２０ベクター（Ｊ．Ｓｏｄｒｏｓｋｉ，Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉ
ｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌからの贈与品）の位置３０１から３０３（Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ
）、３２４から３２５（Ｇｌｙ−Ａｓｐ）および３３２（Ａｓｎ）（ＨＸＢｃ２アミノ酸
番号付け）に導入した。同じ手順を用いて、ｐＹＵ−２  ｇｐ１２０Ｎ３３２Ａベクター
におけるＡｓｎ２６２ｇｐ１２０とＡｓｎ４０６ｇｐ１２０の間に位置する各ＰＮＧＳに
単一アラニン突然変異を導入することによって「二重グリカン」突然変異体を生成した。
部位特異的突然変異をＤＮＡシークエンシングによって確認した。
【０１１３】
ＹＵ−２  ｇｐ１４０（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４（１２）：５
７１６−５７２５）、ＹＵ−２  ｇｐ１２０、ＨＸＢ２ｃ  ｇｐ１２０コア（Ｎａｔｕｒ
ｅ  ３９３（６６８６）：６４８−６５９）、ＨＸＢ２ｃ  ２ＣＣコア（ＰＬｏＳ  Ｐａ
ｔｈｏｇ  ５（５）：ｅ１０００４４５）タンパク質、およびＹＵ−２  ｇｐ１２０突然
変異体タンパク質をコードする発現ベクターを使用して、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞をトラン
スフェクトした。高マンノースのみのＹＵ−２  ｇｐ１２０タンパク質（ｇｐ１２０ｋｉ
ｆ）を生産するために、２５μＭキフネシン（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）
をトランスフェション時に添加した。培養上清を回収し、１０ｍＭイミダゾール、５０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム；ｐＨ７．４への試料の緩衝液交換を可
能にする遠心分離ベースの濾過装置（Ｖｉｖａｃｅｌｌ  １００、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  
Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｇｍｂｈ）を使用して濃縮した。ＨｉｓＰｕｒ（商標）
コバルト樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をその製造業者の説明書に従って
使用してアフィニティークロマトグラフィーによってタンパク質を精製した。
【０１１４】
脱グリコシル化反応のために、ＰＢＳ中の５０μｇのＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞生産ＹＵ−
２  ｇｐ１２０を一晩、３７℃で、変性剤を含有しないそれぞれの反応バッファー中の２
００ＵのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）または１０，０
００ＵのＥｎｄｏ  Ｈｆ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した。遠心
濾過機（Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してバッフ
ァーをＰＢＳに交換した後、グリコシダーゼ処理されたｇｐ１２０（２００ｎｇ）を、４
〜１２％ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続い
て銀染色（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ）によって検査した。
【０１１５】
ＥＬＩＳＡｓ
高結合性９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を一晩、ＰＢＳ中の１００ｎ
ｇ／ウェルの精製ｇｐ１２０で被覆した。洗浄後、プレートを２時間、２％ＢＳＡ、１μ
Ｍ  ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ（ブロッキングバッファー）でブロックし
、その後、２時間、２６．７ｎＭ（またはＹＵ−２  ｇｐ１２０二重グリカン突然変異体
を使用するＥＬＩＳＡについては４２７．２ｎＭ）の濃度のＩｇＧとともにインキュベー
トし、ＰＢＳで７回連続的に１：４希釈した。洗浄後、ヤギＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ抗体
（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ）（ブロッキングバッファー中０．８μ
ｇ／ｍＬで）との１時間のインキュベーションにより、およびＨＲＰ色素原基質（ＡＢＴ
Ｓ溶液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６（９）：ｅ２４０７８）の添加
によりプレートを進めた。選択されたｇｐ１２０Ｖ３オーバーラッピングペプチドへの抗
体結合を、前に説明したペプチド−ＥＬＩＳＡ法を用いて試験した。
【０１１６】
競合ＥＬＩＳＡｓのために、ｇｐ１２０被覆プレートを２時間、ブロッキングバッファ
ーでブロックし、その後、ＰＢＳ中の抗体競合物質の１：２系列希釈液（５．２から６６
７ｎＭのＩｇＧ濃度範囲）中、ビオチン化抗体（ＰＧＴ１２１については２６．６ｎＭ、
１０−１０７４については０．２１ｎＭ、１０−９９６については０．４３ｎＭ、および
１０−１３６９については１．６７ｎＭの濃度で）とともに２時間インキュベートした。
ＨＲＰ結合ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ）を（ブ
ロッキングバッファー中、０．８μｇ／ｍＬで）使用して、上で説明したようにプレート
を進めた。すべての実験を少なくとも繰り返しで行った。
【０１１７】
グリカンマイクロアレイ分析
脂質に結合したグリカンプローブ（ネオ糖脂質）を、２つのレベル（２および５ｆｍｏ
ｌ／スポット）で、繰り返し、ニトロセルロース被覆スライドガラスにロボット制御でプ
リントすること（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ８０８：１１７−１３６）により
、マイクロアレイを生成した。高マンノースおよび複合型のＮグリカンに由来する１５の
ネオ糖脂質を含有するマイクロアレイを用いて、結合アッセイを行った。プローブの配列
を図７Ａに示す。簡単に言うと、抗体を５０μｇ／ｍＬで試験し、結合をビオチン化抗ヒ
トＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ）、続いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７標識ストレプトアビジ
ン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で検出した。
【０１１８】
表面プラズモン共鳴
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ）（Ｎａｔｕｒｅ  ４６７（７３
１５）：５９１−５９５）を用いて実験を行った。簡単に言うと、ＹＵ−２  ｇｐ１４０
およびｇｐ１２０タンパク質を３００ＲＵのカップリング密度でＣＭ５チップ（Ｂｉａｃ
ｏｒｅ，Ｉｎｃ）上に第一級アミンカップリングさせた。抗ｇｐ１２０  ＩｇＧおよび生
殖細胞系前駆体（ＧＬ）を、３５μＬ／分の流量と３分の会合相および５分の解離相で、
１μＭおよび１０μＭでそれぞれフローセル上に注入した。１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ  
ｐＨ２．５の５０μＬ／分の流量での３０秒の注入によって、センサー面を再生した。解
離（ｋｄ（秒−１））、会合（ｋａ（Ｍ−１秒−１）および結合定数（ＫＤ（Ｍ）または
ＫＡ（Ｍ−１）を、バルク反射係数（ＲＩ）補正のない１：１結合モデルを使用して、背
景差分後、動態解析から算定した（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソ
フトウェア）。１：１結合モデルを使用して算定した二価ＩｇＧについての結合定数を、
ＫＤ値が潜在的結合活性効果（ａｖｉｄｉｔｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ）を含むことを強調する
ために、本文書では「見かけの」親和性と呼ぶ。
【０１１９】
中和アッセイ
ＴＺＭ．ｂｌ細胞におけるルシフェラーゼベースのアッセイ（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９（
１６）：１０１０８−１０１２５）を用いて、ウイルス中和を評価した。試験したＨＩＶ
−１シュードウイルスは、主に、ｔｉｅｒ−２およびｔｉｅｒ−３ウイルス（Ｊｏｕｒｎ
ａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８４（３）：１４３９−１４５２）を含有した（表４お
よび５）。高マンノースのみのシュードウイルスを、２５μＭキフネシンで処理された野
生型細胞（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）において（図８Ｃ）またはＨＥＫ２
９３Ｓ  ＧｎＴＩ−／−細胞において（図８Ｄ）生産した。非線形回帰分析を用いて、最
大半量の阻害が観察された濃度（ＩＣ５０値）を算定した。１９８５年と１９８９年の間
のセロコンバージョン日が判っているクレードＢ感染ドナー（「過去の抗体陽転者」、ｎ
＝１４）または２００３年と２００６年のセロコンバージョン日が判っているクレードＢ
感染ドナー（「現在の抗体陽転者」、ｎ＝２１）から単離した一次ＨＩＶ−１変異体（ｎ
＝９５）での感染を用いて、以前に特性付けされたＰＢＭＣに基づくアッセイ（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８５（１４）：７２３６−７２４５；Ｎａｔ  Ｍｅｄ
１６（９）：９９５−９９７）でも中和活性を評価した。各抗体の中和活性を、中和さ
れたウイルスの割合を０．００１から５０μｇ／ｍＬの範囲のＩＣ５０値にフィッティン
グするＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ｖ５．０ｂ）を使用してベストフィ
ット曲線下面積として算定した。（１０−１０７４で得られた）最高値によってすべての
ＡＵＣ値を正規化することにより、相対曲線下面積（ＲＡＵＣ）値を導出した。
【０１２０】
統計分析
統計分析をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ｖ５．０ｂ）で行った。ｇｐ
１２０およびｇｐ１４０に対する抗体の見かけの結合親和性に対する、選択された９ウイ
ルス株パネルに対するＴＺＭ−ｂｌアッセイにおける中和効力を、スピアマン相関検定を
用いて分析した。マン・ホイットニー検定を用いて、（ｉ）ＰＧＴ１２１または１０−１
０７４群に属する抗体のｇｐ１２０／ｇｐ１４０に対する親和性、および（ｉｉ）過去お
よび現在の抗体陽転者から単離されたウイルスに対する中和活性を比較した。
【０１２１】
結晶化および構造決定
結晶化のために６ｘ−Ｈｉｓタグ付きＰＧＴ１２１、１０−１０７４および１０−９９
６ＧＬ  Ｆａｂを発現させた。Ｆａｂを一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞
の上清から逐次的Ｎｉ２＋−ＮＴＡアフィニティー（Ｑｉａｇｅｎ）およびＳｕｐｅｒｄ
ｅｘ２００  １０／３００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）サイズ排除クロマトグラフィ
ーによって精製した。リガンドを持たないＰＧＴ１２１  Ｆａｂの結晶については、ＰＧ
Ｔ１２１  ＩｇＧを一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞の上清からプロテイ
ンＡアフィニティークロマトグラフィー（Ｐｉｅｒｃｅ）によって単離し、そのＩｇＧの
パパイン切断によってＦａｂ断片を得、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００（ＧＥ  
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。
【０１２２】
精製されたＦａｂをＰＢＳバッファー中８〜２０ｍｇ／ｍＬ（「リガンドを持たない」
ＰＧＴ１２１、８ｍｇ／ｍＬ；１０−１０７４およびＧＬ、２０ｍｇ／ｍＬ）に濃縮した
。３倍モル過剰のＮＡ２グリカンと混合し、２０℃で２時間インキュベートしたタンパク
質試料（最終濃度：１５ｍｇ／ｍＬ）から、「リガンドを持つ」ＰＧＴ１２１  Ｆａｂ結
晶を調製した。２０℃で、１：１のタンパク質対リザーバ比を用いて、４００ｎＬ液滴で
、Ｍｏｓｑｕｉｔｏ（登録商標）結晶化ロボット（ＴＴＰ  ｌａｂｓ）で、結晶化状態を
スクリーニングした。「リガンドを持たない」ＰＧＴ１２１  Ｆａｂの結晶（Ｐ２１２１
２１；ａ＝５６．８、ｂ＝７４．７、ｃ＝１１４．９Å）を、２４％ＰＥＧ  ４，０００
、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５、１０ｍＭ  ＣｕＣｌ２中で得、「リガンド
を持つ」ＰＧＴ１２１  Ｆａｂの結晶（Ｐ２１２１２１；ａ＝６７．８、ｂ＝６７．８、
ｃ＝９４．１Å）を、１７％ＰＥＧ  １０，０００、０．１Ｍ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｐＨ
５．５、０．１Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＨＮＨ４中で得た。１０−１０７４  Ｆａｂの結晶（Ｐ
２１；ａ＝６１．４、ｂ＝４０．３、ｃ＝８４．５Å；β＝９５．３９°）を、２５％Ｐ
ＥＧ  ３，３５０、０．１Ｍ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｐＨ５．５、０．２Ｍ  ＮａＣｌ中で
得、ＧＬ  Ｆａｂの結晶（Ｐ２１；ａ＝５４．９、ｂ＝３４４．７、ｃ＝５５．２Å；β
＝９１．９５°）は、２０％ＰＥＧ  ３，３５０、０．２４Ｍマロン酸ナトリウムｐＨ７
．０、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２中で得た。２０％グリセロール（「リガンドを持たない」お
よび「リガンドを持つ」ＰＧＴ１２１  Ｆａｂ）または２０％エチレングリコール（１０
−１０７４ＦａｂおよびＧＬ  Ｆａｂ）を含有する母液に浸漬し、その後、液体窒素でフ
ラッシュ冷却することによって、結晶を凍結保護した。
【０１２３】
Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｌｉｇｈｔｓｏｕ
ｒｃｅ（ＳＳＲＬ）においてＰｉｌａｔｕｓ  ６Ｍピクセル検出器（Ｄｅｃｔｒｉｓ）を
用いてビームライン１２−２（波長＝１．０２９Å）で回折データを収集した。ＸＤＳを
使用してデータにインデックスを付け、統合し、スケール化した。「リガンドを持たない
」ＰＧＴ１２１  Ｆａｂ結晶から得たデータを用い、我々は、Ｐｈｅｎｉｘを使用して、
ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３ループ内の残基を除去した後の２つの検索モデル、すなわち
、ＰＧＴ１２８  ＦａｂのＣＨ−ＣＬドメイン（ＰＤＢコード３ＰＶ３）および２Ｆ５の
ＶＨ−ＶＬドメイン（ＰＤＢコード３ＩＤＪ）を用いて１つの非対称ユニット（重および
軽鎖についての鎖ＨおよびＬ、それぞれ）につき１つのＦａｂの分子置換ソリューション
を見つけた。その後、我々は、「リガンドを持たない」ＰＧＴ１２１構造を検索モデルと
して用いて、「リガンドを持つ」ＰＧＴ１２１  Ｆａｂ（１つの非対称ユニットにつき１
つのＦａｂ）、１０−１０７４  Ｆａｂ（１つの非対称ユニットにつき１つのＦａｂ）お
よびＧＬ（１つの非対称ユニットあたり４つのＦａｂ）についての分子置換ソリューショ
ンを見つけた。
【０１２４】
Ｐｈｅｎｉｘを用いて反復改良（ＧＬについての非結晶学的対称拘束を含む）を行い、
Ｃｏｏｔを用いてモデルを電子密度マップに手動でフィッティングした。原子モデルをＰ
ＧＴ１２１  Ｆａｂについては３．０Å分解能（Ｒｗｏｒｋ＝２１．６％、Ｒｆｒｅｅ＝
２６．４％）に、１０−１０７４  Ｆａｂについては、１．９Å分解能（Ｒｗｏｒｋ＝１
８．７％、Ｒｆｒｅｅ＝２２．３％）に、４つのＧＬ  Ｆａｂ分子については２．４Å分
解能（Ｒｗｏｒｋ＝１９．４％、Ｒｆｒｅｅ＝２３．７％）におよび「リガンドを持つ」
ＰＧＴ１２１  Ｆａｂについては２．４Å分解能（Ｒｗｏｒｋ＝２０．１％、Ｒｆｒｅｅ
＝２４．９％）に改良した。ＰＧＴ１２１  Ｆａｂの原子モデルは、ラマチャンドランプ
ロットの好適、許容および非許容領域内に９５．２％、４．９％および０．０％の残基を
それぞれ含有する（１０−１０７４  Ｆａｂ：９８．８％、０．９％、０．２％；ＧＬ  
Ｆａｂ：９６．０％、３．８％、０．２３％；「リガンドを持つＰＧＴ１２１  Ｆａｂ：
９６．７％、３．１％、０．２％）。ＰｙＭＯＬを分子可視化のために、およびＦａｂ構
造の図を生成するために使用した。埋まっている表面積の算定は、１．４Åプローブを使
用してＡｒｅａｉｍｏｌ（ＣＣＰ４スイート）で行った。
【０１２５】
ＰｙＭＯＬのＳｕｐｅｒスクリプトを用いてＦａｂ構造を整合した。ＰＤＢｅＦｏｌｄ
を用いて、ペアワイズＣαアラインメントを行った。
【０１２６】
実施例２  ＰＧＴ１２１クローン型の優勢および多様性
ＹＵ−２  ｇｐ１４０三量体を「ベイト」として使用してクレードＡ感染アフリカ人ド
ナーからｇｐ１４０特異的ＩｇＧメモリーＢ細胞を単離した。２３のユニークなクローン
ファミリーに対応する、８７のマッチする免疫グロブリン重（ＩｇＨ）および軽（ＩｇＬ
）鎖遺伝子を同定した。ＩｇＨ抗ｇｐ１４０レパートリーでは１つのクローンファミリー
が優勢であり、それはすべての増殖Ｂ細胞クローンの約２８％に相当する。このＢ細胞フ
ァミリーは、ＰＧＴ１２１−１２３と同じクローンに対応し（Ｎａｔｕｒｅ  ４７７（７
３６５）：４６６−４７０）、３８メンバーを含有し、そのうち２９は、ヌクレオチドレ
ベルでユニークな変異体であった（表３）。それらのＩｇＨヌクレオチド配列に基づき、
ＰＧＴ１２１ファミリーは、２群に分かれる：ＰＧＴ１２１−１２３および９つの近縁変
異体を含有するＰＧＴ１２１様群と、２０メンバーを含有する、１０−１０７４様の、第
二の群。我々の旧来のプライマー（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２９（１−
２）：１１２−１２４；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１（５６３８）：１３７４−１３７７）は
、フレームワーク領域１をコードする領域でのヌクレオチド欠失のためＰＧＴ１２１Ｂ細
胞クローンによって発現されるＩｇＬ遺伝子を増幅しなかったが、大きく体細胞突然変異
した遺伝子を増幅するように設計された新たなＩｇλ特異的プライマーを使用して３８Ｉ
ｇλ遺伝子のうちの２４の遺伝子を得た（表３）。ＩｇＨ遺伝子の高い超突然変異レベル
（平均でＶＨ遺伝子の１８．２％）と一致して、増幅されたＩｇλ遺伝子は、非常に突然
変異しており（平均でＶλ遺伝子の１８．２％）、フレームワーク領域１（ＦＷＲ１）に
ヌクレオチド欠失（１２から２１ヌクレオチド）をおよびフレームワーク領域３（ＦＷＲ
３）に９ヌクレオチド挿入を有した（図３Ｂおよび表３）。
【０１２７】
３つのＰＧＴ抗体（ＰＧＴ−１２１、−１２２および−１２３）、１１のＰＧＴ１２１
および１０−１０７４クローナル変異体（１０−２５９、１０−３０３、１０−４１０、
１０−８４７、１０−９９６、１０−１０７４、１０−１１２１、１０−１１３０、１０
−１１４６、１０−１３４１、１０−１３６９、および１０−１０７４ＧＭ、）、推定生
殖細胞系（ＧＬ）、およびコンセンサス配列の配列アラインメントを図３（ａ）および３
（ｂ）に示す。ＩＭＧＴおよびＫＡＢＴ両方のシステムに従って、対応する重鎖可変領域
、軽鎖可変領域、重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲについての配列を下の表１に収載する。Ｋ
ＡＢＴシステムに従って配列に割り当てられた配列識別番号を下の表２に収載する。
【０１２８】
【表１−１】
2019071888.tif 000002
【０１２９】
【表１−２】
2019071888.tif 000003
【０１３０】
【表１−３】
2019071888.tif 000004
【０１３１】
【表１−４】
2019071888.tif 000005
【０１３２】
【表２】
2019071888.tif 000006
【０１３３】
１１の新規のユニークな変異体を発現させ（表３）、ＥＬＩＳＡおよび表面プラズモン
共鳴（ＳＰＲ）によってＹＵ−２  ｇｐ１２０およびｇｐ１４０への結合を実証した。別
段の注記がない限り、これらおよび他の実験についてのｇｐ１２０およびｇｐ１４０タン
パク質は、複合型Ｎグリカンまたは高マンノースＮグリカンのいずれかをＰＮＧＳに結合
させることができる哺乳動物細胞において発現させた。ｇｐ１２０との反応性レベルは、
ＰＧＴ１２１および１０−１０７４群に属する抗体間で異なり、後者のほうが、主として
１０−１０７４類縁抗体についてのｇｐ１２０／ｇｐ１４０からの遅い解離（図４Ｂ）の
ため、高い見かけの親和性を呈示した（図３Ａ）。
【０１３４】
実施例３  ＰＧＴ１２１および１０−１０７４エピトープ
Ｖ３ループステムの近傍のＡｓｎ３３２ｇｐ１２０は、ＰＧＴ１２１による結合および
ウイルス中和に極めて重要であると報告されており（Ｎａｔｕｒｅ  ４７７（７３６５）
：４６６−４７０）、それ故、我々は、ＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様抗体によ
る抗原認識におけるＶ３の役割を調査した。Ｖ１−Ｖ３ループを欠く（ｇｐ１２０コア）
またはＶ３の一部分を保持する（２ＣＣ−コア）ＨＸＢ２  ｇｐ１２０「コア」タンパク
質を使用し、およびＶ３ステムに二重アラニン置換を有するＹＵ−２  ｇｐ１２０突然変
異体タンパク質（ｇｐ１２０ＧＤ３２４−５ＡＡ）を使用して、ＥＬＩＳＡを行った。試
験した抗体は、インタクトＹＵ−２  ｇｐ１２０と比較してＶ３ループを欠く変異体およ
びｇｐ１２０ＧＤ３２４−５ＡＡに対する減少した反応性を示し、１０−１０７４群抗体
の結合が最も影響を受けた（図５ＡおよびＢ）。これらの結果は、両方の抗体群による認
識が、Ｖ３ループの近傍のタンパク質決定基を必要とすることを示唆する。Ｖ３に及ぶオ
ーバーラッピングペプチドに結合した抗体はなく、これは、標的エピトープが、不連続で
あること、および／または単離されたペプチドによって達成されない特定の高次構造を必
要とすることを示唆する（図５Ｃ）。
【０１３５】
Ａｓｎ３３２ｇｐ１２０（以前の番号付け（Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  ７（４）
：１６６０−１６７４）ではＡｓｎ３３７ｇｐ１２０）は、配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔ
ｈｒと定義された有望なＮ−グリコシル化部位（ＰＮＧＳ）のＮ末端残基である。Ａｓｎ
３３２ｇｐ１２０および／またはそのＮ結合グリカンが、新規ＰＧＴ１２１群および１０
−１０７４群抗体のｇｐ１２０反応性に必要とされるかどうかを判定するために、我々は
、ＥＬＩＳＡによってＹＵ−２ｇｐ１２０Ｎ３３２Ａへのそれらの結合を試験した。Ｎ３
３２Ａ置換は、ＰＧＴ１２１およびすべての新規抗体変異体の結合を減少させたが、隣接
グリコシル化部位を欠く突然変異体ｇｐ１２０（ｇｐ１２０ＮＮＴ３０１−３ＡＡＡ突然
変異体）に対するそれらの反応性は不変であった。Ａｓｎ３３２ｇｐ１２０ＰＮＧＳに加
えて、ＰＮＧＳが、新規抗体による認識に影響を及ぼすかどうかを判定するために、我々
は、ＹＵ−２  ｇｐ１２０におけるＮ３３２Ａ突然変異をＡｓｎ２６２ｇｐ１２０とＡｓ
ｎ４０６ｇｐ１２０間に位置するＰＮＧＳの突然変異と組み合わせた一連の１１の二重グ
リカン突然変異体を構築した。ＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様抗体のすべてが、
ｇｐ１２０Ｎ３３２Ａに対する親和性について匹敵する親和性で二重グリカン突然変異体
の各々に結合した。
【０１３６】
ＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様抗体による全グリカン認識を比較するために、
我々は、複合型Ｎ−グリカンと高マンノースＮ−グリカンの両方を切断するＰＮＧａｓｅ
Ｆで処理したＹＵ−２  ｇｐ１２０へのそれらの結合を調査した。ｇｐ１２０は、それ
が変性されない限り、酵素的により完全に脱グリコシル化され得ないので、ＰＮＧａｓｅ
Ｆ処理は、天然にフォールディングされたｇｐ１２０の部分的な脱グリコシル化をもた
らした（図６）。それにもかかわらず、前記２群の抗体の反応性は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆに
よるｇｐ１２０の部分的脱グリコシル化が、すべてのＰＧＴ１２１様抗体の結合活性を減
少させたが、いずれの１０−１０７４様抗体の結合活性も減少させなかった点で異なった
（図６Ｃ）。高マンノースＮ−グリカンを切断するが複合型Ｎ−グリカンを切断しないＥ
ｎｄｏ  Ｈで処理したＹＵ−２  ｇｐ１２０を用いて行った類似の実験は、ＰＧＴ１２１
様抗体より１０−１０７４様抗体の結合に影響を及ぼした（図６Ｄ）。
【０１３７】
Ｎ−グリカンマイクロアレイにより、７つの試験したＰＧＴ１２１様抗体のうちの６つ
は、ガラクトースまたはα２−６結合シアル酸を末端に有する複合型モノまたはバイアン
テナＮ−グリカンへの検出可能な結合を示すが、高マンノース型グリカンへの検出可能な
結合を示さないことが明らかになった。これは、ＰＧＴ１２１−１２３の高マンノースＮ
グリカンへの結合がない、ならびにｇｐ１２０結合についてのＭａｎ４およびＭａｎ９デ
ンドロンによる競合がないという以前の報告を確証し、拡張する（図７）。対照的に、１
０−１０７４様抗体による無タンパク質のグリカンへの検出可能な結合はなかった（図７
）。ＰＧＴ１２１様抗体は、無タンパク質の複合型Ｎ−グリカンに結合し、高マンノース
Ｎ−グリカンには結合しなかったが、ＰＧＴ１２１様抗体は、ＰＮＧＳへの高マンノース
グリカンの排他的結合をもたらすマンノシダーゼ阻害剤であるキフネシンで処理した細胞
において生産されたＹＵ−２  ｇｐ１２０（ｇｐ１２０ｋｉｆ）への結合を保持した（図
８Ｂ）。ＰＧＴ１２１様抗体の大部分は、ｇｐ１２０ｋｉｆへの結合に、小さいが再現性
のある減少を呈示した。一方、１０−１０７４様抗体は、ｇｐ１２０ｋｉｆへの完全結合
を保持した（図８Ｂ）。これらの結果は、高マンノースＮグリカンはもちろん、複合型Ｎ
−グリカンも、ＰＧＴ１２１様抗体のエピトープに関与し得るという仮説と一致する。
【０１３８】
各群の２つの代表メンバー（ＰＧＴ１２１様群についてはＰＧＴ１２１および１０−１
３６９；１０−１０７４様群については１０−１０７４および１０−９９６）を用いて競
合ＥＬＩＳＡによりエピトープマッピング実験を行った。４つすべての抗体が交差競合を
示したが、ＰＧＴ１２１は、１０−９９６および１０−１０７４のｇｐ１２０への結合を
逆の場合より穏やかに阻害した。標的エピトープをさらにマッピングするために、我々は
、Ｖ３ループのクラウン（図５）、ＣＤ４ｂｓ、共受容体結合部位（ＣＤ４誘導型；ＣＤ
４ｉ）、一群の高マンノースＮ−グリカン（２Ｇ１２）（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ  ７６（１４）：７２９３−７３０５；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃ
ｉ  ＵＳＡ  １０２（３８）：１３３７２−１３３７７））または位置３０１および３３
２のＶ３ループおよびＮ結合グリカン（ＰＧＴ１２８）を認識する抗ｇｐ１２０抗体を使
用した。抗Ｖ３クラウン抗体は、ＰＧＴ１２１および１０−１３６９の結合を阻害したが
、１０−９９６および１０−１０７４の結合に干渉しなかった。ＰＧＴ１２８、およびよ
り少ない程度に２Ｇ１２は、４つすべての抗体のｇｐ１２０への結合を減少させたが、Ｃ
Ｄ４ｂｓおよびＣＤ４ｉ抗体は、減少させなかった。
【０１３９】
考え合わせると、これらのデータは、ＰＧＴ１２１クローンメンバーが、Ｖ３ループお
よびＡｓｎ３３２ｇｐ１２０関連グリカンの近傍のタンパク質決定基を含む部位を認識す
ることを示唆する。しかし、クローンは、ｇｐ１２０に対する親和性が異なるとともにエ
ピトープ形成におけるグリカンの役割が異なる２つのファミリー、ＰＧＴ１２１様群およ
び１０−１０７４様群、に分かれる。
【０１４０】
実施例４  広域かつ強力なＨＩＶ中和
新規ＰＧＴ１２１変異体の中和活性を評価するために、我々は、ｇｐ１２０位置３３２
のＰＮＧＳを欠くＲ１１６６．ｃ１を含む１０のウイルス株を使用して、ＴＺＭ−ｂｌ細
胞のＨＩＶ感染を阻害するそれらの能力を測定した。１０−１０７４様抗体を含めて、す
べてのＰＧＴ１２１変異体は、９つのシュードウイルスを中和し、およびいずれもＲ１１
６６．ｃ１コントロールを中和しなかった（図１Ａおよび表４）。中和活性は、ＨＩＶス
パイクに対する親和性と相関し、１０−１０７４群は、ＰＧＴ１２１群よりわずかに大き
い効力を示した（図１Ｂおよび図４Ｃ）。ＰＧＴ１２１／１０−１０７４抗体クローン型
の代表的な生殖細胞系バージョン（ＧＬ）は、ｇｐ１２０／ｇｐ１４０を結合することが
できず、そのパネル内のいずれのウイルスも中和することもできなかった。これは、体細
胞突然変異が結合および中和には必要であることを含意する。ＧＬ軽鎖と突然変異１０−
１０７４−または１０−９９６−群重鎖の対合は、結合または中和をレスキューすること
ができなかった。これは、両方の突然変異鎖が抗体パラトープの正しい構築に寄与するこ
とを示唆する。
【０１４１】
１１９の中和困難シュードウイルス（ｔｉｅｒ−２およびｔｉｅｒ−３として分類され
る）の拡張パネルに対するＰＧＴ１２１の中和活性と２つの１０−１０７４様抗体（１０
−９９６および１０−１０７４）の中和活性を比較するために次のアッセイを行った（表
４および５）。１０−９９６および１０−１０７４は、ＰＧＴ１２１に類似した中和効力
および幅を示した（図１Ｃ、図９ならびに表５および６）。予想どおり、ｇｐ１２０位置
３３２および／または３３４（Ａｓｎ３３２−Ｘ−Ｓｅｒ３３４／Ｔｈｒ３３４ＰＮＧＳ
に及ぶ）のアミノ酸変化を有する大部分のウイルスは、中和に対して耐性であった（８３
．８％がＰＧＴ１２１に対して耐性であり、１００％が１０−１０７４および１０−９９
６に対して耐性であった）。中和に対して耐性のウイルスの大部分（１０−９９６につい
ては６８．５％、１０−１０７４については７２．５％およびＰＧＴ１２１については６
０．８％）が、このＰＮＧＳでの突然変異に起因した（表７）。匹敵する中和活性がＩｇ
ＧおよびＦａｂ形態のＰＧＴ１２１および１０−１０７４について観察された。これは、
二価がそれらの活性にとって重要でないことを示唆する（図１Ｄ）。
【０１４２】
ＰＧＴ１２１および１０−１０７４による中和におけるＨＩＶエンベロープ上の複合型
Ｎ−グリカンの潜在的役割を評価するために、我々は、２つの異なる方法で、高マンノー
スのみのビリオンを生産した：キフネシンで処理した細胞におけるシュードウイルスの構
築による、結果としてＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ結合グリカンが得られる方法、またはＨ
ＥＫ２９３Ｓ  ＧｎＴＩ−／−細胞における構築による、結果としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡ
ｃ２Ｎ結合グリカンが得られる方法。我々は、ＰＧＴ１２１が、３つのキフネシン由来Ｐ
ＧＴ１２１感受性／１０−１０７４耐性株のうちの２つを、野生型細胞において生産され
たそれらの対応物と等価に中和することを発見した（図８Ｃ）。ＧｎＴＩ−／−細胞にお
いて生産された２つのＰＧＴ１２１感受性／１０−１０７４耐性ウイルス株は、野生型細
胞において生産されたそれらの対応物と同等にＰＧＴ１２１および１０−１０７４に対し
て感受性があった。複合型Ｎ−グリカンは、ＣＤ４結合部位が抗体結合しないようにある
程度保護するという以前の報告と一致して、ＧｎＴＩ−／−細胞において生産されたウイ
ルスは、ＣＤ４結合部位抗体（ＮＩＨ４５−４６Ｇ５４Ｗおよび３ＢＮＣ６０）に対して
より感受性があった（図８Ｄ）。
【０１４３】
実施例５  新規伝染ＨＩＶ−１
次に、我々は、伝染始祖（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  ｆｏｕｎｄｅｒ）ウイルスに対す
るＰＧＴ１２１および１０−１０７４の活性を、１９８５年と１９８９年の間に抗体陽転
した個体（「過去の抗体陽転者」、ｎ＝１４）または２００３年と２００６年の間に抗体
陽転した個体（「現在の抗体陽転者」、ｎ＝２５）のコホートから単離した９５のクレー
ドＢウイルスを使用して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ベースのアッセイで中和を評価する
ことによって調査した（５１、５２）。我々は、ＰＧＴ１２１および１０−１０７４を、
抗ＣＤ４ｂｓ  ｂＮＡｂおよび他のｂＮＡｂ（ＶＲＣ０１、ＰＧ９／ＰＧ１６、ｂ１２、
２Ｇ１２、４Ｅ１０および２Ｆ５を含む）と比較した。中和活性のクラスター化分析は、
２つの群への分離を示した；ＰＧＴ１２１／１０−１０７４群は、抗ＣＤ４ｂｓおよびＰ
Ｇ９抗体を含む最も活性の高いＨＩＶ中和剤を含んだ（表８）。驚くべきことに、１０−
１０７４は、このクレードＢウイルスパネルに対して非常に優れた中和効力を示し、試験
したすべてのｂＮＡｂについて０．１μｇ／ｍＬで最大幅（９５のクレードＢウイルスの
６７％）を呈示した（表８）。１０−１０７４は、現在のクレードＢウイルスに対してＰ
ＧＴ１２１より高い効力（〜２０倍差）を示したが、両方の抗体は、現在のウイルスより
過去のウイルスに対して有効であった（図１Ｅおよび図１０）。
【０１４４】
実施例６  ＰＧＴ１２１、１０−１０７４およびＧＬの結晶構造
ＰＧＴ１２１様抗体と１０７４様抗体間の差の構造決定因子を調査するために、我々は
、ＰＧＴ１２１、１０−１０７４および代表的な生殖細胞系前駆体（ＧＬ）のＦａｂ断片
の結晶構造をそれぞれ３．０Å、１．９Åおよび２．４Å分解能で解明した（表９）。前
記３つのＦａｂの中での重および軽鎖可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）の重ね合わせによ
り、主鎖構造の保存とともにＧＬに対する差が親和性成熟ＦａｂのＣＤＲＨ３およびＣＤ
ＲＬ３ループの小さな変位に限定されることが明らかになった（表１０）。
【０１４５】
抗体により共有される珍しい特徴は、それらの長い（２５残基）ＣＤＲＨ３ループであ
り、このループは、ＶＨドメインＦおよびＧ鎖を伸長する２本鎖逆平行βシートを形成す
る。各Ｆａｂにおいて、伸長ＣＤＲＨ３ループの先端は、主として非極性残基を含有する
。類似の構造的特徴が、エピトープがｇｐ１２０  Ｖ１Ｖ２ループを含む炭水化物感受性
抗体であるＰＧＴ１４５のＣＤＲＨ３について観察された。しかし、ＰＧＴ１４５のＣＤ
ＲＨ３の伸長された２本鎖βシートは、先端に２つの硫酸化チロシンを含む、負の電荷を
有する残基を主として含有する。ＰＧＴ１２１およびＰＧＴ１４５のＶＨ−ＶＬのアライ
ンメント（表１０）は、ＣＤＲＨ３ＰＧＴ１４５が以前のＣＤＲＨ３ＰＧＴ１２１を伸長
すること、ならびにその先端とＶＨドメインは整列されるが、ＰＧＴ１２１、１０−１０
７４およびＧＬのＣＤＲＨ３はＶＬの方に傾くことを示す。ＶＬの方へのＣＤＲＨ３ＰＧ
Ｔ１２１／ＣＤＲＨ３１０−１０７４／ＣＤＲＨ３ＧＬの傾きは、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ
３間のクレフトを開き、これは、類縁の抗体では共有されない特徴である。
【０１４６】
ＰＧＴ１２１および１０−１０７４は、ＧＬに対しておよび互いに大きく異なる（１３
２残基のうち、ＰＧＴ１２１ＶＨは、１０−１０７４ＶＨおよびＧＬＶＨとそれぞれ３６
および４５残基異なり、１０−１０７４ＶＨとＧＬＶＨは２９異なる）。これらのＰＧＴ
１２１／１０−１０７４の差の大部分は、ＣＤＲＶＨループおよびＣＤＲＬ３にある。興
味深いことに、ＣＤＲＨ３における６つの置換（残基１００ｄ、１００ｆ、１００ｈ、１
００ｊ、１００ｌ、１００ｎ）は、２残基ごとに置換されるように交互になっており、そ
の結果、ＶＬへのＣＤＲＨ３の傾きに起因してＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３間のクレフトが再
び表面に現れることになる。この領域は、ＰＧＴ１２１および１０−１０７４の異なる微
細な特異性の一因となる可能性が高い。重鎖フレームワーク領域３（ＦＷＲ３ＨＣ）にお
ける５つの他の溶媒曝露置換（残基６４、７８、８０−８２；鎖ＤおよびＥ）は、ＨＩＶ
抗体におけるフレームワーク領域がｇｐ１２０と接触できることを考えると、潜在的抗原
接触部位である。微細な特異性差の一因となり得る他の差としては、１０−１０７４また
はＧＬには存在しないＡｓｐ５６ＨＣの近傍のＰＧＴ１２１上の負のパッチ（１０−１０
７４およびＧＬにおけるＳｅｒ５６ＨＣ）、ならびにＧＬの類似した表面では見いだせな
いＣＤＲＬ１およびＣＤＲＬ３上の正のパッチが挙げられる。
【０１４７】
ＰＧＴ１２１および１０−１０７４に共通の体細胞突然変異は、それらのエピトープの
共有の特徴に関与し得る。ＰＧＴ１２１および１０−１０７４の重鎖は、（３６のＰＧＴ
１２１−ＧＬ差および２９の１０−１０７４−ＧＬ差のうち）３つの共通の突然変異しか
共有しない。対照的に、ＰＧＴ１２１および１０−１０７４は、（３７のＰＧＴ１２１−
ＧＬ差および３６の１０−１０７４−ＧＬ差のうち）１８の共通の軽鎖突然変異を共有し
、それらには、鎖ＤおよびＥを接続するループの膨隆の原因となる、軽鎖ＦＷＲ３内への
挿入、および低負電荷の表面をもたらす、ＣＤＲＬ２ＧＬ内のＡｓｐ５０ＬＣ−Ａｓｐ５
１ＬＣのＰＧＴ１２１と１０−１０７４両方におけるＡｓｎ５０ＬＣ−Ａｓｎ５１ＬＣへ
の置換が含まれる。ＬＣＰＧＴ１２１およびＬＣ１０−１０７４に導入される多数の共通
の置換（ＬＣ置換のおおよそ５０％）は、ＰＧＴ１２１および１０−１０７４によって共
有されるエピトープの潜在的接触領域としてＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＦＷＲ２ＬＣ
を指摘する。
【０１４８】
次に、Ａｓｎ３３２ｇｐ１２０結合およびＡｓｎ３０１ｇｐ１２０結合グリカンならび
にＶ３を認識するＰＧＴ１２８であって、複合型Ｎ−グリカン変性タンパク質を生産する
ことができない細胞において発現される外部ドメイン／ミニＶ３ループ  ｇｐ１２０との
複合体として解明されたものであるＰＧＴ１２８の構造との比較を行った。ＰＧＴ１２１
および１０−１０７４のＣＤＲＨ３ループとは異なり、ＰＧＴ１２８ＣＤＲＨ３は、ＰＧ
Ｔ１２８ＶＬの方に傾いておらず、ＣＤＲＨ３ＰＧＴ１２８は、２本鎖βシートを含まな
い。加えて、ＣＤＲＨ３ＰＧＴ１２８（１８残基）は、ＰＧＴ１２１および１０−１０７
４（２４残基）のＣＤＲＨ３より短いが、ＣＤＲＨ２ＰＧＴ１２８は、ＰＧＴ１２１また
は１０−１０７４においても見られない６残基挿入を含有する。これらの差のため、ＰＧ
Ｔ１２８ではＣＤＲＨ２が最も顕著な特徴であるのに対し、ＰＧＴ１２１および１０−１
０７４ではＣＤＲＨ３が最も顕著である。ＣＤＲＨ２ＰＧＴ１２８およびＣＤＲＬ３ＰＧ
Ｔ１２８は一緒に、Ａｓｎ３３２ｇｐ１２０に結合しているＭａｎ８／９を認識し、ＣＤ
ＲＨ３ＰＧＴ１２８は、Ｖ３ループ基部と接触する。このｇｐ１２０認識モードは、ＰＧ
Ｔ１２１および１０−１０７４には、それらのＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３ループの構造
的特徴がＰＧＴ１２８のものと有意に異なるので、不可能であり、これは、無タンパク質
高マンノースグリカンを認識する、ＰＧＴ１２１および１０−１０７４ではなく、ＰＧＴ
１２８の能力（図７）と一致する。
【０１４９】
実施例７  ＰＧＴ１２１−グリカン複合体の結晶構造
複合型シアル化バイアンテナグリカンを伴うＰＧＴ１２１の２．４Å分解能構造を、Ｎ
Ａ２、複合型アシアリルバイアンテナグリカン（図７）を含む条件下で得た結晶を使用し
て解明した（表９）。驚くべきことに、我々の結晶構造におけるＰＧＴ１２１に結合した
グリカンは、ＮＡ２ではなく、むしろ、結晶格子内の隣接ＰＧＴ１２１  Ｆａｂからの複
合型Ｎグリカン、具体的にはＡｓｎ１０５ＨＣに結合しているＮ−グリカンであった。こ
のグリカン同一性は、Ａｓｎ１０５ＨＣへのグリコシド結合についてのおよびＭａｎα１
−３Ｍａｎアンテナ上の末端シアル酸についての電子密度があるため、明らかである（Ｍ
ａｎα１−６Ｍａｎアンテナのガラクトースおよびシアル酸部分は、未解明であった）。
結合グリカンの組成は、マイクロアレイ実験においてＰＧＴ１２１により結合されたα２
−６シアル化Ａ２（２−６）グリカンの部分に対応し（図７）、かつ、ＨＥＫ２９３Ｔ細
胞において発現されたタンパク質上のＰＮＧＳに結合している複合型Ｎ−グリカンでの予
想したシアリル結合に対応した。この構造（「リガンドを持つ」ＰＧＴ１２１）のＶＨ−
ＶＬドメインは、結合Ｎ−グリカンのないＰＧＴ１２１構造（「リガンドを持たない」Ｐ
ＧＴ１２１）のＶＨ−ＶＬドメインに有意差なく重なり合う（図１０）が、エルボ屈曲角
（ｅｌｂｏｗ  ｂｅｎｄ  ａｎｇｌｅ）（ＶＨ−ＶＬとＣＨ１−ＣＬ擬二分子（ｐｓｅｕ
ｄｏ−ｄｙａｄ）間の角度）は構造間で異なる。この差は、結晶格子力に依存して変動し
得るエルボ屈曲角をＦａｂにとらせる柔軟性を反映する可能性が高い。
【０１５０】
ある結晶構造（「リガンドを持つ」ＰＧＴ１２１構造）では複合型Ｎ−グリカンの結合
が観察され、別の構造（「リガンドを持たない」ＰＧＴ１２１構造）では観察されなかっ
たことを考えると、我々は、ｇｐ１２０に結合していない複合型Ｎ−グリカンに対するＰ
ＧＴ１２１の親和性は、結晶中のＰＧＴ１２１の濃度（〜１０ｍＭ）の範囲内であると推
測する。単離されたグリカンを結合するためのＫＤが、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−Ａｓｎ
へのＰＧ９結合について得られた１．６ｍＭ  ＫＤに匹敵する、１〜１０ｍＭの範囲内で
あると仮定すると、単離されたグリカンのＰＧＴ１２１結合についてのＫＤは、ｇｐ１２
０に対するＰＧＴ１２１の親和性、ｎＭ範囲である、へのほんの小さな寄与を表す（図４
Ａ）。
【０１５１】
「リガンドを持つ」ＰＧＴ１２１構造内のグリカンは、ＶＨドメインと排他的に相互作
用し、３つすべてのＣＤＲ内の残基と広範に接触する（ＰＧＴ１２１ＨＣ上の埋まってい
る表面積＝６００Å２）。接触は、９つのアミノ酸での１０の直接の水素結合および１８
の水媒介水素結合（図１１）を含み、枝分かれ部位のマンノースに結合したＮ−アセチル
グルコサミン部分と１−３アンテナ上の末端シアル酸との間にグリカンを固定している。
Ａｓｐ３１ＨＣとの水媒介水素結合に加えて、ＰＧＴ１２１残基Ａｓｐ３１ＨＣおよびＨ
ｉｓ９７ＨＣとの３つの直接の水素結合を含む、ＰＧＴ１２１とのいくつかの接触がこの
シアル酸によってなされる。シアル酸は、水媒介グリカン内水素結合ネットワークにも寄
与する。シアル酸との直接の接触は、我々のグリカンマイクロアレイ分析におけるＰＧＴ
１２１のシアル化Ａ２（２−６）グリカンに対する、非シアル化ＮＡ２グリカンに対する
よりも強い結合（図７）の説明になり得る。１−３アンテナのＮ−アセチルグルコサミン
およびガラクトース部分により確立される広範な水媒介タンパク質接触により、非シアル
化モノおよびバイアンテナグリカンについてＰＧＴ１２１への観察された結合を説明する
ことができるだろう（図７）。
【０１５２】
グリカンへの直接のまたはおそらくアミノ酸側鎖の接触に寄与する残基のうちの６つ（
Ｓｅｒ３２ＨＣ−ＣＤＲＨ１、Ｌｙｓ５３ＨＣ−ＣＤＲＨ２、Ｓｅｒ５４ＨＣ−ＣＤＲＨ
２、Ａｓｎ５８ＨＣ−ＣＤＲＨ２、Ｈｉｓ９７ＨＣ−ＣＤＲＨ３、Ｔｈｒ１００ｌＨＣ−
ＣＤＲＨ３）は、１０−１０７４のもの（Ｔｙｒ３２ＨＣ−ＣＤＲＨ１、Ａｓｐ５３ＨＣ
−ＣＤＲＨ２、Ａｒｇ５４ＨＣ−ＣＤＲＨ２、Ｔｈｒ５８ＨＣ−ＣＤＲＨ２、Ａｒｇ９７
ＨＣ−ＣＤＲＨ３、Ｔｙｒ１００ｌＨＣ−ＣＤＲＨ３）と異なり、ＰＧＴ１２１様抗体間
で高度に保存されるが、１０−１０７４様抗体間ではされない。１０−１０７４残基には
、観察されたグリカン接触をなすための、または立体的衝突の原因となる嵩高い側鎖を有
するための、対応する官能基がない。これらの残基のうちの４つは、ＧＬのもの（Ｔｙｒ
３２ＨＣ−ＣＤＲＨ１、Ｔｙｒ５３ＨＣ−ＣＤＲＨ２、Ｇｌｎ９７ＨＣ−ＣＤＲＨ３、Ｔ
ｙｒ１００ｌＨＣ−ＣＤＲＨ３）とも異なり、これは、我々のグリカンマイクロアレイに
おける無タンパク質複合型グリカンへの１０−１０７４様抗体およびＧＬの結合の欠乏が
、水素結合および／または立体的衝突（例えば、Ａｒｇ９７１０−１０７４対してＨｉｓ
９７ＰＧＴ１２１；Ｔｙｒ１００ｌ１０−１０７４対してＴｈｒ１００ｌＰＧＴ１２１）
の欠如に起因することを示唆する。ＣＤＲＨループにおいて、ＰＧＴ１２１と１０−１０
７４群の間の配列の差の大部分のように、特に、我々が結合した複合型Ｎ−グリカンを観
察したＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３の間のクレフトの表面について、ｇｐ１２０上の複合型グ
リカンの異なる認識は、観察されたそれらの微細な特異性の差のいくつかまたはすべての
主要因でありうる。
【０１５３】
実施例８  グリカン含有抗体残基の置換は中和に影響を及ぼす
「リガンドを持つ」ＰＧＴ１２１構造から同定された複合型Ｎ−グリカン含有残基の寄
与を評価するために、我々は、複合型グリカン含有残基をＰＧＴ１２１と１０−１０７４
間で交換するように設計した２つの突然変異体抗体、すなわち、ＰＧＴ１２１残基（Ｉｇ
Ｈ  Ｙ３２Ｓ、Ｄ５３Ｋ、Ｒ５４Ｓ、Ｔ５８Ｎ、Ｒ９７Ｈ、Ｙ１００ｌＴにおける６置換
）を有する１０−１０７４  ＩｇＧ、および相互置換を有するＰＧＴ１２１  ＩｇＧを産
生した。「グリコミュータント」抗体（１０−１０７４ＧＭおよびＰＧＴ１２１ＧＭ）は
、ＳＰＲによって測定したとき、ＹＵ−２  ｇｐ１２０／ｇｐ１４０に対して野生型に近
い見かけの親和性を呈示した（図２Ａ）。これは、前記置換は、ＰＧＴ１２１および１０
−１０７４両方によって中和されたウイルス株に由来するエンベロープスパイクへの結合
を破壊しなかったこと（図１Ａ）の証拠になる。ＰＧＴ１２１複合型Ｎ−グリカン含有残
基を、両方の野生型抗体により結合されたｇｐ１２０／ｇｐ１４０への結合を破壊するこ
となく１０−１０７４バックグラウンド内に適応させることができることは、微細な特異
性差にもかかわらず抗原結合が総体的に類似していることを含意する。
【０１５４】
野生型ＰＧＴ１２１とは異なり、ＰＧＴ１２１ＧＭは、マイクロアレイ実験においてグ
リカン結合を示さなかった。これは、置換位置の１０−１０７４残基が無タンパク質グリ
カン結合と適合性を有さないこと（図２Ｂ）を確証し、および「リガンドを持つ」ＰＧＴ
１２１構造内のグリカンと接触している残基が前記マイクロアレイにおける複合型グリカ
ンの認識に関与するという示唆を裏付ける。１０−１０７４ＧＭもまた無タンパク質グリ
カンへの結合を示さなかった（図２Ｂ）。これは、無タンパク質複合型Ｎ−グリカンのた
めの結合部位の生成に、置換されたものの他にも残基が関与することを示す。
【０１５５】
次に、ＴＺＭ−ｂｌベースのアッセイを用いて、野生型抗体と「グリコミュータント」
抗体の中和を比較した。我々は、ＰＧＴ１２１または１０−１０７４に対して異なる耐性
を有する株ならびに両方の野生型抗体に感受性の株を含む、４０のウイルス株を試験した
（図２Ｃおよび表１２）。精製ＹＵ−２エンベロープタンパク質へのＰＧＴ１２１ＧＭお
よび１０−１０７４ＧＭの結合と一致して、両方の突然変異体はＹＵ−２ウイルスを中和
したが、ＰＧＴ１２１感受性株の６４％は、ＰＧＴ１２１ＧＭに対して耐性であった（図
２Ｃおよび表１２）。これは、「リガンドを持つ」ＰＧＴ１２１構造において同定された
グリカン含有残基が、ＰＧＴ１２１の中和活性に関係があることを示唆する。逆に、１０
−１０７４ＧＭは、４つの１０−１０７４感受性株（ＷＩＴＯ４１６０．３３、ＺＭ２１
４Ｍ．ＰＬ１５、Ｃｅ１１７２＿Ｈ１、および３８１７．ｖ２．ｃ５９）に対する３倍よ
り大きい効力増加を含めて、１０−１０７４感受性株に対して野生型１０−１０７４より
高い平均効力を呈示した（図２Ｃおよび表１２）。一般に、１０−１０７４へのＰＧＴ１
２１置換は、ＰＧＴ１２１感受性／１０−１０７４耐性株では１０−１０７４ＧＭに対す
る感受性を付与しないが、これらの株のうちの２つ（ＣＮＥ１９および６２３５７＿１４
＿Ｄ３＿４５８９）は、１０−１０７４ＧＭに対して感受性になった（それぞれ、ＩＣ５
０＝０．１９μｇ／ｍＬおよび４０．８μｇ／ｍＬ）。興味深いことに、これらは、イン
タクトＡｓｎ３３２ｇｐ１２０結合ＰＮＧＳを含む唯一のＰＧＴ１２１感受性／１０−１
０７４耐性株である。他のＰＧＴ１２１感受性／１０−１０７４耐性株は、Ａｓｎ３３２
ｇｐ１２０結合グリカンを欠き、かつＰＧＴ１２１ＧＭおよび１０−１０７４ＧＭに対し
て耐性であり、これは、野生型ＰＧＴ１２１に対するそれらの感受性が、隣接Ｎ−グリカ
ン、および／またはエピトープのタンパク質部分による補償を必要とすることを含意する
。機能の劇的な獲得が、１つの株（ＣＮＥ１９）に対する１０−１０７４ＧＭについての
み観察されたが、この結果は、１０−１０７４感受性株に対して１０−１０７４ＧＭにつ
いて観察された一般的改善（図２Ｃ）とともに、結晶学的に同定されたグリカン含有残基
がある状況ではＰＧＴ１２１様認識特性を１０−１０７４に移入する場合があり、および
／または他の状況ではその効力に影響を及ぼす場合があるという解釈と一致する。加えて
、ＰＧＴ１２１感受性株に対するＰＧＴ１２１ＧＭの中和活性の喪失は、ＰＧＴ１２１の
中和活性は、「リガンドを持つ」ＰＧＴ１２１構造において複合型Ｎ−グリカンと接触す
ると同定された残基を必要とすることの証拠となる。
【０１５６】
結果
ＰＧＴ１２１は、２つのクローン的に関連したメンバーのみを生じさせる、元をただせ
ば機能性スクリーニングにおいてクレードＡ感染ドナーの血清中で同定された、グリカン
依存性ｂＮＡｂである。ｇｐ１４０三量体を、単一細胞選別のための「ベイト」として使
用して、２９の新たなクローナル変異体を単離した。ＰＧＴ１２１クローンファミリーは
、近縁抗体のはっきりと異なる群、ＰＧＴ１２１群および１０−１０７４群、を含む。結
果は、両方の群のエピトープが、Ａｓｎ３３２ｇｐ１２０およびＶ３ループの基部にＰＮ
ＧＳを含むことを示唆する。ＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様抗体群は、アミノ酸
配列、ｇｐ１２０／ｇｐ１４０結合親和性、および中和活性が異なり、１０−１０７４様
抗体は、中和がＡｓｎ３３２ｇｐ１２０におけるインタクトＰＮＧＳに完全に依存するが
、ＰＧＴ１２１様抗体は、Ａｓｎ３３２ｇｐ１２０ＰＮＧＳを欠く一部のウイルス株を中
和することができた。
【０１５７】
２つの抗体群間の注目に値する差は、ＰＧＴ１２１様抗体が炭水化物アレイにおいて複
合型Ｎ−グリカンを結合したのに対して、１０−１０７４様抗体が試験したいずれの無タ
ンパク質Ｎ−グリカンにも検出可能な結合を示さなかったことである（図７）。抗ＨＩＶ
抗体による無タンパク質グリカン結合は、常に検出されるとは限らない；例えば、ＰＧ９
は、ｇｐ１２０結合高マンノースグリカンを認識するが、マイクロアレイではいずれの無
タンパク質グリカンへの結合も検出されなかった。したがって、グリカンマイクロアレイ
における陽性結果は、抗体エピトープの特定のグリカンの関与を含意するが、陰性結果は
、グリカン認識を排除しない。例えば、たとえグリカンマイクロアレイ実験において検出
可能でなくても、高マンノースグリカンは、ＰＧＴ１２１エピトープに関与することがあ
り、これは、高マンノースのみの形態のｇｐ１２０タンパク質およびビリオンの結合およ
び中和と一致する（図８）。
【０１５８】
ＰＧＴ１２１、１０−１０７４およびそれらのＧＬ前駆体の間の差についての分子的基
礎をそれらの結晶構造によって一部明らかにした。軽鎖体細胞突然変異体の大部分はＰＧ
Ｔ１２１および１０−１０７４間で共有されるが、重鎖の突然変異は異なるという発見は
、軽鎖がｇｐ１２０エピトープの共有部分と接触し、重鎖がはっきりと異なる特徴部を認
識することを示唆する。これらの三つの抗体のすべては、潜在エピトープの接近を可能に
し得る非極性の先端を有する伸長したＣＤＲＨ３を呈示する。２つの成熟Ｆａｂの抗原結
合部位の差は、主として、ＣＤＲＨ２と伸長したＣＤＲＨ３の間のクレフトに限局された
。興味深いことに、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３間の推定抗原結合クレフトは、ＰＧＴ１２１
および１０−１０７４の代表的な生殖細胞系前駆体においても見つけられた。
【０１５９】
ＶＨドメイン残基に結合している複合型シアル化Ｎ−グリカンが隣接ＰＧＴ１２１Ｆａ
ｂの結合部位と相互作用する結晶構造からＰＧＴ１２１様抗体によるグリカン認識に関す
る構造情報を得た。「リガンドを持つ」ＰＧＴ１２１構造のいくつかの特徴は、それが、
ＰＧＴ１２１様抗体によるｇｐ１２０上の複合型Ｎ−グリカンの認識を理解するために適
していることを示唆する。第一に、α２−６シアル化グリカンＡ２（２−６）ＰＧＴ１２
１に対応する構造におけるグリカンは、マイクロアレイにおいて結合する（図７）。第二
に、前記グリカンは、エピトープ認識に関与することが構造分析により示唆されたＣＤＲ
Ｈ３とＣＤＲＨ２間のクレフトを用いてＰＧＴ１２１と相互作用し、このことは、ＰＧＴ
１２１および１０−１０７４構造におけるＶＬの方へのＣＤＲＨ３の異常な傾きを潜在的
に説明する。第三に、グリカンと相互作用すると同定されたＶＨ残基の大部分は、ＰＧＴ
１２１と１０−１０７４間で異なり、これにより、グリカンマイクロアレイにおける異な
る結合プロファイルが合理的に説明され、およびタンパク質結合実験において明らかにな
った異なる微細な特異性を潜在的に説明する。第四に、ＰＧＴ１２１と１０−１０７４間
の結晶学的に同定されたグリカン接触残基の交換は、一部分、それらの特性を転移した：
ＰＧＴ１２１ＧＭは、１０−１０７４同様、無タンパク質グリカンに結合しなかったが、
ＰＧＴ１２１ＧＭおよび１０−１０７４ＧＭの両方が、精製ＹＵ−２  ｇｐ１２０／ｇｐ
１４０への野生型に近い結合を保存した。ＰＧＴ１２１ＧＭは、野生型ＰＧＴ１２１およ
び１０−１０７４によって中和された一部のウイルス株を中和する能力を保持したが、Ｐ
ＧＴ１２１感受性／１０−１０７４耐性である株を中和することはできなかった。これは
、グリカン結合モチーフが、１０−１０７４耐性株に対するＰＧＴ１２１の中和活性にと
って不可欠であることの証拠となる。相互交換のため、結晶学的に同定されたグリカンモ
チーフの転移と一致して、ならびにＰＧＴ１２１様および１０−１０７４様抗体のエピト
ープが類縁であるという仮説と一致して、１０−１０７４ＧＭの中和効力は、１０−１０
７４に対して増加され、または影響を受けず、およびある場合には、１０−１０７４ＧＭ
は、ＰＧＴ１２１感受性／１０−１０７４耐性株を強力に中和した。ＰＧＴ１２１様およ
び１０−１０７４様抗体に対して感受性のウイルスについてのＡｓｎ３３２ｇｐ１２０に
おけるＰＮＧＳとの相互作用以外、ＰＧＴ１２１中和データを入手できる株からのｇｐ１
２０配列の分析において、１０−１０７４耐性株には一般にＡｓｎ３３２ｇｐ１２０関連
ＰＮＧＳがないことを除き、ウイルス株の異なるカテゴリー（ＰＧＴ１２１感受性／１０
−１０７４感受性、ＰＧＴ１２１感受性／１０−１０７４耐性、ＰＧＴ１２１耐性／１０
−１０７４感受性）についてＰＮＧＳ利用の明確なパターンは出てこない。
【０１６０】
実施例９  抗ＨＩＶ−１中和ｍＡｂのインビボでの受動伝達
５つの単離された強力かつ広域作用性の抗ＨＩＶ中和モノクローナル抗体をアカゲザル
に投与し、２４時間後にそれらのアガケザルを２つの異なるＳＨＩＶのいずれかで直腸内
にチャレンジ感染した。チャレンジ感染した６０匹の動物から得た結果を併せることによ
り、曝露されたサルの５０％においてウイルス獲得を予防する血漿中の防御中和力価は、
おおよそ１：１００であった。
【０１６１】
動物実験
この研究において用いたマカクは、ＭＨＣクラスＩＭａｍｕ−Ａ＊０１対立遺伝子につ
いて陰性であった。
【０１６２】
Ｒ５指向性ＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８の構築
ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯ（ＰＮＡＳ  １０９，１９７６９−１９７７４（２０１２））ｇｐ
１２０  Ｖ３コード領域の５’および３’の半分に対応するプライマー（フォワードプラ
イマー：ＡＧＡＧＣＡＴＴＴＴＡＴＡＣＡＡＣＡＧＧＡＧＡＣＡＴＡＡＴＡＧＧＡＧＡＴ
ＡＴＡＡＧＡＣＡＡＧＣＡＣＡＴＴＧＣＡＡＣＡＴＴＡＧＴＡＡＡＧＴＡＡＡＡＴＧＧＣ
、およびリバースプライマー：ＴＣＣＴＧＧＴＣＣＴＡＴＡＴＧＴＡＴＡＣＴＴＴＴＣＣ
ＴＴＧＴＡＴＴＧＴＴＧＴＴＧＧＧＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＴＴＣＴＡＣＡＧＴ
ＴＴＣＡＴＴＣ）でのＰＣＲ突然変異誘発を用いて、これらのＶ３配列をｐＳＨＩＶＤＨ
１２＿ＣＬ７分子クローンの遺伝的背景（Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８，５５１３
−５５１９（２００４））に、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＰＦＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して導入した。ゲル精製後、ＰＣＲ産物をＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）で処理し、平滑末端結合してｐＳＨＩＶＤＨ１２＿Ｖ３Ａ
Ｄ８を生成し、それを使用してコンピテント細胞を形質転換させた。
【０１６３】
ウイルス
先ず、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズ
バッド）を使用して２９３Ｔ細胞をＳＨＩＶＡＤ８ＥＯまたはＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３Ａ
Ｄ８分子クローンでトランスフェクトすることにより、ウイルスストックを調製した。４
８時間後に培養上清を回収し、アリコートを使用するまで−８０℃で保管した。コンカナ
バリンＡ刺激性アカゲザルＰＢＭＣ（５００μＬ中、２×１０６細胞）を１時間のスピノ
キュレーション（Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４，１００７４−１００８０（２００
０））によりトラスフェクト細胞上清で感染させ、同数／体積の活性化ＰＢＭＣと混合し
、培養培地を毎日置換して少なくとも１２日間、培養物を維持した。上清培地の試料をピ
ークＲＴ生産時あたりでプールして個々のウイルスストックを調製した。
【０１６４】
抗体
１１のモノクローナル抗体（ＶＲＣ０１、ＮＩＨ４５−４６、４５−４６Ｇ５４Ｗ、４
５−４６ｍ２、３ＢＮＣ１１７、１２Ａ１２、１ＮＣ９、および８ＡＮＣ１９５、１０−
１０７４、ＰＧＴ１２１、およびＰＧＴ１２６）を単離し、生産した。ＤＥＮ３、デング
ウイルスＮＳ１特異的ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体（ＰＮＡＳ  １０９，１８９２１
−１８９２５（２０１２））、または対照ヒトＩｇＧ（ＮＩＨ  Ｎｏｎｈｕｍａｎ  Ｐｒ
ｉｍａｔｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｈｐｒｅａ
ｇｅｎｔｓ．ｏｒｇ）を陰性対照抗体としてこの研究で使用した。曝露前受動伝達に選択
したモノクローナル抗体を、ウイルスチャレンジ感染の２４時間前に静脈内投与した。
【０１６５】
血漿ウイルスＲＮＡレベルの定量
血漿中のウイルスＲＮＡレベルをリアルタイム逆転写−ＰＣＲ（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  
７９００ＨＴ配列検出システム；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって決定
した。
【０１６６】
血漿中の抗体濃度
サル血漿中の投与したモノクローナル抗体の濃度を、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩ
ＳＡ）により、組換えＨＩＶ−１ＪＲＦＬ  ｇｐ１２０（Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ  Ｐｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）またはＨＩＶＩＩＩＢ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ  ｉｎｃ）（Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５，８３４０−８３４７（２０
０１））を使用して測定した。簡単に言うと、マイクロタイタープレートをＨＩＶ−１  
ｇｐ１２０（２μｇ／ｍＬ）で被覆し、一晩、４℃でインキュベートした。プレートをＰ
ＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、１％（容量／容量）ＢＳＡでブロックした
。ブロッキング後、抗体または血漿試料の系列希釈物をそのプレートに添加し、１時間、
室温でインキュベートした。アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（
ａｂ）２断片（Ｐｉｅｒｃｅ）で結合を検出し、ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ  ＯＰＤ（Ｓｉｇｍ
ａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で視覚化した。中和モノクローナル抗体の減衰半減期を、抗体投与
後第５日または第７日で開始する血漿濃度に基づく単一指数減衰式によって算定した（Ｊ
．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８４，１３０２−１３１３（２０１０））。
【０１６７】
中和アッセイ
アカゲザルから採取した血漿試料中に存在する各ｍＡｂのインビトロ効力および中和活
性を、２タイプの中和アッセイによって評価した；１）偽型チャレンジ感染ウイルスでの
ＴＺＭ−ｂｌエントリアッセイ（ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ
２６，８９−９８（２０１０））または２）複製可能なウイルスでの１４日ＰＢＭＣ複
製アッセイ（Ｊ．ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７６，２１２３−２１３０（２００２））。
ＴＺＭ−ｂｌアッセイのために、ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯまたはＳＨＩＶＤＨ１２＿Ｖ３ＡＤ
８に由来するｅｎｖ遺伝子を発現する偽型ウイルスであって、それぞれのエンベロープタ
ンパク質を発現するｐＮＬｅｎｖ１およびｐＣＭＶベクターで２９３Ｔ細胞をコトランス
フェクトすることによって調製したものである偽型ウイルス（Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ  ８４，４７６９−４７８１（２０１０））とともに、系列希釈ｍＡｂまたは血漿試料
をインキュベートした。５０％中和阻害用量（ＩＣ５０）力価を、細胞対照ＲＬＵ減算後
、ウイルス対照ウェル中のレベルと比較した相対発光単位（ＲＬＵ）の５０％低下を生じ
させる希釈度として算定した（Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８４，１４３９−１４５２
（２０１０））。サブタイプＢ  ＨＩＶ−１単離体に対して広範な中和活性を呈示する（
Ｊ．ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ９１，２７９４−２８０３（２０１０）
）、コホート研究からの血漿試料を使用して、ＴＺＭ−ｂｌ細胞アッセイにより、ＳＨＩ
ＶＤＨ１２＿Ｖ３ＡＤ８分子クローンの中和表現型（力価レベル）を決定した。
【０１６８】
動物防御力価の決定および統計分析
ウイルスチャレンジ感染した動物の５０または８０％のウイルス獲得を予防する結果と
なる、各Ｒ５  ＳＨＩＶに対する血漿中の中和力価の算定を、リードおよびミュンヒの方
法（Ａｍ  Ｊ  Ｈｙｇ  ２７，４９３−４９７（１９３８））を用いて行った。１つの有
意な異常値の動物（ＤＥＷ７）は、算定から割愛した。６０匹すべての受動免疫サルを使
用してインビボで滅菌免疫性（ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を付与する
ために要する血漿中の力価（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，
Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ，ｅｄ．３ｒｄ，２００７）の間の関係を、尤度比
検定に基づくこのモデルからのｐ値を含んで、モデル化するために、プロビット回帰を用
いた。様々なインビボ防御レベル（３３％、５０％、８０％、９０％および９５％）に必
要な血漿力価をプロビッドモデル推定値から決定し、ブートストラップ法を用いて、９０
％信頼区画を構築した。
【０１６９】
結果：
ＳＨＩＶＤＨ１２＿Ｖ３ＡＤ８は、ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯ同様、Ｔｉｅｒ２抗ＨＩＶ−１
中和感受性特性を有した（表１３）。ＳＨＩＶＤＨ１２＿Ｖ３ＡＤ８を静脈内にまたは直
腸内に接種したアカゲザルは、感染後（ＰＩ）第２から３週の時点で血漿の１０５から１
０７ウイルスＲＮＡコピー／ｍＬの範囲でピークのウイルス血症を呈示した。大部分のＳ
ＨＩＶＤＨ１２＿Ｖ３ＡＤ８感染動物において、血漿ウイルス負荷量は、第８から２０週
ＰＩの間にバクグラウンドレベルに低下する。
【０１７０】
１１の最近報告された広域反応性抗ＨＩＶ−１  ｍＡｂに対するＳＨＩＶＡＤ８ＥＯの
中和感受性を、最初にＴＺＭ−ｂｌアッセイシステムにおいて判定した（図１１Ａおよび
Ｂ）。これらの抗体のうちの８つ、ＶＲＣ０１、ＮＩＨ４５−４６（２３）、４５−４６
Ｇ５４Ｗ、４５−４６ｍ２、３ＢＮＣ１１７、１２Ａ１２、１ＮＣ９および８ＡＮＣ１９
５は、ｇｐ１２０  ＣＤ４  ｂｓを標的にし（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３，１６３３−１６
３７（２０１１））、ならびに３つ、１０−１０７４、ＰＧＴ１２１およびＰＧＴ１２６
（Ｎａｔｕｒｅ  ４７７，４６６−４７０（２０１１））は、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０  
Ｎ３３２グリカンの存在に依存した。ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯに対して試験したとき、３つの
グリカン依存性ｍＡｂすべてが、ＣＤ４  ｂｓ  ｍＡｂより大きい効力を呈示した（図１
１Ａ）。ｇｐ１２０  Ｎ３３２グリカンを標的にする前記３つのｍＡｂについてのＩＣ５
０値は、０．０９から０．１５μｇ／ｍＬの範囲であった。ＣＤ４  ｂｓ  ｍＡｂは、最
も強力である３ＢＮＣ１１７により、はるかに広範囲（０．１４から６．３４μｇ／ｍＬ
）のＩＣ５０中和活性を呈示した。中和ｍＡｂ効力の同様の序列（グリカン依存性＞ＣＤ
４  ｂｓ依存性）が、ＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８でも観察されたが、その中和活性は
、ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯについて観察されたＩＣ５０値と比較してはるかに広い（＞１００
倍）範囲にわたって分布した（図１１Ｂ）。ＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８は、ＳＨＩＶ
ＡＤ８ＥＯより、グリカンターゲッティングｍＡｂに対して多少感受性が高く、ＣＤ４  
ｂｓ中和ｍＡｂに対して耐性が高かった。
【０１７１】
図１１に示した結果に基づき、５つの中和ｍＡｂを曝露前受動伝達研究に選択した：Ｖ
ＲＣ０１（これは、特性付けすべき新たに単離された広域作用性ＮＡｂの第一のＣＤ４ｂ
ｓ  ＮＡｂであったので）；ＣＤ４  ｂｓ  ｍＡｂ  ４５−４６ｍ２および３ＢＮＣ１１
７（これらの両方は、ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯおよびＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８に対して
強い中和活性を呈示した）；ならびにｇｐ１２０  Ｎ３３２グリカン依存性ｍＡｂ、ＰＧ
Ｔ１２１および１０−１０７４。
【０１７２】
受動伝達実験についてのプロトコルは、漸減量の中和ｍＡｂの静脈内投与および２４時
間後の動物への直腸内チャレンジ感染であった。目標は、ウイルス獲得を阻止することで
あり、個々のマカクへのヒト化抗ＨＩＶ  ｍＡｂの反復投与がそれらの効力を低下させる
ことがあり得、および／またはことによると、アナフィラキシー反応を誘導することがあ
り得るという知識を加味して、単回接種後にインビボ感染を確立するために十分なサイズ
のＳＨＩＶチャレンジ感染用量を選択した。これに関して、我々は、アカゲザルにおいて
ＳＨＩＶＡＤ８の直腸内力価測定を以前に行い、アカゲザルＰＢＭＣにおけるエンドポイ
ント希釈によって決定した１×１０３  ＴＣＩＤ５０の接種が、おおよそ３の動物感染用
量５０（ＡＩＤ５０）を投与することと等価であることを報告した（Ｊ．ｏｆ  ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ  ８６，８５１６−８５２６（２０１２））。実際、３  ＡＩＤ５０の単回直腸
内接種は、１０匹のアカゲザルのうちの１０匹においてＳＨＩＶＡＤ８ＥＯおよびＳＨＩ
ＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８での感染の確立に成功する結果となった。
【０１７３】
第一の受動伝達実験の対照として、抗デングウイルスＮＳ１  ＩｇＧ１  ｍＡｂを動物
に静脈内投与し、２４時間後にＳＨＩＶＡＤ８ＥＯでチャレンジ感染した。両方のサル（
ＭＬ１およびＭＡＡ）が急速に感染し、第２週ＰＩに血漿ウイルス血症のピークレベルを
生じた。ＶＲＣ０１は、ウイルス獲得に対する防御について試験した第一の抗ＨＩＶ−１
中和ｍＡｂであり、それを５０ｍｇ／ｋｇの用量で２匹のマカクに投与した。接種を受け
た２匹のマカクのうちの１匹（ＤＥＧＦ）は、ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯチャレンジ感染から完
全に防御され、４５週の観察期間にわたって血漿ウイルス血症の形跡も細胞随伴性ウイル
スＤＮＡの形跡もなかった。他方の５０ｍｇ／ｋｇ  ＶＲＣ０１レシピエント（ＤＥＨ３
）は感染したが、ピークの血漿ウイルス血症が第５週ＰＩまで遅延された。より少量（２
０ｍｇ／ｋｇ）のＶＲＣ０１を投与した追加の二匹のマカクは、ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯチャ
レンジ感染から防御されなかった。これらの結果を表１３に要約する。
【０１７４】
ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯチャレンジ感染に対するＰＧＴ１２１の防御特性を次に調査した。
ＰＧＴ１２１は、ＴＺＭ−ｂｌアッセイにおいて測定された最も強力なグリカン標的化中
和ｍＡｂの１つであった（図１１）。ＶＲＣ０１で得た結果に基づき、２０ｍｇ／ｋｇで
のインビボＰＧＴ１２１  ｍＡｂ力価測定から始めることを選択した。チャレンジ感染を
受けた２匹のサル（ＫＮＸおよびＭＫ４）は、ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯチャレンジ感染に耐え
た。より少ない量（すなわち、５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または０．２ｍｇ／ｋｇ）
のＰＧＴ１２１を投与したとき、２匹動物のうち１匹、２匹動物のうち２匹、および２匹
の動物のうち０匹が、それぞれ防御された（表１３）。
【０１７５】
ＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８獲得を阻止するＶＲＣ０１およびＰＧＴ１２１  ｍＡｂ
の能力を同様に評価した（表１３）。ＶＲＣ０１で得られた結果は、ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯ
チャレンジ感染で観察されたものに匹敵した：３０ｍｇ／ｋｇの２匹のレシピエントのう
ちの１匹は、ＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８感染の確立から防御された。ＰＧＴ１２１  
ｍＡｂは、ＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８獲得の予防においてＶＲＣ０１より著しく高か
った：０．２ｍｇ／ｋｇ  ＰＧＴ１２１の２匹のレシピエントのうちの２匹が感染に耐え
た。ＰＧＴ１２１は、ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯインビボ感染に対して、ＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ
３ＡＤ８の予防において多少有効であるようでもあった（表１３）。この結果は、インビ
トロアッセイにおける２つのＳＨＩＶの中和についてのＰＧＴ１２１のＩＣ５０値の８倍
差（図１１）と一致する。
【０１７６】
アカゲザルへの１０−１０７４、３ＢＮＣ１１７または４５−４６ｍ２中和ｍＡｂの受
動伝達、続いてのＳＨＩＶＡＤ８ＥＯまたはＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８いずれかでの
チャレンジ感染の結果を表１３に要約する。１０−１０７４  ｍＡｂは、両方のＳＨＩＶ
のインビボ獲得を強力に阻止した。ＣＤ４ｂｓ  ３ＢＮＣ１１７および４５−４６ｍ２  
ｍＡｂを、図１１に示すインビトロ中和実験における両方のＳＨＩＶに対するそれらのＩ
Ｃ５０値に基づいて、マカクへの受動伝達に選択した。３ＢＮＣ１１７は、５ｍｇ／ｋｇ
で２匹のサルのうちの２匹においてＳＨＩＶＡＤ８ＥＯ感染の阻止に成功したが、１ｍｇ
／ｋｇの用量を与えた他の２匹の動物では阻止に成功しなかった（表１３）。これは、同
じ量の３ＢＮＣ１１７を、ＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８チャレンジ感染を受けたマカク
に投与したときに観察された結果（２匹のうちの１匹が５ｍｇ／ｋｇで感染し、２匹のう
ちの１匹が１ｍｇ／ｋｇで感染した）に類似していた。
【０１７７】
受動伝達を受けたマカクから様々な時点で採取した血漿試料をＨＩＶ−１  ｇｐ１２０
ＥＬＩＳＡによって分析して中和ｍＡｂ濃度を決定した。一般に、チャレンジ感染の時
点（抗体投与の２４時間後）の各ｍＡｂの血漿濃度は、投与した抗体の用量と相関した（
表１３）。
【０１７８】
血漿ｍＡｂ濃度とインビボ防御の関係を図１２に示す。評価した５つの中和ｍＡｂのう
ち、ＰＧＴ１２１は、両方のウイルスに対して明らかに最も有効であり、ＳＨＩＶＤＨ１
２−Ｖ３ＡＤ８は、このｍＡｂに対してのほうが多少大きい感受性を呈示した（２匹のサ
ルのうちの２匹が０．２μｇ／ｍＬの血漿濃度で防御された）。対照的に、ほぼ４００μ
ｇ／ｍＬのＶＲＣ０１の血漿濃度が、同じＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８チャレンジ感染
ウイルスから２匹の動物のうちの１匹を防御するために必要であった（表１３）。この研
究でマカクに投与した最も強力なＣＤ４  ｂｓ  ｍＡｂ、３ＢＮＣ１１７は、いずれかの
ＳＨＩＶの獲得を予防する点でもＶＲＣ０１よりおおよそ６から１０倍有効であった（図
１２、表１３）。
【０１７９】
ＰＧＴ１２１、１０−１０７４、３ＢＮＣ１１７およびＶＲＣ０１  ｍＡｂの循環半減
期は、かなり似ていた：それぞれ３．５日、３．５日、３．３日および３．１日。対照的
に、４５−４６ｍ２の半減期は極度に短く、決定することができなかった。２０ｍｇ／ｋ
ｇのヒト化中和ｍＡｂ投与の２４時間後の数匹のマカクにおける血漿ｍＡｂ濃度（すなわ
ち、おおよそ２５０μｇ／ｍＬ［表１３］）に基づき、２０ｍｇ／ｋｇの４５−４６ｍ２
を受けた２匹のサルは、１５．０および１７．６μｇ／ｍＬの血漿ｍＡｂ濃度しか有さず
、これは、２４時間での他の中和ｍＡｂに比べて９５％より大きな減衰であった。
【０１８０】
マカクをＳＨＩＶＡＤ８ＥＯおよびＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８でチャレンジ感染し
たとき、ｍＡｂ投与の２４時間後に採取した血漿試料を用いて中和力価を測定した。表１
３に示すように、抗ウイルス血漿中和力価とＳＨＩＶ感染からの防御との間に良好な相関
関係が観察された。２つのグリカン依存性ｍＡｂ（ＰＧＴ１２１および１０−１０７４）
の投与の結果、ウイルスチャレンジ感染時に抗ＨＩＶ−１中和活性の最高力価が明確に得
られた。４５−４６ｍ２  ｍＡｂのレシピエントにおいて測定された力価は、その極度に
短いインビボ半減期のため、検出限界であったかまたは検出不能であった。
【０１８１】
チャレンジ感染を受けたサルの５０％においてウイルス獲得を予防するために必要とさ
れる、血漿中で測定される、中和力価を、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈにより記載された
方法（Ａｍ  Ｊ  Ｈｙｇ  ２７，４９３−４９７（１９３８））を用いて算定した。ＳＨ
ＩＶＡＤ８ＥＯでチャレンジ感染した２８匹のサル、またはＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ
８でチャレンジ感染した３２匹のサルについて、これらの防御力価を別々に導出した（表
１５および１６）。ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯまたはＳＨＩＶＤＨ１２−Ｖ３ＡＤ８でチャレン
ジ感染した動物の５０％を防御するために要する血漿中和力価をそれぞれ１：１１５およ
び１；９６であると算定した。これらの類似した力価が、１）同一の経路および接種サイ
ズによるＳＨＩＶチャレンジ感染および２）同じ中和ｍＡｂ集団の投与後に得られたので
、６０匹すべての動物からの中和データを併せ、プロビット回帰に付して、血漿中和力価
とインビボ防御との関係を調査した。さらなる確認として、ＳＨＩＶウイルスについての
項を６０匹すべてのマカクに関するプロビット回帰モデルに含めたとき、２つのＳＨＩＶ
ウイルス間の差の証拠はなかった（ｐ＝０．１６）。６０匹のマカクの群全体に適用した
とき、プロビット回帰は、１：１０４の血漿中和力価が動物の５０％においてウイルス獲
得を予防すると推定した。データのプロビッド分析により、１：５７または１：３２９の
５０％血漿中和力価が、被曝動物のそれぞれ３３％または８０％を防御することも推定し
た。
【０１８２】
実施例１０  慢性感染のＨＩＶインビボモデルへの中和ｍＡＢの投与
方法の要約：ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯに対する広域作用性３ＢＮＣ１１７２４および１０−
１０７４２３中和ｍＡｂの中和活性を、最初に、ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯに対するＴＺＭ−ｂ
ｌ細胞システムで判定した。Ｒ５指向性ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯでチャレンジ感染した慢性感
染の動物におけるウイルス獲得を阻止するまたは血漿ウイルス血症を制御するそれらの能
力を、血漿ウイルス負荷量および細胞随伴性ウイルス核酸をモニターすることにより評価
した；ＣＤ４＋  Ｔ細胞サブセットのレベルをフローサイトメトリーによって測定した。
循環ウイルス変異体のＳＧＡ分析および血漿中の抗体レベルの決定。ＮＡｂの血漿濃度を
、１０−１０７４または３ＢＮＣ１１７のいずれかにのみ感受性があるＨＩＶ−１シュー
ドウイルス調製物に対する中和活性を測定することによって決定した。
【０１８３】
結果：
慢性感染マカクの２つの群を評価した。１５９週間感染しており、循環ＣＤ４＋  Ｔ細
胞の類似したおよび有意な減少を続けた２匹の臨床的に無症状の動物（ＤＢＺ３およびＤ
Ｃ９９Ａ）からなる第一の群（表１７）。進行中のＳＨＩＶ感染を治療するための治療法
は、１０１０７４と３ＢＮＣ１１７の１０ｍｇ／ｋｇ用量での併用投与であった。ｍＡｂ
投与時、マカクＤＢＺ３およびＤＣ９９Ａにおける血漿ウイルス負荷量は、それぞれ１．
０８×１０４および７．６×１０３ＲＮＡコピー／ｍＬであった。両方のサルは、併用抗
ＨＩＶ−１  ｍＡｂ治療に応答し、血漿ウイルス血症が直ぐにおよび急速に低減されて７
から１０日以内に検出不能レベルになった。２つのｍＡｂの単回投与後の、マカクＤＢＺ
３およびＤＣ９９Ａの血漿中の測定可能なＳＨＩＶＡＤ８ＥＯの抑制は、それぞれ、２７
および４１日続いた。各場合において、血漿ウイルス血症は、治療前のレベルに逆戻りし
た。
【０１８４】
各々が同じく３年より長くＳＨＩＶＡＤ８ＥＯに感染しており、ならびに間欠性下痢お
よびまたは食欲低下の臨床な症状があった３匹の動物（ＤＢＸ３、ＤＣＦ１およびＤＣＭ
８）の第二の群を、２つの中和抗体で治療した（表１７）。ｍＡｂ投与時、マカクＤＣＭ
８における循環ＣＤ４＋  Ｔ細胞のレベルは、４３細胞／μＬしかなく、動物ＤＣＦ１（
１０５細胞／μＬ）およびＤＢＸＥ（１５８細胞／μＬ）でのほうが多少高かった。血漿
ウイルス負荷量は、動物ＤＢＸＥおよびＤＣＦ１では１０５ＲＮＡコピー／ｍＬを超えて
おり、サルＤＣＭ８では有意に、より低かった（１．５９×１０３  ＲＮＡコピー／ｍＬ
）。２つのｍＡｂのサルＤＢＸＥへの投与は、第０日での２．０×１０５  ＲＮＡコピー
から第２０日での検出不能な血漿中レベルへの二相性の低下をもたらした。この後、数日
以内に、ＤＢＸＥでは高い循環ウイルスレベルが復活した。より少量の血漿ウイルス負荷
量および非常に少ない循環ＣＤ４＋  Ｔ細胞数を有するマカクＤＣＭ８は、ｍＡｂ処置開
始後第６日と第２０日の間にウイルス血症の検出不能なレベルへの急速な低下を経験した
。最後に、広域反応性抗ＨＩＶ−１  ＮＡｂを産生することが以前に報告されている動物
ＤＣＦ１は、併用ｍＡｂ療法に応答して第６日までに血漿ウイルス血症の一時的および比
較的ささやかな２７倍の低下を呈示した後、ウイルス負荷量が、高い治療前レベルに戻っ
た。
【０１８５】
ＰＢＭＣ随伴性ウイルスＲＮＡおよびＤＮＡレベルも抗体投与前および後に決定した（
表１８）。各動物について、ｍＡｂ治療は、血漿ウイルス負荷量測定値とよく相関して細
胞随伴性ウイルスＲＮＡレベルの低下をもたらした。抗体治療の結果として細胞随伴性ウ
イルスＤＮＡレベルについて一貫したパターンは観察されなかった。慢性ＳＨＩＶＡＤ８
ＥＯ感染サルへの中和ｍＡｂの投与も、特に、非常に高いウイルス負荷量を有する動物で
は、循環ＣＤ４＋  Ｔ細胞レベルに有益な効果を及ぼした。マカクＤＢＸＥおよびＤＣＦ
１におけるＣＤ４＋  Ｔ細胞数は、ｍＡｂ媒介ウイルス抑制期間には２から３倍増加した
が、ウイルス血症が再び検出可能になるにつれて治療前のレベルに徐々に減少した。
【０１８６】
各ｍＡｂの血漿濃度を、一方または他方に感受性だが両方の抗体には感受性でない選択
ＨＩＶ−１シュードウイルス株に対する血漿中和活性を測定することによって決定した（
図１３Ａ）。すべての治療動物において、ＳＨＩＶＡＤ８ＥＯウイルス血症の抑制が、お
およそ１から３μｇ／ｍＬの閾血漿ｍＡｂ濃度に達するまで維持された（図１３Ｂおよび
１３Ｃ）。これは、血漿ウイルスＲＮＡレベルのささやかな一時的低下が観察されたマカ
クＤＣＦ１にも当てはまった。興味深いことに、臨床症状のあるマカクＤＣＭ８およびＤ
ＣＦ１に投与されたｍＡｂは、半減期を短縮したか、または検出不能であった。前に述べ
たように、マカクＤＣＭ８は、極度に低いＣＤ４＋  Ｔ細胞レベル（４３細胞／μＬ血漿
））を有し、マカクＤＣＦ１は、その悪化する臨床状態のため、治療開始後第５６日に安
楽死させなければならなかった。ＤＣＦ１の剖検は、播種性胃腸クリプトスポリジウム症
、膵炎および胆管炎を特徴とする、重度の腸症を明らかにした。
【０１８７】
ＳＧＡ分析を用いて、アミノ酸置換が、１０−１０７４または３ＢＮＣ１１７  ｍＡｂ
に対する感受性に影響を及ぼすと以前に示されたｇｐ１２０領域において起こったかどう
かを判定した。各場合、免疫治療後に血漿中に存在するリバウンドウイルスは不変であっ
た。再出現ウイルスの感受性をさらに試験するために、１０−１０７４と３ＢＮＣ１１７
の併用療法（各々の１０ｍｇ／ｋｇ）を２匹の臨床的に無症状のサル（ＤＢＺ３およびＤ
Ｃ９９Ａ）に再び投与した。各動物のウイルス負荷量は、再び急速に降下し、第二免疫治
療サイクルの第７日の時点で検出不能になった。ウイルス血症は、マカクＤＢＺ３におい
て７日間、およびサルＤＣ９９Ａにおいて２１日より長く抑制された。考え合わせると、
これらの結果は、これらの２匹の動物における第一処置サイクル後のウイルスの再出現は
、抗体選択ウイルス耐性ではなくインビボでの不十分なｍＡｂレベルを表したことを示唆
する。
【０１８８】
【表３】
2019071888.tif 000007
【０１８９】
【表４】
2019071888.tif 000008
【０１９０】
【表５】
2019071888.tif 000009
【０１９１】
【表６】
2019071888.tif 000010
【０１９２】
【表７】
2019071888.tif 000011
【０１９３】
【表８】
2019071888.tif 000012
【０１９４】
【表９】
2019071888.tif 000013
【０１９５】
【表１０】
2019071888.tif 000014
【０１９６】
【表１１】
2019071888.tif 000015
【０１９７】
【表１２】
2019071888.tif 000016
【０１９８】
【表１３】
2019071888.tif 000017
【０１９９】
【表１４】
2019071888.tif 000018
【０２００】
【表１５】
2019071888.tif 000019
【０２０１】
【表１６】
2019071888.tif 000020
【０２０２】
【表１７】
2019071888.tif 000021
【０２０３】
【表１８】
2019071888.tif 000022
【０２０４】
好ましい実施形態の上述の実施例および説明は、クレームによって定義される本発明を
制限するものではなく、例証するものと考えるべきである。容易に理解されるように、上
記の特徴の非常に多くの変形形態および組み合わせを、クレームに記載の本発明から逸脱
することなく用いることができる。かかる変形形態は、本発明の範囲からの逸脱とはみな
されず、すべてのかかる変形形態は、後続のクレームの範囲内に含まれると解釈される。
本明細書において引用するすべての参考文献は、それら全体が参照により本明細書に援用
されている。
【図１−１】
2019071888.tif 000023
【図１−２】
2019071888.tif 000024
【図１−３】
2019071888.tif 000025
【図２】
2019071888.tif 000026
【図３−１】
2019071888.tif 000027
【図３−２】
2019071888.tif 000028
【図４】
2019071888.tif 000029
【図５−１】
2019071888.tif 000030
【図５−２】
2019071888.tif 000031
【図５−３】
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【図６−１】
2019071888.tif 000033
【図６−２】
2019071888.tif 000034
【図６−３】
2019071888.tif 000035
【図６−４】
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【図７−１】
2019071888.tif 000037
【図７−２】
2019071888.tif 000038
【図８−１】
2019071888.tif 000039
【図８−２】
2019071888.tif 000040
【図９−１】
2019071888.tif 000041
【図９−２】
2019071888.tif 000042
【図９−３】
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【図１０】
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【図１１】
2019071888.tif 000045
【図１２】
2019071888.tif 000046
【図１３−１】
2019071888.tif 000047
【図１３−２】
2019071888.tif 000048
【配列表】
2019071888000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年1月24日(2019.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体からの生体試料中の抗ＨＩＶ中和抗体に特異的に結合する１つ以上の検出試薬を含む、被検体におけるＨＩＶ感染の診断、予後診断または治療モニタリングのためのキット。
【請求項２】
ＰＣＲを行うための試薬をさらに含む、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
質量分析を行うための試薬をさらに含む、請求項２に記載のキット。