(57)【要約】【課題】  本発明の目的は、新たなアプローチによる抗菌剤耐性菌治療および予防薬の探索のためのスクリーニング方法を提供することにある。さらに、本発明の別の課題は、耐性菌に有効な新規な抗菌剤、特に抗菌剤耐性菌に有効な抗菌剤を提供することにある。【解決手段】  抗菌剤のスクリーニング方法であって、（ａ）体液存在下の培地において、微生物の発育を阻害する被検物質を選択する工程、（ｂ）（ａ）の工程において選択された被検物質において、体液非存在下の培地においては微生物の発育を阻害しない被検物質を選択する工程、を含む、前記方法。さらに、式（I）で表される化合物、あるいはそれらの薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、プロドラッグを含む、大腸菌のための抗菌剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗菌剤のスクリーニング方法であって、
（ａ）体液存在下の培地において、微生物の発育を阻害する被検物質を選択する工程、
（ｂ）（ａ）の工程において選択された被検物質において、体液非存在下の培地においては微生物の発育を阻害しない被検物質を選択する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２】
微生物が、細菌である、請求項１に記載の抗菌剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
細菌が、抗菌剤耐性菌である、請求項２に記載の抗菌剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
微生物が、腸内細菌科細菌、ブドウ糖非発酵菌、ブドウ球菌属、レンサ球菌属および腸球菌属からなる群から選択される、請求項１または２に記載の抗菌剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
体液が、血液、血清、尿、気管支粘液、肺胞粘液、髄液、涙、鼻汁、唾液または消化液である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗菌剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
式（Ｉ）
【化５】
2019071853.tif 000007
式中、
Ａは、ＣＯＯＨ、ＣＨ２−Ｎ＝Ｃ＝ＳまたはＣＨ２−Ｓ−Ｃ≡Ｎであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ６、ＮＨ２、ＮＨＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ６、アルキル、アルケニル、アルキニルまたはＯＣＯＲ６であり、
Ｒ６は、アルキル、アルケニルまたはアルキニルである、
で表される化合物、あるいはそれらの薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、プロドラッグを含む、大腸菌のための抗菌剤。
【請求項７】
プロドラッグが、式（ＩＩ）
【化６】
2019071853.tif 000008
式中、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ６、ＮＨ２、ＮＨＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ６、アルキル、アルケニル、アルキニルまたはＯＣＯＲ６であり、
Ｒ６は、アルキル、アルケニルまたはアルキニルである、
で表される化合物である、請求項６に記載の大腸菌のための抗菌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗菌剤のスクリーニング方法および当該スクリーニングで得られた抗菌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
感染症は、細菌、真菌、ウイルス等の微生物への感染により引き起こされる疾患であり、その治療のためこれまで数多くの抗菌剤が開発され、医療現場に大きく貢献してきた。しかしながら高齢化に加えたこれらの抗菌剤に対する耐性菌の出現により、感染症による死亡者数は年々増加し続けており、医療現場からは早急な対策が望まれている。この深刻な現況から耐性菌を国際的脅威ととらえ、２０１５年５月の世界保健総会において、「薬剤耐性（ＡＭＲ）に関するグローバル・アクション・プラン」が採択された。この枠組みにおいて、日本では「薬剤耐性の研究や、薬剤耐性微生物に対する予防、診断、治療手段を確保するための研究開発を促進する」ことを目標の１つとし、感染症を予防および治療するための新規な治療薬の開発が推奨されている。
【０００３】
感染症による疾患としては、敗血症、尿路感染症、呼吸器感染症、消化管感染症等、あらゆる臓器における疾患が存在し、特に敗血症は死亡率の高い疾患である。敗血症は現在、世界で年間約８００万人、日本では年間約１２０００人、米国では年間２３０００人という死亡者数をもたらしており、死亡者数がこの１０年で約２倍に増加している深刻な疾患である。敗血症は免疫力の低下に伴い引き起こされることが多く、典型的には肺炎、外傷、侵襲度の高い手術、栄養不良、がんまたはＡＩＤＳ等に起因して引き起こされることが多い。またその症状は、通常、発熱、血圧低下、呼吸促迫、頻脈等に始まり、数時間のうちに、播種性血管内凝固症候群、急性呼吸窮迫症候群、多臓器不全、ショックを引き起こし、最終的には死にいたるというものである。これらの症状は、サイトカイン、白血球および補体などの宿主防御反応、すなわち炎症反応が全身で過剰に活性化されることで引き起こされることが知られている。
【０００４】
この敗血症は、微生物の感染、特に細菌（グラム陰性もしくはグラム陽性細菌）の感染に起因して引き起こされることが多く、特にグラム陰性細菌の感染によって引き起こされることが多い。また、薬剤耐性化に関連して、臨床現場では、例えばクロストリジウム・ディフィシル、カルバペネム耐性腸内細菌科細菌（ＣＲＥ）、多剤耐性アシネトバクター、薬剤耐性カンピロバクター、基質特異性拡張型βラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）産生腸内細菌科細菌、バンコマイシン耐性エンテロコッカス（ＶＲＥ）、多剤耐性緑膿菌、薬剤耐性非チフス性サルモネラ菌、薬剤耐性サルモネラ・チフィ、薬剤耐性赤痢菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、薬剤耐性肺炎球菌、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）、エリスロマイシン耐性Ａ群レンサ球菌、およびクリンダマイシン耐性Ｂ群レンサ球菌など、多くの耐性菌が全世界で問題になっている現状である。さらに、臨床現場では、多剤耐性菌などの耐性菌による感染症治療の最終手段として、コリスチンやチゲサイクリンが承認されているが、近年、これらの抗菌剤に対しても耐性を示す菌の存在が確認され始めており、例えばコリスチンに対しては、耐性遺伝子ｍｃｒを有する細菌が世界中で確認されており、チゲサイクリンの耐性菌の存在もまた確認されはじめている。
【０００５】
多剤耐性菌に対する治療の最終手段と位置づけられているこれらの抗菌剤への耐性菌の出現により、臨床現場では新しい抗菌剤の迅速な開発が期待されている。本発明による抗菌剤のスクリーニング方法は、そのような多剤耐性菌に対する抗菌剤を探索するための新たな手法として期待される。
【０００６】
非特許文献１には、チゲサイクリン（ＴＧＣ）に耐性を有する大腸菌の臨床分離株について記載されており、ＴＧＣ耐性株がフルオロキノロン耐性株のなかからのみ見出されたこと、ＴＧＣ耐性株は、感受性分離株と比較して薬剤排出ポンプをより高度に発現していること、細胞内のＴＧＣ濃度がより低いこと、さらに薬剤排出ポンプの発現調節因子に遺伝子変異を有することが記載されている。また、結果としてフルオロキノロン耐性大腸菌分離株は、排出ポンプの過剰発現を起こすことでＴＧＣの細胞内濃度が低下し、ＴＧＣ感受性が低下することが記載されている。
【０００７】
また、非特許文献２には、尿路感染症から分離された大腸菌の血清感受性について記載されている。この中では、大腸菌が産生する抗菌タンパク質コリシンを用いた研究により、抗菌剤耐性と血清耐性が必ずしも関連しないこと、血清耐性とコリシン生産性の相関関係も明らかでないこと、およびヘモリシンが血清耐性と深く関連していることが記載されている。
【０００８】
非特許文献３では、尿路感染症や血流感染の原因となっている大腸菌の多剤耐性クローンＳＴ１３１において、血清耐性の分子メカニズムが検討され、血清耐性に関与する遺伝子、特にＬＰＳ生合成遺伝子群について記載されている。この中で、ＬＰＳ生合成遺伝子群についてＯ抗原生合成に関与するオペロン、リピドＡおよびコア多糖生合成に関与するwaa遺伝子群を含むオペロン、腸内細菌共通抗原の生合成に関与するオペロン、およびwaa遺伝子群の発現調節に関与する遺伝子rfaHなどがその機能と共に記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Antimicrob. Agents Chemother. 2017 Jan 24;61(2).
【非特許文献２】Infect. Immun. Vol.35, 1982, 270-275.
【非特許文献３】PLOS Genetics 2013 Oct. Vol.9, Issue 10, e1003834.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、新たなアプローチによる病原微生物、特に抗菌剤耐性菌を対象とした感染症の治療および予防薬の探索のためのスクリーニング方法を提供することにある。さらに、本発明の別の課題は、細菌、特に抗菌剤耐性菌に有効な抗菌剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、細菌、特に抗菌剤耐性菌に有効な抗菌剤を得るためのスクリーニングにおいて、既存の抗菌剤の探索において見落とされてきた化合物を対象とすることで上記目的を達成するスクリーニング方法を開発すべく検討を開始した。かかる目的を達成するため鋭意検討を重ねたところ、一般的な培養方法では微生物の発育に影響を与えないが、感染部位などの生体内の特定部位において微生物の発育に必須となる因子（ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆａｃｔｏｒ＝ｖｉｖｏＥＦ）に着目し、さらに研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下に関する。
［１］抗菌剤のスクリーニング方法であって、
（ａ）体液存在下の培地において、微生物の発育を阻害する被検物質を選択する工程、
（ｂ）（ａ）の工程において選択された被検物質において、体液非存在下の培地においては微生物の発育を阻害しない被検物質を選択する工程、
を含む、前記方法。
［２］微生物が、細菌である、［１］に記載の抗菌剤のスクリーニング方法。
［３］細菌が、抗菌剤耐性菌である、［２］に記載の抗菌剤のスクリーニング方法。
［４］微生物が、腸内細菌科細菌、ブドウ糖非発酵菌、ブドウ球菌属、レンサ球菌属および腸球菌属からなる群から選択される、［１］または［２］に記載の抗菌剤のスクリーニング方法。
［５］体液が、血液、血清、尿、気管支粘液、肺胞粘液、髄液、涙、鼻汁、唾液または消化液である、［１］〜［４］のいずれかに記載の抗菌剤のスクリーニング方法。
［６］式（Ｉ）
【化１】
2019071853.tif 000002
式中、
Ａは、ＣＯＯＨ、ＣＨ２−Ｎ＝Ｃ＝ＳまたはＣＨ２−Ｓ−Ｃ≡Ｎであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ６、ＮＨ２、ＮＨＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ６、アルキル、アルケニル、アルキニルまたはＯＣＯＲ６であり、
Ｒ６は、アルキル、アルケニルまたはアルキニルである、
で表される化合物、あるいはそれらの薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、プロドラッグを含む、大腸菌のための抗菌剤。
[７]プロドラッグが、式（ＩＩ）
【化２】
2019071853.tif 000003
式中、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ６、ＮＨ２、ＮＨＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ６、アルキル、アルケニル、アルキニルまたはＯＣＯＲ６であり、
Ｒ６は、アルキル、アルケニルまたはアルキニルである、
で表される化合物である、［６］に記載の大腸菌のための抗菌剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のスクリーニング方法により、従来知られていたものとは異なる新たな作用機序によって抗菌活性を示す、新規な抗菌剤が提供される。すなわち本発明により提供される化合物が、体液に存在する生体内成分に対する微生物の感受性を高めて抗菌活性を示すものと考えられる。したがって、かかるスクリーニング方法により選択された被検物質は従来の抗菌剤にはない新たな作用機序を有し、多剤耐性菌感染症にも対応できる抗菌剤となることが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、左図では、野生型菌株およびwaa遺伝子群プロモーター欠損菌株について、ＬＢ培地における発育の時間経過を測定した結果を示し、右図では、両菌株の懸濁液に血清の存在下および血清非存在下の菌の生残数をコロニー形成法で測定した結果を示した図である。
【図２】図２は、化合物ライブラリーのスクリーニングにより選択された化合物について、濃度の異なる血清の存在下および血清非存在下の各ＬＢ培地における大腸菌の発育をＯＤ６００により測定した結果、およびＩＣ５０値を示した図である。
【図３】図３は、化合物ライブラリーのスクリーニングにより選択された化合物について、濃度の異なる血清の存在下および血清非存在下の各ＬＢ培地における大腸菌の発育をＯＤ６００により測定した結果、およびＩＣ５０値を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明について、詳細に説明する。
本発明において、「抗菌剤」とは、微生物により引き起こされる感染症の治療もしくは予防のために用いられる物質であり、好ましくは低分子もしくは高分子の有機化合物であり、より好ましくは低分子有機化合物である。
本発明の抗菌剤は、これらに限定するものではないが、例えば全身性感染症（敗血症、髄膜炎を含む）、泌尿器感染症（尿路感染症を含む）、呼吸器感染症（肺炎を含む）、消化器感染症、皮膚感染症、腹腔内感染症、性感染症に用いることができ、好ましくは敗血症、尿路感染症、肺炎、髄膜炎に用いることができ、最も好ましくは敗血症に用いることができる。
【００１６】
本発明において、「体液」とは、生体内成分を含む体液を意味する。体液の例としては、これらに限定するものではないが、例えば血液、血清、尿、気管支粘液、肺胞粘液、髄液、涙、鼻汁、唾液、消化液などを用いることができ、好ましくは血清、尿、気管支粘液、肺胞粘液、特に好ましくは血清である。また、本発明における抗菌効果において重要な役割を担う各「体液に存在する生体内成分」は、これらに限定するものではないが、例えば、血清においては補体、唾液、涙および鼻汁においてはリゾチーム、尿、消化液においては免疫グロブリンである。
本発明において、「血液」とは、有形成分である赤血球、白血球、血小板等および液体成分である血漿からなる体液であり、血漿はさらに血清と血餅からなる。
本発明において、「抗菌剤耐性菌」とは、１系統以上の抗菌剤に対して抵抗性を有する微生物であって、当該１系統以上の抗菌剤が効かない微生物のことである。また、本明細書において、用語「抗菌剤耐性」と「薬剤耐性」は同義で用いられる。
【００１７】
「補体」とは、微生物の侵入により活性化されて感染に対する重要な防御系を形成する一連の約２０種のタンパク質に与えられた名称である。一般に微生物の細胞の内膜、外膜または莢膜の成分は、補体酵素カスケードの複雑で連係した経路を誘発し、その結果、補体は、例えば、浸透圧溶解による微生物の殺傷および／または食作用へのオプソニン化、炎症部位への白血球の走化性の誘引、白血球の活性化、及び免疫複合体のプロセシングを引き起こす。微生物の殺傷における補体の役割としては膜侵襲複合体（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｔｔａｃｋ  ｃｏｍｐｌｅｘ、以下ＭＡＣという）がある。補体が活性化されるとＭＡＣが形成され、微生物の細胞膜を破壊するなどして感染性生物を殺傷する。
「リゾチーム」とは、細菌の細胞壁のペプチドグリカンを破壊することにより溶菌を引き起こす加水分解酵素であり、唾液、涙および鼻汁などに存在する。
「免疫グロブリン」とは、血液、組織液等の体液中に存在し、リンパ系細胞によって作り出されるタンパク質（抗体）である。免疫グロブリンには、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥがあり、細菌やウイルスの働きを阻害するものもある。特にＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭのいずれかが本発明の抗菌効果に寄与しているものと考えられる。
【００１８】
本発明の「微生物」は、細菌、真菌、ウイルスであり、好ましくは細菌である。
本発明の「細菌」は、グラム陽性菌またはグラム陰性菌であり、特に好ましくは腸内細菌科細菌、ブドウ糖非発酵菌、ブドウ球菌属、レンサ球菌属、腸球菌属である。
本発明の「被検物質」は、これらに限定するものではないが、天然または合成の有機または無機の低分子または高分子物質等の任意の物質であってよく、典型的には、低分子有機化合物である。
【００１９】
本発明の「多剤耐性菌」とは、２系統以上の抗菌剤に対して抵抗性を有する微生物であって、当該２系統以上の抗菌剤が効かない微生物のことである。
本発明におけるｖｉｖｏＥＦとしては、これらに限定するものではないが、例えばＬＰＳ合成遺伝子である。本発明者らは、ＬＰＳ合成遺伝子群に関してwaaオペロン、waaプロモーターおよびrfaH遺伝子の欠損菌株を用いて、ＬＰＳ合成遺伝子がｖｉｖｏＥＦとなり得ること、すなわち、一般的な培養方法では細菌の発育に必須ではないが、生体内で細菌が発育する上で必須となる因子であることを見出した（実施例１）。
「ＬＰＳ」とは、グラム陰性菌の細胞壁表面に存在するリピドＡという脂質部分、コア多糖部分およびＯ抗原部分からなる糖脂質である。waaオペロンは、ＬＰＳ合成に関与するＬＰＳ合成遺伝子群の転写単位であり、これを欠損している菌株は細胞壁表面にコア多糖、Ｏ抗原、莢膜を有さない。
【００２０】
本発明者らは、大腸菌を用いて、ＬＰＳ合成遺伝子群のうち、上記waaオペロン、またはＬＰＳの発現の調節に関与する遺伝子rfaHが欠損した菌株は血清存在下で発育できないことを確認し、ＬＰＳ合成遺伝子がｖｉｖｏＥＦとなり得ることを見出した。
【００２１】
本発明におけるスクリーニング方法により得られた被検物質が抗菌活性を示すメカニズムは明らかではないが、当該被検物質が上記タンパク質を含む体液中成分に対して微生物を感受性にする働きをもたらすと考えられ、例えば血清を用いた場合、当該被検物質が微生物を血清感受性にするものと考えられる。すなわち、実施例２における大腸菌を用いた場合、当該被検物質はＬＰＳ生合成遺伝子群のいずれかの働きを抑制することにより、微生物を血清感受性にし、補体の働きにより抗菌活性を示したものと考えられる。ただし、当該被検物質は、必ずしもＬＰＳ生合成遺伝子群のいずれかの働きを抑制するものに限らない。
【００２２】
本明細書において微生物が血清感受性であるとは、血清中の生体内成分であるタンパク質、特に補体が、ＭＡＣを形成し、微生物の細胞膜を破壊できる状態のこと、微生物が細菌である場合、菌体表面において血清殺菌能が働き得る状態になっていることである。しかし、本成分は自然免疫に関与するタンパク質に限らない。
本明細書に記載する抗菌剤は、微生物感染に関連する疾患を治療または予防するために使用することができる。
【００２３】
本発明の１つの態様において、本発明の微生物を血清感受性にする抗菌剤としては、例えば、以下の構造を有する化合物、その薬学的に許容される塩、またはプロドラッグを含む抗菌剤耐性大腸菌のための抗菌剤が挙げられる。
【００２４】
式（Ｉ）
【化３】
2019071853.tif 000004
において、
Ａは、ＣＯＯＨ、ＣＨ２−Ｎ＝Ｃ＝ＳまたはＣＨ２−Ｓ−Ｃ≡Ｎを示し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ６、ＮＨ２、ＮＨＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ６、アルキル、アルケニル、アルキニルまたはＯＣＯＲ６であり、
Ｒ１は、好ましくはＨ、ＯＨ、ＯＲ６、ＯＣＯＲ６またはＲ６であり、特に好ましくはＨ、ＯＨ、ＣＨ３またはＯＣＯＣＨ３であり、
Ｒ２は、好ましくはＨ、Ｒ６、ＯＨ、ＯＲ６、ＯＣＯＲ６、ＮＨ２、ＮＨＲ６またはＮ（Ｒ６）２であり、特に好ましくはＨ、ＣＨ３、ＯＣＯＣＨ３またはＮＨ２であり、
Ｒ３は、好ましくはＨ、Ｒ６、ＯＨ、ＯＲ６、ＯＣＯＲ６、ＮＨ２、ＮＨＲ６またはＮ（Ｒ６）２であり、特に好ましくはＨまたはＮＨ２であり、
Ｒ４は、好ましくはＨ、Ｒ６、ＯＨ、ＯＲ６またはＯＣＯＲ６であり、特に好ましくはＨであり、
Ｒ５は、好ましくはＨ、Ｒ６、ＯＨ、ＯＲ６またはＯＣＯＲ６であり、特に好ましくはＨであり、
Ｒ６は、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、好ましくはアルキルまたはアルケニルであり、特に好ましくはアルキルである、
で表される化合物、あるいはそれらの薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、プロドラッグを含む、大腸菌のための抗菌剤。
【００２５】
また、ある態様において、プロドラッグは、式（ＩＩ）
【化４】
2019071853.tif 000005
において、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ６、ＮＨ２、ＮＨＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ６、アルキル、アルケニル、アルキニルまたはＯＣＯＲ６であり、
Ｒ２は、好ましくはＨ、Ｒ６、ＯＨ、ＯＲ６またはＯＣＯＲ６であり、特に好ましくはＨであり、
Ｒ３は、好ましくはＨ、Ｒ６、ＯＨ、ＯＲ６またはＯＣＯＲ６であり、特に好ましくはＨであり、
Ｒ４は、好ましくはＨ、Ｒ６、ＯＨ、ＯＲ６またはＯＣＯＲ６であり、特に好ましくはＨであり、
Ｒ５は、好ましくはＨ、Ｒ６、ＯＨ、ＯＲ６またはＯＣＯＲ６であり、特に好ましくはＨであり、
Ｒ６は、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、好ましくはアルキルまたはアルケニルであり、特に好ましくはアルキルである、
で表される化合物であり得る。
【００２６】
本明細書において、アルキルは直鎖状、分枝状、環状、またはそれらの組み合わせからなるアルキル基のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は、これらに限定するものではないが、例えば炭素数１〜１０個、好ましくは炭素数１〜５個であり、特に好ましくはメチル、エチルまたはプロピルである。また、アルキル基は任意の置換基を１個以上有していてもよい。上記置換基としては、これらに限定するものではないが、例えば、アルコキシ基、ハロゲン、アミノ基、モノもしくはジ置換アミノ基、カルボキシル基、カルボキシエステル基、置換シリル基、またはアシルなどを挙げることができる。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルコシ基、アリールアルキル基など）のアルキル部分についても同様である。
【００２７】
本明細書において、アルケニルは、少なくとも１つの二重結合を有している直鎖または分枝鎖のアルケニル基であり、これらに限定するものではないが、例えば、ビニル、アリル、１−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１，３−ブタンジエニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、１，３−ペンタンジエニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、５−ヘキセニルおよび１，４−ヘキサンジエニルを含む。アルケニル基の炭素数は、これらに限定するものではないが、例えば炭素数１〜１０個、好ましくは炭素数１〜５個である。アルケニル基は任意の置換基を１個以上有していてもよい。上記置換基としては、これらに限定するものではないが、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノもしくはジ置換アミノ基、置換シリル基、またはアシルなどを挙げることができる。アルキルケニル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。
【００２８】
本明細書において、アルキニルは、少なくとも１の三重結合を有している直鎖または分枝鎖のアルキニル基であり、これらに限定するものではないが、例えば、エチニル、１−プロピニルおよびプロパルギルを含む。
本明細書において、ハロゲンは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩのいずれかである。
本明細書において、薬学的に許容される塩は、慣用的な方法によって製造される。式Ｉで表される化合物がカルボキシル基を含む場合は、これらに限定するものではないが、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、リチウム、マグネシウム、マンガン（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛塩などの金属を含む塩、第一、第二および第三アミン類、また天然に存在する置換アミン類を含む置換アミン類、環状アミン類を含み、好ましくはカリウム、ナトリウム、アンモニウム塩であり、特に好ましくはカリウム、ナトリウム塩である。また、これらの塩は、当該化合物を好適な塩基と反応させて対応する塩基付加塩を得ることによって生成することができ、塩基としては、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウムおよび水酸化リチウムを含むアルカリ金属水酸化物；アルカリ土類金属水酸化物、例えば水酸化バリウムおよび水酸化カルシウム；アルカリ金属アルコキシド類、例えばカリウムエトキシドおよびナトリウムプロポキシド；ならびに種々の有機塩基、例えばトリエチルアミン、ピペリジン、ジエタノールアミンおよびＮ−メチルグルタミンを用いることができる。
【００２９】
本明細書において、プロドラッグとは、水に対する溶解性、安定化、バイオアベイラビリティーの改善等を目的とした式Ｉで表される化合物の誘導体であって、生物学的条件下において、加水分解、酸化等により、式Ｉで表される化合物を提供することができるあらゆるものを意味する。プロドラッグの例としては、これらに限定するものではないが、式Ｉで表される化合物の誘導体および代謝物であって、加水分解可能部分を含むもの、例えば生体内で加水分解可能なカルボン酸エステル、カルバメート、カルボナート、ウレイド、ホスファートおよびエーテルがあり、好ましくはカルボン酸エステル、エーテルであり、カルボン酸エステルの場合、体内でエステラーゼにより加水分解され活性化される。カルボキシル基を有する化合物のプロドラッグとしては、これらに限定するものではないが、例えばカルボン酸エステル、アミド、イミドなどがある。また、エーテルとしては、これらに限定するものではないが、例えばアルキルエーテル、シリルエーテルがある。また、本発明の１つの態様において、プロドラッグは式ＩＩで表される化合物であってよい。
【００３０】
本発明の大腸菌のための抗菌剤は、上述のとおり、従来の抗菌剤とは異なる新たな作用機序により大腸菌を攻撃し死滅させるものである。したがって、本発明の好ましい態様において、本発明の抗菌剤は、従来の抗菌剤が有効でなくなった対象における大腸菌による感染症の治療、予防に用いることができる。
【００３１】
以上、本発明について好適な実施態様に基づき詳細に説明したが、本発明はこれらに限定されず、各構成は、同様の機能を発揮し得る任意のものと置換でき、または任意の構成を付加することもできる。
【実施例】
【００３２】
実施例１
野生型株、waaオペロン欠損株（△waa）およびrfaH遺伝子欠損株（△rfaH）のＬＢ培地における大腸菌の増殖を血清の有無により比較した結果を以下に示す。
【表１】
2019071853.tif 000006
表中の増殖の評価において、「＋」はＯＤ６００が０．３以上、「−」はＯＤ６００が０．１以下を表す。
上記表に記載のとおり、waaオペロン欠損株およびrfaH遺伝子欠損株は、血清非存在下では大腸菌の発育を阻害しないが、血清存在下ではその発育が阻害されることを確認した。
評価に用いた細菌は、患者より分離された薬剤耐性大腸菌であり、実施例２の評価に用いた菌株と同一である。本株はβ-ラクタム系抗菌薬(ペニシリン系および第３世代セファロスポリン系抗菌薬)およびフルオロキノロン系抗菌薬に耐性を示す。
評価に用いたＬＢ培地は、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）から購入したＤｉｆｃｏＴＭ  ＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｌｅｎｎｏｘ粉末２０ｇを蒸留水１Ｌに加え、オートクレーブ滅菌したものからなる。
【００３３】
野生型株およびＬＰＳ合成遺伝子のwaaプロモーター欠損株について、ＬＢ培地における増殖の時間による変化を血清の有無により測定した結果を図１に示す。ＯＤ６００は、６００ｎｍにおける吸光度であり、菌体量を示す数値として用いられる。ＯＤ６００の測定には、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  ＰＲＯ  （ＴＥＣＡＮ，Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ)を用いた。
図１より、waaプロモーター欠損株は血清非存在下でのＬＢ培地では発育するが、血清存在下では発育しないことが示された。この結果より、ＬＰＳ合成遺伝子は、ｖｉｖｏＥＦとなり得ることが示された。
【００３４】
実施例２
化合物はジメチルスルホキシドで１００ｍＭに溶解したものから滅菌済みの精製水で４０μＭに希釈し、１０μＬずつ３８４  ｗｅｌｌ  ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｐｌａｔｅ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｊａｐｎａ，Ｔｏｋｙｏ）に加えた。
評価に用いた細菌は、患者より分離された薬剤耐性大腸菌であり、実施例１の野生株と同一である。本株はβ-ラクタム系抗菌薬(ペニシリン系および第３世代セファロスポリン系抗菌薬)およびフルオロキノロン系抗菌薬に耐性を示す。
評価に用いた２ｘ  ＭＨＢ−ＩＩ培地は、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）から購入したＢＢＬＴＭ  Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ  ＩＩ  ｂｒｏｔｈ，Ｌｅｎｎｏｘ粉末４４ｇを蒸留水１Ｌに加え、オートクレーブ滅菌したものからなる。滅菌後本培地に０％、４％または８％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）になるように血清を加えた。血清は、ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ）から購入したＨｕｍａｎ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ，Ｐｏｏｌｅｄ，Ｆｒｏｚｅｎを用いた。本液に薬剤耐性大腸菌を５ｘ１０３ｃｆｕ／ｍＬになるように菌液を加えた。本液を各１０μＬずつ、化合物添加済み(最終濃度,２０μＭ)の３８４  ｗｅｌｌ  ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｐｌａｔｅに加え、３７℃で１６時間培養した。培養後、ＯＤ６００を測定した。本方法で４％，８％のいずれかの血清存在下で抗菌活性を示し(ＯＤ６００が１．０以下)、血清０％で抗菌活性を示さなかった(ＯＤ６００が３．０以上)化合物に対しては、化合物濃度を調整し(７．８、１５．６、３１．３、６２．５、１２５、２５０、５００、１０００μＭ)した上記の方法でＩＣ５０を算出した。
【００３５】
化合物ライブラリーを用いたスクリーニング結果を図２および図３に示す。
図２および図３に記載のとおり、式Ｉおよび式ＩＩに記載の化合物が血清非存在下では大腸菌の発育を阻害しないが、血清存在下においては血清濃度依存的に大腸菌の発育を阻害するという結果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明のスクリーニング方法は、従来知られていたものとは異なる新たな作用機序によって抗菌活性を示す、新規な抗菌剤を選択する方法である。すなわち本発明により選択される化合物は、体液中の生体内物質を介して微生物を感受性にすることにより抗菌活性を示すという作用機序により抗菌活性を示すものと考えられ、細菌、特に抗菌剤耐性菌に対する抗菌剤となり得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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