(57)【要約】      （修正有）【課題】患者における悪性黒色腫を診断し、この転移を予後予測するための方法を提供すること。【解決手段】悪性黒色腫の診断、悪性黒色腫の転移の予後予測のため、特定の遺伝子および／または染色体領域のコピー数をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより決定する。ならびに悪性黒色腫の診断およびこの転移の予後予測に有用な１つ以上のプローブのセットおよびキットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における悪性黒色腫の転移を予後予測する方法であって、前記患者から得られた悪性黒色腫試料における（ｉ）（ａ）および／もしくは（ｂ）、（ｉｉ）（ｃ）および／もしくは（ｄ）、（ｉｉｉ）（ａ）および／もしくは（ｄ）、または（ｉｖ）（ｂ）および／もしくは（ｃ）を決定することを含み、
（ａ）は、ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比またはＣＣＮＤ１のコピー数であり、ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比が約１．５５超／細胞であるか、またはＣＣＮＤ１のコピー数が約２．８１超／細胞の場合、転移が起こる可能性があることを示し、
（ｂ）は、ＭＹＣのコピー数であり、ＭＹＣのコピー数が約２．４８超／細胞の場合、転移が起こる可能性があることを示し、
（ｃ）は、ＣＣＮＤ１／対照セントロメアが増加している細胞の割合、またはＣＣＮＤ１が増加している細胞の割合であり、ＣＣＮＤ１が増加している細胞の割合が約３０％以上であるか、またはＣＣＮＤ１／対照セントロメアが増加している細胞の割合が約５４％以上の場合、転移が起こる可能性があることを示し、および
（ｄ）は、ＭＹＣが増加している細胞の割合であり、ＭＹＣが増加している細胞の割合が約２０％超である場合、転移が起こる可能性があることを示し、
これにより、前記患者における悪性黒色腫の転移を予測する、方法。
【請求項２】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ブレスローの深さが約１ｍｍ未満の黒色腫を有する患者における悪性黒色腫の転移を予後予測する方法であって、前記患者から得られた悪性黒色腫試料におけるＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比およびＭＹＣのコピー数を決定することを含み、
ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比が約１．５５超であるか、またはＭＹＣのコピー数が約２．４８超である場合、転移が起こる可能性があることを示し、これにより、ブレスローの深さが約１ｍｍ未満の黒色腫を有する患者における悪性黒色腫の転移を予測する、方法。
【請求項５】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって前記コピー数比を決定する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションがＦＩＳＨである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ブレスローの深さが２ｍｍ以下の黒色腫を有する患者における悪性黒色腫の転移を予後予測する方法であって、前記患者から得られた悪性黒色腫試料におけるＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比およびＭＹＣのコピー数を決定することを含み、
ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比が約１．３８超であり、およびＭＹＣのコピー数が約２．３６超である場合、転移が起こる可能性があることを示し、これにより、ブレスローの深さが２ｍｍ以下の黒色腫を有する患者における悪性黒色腫の転移を予測する、方法。
【請求項８】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって前記コピー数比を決定する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションがＦＩＳＨである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ブレスローの深さが１ｍｍ以上約４ｍｍ未満の黒色腫を有する患者における悪性黒色腫の転移を予後予測する方法であって、前記患者から得られた悪性黒色腫試料におけるＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比を決定することを含み、
ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比が約１．５５超である場合、転移が起こる可能性があることを示し、これにより、ブレスローの深さが１ｍｍ以上約４ｍｍ未満の黒色腫を有する患者における悪性黒色腫の転移を予測する、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記患者から得られた悪性黒色腫試料におけるＭＹＣのコピー数を決定することをさらに含み、ＭＹＣのコピー数が約２．６０超であることもまた、転移が起こる可能性があることを示す、方法。
【請求項１２】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって前記コピー数比を決定する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションがＦＩＳＨである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ブレスローの深さが約２．０ｍｍ超の黒色腫を有する患者における悪性黒色腫の転移を予後予測する方法であって、前記患者から得られた悪性黒色腫試料におけるＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比またはＭＹＣのコピー数を決定することを含み、
ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比が約１．５５超であるか、またはＭＹＣのコピー数が約２．２２超である場合、転移が起こる可能性があることを示し、これにより、ブレスローの深さが約２．０ｍｍ超の黒色腫を有する患者における悪性黒色腫の転移を予測する、方法。
【請求項１５】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって前記コピー数比を決定する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションがＦＩＳＨである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
キットであって、
（ａ）患者における悪性黒色腫の転移の予後予測を可能にする１つ以上のプローブのセット、ここで、前記１つ以上のプローブのセットは、（ｉ’）ＣＣＮＤ１に対するプローブ単独、もしくは対照セントロメアに対するプローブとさらに組み合わせたプローブ、および／または（ｉｉ’）ＭＹＣに対するプローブを含み、および
（ｂ）前記患者における悪性黒色腫の転移を予後予測するための説明書
を含み、
前記説明書は、前記患者から得られた悪性黒色腫試料における（ｉ）（ａ）および／もしくは（ｂ）、（ｉｉ）（ｃ）および／もしくは（ｄ）、（ｉｉｉ）（ａ）および／もしくは（ｄ）、または（ｉｖ）（ｂ）および／もしくは（ｃ）を決定することを含み、
ここで（ａ）は、ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比またはＣＣＮＤ１のコピー数であり、ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比が約１．５５超／細胞であるか、またはＣＣＮＤ１のコピー数が約２．８１超／細胞である場合、転移が起こる可能性があることを示し、
（ｂ）は、ＭＹＣのコピー数であり、ＭＹＣのコピー数が約２．４８超／細胞である場合、転移が起こる可能性があることを示し、
（ｃ）は、ＣＣＮＤ１／対照セントロメアが増加している細胞の割合、またはＣＣＮＤ１が増加している細胞の割合であり、ＣＣＮＤ１が増加している細胞の割合が約３０％以上であるか、またはＣＣＮＤ１／対照セントロメアが増加している細胞の割合が約５４％以上である場合、転移が起こる可能性があることを示し、
（ｄ）は、ＭＹＣが増加している細胞の割合であり、ＭＹＣが増加している細胞の割合が約２０％超である場合、転移が起こる可能性があることを示す、
キット。
【請求項１８】
患者における悪性黒色腫を診断する方法であって、前記患者から得られた有核細胞を含む診断試料中の幾つかの核におけるＲＲＥＢ１のコピー数、ＭＹＣのコピー数、ＣＣＮＤ１のコピー数およびＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定することを含み、
前記ＲＲＥＢ１のコピー数が増加し、前記ＭＹＣのコピー数が増加し、前記ＣＣＮＤ１のコピー数が増加し、かつ前記ＣＤＫＮ２Ａのコピー数が減少している場合、前記試料が悪性黒色腫を含むことを示し、これにより、患者における悪性黒色腫を診断する、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、核数が約３０個であり、ならびにＲＲＥＢ１、ＭＹＣおよびＣＣＮＤ１のコピー数の増加と、ＣＤＫＮ２Ａのホモ接合性欠失とが、前記核の２７％以上で検出される場合、前記試料が悪性黒色腫を含む、方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法であって、核数が約３０個であり、ならびにＲＲＥＢ１、ＭＹＣおよびＣＣＮＤ１のコピー数の増加と、ＣＤＫＮ２Ａのホモ接合性欠失とが、８個以上の核で検出される場合、前記試料が悪性黒色腫を含む、方法。
【請求項２１】
悪性黒色腫の診断および予後予測を可能にするプローブのセットであって、ＲＲＥＢ１に対するプローブ、ＭＹＣに対するプローブ、ＣＣＮＤ１に対するプローブおよびＣＤＫＮ２Ａに対するプローブを含む、セット。
【請求項２２】
キットであって、
（ａ）患者における悪性黒色腫の診断および予後予測を可能にするプローブのセットと、
ここで、前記プローブのセットは、ＲＲＥＢ１に対するプローブ、ＭＹＣに対するプローブ、ＣＣＮＤ１に対するプローブおよびＣＤＫＮ２Ａに対するプローブを含み、
（ｂ）前記患者における悪性黒色腫を診断するための説明書
とを含み、
前記説明書は、前記患者から得られた診断試料におけるＲＲＥＢ１のコピー数、ＭＹＣのコピー数、ＣＣＮＤ１のコピー数およびＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定することを含み、
前記説明書は、前記ＲＲＥＢ１のコピー数が増加し、前記ＭＹＣのコピー数が増加し、前記ＣＣＮＤ１のコピー数が増加し、かつ前記ＣＤＫＮ２Ａのコピー数が減少している場合、前記患者が悪性黒色腫を有することを示し、
および／または前記患者における悪性黒色腫の転移を予後予測するための説明書
を含み、
前記説明書は、前記患者から得られた悪性黒色腫試料におけるＲＲＥＢ１のコピー数、ＭＹＣのコピー数、ＣＣＮＤ１のコピー数およびＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定することを含み、
前記ＲＲＥＢ１のコピー数が増加し、前記ＭＹＣのコピー数が増加し、前記ＣＣＮＤ１のコピー数が増加し、かつ前記ＣＤＫＮ２Ａのコピー数が減少している場合、転移が起こる可能性があることを示す、
キット。
【請求項２３】
患者における悪性黒色腫の転移を予後予測する方法であって、前記患者から得られた試料中の有核細胞を含む幾つかの核におけるＲＲＥＢ１のコピー数、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７のコピー数、ＣＣＮＤ１のコピー数およびＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定することを含み、前記ＲＲＥＢ１のコピー数が増加し、前記ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７のコピー数が増加し、前記ＣＣＮＤ１のコピー数が増加し、かつ前記ＣＤＫＮ２Ａのコピー数が減少している場合、転移が起こる可能性があることを示し、これにより、患者における悪性黒色腫の転移を予測する、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、核数が約３０個であり、ならびにＲＲＥＢ１、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７、およびＣＣＮＤ１のコピー数の増加と、ＣＤＫＮ２Ａのホモ接合性欠失とが、前記核の２７％以上で検出される場合、転移が起こる可能性がある、方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載の方法であって、核数が約３０個であり、ならびにＲＲＥＢ１、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７、およびＣＣＮＤ１のコピー数の増加と、ＣＤＫＮ２Ａのホモ接合性欠失とが、８個以上の核に検出される場合、転移が起こる可能性がある、方法。
【請求項２６】
悪性黒色腫の転移の予後予測を可能にするプローブのセットであって、ＲＲＥＢ１に対するプローブ、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７に対するプローブ、ＣＣＮＤ１に対するプローブおよびＣＤＫＮ２Ａに対するプローブを含む、セット。
【請求項２７】
キットであって、
（ａ）患者における悪性黒色腫の転移の予後予測を可能にするプローブのセットと、
ここで、前記プローブのセットは、ＲＲＥＢ１に対するプローブ、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７に対するプローブ、ＣＣＮＤ１に対するプローブおよびＣＤＫＮ２Ａに対するプローブを含み、
（ｂ）前記患者における悪性黒色腫を予後予測するための説明書
とを含み、
前記説明書は、前記患者から得られた試料におけるＲＲＥＢ１のコピー数、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７のコピー数、ＣＣＮＤ１のコピー数およびＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定することを含み、
前記ＲＲＥＢ１のコピー数が増加し、前記ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７のコピー数が増加し、前記ＣＣＮＤ１のコピー数が増加し、かつ前記ＣＤＫＮ２Ａのコピー数が減少している場合、転移が起こる可能性があることを示す、
キット。
【請求項２８】
患者における非定型スピッツ腫瘍の転移を予後予測する方法であって、前記患者由来の腫瘍試料におけるＲＲＥＢ１、ＣＣＮＤ１および／またはＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定することを含み、ＲＲＥＢ１のコピー数が増加し、またはＣＣＮＤ１のコピー数が増加し、またはＣＤＫＮ２Ａのホモ接合性が欠失している場合、悪性の転移が起こる可能性があることを示し、ならびにＣＤＫＮ２Ａのホモ接合性が欠失している場合、さらにより悪性の転移が起こる可能性があることを示す、方法。
【請求項２９】
非定型スピッツ腫瘍の転移の予後予測を可能にするプローブのセットであって、ＲＲＥＢ１に対するプローブ、ＣＣＮＤ１に対するプローブおよびＣＤＫＮ２Ａに対するプローブを含む、セット。
【請求項３０】
キットであって、
（ａ）患者における非定型スピッツ腫瘍の転移の予後予測を可能にするプローブのセットと、
ここで、前記プローブのセットは、ＲＲＥＢ１に対するプローブ、ＣＣＮＤ１に対するプローブおよびＣＤＫＮ２Ａに対するプローブを含み、
（ｂ）前記患者における非定型スピッツ腫瘍の転移を予後予測するための説明書
とを含み
前記説明書は、前記患者由来の腫瘍試料におけるＲＲＥＢ１、ＣＣＮＤ１および／またはＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定することを含み、ＲＲＥＢ１のコピー数が増加し、またはＣＣＮＤ１のコピー数が増加し、またはＣＤＫＮ２Ａのホモ接合性が欠失している場合、悪性の転移が起こる可能性があることを示し、ならびにＣＤＫＮ２Ａがホモ接合性欠失である場合、さらにより悪性の転移が起こる可能性があることを示す、
キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年１２月１０日に出願された同時係属中の米国仮出願第６１／５６９，２４５号の優先権を主張するものであり、この内容は、この全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、悪性黒色腫の診断、悪性黒色腫の転移の予後予測、遺伝子および／または染色体領域のコピー数の決定、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ならびに悪性黒色腫の診断およびこの転移の予後予測に有用な１つ以上のプローブのセットおよびキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
黒色腫の発生率および死亡率は、過去数十年間にわたって増加している（Ｂａｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２７（３６）：６１９９−６２０６（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０，２００９））。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（ＡＣＳ）は、黒色腫を発症する生涯リスクが、およそ、白人では５０人に１人、アフリカ系アメリカ人では１，０００人に１人、およびラテンアメリカ系では２００人に１人であると推定している。全体的には、黒色腫は、男性では６番目に多い癌であり、女性では７番目に多い癌である（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（ＡＣＳ），Ｍｅｌａｎｏｍａ，ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ｄｏｃｒｏｏｔ／ＣＲＩ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ＣＲＩ＿２＿４＿１ｘ＿Ｗｈａｔ＿ａｒｅ＿ｔｈｅ＿ｋｅｙ＿ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ＿ｆｏｒ＿ｍｅｌａｎｏｍａ＿５０．ａｓｐ？ｓｉｔｅａｒｅａ＝（２００９））。２００９年には、６８，７２０例の新たな浸潤性黒色腫症例、および８，６５０件の死亡が米国で報告されている（ＡＣＳ（２００９）、前掲）。
【０００４】
現在のところ、組織学が、黒色腫診断のゴールドスタンダードであると認識されているので、これが、臨床的挙動を予測するための現在のゴールドスタンダードである。組織学は、本質的には、臨床転帰を予測するための代理マーカーである。しかしながら、組織学はデフォルトで選択される方法であり、十分に検証されていなかった。多数の疫学的および臨床的研究が、組織学の限界を例証している。例えば、組織学的には悪性のように見える病変の大部分が良性的に振る舞うことが十分に認識されている；このような病変は、「緩慢性黒色腫」と称される。対照的に、浅いブレスローの深さまで皮膚に浸潤する黒色腫のごく一部は、非常に悪性的におよび侵襲的に振る舞って転移および死亡をもたらす。
【０００５】
センチネルリンパ節生検は、黒色腫転移病変についてリンパ節を評価するために、高い転移リスクを有する黒色腫患者で実施される。一般に、ブレスローの深さが約０．７５ｍｍ超の黒色腫を有する患者に生検を行う。このような患者は、高い有糸分裂速度、潰瘍形成、またはクラークレベルＩＶもしくはＶなどの組織学的因子によれば予後不良である。センチネルリンパ節が黒色腫に関与している場合、患者が転移疾患を発症する可能性は８０から９０％である。従って、センチネルリンパ節の状態は、最強の黒色腫予後指標である。センチネルリンパ節が黒色腫に関与していない患者は、センチネルリンパ節が黒色腫に関与している患者と比較して有意に予後良好な患者のコホートであると判断される。
【０００６】
黒色腫癌関連の死亡数は増加し続けており、進行性黒色腫の処置は惨憺たる結果を示し続けているが、過去１０年で幾つかのブレイクスルーがあった。これらのブレイクスルーとしては、黒色腫を、予後と相関する分子サブタイプに層別化すること（Ｖｉｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ  ５（６）：ｅｌ２０（Ｊｕｎｅ  ３，２００８））、および特定の活性化癌遺伝子経路に合わせることができる標的療法（Ｈｏｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６（１２）：２０４６−２０５１（Ａｐｒｉｌ  ２０，２００８）；およびＪｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１４（２３）：７７２６−７７３２（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １，２００８））が挙げられる。例えば、ＢＲＡＦ阻害剤またはＣＫＩＴ阻害剤、例えば、イマチニブメシレートなどの特定の標的阻害剤は、進行性黒色腫を有する患者を処置するのに使用されて成功している（Ｈｏｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）、前掲；およびＬｕｔｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ．２１（４）：４９２−４９３（Ａｕｇｕｓｔ  ２００８））。従って、黒色腫における特定の癌遺伝子経路を同定することは、黒色腫患者を予後的に層別化するのに役立ち得、治療結果を予測するのに役立ち得る。
【０００７】
体細胞突然変異に加えて、特定の癌遺伝子の増加または特定の腫瘍抑制遺伝子の減少によるコピー数異常が、黒色腫に非常に特徴的である。遺伝子コピー数異常のパターンに基づいて、悪性黒色腫をゲノム分類することが提案されている；このような分類は、報告によれば、処置のための合理的な患者選択を可能にする（米国特許出願公開第２０１０／０１４５８９７号明細書および国際公開第２０１０／０５１３１９号）。比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）研究は、黒色腫の９５％が染色体コピー数異常を有することを示している（Ｂａｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（１０）：２１７０−２１７５（Ｍａｙ  １５，１９９８））。頻繁な染色体コピー数の減少としては、９ｐ（８２％）、１０ｑ（６３％）、６ｑ（２８％）および８ｐ（２２％）における欠失が挙げられる。頻繁なコピー数の増加は、とりわけ、７ｑ（５０％）、８ｑ（３４％）、６ｐ（２８％）および１ｑ（２５％）で起こり得る（Ｂａｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）、前掲）。末端部の黒色腫は、報告によれば、染色体５ｐ、１１ｑ、１２ｑおよび１５が関与する有意により多くの異常ならびに集中的な遺伝子増幅を有する（Ｂａｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１６３：１７６５−１７７０（２００３））。染色体６ｐ２５、６セントロメア、６ｑ２３および１１ｑ１３を標的とする４個の蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）プローブの組み合わせからのシグナル数を使用するアルゴリズムは、８６．７％の感度および９５．４％の特異性で、黒色腫と母斑との間の最高の診断判別を提供する（Ｇｅｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｐａｔｈ．３３：１１４６−１１５６（２００９））；Ｇｅｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１４４（９）：１２３５−１２３６（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００８）およびＰｏｕｒｙａｚｄａｎｐａｒａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｐａｔｈｏｌ．３１（４）：４０２−４０３（Ｊｕｎｅ  ２００９）も参照のこと。）。野生型ＢＲＡＦまたはＮ−ＲＡＳを有する黒色腫は、報告によれば、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）およびサイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）の遺伝子コピー数が頻繁に増加している（Ｃｕｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３５３：２１３５−２１４７（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １７，２００５））。スピッツ母斑の一部のサブセットは、報告によれば、染色体１１ｐ短腕の個別増加を示すが、これは黒色腫では観察されていない（Ｂａｓｔｉａｎ，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１６０：９２−９９（２００２）；およびＢａｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）、前掲）。しかしながら、コピー数の増加は黒色腫診断と関連しているが、これまでは予後との関連性はなかった。遺伝子異常を黒色腫の予後と関連付ける能力は、従来の治療による患者の予後予測および管理を改善するのに役立ち、治療標的の同定に役立つであろう。
【０００８】
特定の癌遺伝子のコピー数の増加は、幾つかの癌では予後に関連している。例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの増幅は、乳癌では予後不良に関連しており（Ｔｏｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １００（５）：６８０−６８３（Ｍａｒｃｈ  １０，２００９））、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子のコピー数の上昇は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤で処置した非小細胞肺癌の予想される反応および生存利益に非常に関連している（Ｄａｈａｂｒｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１６（１）：２９１−３０３（Ｊａｎｕａｒｙ  １，２０１０））。
【０００９】
本開示は、患者における、非定型スピッツ腫瘍を含む悪性黒色腫を予後予測するための方法を提供しようとするものである。このおよび他の目的および利点ならびにさらなる特徴は、本明細書で提供される詳細な説明から明らかになるであろう。
【００１０】
上記に加えて、本開示は、患者における悪性黒色腫を診断するための方法を提供しようとするものである。病理学者の間では、良性または悪性のいずれかに明確に分類することが困難であり得る幾つかのサブセットのメラニン細胞腫瘍が存在することが広く受け入れられている（Ｂａｒｎｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．３０（５）：５１３−５２０（１９９９）；Ｃｏｒｏｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１４（４）：１２１８−１２２３（１９９６）；およびＭｃＧｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３８（５）：６１７−６２１（２００２））。多くの場合、鑑別診断は、スピッツ様の形態的特徴を有する黒色腫などの致死率が高い悪性病変とは対照的に、スピッツ母斑などの全く良性な病変を含んでいる。黒色腫の新たな生物学的療法の開発を考えると、黒色腫と良性病変を区別することができることが望ましい。鑑別診断のさらなる利点としては、誤診断から生じる過度の精神的負担の回避、センチネルリンパ節生検の有無にかかわらない適切な外科的管理の決定、および適切な全身療法の決定が挙げられる。
【００１１】
従来の顕微鏡検査に加えて、分子診断技術が新たに登場し、診断補助として有望である。６ｐ２５（ＲＲＥＢ１）、６ｑ２３（ＭＹＢ）、Ｃｅｐ６（セントロメア６）および１１ｑ１３（ＣＣＮＤ１）を標的とする４個のプローブの蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイは、８６．７％の感度および９５．４％の特異性で、明らかな黒色腫と良性母斑を組織学的に区別することが示されている（Ｇｅｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．３３（８）：１１４６−５６（２００９））。このプローブセットおよび所定の基準を、経過観察が公知の曖昧なメラニン細胞性新生物のセットに適用した場合、転移群（６／６が陽性）対非転移群（６／２１が陽性）では、結果に有意差があった。転移群対非転移群における陽性結果の可能性の差を示すｐ値は、非常に有意、即ち、フィッシャーの直接確率検定によれば．００３未満であった。上記プローブセットはまた、母斑性黒色腫と有糸分裂が活発な母斑（Ｇｅｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．３３（１２）：１７８３−１７８８（２００９））、青色母斑様転移と類上皮青色母斑（Ｐｏｕｒｙａｚｄａｎｐａｒａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．３３（９）：１３９６−４００（２００９））および結膜黒色腫と結膜母斑（Ｂｕｓａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３７（２）：１９６−２０３（２０１０））を区別するのに有用であった。しかしながら、一連のスピッツ様黒色腫の個別分析により、このサブセットの病変では感度が７０％であることが示された（Ｇａｍｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．，「Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｉｔｚｏｉｄ  Ｍｅｌａｎｏｍａｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  ９ｐ２１  ａｓ  ａｎ  Ａｄｊｕｎｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｂｅ」（Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ，Ｏｃｔｏｂｅｒ  １０，２０１１））。従って、上記プローブセットの開発は、メラニン細胞性新生物の分子診断についての大きな進歩であったが、特にスピッツ様黒色腫に対するアッセイ感度については改善余地がある。上記プローブセットは、比較的高い特異性であったが、スピッツ様新生物における四倍体細胞の存在が、時として、ＦＩＳＨ結果の解釈が困難な原因となり得る（Ｉｓａａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｐａｔｈｏｌ．３２（２）：１４４−１４８（２０１０））。患者における悪性黒色腫を診断するための方法についての他の目的および利点、ならびにさらなる特徴は、本明細書で提供される詳細な説明から明らかになるであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／０１４５８９７号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１０／０５１３１９号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｂａｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２７（３６）：６１９９−６２０６（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０，２００９）
【非特許文献２】Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（ＡＣＳ），Ｍｅｌａｎｏｍａ，ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ｄｏｃｒｏｏｔ／ＣＲＩ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ＣＲＩ＿２＿４＿１ｘ＿Ｗｈａｔ＿ａｒｅ＿ｔｈｅ＿ｋｅｙ＿ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ＿ｆｏｒ＿ｍｅｌａｎｏｍａ＿５０．ａｓｐ？ｓｉｔｅａｒｅａ＝（２００９）
【非特許文献３】Ｖｉｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ  ５（６）：ｅｌ２０（Ｊｕｎｅ  ３，２００８）
【非特許文献４】Ｈｏｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６（１２）：２０４６−２０５１（Ａｐｒｉｌ  ２０，２００８）
【非特許文献５】Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１４（２３）：７７２６−７７３２（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １，２００８）
【非特許文献６】Ｌｕｔｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ．２１（４）：４９２−４９３（Ａｕｇｕｓｔ  ２００８）
【非特許文献７】Ｂａｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（１０）：２１７０−２１７５（Ｍａｙ  １５，１９９８）
【非特許文献８】Ｂａｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１６３：１７６５−１７７０（２００３）
【非特許文献９】Ｇｅｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｐａｔｈ．３３：１１４６−１１５６（２００９））
【非特許文献１０】Ｇｅｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１４４（９）：１２３５−１２３６（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００８）
【非特許文献１１】Ｐｏｕｒｙａｚｄａｎｐａｒａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｐａｔｈｏｌ．３１（４）：４０２−４０３（Ｊｕｎｅ  ２００９）
【非特許文献１２】Ｃｕｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３５３：２１３５−２１４７（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １７，２００５）
【非特許文献１３】Ｂａｓｔｉａｎ，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１６０：９２−９９（２００２）
【非特許文献１４】Ｔｏｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １００（５）：６８０−６８３（Ｍａｒｃｈ  １０，２００９）
【非特許文献１５】Ｄａｈａｂｒｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１６（１）：２９１−３０３（Ｊａｎｕａｒｙ  １，２０１０）
【非特許文献１６】Ｂａｒｎｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．３０（５）：５１３−５２０（１９９９）
【非特許文献１７】Ｃｏｒｏｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１４（４）：１２１８−１２２３（１９９６）
【非特許文献１８】ＭｃＧｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３８（５）：６１７−６２１（２００２）
【非特許文献１９】Ｇｅｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．３３（８）：１１４６−５６（２００９）
【非特許文献２０】Ｇｅｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．３３（１２）：１７８３−１７８８（２００９）
【非特許文献２１】Ｐｏｕｒｙａｚｄａｎｐａｒａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．３３（９）：１３９６−４００（２００９）
【非特許文献２２】Ｂｕｓａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３７（２）：１９６−２０３（２０１０）
【非特許文献２３】Ｇａｍｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．，「Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｉｔｚｏｉｄ  Ｍｅｌａｎｏｍａｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  ９ｐ２１  ａｓ  ａｎ  Ａｄｊｕｎｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｂｅ」（Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ，Ｏｃｔｏｂｅｒ  １０，２０１１）
【非特許文献２４】Ｉｓａａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｐａｔｈｏｌ．３２（２）：１４４−１４８（２０１０）
【発明の概要】
【００１４】
患者における悪性黒色腫の転移を予後予測する方法が提供される。前記方法は、前記患者から得られた悪性黒色腫試料における（ｉ）（ａ）および／もしくは（ｂ）、（ｉｉ）（ｃ）および／もしくは（ｄ）、（ｉｉｉ）（ａ）および／もしくは（ｄ）、または（ｉｖ）（ｂ）および／もしくは（ｃ）を決定することを含み、
（ａ）は、ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比またはＣＣＮＤ１のコピー数であり、ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比が約１．５５超／細胞であるか、またはＣＣＮＤ１のコピー数が約２．８１超／細胞である場合、転移が起こる可能性があることを示し、
（ｂ）は、ＭＹＣのコピー数であり、ＭＹＣのコピー数が約２．４８超／細胞である場合、転移が起こる可能性があることを示し、
（ｃ）は、ＣＣＮＤ１／対照セントロメアが増加している細胞の割合、またはＣＣＮＤ１が増加している細胞の割合であり、ＣＣＮＤ１が増加している細胞の割合が約３０％以上であるか、またはＣＣＮＤ１／対照セントロメアが増加している細胞の割合が約５４％以上である場合、転移が起こる可能性があることを示し、
（ｄ）は、ＭＹＣが増加している細胞の割合であり、ＭＹＣが増加している細胞の割合が約２０％超である場合、転移が起こる可能性があることを示す。
【００１５】
ブレスローの深さが約１ｍｍ未満の黒色腫を有する患者における悪性黒色腫の転移を予後予測する方法も提供される。前記方法は、前記患者から得られた悪性黒色腫試料におけるＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比およびＭＹＣのコピー数を決定することを含む。ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比が約１．５５超／細胞であるか、またはＭＹＣのコピー数が約２．４８超／細胞である場合、転移が起こる可能性があることを示す。
【００１６】
ブレスローの深さが２ｍｍ以下の黒色腫を有する患者における悪性黒色腫の転移を予後予測する方法も提供される。前記方法は、前記患者から得られた悪性黒色腫試料におけるＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比およびＭＹＣのコピー数を決定することを含む。ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比が約１．３８超／細胞であり、およびＭＹＣのコピー数が約２．３６超／細胞である場合、転移が起こる可能性があることを示す。
【００１７】
ブレスローの深さが１ｍｍ以上約４ｍｍ未満の黒色腫を有する患者における悪性黒色腫の転移を予後予測する方法がさらに提供される。前記方法は、前記患者から得られた悪性黒色腫試料におけるＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比を決定することを含む。ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比が約１．５５超／細胞である場合、転移が起こる可能性があることを示す。前記方法は、前記患者におけるＭＹＣのコピー数を検出することをさらに含むことができ、ＭＹＣのコピー数が約２．６０超／細胞であることもまた、転移が起こる可能性があることを示す。
【００１８】
ブレスローの深さが約２．０ｍｍ超の黒色腫を有する患者における悪性黒色腫の転移を予後予測する方法もさらに提供される。前記方法は、前記患者から得られた悪性黒色腫試料におけるＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比またはＭＹＣのコピー数を決定することを含む。ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比が約１．５５超／細胞である場合、転移が起こる可能性があることを示す。ＭＹＣのコピー数が約２．２２超／細胞である場合、転移が起こる可能性があることを示す。
【００１９】
上記方法は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、前記ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比および／または前記ＭＹＣのコピー数を決定することを含むことができる。前記ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）であり得る。
【００２０】
また、上記を考慮して、（ａ）患者における悪性黒色腫の転移の予後予測を可能にする１つ以上のプローブのセットと、（ｂ）前記患者における悪性黒色腫の転移を予後予測するための説明書とを含むキットが提供される。前記１つ以上のプローブのセットは、（ｉ’）ＣＣＮＤ１に対するプローブ単独、もしくはこれを、対照セントロメアに対するプローブとさらに組み合わせたもの、および／または（ｉｉ’）ＭＹＣに対するプローブを含む。前記説明書は、前記患者から得られた悪性黒色腫試料における（ｉ）（ａ）および／もしくは（ｂ）、（ｉｉ）（ｃ）および／もしくは（ｄ）、（ｉｉｉ）（ａ）および／もしくは（ｄ）、または（ｉｖ）（ｂ）および／もしくは（ｃ）を決定することを含むことができ、
（ａ）は、ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比またはＣＣＮＤ１のコピー数であり、ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比が約１．５５超／細胞であるか、またはＣＣＮＤ１のコピー数が約２．８１超／細胞である場合、転移が起こる可能性があることを示し、
（ｂ）は、ＭＹＣのコピー数であり、ＭＹＣのコピー数が約２．４８超／細胞である場合、転移が起こる可能性があることを示し、
（ｃ）は、ＣＣＮＤ１／対照セントロメアが増加している細胞の割合、またはＣＣＮＤ１が増加している細胞の割合であり、ＣＣＮＤ１が増加している細胞の割合が約３０％以上であるか、またはＣＣＮＤ１／対照セントロメアが増加している細胞の割合が約５４％以上である場合、転移が起こる可能性があることを示し、
（ｄ）は、ＭＹＣが増加している細胞の割合であり、ＭＹＣが増加している細胞の割合が約２０％超である場合、転移が起こる可能性があることを示す。
【００２１】
患者における悪性黒色腫を診断する方法も提供される。前記方法は、前記患者から得られた有核細胞を含む診断試料中の幾つかの核におけるＲＲＥＢ１のコピー数、ＭＹＣのコピー数、ＣＣＮＤ１のコピー数およびＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定することを含み、前記ＲＲＥＢ１のコピー数が増加しており、前記ＭＹＣのコピー数が増加しており、前記ＣＣＮＤ１のコピー数が増加しており、および前記ＣＤＫＮ２Ａのコピー数が減少している場合、前記試料が悪性黒色腫を含むことを示す。前記核数は約３０個であり得、ＲＲＥＢ１、ＭＹＣおよびＣＣＮＤ１のコピー数の増加、ならびにＣＤＫＮ２Ａのホモ接合性欠失が前記核の２７％以上で検出される場合、前記試料は悪性黒色腫を含む。または、前記核数は約３０個であり得、ＲＲＥＢ１、ＭＹＣおよびＣＣＮＤ１のコピー数の増加、ならびにＣＤＫＮ２Ａのホモ接合性欠失が８個以上の核で検出される場合、前記試料は悪性黒色腫を含む。
【００２２】
悪性黒色腫の診断および予後予測を可能にするプローブのセットがさらに提供される。前記セットは、ＲＲＥＢ１に対するプローブ、ＭＹＣに対するプローブ、ＣＣＮＤ１に対するプローブおよびＣＤＫＮ２Ａに対するプローブを含む。
【００２３】
キットもさらに提供される。前記キットは、（ａ）患者における悪性黒色腫の診断および予後予測を可能にするプローブのセットであって、ＲＲＥＢ１に対するプローブ、ＭＹＣに対するプローブ、ＣＣＮＤ１に対するプローブおよびＣＤＫＮ２Ａに対するプローブを含むプローブのセットと、（ｂ）前記患者における悪性黒色腫を診断するための説明書であって、前記患者から得られた診断試料におけるＲＲＥＢ１のコピー数、ＭＹＣのコピー数、ＣＣＮＤ１のコピー数およびＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定することを含み、前記ＲＲＥＢ１のコピー数が増加しており、前記ＭＹＣのコピー数が増加しており、前記ＣＣＮＤ１のコピー数が増加しており、および前記ＣＤＫＮ２Ａのコピー数が減少している場合、前記患者が悪性黒色腫を有することを示す説明書、および／または前記患者における悪性黒色腫の転移を予後予測するための説明書であって、前記患者から得られた悪性黒色腫試料におけるＲＲＥＢ１のコピー数、ＭＹＣのコピー数、ＣＣＮＤ１のコピー数およびＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定することを含み、前記ＲＲＥＢ１のコピー数が増加しており、前記ＭＹＣのコピー数が増加しており、前記ＣＣＮＤ１のコピー数が増加しており、および前記ＣＤＫＮ２Ａのコピー数が減少している場合、転移が起こる可能性があることを示す説明書とを含む。
【００２４】
患者における悪性黒色腫の転移を予後予測する方法も提供される。前記方法は、前記患者から得られた有核細胞を含む試料中の幾つかの核におけるＲＲＥＢ１のコピー数、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７のコピー数、ＣＣＮＤ１のコピー数およびＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定することを含み、前記ＲＲＥＢ１のコピー数が増加しており、前記ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７のコピー数が増加しており、前記ＣＣＮＤ１のコピー数が増加しており、および前記ＣＤＫＮ２Ａのコピー数が減少している場合、転移が起こる可能性があることを示す。前記核数は約３０個であり得、ＲＲＥＢ１、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７、およびＣＣＮＤ１のコピー数の増加、ならびにＣＤＫＮ２Ａのホモ接合性欠失が前記核の２７％以上で検出される場合、転移が起こる可能性がある。または、前記核数は約３０個であり得、ＲＲＥＢ１、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７、およびＣＣＮＤ１のコピー数の増加、ならびにＣＤＫＮ２Ａのホモ接合性欠失が８個以上の核で検出される場合、転移が起こる可能性がある。
【００２５】
悪性黒色腫の転移の予後予測を可能にするプローブのセットも提供される。前記セットは、ＲＲＥＢ１に対するプローブ、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７に対するプローブ、ＣＣＮＤ１に対するプローブおよびＣＤＫＮ２Ａに対するプローブを含む。
【００２６】
キットも提供される。前記キットは、（ａ）患者における悪性黒色腫の転移の予後予測を可能にするプローブのセットであって、ＲＲＥＢ１に対するプローブ、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７に対するプローブ、ＣＣＮＤ１に対するプローブおよびＣＤＫＮ２Ａに対するプローブを含むプローブのセットと、（ｂ）前記患者における悪性黒色腫を予後予測するための説明書であって、前記患者から得られた試料におけるＲＲＥＢ１のコピー数、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７のコピー数、ＣＣＮＤ１のコピー数およびＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定することを含み、前記ＲＲＥＢ１のコピー数が増加しており、前記ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７のコピー数が増加しており、前記ＣＣＮＤ１のコピー数が増加しており、および前記ＣＤＫＮ２Ａのコピー数が減少している場合、転移が起こる可能性があることを示す説明書とを含む。
【００２７】
加えて、患者における非定型スピッツ腫瘍の転移を予後予測する方法が提供される。前記方法は、前記患者由来の腫瘍試料におけるＲＲＥＢ１、ＣＣＮＤ１および／またはＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定することを含み、ＲＲＥＢ１のコピー数が増加しているか、またはＣＣＮＤ１のコピー数が増加しているか、またはＣＤＫＮ２Ａがホモ接合性欠失である場合、悪性の転移が起こる可能性があることを示し、およびＣＤＫＮ２Ａがホモ接合性欠失である場合、さらにより悪性の転移が起こる可能性があることを示す。
【００２８】
これに関して、非定型スピッツ腫瘍の転移の予後予測を可能にするプローブのセットがさらに提供される。前記セットは、ＲＲＥＢ１に対するプローブ、ＣＣＮＤ１に対するプローブおよびＣＤＫＮ２Ａに対するプローブを含む。
【００２９】
キットもさらに提供される。前記キットは、（ａ）患者における非定型スピッツ腫瘍の転移の予後予測を可能にするプローブのセットであって、ＲＲＥＢ１に対するプローブ、ＣＣＮＤ１に対するプローブおよびＣＤＫＮ２Ａに対するプローブを含むプローブのセットと、（ｂ）前記患者における非定型スピッツ腫瘍の転移を予後予測するための説明書であって、前記患者由来の腫瘍試料におけるＲＲＥＢ１、ＣＣＮＤ１および／またはＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定することを含み、ＲＲＥＢ１のコピー数が増加しているか、またはＣＣＮＤ１のコピー数が増加しているか、またはＣＤＫＮ２Ａがホモ接合性欠失である場合、悪性の転移が起こる可能性があることを示し、およびＣＤＫＮ２Ａがホモ接合性欠失である場合、さらにより悪性の転移が起こる可能性があることを示す説明書とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１ａ】図１ａは、ＣＣＮＤ１／第６染色体、ＣＣＮＤ１／細胞およびＭＹＣ／細胞の感度対１−特異性のグラフである。
【図１ｂ】図１ｂは、ＣＣＮＤ１／第６染色体が１．５５以下であるもの、患者全員およびＣＣＮＤ１／第６染色体が１．５５超であるものについての、累積無転移生存確率対時間（月）のグラフである。
【図１ｃ】図１ｃは、ＭＹＣ／細胞が２．４８以下であるもの、患者全員およびＭＹＣ／細胞が２．４８超であるものについての、累積無転移生存確率対時間（月）のグラフである。
【図１ｄ】図１ｄは、ＣＣＮＤ１／第６染色体が１．５５以下でありＭＹＣ／細胞が２．４８以下であるもの、患者全員、ならびにＣＣＮＤ１／第６染色体が１．５５超またはＭＹＣ／細胞が２．４８超であるものについての、累積無転移生存確率対時間（月）のグラフである。
【図２ａ】図２ａは、ＣＣＮＤ１／第６染色体が１．５５以下であるもの、患者全員およびＣＣＮＤ１／第６染色体が１．５５超であるものについての、累積生存確率対時間（月）のグラフである。
【図２ｂ】図２ｂは、ＭＹＣ／細胞が２．４８以下であるもの、患者全員およびＭＹＣ／細胞が２．４８超であるものについての、累積生存確率対時間（月）のグラフである。
【図３ａ】図３ａは、ブレスローの深さが１．０ｍｍ以下でありＣＣＮＤ１／第６染色体が１．５５以下であるもの、すべてのブレスローの深さが１．０ｍｍ以下であるもの、ブレスローの深さが１．０ｍｍ超でありＣＣＮＤ１／第６染色体が１．５５以下であるもの、すべてのブレスローの深さが１．０ｍｍ超であるもの、すべてのブレスローの深さが１．０ｍｍ超でありＣＣＮＤ１／第６染色体が１．５５超であるもの、ならびにブレスローの深さが１．０ｍｍ以下でありＣＣＮＤ１／第６染色体が１．５５超であるものについての、累積無転移生存確率対時間（月）のグラフである。
【図３ｂ】図３ｂは、ブレスローの深さが１．０ｍｍ以下でありＭＹＣ／細胞が２．４８以下であるもの、すべてのブレスローの深さが１．０ｍｍ以下であるもの、ブレスローの深さが１．０ｍｍ超でありＭＹＣ／細胞が２．４８以下であるもの、すべてのブレスローの深さが１．０ｍｍ超であるもの、すべてのブレスローの深さが１．０ｍｍ超でありＭＹＣ／細胞が２．４８超であるもの、ならびにブレスローの深さが１．０ｍｍ以下でありＭＹＣ／細胞が２．４８超であるものについての、累積無転移生存確率対時間（月）のグラフである。
【図３ｃ】図３ｃは、ブレスローの深さが２．０ｍｍ以下でありＣＣＮＤ１／第６染色体が１．５５以下であるもの、すべてのブレスローの深さが２．０ｍｍ以下であるもの、ブレスローの深さが２．０ｍｍ超でありＣＣＮＤ１／第６染色体が１．５５以下であるもの、すべてのブレスローの深さが２．０ｍｍ超であるもの、ブレスローの深さが２．０ｍｍ以下でありＣＣＮＤ１／第６染色体が１．５５超であるもの、ならびにすべてのブレスローの深さが２．０ｍｍ超でありＣＣＮＤ１／第６染色体が１．５５超であるものについての、累積無転移生存確率対時間（月）のグラフである。
【図３ｄ】図３ｄは、ブレスローの深さが２．０ｍｍ以下でありＭＹＣ／細胞が２．４８以下であるもの、すべてのブレスローの深さが２．０ｍｍ以下であるもの、ブレスローの深さが２．０ｍｍ以下でありＭＹＣ／細胞が２．４８超であるもの、すべてのブレスローの深さが２．０ｍｍ超でありＭＹＣ／細胞が２．４８以下であるもの、すべてのブレスローの深さが２．０ｍｍ超であるもの、ならびにブレスローの深さが２．０ｍｍ超でありＭＹＣ／細胞が２．４８超であるものについての、累積無転移生存確率対時間（月）のグラフである。
【図４ａ】図４ａは、ブレスローの深さが１から４ｍｍでありＣＣＮＤ１／第６染色体（ｃｅｎ６）が１．５５以下であるもの、すべてのブレスローの深さが１から４ｍｍであるもの、ならびにブレスローの深さが１から４ｍｍでありＣＣＮＤ１／第６染色体（ｃｅｎ６）が１．５５超であるものについての、累積無転移生存確率対時間（月（ｍｏ））のグラフである。
【図４ｂ】図４ｂは、ＣＣＮＤ１／第６染色体（ｃｅｎ６）が１．５５以下であるもの、患者全員およびＣＣＮＤ１／第６染色体（ｃｅｎ６）が１．５５超であるものについての、累積生存確率対時間（月（ｍｏ））のグラフである。
【図５】図５は、検体カテゴリの平均対パラメータの棒グラフであり、プローブＣＤＫＮ２Ａ、ＭＹＣ、ＣＥＰ９、ＺＮＦ２１７、Ｃｏｘ２、ＢＲＡＦおよびＣＥＰ１０のそれぞれについて計算した代表的なパラメータについて、黒色腫群および母斑群における染色体異常（増加または減少）を有する細胞の割合を示す。
【図６】図６は、ＣＤＫＮ２Ａの％ホモ接合性欠失（△）、ＣＣＮＤ１の％増加（○）、ＲＲＥＢ１の％増加（□）、ＭＹＣの％増加（◇）およびすべてのプローブ（●）の感度対１−特異性のグラフである。
【図７】図７は、ＣＣＮＤ１／ＣＥＰ６（◆）、ＣＣＮＤ１／ＣＥＰ６の％増加（■）、ＣＣＮＤ１の％増加（▲）、ＣＣＮＤ１／細胞（×）、ＭＹＣ／細胞（＊）およびＭＹＣの％増加（●）の感度対１−特異性のグラフである。
【図８】図８は、ＣＤＫＮ２Ａの％ホモ接合性減少、ＲＲＥＢ１の％増加、ＭＹＣの％増加およびＣＣＮＤ１の％増加の感度対１−特異性のグラフである。
【００３１】
詳細な説明
本開示は、（ｉ）患者から得られた悪性黒色腫試料におけるＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比、もしくはＣＣＮＤ１のコピー数および／もしくはＭＹＣのコピー数の決定、または（ｉｉ）ＣＣＮＤ１／対照セントロメアが増加している細胞の割合、もしくはＣＣＮＤ１が増加している細胞の割合および／もしくはＭＹＣが増加している細胞の割合の決定に基づいて、患者における悪性黒色腫の予後予測を行うことができるという驚くべきおよび予想外の発見に基づくものである。（ｉ）ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比を所定のカットオフと比較し、および／もしくはＭＹＣのコピー数を所定のカットオフと比較し、または（ｉｉ）ＣＣＮＤ１が増加している細胞の割合を所定のカットオフと比較し、および／もしくはＭＹＣが増加している細胞の割合を所定のカットオフと比較することによって、患者において転移が起こる可能性を予測することができる。上記を考慮して、本開示は、患者における悪性黒色腫の転移などの疾患進行を予後予測する方法、悪性黒色腫の転移などの疾患進行の予後予測を可能にする１つ以上のプローブのセット、および１つ以上のこのようなプローブのセットと、患者における悪性黒色腫の転移などの疾患進行を予後予測するための説明書とを含むキットを提供する。
【００３２】
本開示はまた、ＲＲＥＢ１、ＭＹＣのコピー数、ＣＣＮＤ１のコピー数およびＣＤＫＮ２Ａのコピー数の決定に基づいて、患者における悪性黒色腫の診断を行うことができるという驚くべきおよび予想外の発見に基づくものである。上記を考慮して、本開示は、患者における悪性黒色腫を診断する方法、悪性黒色腫の診断を可能にするプローブのセット、およびこのようなプローブのセットと、患者における黒色腫を診断するための説明書とを含むキットを提供する。前記方法は、組織学的に曖昧なメラニン細胞腫瘍をより良く分類するために、および遠隔転移または患者の死亡をもたらす可能性が最も高い組織学的に曖昧なメラニン細胞腫瘍をより選択的に同定するために使用することができる。これに関して、前記方法はまた、悪性黒色腫の転移などの疾患進行を予測するのに使用することができる。従って、本開示はまた、ＲＲＥＢ１、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７のコピー数、ＣＣＮＤ１のコピー数およびＣＤＫＮ２Ａのコピー数の決定に基づいて、患者における悪性黒色腫の転移の予後予測を行うことができるという発見に基づくものである。これに関して、本開示は、患者における悪性黒色腫の転移を予後予測する方法、悪性黒色腫の転移の予後予測を可能にするプローブのセット、およびこのようなプローブのセットと、悪性黒色腫の転移を予後予測するための説明書とを含むキットを提供する。
【００３３】
以下の用語は、本開示に関するものである：
「約」は、表示されている値からおよそ＋／−１０％の変動を指す。このような変動は、常に、これについて具体的な言及がなされているか否かにかかわらず、本明細書で提供される任意の所定の値に含まれると理解するべきである。
【００３４】
「ブレスローの深さ」は、３つの最も重要な黒色腫予後因子の１つであると考えられている。他の因子は、Ｔ期および潰瘍形成である。ブレスローの深さは、皮膚に対して直角に接眼マイクロメーターを使用することによって決定される。表皮顆粒層から、腫瘍細胞が皮膚に浸潤した最深浸潤点までの深さを直接測定する。
【００３５】
「癌の診断」は、一般に、癌の種類の同定を指す。診断は、本質的にディファレンシャルなもの、例えば、組織学的に曖昧なメラニン細胞腫瘍を区別すること、例えば、母斑性黒色腫と有糸分裂が活発な母斑を区別すること、青色母斑様転移と類上皮青色母斑を区別すること、または結膜黒色腫と結膜母斑を区別することであり得る。
【００３６】
「癌の予後予測」は、一般に、癌の予想される経過（例えば、疾患進行）または転帰（例えば、転移または死亡）の予想または予測を指す。本明細書で使用される場合、癌の予後予測は、悪性黒色腫の転移および死亡を含む黒色腫の進行の予想または予測を含む。
【００３７】
「染色体計数プローブ（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅ）（ＣＥＰ）」は、細胞中の特定の染色体の数を計数することを可能にする任意のプローブである。染色体計数プローブは、典型的には、特定の染色体のセントロメア付近の（「ペリセントロメアの」と称される。）または前記セントロメアの領域、典型的には反復ＤＮＡ配列（例えば、αサテライトＤＮＡ）を認識して結合する。染色体のセントロメアは、典型的には、細胞分裂時の忠実な分離に必要であるので、この染色体を表すと考えられる。特定の染色体領域の欠失または増幅は、特定の遺伝子座に対応するシグナル数（コピー数）をセントロメアに対応するシグナル数と比較することによって、これが通常存在する染色体全体の減少または増加（異数染色体性（ａｎｅｕｓｏｍｙ））と区別することができる。この比較を行う方法の１つは、遺伝子座を表すシグナル数を、セントロメアを表すシグナル数で割ることである。１未満の比は、遺伝子座の相対的な減少または欠失を示し、１超の比は、遺伝子座の相対的な増加または増幅を示す。同様に、染色体内のアンバランスな増加または減少を示すために、同じ染色体上、例えば、染色体の２つの異なる腕上の２つの異なる遺伝子座間で比較を行うことができる。染色体に対するセントロメアプローブの代わりに、当業者であれば、染色体全体の減少または増加を概算するために、染色体腕プローブを代替的に使用してもよいことを認識するであろう。しかしながら、このようなプローブのシグナルの減少は、染色体全体の減少を常に示し得ないので、このようなプローブは染色体の計数ほど正確ではない。染色体計数プローブの例としては、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ（以前は、Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）から市販されているＣＥＰ（登録商標）プローブが挙げられる。
【００３８】
「クラークレベル」は、黒色腫に関与する皮膚層の尺度である。例えば、レベルＩは、表皮を含む。レベルＩＩは、表皮および真皮上層を含む。レベルＩＩＩは、表皮、真皮上層および真皮深部を含む。レベルＩＶは、表皮、真皮上層、真皮深部および皮下組織を含む。
【００３９】
「コピー数」は、単一遺伝子座、１つ以上の遺伝子座、またはゲノム全体にかかわらず、ＤＮＡの測定である。２の「コピー数」は、ヒトでは（性染色体を除いて二倍性であるので）「野生型」である。ヒトにおける２以外の「コピー数」（性染色体を除く）は、野生型から逸脱している。このような逸脱としては、コピー数の増幅、即ち増加、コピー数の欠失、即ち減少、およびさらにはコピー数の欠如が挙げられる。
【００４０】
「固定剤」としては、限定されないが、アルコール溶液、酸性アセトン溶液、アルデヒド（例えば、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒド）、メタノール／酢酸およびホルマリンが挙げられる。
【００４１】
「標識された」、「検出可能な標識で標識された」および「検出可能に標識された」は、本明細書では、実体（例えば、プローブ）を検出することができることを示すのに互換的に使用される。「標識」および「検出可能な標識」は、実体を検出可能にするために実体に結合される部分、例えば、標的配列への結合の際にプローブを検出可能にするためにプローブに結合される部分を意味する。部分これ自体は検出可能ではなくてもよいが、さらに別の部分と反応すると検出可能になり得る。「検出可能に標識された」という用語の使用は、このような標識を包含することを意図する。検出可能な標識は、この標識が測定可能なシグナルを発生し、この強度が結合実体の量に比例するように選択することができる。核酸などの分子を標識および／または検出するための多種多様なシステム、例えば、プローブが周知である。標識された核酸は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的または他の手段によって直接的または間接的に検出可能な標識を組み込むか、またはこれをコンジュゲートすることによって調製することができる。適切な検出可能な標識としては、放射性同位体、フルオロフォア、発色団、化学発光剤、微粒子、酵素、磁気粒子、高電子密度粒子、質量標識、スピン標識、ハプテンなどが挙げられる。本明細書では、フルオロフォアおよび化学発光剤が好ましい。
【００４２】
「遺伝子座特異的プローブ」は、染色体上の領域の特定の遺伝子座、例えば、転移で増加／減少すると決定された遺伝子座に選択的に結合するプローブを指す。プローブは、エクソン、イントロンおよび／または調節配列、例えば、プロモーター配列などを含むコード領域もしくは非コード領域またはこれら両方を標的とすることができる。
【００４３】
「核酸試料」は、プローブとのハイブリダイゼーションに適切な形態の核酸を含む試料、例えば、核またはこのような核から単離もしくは精製された核酸を含む試料を指す。核酸試料は、全部または一部（例えば、特定の染色体）のゲノムＤＮＡ、全部または一部のｍＲＮＡ（例えば、特定の染色体または遺伝子）、または選択された配列を含んでもよい。凝縮染色体（例えば、間期または中期に存在するもの）は、ＦＩＳＨなどのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの標的として使用するのに適切である。
【００４４】
「増加割合」および「％増加」は、一般に、特定遺伝子のコピー数が増加している細胞の割合を指すのに対して、「減少割合」および「％減少」は、一般に、特定遺伝子のコピー数が減少している細胞の割合を指す。例えば、正常細胞または野生型細胞は、各遺伝子の２コピーを含有する。増加／減少割合は、以下のように決定することができる：
（遺伝子のコピー数が増加または減少している細胞の数／細胞の総数）×１００＝％増加／減少
【００４５】
「所定のカットオフ」および「所定のレベル」は、一般に、種々の臨床パラメータ（例えば、疾患の重症度、進行／非進行／改善など）と既にリンクされているかまたはこれらに関連付けられている所定のカットオフ／レベルに対してアッセイの結果を比較することによって、診断／予後／治療有効性の結果を評価するのに使用されるカットオフ値を指す。本開示は、悪性黒色腫を有する患者における転移を予後予測するための例示的な所定のレベルを提供する。カットオフ値はアッセイの様式により変化し得るが、本明細書に記載される相関関係は、依然として一般に適用可能なはずである。
【００４６】
本開示との関連では、「プローブ」は、選択的なハイブリダイゼーションを可能にするか、またはこれを促進する条件下で、標的配列（例えば、ＣＣＮＤ１遺伝子、ＭＹＣ遺伝子、または第６染色体のセントロメア、例えば、第６染色体のセントロメアに位置するαサテライトＤＮＡ）の少なくとも一部に選択的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。一般に、プローブは、ＤＮＡのコード鎖またはセンス（＋）鎖に相補的でもよいし、またはＤＮＡの非コード鎖またはアンチセンス（−）鎖に相補的（「逆相補的」と称されることもある。）でもよい。プローブは、長さが大きく変化し得る。好ましくは、約１０から約１００ヌクレオチド、例えば、約１５から約７５ヌクレオチド、例えば、約１５から約５０ヌクレオチドの長さであり得る。
【００４７】
組織試料の「切片」は、組織試料の一部分または一片、例えば、組織の薄片または組織試料由来の細胞片である。組織試料の２つ以上の切片を採取および分析してもよい。所望により、種々のレベルで、例えば、形態的および分子的（例えば、核酸およびタンパク質）に、単一切片を分析することができる。
【００４８】
本開示との関連では、「に選択的にハイブリダイズする」（ならびに、「選択的なハイブリダイゼーション」、「に特異的にハイブリダイズする」および「特異的なハイブリダイゼーション」）は、核酸分子が、ストリンジェントな条件下で、特定のヌクレオチド配列に選択的に結合するか、これと選択的に二重鎖形成するか、またはこれに選択的にハイブリダイズすることを指す。「ストリンジェントな条件」という用語は、プローブが、この標的配列に選択的にハイブリダイズし、および他の非標的配列にはより弱くハイブリダイズするかまたはこれには全くハイブリダイズしない条件を指す。核酸ハイブリダイゼーション（例えば、アレイ、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーションまたはＦＩＳＨ）との関連では、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存的であり、異なる条件下では異なる。核酸ハイブリダイゼーションについての広範な指針は、例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈ．２，「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮＹ（１９９３）（「Ｔｉｊｓｓｅｎ」）に見られる。一般に、高ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くあるように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が、パーフェクトマッチプローブにハイブリダイズする（規定のイオン強度およびｐＨにおける）温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴｍと等しいように選択される。サザンブロットまたはノーザンブロットのアレイまたはフィルタでは、１００超の相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、標準的なハイブリダイゼーション溶液を使用して４２℃である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（２００１）を参照のこと。）。
【００４９】
「標的配列」、「標的領域」および「核酸標的」は、この減少および／または増加を決定する特定の染色体位置に存在するヌクレオチド配列を指す。
【００５０】
本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定的であることを意図するものではない。
【００５１】
悪性黒色腫を診断する方法および悪性黒色腫の転移を予後予測する方法
上記を考慮して、患者における悪性黒色腫の転移を予後予測する方法が提供される。前記方法は、前記患者から得られた悪性黒色腫試料における（ｉ）（ａ）および／もしくは（ｂ）、（ｉｉ）（ｃ）および／もしくは（ｄ）、（ｉｉｉ）（ａ）および／もしくは（ｄ）、または（ｉｖ）（ｂ）および／もしくは（ｃ）を決定することを含み、
（ａ）は、ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比またはＣＣＮＤ１のコピー数であり、ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比が約１．５５超／細胞であるか、またはＣＣＮＤ１のコピー数が約２．８１超／細胞である場合、転移が起こる可能性があることを示し、
（ｂ）は、ＭＹＣのコピー数であり、ＭＹＣのコピー数が約２．４８超／細胞である場合、転移が起こる可能性があることを示し、
（ｃ）は、ＣＣＮＤ１／対照セントロメアが増加している細胞の割合、またはＣＣＮＤ１が増加している細胞の割合であり、ＣＣＮＤ１が増加している細胞の割合が約３０％以上であるか、またはＣＣＮＤ１／対照セントロメアが増加している細胞の割合が約５４％以上である場合、転移が起こる可能性があることを示し、
（ｄ）は、ＭＹＣが増加している細胞の割合であり、ＭＹＣが増加している細胞の割合が約２０％超である場合、転移が起こる可能性があることを示す。
【００５２】
ブレスローの深さが約１ｍｍ未満、例えば、１ｍｍ未満の黒色腫を有する患者における悪性黒色腫の転移を予後予測する方法も提供される。前記方法は、前記患者から得られた悪性黒色腫試料におけるＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比およびＭＹＣのコピー数を決定することを含む。ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比が約１．５５超、例えば、１．５５超であり、およびＭＹＣのコピー数が約２．４８超、例えば、２．４８超である場合、転移が起こる可能性があることを示す。
【００５３】
ブレスローの深さが２ｍｍ以下の黒色腫を有する患者における悪性黒色腫の転移を予後予測する方法も提供される。前記方法は、前記患者から得られた悪性黒色腫試料におけるＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比およびＭＹＣのコピー数を決定することを含む。ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比が約１．３８超、例えば、１．３８超であり、およびＭＹＣのコピー数が約２．３６超、例えば、２．３６超である場合、転移が起こる可能性があることを示す。
【００５４】
ブレスローの深さが１ｍｍ以上約４ｍｍ未満、例えば、約４ｍｍ未満の黒色腫を有する患者における悪性黒色腫の転移を予後予測する方法がさらに提供される。前記方法は、前記患者から得られた悪性黒色腫試料におけるＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比を決定することを含む。ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比が約１．５５超、例えば、１．５５超である場合、転移が起こる可能性があることを示す。前記方法は、前記患者から得られた悪性黒色腫試料におけるＭＹＣのコピー数を決定することをさらに含むことができ、ＭＹＣのコピー数が約２．６０超、例えば、２．６０超であることもまた、転移が起こる可能性があることを示す。
【００５５】
ブレスローの深さが約２．０ｍｍ超、例えば、２．０ｍｍ超の黒色腫を有する患者における悪性黒色腫の転移を予後予測する方法もさらに提供される。前記方法は、前記患者から得られた悪性黒色腫試料におけるＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比またはＭＹＣのコピー数を決定することを含む。ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比が約１．５５超、例えば、１．５５超である場合、転移が起こる可能性があることを示す。ＭＹＣのコピー数が約２．２２超、例えば、２．２２超である場合、転移が起こる可能性があることを示す。
【００５６】
さらに、患者における悪性黒色腫を診断する方法もさらに提供される。前記方法は、前記患者から得られた有核細胞を含む診断試料中の幾つかの核におけるＲＲＥＢ１のコピー数、ＭＹＣのコピー数、ＣＣＮＤ１のコピー数およびＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定することを含み、前記ＲＲＥＢ１のコピー数が増加しており、前記ＭＹＣのコピー数が増加しており、前記ＣＣＮＤ１のコピー数が増加しており、および前記ＣＤＫＮ２Ａのコピー数が減少している場合、前記試料が悪性黒色腫を含むことを示す。前記診断試料は、核を含む細胞を含むことができ、幾つかの核において、前記ＲＲＥＢ１のコピー数、前記ＭＹＣのコピー数、前記ＣＣＮＤ１のコピー数および前記ＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定する。前記核数は約３０個であり得、ＲＲＥＢ１、ＭＹＣおよびＣＣＮＤ１のコピー数の増加、ならびにＣＤＫＮ２Ａのホモ接合性欠失が前記核の２７％以上で検出される場合、前記試料は悪性黒色腫を含む。または、前記核数は約３０個であり得、ＲＲＥＢ１、ＭＹＣおよびＣＣＮＤ１のコピー数の増加、ならびにＣＤＫＮ２Ａのホモ接合性欠失が８個以上の核で検出される場合、前記試料は悪性黒色腫を含む。
【００５７】
ブレスローの深さによる特性決定を使用しない、悪性黒色腫の転移を予後予測する方法も提供される。前記方法は、前記患者から得られた有核細胞を含む試料中の幾つかの核におけるＲＲＥＢ１のコピー数、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７のコピー数、ＣＣＮＤ１のコピー数およびＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定することを含み、前記ＲＲＥＢ１のコピー数が増加しており、前記ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７のコピー数が増加しており、前記ＣＣＮＤ１のコピー数が増加しており、および前記ＣＤＫＮ２Ａのコピー数が減少している場合、転移が起こる可能性があることを示す。前記試料は、核を含む細胞を含むことができ、幾つかの核において、前記ＲＲＥＢ１のコピー数、前記ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７のコピー数、前記ＣＣＮＤ１のコピー数および前記ＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定する。前記核数は約３０個であり得、ＲＲＥＢ１、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７、およびＣＣＮＤ１のコピー数の増加、ならびにＣＤＫＮ２Ａのホモ接合性欠失が前記核の２７％以上で検出される場合、転移が起こる可能性がある。または、前記核数は約３０個であり得、ＲＲＥＢ１、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７、およびＣＣＮＤ１のコピー数の増加、ならびにＣＤＫＮ２Ａのホモ接合性欠失が８個以上の核で検出される場合、転移が起こる可能性がある。
【００５８】
さらに、患者における非定型スピッツ腫瘍の転移を予後予測する方法もさらに提供される。前記方法は、前記患者由来の腫瘍試料におけるＲＲＥＢ１、ＣＣＮＤ１および／またはＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定することを含み、ＲＲＥＢ１のコピー数が増加しているか、またはＣＣＮＤ１のコピー数が増加しているか、またはＣＤＫＮ２Ａがホモ接合性欠失である場合、悪性の転移が起こる可能性があることを示し、およびＣＤＫＮ２Ａがホモ接合性欠失である場合、さらにより悪性の転移が起こる可能性があることを示す。
【００５９】
ブレスローの深さによる特性決定を使用する上記予後予測方法は、各プローブを検出可能に標識し、２つ以上のプローブを同じ試料に同時にまたは連続してハイブリダイズさせる場合には、各プローブを異なる標識で検出可能に標識するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比および／またはＭＹＣのコピー数を決定することを含むことができる。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、各プローブを検出可能に標識し、２つ以上のプローブを同じ試料に同時にまたは連続してハイブリダイズさせる場合には、各プローブを異なるフルオロフォアで検出可能に標識する蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）であり得る。ＣＣＮＤ１遺伝子のコピー数は、プローブＶｙｓｉｓ  Ｌｏｃｕｓ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（ＬＳＩ）ＣＣＮＤ１を使用することによって決定することができる。対照セントロメアのコピー数は、染色体のセントロメアに位置するαサテライトＤＮＡにハイブリダイズするプローブを使用することによって決定することができる。このプローブは対照として機能し、これにより必要に応じて、試料間のハイブリダイゼーション効率の差を説明することが可能になる。染色体のセントロメアに位置するαサテライトＤＮＡにハイブリダイズするプローブの例は、染色体計数プローブ（Ｃｅｐ）である。第１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２染色体のセントロメアに位置するαサテライトＤＮＡにハイブリダイズするプローブを使用することができる。好ましい対照セントロメアプローブは、第１１染色体のαサテライトＤＮＡにハイブリダイズするもの、例えば、Ｃｅｐ１１である。ＭＹＣのコピー数は、プローブＶｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＭＹＣを使用することによって決定することができる。
【００６０】
上記診断方法は、各プローブを検出可能に標識し、２つ以上のプローブを同じ試料に同時にまたは連続してハイブリダイズさせる場合には、各プローブを異なる標識で検出可能に標識するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、ＲＲＥＢ１、ＭＹＣ、ＣＣＮＤ１およびＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定することを含むことができる。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、各プローブを検出可能に標識し、２つ以上のプローブを同じ試料に同時にまたは連続してハイブリダイズさせる場合には、各プローブを異なるフルオロフォアで検出可能に標識する蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）であり得る。ＲＲＥＢ１遺伝子のコピー数は、プローブＶｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＲＲＥＢ１を使用することによって決定することができる。ＭＹＣ遺伝子のコピー数は、プローブＶｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＭＹＣを使用することによって決定することができる。ＣＣＮＤ１遺伝子のコピー数は、プローブＶｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＣＣＮＤ１を使用することによって決定することができる。ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子のコピー数は、プローブＶｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＣＤＫＮ２Ａを使用することによって決定することができる。
【００６１】
ブレスローの深さによる特性決定を使用しない上記予後予測方法は、各プローブを検出可能に標識し、２つ以上のプローブを同じ試料に同時にまたは連続してハイブリダイズさせる場合には、各プローブを異なる標識で検出可能に標識するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、ＲＲＥＢ１、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７、ＣＣＮＤ１およびＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定することを含むことができる。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、各プローブを検出可能に標識し、２つ以上のプローブを同じ試料に同時にまたは連続してハイブリダイズさせる場合には、各プローブを異なるフルオロフォアで検出可能に標識する蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）であり得る。ＲＲＥＢ１遺伝子のコピー数は、プローブＶｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＲＲＥＢ１を使用することによって決定することができる。ＭＹＣ遺伝子のコピー数は、プローブＶｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＭＹＣを使用することによって決定することができる。ＺＮＦ２１７遺伝子のコピー数は、プローブＶｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＺＮＦ２１７を使用することによって決定することができる。ＣＣＮＤ１遺伝子のコピー数は、プローブＶｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＣＣＮＤ１を使用することによって決定することができる。ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子のコピー数は、プローブＶｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＣＤＫＮ２Ａを使用することによって決定することができる。
【００６２】
上記方法のすべてに関して、プローブの性質／サイズは、少なくとも部分的には、特定のパラメータ、例えば、関心対象の遺伝子のコピー数、コピー数比、または増加割合を決定するのに使用される方法に依存するであろう。ＦＩＳＨなどのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって上記診断／予後予測方法を行う場合、例えば、プローブは、比較的大きなものであり得る。別の方法によって上記診断／予後予測方法を行う場合、プローブは、ＦＩＳＨなどのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに使用されるプローブよりも小さなもの、さらには実質的に小さなものであり得、この場合、プローブは、好ましくは、関心対象の遺伝子内の配列にハイブリダイズする。
【００６３】
上記を考慮して、ＦＩＳＨなどのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、ＣＣＮＤ１に関連するパラメータ、例えば、ＣＣＮＤ１のコピー数、ＣＣＮＤ１に関連するコピー数比、またはＣＣＮＤ１の増加割合を検出するためのプローブは、好ましくは、ＣＣＮＤ１遺伝子を含む第１１染色体の１１ｑ１３領域にハイブリダイズする。前記プローブはまた、隣接領域、例えば、セントロメア部位上に位置するＳＴＳ（配列タグ付部位）マーカーＤ１１Ｓ１０７６、テロメア部位上に位置するＦＧＦ４遺伝子、またはＤ１１Ｓ１０７６およびＦＧＦ４の両方にハイブリダイズすることができる。別の方法によって、ＣＣＮＤ１に関連するパラメータを検出するためのプローブは、ＦＩＳＨなどのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに使用されるプローブよりも小さなもの、さらには実質的に小さなものであり得、この場合、プローブは、好ましくは、ＣＣＮＤ１遺伝子（配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ）およびＧｅｎｅＣａｒｄｓ（登録商標）（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ）などのソースからオンラインで入手可能である。）内の配列にハイブリダイズする。「ＣＣＮＤ１」は、本明細書では、コピー数、コピー数比、増加割合などにかかわらず、パラメータを決定するのに使用される特定の方法に関係なく、ＣＣＮＤ１に関連するパラメータを決定するのに使用することができる任意のおよびすべてのプローブを指すのに使用される。
【００６４】
同様に、ＦＩＳＨなどのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、ＭＹＣに関連するパラメータ、例えば、ＭＹＣのコピー数、ＭＹＣに関連するコピー数比、またはＭＹＣの増加割合を検出するためのプローブは、好ましくは、ＭＹＣ遺伝子を含む第８染色体の８ｑ２４領域にハイブリダイズする。前記プローブはまた、８ｑ２４のセントロメア部位上に位置する隣接領域、８ｑ２４のテロメア部位上に位置する隣接領域、またはこれらの両方にハイブリダイズすることができる。好ましいプローブは、８ｑ２４の約８２０ｋｂ、例えば、８２１ｋｂにおよび、ＭＹＣ遺伝子の中心部に配置される。別の方法によって、ＭＹＣに関連するパラメータを検出するためのプローブは、ＦＩＳＨなどのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに使用されるプローブよりも小さなもの、さらには実質的に小さなものであり得、この場合、プローブは、好ましくは、ＭＹＣ遺伝子（配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ）およびＧｅｎｅＣａｒｄｓ（登録商標）（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ）などのソースからオンラインで入手可能である。）内の配列にハイブリダイズする。「ＭＹＣ」は、本明細書では、コピー数、コピー数比、増加割合などにかかわらず、パラメータを決定するのに使用される特定の方法に関係なく、ＭＹＣに関連するパラメータを決定するのに使用することができる任意のおよびすべてのプローブを指すのに使用される。
【００６５】
同様に、ＦＩＳＨなどのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、ＣＤＫＮ２Ａに関連するパラメータ、例えば、ＣＤＫＮ２Ａのコピー数、ＣＤＫＮ２Ａに関連するコピー数比、またはＣＤＫＮ２Ａの増加割合を検出するためのプローブは、好ましくは、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子を含む第９染色体の９ｐ２１領域にハイブリダイズする。前記プローブはまた、隣接領域、例えば、９ｐ２１のセントロメア部位上に位置するＳＴＳマーカーＤ９Ｓ１７４９、およびテロメア部位上に位置するＳＴＳマーカーＤ９Ｓ１７５２、またはＤ９Ｓ１７４９およびＤ９Ｓ１７５２の両方にハイブリダイズすることができる。好ましいプローブは、９ｐ２１の約１９０ｋｂに及ぶ。別の方法によって、ＣＤＫＮ２Ａに関連するパラメータを検出するためのプローブは、ＦＩＳＨなどのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに使用されるプローブよりも小さなもの、さらには実質的に小さなものであり得、この場合、プローブは、好ましくは、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子（配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ）およびＧｅｎｅＣａｒｄｓ（登録商標）（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ）などのソースからオンラインで入手可能である。）内の配列にハイブリダイズする。「ＣＤＫＮ２Ａ」は、本明細書では、コピー数、コピー数比、増加割合などにかかわらず、パラメータを決定するのに使用される特定の方法に関係なく、ＣＤＫＮ２Ａに関連するパラメータを決定するのに使用することができる任意のおよびすべてのプローブを指すのに使用される。
【００６６】
同様に、ＦＩＳＨなどのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、ＲＲＥＢ１に関連するパラメータ、例えば、ＲＲＥＢ１のコピー数、ＲＲＥＢ１に関連するコピー数比、またはＲＲＥＢ１の増加割合を検出するためのプローブは、好ましくは、ＲＲＥＢ１遺伝子を含む第６染色体の６ｑ２５領域にハイブリダイズする。前記プローブはまた、隣接領域、例えば、セントロメア部位上に位置するＳＴＳマーカーＳＨＧＣ−１４０２７８、およびテロメア部位上に位置するＳＴＳマーカーＲＨ６１０７０、またはＳＨＧＣ−１４０２７８およびＲＨ６１０７０の両方にハイブリダイズすることができる。別の方法によって、ＲＲＥＢ１に関連するパラメータを検出するためのプローブは、ＦＩＳＨなどのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに使用されるプローブよりも小さなもの、さらには実質的に小さなものであり得、この場合、プローブは、好ましくは、ＲＲＥＢ１遺伝子（配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ）およびＧｅｎｅＣａｒｄｓ（登録商標）（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ）などのソースからオンラインで入手可能である。）内の配列にハイブリダイズする。「ＲＲＥＢ１」は、本明細書では、コピー数、コピー数比、増加割合などにかかわらず、パラメータを決定するのに使用される特定の方法に関係なく、ＲＲＥＢ１に関連するパラメータを決定するのに使用することができる任意のおよびすべてのプローブを指すのに使用される。
【００６７】
同様に、ＦＩＳＨなどのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、ＺＮＦ２１７に関連するパラメータ、例えば、ＺＮＦ２１７のコピー数、ＺＮＦ２１７に関連するコピー数比、またはＺＮＦ２１７の増加割合を検出するためのプローブは、好ましくは、ＺＮＦ２１７遺伝子を含む第２０染色体の２０ｑ１３領域にハイブリダイズする。前記プローブはまた、隣接領域、例えば、セントロメア部位上に位置するＳＴＳマーカーＲＩ−２９７２７、およびテロメア部位上に位置するＳＴＳマーカーＳＨＧＣ−８３１５３、またはＲＩ−２９７２７およびＳＨＧＣ−８３１５３の両方にハイブリダイズすることができる。別の方法によって、ＺＮＦ２１７に関連するパラメータを検出するためのプローブは、ＦＩＳＨなどのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに使用されるプローブよりも小さなもの、さらには実質的に小さなものであり得、この場合、プローブは、好ましくは、ＺＮＦ２１７遺伝子（配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ）およびＧｅｎｅＣａｒｄｓ（登録商標）（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ）などのソースからオンラインで入手可能である。）内の配列にハイブリダイズする。「ＺＮＦ２１７」は、本明細書では、コピー数、コピー数比、増加割合などにかかわらず、パラメータを決定するのに使用される特定の方法に関係なく、ＺＮＦ２１７に関連するパラメータを決定するのに使用することができる任意のおよびすべてのプローブを指すのに使用される。
【００６８】
各プローブを検出可能に（２つ以上のプローブを同じ試料で同時にまたは連続して使用する場合には、さらに区別可能に）標識するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、例えば、各プローブをフルオロフォアで検出可能に（２つ以上のプローブを同じ試料で同時にまたは連続して使用する場合には、さらに区別可能に）標識するＦＩＳＨによって、上記方法を行う場合、典型的には、前記方法を新鮮な（新鮮細胞は１から３日間培養することができ、コルセミドなどのブロッキング剤を培養液に追加して、染色体が高凝縮している時期である中期の細胞を遮断することができ、および可視化することができる。）、凍結されたまたは固定された（例えば、ホルマリンで固定し、パラフィン包埋する。）黒色腫試料で行い、（例えば、ＲＮａｓｅおよびペプシンで）処理して、標的核酸（例えば、ＤＮＡ）の接触性を増加させ、非特異的結合を減少させ、次いで、１つ以上のプローブとハイブリダイズさせ、洗浄して任意の未結合のプローブを除去し、ハイブリダイズしたプローブを検出することができる。例えば、細胞懸濁液を単層としてスライド上にアプライすることができ、光学顕微鏡または位相差顕微鏡によって、細胞密度を測定することができる。ホルマリン固定してパラフィン包埋した黒色腫試料の切片（厚さ約５μｍ）をスライド、例えば、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ正帯電スライド（ＴｈｅｒｍｏＳｈａｎｄｏｎ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡから入手可能）上に載せ、５６℃で一晩ベークし、脱パラフィン処理し、１ｘクエン酸ナトリウム生理食塩水、ｐＨ６．３に８０℃で３５分間浸漬し、水で３分間洗浄することができる。３７℃で１５分間プロテアーゼ消化（４ｍｇペプシン／ｍＬおよび０．２Ｎ  ＨＣｌ）した後、切片を水で３分間洗浄し、勾配エタノールに通して乾燥することができる。好ましくは、上記１つ以上のプローブによるハイブリダイゼーションは、製造業者の説明書に従って、ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｃｏ−ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｖｅｎ（ＨＹＢｒｉｔｅまたはＴｈｅｒｍｏＢｒｉｔｅ  Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ／Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｂｂｏｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ）において、３７℃で１６から１８時間行う（このような方法は、典型的には、プローブおよび標的核酸の変性を含む。）。ハイブリダイゼーション後、好ましくは、切片を洗浄緩衝液（２ｘクエン酸ナトリウム生理食塩水／０．３％ＮＰ４０；Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．から入手可能）に室温で２から１０分間入れてカバースリップを取り除き、次いで、７３℃の洗浄緩衝液に２分間浸漬し、乾燥し、４’６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩水和物（ＤＡＰＩ）Ｉ抗退色溶液（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）でマウントする。好ましくは、単一帯域フィルタを備える落射蛍光顕微鏡（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて、スライドを分析する。
【００６９】
検出に先立ち、見かけの細胞学的異常に基づいて場合により細胞試料を予備選択してもよい。予備選択は疑わしい細胞を識別することによって、スクリーニングをこれらの細胞に絞ることができる。予備選択はスクリーニングを迅速にすることができ、陽性結果を見落とさない確率が増加する。予備選択中には、生体試料からの細胞を顕微鏡スライドに載せ、一般に形成異常細胞および新生細胞に関連する細胞学的異常を目視検査する。このような異常としては、核寸法、核形状、および核染色の異常が挙げられ、通常はプローブとこの標的ＤＮＡのハイブリダイゼーション後にヨウ化プロピジウムや４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）などの核酸染色試薬または色素による核の対比染色によって評価される。典型的には、新生細胞は核が拡大し、不規則形状となり、および／または斑状染色パターンを示す。ヨウ化プロピジウムは、典型的には、約０．４μｇ／ｍｌから約５μｇ／ｍｌの濃度で使用され、６１４ｎｍの発光ピーク波長で観測可能な赤色蛍光ＤＮＡ特異的色素である。ＤＡＰＩは、典型的には、約１２５ｎｇ／ｍｌから約１，０００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用され、低倍率のＤＡＰＩフィルタを用いて４５２ｎｍの発光ピーク波長で観測可能な青色蛍光ＤＮＡ特異的染色試薬である。この場合には、検出に予備選択された細胞のみの染色体減少および／または増加を計数する。染色体減少および／または増加を評価するためには、数字上では約少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも３０から４０個の予備選択細胞を選択することが好ましい。
【００７０】
または、低倍率のＤＡＰＩフィルタを使用して担腫瘍領域を局在化し、任意のプローブの異常コピー数を持つ核の存在について徹底的に検査することができる。正常細胞では、所定のプローブの２コピーが検出されるであろう。異常細胞では、所定のプローブのより多いまたはより少ないコピーが検出されるであろう。計数のためには、好ましくは、最も有意なコピー数変化を有する領域を選択する。可能な限り、３つの異常領域を選択し、各異常領域内で、１０個の核を高倍率（６４ｘまたは１００ｘ対物レンズ）で無作為に分析する。好ましくは、核はオーバーラップしておらず、十分に明るいシグナルを持つ。
【００７１】
または、細胞学的または組織学的特徴とは無関係に検出用細胞を選択してもよい。例えば、顕微鏡スライド上の１つまたは複数の領域内のオーバーラップしない全細胞を染色体減少および／または増加について評価することができる。さらなる例として、顕微鏡スライド上に連続して出現する、数字上では約少なくとも約５０個、より好ましくは少なくとも約１００個のスライド上の細胞、例えば、形態変化を示す細胞を、染色体の減少および／または増加について評価するために選択してもよい。
【００７２】
予後予測方法、例えば、ブレスローの深さによる特性決定を使用する予後予測方法の場合、ＣＣＮＤ１のコピーを単独で、または対照セントロメアのコピーとさらに組み合わせて計数し、ＣＣＮＤ１のコピー数またはＣＣＮＤ１／対照セントロメアの比を決定する。または、もしくは加えて、ＭＹＣのコピーを計数する。次いで、（ｉ）ＣＣＮＤ１のコピー数もしくはＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比、および／または（ｉｉ）ＭＹＣのコピー数を、本明細書に示される適切な所定のカットオフと比較する。ＣＣＮＤ１のコピー数またはＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比が所定のカットオフを超える場合、転移が起こる可能性があることを示す。同様に、ＭＹＣのコピー数が所定のカットオフを超える場合、転移が起こる可能性があることを示す。
【００７３】
または、予後予測方法、例えば、ブレスローの深さによる特性決定を使用する予後予測方法の場合、ＣＣＮＤ１のコピーを単独で、または対照セントロメアのコピーとさらに組み合わせて計数し、ＣＣＮＤ１が増加している細胞の割合、またはＣＣＮＤ１／対照セントロメアが増加している細胞の割合を決定する。または、もしくは加えて、ＭＹＣが増加している細胞の割合を決定する。次いで、ＣＣＮＤ１が増加している細胞の割合、またはＣＣＮＤ１／対照セントロメアが増加している細胞の割合を、本明細書に示される適切な所定のカットオフと比較する。ＣＣＮＤ１／対照セントロメアが増加している細胞の割合、またはＣＣＮＤ１が増加している細胞の割合が所定のカットオフを超える場合、転移が起こる可能性があることを示す。同様に、ＭＹＣが増加している細胞の割合が所定のカットオフを超える場合、転移が起こる可能性があることを示す。
【００７４】
診断方法の場合、ＲＲＥＢ１、ＭＹＣ、ＣＣＮＤ１およびＣＤＫＮ２Ａのコピーを計数する。前記ＲＲＥＢ１のコピー数が増加しており、前記ＭＹＣのコピー数が増加しており、前記ＣＣＮＤ１のコピー数が増加しており、および前記ＣＤＫＮ２Ａのコピー数が減少している場合、前記試料が悪性黒色腫を含むことを示す。前記診断試料は、核を含む細胞を含むことができ、幾つかの核において、前記ＲＲＥＢ１のコピー数、前記ＭＹＣのコピー数、前記ＣＣＮＤ１のコピー数および前記ＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定する。前記核数は約３０個であり得、ＲＲＥＢ１、ＭＹＣおよびＣＣＮＤ１のコピー数の増加、ならびにＣＤＫＮ２Ａのホモ接合性欠失が前記核の２７％以上で検出される場合、前記試料は悪性黒色腫を含む。または、前記核数は約３０個であり得、ＲＲＥＢ１、ＭＹＣおよびＣＣＮＤ１のコピー数の増加、ならびにＣＤＫＮ２Ａのホモ接合性欠失が８個以上の核で検出される場合、前記試料は悪性黒色腫を含む。
【００７５】
他の予後予測方法、例えば、ブレスローの深さによる特性決定を使用しない予後予測方法の場合、ＲＲＥＢ１、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７、ＣＣＮＤ１およびＣＤＫＮ２Ａのコピーを計数する。前記ＲＲＥＢ１のコピー数が増加しており、前記ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７のコピー数が増加しており、前記ＣＣＮＤ１のコピー数が増加しており、および前記ＣＤＫＮ２Ａのコピー数が減少している場合、前記試料が悪性黒色腫を含むことを示す。前記診断試料は、核を含む細胞を含むことができ、幾つかの核において、前記ＲＲＥＢ１のコピー数、前記ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７のコピー数、前記ＣＣＮＤ１のコピー数および前記ＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定する。前記核数は約３０個であり得、ＲＲＥＢ１、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７、およびＣＣＮＤ１のコピー数の増加、ならびにＣＤＫＮ２Ａのホモ接合性欠失が前記核の２７％以上で検出される場合、転移が起こる可能性がある。または、前記核数は約３０個であり得、ＲＲＥＢ１、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７、およびＣＣＮＤ１のコピー数の増加、ならびにＣＤＫＮ２Ａのホモ接合性欠失が８個以上の核で検出される場合、転移が起こる可能性がある。
【００７６】
従って、このような方法は、患者由来の悪性黒色腫試料、例えば、核酸試料を、標的核酸配列（即ち、予後予測方法、例えば、ブレスローの深さによる特性決定を使用する予後予測方法の場合にはＣＣＮＤ１であり、これは単独でもよいし、または対照セントロメアとさらに組み合わせてもよく、および、またはもしくは加えて、同時にまたはいずれかの順序で連続してＭＹＣ；診断方法の場合にはＲＲＥＢ１、ＭＹＣ、ＣＣＮＤ１およびＣＤＫＮ２Ａ；ならびに、他の予後予測方法、例えば、ブレスローの深さによる特性決定を使用しない予後予測方法の場合にはＲＲＥＢ１、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７、ＣＣＮＤ１およびＣＤＫＮ２Ａ）に選択的に結合する少なくとも１つのプローブと、前記プローブがこの標的核酸配列に選択的に結合して安定ハイブリダイゼーション複合体を形成することを可能にする（または、促進する）条件下で接触させることを含む。このような方法は、ハイブリダイゼーション複合体の形成を検出すること、およびハイブリダイゼーション複合体の数を計数することをさらに含む。
【００７７】
ＣＣＮＤ１を含むハイブリダイゼーション複合体の数を単独で、または対照セントロメアを含むハイブリダイゼーション複合体の数とさらに組み合わせて考慮して、前記予後予測方法は、ＣＣＮＤ１のコピー数またはＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比を決定すること、および前記コピー数または前記コピー数比を適切な所定のカットオフと比較することをさらに含み、コピー数またはコピー数比が適切な所定のカットオフを超える場合、転移が起こる可能性があることを示す。ＭＹＣを含むハイブリダイゼーション複合体の数を考慮して、前記予後予測方法は、ＭＹＣのコピー数を決定すること、および前記コピー数を適切な所定のカットオフと比較することをさらに含み、コピー数が所定のカットオフを超える場合、転移が起こる可能性があることを示す。
【００７８】
また、ＣＣＮＤ１を含むハイブリダイゼーション複合体の数を単独で、または対照セントロメアを含むハイブリダイゼーション複合体の数とさらに組み合わせて考慮して、または前記予後予測方法は、ＣＣＮＤ１またはＣＣＮＤ１／対照セントロメアが増加している細胞の割合を決定すること、および前記増加している細胞の割合を適切な所定のカットオフと比較することをさらに含み、増加している細胞の割合が適切な所定のカットオフを超える場合、転移が起こる可能性があることを示す。ＭＹＣを含むハイブリダイゼーション複合体の数を考慮して、前記予後予測方法は、ＭＹＣが増加している細胞の割合を決定すること、および前記増加している細胞の割合を所定のカットオフと比較することをさらに含み、増加している細胞の割合が適切な所定のカットオフを超える場合、転移が起こる可能性があることを示す。
【００７９】
ＲＲＥＢ１、ＭＹＣ、ＣＣＮＤ１およびＣＤＫＮ２Ａを含むハイブリダイゼーション複合体の数を考慮して、前記診断方法は、ＲＲＥＢ１、ＭＹＣ、ＣＣＮＤ１およびＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定することをさらに含み、前記ＲＲＥＢ１、ＭＹＣ、ＣＣＮＤ１のコピー数が増加しており、および前記ＣＤＫＮ２Ａのコピー数が減少している場合、前記試料が悪性黒色腫を含むことを示す。ＲＲＥＢ１、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７、ＣＣＮＤ１およびＣＤＫＮ２Ａを含むハイブリダイゼーション複合体の数を考慮して、ブレスローの深さによる特性決定を使用しない前記予後予測方法は、ＲＲＥＢ１、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７、ＣＣＮＤ１およびＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定することをさらに含み、前記ＲＲＥＢ１、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７、ＣＣＮＤ１のコピー数が増加しており、および前記ＣＤＫＮ２Ａのコピー数が減少している場合、転移が起こる可能性があることを示す。
【００８０】
上記方法が好ましいが、当技術分野において既知のまたは現在開発中の他の方法に従って、遺伝子のコピー数または（例えば、２つの遺伝子の、２つの染色体の、または遺伝子および染色体の）コピー数比を決定することが可能である。このような方法は、ホルマリン固定してパラフィン包埋した悪性黒色腫切片以外の悪性黒色腫試料、例えば、悪性黒色腫の新鮮切片または凍結切片、悪性黒色腫由来の細胞ホモジネート、悪性黒色腫由来の細胞溶解物、または悪性黒色腫から単離もしくは精製された核酸（例えば、ＤＮＡなどの「核酸試料」）の使用を必要としてもよい（本明細書で使用される場合、「悪性黒色腫試料」は、コピー数比の決定を可能にする悪性黒色腫試料のすべての形態を包含することを意図する。）。これに関して、未培養の原発性腫瘍から調製されたタッチ調製物（ｔｏｕｃｈ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）（新鮮組織または凍結組織をスライドに押し付けることによって得られる単層細胞）を使用することができる（例えば、Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．６０：１９０−１９３（１９９２）を参照のこと。）。タッチ調製物は、インタクトな核を含有し、切片化によるトランケーションアーチファクトを受けていない。タッチ調製物中の単層細胞は、例えば、エタノールなどのアルコール、または３：１メタノール：酢酸などのアルコール溶液で固定してもよい。パラフィン包埋検体の厚い切片から核を抽出し、トランケーションアーチファクトを減らし、外部包埋材料をなくすこともできる。典型的には、生体試料が得られたら直ぐに回収および処理してから、当技術分野において公知の標準方法を使用してハイブリダイゼーションする。このような処理は、典型的には、プロテアーゼ処理、およびホルムアルデヒドなどのアルデヒド溶液中でのさらなる固定を含む。
【００８１】
本明細書で使用することができる方法の例としては、限定されないが、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）、リアルタイムＱ−ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＰＣＲ産物の比重走査、コピー数を決定するべき遺伝子および／または染色体領域を場合により前増幅するデジタルＰＣＲ（例えば、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９６：９２３６−９２４１（１９９９）；米国特許出願公開第２００５／０２５２７７３号明細書；および米国特許出願公開第２００９／００６９１９４号明細書を参照のこと。）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ；例えば、Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：８１８−８２１（１９９２）；および国際公開第９３／１８１８６号を参照のこと。）、マイクロサテライトまたはサザンアレロタイプ解析、ドットブロット、アレイ、マイクロアレイ（Ｃａｒｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３９：Ｓ１６−Ｓ２１（Ｊｕｌｙ  ２００７））、多重増幅プローブハイブリダイゼーション（ＭＡＰＨ）、多重ライゲーション依存的プローブ増幅（ＭＬＰＡ；例えば、Ｓｃｈｏｕｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：ｅ  ５７（２００２）を参照のこと。）、変性高速液体クロマトグラフィー（ｄＨＰＬＣ；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６４（３）：２２６−２３４（２００５））、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、コーム状ゲノムＤＮＡ上の蛍光プローブ長の測定（Ｈｅｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９７（１）：２２２−２２７（２０００））、リファレンスクエリパイロシーケンシング（ＲＱＰＳ；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｐｒｏｔｏｃ．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４９１（２０１０））、フォスミド末端から参照配列までのマッピング（キャピラリーベースの技術）、微小電気泳動シーケンシングおよびナノポアシーケンシング（例えば、Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１１：１５４４−１５４６（２００６）；およびＳｈｅｎｄｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．５：３３５−３４４（２００４）を参照のこと。）などが挙げられる。
【００８２】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび類似方法による分析のための核酸標的の変性は、典型的には、細胞形態を保存するような様式で行う。例えば、染色体ＤＮＡは、高ｐＨ、熱（例えば、約７０から９５℃の温度）、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）およびこれらの組み合わせによって変性させることができる。一方、プローブは、数分間の加熱によって変性させることができる。
【００８３】
変性後、ハイブリダイゼーションを行う。プローブをこの核酸標的に特異的にハイブリダイズさせるための条件は、典型的には、特定ハイブリッドを作製するための所与ハイブリダイゼーション法で利用可能な条件の組み合わせを含み、当業者であればこの条件を容易に決定することができる。このような条件は、典型的には、制御下の温度、液相、およびプローブと標的の接触を含む。ハイブリダイゼーション条件は、プローブ濃度、標的長、標的およびプローブＧ−Ｃ含量、溶媒組成、温度、ならびにインキュベーション時間などの多くの要因に応じて変化する。少なくとも１つの変性工程は、プローブを標的と接触させる前に行われ得る。または、プローブおよび標的は、相互接触中に変性条件に供してもよいし、またはプローブを生体試料と接触させた後に変性条件に供してもよい。この後、例えば、２から４×ＳＳＣとホルムアミドの約５０：５０容量比混合物の液相中で、約２５から約５５℃の温度で、例えば、約０．５から約９６時間、またはより好ましくは約３２から約４０℃の温度で、約２から約１６時間、プローブ／試料をインキュベートすることによってハイブリダイゼーションを実施することができる。特異性を増加させるために、米国特許第５，７５６，６９６号明細書（この内容は、この全体が、および具体的にはブロッキング核酸の使用の説明について、参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されている未標識ブロッキング核酸などのブロッキング剤を使用してもよい。当業者には容易に明らかであるように、プローブを試料中に存在するこの核酸標的と特異的にハイブリダイズさせるために、他の条件も容易に利用することができる。ハイブリダイゼーションのプロトコールは、例えば、Ｐｉｎｋｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：９１３８−９１４２（１９８８）；Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３３，Ｃｈｏｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（１９９４）；およびＫａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：５３２１−５３２５（１９９２）に記載されている。
【００８４】
適切なインキュベーション時間の完了後、染色体プローブと試料ＤＮＡの非特異的結合を一連の洗浄によって除去することができる。温度および塩濃度は所望ストリンジェンシーに合わせて適切に選択される。必要なストリンジェンシーレベルは、遺伝子配列に対する特定プローブ配列の複雑さに依存し、公知遺伝子組成の試料とプローブを系統的にハイブリダイズさせることによって決定することができる。一般に、約６５から約８０℃の温度で約０．２×から約２×ＳＳＣおよび約０．１％から約１％の非イオン性界面活性剤、例えば、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ４０）を使用して高ストリンジェンシー洗浄を行うことができる。低ストリンジェンシー洗浄が必要な場合には、より低温で塩濃度を増加して洗浄を行うことができる。
【００８５】
フルオロフォアで標識したプローブまたはプローブ組成物を使用する場合、検出法は、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、またはプローブハイブリダイゼーションを測定するための他の手段を利用することができる。複数フルオロフォアを観察するために、任意の適切な顕微鏡撮像法を、本明細書に記載される方法と併用することができる。蛍光顕微鏡を使用する場合には、各フルオロフォアの励起に適切な光線下で適切な１つまたは複数のフィルタを使用して、ハイブリダイズした試料を観察することができる。ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ、Ｂｉｏ  ＶｉｅｗまたはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓなどの自動デジタルイメージングシステムを使用してもよい。
【００８６】
結果の表示を容易にし、蛍光強度のわずかな差を検出する感度を改善するために、用いる方法に応じてデジタル画像分析システムを使用することができる。例示的なシステムはＱＵＩＰＳ（定量的画像処理システム（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｉｍａｇｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）の頭字語）であり、これは自動化ステージ、焦点制御およびフィルタホイールを備えた標準の蛍光顕微鏡をベースとする自動化画像分析システム（Ｌｕｄｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌｔｄ．，Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ，ＮＹ）である。フィルタホイールは、励起波長の選択のために顕微鏡の蛍光励起通路に取り付けられている。ダイクロイックブロック中の特別なフィルタ（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）が、画像レジストレーションシフトを伴わずに多種色素の励起を可能にする。顕微鏡は２つのカメラポートを有し、この１つが、スライド上の関心領域の発見およびフォーカシングに使用される高感度高速ビデオ画像ディスプレイ用の増感ＣＣＤカメラ（Ｑｕａｎｔｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を有する。他のカメラポートは、高解像度および高感度で実際の画像取得に使用される冷却ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｌｔｄ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ製のモデル２００）を有する。冷却ＣＣＤカメラは、ＶＭＥバスによってＳＵＮ４／３３０ワークステーション（ＳＵＮ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）にインターフェースされる。画像処理ソフトウェアパッケージＳＣＩＬ−Ｉｍａｇｅ（Ｄｅｌｆｔ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｐｒ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｄｅｌｆｔ，オランダ）を使用して、多色画像の完全取得を制御する。
【００８７】
アレイＣＧＨ（ａＣＧＨ）では、プローブを基板上の異なる位置に固定化し、標識しない（例えば、国際公開第９６／１７９５８号を参照のこと。）。この代わりに、標的核酸を含む試料核酸を標識する。ハイブリダイゼーション前に試料核酸を標識するか、またはハイブリダイゼーション複合体を検出可能に標識する。二色または多色ａＣＧＨでは、プローブアレイを、異なる方法で標識した標的核酸の２つ以上の集合物に同時にまたは連続してハイブリダイズさせる。
【００８８】
プローブ
上記を考慮して、悪性黒色腫の転移の予後予測を可能にする１つ以上のプローブのセットが提供される。前記セットは、（ａ）ＣＣＮＤ１に対するプローブ単独、もしくはこれを、対照セントロメアに対するプローブとさらに組み合わせたもの、および／または（ｂ）ＭＹＣに対するプローブを含むか、またはこれらからなる。前記ＣＣＮＤ１に対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＣＣＮＤ１であり得る。前記対照セントロメアに対するプローブは、染色体のセントロメアに位置するαサテライトＤＮＡにハイブリダイズする。対照セントロメアに対するプローブの例は、染色体計数プローブ（Ｃｅｐ）である。このプローブは対照として機能し、これにより必要に応じて、試料間のハイブリダイゼーション効率の差を説明することが可能になる。第１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２染色体のセントロメアに位置するαサテライトＤＮＡにハイブリダイズするプローブを使用することができる。好ましい対照セントロメアプローブは、第１１染色体のαサテライトＤＮＡにハイブリダイズするもの、例えば、Ｃｅｐ１１である。ＭＹＣに対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＭＹＣであり得る。
【００８９】
さらに上記を考慮して、悪性黒色腫の診断および予後予測を可能にするプローブのセットが提供される。前記セットは、ＲＲＥＢ１に対するプローブ、ＭＹＣに対するプローブ、ＣＣＮＤ１に対するプローブおよびＣＤＫＮ２Ａに対するプローブを含むか、またはこれらからなる。前記ＲＲＥＢ１に対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＲＲＥＢ１であり得る。前記ＭＹＣに対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＭＹＣであり得る。前記ＣＣＮＤ１に対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＣＣＮＤ１であり得る。前記ＣＤＫＮ２Ａに対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＣＤＫＮ２Ａであり得る。
【００９０】
またさらに上記を考慮して、悪性黒色腫の転移の予後予測を可能にするプローブのセットが提供される。前記セットは、ＲＲＥＢ１に対するプローブ、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７に対するプローブ、ＣＣＮＤ１に対するプローブおよびＣＤＫＮ２Ａに対するプローブを含むか、またはこれらからなる。前記ＲＲＥＢ１に対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＲＲＥＢ１であり得る。前記ＭＹＣに対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＭＹＣであり得る。前記ＺＮＦ２１７に対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＺＮＦ２１７であり得る。前記ＣＣＮＤ１に対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＣＣＮＤ１であり得る。前記ＣＤＫＮ２Ａに対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＣＤＫＮ２Ａであり得る。
【００９１】
さらにまた上記を考慮して、非定型スピッツ腫瘍の転移の予後予測を可能にするプローブのセットが提供される。前記セットは、ＲＲＥＢ１に対するプローブ、ＣＣＮＤ１に対するプローブおよびＣＤＫＮ２Ａに対するプローブを含むか、またはこれらからなる。前記ＲＲＥＢ１に対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＲＲＥＢ１であり得る。前記ＣＣＮＤ１に対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＣＣＮＤ１であり得る。前記ＣＤＫＮ２Ａに対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＣＤＫＮ２Ａであり得る。
【００９２】
染色体計数プローブ（ＣＥＰ）および、染色体領域またはサブ領域を標的とする遺伝子座特異的プローブは商業的に入手することもできるし、または当業者であれば容易に調製することもできる。このようなプローブは、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．（Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、またはＣｙｔｏｃｅｌｌ（Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から商業的に入手することができる。染色体プローブは、例えば、タンパク質核酸（ＰＮＡ）、クローニングしたヒトＤＮＡ、例えば、ヒトＤＮＡ配列インサートを含有するプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）およびＰ１人工染色体（ＰＡＣ））から調製することができる。関心対象の領域は、ＰＣＲ増幅またはクローニングによって得ることができる。または、染色体プローブは、当技術分野において公知の方法に従って合成的に調製することができる。
【００９３】
特定の遺伝子座を標的とすることを所望する場合、標的遺伝子の全長に沿ってハイブリダイズするプローブが好ましいものであり得るが、必須ではない。遺伝子座特異的プローブは、この遺伝子異常が転移と相関する癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子、例えば、ＣＣＮＤ１またはＭＹＣにハイブリダイズするように設計することができる。
【００９４】
好ましくは、プローブを検出可能に標識し、２つ以上のプローブを同じ試料で同時にまたは連続して使用する場合には、各プローブを区別可能に標識する。好ましくは、プローブをフルオロフォアで検出可能に標識し、２つ以上のプローブを同じ試料で同時にまたは連続して使用する場合には、各プローブを区別可能に標識する。好ましいフルオロフォアの例としては、限定されないが、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、リサミンローダミンＢ、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸、テトラメチルローダミン−５−イソチオシアネート、テトラメチルローダミン−６−イソチオシアネート、５−カルボキシルテトラメチルローダミン、６−カルボキシテトラメチルローダミン、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸、Ｎ−４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル（ｄｉｍｅｔｈｙ）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−３−インダセンプロピオン酸、エオシン−５−イソチオシアネート、エリトロシン−５−イソチオシアネート、ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｏｌｄ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）およびＣＡＳＣＡＤＥ  ｂｌｕｅアセチルアジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。使用する特定の標識は、重要ではない；しかしながら、望ましくは、特定の標識は、プローブのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを妨げない。アッセイの感度を最大化し、任意のバックグラウンドシグナルを超えて検出可能であるために、標識は、望ましくは、可能な限り少ないコピー数で検出可能である。また、望ましくは、標識は、高度に局在化したシグナルを提供し、これにより、高度の空間分解能を提供する。
【００９５】
フルオロフォアと核酸プローブの結合は当技術分野において周知であり、任意の利用可能な手段によって達成することができる。フルオロフォアを例えば特定ヌクレオチドと共有結合させ、ニック翻訳、ランダムプライミング（Ｒｉｇｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１３：２３７（１９９７））、ＰＣＲ標識、シトシン残基などの特定の残基の化学的修飾による直接的な標識（米国特許第５，４９１，２２４号明細書）などの標準技術を使用して標識ヌクレオチドをプローブに組み込むことができる。または、トランスアミノ化したプローブのデオキシシチジンヌクレオチドにリンカーを介してフルオロフォアを共有結合させることができる。プローブの標識方法は、米国特許第５，４９１，２２４号明細書およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，「Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ」，ｐｐ．２１−４０，Ｆａｎ，Ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００２）に記載されており、これらは両方とも、プローブの標識に関するこれらの説明について、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９６】
当業者であれば、標識含有部分としてフルオロフォアの代わりに他の薬剤または色素を使用することができることを認識するであろう。発光剤としては、例えば、放射性発光、化学発光、生物発光およびリン発光標識含有部分が挙げられる。または、間接手段によって可視化される検出部分を使用することができる。例えば、当技術分野において公知の日常的方法を使用してプローブをビオチンまたはジゴキシゲニンで標識し、次いで、検出のためにさらに処理することができる。続いて、検出可能なマーカーとコンジュゲートしたアビジンの結合によって、ビオチン含有プローブの可視化を達成することができる。検出可能なマーカーはフルオロフォアであり得、この場合、プローブの可視化および判別は、下記のように達成することができる。
【００９７】
または、不溶性呈色物の生成に適切な基質と標識部分の酵素反応によって、標的領域にハイブリダイズした染色体プローブを可視化することができる。異なる標識部分を選択することによって、各プローブとセット内の他のプローブを判別することができる。続いて、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）または西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたアビジンおよび適切な基質と共にインキュベーションすることによって、セット内のビオチン含有プローブを検出することができる。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートおよびニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）はアルカリホスファターゼの基質として機能し、ジアミノベンゾエートはＨＲＰの基質として機能する。
【００９８】
キット
また、上記を考慮して、（ａ）患者における悪性黒色腫の転移の予後予測を可能にする１つ以上のプローブのセットと、（ｂ）前記患者における悪性黒色腫の転移を予後予測するための説明書とを含むか、またはこれらからなるキットが提供される。前記１つ以上のプローブのセットは、（ｉ’）ＣＣＮＤ１に対するプローブ単独、もしくはこれを、対照セントロメアに対するプローブとさらに組み合わせたもの、および／または（ｉｉ’）ＭＹＣに対するプローブを含む。前記説明書は、（ｉ’）前記患者から得られた悪性黒色腫試料における（ｉ）（ａ）および／もしくは（ｂ）、（ｉｉ）（ｃ）および／もしくは（ｄ）、（ｉｉｉ）（ａ）および／もしくは（ｄ）、または（ｉｖ）（ｂ）および／もしくは（ｃ）を決定することを含み、
（ａ）は、ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比またはＣＣＮＤ１のコピー数であり、ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比が約１．５５超／細胞であるか、またはＣＣＮＤ１のコピー数が約２．８１超／細胞である場合、転移が起こる可能性があることを示し、
（ｂ）は、ＭＹＣのコピー数であり、ＭＹＣのコピー数が約２．４８超／細胞である場合、転移が起こる可能性があることを示し、
（ｃ）は、ＣＣＮＤ１／対照セントロメアが増加している細胞の割合、またはＣＣＮＤ１が増加している細胞の割合であり、ＣＣＮＤ１が増加している細胞の割合が約３０％以上であるか、またはＣＣＮＤ１／対照セントロメアが増加している細胞の割合が約５４％以上である場合、転移が起こる可能性があることを示し、
（ｄ）は、ＭＹＣが増加している細胞の割合であり、ＭＹＣが増加している細胞の割合が約２０％超である場合、転移が起こる可能性があることを示す。ＣＣＮＤ１に対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＣＣＮＤ１であり得る。セントロメア対照に対するプローブは、染色体のセントロメアに位置するαサテライトＤＮＡにハイブリダイズする。セントロメア対照プローブの例は、染色体計数プローブ（Ｃｅｐ）である。このプローブは対照として機能し、これにより必要に応じて、試料間のハイブリダイゼーション効率の差を説明することが可能になる。第１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、ｌ３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２染色体のセントロメアに位置するαサテライトＤＮＡにハイブリダイズするプローブを使用することができる。好ましい対照セントロメアプローブは、第１１染色体のαサテライトＤＮＡにハイブリダイズするもの、例えば、Ｃｅｐ１１である。ＭＹＣに対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＭＹＣであり得る。前記キットは、ブロッキング剤またはプローブ、プローブの検出を容易にするための種々の標識または標識剤、ハイブリダイゼーション用試薬（例えば、緩衝液）、中期スプレッドなどをさらに含み得るか、またはこれらからなり得る。
【００９９】
（ａ）患者における悪性黒色腫の診断および予後予測を可能にする１つ以上のプローブのセットと、（ｂ）患者における悪性黒色腫を診断するための説明書、および／または患者における悪性黒色腫の転移を予後予測するための説明書とを含むか、またはこれらからなるキットも提供される。前記プローブのセットは、ＲＲＥＢ１に対するプローブ、ＭＹＣに対するプローブ、ＣＣＮＤ１に対するプローブおよびＣＤＫＮ２Ａに対するプローブを含み、（ｂ）前記患者における悪性黒色腫を診断するための説明書は、前記患者から得られた診断試料におけるＲＲＥＢ１のコピー数、ＭＹＣのコピー数、ＣＣＮＤ１のコピー数およびＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定することを含み、前記ＲＲＥＢ１のコピー数が増加しており、前記ＭＹＣのコピー数が増加しており、前記ＣＣＮＤ１のコピー数が増加しており、および前記ＣＤＫＮ２Ａのコピー数が減少している場合、前記患者が悪性黒色腫を有することを示し、および／または前記患者における悪性黒色腫の転移を予後予測するための説明書は、前記患者から得られた悪性黒色腫試料におけるＲＲＥＢ１のコピー数、ＭＹＣのコピー数、ＣＣＮＤ１のコピー数およびＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定することを含み、前記ＲＲＥＢ１のコピー数が増加しており、前記ＭＹＣのコピー数が増加しており、前記ＣＣＮＤ１のコピー数が増加しており、および前記ＣＤＫＮ２Ａのコピー数が減少している場合、転移が起こる可能性があることを示す。前記ＲＲＥＢ１に対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＲＲＥＢ１であり得る。前記ＭＹＣに対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＭＹＣであり得る。前記ＣＣＮＤ１に対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＣＣＮＤ１であり得る。前記ＣＤＫＮ２Ａに対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＣＤＫＮ２Ａであり得る。前記キットは、ブロッキング剤またはプローブ、プローブの検出を容易にするための種々の標識または標識剤、ハイブリダイゼーション用試薬（例えば、緩衝液）、中期スプレッドなどをさらに含み得るか、またはこれらからなり得る。
【０１００】
（ａ）患者における悪性黒色腫の転移の予後予測を可能にするプローブのセットであって、ＲＲＥＢ１に対するプローブ、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７に対するプローブ、ＣＣＮＤ１に対するプローブおよびＣＤＫＮ２Ａに対するプローブを含むプローブのセットと、（ｂ）前記患者における悪性黒色腫を予後予測するための説明書であって、前記患者から得られた試料におけるＲＲＥＢ１のコピー数、ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７のコピー数、ＣＣＮＤ１のコピー数およびＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定することを含み、前記ＲＲＥＢ１のコピー数が増加しており、前記ＭＹＣまたはＺＮＦ２１７のコピー数が増加しており、前記ＣＣＮＤ１のコピー数が増加しており、および前記ＣＤＫＮ２Ａのコピー数が減少している場合、転移が起こる可能性があることを示す説明書とを含むか、またはこれらからなるキットがさらに提供される。前記ＲＲＥＢ１に対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＲＲＥＢ１であり得る。前記ＭＹＣに対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＭＹＣであり得る。前記ＣＣＮＤ１に対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＣＣＮＤ１であり得る。前記ＣＤＫＮ２Ａに対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＣＤＫＮ２Ａであり得る。前記ＺＮＦ２１７に対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＺＮＦ２１７であり得る。前記キットは、ブロッキング剤またはプローブ、プローブの検出を容易にするための種々の標識または標識剤、ハイブリダイゼーション用試薬（例えば、緩衝液）、中期スプレッドなどをさらに含み得るか、またはこれらからなり得る。
【０１０１】
（ａ）患者における非定型スピッツ腫瘍の転移の予後予測を可能にするプローブのセットであって、ＲＲＥＢ１に対するプローブ、ＣＣＮＤ１に対するプローブおよびＣＤＫＮ２Ａに対するプローブを含むプローブのセットと、（ｂ）前記患者における非定型スピッツ腫瘍の転移を予後予測するための説明書であって、前記患者由来の腫瘍試料におけるＲＲＥＢ１、ＣＣＮＤ１および／またはＣＤＫＮ２Ａのコピー数を決定することを含み、ＲＲＥＢ１のコピー数が増加しているか、またはＣＣＮＤ１のコピー数が増加しているか、またはＣＤＫＮ２Ａがホモ接合性欠失である場合、悪性の転移が起こる可能性があることを示し、およびＣＤＫＮ２Ａがホモ接合性欠失である場合、さらにより悪性の転移が起こる可能性があることを示す説明書とを含むか、またはこれらからなるキットもさらに提供される。前記ＲＲＥＢ１に対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＲＲＥＢ１であり得る。前記ＣＣＮＤ１に対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＣＣＮＤ１であり得る。前記ＣＤＫＮ２Ａに対するプローブは、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＣＤＫＮ２Ａであり得る。前記キットは、ブロッキング剤またはプローブ、プローブの検出を容易にするための種々の標識または標識剤、ハイブリダイゼーション用試薬（例えば、緩衝液）、中期スプレッドなどをさらに含み得るか、またはこれらからなり得る。
【実施例】
【０１０２】
以下の実施例は、本開示を例証するのに役立つ。実施例は、何ら特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１０３】
［実施例１］
本実施例では、悪性黒色腫を有する患者における転移の予後予測において、ＣＣＮＤ１単独、またはこれを対照セントロメアとさらに組み合わせたもの、およびＭＹＣを評価することを説明する。
【０１０４】
Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｒｃｈｉｖｅｓにおいて、黒色腫および確認された転移を有する患者（ｎ＝５５）を特定した。患者には、リンパ節に限定された転移（ｎ＝１５）、ｉｎ−ｔｒａｎｓｉｔ疾患（ｎ＝８）および遠隔転移（ｎ＝３２）を有する者が含まれていた。患者５５人のうちの２７人（２７）は、疾患の結果死亡した。ブレスローの深さが１ｍｍ以下の患者数は４人であり、ブレスローの深さが１ｍｍ超４ｍｍ以下の患者数は３７人であり、ブレスローの深さが４ｍｍ超の患者数は１４人であった。最低５年間の経過観察後に転移を有しない患者４２人が有していたブレスローの深さは、転移を有する患者のものとほぼマッチしていた。ブレスローの深さが１ｍｍ以下の患者数は１２人であり、ブレスローの深さが１ｍｍ超４ｍｍ以下の患者数は２４人であり、ブレスローの深さが４ｍｍ超の患者数は６人であった。スライド、組織塊および臨床経過がすべて利用可能であった症例のみが研究に含まれていた。全症例の病理組織は、皮膚病理学者が検証した。臨床経過に沿って、ブレスローの深さ、年齢、性別、部位、潰瘍形成の有無、有糸分裂数およびクラークレベルを記録した。
【０１０５】
研究の開始時点において、黒色腫データベースの分析により、６ｐ２５、Ｃｅｎ６（セントロメア６）、６ｑ２３および１１ｑ１３を標的とする黒色腫用臨床診断プローブセットを用いたＦＩＳＨによって研究された黒色腫１８２例が明らかになった。黒色腫３１例は、標的領域におけるコピー数異常の証拠を示さなかった（コホート１）。明らかな良性母斑３５例を対照として選択した。次いで、８個のさらなる遺伝子座、即ち、９ｐ２１（ＣＤＫＮ２Ａ）、Ｃｅｎ９（セントロメア９）、８ｑ２４（ＭＹＣ）、７ｑ３４（ＢＲＡＦ）、Ｃｅｎ１７（セントロメア１７）、Ｃｅｎ１０（セントロメア１０）、２０ｑ１３（ＺＮＦ２１７）および１ｑ２５（Ｃｏｘ２）に対するプローブを用いて、黒色腫３１例および母斑対照３５例を評価した。これら８個の遺伝子座は、６ｐ２５、６ｑ２３、Ｃｅｎ６および１１ｑ１３と共に、黒色腫における最も頻繁な異常遺伝子座についてのＣＧＨデータの組み合わせ分析によって最初に同定された上位１２個に入る遺伝子座であった（Ｇｅｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）、前掲）。これらのプローブを２つのパネルに配置した。第１のパネルは、９ｐ２１、Ｃｅｎ９、１ｑ２５およびＣｅｎ１７を含んでいた。第２のパネルは、８ｑ２４、７ｑ３４、Ｃｅｎ１０および２０ｑ１３を含んでいた。ハイブリダイゼーションはすべて、以前に記載されているように（Ｇｅｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）、前掲）、ホルマリン固定パラフィン包埋切片で実施した。症例診断を把握していないレビュアーが、下記プロトコールを使用して症例を計数した。最も相補的および付加的なさらなる標的を同定するために、黒色腫群における最も頻繁な異常遺伝子座を母斑対照群と比べて調査する判別分析を実施した。
【０１０６】
転移を有する５５例および転移を有しない４２例を含む黒色腫９７例（コホート２）を、２つのプローブパネルを用いてＦＩＳＨによって分析した。第１のパネルは、６ｐ２５（ＲＲＥＢ１）、６ｑ２３（ＭＹＢ）、ｃｅｎ６および１１ｑ１３（ＣＣＮＤ１）を標的とする黒色腫用インデックスプローブセットを含んでいた。第２のパネルは、コホート１の判別分析で同定した４個の標的、即ち、９ｐ２１（ＣＤＫＮ２Ａ）、ｃｅｎ９、８ｑ２４（ＭＹＣ）および２０ｑ１３（ＺＮＦ２１７）を含んでいた。症例の状態が転移性または非転移性であると把握していないレビュアーが、全検体を計数した。第１のパネルでは９７症例のうちの９７症例、および第２のパネルでは９７症例のうちの９１症例において、ハイブリダイゼーションの質が高い計数に十分な組織を得た。
【０１０７】
ハイブリダイゼーションの手順は、以前に記載されているように実施した（Ｇｅｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）、前掲）。単一帯域フィルタを備える落射蛍光顕微鏡（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ）を用いて、スライドを分析した。分析は、熟練の技術者および皮膚病理学者が実施した。すべての分析は、検体の診断を伏せて実施した。低倍率のＤＡＰＩフィルタを使用して、担腫瘍領域を局在化した。次いで、任意のプローブの異常コピー数を持つ核の存在について、腫瘍領域を徹底的に検査した。計数のために、最も有意なコピー数変化を有する領域を選択した。可能な限り、３つの異常領域を選択し、各領域内で、１０個の核を高倍率（６０ｘ対物レンズ）で無作為に分析した。核はオーバーラップしておらず、十分に明るいシグナルを持たなければならなかった。２個以上のプローブについてのシグナルを示さなかった核は分析しなかった。各検体において、３０個の細胞を計数した。
【０１０８】
各検体の各プローブについて、以下のパラメータを計算した：核１個あたりの平均シグナル数、２シグナル超のシグナル数（％増加）、２シグナル未満のシグナル数（％減少）または２シグナルとは異なるシグナル数（％異常）を有する核の割合。あるプローブのシグナルが別のものと比較して多かったかまたは少なかった核の割合（それぞれ％相対増加および％相対減少）、および２個のプローブの比（あるプローブの全シグナルの合計を別のプローブの全シグナルの合計で割ったもの）も計算した。転移症例および非転移症例について、幅広い数のパラメータを別々に計算し、スチューデントｔ検定によって比較した。転移症例対非転移症例を判別した最良の組み合わせをもたらした個々のカットオフおよびパラメータの組み合わせを、「理想からの距離」（ＤＦＩ）パラメータ（ＤＦＩ＝［（１−感度）２＋（１−特異性）２］−１／２）およびＡＵＣ、即ち、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積を計算することによって決定した（図１ａから図１ｄを参照のこと。）。各パラメータについて閾値を独立に変化させて、点領域をグラフ上に作成し、各特異性値において最高感度値を有する点を使用して、曲線を定義した。転移症例対非転移症例を区別するための最適な基準を特定し、次いで、この基準を満たす症例対この基準を満たさない症例のカプランマイヤー曲線、および群全体のカプランマイヤー曲線をプロットした。
【０１０９】
また、ブレスローの深さ、および他の統計的に有意なＦＩＳＨパラメータと組み合わせた深さに従って、ＲＯＣ曲線を計算した。次いで、ブレスローの深さおよびＦＩＳＨを組み合わせた最適な判別基準のカプランマイヤー曲線をプロットした。ブレスローの深さが１ｍｍ以下の症例、ブレスローの深さが１ｍｍ超４ｍｍ以下の症例、およびブレスローの深さが４ｍｍ超の症例を含むブレスローサブグループ内で、この分析を繰り返した。２ｍｍ以下の全症例および２ｍｍ超の全症例についての個別分析も実施した。ログランク検定を使用して、カプランマイヤー曲線の差のｐ値を計算した。
【０１１０】
ブレスローの深さ、年齢、性別、部位、有糸分裂数、潰瘍形成の有無およびクラークレベルを含む最新のＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）基準すべて、ならびに連続型変数としてＣＣＮＤ１／Ｃｅｐ６およびＭＹＣ値の最適な単一パラメータＦＩＳＨ基準を使用したロジスティック回帰分析を実施した。
【０１１１】
コホート１のデータセットでは、遺伝子座９ｐ２１、８ｑ２４および２０ｑ１３を最も頻繁に変化する遺伝子座として、およびそれ故に最も相補的な標的として同定した。コホート２のデータセットでは、約１．５５超の平均ＣＣＮＤ１／第６染色体、および約２．４８超の平均ＭＹＣコピー数を、転移に最も高度に関連する２つのパラメータであると同定した（図１ａを参照のこと。）。ＣＣＮＤ１／第６染色体の基準は、転移に対して９５％の特異性および３８％の感度であった。陽性予測値（ＰＰＶ）は９１％であり、陰性予測値（ＮＰＶ）は５４％であった。この基準を満たす症例対この基準を満たさなかった症例、および群全体について、カプランマイヤー曲線をプロットした（図１ｂを参照のこと。）。ログランク検定を使用すると、転移群と非転移群との間の差は、６．４８×１０−６のｐ値になった。ＭＹＣの基準は、転移に対して９０％の特異性および３２％の感度であり、ＰＰＶは８０％であり、ＮＰＶは５３％であった。カプランマイヤー曲線により、ＭＹＣ基準を満たす症例と、ＭＹＣ基準を満たさなかった症例と、群全体との間の差も実証された（図１ｃを参照のこと。）。ログランク検定によると、転移群と非転移群との間の差は、５．６１×１０−３のｐ値になり、これもまた有意に達した。従って、２つの基準のいずれかを満たす場合、患者は、転移群に属する可能性が高かった。
【０１１２】
特定のＣＣＮＤ１／第６染色体の値またはＭＹＣ平均コピー数の値を満たせばよい組み合わせ基準も、転移に高度に関連していた。ＣＣＮＤ１／第６染色体の値が１．５９超であるか、またはＭＹＣ平均コピー数が２．４８超の症例対これらの基準のいずれも満たさない症例のカプランマイヤー曲線の差のｐ値は、８．９×１０−７であった（図１ｄを参照のこと。）。
【０１１３】
ブレスローの深さが１ｍｍ以下の患者計１６人が、この研究に含まれていた；これらの患者のうちの４人は、転移を有していた。ＭＹＣコピーおよび／またはＣＣＮＤ１／第６染色体の増加も、この群の転移患者に特徴的であった。ＣＣＮＤ１／第６染色体の値について、患者１６人全員を分析し、ＭＹＣ平均コピー数について、患者１６人のうちの１５人を分析した。ブレスローの深さが１ｍｍ以下の患者では、１．５５のＣＣＮＤ１／第６染色体カットオフ値は、転移に対して１００％の特異性であり、この基準を満たす患者２人のうちの２人が転移を有していた。ＣＣＮＤ１／第６染色体のカットオフ基準は５０％の感度であり、この群の転移患者４人のうちの２人を特定した。ブレスローの深さが１ｍｍ以下の患者では、２．４８のＭＹＣカットオフ値も、転移に対して１００％の特異性であり、この基準を満たす患者２人のうちの２人が転移を有していた。ＭＹＣのカットオフ基準は６７％の感度であり、この群の転移患者３人のうちの２人を特定した。ＣＣＮＤ１／第６染色体の値が１．５５超であるか、またはＭＹＣ平均コピー数が２．４８超の患者の組み合わせ基準を使用すると、ブレスローの深さが１ｍｍ以下の患者に対して１００％の感度および１００％の特異性であった。これらの数は、より詳細な統計分析には少なすぎるが、これらの予備的結果は、これらのマーカーが、薄い黒色腫を有する患者の中から高リスク患者を特定することができることを示唆している。
【０１１４】
ブレスローの深さが２ｍｍ以下の患者計５７人が、この研究に含まれていた。ＣＣＮＤ１／第６染色体の値のデータは、患者５７人全員について利用可能であったが、平均ＭＹＣの値のデータは、患者５７人のうちの５３人について利用可能であった。患者５７人のうち、２６人で転移事象が起こった。ブレスローの深さが２ｍｍ以下の患者では、約１．５５超のＣＣＮＤ１／第６染色体の値は、転移に対して９４％の特異性および４２％の感度であった。図２ａは、ブレスローの深さが２ｍｍ以下の患者全員、ＣＣＮＤ１／第６染色体が１．５５超のもの、およびＣＣＮＤ１／第６染色体が１．５５未満のもののカプランマイヤー曲線を示す。１．５５超および１．５５未満の患者の曲線を比較する際のｐ値は、４．８×１０−５で非常に有意であった。ブレスローの深さが２ｍｍ以下の患者では、２．４８超の平均細胞数のＭＹＣ基準は、転移と最も強い関連性を示した。１．５５のカットオフ値は、８７％の特異性および３９％の感度であった。図２ｂは、ブレスローの深さが２ｍｍ以下の患者全員、ならびにＭＹＣ基準を満たすもの、およびＭＹＣ基準を満たさないもののカプランマイヤー曲線を示す。この基準を満たす患者およびこの基準を満たさない患者の曲線の差は、８．２４×１０−３のｐ値で非常に統計的に有意であった。２．３６の平均ＭＹＣコピー数および１．３８のＣＣＮＤ１／第６染色体を要求するカットオフは、９３％の特異性および４８％の感度をもたらした。この基準を満たす症例対この基準を満たさない症例のカプランマイヤー曲線の差は、４．１６×１０−５であった。
【０１１５】
ブレスローの深さが１ｍｍ以上４ｍｍ未満の患者では、１．５５超のＣＣＮＤ１／第６染色体のカットオフが、最大判別値を保持した。このブレスローカテゴリでは、ＣＣＮＤ１／第６染色体の値は患者６１人で利用可能であり、このブレスローカテゴリでは、ＭＹＣ平均コピー数は患者５８人で利用可能であった。このブレスロー群では、ＣＣＮＤ１／第６染色体の値は、転移に対して９２％の特異性および４３％の感度であった。この基準を満たす患者対この基準を満たさない患者のカプランマイヤー曲線の差のｐ値は、ログランク検定によれば５．５７×１０−４であった（図３ａを参照のこと。）。２．６０超のＭＹＣ平均コピー数のカットオフは、９１％の特異性および１７％の感度であった。この値を超える症例は転移傾向が高かったが、この基準を満たす患者とこの基準を満たさない患者との間のカプランマイヤー曲線の差のｐ値は、感度が低いため統計的な有意に達しなかった（図３ｂを参照のこと。）。
【０１１６】
ブレスローの深さが２．０ｍｍ超の患者では、ＣＣＮＤ１／第６染色体およびＭＹＣのパラメータは、最も高リスクな症例と強い関連性を示し続けた。ＣＣＮＤ１／第６染色体のカットオフ値が１．５５超の１０症例のうちの１０症例が転移を有していたが（１００％の特異性）、ブレスローの深さが２．０ｍｍ超でありＣＣＮＤ１／第６染色体の値が１．５５未満の患者は３０人のうちの１９人のみが転移を有していた。図４ａでは、カプランマイヤー曲線は、ＣＣＮＤ１／第６染色体の値が１．５５超でありブレスローの深さが２．０ｍｍ以上の症例対ＣＣＮＤ１／第６染色体が１．５５未満でありブレスローの深さが２．０超の症例、ＣＣＮＤ１／第６染色体が１．５５超でありブレスローの深さが２．０以下の症例、およびＣＣＮＤ１／第６染色体の値が１．５５未満でありブレスローの深さが２．０未満の症例の曲線の差を示す。ＣＣＮＤ１／第６染色体の値が２．０以上でありＣＣＮＤ１／第６染色体が１．５５超の患者では、転移の可能性が、ＣＣＮＤ１／第６染色体が１．５５以下の患者よりも有意に高かった。ログランク検定によれば、これらの症例のカプランマイヤー曲線の差のｐ値は．００１未満であり、非常に統計的に有意であった。平均ＭＹＣ値が２．２２超でありブレスローの深さが２．０超の患者２１人のうちの１９人（９０％）が、転移を発症した。平均ＭＹＣ値が２．２２以下でありブレスローの深さが２．０超の患者９人のうちの６人（６６％）が、転移を発症した。これらの２群のカプランマイヤー曲線の差は、ログランクおよびウィルコクスン検定によれば．０００１未満のｐ値で統計的に有意であった（図４ｂを参照のこと。）。
【０１１７】
独立した予後パラメータとして、平均ＭＹＣ値、ＣＣＮＤ１／第６染色体の値、潰瘍形成の有無、クラークレベル、ブレスローの深さ、性別、年齢、部位、有糸分裂数、特定した平均ＭＹＣ値、およびＣＣＮＤ１／第６染色体の値を含むロジスティック回帰分析（図５ａを参照のこと。）を実施した。多変量分析により、ＣＣＮＤ１／第６染色体が、すべての変数の中で最高の予後予測力を有し、ＭＹＣ平均値が２番目に高い予後予測力を有することが示された。
【０１１８】
従って、２個の癌遺伝子ＣＣＮＤ１およびＭＹＣのコピー数増加は、転移に高度に関連することが分かった。約１．５５超のＣＣＮＤ１／第６染色体の平均値をもたらすＣＣＮＤ１のコピー数増加は、転移を有する症例と転移を有しない症例とを判別した。Ｃｅｐ６は参照プローブとして機能し、四倍性の効果をなくすことによって、ＣＣＮＤ１特異的な増加の過剰推定を回避するのに役立つ（Ｉｓａａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｐａｔｈｏｌ．３２（２）：１４４−１４８（２０１０））。この知見は非常に特異的（９５％）であり、転移のＰＰＶが９１％であった。同様に、約２．４８超の平均コピー数を有するＭＹＣ基準は非常に特異的（９０％）であり、ＰＰＶが８０％であった。カプランマイヤー分析およびロジスティック回帰分析を含む幾つかのさらなる統計分析により、これらのパラメータの転移との強い関連性が確認された。実際、多変量分析では、ＣＣＮＤ１／第６染色体およびＭＹＣ平均コピー数は、現在認められている他のＡＪＣＣ予後因子、例えば、ブレスローの深さ、クラークレベル、潰瘍形成の状態、性別、部位および年齢よりも統計的に有力であった。
【０１１９】
ＣＣＮＤ１およびＭＹＣの増加の有意性は、種々のブレスローの深さのカテゴリを通して明白であり続けた。種々のブレスローの深さのカテゴリでは、このことは、ＣＣＮＤ１／第６染色体の基準を満たす患者対この基準を満たさない患者のカプランマイヤー曲線を比較することによって明白であった。全体的には、ＣＣＮＤ１／第６染色体の陽性値（即ち、約１．５５超）を有していた、データセット全体からの患者２１人のうち、２０人が、１ｍｍ超４ｍｍ以下のブレスローの深さを有していた。従って、これらの患者の大部分は、転帰に大きなばらつきがあり得るグループである第ＩＩ病期または第ＩＩＩ病期であろう。従って、これらの患者における予後予測の改善は、明らかに妥当であり有益である。平均ＭＹＣコピー数が約２．６超の患者８人のうち、７人が、１ｍｍ超４ｍｍ以下のブレスローの深さを有していた。このブレスローの深さの群における患者６０人のコホート全体と比較すると、ＣＣＮＤ１基準またはＭＹＣ基準のいずれかを満たす患者は、転移群である可能性が有意に高かった。従って、これらのマーカーは、これらの癌遺伝子に対して特異的な標的化阻害剤に反応する、伝統的分類の中間段階の高リスク患者、および疾患の初期段階の患者を特定することができる。
【０１２０】
上記マーカーを伝統的なマーカー、例えば、ブレスローの深さと組み合わせると、付加的な情報を得ることができる。例えば、ブレスローの深さが２ｍｍ超の患者のサブグループの分析では、ＣＣＮＤ１／第６染色体が１．５５超の患者は、ＣＣＮＤ１／第６染色体が１．５５以下の患者よりも有意に予後不良であった。図４ａは、ブレスローの深さおよびＣＣＮＤ１／第６染色体の値の組み合わせが、４つの潜在的に異なる曲線をもたらすことを示しており、ブレスローの深さが２ｍｍ超でありＣＣＮＤ１／第６染色体が１．５５以下の患者は予後最良であり、ブレスローの深さが２ｍｍ超でありＣＣＮＤ１／第６染色体が１．５５超の患者は予後不良であった。同様に、ブレスローの深さが２ｍｍ超であり平均ＭＹＣコピー数が２．４８超の患者は、ブレスローの深さが２ｍｍ超でありＭＹＣのコピー数が２．４８以下の患者よりも有意に予後不良であった。図４ｂは、ブレスローの深さおよびＭＹＣのコピー数に応じた４つの異なるＫＭ曲線を実証しており、ブレスローの深さが２ｍｍ超であり平均ＭＹＣコピー数が２．２２超の患者は予後不良であり、ブレスローの深さが２ｍｍ未満であり平均ＭＹＣコピー数が２．２２以下の患者は予後最良である。
【０１２１】
ＣＣＮＤ１／第６染色体およびＭＹＣ、ならびにブレスローの深さ、クラークレベル、潰瘍形成の有無、性別、年齢、部位および有糸分裂数を調べるロジスティック回帰分析（表１および２を参照のこと。）は、これらのＦＩＳＨパラメータが独立した予後因子であることをさらに裏付けている。加えて、多変量分析は、ＡＪＣＣによって現在使用されている上記他の予後因子と比較して、ＣＣＮＤ１／第６染色体およびＭＹＣが、予後予測力においてそれぞれ第１位および第２位であることを示している。
【０１２２】
【表１】
2019047798.tif 000002
【０１２３】
【表２】
2019047798.tif 000003
【０１２４】
【表３】
2019047798.tif 000004
【０１２５】
上記データは、２個の癌遺伝子、即ち、ＣＣＮＤ１およびＭＹＣの特異的なコピー数増加を予後不良と高度に関連付けるものであり、これらが黒色腫における駆動遺伝子であることをさらに暗示している。従って、これらの遺伝子の両方が、治療標的候補であり得る。
【０１２６】
上記に加えて、悪性黒色腫を有する患者における転移の予後予測では、ＣＣＮＤ１コピー数／細胞の増加、ＣＣＮＤ１が増加している細胞の割合、ＭＹＣが増加している細胞の割合およびＣＣＮＤ１／対照セントロメア（例えば、第６染色体のセントロメア）が増加している細胞の割合も評価した。このようなパラメータは、ロジスティック回帰分析では統計的有意性で、転移に進行する患者と、転移に進行しない患者とを判別することが示された。カットオフを定義するために、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成した（図７を参照のこと；表４も参照のこと。）。最適なカットオフは、約９０％超の特異性および約３０％超の感度をもたらすものであると考え、特異性を優先して、即ち、転移を有しない患者を「陽性」と判定する可能性を最小限にするように、カットオフを選択した。このような割合は予後的であったことが発見された。生存分析において、このカットオフを確認した（ｐ＜０．０５）。ＭＹＣのコピー数が約２．４８超／細胞（約２．０７から約２．５３の範囲）である場合、転移が起こる可能性があることを示す（感度／特異性（％）＝３２／９０（８４／４４（ＲＯＣで最良）から３２／９０（選択したカットオフで最低））に対応する。）。ＣＣＮＤ１／対照セントロメアのコピー数比が約１．５５超／細胞（約１．３３から約１．５６の範囲）である場合、転移が起こる可能性があることを示す（感度／特異性（％）＝３４／９３（６８／６８（ＲＯＣで最良）から３２／９５）に対応する。）。ＣＣＮＤ１のコピー数／細胞が約２．８１超（約２．２３から約２．９６の範囲）に増加している場合、転移が起こる可能性があることを示す（感度／特異性（％）＝２４／９０（６８／６６（ＲＯＣで最良）から２４／９３）に対応する。）。ＣＣＮＤ１が増加している細胞の割合が約５１％超（約３０％から約５３％の範囲）である場合、転移が起こる可能性があることを示す（感度／特異性（％）＝２６／９０（７４／６６（ＲＯＣで最良）から２６／９０）に対応する。）。ＭＹＣが増加している細胞の割合が約５１％超（約２０％から約５３％の範囲）である場合、転移が起こる可能性があることを示す（感度／特異性（％）＝２６／９３（９０／４６（ＲＯＣで最良）から２６／９３）に対応する。）。ＣＣＮＤ１／対照セントロメア（例えば、第６染色体のセントロメア）が増加している細胞の割合が約６１％超（約５４％から約６３％の範囲）である場合、感度／特異性（％）＝３２／９０（５８／８１（ＲＯＣで最良）から３２／９０）に対応する。ＣＣＮＤ１が増加している細胞の割合が約３０％以上（カイ二乗＝５．１０２９６７９１、カイ二乗＝０．０２３９よりも大きい確率）であり、および／またはＭＹＣが増加している細胞の割合が約２０％超（カイ二乗＝６．１２５８０２０７、カイ二乗＝０．０１３３よりも大きい確率）である場合、転移が起こる可能性があることを示した。
【０１２７】
【表４】
2019047798.tif 000005
【０１２８】
［実施例２］
本実施例では、悪性黒色腫の診断において有用なプローブセットの決定について説明する。
【０１２９】
Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌｕｒｉｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）およびＮｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）からの承認後に、ＦＩＳＨによる研究のために、黒色腫２０７例および母斑２１８例を含む検体計４２５例を、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙから特定した。全検体は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から構成されていた。全症例を評価し、皮膚病理学者が診断を確認した。４つの個別のコホートで、検体を研究した。黒色腫であると明らかに組織学的診断されたが、プローブセット１（ＲＲＥＢ１（ｒａｓ−応答因子結合タンパク質１；６ｐ２５）、ＭＹＢ（６ｑ２３）、Ｃｅｐ６（セントロメア６）およびＣＣＮＤ１（１１ｑ１３））によるＦＩＳＨでは陰性結果の症例について黒色腫データベースを検索することによって特定した３１症例から、コホート１は構成されていた。また、軽度、中度および重度の異型性を含む様々な程度の異型性を有する明らかな良性母斑３４症例を選択した。さらなる分析のための最良のプローブの組み合わせを開発するために、このコホートを使用した。コホート２、３および４の症例は、ＦＩＳＨによって過去に研究されていなかった。コホート２は、黒色腫４９例および母斑５１例から構成されていた。プローブの組み合わせをさらに絞り込むために、このコホートを使用した。コホート３は、さらなる黒色腫７２例および母斑８５例から構成されており、「最良の」プローブの組み合わせのためのカットオフを開発するのに使用した。第４のコホートは、黒色腫５１例および母斑５１例から構成されており、先のコホートを使用して開発した組み合わせおよびカットオフを検証するのに使用した。
【０１３０】
下記多色プローブセットによるＦＩＳＨは、以前に記載されているように実施した（Ｂｕｓａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ  ３７（２）：１９６−２０３（２０１０））。単一帯域フィルタを備える落射蛍光顕微鏡（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ）を用いて、スライドを分析した。分析は、熟練の技術者および皮膚病理学者が実施した。すべての分析は、検体の診断を伏せて実施した。低倍率のＤＡＰＩフィルタを使用して、担腫瘍領域を局在化した。次いで、任意のプローブの異常コピー数を持つ核の存在について、腫瘍領域を徹底的に検査した。計数のために、最も有意なコピー数変化を有する領域を選択した。可能な限り、３つ以下の異常領域を選択し、各領域内で、最低１０個の核を高倍率（６０ｘ対物レンズ）で無作為に分析した。定量するために、核はオーバーラップしておらず、十分に明るいシグナルを持たなければならなかった。３個以上のプローブについてのシグナルを示さなかった核は分析しなかった。各検体において、３０個の細胞を計数した。ＦＩＳＨの計数および組織病理学について非常に経験豊富な技術者が計数した。
【０１３１】
データは、各検体の個々の細胞における各プローブのシグナル数の形で得られた（１検体あたり３０個の細胞を計数した。）。次いで、各プローブについて、１検体ごとに以下のパラメータを計算するために、データを縮小した：
−％増加：プローブシグナルが２超の細胞の割合（シグナルが２超の細胞の数を、計数した細胞の数で割って１００を乗じたもの）、および
−％減少：プローブシグナルが２未満の細胞の割合（シグナルが２未満の細胞の数を、計数した細胞の数で割って１００を乗じたもの）
【０１３２】
ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）の場合、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子座のホモ接合性欠失の割合（または、細胞１個あたりのゼロシグナル）をさらに計算した。加えて、幾つかの場合、２個のプローブの比を作成し、細胞１個あたりの比の増加を１超、および細胞１個あたりの比の減少を１未満であると考え、これらの比の％増加、％減少および％アンバランスを計算した。
【０１３３】
一般に、２つの分析方法を使用した。第１の方法は、黒色腫または母斑として分類されるものの確率を分類するために、ロジスティック回帰モデルを使用することを含んでいた。第２の方法は、黒色腫対母斑を判別する感度および特異性を計算するために、各ＦＩＳＨパラメータの様々なカットオフ値を使用することを含んでいた。複数のプローブの組み合わせでは、各パラメータについてカットオフを独立に変化させて、点領域をグラフ上に作成し、各特異性値において最高感度値を有する点を使用して、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を定義する。ＲＯＣ曲線から、理想からの距離（ＤＦＩ）およびＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。
【０１３４】
ＤＦＩパラメータは、以下のように計算した：
【０１３５】
【数１】
2019047798.tif 000006
【０１３６】
ＤＦＩは、ＲＯＣ曲線から感度１および偽陽性率（１−特異性）０までの最小距離を表す。ＤＦＩは０から１の範囲であり、０が理想的である。
【０１３７】
可能な組み合わせおよびカットオフ値を作成するためには、統計的方法を使用したが、カットオフ値およびプローブの組み合わせの最終決定につながる種々のトレードオフを検討するためには、科学的判断を使用した。具体的には、各検体コホートについて、プローブの選択、プローブセットの定義および検証のために、以下の分析を行った。
【０１３８】
コホート１
Ｂａｓｔｉａｎらによる黒色腫の比較ゲノムハイブリダイゼーションデータの組み合わせ分析における過去の研究では、１４個の遺伝子座が、最も頻繁に変化するものとして同定された。これには、プローブセット１に使用したプローブが含まれている（Ｂｕｓａｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）、前掲）。このリストの残りのプローブのうち、以下の８個のさらなるプローブ：ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）、セントロメア９（Ｃｅｐ９）、ＭＹＣ（８ｑ２４）、ＢＲＡＦ（７ｑ３４）、セントロメア１７（Ｃｅｐ１７）、セントロメア１０（Ｃｅｐ１０）、ＺＮＦ２１７（ジンクフィンガータンパク質１７；２０ｑ１３）およびＣｏｘ２（１ｑ２５）を選択し、２個のプローブセットに配置した。これには、ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）、セントロメア９（Ｃｅｐ９）、Ｃｏｘ２（１ｑ２５）およびセントロメア１７（Ｃｅｐ１７）が第１のプローブセットに含まれており、ＭＹＣ（８ｑ２４）、ＢＲＡＦ（７ｑ３４）、セントロメア１０（Ｃｅｐ１０）およびＺＮＦ２１７（２０ｑ１３）が第２のプローブセットに含まれていた。両方のプローブセットを、コホート１の黒色腫３１例および母斑３５例に適用した。黒色腫検体では、どの遺伝子座が、母斑検体と比較して最も頻繁に増加または減少したかを決定するために分析を行って、さらなる評価のために、上位の性能のプローブ４個を選択した（プローブセット２と称される。）。各コホートの良性症例および悪性症例について、各ＦＩＳＨパラメータの平均および標準偏差を個別に計算し、スチューデントｔ検定によって比較した。さらなる分析のために、２群間で有意差を示すパラメータ（ｐ＜０．０５）を選択した。この情報を、癌検出のための異なる遺伝子座の感度および特異性として表した。各プローブパラメータ−％増加および％減少−について、個々の陽性閾値を一定範囲でシフトさせて、ＲＯＣ曲線を作成した。感度および特異性についての理想からの最小距離（ＤＦＩ）およびＡＵＣを計算した。
【０１３９】
コホート２
コホート２では、最良の感度および特異性の組み合わせをもたらしたパラメータの組み合わせを決定した。プローブパラメータをすべての可能な２個、３個および４個の組み合わせにグループ分けし、次いで、ロジスティック回帰モデルを使用して分析した。個々のカットオフ値の計算を可能にするものではないが、ロジスティック回帰は、ＲＯＣ曲線およびこの面積ならびに最小ＤＦＩの推定を可能にする。この分析に基づいて、９ｐ２１内のホモ接合性欠失および第９染色体外側にある３個の他の標的を含む上位の性能のプローブの組み合わせ４個を同定した。
【０１４０】
コホート３
コホート３は、ＲＲＥＢ１（６ｐ２５）、ｐ１６（９ｐ２１）、ＣＣＮＤ１（１１ｑ１３）およびＭＹＣ（８ｑ２４）を標的とする最終選択プローブセットを使用して評価した黒色腫７２例および母斑８５例を含む検体１５７例から構成されていた。最終プローブセットの最適な陽性カットオフを選択するために、コホート２の分析に基づいて、コホート３のデータセットを使用してプローブパラメータの種々のカットオフを調べた。４個のプローブの組み合わせ内では個々のプローブに基づいてカットオフを計算し、４個のプローブ全体の固定値としても計算した。四倍体細胞および準最適なハイブリダイゼーションの細胞の影響を軽減するために、２つのさらなるルールをシグナル計数に適用した。四倍体細胞の影響を軽減するために、ＣＤＫＮ２Ａ、ＲＲＥＢ１、ＣＣＮＤ１およびＭＹＣが３から４シグナルの細胞は、割合（減少、増加、アンバランスまたはホモ接合性）を計算するのに使用する分子に含めなかったが、分母には含めた。不十分なハイブリダイゼーションの影響を軽減するために、４個のプローブうちの任意の３個以上のシグナルがゼロの細胞は、割合（減少、増加、アンバランスまたはホモ接合性）の計算から除外した。ＲＯＣ曲線を作成し、ＤＦＩおよびＡＵＣの値を計算した。
【０１４１】
コホート４
検証コホートとして、黒色腫検体５１例および母斑検体５１例から構成される独立したコホートを、新たに決定したプローブセット３および所定の基準で評価した。公開されている元のカットオフ（Ｂｕｓａｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）、前掲）を使用して、このコホートをプローブセット１でも評価した。このデータセットのプローブは、プローブセット１ではＲＲＥＢ１、ＭＹＢ、ＣＣＮＤ１およびＣｅｐ６であり、プローブセット３ではＲＲＥＢ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＣＮＤ１およびＭＹＣであった。
【０１４２】
図５は、ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）、Ｃｅｐ９（セントロメア９）、ＭＹＣ（８ｑ２４）、ＢＲＡＦ（７ｑ３４）、Ｃｅｐ１７、Ｃｅｐ１０、ＺＮＦ２１７（２０ｑ１３）およびＣｏｘ２（１ｑ２５）を標的とするプローブを用いて、黒色腫３１例および母斑３５例を含むコホート１を分析した評価結果を示す。８個のプローブそれぞれについて計算した代表的なパラメータについて、プロットは、黒色腫群および母斑群における染色体異常（増加または減少）を有する細胞の平均の割合を示す。母斑検体では、染色体が増加している細胞はゼロまたは非常に少数であり、細胞の約１８から３０％は、主にＦＦＰＥ検体での核トランケーションにより染色体が明らかに減少していることが示された。黒色腫検体では、有意な染色体コピー数の増加、およびＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）遺伝子座に欠失を有する細胞数の上昇が実証された。
【０１４３】
表５は、最高ＡＵＣおよびＤＦＩによって判断した場合の、上記遺伝子座の判別分析の結果として選択した上位１０個の最良のパラメータを示す。判別分析により、ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）、Ｃｅｐ９、ＺＮＦ２１７（２０ｑ１３）およびＭＹＣ（８ｑ２４）が、プローブセット１と最も相補的なプローブセットとして同定された。黒色腫群と母斑群との間で平均計数値を比較すると、このセットのプローブはそれぞれ、非常に有意なｐ値を示した。
【０１４４】
【表５】
2019047798.tif 000007
【０１４５】
加えて、ＲＯＣ分析では、さらなる研究のために選択したプローブに基づくパラメータが、最高ＡＵＣおよびＤＦＩを示した。ＤＦＩ値は、プローブの優先順位決定のみに使用した。ＲＲＥＢ１、ＭＹＢ、ＣＣＮＤ１、Ｃｅｐ６、ＣＤＫＮ２Ａ、ＺＮＦ２１７、Ｃｅｐ９およびＭＹＣに対するプローブで分析したコホート２を使用して、最適なプローブの組み合わせを選択した。さらなる調査のために、ロジスティック回帰分析を使用して、最高ＡＵＣおよび最低ＤＦＩを有する４個のプローブパラメータの４個の組み合わせを選択した（表６）。
【０１４６】
【表６】
2019047798.tif 000008
【０１４７】
コホート２のＤＦＩ分析により、上位４個のプローブの組み合わせから、プローブ標的の潜在的なセット２個が同定された。これら２個の組み合わせには、第１のセットではＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）、ＲＲＥＢ１（６ｐ２５）、ＭＹＣ（８ｑ２４）およびＣＣＮＤ１（１１ｑ１３）が含まれており、第２のセットではＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）、ＲＲＥＢ１（６ｐ２５）、ＭＹＣ（８ｑ２４）およびＺＮＦ２１７（２０ｑ１３）が含まれていた。両セットは、それぞれ０．１４５対０．１１３の優れたＤＦＩを有しており、差はごくわずかであった。過去の予後研究では、８ｑ２４（Ｂａｒｎｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）、前掲）および１１ｑ１３遺伝子座の有意な予後価値が示されたので、アッセイの予後ポテンシャルを最大限にするために、第１の組み合わせを選択した。従って、選択した最終プローブセットには、ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）、ＲＲＥＢ１（６ｐ２４．３）、ＭＹＣ（８ｑ２４）およびＣＣＮＤ１（１１ｑ１３．３）が含まれていた。これをプローブセット３と名付けた。
【０１４８】
コホート３を使用して、カットオフを決定した。プローブセット３で試験したコホート３の検体１５７例のＲＯＣ曲線を図６に示す。個々の各プローブパラメータ（ＣＤＫＮ２Ａの％ホモ接合性、ＲＲＥＢ１の％増加、ＭＹＣの％増加、およびＣＣＮＤ１の％増加）および４個のパラメータの組み合わせのプロットを示す。特異性が９５％以上である領域の目的曲線領域では、４個のプローブの幾つかのカットオフの組み合わせが利用可能であり、プロット上ではこれらを薄黒丸によって表した。
【０１４９】
図６は、個々のＦＩＳＨパラメータ（ＣＤＫＮ２Ａの％ホモ接合性、ＲＲＥＢ１の％増加、ＭＹＣの％増加およびＣＣＮＤ１の％増加）および４個のパラメータの組み合わせのＲＯＣプロットである。黒色腫検体７２例および母斑検体８５例（コホート３）のＦＩＳＨ評価から、パラメータを計算した。最高感度および特異性は、最小ＤＦＩの点で示されている。保守的に選択したカットオフセットの性能を矢印によって示す。プロット上では、各プローブについて選択した２７％のカットオフをエラーとして示す。黒丸によって強調されているＡＵＣは、感度および特異性の目的領域を示す。
【０１５０】
本発明者らの実際的経験では、８／３０未満のカットオフは、四倍体の結果としての偽陽性に対していくらか影響を受けやすいので、検体を陽性と判定するためには、細胞３０個のうちの８個以上が異常でなければならないという条件を使用して、最も保守的なカットオフを選択した。図６から明らかなように、この条件を満たすカットオフは、４個のパラメータすべてについて同じ（ＣＤＫＮ２Ａの％ホモ接合性、ＲＲＥＢ１の％増加、ＭＹＣの％増加およびＣＣＮＤ１の％増加について、それぞれ２７、２７、２７、２７）であり、８３．３３％の感度および１００．００％の特異性をもたらした。つまり、このコホートでは、陽性予測値が１．０であり、陰性予測値が０．８８であるということになる。また図６から明らかなように、ホモ接合性ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）欠失は、スピッツ母斑とスピッツ様黒色腫との区別について高い判別価値を示した。
【０１５１】
カットオフの選択に加えて、新たなプローブセットの性能をプローブセット１の性能と比較した。表７は、公開されている評価基準および陽性カットオフ（Ｇｅｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．３３（１２）：１７８３−１７８８（２００９））を使用したプローブセット１の性能を、２つの異なるカットオフセット：ＲＯＣ曲線で最高感度および特異性をもたらすものおよび保守的に選択したものを用いた新たなプローブセットの性能と比較して示す。プローブセット１は、７２％の感度および９８％の特異性をもたらしたが、保守的に選択したカットオフを用いた、プローブセット３として知られる新たなプローブセットは、８３％の感度および１００％の特異性を実証した。
【０１５２】
【表７】
2019047798.tif 000009
【０１５３】
ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）、ＲＲＥＢ１（６ｐ２４．３）、ＭＹＣ（８ｑ２４）およびＣＣＮＤ１（１１ｑ１３．３）から構成されるプローブセットの検証研究では、コホート３で確立した所定のカットオフを使用して、黒色腫検体５１例および母斑検体５１例の独立したコホートを分析した。細胞を陽性と判定するための以下のルールを適用した：
−−ある細胞が、３個のプローブ（ＭＹＣ、ＣＣＮＤ１およびＲＲＥＢ１）すべてについて細胞が四倍体である場合、この細胞は、ＭＹＣ、ＣＣＮＤ１およびＲＲＥＢ１について異常であるとして計数しない。
−−ある細胞が、３個のプローブ（ＭＹＣ、ＣＣＮＤ１およびＲＲＥＢ１）すべてについて細胞が四倍体である場合であって、これが９ｐ２１欠失についてホモ接合性である場合、この細胞は、異常であるとして計数する。
【０１５４】
この検証コホートにおいて、各プローブについて２７％のカットオフ（計数した核の２７％以上が異常である場合、検体は陽性である。）を使用して、感度が９４％であると決定し、特異性が９８％であると決定し、新たなプローブセットの優れた性能を確認した（表８）。細胞３０個の２７％は細胞８．１個であるので、カットオフとして８個の細胞も使用して分析を行ったところ（計数した核３０個のうちの８個以上の核が異常である場合、検体は陽性である。）、さらにより高い感度が得られた（表９）。
【０１５５】
【表８】
2019047798.tif 000010
【０１５６】
【表９】
2019047798.tif 000011
【０１５７】
９ｐ２１の頻繁な減少、および４個の異なる染色体の遺伝子座を標的とすることにより、このアッセイは、四倍体の結果としての偽陽性に対して有意に影響を受けにくくなる。スピッツ様新生物中の四倍体細胞の存在は、プローブセット１による偽陽性の主要原因である。特に切片化で核をトランケーションする場合に、経験不足の計数者が、アンバランスな染色体の増加についての間違った印象を与え得る以外は、四倍体細胞は、良性スピッツ母斑、スピッツ腫瘍およびスピッツ様黒色腫で見られ得るので診断に用いることができない。プローブセット１は、第６染色体の３個の遺伝子座および第１１染色体の１個の遺伝子座を標的とするので、四倍体細胞と、第６染色体全体が増加している細胞を区別することは、困難であることが分かる。反対に、プローブセット４が標的とする４個の遺伝子座は、４個の異なる遺伝子座に由来しており、通常は欠失している９ｐ２１を標的として含む。従って、９ｐ２１を含む４個のプローブすべてについてバランスの取れた増加を示す細胞が四倍体細胞である確率が非常に高い。また、四倍体細胞をより高い信頼性で認識することができるので、偽陽性の原因である四倍性を除外するために、ある手続きを使用することができる。この手続きは、異常細胞の割合を計算する場合に、分子に含まれているものから四倍体細胞を除外するが、分母にはこれらを維持する。これにより、アッセイの感度を減少させずに陽性結果を得るために、クローン異常細胞が計数細胞の中に存在する必要性が本質的に増加する。このルールを適用する場合、感度を有意に減少させることなく、偽陽性の原因としての四倍性が除外される。
【０１５８】
コホート２から同定した上位４個の性能のプローブセットの組み合わせのうち、２個のプローブセットが、予後ポテンシャルを示した（表６）。一方のプローブセットは、６ｐ２５、９ｐ２１、１１ｑ１３および２０ｑ１３を標的とするものであり、他方のプローブセットは、６ｐ２５、９ｐ２１、１１ｑ１３および８ｑ２４を標的とするものであった。ＤＦＩ値は、２０ｑ１３を含むプローブセットがわずかに優れていた（８ｑ２４および１１ｑ１３を含むプローブセットの０．１４５と比較して０．１１３）。しかしながら、８ｑ２４および１１ｑ１３の予後価値が過去に実証されており、ＤＦＩの差がわずかなので、８ｑ２４および１１ｑ１３を含むプローブセットは、曖昧なスピッツ腫瘍では、最大の予後ポテンシャルを有すると予想される。
【０１５９】
コホート３について、ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）、ＲＲＥＢ１（６ｐ２５）、ＭＹＣ（８ｑ２４）およびＣＣＮＤ１（１１ｑ１３）のカットオフを定義するために、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成した（図８を参照のこと；表１０も参照のこと。）。１検体あたり計３０個の細胞を分析し、異常細胞の割合を計算した。ＣＤＫＮ２Ａを除くすべてのプローブについて３または４のＦＩＳＨシグナルを有していたが、ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）欠失を有していなかった細胞を四倍体であると判断し、異常細胞として計数しなかった；この代わりに、異常細胞の割合を計算するために、これらを正常細胞として計数した。ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）を除くすべてのプローブについて３または４のＦＩＳＨシグナルを有しており、ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）欠失を有していた細胞を異常細胞として計数した。上記ルール（「四倍性ルール」）の適用により、良性四倍体母斑（これの細胞は、ゲノム中のすべての染色体が２倍増加していた。）と、黒色腫（これの細胞は、遺伝子座特異的な染色体異常を有していた。）を判別する特異性が増加した。最適なカットオフは、約９０％超の特異性および約８０％超の感度をもたらすものであると考え、特異性を優先して、即ち、転移を有しない患者を「陽性」と判定する可能性を最小限にするように、カットオフを選択した。このような割合は診断的であったことが発見された。
【０１６０】
以下に列挙されているＣＤＫＮ２Ａ、ＲＲＥＢ１、ＭＹＣおよびＣＣＮＤ１のＦＩＳＨパラメータのカットオフの複数の組み合わせは、少なくとも約８０％の感度および少なくとも約９０％の特異性をもたらした（目的の性能によって定義した場合）：
−−ＣＤＫＮ２Ａの％ホモ接合性欠失は約２０から約３３、
−−ＲＲＥＢ１の％増加は約２０から約３３、
−−ＭＹＣの％増加は約１から約４８、および
−−ＣＣＮＤ１の％増加は約１１から約４６。
【０１６１】
各プローブについて約２７％の選択カットオフ前後の許容可能範囲内、例えば、２７％の選択カットオフにおいて、最低性能および最高性能を定義した具体的なカットオフの組み合わせを表１０に示す。
【０１６２】
【表１０】
2019047798.tif 000012
【０１６３】
コホート２について、ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）、ＲＲＥＢ１（６ｐ２５）、ＭＹＣ（８ｑ２４）またはＣＣＮＤ１（１１ｑ１３）のいずれか、およびＺＮＦ２１７のカットオフを定義するために、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成した（表１１を参照のこと。）。１検体あたり計３０個の細胞を分析し、異常細胞の割合を計算した。ＣＤＫＮ２Ａを除くすべてのプローブについて３または４のＦＩＳＨシグナルを有していたが、ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）欠失を有していなかった細胞を四倍体であると判断し、異常細胞として計数しなかった；この代わりに、異常細胞の割合を計算するために、これらを正常細胞として計数した。ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）を除くすべてのプローブについて３または４のＦＩＳＨシグナルを有しており、ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）欠失を有していた細胞を異常細胞として計数した。四倍性ルールの適用により、良性四倍体母斑（これの細胞は、ゲノム中のすべての染色体が２倍増加していた。）と、黒色腫（これの細胞は、遺伝子座特異的な染色体異常を有していた。）を判別する特異性が増加した。最適なカットオフは、約９０％超の特異性および約８０％超の感度をもたらすものであると考え、特異性を優先して、即ち、転移を有しない患者を「陽性」と判定する可能性を最小限にするように、カットオフを選択した。このような割合は診断的であったことが発見された。
【０１６４】
以下に列挙されているＣＤＫＮ２Ａ、ＲＲＥＢ１、ＺＮＦ２１７およびＣＣＮＤ１のＦＩＳＨパラメータのカットオフの複数の組み合わせは、少なくとも約８０％の感度および少なくとも約９０％の特異性をもたらした（目的の性能によって定義した場合）：
−−ＣＤＫＮ２Ａの％ホモ接合性欠失は約２０から約３０、
−−ＲＲＥＢ１の％増加は約２７から約３０、
−−ＺＮＦ２１７の％増加は約１４から約３３、および
−−ＣＣＮＤ１の％増加は約２４から約２９。
【０１６５】
各プローブについて約２７％の選択カットオフ前後の許容可能範囲内、例えば、２７％の選択カットオフにおいて、最低性能および最高性能を定義した具体的なカットオフの組み合わせを表１１に示す。
【０１６６】
【表１１】
2019047798.tif 000013
【０１６７】
以下に列挙されているＣＤＫＮ２Ａ、ＲＲＥＢ１、ＭＹＣおよびＺＮＦ２１７のＦＩＳＨパラメータのカットオフの複数の組み合わせは、少なくとも約８０％の感度および少なくとも約９０％の特異性をもたらした（目的の性能によって定義した場合）：
−−ＣＤＫＮ２Ａの％ホモ接合性欠失は約２０から約３０、
−−ＲＲＥＢ１の％増加は約２７から約３３、
−−ＭＹＣの％増加は約１４から約３３、および
−−ＺＮＦ２１７の％増加は約２４から約３３。
【０１６８】
各プローブについて約２７％の選択カットオフ前後の許容可能範囲内、例えば、２７％の選択カットオフにおいて、最低性能および最高性能を定義した具体的なカットオフの組み合わせを表１２に示す。
【０１６９】
【表１２】
2019047798.tif 000014
【０１７０】
［実施例３］
本実施例では、非定型スピッツ腫瘍を有する患者における転移の予後予測において、ＲＲＥＢ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫＮ２ＡおよびＭＹＣを評価することを説明する。
【０１７１】
Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌｕｒｉｅ  Ｃａｎｃｅｒ  ＣｅｎｔｅｒおよびＮｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）およびＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｂｏａｒｄｓ  ｏｆ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＭｉｃｈｉｇａｎおよびＭｅｌａｎｏｍａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ａｕｓｔｒａｌｉａからの承認後に、組み入れ基準を満たした計７５症例を特定した。これには、病理学者による非定型スピッツ腫瘍の診断が含まれていた。次いで、診断に同意した最低３人の熟練の皮膚病理学者が、全症例を再検討した。病変を非定型スピッツ腫瘍とみなすのに使用した組織学特徴には、限定されないが、通常よりも高い核異型度（ｎｕｃｌｅａｒ  ａｔｙｐｉａ）、膨脹性結節性増殖もしくはシート状増殖、頻繁な、深いもしくは非定型の有糸分裂、成熟の欠如、表皮破壊もしくは潰瘍形成もしくは壊死、大きなサイズ（１ｃｍ超）、または皮下脂肪深くへの広がりが含まれていた。加えて、全症例は、センチネルリンパ節を越える腫瘍拡大の証拠がない場合には最低５年間の経過観察を有し、または症例が、進行性局所領域転移または遠隔転移および死亡をもたらすセンチネルリンパ節を越える腫瘍拡大の証拠を有していた場合にはより短い経過観察期間を有していた。組み入れ基準を満たす７５症例を特定した。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）ｍｅｌａｎｏｍａ  ｔａｓｋｆｏｒｃｅ（Ｂａｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２７：６１９９−６２０６（２００９））によって特定された７個の重要な黒色腫予後因子すべて：原発性腫瘍の解剖学的部位、性別、年齢、潰瘍形成の状態、有糸分裂速度、ブレスローの深さおよびクラークレベルを含む臨床的および組織学的パラメータを、全７５症例について得た。また、表皮破壊、膨脹性結節性増殖、Ｋａｍｉｎｏ体の存在および細胞形態（主に、類上皮、紡錘体またはこの両方）を、全症例について得た。「表皮破壊」という用語は、本明細書では、基底層および間隙の剥離に伴うことが多い乳頭間隆起パターンの喪失によって、表皮が有意に薄くなる過程を指すのに使用され、すべてが、メラニン細胞の厳密には反対の根本的膨脹性増殖の結果である。症例をこれらの転帰によって４群に分類した。第１群は、３個のカテゴリ、即ち、１ｘ、１ａおよび１ｂを有していた。再切除後に疾患の証拠がなく、センチネルリンパ節生検を実施しなかった症例は、１ｘであった。再切除後に疾患の証拠がなく、陰性センチネルリンパ節を有していた症例は、１ａであり、陽性センチネルリンパ節を有していた症例は、１ｂであった。センチネルリンパ節の顕微鏡的病変の他に局所領域疾患を有するが、遠隔転移を有しない患者は、第２群として分類した。これには、臨床的に触知可能なリンパ節腫脹、完全切除の際に非センチネルリンパ節中に存在する腫瘍、およびｉｎ−ｔｒａｎｓｉｔ転移を有する患者が含まれていた。第３群は、遠隔転移を有する患者であり、第４群は、遠��転移を有する、および疾患により死亡した患者であった。各患者のグループステータスを表１３に列挙し、より詳細な病歴を表１４に示す。
【０１７２】
【表１３】
2019047798.tif 000015
【０１７３】
【表１４】
2019047798.tif 000016
【０１７４】
以下に概説されている多色ＦＩＳＨプローブセットによるハイブリダイゼーションの手順は、以前に記載されているように実施した（Ｇｅｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．３３：１１４６−１１５６（２００９））。２回のハイブリダイゼーションを個別に実施した−−１回目は、ＲＲＥＢ１（６ｐ２５）、ＭＹＢ（６ｑ２３）、ＣＣＮＤ１（１１ｑ１３）および第６染色体（Ｃｅｐ６を使用）を標的とする４プローブＦＩＳＨアッセイを使用し、２回目は、ＲＲＥＢ１（６ｐ２５）、ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）、ＣＣＮＤ１（１１ｑ１３）およびＭＹＣ（８ｑ２４）を標的とする４プローブＦＩＳＨアッセイを用いた（Ｇｅｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）、前掲；およびＧｅｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．３６：８０８−８１７（２０１２））。単一帯域フィルタを備える落射蛍光顕微鏡（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ）を用いて、スライドを分析した。分子診断およびＦＩＳＨ試験について経験豊富な熟練の技術者、および症例の臨床データまたは転帰をいずれも把握していない皮膚病理学者が分析を実施した。低倍率のＤＡＰＩフィルタを使用して、担腫瘍領域を局在化した。次いで、各プローブの異常コピー数を持つ核の存在について、腫瘍領域を徹底的に検査した。計数のために、最も有意なコピー数変化を有する領域を選択した。可能な限り、３つ以下の異常領域を選択し、各領域内で、最低１０個の核を高倍率（６０ｘ対物レンズ）で無作為に分析した。定量するために、核はオーバーラップしておらず、十分に明るいシグナルを持たなければならなかった。３個以上のプローブについてのシグナルを示さなかった核は分析しなかった。各検体において、３０個の細胞を計数した。
【０１７５】
ＦＩＳＨ陽性の基準は、各プローブセットについて以前に発表されているとおりであった（Ｇｅｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）、前掲；およびＧｅｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）、前掲）。元の黒色腫ＦＩＳＨアッセイでは、陽性基準は、２コピー超のＲＲＥＢ１（６ｐ２５）を有する細胞が２９％超であること、またはＲＲＥＢ１（６ｐ２５）のコピーが第６染色体（Ｃｅｐ６）よりも多い細胞が５５％超であること、または２コピー超のＣＣＮＤ１（１１ｑ１３）を有する細胞が３８％超であること、またはＭＹＢ（６ｑ２３）のコピーが第６染色体（Ｃｅｐ６）と比較して少ない細胞が４２％超であることであった。第２のプローブセットでは、陽性基準は、ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）のホモ接合性欠失を有する計数細胞が２９％超であること、または２コピー超のＲＲＥＢ１（６ｐ２５）、ＭＹＣ（８ｑ２４）またはＣＣＮＤ１（１１ｑ１３）を有する細胞が２９％超であることであった。また、コピー数異常を有する細胞の割合を計算する場合、四倍性の結果としての偽陽性を回避するために、四倍性の結果であると判断したコピー数の増加を有する細胞を分子から除外したが、分母には残した（Ｉｓａａｃ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｏｌｙｐｌｏｉｄｙ  ｉｎ  Ｓｐｉｔｚ  Ｎｅｖｉ：Ａ  Ｎｏｔ  Ｕｎｃｏｍｍｏｎ  Ｋａｒｙｏｔｙｐｉｃ  Ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉａｂｌｅ  ｂｙ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」，Ａｍ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｐａｔｈｏｌ．３２（２）：１４４−１４８（２０１０））。いずれかのプローブセットの任意の一基準が陽性である場合、症例をＦＩＳＨ陽性と判断した。第１群の症例対第２群から第４群の症例におけるＦＩＳＨ陽性頻度を比較するために、フィッシャーの直接確率検定を使用した。第１群、第２群および第３群対第４群を比較するのにも、同じ分析を実施した。第１群対第２群から第４群における個々の各プローブの陽性頻度を調べるためにも、フィッシャーの直接確率検定を使用し、ｐ値を計算した。ＡＪＣＣ確認黒色腫予後因子：原発性腫瘍の解剖学的部位、性別、年齢、ブレスローの深さ、クラークレベル、潰瘍形成の状態および有糸分裂速度のすべて、ならびに他の組織学的特徴、例えば、表皮破壊、Ｋａｍｉｎｏ体の存在、膨脹性結節性増殖および細胞形態を含む得られたすべての変数について第１群対第２群から第４群を比較する際、ｐ値を評価するために、ロジスティック回帰分析も使用した。単変量分析で有意な（ｐ＜０．０５）関連性を有するすべての変数を用いて、多変量分析を実施した。
【０１７６】
２個のプローブセットを使用して、患者７５人に由来する臨床経過観察が公知の非定型スピッツ腫瘍計７５例を分析した。患者の年齢は２から５８歳の範囲であり、平均年齢は２０歳であった。患者７５人のうち、１１人が、センチネルリンパ節を越える腫瘍拡大の証拠を有しており、これらの症例のうち３例では、患者は、遠隔転移および死亡に発展した（第４群）（表１４）。遠隔転移を有しないが、センチネルリンパ節を越える疾患を有する患者は８人であった。これには、センチネルリンパ節内にｉｎ−ｔｒａｎｓｉｔ転移および腫瘍を有する患者４人が含まれていた。これらのセンチネルリンパ節陽性患者のうち４人は、リンパ節の完全切除の際に非センチネルリンパ節内にも腫瘍を有していたが、２歳患者１人は、完全切除を受けなかった。ｉｎ−ｔｒａｎｓｉｔ疾患を有しない残りの患者４人のうち、３人が陽性センチネル節を有しており、完全切除の際に非センチネル節内にさらなる腫瘍が検出され、２人が、肉眼で触知可能なリンパ節疾患を発症した（表１４）。進行性局所領域疾患、遠隔転移を有するかまたは死亡した患者１１人全員（第２群から第４群）が、陽性ＦＩＳＨ結果を有しており、試験した遺伝子座の少なくとも１つにコピー数異常があった（表１４）。残りの６４症例のうち、１５症例（２３．４％）が陽性ＦＩＳＨ結果を有していた。フィッシャーの直接確率検定によって、第１群対第２群から第４群におけるＦＩＳＨ陽性の頻度を比較するｐ値は、＜０．０００１であった。
【０１７７】
疾患により死亡した患者３人全員、およびセンチネルリンパ節を越える進行性局所領域疾患を有する患者８人のうちの６人が、ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）のホモ接合性欠失の証拠を有していた（表１４）。疾患により死亡したか、または進行性局所領域疾患を有しており、ホモ接合性ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）欠失を有する細胞の割合が陽性ＦＩＳＨ結果のカットオフを超えていた患者９人うち、ホモ接合性ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）欠失を有する計数細胞の平均数は８０％であった。反対に、５年後の経過観察では良性であった残りの患者６４人のうちのわずか３人が、ホモ接合性ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）欠失の証拠を有していた。フィッシャーの直接確率検定によって、第１群対第２群および第４群におけるホモ接合性ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）欠失の頻度を比較すると、ｐ値は、＜０．０００１で非常に有意であった。第１群対第２群および第４群において、先に決定したカットオフを使用して、ＲＲＥＢ１（６ｐ２５）の増加、ＭＹＢ（６ｑ２３）／第６染色体（Ｃｅｐ６）の減少、ＲＲＥＢ１（６ｐ２５）／第６染色体６（Ｃｅｐ６）の増加、ＣＣＮＤ１（１１ｑ１３）の増加、ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）ホモ接合性の減少およびＭＹＣ（８ｑ２４）の増加について、個々のプローブパラメータそれぞれの陽性頻度を評価すると、それぞれ．０２、．０２および＜．０００１のｐ値で、ＲＲＥＢ１（６ｐ２５）、ＣＣＮＤ１（１１ｑ１３）およびＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）について、統計的有意性が見られた（表１５）。
【０１７８】
【表１５】
2019047798.tif 000017
【０１７９】
個々の各ＦＩＳＨパラメータ、ならびに年齢、性別、原発性腫瘍の部位、潰瘍形成の状態、ブレスローの深さ、クラークレベルおよび有糸分裂速度を含むすべてのＡＪＣＣ予後パラメータ、ならびにスピッツ腫瘍で評価されることが多い他の因子、例えば、表皮破壊の有無、Ｋａｍｉｎｏ体、膨脹性結節性増殖および類上皮対紡錘体の形態を分析する多変量ロジスティック回帰分析では、有糸分裂速度（ｐ＝０．０３）およびホモ接合性ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）欠失（ｐ＜０．０００１）のみが、センチネルリンパ節を越える腫瘍進行との統計的に有意な関連性を示した。さらに、ホモ接合性ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）欠失のみが、疾患による死亡との統計的に有意な関連性を示した（ｐ＝０．０１）（表１６）。
【０１８０】
【表１６】
2019047798.tif 000018
【０１８１】
重要なことに、ＭＹＢ（６ｑ２３）が個別に減少している６個の非定型スピッツ腫瘍サブセットの中では、６０から９６カ月の範囲の経過観察期間で、進行性局所領域疾患、遠隔転移または死亡に発展したものはなかった。これらの患者６人のうちの４人にセンチネルリンパ節生検（ｓｅｎｔｉｎｅｌ  ｎｏｄｅ  ｂｉｏｐｓｙ）を行ったところ、患者４人全員が、センチネルリンパ節内に腫瘍を有していた。すべてのプローブパラメータによるＦＩＳＨ結果が陰性であり、進行性局所領域疾患、遠隔転移または死亡をもたらす非定型スピッツ腫瘍はなかった。
【０１８２】
本研究は、ＲＲＥＢ１（６ｐ２５）またはＣＣＮＤ１（１１ｑ１３）の増加およびＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）のホモ接合性減少などの特定の染色体異常の存在が、悪性の挙動の可能性が高いメラニン細胞腫瘍を明らかに特定することを実証している。加えて、個々のプローブパラメータのロジスティック回帰分析および多変量分析は、中悪性度のメラニン細胞腫瘍では、すべてのコピー数異常が同等の価値を有するわけではないという有力な証拠を提供している。具体的には、ホモ接合性ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）欠失は、悪性の疾患経過との関連では非常に有意であり、センチネルリンパ節を越える腫瘍拡大を有する患者１１人のうちの９人が、ホモ接合性ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）欠失の証拠を示した。患者９人のこのグループ内では、ホモ接合性欠失を示す計数細胞の平均割合が８０％であったことも重要であった。従って、明らかな良性腫瘍および悪性腫瘍で決定した陽性結果のカットオフ閾値は、ホモ接合性欠失を有する細胞の２９％超であるが、臨床診療で非定型スピッツ腫瘍を評価する場合、真に有意な結果は全く劇的であり、ホモ接合性ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）欠失を有する細胞の割合が有意に高い可能性がある。
【０１８３】
研究における非定型スピッツ腫瘍患者７５人のうち、１２人が、所定のカットオフ値を超えるホモ接合性ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）欠失を有していた。これらの患者１２人のうち、９人が、進行性局所領域疾患、遠隔転移または死亡に発展した。これらの患者のうち、３人が遠隔転移を有しており、疾患により死亡した。悪性の挙動群対非悪性の挙動群において、ホモ接合性ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）欠失の頻度を比較するフィッシャーの直接確率検定によるｐ値は＜０．０００１であった。
【０１８４】
興味深いことに、全員が別個の機関に由来する患者４人（子供３人および成人１人、それぞれ表１４の症例７、症例３７、症例４８および症例６６）が、多くのホモ接合性ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）欠失を有する非定型スピッツ様メラニン細胞性新生物、および原発性腫瘍部位周辺の持続性ｉｎ−ｔｒａｎｓｉｔ疾患／サテリトーシスの存在を伴う著しく類似する経過を示し、４症例のうちの４症例が、センチネルリンパ節の病変も示した。これらの患者４人のうちの３人に完全切除を行ったところ、３人全員が、非センチネルリンパ節の腫瘍病変の証拠も有していた。従って、従来の黒色腫よりも低悪性度の可能性があり、成人よりも子供で頻繁に見られ、細胞の大部分にホモ接合性ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）欠失を有するスピッツ様細胞形態を有し、ｉｎ−ｔｒａｎｓｉｔ転移を頻繁にもたらし、非センチネルリンパ節を含むリンパ節の病変を有することが多いこのサブタイプの黒色腫を説明するために、本発明者らは、「ホモ接合性ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）欠失を有するスピッツ様黒色腫」という用語を提案する。８年間以上の臨床経過観察を行っている患者７は、手術およびインターフェロン処置後において依然として無病である。残りの患者３人は、より限定的な経過観察期間を有する。遠隔転移および死亡に発展する可能性、頻度および時期を決定するためには、これらの患者についてのさらなる経過観察研究が必要である。
【０１８５】
６ｐ２５および１１ｑ１３の両方のコピー数増加が、悪性の非定型スピッツ腫瘍群において、両パラメータとも．０２のｐ値で統計的に有意により頻繁に見られた。これは、これらの変化を有する非定型スピッツ様メラニン細胞腫瘍が、ＦＩＳＨ陰性であるものと比較して、悪性の挙動についてより高リスクであると判断するべきものであるが、ホモ接合性ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）欠失を有する症例ほどではないことを示唆している。暫定的に、「ＲＲＥＢ１（６ｐ２５）が増加しているかまたはＣＣＮＤ１（１１ｑ１３）が増加しているスピッツ様黒色腫」という用語を、後者の２つが、ホモ接合性ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）欠失を有する症例よりも極めて低リスクであるという理解のもとで用いることができる。
【０１８６】
最低５年間の経過観察にもかかわらず、ＭＹＢ（６ｑ２３）が個別に減少している６個の非定型スピッツ腫瘍はいずれも、進行性局所領域疾患、遠隔転移または死亡の証拠を示さなかった。従って、ＦＩＳＨがＭＹＢ（６ｑ２３）の個別減少を示す非定型スピッツ腫瘍の状況では、本発明者らは、黒色腫の診断を控え、少なくとも暫定的にこれを「ＭＹＢ（６ｑ２３）欠失を有する非定型スピッツ腫瘍」と称することを提案する。これは、陽性センチネルリンパ節生検を頻繁にもたらすが、これを越えて進行することはごくまれであるスピッツ様メラニン細胞性新生物のサブセットであると思われるが、このデータは限定的なものであり、さらなる経過観察研究が必要である。従来の黒色腫では、明らかに有意な予後効果を有することが示されているＭＹＣ（８ｑ２４）に関して（Ｇｅｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．１３：３５２−３５８（２０１１））、本研究では陽性症例が非常に少ないため統計的有意性がなかった。本発明者らは、８ｑ２４がメラニン欠乏性結節型黒色腫または母斑性黒色腫に最も典型的であることを以前に示したので（Ｐｏｕｒｙａｚｄａｎｐａｒａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．３６：２５３−２６４（２０１２）；Ｐｏｕｒｙａｚｄａｎｐａｒａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ８ｑ２４  Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｇａｉｎｓ  ａｎｄ  ｃ−ＭＹＣ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ａｍｅｌａｎｏｔｉｃ  Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｅｌａｎｏｍａ」，Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．２５（９）：１２２１−１２２６（２０１２））、これは驚くべきものではないがスピッツ様新生物では低頻度のコピー数異常である。
【０１８７】
要約すると、ＲＲＥＢ１（６ｐ２５）またはＣＣＮＤ１（１１ｑ１３）の増加およびホモ接合性ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）欠失は、それぞれ０．０２、０．０２および＜０．０００１のｐ値で、悪性の臨床的挙動との統計的に有意な関連性を有していた。多変量分析では、ホモ接合性ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）欠失は、悪性の臨床的挙動（ｐ＜０．０００１）および疾患による死亡（ｐ＝０．００３）と非常に関連していた。ホモ接合性ＣＤＫＮ２Ａ（９ｐ２１）欠失を有する症例は、進行性局所領域疾患およびさらには遠隔転移および死亡に発展する最大リスクを有する。ＲＲＥＢ１（６ｐ２５）またはＣＣＮＤ１（１１ｑ１３）が増加している症例も、悪性の臨床的挙動について、ＦＩＳＨ陰性の非定型スピッツ腫瘍またはＭＹＢ（６ｑ２３）欠失を有する症例よりも高いリスクを有する。従って、限られた数の染色体コピー数異常を検出するＦＩＳＨにより、非定型スピッツ腫瘍の臨床的に有用で統計的に有意なリスク評価を提供することができる。
【０１８８】
明細書中において挙げられたすべての特許、特許出願刊行物、雑誌論文、教科書および他の刊行物は、本開示が関係する当業者の熟練度を示す。すべてのこのような刊行物は、各個別の刊行物が具体的におよび個別に参照により組み込まれていることが示されているのと同じように、同程度に参照により本明細書に組み込まれている。
【０１８９】
本明細書において例示的に記載されている本発明は、本明細書において具体的に開示されていない任意の要素または限定の非存在下で、適切に実施され得る。従って、例えば、「含む」、「から実質的になる」および「からなる」という用語のいずれかの本明細書における各例は、他の２つの用語のいずれかと置き換えることができる。同様に、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、文脈によって明らかに表されない限り、複数の参照を含む。従って、例えば、「方法（ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」に対する参照は、（本明細書において記載され、および／または、本開示を読んだ際に当業者に明らかとなる）この型の１つ以上の方法および／または工程を含む。
【０１９０】
用いられた用語および表現は、説明の用語として用いられるものであって、限定の用語として用いられるものではない。この点に関して、ある種の用語は、「定義」の下で定義され、これ以外の場合、「詳細な説明」における他の場所で定義、記載または考察され、すべてのこのような定義、記載および考察は、このような用語に帰することが意図される。また、このような用語および表現の使用において、示されたおよび記載された特徴またはこれらの一部のいかなる均等物も除外することを意図するものでもない。さらに、小見出し、例えば「定義」が「詳細な説明」において使用されているが、このような使用は、参照を容易にするためのものに過ぎず、ある見出し内において行われた任意の開示をこの見出しのみに限定することを意図するものではなく、１つの小見出しの下に為された任意の開示は、それぞれのおよびすべての他の小見出し下における開示を構成することが意図される。
【０１９１】
主張された本発明の範囲内で、様々な修飾が可能であることが認識される。従って、本発明は好ましい実施形態および任意の特徴の状況において具体的に開示されているが、本明細書に開示されている概念の修飾および変更を当業者が行使し得ることを理解すべきである。このような修飾および変更は、添付の特許請求の範囲によって定義されている本発明の範囲内にあると考えられる。
【図１Ａ】
2019047798.tif 000019
【図１Ｂ】
2019047798.tif 000020
【図１Ｃ】
2019047798.tif 000021
【図１Ｄ】
2019047798.tif 000022
【図２Ａ】
2019047798.tif 000023
【図２Ｂ】
2019047798.tif 000024
【図３Ａ】
2019047798.tif 000025
【図３Ｂ】
2019047798.tif 000026
【図３Ｃ】
2019047798.tif 000027
【図３Ｄ】
2019047798.tif 000028
【図４Ａ】
2019047798.tif 000029
【図４Ｂ】
2019047798.tif 000030
【図５】
2019047798.tif 000031
【図６】
2019047798.tif 000032
【図７】
2019047798.tif 000033
【図８】
2019047798.tif 000034
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月21日(2018.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における非定型スピッツ腫瘍の転移を予後予測するために、患者から得た腫瘍試料における、ＲＲＥＢ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫＮ２Ａ及びＭＹＣのコピー数を決定する方法であって、
（ｉ）ＲＲＥＢ１又はＣＣＮＤ１のコピー数の増加、
（ｉｉ）ＭＹＣのコピー数の増加、及び
（ｉｉｉ）ＣＤＫＮ２Ａのホモ接合性の欠失、
が、悪性の転移が起こる可能性があることを示す、方法。
【請求項２】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、ＲＲＥＢ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫＮ２Ａ及びＭＹＣのそれぞれのコピー数が決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）ＲＲＥＢ１のコピー数の増加、
（ｉｉ）ＣＣＮＤ１のコピー数の増加、
（ｉｉｉ）ＭＹＣのコピー数の増加、及び
（ｉｖ）ＣＤＫＮ２Ａのホモ接合性の欠失、
が、悪性の転移が起こる可能性があることを示す、請求項１に記載の方法。