(57)【要約】【課題】シンナムアルデヒドを製造するための組換え微生物に導入される発現カセットを提供する。【解決手段】シンナムアルデヒド生産用発現カセットは、ストレプトマイセス・マリチムス（Streptomyces maritimus）由来のｐａｌ（phenylalanine ammonia lyase）遺伝子、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）由来の４ｃｌ（4-coumarate:CoA ligase）遺伝子、及びシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来のｃｃｒ（cinnamoyl Co-A reductase）遺伝子を含む。【選択図】図１
2019071911.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトマイセス・マリチムス（Streptomyces maritimus）由来のｐａｌ（phenylalanine ammonia lyase）遺伝子、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）由来の４ｃｌ（4-coumarate:CoA ligase）遺伝子、及びシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来のｃｃｒ（cinnamoyl Co-A reductase）遺伝子を含む、シンナムアルデヒド生産用発現カセット。
【請求項２】
前記ｐａｌ遺伝子は、配列番号１または配列番号１９で表される塩基配列を有する、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項３】
前記ｐａｌ遺伝子は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項４】
前記４ｃｌ遺伝子は、配列番号３で表される塩基配列を有する、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項５】
前記４ｃｌ遺伝子は、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項６】
前記ｃｃｒ遺伝子は、配列番号５で表される塩基配列を有する、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項７】
前記ｃｃｒ遺伝子は、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の発現カセットを含む、シンナムアルデヒドの生産用ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターを含むシンナムアルデヒド生産用形質転換体。
【請求項１０】
前記形質転換体は、エシェリキア（Escherichia）属微生物である、請求項９に記載のシンナムアルデヒド生産用形質転換体。
【請求項１１】
請求項９に記載の形質転換体を培養する段階を含む、シンナムアルデヒドの製造方法。
【請求項１２】
前記形質転換体は、フェニルアラニンを含む培地で培養される、請求項１１に記載のシンナムアルデヒドの製造方法。
【請求項１３】
前記形質転換体は、カサミノ酸（casamino acid）を含む培地で培養される、請求項１１に記載のシンナムアルデヒドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え微生物を用いたシンナムアルデヒドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シンナムアルデヒドは、桂皮の香りと味を表す主要な成分であり、桂皮精油の９０％を占めている。主に桂皮油またはカシア油に濃い亜硫酸水素ナトリウム溶液を添加した後、生成された添加物を分離し、エタノールで洗浄して、淡硫酸または炭酸ナトリウム水溶液で分解して水蒸気蒸留した後、真空蒸留して製造する。またはベンズアルデヒド、水、水酸化ナトリウムの混合物を撹拌ながらアセトアルデヒドを一滴ずつ添加して反応させてベンゼンで抽出し、減圧下で分別蒸留して製造する。
【０００３】
シンナムアルデヒドは、多様な用途に使用される。例えば、特許文献１はシンナムアルデヒドの抗酸化活性について記載しており、特許文献２はシンナムアルデヒドの肥満治療効果について記載している。特許文献３は桂皮から分離したトランス−シンナムアルデヒドのＢ型肝炎の治療効果について記載している。
【０００４】
このように、多様な有用な効果が知られているシンナムアルデヒドを効果的に生産するための方法が研究される必要がある。特許文献４はベンズアルデヒド誘導体とビニルアセテートとを炭酸カリウムと水の存在下で、アセトニトリル溶媒中で加熱、還流させてシンナムアルデヒド誘導体を製造する方法について記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】韓国公開特許第２００３−００３３２８２号公報
【特許文献２】韓国登録特許第１０−０６８３１１３号公報
【特許文献３】韓国公開特許第２０１３−００３８０００号公報
【特許文献４】韓国登録特許第１０−０６２４２３６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Engels and Uhlmann、Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127、1988
【非特許文献２】Sambrook et al., 1989、Infra
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このような背景の下、本発明者らはシンナムアルデヒドを効率的に生産する方法を開発すべく鋭意研究努力した結果、ストレプトマイセス・マリチムス由来のｐａｌ遺伝子、ストレプトマイセス・セリカラー由来の４ｃｌ遺伝子、及びシロイヌナズナ由来のｃｃｒ遺伝子を含む組換え菌株を利用して、シンナムアルデヒドを高収率で生産することができることを確認し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の主な目的は、ストレプトマイセス・マリチムス（Streptomyces maritimus）由来のｐａｌ（phenylalanine ammonia lyase）遺伝子、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）由来の４ｃｌ（4-coumarate:CoA ligase）遺伝子、及びシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来のｃｃｒ（cinnamoyl Co-A reductase）遺伝子を含む、シンナムアルデヒド生産用発現カセットを提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記発現カセットを含む、シンナムアルデヒド生産用ベクターを提供することにある。
本発明の他の目的は、前記ベクターを含むシンナムアルデヒド生産用形質転換体を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記菌株を培養する段階を含む、シンナムアルデヒドの製造方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によるシンナムアルデヒド生産用発現カセット、それを含むベクター、それを含む形質転換体、及びそれを用いたシンナムアルデヒドの製造方法を用いる場合、優れた効率でシンナムアルデヒドを生成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一実施例によるシンナムアルデヒド生産システムに対する模式図を示したものである。
【図２】本発明の一実施例で使用されたＰＡＬ、４ＣＬ、ＣＣＲの発現のために構築したプラスミドを示したものである。
【図３】精製されたＰＡＬ、４ＣＬ、ＣＣＲタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで定量して表したものである。
【図４】最終的に生成されたケイ皮酸（cinnamate, CA）の濃度を定量して示したものである。
【図５】シンナムアルデヒド（cinnamaldehyde, CAD）の濃度を定量して示したものである。
【図６】複合培地１で形質転換体を培養した後、時間帯別に測定した光学密度（OD600;open circle）とそれに伴うシンナムアルデヒドの濃度（CAD con;closed circle）を示したものである。
【図７】複合培地２で形質転換体を培養した後、時間帯別に測定した光学密度（OD600;open circle）とそれに伴うシンナムアルデヒドの濃度（CAD con;closed circle）を示したものである。
【図８】制限培地１で形質転換体を培養した後、時間帯別に測定した光学密度（OD600;open circle）とそれに伴うシンナムアルデヒドの濃度（CAD con;closed circle）を示したものである。
【図９】制限培地２で形質転換体を培養した後、時間帯別に測定した光学密度（OD600;open circle）とそれに伴うシンナムアルデヒドの濃度（CAD con;closed circle）を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
前記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、シンナムアルデヒド生合成遺伝子を含む、シンナムアルデヒド生産用発現カセット、それを含むベクター、それを含む形質転換体、またはそれを用いたシンナムアルデヒドの製造方法を提供する。
【００１４】
本発明者らは、シンナムアルデヒド生合成遺伝子であるｐａｌ（phenylalanine ammonia lyase）遺伝子、４ｃｌ（4-coumarate:CoA ligase）遺伝子、及びｃｃｒ（cinnamoyl Co-A reductase）遺伝子を導入した微生物を製造した結果、前記の微生物から１．９８ｍｇ／Ｌの収率でシンナムアルデヒドを生成することを確認した（図６〜図９）。
【００１５】
また、ストレプトマイセス・マリチムス由来のＰＡＬ、ストレプトマイセス・セリカラー由来の４ＣＬ、シロイヌナズナ由来のＣＣＲの組み合わせが、他の微生物由来の遺伝子に比べて優れた活性を示すことを確認した（図４及び図５）。
【００１６】
以下、本発明におけるシンナムアルデヒド生産用発現カセットを具体的に説明する。
本明細書において、「シンナムアルデヒド生合成遺伝子」とは、ｐａｌ（phenylalanine ammonia lyase）遺伝子、４ｃｌ（4-coumarate:CoA ligase）遺伝子、及びｃｃｒ（cinnamoyl Co-A reductase）遺伝子を意味する。
【００１７】
前記ｐａｌ遺伝子は、ストレプトマイセス・マリチムス（Streptomyces maritimus）由来であり得る。本発明の一実施例では、ストレプトマイセス・マリチムス由来のＰＡＬ酵素は、シロイヌナズナＰＡＬ酵素に比べて酵素活性が優れることを確認した（図４）。
【００１８】
非限定的な一例として、前記ｐａｌ遺伝子は、配列番号１または配列番号１９で表される塩基配列を含むものであり得る。前記ｐａｌ遺伝子は、配列番号１または配列番号１９で表される塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列相同性を有する配列で表されるものであり得る。前記配列の中、１つ以上の塩基が置換、欠失、挿入またはこれらの組み合わせにより変異された配列も、それに含まれ得ることは自明である。
【００１９】
非限定的な一例として、前記ｐａｌ遺伝子は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するＰＡＬタンパク質をコードするものであり得る。前記ＰＡＬタンパク質は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（phenylalanine ammonia lyase）の活性を有する限り、配列番号２のアミノ酸配列のＮ−末端またはＣ−末端に多様なアミノ酸配列が付加されたすべてのペプチドを含むことができる。それだけでなく、前記ＰＡＬタンパク質は、標的化配列、タグ（ｔａｇ）、標識された残基、半減期またはペプチドの安定性を増加させるための特定の目的で考案されたアミノ酸配列を配列番号２で表されるペプチドのＮ−末端またはＣ−末端にさらに含まれるペプチドを意味することができる。また、前記ＰＡＬタンパク質は、前記配列番号２のアミノ酸配列の一部のアミノ酸が付加、置換、欠失などの方法で変異された変異体タンパク質を意味することができる。
【００２０】
前記４ｃｌ遺伝子は、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）由来であり得る。
非限定的な一例として、前記４ｃｌ遺伝子は、配列番号３で表される塩基配列を含むものであり得る。前記４ｃｌ遺伝子は、配列番号３で表される塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列相同性を有する配列で表されるものであり得る。前記配列の１つ以上の塩基が置換、欠失、挿入またはこれらの組み合わせにより変異された配列も、それに含まれ得ることは自明である。
【００２１】
非限定的な一例として、前記４ｃｌ遺伝子は、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する４ＣＬタンパク質をコードするものであり得る。前記４ＣＬタンパク質は、４−ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ＣｏＡ  ｌｉｇａｓｅの活性を有する限り、配列番号４のアミノ酸配列のＮ−末端またはＣ−末端に多様なアミノ酸配列が付加されたすべてのペプチドを含むことができる。それだけでなく、前記４ＣＬタンパク質は標的化配列、タグ（ｔａｇ）、標識された残基、半減期またはペプチドの安定性を増加させるための特定の目的で考案されたアミノ酸配列を配列番号４で表されるペプチドのＮ−末端またはＣ−末端にさらに含まれるペプチドを意味することができる。また、前記４ＣＬタンパク質は、前記配列番号４のアミノ酸配列の一部のアミノ酸が付加、置換、欠失などの方法で変異された変異体タンパク質を意味することができる。
【００２２】
前記ｃｃｒ遺伝子は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来であり得る。
非限定的な一例として、前記ｃｃｒ遺伝子は、配列番号５で表される塩基配列を含むものであり得る。前記ｃｃｒ遺伝子は、配列番号５で表される塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列相同性を有する配列で表されるものであり得る。前記配列の１つ以上の塩基が置換、欠失、挿入またはこれらの組み合わせにより変異された配列も、それに含まれ得ることは自明である。
【００２３】
非限定的な一例として、前記ｃｃｒ遺伝子は、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するＣＣＲタンパク質をコードするものであり得る。前記ＣＣＲタンパク質はｃｉｎｎａｍｏｙｌ  Ｃｏ−Ａ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅの活性を有する限り、配列番号６のアミノ酸配列のＮ−末端またはＣ−末端に多様なアミノ酸配列が付加されたすべてのペプチドを含むことができる。それだけでなく、前記ＣＣＲタンパク質は標的化配列、タグ（ｔａｇ）、標識された残基、半減期またはペプチドの安定性を増加させるための特定の目的で考案されたアミノ酸配列を配列番号６で表されるペプチドのＮ−末端またはＣ−末端にさらに含まれるペプチドを意味することができる。また、前記ＣＣＲタンパク質は、前記配列番号６のアミノ酸配列の一部のアミノ酸が付加、置換、欠失などの方法で変異された変異体タンパク質を意味することができる。
【００２４】
前記ポリヌクレオチドは、一つ以上の塩基が置換、欠失、挿入またはそれらの組み合わせにより変異することができる。ヌクレオチド配列を化学的に合成して製造する場合、当業界において広く公知となった合成法、例えば、非特許文献１に記述された方法を用いることができ、トリエステル、ホスファイト、ホスホラミダイト及びＨ−ホスフェート方法、ＰＣＲ、及びその他のオートプライマー方法、固体支持体上のオリゴヌクレオチド合成法などにより製造することもできる。
【００２５】
本発明の一実施例において、ストレプトマイセス・セリカラー由来の４ＣＬとシロイヌナズナ由来のＣＣＲの組み合わせを使用する場合は、シロイヌナズナ由来の４ＣＬとシロイヌナズナ由来のＣＣＲの組み合わせに比べて酵素活性が優れることを確認した（図５）。
【００２６】
本明細書において配列と関連して使用された用語、「相同性」とは、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と一致する程度を意味し、パーセンテージで表示することができる。本明細書において、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と同一または類似の活性を有するその相同性配列が「％相同性」と示される。例えば、スコア（score）、同一性（identity）及び類似度（similarity）などのパラメータ（parameter）を計算する標準ソフトウェア、具体的にはＢＬＡＳＴ２．０を用いたり、定義された厳格な条件の下でサザン混成化実験により配列を比較することにより確認することができ、定義される適切な混成化条件は、当該技術の範囲内であり（非特許文献２）、当業者によく知られている方法で決定することができる。
【００２７】
前記遺伝子は、形質転換体にコドン最適化されたものであり得る。前記コドンの最適化は、宿主での前記遺伝子の発現をより効率的にするために遺伝子のコドンを、前記宿主遺伝子で高い頻度で使用されるコドンで置換することを意味する。最適化のための方法は、当業界において形質転換体でのタンパク質発現を増加するために使用される方法であれば、限定なく使用することができる。
【００２８】
本明細書において、「発現カセット」とは、シンナムアルデヒド生合成遺伝子を含め、シンナムアルデヒドを発現させる単位カセットを意味する。また、本発明において発現カセットは、発現構造体と混用することができる。本発明による発現カセットは、本発明の目的上、菌株に導入され、シンナムアルデヒドを生成することができる。
【００２９】
他の態様として、本発明は、前記発現カセットを含む、シンナムアルデヒド生産用ベクターを提供する。
本明細書において、「ベクター」または「発現ベクター」とは、適切な宿主内で目的タンパク質を発現させるように、適切な調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始することができるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含む。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノムそのものに統合することができる。
【００３０】
前記ベクターは、前記シンナムアルデヒド生合成遺伝子が作動可能に連結されて含まれたものであり得る。本発明において、「作動可能に連結された（operably linked）」とは、一般的な機能を行うように核酸発現調節配列と、目的とするタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸配列が機能的に連結（functional linkage）されているものをいう。例えば、プロモーターとタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸配列が作動可能に連結され、コーディング配列の発現に影響を与えることができる。組換えベクターとの作動的な連結は、当該技術分野においてよく知られている遺伝子組換え技術を利用して製造することができ、部位−特異的ＤＮＡ切断及び連結は、当該技術分野において一般的に知られている酵素などを使用することができる。
【００３１】
本発明で使用される発現ベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界において知られている任意のベクターを用いることができる。通常使用されるベクターの例としては、天然の状態であるか、組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージを挙げることができる。例えば、ファージベクター、またはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＭＢＬ３、λＭＢＬ４、λＩＸＩＩ、λＡＳＨＩＩ、λＡＰＩＩ、λｔ１０、λｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用することができ、プラスミドベクターとしてｐＥＴ系、ｐＴｒｃ系、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＭＡＬ系またはｐＨＴ系などを用いることができる。本発明で使用可能なベクターは、特に制限されるものではなく、公知となった発現ベクターを使用することができる。具体的には、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＴｒｃ９９ａ、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣ、ｐＭＡＬ−ｐ２ｘまたはｐＨＴ４３ベクターなどを使用することができる。
【００３２】
本発明のベクターは、相同組換えを起こして染色体に挿入されることができるため、前記染色体に挿入するかどうかを確認するための選別マーカー（selection marker）をさらに含むことができる。
【００３３】
適切な発現ベクターは、プロモーター、オペレーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、エンハンサーなどのような発現調節要素以外にも、膜標的化または分泌のための信号配列またはリーダー配列を含み、目的に応じて多様に製造することができる。開始コドン及び終止コドンは、一般に標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部とみなされ、遺伝子作製物が投与されたとき、個体で必ず作用を示さなければならず、コーディング配列とイン・フレーム（in frame）に含まれることができる。ベクターのプロモーターは、構成的または誘導性であり得る。また、発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合、複製起源を含むことができる。ベクターは、自己複製したり、宿主ＤＮＡに組み込むことができる。
【００３４】
また、前記発現ベクターは、シンナムアルデヒドの検出を容易にするために、任意にエンドペプチダーゼを使用して除去することができるタンパク質タグをさらに含むことができる。前記タグ（tag）とは、定量可能な活性または特性を示す分子を意味し、フルオレセインのような化学的蛍光物質（fluoracer）、蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または関連するタンパク質のようなポリペプチド蛍光物質を含む蛍光分子であることもでき；Ｍｙｃタグ、フラグ（Ｆｌａｇ）タグ、ヒスチジンタグ、ロイシンタグ、ＩｇＧタグ、ストレプトアビジンタグなどのエピトープタグであることもできる。特に、エピトープタグを使用する場合、好ましくは、６個以上のアミノ酸残基で構成され、より好ましくは８個〜５０個のアミノ酸残基で構成されたペプチドタグを使用することができる。
【００３５】
ベクターを製造する方法は、特に制限されず、当該技術分野において通常使用される方法であれば、いずれのものでも使用することができる。
他の態様として、本発明は、前記ベクターを含むシンナムアルデヒド生産用形質転換体を提供する。
【００３６】
本発明において、「生産」とは、シンナムアルデヒドを菌株内で作り出すだけでなく、シンナムアルデヒドを細胞外、例えば、培養液に排出することも含む概念である。
本明細書において、「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させるようにすることを意味することができる。
【００３７】
前記形質転換の方法は、当業界において知られている方法であれば、限定されずに使用することができるが、シンナムアルデヒドを生成することができる限り、特にそれに限定されないが、ＣａＣｌ２沈殿法、ＣａＣｌ２沈殿法にＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）という還元物質を使用することにより効率を高めたＨａｎａｈａｎ方法、電気穿孔法（electroporation）、リン酸カルシウム沈殿法、原形質融合法、シリコンカーバイド繊維を用いた攪拌法、アグロバクテリア媒介された形質転換法、ＰＥＧを用いた形質転換法、デキストラン硫酸、リポフェクタミン及び乾燥／抑制媒介された形質転換方法などを用いることができる。
【００３８】
形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内に発現しさえすれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体以外に位置するかに関係なく、それらをいずれも含む。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現されるものであれば、いかなる形態で導入されても関係ない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されるが、必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入することができる。
【００３９】
前記形質転換体として使用することができる微生物は、エシェリキア属（Escherichia sp.）、シゲラ属（Shigella sp.）、シトロバクター属（Citrobacter sp.）、サルモネラ属（Salmonella sp.）、エンテロバクター属（Enterobacter sp.）エルシニア属（Yersinia sp.）、クレブシエラ属（Klebsiella sp.）、エルウイニア属（Erwinia sp.）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium sp.）、ラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）、セレノモナス属（Selenomanas sp.）、ビブリオ属（Vibrio sp.）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）、ストレプトマイシス属（Streptomyces sp.）、アルカノバクテリウム属（Arcanobacterium sp.）、アルカリゲネス属（Alcaligenes sp.）などに属する微生物であり得るが、それに限定されない。具体的には、エシェリキア属微生物であることができる。
【００４０】
他の態様として、本発明は、前記形質転換体を培養する段階を含む、シンナムアルデヒド製造方法を提供する。
本発明の具体的な一実施形態では、前記シンナムアルデヒド生産能を有する形質転換体を培養した後、その培養物に含まれたシンナムアルデヒド生産量を測定した結果、前記微生物から１．９８ｍｇ／Ｌの収率でシンナムアルデヒドを生成することができることを確認した（図６〜図８）。
【００４１】
本発明の用語「培養」とは、微生物を適当に人工的に調節した環境条件で生育させる方法を意味する。本発明において、前記形質転換体を培養する方法は、当業界において広く知られている方法を用いて行うことができる。具体的には、前記培養は、本発明のシンナムアルデヒドを発現させて生産することができる限り、特にそれに限定されないが、公知となった回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行うことができる。
【００４２】
培養条件は、特にこれに限定されないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）を使用し、適正のｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８、最も好ましくはｐＨ６．８）を調節することができ、酸素または酸素−含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持することができ、培養温度は２０〜４５、好ましくは２５〜４０を維持することができ、約１０〜１６０時間培養することが好ましい。
【００４３】
前記培養のために使用される培地は、適切な炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミンなどを含有した通常の培地内で温度、ｐＨなどを調節しながら、適切な方式で特定の菌株の要件を満たすことができる。
【００４４】
使用される炭素供給源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、デンプン及びセルロース）、油脂及び脂肪（例えば、大豆油、ひまわり油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール及びエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に使用したり、または混合して使用することができる。
【００４５】
窒素供給源としては、窒素−含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、コーン浸漬液、大豆粕粉及びウレア）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に使用したり、または混合して使用することができる。
【００４６】
リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別に使用したり、または混合して使用することができ；その他の金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンのような必須成長−促進物質を含むことができる。
【００４７】
また、培養培地に適切な前駆体が使用されることができる。前記原料は、培養過程で培養物に適切な方式により回分式、流加式または連続式で添加されることができるが、特にそれに限定されない。水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような基礎化合物またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方式で使用して培養物のｐＨを調節することができる。
【００４８】
本明細書において、前記培地は培養液と同じ意味で使用することができる。
一例として、前記製造方法は、培養された形質転換体またはその培養物からシンナムアルデヒドを回収する段階をさらに含むことができる。
【００４９】
本明細書において、「培養物」とは、微生物の培養結果として得られる物質であり、前記培地、培養された微生物、及び培養された微生物から分泌される物質を全て含むものであり得る。例えば、菌体を培養するために必要な栄養供給源、例えば、炭素源、窒素源など以外に、無機塩成分、アミノ酸、ビタミン、核酸及び／またはその他、一般に培養培地（または培養液）に含有される成分が含まれていることができる。また、例えば、菌体が生産・分泌した酵素などが含まれていることができる。
【００５０】
培養により生産されたシンナムアルデヒドは、培地中に分泌されたり、細胞内に残留することができるため、前記培養物は、微生物の培養により生産されたシンナムアルデヒドを含むことができる。
【００５１】
本発明の前記培養段階で生産されたシンナムアルデヒドを回収する方法は、培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式培養方法などにより当該分野において公知となった適切な方法を用いて培養液からシンナムアルデヒドを収集することができる。具体的には、前記回収方法は、例えば、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈殿、結晶化、電気泳動、分別溶解（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性及びサイズ排除）などの方法を使用することができる。
【００５２】
一例として、前記製造方法は、前記回収されたシンナムアルデヒドを精製する段階をさらに含むことができる。前記精製段階は、免疫親和性クロマトグラフィー、受容体親和性クロマトグラフィー、疎水性作用クロマトグラフィー、レクチン親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣなどを含む従来のクロマトグラフィー方法により行うことができる。また、所望のタンパク質が特異的タグ、ラベルまたはキレート一部分を有する融合タンパク質であるため、特異的結合パートナーまたは製剤により認識して精製する方法がある。精製されたタンパク質は、所望のタンパク質部分に切断されたり、それ自体で残ることができる。融合タンパク質の切断により切断過程で付加的なアミノ酸を有する所望のタンパク質の形態が作られる。
【００５３】
一例として、前記形質転換体は、フェニルアラニンを含む培地で培養されるものであり得る。前記形質転換体に含まれたｐａｌ遺伝子は、フェニルアラニンを基質として使用するため、フェニルアラニンを含む培地で培養した場合、優れた効率でシンナムアルデヒドを生成することができる。
【００５４】
一例として、前記形質転換体は、カサミノ酸（casamino acid）を含む培地で培養されるものであり得る。本発明の一実施例において、シンナムアルデヒド生合成遺伝子を含む形質転換体をカサミノ酸を含む培地で培養した結果、最大生産収率が１．９８ｍｇ／Ｌと高く示されたのに対し、カサミノ酸を含まない培地で培養した結果、最大生産収率は１．２３ｍｇ／Ｌで示された。
【００５５】
以下、本発明を下記例により詳しく説明する。ただし、下記例は本発明を例示するためのものに過ぎず、下記例により本発明の範囲が制限されるものではない。
実施例１．組換え遺伝子発現のための菌株及びプラスミド制作
まず、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ｃＤＮＡから下記表１に記載された配列のＢＨＢ２２−Ｆ及びＢＨＢ２２−Ｒ、ＢＨＢ２０−Ｆ及びＢＨＢ２０−Ｒ、ＢＨＢ１９−Ｆ及びＢＨＢ１９−Ｒを利用して重合酵素連鎖反応を通じてｐａｌ（phenylalanine ammonia-lyase、配列番号１７）、４ｃｌ（4-coumarate:CoA ligase、配列番号１８）、ｃｃｒ（cinnamoyl-CoA reductase、配列番号５）遺伝子を得た。
【００５６】
また、コドン最適化されて合成したストレプトマイセス・マリチムス（Streptomyces maritimus）ｐａｌ遺伝子から下記表１に記載された配列のＢＨＢ  ３１−Ｆ及びＢＨＢ  ３１−Ｒを使用し、重合酵素連鎖反応を通じてｐａｌ遺伝子（配列番号１９）を得た。また、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）遺伝体ＤＮＡ（genomic DNA）から下記表１に記載された配列のＢＨＢ  ２１−Ｆ及びＢＨＢ  ２１−Ｒを用いて重合酵素連鎖反応を通じて４ｃｌ遺伝子（配列番号３）を得た。
【００５７】
【表１】
2019071911.tif 000003
【００５８】
それぞれの重合酵素連鎖反応産物を制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、下記表２及び図２に記載された各ベクターにライゲーション（ligation）した。
【００５９】
【表２】
2019071911.tif 000004
【００６０】
ライゲーションが完了したｐＨＢ−Ｉ０１、ｐＨＢ−Ｉ０２、ｐＨＢ−Ｉ０３、ｐＨＢ−Ｉ０４、またはｐＨＢ−Ｉ０５ベクターは、大腸菌菌株ＭＧ１６５５を経て最終的にＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた。ｐＨＢ−Ｐ０１ベクターは、大腸菌菌株ＮＳＴ７４に形質転換させた。
【００６１】
実施例２．ＰＡＬ、４ＣＬ、ＣＣＲタンパク質の分離精製
大腸菌菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＮＳＴ７４菌株を２％のグルコースと１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ampicillin）を含むＬＢ（Luria-Bertani）培地に接種した。これを３７℃、２００ｒｐｍの条件で１２時間培養した後、新しいＬＢ培地に１／１００体積だけ移した。その後、同様な条件でＯＤ６００が０．６に到達するまで培養した。
【００６２】
その後、ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株は、タンパク質の生産のために、２５℃、２００ｒｐｍの条件で３０分間適応させた後、１ｍＭのＩＰＴＧ（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）を添加し、６時間さらに培養した。一方、ＮＳＴ７４菌株は３７℃、２００ｒｐｍの条件で１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加した後、培養した。
【００６３】
その後、前記培養液を４℃、６０００ｒｐｍの条件で１０分間遠心分離して上澄液を除去した。これをバッファー（５０ｍＭ リン酸カリウム、３００ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）で再懸濁（resuspension）し、超音波細胞破砕機を利用し、破砕して細胞懸濁液を得た。その後、前記細胞懸濁液を４℃、１００００ｒｐｍの条件で１０分間遠心分離し、水溶性の上層液の部分を得た。
【００６４】
その後、前記細胞懸濁液からＩＭＡＣ（immobilized metal affinity chromatography）を利用して８Ｘヒスチジンタグ（Histidine tag）を有するＰＡＬ、４ＣＬ、ＣＣＲタンパク質を精製した。
【００６５】
また、前記水溶性の上層液の部分を０．４５μｍでフィルタした後、結合バッファー（binding buffer:５０ｍＭ リン酸カリウム、３００ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）で前処理されたＴａｌｏｎ（Ｒ）金属親和樹脂に加えた。その後、前記樹脂を、１０ｍＬの洗浄バッファー（washing buffer:５０ｍＭ リン酸カリウム、３００ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．０）で洗浄した後、１ｍＭの溶出バッファ（elution buffer:５０ｍＭ リン酸カリウム、３００ｍＭ 塩化ナトリウム、１５０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．０）を用いて最終的にタンパク質を精製した。
【００６６】
実験例１．ＰＡＬ、４ＣＬ、ＣＣＲタンパク質の定量
前記精製されたタンパク質を１２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）を用いたデンシトメトリー（densitometry）方法とＢＳＡ（bovine serum albumin）を用いた総タンパク質定量法を通じて定量し、図３に示した。
【００６７】
図３において、レーンＭはタンパク質のサイズを示し、レーン１〜３はシロイヌナズナＰＡＬ酵素の全体（total）部分、水溶性（soluble）部分、精製後の溶出（elution）部分であり、レーン４〜６はシロイヌナズナ４ＣＬ酵素の全体部分、水溶性部分、精製した後の溶出部分、レーン７〜９はシロイヌナズナＣＣＲ酵素の全体部分、水溶性部分、精製した後の溶出部分、レーン１０〜１２はストレプトマイセス・マリチムスＰＡＬ酵素の全体部分、水溶性部分、精製した後の溶出部分、そしてレーン１３〜１５はストレプトマイセス・セリカラー４ＣＬ酵素の全体部分、水溶性部分、精製した後の溶出部分を示したものである。
【００６８】
各タンパク質のサイズは、シロイヌナズナＰＡＬは７８ｋＤａ（solid arrow）、シロイヌナズナ４ＣＬは６１ｋＤａ（dashed arrow）、シロイヌナズナＣＣＲは３７ｋＤａ（closed triangle）、ストレプトマイセス・マリチムスＰＡＬは５６ｋＤａ（open triangle）、ストレプトマイセス・セリカラー４ＣＬは５５ｋＤａ（open triangle）で示され、ＰＡＬ、４ＣＬ、ＣＣＲタンパク質がそれぞれよく生成されたことを確認した。
【００６９】
実験例２．酵素の活性分析
前記実施例２で精製したＰＡＬ、４ＣＬ、ＣＣＲタンパク質の活性は、細胞外の反応を通じて分析した。
【００７０】
まず、ＰＡＬの活性分析のために１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２ｍＭフェニルアラニン、精製したＰＡＬ酵素２００μｇ／ｍＬを反応させた。また、４ＣＬ及びＣＣＲの活性分析のために、４００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭの塩化マグネシウム（magnesium chloride）、０．３ｍＭのコエンザイムＡ（Coenzyme A）、０．５ｍＭのトランス−ケイ皮酸（trans-cinnamate）及び精製した４ＣＬ及びＣＣＲ酵素をそれぞれ５０μｇ／ｍＬずつ反応させた。
【００７１】
前記反応を、３０℃で１時間行った後、ＰＡＬ酵素により生成されたケイ皮酸、そして４ＣＬとＣＣＲ酵素により生成されたシンナムアルデヒド（cinnamaldehyde）を逆相高性能液体クロマトグラフィー（reverse-phase high-performance liquid chromatography、reverse-phase HPLC）を通じて分析した。具体的には、ＺＯＲＢＡＸ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＡＡＡカラム（150 X 4.6 mm;3.5μm;Agilent, CA, USA）で、移動相Ａ（mobile phase A）は０．１％トリフルオロ酢酸（trifluoroacetic acid）、移動相Ｂ（mobile phase B）はアセトニトリル（acetonitrile）を使用した。アセトニトリル（acetonitrile）の割合は、最初の１分間は１０％、それ以降の０９分間は７０％に段階的に変更した。カラムの温度は４０℃、流速は１ｍＬ／ｍｉｎと固定した。
【００７２】
標準溶液（standard solution;１，１０，５０，１００，２００ｍｇ／Ｌ ケイ皮酸及び０．４１，４．１，４１，８２，１３６．７ｍｇ／Ｌ シンナムアルデヒド）を使用して標準曲線（standard curve）を作成し、これを利用して最終的に生成されたケイ皮酸（cinnamate、図４にＣＡで表記）及びシンナムアルデヒド（cinnamaldehyde、図５にＣＡＤと表記）を定量した。
【００７３】
その結果、図４で示されるように、シロイヌナズナ由来のＰＡＬに比べてストレプトマイセス・マリチムス（Streptomyces maritimus）由来のＰＡＬの活性が優れることが示された。また、図５で示されるように、ストレプトマイセス・マリチムス由来の４ＣＬとシロイヌナズナ由来のＣＣＲとの組み合わせを使用する場合は、シロイヌナズナ由来の４ＣＬとシロイヌナズナ由来のＣＣＲとの組み合わせに比べて酵素活性が優れることが示された。
【００７４】
実験例３．細胞高濃度培養（High-cell density cultivation）
まず、Ｒ／２  ｓｅｍｉ−ｄｅｆｉｎｅｄ培地（６．７５ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、２ｇ／Ｌリン酸二アンモニウム、０．８５ｇ／Ｌクエン酸、０．７ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム七水和物、５ｍＬ／Ｌ微量金属溶液（ＴＭＳ;１０ｇ／Ｌ硫酸鉄七水和物、２．２ｇ／Ｌ硫酸亜鉛七水和物、２ｇ／Ｌ塩化カルシウム二水和物、１ｇ／Ｌ硫酸銅五水和物、０．５８ｇ／Ｌ硫酸マンガン五水和物、０．１ｇ／Ｌ七モリブデン酸アンモニウム四水和物、０．０２ｇ／Ｌ四ホウ酸ナトリウム十水和物、ｐＨ６．８）に適応された、ＰＨＢ−Ｐ０１を含む大腸菌菌株ＮＳＴ７４を２００ｍＬの量で３７℃、２００ｒｐｍで１２時間培養した。
【００７５】
その後、同一な培地１．８Ｌに接種し、合計２Ｌの量で５Ｌサイズのバイオリアクターで高濃度培養した。ｐＨが６．７７より低くなる場合には５０％（ｖ／ｖ）のアンモニア（ammonia）を、６．８６より高くなる場合には、餌培地（feeding solution）を供給した。餌培地には、複合培地１（complex feeding solution 1;５００ｇ／Ｌグルコース、７５ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム七水和物）、複合培地２（complex feeding solution 2;５００ｇ／Ｌグルコース、１００ｇ／Ｌカサミノ酸（casamino acid）、２０ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム七水和物）、制限培地１（defined feeding solution;７００ｇ／Ｌグルコース、２０ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム七水和物）、または制限培地２（defined feeding solution;５００ｇ／Ｌグルコース、２０ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム七水和物、０．８１ｇ／Ｌフェニルアラニン）を使用した。
【００７６】
温度は３７℃に維持させ、溶存酸素（ＤＯ）は、攪拌速度（agitation rate）を１０００ｒｐｍまで上昇させた後、酸素を供給して４０％に維持させた。光学密度（optical density、OD600）が６０に達すると、タンパク質（酵素）を生成させるためにＩＰＴＧ  １ｍＭを供給した。泡抑制剤は、滅菌後に手動で供給した。
【００７７】
培養した大腸菌菌株は、時間帯別に光学密度（ＯＤ６００）が４になるように別々に集めてタンパク質分析に用いた。培養液の上澄液は０．２２μｍでフィルター（filter）して逆相高性能液体クロマトグラフィー（reverse-phase HPLC）分析を通じてシンナムアルデヒドの定量に用いた。
【００７８】
図６は、前記餌培地として複合培地１を使用した後、時間帯別に測定した光学密度（OD600;open circle）とそれに伴うシンナムアルデヒドの濃度（CAD con;closed circle）を示す。最大生産収率は１．２３ｍｇ／Ｌであった。
【００７９】
図７は、前記餌培地として複合培地２を使用した後、時間帯別に測定した光学密度（OD600;open circle）とそれに伴うシンナムアルデヒドの濃度（CAD con;closed circle）を示す。最大生産収率は１．９８ｍｇ／Ｌであった。
【００８０】
図８は、前記餌培地として制限培地１を使用した後、時間帯別に測定した光学密度（OD600;open circle）とそれに伴うシンナムアルデヒドの濃度（CAD con;closed circle）を示す。最大生産収率は０．７１ｍｇ／Ｌであった。
【００８１】
図９は、前記餌培地として制限培地２を使用した後、時間帯別に測定した光学密度（OD600;open circle）とそれに伴うシンナムアルデヒドの濃度（CAD con;closed circle）を示す。最大生産収率は１．０５ｍｇ／Ｌであった。
【００８２】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せずに、他の具体的な形態で実施されることがあることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
したがって、本発明は、シンナムアルデヒド生産用発現カセット、それを含むシンナムアルデヒド生産用ベクター、それを含むシンナムアルデヒド生産用形質転換体、及びそれを用いたシンナムアルデヒドの製造方法を提供することができる。
【図１】
2019071911.tif 000005
【図２】
2019071911.tif 000006
【図３】
2019071911.tif 000007
【図４】
2019071911.tif 000008
【図５】
2019071911.tif 000009
【図６】
2019071911.tif 000010
【図７】
2019071911.tif 000011
【図８】
2019071911.tif 000012
【図９】
2019071911.tif 000013
【配列表】
2019071911000001.app