(57)【要約】      （修正有）【課題】根寄生植物を効果的に防除することができる根寄生植物の防除剤及び根寄生植物の防除方法。【解決手段】プランテオースの加水分解を触媒するα-ガラクトシダーゼの阻害剤を含有することを特徴とする根寄生植物の防除剤を提供。例えば、下記の防除剤。2019147749.tif 000044【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プランテオースの加水分解を触媒するα-ガラクトシダーゼの阻害剤を含有することを特徴とする根寄生植物の防除剤。
【請求項２】
プランテオースの加水分解を触媒するα-ガラクトシダーゼの阻害剤が
【化１】
2019147749.tif 000032
(I)
式(I)中、
Ｒaは、ナフチル基、フェニル基、フェニルＣ１〜Ｃ４アルキル基又はＣ１〜Ｃ１２アルキル基であり、ここで、ナフチル基、フェニル基又はフェニルアルキル基のフェニルは、ハロゲン、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキルオキシ基又はＣ１〜Ｃ６アルキルオキシカルボニル基で置換されていてもよく、隣り合う２つのＣ１〜Ｃ６アルキル基及び/又はＣ１〜Ｃ６アルキルオキシ基はそれぞれが結合する炭素と共に環を形成してもよく、また、アルキル基又はフェニルアルキル基のアルキルは、ハロゲン、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ１〜Ｃ６アルキルオキシ基で置換されていてもよく、
各Ｘは、独立して-ＣＲ1Ｒ2-(ここで、Ｒ1及びＲ2は各々独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基若しくはＣ１〜Ｃ６アルキルオキシ基であるか、又はＲ1及びＲ2は一緒になって=Ｏ若しくは=Ｓである)又は-ＳＯ2-であり、
ｍ＝１又は２であり、
Ｙは、結合手、-ＣＲ3Ｒ4-、-ＣＲ5Ｒ6-Ｏ-又は-ＣＲ7Ｒ8-Ｓ-(ここで、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は各々独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ１〜Ｃ６アルキルオキシ基である)であり、
Ｚ1は-Ｎ<又は-ＣＲz1<(ここで、Ｒz1はＺ5のＲz13と一緒になって結合手を形成している)であり
Ｚ2は-ＣＲz2Ｒz3-(ここで、Ｒz2及びＲz3は一緒になって=Ｏ又は=Ｓであるか、或いは、Ｒz2は水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ１〜Ｃ６アルキルオキシ基であり、Ｒz3はＺ3のＲz6と一緒になって結合手を形成している)であり、
Ｚ3は-ＮＲz4-(ここで、Ｒz4は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキルオキシ基又はＣ２〜Ｃ６アルケニル基であるか、或いは、Ｚ4のＲz8と一緒になって結合手を形成している)又は-ＣＲz5Ｒz6-(ここで、Ｒz5は水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ１〜Ｃ６アルキルオキシ基であり、Ｒz6はＺ2のＲz3と一緒になって結合手を形成している)であり、
Ｚ4は-ＣＲz7Ｒz8-(ここで、Ｒz7は水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ１〜Ｃ６アルキルオキシ基又はフェニル基であり、該フェニル基は、ハロゲン、ヒドロキシ基、ニトロ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ１〜Ｃ６アルキルオキシ基で置換されていてもよく、Ｒz8はＺ5のＲz11若しくはＺ3のＲz4と一緒になって結合手を形成している)又は-ＣＲz9ＣＲz10-(ここで、Ｒz9及びＲz10は各々独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキルオキシ基又フェニル基であるか、或いはＲz9及びＲz10は一緒になってベンゼン環を形成し、該環はハロゲン、ヒドロキシ基、ニトロ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ１〜Ｃ６アルキルオキシ基で置換されていてもよい)であり、
Ｚ5は-ＮＲz11-(ここで、Ｒz11は、Ｚ4のＲz8と一緒になって結合手を形成しているか、或いは、水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキルオキシ基又はＣ２〜Ｃ６アルケニル基である)又は-ＣＲz12Ｒz13-(式中、Ｒz12は水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ１〜Ｃ６アルキルオキシ基であり、Ｒz13はＺ1のＲz1と一緒になって結合手を形成している)である)；
【化２】
2019147749.tif 000033
【化３】
2019147749.tif 000034
(式中、
Ｒb及びＲcは、各々独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ１〜Ｃ６アルキルオキシ基であるか、又は一緒になって結合手を形成し、
Ｒdは、水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ１〜Ｃ６アルキルオキシ基であり、
各Ｒdは、独立して、ハロゲン、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ１〜Ｃ６アルキルオキシ基であり、
ｎは０〜９の整数である)；
【化４】
2019147749.tif 000035
【化５】
2019147749.tif 000036
(式中、各Ｒfは独立してハロゲン、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ１〜Ｃ６アルキルオキシ基であり、ｐ＝０〜５の整数である)；
【化６】
2019147749.tif 000037
(式中、各Ｒg及び各Ｒhは、ハロゲン、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ１〜Ｃ６アルキルオキシ基であり、ｑ＝０〜５の整数、ｑ＝０〜５の整数である)
からなる群より選択される請求項１に記載の防除剤。
【請求項３】
プランテオースの加水分解を触媒するα-ガラクトシダーゼ活性の阻害剤が
【化７】
2019147749.tif 000038
(式中、Ｒa、Ｒz4及びＲz7は上記と同義である)
又は
【化８】
2019147749.tif 000039
(I-2)
(式中、Ｒa、Ｒz4、Ｒz9、Ｒz10及びＲz12は上記と同義である)
又は
【化９】
2019147749.tif 000040
(I-3)
(式中、Ｒa、Ｙ、Ｒz2、Ｒz5、Ｒz9、Ｒz10及びＲz12は上記と同義である)
である請求項１又は２に記載の防除剤。
【請求項４】
プランテオースの加水分解を触媒するα-ガラクトシダーゼ活性の阻害剤が
【化１０】
2019147749.tif 000041
(式中、
各Ｒjは独立してハロゲン、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシ基又はＣ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシカルボニル基であり、
ｔ＝０〜５の整数であり、
各Ｒi、ｓ及びＲz4は、上記と同義である)
【化１１】
2019147749.tif 000042
(I-3-ia)
(式中、
各Ｒkは独立してハロゲン、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシ基又はＣ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシカルボニル基であり、
ｕ＝０〜４の整数であり、
各Ｒj、ｓ、Ｒz4及びＲz12は、上記と同義である)
【化１２】
2019147749.tif 000043
(I-4-ia)
(式中、
各Ｒjは独立してハロゲン、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシ基又はＣ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシカルボニル基であり、
ｔ＝０〜５の整数であり、
各Ｒi、ｓ、Ｒz4及びＲz7は、上記と同義である)
である請求項１〜３のいずれか１項に記載の防除剤。
【請求項５】
根寄生植物がハマウツボ科に属する植物である請求項１〜４のいずれか１項に記載の防除剤。
【請求項６】
根寄生植物がハマウツボ属(Orobanche)、ストライガ属(Striga)又はフェリパンキ属(Phelipanche)に属する植物である請求項１〜５のいずれか１項に記載の防除剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の防除剤を用いることを特徴とする根寄生植物の防除方法。
【請求項８】
(i)配列番号２の１位〜412位のアミノ酸配列、２位〜412位のアミノ酸配列、３位〜412位のアミノ酸配列、４位〜412位のアミノ酸配列、５位〜412位のアミノ酸配列、６位〜412位のアミノ酸配列、７位〜412位のアミノ酸配列、８位〜412位のアミノ酸配列、９位〜412位のアミノ酸配列、10位〜412位のアミノ酸配列、11位〜412位のアミノ酸配列、12位〜412位のアミノ酸配列、13位〜412位のアミノ酸配列、14位〜412位のアミノ酸配列、15位〜412位のアミノ酸配列、16位〜412位のアミノ酸配列、17位〜412位のアミノ酸配列、18位〜412位のアミノ酸配列、19位〜412位のアミノ酸配列、20位〜412位のアミノ酸配列、21位〜412位のアミノ酸配列、22位〜412位のアミノ酸配列、23位〜412位のアミノ酸配列、24位〜412位のアミノ酸配列、25位〜412位のアミノ酸配列、26位〜412位のアミノ酸配列、27位〜412位のアミノ酸配列、28位〜412位のアミノ酸配列、29位〜412位のアミノ酸配列、30位〜412位のアミノ酸配列、31位〜412位のアミノ酸配列、32位〜412位のアミノ酸配列、33位〜412位のアミノ酸配列、34位〜412位のアミノ酸配列若しくは35位〜412位のアミノ酸配列、
(ii)(i)のアミノ酸配列と少なくとも90％の配列相同性を有するアミノ酸配列、
(iii)(i)若しくは(ii)のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入及び/若しくは欠失されたアミノ酸配列、又は
(iv)(i)〜(iii)のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌクレオチド分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド分子の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列
からなるタンパク質であることを特徴とする、プランテオースの加水分解を触媒するα-ガラクトシダーゼ。
【請求項９】
Ｎ末端及び/又はＣ末端にタグが付されている請求項８に記載のα-ガラクトシダーゼ。
【請求項１０】
請求項８に記載のα-ガラクトシダーゼをコードする塩基配列からなる核酸分子。
【請求項１１】
塩基配列が
(i)配列番号１の103位〜1236位、100位〜1236位、97位〜1236位、94位〜1236位、91位〜1236位、88位〜1236位、85位〜1236位、82位〜1236位、79位〜1236位、76位〜1236位、73位〜1236位、70位〜1236位、67位〜1236位、64位〜1236位、61位〜1236位、58位〜1236位、55位〜1236位、52位〜1236位、49位〜1236位、46位〜1236位、43位〜1236位、40位〜1236位、37位〜1236位、34位〜1236位、31位〜1236位、28位〜1236位、25位〜1236位、22位〜1236位、19位〜1236位、16位〜1236位、13位〜1236位、10位〜1236位、７位〜1236位、４位〜1236位若しくは１位〜1236位の塩基配列、又は
(ii)(i)の塩基配列からなるヌクレオチド分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド分子の塩基配列
である請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１２】
5'末端及び/又は3'末端にタグのアミノ酸配列をコードする塩基配列が付加されている請求項１０又は１１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターを含んでなる細胞。
【請求項１５】
被検物質の存在下に請求項８又は９に記載のタンパク質とα-ガラクトシダーゼ基質とを接触させて、該タンパク質によるα-ガラクトシダーゼ基質のいずれかの分解産物を検出する工程を含むことを特徴とする、根寄生植物の防除剤の有効成分として用い得る物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、根寄生植物を効果的に防除することができる根寄生植物の防除剤及び根寄生植物の防除方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
根寄生植物は、世界の農業に甚大な被害をもたらしている。例えば、ハマウツボ属植物やフェリパンキ属植物は、地中海沿岸地域や東西ヨーロッパ、西アジアに分布し、野菜や豆類などの農作物に被害を与えている。ストライガ属植物は主にアフリカ地域に分布し、これら地域における作物損失の最大の生物的要因と考えられている。根寄生植物による農作物の損失額は年間に約70億を超え130億ドルにも及ぶと試算されている。また、アフリカの一部では、ストライガ属植物の侵入により、耕作地の変更を余儀なくされている。
【０００３】
根寄生植物の防除には、従来、根寄生植物の種子発芽刺激活性物質として作用するストリゴラクトン又はその類縁体(例えば、カルバメート誘導体)や、エチレンを用いて、宿主植物の非存在下で強制発芽させる方法(自殺発芽)(特許文献１〜４、非特許文献１)や、根寄生植物の種子発芽を誘導するが寄生させない「おとり植物」を栽培する方法(トラップクロップ法)が用いられてきた。
一方、ストリゴラクトンの幾つか又はその類縁体(例えば、カルバメート誘導体)は発芽を阻害することが見出されており、これを根寄生植物の防除に用いることが提案されている(非特許文献２、３、特許文献５)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１０−２５１２４３
【特許文献２】特開平１１−１３９９０７
【特許文献３】特開平１１−１３９９０８
【特許文献４】国際公開第２０１１／１２５７１４号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２０１３／１４０９４６号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】杉本幸裕ら，根の研究(Root Research)，12(2):51-56(2003)
【非特許文献２】K. Uenoら，Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59，10485-10490
【非特許文献３】K. Uenoら，Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59，9226-9231
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、トラップクロップ法や発芽誘導剤を用いる方法では、寄生植物の発芽を強力に誘導することができないとともに、膨大な数の寄生植物を完全には防除できないという問題点を有している。
また、ストリンゴラクトン受容体に作用すると考えられる従来の発芽阻害剤は選択性の点で問題があり得る。
これまでに根寄生植物に選択的な除草剤は知られておらず、その開発は急務である。        
【０００７】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、効果的に寄生植物を防除し得る寄生植物の防除剤、および寄生植物の防除方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
根寄生植物は発芽後直ぐに宿主植物と物理的、化学的に結合することから、本発明者らは、発芽過程に着目して根寄生植物を選択的に防除することを試みた。
その結果、本発明者らは、根寄生植物の種子における貯蔵糖であり、その代謝が発芽過程において重要な役割を果たすプランテオースの加水分解を触媒するα-ガラクトシダーゼを同定し、該酵素を阻害することにより根寄生植物の発芽又は幼根の伸長が抑制されるという新たな知見に基き、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明によれば、プランテオースの加水分解を触媒するα-ガラクトシダーゼの阻害剤を含有することを特徴とする根寄生植物の防除剤が提供される。
また、本発明によれば、プランテオースの加水分解を触媒するα-ガラクトシダーゼの阻害剤を含有する根寄生植物の防除剤を用いることを特徴とする根寄生植物の防除方法が提供される。
【００１０】
本発明によれば、α-ガラクトシダーゼ活性を有し、プランテオースを加水分解することができるタンパク質も提供される。
本発明によれば、上記タンパク質をコードする塩基配列からなる核酸分子、該核酸分子を含んでなるベクター、又は該ベクターを含んでなる細胞も提供される。
本発明によれば、更に、候補化合物の存在下に上記タンパク質とα-ガラクトシダーゼ基質とを混合して、該タンパク質によるα-ガラクトシダーゼ基質のいずれかの分解産物を検出する工程を含むことを特徴とする、根寄生植物の防除剤の有効成分として用い得る化合物をスクリーニングする方法が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、根寄生植物を効果的に防除することができる根寄生植物の防除剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヤセウツボα-ガラクトシダーゼ(OmAGAL)の大腸菌での発現を示す電気泳動写真である。
【図２】OmAGALの転写量を示す図である。
【図３】OmAGALのプランテオースに対する活性を示す図である。
【図４】OmAGAL阻害剤のスクリーニング結果を示す写真である。
【図５】OmAGAL阻害剤のスクリーニング結果を示す写真である。
【図６】OmAGAL阻害剤のスクリーニング結果を示す写真である。
【図７】OmAGAL阻害剤のスクリーニング結果を示す写真である。
【図８】発芽刺激物質GR24のみで処理したヤセウツボ種子(WT)及び阻害剤PI-1で処理したヤセウツボ種子の発芽状況を示す写真である。左下バー = 0.2 mm
【図９】発芽刺激物質GR24のみで処理したヤセウツボ種子(WT)及び阻害剤PI-1で処理したヤセウツボ種子の幼根の長さを示すグラフである。
【図１０】発芽刺激物質GR24のみで処理したヤセウツボ種子(WT)及び阻害剤PI-1で処理したヤセウツボ種子の発芽率を示すグラフである。
【図１１】発芽刺激物質GR24のみで処理したヤセウツボ種子(WT)及び阻害剤PI-1〜PI-20で処理したヤセウツボ種子の幼根の長さを示すグラフである。
【図１２】発芽刺激物質GR24のみで処理したヤセウツボ種子(WT)及び阻害剤PI-28で処理したヤセウツボ種子の発芽状況を示す写真である。(左下バー＝0.2 mm)
【図１３】発芽刺激物質GR24のみで処理したヤセウツボ種子(control)及び阻害剤PI-28で処理したヤセウツボ種子の幼根の長さを示すグラフである。
【図１４】発芽刺激物質GR24のみで処理したヤセウツボ種子(control)及び阻害剤PI-21〜PI-28で処理したヤセウツボ種子の幼根の長さを示すグラフである。
【図１５】無処理のシロイヌナズナ種子(control)及び阻害剤PI-1で処理したシロイヌナズナ種子の７日後の発芽状況を示す写真である。左下バー＝１cm。
【図１６】無処理のシロイヌナズナ種子(WT)及び阻害剤PI-1で処理したシロイヌナズナ種子の幼根の長さを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
(防除剤)
本発明の根寄生植物の防除剤(以下、単に「本発明の防除剤」とも呼ぶ。)は、プランテオースの加水分解を触媒するα-ガラクトシダーゼの阻害剤を含有することを特徴とする。
本発明の防除剤の防除対象は、根寄生植物であれば特に限定されない。本明細書において、「根寄生植物」とは、他の植物(宿主植物)の根部に寄生し、水分及び栄養分を奪い取って生育する植物である。宿主植物は、特に限定されないが、例えば、マメ科、イネ科、ナス科、キク科、ウリ科の植物である。
根寄生植物は、例えば、ハマウツボ科(Orobanchaceae)に属する植物であり、好ましくはハマウツボ属(Orobanche)、フェリパンキ属(Phelipanche)又はストライガ属(Striga)に属する植物である。ハマウツボ属植物(Orobanche spp.)としては、例えば、O. minor、O. cernua、O. ramosa、O. aegyptiaca、O. coerulescens、O. cumana、O. crenataなどが挙げられる。フェリパンキ属植物(Phelipanche spp.)としては、例えば、P. aegyptiaca、P. ramosaなどが挙げられる。ストライガ属植物(Striga spp.)としては、例えば、S. hermonthica、S. asiatica、S. gesnerioides、S. aspera、S. forbesiiなどが挙げられる。
【００１４】
本明細書において、「プランテオースの加水分解を触媒するα-ガラクトシダーゼ」とは、プランテオースのガラクトース及びスクロースへの加水分解を触媒するα-ガラクトシダーゼをいう。
本発明の防除剤の１つの実施形態において、プランテオースの加水分解を触媒するα-ガラクトシダーゼは
(i)配列番号２の35位〜412位のアミノ酸配列からなるタンパク質、
(ii)(i)のアミノ酸配列と少なくとも90％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、プランテオースを加水分解し得るタンパク質、
(iii)(i)若しくは(ii)のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入及び/若しくは欠失されたアミノ酸配列からなり、プランテオースを加水分解し得るタンパク質、又は
(iv)(i)〜(iii)のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌクレオチド分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド分子の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなり、プランテオースを加水分解し得るタンパク質
である。
【００１５】
本明細書において、配列番号２のアミノ酸配列配列相同性は、２つの配列をBlastアルゴリズム(例えば、BLAST 2.0；National Center for Biotechnology Information(NCBI)のサイトから入手可能)のデフォルトパラメータを用いて決定することができる。配列番号２のアミノ酸配列との配列相同性は、好ましくは少なくとも93％、より好ましくは95％、より好ましくは97％、最も好ましくは少なくとも99％である。
本明細書において、「複数個」とは、アミノ酸の置換、付加、挿入及び/又は欠失に関しては、10以下の整数、例えば２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４の整数をいう。
本明細書において、ストリンジェントな条件とは、例えば、５×又は６×SSC(50％ホルムアミドを含んでもよい)中での少なくとも60℃(例えば63℃、65℃、68℃、70℃)でのハイブリダイゼーションをいう。このストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、0.1〜１×SSC中での約40℃〜60℃での洗浄処理を伴ってもよい。１×SSCは、0.15Ｍ NaCl、0.015Ｍクエン酸ナトリウムを含有する溶液を意味する。
【００１６】
本発明の防除剤の１つの実施形態において、プランテオースの加水分解を触媒するα-ガラクトシダーゼの阻害剤は下記(ａ)〜(ｆ)の化合物群から選択される少なくとも１つの化合物である：
【００１７】
(ａ)化合物(I)：
【化１】
2019147749.tif 000002
(I)
式(I)中、
Ｒaは、ナフチル基、フェニル基、フェニルＣ１〜Ｃ４アルキル基又はＣ１〜Ｃ１２(好ましくはＣ１〜Ｃ１０、より好ましくはＣ１〜Ｃ８、より好ましくはＣ１〜Ｃ６)アルキル基である。フェニルＣ１〜Ｃ４アルキル基としては、具体的には、フェニルメチル基、フェニルエチル基、フェニルｎ-プロピル基、フェニルイソプロピル基、フェニルｎ-ブチル基、フェニルイソブチル基が挙げられ、フェニルメチル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基が好ましく、フェニルメチル基、フェニルエチル基がより好ましい。
ナフチル基、フェニル基又はフェニルアルキル基のフェニルは、ハロゲン、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキルオキシ基(アルコシキ基)又はＣ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキルオキシカルボニル基(アルコキシカルボニル基)で置換されていてもよい。ここで、隣り合う２つのＣ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキル基及び/又はＣ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキルオキシ基はそれぞれが結合する炭素と共に環を形成してもよい。
【００１８】
また、アルキル基又はフェニルアルキル基のアルキルは、ハロゲン、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキル基又はＣ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキルオキシ基で置換されていてもよい。
ハロゲンとしては、具体的には、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられる。
Ｃ１〜Ｃ６アルキル基としては、具体的には、例えば、メチル基、エチル基、ｎ-プロピル基、イソプロピル基、ｎ-ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、sec-ブチル基、ｎ-ペンチル基、ネオペンチル基、ｎ-ヘキシル基が挙げられ、メチル基、エチル基、ｎ-プロピル基が好ましく、メチル基及びエチル基がより好ましい。アルキル基は、更にハロゲンで置換されていてもよい。
Ｃ１〜Ｃ６アルキルオキシ基(アルコキシ基)としては、具体的には、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ-プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ-ブトキシ基、イソブトキシ基、sec-ブトキシ基、ｔ-ブトキシ基、ｎ-ペンチルオキシ基、ｎ-ヘキシルオキシ基が挙げられ、メトキシ基、エトキシ基、ｎ-プロポキシ基、ｎ-ブトキシ基が好ましく、メトキシ基、エトキシ基、ｎ-プロポキシ基がより好ましく、メトキシ基及びエトキシ基がより好ましい。アルキルオキシ基は、更にハロゲンで置換されていてもよい。
Ｒaは、その炭素数の合計が好ましくは４以上、より好ましくは５以上、より好ましくは６以上であり、好ましくは１２以下、より好ましくは１１以下、より好ましくは１０以下、より好ましくは９以下である。
【００１９】
各Ｘは、独立して-ＣＲ1Ｒ2-(ここで、Ｒ1及びＲ2は各々独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキル基若しくはＣ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシ基であるか、又はＲ1及びＲ2は一緒になって=Ｏ若しくは=Ｓである)又は-ＳＯ2-である。Ｘとしては、具体的には、例えば、-ＣＨ2-、-ＣＯ-、-ＣＳ-及び-ＳＯ2-が挙げられ、-ＣＨ2-、-ＣＯ-及び-ＣＳ-が好ましく、-ＣＨ2-及び-ＣＯ-がより好ましい。ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基及びＣ１〜Ｃ６アルコキシ基については、上記と同様である。
ｍ＝１又は２であり、ｍ＝１が好ましい。
【００２０】
Ｙは、結合手、-ＣＲ3Ｒ4-、-ＣＲ5Ｒ6-Ｏ-又は-ＣＲ7Ｒ8-Ｓ-(ここで、Ｒ3、Ｒ4、  Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は各々独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキル基又はＣ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシ基である)である。Ｙとしては、具体的には、例えば、結合手、-ＣＨ2-、-ＣＨ2-Ｏ-及び-ＣＨ2-Ｓ-が挙げられ、結合手、-ＣＨ2-及び-ＣＨ2-Ｏ-が好ましい。ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基及びＣ１〜Ｃ６アルコキシ基については、上記と同様である。
【００２１】
Ｚ1は-Ｎ<又は-ＣＲz1<(ここで、Ｒz1はＺ5のＲz13と一緒になって結合手を形成している)である。
Ｚ2は-ＣＲz2Ｒz3-(ここで、Ｒz2及びＲz3は一緒になって=Ｏ又は=Ｓであるか、或いは、Ｒz2は水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキル基又はＣ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシ基であり、Ｒz3はＺ3のＲz6と一緒になって結合手を形成している)である。ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基及びＣ１〜Ｃ６アルコキシ基については、上記と同様である。
Ｚ3は-ＮＲz4-(ここで、Ｒz4は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシ基又はＣ２〜Ｃ６(好ましくはＣ２〜Ｃ４)アルケニル基であるか、或いは、Ｚ4のＲz8と一緒になって結合手を形成している)又は-ＣＲz5Ｒz6-(ここで、Ｒz5は水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキル基又はＣ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシ基であり、Ｒz6はＺ2のＲz3と一緒になって結合手を形成している)である。Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基としては、具体的には、例えば、ビニル基、アリル基、１−プロペニル基、イソプロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基が挙げられる。ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基及びＣ１〜Ｃ６アルコキシ基については、上記と同様である。
【００２２】
Ｚ4は-ＣＲz7Ｒz8-(ここで、Ｒz7は水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキル基又はＣ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシ基又はフェニル基であり、該フェニル基は、ハロゲン、ヒドロキシ基、ニトロ基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキル基又はＣ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキルオキシ基で置換されていてもよく、Ｒz8はＺ5のＲz111若しくはＺ3のＲz4と一緒になって結合手を形成している)又は-ＣＲz9ＣＲz10-(ここで、Ｒz9及びＲz10は各々独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシ基又フェニル基であるか、或いはＲz9及びＲz10は一緒になってベンゼン環を形成し、該環はハロゲン、ヒドロキシ基、ニトロ基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキル基又はＣ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシ基で置換されていてもよい)である。ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基及びＣ１〜Ｃ６アルコキシ基については、上記と同様である。
【００２３】
Ｚ5は-ＮＲz11-(ここで、Ｒz11は、Ｚ4のＲz8と一緒になって結合手を形成しているか、或いは、水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシ基又はＣ２〜Ｃ６(好ましくはＣ２〜Ｃ４)アルケニル基である)又は-ＣＲz12Ｒz13-(式中、Ｒz12は水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキル基又はＣ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシ基であり、Ｒz13はＺ1のＲz1と一緒になって結合手を形成している)である。ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基及びＣ２〜Ｃ６アルケニル基については、上記と同様である。
【００２４】
【化２】
2019147749.tif 000003
としては、具体的には、例えば、
【化３】
2019147749.tif 000004
(Ｒz4及びＲz7は上記と同義である)；
【化４】
2019147749.tif 000005
(Ｒz4、Ｒz9、Ｒz10及びＲz12は上記と同義である)；
【化５】
2019147749.tif 000006
(Ｒz2、Ｒz5、Ｒz9、Ｒz10及びＲz12は上記と同義である)
が挙げられる。
【００２５】
化合物(I)のより具体的な例としては、
【化６】
2019147749.tif 000007
(式中、Ｒa、Ｒz4及びＲz7は上記と同義である)(まとめて「化合物(I-1)」と呼ぶ)
【化７】
2019147749.tif 000008
(I-2)
(式中、Ｒa、Ｒz4、Ｒz9、Ｒz10及びＲz12は上記と同義である)
【化８】
2019147749.tif 000009
(I-3)
(式中、Ｒa、Ｙ、Ｒz2、Ｒz5、Ｒz9、Ｒz10及びＲz12は上記と同義である)
が挙げられる。
【００２６】
化合物(I)の更に具体的な例としては、
【化９】
2019147749.tif 000010
(式中、
各Ｒiは、ハロゲン、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシ基又はＣ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシカルボニル基であり、
ｓ＝０〜５の整数であり、
Ｒz4及びＲz7は、上記と同義である)(まとめて「化合物(I-1-i)」と呼ぶ)
【化１０】
2019147749.tif 000011
(I-2-i)
(式中、
各Ｒi、ｓ、Ｒz4、Ｒz9、Ｒz10及びＲz12は、上記と同義である)
【化１１】
2019147749.tif 000012
(I-3-i)
(式中、
各Ｒi、ｓ、Ｒz2、Ｒz5、Ｒz9、Ｒz10及びＲz12は、上記と同義である)
が挙げられる。
【００２７】
化合物(I)の尚更に具体的な例としては、
【化１２】
2019147749.tif 000013
(式中、
各Ｒjは独立してハロゲン、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシ基又はＣ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシカルボニル基であり、
ｔ＝０〜５の整数であり、
各Ｒi、ｓ及びＲz4は、上記と同義である)(まとめて「化合物(I-1-i-A)」と呼ぶ)
【化１３】
2019147749.tif 000014
(I-2-i-A)
(式中、
各Ｒkは独立してハロゲン、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシ基又はＣ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシカルボニル基であり、
ｕ＝０〜４の整数であり、
各Ｒj、ｓ、Ｒz4及びＲz12は、上記と同義である)
【化１４】
2019147749.tif 000015
(I-3-i-A)
(式中、
各Ｒjは独立してハロゲン、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシ基又はＣ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシカルボニル基であり、
ｔ＝０〜５の整数であり、
各Ｒi、ｓ、Ｒz4及びＲz7は、上記と同義である)
が挙げられる。
【００２８】
化合物(I)の具体例としては、
【化１５】
2019147749.tif 000016
が挙げられる。
【００２９】
(ｂ)化合物PI-2及びPI-3：
【化１６】
2019147749.tif 000017
【００３０】
(ｃ)化合物(II)
【化１７】
2019147749.tif 000018
(II)
式(II)中、
Ｒb及びＲcは、各々独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキル基又はＣ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシ基である。或いは、Ｒb及びＲcは一緒になって結合手を形成する。
Ｒdは、水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキル基又はＣ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシ基又はＣ２〜Ｃ６(好ましくはＣ２〜Ｃ４)アルケニル基であり、
各Ｒeは、独立して、ハロゲン、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルキル基又はＣ１〜Ｃ６(好ましくはＣ１〜Ｃ４)アルコキシ基であり、
ｎは０〜９の整数である。
ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基及びＣ２〜Ｃ６アルケニル基については上記と同様である。
【００３１】
化合物(II)の具体例としては、
【化１８】
2019147749.tif 000019
が挙げられる。
【００３２】
(ｄ)化合物PI-14、PI-15及びPI-16
【化１９】
2019147749.tif 000020
【００３３】
(ｅ)化合物(III)
【化２０】
2019147749.tif 000021
(III)
式(III)中、
各Ｒfは独立してハロゲン、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ１〜Ｃ６アルコキシ基である。
ｐ＝０〜５の整数である。
【００３４】
化合物(III)の具体例としては、
【化２１】
2019147749.tif 000022
が挙げられる。
【００３５】
(ｆ)化合物(IV)
【化２２】
2019147749.tif 000023
(IV)
式(IV)中
各Ｒg及び各Ｒhは、ハロゲン、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基又はＣ１〜Ｃ６アルコキシ基である。
ｑ＝０〜５の整数である。
ｑ＝０〜５の整数である。
【００３６】
化合物(IV)の具体例としては
【化２３】
2019147749.tif 000024
が挙げられる。
【００３７】
上記化合物は、公知の方法により製造することができる。
例えば、化合物(I-1a)及び(I-1b)は、それぞれ例えばHavaldar F.H.及びMishra S.K.J.(Asian J. Chem., 16(3-4): 1681-1684, 2004)の方法及びGodhani D.R.ら(J. Chem. Pharm. Res., 5(1): 240-243, 2013)の方法に準じて合成することができる。
簡潔には、アシルヒドラジン化合物(例えば、ベンゾイルヒドラジン)を例えばメタノール中で等モル量のイソチオシアネート化合物(例えば、アリルイソチオシアネート)と反応させ、得られたアシルチオセミカルバジド化合物を水酸化ナトリウムの存在下で環化して3,4-置換1,2,4-トリアゾール-5-チオンを得て、これをホルムアルデヒド及び種々のアミン(例えばアニリン)を用いてアミノメチル化することにより化合物(I-1a)が得られる。
また、アシルイソチオシアネート化合物とヒドラジン化合物とを反応させて1,5-置換1,2,4-トリアゾール-3-チオンを得て、これをホルムアルデヒド及び種々のアミン(例えばアニリン)と1,4-ジオキサンの存在下に反応させることにより化合物(I-1b)が得られる。
【００３８】
また、例えば、化合物(I-2)は、例えば特表2013-543861号公報に記載の方法(工程１及び２)に準じて合成することができる。
簡潔には、アニリン化合物(例えば、Ｎ-ペンチルアニリン)をメタントリカルボン酸トリエチルエステルとマイクロウェーブ照射下で縮合し、得られるキノリノンカルボキシレートをマイクロウェーブ照射下でアニリン化合物(例えば、2,4-ジメチルアニリン)と反応させることにより化合物(I-2)が得られる。
【００３９】
本発明の防除剤は、上記(ａ)〜(ｆ)の化合物群から選択される少なくとも１つの化合物を含んでなる。本発明の防除剤に含まれる有効成分は、前記化合物そのものであってもよいし、又はその塩、水和物若しくは溶媒和物であってもよい。本発明の防除剤は、当該化合物(又はその塩、水和物若しくは溶媒和物)に加えて、添加剤を含んでなってもよい。本発明の防除剤中の前記化合物の配合割合は、防除剤全量に対して、０.０００１〜１００重量％、例えば０.００１〜９０重量％、０.０１〜８０重量％、０.１〜７０重量％、１〜６０重量％であり得る。
【００４０】
本発明の防除剤は、農薬製剤上の常法に従って、上記(ａ)〜(ｆ)の化合物群から選択される少なくとも１つの化合物をそのまま又は液体若しくは固体担体に担持させて製剤化することができる。
本発明の防除剤の剤形は、農学的に許容される剤形である限り特に限定されず、液体(懸濁液を含む)形態であっても、固相に担持された形態であってもよい。本発明の防除剤の剤形は、例えば、液剤、固形剤、粉剤、顆粒剤、粒剤、水和剤、フロアブル剤、乳剤、ペースト剤、分散剤であり得る。
【００４１】
固体担体としては特に限定されず、農薬製剤に一般的に用いられる固体担体を用いることができる。固体担体として、例えば、天然鉱物(例えば、石英、クレー、カオリナイト、ピロフィライト、セリサイト、タルク、ベントナイト、酸性白土、アタパルジャイト、ゼオライト、珪藻土)、無機塩(例えば、炭酸カルシウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム)、有機固体担体(例えば、合成ケイ酸、合成ケイ酸塩、デンプン、セルロース)、プラスチック担体(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニリデン)の単独又は任意の組合せを挙げることができる。
液体担体としては特に限定されず、農薬製剤に一般的に用いられる液体担体を用いることができる。液体担体として、例えば、水、アルコール、ケトン、エーテル、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、エステル、アミド、ジメチルスルホキシド、含窒素担体若しくは油脂又はこれらの任意の組合せの混合溶媒を挙げることができる。
【００４２】
本発明の防除剤は、例えば、防除対象の根寄生植物の種子を含む土壌に散布することにより、当該根寄生植物の種子は発芽できないか、又は幼根を伸長させることができず、したがって当該土壌を浄化することができる。
また、本発明の農薬組成物を土壌に散布、噴霧、散粉などすることにより施用することもできる。
【００４３】
(防除方法)
本発明は根寄生植物の防除方法にも関する。
本発明の根寄生植物の防除方法(以下、単に「本発明の防除方法」ともいう。)は、上記の防除剤(本発明の防除剤)を用いることを特徴とする。
本発明の防除方法によれば、根寄生植物の種子の発芽又は幼根の伸長を阻害することにより、根寄生植物を防除することができ、延いては、根寄生植物による農作物の生育阻害を防除することができる。
【００４４】
防除剤の施用方法としては、通常の農薬と同様な方法によって施用することができるが、防除対象の根寄生植物の種子を含有すると疑われる土壌への、宿主となり得る有用植物の播種前及び/又は播種後の適用が好ましい。土壌への適用方法としては、例えば、液状製剤(例えば、原液のまま又は適切な溶媒での希釈液など)を土壌に注入又は散布する方法や、固形製剤(例えば、粉剤、水和剤、顆粒水和剤、粒剤など)を土壌に混和又は散布する方法などが挙げられる。
本発明の防除剤の施用量は、種々の要因(例えば、環境条件、剤型、施用方法、施用場所、施用時期など)により変動し得るが、例えば有効成分として０.１ｇ/ｈａ〜１０ｋｇ/ｈａ、より具体的には１ｇ/ｈａ〜５ｋｇ/ｈａの範囲から適宜選択することができる。
【００４５】
(根寄生植物由来のα-ガラクトシダーゼ)
本発明は、プランテオースの加水分解を触媒するα-ガラクトシダーゼにも関する。
本発明のプランテオースの加水分解を触媒するα-ガラクトシダーゼ(以下、単に「本発明のα-ガラクトシダーゼ」ともいう。)は、
(i)配列番号２の35位〜412位のアミノ酸配列、
(ii)(i)のアミノ酸配列と少なくとも90％の配列相同性を有するアミノ酸配列、
(iii)(i)若しくは(ii)のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入及び/若しくは欠失されたアミノ酸配列、又は
(iv)(i)〜(iii)のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌクレオチド分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド分子の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列
からなるタンパク質であることを特徴とする。
【００４６】
本発明のα-ガラクトシダーゼは、根寄生植物の種子における貯蔵糖であり、その発芽過程に関与するプランテオースの加水分解を触媒する天然型酵素(又は野生型酵素)であるか、又は該天然型酵素(又は野生型酵素)と同等の酵素活性を有するものであるため、例えば、根寄生植物の種子の発芽又は幼根の伸長を阻害することによる該根寄生植物の防除剤において有効成分として用い得る物質のスクリーニングに有用である。
【００４７】
特定の実施形態において、本発明のα-ガラクトシダーゼは、
(i)配列番号２の35位〜412位のアミノ酸配列のＮ末端に、配列番号２の１位〜34位(すなわち、全長が１位〜412位)、２位〜34位(すなわち、全長が２位〜412位)、３位〜34位(すなわち、全長が３位〜412位)、４位〜34位(すなわち、全長が４位〜412位)、５位〜34位(すなわち、全長が５位〜412位)、６位〜34位(すなわち、全長が６位〜412位)、７位〜34位(すなわち、全長が７位〜412位)、８位〜34位(すなわち、全長が８位〜412位)、９位〜34位(すなわち、全長が９位〜412位)、10位〜34位(すなわち、全長が10位〜412位)、11位〜34位(すなわち、全長が11位〜412位)、12位〜34位(すなわち、全長が12位〜412位)、13位〜34位(すなわち、全長が13位〜412位)、14位〜34位(すなわち、全長が14位〜412位)、15位〜34位(すなわち、全長が15位〜412位)、16位〜34位(すなわち、全長が16位〜412位)、17位〜34位(すなわち、全長が17位〜412位)、18位〜34位(すなわち、全長が18位〜412位)、19位〜34位(すなわち、全長が19位〜412位)、20位〜34位(すなわち、全長が20位〜412位)、21位〜34位(すなわち、全長が21位〜412位)、22位〜34位(すなわち、全長が22位〜412位)、23位〜34位(すなわち、全長が23位〜412位)、24位〜34位(すなわち、全長が24位〜412位)、25位〜34位(すなわち、全長が25位〜412位)、26位〜34位(すなわち、全長が26位〜412位)、27位〜34位(すなわち、全長が27位〜412位)、28位〜34位(すなわち、全長が28位〜412位)、29位〜34位(すなわち、全長が29位〜412位)、30位〜34位(すなわち、全長が30位〜412位)、31位〜34位(すなわち、全長が31位〜412位)、32位〜34位(すなわち、全長が32位〜412位)若しくは33位〜34位(すなわち、全長が33位〜412位)のアミノ酸配列又は34位のアミノ酸(すなわち、全長が34位〜412位)が付加されたアミノ酸配列、
(ii)(i)のアミノ酸配列と少なくとも90％の配列相同性を有するアミノ酸配列、
(iii)(i)若しくは(ii)のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入及び/若しくは欠失されたアミノ酸配列、又は
(iv)(i)〜(iii)のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌクレオチド分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド分子の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列
からなるタンパク質である。
【００４８】
本発明のα-ガラクトシダーゼは、Ｎ末端及び/又はＣ末端にタグが付加されていてもよい。
タグとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(GST)、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、β−ガラクトシダーゼ、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリシステイン、ポリフェニルアラニン、プロテインＡ、プロテインＧ、アルカリホスファターゼ、糖結合ポリペプチド(例えばマルトース結合ポリペプチド)が挙げられる。
タグと結合された本発明のα-ガラクトシダーゼは、アフィニティー精製により容易に回収できるので有用である。タグは、適切なプロテアーゼにより切断可能であるように結合されていてもよい。
【００４９】
本発明は、上記の本発明のα-ガラクトシダーゼをコードする塩基配列からなる核酸分子にも関する。
本発明の核酸分子は、上記で説明したα-ガラクトシダーゼのいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸分子である。本発明において、核酸分子はDNA分子であってもRNA分子であってもよい。
１つの実施形態において、本発明の核酸分子は、配列番号１の103位〜1236位の塩基配列からなってもよい。。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、
(i)配列番号１の103位〜1236位の塩基配列の5'末端に、配列番号１の１位〜102位(すなわち、全長が１位〜1236位)、４位〜102位(すなわち、全長が４位〜1236位)、７位〜102位(すなわち、全長が７位〜1236位)、10位〜102位(すなわち、全長が10位〜1236位)、13位〜102位(すなわち、全長が13位〜1236位)、16位〜102位(すなわち、全長が16位〜1236位)、19位〜102位(すなわち、全長が19位〜1236位)、22位〜102位(すなわち、全長が22位〜1236位)、25位〜102位(すなわち、全長が25位〜1236位)、28位〜102位(すなわち、全長が28位〜1236位)、31位〜102位(すなわち、全長が31位〜1236位)、34位〜102位(すなわち、全長が34位〜1236位)、37位〜102位(すなわち、全長が37位〜1236位)、40位〜102位(すなわち、全長が40位〜1236位)、43位〜102位(すなわち、全長が43位〜1236位)、46位〜102位(すなわち、全長が46位〜1236位)、49位〜102位(すなわち、全長が49位〜1236位)、52位〜102位(すなわち、全長が52位〜1236位)、55位〜102位(すなわち、全長が55位〜1236位)、58位〜102位(すなわち、全長が58位〜1236位)、61位〜102位(すなわち、全長が61位〜1236位)、64位〜102位(すなわち、全長が64位〜1236位)、67位〜102位(すなわち、全長が67位〜1236位)、70位〜102位(すなわち、全長が70位〜1236位)、73位〜102位(すなわち、全長が73位〜1236位)、76位〜102位(すなわち、全長が76位〜1236位)、79位〜102位(すなわち、全長が79位〜1236位)、82位〜102位(すなわち、全長が82位〜1236位)、85位〜102位(すなわち、全長が85位〜1236位)、88位〜102位(すなわち、全長が88位〜1236位)、91位〜102位(すなわち、全長が91位〜1236位)、94位〜102位(すなわち、全長が94位〜1236位)、97位〜102位(すなわち、全長が97位〜1236位)若しくはは100位〜102位(すなわち、全長が100位〜1236位)の塩基配列が付加された塩基配列、又は
(ii)(i)の塩基配列からなるヌクレオチド分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド分子の塩基配列
からなる。
【００５０】
上記の本発明の核酸分子は、5'末端及び/又は3'末端にタグ(上記の通り)をコードする核酸配列が付加されていてもよい。
本発明の核酸分子はベクターに含まれ、又は組み込まれていてもよい。ベクターの骨格は、目的とする宿主細胞(例えば、原核生物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞など)において自律複製が可能であるか、又はその染色体中への組み込みが可能であるように適切に選択し得る。ベクターは、適切な選択マーカー(例えば薬剤耐性遺伝子)を含んでいてもよい。ベクターはプラスミドであり得る。
ベクターは、宿主細胞における発現に適切なプロモーター(例えば、CMVプロモーター)その他の種々の発現調節エレメント(例えばターミネーター、エンハンサー)を含んでもよい(このようなベクターは「発現ベクター」と呼ばれる)。発現ベクターのタイプ及び調節エレメントの種類は、宿主細胞に応じて適切に選択し得る。
【００５１】
本発明のベクターを用いて細胞を形質転換してもよい。宿主細胞としては、ポリペプチド/タンパク質の発現に適切な宿主細胞を用いることができ、例えば、大腸菌(Escherichia coli)細胞のような原核細胞、酵母(例えばSaccharomyces cerevisiae)、昆虫、植物細胞及び動物細胞(HEK293細胞、COS細胞、CHO細胞、BHK細胞、3T3細胞、HeLa細胞など)のような真核細胞が挙げられる。形質転換された細胞は、例えば本発明の核酸分子の維持・増殖又は本発明のα-ガラクトシダーゼの発現に有用である。
本発明のα-ガラクトシダーゼの発現に適切な条件(例えば培地、培養温度など)は、宿主細胞、発現に用いたベクター(例えばプラスミド)などを考慮して適切に決定できる。
【００５２】
本発明に関連して必要となる遺伝子組換え/発現技術の詳細は、標準的な教科書(例えば、Ausubel，F.A.ら編(1988)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，New York，NY；Sambrook,J.ら(1989)，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)に記載されている。
【００５３】
(スクリーニング方法)
本発明の根寄生植物の防除剤の有効成分として用い得る物質(以下、「有用物質」ともいう)をスクリーニングする方法(以下、「本発明のスクリーニング方法」ともいう。)は、被検物質の存在下に、プランテオースの加水分解を触媒するα-ガラクトシダーゼとα-ガラクトシダーゼ基質とを接触させて、該ガラクトシダーゼによるα-ガラクトシダーゼ基質のいずれかの分解産物を検出する工程を含むことを特徴とする。
本発明のスクリーニング方法において、「プランテオースの加水分解を触媒するα-ガラクトシダーゼ」は、防除剤が対象とする根寄生植物に由来するものであり得るが、当該スクリーニング方法により選択される物質が、防除対象の根寄生植物におけるプランテオースの加水分解を阻害し得る限り、根寄生植物に由来するものと異なってもよい。
【００５４】
本発明のスクリーニング方法の１つの実施形態において、プランテオースの加水分解を触媒するα-ガラクトシダーゼは
(i)配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質、
(ii)(i)のアミノ酸配列と少なくとも90％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、プランテオースを加水分解し得るタンパク質、
(iii)(i)若しくは(ii)のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入及び/若しくは欠失されたアミノ酸配列からなり、プランテオースを加水分解し得るタンパク質、又は
(iv)(i)〜(iii)のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌクレオチド分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド分子の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなり、プランテオースを加水分解し得るタンパク質
である。
【００５５】
１つの具体的形態において、本発明のスクリーニング方法は、
(ａ)被検物質の存在下に、プランテオースの加水分解を触媒するα-ガラクトシダーゼとα-ガラクトシダーゼ基質とを接触させる工程；
(ｂ)該ガラクトシダーゼによるα-ガラクトシダーゼ基質のいずれかの分解産物を検出する工程；
(ｃ)分解産物が検出されない場合に、被検物質を有用物質として選択する工程
を含んでなる。
別の１つの具体的形態において、本発明のスクリーニング方法は、
(a-1)被検物質の存在下に、プランテオースの加水分解を触媒するα-ガラクトシダーゼとα-ガラクトシダーゼ基質とを接触させる工程；
(b-1)被検物質の存在下での該ガラクトシダーゼによるα-ガラクトシダーゼ基質のいずれかの分解産物を定量する工程；
(a-2)被検物質の非存在下に、プランテオースの加水分解を触媒するα-ガラクトシダーゼとα-ガラクトシダーゼ基質とを接触させる工程；
(b-1)被検物質の非存在下での該ガラクトシダーゼによるα-ガラクトシダーゼ基質のいずれかの分解産物を定量する工程；
(ｂ')被検物質の存在下で測定した分解産物の量と被検物質の非存在下で測定した分解産物の量とを比較する工程；
(ｃ)被検物質の存在下で測定した分解産物の量が、被検物質の非存在下で測定した分解産物の量と有意に低い場合に、被検物質を候補物質として選択する工程
を含んでなる。
【００５６】
本明細書において、α-ガラクトシダーゼ基質の分解産物に関して「検出」とは、存否の判定だけでなく定量及び半定量も含む。
本発明のスクリーニング方法において、「α-ガラクトシダーゼ基質」は、防除剤が対象とする根寄生植物に由来するプランテオースであり得るが、当該スクリーニング方法により選択される物質が、防除対象の根寄生植物におけるプランテオースの加水分解を阻害し得る限り、根寄生植物に由来するものと異なってもよい。更に、α-ガラクトシダーゼ基質は、必ずしもプランテオースであることを要さず、当該スクリーニング方法により選択される物質が、防除対象の根寄生植物におけるプランテオースの加水分解を阻害し得る限り、他の基質であってもよい。このような基質としては、非還元末端にα-ガラクトシル基を有するラフィノース、メリビオース、スタキオース又はｐ-ニトロフェニル-α-Ｄ-ガラクトピラノシドなどを用いることができる。
【００５７】
例えば、α-ガラクトシダーゼ基質として、ｐ-ニトロフェニル-α-Ｄ-ガラクトピラノシドを用いる場合には、検出すべき分解産物はニトロフェノール又はガラクトースである。ニトロフェノールを検出する場合、簡潔には、ｐ-ニトロフェニル-α-Ｄ-ガラクトピラノシドを単独で又は被検物質と共に含む溶液(例えば、緩衝液(例えば、pH５))に、本発明のα-ガラクトシダーゼを添加するか、或いは、本発明のα-ガラクトシダーゼを単独で又は被検物質と共に含む溶液(例えば、緩衝液(例えば、pH５))に、ｐ-ニトロフェニル-α-Ｄ-ガラクトピラノシドを添加し、例えば室温〜４０℃で、例えば10分間〜１時間反応させた後、例えば炭酸ナトリウムを用いて反応を停止させ、得られた溶液の吸光度(波長400〜420nm)を測定する。
【実施例】
【００５８】
１．プランテオースを加水分解するα-ガラクトシダーゼの同定
1.1．実験方法
(1)OmAGAL配列の取得
ヤセウツボの発芽は、Wakabayashi et al.，J. Exp. Bot.，66，3085-3097，2015に記載に方法に従って誘導した。発芽種子からのトータルRNAの抽出は、PureLink RNA Mini Kit(Thremo Fischer Scientific)を用いて行なった。RNA-Seqライブラリの合成と配列の取得はBGI Japanにて行われた。配列取得にはHiSeq 2000を用いた。トランスクリプトームデータの取得はDDBJ Read Annotation Pipelineを用いたDe Noveアセンブリによって行なった。このトランスクリプトームデータからOmAGAL配列を取得した。クエリーとして、プランテオースを種子中に含むタバコ(Nicotiana tabacum)のα-ガラクトシダーゼ配列(GenBank:AEB98600.1；配列番号３)を用いた。この配列からシグナルペプチド部(Ｎ末端側１〜34アミノ酸)をOkazawa et al.，Plant Biotechnol.，31，561-566，2014に記載の方法によってpGEX-5X-1-GWに導入し、大腸菌で発現させた。発現したGST-ΔTP-OmAGALタンパク質をGST GraviTrapカラム(GE Healthe care Life Sciences)によって精製し(図１)、アッセイに用いた。
【００５９】
(2)酵素アッセイ
40 mMリン酸バッファー(pH 5)中で、1.0 mMプランテオースとGST-ΔTP-OmAGALを30μg加えて全量を200μlとした。それを23℃で１時間反応させた後、95℃で５分間加熱することで反応を停止した。反応はUPLC分析によって確認した。
【００６０】
1.2．結果
(1)OmAGAL配列の取得
ヤセウツボの発芽時におけるトランスクリプトームデータからOmAGAL配列を探索した。ヒットした配列の中で発芽時に転写量が大きく上昇する配列をOmAGALとした(図２)。
(2)酵素アッセイ
プランテオースとGST-ΔTP-OmAGALの反応を確認した結果、スクロースのピークが現れた(図３)。このことから、GST-ΔTP-OmAGALがプランテオースを加水分解することがわかった。
【００６１】
２．プランテオースを加水分解するα-ガラクトシダーゼの阻害物質のスクリーニング
2.1．実験方法
(1)酵素阻害活性測定(化合物ライブラリを用いた二次スクリーニング)
0.1Ｍリン酸バッファー(pH 5)に、GST-ΔTP-OmAGAL(配列番号２の35位〜412位[ΔTP-OmAGAL]とGSTとの融合タンパク質) 0.2μgと化合物ライブラリMyria Screen II(Sigma-Aldrich)に含まれる化合物３μl加え、更にモデル基質４-ニトロフェニルα-Ｄ-ガラクトピラノシドを0.67mM加えて全量を150μlとするか、或いは、0.1Ｍリン酸バッファー(pH 5)に、GST-ΔTP-OmAGAL 0.1μgと化合物ライブラリMyria Screen I(Sigma-Aldrich)に含まれる化合物２μl加え、更に４-ニトロフェニルα-Ｄ-ガラクトピラノシドを1.0mM加えて全量を150μlとし、室温で30分間反応させた。0.5Ｍ Na2CO3を100μl加えて反応を停止させた。ネガティブコントロールとして、0.1Ｍリン酸バッファー(pH 5)に４-ニトロフェニルα-Ｄ-ガラクトピラノシド(0.67mM又は1.0mM)を加えたものを準備し、ポジティブコントロールとして、0.1Ｍリン酸バッファー(pH 5)にGST-ΔTP-OmAGAL(0.2μg又は0.1μg)とDMSO(３μl又は２μl)と４-ニトロフェニルα-Ｄ-ガラクトピラノシド(0.67mM又は1.0mM)を加えたものを準備した。反応停止後、目視による確認と吸光度(A410)の測定を行った。
【００６２】
(2)発芽阻害実験
(2-1)選抜した阻害剤のヤセウツボへの処理
ヤセウツボ種子を１％次亜塩素酸及び0.1％ Tween20を含む溶液で42℃にて１分間振とう滅菌した。その後、蒸留水(DW)でリンスし、乾燥させた。乾燥させた種子を1.5mLエッペンドルフチューブに入れ、更に0.1％寒天を1.0mL加えて混合した。シャーレ(アズノールシャーレφ50×15)に、GF/Dガラス繊維ろ紙(Whatman 47mmφ)を２枚敷き、1.5mLのDWを加えた。その上に、直径６mmの円形ろ紙(桐山ロート用ろ紙60mmφ)を敷き、その上に種子を置いた。パラフィルムでシャーレの周りを巻き、更にアルミニウムで覆った後、23℃で１週間コンディショニングを行った。
コンディショニングを行った種子を、根寄生植物種子の発芽刺激物質ストリゴラクトンの一種であるGR24(１ppm) 190μl又は95μl及び阻害剤10μl又は５μlで処理した。処理の３、５、７日後に観察した。幼根の測定にはImage Jを用いた。
【００６３】
(2-2)阻害剤のシロイヌナズナへの処理
シャーレにGF/Dろ紙を２枚敷き、その上に滅菌シロイヌナズナ種子を置いた。種子をDW 190 μlに阻害剤10μlを加えた溶液を種子に処理した。パラフィルムでシャーレの周りを巻き、更にアルミニウムで覆い４℃で48時間培養した後(春化処理)、長日条件下で培養し、７日後に観察を行った。
【００６４】
2.2．結果
(1)酵素阻害活性測定
(1-1)Myria Screen IIを用いたスクリーニング
下記の20の化合物について発色なし又は黄色発色の低減が観察され、α-ガラクトシダーゼ活性が確認できた(図４及び表１)。
【表１】
2019147749.tif 000025
【００６５】
【化２４】
2019147749.tif 000026
【００６６】
例えば、PI-1、PI-7、PI-8、PI-14の吸光度はそれぞれ0.039、0.092、0.066、0.103であった(図５及び表１)。酵素阻害活性測定時の各化合物の濃度を表２に示す。
【表２】
2019147749.tif 000027
なお、ネガティブコントロール及びポジティブコントロールの吸光度はそれぞれ0.034及び0.16であった。
【００６７】
(2-2)Myria Screen Iを用いたスクリーニング
下記の８つの化合物について発色なし又は黄色発色の低減が観察され、α-ガラクトシダーゼ活性が確認できた(図６並びに表３及び４)。
【表３】
2019147749.tif 000028
【表４】
2019147749.tif 000029
【化２５】
2019147749.tif 000030
【００６８】
例えば、PI-28の吸光度は0.095であった(図７)。酵素阻害活性測定時の各化合物の濃度を表５に示す。
【表５】
2019147749.tif 000031
なお、ネガティブコントロール及びポジティブコントロールの吸光度はそれぞれ0.036及び0.203であった。PI-28 で黄色の発色が薄くなっていることを，目視によっても確認できた。PI-28 の構造を下記に示す。PIの濃度を表２に示す。
【００６９】
(2)発芽阻害実験
(2-1)阻害剤PI-1〜PI-20
発芽刺激物質GR24のみで処理したヤセウツボ種子(WT)は３DAG(発芽処理後日数)で発芽している種子が見られ、５DAG、７DAGと経つにつれ幼根は伸長した(図８)。
一方、阻害剤PI-1(140μM)で処理したヤセウツボ種子は５DAGで発芽している種子が見られ、７DAGにはその幼根は伸長していた(図８)。５DAGで、PI-1で処理した種子の幼根の長さは、WTの幼根の長さの約１/３であった(図９)。PI-1で処理したヤセウツボ種子の発芽率はWTのものより低かった(図10)。ヤセウツボ種子に処理したPIの濃度を表３に示す。
阻害剤PI-2〜PI-20で処理したヤセウツボ種子も、５DAGでの幼根の長さがWTの約１/４程度であった(図11)。
【００７０】
(2-2)阻害剤PI-21〜PI-28
阻害剤PI-28(142μM)で処理したヤセウツボ種子は、WT(control)と同様に３DAGで発芽が見られたが、幼根の長さは短かく、その後もほとんど伸長しなかった(図12及び図13)。
阻害剤PI-21〜PI-28で処理したヤセウツボ種子の５DAGでの幼根の長さを図14に示す。
【００７１】
(2-2)阻害剤のシロイヌナズナ種子への処理
PI-1(140μM)で処理したシロイヌナズナ種子の根はWTの約１/２であり、ヤセウツボ種子の場合より阻害の程度は小さかった(図15及び図16)。
【００７２】
上記の実施形態および実施例は、本発明の理解を容易にするために例示として記載されたものであって、本発明は本明細書または添付図面に記載された具体的な構成および配置のみに限定されるものではないことに留意すべきである。本明細書に記載した具体的構成、手段、方法及び装置は、本発明の技術思想の範囲を逸脱することなく、当該分野において公知の他の多くのものと置換可能であることを、当業者は理解すべきであり、そして容易に認識する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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