(57)【要約】【課題】潰瘍性大腸炎に伴う原発性硬化性胆管炎の発症の原因となる微生物の特定。【解決手段】肝臓で炎症を誘導する、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓で炎症を誘導する、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株。
【請求項２】
肝臓でＴｈ１７細胞を誘導する、請求項１に記載のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株。
【請求項３】
大腸上皮に対して孔形成能を有する、請求項１または２に記載のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株。
【請求項４】
６型分泌装置を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株。
【請求項５】
原発性硬化性胆管炎および潰瘍性大腸炎を合併している患者由来である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株。
【請求項６】
米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）にＡｓｓｅｍｂｌｙ  Ｎａｍｅ：ＡＳＭ３８５１８２ｖ１として登録されている塩基配列からなるＤＮＡを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株。
【請求項７】
寄託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７９である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株。
【請求項８】
米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）にＡｓｓｅｍｂｌｙ  Ｎａｍｅ：ＡＳＭ３８６５１１ｖ１として登録されている塩基配列からなるＤＮＡを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株。
【請求項９】
受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２９２３である、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ菌株。
【請求項１０】
受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２９２２である、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株の、原発性硬化性胆管炎の発症予測または診断のための使用。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ菌株およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株の、原発性硬化性胆管炎の発症予測または診断のための使用。
【請求項１３】
Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ菌株が受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２９２３であり、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株が受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２９２２である請求項１２に記載の、原発性硬化性胆管炎の発症予測または診断のための使用。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株を含む菌液をマウスに投与する工程および、
３，５−ジカルベトキシ−１，４−ジヒドロコリジンを投与する工程を有する原発性硬化性胆管炎および潰瘍性大腸炎を合併したモデルマウスの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓で炎症を誘導するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株に関する。
【背景技術】
【０００２】
原発性硬化性胆管炎（Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ  ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ：ＰＳＣ）は、特発性の慢性胆汁うっ滞性の慢性肝疾患であり、胆管狭窄の進行及び胆樹の崩壊を経て、末期の肝硬変を引き起こす。現在までに、この症状に対する肝臓移植以外の決定的な治療は確立されておらず、この不治の病を治療するための病態生理の更なる理解が必要とされている。
【０００３】
原発性硬化性胆管炎の患者から、門脈菌血症や、胆管細胞中の高レベルの内毒素が確認されていることから、腸内細菌叢がダメージを受けた腸のバリアを通る細菌転移（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）が、肝臓の炎症に重要な役割を果たしていると考えられている。しかしながら、原発性硬化性胆管炎の患者における多くの細菌転移のエビデンスに関わらず、腸バリアの崩壊と細菌転移のトリガーとなるメカニズムについては未だ分かっていない。
【０００４】
原発性硬化性胆管炎の患者の半数以上が潰瘍性大腸炎を合併していることが知られており、慢性大腸炎によって誘導された細菌転移が肝炎を引き起こしている可能性が示唆されている。一方で、潰瘍性大腸炎の患者のうち、原発性硬化性胆管炎を合併しているのはごくわずかに過ぎない。さらに、原発性硬化性胆管炎を合併している潰瘍性大腸炎の患者は、断続的な区域性大腸炎（ｒｉｇｈｔ  ｓｉｄｅｄ  ｃｏｌｉｔｉｓ）を呈しているが、これは原発性硬化性胆管炎を合併していない典型的な潰瘍性大腸炎における直腸の連続的な病変とは著しく対照的である。従って、潰瘍性大腸炎を合併している原発性硬化性胆管炎の発病には、大腸炎をその基礎疾患として有するだけでは不十分であり、その他の疾患因子が関与していると考えられている。
【０００５】
近年、微生物解析によって、原発性硬化性胆管炎を合併している潰瘍性大腸炎の患者の腸内細菌叢は、健常者および原発性硬化性胆管炎を合併していない典型的な潰瘍性大腸炎の患者のそれらと異なることが報告されている（非特許文献１〜３）。原発性硬化性胆管炎を合併している潰瘍性大腸炎と、原発性硬化性胆管炎を合併していない典型的な潰瘍性大腸炎の臨床的な症状の違いを考慮すると、腸内細菌叢の異常（ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ）が潰瘍性大腸炎に伴う原発性硬化性胆管炎の発症に重要な役割を果たしている可能性が示唆されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓａｂｉｎｏ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ  ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ  ｉｓ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｆｒｏｍ  ＩＢＤ．  Ｇｕｔ  ６５，  １６８１−１６８９  （２０１６）．
【非特許文献２】Ｋｕｍｍｅｎ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ  ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ  ｉｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｂｉｌｉａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ．  Ｇｕｔ  ６６，  ６１１−６１９  （２０１７）．
【非特許文献３】Ｉｗａｓａｗａ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆａｅｃａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｉｎ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ−ｏｎｓｅｔ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ  ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ．  Ｇｕｔ  ６６，  １３４４−１３４６  （２０１７）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、ｄｙｓｂｉｏｓｉｓが潰瘍性大腸炎に伴う原発性硬化性胆管炎の発症の原因であるとする明確なエビデンスは未だなく、また、特定の微生物種が潰瘍性大腸炎に伴う原発性硬化性胆管炎の発症に寄与しているかも不明である。そのため、潰瘍性大腸炎に伴う原発性硬化性胆管炎の発症の原因となる微生物の特定が強く望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を鑑みて鋭意研究を重ねた結果、潰瘍性大腸炎に伴う原発性硬化性胆管炎の発症の原因となる、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ菌株およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株を特定し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、例えば、以下の［１］〜［１４］に関する。
【０００９】
［１］肝臓で炎症を誘導する、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株。
［２］肝臓でＴｈ１７細胞を誘導する、［１］に記載のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株。
［３］大腸上皮に対して孔形成能を有する、［１］または［２］に記載のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株。
［４］６型分泌装置を有する、［１］〜［３］のいずれかに記載のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株。
［５］原発性硬化性胆管炎および潰瘍性大腸炎を合併している患者由来である、［１］〜［４］のいずれかに記載のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株。
［６］米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）にＡｓｓｅｍｂｌｙ  Ｎａｍｅ：ＡＳＭ３８５１８２ｖ１として登録されている塩基配列からなるＤＮＡを有する、［１］〜［５］のいずれかに記載のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株。
［７］寄託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７９である、［１］〜［６］のいずれかに記載のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株。
［８］米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）にＡｓｓｅｍｂｌｙ  Ｎａｍｅ：ＡＳＭ３８６５１１ｖ１として登録されている塩基配列からなるＤＮＡを有する、［１］〜［５］のいずれかに記載のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株。
［９］受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２９２３である、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ菌株。
［１０］受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２９２２である、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株。
［１１］［１］〜［８］のいずれかに記載のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株の、原発性硬化性胆管炎の発症予測または診断のための使用。
［１２］［１］〜［８］のいずれかに記載のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ菌株およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株の、原発性硬化性胆管炎の発症予測または診断のための使用。
［１３］Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ菌株が受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２９２３であり、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株が受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２９２２である［１２］に記載の、原発性硬化性胆管炎の発症予測または診断のための使用。
［１４］［１］〜［８］のいずれかに記載のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株を含む菌液をマウスに投与する工程および、
３，５−ジカルベトキシ−１，４−ジヒドロコリジンを投与する工程を有する原発性硬化性胆管炎および潰瘍性大腸炎を合併したモデルマウスの作製方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ菌株、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株を、原発性硬化性胆管炎の発症予測に使用することができる。また、原発性硬化性胆管炎および潰瘍性大腸炎を合併したモデルマウスを、原発性硬化性胆管炎の治療法の確立に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１ａは、健常者（Ｈｃ１〜４）、原発性硬化性胆管炎と潰瘍性大腸炎を合併している患者（Ｐｓｃ／Ｕｃ１〜５）および潰瘍性大腸炎のみを発症している患者（Ｕｃ１〜４）の便サンプル、並びにこれら患者の便サンプルを投与したヒト化ノトバイオートマウスの便サンプルに存在する細菌叢の、Ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ  ＵｎｉＦｒａｃ解析の結果を示したグラフである。図１ｂは、ヒトの便サンプルとヒト化ノトバイオートマウスのＵｎｉＦｒａｃ解析に基づく主座標分析の結果を示したグラフである。
【図２】図２ａ〜ｃは、ＧＦマウス（ＧＦ）、健常者由来の便サンプルを投与したヒト化ノトバイオートマウス（ＨＣ）、および原発性硬化性胆管炎と潰瘍性大腸炎を合併している患者由来の便サンプルを投与したヒト化ノトバイオートマウス（ＰＳＣＵＣ）の、肝臓（ａ）、結腸（ｂ）および脾臓（ｃ）中の血清アミロイドタンパク質Ａ（Ｓａａ１〜３）およびＩＬ−１β（Ｉｌ１ｂ）の遺伝子発現量の測定結果を示したグラフである。*はＰ＜０．０５、**はＰ＜０．０１、***はＰ＜０．００１、****はＰ＜０．０００１を示す（以下の図において同じ）。
【図３】図３ａは、ＧＦ、ＨＣおよびＰＳＣＵＣの、血清アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ、左）および血清トータルビリルビン（ＴＢ、右）を測定した結果を示したグラフである。図３ｂは、ＧＦ、ＨＣおよびＰＳＣＵＣの肝臓の組織切片をシリウスレッド染色（上）、並びにヘマトキシリン−エオシン染色およびマッソントリクローム染色（下）をした標本サンプルの顕微鏡写真である。スケールバーは、１００μｍを示す。図３ｃは、ＧＦ、ＨＣおよびＰＳＣＵＣの肝臓中の細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示したグラフである。
【図４】図４ａは、Ｈｃ、Ｐｓｃ／Ｕｃ、およびＵｃの便サンプル中に含まれるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＫＰ）、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ（ＰＭ）、およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ（ＥＧ）の菌数をカウントした結果を示したグラフである。図４ｂは、ＰＳＣＵＣの肝臓中のＴｈ１７細胞またはＴｈ１細胞の割合と、該便サンプル中のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの細胞量との相関関係を示したグラフである。
【図５】図５ａは、Ｐｓｃ／Ｕｃ由来の便サンプル中のＫＰのみを投与（ＫＰ）、ＰＭおよびＥＧを投与（ＰＭ＋ＥＧ）、並びにＫＰ、ＰＭおよびＥＧの３菌株を投与（３−ｍｉｘ）した場合の各ヒト化ノトバイオートマウス、ＧＦマウス（ＧＦ）、およびＳＰＦマウス（ＳＰＦ）の、肝臓、結腸および腸間膜リンパ節中の各細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示したグラフである。図５ｂは、ＳＰＦマウス、上記ヒト化ノトバイオートマウス（ＫＰ  ｇｎｏｔｏ、ＰＭ＋ＥＧ  ｇｎｏｔｏ、および３−ｍｉｘ  ｇｎｏｔｏ）の回腸の蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍを示す。
【図６】図６ａは、腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７：Ｈ７、大腸上皮に孔形成能を有しないＫＰ株（ＫＰ  ＪＣＭ１６６２）、Ｐｓｃ／Ｕｃ由来の便サンプルを投与したマウスの腸間膜リンパ節から単離したＫＰ株（ＫＰ−Ｐ１およびＫＰ−Ｐ５）を、大腸の単層オルガノイド共培養システムに加えて共培養した大腸上皮の走査型電子顕微鏡写真である。スケールバーは２０μｍを示す。図６ｂは、大腸上皮に形成された孔の単位面積（ｍｍ2）当たりの数を示したグラフである。図６ｃは、共培養後の大腸上皮を抗切断型Ｃａｓｐａｓｅ３抗体、ファロイジン、およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３２４で３重染色したときの、蛍光顕微鏡像である。スケールバーは１００μｍを示す。
【図７】図７は、大腸上皮への孔形成能を有しないＫＰ菌株（ＡＴＣＣ  ７００６０３、ＪＣＭ１６６４、ＪＣＭ１６６２、ＪＣＭ１６６３）または有するＫＰ菌株（ＪＣＭ２０６９４、ＪＣＭ２００３４、ＪＣＭ２０３４８、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ２５５２、ＡＴＣＣ  ７００７２１、ＫＰ−Ｐ１、ＫＰ−Ｐ５、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ１７０５、ＪＣＭ２０５０７）に対し、全ゲノムシークエンスを行ったときの比較解析結果を示したチャートである。
【図８】図８ａは、実験スキームの模式図である。図８ｂは、ＧＦマウスにＫＰ−Ｐ１、ＰＭおよびＥＧを投与したヒト化ノトバイオートマウス（３−ｍｉｘ  ｇｎｏｔｏ）、並びにＪＣＭ１６６２、ＰＭおよびＥＧを投与したヒト化ノトバイオートマウス（ｍ３−ｍｉｘ  ｇｎｏｔｏ）の肝臓の蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは、２０μｍを示す。図８ｃは、各マウスの血清リポ多糖（ＬＰＳ）を測定した結果を示したグラフである。図８ｄは、各マウスの肝臓中の細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示したグラフである。
【図９】図９ａは、実験スキームの模式図である。図９ｂは、３，５−ジカルベトキシ−１，４−ジヒドロコリジン（ＤＤＣ）およびＲＯＲγｔインバースアゴニスト（ＲＯＲＩＡ）またはコントロールの水で処理したヒト化ノトバイオートマウス（３−ｍｉｘ  ｇｎｏｔｏ）の肝臓中の細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示したグラフである。図９ｃは、上記ヒト化ノトバイオートマウスの血清ＡＬＰ（左）および血清ＴＢ（右）を測定した結果を示したグラフである。
【図１０】図１０は、ＤＤＣおよびＲＯＲＩＡで処理したヒト化ノトバイオートマウス（３−ｍｉｘ  ｇｎｏｔｏ）の肝臓の切片をヘマトキシリン−エオシン染色およびマッソントリクローム染色した顕微鏡像である。スケールバーは、１００μｍを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明を詳細に説明する。
＜Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株＞
本発明の一の態様は、肝臓で炎症を誘導する、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株である。肝臓の炎症には、肝臓および肝内外の胆管の炎症も含まれ、例えば、肝炎や胆管炎が挙げられる。肝炎としては、例えば、ウイルス性肝炎、薬剤性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、および自己免疫性肝炎等が挙げられる。胆管炎としては、例えば、硬化性胆管炎（原発性硬化性胆管炎、ＩｇＧ４関連硬化性胆管炎、続発性硬化性胆管炎など）、原発性胆汁性胆管炎（原発性胆汁性肝硬変）、上行性胆管炎、二次性硬化性胆管炎、および再発性化膿性胆管炎等が挙げられる。
【００１３】
本発明のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株は、肝臓におけるＴｈ１７細胞を誘導する菌株が好ましい。Ｔｈ１７細胞の誘導は、例えば、肝臓の単核細胞を蛍光標識化抗ＣＤ４抗体および抗ＩＬ−１７抗体で処理し、フローサイトメトリー解析によって、ＩＬ−１７を産生するＣＤ４陽性ヘルパーＴ（Ｔｈ１７）細胞の有意な増加によって確認することができる。
【００１４】
本発明のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株は、大腸上皮に対して孔を形成する孔形成能を有することが好ましい。孔の形、大きさは、特に制限はされないが、該孔から腸内細菌が漏出できる程度であればよい。例えば、大腸上皮の走査型電子顕微鏡観察において、直径が０．１〜２０μｍであればよく、０．５〜１５μｍがより好ましい。該孔から腸内細菌の漏出を確認する方法としては、例えば、腸内細菌のＤＮＡを蛍光化プローブでハイブリダイゼーションし、該蛍光とは異なる色の蛍光を発する蛍光色素で大腸上皮細胞を染色した大腸上皮切片を、蛍光顕微鏡観察することで確認することができる。孔が形成される詳細なメカニズムは不明であるが、本発明のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株が大腸上皮に直接接触しアポトーシスを誘導することで、孔が形成されると推測される。
【００１５】
本発明のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株は、６型分泌装置（Ｔｙｐｅ  ６  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ｔ６ＳＳ）を有することが好ましい。６型分泌装置の確認は、例えば、該菌株の全ゲノムシークエンスによる比較解析による遺伝子の存在から確認することができる。
【００１６】
本発明のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株は、後述する原発性硬化性胆管炎および潰瘍性大腸炎を合併している患者由来の菌株であることが好ましい。該菌株は患者の便サンプルから、公知の方法により汎用増殖培地を用いて単離することができる。該培地としては、例えば、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培地、マッコンキー寒天培地、ＶＲＢＧ培地などが挙げられる。
【００１７】
本発明のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株は、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）にＡｓｓｅｍｂｌｙ  Ｎａｍｅ：ＡＳＭ３８５１８２ｖ１として登録されている塩基配列からなるＤＮＡを有することが好ましく、該Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株が、寄託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７９であることがより好ましい。
【００１８】
本発明のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株は、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）にＡｓｓｅｍｂｌｙ  Ｎａｍｅ：ＡＳＭ３８６５１１ｖ１として登録されている塩基配列からなるＤＮＡを有することが好ましい。
【００１９】
＜原発性硬化性胆管炎＞
原発性硬化性胆管炎は公知の臨床ガイドラインに即して診断することができる。例えば、診断項目として、大項目を（Ａ）「胆管像」、および（Ｂ）「アルカリフォスファターゼ値の上昇」とし、小項目を（ａ）「炎症性腸疾患の合併」、および（ｂ）「肝組織像（繊維性胆管炎／ｏｎｉｏｎ  ｓｋｉｎ  ｌｅｓｉｏｎ）」とし、（Ａ）胆管像を、（Ａ１）「原発性硬化性胆管炎に特徴的な胆管像の所見を認める」、および（Ａ２）「原発性硬化性胆管炎に特徴的な胆管像の所見を認めない」、と分けた場合、以下の表１において、確診および準確診のみを原発性硬化性胆管炎として取り扱うことができる。
【００２０】
【表１】
2019187416.tif 000002
【００２１】
アルカリフォスファターゼ値は、公知の方法により測定することができる。例えば、日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）常用基準法に即して測定することができる。測定値が、例えば、基準値の２〜３倍高い場合を異常値と判断することができる。
【００２２】
胆管像は、例えば、内視鏡的逆行性胆管造影（ＥＲＣ）やＭＲＩ膵胆管造影（ＭＲＣＰ）検査を行い、原発性硬化性胆管炎に特徴的な肝内、肝外胆管の炎症に伴うびまん性の壁不整や狭窄の所見から、上記（Ａ１）と（Ａ２）の判断を行うことができる。
【００２３】
なお、上記原発性硬化性胆管炎の診断に際しては、胆管癌などの悪性腫瘍、ＩｇＧ４関連硬化性胆管炎、および二次性硬化性胆管炎を除く必要がある。ＩｇＧ４関連硬化性胆管炎は、例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｏｆ  ＩｇＧ４−ｒｅｌａｔｅｄ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ  ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ  ２０１２（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏ−Ｂｉｌｉａｒｙ−Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｖｏｌ．１９、ｐｐ５３６−５４２）により、４つの基準（（１）特徴的な胆管像の知見、（２）血清ＩｇＧ４濃度の上昇、（３）胆道以外のＩｇＧ４関連疾患の合併および（４）特徴的な病理組織学的所見））の組合せに基づいて診断することができる。
【００２４】
二次性硬化性胆管炎としては、例えば、カロリ病、嚢胞性線維症などの先天性疾患；総胆管結石、胆管狭窄、Ｍｉｒｉｚｚｉ症候群、肝移植後の吻合狭窄、腫瘍などの慢性閉塞性疾患；細菌性胆管炎、再発性化膿性胆管炎、寄生虫感染、サイトメガロウィルス感染などの感染性疾患；アルコール、ホルムアルデヒド、高張生理食塩水の胆管内誤注入などの中毒性疾患；好酸球性胆管炎、ＡＩＤＳを伴うものなどの免疫異常；血管損傷、外傷後性硬化性胆管炎、肝移植後肝動脈塞栓、肝移植後の拒絶反応、冠動脈抗癌剤動注に関連するものなどの虚血性疾患；全身性血管炎、アミロイドーシス、サルコイドーシス、全身性肥満細胞症、好酸球増加症候群、Ｈｏｄｇｋｉｎ病、黄色肉芽腫性胆管炎などの浸潤性病変が挙げられる。
【００２５】
＜潰瘍性大腸炎＞
潰瘍性大腸炎は公知の臨床ガイドラインに即して診断することができる。例えば、以下の項目（Ａ）および（Ｃ）に加えて、（Ｂ−１）または（Ｂ−２）のいずれかを満たし、（Ｄ）の疾患が除外できれば確診することができる。
【００２６】
（Ａ）臨床症状：持続性若しくは反復性の粘血、血便またはその既往がある。
（Ｂ−１）内視鏡検査：（１）粘膜はびまん性におかされ、血管透見像は消失し、粗ぞうまたは細顆粒状を呈する。さらにもろくて易出血性（接触出血）を伴い、粘血膿性の分泌が付着しているか、（２）多発性のびらん、潰瘍あるいは偽ポリポーシスを認める。（３）原則として、病変は直腸から連続して認める。
（Ｂ−２）注腸Ｘ線検査：（１）粗ぞうまたは細顆粒状の粘膜表面のびまん性変化、（２）多発性のびらん、潰瘍、（３）偽ポリポーシスを認める。その他、ハウストラの消失（鉛管像）や腸管の狭小、短縮が認められる。
（Ｃ）生検組織学的検査：活動期では粘膜全層にびまん性炎症性細胞浸潤、陰窩腫瘍、高度な杯細胞減少が認められる。いずれも非特異的所見であるので、総合的に判断する。寛解期では腺の配列異常（蛇行、分岐）、萎縮が残存する。上記変化は通常直腸から連続性に口側にみられる。
（Ｄ）細菌性、クロストリジウム  ディフィシル腸炎、アメーバ性大腸炎、サルモネラ腸炎、カンピロバクタ腸炎、大腸結核、クラミジア腸炎などの感染性腸炎；クローン病；放射性照射性大腸炎；薬剤性大腸炎；リンパ濾胞増殖症；虚血性大腸炎；腸型ベーチェット等
【００２７】
上記確診例のほかに、（Ｂ−１）または（Ｂ−２）、および（Ｃ）を複数回にわたって満たす場合、切除手術または剖検により、肉眼的および組織学的に潰瘍性大腸炎に特徴的な所見を認める場合は、確診することができる。
【００２８】
＜原発性硬化性胆管炎の発症予測のため使用＞
本発明の別の態様は、上記Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株のみ、または上記Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ菌株およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株を、原発性硬化性胆管炎の発症予測のために使用することである。
【００２９】
上記のとおり、例えば、原発性硬化性胆管炎および潰瘍性大腸炎を合併している患者由来のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株は、（１）６型分泌装置を有すること、（２）大腸上皮に対する孔形成能を有すること、（３）肝臓においてＴｈ１７細胞を誘導することを特徴とする。このことから、潰瘍性大腸炎に罹患している患者は、６型分泌装置を有するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株が、大腸上皮に孔を形成してＰｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ菌株、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株等の腸内細菌を漏出させ、肝臓のおけるＴｈ１７細胞を誘導することで、原発性硬化性胆管炎を合併することが推測される。
【００３０】
従って、潰瘍性大腸炎に罹患している患者の便サンプル中のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株が、ゲノムシークエンスなどによって６型分泌装置を有することが認められた場合、原発性硬化性胆管炎を発症することが予測され得る。また、その後の大腸の組織生検を行い走査型電子顕微鏡観察によって大腸上皮に孔の形成が認められた場合は、その予測精度が高くなる。さらに、肝生検を行いフローサイトメトリーなどの手法により肝臓におけるＴｈ１７細胞が増加していることが認められた場合は、さらに予測精度が高くなる。
【００３１】
また、患者の便サンプルを培養し、上記Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株の他に、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ菌株、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株の存在の有無を予測の判断材料に用いることができる。上記Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ菌株、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌は、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ菌株（受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２９２３）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株（受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２９２２）が好ましい。
【００３２】
＜原発性硬化性胆管炎および潰瘍性大腸炎を合併したモデルマウスの作製方法＞
本発明の別の態様は、原発性硬化性胆管炎および潰瘍性大腸炎を合併したモデルマウスの作製方法である。具体的には、上記＜Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株＞の項で記載したＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株を含む菌液をマウスに投与する工程および、３，５−ジカルベトキシ−１，４−ジヒドロコリジンを投与する工程を有する原発性硬化性胆管炎および潰瘍性大腸炎を合併したモデルマウスの作製方法である。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株を含む菌液をマウスに投与する工程と、３，５−ジカルベトキシ−１，４−ジヒドロコリジンを投与する工程とを行う順番に特に制限は無いが、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株を含む菌液をマウスに投与する工程を行った後に、３，５−ジカルベトキシ−１，４−ジヒドロコリジンを投与する工程を行うのが好ましい。
【００３３】
該モデルマウス作製に使用するオリジナルマウスは、原発性硬化性胆管炎および潰瘍性大腸炎を合併することができるマウスであれば特に制限されないが、無菌マウスが好ましい。無菌マウスとしては、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、ＩＣＲなどの系統から作出したマウスが挙げられる。
【００３４】
該モデルマウスの作製するために、例えば、原発性硬化性胆管炎および潰瘍性大腸炎患者から採取した便サンプルを、例えば、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）などの溶液に懸濁した懸濁液を調製し、該懸濁液をオリジナルマウスに経口投与し、ヒト化ノトバイオートマウスを作製する。次いで、投与１９日〜２３日後のヒト化ノトバイオートマウスに、０．０１％〜０．１％の３，５−ジカルベトキシ−１，４−ジヒドロコリジン（ＤＤＣ）入りの餌を１２〜１６日間自由摂取させることで、原発性硬化性胆管炎および潰瘍性大腸炎を合併したモデルマウスを作製することができる。
【００３５】
本発明の別の態様は、受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２９２３である、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ菌株である。
【００３６】
本発明の別の態様は、受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２９２２である、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ菌株である。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を実施例に基づいて更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
［実施例１］ヒトおよびヒト化ノトバイオートマウスの腸内細菌叢の比較
（１）便サンプルの回収
原発性硬化性胆管炎と潰瘍性大腸炎を合併している患者（以下、「Ｐｓｃ／Ｕｃ」と称すことがある）１４名、潰瘍性大腸炎のみを発症している患者（以下、「Ｕｃ」と称すことがある）８名、健常者（以下、「Ｈｃ」と称すことがある）１０名を被検者とした。原発性硬化性胆管炎の診断は、臨床ガイドライン、胆管造影および肝生検による所見によって行った。潰瘍性大腸炎の診断は、内視鏡検査、病理組織検査、ならびに放射線および血清学的検査を組み合わせて行った。便サンプルは便収集管を用いて回収し、４０％グリセロールと同量（ｗ／ｖ）のＰＢＳを含む溶液に懸濁し、懸濁液を急速冷凍し、使用するまでマイナス８０℃で保管した。
【００３８】
（２）ヒト化ノトバイオートマウスの作製
上記（１）の各便サンプルの冷凍ストックを解凍し、６倍量のＰＢＳ中に懸濁したあと、７０μｍのセルストレーナーを通して経口投与用懸濁液を調製した。６〜８週齢の雄の無菌マウス（ＧＦマウス、三共ラボラトリーズ社製）に、２００μＬの経口投与用懸濁液をステンレス製の経口ゾンデを用いて経口投与し、ヒト化ノトバイオートマウスを作製した。投与３〜４週間後、該ヒト化ノトバイオートマウスから便サンプルを回収した。
【００３９】
（３）便サンプル中のＤＮＡの回収
（１）のヒトおよび（２）のヒト化ノトバイオートマウスの便サンプル中の細菌のＤＮＡは、ライソザイム（シグマアルドリッチ社製）とアクロモペプチダーゼ（富士フィルム和光純薬社製）を用いる酵素的溶解方法によって単離した。得られたＤＮＡサンプルをリボヌクレアーゼＡ（富士フィルム和光純薬社製）で処理して精製したあと、２０％ポリエチレングリコール溶液（ＰＥＧ６０００、２．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液）を用いて沈殿させた。遠心分離で沈殿物を回収したあと、７５％エタノールで洗浄し、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファー中に溶解した。
【００４０】
（４）１６ＳｒＲＮＡメタゲノム解析
（３）で得られたＤＮＡの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の超可変性領域Ｖ３−Ｖ４を、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）を用いて増幅し、増幅産物をＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（ベックマン  コールター社製）を用いて精製した。得られたＤＮＡからミックスサンプルを調製し、Ｍｉｓｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  Ｖ３およびＭｉｓｅｑ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（イルミナ社製）を用いて、製品マニュアルに従って配列決定した。配列解析は、ＱＩＩＭＥ  ソフトウェア  パッケージ  ｖｅｒ．１．９．１を用いて行った。ペアエンドシークエンスは、ＥＡ−Ｕｔｉｌｓ  ソフトウェアパッケージのｆａｓｔｑ−ｊｏｉｎツールを用いて結合した。クオリティフィルタを経た配列から、一サンプルあたり高品質の１５０００配列を選択した。ＵＳＥＡＲＣＨを用いて、キメラ配列を検出し、ｃｕｔａｄａｐｔを用いてプライマー配列を除去したあと、ＵＣＬＵＳＴアルゴリズムを用いて、９６％の配列類似度でＯＴＵをアサインした。ＯＴＵのアサイン、ＧＬＳＥＡＲＣＨプログラムを用いて、１６Ｓ（ＲＤＰ  ｖｅｒ．１０．２７  ａｎｄ  ＣＯＲＥ  ｕｐｄａｔｅ  ２  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１２）とＮＣＢＩのゲノムデータベースに対する類似性検索によりなされた。レアファンクション曲線で決定されたように、データを一サンプル当たり１００００配列に希薄化し、細菌の相対的存在量を決定した。Ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ ＵｎｉＦｒａｃ解析は、文献（Ｔｓｕｄａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｏｎ−Ｐｕｍｐ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｌｕｍｉｎａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｔｒａｃｔ．  Ｃｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ６，  ｅ８９  （２０１５））の記載の方法に従って行った。結果を図１に示す。これより、ヒトおよびヒト化ノトバイオートマウス間の主要な細菌叢が保存されていることが示された。
【００４１】
［実施例２］臓器中の血清アミロイドタンパク質Ａ（ＳＡＡ）およびＩＬ−１βの遺伝子発現量の測定
実施例１で作製したヒト化ノトバイオートマウスの肝臓、結腸および脾臓をホモジネートし、各臓器中のトータルＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出した。得られたトータルＲＮＡ１μｇから、逆転写によりｃＤＮＡを合成し、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  Ｆａｓｔ  ＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）および以下のデザインプライマー（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて標的遺伝子のＰＣＲを行った。
【００４２】
Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｏｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  （Ｇａｐｄｈ）：Ｍｍ０３３０２２４９＿ｇ１
Ｓａａ１：Ｍｍ００６５６９２７＿ｇ１
Ｓａａ２：Ｍｍ０４２０８１２６＿ｍＨ
Ｓａａ３：Ｍｍ００４４１２０３＿ｍ１
ＩＬ−１β：Ｍｍ０１３３６１８９＿ｇ１
【００４３】
増幅産物を、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ａｎｄ  ＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲにより定量した。各サンプルにおいて、標的の遺伝子発現量はＧａｐｄｈを用いて標準化した。結果を図２に示す。これよりＰｓｃ／Ｕｃ由来の便サンプルを投与したヒト化ノトバイオートマウス（図中、ＰＳＣＵＳ）の肝臓（図２ａ）および結腸（図２ｂ）において、血清アミロイドタンパク質ＡおよびＩＬ−１βの遺伝子発現が亢進していることが示され、Ｐｓｃ／Ｕｃの腸内細菌叢に、肝臓および大腸の疾患に関連した細菌が存在することが示された。
【００４４】
［実施例３］原発性硬化性胆管炎および潰瘍性大腸炎を合併したモデルマウスの作製
（１）血清アルカリフォスファターゼおよび血清トータルビリルビン測定
ＧＦマウス、並びに実施例１（２）で作製したＨｃまたはＰｓｃ／Ｕｃの便を経口投与した各ヒト化ノトバイオートマウスに、投与２１日後に０．０５％の３，５−ジカルベトキシ−１，４−ジヒドロコリジン（ＤＤＣ）入りの餌を１４日間自由摂取させ、血清中のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）およびトータルビリルビン（ＴＢ）をＬＤＨ−ＵＶ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ（ＳＲＬ社製）を用いて測定した。結果を図３ａに示す。Ｐｓｃ／Ｕｃ由来の便サンプルを投与したヒト化ノトバイオートマウス（図中、ＰＳＣＵＣ）は、ＧＦマウス（図中、ＧＦ）およびＨｃ由来の便サンプルを投与したヒト化ノトバイオートマウス（図中、ＨＣ）に比べて、ＡＬＰ（図１ａ左）およびＴＢ（図１ａ右）のいずれも高い発現量が示された。
【００４５】
（２）肝臓の組織化学的観察
上記ＤＤＣ処理したヒト化ノトバイオートマウスから肝臓を採取し、常法に従い、１０％のホルマリンで固定しパラフィンで包埋してパラフィンブロックを作成した。該パラフィンブロックから切片を切り出し、切片をヘマトキシリン−エオシン染色およびマッソントリクローム染色、またはシリウスレッド染色をして標本サンプルを作成した。該標本サンプルの顕微鏡観察結果を図３ｂに示す。図３ｂ上段がシリウスレッド染色の結果、図３ｂ下段がヘマトキシリン−エオシン染色およびマッソントリクローム染色による共染色の結果である。Ｐｓｃ／Ｕｃ由来の便サンプルを投与したヒト化ノトバイオートマウスの肝臓では、肝臓の繊維形成による肝障害が示された。
【００４６】
（３）免疫学的解析
上記ＤＤＣ処理したマウスの肝臓を採取して、ＰＢＳを門脈から灌流させた。灌流後に肝臓を細断し、１００μｍのナイロンメッシュに通して肝臓の細胞を得た。
【００４７】
得られた細胞を４０％のＰｅｒｃｏｌｌ溶液に懸濁したあと、７５％のＰｅｒｃｏｌｌフラクションにオーバーレイした。これを、室温で８４０×ｇ、２０分間、密度勾配遠心による分離を行い、中間層から単核細胞を回収した。得られた単核細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ用のバッファーに懸濁した。単核細胞を抗Ｆｃ抗体（ＣＤ１６／３２，ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を用いてブロッキング処理を行ったあと、抗ＣＤ４抗体（ＡＰＣ−ｃｙ７、ＢＶ５１０）、抗ＣＤ１１ｂ抗体（ＡＰＣ−ｃｙ７）で細胞内染色を行った。該細胞内染色は、リポ多糖（大腸菌Ｂ５由来、シグマアルドリッチ社製）またはＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ社製）、およびｂｒｅｆｉｌｄｉｎＡ（１０μｇ／ｍＬ、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）の存在下、Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎｅ（５００ｎｇ／ｍＬ）またはＧｏｌｇｉｓｔｏｐ（１０μｇ／ｍＬ  ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて処理した。
【００４８】
その後、抗ＩＦＮ−γ抗体、抗ＴＮＦ−α抗体、抗ＩＬ−１β抗体、および抗ＩＬ−１７抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を加え、４℃で２０分間共培養した。培養後の細胞をＰＢＳで洗浄し、セルソーター（「ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ」、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ社製）を用いて解析を行った。結果を図３ｃに示す。これより、Ｐｓｃ／Ｕｃ由来の便サンプルを投与し、ＤＤＣ処理したマウスにおいて、肝障害の発達および、Ｔｈ１７細胞、ＩＬ−１β+ＣＤ１１ｂ+ マクロファージの動員が認められ、原発性硬化性胆管炎および潰瘍性大腸炎を合併したモデルマウスを得た。
【００４９】
［実施例４］Ｐｓｃ／Ｕｃ由来の腸内細菌叢の特定
（１）マウス便サンプル中の腸内細菌叢の解析
肝炎誘導の原因となる細菌を特定するため、ＨｃまたはＰｓｃ／Ｕｃの便サンプルを経口投与したヒト化ノトバイオートマウス、およびコントロール群であるＳＰＦマウス（６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス、日本クレア製）から、投与２１日目に肝臓、腸間膜リンパ節および脾臓を採取し、寒天プレートにて細菌を培養した。その結果、肝臓および脾臓からはいずれのマウスからもコロニーが確認できなかった。また、腸間膜リンパ節においては、Ｐｓｃ／Ｕｃ由来の便サンプルを投与したヒト化ノトバイオートマウスからのみコロニーが確認された。上記コロニーの１６Ｓ  ｒＲＮＡの菌叢解析によって、該コロニー中の細菌は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：ＫＰ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ：ＰＭ）およびエンテロコッカス・ガリナリム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ：ＥＧ）であることが示された。
【００５０】
（２）ヒト便サンプル中の腸内細菌叢の解析
Ｈｃ、Ｐｓｃ／ＵｃおよびＵｃ由来の便サンプルをＢＨＩ培地（ベクトンデッキンソン社製）を用いて嫌気培養し、ＫＰ、ＰＭおよびＥＧの細胞数をカウントした。結果を図４ａに示す。Ｐｓｃ／Ｕｃ由来の便サンプルには、ＫＰが顕著に存在し、ＰＭおよびＥＧも認められることが示された。該ＫＰには、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）にＡｓｓｅｍｂｌｙ  Ｎａｍｅ：ＡＳＭ３８５１８２ｖ１として登録された塩基配列からなるＤＮＡを有するＫＰ菌株（寄託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８７９）、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）にＡｓｓｅｍｂｌｙ  Ｎａｍｅ：ＡＳＭ３８６５１１ｖ１として登録された塩基配列からなるＤＮＡを有するＫＰ菌株が含まれていた。また、該ＰＭにはＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２９２３の菌株が、該ＥＧにはＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２９２２の菌株が含まれていた。
【００５１】
（３）ヒトおよびヒト化ノトバイオートマウスの便サンプル中のＫＰの相関解析
実施例２（３）と同様にして、抗ＣＤ３ｅ抗体（ＦＩＴＣ）、抗ＣＤ４抗体（ＡＰＣ−ｃｙ７、ＢＶ５１０）、抗ＩＦＮ−γ抗体および抗ＩＬ−１７抗体を用いた、フローサイトメトリーによる解析から、Ｐｓｃ／Ｕｃ由来の便サンプルを投与されたヒト化ノトバイオートマウスの肝臓中のＴｈ１７細胞またはＴｈ１細胞の割合と、該便サンプル中のＫＰの細胞量との相関関係を、スピアマン順位相関検定を用いて有意性を検証した。結果を図４ｂに示す。ＫＰとＴｈ１７細胞との間で相関が認められた（図４ｂ左）が、ＫＰとＴｈ１細胞との間では相関が認められなかった（図４ｂ右）。これより、肝臓におけるＴｈ１７細胞の誘導には、Ｐｓｃ／Ｕｃ由来のＫＰが寄与していることが示された。
【００５２】
［実施例５］ＫＰ、ＰＭおよびＥＧの性質評価
（１）単一菌株および混合菌株投与時の肝臓におけるＴｈ１７細胞誘導評価
Ｔｈ１７細胞誘導の上記３菌株の寄与を検討するため、ＧＦマウスに、１×１０8ＣＦＵ／２００μＬのＫＰ、ＰＭおよびＥＧを、（１）ＫＰ単独（ＫＰ）、（２）ＰＭとＥＧの組合せ（ＰＭ＋ＥＧ）、（３）３菌株の組合せ（３−ｍｉｘ）で、それぞれ１週間に２回経口投与した。投与２１日後に、実施例２（３）と同様にして、肝臓、結腸および腸間膜リンパ節における抗ＣＤ４抗体（ＡＰＣ−ｃｙ７、ＢＶ５１０）、抗ＩＬ−１７抗体および抗ＲＯＲγｔ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を用いたフローサイトメトリーによる解析を行った。結果を図５ａに示す。肝臓（図５ａ左）、結腸（図５ａ中）および腸間膜リンパ節（図５ａ右）のいずれの臓器のおいても、菌株を投与していないＧＦマウス（ＧＦ）、ＳＰＦマウス（ＳＦＰ）に比べて、ＫＰ投与群、特に３−ｍｉｘ投与群でＴｈ１７細胞誘導が認められた。
【００５３】
（２）大腸の組織化学的観察
ＧＦマウスに、ＫＰ単独、ＰＭおよびＥＧ並びにＫＰ、ＰＭおよびＥＧの３菌株を投与したヒト化ノトバイオートマウス（それぞれ、ＫＰ、ＰＭ＋ＥＧ  ｇｎｏｔｏ、３−ｍｉｘ  ｇｎｏｔｏ）の便物質を含む回腸組織を、Ｃａｒｎｏｙ’ｓ溶液を用いて３時間固定し、パラフィンで包埋してパラフィンブロックを作製した。該ブロックから組織切片を切り出し、ハイブリダイゼーションバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．９Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％  ＳＤＳ、２０％ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）中の最終濃度が１０μｇ／ｍＬになるよう調製された上記菌株のＤＮＡとハイブリダイズするＥＵＢ３３８プローブ（Ａｌｅｘａ５５５  ｌａｂｅｌ）を用いて、５０℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。
【００５４】
洗浄バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．９Ｍ  ＮａＣｌ）で１０分間、およびＰＢＳで１０分間×３回洗浄した後、Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ−ｉＦｌｕｏｒ（Ａｂｃａｍ社製）で組織切片を染色した。ＰＢＳで１０分間×３回洗浄した後、スライドをＰｒｏｌｏｎｇ  ａｎｔｉ−ｆａｄｅ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉａ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて封入した。顕微鏡観察は、ＢＩＯ−ＲＥＶＯ  ＢＺ−９０００  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＫＥＹＥＮＣＥ社製）を用いて行った。結果を図５ｂに示す。図中赤く示された菌が、３−ｍｉｘ  ｇｎｏｔｏおよびＫＰ  ｇｎｏｔｏでは大腸上皮粘膜を侵襲し、さらに一部の菌の大腸上皮内への侵襲が認められた。特に３−ｍｉｘ  ｇｎｏｔｏではこれが顕著だった。一方、ＰＭ＋ＥＧ  ｇｎｏｔｏではわずかに侵襲するに留まり、コントロールのＳＰＦでは侵襲が認められなかった。
【００５５】
［実施例６］ＫＰ菌株の大腸上皮孔形成能評価１
（１）単層オルガノイド共培養システムの作製
健全なヒト結腸オルガノイドをＭａｔｒｉｇｅｌ（コーニング）に埋め込み、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ、１ｘＢ２７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、１ｍＭ  Ｎａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ（和光純薬工業社製）、１０ｎＭ  ＧａｓｔｒｉｎＩ（シグマアルドリッチ社製）、５０ｎｇ／ｍＬ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＥＧＦ、０．５μＭ  Ａ８３−０１、３μＭ  ＳＢ２０２１９０、５０％  Ａｆａｍｉｎ−Ｗｎｔ３ａ（Ａｆｍ−Ｗ）ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（ＣＭ、ｖ／ｖ）、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１（Ｒ）−ＣＭ（１０％ｖ／ｖ）、Ｎｏｇｇｉｎ（Ｎ）−ＣＭ（１０％ｖ／ｖ）添加）で３次元培養した。
【００５６】
上記３次元培養されたヒト結腸オルガノイドを、１０μＭ  Ｙ−２７６３２含む、Ａｆｍ−Ｗｎｔ、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１、Ｎｏｇｇｉｎ、ＥＧＦ、Ａ８３−０１およびＳＢ２０２１９０を含む培地で少なくとも１日間培養したあと分離し、１０％  Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  ｔｙｐｅ  Ｉ−Ｃ（新田ゼラチン社製）でコートされたポアサイズ０．４μｍのＴｈｉｎＣｅｒｔ  ２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅｓ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に播種した。播種２〜３日後、培地を、Ａｆｍ−ＷｎｔおよびＳＢ２０２１９０Ｙ−２７６３２を含まないコンディション培地に置換した。菌株を播種する前に、結腸上皮をＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液で洗浄し、抗生物質フリーのＤＭを添加し、単層オルガノイド共培養システムを作製した。
【００５７】
（２）菌株と大腸上皮細胞との共培養および形態学的解析
Ｐｓｃ／Ｕｃ由来の便サンプルを投与したマウスの腸間膜リンパ節から単離したＫＰ菌株（ＫＰ−Ｐ１およびＫＰ−Ｐ５）、腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７：Ｈ７、並びに理研バイオリサーチセンターより入手したＫＰ株（ＫＰ  ＪＣＭ１６６２）を、それぞれ１×１０5ＣＦＵの濃度で上記単層オルガノイド共培養システムに加え８時間培養した。コントロールとしてＰＢＳを添加した。共培養した大腸上皮を回収し、ＰＢＳ中に溶解した５％のグルタルアルデヒド（ＴＣＩ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）で４℃で一晩前固定した。前固定後のサンプルをＰＢＳ中に溶解させた１％の四酸化オスミウムで１時間、後固定した。後固定したサンプルをエタノールによる脱水および金スパッタリングによるコート後、走査型電子顕微鏡（「ＶＨＸ−Ｄ５１０  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ」、Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）を用いて、高真空モードで観察した。結果を図６ａに示す。
【００５８】
また、大腸上皮の４つの独立した位置の観察により、ポアサイズ１０μｍ以上の大腸の孔の数をカウントした。実験は３〜６回繰り返した。結果を図６ｂに示す。これより、Ｐｓｃ／Ｕｃ由来の便サンプルを投与したＫＰ菌株（ＫＰ−Ｐ１およびＫＰ−Ｐ５）は、大腸上皮に孔を形成するのに対し、ＪＣＭ１６６２菌株は孔を形成しないことが示された。また、他のＫＰ菌株を用いた同様の試験から、７つのＫＰ菌株（ＪＣＭ２００３４、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ１７０５、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ２５５２、ＡＴＣＣ７００７２１、ＪＣＭ２０３４８、ＪＣＭ２０６９４およびＪＣＭ２０５０７）は大腸上皮に孔を形成するのに対し、４つのＫＰ菌株（ＪＣＭ１６６２、ＪＣＭ１６６３、ＪＣＭ１６６４およびＡＴＣＣ７００６０３）は大腸上皮に孔を形成しないことが示された。
【００５９】
さらに、共培養後の大腸上皮細胞を、抗切断型Ｃａｓｐａｓｅ３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、繊維状アクチンの染色剤のファロイジン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、およびＤＮＡ染色剤のＨｏｅｃｈｓｔ３３３２４（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で３重染色し、アポトーシス細胞を共焦点レーザー顕微鏡（ＳＰ５、Ｌｅｉｃａ社製）を用いて観察した。結果を図６ｃに示す。これより、ＫＰ―Ｐ１は、大腸上皮に直接接触しアポトーシスを誘導することが推測される。
【００６０】
（３）ＫＰ菌株のゲノムシークエンス
上記大腸上皮に対する孔形成能を有するまたは有しないＫＰ菌株に対し、全ゲノムシークエンスを、ＰａｃＢｉｏ  ＲＳＩＩ  ａｎｄ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓを用いて全ゲノムショットガン法により行い、比較解析を行った。結果を図７に示す。これにより、９７のオルソロガス遺伝子中、大腸上皮に対する孔形成能を有するＫＰ菌株は、６型分泌装置（Ｔｙｐｅ  ６  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ：Ｔ６ＳＳ）および活性酸素（ＲＯＳ）分解に関与する遺伝子が含まれていることが示された。
【００６１】
［実施例７］ＫＰ菌株の大腸上皮孔形成能評価２
（１）大腸の組織化学的観察
ＧＦマウスにＰＭ、ＥＧおよび大腸上皮に孔を形成するＫＰ菌株であるＫＰ−Ｐ１の３菌株を投与したヒト化ノトバイオートマウス（３−ｍｉｘ  ｇｎｏｔｏ）と、ＰＭ、ＥＧおよび大腸上皮に孔を形成しないＫＰ菌株であるＫＰ  ＪＣＭ１６６２の３菌株を投与したマウス（ｍ３−ｍｉｘ  ｇｎｏｔｏ）をヒト化ノトバイオートマウスを作製し、投与２１日後に各マウスから回腸を採取し、実施例５（２）と同様の方法により組織化学的観察を行った。結果を図８ｂに示す。ｍ３−ｍｉｘ  ｇｎｏｔｏは大腸粘膜にわずかしか侵襲できないのに対し、３−ｍｉｘ  ｇｎｏｔｏは大腸粘膜および上皮組織内に侵襲できることが示された。
【００６２】
（２）血清中のＬＰＳ濃度の測定
ＧＦマウス、ＳＰＦマウス、３−ｍｉｘ  ｇｎｏｔｏおよびｍ３−ｍｉｘ  ｇｎｏｔｏから血液を採取して、ＴｏｘｉｎＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  （ＬＡＬ）  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）を用いて、製品のマニュアルに従ってサンプルを調製し、５４０ｎｍの吸光度をＦｉｌｔｅｒＭａｘ  Ｆ３  Ｍｕｌｔｉ−Ｍｏｄｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。結果を図８ｃに示す。これより、ＧＦマウス、ＳＰＦマウスおよびｍ３−ｍｉｘ群に比べ、３−ｍｉｘにおいて血清ＬＰＳレベルが有意に増加することが示された。
【００６３】
（３）Ｔｈ１７細胞誘導評価
実施例２（３）と同様の方法で、ＧＦマウス、３−ｍｉｘ  ｇｎｏｔｏとｍ３−ｍｉｘ  ｇｎｏｔｏの肝臓における抗ＣＤ４抗体（ＡＰＣ−ｃｙ７、ＢＶ５１０）、抗ＩＬ−１７抗体および抗ＲＯＲγｔ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を用いたフローサイトメトリーによる解析を行った。結果を図８ｄに示す。これより、３−ｍｉｘ  ｇｎｏｔｏはＧＦマウスおよびｍ３−ｍｉｘ  ｇｎｏｔｏに比べ有意にＴｈ１７細胞を誘導することが示された。
【００６４】
［実施例８］ＫＰ菌株誘導Ｔｈ１７細胞の病原性評価
（１）ＲＯＲγｔインバースアゴニスト処理によるＴｈ１７細胞誘導評価
３−ｍｉｘ  ｇｎｏｔｏに対し、菌株投与１４日後からＲＯＲγｔインバースアゴニスト（ＲＯＲγｔ  ＩＡ）またはコントロールとして水、およびＤＤＣとを含む餌を毎日２週間摂取させた（図９ａ）。その後、実施例２（３）と同様の方法で、該マウスの肝臓における抗ＣＤ４抗体（ＡＰＣ−ｃｙ７、ＢＶ５１０）、抗ＩＬ−１７抗体、抗ＩＦＮ−γ抗体および抗ＲＯＲγｔ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を用いたフローサイトメトリー解析を行った。結果を図９ｂに示す。
【００６５】
また、実施例３（１）と同様の方法により、血清アルカリフォスファターゼおよび血清トータルビリルビンを測定した。結果を図９ｃに示す。さらに、実施例３（２）と同様の方法により肝臓の切片をヘマトキシリン−エオシン染色およびマッソントリクローム染色処理して顕微鏡観察を行った。結果を図１０に示す。
これらの結果から、肝臓における菌株によって誘導されたＴｈ１７細胞は、ＤＤＣによって誘発された胆管道障害の発達に病原的な役割を果たすことが推測される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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