(57)【要約】      （修正有）【課題】マイクロリアクタチップ上での濃度勾配形成方法およびマイクロリアクタチップを提供する。【解決手段】マイクロリアクタチップ２０上での濃度勾配形成方法は、疎水性物質からなる層２４であって、複数のチャンバー２６の開口部が該層の主面上に規則的に配列するように形成されている、疎水層を備えたマイクロリアクタチップの、疎水層の主面上に設けられた第１液体流路４８ａに第１水溶液を導入し、第１液体流路に面する各チャンバーを第１水溶液で満たすステップと、第１液体流路の第１導入口４５ａから第１水溶液とは濃度が異なる第２水溶液を導入し、各チャンバーに満たされた水溶液の濃度に第１導入口からの距離に応じた勾配を形成するステップと、第１液体流路に脂質を含有する有機溶媒と第３水溶液とを順に導入し、各チャンバーの開口部に水溶液を液封するように脂質二重膜を形成するステップと、を含む。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性物質からなる層であって、複数のチャンバーの開口部が該層の主面上に規則的に配列するように形成されている、疎水層を備えたマイクロリアクタチップの、前記疎水層の主面上に設けられた第１液体流路に第１水溶液を導入し、前記第１液体流路に面する各チャンバーを前記第１水溶液で満たすステップと、
前記第１液体流路の第１導入口から前記第１水溶液とは濃度が異なる第２水溶液を導入し、各チャンバーに満たされた水溶液の濃度に前記第１導入口からの距離に応じた勾配を形成するステップと、
前記第１液体流路に脂質を含有する有機溶媒と第３水溶液とを順に導入し、各チャンバーの開口部に前記水溶液を液封するように脂質二重膜を形成するステップと、
を含む、マイクロリアクタチップ上での濃度勾配形成方法。
【請求項２】
前記第１導入口は前記第１液体流路の一端に形成されており、前記第１液体流路の他端は大気に開放されている、
請求項１に記載の濃度勾配形成方法。
【請求項３】
前記第１液体流路に前記第２水溶液を導入する工程では、電動ピペットを用いて予め定められた容量の前記第２水溶液を予め定められた流速で導入する、
請求項１または２に記載の濃度勾配形成方法。
【請求項４】
前記第１液体流路に導入される前記第２水溶液の容量は、前記第１液体流路の容量の３０％〜７０％である、
請求項１〜３のいずれかに記載の濃度勾配形成方法。
【請求項５】
前記疎水槽の主面上に設けられた、前記第１液体流路とは異なる第２液体流路に第４水溶液を導入し、前記第２液体流路に面する各チャンバーを前記第４水溶液で満たすステップと、
前記第２液体流路の第２導入口から前記第４水溶液とは濃度が異なる第５水溶液を導入し、各チャンバーに満たされた水溶液の濃度に前記第２導入口からの距離に応じた勾配を形成するステップと、
前記第２液体流路に脂質を含有する有機溶媒と第６水溶液とを順に導入し、各チャンバーの開口部に前記水溶液を液封するように脂質二重膜を形成するステップと、
をさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の濃度勾配形成方法。
【請求項６】
前記第２液体流路は前記第１液体流路と平行である、
請求項５に記載の濃度勾配形成方法。
【請求項７】
各チャンバーの容量は、４０００×１０-18ｍ3以下である、
請求項１〜６のいずれかに記載の濃度勾配形成方法。
【請求項８】
疎水性物質からなる層であって、複数のチャンバーの開口部が該層の主面上に規則的に配列するように形成されている、疎水層と、
前記疎水層の主面上に設けられた第１液体流路と、
を備え、
前記第１液体流路に面する各チャンバーには水溶液が満たされており、各チャンバーの開口部には前記水溶液を液封するように脂質二重膜が形成されており、
各チャンバーに満たされた水溶液の濃度には、前記第１液体流路上の基準位置からの距離に応じた勾配がある、マイクロリアクタチップ。
【請求項９】
前記基準位置は前記第１液体流路の一端に定められており、前記第１液体流路の他端は大気に開放されている、
請求項８に記載のマイクロリアクタチップ。
【請求項１０】
前記疎水層の主面上に設けられた、前記第１液体流路とは異なる第２液体流路をさらに備え、
前記第２液体流路に面する各チャンバーには水溶液が満たされており、各チャンバーの開口部には前記水溶液を液封するように脂質二重膜が形成されており、
各チャンバーに満たされた水溶液の濃度には、前記第２液体流路上の基準位置からの距離に応じた勾配がある、
請求項８または９に記載のマイクロリアクタチップ。
【請求項１１】
前記第２液体流路は前記第１液体流路と平行である、
請求項１０に記載のマイクロリアクタチップ。
【請求項１２】
各チャンバーの容量は、４０００×１０-18ｍ3以下である、
請求項８〜１１のいずれかに記載のマイクロリアクタチップ。
【請求項１３】
前記第２液体流路に面する各チャンバーに満たされた水溶液における濃度勾配は、前記第１液体流路に面する各チャンバーに満たされた水溶液における濃度勾配とは異なる、
請求項８〜１２のいずれかに記載のマイクロリアクタチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロリアクタチップ上での濃度勾配形成方法およびマイクロリアクタチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１は、平坦な基板と、基板の表面に疎水性の物質により規則的に高密度に配列するように形成された容量が４０００×１０-18ｍ3以下の複数の微小チャンバーと、試験用水溶液が満たされた状態の複数の微小チャンバーの開口部に試験用水溶液を液封するよう形成された脂質二重膜とを備える高密度微小チャンバーアレイを開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開第２０１５−０４０７５４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記従来の高密度微小チャンバーアレイを基礎として、その応用技術の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示の一側面に係るマイクロリアクタチップ上での濃度勾配形成方法は、
疎水性物質からなる層であって、複数のチャンバーの開口部が該層の主面上に規則的に配列するように形成されている、疎水層を備えたマイクロリアクタチップの、前記疎水層の主面上に設けられた第１液体流路に第１水溶液を導入し、前記第１液体流路に面する各チャンバーを前記第１水溶液で満たすステップと、
前記第１液体流路の第１導入口から前記第１水溶液とは濃度が異なる第２水溶液を導入し、各チャンバーに満たされた水溶液の濃度に前記第１導入口からの距離に応じた勾配を形成するステップと、
前記第１液体流路に脂質を含有する有機溶媒と第３水溶液とを順に導入し、各チャンバーの開口部に前記水溶液を液封するように脂質二重膜を形成するステップと、
を含む。
【発明の効果】
【０００６】
高密度微小チャンバーアレイの応用技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、一実施形態に係るマイクロリアクタチップの概略構成の一例を示す平面図である。
【図２】図２は、図１に示すマイクロリアクタチップをＡ−Ａ線に沿って切断した断面を示す図である。
【図３】図３は、一実施形態に係るマイクロリアクタチップの製造方法の一例を示すフローチャートである。
【図４Ａ】図４Ａは、一実施形態に係るマイクロリアクタチップのチップ本体の製造方法を説明するための図であって、基板を用意する工程を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、一実施形態に係るマイクロリアクタチップのチップ本体の製造方法を説明するための図であって、基板上に物質膜を形成する工程を示す図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、一実施形態に係るマイクロリアクタチップのチップ本体の製造方法を説明するための図であって、物質膜上にレジストを形成する工程を示す図である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、一実施形態に係るマイクロリアクタチップのチップ本体の製造方法を説明するための図であって、レジストをパターニングする工程を示す図である。
【図４Ｅ】図４Ｅは、一実施形態に係るマイクロリアクタチップのチップ本体の製造方法を説明するための図であって、パターニングされたレジストをマスクとして物質膜をエッチングする工程を示す図である。
【図４Ｆ】図４Ｆは、一実施形態に係るマイクロリアクタチップのチップ本体の製造方法を説明するための図であって、レジストを除去する工程を示す図である。
【図５】図５は、一実施形態に係るマイクロリアクタチップ上での濃度勾配形成方法の一例に用いる装置構成を示す平面図である。
【図６】図６は、一実施形態に係るマイクロリアクタチップ上での濃度勾配形成方法の一例を示すフローチャートである。
【図７Ａ】図７Ａは、一実施形態に係るマイクロリアクタチップ上での濃度勾配形成方法の一例を説明するための図であって、第１液体流路に第１水溶液を導入する工程（ステップＳ１１）を示す図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、一実施形態に係るマイクロリアクタチップ上での濃度勾配形成方法の一例を説明するための図であって、第１液体流路に第２水溶液を導入する工程（ステップＳ１２）を示す図である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、一実施形態に係るマイクロリアクタチップ上での濃度勾配形成方法の一例を説明するための図であって、第１液体流路に脂質を含有する有機溶媒と第３水溶液とを順に導入する工程（ステップＳ１３）を示す図である。
【図７Ｄ】図７Ｄは、一実施形態に係るマイクロリアクタチップ上での濃度勾配形成方法の一例を説明するための図であって、第１液体流路に脂質を含有する有機溶媒と第３水溶液とを順に導入する工程（ステップＳ１３）を示す図である。
【図７Ｅ】図７Ｅは、一実施形態に係るマイクロリアクタチップ上での濃度勾配形成方法の一例を説明するための図であって、第１液体流路に脂質を含有する有機溶媒と第３水溶液とを順に導入する工程（ステップＳ１３）を示す図である。
【図７Ｆ】図７Ｆは、一実施形態に係るマイクロリアクタチップ上での濃度勾配形成方法の一例を説明するための図であって、第１液体流路に脂質を含有する有機溶媒と第３水溶液とを順に導入する工程（ステップＳ１３）を示す図である。
【図８】図８は、第１実施例に係るマイクロリアクタチップについての測定結果であって、第１導入口からの距離に応じた各チャンバーの蛍光画像を示す図ある。
【図９Ａ】図９Ａは、第１実施例に係るマイクロリアクタチップについての測定結果であって、異なる流速で第２水溶液を導入した場合の、第１導入口からの距離と青色蛍光の強度との関係を示すグラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、第１実施例に係るマイクロリアクタチップについての測定結果であって、異なる流速で第２水溶液を導入した場合の、第１導入口からの距離と緑色蛍光の強度との関係を示すグラフである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、第１実施例に係るマイクロリアクタチップについての測定結果であって、異なる容量で第２水溶液を導入した場合の、第１導入口からの距離と青色蛍光の強度との関係を示すグラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、第１実施例に係るマイクロリアクタチップについての測定結果であって、異なる容量で第２水溶液を導入した場合の、第１導入口からの距離と緑色蛍光の強度との関係を示すグラフである。
【図１１】図１１は、第２実施例に係るマイクロリアクタチップを説明するための図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、第２実施例に係るマイクロリアクタチップについての測定結果であって、第１導入口の位置におけるチャンバーの蛍光画像を示す図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、第２実施例に係るマイクロリアクタチップについての測定結果であって、第１導入口から８．１ｍｍ離れた位置におけるチャンバーの蛍光画像を示す図である。
【図１３】図１３は、第２実施例に係るマイクロリアクタチップについての測定結果であって、第１導入口からの距離が異なる位置における、経過時間と緑色蛍光の強度との関係を示すグラフである。
【図１４】図１４は、第２実施例に係るマイクロリアクタチップについての測定結果であって、基質濃度と単位時間あたりの蛍光強度変化量との関係を示すグラフである。
【図１５Ａ】図１５Ａは、第３実施例に係るマイクロリアクタチップを説明するための図である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、第３実施例に係るマイクロリアクタチップについての測定結果であって、第１導入口から８．１ｍｍ離れた位置におけるチャンバーの蛍光画像を示す図である。
【図１６】図１６は、第３実施例に係るマイクロリアクタチップについての測定結果であって、第１導入口から８．１ｍｍ離れた位置における、経過時間とチャンバーの蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図１７】図１７は、第３実施例に係るマイクロリアクタチップについての測定結果であって、α−ヘモリシンの濃度と、脂質二重膜にナノポアが形成されたチャンバーの割合との関係を示すグラフである。
【図１８】図１８は、一実施形態に係るマイクロリアクタチップ上での濃度勾配形成方法の一変形例に用いる装置構成を示す平面図である。
【図１９】図１９は、一実施形態に係るマイクロリアクタチップ上での濃度勾配形成方法の一変形例を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
脂質二重膜を介して生じる様々の生体分子反応、例えば膜輸送過程や膜透過反応、膜表面での酵素反応などでは、反応生成物の拡散に長時間かかることや、酵素活性に伴った物質濃度の変化が極めて緩やかであることなどから、脂質二重膜を介して生じる様々な生体分子反応を高感度に検出することが困難となりやすい。チャンバーの容量が大きいと、チャンバー内の濃度変化が小さくなり、濃度変化としての検出が困難となる。チャンバー数が少ない場合は、計測のスループットが悪くなる。したがって、脂質二重膜により液封された極めて容量が小さな多数の微小チャンバーが高密度に形成された高密度微小チャンバーアレイが必要となる。上記特許文献１は、かかる高密度微小チャンバーアレイを開示する。しかしながら、その応用技術については未検討の部分があった。
【０００９】
発明者らは、従来の高密度微小チャンバーアレイの応用技術を見出すべく、鋭意検討した。その結果、以下の知見を得た。なお、以下の知見はあくまで本発明をなすきっかけとなったものであり、本発明を限定するものではない。
【００１０】
すなわち、上記高密度微小チャンバーアレイが開発されたことにより、膜タンパク質による膜横断型の物質輸送などの計測が効率的に実施可能となった。しかしながら、高密度微小チャンバーアレイ上に基質や阻害剤などの濃度勾配を形成するには、高価かつ大規模な装置が必要とされており、物質濃度勾配を簡易的に形成する技術は実現していない。そのため、従来の高密度微小チャンバーアレイでは、多数の微小チャンバーが集積化されているにもかかわらず、一度の操作で測定できるのは均一な濃度の１種類の試料に限られる。これは、高密度微小チャンバーアレイ全体に共通する問題であり、高密度微小チャンバーアレイを活用した分析技術の汎用性を著しく制限している。
【００１１】
かかる洞察に基づき、発明者らは、高密度微小チャンバーアレイ上に、基質や阻害剤などの濃度勾配を簡易的に形成する手法および機構を新規開発し、具体的には、流体拡散モデルに立脚し、特定の物質の濃度勾配を高密度微小チャンバーアレイ上に形成するプロトロコルを新規開発することことに成功した。当該技術においては、流速、流量等の簡易的に変化させることができるパラメータを調整することで、様々な濃度勾配を形成できるだけでなく、従来、濃度勾配を形成するのに必要とされてきた、高価かつ大規模な装置を一切必要としない。すなわち、当該技術の開発は、膜タンパク質の網羅的機能解析におけるイノベーションであると言える。
【００１２】
以下で説明する実施形態は、このような知見に基づいて創案されたものである。
【００１３】
実施形態の第１の態様に係るマイクロリアクタチップ上での濃度勾配形成方法は、
疎水性物質からなる層であって、複数のチャンバーの開口部が該層の主面上に規則的に配列するように形成されている、疎水層を備えたマイクロリアクタチップの、前記疎水層の主面上に設けられた第１液体流路に第１水溶液を導入し、前記第１液体流路に面する各チャンバーを前記第１水溶液で満たすステップと、
前記第１液体流路の第１導入口から前記第１水溶液とは濃度が異なる第２水溶液を導入し、各チャンバーに満たされた水溶液の濃度に前記第１導入口からの距離に応じた勾配を形成するステップと、
前記第１液体流路に脂質を含有する有機溶媒と第３水溶液とを順に導入し、各チャンバーの開口部に前記水溶液を液封するように脂質二重膜を形成するステップと、
を含む。
【００１４】
このような態様によれば、疎水層の主面上に設けられた第１液体流路に第１水溶液を導入し、第１液体流路に面する各チャンバーを第１水溶液で満たした後、第１液体流路の第１導入口から第１水溶液とは濃度が異なる第２水溶液を導入する。このとき、第１液体流路の壁面では摩擦があるため第１液体流路の中心部に比べて第２水溶液が流れにくく、第１水溶液と第２水溶液との界面での希釈現象により、各チャンバーに満たされた水溶液の濃度には第１導入口からの距離に応じた濃度勾配が形成される。すなわち、第２水溶液の濃度が第１水溶液の濃度よりも低い場合には、第１導入口に近いチャンバーほど水溶液の濃度が低くなるような濃度勾配が形成され、第２水溶液の濃度が第１水溶液の濃度よりも高い場合には、第１導入口に近いチャンバーほど水溶液の濃度が高くなるような濃度勾配が形成される。その後、第１液体流路に脂質を含有する有機溶媒と第３水溶液とを順に導入し、各チャンバーの開口部に脂質二重膜を形成する。これにより、脂質二重膜で覆われたマイクロリアクタチップの各チャンバーにおいて物質濃度勾配を簡易的に形成することができ、１枚のマイクロリアクタチップによる網羅的かつ高効率な生体試料の機能解析が実現する。
【００１５】
実施形態の第２の態様に係るマイクロリアクタチップ上での濃度勾配形成方法は、第１の態様に係る濃度勾配形成方法であって、
前記第１導入口は前記第１液体流路の一端に形成されており、前記第１液体流路の他端は大気に開放されている。
【００１６】
このような態様によれば、第１導入口から導入された液体は第１液体流路の一端から他端に向かって一方向に流れることになり、すなわち液体の流れる方向に乱れや滞留が生じることが低減される。これにより、マイクロリアクタチップ上に形成される物質濃度勾配に揺らぎが生じることを低減することができる。
【００１７】
実施形態の第３の態様に係るマイクロリアクタチップ上での濃度勾配形成方法は、第１または２の態様に係る濃度勾配形成方法であって、
前記第１液体流路に前記第２水溶液を導入する工程では、電動ピペットを用いて予め定められた容量の前記第２水溶液を予め定められた流速で導入する。
【００１８】
このような態様によれば、マイクロリアクタチップ上に形成される物質濃度勾配を容易に制御することができ、言い換えれば、マイクロリアクタチップ上にて所望の物質濃度勾配を容易に形成することができる。
【００１９】
実施形態の第４の態様に係るマイクロリアクタチップ上での濃度勾配形成方法は、第１〜３のいずれかの態様に係る濃度勾配形成方法であって、
前記第１液体流路に導入される前記第２水溶液の容量は、前記第１液体流路の容量の３０％〜７０％である。
【００２０】
実施形態の第５の態様に係るマイクロリアクタチップ上での濃度勾配形成方法は、第１〜４のいずれかの態様に係る濃度勾配形成方法であって、
前記疎水槽の主面上に設けられた、前記第１液体流路とは異なる第２液体流路に第４水溶液を導入し、前記第２液体流路に面する各チャンバーを前記第４水溶液で満たすステップと、
前記第２液体流路の第２導入口から前記第４水溶液とは濃度が異なる第５水溶液を導入し、各チャンバーに満たされた水溶液の濃度に前記第２導入口からの距離に応じた勾配を形成するステップと、
前記第２液体流路に脂質を含有する有機溶媒と第６水溶液とを順に導入し、各チャンバーの開口部に前記水溶液を液封するように脂質二重膜を形成するステップと、
をさらに含む。
【００２１】
このような態様によれば、１枚のマイクロリアクタチップ上において、第１液体流路に面する各チャンバーに形成された濃度勾配とは異なる濃度勾配を、第２液体流路に面する各チャンバーに形成することができる。言い換えれば、１枚のマイクロリアクタチップ上において、複数種類の物質濃度勾配を容易に形成することができる。これにより、１枚のマイクロリアクタチップによる網羅的かつ高効率な生体試料の機能解析を更に進めることができる。
【００２２】
実施形態の第６の態様に係るマイクロリアクタチップ上での濃度勾配形成方法は、第５の態様に係る濃度勾配形成方法であって、
前記第２液体流路は前記第１液体流路と平行である。
【００２３】
このような態様によれば、第１液体流路と第２液体流路との間のスペースを狭めることができ、１枚のマイクロリアクタチップという限られたスペースを有効に活用できる。
【００２４】
実施形態の第７の態様に係るマイクロリアクタチップ上での濃度勾配形成方法は、第１〜６のいずれかの態様に係る濃度勾配形成方法であって、
各チャンバーの容量は、４０００×１０-18ｍ3以下である。
【００２５】
実施形態の第８の態様に係るマイクロリアクタチップは、
疎水性物質からなる層であって、複数のチャンバーの開口部が該層の主面上に規則的に配列するように形成されている、疎水層と、
前記疎水層の主面上に設けられた第１液体流路と、
を備え、
前記第１液体流路に面する各チャンバーには水溶液が満たされており、各チャンバーの開口部には前記水溶液を液封するように脂質二重膜が形成されており、
各チャンバーに満たされた水溶液の濃度には、前記第１液体流路上の基準位置からの距離に応じた勾配がある。
【００２６】
実施形態の第９の態様に係るマイクロリアクタチップは、第８の態様に係るマイクロリアクタチップであって、
前記基準位置は前記第１液体流路の一端に定められており、前記第１液体流路の他端は大気に開放されている。
【００２７】
実施形態の第１０の態様に係るマイクロリアクタチップは、第８または９の態様に係るマイクロリアクタチップであって、
前記疎水層の主面上に設けられた、前記第１液体流路とは異なる第２液体流路をさらに備え、
前記第２液体流路に面する各チャンバーには水溶液が満たされており、各チャンバーの開口部には前記水溶液を液封するように脂質二重膜が形成されており、
各チャンバーに満たされた水溶液の濃度には、前記第２液体流路上の基準位置からの距離に応じた勾配がある。
【００２８】
実施形態の第１１の態様に係るマイクロリアクタチップは、第１０の態様に係るマイクロリアクタチップであって、
前記第２液体流路は前記第１液体流路と平行である。
【００２９】
実施形態の第１２の態様に係るマイクロリアクタチップは、第８〜１１のいずれかの態様に係るマイクロリアクタチップであって、
各チャンバーの容量は、４０００×１０-18ｍ3以下である。
【００３０】
実施形態の第１３の態様に係るマイクロリアクタチップは、第８〜１２のいずれかの態様に係るマイクロリアクタチップであって、
前記第２液体流路に面する各チャンバーに満たされた水溶液における濃度勾配は、前記第１液体流路に面する各チャンバーに満たされた水溶液における濃度勾配とは異なる。
【００３１】
以下に、添付の図面を参照して、実施の形態の具体例を詳細に説明する。なお、各図において同等の機能を有する構成要素には同一の符号を付し、同一符号の構成要素の詳しい説明は繰り返さない。
【００３２】
［マイクロリアクタチップの構成］
図１は、一実施形態に係るマイクロリアクタチップ２０の概略構成の一例を示す平面図である。図２は、図１に示すマイクロリアクタチップ２０をＡ−Ａ線に沿って切断した断面を示す図である。
【００３３】
図１および図２に示すように、マイクロリアクタチップ２０は、基板２２と、基板２２上に設けられた疎水層２４とを備えている。
【００３４】
基板２２は、透光性を有しており、平坦である。基板２２は、たとえばガラス、アクリル樹脂などで構成され得る。基板２２の材料、厚み、および形状などは、基板２２の下方から基板２２へと入射した光が基板２２を透過してチャンバー２６の内部へと進入し、かつ、チャンバー２６の内部から基板２２へと入射した光が基板２２を透過して基板２２の下方へと脱出可能であれば特に限定されない。具体的には、たとえば、基板２２の厚みは０．１ｍｍ以上５ｍｍ以下であってもよいし、０．３ｍｍ以上３ｍｍ以下であってもよいし、０．７ｍｍ以上１．５ｍｍ以下であってもよい。平面視における基板２２の大きさは特に限定されない。
【００３５】
疎水層２４は、疎水性物質からなる層である。疎水性物質としては、たとえばフッ素樹脂などの疎水性の樹脂、およびガラスなどの樹脂以外の物質が含まれる。疎水層２４の厚みは、後述するチャンバー２６の容量に応じて適宜に調整され得る。具体的には、たとえば、１０ｎｍ以上１００μｍ以下であってもよいし、１００ｎｍ以上５μｍ以下であってもよいし、２５０ｎｍ以上１μｍ以下であってもよい。
【００３６】
疎水層２４には、複数の微小なチャンバー２６の開口部が、疎水層２４の主面上に規則的かつ高密度に配列するように設けられている。チャンバー２６の容量は４０００×１０-18ｍ3以下（４０００μｍ3以下）である。チャンバー２６の容量は、たとえば、０．１×１０-18ｍ3以上４０００×１０-18ｍ3以下であってもよいし、０．５×１０-18ｍ3以上４００×１０-18ｍ3以下であってもよいし、１×１０-18ｍ3以上４０×１０-18ｍ3以下であってもよい。
【００３７】
チャンバー２６の深さは、たとえば、１０ｎｍ以上１００μｍ以下であってもよいし、１００ｎｍ以上５μｍ以下であってもよいし、２５０ｎｍ以上１μｍ以下であってもよい。
【００３８】
チャンバー２６の開口部は、たとえば円形とすることができる。円形とする場合の円の直径は、たとえば、０．１μｍ以上１００μｍ以下であってもよいし、０．５μｍ以上５μｍ以下であってもよいし、１μｍ以上１０μｍ以下であってもよい。
【００３９】
「規則的」とは、たとえば、基板の厚み方向から見て、各チャンバーが基板上に、格子状、マトリクス状、千鳥状などに配列されていることを言う。「規則的」とは、たとえば、各チャンバーが複数の列をなすように一定間隔で配列されていることを意味し得る。
【００４０】
「高密度」とは、たとえば、１平方ｍｍ（１ｍｍ2）あたりのチャンバーの数が、０．１×１０3個以上２０００×１０3個以下であってもよいし、１×１０3個以上１０００×１０3以下であってもよいし、５×１０3個以上１００×１０3以下であってもよい。１ｃｍ2（１×１０-4ｍ2）あたりに換算すると、１０×１０3個以上２００×１０6個以下であってもよいし、１００×１０3個以上１００×１０6個以下であってもよいし、０．５×１０6個以上１０×１０6個以下であってもよい。
【００４１】
マイクロリアクタチップ２０において、複数のチャンバー２６は、深さが１００μｍ以下で、円形に換算したときに直径が１００μｍ以下となるよう形成されているものとしたり、深さが２μｍ以下で、円形に換算したときも直径が１０μｍ以下となるよう形成されているものとしたり、深さが１μｍ以下で、円形に換算したときに直径が５μｍ以下となるよう形成されているものとしたりすることもできる。こうすれば、基板２２の表面に疎水性物質による薄膜を形成し、該薄膜に複数の微小なチャンバー２６を形成する手法を用いて、脂質二重膜形成前のマイクロリアクタチップ２０を比較的容易に製造することができる。なお、「円形に換算したとき」の「直径」とは、深さ方向に対して垂直な断面の形状と同じ面積を有する円形の直径を言い、たとえば、該断面が１μｍ四方の正方形の場合には、円形に換算したときの直径は２／√π≒１．１μｍとなる。
【００４２】
チャンバー２６は、それぞれ厚さが５００ｎｍを含む所定厚範囲の疎水性物質による薄膜に、円形に換算したときに直径が１μｍを含む所定直径範囲となるよう形成されているものとすることもできる。試験対象の生体分子の反応速度の大きさや生体分子の含有率を考慮するとともに製造の容易さも考慮すると、チャンバー２６の深さや直径は数百ｎｍ〜数μｍが好適であると考えられる。ここで、「所定厚範囲」は、たとえば、５００ｎｍの０．１倍の５０ｎｍ以上で５００ｎｍの１０倍の５μｍ以下の範囲としたり、５００ｎｍの０．５倍の２５０ｎｍ以上で５００ｎｍの２倍の１μｍ以下の範囲としたりすることができる。「所定直径範囲」は、たとえば、１μｍの０．１倍の１００ｎｍ以上で１μｍの１０倍の１０μｍ以下としたり、１μｍの０．５倍の５００ｎｍ以上で１μｍの２倍の２μｍ以下の範囲としたりすることができる。
【００４３】
一例において、それぞれのチャンバー２６は、厚さＤが１μｍの疎水層２４に、直径Ｒが５μｍとなるよう形成されている。したがって、それぞれのチャンバー２６の容量Ｌは、Ｌ＝π（２．５×１０-6）2×１×１０-6ｍ3≒１９．６×１０-18ｍ3となる。仮に平面視においてチャンバー２６を縦横２μｍの間隔で配列したものとすると、１つのチャンバー２６に必要な面積Ｓは一辺が７μｍの正方形となり、Ｓ＝（７×１０-6）2ｍ2＝４９×１０-12ｍ2と計算される。したがって、ガラス基板２２には、１ｃｍ2（１×１０-4ｍ2）あたり約２×１０6個（１平方ｍｍあたり２０×１０3個）のチャンバー２６が形成されることになる。
【００４４】
図示は省略するが、各チャンバー２６の内部（たとえばチャンバー２６の内側面または底面）には電極が設けられていてもよい。各電極は互いに電気的に接続されていてもよい。電極は、金属、たとえば、銅、銀、金、アルミ、クロムなどで構成されていてもよい。電極は、金属以外の材料、たとえば、ＩＴＯ（酸化インジウムスズ）、ＩＺＯ（酸化インジウムスズと酸化亜鉛とからなる材料）、ＺｎＯ、ＩＧＺＯ（インジウム、ガリウム、亜鉛、酸素から構成される材料）などで構成されていてもよい。
【００４５】
電極の厚みは、たとえば、１０ｎｍ以上１００μｍ以下であってもよいし、１００ｎｍ以上５μｍ以下であってもよいし、２５０ｎｍ以上１μｍ以下であってもよい。
【００４６】
かかる構成において、基板２２の下方から基板２２へと入射した光は、基板２２を透過してチャンバー２６の内部へと進入し、かつ、チャンバー２６の内部から基板２２へと入射した光は、基板２２を透過して基板２２の下方へと脱出する。
【００４７】
［マイクロリアクタチップの製造方法］
次に、図３および図４Ａ〜図４Ｆを参照し、マイクロリアクタチップ２０の製造方法を説明する。図３は、マイクロリアクタチップ２０の製造方法の一例を示すフローチャートである。図４Ａ〜図４Ｆは、マイクロリアクタチップ２０の製造方法における各工程を示す図である。
【００４８】
まず、図３および図４Ａに示すように、ガラス基板２２のガラス表面を洗浄するための洗浄処理として、１０Ｍの水酸化カリウム（ＫＯＨ）溶液にガラス基板２２を２４時間程度浸す（ステップＳ１１１）。これにより、ガラス基板２２の表面は親水性を帯びる。
【００４９】
次に、図４Ｂに示すように、ガラス基板２２の表面に、疎水性の物質（たとえば、旭硝子株式会社製のフッ素樹脂（ＣＹＴＯＰ））をスピンコートして物質膜２４ａを形成し、物質膜２４ａをガラス基板２２の表面に密着させる（ステップＳ１１２）。スピンコートの条件としては、たとえば、２０００ｒｐｓ、３０秒という条件を用いることができ、この場合、物質膜２４ａの膜厚は約１μｍとなる。物質膜２４ａのガラス基板２２表面への密着は、たとえば、１８０℃のホットプレートで１時間ベークすることにより行うことができる。
【００５０】
次に、図４Ｃに示すように、物質膜２４ａの表面にレジスト２５ａをスピンコートにより形成し、レジスト２５ａを物質膜２４ａの表面に密着させる（ステップＳ１１３）。レジスト２５ａとしては、ＡＺ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ製のＡＺ−４９０３などを用いることができる。スピンコートの条件としては、たとえば、４０００ｒｐｓ、６０秒という条件を用いることができる。レジスト２５ａの物質膜２４ａ表面への密着は、たとえば、１１０℃のホットプレートで５分間ベークして、レジスト２５ａ内の有機溶媒を蒸発させることにより行うことができる。
【００５１】
次に、図４Ｄに示すように、チャンバー２６のパターンのマスクを用いてレジスト２５ａを露光し、レジスト専用の現像液に浸して現像して、チャンバー２６を形成する部分が除かれたレジスト２５ｂを形成する（ステップＳ１１４）。露光の条件は、たとえば、ＳＡＮ−ＥＩ製の露光機によりＵＶ  ｐｏｗｅｒ  ２５０Ｗで７秒照射する条件を用いることができる。現像の条件としては、たとえば、ＡＺ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ製のＡＺ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｒに５分浸す条件を用いることができる。
【００５２】
次に、図４Ｅに示すように、レジスト２５ｂによりマスクされた物質膜２４ａをドライエッチングすることにより、物質膜２４ａからチャンバー２６となる部分を取り除いた物質膜２４ｂとし（ステップＳ１１５）、その後、図５Ｆに示すように、レジスト２５ｂを除去する（ステップＳ１１６）。ドライエッチングは、たとえば、Ｓａｍｃｏ製のＲｅａｃｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ｅｔｃｈｉｎｇ装置を使用し、エッチング条件として、Ｏ2  ５０ｓｃｃｍ、Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  １０Ｐａ、Ｐｏｗｅｒ  ５０Ｗ、Ｔｉｍｅ  ３０ｍｉｎという条件を用いることができる。レジスト２５ｂの除去は、アセトンに浸し、イソプロパノールで洗浄した後に純水で洗浄することにより行うことができる。
【００５３】
なお、ドライエッチング以外の手法、たとえばナノインプリンティングなどの手法を用いて疎水性物質の薄膜に複数のチャンバー２６を形成するものとしてもよい。ドライエッチングの場合には、Ｏ2プラズマの作用によりチャンバー２６の内側面が親水性を帯び、チャンバー２６内に水溶液を充填しやすくなるため好ましい。
【００５４】
［マイクロリアクタチップ上での濃度勾配形成の一例］
次に、図５〜図７Ｆを参照し、一実施形態に係るマイクロリアクタチップ２０上での濃度勾配形成方法の一例について説明する。図５は、一実施形態に係るマイクロリアクタチップ２０上での濃度勾配形成方法の一例に用いる装置構成を示す平面図である。図６は、一実施形態に係るマイクロリアクタチップ２０上での濃度勾配形成方法の一例を示すフローチャートである。図７Ａ〜図７Ｆは、一実施形態に係るマイクロリアクタチップ２０上での濃度勾配形成方法の一例における各工程を示す図である。
【００５５】
まず、図５に示すように、マイクロリアクタチップ２０の疎水層２４の主面上に平面視「コ」字形状を有するスペーサ４２を介在させつつ、第１導入口４５ａが形成されたガラス板４４を載せる。これにより、疎水層２４の主面が略水平な底面となる第１液体流路４８ａが形成される。図示された例では、第１液体流路４８ａの大きさは、長さ８．１ｍｍ、幅２ｍｍである。図５に示すように、ガラス板４４の第１導入口４５ａは第１液体流路４８ａの一端に位置するように位置決めされ、第１液体流路４８ａの他端は大気に開放されてもよい。
【００５６】
次いで、図６および図７Ａに示すように、第１導入口４５ａから第１液体流路４８ａに界面活性剤を含む第１水溶液を導入し、第１液体流路４８ａおよび第１液体流路４８ａに面する各チャンバー２６を第１水溶液で満たす（ステップＳ１１）。
【００５７】
次に、図６および図７Ｂに示すように、第１導入口４５ａから第１液体流路４８ａに、第１水溶液とは濃度が異なる第２水溶液を導入する（ステップＳ１２）。このとき、電動ピペットを用いて予め定められた容量の第２水溶液を予め定められた流速で導入してもよい。また、第１液体流路４８ａに導入される第２水溶液の容量は、第１液体流路４８ａの容量の３０％〜７０％であってもよいし、３５％〜６５％であってもよいし、４０％〜６０％であってもよいし、４５％〜５５％であってもよい。
【００５８】
第１導入口４５ａから第１液体流路４８ａに第２水溶液が導入されると、第１液体流路４８ａの壁面では摩擦があるため第１液体流路４８ａの中心部に比べて第２水溶液が流れにくく、第１水溶液と第２水溶液との界面での希釈現象により、各チャンバー２６に満たされた水溶液の濃度には第１導入口４５ａからの距離に応じた濃度勾配が形成される。すなわち、第２水溶液の濃度が第１水溶液の濃度よりも低い場合には、第１導入口４５ａに近いチャンバー２６ほど水溶液の濃度が低くなるような濃度勾配が形成され、第２水溶液の濃度が第１水溶液の濃度よりも高い場合には、第１導入口４５ａに近いチャンバー２６ほど水溶液の濃度が高くなるような濃度勾配が形成される。
【００５９】
次に、図６および図７Ｃ〜図７Ｆに示すように、第１導入口４５ａから第１液体流路４８ａに、脂質を含有する有機溶媒と第３水溶液とを順に導入する（ステップＳ１３）。ここで、脂質としては、大豆や大腸菌由来などの天然脂質、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）やＤＯＰＧ（ジオレオイルホスファチジルグリセロール）などの人工脂質を用いることができる。有機溶媒としては、ヘキサデカンやクロロホルムを用いることができる。
【００６０】
第１導入口４５ａから第１液体流路４８ａに脂質を含有する有機溶媒が導入されると、チャンバー２６が水溶液で満たされた状態で、脂質の親水基がチャンバー２６の内側を向いた状態の内側脂質単層膜が、チャンバー２６の開口部を液封するように形成され、次いで、第１導入口４５ａから第１液体流路４８ａに第３水溶液が導入されると、脂質の疎水基が内側脂質単層膜側を向いた状態の外側脂質単層膜が、内側脂質単層膜に重なるように形成される。これにより、各チャンバー２６の開口部に水溶液を液封するように脂質二重膜が形成される。
【００６１】
脂質二重膜を形成する工程の後に、脂質二重膜に膜タンパク質を再構成させる工程を備えるものとすることもできる。再構成させる工程は、膜タンパク質を含む細胞膜断片、タンパク質を埋め込んだ脂質二重膜、水溶性タンパク質、タンパク質を取り込んだリポソーム、界面活性剤により可溶化させたタンパク質のいずれかを脂質二重膜に導入し、脂質二重膜にタンパク質を組み込んで膜タンパク質とする工程であってもよい。脂質二重膜にタンパク質を組み込む手法としては、リポソームの場合には膜融合などを用いることができ、界面活性剤により可溶化させたタンパク質の場合には熱揺動などを用いることができる。
【００６２】
以上のような方法により、各チャンバー２６に満たされた水溶液の濃度に、第１液体流路４８ａ上の基準位置（すなわち、第１導入口４５ａの位置）からの距離に応じた勾配があるマイクロリアクタチップ２０を得ることができる。
【００６３】
ここで、マイクロリアクタチップ２０の基板２２の下方から基板２２へと入射した光は、基板２２を透過してチャンバー２６の内部へと進入し、かつ、チャンバー２６の内部から基板２２へと入射した光は、基板２２を透過して基板２２の下方へと脱出する。脂質二重膜に膜タンパク質が再構成されている場合、該膜タンパク質の機能は、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、チャンバー２６の内部に収容されている水溶液に含まれる蛍光物質が発する光を検出することなどにより解析することができる。顕微鏡として、落射型共焦点顕微鏡が用いられてもよい。
【００６４】
次に、上述した実施形態に関連して検証された具体的な実施例について説明する。
【００６５】
［第１実施例］
上述した実施形態に係る第１実施例として、発明者らは、マイクロリアクタチップＡ〜Ｅを用意し、各マイクロリアクタチップＡ〜Ｅの第１導入口４５ａから第１液体流路４８ａに第１水溶液を導入し、第１液体流路４８ａに面する各チャンバー２６を第１水溶液で満たした。ここで、第１水溶液として、１００ｍＭのＴＲＩＳと１ｍＭの塩化マグネシウムとを含有する液体（以下「緩衝液Ａ」と呼ぶことがある）にＡｌｅｘａ４０５（青色蛍光色素）とＡｌｅｘａ４８８（緑色蛍光色素）とを添加したものを用いた。
【００６６】
次に、発明者らは、各マイクロリアクタチップＡ〜Ｅの第１導入口４５ａから第１液体流路４８ａに、第１水溶液とは濃度が異なる第２水溶液を導入した。ここで、第２水溶液として、緩衝液ＡにＡｌｅｘａ４０５を添加するがＡｌｅｘａ４８８を添加しないものを用いた。また、発明者らは、電動ピペットを用いて、下表１に示すように予め定められた容量の第２水溶液を予め定められた流速で第１液体流路４８ａに導入した。
【表１】
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【００６７】
なお、第２水溶液にはＡｌｅｘａ４８８を添加していないことから、第２水溶液におけるＡｌｅｘａ４８８の濃度は、第１水溶液におけるＡｌｅｘａ４８８の濃度より低い。そのため、第１導入口４５ａから第１液体流路４８ａに第２水溶液を導入すると、第１導入口４５ａに近いチャンバー２６ほどＡｌｅｘａ４８８の濃度が希釈され、すなわち、各チャンバー２６に満たされた水溶液には、第１導入口４５ａからの距離に応じて徐々にＡｌｅｘａ４８８の濃度が高くなるような濃度勾配が形成される。
【００６８】
次いで、発明者らは、各マイクロリアクタチップＡ〜Ｅの第１導入口４５ａから第１液体流路４８ａに脂質を含有する有機溶媒と第３水溶液とを順に導入し、各チャンバー２６の開口部にチャンバー２６内に満たされた水溶液を液封するように脂質二重膜を形成した。ここで、脂質を含有する有機溶媒として、０．３ｍｇ／ｍｌのＰＯＰＣを含有するクロロホルムを用いた。また、第３水溶液として、緩衝液Ａを５０％に希釈したものを用いた。
【００６９】
その後、発明者らは、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、各マイクロリアクタチップＡ〜Ｅについて、チャンバー２６内の水溶液に含まれる蛍光物質が発する光を検出した。図８は、マイクロリアクタチップＣについて、第１導入口４５ａからの距離Ｌに応じた各チャンバー２６の蛍光画像を示している。図８に示す蛍光画像では、第１導入口４５ａに近いチャンバー２６ほどＡｌｅｘａ４８８からの緑色蛍光の強度が小さくなっており、このことから、各チャンバー２６内の水溶液には、第１導入口４５ａからの距離に応じて徐々にＡｌｅｘａ４８８の濃度が高くなるような濃度勾配が形成されていることが確認できる。
【００７０】
図９Ａは、異なる流速で第２水溶液が導入されたマイクロリアクタチップＡ〜Ｃについて、第１導入口４５ａからの距離Ｌと青色蛍光の強度との関係を示すグラフであり、図９Ｂは、これらのマイクロリアクタチップＡ〜Ｃについて、第１導入口４５ａからの距離Ｌと緑色蛍光の強度との関係を示すグラフである。図９Ｂに示すように、第２水溶液を導入する際の流速に応じて、緑色蛍光の強度変化の勾配（グラフの傾き）が変化しており、すなわち、第２水溶液を導入する際の流速に応じて、Ａｌｅｘａ４８８の濃度勾配の傾きが変化していることが確認できる。
【００７１】
図１０Ａは、異なる容量で第２水溶液が導入されたマイクロリアクタチップＣ〜Ｅについて、第１導入口４５ａからの距離Ｌと青色蛍光の強度との関係を示すグラフであり、図１０Ｂは、これらのマイクロリアクタチップＣ〜Ｅについて、第１導入口４５ａからの距離Ｌと緑色蛍光の強度との関係を示すグラフである。図１０Ｂに示すように、第２水溶液を導入する際の容量に応じて、緑色蛍光の強度変化の勾配（グラフの傾き）が変化しており、すなわち、第２水溶液を導入する際の容量に応じて、Ａｌｅｘａ４８８の濃度勾配の傾きが変化していることが確認できる。
【００７２】
以上の検証結果から、第２水溶液を導入する際の容量および／または流速を制御することにより、マイクロリアクタチップ２０上に形成される物質濃度の勾配具合を容易に制御できることが分かり、すなわちマイクロリアクタチップ２０上において所望の濃度勾配を形成できることが分かる。
【００７３】
［第２実施例］
上述した実施形態に係る第２実施例として、発明者らは、図１１に示すように、第１導入口４５ａから第１液体流路４８ａに第１水溶液を導入し、第１液体流路４８ａに面する各チャンバー２６を第１水溶液で満たした。ここで、第１水溶液として、緩衝液Ａにアルカリフォスターゼ（ＡＬＰ）酵素を１つのチャンバー２６あたり平均１個以下の濃度になるよう事前に加えておくとともに、Ａｌｅｘａ４０５（青色蛍光色素）とｓＴＧ−ｐｈｏｓ（緑色蛍光色素）とを添加したものを用いた。なお、ｓＴＧ−ｐｈｏｓは、ＡＬＰにより分解されると光を発する蛍光物質である。
【００７４】
次に、発明者らは、第１導入口４５ａから第１液体流路４８ａに、第１水溶液とは濃度が異なる第２水溶液を導入した。ここで、第２水溶液として、緩衝液ＡにＡｌｅｘａ４０５を添加するがｓＴＧ−ｐｈｏｓを添加しないものを用いた。第２水溶液にはｓＴＧ−ｐｈｏｓを添加していないことから、第２水溶液におけるｓＴＧ−ｐｈｏｓの濃度は、第１水溶液におけるｓＴＧ−ｐｈｏｓの濃度より低い。そのため、第１導入口４５ａから第１液体流路４８ａに第２水溶液を導入すると、第１導入口４５ａに近いチャンバー２６ほどｓＴＧ−ｐｈｏｓの濃度が希釈され、すなわち、各チャンバー２６に満たされた水溶液には、第１導入口４５ａからの距離に応じて徐々にｓＴＧ−ｐｈｏｓの濃度が高くなるような濃度勾配が形成される（図１１参照）。
【００７５】
次いで、発明者らは、第１導入口４５ａから第１液体流路４８ａに脂質を含有する有機溶媒と第３水溶液とを順に導入し、各チャンバー２６の開口部にチャンバー２６内に満たされた水溶液を液封するように脂質二重膜を形成した。ここで、脂質を含有する有機溶媒として、０．３ｍｇ／ｍｌのＰＯＰＣを含有するクロロホルムを用いた。また、第３水溶液として、緩衝液Ａを５０％に希釈したものを用いた。
【００７６】
その後、発明者らは、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、チャンバー２６内の水溶液に含まれる蛍光物質が発する光を検出した。図１２Ａは、第１導入口４５ａの位置におけるチャンバーの緑色蛍光画像（右図）、青色蛍光画像（中央図）および緑色＋青色蛍光画像（左図）を示している。また、図１２Ｂは、第１導入口４５ａから８．１ｍｍ離れた位置におけるチャンバーの緑色蛍光画像（右図）、青色蛍光画像（中央図）および緑色＋青色蛍光画像（左図）を示している。
【００７７】
図１２Ａに示すように、第１導入口４５ａから８．１ｍｍ離れた位置では、ＡＬＰが導入されたチャンバー２６においてｓＴＧ−ｐｈｏｓが分解されたことを示す緑色蛍光を目視で確認できた。一方、図１２Ｂに示すように、第１導入口４５ａの位置では、ＡＬＰが導入されたチャンバー２６において緑色蛍光を目視では確認できなかった。このことから、第１導入口４５ａに近いチャンバー２６ほどｓＴＧ−ｐｈｏｓの濃度が小さくなっており、すなわち、各チャンバー２６内の水溶液には、第１導入口４５ａからの距離に応じて徐々にｓＴＧ−ｐｈｏｓの濃度が高くなるような濃度勾配が形成されていることが確認できる。
【００７８】
図１３は、第１導入口４５ａから１．８ｍｍ、２．７ｍｍ、３．６ｍｍ、４．５ｍｍ、５．４ｍｍ、６．３ｍｍ、７．２ｍｍ、８．１ｍｍ離れた各位置における、経過時間と緑色蛍光の強度との関係を示すグラフである。図１３に示すグラフでは、第１導入口４５ａからの距離に応じて、緑色蛍光の強度変化の勾配（グラフの傾き）が大きくなっており、すなわち、ＡＬＰ酵素によるｓＴＧ−ｐｈｏｓの分解速度が大きくなっていることが確認できる。
【００７９】
図１４は、基質濃度と単位時間あたりの蛍光強度変化量との関係を示すグラフである。図１４において、横軸は、各チャンバーに満たされた水溶液の基質（すなわち、ｓＴＧ−ｐｈｏｓ）濃度を示しており、縦軸は、単位時間あたりの緑色蛍光の強度変化量、すなわちＡＬＰ酵素によるｓＴＧ−ｐｈｏｓの分解速度を示している。図１４に示すグラフから、基質（ｓＴＧ−ｐｈｏｓ）濃度とＡＬＰ酵素の反応速度（すなわち活性）とが比例関係にあることが確認できる。
【００８０】
［第３実施例］
上述した実施形態に係る第３実施例として、発明者らは、図１５Ａに示すように、マイクロリアクタチップ２０の第１導入口４５ａから第１液体流路４８ａに第１水溶液を導入し、第１液体流路４８ａに面する各チャンバー２６を第１水溶液で満たした。ここで、第１水溶液として、緩衝液ＡにＡｌｅｘａ４８８（緑色蛍光色素）とα−ヘモリシンとを添加したものを用いた。
【００８１】
次に、発明者らは、第１導入口４５ａから第１液体流路４８ａに、第１水溶液とは濃度が異なる第２水溶液を導入した。ここで、第２水溶液として、緩衝液ＡにＡｌｅｘａ４８８を添加するがα−ヘモリシンを添加しないものを用いた。第２水溶液にはα−ヘモリシンを添加しないことから、第２水溶液におけるα−ヘモリシンの濃度は、第１水溶液におけるα−ヘモリシンの濃度より低い。そのため、第１導入口４５ａから第１液体流路４８ａに第２水溶液を導入すると、第１導入口４５ａに近いチャンバー２６ほどα−ヘモリシンの濃度が希釈され、すなわち、各チャンバー２６に満たされた水溶液には、第１導入口４５ａからの距離に応じて徐々にα−ヘモリシンの濃度が高くなるような濃度勾配が形成される（図１５Ａ参照）。
【００８２】
次いで、発明者らは、第１導入口４５ａから第１液体流路４８ａに脂質を含有する有機溶媒と第３水溶液とを順に導入し、各チャンバーの開口部に前記水溶液を液封するように脂質二重膜を形成した。ここで、脂質を含有する有機溶媒として、０．３ｍｇ／ｍｌのＰＯＰＣを含有するクロロホルムを用いた。また、第３水溶液として、緩衝液Ａを５０％に希釈したものを用いた。
【００８３】
その後、発明者らは、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、チャンバー２６内の水溶液に含まれる蛍光物質が発する光を検出した。図１５Ｂは、第１導入口４５ａから８．１ｍｍ離れた位置における測定開始直後の緑色蛍光画像（左図）、１時間経過後の緑色蛍光画像（中央図）、およびそれらの差分画像（右図）を示している。
【００８４】
図１５Ｂに示すように、測定開始直後には全てのチャンバー２６にて緑色蛍光を視認できたが、１時間経過後には幾つかのチャンバー２６において緑色蛍光を視認できなくなった。これは、１時間の間にチャンバー２６内のα−ヘモリシンが脂質二重膜に組み込まれて、脂質二重膜に微小な穴（ナノポア）を形成し、チャンバー２６内のＡｌｅｘａ４８８（緑色蛍光色素）がこのナノポアを通過してチャンバー２６の外側に漏出したためであると推測される。
【００８５】
図１６は、経過時間とチャンバー２６の蛍光強度との関係を示すグラフである。図１６に示すグラフでは、時間の経過に従って、徐々に蛍光強度が減少しており、このことから、チャンバー２６の開口部には、α−ヘモリシンによるナノポアが形成されるような脂質二重膜が確かに存在していることが確認できる。
【００８６】
図１７は、α−ヘモリシンの濃度と、脂質二重膜にナノポアが形成されたチャンバー２６の割合との関係を示すグラフである。図１７において、横軸は、各チャンバー２６に満たされた水溶液のα−ヘモリシンの濃度を示しており、縦軸は、脂質二重膜にナノポアが形成されたチャンバー２６の割合、すなわち所定時間経過後に緑色蛍光を視認できなくなったチャンバー２６の割合を示している。図１７に示すグラフから、水溶液中のα−ヘモリシンの濃度が１μｇ／ｍｌを超えると、脂質二重膜にナノポアが形成される割合が７次関数的に増加することが確認できる。
【００８７】
以上のように、上述した実施形態によれば、疎水層２４の主面上に設けられた第１液体流路４８ａに第１水溶液を導入し、第１液体流路４８ａに面する各チャンバー２６を第１水溶液で満たした後、第１液体流路４８ａの第１導入口４５ａから第１水溶液とは濃度が異なる第２水溶液を導入する。このとき、第１液体流路４８ａの壁面では摩擦があるため第１液体流路４８ａの中心部に比べて第２水溶液が流れにくく、第１水溶液と第２水溶液との界面での希釈現象により、各チャンバー２６に満たされた水溶液の濃度には第１導入口４５ａからの距離に応じた濃度勾配が形成される。すなわち、第２水溶液の濃度が第１水溶液の濃度よりも低い場合には、第１導入口４５ａに近いチャンバー２６ほど水溶液の濃度が低くなるような濃度勾配が形成され、第２水溶液の濃度が第１水溶液の濃度よりも高い場合には、第１導入口４５ａに近いチャンバー２６ほど水溶液の濃度が高くなるような濃度勾配が形成される。その後、第１液体流路４８ａに脂質を含有する有機溶媒と第３水溶液とを順に導入し、各チャンバー２６の開口部に脂質二重膜を形成する。これにより、脂質二重膜で覆われたマイクロリアクタチップの各チャンバーにおいて物質濃度勾配を簡易的に形成することができ、１枚のマイクロリアクタチップによる網羅的かつ高効率な生体試料の機能解析が実現する。例えば、創薬への貢献であるが、市販薬の主標的である膜タンパク質への新薬の親和性を計測するためには、当該薬剤の濃度を幅広く変化させる計測が費用であり、従来法では高価かつ大規模な装置が必要であったり、煩雑な作業を伴ったりしていた。これに対し、上述した実施形態に係る技術を利用すると、１枚のマイクロリアクタチップ上にて薬剤の濃度勾配を幅広く形成できるため、たった一度の計測で膜タンパク質への薬剤の親和性を容易に定量することが可能となる。
【００８８】
また、上述した実施形態によれば、第１導入口４５ａが第１液体流路４８ａの一端に形成されており、第１液体流路４８ａの他端は大気に開放されているため、第１導入口４５ａから導入された液体は第１液体流路４８ａの一端から他端に向かって一方向に流れることになり、すなわち液体の流れる方向に乱れや滞留が生じることが低減される。これにより、マイクロリアクタチップ２０上に形成される物質濃度勾配に揺らぎが生じることを低減することができる。
【００８９】
また、上述した実施形態によれば、電動ピペットを用いて予め定められた容量の第２水溶液を予め定められた流速で第１液体流路４８ａに導入するため、マイクロリアクタチップ２０上に形成される物質濃度勾配を容易に制御することができ、言い換えれば、マイクロリアクタチップ２０上にて所望の物質濃度勾配を容易に形成することができる。
【００９０】
なお、上述した実施形態では、図７Ａ〜図７Ｆに示すように、マイクロリアクタチップ２０の疎水層２４の上方に第１液体流路４８ａが設けられた態様にて各チャンバー２６の上向きの開口部に脂質二重膜を形成したが、これに限定されず、図７Ａ〜図７Ｆを上下逆さまにした態様、すなわち疎水層２４の下方に第１液体流路４８ａが設けられた態様にて各チャンバー２６の下向きの開口部に脂質二重膜を形成してもよい。あるいは、図７Ａ〜図７Ｆを左右に延びる回転軸回りに９０°回転させた態様、すなわち疎水層２４の側方に第１液体流路４８ａが設けられた態様にて各チャンバー２６の横向きの開口部に脂質二重膜を形成してもよい。
【００９１】
なお、上述した実施形態に対して様々な変更を加えることが可能である。以下、図面を参照しながら、変形の一例について説明する。以下の説明および以下の説明で用いる図面では、上述した実施形態と同様に構成され得る部分について、上述した実施形態における対応する部分に対して用いた符号と同一の符号を用いるとともに、重複する説明を省略する。
【００９２】
［マイクロリアクタチップ上での濃度勾配形成の一変形例］
図１８は、一実施形態に係るマイクロリアクタチップ２０上での濃度勾配形成方法の一変形例に用いる装置構成を示す平面図である。図１９は、一実施形態に係るマイクロリアクタチップ２０上での濃度勾配形成方法の一変形例を示すフローチャートである。
【００９３】
図１８および図１９に示す例では、まず、マイクロリアクタチップ２０の疎水層２４の主面上に平面視「Ｅ」字形状を有するスペーサ４２’を介在させつつ、第１導入口４５ａおよび第２導入口４５ｂが形成されたガラス板４４’を載せる。これにより、疎水層２４の主面が略水平な底面となる第１液体流路４８ａおよび第２液体流路４８ｂが形成される。第１液体流路４８ａおよび第２液体流路４８ｂの大きさは、互いに同じであってもよく、たとえば、長さ８．１ｍｍ、幅２ｍｍである。図１８に示すように、ガラス板４４’の第１導入口４５ａは第１液体流路４８ａの一端に位置するように位置決めされ、第１液体流路４８ａの他端は大気に開放されてもよい。同様に、ガラス板４４’の第２導入口４５ｂは第２液体流路４８ｂの一端に位置するように位置決めされ、第２液体流路４８ｂの他端は大気に開放されてもよい。
【００９４】
図１８に示すように、第２液体流路４８ｂは、第１液体流路４８ａと平行であってもよい。この場合、第１液体流路４８ａと第２液体流路４８ｂとの間のスペースを狭めることができ、１枚のマイクロリアクタチップ２０という限られたスペースを有効に活用することができる。
【００９５】
疎水層２４の主面上に第１液体流路４８ａおよび第２液体流路４８ｂを設けたのち、図１９を参照し、上述した実施形態と同様にして、第１導入口４５ａから第１液体流路４８ａに第１水溶液を導入し、第１液体流路４８ａおよび第１液体流路４８ａに面するチャンバー２６を第１水溶液で満たし（ステップＳ１１）、次いで、第１導入口４５ａから第１液体流路４８ａに、第１水溶液とは濃度が異なる第２水溶液を導入し、各チャンバー２６に満たされた水溶液の濃度に第１導入口４５ａからの距離に応じた濃度勾配を形成し（ステップＳ１２）、その後、第１導入口４５ａから第１液体流路４８ａに、脂質を含有する有機溶媒と第３水溶液とを順に導入し、各チャンバー２６の開口部に水溶液を液封するように脂質二重膜を形成する（ステップＳ１３）。
【００９６】
次いで、第１液体流路４８ａに面する各チャンバー２６の開口部に脂質二重膜を形成したのち、図１９に示すように、電動ピペットを用いて、第２導入口４５ｂから第２液体流路４８ｂに第４水溶液を導入し、第２液体流路４８ｂおよび第２液体流路４８ｂに面するチャンバー２６を第４水溶液で満たす（ステップＳ１４）。なお、第４水溶液は第１水溶液と同じ組成であってもよいし、異なる組成であってもよい。
【００９７】
次に、図１９に示すように、電動ピペットを用いて、第２導入口４５ｂから第２液体流路４８ｂに、第４水溶液とは濃度が異なる第５水溶液を導入する（ステップＳ１５）。第５水溶液は第２水溶液と同じ組成であってもよいし、異なる組成であってもよい。第２導入口４５ｂから第２液体流路４８ｂに第５水溶液を導入すると、第２液体流路４８ｂの壁面では摩擦があるため第２液体流路４８ｂの中心部に比べて第５水溶液が流れにくく、第４水溶液と第５水溶液との界面での希釈現象により、各チャンバー２６に満たされた水溶液の濃度には第２導入口４５ｂからの距離に応じた濃度勾配が形成される。すなわち、第５水溶液の濃度が第４水溶液の濃度よりも低い場合には、第２導入口４５ｂに近いチャンバー２６ほど水溶液の濃度が低くなるような濃度勾配が形成され、第５水溶液の濃度が第４水溶液の濃度よりも高い場合には、第２導入口４５ｂに近いチャンバー２６ほど水溶液の濃度が高くなるような濃度勾配が形成される。
【００９８】
次に、図１９に示すように、第２導入口４５ｂから第２液体流路４８ｂに、脂質を含有する有機溶媒と第６水溶液とを順に導入し、各チャンバー２６の開口部に水溶液を液封するように脂質二重膜を形成する（ステップＳ１６）。第６水溶液は第３水溶液と同じ組成であってもよいし、異なる組成であってもよい。
【００９９】
脂質二重膜を形成する工程（ステップＳ１３、Ｓ１６）の後に、脂質二重膜に膜タンパク質を再構成させる工程を備えるものとすることもできる。再構成させる工程は、膜タンパク質を含む細胞膜断片、タンパク質を埋め込んだ脂質二重膜、水溶性タンパク質、タンパク質を取り込んだリポソーム、界面活性剤により可溶化させたタンパク質のいずれかを脂質二重膜に導入し、脂質二重膜にタンパク質を組み込んで膜タンパク質とする工程であってもよい。脂質二重膜にタンパク質を組み込む手法としては、リポソームの場合には膜融合などを用いることができ、界面活性剤により可溶化させたタンパク質の場合には熱揺動などを用いることができる。
【０１００】
このような態様によれば、１枚のマイクロリアクタチップ２０上において、第１液体流路４８ａに面する各チャンバー２６に形成された濃度勾配とは異なる濃度勾配を、第２液体流路４８ｂに面する各チャンバー２６に形成することができる。言い換えれば、１枚のマイクロリアクタチップ２０上において、複数種類の物質濃度勾配を容易に形成することができる。これにより、１枚のマイクロリアクタチップ２０による網羅的かつ高効率な生体試料の機能解析を更に進めることができる。
【０１０１】
なお、図１８および図１９に示す例では、マイクロリアクタチップ２０の疎水層２４の主面上に互いに平行な３本の延伸部を有するスペーサ４２’（平面視「Ｅ」字形状を有するスペーサ４２’）を介在させつつ、導入口４５ａ、４５ｂが２つ形成されたガラス板４４’を載せることで、疎水層２４の主面上に互いに平行な２本の液体流路４８ａ、４８ｂを形成したが、これに限定されるものではなく、マイクロリアクタチップ２０の疎水層２４の主面上に互いに平行な（Ｎ＋１）本（Ｎは３以上の自然数）の延伸部を有するスペーサ４２’を介在させつつ、導入口がＮ個形成されたガラス板４４’を載せることで、疎水層２４の主面上に互いに平行なＮ本の液体流路を形成してもよい。
【０１０２】
なお、上述した実施の形態および個々の変形例の記載ならびに図面の開示は、特許請求の範囲に記載された発明を説明するための一例に過ぎず、上述した実施の形態および個々の変形例の記載または図面の開示によって特許請求の範囲に記載された発明が限定されることはない。上述した実施の形態および個々の変形例の構成要素は、発明の主旨を逸脱しない範囲で任意に組み合わせることが可能である。
【符号の説明】
【０１０３】
２０    マイクロリアクタチップ
２２    基板
２４    疎水層
２４ａ  パターニング前の物質膜
２４ｂ  パターニング後の物質膜
２５ａ  パターニング前のレジスト
２５ｂ  パターニング後のレジスト
２６    チャンバー
４２、４２’    スペーサ
４４、４４’    ガラス板
４５ａ  第１導入口
４５ｂ  第２導入口
４８ａ  第１液体流路
４８ｂ  第２液体流路
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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