(57)【要約】      （修正有）【課題】高等植物における葉緑体にターゲッティングされるタンパク質の異種発現において有用である合成葉緑体輸送ペプチドの提供。【解決手段】合成葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）と対象とするポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、前記ポリヌクレオチドが植物細胞中で発現される際に、前記対象とするポリペプチドが植物細胞中の葉緑体にターゲッティングされ、前記ポリヌクレオチドが、前記合成ＣＴＰをコードする第一のヌクレオチド配列であって、前記合成ＣＴＰのそれぞれのアミノ酸残基が、３−エノールピルビルシキミ酸−５−リン酸シンセターゼ（ＥＰＳＰＳ）の同じ位置のアミノ酸残基と同じであり、前記第１のヌクレオチド配列とインフレームで作動可能に連結している対象とするポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列とを含む、核酸分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）酵素のアライン
メントから得られた参照ヌクレオチド配列から誘導される合成葉緑体輸送ペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項２】
合成葉緑体輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している対象
とするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
参照ヌクレオチド配列が、アブラナ属種（Brassica sp.）、ダイズ属種（Glycine sp.
）、アラビドプシス属種（Arabidopsis sp.）、およびデュネイラ属種（Duneila sp.）か
らなる群から選択される種から単離された５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シ
ンターゼ（ＥＰＳＰＳ）酵素のアラインメントから得られる、請求項１に記載の単離され
た核酸分子。
【請求項４】
参照ヌクレオチド配列が、配列番号１〜１０からなる群から選択されるポリペプチドの
アラインメントから得られる、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
合成葉緑体輸送ペプチドが、配列番号１１の葉緑体輸送ペプチドと少なくとも８０％同
一である、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
合成葉緑体輸送ペプチドが、配列番号１１の葉緑体輸送ペプチドと少なくとも８５％同
一である、請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
合成葉緑体輸送ペプチドが、配列番号１１の葉緑体輸送ペプチドと少なくとも９０％同
一である、請求項６に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
合成葉緑体輸送ペプチドが、配列番号１１の葉緑体輸送ペプチドと少なくとも９５％同
一である、請求項７に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
合成葉緑体輸送ペプチドが、配列番号１１の葉緑体輸送ペプチドと少なくとも９８％同
一である、請求項８に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
合成葉緑体輸送ペプチドが、配列番号１１を含む、請求項９に記載の単離された核酸分
子。
【請求項１１】
合成葉緑体輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号１２の核酸に特異
的にハイブリダイズ可能である、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
各々、葉緑体輸送ペプチドをコードする、少なくとも１種のさらなるヌクレオチド配列
をさらに含み、さらなるヌクレオチド配列が、対象とするヌクレオチド配列に作動可能に
連結している、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
少なくとも１種のさらなるヌクレオチド配列が、原核生物、下等光合成真核生物および
緑藻植物からなる群から選択される生物に由来する、請求項１２に記載の単離された核酸
分子。
【請求項１４】
対象とする合成葉緑体輸送ペプチドをコードする配列およびヌクレオチド配列が、１つ
または複数の調節配列に作動可能に連結している、請求項２に記載の単離された核酸分子
。
【請求項１５】
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドおよび合成葉緑体輸送ペプ
チドを含むキメラポリペプチドをコードする、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸分子によってコードされるキメラポリペプチド。
【請求項１７】
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、プラスチド含有細胞中
のプラスチドにターゲッティングされる、請求項１６に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１８】
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、プラスチドにターゲッ
ティングされると除去される合成葉緑体輸送ペプチドを含む、請求項１７に記載のキメラ
ポリペプチド。
【請求項１９】
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、生物学的に活性なペプ
チドである、請求項１６に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２０】
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、蛍光ペプチドである、
請求項１６に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２１】
生物学的に活性なペプチドが、アセトラクターゼシンターゼ（ＡＬＳ）、突然変異ＡＬ
Ｓ、ＡＬＳの前駆体、３−エノールピルビルシキミ酸−５−リン酸シンセターゼ（ＥＰＳ
ＰＳ）、ＣＰ４  ＥＰＳＰＳおよびクラスＩＩＩ  ＥＰＳＰＳからなる群から選択される
、請求項１９に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２２】
生物学的に活性なペプチドが、ＤＧＴ−２８またはＣｒｙ２Ａａである、請求項１９に
記載のキメラポリペプチド。
【請求項２３】
生物学的に活性なペプチドが、除草剤抵抗性、ウイルス抵抗性、細菌病原体抵抗性、昆
虫抵抗性、線虫抵抗性、真菌抵抗性、草勢、植物の収量、温度耐性、土壌条件耐性、低光
量レベル耐性、低水分レベル耐性、高水分レベル耐性、化学的環境耐性、種子色、デンプ
ン変性、アミノ酸合成、光合成、脂肪酸の合成、油の合成、アロテノイド（arotenoid）
の合成、テルペノイドの合成、デンプンの合成および除草剤抵抗性からなる群から選択さ
れるプロセスに関与している、請求項１９に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２４】
生物学的に活性なペプチドが、除草剤抵抗性に関与している、請求項１９に記載のキメ
ラポリペプチド。
【請求項２５】
請求項２に記載の核酸分子を含む植物材料。
【請求項２６】
植物細胞、植物組織、植物組織培養物、カルス培養物、植物の一部および全植物体から
なる群から選択される、請求項２５に記載の植物材料。
【請求項２７】
核酸分子が、植物材料から得た細胞のゲノムに安定に組み込まれる、請求項２５に記載
の植物材料。
【請求項２８】
トランスジェニック植物材料を製造する方法であって、
請求項２に記載の単離された核酸分子を得ることと、
植物材料を、核酸分子を用いて形質転換することと
を含む、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法によって製造されるトランスジェニック植物材料。
【請求項３０】
ポリペプチドを葉緑体にターゲッティングするためのＥＰＳＰＳ由来の手段を含む単離
された核酸分子。
【請求項３１】
ポリペプチドを葉緑体にターゲッティングするためのＥＰＳＰＳ由来の手段に作動可能
に連結している対象とするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３０に記載の単離され
た核酸分子。
【請求項３２】
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドを含むキメラポリペプチド
をコードする、請求項３１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３３】
請求項３１に記載の核酸分子を含む植物発現ベクター。
【請求項３４】
請求項３３に記載の核酸分子を含む植物材料。
【請求項３５】
トランスジェニック植物材料を製造する方法であって、
請求項３１に記載の単離された核酸分子を得ることと、
植物材料を、核酸分子を用いて形質転換することと
を含む、方法。
【請求項３６】
植物材料が、植物細胞、植物組織、植物組織培養物、カルス培養物、植物の一部および
全植物体からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項３５に記載の方法によって製造されるトランスジェニック植物材料。
【請求項３８】
請求項３７に記載のトランスジェニック植物材料から再生されたトランスジェニック植
物。
【請求項３９】
植物体に再生され得ない植物細胞である、請求項２６に記載の植物材料。
【請求項４０】
植物材料が、植物体を生成するよう再生できない植物細胞である、請求項２８に記載の
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本願は、２０１２年２月１日に出願された米国特許仮出願番号第６１／５９３，５５５
号および２０１２年４月１７日に出願された米国特許仮出願番号第６１／６２５，２２２
号の利益を主張する。
【０００２】
３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§  １．８２１（ｃ）または（ｅ）に従う声明−ＡＳＣＩＩテキス
トファイルとして提出された配列表
３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§  １．８２１（ｃ）または（ｅ）に従って、配列表のＡＳＣＩＩ
テキストバージョンを含むファイルは、本出願と同時に提出され、その内容は参照により
本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本開示は、プラスチド含有細胞のプラスチドへターゲッティングされるポリペプチドを
遺伝的にコードし、発現するための組成物および方法に関する。特定の実施形態では、本
開示は、ポリペプチドを葉緑体（例えば、高等植物の）にターゲッティングするアミノ酸
配列および／またはそれをコードする核酸分子に関する。特定の実施形態では、本開示は
、キメラポリペプチドのプラスチドへの輸送を制御するアミノ酸配列を含むキメラポリペ
プチドおよび／またはそれをコードする核酸分子に関する。
【背景技術】
【０００４】
植物細胞は、特徴的な膜系によって区切られており、細胞内で特殊な機能を果たす、一
般に「プラスチド」と呼ばれる、個別の細胞内オルガネラを含有する。個々のプラスチド
は、光合成、ならびに特定の化学化合物の合成および保存に関与している。すべてのプラ
スチドは、植物の成長点領域中に存在するプロプラスチドに由来する。プロプラスチドは
、例えば、葉緑体、エチオプラスト、有色体、ゲロントプラスト（gerontoplasts）、白
色体、アミロプラスト、エライオプラストおよびプロテイノプラストに発達し得る。プラ
スチドは、細胞内に半自律的に存在し、自身の遺伝子系およびタンパク質合成機構を含有
するが、その発達および生合成活性において核細胞質系との密接な協力関係に依存してい
る。
【０００５】
高等植物の光合成葉細胞では、最も顕著なプラスチドは葉緑体である。葉緑体の最も必
須の機能は、光合成の光によって駆動される反応の実施である。しかし、葉緑体はまた、
植物細胞にとって重要な多数のその他の生合成プロセスも実施する。例えば、細胞の脂肪
酸のすべては、葉緑体ストロマに局在する酵素によって、そこで容易に入手可能なＡＴＰ
、ＮＡＯＰＨおよび炭水化物を使用して製造される。さらに、光活性化された電子の還元
力は、葉緑体における亜硝酸化合物（ＮＯ２−）のアンモニア（ＮＨ３）への還元を駆動
し、このアンモニアが、植物に、アミノ酸およびヌクレオチドの合成に必要な窒素を提供
する。
【０００６】
葉緑体はまた、農業化学産業において特に重要なプロセスに参加する。例えば、多くの
除草剤が、葉緑体内で実施される機能を遮断することによって作用するということがわか
っている。最近の研究によって、いくつかの除草剤の特異的標的が同定された。例えば、
トリアジン由来除草剤は、プラストキノン分子を、光化学系ＩＩの３２ｋＤポリペプチド
中のその結合部位から移動させることによって光合成を阻害する。この３２ｋＤのポリペ
プチドは、葉緑体ゲノム中にコードされ、オルガネラ機構によって合成される。トリアジ
ン除草剤に対して耐性である突然変異体植物が得られている。これらの植物は、トリアジ
ン除草剤によってプラストキノンが、もはや移動され得ない突然変異体３２ｋＤポリペプ
チドを含有する。スルホニル尿素は、葉緑体においてアセト乳酸シンターゼを阻害する。
アセト乳酸シンターゼは、イソロイシンおよびバリン合成に関与している。グリホサート
は、芳香族アミノ酸の合成に関与する酵素である、５−エノールピルビル−３−ホスホシ
キミ酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）の機能を阻害する。すべてのこれらの酵素は、核ゲノム
によってコードされるが、葉緑体中に転位置され、そこで実際のアミノ酸合成が起こる。
【０００７】
ほとんどの葉緑体タンパク質は、植物細胞の核中にコードされ、サイトゾルにおいて大
きな前駆体タンパク質として合成され、翻訳後、葉緑体中に輸送される。ストロマへの外
包膜および内包膜を越える輸送は、ストロマ、チラコイド膜およびチラコイドルーメンに
向かう予定であるタンパク質が入るための主要な手段である。チラコイド膜およびチラコ
イドルーメンへの輸送される前駆体タンパク質の局在性は、細菌タンパク質輸送系と相同
である２種を含めた４種の別個の機序によって達成される。したがって、葉緑体における
タンパク質局在性のための機序は、幾分かは、原核生物の内部共生体に由来する。Cline 
and Henry (1996) Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 12:1-26。
【０００８】
葉緑体発現に向かう予定である前駆体タンパク質は、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）と
して知られるＮ末端伸長部分を含有する。輸送ペプチドは、葉緑体表面の特異的認識およ
び葉緑体包膜を越える、ゆえに、葉緑体内の種々のサブコンパートメント（例えば、スト
ロマ、チラコイドおよびチラコイド膜）へのプレタンパク質の翻訳後転位置の媒介に役立
つ。これらのＮ末端輸送ペプチド配列は、葉緑体タンパク質のプラスチド中への輸送に必
要な情報のすべてを含有し、輸送ペプチド配列は、プラスチド輸送にとって必要であり、
十分である。
【０００９】
そのＮ末端に天然にコードされる輸送ペプチド配列を有すると報告される植物遺伝子と
して、リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ（ＲｕＢｉｓＣｏ）の葉緑体小サ
ブユニット（de Castro Silva-Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30:769-80; Schn
ell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:3335-42）；ＥＰＳＰＳ（例えば、Archer et al
. (1990) J. Bioenerg. and Biomemb. 22:789-810および米国特許第６，８６７，２９３
号、同７，０４５，６８４号およびＲｅ．３６，４４９を参照のこと）；トリプトファン
シンターゼ（Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:6081-7）；プラストシアニン（La
wrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:20357-63）；コリスミ酸シンターゼ（Schmid
t et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:27447-57）；集光性葉緑素ａ／ｂ結合タンパク質
（ＬＨＢＰ）（Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999）；およびシロ
イヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の葉緑体タンパク質（Lee et al. (2008) Plant Ce
ll 20:1603-22）が挙げられる。米国特許出願公開ＵＳ２０１０／００７１０９０は、ク
ラミドモナス（Chlamydomonas）種に由来する特定の葉緑体ターゲッティングペプチドを
提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、葉緑体ターゲッティングペプチドによってコードされる情報の構造的必要要件
は、その高レベルの配列多様性および共通またはコンセンサス配列モチーフの欠如のため
にわかりにくいままであるが、独立した構造モチーフを有する葉緑体ターゲッティングペ
プチドの別個のサブグループがある可能性がある。Lee et al. (2008)、前掲。さらに、
これらの配列の一部のものが、高等植物における葉緑体にターゲッティングされるタンパ
ク質の異種発現において有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
植物におけるポリペプチドのプラスチドターゲッティングのための組成物および方法が
、本明細書において記載される。いくつかの実施形態では、組成物は、対象とするヌクレ
オチド配列と作動可能に連結している合成葉緑体輸送ペプチド（例えば、ＴｒａＰ２３ペ
プチド）をコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。特定の
実施形態では、このような核酸分子は、単子葉植物または双子葉植物における、対象とす
るヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの発現およびターゲッティングに
とって有用であり得る。対象とするヌクレオチド配列と作動可能に連結している合成葉緑
体輸送ペプチドをコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むベ
クターが、さらに記載される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、合成ＣＴＰをコードするヌクレオチド配列は、５−エノール
ピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）酵素のアラインメントから得ら
れる参照ヌクレオチド配列由来のヌクレオチド配列またはその機能的変異体であり得る。
いくつかの実施形態では、合成ＣＴＰをコードするヌクレオチド配列は、種々の生物に由
来するヌクレオチド配列をコードする部分ＣＴＰまたはその機能的変異体を含むヌクレオ
チド配列であり得る。特定の実施形態では、合成ＣＴＰをコードするヌクレオチド配列は
、参照ＥＰＳＰＳ  ＣＴＰまたは前記のもののいずれかの機能的変異体の各々から得られ
た連続するヌクレオチド配列を含有し得る。これらおよびさらなる実施形態では、合成Ｃ
ＴＰをコードするヌクレオチド配列は、２種以上のＣＴＰをコードするヌクレオチド配列
を含むヌクレオチド配列であり得る。
【００１３】
いくつかの例では、合成ＣＴＰをコードするヌクレオチド配列は、ＥＰＳＰＳ酵素由来
の部分ＣＴＰヌクレオチド配列またはその機能的変異体を含むヌクレオチド配列であり得
る。特定の例では、合成ＣＴＰをコードするヌクレオチド配列は、ＥＰＳＰＳ酵素から得
られた連続ヌクレオチド配列またはその機能的変異体を含有し得る。
【００１４】
いくつかの実施形態では、組成物は、ポリペプチドを葉緑体にターゲッティングするた
めの少なくとも１種のＥＰＳＰＳ由来の手段を含む核酸分子を含む。対象とするヌクレオ
チド配列と作動可能に連結している、ポリペプチドを葉緑体にターゲッティングするため
の少なくとも１種のＥＰＳＰＳ由来の手段を含む核酸分子を含む核酸分子がさらに記載さ
れる。特定の実施形態では、このような核酸分子は、単子葉植物または双子葉植物におけ
る、対象とするヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの発現およびターゲ
ッティングにとって有用であり得る。本開示の目的上、ポリペプチドを葉緑体にターゲッ
ティングするためのＥＰＳＰＳ由来の手段とは、特定の合成ヌクレオチド配列を指す。特
定の実施形態では、ポリペプチドを葉緑体にターゲッティングするためのＥＰＳＰＳ由来
の手段は、ＴｒａＰ２３と本明細書において呼ばれるヌクレオチド配列からなる群から選
択される。
【００１５】
また、対象とするヌクレオチド配列と作動可能に連結している合成ＣＴＰをコードする
少なくとも１種のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む植物材料（例えば、限定するも
のではないが、植物、植物組織および植物細胞）も本明細書において記載される。いくつ
かの実施形態では、植物材料は、そのゲノム中に安定に組み込まれたこのような核酸分子
を有し得る。いくつかの実施形態では、植物材料は、対象とするヌクレオチド配列と作動
可能に連結している合成ＣＴＰをコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列を含む核
酸分子の産物を一時的に発現し得る。いくつかの実施形態では、植物材料は、植物体を製
造するよう再生できない植物細胞である。
【００１６】
プラスチド含有細胞（例えば、植物）において、プラスチド含有細胞のプラスチド（例
えば、葉緑体）においてヌクレオチド配列を発現するための方法も記載される。特定の実
施形態では、対象とするヌクレオチド配列と作動可能に連結している合成ＣＴＰをコード
する少なくとも１種のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、対象とするヌクレオチド配列
の発現生成物と融合している合成ＣＴＰを含む前駆体融合ポリペプチドが、植物細胞の細
胞質において産生され、次いで、融合ポリペプチドが、植物細胞の葉緑体中にｉｎ  ｖｉ
ｖｏで輸送されるよう、植物細胞を形質転換するために使用され得る。このような方法の
いくつかの実施形態では、植物細胞は、植物体を製造するよう再生できない。
【００１７】
対象とするヌクレオチド配列と作動可能に連結している合成ＣＴＰをコードする少なく
とも１種のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むトランスジェニック植物の製造のため
の方法がさらに記載される。また、このようなトランスジェニック植物から製造される植
物商品生産物（例えば、種子）も記載される。
【００１８】
以下およびその他の特徴は、添付の図面を参照して進行するいくつかの実施形態の以下
の詳細な説明から、より明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】対象とするヌクレオチド配列に作動可能に連結している、合成ＣＴＰをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＴｒａＰ２３）の特定の例を代表するｍＲＮＡ分子を示す図である。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ分子（例えば、示されているもの）は、対象とするヌクレオチド配列に作動可能に連結している、合成ＣＴＰをコードする配列を含むオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ分子から転写され得る。対象とするヌクレオチド配列は、いくつかの実施形態において、対象とするペプチドをコードする配列であってもよく、例えば、限定されないが、プラスチドにターゲティングされるマーカー遺伝子産物またはペプチドであってもよい。
【図２】多重ＥＰＳＰＳ葉緑体輸送ペプチド配列のアラインメントを示す図である。影付きのアミノ酸残基は、ＴｒａＰ２３について選ばれたアミノ酸配列を示す。
【図３】ｐＤＡＢ１０７６４０のプラスミドマップを示す図である。
【図４】タバコ葉組織へのＴｒａＰ２３−ＧＦＰ浸潤の顕微鏡画像を示す図である。
【図５】ｐＤＡＢ１０６５９８のプラスミドマップを示す図である。
【図６】トウモロコシプロトプラストの葉緑体への移動を示す、トウモロコシプロトプラストに形質転換されたＴｒａＰ２３−ＧＦＰの顕微鏡画像を示す図である。
【図７】プラスミドマップｐＤＡＢ１０９８０８を示す図である。
【図８】プラスミドマップｐＤＡＢ１０７６８７を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
Ｉ．いくつかの実施形態の概要
葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）（またはプラスチド輸送ペプチド）は、ＣＴＰを含むポ
リペプチドをプラスチド（例えば、葉緑体）に向かわせるよう、同時翻訳的または翻訳後
に機能する。本発明のいくつかの実施形態では、内因性葉緑体タンパク質または異種タン
パク質のいずれかが、ＣＴＰを含む大きな前駆体ポリペプチドとして、このようなタンパ
ク質の発現によって葉緑体に向けられ得る。特定の実施形態では、ＣＴＰは、たとえば、
限定されないが、異種生物から得られるオーソロガス遺伝子由来の少なくとも１つの連続
配列を組み込むことによって、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（
ＥＰＳＰＳ）酵素のアラインメントから得られるヌクレオチド配列またはその機能的変異
体から誘導され得る。
【００２１】
例示的な一実施形態では、各々、ＣＴＰをコードする核酸配列を、セイヨウアブラナ（
Brassica napus）から得られたＥＰＳＰＳタンパク質配列のアラインメント（図２）から
単離した。ＣＴＰをコードする配列は、ＥＰＳＰＳ遺伝子配列を、ＣｈｌｏｒｏＰ予測サ
ーバーを用いて解析することによって単離した。Emanuelsson et al. (1999) Protein Sc
ience 8:978-84（cbs.dtu.dk/services/ChloroPで入手可能）。単離されたＣＴＰをコー
ドする配列の予測されるタンパク質産物は、およそ６０〜７０個のアミノ酸長の輸送ペプ
チドである。この例では、ＥＰＳＰＳ  ＣＴＰ配列のアラインメントを参照配列として用
いて、アミノ酸を無作為に選択することによって典型的な合成ＣＴＰを設計し、新規合成
ＣＴＰを製造した。この設計プロセスは、合成ＣＴＰの誘導の特徴を例示する。例示的合
成ＣＴＰは、本開示内容を通じて、ＴｒａＰ２３と呼ばれる。例示的合成ＴｒａＰ２３を
、プラスチドをターゲッティングする機能について試験し、個々に、少なくとも、天然Ｃ
ＴＰ配列について観察されたものと同程度に好都合であるプラスチドターゲッティングを
示すとわかった。
【００２２】
さらなる例示的一実施形態では、各々、本発明の合成ＴｒａＰペプチドをコードする核
酸配列を独立に合成し、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする核酸配列と作動可能
に連結させて、各々、キメラＴｒａＰ：ＧＦＰ融合ポリペプチドをコードする合成核酸分
子を製造した。各々、キメラＴｒａＰ：ＧＦＰポリペプチドをコードするこのような核酸
分子を、各々、ＴｒａＰ：ＧＦＰをコードする核酸配列が、ＡｔＵｂｉ１０プロモーター
と作動可能に連結されるよう、各々、バイナリーベクターに導入した。
【００２３】
なおさらなる例示的一実施形態では、各々、ＡｔＵｂｉ１０プロモーターと作動可能に
連結されたＴｒａＰ：ＧＦＰをコードする核酸配列を含むバイナリーベクターを、独立に
、アグロバクテリウム媒介性形質転換によってタバコ（Nicotiana benthamiana）に一時
的に形質転換した。共焦点顕微鏡観察およびウエスタンブロット解析によって、各Ｔｒａ
Ｐが、ＧＦＰをタバコ葉緑体に成功裏にターゲッティングしたことを確認した。
【００２４】
さらなる例示的一実施形態では、本発明の合成ＴｒａＰペプチドをコードする核酸配列
を独立に合成し、農業的に重要な遺伝子配列をコードする核酸配列に作動可能に連結させ
た。ＴｒａＰ配列を、除草剤耐性形質（例えば、ｄｇｔ−２８）に融合して、キメラＴｒ
ａＰ：ＤＧＴ−２８融合ポリペプチドをコードする合成核酸分子を製造した。キメラＴｒ
ａＰ：ＤＧＴ−２８ポリペプチドをコードするこのような核酸分子を、各ＴｒａＰ：ｄｇ
ｔ−２８をコードする核酸配列が、プロモーターおよびその他の遺伝子調節エレメントと
作動可能に連結されるようにバイナリーベクター中に導入した。ＴｒａＰ：ｄｇｔ−２８
をコードする核酸配列を含有するバイナリーを使用して、種々の植物種を形質転換した。
トランスジェニック植物を、ＤＧＴ−２８酵素の葉緑体への発現および転位置の結果とし
ての除草剤耐性についてアッセイした。
【００２５】
さらなる例示的一実施形態では、本発明の合成ＴｒａＰペプチドをコードする核酸配列
を独立に合成し、農業的に重要な遺伝子配列をコードする核酸配列に作動可能に連結させ
た。ＴｒａＰ配列を、昆虫耐性形質（例えば、ｃｒｙ２Ａａ）と融合して、キメラＴｒａ
Ｐ：Ｃｒｙ２Ａａ融合ポリペプチドをコードする合成核酸分子を製造した。キメラＴｒａ
Ｐ：Ｃｒｙ２Ａａポリペプチドをコードするこのような核酸分子を、各ＴｒａＰ：ｃｒｙ
２ａａをコードする核酸配列が、プロモーターおよびその他の遺伝子調節エレメントと作
動可能に連結されるように、バイナリーベクターに導入した。ＴｒａＰ：ｃｒｙ２ａａを
コードする核酸配列を含有するバイナリーを使用して、種々の植物種を形質転換した。ト
ランスジェニック植物を、Ｃｒｙ２Ａａ酵素の葉緑体への発現および転位置の結果として
の昆虫抵抗性についてバイオアッセイした。
【００２６】
上記の詳細な実施例を考慮して、本発明の合成ＣＴＰ配列およびそれをコードする核酸
は、任意のポリペプチドを、様々なプラスチドを含有する細胞中のプラスチドに向かわせ
るために使用され得る。例えば、本開示によって当業者に利用可能になった方法によって
、任意の第２のペプチド配列のＮ末端に融合された合成ＣＴＰ配列を含むキメラポリペプ
チドを、第２のペプチド配列のプラスチドターゲッティングのためにプラスチド含有宿主
細胞中に導入してもよい（またはそこで発現させてもよい）。したがって、特定の実施形
態では、本発明のＴｒａＰペプチドは、天然ＣＴＰと比較した場合に、プラスチド発現が
望まれるペプチドの輸送およびプロセシングの増大された効率を提供し得る。
【００２７】
ＩＩ．略語
ＣＴＰ        葉緑体輸送ペプチド
ＥＰＳＰＳ    ３−エノールピルビルシキミ酸−５−リン酸シンセターゼ
ＹＦＰ        黄色蛍光タンパク質
Ｔｉ          腫瘍誘導性（Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）に由来するプラ
スミド）
Ｔ−ＤＮＡ    トランスファーＤＮＡ
【００２８】
ＩＩＩ．用語
本開示の種々の実施形態の再調査を容易にするために、特定の用語の以下の説明を提供
する：
【００２９】
葉緑体輸送ペプチド：本明細書において、用語「葉緑体輸送ペプチド」（ＣＴＰ）（ま
たは「プラスチド輸送ペプチド」）とは、ポリペプチドのＮ末端に存在する場合に、ポリ
ペプチドの輸送を、プラスチドを含有する細胞（例えば、全植物体または植物細胞培養物
などの中の植物細胞）のプラスチド中に向かわせるアミノ酸配列を指し得る。ＣＴＰは、
一般に、タンパク質の輸送を、宿主細胞のプラスチド（例えば、一次、二次または葉緑体
などの三次プラスチド）中に向かわせるのに必要であり、十分である。推定葉緑体輸送ペ
プチドは、いくつかの利用可能なアルゴリズム（例えば、ＰＳＯＲＴおよびＣｈｌｏｒｏ
Ｐ（cbs.dtu.dk/services/ChloroPで入手可能））のうち１種によって同定され得る。Ｃ
ｈｌｏｒｏＰは、ＣＴＰの特に良好な予測を提供し得る。Emanuelsson et al. (1999) Pr
otein Science 8:978-84。しかし、機能的ＣＴＰの予測は、いずれの既存のアルゴリズム
によっても１００％の効率では達成されない。したがって、同定された推定ＣＴＰが、例
えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ方法論において意図されるように実際に機
能することを確認することは重要である。
【００３０】
葉緑体輸送ペプチドは、プラスチド中に輸送されるポリペプチドのＮ末端に位置し得る
。ＣＴＰは、ＣＴＰを含むポリペプチドの、プラスチドへの同時翻訳輸送または翻訳後輸
送を容易にし得る。葉緑体輸送ペプチドは、通常、約４０個から約１００個の間のアミノ
酸を含み、このようなＣＴＰは、特定の共通する特徴を含有することが観察された。例え
ば、ＣＴＰは、あったとしても、極めて少ない負に帯電したアミノ酸（アスパラギン酸、
グルタミン酸、アスパラギンまたはグルタミンなど）しか含有しない；ＣＴＰのＮ末端領
域は、帯電したアミノ酸、グリシンおよびプロリンを欠く；ＣＴＰの中央領域はまた、極
めて高い割合の塩基性またはヒドロキシル化アミノ酸（セリンおよびトレオニンなど）を
含有する可能性が高い；ＣＴＰのＣ末端領域は、アルギニンが豊富であり、両親媒性のベ
ータシート構造を含む能力を有する可能性が高い。プラスチドプロテアーゼは、ポリペプ
チドのプラスチド中への輸送後に、ＣＴＰを、ＣＴＰを含むポリペプチドの残部から切断
し得る。
【００３１】
接触：本明細書において、用語、細胞、組織または生物（例えば、植物細胞；植物組織
；および植物体）「と接触する」または「によって取り込まれる」は、核酸分子に関して
、核酸分子の、生物への内部移行、例えば、限定されるものではないが、生物を核酸分子
を含む組成物と接触させること；および生物を核酸分子を含む溶液に浸漬することを含む
。
【００３２】
内因性：本明細書において、用語「内因性」とは、特定の生物、組織または細胞内に起
因する物質（例えば、核酸分子およびポリペプチド）を指す。例えば、植物細胞において
発現された「内因性」ポリペプチドは、同一種の遺伝子操作されていない植物から得られ
た同一種の細胞において正常に発現されるポリペプチドを指し得る。いくつかの例では、
内因性遺伝子（例えば、ＥＰＳＰＳ遺伝子）が、参照ＣＴＰ配列を得るために使用され得
る。
【００３３】
発現：本明細書において、コード配列（例えば、遺伝子または導入遺伝子）の「発現」
とは、核酸転写単位（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む）のコードされた情報
が、細胞の作動可能な、作動可能でない、または構造的部分に変換されるプロセスを指し
、タンパク質の合成を含むことが多い。遺伝子発現は、外部シグナル；例えば、遺伝子発
現を増大または減少させる薬剤に対する細胞、組織または生物の曝露によって影響を受け
得る。遺伝子の発現はまた、ＤＮＡからＲＮＡへ、タンパク質への経路のどこでも調節さ
れ得る。遺伝子発現の調節は、例えば、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送およびプロセシング、ｍ
ＲＮＡなどの中間分子の分解に対して作用する制御によって、または特定のタンパク質分
子の、製造された後の活性化、不活性化、コンパートメント化もしくは分解によって、ま
たはそれらの組合せによって起こる。遺伝子発現は、当技術分野で公知の任意の方法、例
えば、限定されるものではないが、ノーザンブロット；ＲＴ−ＰＣＲ；ウエスタンブロッ
ト；またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ；ｉｎ  ｓｉｔｕ；およびｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質活性ア
ッセイ（複数可）によって、ＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで測定され得る。
【００３４】
遺伝物質：本明細書において、用語「遺伝物質」は、ＤＮＡおよびＲＮＡなどのすべて
の遺伝子および核酸分子を含む。
【００３５】
異種：本明細書において、用語「異種」とは、特定の生物、組織または細胞内に起因し
ない物質（例えば、核酸分子およびポリペプチド）を指す。例えば、植物細胞において発
現された「異種」ポリペプチドとは、同一種の遺伝子操作されていない植物から得られた
同一種の細胞において正常には発現されないポリペプチド（例えば、同一生物の異なる細
胞または異なる生物の細胞において発現されるポリペプチド）を指し得る。
【００３６】
単離された：本明細書において、用語「単離された」とは、分子が天然に存在する生物
の細胞において、分子が正常には関連している同種のその他の分子（例えば、その他の核
酸分子およびその他のポリペプチド）から実質的に分離または精製されている分子（例え
ば、核酸分子およびポリペプチド）を指す。例えば、単離された核酸分子は、核酸分子が
天然に存在する生物の細胞において、染色体ＤＮＡまたは染色体外ＤＮＡから実質的に分
離または精製され得る。したがって、この用語は、その他の核酸分子、ポリペプチドおよ
び細胞成分が除去されるように生化学的に精製された組換え核酸分子およびポリペプチド
を含む。この用語はまた、組換え核酸分子、化学合成された核酸分子および組換えによっ
て製造されたポリペプチドを含む。
【００３７】
本明細書において、用語「実質的に精製された」とは、その天然状態ではそれと正常に
関連しているその他の分子から分離されている分子を指す。実質的に精製された分子が、
組成物中に存在する主な種であり得る。実質的に精製された分子は、例えば、天然混合物
中に存在する溶媒以外に、その他の分子を少なくとも６０％含まない、少なくとも７５％
含まない、または少なくとも９０％含まないものであり得る。用語「実質的に精製された
」は、その天然状態で存在する分子を指さない。
【００３８】
核酸分子：本明細書において、用語「核酸分子」とは、ヌクレオチドのポリマー形態を
指し、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖の両方ならびに上
記のものの合成形態および混合ポリマーを含み得る。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド
、デオキシリボヌクレオチドまたはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態を指す場合
もある。本明細書において「核酸分子」とは、「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同
義語である。核酸分子は、特に断りのない限り、普通、少なくとも１０塩基長である。こ
の用語は、ＤＮＡの一本鎖および二本鎖形態を含む。核酸分子は、二量体の（いわゆる、
タンデム）形態および核酸分子の転写産物を含む。核酸分子は、天然に存在する、および
／または天然に存在しないヌクレオチド結合によって一緒に連結している、天然に存在す
るヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドのいずれかまたは両方を含み得る。
【００３９】
当業者には、容易に理解されるように、核酸分子は、化学的または生化学的に修飾され
得るか、または非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含有し得る。このような修飾
として、例えば、標識、メチル化、天然に存在するヌクレオチドのうち１個または複数の
類似体との置換、ヌクレオチド間修飾（例えば、無電荷結合：例えば、メチルホスホネー
ト、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、カルバメートなど；電荷結合：例えば、ホ
スホロチオエート、ホスホロジチオエートなど；懸垂部分：例えば、ペプチド；介入物：
例えば、アクリジン、ソラレンなど；キレート剤；アルキル化剤；および修飾された結合
：例えば、アルファアノマー核酸など）が挙げられる。用語「核酸分子」はまた、一本鎖
、二本鎖、部分二本鎖、三本鎖、ヘアピン、環状およびパドロック型（padlocked）コン
ホメーションを含めた任意のトポロジカルコンホメーションも含む。
【００４０】
本明細書において、ＤＮＡに関して、用語「コード配列」、「構造的ヌクレオチド配列
」または「構造的核酸分子」とは、適当な調節配列の制御下に置かれた場合に、転写およ
びｍＲＮＡによってポリペプチドに最終的に翻訳されるヌクレオチド配列を指す。ＲＮＡ
に関して、用語「コード配列」とは、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳さ
れるヌクレオチド配列を指す。コード配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドンおよび３
’末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列として、それだけには限らない
が、ゲノムＤＮＡ；ｃＤＮＡ；ＥＳＴ；および組換えヌクレオチド配列が挙げられる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本発明は、例えば、例えば、イオン交換クロマトグラフィー
などの分離方法を使用して；分子の大きさに基づく排除によって、または親和性によって
、種々の溶媒における溶解度に基づく分画技術ならびに増幅、クローニングおよびサブク
ローニングなどの遺伝子工学の方法によって、単離、精製または部分精製され得るヌクレ
オチド配列を含む。
【００４２】
配列同一性：本明細書において、２種の核酸またはポリペプチド配列に関連して、用語
「配列同一性」または「同一性」とは、特定の比較ウィンドウにわたって最大一致を求め
てアラインされた場合に同一である２種の配列中の残基を指し得る。
【００４３】
本明細書において、用語「配列同一性のパーセンテージ」とは、２種の最適にアライン
された配列（例えば、核酸配列およびアミノ酸配列）を比較ウィンドウにわたって比較す
ることによって決定される値を指し得、ここで、比較ウィンドウ中の配列の部分は、２種
の配列の最適アラインメントを求めて参照配列（付加または欠失を含まない）に対して比
較されると付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両配
列中に同一ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定し、対応する位置の
数を得ること、対応する位置の数を、比較ウィンドウ中の位置の総数によって除すること
および結果に１００を乗じて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出され
る。
【００４４】
比較のために配列をアラインするための方法は、当技術分野で周知である。種々のプロ
グラムおよびアラインメントアルゴリズムが、例えば、Smith and Waterman (1981) Adv.
Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson an
d Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) 
Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nu
cleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; 
Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS M
icrobiol. Lett. 174:247-50に記載されている。配列アラインメント方法および相同性算
出の詳細な検討事項は、例えば、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に
見出すことができる。
【００４５】
米国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Info
rmation）（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  
Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標）;Altschul et al. (1990)）は、いくつかの配列解析プロ
グラムに関連して使用するために、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｂｅｔｈ
ｅｓｄａ、ＭＤ）およびインターネットを含め、いくつかの供給源から入手可能である。
このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法の説明は、ＢＬＡＳＴ（商標）の「
ヘルプ」セクションの下でインターネットで入手可能である。核酸配列を比較するために
、ＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「ＢＬＡＳＴ２配列」機能が、デフ
ォルトパラメータに設定されたデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用して用い
られ得る。参照配列に対してさらに大きな類似性を有する核酸配列は、この方法によって
評価されると、増大する同一性パーセンテージを示す。
【００４６】
特異的にハイブリダイズ可能な／特異的に相補的な：本明細書において、用語「特異的
にハイブリダイズ可能な」および「特異的に相補的な」とは、核酸分子および標的核酸分
子間で安定な、特異的な結合が生じるよう、十分な相補性度を示す用語である。２種の核
酸分子間のハイブリダイゼーションは、２種の核酸分子の核酸配列間の逆行性アラインメ
ントの形成を含む。次いで、２種の分子は、反対の鎖の対応する塩基と水素結合を形成し
て二本鎖分子を形成でき、これは十分に安定である場合には当技術分野で周知の方法を使
用して検出可能である。核酸分子は、特異的にハイブリダイズ可能であるその標的配列に
対して１００％相補的である必要はない。しかし、特異的であるハイブリダイゼーション
のために存在しなくてはならない配列相補性の量は、使用されるハイブリダイゼーション
条件の関数である。
【００４７】
特定の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、選択され
るハイブリダイゼーション方法の性質および組成物およびハイブリダイズする核酸配列の
長さに応じて変わる。一般に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーシ
ョンバッファーのイオン強度（特に、Ｎａ＋および／またはＭｇ＋＋濃度）が、ハイブリ
ダイゼーションのストリンジェンシーを左右するが、洗浄時間も、ストリンジェンシーに
影響を及ぼす。特定の程度のストリンジェンシーを得るのに必要なハイブリダイゼーショ
ン条件に関する計算は、当業者には公知であり、例えば、Sambrook et al. (ed.) Molecu
lar Cloning:A Laboratory Manual, 2nded., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11;およびHames and Higgins 
(eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985に論じられている。核酸
のハイブリダイゼーションに関するさらなる詳細な指示および案内は、例えば、Tijssen,
「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid prob
e assays」, in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybri
dization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993;およびA
usubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene P
ublishing and Wiley-Interscience, NY, 1995に見出すことができる。
【００４８】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが、ハイ
ブリダイゼーション分子および標的核酸分子内の相同配列間に２０％未満のミスマッチが
ある場合にのみ起こる条件を包含する。「ストリンジェントな条件」は、さらに特定のレ
ベルのストリンジェンシーを含む。したがって、本明細書において、「中程度のストリン
ジェンシー」条件とは、２０％を超える配列ミスマッチを有する分子が、ハイブリダイズ
しないものであり；「高ストリンジェンシー」の条件とは、１０％を超えるミスマッチを
有する配列が、ハイブリダイズしないものであり；「極めて高ストリンジェンシー」の条
件とは、５％を超えるミスマッチを有する配列が、ハイブリダイズしないものである。
【００４９】
以下は、代表的な、限定するものではないハイブリダイゼーション条件である。
高ストリンジェンシー条件（少なくとも９０％の配列同一性を共有する配列を検出する
）：６５℃で１６時間の５×ＳＳＣバッファー中でのハイブリダイゼーション；室温で各
１５分の２×ＳＳＣバッファーでの２回の洗浄；および６５℃で各２０分間の０．５×Ｓ
ＳＣバッファーでの２回の洗浄。
中程度のストリンジェンシー条件（少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列を検
出する）：６５〜７０℃で１６〜２０時間の５×〜６×ＳＳＣバッファー中でのハイブリ
ダイゼーション；室温で各５〜２０分の２×ＳＳＣバッファーでの２回の洗浄；および５
５〜７０℃で各３０分間の１×ＳＳＣバッファーでの２回の洗浄。
非ストリンジェント対照条件（少なくとも５０％の配列同一性を共有する配列がハイブ
リダイズする）：室温〜５５℃で１６〜２０時間の６×ＳＳＣバッファーでのハイブリダ
イゼーション；室温〜５５℃で各２０〜３０分の２×〜３×ＳＳＣバッファーでの少なく
とも２回の洗浄。
【００５０】
本明細書において、用語「実質的に相同な」または「実質的相同性」とは、連続する核
酸配列に関して、ストリンジェントな条件下で、参照核酸配列とハイブリダイズする連続
するヌクレオチド配列を指す。例えば、参照核酸配列（例えば、配列番号１２）に対して
実質的に相同である核酸配列とは、ストリンジェントな条件（例えば、上記で示される、
中程度のストリンジェンシー条件）下で、参照核酸配列とハイブリダイズする核酸配列で
ある。実質的に相同な配列は、少なくとも８０％配列同一性を有し得る。例えば、実質的
に相同な配列は、約８０％〜１００％配列同一性、例えば、約８１％、約８２％、約８３
％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１
％、約９２％、約９３％、約９４％約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９８．
５％、約９９％、約９９．５％、および約１００％を有し得る。実質的相同性の特性は、
特異的ハイブリダイゼーションと密接に関連している。例えば、核酸分子は、特異的結合
が望まれる条件下で、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、核
酸の、非標的配列との非特異的結合を避けるための十分な程度の相補性がある場合に、特
異的にハイブリダイズ可能である。
【００５１】
本明細書において、用語「オーソログ」（または「オーソロガス」）とは、共通の先祖
ヌクレオチド配列から進化した２種以上の種における遺伝子を指し、２種以上の種におい
て同一機能を保持し得る。
【００５２】
本明細書において、２種の核酸配列分子は、５’から３’方向に読まれる配列のどのヌ
クレオチドも、３’から５’方向に読まれる場合のもう一方の配列のどのヌクレオチドと
も相補的である場合に、「完全相補性」を示すといわれる。参照ヌクレオチド配列に対し
て相補的であるヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列の逆相補配列に対して配列同
一性を示す。これらの用語および説明は、当技術分野で十分に定義されており、当業者に
容易に理解される。
【００５３】
アミノ酸配列間の配列同一性パーセンテージを決定する場合には、アラインメントによ
って提供された所与の位置におけるアミノ酸の同一性は、アラインされた配列を含むポリ
ペプチドの所望の特性に影響を及ぼすことなく異なり得るということは、当業者には周知
である。これらの例では、配列同一性パーセントは、保存的に置換されたアミノ酸間の類
似性を説明するよう調整され得る。これらの調整は、当業者には周知であり、よく使用さ
れる。例えば、Myers and Miller (1988) Computer Applications in Biosciences 4:11-
7を参照のこと。
【００５４】
本発明の実施形態は、例示的プラスチド輸送ペプチドアミノ酸配列の機能的変異体およ
びそれをコードする核酸配列を含む。例示的輸送ペプチド配列の機能的変異体は、例えば
、例示的輸送ペプチドアミノ酸配列の断片（Ｎ末端またはＣ末端断片など）、または全長
の例示的輸送ペプチドアミノ酸配列もしくは例示的輸送ペプチドアミノ酸配列の断片の修
飾された配列であり得る。例示的輸送ペプチドアミノ酸配列は、修飾され得、いくつかの
実施形態では、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を導入し得る。「保存的」アミノ酸
置換とは、アミノ酸残基が、同様の機能的側鎖、同様の大きさおよび／または同様の疎水
性を有するアミノ酸残基によって置き換えられているものである。保存的置換を導入する
ために同一ファミリーの別のアミノ酸を置き換えるために使用され得るアミノ酸のファミ
リーは、当技術分野で公知である。例えば、これらのアミノ酸ファミリーとして、塩基性
アミノ酸（例えば、リシン、アルギニンおよびヒスチジン）；酸性アミノ酸（例えば、ア
スパラギン酸およびグルタミン酸）；無電荷（生理学的ｐＨで）極性アミノ酸（例えば、
グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシンおよびシトシン）
；非極性アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フ
ェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファン）；ベータ−分岐アミノ酸（例えば、
トレオニン、バリンおよびイソロイシン）；および芳香族アミノ酸（例えば、チロシン、
フェニルアラニン、トリプトファンおよびヒスチジン）が挙げられる。例えば、Sambrook
et al. (Eds.), 前掲;およびInnis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and A
pplications, 1990, Academic Press, NY, USAを参照のこと。
【００５５】
作動可能に連結された：第１のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列が、第２
のヌクレオチド配列と機能的関係にある場合に、第２のヌクレオチド配列と「作動可能に
連結している」。例えば、プロモーターは、プロモーターが、コード配列の転写または発
現に影響を及ぼす場合に、コード配列と作動可能に連結している。組換えによって作製さ
れた場合には、作動可能に連結しているヌクレオチド配列は、一般に、連続しており、２
つのタンパク質コード領域をつなげる必要がある場合には、同一リーディングフレーム中
にある。しかし、ヌクレオチド配列は、作動可能に連結されるよう連続している必要はな
い。
【００５６】
用語「作動可能に連結された」とは、調節配列およびコード配列に関して使用される場
合には、調節配列が、連結されたコード配列の発現に影響を及ぼすことを意味する。「調
節配列」または「制御エレメント」とは、関連しているコード配列の転写のタイミングお
よびレベル／量、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性または翻訳に影響を及ぼすヌクレオ
チド配列を指す。調節配列は、プロモーター；翻訳リーダー配列；イントロン；エンハン
サー；ステム−ループ構造；リプレッサー結合性配列；終結配列；ポリアデニル化認識配
列などを含み得る。特定の調節配列は、それに作動可能に連結しているコード配列の上流
および／または下流に配置され得る。また、コード配列と作動可能に連結している特定の
調節配列は、二本鎖核酸分子の関連する相補鎖上に配置され得る。
【００５７】
２種以上のアミノ酸配列に関連して使用される場合には、用語「作動可能に連結してい
る」とは、第１のアミノ酸配列が、少なくとも１種のさらなるアミノ酸配列と機能的関係
にあることを意味する。例えば、輸送ペプチド（例えば、ＣＴＰ）は、輸送ペプチドが、
ポリペプチドまたは第２のアミノ酸配列の発現または輸送に影響を及ぼす場合に、両配列
を含むポリペプチド内の第２のアミノ酸配列と作動可能に連結している。
【００５８】
プロモーター：本明細書において、用語「プロモーター」とは、転写の開始から上流で
あり得る、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写を開始するためのその他のタンパク質の認識お
よび結合に関与し得るＤＮＡの領域を指す。プロモーターは、細胞における発現のために
コード配列と作動可能に連結され得るか、またはプロモーターは、細胞における発現のた
めにコード配列と作動可能に連結され得るシグナル配列をコードするヌクレオチド配列と
作動可能に連結され得る。「植物プロモーター」は、植物細胞において転写を開始できる
プロモーターであり得る。発達制御下にあるプロモーターの例として、葉、根、種子、繊
維、木部導管、仮導管または厚壁組織などの特定の組織における転写を優先的に開始する
プロモーターが挙げられる。このようなプロモーターは、「組織優先型」と呼ばれる。特
定の組織においてのみ転写を開始するプロモーターは、「組織特異的」と呼ばれる。「細
胞種特異的」プロモーターは、主に、１種または複数の器官中の特定の細胞種、例えば、
根または葉中の維管束細胞において発現を駆動する。「誘導可能な」プロモーターとは、
環境制御下にあるプロモーターであり得る。誘導プロモーターによる転写を開始し得る環
境条件の例として、嫌気性条件および光の存在が挙げられる。組織特異的、組織優先的、
細胞種特異的および誘導性プロモーターは、「非構成的」プロモーターのクラスを構成す
る。「構成的」プロモーターとは、ほとんどの環境条件下で活性であり得るプロモーター
である。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態では、任意の誘導プロモーターが使用され得る。Ward et 
al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366参照のこと。誘導プロモーターを用いると、誘
導物質に応じて転写の速度が増大する。例示的誘導プロモーターとして、それだけには限
らないが、銅と反応するＡＣＥＩ系；ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤と反応するト
ウモロコシ由来のＩｎ２遺伝子；Ｔｎ１０由来のＴｅｔリプレッサーに由来するプロモー
ター；およびステロイドホルモン遺伝子由来の誘導プロモーターが挙げられ、糖質コルチ
コステロイドホルモンによってそれらの転写活性が誘導され得る（Schena et al. (1991)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421）。
【００６０】
例示的構成プロモーターとして、それだけには限らないが、ＣａＭＶ由来の３５Ｓプロ
モーター；コメアクチン遺伝子由来のプロモーター；ユビキチンプロモーター；ｐＥＭＵ
；ＭＡＳ；トウモロコシＨ３ヒストンプロモーター；およびＡＬＳプロモーター、セイヨ
ウアブラナ（Brassica napus）ＡＬＳ３構造遺伝子の５’のＸｂａ１／ＮｃｏＩ断片（ま
たは前記Ｘｂａ１／ＮｃｏＩ断片と同様のヌクレオチド配列）（国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ
９６／３０５３０）などの植物ウイルス由来のプロモーターが挙げられる。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態では、さらに、任意の組織特異的または組織優先的プロモ
ーターが利用され得る。組織特異的プロモーターと作動可能に連結しているコード配列を
含む核酸分子で形質転換された植物は、もっぱら、または優先的に特定の組織においてコ
ード配列の産物を製造し得る。例示的組織特異的または組織優先的プロモーターとして、
それだけには限らないが、ファゼオリン遺伝子由来のものなどの根優先的プロモーター；
ｃａｂまたはリブロース二リン酸カルボキシラーゼ由来のものなどの葉特異的および光誘
導性プロモーター；ＬＡＴ５２由来のものなどの別の特異的プロモーター；Ｚｍ１３由来
のものなどの花粉特異的プロモーター；およびａｐｇ由来のものなどの小胞子優先的プロ
モーターがある。
【００６２】
形質転換：本明細書において、用語「形質転換」または「形質導入」とは、１種または
複数の核酸分子の細胞への転移を指す。細胞は、核酸分子の細胞ゲノムへの組み込みまた
はエピソーム複製のいずれかによって、核酸分子が細胞によって安定に複製されるように
なった場合に、細胞に軽質導入される核酸分子によって「形質転換される」。本明細書に
おいて、用語「形質転換」は、核酸分子が、このような細胞中に導入され得るすべての技
術を包含する。例として、それだけには限らないが：ウイルスベクターを用いるトランス
フェクション；プラスミドベクターを用いる形質転換；エレクトロポレーション（Fromm 
et al. (1986) Nature 319:791-3）;リポフェクション（Felgner et al. (1987) Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 84:7413-7）;マイクロインジェクション（Mueller et al. (1978) 
Cell 15:579-85）;アグロバクテリウム媒介性転移（Fraley et al. (1983) Proc. Natl. 
Acad. Sci. USA 80:4803-7）;直接ＤＮＡ取り込み；および微粒子銃（Klein et al. (198
7) Nature 327:70）が挙げられる。
【００６３】
導入遺伝子：外因性核酸配列。いくつかの例では、導入遺伝子は、少なくとも１種の合
成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードする配列であり得る。特定の例では、導入遺伝子は
、少なくとも１種の合成ＣＴＰおよびプラスチド発現が望ましい、少なくとも１種のさら
なるペプチド配列（例えば、除草剤抵抗性を付与するペプチド配列）を含むポリペプチド
をコードし得る。これらおよびその他の例では、導入遺伝子は、導入遺伝子のコード配列
と作動可能に連結している調節配列（例えば、プロモーター）を含有し得る。本開示の目
的上、用語「トランスジェニック」は、生物（例えば、植物）を指すために使用される場
合には、外因性核酸配列を含む生物を指す。いくつかの例では、外因性核酸配列を含む生
物は、分子形質転換技術によって核酸配列が導入された生物であり得る。その他の例では
、外因性核酸配列を含む生物は、例えば、遺伝子移入または植物における他家受粉によっ
て核酸配列が導入された生物であり得る。
【００６４】
輸送：本明細書において、用語「輸送」、「ターゲッティング」、および「転移」とは
、宿主細胞の核から宿主細胞のプラスチドへの、アミノ酸配列を含むポリペプチドの移動
を促進する、本発明の特定のアミノ酸配列の特性を指す。特定の実施形態では、このよう
なアミノ酸配列（すなわち、合成ＣＴＰ配列）は、アミノ酸配列を含むポリペプチドの約
１００％、少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも
約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、および／または少なくとも約５０
％を、宿主細胞のプラスチド中に輸送できる可能性がある。
【００６５】
ベクター：例えば、形質転換された細胞を製造するために、細胞中に導入されるような
核酸分子。ベクターは、複製起点などの、宿主細胞においてそれが複製するのを可能にす
る核酸配列を含み得る。ベクターの例として、それだけには限らないが、プラスミド；コ
スミド；バクテリオファージ；または外因性ＤＮＡを細胞中に運ぶウイルスが挙げられる
。ベクターはまた、１種または複数の遺伝子、アンチセンス分子および／または選択マー
カー遺伝子および当技術分野で公知のその他の遺伝子エレメントを含み得る。ベクターは
、細胞を形質導入、形質転換または感染し、それによって、細胞に、ベクターによってコ
ードされる核酸分子および／またはタンパク質を発現させ得る。ベクターは、任意選択で
、核酸分子の細胞（例えば、リポソーム、タンパク質コーティングなど）への侵入の達成
を補助する物質を含んでもよい。
【００６６】
具体的に示され、暗示されない限り、用語「１つの（a）」、「１つの（an）」および
「その（the）」は、本明細書において「少なくとも１つの」を示す。
【００６７】
具体的に説明されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学
用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を
有する。分子生物学における一般的な用語の定義は、例えば、Lewin B.,Genes V, Oxford
University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9);Kendrew et al. (eds.), The Encyclop
edia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9);お
よびMeyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk
Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8）に見出すことができる
。別に記載されない限り、すべてのパーセンテージは、重量によるものであり、すべての
溶媒混合物割合は、容量によるものである。すべての温度は、摂氏度である。
【００６８】
ＩＶ．合成ＣＴＰをコードする配列を含む核酸分子
いくつかの実施形態では、本開示は、対象とするヌクレオチド配列と作動可能に連結し
ている合成ＣＴＰをコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供
する。特定の実施形態では、対象とするヌクレオチド配列は、対象とするポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列であり得る。特定の例では、ＴｒａＰ２３配列が対象とする
ポリペプチドのＮ末端と融合しているポリペプチドをコードする単一の核酸分子が、提供
される。
【００６９】
いくつかの実施形態では、合成葉緑体輸送ペプチドは、キメラＣＴＰであり得る。合成
ＣＴＰは、ＥＰＳＰＳ酵素のアラインメントからアミノ酸を無作為に選択することから誘
導され得る。図２は、ＣＴＰ配列のアラインメントが植物ＥＰＳＰＳ酵素から単離された
ことを示す。したがって、合成ＣＴＰをコードするアミノ酸配列は、天然の葉緑体輸送ペ
プチド配列のアラインメントからのアミノ酸配列を無作為に選択することから誘導され得
る。これらおよび他の例では、アラインメントを製造するために使用された参照ＣＴＰ配
列の連続アミノ酸配列は合成ＣＴＰを含み得る。
【００７０】
当業者ならば、合成ＣＴＰ配列内の第１の連続するアミノ酸配列の選択後に、前述の誘
導プロセスに従う、相同なＣＴＰ配列の残部からの連続するアミノ酸配列の同定および選
択は、明白なものであり、自動的であるということは理解されよう。いくつかの例では、
第１の連続するアミノ酸配列は、約２５から約４１個の間のアミノ酸長（例えば、２４、
２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３
８、３９、４０、４１および４２個のアミノ酸長）であり得る。
【００７１】
前記のプロセスに従う、合成ＣＴＰタンパク質配列の例は、配列番号１１によって表さ
れる。当業者によれば、遺伝暗号の縮重を考慮して、これらのペプチドをコードするヌク
レオチド配列の種類は、すぐに思い浮かぶ。これらの特定の例は、異なる植物種由来のい
くつかのＥＳＰＳＰオーソログの１種から得た相同ＣＴＰのアラインメントに由来する連
続する配列を組み込むことによって、合成ＣＴＰの構造的特徴を例示する。
【００７２】
いくつかの実施形態は、合成葉緑体輸送ペプチドおよび／またはそれをコードする核酸
の機能的変異体を含む。このような機能的変異体として、例えば、限定するものではない
が、配列番号１１として示される合成ＣＴＰをコードする配列および／またはそれによっ
てコードされるＣＴＰ；配列番号１１内の連続するアミノ酸配列を含む合成ＣＴＰをコー
ドする核酸および／またはそれによってコードされるＣＴＰ；配列番号１２の連続する核
酸配列を含む末端切断型合成ＣＴＰをコードする配列；配列番号１２に対して実質的に相
同である、連続する核酸配列を含む末端切断型合成ＣＴＰをコードする配列；配列番号１
１の連続するアミノ酸配列を含む末端切断型合成ＣＴＰ；配列番号１１の連続するアミノ
酸配列を含む合成ＣＴＰをコードする核酸および／またはそれによってコードされるＣＴ
Ｐ；１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有する、配列番号１１の連続するアミノ酸配
列を含む合成ＣＴＰをコードする核酸および／またはそれによってコードされるＣＴＰ；
ならびに、作動可能に連結しているペプチドをプラスチドを含有する細胞中のプラスチド
に向けると実証されている、１つまたは複数の非保存的アミノ酸置換を有する、配列番号
１１内の連続するアミノ酸配列を含む合成ＣＴＰをコードする核酸および／またはそれに
よってコードされるＣＴＰが挙げられる。
【００７３】
したがって、本発明のいくつかの実施形態は、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を
含む合成ＣＴＰをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。このような核酸分
子は、例えば、分子生物学の技術における本発明のＣＴＰをコードする配列の製造を容易
にすることにおいて有用であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、本発明のＣＴＰ
をコードする配列は、発現ベクターに配列をサブクローニングするために適したベクター
中に導入され得るか、または本発明のＣＴＰをコードする配列は、対象とするヌクレオチ
ド配列と作動可能に連結しているＣＴＰをコードする配列を含むさらなる核酸分子の製造
を容易にする核酸分子中に導入され得る。これらのおよびさらなる実施形態では、合成Ｃ
ＴＰの配列中の１つまたは複数のアミノ酸位置が欠失している場合がある。例えば、合成
ＣＴＰの配列は、配列中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１
３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０位のアミノ酸（複数可）が欠失され
るよう修飾され得る。相同ＣＴＰ配列のアラインメントを使用して、どのアミノ酸が、合
成ＣＴＰの機能に影響を及ぼすことなく欠失され得るかについてのガイダンスが提供され
得る。
【００７４】
特定の例では、合成葉緑体輸送ペプチドは、８０個未満のアミノ酸長である。例えば、
合成ＣＴＰは、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、
６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０個またはそれより少ないアミノ
酸長であり得る。特定の例では、合成ＣＴＰは、約６５、約６８、約７２または約７４個
のアミノ酸長であり得る。これらおよびさらなる例では、合成ＣＴＰは、配列番号１１と
して示されるアミノ酸配列または前記のものの機能的変異体を含み得る。したがって、合
成ＣＴＰは、合成ＣＴＰの長さが、８０個未満のアミノ酸長である、配列番号１１のアミ
ノ酸配列またはその機能的変異体を含み得る。特定の例では、合成ＣＴＰは、例えば、配
列番号１１のうち１種に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０
％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少な
くとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸
配列を含み得る。
【００７５】
特定の合成ＣＴＰタンパク質、例えば、配列番号１１のＴｒａＰ２３ペプチド、または
任意の特定の欠失および／もしくは保存的アミノ酸置換を含む前記のもののいずれかの機
能的変異体をコードするヌクレオチド配列のすべてが、本開示を考慮して当業者には認識
されよう。遺伝暗号の縮重は、特定のアミノ酸配列について有限数のコード配列を提供す
る。合成ＣＴＰをコードするよう特定の配列を選択することは、実施者の判断の自由の範
囲内にある。異なる適用では、異なるコード配列が望ましいものであり得る。例えば、特
定の宿主における合成ＣＴＰの発現を増大するために、宿主のコドン使用バイアスに影響
を及ぼすコード配列が、選択され得る。例として、合成ＣＴＰは、配列番号１２として示
されるヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【００７６】
本発明のいくつかの実施形態において提供される核酸分子では、合成ＣＴＰをコードす
るヌクレオチド配列の最後のコドンおよび対象とするヌクレオチド配列の第１のコドンは
、例えば、イントロンまたは「停止」をコードしない任意の数のヌクレオチドトリプレッ
トによって離れている場合もある。いくつかの例では、天然前駆体ポリペプチドにおいて
葉緑体輸送ペプチドと普通関連している成熟タンパク質の第１のアミノ酸をコードする配
列が、合成ＣＴＰをコードするヌクレオチド配列の最後のコドンと、対象とするヌクレオ
チド配列の第１のコドンの間に存在し得る。合成ＣＴＰをコードするヌクレオチド配列と
、対象とするヌクレオチド配列の第１のコドンを分離する配列は、例えば、コードされる
アミノ酸配列が、キメラポリペプチドの翻訳およびプラスチドへのその転位置を大幅に変
更する可能性が低いような任意の配列からなり得る。これらおよびさらなる実施形態では
、合成葉緑体輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列の最後のコドンは、位相レジス
タにおいて、対象とするヌクレオチド配列の第１のコドンとそれと直接連続して、または
合成ヌクレオチドリンカー（例えば、融合を達成するために使用されることばあるヌクレ
オチドリンカー）によってコードされるような短いペプチド配列だけそれから離れて融合
され得る。
【００７７】
いくつかの実施形態では、例えば、特定の宿主におけるコード配列の発現を増強するた
めに、対象とするヌクレオチド配列および／または単一コード配列にそれと融合している
合成ＣＴＰをコードする配列のヌクレオチドを修飾することが望ましい場合がある。遺伝
暗号は、６４種の可能性あるコドンと重複しているが、ほとんどの生物は、これらのコド
ンのサブセットを優先的に使用する。種において最も多く利用されるコドンは、最適コド
ンと呼ばれ、あまり多くは利用されないものは、稀に使用されるコドンまたは低使用コド
ンとして分類される。Zhang et al. (1991) Gene 105:61-72.コドンは、「コドン最適化
」と呼ばれることもあるプロセスにおいて、特定の宿主の好ましいコドン使用を反映する
よう置換され得る。例えば、翻訳の速度を高めるよう、または望ましい特性（例えば、最
適化されていない配列から製造された転写物と比較して、より長い半減期）を有する組換
えＲＮＡ転写物を製造するよう、個々の原核生物または真核生物宿主によって好まれるコ
ドンを含有する最適化されたコード配列が調製され得る。
【００７８】
合成ＣＴＰ配列を組み込むことによって、任意のポリペプチドが、プラスチドを含有す
る細胞のプラスチドにターゲッティングされ得る。例えば、いくつかの実施形態では、連
結しているポリペプチド−ＣＴＰ分子が発現される細胞において、ポリペプチドをプラス
チドに向かわせるために、ポリペプチドが合成ＣＴＰ配列に連結され得る。特定の実施形
態では、合成ＣＴＰ配列の組み込みによってプラスチドにターゲッティングされるポリペ
プチドは、例えば、ポリペプチドが天然に発現される細胞のプラスチドにおいて普通発現
されるポリペプチドであり得る。例えば、限定するものではないが、合成ＣＴＰ配列の組
み込みによってプラスチドにターゲッティングされるポリペプチドは、除草剤抵抗性、ウ
イルス抵抗性、細菌病原体抵抗性、昆虫抵抗性、線虫抵抗性または真菌抵抗性に関与して
いるポリペプチドであり得る。例えば、米国特許第５，５６９，８２３号；同５，３０４
，７３０号；同５，４９５，０７１号；同６，３２９，５０４号；および同６，３３７，
４３１号を参照のこと。合成ＣＴＰ配列の組み込みによってプラスチドにターゲッティン
グされるポリペプチドは、別法として、例えば、限定するものではないが、草勢または収
量に関与するポリペプチド（極端な温度、土壌条件、光量レベル、水分レベルおよび化学
的環境に対する耐性に関与しているポリペプチドを含む）または対象とする形質（例えば
、選択マーカー遺伝子産物、種子色に関与しているポリペプチドなど）を含む植物を同定
するためのマーカーとして使用され得るポリペプチドであり得る。
【００７９】
本発明のいくつかの実施形態において、合成ＣＴＰ配列と連結され得る、除草剤抵抗性
に関与しているポリペプチドの限定されない例として、アセトラクターゼシンターゼ（Ａ
ＬＳ）、突然変異ＡＬＳおよびＡＬＳの前駆体（例えば、米国特許第５，０１３，６５９
号を参照のこと）；ＣＰ４  ＥＰＳＰＳまたはクラスIII ＥＰＳＰＳなどのＥＰＳＰＳ（
例えば、米国特許第４，９７１，９０８号および同６，２２５，１１４号を参照のこと）
；光合成および脂肪酸、アミノ酸、油、アロテノイド（arotenoid）、テルペノイド、デ
ンプンの合成などを含めたプラスチドにおいて生じる生理学的プロセスを修飾する酵素が
挙げられる。特定の実施形態において、合成葉緑体輸送ペプチドと連結され得るポリペプ
チドのその他の限定されない例として、ゼアキサンチンエポキシダーゼ、コリンモノオキ
シゲナーゼ、フェロケラターゼ、オメガ３脂肪酸不飽和化酵素、グルタミンシンセターゼ
、デンプン変性酵素、必須アミノ酸の合成に関与しているポリペプチド、プロビタミンＡ
、ホルモン、Ｂｔ毒素タンパク質などが挙げられる。前記のペプチドをコードするヌクレ
オチド配列は、当技術分野で公知であり、このようなヌクレオチド配列は、合成ＣＴＰと
連結している対象とするポリペプチドを含むポリペプチドに発現されるよう、合成ＣＴＰ
をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結され得る。さらに、前記のポリペプチド
のいずれかをコードするさらなるヌクレオチド配列は、当業者によって同定され得る（例
えば、特定のポリペプチドをコードするその他の遺伝子に対して高い相同性を有する遺伝
子のクローニングによって）。このようなヌクレオチド配列が同定されると、同定された
ヌクレオチド配列と作動可能に連結された合成ＣＴＰをコードする配列を含むヌクレオチ
ド配列または同等のポリペプチドをコードする配列を設計することが簡単なプロセスであ
る。
【００８０】
Ｖ．合成葉緑体輸送ペプチドを含むポリペプチドの発現
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドまたはその
機能的同等物をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１種の核酸分子が、そこで
のポリペプチドの発現のために細胞、組織または生物中に導入され得る。特定の実施形態
では、核酸分子は、合成ＣＴＰをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結している
対象とするヌクレオチド配列を含み得る。例えば、核酸分子は、少なくとも１種の合成Ｃ
ＴＰと、対象とするヌクレオチド配列によってコードされる少なくとも１種のさらなるペ
プチド配列を含むポリペプチドをコードするコード配列を含み得る。いくつかの実施形態
では、本発明の核酸分子が、プラスチドを含有する宿主細胞、組織または生物（例えば、
植物細胞、植物組織および植物体）中に導入され得、その結果、ポリペプチドが、プラス
チドを含有する宿主細胞、組織または生物中の核酸分子から発現され得、発現されたポリ
ペプチドが、少なくとも１種の合成ＣＴＰおよび対象とするヌクレオチド配列によってコ
ードされる少なくとも１種のさらなるペプチド配列を含む。特定の例では、このような発
現されたポリペプチドの合成ＣＴＰは、少なくともさらなるペプチド配列を含むポリペプ
チドの一部を、宿主細胞、組織または生物のプラスチドへのターゲッティングを容易にし
得る。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、当業者に公知の方法論のいずれかのう
ち１種によってプラスチドを含有する細胞中に導入され得る。特定の実施形態では、宿主
細胞、組織または生物は、細胞、組織または生物中に核酸分子を導入するために本発明の
核酸分子と接触され得る。特定の実施形態では、細胞は、核酸分子が細胞中に導入され、
核酸分子が、細胞のゲノム中に安定に組み込まれるように、本発明の核酸分子を用いて形
質転換され得る。いくつかの実施形態では、対象とするヌクレオチド配列と作動可能に連
結している合成ＣＴＰをコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列を含む核酸分子が
、細胞、例えば、プラスチドを含有する細胞（例えば、植物細胞）の形質転換のために使
用され得る。発現を開始または増強するために、核酸分子は、１種または複数の調節配列
を含んでもよく、この調節配列は、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。
【００８２】
核酸分子は、例えば、例えば、直鎖または閉じた環状プラスミドを含めたベクター系で
あり得る。特定の実施形態では、ベクターは、発現ベクターであり得る。本発明の核酸配
列は、例えば、核酸配列が、１種または複数の調節配列と作動可能に連結されるようベク
ター中に挿入され得る。多数のベクターが、この目的のために利用可能であり、特定のベ
クターの選択は、例えば、ベクター中に挿入される核酸の大きさおよびベクターを用いて
形質転換される個々の宿主細胞に応じて変わり得る。ベクターは、通常、種々の成分を含
有し、その同一性は、ベクターの機能（例えば、ＤＮＡの増幅およびＤＮＡの発現）およ
びベクターが適合する個々の宿主細胞（複数可）に応じて変わる。
【００８３】
いくつかの実施形態は、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードする
１種または複数のヌクレオチド配列と作動可能に連結している上記の調節配列のうち少な
くとも１種を含むヌクレオチド配列を含む植物形質転換ベクターを含み得る。１種または
複数のヌクレオチド配列は、ポリペプチドの少なくとも一部を、植物細胞、組織または生
物のプラスチドにターゲッティングする合成ＣＴＰを含むポリペプチドを製造するよう、
植物細胞、組織または生物において調節配列（複数可）の制御下で発現され得る。
【００８４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列と作動可能に連結している調節配列は、核酸分子が増幅される細菌細
胞または核酸分子が発現される植物細胞などの宿主細胞において機能するプロモーター配
列であり得る。本発明の核酸分子における使用に適したプロモーターとして、誘導可能、
ウイルス性、合成または構成性であるものが挙げられ、そのすべてが、当技術分野で周知
である。本発明の実施形態において有用であり得るプロモーターの限定されない例は、米
国特許第６，４３７，２１７号（トウモロコシＲＳ８１プロモーター）；同５，６４１，
８７６号（コメアクチンプロモーター）；同６，４２６，４４６号（トウモロコシＲＳ３
２４プロモーター）；同６，４２９，３６２号（トウモロコシＰＲ−１プロモーター）；
同６，２３２，５２６号（トウモロコシＡ３プロモーター）；同６，１７７，６１１号（
構成的トウモロコシプロモーター）；同５，３２２，９３８号、同５，３５２，６０５号
、同５，３５９，１４２号および同５，５３０，１９６号（３５Ｓプロモーター）；同６
，４３３，２５２号（トウモロコシＬ３オレオシンプロモーター）；同６，４２９，３５
７号（コメアクチン２プロモーターおよびコメアクチン２イントロン）；同６，２９４，
７１４号（光誘導性プロモーター）；同６，１４０，０７８号（塩誘導性プロモーター）
；同６，２５２，１３８号（病原体誘導性プロモーター）；同６，１７５，０６０号（亜
リン酸欠乏誘導性プロモーター）；同６，３８８，１７０号（双方向性プロモーター）；
同６，６３５，８０６号（γ−コイキシン（coixin）プロモーター）；および米国特許出
願番号第０９／７５７，０８９号（トウモロコシ葉緑体アルドラーゼプロモーター）によ
って提供される。
【００８５】
さらなる例示的プロモーターとして、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター（Eb
ert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9）;オクトピンシンター
ゼ（ＯＣＳ）プロモーター（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tu
mefaciens）の腫瘍誘導性プラスミドで実施される）；カリフラワーモザイクウイルス（
ＣａＭＶ）１９Ｓプロモーターなどのカリモウイルスプロモーター（Lawton et al. (198
7) Plant Mol. Biol. 9:315-24）;ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（Odell et al. (1985)
Nature 313:810-2;ゴマノハグサ（figwort）モザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Wal
ker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8）;スクロースシンター
ゼプロモーター（Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8）;
Ｒ遺伝子複合体プロモーター（Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83）;クロロ
フィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーター；ＣａＭＶ３５Ｓ（米国特許第５，３２
２，９３８号、同５，３５２，６０５号、同５，３５９，１４２号および同５，５３０，
１９６号）；ＦＭＶ３５Ｓ（米国特許第６，０５１，７５３号および同５，３７８，６１
９号）；ＰＣ１ＳＶプロモーター（米国特許第５，８５０，０１９号）；ＳＣＰ１プロモ
ーター（米国特許第６，６７７，５０３号）；およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓプロモーター（
GenBank受託番号V00087;Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73;Bevan
et al. (1983) Nature 304:184-7）が挙げられる。
【００８６】
特定の実施形態では、本発明の核酸分子は、組織特異的プロモーターを含み得る。組織
特異的プロモーターは、生物のその他の組織と比較して、プロモーターが特異的である組
織において、作動可能に連結しているヌクレオチド配列のより高レベルの転写を指示する
ヌクレオチド配列である。組織特異的プロモーターの例として、限定するものではないが
、タペータム特異的プロモーター；別の特異的プロモーター；花粉特異的プロモーター（
例えば、米国特許第７，１４１，４２４号および国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９９／０４２５
８７を参照のこと）；胚珠特異的プロモーター；（例えば、米国特許出願第２００１／０
４７５２５号  Ａ１を参照のこと）；果実特異的プロモーター（例えば、米国特許第４，
９４３，６７４号および同５，７５３，４７５号参照のこと）；および種子特異的プロモ
ーター（例えば、米国特許第５，４２０，０３４号および同５，６０８，１５２号参照の
こと）が挙げられる。いくつかの実施形態では、発達段階特異的プロモーター（例えば、
発達の後期段階で活性なプロモーター）が、本発明の組成物または方法において使用され
得る。
【００８７】
いくつかの実施形態において、核酸分子と作動可能に連結され得るさらなる調節配列と
して、翻訳リーダー配列として機能するプロモーター配列とコード配列の間に位置する５
’ＵＴＲが挙げられる。翻訳リーダー配列は、完全にプロセシングされたｍＲＮＡ中に存
在し、一次転写物のプロセシングおよび／またはＲＮＡ安定性に影響を及ぼし得る。翻訳
リーダー配列の例として、トウモロコシおよびペチュニア熱ショックタンパク質リーダー
（米国特許第５，３６２，８６５号）、植物ウイルスコートタンパク質リーダー、植物リ
ブロース二リン酸カルボキシラーゼリーダーおよびその他のものが挙げられる。例えば、
Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36を参照のこと。５’ＵＴＲ
の限定されない例は、ＧｍＨｓｐ（米国特許第５，６５９，１２２号）；ＰｈＤｎａＫ（
米国特許第５，３６２，８６５号）；ＡｔＡｎｔ１；ＴＥＶ（Carrington and Freed (19
90) J. Virol. 64:1590-7）;およびＡＧＲ腫瘍（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｖ０００８７；
およびBevan et al. (1983) Nature 304:184-7）によって提供されている。
【００８８】
いくつかの実施形態において、核酸分子と作動可能に連結され得るさらなる調節配列は
また、３’非翻訳配列、３’転写終結領域またはポリアデニル化領域も含む。これらは、
ヌクレオチド配列の下流に位置する遺伝子エレメントであり、ポリアデニル化シグナルお
よび／または転写もしくはｍＲＮＡプロセシングに影響を及ぼすことができるその他の調
節シグナルを提供するポリヌクレオチドを含む。ポリアデニル化シグナルは、植物におい
て、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル化（polyadenylate）ヌクレオチドの付
加を引き起こすよう機能する。ポリアデニル化配列は、様々な植物遺伝子から、またはＴ
−ＤＮＡ遺伝子から導かれ得る。３’転写終結領域の限定されない例として、ノパリンシ
ンターゼ３’領域（ｎｏｓ３’；Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80
:4803-7）がある。異なる３’非翻訳領域の使用の例が、Ingelbrecht et al., (1989) Pl
ant Cell 1:671-80に提供されている。ポリアデニル化シグナルの限定されない例として
、エンドウ（Pisum sativum）ＲｂｃＳ２遺伝子に由来するもの（Ps.RbcS2-E9; Coruzzi 
et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9）およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号
Ｅ０１３１２）が挙げられる。
【００８９】
本発明の組換え核酸分子またはベクターは、植物細胞などの形質転換された細胞に選択
可能な表現型を付与する選択マーカーを含み得る。選択マーカーはまた、本発明の組換え
核酸分子を含む植物または植物細胞を選択するために使用され得る。マーカーは、殺生物
剤抵抗性、抗生物質抵抗性（例えば、カナマイシン、ジェネテシン（Ｇ４１８）、ブレオ
マイシン、ハイグロマイシンなど）または除草剤抵抗性（例えば、グリホサートなど）を
コードし得る。選択マーカーの例として、それだけには限らないが、カナマイシン抵抗性
をコードし、カナマイシン、Ｇ４１８などを使用して選択され得るｎｅｏ遺伝子；ビアラ
ホス抵抗性をコードするｂａｒ遺伝子；グリホサート抵抗性をコードする変異株ＥＰＳＰ
シンターゼ遺伝子；ブロモキシニルに対する抵抗性を付与するニトリラーゼ遺伝子；イミ
ダゾリノン（imidazolinone）またはスルホニル尿素抵抗性を付与する変異株アセト乳酸
シンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）；メトトレキサート抵抗性ＤＨＦＲ遺伝子が挙げられる。ア
ンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシ
ン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノトリシン、ピューロ
マイシン、スペクチノマイシン、リファンピシン、ストレプトマイシンおよびテトラサイ
クリンなどに対する抵抗性を付与する複数の選択マーカーが利用可能である。このような
選択マーカーの例は、例えば、米国特許第５，５５０，３１８号；同５，６３３，４３５
号；同５，７８０，７０８号および同６，１１８，０４７号に例示されている。
【００９０】
本発明の組換え核酸分子またはベクターはまた、またはあるいは、スクリーニング可能
なマーカーを含み得る。スクリーニング可能なマーカーは、発現をモニタリングするため
に使用され得る。例示的なスクリーニング可能なマーカーとして、β−グルクロニダーゼ
または種々の発色基質が公知である酵素をコードするｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）（Jeffer
son et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405）；植物組織におけるアントシア
ニン色素（赤色）の産生を調節する産物をコードするＲ遺伝子座遺伝子（Dellaporta et 
al. (1988)「Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging wit
h Ac.」In 18th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson and R. Appels, eds. (New
York: Plenum), pp. 263-82)；β−ラクタマーゼ遺伝子（Sutcliffe et al. (1978) Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41)；種々の発色基質が公知である酵素をコードする
遺伝子（例えば、ＰＡＤＡＣ、発色性セファロスポリン）；ルシフェラーゼ遺伝子（Ow e
t al. (1986) Science 234:856-9)；発色性カテコールを変換できるカテコールジオキシ
ゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子（Zukowski et al. (1983) Gene 46(2-3):247-55)
；アミラーゼ遺伝子（Ikatu et al. (1990) Bio/Technol. 8:241-2)；チロシンをＤＯＰ
Ａおよびドーパキノンに酸化でき、それが、順に、メラニンに縮合する酵素をコードする
チロシナーゼ遺伝子（Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14）;およびα
−ガラクトシダーゼが挙げられる。
【００９１】
宿主細胞の形質転換に適した方法として、例えば、限定するものではないが、プロトプ
ラストの形質転換によって（例えば、米国特許第５，５０８，１８４号を参照のこと）；
乾燥／阻害媒介性ＤＮＡ取り込みによって（例えば、Potrykus et al. (1985) Mol. Gen.
Genet. 199:183-8を参照のこと）；エレクトロポレーションによって（例えば、米国特
許第５，３８４，２５３号を参照のこと）；シリコンカーバイドファイバーを用いる撹拌
によって（例えば、米国特許第５，３０２，５２３号および同５，４６４，７６５号を参
照のこと）；アグロバクテリウム媒介性形質転換によって（例えば、米国特許第５，５６
３，０５５号、同５，５９１，６１６号、同５，６９３，５１２号、同５，８２４，８７
７号、同５，９８１，８４０号および同６，３８４，３０１号を参照のこと）；およびＤ
ＮＡがコーティングされた粒子の加速によって（例えば、米国特許第５，０１５，５８０
号、同５，５５０，３１８号、同５，５３８，８８０号、同６，１６０，２０８号、同６
，３９９，８６１号および同６，４０３，８６５号を参照のこと）など、ＤＮＡが細胞中
に導入され得る任意の方法が挙げられる。これらなどの技術の適用によって、実質的にい
かなる種の細胞も、安定に形質転換され得る。いくつかの実施形態では、形質転換ＤＮＡ
は、宿主細胞のゲノム中に組み込まれる。多細胞性種の場合には、トランスジェニック細
胞は、トランスジェニック生物に再生され得る。例えば、トランスジェニック植物のゲノ
ム中に本発明の１種または複数の核酸配列を含むトランスジェニック植物を生成するため
に、これらの技術のいずれも使用され得る。
【００９２】
発現ベクターを植物中に導入するために最も広く利用されている方法は、アグロバクテ
リウムの天然形質転換システムに基づいている。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens
）およびA.リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞を遺伝的に形質転換する植物病原
性土壌細菌である。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびA.リゾゲネス（A. r
hizogenes）のＴｉおよびＲｉプラスミドは、それぞれ、植物の遺伝子形質転換に関与す
る遺伝子を保持する。Ｔｉ（腫瘍誘導性）プラスミドは、形質転換された植物に転移され
るＴ−ＤＮＡとして知られる大きなセグメントを含有する。Ｔｉプラスミドの別のセグメ
ント、ｖｉｒ領域が、Ｔ−ＤＮＡ転移に関与している。Ｔ−ＤＮＡ領域は、末端反復に隣
接している。一部の修飾されたバイナリーベクターでは、腫瘍誘導性遺伝子が欠失されて
おり、Ｔ−ＤＮＡ境界配列に隣接している外来ＤＮＡを転移させるために、ｖｉｒ領域の
機能が利用される。Ｔ−領域はまた、例えば、トランスジェニック植物および細胞の効率
的な回収のための選択マーカーならびに合成ＣＴＰをコードする核酸などの転移のための
配列を挿入するための多重クローニング部位を含有し得る。
【００９３】
したがって、いくつかの実施形態では、植物形質転換ベクターは、Ａ．ツメファシエン
ス（A. tumefaciens）のＴｉプラスミド（例えば、米国特許第４，５３６，４７５号、同
４，６９３，９７７号、同４，８８６，９３７号および同５，５０１，９６７号；および
欧州特許ＥＰ０１２２７９１を参照のこと）またはＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）の
Ｒｉプラスミドから導くことができる。さらなる植物形質転換ベクターとして、例えば、
限定するものではないが、Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-13;Bevan e
t al. (1983) Nature 304:184-7;Klee et al. (1985) Bio/Technol. 3:637-42;によって
、および欧州特許ＥＰ０１２０５１６において記載されたものおよび前記のいずれかから
誘導されたものが挙げられる。植物と天然に相互作用する、シノリゾビウム（Sinorhizob
ium）、根粒菌（Rhizobium）およびメソリゾビウム（Mesorhizobium）などのその他の細
菌が、いくつかの多様な植物への遺伝子導入を媒介するよう修飾され得る。これらの植物
と関連する共生細菌は、武装解除されたＴｉプラスミドおよび適したバイナリーベクター
の両方を獲得することによって遺伝子導入に適任にされ得る。
【００９４】
外因性ＤＮＡをレシピエント細胞に提供した後、一般に、さらなる培養および植物再生
のために形質転換された細胞が同定される。形質転換された細胞を同定する能力を改善す
るために、形質転換体を生成するために使用されるベクターとともに、先に示されたよう
な選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を使用することが望ましい場合
がある。選択マーカーが使用される場合には、形質転換された細胞は、細胞を、選択物質
（単数または複数）に曝露することによって、形質転換された可能性のある細胞集団内で
同定される。スクリーニング可能なマーカーが使用される場合には、細胞は、所望のマー
カー遺伝子形質についてスクリーニングされ得る。
【００９５】
選択物質に対する曝露を生き延びる細胞またはスクリーニングアッセイにおいて陽性と
スコアされた細胞が、植物の再生を支持する培地で培養され得る。いくつかの実施形態で
は、任意の適した植物組織培養培地（例えば、ＭＳおよびＮ６培地）は、成長調節物質な
どのさらなる物質を含むことによって修飾され得る。組織は、植物再生の試みを開始する
のに、または手作業での選択の反復ラウンド後に十分な組織が利用可能になるまで、組織
の形態が再生に適するまで（例えば、少なくとも２週間）、成長調節物質を含む基本培地
で維持され、次いで、シュート形成につながる培地に移され得る。培養物は、十分なシュ
ート形成が起こるまで周期的に移される。シュートが形成されると、それらは、根形成に
つながる培地に移される。十分な根が形成されると、植物は、さらなる成長および成熟度
のために土壌に移され得る。
【００９６】
再生植物における対象とする核酸分子（例えば、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列）の存在を確認するために、様々なアッセイが
実施され得る。このようなアッセイとして、例えば、サザンおよびノーザンブロッティン
グ、ＰＣＲおよび核酸配列決定などの分子生物学的アッセイ；例えば、免疫学的手段によ
って（ＥＬＩＳＡおよび／またはウエスタンブロット）、または酵素機能によってタンパ
ク質産物の存在を検出することなどの生化学的アッセイ；葉または根のアッセイなどの植
物部分アッセイ；および再生した植物体全体の表現型の解析が挙げられる。
【００９７】
例として、組み込み事象は、例えば、対象とするヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌ
クレオチドプライマーを使用するＰＣＲ増幅によって解析され得る。ＰＣＲ遺伝子型判定
は、ゲノムに組み込まれた、対象とする核酸分子を含有すると予測される単離された宿主
植物組織に由来するゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅と、それに続く
ＰＣＲ増幅産物の標準的なクローニングおよび配列解析を含むが、それに限定されないと
理解される。ＰＣＲ遺伝子型判定の方法は、十分に記載されており（例えば、Rios, G. e
t al. (2002) Plant J. 32:243-53を参照のこと）、任意の植物種（例えば、トウモロコ
シ（Z. mays）またはダイズ（G. max））または細胞培養物を含めた組織種に由来するゲ
ノムＤＮＡに適用され得る。
【００９８】
アグロバクテリウム依存性形質転換法を使用して形成されたトランスジェニック植物は
、通常、１つの染色体に挿入された単一の組換えＤＮＡ配列を含有する。単一組換えＤＮ
Ａ配列は、「トランスジェニック事象」または「組み込み事象」と呼ばれる。このような
トランスジェニック植物は、挿入されたＤＮＡ配列についてヘテロ接合性である。いくつ
かの実施形態では、導入遺伝子に関してホモ接合性のトランスジェニック植物体は、単一
の外因性遺伝子配列を含有する独立した分離個体のトランスジェニック植物を、自身と性
的に交配すること（自家受粉）によって得られ得る、例えば、Ｆ１種子を製造するための
Ｆ０植物。製造されたＦ１種子の４分の１が、導入遺伝子に関してホモ接合体となる。Ｆ
１種子を発芽させることが、通常、ＳＮＰアッセイまたはヘテロ接合性とホモ接合性間の
区別を可能にする熱増幅アッセイ（すなわち、接合状態アッセイ）を使用してヘテロ接合
性について試験され得る植物をもたらす。
【００９９】
特定の実施形態では、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含む少なくとも１種のポリペプチ
ドのコピーが、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含む少なくとも１種のポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列を含む少なくとも１種の核酸分子が導入されているプラスチドを
含有する細胞において製造される。少なくとも１種の合成ＣＴＰを含む各ポリペプチドは
、異なる形質転換事象において導入された複数の核酸配列から、または単一の形質転換事
象において導入された単一の核酸配列から発現され得る。いくつかの実施形態では、複数
のこのようなポリペプチドが、単一プロモーターの制御下で発現される。その他の実施形
態では、複数のこのようなポリペプチドが、複数のプロモーターの制御下で発現される。
複数のペプチド配列を含み、ペプチド配列の各々が、プラスチドにターゲッティングされ
るべき、単一のポリペプチドが、発現され得る。
【０１００】
組換え核酸分子を用いる植物の直接形質転換に加えて、少なくとも１つのトランスジェ
ニック事象を有する第１の植物を、このような事象を欠く第２の植物と交雑させることに
よってトランスジェニック植物が調製され得る。例えば、少なくとも１種の合成ＣＴＰを
含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を、形質転換を受
け入れる第１の植物株に導入して、トランスジェニック植物を製造してもよく、このトラ
ンスジェニック植物を、第２の植物と交雑させて、ポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列を第２の植物株中に遺伝子移入してもよい。
【０１０１】
ＶＩ．合成葉緑体輸送ペプチドによって指示されるポリペプチドを含む植物材料
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列を含む植物細胞を含む植物が、提供される。特定の実施形態では、こ
のような植物は、植物組織または植物細胞の形質転換および全植物体の再生によって製造
され得る。さらなる実施形態では、このような植物は、市販の供給源から、または少なく
とも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸の生
殖質への遺伝子移入によって得られ得る。少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列を含む植物細胞を含む植物材料も提供される。このよう
な植物材料は、植物細胞を含む植物から得られ得る。
【０１０２】
少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む
トランスジェニック植物または植物材料は、いくつかの実施形態では、以下の特徴：植物
の細胞におけるポリペプチドの発現；植物の細胞のプラスチドにおけるポリペプチドの一
部の発現；植物の細胞のサイトゾルから細胞のプラスチドへのポリペプチドの輸送；植物
の細胞におけるポリペプチドのプラスチド特異的発現；および／または植物の細胞におけ
るポリペプチドの局在性のうち１種または複数を示し得る。このような植物は、コードさ
れるポリペプチドの発現以外の１種または複数の望ましい形質をさらに有し得る。このよ
うな形質は、例えば：昆虫、その他の有害生物および疾患を引き起こす物質に対する抵抗
性；除草剤に対する耐性；増強された安定性、収率または有効期間；環境耐性；薬剤製造
；工業製品製造；および栄養強化を含み得る。
【０１０３】
本発明のトランスジェニック植物は、本発明の核酸分子を用いて形質転換され得る任意
の植物であり得る。したがって、植物は、双子葉植物または単子葉植物であり得る。本方
法において使用可能な双子葉類植物の限定されない例として、アラビドプシス属（Arabid
opsis）、アルファルファ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、
セロリ、ハクサイ、ワタ、キュウリ、ナス、レタス、メロン、エンドウマメ、コショウ、
ピーナッツ、ジャガイモ、カボチャ（pumpkin）、ラディッシュ、ナタネ、ホウレンソウ
、ダイズ、カボチャ（squash）、サトウダイコン、ヒマワリ、タバコ、トマトおよびスイ
カが挙げられる。本方法において使用可能な単子葉類植物の限定されない例として、トウ
モロコシ、アブラナ属、タマネギ、コメ、ソルガム、コムギ、ライムギ、アワ、サトウキ
ビ、カラスムギ、ライコムギ、スイッチグラスおよびシバクサが挙げられる。本発明のト
ランスジェニック植物は、任意の方法で使用または栽培され得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態はまた、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコード
する１種または複数のヌクレオチド配列を含有する商品生産物、例えば、１種または複数
のこのようなヌクレオチド配列を含有する組換え植物または種子から製造される商品生産
物を提供する。少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードする１種または
複数のヌクレオチド配列を含有する商品生産物として、例えば、限定するものではないが
、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードする１種または複数のヌクレ
オチド配列を含む、食品、食事、油または破砕された穀類もしくは全粒または植物の種子
が挙げられる。１種または複数の商品または商品生産物における少なくとも１種の合成Ｃ
ＴＰを含むポリペプチドをコードする１種または複数のヌクレオチド配列の検出は、商品
または商品生産物が、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードする１種
または複数のヌクレオチド配列を含む植物から、少なくとも幾分かは製造されたという事
実上の証拠である。特定の実施形態では、本発明の商品生産物は、少なくとも１種の合成
ＣＴＰを含むポリペプチドをコードする核酸配列の検出可能な量を含む。いくつかの実施
形態では、このような商品生産物は、例えば、トランスジェニック植物を得ることおよび
それから食物または餌を調製することによって製造され得る。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むトランスジェニック植物または種子はまた、
限定するものではないが、ｉＲＮＡ分子；殺虫性タンパク質（例えば、バチルス・チュー
リンゲンシス（Bacilus thuringiensis）殺虫性タンパク質）をコードする遺伝子；除草
剤耐性遺伝子（例えば、グリホサートに対する耐性を提供する遺伝子）；およびトランス
ジェニック植物において望ましい表現型（例えば、増大した収量、変更された脂肪酸代謝
または細胞質雄性不稔の回復）に貢献する遺伝子が転写されるトランスジェニック事象を
含めた、少なくとも１種のその他のトランスジェニック事象を、そのゲノム中に含み得る
。
【０１０６】
ＶＩＩ．プラスチドへの、遺伝子産物の合成葉緑体輸送ペプチド媒介性局在
本発明のいくつかの実施形態は、プラスチド（例えば、葉緑体）への遺伝子産物の発現
および／または局在のための方法を提供する。特定の実施形態では、遺伝子産物は、マー
カー遺伝子産物、例えば、蛍光分子であり得る。合成ＣＴＰを含むポリペプチドの一部と
しての遺伝子産物の発現は、特定の合成ＣＴＰ配列のプラスチド局在能を評価するための
システムを提供し得る。いくつかの実施形態では、合成ＣＴＰを含有するポリペプチドの
一部としてのマーカー遺伝子産物の発現は、マーカー遺伝子産物の発現を、ポリペプチド
が発現される細胞のプラスチドにターゲッティングするために使用される。特定の実施形
態では、このようなマーカー遺伝子産物は、宿主細胞のプラスチド（複数可）に局在して
いる。例えば、マーカー遺伝子産物は、プラスチド（複数可）において、宿主細胞のサイ
トゾルまたはその他のオルガネラよりも高レベルで発現され得るか；マーカー遺伝子産物
は、本質的にプラスチド（複数可）のみにおいて発現され得るか；またはマーカー遺伝子
産物は、サイトゾルまたは非プラスチドオルガネラにおける発現が検出され得ないよう、
プラスチド（複数可）において完全に発現され得る。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、マーカー遺伝子産物と作動可能に連結している、合成ＣＴＰ
の機能的変異体を含むポリペプチドは、機能的変異体ペプチドの特徴を評価するために使
用される。例えば、合成ＣＴＰの配列は、例えば、少なくとも１つの保存的突然変異（複
数可）を合成ＣＴＰ中に導入することによって変更され得、得られた変異体ペプチドは、
マーカー遺伝子産物に連結され得る。適した宿主細胞（例えば、発現構築物中の１つまた
は複数の調節エレメントが作動可能である細胞）における発現後、マーカー遺伝子産物の
発現が決定され得る。参照合成ＣＴＰ−マーカー構築物と変異体ペプチド−マーカー構築
物間のマーカー遺伝子産物の細胞内局在性を比較することによって、変異体ペプチドが、
例えば、より大きなプラスチド局在性を提供するか、または実質的に同一のプラスチド局
在性を提供するかどうかが決定され得る。このような変異体は、機能的変異体と考えられ
得る。より大きなプラスチド（plastic）局在性を提供する合成ＣＴＰの機能的変異体を
同定することによって、このような変異体における突然変異が、合成ＣＴＰのさらなる変
異体に組み込まれ得る。この評価プロセスの複数ラウンドを実施すること、続いて、同定
された好都合な突然変異を合成ＣＴＰ配列に組み込むことは、合成ＣＴＰ配列の最適化の
ための反復プロセスをもたらし得る。このような最適化された合成ＣＴＰ配列およびそれ
をコードするヌクレオチド配列は、このような最適化された合成ＣＴＰ配列が、さらなる
突然変異によってさらに最適化され得るか否かにかかわらず、本発明の一部と考えられる
。
【０１０８】
本明細書で引用された刊行物、特許および特許出願を含む全ての参考文献は、本開示の
明示的な詳細と矛盾しない程度に参照により本明細書に組み込まれ、このようにして、そ
れぞれの文献が、参照により組み込まれているものと個別にかつ具体的に指示されている
かのように、および全体として本明細書に記載されているかのように同程度に組み込まれ
ている。本明細書で議論される参考文献は、単に、本願の出願日に先立つその開示のため
に提供される。本明細書において、先行発明のために、本発明者らがこのような開示に先
行する権利がないという承認と解釈されるべきものはない。
【０１０９】
以下の実施例は、特定の個々の特徴および／または態様を例示するために提供される。
これらの実施例は、本開示を、記載される個々の特徴または態様に制限すると解釈されて
はならない。
（実施例）
【実施例１】
【０１１０】
合成葉緑体輸送ペプチド（ＴｒａＰ）配列の設計および生成
プラスチドは、高等植物種に見出される細胞小器官であり、すべての植物組織中に存在
する。葉緑体は、本質的な生理機能に関与している緑色の光合成組織に見られる特定のタ
イプのプラスチドである。例えば、このような１つの主要な生理機能は、植物に必要とさ
れる芳香族アミノ酸の合成である。核コードされた酵素は、この生合成経路に必要とされ
、細胞質から葉緑体の内部に輸送される。これらの核コードされた酵素は、通常、葉緑体
のストロマへのペプチド輸送を促進するために、葉緑体の膜と相互作用するＮ末端輸送ペ
プチドを有する。Bruce B. (2000) Chloroplast transit peptides: structure, functio
n, and evolution. Trends Cell Bio. 10: 440-447。取り込み時に、間質ペプチダーゼは
輸送ペプチドを切断し、葉緑体に取り込まれた成熟機能性タンパク質を残す。Richter S,
Lamppa GK. (1999) Stromal processing peptidase binds transit peptides and initi
ates their ATP-dependent turnover in chloroplasts. Journ. Cell Bio. 147: 33-43。
葉緑体輸送ペプチドは、長さ、組成および機構において高度に分岐している可変配列であ
る。Bruce B. (2000) Chloroplast transit peptides: structure, function, and evolu
tion. Trends Cell Bio. 10: 440-447。葉緑体輸送ペプチドの配列類似性は、異なる植物
種由来の相同タンパク質間で有意に分岐する。異なる植物種から得られた相同タンパク質
は、プロセシングされた成熟機能性タンパク質を比較する場合、典型的に、比較的高レベ
ルの配列類似性を共有することを考慮すると、葉緑体輸送ペプチド間の分岐量は予期され
ない。
【０１１１】
新規な合成葉緑体輸送ペプチド配列を設計し、生成し、ｉｎ  ｐｌａｎｔａにおいて試
験した。新規な合成葉緑体輸送ペプチドは、葉緑体内への農学的に重要なタンパク質の取
り込みのための効果的な移行およびプロセシング特性を有することが示された。最初に、
異なる植物種由来の天然の５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰ
ＳＰＳ）タンパク質配列は、http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/にて利用可能な
ＣｈｌｏｒｏＰ（商標）コンピュータプログラムを介して分析され、推定上の葉緑体輸送
ペプチド配列を同定した（Emanuelsson O, Nielsen H, von Heijne G, (1999) ChloroP, 
a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and th
eir cleavage sites, Protein Science 8; 978-984）。葉緑体輸送ペプチド配列アライン
メントを利用して、新規な合成葉緑体輸送ペプチドは、新規合成の推定葉緑体輸送ペプチ
ド配列を製造するためにアミノ酸を無作為に選択することによって設計された。新たに設
計された合成葉緑体輸送ペプチドの典型的な配列はＴｒａＰ２３（配列番号１１）である
。新規な合成葉緑体輸送ペプチドは、農学的に重要な導入遺伝子配列に融合させた遺伝子
発現エレメントを含む安定な形質転換事象として、一過性のｉｎ  ｐｌａｎｔａ発現系を
含んだ複数のアッセイを介して、および遺伝子導入で試験された。
【実施例２】
【０１１２】
合成葉緑体輸送ペプチド（ＴｒａＰ）配列の一過性ｉｎ  ｐｌａｎｔａ試験
タバコ一過性アッセイ：
最初に、一過性ｉｎ  ｐｌａｎｔａアッセイを介して、ＴｒａＰ２３の合成葉緑体輸送
ペプチド配列を試験した。ＴｒａＰ  ｖ２（配列番号１２）の合成葉緑体輸送ペプチド配
列をコードするポリヌクレオチド配列を合成した。得られた構築物は２つの植物転写単位
（ＰＴＵ）を含有した。第１のＰＴＵは、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ユビ
キチン１０プロモーター（ＡｔＵｂｉ１０プロモーター；Callis, et al, (1990) J. Bio
l. Chem., 265: 12486-12493）、ＴｒａＰ−緑色蛍光タンパク質融合遺伝子（ＴｒａＰ−
ＧＦＰ；米国特許第７，６７８，８９３号）、およびアグロバクテリウム・ツメファシエ
ンス（Agrobacterium tumefaciens）ＯＲＦ２３  ３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ２３  
３’ＵＴＲ；米国特許第５，４２８，１４７号）で構成された。第２のＰＴＵは、キャッ
サバ葉脈モザイクウイルスプロモーター（ＣｓＶＭＶプロモーター；Verdaguer et al, (
1996) Plant Molecular Biology, 31 : 1129-1139）、ｄｓｍ−２（ＤＳＭ２；米国特許
出願第２０１１／０１０７４５５号）、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（
Agrobacterium tumefaciens）ＯＲＦ１  ３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ
；Huang et al, (1990) J. Bacteriol, 172: 1814-1822）で構成された。構築物ｐＤＡＢ
１０７６４０は、ＴｒａＰ２３  ｖ２の合成葉緑体輸送ペプチドを含有する（図３）。構
築物を制限酵素消化および配列決定を介して確認した。最後に、構築物をアグロバクテリ
ウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に形質転換し、グリセロールス
トックとして保存した。
【０１１３】
アグロバクテリウムグリセロールストックから、凍結培養物で満ちたループを１４ｍｌ
の滅菌チューブ中のＹＰＤ（１００μｇ／ｍｌスペクチノマイシン）の２ｍｌに接種した
。接種した培地を２００ｒｐｍで振とうしながら、２８℃にて一晩インキュベートした。
翌日、約１００μｌの培養物を用いて、１２５ｍｌの滅菌したトリバッフル付きフラスコ
中に２５ｍｌのＹＰＤ（１００μｇ／ｍｌスペクチノマイシン）を接種し、２００ｒｐｍ
で振とうしながら一晩２８℃にて一晩インキュベートした。翌日、滅菌ｄｄＨ２Ｏ（ｐＨ
８．０）中でＯＤ６００が０．５になるまで培養物を希釈した。希釈されたアグロバクテ
リウム株は、１：１の比率でＰ１９ヘルパータンパク質を含有する第２のアグロバクテリ
ウム株と混合した。培養物は、Voinnet O, Rivas S, Mestre P, and Baulcombe D., (200
3) An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gen
e silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus, The Plant Journal, 3
3: 949-956の方法を介して、タバコ葉浸潤に使用された。浸潤されたタバコ植物は、アッ
セイするまで、少なくとも３日間、２４℃にて１６時間の光に設定されたＣｏｎｖｉｒｏ
ｎ（商標）に置かれた。
【０１１４】
顕微鏡の結果：
アグロバクテリウム浸潤したタバコの葉を植物から切断し、脱水を防ぐために水ととも
にペトリ皿に入れた。浸潤したタバコの葉は、ＧＦＰレポータータンパク質を首尾よく発
現している葉の損傷がない領域を同定するために、Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ  Ｈａｎｄ  
Ｌａｍｐ（商標）（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏ．；Ｄｏｌ
ｏｒｅｓ、ＣＯ）を用いて、適所に保持されたロングパスフィルターガラスを用いた青色
光励起下で観察された。具体的に同定された葉の領域は葉から切断され、共焦点顕微鏡（
Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ５  ＡＯＢＳ（商標）；Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）
による画像化のために水中でマウントされた。ＧＦＰレポータータンパク質は、マルチラ
インアルゴンイオンレーザーを用いて、５１４ｎｍのレーザー線で励起した。検出スリッ
トの幅は、バックグラウンドの葉の自己蛍光を排除するために、非発現（暗）対照の葉試
料を用いて調整された。クロロフィルの自己蛍光は、葉緑体の局在を決定するための蛍光
レポータータンパク質シグナルとの直接比較のために第２のチャネルに同時に回収された
。
【０１１５】
顕微鏡撮像の結果は、ＴｒａＰ２３葉緑体輸送ペプチドを含むＧＦＰ蛍光タンパク質が
、タバコ細胞の細胞質に位置する葉緑体に検出可能な量のＧＦＰタンパク質を蓄積しない
ことを示した（図４）。
【０１１６】
ウエスタンブロットの結果：
浸潤したタバコ植物の試料をウエスタンブロッティングを介してアッセイした。リーフ
パンチを収集し、ビーズミルに供した。約１００〜２００ｍｇの葉材料は、Ｋｌｅｃｏ（
商標）ビーズミル中で３分間、２ＢＢ（鋼球；Ｄａｉｓｙ；Ｒｏｇｅｒｓ、ＡＲ）および
５００ｍｌのＰＢＳＴと混合された。次に、試料を１４，０００×ｇ、４℃にて遠心機で
スピンダウンした。上清を除去し、ウエスタンブロットまたは免疫沈降のいずれかを介し
て直接分析した。製造業者のプロトコールに従って、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＩＰ
キット（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用
いて免疫沈降を行った。およそ５０μｇの抗ＧＦＰを樹脂に結合させた。試料を樹脂とと
もに一晩、４℃にてインキュベートした。次に、試料を洗浄し、翌朝溶出した。等量の２
×８Ｍ尿素試料緩衝液を合わせ、その後、試料を５分間煮沸することによって分析用に準
備した。ＭＯＰＳ緩衝液中の４〜１２％ＳＤＳ−Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓゲル上で煮沸試料を４
０分間泳動した。次に、製造業者のプロトコールに従って、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｉＢ
ｌｏｔ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用
いてゲルをブロットした。ブロットしたメンブレンをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液中の５％脱
脂粉乳を用いて１０分間ブロックした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液中の５％脱脂粉乳で１：
１０００希釈で使用した一次抗体（ウサギのモノクローナル抗ＧＦＰ）を用いてメンブレ
ンを１時間探査した。次に、すべての未結合の一次抗体を除くために、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅ
ｎを用いて５分間３回、メンブレンを濯いだ。１：１０００希釈で使用したヤギの二次モ
ノクローナル抗ウサギ抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてメンブレン
を６０分間探査した。メンブレンを上記に記載の通りに洗浄し、Ｔｈｅｍｏ  ＢＣＩＰ／
ＮＢＴ基質を添加することによって発色させた。比色基質は、５〜１０分間発色させ、続
いて、乾燥させる前にブロットを水で濯いだ。
【０１１７】
ウエスタンブロットの結果は、ＧＦＰタンパク質が浸潤したタバコ細胞で発現したこと
を示した。ｐＤＡＢ１０７６４０で浸潤されたタバコ植物葉組織は、ＧＦＰ抗体に反応し
たタンパク質バンドの存在によって指示されるようにＧＦＰタンパク質を発現し、葉緑体
輸送ペプチドを含まないＧＦＰ対照から得られたＧＦＰタンパク質バンドと大きさが同等
であった。さらに、これらの結果は、ＴｒａＰ合成葉緑体輸送ペプチドがプロセシングさ
れ、ＧＦＰタンパク質から切断されることを示した。ＴｒａＰ２３−ＧＦＰ構築物は、対
照ＧＦＰタンパク質よりも分子量が大きい事前にプロセシングされたタンパク質バンドを
発現する。対照ＧＦＰとサイズにおいて同等であるウエスタンブロット上のバンドの存在
は、ＴｒａＰ２３の葉緑体輸送ペプチド配列がプロセシングされ、それによって、ＧＦＰ
対照と同等である分子量の大きさにＧＦＰの大きさを小さくしたことを示す。
【０１１８】
トウモロコシプロトプラスト一過性アッセイ：
ＴｒａＰ２３  ｖ２合成葉緑体輸送ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（配列
番号１２）は、緑色蛍光タンパク質遺伝子の上流にクローニングされ、トウモロコシプロ
トプラストの一過性ｉｎ  ｐｌａｎｔａアッセイを介した試験のためにｐＤＡＢ１０６５
９８構築物（図５）に組み込まれた。得られた構築物は、以下の植物転写単位（ＰＴＵ）
を含有した。第１のＰＴＵは、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター（Ｚ
ｍＵｂｉ１プロモーター；Christensen, A., Sharrock R., and Quail P., (1992) Maize
polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcri
pt splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electrop
oration, Plant Molecular Biology, 18: 675-689）、ＴｒａＰ−緑色蛍光タンパク質融
合遺伝子（ＴｒａＰ２３−ＧＦＰ；米国特許第７，６７８，８９３号）、およびトウモロ
コシ（Zea mays）ペルオキシダーゼ５  ３’非翻訳領域（ＺｍＰｅｒ５  ３’ＵＴＲ；米
国特許第６３８４２０７号）で構成された。制限酵素消化および配列決定を介して構築物
を確認した。
【０１１９】
トウモロコシ（Zea mays）変種Ｂ１０４の種子は、２〜３滴のＴｗｅｅｎ２０を含む５
０％Ｃｌｏｒｏｘ（３％次亜塩素酸ナトリウム）中で、約２０分間激しく振とうすること
によって表面を滅菌した。種子を滅菌蒸留水で十分に濯いだ。無菌種子は、Ｐｈｙｔａｔ
ｒａｙまたは類似タイプのボックス中で１／２ＭＳ培地に播種され、暗所（２８℃）にて
１２〜２０日間成長させた。トウモロコシプロトプラスト一過性アッセイを用いて、Ｂ１
０４−トウモロコシの葉からのトウモロコシプロトプラストを得てトランスフェクトした
。このトウモロコシプロトプラストアッセイは、Yoo, S.-D., Cho, Y.-H., and Sheen, J
., (2007), Arabidopsis Mesophyll Protoplasts: A Versitile Cell System for Transi
ent Gene Expression Analysis, Nature Protocols, 2: 1565-1572によって記載されてい
るシステムの変法である。溶液をYooら（2007）によって記載されるように調製したが、
以下の実験に使用したマンニトール濃度を０．６Ｍに変更したことを除く。
【０１２０】
１００〜５００μｌのプロトプラスト（１−５×１０５）のトランスフェクションは、
室温にて、約４０μｇのプラスミドＤＮＡ（ｐＤＡＢ１０６５９８）を含む２ｍｌの微量
遠心管にプロトプラストを添加することによって完了した。ＤＮＡの体積は、好ましくは
、プロトプラストの体積の約１０％に維持された。プロトプラストおよびＤＮＡは、時々
、５分間のインキュベーション期間中に混合された。等体積のＰＥＧ溶液を１回につき２
滴、プロトプラストとＤＮＡにゆっくりと添加し、ＰＥＧ溶液の液滴の添加間に混合した
。チューブは、時々穏やかに混合しながら約１０分間インキュベートした。次に、１ｍｌ
のＷ５＋溶液を添加し、チューブを数回反転させることによって混合した。チューブ（複
数可）を４℃の温度にて７５×ｇで５分間遠心分離した。最後に、上清を除去し、ペレッ
トを１ｍｌのＷＩ溶液に再懸濁し、プロトプラストを小さなペトリ皿（３５×１０ｍｍ）
または６ウェルのマルチウェルプレート中に置き、一晩、暗所にて室温でインキュベート
した。ＧＦＰの蛍光を、１２時間のインキュベーション後に顕微鏡で観察した。前述した
顕微鏡の条件を撮像のために使用した。
【０１２１】
顕微鏡撮像の結果は、ＴｒａＰ２３合成葉緑体輸送ペプチドを含むＧＦＰ蛍光タンパク
質が、トウモロコシ細胞の細胞質の葉緑体内に移行しない対照ＧＦＰ蛍光タンパク質と比
較して、トウモロコシ細胞の細胞質に位置する葉緑体に蓄積されたことを示した（図６）
。これらの顕微鏡撮像の結果は、葉緑体へのＧＦＰタンパク質の移行が、ＴｒａＰ２３の
合成葉緑体輸送ペプチドの結果であったことを示唆している。
【実施例３】
【０１２２】
アラビドプシス属（Arabidopsis）における農学的に重要な導入遺伝子の発現のための合
成葉緑体輸送ペプチド（ＴｒａＰ）配列
大腸菌（Esherichia coli）の５−エノールピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ酵
素（ＥＰＳＰシンターゼ）における１アミノ酸突然変異（Ｇ９６Ａ）は、グリホサート非
感受性をもたらすことができる（Padgette et al, (1991); Eschenburg et al., (2002);
Priestman et al, (2005); Haghani et al, (2008)）。この突然変異はグリホサートに
対する耐性を付与するが、その天然基質であるホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）によ
るＥＰＳＰシンターゼの結合に悪影響を及ぼすことも知られている。基質結合効率におい
て生じた変化は、グリホサートに対するｉｎ  ｐｌａｎｔａにおける耐性を提供するため
に、突然変異した酵素を不適当なものにし得る。
【０１２３】
ＥＰＳＰシンターゼ酵素内の、該酵素の大腸菌（E.coli）バージョンに導入したＧ９６
Ａ突然変異と類似した位置でアラニンを天然に含有するＥＰＳＰシンターゼタンパク質配
列とポリヌクレオチド配列についてインシリコにおいてＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋデータ
ベースをスクリーニングした（Padgette et al, (1991); Eschenburg et al, (2002); Pr
iestman et al, (2005); Haghani et al, (2008)）。
【０１２４】
この位置で天然のアラニンを含むことが同定された１つの酵素は、ストレプトマイセス
・スビセウス（Streptomyces sviceus）ＡＴＣＣ２９０８３由来のＤＧＴ−２８（ＧＥＮ
ＢＡＮＫ受託番号：ＺＰ＿０６９１７２４０．１）であった。さらに、インシリコのデー
タマイニングは、ＤＧＴ−２８；ＤＧＴ−３１（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＹＰ＿００４
９２２６０８．１）；ＤＧＴ−３２（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＺＰ＿０４６９６６１３
）；およびＤＧＴ−３３（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＮＣ＿０１０５７２）により高い相
同性を有する３つの他の固有のストレプトマイセス酵素を示した。これらの酵素のそれぞ
れは、ＥＰＳＰシンターゼ酵素内の、該酵素の大腸菌（E.coli）バージョンに導入された
Ｇ９６Ａ突然変異と類似した位置で天然のアラニンを含有する。
【０１２５】
異なる生物由来のＥＰＳＰシンターゼタンパク質は長さが異なるため、ＥＰＳＰシンタ
ーゼ酵素の大腸菌（E.coli）バージョンの突然変異の番号付けは、他の生物由来のＥＰＳ
Ｐシンターゼ酵素の突然変異の番号付けと必ずしも対応しない。これらの同定されたＥＰ
ＳＰシンターゼ酵素は、グリホサート耐性またはＰＥＰ基質親和性に関して従前特徴付け
られていなかった。さらに、これらのＥＰＳＰシンターゼ酵素は、ＥＰＳＰシンターゼ酵
素の新しいクラスを表し、前述のクラスＩ（米国再発行特許第３９２４７号にさらに記載
されている植物由来の配列）、ＩＩ（米国再発行特許第３９２４７号にさらに記載されて
いる細菌由来の配列）、およびＩＩＩ（国際特許出願ＷＯ２００６／１１０５８６にさら
に記載されている細菌由来の配列）のＥＰＳＰシンターゼ酵素を特徴付けるために使用さ
れているいずれもの配列モチーフを含まない。
【０１２６】
新規なＤＧＴ−２８、ＤＧＴ−３１、ＤＧＴ−３２、およびＤＧＴ−３３酵素は、クラ
スＩのＥＰＳＰシンターゼ酵素と比較することによって、グリホサート耐性およびＰＥＰ
基質親和性について特徴付けられた。以下のクラスＩの酵素；ダイズ（Glycine max）由
来のＤＧＴ−１、セイヨウアブラナ（Brassica napus）由来のＤＧＴ−３（ＧＥＮＢＡＮ
Ｋ受託番号：Ｐ１７６８８）、およびコムギ（Triticum aestivum）由来のＤＧＴ−７（
ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＥＵ９７７１８１）は比較のためのものであった。クラスＩの
ＥＰＳＰシンターゼ酵素およびその変異改変体を合成し、評価した。植物ＥＰＳＰシンタ
ーゼ酵素に導入された突然変異は、酵素の大腸菌（E.coli）バージョン由来のＧ９６Ａ突
然変異と同様の位置で、ＥＰＳＰシンターゼ酵素内でなされたグリシンからアラニンへの
突然変異からなっていた。さらに、トレオニンからイソロイシンおよびプロリンからセリ
ンの突然変異は、Funke et al., (2009)において記載されているように、大腸菌（E.coli
）のＥＰＳＰシンターゼにおけるアミノ酸９７（ＴからＩ）とアミノ酸１０１（ＰからＳ
）の突然変異と類似した位置で、これらのクラスＩのＥＰＳＰシンターゼ酵素内に導入さ
れた。
【０１２７】
ＤＧＴ−２８、ＤＧＴ−３１、ＤＧＴ−３２、およびＤＧＴ−３３：
新たに設計された、双子葉植物の最適化されたｄｇｔ−２８  ｖ５ポリヌクレオチド配
列は配列番号１４に列挙されている。新たに設計された、単子葉植物の最適化されたｄｇ
ｔ−２８  ｖ６ポリヌクレオチド配列は配列番号１５に列挙されている：この配列は、制
限酵素部位を導入するために、第２のアミノ酸位置でアラニンを含むことによって僅かに
改変された。得られたＤＮＡ配列は、高度なコドン多様性、所望の塩基組成を有し、戦略
的に配置された制限酵素認識部位を含み、遺伝子の転写または生成物ｍＲＮＡの翻訳を干
渉し得る配列を欠損している。
【０１２８】
６個のフレーム終止（コード配列の３’端に追加された全６個のリーディングフレーム
に位置した終止コドン）およびクローニングのための５’制限部位などの追加配列を含有
する配列番号１４と配列番号１５を含むＤＮＡ断片の合成は、商業的供給業者（ＤＡＮ２
．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）によって行われた。次に、合成核酸分子は、発現ベ
クターにクローニングされ、以下の実施例に記載されるように、植物または細菌に形質転
換された。
【０１２９】
同様のコドン最適化戦略を用いて、ｄｇｔ−１、ｄｇｔ−３  ｖ２（Ｇ１７３Ａ）、ｄ
ｇｔ−３  ｖ３（Ｇ１７３Ａ；Ｐ１７８Ｓ）、ｄｇｔ−３  ｖ４（Ｔ１７４Ｉ；Ｐ１７８
Ｓ）、ｄｇｔ−７  ｖ４（Ｔ１６８Ｉ；Ｐ１７２Ｓ）、ｄｇｔ−３２  ｖ３、ｄｇｔ−３
３  ｖ３、およびｄｇｔ−３１  ｖ３を設計した。これらの遺伝子のコドン最適化バージ
ョンは、それぞれ、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番
号２０、配列番号２１、配列番号２２、および配列番号２３として列挙されている。
【０１３０】
植物バイナリーベクター構築。標準的なクローニング法は、インフレーム融合としてｄ
ｇｔ−２８に連結した葉緑体輸送ペプチドポリヌクレオチド配列を含有するエントリーベ
クターの構築に使用された。ｄｇｔ−２８に融合した輸送ペプチド（ＴｒａＰ）を含むエ
ントリーベクターは、ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（商標）Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて組み立てられ
た。融合の結果として、第１のアミノ酸であるメチオニンをｄｇｔ−２８から除いた。輸
送ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列ＴｒａＰ４  ｖ２（配列番号２４）、Ｔｒ
ａＰ５  ｖ２（配列番号２５）、ＴｒａＰ８  ｖ２（配列番号２６）、ＴｒａＰ９  ｖ２
（配列番号２７）、ＴｒａＰ１２  ｖ２（配列番号２８）、およびＴｒａＰ１３  ｖ２（
配列番号２９）は、それぞれ、それぞれ、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）
によって合成され、最大で固有のＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むｄｇｔ
−２８の５’端の断片に融合させた。
【０１３１】
様々なＴｒａＰおよびｄｇｔ−２８発現カセットを含んだバイナリープラスミドをシロ
イヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ユビキチン１０プロモーター（ＡｔＵｂｉ１０  ｖ
２；Callis, et al, (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493）によって駆動させ、隣
接してアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオープ
ンリーディングフレームの２３個の３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ
１；米国特許第５，４２８，１４７号）を並べた。
【０１３２】
組み立てられたＴｒａＰおよびｄｇｔ−２８発現カセットは、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商
標）技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて遺伝子操作され、
アグロバクテリウムを媒介した植物形質転換を介して植物に形質転換させた。制限エンド
ヌクレアーゼをＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍ
Ａ）から得て、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＤＮＡライゲーション
のために使用した。選択マーカーカセットキャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター
（ＣｓＶＭＶ  ｖ２；Verdaguer et al, (1996) Plant Mol. Biol, 31: 1129-1139）−Ｄ
ＳＭ−２（米国特許出願第２００７／０８６８１３号）−アグロバクテリウム・ツメファ
シエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオープンリーディングフレームの１つの３’
非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦｌ  ３’ＵＴＲ  ｖ６；Huang et al, (1990) J. Bacteriol. 
172: 1814-1822）を含む単一のデスティネーションベクターに１つのエントリーベクター
を組み込むことによって、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標
）酵素ミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＧａｔｅｗａｙ反応を行った。プラス
ミド調製は、供給業者の指示に従って、ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ（登録商標）プラスミドキ
ット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）またはプ
ラスミドＭｉｄｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行われた。ＤＮＡ断片は、アガロース
、Ｔｒｉｓ−アセテートゲル電気泳動後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ゲル抽出キット（Ｑ
ｉａｇｅｎ）を用いて単離された。
【０１３３】
すべての組み立てられたプラスミドのコロニーは、最初に、ミニプレップＤＮＡの制限
消化によってスクリーニングされた。選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを、市販の
シークエンシングベンダー（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ（商標）ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ、Ｈｕｎｔ
ｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）によって配列決定された。配列データを組み立て、ＳＥＱＵＥＮＣ
ＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ
、ＭＩ）を用いて分析した。
【０１３４】
以下のバイナリー構築物は、様々なＴｒａＰ：ｄｇｔ−２８融合遺伝子配列を発現する
：ｐＤＡＢ１０７５２７はＴｒａＰ４  ｖ２：ｄｇｔ−２８  ｖ５（配列番号３０）を含
む；ｐＤＡＢ１０５５３０はＴｒａＰ５  ｖ２：ｄｇｔ−２８  ｖ５（配列番号３１）を
含む；ｐＤＡＢ１０５５３１はＴｒａＰ８  ｖ２：ｄｇｔ−２８  ｖ５（配列番号３２）
を含む；ＰＤＡＢ１０５５３２はＴｒａＰ９  ｖ２：ｄｇｔ−２８  ｖ５（配列番号３３
）を含む；ｐＤＡＢ１０５５３３はＴｒａＰ１２  ｖ２：ｄｇｔ−２８  ｖ５（配列番号
３４）を含む；ｐＤＡＢ１０５５３４はＴｒａＰ１３  ｖ２：ｄｇｔ−２８  ｖ５（配列
番号３５）を含む。ｐＤＡＢ１０５５３４のｄｇｔ−２８  ｖ５配列は修飾され、第１の
コドン（ＧＣＡ）を（ＧＣＴ）に変更した。
【０１３５】
追加の植物バイナリーベクター構築。上述したものと類似したクローニング戦略を用い
て、ｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２、ｄｇｔ−３３、ｄｇｔ−１、ｄｇｔ−３、およびｄｇ
ｔ−７を含むバイナリープラスミドを構築した。
【０１３６】
微生物由来の遺伝子；ｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２、およびｄｇｔ−３３は、先に記載
したものとは異なる葉緑体輸送ペプチドと融合させた。以下の葉緑体輸送ペプチドを使用
した；ＴｒａＰ１４  ｖ２（配列番号３６）、ＴｒａＰ２３  ｖ２（配列番号３７）、Ｔ
ｒａＰ２４  ｖ２（配列番号３８）。ｐＤＡＢ１０７５３２は、ＴｒａＰ１４  ｖ２に融
合させたｄｇｔ−３２  ｖ３（配列番号３９）を含み、ｐＤＡＢ１０７５３４は、Ｔｒａ
Ｐ２４  ｖ２と融合させたｄｇｔ−３３  ｖ３（配列番号４０）を含み、ｐＤＡＢ１０７
５３３は、ＴｒａＰ２３  ｖ２に融合させたｄｇｔ−３１  ｖ３（配列番号４１）を含む
。ｄｇｔ発現カセットは、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ユビキチン１０プロ
モーター（ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２）によって駆動され、アグロバクテリウム・
ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオープンリーディングフレームの２
３個の３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１）を並べた。キャッサバ葉
脈モザイクウイルスプロモーター（ＣｓＶＭＶ  ｖ２）−ＤＳＭ−２−アグロバクテリウ
ム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオープンリーディングフレーム
の１つの３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ  ｖ６）を含むＤＳＭ−２選択マ
ーカーカセットもバイナリーベクターに存在した。
【０１３７】
ｄｇｔ−３１  ｖ３、ｄｇｔ−３２  ｖ３、およびｄｇｔ−３３  ｖ３が先に記載され
た葉緑体輸送ペプチド配列に融合している追加のバイナリーを構築する。例えば、Ｔｒａ
Ｐ８  ｖ２配列は、ｄｇｔ−３１  ｖ３、ｄｇｔ−３２  ｖ３、およびｄｇｔ−３３  ｖ
３に融合され、上記したバイナリーベクターにクローニングされる。
【０１３８】
クラスＩ遺伝子（ｄｇｔ−１、ｄｇｔ−３、およびｄｇｔ−７）を含むバイナリーベク
ターを構築した。以下のバイナリーベクターを構築し、植物に形質転換した：米国特許出
願公開第２０１１／０１２４５０３号に記載されているｄｇｔ−１  ｖ４配列を含むｐＤ
ＡＢ４１０４を米国特許出願公開第２００９／００６４３７６号に記載されているニコチ
アナ・タバカム（Nicotiana tabacum）オスモチン配列；ｐＤＡＢ１０２７１５；ｐＤＡ
Ｂ１０２７１６；ｐＤＡＢ１０２７１７；およびｐＤＡＢ１０２７８５と並べる。ｄｇｔ
−２８、ｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２、およびｄｇｔ−３３に融合させた様々なＴｒａＰ
葉緑体輸送ペプチドは、これらの植物由来の配列は天然の植物葉緑体輸送ペプチドを有す
るため、クラスＩ遺伝子に追加されなかった。これらのベクターは、表１においてさらに
詳細に記載されている。
【０１３９】
【表１】
2019047803.tif 000002
【０１４０】
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の形質転換。アラビドプシス属（Arabidopsi
s）は、CloughおよびBent（1998）のフローラルディップ法を用いて形質転換された。上
記のバイナリープラスミドの１つを含む選択されたアグロバクテリウムコロニーを使用し
て、スペクチノマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびカナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含む
ＹＥＰブロスの１つまたは複数の１００ｍＬの前培養物を植菌した。培養物を２２５ｒｐ
ｍで一定に撹拌しながら一晩２８℃にてインキュベートした。細胞を１０分間、室温にて
約５０００×ｇでペレットにし、得られた上清を捨てた。５％（ｗ／ｖ）スクロース、１
０μｇ／Ｌの６−ベンジルアミノプリン、および０．０４％Ｓｉｌｗｅｔ（商標）Ｌ−７
７を含有する４００ｍＬの液体培地において穏やかに再懸濁させた。約１カ月齢の植物は
、穏やかに撹拌しながら５〜１０分間、培地中に浸漬させた。植物は、それらの側面を下
に置き、２〜３時間、透明または不透明なプラスチックバッグで覆い、その後、直立に配
置された。植物は、２２℃にて１６時間の明／８時間の暗の光周期で成長させた。浸漬か
ら約４週間後、種子を回収した。
【０１４１】
形質転換植物の選択。新たに回収したＴ１種子［ｄｇｔとＤＳＭ−２発現カセットを含
む］を７日間室温にて乾燥させた。Ｔ１種子は、２６．５×５１ｃｍの発芽トレイに播種
され、それぞれは、予め４０ｍＬの０．１％アガロース溶液に懸濁され、４℃にて２日間
保存された、層状にしたＴ１種子の２００ｍｇアリコート（約１０，０００個の種子）を
受け、休眠要件を完了し、同期種子発芽を確保した。
【０１４２】
Ｓｕｎｓｈｉｎｅ  Ｍｉｘ  ＬＰ５は微細なバーミキュライトで覆われ、湿るまでホー
グランド液で地下灌漑され、次に、重力排出を可能にした。層状にした種子のそれぞれ４
０ｍＬのアリコートは、ピペットを用いてバーミキュライト上に均一に播種され、４〜５
日間、湿気ドームで覆われた。ドームは、グルホシネート出芽後噴霧（同時形質転換され
たＤＳＭ−２遺伝子を選択する）を使用した最初の形質転換体選択の１日前に外された。
【０１４３】
植え付け後（ＤＡＰ）７日とさらに１１ＤＡＰに、Ｔ１植物（それぞれ子葉と２−４−
ｌｆ段階）は、適用あたり２８０ｇ  ａｉ／ｈａグルホシネートの有効比率を達成するた
めに、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ圧縮空気噴霧チップを用いて、１０ｍＬ／トレイ（７０３Ｌ／
ｈａ）の噴霧体積で、Ｌｉｂｅｒｔｙ除草剤（２００ｇ  ａｉ／Ｌグルホシネート、Ｂａ
ｙｅｒ  Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ、ＭＯ）の０．２％溶液
で噴霧された。生存者（活発に成長している植物）は、最終噴霧から４〜７日後に特定さ
れ、ポッティングメディア（Ｍｅｔｒｏ  Ｍｉｘ  ３６０）を用いて調製された３インチ
（７．６ｃｍ）のポットに個別に移植された。移植された植物を温室（２２±５℃、５０
±３０％ＲＨ、１４時間の明：１０時間の暗、最小５００μΕ／ｍ２ｓ１自然＋補助照明
）で育てた。分子確認分析は、生存Ｔ１植物について完了し、グリホサート耐性遺伝子が
植物のゲノムに安定に組み込まれたことを確認した。
【０１４４】
分子確認。ｐＤＡＢ１０７５２７、ｐＤＡＢ１０５５３０、ｐＤＡＢ１０５５３１、ｐ
ＤＡＢ１０５５３２、ｐＤＡＢ１０５５３３、またはｐＤＡＢ１０５５３４で形質転換さ
れたアラビドプシス属（Arabidopsis）植物のゲノム内でｄｇｔ−２８およびＤＳＭ−２
導入遺伝子の存在が確認された。これらのポリヌクレオチド配列の存在は、加水分解プロ
ーブアッセイ、遺伝子発現カセットＰＣＲ（植物転写単位ＰＣＲ−−ＰＴＵ  ＰＣＲとも
記載される）、サザンブロット分析、および定量的逆転写ＰＣＲ分析によって確認された
。
【０１４５】
Ｔ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物は、最初に、ＴＡＱＭＡＮ（商標）に類似
した加水分解プローブアッセイを介してスクリーニングされ、ＤＳＭ−２およびｄｇｔ−
２８導入遺伝子の存在を確認した。事象は、遺伝子発現カセットＰＣＲによりスクリーニ
ングされ、ｄｇｔ発現カセットが、再配列することなく、植物ゲノムに完全に組み込まれ
たかどうかを決定した。これらの研究から得られたデータを用いて、自家受精およびＴ２
世代への進行に関して、導入遺伝子のコピー数を決定し、選択アラビドプシス属（Arabid
opsis）事象を同定した。また、進行したＴ２アラビドプシス属（Arabidopsis）植物を加
水分解プローブアッセイによりスクリーニングし、植物染色体内にＤＳＭ−２遺伝子とｄ
ｇｔ遺伝子の存在を確認し、そのコピー数を推定した。最後に、サザンブロットアッセイ
を用いて、Ｔ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物のサブセット上の推定コピー数を
確認した。
【０１４６】
同様のアッセイを用いて、ｐＤＡＢ４１０４で形質転換された植物由来のｄｇｔ−１導
入遺伝子の存在、ｐＤＡＢ１０７５３２で形質転換された植物由来のｄｇｔ−３２導入遺
伝子の存在、ｐＤＡＢ１０７５３４で形質転換された植物由来のｄｇｔ−３３導入遺伝子
の存在、ｐＤＡＢ１０７５３３で形質転換された植物由来のｄｇｔ−３３導入遺伝子の存
在、ｐＤＡＢ１０２７１５で形質転換された植物由来のｄｇｔ−３導入遺伝子の存在、ｐ
ＤＡＢ１０２７１６で形質転換された植物由来のｄｇｔ−３導入遺伝子の存在、ｐＤＡＢ
１０２７１７で形質転換された植物由来のｄｇｔ−３導入遺伝子の存在、およびｐＤＡＢ
１０２７８５で形質転換された植物由来のｄｇｔ−７導入遺伝子の存在を確認した。
【０１４７】
加水分解プローブアッセイ。後述する加水分解プローブアッセイを用いて、Ｔ１とＴ２
アラビドプシス属（Arabidopsis）植物におけるコピー数を決定した。様々な数の導入遺
伝子を有する植物を同定し、その後のグリホサート耐性研究に進めた。
【０１４８】
組織試料を９６ウェルプレートに回収し、２日間凍結乾燥した。組織浸軟は、ＫＬＥＣ
Ｏ（商標）組織粉砕機とタングステンビーズを用いて実施された（Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｅ
ｔａｌ  ＩＮＣ．、Ｓｗｅｅｔ  Ｈｏｍｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）。組織浸軟後、製造業者が示
唆するプロトコールに従って、Ｂｉｏｓｐｒｉｎｔ（商標）９６植物キット（Ｑｉａｇｅ
ｎ（商標）、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いて、ハイスループット形式でゲノムＤ
ＮＡを単離した。ゲノムＤＮＡをＱＵＡＮＴ−ＩＴ（商標）ＰＩＣＯ  ＧＲＥＥＮ  ＤＮ
Ａアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒ
ｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって定量した。定量されたゲノムＤＮＡは、ＢＩＯＲＯＢＯＴ３
０００（商標）自動化液体ハンドラー（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を
用いて、加水分解プローブアッセイのために約２ｎｇ／μＬに調整された。加水分解プロ
ーブアッセイによる導入遺伝子のコピー数の決定は、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標
）４８０システム（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏ
ｌｉｓ、ＩＮ）を用いたリアルタイムＰＣＲによって行われた。アッセイは、ＤＳＭ−２
、ｄｇｔ−２８および内部参照遺伝子、ＴＡＦＩＩ１５（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＮＣ０
０３０７５；Duarte et al., (201) BMC Evol. Biol., 10:61）について設計された。
【０１４９】
増幅のために、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０プローブマスターミックス
（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）は
、ＤＳＭ−２とｄｇｔ−２８用のそれぞれ０．１μＭのプライマー、ＴＡＦＩＩ１５につ
いてそれぞれ０．４μＭのプライマーおよび０．２μＭのそれぞれのプローブを含有する
１０μＬ体積の多重反応物において１×最終濃度で調製された。表２。二段階増幅反応は
、６０℃にて４０秒間の伸長を用いて行い、蛍光を得た。すべての試料を実施し、平均サ
イクル閾値（Ｃｔ）をそれぞれの試料の分析に使用した。リアルタイムＰＣＲデータの分
析は、相対的な定量モジュールを用いるＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）ソフトウェアリ
リース１．５を使用して行い、ΔΔＣｔ法に基づいている。このために、１コピーの較正
物質由来のゲノムＤＮＡの試料と既知の２コピーチェックをそれぞれの実行に含めた。加
水分解プローブスクリーニングのコピー数の結果は、Ｔ１およびＴ２トランスジェニック
アラビドプシス属（Arabidopsis）植物について決定された。
【０１５０】
【表２】
2019047803.tif 000003
【０１５１】
サザンブロット分析を介したｄｓｔ−２８組み込み確認。サザンブロット分析を用いて
、挿入されたＴ−鎖ＤＮＡ断片の組み込みパターンを確立し、ｄｇｔ−２８を含有する事
象を同定した。データを作成し、アラビドプシス属（Arabidopsis）ゲノム内の導入遺伝
子挿入物の組み込みと完全性を実証した。サザンブロットデータは、Ｔ−鎖ＤＮＡの無傷
のコピーの単純な組み込みを同定するために使用された。詳細なサザンブロット分析は、
ｄｇｔ−２８遺伝子発現カセットに特異的なＰＣＲ増幅されたプローブを用いて行われた
。特定の制限酵素で消化されたゲノムＤＮＡとプローブのハイブリダイゼーションは、特
定の分子量のゲノムＤＮＡ断片を同定した。そのパターンを用いて、次世代への進行のた
めの完全長の単一挿入物Ｔ１トランスジェニック事象を同定した。
【０１５２】
組織試料を２ｍＬのコニカルチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標））に回収し、２日
間凍結乾燥した。組織浸軟は、ＫＬＥＣＫＯ（商標）組織粉砕機とタングステンビーズを
用いて実施された。組織浸軟後、ＣＴＡＢ単離手法を用いてゲノムＤＮＡを単離した。Ｑ
ｉａｇｅｎ（商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｔｉｐｓキットを用いて、ゲノムＤＮＡをさらに精
製した。ゲノムＤＮＡをＱｕａｎｔ−ＩＴ（商標）Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＡアッセ
イキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａ
ｄ、ＣＡ）によって定量した。定量されたゲノムＤＮＡは、一定濃度にするために４μｇ
に調整された。
【０１５３】
それぞれの試料について、制限酵素ＳｗａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ
ｓ、Ｂｅｖｅｒｌｅｙ、ＭＡ）を用いて、４μｇのゲノムＤＮＡを完全に消化し、２５℃
で一晩インキュベートし、次に、反応にＮｓｉＩを添加し、３７℃にて６時間インキュベ
ートした。消化されたＤＮＡは、製造業者が示唆したプロトコールに従って、Ｑｕｉｃｋ
Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標）（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて沈殿させて濃縮された。その後、６
５℃にて１時間、２５μＬの水にゲノムＤＮＡを再懸濁した。再懸濁した試料は、１×Ｔ
ＡＥ中で調製された０．８％アガロースゲルに装填され、１×ＴＡＥ緩衝液中で１．１Ｖ
／ｃｍで一晩電気泳動された。連続的に、ゲルは、３０分間の変性（０．２ＭのＮａＯＨ
／０．６ＭのＮａＣｌ）、および３０分間の中和（０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７
．５）／１．５ＭのＮａＣｌ）に供された。
【０１５４】
ナイロンメンブレンへのＤＮＡ断片の転写は、クロマトグラフィーペーパーの芯や紙タ
オルを使用することによって、処理されたＩＭＭＯＢＩＬＯＮ（商標）ＮＹ＋転写メンブ
レン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）上にゲルを介して一晩２０×Ｓ
ＳＣ溶液を受動的に吸い上げることによって行われた。転写後、メンブレンは、簡単に、
２×ＳＳＣで洗浄し、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ（商標）１８００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて架橋し、８０℃にて３時間、真空乾燥させた。
【０１５５】
モデル４００ハイブリダイゼーションインキュベータ（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ、Ｓｙｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて、ガラスローラーボトル中で１時間６５
℃にてプレハイブリダイゼーション溶液（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｈｙｂ  ｐｌｕｓ、Ｓｉｇｍ
ａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）とともにブロットをインキュベートした。プローブは、全
コード配列を含むＰＣＲ断片から調製された。ＰＣＲアンプリコンは、ＱＩＡＥＸ（商標
）ＩＩゲル抽出キットを用いて精製され、Ｒａｎｄｏｍ  ＲＴ  Ｐｒｉｍｅ  ＩＴ（商標
）標識キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を介して、α３２Ｐ−
ｄＣＴＰで標識された。ブロットは、ブロットあたり約２００万カウント／ｍＬまでハイ
ブリダイゼーション緩衝液に直接添加された変性プローブを用いて、一晩６５℃にてハイ
ブリダイズされた。ハイブリダイゼーション後、ブロットは、連続して、６５℃にて０．
１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで４０分間洗浄された。最後に、ブロットをストレージリン
光イメージングスクリーンに曝露し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｓｔｏｒ
ｍ  ８６０（商標）イメージングシステムを用いて撮像した。
【０１５６】
この研究において完成されたサザンブロット分析を用いて、コピー数を決定し、その選
択された事象がアラビドプシス属（Arabidopsis）のゲノム内のｄｇｔ−２８導入遺伝子
を含有していることを確認した。
【０１５７】
ＰＣＲ分析を介したｄｇｔ−２８遺伝子発現カセットの確認。Ｔ１の植物事象に含まれ
るｄｇｔ−２８遺伝子発現カセットの存在は、エンドポイントＰＣＲ反応によって検出さ
れた。ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２とｄｇｔ−２８遺伝子発現カセットのＡｔｕＯＲ
Ｆ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１領域に特異的なプライマー（表３）を検出のために使用した。
【０１５８】
【表３】
2019047803.tif 000004
【０１５９】
ＰＣＲ反応は、遺伝子発現カセットを増幅するために、標準的な三段階のＰＣＲサイク
リングプロトコールを必要とした。すべてのＰＣＲ反応は、以下のＰＣＲ条件を使用して
完了された：９４℃にて３分間、続いて、９４℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間、お
よび７２℃にて３分間の３５サイクル。製造者の指示に従って、ＥＸ−ＴＡＱ（商標）Ｐ
ＣＲキット（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｏｔｓｕ、Ｓｈｉ
ｇａ、Ｊａｐａｎ）を用いて、反応を完了させた。最終サイクル後、反応を７２℃にて１
０分間インキュベートした。ＴＡＥアガロースゲル電気泳動を用いて、ＰＣＲアンプリコ
ンのサイズを決定した。予想されるサイズのＰＣＲアンプリコンは、全長遺伝子発現カセ
ットの存在がトランスジェニックアラビドプシス属（Arabidopsis）事象のゲノム中に存
在することを示した。
【０１６０】
定量的逆転写ＰＣＲ分析を介したｄｇｔ−２８相対転写の確認。ｄｇｔ−２８トランス
ジェニック植物の組織試料を９６ウェルプレートに回収し、８０℃にて凍結した。組織浸
軟は、ＫＬＥＣＯ（商標）組織粉砕機とタングステンビーズ（Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｅｔａ
ｌ  ＩＮＣ．、Ｓｗｅｅｔ  Ｈｏｍｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）を用いて行った。組織浸軟の後、
全ＲＮＡは、製造業者が示唆したプロトコールに従って、カラム上のオプションのＤｎａ
ｓｅＩ処置を含めたＱｉａｇｅｎ（商標）Ｒｎｅａｓｙ  ９６キット（Ｑｉａｇｅｎ（商
標）、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いたハイスループット形式で単離された。その
後、このステップは、溶出された全ＲＮＡの追加のＤｎａｓｅＩ（Ａｍｂｉｏｎ（商標）
、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）処理に続いた。ｃＤＮＡ合成は、製造業者が示唆した手法に従っ
て、オリゴヌクレオチド、ＴＶＮを加えて、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒ
ｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（商標）キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いて、鋳型として全ＲＮＡを使用して行われた
。発現の定量は、加水分解プローブアッセイによって完了し、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（
登録商標）４８０システム（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａ
ｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いたリアルタイムＰＣＲにより行われた。アッセイは、ＬＩ
ＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）プローブデザインソフトウェア２．０を用いて、ｄｇｔ
−２８および内部参照遺伝子「未知タンパク質」（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＴ４Ｇ２４
６１０）について設計された。増幅のために、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８
０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉ
ａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）は、０．４μＭのそれぞれのプライマー、および０．２μＭの
それぞれのプローブを含む１０μＬ体積の一重反応中で１×最終濃度で調製された。表４
。
【０１６１】
【表４】
2019047803.tif 000005
【０１６２】
二段階の増幅反応は、６０℃にて４０秒間の伸長を用いて行われ、蛍光を得た。すべて
の試料は３重にして行い、平均サイクル閾値（Ｃｔ）をそれぞれの試料の分析に使用した
。マイナス逆転写反応をそれぞれの試料について行い、ｇＤＮＡ汚染がないことを確認し
た。リアルタイムＰＣＲデータの分析はΔΔＣｔ法に基づいて行った。このアッセイを用
いて、ヘミ接合性およびホモ接合性であることが決定されたトランスジェニックアラビド
プシス属（Arabidopsis）事象におけるｄｇｔ−２８の相対的発現を決定した。ｄｇｔ−
２８  ｍＲＮＡの相対的転写レベルは、内部対照より２．５倍から２０７．５倍高い範囲
であった。これらのデータは、ｄｇｔ−２８トランスジェニック植物が、機能的ｄｇｔ−
２８遺伝子発現カセットを含有し、植物がｄｇｔ−２８導入遺伝子を転写することができ
たことを示している。
【０１６３】
ウエスタンブロッティング分析。ＤＧＴ−２８は、トランスジェニックシロイヌナズナ
（Arabidopsis thaliana）植物から得られる葉の試料において検出された。ｄｇｔ−２８
トランスジェニック植物由来の植物抽出物とＤＧＴ−２８タンパク質標準は、ＤＴＴを含
有するＮＵＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓ
ｂａｄ、ＣＡ）とともに、９０℃にて１０分間インキュベートされ、アクリルアミドプレ
キャストゲルにおいて電気泳動的に分離された。次に、タンパク質は、製造者のプロトコ
ールを用いて、ニトロセルロースメンブレン上に電気的に転写された。ＷＥＳＴＥＲＮＢ
ＲＥＥＺＥ（登録商標）ブロッキングミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてブロッ
キング後、ＤＧＴ−２８タンパク質を抗ＤＧＴ−２８抗血清、次にヤギ抗ウサギホスファ
ターゼによって検出した。検出されたタンパク質は、化学発光基質ＢＣＩＰ／ＮＢＴウエ
スタン分析試薬（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）によって可視化された。ウ
エスタンブロットを介した無傷のＤＧＴ−２８タンパク質の生産は、アッセイされたｄｇ
ｔ−２８トランスジェニック植物がＤＧＴ−２８タンパク質を発現したことを示した。
【０１６４】
ｄｇｔ−２８導入遺伝子を含むトランスジェニックＴ１アラビドプシス属（Arabidopsi
s）植物は、異なる比率のグリホサートで噴霧された。高い比率がこの研究において適用
され、抵抗性の相対的なレベル（１０５、４２０、１，６８０または３，３６０ｇ  ａｅ
／ｈａ）を決定した。非形質転換アラビドプシス属（Arabidopsis）を防除する典型的な
１×使用率は、４２０ｇ  ａｅ／ｈａである。硫酸アンモニウムの添加を伴うグリホサー
ト製剤は、１８７Ｌ／ｈａで較正されたトラック噴霧器を用いてＴ１植物に適用された。
この研究で使用されたＴ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物は、様々なコピー数の
ｄｇｔ−２８導入遺伝子であった。低コピーのｄｇｔ−２８  Ｔ１アラビドプシス属（Ar
abidopsis）植物を自家受粉し、これを用いてＴ２植物を生成させた。表５は、グリホサ
ート除草剤抵抗性遺伝子、ｄｇｔ−１、および野生型対照を引用したｄｇｔ−２８トラン
スジェニック植物の比較を示す。表６は、グリホサート除草剤抵抗性遺伝子、ｄｇｔ−１
、および野生型対照を引用したｄｇｔ−３２とｄｇｔ−３３の比較を示す。表７は、新規
な微生物ＥＰＳＰシンターゼ酵素と、クラスＩのＥＰＳＰシンターゼ酵素およびグリホサ
ート比率が１，６８０ｇ  ａｅ／ｈａの対照の比較を示す。
【０１６５】
形質転換されたｄｇｔ−２８アラビドプシス属（Arabidopsis）植物のグリホサート選
択の結果。アラビドプシス属（Arabidopsis）Ｔ１形質転換体は、最初に、グルホシネー
ト選択スキームを使用して、非形質転換の種子のバックグラウンドから選択された。３フ
ラットまたは３０，０００個の種子は、各Ｔ１構築物について分析された。上記で選択さ
れたＴ１植物は、分子的に特徴付けられ、その後、様々なコピー数を有する代表的な植物
は、個別のポットに移植され、前述のように様々な比率の市販のグリホサートで噴霧され
た。これらの植物の応答は、処理から２週間後（ＷＡＴ）、視覚的損傷％の観点から提示
される。データは表に示され、損傷がほとんどないもしくは全くない（＜２０％）、中程
度の損傷（２０〜４０％）、または重度の損傷（＞４０％）を提示する個々の植物を示す
。算術平均および標準偏差は、アラビドプシス属（Arabidopsis）形質転換のために使用
されるそれぞれの構築物について提示される。個別の応答における範囲もまた、それぞれ
の比率および形質転換に関して、最後の列に示されている。野生型、非形質転換アラビド
プシス属（Arabidopsis）（栽培品種コロンビア）は、グリホサート感受性対照として用
いた。
【０１６６】
植物応答のレベルは変化した。この差異は、それぞれの植物が独立した形質転換事象を
表すという事実に起因することができ、したがって、対象とする遺伝子のコピー数は、植
物ごとに変動する。導入遺伝子を含んでいたいくつかの植物はグリホサートに耐性ではな
く；これらの植物が導入遺伝子を発現したかどうかを判断する徹底的な分析が完了しなか
ったことに気付いた。Ｔ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物内での高いコピー数の
導入遺伝子の存在は、ｄｇｔ−２８導入遺伝子の存在にもかかわらず、導入遺伝子サイレ
ンシングをもたらしたかまたはグリホサートに対する感受性をもたらした他のエピジェネ
ティックな効果をもたらした可能性がある。
【０１６７】
比率による全体的な集団の損傷平均は、１，６８０ｇ  ａｅ／ｈａでのグリホサートの
比率について表７に示され、ｄｇｔ−３、ｄｇｔ−７、ｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３２およ
びｄｇｔ−３３対ｄｇｔ−１および野生型対照で形質転換された植物の間に有意な差を実
証する。
【０１６８】
新規な細菌ＥＰＳＰシンターゼによって提供される耐性は、特異的酵素に依存して変化
した。ＤＧＴ−２８、ＤＧＴ−３２、およびＤＧＴ−３３は、予想外にグリホサートに有
意な耐性を示した。ｄｇｔ遺伝子は、試験したすべての輸送ペプチド全体で個々のＴ１ア
ラビドプシス属（Arabidopsis）植物に除草剤抵抗性を付与した。このように、追加的な
葉緑体輸送ペプチド（すなわち、ＴｒａＰ８−ｄｇｔ−３２またはＴｒａＰ８−ｄｇｔ−
３３）の使用は、所定の処置内で報告されているのと同様の損傷レベルでグリホサートに
対する保護を提供する。
【０１６９】
【表５】
2019047803.tif 000006
2019047803.tif 000007
【０１７０】
【表６】
2019047803.tif 000008
【０１７１】
【表７】
2019047803.tif 000009
【０１７２】
選択マーカーとしてのｄｇｔ−２８。グリホサート選択剤のための選択マーカーとして
のｄｇｔ−２８の使用は、上記のアラビドプシス属（Arabidopsis）形質転換植物を用い
て試験される。約５０個のＴ４世代アラビドプシス属（Arabidopsis）種子（ｄｇｔ−２
８についてホモ接合）は、約５，０００個の野生型（グリホサートに感受性である）の種
子に混ぜられる。種子は発芽され、苗木はグリホサートの選択用量で噴霧される。グリホ
サートのいくつかの処理を比較する：植物のそれぞれのトレイは、以下の処置スキーム：
７ＤＡＰ（植え付け後の日数）、１１ＤＡＰ、または７ＤＡＰの後１１ＤＡＰの１つにお
いて、グリホサートの１回または２回の適用時期のいずれかを受ける。すべての植物はま
た、同じ形質転換ベクターにグルホシネート抵抗性遺伝子を含んでいるため、グリホサー
トを用いて選択されたｄｇｔ−２８を含む植物は、グルホシネートを用いて選択されたＤ
ＳＭ−２またはｐａｔを含む植物と直接比較することができる。
【０１７３】
前述のように、グリホサート処置は、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ（商標）噴霧チップを用いて
適用される。ｄｇｔ−２８を含有するトランスジェニック植物は、「抵抗性」または「感
受性」１７ＤＡＰとして同定される。植え付け後（ＤＡＰ）７日および１１日に適用され
た２６．２５〜１６８０ｇ  ａｅ／ｈａグリホサートの処理は、ｄｇｔ−２８を含むトラ
ンスジェニックアラビドプシス属（Arabidopsis）植物について有効な選択を示す。感受
性および抵抗性の植物をカウントし、グリホサート耐性植物の数は、植え付けられるｄｇ
ｔ−２８導入遺伝子を含むトランスジェニック種子の元の数と相関することが見出される
。これらの結果は、ｄｇｔ−２８が、形質転換されたアラビドプシス属（Arabidopsis）
の集団に対して代替的な選択マーカーとして効果的に使用できることを示す。
【０１７４】
遺伝可能性。確認されたトランスジェニックＴ１アラビドプシス属（Arabidopsis）事
象は、Ｔ２種子を生産するために自家受粉された。これらの種子は、１００個の無作為な
Ｔ２同胞に、グルホシネート（２００ｇ  ａｅ／ｈａ）を含有するＩｇｎｉｔｅ（商標）
除草剤を適用することによって後代検定を行われた。それぞれの個々のＴ２植物は、噴霧
適用（１８７Ｌ／ｈａ適用率でのトラック噴霧器）前に７．５ｃｍの正方形ポットに移植
された。Ｔ１ファミリー（Ｔ２植物）は、カイ二乗分析（Ｐ＞０．０５）によって決定し
たメンデル遺伝を用いた優性遺伝単一遺伝子座について、予期される３抵抗性：１感受性
モデルに分離した。期待されたメンデル遺伝を用いて分離されたＴ１ファミリーの割合は
表８に示され、ｄｇｔ−２８形質はＴ２世代にメンデル遺伝を介して渡されることを実証
する。種子は、５〜１５個のＴ２個体（Ｔ３種子）から回収された。３〜４個の無作為に
選択されたＴ２ファミリーのそれぞれからの２５個のＴ３同胞について前述のように後代
検定を行った。データは分離を示さず、したがって、ｄｇｔ−２８およびｄｇｔ−３は、
染色体内に安定に組み込まれ、少なくとも３世代にメンデル様式で遺伝されることを実証
した。
【０１７５】
【表８】
2019047803.tif 000010
【０１７６】
Ｔ２アラビドプシス属（Arabidopsis）データ。低コピー数のｄｇｔ−２８導入遺伝子
を含んだ選択されたＴ１アラビドプシス属（Arabidopsis）事象の第２世代植物（Ｔ２）
は、グリホサート耐性についてさらに特徴付けられた。グリホサートを前述のように適用
した。植物の応答は、処置から２週間後（ＷＡＴ）、視覚的損傷％の観点から提示される
。データは、損傷がほとんどないもしくは全くない（＜２０％）、中程度の損傷（２０〜
４０％）、または重度の損傷（＞４０％）を提示する個体のヒストグラムとして示される
。算術平均および標準偏差は、アラビドプシス属（Arabidopsis）形質転換のために使用
されるそれぞれの構築物について提示される。個別の応答における範囲もまた、それぞれ
の比率および形質転換に関して、最後の列に示されている。野生型、非形質転換アラビド
プシス属（Arabidopsis）（栽培品種コロンビア）は、グリホサート感受性対照として用
いた。Ｔ２世代において、ヘミ接合およびホモ接合植物は、それぞれの事象についての試
験に利用可能であり、したがって、試験されたそれぞれの比率のグリホサートに含まれた
。遺伝子座で同じ２つの対立遺伝子を含むホモ接合植物と比較して、ヘミ接合植物は、遺
伝子座で２つの異なる対立遺伝子を含む。グリホサートに対する応答の変動性は、ホモ接
合植物と比較して、ヘミ接合性についての遺伝子量の差の結果として、Ｔ２世代で期待さ
れる。グリホサートへの応答の変動性は、標準偏差と応答の範囲に反映される。
【０１７７】
Ｔ２世代において、１コピーとマルチコピーのｄｇｔ−２８事象の両方はグリホサート
耐性について特徴付けられた。事象内では、１コピーの植物はグリホサートに対して同レ
ベルの耐性を示した。１コピーＴ２事象について特徴的データを表９に示す。ＴｒａＰ５
ｖ２と連結されたｄｇｔ−２８を含む事象は、他のＴｒａＰ輸送ペプチドを含有したｄ
ｇｔ−２８構築物と比較して、グリホサートに対する強固な耐性を提供しなかった。しか
しながら、ｄｇｔ−２８  ＴｒａＰ５構築物は、非形質転換コロンビア対照と比較して、
低レベルのグリホサート耐性を提供した。２以上のコピーのｄｇｔ−２８を含有すること
が示された事象が高比率のグリホサートにより感受性であるという例があった（データ示
さず）。グリホサートに対する感受性のこの増加は、高いコピー数のｄｇｔ−２８導入遺
伝子も含有したＴ１植物について先に記載されたデータに類似する。アラビドプシス属（
Arabidopsis）植物内の高いコピー数の導入遺伝子の存在は、ｄｇｔ−２８導入遺伝子の
存在にもかかわらず、導入遺伝子サイレンシングまたはグリホサートに対する感受性をも
たらす他のエピジェネティックな効果をもたらす可能性がある。
【０１７８】
これらの事象は、ＴｒａＰ５  ｖ２（ｐＤＡＢ１０５５３０）、ＴｒａＰ１２  ｖ２（
ｐＤＡＢ１０５５３３）およびＴｒａＰ１３  ｖ２（ｐＤＡＢ１０５５３４）と連結した
ｄｇｔ−２８を含んでいた。
【０１７９】
ｄｇｔ−２８に加えて、ｄｇｔ−３で形質転換されたＴ２アラビドプシス属（Arabidop
sis）事象を表１０に示す。表９においてｄｇｔ−２８事象について記載したように、デ
ータ表は、それぞれの構築物についてのグリホサートに対する応答に特徴的である代表的
な事象を含む。ｄｇｔ−３の特徴付けのために、ＡｔＵｂｉ１０プロモーターによって駆
動されるｄｇｔ−３遺伝子を有する単一ＰＴＵ（植物形質転換単位）を含む構築物（ｐＤ
ＡＢ１０２７１６とｐＤＡＢ１０２７１５）は、遺伝子の２ＰＴＵ（ｐＤＡＢ１０２７１
９；ｐＤＡＢ１０２７１８）を含む同遺伝子を有する構築物と比較された。２ＰＴＵを含
んだ構築物は、該遺伝子の１コピーを駆動するためにＡｔＵｂｉ１０プロモーターを使用
し、他のコピーを駆動するためにＣｓＶＭＶプロモーターを使用した。二重ＰＴＵの使用
は、ｄｇｔ−３トランスジェニック植物と、２コピーの導入遺伝子を含有したｄｇｔ−２
８トランスジェニック植物を比較するために組み込まれた。データは、単一のＰＴＵのみ
を有する１コピーのＴ２  ｄｇｔ−３事象が、試験された１コピーのｄｇｔ−２８事象よ
りもグリホサートに対して感受性であるが、非形質転換対照より高い耐性であることを実
証した。ｄｇｔ−３遺伝子の２ＰＴＵを含むＴ１ファミリーは、１ＰＴＵ構築物と比較し
て、グリホサートに対して高いレベルの視覚的耐性を提供した。いずれの場合も、Ｔ１フ
ァミリーは、ｄｇｔ−１および野生型対照と比較された。Ｔ２データは、ｄｇｔ−２８が
１コピー事象として強固な耐性を提供することを実証している。
【０１８０】
【表９】
2019047803.tif 000011
2019047803.tif 000012
【０１８１】
【表１０】
2019047803.tif 000013
【０１８２】
Ｔ３アラビドプシス属（Arabidopsis）データ。低コピー数のｄｇｔ−２８導入遺伝子
を含んだ選択されたＴ２アラビドプシス属（Arabidopsis）事象の第３世代植物（Ｔ３）
は、グリホサート耐性についてさらに特徴付けられた。株あたり２５個の植物は、上述の
ようにグリホシネートを用いて選択され、試験したすべての構築物からの株は選択マーカ
ー遺伝子について分離しなかった。グリホサートを前述のように適用した。植物の応答は
、処置から２週間後（ＷＡＴ）、視覚的損傷％の観点から提示される。データは、損傷が
ほとんどないもしくは全くない（＜２０％）、中程度の損傷（２０〜４０％）、または重
度の損傷（＞４０％）を提示する個体のヒストグラムとして示される。算術平均および標
準偏差は、アラビドプシス属（Arabidopsis）形質転換のために使用されるそれぞれの構
築物について提示される。個別の応答における範囲もまた、それぞれの比率および形質転
換に関して、最後の列に示されている。野生型、非形質転換アラビドプシス属（Arabidop
sis）（栽培品種コロンビア）は、グリホサート感受性対照として用いた。
【０１８３】
【表１１】
2019047803.tif 000014
2019047803.tif 000015
【０１８４】
形質転換植物の選択。新たに回収したＴ１種子［ｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２、および
ｄｇｔ−３３  ｖ１遺伝子］を室温にて乾燥させ、試験のためにインディアナポリスに搬
送した。Ｔ１種子は、２６．５×５１ｃｍの発芽トレイ（Ｔ．Ｏ．Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｉ
ｎｃ．、Ｃｌｅａｒｗａｔｅｒ、ＭＮ）に播種され、それぞれは、予め４０ｍＬの０．１
％アガロース溶液に懸濁され、４℃にて２日間保存された、層状にしたＴ１種子の２００
ｍｇアリコート（約１０，０００個の種子）を受け、休眠要件を完了し、同期種子発芽を
確保した。
【０１８５】
Ｓｕｎｓｈｉｎｅ  Ｍｉｘ  ＬＰ５（Ｓｕｎ  Ｇｒｏ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉ
ｎｃ．、Ｂｅｌｌｅｖｕｅ、ＷＡ）は微細なバーミキュライトで覆われ、湿るまでホーグ
ランド液で地下灌漑され、次に、重力排出を可能にした。層状にした種子のそれぞれ４０
ｍＬのアリコートは、ピペットを用いてバーミキュライト上に均一に播種され、４〜５日
間、湿度ドーム（ＫＯＲＤ（商標）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｒａｍａｌｅａ、Ｏｎｔａｒｉ
ｏ、Ｃａｎａｄａ）で覆われた。ドームは、グルホシネート出芽後噴霧（同時形質転換さ
れたｄｓｍ−２遺伝子を選択する）を使用した最初の形質転換体の選択前に植物が発芽し
た時点で外された。
【０１８６】
植え付け後（ＤＡＰ）６日とさらに１０ＤＡＰに、Ｔ１植物（それぞれ子葉と２−４−
ｌｆ段階）は、適用あたり２００ｇ  ａｅ／ｈａグルホシネートの有効比率を達成するた
めに、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ（商標）圧縮空気噴霧チップを用いて、１０ｍＬ／トレイ（７
０３Ｌ／ｈａ）の噴霧体積で、ＩＧＮＩＴＥ（商標）除草剤（２８０ｇ  ａｉ／Ｌグルホ
シネート、Ｂａｙｅｒ  Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ、ＭＯ）
の０．１％溶液で噴霧された。生存者（活発に成長している植物）は、最終噴霧から４〜
７日後に特定された。生存植物は、ポッティングメディア（Ｍｅｔｒｏ  Ｍｉｘ  ３６０
（商標））を用いて調製された３インチ（７．６ｃｍ）のポットに個別に移植された。植
物は、コピー数分析のための組織サンプリングの少なくとも１日前に温室において生育さ
れた。
【０１８７】
Ｔ１植物をサンプリングし、ｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２、およびｄｇｔ−３３  ｖ１
遺伝子についてのコピー数分析を完了した。次に、コピーの範囲が、それぞれの比率にあ
るように、Ｔ１植物を様々な比率のグリホサートに割り当てた。アラビドプシス属（Arab
idopsis）について、２６．２５ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートは、感受性の植物と意味
のあるレベルの抵抗性を有する植物を区別するのに有効な用量である。高い比率は、相対
的レベルの抵抗性（１０５、４２０、１６８０、または３３６０ｇ  ａｅ／ｈａ）を決定
するために適用された。表１３は、ｄｇｔ−１を引用した比較を示す。
【０１８８】
すべてのグリホサート除草剤適用は、１８７Ｌ／ｈａの噴霧体積でトラック噴霧器によ
ってなされた。使用されたグリホサートは、市販のＤｕｒａｎｇｏジメチルアミン塩製剤
（４８０ｇ  ａｅ／Ｌ、Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＡｃｉｅｎｃｅｓ、ＬＬＣ）であった。グルホ
シネートまたはグリホサートのいずれかに耐性を示した低コピーのＴ１植物は、Ｔ２世代
においてさらに評価された。
【０１８９】
最初のアラビドプシス属（Arabidopsis）形質転換は、ｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２、
およびｄｇｔ−３３  ｖ１を用いて行われた。Ｔ１形質転換体は、最初に、グルホシネー
ト選択スキームを用いて、非形質転換種子のバックグラウンドから選択された。３フラッ
トまたは３０，０００個の種子は、各Ｔ１構築物について分析された。形質転換頻度を計
算し、Ｔ１のｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２、およびｄｇｔ−３３構築物の結果は表１２に
列挙する。
【０１９０】
【表１２】
2019047803.tif 000016
【０１９１】
その後、上記で選択されたＴ１植物は、個別のポットに移植され、様々な比率の市販の
グリホサートで噴霧された。表１３は、アラビドプシス属（Arabidopsis）Ｔ１形質転換
体にグリホサート抵抗性を付与するｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２およびｄｇｔ−３３  ｖ
１ならびに対照遺伝子の応答を比較する。応答は、２ＷＡＴで視覚的損傷％の観点から提
示される。データは、損傷がほとんどないもしくは全くない（＜２０％）、中程度の損傷
（２０〜４０％）、または重度の損傷（＞４０％）を提示する個体のヒストグラムとして
示される。算術平均および標準偏差は、それぞれの処理について提示される。個別の応答
における範囲もまた、それぞれの比率および形質転換に関して、最後の列に示されている
。野生型、非形質転換アラビドプシス属（Arabidopsis）（栽培品種コロンビア）は、グ
リホサート感受性対照として用いた。輸送ペプチドＴｒａＰ２３を含むＤＧＴ−３１（ｖ
１）遺伝子は、陰性対照と比較して、個々のＴ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物
に対してわずかに除草剤耐性を付与したが、該遺伝子は、輸送ペプチドＴｒａＰ８により
改善された耐性を示した。ＤＧＴ−３２とＤＧＴ−３３はともに、ＴｒａＰ８およびそれ
ぞれの異なる葉緑体輸送ペプチド（それぞれＴｒａＰ１４およびＴｒａＰ２４）を用いて
試験された比率でグリホサートに対して強固な耐性を実証した。所与の処理中で、植物応
答のレベルは非常に変化した。これは、それぞれの植物が独立した形質転換事象を表すと
いう事実に帰することができ、したがって、対象とする遺伝子のコピー数は植物ごとに変
動する。重要にも注目すべきことに、試験したそれぞれのグリホサート比率で、他よりも
耐性である個体があった。比率による全集団の損傷平均は表１３に示され、ｄｇｔ−３１
、ｄｇｔ−３２、およびｄｇｔ−３３  ｖ１対ｄｇｔ−１  ｖ１または野生型対照で形質
転換された植物間で有意な相違を実証する。
【０１９２】
【表１３】
2019047803.tif 000017
2019047803.tif 000018
【０１９３】
トウモロコシ形質転換。標準的なクローニング方法は、上述した通りであり、アグロバ
クテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を媒介したトウモロコシ
の形質転換において使用するためのバイナリーベクターの構築に用いた。表１４は、トウ
モロコシ形質転換のために構築されたベクターを列挙する。以下の遺伝子エレメントはｄ
ｇｔ−２８を含んだベクターにおいて使用された；トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン
１プロモーター（ＺｍＵｂｉ１；米国特許第５，５１０，４７４号）を用いて、トウモロ
コシ（Zea mays）リパーゼ３’非翻訳領域（ＺｍＬｉｐ  ３’ＵＴＲ；米国特許第７１７
９９０２号）に並べられたｄｇｔ−２８コード配列を駆動し、選択マーカーカセットは、
トウモロコシ（Zea mays）リパーゼ３’非翻訳領域に並べられたａａｄ−１コード配列（
米国特許第７，８３８，７３３号）を駆動するために使用されたトウモロコシ（Zea mays
）ユビキチン１プロモーターからなる。ａａｄ−１コード配列は、例えば、２，４−ジク
ロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）およびアリールオキシフェノキシプロピオネート（Ａ
ＯＰＰ）除草剤などのフェノキシオーキシン除草剤に対する耐性を付与する。
【０１９４】
ｄｇｔ−２８構築物は、標準的なバイナリーベクターおよびアグロバクテリウムスーパ
ーバイナリーシステムベクター（Ｊａｐａｎ  Ｔｏｂａｃｃｏ、Ｔｏｋｙｏ、ＪＰ）とし
て構築された。標準的なバイナリーベクターとしては、ｐＤＡＢ１０７６６３、ｐＤＡＢ
１０７６６４、ｐＤＡＢ１０７６６５、およびｐＤＡＢ１０７６６５が挙げられる。アグ
ロバクテリウムスーパーバイナリーシステムベクターには、ｐＤＡＢ１０８３８４、ｐＤ
ＡＢ１０８３８５、ｐＤＡＢ１０８３８６、およびｐＤＡＢ１０８３８７が含まれる。
【０１９５】
黄色蛍光タンパク質（ｙｆｐ；米国特許出願公開第２００７／０２９８４１２号）レポ
ーター遺伝子を含有しているさらなる構築物を完成した。ｐＤＡＢ１０９８１２は、トウ
モロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターによって駆動され、トウモロコシ（Zea 
mays）ｐｅｒ５  ３’非翻訳領域（Ｚｍ  ｐｅｒ５  ３’ＵＴＲ；米国特許第７１７９９
０２号）に並べられたｙｆｐレポーター遺伝子カセットを含み、選択マーカーカセットは
、ａａｄ−１発現を駆動するために使用され、トウモロコシ（Zea mays）リパーゼ３’非
翻訳領域に並べられたサトウキビ桿菌状ウイルスプロモーター（ＳＣＢＶ；米国特許第５
，９９４，１２３号）からなる。ｐＤＡＢ１０１５５６は、トウモロコシ（Zea mays）ユ
ビキチン１プロモーターによって駆動され、トウモロコシ（Zea mays）ｐｅｒ５  ３’非
翻訳領域に並べられたｙｆｐカセットを含み、選択マーカーカセットは、ａａｄ−１発現
を駆動するために使用され、トウモロコシ（Zea mays）リパーゼ３’非翻訳領域に並べら
れたトウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターからなる。ｐＤＡＢ１０７６９
８は、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターによって駆動され、トウモロ
コシ（Zea mays）リパーゼ３’非翻訳領域に並べられたｄｇｔ−２８カセットを含み、ｙ
ｆｐカセットは、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターによって駆動され
、トウモロコシ（Zea mays）ｐｅｒ５  ３’非翻訳領域に並べられ、選択マーカーカセッ
トは、ａａｄ−１発現を駆動するために使用され、トウモロコシ（Zea mays）リパーゼ３
’非翻訳領域に並べられたサトウキビ桿菌状ウイルスプロモーターからなる。これらの構
築物の３つすべてが標準的なバイナリーベクターである。
【０１９６】
【表１４】
2019047803.tif 000019
【０１９７】
穂の滅菌および胚の単離。トウモロコシ未熟胚を得るために、トウモロコシ（Zea mays
）の同系交配株Ｂ１０４の植物を温室で生育させ、自家受粉または同胞受粉し、穂を生成
した。受粉後の約９〜１２日目に穂を回収した。実験日に、穂は、次亜塩素酸ナトリウム
（５％）の２０％溶液に浸漬することによって表面を滅菌し、２０〜３０分間振とうし、
次に、滅菌水で３回濯いだ。滅菌後、未熟接合胚（１．５〜２．４ｍｍ）は、それぞれの
穂から無菌的に切除し、液体感染培地（ＬＳ基礎培地、４．４３ｇ／Ｌ；Ｎ６ビタミン溶
液［１０００×］、１．００ｍＬ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；スクロース
、６８．５ｇ／Ｌ；Ｄ（＋）グルコース、３６．０ｇ／Ｌ；１０ｍｇ／ｍｌの２，４−Ｄ
、１５０μＬ／Ｌ）を含む微量遠心管に無作為に分配した。所与の実験セットについて、
３つの穂からプールされた胚をそれぞれの形質転換に使用した。
【０１９８】
アグロバクテリウム培養開始：
上記のバイナリー形質転換ベクターを含むアグロバクテリウムのグリセロールストック
は、適切な抗生物質を含むＡＢ最小培地プレート上に筋状にし、２０℃にて３〜４日間で
増殖させた。単一のコロニーを採取し、同じ抗生物質を含むＹＥＰプレート上に筋状にし
、２８℃にて１〜２日間インキュベートした。
【０１９９】
アグロバクテリウム培養および共培養。アグロバクテリウムコロニーをＹＥＰプレート
から採取し、５０ｍＬ使い捨てチューブ中の１０ｍＬ感染培地に懸濁した。細胞密度は、
分光光度計を用いてＯＤ６００ｎｍが０．２〜０．４になるように調整した。アグロバク
テリウム培養物を１２５ｒｐｍ、室温にてロータリーシェーカー上に置き、胚切除を行っ
た。サイズが１．５〜２．４ｍｍ間の未熟接合胚は、滅菌トウモロコシ穀粒から単離し、
１ｍＬの感染培地に入れ、同じ培地で１回洗浄した。アグロバクテリウム懸濁液（２ｍＬ
）をそれぞれのチューブに加え、チューブを１０〜１５分間振とうプラットホーム上に置
いた。胚を共培養培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；
ミオ−イノシトール、１００．０ｍｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物  １００．０ｍｇ／
Ｌ；３０ｍＭジカンバ−ＫＯＨ、３．３ｍｇ／Ｌ；スクロース、３０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌ
ｚａｎ（商標）、３．００ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００
ｍｌ／Ｌ；８．５ｍｇ／ｍｌのＡｇＮｏ３、１５．０ｍｇ／Ｌ；ＤＭＳＯ、１００μΜ）
に移し、胚盤を上に向けて配向し、５０μｍｏｌｅ  ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の２４時間
光の下で２５℃にて３日間インキュベートした。
【０２００】
カルス選択および推定事象の再生。共培養期間後、胚を残りの培地（ＭＳ塩、４．３３
ｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；１，２，３，５／４，６−ヘキサヒドロキ
シシクロヘキサン、１００ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ［（２−（ｎ−モルホリノ）−エタンスルホ
ン酸）、遊離酸］０．５００ｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物  １００．０ｍｇ／Ｌ；３
０ｍＭ  ジカンバ−ＫＯＨ、３．３ｍｇ／Ｌ；スクロース、３０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｚａ
ｎ  ２．３０ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；８
．５ｍｇ／ｍｌ  ＡｇＮｏ３、１５．０ｍｇ／Ｌ；カルベニシリン、２５０．０ｍｇ／Ｌ
）（選択剤を含まない）に移し、５０μｍｏｌｅ  ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の２４時間光
の下で２５℃にて３日間インキュベートした。
【０２０１】
増殖阻害用量応答実験により、０．２５ｍＭ以上のグリホサート濃度が非形質転換Ｂ１
０４トウモロコシ株において細胞増殖を阻害するのに十分であることが示唆された。胚は
、０．５ｍＭグリホサートを含む選択１培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、
７００．０ｍｇ／Ｌ；ミオイノシトール、１００．０ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ［（２−（ｎ−モ
ルホリノ）−エタンスルホン酸）、遊離酸］０．５００ｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物
１００．０ｍｇ／Ｌ；３０ｍＭ  ジカンバ−ＫＯＨ、３．３ｍｇ／Ｌ；スクロース、３
０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ（商標）２．３０ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０
００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；８．５ｍｇ／ｍｌ  ＡｇＮｏ３、１５．０ｍｇ／Ｌ；カル
ベニシリン、２５０．０ｍｇ／Ｌ）に移され、暗所および／または５０μｍｏｌｅ  ｍ−
２ｓｅｃ−１光強度の２４時間光の下で２８℃にて７〜１４日間インキュベートされた。
【０２０２】
増殖中の胚発生カルスは、１．０ｍＭグリホサートを含有する選択２培地（ＭＳ塩、４
．３３ｇ／Ｌ；１，２，３，５／４，６−ヘキサヒドロキシシクロヘキサン、１００ｍｇ
／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ［（２−（ｎ−モルホリノ）−エタン
スルホン酸）、遊離酸］０．５００ｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物  １００．０ｍｇ／
Ｌ；３０ｍＭ  ジカンバ−ＫＯＨ、３．３ｍｇ／Ｌ；スクロース、３０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅ
ｌｚａｎ（商標）２．３０ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００
ｍｌ／Ｌ；８．５ｍｇ／ｍＬ  ＡｇＮｏ３、１５．０ｍｇ／Ｌ；カルベニシリン、２５０
．０ｍｇ／Ｌ；Ｒ−ハロキシホップ酸０．１８１０ｍｇ／Ｌ）に移し、暗所および／また
は５０μｍｏｌｅ  ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の２４時間光の下で２８℃にて１４日間イン
キュベートされた。この選択工程は、トランスジェニックカルスをさらに増殖および分化
させた。カルス選択期間を３〜４週間継続した。
【０２０３】
増殖中の胚発生カルスは、０．５ｍＭグリホサート含有ＰｒｅＲｅｇ培地（ＭＳ塩、４
．３３ｇ／Ｌ；１，２，３，５／４，６−ヘキサヒドロキシシクロヘキサン、１００ｍｇ
／Ｌ；Ｌ−プロリン、３５０．０ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ［（２−（ｎ−モルホリノ）−エタン
スルホン酸）、遊離酸］０．２５０ｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物  ５０．０ｍｇ／Ｌ
；ＮＡＡ−ＮａＯＨ  ０．５００ｍｇ／Ｌ；ＡＢＡ−ＥｔＯＨ  ２．５０ｍｇ／Ｌ；ＢＡ
１．００ｍｇ／Ｌ；スクロース、４５．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ（商標）２．５０ｇ／
Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；８．５ｍｇ／ｍｌ  
ＡｇＮｏ３、１．００ｍｇ／Ｌ；カルベニシリン、２５０．０ｍｇ／Ｌ）に移し、５０μ
ｍｏｌｅ  ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の２４時間光の下で２８℃にて７日間培養された。
【０２０４】
シュート様芽を有する胚発生カルスは、０．５ｍＭグリホサート含有再生培地（ＭＳ塩
、４．３３ｇ／Ｌ；１，２，３，５／４，６−ヘキサヒドロキシシクロヘキサン、１００
．０ｍｇ／Ｌ；スクロース、６０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｌａｎ  Ｇｕｍ  Ｇ４３４（商標）
３．００ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；カルベ
ニシリン、１２５．０ｍｇ／Ｌ）に移し、５０μｍｏｌｅ  ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の２
４時間光の下で７日間培養された。
【０２０５】
一次根を有する小さなシュートは、Ｐｈｙｔｏｔｒａｙ中の発根培地（ＭＳ塩、４．３
３ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；１，２，３，
５／４，６−ヘキサヒドロキシシクロヘキサン、１００ｍｇ／Ｌ；スクロース、６０．０
ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｌａｎ  Ｇｕｍ  Ｇ４３４（商標）３．００ｇ／Ｌ；カルベニシリン、２
５０．０ｍｇ／Ｌ）に移し、１４０〜１９０μｍｏｌｅ  ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の１６
／８時間の明／暗で２７℃にて７日間インキュベートされた。推定されるトランスジェニ
ック苗木は、上述のプロトコールを用いて、導入遺伝子のコピー数について分析され、土
壌に移された。
【０２０６】
トウモロコシ植物内のｄｇｔ−２８およびａａｄ−１導入遺伝子の存在の分子確認。ｄ
ｇｔ−２８およびａａｄ−１のポリヌクレオチド配列の存在は、加水分解プローブアッセ
イによって確認された。単離されたＴ０トウモロコシ植物は、最初に、ａａｄ−１とｄｇ
ｔ−２８導入遺伝子の存在を確認するために、ＴＡＱＭＡＮ（商標）に類似した加水分解
プローブアッセイを介してスクリーニングされた。これらの研究から生じたデータは、導
入遺伝子のコピー数を決定するために使用され、Ｔ１世代へ戻し交配および進行のための
トランスジェニックトウモロコシ事象を選択するために使用された。
【０２０７】
組織試料を９６ウェルプレートに回収し、組織浸軟は、Ｑｉａｇｅｎ（商標）ＲＬＴ緩
衝液中でＫＬＥＣＯ（商標）組織粉砕機およびステンレス製ビーズ（Ｈｏｏｖｅｒ  Ｐｒ
ｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃｕｍｍｉｎｇ、ＧＡ）を用いて行った。組織浸軟
後、製造業者が示唆するプロトコールに従って、ゲノムＤＮＡは、Ｂｉｏｓｐｒｉｎｔ  
９６（商標）Ｐｌａｎｔキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いて
、ハイスループット形式で単離された。ゲノムＤＮＡは、Ｑｕａｎｔ−ＩＴ（商標）Ｐｉ
ｃｏ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＡアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって定量した。定量されたゲノムＤＮＡ
は、ＢＩＯＲＯＢＯＴ３０００（商標）自動化液体ハンドラー（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍ
ａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いて、加水分解プローブアッセイのために約２ｎｇ／μＬに調
整された。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイに類似した加水分解プローブアッセイによ
る導入遺伝子のコピー数の決定は、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システム
（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を
用いたリアルタイムＰＣＲによって行われた。アッセイは、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登
録商標）Ｐｒｏｂｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ２．０を用いて、ａａｄ−１、
ｄｇｔ−２８および内部参照遺伝子インベルターゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｕ１６１
２３．１）について設計された。増幅のために、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４
８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄ
ｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）は、ａａｄ−１とｄｇｔ−２８についての０．４μＭの各プ
ライマーおよび０．２μＭの各プローブを含有する１０μＬ体積の多重反応において１×
最終濃度にて調製された（表１５）。
【０２０８】
二段階の増幅反応は、６０℃にて４０秒間の伸長を用いて行われ、蛍光を得た。すべて
の試料を行い、平均サイクル閾値（Ｃｔ）をそれぞれの試料の分析に使用した。リアルタ
イムＰＣＲデータの分析は、相対的な定量モジュールを用いたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（
登録商標）ソフトウェアリリース１．５を使用して行われ、ΔΔＣｔ法に基づいている。
対照は、それぞれの実行に含まれた単一コピー較正因子と既知の２つのコピーチェックか
らのゲノムＤＮＡの試料を含んだ。表１６は、加水分解プローブアッセイの結果を列挙す
る。
【０２０９】
【表１５】
2019047803.tif 000020
【０２１０】
【表１６】
2019047803.tif 000021
【０２１１】
ｄｇｔ−２８形質転換されたトウモロコシにおける除草剤耐性。トウモロコシ（Zea ma
ys）ｄｇｔ−２８形質転換事象（Ｔ０）は、温室で順化させ、植物が、組織培養から温室
生育条件（すなわち、２〜４の新しく、通常に見える葉が渦巻きから出現していた）に移
行するまで成長させた。植物を温室で、２７℃にて１６時間の明所：８時間の暗所の条件
で生育した。次に、植物を２％ｗ／ｖの硫酸アンモニウムの添加とともに、ＤＵＲＡＮＧ
Ｏ  ＤＭＡ（商標）（除草剤グリホサートを含む）の市販製剤で処理した。除草剤適用は
、１８７Ｌ／ｈａの噴霧量、５０ｃｍの噴霧高でトラック噴霧器を用いて行われた。Ｔ０
植物は、非形質転換トウモロコシ株に重大な損傷を与えることができる２８０〜４４８０
ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートの範囲のグリホサートで噴霧された。致死量は、近交系Ｂ
１０４に対して＞９５％損傷を引き起こす比率として定義される。
【０２１２】
Ｔ０  ｄｇｔ−２８トウモロコシ植物の結果は、グリホサートに対する耐性が最大４４
８０ｇ  ａｅ／ｈａまでの比率で達成されたことを実証した。特定の媒体タイプをＴ０世
代に使用した。非形質転換対照と比較した、形質転換植物の最小発育阻害および全体の植
物成長は、ＴｒａＰ５、ＴｒａＰ８、およびＴｒａＰ２３葉緑体輸送ペプチドに連結され
たとき、ｄｇｔ−２８がグリホサートに対する強固な耐性を提供することを実証した。
【０２１３】
選択されたＴ０植物は、次世代におけるさらなる特徴付けのために自家受粉され、また
は戻し交配される。Ｔ１植物を含む１００個の選ばれたｄｇｔ−２８株は、１４０〜１１
２０ｇ  ａｅ／ｈａのグルホシネートまたは１０５〜１６８０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサ
ートで噴霧される。選択マーカーとグリホサート抵抗性遺伝子の両方は、同じプラスミド
上に構築される。したがって、１つの除草剤耐性遺伝子が除草剤で噴霧することによって
選択される場合、両方の遺伝子が存在すると考えられる。１４ＤＡＴで、抵抗性および感
受性植物は、カイ二乗分析によって決定された単一遺伝子座の優性メンデル形質（３Ｒ：
１Ｓ）として分離された株の割合を決定するためにカウントされる。これらのデータは、
ｄｇｔ−２８が、単子葉植物種において強固なグリホサート抵抗性遺伝子として遺伝され
得ることを実証する。グリホサート比率の増加は、ｄｇｔ−２８遺伝子によって提供され
る耐性および保護をさらに特徴付けるために、Ｔ１またはＦ１生存者に適用される。
【０２１４】
ｄｇｔ−２８で形質転換されたＴ０トウモロコシにおける発芽後の除草剤耐性。Ｔｒａ
Ｐ４、ＴｒａＰ５、ＴｒａＰ８およびＴｒａＰ２３と連結されたｄｇｔ−２８のＴ０事象
は、アグロバクテリウム形質転換によって生成され、２〜４枚の新しく、通常に見える葉
が渦巻きから出現するまで、制御された成長チャンバー条件下で順化させた。植物は、個
々の識別番号が割り当てられ、ｄｇｔ−２８とａａｄ−１の両方のコピー数分析のために
サンプリングされた。コピー数分析に基づいて、タンパク質発現分析のための植物を選択
した。植物を新しい成長培地とともに大きなポットに移植し、温室で２７℃にて１６時間
明所：８時間暗所の条件で生育した。次に、タンパク質発現のためにサンプリングされな
かった残りの植物を２％ｗ／ｖの硫酸アンモニウムの添加とともにＤＵＲＡＮＧＯ  ＤＭ
Ａ（商標）（グリホサート）の市販製剤で処理した。植物のそれぞれのグループがコピー
数を変化させるＴ０事象を含むように処置を分配させた。除草剤適用は、１８７Ｌ／ｈａ
の噴霧量、５０ｃｍの噴霧高でトラック噴霧器を用いて行われた。Ｔ０植物は、非形質転
換トウモロコシ株に重大な損傷を与えることができる２８０〜４４８０ｇ  ａｅ／ｈａの
グリホサートの範囲のグリホサートで噴霧された。致死量は、近交系Ｂ１０４に対して＞
９５％損傷を引き起こす比率として定義される。Ｂ１０４は、形質転換体の遺伝的バック
グラウンドであった。
【０２１５】
Ｔ０  ｄｇｔ−２８トウモロコシ植物の結果は、グリホサートに対する耐性が最大４４
８０ｇ  ａｅ／ｈａまで達成されたことを実証する。表１７。非形質転換対照と比較した
、形質転換植物の最小発育阻害および全体の植物成長は、ＴｒａＰ５、ＴｒａＰ８、およ
びＴｒａＰ２３に連結されたとき、ｄｇｔ−２８がグリホサートに対する強固な保護を与
えることを実証した。
【０２１６】
【表１７】
2019047803.tif 000022
【０２１７】
標準的なＥＬＩＳＡによるタンパク質発現分析は、試験された構築物全体で１２．６〜
２２．５ｎｇ／ｃｍ２のＤＧＴ−２８タンパク質の平均範囲を実証した。
【０２１８】
温室条件下でのＦ１世代におけるグリホサート耐性の確認。噴霧されなかった１コピー
のＴ０植物は、次世代においてさらなる特徴付けのために、非形質転換のバックグラウン
ドＢ１０４に戻し交配された。Ｔ１世代において、グリホサート耐性は、ｄｇｔ−２８遺
伝子の遺伝を確認するために評価された。Ｔ１植物について、除草剤ＡＳＳＵＲＥ  ＩＩ
（商標）（３５ｇ  ａｅ／ｈａのキザロホップ−メチル）は、ＡＡＤ−１タンパク質を選
択するためのＶ１成長段階で適用された。選択マーカーとグリホサート抵抗性遺伝子の両
方は、同じプラスミド上に構築される。したがって、１つの遺伝子が選択される場合、両
方の遺伝子が存在すると考えられる。７ＤＡＴ後、抵抗性および感受性植物をカウントし
、ヌル植物を集団から除去した。これらのデータは、ｄｇｔ−２８（ｖ１）は、単子葉植
物種において強固なグリホサート抵抗性遺伝子として遺伝することができることを実証す
る。標準的なＥＬＩＳＡおよびＲＮＡ転写レベルによるＤＧＴ−２８タンパク質の特徴付
けのために植物をサンプリングした。抵抗性植物は、前述のように、５６０〜４４８０ｇ
ａｅ／ｈａのグリホサートで噴霧された。データは、４４８０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホ
サートまで、葉緑体輸送ペプチドＴｒａＰ４、ＴｒａＰ５、ＴｒａＰ８およびＴｒａＰ２
３と連結されたｄｇｔ−２８の強固な耐性を実証する。表１８。
【０２１９】
【表１８】
2019047803.tif 000023
【０２２０】
タンパク質発現データは、Ｔ１世代のタンパク質発現を確立する、Ｔ１事象および試験
された構築物全体で、４２．２〜８８．２ｎｇ／ｃｍ２のある範囲の平均ＤＧＴ−２８タ
ンパク質を実証する。
【０２２１】
野外条件下のｄｇｔ−２８トウモロコシの特徴付け。１コピーのＴ１事象は、さらなる
特徴付けのために、ハイブリッドヘミ接合種子と近交系ホモ接合種子の両方を作製するた
めに野外場所に搬送された。ハイブリッド種子は、トウモロコシ形質転換株Ｂ１０４にお
けるＴ１事象を、事象について１：１（ヘミ接合：ヌル）を分離するハイブリッド集団を
生成する近交株４ＸＰ８１１に交配させることによって作製された。得られた種子は、２
つの別々の場所に搬送された。構築物あたり５つの１コピー事象の合計は、３重の無作為
化された完全ブロック設計のそれぞれの場所で植え付けられた。野外は、Ｖ４成長段階で
生じさせるためのグリホサート適用、およびＶ８成長段階で適用される植物の別のグルー
プについて設計された。４ＸＰ８１１／Ｂ１０４の従来のハイブリッドを陰性対照として
使用した。
【０２２２】
実験行は、ヌル分離体を排除するために、１８４ｇ  ａｅ／ｈａのＡＳＳＵＲＥ  ＩＩ
（商標）（１０６ｇ  ａｉ／Ｌのキザロホップ−メチル）で処理された。すべての実験エ
ントリーは、ＡＳＳＵＲＥ  ＩＩ（商標）適用に関して１：１（感受性：抵抗性）（ｐ＝
０．０５）を分離した。選択された抵抗性植物は、標準的なＥＬＩＳＡによってＤＧＴ−
２８タンパク質の定量化のためにそれぞれの事象からサンプリングされた。
【０２２３】
キザロホップメチル抵抗性植物は、Ｖ４またはＶ８成長段階のいずれかで２．５％ｗ／
ｖ硫酸アンモニウムの添加とともに、市販の除草剤ＤＵＲＡＮＧＯ  ＤＭＡ（商標）（４
８０ｇ  ａｅ／Ｌのグリホサート）で処理された。除草剤適用は、１８７Ｌ／ｈａの体積
、５０ｃｍの噴霧高を送達するように較正されたブーム噴霧器を用いて行われた。植物は
、非形質転換トウモロコシ株に対して重大な損傷を与えることができる１１２０〜４４８
０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートのある範囲のグリホサートで噴霧された。致死量は、４
ＸＰ８１１近交系に対して＞９５％損傷を引き起こす比率として定義される。視覚的損傷
評価は、７、１４および２１ＤＡＴ（処置後の日数）での視覚的な白化の割合、壊死の割
合、成長阻害の割合および全視覚的損傷について行われた。評価は、それぞれの株および
陰性対照について、未処理チェックと比較された。
【０２２４】
すべての評価時期の視覚的損傷データは、場所と適用時期の両方で、最大４４８０ｇ  
ａｅ／ｈａまでのＤＵＲＡＮＧＯ  ＤＭＡ（商標）に対する強固な耐性を実証した。Ｖ４
適用に関する代表的な事象は１つの場所から示され、他の事象、適用時期および場所と一
致している。表１９。ＴｒａＰ２３（ｐＤＡＢ１０７６６５）と連結されたｄｇｔ−２８
を含む構築物からの１つの事象は、ＡＡＤ−１タンパク質についてＡＳＳＵＲＥ  ＩＩ（
商標）選択に対して耐性であったが、適用されたすべての比率のグリホサートに感受性で
あった。
【０２２５】
【表１９】
2019047803.tif 000024
【０２２６】
追加の評価は、４４８０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサート比率について、再生成長段階中
に行われた。房、受粉時期および穂の膨らみの視覚的評価は、すべての構築物、適用時期
および場所について、それぞれの株の未処理チェックと同様であった。ＤＧＴ−２８タン
パク質の定量結果は、１８６．４〜３０３．０ｎｇ／ｃｍ２のある範囲の平均タンパク質
発現を実証した。データは、最大４４８０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートまで再生成長段
階を通じて、野外条件下でｄｇｔ−２８形質転換されたトウモロコシの強固な耐性を実証
する。また、データは、噴霧耐性結果に基づいて、ＤＧＴ−２８タンパク質の検出および
機能を実証した。
【０２２７】
ホモ接合状態におけるｄｇｔ−２８トウモロコシの遺伝可能性および耐性の確認。Ｔ１
Ｓ２から種子は、前述のように、温室条件下で植え付けられた。野外条件下で特徴付けた
同じ５つの１コピー株は均一な状態で特徴付けた。植物は、Ｖ３成長段階まで成長させ、
１１２０〜４４８０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサート（ＤＵＲＡＮＧＯ  ＤＭＡ（商標））
の範囲の３つの比率のグリホサートおよび処理あたり４つの複製に分離された。適用は、
前述のようにトラック噴霧器で行われ、２．０％ｗ／ｖの硫酸アンモニウムにおいて製剤
化された。硫酸アンモニウムの適用は、それぞれの株に対して未処理のチェックとして用
いた。前述のように、視覚的評価は処置から７日後および１４日後に行われた。データは
、試験されたすべての事象について、最大４４８０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートまで強
固な耐性を実証した。表２０。
【０２２８】
【表２０】
2019047803.tif 000025
【０２２９】
野外条件下で耐性でないｐＤＡＢ１０７６６５からの株はグリホサートに対して耐性を
示さず、したがって、野外観察と一致する（データ示さず）。前述の１つの株を除いて、
株からグリホサートで処理したすべての複製物は、グリホサートに対して感受性でなかっ
た。したがって、データは、メンデル様式でｄｇｔ−２８トウモロコシの均質な集団に対
する遺伝可能性を実証する。標準的なＥＬＩＳＡによるＤＧＴ−２８タンパク質の発現は
、グリホサートに耐性であった１コピー事象全体で２７．５〜６５．８ｎｇ／ｃｍ２のあ
る範囲の平均タンパク質発現を実証した。データは、機能的タンパク質、および世代全体
でＤＧＴ−２８タンパク質の安定性を実証する。
【０２３０】
選択マーカーとしてのグリホサートの発芽後の除草剤耐性使用。前述したように、Ｔ０
形質転換植物を組織培養から移動させ、温室内で順化させた。試験された事象は、Ｔｒａ
Ｐ５、ＴｒａＰ８、およびＴｒａＰ２３葉緑体輸送ペプチドに連結されたｄｇｔ−２８を
含有した。これらのＴ０植物は最大４４８０ｇ  ａｅ／ｈａまでのグリホサートに強固な
耐性を提供し、非形質転換植物は、２８０ｇ  ａｅ／ｈａ程度に低い濃度のグリホサート
で制御されたことが実証された。これらのデータは、ｄｇｔ−２８が、２８０〜４４８０
ｇ  ａｅ／ｈａの範囲のグリホサートの濃度を用いる選択マーカーとして利用され得るこ
とを実証する。
【０２３１】
ｄｇｔ−２８導入遺伝子を含むトウモロコシの固定された株からの多数の種子が、多数
の非形質転換トウモロコシ種子に混ぜられた。種子を植え付け、Ｖ１〜Ｖ３発育段階まで
生育させ、その時点で、苗木は、２８０〜４４８０ｇ  ａｅ／ｈａの範囲でグリホサート
の選択用量を用いて噴霧される。７〜１０日後に、感受性および抵抗性植物をカウントし
、グリホサート耐性植物の量は、植え付けられるｄｇｔ−２８導入遺伝子を含むトランス
ジェニック種子の元の数と相関する。
【０２３２】
ｄｇｔ−２８トウモロコシのスタッキング。ＡＡＤ−１タンパク質は、研究目的のため
にｄｇｔ−２８形質転換されたトウモロコシにおいて選択マーカーとして使用される。ま
た、ａａｄ−１遺伝子は、作物における最大Ｖ８適用までに強固な２，４−Ｄ耐性を提供
するために、トウモロコシにおける除草剤耐性の形質として利用することができる。構築
物ｐＤＡＢ１０７６６３（ＴｒａＰ４：：ｄｇｔ−２８）、ｐＤＡＢ１０７６６４（Ｔｒ
ａＰ８：：ｄｇｔ−２８）およびｐＤＡＢ１０７６６６（ＴｒａＰ５：：ｄｇｔ−２８）
からの４つの事象は、グリホサートおよび２，４−Ｄのタンク混合適用の耐性について特
徴付けられた。特徴付け研究は、温室条件下でＦ１種子を用いて完了された。適用は、前
述されるように、以下の比率：１１２０〜２２４０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサート（ｄｇ
ｔ−２８遺伝子について選択的である）、１１２０〜２２４０ｇ  ａｅ／ｈａの２，４−
Ｄ（ａａｄ−１遺伝子について選択的である）、または記載される比率での２つの除草剤
のタンク混合物でトラック噴霧器において行われた。植物は７および１４ＤＡＴで等級付
けされた。２２４０ｇ  ａｅ／ｈａの除草剤の適用についての噴霧結果を表２１に示す。
【０２３３】
【表２１】
2019047803.tif 000026
【０２３４】
結果は、ｄｇｔ−２８がａａｄ−１と首尾よく積層できることを確認し、したがって、
対象とする作物に適用され得るスペクトル除草剤（ｄｇｔ−２８およびａａｄ−１につい
てそれぞれグリホサート＋フェノキシ酢酸）を増やす。防除が難しい広葉雑草または抵抗
性雑草生物型が存在する作物生産において、積層は雑草防除および対象とする作物の保護
の手段として使用され得る。追加のインプットまたはアウトプット特性はまた、トウモロ
コシおよび他の植物におけるｄｇｔ−２８遺伝子を用いて積層することができる。
【０２３５】
ダイズ形質転換。安定に組み込まれたｄｇｔ−２８導入遺伝子を含むトランスジェニッ
クダイズ（Glycine max）は、アグロバクテリウムを媒介したダイズ子葉節外植片の形質
転換を介して生成された。機能的ｄｇｔ−２８を含有するバイナリーベクターを担持する
安全化されたアグロバクテリウム株を、形質転換を開始するために使用した。
【０２３６】
アグロバクテリウムを媒介した形質転換は、Zengら（Zeng P., Vadnais D.A., Zhang Z
., Polacco J.C., (2004), Plant Cell Rep., 22(7): 478-482）の修正された半子葉節手
法を用いて行われた。簡単に説明すると、ダイズ種子（品種マーベリック）を基本培地で
発芽させ、子葉節を単離し、アグロバクテリウムで感染させた。シュート開始、シュート
伸長、および発根培地には、アグロバクテリウムを除去するためのセフォタキシム、チメ
ンチンおよびバンコマイシンが補足される。除草剤を介した選択を、非形質転換シュート
の生育を阻害するために使用した。選択されたシュートは、根の発育のために発根培地に
移され、次に、苗木の順化のための土壌ミックスに移される。
【０２３７】
選択された苗木の末端の小葉を、推定の形質転換体をスクリーニングするために、除草
剤（葉塗装技術）で局所的に処理した。スクリーニングされた苗木を、温室に移し、順化
させ、次に、除草剤で葉を塗装し、耐性を再確認した。これらの推定の形質転換されたＴ
０植物をサンプリングし、分子分析を用いて、除草剤選択マーカーおよびｄｇｔ−２８導
入遺伝子の存在を確認した。Ｔ０植物を温室で自家受粉させ、Ｔ１種子を作製した。
【０２３８】
第２のダイズ形質転換法を用いて、追加のトランスジェニックダイズ植物を作製するこ
とができる。機能的ｄｇｔ−２８を含むバイナリーベクターを担持する安全化されたアグ
ロバクテリウム株を使用して、形質転換を開始する。
【０２３９】
アグロバクテリウムを媒介した形質転換は、Paz et al.（Paz M., Martinez J., Kalvi
g A., Fonger T., and Wang K., (2005) Plant Cell Rep., 25: 206-213）の修正された
半種子手法を用いて実施された。簡単に説明すると、成熟ダイズ種子を、塩素ガスで一晩
滅菌し、アグロバクテリウムを媒介した植物形質転換の２０時間前に滅菌Ｈ２Ｏを吸収さ
せた。種子は、種子を分離し、種皮を除去するために、へそに沿って長手方向の切り込み
によって半分に切断した。胚軸を切除し、いずれもの軸方向のシュート／芽を子葉節から
除去した。得られた半種子の外植片をアグロバクテリウムで感染させた。シュート開始、
シュート伸長、および発根培地には、アグロバクテリウムを除去するためのセフォタキシ
ム、チメンチンおよびバンコマイシンが補足された。除草剤選択を、非形質転換シュート
の生育を阻害するために使用した。選択されたシュートを、根の発育のために発根培地に
移し、次に、苗木の順化のための土壌ミックスに移した。
【０２４０】
推定の形質転換されたＴ０植物をサンプリングし、分子分析を用いて、選択マーカーお
よびｄｇｔ−２８導入遺伝子の存在を確認した。いくつかの事象は、導入遺伝子を含むも
のとして同定される。これらのＴ０植物を、さらなる分析に進め、温室で自家受粉させ、
Ｔ１種子を生じさせた。
【０２４１】
ｄｇｔ−２８形質転換Ｔ１ダイズにおける発芽後の除草剤耐性。前述のスクリーニング
法によって、遺伝可能性であることが決定されたＴ１事象由来の種子は、温室条件下でメ
トロミックス培地に植え付けられた。第１の三つ葉が完全に展開されるまで植物を生育さ
せ、前述のように、ｐａｔ遺伝子の選択のために４１１ｇ  ａｅ／ｈａのＩＧＮＩＴＥ（
商標）２８０ＳＬで処理した。それぞれの事象由来の抵抗性植物は、固有の識別子が与え
られ、ｄｇｔ−２８遺伝子の接合性分析のためにサンプリングされた。接合性データは、
十分な植物が存在する場合に処理あたり全４つの複製物について可能にする、適用された
それぞれの比率のグリホサートに、２つのヘミ接合複製物と２つのホモ接合複製物を割り
当てるために使用された。これらの植物は、野生型のプチハバナタバコと比較された。す
べての植物は、１８７Ｌ／ｈａで設定されたトラック噴霧器で噴霧された。植物は、５６
０〜４４８０ｇ  ａｅ／ｈａの範囲のＤＵＲＡＮＧＯ（商標）ジメチルアミン塩（ＤＭＡ
）から噴霧された。すべての適用は、２％ｗ／ｖの硫酸アンモニウム（ＡＭＳ）の添加と
ともに水中で製剤化された。植物は、処理の７日および１４日後に評価された。植物は、
全体的な視覚的な発育阻害、白化、および壊死に関して損傷評価が割り当てられた。Ｔ１
世代は分離されているので、いくつかの変数応答は接合性の違いにより期待される。
【０２４２】
【表２２】
2019047803.tif 000027
【０２４３】
Ｔ２世代における高いグリホサート率に対するｄｇｔ−２８保護。４５個の植物の後代
検定は、構築物あたりｄｇｔ−２８の２〜５個のＴ２株に対して行われた。ホモ接合体株
は、前の世代に完成した接合性分析に基づいて選択された。前述のように種子を植え付け
た。次に、植物は、前述のようなｐａｔ選択マーカーの選択のために、４１１ｇ  ａｅ／
ｈａのＩＧＮＩＴＥ  ２８０ＳＬで噴霧された。３ＤＡＴ後、抵抗性および感受性植物を
カウントした。
【０２４４】
ｄｇｔ−２８と連結されたＴｒａＰ４を含む構築物（ｐＤＡＢ１０７５４３およびｐＤ
ＡＢ１０７５４８）について、試験された１２個の株のうち９個は分離せず、それによっ
て、Ｔ２世代において均一な株を確認した。ｄｇｔ−２８と連結されたＴｒａＰ８を含む
株（ｐＤＡＢ１０７５４５）は、４つの株のうち２つは分離がないことを実証し、ダイズ
におけるｄｇｔ−２８の少なくとも２つの世代を介したメンデル遺伝を実証した。組織試
料は、抵抗性植物から採取され、ＤＧＴ−２８タンパク質は、標準的なＥＬＩＳＡ法によ
って定量された。データは、試験された非分離のＴ２株について、３２．８〜１０７．５
ｎｇ／ｃｍ２のある範囲の平均ＤＧＴ−２８タンパク質を実証した。構築物ｐＤＡＢ１０
７５５３（ＴｒａＰ２３：：ｄｇｔ−２８）由来の株は、グルホシネートで以前に選択さ
れなかった。グリホサートの用量反応は、均質性と高い比率のグリホサートに対する耐性
を試験するために利用された。構築物ｐＤＡＢ１０７５５３由来の株からの複製物は、５
６０〜４４８０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートの範囲の比率に耐性であり、したがって、
少なくとも２つの世代で均質な集団であり、遺伝可能性であることが確認された。
【０２４５】
５６０〜４４８０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートの範囲のＤＵＲＡＮＧＯ  ＤＭＡの比
率は、前述のように２〜３個の三つ葉のダイズに適用された。１４ＤＡＴの視覚的損傷デ
ータは、Ｔ１世代において実証された耐性結果を確認した。
【０２４６】
【表２３】
2019047803.tif 000028
【０２４７】
ｄｇｔ−２８を用いたイネの形質転換。典型的な形質転換法において、安定に組み込ま
れたｄｇｔ−２８導入遺伝子を含むトランスジェニックイネ（コメ（Oryza sativa））は
、滅菌したイネ種子のアグロバクテリウムを媒介した形質転換を介して生成される。機能
的ｄｇｔ−２８を含むバイナリーベクターを担持する安全化されたアグロバクテリウム株
は、形質転換を開始するために使用される。
【０２４８】
培養培地は、１ＭのＫＯＨでｐＨ５．８に調整され、２．５ｇ／ｌのＰｈｙｔａｇｅｌ
（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で固化される。胚発生カルス
は、３０ｍｌの半固形培地を含む１００×２０ｍｍのペトリ皿中で培養される。イネ苗木
は、ＭＡＧＥＮＴＡボックス中の５０ｍｌの培地上で生育される。細胞懸濁液は、３５ｍ
Ｌの液体培地を含む１２５ｍｌのコニカルフラスコ中で維持され、１２５ｒｐｍで回転さ
せる。胚発生培養の誘導および維持は、２５〜２６℃にて暗所で発生させ、植物再生およ
び全植物体培養は、１６時間の光周期（Ｚｈａｎｇら、１９９６）を用いて照明の部屋で
発生させる。
【０２４９】
胚発生カルスの誘導および維持は、前述されるような改変されたＮＢ基礎培地（Ｌｉら
、１９９３）上で行われ、ここで、培地は、５００ｍｇ／Ｌのグルタミンを含むように適
合される。懸濁培養物は、マルトースの代わりに３０ｇ／Ｌのスクロースを含む、ＳＺ液
体培地（Ｚｈａｎｇら、１９９８）中で開始され、維持される。浸透培地（ＮＢＯ）は、
それぞれ０．２５６Ｍのマンニトールとソルビトールの添加を伴うＮＢ培地からなる。除
草剤抵抗性カルスは、３〜４週間、適切な除草剤選択剤が補足されたＮＢ培地上で選択さ
れる。プレ再生は、１週間、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、１ｍｇ／
ｌのα−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、５ｍｇ／ｌのアブシジン酸（ＡＢＡ）と選択的除草
剤を含むＮＢ培地からなる培地（ＰＲＨ５０）上で行われる。苗木の再生は、推定上、ト
ランスジェニックシュートが再生されるまで、２，４−Ｄ、０．５ｍｇ／ｌのＮＡＡおよ
び選択的除草剤を含有するＮＢ培地を含む再生培地（ＲＮＨ５０）上での培養に続く。シ
ュートは、１％スクロースと選択的除草剤が補足された、半強度のＭｕｒａｓｈｉｇｅお
よびＳｋｏｏｇ基本塩とＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミンを含む発根培地に移される。
【０２５０】
コメ（Oryza sativa）Ｌ．ジャポニカ品種Ｔａｉｐｅｉ３０９の成熟乾燥種子は、Ｚｈ
ａｎｇら、１９９６に記載されるように滅菌される。胚発生組織は、暗所においてＮＢ培
地上で滅菌成熟イネ種子を培養することによって誘導される。約１ｍｍ径の一次カルスは
、胚盤から取り出され、ＳＺ液体培地中で細胞懸濁を開始するために使用される。次に、
懸濁液は、Zhang、1996に記載されるように維持される。懸濁誘導された胚発生組織は、
先の継代培養から３〜５日後、液体培地から取り出され、ＮＢＯ浸透培地上に配置され、
ペトリ皿全体において約２．５ｃｍの円を形成し、照射前４時間、培養される。照射の１
６〜２０時間後、組織をＮＢＯ培地からＮＢＨ５０選択培地に移し、照射表面が上を向い
ていることを確認し、暗所にて１４〜１７日間インキュベートされる。次に、新たに形成
されたカルスは、元の照射された外植片から分離され、同じ培地上で、近くに配置される
。さらに８〜１２日後、比較的にコンパクトであり、不透明なカルスは、視覚的に識別さ
れ、暗所での７日間、ＰＲＨ５０プレ再生培地に移される。次に、よりコンパクトで不透
明になる成長中のカルスは、１６時間の光周期の下で１４〜２１日間、ＲＮＨ５０再生培
地上で継代培養される。再生中のシュートは、１／２のＭＳＨ５０培地を含むＭＡＧＥＮ
ＴＡボックスに移される。単一の外植片から再生された複数の植物は、同胞種であると考
えられ、１つの独立した植物株として処理される。植物は、厚く、白い根を生成し、１／
２のＭＳＨ５０培地上で積極的に成長している場合、ｄｇｔ−２８遺伝子について陽性と
して採点される。苗木がＭＡＧＥＮＴＡボックスの最上部に達すると、１００％湿度で１
週間、６ｃｍポット中の土壌に移され、次に、３０℃にて１４時間の光周期の成長チャン
バーに移動させ、温室において１３ｃｍポットに移植される前に、２１℃にて２〜３週間
、暗所に配置される。種子を回収し、４℃で保存する前に１週間、３７℃で乾燥させる。
【０２５１】
ｄｇｔ−２８イネのＴ０分析。アグロバクテリウム形質転換を介して得られた植え付け
られたイネ形質転換体を培地に移植し、温室条件に順化させた。すべての植物は、ｄｇｔ
−２８のＰＣＲ検出のためにサンプリングされ、結果は、ｐＤＡＢ１１０８２７（Ｔｒａ
Ｐ８：：ｄｇｔ−２８）について２２個のＰＣＲ陽性事象と、ｐＤＡＢ１１０８２８（Ｔ
ｒａＰ２３：：ｄｇｔ−２８）について１６個のＰＣＲ陽性事象の最小を実証する。ＰＣ
Ｒ陽性事象のｄｇｔ−２８についてのサザン分析は、両方の構築物について単一（１〜２
コピー）事象を実証した。選択されたＴ０事象のタンパク質発現は、ＤＧＴ−２８タンパ
ク質の発現が、検出レベル未満から１３０ｎｇ／ｃｍ２の範囲であることを実証した。構
築物ｐＤＡＢ１１０８２８からの選択されたＴ０事象は、前述されるように２２４０ｇ  
ａｅ／ｈａのＤＵＲＡＮＧＯ  ＤＭＡ（商標）で処理され、処置の７および１４日後に評
価された。データは、適用されたグリホサートの比率に強固な耐性を実証した。すべての
ＰＣＲ陽性植物は、さらなる特徴付けのためにＴ１種子を生成させた。
【０２５２】
イネにおけるｄｇｔ−２８遺伝可能性。１００個の植物後代検定は、葉緑体輸送ペプチ
ドＴｒａＰ８を含む構築物ｐＤＡＢ１１０８２７からのｄｇｔ−２８の４つのＴ１株にお
いて行われた。種子は、培地で満たされたポットに植えられた。次に、すべての植物は、
前述されるように、ｄｇｔ−２８遺伝子の選択について、５６０ｇ  ａｅ／ｈａのＤＵＲ
ＡＮＧＯ  ＤＭＡ（商標）で噴霧された。７ＤＡＴ後、抵抗性および感受性の植物をカウ
ントした。それぞれの構築物について試験された４つの株のうちの２つは、カイ二乗分析
によって決定されるように、単一の遺伝子座の優性メンデル形質（３Ｒ：１Ｓ）として分
離された。ｄｇｔ−２８は、複数種における遺伝可能なグリホサート抵抗性遺伝子である
。
【０２５３】
ｄｇｔ−２８形質転換されたＴ１イネにおける発芽後の除草剤耐性。後代検定において
使用されるそれぞれの事象からのＴ１抵抗性植物は、固有の識別子が与えられ、ｄｇｔ−
２８遺伝子の接合性分析のためにサンプリングされた。接合性データは、処理あたり全４
つの複製物について可能にする、適用されたそれぞれの比率のグリホサートに、２つのヘ
ミ接合複製物と２つのホモ接合複製物を割り当てるために使用された。これらの植物は、
野生型のキタアケイネと比較された。すべての植物は、１８７Ｌ／ｈａで設定されたトラ
ック噴霧器で噴霧された。植物は、５６０〜２２４０ｇ  ａｅ／ｈａの範囲のＤＵＲＡＮ
ＧＯ  ＤＭＡ（商標）から噴霧された。すべての適用は、２％ｗ／ｖの硫酸アンモニウム
（ＡＭＳ）の添加とともに水中で製剤化された。植物は、処理の７日および１４日後に評
価された。植物は、全体的な視覚的な発育阻害、白化、および壊死に関して損傷評価が割
り当てられた。Ｔ１世代は分離されているので、いくつかの変数応答は接合性の違いによ
り期待される。
【０２５４】
噴霧結果は、７ＤＡＴ（処置後の日数）で、高い比率のグリホサートに対する最小植物
損傷が検出されたことを実証する（データ示さず）。
【０２５５】
【表２４】
2019047803.tif 000029
【０２５６】
ＤＧＴ−２８のタンパク質検出は、ｐＤＡＢ１１０８２７から試験された４つすべての
Ｔ１株からの複製物について評価された。データは、ＤＧＴ−２８平均タンパク質が、ヘ
ミ接合複製物とホモ接合複製物について、それぞれ２０〜８２ｎｇ／ｃｍ２と２１〜２０
９ｎｇ／ｃｍ２の範囲であることを実証した。これらの結果は、Ｔ１世代に対する安定な
タンパク質発現と、選択のために使用された５６０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサート適用後
の最大２２４０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートまでのｄｇｔ−２８イネの耐性を実証した
。
【０２５７】
ｄｇｔ−２８を用いたタバコの形質転換。タバコ（cv. Petit Havana）の葉片を、ｄｇ
ｔ−２８導入遺伝子を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tume
faciens）を用いて形質転換した。ｄｇｔ−２８導入遺伝子を含むプラスミドを含有する
単一コロニーを、スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍＬ）とストレプトマイシン（１２５
μｇ／ｍＬ）を含有する４ｍＬのＹＥＰ培地に植菌し、１９０ｒｐｍの振とう機上で一晩
２８℃にてインキュベートした。その後、４ｍＬの種子培養物を用いて、１２５ｍＬのバ
ッフルされた三角フラスコ中で同じ培地の２５ｍＬの培養物を植菌した。この培養物を、
ＯＤ６００が約１．２に達するまで１９０ｒｐｍで振とうしながら２８℃にてインキュベ
ートした。次に、１０ｍＬのアグロバクテリウム懸濁液を、滅菌した６０×２０ｍｍのペ
トリ（商標）皿に配置した。
【０２５８】
ＰｈｙｔａＴｒａｙｓ（商標）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）における３０
ｇ／Ｌのスクロースを含むＭＳ培地（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｓ、Ｓｈ
ａｗｎｅｅ  Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）上で無菌で成長させた植物の新鮮なカットされた葉
片（０．５ｃｍ２）を、アグロバクテリウムの１０ｍＬの一晩培養物に数分間浸漬させ、
滅菌ろ紙上にブロット乾燥させ、次に、１ｍｇ／Ｌインドール酢酸および１ｍｇ／Ｌの６
−ベンジルアミノプリンの添加を伴う同じ培地上に配置した。３日後、ｄｇｔ−２８導入
遺伝子を保有するアグロバクテリウムと共培養された葉片を、５ｍｇ／ＬのＢａｓｔａ（
商標）および２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを含む同じ培地に移した。
【０２５９】
３週間後、個々のＴ０苗木を、１０ｍｇ／ＬのＢａｓｔａ（商標）および２５０ｍｇ／
Ｌのセフォタキシムを含むＭＳ培地に移し、さらに３週間後、土壌に移植し、温室に移す
。選択されたＴ０植物（上述の分子分析プロトコールを用いて同定される）に、自家受粉
させ、完全に乾燥したとき、種子をカプセルから回収した。Ｔ１実生は、接合性およびレ
ポーター遺伝子発現（後述）についてスクリーニングされ、ｄｇｔ−２８導入遺伝子を含
む選択された植物を同定した。
【０２６０】
植物は、根から寒天を洗浄し、１３．７５ｃｍの正方形ポット中の土壌に移植し、ポッ
トをＺｉｐｌｏｃ（登録商標）バッグ（ＳＣ  Ｊｏｈｏｎｓｏｎ  ＆  Ｓｏｎ，Ｉｎ．）
に置き、バッグの底に水道水を入れ、間接光中の３０℃の温室に１週間置くことによって
温室に移動された。３〜７日後、バッグを開封した；植物を受精し、植物が温室で順化さ
れるまで開封したバッグで成長させた。その時点でバッグを除去した。植物は、通常の暖
かい温室条件（日中２７℃、夜間２４℃、日中１６時間、最小の自然光＋補足光＝１２０
０μΕ／ｍ２ｓ１）下で成長させた。
【０２６１】
繁殖前に、Ｔ０植物をＤＮＡ分析のためにサンプリングし、リアルタイムＰＣＲによっ
てインサートｄｇｔ−２８のコピー数を決定した。新鮮な組織をチューブに入れ、４℃に
て２日間凍結乾燥した。組織が完全に乾燥した後、タングステンビーズ（Ｖａｌｅｎｉｔ
ｅ）をチューブ中に配置し、試料をＫｅｌｃｏビーズミルを用いた１分間の乾式粉砕に供
した。次に、標準のＤＮｅａｓｙ（商標）ＤＮＡ単離手法を続けた（Ｑｉａｇｅｎ、ＤＮ
ｅａｓｙ  ６９０１９）。抽出したＤＮＡのアリコートをピコグリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｐ７５８９）で染色し、既知の標準とともに蛍光光度計（ＢｉｏＴ
ｅｋ（商標））において読み出し、濃度（ｎｇ／μｌ）を得た。総ＤＮＡの全１００ｎｇ
を鋳型として使用した。ＰＣＲ反応は、９７００Ｇｅｎｅａｍｐ（商標）サーモサイクラ
ー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において実施され、試料を９４℃で３分間
と、９４℃で３０秒間、６４℃にて３０秒間および７２℃で１分４５秒の３５サイクル、
ならびに７２℃で１０分間に供した。ＰＣＲ産物をＥｔＢｒで染色した１％アガロースゲ
ル上の電気泳動によって分析し、サザンブロットによって確認した。
【０２６２】
異なる葉緑体輸送ペプチド配列を含む３つの構築物（ＴｒａＰ４、ＴｒａＰ８およびＴ
ｒａＰ２３）からのｄｇｔ−２８遺伝子の１〜３コピーを有する５〜９個のＰＣＲ陽性事
象を再生し、温室に移した。
【０２６３】
すべてのＰＣＲ陽性植物は、標準的なＥＬＩＳＡによってＤＧＴ−２８タンパク質の定
量のためにサンプリングされた。ＤＧＴ−２８タンパク質は、すべてのＰＣＲ陽性植物に
おいて検出され、タンパク質濃度が増加する傾向は、ｄｇｔ−２８のコピー数の増加とと
もに注目された。
【０２６４】
タバコにおけるａａｄ−１２（ｖ１）遺伝可能性。１００個の植物の後代検定は、構築
物あたりｄｇｔ−２８の５つのＴ１株について行われた。構築物は、以下の葉緑体輸送ペ
プチド配列：ＴｒａＰ４、ＴｒａＰ８またはＴｒａＰ２３の１つを含んだ。種子は、大部
分、上記で例示されたアラビドプシス属（Arabidopsis）手法のように、層状にし、播種
され、植え付けられたが、ヌル植物は、植え付け前に初期の選択によって除かれなかった
ことを除く。次に、すべての植物は、前述されるように、ｐａｔ選択マーカーの選択のた
めに、２８０ｇ  ａｅ／ｈａのＩＧＮＩＴＥ  ２８０ＳＬで噴霧された。３ＤＡＴ後、抵
抗性および感受性植物をカウントした。
【０２６５】
それぞれの構築物について試験された５つの株のうちの４つは、カイ二乗分析によって
決定されるように、単一の遺伝子座の優性メンデル形質（３Ｒ：１Ｓ）として分離された
。ｄｇｔ−２８は、複数種における遺伝可能なグリホサート抵抗性遺伝子である。
【０２６６】
ｄｇｔ−２８形質転換されたＴ１タバコにおける発芽後の除草剤耐性。後代検定におい
て使用されるそれぞれの事象からのＴ１抵抗性植物は、固有の識別子が与えられ、ｄｇｔ
−２８遺伝子の接合性分析のためにサンプリングされた。接合性データは、処理あたり全
４つの複製物について可能にする、適用されたそれぞれの比率のグリホサートに、２つの
ヘミ接合複製物と２つのホモ接合複製物を割り当てるために使用された。これらの植物は
、野生型のプチハバナ（Petite havana）タバコと比較された。すべての植物は、１８７
Ｌ／ｈａで設定されたトラック噴霧器で噴霧された。植物は、５６０〜４４８０ｇ  ａｅ
／ｈａの範囲のＤＵＲＡＮＧＯ  ＤＭＡ（商標）から噴霧された。すべての適用は、２％
ｗ／ｖの硫酸アンモニウム（ＡＭＳ）の添加とともに水中で製剤化された。植物は、処理
の７日および１４日後に評価された。植物は、全体的な視覚的な発育阻害、白化、および
壊死に関して損傷評価が割り当てられた。Ｔ１世代は分離されているので、いくつかの変
数応答は接合性の違いにより期待される。
【０２６７】
噴霧結果は、７ＤＡＴ（処置後の日数）で、高い比率のグリホサートに対する最小植物
損傷が検出されたことを実証する（データ示さず）。１４ＤＡＴ後、視覚的損傷データは
、構築物ＴｒａＰ８およびＴｒａＰ２３からの単一コピーの事象と比較して、ＴｒａＰ４
を含む構築物の単一コピー事象を用いて損傷の増加を実証する。表２５。
【０２６８】
【表２５】
2019047803.tif 000030
【０２６９】
これらの結果は、最大４４８０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートまでのｄｇｔ−２８の耐
性、ならびにｄｇｔ−２８遺伝子に連結された葉緑体輸送ペプチド配列によって与えられ
る耐性における相違を実証した。
【０２７０】
Ｔ２世代における高いグリホサート比率に対するｄｇｔ−２８保護。２５個の植物の後
代検定は、構築物あたりｄｇｔ−２８の２〜３個のＴ２株について行われた。ホモ接合体
株は、前の世代において完成された接合性分析に基づいて選択された。前述のように、種
子を層状にし、播種し、および移植した。次に、すべての植物は、前述のように、ｐａｔ
選択マーカーの選択のために、２８０ｇ  ａｅ／ｈａのＩｇｎｉｔｅ  ２８０ＳＬで噴霧
された。３ＤＡＴ後、抵抗性と感受性の植物をカウントした。それぞれの構築物について
試験されたすべての株は分離せず、それによって、Ｔ２世代において均一な株を確認し、
タバコにおけるｄｇｔ−２８の少なくとも２つの世代を介したメンデル遺伝を実証した。
【０２７１】
４２０〜３３６０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートの範囲のＤＵＲＡＮＧＯ  ＤＭＡ（商
標）の比率は、前述したように、２〜３枚の葉タバコに適用された。視覚的損傷データ１
４ＤＡＴは、Ｔ１世代において実証された耐性の結果を確認した。ＴｒａＰ４を含む構築
物由来の２コピー株からの葉面結果が単一コピーのＴｒａＰ８およびＴｒａＰ２３株と同
様の耐性を示した（データは示さず）。
【０２７２】
【表２６】
2019047803.tif 000031
【０２７３】
データは、非形質転換対照と比較して、２つの世代を通じて最大３３６０ｇ  ａｅ／ｈ
ａのグリホサートまでｄｇｔ−２８タバコの強固な耐性を実証する。
【０２７４】
それぞれの事象から選択された植物は、標準的なＤＧＴ−２８  ＥＬＩＳＡによって、
ＤＧＴ−２８タンパク質の分析のために、グリホサート適用前にサンプリングされた。デ
ータは、７２．８〜１１４．５ｎｇ／ｃｍ２の範囲の構築物全体で単一（１〜２コピー）
株のＤＧＴ−２８平均タンパク質発現を実証した。データは、形質転換されたタバコのＴ
２世代において、ｄｇｔ−２８がタンパク質を発現していることを実証し、耐性データは
、機能的なＤＧＴ−２８タンパク質を確認する。
【０２７５】
タバコ（cv. Petit Havana）における除草スペクトルを増加させるためのｄｇｔ−２８
のスタッキング。ホモ接合ｄｇｔ−２８（ｐＤＡＢ１０７５４３とｐＤＡＢ１０７５４５
）およびａａｄ−１２  ｖ１（ｐＤＡＢ３２７８）植物（後者について、参照により全体
として本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４２１３３参照）はともに相互
交雑され、Ｆ１種子を回収した。それぞれの遺伝子の２つの相互交雑からのＦ１種子は層
状にされ、それぞれの交雑の処理された６個の代表は、１１２０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホ
サート（ｄｇｔ−２８遺伝子について選択的である）、１１２０ｇ  ａｅ／ｈａの２，４
−Ｄ（ａａｄ−１２遺伝子について選択的である）、または記載される比率での２つの除
草剤のタンク混合物で処理された。植物は、１４ＤＡＴで等級付けされた。噴霧結果を表
２７に示す。
【０２７６】
【表２７】
2019047803.tif 000032
【０２７７】
結果は、ｄｇｔ−２８がａａｄ−１２（ｖ１）と首尾よく積層され得ることを確認し、
したがって、対象とする作物に適用され得るスペクトル除草剤（ｄｇｔ−２８およびａａ
ｄ−１２についてそれぞれグリホサート＋フェノキシ酢酸）を増やす。防除が難しい広葉
雑草または抵抗性雑草生物型が存在する作物生産において、積層は雑草防除および対象と
する作物の保護の手段として使用され得る。追加のインプットまたはアウトプット特性は
また、ｄｇｔ−２８遺伝子を用いて積層することができる。
【０２７８】
コムギにおけるグリホサートに対する抵抗性。ＤＧＴ−２８をコードするバイナリーベ
クターの製造。ＤＧＴ−２８発現およびＰＡＴ選択カセットを含むバイナリーベクターを
設計し、当該技術分野において一般的に知られている技法および技術を用いて組み立てた
。それぞれのＤＧＴ−２８発現カセットは、プロモーター、トウモロコシ（Zea mays）由
来のユビキチン（Ｕｂｉ）遺伝子からの５’非翻訳領域とイントロン（Toki et al., Pla
nt Physiology 1992, 100 1503-07）、続く５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸
シンターゼ遺伝子（ＤＧＴ−２８）の合成バージョンの５’端に融合された４つの輸送ペ
プチドのうちの１つ（ＴｒａＰ４、ＴｒａＰ８、ＴｒａＰ２３またはＴｒａＰ５）からな
るコード配列を含み、植物における発現にコドン最適化されている。ＤＧＴ−２８発現カ
セットは、トウモロコシ（Z. mays）由来のリパーゼ遺伝子（Ｖｐ１）の転写ターミネー
ターとポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域（ＵＴＲ）（Paek et al., Mol. Cells 
1998 30;8(3) 336-42）を用いて終了させた。ＰＡＴ選択カセットは、プロモーター、コ
メ（Oryza sativa）由来のアクチン（Ａｃｔ１）遺伝子からの５’非翻訳領域とイントロ
ン（McElroy et al., The Plant Cell 1990 2( 2) 163-171）、続くストレプトマイセス
・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）から単離されたホスフィノト
リシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子の合成バージョンから構成され、植
物における発現にコドン最適化されている。ＰＡＴ遺伝子は、ホフィノトリシン、グルホ
シネート、およびビアラホスを含むグルタミン合成酵素の阻害剤に対する抵抗性を付与す
るタンパク質をコードする（Wohlleben et al., Gene 1988, 70(1), 25-37）。選択カセ
ットは、転写ターミネーターとカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５ｓ遺伝
子（Chenault et al., Plant Physiology 1993 101 (4), 1395-1396）からのポリアデニ
ル化部位を含む３’ＵＴＲで終了された。
【０２７９】
選択カセットは、市販の遺伝子合成販売会社（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ）によって合成され、およびゲートウェイ対応のバイナリーベクターにク
ローニングされた。ＤＧＴ−２８発現カセットをｐＤＯＮＲ２２１にサブクローニングし
た。得られたエントリークローンは、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（
ＰＡＴ）発現カセットをコードするゲートウェイ対応のバイナリーベクターを用いて、Ｌ
ＲクロナーゼＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）反応
に使用された。すべての組み立てられたプラスミドのコロニーは、最初に、Ｎｅｗ  Ｅｎ
ｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ；Ｉｐｓｗｉｓｈ、ＭＡ）とＰｒｏｍｅｇａ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＷＩ）から得られた制限エンドヌクレアーゼを用
いて、精製されたＤＮＡの制限消化によってスクリーニングされた。プラスミドＤＮＡ調
製物は、供給業者の指示に従って、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット
（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ）またはＰｕｒｅ  Ｙｉｅｌｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘ
ｉｐｒｅｐシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＷＩ）を用いて実施さ
れた。選択されたクローンのプラスミドＤＮＡは、ＡＢＩ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇとＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１サイクル配列決定プロトコ
ール（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
を用いて配列決定された。配列データを集め、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェ
ア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用
いて分析した。
【０２８０】
得られた４つのバイナリー発現クローン：ｐＤＡＳ０００１２２（ＴｒａＰ４−ＤＧＴ
２８）、ｐＤＡＳ０００１２３（ＴｒａＰ８−ＤＧＴ２８）、ｐＤＡＳ０００１２４（Ｔ
ｒａＰ２３−ＤＧＴ２８）およびｐＤＡＳ０００１２５（ＴｒａＰ５−ＤＧＴ２８）はそ
れぞれ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＥＨ
Ａ１０５に形質転換された。
【０２８１】
ｄｇｔ−２８発現構築物を用いたトランスジェニックコムギ事象の生成。４つのＤＧＴ
−２８発現構築物のうちの１つを発現するトランスジェニックコムギ植物は、Wuら、Tran
sgenic Research 2008、17:425-436に類似したプロトコールに従って、ドナーコムギ株Ｂ
ｏｂｗｈｉｔｅ  ＭＰＢ２６ＲＨを使用して、アグロバクテリウムを媒介した形質転換に
よって生成された。推定されるＴ０トランスジェニック事象は、ホスフィノトリシン（Ｐ
ＰＴ）耐性について選択され、表現型はＰＡＴ選択マーカーによって付与され、土壌に移
された。Ｔ０植物を温室の閉じ込められた条件下で成長させ、Ｔ１種子を作製した。全体
として、約４５個の独立したＴ０事象が、それぞれのＤＧＴ−２８発現構築物について生
成された。
【０２８２】
Ｔ０コムギｄｇｔ−２８コムギ事象におけるグリホサート抵抗性。Ｔ０事象を温室で順
化させ、２〜４枚の新しく、通常に見える葉が渦巻きから出現するまで成長させた（すな
わち、植物は、組織培養から温室生育条件に移行された）。植物は、成熟するまで温室で
１２時間の補足照明下で、２５℃にて成長させた。グリホサート耐性とＴａｑｍａｎ分析
の初期スクリーニングは、前述したように、同じ条件下で成長させたＴ１植物について完
了された。データは、さらに特徴付けられる遺伝可能なＴ１事象の決定を可能にした。６
つの低コピー（１〜２コピー）と２つのマルチコピーＴ１事象は、温室条件下で植え替え
られ、３葉期まで成長させた。Ｔ１植物は、非形質転換のコムギ株に重大な損傷を与える
ことができる４２０〜３３６０ｇ  ａｅ／ｈａの範囲のグリホサートの市販製剤（Ｄｕｒ
ａｎｇｏ  ＤＭＡ（商標））で噴霧された。２％ｗ／ｖの硫酸アンモニウムの添加は適用
に含まれた。致死量は、Ｂｏｂ  Ｗｈｉｔｅ  ＭＰＢ２６ＲＨ非形質転換対照に対して＞
７５％損傷を引き起こす比率として定義される。除草剤を適用した。
【０２８３】
この実施例では、グリホサート適用は、Ｔ１世代におけるｄｇｔ−２８遺伝子の分離を
決定すること、ならびにグリホサートの増加レベルに対する耐性を実証することについて
利用された。植物の応答は、処理から２１日後（ＤＡＴ）の視覚的損傷の規模に関して提
示される。データは、２５％未満の視覚損傷（４）、２５％〜５０％の視覚損傷（３）、
５０％〜７５％の視覚損傷（２）、および７５％を超える損傷（１）を提示する個体のヒ
ストグラムとして示される。算術平均および標準偏差は、コムギ形質転換のために使用さ
れる各構築物について提示されている。個別の応答におけるスコア範囲もまた、それぞれ
の比率および形質転換に関して、最後の列に示される。野生型、非形質転換コムギ（栽培
品種Ｂｏｂ  Ｗｈｉｔｅ  ＭＰＢ２６ＲＨ）は、グリホサート感受性対照として用いた。
Ｔ１世代において、ヘミ接合およびホモ接合植物は、それぞれの事象についての試験に利
用可能であり、したがって、試験されたグリホサートのそれぞれの比率について含まれた
。ヘミ接合植物は、ホモ接合植物としての遺伝子の用量の半分を含み、したがって、グリ
ホサートに対する応答の変動性は、Ｔ１世代で予想され得る。
【０２８４】
Ｔ１のｄｇｔ−２８コムギ植物の結果は、グリホサートに対する耐性が、葉緑体輸送ペ
プチドＴｒａＰ４、ＴｒａＰ５、ＴｒａＰ８およびＴｒａＰ２３を用いて、最大３３６０
ｇ  ａｅ／ｈａの比率で達成されることを実証した。表２８。データは、低コピーのＴ１
事象のものであるが、それぞれの構築物について、集団の代表的なものである。
【０２８５】
【表２８】
2019047803.tif 000033
【０２８６】
２１ＤＡＴで、抵抗性および感受性植物をカウントし、カイ二乗分析によって決定され
るように、単一の遺伝子座の優性メンデル形質（３Ｒ：１Ｓ）として分離された株の割合
を決定する。表２９。これらのデータは、ｄｇｔ−２８が単子葉植物種において強固なグ
リホサート抵抗性遺伝子として遺伝可能であることを実証する。
【０２８７】
【表２９】
2019047803.tif 000034
【実施例４】
【０２８８】
トウモロコシにおける農学的に重要な導入遺伝子を発現させるための合成葉緑体輸送ペプ
チド（ＴｒａＰ）配列
Ｃｒｙ２Ａａ：
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）由来のＣｒｙ２Ａａタンパ
ク質は、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）（ＣＥＷ）およびヨーロッパアワノメイ
ガ（Ostrinia nubilalis）（ＥＣＢ）に対して活性を実証した。ｃｒｙ２Ａａ遺伝子（配
列番号１３）の単一バージョンは、トウモロコシのための偏ったコドンであり、トウモロ
コシにおいて試験された。この実験では、Ｃｒｙ２Ａａは、単独で、およびトウモロコシ
におけるＴｒａＰ２３合成葉緑体輸送ペプチドと組み合わせて評価され、昆虫耐性活性を
決定し、ＴｒａＰ２３合成葉緑体輸送ペプチド配列がトウモロコシにおけるＣｒｙ２Ａａ
タンパク質の発現に及ぼす効果を評価した。
【０２８９】
ＴｒａＰ１２  ｖ２合成葉緑体輸送ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（配列
番号１２）およびＧＣＡコドンリンカーは、ｃｒｙ２Ａａ遺伝子の上流にクローニングさ
れ、トウモロコシ植物における昆虫耐性試験のために構築物ｐＤＡＢ１０９８０８に組み
込まれた（図７）。得られた構築物は２つの植物転写単位（ＰＴＵ）を含有した。第１の
ＰＴＵは、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター（ＺｍＵｂｉ１プロモー
ター；Christensen, A., Sharrock R., and Quail P., (1992) Maize polyubiquitin gen
es: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and p
romoter activity following transfer to protoplasts by electroporation, Plant Mol
ecular Biology, 18:675-689）、ＴｒａＰ２３−ｃｒｙ２Ａａ融合遺伝子（ＴｒａＰ２３
Ｃｒｙ２Ａａ）、およびトウモロコシ（Zea mays）リパーゼ３’非翻訳領域（ＺｍＬｉ
ｐ  ３’ＵＴＲ；米国特許第７，１７９，９０２号）で構成された。第２のＰＴＵは、サ
トウキビ桿菌状ウイルスプロモーター（ＳＣＢＶプロモーター；米国特許第６，４８９，
４６２号）、ＭＳＶリーダーとアルコールデヒドロゲナーゼ１イントロン６を含有するａ
ａｄ−１除草剤耐性遺伝子（ＡＡＤ−１；米国特許第７，８３８，７３３号、およびＭＳ
Ｖリーダー配列；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＦＪ８８２１４６．１、およびアルコールデヒ
ドロゲナーゼイントロン；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＥＦ５３９３６８．１）、およびトウ
モロコシ（Zea mays）リパーゼ３’非翻訳領域（ＺｍＬｉｐ  ３’ＵＴＲ）で構成された
。ｃｒｙ２Ａａ遺伝子の上流に葉緑体輸送ペプチド配列を含まない対照プラスミドである
ｐＤＡＢ１０７６８７を構築し、研究に含めた（図８）。プラスミドは、植物形質転換用
のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に導入された
。
【０２９０】
トウモロコシ（Zea mays）の栽培品種Ｂ１０４由来の穂を受粉から１０〜１２日後に回
収した。回収された穂は脱穀され、市販の漂白剤（Ｕｌｔｒａ  Ｃｌｏｒｏｘ（登録商標
）殺菌漂白剤、６．１５％次亜塩素酸）とＴｗｅｅｎ２０の２滴の２０％溶液中で２０分
間浸漬させることによって表面殺菌し、層流フード内で滅菌した脱イオン水中で３回濯い
た。未熟接合胚（１．８〜２．２ｍｍの長さ）は、それぞれの穂から無菌的に切り出され
、２μｌの１０％Ｂｒｅａｋ−Ｔｈｒｕ（登録商標）Ｓ２３３界面活性剤を添加した２．
０ｍｌのアグロバクテリウム懸濁液を含む１つまたは複数の微量遠心管に分配された。
【０２９１】
胚単離活動が完了すると、胚のチューブを閉じ、５分間ロッカープラットフォーム上に
置いた。チューブの内容物は、共培養培地のプレートに注ぎ出し、液体アグロバクテリウ
ム懸濁液は、無菌の使い捨てトランスファーピペットを用いて取り出された。胚を含む共
培養プレートは、３０分間、蓋を少し開けた層流フードの背面に配置させた；その時間後
、胚は、顕微鏡を用いて、胚盤が上を向くように配向させた。次に、胚との共培養プレー
トは、さらに１５分間、蓋を少し開けた層流フードの背面に戻された。その後、プレート
を閉じ、３Ｍマイクロポアテープで密封し、約６０μｍｏｌのｍ−２ｓ−１の光強度で２
４時間／日の光を用いて、２５℃にてインキュベーターに置かれた。
【０２９２】
共培養期間後、胚を休息培地に移した。３６個以下の胚をそれぞれのプレートに移した
。プレートを３Ｍマイクロポアテープでラップし、７〜１０日間、約５０μｍｏｌのｍ−
２ｓ−１の光強度で２４時間／日の光を用いて、２７℃にてインキュベートした。次に、
カルス胚を選択Ｉ培地に移した。１８個以下のカルス胚を選択Ｉ培地のそれぞれのプレー
トに移した。プレートを３Ｍマイクロポアテープでラップし、７日間、約５０μｍｏｌの
ｍ−２ｓ−１の光強度で２４時間／日の光を用いて、２７℃にてインキュベートした。次
に、カルス胚を選択ＩＩ培地に移した。１２個以下のカルス胚を選択ＩＩのそれぞれのプ
レートに移した。プレートを３Ｍマイクロポアテープでラップし、１４日間、約５０μｍ
ｏｌのｍ−２ｓ−１の光強度で２４時間／日の光を用いて、２７℃にてインキュベートし
た。
【０２９３】
この段階で、抵抗性カルスをプレ再生培地に移した。９個以下のカルスをプレ再生のそ
れぞれのプレートに移した。プレートを３Ｍマイクロポアテープでラップし、７日間、約
５０μｍｏｌのｍ−２ｓ−１の光強度で２４時間／日の光を用いて、２７℃にてインキュ
ベートした。次に、再生中のカルスをＰｈｙｔａｔｒａｙ（商標）中の再生培地に移し、
７〜１４日間またはシュートが発生するまで、約１５０μｍｏｌのｍ−２ｓ−１の光強度
で、１日あたり１６時間明所／８時間暗所で２８℃にてインキュベートした。５個以下の
カルスをそれぞれのＰｈｙｔａｔｒａｙ（商標）に置いた。次に、一次根を有する小さな
シュートを単離し、シュート／根培地に移した。約６ｃｍ以上の高さの根ざした苗木を土
壌に移植し、ハードニングのために成長チャンバーに移動させた。
【０２９４】
トランスジェニック植物は、全体で固有の識別子が割り当てられ、温室に定期的に移さ
れた。植物は、成長培地（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｔｅｃｈ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ｐｒ
ｏＭｉｘ  ＢＸ、０５８１Ｐ）で充填された小さなポットに、Ｐｈｙｔａｔｒａｙ（商標
）から移植され、加湿ドームで覆われ、植物を順化させた。植物は、Ｖ３〜Ｖ４段階に達
するまで、Ｃｏｎｖｉｒｏｎ（商標）成長チャンバー（２８℃／２４℃、１６時間の光周
期、５０〜７０％ＲＨ、２００μｍｏｌの光強度）内に配置された。この段階は、土壌お
よび厳しい温度に植物を順化させることに役立つ。次に、植物を温室（光曝露タイプ：光
または同化；光の上限：１２００ＰＡＲ；１６時間の日の長さ；日中２７℃／夜間２４℃
）に移動させ、小さなポットから５．５インチ（１４ｃｍ）ポットに移植した。大きなポ
ットに移植してから約１〜２週間後、植物をバイオアッセイのためにサンプリングした。
事象あたり１つの植物をバイオアッセイした。
【０２９５】
選択事象は、遺伝子のコピー数に基づく次世代への進行、ウエスタンブロットによるタ
ンパク質検出、およびバイオアッセイ昆虫に対する活性について同定された。スペクチノ
マイシン抵抗性遺伝子を含む事象が注目されたが、必ずしも進行から省略されなかった。
進行のために選択された事象は、５ガロン（１９Ｌ）のポットに移植された。観察は、い
ずれかの異常な表現型を追跡するために定期的に行われた。浮遊花粉による交雑汚染を防
止するために、シュート袋を毛（ｓｉｌｋ）の出現前にシュート上に置いた。覆いの前に
毛を生成しているいずれものシュートを注目し、シュートを除去した。次に、第２のシュ
ートを覆い、受粉のために使用した。異常シュートを生成した植物またはシュートが全く
ない植物をデータベースに記録した。受粉の前日に毛を刈り込み、花粉を受け入れるよう
に均一なブラシを与え、植物を自家受粉させた。
【０２９６】
Ｔ１選択のための植物は、播種の７日後に噴霧された。それらは、フラットあたり１５
ポットで、Ｍｅｔｒｏ  ３６０の鉢植え用土の４インチ（１０．２ｃｍ）ポットにおいて
成長させた。実生の成長段階は、Ｖ１〜Ｖ１．５であった。発芽が乏しいまたは非常に小
さな植物（渦巻きがまだ閉じている）を含むポットに印を付け、それらを選択評価に含め
なかった。次に、植物の全フラットは、トラック噴霧器適用用の二次キャリアトレイに入
れられた。トレイは、Ｍａｎｄｅｌトラック噴霧器において一度に２つ配置され、８００
２Ｅフラットファンノズル（Ｔｅｅ  Ｊｅｔ）を使用して標的領域に体積１８７Ｌ／ｈａ
を送達するように較正された。３５ｇ  ａｅ／ｈａのＡｓｓｕｒｅ  ＩＩ（キザロホップ
）＋１％ＣＯＣ（穀物油濃縮物）の溶液は適用のために製剤化された。１５ｍｌ／噴霧の
体積を用いて、必要とされる総噴霧溶液を算出した。計算；（３５ｇ  ａｅ／ｈａ）×（
１ｈａ／１８７Ｌ）×（１Ｌ／９７．７ｇ  ａｅ  Ａｓｓｕｒｅ  ＩＩ）＝０．１９２％
溶液または２８．７４μｌ／１５ｍｌ  Ｈ２Ｏ＋１％ｖ／ｖ）。次に、適用後、植物を温
室に戻す前に、噴霧室で１時間乾燥させた。大きなポットに移植してから約１〜２週間後
、植物をバイオアッセイのためにサンプリングした。事象あたり１つの植物はバイオアッ
セイした。
【０２９７】
分子解析スクリーニングを通過したＴ０事象のすべては、Ｃｒｙ２Ａａタンパク質発現
レベルについて分析された。ＴｒａＰを含まないＣｒｙ２Ａａを含む対照構築物であるｐ
ＤＡＢ１０７６８７からの事象は、ＴｒａＰ２３を含むｐＤＡＢ１０９８０８（０．２ｎ
ｇ／ｃｍ２）からの事象と比較して、Ｃｒｙ２Ａａの有意に高い平均発現レベル（１５．
０ｎｇ／ｃｍ２）を有していた。ｐＤＡＢ１０９８０８事象の発現レベルの低下にもかか
わらず、これらの事象はなおもＣｒｙ２Ａａタンパク質を発現した。
【０２９８】
ｃｒｙ２Ａａ遺伝子を含むＴ鎖の単一コピーを含むトランスジェニック植物は、該トラ
ンスジェニック植物からの葉の上に新生児鱗翅類の幼虫を用いて行われたバイオアッセイ
における殺虫活性について試験された。アッセイされた鱗翅目種は、ヨーロピアンコーン
ボーラー、ヨーロッパアワノメイガ（Ostrinia nubilalis）（Ｈｕｂｎｅｒ）（ＥＣＢ）
、およびトウモロコシイヤーワーム、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）（ＣＥＷ）
であった。
【０２９９】
３２ウェルトレイ（Ｃ−Ｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐｉｔｍａｎ、ＮＪ）は、
２％寒天溶液で部分的に満たされ、寒天を固化させた。葉のセクションの約２つのうち１
つは、それぞれの植物から採取され、３２ウェルトレイのウェルに単独で入れられた。１
枚の葉片をそれぞれのウェルに入れ、２つの葉片を植物あたりおよび昆虫あたり試験した
。昆虫は、ペイントブラシを用いて大量に群棲させ、それぞれのウェルに１０匹の新生児
幼虫を入れた。トレイは、試験中に換気を可能にする有孔粘着性の蓋で密封された。トレ
イは、２８℃にて、４０％ＲＨ、１６時間明所：８時間暗所で３日間置かれた。試験期間
後、単純な損傷割合スコアをそれぞれの葉片について得た。それぞれの試験についての損
傷スコアを平均し、相関分析を行うために、タンパク質発現解析と一緒に使用した。
【０３００】
バイオアッセイの結果は、ＴｒａＰ２３合成葉緑体輸送ペプチド配列が、バイオアッセ
イにおいて試験された昆虫に対して保護を与えたｐＤＡＢ１０９８０８事象として機能的
であることが示された。トランスジェニック事象では、ＴｒａＰを含まないＣｒｙ２Ａａ
タンパク質（ｐＤＡＢ１０７６８７）を発現する植物は、試験されたすべての昆虫種全体
でＴｒａＰ２３を有するＣｒｙ２Ａａタンパク質（ｐＤＡＢ１０９８０８）を発現する植
物よりも有意に大きい平均の葉損傷を有した。ＴｒａＰ２３を有するｐＤＡＢ１０９８０
８事象はＴｒａＰを含まない事象と比較して多くの葉損傷を有したが、ｐＤＡＢ１０９８
０８事象は、バイオアッセイされた昆虫に対する保護を与えた。
【図１】
2019047803.tif 000035
【図２】
2019047803.tif 000036
【図３】
2019047803.tif 000037
【図４】
2019047803.tif 000038
【図５】
2019047803.tif 000039
【図６】
2019047803.tif 000040
【図７】
2019047803.tif 000041
【図８】
2019047803.tif 000042
【配列表】
2019047803000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月30日(2018.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）と対象とするポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、
前記ポリヌクレオチドが植物細胞中で発現される際に、前記対象とするポリペプチドが植物細胞中の葉緑体にターゲッティングされ、
前記ポリヌクレオチドが、
前記合成ＣＴＰをコードする第一のヌクレオチド配列であって、前記合成ＣＴＰのそれぞれのアミノ酸残基が、配列番号１〜１０からなる群から選択される３−エノールピルビルシキミ酸−５−リン酸シンセターゼ（ＥＰＳＰＳ）の同じ位置のアミノ酸残基と同じであり、前記合成ＣＴＰは配列番号１〜１０からなる群から選択されるＥＰＳＰＳのＣＴＰではない、第１のヌクレオチド配列と、
前記第１のヌクレオチド配列とインフレームで作動可能に連結している対象とするポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列と
を含む、核酸分子。
【請求項２】
前記合成ＣＴＰが配列番号１１のＣＴＰと少なくとも８０％同一である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記対象とするポリペプチドが蛍光ポリペプチドである、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記対象とするポリペプチドが、生物学的に活性なポリペプチドである、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記生物学的に活性なポリペプチドが、アセトラクターゼシンターゼ（ＡＬＳ）、突然変異ＡＬＳ、ＡＬＳの前駆体、３−エノールピルビルシキミ酸−５−リン酸シンセターゼ（ＥＰＳＰＳ）、ＣＰ４  ＥＰＳＰＳおよびクラスＩＩＩ  ＥＰＳＰＳからなる群から選択される、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記生物学的に活性なポリペプチドが、配列番号１４〜１５（ＤＧＴ−２８）によってコードされるポリペプチドのアミノ酸残基２〜４１５または配列番号１３によってコードされる殺虫性Ｃｒｙ２Ａａタンパク質を含む、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項７】
生物学的に活性なポリペプチドが、除草剤抵抗性、ウイルス抵抗性、細菌病原体抵抗性、昆虫抵抗性、線虫抵抗性、真菌抵抗性、草勢、植物の収量、温度耐性、土壌条件耐性、低光量レベル耐性、低水分レベル耐性、高水分レベル耐性、化学的環境耐性、種子色、デンプン変性、アミノ酸合成、光合成、脂肪酸の合成、油の合成、アロテノイド（arotenoid）の合成、テルペノイドの合成およびデンプンの合成からなる群から選択されるプロセスに関与している、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記生物学的に活性なペプチドが除草剤抵抗性に関与している、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが、各々ＣＴＰをコードする少なくとも１種のさらなるヌクレオチド配列をさらに含み、前記さらなるヌクレオチド配列が、対象とするヌクレオチド配列に作動可能に連結している、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記さらなるヌクレオチド配列によってコードされるＣＴＰが、原核生物、下等光合成真核生物および緑藻植物からなる群から選択される生物に由来する、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドが１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結している、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記調節配列が植物細胞中で機能的であるプロモーターを含む、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか一項の核酸分子のポリヌクレオチドによってコードされる、キメラポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１２に記載の核酸分子を含む、トランスジェニック植物材料。
【請求項１５】
前記植物材料が、植物細胞、植物組織、植物組織培養物、カルス培養物および植物の一部からなる群から選択される、請求項１４に記載のトランスジェニック植物材料。
【請求項１６】
前記植物材料が一般植物または種子である、請求項１４に記載のトランスジェニック植物材料。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドが植物材料のゲノムに安定に組み込まれる、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物材料。
【請求項１８】
トランスジェニック植物材料を製造する方法であって、請求項１２に記載の核酸分子を用いて植物材料を形質転換することとを含む、方法。
【請求項１９】
トランスジェニック植物を製造する方法であって、請求項１５に記載のトランスジェニック植物材料を用いて植物を再生することを含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３００】
バイオアッセイの結果は、ＴｒａＰ２３合成葉緑体輸送ペプチド配列が、バイオアッセイにおいて試験された昆虫に対して保護を与えたｐＤＡＢ１０９８０８事象として機能的であることが示された。トランスジェニック事象では、ＴｒａＰを含まないＣｒｙ２Ａａタンパク質（ｐＤＡＢ１０７６８７）を発現する植物は、試験されたすべての昆虫種全体でＴｒａＰ２３を有するＣｒｙ２Ａａタンパク質（ｐＤＡＢ１０９８０８）を発現する植物よりも有意に大きい平均の葉損傷を有した。ＴｒａＰ２３を有するｐＤＡＢ１０９８０８事象はＴｒａＰを含まない事象と比較して多くの葉損傷を有したが、ｐＤＡＢ１０９８０８事象は、バイオアッセイされた昆虫に対する保護を与えた。
本発明は、以下の態様を含む。
［１］
５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）酵素のアラインメントから得られた参照ヌクレオチド配列から誘導される合成葉緑体輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
［２］
合成葉緑体輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している対象とするヌクレオチド配列をさらに含む、［１］に記載の単離された核酸分子。
［３］
参照ヌクレオチド配列が、アブラナ属種（Brassica sp.）、ダイズ属種（Glycine sp.）、アラビドプシス属種（Arabidopsis sp.）、およびデュネイラ属種（Duneila sp.）からなる群から選択される種から単離された５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）酵素のアラインメントから得られる、［１］に記載の単離された核酸分子。
［４］
参照ヌクレオチド配列が、配列番号１〜１０からなる群から選択されるポリペプチドのアラインメントから得られる、［１］に記載の単離された核酸分子。
［５］
合成葉緑体輸送ペプチドが、配列番号１１の葉緑体輸送ペプチドと少なくとも８０％同一である、［１］に記載の単離された核酸分子。
［６］
合成葉緑体輸送ペプチドが、配列番号１１の葉緑体輸送ペプチドと少なくとも８５％同一である、［５］に記載の単離された核酸分子。
［７］
合成葉緑体輸送ペプチドが、配列番号１１の葉緑体輸送ペプチドと少なくとも９０％同一である、［６］に記載の単離された核酸分子。
［８］
合成葉緑体輸送ペプチドが、配列番号１１の葉緑体輸送ペプチドと少なくとも９５％同一である、［７］に記載の単離された核酸分子。
［９］
合成葉緑体輸送ペプチドが、配列番号１１の葉緑体輸送ペプチドと少なくとも９８％同一である、［８］に記載の単離された核酸分子。
［１０］
合成葉緑体輸送ペプチドが、配列番号１１を含む、［９］に記載の単離された核酸分子。
［１１］
合成葉緑体輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号１２の核酸に特異的にハイブリダイズ可能である、［１］に記載の単離された核酸分子。
［１２］
各々、葉緑体輸送ペプチドをコードする、少なくとも１種のさらなるヌクレオチド配列をさらに含み、さらなるヌクレオチド配列が、対象とするヌクレオチド配列に作動可能に連結している、［２］に記載の単離された核酸分子。
［１３］
少なくとも１種のさらなるヌクレオチド配列が、原核生物、下等光合成真核生物および緑藻植物からなる群から選択される生物に由来する、［１２］に記載の単離された核酸分子。
［１４］
対象とする合成葉緑体輸送ペプチドをコードする配列およびヌクレオチド配列が、１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結している、［２］に記載の単離された核酸分子。
［１５］
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドおよび合成葉緑体輸送ペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする、［２］に記載の単離された核酸分子。
［１６］
［１５］に記載の核酸分子によってコードされるキメラポリペプチド。
［１７］
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、プラスチド含有細胞中のプラスチドにターゲッティングされる、［１６］に記載のキメラポリペプチド。
［１８］
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、プラスチドにターゲッティングされると除去される合成葉緑体輸送ペプチドを含む、［１７］に記載のキメラポリペプチド。
［１９］
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、生物学的に活性なペプチドである、［１６］に記載のキメラポリペプチド。
［２０］
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、蛍光ペプチドである、［１６］に記載のキメラポリペプチド。
［２１］
生物学的に活性なペプチドが、アセトラクターゼシンターゼ（ＡＬＳ）、突然変異ＡＬＳ、ＡＬＳの前駆体、３−エノールピルビルシキミ酸−５−リン酸シンセターゼ（ＥＰＳＰＳ）、ＣＰ４  ＥＰＳＰＳおよびクラスＩＩＩ  ＥＰＳＰＳからなる群から選択される、［１９］に記載のキメラポリペプチド。
［２２］
生物学的に活性なペプチドが、ＤＧＴ−２８またはＣｒｙ２Ａａである、［１９］に記載のキメラポリペプチド。
［２３］
生物学的に活性なペプチドが、除草剤抵抗性、ウイルス抵抗性、細菌病原体抵抗性、昆虫抵抗性、線虫抵抗性、真菌抵抗性、草勢、植物の収量、温度耐性、土壌条件耐性、低光量レベル耐性、低水分レベル耐性、高水分レベル耐性、化学的環境耐性、種子色、デンプン変性、アミノ酸合成、光合成、脂肪酸の合成、油の合成、アロテノイド（arotenoid）の合成、テルペノイドの合成、デンプンの合成および除草剤抵抗性からなる群から選択されるプロセスに関与している、［１９］に記載のキメラポリペプチド。
［２４］
生物学的に活性なペプチドが、除草剤抵抗性に関与している、［１９］に記載のキメラポリペプチド。
［２５］
［２］に記載の核酸分子を含む植物材料。
［２６］
植物細胞、植物組織、植物組織培養物、カルス培養物、植物の一部および全植物体からなる群から選択される、［２５］に記載の植物材料。
［２７］
核酸分子が、植物材料から得た細胞のゲノムに安定に組み込まれる、［２５］に記載の植物材料。
［２８］
トランスジェニック植物材料を製造する方法であって、
［２］に記載の単離された核酸分子を得ることと、
植物材料を、核酸分子を用いて形質転換することと
を含む、方法。
［２９］
［２８］に記載の方法によって製造されるトランスジェニック植物材料。
［３０］
ポリペプチドを葉緑体にターゲッティングするためのＥＰＳＰＳ由来の手段を含む単離された核酸分子。
［３１］
ポリペプチドを葉緑体にターゲッティングするためのＥＰＳＰＳ由来の手段に作動可能に連結している対象とするヌクレオチド配列をさらに含む、［３０］に記載の単離された核酸分子。
［３２］
対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする、［３１］に記載の単離された核酸分子。
［３３］
［３１］に記載の核酸分子を含む植物発現ベクター。
［３４］
［３３］に記載の核酸分子を含む植物材料。
［３５］
トランスジェニック植物材料を製造する方法であって、
［３１］に記載の単離された核酸分子を得ることと、
植物材料を、核酸分子を用いて形質転換することと
を含む、方法。
［３６］
植物材料が、植物細胞、植物組織、植物組織培養物、カルス培養物、植物の一部および全植物体からなる群から選択される、［３５］に記載の方法。
［３７］
［３５］に記載の方法によって製造されるトランスジェニック植物材料。
［３８］
［３７］に記載のトランスジェニック植物材料から再生されたトランスジェニック植物。
［３９］
植物体に再生され得ない植物細胞である、［２６］に記載の植物材料。
［４０］
植物材料が、植物体を生成するよう再生できない植物細胞である、［２８］に記載の方法。
【外国語明細書】
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