(57)【要約】      （修正有）【課題】１−ケストースを工業規模で生産する方法の提供。【解決手段】１−ケストースを工業規模で生産する方法であって、糖非分解性酵母で構成的に発現された、オニウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）由来の組換えフルクトース転移酵素（ＦＴＦ）を使用して、バイオリアクター中でスクロースを１−ケストースに転換することを特徴とする方法、スクロースを１−ケストースに工業規模で変換するための粗酵素調製物、スクロース：スクロース１−フルクトース転移酵素（１−ＳＳＴ）を工業規模で生産する方法、及び該方法によって生産された１−ケストースを含む、ヒト又は動物に摂食させるための製品。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１−ケストースを工業規模で生産する方法であって、糖非分解性酵母で構成的に発現された、オニウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）由来の組換えフルクトース転移酵素（ＦＴＦ）を使用して、バイオリアクター中でスクロースを１−ケストースに転換することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ＦＴＦがスクロース：スクロース１−フルクトース転移酵素（１−ＳＳＴ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記糖非分解性酵母がピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株が、ゲノムに組込まれた１−ＳＳＴコード遺伝子の多コピーを含有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＦＴＦが、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）培養物の上清及び／又は細胞沈殿物から回収される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
スクロース濃度が４００ｇ／Ｌを超える、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＦＴＦが、不連続、連続又は流加培養運転で発酵槽中で増殖させた前記組換え酵母によって生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記酵母の増殖に使用される炭素源が、任意の純度のグリセロール、グルコース及びスクロースから選択される化合物である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記スクロースの１−ケストースへの転換が、遊離又は固定化１−ＳＳＴによって行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記スクロースの１−ケストースへの転換が、撹拌槽、固定床又は膜型のバイオリアクター中で行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記膜型バイオリアクターが、連続又は半連続様式で運転される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
糖非分解性酵母で構成的に発現されたオニウシノケグサ（Ｆ．ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）１−ＳＳＴを含む、スクロースを１−ケストースに工業規模で変換するための粗酵素調製物。
【請求項１３】
前記糖非分解性酵母がピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株である、請求項１２に記載の粗酵素調製物。
【請求項１４】
前記ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株が、ゲノムに組込まれた、１−ＳＳＴコード遺伝子の多コピーを含有する、請求項１３に記載の粗酵素調製物。
【請求項１５】
１−ＳＳＴが、固体又は液体状態であり、遊離又は固定化形態である、請求項１２に記載の粗酵素調製物。
【請求項１６】
１−ＳＳＴが、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）培養物の上清及び／又は細胞沈殿物から回収される、請求項１３に記載の粗酵素調製物。
【請求項１７】
スクロース濃度が４００ｇ／Ｌを超える、請求項１２に記載の粗酵素調製物。
【請求項１８】
オニウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）から単離されてゲノムに組込まれた１−ＳＳＴコード遺伝子の多コピーを構成的に発現する、糖非分解性酵母の発酵を特徴とする、１−ＳＳＴを工業規模で生産する方法。
【請求項１９】
前記糖非分解性酵母がピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記１−ＳＳＴが、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）培養物の上清及び／又は細胞沈殿物から回収される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１から１１までに記載の方法によって生産された１−ケストースを含む、ヒト又は動物に摂食させるための製品。
【請求項２２】
栄養補助食品として使用するためのシンバイオテックスを構成する、プロバイオティック調製物に追加的に配合される、請求項２１に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品及び製糖業に関し、特に、甘蔗糖／甜菜糖、又は蜂蜜、糖蜜、植物抽出物、シロップなどのような他のスクロース含有原材料からのフラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）合成に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＦＯＳは、１〜９個のフルクトース残基がβ２→１結合によってスクロース分子に結合された直鎖によって構成される（Ｙｕｎ、１９９６年、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９：１０７〜１１７）。これらの化合物の重要性は、ヒト及び動物における食事のプレバイオティック効果を有する非消化性成分としてのその使用にある。それは、それらが結腸中の１種又は複数種の有益な微生物の増殖及び活性を選択的に刺激することによって、健康上の利益をもたらすからである。こうした微生物に挙げられるのは、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属及びビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の菌種である（Ｇｉｂｓｏｎ及びＲｏｂｅｒｆｒｏｉｄ．、１９９５年、Ｊ．Ｎｕｔｒ．１２５（６）：１４０１〜１４１２年）。天然には、ＦＯＳは、植物、真菌、細菌及び幾つかの酵母において、フルクトース転移酵素（ＦＴＦ、ＥＣ２．４．１．９）及びβ−フルクトフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２６）と呼ばれるような酵素の作用によって産生される（Ｇｕｉｏら、２００９年；Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ｏｎ  Ｆｏｏｄ，Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ＆Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  １（３）：２２１〜３０）。
【０００３】
ＦＯＳの工業生産は、現在２つの戦略に従って行われている。すなわち、イヌリンの部分的分解（Ｙｕｎ．、１９９６年；Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９：１０７〜１１７；Ｆｒａｎｃｋ．、２００２年；Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ８７（２）：Ｓ２８７〜Ｓ２９１）、又はスクロースからの酵素的合成であって、主に真菌（アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、Ａ・ジャポニクス（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、Ａ・アクリータス（Ａ．ａｃｕｌｅａｔｕｓ）及びアウレオバシジウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ））によって生産される、高トランスフルクトシラーゼ（ｔｒａｎｓｆｒｕｃｔｏｓｙｌａｓｅ）活性を有するβ−フルクトフラノシダーゼ又はＦＴＦを使用することによる合成（Ｙｕｎ．、１９９６年；Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９：１０７〜１１７；Ｖａｎｋｏｖａら、２００８年；Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐａｐｅｒｓ  ６２（４）３７５〜３８１）である。両方の技術では、２〜１０の様々な重合度（ＤＰ）を有するＦＯＳの混合物が生じ、その主な構成成分は、１−ケストース（ＧＦ２）、ニストース（ＧＦ３）、フルクトシルニストース（ＧＦ４）、ビフルコース（ＧＦ３）、イヌロビオース（Ｆ２）、イヌロトリオース（Ｆ３）及びイヌロテトラオース（Ｆ４）である。商業上の観点から見ると、三糖の１−ケストースは、天然のプレバイオティックとして、及び糖尿病患者にとって砂糖の代用品として有用な低カロリー甘味料として二重に重要であるために、最も価値のあるＦＯＳである（Ｖｅｇａ及びＺｕｎｉｇａ−Ｈａｎｓｅｎ．、２０１１年；Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０２（２２）、１０１８０〜１０１８６）。
【０００４】
スクロースからのＦＯＳの生産に関する技術及び特許文献は、様々な野生型の微生物、例えば、真菌であるアウレオバシジウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）（Ｓｍｉｔｈ及びＬｕｅｎｓｅｒ、１９８０年。米国特許第４３０９５０５号）、アスペルギルス・フォエニシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ）（Ｖａｎ  Ｄｏｏｒｅｎら、１９８８年。米国特許第４８４９３５６号）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（Ｈｉｄａｋａら、１９８８年、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １１８１）、アスペルギルス・アクリータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｒｒｏｊｏら、２００９年。ＷＯ２０１０／１０３１５０Ａ１）、酵母であるロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｓｐ．）（Ａｇｕｉａｒ  ｄｅ  Ｏｌｉｖｅｉｒａら、２００７年。ＢＲＰＩ０７０５３５９特許出願Ａ２−２）、及び細菌であるミクロバクテリウム・レバニフォルマンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｅｖａｎｉｆｏｒｍａｎｓ）（Ｈａｔｃｈｅｒら、１９８８年。米国特許第４９２７７５７号）、ラーネラ・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）（Ｏｈｔｓｕｋａ，Ｋ．らＢｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．ＢｉｏＣｈｅｍ．５６（９）、１３７３〜１３７７、１９９２年）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）（Ｈａｔｃｈｅｒら、１９８８年。米国特許第４７９７３６０号）から単離された細胞及び酵素（遊離又は固定化のいずれか）の使用に基づいている。これらの生産プロセスは、不連続的又は連続的のいずれかで運転される様々な種類の反応器中、主に撹拌槽及び固定床中で行われる。不連続プロセスでは、放出されたグルコースが蓄積して、ＦＯＳ合成反応を阻害する場合がある。その一方で、様々な支持体上に固定化された細胞又は酵素を使用する連続プロセスを用いると、生体触媒の再利用が可能となるが、基質が固定化された酵素に接近する上での内部拡散的な制限があるために、高流速で運転することができない。反応時間は、合成されたフルクタンの加水分解を回避するために調整する必要がある。インキュベーション時間は、１−ケストース、ニストース及びフルクトシルニストース（ｆｒｕｃｔｓｙｌｎｙｓｔｏｓｅ）の混合物が合成される場合、基質１グラム当たりの酵素活性の初期量に応じて８時間から２４時間まで変動する。
【０００５】
純粋な１−ケストースの結晶又は９０％を超える純度を有する１−ケストース調製物の生産（Ｔｅｔｓｕｈｉｒｏら、１９９５年、米国特許第５４６３０３８号；Ｋｏｉｃｈｉｒｏら、２０１０年、特開２０１０−２７３５８０号公報）は、２０〜２５％のグルコース、１０〜１５％のスクロース、５％のフルクトース、及び５５〜６０％の全ＦＯＳから構成され、ＦＯＳは４０％〜６０％が１−ケストースである最も一般的な反応混合物から出発するとき、極めて複雑なプロセスである。このプロセスは、食品にそれを使用するためには経済的に実行不可能であろう。１−ケストースのクロマトグラフ分離が経済的に実行可能であるのは、その含有量が全ＦＯＳ画分の８０％超に相当するときだけである（Ｎｉｓｈｉｚａｗａら、１９９６年。米国特許第６４７９６５７号）。
【０００６】
ＦＯＳの含有物が主に１−ケストースである（混合物中の糖類の８０％超）反応混合物は稀である。高レベルの１−ケストースは、アスペルギルス・アクリータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）（Ｈａｎｇ及びＷｏｏｄａｍｓ、１９９５年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １７：２９５〜２９８）及びアスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ  ２０２３６（Ｍｕｓｓａｔｔｏら、２００９年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ５９：７６〜８１）などの真菌由来のＦＴＦ酵素によって、２２７ｇ／Ｌ未満のスクロース濃度で合成されてきた。両方の報告において、１−ケストースの含有量は混合物中に存在する全ＦＯＳ画分の約７１％であったが、５００ｇ／Ｌを超えるスクロース濃度で試験したとき、１−ケストースの割合（％）は６０％に近い又はそれより低い値に減少した（Ｇｈａｚｉら、２００５年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ３５：１９〜２７）。アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＡＴＣＣ  ２０６１１、ペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）及びスコプラリオプシス・ブレビカウリス（Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ  ｂｒｅｖｉｃａｕｌｉｓ）由来のβ−フルクトフラノシダーゼは、５００ｇ／Ｌのスクロース濃度で１−ケストースをそれぞれ最大７６．７％、８６．７％及び９１．３％生産することができる（Ｎｉｓｈｉｚａｗａら、２００２年。米国特許第６４７９６５７Ｂ１号）。これらの割合（％）は、Ｐ．ロックフォルティ及びＳ．ブレビカウリス由来の酵素が１−ケストースの収率に関してＡ．ニガーのものより優れていることを示しているが、生産性及び安定性の点から見ると状況が変わる。加えて、これらの生物はいずれも食品用に使用するのに安全だと認められていない（ＧＲＡＳ又はＱＰＳ、食品医薬品局合格証又は安全性適格推定）（ＥＦＳＡ生物学的ハザード委員会、２００９年；ＥＦＳＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７（１２）：１４３１；Ｃｕｅｎｃａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、２００３年、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４７（７）：２３３９〜２３４１）。
【０００７】
糸状菌の増殖は、その糸状体がプロペラ羽根にまとわりつき、発酵槽の通気口を塞ぐことも多いために、工業的な発酵における別の非常に大きな生産上の制約である（Ａｈｍａｄら、２０１０年、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｓｙｓｔ  ３３、５９９〜６０６）。
【０００８】
Ａ．ニガーのβ−フルクトフラノシダーゼを変異させた変異体が、タンパク質工学によって作製された。この変異遺伝子を、これと同じ真菌のβ−フルクトフラノシダーゼ欠失株で発現させた。この酵素は、濃度５５０ｇ／Ｌのスクロースと反応させたときに、全ＦＯＳの９３．５％となる１−ケストースを合成した（Ｎａｋａｍｕｒａら、２０１０年。米国特許第７６５５４４９号）。
【０００９】
しかし、工業的にＦＯＳを生産するためにかかる酵素を大量に利用できるようにする、技術的に実行可能なＦＴＦ生産システムは存在しない（Ｖｅｇａ及びＺｕｎｉｇａ−Ｈａｎｓｅｎ、２０１１年；Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０２（２２）：１０１８０〜１０１８６）。真菌の培養及びそれに続くその内在性ＦＴＦの抽出及び／又は精製は、主要な制約因子である。選択されたＦＴＦ酵素の高レベルの生産及び分泌にさらに適した他の天然の又は組換え宿主の使用を調査する必要がある。
【００１０】
主に植物におけるフルクタン合成の機序を開示するために行われた基礎研究の結果、様々な論文が、基質としてのスクロースに作用することができるＦＴＦ酵素をコードする遺伝子の単離を記載してきた。そのような遺伝子は、チコリー（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ  ｉｎｔｙｂｕｓ）（ｄｅ  Ｈａｌｌｅｕｘ及びｖａｎ  Ｃｕｔｓｅｍ、１９９７年、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １１３：１００３）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）（Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒら、１９９８年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４４０：３５６〜３６０）、キクイモ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ）（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒら、１９９８年、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１５：４８９〜５００）、オニウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（Ｌｕｓｃｈｅｒら、２０００年、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２４（３）：１２１７〜１２２７、アガベ・テキラーナ（Ａｇａｖｅ  ｔｅｑｕｉｌａｎａ）（Ａｖｉｌａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２００７年、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １７３：４７８〜４８６）、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）（Ｖｉｊｎら、１９９８年、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １１７：１５０７〜１５１３）、ホソムギ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ）（Ｌａｓｓｅｕｒら、２００９年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｏｔａｎｙ  ５７（１１）：２７１９〜２７３４）及びコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）（Ｓｃｈｒｏｅｖｅｎら、２００８年、Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ  １８０：８２２〜８３１）などの様々な種から単離されてきた。これらの遺伝子のうちの幾つかは、実験室規模で行われたｉｎ−ｖｉｔｒｏ実験で、酵素の基質特異性、作用様式及び生成物プロファイルを特性評価することを主な目的とする基礎研究のために、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）で発現されてきた（Ａｌｔｅｎｂａｃｈら、２００４年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５６７：２１４〜２１８）。上述の報告すべてにおいて、Ｐ．パストリスでの導入遺伝子の発現を誘導するためにアルコールオキシダーゼＩプロモーター（ｐＡＯＸＩ）が使用された。こうしたメタノール誘導性プロモーターの選択は、酵母の発酵中に大量のメタノールが必要とされるため、工業規模のプロセスには不利である。メタノールは可燃性であり、毒性が高いので、それを食品加工又は食品成分に使用することは禁止されている。これらの研究において、酵素スクロース：スクロース１−フルクトース転移酵素（１−ＳＳＴ）の１−ケストース合成能が、０．１〜０．１５Ｍ（３４．２〜５１．３ｇ／Ｌ）の範囲である比較的低いスクロース濃度だけで試験された。この酵素は、１−ケストースを加水分解する又はさらに重合する能力があることも見出された（Ｌｕｓｃｈｅｒら、２０００年；Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２４（３）：１２１７〜１２２７；Ａｖｉｌａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら；２００７年  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １７３：４７８〜４８６）。分解及び不安定性の問題のために、ピキア生産１−ＳＳＴ酵素は極めて低い収率で得られた。
【００１１】
これまで、工業規模でスクロースから１−ケストースを生産するための天然又は組換えの植物酵素の使用を扱う報告はない。
【００１２】
工業規模では、様々な重合度（ＤＰ）のＦＯＳの混合物から構成される（１−ケストースは主構成成分ではない）、植物であるチコリー及びヤーコン（Ｐｏｌｙｍｎｉａ  ｓｏｎｃｈｉｆｏｌｉａ）の汁が使用されただけである（Ｇｕｉｏら、２００９年、Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ｏｎ  Ｆｏｏｄ、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ＆Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ第１巻第３号）。収率の低さ、細胞外培地への分泌の少なさ、及び組換えデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）技術によるその発現の際のプロテアーゼによる分解などの因子が、酵素の不安定さと相まって、ＦＯＳの工業生産では真菌又はそれらによって生産される酵素ＦＴＦの使用を促していた。
【００１３】
Ｐ．パストリスで植物ＦＴＦを生産するための構成的プロモーターの使用は報告されていない。これは、食品工業に用途を有する組換え酵素を工業規模で生産するのに最も適した選択肢である。
【００１４】
膜型バイオリアクター（ＭＢＲ）は、建物における水の再生利用、小規模な地域社会のための廃水処理、工場廃水処理、埋立地浸出水処理などに広く使用されている（Ｊｕｄｄ  Ｓ．、２００８年、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５（２）：１０９〜１１６）。ＦＯＳを生産するための直接接触ＭＢＲ（ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｎｔａｃｔ  ＭＢＲ）の使用を記載する報告は２件だけである（Ｓａｎｃｈｅｚら、２００８年；Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ８６、１０９〜１１５）。そのうちの１つにおいて、ＦＯＳを含有する反応混合物から微生物を分離するために膜が使用されるが、１−ケストースは主生成物ではなかった。同様のバイオリアクターが、バッチ反応において固定化されていないＡ．ニガーＡＴＣＣ  ２０６１１のβ−フルクトフラノシダーゼによって放出されたグルコース（ＦＯＳの合成を阻害する）をナノ濾過膜を通して除去するために使用され、この反応では、初期スクロース濃度は３００ｇ／Ｌにすぎず、生成物である１−ケストースは全ＦＯＳ画分の３８．７％となった（Ｎｉｓｈｉｚａｗａら、２００１年；Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈ  ｒｅｓ．７．１  ３９〜４４）。このような状況下では、１−ケストースの工業生産は経済的に実行不可能であろう。任意の起源の可溶性フルクトース転移酵素を再利用しながらスクロースから連続的に１−ケストースを生産するためのＭＢＲの使用を報告する論文又は特許は存在していない。
【００１５】
１−ケストースを費用的に効率良く工業規模で生産する方法及び技術の開発に依然として多大な関心が寄せられている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、簡単で安価であり、効率的で工業的規模に拡張可能な技術により、１−ケストースをスクロースから工業規模で生産する方法を提供することによって、上述の問題を解決する。本発明の方法は、オニウシノケグサ（Ｆ．ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）から単離され、組換え宿主としての糖非分解性酵母で構成的に発現された組換えＦＴＦ酵素を用いるバイオリアクター中で、スクロースを１−ケストースに転換することを特徴とする。
【００１７】
本発明で初めて記載された本方法は、スクロースからのＦＯＳを生産するプロセスに存在する主な技術的制約、特に１−ケストースの生産に関する制約を解決する方法を包括的に取り扱う。記載する手順は、プロセスの２つの重要な段階、すなわち、１）酵素又は生体触媒の生産、及び２）１−ケストースの生産に関わる。
【００１８】
本発明の目的では、工業規模とは、得られた生成物の全容量又は一部の容量が商業的に使用される、１−ケストースの生産規模として定義される。この目的のために、市販される現行の設計設備を使用することができる。
【００１９】
本発明の文脈の中で、糖非分解性酵母とは、スクロースを加水分解する又は重合する内因性活性を欠く、野生型又は変異酵母として定義される。これらの酵母の幾つかの例は、メタノール資化性酵母であるＰ．パストリス、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母の変異体ＹＳＨ２．６４−１Ａである（Ｒｅｈｍら、１９９８年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８０（５）：１３０５〜１３１０）。
【００２０】
本発明の一実施形態では、ＦＴＦはスクロース：スクロース１−フルクトース転移酵素（１−ＳＳＴ）である。本発明において、組換えＤＮＡ技術によって得られた１−ＳＳＴは、１−ＳＳＴｒｅｃと称する。酵素を生産する段階を最適化するために、本発明は、オニウシノケグサ（Ｆ．ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）、タマネギ（Ａ．ｃｅｐａ）及びブルーアガベ（Ａ．ｔｅｑｕｉｌａｎａ）からそれぞれ単離された１−ＳＳＴ型の植物ＦＴＦを選択し、同定するプロセスから出発した。この手法は、ＦＯＳの工業生産に関する以前の文献にはなかった。前記酵素のそれぞれをコードする遺伝子を、酵母Ｐ．パストリスの遺伝子を改変するための発現カセットにクローニングした。この酵母には工業生産用の宿主として考え得る生産上の制約、例えばその増殖中の溶存酸素の制約があるものの、この酵母は、スクロース又はフルクタンと反応する能力がある内在性酵素を欠失しているという要求を満たし、生物工学的な目的のための宿主として適当だと考えられる。Ｐ．パストリスは、発酵槽中で制御された条件下で増殖させれば高いバイオマス収率を達成することが可能であり、また高レベルの異種タンパク質を生産し、培養培地に分泌することができることがよく知られている。この酵母は、食品加工のためのバイオセイフティー規制の観点から見れば、ＧＲＡＳステータスを有している。従って、糖非分解性酵母がＰ．パストリス株である、前述の１−ケストース生産方法は、本発明の一部である。
【００２１】
本研究の第１のステップでは、アルコールオキシダーゼＩプロモーター（ｐＡＯＸＩ）が、１−ＳＳＴｒｅｃの導入遺伝子発現を誘導するために成功裡に使用された。しかし、こうしたメタノール誘導性プロモーターの使用は、大量のメタノールが酵母の発酵中に必要とされるために、工業規模プロセスには許容できない。メタノールはまた、可燃性で揮発性である。他方では、それを食品加工又は食品成分に使用することは禁止されている。驚くべきことに、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素プロモーター（ｐＧＡＰ）の転写制御下でオニウシノケグサ１−ＳＳＴ遺伝子を発現させると、細胞毒性を生じず、多量のバイオマスを生産し、本発明で試験した他の２種のＦＴＦよりも高いレベルで細胞外培地に分泌される酵素を発現させることが可能となった。これは、植物ＦＴＦ遺伝子を発現させるためのこうした構成的プロモーターの使用に関する最初の報告である。
【００２２】
上述の構築物のそれぞれに由来する３種のＰ．パストリス形質転換体を、流加発酵(fed-batch fermentations)でのバイオマス生産及びフルクトース転移酵素活性について評価した。５リットルの発酵槽中で７２時間酵母を増殖させた後、培養ブロスを遠心分離し、２つの画分を得た。１つの画分は無傷細胞又はバイオマスであり、他の画分は培養上清である。両方の画分を、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）の０．８７Ｍスクロース溶液（３００ｇ／Ｌ）で、３０℃で３０分間インキュベートして、酵素活性についてアッセイした。前記条件で、オニウシノケグサ１−ＳＳＴ遺伝子を持つ３つの遺伝子導入酵母のクローンは、細胞内及び細胞外画分のいずれにおいても最も高いレベルの活性を示し、分析した残りの酵素に観察されたものよりも高い活性を示した。驚くべきことに、オニウシノケグサから単離された１−ＳＳＴｒｅｃは、タマネギ及びアガベから単離されたそのホモログよりも安定していた。これは、１−ケストースを大規模に生産することを可能にする。
【００２３】
１−ＳＳＴｒｅｃの収率を上げることを目指し、連続的な再形質転換ステップ及びＦＴＦ活性に関するクローンの大量スクリーニングを行った上で、オニウシノケグサ１−ＳＳＴ発現カセットの多コピーを二重及び一重の相同組換え事象によって宿主酵母のゲノムに組み入れた。導入遺伝子量（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｄｏｓａｇｅ）を徐々に増加させると、細胞増殖を阻害することなく１−ＳＳＴｒｅｃの収率に付加的効果を及ぼした。ＣＩＧＢ３０８と名付けられた選り抜きのクローンは、１−ＳＳＴコード遺伝子及び在来のＡＯＸ１遺伝子座の５’領域をハイブリッド形成プローブとして使用するサザンブロット実験での測定によれば、ゲノムに安定に組込まれた少なくとも９つの遺伝子コピーを含有する。観察されたハイブリッド形成パターンにより、選り抜きのクローンＣＩＧＢ３０８を含めた、多コピーのＰ．パストリス株の正確な同定が可能である。したがって、１−ケストースを工業規模で生産する方法であって、Ｐ．パストリスの株が、ゲノムに組込まれた多コピーの１−ＳＳＴコード遺伝子を含有する方法も本発明の対象である。
【００２４】
Ｐ．パストリス株ＣＩＧＢ３０８を発酵槽で培養すると、１−ＳＳＴｒｅｃ酵素を生産する。これは、酵母抽出物、微量元素類及びビタミン類が補給された培養培地を使用し、グリセロール又はグルコースを炭素源として用いて、発酵槽を不連続、連続又は流加運転で使用するときに起こる。しかし、スクロース又はそれを含有する原材料を用いるとより高い生産収率が得られるので、このような基質を使用することが好ましい。
【００２５】
このため、本発明のある態様では、工業規模での１−ケストースの生産に用いられるＦＴＦは、Ｐ．パストリスの培養上清及び／又は細胞ペレット中に得られる。本発明のある実施形態では、ＦＴＦは、不連続、連続又は流加運転で使用する発酵槽中で組換え酵母宿主を培養することによって生産される。特定の実施形態では、酵母の培養に使用される炭素源は、任意の純度のグリセロール、グルコース及びスクロースの中から選択される化合物である。
【００２６】
本発明で実現される細胞外１−ＳＳＴｒｅｃ活性（約１００．０Ｕ／ｍＬ（細胞のない培養上清））は、真菌酵素に関して報告される平均レベルとかなり類似しており（Ｄｒｉｏｕｃｈら、２０１０年、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８７：２０１１〜２０２４）、それは酵母で発現された様々な起源のＦＴＦに関して記載された値よりはるかに高い（Ｔｒｕｊｉｌｌｏら、２００２年；Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ５９（５００）：３６５〜３７０；Ｒｅｈｍら、１９９８年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８０（５）：１３０５〜１３１０）。細胞内画分における活性に関しては、高活性と高細胞密度とが組み合わさって、バイオマスでの収率は培養物１リットル当たり３８０００Ｕ超となり、それは真菌酵素に関する文献に報告される最大値より６倍又は７倍上である（Ｄｏｒｔａら、２００６年；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。３３（１２）：１００３〜１００９）。
【００２７】
既に述べたＰ．パストリスの生産上の制約にもかかわらず、Ｐ．パストリスを１−ＳＳＴｒｅｃの組換え発現用の宿主として選択すると、天然のＦＴＦ源としての真菌の使用に関する上述の技術的制約が克服される。一方、バイオセイフティー規制の観点から見ると、Ｐ．パストリスは食品加工用のＧＲＡＳ生物である。
【００２８】
本発明の一実施形態では、工業規模でのスクロースの１−ケストースへの変換は、４００ｇ／Ｌより高い基質濃度を使用して行われる。本発明の特定の実施形態では、スクロースの１−ケストースへの転換は遊離又は固定化１−ＳＳＴによって行われる。
【００２９】
本発明のある態様では、スクロースの１−ケストースへの変換は、膜、固定床、又は撹拌槽型のバイオリアクター中で行われる。特定の実施形態では、膜型バイオリアクターは、連続的又は半連続的に運転される。
【００３０】
オニウシノケグサから単離され、糖非分解性酵母で構成的に発現された１−ＳＳＴを含む、スクロースを１−ケストースに工業的に変換するための酵素調製物も本発明の対象である。
【００３１】
本発明の目的では、酵素調製物とは、酵素活性を有し、特定の基質と反応して、それを生成物へと変換させる（ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）ことができる、液体又は固体の調製物として定義される。
【００３２】
本発明の一実施形態では、１−ＳＳＴｒｅｃを得るために使用される糖非分解性酵母はＰ．パストリス株である。特定の実施形態では、前記Ｐ．パストリス株は、そのゲノムに組込まれた多コピーの１−ＳＳＴコード遺伝子を含有する。この酵母の培養物から、１−ＳＳＴｒｅｃが培養上清中及び／又は細胞ペレット中に得られる。本発明の目的に沿って、１−ＳＳＴは、液体又は固体の状態で、遊離又は固定化酵素として使用することができる。本発明のある実施形態では、１−ＳＳＴを含む酵素調製物を使用することによる１−ケストースの工業生産に用いられるスクロースの濃度は、４００ｇ／Ｌより高い。
【００３３】
本願の実施例で実証されるように、タンパク質を精製、凍結乾燥及び固定化する従来のプロセスを通してＰ．パストリスＣＩＧＢ３０８株の培養上清又は細胞バイオマスから得られた、液体又は固体状態で遊離又は固定化形態の１−ＳＳＴｒｅｃ調製物は、冷蔵を必要とすることなく保存及び販売するのに十分な熱安定性を示した。この特性の故に、かかる調製物は、ＦＯＳの工業生産のための生体触媒として最終的に使用することができ、本発明の１−ケストース生産方法の第二段階で利用できる。本発明の酵素調製物は、様々な形態であっても共通して、基質としてのスクロースの存在下で５５％より高い転換率でＦＯＳを生産することができ、この場合、特に１−ケストースが全ＦＯＳ画分の９０％超を占める。
【００３４】
本発明の一実施形態では、１−ケストース合成反応は、以下の条件下で行われる：２００〜８００ｇ／Ｌのスクロース、好ましくは６００ｇ／Ｌ；ｐＨ４．０〜７．０、最適には５．５；温度３０〜５０℃、好ましくは４０℃；酵素／基質比は、反応時間１〜２４時間で２〜４０Ｕ／ｇ、好ましくは３時間の反応で１５Ｕ／ｇ。これらの条件は、ＦＯＳを生産するのに使用されるバイオリアクターの種類及び運転様式とは無関係に、液体又は固体の１−ＳＳＴｒｅｃ調製物に適用可能である。
【００３５】
本発明の方法は、ＦＯＳ、特に１−ケストースを工業生産するプロセスに関する技術の、現状を反映する制約を克服するものである。真菌ＦＴＦを使用する代わりに組換え植物酵素が使用され、前記酵素は、予想外なことに、また他の植物由来のＦＴＦとは対照的に、Ｐ．パストリスで安定に高レベルで分泌され、スクロースに作用させると１−ケストースを効率的に生産する。本発明以前に、組換え植物酵素はＦＯＳの工業生産に使用されていなかった。一方、工業的な酵素反応のために一般に使用される撹拌槽型反応器技術において、酵素は一回しか使用されず、それが生産性の低さ、生成物の品質のばらつき（ロット間の不一致による）などにつながっている。本発明のある実施形態では、バッチ式、連続的(continuous)又は順次様式(sequential mode)（好ましくは後者）のいずれかで運転される膜型バイオリアクターを使用することにより、撹拌槽型反応器で得られるものと同様の転換がより少ない時間で実現されるために、生産性を増大させることが可能となり、その場合、５５％を超えるスクロースがＦＯＳに転換され、１−ケストースがＦＯＳ含有量の９０％超を占める。これらの結果は以前の報告を凌ぎ、すべて糸状菌の使用に基づいたＦＯＳの工業生産に関する既存の技術の制約を解決するものである。一方、本発明の方法により、必要とされる投資費用、エネルギー使用量が低下し、生産される１−ケストースの量当たりの酵素の必要消費量が低下し、最終生成物を精製する操作の数が減少する。
【００３６】
前に述べたように、本発明の方法を適用すると、いかなる微生物であっても、またいかなる種類の反応器であっても、記載したＦＯＳ生産プロセスに存在する制約が克服される。
【００３７】
オニウシノケグサの１−ＳＳＴが初めて１−ケストースの工業生産に使用される。組換え植物ＦＴＦを使用してＦＯＳを工業生産するという報告はない。予想外なことに、試験した他の植物ＦＴＦとは異なり、この酵素は高レベルで安定に生産され、宿主酵母Ｐ．パストリスの培養培地に分泌される。これらの技術的利点に加え、本発明の組換え酵素は、４００ｇ／Ｌより高い濃度のスクロースに対するその作用の結果として、主に１−ケストースを生産する。
【００３８】
真菌酵素もこの三糖を合成するが、１−ケストースを最終的に得ようとしても、ほぼ反応開始時からそれを基質として使用して１−ニストース及びフルクトシルニストースを生産する。
【００３９】
一方、現在、国際市場でＦＯＳの大量生産のためにＦＴＦを供給する業者はいない。本発明の方法は、大量の１−ケストースを生産する、組換え植物の工業生産のための新たな低コストの手順を創出し、それによってこの種の酵素を商業的に利用しやすいようにする。驚いたことに、オニウシノケグサの組換えＦＴＦの使用には、ＦＯＳ、特に１−ケストースを得るプロセスを、他のＦＯＳ生産技術に関して今までに記載されたものと比較して安価にするという追加的な利点がある。
【００４０】
かくして、本発明は、１−ＳＳＴを工業規模で生産する方法であって、発酵槽で増殖する微生物が、そのゲノムに組込まれた、オニウシノケグサ１−ＳＳＴをコードする遺伝子の多コピーを含有する糖非分解性酵母であることを特徴とする方法を提供する。組換え酵母は、１−ＳＳＴコード遺伝子を構成的に発現する。本発明の一実施形態では、１−ＳＳＴコード遺伝子を構成的に発現する糖非分解性酵母はＰ．パストリス株である。本発明の目的では、組換え１−ＳＳＴは、Ｐ．パストリスの培養上清及び／又は細胞ペレットから収集される。
【００４１】
本発明の目的では、１−ＳＳＴの工業規模生産とは、その全容量又は一部の容量が１００００単位の酵素を超える１−ＳＳＴを生産する、組換え株の発酵槽中での培養を伴う規模である。
【００４２】
専門的な文献に見られる報告に反して、本発明のある実施形態では、前記植物ＦＴＦの使用と膜型バイオリアクターの利用とが初めて組み合わされた。この組合せにより、高収率のＦＯＳ及び１−ケストースを得るようにプロセスが最適化される。この組合せで得られた結果は驚くべきものであり、収率の値は数学的モデルによって理論的に計算されたものより高かった。加えて、このプロセスは、他の種類の反応器が使用されたときに見られるロット間の不一致及び生成物のばらつきを解消する。このプロセスにより可溶性ＦＴＦの再利用が可能となり、それによって、技術経済的な観点から実行可能な酵素−基質比が実現され、それは撹拌槽で使用されるものより１０倍高い。これらの２つの利点は、反応時間を３時間に短縮し、撹拌槽と比較して生産性を１日当たり少なくとも５倍増大させ、結果的に製造費用の低減につながる。さらに、このプロセスは操作ステップを減少させ、生産プロセスのために必要とする物理的面積を減少させる。
【００４３】
本発明の別の態様は、本発明の方法によって得られる１−ケストースを含む、ヒト又は動物に摂食させるための製品であり、この方法は、オニウシノケグサから単離され、糖非分解性酵母宿主で構成的に発現された組換えＦＴＦを使用することによって、バイオリアクター中でスクロースを１−ケストースに転換することを特徴とする。特定の実施形態では、ヒト又は動物に摂食させるためのこの製品は、栄養補助食品として利用されるシンバイオテックス調製物中にプロバイオティクスと共に配合される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】オニウシノケグサ（１−ｓｓｔｆ）、タマネギ（１−ｓｓｔｃ）及びブルーアガベ（１−ｓｓｔａ）由来の１−ＳＳＴ酵素をそれぞれコードする遺伝子を、ベクターｐＧＡＰＺαＡ、Ｂ、Ｃ中に挿入した結果得られる発現カセットを示す図である。対応するプラスミドを、ｐ１−ＳＳＴＦ（オニウシノケグサ１−ＳＳＴ）、ｐ１−ＳＳＴＣ（タマネギ１−ＳＳＴ）、及びｐ１−ＳＳＴＡ（ブルーアガベ１−ＳＳＴ）とそれぞれ名付けた。ＰＧＡＰ：ＧＡＰプロモーター、ＳＰ：サッカロミセス・セレビシエのα因子シグナルペプチド、Ｈｉｓ６：ポリヒスチジンタグ、ＴＴ：ピキア・パストリスのＡＯＸ１転写ターミネーター。
【図２】ピキア・パストリス株ＧＳ１１５で１−ｓｓｔｆ遺伝子を高レベルで構成的に発現させるためのプラスミドｐ１ＳＳＴＦ６ｘ＋発現カセットの６つの追加コピーの構築に使用される戦略を示す図である。Ａ．１つの遺伝子コピーで構築。Ｂ．６遺伝子コピーで構築、ヒスチジン４遺伝子相補によって選択  Ｃ．９遺伝子及びハイグロマイシン耐性で構築。ＰＧＡＰ：ＧＡＰプロモーター、５’ＡＯＸ１：アルコールオキシダーゼのプロモーター、ＳＰ：Ｓ．セレビシエのα因子シグナルペプチド、Ｈｉｓ６：ポリヒスチジンタグ、ＴＴ：ＡＯＸ１転写ターミネーター、Ｈｉｓ４：非突然変異ヒスチジン４遺伝子。
【図３】バッチ式撹拌槽型反応器中での酵素１−ＳＳＴｒｅｃによるＦＯＳ合成の経時変化を示す図である。反応条件：１−ＳＳＴｒｅｃ９０００Ｕ／Ｌ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中スクロース６００ｇ／Ｌ；温度４０℃、撹拌速度２５０ｒｐｍ、反応時間６時間。凡例：１−ケストース（ＧＦ２）；ニストース（ＧＦ３）、全ＦＯＳ（ＦＯＳ＝ＧＦ２とＧＦ３の合計）；スクロース（ＧＦ）；グルコース（Ｇ）；フルクトース（Ｆ）。
【図４】様々な反応時間（ｔｒ）で回収した試料における生成物プロファイルを示すＨＰＬＣクロマトグラムである。Ａ．標準のニストース（ＧＦ３）、１−ケストース（ＧＦ２）、スクロース（ＧＦ）、グルコース（Ｇ）、及びフルクトース（Ｆ）の混合物。Ｂ．反応時間ｔｒ＝０での１−ＳＳＴｒｅｃによるＦＯＳ合成。Ｃ．ｔｒ＝１８０分。Ｄ．ｔｒ＝３６０分。
【図５】膜型バイオリアクター中でＦＯＳを生産するように設計されたシステムの略図である。
【図６】半連続的運転の３回の連続サイクルの間の、膜型バイオリアクター中での酵素１−ＳＳＴｒｅｃによる１−ケストース合成の経時変化を示す図である。反応条件：１−ＳＳＴｒｅｃ９０００Ｕ／Ｌ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中スクロース６００ｇ／Ｌ；温度４０℃、撹拌速度２５０ｒｐｍ。運転順序：第１のサイクル、３時間の連続合成反応及び３０分間の排出（Ｄ）。第２〜３のサイクル、２．５時間の連続合成反応及び３０分間の排出（Ｄ）。
【図７】半連続的運転での膜型バイオリアクター中のＦＯＳ合成の各連続サイクルの後に回収した試料における生成物プロファイルを示すＨＰＬＣクロマトグラムである。Ａ、第１のサイクル、Ｂ、第２のサイクル、Ｃ、第３のサイクル。凡例：ニストース（ＧＦ３）、ケストース（ＧＦ２）、スクロース（ＧＦ）、グルコース（Ｇ）、フルクトース（Ｆ）。
【実施例】
【００４５】
（例１）
ピキア・パストリスで生産された植物由来の３種のスクロース：スクロース１−フルクトース転移酵素（１−ＳＳＴ）によって示されるフルクトース転移酵素（ＦＴＦ）活性レベルの比較試験
上述の３種の酵素ＦＴＦ活性レベルを比較するために、以前の文献［Ｖｉｊｎら、１９９８年、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １１：３８７〜３９８；Ｌｕｓｃｈｅｒら２０００年、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２４：１２１７〜１２２７；Ａｖｉｌａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら２００７年、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １７３：４７８〜４８６］に記載されたプライマーを使用する逆転写（ＲＴ）−ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって、オニウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）、及びブルーアガベ（Ａｇａｖｅ  ｔｅｑｕｉｌａｎａ）由来の１−ＳＳＴ酵素をコードするｃＤＮＡをその生来の宿主から単離した。
【００４６】
成熟酵素（サイズ：オニウシノケグサ１−ＳＳＴ：１６６８ｂｐ、タマネギ１−ＳＳＴ：１６６８ｂｐ及びアガベ１−ＳＳＴ：２０２６ｂｐ）をコードするＤＮＡに対応する増幅されたＰＣＲ産物を、正しい読み枠に従ってその５’末端をＳ．セレビシエのα因子シグナルペプチドに融合し、３’末端を、市販のベクターｐＧＡＰＺ  α  Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、リーク、オランダ）に存在する、ｍｙｃエピトープと６個のヒスチジン残基のタグの両方をコードする配列に融合した。この市販のベクターにより、得られた形質転換体を抗生物質ゼオシンへの耐性によって選択することができる。
【００４７】
ｐ１−ＳＳＴＦ（オニウシノケグサ１−ＳＳＴ）、ｐ１−１ＳＳＴＣ（タマネギ１−ＳＳＴ）及びｐ１−ＳＳＴＡ（１−ＳＳＴアガベ）と呼ばれる、得られた３種の構築物では、図１に示すように、３種の１−ＳＳＴをコードするキメラ遺伝子が、ＧＡＰプロモーター及びアルコールオキシダーゼ１転写ターミネーター（ＡＯＸ１ＴＴ）の転写制御下に置かれた。
【００４８】
これら３種の構築物をＧＡＰプロモーター中の単一のＡｖｒＩＩ制限部位で消化し、Ｘ−３３宿主酵母株のゲノムに電気穿孔法によって導入した。その結果、２％グリセロール及びゼオシン１００ｍｇ／ｍＬを補給したＹＰ培地上で増殖させた後、各構築物につき約２０の形質転換体が得られた。比較試験のために、３種の変異体のそれぞれの３つのゼオシン耐性クローンを５リットル（有効容積）の発酵槽中で細胞が定常期に達するまで増殖させた。各発酵槽には、予め振とう器内で増殖させた各クローンの接種物２００ｍＬを接種した。
【００４９】
発酵の第一段階において溶存酸素値を２０％より上に維持するために、撹拌を５００ｒｐｍから９００ｒｐｍまで自動的に増大させ、通気を１ｖｖｍ（空気の容積／培地の容積／分）に保持した。溶存酸素の値が増加した時点で（グリセロールが枯渇したことを示す）、第二の供給段階を開始した。
【００５０】
第二段階を開始するために、空気流を２ｖｖｍに増加し、培養物に１．５Ｌの追加溶液（当初と同一の炭素源を有する）を、溶存酸素値の変動に応じて制御される５〜７ｍＬ／Ｌ／時の流量で供給した。組換え株又は同様の条件下で増殖させた野生型株に関して、７２時間の培養の間に毒性作用は観察されなかった。
【００５１】
次いで、最終培養物を遠心分離によって分離し、２つの画分、すなわち細胞ペレット（又はバイオマス）及び培養上清を生成した。両方の画分の試料０．２ｍＬを３００ｇ／Ｌ（０．８７Ｍ）までのスクロース溶液と３０分間反応させた。スクロースに対するトランスフルクトシル化（ｔｒａｎｓｆｒｕｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ）反応の結果として遊離したグルコースの濃度を組換えクローンのＦＴＦの活性レベルを示すものとして使用した。
【００５２】
試料の色の変化をグルコースの規定量と関係付ける検量線から、トランスフルクトシル化反応の強度を確定した。オニウシノケグサ１−ＳＳＴ遺伝子を発現する３つのクローンからの無傷細胞及び培養上清の試料を３０分間反応させたものに、比較的高い活性（試料の色が、５．５ｍＭより上のグルコース濃度と等しい強度を有する赤色に変わった）が観察された。対照的に、タマネギ１−ＳＳＴ遺伝子又はブルーアガベ１−ＳＳＴ遺伝子を持つクローンはいずれも、３０分間反応させたものに検出可能な活性を示さなかった。わずかな活性（試料の色が、０．５〜５．５ｍＭの範囲のグルコース濃度と等しい明るいピンク色に変わった）は、より長い３時間及び５時間インキュベートした後のみで明らかになった。
【００５３】
（例２）
高ＦＴＦ活性を有する３つの１−ｓｓｔｆ単一遺伝子コピークローンの発酵運転中に分析されたパラメータの平均値
ゲノムに組込まれた単一の１−ｓｓｔｆコピーを持つ３つのクローンを、例１に記載した同一の実験条件を使用して発酵槽レベルで比較した。
【表１】
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【００５４】
これら３つのクローンの生産性は、この構成的発現系を使用したときに、より短い培養時間（６９時間）でより高い細胞濃度（３６６ｇ／Ｌ）が達成され、メタノール誘導性系で得られたものよりも２倍高かった。
【００５５】
（例３）
１−ｓｓｔｆ遺伝子発現カセットの多コピーをピキア・パストリスのＡＯＸ１遺伝子座に組込むことによる１−ＳＳＴｒｅｃ活性の増大
ＦＯＳを生産する経済的な工業生産技術を開発するために、高レベルの１−ＳＳＴｒｅｃ活性がそのために必要とされ、宿主酵母中の遺伝子量を増加させることが求められる。
【００５６】
直列型(in tandem)の多コピーの発現カセットを得るために、遺伝子１−ｓｓｔｆを含有する発現カセットの１コピーだけそのゲノムに含有するプラスミドｐ１−ＳＳＴＦを、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩで消化した。得られた発現カセットを含有する２．８２ｋｂのバンドをアガロースゲルから単離し、Ｔ４リガーゼを使用して再連結した。
【００５７】
Ｔ４リガーゼによってＢａｍＨＩ（Ｇ−ＧＡＴＣＣ）制限部位とＢｇｌＩＩ（Ａ−ＧＡＴＣＴ）制限部位とを結合して、これら２つの酵素のどちらからも認識されない、ＧＧＡＴＣＴ配列を有するハイブリッド部位を作製する。連結反応中に、これらの２つの酵素、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩを添加して、異なる末端が容易に接続するようにした。発現カセットを２コピー含有する５．６４ｋｂのバンドを単離し、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩ酵素で再び処理して、発現カセットが確実に同じ転写方向で結合されるようにした。
【００５８】
ＢａｍＨＩで消化し、アルカリホスファターゼで脱リン酸化した同じプラスミドｐ１−ＳＳＴＦに、この配列を挿入した。新たに構築した構築物（ｐ１−ＳＳＴＦ３ｘ）は、直列型の３コピーの発現カセットを持つ。このｐ１−ＳＳＴＦ３ｘを酵素ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、前のステップで記載したようにして、８．４６ｋｂのバンドを単離し、得られたものを再連結した。１６．９２ｋｂの配列を、ＢａｍＨＩで消化し、アルカリホスファターゼで脱リン酸化したｐＡＯ８１５ベクターに挿入した。
【００５９】
このベクターは、ｈｉｓ４要求性の補足によって、Ｐ．パストリスＧＳ１１５形質転換体の選択を可能とする。得られたプラスミド（ｐ１ＳＳＴＦ６ｘ）は、（図２の）ＡＯＸ１プロモーターとＡＯＸ１遺伝子座ターミネーター領域の３’断片の間に挿入された、同じ転写方向に直列で配置された６コピーの発現カセットを含有する。
【００６０】
このプラスミドを、電気穿孔法によるＰ．パストリスＧＳ１１５株の形質転換のためにＢｇｌＩＩで消化した。この消化で２つの断片、１つは中央に６つの直列型の発現カセットと、ｈｉｓ４によって生じる栄養要求性を補足する遺伝子とを持ち、５’末端はＡＯＸ１プロモーターであり、３’末端はＡＯＸ１遺伝子座のターミネーター領域の３’断片である、２２．２３ｋｂのバンドをもたらした。
【００６１】
この戦略では、ＡＯＸ１遺伝子座を置換する二重相同組換えが好ましい。プラスミドｐ１−ＳＳＴＦ６ｘで形質転換されたＧＳ１１５株のコロニーを、２％グルコースを補給した最小ＹＮＢ培地上で選択した。スクロースを炭素源として使う形質転換体の能力を評価するために、９３のコロニーＨｉｓ４＋を、５％スクロース及びｐＨ指示薬であるブロモチモールブルー０．０２５％を補給した１００ウェルＹＰ寒天プレート（ｐＨ５．５）中で個別に増殖させた。
【００６２】
単一の１−ｓｓｔ遺伝子コピー（ＰＦ１ｘ）を有するＧＳ１１５／ｐ１−ＳＳＴＦクローンを、この実験の陽性対照として使用した。ＰＦ６Ｘｂ、ＰＦ６Ｘａと名付けた２つのクローンは、培地の色を当初の緑色（ｐＨ５．５）から黄色（ｐＨ≦６．０）に変化させた。それは、スクロースに対する１−ＳＳＴｒｅｃのトランスフルクトシル化反応が起こり、スクロースから放出されたグルコースを微生物が消費することによって乳酸を生じたことに起因する。こうした培地の色の変化は、単一の遺伝子を持つ株より多コピー株の方に早く起こった。このことから、多コピークローンの方が単一の遺伝子コピーを持つものよりも高い酵素活性を示すことが示される。
【００６３】
この結果を確証するために、ＰＦ６Ｘｂ、ＰＦ６Ｘａ多コピークローン及び単一コピークローンＰＦ１ｘを、２％グリセロールを補給した液体ＹＰ培地１０ｍＬ中で、オービタルシェーカー上で、２４時間２８℃で増殖させた。多コピークローンだけでなく単一コピークローンのペレット（バイオマス又は細胞）及び培養上清の両方に対応する画分中の、組換え酵素のＦＴＦ活性によって放出されたグルコースを、オキシダーゼ／ペルオキシダーゼ／グルコース発色酵素複合体の比色反応に基づく「グルコース−トリンダー」（Ｓｉｇｍａ）キットによって、例１に説明したのと同じように決定した。
【００６４】
２つの多コピークローンが単一コピークローンによって示されたものよりも高い酵素活性を示したことから（表２）、Ｐ．パストリスゲノムに組込まれた１−ｓｓｔｆ遺伝子のコピーが増加したことにより、これらの２つの組換え株における１−ＳＳＴｒｅｃ活性が増大したことが実証された。クローンＰＦ６Ｘｂは、培養上清ではＰＦ６Ｘａクローンより３１．４％高く、単一コピークローンより６４．２％高い１−ＳＳＴｒｅｃ活性を示した。バイオマスでは、クローンＰＦ６Ｘｂは酵素活性がＰＦ６Ｘａクローンより１８％高く、単一コピークローンより３６％高かった。
【００６５】
表２は、１−ｓｓｔｆ遺伝子のコピー数が多コピーＰ．パストリスクローンの酵素活性に及ぼす影響を示している。対照として株ＧＳ１１５及び単一コピークローンを使用した。データの右に付された様々な文字は、統計パッケージＳｔａｔＧｒａｐｈ３を使用して単純分類ＡＮＯＶＡによって決定された有意差を示す。酵素活性の平均値（ｎ＝３）をＴｕｋｅｙ  ＨＳＤ検定（ｐ＜０．０１）を使用して比較した。
【表２】
2019047797.tif 000003
【００６６】
上で得られた結果によれば、多コピークローンＰＦ６Ｘｂはバイオマスと培養上清の両方において最も高い１−ＳＳＴｒｅｃ活性を示したので、それをさらなる発現実験用に選択した。以降、選択したこのクローンをＰＦ６Ｘと新たに名付けた。
【００６７】
（例４）
追加的な６コピーの発現カセットをＡＯＸ１遺伝子座に挿入することによる、ＰＦ６Ｘ多コピークローンの再形質転換による１−ＳＳＴ活性の増大
クローン１−ＳＳＴ  ＰＦ６Ｘの酵素活性を増大させるために、ｐＡＬＳ２２３と呼ばれる新たなプラスミドを構築した。この新たな構築物を得るために、プラスミドｐ１−ＳＳＴＦ６ｘを構築するのに使用した、６コピーの発現カセットを同じ転写方向に直列に含有する１６．９２ｋｂの配列を、ＢａｍＨＩで予め消化され、アルカリホスファターゼで脱リン酸化されたベクターｐＰＩＣＨａＣのＡＯＸ１リンカーに挿入した。
【００６８】
このベクターにより、Ｐ．パストリスのＡＯＸ１プロモーターで一重の相同組換えが可能となり、さらに抗生物質ハイグロマイシンでの形質転換体の選択が可能となる。この遺伝子構築物を制限分析及びＤＮＡ配列決定によって点検した後で、この新たなプラスミドを酵素Ｈｐａ  Ｉで直線化し、ＰＦ６Ｘ細胞の電気穿孔によってＰＦ６Ｘクローンをこの新たなコンストラクトで再形質転換した。この酵素はＡＯＸ１プロモーターの特異的部位を切断し、それによってＡＯＸ１遺伝子座での単一相同組換えによる酵母ゲノムへの組込みが促進される。
【００６９】
宿主酵母のゲノムに挿入された発現カセットを６コピーより多く有する形質転換体を、ハイグロマイシン２％、グリセロール０．２ｇ／Ｌを補給した固体ＹＰ培地中で選択した。６０超のハイグロマイシン（ＨｉｇＲ）に耐性のコロニーのバイオマス及び培養上清中の酵素活性を、酵素複合体グルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ／発色試薬キット「グルコース−トリンダー」の比色反応を使用して決定した。このアッセイには、ＰＦ６ｘ及びＰＦ１ｘ株も対照として含めた。
【００７０】
ＣＩＧＢ３０８と呼ばれる１つのハイグロマイシン耐性クローンは、細胞ペレットと培養上清の両方で最も高い１−ＳＳＴｒｅｃ酵素活性を示した。この新たなクローンは、上清（１．８７倍）及びバイオマス（１．７６倍）においてＰＦ６Ｘ株より高い酵素活性を示した。
【００７１】
単一コピー株と比較したときに、クローンＣＩＧＢ３０８によって示された１−ＳＳＴ活性は、上清では３．５８倍高く、バイオマスでは２．４１倍増大したことから、安定に宿主に組込まれた１−ｓｓｔｆ遺伝子のコピー数が増加すると、酵母宿主における１−ＳＳＴ活性も増大することが確認された。サザンブロット分析により、クローンＣＩＧＢ３０８中に９コピーの発現カセットが安定に組込まれたことが明らかになった。これらの結果から、再形質転換の事象では、予想される通りの６コピーではなく３コピーの発現カセットしか挿入されなかったことが示される。
【００７２】
（例５）
Ｐ．パストリスＧＩＧＢ３０８株は、発酵槽規模で前躯体ＰＦ１Ｘ及びＰＦ６Ｘより高い１−ＳＳＴ酵素活性を有し、高い生産性を示す
Ｐ．パストリスのＣＩＧＢ３０８クローン、並びにゲノムに組込まれた発現カセットのコピーがそれぞれ１つ及び６つであるそれらの前駆体（ＰＦ１Ｘ、ＰＦ６Ｘ）を、５Ｌの作業容積を有する７．５Ｌの発酵槽中で、２８℃、ｐＨ５．５、５００〜９００ｒｐｍ、通気１．２ｖｖｍ、及び２０％超に制御された溶存酸素で増殖させた。組込まれた発現カセットのコピー数が異なるにもかかわらず、３つの組換え株は同様の増殖パターンを示した。
【００７３】
１９時間及び２０時間の増殖後に当初のグリセロール含有量が枯渇し、その間は撹拌を５００ｒｐｍから９００ｒｐｍに徐々に増加することによって溶存酸素圧を２０％までに制御した。グリセロールが枯渇すると、急速に溶存酸素が上昇した。その時に培養物への５０％グリセロール（ｖ／ｖ）の供給を開始し、７２時間の発酵プロセスの間中行った。
【００７４】
これらの培養条件下で、比較される３つのクローンから得られたバイオマス全体は３５８±８ｇ／Ｌ（湿重量）であったので、遺伝子量のみならず組換え酵素の生産及び蓄積も増殖に影響を及ぼさず、また酵母宿主に対して毒性を持っていなかったと推測することができる。
【００７５】
７０〜７２時間の培養の直後にＧＩＧＢ３０８クローンは最も高い細胞外及び細胞内１−ＳＳＴ活性を示し、それぞれ最大２９．７±０．２Ｕ／ｍＬ（培養物）及び１２．４±０，２Ｕ／ｍＬ（培養物）（３４Ｕ／ｇ（湿重量））に達した。３０８ＣＩＧＢの増殖後に全体で４２．１±０．２Ｕ／ｍＬが検出されたことから、７０．６％のＦＴＦ活性が培養上清に見られ、２９．４％が細胞に見られた。この比較試験で得られた結果から、１−ＳＳＴｒｅｃの大量生産用にＣＩＧＢ３０８クローンを選択することにした。
【００７６】
本発明の時点では、多コピーのＰ．パストリスクローンから構成的に発現された植物の１−ＳＳＴｒｅｃを得る発酵戦略を文献中に記載する報告はなかった。
【００７７】
（例６）
スクロースを炭素源として使用してピキア・パストリスＣＩＧＢ３０８株を増殖させるための追加培養戦略
グリセロール以外の、スクロース又はグルコースなどのより安価な炭素源を使用することで、Ｐ．パストリスＣＩＧＢ３０８株の発酵費用が減少する。宿主として使用されるＰ．パストリスＧＳ１１５株にはインベルターゼ活性がないので、スクロースを炭素源として使用することができない。しかし、酵母宿主が獲得した新たなＦＴＦ活性によって、１−ＳＳＴｒｅｃがスクロースからトランスフルクトシル化反応を行う結果としてグルコースが放出され、次いでそれが組換え酵母宿主の増殖のために直接代謝される。組換え酵母株のこうした挙動により、生産プロセス中の発酵費用を減少させることができる。
【００７８】
バッチ式に増加する培養物でのスクロース発酵を、作業容積５０Ｌの容量を有する７５Ｌの発酵槽中で行った。調整したパラメータは次の通りであった：温度：２８℃、ｐＨ５．５、撹拌：６００ｒｐｍ。通気：１．０ｖｖｍ。運転圧：０．２気圧。使用した炭素源は、精製糖、粗糖又は蜂蜜のいずれかに含有される、５０ｇ／Ｌのスクロースであった。
【００７９】
発酵開始からおよそ２０時間後に炭素源が枯渇した時点で（ｐＨの増大又は酸素の圧力の増大によって検出される）、当初の培養物容積に対して８ｍＬ／Ｌ／時の追加速度で追加溶液を添加した（当初使用した同じ炭素源の溶液であるが、５００ｇ／Ｌである）。次いで、発酵パラメータを次のように再調整した：撹拌：８００ｒｐｍ、通期１．５ｖｖｍ、酸素圧：０．４気圧。発酵を７２時間の間行った。
【００８０】
これらの培養条件で達したバイオマス収率は、これと同じクローンであるがグリセロール培地で増殖させたもので実現した収率と同様であった。一方、全酵素活性（培養７２時間以内）は、スクロースを含有する原材料を使用したにもかかわらず、スクロース含有培地の方がはるかに優れていた。様々な炭素源を使用してＰ．パストリス３０８ＣＩＧＢ株を増殖させた結果を表３に要約する。
【表３】
2019047797.tif 000004
【００８１】
これらの結果に従い、スクロース及び蜂蜜はいずれもこの組換えＦＴＦの工業生産を行うのに適切な基質であるという結論に達した。
【００８２】
（例７）
連続培養での１−ＳＳＴｒｅｃ酵素の生産
Ｐ．パストリスで高レベルで発現する組換えＦＴＦの連続生産を記載する報告は文献中にない。１−ＳＳＴｒｅｃの連続生産は、５Ｌの全作業容積を有する７．５ＬのＩＮＦＯＲＳ  ＨＴ発酵槽中で行われた。Ｉｒｉｓ  Ｖ  ５．０  Ｓｏｆｔｗａｒｅによって次のパラメータを確定し、培養期間を通して記録した：温度を２８℃に維持し、その間、ＮＨ３ＯＨ（２８％（ｖ／ｖ））及びＨ３ＰＯ４（４０％（ｖ／ｖ））を自動的に添加することによってｐＨ値を５．５に制御した。溶存酸素を、撹拌（５００〜９００ｒｐｍの間）、空気流（１〜２ｖｖｍ）及び圧力（０〜０．７気圧）を自動的に変えることによって培養期間を通して２０％より高く維持した。
【００８３】
初期容量は、２２ｇ／ＬのＮＨ４ＳＯ４、１８．２ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、７．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；酵母抽出物５ｇ／Ｌ、微量の塩類及び十分な量のビタミン類を含有し、スクロース５０ｇ／Ｌを加えた発酵培地３Ｌであった。不連続増加段階の場合は、スクロース５００ｇ／Ｌの溶液１．５Ｌを使用した。連続培養の段階では、２００ｇ／Ｌのスクロース、酵母抽出物２．５ｇ／Ｌ、１１ｇ／ＬのＮＨ４ＳＯ４、９．１ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、３．７５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２５ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；微量の塩類及びビタミン類を含有する培地を使用した。
【００８４】
発酵槽に、予め振とう器内で増殖させた接種物２００ｍＬを接種した。炭素源を使い果たしたら、不連続追加段階を開始し、培養物を７〜３０ｍＬ／Ｌ・時の範囲の流量で供給した。増分が枯渇したら、バイオリアクターに１日１回の希釈速度（Ｄ）で供給することによって連続培養を開始した。定常状態に達した後に培養運転を４５日間続け、平均活性収率は７０±５Ｕ／ｍＬ及び細胞濃度は３５２±１１ｇ／Ｌ（湿重量）であった。
【００８５】
（例８）
１−ケストースを合成するために最適な１−ＳＳＴｒｅｃの反応パラメータの決定
発酵槽の上清に得られた酵素調製物を、Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜（０．２μｍ）を備えたＳａｒｔｉｃｏｎ  Ｓｌｉｃｅ  ２００（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）フィルターを製造業者の指示書に従って使用して、濾過プロセスに供した。続いて、濾過したものを、同じ機器であるがＨｙｄｒｏｓａｒｔ限外濾過膜（１０ｋＤａ）を備えたものを使用して、酢酸ナトリウム緩衝液０．１Ｍに対するダイアフィルトレーションによって１０倍に濃縮して、１０００Ｕ／ｍＬの最終調製物を得た。任意選択で、濾液を凍結乾燥プロセスに供して、８５００Ｕ／ｇより高い活性を有する固体の酵素調製物を得た。
【００８６】
ａ）１−ＳＳＴｒｅｃ活性に最適なｐＨの決定：
１−ＳＳＴｒｅｃ活性を４〜８の範囲内のｐＨで調査した。反応を、最終容積０．５ｍＬ中に０．８７Ｍスクロース溶液及び１０Ｕの酵素で、１時間３０℃で行った。ｐＨの範囲が４．０〜５．５の場合は酢酸ナトリウム緩衝液０．１Ｍを使用し、ｐＨが６．０〜８．０の間の場合は０．１Ｍリン酸塩緩衝液を使用した。１−ＳＳＴｒｅｃ酵素活性の最大値は５．５〜６．０の間のｐＨ値に見出された。
【００８７】
ｂ）ＦＯＳ合成に最適な温度及び基質濃度：
これらのパラメータを決定するために、６０Ｕの１−ＳＳＴｒｅｃを、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５の緩衝液中、２００〜６００ｇ／Ｌの範囲内の基質濃度で、それぞれ３０、４０及び５０℃で、最終反応容量１０ｍＬ中で、２５０ｒｐｍで反応させた。１時間の反応後に、ＨＰＬＣによって反応混合物中の糖類の組成を決定した。このクロマトグラフィーのために、２０μｌの試料を、Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ  ４２−Ｃ（ＢｉｏＲａｄ、リッチモンド）カラム中に、作業流量０．６ｍＬ／分、圧力約５２ｂａｒ及び作業温度８１℃で加えた。使用した移動相は水であり、示差屈折率検出器−Ｋｎａｕｅｒ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｒｅｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒを用いた。糖類を、Ｂｉｏｃｒｏｍソフトウェアパッケージ、バージョン３．０、ＩＧＢＣ、１９９６〜１９９７を使用して定量化した。
【００８８】
表４は、様々な反応条件について決定された糖類の組成及び定量化（％）、１−ケストース合成速度及びトランスフルクトシル化と加水分解活性の間の関係を示している。加水分解活性を有することなく１−ケストース合成の最高速度に達したのは、４０℃及びスクロース濃度６００ｇ／Ｌのときであった。
【００８９】
スクロースを１−ケストースに転換するための酵素調製物として、１−ＳＳＴペリプラズム活性を有する無傷細胞、又はアルギン酸カルシウム中に固定化された細胞若しくはＥｕｐｅｒｇｉｔ（Ｓｉｇｍａ）に共有結合で結合された固定化酵素が使用されたときに、同様の結果が得られた。
【００９０】
【表４】
2019047797.tif 000005
【００９１】
ｃ）遊離及び固定化１−ＳＳＴｒｅｃの半減期：
遊離及びＥｕｐｅｒｇｉｔ固定化酵素並びにアルギン酸カルシウム中に固定化されたＰ．パストリスＣＩＧＢ３０８細胞について熱安定性を評価した。遊離又は固定化形態の両方を、ｐＨ５．５の０．１Ｍ酢酸塩緩衝液中、３０、３５及び４０℃でインキュベートした。３０℃の場合は２４時間間隔、３５℃の場合は１時間間隔、及び４０℃の場合は２０分間隔で、各反応物からそれぞれ試料を採取して、残留する活性を試験した。続いて、半減期を、アッセイした酵素調製物のそれぞれがその当初の活性の５０％を失った時間として定義した。表５の結果から、遊離１−ＳＳＴｒｅｃを含有する酵素調製物は、アルギン酸カルシウム中に固定化された１−ＳＳＴ活性を有する細胞よりもはるかに安定であることが示される。
【００９２】
さらに、予想外なことに、３０℃での１−ＳＳＴｒｅｃの溶液の粗抽出物の平均半減期は、非反応性条件下で１４３２時間である。この時間は、植物酵素の１−ＳＳＴ型について今までに報告された半減期の１００倍を上回る。
【表５】
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【００９３】
熱安定性試験を凍結乾燥された酵素調製物に対して行った。その結果は、固体調製物は３０℃で３年より長い半減期を有しているというものであった。
【００９４】
（例９）
撹拌槽型反応器を使用するバッチ反応における、１−ＳＳＴｒｅｃによって触媒されるスクロースのＦＯＳへの転移
１−ＳＳＴｒｅｃに触媒されるＦＯＳ合成の経時変化を、スクロース濃度６００ｇ／ＬでｐＨ５．５の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中に酵素−基質重量比１５Ｕ／ｇで酵素を添加して、４０℃で６時間、１Ｌの反応器中、２５０ｒｐｍで試験した。生産された糖類の定量及び組成を、２０分毎に取った試料でＨＰＬＣによって例８と同様に決定した。
【００９５】
１−ケストースの最大生成量は３２０．８ｇ／Ｌであり、混合物中の全炭水化物の５３．４％、全ＦＯＳの９０．４％であった。図３から、１−ケストースの最大生成量には２．７〜３時間の反応で達し、当初のスクロースの７０％超が消費されたときであったことが示される。この時点で、１−ケストースの最大濃度と四糖であるニストースの出現開始が一致している。
【００９６】
このことは、１−ケストースの大規模生産に１−ＳＳＴｒｅｃを使用するのに有利である。なぜなら、図４に見られるように、スクロースの転移反応において、合成されたニストースが当初のスクロースの５０％が消費されるまで出現しないからである。対照的に、真菌のＦＴＦは、反応の開始から最初の１−ケストース分子を合成すると共にニストースを蓄積し、また五糖のフルクトシルニストースも合成する。
【００９７】
スクロースの１−ケストースへの変換経過と同様の値及び挙動が、遊離若しくはアルギン酸カルシウム中に固定化されたペリプラズム１−ＳＳＴｒｅｃ活性を有する細胞又はＥｕｐｅｒｇｉｔ（Ｓｉｇｍａ）に共有結合で固定化された１−ＳＳＴｒｅｃを使用して、同様の反応条件下で得られた。表６は、様々な酵素調製物によって得られたＦＯＳ濃度を示す。
【表６】
2019047797.tif 000007
【００９８】
３時間の合成後に得られたトランスフルクトシル化反応混合物を低温殺菌プロセス(pasteurization process)に供して酵素を失活させた。続いて、このシロップを、濾過から始まり、脱塩、脱色と続き、擬似移動床式（ＳＭＢ）クロマトグラフ分離で終わるポリッシングプロセスに供し、溶出後に９０％より多い１−ケストースを有する濃厚なＦＯＳ流を得た。このことから、最も高いプレバイオティック効果を有するＦＯＳである、１−ケストース濃厚シロップを生産するこの手順が技術的に実行可能であり、故に最も商業的なものとなることが実証される。
【００９９】
この手順の工業規模での技術的実現可能性を、スクロースから１−ケストースへの変換反応を３０Ｌ及び１００Ｌの容量の反応器にそれぞれスケールアップすることによって確認した。この運転のスケールアップを、１Ｌのモデル反応器で行った試験で得られた情報から、「相似則」(principle of similarity)に基づく方法によって行った。新たな２つの規模で得られた１−ケストースの濃度は、平均すると３２２±７ｇ／Ｌであった。この結果は、モデル反応器で得られたものと有意差がないことを示している。このことから、撹拌槽型反応器中で１−ＳＳＴｒｅｃによって触媒されるスクロースから１−ケストースへの変換反応は、より大きい規模で再現可能であることも実証された。
【０１００】
（例１０）
半連続的に運転される膜型バイオリアクター中でのスクロースからの１−ケストース合成
撹拌槽型バイオリアクター中で遊離の１−ＳＳＴｒｅｃを用いることによってスクロースから１−ケストースを合成する、例９に記載の手順に従った。この目的のために、図５に示すように、１Ｌ（作業容積）の撹拌槽型バイオリアクターの出力部にカートリッジ型の限外濾過膜（Ｐｒｅｐ／Ｓｃａｌｅ  ＴＦＦ−１  ３０ｋＤａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０．０９ｍ２の公称フィルター面積を有する）を結合し、反応生成物と酵素を分離できるようにした。
【０１０１】
使用したパラメータは次の通りであった：酵素初濃度９０００Ｕ／Ｌ、スクロース初濃度ｐＨ５．５の０．１Ｍ酢酸塩緩衝液中６００ｇ／Ｌ、温度４０℃、撹拌速度２５０ｒｐｍ、膜に供給されるバイオリアクター出力流は４０ｍＬ／分であった。
【０１０２】
合成ステップの間、膜の出口の保持流(retentateflow)及び通過流(permeate flow)はいずれも酵素バイオリアクターに戻す。例８及び９に記載したように、スクロースから１−ケストースへの転換速度を決定するために、３０分毎に通過液流の試料をＨＰＬＣによって分析した。
【０１０３】
反応の３時間後に、バイオリアクターへの通過液再循環バルブを閉め、予め閉めたままであったＦＯＳ捕集槽へのバルブを開いた。保持流に対応するバルブは、通過液流３０ｍＬ／分を実現するように調節した。
【０１０４】
３０分後に全反応容量の９０％が取り出されたので、収集槽への通過液出口バルブを閉めた。次いでバイオリアクターへの戻りバルブを開き、保留バルブを、バイオリアクターに戻る通過液流が５ｍＬ／分に定まるように調節した。この時点でバイオリアクターには、０．１Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）中６００ｇ／Ｌのスクロースが９００ｍＬ充填されていた。同じ反応時間及び同じ１−ケストース転換速度を保持するために、１８０Ｕの１−ＳＳＴｒｅｃも添加して、第２の合成サイクルを開始した。
【０１０５】
２時間３０分の反応後に、第１のサイクルで行ったように反応生成物の取り出しに進んだ。第２のサイクルに対応する反応容量の９０％を取り出し終えた後に、第２のサイクルで行ったのと同様にして再びバイオリアクターに装填した。これらの反応−排出ステップを１０回の運転サイクルが完了するまで順次繰り返し、次いでＢＲＭ洗浄ステップを行う。図６は最初の３サイクルの間の挙動を示し、図７は各連続サイクルの終了時の生成物プロファイルを示す。
【０１０６】
連続運転するＢＲＭを使用すると、生産性は同じ容量を有する撹拌槽型バイオリアクターと同様であるが、消費される酵素は生産される１−ケストースの量につき８倍少ない。
【０１０７】
半連続的に運転される他のＢＲＭ運転条件で、同様の１−ケストース濃度が得られる。運転条件のうち、生成物プロファイルに影響を及ぼすことなく変化させることができると思われるものは、取り出し時間が１−ケストースの最大生産量に達する時間の１０〜２０％の間に維持されると仮定した場合、酵素−基質比（２〜４０Ｕ／ｇ（スクロース））、スクロース濃度４００〜８００ｇ／Ｌ、温度（３０〜５０℃）、ｐＨ（５．０〜６．５）である。
【０１０８】
この範囲を超える取り出し時間は、ニストース合成及び１−ケストースからのフルクトース生産に好ましい。本発明以前に、ＢＲＭでの１−ケストースの生産を文献中に記載する報告はない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年12月3日(2018.12.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖非分解性酵母でＧＡＰプロモーターを使用して構成的に発現された、オニウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）由来の組換えスクロース：スクロース１−フルクトース転移酵素（１−ＳＳＴ）を使用して、バイオリアクター中でスクロースを１−ケストースに転換する、１−ケストースを生産する方法であって、前記バイオリアクター中の前記スクロースの初期濃度が４００〜８００ｇ／Ｌの範囲で、４０〜５０℃の温度ある、方法。
【請求項２】
前記糖非分解性酵母がピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株が、ゲノムに組込まれた前記１−ＳＳＴをコードする遺伝子の多コピーを含有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記１−ＳＳＴが、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）培養物の上清及び／又は細胞沈殿物から回収される、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＦＴＦが、不連続、連続又は流加培養運転で発酵槽中で増殖させた前記組換え酵母によって生産される、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記酵母の増殖に使用される炭素源が、任意の純度のグリセロール、グルコース及びスクロースから選択される化合物である、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記スクロースの１−ケストースへの転換が、遊離又は固定化１−ＳＳＴによって行われる、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記スクロースの１−ケストースへの転換が、撹拌槽、固定床又は膜型のバイオリアクター中で行われる、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記膜型バイオリアクターが、連続又は半連続様式で運転される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
４００〜８００ｇ／Ｌの範囲のスクロースの初期濃度で、４０〜５０℃の温度で、バイオリアクター中でスクロースを１−ケストースに変換するための、オニウシノケグサ（Ｆ．ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）１−ＳＳＴを含む、粗酵素調製物。
【請求項１１】
１−ＳＳＴが、固体又は液体状態であり、遊離又は固定化形態である、請求項１０に記載の粗酵素調製物。
【請求項１２】
オニウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）から単離されてゲノムに組込まれた１−ＳＳＴコード遺伝子の多コピーを構成的に発現する、糖非分解性酵母の発酵を行なう、１−ＳＳＴを生産する方法であって、
前記ゲノムの発現が、構成的プロモーターによる転写制御下にある、方法。
【請求項１３】
前記糖非分解性酵母がピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記１−ＳＳＴが、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）培養物の上清及び／又は細胞沈殿物から回収される、請求項１３に記載の方法。
【外国語明細書】
2019047797000001.pdf