(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトの尿及び血液中に存在し、セリンプロテアーゼファミリーに対する阻害効果のようなさまざまな生理活性を有する尿トリプシン阻害剤（ＵＴＩ）融合タンパク質、それを製造するためのＤＮＡ配列並びに医薬組成物及びその使用方法の提供。【解決手段】野生型Ｆｃドメイン又はそのフラグメントに連結された特定のアミノ酸１〜１４９を含む、単離されたＵＴＩ融合タンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１を含むＵＴＩ融合タンパク質。
【請求項２】
配列番号１を含む単離されたＵＴＩ融合タンパク質。
【請求項３】
融合タンパク質が、Ｆｃドメインが共有結合的に結合する二量体である請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
請求項１、２又は３に記載のＵＴＩ融合タンパク質、及び医薬上許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項４】
医薬としての請求項１、２又は３に記載のＵＴＩ融合タンパク質の使用。
【請求項５】
有効量の請求項１、２又は３に記載のＵＴＩ融合タンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含むＵＴＩ関連病態の治療方法。
【請求項６】
配列番号１をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターを含む組み換え宿主細胞。
【請求項９】
組み換え融合タンパク質が発現するように増殖培地に請求項８に記載の組み換え宿主細胞を置くこと、及び細胞又は増殖培地から融合タンパク質を単離することを含むＵＴＩ融合タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学、薬理学、及び医学に関する。
【背景技術】
【０００２】
尿トリプシン阻害剤（ＵＴＩ）（ウリナスタチン（ｕｌｉｎａｓｔａｔｉｎ）、ウリスタチン、ウリナスタチン（ｕｒｉｎａｓｔａｔｉｎ）、ウリスチン、ヒト阻害剤３０（ＨＩ−３０）、ミンギン及びビクニンとしても知られる）は、約４０ｋＤの分子量を有するプロテアーゼ阻害剤である。ＵＴＩは、ヒトの尿及び血液中に存在し（ｈＵＴＩ）、セリンプロテアーゼファミリー（例えば、トリプシン、α−キモトリプシン、プラスミン、カテプシンＧ及び白血球エラスターゼ）に対する阻害効果のようなさまざまな生理活性を有する。また、ＵＴＩは免疫調節効果を有し、炎症性サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）及びインターロイキン（ＩＬ−６））の放出をダウンレギュレートすることができる。さらに、ＵＴＩは、二量体を無力化することにより、ＰＤＧＦ−Ｄ（ＰＤＧＦ−ＤＤ）／ＰＤＧＦ−ＢＢＲ活性二量体媒介シグナル伝達経路も妨げる。
【０００３】
ｈＵＴＩは、販売承認を受けており、１つの製品が、商標Ｍｉｒａｃｌｉｄとして日本で市販されており、ヒトの尿から単離されている。実際、ヒトの尿から単離されたｈＵＴＩは、現在、膵炎及びショックに起因する急性循環障害の治療のために、いくつかの製造業者により市販されている。
【０００４】
はじめに、ＵＴＩは、ヒト９番染色体上にコードされたＡＭＢＰ（α１−マイクログロブリン／ビクニン前駆体）と呼ばれる前駆体タンパク質としてヒトにおいて産生される。ＡＭＢＰのタンパク質分解は、１４３個のアミノ酸を含む遊離ＵＴＩをもたらす。ＵＴＩは、セリンプロテアーゼを阻害することが知られている２つのクニッツドメインを含む。それは、ＵＴＩのＮ及びＣ末端の未構造化アミノ酸に隣接する。２つのドメインは、プロテアーゼ結合に関与する異なるアミノ酸による、プロテアーゼ阻害の異なる特異性をもたらすことが期待される。他のセリンプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＢＰＴＩ（ウシ膵臓トリプシン阻害剤））と同様に、我々は、プロテアーゼ阻害のための二つの重要なアミノ酸には、Ｍｅｔ２６（クニッツドメイン１）及びＡｒｇ８８（クニッツドメイン２）が含まれると推定することができる。異なるプロテアーゼの阻害時のＵＴＩの異なる部分の関与についてはほとんどわかっていない。しかし、クニッツドメイン１の除去は、プロテアーゼ特異性の変化を示し、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ及び血漿カリクレインに対する新しい阻害活性が見出される。完全長のＵＴＩは、これらの２つのプロテアーゼの阻害を示さない（Morishita et al., Thrombosis Research 1994, vol 73 (3/4) p193-204）。また、ＵＴＩは、２つの結合した糖を含む。１つはＳｅｒ１０でＯ結合し、１つはＡｓｎ４５でＮ結合している。げっ歯類及びヒトにおけるＵＴＩの半減期は、４〜３０分である（Fries et al, International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 2000, vol 32, p 125-137）。
【０００５】
ＵＴＩ融合タンパク質は、任意のＵＴＩドメインの最良のスタートポイント及びストップポイントを含むアミノ酸の最適配列を含むべきであり、他のタンパク質と融合させて、発現、精製、半減期、及び安定性のような性質を向上させてもよい。融合パートナーの正確な配列を、決定する必要があり、融合パートナーの機能的性質を変化し得るリンカー、スタート／ストップポイント、及び／又は突然変異の変化を含み得る。尿から得られるウリナスタチンの変異体は、公知である（ＷＯ１９９８５６９１６、ＵＳ５７９２６２９、ＵＳ５４０７９１５、ＵＳ５４０９８９５、ＵＳ７０１９１２３、及びＵＳ６５８３１０８）。ウリナスタチン（その変異体）の融合タンパク質の概念は、ＵＳ２００８０１８１８９２、ＵＳ５５４１２８８、及びＵＳ２００８０２５５０２５に開示されている。特定のＵＴＩ融合タンパク質が、ＣＮ１０３０４４５５４Ａに記載されている。ＣＮ１０３０４４５５４Ａの融合タンパク質は、おそらく任意のＦｃ媒介薬理効果を避けるためのＦｃドメイン内の特定の変異に関連する（ＡＤＣＣ、ＣＤＣ）。我々は、驚くべきことに、野生型ＩｇＧ１を伴うＵＴＩ−Ｆｃが、良好な耐容性を示し、半減期の有意な増大をもたらすことを見出した。また、ＣＮ１０３０４４５５４ＡのＵＴＩ融合タンパク質と比較して、本願のＵＴＩ融合タンパク質（特に、配列番号１）は、より高い熱安定性を示す。
【０００６】
本発明は、ＵＴＩ融合タンパク質、それを含む医薬組成物、その調製方法、及びその使用を提供する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ＵＴＩドメイン及び融合パートナー（ここで、ＵＴＩドメインは、作用可能なように融合パートナーに結合する。）を含むＵＴＩ融合タンパク質を提供する。本発明は、ＵＴＩドメイン及びＦｃドメイン（ここで、ＵＴＩドメインは作用可能なようにＦｃドメインに結合する。）を含むＵＴＩ融合タンパク質を提供する。また、本発明は、本明細書に記載の単離されたＵＴＩ融合タンパク質を提供する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、及び２９を含む配列を含むＵＴＩ融合タンパク質を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号１を含むＵＴＩ融合タンパク質を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号３を含むＵＴＩ融合タンパク質を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号５を含むＵＴＩ融合タンパク質を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号７を含むＵＴＩ融合タンパク質を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号９を含むＵＴＩ融合タンパク質を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号１１を含むＵＴＩ融合タンパク質を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号１３を含むＵＴＩ融合タンパク質を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号１５を含むＵＴＩ融合タンパク質を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号１７を含むＵＴＩ融合タンパク質を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号１９を含むＵＴＩ融合タンパク質を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号２１を含むＵＴＩ融合タンパク質を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号２３を含むＵＴＩ融合タンパク質を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号２５を含むＵＴＩ融合タンパク質を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号２７を含むＵＴＩ融合タンパク質を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号２９を含むＵＴＩ融合タンパク質を提供する。
【０００９】
本発明の他の実施形態にしたがって、本発明は、本明細書に記載のＵＴＩ融合タンパク質を含むＵＴＩ融合タンパク質をコードする核酸配列を提供する。さらに、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、及び３０として示されるＤＮＡ配列を提供する。一実施形態では、ＵＴＩ融合タンパク質をコードする核酸は、さらに、核酸が作動可能に結合しているコントロール配列を含むベクターを含む。他の実施形態では、本発明は、哺乳動物、昆虫、大腸菌又は酵母の細胞のような、ＵＴＩ融合タンパク質をコードする核酸配列を含む宿主細胞を提供し、融合タンパク質分子が発現する条件下で宿主細胞を維持する。
【００１０】
他の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のＵＴＩ融合タンパク質及び医薬上許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
本発明のさらなる実施形態によれば、有効量の本明細書に記載のＵＴＩ融合タンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含むＵＴＩ関連障害の治療方法を提供する。
【００１２】
すなわち、本発明は、医薬の製造を含む医薬としてのＵＴＩ融合タンパク質の使用、及び本明細書に記載のＵＴＩ関連障害の治療のための本明細書に記載のＵＴＩ融合タンパク質の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＵＴＩドメイン構造及びグリコシル化部位。
【図２】変更されたリンカーを実証する２つのＵＴＩ−Ｆｃコンストラクト。
【図３】本発明の様々なＵＴＩ−Ｆｃコンストラクト。
【図４】ＵＴＩ融合構築で用いられるＤＮＡアセンブル戦略（ＳＬＩＣ）。
【図５】ＵＴＩ及びＵＴＩ−Ｆｃ１、配列番号１によるプロテアーゼ活性の抑制（トリプシン）。
【図６】ＵＴＩ−Ｆｃ１、ＵＦＣ１、配列番号１によるプロテアーゼ活性の抑制（キモトリプシン）。
【図７】ＵＴＩ−Ｆｃ１、ＵＦＣ１、配列番号１によるプロテアーゼ活性の抑制（複数のプロテアーゼ）。
【図８】ＵＴＩ及びＵＴＩ−Ｆｃ１、ＵＴＩ−Ｆｃ、配列番号１によるサイトカイン分泌の抑制（ＩＬ−６）。
【図９】ＵＴＩ融合タンパク質の精製収率。
【図１０】Ｃ３ＨマウスにおけるＬＰＳ誘導Ｃ５ａに対する配列番号１の効果。
【発明の詳細な説明】
【００１４】
本発明は、ＵＴＩ融合タンパク質、ＵＴＩドメイン及び融合パートナー（ここで、ＵＴＩドメインは融合パートナーに作用可能なように結合する。）を提供する。本発明のＵＴＩ融合タンパク質は、トリプシンを含むプロテアーゼに対する阻害効果を有する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、融合パートナーが、Ｆｃポリペプチドである。いくつかの実施形態では、融合パートナーが、ヒトＦｃポリペプチドである。いくつかの実施形態では、融合パートナーが、ヒトＦｃポリペプチド類似体である。いくつかの実施形態では、融合パートナーが、ヒトＦｃポリペプチドのフラグメントである。他の実施形態では、融合パートナーが、マウスＦｃポリペプチドである。他の実施形態では、融合パートナーが、ラットＦｃポリペプチドである。
【００１６】
いくつかの実施形態では、融合パートナーが、ヒトアルブミンである。いくつかの実施形態では、融合パートナーが、ヒトアルブミン類似体である。いくつかの実施形態では、融合パートナーが、修飾ヒトアルブミンである。いくつかの実施形態では、融合パートナーが、ヒトアルブミンのフラグメントである。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ＵＴＩドメインが、ヒトＵＴＩ（ｈＵＴＩ）である。いくつかの実施形態では、ＵＴＩドメインが、ｈＵＴＩの類似体である。いくつかの実施形態では、ＵＴＩドメインが、ｈＵＴＩのフラグメントである。いくつかの実施形態では、ＵＴＩ融合タンパク質は、野生型ｈＵＴＩドメインを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ＵＴＩ融合タンパク質は、野生型ヒトＵＴＩドメイン及びヒトＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＵＴＩ融合タンパク質は、野生型ｈＵＴＩドメイン、及びリンカードメイン、及びヒトＦｃドメインを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ＵＴＩ融合タンパク質は、野生型ヒトＵＴＩドメイン及びヒトアルブミン又はその類似体又はそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＵＴＩ融合タンパク質は、野生型ｈＵＴＩドメイン、リンカードメイン、及びヒトアルブミン又はその類似体又はそのフラグメントを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒト細胞上のＦｃ受容体に結合する。いくつかの実施形態では、分子の血清半減期は、ＵＴＩドメイン単独の血清半減期よりも有意に長い。いくつかの実施形態では、分子のＵＴＩドメインのプロテアーゼ阻害活性は、ＵＴＩドメイン単独と同一或いはそれより大きい。いくつかの実施形態では、マウスへの分子の投与は、炎症反応を減少させる。これには、免疫細胞の活性化を低下させるか、或いはサイトカイン又はケモカインの産生、分泌又は活性を低下させることが含まれるが、これらに限定されない。
【００２１】
ＵＴＩドメインは、リンカードメインにより融合パートナーに作用可能なように結合してもよいと理解される。
【００２２】
本発明は、ａ）Ｆｃドメイン、ｂ）Ｆｃドメイン類似体、及びｃ）Ｆｃドメインのフラグメントからなる群から選ばれるポリペプチドに融合したＵＴＩドメイン（ここで、ＵＴＩドメインは、リンカードメインにより、Ｆｃドメイン、その類似体、又はそのフラグメントに融合する。）を含むＵＴＩ融合タンパク質を提供する。本発明は、ａ）Ｆｃドメイン、ｂ）Ｆｃドメイン類似体、及びｃ）Ｆｃドメインのフラグメントからなる群から選ばれるポリペプチドに融合したｈＵＴＩドメイン（ここで、ｈＵＴＩドメインは、リンカードメインにより、Ｆｃドメイン、その類似体、又はそのフラグメントに融合する。）を含むＵＴＩ融合タンパク質を提供する。
【００２３】
本融合タンパク質は、無傷の抗体の消化により調製されるか或いは他の手段で製造される単量体及び多量体を有するタンパク質を包含する。
【００２４】
用語「多量体」及び「多量体の」とは、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む分子が、共有結合的に、又は非共有結合的に結合するか、或いは共有結合性相互作用及び非共有結合性相互作用の両方を有する２以上のポリペプチド鎖を有するタンパク質をいう。用語多量体は、用語二量体を含む。
【００２５】
用語「二量体」とは、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む分子が、共有結合的、又は非共有結合的に結合するか、或いは共有結合性相互作用及び非共有結合性相互作用両方を有する２本のポリペプチド鎖を有するタンパク質を言う。すなわち、用語「二量体」とは、２つのＦｃドメインが、共有結合的、又は非共有結合的に結合するか、或いは共有結合性相互作用及び非共有結合性相互作用両方を有するＵＴＩ融合タンパク質をいう。より具体的に、用語「二量体」とは、２つのＦｃドメインが共有結合的に結合するＵＴＩ融合タンパク質をいう。
【００２６】
本発明は、ａ）アルブミン、ｂ）アルブミン類似体、ｃ）アルブミンのフラグメントからなる群から選ばれるポリペプチドに融合したＵＴＩドメインを含むＵＴＩ融合タンパク質を提供する。また、本発明は、ａ）ヒトアルブミン、ｂ）アルブミン類似体、ｃ）ヒトアルブミンのフラグメントからなる群から選ばれるポリペプチドに融合したｈＵＴＩドメイン（ここで、ｈＵＴＩは、リンカードメインにより、アルブミン、その類似体、又はそのフラグメントに融合する。）を含むＵＴＩ融合タンパク質を提供する。
【００２７】
（用語の定義）
本明細書及び特許請求の範囲で用いられる用語は、特に記載がない限り下記に示されるように定義される。
【００２８】
本明細書で用いられる、用語「結合された(linked)」、「融合された(fused)」又は「融合(fusion)」は、相互に交換可能なように使用される。
【００２９】
これらの用語は、化学的結合又は組み換えの手段を含む何らかの手段により、２以上の元素又は成分又はドメインを共に結び合わせることをいう。化学的結合の方法は当技術分野で周知である。
【００３０】
「融合タンパク質」とは、１以上の部分が異なるタンパク質に由来する互いに共有結合した２以上の部分を有するポリペプチドを言う。２つの部分は、単一のペプチド結合により直接結合していてもよく（例、互いに直接結合した部分）、或いは１以上のアミノ酸残基を含むペプチドリンカーを通して結合していてもよい（例、部分間の介在アミノ酸又はアミノ酸配列を伴うもの）。一般的に、２つの部分及びリンカーをコードするＤＮＡは、互いにリーディングフレームとなり、組み換え技術を用いて製造され得る。
【００３１】
「ＵＴＩドメイン」は、ＵＴＩの活性を模倣するタンパク質又はペプチドである。本発明のＵＴＩドメインは、天然の配列の所望の活性を保持しつつ、それに由来する自然発生する配列又は天然の配列から配列を変化させるようにして変更してもよいと理解される。好ましいＵＴＩドメインは、天然ヒトＵＴＩ（ｈＵＴＩ）、その類似体、及びその変異体である。ｈＵＴＩの変異体は、保存的な置換を含む、必要な構造上の特徴ではないか或いは機能的活性をもたらす天然ｈＵＴＩの１以上のアミノ酸を置き換えること又は修飾することを含む。ｈＵＴＩの変異体は、必要な構造上の特徴ではないか或いは機能的活性をもたらす天然ｈＵＴＩの１以上のアミノ酸を除去すること又は挿入することを含む。ｈＵＴＩの変異体は、天然ｈＵＴＩの１以上のアミノ酸を置き換えるか又は修飾して、１以上の性質又は活性を変化させることを含む。ｈＵＴＩの変異体は、天然ｈＵＴＩの１以上のアミノ酸を除去するか又は挿入して、１以上のＵＴＩ性質又は活性を変化させることを含む。ｈＵＴＩの変異体は、天然ヒトＵＴＩのグリコリシル化部位を除去するか又は変化させることを含む。ｈＵＴＩの変異体は、１以上のクニッツドメインを除去するか又は変化させることを含む。ｈＵＴＩの変異体は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発のような標準的な技術により導入することができる。
【００３２】
組み換えｈＵＴＩドメインのアミノ酸残基配列は、配列番号３１として示される。一般的に、ＵＴＩドメインは、配列番号３１として示される組み換えｈＵＴＩドメインと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含む。
【００３３】
「Ｆｃドメイン」は、最初の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域及びある場合ではヒンジの１部又は全てを含むポリペプチドである。したがって、Ｆｃドメインとは、単量体又は多量体の抗体の非抗原結合部分をいう。ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が好ましいが、Ｆｃドメインが生じる抗体は、ヒト由来のものが好ましく、いずれの免疫グロブリンであってもよい。
【００３４】
Ｆｃドメインは、重鎖のヒンジ領域を含む。本明細書において、「ヒンジ」又は「ヒンジ領域」又は「抗体ヒンジ領域」又は「免疫グロブリンヒンジ領域」は、抗体の第一の定常ドメイン及び第二の定常ドメインの間（パパイン（ｐａｐｉａｎ）開裂のすぐ上流）のアミノ酸を含む柔軟なポリペプチドを意味する。したがって、ＩｇＧに関して、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンドメインＣＨ２及びＣＨ３並びにＣＨ１とＣＨ２の間のヒンジ領域を含む。Ｆｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシル末端に残基Ｃ２２６又はＰ２３０（ナンバリングはＥＵインデックス及びＫａｂａｔに従う）を含むことと定義される。いくつかの実施形態では、より完全に以下に記載されるように、アミノ酸修飾は、Ｆｃドメインに形成させ、例えば、１以上のＦｃγＲ受容体又はＦｃＲｎ受容体への結合を変化させる。
【００３５】
従って、ある実施形態では、用語Ｆｃドメインは、切断、置換による修飾、欠失及び／又は挿入していてもよいヒンジ領域を含む。さらに修飾又は非修飾ヒンジ領域は、リンカードメインの結合部位であり得る。
【００３６】
「Ｆｃドメイン類似体」とは、天然Ｆｃから修飾されたが、なおサルベージ受容体に対する結合部位を含む分子又は配列をいう。用語Ｆｃドメイン類似体は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化された分子又は配列を含む。また、用語Ｆｃドメイン類似体は、ジスルフィド形成、宿主細胞との不和合性、発現時のＮ末端不均一性、安定性、グリコリシル化、補体との相互作用、Ｆｃサルベージ受容体への結合及び／又はＦｃγ受容体との相互作用に影響する或いは関与する１以上の天然Ｆｃ残基が欠失した又は修飾を有する分子又は配列を含む。
【００３７】
用語「Ｆｃドメインのフラグメント（複数）」又は「Ｆｃドメインのフラグメント（単数）」とは、１以上の部位を除去した天然Ｆｃであって、除去した部分が本発明の融合タンパク質により必要とされる構造上の特徴又は機能的活性を構成しないものをいう。Ｆｃドメインのフラグメントは、天然Ｆｃの残基の除去、又は天然Ｆｃの切断、及び残りの残基の置換を含み得る。挿入又は変化した残基（例えば置換残基）は、天然アミノ酸又は改変アミノ酸、ペプチド模倣体、非天然アミノ酸、又はＤ−アミノ酸であり得る。
【００３８】
一般的に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ、特に、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含む。
【００３９】
用語Ｆｃドメインは、天然Ｆｃ及びＦｃ類似体を包含し、無傷の抗体の消化により調製されたか或いは他の手段で製造された単量体及び多量体を含む。
【００４０】
ある実施形態では、Ｆｃドメインは、少なくとも、ヒンジドメイン（アッパー、ミドル及び／又はローワーヒンジ領域）、ＣＨ２ドメイン（或いはその変異体又はそのフラグメント）、及びＣＨ３ドメイン（或いはその変異体又はそのフラグメント）を含む。他の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（アッパー、ミドル及び／又はローワーヒンジ領域）、ＣＨ２ドメイン（或いはその変異体又はそのフラグメント）、及びＣＨ３ドメイン（或いはその変異体又はそのフラグメント）からなる。ある他の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（アッパー、ミドル及び／又はローワーヒンジ領域）、ＣＨ２ドメイン（或いはその変異体又はそのフラグメント）、ＣＨ３ドメイン（或いはその変異体又はそのフラグメント）、及びＣＨ４ドメイン（或いはその変異体又はそのフラグメント）からなる。他の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（アッパー、ミドル及び／又はローワーヒンジ領域）及びＣＨ２ドメインからなる。他の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（アッパー、ミドル及び／又はローワーヒンジ領域）及びＣＨ３ドメイン（或いはその変異体又はそのフラグメント）からなる。他の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメイン（或いはその変異体又はそのフラグメント）、及びＣＨ３ドメイン（或いはその変異体又はそのフラグメント）からなる。他の実施形態では、Ｆｃドメインは、完全ＣＨ２ドメイン及び完全ＣＨ３ドメインからなる。他の実施形態では、Ｆｃドメインは、完全ＣＨ２ドメイン及び完全ＣＨ３ドメインからなる。一実施形態では、本発明のＦｃドメインは、少なくとも、ＦｃＲｎ結合のために必要とされる当技術分野で周知のＦｃ分子の部分を含む。他の実施形態では、本発明のＦｃドメインは、少なくとも、プロテインＡ結合のために必要とされる当技術分野で周知のＦｃ分子の部分を含む。他の実施形態では、本発明のＦｃドメインは、少なくとも、プロテインＧ結合のために必要とされる当技術分野で周知のＦｃ分子の部分を含む。
【００４１】
本発明によれば、Ｆｃドメインとは、通常、免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインの全て又は一部を含むポリペプチドを言う。前述のとおり、これには、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３ドメインの全体を含むポリペプチド、並びに例えば、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むこのようなペプチドのフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。Ｆｃドメインは、任意の種及び／又はサブタイプ（ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ抗体を含むが、これらには限定されない。）の任意の免疫グロブリンに由来し得る。Ｆｃドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにこれらのドメインの柔軟なヒンジＮ末端を含む。ＩｇＡ及びＩｇＭについて、ＦｃはＪ鎖を含んでいてもよい。
【００４２】
本明細書で用いられるＦｃドメインは、天然Ｆｃ及びＦｃ変異体分子を包含する。Ｆｃ変異体及び天然Ｆｃタンパク質と同様に、用語Ｆｃドメインは、抗体から消化されたか或いは他の手段により製造された単量体及び多量体の分子を含む。
【００４３】
本明細書に示されるように、任意のＦｃドメインは、天然に存在する免疫グロブリン分子の天然Ｆｃドメインのアミノ酸配列を変化させるように修飾され得ると理解される。特定の代表的な実施形態では、Ｆｃドメインは、エフェクター機能（例えば、ＦｃγＲ結合）を保持する。特定の代表的な実施形態では、Ｆｃドメインは、エフェクター機能（例えば、ＦｃγＲ結合）を欠いている。
【００４４】
本発明のＦｃドメインは、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１に由来するＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメイン並びにＩｇＧ３に由来するヒンジ領域を含み得る。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ＵＴＩ融合タンパク質は、Ｆｃドメインを含む。本発明のＵＴＩ融合タンパク質の製造のために有用なＦｃドメインは、多くの異なるソースから得られ得る。好ましい実施形態では、ＵＴＩ融合タンパク質のＦｃドメインは、ヒト免疫グロブリンに由来する。しかしながら、Ｆｃドメインは、その他の哺乳動物種（例えば、げっ歯類種（例、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）又は非ヒト霊長類種（例、チンパンジー、サル）を含む。）の免疫グロブリンに由来してもよいと理解される。また、ＵＴＩ融合タンパク質のＦｃドメイン又はその部分は、任意の免疫グロブリンクラスに由来してもよい。
【００４６】
本明細書で用いられる用語「野生型」又は「ｗｔ」又は「天然」は、対立遺伝子変異を含む天然で見出されるアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を意味する。野生型タンパク質、ポリペプチド、抗体、免疫グロブリン、ＩｇＧ、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ等は、意図的に修飾されていないアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を有する。
【００４７】
ある実施形態では、本発明のＵＴＩ融合タンパク質は、リンカードメインを用いることができる。リンカードメインは、ＵＴＩドメインを融合パートナーに作動可能に接続するために使用される。
【００４８】
用語「リンカードメイン」とは、ポリペプチドリンカー、非ペプチドリンカー及びそれらの組み合わせをいう。特に、リンカードメインは、ポリペプチドであり得る。本明細書で用いられる、用語「リンカードメイン」とは、直鎖状配列で２つのドメインを接続する配列をいう。本明細書で用いられる、用語「ポリペプチドリンカー」とは、ポリペプチド鎖の直鎖状アミノ酸配列の２つのドメインを接続するペプチド配列又はポリペプチド配列（例、合成ペプチド配列又はポリペプチド配列）をいう。例えば、ポリペプチドリンカーは、ＵＴＩドメインをＦｃドメインに接続するために用いてもよい。好ましくは、このようなポリペプチドリンカーは、ポリペプチド分子に柔軟性をもたらし得る。本発明のＵＴＩ融合タンパク質は、ペプチドリンカーを含むリンカードメインを含んでいてもよい。
【００４９】
例えば、リンカードメインは、ＵＴＩドメインをＦｃドメインと連結するようにポリペプチドリンカーの直鎖状アミノ酸配列の２つのドメインを接続するために用いることができる。ある実施形態では、リンカードメインは、ＵＴＩドメインをＦｃドメインに接続するために用いることができる。リンカードメインは、任意の順序でドメインを接続するために用いられ得る。例えば、いくつかの実施形態では、リンカーは、ＵＴＩドメインとＦｃドメインをＵＴＩ−リンカー−Ｆｃの順序で接続し得る。その一方で、他の実施形態では、リンカーは、ＵＴＩドメインとＦｃドメインをＦｃ−リンカー−ＵＴＩの順序で接続し得る。ここで、ポリペプチド領域は、Ｎ末端からＣ末端を表す。代表的なポリペプチドリンカーは、グリシン及びセリン残基からなるもの、いわゆるＧｌｙ−Ｓｅｒポリペプチドリンカーを含む。本明細書で用いられる、用語「Ｇｌｙ−Ｓｅｒポリペプチドリンカー」とは、グリシン及びセリン残基からなるペプチドをいう。代表的なＧｌｙ−Ｓｅｒポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（式中ｎは１〜１０の整数、それぞれ配列番号３３〜４２）を含む。一実施形態では、ＵＴＩ融合タンパク質は、ｎ＝ｌである１又は２のＧｌｙ−Ｓｅｒポリペプチドリンカーを含む。一実施形態では、ＵＴＩ融合タンパク質は、ｎ＝２である１又は２のＧｌｙ−Ｓｅｒポリペプチドリンカーを含む。一実施形態では、ＵＴＩ融合タンパク質は、ｎ＝３である１又は２のＧｌｙ−Ｓｅｒポリペプチドリンカーを含む。一実施形態では、ＵＴＩ融合タンパク質は、ｎ＝４である１又は２のＧｌｙ−Ｓｅｒポリペプチドリンカーを含む。一実施形態では、ＵＴＩ融合タンパク質は、ｎ＝５である１又は２のＧｌｙ−Ｓｅｒポリペプチドリンカーを含む。一実施形態では、ＵＴＩ融合タンパク質は、ｎ＝６である１又は２のＧｌｙ−Ｓｅｒポリペプチドリンカーを含む。一実施形態では、ＵＴＩ融合タンパク質は、ｎ＝７である１又は２のＧｌｙ−Ｓｅｒポリペプチドリンカーを含む。一実施形態では、ＵＴＩ融合タンパク質は、ｎ＝８である１又は２のＧｌｙ−Ｓｅｒポリペプチドリンカーを含む。一実施形態では、ＵＴＩ融合タンパク質は、ｎ＝９である１又は２のＧｌｙ−Ｓｅｒポリペプチドリンカーを含む。一実施形態では、ＵＴＩ融合タンパク質は、ｎ＝１０である１又は２のＧｌｙ−Ｓｅｒポリペプチドリンカーを含む。
【００５０】
他の代表的なリンカーは、配列番号４３で示される。
【００５１】
用語「含む」は、化合物、即ち、融合タンパク質が、Ｎ末端又はＣ末端の何れか又は両方でさらなるアミノ酸を含んでいてもよいことを意味する。もちろん、これらのさらなるアミノ酸は、化合物、即ち、融合タンパク質の活性を有意に妨げるべきではない。
【００５２】
用語「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子のコードによりコードされるもの、並びに後で修飾されるそれらのコードされるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン及びホスホセリン）である。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同様の基本化学構造（すなわち、水素原子、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基に結合する炭素原子）を有する化合物、即ち、融合タンパク質をいう。アミノ酸類似体は、修飾したＲ基を有するか、或いは修飾したペプチド骨格を生じるが、天然に存在するアミノ酸と同様の基本化学構造を保持する。
【００５３】
用語「アミノ酸の置換」とは、異なる「置き換え」アミノ酸を用いる所定のアミノ酸配列又は天然のアミノ酸配列の少なくとも１の既存のアミノ酸残基の置き換えをいう。
【００５４】
用語「アミノ酸の挿入」とは、所定のアミノ酸配列又は天然のアミノ酸配列に１以上のさらなるアミノ酸を挿入することをいう。挿入は、１、２、３、４、５、又は２０以下のアミノ酸残基であり得る。
【００５５】
用語「アミノ酸の欠失」とは、所定のアミノ酸配列又は天然のアミノ酸配列から少なくとも１のアミノ酸を除去するこという。欠失は、１、２、３、４、５、又は２０以下のアミノ酸残基であり得る。
【００５６】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において交換可能であるように用いられ、アミノ酸残基のポリマーをいう。その用語は、１以上のアミノ酸が、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、又はアミノ酸模倣体であるアミノ酸ポリマーに適用される。
【００５７】
用語「核酸」とは、１本鎖又は２本鎖の形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそれらのポリマーをいう。用語「核酸」は、遺伝子、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、及びｍＲＮＡと交換可能であるように用いられる。特に限定されない限り、その用語は、天然核酸と同様の結合特性を有する天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。特に限定されない限り、特定のヌクレオチド配列は、その保存的に修飾した変異体（例えば、縮重コドン置換を含むもの）及び相補的配列並びに具体的に記載した配列も包含する。
【００５８】
本発明のポリヌクレオチドは、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドで構成され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、１本鎖又は２本鎖の領域、混合した１本鎖又は２本鎖の領域で構成され得る。さらに、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む３本鎖領域であり得る。修飾ポリヌクレオチドは、トリチル化塩基のような修飾塩基又はイノシンのような普通ではない塩基を含む。さまざまな修飾が、ＲＮＡ及びＤＮＡで行うことができ、したがって、ポリヌクレオチドは、化学的、酵素的、又は代謝的に修飾された形態を含む。
【００５９】
用語「誘導体化」又は「誘導体」とは、例えば、システイニル残基間で架橋した環状部分を有する化合物、即ち、融合タンパク質、架橋され、１以上のペプチジル結合が非ペプチド結合で置き換えられ、Ｎ末端がＮＲＲ１、ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ１、ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ２、スクシンアミド又はその他の基（ここで、Ｒ及びＲ１は本明細書で定義された通り）で置き換えられ、且つ／或いはＣ末端がＣ（Ｏ）Ｒ３又はＮＲ４Ｒ５で置き換えられた化合物、即ち、融合タンパク質、並びにアミノ酸部分が、選択された側鎖又は末端残基で反応可能な薬剤で処理することにより修飾した化合物、即ち、融合タンパク質をいう。Ｒは、水素及びＣ１−６アルキルからなる群から選ばれ、Ｒ１は、水素及びＣ１−６アルキルからなる群から選ばれ、Ｒ２は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−８シクロアルキル、及び置換されていてもよいフェニルからなる群から選ばれ；Ｒ３は、水素、Ｃ１−６アルキル、及びＣ３−８シクロアルキルからなる群から選ばれ；Ｒ４は、水素及びＣ１−６アルキルからなる群から選ばれ；Ｒ５は、水素、Ｃ１−６アルキル及びＣ３−８シクロアルキルからなる群から選ばれるか；或いはＲ４及びＲ５は、それらが結合する窒素と一緒になって、Ｎ、Ｏ、及びＳの群から選ばれるさらなる１個の環ヘテロ原子を有していてもよい４〜７員の飽和環を形成する。
【００６０】
用語「Ｃ１−６アルキル」とは、１ないし６個の炭素原子の直鎖又は分枝鎖のアルキル鎖をいう。
【００６１】
用語「Ｃ３−８シクロアルキル」とは、３ないし８個の炭素原子の単環式の又は二環式の飽和又は部分（しかし不完全）不飽和のアルキル環をいい、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等が挙げられる。その用語はベンゾ縮合したシクロペンチル及びシクロヘキシルを含むと理解される。
【００６２】
用語「置換されていてもよいフェニル」とは、独立して、ハロ、Ｃｌ−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、シアノ、及びトリフルオロメチルからなる群から選ばれる１〜３個の置換基で置換されていてもよいフェニル基をいう。
【００６３】
（調製）
本発明の化合物、即ち、融合タンパク質は、標準的な合成方法、組み換えＤＮＡ技術、又はペプチド及び融合タンパク質を調製するその他の方法により調製してもよい。代表的な方法において、ｈＵＴＩドメインは、ＵＴＩドメイン及びＦｃドメイン及び任意のリンカードメインをコードするＤＮＡ構築物の発現によりＦｃドメインに共有結合的に連結させる。
【００６４】
ＵＴＩ融合タンパク質を構築する別の方法が想定される。いくつかの実施形態では、ドメインオリエンテーションを変化させて、ＦｃＲ結合を保持し且つ活性ＵＴＩドメインを有するＦｃ−ＵＴＩ分子又はＵＴＩ−Ｆｃ分子又はＵＴＩ−Ｆｃ−ＵＴＩ分子を構築することができる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ＵＴＩ融合タンパク質は、ＦｃＲｎ（Ｆｃ新生児型受容体）の結合後に融合タンパク質がエンドサイトーシスを受けるようにすることができる野生型Ｆｃドメインを含む。したがって、本発明は、さらに、開示されたＵＴＩ融合タンパク質の製造方法を提供する。これらの方法は、本発明のＵＴＩ融合タンパク質をコードする単離された核酸を含む宿主細胞を培養することを包含する。当業者によって理解されるように、これは、ＵＴＩ融合タンパク質の性質に応じてさまざまな方法で行うことができる。いくつかの実施形態では、本発明のＵＴＩ融合タンパク質を製造し、単離することができる。
【００６６】
一般的に、本発明のＵＴＩ融合タンパク質をコードする核酸が提供される。このようなポリヌクレオチドは、ＵＴＩドメイン、融合パートナー、及び任意のリンカードメインをコードする。また、本発明は、開示されたポリヌクレオチド及びこれらのポリヌクレオチドに相補的な核酸配列に由来するオリゴヌクレオチドフラグメントを意図する。
【００６７】
ポリヌクレオチドはＲＮＡ又はＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、核酸類似体、及び合成ＤＮＡの形態のポリヌクレオチドは、本発明の範囲内である。ＤＮＡは、２本鎖又は１本鎖であり得、１本鎖の場合、コード（センス）鎖又は非コード（アンチセンス）鎖であり得る。ポリペプチドをコードするコード配列は、本明細書で提供されるコード配列と同一であってもよく、或いは遺伝子のコードの重複又は縮重の結果として配列が本明細書で提供されるＤＮＡのような同じポリペプチドをコードする異なるコード配列であってもよい。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本発明のＵＴＩ融合タンパク質をコードする核酸は、染色体外であるか或いはそれが導入される宿主細胞のゲノムに組み込まれるように設計され得る発現ベクターに組み込まれる。発現ベクターは、任意の数の適切な調節配列（転写及び翻訳制御配列、プロモーター、リボソームの結合部位、エンハンサー、複製起点等が挙げられるが、これらに限定されない）又はその他の成分（選択遺伝子等）を含み得る。それらの全ては当技術分野でよく知られたようにして作用可能なように連結される。ある場合では、２つの核酸が使用され、それぞれ異なる発現ベクター（例えば、第一の発現ベクターにおいて重鎖、第二の発現ベクターにおいて軽鎖）に導入し、或いは代替的に同じ発現ベクターに導入することができる。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が、宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等のような要因に依存し得るということが当業者に理解されるだろう。
【００６９】
一般的に、核酸分子を１以上の発現制御因子に作動可能なように結合させる（例、宿主細胞ゲノム内に組み込まれる、ベクター中で、細胞内のプロセスのより作られる構築物中で）ように、選択された宿主細胞に適した任意の方法（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、インフェクション）を用いて、核酸及び／又は発現を適切な宿主細胞に導入して、組み換え宿主細胞を作り出すことができる。得られた組み換え宿主細胞を、発現に適した条件下（例えば、誘導因子の存在下、適切な非ヒト動物内、適切な塩、成長因子、抗生剤、栄養補助剤等を補充した適切な培地中）に維持して、それにより、コードされたポリペプチドを生成させることができる。ある場合では、一方の細胞内では重鎖が作られ、他方では軽鎖が作られる、
【００７０】
発現のためのホストとして利用可能な哺乳動物の細胞株は、当技術分野で周知であり、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）（バージニア州マナッサス）から利用可能な多くの不死化細胞株を含む。これには、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例、Ｈｅｐ  Ｇ２）、及び多くのその他の細胞株が含まれるが、これらに限定されない。また、非哺乳動物細胞（細菌、酵母、昆虫、及び植物を含むがこれらに限定されない）を用いて、組み換え抗体を発現させる。いくつかの実施形態では、抗体を、ウシ又はニワトリのようなトランスジェニック動物で作ることができる。
【００７１】
実施形態において、本発明の融合タンパク質は、ヌクレオチド配列によりコードされる。本発明のヌクレオチド配列は、クローニング、遺伝子治療、タンパク質の発現及び精製、変異導入、それを必要とするホストのＤＮＡワクチン接種、抗体生成（例えば、受動免疫付与）、ＰＣＲ、プライマー及びプローブの生成、ｓｉＲＮＡのデザイン及び生成等を含む多くの用途に有用であり得る。実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、又は３２から選ばれるヌクレオチド配列を含むか、それらからなるか、或いは本質的にそれらからなる。
【００７２】
実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、又は３２で示されるヌクレオチド配列と少なくとも、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のヌクレオチド配列を含む。実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、又は３２で示される連続ヌクレオチド配列と少なくとも、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の連続ヌクレオチド配列を含む。
【００７３】
好ましい本発明のＵＴＩ融合タンパク質は、ヒト免疫グロブリン配列由来の配列（例、少なくとも１つのＦｃドメイン）を含む。しかしながら、配列は、他の哺乳動物種由来の１以上の配列を含んでいてもよい。例えば、霊長類Ｆｃドメイン又はヌクレアーゼドメインが、対象配列に含まれていてもよい。代替的に、１以上のマウスアミノ酸が、ポリペプチド中に存在していてもよい。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド配列は、免疫原性ではない且つ／或いは低下した免疫原性を有する。本発明のＵＴＩ融合タンパク質は、１以上のアミノ酸残基（例えば、必須アミノ酸残基又は非必須アミノ酸残基）で保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義され、塩基性側鎖（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、結合ポリペプチドの非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーに由来するその他のアミノ酸残基で置き換えられていてもよい。他の実施形態では、アミノ酸のストリングは、側鎖ファミリーメンバーの順序及び／又は組成が異なる構造的に同様のストリングで置き換えることができる。代替的に、他の実施形態では、例えば飽和突然変異誘発により、突然変異を、コード配列の全て又は一部に無作為に導入してもよい。結果として得られた変異体を、本発明の結合ポリペプチドに組み込み、それらの所望の標的に結合する能力でスクリーニングすることができる。
【００７４】
（用途）
一実施形態では、本発明は、ＵＴＩ関連病態の診断方法及び治療方法を提供する。本明細書で用いられる用語「条件」、「障害」及び「疾患」は、任意の不健康な状態又は異常な状態に関連する。用語「ＵＴＩ関連病態」は、ＵＴＩが治療上の利益をもたらす病態、障害、及び疾患を含む。用語「ＵＴＩ関連病態」は、免疫調節効果又は炎症効果により特徴付けられる病態を含む。特に、用語ＵＴＩ関連病態は、膵炎（急性膵炎及び慢性膵炎を含む）、全身性炎症反応症候群、急性循環障害（例えば、ショックによって引き起こされるもの）、播種性血管内凝固症候群、及び多臓器不全症候群を含む。また、用語ＵＴＩ関連病態は、高リスク外科患者における使用を含む。また、用語ＵＴＩ関連病態は、肺、肝臓、心臓、又は腎臓の感染を含む。また、用語ＵＴＩ関連病態は、重度の敗血症を含む。また、用語ＵＴＩ関連病態は、ＳＡＲＳウイルスにより引き起こされる急性肺損傷（ＡＬＩ）又は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む。
【００７５】
一実施形態では、本発明は、有効量（例えば、薬学的な有効量）の開示されたＵＴＩ融合タンパクを、それを必要とする患者に投与することを含むＵＴＩ関連病態の治療方法を提供する。ある実施形態では、病態は、本明細書で具体的に言及されるものである。
【００７６】
本発明の医薬組成物は、医薬分野においてよく知られている方法で調製され、活性成分として少なくとも１つの本発明のＵＴＩ融合タンパク質を含む。本発明に従って使用されるＵＴＩ融合タンパク質の医薬組成物は、所望の程度の純度を有するＵＴＩ融合タンパク質を、任意の医薬上許容される賦形剤と混合することにより調製される。用語「医薬上許容される賦形剤」とは、通常、医薬組成物を調製する時に使用されるものをいい、薬学的に純粋で且つ使用量で非毒性であるべきである。それらは、一般的に、集合中で活性成分のためのビヒクル又は培地として働くことができる固体、半固体、又は液体物質である。医薬上許容される賦形剤のいくつかの例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」及び「ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」中に見いだされ、希釈剤、ビヒクル、担体、徐放マトリックス、安定剤、保存剤、溶剤、懸濁化剤、緩衝剤、乳化剤、色素剤、噴霧剤、コーティング剤、及びその他のものを含む。注射又は静脈内投与に一般的な、本発明のＵＴＩ融合タンパク質は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態である。
【００７７】
医薬上許容される賦形剤は、使用量で対象に無毒性であり、緩衝剤（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及びその他の有機酸類）；酸化防止剤（アスコルビン酸及びメチオニンを含む）；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えば、メチル又はプロピルパラベン）；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン）；単糖類、二糖類、及びその他の炭水化物（グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖類（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又は非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含む。
【００７８】
また、本明細書における医薬組成物は、１つより多くの活性化合物、即ち、融合タンパク質、必要に応じて、治療する特定の症状のためのもの、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない補体活性を有するものを含んでいてもよい。このような分子は、適切に、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【００７９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用する医薬組成物は、滅菌或いはそれに近いものであるべきである。これは、滅菌ろ過膜に通してろ過することにより容易に達成される。
【００８０】
本発明のＵＴＩ融合タンパク質は、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、関節滑液嚢内、又は髄腔内注射又は注入により、或いは局所経路又は吸入経路により、ボーラスとしての或いは一定期間にわたる持続注入による静脈内投与のような既知の方法にしたがって対象に投与される。ＵＴＩ融合タンパク質の静脈内投与又は皮下投与が好ましい。
【００８１】
用語「治療する」、「治療」及び「治療すること」は、本明細書に記載の病態の改善を含む。用語「治療する」、「治療」及び「治療すること」は、本明細書に記載の病態の状態又は進行の減速、防止、阻害、制御又は停止をもたらす全てのプロセスを含むが、必ずしも、全ての症状の完全な排除又は病態の治癒を示すものではない。用語「治療する」、「治療」及び「治療すること」は、このような障害の治療的処置を含むことを意図する。用語「治療する」、「治療」及び「治療すること」は、このような障害の予防的処置を含むことを意図する。
【００８２】
本明細書で用いられる、用語「患者」及び「対象」は、ヒト及び非ヒト動物、例えば、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、及びブタ）を含む。また、その用語は、鳥類、魚、爬虫類、両生類等を含む。より特定の患者はヒトであると理解される。また、より特定の患者及び対象は、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、及びイヌ）である。
【００８３】
本明細書で用いられる、用語「有効量」とは、単回投与又は多回投与で、言及された病態に罹患している患者を治療する本発明の化合物、即ち、融合タンパク質の量をいう。有効量は、既知の技術を用いることにより且つ類似の状況下で得られた結果を観察することにより、当業者としての医師又は獣医のような医療専門家である担当診断医により容易に決定され得る。例えば、医療専門家は、所望の治療効果を達成するために必要な水準よりも低い水準で、医薬組成物で使用される医薬の投与を開始し、所望の効果が達成できるまで用量を徐々に増加させることができる。
【００８４】
有効量、用量の決定する場合、多くの要因が、担当診断医により考慮され、それには、患者の種；そのサイズ、年齢、及び全身の健康；関与する具体的な病態、障害、又は疾患；個々の患者の病態、障害、又は疾患の関与又は重症度、反応の程度；投与された特定の化合物、即ち、融合タンパク質；投与様式；投与製剤の生物学的利用能特性；選択された投与計画；併用薬の使用；及びその他の関連する状況が含まれるが、これらに限定されない。具体的な量は、当業者により決定され得る。これらの用量は、約６０ｋｇ〜約７０ｋｇの重量の平均的なヒト対象に基づくが、医師は、重量がこの体重範囲の外にある患者（例えば、幼児）のための適切な用量を決定することができるだろう。
【００８５】
投与計画を調整して所望の反応を提供する。治療の状況の緊急性により示されるように、例えば、単回のボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、或いは用量を比例的に減少又は増加させてもよい。
【００８６】
非経口組成物は、投与の容易さ及び用量の均一性のために単位用量形態で製剤化してもよい。本明細書で用いられる単位用量形態とは、治療対象のための単位用量として適切な物理的に分離した単位をいう。各単位は、必要な医薬担体と併せて所望の治療効果をもたらすために計算された所定の量の活性化合物、即ち、融合タンパク質を含む。
【００８７】
本医薬組成物は、好ましくは、通常、それぞれ約０．５ｍｇ〜約１００ｍｇの本発明のＵＴＩ融合タンパク質を含む単位剤形で処方される。用語「単位剤形」とは、１以上が所望の治療効果を生み出す投与計画を通じて使用される、適切な医薬賦形剤と共に所定の量の活性成分を含む物理的に分離した単位をいう。１以上の「単位剤形」が治療用量に影響を与えるために必要とされてもよい。
【００８８】
本発明において使用されるＵＴＩ融合タンパク質の有効量の代表的な非限定的範囲は、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、又は約３ｍｇ／ｋｇである。他の実施形態では、ＵＴＩ融合タンパク質は、１ｍｇ／ｋｇ以上の用量、例えば、１〜２０ｍｇ／ｋｇの用量、例えば、５〜２０ｍｇ／ｋｇの用量、例えば、８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。本発明において使用されるＵＴＩ融合タンパク質の有効量の代表的な非限定的範囲は、約１〜５００ｍｇ／用量、例えば、約１〜１００ｍｇ／用量、例えば、約１〜５０ｍｇ／用量、例えば、約１〜１０ｍｇ／用量、例えば、約１ｍｇ／用量、又は約３ｍｇ／用量、又は約５ｍｇ／用量である。一実施形態では、ＵＴＩ融合タンパク質は、３日ごとに注入により或いは毎週１０〜５００ｍｇ／用量の用量で投与される。このような投与は、必要に応じて所望の治療効果を維持するために繰り返されてもよい。
【００８９】
非限定的な例として、本発明に基づく治療は、治療開始後、１日あたり、１日少なくとも１回、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｍｇ／ｋｇ；１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ｍｇ／ｋｇ、又は代替的に、少なくとも週に一度、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ｍｇ／ｋｇ、又は任意のそれらの組み合わせの量でＵＴＩ融合タンパク質の投薬を提供してもよい。非限定的な例として、本発明に基づく治療は、約１〜１００ｍｇ／用量、例えば、１、５、１０、２０、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、又は４００ｍｇ／用量の量でＵＴＩ融合タンパク質の投薬を提供してもよい。治療開始後、少なくとも１日１回、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ｍｇ／用量又はそれらの任意の組み合わせ。治療開始後、少なくとも週に１回、１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ｍｇ／用量又はそれらの任意の組み合わせ。
【００９０】
本発明のＵＴＩ融合タンパク質は、ＵＴＩ関連疾患の治療を含むさまざまな用途での使用が見出される。本発明のＵＴＩ融合タンパク質は、免疫系の関与を伴う疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、術後炎症反応、リソソーム関連疾患、凝固疾患、プロテアーゼ関連疾患の治療での使用、及び手術間アジュバント療法としての使用を見出すことができる。本発明のＵＴＩ融合タンパク質は、膵炎（内視鏡誘発性膵炎及び急性膵炎を含む）、関節炎、ＳＡＲＳ、全身性炎症反応症候群、急性循環障害、敗血症、肝炎、虫垂炎、大腸炎、臓器不全、臓器障害（膵臓、腎臓、肺を含む）、再潅流傷害、スティーブンス・ジョンソン症候群、中毒性表皮壊死症、ショック、虚血性傷害、急性肺損傷（急性大動脈解離に起因するものを含む）、喘息、肺炎症、肺炎（人工呼吸器関連を含む）、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、及び全身性炎症反応症候群の治療での使用を見出すことができる。
【００９１】
本発明のＵＴＩ融合タンパク質は、プロテアーゼ（セリンプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、カリクレイン、プラスミン、エラスターゼ、カテプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、第ＩＸａ、Ｘａ、ＸＩａ、及びＸｌＩａ因子、並びに多形核白血球エラスターゼを含む）を含む）の阻害での使用を見出すことができる。
【００９２】
本発明のＵＴＩ融合タンパク質は、前炎症性メディエータ（例えば、サイトカイン、腫瘍壊死因子アルファ、インターロイキン１、１β、４、６及び８、１０並びにケモカイン）の抑制での使用を見出すことができる。
【００９３】
本発明のＵＴＩ融合タンパク質は、腫瘍侵襲及び転移、変化した速度のアポトーシスの予防、並びにシスプラチン治療における腎機能損失の低減を含む癌治療での使用を見出すことができる。
【００９４】
本発明のＵＴＩ融合タンパク質は、補助療法を含むＡＩＤＳの治療のための使用を見出すことができる。
【実施例】
【００９５】
以下は、本発明を実施するための具体的な実施形態の例である。実施例は、例示を目的としてのみ示され、多少なりとも本発明の範囲を限定することを意図するものではない。用いられる数値（例えば量、温度等）に対する正確さを保証する努力がなされているが、もちろん、一部の実験の誤差及び偏差は許容されるべきである。本発明の実施は、特に記載がない限り、当技術分野の技術範囲内で、タンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来の方法を採用するだろう。このような技術は、文献において十分に説明される。例えば、T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993)；A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc.)；Sambrook, et al, Molecular Cloning: A Laboratory manual (2nd Edition, 1989)；Methods In Enzymology (S. Colowlck and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)； Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)；Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B (l992)を参照。
【００９６】
実施例１：ＵＴＩ融合タンパク質をコードするＤＮＡベクターの構築
【００９７】
分子生物学を実施するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  クローニング）：実験室マニュアル第四版（Micheal Green and Joseph Sambrook, Cold Spring Harbor Press, 2012）で見出される。
【００９８】
ＵＴＩ−Ｆｃ１をコードする遺伝子を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州カールズバッド）のＧｅｎｅＡｒｔコドン最適化遺伝子合成サービスを用いて発注した。タンパク質配列は、分泌のために加えられたシグナルペプチドＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳと共に配列番号１にリストされている。図１は、融合に用いられるＵＴＩの一般領域を示す。ＵＴＩ−Ｆｃ１をコードする遺伝子は、哺乳動物の発現ベクターに結合した。哺乳動物の発現ベクターは、当技術分野で周知であり、ｐＳｅｃＴａｇ２／Ｈｙｇｒｏ  Ａ、ｐｃＤＮＡ４及びｐｃＤＮＡ６ベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）を含む。ベクターを制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ及びＥｃｏＲＩ）で消化した。このフラグメントを、カルベニシリン耐性をもたらす発現ベクターに結合し、同じ２つの制限酵素で消化した。１：３のベクター：インサートのモル比を、結合で使用した。結合したＤＮＡを、ＮＥＢの１０ベータの化学的に適格性がある大腸菌細胞にトランスフォームし、終夜増殖させるためにＬＢカルベニシリンプレートに播種した。コロニーを、カルベニシリンを伴うＬＢ中で終夜増殖させ、ミニプレップＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ’ｓ  ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、独国ヒルデン）で調製した。次いで、Ｂｉｏ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｊｏｉｎｔ（ＢＡＴＪ、サンディエゴ）のＤＮＡシークエンシングサービスを利用してＤＮＡの配列を決定した。配列を検証したコロニーを、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＢｅｎｃｈＰｒｏ２１００計器及びＭａｘｉＣａｒｄを用いて、ＤＮＡの精製のためにカルベニシリンを伴うＬＢ培地中で増殖させた。
【００９９】
実施例２：ＵＴＩ−Ｆｃ融合タンパク質の変異体をコードするＤＮＡベクターの構築
【０１００】
配列番号１〜２８は、ＤＮＡ及びいくつかのＵＴＩ−Ｆｃ融合タンパク質のタンパク質配列をリストする。これらのＵＴＩ融合タンパク質は、Ｉｇアイソタイプ、リンカー、ＵＴＩドメイン、ＵＴＩ及びＦｃドメインの順序（Ｎ末端又はＣ末端）、ＵＴＩ種、Ｆｃ種、ＵＴＩ開始／停止残基、糖結合、プロテアーゼ感受性部位、及びＦｃエフェクター機能を変更する修飾を含む。いくつかのＵＴＩ−Ｆｃタンパク質は、図２及び３に示される。Ｓｅｒ（ＩｇＧ１  Ｆｃ３Ｓｅｒ、Ｃ１５４Ｓ／Ｐ１７２Ｓ／Ｐ２６５Ｓ）に３つのアミノ酸修飾を含むＵＴＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、ジスルフィド結合形成及びＦｃγＲ機能を変化させる変異を含む。
【０１０１】
ＵＴＩ−Ｆｃ発現構築物の作成
【０１０２】
ＵＴＩ（例えば、野生型、Ｓ１０Ａ、及びＫ２１Ｓ  Ｋ２２Ｓ変異体）及びヒトＦｃ３Ｓｅｒドメインのヌクレオチド配列は、ＣＨＯ細胞発現に対して最適化されたコドンであり、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州カールズバッド）で合成されたものである。以下の構築物を、シーケンス及びライゲーション非依存性クローニング（ＳＬＩＣ）法（Li and Elledge 2007 Nature Methods 4(3):251-256）によりＵＴＩ及びＦｃ３ＳｅｒドメインをアセンブルすることによりＣＨＯ発現ベクターで作成した：ＵＴＩ−Ｆｃ３Ｓｅｒ、ＵＴＩ  Ｓ１０Ａ−Ｆｃ３Ｓｅｒ、ＵＴＩ  Ｋ２１Ｓ  Ｋ２２Ｓ−Ｆｃ３Ｓｅｒ、ＵＴＩ  ｍ２−Ｆｃ３Ｓｅｒ、ＵＴＩ  Ｌ１−Ｆｃ３Ｓｅｒ、ＵＴＩ  Ｌ２−Ｆｃ３Ｓｅｒ（図４Ａ）。ＳＬＩＣベースのＤＮＡアセンブリを、線状化ベクター（３０ｎｇ）、ＵＴＩ（１００ｎｇ）及びＦｃ３Ｓｅｒ（１００ｎｇ）ＰＣＲ生成物を、相同的組み換えのための適切なオーバーハング配列、及びＮＥＢｕｆｆｅｒ２及びＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む５μＬの体積のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（０．５Ｕ）と混合することにより行った。３０分の室温でのインキュベーション後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を、２ｍＭのｄＣＴＰを加えることによりクエンチした。次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ相同的組み換えを、３０分にわたる７５Ｃから３７Ｃへの温度勾配により行った。アセンブルされたＤＮＡを含む反応混合物を、ＴＯＰ１０大腸菌（インビトロゲン）に化学的にトランスフォームし、カルベニシリンを含むＬＢ寒天に播種した。残りの構築物（ＵＴＩ  ｍ１−Ｆｃ３Ｓｅｒ、ＵＴＩ  ｄ１−Ｆｃ３Ｓｅｒ、ＵＴＩ  ｄ２−Ｆｃ３Ｓｅｒ、ＵＴＩ  Ｌ３−Ｆｃ３Ｓｅｒ、ＵＴＩ−Ｆｃ  ＩｇＧ２、Ｆｃ３Ｓｅｒ−ＵＴＩ、及びマウスＵＴＩ−マウスＩｇＧ１）のためのオープンリーディングフレームは、最適化されたコドンであり、融合構築物として合成した。これらの構築物を、上記のようにＳＬＩＣ法を用いて発現ベクターにクローニングした（図４Ｂ）。ベクター中の１３の構築物全てのＤＮＡ配列を、ＳａｎｇｅｒＤＮＡシークエンシングで確認した。
【０１０３】
実施例３：ＣＨＯ細胞におけるＵＴＩ−Ｆｃ融合体の発現
【０１０４】
ＵＴＩ−Ｆｃ１をコードするＤＮＡベクターを、インビトロゲンのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ＭＡＸ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いてＣＨＯ−Ｓ細胞に安定的にトランスフェクトした。バルク培養物を、Ｔ−フラスコに播種し、５０〜１００μＭの範囲の様々な濃度のメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を補ったＣＤ  ＣＨＯを用いて選択した。培養物を選択物から回収した時点で、製造及び凍結保存のために拡大した。複数の製造バッチ処理は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ試験をサポートするために行った。製造方法は、インビトロゲンのＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯ、ＣＤ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ｂ、及びＣＤ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ｃを用いる１０〜１４日のフェドバッチ培養である。製造量は１Ｌ〜３Ｌの範囲であり、培養物を１〜２時間の３５００ｒｐｍの遠心分離で回収し、続いて、上清を滅菌ろ過し、得られた細胞上清を精製で用いた。
【０１０５】
実施例４：ＵＴＩ−Ｆｃ融合タンパク質の精製
【０１０６】
２つのＵＴＩ−Ｆｃ１のバッチの精製を、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム（ｐＨ８．１）、１２５ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化した３０ｍｌのプロテインＡ  ｍＡｂ  ｓｅｌｅｃｔ  ｌｘ（ＧＥヘルスケア）に、発現したＵＴＩ−Ｆｃ１を伴う２．３リッターのＣＨＯ細胞馴化培地を適用することにより行った。カラムを、２カラム体積（６０ｍｌ）（２５ｍＭクエン酸三ナトリウム（ｐＨ８．１）、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ）で洗浄し、次いで、２カラム体積（６０ｍｌ）（２５ｍＭクエン酸三ナトリウム（ｐＨ８．１）、２０００ｍＭ  ＮａＣｌ）で洗浄した。次いで、カラムを、２カラム容量（６０ｍｌ）（２５ｍＭクエン酸三ナトリウム（ｐＨ８．１）、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ）で平衡化した。ＵＴＩ−Ｆｃ１を、１００％の２５ｍＭクエン酸（ｐＨ２．９）、１２５ｍＭ  ＮａＣｌへの７カラム体積（２１０ｍｌ）勾配で溶出した。ＵＴＩ−Ｆｃ１は、２つのピーク、おおよそのｐＨ５．５の幅広い隣接ピーク及びおおよそのｐＨ３．５のより鋭いピークとして溶出した。次いで、濃縮ＵＴＩ−Ｆｃを、３０Ｋ  Ｍ．Ｗ．Ｃ．Ｏ．を備えるＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心濃縮器を用いてＴＢＳ  ｐＨ７．４（２５ｍＭトリス、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ  ｐＨ７．４）の最終バッファーにバッファー交換した。精製したタンパク質の収率を表１に示し、タンパク質をさらに使用するために−８０℃で保存した。
【０１０７】
【表１】
2019187427.tif 000002
【０１０８】
実施例５：さらなるＵＴＩ−Ｆｃ融合タンパク質の発現及び精製
【０１０９】
トランスフェクションの日に、ＣＨＯ細胞をカウントし、９０％総体積９００ｍＬに２．２ｘ１０＾６生細胞／ｍＬの密度で播種し、トランスフェクションされるまで３３℃で振盪フラスコ内にて増殖させた。凍結ＤＮＡを解凍し、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン−カチオン性ポリマー）及びＡＫＴに加えた。ＤＮＡを０．６２５ｕｇ／１００万細胞で加えた。１Ｌの細胞は１．２５ｍｇを必要とする。加えた総ＤＮＡの９０％が、目的のＤＮＡ＝１．１２５ｍｇｓであった。残りの１０％は、ＡＫＴ（抗アポトーシスタンパク質をコードするもの）＝０．１２５ｍｇｓであった。ＰＥＩを２．５ｕｇ／１００万細胞で加えた。１Ｌのトランスフェクションため、これは５ｍｇであった。ＰＥＩ溶液を希釈したＤＮＡに加えて、室温で１５分間インキュベートし、その後、ＤＮＡ複合体を細胞に添加した。
【０１１０】
培養物を、３３℃、５％ＣＯ２、及び１２５ｒｐｍで増殖させた。１〜４時間のトランスフェクション後に、０．６ｍＭのバルプロ酸を加えた。１Ｌのトランスフェクションのために、これは、２ｍＬの３００ｍＭのストックであった。１日目に、１：２５０の凝固防止剤を加え（即ち、４ｍＬｓ／１Ｌ）、１５％ｖ／ｖ  ＣＤ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ｃを加えた（即ち、１５０ｍＬｓ／１Ｌ）。５日目及び９日目に１５％ＣＤ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ｃを加えた。
【０１１１】
細胞上清を１４日目に採取し、細胞をカウントし、タンパク質力価を決定した。４℃にて３０分間３０００ｒｐｍでの遠心分離により細胞を沈降させた。上清を０．２ミクロンのフィルターに通してろ過し、４℃で保存するか或いは−２０℃で凍結した。
【０１１２】
ＵＴＩ−Ｆｃ融合体の精製は、プロテインＡクロマトグラフィーで行った。２００ｍＬの細胞培養上清を、２ｍｌのＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕｒｅプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズと混合し、４℃で終夜振盪した。次いでビーズ混合物を、５０ｍｌチューブ内にて１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。ビーズをカラムに加え、結合バッファー（Ｂｉｏｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）で三回洗浄した。ＵＴＩ融合体を、８ｍｌのＭＡＰＳ  ＩＩ  Ｅｌｕｔｉｏｎバッファー（Ｂｉｏｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）で溶出した。２ｍｌの中和溶液（１Ｍトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８）を加えた。次いで、Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌユニット（３０ＭＷＣＯ、１５  ｍＬｓ、ミリポア）を用いて濃縮及びバッファーでの希釈を繰り返すことにより、サンプルを、２５ｍＭクエン酸塩、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）にバッファー交換した。図９は、様々なＵＴＩ融合タンパク質の精製結果をリストする。
【０１１３】
実施例６：ＵＴＩ融合タンパク質によるプロテアーゼの阻害
【０１１４】
ＵＴＩ−Ｆｃ融合タンパク質によるトリプシン阻害についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素アッセイ
【０１１５】
様々な濃度（≦２００ｎＭ最終濃度）のＵＴＩ−Ｆｃ１溶液は、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．０１％Ｂｒｉｊ  Ｌ２３（ｐＨ７．４）で調製される。活性アッセイをＧｒｅｉｎｅｒ３８４ウェル小容量プレートで行った。全ての工程を室温で行った。
【０１１６】
ヒト膵臓トリプシン（１．５ｎＭ最終濃度）（Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を希釈液に加え、次いで１５分間試験ＵＴＩ−Ｆｃでプレインキュベートした。次いで、反応を、１００μＭ（最終）の基質Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン−７−アミド−４−メチルクマリン塩酸塩（ＳＩＧＭＡＢ７２６０−２５ＭＧ）で開始した。反応混合物の総体積は、２０  ｌであった。トリプシン活性を蛍光により決定した。例えば、蛍光強度を、３７０ｎｍの励起波長及び４７０ｎｍの発光波長を用いて、ＢＭＧ  ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳ又はＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ｐｌｕｓで３０〜６０分のウィンドウにわたるカイネティックモードで測定した。トリプシン活性は、観察された蛍光の変化に直線的に比例した（最終−初期）。所定のＵＴＩ−Ｆｃ濃度でのトリプシンの阻害パーセントは、以下のように定義された：
【０１１７】
阻害パーセント＝１００＊（１−（（Ｆｉ−Ｆｐ）／（Ｆｎ−Ｆｐ）））
【０１１８】
ここで、Ｆｉは、所定の濃度の試験ＵＴＩ−Ｆｃで観察された蛍光であった。
【０１１９】
Ｆｐは、陽性対照（即ち、トリプシンの不存在下での２〜６のアッセイの平均値）で観察された蛍光であった。
【０１２０】
Ｆｎは、陰性対照（即ち、ビヒクル単独の存在下での２〜６のトリプシンアッセイの平均値）で観察された蛍光であった。
【０１２１】
試験化合物、即ち、融合タンパク質のＩＣ５０（５０％阻害を生み出す化合物、即ち、融合タンパク質のモル濃度）は、方程式、阻害パーセント＝Ｂｏｔｔｏｍ＋（（Ｔｏｐ−Ｂｏｔｔｏｍ）／（１＋（（ＩＣ５０／［ＵＴＩ−Ｆｃ］）＾Ｈｉｌｌ）））にあてはめた非線形最小二乗曲線により計算された。１つの陽性対照がＵＴＩ−Ｆｃのパネル内に含まれた。図５に示されるように、ヒトＵＴＩは、〜３ｎＭのＩＣ５０を有する。
【０１２２】
また、ＵＴＩ−Ｆｃ１によるその他のプロテアーゼの阻害測定を、Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ペンシルベニア州マルバーン）で測定した。図６は、キモトリプシンのＵＴＩ−Ｆｃ１の阻害を証明する。図７は、さまざまなプロテアーゼに対するＵＴＩ−Ｆｃ１の阻害定数をリストする。ＵＴＩ−Ｆｃ１は、キモトリプシン及びプラスミンを適度に阻害し、カスパーゼ−１、カテプシンＣ、及びパパインの弱い阻害を示す。
【０１２３】
実施例７：ＵＴＩ融合タンパク質での治療の細胞効果
【０１２４】
サイトカイン放出のＵＴＩ−Ｆｃ１阻害は、細胞ベースアッセイにおける測定値であった。ＢＥＡＳ２Ｂ細胞を、９６ウェルプレートにおいて２０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、ＣＯ２インキュベーターにおいて完結ＢＥＧＭ  Ｂｕｌｌｅｔ  Ｋｉｔ（ロンザ）を用いて培養した。２４時間後、培養培地を、飢餓のためにプレーンＤＭＥＭに置き換え、細胞を終夜培養した。次いで、細胞を、様々な濃度のヒト尿ＵＴＩ又は組み換えＵＴＩ−Ｆｃ１タンパク質を有する１００ｎＭトリプシンを含むフレッシュなプレーンＤＭＥＭとインキュベートした。８時間後、培養上清を回収し、ヒトＩＬ−６  ＤｕｏＳｅｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＩＬ−６タンパク質レベルを評価した。
【０１２５】
結果は、ＵＴＩ及びＵＴＩ−Ｆｃの両方が、ＢＥＡＳ２Ｂ細胞におけるトリプシン誘導性ＩＬ−６の産生を減少させることを証明する。図８に示されるように、阻害は、それぞれ０．４０及び０．４１μｇ／ｍＬのＩＣ５０値で用量依存的であった。
【０１２６】
実施例８
【０１２７】
ＵＴＩ−Ｆｃ分子の安定性の測定（熱変性）
【０１２８】
アッセイを、熱安定性及びリアルタイム安定性を測定するために行った。全ての分子でトリプシン阻害活性が証明された。熱安定性を、Ｍｉｃｒｏｃａｌ  ＶＰ−ＤＳＣ熱量計の示差走査熱量計で測定した。サンプルを１ｍｇ／ｍｌで調製し、０．２５ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、０．１３Ｍ  ＮａＣｌ及び０．００２７Ｍ  ＫＣｌでバッファーリングした。サンプルを、毎時２００℃の速度で２５℃から１１０℃に加熱した。ＵＴＩ−Ｆｃ１を、それぞれＩｇＧ２又はＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む出願公開番号ＣＮ１０３０４４５５４Ａの配列２及び６と比較した。結果を表８に示す。
【０１２９】
【表８】
2019187427.tif 000003
【０１３０】
実施例９
【０１３１】
リアルタイム安定性測定
【０１３２】
リアルタイム安定性測定は、ＴＢＳのｐＨ７．４バッファー中にて０、２及び４週間２〜８℃及び４０℃で配列番号１（ＵＴＩ−Ｆｃ１）又はＣＮ１０３０４４５５４Ａの配列２又は６をインキュベートすることにより行われた。より高分子量及びより低分子量の種の形成を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で測定し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で可視化した。また、各ＵＴＩ−Ｆｃの濃度を、タンパク質の組成により決定される吸光係数を用いて２８０ｎｍ（Ａ２８０）での溶液の吸光度を測定することによりモニターした。ＵＴＩ−Ｆｃ分子は、ＳＥＣにより分析した場合に２つの部分的重複ピークを生じさせる。ＳＥＣにより測定された各ＵＴＩ−Ｆｃサンプルにおけるパーセントのピーク面積を、時間＝０週目、２週目及び４週目で表９にて報告する。また、時間＝２週目及び４週目でのＡ２８０（％Δ（ｍｇ／ｍｌ））により測定された濃度の変化率も示す。各サンプルの初期Ｔ０濃度は、ＵＴＩ−Ｆｃ１＝３３．５ｍｇ／ｍＬ、ＣＮ１０３０４４５５４の配列２＝８．５ｍｇ／ｍＬ、及びＣＮ１０３０４４５５４Ａの配列６＝５．６ｍｇ／ｍＬであった。３％の変動がＳＥＣで典型的であり、１５％が個々のＵＶ測定で典型的である。ＰＡＧＥの分析は、各ＵＴＩ−Ｆｃ分子が、完全長のＵＴＩ−Ｆｃの期待されるバンドパターンを示したことを示した。
【０１３３】
【表９】
2019187427.tif 000004
【０１３４】
実施例１０
【０１３５】
補体阻害のｉｎ  ｖｉｖｏ試験
【０１３６】
補体系に対するＵＴＩ−Ｆｃ１（配列番号１）の影響をｉｎ  ｖｉｖｏで測定した。雌のＣ３ｈ／ＨｅＪマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。動物に、表１０の実験計画に従って投与した。動物にゼロ時間でのＬＰＳの投与１５分後に腹腔内注射した（１００ｕｌ／マウス）。動物を、ＬＰＳ注射の２及び４時間後にＣＯ２過剰摂取により安楽死させ、血液を心穿刺により採取した。血液を血清セパレータマイクロチューブに移し、室温で３０分間凝固させた。次いで、マイクロチューブを、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。血清を除去し、９６ウェルプレートに分注した。ロスマリン酸を陽性対照として使用し、食塩水中で３ｍｇ／ｍｌとして使用した。９６ウェルプレートを−２０℃で凍結した。血清サンプルを、ｄｕｏｓｅｔによりＣ５ａ含有量について分析した。統計的有意性は、Ｐｒｉｓｍグラフソフトウエアを用いて決定され、効果は、ｐ＜０．０５の場合に統計学的に有意であるとみなした。図１０に示されるように、配列番号１（ＵＴＩ−Ｆｃ１）は、ＬＰＳ投与の４時間後に２０、５０、及び１００ｍｇ／ｋｇでＣ５ａを有意に減少させた。
【０１３７】
表１０：実験計画（ＵＴＩ−Ｆｃ１は配列１）
【０１３８】
【表１０】
2019187427.tif 000005
【０１３９】
配列表
【０１４０】
配列番号１  ＵＴＩ−Ｆｃ１タンパク質配列
AVLPQEEEGSGGGQLVTEVTKKEDSCQLGYSAGPCMGMTSRYFYNGTSMACETFQYGGCMGNGNNFVTEKECLQTCRTVAACNLPIVRGPCRAFIQLWAFDAVKGKCVLFPYGGCQGNGNKFYSEKECREYCGVPGDGDEELLGSGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
【０１４１】
配列番号２  ＵＴＩ−Ｆｃ１  ＤＮＡ配列
GCTGTGCTGCCTCAGGAAGAGGAAGGCTCTGGCGGAGGCCAGCTCGTGACCGAAGTGACCAAGAAAGAGGACTCCTGCCAGCTGGGCTACTCTGCCGGCCCTTGTATGGGCATGACCTCCCGGTACTTCTACAACGGCACCTCCATGGCCTGCGAGACATTCCAGTACGGCGGCTGCATGGGCAACGGCAACAACTTTGTGACAGAGAAAGAGTGCCTGCAGACCTGCAGAACCGTGGCCGCCTGTAACCTGCCTATCGTGCGGGGACCCTGTCGGGCCTTTATCCAGCTGTGGGCCTTCGACGCCGTGAAGGGCAAATGCGTGCTGTTCCCCTATGGCGGCTGCCAGGGAAATGGAAACAAGTTCTACTCCGAGAAAGAATGCCGCGAGTACTGTGGCGTGCCAGGCGACGGGGATGAGGAACTGCTGGGATCAGGCGGCGGAGGCGACAAGACCCATACCTGTCCACCTTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGACCTTCTGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGGGAACCCCAGGTGTACACACTGCCCCCTAGCCGGGAAGAGATGACAAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTCGTGAAGGGATTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGC
【０１４２】
配列番号３  ＵＴＩ−Ｆｃ  ＩｇＧ１  ３Ｓｅｒタンパク質配列
avlpqeeegsgggqlvtevtkkedscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacetfqyggcmgngnnfvtekeclqtcrtvaacnlpivrgpcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeellrepkssdkthtcppcpapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpasiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg
【０１４３】
配列番号４  ＵＴＩ−Ｆｃ  ＩｇＧ１  ３Ｓｅｒ  ＤＮＡ配列
gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctgggctactctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcggctgcatgggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgtgcggggaccctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgccagggaaatggaaacaagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgctgcgggagcccaaatcttccgacaagacccatacctgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc
【０１４４】
配列番号５  ＵＴＩ−Ｆｃ  ＩｇＧ２  Ｓｅｒタンパク質配列
avlpqeeegsgggqlvtevtkkedscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacetfqyggcmgngnnfvtekeclqtcrtvaacnlpivrgpcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeellrkscvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgmevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
【０１４５】
配列番号６  ＵＴＩ−Ｆｃ  ＩｇＧ２  Ｓｅｒ  ＤＮＡ配列
gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctgggctactctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcggctgcatgggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgtgcggggaccctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgccagggaaatggaaacaagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgctgcggaaatcctgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcatggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
【０１４６】
配列番号７  ＵＴＩ−Ｆｃ  ＩｇＧ２タンパク質配列
avlpqeeegsgggqlvtevtkkedscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacetfqyggcmgngnnfvtekeclqtcrtvaacnlpivrgpcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeellrkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgmevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
【０１４７】
配列番号８  ＵＴＩ−Ｆｃ  ＩｇＧ２  ＤＮＡ配列
gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctgggctactctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcggctgcatgggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgtgcggggaccctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgccagggaaatggaaacaagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgctgcggaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcatggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
【０１４８】
配列番号９  ＵＴＩ−Ｆｃ  ＩｇＧ１  ３Ｓｅｒ  Ｓ１０Ａタンパク質配列
avlpqeeegagggqlvtevtkkedscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacetfqyggcmgngnnfvtekeclqtcrtvaacnlpivrgpcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeellrepkssdkthtcppcpapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpasiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg
【０１４９】
配列番号１０  ＵＴＩ−Ｆｃ  ＩｇＧ１  ３Ｓｅｒ  Ｓ１０Ａ  ＤＮＡ配列
gctgtgctgcctcaggaagaggaaggcgcaggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctgggctactctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcggctgcatgggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgtgcggggaccctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgccagggaaatggaaacaagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgctgcgggagcccaaatcttccgacaagacccatacctgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc
【０１５０】
配列番号１１  ＵＴＩ−Ｆｃ  ＩｇＧ１  ３Ｓｅｒ  ｍ２タンパク質配列
edscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacetfqyggcmgngnnfvtekeclqtcrtvaacnlpivrgpcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeellrepkssdkthtcppcpapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpasiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg
【０１５１】
配列番号１２  ＵＴＩ−Ｆｃ  ＩｇＧ１  ３Ｓｅｒ  ｍ２  ＤＮＡ配列
gaggactcctgccagctgggctactctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcggctgcatgggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgtgcggggaccctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgccagggaaatggaaacaagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgctgcgggagcccaaatcttccgacaagacccatacctgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc
【０１５２】
配列番号１３  ＵＴＩ−Ｆｃ  ＩｇＧ１  ３Ｓｅｒ  ｍ１タンパク質配列
avlpqeeegsgggqlvtevtkkepkssdkthtcppcpapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpasiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg
【０１５３】
配列番号１４  ＵＴＩ−Ｆｃ  ＩｇＧ１  ３Ｓｅｒ  ｍ１  ＤＮＡ配列
gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagagcccaaatcttccgacaagacccatacctgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc
【０１５４】
配列番号１５  ＵＴＩ−Ｆｃ  ＩｇＧ１  ３Ｓｅｒ  ｌｉｎｋ３タンパク質配列
avlpqeeegsgggqlvtevtkkedscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacetfqyggcmgngnnfvtekeclqtcrtvaacnlpivrgpcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeellggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpasiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg
【０１５５】
配列番号１６  ＵＴＩ−Ｆｃ  ＩｇＧ１  ３Ｓｅｒ  ｌｉｎｋ３  ＤＮＡ配列
gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctgggctactctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcggctgcatgggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgtgcggggaccctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgccagggaaatggaaacaagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgctgggaggtggtggatcaggtggcggaggatcagagcccaaatcttccgacaagacccatacctgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc
【０１５６】
配列番号１７  ＵＴＩ−Ｆｃ  ＩｇＧ１  ３Ｓｅｒ  ｌｉｎｋ２  タンパク質配列
avlpqeeegsgggqlvtevtkkedscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacetfqyggcmgngnnfvtekeclqtcrtvaacnlpivrgpcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeellrcppcpapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpasiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg
【０１５７】
配列番号１８  ＵＴＩ−Ｆｃ  ＩｇＧ１  ３Ｓｅｒ  ｌｉｎｋ２  ＤＮＡ配列
gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctgggctactctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcggctgcatgggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgtgcggggaccctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgccagggaaatggaaacaagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgctgcggtgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc
【０１５８】
配列番号１９  ＵＴＩ−Ｆｃ  ＩｇＧ１  ３Ｓｅｒ  ｌｉｎｋ１タンパク質配列
avlpqeeegsgggqlvtevtkkedscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacetfqyggcmgngnnfvtekeclqtcrtvaacnlpivrgpcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpasiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg
【０１５９】
配列番号２０  ＵＴＩ−Ｆｃ  ＩｇＧ１  ３Ｓｅｒ  ｌｉｎｋ１  ＤＮＡ配列
gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctgggctactctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcggctgcatgggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgtgcggggaccctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgccagggaaatggaaacaagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgtcctctgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc
【０１６０】
配列番号２１  ＵＴＩ−Ｆｃ  ＩｇＧ１  ３Ｓｅｒ  Ｋ２１Ｓ  Ｋ２２Ｓタンパク質配列avlpqeeegsgggqlvtevtssedscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacetfqyggcmgngnnfvtekeclqtcrtvaacnlpivrgpcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeellrepkssdkthtcppcpapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpasiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg
【０１６１】
配列番号２２  ＵＴＩ−Ｆｃ  ＩｇＧ１  ３Ｓｅｒ  Ｋ２１Ｓ  Ｋ２２Ｓ  ＤＮＡ配列
gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgacctcctccgaggactcctgccagctgggctactctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcggctgcatgggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgtgcggggaccctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgccagggaaatggaaacaagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgctgcgggagcccaaatcttccgacaagacccatacctgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc
【０１６２】
配列番号２３  ＵＴＩ−Ｆｃ  ＩｇＧ１  ３Ｓｅｒ  ｄ２タンパク質配列
avlpqeeegsgggqlvtevtkktvaacnlpivrgpcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeellrepkssdkthtcppcpapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpasiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg
【０１６３】
配列番号２４  ＵＴＩ−Ｆｃ  ＩｇＧ１  ３Ｓｅｒ  ｄ２  ＤＮＡ配列
gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgtgcggggaccctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgccagggaaatggaaacaagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgctgcgggagcccaaatcttccgacaagacccatacctgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc
【０１６４】
配列番号２５  ＵＴＩ−Ｆｃ  ＩｇＧ１  ３Ｓｅｒ  ｄ１タンパク質配列
avlpqeeegsgggqlvtevtkkedscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacetfqyggcmgngnnfvtekeclqtcrepkssdkthtcppcpapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpasiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg
【０１６５】
配列番号２６  ＵＴＩ−Ｆｃ  ＩｇＧ１  ３Ｓｅｒ  ｄ１  ＤＮＡ配列
gctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctgggctactctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcggctgcatgggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagagagcccaaatcttccgacaagacccatacctgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc
【０１６６】
配列番号２７  ｍＵＴＩ−ｍＦｃ  ｍＩｇＧ１タンパク質配列
avlpqesegsgteplitgtlkkedscqlnysegpclgmqeryyyngasmacetfqyggclgngnnfisekdclqtcrtiaacnlpivqgpcrafiklwafdaaqgkciqfhyggckgngnkfysekeckeycgvpgdgyeelirskivprdcgckpcictvpevssvfifppkpkdvltitltpkvtcvvvdiskddpevqfswfvddvevhtaqtqpreeqfnstfrsvselpimhqdwlngkefkcrvnsaafpapiektisktkgrpkapqvytipppkeqmakdkvsltcmitdffpeditvewqwngqpaenykntqpimdtdgsyfvysklnvqksnweagntftcsvlheglhnhhtekslshspgk
【０１６７】
配列番号２８  ｍＵＴＩ−ｍＦｃ  ｍＩｇＧ１  ＤＮＡ配列
gcagtgctgccccaagagagtgaggggtcagggactgagccactaataactgggaccctcaagaaagaagactcctgccagctcaattactcagaaggcccctgcctagggatgcaagagaggtattactacaacggcgcttccatggcctgcgagacctttcaatatgggggttgcctaggcaacggcaacaacttcatctctgagaaggactgtctgcagacatgtcggaccatagcggcctgcaatctccccatagtccaaggcccctgccgagccttcataaagctctgggcatttgatgcagcacaagggaagtgcatccaattccactacgggggctgcaaaggcaacggcaacaaattctactctgagaaggaatgcaaagagtactgtggagtccctggtgatgggtacgaggaactaatacgcagtaaaatcgtgcctcgggactgcggctgcaagccctgcatctgcaccgtgcccgaggtgtcctccgtgttcatcttcccacccaagcccaaggacgtgctgaccatcaccctgacccccaaagtgacctgcgtggtggtggacatctccaaggacgaccccgaggtgcagttcagttggttcgtggacgacgtggaagtgcacaccgcccagacccagcccagagaggaacagttcaactccaccttcagatccgtgtccgagctgcccatcatgcaccaggactggctgaacggcaaagagttcaagtgcagagtgaactccgccgccttcccagcccccatcgaaaagaccatctccaagaccaagggcagacccaaggccccccaggtgtacaccatccccccacccaaagaacagatggccaaggacaaggtgtccctgacctgcatgatcaccgatttcttcccagaggacatcaccgtggaatggcagtggaacggccagcccgccgagaactacaagaacacccagcccatcatggacaccgacggctcctacttcgtgtactccaagctgaacgtgcagaagtccaactgggaggccggcaacaccttcacctgtagcgtgctgcacgagggcctgcacaaccaccacaccgagaagtccctgtcccactcccccggcaag
【０１６８】
配列番号２９  Ｆｃ  ＩｇＧ１  ３Ｓｅｒ  ＵＴＩタンパク質配列
epkssdkthtcppcpapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpasiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkggggsggggsggggsavlpqeeegsgggqlvtevtkkedscqlgysagpcmgmtsryfyngtsmacetfqyggcmgngnnfvtekeclqtcrtvaacnlpivrgpcrafiqlwafdavkgkcvlfpyggcqgngnkfysekecreycgvpgdgdeellr
【０１６９】
配列番号３０  Ｆｃ  ＩｇＧ１  ３Ｓｅｒ  ＵＴＩ  ＤＮＡ配列
gagcccaaatcttccgacaagacccatacctgtccaccttgccctgcccccgagctgctgggaggatcctctgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcctccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgacaaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggattctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggcaagggaggtggtggatcaggaggtggaggttccggtggcggaggatcagctgtgctgcctcaggaagaggaaggctctggcggaggccagctcgtgaccgaagtgaccaagaaagaggactcctgccagctgggctactctgccggcccttgtatgggcatgacctcccggtacttctacaacggcacctccatggcctgcgagacattccagtacggcggctgcatgggcaacggcaacaactttgtgacagagaaagagtgcctgcagacctgcagaaccgtggccgcctgtaacctgcctatcgtgcggggaccctgtcgggcctttatccagctgtgggccttcgacgccgtgaagggcaaatgcgtgctgttcccctatggcggctgccagggaaatggaaacaagttctactccgagaaagaatgccgcgagtactgtggcgtgccaggcgacggggatgaggaactgctgcgg
【０１７０】
配列番号３１  ｈＵＴＩタンパク質配列
avlpq eeegsgggql vtevtkkeds cqlgysagpc
mgmtsryfyn gtsmacetfq yggcmgngnn fvtekeclqt crtvaacnlp ivrgpcrafi
qlwafdavkg kcvlfpyggc qgngnkfyse kecreycgvp gdgdeellrf sn
【０１７１】
配列番号３２  ＡＭＢＰプレプロタンパク質配列
mrslgallll lsaclavsag pvptppdniq vqenfnisri ygkwynlaig stcpwlkkim
drmtvstlvl gegateaeis mtstrwrkgv ceetsgayek tdtdgkflyh kskwnitmes
yvvhtnydey aifltkkfsr hhgptitakl ygrapqlret llqdfrvvaq gvgipedsif
tmadrgecvp geqepepili prvrravlpq eeegsgggql vtevtkkeds cqlgysagpc
mgmtsryfyn gtsmacetfq yggcmgngnn fvtekeclqt crtvaacnlp ivrgpcrafi
qlwafdavkg kcvlfpyggc qgngnkfyse kecreycgvp gdgdeellrf sn
【０１７２】
配列番号３３
SGGGGS
【０１７３】
配列番号３４
SGGGGSGGGGS
【０１７４】
配列番号３５
SGGGGSGGGGSGGGGS
【０１７５】
配列番号３６
SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
【０１７６】
配列番号３７
SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
【０１７７】
配列番号３８
SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
【０１７８】
配列番号３９
SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
【０１７９】
配列番号４０
SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
【０１８０】
配列番号４１
SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
【０１８１】
配列番号４２
SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
【０１８２】
配列番号４３
GSGGGSGGGGSGGGGS 
【図１】
2019187427.tif 000006
【図２】
2019187427.tif 000007
【図３】
2019187427.tif 000008
【図４】
2019187427.tif 000009
【図５】
2019187427.tif 000010
【図６】
2019187427.tif 000011
【図７】
2019187427.tif 000012
【図８】
2019187427.tif 000013
【図９】
2019187427.tif 000014
【図１０】
2019187427.tif 000015
【配列表】
2019187427000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年7月4日(2019.7.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型Ｆｃドメイン又はそのフラグメントに連結された配列番号１のアミノ酸１〜１４９を含む、単離された尿トリプシン阻害剤（ＵＴＩ）融合タンパク質。
【請求項２】
Ｆｃドメイン又はそのフラグメントが共有結合的に結合された、２つの請求項１に記載の単離されたＵＴＩ融合タンパク質を含む二量体。
【請求項３】
Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のＦｃドメインからなる群から選択される、請求項１に記載の単離されたＵＴＩ融合タンパク質又は請求項２に記載の二量体。
【請求項４】
ＦｃドメインがＩｇＧ１のＦｃドメインである、請求項１に記載の単離されたＵＴＩ融合タンパク質又は請求項２に記載の二量体。
【請求項５】
請求項１に記載のＵＴＩ融合タンパク質又は請求項２に記載の二量体、及び医薬上許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項６】
医薬として使用するための請求項１に記載のＵＴＩ融合タンパク質又は請求項２に記載の二量体。
【請求項７】
膵炎、内視鏡誘発性膵炎、急性膵炎、関節炎、重症急性呼吸器症候群、全身性炎症反応症候群、急性循環障害、敗血症、肝炎、虫垂炎、大腸炎、臓器不全、臓器障害、膵臓障害、腎臓障害、肺障害、再潅流傷害、スティーブンス・ジョンソン症候群、中毒性表皮壊死症、ショック、虚血性傷害、急性肺損傷、急性大動脈解離に起因する肺損傷、喘息、肺炎症、肺炎、人工呼吸器関連肺炎、播種性血管内凝固症候群、及び急性呼吸窮迫症候群からなる群から選択される疾患の治療における使用のための、請求項１に記載のＵＴＩ融合タンパク質又は請求項２に記載の二量体。
【請求項８】
急性膵炎の治療における使用のための、請求項１に記載のＵＴＩ融合タンパク質又は請求項２に記載の二量体。
【請求項９】
請求項１に記載のＵＴＩ融合タンパク質又は請求項２に記載の二量体をコードする核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現ベクターを含む組み換え宿主細胞。
【請求項１２】
細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、大腸菌細胞、酵母細胞、及び植物細胞からなる群から選択される、請求項１１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１３】
哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、及びヒト肝細胞癌細胞からなる群から選択される、請求項１２に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１４】
ＵＴＩ融合タンパク質の製造方法であって、組み換え融合タンパク質が発現するように増殖培地に請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の組み換え宿主細胞を置く工程、及び細胞又は増殖培地から組み換え融合タンパク質を単離する工程を含む、方法。
【請求項１５】
請求項１に記載のＵＴＩ融合タンパク質又は請求項２に記載の二量体が、トランスジェニック動物中で産生される、ＵＴＩ融合タンパク質の製造方法。
【請求項１６】
有効量の請求項１に記載のＵＴＩ融合タンパク質又は請求項２に記載の二量体を含む、ＵＴＩ関連病態の治療用の医薬組成物。
【請求項１７】
ＵＴＩ関連病態が、膵炎、内視鏡誘発性膵炎、急性膵炎、関節炎、重症急性呼吸器症候群、全身性炎症反応症候群、急性循環障害、敗血症、肝炎、虫垂炎、大腸炎、臓器不全、臓器障害、膵臓障害、腎臓障害、肺障害、再潅流傷害、スティーブンス・ジョンソン症候群、中毒性表皮壊死症、ショック、虚血性傷害、急性肺損傷、急性大動脈解離に起因する肺損傷、喘息、肺炎症、肺炎、人工呼吸器関連肺炎、播種性血管内凝固症候群、及び急性呼吸窮迫症候群からなる群から選択される、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ＵＴＩ関連病態が急性膵炎である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ＵＴＩ関連病態の治療用の医薬組成物又は医薬の製造のためのものであること特徴とする、請求項１に記載のＵＴＩ融合タンパク質又は請求項２に記載の二量体の使用。
【請求項２０】
膵炎、内視鏡誘発性膵炎、急性膵炎、関節炎、重症急性呼吸器症候群、全身性炎症反応症候群、急性循環障害、敗血症、肝炎、虫垂炎、大腸炎、臓器不全、臓器障害、膵臓障害、腎臓障害、肺障害、再潅流傷害、スティーブンス・ジョンソン症候群、中毒性表皮壊死症、ショック、虚血性傷害、急性肺損傷、急性大動脈解離に起因する肺損傷、喘息、肺炎症、肺炎、人工呼吸器関連肺炎、播種性血管内凝固症候群、及び急性呼吸窮迫症候群からなる群から選択される疾患の治療のためのものであることを特徴とする、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
ＵＴＩ関連病態が急性膵炎である、請求項１９に記載の使用。
【外国語明細書】
2019187427000001.pdf
2019187427000002.pdf
2019187427000003.pdf
2019187427000004.pdf