(57)【要約】      （修正有）【課題】医薬として用いられる、ならびに癌の予防および／または治療に用いられる、Ｏｍｏｍｙｃと呼ばれるＭｙｃドミナントネガティブ変異体の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列のポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアント、（ｉ）該ポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアント、および（ｉｉ）該ポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントの細胞取り込みを促進する化学的部分を含んでなる、コンジュゲート。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬として用いられる、配列番号１のポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアント。
【請求項２】
癌の予防および／または治療に用いられる、配列番号１のポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアント。
【請求項３】
ポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントが投与される、請求項１または２のいずれかに記載の用途のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、配列番号４７および配列番号４８からなる群より選択される、配列番号１のポリペプチドの機能的に等価なバリアントである、請求項１から３のいずれかに記載の用途のポリペプチド。
【請求項５】
（ｉ）配列番号１のポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアント、および
（ｉｉ）該ポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントの細胞取り込みを促進する化学的部分
を含んでなる、コンジュゲート。
【請求項６】
ポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントの細胞取り込みを促進する化学的部分が細胞透過ペプチドであり、前記細胞透過ペプチドおよび前記ポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントが融合タンパク質を形成する、請求項５に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記細胞透過ペプチド配列が、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２８）およびＲＲＲＲＲＲＬＲ（配列番号２９）からなる群より選択される、請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
核局在化シグナルをさらに含んでなる、請求項５から７のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項９】
前記核局在化シグナルが、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３９）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号５０）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号４０）からなる群より選択される、請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
配列番号１のポリペプチドの機能的に等価なバリアントが、配列番号４７および配列番号４８からなる群より選択される、請求項５から９のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
医薬的に活性な量の請求項５から１０のいずれかに記載のコンジュゲートおよび医薬的に許容され得る賦形剤を含んでなる、医薬組成物。
【請求項１２】
医薬として用いられる、請求項５から１０のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
癌の予防および／または治療において用いられる、請求項５から１０のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
前記コンジュゲートが投与される、請求項１２または１３のいずれかに記載の用途のコンジュゲート。
【請求項１５】
（ｉ）配列番号１のポリペプチド、その機能的に等価なバリアントまたは請求項５から１０のいずれかに記載のコンジュゲートおよび
（ｉｉ）抗腫瘍剤
を共にまたは別々に含んでなる、組成物。
【請求項１６】
前記抗腫瘍剤が、細胞傷害剤、抗血管新生剤および抗転移剤からなる群より選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
配列番号１のポリペプチドの機能的に等価なバリアントが、配列番号４７および配列番号４８からなる群より選択される、請求項１５または１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
医薬的に活性な量の請求項１５から１７のいずれかに記載の組成物および医薬的に許容され得る賦形剤を含んでなる、医薬組成物。
【請求項１９】
医薬として用いられる、請求項１５から１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
癌の予防および／または治療に用いられる、請求項１５から１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
配列番号１のポリペプチド、その機能的に等価なバリアントまたはコンジュゲートが投与される、請求項１９または２０に記載の用途の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の分野、より詳細には、Ｏｍｏｍｙｃポリペプチドを使用して癌を治療する方法および組成物、ならびにＯｍｏｍｙｃおよび１つ以上の抗癌薬を含んでなる組成物および癌を治療するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
理想的な抗癌薬は、腫瘍の維持に継続的に必要であるがいかなる正常な組織の維持および機能にとっても不必要な重複しない機能を標的にするべきである。ゆえに、最も一般的な論理にあっては、癌において特異的に変異した変異体分子は、おそらく癌の「ドライバー」であるだろうし、おそらく正常な組織にとってはそれほど重要でないだろうということに基づいて、これらの癌において特異的に変異した遺伝子産物を標的にする。これらの理由から、特定の癌のタイプにおいて繰り返し発生する病変を挙げることに多くの関心が寄せられた。残念なことに、このアプローチには、いくつかの問題がある。第１に、ほとんどのヒト固形癌は、ゲノム不安定性というエピソードを経験し、その「操縦者」の変異およびそれらに伴うエフェクター経路を不明瞭にし得る変異ノイズを示す。第２に、癌は、進展上の複数のボトルネックを通り抜けるトランジションを含む方法の最終結果である。各ボトルネックは、特定のタイプの変異を必要とすることがあり、その変異の機能は、後に腫瘍の維持にとって不必要になり、その結果として、腫瘍の進展におけるその時点の後では良好な治療標的でなくなる。
【０００３】
Ｍｙｃは、増殖調節および癌に関わる塩基性ヘリックスループヘリックスロイシンジッパー（ｂ−ＨＬＨ−ＬＺ）タンパク質であり、これは、構造的に関連するタンパク質Ｍａｘ、ＭａｄおよびＭｎｔとともにネットワークにおいて機能する。Ｍｙｃ／Ｍａｘ二量体は、遺伝子の転写を活性化し、細胞の増殖またはアポトーシスを誘導する。Ｍａｄ／ＭａｘおよびＭｎｔ／Ｍａｘ複合体は、リプレッサーとして作用し、細胞の増殖停止および分化を引き起こす。すべての二量体が、同じＤＮＡコンセンサス部位ＣＡＣＧＴＧ  Ｅ−ボックスを認識する。
【０００４】
Ｍｙｃは、正常細胞では厳重に制御されており、そのレベルは、増殖時は高く、非増殖時は低い。必然的に、異常に高いＭｙｃ活性および／または調節が解除されたＭｙｃ活性は、ほとんどの癌に関与し、しばしば、高悪性度で低分化の血管新生性の腫瘍に関連する。Ｍｙｃ発現の調節解除は、遺伝子増幅による過剰発現、転写調節の喪失、分解の減少または安定化の増大に起因する。このことにより、異常な増殖、生存の増加、代謝の変化、血管新生および炎症がもたらされ、これらのすべてが、癌の主要な特徴である。複数の研究が、腫瘍形成の細胞内および細胞外の局面を支配する際のＭｙｃの重要な役割を実証したことから、その機能を標的にすることが、治療的に価値があるだろうと示唆された。
【０００５】
ＢＥＴブロモドメイン阻害剤によるｍｙｃのダウンレギュレーションが、複数の腫瘍タイプの後退をもたらすことが知られている（Ｄｅｌｍｏｒｅ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａ．，２０１１，Ｃｅｌｌ，１４６：９０４−９１７）。このアプローチは、優れた可能性を示すが、毒性および数多くのオフターゲット効果などのいくつかの限界も示す。
【０００６】
Ｍｙｃ／Ｍａｘ相互作用を破壊する多くの小分子は、ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏにおいて低特異性を示した（Ｐｒｏｃｈｏｗｎｉｋ，Ｅ．Ｖ．ａｎｄ  Ｖｏｇｔ，Ｐ．Ｋ．，２０１０，Ｇｅｎｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １，６５０−６５９）。
【０００７】
しかしながら、Ｍｙｃ阻害剤は、まだ臨床的に利用可能になっておらず、そのデザインは、様々な警告を示す：第１に、Ｍｙｃは、核転写因子であり、その結果として、膜または細胞質の分子よりも到達しにくい；第２に、Ｍｙｃは、標的にされ得る酵素「活性部位」を有しない；第３に、Ｍｙｃファミリーは、３つの異なるタンパク質、ｃ−、ＮおよびＬ−Ｍｙｃを含み、それらは、一定の条件において機能的に重複しているので、それらのすべてを同時に阻害する必要がある。さらに、Ｍｙｃの阻害が、正常な組織の増殖を阻害することによって重大な副作用を誘導し得るという懸念がある。これらのすべての理由のために、Ｍｙｃ阻害薬を作製することは、困難である。
【０００８】
Ｏｍｏｍｙｃは、Ｍｙｃのｂ−ＨＬＨ−ＬＺドメインを含みかつＭｙｃのロイシンジッパー内に４つのアミノ酸置換を有するドミナントネガティブＭＹＣ変異体である（Ｓｏｕｃｅｋ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １７，２４６３−２４７２；Ｓｏｕｃｅｋ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２：３５０７−３５１０）。そのアミノ酸置換Ｅ６１Ｔ、Ｅ６８Ｉ、Ｒ７４ＱおよびＲ７５Ｎは、そのタンパク質に二量体化特異性の変更をもたらすが、その天然のパートナーであるＭａｘに結合する能力、ならびに野生型ｃ−、Ｎ−およびＬ−Ｍｙｃとホモ二量体およびヘテロ二量体を形成する能力は保持する。
【０００９】
これらの特性を理由に、Ｏｍｏｍｙｃは、ＭｙｃがそのＤＮＡ認識結合部位であるＥボックスに結合する能力を打ち消すことによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方においてＭｙｃ依存的な遺伝子トランス活性化機能を妨げることが可能である（Ｓａｖｉｎｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６，ｅ２２２８４；Ｓｏｕｃｅｋ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  １１，１０３８  １０４５）。同時に、Ｏｍｏｍｙｃは、Ｍｙｃ発現レベルに依存した様式でＭｙｃ誘導性アポトーシスを強く増強し、それにより、Ｍｙｃトランス抑制活性を強める。したがって、Ｏｍｏｍｙｃは、プロモーターへのＭｉｚ−１依存的結合およびトランス抑制を保持しつつ、プロモーターＥ−ボックスへのＭｙｃの結合および標的遺伝子のトランス活性化を妨げる。Ｏｍｏｍｙｃの存在下において、Ｍｙｃインタラクトームは、抑制に向かわせ、その活性は、腫瘍形成促進から腫瘍抑制に切り換わる。
【００１０】
Ｏｍｏｍｙｃ発現がテトラサイクリン応答性プロモーターエレメントによって調節され、広く発現されるｒｔＴＡトランス活性化因子がＣＭＶプロモーターによって駆動される、ＴＲＥ−Ｏｍｏｍｙｃ；ＣＭＶｒｔＴＡマウスは、ドキシサイクリンの投与後に、ほとんどの組織において高いＯｍｏｍｙｃ発現を示す（Ｓｏｕｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｎａｔｕｒｅ，４５５：６７９−６８３）。これらのマウスを、肺腫瘍形成の確立されたＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄマウスモデルと交雑させた。ちょうど３日間のＯｍｏｍｙｃ発現が、劇的な腫瘍の収縮を引き起こすのに十分であり、１週間で、それらの動物から本質的に腫瘍が無くなる。重要なことには、他の分裂組織、例えば、皮膚、精巣および腸は、治療中に、有意に低下した増殖速度を示し、一定程度の萎縮を示したが、それらのマウスは、窮迫または疾患の明らかな徴候を示さなかった。さらに、Ｏｍｏｍｙｃ発現に起因するＭｙｃ阻害の副作用は、完全に可逆的であり、治療を中断すると消失する。
【００１１】
これまで、Ｏｍｏｍｙｃの発現が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて効果的なＭｙｃ阻害ストラテジーであると証明されたという事実にもかかわらず、Ｏｍｏｍｙｃは、もっぱら遺伝子治療アプローチを使用して適用されてきた。実際に、Ｏｍｏｍｙｃは、かさ高すぎて所望の細胞内コンパートメントへの送達に適さないと考えられているペプチドである（Ｍｏｎｔａｇｎｅ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１２；７：ｅ３２１７２．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３２１７２）、Ｓａｖｉｎｏ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１１；６：ｅ２２２８４．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２２２８４）およびＧｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，２０１１，２５：８９５−７．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇａｄ．２０５３３１１）。
【００１２】
さらに、Ｏｍｏｍｙｃは、その固有の物理化学的特性（例えば、Ｋｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシープロットを使用して予想されるような疎水性，Ｋｙｔｅ  Ｊ．，Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  Ｒ．Ｆ．（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２）のせいで生理学的障壁を横断する低い能力を示すと予想される。さらに、Ｏｍｏｍｙｃの塩基性領域内にいくつかのアルギニン残基が存在するにもかかわらず、ペプチドの自発的な細胞透過能を予想する最新のアルゴリズムは、Ｏｍｏｍｙｃがそのような特性を有すると予想しない（Ｇａｕｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１３，１１：７４）。
【００１３】
ゆえに、真核細胞の細胞膜を越えて形質導入することが可能なｂ−ＨＬＨ−ＬＺドメインに基づいて癌を治療するための治療的アプローチを提供することおよびＭｙｃ依存的な遺伝子トランス活性化を阻害することが、有益だろう。
【発明の概要】
【００１４】
第１の態様において、本発明は、医薬として用いられる、ならびに癌の予防および／または治療に用いられる、配列番号１のポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントについて言及する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、
（ｉ）配列番号１のポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアント、ならびに
（ｉｉ）細胞透過ペプチド配列および／または核局在化シグナル
を含んでなる融合タンパク質について言及する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、本発明に係る融合タンパク質を含んでなる医薬組成物、ならびに医薬としてのその融合タンパク質の使用、特に癌の治療のためのその融合タンパク質の使用について言及する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、
（ｉ）配列番号１のポリペプチド、その機能的に等価なバリアントまたは本発明に係る融合タンパク質、および
（ｉｉ）抗腫瘍剤
を共にまたは別々に含んでなる組成物に関する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、本発明の組成物を含んでなる医薬組成物、ならびに医薬としての本発明の組成物の使用、特に癌の治療のための本発明の組成物の使用について言及する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】（Ａ）３７℃においてＯｍｏｍｙｃ−ＦＩＴＣとともに２時間インキュベートされたＡ５４９細胞の蛍光イメージングは、Ｏｍｏｍｙｃ−ＦＩＴＣが核および細胞質に局在化されることを示している。（Ｂ）核のＨｏｅｓｃｈｔ染色。（Ｃ）位相差。
【図２ＡＢ】１０ｕＭのＯｍｏｍｙｃまたはＭａｘ＊とともにインキュベートされた細胞を計数し、ＡｎｎｅｘｉｎＶおよびＰＩで染色した。（Ａ）ＰＢＳ、ＯｍｏｍｙｃまたはＭａｘで治療されたＡ５４９の総細胞数。（Ｂ）ＰＩで染色された死細胞のパーセンテージ。
【図２ＣＤ】（Ｃ）生（染色されなかった）細胞のパーセンテージ。（Ｄ）ＡｎｎｅｘｉｎＶ陽性細胞のパーセンテージ。
【図３】（Ａ）Ｏｍｏｍｙｃが、Ｍｙｃ＊よりもＭａｘ＊の折り畳まれた構造と類似の折り畳まれた構造を有することを示している、ｃ−Ｍｙｃ＊、Ｍａｘ＊およびＯｍｏｍｙｃ精製タンパク質（３２μＭ）について２０℃において記録された円偏光二色性（ＣＤ）スペクトル。（ｍｄｅｇ，ミリ度）（Ｂ）Ｏｍｏｍｙｃが、Ｍａｘ＊の折り畳まれた構造よりも熱的に安定な折り畳まれた構造を有することを示している、ｃ−Ｍｙｃ＊、Ｍａｘ＊およびＯｍｏｍｙｃ精製タンパク質に対する１℃／分における円偏光二色性によって調べた熱変性。（°ｍ，２２２ｎｍという指定の波長におけるミリ度）
【図４】種々のペプチド濃度（５、１０および２５μＭ）におけるＯｍｏｍｙｃまたはＭａｘ＊とともに３７℃において２時間インキュベーションした後の、４％ＰＦＡで固定されたＡ５４９細胞の共焦点顕微鏡像からの蛍光の定量（像１つあたり３０〜８０個の細胞をカウントした）。ＡＵ，任意単位。
【図５】３７℃においてＯｍｏｍｙｃまたはＭａｘ＊（２０μＭ）とともに２０分間インキュベーションした後のＡ５４９生細胞の共焦点顕微鏡像からの蛍光の定量。ＡＵ，任意単位。
【図６】示されている時間にわたって２５μＭ  ＯｍｏｍｙｃまたはＭａｘ＊ペプチドで治療されたＡ５４９およびＨ１６５０肺腺癌細胞のクリスタルバイオレット染色。
【図７】示されている時間にわたって２５μＭ  ＯｍｏｍｙｃまたはＭａｘ＊ペプチドで治療されたＡ５４９およびＨ１６５０肺腺癌細胞のクリスタルバイオレット染色による増殖の阻害の定量。
【図８】クリスタルバイオレット染色定量による、ＯｍｏｍｙｃおよびＭａｘ＊に対するＡ５４９細胞の用量反応。
【図９】２５μＭのＯｍｏｍｙｃまたはＭａｘ＊ペプチドで治療されたＵ８７神経膠腫細胞の増殖の定量。
【図１０】（Ａ）治療されていない動物の肺（左）および蛍光ペプチドＯｍｏｍｙｃ（３７．５ｍｇ／ｋｇの単回投与）を鼻腔内投与した１０分後の、治療された動物の肺（右）。（Ｂ）治療されていない動物の脳（左）および蛍光ペプチドＯｍｏｍｙｃ（３７．５ｍｇ／ｋｇの単回投与）を鼻腔内投与した１０分後の、治療された（右）動物の脳。
【図１１】鼻腔内投与によるＰＢＳまたはＯｍｏｍｙｃによる肺腺癌の治療。（Ａ）腫瘍の増殖速度。（Ｂ）細胞密度。
【図１２】鼻腔内投与によって肺腺癌をＰＢＳまたはＯｍｏｍｙｃで治療した後の％腫瘍面積の測定。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の著者らは、驚いたことに、Ｏｍｏｍｙｃが、細胞膜を越えて効率的に形質導入し、核に移動することが可能であり、それが腫瘍抑制作用を発揮することを見出した。ゆえに、Ｏｍｏｍｙｃは、真のタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）である。したがって、初めてＯｍｏｍｙｃは、細胞の細胞質にポリペプチドを送達するためにビヒクルを使用する必要なく、または細胞にＯｍｏｍｙｃをコードする核酸を送達するために遺伝子治療アプローチを使用する必要なく、それ自体を抗Ｍｙｃ薬物として使用することができる。これにより、調節が解除された細胞増殖、例えば、癌に関連する疾患の治療のためのＯｍｏｍｙｃポリペプチドの使用が可能になる。本発明の著者らは、驚いたことに、Ｏｍｏｍｙｃが、ＭａｘのｂＨＬＨＺドメイン（Ｍａｘ＊）と比較していくつかの利点を有することを見出した：
・Ｏｍｏｍｙｃは、種々の細胞型および種々の濃度において、Ｍａｘ＊と比較してより高い細胞透過能を示す（実施例６）
・Ｏｍｏｍｙｃは、Ｍａｘ＊よりも熱的に安定であり、これは、ドラッグデザインにとって明らかな利点である（実施例５）
・Ｏｍｏｍｙｃは、細胞の成長の防止（実施例８）および癌細胞死の増大（実施例４）の両方においてＭａｘ＊よりも有効である。
【００２１】
さらに、Ｏｍｏｍｙｃは、血液脳関門を通過することが可能であり（実施例９および図１０Ｂ）、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてその治療効果を発揮することが可能である（実施例１０）。
【００２２】
Ｏｍｏｍｙｃを使用する治療方法
本発明は、Ｏｍｏｍｙｃに対応する配列番号１の配列を有するポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントの使用に基づいた癌の治療のための方法を提供する。
【００２３】
第１の態様において、本発明は、医薬として用いられる、配列番号１のポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントについて言及する。
【００２４】
別の態様において、本発明は、癌の予防および／または治療に用いられる、配列番号１のポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントについて言及する。
【００２５】
別の態様において、本発明は、癌の予防および／または治療のための方法についても言及し、その方法は、それを必要とする被験体に、治療有効量の配列番号１のポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントを投与する工程を含む。
【００２６】
別の態様において、本発明は、癌の予防および／または治療のための薬剤を調製するための配列番号１のポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントについても言及する。
【００２７】
配列番号１の配列のポリペプチドは、Ｏｍｏｍｙｃタンパク質配列に対応する。用語「Ｏｍｏｍｙｃ」は、本明細書中において使用されるとき、Ｅ６１Ｔ、Ｅ６８Ｉ、Ｒ７４ＱおよびＲ７５Ｎ変異を保有するＭｙｃのｂＨＬＨＺｉｐドメインの変異バージョンからなるポリペプチドのことを指す（ここで、変異位置のナンバリングは、２０１２年６月２７日公開のＮＣＢＩデータベースに受託番号ＮＰ＿００２４５８のもと定義されたポリペプチドのアミノ酸３６５〜４５４に対応するＭｙｃ領域の配列に関して与えられる）。受託番号ＮＰ＿００２４５８のもとにＮＣＢＩデータベースにおいて提供されているｃ−Ｍｙｃの配列を下記に示し、ここで、Ｏｍｏｍｙｃが由来する領域を下線によって示す：
【化１】
2019147792.tif 000002
【００２８】
Ｏｍｏｍｙｃをコードするポリヌクレオチド（配列番号３）および対応するポリペプチド配列（配列番号１）を下記に示し、ここで、下線が引かれた太字のトリプレットは、Ｍｙｃに対して変異された位置に対応する：
【化２】
2019147792.tif 000003
【００２９】
Ｏｍｏｍｙｃは、配列ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＦ（配列番号４９）（Ｄａｎｇ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８８，８：４０４８−４０５４を参照のこと）（上記において二重下線が引かれている）を有し、核局在化シグナルに対応するｃ−ＭｙｃのＭ２ドメインも含む。
【００３０】
Ｏｍｏｍｙｃは、３つすべての腫瘍形成Ｍｙｃタンパク質（ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−ＭｙｃおよびＬ−Ｍｙｃ）との高い二量体化能を示すことを特徴とする。Ｏｍｏｍｙｃは、腫瘍抑制効果をもたらす変異が保存されているという条件で、当該分野で公知の任意のＭｙｃタンパク質のｂＨＬＨＺｉｐドメインに由来し得る。したがって、本発明において使用できるＯｍｏｍｙｃは、家畜および農場動物（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類）、霊長類およびヒトを含むがこれらに限定されない任意の哺乳動物種に由来し得る。好ましくは、Ｏｍｏｍｙｃタンパク質は、ヒトＭｙｃタンパク質（２０１２年６月２７日公開の受託番号ＮＰ＿００２４５８）に由来する。
【００３１】
用語「Ｍｙｃ」は、本明細書中において使用されるとき、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−ＭｙｃおよびＬ−Ｍｙｃを含む転写因子のファミリーのことを指す。Ｍｙｃタンパク質は、コンセンサス配列ＣＡＣＧＴＧ（エンハンサーボックス配列またはＥ−ボックスであって、ヒストンアセチル−トランスフェラーゼまたはＨＡＴをリクルートする）に対する結合によって多くの遺伝子の発現を活性化する。しかしながら、Ｍｙｃは、転写抑制因子としても作用できる。Ｍｙｃは、Ｍｉｚ−１転写因子に結合し、ｐ３００コアクチベーターに取って代わることによって、Ｍｉｚ−１標的遺伝子の発現を阻害する。Ｍｙｃは、ＤＮＡ複製の調節においても直接的な役割を果たす。
【００３２】
Ｍｙｃ  ｂ−ＨＬＨ−ＬＺまたはＭｙｃ塩基性領域ヘリックスループヘリックスロイシンジッパードメインとは、ＭｙｃとＭａｘタンパク質との二量体化およびＭｙｃ標的遺伝子への結合を決定する領域のことを指す。この領域は、ヒトＭｙｃのアミノ酸３６５〜４５４に対応し、ループによって接続された２つのアルファヘリックスによって特徴づけられる（Ｎａｉｒ，Ｓ．Ｋ．，＆  Ｂｕｒｌｅｙ，Ｓ．Ｋ．，２００３，Ｃｅｌｌ，１１２：１９３−２０５）。
【００３３】
用語「機能的に等価なバリアント」は、Ｏｍｏｍｙｃについて言及しているとき、配列番号１のポリペプチドに対する１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入もしくは付加から生じるかまたは配列番号１のポリペプチドの化学修飾から生じ、Ｏｍｏｍｙｃポリペプチドの腫瘍抑制活性を実質的に保存している、任意のポリペプチドのことを指す。当業者は、Ｏｍｏｍｙｃの腫瘍抑制活性の保存には、バリアントが、Ｍｙｃと二量体化でき、いったん核において見られたらその活性を阻害できること、細胞膜を越えて移動することが可能であること、および核膜を越えて移動することが可能であることが必要であることを理解するだろう。
【００３４】
Ｏｍｏｍｙｃの好適な機能的に等価なバリアントは、配列番号１のポリペプチドから本質的になるポリペプチドを含む。この文脈において、「〜から本質的になる」は、指定の分子が、Ｏｍｏｍｙｃの活性を変化させ得るいかなる追加の配列も含まないであろうことを意味する。
【００３５】
標的ペプチドの好適な機能的バリアントは、配列番号１のペプチドに対して約２５％超のアミノ酸配列同一性、例えば、２５％  ４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性の程度を示すバリアントである。２つのポリペプチド間の同一性の程度は、当業者に広く公知のコンピュータアルゴリズムおよび方法を使用して測定される。２つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくは、以前に報告されたようなＢＬＡＳＴＰアルゴリズム［ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０；２１５：４０３−４１０］を使用することによって測定される。好ましい実施形態において、配列同一性は、配列番号１のポリペプチドの全体の長さもしくはバリアントの全体の長さまたはその両方にわたって測定される。
【００３６】
Ｏｍｏｍｙｃポリペプチドの機能的に等価なバリアントは、翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、イソプレニル化、ミリストイル化、タンパク分解性プロセシングなども含むことがある。
【００３７】
あるいは、標的ペプチドの好適な機能的バリアントは、Ｏｍｏｍｙｃポリペプチド内の１つ以上の位置が、上で述べられたＯｍｏｍｙｃタンパク質の中に存在するアミノ酸の保存的置換であるアミノ酸を含むバリアントである。「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸を、類似の構造的特性および／または化学的特性を有する別のアミノ酸で置き換えることによって生じる。例えば、以下の６つの群の各々が、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。そのような保存的アミノ酸置換の選択は、当業者の技術の範囲内であり、例えば、Ｄｏｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９９，２１７；７２１−７３９）およびＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．，１９８６，１１９：２０５−２１８）によって説明されている。
【００３８】
Ｏｍｏｍｙｃの機能的に等価なバリアントは、ヒトｃ−Ｍｙｃに由来するＯｍｏｍｙｃに見られる変異Ｅ６１Ｔ、Ｅ６８Ｉ、Ｒ７４ＱおよびＲ７５Ｎに対応する位置に変異を含むことが理解されるだろう。前記変異が機能的に等価なバリアントにおいて生じなければならない位置は、種々のＭｙｃ配列のマルチプル配列アラインメントによって決定することができ、ヒトｃ−Ｍｙｃに由来するＯｍｏｍｙｃの配列内の６１、６８、７４および７５位に対応する位置のアラインメントによって同定することができる。
【００３９】
マルチプル配列アラインメントは、２つより多い配列を一度に組み込むペアワイズアラインメントの拡大である。マルチプルアラインメント法は、所与のクエリーセットにおいてすべての配列をアラインメントする。好ましいマルチプル配列アラインメントプログラム（およびそのアルゴリズム）は、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓａｌ２ＷまたはＣｌｕｓｔａｌＷ  ＸＸＬである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２：４６７３−４６８０を参照のこと）。いったん、種々の生物由来のｃ−Ｍｙｃおよびバリアントの配列が、本明細書中に記載されるように比較（アラインメント）されたら、当業者は、位置に対応する各配列内の位置を容易に同定でき、ヒトｃ−Ｍｙｃに由来するＯｍｏｍｙｃに見られるＥ６１Ｔ、Ｅ６８Ｉ、Ｒ７４ＱおよびＲ７５Ｎ変異に対応する変異をＯｍｏｍｙｃバリアント内に導入できる。
【００４０】
あるポリペプチドがＯｍｏｍｙｃの機能的に等価なバリアントと見なすことができるかを判定するための好適なアッセイとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・ポリペプチドがＭａｘおよびＭｙｃと二量体複合体を形成する能力を測定するアッセイ、例えば、Ｓｏｕｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９８，１７：２４６３−２４７２）に記載されているようなレポーター遺伝子の発現に基づくアッセイならびにＰＬＡ（タンパク質ライゲーションアッセイ）または免疫共沈降。
・ポリペプチドがＤＮＡ内のＭｙｃ／Ｍａｘ認識部位（ＣＡＣＧＴＧ部位）に結合する能力を測定するアッセイ、例えば、Ｓｏｕｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（前出）に記載されている電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）。
・Ｍｙｃ誘導性のトランス活性化を抑制する能力を測定するアッセイ、例えば、Ｓｏｕｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（前出）に記載されているようなＭｙｃ／Ｍａｘに特異的なＤＮＡ結合部位の支配下におけるレポーター遺伝子の発現に基づくアッセイ。
・Ｓｏｕｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（前出）に記載されているような、ポリペプチドが、ｍｙｃ癌遺伝子を発現している細胞の成長を阻害する能力に基づくアッセイ。
・ポリペプチドがｍｙｃ誘導性のアポトーシスを増強する能力を測定するアッセイ、例えば、Ｓｏｕｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９８：１７，２４６３−２４７２）によって記載されたアッセイ。さらに、細胞におけるアポトーシスを評価するための当該分野で一般に公知の任意のアッセイ、例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）またはアネキシンＶ染色）、トリパンブルー、ＤＮＡラダリング／断片化およびＴＵＮＥＬを使用することができる。
【００４１】
好ましい実施形態において、あるポリペプチドは、上記アッセイの１つ以上において、天然のＯｍｏｍｙｃの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％である活性を示す場合、Ｏｍｏｍｙｃの機能的に等価なバリアントと見なされる。
【００４２】
さらに、Ｏｍｏｍｙｃの機能的に等価なバリアントは、細胞と接触した後、前記細胞に形質導入することも可能である。Ｏｍｏｍｙｃの機能的に等価なバリアントは、天然のＯｍｏｍｙｃに見られるタンパク質形質導入ドメインまたは別の機能的なタンパク質形質導入ドメインを含むことが理解されるだろう。
【００４３】
用語「細胞透過ペプチド配列」は、本明細書において、「ＣＰＰ」、「タンパク質形質導入ドメイン」または「ＰＴＤ」と交換可能に使用される。この用語は、細胞内部へのタンパク質の輸送を指示する可変長のペプチド鎖のことを指す。細胞内への送達方法は、通常、エンドサイトーシスによって行われるが、当該ペプチドは、直接的な膜移行によって細胞内に内部移行されることもできる。ＣＰＰは、通常、高い相対存在量の正に帯電したアミノ酸、例えば、リジンもしくはアルギニンを含むか、または極性／荷電アミノ酸と非極性の疎水性アミノ酸との交互のパターンを含む配列を有する、アミノ酸組成を有する。本発明において使用できるＣＰＰの例としては、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのアンテナペディアタンパク質に見られるＣＰＰ（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ  配列番号４）、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）ＶＰ２２  ＤＮＡ結合タンパク質に見られるＣＰＰ（ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＥ，配列番号５）、Ｂａｃ−７のＣＰＰ（ＲＲＩＲＰＲＰＰＲＬＰＲＰＲＰＲＰＬＰＦＰＲＰＧ；配列番号６）、アミノ酸４９〜５７（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ，配列番号７）、アミノ酸４８〜６０（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＴＰＱ，配列番号８）、アミノ酸４７〜５７（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号９）からなるＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質のＣＰＰ；Ｓ４１３−ＰＶペプチドのＣＰＰ（ＡＬＷＫＴＬＬＫＫＶＬＫＡＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号１０）、ペネトラチンのＣＰＰ（ＲＱＩＫＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ；配列番号１１）、ＳｙｎＢ１のＣＰＰ（ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ；配列番号１２）、ＳｙｎＢ３のＣＰＰ（ＲＲＬＳＹＳＲＲＲＦ；配列番号１３）、ＰＴＤ−４のＣＰＰ（ＰＩＲＲＲＫＫＬＲＲＬＫ；配列番号１４）、ＰＴＤ−５のＣＰＰ（ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ；配列番号１５）、ＦＨＶ  Ｃｏａｔ−（３５−４９）のＣＰＰ（ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ；配列番号１６）、ＢＭＶ  Ｇａｇ−（７−２５）のＣＰＰ（ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ；配列番号１７）、ＨＴＬＶ−ＩＩ  Ｒｅｘ−（４−１６）のＣＰＰ（ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ；配列番号１８）、Ｄ−ＴａｔのＣＰＰ（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ；配列番号１９）、ＣＰＰ  Ｒ９−Ｔａｔ（ＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲＰＰＱ；配列番号２０）、ＭＡＰのＣＰＰ（ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＬＡＬＡＬＫＬＡ；配列番号２１）、ＳＢＰのＣＰＰ（ＭＧＬＧＬＨＬＬＶＬＡＡＡＬＱＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号２２）、ＦＢＰのＣＰＰ（ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号２３）、ＭＰＧのＣＰＰ（ａｃ−ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ−ｃｙａ；配列番号２４）、ＭＰＧ（ＥＮＬＳ）のＣＰＰ（ａｃ−ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＳＫＲＫＶ−ｃｙａ；配列番号２５）、Ｐｅｐ−１のＣＰＰ（ａｃ−ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ−ｃｙａ；配列番号２６）、Ｐｅｐ−２のＣＰＰ（ａｃ−ＫＥＴＷＦＥＴＷＦＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ−ｃｙａ；配列番号２７）、構造ＲＮを有するポリアルギニン配列（ここで、Ｎは、４〜１７である）、ＧＲＫＫＲＲ���ＲＲＲ配列（配列番号２８）、ＲＲＲＲＲＲＬＲ配列（配列番号２９）、ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ配列（配列番号３０）；トランスポータンＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号３１）；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号３２）；ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３３）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ配列（配列番号３４）；ＲＫＫＲＲＱＲＲ配列（配列番号３５）；ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ配列（配列番号３６）；ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ配列（配列番号３７）；ＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ配列（配列番号３８）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
ポリペプチドがＯｍｏｍｙｃの細胞膜移行能力を保存しているかを判定するための好適なアッセイとしては、そのポリペプチドが培養下の細胞に形質導入する能力を測定するアッセイ、例えば、本発明の実施例３に示されるアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。このアッセイは、当該ポリペプチドを培養細胞と接触させ、そのポリペプチドが細胞内の位置に存在することを検出することに基づく。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドの検出は、蛍光顕微鏡法によって行われる。
【００４５】
好ましい実施形態において、あるポリペプチドが、天然のＯｍｏｍｙｃと比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％効率的に標的細胞に形質導入することが可能である場合、そのポリペプチドは、Ｏｍｏｍｙｃの機能的に等価なバリアントと見なされる。
【００４６】
さらに、Ｏｍｏｍｙｃの機能的に等価なバリアントは、形質導入された細胞と接触した後、前記細胞の核に到達することも可能である。Ｏｍｏｍｙｃの機能的に等価なバリアントは、天然のＯｍｏｍｙｃに見られるＮＬＳまたは別の機能的なＮＬＳを含むことが理解されるだろう。
【００４７】
用語「核局在化シグナル」は、本明細書中において使用されるとき、あるタンパク質が核に向かうように働く約４〜２０アミノ酸残基長のアミノ酸配列のことを指す。通常、核局在化配列は、塩基性アミノ酸が豊富であり、例示的な配列は、当該分野で周知である（Ｇｏｒｌｉｃｈ  Ｄ．（１９９８）ＥＭＢＯ  ５．１７：２７２１−７）。いくつかの実施形態において、ＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ，配列番号３９）；ヌクレオプラスミンＮＬＳ（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ，配列番号４０）；ＣＢＰ８０  ＮＬＳ（ＲＲＲＨＳＤＥＮＤＧＧＱＰＨＫＲＲＫ，配列番号４１）；ＨＩＶ−Ｉ  Ｒｅｖタンパク質ＮＬＳ（ＲＱＡＲＲＮＲＲＲＷＥ，配列番号４２）；ＨＴＬＶ−Ｉ  Ｒｅｘ（ＭＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ，配列番号４３）；ｈｎＲＮＰ  Ａ  ＮＬＳ（ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＫＰＲＮＱＧＧＹ，配列番号４４）；ｒｐＬ２３ａ  ＮＬＳ（ＶＨＳＨＫＫＫＫＩＲＴＳＰＴＦＴＴＰＫＴＬＲＬＲＲＱＰＫＹＰＲＫＳＡＰＲＲＮＫＬＤＨＹ，配列番号４５）からなる群より選択される。本発明の１つの実施形態において、核局在化シグナルは、モチーフＫ（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｋ／Ｒ）（配列番号４６）を含む。
【００４８】
あるポリペプチドが、Ｏｍｏｍｙｃの機能的に等価なバリアントであるかを、細胞膜を越えて移動するその能力に関して判定するための好適なアッセイは、そのポリペプチドに特異的な試薬および細胞の核を特異的に標識する色素（例えば、ＤＡＰＩまたはＨｏｅｃｈｓｔ色素）で細胞を二重標識すること含む。そのようなアッセイは、本発明の実施例６に示される。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドの検出は、共焦点顕微鏡法または蛍光顕微鏡法によって行われる。
【００４９】
好ましい実施形態において、あるポリペプチドが、天然のＯｍｏｍｙｃと比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％効率的に標的腫瘍細胞の核に移動することが可能である場合、そのポリペプチドは、Ｏｍｏｍｙｃの機能的に等価なバリアントと見なされる。
【００５０】
好適な機能的に等価なバリアントには、下記で定義されるようなポリペプチドＯｍｏｍｙｃ＊ＴＡＴおよびＯｍｏｍｙｃ＊ＬＺＡｒｇが含まれる：
【表１】
2019147792.tif 000004
【００５１】
本発明によると、Ｏｍｏｍｙｃポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントは、被験体における癌の予防または治療のための方法において使用される。本発明に係る予防的または治療的な方法が、Ｏｍｏｍｙｃポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントの直接的な使用を含むことが理解されるだろう。したがって、本発明に係る予防的または治療的な方法は、Ｏｍｏｍｙｃまたはその機能的に等価なバリアントをコードする核酸の投与を含まない。
【００５２】
「予防」は、疾患の初期段階もしくは早期段階における、またはその発症も予防するための、配列番号１のポリペプチドもしくは本発明の第１の態様に係るその機能的に等価なバリアントまたはそれを含む薬剤の投与と理解される。
【００５３】
用語「治療」は、臨床的徴候が現れる前または現れた後に疾患の進行を調節する、配列番号１のポリペプチドもしくは本発明の第１の態様に係るその機能的に等価なバリアントまたはそれを含む薬剤の投与を明示するために使用される。疾患の進行の調節は、症状の低減、疾患の持続時間の短縮、病理学的状態の安定化（具体的には、さらなる機能障害の回避）、疾患の進行の遅延、病理学的状態の改善および寛解（部分的および完全の両方）を含むがこれらに限定されない有益なまたは所望の臨床結果と理解される。疾患の進行の調節は、その治療が適用されなかった場合に予想される生存時間と比較したときの生存時間の延長も含む。
【００５４】
用語「癌」は、調節されていない細胞分裂（または生存の増加もしくはアポトーシス抵抗性）、前記細胞が他の隣接組織を浸潤する能力（浸潤）、または細胞が正常では位置しない他の身体領域へのリンパ管および血管を通じた拡散（転移）によって特徴づけられる疾患のことを指す。腫瘍が浸潤および転移によって広がることができるか否かに応じて、それらは、良性または悪性のいずれかに分類される：良性の腫瘍は、浸潤または転移によって広がることができない腫瘍であり、すなわち、それらは、局所的にしか成長しない；一方で、悪性の腫瘍は、浸潤および転移によって広がることが可能な腫瘍である。本発明に係る方法は、局所的な腫瘍および悪性の腫瘍の治療に有用である。本明細書中において使用されるとき、癌という用語には、以下のタイプの癌が含まれるが、これらに限定されない：乳癌；胆管癌；膀胱癌；神経膠芽腫および髄芽腫を含む脳腫瘍；子宮頸癌；絨毛癌；結腸癌；子宮体癌；食道癌；胃癌；急性リンパ性白血病および骨髄性白血病を含む血液学的新生物；Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫；ヘアリーセル白血病；慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫；ＡＩＤＳ関連白血病および成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫；ボーエン病およびパジェット病を含む上皮内新生物；肝臓癌；肺癌；ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫；神経芽細胞腫；扁平上皮細胞癌を含む口腔癌；上皮細胞、ストローマ細胞、生殖細胞および間葉系細胞から生じるものを含む卵巣癌；膵癌；前立腺癌；直腸癌；平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫および骨肉腫を含む肉腫；メラノーマ、メルケル細胞癌、カポジ肉腫、基底細胞癌および扁平上皮細胞癌を含む皮膚癌；胚腫瘍、例えば、セミノーマ、非セミノーマ（奇形腫、絨毛癌）、間質腫瘍および胚細胞性腫瘍を含む精巣癌；甲状腺癌および髄様癌を含む甲状腺癌；ならびに腺癌およびウィルムス腫瘍を含む腎癌。他の癌も当業者に公知であるだろう。好ましい実施形態において、治療される癌は、肺癌、好ましくは、肺腺癌、より好ましくは、ＫＲａｓによってもたらされる肺腺癌である。
【００５５】
本発明の著者らは、その癌がＭｙｃタンパク質の高発現または高活性を示すかに関係なく、Ｏｍｏｍｙｃまたはその機能的に等価なバリアントが細胞増殖を減少させることが可能であることも観察した。
【００５６】
「被験体」は、本明細書中において使用されるとき、癌を有するかもしくは癌の症状（ｓｙｍｐｔｏｍ  ｏｒ  ｃａｎｃｅｒ）を示すかまたは癌を有するかもしくは癌の症状を示すリスクがある任意の動物を含む。好適な被験体（患者）としては、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギまたはモルモット）、農場動物および家畜またはペット（例えば、ネコまたはイヌ）が挙げられる。非ヒト霊長類および好ましくはヒト患者も含まれる。
【００５７】
本発明に係る方法において使用されるＯｍｏｍｙｃまたはその機能的に等価なバリアントの適切な投与量は、種々の因子、例えば、治療される癌のタイプ、疾患の重症度および経過、当該組成物が予防目的で投与されるのかまたは治療目的で投与されるのか、以前の治療、患者の病歴および当該ペプチドまたはポリペプチドに対する応答、ならびに主治医の判断に依存する。
【００５８】
配列番号１のポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントの量は、一度にまたは一連の治療にわたって適切に患者に投与される。その疾患のタイプおよび重症度に応じて、適切な投与量レベルは、一般に、単回投与または複数回投与において投与され得る約０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ患者体重／日である。好ましくは、投与量レベルは、約０．１〜約２５０ｍｇ／ｋｇ／日；より好ましくは、約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日である。好適な投与量レベルは、約０．０１〜２５０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ／日または約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。この範囲内において、投与量は、０．０５〜０．５、０．５〜５または５〜５０ｍｇ／ｋｇ／日であってよい。経口投与の場合、組成物は、好ましくは、治療される患者に対する投与量の対症調整（ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）のために、１．０〜１０００ミリグラムの活性成分、特に、１．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、５０．０、７５．０、１００．０、１５０．０、２００．０、２５０．０、３００．０、４００．０、５００．０、６００．０、７５０．０、８００．０、９００．０および１０００．０ミリグラムの活性成分を含む錠剤の形態で提供される。それらの化合物は、１日あたり１〜４回、好ましくは、１日あたり１回または２回のレジメンにおいて投与されてもよい。
【００５９】
配列番号１のポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントは、任意のタイプの好適な経路、例えば、経口経路、局所的経路、吸入または非経口経路によって投与されてよく、所望の剤形の製剤にとって必要な医薬的に許容され得る賦形剤が含まれる。前記医薬組成物の好ましい投与経路は、静脈内経路である。別の実施形態において、投与経路は、鼻腔内経路である。
【００６０】
１つの実施形態において、Ｏｍｏｍｙｃまたはその機能的に等価なバリアントは、前記ポリペプチドを身体からの迅速な排除から保護する担体を用いて調製される（例えば、植込錠およびマイクロカプセル化された投与システムを含む放出制御製剤）。生分解性の生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。前記製剤を調製するための方法は、当業者にとって明らかだろう。それらの材料は、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃにおいて商業的に入手可能でもある。
【００６１】
Ｏｍｏｍｙｃおよびその機能的に等価なバリアントが、生体膜を越えて移動することが可能であるという事実にもかかわらず、Ｏｍｏｍｙｃまたは任意のその機能的に等価なバリアントをナノ粒子として製剤化することが可能である。それらのナノ粒子は、それが標的器官に到達するまで、生体液中においてそのポリペプチドの完全性を保存するのに寄与し得る。さらに、ナノ粒子は、目的の器官にナノ粒子を標的化することを可能にする部分を含むようにも改変することができる。このようにして、Ｏｍｏｍｙｃまたはその機能的に等価なバリアントは、標的器官の近くに送達され、その生物学的活性を必要している細胞の内部へのＯｍｏｍｙｃの接近が促進される。
【００６２】
したがって、別の実施形態において、ナノ粒子の一部を形成しているＯｍｏｍｙｃまたは任意のその機能的に等価なバリアントが、提供される。
【００６３】
本明細書中において使用されるとき、用語「ナノ粒子」とは、１〜１，０００ｎｍの範囲の寸法を有する任意の材料のことを指す。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、２〜２００ｎｍの範囲、好ましくは、２〜１５０ｎｍの範囲、なおもより好ましくは、２〜１００ｎｍの範囲の寸法を有する。本発明において使用することができるナノ粒子には、脂質ベースのナノ粒子、超常磁性のナノ粒子、ナノシェル、半導体ナノ結晶、量子ドット、ポリマーベースのナノ粒子、ケイ素ベースのナノ粒子、シリカベースのナノ粒子、金属ベースのナノ粒子、フラーレンおよびナノチューブのようなナノスケールの材料が含まれる。
【００６４】
標的化送達は、ナノ粒子がそれらのポリペプチド搭載物を送達する能力を損なわずにリガンドを付加することによって達成することができる。これにより、特定の細胞、組織および器官への送達が可能になることが企図される。リガンドベースの送達系の標的化の特異性は、種々の細胞型上のリガンドレセプターの分布に基づく。標的化リガンドは、ナノ粒子と非共有結合的に会合してもよいし共有結合的に会合してもよく、本明細書中において論じられる種々の方法によってナノ粒子にコンジュゲート化することができる。
【００６５】
ナノ粒子を標的化するために使用することができるタンパク質またはペプチドの例としては、トランスフェリン、ラクトフェリン、ＴＧＦ−β、神経成長因子、アルブミン、ＨＩＶ  Ｔａｔペプチド、ＲＧＤペプチドおよびインスリンならびにその他のものが挙げられる。
【００６６】
ナノ粒子としてのＯｍｏｍｙｃまたはその機能的に等価なバリアントの製剤は、細胞内部へのＯｍｏｍｙｃの接近を促進することを目的としているかまたはもっぱら目的としているのではなく、Ｏｍｏｍｙｃを分解から保護することおよび／または目的の器官へのナノ粒子の標的化を促進することを目的としているかまたはもっぱら目的としていることが理解されるだろう。
【００６７】
ＯｍｏｍｙｃコンジュゲートおよびＯｍｏｍｙｃを含んでなる融合タンパク質
本発明は、配列番号１のポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントを含む第１の領域およびそのポリペプチドの細胞取り込みを促進する化学的部分を含む第２の領域を含んでなるコンジュゲートも提供する。細胞取り込みを高めるための部分の例としては、疎水性基（例えば、脂質または脂肪酸）、タンパク質形質導入ドメインおよびある特定の金属キレートが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６８】
Ｏｍｏｍｙｃ分子におけるさらなる化学的部分の存在は、改変されていないＯｍｏｍｙｃと比べて、生体膜を越えた移動について高い能力を示すコンジュゲートをもたらし、それにより、高い腫瘍抑制活性がもたらされる。
【００６９】
したがって、別の態様において、本発明は、
（ｉ）配列番号１のポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアント、および
（ｉｉ）そのポリペプチドの細胞取り込みを促進する化学的部分
を含んでなるコンジュゲートに関する。
【００７０】
用語「コンジュゲート」は、本明細書中において使用されるとき、各化合物の機能がコンジュゲートにおいて保持されるように互いに共有結合的に連結された２つ以上の化合物のことを指す。
【００７１】
好ましい実施形態において、本発明に係るコンジュゲートは、ポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントの細胞取り込みを促進する少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個またはそれ以上の化学的部分を含んでなる。
【００７２】
１つの実施形態において、ポリペプチドの細胞取り込みを促進する化学的部分は、脂質または脂肪酸である。
【００７３】
脂肪酸は、一般に、鎖の一端に酸性部分（例えば、カルボン酸）を有する炭素鎖を含む分子である。その脂肪酸の炭素鎖は、任意の長さであってよいが、しかしながら、炭素鎖の長さは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれ以上の炭素原子およびその中の導き出せる任意の範囲であることが好ましい。ある特定の実施形態において、炭素鎖の長さは、脂肪酸の鎖部分において４〜１８個の炭素原子である。ある特定の実施形態において、脂肪酸炭素鎖は、奇数の炭素原子を含むことがあるが、しかしながら、ある特定の実施形態では、鎖の中の偶数の炭素原子が好ましいこともある。その炭素鎖の中に単結合だけを含む脂肪酸は、飽和と呼ばれるのに対し、その鎖の中に少なくとも１つの二重結合を含む脂肪酸は、不飽和と呼ばれる。脂肪酸は、分枝状であってもよいが、本発明の好ましい実施形態では、非分枝状である。具体的な脂肪酸としては、リノール酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノレン酸、ステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、アラキジン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
好ましい実施形態において、ポリペプチドの細胞取り込みを促進する化学的部分は、細胞透過ペプチド配列であり、その場合、コンジュゲートは、Ｏｍｏｍｙｃまたはその機能的に等価なバリアントおよび細胞透過ペプチド配列を含んでなる融合タンパク質である。
【００７５】
用語「融合タンパク質」は、異なるタンパク質に由来する２つ以上の機能ドメインからなる、遺伝子技術によって作製されるタンパク質に関する。融合タンパク質は、従来の手段によって、例えば、好適な細胞において前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の遺伝子発現によって、得てもよい。細胞透過ペプチドとは、配列番号１のポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントの一部を形成している細胞透過ペプチドとは異なる細胞透過ペプチドのことを指すことが理解されるだろう。
【００７６】
用語「配列番号１のポリペプチド」、「配列番号１のポリペプチドの機能的に等価なバリアント」および「細胞透過ペプチド」は、本発明の医薬としての使用の文脈において詳細に説明されており、融合タンパク質の文脈において等しく適用可能である。
【００７７】
好ましい実施形態において、前記細胞透過ペプチドは、内因性のＯｍｏｍｙｃ細胞透過ペプチドではない。
【００７８】
１つの実施形態において、細胞透過ペプチド配列は、配列番号１のポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントのＮ末端において融合される。別の実施形態において、細胞透過ペプチドは、配列番号１のポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントのＣ末端において融合される。
【００７９】
好ましい実施形態において、本発明に係る融合タンパク質は、配列番号１のポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントに見られるそれ自体の細胞透過ペプチドに加えて、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個またはそれ以上のさらなる細胞透過ペプチドを含んでなる。
【００８０】
別の好ましい実施形態において、本発明のコンジュゲートまたは融合タンパク質は、配列番号１のポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントを含んでなり、Ｎ末端またはＣ末端の核局在化シグナルをさらに含んでなる。用語「核局在化シグナル（ＮＬＳ）」は、本発明の治療的な使用の文脈において説明されており、本発明の融合タンパク質に等しく適用可能である。さらなるＮＬＳとは、Ｏｍｏｍｙｃまたはその機能的に等価なバリアントに見られる内在性ＮＬＳとは異なるＮＬＳのことを指すことが認識されるだろう。さらなるＮＬＳは、Ｏｍｏｍｙｃまたはその機能的に等価なバリアントに見られる内在性ＮＬＳと同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００８１】
１つの実施形態において、ＮＬＳは、Ｍｙｃ配列に内在的に現れるＮＬＳの１つ、例えば、Ｍ１ペプチド（ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ，配列番号５０）またはＭ２ペプチド（ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＦ，配列番号４９）（Ｄａｎｇ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，前出を参照のこと）である。
【００８２】
好ましい実施形態において、本発明に係るコンジュゲートまたは融合タンパク質は、配列番号１のポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントに見られる内在性ＮＬＳに加えて、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個またはＮＬＳを含んでなる。
【００８３】
当業者は、融合タンパク質が、配列番号１のポリペプチドもしくはその機能的に等価なバリアント、細胞透過ペプチド配列および／またはＮＬＳを接続する１つ以上の可動性ペプチドをさらに含んでなることが望ましい場合があることを理解するだろう。したがって、特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、細胞透過ペプチド配列に直接接続される。別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、可動性ペプチドを介して細胞透過ペプチド配列に接続される。特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、細胞透過ペプチド配列およびＮＬＳに直接接続される。別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、第１の可動性ペプチドリンカーを介して細胞透過ペプチド配列に、および第２の可動性ペプチドリンカーを介してＮＬＳに接続される。
【００８４】
本明細書中において使用されるとき、用語「可動性ペプチド」、「スペーサーペプチド」または「リンカーペプチド」とは、２つのタンパク質または２つの部分に共有結合的に結合するが、いずれのポリペプチドの一部でもなく、そのタンパク質またはその部分のいずれの機能に対しても実質的な有害な影響を引き起こさずに、他方に対して一方の動きを可能にする、ペプチドのことを指す。したがって、可動性リンカーは、Ｏｍｏｍｙｃ配列の腫瘍抑制活性、細胞透過ペプチドの細胞透過活性またはＮＬＳの核局在化能力に影響しない。
【００８５】
可動性ペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸、少なくとも２つのアミノ酸、少なくとも３つのアミノ酸、少なくとも４つのアミノ酸、少なくとも５つのアミノ酸、少なくとも６つのアミノ酸、少なくとも７つのアミノ酸、少なくとも８つのアミノ酸、少なくとも９つのアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１２個のアミノ酸、少なくとも１４個のアミノ酸、少なくとも１６個のアミノ酸、少なくとも１８個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも２５個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも３５個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも４５個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも６０個のアミノ酸、少なくとも７０個のアミノ酸、少なくとも８０個のアミノ酸、少なくとも９０個のアミノ酸または約１００個のアミノ酸を含んでなる。いくつかの実施形態において、可動性ペプチドは、タンパク質の溶解性を高めるためおよび／またはその活性を改善するために、他方のタンパク質に対して一方のタンパク質の動きを可能にする。好適なリンカー領域としては、グリシン、プロリンおよびアラニン残基の組み合わせのＧＰＲＲＲＲ配列（配列番号５１）であるポリ−グリシン領域が挙げられる。
【００８６】
いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、とりわけ、蛍光基、ビオチン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アミノ酸アナログ、非天然アミノ酸、リン酸基、グリコシル基、放射性同位体標識および医薬分子を含むさらなる化学的部分を含んでなることができる。他の実施形態において、異種ポリペプチドは、とりわけ、ケトン、アルデヒド、Ｃｙｓ残基およびＬｙｓ残基を含む１つ以上の化学的反応基を含んでなることができる。
【００８７】
特定の実施形態において、本発明のコンジュゲートまたは融合タンパク質は、コンジュゲートまたは前記融合タンパク質もしくはそのバリアントのＣ末端ドメインもしくはＮ末端ドメインに結合したタグを含んでなる。前記タグは、通常、前記融合タンパク質の単離または精製において使用することができるペプチドまたはアミノ酸配列である。したがって、前記タグは、１つ以上のリガンド、例えば、クロマトグラフィーの支持体またはビーズなどの親和性マトリックスの１つ以上のリガンドに高親和性で結合することが可能である。前記タグの例は、ニッケル（Ｎｉ２＋）またはコバルト（Ｃｏ２＋）のカラムに高親和性で結合できるヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−タグまたはＨＴ）、例えば、ヒスチジンの６つの残基を含むタグ（Ｈｉｓ６またはＨ６）である。Ｈｉｓ−タグは、ほとんどのタンパク質にとって変性の条件およびほとんどのタンパク質間相互作用にとって破壊的な条件下において、そのリガンドに結合できるという望ましい特徴を有する。したがって、それは、ベイトタンパク質が関与しているタンパク質間相互作用を破壊した後に、Ｈ６によってタグ化されたそのベイトを除去するために使用することができる。
【００８８】
融合タンパク質を単離するためまたは精製するために有用なタグのさらなる例証的であって非限定的な例としては、Ａｒｇ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号５２）、Ｓｔｒｅｐ−タグ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ，配列番号５３）、抗体によって認識されることが可能なエピトープ、例えば、ｃ−ｍｙｃ−タグ（抗ｃ−ｍｙｃ抗体によって認識される）、ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ，配列番号５４）、Ｖ５タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ，配列番号５５）、ＳＢＰ−タグ、Ｓ−タグ、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合ドメイン、キチン結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−タグ、マルトース結合タンパク質、ＮｕｓＡ、ＴｒｘＡ、ＤｓｂＡ、Ａｖｉ−タグなど（Ｔｅｒｐｅ  Ｋ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３，６０：５２３−５２５）、アミノ酸配列、例えば、ＡＨＧＨＲＰ（配列番号５６）またはＰＩＨＤＨＤＨＰＨＬＶＩＨＳＧＭＴＣＸＸＣ（配列番号５７）、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。
【００８９】
タグは、所望であれば、前記融合タンパク質の単離または精製のために使用することができる。
【００９０】
別の態様において、本発明は、医薬として用いられる、本発明に係るコンジュゲートまたは融合タンパク質に関する。
【００９１】
別の態様において、本発明は、癌の予防および／または治療に用いられる、本発明に係るコンジュゲートまたは融合タンパク質に関する。
【００９２】
別の態様において、本発明は、癌の予防および／または治療のための薬剤を調製するための本発明に係るコンジュゲートまたは融合タンパク質の使用に関する。
【００９３】
別の態様において、本発明は、被験体における癌の治療および／または予防の方法に関し、その方法は、前記被験体への、本発明に係るコンジュゲートまたは融合タンパク質の投与を含む。
【００９４】
好ましい実施形態において、予防されるべきまたは治療されるべき癌は、Ｍｙｃによって誘導される癌である。別の好ましい実施形態において、予防されるべきまたは治療されるべき癌は、ＫＲＡＳ遺伝子における変異に関連する癌である。１つの実施形態において、ＫＲＡＳ遺伝子における変異は、１２位のグリシン、１３位のグリシンまたは６１位のグルタミンにおける変異である。より好ましい実施形態において、変異は、Ｇ１２Ｓ変異、Ｇ１２Ｖ変異、Ｇ１３Ｄ変異、Ｇ１２Ｃ変異、Ｇ１２Ｒ変異、Ｇ１２Ｆ変異、Ｇ１２Ｉ変異、Ｇ１３Ｃ変異、Ｇ１３Ｒ変異またはＱ６１Ｌ変異からなる群より選択される。
【００９５】
用語「薬剤」、「予防」、「治療」、「癌」および「Ｍｙｃによって誘導される癌」は、先に定義されており、本発明のこの態様に等しく適用される。
【００９６】
抗腫瘍組成物
Ｏｍｏｍｙｃポリペプチドが、ポリペプチドとして提供されたとき、生体膜を越えて移動することが可能であり、その腫瘍抑制活性を発揮することが可能であるという予想外の知見は、Ｏｍｏｍｙｃを他の抗腫瘍薬とともに製剤化する可能性を切り開くものである。したがって、別の態様において、本発明は、
（ｉ）Ｏｍｏｍｙｃ、
（ｉｉ）その機能的に等価なバリアント、
（ｉｉｉ）本発明に係るコンジュゲートまたは融合タンパク質
からなる群より選択される第１の構成要素
および第２の構成要素として抗腫瘍化合物
を共にまたは別々に含んでなる組成物も提供する。
【００９７】
本発明に係る組成物の第１の構成要素には、配列番号１に記載のポリペプチド、その機能的に等価なバリアントまたは本発明に係る融合タンパク質が含まれる。好適なポリペプチド、配列番号１のポリペプチドの機能的に等価なバリアントおよび融合タンパク質は、本発明に係る治療方法の文脈において上記で説明されており、本発明に係る組成物に等しく適用可能である。
【００９８】
本明細書中において使用されるとき、「抗腫瘍剤」は、腫瘍を治療するかまたはその形成を予防する前記生物学的化合物または化学的化合物と理解される。好ましい実施形態において、前記抗腫瘍剤は、細胞傷害剤、抗血管新生剤、抗転移剤および抗増殖剤からなる群より選択される。
【００９９】
本発明において使用されるとき、用語「細胞傷害剤」は、細胞死を促進することが可能であって、成長を減少させるため、成長を停止するためまたは細胞を破壊するため、特に、急速に増殖する細胞、なおもより詳細には腫瘍細胞を破壊するための能力を有する、作用物質に関する。細胞死は、任意のメカニズム、例えば、アポトーシス、代謝の阻害、細胞骨格の組織化の干渉またはＤＮＡの化学修飾によって引き起こされる可能性があるが、この原因に限定されない。細胞傷害剤という用語は、有機小分子、ペプチド、オリゴヌクレオチドなど；トキシン；酵素；サイトカイン；放射性同位体または放射線治療剤をはじめとした任意の化学療法剤を含む。
【０１００】
「化学療法剤」は、化学的化合物、例えば、以下に限定されないが、アントラサイクリン抗生物質、例えば、ドキソルビシンおよびダウノルビシン、タキサン類、例えば、ＴａｘｏｌＴＭおよびドセタキセル、ビンカアルカロイド類、例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、イリノテカン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、オキサリプラチン、ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）、タモキシフェン、シスプラチン、カルボプラチン、メトトレキサート、アクチノマイシンＤ、ミトキサントロン、ブレノキサン（ｂｌｅｎｏｘａｎｅ）またはミトラマイシンと理解される。
【０１０１】
「トキシン」は、本発明の第１の態様に係るポリペプチドまたは本発明の第２の態様に係る融合タンパク質とコンジュゲート化して免疫毒素を形成する有毒な作用物質と理解される。確定したトキシンは、コンジュゲート化されなければ有毒すぎるだろうことから、それらのトキシンおよび前記ポリペプチドまたは前記融合タンパク質のコンジュゲート化は、前者の毒性を低減して、治療薬としてそれらを使用することを可能にする。トキシンと本発明の第１の態様に係るポリペプチドまたは本発明の第２の態様に係る融合タンパク質との間の結合は、化学的に行われ、その生物学的活性を保存する。それらの分離は、一般に、述べた化学的結合が、リソソームによって提供される閉じられた酸性の細胞環境においてのみ破壊されるように、標的細胞のリソソームにおいて生じる。本発明の文脈において有用なトキシンは、植物トキシン、細菌毒素、真菌または動物起源のトキシンおよびそれらのフラグメント、例えば、以下に限定されないが、リシンＡ鎖、サポニン、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の活性な非結合性フラグメント、緑膿菌外毒素Ａ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）、Ｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ  Ａタンパク質、ジアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）タンパク質、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン（ｃｕｒｃｉｎｅ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、マイトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）およびトリコテシンである。
【０１０２】
「酵素」は、本発明の文脈において、トキシンまたは薬物を活性化する酵素、例えば、以下に限定されないが、エトポシドおよびドキソルビシンを活性化するアルカリホスファターゼ；ナイトロジェンマスタードを活性化するカルボキシペプチダーゼＧ２；ドキソルビシン、パクリタキセルおよびマイトマイシンを活性化するベータ−ラクタマーゼと理解される。
【０１０３】
「サイトカイン」は、免疫応答を制御する目的で免疫系の細胞を合成する種々のサイズおよび分子量のペプチドと理解され、それらは、ホルモン、成長因子、壊死因子などであり得る。それらは、天然起源であり得るか、または天然の配列のサイトカインの組換え細胞培養物および生物学的に活性な等価物に由来し得る。抗体とのそれらのコンジュゲート化によって、免疫サイトカインが生じる。本発明において有用なサイトカインは、以下に限定されないが、ＴＮＦ因子アルファ、ＩＮＦ−ガンマ、ＧＭ−ＧＳＦ因子またはＩＬ−２である。
【０１０４】
「放射性同位体」は、放射性同位元素、例えば、以下に限定されないが、１３１Ｉ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、１８８Ｒｅ、６７Ｃｕ、２１１Ａｔ、２１３Ｂｉ、１２５Ｉ、１１１Ｉｎと理解される。
【０１０５】
「抗血管新生剤」は、新しい血管の形成、すなわち、血管新生を阻害するかまたは減少させる化学的物質または生物学的物質と理解される。
【０１０６】
本発明の第１の態様に係るポリペプチドまたは本発明の第２の態様に係る融合タンパク質とコンジュゲート化できる抗血管新生剤としては、パクリタキセル、２−メトキシエストラジオール、プリノマスタット（ｐｒｉｎｏｍａｓｔａｔ）、バチマスタット（ｂａｔｉｍａｓｔａｔ）、ＢＡＹ１２−９５６６、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＣ−１０８８、デキストロメトルファン酢酸、ジメチルキサンテノン酢酸、エンドスタチン、ＩＭ−８６２、マリマスタット（ｍａｒｉｍａｓｔａｔ）、ペニシラミン、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、ＲＰＩ．４６１０、乳酸スクアラミン、ＳＵ５４１６、サリドマイド、コンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）、タモキシフェン、ＣＯＬ−３、ネオバスタット（ｎｅｏｖａｓｔａｔ）、ＢＭＳ−２７５２９１、ＳＵ６６６８、抗ＶＥＧＦ抗体、Ｍｅｄｉ−５２２（Ｖｉｔａｘｉｎ  ＩＩ）、ＣＡＩ、インターロイキン１２、ＩＭ８６２、アミロライド、アンジオスタチン、Ｋｌ−３アンジオスタチン、Ｋｌ−５アンジオスタチン、カプトプリル、ＤＬ−アルファ−ジフルオロメチルオルニチン、ＤＬ−アルファ−ジフルオロメチルオルニチンＨＣｌ、エンドスタチン、フマギリン、ハービマイシンＡ、４−ヒドロキシフェニルレチンアミド、ジュグロン、ラミニン、ラミニンヘキサペプチド、ラミニンペンタペプチド、ラベンダスチン（ｌａｖｅｎｄｕｓｔｉｎ）Ａ、メドロキシプロゲステロン、ミノサイクリン、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤、スラミン、トロンボスポンジン、血管新生促進因子に対する抗体（例えば、アバスチン、アービタックス、ベクティベックス、ハーセプチン）；血管新生促進成長因子の低分子量チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、タルセバ、ネクサバール、スーテント、イレッサ）；ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、Ｔｏｒｉｓｅｌ）；インターフェロンアルファ、ベータおよびガンマ、ＩＬ−１２、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＣＯＬ３、マリマスタット、バチマスタット）；ＺＤ６４７４、ＳＵｌ１２４８、ビタキシン（ｖｉｔａｘｉｎ）；ＰＤＧＦＲ阻害剤（例えば、グリベック）；ＮＭ３および２−ＭＥ２；シクロペプチド、例えば、シレンジタイドの群から選択される抗血管新生剤が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０７】
「抗転移剤」は、転移、すなわち、癌を引き起こす細胞の基本的にはリンパ流または血流による離れた場所への伝播および前記転移の到着部位における新しい腫瘍の成長を阻害するかまたは減少させる、化学的物質または生物学的物質と理解される。
【０１０８】
「抗増殖剤」は、腫瘍の形成または成長を予防することまたは阻害することが可能である化学的物質または生物学的物質と理解される。抗増殖剤としては、（ｉ）代謝拮抗物質、例えば、葉酸代謝拮抗物質（アミノプテリン、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキサート、エダトレキセート、トリメトレキサート、ノラトレキセド（ｎｏｌａｔｒｅｘｅｄ）、ロメトレキソール（ｌｏｍｅｔｒｅｘｏｌ）、ペメトレキセド、ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）、ピリトレキシム（ｐｉｒｉｔｒｅｘｉｍ）、プテロプテリン、ロイコボリン、１０−プロパルギル−５，８−ジデアザフォレート（ＰＤＤＦ、ＣＢ３７１７））、プリンアナログ（クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、ペントスタチン、チオグアニン）およびピリミジンアナログ（カペシタビン、シタラビンまたはａｒａ−Ｃ、デシタビン、フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、ドキシフルリジン、フロクスウリジンおよびゲムシタビン）、（ｉｉ）天然物、例えば、抗腫瘍抗生物質および有糸分裂阻害剤、例えば、ビンカアルカロイド、例えば、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン；タキサン類、例えば、パクリタキセル（ＴａｘｏｌＴＭ）、ドセタキセル（タキソテールＴＭ）；コルヒチン（ＮＳＣ７５７）、チオコルヒチン（ＮＳＣ３６１７９２）、コルヒチン誘導体（例えば、ＮＳＣ３３４１０）、およびアロコルヒチン（ａｌｌｏｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）（ＮＳＣ４０６０４２）；ハリコンドリンＢ（ＮＳＣ６０９３９５）；ドラスタチン１０（ＮＳＣ３７６１２８）；メイタンシン（ＮＳＣ１５３８５８）；リゾキシン（ＮＳＣ３３２５９８）；エポチロンＡ、エポチロンＢ；ディスコデルモリド；エストラムスチン；ノコダゾール；（ｉｉｉ）ホルモンおよびそのアンタゴニスト、例えば、タモキシフェン、トレミフェン、アナストロゾール、アルゾキシフェン（ａｒｚｏｘｉｆｅｎｅ）、ラソフォキシフェン（ｌａｓｏｆｏｘｉｆｅｎｅ）、ラロキシフェン、ナフォキシジン、フルベストラント、アミノグルテチミド、テストラクトン、アタメスタン（ａｔａｍｅｓｔａｎｅ）、エキセメスタン、ファドロゾール、フォルメスタン、レトロゾール、ゴセレリン、リュープロレリンまたはリュープロリド、ブセレリン、ヒストレリン、メゲストロールおよびフルオキシメステロン；（ｉｖ）生物学的剤、例えば、ウイルスベクター、インターフェロンアルファおよびインターロイキン；（ｖ）白金系化合物、例えば、カルボプラチン、シスプラチン［ｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金、（ＣＤＤＰ）］、オキサリプラチン、イプロプラチン（ｉｐｒｏｐｌａｔｉｎ）、ネダプラチン、四硝酸トリプラチン（ｔｒｉｐｌａｔｉｎ  ｔｅｔｒａｎｉｔｒａｔｅ）、テトラプラチン（ｔｅｔｒａｐｌａｔｉｎ）、サトラプラチン（ｓａｔｒａｐｌａｔｉｎ）（ＪＭ２１６）、ＪＭ１１８［ｃｉｓアンミンジクロロ（ＩＩ）］、ＪＭ１４９［ｃｉｓアンミンジクロロ（シクロヘキシルアミン）ｔｒａｎｓジヒドロキソ白金（ＩＶ）］、ＪＭ３３５［ｔｒａｎｓアンミンジクロロジヒドロキソ白金（ＩＶ）］、トランスプラチン（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎ）、ＺＤ０４７３、ｃｉ���，ｔｒａｎｓ，ｃｉｓ−Ｐｔ（ＮＨ３）（Ｃ６Ｈ１１ＮＨ２）（ＯＯＣＣ３Ｈ７）２Ｃｌ、マラネート−１，２−ジアミノシクロヘキサノプラチン（ＩＩ）、５−スルホサリシレート−ｔｒａｎｓ−（１，２−ジアミノシクロヘキサン）プラチン（ＩＩ）（ＳＳＰ）、ポリ−［（ｔｒａｎｓ−１，２−ジアミノシクロヘキサン）プラチン］−カルボキシアミロース（ＰＯＬＹ−ＰＬＡＴ）および４−ヒドロキシ−スルホニルフェニルアセテート（ｔｒａｎｓ−１，２−ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）（ＳＡＰ）など、および（ｖｉ）ＤＮＡアルキル化薬、例えば、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル類およびトリアゼン（シクロホスファミド（ＣｙｔｏｘａｎＴＭ）、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン、ピポブロマン、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）、クロラムブシル、メクロレタミンまたはムスチン、ウラムスチンまたはウラシルマスタード、ノベンビキン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、イホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、クロロゾトシン、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ニムスチン、ラニムスチン（ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン、チオテパ、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホルアミン、プロカルバジン、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、ダカルバジン、ミトゾロミド（ｍｉｔｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）およびテモゾロマイドを含むがこれらに限定されない）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０９】
医薬組成物
本発明は、本発明のコンジュゲートおよび融合タンパク質を含んでなる医薬組成物または本発明に係る組成物も提供する。したがって、別の態様において、本発明は、医薬的に活性な量の本発明に係るコンジュゲートまたは融合タンパク質および医薬的に活性な担体を含んでなる医薬組成物（本発明の第１の医薬組成物）を提供する。別の態様において、本発明は、医薬的に活性な量の本発明に係る組成物および医薬的に活性な担体を含んでなる医薬組成物（本発明に係る第２の医薬組成物）を提供する。
【０１１０】
本発明において使用されるとき、表現「医薬組成物」は、所定の用量の１つまたはいくつかの治療的な有用な作用物質を、癌のような細胞分裂が調節されていない、細胞、細胞の群、器官、組織または動物に投与するために適合された製剤に関する。
【０１１１】
本発明の第１の医薬組成物は、医薬的に有効な量の本発明に係るコンジュゲートまたは融合タンパク質を含んでなる。本発明に係る医薬組成物において用いられる好適なコンジュゲートおよび融合タンパク質としては、Ｏｍｏｍｙｃコンジュゲートのパラグラフにおいて上で述べた融合タンパク質のいずれかおよび本発明の融合タンパク質が挙げられる。
【０１１２】
本発明の第２の医薬組成物は、医薬的に有効な量の本発明に係る組成物および医薬的に活性な担体を含んでなる。本発明の第２の医薬組成物は、配列番号１のポリペプチド、その機能的に等価なバリアントまたは本発明に係る融合タンパク質を含んでなる。本発明に係る第２の医薬組成物において用いられる配列番号１のポリペプチドの好適な機能的に等価なバリアントまたは好適な融合タンパク質は、それぞれ、本発明の治療的な用途においてまたは本発明の融合タンパク質において上で定義されたとおりのものである。
【０１１３】
表現「医薬的に有効な量」は、本明細書中において使用されるとき、治療効果を提供することが可能であって、通常使用される手段によって当業者が決定できる量と理解される。本発明に係る医薬組成物において組み合され得る、Ｏｍｏｍｙｃポリペプチド、その機能的に等価なバリアントまたは融合タンパク質または抗腫瘍化合物の量は、被験体および特定の投与様式に応じて変動する。当業者は、投与量が、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｎｉｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９６），Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ＩＩ，ｐｐ．１７０７−１７１１およびＧｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｔｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１），Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ＩＩ，ｐｐ．４７５−４９３からのガイダンスに従っても決定され得ることを認識するだろう。
【０１１４】
医薬組成物内の有効成分または活性成分の適切な投与量は、治療される癌のタイプ、疾患の重症度および経過、当該組成物が予防目的で投与されるのかまたは治療目的で投与されるのか、以前の治療、患者の病歴および当該ペプチドまたはポリペプチドに対する応答、ならびに主治医の判断に依存する。配列番号１のポリペプチド、その機能的に等価なバリアント、融合タンパク質の量は、一度にまたは一連の治療にわたって適切に患者に投与される。その疾患のタイプおよび重症度に応じて、適切な投与量レベルは、一般に、単回投与または複数回投与において投与され得る約０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ患者体重／日であり得る。好ましくは、投与量レベルは、約０．１〜約２５０ｍｇ／ｋｇ／日；より好ましくは、約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日である。好適な投与量レベルは、約０．０１〜２５０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ／日または約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。この範囲内において、投与量は、０．０５〜０．５、０．５〜５または５〜５０ｍｇ／ｋｇ／日であってよい。経口投与の場合、組成物は、好ましくは、治療される患者に対する投与量の対症調整のために、１．０〜１０００ミリグラムの活性成分、特に、１．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、５０．０、７５．０、１００．０、１５０．０、２００．０、２５０．０、３００．０、４００．０、５００．０、６００．０、７５０．０、８００．０、９００．０および１０００．０ミリグラムの活性成分を含む錠剤の形態で提供される。それらの化合物は、１日あたり１〜４回、好ましくは、１日あたり１回または２回のレジメンにおいて投与されてもよい。
【０１１５】
配列番号１のポリペプチド、その機能的に等価なバリアントおよび本発明に係る融合タンパク質から選択される第１の構成要素、ならびに抗腫瘍剤である第２の構成要素を含む本発明に係る第２の医薬組成物の場合、その組成物は、単一の製剤として（例えば、定量のそれらの構成要素のうちの各１つを含む錠剤またはカプセル剤として）提供されることがあるか、または他方で、併用（ｊｏｉｎｔ）投与、連続投与もしくは別々の投与のために、後で組み合される別個の製剤として提供されることもある。本発明の組成物は、キット・オブ・パーツとしての製剤も含み、ここで、それらの構成要素は、別々に製剤化されているが、同じ容器に包装されている。本発明に係る第２の医薬組成物の場合における種々の構成要素の製剤は、類似のものである場合があり、換言すれば、同じように製剤化されており（錠剤または丸剤として）、そのおかげで、それらは同じ経路による投与が可能であることを当業者は認識するだろう。本発明の異なる構成要素が別々に製剤化される場合、その２つの構成要素は、ブリスター内に提供することができる。各ブリスターは、その日のうちに消費されなければならない薬物を含む。それらの薬物が、１日に数回投与されなければならない場合、各投与に対応する薬物は、ブリスターの異なる区画に配置されることがあり、好ましくは、ブリスターの各区画にそれらが投与されるべき日の時間が記録されている。あるいは、本発明の組成物の構成要素は、異なる構成要素が異なって投与されるように異なって製剤化されている場合がある。したがって、第１の構成要素は、経口投与用の錠剤またはカプセル剤として製剤化され、第２の構成要素は、静脈内投与用に製剤化されるか、またはその逆であることが可能である。本発明に係る第２の医薬組成物において使用される組成物の一部である構成要素間の比は、特定の各場合ならびに所望の適応症において使用される抗腫瘍剤に応じて当業者が調整できる。したがって、本発明は、２つの構成要素の量の比が、５０：１〜１：５０、特に、２０：１〜１：２０、１：１０〜１０：１または５：１〜１：５の範囲であり得る組成物を想定する。
【０１１６】
本発明の第１および第２の医薬組成物は、癌などの調節されていない細胞分裂が存在する病状の予防および／または治療のための１つまたはいくつかのさらなる化合物も含んでなることができる。前記さらなる化合物、例えば、抗腫瘍剤は、独立した実体として医薬組成物の一部を形成することができる。
【０１１７】
本発明の第１および第２の医薬組成物は、１つまたはいくつかのさらなる医薬的に許容され得る賦形剤も含んでなる。「医薬的に許容され得る賦形剤」は、活性成分を組み込むために使用されると考えられていて、組成、製剤化、安定性、患者の容認およびバイオアベイラビリティに関して、薬理学的／毒物学的な観点から患者にとって許容できるおよび物理的／化学的な観点からそれを製造する製薬化学者にとって許容できる、治療的に不活性な物質と理解される。
【０１１８】
医薬的に許容され得る賦形剤の数および性質は、所望の剤形に依存する。医薬的に許容され得る賦形剤は、当業者に公知である（Ｆａｕｌｉ  ｙ  Ｔｒｉｌｌｏ  Ｃ．（１９９３）“Ｔｒａｔａｄｏ  ｄｅ  Ｆａｒｍａｃｉａ  Ｇａｌｅｎｉｃａ”，Ｌｕｚａｎ  ５，Ｓ．Ａ．Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓ，Ｍａｄｒｉｄ）。前記組成物は、最先端技術において公知の従来の方法を用いて調製できる（“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”，２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００３）Ｇｅｎａｒｏ  Ａ．Ｒ．，ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＵＳ）。
【０１１９】
本発明の第１および第２の医薬組成物は、任意のタイプの好適な経路、例えば、経口経路、局所的経路、吸入または非経口経路によって投与でき、所望の剤形の製剤化に必要な医薬的に許容され得る賦形剤が含まれる。前記医薬組成物の好ましい投与経路は、静脈内経路である。
【０１２０】
「経口経路」は、嚥下後に生物に取り込まれる医薬組成物と理解される。特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、それが固体であるか液体であるかに関係なく、経口経路によるその投与に適した剤形で存在できる。経口経路による投与に適した剤形は、錠剤、カプセル剤、シロップ剤または液剤であり得、当該分野で公知の任意の従来の賦形剤、例えば、結合剤、例えば、シロップ剤、アカシア、ゼラチン、ソルビトールまたはポリビニルピロリドン；充填剤、例えば、ラクトース、糖、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシン；圧縮のための潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム；崩壊剤、例えば、デンプン、ポリビニルピロリドン、デンプンのグリコール酸ナトリウムまたは微結晶性セルロース；または医薬的に許容され得る湿潤剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムを含むことができる。固体の経口組成物は、混合、充填または圧縮の従来の方法を用いて調製できる。繰り返しの混合操作を用いることにより、多量の充填剤を使用する組成物の中に活性な作用物質を完全に分散させることができる。前記操作は、当該分野において従来のものである。錠剤は、例えば、湿式造粒または乾式造粒によって、および場合により、通常の医薬的実施において公知の方法に従ってそれらをコーティングして、特に腸溶コーティングでコーティングすることによって、調製できる。
【０１２１】
他方で、「局所的経路」は、非全身性経路による投与と理解され、著しく血流に入らない、表皮上、口腔内における表面への本発明の医薬組成物の適用ならびに耳、眼および鼻の中への前記組成物の滴下を含む。「全身性経路」は、経口経路、静脈内経路、腹腔内経路および筋肉内経路による投与と理解される。治療効果または予防効果のために必要とされる抗体の量は、選ばれた抗体、治療されることになっている疾病の性質および重症度ならびに患者に応じて、当然、変動する。
【０１２２】
「吸入」は、鼻腔内経路および経口吸入による投与と理解される。前記投与に適した剤形、例えば、エアロゾルまたは定量吸入器における製剤は、従来の手法を用いて調製できる。ある実施形態において、投与経路は、鼻腔内経路である。
【０１２３】
本明細書中において使用されるとき、用語「非経口」は、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路または皮下経路による投与を含む。非経口投与の皮下、筋肉内および静脈内の剤形が、通常好ましい。
【０１２４】
１つの実施形態において、本発明の第１および第２の医薬組成物は、適切な投薬単位形態（ｄｏｓａｇｅ  ｕｎｉｔ  ｆｏｒｍ）における滅菌された溶液、懸濁液または凍結乾燥された製品など、非経口投与に適合できる。注射可能な使用に適した医薬組成物には、滅菌された水溶液（それらが水に可溶性であるとき）または分散液、および滅菌された注射可能な溶液または分散液の即時調製用の滅菌された粉末が含まれる。静脈内経路によって投与する場合、いくつかの好適な担体には、リン酸塩で緩衝された食塩水溶液（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合において、組成物は、滅菌されていなければならないし、容易に注射できる程度にまで流動性でなければならない。それは、調製および貯蔵の条件において安定でなければならないし、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、医薬的に許容され得るポリオール、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールおよび好適なそれらの混合物を含む、溶媒または分散媒であり得る。好適な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを用いて、分散液の場合、要求される粒径を維持することによって、および界面活性剤を用いて、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チオメルサールなどを用いて達成することができる。ほとんどの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖；多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール；または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能な組成物の長期の吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、アルミニウムおよびゼラチンモノステアレートを含めることによって引き起こされることがある。
【０１２５】
注射可能な滅菌された溶液は、必要とされる量の活性な化合物を、上述の成分のうちの１つまたは組み合わせとともに、好適な溶媒に組み込み、必要に応じその後、滅菌された膜を通す濾過による滅菌によって、調製できる。通常、分散液は、活性な化合物を、基本分散媒および先に列挙されたものの中から必要とされる残りの成分を含む滅菌されたビヒクル中に組み込むことによって、調製される。注射可能な滅菌された溶液を調製するための滅菌された粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分＋任意の所望のさらなる成分の予め濾過滅菌された溶液から、それらを含む粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１２６】
本発明の医薬組成物は、パルス注入を用いて、例えば、組成物の用量を減少させながら、適切に投与できる。好ましくは、その用量は、投与が急性であるか慢性であるかに部分的に応じて、注射によって、より好ましくは、静脈内注射または皮下注射によって、投与される。
【０１２７】
１つの実施形態において、本発明の第１または第２の医薬組成物は、前記ポリペプチドを身体からの迅速な排除から保護する担体を用いて調製される（例えば、植込錠およびマイクロカプセル化された投与システムを含む放出制御製剤）。生分解性の生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。前記製剤を調製するための方法は、当業者には明らかだろう。それらの材料は、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃにおいて商業的に入手可能でもある。
【０１２８】
徐放組成物には、抗体の結晶を懸濁液中で維持できる好適な製剤に懸濁された抗体の結晶の調製物も含まれる。これらの調製物は、皮下経路または腹腔内経路によって注射されるとき、徐放作用をもたらすことがある。他の組成物は、リポソームの中に捕捉された抗体も含んでなる。そのような抗体を含むリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８５）８２：３６８８−３６９２；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８０）７７：４０３０−４０３４；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９などの公知の方法を用いて調製される。
【０１２９】
ＯｍｏｍｙｃならびにＯｍｏｍｙｃを含んでなるコンジュゲートおよび融合タンパク質が、生体膜を超えて移動することが可能であるという事実にもかかわらず、当業者は、Ｏｍｏｍｙｃを含んでなるコンジュゲートまたは融合タンパク質をナノ粒子として製剤化することもまた好都合な場合があることを理解するだろう。それらのナノ粒子は、標的器官に到達するまで、生体液中においてそのポリペプチドの完全性を保存するのに寄与し得る。さらに、抗腫瘍剤を含んでなる組成物の場合、その組成物のカプセル封入により、抗腫瘍剤によって引き起こされる副次的作用が減少することがある。最後に、ナノ粒子は、目的の器官へのナノ粒子の標的化を可能にする部分を含むようにも改変できる。
【０１３０】
したがって、別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、ナノ粒子の一部を形成する本発明に係るコンジュゲート、融合タンパク質および組成物を含んでなる。
【０１３１】
本発明の文脈において使用できる好適なナノ粒子には、脂質ベースのナノ粒子、超常磁性のナノ粒子、ナノシェル、半導体ナノ結晶、量子ドット、ポリマーベースのナノ粒子、ケイ素ベースのナノ粒子、シリカベースのナノ粒子、金属ベースのナノ粒子、フラーレンおよびナノチューブのようなナノスケールの材料が含まれる。
【０１３２】
標的化送達は、ナノ粒子がそれらのポリペプチド搭載物を送達する能力を損なわずにリガンドを付加することによって達成することができる。これにより、特定の細胞、組織および器官への送達が可能になることが企図される。リガンドベースの送達系の標的化の特異性は、種々の細胞型上のリガンドレセプターの分布に基づく。標的化リガンドは、ナノ粒子と非共有結合的に会合してもよいし共有結合的に会合してもよく、本明細書中において論じられる種々の方法によってナノ粒子にコンジュゲート化することができる。
【０１３３】
ナノ粒子を標的化するために使用することができるタンパク質またはペプチドの例としては、トランスフェリン、ラクトフェリン、ＴＧＦ−β、神経成長因子、アルブミン、ＨＩＶ  Ｔａｔペプチド、ＲＧＤペプチドおよびインスリンならびにその他のものが挙げられる。
【０１３４】
本発明の第１および第２の医薬組成物は、医薬的に許容され得る担体とともに製剤化されることがある。好ましい実施形態において、その担体は、細胞の細胞質に融合タンパク質または組成物を直接送達することを可能にせず、すなわち、その担体は、標的細胞の原形質膜と融合することができない。本明細書中において使用されるとき、「担体」は、医薬組成物内の有効成分の送達および有効性を改善するように働く任意の物質のことを意味する。医薬的に許容され得る担体の例としては、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにそれらの組み合わせのうちの１つ以上が挙げられる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。医薬的に許容され得る担体は、医薬組成物の一部を形成する、融合タンパク質または組成物の有効期間または有効性を高める少量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤または緩衝剤をさらに含むことがある。適切な担体の例は、文献において周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５を参照のこと）。担体の例は、以下に限定されないが、一連の糖類、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトールおよびマルチトール；一連のデンプン、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプンおよびジャガイモデンプン；一連のセルロース、例えば、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシルプロピルメチルセルロース；および一連の充填剤、例えば、ゼラチンおよびポリビニルピロリドンである。場合によっては、崩壊剤、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムを加えてもよい。
【０１３５】
本発明の第１および第２の医薬組成物は、任意のタイプの哺乳動物、好ましくは、人間への投与に適している。
【０１３６】
本発明は、単なる例証であって本発明の範囲を限定するものではない以下の実施例を用いて、下記において詳述される。
【実施例】
【０１３７】
材料および方法
実施例１
富栄養培地または最少Ｍ９培地におけるＯｍｏｍｙｃ構築物の発現
富栄養培地においてＯｍｏｍｙｃを生成する場合、アンピシリンを含む１Ｌの２ＹＴ培地に、Ｏｍｏｍｙｃ−ｐＥＴ−３ａ構築物で形質転換されたＢＬ２１−ＡＩＴＭＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）化学的コンピテントＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を接種し、３７℃において２５０ｒｐｍで撹拌しながら、ＯＤ６００が０．８に達するまで生育させた。３７℃において１２時間インキュベートして、１０ｍＬのアラビノース溶液を用いてタンパク質発現を誘導した。あるいは、Ｍ９最少培地においてＯｍｏｍｙｃを生成する場合、Ｏｍｏｍｙｃ−ｐＥＴ３ａ構築物で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを、ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）とともにクロラムフェニコールおよびアンピシリンを含む１ＬのＭ９最少培地に接種し、３７℃において２５０ｒｐｍで撹拌しながら、ＯＤ６００が０．８に達するまで生育させた。１ｍＬのＩＰＴＧ１０００×溶液を用いてタンパク質発現を誘導した。細胞培養物を、３７℃において２５０ｒｐｍで撹拌しながら１２時間にわたってインキュベートした。
【０１３８】
細菌培養物を、２５０ｍＬのボトルを使用して、１０，０００ｒｐｍ、４℃において５分間、ＳＬＡ−１５００ローターにおいて遠心分離した。培養物を順次遠心分離して、ボトル１本に１Ｌに相当する培養物をまとめた。
【０１３９】
タンパク質発現の成功を検証するために、培養物から１ｍＬのアリコートを回収し、そのＯＤ６００を測定した。８００μＬの前記アリコートを１６，０６０×ｇにおいて１分間遠心し、上清を廃棄した。各サンプル中の等量の溶解細胞抽出物を確実にするため、およびタンパク質発現の前および後の細胞間の比較を容易にするために、ペレットを、（０．１×ＯＤ６００値）μＬに等しい体積のＩＢ  Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液に懸濁した。次いで、そのサンプルをボルテックスによって混合し、５秒間にわたって最大の力で超音波処理し、液体窒素中で凍結し、最後に２分間煮沸した（３回繰り返す）後、変性１６．５％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにローディングした。電気泳動の後、クマシーブルー染色またはウエスタンブロットを行った。封入体の可溶化を可能にするように、ならびに適切な泳動およびタンパク質分離を確実にしてＯｍｏｍｙｃの発現を可視化にするように、ＩＢ  Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を最適化した。
【０１４０】
実施例２
Ｏｍｏｍｙｃ  ｂ−ＨＬＨ−ＬＺの精製
細胞ペレットを、ペレット１グラムあたり３ｍＬの溶解緩衝液に、ボルテックスすることによって懸濁した。培養ペレット１グラムあたり１５０μＬのＴｒｉｔｏｎ溶液を加えた。超音波ホモジナイザーを使用して出力１５において６×１５秒にわたって氷上で超音波処理することによって、その懸濁液の粘度を低下させた。
【０１４１】
次いで、培養ペレット１ｇあたり１００μＬに相当する量のウシ膵ＤＮａｓｅ  Ｉを加えた後、３７℃において５０ｒｐｍで撹拌しながら６０分間インキュベーションした。サンプルを、１２，０００×ｇ（３５ｍＬの遠心分離用ボトルを使用する、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ  ５Ｂ  ＰｌｕｓにおけるＳＳ３４ローターでの１３，０００ｒｐｍ）、４℃において２０分間遠心分離して、封入体ならびに高分子量の複合物、例えば、細胞壁、リボソームおよび分解されなかったゲノムＤＮＡをペレットにした。脂質、可溶性タンパク質、アミノ酸、糖および核酸が、遠心分離後に廃棄された上清を構成する。
【０１４２】
ペレットになった封入体を、ボルテックスすることによって、１５ｍＬのＢｕｌｌクラッカー緩衝液（Ｂｕｌｌ  ｃｒａｃｋｅｒ  ｂｕｆｆｅｒ）パートＡに可溶化した。この酸性で高イオン強度の変性緩衝液は、封入体からのＯｍｏｍｙｃ構築物の完全な可溶化を可能にし、遠心分離による高分子量の複合物および残留ＤＮＡの除去を可能にする。
【０１４３】
封入体溶液をＢｕｌｌクラッカーパートＢで１：１に希釈した。その後、サンプルを、３０，０００×ｇ（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ  ５Ｂ  ＰｌｕｓにおけるＳＳ３４ローターでの１９，０００ｒｐｍ）、４℃において３０分間遠心分離した。
【０１４４】
ＦＰＬＣシステムにおいて直列に取り付けられた５ｍＬの５本の陽イオン交換カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＨｉＴｒａｐＴＭＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラムまたは等価物）における陽イオン交換クロマトグラフィーによって、上清を精製した。まず、カラムを、５ｍＬ／分の流速において２カラム体積（ＣＶ）のＦＰＬＣ緩衝液Ｂで洗浄した。次いで、そのカラムを、２．５ｍＬ／分の流速において５ＣＶ（１２５ｍＬ）のＦＰＬＣ緩衝液Ａと平衡化した。上清（１ロードあたり最大９ｇの培養ペレットに相当）を２．５ｍＬ／分でローディングした。上清をローディングした直後に、カラムを、２．５ｍＬ／分の流速において７５ｍＬ（３ＣＶ）のＵ８緩衝液で洗浄した。１ＣＶの緩衝液Ａで洗浄。次いで、そのカラムに３ＣＶの１０％緩衝液Ｂを加えた。Ｏｍｏｍｙｃの溶出を、２．５ｍＬの画分ずつ、２．５ｍＬ／分で、５０ｍＬにおける緩衝液Ｂの１０〜３５％というグラジエント（０．５％／ｍＬ）を用いて行った。これらの条件において、Ｏｍｏｍｙｃは、約１．５Ｍ  ＮａＣｌ（すなわち、約３０％ｖ／ｖのグラジエント）において９０％の純度で溶出した。
【０１４５】
純粋な構築物を含む画分をプールし、３．０ｍＬ／分の流速において、脱塩ＴＦＡ緩衝液と平衡化されたＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製の５本連続したＨｉＴｒａｐＴＭＤｅｓａｌｔｉｎｇカラム（または等価物）で脱塩した。プールされた画分を注入し（注入１回あたり７．５ｍＬの最大体積）、溶出をＯＤ２８０検出器で追跡した。当該タンパク質は、注入後の最初の１５ｍＬ以内に溶出した。低いＯＤ２８０値および高い伝導度を示すその後の画分は、廃棄した。この方法により、９８〜９９％の脱塩タンパク質の約９５％の回収率が可能だった。
【０１４６】
精製されたタンパク質は、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルターＵｌｔｒａｃｅｌ（登録商標）−３Ｋ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＴＭ）もしくは等価物における遠心分離または凍結乾燥のいずれかによって濃縮できる。Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａを使用する濃縮の場合、製造者の指示に従う。あるいは、凍結乾燥の場合は、脱塩された画分に５０％ｖ／ｖアセトニトリルを加え、液体窒素中で凍結し、凍結乾燥する。得られた泡沫状の凍結乾燥タンパク質を計量し、０．０５％ｖ／ｖ  ＴＦＡを含む５０％ｖ／ｖアセトニトリルにおいて１００μｌ／ｍｇに再度可溶化し、エッペンドルフ１本あたり１〜１０ｍｇに等分し、再度凍結乾燥することができる。
【０１４７】
収量は、富栄養培地における培養物１Ｌあたりおよそ２５ｍｇおよび最少Ｍ９培地における培養物１Ｌあたり１５ｍｇ。
【０１４８】
実施例３
ＯｍｏｍｙｃはＡ５４９細胞に形質導入する
本発明の著者らは、Ｏｍｏｍｙｃで治療された細胞が、非常に短い時間の後でさえ、Ｏｍｏｍｙｃがすでに核に到達すると示すことの証明を目標とした。
【０１４９】
Ｏｍｏｍｙｃの発現および精製を、実施例１および２に示されているように行った。
【０１５０】
Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ）を、３７℃の５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気において、１０％ウシ胎児血清が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。蛍光顕微鏡法に向けて、２０，０００個のＡ５４９細胞を、０．５インチのカバーガラス上に播種し、１６時間生育した。Ｏｍｏｍｙｃペプチド（３５μＭ）が補充された新鮮培地を加え、３７℃において２時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、３％パラホルムアルデヒドにおいて固定し、顕微鏡下で観察した。
【０１５１】
図１は、Ｏｍｏｍｙｃが、細胞膜を越えて形質導入して核に移動させるタンパク質形質導入ドメインとして機能できることを示している。
【０１５２】
実施例４
Ｏｍｏｍｙｃは、生存可能なＡ５４９細胞の数を減少させ、アポトーシスを誘導する
Ａ５４９細胞を、２４ウェルプレートにおいて７２時間にわたって１０μＭ  Ｍａｘ＊またはＯｍｏｍｙｃと共にインキュベートした。Ｍａｘ＊は、Ｍｏｎｔａｇｎｅ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｎｔａｇｎｅ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．２０１２．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，７（２）：ｅ３２１７２）に記載されているように得られた。細胞を回収し、製造者のプロトコル（Ｔａｌｉ（登録商標）Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｋｉｔ  Ａ１０７８８，Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってＡｎｎｅｘｉｎＶおよびＰＩで染色し、Ｔａｌｉ（登録商標）イメージベースサイトメーターを使用して、蛍光を定量した。
【０１５３】
この研究において、本発明の著者らは、Ｏｍｏｍｙｃが、生存可能なＡ５４９細胞の数の減少においてＭａｘのｂＨＬＨＺドメインよりも効率的であることを示す（図２ＡおよびＣ）。一貫して、死細胞／アポトーシス細胞のパーセンテージは、Ｍａｘ＊ペプチドによる治療よりもＯｍｏｍｙｃペプチドによる治療において高い（図２ＢおよびＤ）。
【０１５４】
実施例５
Ｏｍｏｍｙｃは、ｃ−Ｍｙｃ＊よりも折り畳まれ、Ｍａｘ＊およびｃ−Ｍｙｃ＊の両方よりも溶液中において熱的に安定である
熱的に安定なポリペプチドは、そのポリペプチドが医薬組成物として製剤化されなければならない状況において有益である。ゆえに、ＯｍｏｍｙｃおよびＭａｘ＊の相対的な熱安定性を測定した。
【０１５５】
Ｏｍｏｍｙｃ遺伝子を、実施例１に記載されているように発現させ、上記の実施例２におけるように精製した。Ｍａｘ＊の精製を、Ｂｅａｕｌｉｅｕ  Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，２０１３（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１０１２：７−２０）に詳細に記載されているように行った。簡潔には、ＢＬ２１−ＤＥ３−ｐＬｙｓ細菌を、Ｍａｘ＊インサートを含むｐＥＴ−３ａ発現ベクターで形質転換し、上に記載されたように培養した。ＩＰＴＧ（０．６ｍＭ）を用いて４時間、誘導を行い、その後、細胞を回収した。溶解緩衝液で溶解し、３００００×ｇにおいて遠心分離した後、可溶化されたタンパク質抽出物を、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製し、上に記載されたように脱塩した。精製され、凍結乾燥されたタンパク質を、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴに再懸濁した（ｐＨは、１Ｎ  ＫＯＨまたは１Ｎ  ＨＣｌを使用して調整した）。
【０１５６】
円偏光二色性測定を、３２μＭのタンパク質濃度を使用して、Ｂｅａｕｌｉｅｕ  Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，２０１２（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ，２５（７）：４１４−２６）に記載されているように行った。ＣＤスペクトルを２０℃において記録し、１℃／分において熱変性を行って（図３Ａおよび３Ｂ）、タンパク質のらせんの含有量（折り畳まれ、構築された状態を反映する）を測定するために、２２２ｎｍの波長においてモニターした。
【０１５７】
実施例６
Ｏｍｏｍｙｃは、Ｍａｘ＊よりも効率的に細胞の核を透過する
簡潔には、精製されたＯｍｏｍｙｃおよびＭａｘ＊ペプチドを、操作されたＣ末端のシステイン残基を介してフルオレセイン−マレイミド（ＦＩＴＣ）で標識した。精製し、タンパク質分子１つあたり単一の蛍光標識の存在を質量分析により評価した後、種々の濃度のタンパク質（５μＭ、１０μＭまたは２５μＭ）を、０．５％血清を含むＲＰＭＩ中で培養されたＡ５４９細胞（Ｋ−Ｒａｓ変異肺腺癌）に加え、３７℃において２時間インキュベートした後、ＰＢＳで３回洗浄し、４％ＰＦＡにおいて１０分間固定し、１．５μｇ／ｍＬ  Ｈｏｅｃｈｓｔで１０分間染色し、顕微鏡スライド上にマウントした。共焦点顕微鏡像は、Ｏｍｏｍｙｃが、５、１０および２５μＭの濃度においてＭａｘ＊よりも効率的にＡ５４９細胞の核を透過することを示した（データ示さず）。核の蛍光強度を、ＩｍａｇｅＪを使用し、像１つあたり３０〜８０個の細胞をカウントして定量した。固定されたＡ５４９細胞においてＯｍｏｍｙｃおよびＭａｘ＊について観察された細胞透過の定量を図４に示す。
【０１５８】
Ｍａｘ＊よりも優れたＯｍｏｍｙｃの細胞透過能を、２０分間のインキュベーションの後に、生細胞において（固定の潜在的なアーチファクトを回避するために）２０μＭの濃度で確かめた。簡潔には、ＦＩＴＣで標識されたＯｍｏｍｙｃおよびＭａｘ＊を、０．５％血清を含むＲＰＭＩ中のＡ５４９培養細胞に加え、３７℃において２０分間インキュベートした後、ＰＢＳにおいて３回洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ含有マウント培地を用いてマウントした。共焦点顕微鏡像は、Ｏｍｏｍｙｃが、２０μＭにおいてＭａｘ＊よりも効率的にＡ５４９生細胞の核を透過することを示した（データ示さず）。核の蛍光強度を、ＩｍａｇｅＪを使用し、像１つあたり３０〜８０個の細胞をカウントして定量した。Ａ５４９生細胞においてＯｍｏｍｙｃおよびＭａｘ＊について観察された細胞透過の定量を図５に示す。
【０１５９】
実施例７
Ｏｍｏｍｙｃの進入は、ＡＴＰ依存的方法によって生じる
Ｍａｘ＊は、温度を４℃に低下させると阻止することができるＡＴＰ依存的方法によって、細胞を透過すると示された。類似のメカニズムが、Ｏｍｏｍｙｃの細胞透過能に関わる。Ａ５４９細胞を、２０μＭ  ＦＩＴＣ標識ペプチドと共に４℃において２時間インキュベートし、４％ＰＦＡで固定した後、ＰＢＳで３回洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ含有マウント培地を用いて顕微鏡スライド上にマウントした。共焦点顕微鏡像は、温度を４℃に低下させるとＯｍｏｍｙｃの進入を阻止することができることを示した。
【０１６０】
実施例８
Ｏｍｏｍｙｃは、Ｍａｘ＊よりも効率的に細胞の総数を減少させる
簡潔には、Ａ５４９およびＨ１６５０肺腺癌細胞を、５％血清を含むＲＰＭＩ中において２５μＭ  ＯｍｏｍｙｃまたはＭａｘ＊ペプチドと共にインキュベートし、示された時点（２日後または４日後）において４％ＰＦＡで固定した後、クリスタルバイオレット染色（１０分間にわたる２５％メタノール中の０．５％クリスタルバイオレット）を行い、水で少なくとも３回洗浄した。ＯｍｏｍｙｃおよびＭａｘ＊の両方が、細胞の成長を妨げるが、Ｏｍｏｍｙｃが、細胞の成長において、より効率的である（図６）。クリスタルバイオレットで染色された細胞を、１０％酢酸に溶解し、得られた溶液を、Ｈ２Ｏｄｄにおいて１：４希釈し、ＯＤ５９５における吸光度を測定することによって定量した。クリスタルバイオレットによる増殖の阻害の定量は、６日間にわたって２５μＭの濃度において使用されたとき、Ｈ１６５０細胞（ＥＧＦＲ変異肺腺癌細胞）の増殖を減少させるのに、ＯｍｏｍｙｃがＭａｘ＊よりも明らかに効率的であることを示した（図７）。
【０１６１】
ＯｍｏｍｙｃおよびＭａｘのＩＣ５０を計算するために、Ａ５４９細胞を、５％血清を含む培養液において、示されたペプチド濃度で処理し、上に記載されたようにクリスタルバイオレットで染色した。定量は、上に記載されたように行った。図８は、ＯｍｏｍｙｃがＭａｘ＊よりも低いＩＣ５０を有する（すなわち、Ｏｍｏｍｙｃは、細胞の数を半数まで減少させるために、Ｍａｘ＊と比べてより低い用量を必要とする）ことを示している、Ｏｍｏｍｙｃ対Ｍａｘ＊に対するＡ５４９細胞の用量反応を示している。詳細には、Ｏｍｏｍｙｃに対するＩＣ５０は、１．２μＭであり、Ｍａｘ＊に対するＩＣ５０は、２．６μＭである。
【０１６２】
細胞の増殖に対するＯｍｏｍｙｃの効果を、Ｕ８７神経膠腫細胞においてアッセイした。Ｕ８７神経膠腫細胞を、５％血清を含むＤＭＥＭ中において、ＯｍｏｍｙｃまたはＭａｘ＊ペプチド（２５μＭ最終濃度）と共に４８時間インキュベートした。細胞をトリプシン処理し、Ｔａｌｉセルカウンター（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いて計数した。図９は、Ｏｍｏｍｙｃが、Ｕ８７神経膠腫細胞の増殖をＭａｘ＊よりも効率的に減少させることを示している。
【０１６３】
実施例９
Ｏｍｏｍｙｃは鼻腔内投与後に肺および脳組織に効率的に到達する
動物を、鼻腔内投与によって、単回用量の３７．５ｍｇ／ｋｇのＯｍｏｍｙｃで治療するかまたは治療せずに（ＰＢＳで治療して）放置した。鼻腔内投与の１０分後、蛍光ペプチドを検出した。治療された動物の肺には、Ｏｍｏｍｙｃ局在化の結果として蛍光が出現する（図１０Ａ）。これは、Ｏｍｏｍｙｃペプチドを鼻腔内滴下によって動物に投与できること、およびそのペプチドが肺に効率的に到達することを証明する。先の図に記載された同じ動物の脳にもまた、蛍光が出現する（図１０Ｂ）。蛍光Ｏｍｏｍｙｃペプチドが、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して、脳に到達できることが明らかである。
【０１６４】
実施例１０
Ｏｍｏｍｙｃペプチドはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて治療効果を有する
Ｏｍｏｍｙｃは、ペプチドとして鼻腔内に投与されたとき、ＫＲａｓによってもたらされる肺腺癌マウスモデルにおける増殖を減少させる。本発明者らは、ＫＲａｓによってもたらされる腫瘍形成のマウスモデル（ＬＳＬＫＲａｓＧ１２Ｄモデル）を利用した。簡潔には、８週齢のマウスに、ＡｄｅｎｏＣｒｅウイルスを滴下注入することにより、ＫＲａｓ−Ｇ１２Ｄ変異体タンパク質の発現を肺において特異的に誘導した。それらのマウスが、肺腺癌を発症したら（感染の１８週間後）、それらの動物を、３日間にわたって毎日、Ｏｍｏｍｙｃペプチド（３５μＬ体積において１５ｍｇ／ｋｇ）で鼻腔内において治療した。Ｏｍｏｍｙｃは、腫瘍の増殖速度を低下させ（Ｋｉ６７染色；図１１Ａ）、細胞密度も低下させた（図１１Ｂ）。
【０１６５】
Ｏｍｏｍｙｃペプチドは、治療の１週間後にｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍量も減少させる。先に記載されたものと同じマウスモデルおよび実験条件を使用して、動物を、１週間にわたって毎日、１５ｍｇ／ｋｇのペプチドで治療した。％腫瘍面積を、ＩｍａｇｅＪを使用して測定した。図１２は、Ｏｍｏｍｙｃが、ＫＲａｓによってもたらされる肺腺癌マウスモデルにおいて腫瘍量を減少させることを示している。
【図１】
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【図２ＡＢ】
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【図２ＣＤ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月25日(2019.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を予防および／または治療するための、配列番号１からなるポリペプチド、または、配列番号１に対して９０％超のアミノ酸配列同一性を示す、その機能的に等価なバリアントからなる、Ｏｍｏｍｙｃとしての機能を保持するポリペプチドと、
医薬的に許容され得る担体と
を含んでなる医薬組成物。
【請求項２】
前記バリアントが、配列番号１からなるポリペプチドに対する１つ以上のアミノ酸の挿入もしくは付加、および／または配列番号１からなるポリペプチドに対する１つ以上のアミノ酸の欠失、および／または配列番号１からなるポリペプチドに対する１つ以上のアミノ酸の保存的置換から生じるポリペプチドである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
（ｉ）配列番号１からなるポリペプチド、または配列番号１に対して９０％超のアミノ酸配列同一性を示す、その機能的に等価なバリアントからなる、Ｏｍｏｍｙｃとしての機能を保持するポリペプチド、および
（ｉｉ）前記ポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントの細胞取り込みを促進する化学的部分
を含んでなる、コンジュゲートであって、
前記ポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントの細胞取り込みを促進する化学的部分が細胞透過ペプチドであり、当該細胞透過ペプチドおよび前記ポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントが融合タンパク質を形成する、コンジュゲート。
【請求項４】
核局在化シグナルをさらに含んでなる、請求項３に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記核局在化シグナルが、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３９）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号５０）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号４０）からなる群より選択されるものである、請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
医薬的に活性な量の請求項３から５のいずれか一項に記載のコンジュゲートおよび医薬的に許容され得る賦形剤を含んでなる、医薬組成物。
【請求項７】
医薬として用いられる、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
癌を予防および／または治療するための、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
コンジュゲートが投与されて用いられる、請求項６から８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
（ｉ）配列番号１からなるポリペプチド、配列番号１に対して９０％超のアミノ酸配列同一性を示す、その機能的に等価なバリアントからなる、Ｏｍｏｍｙｃとしての機能を保持するポリペプチド、または請求項３から５のいずれか一項に記載のコンジュゲート、および
（ｉｉ）抗腫瘍剤
を共にまたは別々に含んでなる、組成物。
【請求項１１】
前記抗腫瘍剤が、細胞傷害剤、抗血管新生剤および抗転移剤からなる群より選択されるものである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
医薬的に活性な量の請求項１０または１１に記載の組成物および医薬的に許容され得る賦形剤を含んでなる、医薬組成物。
【請求項１３】
医薬として用いられる、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
癌を予防および／または治療するための、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
配列番号１からなるポリペプチド、配列番号１に対して９０％超のアミノ酸配列同一性を示す、その機能的に等価なバリアントからなる、Ｏｍｏｍｙｃとしての機能を保持するポリペプチド、または前記コンジュゲートが投与されて用いられる、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。