(57)【要約】      （修正有）【課題】ファージ受容体が不活性化された、Ｌ−アミノ酸を生産するエシェリキア属組換え微生物の提供。【解決手段】微生物のファージ受容体の活性を不活性化させることにより、Ｌ−アミノ酸の生産能が向上した組換え微生物、及びそれを利用するＬ−アミノ酸を生産する方法を提供し、該組換え微生物を利用して、高い効率でＬ−アミノ酸を生産することが可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮｆｒＡ、ＮｆｒＢ、またはＮｆｒＡ及びＮｆｒＢの活性が不活性化された、Ｌ−アミノ酸を生産するエシェリキア属組換え微生物。
【請求項２】
前記ＮｆｒＡは、配列番号４０のアミノ酸配列を含み、前記ＮｆｒＢは、配列番号４２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のＬ−アミノ酸を生産するエシェリキア属組換え微生物。
【請求項３】
前記微生物は、Ｔｓｘ、ＦｈｕＡ、またはＴｓｘ及びＦｈｕＡの活性が追加して不活性化されたことを特徴とする、請求項１に記載のＬ−アミノ酸を生産するエシェリキア属組換え微生物。
【請求項４】
前記Ｔｓｘは、配列番号４５のアミノ酸配列を含み、前記ＦｈｕＡは、配列番号４７のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項３に記載のＬ−アミノ酸を生産するエシェリキア属組換え微生物。
【請求項５】
前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−トレオニンまたはＬ−トリプトファンであることを特徴とする、請求項１に記載のＬ−アミノ酸を生産するエシェリキア属組換え微生物。
【請求項６】
前記組換え微生物は、大腸菌であることを特徴とする、請求項１に記載のＬ−アミノ酸を生産するエシェリキア属組換え微生物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換え微生物を培養する段階と、
培養物からＬ−アミノ酸を回収する段階と、
を含む、Ｌ−アミノ酸を生産する方法。
【請求項８】
前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−トレオニンまたはＬ−トリプトファンであることを特徴とする、請求項７に記載のＬ−アミノ酸を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−アミノ酸を生産する組換え微生物、及び前記組換え微生物を利用したＬ−アミノ酸を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸など有用産物の量産のために、微生物を利用した多様な発酵方法が利用されており、かような微生物を利用した成功に至る発酵のために、菌株開発、発酵条件確立など、多様な技術が開発されてきた。特に、有用産物の量産のための宿主菌株開発のために、特定遺伝子の過発現または低発現を誘導する多くの試みが行われている。
【０００３】
一方、バクテリアを利用した発酵生産において、ファージ（phage）の汚染によって、有用産物の生産が低下する。ファージの汚染は、主にファージ受容体（phage receptor）を介して行われるが、ファージ受容体とは、ファージがバクテリア表面に付着することができるタンパク質、脂質多糖体などを意味する。大腸菌の場合、多様なファージによって攻撃を受け、それぞれのファージに対する受容体も研究が比較的良好になされている。しかし、ファージ受容体とＬ−アミノ酸生産性との関係については、十分な研究が進められていない実情である。
【０００４】
そのために、本発明者らは、大腸菌の弱みのうち一つである、ファージ汚染によるＬ−アミノ酸生産の低下という危険性を減らすために、ファージ受容体として周知の遺伝子を選択し、それぞれを不活性化させた後、それによるＬ−アミノ酸生産性に対する影響を確認することにより、それをＬ−アミノ酸生産菌株に適用し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、ファージ受容体が不活性化された、Ｌ−アミノ酸を生産するエシェリキア属組換え微生物を提供するものである。
【０００６】
本発明が解決しようとする課題はまた、前記微生物を利用したＬ−アミノ酸を生産する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一様相は、ＮｆｒＡ、ＮｆｒＢ、またはＮｆｒＡ及びＮｆｒＢの活性が不活性化された、Ｌ−アミノ酸を生産する組換え微生物を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
一様相によるタンパク質ＮｆｒＡ、タンパク質ＮｆｒＢ、タンパク質Ｔｓｘ、タンパク質ＦｈｕＡからなる群から選択される１以上のタンパク質の活性が除去されるか低下された微生物は、Ｌ−アミノ酸生産のために利用される。
【０００９】
他の様相によるＬ−アミノ酸生産用組成物、またはＬ−アミノ酸を生産する方法によれば、Ｌ−アミノ酸を効率的に生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
一様相は、ＮｆｒＡ、ＮｆｒＢ、またはＮｆｒＡ及びＮｆｒＢの活性が不活性化された、Ｌ−アミノ酸を生産する組換え微生物を提供する。
【００１１】
本明細書の用語「ＮｆｒＡ」は、バクテリオファージＮ４（bacteriophage Ｎ４）の受容体を構成するものであり、それは、バクテリアの細胞膜タンパク質でもあり、例えば、外膜（outer membrane）タンパク質の構成単位（subunit）でもある。前記タンパク質ＮｆｒＡは、例えば、配列番号４０のアミノ酸配列を含んでもよい。前記ＮｆｒＡは、例えば、配列番号４０のアミノ酸配列、またはそれと相同性が、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上であるアミノ酸配列を有するものでもある。前記タンパク質ＮｆｒＡを暗号化する遺伝子配列は、前記配列番号４０のアミノ酸を暗号化するポリヌクレオチド配列を含んでもよい。前記タンパク質ＮｆｒＡを暗号化する遺伝子配列は、例えば、ｎｆｒＡ遺伝子（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２９３０８９６）配列でもあり、例えば、配列番号３９のポリヌクレオチド配列、またはそれと相同性が、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上であるポリヌクレオチド配列を有することができる。
【００１２】
用語「ＮｆｒＢ」は、バクテリオファージＮ４（bacteriophage Ｎ４）の受容体を構成するものであり、それは、バクテリアの細胞膜タンパク質でもあり、例えば、内膜（inner membrane）タンパク質の構成単位（subunit）でもある。前記ＮｆｒＢは、例えば、配列番号４２のアミノ酸配列を含んでもよい。前記ＮｆｒＢは、例えば、配列番号４２のアミノ酸配列、またはそれと相同性が、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上であるアミノ酸配列を有するものでもある。前記タンパク質ＮｆｒＢを暗号化する遺伝子配列は、前記配列番号４２のアミノ酸を暗号化するポリヌクレオチド配列を含んでもよい。前記タンパク質ＮｆｒＢを暗号化する遺伝子配列は、例えば、ｎｆｒＢ遺伝子（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２９３３９４３）配列でもあり、例えば、配列番号４１のポリヌクレオチド配列、またはそれと相同性が、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上であるポリヌクレオチド配列を有することができる。
【００１３】
また、前記Ｌ−アミノ酸を生産する組換え微生物は、ＮｆｒＡ、ＮｆｒＢ、またはＮｆｒＡ及びＮｆｒＢの活性が不活性化された微生物において、Ｔｓｘ、ＦｈｕＡ、またはＴｓｘ及びＦｈｕＡの活性が追加して不活性化されたものでもある。
【００１４】
用語「Ｔｓｘ」は、ヌクレオシドチャネル（nucleoside channel）、すなわち、ヌクレオシドに特異的であるチャネルを構成するものであり、ファージＴ６及びコリシンＫ（colicin Ｋ）の受容体を構成することができる。前記Ｔｓｘは、例えば、配列番号４５のアミノ酸配列、またはそれと相同性が、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上であるアミノ酸配列を含んでもよい。前記タンパク質Ｔｓｘを暗号化する遺伝子配列は、前記配列番号４５のアミノ酸を暗号化するポリヌクレオチド配列を含んでもよい。例えば、前記タンパク質Ｔｓｘを暗号化する遺伝子配列は、ｔｓｘ遺伝子（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２９３４１８８）配列でもあり、配列番号４４のポリヌクレオチド配列、またはそれと相同性が、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上であるポリヌクレオチド配列を有することができる。
【００１５】
用語「ＦｈｕＡ」は、バクテリアの外膜タンパク質において、（Ｆｅ３＋）フェリクローム、またはアルボマイシン（albomycin）及びリファマイシン（rifamycin）のような抗生物質を輸送するような多くの機能を行うタンパク質であり、ファージＴ１，Ｔ５及びファイ８０（phi８０）の受容体でもある。前記ＦｈｕＡは、例えば、配列番号４７のアミノ酸配列、またはそれと相同性が、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上であるアミノ酸配列を含んでもよい。前記タンパク質ＦｈｕＡを暗号化する遺伝子配列は、前記配列番号４７のアミノ酸を暗号化するポリヌクレオチド配列を含んでもよい。前記タンパク質ＦｈｕＡを暗号化する遺伝子配列は、例えば、ｆｈｕＡ遺伝子配列（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２９３０７５１）でもあり、配列番号４７のポリヌクレオチド配列、またはそれと相同性が、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上であるポリヌクレオチド配列を有することができる。
【００１６】
用語「相同性」は、２つのアミノ酸配列間の同一性を示すものであり、点数（score）、同一性（identity）及び類似度（similarity）のような媒介変数（parameter）を計算するＢＬＡＳＴ ２．０を利用する、当業者に周知の方法で決定される。
【００１７】
用語「組換え微生物（recombinant microorganism）」は、遺伝的に操作された微生物でもある。遺伝工学によって製造された微生物、例えば、遺伝工学方法によって微生物内に外因性（exogenous）核酸が導入されたり、微生物の内因性（endogenous）遺伝子の配列または位置が変形されたものでもある。
【００１８】
用語「Ｌ−アミノ酸」は、一般的に、アミノ基とカルボン酸基とが同一炭素原子に結合されている生物の本体を構成するタンパク質の基本構成単位を意味する。例えば、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−リシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−トリプトファン及びＬ−メチオニンから構成された群から選択され、例えば、Ｌ−トリプトファンまたはＬ−トレオニンでもある。
【００１９】
本明細書で使用された用語、酵素またはポリペプチドの「不活性化」は、微生物中の言及されたタンパク質が全く発現されないか、あるいは発現されたとしても、全く活性を有さないこと、または内在的活性に比べて弱化されたことを意味する。用語「内在的活性」とは、微生物が天然の状態、すなわち、微生物が本来有していた、遺伝子変形を経ないタンパク質の活性を意味する。
【００２０】
前記タンパク質ＮｆｒＡ、タンパク質ＮｆｒＢ、タンパク質Ｔｓｘ、タンパク質ＦｈｕＡの活性が不活性化されるということは、前記タンパク質を暗号化する各遺伝子の変異、除去または破壊によるものでもある。前記「遺伝子の変異、除去または破壊」は、遺伝子が発現されないか、あるいは発現量が減少したり、発現したとしても、酵素活性を示さないか、活性が低下したりするように、遺伝子の一部または全部が、またはそのプローモーター、そのターミネーター領域などの調節因子の一部または全部が、変異、置換、削除されるか、あるいは遺伝子に１以上の塩基が挿入されることをいう。前記「遺伝子の除去または破壊」は、相同組換えのような遺伝子操作、突然変異誘発、分子進化を介して達成される。細胞が複数個の同じ遺伝子を含むか、あるいは２個以上の異なるポリペプチド同種相同遺伝子（paralog）を含む場合、１またはそれ以上の遺伝子が除去または破壊される。本発明の一具体例において、本発明が提示した遺伝子を不活性化させるために、ラムダレッド組換え酵素を利用した突然変異作製技法を使用することができる。
【００２１】
前記組換え微生物は、本発明で提示したタンパク質の活性を、それぞれまたは組み合わせて除去したり低下させたりすることにより、活性が不活性化される前より、Ｌ−アミノ酸生産性が向上し、Ｌ−アミノ酸生産用途で望ましく使用される。
【００２２】
前記組換え微生物は、エセルキア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterbacter）属、オウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、プロビデンシア（Providencia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属及びブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物でもある。例えば、エセルキア属に属する微生物でもある。前記エセルキア属微生物は、大腸菌（Escherichia coli）でもあり、例えば、大腸菌ＫＣＣＭ１１５０１Ｐでもある。前記大腸菌ＫＣＣＭ１１５０１Ｐは、トレオニン生産菌株であるＫＣＣＭ１０９１０Ｐを親菌株にして、ｎｆｒＡ遺伝子及びｎｆｒＢ遺伝子をいずれも欠損させた菌株（ＫＣＣＭ１０９１０ＰΔｎｆｒＡＢ）であり、親菌株ＫＣＣＭ１０９１０Ｐ対比で、糖消費能が上昇するということを確認した。前記菌株を「ＣＡ０３−８２５３Ｐ」と命名した後、ブダペスト条約下で、２０１３年１２月１３日付けで、韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託し、寄託番号ＫＣＣＭ１１５０１Ｐを受けた。
【００２３】
他の様相は、前記Ｌ−アミノ酸を生産する組換え微生物を培養する段階と、培養物からＬ−アミノ酸を回収する段階と、を含む、Ｌ−アミノ酸を生産する方法を提供する。
【００２４】
前記Ｌ−アミノ酸を生産する組換え微生物については、前述の通りである。
【００２５】
前記Ｌ−アミノ酸は、例えば、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−リシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−トリプトファン及びＬ−メチオニンから構成された群から選択され、例えば、Ｌ−トレオニンまたはＬ−トリプトファンでもある。前記培養は、当業界に知られた適当な培地及び培養条件によってなされる。当業者であるならば、選択される微生物によって、培地及び培養条件を容易に調整して使用することができるであろう。培養方法は、回分式、連続式、流加式、またはそれらの組み合わせ培養を含んでもよい。
【００２６】
前記培地は、多様な炭素源、窒素源及び微量元素成分を含んでもよい。
【００２７】
前記炭素源は、例えば、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、果糖、マルトース、澱粉、セルロースのような炭水化物；大豆油、ひまわり油、ひまし油、ココナッツ油のような脂肪；パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸；グリセロール及びエタノールのようなアルコール；酢酸のような有機酸；またはそれらの組み合わせを含んでもよい。前記培養は、グルコースを炭素源にして行われる。前記窒素源は、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、とうもろこし浸漬液（ＣＳＬ）及び大豆ミールのような有機窒素源；尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源；またはそれらの組み合わせを含んでもよい。前記培地は、リンの供給源であり、例えば、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、及び相応するナトリウム含有塩、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含んでもよい。また、アミノ酸、ビタミン、及び適切な前駆体などが培地に含まれてもよい。前記培地または個別成分は、培養液に回分式または連続式で添加される。
【００２８】
また、培養中に、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化合物を、微生物培養液に適切な方式で添加し、培養液のｐＨを調整することができる。また、培養中に、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用し、気泡生成を抑制することができる。培養液の好気状態を維持するために、培養液内に、酸素または酸素含有ガス（例えば、空気）を注入することができる。培養液の温度は、一般的に２０℃ないし４５℃でもある。培養期間は、所望のＬ−アミノ酸の生成量が得られるまで持続することができ、例えば、１０ないし１６０時間でもある。
【００２９】
用語「培養物」は、前記組換え微生物を含んだ培養原液でもあり、菌体を除去した培養上澄み液または培養物の希釈液でもある。前記組成物は、Ｌ−アミノ酸の生産性を向上させるための成分を追加して含んでもよい。例えば、炭素源、窒素源、または微量の元素成分を含んでもよい。
【００３０】
前記培養物から、Ｌ−アミノ酸を回収する方法は、培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式の培養方法などにより、当該分野に公知の適する方法を利用して、培養物から生産されたＬ−アミノ酸を収集または回収することができる。
【００３１】
以下、本発明について、実施例によってさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例によって制限されるものではない。
【実施例】
【００３２】
実施例１．ＫＣＣＭ１０９１０Ｐ基盤ファージ受容体が不活性化されたトレオニン生産菌株の作製
ファージ受容体が不活性化されたトレオニン生産菌株を作製するために、親菌株として、ＫＣＣＭ１０９１０Ｐ（韓国登録特許第１０−０９６６３２４号）を使用し、各ファージ受容体に係わる遺伝子の不活性化用カセットを作製して形質転換を行った。
【００３３】
１−１．ｎｆｒＡ遺伝子が不活性化されたトレオニン菌株作製
ｎｆｒＡ遺伝子が不活性化された菌株作製のために、ｎｆｒＡ不活性化用カセットを作製した。該カセットは、Datsenko ＫＡらが開発したラムダレッド組換え酵素（lambda Red recombinase）を利用した突然変異作製技法である１段階不活性化（one step inactivation）方法を使用したものであり（Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97: 6640-6645）、遺伝子内部への挿入を確認するためのマーカーとしては、ｐＵＣｐｒｍｆｍｌｏｘＣのクロラムフェニコール（Chloramphenicol）遺伝子を使用した（大韓民国公開特許：２００９−００７５５４）。
【００３４】
ｎｆｒＡ遺伝子（配列番号３９）の一部分、及びｐＵＣｐｒｍｆｍｌｏｘＣ遺伝子のクロラムフェニコール耐性遺伝子の一部の塩基配列を有するＤＮＡを得るために、配列番号２と３のプライマーを利用して、約１．１ｋｂ ＤＮＡ断片を得た。そのために、ＰＣＲ premix kit（BIONEER社製、以下、同一である）を使用して、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ：polymerase chain reaction）を行い、条件は、９５℃で３０秒の変性（denaturation）、５６℃で３０秒のアニーリング（annealing）、及び７２℃で１分の伸張（elongation）からなるサイクルを２７回反復遂行した。前記ＰＣＲ結果物を、０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、溶離させて得て、それをテンプレートとして、配列番号１と４とのプライマーを利用して、前述のような条件でＰＣＲを行い、約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を得て、それを０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、溶離させて得て、最終的にｎｆｒＡ不活性化カセットを作製した。
【００３５】
ｎｆｒＡが不活性化されたトレオニン菌株を作製するために、Datsenko ＫＡらが開発した方法（Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97: 6640-6645）によって、ｐＫＤ４６で形質転換された対象トレオニン生産菌株ＫＣＣＭ１０９１０Ｐを、コンピテントな状態で製造した後、前記獲得されたｎｆｒＡ不活性化カセットＤＮＡを導入して形質転換させた。
【００３６】
得られた菌株は、クロラムフェニコール耐性を有しているＬＢプレートで選別した。それは、ゲノム上の不活性化カセットのｎｆｒＡ相同配列両側外側のＤＮＡ配列を有する配列番号５と６とのプライマーを利用して、ＰＣＲ結果物のサイズが２．８ｋｂから１．５ｋｂに小さくなるコロニーを選別した。
【００３７】
クロラムフェニコール耐性を有した一次組換え菌株は、ｐＫＤ４６を除去した後、ｐＪＷ１６８を導入し、クロラムフェニコールマーカー遺伝子を菌体から除去する（Gene, (2000) 247, 255-264）。最終菌株は、プライマー５と６とを利用したＰＣＲを介して得られたＤＮＡの結果物が、０．４ｋｂにサイズが小さくなることを確認して作製された。これを介して、ｎｆｒＡ遺伝子が不活性化されたＬ−トレオニン生産菌株、ＫＣＣＭ１０９１０ＰΔｎｆｒＡを作製した。
【００３８】
１−２．ｎｆｒＢ遺伝子が不活性化されたトレオニン菌株の作製
ｎｆｒＢ（配列番号４１）遺伝子が不活性化された菌株を作製するために、ｎｆｒＢ不活性化用カセットを作製した。ｎｆｒＢ不活性化用カセットは、前記実施例１−１のｎｆｒＡ不活性化カセット作製のような方法によって作製され、配列番号８，９のプライマーを利用して、約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を得て、配列番号７，１０を利用して、約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を作製した。
【００３９】
ｎｆｒＢが不活性化されたトレオニン菌株の作製方法は、前記実施例１−１と同一方法によって行われ、配列番号１１と１２とのプライマーを利用して、ＰＣＲ結果物のサイズを確認し、ｎｆｒＢが不活性化されたＬ−トレオニン生産菌株、ＫＣＣＭ１０９１０ＰΔｎｆｒＢを作製した。
【００４０】
１−３．ｎｆｒＡＢ遺伝子が不活性化されたトレオニン菌株の作製
ｎｆｒＡＢ（配列番号４３）遺伝子が不活性化された菌株の作製のために、前記１−１において記述されたｎｆｒＡ不活性化カセット作製のような方法で、ｎｆｒＡＢ不活性化用カセットを作製した。使用プライマーとして、配列番号２，９を利用して、約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を得て、配列番号１，１０を利用して、約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を作製した。
【００４１】
ｎｆｒＡＢが不活性化されたトレオニン菌株の作製方法は、前記実施例１−１と同一方法によって行われ、配列番号５と１２とのプライマーを利用して、ＰＣＲ結果物のサイズを確認し、最終的に、ｎｆｒＡＢが不活性化されたＬ−トレオニン生産菌株ＫＣＣＭ１０９１０ＰΔｎｆｒＡＢを作製した。
【００４２】
１−４．ｔｓｘ遺伝子が不活性化されたトレオニン菌株の作製
ｔｓｘ（配列番号４４）遺伝子が不活性化された菌株を作製するために、前記１−１において記述されたｎｆｒＡ不活性化カセット作製のような方法で、ｔｓｘ不活性化用カセットを作製した。使用プライマーは、配列番号１３，１４を利用して、約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を得て、配列番号１５，１６を利用して、約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を作製した。
【００４３】
ｔｓｘが不活性化されたトレオニン菌株の作製方法は、前記実施例１−１と同一方法によって行われ、配列番号１７と１８とのプライマーを利用して、ＰＣＲ結果物のサイズを確認し、最終的に、Ｌ−トレオニン生産菌株ＫＣＣＭ１０９１０ＰΔｔｓｘを作製した。
【００４４】
１−５．ｆｈｕＡ遺伝子が不活性化されたトレオニン菌株の作製
ｆｈｕＡ（配列番号４６）遺伝子が不活性化された菌株を作製するために、ｆｈｕＡ不活性化用カセットを作製した。該カセットは、前記記述された技法である１段階不活性化（one step inactivation）方法を利用するように作製され、ｆｈｕＡと相同性を有する塩基配列のＤＮＡ断片を得るために、それぞれ配列番号１９及び２０、配列番号２１及び２２を利用して、ＰＣＲ結果物を得た。また、クロラムフェニコール耐性を有する塩基配列を含むＤＮＡ断片を獲得するために、配列番号２３と２４とを利用して、ＰＣＲ結果物を得た。そのようにして得た３つのＰＣＲ結果物を、０．８％アガロースゲル（agarose gel）で電気泳動した後、溶離させて得て、該３つの結果物をテンプレートにして、配列番号１９と２２とを使用してＰＣＲを行い、ｆｈｕＡ不活性化カセットを作製した。
【００４５】
ｆｈｕＡが不活性化されたトレオニン菌株を作製するために、前記実施例１−１と同一方法によって行われ、配列番号２５と２６とのプライマーを利用して、ＰＣＲ結果物のサイズを確認し、最終的に、ｆｈｕＡが不活性化されたＬ−トレオニン生産菌株ＫＣＣＭ１０９１０ＰΔｆｈｕＡを作製した。
【００４６】
１−６．ｌａｍＢ遺伝子が不活性化されたトレオニン菌株の作製
ｌａｍＢ遺伝子（配列番号４８）が不活性化された菌株を作製するために、前記実施例１−１で記述された方法で、配列番号２７，２８を利用して、約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を得て、配列番号２９，３０を利用して、約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を作製した。
【００４７】
ｌａｍＢが不活性化されたトレオニン菌株の作製方法は、前記実施例１−１において記述された方法と同一方法によってなり、配列番号３１と３２とのプライマーを利用して、ＰＣＲ結果物のサイズを確認し、最終的に、ｌａｍＢが不活性化されたＬ−トレオニン生産菌株ＫＣＣＭ１０９１０ＰΔｌａｍＢを作製した。
【００４８】
１−７．ｂｔｕＢ遺伝子が不活性化されたトレオニン菌株の作製
ｂｔｕＢ遺伝子（配列番号５０）が不活性化された菌株作製のために、前記実施例１−１で記述された方法で、ｂｔｕＢ不活性化用カセットを作製した。使用プライマーは、配列番号３３，３４を利用して、約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を得て、配列番号３５，３６を利用して、約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を作製した。
【００４９】
ｂｔｕＢが不活性化されたトレオニン菌株を作製するために、トレオニン菌株の作製方法は、前記実施例１−１において記述された方法と同一方法によって行われ、配列番号３７と３８とのプライマーを利用して、ＰＣＲ結果物のサイズを確認し、最終的に、ｂｔｕＢが不活性化されたＬ−トレオニン生産菌株ＫＣＣＭ１０９１０ＰΔｂｔｕＢを作製した。
【００５０】
実施例２．組換え微生物のＬ−トレオニン生産性比較
前記実施例１で製造した組換え微生物を、表１のトレオニン力価培地を利用して、三角フラスコで培養し、Ｌ−トレオニン生産性を確認した。
【００５１】
【表１】
2019047790.tif 000002
【００５２】
３３℃培養基でＬＢ固体培地中で一晩中培養した実施例１で作製された大腸菌７種の菌株、及びＫＣＣＭ１０９１０Ｐを、それぞれ表１の２５ｍＬ力価培地に１白金耳ずつ接種した後、それを３３℃、２００ｒｐｍの培養基で４８時間培養した。
【００５３】
【表２】
2019047790.tif 000003
【００５４】
表２に記載されているようにｎｆｒＡ、ｎｆｒＢ、ｎｆｒＡＢ、ｔｓｘ及びｆｈｕＡの各不活性化菌株は、親菌株であるＫＣＣＭ１０９１０Ｐ対比で、糖消耗速度が向上しながら、４８時間収率が下がらないということを確認した。一方、ｌａｍＢとｂｔｕＢとの不活性化菌株は、親菌株対比で、糖消耗速度が類似しているか、あるいは小幅下がり、４８時間の培養時、トレオニン濃度も、いずれも類似しているということを確認した。ｎｆｒＡ、ｎｆｒＢ及びｎｆｒＡＢの不活性化菌株は、培養結果が同一に示され、２つの遺伝子のうちいずれか一つだけ欠損した場合と、２つの遺伝子が同時に欠損した場合とにおいて、いずれも同じ結果を示すということを確認した。
【００５５】
実施例３．有効変異組み合わせ菌株の作製、及びＬ−トレオニン生産能の比較
３−１．ｎｆｒＡＢ、ｆｈｕＡ同時不活性化、ｎｆｒＡＢ、ｔｓｘ同時不活性化、及びｎｆｒＡＢ、ｔｓｘ、ｆｈｕＡ同時不活性化菌株の作製
糖消費能が上昇したｎｆｒＡＢ、ｆｈｕＡ、ｔｓｘの不活性化特徴を組み合わせた場合の糖消費能追加向上いかんを確認するために、ＫＣＣＭ１０９１０ＰΔｎｆｒＡＢΔｆｈｕＡ、ＫＣＣＭ１０９１０ＰΔｎｆｒＡＢΔｔｓｘ及びＫＣＣＭ１０９１０ＰΔｎｆｒＡＢΔｔｓｘΔｆｈｕＡを作製した。そのために、実施例１−３で作製されたＫＣＣＭ１０９１０ＰΔｎｆｒＡＢを基に、実施例１で作製したような方法で、ｆｈｕＡ及びｔｓｘをそれぞれ同時不活性化させた菌株を作製した（ＫＣＣＭ１０９１０ＰΔｎｆｒＡＢΔｆｈｕＡ及びＫＣＣＭ１０９１０ＰΔｎｆｒＡＢΔｔｓｘ）。また、ＫＣＣＭ１０９１０ＰΔｎｆｒＡＢΔｔｓｘを基にｆｈｕＡを不活性化させ、最終的に、ＫＣＣＭ１０９１０ＰΔｎｆｒＡＢΔｔｓｘΔｆｈｕＡを作製した。
【００５６】
表２から確認されるように、ｎｆｒＡ，ｎｆｒＢ，ｎｆｒＡＢ不活性化菌株は、その効果が同一であると判断されるので、有効変異組み合わせ菌株の作製においては、ｎｆｒＡＢが、不活性化を基に、ｔｓｘ，ｆｈｕＡ不活性化を進めた。しかし、その効果は、ｎｆｒＡかｎｆｒＢだけ不活性化させた場合と、２つの遺伝子を同時不活性化させた場合とにおいて、いずれも同一であると見られる。
【００５７】
３−２．有効変異組み合わせ菌株のＬ−トレオニン生産能比較
前述のところで作製された有効変異統合株のＬ−トレオニン生産能を比較するために、表１の培地を利用して、前述のところにおいて記述された方法と同一に培養を進め、その結果は、表３の通りである。
【００５８】
【表３】
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【００５９】
糖消費能が上昇したｎｆｒＡＢ、ｆｈｕＡ、ｔｓｘの不活性化特徴を組み合わせて作製したＫＣＣＭ１０９１０ＰΔｎｆｒＡＢΔｆｈｕＡ菌株、ＫＣＣＭ１０９１０ＰΔｎｆｒＡＢΔｔｓｘ菌株及びＫＣＣＭ１０９１０ＰΔｎｆｒＡＢΔｔｓｘΔｆｈｕＡ菌株の力価評価の結果、ｎｆｒＡＢ単独変異に、ｆｈｕＡやｔｓｘを追加して不活性化させた場合、糖消費能が上昇するということを確認した。ここで、糖消費能が上昇したように見える前記形質転換された大腸菌ＫＣＣＭ１０９１０ＰΔｎｆｒＡＢを「ＣＡ０３−８２５３Ｐ」と命名し、ＫＣＣＭ １１５０１Ｐとして、２００１３年１２月１３日に韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ：Korean Culture Center of Microorganisms）に寄託した（受託番号ＫＣＣＭ１１５０１Ｐ）。
【００６０】
実施例４．ＫＣＣＭ−１０１３２基盤ファージ受容体不活性化菌株の作製及びトレオニン生産能比較
４−１．ＫＣＣＭ−１０１３２基盤ファージ受容体不活性化菌株の作製
実施例１及び実施例３のような方法で、実施例１で作製された７種の不活性化カセットを利用して、同一にＫＣＣＭ−１０１３２菌株を基にして、ファージ受容体不活性化菌株１０種を作製した（表４）。ＫＣＣＭ−１０１３２菌株は、韓国登録特許第１０−０２７０５１０号において記述された菌株であり、大腸菌由来トレオニン生産能が付与された菌株である。
【００６１】
４−２．ＫＣＣＭ−１０１３２基盤ファージ受容体不活性化菌株の作製トレオニン生産能比較
実施例２において記述された方法で、表１の培地を利用して、実施例４−１で作製されたＫＣＣＭ−１０１３２基盤ファージ受容体不活性化菌株１０種と、親菌株ＫＣＣＭ−１０１３２とのトレオニン生産能を比較評価進行した。
【００６２】
【表４】
2019047790.tif 000005
【００６３】
表４に記載されているように、ｎｆｒＡ，ｎｆｒＢ，ｎｆｒＡＢ，ｔｓｘ，ｆｈｕＡ不活性化菌株は、親菌株であるＫＣＣＭ−１０１３２対比で、糖消耗速度が向上しながら、４８時間収率が下がらないということを確認した。一方、ｌａｍＢとｂｔｕＢとの不活性化菌株は、親菌株対比で、糖消耗速度が類似しているか、あるいは小幅遅延し、４８時間の培養時、トレオニン濃度は、類似しているということを確認した。また、ｎｆｒＡＢ、ｆｈｕＡ、及びｎｆｒＡＢ、ｔｓｘの同時不活性化菌株、ｎｆｒＡＢ，ｔｓｘ，ｆｈｕＡの同時不活性化菌株は、ｎｆｒＡＢ単独不活性化菌株対比で、糖消耗速度が改善するということが確認された。
【００６４】
実施例５．ＫＣＣＭ１１１６６Ｐ基盤ファージ受容体不活性化菌株の作製及びトリプトファン生産能比較
５−１．ＫＣＣＭ１１１６６Ｐ基盤ファージ受容体不活性化菌株の作製
実施例１で作製された７種の不活性化カセットを利用して、実施例１のような方法で、ＫＣＣＭ１１１６６Ｐ（大韓民国登録特許１０−１２６１１４７）を基にして、ファージ受容体が不活性化されたトリプトファン生産菌株７種を作製した。
【００６５】
５−２．ＫＣＣＭ１１１６６Ｐ基盤ファージ受容体不活性化菌株の作製及びトリプトファン生産能比較
実施例５−１で作製されたＫＣＣＭ１１１６６Ｐ基盤ファージ受容体が不活性化されたトリプトファン生産菌株７種の生産能を評価するために、表５の培地を利用して進めた。そのために、菌体を白金耳で接種した後、ＬＢ固体培地で一晩培養し、表５のような組成を有する２５ｍｌのフラスコ力価培地に、１白金耳ずつ接種した。菌株接種後、３７℃、２００ｒｐｍで４８時間培養し、そこから得られた結果を表６に示した。
【００６６】
【表５】
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【００６７】
【表６】
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【００６８】
表６から分かるように、ｎｆｒＡ，ｎｆｒＢ，ｎｆｒＡＢ，ｔｓｘ，ｆｈｕＡ欠失の場合、菌株のトリプトファン生産量は、類似しており、糖消耗速度が速くなったということを確認することができる。一方、ｌａｍｂ、ｂｔｕＢの場合には、トリプトファン生産量や糖消耗速度の変化は見られなかった。
【００６９】
実施例６．有効変異組み合わせ菌株の作製及びＬ−トリプトファン生産能比較
６−１．ｎｆｒＡＢ，ｆｈｕＡ同時不活性化、ｎｆｒＡＢ，ｔｓｘ同時不活性化、及びｎｆｒＡＢ，ｔｓｘ，ｆｈｕＡ同時不活性化されたＬ−トリプトファン生産菌株の作製
糖消費能が上昇したｎｆｒＡＢ、ｆｈｕＡ、ｔｓｘの不活性化特徴を組み合わせた場合の糖消費能追加向上いかんをトリプトファン生産菌株で確認するために、ＫＣＣＭ１１１６６ＰΔｎｆｒＡＢΔｆｈｕＡ、ＫＣＣＭ１１１６６ＰΔｎｆｒＡＢΔｔｓｘ及びＫＣＣＭ１１１６６ＰΔｎｆｒＡＢΔｔｓｘΔｆｈｕＡを作製した。
【００７０】
６−２．有効変異組み合わせ菌株のＬ−トリプトファン生産能比較
前記６−１で作製された３種菌株のＬ−トリプトファン生産能を比較するために、表５の培地を利用して、実施例５において記述された方法と同一に培養を進め、その結果は、下記表７の通りである。
【００７１】
【表７】
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【００７２】
作製された有効変異組み合わせトリプトファン生産菌株の力価評価結果、ｎｆｒＡＢ単独変異に、ｆｈｕＡとｔｓｘとを追加不活性化させたとき、ｎｆｒＡＢ単独変異対比で、糖消耗能が上昇するということを確認した。
【００７３】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であるならば、本発明が、その技術的思想や必須特徴を変更せずとも、他の具体的な形態で実施されるということを理解することができるであろう。それと係わり、本明細書で記述された実施例及び試験例は、全ての面において例示的なものであり、本発明の範囲を制限するものではないと理解されなければならない。本発明の範囲は、前述の詳細な説明よりは、特許請求の範囲の意味、範囲及びその等価概念から導み出される全ての変更、または変形された形態が本発明の範囲に含まれると解釈されなければならない。
【受託番号】
【００７４】
寄託機関人：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１５０１Ｐ
受託日付け：２０１３１２１３
2019047790.tif 000009
【配列表】
2019047790000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月9日(2018.11.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮｆｒＡ、ＮｆｒＢ、又はＮｆｒＡ及びＮｆｒＢの活性が不活性化され、且つＬ−アミノ酸生産性が向上した、Ｌ−アミノ酸を生産するエシェリキア属組換え微生物であって、Ｔｓｘの活性が追加して不活性化された、前記組換え微生物。
【請求項２】
前記ＮｆｒＡは、配列番号４０のアミノ酸配列を含み、前記ＮｆｒＢは、配列番号４２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のＬ−アミノ酸を生産するエシェリキア属組換え微生物。
【請求項３】
前記微生物は、ＦｈｕＡの活性が追加して不活性化されたことを特徴とする、請求項１に記載のＬ−アミノ酸を生産するエシェリキア属組換え微生物。
【請求項４】
前記Ｔｓｘは、配列番号４５のアミノ酸配列を含み、前記ＦｈｕＡは、配列番号４７のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項３に記載のＬ−アミノ酸を生産するエシェリキア属組換え微生物。
【請求項５】
前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−トレオニン又はＬ−トリプトファンであることを特徴とする、請求項１に記載のＬ−アミノ酸を生産するエシェリキア属組換え微生物。
【請求項６】
前記組換え微生物は、大腸菌であることを特徴とする、請求項１に記載のＬ−アミノ酸を生産するエシェリキア属組換え微生物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換え微生物を培養する段階と、
培養物からＬ−アミノ酸を回収する段階と、
を含む、Ｌ−アミノ酸を生産する方法。
【請求項８】
前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−トレオニン又はＬ−トリプトファンであることを特徴とする、請求項７に記載のＬ−アミノ酸を生産する方法。
【請求項９】
前記組換え微生物の糖消費速度が上昇した、請求項１に記載の組換え微生物。
【外国語明細書】
2019047790000001.pdf