(57)【要約】      （修正有）【課題】動物におけるアポリポタンパク質（ａ）ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を低下させるための方法、化合物、および組成物を提供する。【解決手段】アポ（ａ）またはＬｐ（ａ）に関連する疾患、障害、または状態を治療する、予防する、または寛解させるためにアポ（ａ）を減少させるためのアンチセンス化合物。アポ（ａ）またはＬｐ（ａ）に関連するある特定の疾患、障害、または状態は、炎症性、心血管、および／もしくは代謝疾患、障害、または状態を含む。本アンチセンス化合物は、治療を必要とする個体のそのような疾患、障害、または状態を治療するために使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１２〜３０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号１の核酸塩基３９０１〜３９２０の等長部分に相補的である少なくとも８個の連続する核酸塩基の一部を含む核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が、配列番号１に少なくとも８０％相補性である、化合物。
【請求項２】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、１５〜３０個、１８〜２４個、１９〜２２個、１３〜２５個、１４〜２５個、１５〜２５個、１６個、または２０個の結合されたヌクレオシドからなる、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号１の等長部分に相補的な少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個の連続する核酸塩基の一部を含む核酸塩基配列を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
１２〜３０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号１の核酸塩基３９００〜３９２３の等長部分に相補的である少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個の連続する核酸塩基の一部を含む核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が、配列番号１に少なくとも８０％相補性である、化合物。
【請求項５】
前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が、配列番号１に少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％相補性である、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
１２〜３０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号５８の核酸塩基配列の少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物。
【請求項７】
１２〜３０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号１２〜１３０、１３３、１３４の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物。
【請求項８】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、単鎖である、請求項１〜７のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
少なくとも１つのヌクレオシド間結合が、修飾ヌクレオシド間結合である、請求項１〜８のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０】
各ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾糖を含む、請求項１〜１０のい
ずれかに記載の化合物。
【請求項１２】
少なくとも１つの修飾糖が、二環式糖である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
少なくとも１つの修飾糖が、２’−Ｏ−メトキシエチル、拘束エチル（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｅｔｈｙｌ）、３’−フルオロ−ＨＮＡ、または４’−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−２’架橋を含み、式中、ｎが１または２である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１４】
少なくとも１つのヌクレオシドが、修飾核酸塩基を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の化合物。
【請求項１５】
前記修飾核酸塩基が、５−メチルシトシンである、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物であって、
前記修飾オリゴヌクレオチドが、１２〜３０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ
結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、
結合されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメントと、
結合されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントと、を含み、
前記ギャップセグメントが、前記５’ウィングセグメントと前記３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが、修飾糖を含む、化合物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の化合物であって、
前記修飾オリゴヌクレオチドが、２０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ
１０個の結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、
５個の結合されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメントと、
５個の結合されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントと、を含み、
前記ギャップセグメントが、前記５’ウィングセグメントと前記３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基が、５−メチルシトシンである、化合物。
【請求項１８】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、２０個の結合されたヌクレオシドからなる、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１９】
２０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号５８のいずれかの等長部分に相補的である少なくとも８個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが、
１０個の結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、
５個の結合されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメントと、
５個の結合されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントと、を含み、
前記ギャップセグメントが、前記５’ウィングセグメントと前記３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが、２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基が、５−メチルシトシンである、化合物。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれかに記載の化合物またはその塩と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、組成物。
【請求項２１】
治療に使用するための、請求項１〜２０のいずれかに記載の化合物を含む、組成物。
【請求項２２】
上昇したアポ（ａ）および／または上昇したＬｐ（ａ）に関連する疾患の治療、予防、またはその進行を緩慢にさせるのに使用するための、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
前記疾患が、炎症性、心血管、または代謝疾患、障害、または状態である、請求項２１に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
配列表
本出願は、電子形式の配列表と共に出願されている。配列表は、２０１３年５月２２日に作成され、３９６ＫｂのサイズであるＢＩＯＬ０１７７ＷＯＳＥＱ．ｔｘｔと表題を付けられたファイルとして提供される。配列表の電子形式での情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本明細書に記載される実施形態は、動物におけるアポリポタンパク質（ａ）ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を低下させるための方法、化合物、および組成物を提供する。そのような方法、化合物、および組成物は、心血管および／または代謝疾患、障害、または状態を治療する、予防する、または寛解させるのに有用である。
【背景技術】
【０００３】
リポタンパク質は、タンパク質、リン脂質、およびコレステロールの両親媒性被膜によって包囲されるアシルグリセロールおよびコレステリルエステルの非極性コアからなる球状のミセル様粒子である。リポタンパク質は、それらの機能的および物理的特性に基づき５つの広範なカテゴリーに分類されている：カイロミクロン、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）。カイロミクロンは、腸から組織に食物性脂質を輸送する。ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、およびＬＤＬは全て、肝臓から組織にトリアシルグリセロールおよびコレステロールを輸送する。ＨＤＬは、組織から肝臓に内因性コレステロールを輸送する。
【０００４】
リポタンパク質粒子は、連続代謝処理を受け、可変の特性および組成を有する。リポタンパク質密度は、それらの外側被膜の密度が内側コアの密度より低いため粒径を増加させることなく増加する。リポタンパク質のタンパク質構成要素は、アポリポタンパク質として知られる。様々なヒトリポタンパク質の中でも、少なくとも９つのアポリポタンパク質がかなりの量で分布する。
【０００５】
リポタンパク質（ａ）［Ｌｐ（ａ）］粒子は、５０年近く前に特定され、１つのアポリポタンパク質Ｂ（アポＢ）タンパク質がジスルフィド結合を介して単一のアポリポタンパク質（ａ）［アポ（ａ）］タンパク質に結合される、高度に独特なＬＤＬ粒子から構成される。アポ（ａ）タンパク質は、特にクリングルＩＶ２型反復ドメイン内のプラスミノーゲンと高度の相同性を共有する。循環Ｌｐ（ａ）のレベルは、分子中に存在するクリングルＩＶ２型可変反復の数に逆比例し、両方の対立遺伝子が個体において同時発現されるとき、ヘテロ接合性血漿イソ型プロファイルを提示することができる（Ｋｒａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ，１９９６；４（２）：７４−８７）。アポ（ａ）におけるこのクリングル反復ドメインは、その血栓形成促進性および抗線維素溶解性特性に関与し得、アテローム性動脈硬化の進行を強化する可能性があると考えられる。
【０００６】
アポ（ａ）は、ＩＬ−６により転写的に調節され、ＩＬ−６阻害剤（トシリズマブ）で治療されたリウマチ性関節炎の患者における研究では、血漿レベルが３ヶ月の治療後に３０％低下した（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１０；５：ｅ１４３２８）。
【０００７】
アポ（ａ）は、酸化リン脂質に優先的に結合し、血管炎症を増強することが示されてき
た（Ｂｅｒｇｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ２００８；４９：２２３０-２２３９、Ｔｓｉｍｉｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００９
；１１９（１３）：１７１１-１７１９）。
【０００８】
さらに、研究は、Ｌｐ（ａ）粒子が内皮透過性を刺激し、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１型発現を誘導し、マクロファージインターロイキン８の分泌を活性化し得ることも示唆する（Ｋｏｓｃｈｉｎｓｋｙ  ａｎｄ  Ｍａｒｃｏｖｉｎａ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ
Ｌｉｐｉｄｏｌ  ２００４；１５：１６７-１７４）。重要なことに、最近の遺伝子関
連研究は、Ｌｐ（ａ）が心筋梗塞、脳卒中、末梢血管疾患、および腹部大動脈瘤の独立した危険因子であることを明らかにした（Ｒｉｆａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ
２００４；５０：１３６４-７１、Ｅｒｑｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ  ２００９；
３０２：４１２-２３、Ｋａｍｓｔｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２
００８１１７：１７６-８４）。さらに、最近の早発性冠動脈疾患（ＰＲＯＣＡＲＤＩＳ
）研究では、Ｃｌａｒｋｅら（Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＥＪＭ（２００９）３６１；２５１８−２５２８）は、冠動脈心疾患と血漿Ｌｐ（ａ）濃度との間の強く独立した関係を説明した。加えて、Ｓｏｌｆｒｉｚｚｉらは、血清Ｌｐ（ａ）の増加がアルツハイマー病（ＡＤ）の危険性の増加と関連付けられ得ることを示唆した（Ｓｏｌｆｒｉｚｚｉ
ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２００２，７２：７３２−７３６。現在、診療所という環境において、心血管疾患を治療するための間接的なアポ（ａ）阻害剤の例としては、それぞれ、血漿Ｌｐ（ａ）レベルを１８％、３９％、３２％、３６％、４３％、および１７％低下させるアスピリン、ナイアスパン、ミポメルセン、アナセトラピブ、エプロチローム（Ｅｐｉｒｏｔｉｒｏｍｅ）、およびロミタピドが挙げられる。加えて、Ｌｐ（ａ）アフェレシスは、診療所において、Ｌｐ（ａ）粒子を含有するアポ（ａ）を低下させるために使用されている。
【０００９】
今まで、アポ（ａ）レベルを直接標的指向することにより心血管疾患を治療するための治療戦略は、限られてきた。リボザイムオリゴヌクレオチド（米国特許第５，８７７，０２２号）およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（国際公開第２００５／０００２０１号、同第２００３／０１４３９７号、米国特許第８，１３８，３２８号、Ｍｅｒｋｉ  ｅｔ
ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ２０１１；５７：１６１１-１６２１
）が開発されてきたが、アポ（ａ）を直接標的指向する化合物のいずれも診療所において現在使用されていない。
【００１０】
よって、慢性的な血漿Ｌｐ（ａ）レベルの上昇による心血管事象の高い危険性がある患者において、アポ（ａ）レベルを強力かつ選択的に低下させることができる新規薬剤の未対処の医学的必要性が明確に存在する。
【発明の概要】
【００１１】
アポ（ａ）ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を調節するための組成物および方法が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、アポ（ａ）特異的阻害剤は、アポ（ａ）ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を減少させる。
【００１２】
ある特定の実施形態では、組成物は、アポ（ａ）特異的阻害剤である。ある特定の実施形態では、アポ（ａ）特異的阻害剤は、核酸、タンパク質、または小分子である。ある特定の実施形態では、アポ（ａ）特異的阻害剤は、アポ（ａ）を標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、アポ（ａ）特異的阻害剤は、１２〜３０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号１の核酸塩基３９０１〜３９２０の等長部分に相補的である少なくとも８個の連続する核酸塩基の一部を含む核酸塩基配列を含む、修飾オリゴヌクレオチドであり、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１に少なくとも８０％相補性である。ある特定の実施形態では、アポ（ａ）特
異的阻害剤は、１２〜３０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号１〜１３０、１３３、１３４の核酸塩基配列の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または２０個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、アポ（ａ）特異的阻害剤は、２０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号５８のいずれかの少なくとも８個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドであり、修飾オリゴヌクレオチドは、（ａ）１０個の結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、（ｂ）５個の結合されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント、（ｃ）５個の結合されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含み、ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基は、５−メチルシトシンである。
【００１３】
ある特定の実施形態は、本明細書に記載される化合物、またはその塩、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む組成物を提供する。
【００１４】
ある特定の実施形態では、アポ（ａ）発現の調節は、細胞または組織で生じる。ある特定の実施形態では、調節は、動物の細胞または組織において生じる。ある特定の実施形態では、動物はヒトである。ある特定の実施形態では、調節は、アポ（ａ）ｍＲＮＡレベルの低下である。ある特定の実施形態では、調節は、アポ（ａ）タンパク質レベルの低下である。ある特定の実施形態では、アポ（ａ）ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方が低下する。そのような低下は、時間依存または用量依存様式で生じ得る。
【００１５】
ある特定の実施形態は、療法で使用するための組成物および方法を提供する。ある特定の実施形態は、アポ（ａ）関連疾患、障害、および状態を予防する、治療する、遅延させる、その進行を緩慢にさせる、および／または寛解させるための組成物および方法を提供する。ある特定の実施形態は、Ｌｐ（ａ）関連疾患、障害、および状態を予防する、治療する、遅延させる、その進行を緩慢にさせる、および／または寛解させるための組成物および方法を提供する。ある特定の実施形態では、そのような疾患、障害、および状態は、炎症性、心血管、および／または代謝疾患、障害、および状態である。ある特定の実施形態では、療法のための組成物および方法は、アポ（ａ）特異的阻害剤を、それを必要とする個体に投与することを含む。ある特定の実施形態では、アポ（ａ）特異的阻害剤は、核酸である。ある特定の実施形態では、核酸は、アンチセンス化合物である。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、修飾オリゴヌクレオチドである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は、例示的および説明的なものでしかなく、特許請求される本発明を限定するものではないことを理解されたい。本明細書で使用されるとき、単数形の使用は、別段の指示がない限り、複数を含む。本明細書で使用されるとき、「または」は、別段の指示がない限り、「および／または」を意味する。加えて、本明細書で使用されるとき、別段の指示がない限り、「および」は、「および／または」を意味する。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる」等の他の形態の使用も限定的なものではない。また、「要素」または「構成要素」等の用語は、別段の指示がない限り、１つのユニットを含む、要素および構成要素と、２つ以上のサブユニットを含む、要素および構成要素の両方を包含する。
【００１７】
本明細書で使用される項目見出しは、構成的な目的のためでしかなく、説明される主題
を限定すると解釈すべきではない。特許、特許出願、公開特許出願、論文、本、専門書、ならびに国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）等のデータベースを通して得ることができるＧＥＮＢＡＮＫ受託番号および関連する配列情報ならびに本開示全体を通して参照される他のデータを含むがこれらに限定されない、本開示に引用される全ての文献または文献の一部は、本明細書において、本明細書に記載される文献の一部の参照により、ならびにその全体が明確に組み込まれる。
【００１８】
定義
特定の定義がなされない限り、本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、医学および薬化学と関連して利用される命名法、ならびにそれらの手順および技法は、当技術分野において公知であって、一般的に使用されるものである。標準的技法が、化学合成および化学分析のために使用されてもよい。
【００１９】
別段の指示がない限り、次の用語は、次の意味を有する。
【００２０】
「２’−Ｏ−メトキシエチル」（同様に２’−ＭＯＥ、ＭＯＥ、２’−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３および２’−Ｏ−（２−メトキシエチル））は、フラノシル環の２’位のＯ−メトキシ−エチル修飾を指す。２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖は、修飾糖である。
【００２１】
「２’−デオキシリボヌクレオシド」は、天然に生じるデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）に見出される、２’−Ｈフラノシル糖部分を含むヌクレオシドを意味する。
【００２２】
「２’−ＭＯＥヌクレオシド」（同様に２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシド）は、２’−ＭＯＥ修飾糖部分を含むヌクレオシドを意味する。「２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド」は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖部分を含む、ヌクレオチドを意味する。
【００２３】
「３’−フルオロ−ＨＮＡ」（同様に「Ｆ−ＨＮＡ」または「３’−Ｆ−ＨＮＡ」）は、次の構造：
【化１】
2019071902.tif 000002
を有するヌクレオシドの糖部分を意味し、式中、Ｂｘは、核酸塩基である。
【００２４】
「３’標的部位」は、特定のアンチセンス化合物の最も３’側のヌクレオチドに相補的である標的核酸のヌクレオチドを指す。
【００２５】
「５’標的部位」は、特定のアンチセンス化合物の最も５’側のヌクレオチドに相補的である標的核酸のヌクレオチドを指す。
【００２６】
「５−メチルシトシン」は、メチル基が５’位に付着して修飾されたシトシンを意味する。５−メチルシトシンは、修飾核酸塩基である。
【００２７】
「約」は、値の±１０％内を意味する。例えば、「マーカーは約５０％増加し得る」と記載される場合、マーカーが４５％〜５５％増加し得ることを意味する。
【００２８】
「活性医薬品」は、個体に投与されると、治療利益を提供する、医薬組成物中の物質ま
たは複数の物質を意味する。例えば、ある特定の実施形態では、アポ（ａ）に対して標的指向されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、活性医薬品である。
【００２９】
「活性標的領域」または「標的領域」は、１つ以上の活性アンチセンス化合物が標的指向される領域を意味する。「活性アンチセンス化合物」は、標的核酸レベルまたはタンパク質レベルを低下させるアンチセンス化合物を意味する。
【００３０】
「同時に投与される」は、両剤の薬理効果が患者において同時に顕在化される、任意の様式における、２つの薬剤の同時投与を指す。同時投与は、両剤が単一の医薬組成物において、同一剤形において、または同一投与経路によって投与されることを要求しない。両剤の効果は、同時に顕現される必要はない。その効果は、ある時間期間の間だけ重複し、共存する必要はない。
【００３１】
「投与する」または「投与」は、個体に医薬品を提供することを意味し、医療専門家および自己投与による投与を含むが、これらに限定されない。医薬品の個体への投与は、連続、長期、短期、または断続的であり得る。投与は、非経口または経口であり得る。
【００３２】
「薬剤」は、動物に投与されると、治療利益を提供することができる活性物質を意味する。「第１の薬剤」は、本発明の治療化合物を意味する。例えば、第１の薬剤は、アポ（ａ）を標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。「第２の薬剤」は、本発明の第２治療化合物（例えばアポ（ａ）を標的指向する第２のアンチセンスオリゴヌクレオチド）、および／または非アポ（ａ）治療化合物を意味する。
【００３３】
「寛解」または「寛解させる（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）」または「寛解させる（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）」は、関連する疾患、障害、または状態のうちの少なくとも１つの指標、兆候、または症状の低下を指す。指標の重症度は、当業者に公知である主観的または客観的手段により決定され得る。
【００３４】
「動物」は、ヒトまたは限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、および限定されないがサルおよびチンパンジーを含む非ヒト霊長動物、を含む、非ヒト動物を指す。
【００３５】
「抗体」は、抗原と特異的に何らかの反応をすることを特徴とする、分子を指し、抗体および抗原は各々、反対の観点から定義される。抗体は、重鎖、軽鎖、Ｆａｂ領域、およびＦｃ領域等、完全抗体分子あるいはその任意の断片またはその領域を指し得る。
【００３６】
「アンチセンス活性」は、アンチセンス化合物のその標的核酸へのハイブリダイゼーションに起因する、任意の検出可能または測定可能活性を意味する。ある特定の実施形態では、アンチセンス活性は、標的核酸またはかかる標的核酸によってコードされるタンパク質の量あるいは発現における減少である。
【００３７】
「アンチセンス化合物」は、水素結合を介して標的核酸にハイブリダーセーションすることが可能なオリゴマー化合物を意味する。アンチセンス化合物の例としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびサテライト反復等の１本鎖および２本鎖化合物が挙げられる。本明細書で使用される、用語「アンチセンス化合物」は、本明細書に記載される化合物の薬学的に許容される誘導体を包含する。
【００３８】
「アンチセンス阻害」は、アンチセンス化合物の不在下における標的核酸レベルまたは標的タンパク質レベルと比較した、標的核酸に相補的なアンチセンス化合物の存在下にお
ける標的核酸レベルまたは標的タンパク質レベルの低下を意味する。
【００３９】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸の対応する領域またはセグメントへのハイブリダイゼーションを許容する核酸塩基配列を有する、１本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。本明細書で使用される、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、本明細書に記載される化合物の薬学的に許容される誘導体を包含する。
【００４０】
「アポ（ａ）」は、アポ（ａ）をコードする任意の核酸またはタンパク質配列を意味する。例えば、ある特定の実施形態では、アポ（ａ）は、アポ（ａ）をコードするＤＮＡ配列、アポ（ａ）をコードするＤＮＡから転写されるＲＮＡ配列（イントロンおよびエクソンを含む、ゲノムＤＮＡを含む）、アポ（ａ）をコードするｍＲＮＡ配列、またはアポ（ａ）をコードするペプチド配列を含む。
【００４１】
「アポ（ａ）核酸」は、アポ（ａ）をコードする任意の核酸を意味する。例えば、ある特定の実施形態では、アポ（ａ）核酸はアポ（ａ）をコードするＤＮＡ配列、アポ（ａ）をコードするＤＮＡから転写されるＲＮＡ配列（イントロンおよびエクソンを含む、ゲノムＤＮＡを含む）、およびアポ（ａ）をコードするｍＲＮＡ配列を含む。
【００４２】
「アポ（ａ）ｍＲＮＡ」は、アポ（ａ）タンパク質をコードするｍＲＮＡを意味する。
【００４３】
「アポ（ａ）タンパク質」は、アポ（ａ）をコードする任意のタンパク質配列を意味する。
【００４４】
「アポ（ａ）特異的阻害剤」は、アポ（ａ）核酸および／またはアポ（ａ）タンパク質の発現を特異的に阻害することが可能である任意の薬剤を指す。例えば、アポ（ａ）特異的阻害剤は、アポ（ａ）核酸および／またはアポ（ａ）タンパク質の発現を阻害することが可能である、核酸（アンチセンス化合物を含む）、ペプチド、抗体、小分子、および他の薬剤を含む。ある特定の実施形態では、アポ（ａ）核酸発現および／またはアポ（ａ）タンパク質発現を特異的に調節することによって、アポ（ａ）特異的阻害剤は、下流構成要素を含む脂質輸送系の他の構成要素に影響を及ぼすことができる。同様に、ある特定の実施形態では、アポ（ａ）特異的阻害剤は、動物における他の分子過程に影響を及ぼすことができる。
【００４５】
「粥状動脈硬化」は、大および中動脈に影響を及ぼす動脈の硬化を意味し、脂肪の蓄積の存在を特徴とする。脂肪の蓄積は、「アテローマ」または「プラーク」と呼ばれ、これは、主に、コレステロール、および他の脂肪、カルシウム、ならびに斑痕組織からなり、動脈の内膜を損傷する。
【００４６】
「二環式糖」は、２つの原子の架橋によって修飾されるフラノシル環を意味する。二環式糖は、修飾糖である。
【００４７】
「二環式ヌクレオシド」（同様にＢＮＡ）は、糖環の２つの炭素原子を接続する架橋を含む糖部分を有し、それによって、二環式環系を形成する、ヌクレオシドを意味する。ある特定の実施形態では、架橋は、糖環の４’炭素および２’炭素を接続する。
【００４８】
「キャップ構造」または「末端キャップ部分」は、アンチセンス化合物のいずれの末端でも取り込まれた化学修飾を意味する。
【００４９】
「心血管疾患」または「心血管障害」は、心臓、血管、または循環に関連する一群の状態を指す。心血管疾患の例としては、動脈瘤、狭心症、不整脈、粥状動脈硬化、脳血管疾
患（脳卒中）、冠動脈心疾患、高血圧、脂質異常症、高脂血症、高トリグリセリド血症、および高コレステロール血症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
「化学的に異なる領域」は、いくつかの点において、同一アンチセンス化合物の別の領域と化学的に異なる、アンチセンス化合物の領域を指す。例えば、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチドを有する領域は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を伴わないヌクレオチドを有する領域と化学的に異なる。
【００５１】
「キメラアンチセンス化合物」は、少なくとも２つの化学的に異なる領域を有する、アンチセンス化合物を意味する。
【００５２】
「コレステロール」は、全ての動物組織の細胞膜に見出されるステロール分子である。コレステロールは、動物の血漿において、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を含むリポタンパク質によって、輸送されなければならない。「血漿コレステロール」は、血漿または血清に存在する全てのリポタンパク質（ＶＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ）エステル化および／または非エステル化されるコレステロールの合計を指す。
【００５３】
「コレステロール吸収阻害剤」は、食事から得られる外因性コレステロールの吸収を阻害する薬剤を意味する。
【００５４】
「同時投与」は、２つ以上の薬剤の個体への投与を意味する。２つ以上の薬剤は、単一医薬組成物中にあってもよく、または別個の医薬組成物中にあってもよい。２つ以上の薬剤は各々、同一または異なる投与経路を通して投与されてもよい。同時投与は、並行または連続投与を包含する。
【００５５】
「相補性」は、第１の核酸および第２の核酸の核酸塩基間で対合する能力を意味する。ある特定の実施形態では、第１と第２の核酸間の相補性は、２つのＤＮＡ鎖間、２つのＲＮＡ鎖間、またはＤＮＡとＲＮＡ鎖間であり得る。ある特定の実施形態では、１本の鎖上の核酸塩基のいくつかは、他の鎖上の相補的水素結合塩基と一致する。ある特定の実施形態では、１本の鎖上の核酸塩基の全てが、他の鎖上の相補的水素結合塩基と一致する。ある特定の実施形態では、第１の核酸はアンチセンス化合物であり、第２の核酸は標的核酸である。ある特定のそのような実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは第１の核酸であり、標的核酸は第２の核酸である。
【００５６】
「拘束エチル（Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｅｔｈｙｌ）」または「ｃＥｔ」は、４’と２’炭素原子との間のメチル（メチレンオキシ）（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）架橋を含むフラノシル糖を有する二環式ヌクレオシドを指す。
【００５７】
「拘束エチルヌクレオシド（Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｅｔｈｙｌ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）」（同様にｃＥｔヌクレオシド）は、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオシドを意味する。
【００５８】
「連続する核酸塩基」は、相互に直接隣接する核酸塩基を意味する。
【００５９】
「交差反応性」は、１つの核酸配列を標的指向するオリゴマー化合物が異なる核酸配列とハイブリダイズすることができることを意味する。例えば、いくつかの場合では、ヒトアポ（ａ）を標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、別の種からのアポ（ａ）と交差反応することができる。オリゴマー化合物がその指定された標的以外の核酸配列と
交差反応するか否かは、化合物が有する非標的核酸配列との相補性の程度に依存する。オリゴマー化合物と非標的核酸との間の相補性が高ければ高いほど、オリゴマー化合物が核酸と交差反応する可能性が高くなる。
【００６０】
「治癒」は、健康を回復する方法または病気の規定の治療を意味する。
【００６１】
「冠動脈心疾患（ＣＨＤ）」は、多くの場合、粥状動脈硬化の結果である、血液および酸素を心臓に供給する小血管の狭窄を意味する。
【００６２】
「デオキシリボヌクレオチド」は、ヌクレオチドの糖部分の２’位に水素を有するヌクレオチドを意味する。デオキシリボヌクレオチドは、様々な置換基のいずれかで修飾され得る。
【００６３】
「真性糖尿病」または「糖尿病」は、不十分なインスリンレベルまたはインスリン感受性の低下に起因する代謝障害および異常な高血糖（高血糖症）を特徴とする症候群である。特徴的な症状は、高血糖値による過度の尿生成（多尿症）、排尿の増加の相殺を試みる過度の口渇および水分摂取の増加（多飲症）、眼の視覚に対する高血糖作用による霧視、不明な体重損失、および嗜眠である。
【００６４】
「糖尿病性脂質異常症」または「脂質異常症を伴う２型糖尿病」は、２型糖尿病、ＨＤＬ−Ｃの低下、トリグリセリド（ＴＧ）の上昇、および小型高密度ＬＤＬ粒子の上昇を特徴とする状態を意味する。
【００６５】
「希釈剤」は、薬理活性を欠くが、薬学的に必要または望ましい組成物中の成分を意味する。例えば、注射用組成物中の希釈剤は、液剤、例えば、生理食塩水溶液であり得る。
【００６６】
「脂質異常症」は、脂質および／またはリポタンパク質の過剰産生もしくは欠乏を含む、脂質および／またはリポタンパク質代謝の障害を指す。脂質異常症は、カイロミクロン、コレステロール、およびトリグリセリド等の脂質、ならびに低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール等のリポタンパク質の上昇により顕在化され得る。
【００６７】
「単位剤形」は、医薬品が提供される形態、例えばピル、錠剤、または当該技術分野に公知の他の単位剤形を意味する。ある特定の実施形態では、単位剤形は、凍結乾燥されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するバイアルである。ある特定の実施形態では、単位剤形は、再構築されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するバイアルである。
【００６８】
「用量」は、単回投与または規定された時間期間において提供される、医薬品の規定された量を意味する。ある特定の実施形態では、用量は、１つ、２つ、またはそれ以上のボーラス、錠剤、または注射剤において投与されてもよい。例えば、皮下投与が所望される、ある特定の実施形態では、所望の用量は、単回注射によって容易に対応されない容量を要求し、したがって、２回以上の注射を使用して、所望の用量を達成してもよい。ある特定の実施形態では、医薬品は、延長された時間期間にわたって、または連続的に、注入によって投与される。用量は、１時間、１日、１週間、または１ヶ月あたりの医薬品の量として述べられ得る。用量は、ｍｇ／ｋｇまたはｇ／ｋｇでも述べられ得る。
【００６９】
「有効量」または「治療有効量」は、薬剤を必要とする個体において所望の生理学的転帰を実現するのに十分な活性医薬品の量を意味する。有効量は、治療される個体の健康および身体状態、治療される個体の分類学的な群、組成物の製剤、個体の病状の査定、および他の関連要因に応じて、個体間で変動し得る。
【００７０】
「完全に相補的」または「１００％相補的」は、第１の核酸の核酸塩基配列の各核酸塩基が、第２の核酸の第２の核酸塩基配列において相補的核酸塩基を有することを意味する。ある特定の実施形態では、第１の核酸はアンチセンス化合物であり、第２の核酸は標的核酸である。
【００７１】
「フラノシル」は、４個の炭素原子と１個の酸素原子を含む５員環を含む構造を意味する。
【００７２】
「ギャップマー」は、ＲＮａｓｅ  Ｈ切断を支援する複数のヌクレオシドを有する内部領域が、１個以上のヌクレオシドを有する外部領域間に位置付けられる、キメラアンチセンス化合物を意味し、内部領域を含むヌクレオシドは、外部領域を含むヌクレオシドまたは複数のヌクレオシドと化学的に異なる。内部領域は、「ギャップ」と称され得、外部領域は、「ウィング」と称され得る。
【００７３】
「ギャップ拡張」は、１〜６個のヌクレオシドを有する５’および３’ウィングセグメント間およびそれに直接隣接して位置付けられる、１２個以上の連続する２’−デオキシリボヌクレオシドのギャップセグメントを有する、キメラアンチセンス化合物を意味する。
【００７４】
「グルコース」は、エネルギー源および炎症性中間体として細胞によって使用される単糖である。「血漿グルコース」は、血漿に存在するグルコースを指す。
【００７５】
「高密度リポタンパク質Ｃ」または「ＨＤＬ−Ｃ」は、高密度リポタンパク質粒子に関係するコレステロールを意味する。血清（または血漿）中のＨＤＬ−Ｃの濃度は、典型的には、ｍｇ／ｄＬまたはｎｍｏｌ／Ｌで定量化される。「血清ＨＤＬ−Ｃ」および「血漿ＨＤＬ−Ｃ」は、それぞれ、血清および血漿中のＨＤＬ−Ｃを意味する。
【００７６】
「ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤」は、アトルバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、およびシンバスタチン等の酵素ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の阻害を通して作用する薬剤を意味する。
【００７７】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸分子のアニーリングを意味する。ある特定の実施形態では、相補的核酸分子は、アンチセンス化合物および標的核酸を含む。
【００７８】
「高コレステロール血症」は、成人における高コレステロールの検出、治療の評価の全国コレステロール教育プログラム（ＮＣＥＰ）の専門家パネル報告のガイドラインによる、コレステロールまたは循環（血漿）コレステロール、ＬＤＬコレステロール、およびＶＬＤＬコレステロールの上昇を特徴とする状態を意味する（Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．（１９８８）１４８，３６−３９を参照）。
【００７９】
「高脂血症」または「高脂質血症」は、血清脂質または循環（血漿）脂質の上昇を特徴とする状態である。この状態は、異常な高濃度の脂肪を顕在化する。循環血液中の脂質画分は、コレステロール、低密度リポタンパク質、超低密度リポタンパク質、カイロミクロン、およびトリグリセリドである。高脂血症のＦｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎ分類は、電気泳動または超遠心分離により測定される、ＴＧおよびコレステロール豊富リポタンパク質粒子のパターンに基づき、高トリグリセリド血症等の高脂血症の主な原因を特徴付けするために一般的に使用される（Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９６５，３１：３２１−３２７、Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ，１９６７，２７６（１）：３４-４２）。
【００８０】
「高トリグリセリド血症」は、トリグリセリドレベルの上昇を特徴とする状態を意味する。その病因は、第１（すなわち遺伝的原因）および第２（糖尿病、代謝症候群／インスリン耐性、肥満、運動不足、喫煙、過度のアルコールおよび炭水化物が非常に高い食事等の他の基礎原因）要因を含むか、またはほとんどの場合、その両方の組み合わせである（Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＣＭＡＪ，２００７，１７６：１１１３−１１２０）。
【００８１】
「特定する」または「代謝または心血管疾患を伴う動物の選択」は、高コレステロール血症、高血糖症、高脂血症、高トリグリセリド血症、高血圧、インスリン耐性の増加、インスリン感受性の減少、正常体重超、および／もしくは正常体脂肪含量超、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、代謝疾患、心血管疾患、もしくは代謝症候群になりやすい、またはそれと診断された対象を特定する、もしくは選択すること、あるいは代謝疾患、心血管疾患、もしくは代謝症候群のいずれかの症状を有する対象を特定する、または選択することを意味する。そのような特定は、血清もしくは循環（血漿）コレステロールの測定、血清もしくは循環（血漿）血糖の測定、血清もしくは循環（血漿）トリグリセリドの測定、血圧の測定、体脂肪含有量の測定、体重の測定等の標準的な臨床試験または評価を含むが、これらに限定されないあらゆる方法によって達成され得る。
【００８２】
「心血管転帰の改善」は、有害な心血管事象の発生、またはその危険性の低下を意味する。有害な心血管事象の例としては、死、再梗塞、脳卒中、心原性ショック、肺水腫、心停止、および心房リズム障害を含むが、これらに限定されない。
【００８３】
「直接隣接する」は、直接隣接する要素間、例えば領域、セグメント、ヌクレオチド、および／またはヌクレオシド間に介在要素が存在しないことを意味する。
【００８４】
「ＨＤＬの増加」または「ＨＤＬの上昇」は、いずれの化合物も投与されない動物におけるＨＤＬレベルと比較して、本発明の少なくとも１つの化合物の投与後の動物におけるＨＤＬのレベルの増加を意味する。
【００８５】
「個体」または「対象」または「動物」は、治療または療法のために選択されるヒトまたはヒト以外の動物を意味する。
【００８６】
「それを必要とする個体」は、治療または療法のために選択されるヒトまたはヒト以外の動物であって、そのような治療または療法を必要とする、ヒトまたはヒト以外の動物を指す。
【００８７】
「誘導する」、「阻害する」、「増強する」、「上昇する」、「増加する」、「減少する」、「低下する」等は、２つの状態間の定量的差を表す。例えば、「アポ（ａ）の活性または発現を阻害するのに十分な量」は、治療されるサンプルにおけるアポ（ａ）の活性または発現のレベルが、未治療のサンプルにおけるアポ（ａ）活性または発現のレベルと異なることを意味する。そのような用語は、例えば発現のレベルおよび活性のレベルに適用される。
【００８８】
「炎症状態」は、疾患、疾患状態、症候群、または炎症をもたらす他の状態を指す。例えば、リウマチ性関節炎および肝線維症は炎症状態である。炎症状態の他の例としては、敗血症、心筋虚血／再潅流障害、成人呼吸促迫症候群、腎炎、移植片拒絶、炎症性腸疾患、多発性硬化症、動脈硬化症、粥状動脈硬化、および血管炎が挙げられる。
【００８９】
「発現または活性の阻害」は、ＲＮＡまたはタンパク質の発現もしくは活性の低下または遮断を指し、発現または活性の完全な排除を必ずしも示さない。
【００９０】
「インスリン耐性」は、正常なインスリン量が脂肪、筋肉、および肝細胞から正常なインスリン応答を生成するのに不適切である状態と定義される。脂肪細胞におけるインスリン耐性は、血漿中の遊離脂肪酸を上昇させる、貯蔵されたトリグリセリドの加水分解をもたらす。筋肉におけるインスリン耐性はグルコース取り込みを減少させ、一方、肝臓におけるインスリン耐性は、グルコース貯蔵を低下させ、両作用とも血中グルコースを上昇させる働きをする。インスリン耐性によるインスリンおよびグルコースの高血漿レベルは、多くの場合、代謝症候群および２型糖尿病につながる。
【００９１】
「インスリン感受性」は、個体がどのくらい効率的にグルコースを処理するかの程度である。高インスリン感受性の個体はグルコースを効率的に処理し、一方、低インスリン感受性の個体はグルコースを効率的に処理しない。
【００９２】
「ヌクレオシド間結合」は、ヌクレオシド間の化学結合を指す。
【００９３】
「静脈内投与」は、血管内への投与を意味する。
【００９４】
「結合されたヌクレオシド」は、共に結合される隣接するヌクレオシドを意味する。
【００９５】
「脂質降下」は、対象における１つ以上の脂質（例えばＬＤＬ、ＶＬＤＬ）の低下を意味する。「脂質上昇」は、対象における脂質（例えばＨＤＬ）の増加を意味する。脂質降下または脂質上昇は、経時的に１つ以上の用量で生じ得る。
【００９６】
「脂質降下療法」または「脂質降下剤」は、対象において１つ以上の脂質を低下させるために対象に提供される治療レジメンを意味する。ある特定の実施形態では、脂質降下療法は、対象においてアポ（ａ）、ＣＥＴＰ、アポＢ、総コレステロール、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＩＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃ、トリグリセリド、小型高密度ＬＤＬ粒子、およびＬｐ（ａ）のうちの１つ以上を低下させるために提供される。脂質降下療法の例としては、アポＢ阻害剤、スタチン、フィブラート、およびＭＴＰ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、およびＨＤＬ等の「リポタンパク質」は、血清、血漿、およびリンパに見出される一群のタンパク質を指し、脂質輸送に重要である。各リポタンパク質の化学組成物は、例えば、ＨＤＬが脂質に対して高い割合のタンパク質を有し、一方、ＶＬＤＬが脂質に対して低い割合のタンパク質を有するという点で異なる。
【００９８】
「Ｌｐ（ａ）」は、アポ（ａ）およびアポＢを含有するＬＤＬ様粒子を含む。アポ（ａ）は、ジスルフィド結合によってアポＢに結合される。
【００９９】
「低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）」は、低密度リポタンパク質粒子に保有されるコレステロールを意味する。血清（または血漿）中のＬＤＬ−Ｃの濃度は、典型的には、ｍｇ／ｄＬまたはｎｍｏｌ／Ｌで定量化される。「血清ＬＤＬ−Ｃ」および「血漿ＬＤＬ−Ｃ」は、それぞれ、血清および血漿中のＬＤＬ−Ｃを意味する。
【０１００】
「主要危険因子」は、特定の疾患または状態に関して高い危険性の一因となる因子を指す。ある特定の実施形態では、冠動脈心疾患の主要リスク因子は、喫煙、高血圧、高ＬＤＬ、低ＨＤＬ−Ｃ、冠動脈心疾患の家族歴、年齢、および本明細書に開示される他の因子を含むが、これらに限定されない。
【０１０１】
「代謝障害」または「代謝疾患」は、代謝機能における変化または障害を特徴とする状態を指す。「代謝性」および「代謝」は、当技術分野において周知である用語であり、一
般的に、生存生物内に生じる生化学過程の全範囲を含む。代謝障害は、高血糖症、前糖尿病、糖尿病（１型および２型）、肥満、インスリン耐性、代謝症候群、および２型糖尿病による脂質異常症を含むが、これらに限定されない。
【０１０２】
「代謝症候群」は代謝由来の脂質および非脂質心血管危険因子のクラスター化を特徴とする状態を意味する。ある特定の実施形態では、代謝症候群は、次の因子のうちの任意の３つの存在により特定される：男性においては１０２ｃｍより大きい、または女性においては８８ｃｍより大きい胴囲、少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬの血清トリグリセリド、男性においては４０ｍｇ／ｄＬ未満、または女性においては５０ｍｇ／ｄＬ未満のＨＤＬ−Ｃ、少なくとも１３０／８５ｍｍＨｇの血圧、および少なくとも１１０ｍｇ／ｄＬの空腹時グルコース。これらの決定因子は、臨床現場において容易に測定することができる（ＪＡＭＡ，２００１，２８５：２４８６−２４９７）。
【０１０３】
「ミスマッチ」または「非相補的核酸塩基」は、第１の核酸の核酸塩基が、第２のまたは標的核酸の対応する核酸塩基と対合することが不可能である場合を指す。
【０１０４】
「混合型脂質異常症」は、コレステロールの上昇およびトリグリセリドの上昇を特徴とする状態を意味する。
【０１０５】
「修飾ヌクレオシド間結合」は、天然に存在するヌクレオシド間結合（すなわち、ホスホジエステルヌクレオシド間結合）からの置換または任意の変化を指す。例えば、ホスホロチオエート結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。
【０１０６】
「修飾核酸塩基」は、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、またはウラシル以外の任意の核酸塩基を指す。例えば、５−メチルシトシンは、修飾核酸塩基である。「非修飾核酸塩基」は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を意味する。
【０１０７】
「修飾ヌクレオシド」は、少なくとも１つの修飾糖部分および／または修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを意味する。
【０１０８】
「修飾ヌクレオチド」は、少なくとも１つの修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間結合、および／または修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを意味する。
【０１０９】
「修飾オリゴヌクレオチド」は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを意味する。
【０１１０】
「修飾糖」は、天然糖からの置換または変化を指す。例えば、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖は修飾糖である。
【０１１１】
「ＭＯＥヌクレオシド」は、２’位にＭＯＥを含む２’置換された糖部分を含むヌクレオシドを意味する。
【０１１２】
「モチーフ」は、アンチセンス化合物中の化学的に異なる領域のパターンを意味する。
【０１１３】
「天然に存在するヌクレオシド間結合」は、３’からの５’ホスホジエステル結合を意味する。
【０１１４】
「天然糖部分」は、ＤＮＡ（２’−Ｈ）またはＲＮＡ（２’−ＯＨ）に見出される糖を意味する。
【０１１５】
「核酸」は、モノマーヌクレオチドから構成される分子を指す。核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、１本鎖核酸（ｓｓＤＮＡ）、２本鎖核酸（ｄｓＤＮＡ）、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、およびミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。核酸は、単一分子中のこれらの要素の任意の組み合わせも含み得る。
【０１１６】
「核酸塩基」は、別の核酸の塩基と対合することが可能な複素環式部分を意味する。
【０１１７】
「核酸塩基相補性」は、別の核酸塩基との塩基対合することが可能である核酸塩基を指す。例えば、ＤＮＡにおいて、アデニン（Ａ）は、チミン（Ｔ）に相補的である。例えば、ＲＮＡにおいて、アデニン（Ａ）は、ウラシル（Ｕ）に相補的である。ある特定の実施形態では、相補的核酸塩基は、その標的核酸の核酸塩基と塩基対合することが可能であるアンチセンス化合物の核酸塩基を指す。例えば、アンチセンス化合物のある位置の核酸塩基が標的核酸のある位置の核酸塩基と水素結合することが可能である場合、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸は、その核酸塩基対で相補的であると考えられる。
【０１１８】
「核酸塩基配列」は、任意の糖、結合、または核酸塩基修飾とも無関係な連続する核酸塩基の順序を意味する。
【０１１９】
「ヌクレオシド」は、糖に結合された核酸塩基を意味する。
【０１２０】
「ヌクレオシド模倣体」は、オリゴマー化合物の１つ以上の位置において、糖または糖および塩基を置換するために使用され、必ずしも結合ではない構造を含み、例えば、非フラノース糖単位等のモルホリノ、シクロヘキセニル、シクロヘキシル、テトラヒドロピラニル、二環または三環糖模倣体を有するヌクレオシド模倣体である。
【０１２１】
「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖部分に共有結合されたリン酸基を有するヌクレオシドを意味する。
【０１２２】
「ヌクレオチド模倣体」は、例えば、ペプチド核酸またはモルホリノ（−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−または他の非ホスホジエステル結合によって結合されるモルホリノ）等のオリゴマー化合物の１つ以上の位置において、ヌクレオシドおよび結合を置換するために使用される構造を含む。
【０１２３】
「オリゴマー化合物」または「オリゴマー」は、核酸分子の領域とハイブリダイズすることが可能である、結合されたモノマーサブユニットのポリマーを意味する。ある特定の実施形態では、オリゴマー化合物は、オリゴヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、オリゴマー化合物は、オリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、オリゴマー化合物は、アンチセンス化合物である。ある特定の実施形態では、オリゴマー化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、オリゴマー化合物は、キメラオリゴヌクレオチドである。
【０１２４】
「オリゴヌクレオチド」は、結合されたヌクレオシドのポリマーであって、その各々が、互いに独立して、修飾または非修飾であり得る、結合されたヌクレオシドのポリマーを意味する。
【０１２５】
「非経口投与」は、注射または注入を通しての投与を意味する。非経口投与は、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または頭蓋内投与、例えば、髄腔内または脳室内投与を含む。投与は、連続、長期、短期、または断続的であり得る。
【０１２６】
「ペプチド」は、アミド結合によって、少なくとも２個のアミノ酸を結合することによって形成される分子を意味する。ペプチドは、ポリペプチドおよびタンパク質を指す。
【０１２７】
「医薬品」は、個体に投与されると、治療利益を提供する物質を意味する。例えば、ある特定の実施形態では、アポ（ａ）に対して標的指向されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬品である。
【０１２８】
「医薬組成物」または「組成物」は、個体に投与するのに適した物質の混合物を意味する。例えば、医薬組成物は、１つ以上の活性剤および薬学的担体、例えば減菌水溶液を含み得る。
【０１２９】
「薬学的に許容される担体」は、化合物の構造に干渉しない媒体または希釈剤を意味する。そのような担体のいくつかは、医薬組成物を、例えば、対象による経口消化用の錠剤、ピル、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液、およびロゼンジ剤として製剤化することができる。そのような担体のいくつかは、医薬組成物を注射、注入、または局所投与用に製剤化することができる。例えば、薬学的に許容される担体は、減菌水溶液であり得る。
【０１３０】
「薬学的に許容される誘導体」は、溶媒和、水和物、エステル、プロドラッグ、多形、異性体、同位体的に標識された変異体、薬学的に許容される塩、および当該技術分野に公知の他の誘導体等の、本明細書に記載される化合物の誘導体を包含する。
【０１３１】
「薬学的に許容される塩」は、アンチセンス化合物の生理学的および薬学的に許容される塩、すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を維持し、その望ましくない毒性作用を付与しない塩を意味する。用語「薬学的に許容される塩」または「塩」は、無機もしくは有機酸および塩基を含む、薬学的に許容される非毒性の酸または塩基から調製された塩を含む。本明細書に記載される「薬学的に許容される塩」は、当該技術分野に周知の方法により調製され得る。薬学的に許容される塩の概説に関しては、Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｗｅｒｍｕｔｈ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２００２）を参照。アンチセンスオリゴヌクレオチドのナトリウム塩は、有用であり、ヒトへの治療投与に良好に認容される。したがって、一実施形態では、本明細書に記載される化合物は、ナトリウム塩の形態である。
【０１３２】
「ホスホロチオエート結合」は、ヌクレオシド間の結合を意味し、ホスホジエステル結合は、非架橋酸素原子の１個を硫黄原子と置換することによって修飾される。ホスホロチオエート結合（Ｐ＝Ｓ）は、修飾ヌクレオシド間結合である。
【０１３３】
「部分」は、一定数の核酸の連続する（すなわち、結合された）核酸塩基を意味する。ある特定の実施形態では、部分は、標的核酸の一定数の連続する核酸塩基である。ある特定の実施形態では、部分は、アンチセンス化合物の一定数の連続する核酸塩基である。
【０１３４】
「予防する（Ｐｒｅｖｅｎｔ）」または「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」は、数分から不確定の時間期間の間、疾患、障害、もしくは状態の開始または発達を遅延するもしくは未然に防ぐことを指す。予防するはまた、疾患、障害、または状態を発症する危険を低下させることを意味する。
【０１３５】
「プロドラッグ」は、不活性形態に調製され、内因性の酵素もしくは他の化学物質または条件の作用によって、身体またはその細胞内において、活性形態（すなわち薬物）に変換される、治療薬剤を意味する。
【０１３６】
「上昇させる」は、量を増加することを意味する。例えば、血漿ＨＤＬレベルを上昇させることは、血漿中のＨＤＬの量を増加させることを意味する。
【０１３７】
「低下させる」は、より小さい程度、大きさ、量、または数に下げることを意味する。例えば、血漿トリグリセリドレベルを低下させることは、血漿中のトリグリセリドの量を下げることを意味する。
【０１３８】
「領域」または「標的領域」は、少なくとも１つの識別可能な構造、機能、または特徴を有する標的核酸の一部分と定義される。例えば、標的領域は、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、エクソン、イントロン、エクソン／イントロン接続部分、コード領域、翻訳開始領域、翻訳終結領域、または他の規定核酸領域を包含し得る。アポ（ａ）の構造的に定義された領域は、ＮＣＢＩ等の配列データベースからの受託番号により得ることができ、そのような情報は、参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、標的領域は、標的領域内の１つの標的セグメントの５’標的部位から標的領域内の別の標的セグメントの３’標的部位までの配列を包含し得る。
【０１３９】
「リボヌクレオチド」は、ヌクレオチドの糖部分の２’位にヒドロキシを有するヌクレオチドを意味する。リボヌクレオチドは、様々な置換基のいずれかで修飾され得る。
【０１４０】
「第２の薬剤」または「第２の治療剤」は、「第１の薬剤」と組み合わせて使用することができる薬剤を意味する。第２の治療剤は、アポ（ａ）またはアポＢを標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得るが、これに限定されない。第２の薬剤は、抗アポ（ａ）抗体、アポ（ａ）ペプチド阻害剤、コレステロール降下剤、脂質降下剤、グルコース降下剤、および抗炎症剤も含み得る。
【０１４１】
「セグメント」は、核酸内の領域のより小さいサブ部分と定義される。例えば、「標的セグメント」は、１つ以上のアンチセンス化合物が標的指向される、標的核酸のヌクレオチドの配列を意味する。「５’標的部位」は、標的セグメントの最も５’側のヌクレオチドを指す。「３’標的部位」は、標的セグメントの最も３’側のヌクレオチドを指す。代替として、「開始部位」は、標的セグメントの最も５’側のヌクレオチドを指し、「終止部位」は、標的セグメントの最も３’側のヌクレオチドを指す。標的セグメントは、１つの配列の「開始部位」で始まり、別の配列の「終止部位」で終わることもできる。
【０１４２】
本明細書に教示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは標的核酸の「短縮」または「先端切断」型は、１つ、２つまたはそれ以上のヌクレオシドが欠失している。
【０１４３】
「副作用」は、所望の効果以外の治療に起因する生理学的応答を意味する。ある特定の実施形態では、副作用は、注射部位反応、肝機能検査異常、腎機能異常、肝毒性、腎毒性、中枢神経系の異常、ミオパシー、および倦怠感を含む。例えば、血清アミノトランスフェラーゼレベルの増加は、肝毒性または肝機能異常を示し得る。例えば、ビリルビンの増加は、肝毒性または肝機能異常を示し得る。
【０１４４】
「１本鎖オリゴヌクレオチド」は、相補鎖へハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドを意味する。
【０１４５】
「特異的にハイブリダイズし得る」は、所望の効果を誘導するのに標的核酸に十分な程度の相補性を有する一方、特異的結合が、所望される条件下、すなわち、体内アッセイおよび療法的治療の場合における生理学的条件下において、非標的核酸に最小限または全く効果を示さない、アンチセンス化合物を指す。
【０１４６】
「スタチン」は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の活性を阻害する薬剤を意味する。
【０１４７】
「皮下投与」は、皮膚のちょうど下への投与を意味する。
【０１４８】
「対象」は、治療または療法のために選択されるヒトまたはヒト以外の動物を意味する。
【０１４９】
「糖部分」は、ヌクレオシドの天然に生じる糖部分または修飾糖部分を意味する。
【０１５０】
「心血管疾患または障害の症状」は、心血管疾患または障害から生じ、それに付随する事象を意味し、その兆候としての役割を果たす。例えば、狭心症、胸痛、息切れ、動悸、脱力感、めまい、悪心、発汗、頻拍、徐脈、不整脈、心房細動、下肢の腫れ、チアノーゼ、疲労、失神、顔面のしびれ、四肢のしびれ、跛行もしくは筋肉の痙攣、腹部の膨満、または発熱は、心血管疾患または障害の症状である。
【０１５１】
「標的指向する」または「標的指向される」は、標的核酸へ特異的にハイブリダイズして、所望の効果を引き起こすアンチセンス化合物の設計および選択の過程を意味する。
【０１５２】
「標的核酸」、「標的ＲＮＡ」、および「標的ＲＮＡ転写物」はすべて、アンチセンス化合物によって標的指向されることが可能な核酸を指す。
【０１５３】
「治療的有効量」は、個体へ治療利益をもたらす医薬品の量を意味する。
【０１５４】
「治療的生活様式の変更」は、脂肪／脂肪組織量および／またはコレステロールを降下させることを目的とする食事および生活様式の変更を意味する。そのような変更は、心疾患の発達の危険性を低下させることができ、１日の総カロリー、総脂肪、飽和脂肪、多価不飽和脂肪、一不飽和脂肪、炭水化物、タンパク質、コレステロール、不溶性繊維の食事摂取の推奨、ならびに身体活動の推奨を含み得る。
【０１５５】
「治療する（Ｔｒｅａｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患、障害、もしくは状態の変化または改善をもたらすために、本明細書に記載される化合物を投与することを指す。
【０１５６】
「トリグリセリド」または「ＴＧ」は、３つの脂肪酸分子と組み合わされたグリセロールからなる脂質または中性脂肪を意味する。
【０１５７】
「２型糖尿病」（「２型真性糖尿病」、「真性糖尿病２型」、「非インスリン依存糖尿病」、「ＮＩＤＤＭ」、「肥満関連糖尿病」、または「成人発症型糖尿病」としても知られる）は、インスリン耐性、相対的インスリン欠乏、および高血糖症を主に特徴とする代謝障害である。
【０１５８】
「非修飾ヌクレオチド」は、天然に存在する核酸塩基、糖部分、およびヌクレオシド間結合から構成される、ヌクレオチドを意味する。ある特定の実施形態では、非修飾ヌクレオチドは、ＲＮＡヌクレオチド（すなわち、β−Ｄ−リボヌクレオシド）またはＤＮＡヌクレオチド（すなわち、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド）である。
【０１５９】
「ウィングセグメント」は、阻害活性の増強、標的核酸への結合親和性の増加、または体内ヌクレアーゼによる分解に対する耐性等の特性をオリゴヌクレオチドに付与するように修飾される１つまたは複数のヌクレオシドを意味する。
【０１６０】
ある特定の実施形態
ある特定の実施形態は、アポ（ａ）ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を減少させるための化合物および方法を提供する。ある特定の実施形態では、化合物は、アポ（ａ）関連疾患を治療する、予防する、または寛解させるためのアポ（ａ）特異的阻害剤である。ある特定の実施形態では、化合物は、アポ（ａ）を標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０１６１】
ある特定の実施形態は、Ｌｐ（ａ）レベルを減少させるための化合物および方法を提供する。ある特定の実施形態では、化合物は、Ｌｐ（ａ）関連疾患を治療する、予防する、または寛解させるためのアポ（ａ）特異的阻害剤である。ある特定の実施形態では、化合物は、アポ（ａ）を標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０１６２】
ある特定の実施形態は、１２〜３０個の結合されたヌクレオシドからなるアポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、１５〜３０個、１８〜２４個、１９〜２２個、１３〜２５個、１４〜２５個、１５〜２５個の結合されたヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、または３０個の結合されたヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２０個の結合されたヌクレオシドからなる。
【０１６３】
ある特定の実施形態は、配列番号１〜４のいずれかの等長部分に相補的な少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の連続する核酸塩基を含むアポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。ある特定の実施形態は、表３〜１３および２８〜３０に示される標的セグメントのいずれかの等長部分に相補的な少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の連続する核酸塩基を含むアポ（ａ）セグメントを標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。表において、「開始部位」は、標的セグメントの最も５’側のヌクレオチドを指し、「停止部位」は、標的セグメントの最も３’側のヌクレオチドを指す。標的セグメントは、表に列挙される各配列の開始部位から停止部位の範囲であり得る。代替として、標的セグメントは、１つの配列の開始部位からの範囲であり得、別の配列の停止部位で停止し得る。例えば、表５に示されるように、標的セグメントは、配列番号５８の開始部位から停止部位の３９０１〜３９２０の範囲であり得る。別の例では、表５に示されるように、標的セグメントは、配列番号５７の開始部位から配列番号６１の停止部位の３９００〜３９２３の範囲であり得る。
【０１６４】
ある特定の実施形態は、アポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１〜４のいずれかに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％相補的である。ある特定の実施形態は、アポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、表３〜１３および２８〜３０に示される標的セグメントのいずれかに少なくとも８０％、少なくとも８
５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％相補的である。
【０１６５】
ある特定の実施形態は、１２〜３０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号１の核酸塩基３９０１〜３９２０の等長部分に相補的である少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の連続する核酸塩基の一部分を含む核酸塩基配列を含むアポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１に少なくとも８０％相補的である。
【０１６６】
ある特定の実施形態は、１２〜３０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号１の核酸塩基３９００〜３９２３の等長部分に相補的である少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、または３０個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を含むアポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１に少なくとも８０％相補的である。
【０１６７】
ある特定の実施形態は、１２〜３０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号１２〜１３０、１３３、１３４の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有するアポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１２〜１３０、１３３、１３４の核酸塩基配列のうちのいずれか１つの少なくとも８個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。
【０１６８】
ある特定の実施形態は、１２〜３０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号１２〜２０、２２〜３３、３５〜４４、４７〜５０、５１、５３、５７〜６２、６５〜６６、６８、７０〜７９、８１、８５〜８６、８９〜９０、９２〜９４、９７、１０５〜１１０、１０３〜１０４、１３３〜１３４の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有するアポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。
【０１６９】
ある特定の実施形態は、１２〜３０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号１２〜１９、２６〜３０、３２、３５、３８〜４４、４６〜４７、５０、５７〜５８、６１、６４〜６６、６８、７２〜７４、７６〜７７、９２〜９４、１０３〜１１０の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有するアポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。
【０１７０】
ある特定の実施形態は、１２〜３０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号１１１、１１４〜１２１、１２３〜１２９の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有するアポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。
【０１７１】
ある特定の実施形態は、１２〜３０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号１４、１７、１８、２６〜２８、３９、７１、１０６〜１０７の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有するアポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。
【０１７２】
ある特定の実施形態は、１２〜３０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号１４、２６〜２９、３９〜４０、８２の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有するアポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。
【０１７３】
ある特定の実施形態は、１２〜３０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号１４、１６〜１８の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有するアポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。
【０１７４】
ある特定の実施形態は、１２〜３０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号２６〜２７、１０７の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有するアポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。
【０１７５】
ある特定の実施形態は、１２〜３０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号２８〜２９、３９〜４０、４７の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有するアポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。
【０１７６】
ある特定の実施形態は、１２〜３０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号２８、９３、１０４、１３４の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有するアポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。
【０１７７】
ある特定の実施形態は、１２〜３０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号５８の核酸塩基配列の少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有するアポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号５８の核酸塩基配列の少なくとも８個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。
【０１７９】
ある特定の実施形態は、アポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、１本鎖である。
【０１８０】
ある特定の実施形態は、アポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。ある特定の実施形態では、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０１８１】
ある特定の実施形態は、アポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、少なくとも１つのヌクレオシドは、修飾核酸塩基を含む。ある特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、５−メチルシトシンである。
【０１８２】
ある特定の実施形態は、アポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾糖を含む。ある特定の実施形態では、修飾糖は、二環式糖である。ある特定の実施形態では、修飾糖は、２’−Ｏ−メトキシエチル、拘束エチル、３’−フルオロ−ＨＮＡ、または４’−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−２’架橋を含み、ｎは、１または２である。
【０１８３】
ある特定の実施形態は、アポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ（ａ）結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、（ｂ）結合されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント、（ｃ）結合されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含み、ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、かつ各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、修飾糖を含む。
【０１８４】
ある特定の実施形態は、アポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、２０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ（ａ）１０個の結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、（ｂ）５個の結合されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント、（ｃ）５個の結合されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含み、ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、かつ各シトシン残基は、５−メチルシトシンである。
【０１８５】
ある特定の実施形態は、アポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、２０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号１２〜１３０、１３３、１３４のいずれかの少なくとも８個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有し、修飾オリゴヌクレオチドは、（ａ）１０個の結合されたデ
オキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、（ｂ）５個の結合されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント、（ｃ）５個の結合されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含み、ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、かつ各シトシン残基は、５−メチルシトシンである。
【０１８６】
ある特定の実施形態は、アポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、２０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号５８の少なくとも８個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有し、修飾オリゴヌクレオチドは、（ａ）１０個の結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、（ｂ）５個の結合されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント、（ｃ）５個の結合されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含み、ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、かつ各シトシン残基は、５−メチルシトシンである。
【０１８７】
ある特定の実施形態は、アポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを提供し、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号５８の核酸塩基配列を有する２０個の結合されたヌクレオシドからなり、修飾オリゴヌクレオチドは、（ａ）１０個の結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、（ｂ）５個の結合されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント、（ｃ）５個の結合されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含み、ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、かつ各シトシン残基は、５−メチルシトシンである。
【０１８８】
ある特定の実施形態では、化合物は塩形態である。さらなる実施形態では、化合物は、薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む。ある特定の実施形態では、化合物は、アポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチド、またはその塩、および薬学的に許容される担体もしくは希釈剤を含む。
【０１８９】
ある特定の実施形態は、本明細書に記載される化合物を含む組成物を提供し、化合物の粘度レベルは、４０センチポアズ（ｃＰ）未満である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるアンチセンス化合物は、実施例１３に記載されるパラメータによって測定されるとき、４０ｃＰ未満、３５ｃＰ未満、３０ｃＰ未満、２５ｃＰ未満、２０ｃＰ未満、または１５ｃＰ未満の粘度を有することによって有効である。
【０１９０】
ある特定の実施形態は、アポ（ａ）関連疾患、障害、または状態を治療するための療法に使用するための組成物および方法を提供する。ある特定の実施形態は、Ｌｐ（ａ）関連疾患、障害、または状態を治療するための療法に使用するための組成物および方法を提供する。ある特定の実施形態では、組成物は、アポ（ａ）特異的阻害剤を含む化合物である。ある特定の実施形態では、アポ（ａ）特異的阻害剤は、核酸である。ある特定の実施形態では、核酸は、アンチセンス化合物である。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、アポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、アポ（ａ）を標的指向する修飾オリゴヌクレオチドは、心血管および／または代謝疾患、障害、または状態を治療する、予防する、その進行を緩慢にさせる、または寛解させるのに使用される。ある特定の実施形態では、療法のための組成物および方法は、アポ（ａ）特異的阻害剤を、それを必要とする個体に投与することを含む。
【０１９１】
ある特定の実施形態は、アポ（ａ）レベルを低下させるための組成物および方法を提供する。ある特定の実施形態は、Ｌｐ（ａ）レベルを低下させるための組成物および方法を提供する。ある特定の実施形態では、組織、臓器、または対象におけるアポ（ａ）レベルを低下させることにより、ＬＤＬのＨＤＬに対する比率、またはＴＧのＨＤＬに対する比率を改善する。
【０１９２】
ある特定の実施形態は、アポ（ａ）関連疾患、障害、および状態を予防する、治療する、遅延させる、その進行を緩慢にさせる、および／または寛解させるための組成物および方法を、それを必要とする対象に提供する。ある特定の実施形態は、Ｌｐ（ａ）関連疾患、障害、および状態を予防する、治療する、遅延させる、その進行を緩慢にさせる、および／または寛解させるための組成物および方法を、それを必要とする対象に提供する。ある特定の実施形態では、そのような疾患、障害、および状態は、心血管、および／または代謝疾患、障害、および状態を含む。ある特定のそのような心血管疾患、障害、または状態は、動脈瘤（例えば腹部大動脈瘤）、狭心症、不整脈、粥状動脈硬化、脳血管疾患、冠動脈疾患、冠動脈心疾患、脂質異常症、高コレステロール血症、高脂血症、高血圧、高トリグリセリド血症、心筋梗塞、末梢血管疾患（例えば末梢動脈疾患、末梢動脈閉塞性疾患）網膜血管閉塞、または脳卒中を含むが、これらに限定されない。ある特定のそのような代謝疾患、障害、または状態は、高血糖症、前糖尿病、糖尿病（１型および２型）、肥満、インスリン耐性、代謝症候群、および糖尿病性脂質異常症を含むが、これらに限定されない。ある特定のそのような炎症性疾患、障害、または状態は、冠動脈疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）（ＣＡＤ）、アルツハイマー病、および血栓塞栓疾患、障害、または状態を含むが、これらに限定されない。ある特定の血栓塞栓疾患、障害、または状態は、脳卒中、血栓症（例えば静脈血栓塞栓症）、心筋梗塞、および末梢血管疾患を含むが、これらに限定されない。
【０１９３】
ある特定の実施形態は、心血管疾患、障害、または状態の少なくとも１つの症状を低下させる方法を提供する。ある特定の実施形態では、症状は、狭心症、胸痛、息切れ、動悸、脱力感、めまい、悪心、発汗、頻拍、徐脈、不整脈、心房細動、下肢の腫れ、チアノーゼ、疲労、失神、顔面のしびれ、四肢のしびれ、跛行もしくは筋肉の痙攣、腹部の膨満、および発熱を含むが、これらに限定されない。
【０１９４】
ある特定の実施形態では、アポ（ａ）またはＬｐ（ａ）発現の調節は、細胞、組織、または臓器で生じる。ある特定の実施形態では、調節は、動物の細胞、組織、または臓器で生じる。ある特定の実施形態では、調節は、アポ（ａ）ｍＲＮＡレベルの低下である。ある特定の実施形態では、調節は、アポ（ａ）タンパク質レベルの低下である。ある特定の実施形態では、アポ（ａ）ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方が低下する。ある特定の実施形態では、調節は、Ｌｐ（ａ）レベルの低下である。そのような低下は、時間依存または用量依存様式で生じ得る。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、対象または動物は、ヒトである。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、化合物は、非経口的に投与される。さらなる実施形態では、非経口投与は、皮下である。
【０１９７】
ある特定の実施形態では、化合物は、第２の薬剤または療法と同時投与される。ある特定の実施形態では、第２の薬剤は、グルコース降下剤である。ある特定の実施形態では、第２の薬剤は、ＬＤＬ、ＴＧ、またはコレステロール降下剤である。ある特定の実施形態では、第２の薬剤は、抗炎症剤である。ある特定の実施形態では、第２の薬剤は、アルツハイマー病治療薬である。ある特定の実施形態では、第２の薬剤は、非ステロイド性抗炎
症性薬物（ＮＳＡＩＤ、例えばアスピリン）、ナイアシン（例えばＮｉａｓｐａｎ）、ニコチン酸、アポＢ阻害剤（ミポメルセン）、ＣＥＴＰ阻害剤（例えばＡｎａｃｅｔｒａｐｉｂ）、アポ（ａ）阻害剤、甲状腺ホルモン類似体（例えばＥｐｒｏｔｉｒｏｍｅ）、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（例えばスタチン）、フィブラート（例えばＧｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ）、およびミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質阻害剤（例えばＬｏｍｉｔａｐｉｄｅ）であり得るが、これらに限定されない。療法は、Ｌｐ（ａ）アフェレシスであり得るが、これに限定されない。薬剤または療法は、同時投与されるか、または併用して投与され得る。薬剤または療法は、経時的に、または引き続き投与され得る。
【０１９８】
ある特定の実施形態は、動物におけるアポ（ａ）レベルを減少させるために、アポ（ａ）に対して標的指向される化合物の使用を提供する。ある特定の実施形態は、動物におけるＬｐ（ａ）レベルを減少させるために、アポ（ａ）に対して標的指向される化合物の使用を提供する。ある特定の実施形態は、アポ（ａ）に関連する疾患、障害、または状態を治療する、予防する、または寛解させるために、アポ（ａ）に対して標的指向される化合物の使用を提供する。ある特定の実施形態は、Ｌｐ（ａ）に関連する疾患、障害、または状態を治療する、予防する、または寛解させるために、アポ（ａ）に対して標的指向される化合物の使用を提供する。
【０１９９】
ある特定の実施形態は、動物におけるアポ（ａ）レベルを減少させるための薬剤の調製において、アポ（ａ）に対して標的指向される化合物の使用を提供する。ある特定の実施形態は、動物におけるＬｐ（ａ）レベルを減少させるための薬剤の調製において、アポ（ａ）に対して標的指向される化合物の使用を提供する。ある特定の実施形態は、アポ（ａ）に関連する疾患、障害、または状態を治療する、予防する、または寛解させるために、薬剤の調製のための化合物の使用を提供する。ある特定の実施形態は、Ｌｐ（ａ）に関連する疾患、障害、または状態を治療する、予防する、または寛解させるために、薬剤の調製のための化合物の使用を提供する。
【０２００】
ある特定の実施形態は、本明細書に記載される疾患、障害、または状態を治療する、予防するまたは寛解させるためのキットを提供し、キットは、（ｉ）本明細書に記載されるアポ（ａ）特異的阻害剤、および任意に（ｉｉ）本明細書に記載される第２の薬剤または療法を含む。
【０２０１】
本発明のキットは、本明細書に記載される併用療法により、本明細書に記載される疾患、障害、または状態を治療する、予防する、または寛解させるためのキットを使用するための説明書をさらに含み得る。
【０２０２】
アンチセンス化合物
オリゴマー化合物は、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣体、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ミクロＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡを含むが、これらに限定されない。オリゴマー化合物は、標的核酸に「アンチセンス」であってよく、水素結合を介して標的核酸とハイブリダーセーションを起こすことが可能であることを意味する。
【０２０３】
ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、５’から３’方向に書かれる時、標的指向される、標的核酸の標的セグメントの逆補体を含む、核酸塩基配列を有する。ある特定のかかる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’から３’方向に書かれる時、標的指向される、標的核酸の標的セグメントの逆補体を含む、核酸塩基配列を有する。
【０２０４】
ある特定の実施形態では、アポ（ａ）核酸に対して標的指向されるアンチセンス化合物
は、長さが１２〜３０個のサブユニットである。言い換えると、そのようなアンチセンス化合物は、１２〜３０個の結合されたサブユニットである。他の実施形態では、アンチセンス化合物は、８〜８０個、１０〜８０個、１２〜５０個、１５〜３０個、１８〜２４個、１９〜２２個、１３〜２５個、１４〜２５個、または１５〜２５個の結合されたサブユニットである。ある特定のそのような実施形態では、アンチセンス化合物は、長さが８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、または８０個の結合されたサブユニットであるか、または上記の値のうちの任意の２つによって画定される範囲である。ある特定のそのような実施形態では、アンチセンス化合物は、長さが８個の結合されたサブユニットである。いくつかの実施形態では、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、結合されるサブユニットは、ヌクレオシドである。
【０２０５】
ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、短縮または先端切断された修飾オリゴヌクレオチドを含む。短縮または先端切断された修飾オリゴヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオシドが５’端（５’先端切断）から欠失されているか、１つ以上のヌクレオシドが３’端（３’先端切断）から欠失されているか、または１つ以上のヌクレオシドが中央部から欠失されていてよい。代替として、欠失されたヌクレオシドは、修飾オリゴヌクレオチド全体に分散してもよく、例えば、あるアンチセンス化合物では、１個のヌクレオシドが、５’端から欠失され、１個のヌクレオシドが、３’端から欠失されている。
【０２０６】
延長されたオリゴヌクレオチド中に単一の付加ヌクレオシドが存在するとき、付加ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの中央部、５’、または３’端に位置してよい。２つ以上の付加ヌクレオシドが存在するとき、付加されたヌクレオシドは、互いに隣接してよく、例えば、あるオリゴヌクレオチドでは、２つのヌクレオシドがオリゴヌクレオチドの中央部、５’端へ付加（５’付加）されるか、または代替として、３’端へ付加（３’付加）される。代替として、付加されたヌクレオシドは、アンチセンス化合物全体に分散してよく、例えば、あるオリゴヌクレオチドでは、１つのヌクレオシドが５’端へ付加され、１つのサブユニットが３’端へ付加される。
【０２０７】
活性を消失させること無く、アンチセンスオリゴヌクレオチドのようなアンチセンス化合物の長さを増加あるいは減少させること、および／またはミスマッチ塩基を導入することが可能である。例えば、Ｗｏｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７３０５−７３０９，１９９２）では、長さが１３〜２５核酸塩基の一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、卵母細胞注入モデルにおいて標的ＲＮＡの切断を誘導するその能力が試験された。アンチセンスオリゴヌクレオチドの末端付近に８または１１のミスマッチ塩基がある、長さが２５核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミスマッチを含有しないアンチセンスオリゴヌクレオチドより低い程度であったが、標的ｍＲＮＡの特異的な切断を指令することができた。同様に、１または３つのミスマッチがあるものが含まれる、１３核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、標的特異的な切断が達成された。
【０２０８】
Ｇａｕｔｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９３：４６３−４７１，Ｍａｒｃｈ  ２００１）は、ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡへの１００％相補性を有して、ｂｃｌ−ｘＬ  ｍＲＮＡに対して３つのミスマッチを有するオリゴヌクレオチドが
ｂｃｌ−２とｂｃｌ−ｘＬの両方の発現を体外および体内で低下させる能力を実証した。さらに、このオリゴヌクレオチドは、強力な抗腫瘍活性を体内で明示した。
【０２０９】
Ｍａｈｅｒ  ａｎｄ  Ｄｏｌｎｉｃｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１６：３３４１−３３５８，１９８８）は、一連のタンデム１４核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、このタンデムアンチセンスオリゴヌクレオチドの２または３の配列より構成される、各々２８および４２の核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、ウサギ網状赤血球アッセイにおいてヒトＤＨＦＲの翻訳を阻止するその能力を試験した。３つの１４核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドの各々は、２８または４２の核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドより控え目なレベルであるものの、単独で翻訳を阻害することができた。
【０２１０】
アンチセンス化合物モチーフ
ある特定の実施形態では、アポ（ａ）核酸に対して標的指向されるアンチセンス化合物は、阻害活性の増強、標的核酸への結合親和性の増加、または体内ヌクレアーゼによる分解への耐性等の特性をアンチセンス化合物へ付与する、パターン配置された化学修飾サブユニットまたはモチーフを有する。
【０２１１】
キメラアンチセンス化合物は、典型的には、ヌクレアーゼ分解への抵抗性増加、細胞取り込み増加、標的核酸への結合親和性の増加、および／または抑制活性の増加を付与するように修飾された、少なくとも１つの領域を含有する。キメラアンチセンス化合物の第２の領域は、任意に、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する、細胞性エンドヌクレアーゼＲＮａｓｅ  Ｈの基質としての役割を果たしてもよい。
【０２１２】
ギャップマーモチーフを有するアンチセンス化合物は、キメラアンチセンス化合物とみなされる。ギャップマーでは、ＲＮａｓｅ  Ｈ切断を支援する複数のヌクレオチドを有する内部領域が、内部領域のヌクレオシドとは化学的に異なる複数のヌクレオチドを有する外部領域間に位置する。ギャップマーモチーフを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、ウィングセグメントが修飾ヌクレオシドを含むのに対し、ギャップセグメントは、概して、エンドヌクレアーゼ切断の基質としての役割を果たす。ある特定の実施形態では、ギャップマーの領域は、各々異なる領域を含む糖部分の種類によって区別される。ギャップマーの領域を区別するために使用される糖部分の種類として、いくつかの実施形態では、β−Ｄ−リボヌクレオシド、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド、２’修飾ヌクレオシド（かかる２’修飾ヌクレオシドは、とりわけ、２’−ＭＯＥ、および２’−Ｏ−ＣＨ３を含んでもよい）、および二環式糖修飾ヌクレオシド（かかる二環式糖修飾ヌクレオシドは、４’−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−２’架橋を有するものを含んでもよく、ここでは、ｎ＝１またはｎ＝２である）が挙げられ得る。好ましくは、各異なる領域は、均一の糖部分を含む。ウィング−ギャップ−ウィングモチーフは、多くの場合、「Ｘ−Ｙ−Ｚ」と記載され、ここでは、「Ｘ」は、５’ウィング領域の長さを表し、「Ｙ」は、ギャップ領域の長さを表し、「Ｚ」は、３’ウィング領域の長さを表す。本明細書で使用されるとき、「Ｘ−Ｙ−Ｚ」として記載されるギャップマーは、ギャップセグメントが、５’ウィングセグメントおよび３’ウィングセグメントの各々に直接隣接して位置付けられるような構成を有する。したがって、５’ウィングセグメントとギャップセグメントとの間、またはギャップセグメントと３’ウィングセグメントとの間に介在ヌクレオチドは存在しない。本明細書で説明されるアンチセンス化合物のいずれも、ギャップマーモチーフを有する可能性がある。いくつかの実施形態では、ＸおよびＺは、同一であって、他の実施形態では、異なる。好ましい実施形態では、Ｙは、８から１５のヌクレオチドである。Ｘ、Ｙ、またはＺは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個以上のヌクレ
オチドのいずれかであり得る。したがって、ギャップマーは、例えば、５−１０−５、４−８−４、４−１２−３、４−１２−４、３−１４−３、２−１３−５、２−１２−２、２−１６−２、１−１８−１、３−１０−３、２−１０−２、１−１０−１、２−８−２、６−８−６、５−８−５、１−８−１、２−６−２、２−１３−２、１−８−２、２−８−３、３−１０−２、１−１８−２、または２−１８−２を含むが、それらに限定されない。
【０２１３】
ある特定の実施形態では、「ウィングマー」モチーフとしてのアンチセンス化合物は、ウィング−ギャップまたはギャップ−ウィング構成、すなわち、ギャップマー構成について上記に説明されるようなＸ−ＹまたはＹ−Ｚ構成を有する。したがって、ウィングマー構成は、例えば、５−１０、８−４、４−１２、１２−４、３−１４、１６−２、１８−１、１０−３、２−１０、１−１０、８−２、２−１３、または５−１３を含むが、これらに限定されない。
【０２１４】
ある特定の実施形態では、アポ（ａ）核酸に対して標的指向されるアンチセンス化合物は、５−１０−５ギャップマーモチーフを保有する。
【０２１５】
ある特定の実施形態では、アポ（ａ）核酸に対して標的指向されるアンチセンス化合物は、ギャップ拡張モチーフを有する。
【０２１６】
標的核酸、標的領域、およびヌクレオチド配列
アポ（ａ）標的配列をコードするヌクレオチド配列は、次の：配列番号１として本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿００５５７７．２、配列番号２として本明細書に組み込まれるヌクレオチド３２３００００〜３３８００００が先端切断されたＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＴ＿００７４２２．１２、配列番号３として本明細書に示されるヌクレオチド６５１２００００〜６５２５８０００が先端切断されたＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＴ＿０２５７４１．１５、および配列番号４として本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿００５５７７．１を含むが、これらに限定されない。
【０２１７】
本明細書に含有される実施例において、各配列番号に記載される配列は、糖部分、ヌクレオシド間結合、または核酸塩基に対するどの修飾とも無関係であると理解されたい。したがって、配列番号によって定義されるアンチセンス化合物は、糖部分、ヌクレオシド間結合、または核酸塩基に対する１つ以上の修飾を独立的に含んでよい。Ｉｓｉｓ番号（Ｉｓｉｓ  Ｎｏ．）によって記載されるアンチセンス化合物は、核酸塩基配列およびモチーフの組み合わせを示す。
【０２１８】
ある特定の実施形態では、「標的領域」は、標的核酸の構造的に規定される領域である。例えば、標的領域は、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、エクソン、イントロン、エクソン／イントロン接続部分、コーディング領域、翻訳開始領域、翻訳終結領域、または他の規定核酸領域を包含し得る。アポ（ａ）の構造的に定義された領域は、ＮＣＢＩ等の配列データベースからの受託番号により得ることができ、そのような情報は、参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、標的領域は、標的領域内の１つの標的セグメントの５’標的部位から同一標的領域内の別の標的セグメントの３’標的部位までの配列を包含し得る。
【０２１９】
ある特定の実施形態では、「標的セグメント」は、核酸内の標的領域のより小さいサブ部分である。例えば、標的セグメントは、１つ以上のアンチセンス化合物が標的指向される標的核酸のヌクレオチドの配列であってよい。「５’標的部位」は、標的セグメントの最も５’側のヌクレオチドを指す。「３’標的部位」は、標的セグメントの最も３’側のヌクレオチドを指す。
【０２２０】
標的領域は、１つ以上の標的セグメントを含有し得る。標的領域内の複数の標的セグメントは重複することができる。代替として、それらは重複しなくてよい。ある特定の実施形態では、標的領域内の標的セグメントは、約３００個以下のヌクレオチドによって分離される。ある特定の実施形態では、標的領域内の標的セグメントは、標的核酸上のいくつかの、すなわち、約２５０個、２００個、１５０個、１００個、９０個、８０個、７０個、６０個、５０個、４０個、３０個、２０個、または１０個のヌクレオチドである、それ以下である、約それ以下である、または先行値の任意の２つによって規定される範囲であるヌクレオチドによって分離される。ある特定の実施形態では、標的領域内の標的セグメントは、標的核酸上の５以下、または約５以下のヌクレオチドによって分離される。ある特定の実施形態では、標的セグメントは連続的である。本明細書に列挙される５’標的部位または３’標的部位のいずれかである、開始核酸を有する範囲によって規定される標的領域が企図される。
【０２２１】
標的指向することには、所望の効果が生じるようにアンチセンス化合物がハイブリダイズする、少なくとも１つの標的セグメントの決定が含まれる。ある特定の実施形態では、所望の効果は、ｍＲＮＡ標的核酸レベルの低下である。ある特定の実施形態では、所望の効果は、標的核酸によってコードされるタンパク質のレベルの低下、または標的核酸に関連した表現型の変化である。
【０２２２】
好適な標的セグメントは、５’ＵＴＲ、コーディング領域、３’ＵＴＲ、イントロン、エクソン、またはエクソン／イントロン接続部分内に見出され得る。開始コドンまたは終止コドンを含有する標的セグメントも、好適な標的セグメントである。好適な標的セグメントには、開始コドンまたは終止コドンのような、ある構造的に規定される領域が特異的に排除されてよい。
【０２２３】
好適な標的セグメントの決定は、標的核酸の配列を他の配列とゲノム全体で比較することを含めてもよい。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、異なる核酸の間で類似した領域を同定することができる。この比較により、選択される標的核酸以外の配列（すなわち、非標的または標的外配列）に非特異的な様式でハイブリダイズし得るアンチセンス化合物配列の選択を防止することができる。
【０２２４】
アンチセンス化合物の活性（例えば、標的核酸レベルの低下パーセントによって定義されるような）には、活性標的領域内で変動があり得る。ある特定の実施形態では、アポ（ａ）ｍＲＮＡレベルの低下は、アポ（ａ）発現の阻害を示す。アポ（ａ）タンパク質レベルの低下は、標的ｍＲＮＡ発現の阻害を示す。さらに、表現型の変化が、アポ（ａ）発現の阻害を示す。例えばＨＤＬレベルにおける増加、ＬＤＬレベルにおける減少、コレステロールレベルにおける減少、またはトリグリセリドレベルにおける減少は、とりわけアポ（ａ）発現の阻害のために評価され得る表現型の変化である。他の表現型の兆候、例えば心血管疾患に関連する症状、例えば、狭心症、胸痛、息切れ、動悸、脱力感、めまい、悪心、発汗、頻拍、徐脈、不整脈、心房細動、下肢の腫れ、チアノーゼ、疲労、失神、顔面のしびれ、四肢のしびれ、跛行もしくは筋肉の痙攣、腹部の膨満、および発熱も評価され得る。
【０２２５】
ハイブリダイゼーション
いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションは、本明細書に開示されるアンチセンス化合物とアポ（ａ）核酸との間で生じる。ハイブリダイゼーションの最も一般的な機序は、核酸分子の相補的な核酸塩基間での水素結合（例、ワトソン−クリック、フーグスティーン、または逆フーグスティーン水素結合）を伴う。
【０２２６】
ハイブリダイゼーションは、多様な条件の下で起こり得る。ストリンジェント条件は、配列依存的であり、ハイブリダイズされる核酸分子の性質および組成によって決定される。
【０２２７】
配列が標的核酸と特異的にハイブリダイズ可能であるかどうかを決定する方法は、当技術分野において公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，２００１）。ある特定の実施形態では、本明細書に提供されるアンチセンス化合物は、アポ（ａ）核酸と特異的にハイブリダイズ可能である。
【０２２８】
相補性
アンチセンス化合物と標的核酸は、アンチセンス化合物の十分な数の核酸塩基が、所望の効果（例えば、アポ（ａ）核酸等の標的核酸のアンチセンス阻害）が生じるように、標的核酸の対応する核酸塩基と水素結合することができるとき、互いに相補的である。
【０２２９】
アンチセンス化合物とアポ（ａ）核酸との間の非相補的な核酸塩基は、アンチセンス化合物が標的核酸と特異的にハイブリダイズすることが可能なままであれば、忍容される場合がある。さらに、アンチセンス化合物は、介在または隣接セグメント（例えば、ループ構造、ミスマッチ、またはヘアピン構造）がハイブリダイゼーション事象に関与しないように、アポ（ａ）核酸の１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズすることができる。
【０２３０】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供されるアンチセンス化合物、またはその特定部分は、アポ（ａ）核酸、標的領域、標的セグメント、またはその特定部分に、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％、または少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％相補的である。アンチセンス化合物の標的核酸との相補性パーセントは、常法を使用して定量化することができる。
【０２３１】
例えば、アンチセンス化合物の２０核酸塩基のうち１８が標的領域に相補的であり、したがって、特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物は、９０パーセントの相補性を表すだろう。本例では、残る非相補的な核酸塩基は、密集していても、相補的な核酸塩基とともに分散されてもよく、互いに、または相補的な核酸塩基に連続している必要はない。したがって、長さが１８個の核酸塩基であり、標的核酸との完全な相補性の２つの領域によって隣接されている４つの非相補的な核酸塩基を有するアンチセンス化合物は、標的核酸と７７．８％の全体相補性を有するので、本発明の範囲に入るだろう。標的核酸の領域とアンチセンス化合物の相補性パーセントは、当技術分野において公知のＢＬＡＳＴプログラム（基本ローカルアライメント検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３  ４１０；Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９  ６５６）を使用して、常法により定量化することができる。相同性パーセント、配列同一性、または相補性は、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２  ４８９）を用いたデフォルト設定を使用するギャッププログラム（ウィスコンシン配列解析パッケージ、バージョン８、Ｕｎｉｘ用、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、ウィスコンシン州マディソン）によって定量化することができる。
【０２３２】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供されるアンチセンス化合物またはその特定部分は、標的核酸またはその特定部分に完全に相補的（すなわち、１００％相補的）である。例えば、アンチセンス化合物は、アポ（ａ）核酸、または標的領域、または標的セグメント、またはその標的配列に完全に相補的であり得る。本明細書で使用されるとき、「完全に相補的」は、アンチセンス化合物の各核酸塩基が、標的核酸の対応する核酸塩基と正確に塩基対合することが可能であることを意味する。例えば、２０核酸塩基アンチセンス化合物は、アンチセンス化合物に完全に相補的である標的核酸の対応する２０核酸塩基部分が存在する限り、４００核酸塩基長である標的配列に完全に相補的である。完全に相補的はまた、第１のおよび／または第２の核酸の特定部分を参照して使用することができる。例えば、３０核酸塩基アンチセンス化合物の２０核酸塩基部分は、４００核酸塩基長である標的配列に「完全に相補的」であり得る。３０核酸塩基オリゴヌクレオチドの２０核酸塩基部分は、標的配列が対応する２０核酸塩基部分を有する場合、標的配列に完全に相補的であって、各核酸塩基は、アンチセンス化合物の２０核酸塩基部分に相補的である。同時に、３０核酸塩基アンチセンス化合物全体は、そのアンチセンス化合物の残る１０核酸塩基も標的配列に相補的であるかどうかに依存して、標的配列に完全に相補的であり得るか、またはあり得ない。
【０２３３】
非相補的核酸塩基（複数可）の場所は、アンチセンス化合物の５’端または３’端であり得る。代替として、非相補的核酸塩基（複数可）は、アンチセンス化合物の内部位置にあってよい。２つ以上の非相補的核酸塩基が存在するとき、それらは、連続的（すなわち、結合される）または非連続的であってもよい。一実施形態では、非相補的核酸塩基は、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドのウィングセグメント内に位置する。
【０２３４】
ある特定の実施形態では、長さが１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の核酸塩基であるか、またはそれ以下であるアンチセンス化合物は、アポ（ａ）核酸等の標的核酸またはその特定部分に対して、４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下の非相補的な核酸塩基（複数可）を含む。
【０２３５】
ある特定の実施形態では、長さが１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、または３０個の核酸塩基であるか、またはそれ以下であるアンチセンス化合物は、アポ（ａ）核酸等の標的核酸またはその特定部分に対して、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下の非相補的な核酸塩基（複数可）を含む。
【０２３６】
本明細書に提供されるアンチセンス化合物には、標的核酸の一部分に相補的であるものも含まれる。本明細書で使用されるとき、「部分」は、標的核酸の領域またはセグメント内にある一定数の連続する（すなわち、結合された）核酸塩基を指す。「部分」はまた、アンチセンス化合物の一定数の連続する核酸塩基を指し得る。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも８つの核酸塩基部分に相補的である。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも１２の核酸塩基部分に相補的である。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも１５の核酸塩基部分に相補的である。また、企図されるのは、標的セグメントの少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上、あるいはこれらの値の任意の２つによって画定される範囲の核酸塩基部分に相補的であるアンチセンス化合物である。
【０２３７】
同一性
本明細書に提供されるアンチセンス化合物はまた、特別なヌクレオチド配列、配列番号、または特定のＩｓｉｓ番号によって表される化合物、あるいはその部分に対して一定の
同一性パーセントを有し得る。本明細書で使用されるとき、アンチセンス化合物は、同一核酸塩基対合能力を有する場合、本明細書に開示される配列と同一である。例えば、開示されるＤＮＡ配列においてチミジンの代わりにウラシルを含有するＲＮＡは、ウラシルとチミジンが共にアデニンと対合するので、そのＤＮＡ配列と同一であるとみなされよう。本明細書で説明されるアンチセンス化合物の短縮または延長バージョン、ならびに本明細書に提供されるアンチセンス化合物に対して非同一の塩基を有する化合物も企図される。この非同一の塩基は、互いに隣接していても、またはアンチセンス化合物全体に分散していてもよい。アンチセンス化合物の同一性パーセントは、比較される配列に対する、同一の塩基対合を有する塩基の数に従って計算される。
【０２３８】
ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物またはその部分は、本明細書に開示されるアンチセンス化合物または配列番号またはその部分のうちの１つ以上に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
【０２３９】
ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物の一部は、標的核酸の等長部分と比較される。ある特定の実施形態では、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０核酸塩基部分は、標的核酸の等長部分と比較される。
【０２４０】
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの一部は、標的核酸の等長部分と比較される。ある特定の実施形態では、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０核酸塩基部分は、標的核酸の等長部分と比較される。
【０２４１】
修飾
ヌクレオシドは、塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの核酸塩基（塩基としても知られる）部分は、通常、ヘテロ環塩基部分である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドでは、リン酸基は、糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分に結合することができる。オリゴヌクレオチドは、相互に隣接するヌクレオシドの共有結合を通して形成され、線状のポリマーオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチド構造の内部で、リン酸基は、一般に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間連結を形成すると称される。
【０２４２】
アンチセンス化合物への修飾には、ヌクレオシド間連結、糖部分、または核酸塩基への置換あるいは変化を包含する。修飾アンチセンス化合物は、多くの場合、例えば、細胞取り込みの増強、核酸標的への親和性の増強、ヌクレアーゼの存在下での安定性の増加、または抑制活性の増加のような望ましい特性のために、天然型に優って好ましい。
【０２４３】
化学修飾ヌクレオシドはまた、短縮または先端切断アンチセンスオリゴヌクレオチドのその標的核酸への結合親和性を増加させるために利用し得る。結果として、かかる化学修飾ヌクレオシドを有する、より短いアンチセンス化合物では、多くの場合、同等の結果を得ることができる。
【０２４４】
修飾ヌクレオシド間結合
ＲＮＡおよびＤＮＡの天然に存在するヌクレオシド間結合は、３’から５’のホスホジエステル結合である。１つ以上の修飾、すなわち、非天然に存在する、ヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物は、多くの場合、例えば、細胞取り込みの増強、核酸標的への親和性の増強、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増加のような望ましい特性
のために、天然に存在するヌクレオシド間連結を有するアンチセンス化合物に優って選択される。
【０２４５】
修飾ヌクレオシド間連結を有するオリゴヌクレオチドには、リン原子を保持するヌクレオシド間連結、ならびにリン原子を有さないヌクレオシド間連結を含む。代表的なリン含有ヌクレオシド間連結として、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、およびホスホロチオエートが挙げられるが、それらに限定されない。リン含有および非リン含有の結合の製造の方法は、公知である。
【０２４６】
ある特定の実施形態では、アポ（ａ）核酸に対して標的指向されるアンチセンス化合物は、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物の各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０２４７】
修飾糖部分
本発明のアンチセンス化合物は、任意に、糖基が修飾された１つ以上のヌクレオシドを含有することができる。かかる糖修飾ヌクレオシドは、ヌクレアーゼ安定性の増強、結合親和性の増加、または他の何らかの有益な生物学的特性をアンチセンス化合物へ付与し得る。ある特定の実施形態では、ヌクレオシドは、化学修飾リボフラノース環部分を含む。化学修飾リボフラノース環の例としては、置換基（５’および２’置換基を含む）の付加、二環式核酸（ＢＮＡ）を形成するためのノンジェミナル環原子の架橋、リボシル環酸素原子のＳ、Ｎ（Ｒ）、またはＣ（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ，Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、または保護基である）での置き換え、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。化学修飾糖の例としては、２’−Ｆ−５’−メチル置換ヌクレオシド（他の開示された５’，２’−ビス置換ヌクレオシドについての２００８年８月２１日公開のＰＣＴ国際出願国際公開第２００８／１０１１５７号を参照）、またはリボシル環酸素原子のＳでの置き換えと２’位でのさらなる置換（２００５年６月１６日公開の公開米国特許出願第２００５−０１３０９２３号を参照）、または代替として、ＢＮＡの５’置換（２００７年１１月２２日公開のＰＣＴ国際出願国際公開第２００７／１３４１８１号を参照。ここでＬＮＡは、例えば５’−メチルまたは５’−ビニル基で置換される）が挙げられる。
【０２４８】
修飾糖部分を有するヌクレオシドの例としては、５’−ビニル、５’−メチル（ＲまたはＳ）、４’−Ｓ、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３、２’−ＯＣＨ２ＣＨ３、２’−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｆ、および２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３置換基を含むヌクレオシドが挙げられるが、これらに限定されない。２’位での置換基はまた、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１−Ｃ１０アルキル、ＯＣＦ３、ＯＣＨ２Ｆ、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、およびＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｌ）−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択され得、各Ｒｌ、Ｒｍ、およびＲｎは、独立して、Ｈであるか、または置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルである。
【０２４９】
本明細書で使用されるとき、「二環式ヌクレオシド」は、二環式糖部分を含む修飾ヌクレオシドを指す。二環式ヌクレオシドの例としては、４’リボシル環原子と２’リボシル環原子との間の架橋を含むヌクレオシドが挙げられるが、これに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に提供されるアンチセンス化合物は、４’〜２’架橋を含む１つ以上の二環式ヌクレオシドを含む。そのような４’〜２’二環式ヌクレオシドの例としては、次の式のうちの１つが挙げられるが、これらに限定されない：４’−（ＣＨ２）−Ｏ−２’（ＬＮＡ）、４’−（ＣＨ２）−Ｓ−２’、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’（ＥＮＡ）、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’、および４’−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−Ｏ−
２’（およびそれらの類似体、２００８年７月１５日に発行された米国特許第７，３９９，８４５号を参照）、４’−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）−Ｏ−２’（およびその類似体、２００９年１月８日に公開された公開国際出願国際公開第／２００９／００６４７８号を参照）、４’−ＣＨ２−Ｎ（ＯＣＨ３）−２’（およびその類似体、２００８年１２月１１日に公開された公開国際出願国際公開第２００８／１５０７２９号を参照）、４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−２’（２００４年９月２日に公開された公開米国特許出願第２００４−０１７１５７０号を参照）、４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’（式中、Ｒは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、または保護基である）（２００８年９月２３日に発行された米国特許第７，４２７，６７２号を参照）、４’−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）−２’（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８−１３４）、および４’−ＣＨ２−Ｃ（＝ＣＨ２）−２’（およびその類似体、２００８年１２月８日に公開された公開国際出願国際公開第２００８／１５４４０１号を参照）。
【０２５０】
二環式ヌクレオシドに関連するさらなる報告は、公開文献にも見出すことができる（例えば、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５−４５６、Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０、Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３−５６３８、Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９−２２２２、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５−１００３９、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００７，１２９（２６）  ８３６２−８３７９、Ｅｌａｙａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ，２００１，２，５５８−５６１、Ｂｒａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００１，８，１−７、およびＯｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００１，３，２３９−２４３、米国特許第６，２６８，４９０号、同第６，５２５，１９１号、同第６，６７０，４６１号、同第６，７７０，７４８号、同第６，７９４，４９９号、同第７，０３４，１３３号、同第７，０５３，２０７号、同第７，３９９，８４５号、同第７，５４７，６８４号、および同第７，６９６，３４５号、米国特許公開第２００８−００３９６１８号、同第２００９−００１２２８１号、米国特許出願第６０／９８９，５７４号、同第６１／０２６，９９５号、同第６１／０２６，９９８号、同第６１／０５６，５６４号、同第６１／０８６，２３１号、同第６１／０９７，７８７号、および同第６１／０９９，８４４号、公開ＰＣＴ国際出願国際公開第１９９４／０１４２２６号、同第２００４／１０６３５６号、同第２００５／０２１５７０号、同第２００７／１３４１８１号、同第２００８／１５０７２９号、同第２００８／１５４４０１；号、および同第２００９／００６４７８号を参照）。前述の二環式ヌクレオシドは各々、例えば、α−Ｌ−リボフラノースおよびβ−Ｄ−リボフラノースを含む、１つ以上の立体化学糖構成を有するように調製することができる（国際公開第９９／１４２２６号として、１９９９年３月２５日公開のＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＤＫ９８／００３９３号を参照されたい）。
【０２５１】
ある特定の実施形態では、ＢＮＡヌクレオシドの二環式糖部分は、ペントフラノシル糖部分の４’位と２’位との間に少なくとも１つの架橋を有する化合物を含むが、これらに限定されず、ここでそのような架橋は独立して、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲａ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ（＝Ｏ）ｘ−、および−Ｎ（Ｒａ）−から独立して選択される１個または２〜４個の結合基を含み、
式中、
ｘは、０、１、または２であり、
ｎは、１、２、３、または４であり、
各ＲａおよびＲｂは、独立して、Ｈ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、置換Ｃ５−Ｃ２０アリール、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ５−Ｃ７脂環式ラジカル、置換Ｃ５−Ｃ７脂環式ラジカル、ハロゲン、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）２−Ｊ１）、またはスルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ１）であり、
各Ｊ１およびＪ２は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、置換Ｃ５−Ｃ２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、または保護基である。
【０２５２】
ある特定の実施形態では、二環式糖部分の架橋は、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−、または−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−である。ある特定の実施形態では、架橋は、４’−ＣＨ２−２’、４’−（ＣＨ２）２−２’、４’−（ＣＨ２）３−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’、および４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’−であり、式中、各Ｒは、独立して、Ｈ、保護基、またはＣ１−Ｃ１２アルキルである。
【０２５３】
ある特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドはさらに、異性体構成によって定義される。例えば、４’−２’メチレン−オキシ架橋を含むヌクレオシドは、α−Ｌ構成中またはβ−Ｄ構成中にあってもよい。以前は、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡは、アンチセンス活性を示すアンチセンスオリゴヌクレオチド中に組み込まれていた（Ｆｒｉｅｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，２１，６３６５−６３７２）。
【０２５４】
ある特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドには、下に示されるような、（Ａ）α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｂ）β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｃ）エチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｄ）アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｅ）オキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、および（Ｆ）メチル（メチレンオキシ）（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｇ）メチレン−チオ（４’−ＣＨ２−Ｓ−２’）ＢＮＡ、（Ｈ）メチレン−アミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｉ）メチル炭素環式（４’−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−２’）ＢＮＡ、および（Ｊ）プロピレン炭素環式（４’−（ＣＨ２）３−２’）ＢＮＡが含まれるが、これらに限定されない。
【化２】
2019071902.tif 000003
式中、Ｂｘは、塩基部分であり、Ｒは、独立して、Ｈ、保護基、またはＣ１−Ｃ１２アルキルである。
【０２５５】
ある特定の実施形態では、式Ｉ
【化３】
2019071902.tif 000004
を有する二環式ヌクレオシドが提供され、式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
−Ｑａ−Ｑｂ−Ｑｃ−は、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒｃ）−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｃ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−、または−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−ＣＨ２であり、
Ｒｃは、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、またはアミノ保護基であり、
ＴａおよびＴｂはそれぞれ、独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合である。
【０２５６】
ある特定の実施形態では、式ＩＩ
【化４】
2019071902.tif 000005
を有する二環式ヌクレオシドが提供され、式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
ＴａおよびＴｂはそれぞれ、独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合であり、
Ｚａは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオール、または置換チオである。
【０２５７】
一実施形態では、置換された基の各々は、独立して、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪｃ、ＮＪｃＪｄ、ＳＪｃ、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊｃ、およびＮＪｅＣ（＝Ｘ）ＮＪｃＪｄから独立して選択される置換基群で一置換または多置換され、式中、各Ｊｃ、ＪｄおよびＪｅは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、または置換Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、Ｘは、ＯまたはＮＪｃである。
【０２５８】
ある特定の実施形態では、式ＩＩＩ
【化５】
2019071902.tif 000006
を有する二環式ヌクレオシドが提供され、式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
ＴａおよびＴｂはそれぞれ、独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合であり、
Ｚｂは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルキニル、または置換アシル（Ｃ（＝Ｏ）−）である。
【０２５９】
ある特定の実施形態では、式ＩＶ
【化６】
2019071902.tif 000007
を有する二環式ヌクレオシドが提供され、式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
ＴａおよびＴｂはそれぞれ、独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合であり、
Ｒｄは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、
置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、または置換Ｃ２−Ｃ６アルキニルであり、
各ｑａ、ｑｂ、ｑｃ、およびｑｄは、独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、もしくは置換Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシル、置換Ｃ１−Ｃ６アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ１−Ｃ６アミノアルキル、または置換Ｃ１−Ｃ６アミノアルキルである。
【０２６０】
ある特定の実施形態では、式Ｖ
【化７】
2019071902.tif 000008
を有する二環式ヌクレオシドが提供され、式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
ＴａおよびＴｂはそれぞれ、独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合であり、
ｑａ、ｑｂ、ｑｅ、およびｑｆはそれぞれ、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、ＯＪｊ、ＳＪｊ、ＳＯＪｊ、ＳＯ２Ｊｊ、ＮＪｊＪｋ、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪｊＪｋであるか、
あるいはｑｅおよびｑｆは一緒に、＝Ｃ（ｑｇ）（ｑｈ）であり、
ｑｇおよびｑｈはそれぞれ、独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、または置換Ｃ１−Ｃ１２アルキルである。
【０２６１】
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ単量体アデニン、シトシン、グアニン、５−メチルシトシン、チミン、およびウラシルの合成および調製が、それらのオリゴマー化、および核酸認識特性と共に記載されている（例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０を参照されたい）。ＢＮＡおよびそれらの調製もまた、国際公開第９８／３９３５２号および同第９９／１４２２６号に記載される。
【０２６２】
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡおよび２’−チオ−ＢＮＡの類似体もまた、調製されている（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９−２２２２）。核酸ポリメラーゼのための基質としてオリゴデオキシリボヌクレオチド二重鎖を含む、固定されたヌクレオシド類似体の調製もまた、記載されている（Ｗｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、国際公開第９９／１４２２６号）。さらに、新規の立体配座的に制限された高親和性オリゴヌクレオチド類似体である２’−アミノ−ＢＮＡの合成が、当該技術分野において記載されている（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５−１００３９）。加えて、２’−アミノ−および２’−メチルアミノ−ＢＮＡが調製されており、相補的ＲＮＡおよびＤＮＡ鎖によるそれらの二重鎖の熱安定性が以前に報告されている。
【０２６３】
ある特定の実施形態では、式ＶＩ
【化８】
2019071902.tif 000009
を有する二環式ヌクレオシドが提供され、式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
ＴａおよびＴｂはそれぞれ、独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合であり、
各ｑｉ、ｑｊ、ｑｋ、およびｑｌは、独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシル、ＯＪｊ、ＳＪｊ、ＳＯＪｊ、ＳＯ２Ｊｊ、ＮＪｊＪｋ、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪｊＪｋであり、
ｑｉおよびｑｊまたはｑｌおよびｑｋは一緒に、＝Ｃ（ｑｇ）（ｑｈ）であり、式中、ｑｇおよびｑｈはそれぞれ、独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、または置換Ｃ１−Ｃ１２アルキルである。
【０２６４】
４’−（ＣＨ２）３−２’架橋およびアルケニル類似体架橋４’−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−２’を有する１つの炭素環式二環式ヌクレオシドが記載されている（Ｆｒｉｅｒ  ｅｔ
ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（２２），４４２９−４４４３およびＡｌｂａｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００６，７１，７７３１−７７４０）。また、炭素環式二環式ヌクレオシドの合成および調製が、それらのオリゴマー化ならびに生化学的研究と共に、記載されている（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００７，１２９（２６），８３６２−８３７９）。
【０２６５】
本明細書で使用されるとき、「４’−２’二環式ヌクレオシド」または「４’〜２’二環式ヌクレオシド」は、糖環の２’炭素原子および４’炭素原子を接続するフラノース環の２個の炭素原子を接続する架橋を含むフラノース環を含む二環式ヌクレオシドを指す。
【０２６６】
明細書で使用されるとき、「単環式ヌクレオシド」は、二環式糖部分でない修飾された糖部分を含むヌクレオシドを指す。本明細書で使用されるとき、ヌクレオシドの糖部分または糖部分類似体は、任意の位置において修飾されるか、または置換され得る。
【０２６７】
本明細書で使用されるとき、「２’修飾糖」は、２’位において修飾されたフラノシル糖を意味する。ある特定の実施形態では、かかる修飾は、置換および非置換アルコキシ、置換および非置換チオアルキル、置換および非置換アミノアルキル、置換および非置換アルキル、置換および非置換アリル、ならびに置換および非置換アルキニルを含むが、これらに限定されないハロゲン化物から選択される置換基を含む。ある特定の実施形態では、２’修飾は、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＦ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）ＣＨ３
、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２を含むが、これらに限定されない置換基から選択され、式中、ｎおよびｍは、１〜約１０である。他の２’置換基群もまた、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、もしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、Ｆ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、インターカレーター、薬物動態特性を改善するための基、またはアンチセンス化合物の薬力学的特性を改善するための基、および類似した特性を有する他の置換基から選択することができる。ある特定の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、２’−ＭＯＥ側鎖を含む（Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２，１１９４４−１２０００）。そのような２’−ＭＯＥ置換は、非修飾ヌクレオシド、ならびに２’−Ｏ−メチル、Ｏ−プロピル、およびＯ−アミノプロピル等の他の修飾ヌクレオシドと比較して改善された結合親和性を有することが記載されている。２’−ＭＯＥ置換基を有するオリゴヌクレオチドもまた、体内での使用に有望な特徴を有する、遺伝子発現のアンチセンス阻害物質であることが示されている（Ｍａｒｔｉｎ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４、Ａｌｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｉｍｉａ，１９９６，５０，１６８−１７６、Ａｌｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，１９９６，２４，６３０−６３７；およびＡｌｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９７，１６，９１７−９２６）。
【０２６８】
本明細書で使用されるとき、「修飾されたテトラヒドロピランヌクレオシド」または「修飾されたＴＨＰヌクレオシド」は、正常なヌクレオシドにおけるペントフラノシル残基の代わりに置換された６員テトラヒドロピラン「糖」を有するヌクレオシドを意味する（糖代用物）。修飾されたＴＨＰヌクレオシドは、当該技術分野でヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、アニトール（ａｎｉｔｏｌ）核酸（ＡＮＡ）、マンニトール核酸（ＭＮＡ）（Ｌｅｕｍａｎｎ、ＣＪ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００２，１０：８４１−８５４を参照されたい）、フルオロＨＮＡ（Ｆ−ＨＮＡ）と称されるもの、または式ＶＩＩ：
【化９】
2019071902.tif 000010
を有する化合物が含まれるが、これらに限定されず、式中、式ＶＩＩの当該少なくとも１つのテトラヒドロピランヌクレオシド類似体のそれぞれについて独立して、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
ＴａおよびＴｂはそれぞれ、独立して、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に結合するヌクレオシド間結合基であるか、あるいはＴａおよびＴｂのうちの１つが、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に結合するヌクレオシド間結合基であり、ＴａおよびＴｂのうちのもう１つが、Ｈ、ヒドロキシル保護基、結合共役基、または５’もしくは３’末端基であり、
ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６、およびｑ７はそれぞれ、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、または置換Ｃ２−Ｃ６アルキニルであり、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、置換または非置換アルコキシ、ＮＪ
１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、およびＣＮから選択され、式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮＪ１であり、各Ｊ１、Ｊ２、およびＪ３は、独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルである。
【０２６９】
ある特定の実施形態では、式ＶＩＩの修飾ＴＨＰヌクレオシドが提供され、式中、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６、およびｑ７はそれぞれ、Ｈである。ある特定の実施形態では、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６、およびｑ７のうちの少なくとも１つは、Ｈ以外である。ある特定の実施形態では、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６、およびｑ７のうちの少なくとも１つは、メチルである。ある特定の実施形態では、式ＶＩＩのＴＨＰヌクレオシドが提供され、式中、Ｒ１およびＲ２のうちの１つは、フルオロである。ある特定の実施形態では、Ｒ１がフルオロであり、かつＲ２がＨである、Ｒ１がメトキシであり、かつＲ２がＨである、またＲ１がメトキシエトキシであり、かつＲ２がＨである。ある特定の実施形態では、Ｒ１がＨであり、かつＲ２がフルオロである、Ｒ１がＨであり、かつＲ２がメトキシである、またＲ１がＨであり、かつＲ２がメトキシエトキシである。
【０２７０】
本明細書で使用されるとき、「２’修飾」または「２’置換」は、２’位において、ＨまたはＯＨ以外の置換基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。２’修飾ヌクレオシドは、その中で糖環の２個の炭素原子を結合する架橋が２’炭素および糖環の別の炭素を結合する、二環式ヌクレオシド、ならびにアリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１−Ｃ１０アルキル、−ＯＣＦ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、またはＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）等の非架橋２’置換基を有するヌクレオシドを含むが、これらに限定されず、式中、各ＲｍおよびＲｎは、独立して、Ｈ、または置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルである。２’修飾ヌクレオシドはさらに、例えば、糖の他の位置におけるおよび／または核酸塩基における、他の修飾を含んでもよい。
【０２７１】
本明細書で使用されるとき、「２’−Ｆ」は、２’位においてフルオロ基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。
【０２７２】
本明細書で使用されるとき、「２’−ＯＭｅ」または「２’−ＯＣＨ３」または「２’−Ｏ−メチル」は各々、糖環の２’位において−ＯＣＨ３基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。
【０２７３】
本明細書で使用されるとき、「ＭＯＥ」または「２’−ＭＯＥ」または「２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３」または「２’−Ｏ−メトキシエチル」は各々、糖環の２’位において−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。
【０２７４】
本明細書で使用されるとき、「オリゴヌクレオチド」は、複数の結合されたヌクレオシドを含む化合物を指す。ある特定の実施形態では、複数のヌクレオシドのうちの１つ以上が修飾される。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上のリボヌクレオシド（ＲＮＡ）および／またはデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）を含む。
【０２７５】
当該技術分野では、アンチセンス化合物への取り込み用にヌクレオシドを修飾するために使用され得る、多くの他の二環および三環糖代用環系も公知である（例えば、総説：Ｌｅｕｍａｎｎ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００２，１０，８４１−８５４を参照）。かかる環系は、活性を高めるために、種々の追加の置換を受けることができる。
【０２７６】
修飾糖の調製方法は、当業者に公知である。
【０２７７】
修飾糖部分を有するヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分（天然、修飾、またはそれらの組み合わせ）は、適切な核酸標的とのハイブリダイゼーションのために維持される。
【０２７８】
ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、修飾糖部分を有する、１つ以上のヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態では、修飾糖部分は、２’−ＭＯＥである。ある特定の実施形態では、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドは、ギャップマーモチーフにおいて配列される。ある特定の実施形態では、修飾糖部分は、（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）架橋基を有する二環式ヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）修飾ヌクレオシドは、ギャップマーモチーフのウィング全体に配列される。ある特定の実施形態では、修飾糖部分は、ｃＥｔである。ある特定の実施形態では、ｃＥｔ修飾ヌクレオチドは、ギャップマーモチーフのウィング全体に配列される。
【０２７９】
修飾核酸塩基
核酸塩基（もしくは塩基）修飾または置換は、機能的に交換可能であるが、天然に生じる、または合成の非修飾核酸塩基と構造的に識別可能である。天然および修飾核酸塩基の両方が、水素結合に関与することができる。そのような核酸塩基修飾は、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性、または他の何らかの有益な生物学的特性をアンチセンス化合物に付与することができる。修飾核酸塩基は、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）等の合成および天然の核酸塩基を含む。５−メチルシトシン置換を含むある特定の核酸塩基置換は、標的核酸に関してアンチセンス化合物の結合親和性を増加させるために特に有用である。例えば、５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２°Ｃ増加させることを示した（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）。
【０２８０】
付加修飾核酸塩基は、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、ならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピル、ならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、ならびに他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、ならびに他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンを含む。
【０２８１】
複素環式塩基部分はまた、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環で置き換えられるもの、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、および２−ピリドンを含み得る。アンチセンス化合物の結合親和性を増加するために特に有用である核酸塩基は、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含むＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリンを含む。
【０２８２】
ある特定の実施形態では、アポ（ａ）核酸に対して標的指向されるアンチセンス化合物は、１つ以上の修飾核酸塩基を含む。ある特定の実施形態では、アポ（ａ）核酸に対して標的指向されるギャップ拡張アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾核酸塩基を含む。ある特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、５−メチルシトシンである。ある
特定の実施形態では、各シトシンは、５−メチルシトシンである。
【０２８３】
組成物および医薬組成物を製剤化するための方法
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物または製剤の調製のために薬学的に容認可能な活性または不活性物質と混合されてもよい。組成物および医薬組成物の製剤化のための方法は、限定されないが、投与の経路、疾患の程度、投与すべき用量を含む、いくつかの判断基準に依存している。
【０２８４】
アポ（ａ）核酸に対して標的指向されるアンチセンス化合物は、アンチセンス化合物を好適な薬学的に許容される希釈剤または担体と組み合わせることによって、医薬組成物において利用することができる。
【０２８５】
ある特定の実施形態では、「薬学的担体」または「賦形剤」は、１つ以上の核酸を動物に送達するための薬学的に許容される溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体または固体であってよく、計画された投与様式を考慮して、核酸および所与の医薬組成物の他の構成要素と組み合わされるときに所望のバルク、稠度等を提供するように選択され得る。典型的な薬学的担体は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖類、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、またはリン酸水素カルシウム等）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）、崩壊剤（例えば、デンプン、グリコール酸ナトリウムデンプン等）、および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）を含むが、これらに限定されない。
【０２８６】
核酸と有害に反応しない、非経口または経口投与に好適な薬学的に許容される有機または無機賦形剤も、本発明の組成物を製剤化するために使用することができる。好適な薬学的に許容される担体は、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等を含むが、これらに限定されない。
【０２８７】
薬学的に許容される希釈剤は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。ＰＢＳは、非経口的に送達される組成物の使用に好適な希釈剤である。したがって、一実施形態では、アポ（ａ）核酸に対して標的指向されるアンチセンス化合物、および薬学的に許容される希釈剤を含む医薬組成物が、本明細書に記載される方法に採用される。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤は、ＰＢＳである。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０２８８】
アンチセンス化合物を含む医薬組成物は、任意の薬学的に許容される塩、エステル、またはそのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物への投与時に、生理活性のある代謝物またはその残基を（直接的および間接的に）提供することが可能なオリゴヌクレオチドが含まれる。したがって、例えば、本開示はまた、アンチセンス化合物の薬学的に許容される塩、プロドラッグ、かかるプロドラッグの薬学的に許容される塩、および他の生物学的同等物に向けられる。好適な薬学的に許容される塩として、ナトリウム塩とカリウム塩が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２８９】
プロドラッグには、アンチセンス化合物の一端または両端での追加ヌクレオシドの取り込みを含めることができる。これは、身体内で内因性ヌクレアーゼによって切断されて、
活性のあるアンチセンス化合物を生成する。
【０２９０】
共役したアンチセンス化合物
アンチセンス化合物は、生じるアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを高める、１つ以上の部分または共役へ共有結合されてもよい。典型的な共役基には、コレステロール部分と脂質部分が含まれる。追加の共役基には、炭水化物、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素が含まれる。
【０２９１】
アンチセンス化合物はまた、例えば、ヌクレアーゼ安定性のような特性を高めるために、一般的にはアンチセンス化合物の一端または両端へ付ける、１つ以上の安定化基を有するように修飾することができる。安定化基に含まれるのは、キャップ構造である。これらの末端修飾は、末端核酸を有するアンチセンス化合物をエクソヌクレアーゼ分解から保護して、細胞内での送達および／または局在化に役立てることができる。キャップは、５’−末端（５’キャップ）、または３’末端（３’キャップ）に存在し得るか、あるいは両方の末端に存在し得る。キャップ構造は、当技術分野において公知であって、例えば、逆位デオキシ脱塩基キャップが含まれる。さらに、ヌクレアーゼ安定性を付与するためにアンチセンス化合物の一端または両端をキャップするのに使用し得るさらなる３’および５’安定化基には、国際公開第０３／００４６０２号（２００３年１月１６日公開）に開示されるものが含まれる。
【０２９２】
細胞培養とアンチセンス化合物処置
アポ（ａ）核酸のレベル、活性、または発現に対するアンチセンス化合物の効果は、多様な細胞種において体外で試験することができる。そのような分析のために使用される細胞種は、市販の供給業者（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓｕｓ，ＶＡ、Ｚｅｎ−Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣ、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手可能であり、供給業者の説明書に従って、市販の試薬（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して培養される。例証的細胞種としては、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、Ｈｕｈ７（肝細胞癌）細胞、初代培養肝細胞、Ａ５４９細胞、ＧＭ０４２８１線維芽細胞、およびＬＬＣ−ＭＫ２細胞が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２９３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの体外試験
本明細書に説明されるのは、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの細胞の処置についての方法であって、これは、他のアンチセンス化合物での処置のために適宜修飾することができる。
【０２９４】
一般に、細胞が培養中に約６０〜８０％の密集度に達したときに、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理する。
【０２９５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞の中へ導入するのに通常使用される試薬の１つには、カチオン性脂質トランスフェクション試薬、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中のＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）と混合して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望の最終濃度と、典型的には１００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドにつき２〜１２μｇ／ｍＬの範囲に及ぶＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）濃度を達成する。
【０２９６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞中へ導入するために使用する別の試薬には、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１低濃度血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中のＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００（登録商標）と混合して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望の濃度と、典型的には１００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドにつき２〜１２μｇ／ｍＬの範囲に及ぶＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）濃度を達成する。
【０２９７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞中へ導入するために使用する別の試薬には、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１低濃度血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中のＣｙｔｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）と混合して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望の濃度と、典型的には１００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドにつき２〜１２μｇ／ｍＬの範囲に及ぶＣｙｔｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）濃度を達成する。
【０２９８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞中へ導入するために使用する別の試薬には、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）−１低濃度血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中のＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）と混合して、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）のオリゴヌクレオチドに対する割合が１００ｎＭにつき約０．２：０．８μＬでオリゴヌクレオチドの所望の濃度を達成する。
【０２９９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞中へ導入するために使用する別の試薬には、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）が含まれる。アンチセンスオリゴマー化合物を１ｍＬの無血清ＲＰＭＩ中のＦｕＧＥＮＥ６と混合して、ＦｕＧＥＮＥ６のオリゴマー化合物に対する割合が１００ｎＭにつきＦｕＧＥＮＥ  ６の１：４μＬでオリゴヌクレオチドの所望の濃度を達成する。
【０３００】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞中へ導入するために使用する別の技術には、エレクトロポレーションが含まれる（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．２００１）。
【０３０１】
常法によって、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置する。典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置後１６〜２４時間で細胞を採取し、この時点で、当技術分野において公知のおよび本明細書に説明される方法によって、標的核酸のＲＮＡまたはタンパク質レベルを測定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．２００１）。一般に、処置を多数の複写物で実施するとき、データは、その複写物処置の平均として提示される。
【０３０２】
使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞系ごとに変動する。特定の細胞系に最適なアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を決定する方法は、当該技術分野で周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．２００１）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、またはＣｙｔｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）でトランスフェクトするとき、典型的には、１ｎＭ〜３００ｎＭの範囲に及ぶ濃度で使用される。エレクトロポレーションを使用してトランスフェクトするときは、６２５〜２０，０００ｎＭの範囲に及ぶ、より高い濃度でアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する。
【０３０３】
ＲＮＡ単離
ＲＮＡ分析は、全細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡで実施することができる。ＲＮＡ単離の方法は、当技術分野において周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．２００１）。例えば、ＲＮＡは、製造業者の推奨プロトコルに従って、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して調製され得る。
【０３０４】
標的レベルまたは発現の阻害の分析
アポ（ａ）核酸のレベルまたは発現の阻害は、当技術分野において公知の多様な方法でアッセイすることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．，２００１）。例えば、標的核酸レベルは、例えば、ノーザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または定量的リアルタイムＰＣＲによって定量化することができる。ＲＮＡ分析は、全細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡで実施することができる。ＲＮＡ単離の方法は、当該技術分野において公知である。ノーザンブロット分析も、当該技術分野では、常法である。定量的リアルタイムＰＣＲは、簡便には、市販のＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７６００、７７００、または７９００配列検出システム（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡより入手可能）を使用して、そして製造業者の説明書に従って使用して達成することができる。
【０３０５】
標的ＲＮＡレベルの定量的リアルタイムＰＣＲ分析
標的ＲＮＡレベルの定量は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７６００、７７００、または７９００配列検出システム（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を製造業者の説明書に従って使用する、定量的リアルタイムＰＣＲによって達成することができる。定量的リアルタイムＰＣＲの方法は、当該技術分野において公知である。
【０３０６】
リアルタイムＰＣＲに先立って、単離したＲＮＡを逆転写酵素（ＲＴ）反応へ処して、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を産生してから、これをリアルタイムＰＣＲ増幅の基質として使用する。ＲＴ反応とリアルタイムＰＣＲ反応は、同一の試料ウェルにおいて連続的に実施する。ＲＴおよびリアルタイムＰＣＲの試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂ
ａｄ，ＣＡ）より入手される。ＲＴおよびリアルタイムＰＣＲ反応は、当業者に公知の方法によって行う。
【０３０７】
リアルタイムＰＣＲによって得られる遺伝子（またはＲＮＡ）標的の量は、シクロフィリンＡもしくはＧＡＰＤＨ等の、その発現が一定である遺伝子の発現レベルを使用して、またはＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して全ＲＮＡを定量化することによって、正規化され得る。シクロフィリンＡまたはＧＡＰＤＨの発現は、リアルタイムＰＣＲによって、標的と同時に実施する、多重化することによって、または別々に定量化され得る。全ＲＮＡは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して定量化する。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によるＲＮＡ定量化の方法は、Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｊ．ら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，２６５，３６８−３７４）に教示されている。Ａ  ＣＹＴＯＦＬＵＯＲ（登録商標）４０００機器（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）蛍光を測定する。
【０３０８】
アポ（ａ）核酸とハイブリダイズするようにプローブとプライマーが設計され得る。リアルタイムＰＣＲのプローブおよびプライマーを設計する方法は、当該技術分野で周知であり、ＰＲＩＭＥＲ  ＥＸＰＲＥＳＳ（登録商標）ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）等のソフトウェアの使用を含み得る。
【０３０９】
タンパク質レベルの分析
アポ（ａ）タンパク質レベルを測定することによって、アポ（ａ）核酸のアンチセンス阻害を評価することができる。アポ（ａ）のタンパク質レベルは、免疫沈降、ウェスタンブロット分析（イムノブロッティング）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、定量的タンパク質アッセイ、タンパク質活性アッセイ（例えば、カスパーゼ活性アッセイ）、免疫組織化学、免疫細胞化学、または蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）等の、当該技術分野において周知の様々な方法で評価または定量化することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．２００１）。標的に指向される抗体は、抗体のＭＳＲＳカタログ（Ａｅｒｉｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＭＩ）等の様々な供給源より特定して入手するか、あるいは当該技術分野において周知の従来のモノクローナルまたはポリクローナル抗体生成法により調製することができる。アポ（ａ）の検出に有用な抗体が市販されている。
【０３１０】
アンチセンス化合物の体内試験
アンチセンス化合物、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アポ（ａ）の発現を阻害し、表現型の変化をもたらすその能力を評価するために、動物において試験される。試験は、正常な動物において、または実験的な疾患モデルにおいて実施され得る。動物への投与のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水等の薬学的に許容される希釈剤に製剤化される。投与は、非経口投与経路を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量および投薬頻度の計算は、投与経路および動物体重等の要因に依存する。アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置の期間に続いて、ＲＮＡを組織から単離し、アポ（ａ）核酸発現の変化を測定する。アポ（ａ）タンパク質レベルの変化も測定する。
【０３１１】
ある特定の適応症
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される１つ以上の医薬組成物を投与することを含む、個体を治療する方法が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、個体は、アポ（ａ）関連疾患を有する。ある特定の実施形態では、個体は、Ｌｐ（ａ）関連疾患を有する。ある特定の実施形態では、個体は、炎症性、心血管、および／または代謝疾患、障害、または状態を有する。
【０３１２】
ある特定の実施形態では、心血管疾患、障害、または状態は、動脈瘤（例えば腹部大動脈瘤）、狭心症、不整脈、粥状動脈硬化、脳血管疾患、冠動脈疾患、冠動脈心疾患、脂質異常症、高コレステロール血症、高脂血症、高血圧、高トリグリセリド血症、心筋梗塞、末梢血管疾患（例えば末梢動脈疾患）、脳卒中等を含むが、これらに限定されない。
【０３１３】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるアポ（ａ）を標的指向する化合物は、心血管疾患、障害、または状態の生理学的マーカーまたは表現型を調節する。例えば、動物への化合物の投与は、未処置の動物と比較して、これらの動物におけるＬＤＬおよびコレステロールレベルを減少させることができる。ある特定の実施形態では、生理学的マーカーまたは表現型の調節は、化合物によるアポ（ａ）の阻害に関連し得る。
【０３１４】
ある特定の実施形態では、心血管疾患、障害、または状態の生理学的マーカーは、定量可能であり得る。例えば、ＬＤＬまたはコレステロールレベルは、例えば標準的な脂質試験により測定され、定量化され得る。そのようなマーカーに関して、ある特定の実施形態では、マーカーは、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％、またはこれらの値の任意の２つにより定義される範囲だけ減少し得る。
【０３１５】
また、治療を必要とする対象において、心血管疾患、障害、または状態に関連する症状を予防する、治療する、または寛解させるための方法が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、心血管疾患、障害、または状態に関連する症状の開始速度を低下させるための方法が提供される。ある特定の実施形態では、心血管疾患、障害、または状態に関連する症状の重症度を低下させるための方法が提供される。そのような実施形態では、本方法は、アポ（ａ）核酸に対して標的指向される治療有効量の化合物を、それを必要とする個体に投与することを含む。
【０３１６】
心血管疾患、障害、または状態は、多くの身体症状を特徴とし得る。心血管疾患、障害、または状態に関連する当業者に既知の任意の症状は、本明細書に記載される化合物および方法により予防、治療、寛解、またはさもなければ調節され得る。ある特定の実施形態では、症状は、狭心症、胸痛、息切れ、動悸、脱力感、めまい、悪心、発汗、頻拍、徐脈、不整脈、心房細動、下肢の腫れ、チアノーゼ、疲労、失神、顔面のしびれ、四肢のしびれ、跛行もしくは筋肉の痙攣、腹部の膨満、および発熱のいずれかであり得るが、これらに限定されない。
【０３１７】
ある特定の実施形態では、代謝疾患、障害、または状態は、高血糖症、前糖尿病、糖尿病（１型および２型）、肥満、インスリン耐性、代謝症候群、および糖尿病による脂質異常症を含むが、これらに限定されない。
【０３１８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるアポ（ａ）に対して標的指向される化合物は、代謝疾患、障害、または状態の生理学的マーカーまたは表現型を調節する。例えば、動物への化合物の投与は、未処置の動物と比較して、これらの動物におけるグルコースおよびインスリン耐性レベルを減少させることができる。ある特定の実施形態では、生理学的マーカーまたは表現型の調節は、化合物によるアポ（ａ）の阻害に関連し得る。
【０３１９】
ある特定の実施形態では、代謝疾患、障害、または状態の生理学的マーカーは、定量可能であり得る。例えばグルコースレベルまたはインスリン耐性は、当該技術分野において公知の標準的な試験により測定され、定量化され得る。そのようなマーカーに関して、ある特定の実施形態では、マーカーは、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％、またはこれらの値の任意の２つにより定義される範囲だけ減少し得る。別の例では、インスリン感受性は、当該技術分野において公知の標準的な試験により測定され、定量化され得る。そのようなマーカーに関して、ある特定の実施形態では、マーカーは、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％、またはこれらの値の任意の２つにより定義される範囲だけ増加し得る。
【０３２０】
また、治療を必要とする対象において、代謝疾患、障害、または状態に関連する症状を予防する、治療する、または寛解させるための方法が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、代謝疾患、障害、または状態に関連する症状の開始速度を低下させるための方法が提供される。ある特定の実施形態では、代謝疾患、障害、または状態に関連する症状の重症度を低下させるための方法が提供される。そのような実施形態では、本方法は、アポ（ａ）核酸に対して標的指向される治療有効量の化合物を、それを必要とする個体に投与することを含む。
【０３２１】
代謝疾患、障害、または状態は、多くの身体症状を特徴とし得る。代謝疾患、障害、または状態に関連する当業者に既知の任意の症状は、本明細書に記載される化合物および方法により予防、治療、寛解、またはさもなければ調節され得る。ある特定の実施形態では、症状は、過度の尿生成（多尿症）、過度の口渇、および水分摂取の増加（多飲症）、霧視、不明な体重損失および嗜眠のいずれかであり得るが、これらに限定されない。
【０３２２】
ある特定の実施形態では、炎症性疾患、障害、または状態は、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、アルツハイマー病、および血栓塞栓疾患、障害、または状態を含むが、これらに限定されない。ある特定の血栓塞栓疾患、障害、または状態は、脳卒中、血栓症、心筋梗塞、および末梢血管疾患を含むが、これらに限定されない。
【０３２３】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるアポ（ａ）を標的指向する化合物は、炎症性疾患、障害、または状態の生理学的マーカーまたは表現型を調節する。例えば、動物への化合物の投与は、未処置の動物と比較して、これらの動物における炎症性サイトカインまたは他の炎症性マーカーレベルを減少させることができる。ある特定の実施形態では、生理学的マーカーまたは表現型の調節は、化合物によるアポ（ａ）の阻害に関連し得る。
【０３２４】
ある特定の実施形態では、炎症性疾患、障害、または状態の生理学的マーカーは、定量可能であり得る。例えば、サイトカインレベルは、当該技術分野において公知の標準的な試験により測定され、定量化され得る。そのようなマーカーに関して、ある特定の実施形態では、マーカーは、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％、またはこれらの値の任意の２つにより定義される範囲だけ減少し得る。
【０３２５】
また、治療を必要とする対象において、炎症性疾患、障害、または状態に関連する症状を予防する、治療する、または寛解させるための方法が、本明細書において提供される。
ある特定の実施形態では、炎症性疾患、障害、または状態に関連する症状の開始速度を低下させるための方法が提供される。ある特定の実施形態では、炎症性疾患、障害、または状態に関連する症状の重症度を低下させるための方法が提供される。そのような実施形態では、本方法は、アポ（ａ）核酸に対して標的指向される治療有効量の化合物を、それを必要とする個体に投与することを含む。
【０３２６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される治療有効量の１つ以上の医薬組成物を投与することを含む、アポ（ａ）関連疾患、障害、または状態を有する個体を治療する方法が提供される。ある特定の実施形態では、個体は、上昇したアポ（ａ）レベルを有する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される治療有効量の１つ以上の医薬組成物を投与することを含む、Ｌｐ（ａ）関連疾患、障害、または状態を有する個体を治療する方法が提供される。ある特定の実施形態では、個体は、上昇したＬｐ（ａ）レベルを有する。ある特定の実施形態では、個体は、炎症性、心血管、および／または代謝疾患、障害、または状態を有する。ある特定の実施形態では、アポ（ａ）核酸に対して標的指向される治療有効量のアンチセンス化合物の投与は、アポ（ａ）またはＬｐ（ａ）レベルの監視を伴う。ある特定の実施形態では、アポ（ａ）核酸に対して標的指向される治療有効量のアンチセンス化合物の投与は、個体のアンチセンス化合物への応答を決定するために、炎症性、心血管、および／または代謝疾患のマーカー、またはアポ（ａ）の発現に関連する他の疾患過程を監視することを伴う。アポ（ａ）を標的指向するアンチセンス化合物の投与に対する個体の応答は、本化合物による治療介入の量および継続期間を決定するために、医師によって使用され得る。
【０３２７】
ある特定の実施形態では、アポ（ａ）核酸に対して標的指向されるアンチセンス化合物の投与は、少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％、またはこれらの値の任意の２つによって画定される範囲だけアポ（ａ）発現の減少をもたらす。ある特定の実施形態では、アポ（ａ）発現は、≦１００ｍｇ／ｄＬ、≦９０ｍｇ／ｄＬ、≦８０ｍｇ／ｄＬ、≦７０ｍｇ／ｄＬ、≦６０ｍｇ／ｄＬ、≦５０ｍｇ／ｄＬ、≦４０ｍｇ／ｄＬ、≦３０ｍｇ／ｄＬ、≦２０ｍｇ／ｄＬ、または≦１０ｍｇ／ｄＬに減少する。
【０３２８】
ある特定の実施形態では、アポ（ａ）核酸に対して標的指向されるアンチセンス化合物の投与は、少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％、またはこれらの値の任意の２つによって画定される範囲だけＬｐ（ａ）発現の減少をもたらす。
【０３２９】
ある特定の実施形態では、アポ（ａ）に対して標的指向されるアンチセンス化合物を含む医薬組成物は、炎症性、心血管、および／または代謝疾患、障害、または状態に罹患する、またはそれに対して感受性を持つ患者を治療するための薬剤の調製のために使用される。
【０３３０】
投薬
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、投薬レジメン（例えば用量、投薬頻度、および継続期間）に従い投与され、投薬レジメンは所望の効果を達成するように選択され得る。所望の効果は、例えば、アポ（ａ）の低下、またはアポ（ａ）に関連する疾患もしくは状態の予防、低下、寛解、またはその進行を緩慢にさせることであり得る。
【０３３１】
ある特定の実施形態では、投薬レジメンの可変値は、対象において医薬組成物の所望の濃度をもたらすように調整される。投薬レジメンに関して使用される「医薬組成物の濃度
」は、医薬組成物の化合物、オリゴヌクレオチド、または活性成分を指し得る。例えば、ある特定の実施形態では、用量および投薬頻度は、所望の効果を達成するのに十分な量の医薬組成物の組織濃度または血漿濃度を提供するように調整される。
【０３３２】
投薬は、治療される疾患状態の重症度および応答性に依存し、治療過程は、数日〜数ヶ月、または治癒がもたらされるか、もしくは疾患状態の減少が達成されるまで続く。投薬は、薬物の効力および代謝にも依存する。ある特定の実施形態では、投与量は、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｍｇであるか、または０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲内の投薬であり、１日に、１週間に、１ヶ月に、もしくは１年に１回以上、またはさらには２〜２０年に１回与え得られ得る。有効な治療後、疾患状態の再発を防止するために、患者に維持療法を受けさせることが望ましい場合があり、１日に、１週間に、１ヶ月に、１年に１回以上から２〜２０年に１回以上、体重の１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｍｇの範囲、または０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇの投薬範囲の維持用量でオリゴヌクレオチドが投与される。
【０３３３】
ある特定の組み合わせ療法
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される化合物を含む第１の薬剤は、１つ以上の第２の薬剤または療法と同時投与される。ある特定の実施形態では、そのような第２の薬剤は、本明細書に記載される第１の薬剤と同じ疾患、障害、または状態を治療するように設計される。ある特定の実施形態では、そのような第２の薬剤は、本明細書に記載される第１の薬剤とは異なる疾患、障害、または状態を治療するように設計される。ある特定の実施形態では、第１の薬剤は、第２の薬剤の望ましくない副作用を治療するように設計される。ある特定の実施形態では、第２の薬剤は、第１の薬剤の望ましくない副作用を治療するように、第１の薬剤と同時投与される。ある特定の実施形態では、そのような第２の薬剤は、本明細書に記載される１つ以上の医薬組成物の望ましくない副作用を治療するように設計される。ある特定の実施形態では、第２の薬剤は、組み合わせ効果をもたらすように第１の薬剤と同時投与される。ある特定の実施形態では、第２の薬剤は、相乗効果をもたらすように第１の薬剤と同時投与される。ある特定の実施形態では、第１および第２の薬剤の同時投与は、薬剤が独立した療法として投与された場合の治療的または予防的効果を達成するのに必要とされるであろう投与量より低い投与量の使用を可能にする。
【０３３４】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される１つ以上の組成物および１つ以上の他の医薬品は、同時に投与される。ある特定の実施形態では、本発明の１つ以上の組成物および１つ以上の他の医薬品は、異なる時点で投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される１つ以上の組成物および１つ以上の他の医薬品は、単一製剤に一緒に調製される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される１つ以上の組成物および１つ以上の他の医薬品は、別々に調製される。
【０３３５】
ある特定の実施形態では、第２の薬剤は、アポ（ａ）降下剤、Ｌｐ（ａ）降下剤、アルツハイマー病を治療するための薬剤、血栓塞栓症形成を低下させるための薬剤、コレステロール降下剤、非ＨＤＬ脂質降下（例えばＬＤＬ）剤、ＨＤＬ上昇剤（ＨＤＬ  ｒａｉｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、魚油、ナイアシン、ニコチン酸、フィブラート、スタチン、ＤＣＣＲ（ジアゾキシドの塩）、グルコース降下剤、抗炎症剤、および／または抗糖尿病剤を含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、第１の薬剤は、最大許容量の第２の薬剤と組み合わせて投与される。ある特定の実施形態では、第１の薬剤は、最大許容量の第２の薬剤に応答しない対象に投与される。
【０３３６】
アポ（ａ）降下剤の例としては、第１の薬剤とは異なるアポ（ａ）アンチセンスオリゴヌクレオチド、ナイアシン、ニコチン酸、またはアポＢアンチセンスオリゴヌクレオチド（すなわち、ミポメルセン）が挙げられる。アポ（ａ）降下療法の例は、Ｌｐ（ａ）アフ
ェレシスである。
【０３３７】
グルコース降下および／または抗糖尿病剤の例としては、治療的生活様式の変更、ＰＰＡＲ作動薬、ジペプチジルペプチダーゼ（ＩＶ）阻害剤、ＧＬＰ−１類似体、インスリンもしくはインスリン類似体、インスリン分泌促進物質、ＳＧＬＴ２阻害剤、ヒトアミリン類似体、ビグアナイド、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤、メトホルミン、スルホニル尿素、ロシグリタゾン、メグリチニド、チアゾリジンジオン、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤等が挙げられるが、これらに限定されない。スルホニル尿素は、アセトヘキサミド、クロルプロパミド、トルブタミド、トラザミド、グリメピリド、グリピジド、グリブリド、またはグリクラジドであってよい。メグリチニドは、ナテグリニドまたはレパグリニドであってよい。チアゾリジンジオンは、ピオグリタゾンまたはロシグリタゾンであってよい。アルファ−グルコシダーゼは、アカルボースまたはミグリトールであってよい。
【０３３８】
コレステロールまたは脂質降下療法の例としては、療的生活様式の変更、スタチン、胆汁酸捕捉剤、ナイアシン、ニコチン酸、ＣＥＴＰ阻害剤、およびフィブラート等のペルオキシソーム増殖活性化受容体作動薬が挙げられるが、これらに限定されない。スタチンは、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、およびシンバスタチン等であってよい。胆汁酸捕捉剤は、コレセベラム、コレスチラミン、コレスチポール等であってよい。フィブラートは、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、クロフィブラート等であってよい。ＣＥＴＰ阻害剤は、ＣＥＴＰアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはトルセトラピブであってよい。
【０３３９】
ある特定の治療集団
高Ｌｐ（ａ）レベルを有するある特定の対象は、様々な疾患の危険性が非常に高い（Ｌｉｐｐｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，２０１１，４１２：７９７−８０１、Ｓｏｌｆｒｉｚｚ  ｅｔ  ａｌ．）。高Ｌｐ（ａ）レベルを有する多くの対象において、現在の治療は、それらのＬｐ（ａ）レベルを安全なレベルに低下させることができない。アポ（ａ）は、Ｌｐ（ａ）の形成に重要な役割を果たし、よって、アポ（ａ）の低下は、Ｌｐ（ａ）を低下させ、Ｌｐ（ａ）に関連する疾患を予防する、治療する、または寛解させることができる。
【０３４０】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される化合物および方法による治療は、アポ（ａ）レベルおよび／またはＬｐ（ａ）レベルの上昇を伴うヒト動物に適応される。ある特定の実施形態では、ヒトは、≧３０ｍｇ／ｄＬ、≧４０ｍｇ／ｄＬ、≧５０ｍｇ／ｄＬ、≧６０ｍｇ／ｄＬ、≧７０ｍｇ／ｄＬ、≧８０ｍｇ／ｄＬ、≧９０ｍｇ／ｄＬ、または≧１００ｍｇ／ｄＬの上昇したアポ（ａ）レベルを有する。
【０３４１】
ある特定の化合物
ＰＣＴ出願国際公開第２００５／０００２０１号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）による選択されたギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドが評価され（実施例１）、最も強力な化合物であるＩＳＩＳ  １４４３６７が、本明細書に記載される新規に設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドのベンチマーク比較として使用された。
【０３４２】
単一用量体外研究により評価されるように（実施例２〜３、５）、約９０の新規に設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドがベンチマークＩＳＩＳ  １４４３６７より強力であることが分かった。約９０のアンチセンスオリゴヌクレオチドのうち、約８３は、体外多用量応答研究用に選択され、６４のアンチセンスオリゴヌクレオチドがベンチマークより強力であることが分かった（実施例４、６）。
【０３４３】
ヒトアポ（ａ）遺伝子導入マウスにおける体内研究のために、約３２のアンチセンスオリゴヌクレオチドがさらに選択された（実施例７）。体内でベンチマークより強力であった複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドが特定された。
【０３４４】
体外での粘度試験のために、約２４のアンチセンスオリゴヌクレオチドがさらに選択された（実施例１３）。粘性であったアンチセンスオリゴヌクレオチドは、さらなる研究に進められなかった。
【０３４５】
ゲッ齒類の忍容性および薬物動態の体内研究のために、約１４のアンチセンスオリゴヌクレオチドがさらに選択された（実施例８〜１０）。本研究は、ＩＳＩＳ  ４９４３７２が最も忍容性を示したアンチセンスオリゴヌクレオチドであったことを示した。
【０３４６】
ＩＳＩＳ  ４９４２８３、４９４２８４、４９４２８６、４９４３０１、４９４３０２、および４９４３７２がカニクイザルにおいて試験された（実施例１１〜１２）。本研究は、ＩＳＩＳ  ４９４３７２がサルにおいて良好に忍容され、強力であったことを示した。
【０３４７】
実施例
非限定的な開示および参照による組み込み
本明細書に記載されるある特定の化合物、組成物、および方法が、ある特定の実施形態に従って特異的に記載されている一方で、次の例は、本明細書に記載される化合物を例証するのみの役割を果たしており、それらを限定するようには意図されない。本出願に列挙される参考文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例１】
【０３４８】
ヒト初代培養肝細胞におけるヒトアポリポタンパク質（ａ）（アポ（ａ））の用量依存アンチセンス阻害
前述の刊行物（国際公開第２００５／０００２０１号、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）による選択されたギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ヒト初代培養肝細胞における単一用量アッセイにおいて試験した。細胞をＴｉｓｓｕｅ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）から入手し、１５０ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した。約１６時間の処置期間後、ＲＮＡを細胞から単離し、定量的リアルタイムＰＣＲによってアポ（ａ）ｍＲＮＡレベルを測定した。ｍＲＮＡレベルを測定するために、ヒトアポ（ａ）ヒトプライマープローブセットｈＡＰＯ（ａ）３’（順方向配列ＡＣＡＧＣＡＡＴＣＡＡＡＣＧＡＡＧＡＣＡＣＴＧ、本明細書では配列番号５として指定される；逆方向配列ＡＧＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＡＡＡＡＴＡＣＣＡＡＡＡＡＴＧＣ、本明細書では配列番号６として指定される；プローブ配列ＴＣＣＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＣＴＡＴＧＣＣＡＡＡＣＣＴＴ、本明細書では配列番号７として指定される）を使用した。加えて、ヒトアポ（ａ）プライマープローブセットｈＡＰＯ（ａ）１２ｋＢ（順方向配列ＣＣＡＣＡＧＴＧＧＣＣＣＣＧＧＴ、本明細書では配列番号８として指定される；逆方向配列ＡＣＡＧＧＧＣＴＴＴＴＣＴＣＡＧＧＴＧＧＴ、本明細書では配列番号９として指定される；プローブ配列ＣＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＧＡＡＣＡＡＧ、本明細書では配列番号１０として指定される）を使用して、ｍＲＮＡレベルも測定された。アポ（ａ）ｍＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現に正規化した。未処置の対照細胞に対するアポ（ａ）の阻害パーセントとして表１に結果を提示する。
【表１】
2019071902.tif 000011
【０３４９】
用量応答アッセイにおいてさらに試験するために、いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択した。
【０３５０】
選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、下の表２に指定される２５ｎＭ、５０ｎＭ、１５０ｎＭ、または３００ｎＭ濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで、ヒト初代培養肝細胞において試験した。約１６時間の処置期間後、ＲＮＡを細胞から単離し、定量的リアルタイムＰＣＲによってアポ（ａ）ｍＲＮＡレベルを測定した。ｍＲＮＡレベルを測定するために、ヒトアポ（ａ）プライマープローブセットｈＡＰＯ（ａ）３’を使用した。アポ（ａ）ｍＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現に正規化した。未処置の対照細胞に対するアポ（ａ）の阻害パーセントとして結果を提示する。
【表２】
2019071902.tif 000012
【０３５１】
ＩＳＩＳ  １４４３６７は、他のアンチセンスオリゴヌクレオチドより良好な有効性および用量依存性を示した。よって、ＩＳＩＳ  １４４３６７は、本明細書に開示される新規に設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力と比較するためのベンチマークアンチセンスオリゴヌクレオチドとみなされた。
【実施例２】
【０３５２】
遺伝子導入マウスの初代培養肝細胞におけるヒトアポ（ａ）のアンチセンス阻害
アポ（ａ）核酸を標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドが新規に設計され、体外でのアポ（ａ）ｍＲＮＡに対するそれらの効果について試験された。類似する培養条件を有する一連の平行実験において、効力についてアンチセンスオリゴヌクレオチドを試験した。ヒトアポ（ａ）遺伝子導入マウスからの初代培養肝細胞（Ｆｒａｚｅｒ，Ｋ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９５．９：４２４−４３１）が、この研究において使用された。エレクトロポレーションを使用して、ウェル当たり３５，０００細胞の密度の肝細胞を１，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約２４時間の処置期間後、ＲＮＡを細胞から単離し、定量的リアルタイムＰＣＲによってアポ（ａ）ｍＲＮＡレベルを測定した。ｍＲＮＡレベルを測定するために、ヒトプライマープローブセットｈＡＰＯ（ａ）１２ｋＢを使用した。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定される、全ＲＮＡ含量によりアポ（ａ）ｍＲＮＡレベルを調整した。各実験の結果は、下に示される別々の表に提示される。新規アンチセンスオリゴヌクレオチドのベンチマークとして、からのＩＳＩＳ  １４４３６７が使用され、本研究においても含まれる。未処置の対照細胞に対するアポ（ａ）の阻害パーセントとして結果を提示する。これらの培養条件下で、合計１，５１１のギャップマーを試験した。さらなる研究用に選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドのみが下の表に提示され、各表は別々の実験を表す。
【０３５３】
新規に設計されたキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを５−１０−５ＭＯＥギャップマーとして設計した。ギャップマーは長さが２０個のヌクレオシドであり、中央ギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオシドを含み、かつそれぞれ５個のヌクレオシドを含む５’方向および３’方向上のウィングセグメントに隣接する。５’ウィングセグメントの各ヌクレオシドおよび３’ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、２’−ＭＯＥ修飾を有する。各ギャップマー全体のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー全体の全てのシトシン残基は、５−メチルシトシンである。
【０３５４】
アポ（ａ）標的配列は複数のクリングル反復配列を含有し、したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドがクリングル配列を標的指向するか否かにより、アポ（ａ）の１つ以上の領域を標的指向することができる。「開始部位」は、ギャッ
プマーがヒト配列において標的指向される最も５’側のヌクレオシドを示す。「停止部位」は、ギャップマーがヒト配列において標的指向される最も３’側のヌクレオシドを示す。アポ（ａ）アンチセンスオリゴヌクレオチドは、クリングル反復を標的指向するか否かにより、２つ以上の「開始部位」または「停止部位」を有することができる。
【０３５５】
表に列挙される大半のギャップマーは、本明細書において配列番号１として指定されるヒトアポ（ａ）ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿００５５７７．２）、もしくは本明細書において配列番号２として指定されるヒトアポ（ａ）ゲノム配列（ヌクレオチド３２３００００〜３３８００００が先端切断されたＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＴ＿００７４２２．１２）のいずれか、またはそれらの両方の１つ以上の領域に１００％相補性で標的指向される。「ｎ／ａ」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが１００％相補性でその特定の配列を標的指向しないことを示す。
【表３】
2019071902.tif 000013
【表４−１】
2019071902.tif 000014
【表４−２】
2019071902.tif 000015
【表４−３】
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【表４−４】
2019071902.tif 000017
【表５】
2019071902.tif 000018
【表６】
2019071902.tif 000019
【表７】
2019071902.tif 000020
【表８】
2019071902.tif 000021
【表９】
2019071902.tif 000022
【表１０】
2019071902.tif 000023
【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
2019071902.tif 000026
【実施例３】
【０３５６】
遺伝子導入マウスの初代培養肝細胞におけるアポ（ａ）の用量依存アンチセンス阻害
アポ（ａ）ｍＲＮＡの有意な体外阻害を示す上述の研究からのギャップマーを選択し、類似する培養条件の一連の平行研究において、遺伝子導入マウスの初代培養肝細胞で様々な用量で試験した。ウェル当たり３５，０００の密度で細胞を平板培養し、エレクトロポレーションを使用して、０．０６２５μＭ、０．１２５μＭ、０．２５μＭ、０．５００μＭ、または１．０００μＭ濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約１６時間の処置期間後、ＲＮＡを細胞から単離し、定量的リアルタイムＰＣＲによってアポ（ａ）ｍＲＮＡレベルを測定した。ｍＲＮＡレベルを測定するために、アポ（ａ）プライマープローブセットｈＡＰＯ（ａ）１２ｋＢを使用した。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定される、全ＲＮＡ含量によりアポ（ａ）ｍＲＮＡレベルを調整した。未処置の対照細胞に対するアポ（ａ）の阻害パーセントとして結果を提示する。
【０３５７】
研究のそれぞれの結果は下に提示される表に示され、各表は別々の実験を表す。各オリゴヌクレオチドの半最大阻害濃度（ＩＣ５０）も表に表す。アポ（ａ）ｍＲＮＡレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置された細胞において、用量依存様式で有意に減少した。新規に設計されたオリゴの効力をベンチマークオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ  １４４３６７と比較した。
【表１４】
2019071902.tif 000027
【表１５】
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【表１６】
2019071902.tif 000029
【表１７】
2019071902.tif 000030
【表１８】
2019071902.tif 000031
【表１９】
2019071902.tif 000032
【表２０】
2019071902.tif 000033
【表２１】
2019071902.tif 000034
【表２２】
2019071902.tif 000035
【０３５８】
上の表に提示されるように、ＩＳＩＳ  ４９４１５７（配列番号１２）、ＩＳＩＳ  ４９４１５８（配列番号１３）、ＩＳＩＳ  ４９４１５９（配列番号１４）、ＩＳＩＳ  ４９４１６０（配列番号１５）、ＩＳＩＳ  ４９４１６１（配列番号１６）、ＩＳＩＳ  ４９４１６２（配列番号１７）、ＩＳＩＳ  ４９４１６３（配列番号１８）、ＩＳＩＳ  ４９４１６４（配列番号１９）、ＩＳＩＳ  ４９４１６５（配列番号２０）、ＩＳＩＳ  ４９４１６７（配列番号２２）、ＩＳＩＳ  ４９４１６８（配列番号２３）、ＩＳＩＳ  ４９４１６９（配列番号２４）、ＩＳＩＳ  ４９４１７０（配列番号２５）、ＩＳＩＳ  ４９４２３０（配列番号１０５）、ＩＳＩＳ  ４９４２４３（配列番号１０６）、ＩＳＩＳ
４９４２４４（配列番号１０７）、ＩＳＩＳ  ４９４２８３（配列番号２６）、ＩＳＩＳ  ４９４２８４（配列番号２７）、ＩＳＩＳ  ４９４２８５（配列番号２８）、ＩＳＩＳ  ４９４２８６（配列番号２９）、ＩＳＩＳ  ４９４２８７（配列番号３０）、ＩＳＩ
Ｓ  ４９４２８８（配列番号３１）、ＩＳＩＳ  ４９４２９０（配列番号３２）、ＩＳＩＳ  ４９４２９１（配列番号３３）、ＩＳＩＳ  ４９４２９２（配列番号３５）、ＩＳＩＳ  ４９４２９４（配列番号３６）、ＩＳＩＳ  ４９４２９９（配列番号３７）、ＩＳＩＳ  ４９４３００（配列番号３８）、ＩＳＩＳ  ４９４３０１（配列番号３９）、ＩＳＩＳ  ４９４３０２（配列番号４０）、ＩＳＩＳ  ４９４３０３（配列番号４１）、ＩＳＩＳ  ４９４３０４（配列番号４２）、ＩＳＩＳ  ４９４３０５（配列番号４３）、ＩＳＩＳ  ４９４３０６（配列番号４４）、ＩＳＩＳ  ４９４３１１（配列番号４７）、ＩＳＩＳ  ４９４３３４（配列番号４８）、ＩＳＩＳ  ４９４３３６（配列番号４９）、ＩＳＩＳ  ４９４３３７（配列番号５０）、ＩＳＩＳ  ４９４３３８（配列番号１３３）、ＩＳＩＳ  ４９４３７１（配列番号５７）、ＩＳＩＳ  ４９４３７２（配列番号５８）、ＩＳＩＳ  ４９４３７３（配列番号５９）、ＩＳＩＳ  ４９４３７４（配列番号６０）、ＩＳＩＳ  ４９４３７５（配列番号６１）、ＩＳＩＳ  ４９４３８６（配列番号６２）、ＩＳＩＳ  ４９４３８９（配列番号６５）、ＩＳＩＳ  ４９４３９０（配列番号６６）、ＩＳＩＳ  ４９４３９２（配列番号６８）、ＩＳＩＳ  ４９４４６６（配列番号１０８）、ＩＳＩＳ  ４９４４７０（配列番号１０９）、ＩＳＩＳ  ４９４４７２（配列番号１１０）、ＩＳＩＳ  ４９４５２１（配列番号５１）、ＩＳＩＳ  ４９４５３０（配列番号５３）、ＩＳＩＳ  ４９８２２９（配列番号７５）、ＩＳＩＳ  ４９８２３８（配列番号７６）、ＩＳＩＳ  ４９８２３９（配列番号７７）、ＩＳＩＳ  ４９８２４０（配列番号７８）、ＩＳＩＳ  ４９８２４１（配列番号７９）、ＩＳＩＳ  ４９８２４３（配列番号８１）、ＩＳＩＳ  ４９８３７９（配列番号７０）、ＩＳＩＳ  ４９８４０８  （配列番号７１）、ＩＳＩＳ  ４９８４３３（配列番号７２）、ＩＳＩＳ  ４９８４３４（配列番号７３）、ＩＳＩＳ  ４９８４３５（配列番号７４）、ＩＳＩＳ  ４９８５１７（配列番号８５）、ＩＳＩＳ  ４９８５２３（配列番号９２）、ＩＳＩＳ  ４９８５２４（配列番号９３）、ＩＳＩＳ  ４９８５２５（配列番号９４）、ＩＳＩＳ  ４９８５５０（配列番号９７）、ＩＳＩＳ  ４９８５８０（配列番号１０３）、ＩＳＩＳ  ４９８５８１（配列番号１０４）、ＩＳＩＳ  ４９８７２１（ＡＴＧＣＣＴＣＧＡＴＡＡＣＴＣＣＧＴＣＣ；配列番号１３４）、ＩＳＩＳ  ４９８８３３（配列番号８６）、ＩＳＩＳ  ４９８８７５（配列番号８９）、およびＩＳＩＳ  ４９９０２０（配列番号９０）は、ＩＳＩＳ  １４４３６７（配列番号１１）より強力であった。
【実施例４】
【０３５９】
遺伝子導入マウスの初代培養肝細胞におけるアポ（ａ）の用量依存アンチセンス阻害
上述の研究からの強力なギャップマーをさらに選択し、類似する培養条件の一連の研究において、遺伝子導入マウスの初代培養肝細胞で様々な用量で試験した。ウェル当たり３５，０００の密度で細胞を平板培養し、エレクトロポレーションを使用して、下の表に指定されるように、０．０４９μＭ、０．１４８μＭ、０．４４４μＭ、１．３３３μＭ、または４．０００μＭ濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約１６時間の処置期間後、ＲＮＡを細胞から単離し、定量的リアルタイムＰＣＲによってアポ（ａ）ｍＲＮＡレベルを測定した。ｍＲＮＡレベルを測定するために、アポ（ａ）プライマープローブセットｈＡＰＯ（ａ）１２ｋＢを使用した。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定される、全ＲＮＡ含量によりアポ（ａ）ｍＲＮＡレベルを調整した。未処置の対照細胞に対するアポ（ａ）の阻害パーセントとして結果を提示する。
【０３６０】
研究のそれぞれの結果は下に提示される表に示され、各表は別々の実験を表す。各オリゴヌクレオチドの半最大阻害濃度（ＩＣ５０）も表に表す。アポ（ａ）ｍＲＮＡレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置された細胞において、用量依存様式で有意に減少した。新規に設計されたオリゴの効力をベンチマークオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ  １４４３６７と比較した。下の表に提示されるように、ＩＳＩＳ  ４９４１５７（配列番号１２）、ＩＳＩＳ  ４９４１５８（配列番号１３）、ＩＳＩＳ  ４９４１５９（配列番号１４）、ＩＳＩＳ  ４９４１６０（配列番号１５）、ＩＳＩＳ  ４９４１６１（配列番号１
６）、ＩＳＩＳ  ４９４１６２（配列番号１７）、ＩＳＩＳ  ４９４１６３（配列番号１８）、ＩＳＩＳ  ４９４１６４（配列番号１９）、ＩＳＩＳ  ４９４２３０（配列番号１０５）、ＩＳＩＳ  ４９４２４３（配列番号１０６）、ＩＳＩＳ  ４９４２４４（配列番号１０７）、ＩＳＩＳ  ４９４２８３（配列番号２６）、ＩＳＩＳ  ４９４２８４（配列番号２７）、ＩＳＩＳ  ４９４２８５（配列番号２８）、ＩＳＩＳ  ４９４２８６（配列番号２９）、ＩＳＩＳ  ４９４２８７（配列番号３０）、ＩＳＩＳ  ４９４２９０（配列番号３２）、ＩＳＩＳ  ４９４２９２（配列番号３５）、ＩＳＩＳ  ４９４３００（配列番号３８）、ＩＳＩＳ  ４９４３０１（配列番号３９）、ＩＳＩＳ  ４９４３０２（配列番号４０）、ＩＳＩＳ  ４９４３０３（配列番号４１）、ＩＳＩＳ  ４９４３０４（配列番号４２）、ＩＳＩＳ  ４９４３０５（配列番号４３）、ＩＳＩＳ  ４９４３０６（配列番号４４）、ＩＳＩＳ  ４９４３１０（配列番号４６）、ＩＳＩＳ  ４９４３１１（配列番号４７）、ＩＳＩＳ  ４９４３３７（配列番号５０）、ＩＳＩＳ  ４９４３７１（配列番号５７）、ＩＳＩＳ  ４９４３７２（配列番号５８）、ＩＳＩＳ  ４９４３７５（配列番号６１）、ＩＳＩＳ  ４９４３８８（配列番号６４）、ＩＳＩＳ  ４９４３８９（配列番号６５）、ＩＳＩＳ  ４９４３９０（配列番号６６）、ＩＳＩＳ  ４９４３９２（配列番号６８）、ＩＳＩＳ  ４９４４６６（配列番号１０８）、ＩＳＩＳ  ４９４４７０（配列番号１０９）、ＩＳＩＳ  ４９４４７２（配列番号１１０）、ＩＳＩＳ  ４９８２３８（配列番号７６）、ＩＳＩＳ  ４９８２３９（配列番号７７）、ＩＳＩＳ  ４９８４３３（配列番号７２）、ＩＳＩＳ  ４９８４３４（配列番号７３）、ＩＳＩＳ  ４９８４３５（配列番号７４）、ＩＳＩＳ  ４９８５２３（配列番号９２）、ＩＳＩＳ  ４９８５２４（配列番号９３）、ＩＳＩＳ  ４９８５２５（配列番号９４）、ＩＳＩＳ  ４９８５８０（配列番号１０３）、およびＩＳＩＳ  ４９８５８１（配列番号１０４）は、ＩＳＩＳ  １４４３６７（配列番号１１）より強力であった。
【表２３】
2019071902.tif 000036
【表２４】
2019071902.tif 000037
【表２５】
2019071902.tif 000038
【表２６】
2019071902.tif 000039
【表２７】
2019071902.tif 000040
【実施例５】
【０３６１】
遺伝子導入マウスの初代培養肝細胞におけるヒトアポ（ａ）のアンチセンス阻害
アポ（ａ）核酸を標的指向するさらなるアンチセンスオリゴヌクレオチドが新規に設計され、体外でのアポ（ａ）ｍＲＮＡに対するそれらの効果について試験された。類似する培養条件を有する一連の実験において、アンチセンスオリゴヌクレオチドを試験した。ヒトアポ（ａ）遺伝子導入マウスからの初代培養肝細胞を本研究に使用した。エレクトロポレーションを使用して、ウェル当たり３５，０００細胞の密度の肝細胞を１，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約２４時間の処置期間後、ＲＮＡを細胞から単離し、定量的リアルタイムＰＣＲによってアポ（ａ）ｍＲＮＡレベルを測定した。ｍＲＮＡレベルを測定するために、ヒトプライマープローブセットｈＡＰＯ
（ａ）１２ｋＢを使用した。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定される、全ＲＮＡ含量によりアポ（ａ）ｍＲＮＡレベルを調整した。各実験の結果は、下に示される別々の表に提示される。比較のために、ＩＳＩＳ  １４４３６７も本研究に含まれた。未処置の対照細胞に対するアポ（ａ）の阻害パーセントとして結果を提示する。これらの培養条件下で、合計２３１のアンチセンスオリゴヌクレオチドを試験した。さらなる研究用に選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドのみが下に提示される。
【０３６２】
新規に設計されたキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを３−１０−４ＭＯＥギャップマーとして設計した。ギャップマーは長さが１７個のヌクレオシドであり、中央ギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオシドを含み、かつそれぞれ、３個のヌクレオシドおよび４個のヌクレオシドを含む５’方向および３’方向上のウィングセグメントに隣接する。５’ウィングセグメントの各ヌクレオシドおよび３’ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、２’−ＭＯＥ修飾を有する。各ギャップマー全体のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー全体の全てのシトシン残基は、５−メチルシトシンである。
【０３６３】
アポ（ａ）標的配列は複数のクリングル反復配列を含有し、したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドがクリングル配列を標的指向するか否かにより、アポ（ａ）の１つ以上の領域を標的指向することができる。「開始部位」は、ギャップマーがヒト配列において標的指向される最も５’側のヌクレオシドを示す。「停止部位」は、ギャップマーがヒト配列において標的指向される最も３’側のヌクレオシドを示す。アポ（ａ）アンチセンスオリゴヌクレオチドは、クリングル反復を標的指向するか否かにより、２つ以上の「開始部位」または「停止部位」を有することができる。
【０３６４】
表に列挙される大半のギャップマーは、本明細書において配列番号１として指定されるヒトアポ（ａ）ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿００５５７７．２）、もしくは本明細書において配列番号２として指定されるヒトアポ（ａ）ゲノム配列（ヌクレオチド３２３００００〜３３８００００が先端切断されたＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＴ＿００７４２２．１２）のいずれか、またはそれらの両方の複数の領域に１００％相補性で標的指向される。「ｎ／ａ」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが１００％相補性でその特定の配列を標的指向しないことを示す。
【表２８−１】
2019071902.tif 000041
【表２８−２】
2019071902.tif 000042
【表２９】
2019071902.tif 000043
【表３０】
2019071902.tif 000044
【実施例６】
【０３６５】
遺伝子導入マウスの初代培養肝細胞におけるアポ（ａ）の用量依存アンチセンス阻害
上述の研究からの強力なギャップマーをさらに選択し、類似する培養条件の一連の研究において、遺伝子導入マウスの初代培養肝細胞で様々な用量で試験した。ウェル当たり３５，０００の密度で細胞を平板培養し、エレクトロポレーションを使用して、下の表に指定されるように、０．１５６μＭ、０．３１３μＭ、０．６２５μＭ、１．２５０μＭ、２．５００μＭ、または５．０００μＭ濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約１６時間の処置期間後、ＲＮＡを細胞から単離し、定量的リアルタイムＰＣＲによってアポ（ａ）ｍＲＮＡレベルを測定した。ｍＲＮＡレベルを測定するために、アポ（ａ）プライマープローブセットｈＡＰＯ（ａ）１２ｋＢを使用した。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によって測定される、全ＲＮＡ含量によりアポ（ａ）ｍＲＮＡレベルを調整した。未処置の対照細胞に対するアポ（ａ）の阻害パーセントとして結果を提示する。
【０３６６】
研究のそれぞれの結果は下に提示される表に示され、各表は別々の実験を表す。各オリゴヌクレオチドの半最大阻害濃度（ＩＣ５０）も表に表す。
【表３１】
2019071902.tif 000045
【表３２】
2019071902.tif 000046
【表３３】
2019071902.tif 000047
【表３４】
2019071902.tif 000048
【０３６７】
アポ（ａ）ｍＲＮＡレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置された細胞において、用量依存様式で有意に減少した。新規に設計されたオリゴヌクレオチドの効力をベンチマークオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ  １４４３６７と比較した。上の表に提示されるように、ＩＳＩＳ  ５１０５４２（配列番号１１１）、ＩＳＩＳ  ５１０５４５（配列番号１１４）、ＩＳＩＳ  ５１０５４６（配列番号１１５）、ＩＳＩＳ  ５１０５４７（配列番号１１６）、ＩＳＩＳ  ５１０５４８（配列番号１１７）、ＩＳＩＳ  ５１０５４９（配列番号１１８）、ＩＳＩＳ  ５１０５９５（配列番号１１９）、ＩＳＩＳ  ５１０５９７（配列番号１２０）、ＩＳＩＳ  ５１０５９８（配列番号１２１）、ＩＳＩＳ  ５１０７０１（配列番号１２７）、ＩＳＩＳ  ５１０７０２（配列番号１２８）、ＩＳＩＳ  ５１０７０４（配列番号１２９）、ＩＳＩＳ  ５１２９４４（配列番号１２３）、ＩＳＩＳ
５１２９４７（配列番号１２４）、ＩＳＩＳ  ５１２９５８（配列番号１２５）、およびＩＳＩＳ  ５１２９５９（配列番号１２６）は、ＩＳＩＳ  １４４３６７（配列番号１１）より強力であった。
【実施例７】
【０３６８】
ヒトアポ（ａ）遺伝子導入マウスにおけるヒトアポ（ａ）の体内でのアンチセンス阻害に対する効果
ヒトアポ（ａ）遺伝子を有する遺伝子導入マウス（Ｆｒａｚｅｒ，Ｋ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９５．９：４２４−４３１）を以下に記載される研究において利用した。上述のように、体外で統計的に有意なアポ（ａ）ｍＲＮＡの阻害を示したＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドを、このモデルにおいてさらに評価した。
【０３６９】
研究１
雌のヒトアポ（ａ）遺伝子導入マウスを１２時間の明／暗サイクルで維持し、通常の実験食餌を自由に摂取させた。マウスをそれぞれ４匹のマウスからなる処置群に分けた。本群は、２週間の間、１週間に２回、２５ｍｇ／ｋｇ  の用量で、ＩＳＩＳ  ４９４１５９、ＩＳＩＳ  ４９４１６０、ＩＳＩＳ  ４９４１６１、ＩＳＩＳ  ４９４１６２、ＩＳＩＳ  ４９４１６３、ＩＳＩＳ  ４９４２３０、ＩＳＩＳ  ４９４２４３、ＩＳＩＳ  ４９４２４４、ＩＳＩＳ  ４９４２８３、ＩＳＩＳ  ４９４２８４、ＩＳＩＳ  ４９４２８５、ＩＳＩＳ  ４９４２８６、ＩＳＩＳ  ４９４３０１、ＩＳＩＳ  ４９４３０２、ＩＳＩＳ  ４９４３０４、ＩＳＩＳ  ４９４４６６、ＩＳＩＳ  ４９４４７０、ＩＳＩＳ  ４９４４７２、ＩＳＩＳ  ４９８２３９、ＩＳＩＳ  ４９８４０８、ＩＳＩＳ  ４９８５１７、ＩＳＩＳ  ４９４１５８、ＩＳＩＳ  ４９４３１１、ＩＳＩＳ  ４９４３３７、ＩＳＩＳ  ４９４３７２、ＩＳＩＳ  ４９８２３８、ＩＳＩＳ  ４９８５２３、ＩＳＩＳ  ４９８５２５、ＩＳＩＳ  ５１０５４８、ＩＳＩＳ  ５１２９４４、ＩＳＩＳ  ５１２９４７
、またはＩＳＩＳ  ５１２９５８の腹腔内注射を受けた。マウスの１群は、２週間の間、１週間に２回、ＰＢＳの腹腔内注射を受けた。ＰＢＳ群を対照群とした。最終用量の２日後、マウスを安楽死させ、臓器を採取し、分析が行われた。
【０３７０】
ヒトアポ（ａ）ｍＲＮＡの阻害
全ＲＮＡを治療群のいくつかの肝臓から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲによってヒトアポ（ａ）ｍＲＮＡを定量化した。結果は表３５に提示され、ＰＢＳ対照と比較したアポ（ａ）ｍＲＮＡの阻害パーセントとして表される。
【表３５】
2019071902.tif 000049
【０３７１】
データは、いくつかのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドによるアポ（ａ）ｍＲＮＡの有意な阻害を示す。ＩＳＩＳ  ４９４１５９（配列番号１４）、ＩＳＩＳ  ４９４１６２（配列番号１７）、ＩＳＩＳ  ４９４１６３（配列番号１８）、ＩＳＩＳ  ４９４２４３（配列番号１０６）、ＩＳＩＳ  ４９４２４４（配列番号１０７）、ＩＳＩＳ  ４９４２８３（配列番号２６）、ＩＳＩＳ  ４９４２８４（配列番号２７）、ＩＳＩＳ  ４９４２８５（配列番号２８）、ＩＳＩＳ  ４９４３０１（配列番号３９）、およびＩＳＩＳ  ４９８４０８（配列番号７１）は、ベンチマークＩＳＩＳ  １４４３６７（配列番号１１）より強力であった。
【０３７２】
ヒトアポ（ａ）タンパク質の阻害
アポ（ａ）ＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ  １０−１１０６−０１，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、全治療群からの血漿ヒトアポ（ａ）タンパク質を測定した。結果は表３６に提示され、ＰＢＳ対照と比較したアポ（ａ）ｍＲＮＡの阻害パーセ
ントとして表される。
【表３６】
2019071902.tif 000050
【０３７３】
データは、いくつかのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドによるアポ（ａ）ｍＲＮＡの有意な阻害を示す。ＩＳＩＳ  ４９４１５９（配列番号１４）、ＩＳＩＳ  ４９４２４４（配列番号８２）、ＩＳＩＳ  ４９４２８３（配列番号２６）、ＩＳＩＳ  ４９４２８４（配列番号２７）、ＩＳＩＳ  ４９４２８５（配列番号２８）、ＩＳＩＳ  ４９４２８６（配列番号２９）、ＩＳＩＳ  ４９４３０１（配列番号３９）、およびＩＳＩＳ  ４９４３０２（配列番号４０）は、ベンチマークＩＳＩＳ  １４４３６７（配列番号１１）と同じくらいか、またはそれ以上強力であった。
【０３７４】
研究２
ＩＳＩＳ  ４９４１５９、ＩＳＩＳ  ４９４１６１、ＩＳＩＳ  ４９４１６２、ＩＳＩＳ  ４９４１６３、およびＩＳＩＳ  ４９４２４３を、この遺伝子導入モデルにおいてさらに評価した。比較のために、ＩＳＩＳ  １４４３６７が含まれた。
【０３７５】
処置
雌のヒトアポ（ａ）遺伝子導入マウスをそれぞれ４匹のマウスからなる処置群に分けた。本群は、２週間の間、１週間に２回、１．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇの用量で、ＩＳＩＳ  １４４３６７、ＩＳＩＳ  ４９４１５９、ＩＳＩＳ  ４９４１６１、ＩＳＩＳ  ４９４１６２、ＩＳＩＳ  ４９４１６３、またはＩＳＩＳ  ４９４２４３の腹腔内注射を受けた。マウスの１群は、２週間の間、１週間に２回、ＰＢＳの腹腔内注射を受けた。ＰＢＳ群を対照群とした。最終用量の２日後、マウスを安楽死させ、臓器を採取し、分析が行われた。
【０３７６】
ヒトアポ（ａ）ｍＲＮＡの阻害
全ＲＮＡを治療群の肝臓から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲによってヒトアポ（ａ）ｍＲＮＡを定量化した。結果は表３７に提示され、ＰＢＳ対照と比較したアポ（ａ）ｍＲＮＡの阻害パーセントとして表される。
【表３７】
2019071902.tif 000051
【０３７７】
データは、いくつかのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドによるアポ（ａ）ｍＲＮＡの有意な阻害を示す。ＩＳＩＳ  ４９４１５９（配列番号１４）、ＩＳＩＳ  ４９４１６１（配列番号１６）、４９４１６２（配列番号１７）、およびＩＳＩＳ  ９４１６３（配列番号１８）は、ベンチマークＩＳＩＳ  １４４３６７（配列番号１１）より有効であった。
【０３７８】
ヒトアポ（ａ）タンパク質レベルの低下
処置群から血液を採取し、アポ（ａ）ＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ  １０−１１０６−０１，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）でヒトアポ（ａ）タンパク質レベルを定量化した。結果は表３８に提示され、ＰＢＳ対照と比較したアポ（ａ）タンパク質レベルの低下パーセントとして表される。
【表３８】
2019071902.tif 000052
【０３７９】
データは、いくつかのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドによるアポ（ａ）血漿タンパク質レベルの有意な低下を示す。ＩＳＩＳ  ４９４１５９（配列番号１４）、ＩＳＩＳ  ４９４１６１（配列番号  １６）、ＩＳＩＳ  ４９４１６２（配列番号１７）、およびＩＳＩＳ
４９４１６３（配列番号１８）は、ベンチマークＩＳＩＳ  １４４３６７（配列番号１
１）より有効であった。
【０３８０】
研究３
ＩＳＩＳ  ４９４２４４、ＩＳＩＳ  ４９４２８３、およびＩＳＩＳ  ４９４２８４を、このモデルにおいてさらに評価した。比較のために、ＩＳＩＳ  １４４３６７が含まれた。
【０３８１】
処置
雌のヒトアポ（ａ）遺伝子導入マウスをそれぞれ４匹のマウスからなる処置群に分けた。本群は、２週間の間、１週間に２回、０．７５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、または２５ｍｇ／ｋｇの用量で、ＩＳＩＳ  １４４３６７、ＩＳＩＳ  ４９４２４４、ＩＳＩＳ  ４９４２８３、またはＩＳＩＳ  ４９４２８４の腹腔内注射を受けた。マウスの１群は、２週間の間、１週間に２回、ＰＢＳの腹腔内注射を受けた。ＰＢＳ群を対照群とした。最終用量の２日後、マウスを安楽死させ、臓器を採取し、分析が行われた。
【０３８２】
ヒトアポ（ａ）ｍＲＮＡの阻害
全ＲＮＡを治療群の肝臓から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲによってヒトアポ（ａ）ｍＲＮＡを定量化した。結果は表３９に提示され、ＰＢＳ対照と比較したアポ（ａ）ｍＲＮＡの阻害パーセントとして表される。
【表３９】
2019071902.tif 000053
【０３８３】
データは、いくつかのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドによるアポ（ａ）ｍＲＮＡの有意な阻害を示す。ＩＳＩＳ  ４９４２４４（配列番号１０７）、ＩＳＩＳ  ４９４２８３（配列番号２６）、およびＩＳＩＳ  ４９４２８４（配列番号２７）は、ベンチマークＩＳＩＳ  １４４３６７（配列番号１１）より有効であった。
【０３８４】
ヒトアポ（ａ）タンパク質レベルの低下
処置群から血液を採取し、アポ（ａ）ＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ  １０−１１０６−０１，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）でヒトアポ（ａ）タンパク質レベルを定
量化した。結果は表４０に提示され、ＰＢＳ対照と比較したアポ（ａ）タンパク質レベルの低下パーセントとして表される。
【表４０】
2019071902.tif 000054
【０３８５】
データは、いくつかのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドによるアポ（ａ）血漿タンパク質レベルの有意な低下を示す。ＩＳＩＳ  ４９４２４４（配列番号１０７）、ＩＳＩＳ  ４９４２８３（配列番号２６）、およびＩＳＩＳ  ４９４２８４（配列番号２７）は、ベンチマークＩＳＩＳ  １４４３６７（配列番号１１）より有効であった。
【０３８６】
研究４
ＩＳＩＳ  ４９４２８５、ＩＳＩＳ  ４９４２８６、ＩＳＩＳ  ４９４３０１、ＩＳＩＳ  ４９４３０２、およびＩＳＩＳ  ４９４３１１を、このモデルにおいてさらに評価した。
【０３８７】
処置
雄のヒトアポ（ａ）遺伝子導入マウスをそれぞれ４匹のマウスからなる処置群に分けた。そのような各群は、２週間の間、１週間に１回、５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇの用量で、ＩＳＩＳ  ４９４２８５、ＩＳＩＳ  ４９４２８６、ＩＳＩＳ  ４９４３０１、ＩＳＩＳ  ４９４３０２、またはＩＳＩＳ  ４９４３１１の腹腔内注射を受けた。３匹のマウスの１群は、２週間の間、１週間に１回、ＰＢＳの腹腔内注射を受けた。ＰＢＳ群を対照群とした。最終用量の２日後、マウスを安楽死させ、臓器を採取し、分析が行われた。
【０３８８】
ヒトアポ（ａ）ｍＲＮＡの阻害
全ＲＮＡを治療群の肝臓から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲによってヒトアポ（ａ）ｍＲＮＡを定量化した。結果は表４１に提示され、ＰＢＳ対照と比較したアポ（ａ）ｍＲＮＡの阻害パーセントとして表される。データは、ＩＳＩＳ  ４９４２８５（配列番号２８）、ＩＳＩＳ  ４９４２８６（配列番号２９）、ＩＳＩＳ  ４９４３０１（配列番号３９）、ＩＳＩＳ  ４９４３０２（配列番号４０）、およびＩＳＩＳ  ４９４３１１（配列番号４７）によるアポ（ａ）ｍＲＮＡの有意な阻害を示す。
【表４１】
2019071902.tif 000055
【０３８９】
ヒトアポ（ａ）タンパク質レベルの低下
処置群から血液を採取し、アポ（ａ）ＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ  １０−１１０６−０１，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）でヒトアポ（ａ）タンパク質レベルを定量化した。結果は表４２に提示され、ＰＢＳ対照と比較したアポ（ａ）タンパク質レベルの低下パーセントとして表される。データは、ＩＳＩＳ  ４９４２８５、ＩＳＩＳ  ４９４２８６、ＩＳＩＳ  ４９４３０１、ＩＳＩＳ  ４９４３０２、およびＩＳＩＳ  ４９４３１１によるアポ（ａ）血漿タンパク質レベルの有意な低下を示す。
【表４２】
2019071902.tif 000056
【０３９０】
研究５
ＩＳＩＳ  ４９４３７２、ＩＳＩＳ  ４９８５２４、ＩＳＩＳ  ４９８５８１、ＩＳＩ
Ｓ  ４９８７２１、およびＩＳＩＳ  ４９８８３３を、このモデルにおいてさらに評価した。
【０３９１】
処置
雌のヒトアポ（ａ）遺伝子導入マウスをそれぞれ４匹のマウスからなる処置群に分けた。本群は、２週間の間、１週間に１回、５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇの用量で、ＩＳＩＳ  ４９４３７２、ＩＳＩＳ  ４９８５２４、ＩＳＩＳ  ４９８５８１、ＩＳＩＳ  ４９８７２１、またはＩＳＩＳ  ４９８８３３の腹腔内注射を受けた。３匹のマウスの１群は、２週間の間、１週間に１回、ＰＢＳの腹腔内注射を受けた。ＰＢＳ群を対照群とした。最終用量の２日後、マウスを安楽死させ、臓器を採取し、分析が行われた。
【０３９２】
ヒトアポ（ａ）ｍＲＮＡの阻害
全ＲＮＡを治療群の肝臓から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲによってヒトアポ（ａ）ｍＲＮＡを定量化した。結果は表４３に提示され、ＰＢＳ対照と比較したアポ（ａ）ｍＲＮＡの阻害パーセントとして表される。データは、ＩＳＩＳ  ４９４３７２（配列番号２８）、ＩＳＩＳ  ４９８５２４（配列番号９３）、ＩＳＩＳ  ４９８５８１（配列番号１０４）、およびＩＳＩＳ  ４９８７２１（ＡＴＧＣＣＴＣＧＡＴＡＡＣＴＣＣＧＴＣＣ；配列番号１３４）によるアポ（ａ）ｍＲＮＡの有意な阻害を示す。
【表４３】
2019071902.tif 000057
【０３９３】
ヒトアポ（ａ）タンパク質レベルの低下
処置群から血液を採取し、アポ（ａ）ＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ  １０−１１０６−０１，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）でヒトアポ（ａ）タンパク質レベルを定量化した。結果は表４４に提示され、ＰＢＳ対照と比較したアポ（ａ）タンパク質レベルの低下パーセントとして表される。データは、ＩＳＩＳ  ４９４３７２（配列番号２８）、ＩＳＩＳ  ４９８５８１（配列番号１０４）、およびＩＳＩＳ  ４９８７２１（ＡＴＧＣＣＴＣＧＡＴＡＡＣＴＣＣＧＴＣＣ；配列番号１３４）によるアポ（ａ）血漿タンパク質レベルの有意な低下を示す。
【表４４】
2019071902.tif 000058
【実施例８】
【０３９４】
ゲッ齒類モデルにおけるヒトアポ（ａ）を標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの忍容性
ヒトアポ（ａ）を標的指向するギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＤ１マウスおよびスプラーグドーリーラットにおける忍容性研究のために、上述の研究から選択された。ゲッ齒類は内因性アポ（ａ）を発現せず、よって、これらの研究は、動物におけるアポ（ａ）を阻害することによって起こり得る任意の表現型の変化ではなく、動物における各ヒトアンチセンスオリゴヌクレオチドの忍容性を試験した。
【０３９５】
ＣＤ１マウスにおける忍容性：研究１
ＣＤ１（登録商標）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，ＭＡ）は、多目的マウスモデルであり、安全性および有効性試験に頻繁に利用される。マウスを上述の研究から選択したＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、様々な血漿化学マーカーのレベルの変化について評価した。
【０３９６】
処置
雄のＣＤ１マウスの群は、６週間の間、１週間に２回、５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ  ４９４１５９、ＩＳＩＳ  ４９４１６１、ＩＳＩＳ  ４９４１６２、ＩＳＩＳ  ４９４２４４、ＩＳＩＳ  ４９４２８３、ＩＳＩＳ  ４９４２８４、ＩＳＩＳ  ４９４２８５、ＩＳＩＳ  ４９４２８６、ＩＳＩＳ  ４９４３０１、ＩＳＩＳ  ４９４３０２、ＩＳＩＳ  ４９４３１１、ＩＳＩＳ  ４９４３３７、ＩＳＩＳ  ４９４３７２、およびＩＳＩＳ  ５１０５４８を皮下注射された。６週齢の雄のＣＤ１マウスの１群は、６週間の間、１週間に２回、ＰＢＳを皮下注射された。最終用量の４８時間後、マウスを安楽死させ、さらなる分析のために臓器および血漿を採取した。
【０３９７】
血漿化学マーカー
肝臓および腎臓の機能に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するために、自動臨床化学分析器（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用して、トランスアミナーゼ、ビリルビン、アルブミン、クレアチニン、
およびＢＵＮの血漿レベルを測定した。結果を表４５に提示する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの予想範囲外の肝臓または腎臓の機能マーカーのいずれかのレベルにおいて変化を引き起こしたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、さらなる研究において除外された。
【表４５】
2019071902.tif 000059
【０３９８】
臓器重量
肝臓、脾臓、および腎臓の重量を、研究の終了時に測定し、表４６に提示する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの予想範囲外の臓器重量において任意の変化を引き起こしたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、さらなる研究から除外された。
【表４６】
2019071902.tif 000060
【０３９９】
スプラーグドーリーラットにおける忍容性
スプラーグドーリーラットは、安全性および有効性評価に使用される多目的モデルである。ラットを上述の研究から選択したＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、様々な血漿化学マーカーのレベルの変化について評価した。
【０４００】
処置
雄のスプラーグドーリーラットの群は、８週間の間、１週間に２回、３０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ  ４９４１５９、ＩＳＩＳ  ４９４１６１、ＩＳＩＳ  ４９４１６２、ＩＳＩＳ
４９４２４４、ＩＳＩＳ  ４９４２８３、ＩＳＩＳ  ４９４２８４、ＩＳＩＳ  ４９４２８５、ＩＳＩＳ  ４９４２８６、ＩＳＩＳ  ４９４３０１、ＩＳＩＳ  ４９４３０２、ＩＳＩＳ  ４９４３１１、ＩＳＩＳ  ４９４３３７、ＩＳＩＳ  ４９４３７２、およびＩＳＩＳ  ５１０５４８を皮下注射された。６匹の雄のスプラーグドーリーラットの１群は、８週間の間、１週間に２回、ＰＢＳを皮下注射された。最終用量の４８時間後、マウスを安楽死させ、さらなる分析のために臓器および血漿を採取した。
【０４０１】
血漿化学マーカー
肝臓および腎臓の機能に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するために、自動臨床化学分析器（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用して、トランスアミナーゼ、ビリルビン、アルブミン、クレアチニン、およびＢＵＮの血漿レベルを測定した。結果を表４７に提示する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの予想範囲外の肝臓または腎臓の機能マーカーのいずれかのレベルにおいて変化を引き起こしたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、さらなる研究において除外された。
【表４７】
2019071902.tif 000061
【０４０２】
腎臓機能
腎臓機能に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するために、自動臨床化学分析器（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用して、総タンパク質量およびクレアチニンの尿レベルを測定した。結果は表４８に提示され、ｍｇ／ｄＬで表される。
【表４８】
2019071902.tif 000062
【０４０３】
臓器重量
肝臓、脾臓、および腎臓重量を、研究の終了時に測定し、表４９に提示する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの予想範囲外の臓器重量において任意の変化を引き起こしたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、さらなる研究から除外された。
【表４９】
2019071902.tif 000063
【０４０４】
ゲッ齒類の忍容性研究による所見は、一般に、スクリーニングされた忍容性マーカー全てを考慮し、ＩＳＩＳ  ４９４３７２がＣＤ１マウスモデルおよびスプラーグドーリーラットモデルの両方において、最良の忍容性を示したアンチセンス化合物であったことを示した。
【実施例９】
【０４０５】
ＣＤ１マウスにおけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬物動態
ＣＤ１マウスをＩＳＩＳオリゴヌクレオチドで処置し、肝臓および腎臓のオリゴヌクレオチド濃度を評価した。
【０４０６】
処置
１群に４匹のＣＤ１マウスの群は、６週間の間、１週間に２回、５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ  ４９４２８３、ＩＳＩＳ  ４９４２８４、ＩＳＩＳ  ４９４２８６、ＩＳＩＳ  ４９４３０１、ＩＳＩＳ  ４９４３０２、またはＩＳＩＳ  ４９４３７２を皮下注射された。マウスを最終用量２日後に屠殺した。肝臓を分析のために採取した。
【０４０７】
オリゴヌクレオチド濃度の測定
総オリゴヌクレオチド濃度の濃度を測定した。使用された方法は、以前に公開された方法の改良であり（Ｌｅｅｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ｇｅａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、これはフェノール−クロロホルム（液体−液体）抽出、続いて固相抽出からなる。抽出前に、内標準（ＩＳＩＳ  ３５５８６８、２７−ｍｅｒ  ２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、配列番号１３１として本明細書に示さ
れるＧＣＧＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＴ）を付加した。較正曲線を使用して組織サンプル濃度を計算し、定量の下限（ＬＬＯＱ）は約１．１４μｇ／ｇであった。次に、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（ＰＨＡＲＳＩＧＨＴ）を使用して、半減期を計算した。
【０４０８】
結果は表５０に提示され、μｇ／ｇ肝臓または腎臓組織として表される。データは、ＩＳＩＳ  ４９４３７２が肝臓および腎臓において許容される濃度であったことを示す。
【表５０】
2019071902.tif 000064
【実施例１０】
【０４０９】
スプラーグドーリーラットにおけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬物動態
雄のスプラーグドーリーラットをＩＳＩＳオリゴヌクレオチドで処置し、肝臓および腎臓におけるオリゴヌクレオチド濃度を評価した。
【０４１０】
処置
１群に４匹のラットの群は、３週間の間、１週間に２回、１０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ  ４９４２８３、ＩＳＩＳ  ４９４２８４、ＩＳＩＳ  ４９４２８６、ＩＳＩＳ  ４９４３０１、ＩＳＩＳ  ４９４３０２、またはＩＳＩＳ  ４９４３７２を皮下注射された。ラットを最終用量２日後に屠殺した。肝臓を分析のために採取した。
【０４１１】
オリゴヌクレオチド濃度の測定
総オリゴヌクレオチド濃度の濃度を測定した。使用された方法は、以前に公開された方法の改良であり（Ｌｅｅｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ｇｅａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、これはフェノール−クロロホルム（液体−液体）抽出、続いて固相抽出からなる。抽出前に、内標準（ＩＳＩＳ  ３５５８６８、２７−ｍｅｒ  ２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、配列番号１３１として本明細書に示されるＧＣＧＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＴ）を付加した。較正曲線を使用して組織サンプル濃度を計算し、定量の下限（ＬＬＯＱ）は約１．１４μｇ／ｇであった。次に、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（ＰＨＡＲＳＩＧＨＴ）を使用して、半減期を計算した。
【０４１２】
結果は表５１に提示され、μｇ／ｇ肝臓または腎臓組織として表される。データは、ＩＳＩＳ  ４９４３７２が肝臓および腎臓において許容される濃度であったことを示す。
【表５１】
2019071902.tif 000065
【実施例１１】
【０４１３】
カニクイザルにおけるヒトアポ（ａ）を標的指向するＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果
カニクイザルを上述の研究から選択したＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した。この研究を始めたとき、カニクイザルのゲノム配列は国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）データベースで利用可能ではなかったため、カニクイザル遺伝子配列との交差反応性は確認できなかった。代わりに、カニクイザルにおいて使用されたＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列を、相同性に関してアカゲザル配列と比較した。アカゲザル配列に相同性を有するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、カニクイザル配列とも完全に交差反応性であると予想される。
【０４１４】
試験されたヒトアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アカゲザルのｍＲＮＡ配列（ＸＭ＿００１０９８０６１．１；配列番号１３２と本明細書において示される）とも交差反応性である。ヒトオリゴヌクレオチドとアカゲザル配列との間の相補性が大きければ大きいほど、ヒトオリゴヌクレオチドがアカゲザル配列と交差反応することができる可能性が大きい。配列番号１３２に対する各オリゴヌクレオチドの開始および停止部位は表５２に提示される。各アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１３２の２つ以上の領域を標的指向し、複数の開始部位を有する。「開始部位」は、ギャップマーがアカゲザル配列において標的指向される最も５’側のヌクレオチドを示す。「ミスマッチ」は、ヒトオリゴヌクレオチド配列とアカゲザル配列との間のミスマッチしたヌクレオチドの数を示す。
【０４１５】
肝臓および腎臓におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド忍容性ならびにそれらの薬物動態プロファイルが評価された。
【表５２】
2019071902.tif 000066
【０４１６】
処置
研究前に、少なくとも３０日間の間、サルを隔離し、その間、一般健康状態についてこれらの動物を毎日観察した。サルは２〜４歳であり、体重は２〜４ｋｇであった。無作為に割り付けられた１群に４匹の雄のカニクイザルの７つの群は、適切な大きさのステンレススチール製の投薬針およびシリンジを使用して、サルの背面の４つの部位のうちの１つにＩＳＩＳオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを皮下注射された。注射は１投薬につき１部位で、時計回りに与えられた。サルは、最初の週に関しては、負荷用量として１週間に４回（１、３、５、および７日目）、そしてその後、２〜１２週目の間、１週間に１回、４０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ  ４９４２８３、ＩＳＩＳ  ４９４２８４、ＩＳＩＳ  ４９４２８６、ＩＳＩＳ  ４９４３０１、ＩＳＩＳ  ４９４３０２、またはＩＳＩＳ  ４９４３７２を皮下投薬された。８匹のカニクイザルの対照群は、最初の週に関しては、１週間に３×４回（１、３、５、および７日目）、そしてその後、２〜１２週目の間、１週間に１回ＰＢＳを皮下注射された。
【０４１７】
研究期間中、少なくとも１日１回、病気または苦痛の兆候についてサルを観察した。処置、損傷、もしくは病気により瞬時を上回るまたはわずかの痛みもしくは苦痛を経験した任意の動物は、研究責任者と相談した後、痛みを軽減するために、承認された鎮痛薬または薬剤で獣医職員によって処置された。健康が不良なまたは危篤状態の可能性がある任意の動物は、さらなる監視および安楽死の可能性について特定された。例えば、ＩＳＩＳ  ４９４３０２の処置群の１匹の動物は、５６日目に危篤状態であることが分かり、安楽死させた。動物の計画的安楽死は、深麻酔下、失血により８６日目と８７日目に行われた。実施例に記載されるプロトコルは、施設内動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。
【０４１８】
標的の低下
ＲＮＡ分析
８６日目に、ヒトプライマープローブセットＡＢＩ  Ｈｓ００９１６６９１＿ｍ１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）を使用するアポ（ａ）のリアルタイムＰＣＲ分析のためにＲＮＡを肝臓組織から抽出した。結果は、ＰＢＳ対照に対するアポ（ａ）ｍＲＮＡの阻害パーセントとして提示される。表５３に示されるように、ＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、ＰＢＳ対照と比較して、アポ（ａ）ｍＲＮＡの有意な低下をもたらした。
【０４１９】
プラスミノーゲン、別のクリングル含有タンパク質のｍＲＮＡレベルも測定した。ＩＳＩＳ  ４９４３７２による処置は、プラスミノーゲンのｍＲＮＡレベルを変更しなかった。
【表５３】
2019071902.tif 000067
【０４２０】
タンパク質分析
異なる日に、全ての研究ザルの橈側皮静脈、伏在静脈、または大腿静脈から１ｍＬの血液を採取した。血液サンプルを、血漿分離のためにＫ２−ＥＤＴＡを含有する管に入れた。管を３，０００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離して血漿を得た。アポ（ａ）ＥＬＩ
ＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ  １０−１１０６−０１，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によりアポ（ａ）タンパク質レベルを分析した。結果は、ベースラインからのレベルのパーセンテージ変化として表される。表５４に示されるように、いくつかのＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、ＰＢＳ対照と比較して、アポ（ａ）タンパク質レベルの有意な低下をもたらした。具体的には、ＩＳＩＳ  ４９４３７２による処置は、アポ（ａ）のカニクイザル血漿タンパク質レベルを低下させた。
【０４２１】
アポＢのタンパク質レベルも本研究群において測定された。アポ（ａ）のアンチセンス阻害は、アポＢレベルに影響がなかった。
【表５４】
2019071902.tif 000068
【０４２２】
忍容性研究
体重および臓器重量測定
動物の全体的な健康状態に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するために、体重および臓器重量を８６日目に測定した。体重を測定し、表５５に提示する。臓器重量を測定し、データを表５６に提示する。結果は、ＩＳＩＳ  ４９４３７２による処置がサルの体重および臓器重量に関して良好に忍容されたことを示す。
【表５５】
2019071902.tif 000069
【表５６】
2019071902.tif 000070
【０４２３】
肝臓機能
肝機能に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するために、血液採取前にサルを一晩絶食させた。約１．５ｍＬの血液を各動物から採取し、血清分離のために抗凝固剤なしの管に入れた。管を最低９０分間室温に保ち、その後、３，０００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離して血清を得た。Ｔｏｓｈｉｂａ  ２００ＦＲ  ＮＥＯ化学分析器（Ｔｏｓｈｉｂａ  Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）を使用して様々な肝機能マーカーのレベルを測定した。ＡＬＴおよびＡＳＴの血漿レベルを測定し、結果は表５７に提示され、ＩＵ／Ｌで表される。同様に肝機能マーカーであるビリルビンを測定し、表５７に提示し、ｍｇ／ｄＬで表す。結果は、ＩＳＩＳ  ４９４３７２による処置がサルの肝機能に関して良好に忍容されたことを示す。
【表５７】
2019071902.tif 000071
【０４２４】
Ｃ反応性タンパク質レベル分析
カニクイザルにおけるＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの任意の炎症性作用を評価するために、血液サンプルを分析用に採取した。血液採取前にサルを一晩絶食させた。約１．５ｍＬの血液を各動物から採取し、血清分離のために抗凝固剤なしの管に入れた。管を最低９０分間室温に保ち、その後、３，０００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離して血清を得た。肝臓において合成され、炎症のマーカーとして機能するＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を、Ｔｏｓｈｉｂａ  ２００ＦＲ  ＮＥＯ化学分析器（Ｔｏｓｈｉｂａ  Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）を使用して測定した。結果は、ＩＳＩＳ  ４９４３７２による処置がサルにおいていずれの炎症も引き起こさなかったことを示す。
【表５８】
2019071902.tif 000072
【０４２５】
補体Ｃ３分析
カニクイザルにおける補体経路に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの任意の効果を評価するために、８４日目（投薬前）、および８５日目（投薬２４時間後）に血液サンプルを分析用に採取した。約０．５ｍＬの血液を各動物から採取し、血清分離のために抗凝固剤なしの管に入れた。管を最低９０分間室温に保ち、その後、３，０００ｒｐｍで１０分
間、室温で遠心分離して血清を得た。Ｔｏｓｈｉｂａ  ２００ＦＲ  ＮＥＯ化学分析器（Ｔｏｓｈｉｂａ  Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）を使用してＣ３を測定した。結果は、ＩＳＩＳ  ４９４３７２による処置がサルにおいて補体経路に対していずれの効果も引き起こさなかったことを示す。
【表５９】
2019071902.tif 000073
【０４２６】
血液学
血液学的パラメータに対するカニクイザルにおけるＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの任意の効果を評価するために、８７日目に利用可能な研究動物のそれぞれから約０．５ｍＬの血液の血液サンプルを、Ｋ２−ＥＤＴＡを含有する管に採取した。ＡＤＶＩＡ１２０血液分析器（Ｂａｙｅｒ，ＵＳＡ）を使用して、赤血球（ＲＢＣ）数、白血球（ＷＢＣ）数、ならびに血小板数に関してサンプルを分析した。データを表６０に提示する。
【０４２７】
結果は、ＩＳＩＳ  ４９４３７２による処置がサルの血液学的パラメータに関して良好に忍容されたことを示す。
【表６０】
2019071902.tif 000074
【実施例１２】
【０４２８】
カニクイザルにおけるＩＳＩＳ  ４９４３７２の薬理活性の特徴付け
ＩＳＩＳ  ４９４３７２の薬理活性は、化合物を１３週間にわたって投与され、さらに１３週間回復させたサルの肝臓アポ（ａ）ｍＲＮＡおよび血漿アポ（ａ）レベルを測定することにより特徴付けされた。
【０４２９】
処置
１群に１４匹の無作為に割り付けられた雄および雌のカニクイザルの５つの群は、適切な大きさのステンレススチール製の投薬針およびシリンジを使用して、サルの背面（肩甲部）の４つの部位のうちの１つにＩＳＩＳオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを皮下注射された。サルは、最初の週に関しては、負荷用量として１週間に４回（１、３、５、および７日目）、そしてその後、２〜１３週目の間、１週間に１回、下の表に示される維持量を
投薬された。最初の週の間の負荷用量は、ｍｇ／ｋｇ／用量として表され、一方、２〜１３週目の維持量は、ｍｇ／ｋｇ／週として表される。
【表６１】
2019071902.tif 000075
【０４３０】
動物からの肝臓サンプルを、アポ（ａ）ｍＲＮＡの分析用に研究の中間、末期および回復段階で採取した。加えて、異なる日に血漿サンプルを採取して、アポ（ａ）タンパク質レベルを測定した。この非臨床研究は、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）の試験実施（ＧＬＰ）規則２１  ＣＦＲ  Ｐａｒｔ  ５８に従い行われた。
【０４３１】
ＲＮＡ分析
３０、９３、および１８２日目に肝臓サンプルをサルから採取し、凍結した。簡潔に、凍結肝臓の一部（０．２ｇ）を２ｍＬのＲＬＴ溶液（Ｑｉａｇｅｎ）に均質化した。得られた可溶化液をＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニカラムに適用した。精製および定量化後、組織をＲＴ−ＰＣＲ分析にかけた。リアルタイム蛍光ＲＴ−ＰＣＲ検出を使用するＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００配列検出システムを使用して、アポ（ａ）ｍＲＮＡを定量化した。アッセイは、対向する端の蛍光レポーターおよび消光剤色素で標識された標的特異的プローブに基づく。プローブをＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’エクソヌクレアーゼを通して加水分解し、反応中に検出することができるレポーター色素の蛍光発光の増加を引き起こした。アカゲザルのアポ（ａ）ｍＲＮＡ転写ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＸＭ＿００１０９８０６１．２（配列番号ＸＸＸ）配列の１５１２位を標的指向するプローブセット（ＡＢＩ  Ｒｈｅｓｕｓ  ＬＰＡプローブセットＩＤ  Ｒｈ０２７８９２７５＿ｍ１，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）を使用して、カニクイザルの肝臓アポ（ａ）ｍＲＮＡ発現レベルを測定した。アポ（ａ）発現はＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）を使用して正規化された。結果は、ＰＢＳ対照に対するアポ（ａ）ｍＲＮＡの阻害パーセントとして提示される。
【０４３２】
表６２に示されるように、ＩＳＩＳ  ４９４３７２による処置は、ＰＢＳ対照と比較して、アポ（ａ）ｍＲＮＡの用量依存低下をもたらした。３０日目に、肝臓のアポ（ａ）ｍＲＮＡ発現は、１２ｍｇ／ｋｇ／週および４０ｍｇ／ｋｇ／週の投薬コホートにおいて、用量依存様式で、それぞれ、７４％および９９％低下した。これらの低下は、一元配置ＡＮＯＶＡにより統計的に有意である（Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定、Ｐ＜０．０５）。
【０４３３】
アポ（ａ）ｍＲＮＡレベルも回復段階中に測定された。最終用量８８日後の肝臓発現レベルはなお、１２ｍｇ／ｋｇ／週および４０ｍｇ／ｋｇ／週投薬コホートにおいて、それぞれ、４９％および６９％低下した。
【表６２】
2019071902.tif 000076
【０４３４】
タンパク質分析
市販のアポ（ａ）ＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ  １０−１１０６−０１，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、約２０μｌの血漿を分析した。アッセイプロトコルは製造者によって説明されるように実施された。結果は、１日目の投薬前アポ（ａ）血漿タンパク質濃度からのパーセンテージ変化として表６３および６４に提示される。Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定を使用した１日目のベースライン血漿アポ（ａ）からの統計的に有意な差には星印を付ける。
【０４３５】
血漿アポ（ａ）タンパク質における最大低下が、９３日目までに全ての投薬コホートにおいて観察された。回復段階において、４０ｍｇ／ｋｇ／週の投薬コホートにおけるアポ（ａ）血漿タンパク質レベルは、４週および１３週（１２１日目および１８２日目）の回復後、それぞれ、ベースラインの２２％および９３％であった。１２ｍｇ／ｋｇ／週のコホートの回復速度は、４０ｍｇ／ｋｇ／週のコホートに見られるものと類似した。
【表６３】
2019071902.tif 000077
【表６４】
2019071902.tif 000078
【実施例１３】
【０４３６】
ヒトアポ（ａ）を標的指向するＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドの粘度の測定
４０ｃＰを超える粘度を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングして排除する目的で、上述の研究からの選択したアンチセンスオリゴヌクレオチドの粘度を測定した。４０ｃＰを超える粘度を有するオリゴヌクレオチドは、最適未満の粘度を有するであろう。
【０４３７】
ＩＳＩＳオリゴヌクレオチド（３２〜３５ｍｇ）をガラスのバイアルに量り入れ、１２０μＬの水を添加し、バイアルを５０℃に加熱することによりアンチセンスオリゴヌクレオチドを溶液に溶解した。予め加熱したサンプルの一部（７５μＬ）をマイクロ粘度計（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）にピペットで注入した。マイクロ粘度計の温度を２５℃に設定し、サンプルの粘度を測定した。８５℃、２６０ｎＭでのＵＶ読み取り（Ｃａｒｙ  ＵＶ機器）のために、予め加熱したサンプルの別の一部（２０μＬ）を１０ｍＬの水にピペットで注入した。結果は表６５に提示され、アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液の大半が上述
の基準によりそれらの粘度が最適であることを示す。最適ではないものは「粘性」と示される。具体的には、ＩＳＩＳ  ４９４３７２は、上述の基準によりその粘度が最適であった。
【表６５】
2019071902.tif 000079
【配列表】
2019071902000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月21日(2019.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１５〜３０個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ以下：
（ａ）配列番号１２、１３、１５、２６、２７、３７〜４４、４７〜４９、５３、５７〜６２、６５、６６、６８、７０〜７９、８１、８５、８６、９２〜９４、９７、１０５〜１１０または１３４の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも１５個の連続する核酸塩基；
（ｂ）配列番号１４、１６〜１９、２４、２５、２８〜３０、３５、３６、５０、８９、９０、１０３、１０４または１３３の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも１８個の連続する核酸塩基；または
（ｃ）配列番号２０、２２、２３、３１〜３３または５１の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも２０個の連続する核酸塩基；
を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が、配列番号１に少なくとも９０％相補性である、前記化合物。
【請求項２】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、１８〜２４個、１９〜２２個、１５〜２５個、１６個、または２０個の結合されたヌクレオシドからなる、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が、配列番号１に少なくとも９５％、または１００％相補性である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
前記化合物が、２０個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、そして配列番号１２〜２０、２２〜３３、３５〜４４、４７〜５０、５１、５３、５７、５９〜６２、６５、６６、６８、７０〜７９、８１、８５、８６、８９、９０、９２〜９４、９７、１０３〜１１０、１３３および１３４のいずれか１つの核酸塩基配列を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記化合物が、以下：
（ｉ）前記修飾オリゴヌクレオチドが、単鎖である、
（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオシド間結合が、修飾ヌクレオシド間結合である、
（ｉｉｉ）前記修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾糖を含む、および
（ｉｖ）少なくとも１つのヌクレオシドが、修飾核酸塩基を含む、
との構成の１またはそれより多くを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
前記化合物が、以下：
（ｉ）少なくとも１つのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、
（ｉｉ）（ａ）少なくとも１つの修飾糖が、二環式糖であるか、又は（ｂ）少なくとも１つの修飾糖が、２’−Ｏ−メトキシエチル、拘束エチル（constrained ethyl）、３’−フルオロ−ＨＮＡ、または４’−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−２’架橋を含み、式中、ｎが１または２である、および
（ｉｉｉ）修飾核酸塩基が、５−メチルシトシンである、
との構成の１またはそれより多くを含む、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが、
結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、
結合されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメントと、
結合されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントと、を含み、
前記ギャップセグメントが前記５’ウィングセグメントと前記３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが修飾糖を含む、前記化合物。
【請求項８】
請求項７に記載の化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが、
１０個の結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、
５個の結合されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメントと、
５個の結合されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントと、を含み、
前記ギャップセグメントが前記５’ウィングセグメントと前記３’ウィングセグメントとの間に位置付けられ、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基が５−メチルシトシンである、前記化合物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の化合物またはその塩と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の化合物または組成物を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
上昇したアポ（ａ）および／または上昇したＬｐ（ａ）に関連する疾患の治療、予防、またはその進行を緩慢にさせるための、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記疾患が、炎症性、心血管、または代謝疾患、障害、または状態である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
（ａ）心血管疾患、障害、または状態が、以下：動脈瘤（例えば腹部大動脈瘤）、狭心症、不整脈、粥状動脈硬化、脳血管疾患、冠動脈疾患、冠動脈心疾患、脂質異常症、高コレステロール血症、高脂血症、高血圧、高トリグリセリド血症、心筋梗塞、末梢血管疾患（例えば末梢動脈疾患、末梢動脈閉塞性疾患）網膜血管閉塞、または脳卒中、から選択される、または
（ｂ）代謝疾患、障害、または状態が、以下：高血糖症、前糖尿病、糖尿病（１型および２型）、肥満、インスリン耐性、代謝症候群、および糖尿病性脂質異常症、から選択される、または
（ｃ）炎症性疾患、障害、または状態が、以下：冠動脈疾患（ＣＡＤ）、アルツハイマー病、脳卒中、血栓症（例えば静脈血栓塞栓症）、心筋梗塞、および末梢血管疾患から選択される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
心血管疾患が狭心症である、請求項１３に記載の医薬組成物。