(57)【要約】【課題】容易に入手することができ、安全性が高く、優れたテストステロン産生促進作用を有するテストステロン産生促進剤、テストステロン産生促進用飲食品添加剤及びテストステロン産生促進用飲食品を提供する。【解決手段】含硫アミノ酸及び含硫アミノ酸の水硫基により生成するジスルフィド結合を有する化合物からなる群から選択される少なくとも１種を含有するテストステロン産生促進剤、並びに前記テストステロン産生促進剤を含有するテストステロン産生促進用飲食品添加剤及びテストステロン産生促進用飲食品である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
含硫アミノ酸及び含硫アミノ酸の水硫基により生成するジスルフィド結合を有する化合物からなる群から選択される少なくとも１種を含有することを特徴とするテストステロン産生促進剤。
【請求項２】
前記含硫アミノ酸及び含硫アミノ酸の水硫基により生成するジスルフィド結合を有する化合物からなる群から選択される少なくとも１種が、システイン、メチオニン及びシスチンからなる群から選択される少なくとも１種を含有する請求項１に記載のテストステロン産生促進剤。
【請求項３】
精子形成促進作用、精巣へのコレステロールの取込み促進作用、細胞膜におけるリポ蛋白受容体の活性亢進作用及びテストステロン産生系遺伝子群の発現増強作用からなる群から選択される少なくとも１種の作用を有する請求項１から２のいずれかに記載のテストステロン産生促進剤。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のテストステロン産生促進剤を含有することを特徴とするテストステロン産生促進用飲食品添加剤。
【請求項５】
請求項１から３のいずれかに記載のテストステロン産生促進剤を含有することを特徴とするテストステロン産生促進用飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効成分として、含硫アミノ酸及び含硫アミノ酸の水硫基により生成するジスルフィド結合を有する化合物からなる群から選択される少なくとも１種を含有するテストステロン産生促進剤、前記テストステロン産生促進剤を含有するテストステロン産生促進用飲食品添加剤又はテストステロン産生促進用飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、少子化という社会問題が指摘されている一方で、不妊症に悩む夫婦は年々増加している。
不妊症に関連する問題として、最近では、シフト勤務等の働き方の多様化、長時間労働等の過酷な労働状況により寝る時間を十分に確保することができないような不規則な生活や、食生活の乱れ等による低栄養状態などにより、男性の精子量が減少するという問題がある。
【０００３】
精子量が減少するという問題に対しては、男性ホルモンの一種であるテストステロンの体内での産生を増加させることが考えられる。
これまでに、プロペニルシステイン又はグルタミル−プロペニルシステインを有効成分とするテストステロン産生促進剤が提案されている（例えば、特許文献１参照）。前記提案の有効成分は、プロペニル基を有することを必須とする化合物であり、ニンニクなどの植物に由来のものである。
しかしながら、前記提案の有効成分は、煩雑な製造工程を経る必要があり、容易に入手できるとは言えないという問題がある。
【０００４】
したがって、容易に入手することができ、安全性が高く、優れたテストステロン産生促進作用を有する新たな素材の提供が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１５−１９６６８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、容易に入手することができ、安全性が高く、優れたテストステロン産生促進作用を有するテストステロン産生促進剤、テストステロン産生促進用飲食品添加剤及びテストステロン産生促進用飲食品を提供すること目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記目的を達成するべく鋭意検討を行った結果、含硫アミノ酸及び含硫アミノ酸の水硫基により生成するジスルフィド結合を有する化合物からなる群から選択される少なくとも１種が、体内におけるテストステロン産生を促進することを見出し、更に、精子数の増加への効果的な素材であることを知見した。
【０００８】
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  含硫アミノ酸及び含硫アミノ酸の水硫基により生成するジスルフィド結合を有する化合物からなる群から選択される少なくとも１種を含有することを特徴とするテストステロン産生促進剤である。
＜２＞  前記含硫アミノ酸及び含硫アミノ酸の水硫基により生成するジスルフィド結合を有する化合物からなる群から選択される少なくとも１種が、システイン、メチオニン及びシスチンからなる群から選択される少なくとも１種を含有する前記＜１＞に記載のテストステロン産生促進剤である。
＜３＞  精子形成促進作用、精巣へのコレステロールの取込み促進作用、細胞膜におけるリポ蛋白受容体の活性亢進作用及びテストステロン産生系遺伝子群の発現増強作用からなる群から選択される少なくとも１種の作用を有する前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のテストステロン産生促進剤である。
＜４＞  前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のテストステロン産生促進剤を含有することを特徴とするテストステロン産生促進用飲食品添加剤である。
＜５＞  前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のテストステロン産生促進剤を含有することを特徴とするテストステロン産生促進用飲食品である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、容易に入手することができ、安全性が高く、優れたテストステロン産生促進作用を有するテストステロン産生促進剤、テストステロン産生促進用飲食品添加剤及びテストステロン産生促進用飲食品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、試験例１の血中テストステロン濃度を測定した結果を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、試験例２のＤ９％における精巣曲精細管中の精子を観察した組織染色像を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、試験例２のＤＣｙｓにおける精巣曲精細管中の精子を観察した組織染色像を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、試験例３のＤ９％における精子形成の割合を計測した結果を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、試験例３のＤＣｙｓにおける精子形成の割合を計測した結果を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、試験例４のＤ９％におけるＬＤＬＲ遺伝子のｍＲＮＡ発現量と、血清テストステロン濃度との相関関係を検証した結果を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、試験例４のＤ９％におけるＳＲ−ＢＩ遺伝子のｍＲＮＡ発現量と、血清テストステロン濃度との相関関係を検証した結果を示す図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、試験例４のＤＣｙｓにおけるＬＤＬＲ遺伝子のｍＲＮＡ発現量と、血清テストステロン濃度との相関関係を検証した結果を示す図である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、試験例４のＤＣｙｓにおけるＳＲ−ＢＩ遺伝子のｍＲＮＡ発現量と、血清テストステロン濃度との相関関係を検証した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（テストステロン産生促進剤）
本発明のテストステロン産生促進剤は、有効成分として含硫アミノ酸及び含硫アミノ酸の水硫基により生成するジスルフィド結合を有する化合物からなる群から選択される少なくとも１種を含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００１２】
＜含硫アミノ酸及び含硫アミノ酸の水硫基により生成するジスルフィド結合を有する化合物からなる群から選択される少なくとも１種＞
前記含硫アミノ酸は、硫黄原子を有するアミノ酸である。
前記含硫アミノ酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メチオニン、システインなどが挙げられる。
【００１３】
前記含硫アミノ酸の水硫基により生成するジスルフィド結合を有する化合物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シスチンなどが挙げられる。
【００１４】
前記含硫アミノ酸及び含硫アミノ酸の水硫基により生成するジスルフィド結合を有する化合物（以下、「含有アミノ酸等」と称することがある。）は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００１５】
前記含硫アミノ酸等の中でも、テストステロン産生促進作用が優れる点で、システイン、メチオニン及びシスチンからなる群から選択される少なくとも１種を含有することが好ましい。
【００１６】
前記含硫アミノ酸等は、市販品を用いてもよいし、公知の方法により製造したものを用いてもよい。
【００１７】
前記含硫アミノ酸等の前記テストステロン産生促進剤における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記テストステロン産生促進剤は、前記含硫アミノ酸等のみからなるものであってもよい。
【００１８】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、剤型などに応じて適宜選択することができ、例えば、水、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、植物抽出エキス類、水溶性高分子、界面活性剤、金属石鹸、アルコール、多価アルコール、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、防腐剤、香料、粉体、増粘剤、色素、キレート剤等の添加剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記その他の成分の前記テストステロン産生促進剤における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００１９】
＜使用＞
前記テストステロン産生促進剤は、単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬等と併せて使用してもよい。また、前記テストステロン産生促進剤は、他の成分を有効成分とする医薬等に配合された状態で使用してもよい。
【００２０】
前記テストステロン産生促進剤の使用態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口、経皮、経腸、経粘膜、経静脈、経動脈、皮下、筋肉内などが挙げられる。これらは、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組み合せて用いてもよい。これらの中でも、経口が好ましい。
【００２１】
前記テストステロン産生促進剤の剤型としては、特に制限はなく、使用態様などに応じて公知の剤型を適宜選択することができる。前記剤型は、固形状であってもよいし、半固形状であってもよいし、液状であってもよく、例えば、錠剤、顆粒剤、粉剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤、シロップ剤等の経口投与製剤；液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、噴霧剤、貼付剤、吸入剤、坐剤等の経皮又は経粘膜投与製剤；注射剤等が挙げられる。
前記テストステロン産生促進剤の製造方法としては、特に制限はなく、剤型などに応じて公知の方法を適宜選択することができる。
【００２２】
前記テストステロン産生促進剤の使用量（「摂取量」、「投与量」と称することもある。）としては、特に制限はなく、対象とする個体の年齢、体重、所望の効果の程度などに応じて適宜選択することができる。
例えば、使用態様が経口の場合は、有効成分である前記含硫アミノ酸等の量として、体重６０ｋｇの個体１日あたり、０．０００００１ｇ〜１００ｇが好ましく、０．００００１ｇ〜１００ｇがより好ましく、０．００１ｇ〜１００ｇが更に好ましく、１ｇ〜１００ｇが特に好ましい。
【００２３】
前記テストステロン産生促進剤の使用頻度としては、特に制限はなく、対象とする個体の年齢、体重、所望の効果の程度などに応じて適宜選択することができ、１日１回でもよいし、１日２回以上であってもよい。また、毎日継続して使用してもよいし、一定の間隔を空けて使用してもよい。
【００２４】
前記テストステロン産生促進剤の使用時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、精子量の減少が認められた後に使用してもよいし、精子量の減少が認められる前に予防的に使用してもよい。
【００２５】
前記テストステロン産生促進剤の対象とする個体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられる。これらの中でも、ヒトが好ましい。
また、前記個体は、テストステロンの産生を促進することが求められる個体であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、不規則な生活や低栄養状態などにより精子量が減少した個体が好適に挙げられる。
【００２６】
本発明のテストステロン産生促進剤は、後述の試験例で示すように、優れたテストステロン産生促進作用を有し、また、精子形成促進作用、精巣へのコレステロールの取込み促進作用、細胞膜におけるリポ蛋白受容体の活性亢進作用及びテストステロン産生系遺伝子群の発現増強作用からなる群から選択される少なくとも１種の作用も有する。
したがって、本発明は、前記含硫アミノ酸等を含有する精子形成促進剤、精巣へのレステロールの取込み促進剤、細胞膜におけるリポ蛋白受容体の活性亢進剤、テストステロン産生系遺伝子群の発現増強剤にも関する。
前記リポ蛋白受容体は、精巣へのコレステロールの取込みに関与する受容体であり、例えば、ＬＤＬ受容体、スカベンジャー受容体クラスＢタイプ１などが挙げられる。
前記テストステロン産生系遺伝子群は、テストステロンの産生に関与する遺伝子群であり、例えば、上記リポ蛋白受容体などが挙げられる。
【００２７】
本発明のテストステロン産生促進剤は、容易に入手することができ、安全性が高く、また、不規則な生活や低栄養状態などにより精子量が減少した個体においてもテストステロン産生を増加させることができるという優れたテストステロン産生促進作用を有する。したがって、本発明は、個体、特に不規則な生活や低栄養状態などにより精子量が減少した個体に、本発明のテストステロン産生促進剤を投与することを特徴とするテストステロンの産生促進方法にも関する。
【００２８】
前記テストステロン産生促進剤は、医薬品、飲食品添加剤、飲食品、飼料、化粧品等の各種製品に配合して使用することもできる。
【００２９】
（テストステロン産生促進用飲食品添加剤）
本発明のテストステロン産生促進用飲食品添加剤は、本発明のテストステロン産生促進剤を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００３０】
＜テストステロン産生促進剤＞
前記テストステロン産生促進剤は、上記した本発明のテストステロン産生促進剤である。
前記テストステロン産生促進剤のテストステロン産生促進用飲食品添加剤における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した（テストステロン産生促進剤）の＜使用＞の項目に記載した使用量などに応じて適宜選択することができる。
【００３１】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、通常の飲食品添加剤に用いられる成分を目的に応じて適宜選択することができる。
前記その他の成分のテストステロン産生促進用飲食品添加剤における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記テストステロン産生促進用飲食品添加剤は、前記テストステロン産生促進剤のみからなるものであってもよい。
【００３２】
（テストステロン産生促進用飲食品）
本発明のテストステロン産生促進用飲食品は、本発明のテストステロン産生促進剤を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００３３】
＜テストステロン産生促進剤＞
前記テストステロン産生促進剤は、上記した本発明のテストステロン産生促進剤である。
前記テストステロン産生促進剤のテストステロン産生促進用飲食品における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した（テストステロン産生促進剤）の＜使用＞の項目に記載した使用量などに応じて適宜選択することができる。
【００３４】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、通常の飲食品に用いられる成分を目的に応じて適宜選択することができる。
前記その他の成分のテストステロン産生促進用飲食品における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記テストステロン産生促進用飲食品は、前記テストステロン産生促進剤のみからなるものであってもよい。
【００３５】
＜飲食品＞
前記飲食品としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、一般の飲食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、病者用食品などが挙げられる。
前記飲食品の具体例としては、パン類、麺類等の主菜；チーズ、ハム、ウインナー、魚介加工品等の副菜；果汁飲料、炭酸飲料、乳酸飲料等の飲料；クッキー、ケーキ、ゼリー、アイス、プリン、キャンディー、ヨーグルト等の嗜好品；錠剤、顆粒、粉剤、カプセル、ソフトカプセル、栄養ドリンク等のサプリメントなどが挙げられる。
【００３６】
（テストステロン産生促進用飼料）
前記テストステロン産生促進用飼料は、本発明のテストステロン産生促進剤を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００３７】
＜テストステロン産生促進剤＞
前記テストステロン産生促進剤は、上記した本発明のテストステロン産生促進剤である。
前記テストステロン産生促進剤のテストステロン産生促進用飼料における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した（テストステロン産生促進剤）の＜使用＞の項目に記載した使用量などに応じて適宜選択することができる。
【００３８】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、通常の飼料に用いられる成分を目的に応じて適宜選択することができる。
前記その他の成分のテストステロン産生促進用飼料における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記テストステロン産生促進用飼料は、前記テストステロン産生促進剤のみからなるものであってもよい。
【００３９】
＜飼料＞
前記飼料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ペットフード、家畜飼料などが挙げられる。
【００４０】
（テストステロン産生促進用化粧品）
前記テストステロン産生促進用化粧品は、本発明のテストステロン産生促進剤を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００４１】
＜テストステロン産生促進剤＞
前記テストステロン産生促進剤は、上記した本発明のテストステロン産生促進剤である。
前記テストステロン産生促進剤のテストステロン産生促進用化粧料における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、皮膚外用剤とする場合、化粧料の形態等に応じて異なるが、例えば、前記含硫アミノ酸等の量として、０．００００００１質量％〜１０質量％とするなどが挙げられる。
【００４２】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、通常の化粧品に用いられる成分を目的に応じて適宜選択することができる。
前記その他の成分のテストステロン産生促進用化粧品における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記テストステロン産生促進用化粧品は、前記テストステロン産生促進剤のみからなるものであってもよい。
【００４３】
＜化粧品＞
前記化粧品としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳液、クリーム、化粧水（ローション）、パック、美容液、洗浄剤、メーキャップ化粧品などが挙げられる。
【実施例】
【００４４】
以下、試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の試験例に制限されるものではない。
【００４５】
（試験例１）
本発明のテストステロン産生促進剤の有効成分の一例であるシスチンのテストステロン産生促進作用を以下のようにして検証した。
【００４６】
Ｆｉｓｃｈｅｒ系４週齢雄ラットを飼料の違いにより以下の２群に群別した（各群２４〜２６匹）。なお、低たんぱく質食とすることで、低栄養状態を反映したモデルとすることができる。
・  群１  ：  飼料を、低たんぱく質食とした群（以下、「Ｄ９％」と称することがある。）
・  群２  ：  飼料を、前記低たんぱく質食にシスチンを添加したものとした群（以下、「ＤＣｙｓ」と称することがある。）
【００４７】
前記低たんぱく質食は、ＡＩＮ−９３Ｇ飼料に準拠したものとした。具体的には、１００ｇあたりのＡＩＮ−９３Ｇ飼料において、Ｌ―シスチンを除き、カゼインの量を２０ｇから９ｇに減らし、α−コーンスターチの量を５２．９４８６ｇから６４．２４８６ｇに増やしたものを前記低たんぱく質食とした。なお、前記低たんぱく質食ではカゼインの量を減らすことにより、カゼイン由来のリンも減少するため、減少した分のリンを補うために、ミネラル混合に減少分のリンを追加した。
【００４８】
前記ＤＣｙｓにおける飼料は、１００ｇあたりの前記低たんぱく質食において、Ｌ−シスチンを０．１３５ｇとなるように加え、α−コーンスターチの量を６４．２４８６ｇから６４．１１３６ｇに減らしたものとした。
【００４９】
前記ラットは、明期がない連続暗黒下で、４週間（７週齢の終わりまで）飼育した。なお、ラットは夜行性であることから、連続暗黒下で飼育することにより、ヒトでの睡眠を十分に取れずに働いている状況を反映したモデルとすることができる。
【００５０】
前記飼育期間中、飼料及び水は、自由摂取とした。なお、ラットの１日あたりの飼料の摂取量は、１２ｇ程度であり、これは、１日あたり、０．０１６ｇ程度のシスチンを摂取したこととなる。なお、これを体重６０ｋｇのヒトに換算すると、１日あたり、６．５ｇ程度のシスチンを摂取する量となる。
【００５１】
飼育後のラットを採血し、血中テストステロン濃度を測定した。結果を図１に示す。
図１に示されるように、低たんぱく質食にシスチンを添加した飼料で飼育したＤＣｙｓでは、低たんぱく質食で飼育したＤ９％と比較して、テストステロン量が有意に増加することが確認された。なお、図１中の「＊」は、ｐ＝０．０１２を表す。
【００５２】
（試験例２）
試験例１と同様の方法によりラットを飼育した後、解剖した。精巣を１０％中性ホルマリンで固定後、パラフィン切片を作製し、次いで過ヨウ素酸シッフ（Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｃｈｉｆｆ：ＰＡＳ）で染色し観察した。精巣曲精細管中の精子の観察結果を図２Ａ（Ｄ９％）及びＢ（ＤＣｙｓ）に示す。
【００５３】
図２Ａに示されるように、低たんぱく質食で飼育したＤ９％では、精子形成の見られない精巣曲精細管が多数存在した。これに対し、図２Ｂに示されるように、低たんぱく質食にシスチンを添加した飼料で飼育したＤＣｙｓでは、正常精子の形成が見られる精巣曲精細管が増加しており、精子形成促進作用を有することが確認された。なお、図２Ａ及びＢ中、「矢印」は精子を示し、棒目盛は５０μｍ（対物レンズ４０倍使用）を示す。
【００５４】
（試験例３）
試験例２のＰＡＳ染色切片において、精巣曲精細管中に精子を形成した割合を計測した。結果を図３Ａ（Ｄ９％）及びＢ（ＤＣｙｓ）に示す。
図３Ａ及びＢでは、横軸にラット体重で補正した精巣重量を示し、縦軸に精子形成の見られた精巣曲精細管が計測した精巣曲精細管全体に占める割合を示し、ラット個体ごとの値を描画した。また、正常な精子形成を行う条件で飼育した群において、すべてのラットが含まれる精子形成陽性の精巣曲精細管の割合から、閾値を７７．６％とし、図３Ａ及びＢ中の黒線で示した。
【００５５】
図３Ａに示されるように、低たんぱく質食で飼育したＤ９％では、閾値を超えた割合（＝正常に精子を形成していると推測される精巣曲精細管の割合）を示した個体の割合は６１．５％であった。これに対し、図３Ｂに示されるように、低たんぱく質食にシスチンを添加した飼料で飼育したＤＣｙｓでは、閾値を超えた割合を示した個体の割合は８４．６％に増加し、この計測からも、精子形成促進作用を有することが確認された。なお、前記二群間のカイ二乗検定によるｐ値は０．０６であった。
【００５６】
（試験例４）
テストステロン合成の基質となるコレステロールの血中から精巣への取り込みを評価するために、試験例１と同様の方法によりラットを飼育した後、解剖し、以下のようにして遺伝子の発現量を測定するための試料を調製した。
＜試料の調製＞
採取した精巣の一部はＲＮＡレーター（ＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ  Ｓｏｌｎ．  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に浸漬後、−８０℃に保存した。保存した精巣から総ＲＮＡを抽出（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ、マッハライ・ナーゲル社製）し、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製（ＰｒｉｍＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ、タカラバイオ株式会社製）した。
【００５７】
前記調製した試料中の、リポ蛋白受容体遺伝子であるＬＤＬ受容体（以下、「ＬＤＬＲ」と称することがある。）及びスカベンジャー受容体クラスＢタイプ１（以下、「ＳＲ−ＢＩ」と称することがある。）のｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲ法（Ｔｈeｒｍａｌ  Ｃｙｃｌeｒ  Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＳｙｓｔｅｍＴＰ８００、タカラバイオ株式会社製）により、測定した。リアルタイムＰＣＲ法は、サイバーグリーン（ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｇＴＭＩＩ、タカラバイオ株式会社製）を用いるインターカレーター法にて行った。
【００５８】
図４Ａ〜Ｄに、試験例１で測定した血清テストステロン濃度と、上記で測定した各遺伝子のｍＲＮＡの発現量との相関関係を検証した結果を示した。なお、前記リポ蛋白受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、Ｒｐｌｐ２遺伝子（一定量発現しているリファレンス遺伝子の１つ）のｍＲＮＡの発現量で補正した値である。
図４Ａ〜Ｄでは、横軸に血清テストステロン濃度、縦軸に精巣中のリポ蛋白受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示し、これらの相関係数をＰｅａｒｓｏｎの積率相関係数ｒで表し、その有意差を検定した（ｐ＜０．０５で相関は有意であるとした）。
【００５９】
その結果、低たんぱく質食で飼育したＤ９％では、血清テストステロン濃度（Ｔ）と、ＬＤＬＲ又はＳＲ−ＢＩ遺伝子のｍＲＮＡの発現量との間に有意な相関は見られなかった（Ｔ対ＬＤＬＲ：ｐ＝０．２０２（図４Ａ）、Ｔ対ＳＲ−ＢＩ：ｐ＝０．６３５（図４Ｂ））。
一方、低たんぱく質食にシスチンを添加した飼料で飼育したＤＣｙｓでは、これらの間に有意な正の相関が認められた（Ｔ対ＬＤＬＲ：ｐ＝０．００００２（図４Ｃ）、Ｔ対ＳＲ−ＢＩ：ｐ＝０．０３５５（図４Ｄ））
以上のことから、低たんぱく質食にシスチンを添加した飼料で飼育したＤＣｙｓでは、テストステロン合成の材料となるコレステロールを血中から精巣に取り込むためのリポ蛋白受容体遺伝子の発現が高まることで、コレステロールの取り込みが進み、テストステロン合成が促進されることが推察された。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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