(57)【要約】      （修正有）【課題】高い親和性で標的抗原（ヒト抗原、例えば、ヒトＰＤＧＦＲβ）に特異的に結合する結合ポリペプチド（抗体又はそのフラグメント）の提供。【解決手段】特定の配列を有し、ＰＤＧＦＲβに特異的に結合する、単離された結合ポリペプチド。結合ポリペプチドのライブラリ、医薬組成物、結合ポリペプチドをコードする核酸、組換え発現ベクター、前記結合ポリペプチドを作るための宿主細胞、及び、前記結合ポリペプチドを用いた疾患の診断、治療方法、も含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のＣＤＲ３配列を備える、ＰＤＧＦＲβに特異的に結合する、単離された結合ポリペプチド。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のＣＤＲ３アミノ酸配列を備えるＶＨドメインを備える、請求項１に記載の結合ポリペプチド。
【請求項３】
前記ＶＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２−３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を備えるＣＤＲ２をさらに備える、請求項２に記載の結合ポリペプチド。
【請求項４】
前記ＶＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３−６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を備えるＣＤＲ１をさらに備える、請求項３に記載の結合ポリペプチド。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１８−３６８からなる群から選択されるＶＨドメインアミノ酸配列との少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を共有するＶＨドメインアミノ酸配列を備える、請求項４に記載の結合ポリペプチド。
【請求項６】
前記ＶＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１８−３６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を備える、請求項４に記載の結合ポリペプチド。
【請求項７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３−１４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を備えるＣＤＲ３を備えるＶＬドメインを備える、請求項１から６のいずれか１項に記載の結合ポリペプチド。
【請求項８】
前記ＶＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４８−２３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を備えるＣＤＲ２をさらに備える、請求項６に記載の結合ポリペプチド。
【請求項９】
前記ＶＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３３−３１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を備えるＣＤＲ１をさらに備える、請求項６に記載の結合ポリペプチド。
【請求項１０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６９−４５３からなる群から選択されるＶＬドメインアミノ酸配列との少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を共有するＶＬドメインアミノ酸配列を備える、請求項７に記載の結合ポリペプチド。
【請求項１１】
前記ＶＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６９−４５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を備える、請求項７に記載の結合ポリペプチド。
【請求項１２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３１８に記載のＶＨドメインアミノ酸配列を備える結合ポリペプチドと同じエピトープに、ＰＤＧＦＲβ上で結合する、結合ポリペプチド。
【請求項１３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３１８に記載のＶＨドメインアミノ酸配列を備える結合ポリペプチドと、ＰＤＧＦＲβへの結合を競合する、結合ポリペプチド。
【請求項１４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１８−３６８からなる群から選択されるＶＨドメインアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を共有するＶＨドメインアミノ酸配列を備える、請求項１２または１３に記載の結合ポリペプチド。
【請求項１５】
ＰＤＧＦＲβの活性を抑制する、請求項１から１４のいずれかに記載の結合ポリペプチド。
【請求項１６】
ＰＤＧＦＲβの前記活性は、ＰＤＧＦＲβへのＰＤＧＦ結合に拮抗することによって抑制される、請求項１５に記載の結合ポリペプチド。
【請求項１７】
ＰＤＧＦＲβの前記活性は、ＰＤＧＦＲβの二量化に拮抗することによって抑制される、請求項１５に記載の結合ポリペプチド。
【請求項１８】
２５０ｐＭ未満のＫｄでＰＤＧＦＲβに結合する、請求項１から１７のいずれかに記載の結合ポリペプチド。
【請求項１９】
１００ｐＭ未満のＫｄでＰＤＧＦＲβに結合する、請求項１から１８のいずれかに記載の結合ポリペプチド。
【請求項２０】
１０-3ｓ-1未満のオフレートでＰＤＧＦＲβに結合する、請求項１から１９のいずれかに記載の結合ポリペプチド。
【請求項２１】
マウスＰＤＧＦＲβおよびヒトＰＤＧＦＲβに特異的に結合する、請求項１から２０のいずれかに記載の結合ポリペプチド。
【請求項２２】
５ｎＭ未満のＩＣ５０で前記ＰＤＧＦＲβへのＰＤＧＦ結合に拮抗する、請求項１から２１のいずれかに記載の結合ポリペプチド。
【請求項２３】
４ｎＭ未満のＩＣ５０でＰＤＧＦＲβのリガンド誘導チロシンリン酸化を抑制する、請求項１から２２のいずれかに記載の結合ポリペプチド。
【請求項２４】
６ｎＭ未満のＩＣ５０で網膜周細胞移動を抑制する、請求項１から２３のいずれかに記載の結合ポリペプチド。
【請求項２５】
溶融温度（Ｔｍ）が少なくとも６８℃であるＶＨドメインを備える、請求項１から２４のいずれかに記載の結合ポリペプチド。
【請求項２６】
抗体である、請求項１から２５のいずれかに記載の結合ポリペプチド。
【請求項２７】
ｓｃＦｖである、請求項１から２６のいずれかに記載の結合ポリペプチド。
【請求項２８】
請求項１から２７のいずれか１項に記載の結合ポリペプチドをエンコードする、単離された核酸。
【請求項２９】
請求項２８に記載の核酸を備える、組換え発現ベクター。
【請求項３０】
請求項２９に記載の組換え発現ベクターを備える、宿主細胞。
【請求項３１】
ヒトＰＤＧＦＲβに特異的に結合する結合ポリペプチドを産生する方法であって、
ヒトＰＤＧＦＲβに特異的に結合する結合ポリペプチドが宿主細胞によって産生されるような条件下で請求項３０に記載の宿主細胞を培養することを備える、方法。
【請求項３２】
請求項１から２７のいずれか１項に記載の結合ポリペプチドと、１つ以上の医薬的に許容可能なキャリアとを備える、医薬組成物。
【請求項３３】
疾患または不調、ＰＤＧＦＲβ関連疾患または不調を治療するための方法であって、
請求項３２に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを備える、方法。
【請求項３４】
前記疾患または不調は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）または癌である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ライブラリの各々のメンバーはヒトＰＤＧＦＲβに結合する、不対ＶＨドメインの多様性ライブラリ。
【請求項３６】
多様性はＦＲ１−ＦＲ３領域に存在し、前記ライブラリの各々のメンバーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のＣＤＲ３アミノ酸配列を備える、請求項３５に記載のライブラリ。
【請求項３７】
ライブラリの各々のメンバーはヒトＰＤＧＦＲβに結合する、安定したＶＨ／ＶＬ対の多様性ライブラリ。
【請求項３８】
前記ライブラリの各々のメンバーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のＣＤＲ３アミノ酸配列を備えるＶＨドメインを備える、請求項３７に記載のライブラリ。
【請求項３９】
ＶＬドメインはヒトＶＬドメインである、請求項３８に記載のライブラリ。
【請求項４０】
前記ライブラリは核酸ディスプレイライブラリである、請求項３５から３９のいずれか１項に記載のライブラリ。
【請求項４１】
前記核酸ディスプレイライブラリはＤＮＡディスプレイライブラリである、請求項４０に記載のライブラリ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１１年１２月５日に出願された米国仮出願６１／５６６，７７８および２０１２年３月１４日に出願された米国仮出願６１／６１０，９０５の優先権を主張し、その両者の全体がここに引用により援用される。
【背景技術】
【０００２】
導入
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、間充織源の有糸分裂促進物質および化学誘因物質であり、多くの疾患の病理に係る。ＰＤＧＦは、３つの区別されるＰＤＧＦアイソフォームであるＡＡ、ＢＢ、またはＡＢを形成するように組合せることができる２つの相同鎖ＡまたはＢからなるジスルフィド結合二量体として存在する。ＰＤＧＦのすべてのアイソフォームは、細胞表面ＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）に結合することによって、それらの有糸分裂促進性効果を媒介する。
【０００３】
ＰＤＧＦ受容体はチロシンキナーゼファミリーに属し、２つの受容体アイソフォームであるアルファおよびベータからなる。アルファおよびベータアイソフォームは、それらの区別されるリガンド結合特異性によって区別可能である。ＰＤＧＦベータ受容体はＢ鎖（アイソフォームＢＢおよびＡＢ）のみに結合することができる一方で、ＰＤＧＦアルファ受容体はＰＤＧＦのすべてのアイソフォームに結合することができる。
【０００４】
細胞表面ＰＤＧＦＲへのＰＤＧＦの結合は、受容体の二量化および自己リン酸転移を引起し、この結果、次に、とりわけ、細胞増殖および細胞移動を引起す細胞内シグナリング事象を生じる。これに応じて、ＰＤＧＦ結合および／または受容体二量化を阻害するＰＤＧＦＲ拮抗阻害体を用いて、ＰＤＧＦＲ活性化と関連付けられる疾患を治療するまたは予防することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、ＰＤＧＦＲ活性化と関連付けられる疾患を治療するのに用いることができる新規のＰＤＧＦＲ拮抗阻害体に対する当該技術分野での必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明は、高い親和性で標的抗原（たとえばヒト抗原、たとえばヒトＰＤＧＦ）に特異的に結合する結合ポリペプチド（たとえば、抗体またはそのフラグメント）を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、高い親和性でＰＤＧＦＲβ（たとえばヒトＰＤＧＦＲβ）に結合し、ＰＤＧＦＲβ活性化に拮抗する結合ポリペプチドを提供する。そのような結合ポリペプチドは、ＰＤＧＦＲβ関連の疾患または不調（たとえば加齢黄斑変性症（ＡＭＤ））を治療するのに特に有用である。本発明は、結合ポリペプチドのライブラリ、医薬組成物、ならびに結合ポリペプチドをエンコードする核酸、組換え発現ベクター、およびそのような結合ポリペプチドを作るための宿主細胞も提供する。ＰＤＧＦＲβを検出し、ＰＤＧＦＲβ活性を調節する、本発明の結合ポリペプチドを用いる方法も本発明に包含される。
【０００７】
そして、１つの局面では、本発明は、ＶＨドメインを備える単離された結合ポリペプチドを提供し、単離されたドメインとして、ＶＨドメインは、１００ｐＭ未満のＫｄで抗原
に結合する。
【０００８】
別の局面では、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のＣＤＲ３配列を備えるＰＤＧＦＲβに特異的に結合する、単離された結合ポリペプチドを提供する。
【０００９】
ある実施形態では、結合ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を備えるＶＨドメインを備える。ＶＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２−３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を備えるＨＣＤＲ２、および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３−６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を備えるＨＣＤＲ１をさらに備えてもよい。
【００１０】
ある実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１８−３６８からなる群から選択されるＶＨドメインアミノ酸配列との少なくとも８０％（たとえば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）のアミノ酸同一性を共有するアミノ酸配列を備えるＶＨドメインを備える。
【００１１】
ある実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１８−３６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を備えるＶＨドメインを備える。
【００１２】
ある実施形態では、結合ポリペプチドはＶＬドメインを備える。ＶＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３−１４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を備えるＬＣＤＲ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４８−２３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を備えるＬＣＤＲ２、および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３３−３１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を備えるＬＣＤＲ１をさらに備えてもよい。
【００１３】
ある実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６９−４５３からなる群から選択されるＶＬドメインアミノ酸配列との少なくとも８０％（たとえば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）のアミノ酸同一性を共有するアミノ酸配列を備えるＶＬドメインを備える。
【００１４】
ある実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６９−４５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を備えるＶＬドメインを備える。
【００１５】
さらなる局面では、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１８に記載のＶＨドメインアミノ酸配列を備える結合ポリペプチドと同じエピトープに、ＰＤＧＦＲβ上で結合する結合ポリペプチドを提供する。好ましい実施形態では、結合ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１８−３６８からなる群から選択されるＶＨドメインアミノ酸配列との少なくとも８０％のアミノ酸同一性（たとえば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）を共有するＶＨドメインアミノ酸配列を備える。
【００１６】
さらなる局面では、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１８に記載のＶＨドメインアミノ酸配列を備える結合ポリペプチドと、ＰＤＧＦＲβへの結合を競合する結合ポリペプチドを提供する。好ましい実施形態では、結合ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１８−３６８からなる群から選択されるＶＨドメインアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を共有するＶＨドメインアミノ酸配列を備える。
【００１７】
ある実施形態では、本発明の結合ポリペプチドはＰＤＧＦＲβの活性を抑制する。１つの実施形態では、ＰＤＧＦＲβの活性は、ＰＤＧＦＲβへのＰＤＧＦ結合に拮抗することによって抑制される。別の実施形態では、ＰＤＧＦＲβの活性は、ＰＤＧＦＲβ二量化に拮抗することによって抑制される。
【００１８】
ある実施形態では、本発明の結合ポリペプチドは、１００ｐＭ未満のＫｄでおよび／または１０-3ｓ-1未満のオフレートでＰＤＧＦＲβに結合する。
【００１９】
ある実施形態では、本発明の結合ポリペプチドは、マウスＰＤＧＦＲβおよびヒトＰＤＧＦＲβに特異的に結合する。
【００２０】
ある実施形態では、本発明の結合ポリペプチドは、５ｎＭ未満のＩＣ５０でＰＤＧＦＲβへのＰＤＧＦ結合に拮抗し、４ｎＭ未満のＩＣ５０でＰＤＧＦＲβのリガンド誘導チロシンリン酸化を抑制し、６ｎＭ未満のＩＣ５０で網膜周細胞を抑制し、および／または少なくとも６８℃の融解温度（Ｔｍ）を有する。
【００２１】
さらなる局面では、本発明は、発明の結合ポリペプチドをエンコードする単離された核酸を提供する。
【００２２】
さらなる局面では、本発明は、発明の結合ポリペプチドをエンコードする単離された核酸を備える組換え発現ベクターを提供する。
【００２３】
さらなる局面では、本発明は、本発明の結合ポリペプチドを発現する宿主細胞を提供する。
【００２４】
さらなる局面では、本発明は、結合ポリペプチドが宿主細胞によって産生されるような条件下で本発明の結合ポリペプチドを発現することができる宿主細胞を培養することを備える、ヒトＰＤＧＦＲβに特異的に結合する結合ポリペプチドを産生する方法を提供する。
【００２５】
さらなる局面では、本発明は、本発明の結合ポリペプチドと、１つ以上の医薬的に許容可能なキャリアとを備える医薬組成物を提供する。
【００２６】
さらなる局面では、本発明は、疾患または不調、ＰＤＧＦＲβ関連疾患または不調（たとえば、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）または癌）を治療するための方法であって、発明の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを備える方法を提供する。
【００２７】
さらなる局面では、本発明は、不対ＶＨドメインの多様なライブラリを提供し、ライブラリの各々のメンバーはヒトＰＤＧＦＲβに結合する。１つの好ましい実施形態では、ライブラリの各々のメンバーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のＣＤＲ３アミノ酸配列を備え、多様性はＦＲ１−ＦＲ３領域にある。１つの好ましい実施形態では、ライブラリは核酸ディスプレイライブラリ（たとえばＤＮＡディスプレイライブラリ）である。
【００２８】
さらなる局面では、本発明は安定したＶＨ／ＶＬ対の多様なライブラリを提供し、ライブラリの各々のメンバーはヒトＰＤＧＦＲβに結合する。１つの好ましい実施形態では、ライブラリの各々のメンバーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のＣＤＲ３アミノ酸配列を備えるＶＨドメインを備える。１つの好ましい実施形態では、ＶＬドメインはヒトＶＬドメインである。１つの好ましい実施形態では、ライブラリは核酸ディスプレイライブラリ（たとえばＤＮＡディスプレイライブラリ）である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】開示される方法で用いるための例示的なＶＨドメイン核酸ディスプレイライブラリの構成の概略図である。
【図２】ＸＢ１５１１  ＶＨドメインのヒトＰＤＧＦＲβまたはマウスＰＤＧＦＲβ、選択を行なわかったＸＢ１５１１  ＣＤＲ３／フレームワークシャッフリングされたＤＮＡディスプレイライブラリ（Ｒ０）、および４ラウンドの選択（Ｒ４）後のＸＢ１５１１  ＣＤＲ３／フレームワークシャッフリングされたＤＮＡディスプレイライブラリプールへの結合を測定するインビトロ結合アッセイの結果を示す図である。
【図３】ＸＢ１５１１ならびにヒトＰＤＧＦＲβに対するフレームワークシャッフリングされた誘導体ＸＢ２２０２およびＸＢ２７０８の結合キネティクスを測定する表面プラズモン共鳴結合研究の結果を示す図である。
【図４】ヒト（Ａ）ＰＤＧＦＲβおよびマウス（Ｂ）ＰＤＧＦＲβへのＸＢ２２０２の結合キネティクスを測定する表面プラズモン共鳴結合アッセイの結果を示す図である。
【図５】ヒト（Ａ）ＰＤＧＦＲβおよびマウス（Ｂ）ＰＤＧＦＲβへのＸＢ２７０８の結合キネティクスを測定する表面プラズモン共鳴結合アッセイの結果を示す図である。
【図６】開示される方法で用いるための例示的なＶＬ核酸ディスプレイライブラリの構成の概略図である。
【図７】ＶＨ／ＶＬペアリングＤＮＡディスプレイスクリーンの２ラウンド目のスクリーニングプールから単離されたＶＬドメインを備えるＸＢ１５１１／ＶＬ  ｓｃＦｖのヒトＰＤＧＦＲβへの結合を測定するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。
【図８】ＶＨ／ＶＬペアリングＤＮＡディスプレイスクリーンの３ラウンド目のスクリーニングプールから単離されるＶＬドメインを備えるＸＢ１５１１／ＶＬ  ｓｃＦｖのヒトＰＤＧＦＲβへの結合を測定するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。
【図９】ＶＨ／ＶＬペアリングＤＮＡディスプレイスクリーンの２ラウンド目のスクリーニングプールから単離されるＶＬドメインを備えるＸＢ２２０２／ＶＬ  ｓｃＦｖのヒトＰＤＧＦＲβへの結合を測定するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。
【図１０】図９に述べられたＸＢ１５１１／ＶＬ  ｓｃＦｖからの不対ＶＬドメインのヒトＰＤＧＦＲβへの結合を測定するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。
【図１１】ＶＨ／ＶＬペアリングＤＮＡディスプレイスクリーンから得られる、35Ｓ  Ｍｅｔ標識ＸＢ１５１１  ＶＨドメインおよびＸＢ１５１１含有ｓｃＦｖのヒトＰＤＧＦＲβへの結合を測定する溶液結合親和性の研究の結果を示す図である。
【図１２】ＶＨ／ＶＬペアリングＤＮＡディスプレイスクリーンから得られる、35Ｓ  Ｍｅｔ標識ＸＢ２２０２  ＶＨドメインおよびＸＢ２２０２含有ｓｃＦｖのヒトＰＤＧＦＲβへの結合を測定する溶液結合親和性の研究の結果を示す図である。
【図１３】ＸＢ２２０２のさまざまな濃度でのＰＤＧＦＲβへのＰＤＧＦ−ＢＢの結合のキネティクスを測定する表面プラズモン共鳴競合結合アッセイの結果を示す図である。
【図１４】ＸＢ２７０８による周細胞移動の抑制を測定するインビトロ細胞移動アッセイの結果を示す図である。
【図１５】ヒト包皮線維芽細胞の移動を抑制するＸＢ１５１１含有ＩｇＧ１の能力を測定する無標識移動アッセイの結果を示す図である。
【図１６】さまざまな温度でのインキュベーション後のＸＢ２２０２  ＶＨドメインおよびＸＢ２２０２／Ａ４  ｓｃＦｖのヒトＰＤＧＦＲβへの結合を測定するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
詳細な説明
本発明は、高い親和性で標的抗原（たとえばヒト抗原）に特異的に結合する結合ポリペプチド（たとえば、抗体またはそのフラグメント）を提供する。好ましい実施形態では、本発明の結合ポリペプチドは、高い親和性でＰＤＧＦＲβ（たとえばヒトＰＤＧＦＲβ）
に結合し、ＰＤＧＦＲβの活性を抑制する。そのような結合ポリペプチドは、ＰＤＧＦＲβ関連の疾患または不調（たとえば加齢黄斑変性症（ＡＭＤ））を治療するのに特に有用である。本発明は、結合ポリペプチドのライブラリ、医薬組成物、ならびに結合ポリペプチドをエンコードする核酸、組換え発現ベクター、およびそのような結合ポリペプチドを作るための宿主細胞も提供する。ＰＤＧＦＲβを検出し、ＰＤＧＦＲβ活性を調節する、本発明の結合ポリペプチドを用いる方法も発明に包含される。
【００３１】
Ｉ．定義
本発明をより容易に理解し得るようにするために、ある用語をまず定義する。
【００３２】
本明細書中で用いるように、「ＰＤＧＦＲβ」という用語は、血小板由来成長因子受容体ベータを指す。ＰＤＧＦＲβヌクレオチドおよびポリペプチド配列は当該技術分野で周知である。例示的なヒトＰＤＧＦＲβアミノ配列はGenBankデポジットＧＩ：４５０５６
８３に記載され、例示的なマウスＰＤＧＦＲβアミノ配列はGenBankデポジットＧＩ：２
２６３７１７５２に記載される。
【００３３】
本明細書中で用いるように、「ＰＤＧＦ」という用語は血小板由来成長因子を指す。ＰＤＧＦヌクレオチドおよびポリペプチド配列は当該技術分野で周知である。例示的なヒトＰＤＧＦアミノ配列はGenBankデポジットＧＩ：４５０５６８１に記載され、例示的なマ
ウスＰＤＧＦアミノ配列はGenBankデポジットＧＩ：４００７４４に記載される。
【００３４】
本明細書中で用いるように、「結合ポリペプチド」という用語は、結合ポリペプチドが標的抗原を特異的に認識するように抗体の抗原結合部位のすべてまたは一部（たとえば、重鎖および／または軽鎖可変ドメインのすべてまたは一部、たとえば重鎖可変ドメインの少なくともＨＣＤＲ３）を含有するポリペプチドを指す。結合ポリペプチドの非限定的例は、抗体またはそのフラグメント、および抗体の抗原結合部位のすべてまたは一部を備えるように変更された免疫グロブリン様ドメイン（たとえばフィブロネクチンドメイン）を含む。
【００３５】
本明細書中で用いるように、「抗体」という用語は、４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって相互接続される２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖、ならびにそのマルチマー（たとえばＩｇＭ）を備える免疫グロブリン分子を指す。各々の重鎖は、（ＶＨと略される）重鎖可変領域および重鎖定常領域を備える。重鎖定常領域は、３つのドメインであるＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を備える。各々の軽鎖は、（ＶＬと略される）軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を備える。軽鎖定常領域は１つのドメイン（ＣＬ１）を備える。ＶＨおよびＶＬ領域は、より保存的な、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域を散在させた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化可能である。
【００３６】
本明細書中で用いるように、抗体の「抗原結合部分」という用語は、抗原に特異的に結合して錯体を形成する、任意の自然発生する、酵素的に入手可能な、合成のまたは遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、たとえば、抗体の可変ドメインおよびオプションで定常ドメインをエンコードするＤＮＡの操作および発現に係るタンパク質分解または組換え遺伝子工学技術などの任意の好適な標準的技術を用いて、完全な抗体分子から誘導されてもよい。抗原結合部分の非限定的例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、（ii）Ｆ（ａｂ´）2フラグメント、（iii）Ｆｄフラグメント、（iv）Ｆｖフラグメント、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（vi）ｄＡｂフラグメント、および（vii）抗体の超可変性領域（たとえば単離された相補性決定領域（Ｃ
ＤＲ））を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位を含む。二価抗体、三価抗体、四価抗体、および小抗体などの他の操作された分子も「抗原結合部分」という表現内に包含
される。
【００３７】
本明細書中で用いるように、「ＶＨドメイン」および「ＶＬドメイン」という用語は、ＦＲ（フレームワーク領域）１、２、３、および４、ならびにＣＤＲ（相補性決定領域）１、２および３を備えるそれぞれ単一の抗体可変重ドメインおよび軽ドメインを指す（Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. (NIH Publication No. 91-3242, Bethesdaを参照）。
【００３８】
本明細書中で用いるように、「ＦＲ１−ＦＲ３」という用語は、ＦＲ１、ＣＤＲ２、ＦＲ２、ＣＤＲ２、およびＦＲ３を包含するがＣＤＲ３およびＦＲ４領域を排除するＶＨの領域を指す。
【００３９】
本明細書中で用いるように、「不対」という用語は、それぞれ相補ＶＬまたはＶＨドメインに（共有にまたは非共有に）結合しないＶＨまたはＶＬを指す。
【００４０】
本明細書中で用いるように、「相補ＶＬまたはＶＨドメイン」という用語は、それぞれＶＨまたはＶＬドメインと関連付けてＶＨ／ＶＬ対を形成するＶＬまたはＶＨドメインを指す。
【００４１】
本明細書中で用いるように、「ＶＨ／ＶＬ対」という用語は、単一のＶＨドメインおよび単一のＶＬドメインの非共有二量体を指し、ＶＬおよびＶＨドメインは完全な四量体免疫グロブリン分子で観察されるのと同じ態様で関連付けられ、二量体は少なくとも１つの標的抗原に特異的に結合することができる。「安定したＶＨ／ＶＬ対」は、生理的条件下で置換ＶＨおよびＶＬドメインの大きな解離を呈しないＶＨ／ＶＬ対である。
【００４２】
本明細書中で用いるように、「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」という用語は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両者の可変領域内に見出される不連続抗原結合部位を意味する。これらの特定の領域は、Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977)および
Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991)によって、
ならびにChothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)によって、ならびにMacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)によって記載され、ここでは、定義は、互いに対して比較されると重なり合うアミノ酸残基またはアミノ酸残基のサブセットを含む。以上引用される文献の各々が定義するようなＣＤＲを包含するアミノ酸残基は比較のために記載される。好ましくは、「ＣＤＲ」という用語は、配列比較に基づいてKabat
によって定義されるようなＣＤＲである。
【００４３】
本明細書中で用いるように、「フレームワーク（ＦＲ）アミノ酸残基」という用語は、免疫グロブリン鎖のフレームワーク領域中のそれらのアミノ酸を指す。本明細書中で用いられるような「フレームワーク領域」または「ＦＲ領域」という用語は、可変領域の一部であるが、（たとえば、ＣＤＲのKabatの定義を用いる）ＣＤＲの一部ではないアミノ酸
残基を含む。
【００４４】
本明細書中で用いるように、「に特異的に結合する」という用語は、少なくとも約１×１０-6Ｍ、１×１０-7Ｍ、１×１０-8Ｍ、１×１０-9Ｍ、１×１０-10Ｍ、１×１０-11Ｍ、１×１０-12Ｍもしくはそれ以上のＫｄで抗原に結合する、および／または非特異的抗
原についてのその親和性よりも少なくとも２倍大きな親和性で抗原に結合する結合ポリペプチドの能力を指す。しかしながら、結合ポリペプチドは、配列について関連のある２つ以上の抗原に特異的に結合することができることが理解される。たとえば、本発明の結合ポリペプチドは、ヒトＰＤＧＦＲβおよび非ヒト（たとえばマウスまたは非ヒト霊長類）ＰＤＧＦＲβの両方に特異的に結合することができる。
【００４５】
本明細書中で用いるように、「抗原」という用語は、結合ポリペプチドによって認識される結合部位またはエピトープを指す。
【００４６】
本明細書中で用いるように、「核酸ディスプレイライブラリ」という用語は、たとえば、その全体がすべてここに引用により援用される米国特許第７，１９５，８８０号、第６，９５１，７２５号、第７，０７８，１９７号、第７，０２２，４７９号、第６，５１８，０１８号、第７，１２５，６６９号、第６，８４６，６５５号、第６，２８１，３４４号、第６，２０７，４４６号、第６，２１４，５５３号、第６，２５８，５５８号、第６，２６１，８０４号、第６，４２９，３００号、第６，４８９，１１６号、第６，４３６，６６５号、第６，５３７，７４９号、第６，６０２，６８５号、第６，６２３，９２６号、第６，４１６，９５０号、第６，６６０，４７３号、第６，３１２，９２７号、第５，９２２，５４５号、および第６，３４８，３１５号、ならびにＷＯ２０１０／０１１９４４に記載のものを含むが、それらに限定されない任意の当該技術分野で認識されるインビトロセルフリー表現型−遺伝子型結合ディスプレイを指す。
【００４７】
本明細書中で用いるように、「ベクター」という用語は、結合されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことが意図される。ベクターの一種が「プラスミド」であり、これは、付加的なＤＮＡセグメントが結合され得る円形の二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別の種類はウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに結合され得る。あるベクターは、それらが導入される宿主細胞の中で自律的増殖を行なうことができる（たとえば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（たとえば非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、それにより宿主のゲノムとともに複製される。さらに、あるベクターは、動作するように結合される遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターは本明細書中では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称される。一般的に、組換えＤＮＡ技術において有益な発現ベクターはしばしばプラスミドの形態にある。「プラスミド」および「ベクター」という用語を相互交換可能に用いてもよい。しかしながら、本発明は、均等の機能を果たすウイルスベクター（たとえば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などの発現ベクターのそのような他の形態を含むことが意図される。
【００４８】
本明細書中で用いるように、「宿主細胞」という用語は、組換え発現ベクターが導入される細胞を指すことが意図される。この用語は、特定の対象の細胞だけではなく、そのような細胞の子孫も指すことが意図されることを理解すべきである。ある修飾は突然変異または環境の影響によって後世で起こり得るので、そのような子孫は実際は親細胞と同一ではないかもしれないが、依然として本明細書中で用いるような「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
【００４９】
本明細書中で用いるように、「治療する」、「治療している」、および「治療」という用語は、本明細書中に記載の療法または予防手段を指す。「治療」の方法は、たとえば、疾患もしくは不調もしくは再発する疾患もしくは不調の１つ以上の症状を防止する、治癒する、遅延させる、その深刻さを低減する、もしくは軽減するための、またはそのような治療の不在下で予期されるよりも対象の生存を長くするための、ＰＤＧＦＲβ関連の疾患もしくは不調（たとえばＡＭＤ）を有するまたはそのような疾患もしくは不調を有することに対して前もって処置される対象などの対象に対して、本発明の抗体または抗原結合部分の投与を用いる。
【００５０】
本明細書中で用いるように、「ＰＤＧＦＲβ関連の疾患または不調」という用語は、ＰＤＧＦＲβ活性に関連付けられる疾患状態および／または症状を含む。例示的なＰＤＧＦ
Ｒβ関連の疾患または不調は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）および癌を含むが、それらに限定されない。
【００５１】
本明細書中で用いるように、「有効な量」という用語は、対象に投与されると、本明細書中に記載のように、ＰＤＧＦＲβ関連の疾患または不調の治療、予後、または診断を行なうのに十分な結合ポリペプチドの量を指す。療法的に有効な量は、治療される対象および疾患の状態、対象の重量および年齢、疾患の状態の深刻さ、投与の態様などに依存して異なるが、これは当業者が容易に決めることができる。投与の投薬量は、たとえば、本発明に従う結合ポリペプチドの、約１ｎｇから約１０，０００ｍｇ、約約１ｕｇから約５，０００ｍｇ、約１ｍｇから約１，０００ｍｇ、約１０ｍｇから約１００ｍｇの範囲にわたり得る。投薬計画は、最適な治療反応を提供するように調整されてもよい。有効な量は、有益な効果が結合ポリペプチドの何らかの毒性効果または有害な効果（すなわち副作用）を最小限にするおよび／またはそれを上回るものでもある。
【００５２】
本明細書中で用いるように、「対象」という用語は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。
【００５３】
本明細書中で用いるように、「表面プラズモン共鳴」という用語は、たとえば、BIAcore（登録商標）システム（GE HealthcareのBiacore Life Sciences部、Piscataway, NJ）
を用いたバイオセンサーマトリクス内でのタンパク質濃度の変更の検出によるリアルタイム相互作用の分析を可能にする光学的現象を指す。
【００５４】
本明細書中で用いるように、「ＫD」という用語は、特定の結合ポリペプチド／抗原相
互作用の平衡解離定数を指す。
【００５５】
本明細書中で用いるように、「オフレート」という用語は、特定の結合ポリペプチド／抗原相互作用の解離速度（Ｋoff）を指す。
【００５６】
本明細書中で用いるように、「エピトープ」という用語は、本発明の結合分子中の特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は１つよりも多くのエピトープを有してもよい。このように、異なる抗体は、抗原上の異なる区域に結合してもよく、異なる生物学的効果を有してもよい。エピトープは立体配座または線形であってもよい。立体配座エピトープは、ポリペプチド直鎖の異なるセグメントから空間的に隣接するアミノ酸によって産生される。直線状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって産生されるものである。
【００５７】
ＩＩ．結合ポリペプチド
１つの局面では、本発明は、ＶＨドメインを備える結合ポリペプチドを提供し、単離されたドメインとして、ＶＨドメインは、約２００ｐＭ未満（たとえば、約２００、１９０、１８０、１７５、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９５、９０、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４０、３０、２０、１０、５、または１ｐＭ以下）のＫｄで抗原に結合する。
【００５８】
別の局面では、本発明は、ＰＤＧＦＲβに特異的に結合し、ＰＤＧＦＲβの活性を抑制する結合ポリペプチド（たとえば、抗体またはその抗原結合フラグメント）を提供する。そのような結合ポリペプチドは、ＰＤＧＦＲβ関連の疾患または不調（たとえば、加齢黄斑変性症またはＡＭＤ）を治療するのに特に有用である。
【００５９】
一般的に、本発明のＰＤＧＦＲβ結合ポリペプチドは、ＰＤＧＦＲβに特異的に結合する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列を備える。本発明の結合ポリペプチドで用い
るのに好適な１つの非限定的ＨＣＤＲ３配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＨＧＧＤＲＳＹ））に記載の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。他の実施形態では、重鎖ＣＤＲ３配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも１つの（たとえば１つ、２つ、または３つの）保存的アミノ酸置換基を備えるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の変異体である。
【００６０】
ＰＤＧＦＲβに特異的に結合する重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列（たとえば、ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：１（ＨＧＧＤＲＳＹ）に記載のＣＤＲ３アミノ酸配列）を組入れることができる任意の結合ポリペプチドは、限定されることなく、抗体またはそのフラグメント、および免疫グロブリン様ドメインを含む本発明の結合ポリペプチドで用いることができる。好適な免疫グロブリン様ドメインは、限定されることなく、フィブロネクチンドメイン（たとえば、その全体がここに引用により援用されるKoide et al. (2007), Methods Mol. Biol. 352: 95-109を参照）、DARPin（たとえば、その全体が本明細書中に引用により援用さ
れるStumpp et al. (2008) Drug Discov. Today 13 (15-16): 695-701を参照）、タンパ
ク質ＡのＺドメイン（たとえば、その全体が本明細書中に引用により援用されるNygren et al. (2008) FEBS J. 275 (11): 2668-76を参照）、リポカリン（たとえば、その全体が本明細書中に引用により援用されるSkerra et al. (2008) FEBS J. 275 (11): 2677-83を参照）、アフィリン（たとえば、その全体が本明細書中に引用により援用されるEbersbach et al. (2007) J. Mol. Biol. 372 (1): 172-85を参照）、アフィチン（たとえば、そ
の全体が本明細書中に引用により援用されるKrehenbrink et al. (2008). J. Mol. Biol.
383 (5): 1058-68を参照）、アビマー（たとえば、その全体が本明細書中に引用により
援用されるSilverman et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23 (12): 1556-61を参照）、フ
ィノマー（Fynomers）（たとえば、その全体が本明細書中に引用により援用されるGrabulovski et al. (2007) J Biol Chem 282 (5): 3196-3204を参照）、およびKunitzドメインペプチド（たとえば、その全体が本明細書中に引用により援用されるNixon et al. (2006) Curr Opin Drug Discov Devel 9 (2): 261-8を参照）を含む。
【００６１】
好ましい実施形態では、ＰＤＧＦＲβ結合ポリペプチドは、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを備える抗体またはその抗原結合フラグメントである。本発明で用いるのに好適な例示的なＣＤＲ、ＶＨ、およびＶＬアミノ酸配列を表１−４に記載する。応じて、ある実施形態では、結合ポリペプチドは、表１に記載される重鎖ＨＣＤＲ２またはＨＣＤＲ１配列のうち任意の１つから独立して選択されるＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ１配列とともに、ＨＣＤＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を備えてもよい。ある実施形態では、本発明の結合ポリペプチドは、表２に記載の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ配列の任意の１つから独立して選択される軽鎖ＣＤＲをさらに備えてもよい。たとえば、本発明の結合ポリペプチドは、表４に記載の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのうち任意の１つとオプションで対にされる、表３に記載の重鎖可変（ＶＨ）ドメインのうち任意の１つを備えてもよい。
【００６２】
【表１】
2019047807.tif 000002
【００６３】
【表２−１】
2019047807.tif 000003
【００６４】
【表２−２】
2019047807.tif 000004
【００６５】
【表２−３】
2019047807.tif 000005
【００６６】
【表３−１】
2019047807.tif 000006
【００６７】
【表３−２】
2019047807.tif 000007
【００６８】
【表３−３】
2019047807.tif 000008
【００６９】
【表４−１】
2019047807.tif 000009
【００７０】
【表４−２】
2019047807.tif 000010
【００７１】
【表４−３】
2019047807.tif 000011
【００７２】
【表４−４】
2019047807.tif 000012
【００７３】
ある実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２−３１７からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲ領域アミノ酸配列とともにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の重鎖ＣＤＲ３配列を備える。例示的な実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、および３；１、２、および３４；１、３、および３５；１、４、および３５；１、５、および３６；１、６、およ
び３６；１、３、および３６；１、７、および３６；１、８、および３６；１、９、および３６；１、１０、および３８；１、２、および３８；１、１１、および３９；１、１２、および４０；１、１３、および４１；１、１３、および４２；１、１３、および３３；１、１４、および４３；１、１４、および４４；１、１５、および４５；１、１６、および４５；１、１７、および４６；１、１８、および４７；１、１９、、および４７；１、２０、および４８；１、２、および４９；１、２１、および５０；１、２、および５１；１、２、および５２；１、２、および５３；１、２２、および５４；１、２３、および５５；１、２４、および５６；１、２５、および４６；１、２６、および５７；１、２７、および５８；１、２８、および５９；１、２９、および６０；１、３０、および６１；１、３１、および６２；ならびに１、３２、および６２からなる群から選択されるＨＣＤＲ３、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ１アミノ酸配列を備える。
【００７４】
他の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３、１４８、および２３３；６４、１４９、および２３４；６５、１５０、および２３５；６６、１５１、および２３６；６７、１５２、および２３７；６８、１５３、および２３８；６９、１５４、および２３９；７０、１５５、および２４０；７１、１５６、および２４１；７２、１５７、および２４２；７３、１５８、および２４３；７４１、１５９、および２４４；７５、１６０、および２４５；７６、１６１、および２４６；７７、１６２、および２４７；７８、１６３、および２４８；７９、１６４、および２４９；８０、１６５、および２５０；８１、１６６、および２５１；８２、１６７、および２５２；８３、１６８、および２５３；８４、１６９、および２５４；８５、１７０、および２５５；８６、１７１、および２５６；８７、１７２、および２５７；８８、１７３、および２５８；８９、１７４、および２５９；９０、１７５、および２６０；９１、１７６、および２６１；９２、１７７、および２６２；９３、１７８、および２６３；９４、１７９、および２６４；９５、１８０、および２６５；９６、１８１、および２６６；９７、１８２、および２６７；９８、１８３、および２６８；９９、１８４、および２６９；１００、１８５、および２７０；１０１、１８６、および２７１；１０２、１８７、および２７２；１０３、１８８、および２７３；１０４、１８９、および２７４；１０５、１９０、および２７５；１０６、１９１、および２７６；１０７、１９２、および２７７；１０８、１９３、および２７８；１０９、１９４、および２７９；１１０、１９５、および２８０；１１１、１９６、および２８１；１１２、１９７、および２８２；１１３、１９８、および２８３；１１４、１９９、および２８４；１１５、２００、および２８５；１１６、２０１、および２８６；１１７、２０２、および２８７；１１８、２０３、および２８８；１１９、２０４、および２８９；１２０、２０５、および２９０；１２１、２０６、および２９１；１２２、２０７、および２９２；１２３、２０８、および２９３；１２４、２０９、および２９４；１２５、２１０、および２９５；１２６、２１１、および２９６；１２７、２１２、および２９７；１２８、２１３、および２９８；１２９、２１４、および２９９；１３０、２１５、および３００；１３１、２１６、および３０１；１３２、２１７、および３０２；１３３、２１８、および３０３；１３４、２１９、および３０４；１３５、２２０、および３０５；１３６、２２１、および３０６；１３７、２２２、および３０７；１３８、２２３、および３０８；１３９、２２４、および３０９；１４０、２２５、および３１０；１４１、２２６、および３１１；１４２、２２７、および３１２；１４３、２２８、および３１３；１４４、２２９、および３１４；１４５、２２０、および３１５；１４６、２３１、および３１６；ならびに１４７、２３２、および３１７からなる群から選択されるＬＣＤＲ３、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ１アミノ酸配列をさらに備える。
【００７５】
他の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３、１４８、および２３３；６４、１４９、および２３４；６５、１５０、および２３５；６６、１５１、
および２３６；６７、１５２、および２３７；６８、１５３、および２３８；６９、１５４、および２３９；７０、１５５、および２４０；７１、１５６、および２４１；７２、１５７、および２４２；７３、１５８、および２４３；７４１、１５９、および２４４；７５、１６０、および２４５；７６、１６１、および２４６；７７、１６２、および２４７；７８、１６３、および２４８；７９、１６４、および２４９；８０、１６５、および２５０；８１、１６６、および２５１；８２、１６７、および２５２；８３、１６８、および２５３；８４、１６９、および２５４；８５、１７０、および２５５；８６、１７１、および２５６；８７、１７２、および２５７；８８、１７３、および２５８；８９、１７４、および２５９；９０、１７５、および２６０；９１、１７６、および２６１；９２、１７７、および２６２；９３、１７８、および２６３；９４、１７９、および２６４；９５、１８０、および２６５；９６、１８１、および２６６；９７、１８２、および２６７；９８、１８３、および２６８；９９、１８４、および２６９；１００、１８５、および２７０；１０１、１８６、および２７１；１０２、１８７、および２７２；１０３、１８８、および２７３；１０４、１８９、および２７４；１０５、１９０、および２７５；１０６、１９１、および２７６；１０７、１９２、および２７７；１０８、１９３、および２７８；１０９、１９４、および２７９；１１０、１９５、および２８０；１１１、１９６、および２８１；１１２、１９７、および２８２；１１３、１９８、および２８３；１１４、１９９、および２８４；１１５、２００、および２８５；１１６、２０１、および２８６；１１７、２０２、および２８７；１１８、２０３、および２８８；１１９、２０４、および２８９；１２０、２０５、および２９０；１２１、２０６、および２９１；１２２、２０７、および２９２；１２３、２０８、および２９３；１２４、２０９、および２９４；１２５、２１０、および２９５；１２６、２１１、および２９６；１２７、２１２、および２９７；１２８、２１３、および２９８；１２９、２１４、および２９９；１３０、２１５、および３００；１３１、２１６、および３０１；１３２、２１７、および３０２；１３３、２１８、および３０３；１３４、２１９、および３０４；１３５、２２０、および３０５；１３６、２２１、および３０６；１３７、２２２、および３０７；１３８、２２３、および３０８；１３９、２２４、および３０９；１４０、２２５、および３１０；１４１、２２６、および３１１；１４２、２２７、および３１２；１４３、２２８、および３１３；１４４、２２９、および３１４；１４５、２２０、および３１５；１４６、２３１、および３１６；ならびに１４７、２３２、および３１７からなる群から選択されるＬＣＤＲ３、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ１アミノ酸配列とを備える。
【００７６】
他の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、および３；１、２、および３４；１、３、および３５；１、４、および３５；１、５、および３６；１、６、および３６；１、３、および３６；１、７、および３６；１、８、および３６；１、９、および３６；１、１０、および３８；１、２、および３８；１、１１、および３９；１、１２、および４０；１、１３、および４１；１、１３、および４２；１、１３、および３３；１、１４、および４３；１、１４、および４４；１、１５、および４５；１、１６、および４５；１、１７、および４６；１、１８、および４７；１、１９、および４７；１、２０、および４８；１、２、および４９；１、２１、および５０；１、２、および５１；１、２、および５２；１、２、および５３；１、２２、および５４；１、２３、および５５；１、２４、および５６；１、２５、および４６；１、２６、および５７；１、２７、および５８；１、２８、および５９；１、２９、および６０；１、３０、および６１；１、３１、および６２；ならびに１、３２、および６２からなる群から選択されるＨＣＤＲ３、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ１アミノ酸配列と、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３、１４８、および２３３；６４、１４９、および２３４；６５、１５０、および２３５；６６、１５１、および２３６；６７、１５２、および２３７；６８、１５３、および２３８；６９、１５４、および２３９；７０、１５５、および２４０；７１、１５６、および２４１；７２、１５７、および２４２；７３、１５８、および２４３；７４１、１５９、および２４４；７５、１６０、および２４５；７６
、１６１、および２４６；７７、１６２、および２４７；７８、１６３、および２４８；７９、１６４、および２４９；８０、１６５、および２５０；８１、１６６、および２５１；８２、１６７、および２５２；８３、１６８、および２５３；８４、１６９、および２５４；８５、１７０、および２５５；８６、１７１、および２５６；８７、１７２、および２５７；８８、１７３、および２５８；８９、１７４、および２５９；９０、１７５、および２６０；９１、１７６、および２６１；９２、１７７、および２６２；９３、１７８、および２６３；９４、１７９、および２６４；９５、１８０、および２６５；９６、１８１、および２６６；９７、１８２、および２６７；９８、１８３、および２６８；９９、１８４、および２６９；１００、１８５、および２７０；１０１、１８６、および２７１；１０２、１８７、および２７２；１０３、１８８、および２７３；１０４、１８９、および２７４；１０５、１９０、および２７５；１０６、１９１、および２７６；１０７、１９２、および２７７；１０８、１９３、および２７８；１０９、１９４、および２７９；１１０、１９５、および２８０；１１１、１９６、および２８１；１１２、１９７、および２８２；１１３、１９８、および２８３；１１４、１９９、および２８４；１１５、２００、および２８５；１１６、２０１、および２８６；１１７、２０２、および２８７；１１８、２０３、および２８８；１１９、２０４、および２８９；１２０、２０５、および２９０；１２１、２０６、および２９１；１２２、２０７、および２９２；１２３、２０８、および２９３；１２４、２０９、および２９４；１２５、２１０、および２９５；１２６、２１１、および２９６；１２７、２１２、および２９７；１２８、２１３、および２９８；１２９、２１４、および２９９；１３０、２１５、および３００；１３１、２１６、および３０１；１３２、２１７、および３０２；１３３、２１８、および３０３；１３４、２１９、および３０４；１３５、２２０、および３０５；１３６、２２１、および３０６；１３７、２２２、および３０７；１３８、２２３、および３０８；１３９、２２４、および３０９；１４０、２２５、および３１０；１４１、２２６、および３１１；１４２、２２７、および３１２；１４３、２２８、および３１３；１４４、２２９、および３１４；１４５、２２０、および３１５；１４６、２３１、および３１６；ならびに１４７、２３２、および３１７からなる群から選択されるＬＣＤＲ３、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ１アミノ酸配列とを備える。
【００７７】
他の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１８−３６８に記載のＶＨアミノ酸配列の少なくとも１つを備える。
【００７８】
他の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６９−４５３に記載のＶＬアミノ酸配列の少なくとも１つを備える。
【００７９】
他の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６９−４５３からなる群から選択されるＶＬ領域アミノ酸配列と対にされる、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１８、３２１、または３６０に記載のＶＨ領域アミノ酸配列を備える。
【００８０】
ある実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−３１７からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲアミノ酸配列を備え、１つ以上のＣＤＲ領域アミノ酸配列は、少なくとも１つ以上の保存的アミノ酸置換基（たとえば、１、２、３、４、または５個の保存的アミノ酸置換基）を備える。保存的アミノ酸置換基は、同じクラスのアミノ酸による１つのクラスのアミノ酸の置換基を含み、この場合、クラスは、たとえば、標準デイホフ周波数変換行列またはＢＬＯＳＵＭ行列によって定められるような、自然に見出される相同性タンパク質における、一般的な生理化学的アミノ酸側鎖性質および高い置換頻度によって規定される。アミノ酸側鎖の６つの一般的なクラスは、クラスＩ（Ｃｙｓ）；クラスＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）；クラスＩＩＩ（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ）；クラスＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；クラスＶ（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）；およびクラスＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔ
ｒｐ）に分類され、これらを含む。たとえば、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕなどの別のクラスＩＩＩ残基に代わるＡｓｐの置換基は保存的置換基である。このように、抗ＰＤＧＦＲβ抗体中の予測される非必須アミノ酸残基は好ましくは、同じクラスからの別のアミノ酸残基で置き換えられる。抗原結合を排除しないアミノ酸保存的置換基を同定する方法は当該技術分野で周知である（たとえば、Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999);およびBurks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997)を参照）。
【００８１】
別の実施形態では、本発明は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１８−３６８に記載のＶＨ領域アミノ酸配列および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６９−４５３に記載のＶＬ領域アミノ酸配列に対して約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＨおよび／またはＶＬ領域アミノ酸配列を備える抗ＰＤＧＦＲβ抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００８２】
別の局面では、本発明は、同じエピトープに結合するおよび／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１８に記載のＶＨドメインアミノ酸配列を備える抗体もしくはその抗原結合フラグメントと交互競合する抗ＰＤＧＦＲβ抗体を提供する。そのような抗体は、たとえば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく競合アッセイを含む慣用的な競合結合アッセイを用いて同定することができる。
【００８３】
別の局面では、本発明は、不対ＶＨドメインの多様なライブラリを提供し、ライブラリの各々のメンバーはヒトＰＤＧＦＲβに特異的に結合し、多様性はＦＲ１−ＦＲ３領域に存在する。好ましい実施形態では、ライブラリの各々のメンバーは、ヒトＰＤＧＦＲβに特異的に結合する同一の重鎖ＣＤＲ３（たとえば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のアミノ酸配列）アミノ酸配列を備え、多様性はＦＲ１−ＦＲ３領域に存在する。
【００８４】
別の局面では、本発明は、安定したＶＨ／ＶＬ対の多様なライブラリを提供し、ライブラリの各々のメンバーはヒトＰＤＧＦＲβに結合する。好ましくは、ライブラリの各々のメンバーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のＣＤＲ３アミノ酸配列を備えるＶＨドメインを備える。安定したＶＨ／ＶＬ対は、ここに全体が引用により援用される米国仮特許出願６１／４５３，１０６に記載のものを含むがこれに限定されない、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて選択することができる。
【００８５】
任意の種類のＶＨまたはＶＬドメイン発現ライブラリを本発明の方法で用いることができる。好適な発現ライブラリは、限定されることなく、核酸ディスプレイ、ファージディスプレイ、および細胞表面ディスプレイライブラリ（たとえば、酵母、哺乳類、細菌細胞）を含む。好ましい実施形態では、ライブラリは、ここにその全体が引用により援用されるＷＯ２０１０／０１１９４４に記載の方法に従って生成される核酸ディスプレイライブラリである。発現ライブラリをスクリーニングするための方法は当該技術分野で周知である。たとえば、ここにその全体が引用により援用されるAntibody Engineering: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology Volume 248, (B.K.C. Lo, Ed) Humana Press, 2004 (ISBN: 1-58829-092-1)を参照。
【００８６】
ＩＩＩ．修飾された結合ポリペプチド
ある実施形態では、本発明の結合ポリペプチドは１つ以上の修飾を備えてもよい。本発明の結合ポリペプチドの修飾された形態は、当該技術分野で公知の任意の技術を用いて作ることができる。
【００８７】
ｉ）  免疫原性の低減
ある実施形態では、本発明の結合ポリペプチド（たとえば、抗体またはその抗原結合フラグメント）は、当該技術分野で認識される技術を用いてそれらの免疫原性を低減するように修飾される。たとえば、抗体またはそのフラグメントは、キメラ化、ヒト化、および／または脱免疫化され得る。
【００８８】
１つの実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントはキメラであり得る。キメラ抗体は、抗体の異なる部分が、ネズミモノクローナル抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体などの、異なる動物種に由来する抗体である。キメラ抗体またはそのフラグメントを産生するための方法は当該技術分野で公知である。たとえば、その全体が本明細書中に引用により援用されるMorrison, Science 229: 1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4: 214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125: 191-202 (1989);米国特許第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号、および第４，８１６，３９７号を参照。当該分子の合成のために、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:
452-454 (1985)）を用いてもよい。たとえば、マウス抗ＰＤＧＦＲβ抗体分子の結合特
異性をエンコードする遺伝子配列は、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの配列とともに融合されてもよい。本明細書中で用いるように、キメラ抗体は、異なる部分がネズミモノクローナル抗体に由来する可変領域とたとえばヒト化抗体などのヒト免疫グロブリン定常領域とを有するものなどの、異なる動物種に由来する分子である。
【００８９】
別の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合部分はヒト化される。ヒト化された抗体は、非ヒト抗体からの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト抗体分子からのフレームワーク領域とを備える結合特異性を有する。しばしば、ヒトフレームワーク領域中のフレームワーク残基は、抗原結合を変更する、好ましくは向上させるように、ＣＤＲドナー抗体からの対応の残基で置換される。これらのフレームワーク置換基は、たとえば、ＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用をモデリングして抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定することと、特定の位置の通常でないフレームワーク残基を同定する配列比較とによって、当該技術分野で周知の方法で同定される。（たとえば、その全体が本明細書中に引用により援用されるQueen et al., 米国特許第５，５８５，０８９号; Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988)を参照。）抗体は、たとえば、ＣＤＲグラフティング（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；および第５，５８５，０８９号）、化粧張り（veneering）または表面付け替え（resurfacing）（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６; Padlan, Molecular Immunology 28 (4/5): 489-498 (1991); Studnicka et al., Protein
Engineering 7 (6): 805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91: 969-973 (1994)）、およびチェインシャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む、当該技術分野で公知のさまざまな技術を用いてヒト化可能である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、脱免疫を用いてＰＤＧＦＲβ結合ポリペプチド（たとえば、抗体またはその抗原結合部分）の免疫原性を低減することができる。本明細書中で用いるように、「脱免疫」という用語は、Ｔ細胞エピトープを修飾するようなポリペプチド（たとえば、抗体またはその抗原結合部分）の変更を含む（たとえば、ＷＯ９８５２９７６Ａ１、ＷＯ００３４３１７Ａ２を参照）。たとえば、本発明の開始ＰＤＧＦＲβ特異的抗体またはその抗原結合部分からのＶＨおよびＶＬ配列を分析してもよく、ヒトＴ細胞エピトープ「マップ」を、相補性決定領域（ＣＤＲ）および配列内の他の重要な残基に対するエピトープの場所を示す各々のＶ領域から生成してもよい。Ｔ細胞エピトープマップからの個々のＴ細胞エピトープは、最終的な抗体の活性を変更する危険性が低い代替的アミノ酸置換基を同定するように分析される。アミノ酸置換基の組合せを備える一連の代替的ＶＨおよびＶＬ配列が設計され、これらの配列は後に、本明細書中に開示される診断および治
療方法で用いるための一連のＰＤＧＦＲβ特異的抗体またはそのフラグメントに組入れられ、これは次に機能について試験される。典型的に、１２個から２４個の間の変異抗体が生成され、試験される。修飾されたＶ領域およびヒトＣ領域を備える完全な重鎖および軽鎖遺伝子は次に発現ベクターにクローニングされ、全抗体の産生のためにその後プラスミドが細胞系に導入される。次に抗体は、適切な生物化学的および生物学的アッセイで比較され、最適な変異体が同定される。
【００９１】
ii）  エフェクタ機能およびＦｃ修飾
本発明の結合ポリペプチドは、１つ以上のエフェクタ機能を媒介する抗体定常領域（たとえば、ＩｇＧ定常領域、たとえばヒトＩｇＧ定常領域、たとえばヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域）を備えてもよい。たとえば、抗体定常領域に対する補体のＣ１成分の結合は補体系を活性化させてもよい。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン作用および溶解において重要である。補体の活性化は炎症反応も刺激し、自己免疫過敏症にも係ることがある。さらに、抗体は、抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体結合部位が細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した状態で、Ｆｃ領域を介してさまざまな細胞上の受容体に結合する。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（イプシロン受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）、およびＩｇＭ（ミュー受容体）を含む、抗体の異なるクラスに特異的な多数のＦｃ受容体が存在する。細胞表面上のＦｃ受容体への抗体の結合は、抗体コーティング粒子の抱き込みおよび破壊、免疫複合体の除去、（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害またはＡＤＣＣと呼ばれる）キラー細胞による抗体コーティング標的細胞の溶解、炎症伝達物質の解放、胎盤通過、および免疫グロブリン産生の制御を含む、多数の重要かつ多様な生物学的応答をトリガする。好ましい実施形態では、本発明の結合ポリペプチド（たとえば、抗体またはその抗原結合フラグメント）はＦｃ−ガンマ受容体に結合する。代替的な実施形態では、本発明の結合ポリペプチドは、１つ以上のエフェクタ機能（たとえばＡＤＣＣ活性）がないおよび／またはＦｃγ受容体に結合することができない定常領域を備えてもよい。
【００９２】
本発明のある実施形態は、ほぼ同じ免疫原性の未変更全抗体と比較して、低減されたもしくは向上したエフェクタ機能、非共有的に二量化する能力、腫瘍の部位で局所化する増大した能力、低減された血清半減期、または増大した血清半減期などの所望の生物化学的特性を与えるように、定常領域ドメインのうち１つ以上において少なくとも１つのアミノ酸が削除されたまたはそれ以外のやり方で変更された抗ＰＤＧＦＲβ抗体を含む。たとえば、本明細書中に記載の診断および治療方法で用いるためのある抗体またはそのフラグメントは、免疫グロブリン重鎖と同様のポリペプチド鎖を備えるが、１つ以上の重鎖ドメインの少なくとも部分を欠いているドメイン削除抗体である。たとえば、ある抗体では、修飾された抗体の定常領域の１つのドメイン全体が削除され、たとえば、ＣＨ２ドメインのすべてまたは一部が削除される。
【００９３】
ある他の実施形態では、結合ポリペプチドは、異なる抗体アイソタイプに由来する定常領域（たとえば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のうち２つ以上からの定常領域）を備える。他の実施形態では、結合ポリペプチドは、キメラヒンジ（すなわち、異なる抗体アイソタイプのヒンジドメインに由来するヒンジ部分を備えるヒンジ、たとえばＩｇＧ４分子からの上側ヒンジドメインおよびＩｇＧ１中間ヒンジドメイン）を備える。１つの実施形態では、結合ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ４分子からのＦｃ領域または部分と、分子のコアヒンジ領域中のＳｅｒ２２８Ｐｒｏ突然変異（ＥＵ番号付け）とを備える。
【００９４】
ある実施形態では、Ｆｃ部分は、当該技術分野で公知の技術を用いてエフェクタ機能を増大させるまたは低減するように突然変異されてもよい。たとえば、定常領域ドメインの（点突然変異または他の手段を通した）削除または不活性化は、循環修飾抗体のＦｃ受容体結合を低減させ、これにより腫瘍の局所化を増大させることがある。他の場合、これは
、本発明と整合する定常領域修飾が補体結合を和らげ、こうして血清半減期、および共役された細胞毒の非特異的会合を低減するのかもしれない。定常領域のまた他の修飾を用いて、増大する抗原特異性または柔軟性による向上した局所化を可能にするジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を修飾してもよい。腫瘍の局所化、生体内分布、および血清半減期などの、結果的に得られる修飾の生理的プロファイル、生物学的利用能、および他の生物化学的効果は、不要な実験なしに、周知の免疫学的技術を用いて容易に測定され、定量化され得る。
【００９５】
ある実施形態では、本発明の抗体中で用いられるＦｃドメインはＦｃ変異体である。本明細書中で用いるように、「Ｆｃ変異体」という用語は、当該Ｆｃドメインがこれに由来する野生型Ｆｃドメインに対する少なくとも１つのアミノ酸置換基を有するＦｃドメインを指す。たとえば、ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１抗体に由来する場合、当該ヒトＩｇＧ１
ＦｃドメインのＦｃ変異体は、当該Ｆｃドメインに対する少なくとも１つのアミノ酸置換基を備える。
【００９６】
Ｆｃ変異体のアミノ酸置換基は、Ｆｃドメイン内の任意の位置（すなわち、任意のＥＵ条約アミノ酸位置）に位置してもよい。１つの実施形態では、Ｆｃ変異体は、ヒンジドメインまたはその部分に位置するアミノ酸位置に置換基を備える。別の実施形態では、Ｆｃ変異体は、ＣＨ２ドメインまたはその部分に位置するアミノ酸位置に置換基を備える。別の実施形態では、Ｆｃ変異体は、ＣＨ３ドメインまたはその部分に位置するアミノ酸位置に置換基を備える。別の実施形態では、Ｆｃ変異体は、ＣＨ４ドメインまたはその部分に位置するアミノ酸位置に置換基を備える。
【００９７】
本発明の結合ポリペプチドは、エフェクタ機能および／またはＦｃＲ結合の改良（たとえば低減または向上）を与えることが公知である、任意の当該技術分野で認識されるＦｃ変異体を用いてもよい。当該Ｆｃ変異体は、たとえば、各々が本明細書中に引用により援用される、国際ＰＣＴ刊行物ＷＯ８８／０７０８９Ａ１、Ｗ０９６／１４３３９Ａ１、ＷＯ９８／０５７８７Ａ１、Ｗ０９８／２３２８９Ａ１、Ｗ０９９／５１６４２Ａ１、Ｗ０９９／５８５７２Ａ１、ＷＯ００／０９５６０Ａ２、ＷＯ００／３２７６７Ａ１、ＷＯ００／４２０７２Ａ２、ＷＯ０２／４４２１５Ａ２、ＷＯ０２／０６０９１９Ａ２、ＷＯ０３／０７４５６９Ａ２、ＷＯ０４／０１６７５０Ａ２、ＷＯ０４／０２９２０７Ａ２、ＷＯ０４／０３５７５２Ａ２、ＷＯ０４／０６３３５１Ａ２、ＷＯ０４／０７４４５５Ａ２、ＷＯ０４／０９９２４９Ａ２、ＷＯ０５／０４０２１７Ａ２、ＷＯ０５／０７０９６３Ａ１、ＷＯ０５／０７７９８１Ａ２、ＷＯ０５／０９２９２５Ａ２、ＷＯ０５／１２３７８０Ａ２、ＷＯ０６／０１９４４７Ａ１、ＷＯ０６／０４７３５０Ａ２、およびＷＯ０６／０８５９６７Ａ２、または米国特許第５，６４８，２６０号；第５，７３９，２７７号；第５，８３４，２５０号；第５，８６９，０４６号；第６，０９６，８７１号；第６，１２１，０２２号；第６，１９４，５５１号；第６，２４２，１９５号；第６，２７７，３７５号；第６，５２８，６２４号；第６，５３８，１２４号；第６，７３７，０５６号；第６，８２１，５０５号；第６，９９８，２５３号；および第７，０８３，７８４に開示されるアミノ酸置換基のうち任意の１つを含んでもよい。１つの例示的な実施形態では、本発明の結合ポリペプチドは、ＥＵ位置２６８（たとえば、Ｈ２６８ＤまたはＨ２６８Ｅ）にアミノ酸置換基を備えるＦｃ変異体を備えてもよい。別の例示的な実施形態では、本発明の結合ポリペプチドは、ＥＵ位置２３９（たとえば、Ｓ２３９ＤもしくはＳ２３９Ｅ）、および／またはＥＵ位置３３２（たとえば、Ｉ３３２ＤもしくはＩ３３２Ｑ）にアミノ酸置換基を備えてもよい。
【００９８】
ある実施形態では、本発明の結合ポリペプチドは、抗体の抗原独立エフェクタ機能、特に結合ポリペプチドの循環半減期、を変更するアミノ酸置換基を備えるＦｃ変異体を備えてもよい。そのような結合ポリペプチドは、これらの置換基を欠いている結合ポリペプチ
ドと比べて、ＦｃＲｎに対する増大したまたは低減した結合を呈し、したがって、それぞれ増大したまたは低減した血清半減期を有する。ＦｃＲｎに対する親和性が向上したＦｃ変異体は、より長い血清半減期を有すると予期され、そのような分子は、たとえば、慢性疾患または不調を治療するために、投与される抗体の長い半減期が望まれる、哺乳類を治療する方法で有用な適用例を有する。これに対して、ＦｃＲｎ結合親和性が低下したＦｃ変異体はより短い半減期を有すると予想され、そのような分子は、たとえばインビボ診断画像化、または開始抗体が長期間循環の中に存在すれば毒性の副作用を有する状況など、たとえば、短くされた循環時間が有利かもしれない哺乳類に対する投与にも有用である。ＦｃＲｎ結合親和性が低下したＦｃ変異体も、胎盤を横切りにくく、したがって妊娠中の女性の疾患または不調の治療に有用である。さらに、低下したＦｃＲｎ結合親和性が望ましいかもしれない他の適用例は、脳、腎臓、および／または肝臓の局所化が望まれるそれらの適用例を含む。１つの例示的な実施形態では、本発明の変更された結合ポリペプチド（たとえば、抗体またはその抗原結合フラグメント）は、脈管構造からの腎糸球体の上皮を横切る低減された輸送を呈する。別の実施形態では、本発明の変更された結合ポリペプチド（たとえば、抗体またはその抗原結合フラグメント）は、脳から血管空間の中へ血液脳関門（ＢＢＢ）を横切る低減された輸送を呈する。１つの実施形態では、ＦｃＲｎ結合が変更された抗体は、Ｆｃドメインの「ＦｃＲｎ結合ループ」内に１つ以上のアミノ酸置換基を有するＦｃドメインを備える。ＦｃＲｎ結合ループは、（ＥＵ番号付けに従う）アミノ酸残基２８０−２９９を備える。ＦｃＲｎ結合活性を変更した例示的なアミノ酸置換基は、本明細書中に引用により援用される国際ＰＣＴ刊行物ＷＯ０５／０４７３２７に開示されている。ある例示的な実施形態では、本発明の結合ポリペプチド（たとえば、抗体またはその抗原結合フラグメント）は、Ｖ２８４Ｅ、Ｈ２８５Ｅ、Ｎ２８６Ｄ、Ｋ２９０Ｅ、およびＳ３０４Ｄ（ＥＵ番号付け）の置換基のうち１つ以上を有するＦｃドメインを備える。
【００９９】
他の実施形態では、本明細書中に記載の診断および治療方法で用いるための結合ポリペプチドは、グリコシル化を低減するまたは排除するように変更される、たとえばＩｇＧ１またはＩｇＧ４重鎖定常領域などの定常領域を有する。たとえば、本発明の結合ポリペプチド（たとえば、抗体またはその抗原結合フラグメント）は、抗体Ｆｃのグリコシル化を変更するアミノ酸置換基を備えるＦｃ変異体も備えてもよい。たとえば、当該Ｆｃ変異体は、低減されたグリコシル化（たとえば、Ｎ−またはＯ−結合グリコシル化）を有してもよい。例示的な実施形態では、Ｆｃ変異体は、通常はアミノ酸位置２９７（ＥＵ番号付け）に見出されるＮ結合多糖の低減されたグリコシル化を備える。別の実施形態では、抗体は、たとえば、アミノ酸配列ＮＸＴまたはＮＸＳを含有するＮ−結合グリコシル化モチーフなどのグリコシル化モチーフの近くにまたはその中にアミノ酸置換基を有する。特定の実施形態では、抗体は、アミノ酸位置２２８または２９９（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換基を有するＦｃ変異体を備える。より特定的な実施形態では、抗体は、Ｓ２２８ＰおよびＴ２９９Ａ突然変異（ＥＵ番号付）を備えるＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域を備える。
【０１００】
低減されたまたは変更されたグリコシル化を与える例示的なアミノ酸置換基は、本明細書中に引用により援用される国際ＰＣＴ刊行物ＷＯ０５／０１８５７２に開示される。好ましい実施形態では、本発明の抗体またはそのフラグメントは、グリコシル化を排除するように修飾される。そのような抗体またはそのフラグメントは、「アグリー（agly）」抗体またはそのフラグメントと称されることがある（たとえば、「アグリー」抗体）。理論によって拘束されないが、「アグリー」抗体またはそのフラグメントは、インビボで向上した安全性および安定性プロファイルを有し得ると考えられる。例示的なアグリー抗体またはそのフラグメントはＦｃエフェクタ機能を欠き、それにより、ＰＤＧＦＲβを発現する正常な生命維持に必要な臓器に対するＦｃ媒介毒性に対する潜在性を排除する、ＩｇＧ４抗体のアグリコシル化Ｆｃ領域を備える。また他の実施形態では、本発明の抗体または
そのフラグメントは変更された多糖を備える。たとえば、抗体は、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７に、Ｎ多糖上の低減された数のフコース残基を有し得る、すなわち、これはアフコシル化される。別の実施形態では、抗体は、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７に、Ｎ多糖上の変更された数のシアル酸残基を有してもよい。
【０１０１】
iii）  共有結合（Attachment)
本発明の結合ポリペプチドは、たとえば、結合ポリペプチドがその同源のエピトープに特異的に結合するのを共有結合が妨げないような結合ポリペプチドへの分子の共有結合によって修飾されてもよい。たとえば、しかし限定のためではなく、本発明の抗体またはそのフラグメントは、細胞リガンドまたは他のタンパク質などへの公知の保護基／ブロック基、タンパク質分解切断、結合によるグリコシル化、アセチル化、ベグ化、リン酸化、アミド化、誘導によって修飾されてもよい。特異的化学分解、アセチル化、ホルミル化などを含むがそれらに限定されない公知の技術によって、数多くの化学的修飾のうち任意のものを行ってもよい。加えて、誘導体は、１つ以上の古典的なアミノ酸を含有してもよい。
【０１０２】
本発明の結合ポリペプチド（たとえば、抗体またはそのフラグメント）はさらに、ＮもしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え融合されるか、またはポリペプチドもしくは他の組成に化学的に共役（共有および非共有共役を含む）されてもよい。たとえば、抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子、および異種ポリペプチド、薬剤、放射性核種、または毒素などのエフェクタ分子に組換え融合または共役されてもよい。たとえば、ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；およびＥＰ３９６，３８７を参照。
【０１０３】
結合ポリペプチドは、インビボでの半減期を増大させるため、または当該技術分野で公知の方法を用いた免疫学的測定で用いるために、異種ポリペプチドに融合されてもよい。たとえば、１つの実施形態では、ＰＥＧを本発明の結合ポリペプチドに共役して、インビボでのそれらの半減期を増大させることができる。Leong, S. R., et al., Cytokine 16:
106 (2001); Adv. in Drug Deliv. Rev. 54: 531 (2002);またはWeir et al., Biochem.
Soc. Transactions 30: 512 (2002)。
【０１０４】
さらに、本発明の結合ポリペプチドを、それらの精製または検出を容易にするペプチドなどのマーカ配列に融合することができる。好ましい実施形態では、マーカアミノ酸配列は、ｐＱＥベクター（QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311）
の中に与えられるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドであり、とりわけ、それらの多くは市販されている。Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989)に
記載のように、たとえば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の好都合な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質（Wilson
et al., Cell 37: 767 (1984)）に由来するエピトープに対応する「ＨＡ」タグおよび「フラグ」タグを含むが、これらに限定されない。
【０１０５】
本発明の結合ポリペプチドは非共役形態で用いられてもよく、またはさまざまな分子のうち少なくとも１つと共役されて、たとえば、標的検出を容易にするためもしくは患者の画像化もしくはその療法のために分子の治療性を向上させてもよい。本発明の結合ポリペプチドは、精製が行なわれる場合は、精製の前または後のいずれかに標識されるまたは共役されることができる。特に、本発明の結合ポリペプチドは、治療薬、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答調節物質、医薬品、またはＰＥＧに共役されてもよい。
【０１０６】
本発明は、診断剤または治療剤に共役される本発明の結合ポリペプチドをさらに包含する。結合ポリペプチドを診断的に用いて、たとえば、臨床試験手順の一部として免疫細胞
障害（たとえばＣＬＬ）の発症または進行をモニタして、たとえば与えられる治療および／または予防計画の効能を判断することができる。検出は、結合ポリペプチドを検出可能な物質に結合することによって容易化可能である。検出可能な物質の例は、さまざまな酵素、補欠分子族、蛍光材料、ルミネセンス材料、生物発光材料、放射性材料、さまざまな陽電子放出断層撮影を用いる陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンを含む。本発明に従う診断として用いるための抗体に共役することができる金属イオンについては、たとえば米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。好適な酵素の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、．ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含む。好適な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含む。好適な蛍光材料の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンを含む。ルミネセンス材料の例はルミノールを含む。生物発光材料の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンを含む。好適な放射性材料の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、または９９Ｔｃを含む。
【０１０７】
本明細書中に開示される診断および治療方法で用いるための結合ポリペプチドは、（放射性同位元素、細胞毒性薬剤、または毒素などの）細胞毒、治療剤、細胞増殖抑制製剤、生体毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答調節物質、医薬品、免疫活性リガンド（たとえば、リンホカイン、もしくは結果的に得られる分子が新生細胞およびＴ細胞などのエフェクタ細胞の両方に結合する他の抗体）、またはＰＥＧに共役されてもよい。
【０１０８】
別の実施形態では、本明細書中に開示される診断および治療方法で用いるための抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、腫瘍細胞成長を低下させる分子に共役されることができる。他の実施形態では、開示される組成物は、薬剤もしくはプロドラッグに結合される抗体またはそのフラグメントを備えてもよい。本発明のまた他の実施形態は、リシン、ゲロニン、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素などの、特異的生体毒素または細胞毒性フラグメントに共役される抗体またはそのフラグメントの使用を備える。どの共役されたまたは共役されていない抗体を用いるかの選択は、癌の種類および段階、補助治療（たとえば、化学療法もしくは体外放射線）の使用、および患者の状態に依存する。当業者ならば、本明細書中の教示に鑑みてそのような選択を容易に行なうことができることが認められる。
【０１０９】
以前の研究では、同位元素で標識付けされる抗腫瘍抗体を、動物モデルで、および場合によってはヒトで、腫瘍細胞を破壊するのに成功裏に用いたことが認められる。例示的な放射性同位元素は、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、および１８８Ｒｅを含む。放射性核種は、核ＤＮＡ中の複数の鎖切断を生じさせて細胞死をもたらすイオン化放射を発することによって作用する。治療用のコンジュゲートを産生するのに用いられる同位元素は典型的に、経路長が短い高エネルギアルファ−またはベータ−粒子を発生させる。そのような放射性核種は、それらが非常に近接している細胞、たとえばコンジュゲートが付着したまたはその中に入った新生細胞を殺してしまう。それらは非局所化細胞に対してはほとんどまたは全く影響を有しない。放射性核種は本質的に非免疫原性である。
【０１１０】
ＩＶ．結合ポリペプチドの発現
上述のような本発明の結合ポリペプチドを与える単離された遺伝子材料の操作に従って、遺伝子は典型的に、所望の量の請求される抗体またはそのフラグメントを産生するように用いられてもよい宿主細胞への導入のために発現ベクター中に挿入される。
【０１１１】
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、本明細書中では、細胞中への導入および所望の遺伝子の細胞中での発現のためのビヒクルとして本発明に従って用いられるベクターを意味するという、明細書および請求項の目的のために用いられる。当業者には公知のように、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、およびレトロウイルスからなる群から容易に選択されてもよい。一般的に、本発明と整合するベクターは、選択マーカ、所望の遺伝子のクローニングを容易にする適切な制限部位、ならびに真核細胞または原核細胞の中に入るおよび／またはそれらを複製する能力を備える。
【０１１２】
この発明の目的のために数多くの発現ベクター系を用いてもよい。たとえば、ベクターの１つのクラスは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、もしくはＭＯＭＬＶ）、またはＳＶ４０ウイルスなどの動物ウイルスに由来するＤＮＡ要素を利用する。他のものは、内部リボソーム結合部位を有する多シストロン系の使用に係る。加えて、ＤＮＡをそれらの染色体に統合した細胞は、移入された宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカを導入することによって選択されてもよい。マーカは、栄養要求性宿主への原栄養性、殺生物剤に対する耐性（たとえば抗生物質）、または銅などの重金属に対する耐性を与えてもよい。選択可能なマーカ遺伝子は、発現されるべきＤＮＡ配列に直接に結合されるか、または同時形質転換によって同じ細胞の中に導入されるかのいずれかであり得る。ｍＲＮＡの最適な合成のためには、付加的な要素も必要かもしれない。これらの要素は、シグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモータ、エンハンサ、および終端シグナルを含み得る。特に好ましい実施形態では、クローニングされた可変領域遺伝子は、以上で論じたように、合成の重鎖および軽鎖定常領域遺伝子（好ましくはヒト）とともに発現ベクターの中に挿入される。
【０１１３】
他の好ましい実施形態では、本発明の結合ポリペプチドまたはそのフラグメントは、多シストロン構成を用いて発現されてもよい。そのような発現系では、抗体の重鎖および軽鎖などの対象の複数の遺伝子産物が単一の多シストロン構成から産生されてもよい。これらの系は有利には、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を用いて、真核宿主細胞の中で比較的高レベルの本発明のポリペプチドを与える。整合するＩＲＥＳ配列は、本明細書中に援用される米国特許第６，１９３，９８０号に開示される。当業者は、そのような発現系を用いて、本願に開示されるポリペプチドの全範囲を効果的に産生してもよいことを認めるであろう。
【０１１４】
より一般的には、抗体またはそのフラグメントをエンコードするベクターまたはＤＮＡ配列が一旦調製されると、発現ベクターが適切な宿主細胞の中に導入されてもよい。すなわち、宿主細胞が変換されてもよい。宿主細胞の中へのプラスミドの導入は、当業者に周知のさまざまな技術によって達成可能である。これらは、（電気泳動および電気穿孔法を含む）移入、原形質融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープで包まれたＤＮＡとの細胞融合、顕微注射、および無傷のウイルスによる感染を含むが、それらに限定されない。Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988)を参照のこと
。最も好ましくは、宿主の中へのプラスミド導入は電気穿孔法を介してである。変換された細胞は、軽鎖および重鎖の産生に適切な条件下で成長され、重鎖および／または軽鎖タンパク質合成についてアッセイされる。例示的なアッセイ技術は、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、または蛍光活性化細胞選別分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などを含む。
【０１１５】
本明細書中で用いらように、「変換」という用語は、遺伝子型を変えて、結果的に受容細胞を変える受容宿主細胞へのＤＮＡの導入を指すように、広い意味で用いられる。
【０１１６】
同じように、「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をエンコードするベクターで変換された細胞を指す。組換え宿主からのポリペプチドの単離のためのプロセスの記載において、「細胞」および「細胞培養物」という用語は、明確にそうでないと記されなければ、抗体の源を示すように交換可能に用いられる。換言すると、「細胞」からのポリペプチドの回収は、スピンダウンされた全細胞から、または媒質および懸濁細胞の両者を含有する細胞培養物から、のいずれかを意味し得る。
【０１１７】
１つの実施形態では、抗体発現に用いられる宿主細胞系は哺乳類由来である。当業者は、その中に発現されるべき所望の遺伝子産物に最も適した特定の宿主細胞系を決めることができる。例示的な宿主細胞系は、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０  Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、２９３（ヒト腎臓）を含むが、これらに限定されない。１つの実施形態では、細胞系は、それから発現される抗体の変更されたグリコシル化、たとえばアフコシル化を提供する（たとえば、ＰＥＲ．Ｃ６．ＲＴＭ．(Crucell)、またはＦＵＴ８−ノックアウト
ＣＨＯ細胞系(Potelligent.RTM. Cells)(Biowa, Princeton, N.J.)）。１つの実施形態では、ＮＳ０細胞を用いてもよい。ＣＨＯ細胞が特に好ましい。宿主細胞系は典型的に、商業サービス、すなわちthe American Tissue Culture Collectionから、または公開された文献から入手可能である。
【０１１８】
インビトロ産生は、大量の所望のポリペプチドを与える規模拡大を可能にする。組織培養条件下での哺乳類細胞培養のための技術は当該技術分野で公知であり、たとえば、エアリフト反応器もしくは連続撹拌反応器などの均質懸濁培養物、または中空ファイバ、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジ上などの固定されたもしくは捕らえられた細胞培養物を含む。必要に応じておよび／または所望により、ポリペプチドの溶液を、たとえばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、ＤＥＡＥセルロース上クロマトグラフィ、および／または（免疫）アフィニティクロマトグラフィなどの通常のクロマトグラフィ法によって精製可能である。
【０１１９】
本発明の結合ポリペプチドまたはそのフラグメントをエンコードする遺伝子も、細菌または酵母または植物細胞などの非哺乳類細胞において発現可能である。この点において、細菌などの、培養または発酵の中で成長可能なさまざまな単細胞非哺乳類微生物も変換可能であることが認められる。変換しやすい細菌は、大腸菌またはサルモネラ菌の株などの腸内細菌科、枯草菌などの細菌科、肺炎双球菌、連鎖球菌、およびヘモフィルスインフルエンゼのメンバーを含む。細菌の中で発現されると、ポリペプチドは封入体の一部となることができることがさらに認められる。ポリペプチドは、単離され、精製され、次に機能分子の中にアセンブルされなければならない。
【０１２０】
原核生物に加えて、真核微生物も用いてもよい。出芽酵母または一般的なパン酵母は、真核微生物の中でも最も一般的に用いられる。尤も、多数の他の株が一般的に利用可能である。サッカロマイセスにおける発現のために、たとえば、プラスミドＹＲｐ７（Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10: 157 (1980)）を一般的に用いる。このプラスミドは、既に、た
とえばＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ４４０７６またはＰＥＰ４−１（Jones, Genetics, 85: 12 (1977)）などのトリプトファン中で成長する能力を欠いている酵母の変異株のための選択マーカを与えるＴＲＰ１遺伝子を含有している。次に酵母宿主細胞ゲノムの特性としてのｔｒｐｌ傷害の存在は、トリプトファンの不在下での成長による変換を検出するための効果的な環境を与える。
【０１２１】
Ｖ．薬剤処方および結合ポリペプチドの投与の方法
別の局面では、本発明は、抗ＰＤＧＦＲβ抗体またはそのフラグメントを備える医薬組成物を提供する。
【０１２２】
本発明の抗体またはそのフラグメントを調製して対象に投与する方法は、当業者に周知である、または当業者によって容易に定められる。本発明の抗体またはそのフラグメントの投与の経路は、経口、非経口、吸入による、または局所的であり得る。本明細書中で用いるように、非経口という用語は、静脈内、動脈内、腸膜内、筋肉内、皮下、直腸、または膣内投与を含む。非経口投与の静脈内、動脈内、皮下、および筋肉内形態が一般的に好ましい。投与のこれらすべての形態は発明の範囲内にあるとして明確に企図されるが、投与の形態は、注射、特に静脈内もしくは動脈内注射、または点滴のための溶液であろう。通常は、注射に好適な医薬組成物は、緩衝液（たとえば、酢酸、リン酸、またはクエン酸塩緩衝液）、界面活性剤（たとえばポリソルベート）、オプションで安定剤（たとえばヒトアルブミン）などを備えてもよい。しかしながら、本明細書中の教示と整合する他の方法では、ポリペプチドを有害な細胞集団の部位に直接に送達して、それにより治療剤に対する疾患組織の露出を増大させることができる。
【０１２３】
非経口投与のための調製物は、滅菌水溶液もしくは非水溶液、懸濁液、および乳剤を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能有機エステルである。水性のキャリアは、塩水および緩衝された媒質を含む水、アルコール溶液／水溶液、乳剤、または懸濁液を含む。本発明では、医薬的に許容可能なキャリアは、０．０１−０．１Ｍおよび好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液、または０．８％塩水を含むが、これらに限定されない。他の一般的な非経口ビヒクルは、リン酸ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー油、または固定油を含む。静脈内ビヒクルは、流体および栄養分補充液、リンガーデキストロース系などの電解質補充液などを含む。たとえば、抗菌薬、酸化防止剤、キレート剤、および不活性ガスなどの保存料および他の添加剤も存在してもよい。より特定的には、注射可能な使用に好適な医薬組成物は、（水溶性の場合は）滅菌水溶液、または分散液、および滅菌注射可能溶液もしくは分散液の即座の調製のための滅菌粉末を含む。そのような場合、組成物は無菌でなければならず、容易なシリンジ操作性が存在する程度に流動的であるべきである。それは製造および保存の条件下で安定しているべきであり、好ましくは、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存される。キャリアは、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにその好適な混合物を含有する溶媒または分散媒質であり得る。たとえば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合は、要件とされる粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の防止は、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどのさまざまな抗菌および抗真菌剤によって達成可能である。多くの場合、組成物中に、たとえば、糖、マンニトールなどの多価アルコール、ソルビトール、または塩化ナトリウムなどの等浸透圧剤を含むことが好ましい。長期にわたる注射可能組成物の吸収は、組成物中に、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる剤を含むことによってもたらすことができる。
【０１２４】
いずれの場合も、滅菌注射可能溶液は、必要に応じて、本明細書中で列挙される成分のうち１つまたはその組合せを有する適切な溶媒の中に必要な量の活性化合物を（たとえば、抗体単独で、または抗体を他の活性剤と組合せて）組入れて、濾過滅菌をその後で行なうことによって調製することができる。一般的に、分散液は、塩基性分散媒質および以上列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルの中に活性化合物を組入れる
ことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これは、活性成分の粉末プラス、当該先に滅菌濾過された溶液からの任意の付加的な所望の成分を生じる。注射のための調製物は処理され、アンプル、袋、瓶、シリンジ、またはガラス瓶などの容器の中に入れられ、当該技術分野で公知の方法に従って無菌条件下で封止される。さらに、調製物は、各々が本明細書中に引用により援用される同時係属中の米国連続番号第０９／２５９，３３７号および米国連続番号第０９／２５９，３３８号に記載のものなどのキットの形態でパッケージ化されて販売されてもよい。そのような製造物品は好ましくは自己免疫疾患または腫瘍性疾患を患っている対象またはそれらに罹りやすい対象を治療するのに、関連付けられる組成物が有用であることを示す標識またはパッケージ挿入物を有する。
【０１２５】
上述の状態の治療のための本発明の安定化された抗体またはそのフラグメントの有効な用量は、投与の手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるかまたは動物であるか、投与されている他の医薬、および治療が予防的であるかまたは療法的であるかを含む、多数の異なる要因に依存して異なる。通常、患者はヒトであるが、遺伝形質転換哺乳類を含む非ヒト哺乳類も治療可能である。治療投薬量は、安全性および効能を最適化するように、当業者に公知の慣用的方法を用いて滴定されてもよい。
【０１２６】
本発明の抗体を用いた受動的免疫のために、投薬量は、たとえば、宿主の体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、およびより通常は０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（たとえば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇなど）の範囲にわたってもよい。たとえば、投薬量は、１ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重、または１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。上記範囲中の中間の用量も本発明の範囲内にあると意図される。
【０１２７】
対象は、そのような用量を、毎日、１日置き、週に１回、または経験的分析によって定められる任意の他のスケジュールに従って投与され得る。例示的な治療は、たとえば、少なくとも６ヶ月の長きにわたり、複数の投薬量の投与を必要とする。付加的な例示的な治療計画は、２週間に１回、または１ヶ月に１回、または３ヶ月から６ヶ月に１回の投与を必要とする。例示的な投薬量スケジュールは、連日の１−１０ｍｇ／ｋｇもしくは１５ｍｇ／ｋｇ、１日置きの３０ｍｇ／ｋｇ、または週に１回の６０ｍｇ／ｋｇを含む。いくつかの方法では、結合特異性が異なる２つ以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、その場合、投与される各々の抗体の投薬量が示される範囲内に入ってもよい。
【０１２８】
本発明の抗体またはそのフラグメントは何度も投与可能である。単回投薬量間の間隔は、たとえば、毎日、週に１回、月に１回、または年に１回であり得る。間隔は、患者のポリペプチドまたは標的分子の血中濃度を測定することによって示されるように、不規則でもあり得る。いくつかの方法では、投薬量は、たとえば１−１０００ｕｇ／ｍｌまたは２５−３００ｕｇ／ｍｌなど、ある血漿抗体または毒素濃度を達成するように調整される。これに代えて、抗体またはそのフラグメントは徐放性処方として投与可能であり、その場合、頻度を低くした投与が必要である。投薬量および頻度は、患者中の抗体の半減期に依存して異なる。一般的に、ヒト化抗体は最も長い半減期を示し、その次にキメラ抗体および非ヒト抗体が続く。１つの実施形態では、本発明の抗体またはそのフラグメントは、共役されていない形態で投与することができる。別の実施形態では、本発明の抗体は、共役された形態で複数回投与することができる。また別の実施形態では、本発明の抗体またはそのフラグメントは、共役されていない形態で、次に共役された形態で投与され得、またはその逆に投与され得る。
【０１２９】
投与の投薬量および頻度は、治療が予防的であるかまたは療法的であるかに依存して異
なり得る。予防的適用例では、本抗体またはそのカクテルを含有する組成物は、既に疾患状態になっているわけではない患者に投与されて、患者の抵抗力を高める。そのような量は、「予防的に有効な用量」と規定される。この用途では、精密な量は、ここでも患者の健康状態および一般的な免疫性に依存するが、一般的には用量当たり０．１〜２５ｍｇ、特に用量当たり０．５〜２．５ｍｇの範囲にわたる。比較的低い投薬量は、長期間にわたって比較的頻繁でない間隔で投与される。患者によっては死ぬまで治療を受け続ける。
【０１３０】
療法的適用例では、時には、疾患の進行を遅らせるかまたは進行が終わるまで、および好ましくは患者が疾患の症状の部分的なまたは完全な軽減を示すまで、比較的短い間隔での比較的高い投薬量（たとえば、用量当たり抗体の約１〜４００ｍｇ／ｋｇ、放射性免疫複合体については５〜２５ｍｇの投薬量がより一般的に用いられ、細胞毒−薬剤共役分子については、より高用量が用いられる）が必要である。その後、患者に予防的計画を投与可能である。
【０１３１】
１つの実施形態では、対象は、（たとえばベクターに）本発明のポリペプチドをエンコードする核酸分子で治療されることができる。ポリペプチドをエンコードする核酸の用量は、患者当たり１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１ｕｇ〜１０ｍｇ、または３０−３００ｕｇ  ＤＮＡの範囲にわたる。感染ウイルスベクターの用量は、用量当たり１０−１００個またはそれ以上のビリオンと、さまざまである。
【０１３２】
治療剤は、予防的および／または療法的治療のための、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腸腔内、鼻腔内、または筋肉内手段によって投与可能である。本発明の抗体の投与のためには、筋肉内注射または静脈内注入が好ましい。いくつかの方法では、治療抗体またはそのフラグメントが頭蓋中に直接に注射される。いくつかの方法では、抗体またはそのフラグメントは、Medipad（登録商標）装置などの徐放性組成物また
は装置として投与される。
【０１３３】
本発明の剤は、オプションで、（たとえば予防的または療法的）治療が必要な不調または状態を治療するのに有効な他の剤と組合せて投与することができる。好ましい付加的な剤は、技術分野で認識され、特定の不調のために標準的に投与されるものである。
【０１３４】
本発明の９０Ｙ標識抗体の有効な単回治療投薬量（すなわち、療法的に有効な量）は、約５〜約７５ｍＣｉの間、より好ましくは約１０〜約４０ｍＣｉの間の範囲にわたる。１３１Ｉ標識抗体の有効な単回治療骨髄非破壊投薬量は、約５〜約７０ｍＣｉ、より好ましくは約５〜約４０ｍＣｉの範囲にわたる。（すなわち、自己骨髄移植を必要とし得る）１３１Ｉ標識抗体の有効単回治療破壊投薬量は、約３０〜約６００ｍＣｉの間、より好ましくは約５０〜約５００ｍＣｉ未満の範囲にわたる。キメラ修飾抗体と関連して、ネズミ抗体と比べてより長い循環半減期により、ヨウ素１３１標識キメラ抗体の有効単回治療骨髄非破壊投薬量は、約５〜約４０ｍＣｉの間、より好ましくは約３０ｍＣｉ未満の範囲にわたる。たとえば１１１Ｉｎ標識のための画像化基準は、典型的には約５ｍＣｉ未満である。
【０１３５】
１３１Ｉおよび．９０Ｙについてはかなり多くの臨床経験が得られたが、他の識別に用いる放射性同位元素が当該技術分野で公知であり、同様の目的のために用いられている。また他の放射線同位元素を画像化のために用いる。たとえば、本発明の範囲と整合する付加的な放射性同位元素は、１２３１、１２５１、３２Ｐ、５７Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、７７Ｂｒ、８１Ｒｂ、８１Ｋｒ、８７Ｓｒ、１１３Ｉｎ、１２７Ｃｓ、１２９Ｃｓ、１３２Ｉ、１９７Ｈｇ、２０３Ｐｂ、２０６Ｂｉ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、４７Ｓｃ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１５３Ｓｍ、１８８Ｒｅ、１９９Ａｕ、２２５Ａｃ、２１１Ａ  ２１３Ｂｉを含むが、これらに限定されない。この点において
、アルファ、ガンマ、およびベータ放射源はすべて本願と整合する。また、本開示に鑑みて、当業者ならば、不要な実験なしに、どの放射性核種が選択された治療過程と整合するかを容易に判断することができると思料される。この目的のため、既に臨床診断で用いられている付加的な放射性核種は、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、および１１１Ｉｎを含む。抗体も、目指す免疫療法での潜在的な使用のためのさまざまな放射性核種で標識される（Peirersz et al. Immunol. Cell Biol. 65: 111-125 (1987)）。これらの放射性核種は、より低程度で１８８Ｒｅおよび１８６Ｒｅならびに１９９Ａｕおよび６７Ｃｕを含む。米国特許第５，４６０，７８５号は、そのような放射性同位元素に関する付加的なデータを提供し、本明細書中に引用により援用される。
【０１３６】
先に論じたように、本発明の抗体またはそのフラグメントは、哺乳類の不調のインビボ治療のために医薬的に有効な量を投与可能である。この点において、開示される抗体またはそのフラグメントは、活性剤の投与を容易にし、その安定性を促進するように処方されることが認められる。好ましくは、本発明に従う医薬組成物は、生理食塩水、非毒性緩衝液、保存料などの医薬的に許容される非毒性滅菌キャリアを備える。本願の目的のため、治療剤に共役されるまたは共役されない医薬的に有効な量の本発明の抗体は、標的に対する効果的な結合を達成し、かつたとえば疾患もしくは不調の症状を軽減するため、または物質もしくは細胞を検出するためなどの利点を達成するのに十分な量を意味すると考えられる。腫瘍細胞の場合、ポリペプチドは好ましくは、新生細胞または免疫反応細胞に対する選択された免疫反応抗原と相互作用することができ、それらの細胞の死を増大させる。当然ながら、本発明の医薬組成物は、単回用量または複数回用量で投与されて医薬的に有効な量のポリペプチドを与えてもよい。
【０１３７】
本開示の範囲の流れに沿って、本発明の抗体は、療法的または予防的効果を生じさせるのに十分な量、前述の治療法に従ってヒトまたは他の動物に投与されてもよい。本発明のポリペプチドは、本発明の抗体を、公知の技術に従う従来の医薬的に許容されるキャリアまたは希釈液と組合せることによって調製される従来の投薬量形態で、そのようなヒトまたは他の動物に投与することができる。当業者には、医薬的に許容可能なキャリアまたは希釈液の形態または特性が、それが組合せられるべき活性成分の量、投与の経路、および他の周知の変数によって決まることが認識されるであろう。当業者はさらに、本発明に従うポリペプチドの１つ以上の種を備えるカクテルが特に有効であるとわかり得ることを認めるであろう。
【０１３８】
ＶＩ．ＰＤＧＦＲβ関連疾患または不調を治療する方法
本発明の結合ポリペプチドまたはそのフラグメントは、ＰＤＧＦＲβ活性に拮抗するのに有用である。したがって、別の局面では、本発明は、本発明の１つ以上の抗ＰＤＧＦＲβ抗体またはその抗原結合フラグメントを備える医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することによってＰＤＧＦＲβ関連の疾患または不調を治療するための方法を提供する。
【０１３９】
治療の対象となるＰＤＧＦＲβ関連の疾患または不調は、限定されることなく、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）；血管形成術後の冠動脈再狭窄、アテローム切除術、またはプラーク除去の他の侵襲性の方法、ならびに同じ手順後の腎動脈または末梢動脈再狭窄を含む再狭窄；成人型呼吸窮迫症候群と関連付けられる肺線維症、腎炎と関連付けられる腎線維症、川崎病と関連付けられる冠動脈狭窄、および高安病などの他の動脈炎（arteritide）と関連付けられる血管の狭まりなどの急性損傷の他の形態と関連付けられる脈管増殖現象および線維症；強皮症、筋線維症などの線維形成過程；ならびに癌（たとえば、腫瘍細胞増殖および新血管新生）を含む。
【０１４０】
当業者は、通常の実験により、ＰＤＧＦＲβ関連の疾患または不調を治療する目的のために、有効な非毒性量の抗体（または付加的な治療剤）が何であるのかを定めることができるであろう。たとえば、療法的に活性な量のポリペプチドは、対象の疾患の段階（たとえばステージＩ対ステージＩＶ）、年齢、性別、医学的合併症（たとえば、免疫反応抑制状態または疾患）、および体重、ならびに対象の中で所望の応答を引出す抗体の能力などの要因に応じて異なることがある。投薬量の計画は、最適な治療反応を与えるように調整されてもよい。たとえば、治療状況の緊急性によって示されるように、いくつかの分割用量を毎日投与してもよく、または比例して用量を減らしてもよい。しかしながら、一般的に、有効な投薬量は、１日当たり体重のキログラム当たり約０．０５〜１００ミリグラムの範囲、より好ましくは１日当たり体重キログラム当たり約０．５〜１０ミリグラムの範囲にあることが予想される。
【実施例】
【０１４１】
ＶＩＩ．実施例
本発明は、さらなる限定と解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに図示される。配列表、図、ならびにこの出願を通じて引用されるすべての文献、特許、および公開特許出願の内容が本明細書中に引用により明示的に援用される。
【０１４２】
実施例１．ヒトＰＤＧＦＲβに特異的に結合するＶＨドメインの単離
特異的にヒトＰＤＧＦＲβに結合するＶＨドメインは、その全体がここに引用により援用されるＷＯ２０１０／０１１９４４に記載のようなＤＮＡディスプレイを用いて選択された。具体的に、１０人の骨髄ドナーに由来するナイーブヒトＶＨドメインＤＮＡディスプレイライブラリがヒトＰＤＧＦＲβに対する６ラウンドの選択を受けた。選択されたバインダはクローニングされ、配列化された。このスクリーンから、ＶＨドメインクローンＡ４、Ｂ４、およびＧ２が選択された。そのアミノ酸配列を表３に記載する。
【０１４３】
実施例２．ＨＣＤＲ３シャッフリング
Ａ．ＶＨライブラリ構成
改良された結合特性を有するＶＨドメインのスクリーニングのため、（ＸＢ１５１１と指定される）クローンＡ４のＨＣＤＲ３配列がナイーブヒトＶＨライブラリにシャッフリングされ、これはさらに、ヒトＰＤＧＦＲβおよびマウスＰＤＧＦＲβへの結合のために選択された。具体的に、クローンＡ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のＨＣＤＲ３のためのＤＮＡ配列コーディングが合成され、フレームワーク特異的オリゴヌクレオチドを用いて骨髄Ｂ細胞およびＰＢＭＣから増幅されたナイーブヒトＶＨドメインのフレームワーク領域１−３を備えるライブラリの中にアセンブルされた。ヒトＶＨフレームワーク領域１−３は、５′ＶＨファミリー特異的および３′ジェネリックＦＲ３リバースプライマーを用いて増幅されて、ＶＨファミリーフレームワーク領域の別個のライブラリを作り出した。ＶＨファミリーフレームワークライブラリおよびＸＢ１５１１  ＨＣＤＲ３は、５’Ｔ７ＴＭＶおよび３’ＸＢ１５１１  ＦＲ３ＣＤＲ３ＦＲ４オリゴを用いたさらなるＰＣＲ増幅によってシャッフリングされた。これは、インビボ転写／翻訳のために、５’端においてＴ７ＴＭＶプロモータ配列も加えた。（翻訳後の精製のための）Ｃ末端Ｃμ３配列およびＦＬＡＧタグも、５’Ｔ７ＴＭＶプライマーとともに、それぞれＦＲ４  Ｃｕ３リバースおよびＹ１０９プライマーを用いてＰＣＲによって加えられた。ＨＣＤＲ３シャッフリングされたＶＨライブラリの調製のために用いられたオリゴヌクレオチドの核酸配列を表５に記載する。ＶＨライブラリ構成の概略を図１に記載する。
【０１４４】
【表５】
2019047807.tif 000013
【０１４５】
Ｂ．ライブラリスクリーニング
ＨＣＤＲ３シャッフリングされたＶＨドメインライブラリは次にｍＲＮＡライブラリに転写され、ＷＯ２０１０／０１１９４４に記載のようにｄｓＤＮＡディスプレイ技術を用いた選択を受けた。選択は、４ラウンドにわたる交互のラウンドでヒトＰＤＧＦＲβおよびマウスＰＤＧＦＲβを用いて行なわれた。速度論的に制御されたオンおよびオフレート選択が連続ラウンドで適用されて、選択の厳しさを増大させ、およびしたがってＰＤＧＦＲβについて高い親和性を有するＶＨドメインを選択した。具体的に、選択は以下のように行なわれた。ラウンド１（Ｒ１）は、１０ｎＭの固定されたヒトＰＤＧＦＲβを用い、Ｒ２は、固定された１００ｎＭのマウスＰＤＧＦＲβを用い、Ｒ３は、１０ｎＭの可溶性ヒトＰＤＧＦＲβを用い、２００ｎＭの固定されたヒトＰＤＧＦＲβと２４時間および１２０時間競合され、Ｒ４は、１０ｎＭのマウスＰＤＧＦＲβを用いた。Ｒ４結合プールは、ＤＮＡ配列化のためにサブクローニングされた。Ｒ４結合プールの配列の分析は、ＸＢ１５１１のＨＣＤＲ３がさまざまな異なるフレームワーク文脈の中に存在することを示した。分析された配列の組からは野生型親配列は得られなかった。選択されたＶＨドメインのアミノ酸配列を本明細書中では表３に記載する。
【０１４６】
Ｃ．選択されたＨＣＤＲ３シャッフリングされたＶＨドメインの結合特異性
以上選択されたＲ４結合プールは、35Ｓ  Ｍｅｔ標識インビトロ翻訳ライブラリを用いて、ヒトＰＤＧＦＲβおよびマウスＰＤＧＦＲβの両方への結合について評定された。具体的に、エポキシビーズ、１００ｎＭのヒトＩｇＧ、ヒトＰＤＧＦＲβ、およびマウスＰＤＧＦＲβに対するプールの結合が評定された。図２に示されるように、親ＸＢ１５１１
ＶＨドメインは、ヒトＰＤＧＦＲβに対する特異的結合を、またマウスＰＤＧＦＲβに対する検出不可能な結合を示した。フレームワークシャッフリングされた、予め選択されたライブラリは、ヒトＰＤＧＦＲβに対する弱い結合を示した。しかしながら、これに対し、Ｒ４フレームワークシャッフリングされたライブラリは、ヒトＰＤＧＦＲβおよびマ
ウスＰＤＧＦＲβの両方に対してかなりの結合を示した。
【０１４７】
実施例３．安定したＶＬ／ＶＨ対の同定
Ａ．ＶＬ  ＤＮＡライブラリの構成
ヒトＶＬライブラリ（ＶカッパおよびＶラムダ）は、ＲＴ−ＰＣＲによる若い健常ドナー（Allcells）のＢ細胞から構築された。ライブラリの多様性を確実にするため、３億個の骨髄一核性細胞および１億個の末梢血単核細胞が１０人のドナーから得て、ナイーブＶＨおよびＶＬライブラリ構築のために用いた。ライブラリ生成法の概略を図３に示す。
【０１４８】
ＶカッパおよびＶラムダ配列のｃＤＮＡ合成およびその後のＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーは、表４に記載のように設計された。具体的に、上流ＵＴＲ配列を有する各々のファミリーのＶκおよびＶλ  ＦＲ１領域から、複数のセンスプライマーが設計された。κおよびλ遺伝子増幅のためのアンチセンスプライマーは、同じＣκ２下流（ＪλＣκ２）を有するＣκ１（Ｃκ２）またはＪλに入れ子にされた定常領域から設計された。ＶκおよびＶλライブラリは、選択サイクルの間、ＰＣＲ増幅のための同じＣ末端配列を担持する。
【０１４９】
ｍＲＮＡは、キットが提供する実験計画案に従って、FastTrack ｍＲＮＡ調製キット（Invitrogen）を用いて個々のドナーから調製された。第１鎖ｃＤＮＡは、軽鎖カッパおよびラムダ定常領域（Ｃκ１およびＣλ１）に特異的なプライマーを用いて、単離されたｍＲＮＡから合成された。
【０１５０】
ＶカッパおよびＶラムダ配列のＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡを鋳型として用いて、Ｃκ２およびＶκファミリー特異的またはＪλＣλ２混合物、およびＶλファミリー特異的プライマーを用いて行なわれた。ＰＣＲは、１８−２０サイクルの間、個々のＶκおよびＶλファミリーならびに個々のドナーについて行なわれた。ゲル精製の後、最終的なＶκおよびＶλライブラリを生成するように、各々の異なる源からのＶκおよびＶλライブラリがプールされた。
【０１５１】
【表６−１】
2019047807.tif 000014
【０１５２】
【表６−２】
2019047807.tif 000015
【０１５３】
Ｂ．ｄｓＤＮＡディスプレイによるＶＬ融合ライブラリの生成
この実施例で述べる方法を用いて生成されたＶκおよびＶλ  ＤＮＡライブラリは、Ｔ７Megascriptキット（Invitrogen、Ｃａｔ＃ＡＭ１３３４）を用いてｍＲＮＡライブラリに転写された。ｍＲＮＡは、キットが提供する実験計画案に従って、RNeasy MinElute Cleanup Kit（Qiagen、Ｃａｔ＃７４２０４）を用いて精製された。合計６００ｐｍｏｌの
ＲＮＡ（３００ｐｍｏｌのＶκおよびＶλライブラリ）が、ＷＯ２０１０／０１１９４４に記載のようにｄｓＤＮＡディスプレイリンカーおよび成分と結合され、アセンブルされた。アセンブルされたＶＬライブラリは、各々のＶＬドメイン（表現型）が安定してそのコーディング配列（遺伝子型）に融合される融合ライブラリを作り出すためにインビトロ翻訳された。35Ｓ  Ｍｅｔを翻訳プロセスに組入れて、融合を放射性同位元素で識別した。次に、ライブラリはオリゴｄＴセルロースを用いて精製されて、後にフラグタグ精製を伴う逆転写、ＲＮアーゼＨ消化、第２鎖ＤＮＡ合成の標準的な分子生物学技術を用いてｄｓＤＮＡディスプレイライブラリに変換された。
【０１５４】
Ｃ．ＸＢ１５１１およびＸＢ２２０２  ＶＨドメインのためのＶＬ対の同定
ＸＢ１５１１  ＶＨドメインは、（翻訳反応への35Ｓ  Ｍｅｔの組入れにより）遊離タンパク質として翻訳され、ｃ末端フラグタグを通してアフィニティ精製された。ＸＢ１５１１  ＶＨドメインおよび（以上のように調製された）精製されたＶＬドメイン融合ライブラリは次に等モル比で混合され、２５Ｃで１晩インキュベーションされて、それらの疎水性パッチを通してＶＨおよびＶＬ融合ドメインのインビトロ会合を可能にした。次に混合物は、エポキシ４５０ビーズ上または溶液の中で予め固定され、かつタンパク質Ａビーズによって捕らえられたＰＤＧＦＲβ標的と接するようにされた。固定されたＰＤＧＦＲβ標的に結合した複合体は０．１ＮのＫＯＨで洗浄され、溶出された。ＰＣＲは、ＶＬ特異的プライマーセットを用いて行なわれて、両者ともＶＨ−ＶＬ対としておよび不対ＶＬドメインとしてＰＤＧＦＲβ標的に結合したＶＬを回収した。ＶＬペアリングは、初めの２ラウンドについては厳しさを低くして（１００ｎＭのＰＤＧＦＲβ）、３ラウンド目については厳しさを高くして（１０ｎＭのＰＤＧＦＲβ）、３ラウンド行なった。ＸＢ２２０２  ＶＨドメインも、２ラウンド同様にＶＬライブラリとペアリングされた。ＸＢ２２０２／ＶＬペアリングおよび選択の各ラウンド毎に、厳しさは、速度論的に制御されたオンおよびオフレート戦略によって増大されて、安定してＸＢ２２０２  ＶＨドメインとペアリングされたＶＬドメインを同定してＶＨ結合を向上させた。
【０１５５】
以上同定されたＶＬドメインプールは次に、Blunt Zero TOPOベクター（Invitrogen）
にクローニングされ、結果的に得られる細菌コロニーから、ＶＬエンコーディングＤＮＡ配列が、Ｍ１３フォワードおよびリバースプライマーを用いてＰＣＲによって増幅された。個々の増幅されたＶＬエンコーディングＤＮＡ配列を次に配列化した。ＶＬプールから得られた配列データは、ＶＬの多様なレパートリがプロセスを通して濃縮されることを示した。複数のファミリーおよびフレームワークがプールの中に存在した。いくつかのＶＬは複製またはファミリーとして存在した。区別されるＶＬファミリーを同定することがで
き、いくつかのＶＬは何度も存在した。ＰＤＧＦＲβ結合ＶＨドメインＸＢ１５１１およびＸＢ２２０２と対になる、本発明の方法を用いて同定された例示的なＶＬ配列を本明細書中の表４に記載する。
【０１５６】
Ｄ．同定されたＶＨおよびＶＬ対の評価
同定されたＶＨ−ＶＬ対の特性を評価するため、各々のプールからの１０−１２個のｓｃＦｖが、インビトロ翻訳によってまたは大腸菌発現によって構築され、産生され、その後アフィニティ精製された。
【０１５７】
ＰＤＧＦＲβ結合ＥＬＩＳＡアッセイが行なわれて、固定されたＰＤＧＦＲβに対するｓｃＦｖの結合を評定し、ＥＣ５０を判断した。具体的に、ＰＢＳ中の２ｕｇ／ｍＬのヒトＰＤＧＦＲβおよびヒトＦｃまたはＩｇＧが４℃で１晩Maxisorpプレート上に固定された。次にプレートは洗浄され、スーパーブロックで阻害された。インビトロ翻訳ｓｃＦｖ粗溶解物は、１Ｘ  ＰＢＳＴ中に１：３希釈された。１００ｕｌの希釈されたｓｃＦｖ溶解物がMaxisorpプレートの各々のウェルの中に入れられ、室温で１時間インキュベーションされた。固定されたＰＤＧＦＲβに結合したｓｃＦｖは、１：５０００希釈のアンチフラグ抗体−ＨＲＰおよびＴＭＢ基質によって検出された。プレートは、ＯＤ４５０ｎｍでエンドポイントアッセイを用いてMolecular Deviceプレートリーダ上で読取られた。図４、図５、および図６に示されるように、ＥＬＩＳＡ結合アッセイでは、ＸＢ１５１１およびＸＢ２２０２について生成されたｓｃＦｖの５０％より多くがＰＤＧＦＲβに対する特異的結合を示した。これに対し、不対ＶＬ単独では、ＰＤＧＦＲβに対する結合を示さなかった（図７を参照）。
【０１５８】
いくつかのｓｃＦｖの親和性は、溶液系平衡結合アッセイによって定められた。具体的に、１２０ｐｍｏｌのｓｃＦｖ  ＲＮＡは、35Ｓ  Ｍｅｔを組入れた遊離タンパク質に翻訳された。翻訳された反応混合物は、０．０２５％のトリトン、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、および０．１ｍｇ／ｍＬのｓｓｓＤＮＡを有する１ＸＰＢＳを含有する結合緩衝液の中で３倍希釈された。ヒトＰＤＧＦＲβは、１００ｎＭ〜０ｎＭへの最終濃度へ、同じ結合緩衝液中に希釈された。希釈されたｓｃＦｖ混合物は、Kingfisherプレート（Thermofisher
Scientific、９７００２０８４）上で、１００ｕｌの最終容積のｈＰＤＧＦＲβでイン
キュベーションされた。インキュベーションの後、２５ｕｌのタンパク質Ａ磁性ビーズ（Invitrogen）を用いて、溶液からＰＤＧＦＲβを捕らえた。捕らえられたＰＤＧＦＲβをkingfisherリーダ（Thermofisher Scientific）の中で洗浄し、溶出した。磁性ビーズ固
定ｈＰＤＧＦＲβに結合した（35Ｓ  Ｍｅｔで標識付けされた）ｓｃＦｖの量は、シンチレーションカウンタを用いて数えられ、Graph Pad Prism 5を用いてＫｄが算出された。
試験されたＸＢ１５１１由来ｓｃＦｖについては、ＸＢ１５１１  ＶＨ単独（図８）と比較して、２つのｓｃＦｖが、８−１０倍、より高いＫｄを示し、１つが、２．５倍、より高いＫｄを示し、４つが同様のＫｄを示した。１つのｓｃＦｖのみが、ＸＢ１５１１  ＶＨ単独よりも低いＫDを示した。図９に示されるように、ＸＢ２２０２  ＶＨ単独と比較
して、試験されたＸＢ２２０２由来ｓｃＦｖの両者ともが、約８−１０倍、より良好なＫｄを示した。
【０１５９】
実施例４．ヒトＰＤＧＦＲβおよびマウスＰＤＧＦＲβに対する抗ＰＤＧＦＲβ  ＶＨドメインの結合親和性
実施例２で選択されたＲ４フレームワークシャッフリングされたヒトＰＤＧＦＲβおよびマウスＰＤＧＦＲβ濃縮ＶＨドメインプールは、大腸菌発現ベクターにクローニングされ、産生され、かつ精製された。ヒトＰＤＧＦＲおよびマウスＰＤＧＦＲへのＶＨドメインの結合キネティクスは、BiacoreＴ１００での表面プラズモン共鳴を用いて測定された
。簡単に述べると、ヒトおよびマウスＰＤＧＦＲ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃキメラ融合タンパク質は、抗ｈＩｇＧ１  Ｆｃモノクローナル抗体に結合されたSeries CM5センサチップ（Ｃ
Ｍ５）を用いて別個に固定された。各サイクル毎に、ＰＤＧＦＲ融合タンパク質がまず捕らえられ、その後に、流量１００ｕＬ／分で１１５秒間、ＶＨを注射した（会合）。会合段階のすぐ後に、６００秒の解離段階がある。表面は、３ＭのＭｇＣｌ２（１０ｕＬ／分、６０秒）の単回注射で各サイクルに再生された。ＶＨドメインの複数の濃縮物が注射され（０．５５ｎＭ−４０ｎＭ）、結果的に得られたセンサグラムがＴ１００評価ソフトウェアで分析された。結合キネティクスは、１：１結合曲線当てはめを用いて測定された。ヒトＰＤＧＦＲβおよびマウスＰＤＧＦＲβに対するＶＨドメインクローンＸＢ２２０２およびＸＢ２７０８の結合キネティクスを、それぞれ図１０、図１１、および図１２に示す。これらの結果は、ＸＢ２２０２およびＸＢ２７０８が、親ＸＢ１５１１と比較して、５０−１５０倍の親和性向上を有することを示す。具体的に、ＸＢ２２０２およびＸＢ２７０８は、それぞれ２４９ｐＭおよび９３ｐＭのＫｄ、ならびにそれぞれ１．８６×１０-3および９．２６７×１０-4のオフレート（Ｋｏｆｆ）を有する。ＸＢ２２０２およびＸＢ２７０８の両者ともがヒトＰＤＧＦＲβおよびマウスＰＤＧＦＲβに結合した。それらは同じＨＣＤＲ３を共有したが、ＸＢ２２０２は、ＶＨ１ファミリー生殖細胞系配列に由来し、ＸＢ２７０８は、ＶＨ３ファミリー生殖細胞系配列に由来したことに特に注目すべきである。
【０１６０】
実施例５．ＰＤＧＦＲβに対するＰＤＧＦＢＢ結合の抑制
本明細書中に開示されるＸＢ２２０２  ＶＨドメインの、ヒトＰＤＦＧＲｂへのＰＤＧＦＢＢリガンドの結合に拮抗する能力は、BiacoreＴ１００での表面プラズモン共鳴を用
いて評定された。簡単に述べると、ヒトＰＤＧＦＲ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃキメラ融合タンパク質は、抗ｈＩｇＧ１  Ｆｃモノクローナル抗体と結合されたSeries CM5センサチップを用いて固定された。１０ｎＭのヒトＰＤＧＦＢＢは、予め捕らえられたヒトＰＤＧＦＲβに注射されて、ＶＨの不在下でＰＤＧＦＲβに対する１００％の結合応答ユニットを得た。各連続サイクル毎に、ＰＤＧＦＲ融合タンパク質がまず捕らえられ、次に、ＶＨドメインが次に１２０秒間注射された。未結合のＶＨドメインを洗浄した後、次に１０ｎＭのＰＤＧＦＢＢを１２０秒間注射した。表面は、３ＭのＭｇＣｌ２（１０ｕＬ／分、６０秒）の単回注射によって各サイクルに再生された。ＶＨの複数の濃縮物が注射され（０．４６ｎＭ−６０ｎＭ）、結果的に得られるセンサグラムがＴ１００評価ソフトウェアで分析され、ＰＤＧＦＢＢ結合抑制が算出された。図１３に示されるように、ＸＢ２２０２は、５ｎＭ未満のＩＣ５０でのヒトＰＤＦＧＲｂへのＰＤＧＦＢＢ結合を抑制する。
【０１６１】
実施例６．周細胞移動の抑制
本明細書中に開示されるＸＢ２７０８  ＶＨドメインの、インビトロＰＤＧＦＢＢ誘導周細胞移動に拮抗する能力が測定された。一次ヒト網膜周細胞がCell Systems Corporation（Kirkland、ＷＡ）から得られ、ＣＳＣ完全成長媒質を用いて、製造者の提案に従って培養された。ほぼ１２５個の細胞（２−５継代）がヒト血漿フィブロネクチン（ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ）でコーティングされ、０．１％のＢＳＡを含有する無血清媒質中のＢＳＡ（ＰＢＳ中の１％）で阻害された３８４ウェルＢＩＮＤ（著作権）バイオセンサプレートの各々のウェルに播種された。細胞は付着を許され、次に１晩血清飢餓とされた。血清飢餓の後に続いて、細胞は、組織培養インキュベータ中で、ヒトＰＤＧＦＲβ受容体に対するＶＨのさまざまな濃縮で１時間インキュベーションされた。移動は、無血清培質中５ｎｇ／ｍｌの最終濃度に対するＰＤＧＦ−ＢＢの添加によって、抗体の予めのインキュベーションの終わりに刺激された。ウェルの画像は、５％のＣＯ2および＞７５％の湿度で３
７℃で組織培養インキュベータ中で２０時間、１８分毎にＢＩＮＤ（著作権）スキャナを用いて取得された。集められたデータを、Matlabに基づく重心識別および追跡アルゴリズムを用いて分析して、１０時間と１６時間との間の細胞の速度を算出した。図１４に記載される結果は、ＸＢ２７０８が、０．５４ｎＭのＩＣ５０でＰＤＧＦ−ＢＢ誘導周細胞移動に拮抗することができることを示す。
【０１６２】
実施例７．異種四量体ＩｇＧへのＶＨ−ＶＬ対の変換および生物学的活性の実証
ＸＢ１５１１  ＶＨおよびＤ８  ＶＬは、２９３Ｔ細胞中の異種四量体ＩｇＧ中にともに発現された。細胞培養上澄みは４８時間および９６時間後に集められ、発現されたＩｇＧは、タンパク質Ａアガロースビーズを用いて精製された。ＩｇＧは、最適化を何ら行なわずに、８ｍｇ／Ｌで産生された。ＸＢ１５１１／Ｄ８  ＩｇＧの生物学的活性を評価するため、ＨＦＦ−１ヒト包皮線維芽が３８４ウェルＢＩＮＤバイオセンサに播種され、無血清培質中で１晩付着を許された。次に、繊維芽細胞は、５ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦＢＢリガンドで刺激され、１００ｎＭのＸＢ１５１１／Ｄ８  ＩｇＧの存在または不在下で、１８時間移動を許された。ＢＩＮＤスキャナ画像は１５分毎に捕捉され、ソフトウェア分析ツールを用いて個々の細胞移動応答の軌跡長さを測定した。軌跡長さは、青（移動なし）から赤（最大移動）への「ヒートマップ」によって表わされる。図１５に示されるように、ＸＢ１５１１／Ｄ８  ＩｇＧは、ヒト線維芽のＰＤＧＦ−ＢＢ誘導移動を完全に阻害することができた。
【０１６３】
実施例８．ｓｃＦｖ熱安定性
ＸＢ２２０２ＶＨおよびＸＢ２２０２／Ａ４  ｓｃＦｖの熱安定性を定めた。具体的に、１ｍｇ／ｍＬのＸＢ２２０２およびＸＢ２２０２−Ａ４が、１２時間、４℃、３７℃、６０℃、および７０℃でインキュベーションされ、インキュベーション後にＰＤＧＦＲβ結合ＥＬＩＳＡを行なってタンパク質の結合活性を試験した。図１６に示されるように、ＸＢ２２０２  ＶＨドメインは、６０℃でのインキュベーション後にかなりのＰＤＧＦＲβ結合活性を失い、７０℃でのインキュベーション後に結合活性を完全に失った。ＸＢ２２０２のＴｍは約６２℃であると測定された。これに対し、ＸＢ２２０２／Ａ４  ｓｃＦｖは、７０℃での１２時間のインキュベーション後に完全に活性であり、このことは、ＸＢ２２０２  ｓｃＦｖのＴｍが７０℃よりも高いことを示した。
【０１６４】
実施例９．ＩｇＧ１抗体の発現、精製、および濃縮
ＸＢ１５１１／Ｄ８およびＸＢ２２０２／Ａ４  ＶＨ／ＶＬ対は、２９３Ｔ細胞中の完全長異種四量体ＩｇＧ１抗体として別個に発現され、精製された。ＸＢ１５１１／Ｄ８およびＸＢ２２０２／Ａ４  ＩｇＧ１抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を本明細書中では表７に記載する。
【０１６５】
細胞培養上澄みは濾過によって得られ、発現された抗体は、二段階精製方式を用いて精製された。具体的に、ｐＨ３．５の抗体結合溶質でタンパク質Ａアフィニティ精製が行なわれた。タンパク質Ａ溶出液のｐＨは、１Ｍのトリスを用いてｐＨ７に調整され、HiTrap
Q XLカラム（GE Healthcare）を用いてイオン交換クロマトグラフィによってさらに精製された。精製された抗体は、ｐＨ７のＰＢＳ中に保存された。
【０１６６】
【表７】
2019047807.tif 000016
【０１６７】
各精製ステップ後の抗体発現レベルおよび抗体濃度は、抗体溶液のＡ280を測定するこ
とによって定められた。精製された抗体の純度および品質は、サイズ排除高性能液体クロマトグラフィ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）によって定められた。これらの実験の結果は、本明細書中では表８に記載されている。これらのデータは、ＸＢ１５１１／Ｄ８およびＸＢ２２０２／Ａ４  ＶＨ／ＶＬ対が完全長異種四量体ＩｇＧ１抗体としてフォーマットされた場合に、結果的に得られる抗体が、それらが高レベルで発現され、容易に高純度に精製され、凝集をほとんど呈しないという点で製造性が高いことを示す。
【０１６８】
【表８】
2019047807.tif 000017
【０１６９】
精製されたＸＢ１５１１／Ｄ８およびＸＢ２２０２／Ａ４  ＩｇＧ１抗体は、それらの濃縮能についてさらに分析された。具体的に、各々の抗体の溶液は、１０ｋＤａおよび３０ｋＤａカットオフリミットを有するセントリコン（登録商標）限外濾過スピンカラムを用いて５０ｍｇ／ｍｌに濃縮された。濃縮された溶液の完全性は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。この分析から、ＸＢ１５１１／Ｄ８  ＩｇＧ１の５０ｍｇ／ｍｌ溶液は約９６％の純度を有し、約２．４％の抗体凝集を含有する一方で、ＸＢ２２０２／Ａ４  ＩｇＧ１の５０ｍｇ／ｍｌ溶液は、約９７．８％の純度を有し、約２．２％の抗体凝集を含有すると判断された。これらのデータは、ＸＢ１５１１／Ｄ８およびＸＢ２２０２／Ａ４  ＩｇＧ１抗体が、濃縮された溶液中で高度に安定していることを実証する。
【０１７０】
実施例１０．ＸＢ１５１１／Ｄ８およびＸＢ２２０２／Ａ４  ＩｇＧ１抗体の熱安定性
ＸＢ１５１１／Ｄ８およびＸＢ２２０２／Ａ４  ＩｇＧ１抗体の熱安定性は、蛍光に基づくアッセイを用いて測定された。具体的に、５ｍｇ／ｍｌの精製されたＸＢ１５１１／Ｄ８  ＩｇＧ１、ＸＢ２２０２／Ａ４  ＩｇＧ１、またはヒトＩｇＧ１対照がサイプロ（登録商標）オレンジ染料（シグマ）と混合され、混合物の温度は、２５℃から９５℃へ１度の増分で上昇された。サイプロオレンジ染料は、温度が上昇してＩｇＧがアンフォールドすると、ＩｇＧの中に混ざる。ＩｇＧとのサイプロオレンジ染料の会合によって発生する蛍光シグナルは、BioRad CFX96器具を用いてモニタされた。このアッセイでは、サイプロオレンジシグナルの負の回帰を用いて、各々のタンパク質毎にピーク融点（すなわちＴm）を同定した。
【０１７１】
この分析から、ＸＢ１５１１／Ｄ８およびＸＢ２２０２／Ａ４はそれぞれ、６７℃〜７０℃の溶融温度（Ｔm）を有すると判断された。これは、７２℃のＴmを呈したヒトＩｇＧ１対照抗体に十分に匹敵した。このデータは、発明のＶＨおよびＶＨ／ＶＬ対が高度に熱安定性の完全長ＩｇＧ分子にフォーマットされ得ることを実証する。
【０１７２】
実施例１１．ヒトに対するＸＢ２２０２  ＶＨ、ｓｃＦｖ、およびＩｇＧ１抗体の結合親和性
ヒトＰＤＦＧＲに対するＸＢ２２０２  ＶＨドメイン、ＸＢ２２０２／Ａ４  ｓｃＦｖ、およびＸＢ２２０２／Ａ４  ＩｇＧ１の結合キネティクスは、BiacoreＴ１００での表
面プラズモン共鳴を用いて測定された。簡単に述べると、組換えヒトＰＤＧＦＲ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃキメラ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ、♯３８５−ＰＲ−１００／ＣＦ）は、（ＶＨおよびｓｃＦｖアッセイについては）抗ｈＩｇＧ１  Ｆｃモノクローナル抗体と、または（ＩｇＧアッセイについては）抗６Ｈｉｓ抗体と結合されたSeries CM5センサチップ上に固定された。ＸＢ２２０２  ＶＨドメイン、ＸＢ２２０２／Ａ４  ｓｃＦｖ、およびＸＢ２２０２／Ａ４  ＩｇＧ１が、異なる濃度（７５、５０、２５、１０、５、および１ｎＭ）で３分間、５０または１００ｕｌ／分で表面の上に流され、１０分間解離するようにされた。データは、１：１モデルを用いてBiacoreＴ１００分析ソフトウェアを用いて分析
された。正確な測定を可能にするように、大量輸送がチェックされ、回避された。すべてのデータは、Biacore標準実験計画案に従って、二重参照された。
【０１７３】
ヒトＰＤＧＦＲβに対するＸＢ２２０２  ＶＨドメイン、ＸＢ２２０２／Ａ４  ｓｃＦｖ、およびＸＢ２２０２／Ａ４  ＩｇＧ１抗体の結合キネティクスを、本明細書中では表９に示す。これらのデータは、ＸＢ２２０２  ＶＨドメイン、ＸＢ２２０２／Ａ４  ｓｃＦｖ、およびＸＢ２２０２／Ａ４  ＩｇＧ１が各々、ＰＤＧＦＲβについて高い結合親和性を有することを示す。不対ＸＢ２２０２  ＶＨドメイン単独（２．９５×１０-3ｓ-1）と比較して、ＸＢ２２０２／Ａ４  ｓｃＦｖおよびＸＢ２２０２／Ａ４  ＩｇＧ１は、向上したオフレート（それぞれ１．５４×１０-3ｓ-1および１．５６×１０-3ｓ-1）を呈することに特に留意すべきである。
【０１７４】
【表９】
2019047807.tif 000018
【０１７５】
実施例１２．インビボマウスモデルを用いた抗ＰＤＧＦＲβ抗体の機能的分析
本明細書中に開示される抗ＰＤＧＦＲβ抗体の、インビボでのＰＤＧＦ誘導血管新生を抑制する能力は、（その全体が本明細書に引用により援用される）Nobuo et al. Am. J. Path, (2006) 168(6), 2036-2052に記載の成長中の網膜血管系モデル、角膜新血管新生モデル、および／または脈絡膜の新血管新生モデルを用いて評価される。これらのアッセイでは、抗体は、ＶＨドメイン、ｓｃＦｖ、および／または完全長ＩｇＧとしてマウスに投与される。
【図１】
2019047807.tif 000019
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2019047807.tif 000029
【図１２】
2019047807.tif 000030
【図１３】
2019047807.tif 000031
【図１４】
2019047807.tif 000032
【図１５】
2019047807.tif 000033
【図１６】
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【配列表】
2019047807000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月18日(2018.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤＧＦＲβに特異的に結合する安定したＶＨ／ＶＬ対を備え、
ＶＨドメインは、ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ１のアミノ酸配列を備え、
（Ａ）ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のアミノ酸配列を備え、ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に記載のアミノ酸配列を備え、ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５に記載のアミノ酸配列を備える、もしくは、
（Ｂ）前記ＶＨドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２１−３２４及び３２６からなる群より選択されるアミノ酸配列を備える、又は、
（Ｃ）ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のアミノ酸配列を備え、ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５に記載のアミノ酸配列を備え、ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６に記載のアミノ酸配列を備える、もしくは、
（Ｄ）前記ＶＨドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４５及び３６０からなる群より選択されるアミノ酸配列を備え、
ＶＬドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６９−４５３からなる群より選択されるアミノ酸配列を備える、単離された結合ポリペプチド。
【請求項２】
ＰＤＧＦＲβの活性を抑制する、請求項１に記載の結合ポリペプチド。
【請求項３】
ＰＤＧＦＲβの活性を、ＰＤＧＦＲβへのＰＤＧＦ結合に拮抗することによって抑制する、請求項１に記載の結合ポリペプチド。
【請求項４】
ＰＤＧＦＲβの活性を、ＰＤＧＦＲβの二量化に拮抗することによって抑制する、請求項１に記載の結合ポリペプチド。
【請求項５】
２５０ｐＭ未満のＫｄでＰＤＧＦＲβに結合する、請求項１に記載の結合ポリペプチド。
【請求項６】
１００ｐＭ未満のＫｄでＰＤＧＦＲβに結合する、請求項１に記載の結合ポリペプチド。
【請求項７】
１０-3ｓ-1未満のオフレートでＰＤＧＦＲβに結合する、請求項１に記載の結合ポリペプチド。
【請求項８】
マウスＰＤＧＦＲβおよびヒトＰＤＧＦＲβに特異的に結合する、請求項１に記載の結合ポリペプチド。
【請求項９】
５ｎＭ未満のＩＣ５０で前記ＰＤＧＦＲβへのＰＤＧＦ結合に拮抗する、請求項１に記載の結合ポリペプチド。
【請求項１０】
４ｎＭ未満のＩＣ５０でＰＤＧＦＲβのリガンド誘導チロシンリン酸化を抑制する、請求項１に記載の結合ポリペプチド。
【請求項１１】
６ｎＭ未満のＩＣ５０で網膜周細胞移動を抑制する、請求項１に記載の結合ポリペプチド。
【請求項１２】
溶融温度（Ｔｍ）が少なくとも７０℃であるＶＨドメインを備える、請求項１に記載の結合ポリペプチド。
【請求項１３】
抗体である、請求項１に記載の結合ポリペプチド。
【請求項１４】
ｓｃＦｖである、請求項１に記載の結合ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１に記載の結合ポリペプチドをエンコードする、単離された核酸。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸を備える、組換え発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組換え発現ベクターを備える、宿主細胞。
【請求項１８】
ヒトＰＤＧＦＲβに特異的に結合する結合ポリペプチドを産生する方法であって、
ヒトＰＤＧＦＲβに特異的に結合する結合ポリペプチドが宿主細胞によって産生されるような条件下で請求項１７に記載の宿主細胞を培養することを備える、方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の結合ポリペプチドと、１つ以上の医薬的に許容可能なキャリアとを備える、医薬組成物。
【請求項２０】
ＰＤＧＦＲβ関連疾患または不調を治療するために使用される、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記ＰＤＧＦＲβ関連疾患または不調は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）または癌である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
安定したＶＨ／ＶＬ対の多様性のライブラリであって、
前記ライブラリの各々のメンバーはヒトＰＤＧＦＲβに結合し、ＣＤＲ３、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ１を備えるＶＨドメインを備え、
（Ａ）ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のアミノ酸配列を備え、ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に記載のアミノ酸配列を備え、ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５に記載のアミノ酸配列を備える、もしくは、
（Ｂ）前記ＶＨドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２１−３２４及び３２６からなる群より選択されるアミノ酸配列を備える、又は、
（Ｃ）ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のアミノ酸配列を備え、ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５に記載のアミノ酸配列を備え、ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６に記載のアミノ酸配列を備える、もしくは、
（Ｄ）前記ＶＨドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４５及び３６０からなる群より選択されるアミノ酸配列を備え、
ＶＬドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６９−４５３からなる群より選択されるアミノ酸配列を備える、ライブラリ。
【請求項２３】
前記ライブラリは核酸ディスプレイライブラリである、請求項２２に記載のライブラリ。
【請求項２４】
前記核酸ディスプレイライブラリはＤＮＡディスプレイライブラリである、請求項２３に記載のライブラリ。
【外国語明細書】
2019047807000001.pdf