(57)【要約】【課題】ポックスウイルスの効率的で安全な製造方法を提供する。【解決手段】ポックスウイルスの製造方法であって、培養細胞にヘルパーウイルスとして増殖性のヘルパーワクシニアウイルスを感染させ培養する工程と、前記培養細胞に目的ウイルスＤＮＡをトランスフェクションし培養する工程と、前記培養細胞から目的ウイルスを回収する工程と、を有する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポックスウイルスの製造方法であって、
（１）培養細胞にヘルパーウイルスとして増殖性のヘルパーワクシニアウイルスを感染させ培養する工程と、
（２）培養細胞に目的ウイルスＤＮＡをトランスフェクションし培養する工程と、
（３）前記培養細胞から目的ウイルスを回収する工程と、
を含み、前記工程（１）と工程（２）とはいずれかの工程の後に他の工程を行う、
方法。
【請求項２】
前記ヘルパーワクシニアウイルスとして安全性の高いワクシニアウイルスが使用されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記安全性の高いワクシニアウイルスは、ワクチン株又はワクチン株に由来することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記安全性の高いワクシニアウイルスは、New York City Board of Health (NYCBH)株、EM-63株、Lister株、Paris株、Copenhagen株、Bern株、Ankara株、Temple of Heaven株、Vaccinia Tian Tan株、Dairen株、ACAM2000株、LC16m8株、Modified Vaccinia Ankara (MVA)株、Dairen I (DIs)株又はLC16mO株のいずれかである、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記ワクチン株が、LC16m8であることを特徴とする、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記ヘルパーウイルスが、蛍光タンパク質を発現することを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
蛍光タンパク質がＧＦＰであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記安全性の高いワクシニアウイルスは、野生型ワクシニアウイルスと比較して、Ｂ５Ｒ遺伝子の機能を欠損する改変が加えられていることを特徴とする、請求項２から請求項７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ヘルパーワクシニアウイルスとして、正常細胞での増殖性を抑制し、腫瘍細胞では増殖可能となるような改変が加えられたヘルパーワクシニアウイルスを使用する、請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヘルパーワクシニアウイルスは、野生型ワクシニアウイルスと比較して、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）、Ｏ１Ｌ、リボヌクレオチド還元酵素（ＲＲ）、γ３４．５、α４７の少なくとも一つの機能を欠損する改変が加えられていることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヘルパーワクシニアウイルスは、野生型ワクシニアウイルスと比較して、ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）とＯ１Ｌを欠損させたウイルスを使用する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記目的ウイルスＤＮＡはワクシニアウイルスＤＮＡであることを特徴とする、請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ワクシニアウイルスＤＮＡは、正常細胞での増殖性を抑制し、腫瘍細胞で増殖可能であるように改変が加えられていることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ワクシニアウイルスＤＮＡの改変として、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）、Ｏ１Ｌ、ＲＲ、γ３４．５及びα４７よりなる群から選ばれた少なくとも一つの改変が加えられていることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ワクシニアウイルスＤＮＡの改変として、ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）、Ｏ１Ｌの機能を欠損させる改変が加えられていることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ワクシニアウイルスＤＮＡの改変は、Bacterial artificial chromosome (BAC)システムを使用することを特徴とする、請求項１３から請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ポックスウイルスの製造方法であって、
（１）第１培養細胞に増殖性のヘルパーワクシニアウイルスを感染させ培養する工程と、
（２）第１培養細胞に第１目的ウイルスＤＮＡをトランスフェクションし培養する工程と、
（３）前記第１培養細胞から第１目的ウイルスを回収する工程と、
（４）第２培養細胞にヘルパーウイルスとして第１目的ウイルスを感染させ培養する工程と、
（５）第２培養細胞に第２目的ウイルスＤＮＡをトランスフェクションし培養する工程と、
（６）前記第２培養細胞から第２目的ウイルスを回収する工程と、
を含み、前記工程（１）と工程（２）、および前記工程（４）と工程（５）とは、いずれかの工程の後に他の工程を行う、方法。
【請求項１８】
前記目的ウイルスを回収する工程は、
目的ウイルスが感染している細胞を回収する工程と、
回収した細胞を凍結する工程と、
凍結した細胞を融解する工程と、
融解した細胞を超音波処理する工程と、
超音波処理した細胞液を遠心分離し、上清からウイルス液のみを得る工程と、
ウイルス液を限界希釈し培養細胞へ感染する工程と、
培養細胞に目的ウイルスのみが感染していることを確認する工程と、
目的ウイルスのみが感染した培養細胞から目的ウイルスを回収する工程と、
を有することを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記目的ウイルスの回収工程において目的ウイルスのみが感染している細胞が存在しない場合は、再度ウイルスの回収工程を繰り返すことを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記目的ウイルスＤＮＡまたは前記ヘルパーワクシニアウイルスのいずれか一方のみには、蛍光タンパク質が発現するウイルスを使用し、蛍光顕微鏡を用いて蛍光タンパク質の発現を確認することで前記目的ウイルスのみが感染している細胞を確認することを特徴とする、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘルパーウイルスを使用したウイルスの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ワクシニアウイルスをワクチン開発のためのベクターとして用いたり、あるいは癌治療薬として開発することが検討されている。前者の一例として、特開2003-321391（特許文献１）には、ウイルス遺伝子治療の一例の免疫療法に関する研究として、ワクシニアウイルスLC16m8株にヒト免疫不全ウイルス（HIV）のエンベロープタンパクをコードするように改変したHIVワクチンが開示されている。その他に、Expert Rev Vaccines. 2011 Aug;10(8):1221-40（非特許文献１）に幾つかの例が示されている。
【０００３】
癌治療への応用としては、腫瘍特異的に増殖するウイルスに関する研究としてWO2015/076422（特許文献２）に、腫瘍溶解性ウイルスとして使用する改変ワクシニアウイルスが開示されている。具体的には、ワクシニアウイルスLC16m0株のワクシニアウイルス増殖因子（VGF）とO1Lの機能が欠損するように改変を加えることにより、腫瘍細胞特異的に増殖するように改変したワクシニアウイルスが開示されている。その他に、J Microbiol. 2015 Apr;53(4):209-18（非特許文献２）にいくつかの例が示されている。
【０００４】
この様なワクチン開発、あるいは腫瘍溶解性ウイルスの作出のためには、ワクシニアウイルスゲノムの改変が必要である。そのための改変方法としてUS7494813（特許文献３）には、ワクシニアウイルスをBacterial Artificial Chromosome（BAC）システムを使用して改変する方法が開示されている。US7494813では、改変したワクシニアウイルスの回収のために、ヘルパーウイルスとして非増殖性のウイルス、または、弱毒Fowlpoxウイルスを感染させた哺乳類の動物細胞に、改変ワクシニアウイルスDNAをトランスフェクションして培養することで改変ワクシニアウイルスを複製している。また、特表2014-513938（特許文献４）には、Lister株由来のワクシニアウイルスの回収のために、ヘルパーウイルスとして紫外線不活化ワクシニアウイルスまたは弱毒Fowlpoxウイルスを使用することが開示されている。また、US5866383（特許文献５）には、ワクシニアウイルス温度感受性株をヘルパーウイルスとして用い、当該ヘルパーウイルスが増殖しない条件で使用することが開示されている。このような手法は、最新報告でも同様であり、PLoS One. Feb 23;13(2):e0192725（2018）（非特許文献３）においても、ヘルパーウイルスとしてFowlpoxウイルスを使用することが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−３２１３９１
【特許文献２】ＷＯ２０１５／０７６４２２
【特許文献３】ＵＳ７４９４８１３
【特許文献４】特表２０１４−５１３９３８
【特許文献５】ＵＳ５８６６３８３
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Expert Rev Vaccines.2011 Aug;10(8):1221-40
【非特許文献２】J Microbiol. 2015 Apr; 53(4):209-18
【非特許文献３】PLoS One.Feb 23;13(2):e0192725 (2018)
【非特許文献４】Antiviral Res. 84, 1-13 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来は、ポックスウイルスの回収のために使用するヘルパーウイルスとして哺乳動物細胞では増殖性を示さない弱毒Fowlpoxウイルスが用いられ、あるいはワクシニアウイルスを増殖させない状態で使用する方法がとられていた。しかしながら、ヘルパーは、ウイルスDNAの転写、複製に関与する酵素の供給を目的としていることから、目的改変ウイルスを回収する効率の点からは、増殖性のウイルスを用いた方が良いと考えられる。これまではヘルパーウイルスとして非増殖性のウイルスが用いられ、あるいは増殖させない状態でワクシニアウイルスが用いられている背景には、増殖性のウイルスを用いると、回収した目的ウイルスにヘルパーウイルスが混入したり、目的ウイルスとヘルパーウイルス間で望ましくない組換えが起こる危険性が生じる点にあった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、増殖性のワクシニアウイルスを用いても目的とするウイルスの効率の良い回収が達成可能であること、ヘルパーウイルスとしてワクチン株あるいはヒトに投与され安全性が確認されている株、これらの株に由来するウイルスを用いることで、予期せぬ病原体の混入の可能性を低減し、実用化に際して、安全性の観点からより好ましい目的ウイルスの作出が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
したがって、本発明は以下を含む。
[１]ポックスウイルスの製造方法であって、
（１）培養細胞にヘルパーウイルスとして増殖性のヘルパーワクシニアウイルスを感染させ培養する工程と、
（２）培養細胞に目的ウイルスＤＮＡをトランスフェクションし培養する工程と、
（３）前記培養細胞から目的ウイルスを回収する工程と、
を含み、前記工程（１）と工程（２）とはいずれかの工程の後に他の工程を行う、方法。
[２]前記ヘルパーワクシニアウイルスとして安全性の高いワクシニアウイルスが使用されることを特徴とする、[１]に記載の方法。
[３]前記安全性の高いワクシニアウイルスは、ワクチン株又はワクチン株に由来することを特徴とする、[２]に記載の方法。
[４]前記安全性の高いワクシニアウイルスは、New York City Board of Health (NYCBH)株、EM-63株、Lister株、Paris株、Copenhagen株、Bern株、Ankara株、Temple of Heaven株、Vaccinia Tian Tan株、Dairen株、ACAM2000株、LC16m8株、Modified Vaccinia Ankara (MVA)株、Dairen I (DIs)株又はLC16mO株のいずれかである、[２]又は[３]に記載の方法。
[５]前記ワクチン株が、LC16m8であることを特徴とする、[３]又は[４]に記載の方法。
[６]前記ヘルパーウイルスが、蛍光タンパク質を発現することを特徴とする、[１]から[５]のいずれかに記載の方法。
[７]蛍光タンパク質がＧＦＰであることを特徴とする、[６]に記載の方法。
[８]前記安全性の高いワクシニアウイルスは、野生型ワクシニアウイルスと比較して、Ｂ５Ｒ遺伝子の機能を欠損する改変が加えられていることを特徴とする、[２]から[７]のいずれかに記載の方法
[９]前記ヘルパーワクシニアウイルスとして、正常細胞での増殖性を抑制し、腫瘍細胞では増殖可能となるような改変が加えられたヘルパーワクシニアウイルスを使用する、[１]から[８]のいずれかに記載の方法。
[１０]前記ヘルパーワクシニアウイルスは、野生型ワクシニアウイルスと比較して、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）、Ｏ１Ｌ、リボヌクレオチド還元酵素（ＲＲ）、γ３４．５、α４７の少なくとも一つの機能を欠損する改変が加えられていることを特徴とする、[９]に記載の方法。
[１１]前記ヘルパーワクシニアウイルスは、野生型ワクシニアウイルスと比較して、ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）とＯ１Ｌを欠損させたウイルスを使用する、[１０]に記載の方法。
[１２]前記目的ウイルスＤＮＡはワクシニアウイルスＤＮＡであることを特徴とする、[１]から[１１]のいずれかに記載の方法。
[１３]前記ワクシニアウイルスＤＮＡは、正常細胞での増殖性を抑制し、腫瘍細胞で増殖可能であるように改変が加えられていることを特徴とする、[１２]に記載の方法。
[１４]前記ワクシニアウイルスＤＮＡの改変として、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）、Ｏ１Ｌ、ＲＲ、γ３４．５及びα４７よりなる群から選ばれた少なくとも一つの改変が加えられていることを特徴とする、[１３]に記載の方法。
[１５]前記ワクシニアウイルスＤＮＡの改変として、ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）、Ｏ１Ｌの機能を欠損させる改変が加えられていることを特徴とする、[１４]に記載の方法。
[１６]前記ワクシニアウイルスＤＮＡの改変は、Bacterial artificial chromosome (BAC)システムを使用することを特徴とする、[１３]から[１５]のいずれかに記載の方法。
[１７]ポックスウイルスの製造方法であって、
（１）第１培養細胞に増殖性のヘルパーワクシニアウイルスを感染させ培養する工程と、
（２）第１培養細胞に第１目的ウイルスＤＮＡをトランスフェクションし培養する工程と、
（３）前記第１培養細胞から第１目的ウイルスを回収する工程と、
（４）第２培養細胞にヘルパーウイルスとして第１目的ウイルスを感染させ培養する工程と、
（５）第２培養細胞に第２目的ウイルスＤＮＡをトランスフェクションし培養する工程と、
（６）前記第２培養細胞から第２目的ウイルスを回収する工程と、
を含み、前記工程（１）と工程（２）、および前記工程（４）と工程（５）とは、いずれかの工程の後に他の工程を行う、方法。
[１８]前記目的ウイルスを回収する工程は、
目的ウイルスが感染している細胞を回収する工程と、
回収した細胞を凍結する工程と、
凍結した細胞を融解する工程と、
融解した細胞を超音波処理する工程と、
超音波処理した細胞液を遠心分離し、上清からウイルス液のみを得る工程と、
ウイルス液を限界希釈し培養細胞へ感染する工程と、
培養細胞に目的ウイルスのみが感染していることを確認する工程と、
目的ウイルスのみが感染した培養細胞から目的ウイルスを回収する工程と、
を有することを特徴とする、[１７]に記載の方法。
[１９]前記目的ウイルスの回収工程において目的ウイルスのみが感染している細胞が存在しない場合は、再度ウイルスの回収工程を繰り返すことを特徴とする、[１８]に記載の方法。
[２０]前記目的ウイルスＤＮＡまたは前記ヘルパーワクシニアウイルスのいずれか一方のみには、蛍光タンパク質が発現するウイルスを使用し、蛍光顕微鏡を用いて蛍光タンパク質の発現を確認することで前記目的ウイルスのみが感染している細胞を確認することを特徴とする、[１８]または[１９]に記載の方法。
[２１]蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であることを特徴とする、[２０]に記載の方法。
【００１０】
本発明の第１の様態では、ウイルスの製造方法であって、培養細胞にヘルパーウイルスとして増殖性のヘルパーワクシニアウイルスを感染させ培養する工程と、培養細胞に目的ウイルスDNAをトランスフェクションし培養する工程と、培養細胞から目的ウイルスを回収する工程と、を有する方法を提供する。
【００１１】
本発明の別の様態では、ウイルスの製造方法であって、第１培養細胞にヘルパーウイルスとして増殖性を有するヘルパーワクシニアウイルスを感染させ培養する工程と、第１培養細胞に第１目的ウイルスDNAをトランスフェクションし培養する工程と、第１培養細胞から第１目的ウイルスを回収する工程と、第２培養細胞にヘルパーウイルスとして第１目的ウイルスを感染させ培養する工程と、第２培養細胞に第２目的ウイルスDNAをトランスフェクションし培養する工程と、第２培養細胞から第２目的ウイルスを回収する工程と、を有する方法を提供する。
【００１２】
本発明で用いられるヘルパーウイルスとしては、ヒトにおいて安全性が確認されているワクシニアウイルス、あるいは当該ウイルスに由来するウイルス、あるいはこれらのウイルスの増殖性を低下させ、あるいはマーカー遺伝子を発現するように改変したウイルスが例示される。
【００１３】
ワクシニアウイルスのワクチン株の例としては、New York City Board of Health (NYCBH)株、EM-63株、Lister株、Paris株、Copenhagen株、Bern株, Ankara株, Temple of Heaven株、Vaccinia Tian Tan株、Dairen株、ACAM2000株、LC16m8株、Modified Vaccinia Ankara (MVA)株、 Dairen I (DIs) 株などがある（Antiviral Res. 84, 1-13（2009）（非特許文献４））。また、ワクチン株ではないが、ヒトに投与しその安全性が確認されている株として、LC16mO株がある。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、増殖性のワクシニアウイルスを用いながら、目的とするウイルスの効率の良い回収を達成することができる。さらに、ヘルパーウイルスとしてワクチン株あるいはヒトに投与され安全性が確認されている株、これらの株に由来するウイルスを用いることで、予期せぬ病原体の混入の可能性を低減し、実用化に際して、安全性の観点からより好ましい目的ウイルスの作出を達成することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１６】
本発明は、増殖性を有するワクシニアウイルスをヘルパーウイルスとして使用するポックスウイルスの製造方法に関する。本発明のウイルスの製造方法では、培養細胞にヘルパーウイルスとして増殖性を有するヘルパーワクシニアウイルスを感染させ培養する工程と、培養細胞に目的ウイルスDNAをトランスフェクションし培養する工程と、培養細胞から目的ウイルスを回収する工程と、を有していてもよい。ヘルパーウイルスを感染させる工程と目的ウイルスDNAをトランスフェクションする工程は前後しても良い。
【００１７】
「培養細胞」とは、ウイルスを培養するための細胞のことで、任意の細胞腫であってよい。本発明の培養細胞を限定するものではないが、培養細胞としてPRK細胞、 RK13細胞、HeLa細胞、HeLaS3細胞、Vero細胞、BSC-1細胞、EB66細胞、CHO細胞、AsPC-1細胞、BxPC-3細胞などを使用してもよい。
【００１８】
「増殖性」とは、正常細胞、癌細胞問わず、上記培養細胞において増殖することができる能力を指す。
【００１９】
「目的ウイルスDNA」とは、目的ウイルスをコードしているDNAであり、DNAとしては、線状ウイルスゲノム、環状ウイルスゲノム、ウイルスBACmidであってもよい。
【００２０】
「目的ウイルス」はポックスウイルスである。ポックスウイルスとしては、ワクシニアウイルス、Fowlpoxウイルス、天然痘ウイルス、牛痘ウイルスなど、どのようなポックスウイルス種であってもよい。また、それらのウイルスの使用方法としては、ウイルスをベクターとして使用してもよいし、ウイルス自体で疾病を治療してもよい。具体的には、治療遺伝子の発現、免疫を惹起するための抗原タンパクの発現、免疫を惹起するサイトカイン遺伝子の発現、ウイルス直接的な腫瘍溶解作用、癌抗原の発現、腫瘍選択性向上遺伝子発現等による治療であってもよい。
【００２１】
「ヘルパーワクシニアウイルス」とは、ウイルス複製に必要な酵素を提供するワクシニアウイルスを指す。ヘルパーワクシニアウイルスの株は、Lister株、Lister株から得られたLC16株、Wyeth株、コペンハーゲン株など特に限定されない。
【００２２】
ヘルパーウイルスの一例として、安全性の高いワクシニアウイルスを使用してもよい。「安全性が高い」とは、ヒトに投与しても安全であるウイルス株のことをいい、ワクチン株として承認され、ヒト以外の外来性の因子を含まないものであってもよい。ワクチン株として承認されている株の一例として、LC16m8株、Lister株、New York City Board of Health (NYBH)株など特に限定されない。
【００２３】
安全性の高いワクシニアウイルスとして、野生型ワクシニアウイルスと比較してB5R遺伝子の機能的な欠損を含むヘルパーワクシニアウイルスを使用してもよい。また、ヘルパーワクシニアウイルスとして、ワクシニアウイルスLC16m8株を使用してもよい。
【００２４】
「野生型ワクシニアウイルス」とは、例えば、ワクシニアウイルスLC16m0株（GenBankの登録番号：KX061501.1）、ワクシニアウイルスLister株（GenBankの登録番号：AY678277.1）、ワクシニアウイルスWestern Reserve株（GenBankの登録番号：AY243312.1）などを指す。
【００２５】
「機能を欠損する改変」とは、遺伝子の全体または一部を欠損する改変、または遺伝子中に別の遺伝子を挿入または置換することにより機能を欠損させる改変のことを指す。
【００２６】
「ワクシニアウイルスLC16m8株」とは、臨床分離株（Lister株）から得られた温度変異株であり、40.8℃以上で増殖することができず、鶏卵漿尿膜に小型のポックを形成する性質を有する。LC16m8株は、親株であるLC16m0株を低温培養で３代後に小さなポックを形成するウイルスとしてクローニングされたもので、B5R遺伝子のフレームシフト変異によるB5Rタンパクが欠損している。
【００２７】
ヘルパーワクシニアウイルスとして、正常細胞における増殖性を抑制し腫瘍細胞で増殖可能となるような改変を加えられたワクシニアウイルスを使用してもよい。ヘルパーワクシニアウイルスとして、野生型ワクシニアウイルスと比較して、B5R、チミジンキナーゼ（TK）、ワクシニアウイルス増殖因子（VGF）、O1L、リボヌクレオチド還元酵素（RR）、γ34.5、α47の少なくとも一つの機能を欠損する改変が加えられたヘルパーワクシニアウイルスを使用してもよい。また、ワクシニアウイルス増殖因子（VGF）とO1Lの機能を欠損させたヘルパーワクシニアウイルスを使用してもよい。
【００２８】
目的ウイルスDNAは、ワクシニアウイルスDNAであってもよい。ワクシニアウイルスDNAは、正常細胞での増殖性を抑制し腫瘍細胞での増殖可能となるように改変が加えられていてもよい。正常細胞での増殖性を抑制し腫瘍細胞での増殖可能となるような改変として、チミジンキナーゼ（TK）、ワクシニアウイルス増殖因子（VGF）、O1L、リボヌクレオチド還元酵素（RR）、γ34.5、α47の少なくとも一つの改変であってもよい。また、正常細胞での増殖性を抑制し腫瘍細胞での増殖可能となるような改変として、ワクシニアウイルス増殖因子（VGF）、O1Lの機能を欠損させてもよい。
【００２９】
ワクシニアウイルスDNAの改変にはBacterial Artificial Chromosome (BAC)システムを使用してもよい。「Bacterial Artificial Chromosome (BAC)システム」とは、BAC配列を組み込まれたゲノム（ウイルスゲノム）を大腸菌内で保持し、大腸菌の遺伝学を駆使して、ゲノム（ウイルスゲノム）の組換えを行うシステムである。
【００３０】
本発明のウイルスの製造方法では、第１培養細胞にヘルパーウイルスとして増殖性を有するヘルパーワクシニアウイルスを感染させ培養する工程と、第１培養細胞に第１目的ウイルスDNAをトランスフェクションし培養する工程と、第１培養細胞から第１目的ウイルスを回収する工程と、第２培養細胞にヘルパーウイルスとして第１目的ウイルスを感染させ培養する工程と、第２培養細胞に第２目的ウイルスDNAをトランスフェクションし培養する工程と、第２培養細胞から第２目的ウイルスを回収する工程と、を有していてもよい。ヘルパーウイルスを感染させる工程と目的ウイルスDNAをトランスフェクションする工程は前後しても良い。
【００３１】
「第１培養細胞」、「第２培養細胞」とは、ウイルスを培養するための細胞のことで、任意の細胞種であってよい。本発明では第１培養細胞と第２培養細胞とは同じ培養細胞としてもよいし、別の培養細胞としてもよい。本発明の第１培養細胞と第２培養細胞を特に限定するものではないが、例えば、PRK細胞、RK13細胞、HeLa細胞、HeLaS3細胞、Vero細胞、BSC-1細胞、EB66細胞、CHO細胞、AsPC-1細胞、BxPC-3細胞を使用してもよい。
【００３２】
「第１目的ウイルスDNA」、「第２目的ウイルスDNA」は、異なる改変が加えられたウイルスDNAである。ここで異なる改変とは、遺伝子の欠損、挿入、置換どのような改変であっても異なっているものを指す。特に限定されるものではないが、例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）が挿入されているものと挿入されていないものの改変であってもよい。
【００３３】
このように、「第１培養細胞」、「第２培養細胞」、「第１目的ウイルスDNA」、「第２目的ウイルスDNA」を用いることにより、様々な種類の目的ウイルスの回収が容易となる。例えば、第１培養細胞において、GFPのようなマーカー遺伝子を有する第１目的ウイルスDNAを用いて、GFPを有する第１目的ウイルスを獲得した上で、第２培養細胞において、これをヘルパーウイルスとして用いることで、GFPを有さない第２目的ウイルスDNAから、GFPを有さない第２目的ウイルスを回収することができる。さらには、第１培養細胞において、第２目的ウイルスよりも増殖性の低い第１目的ウイルスを獲得した上で、第２培養細胞において、これをヘルパーウイルスとして用いることで、容易に第２目的ウイルスを回収することができる。
【００３４】
ウイルスを回収する工程は、目的ウイルスが感染している細胞を回収する工程と、回収した細胞を凍結する工程と、凍結した細胞を融解する工程と、融解した細胞を超音波処理する工程と、超音波処理した細胞液を遠心分離し、上清からウイルス液のみを得る工程と、ウイルス液を限界希釈し培養細胞へ感染する工程と、培養細胞に目的ウイルスのみが感染していることを確認する工程と、目的ウイルスのみが感染した培養細胞から目的ウイルスを回収する工程と、を有していてもよい。
【００３５】
ウイルスの回収工程において目的ウイルスのみが感染している細胞が存在しない場合は、再度ウイルスの回収工程を繰り返してもよい。目的ウイルスのみが感染していることを確認するために、目的ウイルスDNAまたはヘルパーワクシニアウイルスのいずれか一方のみに緑色蛍光タンパク質（GFP）、その改変体であるEGFP、赤色蛍光タンパク質（DsRed）、青色蛍光タンパク質（BFP）などが発現するようにし、蛍光顕微鏡を用いて蛍光を確認することで目的ウイルスのみが感染しているか否かを確認してもよい。
【００３６】
「目的ウイルスのみが感染している」ことの確認方法とは、各種セレクションにより、目的ウイルスのみが感染していることの確認をいい、例えば、「ウイルスプラーク数＝目的のGFP発現数」により目的ウイルスのみが感染していることを確認してもよい。
【００３７】
本発明の目的ウイルスDNAから目的ウイルスを発現させる方法では、ワクシニアウイルスLC16m8株をヘルパーウイルスとして使用してもよい。
【００３８】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
BACmidの作製
細胞培養相同組換えでワクシニアウイルスLC16m8にBAC配列を挿入したBACウイルスを作製し、BACウイルスのゲノムを環状化してLC16m8−BACmidを作製した。
【００４０】
＜インサーションプラスミドの構築＞
LC16m8にBACgfp配列を導入するためのインサーションプラスミド（pUC-VVTK-BAC-EGFP）の構築を行った。まず、ワクシニアウイルスLC16m8株ゲノム（GenBank：AY678275.1）を鋳型に、TK１プライマーFw：CGGGGTACCATAAATTAGAAGCCGTGGGTC（配列番号１）、TK１プライマーRe：CCTTAATTAAGAAAAATATTATGAGTCGATGTAACACTTT（配列番号２）を用いてTK１を増幅し、また、同株ゲノムを鋳型に、TK２プライマーFw：CCTTAATTAATATATTTTTTATCTAAAAAACTAAA（配列番号３）、TK２プライマーRe：GCTCTAGACGGTAGTATATCTCAGTAGTACGTT（配列番号４）を用いてTK２を増幅した。次に、TK１に制限酵素KpnI（Takara、製品番号：1068A）及びPacI（NEB、製品番号：R0547L）を処理し、また、TK２に制限酵素XbaI（Takara、製品番号：1093A）及びPacIを処理した後、アガロースゲルから目的断片を精製した（TK1/KpnI/PacI/elution：約0.88kb、TK2/PacI/XbaI/elution：約1.1kb）。次に、pUC119プラスミド（GenBank：U07650.1）に制限酵素KpnI及びXbaIを処理、精製し、アルカリフォスファターゼ処理したプラスミド（pUC119/KpnI/XbaI/elution/BAP）のKpnI/XbaIサイトに、上で精製した二つの断片TK1/KpnI/PacI/elution及びTK2/PacI/XbaI/elutionをクローニングし、pUC119-TK1-2を構築した。
【００４１】
次に、pUCIDT-KAN-op7.5+EGFPプラスミド（配列番号５）を人工合成し、制限酵素PacIを処理後、アガロースゲルから約1.1kbの目的断片を精製した（pUCIDT-KAN-op7.5+EGFP/PacI/elution）。さらに、pUC119-TK1-2に制限酵素PacIを処理、精製し、アルカリフォスファターゼ処理したプラスミド（pUC119-TK1-2/PacI/elution/BAP）のPacIサイトに、pUCIDT-KAN-op7.5+EGFP/PacI/elutionをクローニングし、pUC-VVTK-op7.5+EGFPプラスミドを構築した。
【００４２】
最後に、pBSIIプラスミド（GenBank：U25267.1）にpBeloBAC11配列（GenBank：CVU51113.1）をクローニングしたプラスミドに、制限酵素NotI（Takara、製品番号：1166A）を処理後、アガロースゲルから約7kbの目的断片を精製した（pBeloBAC11+pBSII/NotI/elution）。次に、pUC-VVTK-op7.5+EGFPに制限酵素NotIを処理、精製後、アルカリフォスファターゼ処理したプラスミド（pUC-VVTK-op7.5+EGFP/NotI/elution/BAP）のNotIサイトに、pBeloBAC11+pBSII/NotI/elutionをクローニングし、pUC-VVTK-BAC-EGFPプラスミドを構築した。
【００４３】
＜LC16m8ゲノムへのBACgfp配列の導入＞
6ウェルプレートにフルシートさせたPRK細胞（自家調製）に、ワクシニアウイルスLC16m8株（自家調製）をMOI=10で感染させ、30℃、5％CO2下で1時間培養後、培地を除き、TrypLE（Invitrogen、製品番号：12563-001）で細胞を回収した。回収細胞をHeBSバッファー（Sigma、製品番号：51558）で1×107cells/mLに調製後、制限酵素HindIII（Takara、製品番号：1060A）で線状化したpUC-VVTK-BAC-EGFPプラスミドを0.5μg/10μLになるように加え、エレクトロポレーション装置（Invitrogen、機器名：Neon Transfection System）を用いて、1.4kV、20ms、2pulseの条件でエレクトロポレーションを行った。次に、エレクトロポレーション液を10倍限界希釈し、96ウェルプレートにフルシートさせたPRK細胞に感染させ、30℃、5％CO2下で48時間程度培養した。蛍光顕微鏡を用いて、GFP発現を観察し、希釈倍率の高いウェルでGFP（+）プラークもしくはCPEが得られたものを選択した。選択したウェルの細胞にTrypLEを添加し、剥がれた細胞を5%FBS添加イーグルMEM培地（ニッスイ、製品番号：05900、05901、05902）で洗いこみ回収を行った。その後、超音波処理器（COSMO BIO CO., LTD.、機器名：BIORUPTOR UCW-310）を用いて250W、30sec×4の条件で超音波処置し、遠心分離機（TOMY、機器名：MUITIPURPOSE REFRIGERATED CENTRIFUGE LX120）を用いて4℃、2000rpm、5分間の条件で遠心後、上清をウイルス液として得た。以降、本作業を繰り返し、2回連続で、ウイルスプラークが全てGFP（+）になったところで、LC16m8にBACgfp配列が挿入されたBACウイルスとしてLC16m8-BACgfpの回収を完了とした。
【００４４】
＜LC16m8-BACgfpゲノムの環状化と大腸菌へのクローニング（LC16m8-BACmidの作製）＞
2%FBS添加イーグルMEM培地（ニッスイ、製品番号：05900、05901、05902）に1/100量の1mg/mL IBT（Pfaltz & Bauer、製品番号：487-16-1）（終濃度0.01mg/mL）と、上記で得たLC16m8-BACgfpをMOI=5となるように混合し、6ウェルプレートにフルシートさせたPRK細胞に1mL／ウェルで接種した。30℃、5％CO2下で1時間吸着させ、0.01mg/mL IBTを添加した2%FBS添加イーグルMEM培地で培地交換を行った。30℃、5％CO2下で24時間培養後、イーグルMEM培地100μL中にpCAGGS-Creプラスミド1μg、X-tremeGENE HP（Sigma-Aldrich、製品番号：06366236001） 3μLを混合した後、室温で15分間静置し、培養液中に混合液を100μL/ウェル添加することでpCAGGS-Creプラスミド（自家調製）のトランスフェクションを行った。30℃、5％CO2下で24時間培養後、環状化したウイルスゲノムとしてLC16m8-BACmidを抽出し、エレクトロポレーション装置（BIO-RAD、機器名：GenePulserII）を用いて、大腸菌GS1783（WO2014077096A1）に、1.8kV、200Ω、25μFの条件でエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション液を、クロラムフェニコールを添加したCG寒天培地にプレーティングし、32℃において、48時間程度培養した。BACmidを保持した大腸菌の選択は、BACgfp配列中のクロラムフェニコール耐性をマーカーとして行い、目的のクローンをグリセロールストックした。得られたクローンについて、BACmidを抽出し、常法により塩基配列を確認した結果、目的とするTK遺伝子領域にEGFP発現カセットとpBeloBAC11の配列が挿入されていることを確認した。
【実施例２】
【００４５】
BACmidの改変
発現カセットをLC16m8-BACmidに組み込み、発現カセットを保持する組換えウイルスゲノム（改変BACmid）を取得した。
【００４６】
＜発現カセットの作製＞
改変BACmid作成のための発現カセットとして、配列番号６のBACgfp除去カセットと、配列番号１１のLC16m0型B5R発現カセットと、配列番号１５のVGF欠損カセットと、配列番号１９のO1L欠損カセットを準備し、表１に記載の各改変BACmidを作製した。
【００４７】
＜BACgfp除去配列カセット（SBTKdup配列）＞
BACgfp配列を除いたウイルスを回収するためにBACgfp除去配列カセット（配列番号６）を作製した。具体的には、まず、J Virol 81(23): 13200-13208を参考に、pUC119-BAC-SBTKdupプラスミドを構築した。その手法は、pUC119プラスミド（GenBank：U07650.1）に制限酵素HincII（Takara、製品番号：1059A）及びBamHI（Takara、製品番号：1010A）を処理、精製後、アルカリフォスファターゼを処理した（pUC119/HincII/BamHI/elution/BAP）。次に、インサーションプラスミドの構築時に用いたpBeloBAC11+pBSIIプラスミドに制限酵素XbaI（Takara、製品番号：1093A）を処理後、アガロースゲルから約7.9kbの目的断片を精製した（pBeloBAC11+pBSII/XbaI/elution）。精製した断片に、制限酵素ScaI（Takara、製品番号：1084A）及びBglII（Takara、製品番号：1021A）を処理後、アガロースゲルから約1.7kbの目的断片を精製した（pBeloBAC11+pBSII/XbaI/elution/ScaI/BglII/elution）。次に、pUC119/HincII/BamHI/elution/BAPとpBeloBAC11+pBSII/XbaI/elution/ScaI/BglII/elutionをライゲーションさせ、pUC119-pBeloSBを構築し、さらに、pUC119-pBeloSBに制限酵素NruI（Takara、製品番号：1168A）を処理し、精製した（pUC119-pBeloSB/NruI/elution）。
【００４８】
また、ワクシニアウイルスLC16m8株ゲノム（GenBank：AY678275.1）を鋳型に、TKプライマーFw：CCGCGGACTTTGTGATTAGTTTGATGCGATT（配列番号７）、TKプライマーRe：ACAGGTATTTATTCGCCGCGGAAGGTTGTAACATTTTATTACCGTGTG（配列番号８）を用いてTK領域を増幅し、また、pEPkan-S（Addgene、製品番号：41017）を鋳型に、カナマイシンプライマー１Fw：TCACAAAGTCCGCGGCGATAAGCTCATGGAGCGGCGTAACCGTCGCACAGGAAGGACAGAGAAAGTAAGTAGGGATAACAGGGTAAT（配列番号９）、カナマイシンプライマー１Re：TCCATGAGCTTATCGTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCA（配列番号１０）を用いてPCRを行い、カナマイシン耐性遺伝子を増幅させた。2つのPCR産物を精製し、上で構築したpUC119-pBeloSB/NruI/elutionとともに、In-Fusion HD Cloning Kit（Takara、製品番号：639648、639649、639650）を用いて、3つの断片を50℃、15分間反応させた。反応液を大腸菌JM109（Takara、製品番号：9052）へ導入し、42℃、1分間反応させた後、アンピシリン、カナマイシン及びクロラムフェニコールを添加したCG寒天培地にプレーティングし、37℃において、24時間程度培養した。得られたコロニーからプラスミドを抽出し、制限酵素HindIII（Takara、製品番号：1060A）及びEcoRV（Takara、製品番号：1042A）を処理し、アガロースゲル電気泳動におけるバンドパターンから、目的のプラスミド（pUC119-BAC-SBTKdup）を保持したクローンが得られたことを確認した。
【００４９】
最後に、pUC119-BAC-SBTKdupに制限酵素PstI（Takara、製品番号：1073A）及びKpnI（Takara、製品番号：1068A）を処理、精製してpUC119-BAC-SBTKdup/PstI/KpnI/elution（SBTKdup配列）を作製し、BACgfp除去配列（配列番号６）としてBACmidの改変に用いた。
【００５０】
＜B5R改変カセット＞
LC16m8においては、B5R遺伝子配列中の1塩基欠損（グアニン欠損）によるフレームシフトにより不完全なB5Rタンパク質が産生されることが知られている。そこで、実施例１で構築したLC16m8-BACmidのB5R遺伝子配列を、完全なB5R遺伝子配列をもつLC16m0の配列に改変したBACmidを構築するためB5R改変カセット（配列番号１１）を作製した。その具体的な手法は、まず、LC16mOのB5R遺伝子配列中の、上記グアニンから上流、下流それぞれ約1kb、計2132bpを人工合成し、pUCFk-B5RmO（配列番号１２）を構築した。その後、制限酵素EcoRI（Takara、製品番号：1040A）を処理、精製後、アルカリフォスファターゼを処理した（pUCFk-B5RmO/EcoRI/elution/BAP）。また、pEPkan-Sプラスミド（Addgene、製品番号：41017）を鋳型に、カナマイシンプライマー２Fw：CCGGAATTCCACCATGACACTAAGTTGCAACGGCGAAACAAAATATTTTCGTTTAAGTAGGGATAACAGGGTA（配列番号１３）、カナマイシンプライマー２Re：CCGGAATTCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCT（配列番号１４）を用いてPCRを行い、カナマイシン耐性遺伝子を増幅させ、精製後、制限酵素EcoRIを処理し、さらに精製することでrKanI/elution/EcoRIを作製した。その後、pUCFk-B5RmO/EcoRI/elution/BAPとrKanI/elution/EcoRIをライゲーションさせ、pUCFk-B5RmO-rKanIを構築した。pUCFk-B5RmO-rKanIに制限酵素XbaI（Takara、製品番号：1093A）及びDraI（Takara、製品番号：1037A）を処理後、アガロースゲルから約3.2kbの目的断片を精製してpUCFk-B5RmO-rKanI/XbaI/DraI/elutionを作製した。これをB5R発現カセット（配列番号１１）としてBACmidの改変に用いた。
【００５１】
＜VGF欠損カセット＞
VGFの機能を不活化したウイルスを回収するためにVGF欠損カセット（配列番号１５）を作製した。VGF欠損カセット作製の具体的な手法は、まず、VGF遺伝子配列の開始コドンから制限酵素AccIサイトまでの255bpを欠損させた配列及びその前後約1kbを人工合成し、pUC57-ΔVGF（配列番号１６）を構築した。次に、pUC57-ΔVGFに制限酵素AccI（Takara、製品番号：1001A）を処理、精製後、アルカリフォスファターゼを処理してpUC57-ΔVGF/AccI/elution/BAPを作製した。
【００５２】
pEPkan-Sプラスミド（Addgene、製品番号：41017）を鋳型に、PCR試薬（Takara、製品番号：RR001A、RR001B）、カナマイシンプライマー３Fw：CAAAATCCATCAAAAGTAGACTATCAACGTTCAGAAAACCCAAACACTACAACGTCATAT（配列番号１７）、カナマイシンプライマー３Re：TTCTGAACGTTGATAGTCTACTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCT（配列番号１８）を用いてPCRを行い、カナマイシン耐性遺伝子を増幅させ、アガロースゲルから約1kbの目的断片を精製後、TOPOベクター（Invitrogen、製品番号45-0641）にクローニングした。反応液を大腸菌JM109（Takara、製品番号9052）へ導入し、得られたコロニーからプラスミドを抽出してTOPO-rKanIを作製した。TOPO-rKanIに制限酵素AccIを処理し、精製後、制限酵素ScaI（Takara、製品番号：1084A）を処理し、アガロースゲルから約1kbの目的断片を精製してrKanI/AccI/ScaI/elutionを作製した。次に、pUC57-ΔVGF/AccI/elution/BAPとrKanI/AccI/ScaI/elutionをライゲーションさせ、pUC57-ΔVGF-rKanIを構築した。pUC57-ΔVGF-rKanIに制限酵素ScaIを処理することで、ベクター配列を切断し、さらに、制限酵素BamHI（Takara、製品番号：1010A）及びEcoRI（Takara、製品番号：1040A）を処理し、アガロースゲルから約8kbの目的断片を精製してpUC57-ΔVGF-rKanI/ScaI/BamHI/EcoRI/elution（配列番号１５）を作製し、これをVGF欠損カセットとしてBACmidの改変に用いた。なお、ここでは、目的断片は約8kbとしたが、pUC57-ΔVGF/AccI/elution/BAPとrKanI/AccI/ScaI/elutionのライゲーションの際、インサートであるrKanI/AccI/ScaI/elutionが複数個結合する場合や一つの断片のみがインサートされる場合などが想定されるため、アガロースゲルから精製する目的断片は、ベクター配列以外の断片とする。
【００５３】
＜O1L欠損カセット＞
O1Lの機能を欠損したウイルスを回収するためにO1L欠損カセット（配列番号１９）を作製した。O1L欠損カセット作製の具体的な手法は、まず、O1L遺伝子配列の開始コドンから制限酵素XbaIサイトまでの1049bpを欠損させ、次に、J Virol 81(23): 13200-13208を参考に、上記XbaIサイト直後50bpに、カナマイシン耐性遺伝子配列（Addgene、製品番号：41017）を挿入した配列を人工合成し、pUC57-ΔO1L-rKanI（配列番号２０）を構築した。pUC57-ΔO1L-rKanIに、制限酵素ScaI及びEcoRIを処理し、アガロースゲルから約2.7kbの目的断片を精製しpUC57-ΔO1L-rKanI/ScaI/EcoRI/elutionを作製し、これをO1L欠損カセット（配列番号１９）としてBACmidの改変に用いた。
【００５４】
＜BACmidの改変＞
LC16m8-BACmidを保持した大腸菌を培養し、各改変BACmid作製に必要な発現カセットをエレクトロポレーション（1.8kV、200Ω、25μF）により導入し、表１に記載の各改変BACmidを作製した。エレクトロポレーション溶液を、クロラムフェニコール及びカナマイシンを添加したCG寒天培地にプレーティングし、32℃において、24〜48時間程度培養した。各発現カセット中のカナマイシン耐性をマーカーとして、発現カセットが導入されたクローンを選択し、グリセロールストックした。次に、カナマイシン耐性遺伝子除去操作を行い（J Virol 81(23): 13200-13208参照）、BAC配列中のクロラムフェニコール耐性をマーカーとして、目的クローンを取得し、グリセロールストックした。
【００５５】
【表１】
2019187249.tif 000002
【００５６】
各改変BACmidを抽出後、PCR試薬（Takara、製品番号：R045A、R045B）とBACgfp除去確認プライマー、B5R確認プライマー、VGF欠損確認プライマー、O1L欠損確認プライマーを使用したPCR及び塩基配列解析を行った。
【００５７】
BACgfp除去確認プライマーは、BACgfp除去確認プライマー１をFw: GTCCCGTTCCGTATCTATTATCG（配列番号２１）、Re： TCAGCATCGCAACCGCATCAG（配列番号２２）とし、BACgfp除去確認プライマー２をFw： CGGGGTACCATAAATTAGAAGCCGTGGGTC（配列番号２３）、Re： GCTCTAGACGGTAGTATATCTCAGTAGTACGTT（配列番号２４）とし、BACgfp除去確認プライマー３をFw： CGGGACTATGGACGCATGATAAG（配列番号２５）、Re： AAATCCGCCGTACTAGGTTCATT（配列番号２６）とした。
【００５８】
B5R確認プライマーは、Fw： ATCCAAGAAGCTGGATGCGG（配列番号２７）、Re： TGGATGATGGAGACCCCGTT（配列番号２８）とした。
VGF欠損確認プライマーは、Fw： AGAACCAGCTGCTCCATGATT（配列番号２９）、Re： GATACGGAACCACCCACTGT（配列番号３０）とした。
O1L欠損確認プライマーは、Fw： TGTCAACGGACCCCAACATC（配列番号３１）、Re： ACATGGACGCATTGGGTGAT（配列番号３２）とした。
解析の結果、得られた各BACmidは、目的の改変BACmidであることを確認した。
【実施例３】
【００５９】
LC16m8-BACgfpの作製
ヘルパーワクシニアウイルスとしてLC16m8株（乾燥細胞培養痘そうワクチン「LC16”化血研”」、製造番号：V01、V11）を用いて、実施例１で作製したLC16m8-BACmid由来のウイルスとしてLC16m8-BACgfpを作製した。
【００６０】
＜ウイルスの作製＞
イーグルMEM培地（ニッスイ、製品番号：05900）を用いて、6ウェルプレートコンフルエント手前まで培養したRK13細胞に、ヘルパーワクシニアウイルスとしてLC16m8（乾燥細胞培養痘そうワクチン「LC16”化血研”」、製造番号：V01、V11）をMOI=2で接種し、30℃、5%CO2の条件で1時間培養した。培養後、上清を除き、培地としてMEMを2mL加えた。次に、LC16m8-BACmid 1μgとトランスフェクション試薬（Roche、製品番号：066366236001） 3μLを混合し、室温で15分間静置した。混合液100μLを、上記のRK13細胞へ添加し、30℃、5% CO2の条件で24〜48時間程度培養した。培養後、蛍光顕微鏡（OLYMPUS、機器名：OLYMPUS IX70）を用いて、GFP発現を確認後、細胞をハーベストし、凍結保存した。その後、超音波処理器（COSMO BIO CO., LTD.、機器名：BIORUPTOR UCW-310）を用いて250W、30sec×4の条件で超音波処置し、遠心分離機（TOMY、機器名：MUITIPURPOSE REFRIGERATED CENTRIFUGE LX120）を用いて4℃、2000rpm、5分間の条件で遠心後、上清をウイルス液として得た。
【００６１】
＜ウイルスの純化＞
回収したウイルス液を、イーグルMEM培地を用いて限界希釈し（10倍〜10000倍）、96ウェルプレートコンフルエントまで培養したRK13細胞に、ウイルス希釈液を100μL/ウェルで接種し、30℃、5%CO2下で24〜48時間程度培養した。培養後、蛍光顕微鏡（OLYMPUS、機器名：OLYMPUS IX70）を用いて、GFP発現を確認し、GFP（+）プラークの割合が多いウェルから細胞をハーベストし、凍結保存した。その後、超音波処理器（COSMO BIO CO., LTD.、機器名：BIORUPTOR UCW-310）を用いて250W、30sec×4の条件で超音波処置し、遠心分離機（TOMY、機器名：MUITIPURPOSE REFRIGERATED CENTRIFUGE LX120）を用いて4℃、2000rpm、5分間の条件で遠心後、上清をウイルス液として得た。以降、本作業を繰り返し、2回連続で、RK13細胞におけるウイルスプラークが全てGFP（+）になったところでウイルス純化完了とし、LC16m8-BACgfpウイルスを作製した。
【実施例４】
【００６２】
LC16m8の作製
実施例３で作製したLC16m8-BACgfpをヘルパーウイルスとして用いて、実施例２で作製したLC16m8-SBTKdup-BACmid由来のウイルスを作製した。
【００６３】
＜ウイルスの作製＞
イーグルMEM培地（ニッスイ、製品番号：05900）を用いて、6ウェルプレートコンフルエント手前まで培養したRK13細胞（DSファーマ、製品番号：EC00021715）に、ヘルパーウイルスとして実施例３で回収したLC16m8-BACgfpをMOI=2で接種し、30℃、5%CO2下で1時間培養した。培養後、上清を除き、培地としてMEM（Thermo scientific、製品番号：11095080）を2mL加えた。次に、LC16m8-SBTKdup-BACmid 1μgとトランスフェクション試薬（Roche、製品番号：066366236001）3μLを混合し、室温で15分間静置した。混合液100μLを、上記のRK13細胞へ添加し、30℃、5%CO2下で24〜48時間程度培養した。培養後、蛍光顕微鏡（OLYMPUS、機器名：OLYMPUS IX70）を用いて、GFP発現を確認後、細胞をハーベストし、凍結保存した。その後、超音波処理器（COSMO BIO CO., LTD.、機器名：BIORUPTOR UCW-310）を用いて250W、30sec×4の条件で超音波処置し、遠心分離機（TOMY、機器名：MUITIPURPOSE REFRIGERATED CENTRIFUGE LX120）を用いて4℃、2000rpm、5分間の条件で遠心後、上清をウイルス液として得た。
【００６４】
＜ウイルスの純化＞
回収したウイルス液を、イーグルMEM培地を用いて限界希釈し（10倍〜10000倍）、96ウェルプレートコンフルエントまで培養したRK13細胞に、ウイルス希釈液を100μL/ウェルで接種し、30℃、5%CO2下で24〜48時間程度培養した。培養後、蛍光顕微鏡（OLYMPUS、機器名：OLYMPUS IX70）を用いて、GFP発現を確認し、GFP（-）プラークの割合が多いウェルから細胞をハーベストし、凍結保存した。その後、超音波処理器（COSMO BIO CO., LTD.、機器名：BIORUPTOR UCW-310）を用いて250W、30sec×4の条件で超音波処置し、遠心分離機（TOMY、機器名：MUITIPURPOSE REFRIGERATED CENTRIFUGE LX120）を用いて4℃、2000rpm、5分間の条件で遠心後、上清をウイルス液として得た。以降、本作業を繰り返し、2回連続で、RK13細胞におけるウイルスプラークが全てGFP（-）になったところでウイルス純化完了とした。
【００６５】
＜回収したウイルスの遺伝子配列解析＞
回収したLC16m8を拡張するため、まず、イーグルMEM培地を用いて、6ウェルプレートコンフルエントまで培養したRK13細胞に、回収したLC16m8を接種し、30℃、5%CO2下で24〜48時間程度培養した。培養後、ゲノム抽出キット（QIAGEN、製品番号：69504、69506）を用いてウイルスゲノムを抽出した。抽出したウイルスゲノムを鋳型とし、PCR試薬（Takara、製品番号：RR001A、RR001B）と実施例２で使用したBACgfp配列除去確認プライマー２（配列番号２３、配列番号２４）を用いてPCRを行ったところ、バンドサイズからBACgfp配列の除去が確認できた。さらに、より詳細な解析を行うため、PCR産物を精製し、塩基配列解析を行ったところ、BACgfp配列挿入部位から当配列が除去されていることを確認した。
【００６６】
以上の結果より、ヘルパーウイルスとしてLC16m8-BACgfpを用いて、RK13細胞からLC16m8-SBTKdup-BACmid由来ウイルス（LC16m8）の回収に成功した。
【実施例５】
【００６７】
LC16m8-B5RmOの作製
実施例３で作製したLC16m8-BACgfpをヘルパーウイルスとして用いて、実施例２で作製したLC16m8-B5RmO-SBTKdup-BACmid由来のウイルスを作製した。
【００６８】
＜ウイルスの作製＞
イーグルMEM培地（ニッスイ、製品番号：05900）を用いて、6ウェルプレートコンフルエント手前まで培養したRK13細胞（DSファーマ、製品番号：EC00021715）に、ヘルパーウイルスとして実施例３で回収したLC16m8-BACgfpをMOI=0.01〜2で接種し、30℃、5%CO2下で1時間培養した。培養後、上清を除き、培地としてOptiProTM SFM（Thermo scientific、製品番号：12309019）を3mL加えた。次に、LC16m8-B5RmO-SBTKdup-BACmid 1μgとトランスフェクション試薬（Roche、製品番号：066366236001）1〜3μLを混合し、室温で15分間静置した。混合液200μLを、上記のRK13細胞へ添加し、30℃、5%CO2下で24〜48時間程度培養した。培養後、蛍光顕微鏡（OLYMPUS、機器名：OLYMPUS IX70）を用いて、GFP発現を確認後、細胞をハーベストし、凍結保存した。その後、超音波処理器（COSMO BIO CO., LTD.、機器名：BIORUPTOR UCW-310）を用いて250W、30sec×4の条件で超音波処置し、遠心分離機（TOMY、機器名：MUITIPURPOSE REFRIGERATED CENTRIFUGE LX120）を用いて4℃、2000rpm、5分間の条件で遠心後、上清をウイルス液として得た。
【００６９】
＜ウイルスの純化＞
回収したウイルス液を、イーグルMEM培地を用いて限界希釈し（10倍〜10000倍）、96ウェルプレートコンフルエントまで培養したRK13細胞に、ウイルス希釈液を100μL/ウェルで接種し、30℃、5%CO2下で24〜48時間程度培養した。培養後、蛍光顕微鏡（OLYMPUS、機器名：OLYMPUS IX70）を用いて、GFP発現を確認し、GFP（-）プラークの割合が多いウェルから細胞をハーベストし、凍結保存した。その後、超音波処理器（COSMO BIO CO., LTD.、機器名：BIORUPTOR UCW-310）を用いて250W、30sec×4の条件で超音波処置し、遠心分離機（TOMY、機器名：MUITIPURPOSE REFRIGERATED CENTRIFUGE LX120）を用いて4℃、2000rpm、5分間の条件で遠心後、上清をウイルス液として得た。以降、本作業を繰り返し、2回連続で、RK13細胞におけるウイルスプラークが全てGFP（-）になったところでウイルス純化完了とした。
【００７０】
＜回収したウイルスの遺伝子配列解析＞
回収したLC16m8-B5RmOを拡張するため、まず、イーグルMEM培地を用いて、6ウェルプレートコンフルエントまで培養したRK13細胞に、LC16m8-B5RmOを接種し、30℃、5%CO2下で24〜48時間程度培養した。培養後、ゲノム抽出キット（QIAGEN、製品番号：69504、69506）を用いてウイルスゲノムを抽出した。抽出したウイルスゲノムを鋳型とし、実施例２で使用したBACgfp配列除去確認プライマー３（配列番号２５、配列番号２６）及びB5R配列確認プライマー（配列番号２７，配列番号２８）とPCR試薬（Takara、製品番号：R045A、R045B）を用いてPCRを行ったところ、バンドサイズからBACgfp配列の除去が確認できた。さらに、より詳細な解析を行うため、両PCR産物を精製し、塩基配列解析を行ったところ、BACgfp配列挿入部位から当配列が除去されていること、さらに、B5R遺伝子配列中の特定の位置に、欠損されている塩基（グアニン）が挿入されていること（LC16mO型への改変）を確認した。
【００７１】
以上の結果より、ヘルパーウイルスとしてLC16m8-BACgfpを用いて、RK13細胞からLC16m8-B5RmO-SBTKdup-BACmid由来ウイルス（LC16m8-B5RmO）の回収に成功した。
【実施例６】
【００７２】
MD-RVVの作製
実施例３で作製したLC16m8-BACgfpをヘルパーウイルスとして用いて、実施例２で作製したMD-RVV-SBTKdup-BACmid由来のウイルスを作製した。
【００７３】
＜ウイルスの作製＞
イーグルMEM培地（ニッスイ、製品番号：05900）を用いて、6ウェルプレートコンフルエント手前まで培養したRK13細胞（DSファーマ、製品番号：EC00021715）に、ヘルパーウイルスとして実施例３で回収したLC16m8-BACgfpをMOI=0.01〜2で接種し、30℃、5%CO2下で1時間培養した。培養後、上清を除き、培地としてOptiProTM SFM（Thermo scientific、製品番号：12309019）を3mL加えた。次に、実施例２で作製したMD-RVV-SBTKdup-BACmid 1μgとトランスフェクション試薬（Roche、製品番号：066366236001）1〜3μLを混合し、室温で15分間静置した。混合液200μLを、上記のRK13細胞へ添加し、30℃、5%CO2下で24〜48時間程度培養した。培養後、蛍光顕微鏡（OLYMPUS、機器名：OLYMPUS IX70）を用いて、GFP発現を確認後、細胞をハーベストし、凍結保存した。その後、超音波処理器（COSMO BIO CO., LTD.、機器名：BIORUPTOR UCW-310）を用いて250W、30sec×4の条件で超音波処置し、遠心分離機（TOMY、機器名：MUITIPURPOSE REFRIGERATED CENTRIFUGE LX120）を用いて4℃、2000rpm、5分間の条件で遠心後、上清をウイルス液として得た。
【００７４】
＜ウイルスの純化＞
回収したウイルス液を、イーグルMEM培地を用いて限界希釈し（10倍〜10000倍）、96ウェルプレートコンフルエントまで培養したRK13細胞に、ウイルス希釈液を100μL/ウェルで接種し、30℃、5%CO2下で24〜48時間程度培養した。培養後、蛍光顕微鏡（OLYMPUS、機器名：OLYMPUS IX70）を用いて、GFP発現を確認し、GFP（-）プラークの割合が多いウェルから細胞をハーベストし、凍結保存した。その後、超音波処理器（COSMO BIO CO., LTD.、機器名：BIORUPTOR UCW-310）を用いて250W、30sec×4の条件で超音波処置し、遠心分離機（TOMY、機器名：MUITIPURPOSE REFRIGERATED CENTRIFUGE LX120）を用いて4℃、2000rpm、5分間の条件で遠心後、上清をウイルス液として得た。以降、本作業を繰り返し、2回連続で、RK13細胞におけるウイルスプラークが全てGFP（-）になったところでウイルス純化完了とした。
【００７５】
＜回収したウイルスの遺伝子配列解析＞
回収したMD-RVVを拡張するため、まず、イーグルMEM培地を用いて、6ウェルプレートコンフルエントまで培養したRK13細胞に、MD-RVVを接種し、30℃、5%CO2下で24〜48時間程度培養した。培養後、ゲノム抽出キット（QIAGEN、製品番号：69504、69506）を用いてウイルスゲノムを抽出した。抽出したウイルスゲノムを鋳型とし、実施例２で使用したBACgfp配列除去確認プライマー３（配列番号２５、配列番号２６）、B5R配列確認プライマー（配列番号２７、配列番号２８）、VGF配列確認プライマー（配列番号２９、配列番号３０）、O1L配列確認プライマー（配列番号３１、配列番号３２）とPCR試薬（Takara、製品番号：R045A、R045B）を用いてPCRを行ったところ、バンドサイズからBACgfp配列の除去、VGF配列の欠損及びO1L配列の欠損が確認できた。さらに、より詳細な解析を行うため、全てのPCR産物を精製し、塩基配列解析を行ったところ、BACgfp配列挿入部位から当配列が除去されていること、B5R遺伝子配列中の特定の位置に、欠損されている塩基（グアニン）が挿入されていること（LC16mO型への改変）、VGF配列及びO1L配列が想定通り欠損されていることを確認した。
【００７６】
以上の結果より、ヘルパーウイルスとしてLC16m8-BACgfpを用いて、RK13細胞からMD-RVV-SBTKdup-BACmid由来ウイルス（MD-RVV）の回収に成功した。
【実施例７】
【００７７】
LC16m8-B5RmO-BACgfpの作製
ヘルパーウイルスとしてLC16m8を用いて、実施例２で作製したLC16m8-B5RmO-BACmid由来のウイルスを作製した。
【００７８】
＜ウイルスの作製＞
イーグルMEM培地（ニッスイ、製品番号：05900）を用いて、6ウェルプレートコンフルエント手前まで培養したRK13細胞（DSファーマ、製品番号：EC00021715）に、ヘルパーウイルスとしてLC16m8（乾燥細胞培養痘そうワクチン「LC16”化血研”」、製造番号：V01、V11）をMOI=0.01〜2で接種し、30℃、5%CO2下で1時間培養した。培養後、上清を除き、培地としてOptiProTM SFM（Thermo scientific、製品番号：12309019）を3mL加えた。次に、実施例２で作製したLC16m8-B5RmO-BACmid 1μgとトランスフェクション試薬（Roche、製品番号：066366236001）1〜3μLを混合し、室温で15分間静置した。混合液200μLを、上記のRK13細胞へ添加し、30℃、5%CO2下で24〜48時間程度培養した。培養後、蛍光顕微鏡（OLYMPUS、機器名：OLYMPUS IX70）を用いて、GFP発現を確認後、細胞をハーベストし、凍結保存した（Thermo scientific、機器名：REVCO CXF）。その後、超音波処理器（COSMO BIO CO., LTD.、機器名：BIORUPTOR UCW-310）を用いて250W、30sec×4の条件で超音波処置し、遠心分離機（TOMY、機器名：MUITIPURPOSE REFRIGERATED CENTRIFUGE LX120）を用いて4℃、2000rpm、5分間の条件で遠心後、上清をウイルス液として得た。
【００７９】
＜ウイルスの純化＞
回収したウイルス液を、イーグルMEM培地を用いて限界希釈し（10倍〜10000倍）、96ウェルプレートコンフルエントまで培養したRK13細胞に、ウイルス希釈液を100μL/ウェルで接種し、30℃、5%CO2下で24〜48時間程度培養した。培養後、蛍光顕微鏡（OLYMPUS、機器名：OLYMPUS IX70）を用いて、GFP発現を確認し、GFP（+）プラークの割合が多いウェルから細胞をハーベストし、凍結保存した。その後、超音波処理器（COSMO BIO CO., LTD.、機器名：BIORUPTOR UCW-310）を用いて250W、30sec×4の条件で超音波処置し、遠心分離機（TOMY、機器名：MUITIPURPOSE REFRIGERATED CENTRIFUGE LX120）を用いて4℃、2000rpm、5分間の条件で遠心後、上清をウイルス液として得た。以降、本作業を繰り返し、2回連続で、RK13細胞におけるウイルスプラークが全てGFP（+）になったところでウイルス純化完了とした。
【００８０】
＜回収したウイルスの遺伝子配列解析＞
回収したLC16m8-B5RmO-BACgfpを拡張するため、まず、イーグルMEM培地を用いて、6ウェルプレートコンフルエントまで培養したRK13細胞に、LC16m8-B5RmO-BACgfpを接種し、30℃、5%CO2下で24〜48時間程度培養した。培養後、ゲノム抽出キット（QIAGEN、製品番号：69504、69506）を用いてウイルスゲノムを抽出した。抽出したウイルスゲノムを鋳型とし、実施例２で使用したB5R確認プライマー（配列番号２７、配列番号２８）とPCR試薬（Takara、製品番号：R045A、R045B）を用いてPCRを行った。次に、PCR産物を精製し、塩基配列解析を行ったところ、B5R遺伝子配列中の特定の位置に、欠損されている塩基（グアニン）が挿入されていること（LC16mO型への改変）を確認した。
【００８１】
以上の結果より、ヘルパーウイルスとしてLC16m8を用いて、RK13細胞からLC16m8-B5RmO-BACmid由来ウイルス（LC16m8-B5RmO-BACgfp）の回収に成功した。
【実施例８】
【００８２】
MD-RVV-BACgfpの作製
ヘルパーウイルスとして実施例６で作製したMD-RVVを用いて、実施例２で作製したMD-RVV-BACmid由来のウイルスを作製した。
【００８３】
＜ウイルスの作製＞
イーグルMEM培地（ニッスイ、製品番号：05900）を用いて、6ウェルプレートコンフルエント手前まで培養したRK13細胞（DSファーマ、製品番号：EC00021715）に、ヘルパーウイルスとして実施例６で回収したMD-RVVをMOI=0.01〜2で接種し、30℃、5%CO2下で1時間培養した。培養後、上清を除き、培地としてOptiProTM SFM（Thermo scientific、製品番号：12309019）を3mL加えた。次に、MD-RVV-BACmid 1μgとトランスフェクション試薬（Roche、製品番号：066366236001）1〜3μLを混合し、室温で15分間静置した。混合液200μLを、上記のRK13細胞へ添加し、30℃、5%CO2下で24〜48時間程度培養した。培養後、蛍光顕微鏡（OLYMPUS、機器名：OLYMPUS IX70）を用いて、GFP発現を確認後、細胞をハーベストし、凍結保存した。その後、超音波処理器（COSMO BIO CO., LTD.、機器名：BIORUPTOR UCW-310）を用いて250W、30sec×4の条件で超音波処置し、遠心分離機（TOMY、機器名：MUITIPURPOSE REFRIGERATED CENTRIFUGE LX120）を用いて4℃、2000rpm、5分間の条件で遠心後、上清をウイルス液として得た。
【００８４】
＜ウイルスの純化＞
回収したウイルス液を、イーグルMEM培地を用いて限界希釈し（10倍〜10000倍）、96ウェルプレートコンフルエントまで培養したRK13細胞に、ウイルス希釈液を100μL/ウェルで接種し、30℃、5%CO2下で24〜48時間程度培養した。培養後、蛍光顕微鏡（OLYMPUS、機器名：OLYMPUS IX70）を用いて、GFP発現を確認し、GFP（＋）プラークの割合が多いウェルから細胞をハーベストし、凍結保存した。その後、超音波処理器（COSMO BIO CO., LTD.、機器名：BIORUPTOR UCW-310）を用いて250W、30sec×4の条件で超音波処置し、遠心分離機（TOMY、機器名：MUITIPURPOSE REFRIGERATED CENTRIFUGE LX120）を用いて4℃、2000rpm、5分間の条件で遠心後、上清をウイルス液として得た。以降、本作業を繰り返し、2回連続で、RK13細胞におけるウイルスプラークが全てGFP（+）になったところでウイルス純化完了とした。
【００８５】
＜回収したウイルスの遺伝子配列解析＞
回収したMD-RVV-BACgfpを拡張するため、まず、イーグルMEM培地を用いて6ウェルプレートコンフルエントまで培養したRK13細胞に、MD-RVVを接種し、30℃、5%CO2下で24〜48時間程度培養した。培養後、ゲノム抽出キット（QIAGEN、製品番号：69504、69506）を用いてウイルスゲノムを抽出した。抽出したウイルスゲノムを鋳型とし、実施例２で使用したB5R配列確認プライマー（配列番号２７、配列番号２８）、VGF配列確認プライマー（配列番号２９、配列番号３０）、O1L配列確認プライマー（配列番号３１、配列番号３２）とPCR試薬（Takara、製品番号：R045A、R045B）を用いてPCRを行ったところ、バンドサイズからVGF配列の欠損及びO1L配列の欠損が確認できた。さらに、より詳細な解析を行うため、全てのPCR産物を精製し、塩基配列解析を行ったところ、B5R遺伝子配列中の特定の位置に、欠損されている塩基（グアニン）が挿入されていること（LC16mO型への改変）、VGF配列及びO1L配列が想定通り欠損されていることを確認した。
【００８６】
以上の結果より、ヘルパーウイルスとしてMD-RVVを用いて、RK13細胞からMD-RVV-BACmid由来ウイルス（MD-RVV-BACgfp）の回収に成功した。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明のウイルスの製造方法は、増殖性のワクシニアウイルスをヘルパーウイルスとして用いてウイルスを製造することができる。
【配列表】
2019187249000001.app