(57)【要約】      （修正有）【課題】完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質を産生するための新たな技術を提供する。【解決手段】完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子が導入されている、哺乳動物由来細胞であって、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子を含む二本鎖核酸を哺乳動物由来細胞に導入する導入工程を含む、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子が導入されている哺乳動物由来細胞の製造方法を有する。完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子は、好ましくは完全長ヒトメガリンタンパク質遺伝子である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子が導入されている、哺乳動物由来細胞。
【請求項２】
前記完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子が完全長ヒトメガリンタンパク質遺伝子である、請求項１に記載の哺乳動物由来細胞。
【請求項３】
完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子が、外因性である、請求項１又は２に記載の哺乳動物由来細胞。
【請求項４】
前記哺乳動物由来細胞が、ＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の哺乳動物由来細胞。
【請求項５】
前記哺乳動物由来細胞の溶解物中に、導入された前記遺伝子に基づき産生された完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質が全タンパク質１ｍｇ当たり１ｐｍｏｌ以上含まれるように、前記完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質を産生することができる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の哺乳動物由来細胞。
【請求項６】
前記哺乳動物由来細胞が、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６３３にて寄託された細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の哺乳動物由来細胞。
【請求項７】
完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子を含む二本鎖核酸を哺乳動物由来細胞に導入する導入工程を含む、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子が導入されている哺乳動物由来細胞の製造方法。
【請求項８】
前記完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子が完全長ヒトメガリンタンパク質遺伝子である、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子を含む二本鎖核酸を、哺乳動物由来細胞に導入し、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子が導入されている哺乳動物由来細胞を得る工程と、
得られた哺乳動物由来細胞を、培養する工程と、
を含む、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物由来細胞及び哺乳動物由来細胞の製造方法に関する。特には完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子、より特には完全長ヒトメガリンタンパク質遺伝子が導入されている哺乳動物由来細胞及び当該哺乳動物由来細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ３３０（ｇｐ３３０）あるいはＬｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＬＤＬ）−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（ＬＲＰ２）としても知られるメガリン（Ｍｅｇａｌｉｎ）は、腎臓の近位尿細管上皮細胞に発現し、分子量が約６００ｋＤａの糖タンパク質である。
【０００３】
メガリンは腎臓のラット近位尿細管上皮細胞を用いた細胞培養実験において、膜結合型の完全長メガリンと、細胞内領域を欠いたＳｏｌｕｂｌｅ−Ｆｏｒｍ（細胞外領域断片）の２種類が存在している可能性が示唆されていた。ヒトにおいて、この傍証が定量的に検証され、やはりヒトメガリンにおいても２種類（完全長型とＳｏｌｕｂｌｅ−Ｆｏｒｍ）が存在する確証が得られている。尿中の完全長ヒトメガリン、細胞外領域、及び細胞内領域を測定する方法も報告されている（特許文献１）。
【０００４】
メガリンを産生する非組換え細胞として、ヒト結腸腺癌由来細胞Ｃａｃｏ−２、ヒト妊娠性絨毛癌由来細胞ＪＥＧ−３、ＪＡＲ、ヒト前立腺癌由来細胞ＰＣ−３、ＬＮＣａＰなどが存在する（非特許文献１、２）。
また、遺伝子組換え技術によってヒトメガリンタンパク質を産生することも開示されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開第２０１０−２５６２５０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｈａｎｔｅｌ  Ｂ．  Ｔｅｒｎｅｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｔｈｅｗ  Ｊ．  Ｒｏｗｌｉｎｇ（２０１３）Ｎｕｔｒ．Ｃａｎｃｅｒ．６５（６）：９００−９０７
【非特許文献２】Ｓｔｏｒｍ  Ｔ．  ，  Ｍ．  Ｍａｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．６４（１２）：７６９−７８４．
【非特許文献３】Ｂａｙ  Ａ．Ｅ．Ｐ．，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｂｏｕｌａｎ  Ｅ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  １６；７：１１５５０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質を工業的に生産することができれば、検査試薬として又は抗体作成用抗原として役立つと考えられる。しかしながら、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質はこれまで工業的に生産することができなかった。完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質を工業的に生産することができない理由の一つとして、その分子量が大きいことが考えられる。
【０００８】
上記非特許文献１及び２には、ヒトメガリンタンパク質を産生する細胞が記載されている。しかしながら、これらの細胞によるヒトメガリンタンパク質の産生量は少ない。そのため、これらの細胞は工業的利用に適さない。
【０００９】
上記非特許文献３には、遺伝子組換え技術によってヒトメガリンタンパク質を産生することも開示されている。しかしながら、非特許文献３に記載された技術により産生されるタンパク質は、ヒトメガリンタンパク質の一部断片であって、完全長のヒトメガリンタンパク質でない。
【００１０】
ヒトの腎臓組織から完全長ヒトメガリンタンパク質を取得することも考えられるが、利用可能なヒトの腎臓組織の量には限りがあり、さらに、倫理的な観点からも望ましくない。
【００１１】
本発明は、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質を産生するための新たな技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子が導入されている、哺乳動物由来細胞を提供する。
本発明の一つの実施態様に従い、前記完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子は完全長ヒトメガリンタンパク質遺伝子であってよい。
本発明の一つの実施態様に従い、前記哺乳動物由来細胞は、前記完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子が導入されていない状態では、前記完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子を発現しないものでありうる。
本発明の一つの実施態様に従い、前記哺乳動物由来細胞は、ＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞であってよい。
本発明の一つの実施態様に従い、前記哺乳動物由来細胞は、前記哺乳動物由来細胞の溶解物中に、導入された前記遺伝子に基づき産生された完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質が全タンパク質１ｍｇ当たり１ｐｍｏｌ以上含まれるように、前記完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質を産生することができるものでありうる。
本発明の一つの実施態様に従い、前記哺乳動物由来細胞が、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６３３として寄託された細胞でありうる。
【００１３】
また、本発明は、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子を含む二本鎖核酸を哺乳動物由来細胞に導入する導入工程を含む、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子が導入されている哺乳動物由来細胞の製造方法も提供する。
本発明の一つの実施態様に従い、前記製造方法は、前記導入工程において前記核酸を導入された哺乳動物由来細胞のうちから、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質の産生能を有する哺乳動物由来細胞を選択する選択工程をさらに含みうる。
本発明の一つの実施態様に従い、前記完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子が完全長ヒトメガリンタンパク質遺伝子でありうる。
本発明の一つの実施態様に従い、前記選択工程は、前記導入工程において前記核酸を導入された哺乳動物由来細胞のうちから、哺乳動物由来細胞の溶解物中に、導入された前記遺伝子に基づき産生された完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質が全タンパク質１ｍｇ当たり１ｐｍｏｌ以上含まれるように、前記完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質を産生することができる細胞を選択することを含みうる。
また、本発明は、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子を含む二本鎖核酸を、哺乳動物由来細胞に導入し、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子が導入されている哺乳動物由来細胞を得る工程と、得られた哺乳動物由来細胞を、培養する工程と、を含む、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質の製造方法も提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に従う哺乳動物由来細胞によって、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質を効率的に製造することができる。完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質、特にはヒトメガリンタンパク質、を安定的に且つ高効率で製造することはこれまで実現されていなかった。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】プラスミドＤＮＡを導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解液に対してウエスタンブロッティングを行った結果を示す図である。
【図２】プラスミドＤＮＡを導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解液をＦＬＡＧタグ精製することにより得られた精製画分に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図である。
【図３】プラスミドＤＮＡを導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解液をＦＬＡＧタグ精製することにより得られた精製画分に対してウエスタンブロッティングを行った結果を示す図である。
【図４】ヒトメガリンタンパク質安定発現細胞プールの細胞溶解物に対して、Ａｎｔｉ―ＬＢＤ１およびＡｎｔｉ―ＦＬＡＧの両方の抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果を示す図である。
【図５】ヒトメガリンタンパク質安定発現細胞プールにおけるヒトメガリンタンパク質の発現を確認した図である。
【図６】ヒトメガリンタンパク質高発現ＨＥＫ２９３細胞株であるクローンＮｏ．７、４４、及び４５のヒトメガリンタンパク質発現量を示す図である。
【図７】組換え細胞および非組換え細胞におけるヒトメガリンタンパク質産生量の比較結果を示す図である。
【図８】ヒトメガリンタンパク質高発現ＨＥＫ２９３細胞株である２９３−Ｍ７細胞株およびｍｏｃｋの細胞上でのメガリンの発現を間接蛍光免疫染色法で確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
１．哺乳動物由来細胞
【００１８】
本発明は、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子が導入されている、哺乳動物由来細胞を提供する。
【００１９】
本発明に従う哺乳動物由来細胞は、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質の産生能を有しうることから、本発明に従う哺乳動物由来細胞によって、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質を効率的に製造することができる。完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質、特には完全長メガリンタンパク質、より特には完全長ヒトメガリンタンパク質、を安定的に且つ高効率で製造することはこれまで実現されていなかった。
２００ｋＤａ以上の分子量を有する単純一本鎖構造のタンパク質は、巨大タンパク質とも呼ばれる。巨大タンパク質は、大量に製造することがしばしば困難である。一方で、巨大タンパク質は、重要な機能又は用途をしばしば有する。本発明によって、巨大タンパク質である完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質、特には完全長ヒトメガリンタンパク質を製造することが可能となる。
【００２０】
本発明に従う哺乳動物由来細胞を用いて製造される完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質は、例えば薬剤の評価系を構成する試薬の一つとして、特には完全長ヒトメガリンタンパク質の標準品として使用することができる。例えば、本発明により製造される完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質は、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質（特にはヒトメガリンタンパク質）の存在の確認ための又は完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質（特には完全長ヒトメガリンタンパク質）の量の測定のための試薬又はキットにおいて、標準品として用いることができる。
【００２１】
また、本発明に従う哺乳動物由来細胞を用いて製造される完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質は、完全長タンパク質であるので、より良い免疫原として利用することができる。すなわち、本発明に従う哺乳動物由来細胞を用いて製造される完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質は、抗完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質抗体を作製する為の免疫原として用いることもできる。また、当該哺乳動物由来細胞自体を免疫原として利用することもできる。
【００２２】
また、本発明に従う哺乳動物由来細胞を用いて製造される完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質は、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質の標準品として利用することもできる。
【００２３】
（ヒトＬＤＬ受容体タンパク質）
本明細書内において、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質とは、例えば低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）などの種々のリガンドの細胞内取り込み、又は、シグナル伝達を司る機能タンパク質でありうる。完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質は、ＬＤＬ受容体ファミリーに属するタンパク質である。
ＬＤＬ受容体ファミリーに属するタンパク質は、例えばリガンド結合ドメイン、上皮成長因子（ＥＧＦ）前駆体相同ドメイン、及びＯ−結合糖ドメインを細胞外領域に有するという構造的特徴を有しうる。さらに、ＬＤＬ受容体ファミリーに属するタンパク質は、細胞膜ドメインとして１回膜貫通ドメインを有するという構造的特徴を有しうる。さらに、ＬＤＬ受容体ファミリーに属するタンパク質は、細胞内ドメインとして、ＮＰｘＹドメインを有しうる。ＮＰｘＹドメインは、種々の細胞内タンパク質と結合する部位として知られており、シグナル伝達及び／又はエンドサイトーシス誘起を司る。本発明において、ヒトＬＤＬ受容体タンパク質は、上記細胞外領域と、上記細胞膜ドメインと、上記細胞内ドメインとを有するタンパク質でありうる。
【００２４】
ＬＤＬ受容体ファミリーに属するタンパク質の具体的な例として、ＬＤＬＲ（Ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＬＲＰ１（ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）、ＬＲＰ１Ｂ（ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ１Ｂ）、ＬＲＰ２（ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）、ＬＲＰ３（ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３）、ＬＲＰ４（ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４）、ＬＲＰ５（ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５）、ＬＲＰ６（ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６）、ＬＲＰ８（ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ８）、ＬＲＰ１０（ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １０）、ＬＲＰ１１（ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １１）、ＬＲＰ１２（ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ１２）、及びＶＬＤＬＲ（Ｖｅｒｙ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明において、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質は、好ましくは完全長ＬＲＰ２である。ＬＲＰ２は、メガリンタンパク質とも呼ばれる。
【００２６】
（ヒトメガリンタンパク質）
本発明において、完全長ヒトメガリンタンパク質とは、
（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列のうち１または複数個のアミノ酸が置換、欠失および／または切断されたアミノ酸配列を含むタンパク質、及び
（ｃ）配列番号６に記載のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質
を包含する。
上記（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）のタンパク質は、上記（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）のそれぞれに記載されたとおりのアミノ酸配列のみからなるタンパク質と、上記（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）のそれぞれに記載されたとおりのアミノ酸配列及び追加アミノ酸配列を含むアミノ酸配列とを、包含する。当該追加アミノ酸配列として、例えばシグナルペプチドのアミノ酸配列及び蛍光タンパク質のアミノ酸配列を挙げることができる。当該シグナルペプチドは、配列番号６に記載のアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端に結合されていてよい。
【００２７】
シグナルペプチドとして、例えば配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するペプチド又は当該配列のうち１、２、又は３残基が置換、欠失および／または切断されたアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。好ましくは、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するペプチド又は当該配列のうち１、２、又は３残基が置換、欠失および／または切断されたアミノ酸配列を有するペプチドは、上記（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）のタンパク質のＮ末端に結合されうる。
【００２８】
上記（ａ）のタンパク質は、例えば配列番号４のアミノ酸配列を有しうる。配列番号４のアミノ酸配列は、配列番号６に記載のアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５のアミノ酸配列が結合したものである。配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質は、前駆体メガリンタンパク質とも呼ばれる。本発明において、好ましくは、完全長ヒトメガリンタンパク質は、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質又は配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００２９】
上記（ｂ）のタンパク質は、好ましくは配列番号６に記載のアミノ酸配列のうち１〜１００、より好ましくは１〜５０、さらにより好ましくは１〜１０、又は１、２、３、４、又は５のアミノ酸が置換、欠失および／または切断されたアミノ酸配列でありうる。
【００３０】
上記（ｃ）のタンパク質は、好ましくは配列番号６に記載のアミノ酸配列と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上、より好ましくは９９．９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質でありうる。
【００３１】
（完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質の産生能）
本発明に従う哺乳動物由来細胞は、好ましくは完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質の産生能、特には完全長ヒトメガリンタンパク質の産生能を有しうる。当該産生能は、導入された完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子によるものであってよい。
【００３２】
本発明に従う哺乳動物由来細胞は、好ましくは、前記哺乳動物由来細胞溶解物中に含まれる全タンパク質１ｍｇ当たり、導入された前記遺伝子に基づき産生された完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質（特には完全長ヒトメガリンタンパク質）が１ｐｍｏｌ以上含まれるように、当該完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質（特には完全長ヒトメガリンタンパク質）を産生することができるものでありうる。より好ましくは、本発明に従う哺乳動物由来細胞は、前記哺乳動物由来細胞溶解物中に含まれる全タンパク質１ｍｇ当たり、導入された前記遺伝子に基づき産生された完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質（特には完全長ヒトメガリンタンパク質）が５ｐｍｏｌ以上、より好ましくは６ｐｍｏｌ以上、さらにより好ましくは７ｐｍｏｌ以上含まれるように、当該完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質を産生することができるものでありうる。このような完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質産生能を有する哺乳動物由来細胞を用いることで、より効率的に完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質を製造することができる。当該産生能を有する哺乳動物由来細胞として、例えば受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６３３として寄託された細胞を挙げることができる。
そのような哺乳動物由来細胞は、哺乳動物由来細胞に、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子を導入し、こうして得られた哺乳動物由来細胞を、哺乳動物由来細胞溶解物中に含まれる全タンパク質１ｍｇ当たりの完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質（特には完全長ヒトメガリンタンパク質）の量によって、選択することによって得ることができる。抗完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質モノクローナル抗体を用いて選択することが好ましい。
前記哺乳動物由来細胞溶解物中に含まれる全タンパク質１ｍｇ当たりの完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質（特には完全長ヒトメガリンタンパク質）の量は、例えば３５ｐｍｏｌ以下、特には３２ｐｍｏｌ以下、より特には３０ｐｍｏｌ以下であってよい。
前記哺乳動物由来細胞溶解物中に含まれる全タンパク質１ｍｇ当たりの完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質（特には完全長ヒトメガリンタンパク質）の量は、以下の実施例の「３−２：トランスフェクション」に記載の方法により前記哺乳動物由来細胞をトランスフェクション、培養し、得られた細胞を、以下の実施例の「３−４：ヒトメガリンタンパク質の定量」に記載の方法により決定する。前記哺乳動物由来細胞溶解物は、特には哺乳動物由来細胞溶解物の上清であり、より特には当該上清を孔径０．２２μｍのフィルターでろ過して得られたろ液である。
代替的に、目的のタンパク質を発現する哺乳動物由来細胞を入手し、培養し、分析する際には、次の条件で培養し、分析しても同様の結果が得られる：前記哺乳動物由来細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で５日間培養する。なお、１プレート当たり１０ｍＬの培地を用い、細胞は５×１０５〜１×１０６細胞／プレートで播種する。
哺乳動物由来細胞に、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子を導入することは、自体公知の遺伝子導入技法で達成することができる。例えば、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子を含む環状二本鎖核酸を哺乳動物由来細胞に導入することによって、本発明の哺乳動物由来細胞を作成することができる。
【００３３】
（細胞溶解物）
本発明における、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子が導入された哺乳動物由来細胞は、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質を含む限り、その溶解物を包含する。
好ましくは、当該溶解物は、当該溶解物中に含まれる全タンパク質１ｍｇ当たり、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質（特には完全長ヒトメガリンタンパク質）を１ｐｍｏｌ以上含むものでありうる。より好ましくは、当該溶解物は、当該溶解物中に含まれる全タンパク質１ｍｇ当たり、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質（特には完全長ヒトメガリンタンパク質）を５ｐｍｏｌ以上、より好ましくは６ｐｍｏｌ以上、さらにより好ましくは７ｐｍｏｌ以上含むものでありうる。
当該溶解物は、例えば前記哺乳動物由来細胞の溶解物の遠心分離により得られる上清であってもよく、より特には当該上清を、例えば孔径０．２２μｍのフィルターで、ろ過して得られたろ液であってもよい。
【００３４】
（哺乳動物細胞）
本発明において、哺乳動物由来細胞は、例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、又はモルモットに由来する細胞であってよく、より好ましくはヒト、サル、ハムスター、マウス、ラット、又はイヌに由来する細胞であり、さらにより好ましくはヒト又はサル由来細胞であり、特に好ましくはヒト由来細胞でありうる。
【００３５】
本発明において、哺乳動物由来細胞は、好ましくは哺乳動物の腎臓、卵巣、末梢血、子宮、副腎髄質に由来する細胞であり、さらにより好ましくは哺乳動物の腎臓に由来する細胞でありうる。
本発明において、哺乳動物由来細胞は、好ましくは胎児由来細胞である。
【００３６】
特に好ましくは、本発明において、哺乳動物由来細胞は、ヒト胎児腎臓由来細胞である。完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子を導入されたヒト胎児腎臓由来細胞、特には当該遺伝子を含む環状二本鎖核酸を導入されたヒト胎児腎臓由来細胞は、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質（特には完全長ヒトメガリンタンパク質）を効率的に産生することができる。
【００３７】
より具体的には、本発明において完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子が導入される哺乳動物細胞として、例えばヒト胎児腎臓由来細胞、ハムスター（特にはチャイニーズハムスター）卵巣由来細胞、ヒト末梢血由来細胞、ヒト子宮頚部由来細胞、イヌ腎臓由来細胞、マウス胎児由来細胞、ラット副腎由来細胞、及びサル腎臓由来細胞を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００３８】
ヒト胎児腎臓由来細胞は、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、及びＨＥＫ２９３Ｆ細胞を包含する。ハムスター卵巣由来細胞は、例えばＣＨＯ細胞を包含する。ヒト末梢血由来細胞は、例えばＨＬ−６０細胞を包含する。ヒト子宮頚部由来細胞は、例えばＨｅＬａ細胞を包含する。イヌ腎臓由来細胞は、例えばＭＤＣＫ細胞を包含する。マウス胎児由来細胞は、例えばＮＩＨ３Ｔ３細胞を包含する。ラット副腎由来細胞は、例えばＰＣ１２細胞を包含する。サル腎臓由来細胞は、例えばＶｅｒｏ細胞を包含する。これらの細胞はいずれも市販入手可能である。
【００３９】
本発明の特に好ましい実施態様に従い、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子が導入されている哺乳動物細胞はヒト胎児腎臓由来細胞であり、より好ましくはヒト胎児腎臓細胞をアデノウィルスのＥ１遺伝子によりトランスフォーメーションして得られたヒト胎児腎臓由来細胞であり、さらにより好ましくはＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、又はＨＥＫ２９３Ｆ細胞である。ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子（特にはヒトメガリンタンパク質遺伝子）を含む環状二本鎖核酸を導入されたＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、又はＨＥＫ２９３Ｆ細胞は、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質（特には完全長ヒトメガリンタンパク質）を効率的に産生することができる。
【００４０】
例えば、上記ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、及びＨＥＫ２９３Ｆ細胞はいずれも、完全長ヒトメガリンタンパク質遺伝子が導入される前には、完全長ヒトメガリンタンパク質を発現しないにもかかわらず、これらの細胞は完全長ヒトメガリンタンパク質の産生に適している。そのため、本発明の特に好ましい実施態様において、前記哺乳動物由来細胞はＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及びＨＥＫ２９３Ｆ細胞から選ばれるいずれか一つであり、前記完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子は完全長ヒトメガリンタンパク質遺伝子であり、且つ、前記完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質の産生能が、完全長ヒトメガリンタンパク質の産生能である。
或る細胞が完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質を発現しない細胞であるかどうかは、当該或る細胞又は当該細胞の溶解物に対して、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質に対して特異的な抗体を用いてＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロッティングを行い、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質が検出されないかどうかにより決定されてよい。上記試験の結果、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質が検出されない場合に、当該試験に付された細胞は完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質を発現しない細胞であると決定される。疑義の回避のために付言すると、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質の分解物が検出される場合、当該試験に付された細胞は完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質を発現しない細胞ではないと決定される。
【００４１】
本発明において、「完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子が導入された」とは、当該完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質をコードする外因性の(exogenous)二本鎖核酸が核内に含まれているがゲノム内に組み込まれていないこと、および、当該外因性の二本鎖核酸が当該細胞のゲノム内に組み込まれていることが包含される。
後者の場合、ゲノム外の核内に完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質をコードする二本鎖核酸が存在しなくてもよい。すなわち、本発明において、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子が導入された細胞は、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子をゲノム内に含むがゲノム外の核内に該完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質をコードする二本鎖核酸を有さない細胞を包含する。
本明細書にいう「外因性の核酸」または「外因性の遺伝子」は、ある宿主に固有ではない核酸または遺伝子を意味し、外因性の核酸または遺伝子は、同種性遺伝子または核酸、および異種性遺伝子または核酸の両方を包含する。
【００４２】
本発明において、「二本鎖核酸」とは、例えば二本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＲＮＡであり、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
本発明において、「完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子を含む二本鎖核酸」とは、例えば任意のベクターに完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子が組み込まれた二本鎖核酸をいう。当該ベクターは、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子に加えて、種々の他の構成要素を含む。含まれることが望ましい他の構成要素として、例えば複製起点、プロモーター、シグナル配列（シグナルペプチドをコードする配列）、アフィニティタグ、ｐｏｌｙ−Ａ配列、非翻訳領域、及び薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。取り扱い性の点で、二本鎖核酸は、環状二本鎖核酸が好ましい。
以下で、ベクターに含まれうるこれらの構成要素について説明する。
【００４３】
（完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子）
完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子とは、上記で述べたＬＤＬ受容体ファミリーに属するタンパク質のいずれかをコードする遺伝子である。好ましくは、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子は、完全長ＬＲＰ２遺伝子、すなわち完全長ヒトメガリンタンパク質遺伝子でありうる。
【００４４】
（完全長ヒトメガリンタンパク質遺伝子）
本発明において、完全長ヒトメガリンタンパク質遺伝子とは、上記（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子をいう。
完全長ヒトメガリンタンパク質遺伝子は、例えば、
（Ａ）配列番号３に記載の塩基配列を含む遺伝子、
（Ｂ）配列番号３に記載の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、且つ、上記（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子、及び、
（Ｃ）配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、且つ、上記（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子
を包含する。
上記（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）の遺伝子は、上記（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）のそれぞれに記載されたとおりの塩基配列のみからなる遺伝子と、上記（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）のそれぞれに記載されたとおりの塩基配列及び追加塩基配列を含む塩基配列と、を包含する。当該追加塩基配列として、例えばシグナルペプチド又は蛍光タンパク質をコードする塩基配列を挙げることができる。当該シグナルペプチドをコードする配列は、上記（Ａ）、（Ｂ）、又は（Ｃ）に記載の塩基配列の５’末端又は３’末端に結合されていてよい。
【００４５】
当該シグナルペプチドをコードする塩基配列として、例えば配列番号２に記載の塩基配列又は当該塩基配列のうち１、２、又は３塩基が置換、欠失および／または切断された塩基配列を挙げることができる。好ましくは、配列番号２に記載の塩基配列又は当該塩基配列のうち１、２、又は３塩基が置換、欠失および／または切断された塩基配列は、上記（Ａ）、（Ｂ）、又は（Ｃ）に記載の塩基配列の５’末端に結合されうる。
【００４６】
上記（Ａ）の遺伝子は、例えば配列番号１に記載の塩基配列でありうる。配列番号１に記載の塩基配列は、配列番号３に記載の塩基配列の５’末端に配列番号２に記載の塩基配列が結合したものである。配列番号１に記載の塩基配列からなるタンパク質は、前駆体メガリンタンパク質をコードする。本発明において、好ましくは、ヒトメガリンタンパク質遺伝子は、配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子又は配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子である。
【００４７】
上記（Ｂ）の遺伝子は、好ましくは配列番号３に記載の塩基配列と好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上、より好ましくは９９．９％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子でありうる。
【００４８】
上記（Ｃ）の遺伝子に関して、「ストリンジェントな条件」は、例えば塩基配列の長さなどの情報を基に、適宜決定されてよい。例えば、ストリンジェントな条件は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照して設定することができる。
具体的なストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーション液（５０％ホルムアミド、１０×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、及び５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））中に配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列と被検ＤＮＡとを添加し、約４２℃〜約５０℃でインキュベーションし、そして０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて約６５℃〜約７０℃で洗浄する条件である。
【００４９】
（複製起点）
本発明において、複製起点とは、哺乳動物由来細胞内で二本鎖核酸の複製開始を可能とするものであってよい。本発明において用いられる複製起点の例として、例えばＳＶ４０  ｏｒｉ、ＥＢＶ  ｏｒｉ、及びＨＰＶ  ｏｒｉなどを挙げることができるが、これらに限定されない。複製起点によって、ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子を含む二本鎖核酸を導入された哺乳動物由来細胞が細胞分裂したときに、当該二本鎖核酸が複製されて、娘細胞へ複製された二本鎖核酸が継承される。その結果、当該二本鎖核酸によりもたらされる形質も、当該娘細胞に継承される。好ましい実施態様において、本発明において用いられる好ましい複製起点は、ＳＶ４０  ｏｒｉでありうる。
【００５０】
（プロモーター）
本発明において、プロモーターとは、哺乳動物由来細胞内に二本鎖核酸によって導入される遺伝子の転写を行わせるための核酸配列であってよい。プロモーターは、通常は非翻訳領域である。本発明において用いられるプロモーターとして、例えばＣＭＶプロモーターやＥＦ１αプロモーターなどを挙げることができるが、これらに限定されない。本発明において用いられる好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーターでありうる。
【００５１】
（シグナルペプチド）
本発明において用いられる二本鎖核酸は、シグナルペプチドをコードする配列を含みうる。シグナルペプチドは、産生されたタンパク質の輸送及び／又は局在化を指示するためのものである。シグナルペプチドの例として、例えばＩｇκシグナル配列、ＩＬ−２シグナル配列、ＩＬ−６シグナル配列、ｐｒｅｐｒｏｔｒｙｐｓｉｎシグナル配列、Ｉｎｓｕｌｉｎシグナル配列、ＢＭ−４０シグナル配列、Ａｚｕｒｏｃｉｄｉｎシグナル配列、Ａｌｂｕｍｉｎシグナル配列、β−ｇｌｏｂｉｎシグナル配列、及びｇｐ６７シグナル配列などを挙げることができるが、これらに限定されない。好ましくはＩｇκシグナル配列がシグナルペプチドとして用いられる。
【００５２】
（アフィニティタグ）
本発明において、アフィニティタグは、産生されたタンパク質の精製のために用いられるアミノ酸配列をコードする配列であってよい。例えば、アフィニティタグが付加されたタンパク質は、当該アフィニティタグに対して親和性のある物質（例えば抗体など）を利用して精製されうる。アフィニティタグをコードする配列は、哺乳動物由来細胞に導入される遺伝子の設計段階で追加されうる。アフィニティタグは、転写及び翻訳を経て産生されたタンパク質の一部として生じてよく、例えば遺伝子がコードするタンパク質のＮ末端側又はＣ末端側に付加されていてよい。アフィニティタグとして、例えば、ストレプトタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ（ＤＤＫタグともいう）、Ｍｙｃタグ、Ｆｃタグ、及びＨＡタグなどを挙げることができるが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施態様において、アフィニティタグは、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、又はこれら２つのタグの組み合わせでありうる。
【００５３】
（ｐｏｌｙ−Ａ配列）
本発明において、ｐｏｌｙ−Ａ配列は、遺伝子が転写されて生じたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３’末端側に付加される配列である。ｐｏｌｙ−Ａ配列は、哺乳動物由来細胞内で目的ｍＲＮＡの安定化、核外輸送、又は核外輸送後の当該目的ｍＲＮＡからのタンパク質の産生（翻訳）に寄与しうる。ｐｏｌｙ−Ａ配列の由来（生物起源）は、当業者により適宜選択されてよい。ｐｏｌｙ−Ａ配列として、例えばｂｏｖｉｎｅ  ｐｏｌｙ−Ａ及びＳＶ４０  ｐｏｌｙ−Ａを挙げることができるが、これらに限定されない。
哺乳動物細胞を含む真核生物において、ポリアデニル化は目的ｍＲＮＡから目的タンパク質を産生する翻訳過程において、成熟ｍＲＮＡを産生するために不可欠である。また、ｐｏｌｙ−Ａ配列は、ｍＲＮＡの安定性、核外輸送、及び翻訳にとって重要である。ｐｏｌｙ−Ａ配列は、時間と共に短くなり、充分に短くなった時点でｍＲＮＡは酵素により分解される。少数の細胞ではｐｏｌｙ−Ａ配列の短いｍＲＮＡが再度ポリアデニル化されるために、細胞質に蓄えられうる。
【００５４】
（非翻訳領域）
本発明において、非翻訳領域として、例えばＷＰＲＥ（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ  ＰｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌＲｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）及びインスレーターなどを挙げることができる。
ＷＰＲＥは、目的遺伝子発現の調節エレメントであり、第一の３’非翻訳領域に存在しうる。ＷＰＲＥは、ｐｏｌｙ−Ａ配列のリードスルーを防ぎ、及び／又は、ＲＮＡのプロセシング及び成熟を促進しうる。ＷＰＲＥはまた、ＲＮＡの核外への輸送を増大させ得る。
インスレーターとは、目的遺伝子の上流（５’側）及び下流（３’側）の両方に存在し、目的遺伝子を挟み込む状態で機能する核酸配列エレメントである。インスレーターは、目的遺伝子の転写を、周囲のクロマチンによる影響を受けずに安定に制御できる配列でありうる。インスレーターとして例えば、ニワトリ赤芽球のベータグロビン遺伝子の転写を制御しているｃＨＳ４インスレーター配列、ショウジョウバエのｇｙｐｓｙインスレーター配列、ウニのヒストンＨ２Ａインスレーター配列、及びウニのＡｒｓインスレーター配列を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００５５】
（薬剤耐性遺伝子）
本発明において、薬剤耐性遺伝子は、目的遺伝子を哺乳動物由来細胞に導入する処理の後に、当該遺伝子が導入された哺乳動物由来細胞のみを、導入されていない哺乳動物由来細胞から区別する為に用いられる。薬剤を添加された細胞培養用培地に、遺伝子導入処理が行われた細胞集団をまきそして培養することで、薬剤耐性遺伝子が導入されていない哺乳動物由来細胞が死滅するので、当該遺伝子が導入された哺乳動物由来細胞のみを選択することができる。薬剤耐性遺伝子として、例えばカナマイシン／ネオマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ／Ｎｅｏ。当該遺伝子はカナマイシン及びネオマイシンに対して耐性を示す。また、Ｇ４１８に対しても耐性を示す。）、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ耐性遺伝子（Ｈｙｇ）、Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ  Ｓ耐性遺伝子（Ｂｓｄ）、Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子（Ｂｌｅ）、及びＰｕｒｏｍｙｃｉｎ／Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ耐性遺伝子（Ｐｕｒｏ。当該遺伝子は、ピューロマイシン及びアンピシリンに対して耐性を示す。）などを挙げることができるが、これらに限定されない。本発明において、二本鎖核酸は、好ましくはＫａｎａｍｙｃｉｎ耐性遺伝子及びＮｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を含みうる。
【００５６】
（標準品）
本発明に従う哺乳動物由来細胞を用いて製造された完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質、特には完全長ヒトメガリンタンパク質は、薬剤の評価系を構成する試薬の一つとして、特には標準品として使用することができる。標準品とは、診断目的又は薬理評価用目的で使用される評価系又は測定系において基準物質として使用される物質をいう。前記評価系として、例えば或る薬剤の有効性を評価するための評価系を挙げることができる。前記測定系として、精密定量目的の測定系又は半定量目的の測定系を挙げることができる。
【００５７】
（標準品の調製方法）
前記標準品の調製方法は、例えば、本発明に従う哺乳動物由来細胞を培養する培養工程、当該培養工程後に、当該哺乳動物由来細胞により産生された完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質、特には完全長ヒトメガリンタンパク質、を当該哺乳動物由来細胞から抽出する抽出工程、及び、当該抽出工程後に精製工程を含みうる。
培養工程は、前記哺乳動物由来細胞の種類に応じて当業者により適宜選択されてよい。
抽出工程は、当該哺乳動物由来細胞に対して、例えば超音波処理、フレンチプレス、乳鉢による粉砕、ホモジナイザーによる破砕、ガラスビーズによる破砕、カニューレシリンジによる吸引又は排出、浸透圧ショック、凍結融解、界面活性剤による可溶化、又は酵素による消化などを行うことを含みうる。または、これらの処理の２つ以上が組み合わされてもよい。
精製工程は、例えば産生された完全長ヒトメガリンタンパク質に付加されているアフィニティタグを利用した精製を行うことを含みうる。当業者は、アフィニティタグの種類に応じて、精製手段を適宜選択することができる。
【００５８】
（免疫抗原）
本発明に従う哺乳動物由来細胞を用いて製造された完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質、特には完全長ヒトメガリンタンパク質は、免疫抗原として使用することができる。完全長ヒトメガリンタンパク質は、ヒトメガリン断片よりも、より良い免疫抗原として利用することができる。
完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質、特には完全長ヒトメガリンタンパク質は、細胞膜に局在化されうる。そのため、本発明に従う哺乳動物由来細胞自体を免疫抗原として利用することもできる。
【００５９】
（免疫抗原の調製方法）
本発明に従う哺乳動物由来細胞を用いて製造された完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質、特には完全長ヒトメガリンタンパク質を免疫抗原として使用する場合、当該完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質は、上記で述べた標準品の調製方法により製造されてよい。また、免疫抗原の調製方法は、さらに、当該完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質を固定化する固定化工程を含みうる。固定化される基材及び固定化手法は当業者により適宜選択されてよい。
本発明に従う哺乳動物由来細胞自体を免疫抗原として利用する場合、免疫抗原の調製方法は、上記で標準品に関して述べた培養工程を含みうる。この場合、免疫抗原の調製方法は、当該哺乳動物由来細胞の固定化工程を含んでもよい。当該細胞の固定化剤は、当業者により適宜選択されうる。
【００６０】
（完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質の製造方法）
本発明に従う哺乳動物由来細胞を用いて完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質、特には完全長ヒトメガリンタンパク質、を製造することができる。
完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質、特には完全長ヒトメガリンタンパク質、の製造方法は、例えば、１）本発明に従う哺乳動物由来細胞を培養する培養工程、及び、２）当該細胞により産生された完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質を回収する回収工程、を含みうる。当該培養工程は、上記で述べたとおり、当該哺乳動物由来細胞の種類に応じて当業者により適宜選択されてよい。また、当該哺乳動物由来細胞の製造方法は、以下で述べる。当該回収工程は、標準品の調製方法において述べた抽出工程と同じであってよい。
【００６１】
２．哺乳動物由来細胞の製造方法
【００６２】
本発明は、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子を哺乳動物由来細胞に導入する導入工程を含む、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子が導入されている哺乳動物由来細胞の製造方法を提供する。前記導入工程では、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子として、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質をコードする二本鎖核酸、好ましくは環状二本鎖核酸を用いることができる。
【００６３】
本発明に従う製造方法によって完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質、特には完全長メガリンタンパク質、より特には完全長ヒトメガリンタンパク質、を安定的に且つ高効率を産生することができる哺乳動物由来細胞を製造することができる。
【００６４】
前記完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子、当該完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子を含む前記二本鎖核酸、前記哺乳動物由来細胞、前記完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質、及び当該タンパク質の産生能は、上記「１．哺乳動物由来細胞」において説明したとおりであるので、これらについての説明は省略する。
【００６５】
本発明に従う製造方法は、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子を哺乳動物由来細胞に導入する導入工程を含む。遺伝子導入は当分野において公知である任意の方法によって行われることができ、そのような方法としては例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含有するウイルスもしくはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体仲介による遺伝子導入、マイクロセル仲介性遺伝子導入、スフェロプラスト融合、等が挙げられるが、これらに限定されない。当該導入工程において、好ましくは、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子を含む二本鎖核酸を哺乳動物由来細胞に導入する。当該導入工程の具体的な手法は、前記二本鎖核酸の母体となるベクターの種類及び当該二本鎖核酸が導入される哺乳動物由来細胞の種類に応じて、当業者により適宜選択されてよい。当該導入工程の具体的な手法として、公知の手法を用いてよい。例えば、当該導入工程において、ベクターの細胞へのトランスフェクションのための試薬が用いられてよい。当該試薬として、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を挙げることができる。この試薬を用いたトランスフェクションは、当該試薬の製造者の指示に従って行われてよい。
【００６６】
本発明に従う製造方法は、前記導入工程において前記二本鎖核酸を導入された哺乳動物由来細胞のうちから、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質の産生能を有する哺乳動物由来細胞を選択する選択工程をさらに含むことができる。当該選択工程は、例えば、前記二本鎖核酸に含まれる薬剤耐性遺伝子を利用して行われてよい。当該選択工程は、例えば、上記「１．哺乳動物由来細胞」中の薬剤耐性遺伝子に関する説明において記載されたとおりに行われうる。
【００６７】
前記選択工程は、前記導入工程において前記遺伝子を導入された哺乳動物由来細胞のうちから、哺乳動物由来細胞溶解物中に含まれる全タンパク質１ｍｇ当たり、導入された前記遺伝子に基づき産生された完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質が１ｐｍｏｌ以上含まれるように、当該完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質を産生することができる細胞を選択することを含みうる。このような完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質の産生能を有する細胞を選択することによって、より効率的に完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質を産生することができる。哺乳動物由来細胞溶解物中に含まれる完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質の量の定量方法は、以下の実施例に記載のとおりである。
【００６８】
３．タンパク質の製造方法
【００６９】
本発明は、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子を含む二本鎖核酸を、哺乳動物由来細胞に導入し、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子が導入されている哺乳動物由来細胞を得る工程と、得られた哺乳動物由来細胞を、培養する工程と、を含む、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質の製造方法を提供する。
完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質遺伝子が導入されている哺乳動物由来細胞を得る工程は、前述の通りである。得られた哺乳動物由来細胞を培養する工程では、細胞が完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質を発現することが可能である条件下で細胞を培養する。そのような条件は自体公知であるが、例えば、哺乳動物由来細胞を増殖可能な培地、例えば１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で、２０〜５０℃で、０〜２０％ＣＯ２条件下で、１〜１００日間培養することができる。
【００７０】
前記製造方法は、培養された前記哺乳動物由来細胞から完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質を取得する取得工程をさらに含んでもよい。
前記取得工程は、例えば、培養された前記哺乳動物由来細胞を溶解又は破壊する溶解又は破壊工程を含みうる。当該工程において用いられる溶解手段又は破壊手段は、当業者により適宜選択されてよい。例えば、当業者に既知の細胞溶解用界面活性剤を用いて細胞を溶解することができる。又は、例えば当業者に既知の手段（例えば超音波破砕）などにより、細胞は破壊されてよい。
また、前記取得工程は、当該溶解又は破壊工程の後に、完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質を他の細胞成分から分離する分離工程を含みうる。当該分離工程では、例えば前記アフィニティタグを利用して、当該完全長ヒトＬＤＬ受容体タンパク質が分離されてよいが、他の分離手法が用いられてもよい。
【００７１】
以下で本発明の実施例を説明するが、本発明は実施例に記載の実施態様に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７２】
１：ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞による完全長ヒトメガリンタンパク質の一過性発現
【００７３】
１−１：メガリン発現用プラスミドＤＮＡ
ヒトメガリン遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを用意した。当該プラスミドＤＮＡは、ＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｍｅｇａｌｉｎ  ＯＲＦ−Ｍｙｃ  ｔａｇ−１×ＦＬＡＧ  ｔａｇ−ｐｏｌｙＡ  ｓｉｇｎａｌ−ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ−Ｋａｎａｍｙｃｉｎ／Ｎｅｏｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ−ＳＶ４０  ｏｒｉが、この順に連結されている環状二本鎖核酸である。当該プラスミドＤＮＡとして、ＯＲＩＧＥＮＥ社よりカタログ番号：ＲＣ２１３７０７として市販されているものを用いた。当該プラスミドＤＮＡは、配列番号１に記載された塩基配列を有する。配列番号１に記載された塩基配列が、上記Ｍｅｇａｌｉｎ  ＯＲＦに対応する。配列番号１に記載された塩基配列は、ヒトメガリンタンパク質のシグナルペプチドをコードする塩基配列（配列番号２）と、完全長ヒトメガリンタンパク質をコードする配列（配列番号３）からなる。すなわち、当該プラスミドＤＮＡは、前駆体ヒトメガリンタンパク質をコードする。
また、配列番号１、２、及び３のそれぞれに記載された塩基配列に対応するアミノ酸配列が、配列番号４、５、及び６に記載されたものである。
【００７４】
１−２：細胞株と培養
前記プラスミドＤＮＡが導入される哺乳動物由来細胞として、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣより分譲された）を用いた。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、ヒト胎児腎細胞をアデノウィルスのＥ１遺伝子によりトランスフォーメーションして樹立されたものである。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の培養培地として、１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた。前記哺乳動物由来細胞の培養条件は、３７℃且つ５％ＣＯ２であった。
【００７５】
１−３：プラスミドＤＮＡのＨＥＫ−２９３Ｔ細胞への導入（トランスフェクション）
前記培養培地を入れたディッシュ内でＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を培養した。当該細胞が９０％〜１００％コンフルエントになった時点でディッシュ内の培地をアスピレートで除いた。当該ディッシュに、恒温槽で３７℃に温めたＰＢＳ（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．３）を添加し、細胞表面を１回洗浄してアスピレートで当該ＰＢＳを除去した。３７℃に温めたＴｒｙｐｓｉｎ溶液を当該ディッシュに添加し、ＣＯ２インキュベーター内で３分間インキュベートした。インキュベート終了後に３７℃で温めた完全培地をディッシュに添加してＴｒｙｐｓｉｎを失活させた。遠沈（１３０×ｇ、３分間）後に上清を除き、細胞沈査に新鮮培地（上記１−２で述べたもの）を加えてピペッティングで攪拌した。撹拌後、細胞数が７×１０６個となるように新鮮培地を加え、ＣＯ２インキュベーター内で約２４時間培養した。
【００７６】
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１（２１．７μＬ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、５００μＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を作製した。Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２（１４μＬ  Ｐ３０００：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１４μｇ 前記プラスミドＤＮＡ、５００μＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を作製した。Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１とＳｏｌｕｔｉｏｎ２を混合して得た混合液を常温で５分間静置した。前日作製したプレート（上記１−２で述べた培地を含む）に当該混合液（約１ｍＬ）を添加し、全体にまんべんなく広げた。当該プレートを、ＣＯ２インキュベーター内で５日間培養した。培養終了後、培養上清をアスピレートして除いた。１ｍＬの１×ＰＢＳで細胞を剥がし、遠心分離（１３０×ｇ、３分間）した。上清をアスピレートして除いた。トランスフェクションした細胞に１ｍＬの細胞溶解液（１×ＰＢＳ、０．２%ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を添加した。添加後、室温で３０分間静置した。静置後、遠心分離（２００００×ｇ、２０分間）し、上清とペレットに分離した。上清を０．２２μｍのフィルターでろ過し、ヒトメガリンタンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解液とした。
【００７７】
１−４：ウエスタンブロッティング
２×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８％ｗ／ｖ  ＳＤＳ、４０％ｗ／ｖ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０２％ｗ／ｖ  Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ、４００ｍＭ  ＤＴＴ）と試料（上記１−３．で得られた溶解液）を等量混合し、９５℃で１０分以上インキュベートしてサンプルを用意した。泳動槽にＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル（４〜１５％ミニプロティアン ＴＧＸ プレキャストゲル、１５ウェル：ＢｉｏＲａｄ）と泳動用バッファーをセットした後、１５μＬのサンプルをゲルにアプライし、２００Ｖで３０分間泳動した。泳動後、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）を使って転写を行った（１．３Ａ、１５分間）。室温で１時間ブロッキング反応を行った。抗原抗体反応システムＳＮＡＰ  ｉ．ｄ．  ２．０（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にメンブレンをセットした。ブロッキング液を加え、室温で１時間静置した後、吸引して除いた。一次抗体溶液として抗ヒトメガリン細胞外領域マウスモノクローナル抗体（以下、Ａｎｔｉ−ＬＢＤ１とも称す）および抗ＦＬＡＧタグマウスモノクローナル抗体（以下、Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧとも称す）を加え、室温で１０分間静置した後、吸引して除いた。洗浄液ＰＢＳ−Ｔ（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、３．６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．３）を加えた後、吸引して除いた。当該洗浄液の添加しそして当該洗浄液を吸引除去する操作を３回繰り返した。５ｍＬの抗体希釈液で希釈した二次抗体溶液（Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎｓ  ＨＲＰ：Ｄａｋｏ）を加え、室温で１０分間静置した後、吸引して除いた。洗浄液ＰＢＳ−Ｔを加えた後、吸引して除いた。当該洗浄液の添加しそして当該洗浄液を吸引除去する操作を３回繰り返した。化学発光基質（ＣＤＰ−Ｓｔａｒ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｗｉｔｈ  Ｅｍｅｒａｌｄ−ＩＩ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えた後、速やかに化学発光画像を撮影した。撮影結果を図１に示す。
ここで、Ａｎｔｉ−ＬＢＤ１は、完全長メガリンタンパク質のＮ末端領域にあるＬＢＤ１に対する抗体である。Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧは、発現タンパク質のＣ末端領域にあるＦＬＡＧタグに対する抗体である。そのため、これら２つの抗体を用いて検出されたバンドが、完全長メガリンタンパク質のバンドである。なお、本試験で用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは２００ｋＤを超える高分子領域についての分離能がないが、上記のとおり２つの抗体を用いることで、完全長メガリンタンパク質の存在を確認することができる。
図１より、メガリン発現用プラスミドをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物（Ｍｅｇ＋）からヒトメガリンタンパク質に相当するバンドが検出されたことが分かる。
発現ベクターをトランスフェクションしていないＨＥＫ２９３Ｔ細胞についても、同様にウエスタンブロッティングを行った。その結果、図１に示されるとおり、発現ベクターをトランスフェクションしていないＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｍｅｇ−）からはヒトメガリンタンパク質に相当するバンドは検出されなかった。
以上のとおり、上記プラスミドＤＮＡをＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に導入することによって、ヒトメガリンを一過性に発現するポリクローナルなＨＥＫ２９３Ｔ細胞集団が得られた。
【実施例２】
【００７８】
２：組換え完全長ヒトメガリンタンパク質の精製
【００７９】
２−１：ＦＬＡＧタグ精製システムによる精製
上記「１：ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞による完全長ヒトメガリンタンパク質の一過性発現」と同様の方法を用いて、ヒトメガリンタンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解液を調製した。精製に必要な量の抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用意し、カラムに詰めた。適量の１×ＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１３８ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）によりカラムをすすぎ、グリセロールを除いた。０．１ＭグリシンＨＣｌで１ＣＶ（Ｃｏｌｕｍｎ  ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ）×３回、カラムを洗浄した。そして、５ＣＶの１×ＴＢＳでカラムを平衡化した。前記溶解液をカラムに通し、素通り画分を回収した。結合効率を上げるため、素通り画分を再度カラムに通した。素通り画分の回収しそして回収された画分をカラムへ通液する操作を３回行った。その後、１０ＣＶの１×ＴＢＳでカラムを洗浄した。２５μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを含んだチューブを６本用意した。０．１ＭグリシンＨＣｌで１ｍＬ×６回溶出することで、ＦＬＡＧタグを有するタンパク質を含む画分が、精製画分として得られた。
【００８０】
２−２：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
２×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒと前記精製画分とを等量混合して得られた混合液を９５℃で１０分以上インキュベートしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに付されるサンプルを得た。泳動槽にＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル（４−１５％ミニプロティアンＴＧＸプレキャストゲル、１５ウェル：ＢｉｏＲａｄ）と泳動用バッファーをセットした後、１５μＬの前記サンプルをゲルにアプライし、２００Ｖで３０分間泳動した。泳動後のゲルを２００ｍＬの蒸留水に浸し撹拌しながら５分インキュベートした後、蒸留水を棄てた。このように５分のインキュベートを行いそして蒸留水の廃棄する操作を３回繰り返した。次に、ゲルを５０ｍＬのＣＢＢ染色液（Ｂｉｏ−Ｓａｆｅクマシーステイン：ＢｉｏＲａｄ）に浸し、撹拌しながら室温で２０分インキュベートして染色した後、Ｂｉｏ−Ｓａｆｅクマシーステインを棄てた。染色したゲルを２００ｍＬの蒸留水に浸し、撹拌しながら室温でインキュベートし、蒸留水が青く着色したら蒸留水を交換して脱色した。脱色後、ゲルの画像を撮影した。撮影結果を図２に示す。精製画分（Ｅ２〜Ｅ６）からヒトメガリンタンパク質に相当する分子量にタンパク質が検出され、精製ヒトメガリンを得たことを確認した。
【００８１】
２−３：ウエスタンブロッティング
上記「１−４：ウエスタンブロッティング」で述べた手法と同様の手法により精製画分中のヒトメガリンを検出した。その結果を図３に示す。精製画分（Ｅ２〜６）からヒトメガリンタンパク質に相当するバンドが検出された（図３Ａ、Ｂ）。したがって、細胞溶解液からヒトメガリンタンパク質が精製できたことが、この実験でも確認された。
【実施例３】
【００８２】
３．完全長ヒトメガリンタンパク質を安定発現する細胞株プールの樹立
【００８３】
３−１：細胞株と培養
プラスミドＤＮＡが導入される哺乳動物由来細胞として、ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ−２９３細胞（ＡＴＣＣより分譲された）を用いた。当該細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養された。
【００８４】
３−２：トランスフェクション
上記「１−１：メガリン発現用プラスミドＤＮＡ」に記載のプラスミドＤＮＡを使用して、以下の通りにトランスフェクションが行われた。すなわち、前記培養培地中でＨＥＫ２９３細胞が培養されているディッシュから、当該培養培地をアスピレートで除いた。当該ディッシュに、恒温槽で３７℃に温めたＰＢＳ（上記「１−３：プラスミドＤＮＡのＨＥＫ−２９３Ｔ細胞への導入（トランスフェクション）」に記載のものと同じ）を添加し、細胞表面を１回洗浄してアスピレートで当該ＰＢＳを除去した。３７℃に温めたＴｒｙｐｓｉｎ溶液を当該ディッシュに添加し、ＣＯ２インキュベーター内で３分間インキュベートした。インキュベート終了後に３７℃で温めた完全培地をディッシュに添加してＴｒｙｐｓｉｎを失活させた。遠沈（１３０×ｇ、３分間）後に上清を除き、細胞沈査に新鮮培地（上記３−１に記載の培地）を加えてピペッティングで攪拌した。撹拌後、細胞数が７×１０６個となるように新鮮培地を加え、ＣＯ２インキュベーター内で約２４時間培養した。
【００８５】
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１（２１．７μＬ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、５００μＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を作製した。Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２（１４μＬ  Ｐ３０００：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１４μｇ  前記プラスミドＤＮＡ、５００μＬＯｐｔｉ−ＭＥＭ：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を作製した。Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１とＳｏｌｕｔｉｏｎ２を混合して得た混合液を常温で５分間静置した。前日作製したプレート（上記３−１に記載の培地を含む）に当該混合液（約１ｍＬ）を添加し、全体にまんべんなく広げた。当該プレートを、ＣＯ２インキュベーター内で２日間培養した。培地を選択培地（上記３−１に記載の培地に５００μｇ／ｍＬとなるようにＧ４１８を加えたもの）に交換した。その後、３〜４日ごとに選択培地を新鮮なものに交換した。トランスフェクション２０日後、コロニーをピックアップし、２４ウェルプレートに播種し、細胞プールとした。２４ウェルプレートで培養した当該細胞プールを６ウェルプレートにスケールアップした。６ウェルプレートで培養した細胞プールを１０ｃｍディッシュに播種した（当該ディッシュは、下記実施例４において用いられた）。その際、６ウェルプレートで培養した細胞プールの一部を、前記選択培地が入った別の６ウェルプレートに播種し、細胞ライセート調製用として用い、以下の処理を行った。すなわち、当該別の６ウェルプレートのウェル内の培地をアスピレートで除き、恒温槽で３７℃に温めたＰＢＳを添加し、細胞表面を１回洗浄してアスピレートで除去した。細胞を溶解するための液（１×ＰＢＳ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）３００μｌを、各ウェルに添加した。ピペッティングで細胞をはがした。前記液の添加によって得られた細胞溶解物を遠心（２００００×ｇ、１０分間）した。ピペットで上清を取り、当該上清を孔径０．２２μｍのフィルターでろ過して、ろ液を得た。当該ろ液に対して、以下のウエスタンブロッティング処理を行った。
【００８６】
３−３：ウエスタンブロッティング
前記ろ液に含まれるヒトメガリンを、上記「１−４：ウエスタンブロッティング」に記載の手法と同様の手法により検出した。検出結果を図４に示す。図４に示されるとおり、Ａｎｔｉ−ＬＢＤ１およびＡｎｔｉ−ＦＬＡＧの両方の抗体によってメガリンに相当する分子量のタンパク質を発現するクローンが前記細胞プール内に含まれることが確認された。両方の抗体によってメガリンに相当する分子量のタンパク質を発現するクローンを含む細胞プールを、ヒトメガリン発現ＨＥＫ２９３細胞集団として、以下の「４：完全長ヒトメガリンタンパク質を高発現する単一細胞株の樹立」にて用いた。
【００８７】
３−４：ヒトメガリンタンパク質の定量
認識するエピトープの異なる２種の抗ヒトメガリンモノクローナル抗体を用いて前記ろ液中のヒトメガリン量を測定した。抗ヒトメガリンモノクローナル抗体固相化マイクロタイタープレートと、アルカリフォスファターゼ（以下ＡＬＰと略す）標識化抗ヒトメガリンモノクローナル抗体を用いて、前記ろ液中のヒトメガリン濃度を測定した。抗ヒトメガリンモノクローナル抗体として、特開２０１０−２５６２５０の実施例３にしたがって得られた抗ヒトメガリンＣｔａｉｌモノクローナル抗体Ａを用い、およびＡＬＰ標識化抗ヒトメガリンモノクローナル抗体として、特開２０１０−２５６２５０の実施例３にしたがって得られたＡＬＰ標識化抗ヒトメガリンＣｔａｉｌモノクローナル抗体Ｂを用いた。
まず、前記ろ液６μＬを希釈溶液（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ８．０）２３４μＬで希釈し、希釈されたろ液１００μＬを抗ヒトメガリンモノクローナル抗体固相化マイクロタイタープレート（ＦｌｕｏｒｏＮｕｎｃＴＭ  Ｍｏｄｕｌｅ  ｐｌａｔｅ、  Ｆ１６、  Ｍ  ｔｙｐｅ：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェルへ加えた。当該希釈されたろ液のウェルへの添加後、３７℃で１時間放置し、その後、ウェル中の当該希釈されたろ液をデカンテーションにより除去した。その後、マイクロタイタープレートのウェルへ、ＴＢＳ−Ｔ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０５％（ｖ．／ｖ．）Ｔｗｅｅｎ２０）を２００μＬ／ウェルで添加し、デカンテーションによりＴＢＳ−Ｔの除去を行うという洗浄工程を行った。この洗浄工程を計３回行った。その後、ＡＬＰ標識化抗ヒトメガリンモノクローナル抗体（０．５ｎｇ／ｍＬ）溶液を１００μＬ／ウェルで加えた。当該ウェルへの当該抗体溶液の添加後、当該ウェルを３７℃で１時間放置し、その後、当該ウェル中の当該抗体溶液をデカンテーションにより除去した。当該除去後、当該ウェルへＴＢＳ−Ｔを２００μＬ／ウェルで添加し、デカンテーションによるＴＢＳ−Ｔの除去を行い、洗浄を行った。この洗浄工程を計４回行った。その後、各ウェルへ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．８（以下、Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒと略す）を２００μＬ／ウェルで添加し、デカンテーションによるＡｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒの除去を行い、洗浄を行った。この洗浄を計２回行った。次に、各ウェルへ、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｏｒ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｕｓｅ（０．４ｍＭ）ｗｉｔｈ  Ｅｍｅｒａｌｄ−ＩＩＴＭ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ（ＥＬＩＳＡ−ＬｉｇｈｔＴＭＳｙｓｔｅｍ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をＡＬＰ酵素反応基質溶液として、１００μＬ／ウェルで加え、３７℃で３０分間遮光放置した。その後直ちに、各ウェルの化学発光強度を測定し、測定値を前記ろ液中の完全長ヒトメガリン測定評価の指標とした。化学発光強度の測定には、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いた。前記ろ液中の全タンパク質濃度はＭｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。前記ろ液中の全タンパク質あたりのメガリン濃度を算出した結果を図５に示す。
【００８８】
図５に示されるとおり、細胞プールにおいて、完全長ヒトメガリンタンパク質が発現されていることが確認された。
また、比較対照として、メガリン発現用プラスミド未導入のＨＥＫ２９３細胞株（ｍｏｃｋと称す）について、完全長ヒトメガリンタンパク質の定量を行った。図５に示されるとおり、ｍｏｃｋからは完全長ヒトメガリンタンパク質が検出されなかった。
【実施例４】
【００８９】
４：完全長ヒトメガリンタンパク質を高発現する単一細胞株の樹立
【００９０】
４−１：シングルクローンの取得
ヒトメガリン発現ＨＥＫ２９３細胞集団を培養しているディッシュ内の培地をアスピレートで除き、恒温槽で３７℃に温めたＰＢＳを添加し、細胞表面を１回洗浄してアスピレートで除去した。ＰＢＳの除去後、３７℃に温めたＴｒｙｐｓｉｎ溶液を添加し、ＣＯ２インキュベーター内で３分間インキュベートした。インキュベート終了後に３７℃で温めた完全培地を当該ディッシュに添加してＴｒｙｐｓｉｎを失活させた。遠沈（１３０×ｇ、３分間）後に上清を除き、細胞沈査に選択培地（上記３−１記載の培地に５００μｇ／ｍＬとなるようにＧ４１８を加えた培地）を加えてピペッティングで攪拌した。撹拌後、細胞数が７．５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように選択培地（上記３−１記載の培地に５００μｇ／ｍＬとなるようにＧ４１８を加えた培地）で段階的に希釈した。希釈した細胞を９６ウェルプレートに２００μＬずつ移し、ＣＯ２インキュベーター内で培養した（１．５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。顕微鏡で当該９６ウェルプレートを観察し、１ウェルあたり２個以上の細胞が存在するウェルをチェックし、候補から外した。９６ウェルプレートで培養した細胞を６ウェルプレートにスケールアップした。さらに６ウェルプレートで培養した細胞を１０ｃｍディッシュに播種した。その際、一部を６ウェルプレートに播種し、細胞ライセート調製用とした。６ウェルプレートのウェル内の培地をアスピレートで除き、恒温槽で３７℃に温めたＰＢＳを添加し、細胞表面を１回洗浄してアスピレートで除去した。細胞を溶解するための液（１×ＰＢＳ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を３００μｌ添加した。ピペッティングで細胞をはがした。細胞溶解物を遠心（２００００×ｇ、１０分間）した。ピペットで上清を取り、孔径０．２２μｍのフィルターでろ過して、ろ液を得た。複数のクローンのそれぞれについて、同様にろ液を得た。
【００９１】
４−２：ヒトメガリンタンパク質発現ＨＥＫ２９３細胞株(ｓｉｎｇｌｅ  ｃｌｏｎｅ)の樹立
上記「３−４：ヒトメガリンタンパク質の定量」に記載された手法と同様の手法により、各クローンから得られたろ液中のヒトメガリン濃度および全タンパク質濃度を測定した。測定結果を以下の表１に示す。
【００９２】
【表１】
2019180262.tif 000002
【００９３】
表１に示されるとおり、上記「４−１：シングルクローンの取得」において得られたクローンＮｏ．１〜５７のそれぞれが、完全長ヒトメガリンタンパク質を発現することが分かる。
これらのクローンのうち、特にクローンＮｏ．７、４４、及び４５は、溶解物中の全タンパク質のうち、ヒトメガリンタンパク質の割合が特に高かった。これらのクローンの溶解物中に含まれるヒトメガリンタンパク質量を図６に示す。
これらのクローン３株（クローンＮＯ．７（２９３−Ｍ７細胞株ともいう）、クローンＮＯ．４４（２９３−Ｍ３３細胞株ともいう）、クローンＮＯ．４５（２９３−Ｍ３４細胞株ともいう））を、完全長ヒトメガリンタンパク質高発現ＨＥＫ２９３細胞株として樹立した。
このうち、クローンＮＯ．７は、２９３−Ｍ７（細胞株の名称）として、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託された。当該寄託の受領日は２０１８年２月８日であり、受託番号はＮＩＴＥ  Ｐ−０２６３３である。この株は、当該機構より一般に入手可能である。
【実施例５】
【００９４】
５：ヒトメガリンタンパク質生産性の比較
【００９５】
５−１：非組換え細胞によるヒトメガリンの産生
メガリンを産生する非組換え細胞として、ヒト結腸腺癌由来細胞Ｃａｃｏ−２、ヒト妊娠性絨毛癌由来細胞ＪＥＧ−３を用いた。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に１０% ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を付加し３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。細胞が９０％コンフルエントになるまで培養を行った。培養上清をアスピレートして除いた。１ｍＬの１×ＰＢＳで細胞を剥がし、遠心分離（１３０×ｇ、３分間）した。上清をアスピレートして除いた。Ｃａｃｏ−２細胞及びＪＥＧ−３細胞にそれぞれ１ｍＬの細胞を溶解するための液（１×ＰＢＳ、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を添加した。添加後、室温で３０分間静置した。静置後、遠心分離（２００００×ｇ、２０分間）し、上清とペレットに分離した。上清を孔径０．２２μｍのフィルターでろ過し、ろ液をＣａｃｏ−２細胞溶解液およびＪＥＧ−３細胞溶解液とした。
【００９６】
５−２：ヒトメガリンタンパク質の定量
上記「３−４：ヒトメガリンタンパク質の定量」に記載された手法と同様の手法により、Ｃａｃｏ−２細胞溶解液およびＪＥＧ−３細胞溶解液中のヒトメガリン濃度および全タンパク質濃度を測定した。
【００９７】
５−３：組換え細胞および非組換え細胞におけるヒトメガリンタンパク質産生量の比較
ヒトメガリンタンパク質高発現ＨＥＫ２９３細胞株（２９３−Ｍ７、２９３−Ｍ３３、２９３−Ｍ３４細胞株）およびヒトメガリン発現ＨＥＫ２９３細胞集団（ヒトメガリンタンパク質の一過性発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞集団）、非組換え細胞株（Ｃａｃｏ−２細胞、ＪＥＧ−３細胞）、ｍｏｃｋによるヒトメガリンタンパク質の産生量を比較した。比較結果を図７に示す。図７に示されるとおり、ヒトメガリンタンパク質高発現ＨＥＫ２９３細胞株およびヒトメガリン発現ＨＥＫ２９３細胞集団は、非組換え細胞株よりも５０乃至１００倍高い発現量を示した。
【実施例６】
【００９８】
蛍光免疫染色によるヒトメガリンタンパク質の観察
【００９９】
６−１：蛍光免疫染色
ヒトメガリンタンパク質高発現ＨＥＫ２９３細胞株である２９３−Ｍ７細胞株およびｍｏｃｋを用いて、以下のとおりに蛍光免疫染色を行った。
すなわち、細胞濃度が３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＣｅｌｌｕｌａｒ  Ｂａｓｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｌｉｑｕｉ−ｐｒｅｐ（ＬＧＭ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を各細胞に添加及び混合して細胞含有液を得た。プレートに当該細胞含有液を滴下し、乾燥させた（５０℃、１０分間）。９５％エタノールで処理し（室温、１０分間）、処理後、乾燥させた。カゼインＰＢＳ（１×ＰＢＳ、１％ｗ／ｖカゼイン）でブロッキングし（室温、１０分間）、処理後、乾燥させた。３μｇ／ｍＬのＡｎｔｉ−ＬＢＤ１を室温で６０分間反応させた。１×ＰＢＳで室温、１０分間洗浄し、乾燥させた。蛍光標識抗体Ｇｏａｔ  Ｆ（ａｂ‘）  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（ＦＩＴＣ）（ａｂｃａｍ）を室温で６０分間反応させた。１×ＰＢＳで室温、１０分間洗浄し、乾燥させた。封入剤（１×ＰＢＳ、９０％グリセロール）を添加し、カバーガラスをのせた。蛍光顕微鏡ＢＺ−Ｘ７００（キーエンス）を用いて観察を行った。その結果を図８に示す。ｍｏｃｋでは蛍光は観察されなかったが、ヒトメガリンタンパク質高発現ＨＥＫ２９３細胞株である２９３−Ｍ７細胞株では蛍光が観察され、メガリンの発現が確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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