(57)【要約】      （修正有）【課題】心筋梗塞、心不全、心筋症、先天性心疾患、栄養性疾患、虚血性または非虚血性心筋症、高血圧性心筋症、弁膜症性心筋症、炎症性心筋症、全身性代謝性疾患に対し二次的に起こる心筋症、アルコール性心筋症、糖尿病性心筋症、拘束型心筋症、及びこれらの組合せによって引き起こされる心臓傷害を治療する方法の提供。【解決手段】心臓神経堤細胞を有する治療上有効量の医薬組成物を投与する工程を有する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
心臓傷害を治療する必要がある対象者において心臓傷害を治療する方法であって、心臓神経堤細胞を有する治療上有効量の医薬組成物を投与する工程を有する、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記心臓神経堤細胞がｃＫｉｔ陽性である、方法。
【請求項３】
請求項１または２記載の方法において、前記心臓傷害が、心筋梗塞、心不全、心筋症、先天性心疾患、栄養性疾患、虚血性または非虚血性心筋症、高血圧性心筋症、弁膜症性心筋症、炎症性心筋症、全身性代謝性疾患に対し二次的に起こる心筋症、アルコール性心筋症、糖尿病性心筋症、拘束型心筋症、及びこれらの組合せによって引き起こされる心臓傷害である、方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか記載の方法において、前記医薬組成物が、約５０重量％から約１００重量％心臓神経堤細胞を有する、方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか記載の方法において、前記医薬組成物が、約５０重量％心臓神経堤細胞を有する、方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載の方法において、前記医薬組成物が、約７０重量％心臓神経堤細胞を有する、方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか記載の方法において、前記医薬組成物が、約９０％心臓神経堤細胞を有する、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載の方法において、前記医薬組成物が、約１×１０６心臓神経堤細胞を有する、方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか記載の方法において、前記医薬組成物が、約１×１０８心臓神経堤細胞を有する、方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか記載の方法において、前記医薬組成物が、１つまたはそれ以上の分化剤をさらに有する、方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法において、前記１つまたはそれ以上の分化剤が、ＢＭＰ拮抗薬、ノギン、コルジン、Ｔｓｇ、ＢＭＰＲ１Ａ及びＢＭＰＲ１Ｂなどの可溶性受容体、ドルソモルフィンなどの低分子ＢＭＰ拮抗薬、レチノイン酸、ビタミンＡ、ＬＧ１００２６８、またはＬＧＤ１０６９などのレチノイン酸受容体作動薬、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ１（ＤＫＫ１）などのｗｎｔ阻害剤から選択される、方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか記載の方法において、前記心臓神経堤細胞が、約５０受容体／マイクロメートル２から約８００受容体／マイクロメートル２の幹細胞因子受容体濃度を有する、方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか記載の方法において、前記心臓神経堤細胞が、約２００受容体／マイクロメートル２から約６００受容体／マイクロメートル２の幹細胞因子受容体濃度を有する、方法。
【請求項１４】
心臓神経堤細胞を生産する方法であって、
ノギン及び白血病阻止因子と共に複数の幹細胞を培養する工程と、
前記複数の幹細胞をノギンと共に培養することにより、前記複数の幹細胞の三次元集合体を形成する工程と、
心臓神経堤細胞を形成するために、前記複数の幹細胞を心臓神経堤分化培地中で培養する工程と
を有する、方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法において、前記心臓神経堤細胞が幹細胞因子受容体を発現する、方法。
【請求項１６】
請求項１４記載の方法において、前記心臓神経堤細胞がｃＫｉｔ陽性である、方法。
【請求項１７】
請求項１４記載の方法において、前記複数の幹細胞が人工多能性幹細胞である、方法。
【請求項１８】
請求項１４記載の方法において、前記複数の幹細胞が胚性幹細胞である、方法。
【請求項１９】
請求項１４記載の方法において、前記ノギン及び白血病阻止因子と共に複数の幹細胞を培養する工程におけるノギンが、濃度１５０ｎｇ／ｍｌである、方法。
【請求項２０】
請求項１４記載の方法において、前記ノギン及び白血病阻止因子と共に複数の幹細胞を培養する工程における白血病阻止因子が、濃度２０００単位／ｍｌである、方法。
【請求項２１】
請求項１４〜２０のいずれか記載の方法において、前記心臓神経堤細胞が、約５０受容体／マイクロメートル２から約８００受容体／マイクロメートル２の幹細胞因子受容体濃度を有する、方法。
【請求項２２】
請求項１４〜２１のいずれか記載の方法において、前記心臓神経堤細胞が、約２００受容体／マイクロメートル２から約６００受容体／マイクロメートル２の幹細胞因子受容体濃度を有する、方法。
【請求項２３】
請求項１４〜２２のいずれか記載の方法であって、さらに、前記幹細胞にタモキシフェンを接触させる工程を有する、方法。
【請求項２４】
心臓神経堤細胞、及び薬学的に許容可能な担体または賦形剤を有する、医薬組成物。
【請求項２５】
請求項２４記載の医薬組成物において、前記心臓神経堤細胞がｃＫｉｔ陽性である、組成物。
【請求項２６】
請求項２４記載の医薬組成物において、前記心臓神経堤細胞が、約５０受容体／マイクロメートル２から約８００受容体／マイクロメートル２の幹細胞因子受容体濃度を有する、組成物。
【請求項２７】
請求項２４記載の医薬組成物において、前記心臓神経堤細胞が、約２００受容体／マイクロメートル２から約６００受容体／マイクロメートル２の幹細胞因子受容体濃度を有する、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年１０月２９日に出願された米国特許仮出願第６１／８９６，９４５号に対する優先権を主張し、その出願はその全体が本参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、様々な心臓の疾患及び状態を治療するために使用されてきた。しかしながら、異なる種類の幹細胞を同定かつ使用する必要がある。本実施形態は、これらの及びその他の需要を満たす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
心臓傷害を治療する必要がある対象者において、心臓神経堤細胞を有する治療上有効量の医薬組成物を投与することにより心臓傷害を治療するための方法が、本明細書で開示される。本方法は、ｃＫｉｔ陽性である心臓神経堤細胞を含みうる。いくらかの実施形態においては、心臓傷害は、心筋梗塞、心不全、心筋症、先天性心疾患、栄養性疾患、虚血性または非虚血性心筋症、高血圧性心筋症、弁膜症性心筋症、炎症性心筋症、全身性代謝性疾患に対し二次的に起こる心筋症、アルコール性心筋症、糖尿病性心筋症、拘束型心筋症、及びこれらの組合せにより引き起こされる心臓傷害でありうる。
【０００４】
いくらかの実施形態においては、医薬組成物は、約５０重量％から約１００重量％心臓神経堤細胞を有しうる。他の実施形態においては、医薬組成物は、約５０重量％心臓神経堤細胞を、約７０重量％心臓神経堤細胞を、または約９０重量％心臓神経堤細胞を有しうる。いくらかの実施形態においては、医薬組成物は、約１×１０６個の心臓神経堤細胞を、または約１×１０８個の心臓神経堤細胞を有しうる。
【０００５】
いくらかの実施形態においては、医薬組成物は、１つまたはそれより多い分化剤を有しうる。１つまたはそれより多い分化剤は、ＢＭＰ拮抗薬、ノギン、コルジン、Ｔｓｇ、ＢＭＰＲ１Ａ及びＢＭＰＲ１Ｂなどの可溶性受容体、ドルソモルフィンなどの低分子ＢＭＰ拮抗薬、レチノイン酸、ビタミンＡ、ＬＧ１００２６８、またはＬＧＤ１０６９などのレチノイン酸受容体作動薬、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ１（ＤＫＫ１）などのｗｎｔ阻害剤から選択されうる。
【０００６】
いくらかの実施形態においては、心臓神経堤細胞は、約５０受容体／マイクロメートル２から約８００受容体／マイクロメートル２の幹細胞因子受容体濃度を有しうる。他の実施形態においては、心臓神経堤細胞は、約２００受容体／マイクロメートル２から約６００受容体／マイクロメートル２の幹細胞因子受容体濃度を有しうる。
【０００７】
本明細書では、心臓神経堤細胞を産生する方法もまた開示される。本方法は、複数の幹細胞をノギン及び白血病阻止因子と共に培養する工程、複数の幹細胞をノギンと培養しこれにより複数の幹細胞の三次元集合体を形成する工程、並びに心臓神経堤細胞を形成するために複数の幹細胞を心臓神経堤分化培地中で培養する工程を含みうる。
【０００８】
いくらかの実施形態においては、心臓神経堤細胞は、幹細胞因子受容体を発現し、かつｃＫｉｔ陽性である。いくらかの実施形態においては、複数の幹細胞は、人口多能性幹細胞、または胚性幹細胞である。いくらかの実施形態においては、複数の幹細胞をノギン及び白血病阻止因子と共に培養する工程におけるノギンは、１５０ｎｇ／ｍｌの濃度であってもよく、また白血病阻止因子は、２０００単位／ｍｌの濃度でありうる。いくらかの実施形態においては、心臓神経堤細胞は、約５０受容体／マイクロメートル２から約８００受容体／マイクロメートル２、または約２００受容体／マイクロメートル２から約６００受容体／マイクロメートル２の幹細胞因子受容体濃度を有しうる。他の実施形態においては、本方法は、幹細胞にタモキシフェンを接触させる工程もまた含みうる。
【０００９】
心臓神経堤細胞と薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを有する医薬組成物が、さらに開示される。いくらかの実施形態においては、心臓神経堤細胞はｃＫｉｔ陽性である。いくらかの実施形態においては、心臓神経堤細胞は、約５０受容体／マイクロメートル２から約８００受容体／マイクロメートル２、または約２００受容体／マイクロメートル２から約６００受容体／マイクロメートル２の幹細胞因子受容体濃度を有しうる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ＣｒｅＥＲＴ２ノックイン対立遺伝子の略図を示し、ＵＴＲは非翻訳領域、ＣＤＳはコード配列であり（Ａ）、またｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスの表現型を図解する写真（Ｂ）を示す。
【図２】図２は、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／Ｒ２６ＲｌａｃＺマウスにおける、７．５−８．５ｄｐｃの細胞系譜追跡の再現実験を図解する写真を示す（Ａ〜Ｃ）。
【図３】図３は、９．５−１１．５ｄｐｃの間にタモキシフェンにさらされた１８．５ｄｐｃのｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／Ｒ２６ＲｌａｃＺ心臓（Ａ&Ｂ）、ＯＦＴにおけるＸ−ｇａｌ（＋）細胞（Ｃ）、精巣におけるＸ−ｇａｌ（＋）細胞（Ｄ）の共焦点画像、及び心臓における神経心臓堤細胞の分布を例証するグラフ（Ｅ）である。
【図４】図４は、Ｘ−ｇａｌ染色を示さない、１３．５ｄｐｃにおいてタモキシフェンにさらされた、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／Ｒ２６ＲｌａｃＺ同腹仔の１４．５ｄｐｃＷＴ胚におけるＸ−ｇａｌ（Ａ）、泌尿生殖器領域（矢印）とメラニン細胞（ボックス及び頭中の矢先）とにおいてＸ−ｇａｌ染色を示す、遺伝子型ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／Ｒ２６ＲｌａｃＺを擁する同腹仔胚（Ｂ）、Ｘ−ｇａｌ（＋）メラニン細胞系細胞を例証する（Ｂ）においてボックスで囲まれた領域の拡大図（Ｃ）、（Ｂ）及び（Ｃ）中の胚の、肝臓及び腸（大きい矢先）における、並びに皮膚メラニン細胞及び脊柱（小さい矢先）における、Ｘ−ｇａｌ（＋）細胞（Ｄ）を示す。
【図５】図５は、１８．５ｄｐｃのｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧ胚の心臓における、ＥＧＦＰ（＋）細胞及びＥＧＦＰ（＋）心筋細胞の定量化を示す。
【図６】図６は、１２．５ｄｐｃのｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧ；Ｉｓｌ１−ｎＬａｃＺ胚のホールマウントイメージングを示し、矢印は、Ｘ−ｇａｌとＥＧＦＰ落射蛍光との共局在の神経管領域を指す。
【図７】図７は、ＭＳＣｓ＋ＳＣＦグループ（最上位の線）における全ＥＧＦＰ（＋）細胞数を、他方のグループと比較した場合に検出される、有意差を図解するグラフを示す（＊ｐ＜０．０１）（Ａ）。パネルＢは、細胞移動をブロックすることに加え、ＭＳＣｓ＋ＳＣＦグループ（最上位の線）と比較して、ＳＣＦの存在下（下から二番目の線）または非存在下（最下位の線）においては、ＡＭＤ３１００がＥＧＦＰ（＋）細胞の数を有意に減少させる（＊ｐ＜０．００１）ことを例証する。さらに、抗ｃＫｉｔ抗体を用いてのＳＣＦ／ｃＫｉｔシグナリングの中和（上から二番目の線）は、ＭＳＣｓ＋ＳＣＦグループ（最上位の線）と比較して、８日間の培養後、ＥＧＦＰ（＋）細胞数を有意に減少させた（§ｐ＜０．００１）。パネルＣは、ＡＭＤ３１００の添加が、他の非ＡＭＤ３１００処理グループと比較して、自発的に拍動するＥＧＦＰ（＋）細胞の数の劇的な増加を引き起こした（＊ｐ＜０．００１）ことを例証する。
【図８】図８は、ヒト胎児心臓における左心房の心内膜表面中の無色素ｃＫｉｔ（＋）／ＭＩＴＦ（＋）ＮＣＣｋｉｔ（挿入図及び矢印）を例証する、ヘマトキシリン−エオシン染色を示す。
【図９】図９は、２．６８秒間の間に自発的に１１回収縮するヒトＮＣＣｋｉｔを示す（Ａ）。ＮＣＣｋｉｔのチロシナーゼ（＋）メラニン細胞への分化、ＮＣＣｋｉｔの水平移動ＮＣＣ起源を実証する（Ｂ）。共培養システムにおける心筋細胞系対メラニン細胞系派生細胞の定量化は、それぞれ、平均値４３．１±１４．７細胞／ｃｍ２及び４．３±０．６細胞／ｃｍ２（ｎ＝２４）を例証した（Ｃ）。
【図１０】図１０は、ＮＲＣＭとの共培養後１２日のＮＣＣｋｉｔを含有するトラスウェルインサートの、共焦点タイルスキャンを示す。この特定のスキャン面においては、３１の心筋トロポニン−Ｉ（＋）（赤）であり自発的に収縮するＮＣＣｋｉｔ由来のヒト心筋細胞が示される。
【図１１】図１１は、新規の心臓ＮＣＣ系列を明らかにする、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋発生予定運命図を示す。ＣｒｅＥＲＴ２ノックイン対立遺伝子の略図、ＵＴＲは非翻訳領域、ＣＤＳはコード配列（Ａ）。ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスの表現型（Ｂ）。研究設計（Ｃ）。ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／Ｒ２６ＲｌａｃＺ対立遺伝子における細胞系譜追跡、５００ピクセル（Ｄ〜Ｇ）。ｃＫｉｔ発生予定運命図の概要（Ｈ）。
【図１２】図１２は、ｃＫｉｔ及びＷｎｔ１の高分解能共通発生予定運命図化、並びに共通発生予定運命図化法の略図を示す（パネルＡ）。ベータガラクトシダーゼ発現の非存在を示すｘ−ｇａｌ染色、縮尺＝５００μｍ（パネルＢ）。ｘ−ｇａｌ染色は、タモキシフェン処理されたｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２；Ｗｎｔ１：：Ｆｌｐｅ；ＲＣ：：Ｆｅｌａ胚の心臓におけるｘ−ｇａｌの発現を示す（パネルＣ）。
【図１３】図１３は、マウス胚におけるＮＣＣｋｉｔ系列の分離を示す。Ｅ１６．５のｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２；Ｗｎｔ１：：Ｆｌｐｅ；ＲＣ：：Ｆｅｌａ胚におけるＮＣＣｋｉｔ系譜の分離を例証する、代表的なｘ−ｇａｌ染色切片。ｘ−ｇａｌの検出は、頭蓋顔面領域、心臓、脊柱、皮膚、腸、及び腎臓において実証される。従って、ＮＣＣｋｉｔは、全ての既知の神経堤系列（頭蓋、心臓、迷走神経系、仙骨系、躯幹）に寄与する。タモキシフェンは、Ｅ９．５−Ｅ１１．５の間に投与された。縮尺＝２００μｍ。
【図１４】図１４は、マウス心臓における心臓ＮＣＣｋｉｔ系譜の分離を示す。Ｅ９．５−Ｅ１１．５間におけるタモキシフェン（Ｔａｍ）投与後の、Ｅ１６．５のｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２；Ｗｎｔ１：：Ｆｌｐｅ；ＲＣ：：Ｆｅｌａ心臓におけるｘ−ｇａｌ＋染色。ＮＣＣｋｉｔは、心筋、心房（Ａ〜Ｃ）、心外膜（Ｄ）、心内膜（Ｅ）、流出路（Ｆ）、及び流入路（Ｇ）を含む全ての予期される心臓ＮＣＣ派生体に寄与する。
【図１５】図１５は、心臓における、心筋細胞系対非心筋細胞系のＥＧＦＰ（＋）派生細胞を示す（Ａ）。心臓中のＥＧＦＰ（＋）細胞の分布［３つの胚からのｎ＝１１凍結切片（Ａ&Ｂ）。図３２中の頭字語は、流出路（ＯＦＴ）、左心房（ＬＡ）、大動脈弁（ＡｏＶ）、僧帽弁（ＭＶ）、左心室（ＬＶ）、右心室（ＲＶ）、心室中隔（ＩＶＳ）、及び心筋細胞（ＣＭ）を含む。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧ：Ｉｓｌ１ｎＬａｃＺ胚における、ｘ−ｇａｌとＥＧＦＰ落射蛍光との共局在を示す。
【図１６】図１６Ｂは、ＮＣＣｋｉｔの表現型を例証する略図を示す。
【図１７】図１７は、ＢＭＰシグナリングの一過性阻害が、多能性幹細胞からのｉｎ−ｖｉｔｒｏでのＮＣＣｋｉｔの産生を促進することを示す。多能性幹細胞からＮＣＣｋｉｔを産生するための方法の図式的開示。
【図１８】図１８は、ｉＰＳＣのＮＣＣｋｉｔへの分化の経過の間の遺伝子発現解析を示す。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及びＭｅｓｐｌ媒介性の造心中胚葉の誘導（Ａ〜Ｄ）の後、ノギンは、ＮＣＣｋｉｔの亜集団である心臓神経堤系列への、多能性幹細胞の分化を促進する（Ｅ〜Ｈ）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本組成物及び方法が開示される前に、工程、組成物、または方法論は変化しうるため、本発明は開示される特定の工程、組成物、または方法論に限定されないことが理解されるべきである。本開示において使用される用語は、特定のバージョンまたは実施形態のみを開示する目的のためであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになる本発明の範囲を限定することを意図しないこともまた理解されるべきである。別に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の実施形態の実施または試験においては、本明細書で開示される方法及び材料と類似するまたは同等のあらゆる方法及び材料が使用されうるが、好ましい方法、装置、及び材料がここで開示される。本明細書において言及される全ての刊行物は、その全体が本参照により本明細書に組み込まれる。本明細書におけるいかなるものも、そのような開示よりも本発明が先立つとする権利が先行発明の効力によりないという承認として解釈されるべきでない。
【００１２】
本明細書において及び添付の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別に規定しない限り、複数の指示物を含むこともまた、特筆されなければならない。
【００１３】
本明細書で使用される用語「約」は、それと共に使用されている数字の数値のプラスまたはマイナス１０％を意味する。従って、約５０％は、４５％〜５５％の範囲にあることを意味する。
【００１４】
「任意の」または「任意で」は、次いで開示される構造、事象、または状況が生じても、あるいは生じなくてもよく、また開示が、その事象が生じる事例、及びそれが生じない事例を含むことを意味するように解釈されうる。
【００１５】
本明細書で使用される用語「細胞培地（ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉｕｍ）」または「細胞培地（ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａ）」は、単核細胞及び／または神経細胞が育成される細胞増殖培地を開示するために使用される。細胞培地は当技術分野において周知であり、少なくとも、最小限で基本培地と、これに加え、成長因子、グルコース、非必須アミノ酸、インスリン、トランスフェリン、及び当技術分野において周知の他の試薬などの、任意の試薬とを有する。
【００１６】
細胞育成、細胞分離、また、適切であれば、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、及びこれらの類似物が関与する酵素反応のための、クローニング、ＤＮＡ単離、増幅、及び精製のための標準的技法、並びに様々な分離技法は、当業者により既知であり一般に用いられる技法である。多数の標準的技法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｗｕ  （Ｅｄ．）  １９９３  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２１８，  Ｐａｒｔ  Ｉ、Ｗｕ  （Ｅｄ．）  １９７９  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ６８、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  （Ｅｄｓ．）  １９８３  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １００  ａｎｄ  １０１、Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｏｌｄａｖｅ  （Ｅｄｓ．）  １９８０  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ６５、Ｍｉｌｌｅｒ  （ｅｄ．）  １９７２  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｏｌｄ  ａｎｄ  Ｐｒｉｍｒｏｓｅ，  １９８１  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、Ｓｃｈｌｅｉｆ  ａｎｄ  Ｗｅｎｓｉｎｋ，  １９８２  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｌｏｖｅｒ  （Ｅｄ．）  １９８５  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｏｌ．  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ＵＫ、Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  （Ｅｄｓ．）  １９８５  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ＵＫ、及びＳｅｔｌｏｗ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ  １９７９  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｖｏｌｓ．  １−４，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにおいて開示される。省略形及び専門的名称は、用いられる場合、本分野において標準的であり、かつ、本明細書において引用されるものなどの専門誌において一般的に使用されるとみなされる。
【００１７】
用語「対象者（ｓｕｂｊｅｃｔ）」、またはある例においては「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」が、本明細書の至るところにおいて、動物を開示するための文脈内で使用される。用語「対象者（ｓｕｂｊｅｃｔ）」及び「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」は、互換的に使用されうる。動物は、ヒトでも非ヒトでもありうる。いくらかの実施形態においては、対象者は、一般に獣医学的動物と呼ばれるものである。獣医学的動物の例は、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、トリ、及びこれらの類似物を含むが、これに限られない。対象者は、サルまたはチンパンジーなどだがこれらに限定されない、非ヒト霊長類であってもまたよい。
【００１８】
本明細書において開示される本発明の実施形態は、心臓細胞へと分化しやすい神経堤細胞、つまり「心臓神経堤細胞」、及び、心臓神経堤細胞を含有する様々な組成物、心臓神経堤細胞を使用するための治療法を対象とする。さらなる実施形態は、ドナー組織から心臓神経堤細胞を抽出するための方法、心臓神経堤細胞を産生し、また治療用組成物への組み込み及び患者への送達のために心臓神経堤細胞を調整する方法を対象とする。様々な実施形態の心臓神経堤細胞は、心臓細胞へと分化しやすく、また例えば、様々な種類の心筋細胞、心内膜及び伝導系細胞、並びにメラニン細胞を含む多様な表現型を有する細胞へと分化可能である。従って、特定の実施形態においては、心臓神経堤細胞、及び心臓神経堤細胞を含有する組成物は、心臓組織の細胞ベースでの治療的再生のために有用となりうる。
【００１９】
具体的には、心臓神経堤細胞は、明確で、一過性に形成され、移動性の、哺乳類心臓の発達に貢献する胚細胞系列である。本明細書において開示される実施形態以前は、発達中の心臓及び出生後の心臓における心臓神経堤の役割及び存在は、不確かであった。さらに、本実施形態以前は、成年哺乳類からそれらを再誘導するための信頼可能な方法が欠如していた。並びに、異性分から成る細胞混合物からそれらを免疫学的に同定し精製するために後に役立つ細胞表面マーカーの欠如とともに、細胞ベースの治療の潜在的可能性を損なわせてきた。本実施形態は、思いがけず、これらの不確実さを解消し、また試料からそのような細胞を得るための信頼可能な方法を提供する。他の驚くべき方法及び組成物が、本明細書において提供される。
【００２０】
一定の実施形態は、心臓神経堤細胞を含有する医薬組成物を対象とする。そのような医薬組成物においては、心臓神経堤細胞は、上で開示されたいかなる心臓神経堤細胞でもよく、またそのような心臓神経堤細胞は、あらゆる細胞源から誘導されうる。いくらかの実施形態においては、心臓神経堤細胞は、上で定義された範囲内の細胞表面ｃＫｉｔ濃度を示してもよく、また特定の実施形態においては、心臓神経堤細胞は、外因性タンパク質発現のための追加の遺伝物質を含有してもよい。医薬組成物は、心臓神経堤細胞を単独で含んでもよく、あるいは一定の実施形態においては、医薬組成物は、心臓神経堤細胞が投与前に生存可能のままであることを可能にし、または心臓神経堤細胞が特定の表現型を呈するもしくは維持することを促進する、追加の非神経堤細胞を含有してもよい。そのような実施形態においては、心臓神経堤細胞は、医薬組成物中の生細胞の大部分を占めうる。いくらかの実施形態においては、医薬組成物は、間葉系及び／または心臓幹細胞を有する。いくらかの実施形態においては、間葉系幹細胞対心臓幹細胞の比は、約３０：１である。いくらかの実施形態においては、その比は約１０：１から約５０：１である。いくらかの実施形態においては、間葉系幹細胞対心臓幹細胞の比は、約２０：１から約５０：１である。いくらかの実施形態においては、間葉系幹細胞対心臓幹細胞の比は、約３０：１から約５０：１である。いくらかの実施形態においては、間葉系幹細胞対心臓幹細胞の比は、約４０：１から５０：１である。例えば、そのような実施形態においては、医薬組成物は、少なくとも約５０重量％、約６０重量％、約７０重量％、約８０重量％、約９０重量％、またはあらゆるこれらの値（端点を含む）の間の範囲で心臓神経堤細胞を含有しうる。他の実施形態においては、医薬組成物は、約５０重量％から約１０００重量％、約６０重量％から約９５重量％、約７０重量％から約９０重量％、またはあらゆるこれらの値（端点を含む）の間のあらゆる範囲で心臓神経堤細胞を含有しうる。いくらかの実施形態においては、医薬組成物は、下に開示されるように、薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含みうる。そのような実施形態においては、医薬組成物中の心臓神経堤細胞の合計量は、約１×１０５細胞から、約１×１０６細胞、約１×１０７細胞、約１×１０８細胞、約１×１０９細胞、約１×１０１０細胞、またはあらゆるこれらの値（端点を含む）の間のあらゆる範囲でありうる。そのような実施形態においては、医薬組成物中の心臓神経堤細胞の合計量は、約１×１０３から約１×１０１０細胞、あるいは他の実施形態においては、約１×１０４から約１×１０９、約１×１０５から約１×１０８、またはあらゆるこれらの値（端点を含む）の間のあらゆる範囲でありうる。
【００２１】
いくらかの実施形態においては、医薬組成物は、心臓神経堤細胞または傷害に関連する他の細胞の分化を助ける、１つまたはそれより多い分化剤を含有しうる。例えば、いくらかの実施形態においては、医薬組成物は、ＢＭＰ拮抗薬、ノギン、コルジン、Ｔｓｇ、ＢＭＰＲ１Ａ及びＢＭＰＲ１Ｂなどの可溶性受容体、ドルソモルフィンなどの低分子ＢＭＰ拮抗薬、レチノイン酸、ビタミンＡ、ＬＧ１００２６８、またはＬＧＤ１０６９などのレチノイン酸受容体作動薬、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ１（ＤＫＫ１）などのｗｎｔ阻害薬、並びにこれらの類似物、さらにこれらの混合物を含みうる。分化剤は、医薬組成物中で投与の前に組み合わせられてもよく、または他の実施形態においては、分化剤は、心臓神経堤細胞を含有する医薬組成物の投与後に傷害へ適用されてもよい。さらに別の実施形態においては、分化剤は、例えば、医薬組成物の投与後に分化剤の放出を可能にするリポソーム中に、カプセル化されてもよい。
【００２２】
いくらかの実施形態においては、医薬組成物は、患者への投与が意図される、１つまたはそれより多い活性剤を含有しうる。例えば、いくらかの実施形態においては、医薬組成物は、抗真菌薬、抗細菌薬、抗ウィルス薬、ステロイド、抗炎症薬、非ステロイド性抗炎症薬、化学療法薬、抗アポトーシス剤、抗酸化剤、制吐薬、及びこれらの類似物、並びにこれらの混合物をさらに含有しうる。実施形態の医薬組成物に追加されうる活性剤のより具体的な例は、１種またはそれより多い種のコラーゲンなどの細胞外マトリックス成分、成長因子、多血小板血漿、また、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯミメティボディー、トロンボポエチン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、肝細胞成長因子、カスパーゼ阻害剤などの抗アポトーシス剤、また、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＴＧＦベータ阻害剤、スタチン、ＩＬ−６及びＩＬ−１阻害剤、ＰＥＭＩＲＯＬＡＳＴ、ＴＲＡＮＩＬＡＳＴ、ＲＥＭＩＣＡＤＥ、ＳＩＲＯＬＩＭＵＳなどの抗炎症性化合物、ＴＥＰＤＸＡＬＩＮ、ＴＯＬＭＥＴＩＮ、及びＳＵＰＲＯＦＥＮなどの非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、またカリシニューリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、抗増殖剤、コルチコステロイド、及び様々な抗体などの免疫抑制または免疫調節剤、またプロブコール、ビタミンＣとＥ、コエンザイムＱ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、及びＮ−アセチルシステインなどの抗酸化剤、局所麻酔薬、並びにこれらの類似物、さらにこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。
【００２３】
神経堤細胞もしくは心臓神経堤細胞、１つもしくはそれより多い分化剤、及び／または１つもしくはそれより多い活性剤を含む、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体または媒体と共に製剤化されうる。そのような組成物は、細胞の溶液、細胞調整物、または細胞組成物を、それに１つまたはそれより多い薬学的に許容可能な運搬体または希釈剤が伴って、また適切なｐＨを有しかつ生理学的流体と等張である緩衝溶液中に含有されて、含む。適切な薬学的に許容可能な担体は、例えば、水、（リンゲル液などの）食塩溶液、アルコール、オイル、ゼラチン、また、ラクトース、アミロース、またはデンプンなどの炭水化物、脂肪酸エステル、ヒトロキシメチルセルロース、及びポリビニルピロリジンを含む。そのような調整物は、ＮＣＣ及び追加の成分と組み合わせられる前に、滅菌されうる。一定の実施形態においては、薬剤は、例えば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤、及び色素などの、１つまたはそれより多い補助剤を含みうる。本発明における使用のために適切な医薬担体は、当技術分野において既知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ，  ＵＳＡ  １９８５）における適切な運搬体において開示される。
【００２４】
生細胞を含有する医薬組成物は、一般に、液体、半固体（例えば、ゲル）、または固体（例えば、マトリックス、スキャフォールド、及び神経組織工学に応じたこれらの類似物）として製剤化される。液体組成物は、標的組織への生細胞の送達を達成するための当技術分野において既知のあらゆる許容可能な投与経路による投与のために、製剤化される。例えば、送達は、全身性、局所性、または傷害部位における標的化注射もしくは注入による、注射または注入により達成されうる。
【００２５】
生細胞を半固体または固体の担体中に含む医薬組成物は、一般に、傷害部位における外科移植のために製剤化される。とりわけ、液体組成物もまた、外科的手技によって投与されうる。特定の実施形態においては、半固体または固体の医薬組成物は、生分解性または非生分解性でありうる、半透性ゲル、格子、細胞スキャフォールド、及びこれらの類似物を含有しうる。例えば、いくらかの実施形態においては、心臓神経堤細胞は、その周囲から隔離されてもよいが、生体分子を周囲の細胞に分泌しかつ送達することが可能でありうる。これは、移植された細胞をホスト組織から物理的に分離する非生分解性であり選択透過性のバリアにより包囲された、生心臓神経堤細胞を有する自律性移植物を作成することによる。そのような移植物は、薬理学的に誘導された免疫抑制の非存在下で免疫細胞及びマクロ分子が移植細胞を死滅させるのを防ぐ能力を有するため、時折「免疫防御性」と呼ばれる。
【００２６】
他の実施形態においては、医薬組成物は、分解性ゲル及びネットワークを含有しうる。分解性材料は、ポリ（乳酸）、乳酸・グリコール酸共重合体、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲン、及びこれらの類似物などの、生体適合性ポリマーを含む持続放出製剤に対して特に適切でありうる。薬物送達運搬体における分解性ポリマーの構造、選択、及び使用は、当技術分野において既知である。他の実施形態においては、心臓神経堤細胞は、生分解性、生体再吸収性、または生体吸収性のスキャフォールド、またはマトリックス上または中に提供されうる。これらの一般には三次元の生体材料は、スキャフォールドに接着している生細胞を、スキャフォールド内に分散した状態で、またはスキャフォールド中に封入された細胞外マトリックス中に組み込まれて、含有する。生体の標的領域中へと移植されると、これらの移植物はホスト組織と統合されて、移植細胞が徐々に確立される。スキャフォールドまたはマトリックス（まとめて「フレームワーク」と呼ばれることもある）の例は、不織布マット、多孔性発泡体、自己集合性ペプチド、及びこれらの類似物、並びにこれらの混合物を含む。不織布マットは、例えば、グリコール酸及び乳酸（ＰＧＡ／ＰＬＡ）の合成吸収性共重合体の繊維を使用して形成されうる。例えばポリ（イプシロン−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）の共重合体で成る発泡体は、フリーズドライなどの工程により形成され、または凍結乾燥されうる。さらなる実施形態においては、医薬組成物は、自己集合性ペプチド（例えば、ＲＡＤ１６）などのヒドロゲルを含みうる。またさらに他の実施形態においては、医薬組成物は、注射のために適切な流体として製剤化される、ｉｎ  ｓｉｔｕ形成性の分解性ネットワークでありうる。その流体は、例えば温度の変化、ｐＨ、光への露出などにより、ｉｎ  ｓｉｔｕまたはｉｎ  ｖｉｖｏで分解性ヒドロゲルネットワークを形成するように促進される。
【００２７】
いくらかの実施形態においては、フレームワークは、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬ共重合体もしくはブレンド、ヒアルロン酸、及びこれらの類似物、またはこれらの混合物などの生体吸収性材料から作成される、マルチフィラメントの紡績糸で成りうるフェルトでありうる。紡績糸は、クリンピング、カッティング、カージング、及びニードリングから構成される標準的な織物加工技法を使用して、フェルトへと加工されうる。他の実施形態においては、フレームワークは、生体吸収性複合物発泡体スキャフォールドでありうる。そのような実施形態のフレームワークは、様々な前もって形成された外科的または移植可能な装置を作成するのに有用な形へと成形されうる。
【００２８】
心臓神経堤細胞は、いつでもフレームワークまたは装置上へと導入されうる。例えば、いくらかの実施形態においては、心臓神経堤細胞は、移植前にフレームワーク上に播種されてもよく、また他の実施形態においては、心臓神経堤細胞はフレームワーク上で培養されうる。いくらかの実施形態においては、フレームワークは、細胞接着を増強させるため、細胞の接種前に処理されうる。例えば、接種前に、ナイロンを被覆するため、ナイロンマトリックスは、０．１モル濃度の酢酸で処理され、ポリリジン、ＰＢＳ、及び／コラーゲン中でインキュベートされうる。ポリスチレンは、硫酸を使用して同様に処理されうる。細胞の接着または成長、及び組織の分化を向上させるため、フレームワークの外表面もまた、例えば、フレームワークをプラズマコーティングすること、あるいは１つのもしくはそれより多いタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸）、細胞マトリックス、及び／または、他にもあるが、ゼラチン、アルギン酸塩、アガー、アガロース、及び植物ガム、などだがこれらに限定されない他の材料の添加により、修飾されうる。
【００２９】
一定の実施形態においては、医薬組成物は、心臓神経堤細胞、及び非心臓神経堤細胞を含有しうる。例えば、いくらかの実施形態においては、心臓神経堤細胞は、間葉系細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、及びこれらの類似物、ならびにこれらの組合せと、組み合わせられ、または製剤化されうる。いくらかの実施形態においては、医薬組成物中の心臓神経堤細胞及び／または非心臓神経堤細胞は、治療される予定である対象者から得られまたは派生させられうる。これは、別個の抽出を通じてであるか、あるいは、心臓神経堤細胞に、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、及びこれらの類似物、またはこれらの組合せなどのより分化した形態を呈させることによる。また、特定の実施形態においては、非心臓神経堤細胞を含有する医薬組成物は、組織パッチの形態を取りうる。特定の実施形態においては、非心臓神経堤細胞は、心臓神経堤細胞の自然な分化の結果として存在しうる。
【００３０】
さらなる実施形態は、心臓神経堤細胞を生成する方法を対象とする。様々な実施形態の心臓神経堤細胞は、胎児の心臓を含むがこれらに限定されない、様々な細胞源から単離されうる。また、細胞源の種は、心臓神経堤細胞が移植されることになる種を基に、異なりうる。例えば、ヒトにおける使用のための心臓神経堤細胞は、ヒト胎児の心臓から単離されうる。また、イヌにおける使用のための心臓神経堤細胞は、イヌから単離されうる。同様にウマ、ブタ、または他の哺乳類における使用のための心臓神経堤細胞は、その動物由来の胎児の心臓から単離されうる。
【００３１】
他の実施形態においては、心臓神経堤細胞は、神経堤細胞としてふるまうように誘導されてきた幹細胞から得られうる。その幹細胞は、胚性幹細胞、または人口多能性幹細胞でありうる。胚性幹細胞は、一般に胚性組織から得られる。人口多能性幹細胞は、例えば、皮膚、血液、臍帯血、骨髄、及び皮膚を含む多数の細胞源から得られうる。また、これらの組織は成年体から得られうる。多分化能性細胞性または多能性細胞はこれらの組織から採取されうる。また、神経堤細胞様活性は、様々な手段を通じて誘導されうる。例えば、いくらかの実施形態においては、神経堤細胞様表現型を呈する幹細胞を産生するために、胚性幹細胞または成年多分化能性もしくは多能性細胞が、ＭＳ５間質細胞と共に培養されうる。他の実施形態においては、神経堤細胞様表現型を呈する幹細胞を産生するために、胚性幹細胞または成年多分化能性もしくは多能性細胞が、例えば、神経芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ノギン、コルジン、Ｔｓｇ、ドルソモルフィンなどの低分子ＢＭＰ拮抗薬、また、レチノイン酸、ビタミンＡ、ＬＧ１００２６８、またはＬＧＤ１０６９などのレチノイン酸受容体作動薬、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ１（ＤＫＫ１）などのｗｎｔ阻害剤、及びこれらの類似物、並びにこれらの組合せと共に培養されうる。特定の実施形態においては、皮膚由来前駆細胞、または表皮神経堤細胞は、成年皮膚から単離されうる。一定の実施形態においては、そのような細胞は、心臓神経堤細胞が移植されることになる患者の皮膚から単離されうる。また、いくらかの実施形態においては、皮膚由来の前駆細胞または表皮神経堤細胞は、例えば、他の細胞の存在下で培養する、または１つもしくはより多い成長因子の存在下で培養することにより特定の表現型を誘導するため、あるいは、心臓神経堤細胞の数を増加させるために、培養されうる。他の実施形態においては、体細胞は、当技術分野において既知のあらゆる手段により、人口多能性幹細胞へと再プログラムされうる。
【００３２】
心臓神経堤分化培地は、幹細胞の培養工程の間に使用されうる。心臓神経堤分化培地は、増殖培地、ウシ胎児血清、抗生剤、及び抗真菌剤を含有しうる。いくらかの実施形態においては、増殖培地は、Ｉｓｃｏｖｅ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ６ＴＭ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８ＴＭ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  １６４０  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｆ１０  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ、Ｈａｍ'ｓ  Ｆ１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ、Ｍｅｄｉａ  １９９、またはこれらのあらゆる組合せから選択されうる。いくらかの実施形態においては、抗生剤は、アクチノマイシンＤ、アンピシリン、カルベニシリン、セフォタキシム、フォスミドマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ペニシリンストレプトマイシン、ポリミキシンＢ、ストレプトマイシン、またはこれらのあらゆる組合せから選択されうる。いくらかの実施形態においては、抗真菌剤は、アンフォテリシンＢ、ナイスタチン、ナタマイシン、エキノカンジン、フルシトシン、またはこれらのあらゆる組合せから選択されうる。特定の実施形態においては、心臓神経堤細胞分化培地は、ＩＭＤＭ、ウシ胎児血清、及びペニシリンストレプトマイシンを含みうる。
【００３３】
いくらかの実施形態においては、心臓分化培地は、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、またはこれらのあらゆる値（端点を含む）の間の範囲の体積パーセントで、ウシ胎児血清を含有しうる。いくらかの実施形態においては、心臓神経堤分化培地は、２０％の体積パーセントのウシ胎児血清を含有しうる。
【００３４】
いくらかの実施形態においては、心臓分化培地は、約０．２５％、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、またはこれらのあらゆる値（端点を含む）の間の範囲の体積パーセントで、抗生剤を含有しうる。いくらかの実施形態においては、心臓神経堤分化培地は、１％の体積パーセントの抗生剤を含有しうる。
【００３５】
いくらかの実施形態においては、心臓分化培地は、約０．２５％、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、またはこれらのあらゆる値（端点を含む）の間の範囲の体積パーセントで、抗真菌剤を含有しうる。
【００３６】
複数の幹細胞は、ノギン及び白血病阻止因子（ＬＩＦ）と共に培養されうる。幹細胞は、胚性幹細胞または人口多能性幹細胞でありうる。いくらかの実施形態においては、幹細胞は、人口多能性幹細胞である。幹細胞は、ゼラチン化ディッシュまたは非接着性ディッシュ中で培養されうる。いくらかの実施形態においては、幹細胞は、ゼラチン化ディッシュ中で培養されうる。幹細胞は、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、またはこれらのあらゆる値（端点を含む）の間の範囲にわたり、培養されうる。いくらかの実施形態においては、幹細胞は、ゼラチン化ディッシュ中で３日間培養される。いくらかの実施形態においては、幹細胞がディッシュから剥離されて、それから心臓神経堤分化培地及びノギンと共に非接着性ディッシュ中で１日間培養されてもよい。幹細胞は、ディッシュ中のあらゆる血清を除去するために細胞を心臓神経堤分化培地で濯ぐ工程、及びトリプシン溶液を使用することにより幹細胞をディッシュから解離させる工程により剥離されうる。トリプシン溶液は、約０．５％トリプシン、約１％トリプシン、約２％トリプシン、約３％トリプシン、約４％トリプシン、約５％トリプシン、約１０％トリプシン、約２０％トリプシン、約２５％トリプシン、約３０％トリプシン、またはこれらのあらゆる値（端点を含む）の間の範囲の体積パーセントを含有しうる。他の実施形態においては、幹細胞は、ディッシュから細胞を削ぎ落とすことによりディッシュから解離されうる。
【００３７】
ノギンは、約２５ｎｇ／ｍｌ、約３５ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約４５ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約７５ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１２５ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約１７５ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約２２５ｎｇ／ｍｌ、約２５０ｎｇ／ｍｌ、約２７５ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、またはこれらのあらゆる値（端点を含む）の間の範囲の濃度で幹細胞に添加されうる。
【００３８】
ＬＩＦは、約１００単位／ｍｌ、約１２５単位／ｍｌ、約１５０単位／ｍｌ、約２００単位／ｍｌ、約３００単位／ｍｌ、約５００単位／ｍｌ、約７５０単位／ｍｌ、約１０００単位／ｍｌ、約１，１００単位／ｍｌ、約１，２００単位／ｍｌ、約１，４００単位／ｍｌ、約１，６００単位／ｍｌ、約１，８００単位／ｍｌ、約２，０００単位／ｍｌ、約２，２００単位／ｍｌ、約２，４００単位／ｍｌ、約２，６００単位／ｍｌ、約２，８００単位／ｍｌ、約３，０００単位／ｍｌ、またはこれらのあらゆる値（端点を含む）の間の範囲の濃度で幹細胞に添加されうる。いくらかの実施形態においては、複数の幹細胞をノギン及び白血病阻止因子と共に培養する際、ノギンは、１５０ｎｇ／ｍｌの濃度であってもよく、また白血病阻止因子は、２０００単位／ｍｌの濃度である。
【００３９】
複数の幹細胞は、さらにノギンと共に培養されうる。そのノギンは、以前に述べられたあらゆる濃度で幹細胞に添加されうる。いくらかの実施形態においては、複数の幹細胞は、これにより複数の幹細胞の三次元集合体を形成しうる。幹細胞の三次元集合体は、胚様体とも呼ばれる。
【００４０】
複数の幹細胞は、心臓神経堤細胞を形成するために、心臓神経堤分化培地とともにさらに培養されうる。いくらかの実施形態においては、心臓神経堤細胞は、拍動する神経堤細胞である。心臓神経堤細胞は、さらに単離され、かつ／または精製されてもまたよい。いくらかの実施形態においては、培地はノギンを含有しない。いくらかの実施形態においては、複数の幹細胞は胚様体である。いくらかの実施形態においては、胚様体は、心臓神経堤分化培地と共に非接着性ディッシュ中で培養される。胚様体は、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、またはこれらのあらゆる値（端点を含む）の間の範囲にわたり培養されうる。いくらかの実施形態においては、胚様体は、心臓神経堤分化培地と共に４日間にわたり非接着性ディッシュ中で培養される。
【００４１】
複数の幹細胞は、タモキシフェンに接触させられうる。タモキシフェンは、複数の幹細胞が心臓神経堤分化培地と共にさらに培養された後に、添加されうる。いくらかの実施形態においては、タモキシフェンは４−ＯＨタモキシフェンでありうる。タモキシフェンは、心臓神経堤分化培地を伴うさらなる培養ステップの約１日後、約２日後、約３日後、約４日後、約５日後、約６日後、約７日後、約８日後、約９日後、約１０日後、またはこれらのあらゆる値（端点を含む）の間の範囲で、複数の幹細胞の胚様体に添加されうる。タモキシフェンは、約１日間の接触、約２日間の接触、約３日間の接触、約４日間の接触、約５日間の接触、約６日間の接触、約７日間の接触、約８日間の接触、約９日間の接触、約１０日間の接触、またはこれらのあらゆる値（端点を含む）の間の範囲の後、複数の幹細胞の胚様体から除去されうる。いくらかの実施形態においては、複数の幹細胞の胚様体は、タモキシフェンでパルスされうる。他の実施形態においては、複数の幹細胞の胚様体は、心臓分化培地と共に複数の幹細胞をさらに培養して４日後に４−ＯＨタモキシフェンが添加され、４−ＯＨタモキシフェンとの３日間の接触後に４−ＯＨタモキシフェンが除去される。
【００４２】
さらなる実施形態においては、胚様体は第４日にゼラチン化プレートへと移される。さらなる実施形態においては、胚様体が心臓神経堤細胞の拍動するコロニーを形成するまで、胚様体はゼラチン化プレート中で培養され続ける。胚様体は、約１日、約２日、約４日、約５日、約６日、約８日、約１０日、約１２日、約１４日、約１５日、約１６日、約１８日、約２０日、約２５日、またはこれらのあらゆる値（端点を含む）の間の範囲の後、心臓神経堤細胞の拍動するコロニーを形成しうる。
【００４３】
いくらかの実施形態においては、心臓神経堤細胞は、細胞膜の外表面上に提示される受容体型チロシンキナーゼである幹細胞因子受容体（ｃＫｉｔ）を発現する。いくらかの実施形態においては、心臓神経堤細胞はｃＫｉｔ陽性である。心臓神経堤細胞が分化するにつれ、ｃＫｉｔの細胞表面濃度の濃度は低下し、十分に分化した細胞は一般に、約０受容体／マイクロメートル２の細胞表面ｃＫｉｔ濃度を有する。従って、ｃＫｉｔの細胞表面濃度は実施形態間で異なってもよく、また心臓神経堤細胞が分化することを可能にするのに十分なあらゆる濃度でありうる。例えば、いくらかの実施形態においては、心臓神経堤細胞は、少なくとも約５０受容体／マイクロメートル２より高い細胞表面ｃＫｉｔ濃度を有しうる。また他の実施形態においては、心臓神経堤細胞についての細胞表面ｃＫｉｔ濃度は、約５０受容体／マイクロメートル２から約８００受容体／マイクロメートル２、約１００受容体／マイクロメートル２から約７００受容体／マイクロメートル２、約２００受容体／マイクロメートル２から約６００受容体／マイクロメートル２、またはこれらの範囲により包含されるあらゆる個々の細胞表面濃度もしくは細胞表面濃度範囲でありうる。
【００４４】
いくらかの実施形態においては、心臓神経堤細胞は、実質的に改変されていないかもしれない。つまりこれは、心臓神経堤細胞が、親組織（例えば、胎児の心臓組織）から抽出された後に意図的には遺伝子的に改変されていないことを意味する。他の実施形態においては、心臓神経堤細胞は、望ましい表現型を精製するために、遺伝的に操作されうる。そのような遺伝的改変は、抽出後の細胞への遺伝物質の導入の、または親組織の遺伝的改変の結果でありうる。例えば、いくらかの実施形態においては、親組織から抽出された心臓神経堤細胞の集団は、例えば、マーカー、ホルモン、シグナリングペプチドまたはタンパク質、及びこれらの類似物、並びにこれらの組合せなどの、外因性タンパク質の発現のために、遺伝物質で形質転換されうる。特定の実施形態においては、遺伝物質が、そのような外因性タンパク質の発現を可能にする、配偶子、受精卵（つまり接合子）、または初期胚へと導入されうる。
【００４５】
さらなる実施形態は、神経堤細胞を作成するための方法、及び神経堤細胞を含有する医薬組成物を作成するための方法を対象とする。いくらかの実施形態においては、神経堤細胞は、ヒト胚から抽出される胎児神経堤細胞でありうる。胎児神経堤細胞を抽出するための方法は、実施形態間で異なりうる。またその方法は、外植された胎児心臓細胞を作成するために胎児心臓組織をコラゲナーゼで消化するステップ、胎児心臓細胞を増殖培地へと導入するステップ、ｃＫｉｔを発現している胎児心臓細胞をｃＫｉｔを発現していない他の胎児心臓細胞から分離するステップ、及びｃＫｉｔを発現している胎児心臓細胞を増やすステップを含みうる。胎児心臓組織を消化するステップは、細胞外マトリックス成分を分解し、かつ組織から個々の細胞または細胞群を開放することが可能なあらゆる酵素を使用する、あらゆる方法により実施されうる。その酵素は、例えば、コラゲナーゼ、トリプシン、エラスターゼ、ヒアルロナーゼ、パパイン、キモトリプシン、プロテアーゼ、及びこれらの類似物、並びにこれらの様々な組合せを含む。一定の実施形態においては、消化は、ＩＩ型コラゲナーゼなどのコラゲナーゼを使用して実施されうる。同様に、増殖培地は、ヒト細胞を維持することが可能な当技術分野で既知のあらゆる増殖培地でありうる。いくらかの実施形態においては、増殖培地は、胎児心臓細胞または神経堤細胞が上に播種される固体増殖培地であってもよく、また他の実施形態においては、増殖培地は液体増殖培地でありうる。液体培地が使用される実施形態においては、増殖培地中の細胞がばらばらのままであることを確実にするため、液体培地は、攪拌され、通気され、またはその類似状態であり、またこれらの組合せであってもよい。一定の実施形態においては、増殖培地は、成長因子、抗生剤、非必須アミノ酸、及びこれらの類似物、並びにこれらの組合せで補足されうる。特定の実施形態においては、培地は、１つまたはそれより多いサイトカイン、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及びこれらの類似物、ならびにこれらの組合せなどだがこれらに限定されない成長因子を含有しうる。増殖培地中に含有される抗生剤は、培地中の細菌の成長の可能性を低下させるように選択されうる。アクチノマイシンＤ、アンピシリン、カルベニシリン、セフォタキシム、フォスミドマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ペニシリンストレプトマイシン（Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ）、ポリミキシンＢ、ストレプトマイシン硫酸塩、及びこれらの類似物、並びにこれらの組合せを含むがこれらに限定されない、あらゆる既知の抗生剤が使用されうる。分離するステップは、あらゆる手段により実施されうる。一定の実施形態においては、分離するステップは、例えばアロフィコシアニン（ＡＰＣ）などの蛍光プローブに共役している抗ｃＫｉｔ抗体を使用する細胞ソーティングにより実施されうる。増やすステップは、例えば、細胞が繁殖するのを可能にするのに十分な時間にわたり、分離された神経堤細胞を上で開示された増殖培地などの増殖培地中へ導入することにより実施されうる。
【００４６】
他の実施形態の方法は、患者から多分化能性または多能性細胞を抽出するステップ、心臓神経堤細胞様表現型を呈するように多分化能性または多能性細胞を誘導するステップ、及び傷害を多分化能性または多能性細胞と接触させるステップを有しうる。多分化能性または多能性細胞を抽出するステップは、あらゆる手段により実施されうる。例えば、いくらかの実施形態においては、多分化能性または多能性細胞は、患者からの皮膚片を得ることにより、皮膚細胞から抽出されうる。他の実施形態においては、幹細胞は、例えば、骨髄、脂肪組織、血液、及びこれらの類似物から抽出されうる、再生細胞を含有する組織から得られうる。一定の実施形態においては、多分化能性または多能性細胞は、患者由来、つまり自家幹細胞であってもよく、また他の実施形態においては、多分化能性または多能性細胞はドナーから得られてもよい。そのような方法は、外植された多分化能性または多能性細胞を作成するために多分化能性または多能性細胞を含有する組織を消化するステップ、多分化能性または多能性を増殖培地中へ導入するステップ、ｃＫｉｔを発現している多分化能性または多能性細胞をｃＫｉｔを発現していない他の多分化能性または多能性から分離するステップ、及びｃＫｉｔを発現している多分化能性または多能性細胞を増やすステップなどの、上で開示されたステップをさらに組み込みうる。特定の実施形態においては、そのような方法は、多分化能性または多能性細胞が神経堤細胞様表現型を呈することを可能にする、１つまたはそれより多いタンパク質、サイトカイン、または他の成長因子で、外植された多分化能性または多能性細胞を処理するステップをさらに含みうる。例えば、いくらかの実施形態においては、多分化能性または多能性細胞は、ｆｌｔ３リガンド、インターロイキン６、インターロイキン７、及びこれらの類似物、並びにこれらの組合せの存在下で増やされうる。ｆｌｔ３リガンド、インターロイキン６、及びインターロイキン７は、多能性細胞におけるｃＫｉｔ発現を促進することが示されている。そのような処理は、神経堤様表現型を有する細胞を産生しうる。
【００４７】
いくらかの実施形態においては、増殖培地は、フィーダー細胞、または神経堤細胞の成長を補助する他の細胞を含有しうる。例えば、フィーダー細胞は、他源からは提供され得ない、神経堤細胞の成長に必要な一定の栄養物を提供しうる。そのようなフィーダー細胞は周知であり、例えば、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、胚性繊維芽細胞、及びこれらの細胞の改変されたまたは不死化されたバージョンを含みうる。いくらかの実施形態においては、フィーダー細胞は、マウスまたはブタなどの非ヒト種から得られうる。他の実施形態においては、フィーダー細胞はヒト細胞から得られうる。また一定の実施形態においては、フィーダー細胞は、その患者から得られうる（つまり、自家フィーダー細胞）。特定の実施形態においては、胎児心臓細胞がより組織様な外観を呈することを可能にする追加の細胞が、増殖培地中に提供されうる。例えば、いくらかの実施形態においては、増やすための増殖培地は、多分化能性または多能性間葉系幹細胞、繊維細胞、または心臓細胞などの他のヒト組織細胞を含有しうる。これらの細胞は、神経堤細胞が組織様集団中へと組み込まれることを可能にしうる。
【００４８】
さらに他の実施形態においては、神経堤細胞は、スキャフォールド上へ播種され、また構造化された組織パッチまたは人工臓器構造を産生するように成長するように誘導されうる。例えば、いくらかの実施形態においては、人工動脈または静脈を産生するように、神経堤細胞はスキャフォールド上に播種されうる。また他の実施形態においては、神経堤細胞は、負傷した心臓組織上に配置されうる柔軟な組織パッチ中へと組み込まれうる。
【００４９】
一定の実施形態においては、神経堤細胞は、上で開示されたように、少なくとも有効量の神経堤細胞を含有する医薬組成物中で投与されうる。またいくらかの実施形態においては、医薬組成物は、上で開示された活性剤などの１つまたはそれより多い活性剤を含有しうる。そのような実施形態においては、方法は、神経堤細胞を１つまたはそれより多い薬学的に許容可能な担体または賦形剤と組み合わせる工程を含有しうる。いくらかの実施形態においては、医薬組成物を調整するための方法は、薬学的に許容可能な担体または賦形剤と組み合わせる前に、例えば細胞ソーティングを使用して、増やすための増殖培地中の他の細胞及び成分から神経堤細胞を単離する工程を含みうる。いくらかの方法は、神経堤細胞を含有する医薬組成物中に１つまたはそれより多い活性剤を組み込むステップを含みうる。他の実施形態においては、方法は、神経堤細胞を含有する医薬組成物とは別に、活性剤を投与するステップを含みうる。活性剤を投与する工程は、神経堤細胞を含有する医薬組成物を投与する前または後に起こってもよく、また活性剤は局所的または全身的に投与されうる。
【００５０】
さらなる実施形態は、心臓神経堤細胞、心臓神経堤細胞を含有する医薬組成物、及び心臓神経堤細胞を含有する医療装置を使用する治療の方法を対象とする。そのような実施形態は、傷害を、心臓神経堤細胞を含有する組成物または装置と接触させるステップを含みうる。そのような方法は、傷害の種類により限定されない。また特定の実施形態においては、傷害は、例えば、心筋梗塞、心不全、心筋症、先天性心疾患、栄養性疾患、虚血性または非虚血性心筋症、高血圧性心筋症、弁膜症性心筋症、炎症性心筋症、全身性代謝性疾患に対し二次的に起こる心筋症、アルコール性心筋症、糖尿病性心筋症、拘束型心筋症、及びこれらの類似物、並びにこれらの組合せにより引き起こされる心臓傷害でありうる。いくらかの実施形態においては、心臓神経堤細胞はｃＫｉｔを発現し、ｃＫｉｔ陽性である。いくらかの実施形態においては、心臓神経堤細胞はｃＫｉｔ陽性である。いくらかの実施形態においては、接触させる工程は、心臓神経堤細胞を含有する医薬組成物の全身性送達により果たされうる。他の実施形態においては、接触させる工程は、心臓神経堤細胞もしくは心臓神経堤細胞を含有する医薬組成物の局所的送達、または、傷害の部位を心臓神経堤細胞、心臓神経堤細胞を含有する医薬組成物、もしくは心臓神経堤細胞を含有する医療装置と直接的に接触させることにより果たされうる。例えば、一定の実施形態においては、心臓神経堤細胞は、梗塞領域への直接的注射、カテーテルを用いる注射により、細胞もしくは医薬組成物として移植され、または手術により心臓パッチとして移植されうる。
【００５１】
心臓神経堤細胞は、一般に、治療上有効量で投与されうる。治療上有効量とは、治療される疾患または傷害の治療または予防を提供するのに十分な、あらゆる量である。治療有効量は、例えば、状態の重度、投与経路、投薬頻度、年齢、体重、体調、及び個々の患者の応答に基づき、実施形態間で異なりうる。担当の医師は、これら及び他の考慮事項に基づき有効量を決定しうる。担当の医師はまた、毒性もしくは有害作用ゆえに投薬量を低下させ、または反対に、臨床応答が十分でない場合は有効量を増加させることにより、有効量をどのように及びいつ終結させ、中断し、または調節するかを決定しうる。
【００５２】
いくらかの実施形態においては、治療のための方法は、心臓神経堤細胞、心臓神経堤細胞を含有する医薬組成物、または心臓神経堤細胞を含有する医療装置と組み合わせて、１つまたはそれより多い活性剤を投与するステップを含有しうる。また他の実施形態においては、１つまたはそれより多い活性剤を投与するステップは、心臓神経堤細胞、心臓神経堤細胞を含有する医薬組成物、または心臓神経堤細胞を含有する医療装置と接触する前に、あるいは、心臓神経堤細胞、心臓神経堤細胞を含有する医薬組成物、または心臓神経堤細胞を含有する医療装置と接触するステップの後に実施されてもよい。活性剤は、上で開示された活性剤のいかなるものでもよく、また一定の実施形態においては、活性剤は、心臓の傷害、疾患、または障害を予防し、治療し、または遅らせるように製剤化されうる。１つまたはそれより多い活性剤は、有効量で投与されうる。また上で議論されたように、例えば、治療される状態の重度、患者の体調など、並びに個々の活性剤に特異的な他の考慮事項などの上で開示された考慮事項を考慮しながら、医師が、投与される各活性剤の有効量を決定しうる。
【００５３】
いくらかの実施形態においては、投与する工程は、神経堤細胞を含有するスキャフォールド、または神経堤細胞を含む組織パッチを患者に移植することにより実施されうる。いくらかの実施形態においては、そのようなスキャフォールドは、神経堤細胞のための構造を提供する、生体適合性ポリマーまたは工学操作された組織を含みうる。スキャフォールドまたは組織パッチは、例えば、疾患を患ったまたは傷害された組織を除去する工程、及び疾患を患ったまたは傷害された組織に代わって神経堤細胞を含むスキャフォールドまたは組織パッチを移植する工程により、外科的に移植されうる。他の実施形態においては、外科的に移植する工程は、疾患を患ったまたは傷害された組織を除去する工程、並びに、外科的除去により産生された傷を、神経堤細胞、神経堤細胞と他の細胞との組合せ、または神経堤細胞と他の細胞と１つもしくはそれより多い活性剤との組合せと接触させる工程により、実施されうる。
【００５４】
実施例
本発明は、その一定の好ましい実施形態への言及を伴いながら、相当詳細に開示されてきたが、他のバージョンも可能である。従って、添付の特許請求の範囲の真髄及び範囲は、本明細書内に含有される開示及び好ましいバージョンには限定されるべきでない。本発明の様々な態様が、以下の非限定的な実施例への言及とともに、例証されることになる。
【実施例１】
【００５５】
ｃＫｉｔ受容体を擁する細胞は、傷害後の心臓回復を刺激するために、治療用に利用されてきた。これらの細胞の胚性源を同定するため、タモキシフェン誘導性ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋マウス系統を使用して予定運命図化が実施された。胚形成の間に順次タモキシフェンを導入することは、これらの細胞の起源、及び心臓形成に対するそれらの寄与の直接的な同定を可能にした。
【００５６】
ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスが、内因性ｃＫｉｔ遺伝子座におけるＡＴＧ開始コドンへのＣｒｅＥＲＴ２発現カセットのノックインとして、相同組換えにより作成された。簡潔には、ＣｒｅＥＲＴ２発現カセット、内部リボソーム進入部位、及びｆｒｔが隣接するネオマイシン耐性カセットを含有する、図１パネルＡに示されるターゲティングベクターが、１２９Ｓ６  ＥＳ細胞中へと電気穿孔された。相同組換え及び単一コピーの挿入は、サザンブロット解析により確認され、正しくターゲットされたＥＳ細胞が、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ胚盤胞中へと注射された。他のヘテロ接合性ｃＫｉｔ変異体と矛盾せずに、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋は健康かつ繁殖能力があり、また図１パネルＢの表現型ｗｈｉｔｅ  ｓｐｏｔｔｉｎｇの特徴を示す。この図１パネルＢのｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスの表現型ｗｈｉｔｅ  ｓｐｏｔｔｉｎｇは、他のｃＫｉｔ変異体と類似し、メラニン形成の欠陥と一致し、従って、ｃＫｉｔの神経堤経路における関与を示唆する。
【実施例２】
【００５７】
ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスｃＫｉｔと、２つの以前に樹立されたＣｒｅレポーターマウス系統とを交配することにより、ｃＫｉｔ発現細胞の発生予定運命図化が行われた。そのレポーターマウス系統とは、二重蛍光色レポーターＤｓＲｅｄ／ＥＧＦＰ（ＩＲＧ）、またはベータガラクトシダーゼレポーターＲ２６ＲｌａｃＺである。ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧ；Ｉｓｌ１−ｎＬａｃＺ遺伝子型を擁する胚の作製には、雄ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧマウスが雌Ｉｓｌ１−ｎＬａｃＺに交配させられた。
【００５８】
交尾後日数（ｄｐｃ）７．５から８．５にｃＫｉｔを活発に発現している細胞は、この期間中にｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧ胚を擁する妊娠マウスへの、ピーナッツオイルに溶解された２０ｍｇ／ｍｌのタモキシフェン１００μｌの腹腔内注射、及び第一または第二心臓予定領域の心筋前駆細胞を観察することにより同定された。第一または第二心臓予定領域の前駆細胞におけるｃＫｉｔの役割を評価するため、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧまたはｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／Ｒ２６ＲＬａｃＺ胚を擁するマウスが、７．５−８．５ｄｐｃの間に、２日間連続で、毎日タモキシフェンを注射された。１８．５ｄｐｃにおいて胚が回収され、ＥＧＦＰ発現が、生組織イメージング、並びに固定された試料中の共焦点落射蛍光及び免疫蛍光分析により評価された。
【００５９】
ＥＧＦＰ落射蛍光が稀であることを例証する生組織イメージングは、組換えの成功を示し、循環する血液細胞、精巣、及び肺中の強いＥＧＦＰ発現に反映された（データ表示なし）。稀に、小さく孤立したＥＧＦＰ（＋）細胞が心臓中（ＬＶは左心室、ＬＡは左心房）に検出され、これは時折、心臓転写因子Ｇａｔａ４と共局在した（データ表示なし）。これは、心臓系列の転写因子Ｇａｔａ４を共発現するＥＧＦＰ（＋）細胞の共焦点免疫蛍光を示す（挿入図中の矢先）。矢印は心外膜中のＥＧＦＰ（＋）細胞を指し、挿入図はＧａｔａ４を発現しない２つのＥＧＦＰ（＋）細胞を強調する（データ表示なし）。
【００６０】
いかなる心筋領域もＥＧＦＰ（＋）心筋系子孫を含有しなかった。従って、発生予定運命図化は、ｃＫｉｔが第一または第二心臓予定領域の心筋系子孫を規定しないことを示唆する。図２パネルＡ〜Ｃは、一匹のＷＴ同腹仔の１８．５ｄｐｃの心臓中にＸ−ｇａｌの発現がないことを示す。図２パネルＢにおいては、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／Ｒ２６ＲｌａｃＺ同腹仔一匹の心臓中に存在する、稀なＸーｇａｌ（＋）細胞（矢先）が示される。図２パネルＣは、７．５−８．５ｄｐｃ間のｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／Ｒ２６ＲｌａｃＺにおける組換えがメラニン細胞を規定しないことを示し、これは、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２対立遺伝子が忠実に内因性ｃＫｉｔ発現を反映することをさらに支持する。
【実施例３】
【００６１】
心臓堤は、心臓発生に寄与することが知られている。これを示すため、ｃＫｉｔが心臓ＮＣＣ系列の細胞を形成するかどうかを決定すべく、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧまたはｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／Ｒ２６ＲＬａｃＺ胚を擁するマウスが、９．５−１１．５ｄｐｃまたは１０．５−１２．５ｄｐｃのいずれかの間、３日間連続でタモキシフェンの注射を毎日受けた。この期間は、心臓ＮＣＣが哺乳類の心臓発生プログラムを補足する、胚のステージである。予期された通り、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋媒介性組換えによりＥＧＦＰ標識された、胚性メラニン芽細胞、神経管、背根神経節（ＤＲＧ）、循環血液細胞、胃腸細胞、精巣、及び肺が同定された（データ表示なし）。しかしながら、７．５−８．５ｄｐｃのｃＫｉｔ発現細胞の発生運命予定図とは対照的に、調べられた全ての生きていて拍動がありｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換えが起こった１８．５ｄｐｃのｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧ胎児心臓における、心臓流出路（ＯＦＴ）、心外膜、及び心筋内において、強いＥＧＦＰ落射蛍光が存在した（データ表示なし）。従って、ｃＫｉｔ（＋）心臓前駆細胞は、大部分が、〜９．５ｄｐｃにおいて発達中の心臓へと移動しそこで心臓発生に寄与するＮＣＣ細胞から生じるようである。
【００６２】
他のネズミ科モデルにおいては異なるＣｒｅレポーター対立遺伝子間でＣｒｅ組換えの特異性及び効率が異なり、これが矛盾する結果を生じうるため、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋対立遺伝子の存在を確認するために、上で開示のｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／Ｒ２６ＲｌａｃＺマウスを使用する予定運命図化方法が使用された。膣栓を有する雌は、０．５ｄｐｃとみなされた。異なるタイムポイントにおける胚が、氷冷のＨａｎｋ'ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ溶液（ＨＢＳＳ、Ｇｉｂｃｏ）中に採取された。ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧ対立遺伝子を擁する１２．５ｄｐｃ及び１８．５ｄｐｃの胚については、解剖直後に蛍光顕微鏡下で生組織イメージングが行われ、ＥＧＦＰ及びＤｓＲｅｄ落射蛍光が画像記録された。それから試料は室温にて４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で１〜１時間半にわたり固定され、次に４℃にて３０％スクロース中で一晩インキュベートされた。翌日、試料は最適なカッティングコンパウンド（ＯＴＣ）中に埋め込まれ、凍結切片化の前に液体窒素中で急速冷凍された。ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／Ｒ２６ＲｌａｃＺまたはＩｓｌ１−ｎＬａｃＺ対立遺伝子を擁する固定された完全なマウス胎児心臓または胚において、並びにそれらの同腹仔それぞれについても、β−ガラクトシダーゼ染色キットを使用してＸ−ｇａｌ染色が行われた。簡潔には、試料が３７℃にてＸ−ｇａｌ溶液中で一晩インキュベートされた。翌日、Ｘ−ｇａｌがＰＢＳで洗い流され、試料は光学顕微鏡化で画像記録され、４℃にて３０％スクロース中で一晩インキュベートされた。固定された組織はそれから、ＯＣＴ中に埋め込まれ、凍結切片化のために処理された。ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧ：Ｉｓｌ１−ｎＬａｃＺ胚のいくらかの場合においては、凍結切片化の後にＥＧＦＰ免疫染色に続き、Ｘ−ｇａｌが実施された。ｃＫｉｔ免疫組織化学解析については、１２．５ｄｐｃ−１４．５ｄｐｃの野生型マウス胚が採取され、１０％緩衝ホルマリン中で一晩固定された。翌日、これらの固定された胚はパラフィン中に埋め込まれ、免疫組織化学のために処理された。
【００６３】
Ｘ−ｇａｌを用いた発生予定運命図の組織学的評価は、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／Ｒ２６ＲｌａｃＺ胚における組換えがｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧと同一のモザイクパターンを生じたことを明らかにし、これは図３パネルＡ〜Ｄ、及び図４パネルＡ〜Ｄに示される。図３パネルＥは、心臓における神経心臓堤細胞の分布を例証する。従って、タモキシフェン誘導性Ｃｒｅ組換えはｃＫｉｔ系列に特異的であり、異なるｌｏｘ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘ発現抑制性レポーター対立遺伝子間で一致する。
【００６４】
他のメラニン芽細胞系及び神経芽細胞系ＮＣＣ系列と同様に、表現型解析は、ＮＣＣｋｉｔ及びこれらの心臓派生細胞が小眼症関連転写因子Ｍｉｔｆを共発現したことを示した（データ表示なし）。凍結切片については、１０μｍ厚の試料が切片作製後に４％ＰＦＡで１０分間固定された。パラフィンに埋め込まれた組織については、４〜５μｍ厚の組織切片が脱パラフィンされ、再水和された。抗原賦活化は、ｐＨ＝６のクエン酸緩衝溶液（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）中でスライドグラスを２ｘ１０分間、マイクロ波にかけることにより実施された。切片は、それから、１０％正常ロバ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）を用いてＲＴにて１時間かけてブロッキングされ、続いて４℃にて一次抗体と共に一晩インキュベートされた。以下の抗体が使用された：ｃＫｉｔ、ＥＧＦＰ、ベータガラクトシダーゼ、コネキシン−４３、ＫＤＲ、ＭＩＴＦ、ＰＥＣＡＭ１、ａ−平滑筋アクチン、抗平滑筋ミオシン重鎖、心臓トロポニン−Ｉ、カルポニン、トロポミオシン、チロシナーゼ、心臓ミオシン軽鎖−２ｖ、ニューロフィラメント−Ｍ、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ−４、Ｉｓｌ−１、及び第ＶＩＩＩ因子関連抗原。続いて、その抗体は、アフィニティー精製された二次抗体のＦＩＴＣ、Ｃｙ３、及びＣｙ５共役Ｆ（ａｂ'）２フラグメントと共に、切片を３７℃にて１時間インキュベートすることにより可視化された。ＭＩＴＦ及びＳＭ１については、チラミドシグナル増幅が用いられた。スライドグラスは、ＤＡＰＩで対比染色され、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｇｏｌｄ試薬でマウントされ、さらなる調査まで４℃にて保管された。顕微鏡法による評価、及び画像取得は、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ−７１０共焦点顕微鏡を用いて実施された。Ｚｅｉｓｓ  ＺＥＮソフトウェアが使用された。とりわけ、Ｍｉｔｆ及びｃＫｉｔ変異は、類似したメラニン細胞及び心筋の欠陥を引き起こす。従って、我々の発見は、メラニン形成においてと同様に、ｃＫｉｔ及びＭｉｔｆ経路の基礎をなす関係が、ＮＣＣｋｉｔ心臓芽細胞をもまた規定することを示唆する。
【００６５】
神経堤細胞の予定運命の決定は、Ｉｓｌ１によっても規定される。Ｉｓｌ１は、心臓神経堤細胞を含む哺乳類心血管細胞系列の大部分を特定もする、ホメオボックス遺伝子である。しかしながら、Ｉｓｌ１関連経路は、心臓においてはｃＫｉｔとは別であると考えられている。Ｉｓｌ１がＮＣＣｋｉｔ心臓芽細胞と関連するかを調べるため、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧマウスが、Ｉｓｌ１核ｌａｃＺ（ｎＬａｃＺ）ノックイン対立遺伝子を擁するマウスと交配された。妊娠マウスが、９．５−１１．５ｄｐｃにタモキシフェンを投与された。胚が１２．５ｄｐｃ及び１４．５ｄｐｃに採取され、ＥＧＦＰ及びｎＬａｃＺの発現が調べられた。実際に、ＥＧＦＰ及びｎＬａｃＺの共局在が、神経管、背根神経節（ＤＲＧ）、及びＯＦＴの細胞中に実証された（データ表示なし）。神経管、及びＤＲＧ中のＥＧＦＰ／ｎＬａｃＺ二重陽性細胞の大部分が、グリア／神経細胞の特異化を例証した。図６。従って、Ｉｓｌ１は、心臓芽細胞系列の特異化の間のＮＣＣｋｉｔと関連するようである。
【００６６】
共焦点免疫蛍光解析は、ＮＣＣｋｉｔが、大動脈弓の中膜、流出路（ＯＦＴ）、心臓及び動脈弁、並びに伝達系細胞を含む、予期される全系譜に寄与したことを明らかにした（データ表示なし）。ＯＦＴの内皮及び平滑筋層へのＮＣＣｋｉｔの寄与は観察されたが（データ表示なし）、冠血管細胞の分化は観察されなかった（データ表示なし）。しかしながら、多くの心房及び心室心筋細胞（全ＥＧＦＰ（＋）派生細胞の２９．９％±３．１％）、並びに、強いＥＧＦＰまたはＸ−ｇａｌ発現を有する心膜、心内膜、及び心外膜細胞は、心臓ＮＣＣ派生細胞の役割としては予期されていなかった。図４及び図５。重要なことには、ＮＣＣｋｉｔ由来の心筋細胞の大部分が、心室中隔中に局在した。図３パネルＥ、図５。
【００６７】
発生予定運命図が、心臓における胚性ｃＫｉｔ抗原の通常の局在パターンと比較してどうであるかを探索するため、野生型マウス胚が調べられた。ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋対立遺伝子における我々の発生に関する発見と一致して、ｃＫｉｔ免疫組織化学は、野生型マウスの胚発生の間の、複数の臓器における固有の細胞集団を明らかにした。重要なことには、本手法を用いて、発達中の神経管から背側性に出現し胎児心臓へと向かって腹側性かつ側方に消失する軌跡を有する、ＮＣＣｋｉｔ系列の移動パターンが明らかに検出された（データ表示なし）。ＮＣＣｋｉｔは、ＯＦＴ、壁側心膜、及び心内膜を介して心筋へのアクセスを得るようであった（データ表示なし）。
【００６８】
心臓ｃＫｉｔと骨髄由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）との間の相互作用は、虚血心の本来の再生反応を顕著に向上させた。他のｃＫｉｔ（＋）系列と同様に、これらの相互作用は、ｃＫｉｔ（＋）心臓前駆細胞をｅｘ−ｖｉｖｏで繁殖させるために、非常に重要であるようである。成年骨髄は、出生後の神経堤細胞の真の細胞源でありうる。さらに、治療用使用のための組織特異的前駆細胞のｅｘ−ｖｉｖｏ増殖は、その起源の間質の存在下では増強されることが分かった。
【実施例４】
【００６９】
出生後の心臓ＮＣＣｋｉｔクローンにおける移動及び増殖を制御するメカニズムを調べるため、２日齢のｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧ新生マウスが、５０μｌタモキシフェンの単一皮下注射が投与された。翌日、３日齢の新生心臓（ＰＮ３）が採取され、氷冷ＰＢＳ中で洗浄され、それから実体顕微鏡下で不必要な組織から分けてきれいにされた。心臓はそれから組織培養フード中へと移動させられ、滅菌条件下でのＤＭＥＭでの追加の洗浄ステップの後、〜１ｍｍ３断片へと切り刻まれ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、及び２００単位／ｍｌのＩＩ型コラゲナーゼ溶液の溶液中で３７℃にて消化された。その後、組織外植物が採取され、ＤＭＥＭで二回洗浄された。それから単一の組織断片が実体顕微鏡下でピペットを使用して採取され、ゼラチン被覆された２４ウェルプレートの単一のウェル中で、１ｘ１０５ＭＳＣフィーダーを伴って、または伴わずに、別々に培養された。試料は、毎日栄養を与えられた。基本の心筋外植物フィーディング培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１５％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％β−メルカプトエタノール、１０００単位／ｍｌ組換えマウスＬＩＦ、１ｎｇ／ｍｌ組換えマウスｂＦＧＦ、及び０．１ｍＭ非必須アミノ酸から構成された。ＳＣＦの効果は、培地に１００ｎｇ／ｍｌ組換えネズミ科ＳＣＦを補足することにより調べられた。ｃＫｉｔの中和のためには、培地に１００ｎｇ／ｍｌのラット抗ネズミ科ｃＫｉｔ抗体が補足された。Ｓｄｆ１／Ｃｘｃｒ４の役割を評価するためには、培地にＡＭＤ３１００が最終濃度１μＭにて補足された。それから試料は毎日監視され、蛍光顕微鏡下で、ＥＧＦＰ（＋）細胞のクローナルな増殖が、連続する５〜８日間にわたり１日おきに定量化された。
【００７０】
翌日これらの動物からの心筋外植物が回収され、ＭＳＣフィーダーの存在下または非存在下で培養された。ブタＭＳＣは、前に開示されたように、一匹の健康なＹｏｒｋｓｈｉｒｅドナーから単離され、増殖させられた。簡潔には、骨髄が腸骨稜から取得され、吸引液が望まれない細胞種を排除するために密度勾配に通され、２０％ウシ胎児血清を含有する２５ｍｌＭＥＭ  Ａｌｐｈａ培地とともに、１６２ｃｍ２培養フラスコ中に蒔かれた。蒔いて５〜７日後、非接着細胞は培地交換の間に洗い流され、残りのプラスチックに接着性の、精製されたＭＳＣ集団が培養液中で増殖させられた。使用された全細胞は、継代数３〜４において集密度８０〜９０％に達したら採取され、１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣを使って３７℃にて３時間かけて不活性化された。不活性化されたブタＭＳＣフィーダーはトリプシン化により回収され、使用まで液体窒素中で凍結保存された。全ての実験について、ＭＳＣフィーダーは、使用の１日前に２ｘ１０５ＭＳＣ／ｍｌの濃度で播種された。異なる培養条件下でのＥＧＦＰ（＋）細胞の応答は、毎日監視され、生細胞蛍光イメージングにより１日おきに定量化された。
【００７１】
培養液中で５日後のＥＧＦＰ（＋）細胞の存在量はＭＳＣ細胞の存在下または非存在下で類似していたものの、ＥＧＦＰ（＋）細胞が組織外に移動するためにはＭＳＣは必要であった。ＭＳＣ細胞の非存在下では、ＥＧＦＰ（＋）細胞は忠実に組織境界内に残ったままだった。さらに、ＭＳＣとの共培養は、ＥＧＦＰ（＋）ＮＣＣｋｉｔの拍動する細胞への自発的分化を妨げた。これらの発見は、内因性ＥＧＦＰ（−）／ＤｓＲｅｄ（＋）出生後心臓間質とは異なり、ＭＳＣはＮＣＣｋｉｔ移動を支持することを示唆する。
【００７２】
他の系列におけるｃＫｉｔの機能と一致して、成年心臓ｃＫｉｔ（＋）細胞の増殖は、ＳＣＦの存在下で増強される。従って、哺乳類ＮＣＣｋｉｔ増殖及び移動におけるＳＣＦ／ｃＫｉｔの役割を明らかにするため、上で開示されたように、組換えネズミ科ＳＣＦの存在下または非存在下で新生心筋外植物が培養された。驚くべきことに、外因性ＳＦＣは、ＭＳＣが存在した場合のみ、ＥＧＦＰ（＋）細胞の増殖能を３．５倍に増加させた。図７パネルＡ〜Ｃ。ＭＳＣの非存在下では有意な差は検出されず、このことは、他の生物学的システムにおいてと同様に、ＳＣＦ単独ではＮＣＣｋｉｔ増殖を支持するのに十分でないことを示唆する。同様に、抗ｃＫｉｔ抗体を用いたＳＣＦ／ｃＫｉｔシグナリングの中和は、ＮＣＣｋｉｔ増殖に対するＳＣＦの効果を妨げた。しかしながら、ＳＣＦまたはｃＫｉｔのいずれも、ＥＧＦＰ（＋）細胞移動に影響しなかった（データ表示なし）。従って、ＳＣＦ／ｃＫｉｔシグナリングは、ＮＣＣｋｉｔの増殖能は制御するが、ＮＣＣｋｉｔの移動能は制御しない。
【実施例５】
【００７３】
最近の研究がＮＣＣに対するＳｄｆ１／Ｃｘｃｒ４系の走化性の役割を明らかにしているため、ＮＣＣｋｉｔ移動に対するＭＳＣの効果が探索された。上で開示のように心筋外植培養が作成され、Ｓｄｆ１／Ｃｘｃｒ４系の阻害剤であるＡＭＤ３１００に応答しての、ＥＧＦＰ（＋）細胞の出現をスクリーニングした。予測通り、ＡＭＤ３１００は、培養された外植物からのＥＧＦＰ（＋）細胞の移動をブロックした（データ表示なし）。驚くべきことに、ＡＭＤ３１００は、ＥＧＦＰ（＋）細胞の、自発的に収縮する心筋細胞への強い分化を引き起こした一方で、ＥＧＦＰ（＋）細胞の存在量を有意に低下させた（データ表示なし）。従って、Ｓｄｆ１／Ｃｘｃｒ４系は、ＮＣＣｋｉｔの移動及び分化を制御する。
【実施例６】
【００７４】
ＮＣＣｋｉｔがヒト心臓発生プログラムの一部であるか、及びネズミ科ＮＣＣｋｉｔに類似する表現型を有する細胞が発達過程のヒト心臓において存在していたのかを決定するため、ｃＫｉｔの共焦点免疫蛍光解析が実施された。この解析は、流出路壁、心外膜壁、心内膜壁、緻密心筋壁、及び血管周囲壁じゅうにわたり平均１１７８±１４２  ＮＣＣｋｉｔ／ｃｍ３を示した。ネズミ科心臓ＮＣＣｋｉｔ表現型と一致して、ヒトＮＣＣｋｉｔは、Ｍｉｔｆ及びＩｓｌ１、並びにコネキシン−４３を共発現した（データ表示なし）。コネキシン−４３は、ネズミ科の心臓発生において心臓ＮＣＣ系列を識別する、ギャップ結合タンパク質である。
【００７５】
ＮＣＣｋｉｔ発現細胞が、上で開示の初代外植技法を使用してヒト胎児心臓（妊娠１５〜２２週）から単離された。簡潔には、ヒト胎児心臓は、処理までの間、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する冷却Ｈａｎｋ'ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中で保管された。ＤＭＥＭでよく洗った後、試料は〜１ｍｍ３断片へと切り刻まれ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、及び２００単位／ｍｌのＩＩ型コラゲナーゼ溶液の溶液中で３７℃にて消化された。それから、全細胞溶解物及び組織外植物が回収され、ＤＭＥＭで二回洗浄され、ＥＣＭ培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１５％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％ベータメルカプトエタノール、１０００単位／ｍｌ組換えヒトＬＩＦ、１００ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌ組換えヒトｂＦＧＦ、及び０．１ｍＭ非必須アミノ酸）中に再懸濁され、それからウェルあたり０．４ｘ１０６ＭＳＣフィーダー細胞を含有するゼラチン被覆の６ウェルプレート中に播種された。７〜１０日後、トリプシン化により試料が回収され、ｃＫｉｔ（＋）細胞が、ＡＰＣ共役の抗ヒトｃＫｉｔモノクローナル抗体、及び５連続サイクルの磁気的細胞ソーティングを使用して磁気的に精製された。精製されたＮＣＣｋｉｔはそれから、複数継代数にわたり、ＭＳＣフィーダー上でＥＣＭ培地とともに増殖させられた。サイトスピンされた調整物に対して、免疫細胞化学的評価が次いで行われた。
【実施例７】
【００７６】
ヒト胎児ＮＣＣｋｉｔの特性がＥｘ  ｖｉｖｏで試験された。ヒト胎児心筋外植物がＭＳＣフィーダー上に播種され、組換えヒトＳＣＦと共に７〜１０日間培養された（データ表示なし）。ＮＣＣｋｉｔがヒトｃＫｉｔに特異的な抗体を使用して単離された（データ表示なし）。精製された細胞は、無着色で紡錘型の形態を有し、ＭＳＣフィーダー上で複数の継代数にわたり継代培養された。増殖したクローンの免疫表現型解析は、８０％より多くのヒトＮＣＣｋｉｔがＩｓｌ１、Ｍｉｔｆ、及びコネキシン−４３、並びに心臓転写因子Ｇａｔａ４及びＮｋｘ２−５を発現したことを実証した。我々の以前の報告と一致して、ＶＥＧＦ受容体であるＫｄｒの発現は実証されなかった。単一細胞遺伝子発現解析が、マルチプレックスＲＮＡ  ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより実施された。ｃＫｉｔ、Ｉｓｌ１、Ｎｋｘ２−５、及びＧａｔａ−４の転写産物は、単一ＮＣＣｋｉｔクローン中で多量に共発現されていた（データ表示なし）。とりわけ、Ｉｓｌ１転写産物はＮＣＣｋｉｔの核内に蓄積し、このことはは、胎児ヒト心臓ＮＣＣの、重要な核質特性及び遺伝子転写のメカニックであることを示唆する。
【実施例８】
【００７７】
ＮＣＣｋｉｔのｉｎ−ｖｉｔｒｏ分化能が、新生ラット心筋細胞（ＮＲＣＭ）との共培養システム中で試験された。簡潔には、ＮＲＣＭが単離され、１．５ｘ１０５ＮＲＣＭ／ｃｍ２の密度でゼラチン被覆された１２ウェルプレート中に蒔かれた。それから、ＮＣＣｋｉｔはＮＲＣＭと１／１０の比で、細孔サイズ０．４μｍを有するトランスウェルインサートを使用して間接的に共培養された。共培養物は、ＩＭＤＭグルタマックス、１０％ＦＢＳ、インスリン−トランスフェリン−セレナイト、１％ウシ血清アルブミン、２０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、１％ペニシリン−ストレプトマイシンから構成されるＮＲＣＭ培地で維持され、３７℃かつ５％ＣＯ２にて最大２週間、加湿インキュベーター中でインキュベートされた。免疫細胞化学的評価のためには、細胞がＲＴにて２０分間、４％パラホルムアルデヒド中で固定された。色素性のメラニン細胞への分化のためにはs、ＮＣＣｋｉｔは超低接着６ウェルプレート中でスフェアとして培養され、ＩＭＤＭグルタマックス、２０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１％非必須アミノ酸、及びモノチオグリセロールがフィードされた。
【００７８】
〜４日間の培養後、培養で増殖したＮＣＣｋｉｔの自発的に収縮する子孫が記録された。図９及び図１０。共焦点免疫蛍光解析は、ＧＡＴＡ４（＋）、心臓トロポニン−Ｉ（＋）、及びトロポミオシン（＋）の横紋ヒト心筋細胞への完全な分化を例証した。カルポニン及びα−平滑筋アクチンの発現は、血管平滑筋細胞分化能を示した。さらに、ＮＣＣｋｉｔはコネキシン−４３を発現し、ニューロフィラメント（＋）伝導系細胞、並びに色素性チロシナーゼ（＋）メラニン細胞へと分化した。図９及び図１０。これに対し、第ＶＩＩＩ因子（＋）またはＫＤＲ（＋）子孫はｅｘ−ｖｉｖｏでは検出されなかった。これは、ｉｎ−ｖｉｖｏにおける内皮系列へのＮＣＣｋｉｔの分化がないことを示す。図９パネルＡ〜Ｃ。
【実施例９】
【００７９】
心臓の発達は、時空依存的に細胞系列の多様化及び成長プログラムが動的に整合化された、高度に制御された工程である。これらのプログラムは、心臓の別個の領域を生じるように、順次、並列的に、または交わるように活性化される。例えば、心筋系列は当初は、心臓発生の中胚葉の前駆細胞から発達する。しかしながら、心臓形態発生間の後期には、造血内皮前駆細胞、心外膜前駆細胞、心肺前駆細胞、ＣＮＣ前駆細胞、及び増殖中の心筋細胞が、新たな心筋細胞を体系的に与えるように収斂することになる。これらの心筋発生、及び結果として治療の能力を調整するために、各系列の相対的寄与を測定することは、挑戦的なタスクである。第一に、これらの系列の多くが異質性でありかつ完全には明らかにされていず、また従って単純な発生予定運命図化の実験下では必ずしも追跡され得ないからである。また第二に、心臓の環境（つまりモルフォゲン勾配、組織組成、組織サイズ）における変化が、各系列に由来する心筋の最終部分を決定するにあたり、どのくらい影響力があるか未知だからである。
【００８０】
最近、単純な発生予定運命図化の研究が、マウス心筋の比較的小さい割合は、ｃＫｉｔを発現している心臓前駆細胞系列に由来することを示した。従って、その心筋発生能は機能的には有意でないことを示唆した。しかしながら、心筋発生性ｃＫｉｔ＋細胞の正体、及びそれらの心筋細胞への分化を制御するメカニズムは、未知のままである。ここでは、高分解能の発生細胞系譜追跡方法を用いることにより、次いでｉＰＳＣベースのマウス心臓発生モデルにより、ｃＫｉｔは心臓神経堤前駆細胞を規定することが示された。また、その心筋への寄与が限定的であることは、乏しい心筋発生能には関係しないが、心臓環境中におけるノギン媒介性ＢＭＰ拮抗作用の活性の変化に関連することを示す。その変化は、心筋への分化を駆動する。
【００８１】
ｃＫｉｔ＋心臓前駆細胞の発生細胞系譜追跡。ｃＫｉｔ＋心臓前駆細胞の系譜を追跡するために、特徴がよく明らかにされる誘導性ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋マウス系統が用いられた。ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスは、最近開示されたように、内因性ｃＫｉｔ遺伝子座におけるＡＴＧ開始コドンへのＣｒｅＥＲＴ２発現カセットのノックインとして、相同組換えにより作成された。他のヘテロ接合性ｃＫｉｔ変異体と矛盾せずに、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋は健康かつ繁殖能力があり、また表現型ｗｈｉｔｅ  ｓｐｏｔｔｉｎｇにより特徴づけられる（図１１パネルＡ〜Ｂ）。
【００８２】
ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスを、２つの以前に樹立されたＣｒｅレポーターマウス系統に交配することにより、ｃＫｉｔ発現細胞の発生予定運命図化が行われた。そのレポーターマウス系統とは、二重蛍光色レポーターＤｓＲｅｄ／ＥＧＦＰ（ＩＲＧ）、またはベータガラクトシダーゼレポーターＲ２６ＲｌａｃＺである（図１１パネルＣ）。
【００８３】
ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧ胚を擁する妊娠マウスに、胎生期Ｅ７．５からＥ８．５日の間に、タモキシフェンを投与ことにより、ｃＫｉｔが第一または第二心臓予定領域心筋前駆細胞を規定するかがまず調べられた。従って、この期間中に活発にｃＫｉｔを発現している細胞、及びその子孫が、不可逆的にＥＧＦＰで標識された。胚はＥ１８．５において回収され、生組織イメージング、並びに固定された試料における共焦点落射蛍光及び免疫蛍光解析により、ＥＧＦＰ発現が評価された。胚性ｃＫｉｔ発現についての以前の報告と矛盾せず、組換えの成功は、循環s血液細胞、精巣、及び肺中の強いＥＧＦＰ発現に反映された（データ表示なし）。しかしながら、他とは対照的に、心臓におけるＥＧＦＰ（＋）発現は稀にしか検出されなかった。これらの稀なＥＧＦＰ（＋）細胞は非心筋細胞であり、時折、心臓転写因子Ｇａｔａ４と共局在した（データ表示なし）。従って我々の発見は、以前に示唆されたように、心臓発生性中胚葉におけるｃＫｉｔ＋心臓幹／前駆細胞系列の存在を支持しない。
【００８４】
次に、ｃＫｉｔが、増殖中の心筋細胞、心外膜原基の前駆細胞、造血内皮及び心内膜の前駆細胞、心肺前駆細胞、並びに心臓神経堤前駆細胞などの他の心筋発生系列を規定するかが試験された。従って、これらの系列は順次心臓中胚葉系前駆細胞へと発達するため、Ｅ９．５−Ｅ１２．５間の選択されたタイムポイントにおいて、妊娠マウスにタモキシフェンが投与された。ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋媒介性組換えは、胚性メラニン芽細胞、頭蓋顔面領域、神経管、背根神経節（ＤＲＧ）、循環血液細胞、胃腸細胞、精巣［データ表示なし］及び肺細胞において、細胞系譜トレーサーの発現をもたらした（データ表示なし）。驚いたことに、Ｅ７．５−Ｅ８．５のｃＫｉｔ発現細胞の発生予定運命図とは対照的に、強いＥＧＦＰ落射蛍光が、調べられたすべての生きていて拍動しているＣｒｅ組換えが起こったＥ１８．５のｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧ胎児心臓における、心臓流出路（ＯＦＴ）、心外膜、及び心筋内に一貫して検出された（データ表示なし）。
【００８５】
Ｃｒｅ媒介性の発生予定運命図化は異なるＣｒｅレポーター対立遺伝子間で顕著に異なり、しばしばデータ解釈の誤りを引き起こすことが報告されているため、類似する欠点がｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋及びＩＲＧ対立遺伝子での解析にも潜みうるかが調べられた。従って、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／Ｒ２６ＲｌａｃＺマウスを使用して、我々の予定運命化方法が再現された。Ｘ−ｇａｌを用いる発生予定運命の組織的評価は、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／Ｒ２６ＲｌａｃＺ胚における組換えが、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧと類似するモザイクパターンを生成したことを明らかにした（図１１パネルＤ〜Ｇ）。従って、タモキシフェン誘導性Ｃｒｅ組換えは、ｃＫｉｔ系列に特異的であり、異なるｌｏｘ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘ発現抑制性レポーター対立遺伝子間で一致する。
【００８６】
次に、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋系譜トレーサーにより標識された当初の細胞集団を同定しようと試みた。従って、時期指定妊娠マウスはＥ９．５−Ｅ１３．５間の選択されたタイムポイントにおいてタモキシフェンを投与され、最後の注射の２４時間後に胚が回収された。免疫組織化学解析は、ｃｒｅ細胞系譜トレーサーを発現している細胞におけるｃＫｉｔの発現を確認した。ライブ落射蛍光及び共焦点免疫蛍光イメージングを使用して、組換えが、神経管、メラニン細胞、肺、腸、流出路、心外膜、及び房室接合部では起こったが、心筋内では起こらなかったことが検出された。従って、タモキシフェン誘導性組換の期間中のｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋標識された心臓細胞の起源は、心筋（つまり、分化した心筋細胞または分化転換中の心臓神経芽細胞）ではなく、従ってｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋心筋子孫は、心臓外の前駆細胞系列から由来する。
【００８７】
最後に、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋対立遺伝子は非機能性であるため、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋またはｃＫｉｔ＋／＋対立遺伝子を擁する胚間の、ｃＫｉｔ発現における潜在的な違いについて調べた。以前の報告と一致して、共焦点免疫組織化学法は、２つの系統間でｃＫｉｔ発現における明らかな違いは示さなかった。ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋細胞系譜トレーサーと類似して、ｃＫｉｔ発現細胞は、神経管、メラニン細胞、肺、ＯＦＴ、及び心外膜中に局在したが、ｃＫｉｔ＋／＋胚の心筋中には局在しなかった。
【００８８】
従って、総括すれば、我々の細胞系譜追跡実験は、ｃＫｉｔが、〜Ｅ９．５で出現しかつ一貫してマウス心臓の発達に寄与する、心臓細胞系列を規定することを描写する。
【００８９】
ｃＫｉｔ及びＷｎｔ１の共通発生予定運命図化。神経管、皮膚、肺、腸、及び心臓におけるｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋細胞系譜トレーサーの発現は、ｃＫｉｔがＣＮＣ系列の前駆細胞を規定するという仮説とより良く一致する。さらに、他のｃＫｉｔ変異体と同様に、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスの表現型ｗｈｉｔｅ  ｓｐｏｔｔｉｎｇ（図１１パネルＢ）は、メラニン形成の欠陥を示唆し、従って、神経堤経路におけるｃＫｉｔの重要な役割を強調する。従って、ｃＫｉｔがＣＮＣ系列の細胞を描写するかを明らかにすることが試みられた。
【００９０】
まず、神経堤特異的マウス系統であるＷｎｔ１−Ｃｒｅ／Ｒ２６ｔｄＴｏｍａｔｏが活用された。この系統では、初期移動ＣＮＣ及びその派生細胞が、赤色蛍光タンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏにより不可逆的に標識されている。ｃＫｉｔに対する共焦点免疫組織化学は、神経管及び心臓を含む、Ｅ１２．５のＷｎｔ１−Ｃｒｅ／Ｒ２６ｔｄＴｏｍａｔｏ胚の様々な組織における、ｃＫｉｔのｔｄＴｏｍａｔｏとの共局在を例証した。このことは、神経堤をｃＫｉｔ＋心臓前駆細胞の起源としてさらに示唆する。
【００９１】
しかしながら、Ｗｎｔ１−Ｃｒｅ及びｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋駆動系統は、それ自身は、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋心臓前駆細胞が本当にＷｎｔ１＋ＣＮＣに由来するかを遺伝的に問うためのマルチプレックス細胞系譜追跡実験には適さない。このため、２つのリコンビナーゼシステム（Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ及びＦｌｐ−ＦＲＴ）を擁する新規のマウス系統が作製された。したがって、これはＷｎｔ１発現ＣＮＣ系列及びその派生細胞におけるｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋の共通発生予定運命図化を可能にする。前に樹立された二重リコンビナーゼ応答性インジケーター対立遺伝子であるＲＣ：：Ｆｅｌａ、及び新規のＦｌｐｅリコンビナーゼ駆動系統であるＷｎｔ１：：Ｆｌｐｅ４３５１が利用された。ＲＣ：：ＦｅｌａはＦｌｐｅ媒介性組換えの際にＥＧＦＰの、またＣｒｅ及びＦｌｐｅリコンビナーゼの両方が発現される場合に核β−ガラクトシダーゼ（ｎＬａｃＺ）の発現を活性化する。Ｗｎｔ１：：Ｆｌｐｅ４３５１は、Ｗｎｔ１発現ＣＮＣにおけるＦｌｐｅ組換えを媒介する。ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋対立遺伝子と共にＲＣ：：Ｆｅｌａ及びＷｎｔ１：：Ｆｌｐｅ４３５１を配置させること（ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２；Ｗｎｔ１Ｆｌｐｅ；ＲＣ：：Ｆｅｌａ）は、我々が、発達中のマウス心臓におけるｃＫｉｔ及びＷｎｔ１の共通発生予定運命図を作成して解析し、また従ってｃＫｉｔが本当に心臓ＣＮＣ系列のマーカーであるかを遺伝的に追跡することを可能にした。
【００９２】
Ｗｎｔ１発現神経堤細胞におけるｃＫｉｔの発現を特に解析するため、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２；Ｗｎｔ１Ｆｌｐｅ；ＲＣ：：Ｆｅｌａ胚を擁する時期指定妊娠マウスがＥ９．５−Ｅ１１．５間にタモキシフェンを投与され、Ｅ１６．５−Ｅ１８．５において胚解析が行われた。前の実験と一致して、Ｆｌｐｅ及びＣｒｅを発現しなかった胚においては、ＥＧＦＰ及びｎＬａｃＺの発現は検出されなかった（データ表示なし）。他のＷｎｔ１レポーターマウス系統と類似して、Ｗｎｔ１：：Ｆｌｐｅ４３５１がＲＣ：：Ｆｅｌａの存在下で発現された場合、強いＥＧＦＰ落射蛍光及び免疫蛍光が、頭蓋顔面領域、メラニン細胞、ＤＲＧ、肺、ＯＦＴ、並びに心外膜及び心筋内の細胞において検出された（図１２パネスＡ〜Ｃ）。ｎＬａｃＺの発現は検出されなかった。Ｗｎｔ１：：Ｆｌｐｅ４３５１及びｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋の両方が発現される場合、ＥＧＦＰ発現は、心臓及びＯＦＴを含む全ての神経堤由来組織において持続した。しかしながら、我々のｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧ及びｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／Ｒ２６ＲｌａｃＺ発生細胞系譜追跡データと一致して、強いｎＬａｃＺ発現が、頭蓋顔面領域、メラニン細胞、ＤＲＧ、腸、ＯＦＴ、並びに心外膜及び心筋内の細胞においてもまた見られた（図１２パネルＡ〜Ｃ）。従って、我々の共通発生予定運命図化実験は、ｃＫｉｔが、頭蓋、心臓、迷走、仙髄、躯幹の神経堤系列におけるＷｎｔ１発現前駆細胞の亜集団（ＣＮＣｋｉｔ）を規定することを示し、またゆえにｃＫｉｔ＋心臓前駆細胞が神経堤起源であることを実証する。
【００９３】
ＣＮＣｋｉｔ派生細胞。ＣＮＣｋｉｔ派生細胞の正体が、共焦点免疫蛍光解析により明らかにされた。細胞系譜トレーサーは、ＯＴＦ（図１１、１２、及び１３）、大動脈弓の中膜（図１３）、心臓及び大動脈弁（図１３）、心房（データ表示なし）、流入路、サテライトグリア前駆細胞、及び感覚細胞を含む、全ての予期された心臓神経堤派生細胞において発現された。その神経堤起源と一致して、ＣＮＣｋｉｔは、ＯＦＴの内皮及び平滑筋層に寄与した（図１３）。しかしながら、冠血管細胞分化は観察されなかった（図１３）。
【００９４】
最後に、ゼブラフィッシュ及びマウスにおける以前の報告と一致して、心房及び心室心筋への寄与［全ＥＧＦＰ＋派生細胞の２９．９％±３．１％（図１３）］、並びに、心膜、心内膜、及び心外膜細胞への寄与が、一貫して記録された（図１１及び図１３）。重要なことには、ＣＮＣｋｉｔ由来の心筋細胞の大部分が、心室中隔中に局在した（図２８Ｋ及び図３０）。
【００９５】
ＣＮＣｋｉｔの正体。心臓ＣＮＣＫｉｔの起源の正体をより良く明らかにするため、心臓ＣＮＣを含む哺乳類心血管細胞系列の大部分を特定するホメオボックス転写因子である、Ｉｓｌ１の発現が調べられた。これに従い、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧマウスが、核ｌａｃＺ（Ｉｓｌ１ｎＬａｃＺ）対立遺伝子を擁するマウスに交配させられた。次いで、妊娠マウスがＥ９．５−１１．５にタモキシフェンを投与され、Ｅ１２．５胚においてＥＧＦＰ及びＩｓｌ１ｎＬａｃＺ発現が評価された。実際に、神経管、背根神経節（ＤＲＧ）、及びＯＦＴの細胞において、ＥＧＦＰ及びｎＬａｃＺの共局在が記録された（図１３〜１４）。以前の報告と一致して、神経管及びＤＲＧ中のＥＧＦＰ／Ｉｓｌ１ｎＬａｃＺ二重陽性細胞は、グリア／神経細胞系列への特定を実証した（図１３〜１４）。
【００９６】
次に、ことによるとｃＫｉｔシグナリングの最も解明されている標的及びトランス活性化因子、かつ頭蓋神経堤派生細胞、肥満細胞だけでなく心筋細胞もの既知マーカーである、小眼症関連転写因子（Ｍｉｔｆ）の発現が調べられた。共焦点免疫蛍光解析は、Ｍｉｔｆが、ＣＮＣｋｉｔ及びその心筋細胞派生細胞においてもまた発現されることを示した（データ表示なし）。しかしながら、心臓中のＥＧＦＰ＋細胞は、メラニン細胞特異的マーカーチロシナーゼまたはｔｒｐ１を発現しなかった。これは、心臓中のＭｉｔｆ＋ＣＮＣｋｉｔ派生細胞がメラニン細胞でないことを示す（図１４パネルＤ）。
【００９７】
ＢＭＰ阻害は、ＣＮＣｋｉｔにおける心筋発生を促進する。我々の発生予定運命図化データは、ｃＫｉｔ＋前駆細胞は一貫して心臓において心筋の小さい一部を生じることを示す（図１３）。逆説的だが、我々の発生運命予定化での発見は、ｃＫｉｔ＋心筋前駆細胞が心臓中胚葉には由来しないことを明確に示すが（図１１）、マウス胚性（ＥＳ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）における実験は、ｃＫｉｔ＋心筋前駆細胞の生成が、Ｎｋｘ２．５＋心臓中胚葉系前駆細胞系列の誘導と重複することを繰返し記録してきた。これらの議論の余地がある発見は、以前にｃＫｉｔ＋前駆細胞を心臓中胚葉の亜集団として誤同定するに至らせたが、我々に、心臓中胚葉の心筋への分化を制御するメカニズムがＣＮＣｋｉｔからの心筋発生をもまた制御するかを試験するように促した。
【００９８】
まず、ＣＮＣｋｉｔとマウスＥＳ及びｉＰＳＣ由来の心臓中胚葉から精製されたｃＫｉｔ＋／Ｎｋｘ２．５＋系列との関係を具体的に扱うため、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧ成年尾先端繊維芽細胞からのｉＰＳＣ（ｉＰＳＣｋｉｔ）が樹立された。ｉＰＳＣｋｉｔは、ＤｓＲｅｄをＥＧＦＰのリークなく安定的に発現した（継代数＜３０）。ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧマウスでの場合と同様に、ＤｓＲｅｄは、４−ＯＨタモキシフェンでの処理に応答して起こるＣｒｅ媒介性組換えに際し、ＥＧＦＰにより不可逆的に置き換えられる。とりわけ、ｉＰＳＣｋｉｔにおけるＥＧＦＰ落射蛍光は、４−ＯＨタモキシフェンでの処理後〜４８時間で見えるようになる。ＲＮＡ−ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び免疫蛍光の組合せ解析は、ＣｒｅリコンビナーゼとｃＫｉｔとの共局在を示した。従って、ｉＰＳＣｋｉｔはｃＫｉｔ発現細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ細胞系譜追跡に適切である。
【００９９】
心筋細胞分化は、前に開示されたように、ｉＰＳＣｋｉｔ由来の胚様体（ＥＢ）のアスコルビン酸での処理により誘導された（図１７）。分化の成功は、自発的に収縮する心筋細胞の発達に反映された。生成した心筋細胞のいずれかがｃＫｉｔ＋前駆細胞の子孫であるかを遺伝的に追跡するため、ＥＢが、分化の間の選択されたタイムポイントにおいて４−ＯＨタモキシフェンでパルスされ、自発的に拍動しているＥＧＦＰ＋派生細胞の出現について監視された（図１７）。実際に、ＥＧＦＰ＋派生細胞は、自発的に拍動しているＥＢの〜４５％において検出され、このことは、マウス多能性幹細胞が、ｃＫｉｔ＋心筋細胞前駆細胞系列により心筋細胞を産生するように一貫して指揮されうるという、前の発見を確認する（データ表示なし）。
【０１００】
しかしながら、アスコルビン酸での処理は、多能性幹細胞における心臓発生を増進するが、これは心臓発生性中胚葉の特異的な誘導物質ではない。従って、ｉＰＳＣｋｉｔ由来の推定のｃＫｉｔ＋／Ｎｋｘ２．５＋心臓中胚葉系前駆細胞系列とＣＮＣｋｉｔとの間の関係を詳細に記述するため、ｃＫｉｔ＋／Ｎｋｘ２．５＋系列がｉＰＳＣｋｉｔの心臓中胚葉への指揮された分化に次いで出現するかを、遺伝的に追跡することが試みられた。従って前に開示されたように、ｉＰＳＣｋｉｔは、ＢＭＰシグナリングのノギン媒介性の拮抗を受けた（図１７）。選択されたタイムポイントにおける遺伝子発現解析は、自発的に拍動する心筋細胞の出現は、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及びＭｅｓｐ１の一時的な誘導より先に起こり、後にＮｋｘ２．５及びＩｓｌ１の発現の漸進的な増加が起こったことを示した。従って、ノギンは、心臓中胚葉系前駆細胞からの心筋細胞の産生を特定することを示す（データなし）。生成した心筋細胞のいずれかがｃＫｉｔ＋／Ｎｋｘ２．５＋系列に由来するかを遺伝的に追跡するため、ノギン処理されたＥＢが、心臓分化の間の選択されたタイムポイントにおいて４−ＯＨタモキシフェンでパルスされ、自発的に拍動しているＥＧＦＰ＋派生細胞の出現について監視された（図１７）。驚くべきことに、アスコルビン酸での処理と同様に、ノギンでの処理は、ＥＧＦＰ＋心筋細胞の産生を引き起こした。共焦点免疫細胞化学解析は、ＥＧＦＰ＋心臓前駆細胞及び心筋細胞がＮｋｘ２．５を共発現することを示した。従って、ノギンは、部分的にはｃＫｉｔ＋／Ｎｋｘ２．５＋心臓発生系列により、心筋細胞の産生を特定することを確認した（データ表示なし）。しかしながら、ＢＭＰシグナリングはまた、マウス神経堤細胞及びＣＮＣの生成、並びにヒトＥＳ及びｉＰＳＣからの神経堤細胞の誘導を制御することが報告されているため、また、マウス胚における我々の発生細胞系譜追跡実験が心臓中胚葉内のｃＫｉｔ＋／Ｎｋｘ２．５＋系列の存在を支持しないため、心臓中胚葉に加え、ｉＰＳＣｋｉｔのノギンでの処理が心臓神経堤の生成を促進し得たかを解析することが試みられた。実際に、心臓発生分化の間の選択されたタイムポイントにおける定量遺伝子発現解析は、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及びＭｅｓｐ１の誘導に次いで、またＮｋｘ２．５及びＩｓｌ１の誘導と並行して、ノギン処理されたｉＰＳＣｋｉｔがｃＫｉｔ、Ｗｎｔ１、Ｓｎａｉ２、Ｐａｘ３、及びＭＩＴＦの心臓特異的アイソフォームであるＭＩＴＦ〜Ｈの発現の劇的な上昇を受けたことを実証した（図１８パネルＥ〜Ｈ）。より重要なことには、ノギンは、心外膜前駆細胞マーカーＷＴ１及びＴｂｘ１８の発現を一時的に抑制した。これは、ｃＫｉｔは心外膜前駆細胞系列を規定しないという、我々の細胞系譜追跡の発見をさらに支持する。さらに、ＥＧＦＰ＋派生細胞の共焦点免疫細胞化学解析は、心筋細胞及びＮｋｘ２．５前駆細胞に分化することに加え、ｉＰＳＣ由来ｃＫｉｔ前駆細胞は、拍動している心筋細胞にニューロフィラメント−Ｍ＋及びＴｕｊｉ１＋神経を供給しつつ、平滑筋細胞及びＮｋｘ２．５前駆細胞を生じたことを実証した（データ表示なし）。ノギンが低分子ＢＭＰ拮抗薬ドルソモルフィンで代替された場合も、類似した発見が得られた（図１７）。従って、我々のマウス発生細胞系譜実験と一致して、我々のｉｎ−ｖｉｔｒｏ  ｉＰＳＣベースの細胞系譜追跡実験は、ｃＫｉｔが十分な心筋発生能を有するＣＮＣ前駆細胞を規定することを確認し、またＢＭＰシグナリングの一時的阻害はその心筋細胞への分化を促進することを示す。
【０１０１】
我々の実験は、ｃＫｉｔの心臓前駆体マーカーとしての役割についての、長く続く論争を詳述する。発達中のマウス心臓において、発生細胞系譜追跡実験、並びに、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋及びＷｎｔ１：：Ｆｌｐｅ４３５１対立遺伝子を用いた高分解能の共通発生予定運命図化解析を実施することにより、我々はｃＫｉｔが神経堤起源の心臓前駆細胞を規定することを決定することができた。我々は、ｃＫｉｔ＋前駆細胞が心筋の比較的小さい一部を与えることを示す。しかしながら、その心筋への分化を調節するメカニズムを心筋発生のマウスｉＰＳＣモデルにおいて研究することにより、我々の研究は、ＣＮＣｋｉｔからの心筋への寄与の度合いが限定的であることは、以前に考えられていたように極微の分化能ゆえではないことを示唆する。むしろ、心原基の誘導のすぐ後、かつ心臓へのＣＮＣの侵入より十分前に、永久的に変化させられるようである、心臓におけるＢＭＰシグナリングの活性により制御されることを示唆する。
【０１０２】
ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋発現細胞からの冠血管派生細胞の欠如は、ｃＫｉｔ＋心臓前駆細胞の二分化能性を実証する前の発見と一致するが、ＫｉｔＣｒｅ／＋及びＫｉｔｍＥＲ−Ｃｒｅ−mＥＲ／＋対立遺伝子を使用する、最近報告された心臓におけるｃＫｉｔの予定運命とは顕著に対照的である。その２つの発生予定運命化研究間のこれらの違いは、可能性としては、ターゲティングコンストラクトの基礎にある違い、従って、ターゲット化されたｃＫｉｔ対立遺伝子により発現されるコード配列の異なる変異体バージョンを反映しうる。さらに、ＣＮＣｋｉｔは内皮及び平滑筋細胞分化に対する能力を有し（データ表示なし）、従って他者により観察されたような血管性ｃＫｉｔ＋心臓系列の存在を排除することはできない。しかしながら、我々の発見は、最近の内皮系列発生予定運命図化解析と一致し、このことは、心臓中の内皮細胞がｃＫｉｔ＋前駆細胞を起源とする可能性はあまりないことを提案する。
【０１０３】
最後に、我々の研究は、マウス多能性幹細胞の心臓神経堤系列へのｉｎ−ｖｉｔｒｏ指揮された分化を可能にする、新規のシグナリング経路を同定し、また適切な環境下で 心筋細胞を派生させる哺乳類ＣＮＣの完全な能力を示す。これらの発明は合わせて、哺乳類における心筋発生を調節するメカニズムに対する新規の洞察を提供し、また心臓再生のための細胞ベースの治療方法のための、新規の戦略の開発を可能にする。
【０１０４】
マウス。ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスは、ドイツにあるＭｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ  Ｋｌｉｎｉｋ  ｕｎｄ  Ｐｏｌｉｋｌｉｎｉｋ  ｄｅｒ  Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ  Ｍｕｎｃｈｅｎにて開発された。内因性ｃＫｉｔ遺伝子座が、胚性幹（ＥＳ）細胞における相同組換えにより、Ｒｏｓａ２６遺伝子配座について前に開示されたように、ターゲット化された。簡潔には、ＣｒｅＥＲＴ２カセット、内部リボソーム進入部位、及びｆｒｔが隣接するネオマイシン耐性カセットを含有する、ターゲティングベクターが、１２９Ｓ６  ＥＳ細胞中に電気穿孔された。相同組換え及び単一コピーの挿入は、サザンブロット解析により確認され、正しくターゲットされたＥＳ細胞が、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ胚盤胞中へと注射された。
【０１０５】
前に樹立されたＷｎｔ１−Ｃｒｅ、Ｒ２６ＲｔｄＴｏｍａｔｏ、ＩＲＧ、及びＲ２６ＲＬａｃＺマウス系統はＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓからであり、詳細は至る所で入手可能である。Ｉｓｌ１ｎＬａｃＺマウスは、米国にあるＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ  ＤｉｅｇｏのＤｒ．  Ｓｙｌｖｉａ  Ｅｖａｎｓによりご親切に提供され、以前に開示されている。Ｉｓｌ１ｎＬａｃＺノックインベクターは、ＬｏｘＰが隣接するｎＬａｃＺレポーター遺伝子、次いでヒト化ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰを含有する。しかしながら、ＬｏｘＰに挟まれたｎＬａｃＺレポーターのＣｒｅ媒介性切除の前または後いずれでも、この導入遺伝子を擁する細胞はＧＦＰを発現しない。
【０１０６】
細胞系譜追跡実験のためには、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスがＩＲＧまたはＲ２６ＲＬａｃＺＣｒｅレポーター系と交配され、タモキシフェン誘導性組換え後の選択されたタイムポイントにおいて胚が研究された。Ｗｎｔ１−ＣｒｅマウスはＲ２６ＲｔｄＴｏｍａｔｏに交配され、生じるＷｎｔ１−Ｃｒｅ／Ｒ２６ＲｔｄＴｏｍａｔｏ子孫が、生後１日で研究された。遺伝子型ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧ：Ｉｓｌ１ｎＬａｃＺを擁する胚の作製のためには、雄ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧマウスが雌Ｉｓｌ１ｎＬａｃＺと交配された。
【０１０７】
全ての動物は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉａｍｉ、Ｍｉｌｌｅｒ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅにおけるＡＡＡＬＡＣ認可の動物施設において維持された。また、処置手順は、ＮＩＨ標準に従うＩＡＣＵＣ認可プロトコールを使用して実施された。
【０１０８】
ジェノタイピング。前に開示されたように５０、ＨｏｔＳＨＯＴ法を使用してマウス尾先端からゲノムＤＮＡが単離された。ジェノタイピングは、ＰＣＲ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）により製造元の取扱説明書に従って実施された。以下のプライマーが使用された。ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋に対してはＣＣＴＣＣＡＣＣＡＴＡＡＧＣＣＧＡＡＴＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ＣＣＴＴＣＧＡＧＧＴＧＧＴＡＧＧＣＡＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、及びＣＣＣＣＡＴＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＣＴＧＡＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、Ｉｓｌ１ｎＬａｃＺに対してはＡＣＴＡＴＴＴＧＣＣＡＣＣＴＡＧＣＣＡＣＡＧＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、及びＧＡＣＡＧＴＡＴＣＧＧＣＣＴＣＡＧＧＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）。Ｗｎｔ１−Ｃｒｅ、Ｒ２６ＲｔｄＴｏｍａｔｏ、ＩＲＧ、及びＲ２６ＲｌａｃＺジェノタイピングのプロトコールは、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能である。ＰＣＲデータを確認するためには、Ｘ−ｇａｌ及び免疫蛍光もまた利用された。さらに、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／＋の表現型ｗｈｉｔｅ  ｓｐｏｔｔｉｎｇは、遺伝子型の最も信頼できるマーカーとみなされた。
【０１０９】
タモキシフェン注射。発生予定運命図化については、前に開示されたように、ピーナッツオイル（Ｓｉｇｍａ）に濃度２０mｇ／ｍｌで溶解されたタモキシフェン１００μｌの、望まれるタイムポイントにおける腹腔内注射により、ＣｒｅＥＲＴ２が活性化された。
【０１１０】
簡潔には、第一または第二心臓予定領域前駆体におけるｃＫｉｔの役割を評価するために、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧまたはｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／Ｒ２６ＲＬａｃＺ胚を擁するマウスが、Ｅ７．５−８．５の間、連続する２日間にわたり毎日タモキシフェンの注射を受けた。胚は、Ｅ１８．５において採取された。神経堤細胞におけるｃＫｉｔの発現を評価するためには、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧまたはｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／Ｒ２６ＲＬａｃＺ胚を擁するマウスが、Ｅ９．５−１１．５の間、またはＥ１０．５−１２．５の間、３日間連続で毎日タモキシフェンの注射を受けた。胚は、Ｅ１８．５において採取された。ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧ：Ｉｓｌ１ＬａｃＺ胚におけるＩｓｌ１駆動性ｎＬａｃＺとｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧ駆動性ＥＧＦＰとの共発現を追跡するためには、最後のタモキシフェンの注射から２４時間以内に顕微鏡解析が実施された。この方法は、我々が、ｎＬａｃＺの発現が消失する前にＥＧＦＰの発現をレポートするのに十分な期間にわたりＣｒｅ媒介性組換えが誘導される細胞を検出することを可能にした。
【０１１１】
ｅｘ−ｖｉｖｏ組織培養実験に対しては、２日齢のｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧ新生マウスが、５０μｌのタモキシフェン単一皮下注射を投与され、２４時間後に心臓が採取された。この方法は、心臓ＣＮＣｋｉｔのクローン標識化を可能にした。
【０１１２】
マウス胚解剖。膣栓を有する雌は、前に開示されたようにＥ０．５とみなされた。異なるタイムポイントにおける胚が、氷冷Ｈａｎｋ'ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ溶液（ＨＢＳＳ、Ｇｉｂｃｏ）中に採取された。ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧ対立遺伝子を擁するＥ１２．５及びＥ１８．５の胚については、解剖直後に蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）下で生組織イメージングが行われ、ＥＧＦＰ及びＤｓＲｅｄ落射蛍光が画像記録された。それから試料は室温にて４％ＰＦＡ（ＥＭＳ）中で１〜１時間半にわたり固定され、次に４℃にて３０％スクロース（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）中で一晩インキュベートされた。翌日、試料はＯＴＣ（ＥＭＳ）中に埋め込まれ、液体窒素中で急速冷凍された。凍結切片化は、前に開示されたように実施された。
【０１１３】
ｃＫｉｔ免疫組織化学解析に対しては、Ｅ１２．５−Ｅ１４．５野生型マウス胚が採取され、１０％緩衝ホルマリン中で一晩固定された。翌日、胚はパラフィンに埋め込まれ、前に開示されたように、免疫組織化学のために処理された。
【０１１４】
Ｘ−ｇａｌ組織化学。前に開示されたように、ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／Ｒ２６ＲｌａｃＺまたはＩｓｌ１ｎＬａｃＺ対立遺伝子を擁する完全なマウス胎児心臓または胚において、並びにそれら各々の同腹仔それぞれについても、β−ガラクトシダーゼ染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＸ−ｇａｌ組織化学が行われた。簡潔には、試料が３７℃にてＸ−ｇａｌ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で一晩インキュベートされた。翌日、ｘ−ｇａｌがＰＢＳで洗い流され、試料は光学顕微鏡化（Ｎｉｋｏｎ）下で画像記録され、４℃にて３０％スクロース中で一晩インキュベートされた。固定された組織はそれから、ＯＣＴ中に埋め込まれ、凍結切片化のために処理された。ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧ：Ｉｓｌ１ｎＬａｃＺ胚のいくらかの場合においては、凍結切片化の後にＥＧＦＰ免疫染色に続き、ｘ−ｇａｌが実施された。
【０１１５】
免疫蛍光共焦点顕微鏡法。凍結切片については、１０μｍ厚の試料が切片作製後に４％ＰＦＡで１０分間固定された。パラフィンに埋め込まれた組織については、前に開示されたように、４〜５μｍ厚の組織切片が脱パラフィンされ、再水和された。抗原賦活化は、ｐＨ＝６のクエン酸緩衝溶液（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）中でスライドグラスを２ｘ１０分間、マイクロ波にかけることにより実施された。切片は、それから、１０％正常ロバ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）を用いてＲＴにて１時間かけてブロッキングされ、続いて４℃にて一次抗体と共に一晩インキュベートされた。
【０１１６】
以下の抗体が使用された：ｃＫｉｔ（Ｄａｋｏ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、及びＲ&Ｄ）、ＥＧＦＰ（Ａｂｃａｍ、Ａｖｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ベータガラクトシダーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、コネキシン−４３、ＫＤＲ、ＭＩＴＦ、ＰＥＣＡＭ１、ａ−平滑筋アクチン（Ｓｉｇｍａ）、抗平滑筋ミオシン重鎖（ＳＭ１；Ｋａｍｉｙａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）、心臓トロポニン−Ｉ、カルポニン、トロポミオシン、チロシナーゼ（Ａｂｃａｍ）、心臓ミオシン軽鎖−２ｖ、ニューロフィラメント−Ｍ、ＢＦＡＢＰ、Ｗｎｔ１（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、Ｎｋｘ２．５（Ｒ&Ｄ）、ＧＡＴＡ−４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｉｓｌ−１（４０．２Ｄ６、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ、ＩＡ）、第ＶＩＩＩ因子関連抗原（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）、Ｔｕｊｉ１（Ｃｏｖａｎｃｅ）。続いて、その抗体は、アフィニティー精製された二次抗体のＦＩＴＣ、Ｃｙ３、及びＣｙ５共役Ｆ（ａｂ'）２フラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に、切片を３７℃にて１時間インキュベートすることにより可視化された。ＭＩＴＦ及びＳＭ１については、製造元の取扱説明書（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に従い、チラミドシグナル増幅が用いられた。スライドグラスは、ＤＡＰＩで対比染色され、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｇｏｌｄ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でマウントされ、さらなる調査まで４℃にて保管された。顕微鏡法による評価、及び画像取得は、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ−７１０共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｃ．  Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，  ＮＹ）を用いて実施された。Ｚｅｉｓｓ  ＺＥＮソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２００９、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、ＧｍｂＨ）が使用された。
【０１１７】
マルチプレックス蛍光ｉｎ  Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＲＮＡ−ＩＳＨ）。単一細胞遺伝子発現解析が、製造元の取扱説明書に従い、マルチプレックスＲＮＡ−ＩＳＨ解析（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ｖｉｅｗＲＮＡキット、Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を使用して実施された。簡潔には、ＣＮＣｋｉｔのサイトスピン産物が、４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定され、３７℃にて１０分間プロテアーゼ溶液で消化された。ヒトｃＫｉｔ（ＮＭ＿０００２２２．２）、Ｉｓｌ１（ＮＭ＿００２２０２．２）、ＮＫＸ２−５（ＮＭ＿００４３８７．３）、ＧＡＴＡ４（ＮＭ＿００２０５２．３）、及びＧＡＰＤＨに対するプローブが適用され、ハイブリダイザー（ＤＡＫＯ）中で一晩ハイブリダイゼーションされた。
【０１１８】
統計解析。発生細胞系譜追跡実験については、我々は、検出力９０％及びアルファレベル０．０５で±６個の心筋細胞の期待される標準偏差では、グループ間で凍結切片あたり最小３０の心筋細胞派生体の違いを検出するためには、グループあたり少なくとも２つの胚が必要であると推定する。ここでは我々は、Ｅ７．５−Ｅ８．５の間のｃＫｉｔの発生細胞系譜追跡を実施するためには１０個の胚を、Ｅ９．５−１２．５の間の１２個の胚、及び遺伝子型ｃＫｉｔＣｒｅＥＲＴ２／ＩＲＧ：Ｉｓｌ１ｎＬａｃＺの６個の胚を使用した。本動物実験については、ランダム化及び盲検化は適用可能でなかった。統計解析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｄｍのバージョン５．００を使用して実施された。ＥＧＦＰ（＋）細胞のｉｎ−ｖｉｔｒｏ定量化データを比較するためには、ｔｗｏ−ｗａｙ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅｓ  ＡＮＯＶＡ、次いでＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔｈｏｃ検定が利用された。全てのデータは、検定の仮定を満たした。ｐ＜０．０５が統計的に有意とみなされた。全ての値は、平均±ＳＥＭとして報告される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
2019077701.tif 000020
【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
2019077701.tif 000022
【図１７】
2019077701.tif 000023
【図１８−１】
2019077701.tif 000024
【図１８−２】
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【配列表】
2019077701000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年1月31日(2019.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心臓傷害を治療する必要がある対象者において心臓傷害を治療する方法であって、心臓神経堤細胞を有する治療上有効量の医薬組成物を投与する工程を有する、方法。
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月8日(2019.3.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心臓傷害を治療する必要がある対象者の心臓傷害を治療する医薬組成物を製造するための、治療上有効量の心臓神経堤細胞の使用であって、前記心臓神経堤細胞はｃＫｉｔ陽性である、使用。
【請求項２】
請求項１記載の使用において、前記心臓傷害が心筋症である、使用。
【請求項３】
請求項１または２記載の使用において、前記心臓傷害が、心筋梗塞、心不全、先天性心疾患、栄養性疾患、虚血性または非虚血性心筋症、高血圧性心筋症、弁膜症性心筋症、炎症性心筋症、全身性代謝性疾患に続発する心筋症、アルコール性心筋症、糖尿病性心筋症、拘束型心筋症、及びこれらの組合せによって引き起こされる心臓傷害である、使用。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか記載の使用において、前記医薬組成物が、約５０重量％から約１００重量％の心臓神経堤細胞を有する、使用。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか記載の使用において、前記医薬組成物が、約５０重量％の心臓神経堤細胞を有する、使用。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載の使用において、前記医薬組成物が、約７０重量％の心臓神経堤細胞を有する、使用。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか記載の使用において、前記医薬組成物が、約９０％の心臓神経堤細胞を有する、使用。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載の使用において、前記医薬組成物が、約１×１０６の心臓神経堤細胞を有する、使用。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか記載の使用において、前記医薬組成物が、約１×１０８の心臓神経堤細胞を有する、使用。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか記載の使用において、前記医薬組成物が、１つまたはそれ以上の分化剤をさらに有する、使用。
【請求項１１】
請求項１０記載の使用において、前記１つまたはそれ以上の分化剤が、ＢＭＰ拮抗薬、ノギン、コルジン、Ｔｓｇ、ＢＭＰＲ１Ａ及びＢＭＰＲ１Ｂなどの可溶性受容体、ドルソモルフィンなどの低分子ＢＭＰ拮抗薬、レチノイン酸、ビタミンＡ、ＬＧ１００２６８、またはＬＧＤ１０６９などのレチノイン酸受容体作動薬、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ１（ＤＫＫ１）などのｗｎｔ阻害剤から選択される、使用。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか記載の使用において、前記心臓神経堤細胞が、約５０受容体／マイクロメートル２から約８００受容体／マイクロメートル２の幹細胞因子受容体濃度を有する、使用。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか記載の使用において、前記心臓神経堤細胞が、約２００受容体／マイクロメートル２から約６００受容体／マイクロメートル２の幹細胞因子受容体濃度を有する、使用。
【請求項１４】
心臓神経堤細胞を生産する方法であって、
ノギン及び白血病阻止因子と共に複数の幹細胞を培養する工程であって、前記複数の幹細胞は人工多能性幹細胞である、前記培養する工程と、
前記複数の幹細胞をノギンと共に培養することによって、前記複数の幹細胞の三次元集合体を形成する工程と、
心臓神経堤細胞を形成するために、前記複数の幹細胞を心臓神経堤分化培地において培養する工程であって、前記心臓神経堤分化培地はウシ胎児血清及び増殖培地を有する、前記培養する工程と
を有する、方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法において、前記心臓神経堤細胞が幹細胞因子受容体を発現する、方法。
【請求項１６】
請求項１４記載の方法において、前記心臓神経堤細胞がｃＫｉｔ陽性である、方法。
【請求項１７】
請求項１４記載の方法において、前記複数の幹細胞が人工多能性幹細胞である、方法。
【請求項１８】
請求項１４記載の方法において、前記人工多能性幹細胞が胚性幹細胞である、方法。
【請求項１９】
請求項１４記載の方法において、前記ノギン及び白血病阻止因子と共に複数の幹細胞を培養する工程におけるノギンが、１５０ｎｇ／ｍｌの濃度である、方法。
【請求項２０】
請求項１４記載の方法において、前記ノギン及び白血病阻止因子と共に複数の幹細胞を培養する工程における白血病阻止因子が、２０００単位／ｍｌの濃度である、方法。
【請求項２１】
請求項１４〜２０のいずれか記載の方法において、前記心臓神経堤細胞が、約５０受容体／マイクロメートル２から約８００受容体／マイクロメートル２の幹細胞因子受容体濃度を有する、方法。
【請求項２２】
請求項１４〜２１のいずれか記載の方法において、前記心臓神経堤細胞が、約２００受容体／マイクロメートル２から約６００受容体／マイクロメートル２の幹細胞因子受容体濃度を有する、方法。
【請求項２３】
請求項１４〜２２のいずれか記載の方法であって、さらに、前記幹細胞にタモキシフェンを接触させる工程を有する、方法。
【請求項２４】
請求項１４〜２３のいずれか記載の方法において、前記増殖培地は、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ６（商標）培地、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）培地、ロズウェルパーク記念研究所１６４０培地、Ｆ１０栄養混合物、Ｆ１２ハム栄養混合物、１９９培地、またはこれらのいずれかの組合せを有する、方法。
【外国語明細書】
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2019077701000002.pdf
2019077701000003.pdf
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