(57)【要約】      （修正有）【課題】多発性硬化症（ＭＳ）、関節炎リウマチ（ＲＡ）、がんの潜在的標的でもあるヒトアルファエノラーゼタンパク質（ＥＮＯ１）のプラスミノーゲンへの結合を阻害することにより、プラスミノーゲン活性化を阻害する方法の提供。【解決手段】ヒトＥＮＯ１（ジェンバンク：ＡＡＨ５０６４２１．１）上のエピトープに結合する抗体又はその抗原結合断片。ＥＮＯ１タンパク質関係疾患又は障害を処置し、がん浸潤を阻害し、がんを診断するための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＥＮＯ１上のエピトープに結合しＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体活性を阻害する抗体又はその抗原結合断片であって、前記エピトープが、ヒトＥＮＯ１の２９６ＦＤＱＤＤＷＧＡＷＱＫＦＴＡＳＡＧＩＱＶＶＧＤＤＬＴＶＴＮＰＫＲＩＡＫＡＶＮＥＫＳ３３６（配列番号３９）の配列からなる領域に位置している、抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
前記エピトープが、ヒトＥＮＯ１の２９６ＦＤＱＤＤＷＧＡＷＱＫＦＴＡ３０９（配列番号４０）又は３２６ＫＲＩＡＫＡＶＮＥＫＳ３３６（配列番号４１）の配列からなる領域に位置している、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
１０ｎＭ又はそれよりも少ない解離定数（ＫＤ）で前記エピトープに結合する、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗体がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
（ｉ）ＬＣＤＲ１（ＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＴ；配列番号６）、ＬＣＤＲ２（ＮＡＫＴＬＰＥ；配列番号７）及びＬＣＤＲ３（ＱＨＨＹＧＴＰＹＴ；配列番号８）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、並びに（ｉｉ）ＨＣＤＲ１（ＧＹＴＦＴＳＣＶＭＮ；配列番号３）、ＨＣＤＲ２（ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ；配列番号４）及びＨＣＤＲ３（ＥＧＦＹＹＧＮＦＤＮ；配列番号５）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、ヒトＥＮＯ１に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
前記ＶＬが、配列番号２又は９のアミノ酸残基１〜１１０を含む、請求項５に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
前記ＶＨが、配列番号１、１０又は１１のアミノ酸残基１〜１２０を含む、請求項５に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
（ｉ）ＬＣＤＲ１（ＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＴ；配列番号６）、ＬＣＤＲ２（ＮＡＫＴＬＰＥ；配列番号７）及びＬＣＤＲ３（ＱＨＨＹＧＴＰＹＴ；配列番号８）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、並びに（ｉｉ）ＨＣＤＲ１（ＧＹＴＦＴＳ−Ｘａａ−ＶＭＮ、Ｘａａはシステイン以外の任意のアミノ酸である；配列番号５０）、ＨＣＤＲ２（ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ；配列番号４）及びＨＣＤＲ３（ＥＧＦＹＹＧＮＦＤＮ；配列番号５）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、ヒトＥＮＯ１に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
前記Ｘａａがセリン又はアラニンである、請求項８に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記ＶＬが、配列番号２又は９のアミノ酸残基１〜１１０を含む、請求項８又は９に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１１】
前記ＶＨが、配列番号１、１０又は５１のアミノ酸残基１〜１２０を含む、請求項８又は９に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子。
【請求項１３】
請求項１２に記載の単離された核酸を含む発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の治療有効量を含む医薬組成物、及び薬学的に許容される担体。
【請求項１７】
ＥＮＯ１タンパク質関係疾患又は障害に罹っている非ヒト対象を処置するための方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の治療有効量を前記非ヒト対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１８】
前記ＥＮＯ１タンパク質関係疾患又は障害が新生物疾患である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記新生物疾患が肺がん、乳がん、膵臓がん、肝臓がん、結腸直腸がん、又は前立腺がんである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＥＮＯ１タンパク質関係疾患又は障害が炎症性疾患又は免疫障害である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記炎症性疾患又は免疫障害が、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、アレルギー、乾癬、１型糖尿病、アテローム性動脈硬化症又は骨粗鬆症である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＥＮＯ１タンパク質関係疾患又は障害を処置するための薬物の製造における請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の使用。
【請求項２３】
前記ＥＮＯ１タンパク質関係疾患又は障害が新生物疾患である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記新生物疾患が肺がん、乳がん、膵臓がん、肝臓がん、結腸直腸がん、又は前立腺がんである、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記ＥＮＯ１タンパク質関係疾患又は障害が炎症性疾患又は免疫障害である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２６】
前記炎症性疾患又は免疫障害が、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、アレルギー、乾癬、１型糖尿病、アテローム性動脈硬化症又は骨粗鬆症である、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
それを必要とする非ヒト対象においてがん浸潤を阻害するための方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の治療有効量を前記非ヒト対象に投与するステップを含む方法。
【請求項２８】
それを必要とする対象においてがん浸潤を阻害するための薬物の製造における請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の使用。
【請求項２９】
がんの診断のための方法であって、前記方法が、検査対象由来の試料を請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と反応させて、結合の程度を判定するステップを含み、基準値よりも大きな結合の前記程度ががん状態を示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明は、ヒトアルファエノラーゼタンパク質（ＥＮＯ１）に特異的に結合する抗体に関する。本発明は、抗ＥＮＯ１抗体を対象に投与することにより炎症性疾患若しくは免疫障害を処置する、又は腫瘍成長及び転移を抑止するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]多発性硬化症（ＭＳ）は神経系の慢性炎症性疾患である。多発性硬化症では、神経線維のミエリン鞘が破壊される、すなわち、神経線維は自己抗体により脱髄される。多発性硬化症の症状は比較的非特異的であり、例えば、疲労、しびれ、歩行及び協調運動の問題、腸／膀胱の機能障害、認知障害並びに疼痛の再発と寛解である。今まで、原因と病態生理の理解は不十分であり、遺伝的背景、ビタミンＤ欠乏及び地理により引き起こされる可能性がある。ＭＳ病理の理解における初期では、ミエリン特異的ＣＤ４＋Ｔリンパ球は血液から脳及び脊椎に遊走し、抗原提示細胞（脳内のミクログリアを含む）により提示される抗原ペプチドに結合し、クローン的に拡大し、オリゴデンドロサイトを攻撃して損傷を与え、ミエリンを破壊すると考えられている。最近の仮説によれば、ミエリンＣＤ＋４Ｔ細胞はＭＳの初期のみに関与していることが示唆されている。ＣＮＳにおいてＭＣＰ−１により誘導される循環単球が、中期及び後期の疾患進行の原因である。そのリガンドがＭＣＰ−１であるケモカイン受容体ＣＣＲ２が欠損しているマウスは実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）に耐性である。ＣＣＲＣ２ノックアウトマウスがＥＡＥ誘導ＣＣＲＣ２＋マウス由来の異なる量の単球を輸血されると、レシピエントマウスの臨床スコアはドナーＥＡＥマウス由来の輸血された単球の量に比例する。この結果から、単球がＥＡＥ疾患進行に極めて重要であることが示唆される。
【０００３】
[0003]関節炎リウマチ（ＲＡ）は、患者の関節を冒す慢性炎症性疾患である。ＲＡの症状は、関節での疼痛、腫脹、凝り、及び変形を含む。患者は常に熱が出て疲労感を覚える。ＲＡの原因は完全に理解されてはいない。この疾患は患者の結合組織に対する自己抗体から始まり、続いて、単球、マクロファージ及び好中球を含む白血球が侵入する。次に、リンパ球が関節の骨及び軟部組織を侵食し浸潤する。
【０００４】
[0004]両方の疾患（ＭＳ及びＲＡ）では、文献のデータは、炎症性血中単球及びマクロファージが両方の免疫疾患の進行に関与していることを支持している。
【０００５】
[0005]腫瘍は単一細胞の異常な制御されない増殖から生じ、形質転換細胞のクローンを生み出す。がんは腫瘍細胞の自律的成長及び遠隔部位への転移能力を特徴とする。
【０００６】
[0006]腫瘍細胞は、免疫系が認識することが可能である独特な抗原を発現することがある。腫瘍関連抗原は、突然変異がん遺伝子、突然変異正常細胞タンパク質、異常に発現した細胞タンパク質、異常な細胞表面タンパク質、及び発癌性ウイルスタンパク質を含むがこれらに限定されない。免疫系はこれらの腫瘍関連抗原を非自己と見なし、抗体を産生して、健康な細胞は温存しつつ、これらの外来抗原担持腫瘍細胞を根絶することが可能である。したがって、免疫原性腫瘍関連抗原の同定は、がんの処置での臨床的予後診断的又は治療的適用のための標的として使用することができる。
【０００７】
[0007]ある特定の悪性腫瘍は、肺と胸壁の間の間隙にある過剰な体液である胸膜滲出により同定することができる。肺癌、乳癌、及びリンパ腫はすべての悪性胸膜滲出のうち約７５％を引き起こす。悪性胸膜滲出では、侵入したリンパ球、及び腫瘍細胞が濃縮されていることがある。腫瘍関連免疫複合体又は抗ｐ５３、抗核、及び抗ｃ−Ｍｙｃ抗体などの自己抗体が滲出液中に見出されており、予後不良に関連付けられている。サイトケラチン１９断片、神経特異的エノラーゼ（ＥＮＯ２）、扁平上皮癌抗原、及び可溶性ＨＬＡ−Ｉ、等を含むいくつかの肺腫瘍関連抗原も、悪性滲出液中で同定されている。
【０００８】
[0008]アルファエノラーゼ（エノラーゼ１、ＥＮＯ１）は多機能タンパク質であり、最初は解糖経路の重要な酵素として発見された。正常な状態下では、ＥＮＯ−１はサイトゾルで発現する。しかし、ＥＮＯ１はプラスミノーゲン受容体として多くのがん細胞の細胞表面で並びに好中球、リンパ球及び単球などの活性化された造血細胞上でも発現することが見出される。プラスミノーゲン受容体タンパク質が上方調節されると、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化系（ｕＰＡＳ）のカスケード応答を誘導することが可能になり、その結果、細胞外マトリックスが分解されることが分かっている。結果として、プラスミノーゲン受容体タンパク質の上方調節により、がん細胞の転移及び免疫細胞の侵入が増加する。炎症性刺激物、例えば、ＬＰＳは、翻訳後修飾及び細胞表面への移行によりヒト血中単球及びＵ９３７単球細胞上でのＥＮＯ１細胞表面発現を上方調節する。
【０００９】
[0009]ＥＮＯ１の移行はＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路により調節されていると考えられている。これは、細胞表面でのＥＮＯ１の発現の増加は炎症性疾患に重要な役割を果たしている可能性があることを意味する。ＥＮＯ１に対する自己抗体は、エリテマトーデス、全身性硬化症、ベーチェット病、潰瘍性、及びクローン病を含む変わりやすい自己免疫及び炎症性疾患に見出されてきた。ＥＮＯ１は、そのプラスミノーゲン受容体活性を経て、単球及びマクロファージの浸潤活性を増加させることによりＲＡ患者の疾患進行で重要な役割を果たしていることは知られてきた。
【００１０】
[00010]要約して言えば、プラスミノーゲン受容体としての細胞表面でのその上方調節されたＥＮＯ１発現が浸潤活性を増加させている単球は、ＭＳ、ＲＡ、及び関係する免疫障害の疾患進行に極めて重要である。したがって、単球の細胞表面のＥＮＯ１を標的とすることは、ＭＳ、ＲＡ、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び全身性エリテマトーデスなどの炎症性疾患、又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、アレルギー、乾癬、１型糖尿病、アテローム性動脈硬化症及び骨粗鬆症などの関係する免疫障害を処置する優れた潜在力を有する。
【００１１】
[00011]ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子系（ｕＰＡＳ）は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、そのコグネイト受容体（ｕＰＡＲ）並びに２つの特異的阻害剤、プラスミノーゲン活性化阻害剤１（ＰＡＩ−１）及びプラスミノーゲン活性化阻害剤２（ＰＡＩ−２）からなる。ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子はプラスミノーゲン酵素前駆体を活性セリンプロテアーゼであるプラスミンに変換する。プラスミンは、基底膜（ＢＭ）及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）リモデリングなどのいくつかの組織リモデリング過程に関与しており、このリモデリングは腫瘍進行及び転移に必要とされる。さらに、ｕＰＡＳは新生物進化に関与して、腫瘍血管新生、悪性細胞増殖、癒着及び遊走、内部血管新生、並びに転移部位での成長に影響を及ぼしている可能性があることが明らかにされている。
【００１２】
[00012]詳細には、プラスミノーゲンの活性化により細胞外マトリックスの分解が可能になり、それにより今度は細胞がんの転移及び免疫細胞の侵入の増加につながりうる。言い換えると、プラスミノーゲン受容体としてのがん細胞表面でのＥＮＯ１発現によりがん細胞の浸潤活性の増加が可能になる。したがって、ＥＮＯ１はがん治療の潜在的標的でもある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
[00013]本発明の実施形態は、ヒトＥＮＯ１に特異的に結合し、それによってリガンド（例えば、プラスミノーゲン）がＥＮＯ１に結合するのを阻害する、抗体又はその抗原結合断片に関する。ＥＮＯ１へのプラスミノーゲンの結合を阻害することにより、本発明の抗体はプラスミノーゲン活性化を阻害することが可能である。
【００１４】
[00014]本発明の実施形態に従えば、抗体又はその抗原結合断片はヒトＥＮＯ１上のエピトープに結合しＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体活性を阻害することが可能であり、エピトープは、ヒトＥＮＯ１の２９６ＦＤＱＤＤＷＧＡＷＱＫＦＴＡＳＡＧＩＱＶＶＧＤＤＬＴＶＴＮＰＫＲＩＡＫＡＶＮＥＫＳ３３６（配列番号３９）の配列からなる領域に位置していることがある。本発明の上記実施形態のいずれかに従えば、抗体又はその結合断片はヒトＥＮＯ１上のエピトープに結合しＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体活性を阻害することが可能であり、エピトープは、ヒトＥＮＯ１の２９６ＦＤＱＤＤＷＧＡＷＱＫＦＴＡ３０９（配列番号４０）又は３２６ＫＲＩＡＫＡＶＮＥＫＳ３３６（配列番号４１）の配列からなる領域に位置していることがある。本発明のある特定の実施形態に従えば、抗体はヒト化抗体又は完全ヒト抗体でもよい。
【００１５】
[00015]本発明の一部の実施形態に従えば、ヒトＥＮＯ１タンパク質に結合できる抗体又はその抗原結合断片は、（ｉ）ＬＣＤＲ１（ＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＴ；配列番号６）、ＬＣＤＲ２（ＮＡＫＴＬＰＥ；配列番号７）及びＬＣＤＲ３（ＱＨＨＹＧＴＰＹＴ；配列番号８）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、並びに（ｉｉ）ＨＣＤＲ１（ＧＹＴＦＴＳＣＶＭＮ；配列番号３）、ＨＣＤＲ２（ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ；配列番号４）及びＨＣＤＲ３（ＥＧＦＹＹＧＮＦＤＮ；配列番号５）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００１６】
[00016]本発明の一部の実施形態に従えば、ヒトＥＮＯ１タンパク質に結合できる抗体は、配列番号２若しくは９のアミノ酸残基１〜１１０を含むＶＬ及び／又は配列番号１、１０若しくは１１のアミノ酸残基１〜１２０を含むＶＨを含む。
【００１７】
[00017]本発明の一部の実施形態に従えば、ヒトＥＮＯ１タンパク質に結合できる抗体又はその抗原結合断片は、（ｉ）ＬＣＤＲ１（ＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＴ；配列番号６）、ＬＣＤＲ２（ＮＡＫＴＬＰＥ；配列番号７）及びＬＣＤＲ３（ＱＨＨＹＧＴＰＹＴ；配列番号８）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、並びに（ｉｉ）ＨＣＤＲ１（ＧＹＴＦＴＳ−Ｘａａ−ＶＭＮ；配列番号５０）、ＨＣＤＲ２（ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ；配列番号４）及びＨＣＤＲ３（ＥＧＦＹＹＧＮＦＤＮ；配列番号５）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００１８】
[00018]本発明の一部の実施形態に従えば、ヒトＥＮＯ１タンパク質に結合できる抗体は、配列番号１、配列番号２若しくは９に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び／又は配列番号１、１０若しくは５１に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００１９】
[00019]本発明の他の実施形態は、本明細書に記載される抗体、若しくはその抗原結合断片のいずれかをコードする単離された核酸分子、抗体、若しくはその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子を有するベクター、又はそのような核酸分子のいずれかで形質転換された宿主細胞に関する。
【００２０】
[00020]本発明の他の実施形態は、ヒトＥＮＯ１タンパク質に結合できる抗体又はその抗原結合断片の治療有効量を含む医薬組成物、及び薬学的に許容される担体に関する。
【００２１】
[00021]本発明のなおさらなる実施形態は、ＥＮＯ１タンパク質関係疾患又は障害に罹っている対象（例えば、ヒト又は非ヒト動物）を効果的に処置するための方法に関する。方法は、それを必要とする対象を選択するステップと、ＥＮＯ１タンパク質に特異的に結合する抗体（ヒト化又は完全ヒト抗体でもよい）又はその断片の治療有効量を対象に投与するステップとを含むことができる。
【００２２】
[00022]本発明のある特定の実施形態に従えば、ヒトＥＮＯ１タンパク質関係疾患又は障害は、ヒトＥＮＯ１タンパク質の異常な活性化又は発現から生じるいかなる状態でもよい。そのような疾患の例は、ヒトＥＮＯ１タンパク質がそのリガンドと異常な相互作用をして、それによって細胞接着又は細胞シグナル伝達特性を変化させる場合を含む。細胞接着又は細胞シグナル伝達特性のこのような変化は、新生物疾患及び／又は炎症性若しくは免疫疾患をもたらすことがある。
【００２３】
[00023]例えば、ヒトＥＮＯ１タンパク質関係疾患は、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデスなどの炎症性疾患若しくは免疫障害、又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、アレルギー、乾癬、１型糖尿病、アテローム性動脈硬化症及び骨粗鬆症などの相対免疫障害、又は肺がん、乳がん、膵臓がん、肝臓がん、結腸直腸がん、及び前立腺がんなどの新生物疾患でもよい。
【００２４】
[00024]本発明の一部の実施形態は、患者又は患者試料中のヒトＥＮＯ１タンパク質のレベルをアッセイするための方法に関する。本発明の方法は、ヒト化抗ＥＮＯ１抗体を患者由来の生体試料に接触させるステップと、上記抗体と上記試料中のヒトＥＮＯ１タンパク質の間の結合のレベルを検出するステップとを含む。さらに具体的な実施形態では、生体試料は血液又は血漿又は組織試料である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ハイブリドーマのアサイト（ａｃｉｔｅｓ）から単離されたＥＮ１０  ｍＡｂによるＥＮＯ１結合からのＥＬＩＳＡ結果を示す図である。硫酸アンモニウム精製、プロテインＡカラム精製、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ精製は実施例１に記載の通りに実施した。これらのデータは、抗ヒトＥＮＯ１抗体ＥＮ１０  ｍＡｂのＫＤを示している。
【図２】ＥＮ１０  ｍＡｂのＵ９３７線維素溶解性アッセイの結果を示す図である。ヒトＵ９３７リンパ腫細胞株でのＬＰＳによるＥＮＯ１発現の誘導及びプラスミン活性アッセイは実施例２に記載の通りに実施した。これらの結果は、ＥＮ１０  ｍＡｂが誘導性ＥＮＯ１タンパク質のプラスミノーゲン受容体活性を軽減することを証明している。
【図３】細胞の表面ＥＮＯ１発現がＬＰＳにより誘導された後、ハイブリドーマから単離されたＥＮ１０  ｍＡｂの異なる濃度で処置されたＵ９３７細胞の浸潤活性の結果を示す図である。詳細な手順は実施例３に記載される通りに実施した。これらのデータは、ＥＮ１０  ｍＡｂがＵ９３７細胞の浸潤活性を用量依存的様式で阻害することを明らかにしている。
【図４】ＥＮ１０  ｍＡｂがＬＰＳで処置されたＵ９３７細胞上で細胞表面ＥＮＯ１を認識することを示す図である。詳細な手順は実施例４に記載される通りに実施した。ヒストグラムは、細胞がＬＰＳを投与された後、ＥＮＯ１がＵ９３７の表面で高発現することを示している。
【図５Ａ】ＥＮ１０  ｍＡｂの可変重鎖領域アミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）及びＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）が示されている。ＥＮ１０  ｍＡｂのクローニングは実施例５に記載される通りに実施した。
【図５Ｂ】ＥＮ１０  ｍＡｂの可変軽鎖領域アミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）及びＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）が示されている。ＥＮ１０  ｍＡｂのクローニングは実施例５に記載される通りに実施した。
【図６Ａ−１】ｈｕｍＥＮＯ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５のＶＬ（配列番号９）及びＶＨ（配列番号１０）配列のヒト化のために行われた配列分析を示す図である。Ｋａｂａｔ方式に従った残基番号付けの下に示している最初のラインでは、マスクはアンダーリング付きで示されており、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲはラインの下で示されている。ヒトＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５のＶＬ及びＶＨのフレームワーク決定は実施例６に記載される通りに実施した。
【図６Ａ−２】ｈｕｍＥＮＯ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５のＶＬ（配列番号９）及びＶＨ（配列番号１０）配列のヒト化のために行われた配列分析を示す図である。Ｋａｂａｔ方式に従った残基番号付けの下に示している最初のラインでは、マスクはアンダーリング付きで示されており、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲはラインの下で示されている。ヒトＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５のＶＬ及びＶＨのフレームワーク決定は実施例６に記載される通りに実施した。
【図６Ｂ−１】ヒトＥＮＯ１０ｍＡｂ  ＩＭＧＴのＶＬ（配列番号９）及びＶＨ（配列番号１１）配列のヒト化のために行われた配列分析を示す図である。Ｋａｂａｔ方式に従った残基番号付けの下に示している最初のラインでは、マスクはアンダーリング付きで示されており、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲは下線で示されている。ヒトＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴのＶＬ及びＶＨのフレームワーク決定は実施例６に記載される通りに実施した。
【図６Ｂ−２】ヒトＥＮＯ１０ｍＡｂ  ＩＭＧＴのＶＬ（配列番号９）及びＶＨ（配列番号１１）配列のヒト化のために行われた配列分析を示す図である。Ｋａｂａｔ方式に従った残基番号付けの下に示している最初のラインでは、マスクはアンダーリング付きで示されており、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲは下線で示されている。ヒトＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴのＶＬ及びＶＨのフレームワーク決定は実施例６に記載される通りに実施した。
【図７Ａ】ＥＮ１０  ｍＡｂのマウスヒトキメラ及びヒト化版を作製するための発現ベクターを示す図である。抗体の異なるＥＮ１０  ｍＡｂ版の精製のための詳細な手順は実施例７に記載されている。
【図７Ｂ】ＥＮ１０  ｍＡｂの結合親和性及び速度定数を決定するために、キメラＥＮ１０、ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５及びｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体を使用して得られる結果を示す図である。キメラ抗体発現、精製及びＫＤ分析の詳細な手順は実施例７に記載されている通りに実施した。ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴの結果ＫＤはマウスヒトキメラＥＮ１０  ｍＡｂのＫＤに対して有意ではない。
【図８Ａ】図８Ａ及び８ＢはそれぞれｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５及びｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体のＵ９３７線維素溶解性アッセイの結果を示す図である。ヒトＵ９３７リンパ腫細胞株におけるＬＰＳによるＥＮＯ１発現の誘導及びプラスミン活性アッセイは実施例２に記載される通りに実施した。データは、ＥＮ１０  ｍＡｂと同じくｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５とｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴの両方が誘導性ＥＮＯ１タンパク質のプラスミノーゲン受容体活性を軽減することを明らかにしている。
【図８Ｂ】図８Ａ及び８ＢはそれぞれｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５及びｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体のＵ９３７線維素溶解性アッセイの結果を示す図である。ヒトＵ９３７リンパ腫細胞株におけるＬＰＳによるＥＮＯ１発現の誘導及びプラスミン活性アッセイは実施例２に記載される通りに実施した。データは、ＥＮ１０  ｍＡｂと同じくｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５とｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴの両方が誘導性ＥＮＯ１タンパク質のプラスミノーゲン受容体活性を軽減することを明らかにしている。
【図９Ａ】細胞の表面ＥＮＯ１発現がＬＰＳにより誘導された後、それぞれ異なる濃度のｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５及びｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体で処置されたＵ９３７細胞の浸潤活性の結果を示す図である。詳細な手順は実施例９に記載されている通りに実施した。これらのデータは、ヒト化後、ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５及びｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体がＵ９３７細胞の浸潤活性を用量依存的様式で阻害する活性を有することを明らかにしている。
【図９Ｂ】細胞の表面ＥＮＯ１発現がＬＰＳにより誘導された後、それぞれ異なる濃度のｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５及びｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体で処置されたＵ９３７細胞の浸潤活性の結果を示す図である。詳細な手順は実施例９に記載されている通りに実施した。これらのデータは、ヒト化後、ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５及びｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体がＵ９３７細胞の浸潤活性を用量依存的様式で阻害する活性を有することを明らかにしている。
【図１０Ａ】マトリックスタンパク質へのＣＬ１−５肺癌細胞の接着活性を示す図である。接着アッセイは実施例１０に記載される通りに実施した。これらのデータは、ＣＬ１−５細胞がコラーゲン及びフィブロネクチンへのより高い接着活性を有することを明らかにしている。
【図１０Ｂ】ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５で処置されたフィブロネクチンからのＣＬ１−５細胞解離の阻害の結果を示す図である。細胞関連接着アッセイは実施例１０に記載の通りに実施した。これらのデータは、ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５がフィブロネクチンからのＣＬ１−５の細胞解離活性を用量依存的様式で阻害することを明らかにしている。
【図１０Ｃ】ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５で処置したコラーゲンからのＣＬ１−５細胞解離の阻害の結果を示す図である。細胞関連接着アッセイは実施例１０に記載の通りに実施した。これらのデータは、ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５がコラーゲンからのＣＬ１−５の細胞解離活性を用量依存的様式で阻害することを明らかにしている。
【図１１Ａ】ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５及びｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体の抗体依存細胞媒介細胞傷害性効果を示す図である。ヒト化抗体の投与及びＣＬ１−５の肺がん細胞株の細胞溶解効果は実施例１１に記載の通りに実施した。データは、両方のヒト化ＥＮ１０抗体が新しいＡＤＣＣ活性を作り出すことを明らかにしている。
【図１１Ｂ】ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５及びｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体の抗体依存細胞媒介細胞傷害性効果を示す図である。ヒト化抗体の投与及びＣＬ１−５の肺がん細胞株の細胞溶解効果は実施例１１に記載の通りに実施した。データは、両方のヒト化ＥＮ１０抗体が新しいＡＤＣＣ活性を作り出すことを明らかにしている。
【図１２】ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５及びｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体の阻害効果を示す図である。ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５及びｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴの投与並びに抗体処置による腫瘍成長の遅延は実施例１２に記載の通りに実施した。データは、両方のヒト化ＥＮ１０  ｍＡｂの週あたり２度の投与がＣＬ１−５異種移植片マウスモデルで有効性を有することを明らかにしている。
【図１３Ａ】ＣＨＯＳ細胞株において発現させるｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴのＶＬ（配列番号１４及び１５）及びＶＨ（配列番号１６及び１７）配列のコドン最適化のために行われた配列分析を示す図である。詳細な手順は実施例１３に記載される通りに実施した。
【図１３Ｂ】ＣＨＯＳ細胞株において発現させるｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴのＶＬ（配列番号１４及び１５）及びＶＨ（配列番号１６及び１７）配列のコドン最適化のために行われた配列分析を示す図である。詳細な手順は実施例１３に記載される通りに実施した。
【図１３Ｃ】ＣＨＯＳ安定細胞株におけるｈｕｍＥＮ１０  ＩＭＧＴのヒト化抗体の作製のための発現ベクターを描いている。詳細な手順は実施例１３に記載される通りに実施した。
【図１３Ｄ】５日目及び１４日目でｈｕｍＥＮ１０  ＩＭＧＴ  ｍＡｂ抗体を発現した上位１５のＣＨＯＳ安定クローンの生産力を示す図である。詳細な手順は実施例１３に記載される通りに実施した。生産速度は５日目では１５５ミニグラム／力価〜９１．３ミニグラム／リットル及び１５日目では３５８．７ミニグラム／力価〜２４７．５ミニグラム／リットルの範囲である。
【図１３Ｅ】ｈｕｍＥＮ１０  ＩＭＧＴ  ｍＡｂ抗体を発現した上位６のＣＨＯＳ安定クローンの生産力を示す図である。詳細な手順は実施例１３に記載される通りに実施した。本発明者らのデータは、コドン最適化及び単一コロニー選択後、これら上位６クローンの生産速度は１ｇ／Ｌ／１５日に近いことを明らかにしている。
【図１３Ｆ】ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体を発現した上位６の安定クローンから単離された抗体のＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す図である。詳細な手順は実施例１３に記載される通りに実施した。本発明者らのデータは、これらのクローンがすべて無傷のｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴを発現することを明らかにしている。
【図１４Ａ】３バッチのｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体のサイズ排除ＨＰＬＣ及び質量スペクトル分析を示す図である。詳細な手順は実施例１４に記載される通りに実施した。本発明者らのデータは、クローン６Ｃ６が３ロット中でシステイニル化抗体の割合が異なるｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴを発現することを明らかにしている。
【図１４Ｂ】３バッチの脱グリコシル化したｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体のサイズ排除ＨＰＬＣ及び質量スペクトル分析を示す図である。詳細な手順は実施例１４に記載される通りに実施した。本発明者らのデータは、クローン６Ｃ６がシステイニル化抗体の割合が異なるｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴを発現することを明らかにしている。３バッチの脱グリコシル化したｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体のグルタチオン付加及びシステイニル化の詳細な組成を表ＩＩＩに示す。
【図１５】重鎖ＨＣＤＲ１の可変領域のそれぞれアラニン３２及びセリン３２の結合親和性及び速度定数を決定するために、ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ、ＥＮ１０．４及びＥＮ１０．５抗体を使用して得られる結果を描いている。抗体発現、精製及びＫＤ分析の詳細な手順は実施例１５に記載される通りに実施した。その結果は、ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴのＫＤ値がＥＮ１０．４及びＥＮ１０．５  ｍＡｂのＫＤ値と有意差がないことを明らかにしている。
【図１６】ｍＡｂ  ＥＮ１０．５．抗体を発現した上位２０のＣＨＯＳ安定クローンの生産力を示す図である。詳細な手順は実施例１６に記載される通りに実施した。本発明者らのデータは、ＨＣＤＲ１（配列番号３）のアミノ酸番号３２でのセリン突然変異及び単一コロニー選択後、これら上位２０クローンの生産速度は３４４ｇ／Ｌ／１４日を超えていることを明らかにしている。
【図１７Ａ】２バッチのＥＮ１０．５抗体のサイズ排除ＨＰＬＣ及び質量スペクトル分析の結果を示す図である。詳細な手順は実施例１７に記載される通りに実施した。本発明者らのデータは、クローンＥＮ１０．５がシステイニル化抗体のないｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴを発現することを明らかにしている。
【図１７Ｂ】２バッチの脱グリコシル化したＥＮ１０．５抗体のサイズ排除ＨＰＬＣ及び質量スペクトル分析の結果を示す図である。詳細な手順は実施例１７に記載される通りに実施した。本発明者らのデータは、クローンＥＮ１０．５がシステイニル化抗体のないｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴを発現することを明らかにしている。
【図１８Ａ】ＥＮＯ１の欠失突然変異体のＥＮ１０  ｍＡｂ結合活性を示している。ＥＮ１０  ｍＡｂの結合エピトープはヒトＥＮＯ１タンパク質のアミノ残基番号２９３と４３４の間に位置している。ＥＮ１０  ｍＡｂの結合領域を決定するためのＥＮＯ１の大きな部分の欠失は実施例１８に記載される通りに実施した。
【図１８Ｂ】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から精製したＥＮＯ１の６つのＣ末端欠失突然変異タンパク質の１２％ＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す図である。ＥＮＯ１欠失突然変異体の精製のための詳細な手順は実施例１８に記載されている。
【図１８Ｃ】ＥＮＯ１の６つのＣ末端欠失突然変異体のＥＮ１０  ｍＡｂ結合活性を示す図である。ＥＮ１０ｍＡｂの結合エピトープはヒトＥＮＯ１タンパク質のアミノ残基番号２９６と３３６の間に位置している。ＥＮ１０  ｍＡｂの結合領域を決定するためのＥＮＯ１の大きな部分の欠失は実施例１８に記載される通りに実施した。
【図１９Ａ】ヒトＥＮＯ１のアミノ番号２９６と３３６の間の結晶構造及び表面露出アミノ酸残基を描いている。構造予測は実施例１９に記載した。
【図１９Ｂ】大腸菌で精製されたＥＮＯ１の６つのアラニンスキャニング突然変異タンパク質の１２％ＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す図である。ＥＮＯ１突然変異タンパク質の精製のための詳細な手順は実施例１９に記載されている。
【図１９Ｃ】ＥＮ１０．５  ｍＡｂに対する６つのアラニンスキャニング突然変異体のＥＮＯ１結合ＥＬＩＳＡ及びＫＤ値を示す図である。結果は、ヒトＥＮＯ１のアミノ残基番号２９６と３３６の間に位置するＡｓｐ２９９及びＡｒｇ３２７のアミノ酸配列がＥＮ１０  ｍＡｂ結合に関与していることを示唆している。アラニンスキャニングは実施例１９に記載の通りに実施した。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
[00058]別の方法で定義されていなければ、本明細書で使用される科学及び専門用語は当業者が一般に理解している意味を有するものとする。さらに、文脈から別の方法で要求されなければ、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載される細胞及び組織培養、分子生物学、並びにタンパク質及びオリゴ又はポリヌクレオチド化学及びハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法並びにその技法は、当技術分野で周知であり一般に使用されている命名法及び技法である。
【００２７】
[00059]組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、並びに組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）には標準技法が使用される。酵素反応及び精製技法は、製造業者の仕様書に従って、又は当技術分野で一般に成し遂げられている通りに、又は本明細書に記載される通りに実施される。前述の技法及び手順は一般的には、当技術分野で周知である従来の方法に従って、並びに本明細書全体を通じて引用され考察されている種々の一般的及びより具体的な参考文献に記載されている通りに実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２００１年））を参照されたい。前記文献は参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、並びに医薬品及び製薬化学と関連して利用される命名法並びにその実験手順及び技法は当技術分野で周知であり一般に使用されている命名法並びに実験手順及び技法である。化学合成、化学分析、医薬品調製、製剤、及び送達、並びに患者の処置には標準技法が使用される。
【００２８】
[00060]本開示に従って利用されるように、以下の用語は、別の方法で指示されなければ、以下の意味を有すると理解されることとする。本明細書で使用される用語「及び／又は」は、２つの特定の特徴又は成分のそれぞれの、もう一方と一緒の又はなしでの、具体的開示と解釈されるべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢのそれぞれの具体的開示と、それぞれが本明細書で個々に提示されているかのように解釈されるべきである。
【００２９】
[00061]アンタゴニストは、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、小分子量化合物、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、アンチセンス、組換えタンパク質、抗体、又はそれらのコンジュゲート若しくは融合タンパク質でもよい。ＲＮＡｉの概説については、Ｍｉｌｈａｖｅｔ  Ｏ、Ｇａｒｙ  Ｄ  Ｓ、Ｍａｔｔｓｏｎ  Ｍ  Ｐ．（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．２００３年１２月；５５巻（４号）：６２９〜４８頁  Ｒｅｖｉｅｗ．）を参照されたい、及びアンチセンスアプローチについては、Ｏｐａｌｉｎｓｋａ  Ｊ  Ｂ、Ｇｅｗｉｒｔｚ  Ａ  Ｍ．（Ｓｃｉ  ＳＴＫＥ．２００３年１０月  ２８巻；２００３（２０６）：ｐｅ４７）を参照されたい。
【００３０】
[00062]ヒトＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体は当業者には公知である（国立衛生研究所のウェブサイトでジェンバンク：ＡＡＨ５０６４２．１を参照）。この受容体はプラスミノーゲン受容体であり、ヒトにおいて２つの異なるスプライシングバリアント、ＥＮＯ１及びＭｙｃ結合タンパク質で存在する。ＥＮＯ１はヒトＥＮＯ１、アルファエノラーゼ、又はＥＮＯ−１遺伝子としても知られている。
【００３１】
[00063]いくつかの他の種由来のＥＮＯ１の対応するオルソログも知られており、例えば、ヒトＥＮＯ１から開始する配列検索により当業者が容易に判定することが可能である。本発明の実施形態に従えば、用語「ＥＮＯ１」とはヒトと動物（例えば、ペット及び家畜）の両方のＥＮＯ１タンパク質のことである。
【００３２】
[00064]本明細書で使用されるように、用語「抗体」とは一般に及び広く、免疫グロブリン、自己抗体、モノクローナル抗体、及びポリクローナル抗体、並びにその活性断片のことである。断片は、それがコグネイト抗原に結合するという点で活性であってもよく、又は生物学的に機能的であるという点で活性であってもよい。本発明の抗体は、当技術分野で公知の技法を使用して、キメラでも、ヒト化でも、又はヒトでもよい。抗体の断片は、抗体Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、切断された抗体由来のＦｖ断片若しくはＦｃ断片、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片、ミニボディ、ダイアボディ又はｓｃＦｖを含むことができるがこれらに限定されない。
【００３３】
[00065]本明細書で使用されるように、用語「抗体」とは一般に及び広く、免疫グロブリン、自己抗体、モノクローナル抗体、及びポリクローナル抗体、並びにその活性断片のことである。断片は、それがコグネイト抗原に結合するという点で活性であってもよく、又は生物学的に機能的であるという点で活性であってもよい。本発明の抗体は、当技術分野で公知の技法を使用して、キメラでも、ヒト化でも、又はヒトでもよい。
【００３４】
[00066]本明細書で使用されるように、用語「モノクローナル抗体」とは、一般的にハイブリドーマにより産生される化学的及び免疫学的に均一である抗体のことである。Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８８年）を参照されたい。
【００３５】
[00067]本明細書で使用されるように、用語「ポリクローナル抗体」とは、同じ抗原に応答して抗体合成プラズマ細胞（Ｂリンパ球）の１つよりも多いクローンにより産生される抗体のことである。ポリクローナル抗体は一般に、動物が抗原で免疫された後に動物により産生される。
【００３６】
[00068]本明細書で使用されるように、用語「キメラ抗体」とは、１つよりも多い供給源由来の配列を含有する抗体のことである。例えば、そのような抗体は、非ヒト供給源に由来し、その後ヒト配列を導入することにより改変される配列を含有していてもよい。
【００３７】
[00069]本明細書で使用されるように、用語「ヒト化抗体」とは、非ヒト抗体の最小部分がその他の点ではヒト抗体に導入されている抗体のことである。
【００３８】
[00070]本明細書で使用されるように、用語「ヒト抗体」とは、タンパク質の実質的にすべての部分がヒトでは実質的に非免疫原性であり、配列変化又は変異がごくわずかである抗体のことである。
【００３９】
[00071]本明細書で使用されるように、用語「アルファエノラーゼ特異的抗体」とは、哺乳動物ＥＮＯ１に対して高度な特異性を有するが、ＥＮＯ２にもＥＮＯ３にも特異性のない抗体のことである。
【００４０】
[00072]抗体などの標的に向けられる結合剤（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）に言及する場合の用語「中和する」は、標的抗原の活性を取り除く、又は著しく減少させる上記標的に向けられる結合剤の能力に関する。したがって、「中和」ＥＮＯ１抗体はＥＮＯ１の活性を取り除く、又は著しく減少させることができる。中和ＥＮＯ１抗体は、例えば、プラスミノーゲンへのＥＮＯ１の結合を遮断することにより作用することができる。この結合を遮断することにより、プラスミノーゲン媒介細胞解離は著しく、又は完全に取り除かれる。理想的には、ＥＮＯ１に対する中和抗体は細胞接着を増強する。
【００４１】
[00073]本明細書で使用される用語「単離されたポリヌクレオチド」は、その天然に存在する環境から単離されているポリヌクレオチドを意味するものとする。そのようなポリヌクレオチドはゲノム、ｃＤＮＡ、又は合成でもよい。単離されたポリヌクレオチドは好ましくは、天然であればそれが会合しているポリヌクレオチドのすべて又は部分と会合していない。単離されたポリヌクレオチドは、それが天然であれば連結されていない別のポリヌクレオチドに作動可能に連結されていてもよい。さらに、単離されたポリヌクレオチドは好ましくは、もっと大きな配列の一部として天然には存在していない。
【００４２】
[00074]本明細書で言及される用語「単離されたタンパク質」はその天然に存在する環境から単離されているタンパク質を意味する。そのようなタンパク質は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えＤＮＡ、組換えＲＮＡ、若しくは合成起源又はそれらのいくつかの組合せ由来でもよく、その起源、又は由来の源によって「単離されたタンパク質」は（１）天然で見出されるタンパク質と会合していない、（２）同じ源由来の他のタンパク質がない、例えば、マウスタンパク質がない、（３）異なる種由来の細胞で発現する、又は（４）天然には存在しない。
【００４３】
[00075]用語「ポリペプチド」は、本明細書では天然のタンパク質、断片、又はポリペプチド配列の類似物を指す総称用語として使用される。したがって、天然のタンパク質、断片、又は類似物はポリペプチド属の種である。本発明に従った好ましいポリペプチドは、ヒト重鎖免疫グロブリン分子及びヒトカッパ軽鎖免疫グロブリン分子、並びに重鎖免疫グロブリン分子とカッパ又はラムダ軽鎖免疫グロブリン分子などの軽鎖免疫グロブリン分子を含む組合せ、及び逆もまた同じにより形成される抗体分子、並びにその断片及び類似物を含む。本発明に従った好ましいポリペプチドは、ヒト重鎖免疫グロブリン分子又はその断片のみも含むことができる。
【００４４】
[00076]本明細書で使用され、物体に適用される用語「天然に存在する」とは、物体を天然において見出すことができるという事実のことである。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し天然の源から単離することが可能であり、実験室において又は他の方法でヒトにより意図的に改変されていないポリペプチド又はポリヌクレオチドは、天然に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチドである。
【００４５】
[00077]本明細書で使用される用語「作動可能に連結された」とは、成分をその意図された様式で機能させる関係にあるように記載された成分の位置のことである。例えば、コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、制御配列と適合する条件下でコード配列の発現が達成されるように連結されている。
【００４６】
[00078]本明細書で言及されている用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドであれデオキシリボヌクレオチドであれ、又はどちらかのタイプのヌクレオチドの改変された形態であれ、又はＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二重鎖であれ、少なくとも１０塩基長のヌクレオチドの重合形態を意味する。この用語はＤＮＡの一本及び二本鎖形態を含む。
【００４７】
[00079]本明細書で言及されている用語「オリゴヌクレオチド」は、天然に存在する及び天然には存在しない連鎖により互いに連結された天然に存在する及び改変されたヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは長さが２００塩基又はそれよりも少ない塩基を一般に含むポリヌクレオチドのサブセットである。オリゴヌクレオチドは１０〜６０塩基長であることが好ましく、もっとも好ましくは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０〜４０塩基長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、プローブでは、通常、一本鎖であるが、オリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝子突然変異体の構築で使用するために二本鎖でもよい。オリゴヌクレオチドはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドでも可能である。
【００４８】
[00080]本明細書で言及されている用語「天然に存在するヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含む。本明細書で言及されている用語「改変されたヌクレオチド」は、改変された又は置換された糖基を有するヌクレオチド及び同類の物を含む。本明細書で言及されている用語「オリゴヌクレオチド連鎖」は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデート、ホスホロアミデート、及び同類の物などのオリゴヌクレオチド連鎖を含む。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４巻：９０８１頁（１９８６年）；Ｓｔｅｃら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６巻：６０７７頁（１９８４年）；Ｓｔｅｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６巻：３２０９頁（１９８８年）；Ｚｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ６巻：５３９頁（１９９１年）；Ｚｏｎら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、８７〜１０８頁（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｅｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１年））；Ｓｔｅｃら、米国特許第５，１５１，５１０号；Ｕｈｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０巻：５４３頁（１９９０年）を参照されたい。前記文献の開示はこれにより参照により組み込まれる。オリゴヌクレオチドは、所望の場合、検出のための標識を含むことが可能である。
【００４９】
[00081]用語「ＣＤＲ領域」又は「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔら、１９９１年（Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら、（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版．ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、ＮＩＨ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）及び後の版により定義される免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖の超可変領域を示すことを意図されている。抗体は典型的には３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含有する。用語ＣＤＲ（単数又は複数）は、場合により、抗体が認識する抗原又はエピトープに対する抗体の親和性により結合の原因であるアミノ酸残基の大多数を含有するこれらの領域のうちの１つ又はこれらの領域のうちのいくつか若しくはさらに全体を示すために、ここで使用される。
【００５０】
[00082]６つの短いＣＤＲ配列の間で、重鎖の第３のＣＤＲ（ＨＣＤＲ３）はより大きなサイズ可変性（本質的にそのＣＤＲを生じる遺伝子の配置の機序に起因するより大きな多様性）を有する。第３のＣＤＲはわずか２アミノ酸の場合もあるが、知られているもっとも長いサイズは２６である。ＣＤＲ長は特定の根底にあるフレームワークによって順応されることが可能な長さに従って変化することもある。機能的には、ＨＣＤＲ３は抗体の特異性の決定において一部役割を果たしている（Ｓｅｇａｌら、ＰＮＡＳ、７１巻：４２９８〜４３０２頁、１９７４年、Ａｍｉｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３３巻：７４７〜７５３頁、１９８６年、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１〜９１７頁、１９８７年、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻：８７７〜８８３頁、１９８９年、Ｃａｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４４巻：１９６５〜１９６８頁、１９９０年、Ｓｈａｒｏｎら、ＰＮＡＳ、８７巻：４８１４〜４８１７頁、１９９０年、Ｓｈａｒｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４４巻：４８６３〜４８６９頁、１９９０年、Ｋａｂａｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻：１７０９〜１７１９頁、１９９１年）。
【００５１】
[00083]本明細書で言及される用語「ＣＤＲのセット」はＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。したがって、ＨＣＤＲのセットとはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３（ＬＣＤＲとは可変重鎖ＣＤＲのことである）のことであり、ＬＣＤＲのセットとはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３（ＬＣＤＲとは可変軽鎖ＣＤＲのことである）のことである。別の方法で述べられていなければ、「ＣＤＲのセット」はＨＣＤＲ及びＬＣＤＲを含む。
【００５２】
[00084]２つのアミノ酸配列は、その配列間に部分的又は完全な同一性があれば「相同」である。例えば、８５％相同性とは、２つの配列を最大適合のために整列させた場合、アミノ酸のうちの８５％が同一であることを意味する。適合を最大にするのにギャップ（適合させている２つの配列のどちらかで）が認められ、５又はそれよりも少ないギャップ長が好ましく、２又はそれよりも少ないがさらに好ましい。代わりに及び好ましくは、２つのタンパク質配列（又は少なくとも約３０アミノ酸長のタンパク質配列に由来するポリペプチド配列）は、変異データマトリックス及び６又はそれよりも大きいギャップペナルティーを用いてプログラムＡＬＩＧＮを使用してそのタンパク質配列が５よりも大きいアライメントスコア（標準偏差単位で）を有する場合、この相同という用語が本明細書で使用される意味での、相同である。Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｍ．Ｏ．、ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１０１〜１１０頁（５巻、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（１９７２年））ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２  ｔｏ  ｔｈｉｓ  ｖｏｌｕｍｅ、１〜１０頁を参照されたい。２つの配列又はその部分はより好ましくは、ＡＬＩＧＮプログラムを使用して最適に整列された場合、そのアミノ酸が５０％よりも多く又はこれに等しく同一であるならば相同である。２つのオルソロガス配列内に異なる領域の相同性が存在可能であることは認識されるべきである。例えば、マウス及びヒトオルソログの機能部位が非機能的領域よりも高度な相同性を有することがある。
【００５３】
[00085]用語「と一致する」は、ポリヌクレオチド配列が基準ポリヌクレオチド配列のすべてに若しくは部分に相同である（すなわち、同一であるが、厳密には進化的に関係があるわけではない）こと、又はポリペプチド配列が基準ポリペプチド配列と同一であることを意味するのに本明細書では使用される。
【００５４】
[00086]これとは対照的に、用語「に相補的な」は、相補的配列が基準ポリヌクレオチド配列のすべてに若しくは部分に相同であることを意味するのに本明細書では使用される。説明すると、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は基準配列「ＴＡＴＡＣ」に一致しており、基準配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。
【００５５】
[00087]用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド又はアミノ酸配列が比較ウィンドウにわたって同一である（すなわち、ヌクレオチドごとに又は残基ごとに）ことを意味する。用語「配列同一性の割合」は、２つの最適に整列された配列を比較ウィンドウにわたって比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、又はＩ）又はアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を決定して適合する位置の数を得て、適合した位置の数を比較ウィンドウの位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性の割合を得ることにより計算される。
【００５６】
[00088]本明細書で使用される用語「実質的な同一性」又は「実質的に同一の」は、ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列の特徴を表し、その特徴において、ポリヌクレオチド又はアミノ酸は、少なくとも１８ヌクレオチド（６アミノ酸）位置の比較ウィンドウにわたって、多くの場合少なくとも２４〜４８ヌクレオチド（８〜１６アミノ酸）位置ウィンドウにわたって、基準配列と比べた場合、少なくとも８５パーセント配列同一性、好ましくは、少なくとも９０〜９５パーセント配列同一性、さらに好ましくは少なくとも９９パーセント配列同一性を有する配列を含み、配列同一性の割合は、欠失又は付加を含むことがある配列であって、比較ウィンドウにわたって合計すると基準配列のうちの２０パーセント又はそれよりも少ない配列と基準配列を比べることにより計算される。基準配列はもっと大きな配列のサブセットでもよい。
【００５７】
[00089]本明細書で使用されるように、２０の通常のアミノ酸及びその略号は従来の使用に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ、Ｅｄｓ．、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．（１９９１年））を参照されたい。前記文献は参照により本明細書に組み込まれる。２０の通常のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、α，α−二置換アミノ酸などの非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、及び他の非通常型アミノ酸も、本発明のポリペプチドに適した成分になることができる。非通常型アミノ酸の例は、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、並びに他の類似するアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）を含む。本明細書で使用されるポリペプチド表示法では、標準的な使用と慣例に従えば、左手方向がアミノ末端方向であり、右手方向がカルボキシ末端方向である。
【００５８】
[00090]同様に、別の方法で明記されていなければ、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手側の端は５’端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’方向の付加は転写方向と呼ばれ；ＲＮＡと同じ配列を有しＲＮＡ転写物の５’端の５’側であるＤＮＡ鎖上の配列領域は「上流配列」と呼ばれ；ＲＮＡと同じ配列を有しＲＮＡ転写物の３’端の３’側であるＤＮＡ鎖上の配列領域は「下流配列」と呼ばれる。
【００５９】
[00091]ポリペプチドに適用されるように、用語「実質的な同一性」は、２つのペプチド配列が、デフォルトギャップ重みを使用するプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによるなどして最適に整列された場合、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは、少なくとも９０パーセントの配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも９５パーセントの配列同一性、及びもっとも好ましくは、少なくとも９９パーセントの配列同一性を共有することを意味する。同一ではない残基位置は保存的アミノ酸置換によって異なることが好ましい。保存的アミノ酸置換とは、類似する側鎖を有する残基の互換性のことである。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループはセリン及びスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループはアスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループはフェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループはリシン、アルギニン、及びヒスチジンであり；並びに硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループはシステイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換グループは、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。
【００６０】
[00092]本明細書で考察されるように、アミノ酸配列の変動が本明細書に記載される抗体又は免疫グロブリン分子に少なくとも約７５％、さらに好ましくは、少なくとも８０％、９０％、９５％、及びもっとも好ましくは、約９９％配列同一性を維持しているならば、抗体又は免疫グロブリン分子のアミノ酸配列のわずかな変動が本発明により包含されていると想定されている。特に、保存的アミノ酸置換が想定されている。保存的置換は関連する側鎖を有するアミノ酸のファミリー内で行われる置換である。遺伝的にコードされたアミノ酸は一般に：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び（４）非電荷極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンのファミリーに分けられる。さらに好ましいファミリーは：セリン及びスレオニンは脂肪族ヒドロキシファミリーであり；アスパラギン及びグルタミンはアミド含有ファミリーであり；アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンは脂肪族ファミリーであり；並びにフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは芳香族ファミリーである。例えば、特に置換がフレームワーク部位内のアミノ酸を含まなければ、ロイシンとイソロイシン又はバリンとの、アスパラギン酸とグルタミン酸との、スレオニンとセリンとの単離された置換、又はアミノ酸と構造的に関係するアミノ酸との類似する置換であれば得られる分子の結合機能又は特性に大きな影響を及ぼさないと予測するのは合理的である。
【００６１】
[00093]アミノ酸変化が機能的ペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド誘導体の特定の活性をアッセイすることにより容易に判定することが可能である。アッセイは本明細書で詳細に説明される。抗体又は免疫グロブリン分子の断片又は類似物は当業者であれば容易に調製することが可能である。断片又は類似物の好ましいアミノ−及びカルボキシル末端は機能的ドメインの境界近くに存在する。構造的及び機能的ドメインは、ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列データを公開の又は所有配列データベースと比較することにより同定することが可能である。コンピュータ化比較方法を使用して、既知の構造及び／若しくは機能の他のタンパク質に存在する配列モチーフ又は予測されるタンパク質立体構造ドメインを同定することが好ましい。既知の三次元構造に折り畳まれているタンパク質配列を同定する方法は公知である。Ｂｏｗｉｅら、（１９９１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３巻：１６４頁。したがって、前述の例は、当業者であれば、本明細書に記載される抗体に従って構造的及び機能的ドメインを定義するのに使用することができる配列モチーフ及び構造的立体構造を認識可能であることを示している。
【００６２】
[00094]本発明のさらなる態様は、配列１、添付の配列表に示される抗体、本明細書に記載される抗体のうちのいずれかのＶＨドメインに、又は配列１に示されるＨＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、又はＨＣＤＲ３）に少なくとも約６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８又は約９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインを含むターゲティング結合剤又は抗体分子である。ターゲティング結合剤又は抗体分子は、任意選択で、配列２、添付の配列表に示される抗体、本明細書に記載される抗体のうちのいずれかのＶＬドメインに、又は配列２に示されるＬＣＤＲ（例えば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、又はＬＣＤＲ３）に少なくとも約６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８又は約９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインも含むことができる。２つのアミノ酸配列の％同一性を計算するのに使用することが可能であるアルゴリズムは、例えば、デフォルトパラメータを用いて、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０５〜４１０頁）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８年）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５巻：２４４４〜２４４８頁）、又はＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７巻：１９５〜１９７頁）を含む。一部の実施形態では、上述のアミノ酸配列同一性を共有するターゲティング結合剤又は抗体は、参照する抗体と実質的に同じ活性を示している。例えば、実質的に同じ活性は、参照抗体の活性とは約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％以下又はそれよりも少なく異なっていた少なくとも１つの活性を含む。
【００６３】
[00095]抗原結合部位は一般に、可変重（ＶＨ）及び可変軽（ＶＬ）免疫グロブリンドメインにより形成されており、抗原結合界面は相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる６つの表面ポリペプチドループで形成されている。フレームワーク領域（ＦＲ）に加え、それぞれのＶＨ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及びそれぞれのＶＬ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）には３つのＣＤＲがある。
【００６４】
[00096]典型的には、ＶＨドメインはＶＬドメインと対になって抗体抗原結合部位を提供するが、ＶＨ又はＶＬドメインは単独でも抗原に結合するのに使用することができる。ＶＨドメイン（例えば、配列１由来）はＶＬドメイン（例えば、配列２由来）と対になることができ、その結果、ＶＨとＶＬドメインの両方を含む抗体抗原結合部位が形成される。本明細書で開示されるもう一方のＶＨとＶＬドメインについて類似の実施形態が提供される。他の実施形態では、配列１のＶＨ鎖は異種のＶＬドメインと対にされる。軽鎖乱交雑は当技術分野では十分に確立している。さらに、本明細書で開示されるもう一方のＶＨとＶＬドメインについては本発明により類似の実施形態が提供される。したがって、親の又は配列２の抗体鎖のいずれかのＶＨは、親の又は配列１、及び２の抗体のいずれか又は他の抗体のＶＬと対にすることができる。
【００６５】
[00097]抗原結合部位は、Ｈ及び／又はＬ  ＣＤＲの開示されたセット内に２０もの、１６、１０、９又はこれよりも少ない、例えば、１、２、３、４、又は５アミノ酸付加、置換、欠失、及び／又は挿入のある親抗体又は配列１及び２の抗体のいずれかのＨ及び／又はＬ  ＣＤＲのセットを含んでもよい。そのような改変は、ＣＤＲのセット内のいかなる残基でも潜在的に行うことができる。
【００６６】
[00098]好ましいアミノ酸置換は：（１）タンパク質分解に対する感受性を減少する、（２）酸化に対する感受性を減少する、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更する、（４）結合親和性を変更する、及び（４）そのような類似物の他の物理化学的又は機能的特性を与える又は改変する置換である。類似物は、天然に存在するペプチド配列以外の配列の種々の突然変異タンパク質を含むことが可能である。例えば、単一の又は複数のアミノ酸置換（好ましくは保存的アミノ酸置換）は天然に存在する配列において（好ましくは、ポリペプチドのうち分子間接触を形成するドメイン（複数可）の外側の部分において）行ってもよい。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させるべきではない（例えば、置換アミノ酸は親配列に存在するヘリックスを壊す、又は親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を破壊する傾向を持つべきではない）。当技術分野において認識されているポリペプチド二次及び三次構造の例はＰｒｏｔｅｉｎｓ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４年））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｔｏｏｚｅ編、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９１年））；及びＴｈｏｒｎｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４巻：１０５頁（１９９１年）に記載されている。前記文献はそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
【００６７】
[00099]本発明のさらなる態様は、配列１、添付の配列表に収載される若しくは本明細書に記載される抗体のうちのいずれかのＶＨドメインに、又は配列１に示されるＨＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、又はＨＣＤＲ３）に少なくとも約６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８又は約９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインを含む抗体分子である。抗体分子は、任意選択で、配列２、添付の配列表に示される若しくは本明細書に記載される抗体のうちのいずれかのＶＬドメインに、又は配列２に示されるＬＣＤＲ（例えば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、又はＬＣＤＲ３）に少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８又は約９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインも含むことができる。２つのアミノ酸配列の％同一性を計算するのに使用することが可能であるアルゴリズムは、例えば、デフォルトパラメータを用いて、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０５〜４１０頁）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ  （１９８８年）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５巻：２４４４〜２４４８頁）、又はＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７巻：１９５〜１９７頁）を含む。
【００６８】
[000100]本発明のさらなる態様は、配列１に収載される抗体のうちのいずれかのＶＨドメインに、又は配列１に示されるＨＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、又はＨＣＤＲ３）に少なくとも約６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８又は約９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインを含む抗体分子である。抗体分子は、任意選択で、配列２、添付の配列表に示される若しくは本明細書に記載される抗体のうちのいずれかのＶＬドメインに、又は配列２に示されるＬＣＤＲ（例えば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、又はＬＣＤＲ３）に少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインも含むことができる。
【００６９】
[000101]アミノ酸配列が本明細書に提示されており、ヒトＥＮＯ１タンパク質に対するターゲティング剤及び抗体において用いることが可能な変異体を含む、本発明のＶＨ及びＶＬドメイン並びにＣＤＲの変異体は、配列変化又は突然変異の方法及び所望の特徴のある抗原ターゲティングを求めてスクリーニングすることにより得ることが可能である。所望の特徴の例は、抗原に特異的である既知の抗体と比べて抗原に対する増加した結合親和性；その活性が既知である場合、抗原に特異的である既知の抗体と比べて抗原活性の増加した中和；特定のモル比での抗原に対する既知の抗体又はリガンドとの特定の競合能力；複合体を免疫沈降する能力；特定のエピトープに結合する能力；直鎖状エピトープ、例えば、本明細書に記載されるペプチド結合スキャンを使用して、例えば、直鎖状及び／又は制約立体構造でスクリーニングされるペプチドを使用して同定されるペプチド配列；非連続残基で形成される立体構造エピトープ；ヒトＥＮＯ１タンパク質又は下流分子の新しい生物活性を調節する能力を含むがこれらに限定されない。そのような方法も本明細書に提供されている。
【００７０】
[000102]本発明のさらなる態様は、アミノ酸配列が、ヒトＥＮＯ１タンパク質上の、配列９又は１０に収載され、少なくとも約６０、７０、８０、８５、９０、又は約９２％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むエピトープペプチドに結合し、ヒトＥＮＯ１タンパク質疾患又は障害を処置するのに使用することが可能である結合剤を含む、標的に向けられる結合剤（すなわち、抗体）に関する。ヒトＥＮＯ１タンパク質関係疾患又は障害は、ヒトＥＮＯ１タンパク質の異常な活性化又は発現に起因して生じるいかなる状態でも可能である。一例では、ヒトＥＮＯ１タンパク質関係疾患は、非小細胞肺がん、肝細胞（肝臓）癌、胃がん、乳がん、膵管癌などの新生物疾患である。
【００７１】
[000103]本明細書で開示される抗体分子の変異体を作製し本発明で使用してもよい。多変量データ解析法を構造／特性−活性関係に適用する計算化学の先導に従って（Ｗｏｌｄら、Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ−Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｅｄ．：Ｂ．Ｋｏｗａｌｓｋｉ）、Ｄ．Ｒｅｉｄｅｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ、Ｈｏｌｌａｎｄ、１９８４年）、抗体の定量的活性−特性関係は、統計的回帰、パターン認識及び分類などの周知の数学的技法を使用して導くことが可能である（Ｎｏｒｍａｎら、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；第３版（１９９８年４月）；Ｋａｎｄｅｌ、Ａｂｒａｈａｍ＆Ｂａｃｋｅｒ、Ｅｒｉｃ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｒｅａｓｏｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ  ＰＴＲ、（１９９５年５月１１日）；Ｋｒｚａｎｏｗｓｋｉ、Ｗｏｊｔｅｋ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｅｒｉｅｓ、Ｎｏ２２（Ｐａｐｅｒ））．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；（２０００年１２月）；Ｗｉｔｔｅｎ、Ｉａｎ  Ｈ．＆Ｆｒａｎｋ、Ｅｉｂｅ．Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｊａｖａ  Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ．Ｍｏｒｇａｎ  Ｋａｕｆｍａｎｎ；（１９９９年１０月１１日）；Ｄｅｎｉｓｏｎ  Ｄａｖｉｄ  Ｇ．Ｔ．（Ｅｄｉｔｏｒ）、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｃ．Ｈｏｌｍｅｓ、Ｂａｎｉ  Ｋ．Ｍａｌｌｉｃｋ、Ａｄｒｉａｎ  Ｆ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ．Ｂａｙｅｓｉａｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；（２００２年７月）；Ｇｈｏｓｅ、Ａｍｐ  Ｋ．＆Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｎ、Ｖｅｌｌａｒｋａｄ  Ｎ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｔｏｏｌｓ、ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）。抗体の特性は、抗体配列、機能的及び三次元構造の経験的及び理論的モデル（例えば、見込みのある接触残基の分析又は計算された物理化学的特性）から導くことが可能であり、これらの特性は単独で及び組み合わせて考慮することが可能である。
【００７２】
[000104]ＶＨドメイン及びＶＬドメインで構成された抗体抗原結合部位は典型的には、３つは軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）由来及び３つは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）由来である、ポリペプチドの６つのループにより形成される。既知の原子構造の抗体の分析により、抗体結合部位の配列と三次元構造の間の関係は解明されてきた。これらの関係は、ＶＨドメインにおける第３の領域（ループ）を除いて、結合部位ループは少数の主鎖立体構造：カノニカル構造のうちの１つを有することを意味する。特定のループで形成されるカノニカル構造は、そのサイズ及びループとフレームワーク領域の両方において重要な部位でのある特定の残基の存在によって決定されることが明らかにされている。
【００７３】
[000105]配列−構造関係についての本研究は、そのＣＤＲループの三次元構造を維持し、したがって、結合特異性を維持するのに重要である、配列は既知であるが三次元構造は分かっていない抗体中の残基の予測に使用することが可能である。これらの予測は、リード最適化実験からの出力の予測と比較することにより後援することが可能である。構造的アプローチでは、ＷＡＭなどの任意の無料公開の又は市販のパッケージを使用して抗体分子のモデルを創造することが可能である。次に、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．）又はＤｅｅｐ  Ｖｉｅｗなどのタンパク質可視化及び分析ソフトウェアパッケージを使用して、ＣＤＲ中のそれぞれの位置での考えうる置換を評価してもよい。次に、この情報を使用して、活性に対して最小の又は有益な効果を及ぼす可能性のある置換を行ってもよい。
【００７４】
[000106]ＣＤＲ、抗体ＶＨ若しくはＶＬドメイン及び／又は結合剤のアミノ酸配列内で置換を行うのに必要な技法は一般に当技術分野で利用可能である。活性に対して最小の又は有益な効果を及ぼすと予想されることも又はされないこともある置換を有する変異配列を作製し、結合する及び／若しくは中和する能力について並びに／又は他の任意の所望の特性について試験してもよい。
【００７５】
[000107]考察されるように、その配列が本明細書において具体的に開示されているＶＨ及びＶＬドメインのいずれかの可変ドメインアミノ酸配列変異体を本発明に従って用いてもよい。
【００７６】
[000108]本明細書で使用される用語「ポリペプチド断片」とは、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は、例えば、完全長ｃＤＮＡ配列から推定される天然に存在する配列の対応する位置に同一であるポリペプチドのことである。断片は典型的には、少なくとも約５、６、８又は１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも約１４アミノ酸長、さらに好ましくは少なくとも約２０アミノ酸長、通常は少なくとも約５０アミノ酸長、及びさらにより好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。本明細書で使用される用語「類似物」とは、推定されるアミノ酸配列の部分に実質的な同一性を有する少なくとも約２５アミノ酸のセグメントで構成され、以下の特性：（１）適切な結合条件下でのヒトＥＮＯ１タンパク質への特異的結合、（２）適切なリガンド／ＥＮＯ１タンパク質結合を遮断する能力、又は（３）ＥＮＯ１タンパク質活性を阻害する能力のうちの少なくとも１つを有するポリペプチドのことである。典型的には、ポリペプチド類似物は、天然に存在する配列に関して保存的アミノ酸置換（又は付加又は欠失）を含む。類似物は典型的には、少なくとも２０アミノ酸長、好ましくは少なくとも５０アミノ酸長又はそれよりも長く、多くの場合、完全長の天然に存在するポリペプチドと同じ長さが可能である。
【００７７】
[000109]本明細書で使用されるように、用語「抗体」とは、内部表面形状を有する三次元結合スペース及び抗原の抗原決定基の特徴に相補的である電荷分布を有するポリペプチド鎖のフォールディングから形成される少なくとも１つの結合ドメインで構成されているポリペプチド又はポリペプチドのグループのことである。抗体は典型的には、２つの同一の対になったポリペプチド鎖を含み、それぞれの対が１つの「軽」及び１つの「重」鎖を有する四量体形態を有する。それぞれの軽／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成する。
【００７８】
[000110]本明細書で使用されるように、「標的に向けられる結合剤」は、標的部位に優先的に結合する薬剤、例えば、抗体、又はその結合断片である。一実施形態では、標的に向けられる結合剤は１つの標的部位のみに特異的である。他の実施形態では、標的に向けられる結合剤は１つよりも多い標的部位に特異的である。一実施形態では、標的に向けられる結合剤はモノクローナル抗体でもよく、標的部位はエピトープでもよい。下に記載されるように、標的に向けられる結合剤は、抗体の少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むことができ、上記ドメインは異種タンパク質内に融合している又は含有されている。
【００７９】
[000111]抗体の「結合断片」は組換えＤＮＡ技法により、又は無傷の抗体の酵素的若しくは化学的切断により作製される。結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及び一本鎖抗体を含む。「二重特異性」又は「二機能性」抗体以外の抗体は、同一であるその結合部位のそれぞれを有すると理解されている。抗体は、過剰な抗体が対抗受容体に結合している受容体の量を少なくとも約２０％、４０％、６０％又は８０％、及びさらに通常では約８５％よりも多く減少させる（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ競合結合アッセイで測定した場合）とき、対抗受容体への受容体の接着を実質的に阻害する。
【００８０】
[000112]抗体は、単独であれ又は既知の技法により提供される他のアミノ酸配列と組み合わせてであれ、オリゴクローナル、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、多特異的抗体、二重特異的抗体、触媒抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、抗イディオタイプ抗体及び可溶性又は結合形態で標識することが可能な抗体、並びにその断片、変異体又は誘導体でもよい。抗体はいかなる種由来でもよい。用語抗体は本発明の抗体の結合断片も含み；例となる断片はＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｖＦｃ）、二量体可変領域（ダイアボディ）及びジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）を含む。
【００８１】
[000113]全抗体の断片は抗原に結合するという機能を果たすことが可能であることが明らかにされている。結合断片の例は（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら、（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１巻、５４４〜５４６頁）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０年）Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻、５５２〜５５４頁）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（Ｈｏｌｔら、（２００３年）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１巻、４８４〜４９０頁）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１巻、５４４〜５４６頁（１９８９年）、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０年）Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻、５５２〜５５４頁、Ｈｏｌｔら、（２００３年）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１巻、４８４〜４９０頁］これはＶＨ又はＶＬドメインからなる；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、２つの連結されたＦａｂ断片を含む二価断片；（ｖｉｉ）単一鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ＶＨドメインとＶＬドメインが、２つのドメインに会合して抗原結合部位を形成させるペプチドリンカーにより連結されている（Ｂｉｒｄら、（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻、４２３〜４２６頁、Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８年）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８５巻、５８７９〜５８８３頁）；（ｖｉｉｉ）二重特異性単一鎖Ｆｖ二量体（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）及び（ｉｘ）「ダイアボディ」、遺伝子融合により構築される多価又は多特異性断片（国際公開第９４／１３８０４号；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．（１９９３年）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０巻  ６４４４〜６４４８頁）である。Ｆｖ、ｓｃＦｖ又はダイアボディ分子はＶＨとＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組込みにより安定化させてもよい（Ｒｅｉｔｅｒ，Ｙ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１４巻、１２３９〜１２４５頁、１９９６年）。ＣＨ３ドメインに結合されたｓｃＦｖを含むミニボディを作ってもよい（Ｈｕ，Ｓ．ら、（１９９６年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５６巻、３０５５〜３０６１頁）。結合断片の他の例は、抗体ヒンジ領域由来の１つ又は複数のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端での２，３の残基の付加によりＦａｂ断片とは異なっているＦａｂ’、及びＦａｂ’断片であって定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離のチオール基を帯びるＦａｂ’−ＳＨである。
【００８２】
[000114]用語「エピトープ」は、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体に特異的に結合することができるいかなるタンパク質決定基も含む。エピトープ決定基は通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、特定の三次元構造的特徴並びに特定の電荷特徴を有することがあるが、必ずしもそうではない。抗体は、解離定数が≦１マイクロＭ、好ましくは≦１００ｎＭ、及びもっとも好ましくは≦１０ｎＭである場合、抗原に特異的に結合すると言われる。
【００８３】
[000115]用語「薬剤」は、化学化合物、化学化合物の混合物、生体巨大分子、又は生体材料から作られる抽出物を意味するために本明細書では使用される。
【００８４】
[000116]ＥＮＯ１ポリペプチドに関して「活性な」又は「活性」とは天然のＥＮＯ１ポリペプチドの生物学的又は免疫学的活性を有するＥＮＯ１ポリペプチドの部分のことである。「生物学的な」は、本明細書で使用される場合、天然のＥＮＯ１ポリペプチドの活性から生じる生物学的機能のことである。好ましいＥＮＯ１生物学的活性は、例えば、ＥＮＯ１誘導されるプラスミノーゲン活性を含む。
【００８５】
[000117]「対象」は、本明細書で使用される場合、いかなる動物のことでもある。対象はヒト又は非ヒト哺乳動物であることが好ましい。対象はヒトであることが好ましい。
【００８６】
[000118]抗体を酵素パパインで消化すると、抗原結合活性はないが結晶化する能力はある、「Ｆａｂ」断片及び「Ｆｃ」断片としても知られる２つの同一の抗原結合断片が得られる。抗体を酵素ペプシンで消化すると、抗体分子の２つのアームが連結されたままであり２つの抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片が得られる。Ｆ（ａｂ’）２断片は抗原と架橋する能力を有する。
【００８７】
[000119]「Ｆｖ」は、本明細書で使用される場合、抗体のうち抗原認識と抗原結合部位の両方を保持する最小断片のことである。「Ｆａｂ」は、本明細書で使用される場合、抗体のうち軽鎖の定常ドメイン及び重鎖のＣＨ１ドメインを含む断片のことである。用語「ｍＡｂ」とはモノクローナル抗体のことである。
【００８８】
[000120]本明細書で使用される用語「医薬剤」又は「医薬品」とは、患者に適切に投与された場合、所望の治療効果を誘導することができる化学化合物又は組成物のことである。本明細書の他の化学用語は、Ｔｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５年））により例証されるように、当技術分野の従来の使用法に従って使用される（参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８９】
[000121]本明細書で使用されるように、「実質的に純粋な」は、対象種が、存在する優勢な種である（すなわち、モル濃度基準では、対象種が組成物中の他のどの個々の種よりも豊富である）ことを意味し、好ましくは、実質的に精製された部分は、対象種が、存在するすべての巨大分子種の少なくとも約５０％（モル濃度基準で）を構成する組成物である。一般には、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての巨大分子種の約８０パーセント以上、さらに好ましくは、約８５％、９０％、９５％、及び９９％以上を構成する。もっとも好ましくは、対象種は組成物が単一の巨大分子種から本質的になる本質的な均一性（混入物種は従来の検出方法では組成物中で検出することはできない）まで精製されている。
【００９０】
[000122]用語「患者」はヒト及び動物対象を含む。
【００９１】
[000123]本明細書で使用されるように、用語「モニターする」とは、がん細胞中のＥＮＯ１タンパク質の量を決定することによりがんの発生を検出する及び／又は観察する過程のことである。
【００９２】
[000124]本明細書で使用される用語「処置する」又は「処置」とは、症状の重症度及び／若しくは頻度の減少をもたらし、症状及び／若しくはその根底にある原因を取り除き、並びに／又は損傷の改善若しくは修復を促進するように、有害な状態、障害、又は疾患で苦しんでいる臨床的に症候性の個体に薬剤又は製剤を投与することである。用語「予防する」又は「予防」とは、特定の有害な状態、障害、又は疾患に罹りやすい臨床的に症候性の個体に薬剤又は製剤を投与することであり、したがって、症状及び／又はその根底にある原因の発生を予防することに関する。当業者であれば理解しているように、予防又は予防することは、状態の絶対的（完全な）遮断又は回避を達成する必要はない。むしろ、予防は、予防されるべき疾患又は状態の実質的な（例えば、約５０％を超える）減少又は回避を達成することでもよい。本明細書で別の方法で明確に又は黙示的に示されなければ、用語「処置」（又は「処置する」）が考えうる予防に言及せずに使用される場合、予防も同様に包含されることが意図されている。
【００９３】
[000125]用語「薬学的に許容される」とは、生物学的に又は他の点で望ましくないわけではない物質のことであり、例えば、その物質は、望ましくないいかなる生物学的効果も引き起こしたり、剤形製剤のその他の成分いずれとも有害な様式で相互作用したりしないで、本発明の製剤に組み込まれることができる。しかし、用語「薬学的に許容される」が医薬品賦形剤を指すのに使用される場合、その賦形剤は毒性及び製造試験の必要基準を満たしていること並びに／又はその賦形剤は米国食品医薬品局が準備している不活性成分手引きに含まれていることが意味されている。以下にさらに詳細に説明されているように、「薬学的に活性な」誘導体又は類似物での「薬学的に活性な」（又は単に「活性な」）とは、誘導体又は類似物が親薬剤と同じ種類の薬理活性を有することである。
【００９４】
[000126]活性薬剤の「有効」量又は「治療有効」量とは、非毒性であるが有益な効果を与えるのに十分な量の薬剤を意味する。「効果的」である活性薬剤の量は、個体の年齢及び全身状態、特定の活性な薬剤（単数又は複数）、並びに同類の物に応じて、対象により異なる。別の方法で示されていなければ、本明細書で使用される用語「治療有効」量は、すなわち、有害な状態の処置に有効な量に加えて、有害な状態の予防及び／又は有害な状態の寛解に有効な量を包含することが意図されている。
【００９５】
[000127]本発明は、ヒトＥＮＯ１に特異的に結合し、それによってリガンド（例えば、プラスミノーゲン）がＥＮＯ１に結合するのを阻害する抗体又はその抗原結合断片を開示する。ＥＮＯ１へのプラスミノーゲンの結合を阻害することにより、本発明の抗体はプラスミノーゲン活性化を阻害することが可能である。本発明の一部の実施形態では、抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である。
【００９６】
[000128]本発明の一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片はヒトＥＮＯ１上のエピトープに結合してＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体活性を阻害し、エピトープは、ヒトＥＮＯ１の２９６ＦＤＱＤＤＷＧＡＷＱＫＦＴＡＳＡＧＩＱＶＶＧＤＤＬＴＶＴＮＰＫＲＩＡＫＡＶＮＥＫＳ３３６（配列番号３９）の配列からなる領域に位置している。
【００９７】
[000129]本発明の一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＥＮＯ１の２９６ＦＤＱＤＤＷＧＡＷＱＫＦＴＡ３０９（配列番号４０）又は３２６ＫＲＩＡＫＡＶＮＥＫＳ３３６（配列番号４１）の配列からなる領域に位置しているエピトープに結合する。
【００９８】
[000130]本発明の一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片はヒトＥＮＯ１に非常に高親和性（すなわち、低解離定数（ＫＤ））で結合する。例えば、ＥＮＯ１に約１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、若しくは約１０−１１、又はそれらの間の任意の範囲若しくは値未満のＫＤで結合することができるヒト化抗体。親和性及び／又は結合活性測定は、本明細書に記載される通りに又は当技術分野で公知の技法に従って、ＥＬＩＳＡ及び／又はＢＩＡＣＯＲＥを使用して実施することが可能である。好ましい実施形態では、ＥＮＯ１に対する抗体又はその抗原結合断片のＫＤ値は１０ｎＭ又はそれよりも少ない、さらに好ましくは１．０ｎＭ又はそれよりも低い。
【００９９】
[000131]一部の実施形態では、本発明は、ヒトＥＮＯ１に結合し、（ｉ）ＬＣＤＲ１（ＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＴ；配列番号６）、ＬＣＤＲ２（ＮＡＫＴＬＰＥ；配列番号７）及びＬＣＤＲ３（ＱＨＨＹＧＴＰＹＴ；配列番号８）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、並びに（ｉｉ）ＨＣＤＲ１（ＧＹＴＦＴＳＣＶＭＮ；配列番号３）、ＨＣＤＲ２（ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ；配列番号４）及びＨＣＤＲ３（ＥＧＦＹＹＧＮＦＤＮ；配列番号５）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、抗体又はその抗原結合断片に関する。
【０１００】
[000132]本発明の一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２若しくは９のアミノ酸残基１〜１１０を含むＶＬ、及び／又は配列番号１、１０若しくは１１のアミノ酸残基１〜１２０を含むＶＨを含む。
【０１０１】
[000133]一部の実施形態では、本発明は、ヒトＥＮＯ１タンパク質に結合し、（ｉ）ＬＣＤＲ１（ＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＴ；配列番号６）、ＬＣＤＲ２（ＮＡＫＴＬＰＥ；配列番号７）及びＬＣＤＲ３（ＱＨＨＹＧＴＰＹＴ；配列番号８）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、並びに（ｉｉ）ＨＣＤＲ１（ＧＹＴＦＴＳ−Ｘａａ−ＶＭＮ、Ｘａａはシステイン以外の任意のアミノ酸である；配列番号５０）、ＨＣＤＲ２（ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ；配列番号４）及びＨＣＤＲ３（ＥＧＦＹＹＧＮＦＤＮ；配列番号５）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、抗体又はその抗原結合断片に関する。好ましい実施形態では、Ｘａａはセリン又はアラニンである。
【０１０２】
[000134]本発明の一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２若しくは９のアミノ酸残基１〜１１０を含むＶＬ、又は配列番号１、１０若しくは５１のアミノ酸残基１〜１２０を含むＶＨを含む。
【０１０３】
[000135]本発明のさらなる実施形態は、哺乳動物をヒトＥＮＯ１タンパク質、その断片、及びその１つ又は複数のオルソロガス配列又はその断片で免疫化することによりヒトＥＮＯ１に対する高親和性抗体を産生するための方法に関する場合がある。例えば、免疫化は、ＥＮＯ１タンパク質の注射により実行することが可能である。適切な抗体の同定も、ハイブリドーマ上清を対応する分子（抗原）を用いてスクリーニングすることにより可能である。同定後、抗体は当業者に公知である方法により産生することが可能である。
【０１０４】
[000136]本発明の一部の実施形態は、本明細書に記載される抗体をコードする単離された核酸分子に関する。抗ＥＮＯ１抗体をコードする単離された核酸分子を有するベクター又はベクターのいずれかで形質転換された宿主細胞も開示される。
【０１０５】
[000137]さらに、本発明の一部の実施形態は、核酸分子が発現する条件下で宿主細胞を培養して抗体を産生し、続いて抗体を回収することにより抗ＥＮＯ１抗体を産生するための方法に関する。本発明の実施形態は、抗体産生のために宿主細胞内にトランスフェクトされた場合に抗体又はその断片の収率を増加するために最適化された核酸配列を含む、本発明の抗体又は抗体の断片をコードするいかなる核酸分子でも含んでいてよいことは了解されるべきである。結合剤及びアプタマーの産生を含む、適切なポリクローナル、モノクローナル及び組換え抗体の産生のための方法は当業者には公知である（例えば、Ｊｏｒｇ  Ｋｎａｂｌｅｉｎ（ｅｄｉｔｏｒ）、Ｍｏｄｅｒｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、２巻、６３５頁参照）。下記の実施例も参照されたい。
【０１０６】
[000138]別の態様では、本発明は、組成物、例えば、医薬組成物、特に、ワクチンを特色とする。組成物は、本明細書に記載される治療有効量の抗体、又はその抗原結合断片、及び薬学的に許容される担体を含むことが可能である。
【０１０７】
[000139]薬学的に許容される担体は一般に、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに無毒であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコールなどの；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む単糖、二糖、及び他の炭化水素；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えば、亜鉛タンパク質複合体）；並びに／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン界面活性剤を含むがこれらに限定されない。
【０１０８】
[000140]組成物は種々の形態でもよい。これらの形態は、例えば、液体溶液（例えば、注射及び不溶解性溶液）、分散液又は懸濁液、リポソーム及び坐薬などの、液体、半固体及び固体剤形を含む。好ましい形態は、意図される投与様式及び治療適用に依拠する。いくつかの典型的な組成物は、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）のために意図された注射又は不溶解性溶液の形態である。一部の実施形態では、組成物は静脈内注入又は注射により投与される。他の実施形態では、組成物は筋肉内又は皮下注射により投与される。
【０１０９】
[000141]抗体又はその抗原結合断片の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びに個体において所望の応答を誘発する抗体又はその抗原結合断片の能力などの要因に従って変化してもよい。治療有効量は、免疫コンジュゲートの任意の毒性又は有害効果よりも治療的に有益な効果がまさる治療有効量でもある。「治療有効投与量」は当業者に公知のアッセイにより評価することが可能である。
【０１１０】
[000142]本発明の一部の実施形態は、ＥＮＯ１タンパク質関係疾患又は障害に罹っている対象を処置するための方法であって、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片の治療有効量を対象に投与することを含む方法に関する。
【０１１１】
[000143]Ｂａｅの研究（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１８９巻：３６５〜３７２頁（２０１３年））によれば、ＲＡ患者のＰＢＭＣをＥＮＯ１に対する抗体で処置すると、ＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体活性が刺激され、ＰＢＭＣ由来の単球及びマクロファージがｐ３８ＭＡＰＫ及びＮＦ−κＢ経路を介してＴＮＦα、ＩＬ１−α／β、ＩＦＮ−γ及びＰＧＥ２などの炎症促進性メディエーターをより大量に産生することが示されている。この所見とは対照的に、本発明の発明者らは驚くべきことに、ＥＮＯ１に対する抗体を投与すると関節リウマチの臨床的改善をもたらすことが可能であることを見出した。すなわち、Ｂａｅらが選んだ抗体エピトープとは異なる抗体エピトープを用いて、活性化するのではなくＥＮＯ１活性に対抗する抗体を投与することにより、炎症性疾患又は免疫障害（関節リウマチなどの）臨床的改善を達成することが可能であることが見出された。同様に、多発性硬化症の臨床的改善をもたらすことが可能であることが見出された。これらの所見は、すべてのＥＮＯ１抗体が免疫疾患に治療効果があるわけではなく、この効果はエピトープ依存性であることを示唆している。
【０１１２】
[000144]さらに、驚くべきことに、動物モデルでは疾患の開始中だけでなく、疾患の明確な臨床症状が既に存在する時でも処置が可能であることが見出された。これにより、とりわけ、ヒト診療において必要とされる比較的遅い治療介入が可能になる。したがって、本発明は、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、若しくは全身性エリトマトーデスなどの炎症性疾患若しくは免疫障害、又は免疫障害の処置のために、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片を対象（例えば、ヒト又は非ヒト動物）に投与するための方法に関する場合がある。
【０１１３】
[000145]本発明の一部の実施形態では、ＥＮＯ１へのプラスミノーゲンの結合を阻害することにより、本発明の抗体又はその抗原結合断片はプラスミノーゲン活性化を阻害し、細胞外マトリックスの分解を減少させ、それにより今度は細胞外マトリックスからのがん細胞の解離を妨げる又は減少させる。これにより、がん細胞の細胞外マトリックスでのウロキナーゼプラスミノーゲン活性化系（ｕＰＡＳ）が阻害される。したがって、本発明の抗体又はその抗原結合断片を使用すれば腫瘍成長及び転移を阻害することが可能になる。これを達成することが可能である機序は、その受容体ＥＮＯ１へのリガンド（プラスミノーゲンなどの）の結合を阻害すること、又は受容体ＥＮＯ１とそのリガンドの間の相互作用を抑止し、それによってＥＮＯ１の効果的な濃度を減少すること、を含むことがあるがこれらに限定されない。
【０１１４】
[000146]「ＥＮＯ１」の疾患関係異常活性化又は発現は、任意の異常な、望ましくない又は病理的細胞接着、例えば、腫瘍関係細胞接着でもよい。細胞接着関係疾患は、白血病又はリンパ腫などの非固形腫瘍、並びにメラノーマ、非小細胞肺がん、肝細胞（肝臓）癌、胃、頭頸部、肝臓系、腹部、乳房、卵巣、肺、肺、子宮、外陰部、結腸直腸、及び膵臓などの固形腫瘍も含むがこれらに限定されない。したがって、本発明は、対象（例えば、ヒト又は非ヒト動物）において肺がん、乳がん、膵臓がん、肝臓がん、結腸直腸がん、又は前立腺がんなどの新生物疾患を処置するために、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片を対象（例えば、ヒト又は非ヒト動物）に投与するための方法に関する場合がある。
【０１１５】
[000147]本発明のさらなる実施形態は、対象（例えば、ヒト又は非ヒト動物）においてＥＮＯ１関係疾患又は障害を処置するための薬物の調製における本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片の使用に関する。
【０１１６】
[000148]本発明の一部の実施形態に従えば、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片を使用してがん細胞の浸潤活性を阻害してもよい。例えば、本発明の抗体は、わずか５０マイクログラム／ｍｌ又はそれよりも少ない抗体濃度で、Ｕ９３７ヒトリンパ腫細胞の浸潤活性の４０％、５０％、６０％、又は７０％よりも多くを阻害することが可能である。
【０１１７】
[000149]本発明の一部の実施形態に従えば、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は細胞外マトリックス分解を阻害し、それによって細胞外マトリックスからのがん細胞解離を阻害する。例えば、本発明の抗体は、わずか５０マイクログラム／ｍｌ又はそれよりも少ない抗体濃度で、コラーゲン又はフィブロネクチンからのＣＬ１−５細胞のプラスミノーゲン媒介解離の４０％、５０％、又は６０％よりも多くを阻害することが可能である。
【０１１８】
[000150]本発明の一部の実施形態はがん発症をモニターするための方法に関する。方法は、ＥＮＯ１の増加レベルががんの重症度と相関している試料（例えば、がん細胞）中のアルファエノラーゼタンパク質（ＥＮＯ１）の量を決定するステップを含んでいてよい。本発明の実施形態に従って、量はＥＮＯ１タンパク質への本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片の結合を測定することにより決定することができる。
【０１１９】
[000151]本発明の一部の実施形態はがんを検出するための方法に関する。そのような方法は、低レベルのＥＮＯ１特異的抗体が悪性腫瘍の存在を示している、血清試料中のＥＮＯ１特異的抗体の量を決定するステップを含んでいてもよい。
【０１２０】
[000152]ＥＮＯ１の量を決定するための方法は、ＥＮＯ１タンパク質とＥＮＯ１特異的抗体の結合を測定すること、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ＲＴ−ＰＣＲ、及び／又はマイクロアレイ分析を含むがこれらに限定されない。
【０１２１】
[000153]以下の実施例は本発明のある特定の実施形態を説明するために提示されるが、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１２２】
実施例１
ＥＮ１０  ｍＡｂ抗体のＥＮＯ１結合ＥＬＩＳＡ
[000154]抗ヒトＥＮＯ１抗体ＥＮ１０  ｍＡｂのＥＮＯ１結合親和性を評価するため、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩでハイブリドーマを生育させた。１週間の培養後、１×１０６細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄し、２００μｌのＲＰＭＩ培地に再懸濁し、ＩＰ注射により重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに注射した。３週間後、マウスの腹水を収集し、１５ｍｌまで希釈した。抗体は４０％の硫酸アンモニウム及びプロテインＡカラム（Ｍｏｎｔａｇｅ抗体精製キットＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）によりさらに精製した。精製された抗体は、製造業者（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）が提供するプロトコルに従って、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターデバイスで濃縮した。抗体の純度は１２％ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した。
【０１２３】
[000155]４００ｎｇのヒトＥＮＯ１タンパク質で９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを被覆し、プレートはＰＢＳでさらに洗浄した。１×１０−１２〜１×１０−８Ｍの段階希釈のＥＮ１０  ｍＡｂをプレートに添加し、プレートは３７℃で１時間インキュベートした。ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）にコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧを添加した。１時間後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加して、ＯＤ４０５を読み取った。すべての研究を３回繰り返した。データは平均±ＳＤとして示した。抗体のＯＤ読み取り及び濃度を使用し、Ｓｉｇｍａｐｌｏｔを使用して複数の散布図を作成した。ＫＤ値は４パラメータロジスティックフィットにより予測した。
【０１２４】
[000156]この実験の結果は図１に示されている。抗体ＥＮ１０  ｍＡｂは、マウスあたり２０．４ｍｇ〜４．６ｍｇの生産性を有していた。ＥＮ１０  ｍＡｂ抗体のＫＤ値は２．０３±０．１２×１０−１０Ｍ（Ｎ＝３）であった。この結果は、ＥＮ１０  ｍＡｂ抗体がヒトＥＮＯ１タンパク質を認識することが可能であり、約２．０３±０．１２×１０−１０Ｍ（Ｎ＝３）のＫＤ値を有する好ましい親和性を有することを示唆している。
【０１２５】
実施例２
[000157]がん細胞のＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体活性を阻害するＥＮ１０  ｍＡｂの能力を評価するために、ヒトリンパ腫Ｕ９３７細胞株を１０％のＦＣＳを含有するＲＰＭＩで生育させた。細胞は１０マイクログラム／ｍｌのＬＰＳで６時間処置して、細胞表面でのＥＮＯ１タンパク質発現を誘導した。次に、ＰＢＳ中１．５×１０６細胞／ｍｌをそれぞれ１マイクログラム／ｍｌのヒトＬｙｓ−プラスミノーゲン及び１０マイクログラム／ｍｌのＥＮ１０  ｍＡｂと一緒に１時間プレインキュベートした。試料はＰＢＳで２度洗浄し、３ｎＭの組織特異的プラスミノーゲン活性化因子及び０．５ｍＭの発色基質Ｓ−２２５１を添加した。３７℃で１時間のインキュベーション後、ＯＤ４０５を読み取った。すべての研究を３回繰り返し、アンタゴニスト活性を分析した。データは平均±ＳＤとして示した。Ｔ検定を使用してそれぞれの群を比較した。Ｐ値＜０．０５は統計的に有意であると見なした。
【０１２６】
[000158]この実験の結果は図２に示されている。ＥＮ１０  ｍＡｂは高ＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体アンタゴニスト活性を有し、ＬＰＳ誘導特異的ＥＮＯ１活性の１００％阻害を達成することが可能である。したがって、ＥＮ１０  ｍＡｂは標的臓器へのがん細胞の遊出を阻害する良好な潜在力を有する。
【０１２７】
実施例３
[000159]実施例２の結果は、ＥＮ１０  ｍＡｂがＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体活性を阻害することが可能であることを示唆している。ＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体活性の阻害により、ＬＰＳ刺激ヒトＵ９３７リンパ腫細胞株でのプラスミノーゲン活性化及び遊出活性が阻害されることがある。
【０１２８】
[000160]ＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体活性を損なえば、がん細胞の浸潤活性を軽減するのかどうかを評価するために、ヒトリンパ腫Ｕ９３７細胞株を１０％のＦＣＳを含有するＲＰＭＩで生育させた。細胞は１０マイクログラム／ｍｌのＬＰＳで６時間処置して、細胞表面でのＥＮＯ１タンパク質発現を誘導した。５〜５０マイクログラム／ｍｌのＥＮ１０  ｍＡｂと混合した後、２×１０４細胞を１５マイクロモルのＬｙｓ−プラスミノーゲンを含有する２チャンバーアッセイシステムの最上部チャンバーに播種し、下のチャンバーに１０％ＦＢＳ及び１０ｎＭのＭＣＰ−１を含有する培地と一緒に２４時間インキュベートした。抗マウスＩｇＧは陰性対照群として使用した。２つのチャンバーは、マトリゲルで被覆されたミクロポアフィルター（８マイクロメートル細孔サイズ）で隔てられた。インキュベーション期間後、下のチャンバーの細胞は顕微鏡下血球計数器により計数した。すべての研究を３回繰り返した。データは平均±ＳＤとして示した。Ｔ検定を使用してそれぞれの群を比較した。Ｐ値＜０．０５は統計的に有意であると見なした。
【０１２９】
[000161]結果は図３に示されている。ＬＰＳ処置Ｕ９３７細胞を５〜５０マイクログラム／ｍｌのＥＮ１０  ｍＡｂで処置すると、Ｕ９３７の浸潤活性は対照ＩｇＧの９０．２±２％〜４９．１±１％（Ｎ＝３）であった。これらの結果は、ＥＮ１０  ｍＡｂが、ＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体活性を用量依存的様式で損なうことにより活性化されたＵ９３７の浸潤能力を軽減することが可能であることを示している。リンパ腫の表面のＥＮＯ１タンパク質を標的とすることにより、ＥＮ１０  ｍＡｂを使用して細胞が罹患部位に入るのを阻害することが実行可能である。
【０１３０】
実施例４
ＥＮ１０  ｍＡｂはＬＰＳにより刺激されたＵ９３７リンパ腫細胞株の表面ＥＮＯ１を認識する
[000162]ヒトＵ９３７リンパ腫細胞を１０％のＦＣＳを含有するＲＰＭＩで生育させた。細胞は１０マイクログラム／ｍｌのＬＰＳで６時間処置して、細胞表面でのＥＮＯ１タンパク質発現を誘導した。フローサイトメトリー分析では、無傷のホールセルをＥＮ１０  ｍＡｂ（１対３００希釈）で又はなしで染色し、ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ）を用いて可視化し、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。ＥＮＯ１発現は得られた蛍光強度により測定した。
【０１３１】
[000163]これらの実験の結果は図４に示されている。Ｕ９３７をＬＰＳ及びＥＮ１０  ｍＡｂと一緒にインキュベートすると、細胞をＬＰＳなしでＥＮ１０  ｍＡｂと一緒にインキュベートした場合と比べるとヒストグラムが右に移動する。この結果は、Ｕ９３７細胞が、細胞をＪＰＳで処置するとその細胞表面におけるＥＮＯ１の発現が増加することを示している。これらのデータは、ＥＮ１０  ｍＡｂがリンパ腫細胞上で、ＬＳＰ誘導された表面ＥＮＯ１を認識するという考えを支持している。
【０１３２】
実施例５
抗体ＥＮ１０  ｍＡｂをコードする遺伝子のクローニングは下記の方法に従って実施した
（１）抗体遺伝子のｃＤＮＡクローニング及び調製
[000164]ハイブリドーマは１０％のＦＣＳを含有するＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で培養した。細胞数が約１０×１０６／ｍｌに到達後、細胞は遠心分離により収集され、次に、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）が添加して、使用説明書に従って全ＲＮＡを抽出した。抗体ｃＤＮＡの可変領域のクローニングは、マウスＩｇプライマーセット（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を添付の使用説明書に従って使用して実施した。
【０１３３】
（ａ）第１鎖ｃＤＮＡの合成はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の使用説明書に従って実施した
[000165]第１鎖ｃＤＮＡは鋳型として５マイクログラムの全ＲＮＡを使用して調製した。全ハイブリドーマＲＮＡを５マイクログラム、５０ｎｇ／マイクロＬのランダムプライマーを１マイクロＬ、及び１０ｍＭ  ｄＮＴＰを１マイクロＬ混合し、ＤＥＰＣ処理水を２００マイクロＬのＰＣＲチューブ中１０マイクロＬに添加した。反応混合物は６５℃で５分間インキュベートし、次に、少なくとも１分間氷上に置いた。２マイクロＬの１０×ＲＴバッファー、４マイクロＬの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２マイクロＬのＤＴＴ、１マイクロＬの４ユニットＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）、及び１マイクロＬの２００ユニットＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ  ＲＴを含有する１０マイクロＬのｃＤＮＡ合成混合物を添加し、穏やかに混合し、短時間の遠心分離により収集した。反応チューブは２５℃で１０分間、続いて５０℃で５０分間インキュベートした。反応は８５℃で５分間終結させ、氷上で冷却した。チューブは短時間遠心分離して反応生成物を収集し、１マイクロＬのＲＮａｓｅ  Ｈを添加して３７℃で２０分間インキュベートした。
【０１３４】
（ｂ）重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子のＰＣＲによる増幅
[000166]５マイクロＬのｃＤＮＡ、５マイクロＬの１０×反応バッファー、１マイクロＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、１マイクロＬの２．５ユニットＴａｑポリメラーゼ、並びにプライマーセットにより提供される１マイクロＬのフォワードプライマー及び１マイクロＬのリバースプライマー２の組成を有する反応溶液を再蒸留水を用いて最終体積５０マイクロＬに調製し、ＰＣＲにかけた。
【０１３５】
[000167]抗体の軽鎖及び重鎖の増幅では、９４℃で１０分間のサイクルを使用し、次に、９４℃で１分間、５２℃で１分間、及び７２℃で１分間のサイクルを３５回繰り返し、反応は７２℃でさらに１０分間インキュベートした。反応溶液は２％アガロースゲル電気泳動にかけて反応生成物を分析した。正確な分子量、重鎖で約４６３ｂｐ、軽鎖で４５１ｂｐを有する生成物は、添付の使用説明書に従ってサブクローニングするためｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲートした。次に、Ｍ１３フォワード（５’−ＧＴＡＡＡＣＡＡＣＧＡＣＧＧＣＧＡＧ−３’（配列番号１２））及びＭ１３リバース（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’（配列番号１３））プライマーを使用してヌクレオチド配列を決定した。配列情報に基づいて、抗体配列はＥｘＰＡＳＹ−翻訳ツールによりタンパク質配列に翻訳された。ＥＮ１０  ｍＡｂの得られた配列は相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖アミノ酸配列及び軽鎖配列を含み、この配列はＫａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．（１９９１年）、１〜３巻より発表された方法により決定された。
【０１３６】
[000168]図５ＡはＥＮ１０  ｍＡｂの可変重鎖領域アミノ酸配列（配列番号１）を描いている。フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）及びＣＤＲ（ＨＣＤＲ１（配列番号３）、ＨＣＤＲ２（配列番号４）、及びＨＣＤＲ３（配列番号５））が示されている。
【０１３７】
[000169]図５ＢはＥＮ１０  ｍＡｂの可変軽鎖領域アミノ酸配列（配列番号２）を描いている。フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）及びＣＤＲ（ＬＣＤＲ１（配列番号６）、ＬＣＤＲ２（配列番号７）、及びＬＣＤＲ３（配列番号８））が示されている。
【０１３８】
実施例６
ＥＮ１０  ｍＡｂのヒト化
ヒトＶ領域フレームワーク配列の選択
[000170]マウスモノクローナル抗体ＥＮ１０  ｍＡｂを親抗体として使用して、Ｋａｂａｔ定義に従ったＥＮ１０  ｍＡｂ  ＣＤＲ配列は図５Ａ及び５Ｂ（配列番号１及び配列番号２）に記載されている。
【０１３９】
[000171]ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５では、ヒトアクセプターフレームワークはデータベースから、又はクリニックで確認されているフレームワークを利用して選択された。ＶＨサブグループＩＩＩ、ＩＧＨＶ３−６６＊０４（配列番号１０）及びＶＬκサブグループＩ、ＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号９）（図６Ａ−１及び６Ａ−２）におけるヒト重及び軽鎖フレームワーク配列はクリニックで確認されており多くのヒト化抗体で使用され成功を収めている。
【０１４０】
[000172]ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴでは、ＥＮ１０  ｍＡｂフレームワーク領域ともっとも高度な相同性を有するヒト生殖系列ＶＬ及びＶＨ配列はＩＭＧＴデータベースから同定された（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標））。相同性検索はＢＬＡＳＴ又は類似の方法を用いて実施することができる。問い合わせ配列として使用されるＥＮ１０  ｍＡｂ可変領域配列は、米国特許出願公開第１４／１４２，１８６号などの文献から入手可能である。
【０１４１】
[000173]ＶＨサブグループＩＩＩ（ＶＨ３）におけるヒト重鎖フレームワーク配列は多くのヒト化抗体で使用され成功を収めており、ＶＬκサブグループＩＩ（Ｖκ２）のヒト軽鎖フレームワーク配列も良好な候補であることが明らかにされている。したがって、ＶＨＩＩＩ及びＶκ２サブグループのフレームワーク配列はそれぞれＶＨ及びＶＬフレームワークについての検索のために選択された。これらの検索により、ＥＮ１０  ｍＡｂにおける対応する重鎖及び軽鎖フレームワーク配列にもっとも相同であるＶＨ及びＶＬ配列として、それぞれＩＧＨＶ３−７２＊０１及びＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２が同定された。
【０１４２】
[000174]図６Ｂ−１及び６Ｂ−２に示されるように、ＩＧＨＶ３−７２＊０１重鎖フレームワーク領域の配列はＥＮ１０  ｍＡｂ中の重鎖フレームワーク領域の配列とは１９アミノ酸（箱で囲った残基）異なっており、この１９残基は２３．４５％（フレームワーク領域中１９／８１全残基）変動に相当する。図６Ｂ−１及び６Ｂ−２に示される軽鎖フレームワークでは、ＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２の配列はＥＮ１０  ｍＡｂ中の配列とは１０アミノ酸（箱で囲った残基）異なっており、この１０残基は１３．１６％（フレームワーク領域中１０／７６全残基）変動に相当する。
【０１４３】
[000175]フレームワーク領域にこの程度の変動を有していても、ＥＮ１０  ｍＡｂ由来のＣＤＲ配列をＩＧＨＶ３−７２＊０１及びＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２配列中に移植することにより作製されるｓｃＦｖ（ＨＨ１２）はＥＮＯ１に対して比較的良好な親和性を有する（ＫＤ＝２．３×１０−１０Ｍ）（下の表１参照）。これらの結果は、フレームワーク領域がＣＤＲ領域立体構造に影響を与えずに比較的高度な変動を許容可能であることを示唆している。
【表１】
2019154414.tif 000002
【０１４４】
[000176]軽鎖と重鎖配列のこれら２つの対（ｈｕｍ  ４Ｄ５とｈｕｍ  ＩＭＧＴ）はヒトＥＮＯ１に対するヒト化抗体の構築のための例として使用されることになる。
【０１４５】
実施例７
ヒト化抗体の結合親和性分析
[000177]マウス抗体をヒト化した後の親和性変化を確かめるため、ＩＭＧＴ及び４Ｄ５版のヒト化軽鎖及びヒト化重鎖の可変領域はそれぞれヌクレオチド合成法により直接作製された。図７Ａに示されるように、マウス可変領域、ＩＭＧＴ及び４Ｄ５可変領域のヒト化版並びにヒトＦｃキメラ抗体発現ベクターｐＴＣＡＥ８−ＥＮＯ１は宿主細胞に導入されて組換え抗体発現細胞を調製した。発現のための宿主細胞として、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用した。ベクターは内含の使用説明書に従ってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により宿主細胞内に導入された。約２．５マイクログラムの抗体発現ベクターを制限酵素により直線化し、遺伝子を４×１０６細胞内に導入し、細胞は６ウェル培養プレートに播種した。発現ベクターの選択マーカーに対応する薬剤を添加し、細胞は連続して培養して安定なプールを形成した。
【０１４６】
[000178]ヒトＩｇＧ抗体を含有する培養上清は下記の方法により調製された。抗体産生細胞はＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（ＧＩＢＣＯ）において順化された。細胞は組織培養フラスコで培養され、培養上清は細胞の生存可能率が９０％のときに収集された。収集された上清は１０マイクロメーター及び０．２マイクロメーターフィルター（Ｍｉｌｌｐｏｒｅ社製）を通して濾過して汚染物質を取り除いた。抗体を含有する培養上清は、プロテインＡ（Ｍｉｌｌｐｏｒｅ社製）、吸収バッファーとしてＰＢＳ、及び溶出バッファーとして２０ｍＭのクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）を使用して親和性精製した。溶出画分は、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）を添加することにより約ｐＨ６に調整した。調製された抗体溶液は、透析膜（１０，０００ＭＷカット、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を使用してＰＢＳと交換し、０．２２マイクロメーターの細孔サイズを有する膜フィルター（Ｍｉｌｌｐｏｒｅ社製）を通して濾過減菌化して精製された抗体を得た。精製された抗体の濃度は、２８０ｎｍでの吸光度を測定し、測定した値を１ｍｇ／ｍｌに相当する１．４５最適密度に基づいて換算することにより決定した。
【０１４７】
[000179]個々の抗体間の結合反応速度の差を知るため、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を以前記載された通りに使用した（Ｋａｒｌｓｓｏｎ＆Ｆａｌｔ、（１９９７年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００巻：１２１〜１３３頁）。カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を供給業者の説明書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒロロキシサクシニミド（ＮＨＳ）を用いて活性化した。キメラＥＮ１０  ｍＡｂは、流速２０マイクロＬ／分で注射する前に、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で５マイクログラム／ｍｌに希釈し、おおよそ１００応答単位（ＲＵ）の結合タンパク質を達成し、続いて未反応基を遮断するために１Ｍのエタノールアミンを注射した。反応速度の測定では、ＥＮＯ１の２倍段階希釈液（０．３１２５ｎＭ〜４０ｎＭ）を製造業者（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）が提供するＨＢＳ−Ｐ  Ｂｉａｃｏｒｅランニングバッファー中、２５℃、流速２５マイクロＬ／分で注射し、ＥＮ１０  ｍＡｂ上での結合応答は空のフローセル上での応答を引くことにより補正した。会合速度（ｋｏｎ又はｋａ）及び解離速度（ｋｏｆｆ又はｋｄ）は簡単な１対１のラングミュアー結合モデルを使用して計算し、ｋｏｎ及びｋｏｆｆの分離フィッティングを使用した（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）評価ソフトウェア３．２版）。
【０１４８】
[000180]結果は図７Ｂ及び表ＩＩに示されている。ＥＮＯ１に結合するキメラＥＮ１０  ｍＡｂのｋｏｎ及びｋｏｆｆは、それぞれ３．５７×１０５及び８．２７１×１０−５であり、ＫＤは２．３１１±０．００３×１０−１０モル／Ｌである。ＥＮＯ１に結合するｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴのｋｏｎ及びｋｏｆｆは、それぞれ５．３１１Ｅ＋５及び１．１６２Ｅ−４であり、ＫＤは２．１８８Ｅ−１０モル／Ｌである。４Ｄ５ヒト化版では、ｋｏｎ及びｋｏｆｆは、それぞれ３．５１１Ｅ＋５及び１．７５５Ｅ−４であり、ＫＤは４．９９７±０．００３×１０−１０モル／Ｌである。
【表２】
2019154414.tif 000003
【０１４９】
[000181]図７Ｂから、結果は、ヒト化ＥＮ１０抗体のすべてがヒトＥＮＯ１タンパク質を認識することが可能であり、ヒト化後、ＩＭＧＴ版の親和性はマウスキメラ抗体の親和性に類似しており、ＫＤ値が約２．０３±０．１２×１０−１０Ｍ（Ｎ＝３）の好ましい親和性を有することを示唆している。
【０１５０】
実施例８
ＨｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５及びＨｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体はＵ９３７のＬＰＳにより誘導されるプラスミノーゲン受容体活性を阻害する
[000182]がん細胞のＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体活性を阻害するｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５  ｍＡｂ及びｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴの能力を評価するため、ヒトリンパ腫Ｕ９３７細胞株を１０％のＦＣＳを含有するＲＰＭＩで生育させた。細胞は１０マイクログラム／ｍｌのＬＰＳで６時間処置して、細胞表面でのＥＮＯ１タンパク質発現を誘導した。次に、ＰＢＳ中１．５×１０６細胞／ｍｌをそれぞれ１マイクログラム／ｍｌのヒトＬｙｓ−プラスミノーゲン並びに異なる濃度のｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５及びｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴと一緒に１時間プレインキュベートした。試料はＰＢＳで２度洗浄し、３ｎＭの組織特異的プラスミノーゲン活性化因子及び０．５ｍＭの発色基質Ｓ−２２５１を添加した。３７℃で１時間のインキュベーション後、ＯＤ４０５を読み取った。すべての研究を３回繰り返し、アンタゴニスト活性を分析した。データは平均±ＳＤとして示した。Ｔ検定を使用してそれぞれの群を比較した。Ｐ値＜０．０５は統計的に有意であると見なした。
【０１５１】
[000183]この実験の結果は図８Ａ及び図８Ｂに示されている。親抗体ＥＮ１０  ｍＡｂと同じく、５０マイクログラムのｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５とｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴの両方が高ＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体アンタゴニスト活性を有し、それぞれＬＰＳ誘導特異的ＥＮＯ１活性の５０及び５６％阻害を達成することが可能であり、阻害割合は用量依存的である。したがって、両方のヒト化抗体は、標的臓器へのがん細胞の遊出を阻害するのに良好な潜在能力を有する。
【０１５２】
実施例９
ＨｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５及びＨｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体はＵ９３７の浸潤活性を阻害する
[000184]実施例８の結果として、ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４５Ｄ及びＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体を投与すればＵ９３７の誘導性ＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体活性は減少する。これにより、その親抗体のように、がん細胞の浸潤活性が阻害されることがある。
【０１５３】
[000185]ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５及びＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴの抗浸潤活性を評価するため、３×１０６のマウス脳内皮ｂＥｎｄ．３細胞を、Ｃｙｔｏｓｅｌｅｃｔ（商標）２４ウェル細胞遊走及び浸潤アッセイキットの上のチャンバー上の１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地において２４時間マトリックスゲルで前被覆した。上のチャンバーはＰＢＳで２度洗浄した。２％及び１０％のウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ培地をそれぞれ上及び下のチャンバーに添加した。それぞれ１０、５０、及び１００マイクログラム／ｍｌのｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５及びｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴと混合した後、Ｕ９３７の２×１０４細胞を２チャンバーアッセイシステムの最上部チャンバーに播種し、２４時間インキュベートした。抗ヒトＩｇＧは陰性対照として使用した。２つのチャンバーはマトリゲルで被覆されたマイクロポアフィルター（８μｍ細孔サイズ）により分離されていた。インキュベーション期間後、下のチャンバー中の細胞数は顕微鏡下血球計数器により計算された。すべての研究を３回繰り返した。データは平均±ＳＤとして示した。Ｔ検定を使用してそれぞれの群間の活性を比較した。Ｐ値＜０．０５は統計的に有意であると見なされる。結果は図９Ａ及び９Ｂに示されている。Ｗａｎｇらの研究と同じく、ｔＰＡはＵ９３７のバックグランド浸潤を刺激した（図８Ａ及び８Ｂ）。Ｕ９３７の浸潤活性は、細胞が１ｍｌあたり５０マイクログラムのｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５及びＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体で処置された場合、それぞれ約４１．８±１１％（Ｎ＝３）及び３３±１１％（Ｎ＝３）阻害された（図９Ａ及び９Ｂ）。これらの結果は実施例４の結果に類似している。両方のヒト化抗体がＵ９３７の浸潤活性を阻害する能力を有する。
【０１５４】
実施例１０
ヒト化ＥＮ１０  ｍＡｂはコラーゲン及びフィブロネクチンからのＣＬ１−５細胞の解離を阻害する
[000186]ＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体−プラスミンと細胞外基質の間のシグナル伝達経路を評価するため、それぞれ１ｍｇ／ｍｌのゼラチン、１００マイクログラム／ｍｌのフィブリノーゲン、１０マイクログラム／ｍｌのコラーゲン、及び１０マイクログラム／ｍｌのフィブロネクチンを非処理ＥＬＩＳＡプレート上に一晩被覆した。ＣＬ１−５細胞（４×１０４細胞）をプレート上に播種し、５０マイクログラム／ｍｌのｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５を１０％のＦＣＳを含有する２００μＬのＤＭＥＭに添加した。細胞は３７℃で２４時間インキュベートし、次にＰＢＳで２度洗浄した。１０％のＷＳＴを添加し、反応混合物は３７℃で４時間インキュベートした。プレートの相対的細胞数はＯＤ４５０の読み取りにより推定した。それぞれの研究を３回繰り返した。データは平均±ＳＤとして示している。Ｔ検定を使用してそれぞれの群間の活性を比較した。Ｐ値＜０．０５は統計的に有意であると見なされる。
【０１５５】
[000187]これらの実験の結果は図１０Ａに示されている。これらのデータは、フィブロネクチン及びコラーゲン被覆プレート上のＯＤ４５０読み取りが２．４５±０．３７（Ｎ＝３）及び１．８３±０．４４（Ｎ＝３）であることを示している。この読み取りは、バックグランド読み取りとは有意差のないゼラチン及びフィブリノーゲンプレートの読みよりもはるかに高い。ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５処置群と非処置群の間には有意差はない。これらの結果は、ＣＬ１−５細胞がフィブロネクチン及びコラーゲンへの結合に有利に働き、細胞が培地で下流プロテアーゼ、例えば、プラスミノーゲン及びｔＰＡなしでインキュベートされた場合、ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５のアンタゴニスト活性は細胞会合経路に関与しないことを示唆している。図１０Ａのデータは、ＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体活性が細胞外マトリックスとの細胞会合に関与していないことも示唆している。
【０１５６】
[000188]本発明者らは、ＥＮＯ１が細胞外マトリックスからの細胞解離に関与しているかどうかをさらに試験した。それぞれ１マイクログラム／ｍｌのフィブロネクチン及び１０マイクログラム／ｍｌのコラーゲンを非処理ＥＬＩＳＡプレート上に一晩被覆した。ＣＬ１−５細胞（４×１０４細胞）をプレート上に播種し、それぞれ０、６．２５、１２．５、２５、及び５０マイクログラム／ｍｌのｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５を１０％のＦＣＳを含有する２００マイクロＬのＤＭＥＭに添加した。さらに、１０マイクログラム／ｍＬのＧｌｕ−プラスミノーゲン及び２ｎＭのｔＰＡを添加した。細胞は３７℃で２４時間インキュベートし、ＰＢＳで２度洗浄した。次に、１０％のＷＳＴを添加し、反応混合物は３７℃で４時間インキュベートした。プレートの相対的細胞数はＯＤ４５０の読み取りにより推定した。それぞれの研究を３回繰り返した。データは平均±ＳＤとして示されている。Ｔ検定を使用してそれぞれの群間の活性を比較した。Ｐ値＜０．０５は統計的に有意であると見なされる。
【０１５７】
[000189]これらの実験の結果は図１０Ｂ及び図１０Ｃに示されている。データは、培地がＥＮＯ１受容体下流プロテアーゼプラスミノーゲン及びｔＰＡを含有する場合、細胞数が両方の細胞外マトリックスでの処置されたｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５の濃度に正比例することを示している。両方の細胞外マトリックス研究において５０マイクログラムのｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５処置群と対照ＩｇＧ群の間には有意差がある（Ｐ＜０．０５）。これらの結果は、ＥＮＯ１が、おそらくプラスミン及びｔＰＡプロテアーゼ活性を増強することにより、細胞外マトリックスからのＣＬ１−５細胞の解離経路に関与していることを示唆している。ＨｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５は、ＥＮＯ１のアンタゴニストとして機能して、ＥＮＯ１の受容体活性を遮断して、プラスミン及びｔＰＡ活性化を阻害し、したがって、細胞外マトリックスからのＣＬ１−５細胞の解離活性及び浸潤を阻害する。
【０１５８】
実施例１１
ヒト化ＥＮＯ１抗体は肺がん細胞株に対してＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）効果を示す
[000190]抗成長阻害に加えて、ハーセプチンのＡＤＣＣはその抗腫瘍効果に非常に重要であることは公知である。ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５及びｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体はハーセプチンの同じＦｃ断片を有しているので、理屈の上では両方の抗体はＡＤＣＣ活性を有すると本発明者らは考えた。
【０１５９】
[000191]がん細胞に対するｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５及びＨｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体のＡＤＣＣ効果を試験するため、２×１０４のヒト肺ＣＬ１−５がん細胞を９６ＥＬＩＳＡプレートで生育させた。一晩のインキュベーション後、異なる濃度のｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５、ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ及び対照ＩｇＧ１抗体を添加した。ＤＣＢのＩＲＢガイドラインに従って、５人のボランティアからの新鮮な血液試料を収集した。ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）は、血液：ＰＢＳ：ＦＩＣＯＬＬ＝１：１：１溶液により、３０分間の３０００ｒｐｍ遠心分離下で調製した。得られたＰＢＭＣを収集しＰＢＳで２度洗浄した。ＰＢＭＣは５％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させ、２．５×１０７細胞／ｍＬの濃度まで希釈した。次に、５０マイクロリットルのＰＢＭＣをＣＬ１−５含有ＥＬＩＳＡプレートに添加した。細胞は３０００ｒｐｍで５分間回転させ、３７℃で４時間インキュベートした。試料はＰＢＳで２度洗浄し、製造業者から提供されるプロトコルに従ってＡＤＣＣ検出キットを添加し、室温で３０分間インキュベートした。プレートでの細胞溶解の割合は、ＯＤ５３０／５９０の読み取りにより推定した。それぞれの研究を３回繰り返した。データは平均±ＳＤとして示している。
【０１６０】
[000192]これらの実験の結果は図１１Ａ及び１１Ｂに示されている。細胞が、４０：１及び１５：１のエフェクター／標的比を用いて研究において異なる濃度の対照ヒトＩｇＧ抗体で処置された場合、細胞溶解割合は著しい増加を示していない。４０：１のエフェクター／標的比を用いて研究では、１×１０−９ＭのｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５抗体で処置された細胞は、同じ濃度のヒトＩｇＧで処置された細胞と比べた場合、有意な溶解差を示し始めた。ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５とｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体の両方が、細胞が１０−６Ｍの抗体で処置された場合、約４２％最大溶解活性を示した。低いエフェクター／標的比（１５：１）を用いた研究では、ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５とｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体群の両方が１×１０−８Ｍで著しい溶解を示し始め、１０−６Ｍで最大溶解に達した。ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５及びｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体のＡＤＣＣ  ＥＣ５０はそれぞれ約８×１０−９Ｍ及び１×１０−８Ｍであると推定される。ヒト化ＥＮ１０抗体の両方がＡＤＣＣ活性を有する。本発明者らの結果は、抗浸潤活性に加えて、ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５及びｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体が抗がん剤としてＡＤＣＣ活性を提供することが可能であることを示唆している。
【０１６１】
実施例１２
腫瘍成長に対するヒト化ＥＮ１０抗体の阻害効果
[000193]ヒト化ＥＮ１０抗体はＫＤが約２．３１１±０．００３×１０−１０モル／Ｌの良好な親和性及びさらなる開発の潜在力を有する。ヒト化ＥＮ１０抗体の治療効果を評価するため、ＣＬ１−５マウス異種移植片モデルを実施した。ＣＬ１−５Ｆ４肺腺癌細胞（１×１０６細胞／マウス；５マウス／群）を０日目に皮下接種した。治療手順は、腫瘍接種の２日後に、１０ｍｐｋ（ｍｇ／Ｋｇ）のアイソタイプ対照（ＣＴＬ）、ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５又はｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体を１週あたり２回投与することにより実施した。それぞれのマウスの腫瘍量及び体重は毎週測定した。データは個々の群についての平均±ＳＤとして表されている。
【０１６２】
[000194]結果は図１２に示されている。２日後、対照、ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ及びｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ群の間で有意な腫瘍サイズ差はない。２３日後、対照群のマウスの腫瘍は指数関数的に成長し始め、ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５及びｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ処置マウスでは著しい腫瘍成長はない。３０日後、対照群マウスの平均腫瘍サイズは１６００±２００ｍｍ３（Ｎ＝５）であり、１０ｍｐｋのｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５及びｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴで処置されたマウスでは、平均腫瘍サイズはそれぞれ５０５±２４ｍｍ３（Ｎ＝５）及び３３０±１１ｍｍ３（Ｎ＝５）である。ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５とｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴの両方の処置群の平均腫瘍サイズは対照群と比べた場合著しく小さく、Ｐ値はそれぞれ０．００４及び０．００３である。ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５とｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ処置群の間には有意な腫瘍サイズ差はない。この結果は、ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５及びｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴがマウス異種移植片モデルではＣＬ１−５細胞に対して腫瘍成長阻害活性を有し、ＥＮ１０  ｍＡｂががん治療のための試薬として良好な有効性を有することを示している。
【０１６３】
実施例１３
ＣＨＯ細胞コドン最適化
[000195]上の実施例から、ＥＮＯ１モノクローナル抗体は治療抗体として開発の潜在力を有すると本発明者らは結論付ける。
【０１６４】
[000196]ＣＨＯ細胞株においてヒト化治療抗体を大量生産するために、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）ソフトウェアツールを使用することによりコドン最適化を実施した。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．ｃｏｍ／ｔｗ／ｚｔ／ｈｏｍｅ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｃｌｏｎｉｎｇ／ｇｅｎｅ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ／ｇｅｎｅａｒｔ−ｇｅｎｅ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ／ｇｅｎｅｏｐｔｉｍｉｚｅｒ．ｈｔｍｌ）。ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴの可変領域は変化にさらされ最適化されたコドンを得た。パラメータはコドン品質分布（所望の発現系のためにもっとも頻繁に使用されるコドンの品質値）及びＧＣ含有量（ＧＣ含有量が所望の範囲内であるようにコドンを最適化する）を含む。ＣＨＯ細胞株のためのコドン最適化軽鎖可変領域及び重鎖可変領域はそれぞれ図１３Ａ及び図１３Ｂに示されている。
【０１６５】
[000197]ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴの軽鎖及び重鎖のＣＨＯ細胞コドン最適化可変領域はそれぞれヌクレオチド合成法により直接作製された。次に、ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴの可変領域及び図１３Ｃに示されるヒトハーセプチン（登録商標）Ｆｃ抗体発現ベクターｐＣＨＯ−ＥＮＯ１を宿主細胞に導入して組換え抗体発現細胞を調製した。発現用の宿主細胞として、ＣＨＯＳ細胞（Ｌｉｆｅ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．由来）を使用した。ベクターは含まれる使用説明書に従ってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により宿主細胞に導入した。約２．５マイクログラムの抗体発現ベクターを制限酵素により直線化し、遺伝子を４×１０６細胞に導入し、細胞は６ウェル培養プレートに播種した。低濃度選択では、得られた細胞プールは１０マイクログラム／ｍｌのピューロマイシン及び１００ナノモルのメトトレキサート又は２０マイクログラム／ｍｌのピューロマイシン及び２００ナノモルのメトトレキサートを含有する選択培地で生育させた。さらなる選択を実施するため、もう一方のステージの高濃度選択を実施した。一次選択プールは、３０マイクログラム／ｍｌのピューロマイシン及び５００ナノモルのメトトレキサートを含有する培地で又は５０マイクログラム／ｍｌのピューロマイシン及び１０００ナノモルのメトトレキサートを含有する培地でさらに生育させた。最終抗体産生細胞株を作製するため、第２ステージプール由来の９６，０００細胞を半固体培地に播種し、７６８の高抗体発現細胞を決定し、使用説明書プロトコルに従ってＣｌｏｎｅＰｉｘ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社製）で実施される蛍光強度により選び取った。上位１０の高リード細胞株は、生育速度、５日バッチ生産速度、及び１４日シンプルフェドバッチ生産速度を含むパラメータを用いて選択した。６０世代の安定性試験後、候補産生細胞株を決定した。
【０１６６】
[000198]結果は図１３Ａに示されている。そのコドンをＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）ソフトウェアツールによりＣＨＯ細胞発現系に最適化したｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴの核酸配列をヒト原型の核酸配列と整列させると、この２つの版間の可変軽鎖及び可変重鎖の相同性はそれぞれ７４．５％及び８４％である。この結果は、コードされた抗体が同じタンパク質配列を有する場合でも、ヒト細胞とＣＨＯ細胞の間のコドン優先度は異なっていることを示している。
【０１６７】
[000199]抗体遺伝子の両方の版がｐＣＨＯ１．０に構築されＣＨＯ細胞で一過性に発現させた場合、ＣＨＯ細胞コドン版の抗体生産速度はヒト原型の抗体生産速度の約３．１倍である（データは示さず）。本発明者らの結果は、コドン最適化が抗体の高収率生産に重要であることを示唆している。ＣＨＯ最適化ｈｕｍ  ＥＮＯ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴの細胞プールはＦｏｒｉＣＨＯ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ）でさらに選択され、高抗体産生細胞株がＣｌｏｎｅＰｉｘ２を用いて選び取られた。５日目及び１４日目の上位１５クローンの生産速度を分析し、その結果は図１３Ｄに示されている。生産速度は５日目で９１．３ミニグラム／リットル〜１５５ミニグラム／リットル、１４日目で２４７．５ミニグラム／リットル〜３５８．７ミニグラム／リットルの範囲である。これらのクローンはすべて簡易培地で良好な生存率及び生育速度を有する。これらの結果は、クローンのすべてが、培地最適化後にその抗体産生能力が改善している可能性があることを示唆している。これらのクローンの抗体生産性をさらに調査するため、グルコースと流加培地研究の異なる組合せを実施し、抗体生産速度は１５日目の上位６クローンで分析された。結果を図１３Ｅに示す。上位６クローンの最大生産速度は１５日間インキュベーション後１リットルあたり０．７グラム〜１リットルあたり０．８１グラムの範囲である。すべてのクローンが６０世代分析後良好な安定性を有し、抗体がＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析された場合無傷の抗体を産生する（図１３Ｆ）。本発明者らの研究は、これらのクローンがＥＮＯ１治療抗体産生細胞株として良好な潜在力を有することを示唆している。
【０１６８】
実施例１４
ｈｕｍ  ＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ抗体の特徴付け
[000200]ＣＨＯ細胞発現ｈｕｍ  ＥＮ１０  ｍＡｂの構造を理解するため、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ及び質量スペクトル分析を実施した。無傷の質量の分析では、３０μｇのタンパク質を０．１％のギ酸中３０μｌのｄＨ２Ｏに溶解させた。還元質量の分析では、１５μｌのｄＨ２Ｏ中３０μｇのタンパク質を８０℃で１５分間１０ｍＭのＤＴＴで処置した。還元タンパク質は、３０μｌのｄＨ２Ｏの０．１％のギ酸中１μｇ／μｌの最終濃度まで希釈した。脱グリコシル化した質量の分析では、３０μｇのタンパク質を５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム中０．６μｌのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（Ｐ０７０５Ｌ、ＮＥＢ）を用いて３７℃で一晩処置した。次に、試料は、それぞれ無傷の質量の分析及び還元質量の分析として記載された手順により分析した。
【０１６９】
[000201]ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析では、試料は、従来のＰＤＡ付きのＳｈｉｍａｄｚｕ  ＰｕｍｐＬＣ−２０ＡＤにかけ、分離カラム、Ｓｅｐａｘ  Ｚｅｎｉｘ  ＳＥＣ−３００ＢＥＨ  Ｃ４（２．１７．８ｍｍ×３００ｍｍ、１．７μｍ）付きの２８０ｎｍ  Ｗａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣ  Ｈ−クラスＢｉｏｓｙｓｔｅｍでモニターした。溶液Ａの組成は、水中ｐＨ６．８に調整された０．１Ｍのリン酸ナトリウム及び０．１Ｍの硫酸ナトリウムであった。移動相は３５分で１００％溶液Ａを用いた等傾度線であった。ＳＥＣ−ＨＰＬＣからの分離試料は収集され、以下の通りに質量スペクトル分析にかけられた。
【０１７０】
[000202]ＬＣ／質量スペクトル分析では、試料は、分離カラムＢＥＨ  Ｃ４（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、１．７μＭ）付きのＷａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣ  Ｈ−クラスＢｉｏｓｙｓｔｅｍにかけた。溶液Ａ及びＢの組成は、それぞれ水及びアセトニトリル中０．１％ギ酸であった。移動相は１５分で５〜５８％の溶液Ｂを用いた勾配であった。ＵＰＬＣからの分離試料はＥＳＩ−ＭＳ機器Ｓｙｎａｐｔ  Ｇ２−Ｓｉ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ．ＵＳＡ）に直接つながれた。質量スペクトルはＥＳＩに連結された。データはスキャニングが終了するまで１サイクルあたり１秒ＭＳを経て収集された。データは、抗体の配列に焦点を合わせたＦａｓｔａ  Ｆｏｒｍａｔデータバンクを含むＵｎｉｆｉ（商標）（Ｖ１．８）により処理された。逆重畳積分後、実験データを抗体の推定分子量と比較した。すべてのデータを３つのバッチから３連で得た。
【０１７１】
[000203]抗体がシステイネート化されている及びグルタチオネート化されている場合、両タイプの産物の分子量はそれぞれ約１１９Ｄａ及び３０５Ｄａ増加していることになる。
【０１７２】
[000204]結果は図１４Ａ及び１４Ｂに示されている。ｈｕｍ  ＥＮ１０  ｍＡｂ抗体のＧ０Ｆ２、Ｇ１Ｆ／Ｇ０Ｆ、及びＧ１Ｆ／Ｇ１Ｆ型の質量スペクトルピークに加えて、約１１９Ｄａの追加の分子量を有する余分な分子が、発現させたｈｕｍ  ＥＮＯ１０  ｍＡｂの３バッチのスペクトルに現れる。ｈｕｍ  ＥＮＯ１０  ｍＡｂのＧ０Ｆ２型上でシステイニル化が起こると仮定される（図１４Ａ）。ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ抗体のシステイニル化をさらに確かめるため、ＰＮＧａｓｅ  Ｆにより消化されたｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ抗体の同じバッチ及びＬＣ／質量スペクトルアッセイが実施された。結果は図１４Ｂに示されている。非グリコシル化ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ抗体の質量スペクトルに加えて、抗体のシステイニル化及びグルタチオニル化であると予測される約１１９Ｄａ及び３０５Ｄａの追加の分子量を有する２つの余分な質量スペクトルピークが現れる。この結果は、ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ抗体がシステイニル化されているだけではなく、グルタチオニル化もされていることをさらに支持している。ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ抗体の３バッチのシステイニル化の組成は表ＩＩＩに示されている。ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂのシステイニル化及びグルタチオニル化の平均はそれぞれ約１７．８％及び６．６％である（表ＩＩＩ）。
【表３】
2019154414.tif 000004
【０１７３】
実施例１５
Ｈｕｍｅｎ１０  ｍＡｂ抗体のＨＣＤＲ１におけるアラニン３２及びセリン３２突然変異体の作製
[000205]実施例１４の結果は、発現させた本発明者らのｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ抗体にはシステイニル化及びグルタチオニル化が存在することを示唆している。Ｍｃｓｈｅｒｒｙの研究はモノクローナル抗体がシステイニル化すると抗体が不活化されることを示している（ＭＡｂｓ．２０１６年、８巻：７１８〜２５頁）。これらの反応は発現させた抗体の不均一性も誘導し、臨床治療抗体のＣＭＣ問題が生じる。ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ抗体のシステイニル化及びグルタチオニル化部位を解明するため、ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ抗体のアミノ酸配列を分析した。ＨＣＤＲ１におけるシステイン３２はタンパク質内で非結合であることが分かった。このシステインがｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂのシステイニル化及びグルタチオニル化に関与しているかどうかを知るため、部位特異的変異誘発法を使用してＨＣＤＲ１のシステイン３２をそれぞれアラニンとセリンに突然変異させることによりｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ抗体の２つの突然変異体を作製した。
プライマー：
ＥＮＯ１−ＨＣ（ＡｖｒＩＩ）−ｆ：
ＴＣＧＣＣＴＡＧＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＴＧＧＡＧＣＣＴＣＡＴＣＴＴＧ（配列番号１８）
ＥＮＯ１−ＨＣＤＲ１Ｃ−（ＳＡ）−Ｒ：
ＴＣＧＣＡＣＣＣＡＧＴＴＣＡＴＣＡＣＧＧＭＧＣＴＧＧＴＡＡＡＧＧＴＧＴＡＧＣＣ（配列番号１９）
ＥＮＯ１−ａｆＨＣＤＲ１−Ｃ−Ｆ：
ＧＴＧＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧ（配列番号２０）
ＥＮＯ１−ＨＣ（ＢｓｔＺ１７  Ｉ）−ｒ：
ＴＴＡＧＴＣＧＴＡＴＡＣＴＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＣＡＧＧ（配列番号２１）
【０１７４】
[000206]それぞれの突然変異体の増幅では、３μＬの鋳型ＤＮＡ約３０ｎｇ、５μＬの１０×反応バッファー、１μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、１μＬの２．５ユニットｐｆｕポリメラーゼ、１２．５μＬの１２５ｎｇフォワードプライマー、及び１２．５μＬの１２５ｎｇリバースプライマーの組成を有する２つの反応溶液を再蒸留水で最終体積５０μＬに調製しＰＣＲにかけた。反応１では、フォワードプライマー及びリバースプライマーはＥＮＯ１−ＨＣ（ＡｖｒＩＩ）−Ｆ及びＥＮＯ１−ＨＣＤＲ１Ｃ−（ＳＡ）−Ｒである。反応２では、フォワードプライマー及びリバースプライマーはＥＮＯ１−ａｆＨＣＤＲ１−Ｃ−Ｆ及びＥＮＯ１−ＨＣ（ＢｓｔＺ１７  Ｉ）−ｒである。９５℃で１０分間のサイクルを使用し、次に９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、及び６８℃で６分間を３５回繰り返した。ＰＣＲ反応後、正しい配列のすべての突然変異クローンを２％アガロースゲル電気泳動にかけた。それぞれの突然変異体のＤＮＡ断片はアガロースゲルから単離し、製造業者が提供する内含の使用説明書に従ってＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎキットにより精製した（ＢＩＯ１０１）。
【０１７５】
[000207]完全長突然変異体を増幅するため、上記の反応１（１９００ｂｐ）及び２（１２６０ｂｐ）の産物を含有する３μＬの鋳型ＤＮＡ、５μＬの１０×反応バッファー、１μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、１μＬの２．５ユニットｐｆｕポリメラーゼ、１２．５μＬの１２５ｎｇフォワードプライマー（ＥＮＯ１−ＨＣ（ＡｖｒＩＩ）−Ｆ）、及び１２．５μＬの１２５ｎｇリバースプライマー（ＥＮＯ１−ＨＣ（ＢｓｔＺ１７  Ｉ）−ｒ）を再蒸留水で最終体積５０μＬに調製しＰＣＲにかけた。ＰＣＲ条件は上記と同じであった。反応産物は制限酵素ＡｖｒＩ及びＢｓｔ１７Ｉで消化し、ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ抗体の軽鎖遺伝子を含有するｐＣＨＯ１．０ＥＮＯ１のＡｖｒＩ及びＢｓｔ１７Ｉ部位に挿入した。次に、プライマー（（ｈｅｒｐＩｇＧ１−Ｆ９５０１  ５’−ＣＡＣＡＡＧＣＣＴＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡ−３’（配列番号２２）及びｈｅｒｐＩｇＧ１−Ｒ９７００  ５’−ＴＣＣＴＣＧＴＧＧＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＧＣＡ−３’（配列番号２３））を使用して、ヌクレオチド配列を決定した。正確な配列を有するすべての突然変異クローンプラスミドで大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。抗体が突然変異された後の親和性変化を確かめるために、ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ抗体のアラニン（ＥＮ１０．４）及びセリン（ＥＮ１０．５）突然変異体を宿主細胞に導入して組換え抗体発現細胞を調製した。発現のための宿主細胞として、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用した。ベクターは内含の使用説明書に従ってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により宿主細胞に導入した。約２．５マイクログラムの抗体発現ベクターを制限酵素により直線化し、遺伝子を４×１０６細胞に導入し、細胞は６ウェル培養プレートに播種した。発現ベクターの選択マーカーに相当する薬剤を添加し、細胞は連続培養して安定なプールを形成した。
【０１７６】
[000208]ヒトＩｇＧ抗体を含有する培養上清を下記の方法により調製した。抗体産生細胞はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（ＧＩＢＣＯ）で順化させた。細胞は組織培養フラスコで培養され、培養上清は細胞の生存可能率が９０％のときに収集された。収集された上清は１０マイクロメーター及び０．２マイクロメーターフィルター（Ｍｉｌｌｐｏｒｅ社製）を通して濾過して汚染物質を取り除いた。抗体を含有する培養上清は、プロテインＡ（Ｍｉｌｌｐｏｒｅ社製）を使用し、吸収バッファーとしてＰＢＳ及び溶出バッファーとして２０ｍＭのクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）を使用して親和性精製した。溶出画分は、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）を添加することにより約ｐＨ６に調整した。調製された抗体溶液は、透析膜（１０，０００ＭＷカットオフ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を使用してＰＢＳと交換し、０．２２マイクロメーターの細孔サイズを有する膜フィルター（Ｍｉｌｌｐｏｒｅ社製）を通して濾過減菌化して精製された抗体を得た。精製された抗体の濃度は、２８０ｎｍでの吸光度を測定し、測定した値を１ｍｇ／ｍｌに相当する１．４５最適密度に基づいて換算することにより決定した。
【０１７７】
[000209]それぞれの突然変異抗体の結合活性を決定するため、４００ｎｇ／１００μＬのヒトＥＮＯ１タンパク質を４℃で一晩９６ウェルＥＬＩＳＡ上に被覆し、プレートはさらにＰＢＳで洗浄した。プレートはＰＢＳ中１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を用いて室温で１時間遮断し、次に１×ＰＢＳで再び洗浄した。ＥＮ１０．４、ＥＮ１０．５、及びｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ抗体は１５の異なる濃度まで２倍段階希釈し、３７℃で１時間プレートに添加した。反応が完了した後、プレートは１×ＰＢＳで３回洗浄した。ヤギ抗ヒトＨＲＰ抗体の１／８０００希釈を添加し、３７℃で１時間インキュベートし、次にプレートを１×ＰＢＳで３回洗浄した。ＴＭＢ基質を添加し室温で３０分間反応させた。反応は１ＮのＨＣｌを添加することにより停止させ、ＯＤ４５０を読み取って活性を決定した。すべての研究は３回繰り返した。データは平均±ＳＤとして示している。抗体のＯＤ読み取り及び濃度を使用してＳｉｇｍａｐｌｏｔにより多重散布図を作成した。ＫＤ値は４パラメータロジスティックフィットにより予測した。
【０１７８】
[000210]この実験の結果は図１５に示されている。ＥＮ１０．４、ＥＮ１０．５、及びｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ抗体のＫＤ値は、それぞれ１．４０±０．０５×１０−１０（Ｎ＝３）、１．５７±０．０６×１０−１０（Ｎ＝３）及び１．６３±０．０６×１０−１０（Ｎ＝３）であった。ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ抗体の３つの異なる版の間には有意な親和性差はない。本発明者らのデータは、ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂのシステインＨＣＤＲ１のセリン又はアラニンへの突然変異は抗体の親和性を有意に変化させないことを示唆している。システインとセリンの間の構造類似性により、抗体産生細胞株を作製するためにＥＮ１０．５が選択される。
【０１７９】
実施例１６
ＥＮ１０．５の産生ＣＨＯ細胞株の作製
[000211]ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ抗体のＨＣＤＲ１中のシステイン３２はシステイニル化及びグルタチオニル化に重要かどうかを知るため、ＥＮ１０．５抗体遺伝子をｐＣＨＯ１．０に構築し、宿主細胞に導入して組換え抗体発現細胞を調製した。発現用の宿主細胞として、ＣＨＯＳ細胞（Ｌｉｆｅ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を使用した。ベクターは内含の使用説明書に従ってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により宿主細胞に導入した。約２．５マイクログラムの抗体発現ベクターを制限酵素により直線化し、遺伝子を４×１０６細胞に導入し、細胞は６ウェル培養プレートに播種した。低濃度選択では、得られた細胞プールは１０マイクログラム／ｍｌのピューロマイシン及び１００ナノモルのメトトレキサート又は２０マイクログラム／ｍｌのピューロマイシン及び２００ナノモルのメトトレキサートを含有する選択培地で生育させた。さらなる選択を実施するため、もう一方のステージの高濃度選択を実施した。一次選択プールは、３０マイクログラム／ｍｌのピューロマイシン及び５００ナノモルのメトトレキサートを含有する培地で又は５０マイクログラム／ｍｌのピューロマイシン及び１０００ナノモルのメトトレキサートを含有する培地でさらに生育させた。最終抗体産生細胞株を作製するため、第２ステージプール由来の９６，０００細胞を半固体培地に播種し、７６８の高抗体発現細胞を決定し、使用説明書プロトコルに従ってＣｌｏｎｅＰｉｘ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社製）で実施される蛍光強度により選び取った。上位２０の高リード細胞株は、生育速度、５日バッチ生産速度、及び１４日シンプルフェドバッチ生産速度を含むパラメータを用いて選択した。１４日目の上位２０クローンの生産速度を分析し、その結果は図１６に示されている。生産速度は１４日目で３４４．５ｍｇ／リットル〜７３５．２グラム／リットルの範囲である。本発明者らの結果は、ＥＮ１０．５の平均生産性がｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ抗体の２倍を超えていることを示唆している。これらのクローンはすべて簡易培地で良好な生存率及び生育速度を有する。これらの結果は、クローンのすべてが、培地最適化後にその抗体産生能力が改善している可能性があることを意味している。これらのクローンの抗体生産性をさらに調査するため、グルコースと流加培地研究の異なる組合せを実施し、抗体産生速度は１５日目の上位１つのクローンで分析された。結果は、上位クローンの最大生産速度が、１５日間インキュベーション後１リットルあたり２グラム〜１リットルあたり２．５グラムの範囲であることを示している。すべてのクローンが６０世代分析後良好な安定性を有し、抗体がＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析された場合無傷の抗体を産生する。本発明者らの研究は、システイニル化部位のないＥＮ１０．５がｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ抗体と比べた場合より良好な生産性を有することを示唆している。
【０１８０】
実施例１７
ＥＮ１０．５抗体の特徴付け
[000212]ＣＨＯ細胞発現ＥＮ１０．５  ｍＡｂの構造及び均一性を理解するため、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ及び質量スペクトル分析を実施した。無傷の質量の分析では、３０μｇのタンパク質を０．１％のギ酸を含有する３０μｌのｄＨ２Ｏに溶解させた。還元質量の分析では、１５μｌのｄＨ２Ｏ中３０μｇのタンパク質を８０℃で１５分間１０ｍＭのＤＴＴで処置した。還元タンパク質は、０．１％のギ酸中３０μｌのｄＨ２Ｏ中１μｇ／μｌを有する最終濃度まで希釈した。脱グリコシル化した質量の分析では、３０μｇのタンパク質を５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム中０．６μｌのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（Ｐ０７０５Ｌ、ＮＥＢ）を用いて３７℃で一晩処置した。次に、試料は、それぞれ無傷の質量の分析及び還元質量の分析として記載される手順により分析した。
【０１８１】
[000213]ＳＥＣ／ＨＰＬＣ分析では、試料は、分離カラムＢＥＨ  Ｃ４（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、１．７ｕｍ）付きのＷａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣ  Ｈ−クラスＢｉｏｓｙｓｔｅｍにかけた。溶液Ａ及びＢの組成は、それぞれ水及びアセトニトリル中０．１％ギ酸であった。移動相は１５分で５〜５８％の溶液Ｂを用いた勾配であった。ＳＥＣ／ＨＰＬＣからの分離試料は質量スペクトル分析を実施するように接続された。
【０１８２】
[000214]ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析では、試料は、従来のＰＤＡ付きのＳｈｉｍａｄｚｕ  ＰｕｍｐＬＣ−２０ＡＤにかけ、分離カラム、Ｓｅｐａｘ  Ｚｅｎｉｘ  ＳＥＣ−３００（７．８ｍｍ×３００ｍｍ、１．７ｕｍ）を用いて２８０ｎＭでモニターした。溶液Ａの組成は、水中ｐＨ６．８に調整された０．１Ｍのリン酸ナトリウム及び０．１Ｍの硫酸ナトリウムであった。移動相は３５分で１００％溶液Ａを用いた等傾度線であった。ＳＥＣ−ＨＰＬＣからの分離試料は収集され、以下の通りに質量スペクトル分析にかけられた。
【０１８３】
[000215]ＬＣ／質量スペクトル分析では、試料は、分離カラムＢＥＨ  Ｃ４（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、１．７μｍ）付きのＷａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣ  Ｈ−クラスＢｉｏｓｙｓｔｅｍにかけた。溶液Ａ及びＢの組成は、それぞれ水及びアセトニトリル中０．１％ギ酸であった。移動相は１５分で５〜５８％の溶液Ｂを用いた勾配であった。ＵＰＬＣからの分離試料はＥＳＩ−ＭＳ機器、Ｓｙｎａｐｔ  Ｇ２−Ｓｉ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ．ＵＳＡ）に直接つながれた。抗体がシステイニル化されている及びグルタチオニル化されている場合、両タイプの抗体の分子量はそれぞれ約１１９Ｄａ及び３０５Ｄａ増加していることになる。
【０１８４】
[000216]結果は図１７Ａ及び１７Ｂに示されている。抗体の典型的なグリカンプロファイルとして、ＣＨＯ細胞発現ＥＮ１０．５抗体にはＧ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、及びＧ１ｘ２Ｆの質量スペクトルピークが存在する。ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂとは違って、このクローンにはいかなるシステイニル化ピークも見つけることはできなかった。ＨＣＤＲ１システイン３２がセリンに突然変異された後はすべてのシステインがＥＮ１０．５において結合していると仮定される。ＥＮ１０．５抗体のシステイニル化をさらに確かめるため、ＥＮ１０．５  ｍＡｂ抗体の同じバッチはＰＮＧａｓｅ  Ｆにより消化され、ＬＣ／質量スペクトル分析が実施された。結果は図１７Ｂに示されている。非グリコシル化ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ抗体の質量スペクトルとは違って、約１１９Ｄａ及び３０５Ｄａの追加の分子量を有する２つの余分な質量スペクトルピークはＥＮ１０．５  ｍＡｂには存在しなかった。本発明者らの結果は、ＥＮ１０．５  ｍＡｂにはシステイニル化もグルタチオニル化も存在しないことを示しており、ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ抗体がシステイニル化されているだけではなくグルタチオニル化もされていることをさらに支持している。ＨＣＤＲ１システイン３２がセリンに突然変異された後、ＥＮ１０．５  ｍＡｂ抗体ではシステイニル化及びグルタチオニル化が損なわれている。得られた抗体はｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂよりも均一であり生産性が高く、治療抗体の候補として高い潜在力を有する。
【０１８５】
実施例１８
抗体エピトープマッピング
[000217]ヒトＥＮＯ１タンパク質上のＥＮ１０  ｍＡｂのエピトープを決定するため、５’−ＧＧＡＴＣＣＧＣＡＧＣＡＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＡＡＧＣＣＡＴＧ−３’（配列番号２４）及び５’−ＧＧＡＴＣＣＴＣＧＡＡＧＡＴＣＣＣＴＴＴＧＡＣＣＡＧＧＡＴＧ−３’（配列番号２５）のヌクレオチド配列を有する２つのフォワードプライマー、並びにリバースプライマー（５’−ＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣ−３’（配列番号２６）を設計した。ヒトＥＮＯ１  ｃＤＮＡ遺伝子を含有する大腸菌発現プラスミドｐＴＲＣ−ＨＩＳ  ＥＮＯ１を鋳型として使用してＥＮＯ１欠失突然変異体を増幅した。配列番号２４及び配列番号２５を有するプライマーをフォワードプライマーとして、配列番号２６を有するプライマーをリバースプライマーとして使用してそれぞれ欠失突然変異体１〜１８２及び１〜２９３を増幅した。５’−ＧＧＡＴＣＣＴＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＡＧＡＴＣＣＡＴＧＣＣ−３’（配列番号２７）及び５’−ＣＴＣＧＡＧＧＴＣＡＴＧＧＴＧＴＣＴＣＡＴＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧＡＧ−３’（配列番号２８）の配列を有するプライマーのもう１つのセットを使用して欠失３７３〜４３４突然変異体を増幅した。それぞれの突然変異体の増幅では、１マイクロＬの１：１０００希釈の鋳型ＤＮＡ約０．１ｎｇ、５マイクロＬの１０×反応バッファー、１マイクロＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、１マイクロＬの２．５ユニットＴａｑポリメラーゼ、１マイクロＬのフォワードプライマー、及び１マイクロＬのリバースプライマーの組成を有する反応溶液を再蒸留水を用いて５０マイクロＬの最終体積に調製し、ＰＣＲにかけた。９４℃で１０分間のサイクルを使用し、次に９４℃で１分間、５２℃で１分間、及び７２℃で１分間のサイクルを３５回繰り返し、反応は７２℃でさらに１０分間インキュベートした。この反応溶液を２％アガロースゲル電気泳動にかけて反応産物を分析した。正確な分子量を有する反応産物をサブクローニングのためにｐＣＲ  ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に添付の使用説明書に従ってライゲートした。次に、Ｍ１３フォワード（５’−ＧＴＡＡＡＣＡＡＣＧＡＣＧＧＣＧＡＧ−３’（配列番号１２））及びＭ１３リバース（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’（配列番号１３））プライマーを使用してヌクレオチド配列を決定した。正確な配列を有するすべての突然変異クローンを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化し、消化産物は２％アガロースゲル電気泳動にかけた。それぞれの突然変異体の挿入断片はアガロースゲルから消化され、Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎキットを用いて製造業者から提供される添付の使用説明書（ＢＩＯ１０１）に従って精製した。それぞれの突然変異体のＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ  ＤＮＡ断片は大腸菌発現ベクターｐＴＲＣ  Ｈｉｓ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位にライゲートした。得られたプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１Ｒｏｓｓｅｔａを形質転換した。ＥＮＯ１突然変異タンパク質を大腸菌においてＩＰＴＧ誘導により発現させ、細菌ペレットを超音波処理した後、製造業者から提供される添付の使用説明書に従ってＮｉ−アガロース（Ｑｉａｇｅｎ）に��り精製した。それぞれの突然変異体の純度は１２％ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した。それぞれの突然変異タンパク質の結合活性を決定するため、４００ｎｇのヒトＥＮＯ１タンパク質を９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上に被覆し、プレートはＰＢＳにより洗浄した。１０マイクログラムのＥＮ１０  ｍＡｂをプレートに添加し、プレートは３７℃で１時間インキュベートした。結合複合体をＰＢＳを用いて２度洗浄後、ＨＰＲＴとコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧを添加した。１時間のインキュベーション後、ＴＭＢを添加した。結合親和性はＯＤ４０５の読みにより決定した。それぞれの研究は３回繰り返した。データは平均±ＳＤとして示している。Ｔ検定を使用してそれぞれの群間で活性を比較した。Ｐ値＜０．０５は統計的に有意であると見なされた。
【０１８６】
[000218]結果は図１８Ａに示されている。ＥＮＯ１突然変異体１〜１８９及び１〜２９７はＯＤ４０５読み取り約１．４３±０．１８及び１．５６±０．０８（Ｎ＝３）を有し、この値は野生型ＥＮＯ１（２．８７±０．０８）（Ｎ＝３）のＯＤ読み取りのそれぞれ約４２％及び３９％である。しかし、アミノ酸残基２９７〜４３４が欠失すると、ＢＳＡバックグランドと比べた場合、ＥＮ１０  ｍＡｂへのこの突然変異されたＥＮＯ１の結合活性は失われた。これらの結果は、アミノ酸残基２９７〜４３４は、ＥＮ１０  ｍＡｂへのＥＮＯ１タンパク結合に必要であり、突然変異体１〜１８９及び１〜２９７の結合活性の減少は突然変異タンパク質の不安定性又は立体構造変化のせいである可能性があることを示唆している。
【０１８７】
[000219]ＥＮＯ１タンパク質におけるＥＮ１０  ｍＡｂのエピトープをさらに調べるため、５’−ＣＴＣＧＡＧＡＧＧＧＡＴＣＴＴＣＧＡＴＡＧＡＣＡＣＣＡＣＴＧＧＧ−３’（配列番号２９）、５’−ＣＴＣＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＴＴＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧ−３’（配列番号３０）、５’−ＣＴＣＧＡＧＡＣＴＴＣＴＣＧＴＴＣＡＣＧＧＣＣＴＴＧＧＣＧＡＴＣ−３’（配列番号３１）、５’−ＣＴＣＧＡＧＡＣＴＴＣＴＣＧＴＴＣＡＣＧＧＣＣＴＴＧＧＣＧＡＴＣＣ−３’（配列番号３２）、５’−ＣＴＣＧＡＧＣＡＧＴＣＴＣＣＣＣＣＧＡＡＣＧＡＴＧＡＧＡＣＡＣＣ−３’（配列番号３３）、及び５’−ＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＧＴＣＴＴＧＡＴＣＴＧＣＣＣＡＧＴＧＣＡＣ−３’（配列番号３４）の配列を有する５つのリバースプライマーを設計した。ヒトＥＮＯ１  ｃＤＮＡ遺伝子を含有する大腸菌発現プラスミドｐＴＲＣ−ＨＩＳ  ＥＮＯ１を鋳型として使用してＥＮＯ１欠失突然変異体を増幅した。配列番号２７はフォワードプライマーとして使用して欠失突然変異体２９６〜４３４、３１６〜４３４、３３６〜４３４、３７６〜４３４及び３９６〜４３４をそれぞれ配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、及び配列番号３４プライマーを用いて増幅させた。それぞれの突然変異体の増幅では、１マイクロＬの１：１０００希釈の鋳型ＤＮＡ約０．１ｎｇ、５マイクロＬの１０×反応バッファー、１マイクロＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、１マイクロＬの２．５ユニットＴａｑポリメラーゼ、１マイクロＬのフォワードプライマー、及び１マイクロＬのリバースプライマーの組成を有する反応溶液を再蒸留水を用いて５０マイクロＬの最終体積に調製し、ＰＣＲにかけた。９４℃で１０分間のサイクルを使用した。次に９４℃で１分間、５２℃で１分間、及び７２℃で１分間のサイクルを３５回繰り返し、反応は７２℃でさらに１０分間インキュベートした。この反応溶液を２％アガロースゲル電気泳動にかけて反応産物を分析した。正確な分子量を有する反応産物をサブクローニングのためにｐＣＲ  ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に添付の使用説明書に従ってライゲートした。次に、Ｍ１３フォワード（５’−ＧＴＡＡＡＣＡＡＣＧＡＣＧＧＣＧＡＧ−３’（配列番号１２））及びＭ１３リバース（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’（配列番号１３））プライマーを使用してヌクレオチド配列を決定した。正確な配列を有するすべての突然変異クローンを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化し、消化産物は２％アガロースゲル電気泳動にかけた。それぞれの突然変異体のＤＮＡ断片はアガロースゲルから単離し、Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎキットを用いて製造業者から提供される添付の使用説明書（ＢＩＯ１０１）に従って精製した。それぞれの突然変異体のＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ  ＤＮＡ断片は大腸菌発現ベクターｐＴＲＣ  Ｈｉｓ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位にライゲートした。得られたプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１Ｒｏｓｓｅｔａを形質転換した。ＥＮＯ１突然変異タンパク質を大腸菌においてＩＰＴＧ誘導により発現させ、細菌ペレットを超音波処理した後、製造業者から提��される添付の使用説明書に従ってＮｉ−アガロース（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。それぞれの突然変異体の純度は１２％ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した。それぞれの突然変異タンパク質の結合活性を決定するため、４００ｎｇのヒトＥＮＯ１タンパク質又は突然変異タンパク質を９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上に被覆し、プレートはＰＢＳにより洗浄した。１０マイクログラムのＥＮ１０  ｍＡｂを添加し、プレートは３７℃で１時間インキュベートした。結合複合体をＰＢＳで２度洗浄後、ＨＰＲＴとコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧを添加した。１時間のインキュベーション後、ＴＭＢを添加した。結合親和性はＯＤ４０５の読み取りにより決定した。それぞれの研究は３回繰り返した。データは平均±ＳＤとして示している。Ｔ検定を使用してそれぞれの群間で活性を比較した。Ｐ値＜０．０５は統計的に有意であると見なされる。
【０１８８】
[000220]それぞれの突然変異及び野生型タンパク質の１２％のＳＤＳ  ＰＡＧＥは図１８Ｂに示されている。それぞれの突然変異体の分子量は突然変異体２９６〜４３４から野生型まで増加する。この結果は、突然変異体３３６〜４３４及び３７６〜４３４のある程度の分解を見ることができるものの、それぞれの突然変異体から総タンパク質を産生することが可能であることを示唆している。図１８Ｃに示されているように、野生型ＥＮＯ１のＥＮ１０  ｍＡｂ結合親和性と欠失突然変異体３３６〜４３４、３７６〜４３４及び３９６〜４３４のＥＮ１０  ｍＡｂ結合親和性の間には有意差はない。しかし、アミノ酸残基２９６〜４３４及び３１６〜４３４が欠失すると、これら２つのＥＮＯ１突然変異体のＥＮ１０  ｍＡｂ結合活性は、大腸菌細胞ライセートバックグランドのＥＮ１０  ｍＡｂ結合活性と比べた場合、失われている。これらの結果は、アミノ酸残基２９６〜３３６（ＦＤＱＤＤＷＧＡＷＱＫＦＴＡＳＡＧＩＱＶＶＧＤＤＬＴＶＴＮＰＫＲＩＡＫＡＶＮＥＫＳ、配列番号３９）が、ＥＮＯ１タンパク質がＥＮ１０  ｍＡｂと結合するのに重要であることを示唆している。
【０１８９】
実施例１９
アラニンスキャニング
[000221]ヒトＥＮＯ１の２９６〜３３６のどの残基がＥＮ１０．５  ｍＡｂ結合に重要であるのかをさらに調べるため、ＥＮＯ１の結晶構造をタンパク質データバンク（ｐｄｂ−ｅｎｔｒｙ：２ＰＳＮ）からダウンロードした。構造分析後、アミノ酸残基Ｑ２９８、Ｄ２９９、Ｓ３１０、Ｇ３１２、及びＲ３２７はタンパク質表面に露出していると予想され、これらの残基が実際にＥＮ１０．５結合に重要であるかどうかを分析するための突然変異の候補である。これら５つの残基はすべて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ部位特異的変異誘発キットを製造業者（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が提供する添付の使用説明書に従って使用してアラニンに突然変異させるために選ばれた。アラニンスキャニングのための以下の変異原性オリゴヌクレオチド（表ＩＶ）は、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社により作製された。
表ＩＶ．オリゴ配列：
５’−AGCTCCCCAGTCATCCGCGTCAAAGGGATCTTCG−３’（配列番号３５）
５’−CGAAGATCCCTTTGACGCGGATGACTGGGGAGCT−３’（配列番号３６）
５’−ATCCCTTTGACCAGGCTGACTGGGGAGCTTG−３’（配列番号３７）
５’−CAAGCTCCCCAGTCAGCCTGGTCAAAGGGAT−３’（配列番号３８）
５’−CTACCTGGATTCCTGCAGCGGCTGTGAACTTCTGCC−３’（配列番号４２）
５’−GGCAGAAGTTCACAGCCGCTGCAGGAATCCAGGTAG−３’（配列番号４３）
５’−CCACTACCTGGATTGCTGCACTGGCTGTG−３’（配列番号４４）
５’−CACAGCCAGTGCAGCAATCCAGGTAGTGG−３’（配列番号４５）
５’−ACGGCCTTGGCGATCGCCTTTGGGTTGGTCAC−３’（配列番号４６）
５’−CCTGCACTGGCTGTGAACGCCTGCCAAGCTCCCC−３’（配列番号４７）
５’−GTGACCAACCCAAAGGCGATCGCCAAGGCCGT−３’（配列番号４８）
【０１９０】
[000222]それぞれの突然変異体の増幅では、３μＬの鋳型ＤＮＡ約３０ｎｇ、５μＬの１０×反応バッファー、１μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、１μＬの２．５ユニットｐｆｕポリメラーゼ、１２．５μＬの１２５ｎｇフォワードプライマー、及び１２．５μＬの１２５ｎｇリバースプライマーの組成を有する反応溶液を再蒸留水を用いて５０μＬの最終体積に調製し、ＰＣＲにかけた。９５℃で１０分間のサイクルを使用した。次に、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、及び６８℃で６分間のサイクルを１６回繰り返した。ＰＣＲ反応後、１μＬのＤｐｎＩをそれぞれのＰＣＲチューブに添加し、３７℃で１時間インキュベートし、次にＤｐｎＩを加熱して８０℃で２０分間不活化した。反応産物で５０μＬのＸＬ１−ブルーコンピテント細胞を添付の使用説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に従って形質転換した。ＥＮＯ１  Ｒ４００−４２０プライマー（５’−ＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＣＡＧＴＣＴＴＧＡＴＣＴＧ−３’（配列番号４９））を使用してヌクレオチド配列を決定した。正確な配列を有するすべての突然変異クローンプラスミドで大腸菌ＢＬ２１  Ｒｏｓｓｅｔａを形質転換した。ＥＮＯ１突然変異タンパク質を大腸菌においてＩＰＴＧ誘導により発現させ、細菌ペレットを超音波処理した後、製造業者から提供される添付の使用説明書に従ってＮｉ−アガロース（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。それぞれの突然変異タンパク質の純度は１２％ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した。
【０１９１】
[000223]それぞれの突然変異タンパク質の結合活性を決定するため、４００ｎｇ／１００μＬのヒトＥＮＯ１タンパク質又は突然変異されたＥＮＯ１タンパク質を９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上に被覆し、４℃で一晩インキュベートし、プレートはＰＢＳで洗浄した。プレートは室温で１時間、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）で遮断し、次に再び１×ＰＢＳで洗浄した。一次抗体（ＥＮ１０．５  ｍＡｂ）は１５の異なる濃度まで２倍段階希釈し、３７℃で１時間プレートに添加した。反応を行った後、プレートは１×ＰＢＳで３回洗浄した。ヤギ抗マウスＨＲＰ抗体の１／８０００希釈を添加し、３７℃で１時間インキュベートし、次にプレートを１×ＰＢＳで３回洗浄した。次に、ＴＭＢ基質を添加し室温で３０分間反応を進行させた。反応は１ＮのＨＣｌを添加することにより停止させ、ＯＤ４５０を読み取って活性を決定した。それぞれの研究は３回繰り返した。データは平均±ＳＤとして示している。抗体のＯＤ読み取り及び濃度を使用してＳｉｇｍａｐｌｏｔ（商標）を使用して多重散布図を作成した。ＫＤ値は４パラメータロジスティックフィットにより予測した。
【０１９２】
[000224]実施例１８に示されるＥＮＯ１大部分欠失研究結果によれば、残基番号２９６〜３３６のペプチド配列ＦＤＱＤＤＷＧＡＷＱＫＦＴＡＳＡＧＩＱＶＶＧＤＤＬＴＶＴＮＰＫＲＩＡＫＡＶＮＥＫＳ（配列番号３９）はＥＮＯ１タンパク質とＥＮ１０  ｍＡｂの結合に必要である。したがって、ＥＮＯ１の結晶構造をタンパク質データバンク（ｐｄｂ−ｅｎｔｒｙ：２ＰＳＮ）からダウンロードしてこの領域から残基位置を分析した。Ｑ２９８、Ｄ２９９、Ｓ３１０、Ｇ３１２、及びＲ３２７を含む５つのアミノ酸残基がタンパク質表面に露出している（図１９Ａ、推定エピトープ）。部位特異的変異誘発を通して、これら５つのアミノ酸は突然変異させ、得られた突然変異タンパク質をそれぞれ大腸菌で発現させ、精製した（図１９Ｂ）。すべての精製されたＥＮＯ１突然変異タンパク質は、ＥＬＩＳＡにおいてＥＮＯ１結合によるいかなるＫＤ変化についても分析された。結果は、これらの突然変異体には３つの機能的クラスのアミノ酸残基が存在することを示している。アミノ酸残基Ｒ３２７はＥＮＯ１タンパク質とＥＮ１０．５  ｍＡｂの間の結合に必要である。Ｒ３２７酸残基がアラニンに突然変異された場合、ＥＮ１０．５  ｍＡｂへのこのＥＮＯ１突然変異体の結合活性は失われる。第２のクラスのアミノ酸残基はＤ２９９に属する。Ｄ２９９がアラニンに突然変異された場合、ＥＮ１０．５  ｍＡｂへのこのＥＮＯ１突然変異体の結合活性は損なわれる。Ｑ２９８、Ｓ３１０、及びＲ３１２を含むアミノ酸残基の残りは、残基が突然変異された場合でも、ＥＮ１０．５  ｍＡｂへのＥＮＯ１タンパク質結合に対して著しい結合効果をもたらさないアミノ酸残基の群に属する（図１９Ｃ）。これらの結果は、Ｄ２９９及びＲ３２７がＥＮＯ１とＥＮ１０．５  ｍＡｂの間のタンパク質とタンパク質の結合に重要であることを示唆している。要約して言えば、その親抗体ＥＮ１０  ｍＡｂと同じように、ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ４Ｄ５、ｈｕｍＥＮ１０  ｍＡｂ  ＩＭＧＴ及びＥＮ１０．５  ｍＡｂはそのＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体アンタゴニスト活性を使用してプラスミノーゲン活性化を阻害し、それによって細胞表面でのプロテアーゼ活性の下方調節を誘導し、そのために今度は細胞外マトリックスからのがん細胞の解離を阻害する。その結果、ＥＮＯ１に対する抗体はがん細胞の浸潤能力を阻害することが可能になる。これらのデータは、ＥＮＯ１抗体（例えば、ＥＮ１０  ｍＡｂ）ががんの処置のための治療抗体として有利な親和性、有効性及び潜在力を有することを支持している。
【０１９３】
[000225]本発明は限られた数の実施形態に関して記載されてきたが、本開示の恩恵を受ける当業者であれば、本明細書に開示される本発明の範囲から逸脱しない他の実施形態を考案することが可能であることを認識するであろう。したがって、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ−１】
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【図６Ａ−２】
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【図６Ｂ−１】
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【図６Ｂ−２】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年5月7日(2019.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＬＣＤＲ１（ＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＴ；配列番号６）、ＬＣＤＲ２（ＮＡＫＴＬＰＥ；配列番号７）及びＬＣＤＲ３（ＱＨＨＹＧＴＰＹＴ；配列番号８）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、並びに（ｉｉ）ＨＣＤＲ１（ＧＹＴＦＴＳ−Ｘａａ−ＶＭＮ、Ｘａａはセリン又はアラニンである；配列番号５０）、ＨＣＤＲ２（ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ；配列番号４）及びＨＣＤＲ３（ＥＧＦＹＹＧＮＦＤＮ；配列番号５）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、ヒトＥＮＯ１に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
前記ＶＬが、配列番号２又は９のアミノ酸残基１〜１０８を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
前記ＶＨが、配列番号５１のアミノ酸残基１〜１１９を含む、請求項２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子。
【請求項５】
請求項４に記載の単離された核酸を含む発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の治療有効量、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項９】
ＥＮＯ１タンパク質関係疾患又は障害に罹っている非ヒト対象を処置するための方法であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の治療有効量を前記非ヒト対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１０】
前記ＥＮＯ１タンパク質関係疾患又は障害が新生物疾患である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記新生物疾患が肺がん、乳がん、膵臓がん、肝臓がん、結腸直腸がん、又は前立腺がんである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＥＮＯ１タンパク質関係疾患又は障害が炎症性疾患又は免疫障害である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記炎症性疾患又は免疫障害が、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、アレルギー、乾癬、１型糖尿病、アテローム性動脈硬化症又は骨粗鬆症である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＥＮＯ１タンパク質関係疾患又は障害を処置するための薬物の製造における請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の使用。
【請求項１５】
前記ＥＮＯ１タンパク質関係疾患又は障害が新生物疾患である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記新生物疾患が肺がん、乳がん、膵臓がん、肝臓がん、結腸直腸がん、又は前立腺がんである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記ＥＮＯ１タンパク質関係疾患又は障害が炎症性疾患又は免疫障害である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１８】
前記炎症性疾患又は免疫障害が、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、アレルギー、乾癬、１型糖尿病、アテローム性動脈硬化症又は骨粗鬆症である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
それを必要とする非ヒト対象においてがん浸潤を阻害するための方法であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の治療有効量を前記非ヒト対象に投与するステップを含む方法。
【請求項２０】
それを必要とする対象においてがん浸潤を阻害するための薬物の製造における請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の使用。
【請求項２１】
がんの診断のための方法であって、前記方法が、検査対象由来の試料を請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と反応させて、結合の程度を判定するステップを含み、基準値よりも大きな結合の前記程度ががん状態を示す、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
[00016]本発明の一部の実施形態に従えば、ヒトＥＮＯ１タンパク質に結合できる抗体は、配列番号２若しくは９のアミノ酸残基１〜１０８を含むＶＬ及び／又は配列番号１、１０若しくは１１のアミノ酸残基１〜１１９を含むＶＨを含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
[00020]本発明の他の実施形態は、ヒトＥＮＯ１タンパク質に結合できる抗体又はその抗原結合断片の治療有効量、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
[000132]本発明の一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２若しくは９のアミノ酸残基１〜１０８を含むＶＬ、及び／又は配列番号１、１０若しくは１１のアミノ酸残基１〜１１９を含むＶＨを含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
[000134]本発明の一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２若しくは９のアミノ酸残基１〜１０８を含むＶＬ、又は配列番号１、１０若しくは５１のアミノ酸残基１〜１１９を含むＶＨを含む。
【外国語明細書】
2019154414000001.pdf