(57)【要約】      （修正有）【課題】非光栄養性Ｃ１代謝微生物において広く利用可能で、基底発現が極めて小さく、非誘導時と誘導時との発現量比が大きい発現制御系を提供すること。特に、Ｃ１原料からの物質生産における生産性能の改善に十分な量のタンパク質発現を、細胞の生育と競合しないように任意のタイミングで達成できる技術の提供。【解決手段】非光栄養性Ｃ１代謝微生物での遺伝子発現制御のための、リボスイッチをコードする配列を含むことを特徴とする核酸、リボスイッチがテオフィリン結合性リボスイッチであり、リボスイッチがプロモーターの下流に配置され、リボソーム結合配列がスペーサーを介しリボスイッチの下流に配置されている核酸、及び核酸を含む非光栄養性Ｃ１代謝微生物の形質転換体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非光栄養性Ｃ１代謝微生物での遺伝子発現制御のための核酸であって、リボスイッチをコードする配列を含むことを特徴とする前記核酸。
【請求項２】
リボスイッチがテオフィリン結合性リボスイッチであることを特徴とする、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記テオフィリン結合性リボスイッチが、５’−ＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＣＴＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＣＡＡＧ−３’（配列番号：１）の配列を有することを特徴とする、請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
前記リボスイッチが、天然もしくは人工的なプロモーターの下流に配置されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項５】
前記プロモーターが、誘導性プロモーターであることを特徴とする請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
前記プロモーターが、恒常性プロモーターであることを特徴とする請求項４に記載の核酸。
【請求項７】
前記プロモーターが、ｔｒｃプロモーターであることを特徴とする請求項５又は６に記載の核酸。
【請求項８】
天然もしくは人工的なリボソーム結合配列を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項９】
前記リボソーム結合配列が、５’−ＡＡＧＧＡＧＧ−３’の配列を有することを特徴とする請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
前記リボソーム結合配列が、スペーサーを介しリボスイッチの下流に配置されていることを特徴とする、請求項８又は９に記載の核酸。
【請求項１１】
更に発現されるべき遺伝子を含み、該遺伝子が、ターミネーターの上流に配置されていることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸を含む非光栄養性Ｃ１代謝微生物の形質転換体。
【請求項１４】
前記核酸が、宿主微生物の染色体上に組み込まれている、請求項１３に記載の形質転換体。
【請求項１５】
前記核酸が、該核酸を含むベクターとして宿主微生物に導入されている、請求項１３に記載の形質転換体。
【請求項１６】
非光栄養性Ｃ１代謝微生物が、メタン資化性菌またはメタノール資化性菌であることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の形質転換体。
【請求項１７】
非光栄養性Ｃ１代謝微生物が、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロシスチス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、メチロマイクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロフィラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、メチロバチルス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）及びパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の形質転換体。
【請求項１８】
光栄養性Ｃ１代謝微生物が、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ（ＮＣＩＭＢ  １１１３２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ  ＡＳ１（ＮＣＩＭＢ  １０５１５）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ（ＮＣＩＭＢ  １１３７５）及びＰａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（ＮＣＩＭＢ  １１６２７）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の形質転換体。
【請求項１９】
請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の形質転換体に、リボスイッチのリガンドを供給することで、該リボスイッチの制御下にある遺伝子の発現を誘導する方法。
【請求項２０】
前記リガンドが、テオフィリンであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記リガンドが、形質転換体により自律的に供給されることを特徴とする、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸を含む、非光栄養性Ｃ１代謝微生物の形質転換のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物における遺伝子発現の制御方法に関する。より具体的には、本発明は、非光栄養性のＣ１代謝微生物における遺伝子発現の制御に必要な核酸分子、特に微生物を用いたメタン、メタノールからの物質生産に関する。
【背景技術】
【０００２】
代謝改変された微生物によって、グルコースやセルロースなどの植物資源から、化学品、タンパク質などの有用物質を生産する技術の開発、実用化が進んでいる。従来技術の多くは有機物、特に糖を原料としたものであったが、改変された光栄養性Ｃ１代謝微生物を用いることで、メタンやメタノールといった代替原料からの物質生産技術が近年新たに注目されるようになった。
【０００３】
宿主とする光栄養性Ｃ１代謝微生物に、生来生産できない物質の生産能力を賦与するためには、当該宿主細胞に生産に必要な外来酵素をコードする遺伝子を導入し、これらを過剰発現させる必要がある。このような潜在的価値があるにもかかわらず、生産可能な物質の種類、数はいまだ限定的である。主たる原因のひとつとして、物質生産のための酵素遺伝子をＣ１代謝微生物へ導入するのはしばしば難しいことが挙げられる。一般に、Ｃ１代謝微生物の生育は従属栄養性細菌のそれに比べ遅い。そのため、発現遺伝子の産物が生育と競合する場合には、長期にわたってその遺伝子型を安定に維持するためだけでなく、そもそも形質転換体を取得するために、非誘導時の基底発現レベルは限りなく低く抑えられていることが望ましい。ゆえに、所望の条件下でのみ遺伝子の発現を誘導できる技術は非常に重要である。一方、物質生産性の最大化のためには、任意のタイミングで遺伝子発現を強く誘導できることもまた強く求められる。すなわち、基底発現が限りなく小さい一方で、誘導時には強力に発現を誘導できる技術が強く求められる。
【０００４】
また、光栄養性Ｃ１代謝微生物の生物学的な諸性質についてはいまだに未解明の部分も多く、基礎的知見の集積も望まれている。そのため、特定遺伝子の生理学的機能の解明においても、所望の条件に限定した遺伝子発現誘導は、光栄養性Ｃ１代謝微生物を用いた研究の推進に大きく寄与することが期待される。
【０００５】
上記のような要請が強くありながら、遺伝子組換え宿主としてこれまで広く用いられてきた従属栄養性細菌に比べると、非光栄養性Ｃ１代謝微生物の遺伝子発現制御ツールは著しく不足している（非特許文献１）。その大きな原因のひとつとして、大腸菌をはじめとした従属栄養性細菌で汎用的に利用されてきた遺伝子発現制御系の多くが、Ｃ１代謝微生物に転用できないことが挙げられる（特許文献２、３）。例えば、特許文献１では、イソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性のｔｒｃプロモーターが使用されているが、メタン資化性菌では良好な性能を示さなかった旨が記載されている。実際、特許文献１、非特許文献２の例を除いて、これまでに報告された発現制御系は非光栄養性Ｃ１代謝微生物のゲノムから同定されたものである（特許文献２、３）。また、上記いずれの先行技術においても、低い基底発現と強力な発現誘導の２つの性能を両立できたものはない。
【０００６】
以上のように、非光栄養性Ｃ１代謝微生物で良好に機能する発現制御系が強く望まれてきたものの、そのような報告例はなかった。それは、既存の発現制御系を非光栄養性Ｃ１代謝微生物へ転用できないこと、代わりに非光栄養性Ｃ１代謝微生物から同定されたものも性能が限定的であることが原因であった。
【０００７】
例えば、特許文献２、非特許文献２では、メタン資化性菌にて利用可能な誘導性プロモーターについて記述されているが、基底発現があるだけでなく、非誘導時と誘導時との発現比も限定的であった。特許文献２では、誘導性プロモーター配列をＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．のゲノムから見出しているが、発現誘導が特定の栄養条件に限定される問題がある。最後に、メタノール資化性菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ  ＭＧＡ３株（非特許文献３）やＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓでは、同一種由来のマンニトール誘導性プロモーターや類縁種由来のキシロース誘導性プロモーター、メタノール誘導性プロモーターの利用例があるが、他の非光栄養性Ｃ１代謝微生物での利用は示されていない。実際、マンニトールやキシロース、メタノール誘導性プロモーターは、宿主微生物固有のシグナル伝達系を介した複雑な発現制御に依存しており、これを有さない非光栄養性Ｃ１代謝微生物への応用は困難と考えられる。
【０００８】
以上のように、本発明者らの知る限り、これまでに知られる非光栄養性Ｃ１代謝微生物用の発現制御系は、その性能が限定的であるだけでなく、天然由来またはその改変型の特定の微生物種における利用を示した例がほとんどであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
特許文献１：  ＵＳ２０１４／２７３１２８号公報
特許文献２：  ＷＯ２０１５／１９５９７２号パンフレット
特許文献３：  特表２００６−５１５１６６号公報
【非特許文献】
【００１０】
非特許文献１：  Ｋａｌｙｕｚｈｎａｙａ，Ｍ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  ｍｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，Ｖｏｌ．２９，１４２−１５２（２０１５）
非特許文献２：  Ｈｅｎａｒｄ，Ｃ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔｈａｎｅ  ｔｏ  ｌａｃｔａｔｅ  ｂｙ  ａｎ  ｏｂｌｉｇａｔｅ  ｍｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，Ｖｏｌ．６，２１５８５（２０１６）
非特許文献３：  Ｉｒｌａ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｏｏｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ：  ｔｈｅｔａ−  ａｎｄ  ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｂａｓｅｄ  ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．７，１４８１（２０１６）
非特許文献４：  Ｓａｌｉｓ，Ｈ．Ｍ．，Ｔｈｅ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌ．４９８，１９−４２（２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記現状に鑑み、本発明の課題は、非光栄養性Ｃ１代謝微生物において広く利用可能で、基底発現が無視できるほど小さく、非誘導時と誘導時との発現量比が大きい技術を提供することにある。特に、本発明は、Ｃ１原料からの物質生産量の改善に十分な量のタンパク質発現を、細胞の生育と競合しないように任意のタイミングで達成できる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記のとおり、大腸菌などの従属栄養性細菌で利用されてきた遺伝子発現制御系の多くは、非光栄養性Ｃ１代謝微生物に転用できないことが一般的に認識されており（特許文献３）、同様にリボスイッチによる発現誘導システムについても非光栄養性Ｃ１代謝微生物に利用できるとの知見はなかった（特許文献１）。しかしながら、本発明者らは、前記の課題を解決すべく鋭意研究を行い、多くの非光栄養性Ｃ１代謝微生物においてリボスイッチによる発現誘導システムが殊に良好に機能することを見出した。具体的には、このシステムが、基底発現が限りなく小さく、先行技術に比べて非誘導時と誘導時の発現比が著しく大きい、従来の非光栄養性Ｃ１代謝微生物における発現制御系にない特長を有することを見出し、本発明を完成するに至った。特に、本発明の発現誘導システムをメタン資化性菌に適用した場合、基底発現が全く検出されないだけでなく、強力な発現誘導も可能であり、大腸菌では達成し得ない特長を有することを見出した。
【００１３】
また、本発明者らは、以前からＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子を恒常発現する配列を含むベクターを非光栄養性Ｃ１代謝微生物へ導入することを試みていたが、全く形質転換体を得ることができていなかった。そこで、本発明者らは、リボスイッチを用いた発現システムでは基底発現が限りなく小さいという上記の新たな発見を踏まえて、前記恒常発現系をリボスイッチを用いた発現誘導系と置き換えたところ、形質転換体の取得効率を劇的に向上させられることを見出した。細胞の生育に影響することのないＧＦＰタンパク質を恒常発現した形質転換体は容易に得られることから、特に非光栄養性Ｃ１代謝微生物の生育と競合する遺伝子を発現する場合においては、発現誘導系の活用が大変重要であることを裏付けるものであった。
【００１４】
すなわち本発明は以下を提供する：
（１）非光栄養性Ｃ１代謝微生物での遺伝子発現制御のための核酸であって、リボスイッチをコードする配列を含むことを特徴とする前記核酸；
（２）リボスイッチがテオフィリン結合性リボスイッチであることを特徴とする、上記（１）の核酸；
（３）前記テオフィリン結合性リボスイッチが、５’−ＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＣＴＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＣＡＡＧ−３’（配列番号：１）の配列を有することを特徴とする、上記（２）の核酸；
（４）前記リボスイッチが、天然もしくは人工的なプロモーターの下流に配置されていることを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかの核酸；
（５）前記プロモーターが、誘導性プロモーターであることを特徴とする上記（４）の核酸；
（６）前記プロモーターが、恒常性プロモーターであることを特徴とする上記（４）の核酸；
（７）前記プロモーターが、ｔｒｃプロモーターであることを特徴とする上記（５）又は（６）の核酸；
（８）天然もしくは人工的なリボソーム結合配列を含むことを特徴とする上記（１）〜（７）の核酸；
（９）前記リボソーム結合配列が、５’−ＡＡＧＧＡＧＧ−３’の配列を有することを特徴とする上記（８）の核酸；
（１０）前記リボソーム結合配列が、スペーサーを介しリボスイッチの下流に配置されていることを特徴とする、上記（８）又は（９）の核酸；
（１１）更に発現されるべき遺伝子を含み、該遺伝子が、ターミネーターの上流に配置されていることを特徴とする、上記（１）〜（１０）のいずれかの核酸；
【００１５】
（１２）上記（１）〜（１１）のいずれかの核酸を含むベクター；
（１３）上記（１）〜（１１）のいずれかの核酸を含む非光栄養性Ｃ１代謝微生物の形質転換体；
（１４）前記核酸が、宿主微生物の染色体上に組み込まれている、上記（１３）の形質転換体；
（１５）前記核酸が、該核酸を含むベクターとして宿主微生物に導入されている、上記（１３）の形質転換体；
（１６）非光栄養性Ｃ１代謝微生物が、メタン資化性菌またはメタノール資化性菌であることを特徴とする、上記（１３）〜（１５）のいずれかの形質転換体；
（１７）非光栄養性Ｃ１代謝微生物が、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロシスチス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、メチロマイクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロフィラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、メチロバチルス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）及びパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）からなる群から選択されることを特徴とする、上記（１３）〜（１５）のいずれかの形質転換体；
（１８）非光栄養性Ｃ１代謝微生物が、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ（ＮＣＩＭＢ  １１１３２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ  ＡＳ１（ＮＣＩＭＢ  １０５１５）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ（ＮＣＩＭＢ  １１３７５）及びＰａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（ＮＣＩＭＢ  １１６２７）からなる群から選択されることを特徴とする、上記（１３）〜（１５）のいずれかの形質転換体；
【００１６】
（１９）上記（１３）〜（１８）のいずれかの形質転換体に、リボスイッチのリガンドを供給することで、該リボスイッチの制御下にある遺伝子の発現を誘導する方法；
（２０）前記リガンドが、テオフィリンであることを特徴とする上記（１９）の方法；
（２１）前記リガンドが、形質転換体により自律的に供給されることを特徴とする、上記（１９）又は（２０）の方法；および、
（２２）上記（１）〜（１１）のいずれかの核酸を含む、非光栄養性Ｃ１代謝微生物の形質転換のためのキット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、基底発現を極めて小さく抑えられることから、従来の恒常発現や、基底発現の無視できない発現誘導系では得られなかった、生育と競合する遺伝子を含む核酸の形質転換体を容易に獲得することができる。つまり、本発明の発現誘導系を用いることによって、非光栄養性Ｃ１代謝微生物で生産可能な物質の種類を著しく拡大しうる。さらに、本発明は、ＩＰＴＧなどの誘導剤を使用する先行技術に比べて非誘導時と誘導時の発現比が著しく大きい特長を有するため、所望の条件に限定した遺伝子発現、遺伝子発現量の柔軟な調節、またこれらを通じて物質生産性能の最大化や遺伝子の生理学的性質の解明を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ｐｍｋ６１Ａのプラスミドマップである。図中、「Ｐｔｒｃ」はｔｒｃプロモーターを、「ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ」はリボスイッチ配列を、「ＲＢＳ」はリボソーム結合配列を、「ＧＦＰ」はｓｆＧＦＰ遺伝子を、「ｍｏｂ」はｍｏｂ遺伝子を、「ｋａｎＲ」はカナマイシン耐性遺伝子を、「Ｒｅｐ］は複製起点を、それぞれ、示している。
【図２】図２は、ｐｍｋ６１Ａを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおける、テオフィリン添加とＧＦＰ蛍光強度の関係を示すグラフである。
【図３】図３は、ｐｍｋ６１Ａを導入したＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈにおける、テオフィリン添加濃度とＧＦＰ蛍光強度の関係を示すグラフである。
【図４】図４は、ｐｍｋ６１Ａを導入したＭｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ  ＡＳ１における、テオフィリン添加とＧＦＰ蛍光強度の関係を示すグラフである。
【図５】図５は、ｐｍｋ６１Ａを導入したＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓにおける、テオフィリン添加とＧＦＰ蛍光強度の関係を示すグラフである。
【図６】図６は、ｐｍｋ６１Ａを導入したＰａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓにおける、テオフィリン添加とＧＦＰ蛍光強度の関係を示すグラフである。
【図７】図7は、ｐｍｋ９６およびｐｍｋ９９のプラスミドマップである。図中、「Ｐｔｒｃ」はｔｒｃプロモーターを、「ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ」はリボスイッチ配列を、「ＲＢＳ」はリボソーム結合配列を、「ｃａｄＡ」はＬ−リジン脱炭酸酵素（ｃａｄＡ）遺伝子を、「ｍｏｂ」はｍｏｂ遺伝子を、「ｋａｎＲ」はカナマイシン耐性遺伝子を、「Ｒｅｐ］は複製起点を、それぞれ、示している。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明について、以下具体的に説明する。
【００２０】
本発明において、核酸とは、リボ核酸（ＲＮＡ）とデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を指すが、本発明の核酸はリボスイッチをコードする配列を含む。
【００２１】
リボスイッチとは特定の低分子化合物と選択的に結合するＲＮＡのことをいい、当該低分子化合物をリガンドと呼ぶ。リガンド非存在下ではＲＮＡ塩基対による二次構造を形成し、リボスイッチ周辺の核酸へ影響を与える。特に、リボスイッチの下流にリボソーム結合部位を含む場合には、リボソームのリボソーム結合部位への接近を妨げることで、その下流に位置する遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を妨げる。一方、リガンド存在下では、リガンド結合に伴う二次構造解消を通じて、リボソームがリボソーム結合部位へ接近できる。そのため、リガンド添加時のみ遺伝子のｍＲＮＡが翻訳され、目的遺伝子の発現が誘導される。
【００２２】
本発明におけるリガンドは特に限定されるものではないが、リガンド非存在下のリボスイッチの二次構造を解消できるものであればよく、天然由来のもの、これを改変したもの、人工的に設計改変されたもののうち１つもしくはいずれをも選択できる。
【００２３】
本発明におけるリボスイッチは、特に限定されるものではなく、リガンド結合に伴い二次構造変化が生じるＲＮＡであればよい。例えば、テオフィリン応答性リボスイッチ、アデノシルコバラミン応答性リボスイッチ、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、フラビンモノヌクレオチド応答性リボスイッチ、グルコサミン−６−リン酸応答性リボスイッチ、グルタミン応答性リボスイッチ、グリシン応答性リボスイッチ、リジン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、プリン応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルメチオニン応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン＆Ｓ−アデノシルメチオニン応答性リボスイッチ、テトラヒドロ葉酸応答性リボスイッチ、チアミンピロリン酸応答性リボスイッチ、モリブデン応答性リボスイッチ、アデニン応答性リボスイッチが挙げられるが、これらに限定されない。すでに天然に存在することが知られているもの、新たに天然から単離されたもの、人工的に設計されたもの、いずれでもよく、また、１つもしくは複数を組み合わせてもよい。
【００２４】
本発明におけるリボスイッチは、好ましくはテオフィリン応答性リボスイッチである。テオフィリン応答性リボスイッチは、テオフィリン非存在下のＲＮＡ二次構造がテオフィリン結合によって解消されるものであればよく、特に限定されるものではない。例えば、５’−ＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＣＴＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＣＡＡＧ−３’（配列番号：１）、５’−ＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＧＡＡＧＧＧＧＣＡＡＣＡＡＧ−３’（配列番号：２）、５’−ＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＣＧＣＴＧＣＧＣＡＧＧＧＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＧ−３’（配列番号：３）、５’−ＧＧＴＡＣＣＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＧＧＧＧＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＡＣＡＡＧ−３’（配列番号：４）、５’−ＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＣＴＡＡＧＧＴＡＡＣＡＡＣＡＡＧ−３’（配列番号：５）、５’−ＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＣＴＡＡＧＧＡＧＧＴＡＡＣＡＡＣＡＡＧ−３’（配列番号：６）などの配列を有するものが挙げられるが、これらに限定されない。さらに好ましくは５’−ＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＣＴＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＣＡＡＧ−３’（配列番号：１）の配列を有する。
【００２５】
また、リガンドであるテオフィリンはテオフィリンの誘導体であってもよい。リガンドとして本発明の形質転換体の培養に添加されるテオフィリン又はその誘導体の濃度は０．１〜１０ｍＭが好ましい。
【００２６】
本発明におけるリボスイッチは、天然もしくは人工のプロモーターの下流に配置され、それにより当該プロモーターに作動可能に連結される。プロモーターは、発現遺伝子の上流に位置するＤＮＡであって、宿主微生物のＲＮＡポリメラーゼを鋳型ＤＮＡへ引き寄せるプロモーター配列を含む。
【００２７】
本発明におけるプロモーターは特に限定されず、非光栄養性Ｃ１代謝微生物において作動するものであればよい。ゆえに、非光栄養性Ｃ１代謝微生物に由来する核酸に限らず天然に存在するもの、または人工的に設計、改変されたものでもよい。例えば、メタノールデヒドロゲナーゼプロモーター、メタンモノオキシゲナーゼプロモーター、リボソームタンパク質プロモーター、ヘキスロース−６−リン酸合成酵素プロモーター、ホスホヘキスロースイソメラーゼプロモーター、グリセルアルデヒド−６−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ｒｈａＢＡＤプロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ5プロモーター、ｌｕｘプロモーター、ｐｈｏＡプロモーター、Ｔ７プロモーター、λファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーターなどが挙げられる。また、本発明のプロモーターとしては、達成したい発現量や性質に応じて、恒常性、誘導性いずれをも選択でき、１つもしくは複数を組み合わせることができる。本発明における好ましいプロモーターの例として、ｔｒｃプロモーターを挙げることができる。
【００２８】
本発明における核酸は、リボソーム結合配列を含む。リボソーム結合配列は、一般に４塩基から１０塩基の長さからなる核酸であり、リボソームとｍＲＮＡを結合させ翻訳の開始に必要である。アデニンもしくはグアニンに富む特徴を有するが、特に限定されるものではなく、非光栄養性Ｃ１代謝微生物において作動可能であればよい。したがって、本発明のリボソーム結合配列は、天然に存在する配列でも、人工的に設計された配列でもよく、達成したい発現量や性質に応じて適したものを選択することができる。例えば、非特許文献３に示されるように、達成したい遺伝子発現量に応じて、任意に設計することができる。本発明のリボソーム結合配列の好ましい例としては、５’−ＡＡＧＧＡＧＧ−３’を有する配列を挙げることができる。これらのリボソーム結合配列は、典型的には、本発明のリボスイッチの下流に配置され、それにより当該リボスイッチに作動可能に連結される。したがって、本発明の好適な態様は、リボスイッチが天然もしくは人工的なプロモーターの下流に配置され、リボソーム結合配列がリボスイッチの下流に配置された核酸である。
【００２９】
なお、本発明において、「作動可能に連結される」とは、両配列が直結される場合、および適当な数の塩基を介して連結される場合のいずれも含む。例えば、プロモーターとリボスイッチとの間には、既知のプロモーターの近傍に見出される余剰配列、および更に適当な数の塩基からなるスペーサーが存在していてもよい。また、リボソーム結合配列とリボスイッチが適当な数の塩基からなるスペーサーを介して連結されていてもよい。当該スペーサーの長さは、典型的には１〜２０塩基、好ましくは５〜１０塩基であり得る。
【００３０】
本発明における核酸が、発現させるべき遺伝子を含むことも好適な１態様である。本発明における遺伝子とは、マーカー遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、色素生合成遺伝子、物質生産経路に属する遺伝子、炭素代謝系に属する遺伝子など非光栄養性Ｃ１代謝微生物で発現できるものであればよく、１つもしくは複数を選択できる。複数の異なる遺伝子を発現する場合には、例えば、リボスイッチ、リボソーム結合配列、遺伝子からなる各遺伝子ごとの単位を複数個配置してもよく、それらの単位の各々は、必要に応じて個別のプロモーター及び／又はターミネーターを含んでもよい。このとき、リボソーム結合配列は、遺伝子ごとの達成したい発現量に応じて設計してもよい。
【００３１】
本発明における形質転換体は、非光栄養性Ｃ１代謝微生物において遺伝子発現誘導を可能にするＲＮＡをコードする核酸を含む。そのような本発明の核酸は、ベクターもしくは染色体上に組み込むことが可能である。組み込むべき核酸が２つ以上の場合、それらの全てがベクターに組み込まれてもよいし染色体上に組み込まれてもよく、或いはそのうちの一部をベクターに、他のものを染色体上に組み込んでもよい。
【００３２】
本発明における核酸がベクターに含まれる場合、当該ベクターは特に限定されるものではないが、例えば、非光栄養性Ｃ１代謝微生物細胞内での自律的複製を可能にする複製起点、選択マーカー、接合伝達起点を含むことができる。ベクターの細胞への導入は、当業者に公知の手段により行われ得る。例えば、接合伝達法やエレクトロポレーション法などを挙げることができる（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７３，８１−８８（１９９８））。なお、本発明における核酸は、非光栄養性Ｃ１代謝微生物の遺伝子改変を実施するためのベクターとして提供でき、同様の目的で商業用ベクターまたは遺伝子改変用のキットとして提供することもできる。
【００３３】
本発明における核酸を、宿主細胞である非光栄養性Ｃ１代謝微生物の染色体上に組み込むことも好適な態様である。そのような組み込みも当業者に公知の手段により行われ得る。例えば、Ｃｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１４９，１７８５−１７９５（２００３）に記載の方法などを挙げることができる。本発明における核酸が染色体上に組み込まれた非光栄養性Ｃ１代謝微生物は、商業用宿主または遺伝子改変用のキットとして提供することもできる。
【００３４】
本発明におけるＣ１代謝微生物は非光栄養性で、炭素数１からなる化合物を代謝できる微生物を指し、例えば、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、一酸化炭素、二酸化炭素、メチル化アミン（例えば、モノ−、ジ−、およびトリ−メチルアミン）、メチル化チオールなどの資化性菌などが挙げられ、既に単離保存されているものでも、新たに天然から分離したもの、遺伝子改変されたもの、上記化合物を代謝できるよう改変された大腸菌や酵母などの非Ｃ１代謝微生物などいずれをも任意に選択できる。本発明における非光栄養性Ｃ１代謝微生物は、好ましくは、メタン資化性菌もしくはメタノール資化性菌である。これらは好ましくは、メチルアシドフィラム（Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｐｈｉｌｕｍ）、メチロセラ（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ）、メチロテネラ（Ｍｅｔｈｙｌｏｔｅｎｅｒａ）、メチロファーガ（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈａｇａ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロシスチス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、メチロマイクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、Ｍｅｔｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ（メチロサーマス）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍａｒｉｎｕｍ（メチロマリナム）、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｕｌｕｍ（メチロバルム）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ（メタノコッカス）、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ（メタノサーモバクター）、メタノモナス（Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ）、メタノサルキナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノゲニウム（Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノハロフィラス（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、メタノマイクロビウム（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａ）、メタノコッコイド（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）、メタノサエタ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ）、メタノロバス（Ｍｅｔｈａｎｏｌｏｂｕｓ）、メチロフィラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、メチロバチルス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ハイフォマイクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などに属する微生物から選択でき、さらに好ましくは、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ（ＮＣＩＭＢ  １１１３２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ  ＡＳ１（ＮＣＩＭＢ  １０５１５）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂ���ｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ（ＮＣＩＭＢ  １１３７５）またはＰａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（ＮＣＩＭＢ  １１６２７）から選択できる。
【００３５】
本発明の形質転換体は、宿主細胞の生育に適した公知の培養方法により培養することができる。例えば、本発明で用いられる培地は、炭素数１からなる化合物を炭素源として含み、さらに窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。培養は、好気的もしくは嫌気的いずれも選択することができ、振盪培養、静置培養または通気攪拌培養など目的に応じて選択できる。
【００３６】
例えば、メタンを炭素源として密閉系で振盪あるいは静置培養を行う場合には、培地と接する気相中にメタンガスを１〜７５％添加する。開放系で通気培養を行う場合には、メタンガスを１〜７５％含む混合ガスを吹き込む。上記いずれの例においても、必要に応じて酸素や二酸化炭素、窒素などのガスを添加できる。メタノールを炭素源として培養する場合には、培地に０．０１〜５％メタノールを添加する。
【００３７】
窒素源としては、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸、アンモニアガス、アンモニア水、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素などを０．０１〜１０％培地に添加して用いる。これらのほかに、通常、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、鉄−ＥＤＴＡ、モリブデン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、硫酸銅、塩化銅、硫酸鉄、硫酸亜鉛、塩化マンガン、塩化コバルト、塩化ニッケル、ホウ酸などの成分が微量添加される。また、培養する微生物種が従属栄養性である場合には、グルコースやキシロースなどの糖やグリセロール、酢酸、コハク酸などの炭素源を０．０１〜１０％添加する。
【００３８】
本発明のリボスイッチによる発現誘導システムを用いた目的遺伝子の発現誘導は、上記のような形質転換体に対してリボスイッチのリガンドを接触させることにより達成することができる。リガンドは、遺伝子の発現誘導を望む任意のタイミングで外部より人為的に供給するか、宿主細胞により自律的に供給させる方法を選択できる。後者については、例えば生育する細胞内に蓄積する代謝物をリガンドに選択することで達成できる（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，１３３５−１３４０（２０１５））。また、リガンドの生合成に必要な遺伝子を該宿主細胞に導入することで、リガンドを自律的に供給させることも可能である。
【００３９】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下では特に断りのない限り、塩基配列は５’末端から３’末端方向に記載される。
【実施例】
【００４０】
各実施例で用いた培地の組成は以下のとおりである。
【００４１】
（ＬＢ培地）
組成は次のとおりである：２０ｇ／Ｌ  ＬＢ培地、レノックス（ディフコ社製）。
［１２０℃、２０分間蒸気滅菌を行った。必要に応じて、終濃度５０ｍｇ／Ｌ  カナマイシン硫酸塩、１．５％  Ｂａｃｔｏ  ａｇａｒ（ディフコ社製）を加えた。］
【００４２】
（ＮＭＳ培地）
組成は次のとおりである：０．８ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍＭ  ＮａＮＯ３、０．１４ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２．３５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、３．４ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、２０．７μＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１μＭ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１０μＭ  ＦｅIII−Ｎａ−ＥＤＴＡ、１ｍＬ  ｔｒａｃｅ  ｍｅｔａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５００ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４００ｍｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｍｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２・７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１５ｍｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ３、２５０ｍｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ）
［Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、ＦｅIII−Ｎａ−ＥＤＴＡ、ＮａＨＣＯ３は、１２０℃、２０分間蒸気滅菌後、添加した。必要に応じて、７．５〜１０ｍｇ／Ｌ  カナマイシン硫酸塩、２５ｍｇ／Ｌ  ナリジクス酸、１．５％  Ｂａｃｔｏ  ａｇａｒも、滅菌後加えた。］
【００４３】
（ＭＭ１培地）
組成は次のとおりである：０．２ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２．５３ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、２．５９ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＬ  ｔｒａｃｅ  ｍｅｔａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２．２ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、７３３ｍｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５０６ｍｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２・７Ｈ２Ｏ、１１０ｍｇ／Ｌ  （ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、１６２ｍｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１６１ｍｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、４９９ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）
［１２０℃、２０分間蒸気滅菌を行った。必要に応じて、０．５％  メタノール、１０ｍｇ／Ｌ  カナマイシン硫酸塩、２５ｍｇ／Ｌ  ナリジクス酸、１．５％  Ｂａｃｔｏ  ａｇａｒも、滅菌後に加えた。］
【００４４】
［実施例１］  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおけるｓｆＧＦＰ発現誘導
（プラスミドの構築）
プラスミド構築に必要な核酸断片のＰＣＲ増幅には、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）を用いた。プラスミド構築には、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いた。広域宿主ベクターであるｐＢＨＲ１（ＭｏＢｉＴｅｃ社製）へリボスイッチとｔｒｃプロモーターのハイブリッド（Ｐｔｒｃ  Ｅ＊）、ｓｆＧＦＰ遺伝子をクローニングすることによりｐｍｋ６１Ａを構築した。Ｐｔｒｃ  Ｅ＊およびｓｆＧＦＰは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社により合成された。まず、Ｐｔｒｃ  Ｅ＊断片をｍｋ３１６およびｍｋ１７３Ｒにより増幅した。次に、ｓｆＧＦＰ断片をｍｋ１７６およびｍｋ３１７Ｒにより増幅した。最後に、ベクター骨格をｍｋ３１８およびｍｋ３１９Ｒにより増幅した。これらの３つの断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇキットにより連結し、ｐｍｋ６１Ａを有するＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ニッポン・ジーン社製）のクローンを得た。プラスミドＤＮＡを細胞から抽出・精製後、シーケンス解析により、ｐｍｋ６１Ａが正しく得られていることを確認した。図１にｐｍｋ６１Ａの概要を示す。また、上記配列を以下に示す。
【００４５】
【化１】
2019154312.tif 000002
【００４６】
【化２】
2019154312.tif 000003
【００４７】
【化３】
2019154312.tif 000004
【００４８】
（ｐｍｋ６１Ａを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ形質転換体におけるｓｆＧＦＰの発現誘導）
ｐｍｋ６１Ａをカルシウムイオン法によりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１株（バイオメダル社製）へ導入し、形質転換体を得た。プラスミドの導入をＰＣＲにより確認した。形質転換体コロニーを、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢ培地３ｍＬにて３７℃で終夜振盪培養した後、０、０．１、２または５ｍＭいずれかの濃度のテオフィリンを加えた３ｍＬの同培地へ植え継ぎ、３７℃で６時間振盪培養した。また、コントロールとして、野生株をテオフィリンを含まない同培地で培養した。遠心分離により培養上清を除去した後、得られた菌体を蒸留水へ懸濁し、適当に希釈した。蛍光強度（Ｅｘ：４８８ｎｍ、Ｅｍ：５３０ｎｍ）を蛍光プレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ社製）で測定した。蛍光強度値はそれぞれのＯＤ６００で割った後、野生株（ブランク）におけるそれから差し引いた。図２に結果を示す。
【００４９】
［実施例２］  Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＢａｔｈにおけるｓｆＧＦＰ発現誘導
（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈへのｐｍｋ６１Ａの導入）
ｐｍｋ６１Ａは、Ａｌｉらにより報告された接合伝達を用いた形質転換法により、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈへ導入した（Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，２９３１−２９４２（２００９））。
【００５０】
まず、ｐｍｋ６１Ａをエレクトロポレーション法により、接合伝達の供与菌であるＥ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１へ導入した。形質転換体は、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地での生育を指標に選択し、プラスミドの配列はシーケンス解析により確認した。５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含んだＬＢ培地に形質転換体のコロニーを懸濁し、３７℃で終夜振盪培養した。５００μＬの終夜培養液を５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含んだ２５ｍＬのＬＢ培地へ植菌し、ＯＤ６００が０．５付近となるまで３７℃で振盪培養した。培養菌体を遠心分離により回収し、新鮮なＮＭＳ培地で３回洗浄後、１ｍＬの同培地へ懸濁した。
【００５１】
Ｓ１７−１の培養と同時に、接合伝達の受容菌であるＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ野生株（ＮＣＩＭＢ  １１１３２）を、新鮮なＮＭＳ培地１０ｍＬを含んだ１３０ｍＬ容の血清ボトルへＯＤ６００が０．０３になるように植菌した。ボトルはブチルゴムセプタムで密閉し、６０ｍＬのボトル内空気を同体積の１０％メタン／９０％窒素の混合ガスと交換した。ボトルは、４３℃で１８時間培養した。培養菌体を遠心分離により回収し、新鮮なＮＭＳ培地５ｍＬへ懸濁した。
【００５２】
ＯＤ６００と体積の積が、Ｓ１７−１とＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈとで１：５となるよう混合後、０．２２μｍのニトロセルロース膜（ミリポア社製）で濾過した。これを０．０２％のプロテオースペプトン（ディフコ社製）を含んだＮＭＳ寒天培地に載せ、５％メタン雰囲気下、３７℃で２４時間インキュベートした。メンブレン上の細胞を新鮮なＮＭＳ培地１０ｍＬで洗い流し、遠心分離で菌体を回収した後、１００μＬの同培地に再懸濁した。これを、７．５ｍｇ／Ｌカナマイシン、２５ｍｇ／Ｌナリジクス酸を含んだＮＭＳ寒天培地へ塗布し、５％メタン雰囲気下、４３℃の条件でコロニーが出現するまでインキュベートした。得られたクローンはＰＣＲにより、プラスミドの存在を確認した。
【００５３】
（ｐｍｋ６１Ａを導入したＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ形質転換体におけるｓｆＧＦＰの発現誘導）
形質転換体コロニーを、１０ｍｇ／Ｌカナマイシンおよび０、０．１、２、５、７．５または１０ｍＭいずれかの濃度のテオフィリンを加えたＮＭＳ培地１０ｍＬを含んだ１３０ｍＬ容の血清ボトルへ植菌した。また、コントロールとして、野生株をテオフィリンを含まない同培地へ植菌した。ボトルはブチルゴムセプタムで密閉し、６０ｍＬのボトル内空気を同体積の１０％メタン／９０％窒素の混合ガスと交換した。ボトルは、４３℃で２４時間培養した。培養液を新鮮なＮＭＳ培地で１０倍希釈し、蛍光強度（Ｅｘ：４８８ｎｍ、Ｅｍ：５３０ｎｍ）を蛍光プレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ社製）で測定した。蛍光強度値はそれぞれのＯＤ６００で割った後、野生株（ブランク）におけるそれから差し引いた。図３に結果を示す。大腸菌を用いた実験結果（図２）とは対照的に、非誘導時の蛍光は検出されなかった。同時に、テオフィリン濃度依存的に良好な発現誘導も示し、２ｍＭのテオフィリン添加時の蛍光強度は、大腸菌におけるそれと同等であった（図２）。
【００５４】
［実施例３］  Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ  ＡＳ１におけるｓｆＧＦＰ発現誘導
（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ  ＡＳ１へのｐｍｋ６１Ａの導入）
ｐｍｋ６１Ａは、Ｋｉｍらにより報告された接合伝達を用いた形質転換法により、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ  ＡＳ１（ＮＣＩＭＢ  １０５１５）へ導入した（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７３，８１−８８（１９９８））。
【００５５】
まず、ｐｍｋ６１Ａをエレクトロポレーション法により、接合伝達の供与菌であるＥ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１へ導入した。形質転換体は、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地での生育を指標に選択し、プラスミドの配列はシーケンス解析により確認した。５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含んだ５ｍＬのＬＢ培地に形質転換体のコロニーを懸濁し、３７℃で終夜振盪培養した。培養菌体を遠心分離により回収し、新鮮なＭＭ１培地で３回洗浄後、１ｍＬの同培地へ懸濁した。
【００５６】
Ｓ１７−１の培養と同時に、接合伝達の受容菌であるＭｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ  ＡＳ１野生株を、新鮮な０．５％メタノールを含むＭＭ１培地２５ｍＬへ植菌し、３０℃で終夜培養した。培養菌体を遠心分離により回収し、新鮮なＭＭ１培地５ｍＬへ懸濁した。
【００５７】
ＯＤ６００と体積の積が、Ｓ１７−１とＭｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ  ＡＳ１とで１：２となるよう混合後、０．２２μｍのニトロセルロース膜（ミリポア社製）で濾過した。これをＬＢ寒天培地に載せ、３７℃で２４時間インキュベートした。メンブレン上の細胞を新鮮なＭＭ１培地１０ｍＬで洗い流し、遠心分離で菌体を回収した後、１ｍＬの同培地に再懸濁し、１０２倍希釈したものを１０ｍｇ／Ｌカナマイシン、０．５％メタノールを含んだＭＭ１寒天培地へ塗布し、３７℃でコロニーが出現するまでインキュベートした。得られたクローンはＰＣＲにより、プラスミドの存在を確認した。
【００５８】
（ｐｍｋ６１Ａを導入したＭｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ  ＡＳ１形質転換体におけるｓｆＧＦＰの発現誘導）
形質転換体コロニーを、０．５％メタノール、１０ｍｇ／Ｌカナマイシンおよび０または２ｍＭいずれかの濃度のテオフィリンを加えたＭＭ１培地２５ｍＬへ植菌した。また、コントロールとして、野生株をテオフィリンを含まない同培地へ植菌した。３０℃で２４時間培養後、培養液を新鮮なＭＭ１培地で１０倍希釈し、蛍光強度（Ｅｘ：４８８ｎｍ、Ｅｍ：５３０ｎｍ）を蛍光プレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ社製）で測定した。蛍光強度値はそれぞれのＯＤ６００で割った後、野生株の自然蛍光値から差し引いた。図４に結果を示す。２ｍＭのテオフィリンで発現誘導した場合の発現強度は、非誘導時の２１倍であった。
【００５９】
［実施例４］  Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓにおけるｓｆＧＦＰ発現誘導
（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓへのｐｍｋ６１Ａの導入）
ｐｍｋ６１Ａは、Ｋｉｍらにより報告された接合伝達を用いた形質転換法により、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ（ＮＣＩＭＢ  １１３７５）へ導入した（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７３，８１−８８（１９９８））。
【００６０】
まず、ｐｍｋ６１Ａをエレクトロポレーション法により、接合伝達の供与菌であるＥ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１へ導入した。形質転換体は、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地での生育を指標に選択し、プラスミドの配列はシーケンス解析により確認した。５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含んだ５ｍＬのＬＢ培地に形質転換体のコロニーを懸濁し、３７℃で終夜振盪培養した。培養菌体を遠心分離により回収し、新鮮なＭＭ１培地で３回洗浄後、１ｍＬの同培地へ懸濁した。
【００６１】
Ｓ１７−１の培養と同時に、接合伝達の受容菌であるＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ野生株を、１％メタノールを含む新鮮なＭＭ１培地２５ｍＬへ植菌し、３０℃で終夜培養した。培養菌体を遠心分離により回収し、新鮮なＭＭ１培地５ｍＬへ懸濁した。
【００６２】
ＯＤ６００と体積の積が、Ｓ１７−１とＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓとで１：２となるよう混合後、０．２２μｍのニトロセルロース膜（ミリポア社製）で濾過した。これをＬＢ寒天培地に載せ、３０℃で２４時間インキュベートした。メンブレン上の細胞を新鮮なＭＭ１培地１０ｍＬで洗い流し、遠心分離で菌体を回収した後、１ｍＬの同培地に再懸濁し、１０５倍希釈したものを１０ｍｇ／Ｌカナマイシン、０．５％メタノールを含んだＭＭ１寒天培地へ塗布し、３０℃でコロニーが出現するまでインキュベートした。得られたクローンはＰＣＲにより、プラスミドの存在を確認した。
【００６３】
（ｐｍｋ６１Ａを導入したＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ形質転換体におけるｓｆＧＦＰの発現誘導）
形質転換体コロニーを、１％メタノール、１０ｍｇ／Ｌカナマイシンおよび０または２ｍＭいずれかの濃度のテオフィリンを加えたＭＭ１培地２５ｍＬへ植菌した。また、コントロールとして、野生株をテオフィリンを含まない同培地へ植菌した。３０℃で２４時間培養後、培養液を新鮮なＭＭ１培地で１０倍希釈し、蛍光強度（Ｅｘ：４８８ｎｍ、Ｅｍ：５３０ｎｍ）を蛍光プレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ社製）で測定した。蛍光強度値はそれぞれのＯＤ６００で割った後、野生株の自然蛍光値から差し引いた。図５に結果を示す。２ｍＭのテオフィリンで発現誘導した場合の発現強度は、非誘導時の４５倍であった。
【００６４】
［実施例５］  Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓにおけるｓｆＧＦＰ発現誘導
（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓへのｐｍｋ６１Ａの導入）
ｐｍｋ６１Ａは、エレクトロポレーション法により、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（ＮＣＩＭＢ  １１６２７）へ導入した（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７３，８１−８８（１９９８））。
【００６５】
Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ野生株を、１％メタノールを含む新鮮なＭＭ１培地２５ｍＬへ植菌し、３０℃で終夜培養した。培養菌体を遠心分離により回収し、新鮮なＭＭ１培地５ｍＬへ懸濁した。３０℃でコロニーが出現するまでインキュベートした。得られたクローンはＰＣＲにより、プラスミドの存在を確認した。
【００６６】
（ｐｍｋ６１Ａを導入したＰａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ形質転換体におけるｓｆＧＦＰの発現誘導）
形質転換体コロニーを、１０ｍｇ／Ｌカナマイシンおよび０または２ｍＭいずれかの濃度のテオフィリンを加えたＬＢ培地５ｍＬへ植菌した。また、コントロールとして、野生株をテオフィリンを含まない同培地へ植菌した。３０℃で３時間培養後、菌体を遠心分離により回収し、蒸留水へ懸濁した。蛍光強度（Ｅｘ：４８８ｎｍ、Ｅｍ：５３０ｎｍ）を蛍光プレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ社製）で測定した。蛍光強度値はそれぞれのＯＤ６００で割った後、野生株の自然蛍光値から差し引いた。図６に結果を示す。非誘導時の蛍光強度は小さく、２ｍＭのテオフィリンで発現誘導した場合の発現強度は、非誘導時の１５倍であった。
【００６７】
［実施例６］および［比較例１］  Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈへのリジン脱炭酸酵素遺伝子発現ベクターの導入
（プラスミドの構築）
リジン脱炭酸酵素をコードするｃａｄＡ遺伝子をｐｍｋ６１Ａへクローニングすることによりｐｍｋ９６およびｐｍｋ９９を構築した。Ｋｏｕらの報告をもとに、Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ由来のｃａｄＡは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社により合成された（Ｋｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，Ｖｏｌ．１３３，８８−９４（２０１６））。
【００６８】
ｐｍｋ９６の構築のために、ｃａｄＡ遺伝子領域はｍｋ４１２およびｍｋ４１３ＲによりＰＣＲ増幅した。次に、リボスイッチ領域を除いたベクター骨格をｍｋ４１４およびｍｋ４１５Ｒにより増幅した。これらの断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇキットにより連結し、ｐｍｋ９６を有するＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅのクローンを得た。プラスミドＤＮＡを常法により抽出後、シーケンス解析により、ｐｍｋ９６が正しく得られていることを確認した。
【００６９】
ｐｍｋ９９の構築のために、ｃａｄＡ遺伝子領域はｍｋ４２５およびｍｋ４２６ＲによりＰＣＲ増幅し、ベクター骨格をｍｋ４２７およびｍｋ４２８ＲによりＰＣＲ増幅した。これらの断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇキットにより連結し、ｐｍｋ９９を有するＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅのクローンを得た。プラスミドＤＮＡを常法により抽出後、シーケンス解析により、ｐｍｋ９９が正しく得られていることを確認した。図７にｐｍｋ９６およびｐｍｋ９９の概要を示す。また、上記配列を以下に示す。
【００７０】
【化４】
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2019154312.tif 000006
2019154312.tif 000007
【００７１】
【化５】
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【００７２】
（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈへのｐｍｋ９６およびｐｍｋ９９の導入）
まず、ｐｍｋ９６およびｐｍｋ９９をエレクトロポレーション法により、接合伝達の供与菌であるＥ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１へ導入した。形質転換体は、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地での生育を指標に選択し、プラスミドの配列はシーケンス解析により確認した。５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含んだＬＢ培地に形質転換体のコロニーを懸濁し、３７℃で終夜振盪培養した。５００μＬの終夜培養液を５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含んだ２５ｍＬのＬＢ培地へ植菌し、ＯＤ６００が０．５付近となるまで３７℃で振盪培養した。培養菌体を遠心分離により回収し、新鮮なＮＭＳ培地で３回洗浄後、１ｍＬの同培地へ懸濁した。
【００７３】
Ｓ１７−１の培養と同時に、接合伝達の受容菌であるＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ野生株（ＮＣＩＭＢ  １１１３２）を、新鮮なＮＭＳ培地１０ｍＬを含んだ１３０ｍＬ容の血清ボトルへＯＤ６００が０．０３になるように植菌した。ボトルはブチルゴムセプタムで密閉し、６０ｍＬのボトル内空気を同体積の１０％メタン／９０％窒素の混合ガスと交換した。ボトルは、４３℃で１８時間培養した。培養菌体を遠心分離により回収し、新鮮なＮＭＳ培地５ｍＬへ懸濁した。
【００７４】
ＯＤ６００と体積の積が、Ｓ１７−１とＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈとで１：５となるよう混合後、０．２２μｍのニトロセルロース膜（ミリポア社製）で濾過した。これを０．０２％のプロテオースペプトン（ディフコ社製）を含んだＮＭＳ寒天培地に載せ、５％メタン雰囲気下、３７℃で２４時間インキュベートした。メンブレン上の細胞を新鮮なＮＭＳ培地１０ｍＬで洗い流し、遠心分離で菌体を回収した後、１００μＬの同培地に再懸濁した。これを、７．５ｍｇ／Ｌカナマイシン、２５ｍｇ／Ｌナリジクス酸を含んだＮＭＳ寒天培地へ塗布し、５％メタン雰囲気下、４３℃の条件でコロニーが出現するまでインキュベートした。コロニーが得られた場合は、ＰＣＲによりプラスミドの存在を確認した。
【００７５】
形質転換の結果、ｐｍｋ９６の形質転換体は全く得られなかった一方で、ｐｍｋ９９の形質転換体のコロニーは多数獲得された。この結果は、非光栄養性Ｃ１代謝微生物の生育と競合するリジン脱炭酸酵素遺伝子の発現が、本発明の発現制御系によって限りなく小さく抑えられたことを意味している。
【００７６】
［実施例７］および［比較例２］  Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ  ＡＳ１へのリジン脱炭酸酵素遺伝子発現ベクターの導入
まず、ｐｍｋ９６およびｐｍｋ９９をエレクトロポレーション法により、接合伝達の供与菌であるＥ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１へ導入した。形質転換体は、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地での生育を指標に選択し、プラスミドの配列はシーケンス解析により確認した。５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含んだ５ｍＬのＬＢ培地に形質転換体のコロニーを懸濁し、３７℃で終夜振盪培養した。培養菌体を遠心分離により回収し、新鮮なＭＭ１培地で３回洗浄後、１ｍＬの同培地へ懸濁した。
【００７７】
Ｓ１７−１の培養と同時に、接合伝達の受容菌であるＭｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ  ＡＳ１野生株を、新鮮な０．５％メタノールを含むＭＭ１培地２５ｍＬへ植菌し、３０℃で終夜培養した。培養菌体を遠心分離により回収し、新鮮なＭＭ１培地５ｍＬへ懸濁した。
【００７８】
ＯＤ６００と体積の積が、Ｓ１７−１とＭｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ  ＡＳ１とで１：２となるよう混合後、０．２２μｍのニトロセルロース膜（ミリポア社製）で濾過した。これをＬＢ寒天培地に載せ、３７℃で２４時間インキュベートした。メンブレン上の細胞を新鮮なＭＭ１培地１０ｍＬで洗い流し、遠心分離で菌体を回収した後、１ｍＬの同培地に再懸濁し、１０２倍希釈したものを１０ｍｇ／Ｌカナマイシン、０．５％メタノールを含んだＭＭ１寒天培地へ塗布し、３７℃でコロニーが出現するまでインキュベートした。コロニーが得られた場合は、ＰＣＲによりプラスミドの存在を確認した。
【００７９】
形質転換の結果、ｐｍｋ９６の形質転換体は全く得られなかった一方で、ｐｍｋ９９の形質転換体のコロニーは多数獲得された。この結果も、非光栄養性Ｃ１代謝微生物の生育と競合するリジン脱炭酸酵素遺伝子の発現が、本発明の発現制御系によって限りなく小さく抑えられたことを意味している。
【００８０】
（プラスミドの寄託）
本明細書に記載したプラスミドｐｍｋ６１Ａは寄託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６２５として、プラスミドｐｍｋ９６は寄託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６２６として、およびプラスミドｐｍｋ９９は寄託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６２７として、日本国独立行政法人製品評価技術基盤機構に２０１８年２月１日付けで寄託されている。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明の核酸は、非光栄養性Ｃ１代謝微生物での、所望の条件に限定した遺伝子発現、遺伝子発現量の柔軟な調節、またこれらを通じて物質生産性能の最大化や遺伝子の生理学的性質の解明を図ることができるので、遺伝子工学に関連する産業において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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