(57)【要約】      （修正有）【課題】肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームの作製方法及び該プラットフォームを提供する。また、該プラットフォームを用いたゾーン特異的肝毒性の評価方法を提供する。【解決手段】肝細胞とゲル化剤を含有する培地とをチューブ内で混合することにより肝細胞をゲル化する工程と、ゲル化された細胞中で肝臓ゾーネーション因子を調節する物質の濃度勾配を形成し、続いて培養を行う工程と、を含む、肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームの作製方法。該プラットフォームは、ｉｎ  ｖｉｖｏ肝臓組織と同様にゾーン１〜３の３つのゾーンに分けられるため、肝臓内の薬物のゾーン特異的肝毒性を、それを用いて評価でき、また、画像解析を用いてゾーン特異的肝毒性の結果を定量的に分析できるため、ゾーン特異的肝毒性のｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングに効果的に使用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを作製する方法であって、
肝細胞とゲル化剤を含有する培地とをチューブ内で混合することにより肝細胞をゲル化する工程と、
工程１）のゲル化された細胞中で肝臓ゾーネーション因子又は肝臓ゾーネーション因子を調節する物質の濃度勾配を形成し、続いて培養を行う工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
前記ゲル化剤が０．５％〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度で含まれる、請求項１に記載の肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを作製する方法。
【請求項３】
工程１）の前記肝細胞の密度が０．５×１０２細胞／ｍｌ〜１×１０１０細胞／ｍｌである、請求項１に記載の肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを作製する方法。
【請求項４】
培養培地が前記細胞及び前記ゲル化剤を１：０．１〜１０の体積比で含有する、請求項１に記載の肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを作製する方法。
【請求項５】
前記ゲル化剤がアガロース、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸、ヒアルロン酸及びマトリゲルからなる群から選択される１つ以上である、請求項１に記載の肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを作製する方法。
【請求項６】
前記肝臓ゾーネーション因子がβ−カテニン、酸素、過酸化水素、二酸化炭素、３−メチルコラントレン、ＣＹＰ誘導剤、ＣＹＰ阻害剤及びインスリンからなる群から選択される１つ以上である、請求項１に記載の肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを作製する方法。
【請求項７】
前記肝臓ゾーネーション因子を調節する物質がＣＨＩＲ、Ｗｎｔ３タンパク質、酸素、過酸化水素、インスリン及び３−メチルコラントレンからなる群から選択される１つ以上である、請求項１に記載の肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを作製する方法。
【請求項８】
前記濃度勾配が、前記チューブの両端の前記肝臓ゾーネーション因子又は前記肝臓ゾーネーション因子を調節する物質の拡散によって形成される、請求項１に記載の肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを作製する方法。
【請求項９】
前記培養を３日間〜２０日間行う、請求項１に記載の肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを作製する方法。
【請求項１０】
前記チューブがポリオレフィン、ポリジメチルシロキサン、シリコーン、ガラス及びラテックスからなる群から選択される１つ以上の材料で作られている、請求項１に記載の肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォーム及びそれを用いたゾーン特異的肝毒性の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓組織は、肝小葉と呼ばれる六角形の単位構造からなる。肝小葉は、中心部の肝静脈（ＣＶ）と周縁部の門脈三つ組（ＰＴ）とを含む。肝臓組織では、血液が栄養素、ホルモン、老廃物及び他のシグナル伝達分子を門脈三つ組から肝静脈へと、類洞と呼ばれる経路を介して運ぶ。
【０００３】
血液が類洞を通って流れる間に、肝臓細胞は、血液との相互作用により栄養供給を受け、更にはシグナル伝達分子を交換する。そのため、門脈三つ組に近い肝臓細胞が初めに栄養、酸素及びホルモン等の因子を消費し、それに応じて、かかる因子の濃度勾配が類洞に沿って形成される。ｉｎ  ｖｉｖｏ環境の違いのために、肝臓細胞は、それらが属する位置に応じて機能的不均一性を有し、例えば、肝細胞はアンモニア解毒、グルコース及びエネルギーの代謝、又は外部物質代謝等の異なる機能を有する。
【０００４】
概して、肝静脈に対する領域は、以下のように門脈三つ組に基づいて分けられる。門脈三つ組の周辺の領域がゾーン１（門脈周辺部（periportal area）、ＰＰ）であり、肝静脈の周辺の領域がゾーン３（静脈周辺部（perivenous area）、ＰＶ）であり、中間部がゾーン２（中間帯部（midzonal area））である。そのため、上記のような肝小葉のゾーン分けが肝臓ゾーネーションと呼ばれる。このような肝小葉の分割は、肝臓ゾーネーションと呼ばれる。
【０００５】
酸素を豊富に含む血液が流れるゾーン１の肝臓細胞では、糖新生、β−酸化、コレステロール合成、及び尿素形成等のような機能が活性化される。これらのゾーン１の肝臓細胞は、活性酸素の影響を受けやすいが、迅速な回復を示す。一方、酸素が不足した血液が流れるゾーン３の肝臓細胞では、シトクロムＰ４５０が高度に活性化されるため、薬物代謝に優れるだけでなく、脂質生成、解糖、胆汁酸合成及びグルタミン合成等の機能も活性化される。それにより、複雑な肝臓機能を同時に達成するために肝小葉がゾーン分けされ、異なる機能が割り当てられることが示唆される。
【０００６】
薬物により誘導される肝毒性についての研究は、新薬の開発において薬物安全性を保証するために不可欠のプロセスである。様々な分析法がこの目的で開発されている。例えば、初代ヒト肝細胞が、第一相酵素及び第二相酵素の発現を検査することによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの肝毒性の評価に有用である。しかしながら、初代ヒト肝細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの不安定な表現型、個体差、困難な操作及び高いコストという不利点を有することから、使用に制限がある。このため、上記の問題を克服するために、初代ヒト肝細胞に取って代わることが可能な様々な細胞モデルが研究されている。これとの関連で、特許文献１は、ヒト幹細胞に由来する肝細胞を用いた免疫に基づく肝毒性の肝毒性スクリーニングの方法を記載している。
【０００７】
毒性評価のための肝細胞モデルが肝細胞自体の薬物代謝を高めるために主流として研究されているが、肝組織の機能は未だ研究されていない。また、毒性評価のための肝細胞モデルの研究は、主に肝細胞自体の薬物代謝を増大する方法に焦点を合わせており、肝組織の微小環境に応じた肝組織の機能についての研究は殆ど進められていない。
【０００８】
肝組織における毒性は、複合条件下で誘導される。そのため、肝毒性の正確な評価及び予測のために、肝細胞自体の機能だけでなく、肝組織の微小環境も反映する肝毒性評価モデルを開発する必要がある。特に、薬物代謝環境が肝小葉のゾーンに応じて異なるため、薬物により誘導される毒性はゾーンによって異なる。したがって、かかるｉｎ  ｖｉｖｏ環境を反映する肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォーム及びそれを用いたゾーン特異的肝毒性の評価方法を開発することが必要とされている。
【０００９】
本発明者らは、肝臓組織のｉｎ  ｖｉｖｏ環境を模倣する細胞モデルの開発を試みた。本発明者らの研究の過程で、本発明者らは、肝細胞とアガロースを含有する培地とをチューブ内で混合することにより肝細胞をゲル化し、ゲル化された細胞中でＣＨＩＲの濃度勾配を形成するプロセスによって肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを調製することに成功した。また、この肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームがゾーンに応じた薬物代謝活性の違いを示し、この肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを用いた肝毒性評価の結果が、動物モデルを用いた肝毒性評価の結果と一致することが本発明者らにより更に確認され、本発明の完成に至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】韓国特許出願公開第１０−２０１５−０１０３４３１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを作製する方法、及び上記の方法によって調製される肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、上記の肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを用いた肝毒性のスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の目的を達成するために、本発明は、肝細胞とゲル化剤を含有する培地とをチューブ内で混合することにより肝細胞をゲル化する工程と、ゲル化された細胞中で肝臓ゾーネーション因子又は肝臓ゾーネーション因子を調節する物質の濃度勾配を形成し、続いて培養を行う工程とを含む、肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを作製する方法を提供する。
【００１４】
本発明は、本発明の方法によって調製される肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームも提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、細胞生存性を分析するために本発明の肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを断片化する工程を含む、ゾーン特異的肝毒性のスクリーニング方法を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の方法に従って調製される肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームは、ｉｎ  ｖｉｖｏ肝臓組織と同様にゾーン１、ゾーン２及びゾーン３の３つのゾーンに分けられるため、肝臓内の薬物のゾーン特異的肝毒性を、それを用いて評価することができる。本発明によると、画像解析を用いることによってゾーン特異的肝毒性の結果を定量的に分析することができることから、本発明のプラットフォームをゾーン特異的肝毒性のｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングに効果的に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明による肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを作製する方法を説明する概念図と、上記の方法によって調製される肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを用いて肝毒性を評価する方法を説明する概要図との組である。
【図２Ａ】本発明の肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームにおけるＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ２Ｅ及びＣＹＰ３Ａ４のゾーン特異的発現変化を説明するグラフである。
【図２Ｂ】本発明の肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームにおけるＣＹＰ１Ａのゾーン特異的活性変化を説明するグラフである。
【図２Ｃ】本発明の肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームにおけるＣＹＰ２Ｅのゾーン特異的活性変化を説明するグラフである。
【図２Ｄ】本発明の肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームにおけるＣＹＰ３Ａ４のゾーン特異的活性変化を説明するグラフである。
【図３Ａ】本発明の肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームをアセトアミノフェンで処理した後に細胞染色（ｃｅｌｌ  ｔｒａｃｋｅｒ  ｄｅｅｐ  ｒｅｄ蛍光）によって調査されたゾーン特異的肝毒性を説明するグラフ及び写真の組である。
【図３Ｂ】本発明の肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームをアセトアミノフェンで処理した後に細胞染色ＣＨＩＲによって調査されたゾーン特異的肝毒性を説明するグラフ及び写真の組である。
【図３Ｃ】本発明の肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームをアセトアミノフェンで処理した後にアポトーシス細胞染色（ＥｔｈＤ−１）によって調査されたゾーン特異的肝毒性を説明するグラフ及び写真の組である。
【図４】本発明の肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームをアセトアミノフェン（Ａ）又はタモキシフェン（Ｂ）で処理した後に評価されたゾーン特異的肝毒性を説明するグラフの組である。
【図５】アセトアミノフェン又はタモキシフェンで処理したラットモデルの肝臓組織における肝毒性を説明する写真の組である（図５(続き)；黄色（Ｙ）：有糸分裂の増加、青色（Ｂ）：壊死、緑色（Ｇ）：炎症性細胞浸潤）。
【図６】本発明の肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームをアセトアミノフェンで処理した後のＣＹＰ２Ｅ１、ＰＡＲＰ又はβ−カテニンタンパク質のゾーン特異的発現パターンを説明する写真の組である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明は、肝細胞とゲル化剤を含有する培地とをチューブ内で混合することにより肝細胞をゲル化する工程と、ゲル化された細胞中で肝臓ゾーネーション因子又は肝臓ゾーネーション因子を調節する物質の濃度勾配を形成し、続いて培養を行う工程とを含む、肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを作製する方法を提供する。
【００２０】
本発明の肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを作製する方法では、肝細胞は当業者に既知の任意の細胞とすることができる。肝細胞は初代培養肝細胞、不死化肝細胞、又は幹細胞から分化した肝細胞であり得る。特に、肝細胞はＨｅｐＧ２、ＨｅｐａＲＧ、Ｈｅｐ３Ｂ及びＨｕｈ７からなる群から選択される１つ以上の細胞株であり得る。肝細胞の好ましい密度は、０．５×１０２細胞／ｍｌ〜１×１０１０細胞／ｍｌ、１×１０３〜１０１０細胞／ｍｌ、１×１０４〜１０１０細胞／ｍｌ、１×１０４〜１０７細胞／ｍｌ、０．５×１０２〜１０９細胞／ｍｌ、０．５×１０２〜１０８細胞／ｍｌ、０．５×１０２〜１０７細胞／ｍｌ、０．５×１０２〜１０６細胞／ｍｌ、１×１０３〜１０８細胞／ｍｌ又は１×１０４〜１０７細胞／ｍｌである。
【００２１】
本発明で使用される「ゲル化剤」という用語は、流動性を有する流体を固体、より正確には細胞培養培地に加えることができる物質に変換し、固形タイプの培養培地を調製する物質を指す。ゲル化剤は、細胞増殖に影響を及ぼさない限りは特に限定されない。例えば、ゲル化剤はアガロース、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸、ヒアルロン酸及びマトリゲル等であり得る。ゲル化剤は、当業者によって決定される適切な量で添加することができ、具体的には０．５％〜１０％（ｗ／ｖ）、０．５％〜８％（ｗ／ｖ）、０．５％〜６％（ｗ／ｖ）、０．５％〜４％（ｗ／ｖ）、０．５％〜２％（ｗ／ｖ）、０．７％〜１０％（ｗ／ｖ）、０．７％〜８％（ｗ／ｖ）、０．７％〜６％（ｗ／ｖ）、０．７％〜４％（ｗ／ｖ）又は０．７％〜２％（ｗ／ｖ）の濃度で含有され得る。
【００２２】
肝細胞の培養に使用されることが知られる任意の培養培地を、ゲル化剤を含有する培養培地として選択することができる。培養培地に添加される抗生物質、及びサプリメント等を、当業者は必要に応じて適切に選択し、使用することができる。
【００２３】
本発明の作製方法では、培養培地は、肝細胞とゲル化剤とを１：０．１〜１０、１：０．１〜５、１：０．１〜４、１：０．１〜３、１：０．１〜２、１：０．５〜１０、１：０．５〜５、１：０．５〜４、１：０．５〜３、又は１：０．５〜２の体積比で含有することができる。上記の範囲の体積比で細胞とゲル化剤とを含有する培養培地をチューブに充填し、続いてゲル化を行う。チューブは、等からなる群から選択される少なくとも１つで作ることができる。
【００２４】
本発明で使用される「肝臓ゾーネーション因子」という用語は、ｉｎ  ｖｉｖｏで肝臓ゾーネーションに関与することが知られる因子を指す。ゾーン１に存在する肝細胞が酸素に富む一方で、ゾーン３に存在する肝細胞には酸素が不足している。そのため、肝臓ゾーネーション因子は、酸素を増加又は減少させることによって肝細胞をゾーン分けすることができる因子であり得る。例えば、肝臓ゾーネーション因子はＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達調節物質、酸素濃度勾配調節物質、代謝調節物質及びホルモン調節物質からなる群から選択される１つ以上の因子であり得る。特に、肝臓ゾーネーション因子はβ−カテニン、酸素、過酸化水素、二酸化炭素、３−メチルコラントレン、ＣＹＰ誘導剤、ＣＹＰ阻害剤及びインスリンを含み得る。
【００２５】
本発明で使用される「肝臓ゾーネーション因子を調節する物質」という用語は、上記のような肝臓ゾーネーション因子を調節することができる物質を指す。特に、肝臓ゾーネーション因子を調節する物質は、上記のような肝臓ゾーネーション因子を調節することが知られる任意の物質を含み得る。例えば、肝臓ゾーネーション因子を調節する物質はＣＨＩＲ、Ｗｎｔ３タンパク質、酸素、過酸化水素、インスリン及び３−メチルコラントレン等を含み得る。
【００２６】
本発明の作製方法では、肝臓ゾーネーション因子又は肝臓ゾーネーション因子を調節する物質は、ゲル化された細胞の両端に位置付けることができる。ゲル化された細胞の両端に位置付けた肝臓ゾーネーション因子又は肝臓ゾーネーション因子を調節する物質は、ゲル化された細胞中に拡散し、それにより濃度勾配を形成する。肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームは、そのように濃度勾配が肝臓ゾーネーション因子又は肝臓ゾーネーション因子を調節する物質によって形成された、ゲル化された細胞を培養することによって作製することができる。本明細書の培養は概して、肝臓ゾーネーションのプロセス中に行うことができ、より具体的には、培養の期間は３日間〜２０日間、３日間〜１５日間、３日間〜１０日間、３日間〜８日間、４日間〜２０日間、４日間〜１５日間、４日間〜１０日間、４日間〜８日間、５日間〜２０日間、５日間〜１５日間、５日間〜１０日間、５日間〜８日間、６日間〜２０日間、６日間〜１５日間、６日間〜１０日間又は６日間〜８日間であり得る。
【００２７】
本発明の一実施形態では、肝細胞の細胞株ＨｅｐａＲＧとアガロースを含有する培養培地とを混合し、混合物をポリオレフィンチューブに注入し、ゲル化した。ゲル化された肝細胞中にＣＨＩＲの濃度勾配を形成するために、ＤＭＳＯ及びＣＨＩＲをゲル化された肝細胞が入ったポリオレフィンチューブの両端に配置した。肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを、ゲル化された肝細胞を７日間培養することによって作製した（図１を参照されたい）。ＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ２Ｅ及びＣＹＰ３Ａ４の発現及び活性は、調製された肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームにおいて高濃度のＣＨＩＲに曝露した肝細胞中で増大した（図２Ａ〜図２Ｄを参照されたい）。
【００２８】
したがって、肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを、ゲル化された肝細胞中でゾーネーションを誘導する因子の濃度勾配を形成することによって調製することが可能であることが確認された。
【００２９】
本発明は、本発明の作製方法によって調製される肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームも提供する。
【００３０】
本発明の肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームは、上記の作製方法によって調製することができる。例としては、肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームは、肝細胞をチューブ内でゲル化し、肝臓ゾーネーション因子又は肝臓ゾーネーション因子を調節する物質の濃度勾配をゲル化された肝細胞の両端で形成し、それを培養することによって調製することができる。ゲル化剤は、細胞増殖に影響を及ぼさない限りは特に限定されない。例えば、ゲル化剤はアガロース、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸、ヒアルロン酸及びマトリゲル等であり得る。
【００３１】
肝臓ゾーネーション因子はＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達調節物質、酸素濃度勾配調節物質、代謝調節物質及びホルモン調節物質からなる群から選択される１つ以上の因子であり得る。一方、肝臓ゾーネーション因子を調節する物質はＣＨＩＲ、Ｗｎｔ３タンパク質、酸素、過酸化水素、インスリン及び３−メチルコラントレン等であり得る。
【００３２】
培養は概して、肝臓ゾーネーションの進行と共に行うことができる。
【００３３】
本発明の一実施形態では、肝細胞の細胞株ＨｅｐａＲＧとアガロースを含有する培養培地とを混合し、混合物をポリオレフィンチューブに注入し、ゲル化した。ゲル化された肝細胞中にＣＨＩＲの濃度勾配を形成するために、ＤＭＳＯ及びＣＨＩＲをゲル化された肝細胞が入ったポリオレフィンチューブの両端に配置した。肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを、ゲル化された肝細胞を７日間培養することによって作製した（図１を参照されたい）。ＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ２Ｅ及びＣＹＰ３Ａ４の発現及び活性は、調製された肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームにおいて高濃度のＣＨＩＲに曝露した肝細胞中で増大した（図２Ａ〜図２Ｄを参照されたい）。
【００３４】
したがって、肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを、ゲル化された肝細胞中でゾーネーションを誘導する因子の濃度勾配を形成することによって調製することが可能であることが確認された。
【００３５】
加えて、本発明は、細胞生存性を分析するために本発明の肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを断片化する工程を含む、ゾーン特異的肝毒性のスクリーニング方法を提供する。
【００３６】
本発明の肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームは、上記の作製方法によって調製することができる。例としては、肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームは、肝細胞をチューブ内でゲル化し、肝臓ゾーネーション因子又は肝臓ゾーネーション因子を調節する物質の濃度勾配をゲル化された肝細胞の両端で形成し、それを培養することによって調製することができる。ゲル化剤は、細胞増殖に影響を及ぼさない限りは特に限定されない。例えば、ゲル化剤はアガロース、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸、ヒアルロン酸及びマトリゲル等であり得る。
【００３７】
肝臓ゾーネーション因子はＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達調節物質、酸素濃度勾配調節物質、代謝調節物質及びホルモン調節物質からなる群から選択される１つ以上の因子であり得る。一方、肝臓ゾーネーション因子を調節する物質はＣＨＩＲ、Ｗｎｔ３タンパク質、酸素、過酸化水素、インスリン及び３−メチルコラントレン等であり得る。
【００３８】
培養は概して、肝臓ゾーネーションの進行と共に行うことができる。
【００３９】
本発明の作製方法によって調製される肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームは、ゾーン１〜ゾーン３にゾーン分けされるという特徴がある。そのため、ゾーンによって異なる特徴を有する肝細胞は、肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームをセグメント化することによって得ることができる。得られる肝細胞を９６ウェルプレートに分配し、続いて細胞生存性又は肝毒性に関連する遺伝子又はタンパク質の調査を行い、肝毒性の評価を得ることができる。細胞生存性又は肝毒性に関連する遺伝子又はタンパク質の調査は、当業者に既知の一般的方法によって行うことができる。例えば、細胞生存性の調査は、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）、ＸＴＴ（ナトリウム３’−［１−［（フェニルアミノ）−カルボニル］−３，４−テトラゾリウム］−ビス（４−メトキシ−６−ニトロ）ベンゼン−スルホン酸水和物）、ＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム））、ＷＳＴ（テトラゾリウム塩）、ＮＲＵ（ニュートラルレッド取込み）及びカルセインＡＭからなる群から選択される１つ以上の試薬を用いることによって行うことができる。一方、肝毒性に関連する遺伝子又はタンパク質の調査はＰＣＲ、ウエスタンブロット法等によって行うことができる。
【００４０】
本発明の一実施形態では、本発明者らは、ポリオレフィンチューブに注入し、ゲル化した肝細胞中でＣＨＩＲの濃度勾配を形成することによって肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを作製した。
【００４１】
一方、肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを、肝毒性を評価するためにアセトアミノフェンで処理した、ｃｅｌｌ  ｔｒａｃｋｅｒ  ｄｅｅｐ  ｒｅｄを用いて蛍光トレース可能なＨｅｐａＲＧ細胞を用いることによって作製した。結果として、細胞及びＣＨＩＲは、アセトアミノフェンへの曝露に関わらず分散したが、アセトアミノフェンによって死滅した細胞は、高濃度のＣＨＩＲに曝露した肝細胞中でより多かった（図３Ａ〜図３Ｃを参照されたい）。
【００４２】
肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを、ゾーン特異的肝毒性を示さないタモキシフェン及びゾーン３特異的肝毒性を示すアセトアミノフェンで処理し、続いて肝毒性の評価を行った。結果として、タモキシフェンがゾーンに関わらず肝毒性を誘導した一方で、アセトアミノフェンはゾーン３特異的肝毒性を誘導した。これらの結果は、ラット動物モデルを用いた実験結果と一致していた（図４及び図５を参照されたい）。
【００４３】
加えて、壊死関連タンパク質が切断された切断型ＰＡＲＰの発現は、アセトアミノフェンにより誘導される肝毒性を示す肝細胞中で増大した（図６を参照されたい）。
【００４４】
したがって、本発明の作製方法によって調製される肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを、肝毒性物質のスクリーニングに使用することができることが確認された。
【００４５】
本発明の実際的な、現在好ましい実施形態は、以下の実施例に示されるように説明されるものである。
【００４６】
しかしながら、当業者が本開示を検討することで本発明の趣旨及び範囲に含まれる修正及び改善を行うことができることが理解される。
【実施例】
【００４７】
実施例１：肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームの調製
肝臓を構成する構造単位である肝小葉の模倣物を、以下のようにゾーン分けされた形態で調製した（図１）。この際に、β−カテニンの量を増加させることにより、薬物代謝効率を上昇させ、肝臓ゾーンに応じて異なる薬物反応を引き起こすＣＨＩＲ（Ｃ６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル））を使用した。
【００４８】
初めに、完全に分化したＨｅｐａＲＧ細胞（Biopredic Internation）を、細胞を０．１％ＤＭＳＯ、１％Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、５μｇ／ｍｌのインスリン及び５０μＭヒドロコルチゾンを添加したウィリアムＥ培養培地（Gibco）中で培養することによって調製した。調製した細胞を、培地が１０％ＦＢＳの代わりに２０％ＦＢＳを含有する以外は同じウィリアムＥ培養培地に１×１０５細胞／ｍｌの密度で懸濁した。
【００４９】
一方、２０ｍｇの低融点アガロースを２％Ｌ−グルタミン、２％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０μｇ／ｍｌのインスリン及び１０μＭヒドロコルチゾンを添加した１ｍｌのウィリアムＥ培養培地に添加し、続いて９０℃で２時間融解させて、固形培地を調製した。この際に、一般に使用されるアガロースは高い融点を有し、細胞を回復させるプロセス中に細胞が熱により損傷を受ける可能性があることから、低融点アガロースを使用した。懸濁した細胞を同量の調製培地に添加し、混合した。混合物を直径３ｍｍ、長さ９ｃｍのポリオレフィンチューブに注入した。この際に、混合物をチューブの中心に位置付けた。チューブを曲がらないように固定し、続いて３７℃でゲル化を行った。０．１％ＤＭＳＯ（ビヒクル）を含有するＨｅＰａＲＧ培養培地及び０．１％ＤＭＳＯに溶解した９μＭ  ＣＨＩＲ（β−カテニン阻害剤）を含有するウィリアムＥ培養培地を、ゲル化された細胞が入ったチューブの両端に位置付けた。すなわち、０．１％ＤＭＳＯ及びＣＨＩＲを溶解した０．１％ＤＭＳＯを上記のようにチューブの両端に配置することによって、ＣＨＩＲを拡散により移動させた。チューブを３７℃で７日間培養し、結果として肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームが調製された。
【００５０】
実施例２：肝臓ゾーネーション因子であるＣＨＩＲで処理したＨｅｐａＲＧ細胞における薬物代謝活性の調査
肝臓ゾーネーション因子であるＣＨＩＲで処理したＨｅｐａＲＧ細胞において薬物代謝活性がゾーンによって異なるか否かを調査するために以下の実験を行った。
【００５１】
初めに、実施例１において調製した肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを、ルシフェリン−１Ａ２（Promega，USA）及びルシフェリン−ＩＰＡ（Promega，USA）で処理した。次いで、ＣＹＰ１Ａ及びＣＹＰ３Ａ４薬物代謝酵素を、製造業者のプロトコルに従って測定した。一方、ＣＹＰ２Ｅを測定するために、肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを３００μＭのＣＹＰ２Ｅ特異的クロルゾキサゾンで処理した後、代謝産物である６−ヒドロキシクロルゾキサゾンをＬＣ／ＭＣによって測定し、ＣＹＰ２Ｅを評価した。
【００５２】
結果として、図２に示されるように、ＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ２Ｅ及びＣＹＰ３Ａ４の発現及び活性は、比較的高濃度のＣＨＩＲに曝露した肝細胞において増大した（図２Ａ〜図２Ｄ）。
【００５３】
したがって、細胞におけるβ−カテニンを分解する酵素であるＧＳＫ−３Ｂの発現が、肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームに対するＣＨＩＲ処理によって阻害されたことから、ＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ２Ｅ及びＣＹＰ３Ａ４の発現及び活性がβ−カテニンによって増大することが確認された。薬物代謝酵素活性の増大によりｉｎ  ｖｉｖｏ薬物代謝が加速することで、毒性の代謝産物が過剰産生された。
【００５４】
実験例１：肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを用いた肝毒性評価−（１）
調製した肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームをアセトアミノフェンで処理し、肝毒性を以下の方法によって評価した。
【００５５】
初めに、ＨｅｐａＲＧ細胞の位置をトレースするために、ｃｅｌｌ  ｔｒａｃｋｅｒ  ｄｅｅｐ  ｒｅｄ蛍光溶液を用いることによって不浸透性の蛍光物質をＨｅｐａＲＧ細胞内で形成した。肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを、実施例１に記載されるものと同じ条件及び同じ方法で、調製したＨｅｐａＲＧ細胞を用いて調製した。肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを、１０ｍＭアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）を添加した培養培地中で４８時間培養した。対照としてアセトアミノフェンを含まない培養培地を使用した。培養の終了後に培地を除去し、死細胞をＥｔｈＤ−１（エチジウムホモダイマー−１）で染色した。染色細胞における蛍光を、ｃｈｅｍｉ−Ｄｏｃ（Bio-Rad）を用いて６５０ｎｍ〜６５７ｎｍ、３０２ｎｍ及び６２５ｎｍ〜６５０ｎｍで測定し、ｄｅｅｐ  ｒｅｄ蛍光溶液、ＣＨＩＲ又はＥｔｈＤ−１で染色された細胞を検査した。
【００５６】
結果として、図３Ａに示されるように、ｃｅｌｌ  ｔｒａｃｋｅｒ  ｄｅｅｐ  ｒｅｄ蛍光溶液は、アセトアミノフェンへの曝露に関わらず細胞中で均一に分散した。図３Ｂに示されるように、ＣＨＩＲも拡散により均一に分散した。一方、図３Ｃに示されるように、死細胞のＥｔｈＤ−１染色は、比較的高濃度のＣＨＩＲに曝露した肝細胞において高い蛍光強度を示した（図３Ａ〜図３Ｃ）。
【００５７】
したがって、上記の結果から、肝小葉模倣物がＣＨＩＲ処理によってゾーン分けされ、アセトアミノフェンにより誘導される毒性がゾーン特異的であることが確認された。
【００５８】
実験例２：肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを用いた肝毒性評価−（２）
アセトアミノフェン及びタモキシフェンにより誘導される肝毒性を、調製した肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを用いて以下の方法によって評価した。
【００５９】
初めに、実施例１において調製した肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームが入った６本のチューブを、６つの均等なピースに分けた。各チューブから得た肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームの第１のピースを、９６ウェルプレートの１行目に各ウェルに１つずつ配置した。第２〜第６のピースもそれぞれ９６ウェルプレートの２行目〜６行目に配置し、ここで、０．１％ＤＭＳＯを含有する培地を培養培地として使用した。一方、ゾーン３特異的肝毒性を示す薬物であるアセトアミノフェン及びゾーン特異的肝毒性を示さないタモキシフェンを、肝毒性を評価するための薬物として使用した。特に、アセトアミノフェンをＤＭＳＯに２Ｍの濃度で溶解することによって粗液体を調製し、０．１％ＤＭＳＯを添加した培養培地に粗液体を１２．５ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ又は２００ｍＭの濃度で希釈した。一方、タモキシフェンをＤＭＳＯに１Ｍの濃度で溶解することによってタモキシフェン粗液体を調製し、０．１％ＤＭＳＯを添加した培養培地に粗液体を３１．２μＭ、６２．５μＭ、１２５μＭ、２５０μＭ又は５００μＭの濃度で希釈した。希釈した２００ｍＭアセトアミノフェン及び５００μＭタモキシフェンを９６ウェルプレートの１行目の各ウェルに添加し（２００μｌ／ウェル）、希釈した１００ｍＭアセトアミノフェン及び２５０μＭタモキシフェンを９６ウェルプレートの２行目の各ウェルに添加した（２００μｌ／ウェル）。このように、アセトアミノフェン及びタモキシフェンを含まない培地を、９６ウェルプレートの６行目の各ウェルに添加した。９６ウェルプレートを３７℃で４８時間培養した。反応の終了後に細胞をＰＢＳで洗浄し、ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（Dojindo Molecular Technologies）を用い、製造業者のプロトコルに従って細胞の吸光度を測定した。細胞生存性を測定された吸光度値から算出し、結果を図４に示す。
【００６０】
図４に示されるように、肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームの作製プロセスの過程で比較的高濃度のＣＨＩＲに曝露した肝細胞は、アセトアミノフェンにより誘導される毒性への感受性がより高かった（図４Ａ）。一方、タモキシフェンは、曝露したＣＨＩＲの濃度に関わらず肝細胞において低い細胞活性を示した（図４Ｂ）。
【００６１】
上記の結果から、アセトアミノフェンの代謝が、ＣＨＩＲが高濃度で分散した領域内に位置付けた肝細胞中で顕著に誘導され、結果として毒性の中間代謝産物が多量に生成し、ＣＨＩＲが高濃度で分散した領域内に位置付けた肝細胞が、ＣＨＩＲが低濃度で分散した領域内の肝細胞よりも細胞毒性への感受性が高いことが確認された。
【００６２】
実験例３：肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを用いた肝毒性評価−（３）
上記の肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを用いた肝毒性評価の結果と、動物モデルを用いた実験から得られた結果とを比較するために以下の実験を行った。
【００６３】
初めに、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに１０００ｍｇ／ｋｇのアセトアミノフェン又は６０ｍｇ／ｋｇのタモキシフェンを３日間にわたって１日１回経口投与した。投与後に動物を屠殺し、動物から肝臓組織を得た。得られた肝臓組織をＨ＆Ｅ染色し、続いて顕微鏡下での観察を行った。結果を図５に示す。
【００６４】
図５に示されるように、肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームを用いた上記の実験の結果と一致して、アセトアミノフェンにより誘導される毒性は、肝臓の中心静脈（ゾーン３）における有糸分裂（黄色の三角）、壊死（青色の三角）及び炎症性細胞浸潤（緑色の三角）を増加させた。一方、タモキシフェンは、ゾーンに関わらず肝臓における肝細胞肥大を誘導した（図５）。
【００６５】
したがって、本発明において調製される肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームが動物モデルと同様にゾーン特異的肝毒性を示すことが確認された。
【００６６】
実験例３：肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームにおけるタンパク質発現変化の調査
毒性を伴って誘導される又は毒性を伴わずに誘導される、肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームにおける肝毒性関連タンパク質の発現の変化をウエスタンブロット法によって調査した。
【００６７】
特に、実施例１において調製した肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームが入った３本のチューブを、３つの均等なピースに分けた。各チューブから得た肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームの第１のピースを、６ウェルプレートの１行目に各ウェルに１つずつ配置した。第２及び第３のピースもそれぞれ６ウェルプレートの２行目及び３行目に配置し、ここで、０．１％ＤＭＳＯを含有する培地を培養培地として使用した。アセトアミノフェンをこれに１０ｍＭの濃度で添加し、続いて４８時間の培養を行った。培養の終了後に５倍ＲＩＰＡバッファー及び４倍サンプルバッファーを各ウェルに添加し、続いて９０℃で１０分間加熱して、アガロースゲルを融解させた。３単位〜５単位のアガラーゼをこれに添加し、続いて４２℃で９０分間撹拌した。撹拌後に、得られたタンパク質を１０ウェル勾配ゲル上にロードし、続いて８０Ｖでおよそ２時間の電気泳動を行った。電気泳動したタンパク質をセルロースシートに転写し、セルロースシートを１０％スキムミルクで前処理した。一次抗体として、β−カテニン、ＣＹＰ２Ｅ１又はＰＡＲＰ抗体をこれに添加し、続いて反応を行った。次いで、タンパク質発現を確認した。
【００６８】
結果として、図６に示されるように、β−カテニン及びＣＹＰ２Ｅ１タンパク質の発現は、肝臓ゾーネーションによりゾーン３に位置付けた肝細胞において、ゾーン１に位置付けた肝細胞と比較して増大した。アセトアミノフェンで処理した肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームでは、壊死関連タンパク質である切断型ＰＡＲＰがゾーン３に存在する肝細胞中で検出された（図６）。
【００６９】
したがって、本発明による肝臓ゾーネーションを模倣する微細加工プラットフォームをゾーン特異的肝毒性の評価に効果的に使用することができることが確認された。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【外国語明細書】
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