(57)【要約】 【課題】培養液中の受精卵の洗浄までの工程を時間短縮する。【解決手段】培養液に５１０ｎｍ〜５４０ｎｍの緑色光を照射し、ガラスキャピラリ―により培養液を毛細管現象によりガラスキャピラリ―に吸い込み、ガラスキャピラリ―内に圧力をかけて、培養液部分を卵丘細胞等の大きなゴミを細かくするのに有効な吐出時間・吐出量・吐出圧力・吐出スピードで吐出し、卵丘細胞等の大きなゴミを細かくするのに有効な所定の間隔でかつ該吸引・吐出工程を卵丘細胞等の大きなゴミが所望の細分化状態となる回数だけ繰り返し、該培養液を静置することによって、受精卵の層と該細分化された卵丘細胞等のゴミの層とをそれぞれ下層と上層に分離し、該受精卵の下層から該細分化された卵丘細胞等のゴミ下層を除去する、培養液中の卵丘細胞等の大きなゴミを受精卵から分離・除去する方法。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１．培養ディッシュ中の受精卵及び卵丘細胞等の大きなゴミを含む培養液に５１０ｎｍ〜５４０ｎｍの緑色光を照射して、受精卵を卵丘細胞等の大きなゴミから明瞭に見分けられるようにし、
２．ガラスキャピラリ―を用いて、培養ディッシュの培養液中の受精卵及び卵丘細胞等の大きなゴミを含む培養液部分を毛細管現象によりガラスキャピラリ―に吸い込み、
３．ガラスキャピラリ―内に圧力をかけて、吸い込んだ該培養液部分を卵丘細胞等の大きなゴミを細かくするのに有効な吐出時間・吐出量・吐出圧力・吐出スピードで培養ディッシュ中に吐出し、
４．該卵丘細胞等の大きなゴミを細かくするのに有効な所定の間隔でかつ該吸引・吐出工程を卵丘細胞等の大きなゴミが所望の細分化状態となる回数だけ繰り返し、
５．該培養液を静置することによって、受精卵の層と該細分化された卵丘細胞等のゴミの層とをそれぞれ下層と上層に分離し、該受精卵の下層から該細分化された卵丘細胞等のゴミ下層を除去する、培養液中の卵丘細胞等の大きなゴミを受精卵から分離・除去する方法。
【請求項２】
該第５工程において該ゴミ上層を複数段階に分けて該受精卵下層から分離・除去する、請求項１に記載の培養液の卵丘細胞等の大きなゴミ層を受精卵から分離・除去する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵丘細胞等の大きなゴミ層を含む培養液から受精卵を分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリジンの生体（自然交配で得られた受精卵）では、排卵される卵子の数は、生まれてくる匹数に見あうような卵子数が排卵されると予想される。つまり、一回の出産に10匹前後を想定すると、排卵される卵の数はそれと同数か、あるいはそれより少し多め（10−20個まで）と予想される。そのため、通常の交配で精子が卵子に到達する過程では、オリジンの生体では、自然の力で卵丘細胞がバラバラになる程度のゴミしか出ない。
過排卵状態になるよう通常ホルモン剤（PMSG）を投与されたメスマウスを使用した場合でも、自然交配により得られる受精卵は、体外受精（IVF）より得られる卵子塊より卵子塊が小さい、もしくは卵子塊が緩い状態、あるいは卵の周りに卵丘細胞がすでにない状態になっている。
自然交配の場合、すでにメスマウス体内で受精が完了しているため、精子が受精のために泳ぎ回る際に、その過程で精子は成熟し、精子頭よりヒアルロニダーゼを放出し、卵丘細胞はバラバラに崩れ、あるいは緩くなっているため、問題になることはあまりない。
【０００３】
一方、体外受精は、卵子をいったん体外に取り出し、採取した精子と受精させて受精卵をつくり、細胞分裂が始まってある程度受精卵が発達したことを確認してから女性の体内に戻すという方法である。
この場合、体外受精をするために、マウス個体に過排卵誘起剤を投与し、通常より多くの卵が取れるように排卵を促し、過排卵状態にあるメスマウス卵管膨大部より卵子塊を採取するが、過排卵状態のため、採取した卵子塊はかなり大きく、その分卵丘細胞等の不要な大きなゴミが多くなる。その後、人工授精すると、卵子塊は精子により受精卵とバラバラになった卵丘細胞等の大きなゴミとなる。大きなゴミは卵丘細胞と卵母細胞のマトリックスとなっているため、卵子が多いということは、必然的に卵丘細胞も多くなり、卵丘細胞と卵母細胞のマトリックスも多くなる。特に、人工授精用に開発された過剰排卵誘起剤HyperOVA（特許第5927588）を使用する場合では、卵丘細胞と卵母細胞のマトリックスが非常に多い状態となる。
現在、受精卵をtubeで輸送の際、浮遊状態の受精卵を培養液から回収する目的で室温３０分間静置するという方法が取られている。受精卵を含む培養液を静置すれば受精卵が重力によって沈み、受精卵のみを輸送することができることは広く知られている。この方法は、輸送された受精卵を受け入れ先で確実に全部沈降させて回収し、最初からゴミが全くない状況での輸送後の回収方法に関するものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】熊本大学  マウス生殖工学技術マニュアル、「2細胞期胚の冷蔵保存・輸送のプロトコル」、2001 年1 月1日発行。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、短時間で受精卵を卵丘細胞等の大きなゴミを含む培養液から分離することを可能とする方法を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（１）本発明に係る培養液中の卵丘細胞等の大きなゴミから受精卵を分離・除去する方法は、次の通りである。
（請求項１）
１．培養ディッシュ中の受精卵及び卵丘細胞等の大きなゴミを含む培養液に５１０ｎｍ〜５４０ｎｍの緑色光を照射して、受精卵を卵丘細胞等の大きなゴミから明瞭に見分けられるようにし、
２．ガラスキャピラリ―を用いて、培養ディッシュの培養液中の受精卵及び卵丘細胞等の大きなゴミを含む培養液部分を毛細管現象によりガラスキャピラリ―に吸い込み、
３．ガラスキャピラリ―内に圧力をかけて、吸い込んだ該培養液部分を卵丘細胞等の大きなゴミを細かくするのに有効な吐出時間・吐出量・吐出圧力・吐出スピードで培養ディッシュ中に吐出し、
４．該卵丘細胞等の大きなゴミを細かくするのに有効な所定の間隔でかつ該吸引・吐出工程を卵丘細胞等の大きなゴミが所望の細分化状態となる回数だけ繰り返し、
５．該培養液を静置することによって、受精卵の層と該細分化された卵丘細胞等のゴミの層とをそれぞれ下層と上層に分離し、該受精卵の下層から該細分化された卵丘細胞等のゴミ下層を除去する、培養液中の卵丘細胞等の大きなゴミを受精卵から分離・除去する方法。
【０００７】
本発明に係る培養液の卵丘細胞等の大きなゴミ層から受精卵を分離する方法は、以下の態様が好ましい。
（請求項２）
該第５工程において該ゴミ上層を複数段階に分けて該受精卵下層から分離・除去する、請求項１に記載の培養液の卵丘細胞等の大きなゴミ層から受精卵を分離する方法。
【発明の効果】
【０００８】
培養ディッシュ中の受精卵及び卵丘細胞等の大きなゴミを含む培養液に５１０ｎｍ〜５４０ｎｍの緑色光を照射して、受精卵を卵丘細胞等の大きなゴミから明瞭に見分けられるようにしているので、受精卵の周りにゴミが少ない受精卵と受精卵の入っていないゴミとを明瞭化し、受精卵の入っていないゴミは不要とし、受精卵の入っているゴミのみを、ガラスキャピラリーに吸い込ませることが可能となる。
第３工程の吐出工程及び第４工程の吸込み・吐出し繰り返し工程により短時間で卵丘細胞等の大きなゴミを所望の細分化状態とすることが可能となる。
さらに、５の細分化された卵丘細胞等のゴミ層の分離・除去工程により受精卵の層を簡便に得ることが可能となる。
従来通常作業のための受精卵の洗浄までの工程は、熟練者にとって一過程に過ぎず、時間的な問題にならないが、本発明の方法によれば、未熟者にとってこの過程は、時間がかかるので、時間短縮することによって洗浄までの工程を能率的に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】（ａ）は受精卵及び卵丘細胞等の大きなゴミを含む培養液に可視光を照射した時の培養液の実体顕微鏡写真で受精卵は大きなごみの中に埋もれており、（ｂ）は５１０ｎｍ〜５４０ｎｍの緑色光を照射した時の、受精卵に陰影が出来て、大きなごみの中から識別が容易となっている培養液の実体顕微鏡写真であり、図１(a)では受精卵の丸い球状が不明瞭であるが、図１(b)では受精卵の丸い球状がゴミの中にあることが判別できる。
【図２】（ａ）は受精卵および卵丘細胞等の大きなゴミを含む培養液の実体顕微鏡写真、（ｂ）は細分化処理を行なった後最終工程まで終了し多くのゴミが除かれたほぼ受精卵のみの実体顕微鏡写真（倍率２０倍）である。
【図３】（ａ）は細分化処理をした培養液を示した模式図であり、（ｂ）は５分間静置した後の受精卵の下層と卵丘細胞等の大きなゴミの上層に分離した培養液の模式図であり、▲はゴミ等を示し、○は受精卵である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下に、本発明に係る培養液の卵丘細胞等の大きなゴミ層を受精卵から分離・除去する方法について詳細に説明する。
１． ５１０ｎｍ〜５４０ｎｍの緑色光の照射工程（第1工程）
（１）  受精卵及び卵丘細胞等の大きなゴミを含む培養液
受精卵及び卵丘細胞等の大きなゴミを含む培養液としては、マウス個体に過排卵誘起剤を投与し、過排卵状態にあるメスマウス卵管膨大部より卵子塊を採取し、人工授精して受精卵を作成後に、卵子塊は精子により、卵子とバラバラになった卵丘細胞等の大きなゴミが残った状態の培養液を対象とする。ヒアルロニダーゼ処理を行う、行わないにかかわらず、媒精後の媒精用ディッシュ内の状態を対象とする。また、本発明の方法が適用可能な対象の動物としては、マウス等の哺乳類が対象となる。
【００１１】
(２)   ５１０ｎｍ〜５４０ｎｍの緑色光
培養ディッシュ中の受精卵及び卵丘細胞等の大きなゴミを含む培養液に５１０ｎｍ〜５４０ｎｍの緑色光を照射して、受精卵を卵丘細胞等の大きなゴミから明瞭に見分けられるようにする。図１ａは可視光による照射の場合の実体顕微鏡写真、図１ｂは５１０ｎｍ〜５４０ｎｍの緑色光による照射の場合の実体顕微鏡写真である。該緑色光を照射により、受精卵とゴミ分離が不十分な個所を特定するためである。該緑色光を照射することで、受精卵の周りにゴミがない受精卵及び受精卵の周りにゴミが多い受精卵が明瞭化するので、受精卵の周りにゴミがない受精卵は処理は不要とし、受精卵の入っているゴミのみを、ガラスキャピラリーに吸い込ますことが可能となる。５１０ｎｍ〜５４０ｎｍの範囲の波長以外の光を照射する場合には、受精卵を卵丘細胞等の大きなゴミから明瞭に見分けられない。
【００１２】
２．培養液を毛細管現象によりガラスキャピラリ―に吸い込む工程（第２工程）
（１）ガラスキャピラリ―
ガラスキャピラリ―を用いて、培養ディッシュの培養液中の受精卵及び卵丘細胞等の大きなゴミを含む培養液部分を毛細管現象によりガラスキャピラリ―に吸い込む。ガラスキャピラリーは両端が開口しており、一方の開口端は受精卵を扱う培養ディッシュ内に入れられ、他方の開口端は圧力調整レギュレーターを介して圧力付加装置であるインジェクターに接続される。圧力調整レギュレーターに接続されているガラス管の他端部は解放されているため、ディッシュ内の培養液中にガラスキャピラリー解放端を入れると毛細管現象でIVF後の受精卵入り培養液を吸い上げる。
【００１３】
ガラスキャピラリーの太さは、受精卵にダメージを与えることなく、また吸引によるゴミのつまりも生じない太さとし、長さは毛細管現象・培養液の吸込み量・吐出量を考慮して決定する。培養ディッシュ内の培養液の量は少量であり、例えば２００ｕＬの場合、ガラスキャピラリーの口径を外径０．９５ｍｍ〜１．００ｍｍ（例えば、０．９７ｍｍ）, 内径０．６５〜０．７５ｍｍ（例えば、０．６９ｍｍ）とすることができ、この場合毛細管現象により培養液を吸込む量（例えば、５０ｕＬ〜２００ｕＬ、好ましくは５０ｕＬ〜１５０ｕＬ）を考慮してガラスキャピラリ―の長さとし、例えば１０〜１５ｃｍとすることができる。ガラスキャピラリーの径が大きすぎると圧力とスピードを制御しても培養ディッシュ上でコントロールするのは難しい。
【００１４】
３．ガラスキャピラリ―内に吸い込んだ該培養液部分を吐出す工程（第３工程）
ガラスキャピラリ―内に毛細管現象により吸い込まれた該培養液部分を卵丘細胞等の大きなゴミを細かくするのに有効な吐出時間・吐出量・吐出圧力・吐出スピードで培養ディッシュ中に吐出す。
該有効吐出量はガラスキャピラリ―内に毛細管現象により吸い込まれた吸込み量とほぼ等しく、吐出圧力は圧力付加装置であるインジェクターの圧力を設定し専用圧力調整レギュレーターで圧力調整して該有効な吐出圧力とし、それによって該有効吐出時間をかけて該有効吐出圧力下に該有効吐出量を有効吐出スピードで吐出すようにする（吐出スピード（ｕＬ/sec）＝吐出量（ｕL)/吐出時間（ｓｅｃ））。本発明では、毛細管現象で吸い上げた培養液に対して吐出圧力をかけ有効吐出スピードで吐き出すという点が物理的に受精卵をバラバラにするということで、吐き出しスピード・吐出量が重要と思われる。本発明では、吐出スピードを好適には10μＬ/s〜50μＬ/sとする。
【００１５】
ガラスキャピラリ―内に吸い込まれた該培養液部分を１秒当たりその１／２以上のスピードで吐出しが吐出時間２秒以下で完了するように吐出圧力、吐出スピードを調整することが好ましい。吐出圧力は、例えば、電動インジェクターＢＪ−１１０（ベックス社製）で設定し、該吐出圧力を圧力調整レギュレーターによって所望の吐出圧力に調整する。圧力調整レギュレーターは、吐出圧力を例えば９８kPa以下の調整ができるものを使用する。吐出圧力を設定する場合、吐出圧力の振れ幅がある場合振れ幅の下限は、それ以下では圧力が低すぎて大きなゴミを細かくすることが出来ず、振れ幅の上限は、それ以上ではごみを細かくすることが出来ても受精卵が死んでしまうという観点から設定する。
なお、吐出量が少ない・吐出スピードが遅いと、受精卵をバラバラにするという目的を果たさず、吐き出す量が多すぎると培地内で泡を吐き続けるような状況になり、吐出スピードが速すぎても圧力が高くなり、受精卵がダメージを受ける懸念がある。
【００１６】
４．吸引・吐出工程の繰り返し工程（第４工程）
卵丘細胞等の大きなゴミを細かくするのに有効な所定の間隔で吸引・吐出工程を卵丘細胞等の大きなゴミが所望の細分化状態となる回数だけ繰り返す。吸引工程の繰り返しの間隔は使用するキャピラリーの長さと排出スピードに依存する。例えば、毛細管現象を示すガラスキャピラリ―の場合、1回の吐出時間２秒以下とすることができる。吸引・吐出回数は、５１０ｎｍ〜５４０ｎｍの緑色光による培養液の照射状況を参考に適宜決定するが、４−５回が好ましい。回数については、マウス個体で得られる卵子塊の大きさが異なるため、最初に顕鏡しておおよその回数の目安をつかむことが出来る。
【００１７】
５．受精卵層から該細分化ゴミ層の分離・除去工程（第５工程）
該培養液を静置することによって、受精卵の層と該細分化された卵丘細胞等のゴミの層がそれぞれ下層と上層に分離し、該受精卵層から該細分化された卵丘細胞等のゴミ層を分離・除去する。第３図参照。１〜４の工程を実施することにより得た培養液を静置し、受精卵の層と該細分化された卵丘細胞等のゴミの層がそれぞれ下層と上層に分離することは、本発明によって初めて発見されたことであり、受精卵の分離には、従来このような方法を用いていなかった。５分程度の短期間の静置によって、受精卵の下層と該細分化された卵丘細胞等のゴミの上層に分離し、該受精卵の下層から該細分化ゴミ下層を吸引等で分離・除去し、受精卵のみを効率的に分離することが可能となる。
【００１８】
６．第５工程において該ゴミの上層を複数段階に分けて該受精卵下層から分離・除去する工程（第６工程）
本発明に係る方法では、第５工程において該上層を複数段階に分けて該受精卵下層から分離・除去する。複数段階に分けてゴミの上層から分離・除去することにより、実質受精卵を除去せずに、ゴミの上層のみを分離・除去することが出来る。
【産業上の利用可能性】
【００１９】
本発明に係る培養-液中の卵丘細胞等の大きなゴミを受精卵から分離・除去する方法は、従来通常作業のための受精卵の洗浄までの工程を時間短縮することによって洗浄までの工程を能率的に行うことができるので、産業上利用可能性は大きい。
また、本方法により採取した受精卵は通常の発生生物学の実験に利用もでき、エレクトロポレーションにも使え、ブタなど他の動物であれば畜産にも活用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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