(57)【要約】      （修正有）【課題】熱及びｐＨ安定性を有するフルクトサミン−６−キナーゼ（ＦＮ６Ｋ）、及び、それを用いたフルクトシルリジンの測定方法の提供。【解決手段】被検試料に、以下の特性（ａ）〜（ｆ）を有するＦＮ６Ｋを反応させることを特徴とするフルクトシルリジンの測定方法；（ａ）ＡＴＰ存在下で、フルクトシルリジンをリン酸化してフルクトシルリジン−６−リン酸を生成する、（ｂ）比活性：１０Ｕ／ｍｇ以上、（ｃ）基質特異性：フルクトシルリジンに対する反応性を１００％としたときのフルクトシルバリンに対する反応性が５％以下、（ｄ）分子量：２５ｋＤａ〜３５ｋＤａ、（ｅ）ｐＨ安定性：６．５〜８．０で安定、（ｆ）温度安定性：３０℃で安定。【選択図】図１
2019180391.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料に、以下の特性（ａ）〜（ｆ）を有するフルクトサミン−６−キナーゼを反応させることを特徴とするフルクトシルリジンの測定方法。
（ａ）ＡＴＰ存在下で、フルクトシルリジンをリン酸化してフルクトシルリジン−６−リン酸を生成する
（ｂ）比活性：１０Ｕ／ｍｇ以上である
（ｃ）基質特異性：フルクトシルリジンに対する反応性を１００％としたときのフルクトシルバリンに対する反応性が５％以下である
（ｄ）分子量：２５ｋＤａ〜３５ｋＤａである
（ｅ）ｐＨ安定性：６．５〜８．０で安定
（ｆ）温度安定性：３０℃で安定である
【請求項２】
フルクトサミン−６−キナーゼがさらに以下の特性（ｇ）及び（ｈ）を有する、請求項１に記載のフルクトシルリジンの測定方法。
（ｇ）至適活性ｐＨ：８．０〜８．５
（ｈ）至適活性温度：３５〜４０℃
【請求項３】
測定温度が３５℃以上であることを特徴とする請求項１又は２に記載のフルクトシルリジンの測定方法。
【請求項４】
ｐＨ５．０〜９．０の範囲内で測定することを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載のフルクトシルリジンの測定方法。
【請求項５】
以下の特性（ａ）〜（ｆ）を有するフルクトサミン−６−キナーゼを含む、フルクトシルリジン測定用試薬。
（ａ）ＡＴＰ存在下で、フルクトシルリジンをリン酸化してフルクトシルリジン−６−リン酸を生成する
（ｂ）比活性：１０Ｕ／ｍｇ以上である
（ｃ）基質特異性：フルクトシルリジンに対する反応性を１００％としたときのフルクトシルバリンに対する反応性が５％以下である
（ｄ）分子量：２５ｋＤａ〜３５ｋＤａである
（ｅ）ｐＨ安定性：６．５〜８．０で安定
（ｆ）温度安定性：３０℃で安定である
【請求項６】
フルクトサミン−６−キナーゼがさらに以下の特性（ｇ）及び（ｈ）を有する、請求項５に記載のフルクトシルリジン測定用試薬。
（ｇ）至適活性ｐＨ：８．０〜８．５
（ｈ）至適活性温度：３５〜４０℃
【請求項７】
以下の特性（ａ）〜（ｆ）を有するフルクトサミン−６−キナーゼを含む、フルクトシルリジン測定用キット。
（ａ）ＡＴＰ存在下で、フルクトシルリジンをリン酸化してフルクトシルリジン−６−リン酸を生成する
（ｂ）比活性：１０Ｕ／ｍｇ以上である
（ｃ）基質特異性：フルクトシルリジンに対する反応性を１００％としたときのフルクトシルバリンに対する反応性が５％以下である
（ｄ）分子量：２５ｋＤａ〜３５ｋＤａである
（ｅ）ｐＨ安定性：６．５〜８．０で安定
（ｆ）温度安定性：３０℃で安定である
【請求項８】
フルクトサミン−６−キナーゼがさらに以下の特性（ｇ）及び（ｈ）を有する、請求項７に記載のフルクトシルリジン測定用キット。
（ｇ）至適活性ｐＨ：８．０〜８．５
（ｈ）至適活性温度：３５〜４０℃
【請求項９】
以下の特性（ａ）〜（ｆ）を有するフルクトサミン−６−キナーゼ。
（ａ）ＡＴＰ存在下で、フルクトシルリジンをリン酸化してフルクトシルリジン−６−リン酸を生成する
（ｂ）比活性：１０Ｕ／ｍｇ以上である
（ｃ）基質特異性：フルクトシルリジンに対する反応性を１００％としたときのフルクトシルバリンに対する反応性が５％以下である
（ｄ）分子量：２５ｋＤａ〜３５ｋＤａである
（ｅ）ｐＨ安定性：６．５〜８．０で安定
（ｆ）温度安定性：３０℃で安定である
【請求項１０】
さらに以下の特性（ｇ）及び（ｈ）を有する、請求項９に記載のフルクトサミン−６−キナーゼ。
（ｇ）至適活性ｐＨ：８．０〜８．５
（ｈ）至適活性温度：３５〜４０℃
【請求項１１】
クロノバクター属、アトランティバクター属、セラチア属、バチルス属又はエセリシア属に属する微生物を培養し、培養物から、請求項９又は１０に記載のフルクトサミン−６−キナーゼを採取することを特徴とする、フルクトサミン−６−キナーゼの製造方法。
【請求項１２】
ｐＨを５．０〜９．０に調整することを特徴とする請求項９又は１０に記載のフルクトサミン−６−キナーゼの安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フルクトシルリジンの測定方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品は加工、貯蔵過程において、タンパク質やアミノ酸が糖と非酵素的に反応（メイラード反応）することで褐変が生じることが知られている。褐変は食品の着色、香りづけ、抗酸化能の付与など、品質形成に重要な役割を果たすだけでなく、加熱時間や貯蔵時間と相関することから、鮮度や品質劣化の指標にもなっている。
【０００３】
メイラード反応の初期段階では、アミノ酸のアミノ基と糖のカルボニル基がアミノカルボニル反応によりシッフ塩基を形成した後、アマドリ転移によって安定なアマドリ化合物が生じる。例えば、多くの食品に含まれている必須アミノ酸の一つであるリジンは、食品に含まれる糖と反応してフルクトシルリジンを生成する。またリジンは、α位だけでなくε位にもアミノ基を有しているため、タンパク質構造中でもアミノ基が遊離の形で存在することが多く、アミノカルボニル反応が起こりやすいと考えられる。したがって、食品に含まれるフルクトシルリジン量は褐変の進行度と相関しており、その測定値は、食品の品質管理の重要な指標となり得るために、測定法の確立は有用である。
【０００４】
フルクトシルリジンを測定する方法にはフルクトサミン−６−キナーゼ（以下、ＦＮ６Ｋとする）を使用した方法が知られている。ＦＮ６Ｋはε位が糖化されたフルクトシルリジン（ε―ＦＫ）をリン酸化してフルクトシルリジン−６−リン酸を生成することが知られている。例えば、エセリシア属（Escherichia）、バチルス属（Bacillus）やアルスロバクター属（Arthrobacter）由来のＦＮ６Ｋが報告されている（非特許文献１）。これらのうち、Bacillus由来のＦＮ６Ｋはε−ＦＫとα−フルクトシルバリン（α−ＦＶ）の両者を基質とすることから基質特異性が低い。EscherichiaやArthrobactor由来のＦＮ６Ｋはε−ＦＫに特異的であるが、前者は熱安定性が悪いこと、後者は比活性が低いことが課題である（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Biotechnology Journal 11 (2016), 797-804
【非特許文献２】Appl. Biochem. Biotechnol. 170 （2013）710-717
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、熱安定性、ｐＨ安定性及び基質特異性に優れたＦＮ６Ｋ及びそれを用いたフルクトシルリジンの測定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために、本発明者らは、自然界におけるＦＮ６Ｋのスクリーニングを鋭意検討したところ、いくつかの菌株から熱安定性及びｐＨ安定性が高いＦＮ６Ｋ活性を有する酵素を見出した。さらに、そのような酵素を用いることによって熱安定性、ｐＨ安定性及び基質特異性に優れたフルクトシルリジンの測定方法を見出し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、以下の［１］〜［１２］に関する。
［１］  被検試料に、以下の特性（ａ）〜（ｆ）を有するフルクトサミン−６−キナーゼを反応させることを特徴とする、フルクトシルリジンの測定方法。
（ａ）ＡＴＰ存在下で、フルクトシルリジンをリン酸化してフルクトシルリジン−６−リン酸を生成する
（ｂ）比活性：１０Ｕ／ｍｇ以上である
（ｃ）基質特異性：ε−フルクトシルリジンに対する反応性を１００％としたときのフルクトシルバリンに対する反応性が５％以下である
（ｄ）分子量：２５ｋＤａ〜３５ｋＤａである
（ｅ）ｐＨ安定性：６．５〜８．０で安定である
（ｆ）温度安定性：３０℃で安定である
［２］  フルクトサミン−６−キナーゼがさらに以下の特性（ｇ）及び（ｈ）を有する、［１］に記載のフルクトシルリジンの測定方法。
（ｇ）至適活性ｐＨ：８．０〜８．５
（ｈ）至適活性温度：３５〜４０℃
［３］  ３５℃以上で測定することを特徴とする［１］又は［２］に記載のフルクトシルリジンの測定方法。
［４］  ｐＨ５．０〜９．０の範囲内で測定することを特徴とする［１］〜［３］の何れかに記載のフルクトシルリジンの測定方法。
［５］  以下の特性（ａ）〜（ｆ）を有するフルクトサミン−６−キナーゼを含む、フルクトシルリジン測定用試薬。
（ａ）ＡＴＰ存在下で、フルクトシルリジンをリン酸化してフルクトシルリジン−６−リン酸を生成する
（ｂ）比活性：１０Ｕ／ｍｇ以上である
（ｃ）基質特異性：ε−フルクトシルリジンに対する反応性を１００％としたときのフルクトシルバリンに対する反応性が５％以下である
（ｄ）分子量：２５ｋＤａ〜３５ｋＤａである
（ｅ）ｐＨ安定性：６．５〜８．０で安定である
（ｆ）温度安定性：３０℃で安定である
［６］  フルクトサミン−６−キナーゼがさらに以下の特性（ｇ）及び（ｈ）を有する、［５］に記載のフルクトシルリジン測定用試薬。
（ｇ）至適活性ｐＨ：８．０〜８．５
（ｈ）至適活性温度：３５〜４０℃
［７］  以下の特性（ａ）〜（ｆ）を有するフルクトサミン−６−キナーゼを含む、フルクトシルリジン測定用キット。
（ａ）ＡＴＰ存在下で、フルクトシルリジンをリン酸化してフルクトシルリジン−６−リン酸を生成する
（ｂ）比活性：１０Ｕ／ｍｇ以上である
（ｃ）基質特異性：ε−フルクトシルリジンに対する反応性を１００％としたときのフルクトシルバリンに対する反応性が５％以下である
（ｄ）分子量：２５ｋＤａ〜３５ｋＤａである
（ｅ）ｐＨ安定性：６．５〜８．０で安定である
（ｆ）温度安定性：３０℃で安定である
［８］  フルクトサミン−６−キナーゼがさらに以下の特性（ｇ）及び（ｈ）を有する、［７］に記載のフルクトシルリジン測定用キット。
（ｇ）至適活性ｐＨ：８．０〜８．５
（ｈ）至適活性温度：３５〜４０℃
［９］  以下の特性（ａ）〜（ｆ）を有するフルクトサミン−６−キナーゼ。
（ａ）ＡＴＰ存在下で、フルクトシルリジンをリン酸化してフルクトシルリジン−６−リン酸を生成する
（ｂ）比活性：１０Ｕ／ｍｇ以上である
（ｃ）基質特異性：ε−フルクトシルリジンに対する反応性を１００％としたときのフルクトシルバリンに対する反応性が５％以下である
（ｄ）分子量：２５ｋＤａ〜３５ｋＤａである
（ｅ）ｐＨ安定性：６．５〜８．０で安定である
（ｆ）温度安定性：３０℃で安定である
［１０］  さらに以下の特性（ｇ）及び（ｈ）を有する、［９］に記載のフルクトサミン−６−キナーゼ。
（ｇ）至適活性ｐＨ：８．０〜８．５
（ｈ）至適活性温度：３５〜４０℃
［１１］  クロノバクター属、アトランティバクター属、セラチア属、バチルス属又はエセリシア属に属する微生物を培養し、培養物から［９］又は［１０］に記載のフルクトサミン−６−キナーゼを採取することを特徴とする、フルクトサミン−６−キナーゼの製造方法。
［１２］  ｐＨを５．０〜９．０に調整することを特徴とする［９］又は［１０］に記載のフルクトサミン−６−キナーゼの安定化方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、安定性が高く、基質特異性に優れたＦＮ６Ｋが得られた。本発明のＦＮ６Ｋは広いｐＨ域での安定性を有し、フルクトシルリジンに対する基質特異性も高いことから、フルクトシルリジンの測定に用いる酵素として有用である。さらに、このＦＮ６Ｋは熱安定性が高いため、フルクトシルリジンを高温で測定することも可能になった。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の酵素によるフルクトシルリジンの測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のフルクトサミン−６−キナーゼは、以下の特性（ａ）〜（ｆ）を有する。
（ａ）フルクトサミン−６−キナーゼ（ＦＮ６Ｋ）活性：ＡＴＰ存在下で、フルクトシルリジンをリン酸化してフルクトシルリジン−６−リン酸を生成する
（ｂ）比活性：１０Ｕ／ｍｇ以上である
（ｃ）基質特異性：フルクトシルリジンに対する反応性を１００％としたときのフルクトシルバリンに対する反応性が５％以下である
（ｄ）分子量：２５ｋＤａ〜３５ｋＤａである
（ｅ）ｐＨ安定性：６．５〜８．０で安定である
（ｆ）温度安定性：３０℃で安定である
【００１２】
以下、各項目について詳細に説明する。
１．フルクトサミン−６−キナーゼの理化学的性質
（ａ）フルクトサミン−６−キナーゼ（ＦＮ６Ｋ）活性
フルクトサミン−６−キナーゼは、ＡＴＰ存在下でフルクトシルリジンをリン酸化してフルクトシルリジン−６−リン酸を生成する反応を触媒する理化学的性質を有する。本明細書においては、この理化学的性質をＦＮ６Ｋ活性という。
ＦＮ６Ｋ活性は、公知の方法又はそれを改変した方法で測定することができる。例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの総称）、ＡＴＰなどを用い、反応前後における３４０ｎｍの波長における試料の吸光度の変化を指標に活性を測定することができる。より具体的には、下記の試薬及び測定条件を用いて活性を測定することができる。
【００１３】
フルクトサミン−６−キナーゼ（ＦＮ６Ｋ）の活性測定方法
＜測定原理＞
本発明において、ＦＮ６Ｋ活性の測定は、文献公知の方法又はそれを適宜改変した方法によって行うことができる。例えば、J. Biol. Chem. 277（2002）42523-42529に記載の方法を改変して行うことができる。本方法は、以下の測定原理に基づく。
【００１４】
【表１】
2019180391.tif 000003
【００１５】
＜試薬及び終濃度＞
２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．１）
２５ｍＭ  ＫＣｌ水溶液
１ｍＭ  塩化マグネシウム水溶液
１ｍＭ  ジチオスレイトール
０.２５ｍＭ  ホスホエノールピルビン酸
０.１５ｍＭ  ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）
１ｍＭ  アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）
１０μｇ／ｍＬ  ピルビン酸キナーゼ
５μｇ／ｍＬ  乳酸脱水素酵素
０.２ｍＭ  ε−フルクトシルリジン
＜測定条件＞
反応中の試薬濃度が上記終濃度になるように、各試薬溶液と水とを混合した０．９ｍＬを３０℃で１０分間保温後、酵素溶液０．１ｍＬを添加して反応を開始する。反応開始時から５分間、酵素反応の進行に伴う３４０ｎｍ（ＮＡＤＨが極大吸収ピークを有する）における吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ３４０）を測定し、直線部分から次式に従い酵素活性を算出する。この際、酵素活性は、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを酸化する酵素量を１Ｕと定義する。
【式１】
【００１６】
2019180391.tif 000004
【００１７】
なお、本式において、６．３はＮＡＤＨのモル吸光係数、分母における１．０はセルの光路長（ｃｍ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、分子における１．０は（反応試薬＋酵素溶液）の液量（ｍＬ）、ΔＡ３４０ｂｌａｎｋは超純水を基質溶液の代わりに添加して反応開始した場合の３４０ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量を表す。
【００１８】
本発明のＦＮ６Ｋは、単離又は精製されたＦＮ６Ｋであることが好ましい。また、本発明のＦＮ６Ｋは、上記保存に適した溶液中（例えば、緩衝液など）に溶解した状態又は凍結乾燥された状態（例えば、粉末状）で存在することができる。本発明のＦＮ６Ｋについて使用する場合の「単離された」とは、当該酵素以外の成分を実質的に含まない状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離された酵素では、夾雑タンパク質の含有量は全体の２０質量％未満であり、好ましくは約１０質量％未満である。
【００１９】
（ｂ）比活性
本発明のＦＮ６Ｋが有する比活性は、１０Ｕ／ｍｇ以上であり、より好ましくは２０Ｕ／ｍｇ以上、さらに好ましくは２５Ｕ／ｍｇ以上である。比活性は酵素の精製度や失活度の指標となる。比活性は、ＦＮ６Ｋ活性値をタンパク濃度で割ることにより算出する。ＦＮ６Ｋ活性値は上記活性測定法により測定し、タンパク濃度はブラッドフォード法により測定する。詳細には、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（日本バイオ・ラッド株式会社製）を用い、取扱説明書に従って、牛血清アルブミン（ＢＳＡ、和光純薬工業株式会社製、生化学用）を標準物質として作成した検量線から換算して求めることができる。該酵素は、好ましくは終濃度０．２〜０．９ｍｇ／ｍＬになるように適宜希釈して用いる。
【００２０】
（ｃ）基質特異性
本発明のＦＮ６Ｋは、リジンと糖がアミノカルボニル反応して生じるε−フルクトシルリジンに対して高い基質特異性を有する。具体的には、本発明のＦＮ６Ｋは、ε−フルクトシルリジンに対する反応性に対して、少なくともフルクトシルバリンに対する反応性が低く、０．２ｍＭのε−フルクトシルリジンに対する反応性を１００％とした場合に、０．２ｍＭのフルクトシルバリンに対する反応性が５％以下であり、好ましくは３％以下であり、より好ましくは２％以下であり、さらに好ましくは１％以下である。
【００２１】
（ｄ）分子量
本発明のＦＮ６Ｋの分子量は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定した場合、ＦＮ６Ｋを構成するポリペプチド部分が２５〜３５ｋＤａであり、好ましくは３０〜３５ｋＤａである。
【００２２】
「ポリペプチド部分」とは、実質的に糖鎖を含まない、タンパク質部分のＦＮ６Ｋを意味する。ポリペプチド部分の分子量は、原核生物由来ＦＮ６Ｋであれば、ＦＮ６ＫをＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定することにより求めることができ、ＦＮ６Ｋのアミノ酸配列から算出してもよい。また、糖鎖を含むＦＮ６Ｋであれば、糖鎖を除去したタンパク質部分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定することにより求めることができる。
【００２３】
（ｅ）熱安定性
本発明のＦＮ６Ｋは３０℃で安定であり、好ましくは３５℃、より好ましくは４０℃、さらに好ましくは４５℃、特に好ましくは５０℃で安定である。詳細には、各温度のｐＨ７．０の緩衝液中で、３０分間静置後の残存活性が９０％以上である場合に、熱安定性を有する、と判断する。例えば、本発明のＦＮ６Ｋは５．０Ｕ／ｍＬの酵素をｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液中、０℃で３０分間静置した酵素活性を１００％とした場合に、各温度において３０分間静置した後の残存活性が９０％以上である。
【００２４】
（ｆ）ｐＨ安定性
本発明のＦＮ６ＫはｐＨ６．５〜８．０で安定である。詳細には、各ｐＨの緩衝液中で、３０℃で６０分間静置後の残存活性が８０％以上である場合に、ｐＨ安定性を有する、と判断する。例えば、本発明のＦＮ６Ｋは５．０Ｕ／ｍＬの酵素を１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）及びトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中、３０℃で６０分間静置した後の残存活性が、処理前の酵素活性を１００％とした場合に８０％以上である。
【００２５】
本発明のＦＮ６Ｋは、上記（ａ）〜（ｆ）の特性を有し、好ましくはさらに（ｇ）、（ｈ）の特性を有し、さらに好ましくは（ｉ）の特性を有する。
【００２６】
（ｇ）至適活性ｐＨ
本発明のＦＮ６Ｋの至適活性ｐＨは、好ましくはｐＨ７．０〜９．０の範囲内であり、より好ましくはｐＨ８．０〜８．５の範囲内である。本明細書において、至適活性ｐＨは、後述の実施例に示すように、酵素濃度０．０５Ｕ／ｍＬで、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０〜５．０）、クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０〜６．０）、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜７．５）、トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５〜９．０）又はグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０〜９．５）を用いて２５℃における各ｐＨでの酵素活性を測定、比較することにより求めることができる。各緩衝液中で測定したうちの一番高い活性値を１００％とした場合に、８０％以上の活性値を示すｐＨ範囲を至適活性ｐＨとする。
【００２７】
（ｈ）至適活性温度
本発明のＦＮ６Ｋの至適活性温度は、好ましくは２５〜４０℃の範囲内であり、より好ましくは３５〜４０℃の範囲内である。本明細書において、至適活性温度は、後述の実施例に示すように、酵素濃度０．０５Ｕ／ｍＬでＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．１）中における各温度での酵素活性を測定、比較することにより求めることができる。各温度で測定したうちの一番高い活性値を１００％とした場合に、８０％以上の活性値を示す温度範囲を至適活性温度とする。
【００２８】
（ｉ）由来
本発明のＦＮ６Ｋは、特に限定されないが、クロノバクター属、アトランティバクター属、セラチア属又はバチルス属に属する微生物に由来することが好ましい。より好ましくは、クロノバクター・サカザキ（Cronobacter sakazakii）、アトランティバクター・ハーマニー（Atlantibacter hermannii）又はバチルス・ヴィレティ（Bacillus vireti）由来のＦＮ６Ｋである。
【００２９】
本発明のフルクトサミン−６−キナーゼは、好ましくは下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列を有し、かつフルクトサミン−６−キナーゼ活性を有するタンパク質である。
（ａ）配列番号５、６、７又は８に示されるアミノ酸配列。
（ｂ）配列番号５、６、７又は８に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
（ｃ）配列番号５、６、７又は８に示されるアミノ酸配列と同一性を有するアミノ酸配列。同一性を有するとは、同一性が好ましくは少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％又は９９％のアミノ酸配列である。
該酵素は、好ましくは（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列からなり、かつフルクトサミン−６−キナーゼ活性を有するタンパク質である。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）からなる。
（ｉ）前記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
（ｉｉ）配列番号１、２、３又は４に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド。
（ｉｉｉ）配列番号１、２、３又は４に示される塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、かつフルクトサミン−６−キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｉｖ）配列番号１、２、３又は４に示される塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、９５％又は９７％の同一性を有し、かつフルクトサミン−６−キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００３１】
本書での同一性は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ解析により算出されたｉｄｅｎｔｉｔｙの値とする。
【００３２】
２．ＦＮ６Ｋ生産株の取得 
前記のポリヌクレオチドを、公知の方法に従い、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、真菌（酵母、アスペルギルス属などの子嚢菌、担子菌等）、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞などに導入することで、生産株を取得することができる。生産株については特に制限されないが、例えば、大腸菌の宿主／ベクター系で発現させることができる。
【００３３】
大腸菌の宿主／ベクター系としては、公知のｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システム、ｐＣｏｌｄ発現システムなどが例示できる。また、必要に応じて、シャペロンやリゾチームなどの共発現を行うことも可能である。本発明においては、宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）、ベクターとしては、ｐＵＣ系又はｐＥＴ系のプラスミドが好ましい。
【００３４】
なお、その他の宿主／ベクター系としては、宿主が酵母の場合は、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Candida utilis、Pichia pastoris等が例として挙げられ、ベクターとしてはｐＡＵＲ１０１、ｐＡＵＲ２２４、ｐＹＥＳ２等が挙げられる。宿主がカビである場合は、例えば、Aspergillus oryzae、Aspergillus niger等を例示することができる。
【００３５】
本発明のＤＮＡの宿主への導入手段は特に制限されないが、例えば、本発明のＤＮＡを含むベクターを、宿主細胞に導入し、本発明のＤＮＡが導入された形質転換体を得ることで、ＦＮ６Ｋの生産菌株を取得することができる。宿主細胞は、本発明のＤＮＡを発現してＦＮ６Ｋを生産することが可能である限り、特に制限されない。具体的には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。大腸菌の場合は、市販のコンピテントセルを使用することで容易に形質転換が可能である。
【００３６】
本発明の形質転換体は、本発明のＦＮ６Ｋを産生する能力を有するため、それを用いて効率的に本発明のＦＮ６Ｋを製造することが可能となる。
【００３７】
３．ＦＮ６Ｋの製造方法
本発明のＦＮ６Ｋは、微生物を培養し、培養物から前記特性を有するフルクトサミン−６−キナーゼを採取することによって製造することができる。培養に供される微生物や細胞は、本発明のＦＮ６Ｋを産生する能力を有する限り特に制限されない。例えば、クロノバクター属、アトランティバクター属、セラチア属、バチルス属又はエセリシア属に属する微生物を例示でき、好ましくは、クロノバクター・サカザキ（Cronobacter sakazakii）、アトランティバクター・ハーマニー（Atlantibacter hermannii）、セラチア・フォンティコラ（Serratia fonticola）又はバチルス・ヴィレティ（Bacillus vireti）であり、より好ましくはクロノバクター・サカザキ、アトランティバクター・ハーマニー又はバチルス・ヴィレティである。又は、前記の形質転換体を培養し、培養物から前記特性を有するＦＮ６Ｋを採取することによって製造することができる。培養方法及び培養条件は、本発明のＦＮ６Ｋが生産される限り特に限定されない。すなわち、ＦＮ６Ｋが生産されることを条件として、使用する微生物や細胞の生育に適合した方法及び条件を適宜設定することができる。
【００３８】
以下に、微生物の培養条件として、培地、培養温度、及び培養時間を例示する。
【００３９】
培地としては、通常の微生物培養用培地が使用でき、炭素源、窒素源、ビタミン類、無機物、その他使用する微生物が必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、合成培地、天然培地のいずれも使用可能である。炭素源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、デキストリン、澱粉、グリセリン、糖蜜などが使用できる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機塩類、ＤＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸などのアミノ酸類、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカーなどの窒素含有天然物が使用できる。ビタミン類としては、リボフラビン、ピリドキシン、ナイアシン（ニコチン酸）、チアミンなどが使用できる。無機物としては、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄などが使用できる。さらに、タンパク質の発現の調整に必要な化合物、例えばイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）や乳糖等を適宜添加してもよい。
【００４０】
培養条件としては、ＦＮ６Ｋの生産に適した培養条件であれば特に限定されないが、培養温度は１０〜４５℃、かつｐＨ５〜１０の範囲で行うのが好ましい。培養期間は回分培養であれば、１〜８日以内の範囲が好ましいが、流加培養や連続培養による生産量増大を行うのであれば、生産性が最適と判断される範囲で期間を延ばすことができる。また、培養法としては例えば振盪培養法、ジャー・ファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。
【００４１】
培養物中からＦＮ６Ｋを得る方法は、通常のタンパク質の精製方法を使用することができる。ＦＮ６Ｋが菌体内にある場合は、生産菌を培養後、培養液を遠心分離して培養微生物を得たのち、適当な方法で該培養微生物を破砕及び／又は溶菌処理し、処理液から遠心分離などによって上清液を得ることで、また、ＦＮ６Ｋが培地中に分泌されている場合は、生産菌を培養後、培養液を遠心分離して上清液を得ることで、それぞれ粗酵素液を取得することができる。
【００４２】
これらの粗酵素液に含まれるＦＮ６Ｋは、限外ろ過、塩析、溶媒沈殿、熱処理、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティクロマトグラフィーなどの適当な精製操作を組み合わせることによって精製することができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００４３】
本発明のＦＮ６Ｋを組換えタンパク質として得る場合、種々の修飾が可能である。例えば、本酵素をコードするＤＮＡと他の適当なＤＮＡとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドやタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる酵素を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、Ｎ末端やＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化及び／又は生物学的機能の付加等が可能である。
【００４４】
４．ＦＮ６Ｋの用途
フルクトシルリジンの測定
次に、本発明によって得られたＦＮ６Ｋの用途について説明する。本発明のＦＮ６Ｋを用いて、フルクトシルリジンの測定を行うことができる。フルクトシルリジンの測定は、フルクトシルリジンを含有すると思われる被検試料に本発明のＦＮ６Ｋを反応させることにより実施することができる。フルクトシルリジンを含有する被検試料は、特に制限されないが、例えば、飲料、食品、生体試料等を挙げることができる。
【００４５】
フルクトシルリジン測定条件は、具体的には、前記のＦＮ６Ｋ測定活性試験と同じ条件で行うことができるが、ＡＴＰからリン酸がε−フルクトシルリジンに移行することから、生成したＡＤＰを比色定量することができる。
【００４６】
フルクトシルリジンの測定条件は、適宜設定できるが、測定温度は、２０℃以上、２５℃以上又は３０℃以上が好ましく、３５℃以上がより好ましく、上限は５０℃以下又は４５℃以下が好ましく、４０℃以下がより好ましく、安定性の高いＦＮ６Ｋを使用することで高い温度での測定が可能である。また、測定時のｐＨはｐＨ５．０〜９．０の範囲内が好ましく、ｐＨ６．０〜９．０の範囲内がより好ましく、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．７の範囲内がさらに好ましく、ｐＨ７．２〜８．５の範囲内がさらに好ましく、ｐＨ７．４〜８．０の範囲内がさらに好ましい。アルカリ条件下でも安定なＦＮ６Ｋを使用することで、高いｐＨ域での測定が可能になり、酸性条件下で不安定なＮＡＤＨをアルカリ条件下で測定することが可能になった。測定時間は適宜設定できるが、例えば０．５分間〜１時間が例示でき、好ましくは１分間〜３０分間反応に付すことによって行うことができる。
【００４７】
本発明のＦＮ６Ｋは、ε−フルクトシルリジンに対する基質選択性が高いため、必ずしも必要ではないが、より正確な測定のために、任意で試料中の夾雑物の影響を実質的に除いてもよい。
【００４８】
本発明は、本発明のＦＮ６Ｋを用いたフルクトシルリジン測定用試薬を提供できる。本発明のＦＮ６Ｋは基質特異性が高く、安定性が高いため、常温下で実用的にフルクトシルリジンを測定することが可能である。該試薬は、酵素として本発明のＦＮ６Ｋを含む試薬であればよい。該試薬は、緩衝剤を含むことが好ましく、安定化剤等の当業者に公知の他の任意成分を適宜含有させ、該酵素や試薬成分の熱安定性や保存安定性を高めるのがより好ましい。
【００４９】
５．ＦＮ６Ｋの安定化方法
本発明は、ＦＮ６Ｋの安定化方法を提供できる。ＦＮ６Ｋを含む組成物のｐＨをＦＮ６Ｋの安定域に調整することで、ＦＮ６Ｋを安定化することができる。好ましくはｐＨ５．０〜ｐＨ９．０の範囲内で、前記組成物を３０℃で６０分間静置した後の活性が、処理前の酵素活性を１００％とした場合に、８０％以上の残存活性を有する範囲内に調整すればよく、より好ましくはｐＨ５．５〜８．７、さらに好ましくはｐＨ６．５〜ｐＨ８．０である。
【００５０】
６．ＦＮ６Ｋを含む、フルクトシルリジン測定用キット
本発明はまた、ＦＮ６Ｋを含有するキットに関する。典型的には、キットの組成物は、本発明のＦＮ６Ｋに加えて、緩衝液、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＡＴＰを含む。好ましくは、少なくとも１回の測定に十分な量のＦＮ６Ｋを含んでいればよいが、１試料あたり０．００１〜２００Ｕ程度が好ましく、０．０５〜５０Ｕ程度がより好ましい。また、本発明のＦＮ６Ｋ含有キットの組成物は、保存又は測定に適した溶液（例えば、緩衝液）中に溶解した組成物の状態、又は凍結乾燥された状態（例えば、粉末状）であるのが望ましい。該ＦＮ６Ｋを含むキットは、フルクトシルリジン濃度の測定を行うための試薬として用いることができる。
【００５１】
また、例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくは卵白アルブミン、糖類（例えば、トレハロースなど）、糖アルコール類（例えば、マルチトール、ソルビトール、グリセロールなど）、カルボキシル基含有化合物、アルカリ土類金属化合物、アンモニウム塩、硫酸塩、酵素と反応しないアミノ酸類、タンパク質等からなる群より選ばれる安定化剤、抗酸化剤等、当業者に公知の安定化成分を適宜含有させることで、ＦＮ６Ｋや試薬成分の熱安定性や保存安定性を高めることができる。
【実施例】
【００５２】
本発明を以下の実施例により説明するが、本発明は以下の実施例に限定されない。
【００５３】
実施例１  ＦＮ６Ｋの取得及び活性の測定
公知菌株の遺伝子を対象として、公知文献をもとにデザインしたＦＮ６Ｋ遺伝子取得用プライマーを用いてスクリーニングを行った結果、最終的に下記の４組のプライマーを用いて、クロノバクター・サカザキ（Cronobacter sakazakii  ＮＢＲＣ１０２４１６）、エセリシア・ハーマニー（Escherichia hermannii  ＮＢＲＣ１０５７０４）（なお、Microbiol Immunol. 2016; 60(5): 303-11においてエセリシア・ハーマニーは、アトランティバクター・ハーマニーに再分類することが提案されていることから、これらは同一のものである）、セラチア・フォンティコラ（Serratia fonticola  ＮＢＲＣ１０２５９７）及びバチルス・ヴィレティ（Bacillus vireti  ＮＢＲＣ１０２４５２）から、フルクトサミン−６−キナーゼ（ＦＮ６Ｋ）と思われる４種の遺伝子（配列番号１、２、３、４のＤＮＡ配列）を取得した。
【００５４】
１）クロノバクター・サカザキ由来の遺伝子取得用プライマー
５’―AAGGAGATATACATAATGAAAACACTGGCGACGG―３’（配列番号９）
５’―GGTGGTGGTGCTCGATTACCAGGCACCGTGATAG―３’ （配列番号１０）
２）エセリシア・ハーマニー由来の遺伝子取得用プライマー
５’―AAGGAGATATACATAATGAAACGGCTGGCAACG―３’ （配列番号１１）
５’―GGTGGTGGTGCTCGATTACCAGGCACCATGGTAG―３’ （配列番号１２）
３）セラチア・フォンティコラ由来の遺伝子取得用プライマー
５’―AAGGAGATATACATAATGAAAACATTGATTACGCTTG―３’ （配列番号１３）
５’―GGTGGTGGTGCTCGATTACCATGCTCCGTGGTAT―３’ （配列番号１４）
４）バチルス・ヴィレティ由来の遺伝子取得用プライマー
５’―AAGGAGATATACATAATGAGAATCGGGGCAGTC―３’ （配列番号１５）
５’―GGTGGTGGTGCTCGACTACCATGCACCCTTATATT―３’ （配列番号１６）
【００５５】
取得した４種の遺伝子をｐＥＴ−２１ａ（＋）ベクターに各々挿入し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに導入して、各組換え大腸菌を取得した。各組換え大腸菌をＬＢ培地で培養し、得られた菌体を超音波破砕し、各無細胞抽出液（ＣＦＥ）を取得した。各ＣＦＥを陰イオン交換クロマトグラフィーで精製し、各精製ＦＮ６Ｋ酵素を取得した。
【００５６】
クロノバクター・サカザキ由来のＦＮ６ＫをＣｓ由来ＦＮ６Ｋ、エセリシア・ハーマニー由来のＦＮ６ＫをＥｈ由来ＦＮ６Ｋ、セラチア・フォンティコラ由来のＦＮ６ＫをＳｆ由来ＦＮ６Ｋ及びバチルス・ヴィレティ由来のＦＮ６ＫをＢｖ由来ＦＮ６Ｋとする。なお、Ｃｓ由来ＦＮ６Ｋは配列番号５、Ｅｈ由来ＦＮ６Ｋは配列番号６、Ｓｆ由来ＦＮ６Ｋは配列番号７、Ｂｖ由来ＦＮ６Ｋは配列番号８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有している。
【００５７】
なお、比較例として、J. Biol. Chem. 277（2002）42523-42529に従い、従来から知られているエセリシア・コリ（Escherichia coli  ＪＭ１０９）由来のＦＮ６Ｋ（以下、Ｅｃ由来ＦＮ６Ｋと称する）も取得した。
【００５８】
取得した各酵素について、前記ＦＮ６Ｋの活性測定方法によってＦＮ６Ｋ活性を測定した結果、ＡＴＰ存在下で、フルクトシルリジンをリン酸化してフルクトシルリジン−６−リン酸を生成することが確認できた。
【００５９】
また、ブラッドフォード法によりタンパク質濃度を測定し、各ＦＮ６Ｋの比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。結果を以下の表２に示す。
【００６０】
【表２】
2019180391.tif 000005
【００６１】
取得した４種の新規ＦＮ６Ｋ及びＥｃ由来ＦＮ６Ｋについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、分子量を求めた結果、いずれも３０ｋＤａ程度であった。
【００６２】
実施例２  取得したＦＮ６ＫのｐＨ安定性の評価
４種の新規ＦＮ６Ｋ及びＥｃ由来ＦＮ６Ｋについて、ｐＨの異なる緩衝液に溶解したものを調製し、３０℃で静置し、６０分後の残存活性について測定した。緩衝液は、１Ｍの緩衝液（リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０及び６．０）、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）及びトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０及び９．０））を用い、終濃度が１００ｍＭになるよう調製し、使用した。なお、調製した緩衝液のｐＨをｐＨ計で測定し、その測定値でｐＨ安定性の値を表した。ＦＮ６Ｋ活性の測定方法は、前記ＦＮ６Ｋの活性測定方法に従った。処理前の活性を１００％としたときの、残存活性が８０％以上のｐＨ域を表３に示す。
【００６３】
【表３】
2019180391.tif 000006
【００６４】
Ｅｃ由来ＦＮ６ＫではｐＨ５．６〜７．１で安定だったのに対し、今回取得した４種のＦＮ６ＫはいずれもｐＨ８．０においても８０％以上の活性を保持していた。したがって、本発明のＦＮ６Ｋは、公知のＦＮ６Ｋよりも使用や保存において使いやすさが向上している。
【００６５】
実施例３  取得したＦＮ６Ｋの熱安定性の評価
４種の新規ＦＮ６Ｋ及びＥｃ由来ＦＮ６Ｋについて、最も安定な緩衝液中で、０、３０、４０、４５、５０℃で３０分間静置し、残存活性を評価した。Ｃｓ由来ＦＮ６Ｋ、Ｓｆ由来ＦＮ６Ｋ、Ｂｖ由来ＦＮ６Ｋ及びＥｃ由来ＦＮ６ＫはｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、また、Ｅｈ由来ＦＮ６ＫはｐＨ６．０の１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を用いた。０℃で３０分間処理した酵素の活性を１００％として、残存活性を測定した。ＦＮ６Ｋ活性の測定方法は、前記ＦＮ６Ｋの活性測定方法に従った。９０％以上の残存活性を示した温度域を表４に示す。
【００６６】
【表４】
2019180391.tif 000007
【００６７】
今回取得した４種類のＦＮ６Ｋはいずれも、公知のＥｃ由来ＦＮ６Ｋと比較して、同等以上の熱安定性を示した。
【００６８】
実施例４  取得したＦＮ６Ｋの基質特異性の評価
ε−フルクトシルリジンに対する作用性を１００％とした場合のフルクトシルバリンに対する作用性について、それぞれの基質濃度を０．２ｍＭとして測定し、基質特異性を評価した。結果を表５に示す。
【００６９】
【表５】
2019180391.tif 000008
【００７０】
今回取得した４種のＦＮ６Ｋはいずれも、公知のＥｃ由来ＦＮ６Ｋと比較して、同等の基質特異性を有していた。
【００７１】
実施例５  取得したＦＮ６Ｋの至適活性ｐＨの評価
４種の新規ＦＮ６Ｋ及びＥｃ由来ＦＮ６Ｋについて、前記ＦＮ６Ｋの活性測定方法の緩衝液をｐＨの異なる緩衝液に変更し、ＦＮ６Ｋ活性を測定した。緩衝液は、２００ｍＭの緩衝液（酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０〜５．０）、クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０〜６．０）、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜７．５）、トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５〜９．０）又はグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０〜９．５））を用いた。各緩衝液中で測定したうちの一番高い活性値を１００％とした場合に、８０％以上の活性値を示すｐＨ範囲を表６に示す。
【００７２】
【表６】
2019180391.tif 000009
【００７３】
実施例６  取得したＦＮ６Ｋの至適活性温度の評価
４種の新規ＦＮ６Ｋ及びＥｃ由来ＦＮ６Ｋについて、前記ＦＮ６Ｋの活性測定方法の温度を２５、３０、３５、４０℃とし、ＦＮ６Ｋ活性を測定した。各温度で測定したうちの一番高い活性値を１００％としたとした場合に、８０％以上の活性値を示す温度域を表７に示す。
【００７４】
【表７】
2019180391.tif 000010
【００７５】
実施例７  ε−フルクトシルリジンの測定
実施例１で得られた４種の新規ＦＮ６Ｋ（Ｃｓ−ＦＮ６Ｋ、Ｅｈ−ＦＮ６Ｋ、Ｓｆ−ＦＮ６Ｋ及びＢｖ−ＦＮ６Ｋ）を用いて、前記ＦＮ６Ｋの活性測定法に準じ、０．０１、０．０５、０．１又は０．２ｍＭの濃度のε−フルクトシルリジンを含有する以下の組成を有する緩衝液における、吸光度変化を測定した。
＜試薬及び終濃度＞
２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．１）
２５ｍＭ  ＫＣｌ水溶液
１ｍＭ  塩化マグネシウム水溶液
１ｍＭ  ジチオスレイトール
０.２５ｍＭ  ホスホエノールピルビン酸
０.１５ｍＭ  ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）
１ｍＭ  アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）
１０μｇ／ｍＬ  ピルビン酸キナーゼ
５μｇ／ｍＬ  乳酸脱水素酵素
０．０１、０．０５、０．１又は０．２ｍＭ  ε−フルクトシルリジン
各ε−フルクトシルリジン濃度における相対活性値を図１に示す。その結果、吸光度計を用いた測定において、本発明のＦＮ６Ｋを用いてε−フルクトシルリジンの定量が可能であることが示された。
【図１】
2019180391.tif 000011
【配列表】
2019180391000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年1月29日(2019.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料に、以下の特性（ａ）〜（ｆ）を有する、クロノバクター属、アトランティバクター属、セラチア属又はバチルス属に属する微生物由来のフルクトサミン−６−キナーゼを反応させることを特徴とするフルクトシルリジンの測定方法。
（ａ）ＡＴＰ存在下で、フルクトシルリジンをリン酸化してフルクトシルリジン−６−リン酸を生成する
（ｂ）比活性：１０Ｕ／ｍｇ以上である
（ｃ）基質特異性：フルクトシルリジンに対する反応性を１００％としたときのフルクトシルバリンに対する反応性が５％以下である
（ｄ）分子量：２５ｋＤａ〜３５ｋＤａである
（ｅ）ｐＨ安定性：６．５〜８．０で安定であって、ｐＨ８．０で８０％以上の安定性を有する
（ｆ）温度安定性：３０℃で安定である
【請求項２】
前記フルクトサミン−６−キナーゼがさらに以下の特性（ｇ）及び（ｈ）を有する、請求項１に記載のフルクトシルリジンの測定方法。
（ｇ）至適活性ｐＨ：８．０〜８．５
（ｈ）至適活性温度：３５〜４０℃
【請求項３】
測定温度が３５℃以上であることを特徴とする請求項１又は２に記載のフルクトシルリジンの測定方法。
【請求項４】
ｐＨ５．０〜９．０の範囲内で測定することを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載のフルクトシルリジンの測定方法。
【請求項５】
以下の特性（ａ）〜（ｆ）を有する、クロノバクター属、アトランティバクター属、セラチア属又はバチルス属に属する微生物由来のフルクトサミン−６−キナーゼを含む、フルクトシルリジン測定用試薬。
（ａ）ＡＴＰ存在下で、フルクトシルリジンをリン酸化してフルクトシルリジン−６−リン酸を生成する
（ｂ）比活性：１０Ｕ／ｍｇ以上である
（ｃ）基質特異性：フルクトシルリジンに対する反応性を１００％としたときのフルクトシルバリンに対する反応性が５％以下である
（ｄ）分子量：２５ｋＤａ〜３５ｋＤａである
（ｅ）ｐＨ安定性：６．５〜８．０で安定であって、ｐＨ８．０で８０％以上の安定性を有する
（ｆ）温度安定性：３０℃で安定である
【請求項６】
前記フルクトサミン−６−キナーゼがさらに以下の特性（ｇ）及び（ｈ）を有する、請求項５に記載のフルクトシルリジン測定用試薬。
（ｇ）至適活性ｐＨ：８．０〜８．５
（ｈ）至適活性温度：３５〜４０℃
【請求項７】
以下の特性（ａ）〜（ｆ）を有する、クロノバクター属、アトランティバクター属、セラチア属又はバチルス属に属する微生物由来のフルクトサミン−６−キナーゼを含む、フルクトシルリジン測定用キット。
（ａ）ＡＴＰ存在下で、フルクトシルリジンをリン酸化してフルクトシルリジン−６−リン酸を生成する
（ｂ）比活性：１０Ｕ／ｍｇ以上である
（ｃ）基質特異性：フルクトシルリジンに対する反応性を１００％としたときのフルクトシルバリンに対する反応性が５％以下である
（ｄ）分子量：２５ｋＤａ〜３５ｋＤａである
（ｅ）ｐＨ安定性：６．５〜８．０で安定であって、ｐＨ８．０で８０％以上の安定性を有する
（ｆ）温度安定性：３０℃で安定である
【請求項８】
前記フルクトサミン−６−キナーゼがさらに以下の特性（ｇ）及び（ｈ）を有する、請求項７に記載のフルクトシルリジン測定用キット。
（ｇ）至適活性ｐＨ：８．０〜８．５
（ｈ）至適活性温度：３５〜４０℃
【請求項９】
ｐＨを５．０〜９．０に調整することを特徴とする、特性（ａ）〜（ｆ）を有する、クロノバクター属、アトランティバクター属、セラチア属又はバチルス属に属する微生物由来のフルクトサミン−６−キナーゼの安定化方法。
（ａ）ＡＴＰ存在下で、フルクトシルリジンをリン酸化してフルクトシルリジン−６−リン酸を生成する
（ｂ）比活性：１０Ｕ／ｍｇ以上である
（ｃ）基質特異性：フルクトシルリジンに対する反応性を１００％としたときのフルクトシルバリンに対する反応性が５％以下である
（ｄ）分子量：２５ｋＤａ〜３５ｋＤａである
（ｅ）ｐＨ安定性：６．５〜８．０で安定であって、ｐＨ８．０で８０％以上の安定性を有する
（ｆ）温度安定性：３０℃で安定である
【請求項１０】
前記フルクトサミン−６−キナーゼがさらに以下の特性（ｇ）及び（ｈ）を有する、請求項９に記載のフルクトサミン−６−キナーゼの安定化方法。
（ｇ）至適活性ｐＨ：８．０〜８．５
（ｈ）至適活性温度：３５〜４０℃
【請求項１１】
被検試料に、下記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のアミノ酸配列を有し、かつフルクトサミン−６−キナーゼ活性を有するタンパク質であって、
（Ａ）配列番号５、６、７又は８に示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号５、６、７又は８に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、又は
（Ｃ）配列番号５、６、７又は８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列
以下の特性（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）を有するフルクトサミン−６−キナーゼを反応させることを特徴とするフルクトシルリジンの測定方法。
（ａ）ＡＴＰ存在下で、フルクトシルリジンをリン酸化してフルクトシルリジン−６−リン酸を生成する
（ｃ）基質特異性：フルクトシルリジンに対する反応性を１００％としたときのフルクトシルバリンに対する反応性が５％以下である
（ｄ）分子量：２５ｋＤａ〜３５ｋＤａである
（ｅ）ｐＨ安定性：６．５〜８．０で安定であって、ｐＨ８．０で８０％以上の安定性を有する
【請求項１２】
下記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のアミノ酸配列を有し、かつフルクトサミン−６−キナーゼ活性を有するタンパク質であって、
（Ａ）配列番号５、６、７又は８に示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号５、６、７又は８に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、又は
（Ｃ）配列番号５、６、７又は８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列
以下の特性（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）を有するフルクトサミン−６−キナーゼを含む、フルクトシルリジン測定用試薬。
（ａ）ＡＴＰ存在下で、フルクトシルリジンをリン酸化してフルクトシルリジン−６−リン酸を生成する
（ｃ）基質特異性：フルクトシルリジンに対する反応性を１００％としたときのフルクトシルバリンに対する反応性が５％以下である
（ｄ）分子量：２５ｋＤａ〜３５ｋＤａである
（ｅ）ｐＨ安定性：６．５〜８．０で安定であって、ｐＨ８．０で８０％以上の安定性を有する
【請求項１３】
下記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のアミノ酸配列を有し、かつフルクトサミン−６−キナーゼ活性を有するタンパク質であって、
（Ａ）配列番号５、６、７又は８に示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号５、６、７又は８に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、又は
（Ｃ）配列番号５、６、７又は８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列  
以下の特性（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）を有するフルクトサミン−６−キナーゼを含む、フルクトシルリジン測定用キット。
（ａ）ＡＴＰ存在下で、フルクトシルリジンをリン酸化してフルクトシルリジン−６−リン酸を生成する
（ｃ）基質特異性：フルクトシルリジンに対する反応性を１００％としたときのフルクトシルバリンに対する反応性が５％以下である
（ｄ）分子量：２５ｋＤａ〜３５ｋＤａである
（ｅ）ｐＨ安定性：６．５〜８．０で安定であって、ｐＨ８．０で８０％以上の安定性を有する
【請求項１４】
ｐＨを５．０〜９．０に調整することを特徴とする、
下記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のアミノ酸配列を有し、かつフルクトサミン−６−キナーゼ活性を有するタンパク質であって、
（Ａ）配列番号５、６、７又は８に示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号５、６、７又は８に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、又は
（Ｃ）配列番号５、６、７又は８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列  
以下の特性（ａ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）を有するフルクトサミン−６−キナーゼの安定化方法。
（ａ）ＡＴＰ存在下で、フルクトシルリジンをリン酸化してフルクトシルリジン−６−リン酸を生成する
（ｃ）基質特異性：フルクトシルリジンに対する反応性を１００％としたときのフルクトシルバリンに対する反応性が５％以下である
（ｄ）分子量：２５ｋＤａ〜３５ｋＤａである
（ｅ）ｐＨ安定性：６．５〜８．０で安定であって、ｐＨ８．０で８０％以上の安定性を有する