(57)【要約】      （修正有）【課題】種々の疾患および障害の治療および予防に有用なジャスモネート化合物（例えば、ナノ担持またはマイクロ担持されたジャスモネート化合物）の医薬組成物の提供。【解決手段】医薬として許容される溶媒、及びメチルジヒドロジャスモネート（ＭＤＪ）を含有する複数のナノキャリア又はマイクロキャリアを含む医薬組成物であって、ナノキャリア又はマイクロキャリアが、シクロデキストリン又はデンドリマーから形成される、或いはリン脂質層に囲まれたコレステリルエステルのコアを含む合成ナノエマルジョン粒子であり、ナノキャリアが、１〜５００ｎｍの範囲のサイズを有し、或いはマイクロキャリアが、１〜１００μｍの範囲のサイズを有し、そして医薬組成物は、１ｎＭ〜１Μの範囲の濃度のＭＤＪを有する、医薬組成物。【選択図】図２４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬として許容される溶媒、およびメチルジヒドロジャスモネート（ＭＤＪ）を含有する複数のナノキャリアまたはマイクロキャリアを含む医薬組成物であって、
ナノキャリアまたはマイクロキャリアは、シクロデキストリンまたはデンドリマーから形成される、あるいはリン脂質層に囲まれたコレステリルエステルのコアを含む合成ナノエマルジョン粒子（ＬＤＥ）であり；
ナノキャリアは、１ナノメートル（ｎｍ）から５００ｎｍの範囲のサイズを有する；あるいは
マイクロキャリアは、１ミクロンから１００ミクロンの範囲のサイズを有する；そして
医薬組成物は、１ｎＭから１Μの範囲の濃度のＭＤＪを有する、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記ナノキャリアは、シクロデキストリンから形成され、そして３ｎｍから１００ｎｍの範囲のサイズを有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記シクロデキストリンナノキャリアは、３．５ｎｍから１１ｎｍの範囲のサイズを有する、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記シクロデキストリンナノキャリアは、５０ｎｍから１００ｎｍの範囲のサイズを有する、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ナノキャリアはＬＤＥであり、そして３０ｎｍから５００ｎｍの範囲のサイズを有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ＬＤＥは５０ｎｍから１１０ｎｍの範囲のサイズを有する、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ナノキャリアは、デンドリマーから形成され、そして２ｎｍから５００ｎｍの範囲のサイズを有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記デンドリマーはポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ＭＤＪの濃度の範囲は１ｎＭから１００μΜである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ＭＤＪの濃度の範囲は１０μΜから１００ｍＭである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ＭＤＪの濃度の範囲は１００ｍＭから１Μである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ナノキャリアまたはマイクロキャリアは、更に２−アミノエチルリン酸二水素、３，７−ジメチル−２，６−オクタジエナール、サリチル酸メチル、またはアブシジン酸を含有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記医薬として許容される溶媒は、水、アルコール、またはそれらの混合物である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記ナノキャリアまたはマイクロキャリアは更に非ジャスモネート化合物を含有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
医薬として許容される溶媒、およびジャスモネート化合物を含有する複数のナノキャリアまたはマイクロキャリアを含む医薬組成物であって、
ナノキャリアまたはマイクロキャリアは、シクロデキストリンまたはデンドリマーから形成される、あるいはリン脂質層に囲まれたコレステリルエステルのコアを含む合成ナノエマルジョン粒子（ＬＤＥ）であり；
ナノキャリアは、１ナノメートル（ｎｍ）から５００ｎｍの範囲のサイズを有する；あるいは
マイクロキャリアは、１ミクロンから５０ミクロンの範囲のサイズを有する；そして
医薬組成物は、１ｎＭから１Μの範囲の濃度のジャスモネート化合物を有する、前記医薬組成物。
【請求項１６】
前記ジャスモネート化合物は、ジャスモン酸、７−イソ−ジャスモン酸、９，１０−ジヒドロジャスモン酸、９，１０−ジヒドロ−イソジャスモン酸、２，３−ジデヒドロジャスモン酸、３，４−ジデヒドロジャスモン酸、３，７−ジデヒドロジャスモン酸、４，５−ジデヒドロジャスモン酸、４，５−ジデヒドロ−７−イソジャスモン酸、ククルビン酸、６−エピ−ククルビン酸、６−エピ−ククルビン酸−ラクトン、１２−ヒドロキシ−ジャスモン酸、１２−ヒドロキシ−ジャスモン酸−ラクトン、１１−ヒドロキシ−ジャスモン酸、８−ヒドロキシ−ジャスモン酸、ホモ−ジャスモン酸、ジホモ−ジャスモン酸、１１−ヒドロキシ−ジホモ−ジャスモン酸、８−ヒドロキシ−ジホモ−ジャスモン酸、ツベロン酸、ツベロン酸−Ｏ−β−グルコピラノシド、ククルビン酸−Ｏ−β−グルコピラノシド、５，６−ジデヒドロ−ジャスモン酸、６，７−ジデヒドロ−ジャスモン酸、７，８−ジデヒドロ−ジャスモン酸、シスジャスモン，ジヒドロジャスモン、およびこれらの低級アルキルエステルからなる群より選択される、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記ジャスモネート化合物はジャスモン酸メチルであり、そして約１ｎＭから１μΜの濃度を有する、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記ジャスモネート化合物はジャスモン酸メチルであり、そして約１μΜから１００ｍＭの濃度を有する、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記ナノキャリアまたはマイクロキャリアは更に非ジャスモネート化合物を含有する、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
血管新生関連疾患の治療の必要がある対象に、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物を有効量投与することを含む、血管新生関連疾患を治療する方法。
【請求項２１】
前記血管新生関連疾患は癌である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記癌は、白血病、結腸癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、肝臓癌、皮膚癌、卵巣癌、黒色腫、または肉腫である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記血管新生関連疾患は炎症性疾患である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記炎症性疾患は炎症性腸疾患である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＮＦ−κＢ関連疾患の治療の必要がある対象に、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物を有効量投与することを含む、ＮＦ−κＢ関連疾患を治療する方法。
【請求項２６】
前記ＮＦ−κＢ関連疾患は、ウイルス、細菌、または真菌感染症である、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１１年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／５３５，８３６号；２０１１年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６１／５５５，６９０号；２０１２年２月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６０３，０４２号；２０１２年３月６日に出願された米国仮特許出願第６１／６０７，３１８号；及び２０１２年３月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／６１２，７７４号；並びに２０１２年２月２７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１２／０００３６４号の優先権および利益を主張する。上記出願のそれぞれの全内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、種々の疾患および障害の治療および予防に有用なジャスモネート化合物（例えば、ナノ担持またはマイクロ担持されたジャスモネート化合物）の医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ジャスモネート化合物またはジャスモネートは、シクロペンタノン環を有することを特徴とし、植物がストレスの多い状況に直面すると生成する植物ストレスホルモンとして知られている。ジャスモネートの例として、ジャスモン酸（ＪＡ）、ジャスモン酸メチル（ＭＪ）、およびシス／トランスジャスモン（例えば、米国特許第６，４６９，０６１号およびＷＯ２００７／０６６３３７号参照）が挙げられるが、これらに限定されない。ＭＪおよびＪＡは両者とも、腫瘍細胞に対し効果的かつ選択的であることが示されている（例えば、Ｆｌｅｓｃｈｅｒ，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  ２００５、１６：９０１〜９１６および米国特許出願第２００２／０１７３４７０号参照）。しかし、ジャスモネートは、インビボで投与した場合、通常、標的癌細胞に到達する前に、例えば、エステラーゼによって代謝されるため、抗がん剤としてあまり魅力がない。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、部分的に、ナノ担持またはマイクロ担持されたジャスモネート、特に、種々の疾患、例えば、血管新生関連疾患および炎症性疾患の治療または予防の用途にナノ担持またはマイクロ担持されたメチルジヒドロジャスモネート（ＭＤＪ、メチル２−（３−オキソ−２−ペンチルシクロペンチル）アセテートとしても知られる）を提供する。以下にＭＤＪの化学構造を示す。
【０００５】
【化１】
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【０００６】
一の態様において、本開示は、医薬として許容される溶媒ならびにＭＤＪを含有する複数のナノキャリアおよび／またはマイクロキャリアを含む医薬組成物を提供する。ナノキャリアおよび／またはマイクロキャリアは、シクロデキストリンもしくはデンドリマー、またはリポソームから形成される、あるいはリン脂質外層に囲まれたコレステリルエステルのコアを含む合成ナノエマルジョン粒子（ＬＤＥ）であり；当該ナノキャリアは、１ナノメートル（ｎｍ）から１０００ｎｍ（例えば、１〜９００ｎｍ、１〜８００ｎｍ、１〜７００ｎｍ、１〜６００ｎｍ、１〜５００ｎｍ、１〜４００ｎｍ、１〜３００ｎｍ、１〜２００ｎｍ、１〜１００ｎｍ、１〜９０ｎｍ、１〜８０ｎｍ、１〜７０ｎｍ、１〜５０ｎｍ、１〜３０ｎｍ、または１〜１０ｎｍ）の範囲のサイズを有し；当該マイクロキャリアは１ミクロンから５０ミクロン（例えば、１ミクロンから約４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１．５ミクロン）の範囲のサイズを有し、そして当該医薬組成物は、１ｎＭから１Ｍ（例えば、１ｎＭから１０ｎＭ、１ｎＭから１００ｎＭ、１ｎＭから１μＭ、１ｎＭから１０μＭ、１ｎＭから１００μＭ、１００μΜから１ｍＭ、１００μΜから１０ｍＭ、１００μΜから１００ｍＭ、または１００ｍＭから１Ｍ）の範囲の濃度のＭＤＪを有する。
【０００７】
この医薬組成物は、以下の特徴の一つ以上を有していてもよい。
【０００８】
当該医薬組成物は、１ｎＭから１０〜１００μΜ（例えば、１ｎＭから１０ｎＭ、１０ｎＭから１００ｎＭ、１００ｎＭから１μＭ、１μΜから１０μＭ、または１０μΜから１００μΜ）、あるいは１００μΜから１ｍΜ（例えば、１００μΜから、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、または９００μΜまで）、あるいは１００μΜから１０ｍΜ（例えば、１００μＭから２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、または、９００μΜから１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、もしくは１０ｍＭまで）、あるいは１００μΜから１００ｍΜ（例えば、１００μＭから、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ、または１ｍＭから、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、もしくは１００ｍＭまで）、あるいは１０μΜから１ｍΜ（例えば、１０μＭから、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、または９０μΜから０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、もしくは１ｍＭまで）、あるいは１から１００ｍΜ（例えば、１〜１０ｍＭ、１〜２０ｍＭ、１〜３０ｍＭ、１〜４０ｍＭ、１〜５０ｍＭ、１〜６０ｍＭ、１〜７０ｍＭ、１〜８０ｍＭ、または１〜９０ｍＭ）、あるいは１００ｍＭから１Ｍ（例えば、０．２Μから、０．３Μ、０．４Μ、０．５Μ、０．６Μ、０．７Μ、０．８Μ、０．９Μ、１Ｍまで）の範囲の濃度のＭＤＪを有する。
【０００９】
当該ナノキャリアは、シクロデキストリンから形成され、そして３ｎｍから１００ｎｍ、例えば、３．５〜１１ｎｍ、１０〜２０ｎｍ、１０〜３０ｎｍ、１０〜４０ｎｍ、１０〜５０ｎｍ、１０〜６０ｎｍ、１０〜７０ｎｍ、１０〜８０ｎｍ、１０〜９０ｎｍ、２０〜３０ｎｍ、２０〜４０ｎｍ、２０〜５０ｎｍ、２０〜６０ｎｍ、２０〜７０ｎｍ、２０〜８０ｎｍ、２０〜９０ｎｍ、３０〜４０ｎｍ、３０〜５０ｎｍ、３０〜６０ｎｍ、３０〜７０ｎｍ、３０〜８０ｎｍ、３０〜９０ｎｍ、４０〜５０ｎｍ、４０〜６０ｎｍ、４０〜７０ｎｍ、４０〜８０ｎｍ、４０〜９０ｎｍ、または５０〜６０ｎｍ、５０〜７０ｎｍ、５０〜８０ｎｍ、５０〜９０ｎｍ、または５０〜１００ｎｍの範囲のサイズを有する。
【００１０】
当該ナノキャリアは、リポソームまたはＬＤＥであり、そして３０ｎｍから５００ｎｍ、例えば、５０ｎｍ〜１１０ｎｍ、３０ｎｍ〜５０ｎｍ、３０ｎｍ〜１００ｎｍ、３０ｎｍ〜１５０ｎｍ、３０ｎｍ〜２００ｎｍ、３０ｎｍ〜２５０ｎｍ、３０ｎｍ〜３００ｎｍ、３０ｎｍ〜３５０ｎｍ、３０ｎｍ〜４００ｎｍ、または３０ｎｍ〜４５０ｎｍの範囲のサイズを有する。
【００１１】
当該マイクロキャリアは、リポソームまたはＬＤＥであり、そして約２μｍから３０μｍ（例えば、２〜５μｍ、２〜１０μｍ、２〜１５μｍ、２〜２０μｍ、または２〜２５μｍ）、約５μｍから２０μｍ（例えば、５〜７．５μｍ、５〜１０μｍ、５〜１２．５μｍ、５〜１５μｍ、または５〜１７．５μｍ）の範囲、あるいは約１０μｍのサイズを有する。更に、ＭＤＪの濃度の範囲は、１０〜１００μΜから１００ｍΜ（例えば、５０〜１００μΜ、または１００μＭから、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、または９００μΜから１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、もしくは１０ｍΜまで、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、もしくは１００ｍＭまで）あるいは１００ｍＭから１Ｍ（例えば、０．２Μ、０．３Μ、０．４Μ、０．５Μ、０．６Μ、０．７Μ、０．８Μ、０．９Μ、１Ｍ）の範囲のサイズを有する。
【００１２】
当該ナノキャリアは、デンドリマーから形成され、そして１ｎｍから５００ｎｍ（例えば、２〜１０ｎｍ、２〜２０ｎｍ、２〜５０ｎｍ、２〜１００ｎｍ、２〜１５０ｎｍ、２〜２００ｎｍ、２〜２５０ｎｍ、２〜３００ｎｍ、２〜３５０ｎｍ、２〜４００ｎｍ、２〜４５０ｎｍ、１０〜１００ｎｍ、１０〜２００ｎｍ、１０〜３００ｎｍ、１０〜４００ｎｍ、１０〜５００ｎｍ、５０〜１００ｎｍ、５０〜２００ｎｍ、５０〜３００ｎｍ、５０〜４００ｎｍ、５０〜５００ｎｍ、１００〜３００ｎｍ、１００〜５００ｎｍ、２００〜５００ｎｍ、３００〜５００ｎｍ、または４００〜５００ｎｍ）の範囲のサイズを有する。
【００１３】
当該デンドリマーは、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）である。
【００１４】
ΜＤＪの濃度の範囲は、１ｎＭから１０〜１００μΜ（例えば、１ｎＭから１０ｎＭ、１０ｎＭから１００ｎＭ、１００ｎＭから１μＭ、１μΜから１０μＭ、または１０μΜから１００μΜ）、１０〜１００μΜから１００ｍΜ（例えば、５０〜１００μΜまたは１００μＭから２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、または９００μΜから１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、または１０ｍΜまで、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または１００ｍＭまで）、あるいは１００ｍＭから１Μ（例えば、０．２Μから、０．３Μ、０．４Μ、０．５Μ、０．６Μ、０．７Μ、０．８Μ、０．９Μ、１Ｍまで）の範囲のサイズを有する。例えば、ＭＤＪの濃度は、１００μΜから１ｍＭ、または５０ｎＭから７０ｎＭである。
【００１５】
当該ナノキャリアまたはマイクロキャリアは、更に、２−アミノエチルリン酸二水素（もしくはホスホエタノールアミン）、３，７−ジメチル−２，６−オクタジエナール（もしくはシトラール）、サリチル酸メチル、アブシジン酸、またはそれらの誘導体もしくは類似体を含む。３，７−ジメチル−２，６−オクタジエナールは、シスまたはトランス異性体のいずれかであり得る。
【００１６】
当該医薬として許容される溶媒は、水、アルコール、またはそれらの混合物である。
【００１７】
別の態様において、本開示は、医薬として許容される溶媒ならびにジャスモネート化合物を含有する複数のナノキャリアおよび／またはマイクロキャリアを含む医薬組成物を提供する。ナノキャリアおよび／またはマイクロキャリアは、シクロデキストリンもしくはデンドリマー、またはリポソームから形成される、あるいは、ナノキャリアおよび／またはマイクロキャリアは、リン脂質層に囲まれたコレステリルエステルのコアを含む合成ナノエマルジョン粒子（ＬＤＥ）である。当該ナノキャリアは、１ｎｍから１０００ｎｍ（例えば、１〜９００ｎｍ、１〜８００ｎｍ、１〜７００ｎｍ、１〜６００ｎｍ、１〜５００ｎｍ、１〜４００ｎｍ、１〜３００ｎｍ、１〜２００ｎｍ、１〜１００ｎｍ、１〜９０ｎｍ、１〜８０ｎｍ、１〜７０ｎｍ、１〜５０ｎｍ、１〜３０ｎｍ、または１〜１０ｎｍ）の範囲のサイズを有し；当該マイクロキャリアは、１ミクロンから５０ミクロン（例えば、１ミクロンから約４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１．５ミクロン）の範囲のサイズを有し、そして当該医薬組成物は、１ｎＭから１Ｍ（例えば、１ｎＭから１０ｎＭ、１ｎＭから１００ｎＭ、１ｎＭから１μＭ、１ｎＭから１０μＭ、１ｎＭから１００μＭ、１００μΜ、１ｍＭ、１００μΜから１０ｍＭ、１００μΜから１００ｍＭ、または１００ｍＭから１Μ）の範囲のジャスモネート化合物の濃度を有する。
【００１８】
この医薬組成物は、以下の特徴の一つ以上を有していてもよい。
【００１９】
当該ジャスモネート化合物は、ジャスモン酸、７−イソ−ジャスモン酸、９，１０−ジヒドロジャスモン酸、９，１０−ジヒドロ−イソジャスモン酸、２、３−ジデヒドロジャスモン酸、３，４−ジデヒドロジャスモン酸、３，７−ジデヒドロジャスモン酸、４，５−ジデヒドロジャスモン酸、４，５−ジデヒドロ−７−イソジャスモン酸、ククルビン酸、６−エピ−ククルビン酸、６−エピ−ククルビン酸−ラクトン、１２−ヒドロキシ−ジャスモン酸、１２−ヒドロキシ−ジャスモン酸−ラクトン、１１−ヒドロキシ−ジャスモン酸、８−ヒドロキシ−ジャスモン酸、ホモ−ジャスモン酸、ジホモ−ジャスモン酸、１１−ヒドロキシ−ジホモ−ジャスモン酸、８−ヒドロキシ−ジホモ−ジャスモン酸、ツベロン酸、ツベロン酸−Ｏ−β−グルコピラノシド、ククルビン酸−Ｏ−β−グルコピラノシド、５，６−ジデヒドロ−ジャスモン酸、６，７−ジデヒドロ−ジャスモン酸、７，８−ジデヒドロ−ジャスモン酸、シスジャスモン、ジヒドロジャスモン、およびこれらの低級アルキルエステルからなる群より選択される。
【００２０】
当該医薬組成物は、１ｎＭから１μΜ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９ｎＭから１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、または９５０ｎＭまで）、あるいは１ｎＭから１００μΜ（例えば、１ｎＭから１０ｎＭ、１０ｎＭから１００ｎＭ、１００ｎＭから１μＭ、１μΜから１０μＭ、または１０μΜから１００μΜ）、あるいは１ｎＭから１ｍΜ（例えば、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭから、または５０μＭ、１００μΜ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、または９００μΜまで）、あるいは１０μΜから１００ｍΜ（例えば、５０μΜから、または９０μΜから、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、または９０ｍＭまで）、あるいは１００μΜから１ｍΜ（例えば、１００μΜから、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μΜ）、あるいは１００μΜ〜１０ｍΜ（例えば、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、または９００μΜから１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、または１０ｍＭまで）、あるいは１００μΜから１００ｍΜ（例えば、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭから、または１ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または１００ｍＭまで）、あるいは１０μΜから１ｍΜ（例えば、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、または９０μΜから、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、または１ｍＭまで）、あるいは１〜１００ｍΜ（例えば、１〜１０ｍＭ、１〜２０ｍＭ、１〜３０ｍＭ、１〜４０ｍＭ、１〜５０ｍＭ、１〜６０ｍＭ、１〜７０ｍＭ、１〜８０ｍＭ、または１〜９０ｍＭ）、あるいは１００ｍＭから１Ｍ（例えば、０．２Μから、０．３Μ、０．４Μ、０．５Μ、０．６Μ、０．７Μ、０．８Μ、０．９Μ、１Ｍまで）の範囲のジャスモネート化合物の濃度を有する。
【００２１】
当該ナノキャリアは、シクロデキストリンから形成され、そして３ｎｍから１００ｎｍ、例えば、３．５〜１１ｎｍ、１０〜２０ｎｍ、１０〜３０ｎｍ、１０〜４０ｎｍ、１０〜５０ｎｍ、１０〜６０ｎｍ、１０〜７０ｎｍ、１０〜８０ｎｍ、１０〜９０ｎｍ、２０〜３０ｎｍ、２０〜４０ｎｍ、２０〜５０ｎｍ、２０〜６０ｎｍ、２０〜７０ｎｍ、２０〜８０ｎｍ、２０〜９０ｎｍ、３０〜４０ｎｍ、３０〜５０ｎｍ、３０〜６０ｎｍ、３０〜７０ｎｍ、３０〜８０ｎｍ、３０〜９０ｎｍ、４０〜５０ｎｍ、４０〜６０ｎｍ、４０〜７０ｎｍ、４０〜８０ｎｍ、４０〜９０ｎｍ、または５０〜６０ｎｍ、５０〜７０ｎｍ、５０〜８０ｎｍ、５０〜９０ｎｍ、または５０〜１００ｎｍの範囲のサイズを有する。
【００２２】
当該ナノキャリアは、リポソームまたはＬＤＥであり、そして３０ｎｍから５００ｎｍ、例えば、５０ｎｍ〜１１０ｎｍ、３０ｎｍ〜５０ｎｍ、３０ｎｍ〜１００ｎｍ、３０ｎｍ〜１５０ｎｍ、３０ｎｍ〜２００ｎｍ、３０ｎｍ〜２５０ｎｍ３０ｎｍ〜３００ｎｍ、３０ｎｍ〜３５０ｎｍ、３０ｎｍ〜４００ｎｍ、または３０ｎｍ〜４５０ｎｍの範囲のサイズを有する。
【００２３】
当該マイクロキャリアは、リポソームまたはＬＤＥであり、そして約２μｍから３０μｍ（例えば、２〜５μｍ、２〜１０μｍ、２〜１５μｍ、２〜２０μｍ、または２〜２５μｍ）、約５μｍから２０μｍ（例えば、５〜７．５μｍ、５〜１０μｍ、５〜１２．５μｍ、５〜１５μｍ、または５〜１７．５μｍ）の範囲、あるいは約１０μｍのサイズを有する。更に、当該ジャスモネート化合物は、ＭＤＪであり、そしてＭＤＪの濃度の範囲は、１００ｍＭから１Ｍ（例えば、０．２Μから、０．３Μ、０．４Μ、０．５Μ、０．６Μ、０．７Μ、０．８Μ、０．９Μ、１Ｍまで）である。
【００２４】
当該ナノキャリアは、デンドリマーから形成され、そして２ｎｍから５００ｎｍ（例えば、２〜１０ｎｍ、２〜２０ｎｍ、２〜５０ｎｍ、２〜１００ｎｍ、２〜１５０ｎｍ、２〜２００ｎｍ、２〜２５０ｎｍ、２〜３００ｎｍ、２〜３５０ｎｍ、２〜４００ｎｍ、２〜４５０ｎｍ、１０〜１００ｎｍ、１０〜２００ｎｍ、１０〜３００ｎｍ、１０〜４００ｎｍ、１０〜５００ｎｍ、５０〜１００ｎｍ、５０〜２００ｎｍ、５０〜３００ｎｍ、５０〜４００ｎｍ、５０〜５００ｎｍ、１００〜３００ｎｍ、１００〜５００ｎｍ、２００〜５００ｎｍ、３００〜５００ｎｍ、または４００〜５００ｎｍ）の範囲のサイズを有する。
【００２５】
当該デンドリマーは、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）である。
【００２６】
当該ジャスモネート化合物は、ＭＤＪであり、そしてＭＤＪの濃度の範囲は、１ｎＭから１０〜１００μＭ、１０〜１００μΜから１００ｍＭ、または１００ｍＭから１Ｍ、例えば、１００μΜから１ｍΜまたは５０ｎＭから７０ｎＭである。
【００２７】
当該ジャスモネート化合物は、ＭＪであり、そしてＭＪの濃度の範囲は、１ｎＭから１μＭ、１０〜１００μΜから１００ｍＭ、または１００ｍＭから１Ｍ、例えば、１００μΜから１ｍΜまたは５０ｎＭから７０ｎＭである。
【００２８】
当該ナノキャリアまたはマイクロキャリアは、更に、２−アミノエチルリン酸二水素（またはホスホエタノールアミン）、３，７−ジメチル−２，６−オクタジエナール（またはシトラール）、サリチル酸メチル、アブシジン酸またはそれらの誘導体もしくは類似体を含む。３，７−ジメチル−２，６−オクタジエナールは、シスまたはトランス異性体のいずれかであり得る。
【００２９】
当該医薬として許容される溶媒は、水、アルコール、またはそれらの混合物である。本明細書に記載の化合物のいずれかは、更に、一つ以上の非ジャスモネート化合物、例えば、２−アミノエチルリン酸二水素（またはホスホエタノールアミン）、３，７−ジメチル−２，６−オクタジエナール（またはシトラール）、サリチル酸メチル、アブシジン酸、天然アミノ酸、Ｃａ2+、Ｚｎ2+、またはこれらの誘導体もしくは類似体、を含み得る。
【００３０】
更に別の態様において、本開示は、本明細書に記載のナノ担持および／またはマイクロ担持されたジャスモネート化合物あるいはそれらの医薬組成物を、癌または炎症性疾患（例えば、炎症性腸疾患、急性皮膚炎、骨盤内炎症性疾患、もしくは扁桃炎）といった血管新生関連疾患の治療または予防のために使用することについて記載する。
【００３１】
更に別の態様において、本開示は、本明細書に記載のナノ担持および／またはマイクロ担持されたジャスモネート化合物あるいはそれらの医薬組成物を、ウイルス、細菌、または真菌感染症といったＮＦ−κΒ関連疾患の治療または予防のために使用することについて記載する。
【００３２】
更に、本発明は、本明細書に記載のナノ担持および／またはマイクロ担持されたジャスモネート化合物あるいはそれらの医薬組成物を、インビトロまたはインビボにおける癌細胞の増殖を阻害するために使用することを特徴とする。例えば、本発明の方法での使用に適した癌細胞株としては：ＵＡＣＣ６２−黒色腫、ΜＣＦ７−癌耐性、ＮＣＩＡＤＲ−多剤耐性乳癌、７８６０−腎臓癌、ＮＣ１４６０−肺癌、ＰＣ０３−前立腺癌耐性、ＯＶＣＡＲ０３−卵巣癌、ＨＴ２９−結腸癌、Ｋ５６２−白血病、ＴＣＰ−１００３（トリプルネガティブ乳癌、パネル３）、Ｃａｃｏ−２−結腸癌、間葉様または管腔状の形態を共通にする１８トリプルネガティブ乳腫瘍細胞株のパネル；乳癌細胞株ＨＣＣ３８（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＣＲＬ−２３１４（商標））およびＭＣＦ７（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＨＴＢ−２２（商標））；前立腺腺癌細胞株ＰＣ−３（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＣＲＬ−１４３５（商標））；前立腺癌細胞株ＶＣａＰ（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＣＲＬ−２８７６（商標））；前立腺癌腫細胞株２２Ｒｖｌ（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＣＲＬ−２５０５（商標））；前立腺癌腫細胞株ＤＵ１４５（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＨＴＢ−８１（商標））；前立腺癌腫細胞株ＬＮＣａＰクローンＦＧＣ（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＣＲＬ−１７４０（商標））；白血病細胞株ＭＯＬＴ−４（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＣＬＲ−１５８２（商標））；白血病（ＡＭＬ）細胞株ＫＧ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＣＣＬ−２４６（商標））；白血病（ＣＭＬ）細胞株Ｋ−５６２（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＣＣＬ−２４３（商標））；白血病ヒト細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥΜ（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＣＣＬ−１１９（商標））；ＣＬＬ白血病細胞株Ｈｓ．５０５．Ｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＣＲＬ−７３０６（商標））；Ｊｕｒｋａｔ細胞株（白血病、ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＴＩＢ−１５６（商標））；Μｏｌｍ細胞株（白血病、例えば、Ｍｏｌｍ−１３、Μｏｌｍ−１４、Μｏｌｍ−１６、Μｏｌｍ−１７、およびＭｏｌｍ−１８）、Ｎｏｍｏ細胞株（白血病、例えば、ＮＯＭＯ−１）、ならびにＲａｓ変異細胞が挙げられる。
【００３３】
本明細書に記載のナノ担持および／またはマイクロ担持されたジャスモネート化合物（例えば、ＭＤＪ）あるいはこれらの医薬組成物には、次のような利点がある。これらは、インビトロおよび／またはインビボで、例えば前立腺癌、乳癌、黒色腫、結腸癌、白血病などにわたる癌では抗癌活性を示すが、一方、インビボで健康な細胞に対する毒性をほとんどまたは全く示さない。それらの新規な作用機構は、前立腺癌用に確立された他の薬物療法を補完するものであってもよい。例えば、進行した疾患に対し、本発明の組成物は、副作用を有する積極的療法の使用を減らし、そして、局所的な疾患に対し、本発明の組成物は、ホルモン療法に対する感受性の効果を延長し転移性疾患に進行することを遅らせるものであってもよい。
【００３４】
また、本開示は、本明細書に記載のナノ担持および／またはマイクロ担持されたジャスモネート化合物あるいはそれらの医薬組成物を合成する方法についても記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
用語「Ａ−１４」および「Ａ１４」は、図面中で交換可能に使用され、測定に使用するＭＤＪ−ナノキャリア複合体を指す。
【００３６】
【図１】（Ａ）ＬＤＥ中のＭＤＪのクロマトグラム；（Ｂ）ＬＤＥに担持されたＭＤＪ（リポソームに担持されたＭＤＪの例示として）の走査型電子顕微鏡像；（Ｃ）ＬＤＥに担持されたΜＤＪおよびアミノ酸の走査型電子顕微鏡像。
【００３７】
【図２】シクロデキストリンに担持されたＭＤＪで処理（ｉ．ｐ．）したマウスの結腸腫瘍において均一に分布した強いＣＡＳＰＡＳＥ３の発現。
【００３８】
【図３】ＭＤＪで処理（ｉ．ｒ．）したマウスの結腸癌上皮表面に限定的な異種ＣＡＳＰＡＳＥ−３の発現。
【００３９】
【図４】（Ａ）シクロデキストリンに担持されたＭＤＪ処理マウス（ＧＴ）および対照（ＧＣ）における腫瘍容積の違いを示す概略図。留意すべきは、処理動物は全て腫瘍体積の著しい低下を示したことである（ＢおよびＣ）。実験終了時に代表的な腫瘍の巨視的な図。対照の腫瘍（Ｃ）と比較して、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪで処理した動物の腫瘍は小さく（Ｂ）、色が薄く固い外層および柔らかい核を示した。組織病理学的解析により壊死領域の存在が示された（Ｎ）。壊死領域はシクロデキストリンに担持されたＭＤＪで処理した動物の腫瘍（Ｅ）において、対照（Ｄ）におけるものよりもはるかに大きかった。留意すべきは、壊死病巣は、多染色体性新生偽柵状構造（ｈｙｐｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｉｃ  ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｐｓｅｕｄｏｐａｌｉｓａｄｅｓ）の集合により取り囲まれていることであり、これは「壊死周辺領域」（ＰＮ）と呼ばれる。対照腫瘍細胞は、細胞のネットワークコードとして組織されており（境界線部）、密接に小血管を伴う（黒矢印）（ＦおよびＨ）。図４Ｇに示すように、シクロデキストリンに担持されたΜＤＪで処理された動物では、この空間組織はひどく破壊されており、血液細胞の漏出（白矢印）およびマイクロ出血性病巣の存在（図４Ｉ）を伴った。対照腫瘍の間質では、ＣＤ３４陽性免疫染色細胞が多数存在した（図４Ｊ）が、一方ＧＴ腫瘍ではＣＤ３４染色細胞数は著しく統計的に有意な減少を示した（図４Ｋおよび４Ｌ）。ＶＥＧＦ免疫染色により、対照腫瘍での腫瘍浸潤前線（ＩＦ）領域における血管組織化ネットワークが示された（図４Ｍ）。ＧＴ腫瘍では、ＩＦ領域の空間組織が著しく破壊され、陽性細胞数が少ないことが示された（図４Ｎ）。定量分析では、ＧＴ群のＩＦおよびＰＮ領域におけるＶＥＧＦ陽性細胞数の劇的な下落が示された（図４Ｏ）。マンホイットニー検定（＊ｐ＜０．０１）。
【００４０】
【図５】ＧＴおよびＣＧ腫瘍における遺伝子発現の違い。マイクロアレイ解析によりみられる、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪ腫瘍において対照腫瘍と比べアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされた第一遺伝子のリスト。また、２つの群の間で少なくとも２倍の変動を示した遺伝子の発現パターンを示す。
【００４１】
【図６】マイクロアレイデータの概略図。図６Ａでは、中心軸（固有ベクトル）に沿ったデータセットの散布図により、両群の遺伝子分布を示す。分析した遺伝子は、色デフォルトによって明示する最小から最大範囲（倍数変化値を含む）に応じて分布する。図６Ｂでは、階層的クラスタリングのようなクラスタリングアルゴリズム（Ｋ−平均）により、それらの発現プロファイルの類似性に基づきまとめた最類似物を明らかにした。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙデータベース内にタンパク質の遺伝子分類子を表すタンパク質の相関がある。これらを色付きの記号で表す（緑の記号は、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪの後に誘導が減少したタンパク質を示し、赤の記号は、誘導が増加したタンパク質を示す。色の強さは誘導の強さについて群間の差を示す。連結タンパク質は、空の記号で表す。直接又は間接的に連結タンパク質を介し連結されていない色付のタンパク質はほんのわずかである。図６Ｃおよび一般的な図において見られる血管新生関与因子のいくつかが、図６Ｄに見られる場合もある。図６Ｅでは、いくつかのサンプリングされた遺伝子について、マイクロアレイデータおよびｑＲＰ−ＰＣＲでの方法間に一致した結果を見ることができる。
【００４２】
【図７】ＮＦκＢ、ＴＧＦβ、ＨＩＦ−１、およびＣＯＸ−２の発現。図７Ａ〜７Ｃでは、ＧＣ群に比べ、ＧＴ群ではウエスタンブロッティングにおいてＮＦκＢサブユニット（ＰＩ０５およびＰ５０）のいずれもが著しい減少を示す。更に、サウスウエスタン組織化学分析により、ＧＴ群における核へのＮＦκＢの転写（図７Ｅ）は、ＧＢ群（図７Ｄ）と比べ、実質的に破壊されたことが確認された。唯一の例外は、Ｈ＆Ｅ染色で見られる、血管損傷のあるＧＴ群の血管のみにおける強く著しいＮＦκＢ染色であった（図７Ｆ）。留意すべきは、血管の数が少ないと、ＷＢ分析によるＮＦκＢの定量が全体的に影響を受けない可能性があるということである。ＧＴ群（図７Ｉ）と比較して、ＧＣ群でのＴＧＦβの免疫染色のほうが、黒矢印の境界で示すように主にＰＮ領域において非常に強い（図７Ｈ）。このことは形態計測により確認した（図７Ｊ）。また、ＧＴ群（図７Ｍおよび７Ｎ）と比較して、ＧＣ群でのＨＩＦ−１免疫染色のほうが、主にＰＮ領域において非常に強い（図７Ｋおよび７Ｌ）。このことは形態計測（図７Ｏ）およびウエスタンブロッティング分析（図７Ｐおよび７Ｑ）により確認した。ＧＣの腫瘍の浸潤前線ではより高濃度のＣＯＸ−２染色細胞が見られ、コード内に多数の細胞が組織されていた（図７Ｒ）。ＧＴ群ではこのような細胞は見られず、組織構成の著しい崩壊がみられた（図７Ｓ）。形態計測により、ＧＴ群でのＣＯＸ−２のＩＨＣ発現の低下（腫瘍の中心核を除く）を確認した（図７Ｔ）。マンホイットニー検定（＊ｐ＜０．０１）。
【００４３】
【図８】幹細胞マーカー（ＣＤ１３３、Ｏｃｔ４、およびＭＴ）およびアポトーシスマーカー（ＴｕｎｅｌおよびＣＡＳＰＡＳＥ３）。図８Ａ〜８Ｆでは、幹細胞マーカーＯｃｔ４およびＣＤ１３３のいずれも似通ったＩＨＣ染色パターンを示す。ＧＴ（それぞれ図Ｂ及びＦ／Ｇ）と比較して、ＧＣ群での免疫染色のほうが主にＰＮ領域において非常に強い（それぞれ図ＡおよびＤ／Ｅ）。このことは形態計測により確認した（それぞれ、図ＣおよびＨ）。ＧＴ（図Ｌ／Ｍ）と比較して、ＧＣ群でのＭＴ免疫染色のほうが主にＩＦ領域において非常に強い（図Ｉ／Ｊ）。このことは形態計測によって確認した（図Ｎ）。また、ＭＴ染色により、ＧＣ群における細胞コードおよび血管の著しい崩壊が示された。ＧＣ（それぞれ図ＯおよびＲ）と比較して、ＧＴ群でのＴＵＮＥＬ及びＣａｓｐａｓｅ-３染色の両者のほうが３つの全領域において高いアポトーシスレベル（それぞれ図ＰおよびＳ）を示した。このことは形態計測分析によって確認した（図ＱおよびＴ）。マンホイットニー検定（＊ｐ＜０．０１）。
【００４４】
【図９】癌の進行を促進する腫瘍における低酸素の役割、および腫瘍シグナル伝達系のスイッチをオフにするシクロデキストリンに担持されたＭＤＪについて提案されたモデル。
【００４５】
【図１０】ＭＤＪの連続希釈液の存在下での９６ウェルプレートにおける内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、２×１０5ｃｅｌｌｓ／ウェル）の増殖に対するＭＤＪの効果。第一軸の□：ＭＴＴの減少により測定された細胞毒性。各点は、各回毎に独立して測定した４つの読み取り値の平均を表す（４重に測定した対照を除く）。無処理の対照の測定値は、グラフ上に対応するエラーバーで示す。第二軸の■：細胞培養物から計算した折り畳み時間。各点は３つの独立した実験の平均を表す。
【００４６】
【図１１】ＭＤＪの連続希釈液の存在下での９６ウェルプレートにおけるマウス黒色腫細胞（Ｂ１６−Ｆ１０、１×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェル）の増殖に対するＭＤＪの効果。第一軸の○：ＭＴＴの減少により測定された細胞毒性。各点は、各回毎に独立して測定した４つの読み取り値の平均を表す（４重に測定した対照を除く）。無処理の対照の測定値は、グラフ上に対応するエラーバーで示す。第二軸の●：細胞培養物から計算した折り畳み時間。各点は３つの独立した実験の平均を表す。
【００４７】
【図１２】対照条件において（ＡおよびＣ）または１ｍＭ  ＭＤＪへ６０ｈ曝露後（ＢおよびＤ）、ＲＰＭＩ培地中のガラススライド上でコンフルエントまで増殖させた内皮細胞（ＡおよびＢ）またはマウス黒色腫Ｂ１６Ｆ１０（ＣおよびＤ）の代表的な画像。
【００４８】
【図１３】インビトロでの暴露１８時間後のＨＵＶＥＣの細胞周期に対するＭＤＪの効果。各検査で用いた濃度をグラフ中に示す。細胞周期の測定は、ヨウ化プロピジウムのみで標識後、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ｃａｌｉｂｕｒ器で行った。アクリジンオレンジを用いた染色を、アポトーシスプロセスの対照とした。
【００４９】
【図１４】ΜＴＴ低減アッセイにより測定した暴露２４時間後の９６ウェルプレート（低密度プレート）における内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、１×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェル）の生存率に対するＭＤＪの効果。各点は、各回毎に独立して４回測定した８つの読み取り値の平均を表す。実線は、比較のために未暴露の対照の測定値を表す。ミトコンドリアへの効果が、Μｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄおよび共焦点顕微鏡観察によって確認され、曝露の４時間後に既にみることができる（図１５参照）。
【００５０】
【図１５】Μｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  ｒｅｄおよび８０倍（４０倍＋２倍デジタルズーム）の倍率の共焦点顕微鏡観察により測定した２４ウェルプレート（低密度プレート、２５ｍｍガラスカバースリップ上）における曝露４時間後の内皮細胞のミトコンドリア活性に対するＭＤＪの効果。較正パラメータは、すべての測定について同じものを使用した。ミトコンドリアの蛍光染色に応じた明度を染色領域に関し定量したところ、２４時間後でも低濃度のＭＤＪに曝露した細胞の数又はミトコンドリア活性に増加があったことが示された。１ｍＭ以上の濃度だと、染色強度／面積の減少につながった。
【００５１】
【図１６】Μｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  ｒｅｄおよび４０倍の倍率の共焦点顕微鏡観察により測定した２４ウェルプレート（低密度プレート、２５ｍｍガラスカバースリップ上）における曝露２４時間後の内皮細胞のミトコンドリア活性に対するＭＤＪの効果。較正パラメータは、すべての測定について同じものを使用した。各点は、各回毎に独立して６回測定した読み取り値の平均を表す。自己の卵白アルブミン溶液中にＭＤＪを投与したとき、卵はかなりの耐性を示した。
【００５２】
【図１７】インビボでの生存率試験におけるＭＤＪの毒性。受精卵は、その卵自体から卵１個あたり５ｍＬ体積のアルブミンを採取し、それに１００、５０、１０、５μＬの用量のＭＤＪを投入することで曝露させた（ｎ＝５）。対照には、ＭＤＪの代わりにビヒクルを暴露した。図示の濃度は、卵１個あたり体積が６０ｍＬであるとして計算した。
【００５３】
【図１８】ＣＡＭモデルＣＯＳＥＳにおける血管新生に対するアルブミン添加ＭＤＪの効果（卵１個あたり、５μＬ（Ａ）、１μＬ（Ｂ）、暴露していない対照（Ｃ）に相当）。黒色腫細胞が存在すると、卵の生存率が減少した。ＭＤＪは部分的にこの生存率を回復させた。ＣＡＭモデルにおける結果により、黒色腫の体は、有効成分の作用の下で用量依存的な退縮が起こることが確認された。
【００５４】
【図１９】１×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェルのＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫を接種した卵についてインビボでの生存率試験におけるＭＤＪの毒性。受精卵は、その卵自体から卵１個あたり５ｍＬ体積のアルブミンを採取し、それに１００、５０、１０、５μＬの用量のＭＤＪを投入することで曝露させた（ｎ＝５）。対照には、ＭＤＪの代わりにビヒクルを暴露した。図示の濃度は、卵１個あたり体積が６０ｍＬであるとして計算した。
【００５５】
【図２０】ＣＡＭ領域における黒色腫の増殖に対するアルブミン添加ＭＤＪの効果。全てのサンプルに１×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェルのＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫を接種した。ＡおよびＢ、倍率が５倍の画像。ＣおよびＤ、倍率が１０倍の同じ領域の画像。ＡおよびＣ、無処理の対照。ＢおよびＤ、５μＬのΜＤＪを単回用量で処理。腫瘍の増殖は血管と密接に関連する。黒色腫は、血管新生を誘導しＣＡＭの主要な血管の近くで増殖した。
【００５６】
【図２１】ＣＡＭ領域における黒色腫の増殖に対するアルブミン添加ＭＤＪの効果。サンプルに１×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェルのＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫を接種した。Ａ：明視野で拡大し、デジタル化した３次元画像。Ｂ：暗視野で撮影した同じ領域の画像。１０倍の倍率。
【００５７】
【図２２】９６ウェルの培養プレートにおける培養内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、１×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェル）またはマウス黒色腫（Ｂ１６Ｆ１０、１×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェル）の増殖に対するシクロデキストリンに担持されたＭＤＪの効果。各点は、独立して２重に測定した３つの読み取り値の平均を表す。
【００５８】
【図２３】ΜＴＴ検査により測定した暴露２４時間後の９６ウェル培養プレートにおける内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、１×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェル）マウス黒色腫（Ｂ１６Ｆ１０、１×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェル）の生存率に対するシクロデキストリンに担持されたＭＤＪの効果。各点は、独立して２重に測定した３つの読み取り値の平均を表す。
【００５９】
【図２４】血管新生のＣＡＭモデルにおける血管成長に対するシクロデキストリンに担持されたＭＤＪの効果。ＡおよびＢ：無染色の新鮮な材料の顕微鏡写真。イエナ顕微鏡。並列コンデンサの照明。８倍の倍率。ＢおよびＤ：無染色の新鮮な材料の顕微鏡写真。イエナ顕微鏡。並列コンデンサの照明。３２倍の倍率。サンプルは独立した試験で得られた。ＡおよびＣ：無処理の対照。ＢおよびＤ：ＣＡＭへの投与量は１μΜのＭＤＪに相当。
【００６０】
【図２５】インキュベーション８日目にｌ×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェルのＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫を接種したＣＡＭの血管新生モデルにおける血管成長に対するシクロデキストリンに担持されたＭＤＪの効果。無染色の新鮮な材料の顕微鏡写真。イエナ顕微鏡。並列コンデンサの照明。３２倍の倍率。Ａ：無処理の対照。Ｂ：インキュベーション１１日目にＣＡＭへ１μΜのＭＤＪに相当する量のシクロデキストリンに担持されたΜＤＪを投与したサンプル。
【００６１】
【図２６】９種の癌細胞株：ＵＡＣＣ６２、ΜＣＦ７、ＮＣＩＡＤＲ、７８６０、ＮＣ１４６０、ＰＣＯ３、ＯＶＣＡＲ０３、およびＨＴ２９、Ｋ５６２に対するＣＤに担持されたΜＤＪ（３〜３０ｎｍの範囲のサイズ）の効果。Ｘ軸はサンプルの総体積に基づくΜＤＪの濃度である；使用したナノエマルジョン中のΜＤＪの濃度は１ミリモル濃度である。
【００６２】
【図２７】血管新生活性に対するナノキャリアのサイズの効果；使用したナノ担持されたＭＤＪの濃度は１ｎＭから１０〜１００マイクロモル濃度である。
【００６３】
【図２８】９種の癌細胞株：ＵＡＣＣ６２、ΜＣＦ７、ＮＣＩＡＤＲ、７８６０、ＮＣ１４６０、ＰＣＯ３、ＯＶＣＡＲ０３、およびＨＴ２９、Ｋ５６２に対する大豆ホスファチジルコリンリポソームに担持されたΜＤＪ（５０〜１２０ｎｍのサイズのリポソーム）の効果。Ｘ軸はサンプルの総体積に基づくΜＤＪの濃度である；使用したナノエマルジョン中のΜＤＪの濃度は１ミリモル濃度である。
【００６４】
【図２９】ＵＡＣＣ−６２細胞にΜＤＪ−大豆ホスファチジルリポソームナノキャリア複合体を投与してから８時間後にΜｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  ｒｅｄおよび共焦点顕微鏡観察により測定した当該細胞のミトコンドリア活性に対する当該複合体の効果（下の３つのパネル）。ＭＤＪの濃度は１０-3Ｍであり、複合体のサイズは２５ｎｍから２００ｎｍの範囲である。
【００６５】
【図３０】ΜＴＴ検査により測定した暴露２４時間後の内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）またはマウス黒色腫（Ｂ１６Ｆ１０）の生存率に対するΜＤＪ−大豆ホスファチジルリポソームナノキャリア複合体の効果。
【００６６】
【図３１】ΜＤＪ−ＰＡＭＡΜナノキャリア複合体の抗血管新生効果、ナノエマルジョン中のΜＤＪの濃度は１０-3Ｍである。上部のパネルでは、マウス黒色腫（Ｂ１６Ｆ１０）の腫瘍塊の形成およびその腫瘍を増殖させるために栄養を提供する新血管網の形成が明確に示され、一方、下部のパネルでは、複合体による処理により血管網は形成されなかった。
【００６７】
【図３２】ＵＡＣＣ−６２細胞に対するΜＤＪ−ＬＤＥナノキャリア複合体の抗血管新生効果、サンプル中のΜＤＪの濃度は１０-3Ｍである。
【００６８】
【図３３】ＵＡＣＣ−６２細胞に対するΜＤＪ−大豆ホスファチジルコリンリポソームナノキャリア複合体の抗血管新生効果、サンプル中のΜＤＪの濃度は１０-4Ｍである。
【００６９】
【図３４】白血病細胞に対するΜＤＪ−ＬＤＥマイクロキャリア複合体（サイズは１０ミクロン、ΜＤＪの濃度は１０-3から１０-1Ｍ）により活性化されたマクロファージの効果。Ａ：マクロファージ（暗像）に飲み込まれたた癌細胞（明像）の顕微鏡写真。Ｂ：マクロファージ内で消化されている癌細胞の顕微鏡写真。
【００７０】
【図３５】低用量のナノ担持されたΜＤＪのインビボでの血管新生効果：ΜＤＪの濃度は、上部２つの画像では１０μΜで、下部３つの画像では１００ｎΜである。
【００７１】
【図３６】３０μΜの濃度のΜＤＪおよびナノ担持されたＭＤＪのインビボでの血管新生効果。
【００７２】
【図３７】癌細胞に対するジャスモネートの作用経路（Ｆｌｅｓｃｈｅｒ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２００７；２４５（１〜２）：１〜１０参照）。
【００７３】
【図３８】Ａ：水（対照）、Ｂ：空のナノ粒子、およびＣ：ΜＤＪを担持するナノ粒子による処理から２４時間後のＪｕｒｋａｔ細胞株（白血病、ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＴＩＢ−１５６（商標））の倒立顕微鏡画像。図３８Ｃでは、処理から２４時間後にほぼ全ての細胞が死滅した。
【００７４】
【図３９】Ａ：水（対照）、Ｂ：空のナノ粒子、およびＣ：ΜＤＪを担持するナノ粒子による処理から２４時間後の前立腺癌細胞株ＶＣａＰ（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＣＲＬ−２８７６（商標））の倒立顕微鏡画像。図３９Ｃでは、処理から２４時間後にほぼ全ての細胞が死滅した。
【００７５】
【図４０】Ａ：水（対照）、Ｂ：空のナノ粒子、およびＣ：ΜＤＪを担持するナノ粒子による処理から２４時間後の乳癌細胞株ＨＣＣ３８（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＣＲＬ−２３１４（商標））の倒立顕微鏡画像。図４０Ｃでは、処理から２４時間後にほぼ全ての細胞が死滅した。
【００７６】
【図４１】Ａ：水（対照）、Ｂ：空のナノ粒子、およびＣ：ΜＤＪを担持するナノ粒子による処理から２４時間後の前立腺癌腫細胞株２２Ｒｖｌ（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＣＲＬ−２５０５（商標））の倒立顕微鏡画像。図４１Ｃでは、処理から２４時間後に６０％〜７０％の細胞が死滅した。
【００７７】
【図４２】Ａ：水（対照）、Ｂ：空のナノ粒子、およびＣ：ΜＤＪを担持するナノ粒子による処理から２４時間後のマクロファージ細胞の倒立顕微鏡画像。
【００７８】
【図４３】亜鉛、カルシウム、またはアミノ酸と結合したＡ−１４と接触した際に血管の断片化を示す画像。カルシウムまたはアミノ酸と結合したＡ−１４に比べ、亜鉛と結合したＡ−１４のほうが血管断片化に対し最も顕著な効果を示した。１：アラニンと結合したＡ−１４。２：銀と結合したＡ−１４。０．５：亜鉛と結合したＡ−１４。５：カルシウムと結合したＡ−１４。ｃ：対照。キャリアはリポソームである。
【００７９】
【図４４】左図：膨大な量の血管。腫瘍細胞の周辺で血管新生が形成された。腫瘍が増殖するには、大量の栄養と酸素を受け取る必要がある。このような必要性があるため、腫瘍からＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）が放出された後に、血管複合体が腫瘍内部／内部方向に形成される。右図：アミノ酸と結合したＡ−１４で処理した後、血管複合体のほとんどが消失した。これらの血管を破壊する抗血管新生と呼ばれる現象により、腫瘍がその成長に必要な栄養と酸素を受け取ることが阻まれる。キャリアはリポソームである。
【００８０】
【図４５】アミノ酸と結合したＡ−１４による内皮細胞の破壊を示す画像。キャリアはリポソームである。
【００８１】
【図４６】亜鉛と結合したＡ−１４による乳癌における血管周囲の抗血管新生効果を示す画像。キャリアはリポソームである。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
ジャスモネートは、ヒト癌細胞のミトコンドリアに直接かつ選択的に作用する有力な抗癌剤であることが見出されている（例えば、ＲｏｔｅΜら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ２００５；６５：１９８４〜１９９３；Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉら、ＪＮＣＩ２０００；９０：１０４２〜１０５３参照）。ジャスモネートのメンバーおよびこれらの合成誘導体のいくつかは、インビトロおよびインビボでの抗癌活性を示すことが報告されている。例えば、ジャスモネートは、ＥＬ−４リンパ腫を有するマウスの寿命を延ばし、ＭＪは、化学療法抵抗性のＢリンパ腫細胞に有効であり、また、予備的なデータにより、ＭＪは、アポトーシス経路を介した細胞毒性を示すことが示唆されている（例えば、Ｆｌｅｓｃｈｅｒ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２００７；２４５（１〜２）：１〜１０；Ｆｉｎｇｒｕｔら、Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００５；１４６（６）：８００〜８０８；Ｆｉｎｇｒｕｔら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２００２；１６：６０８〜６１６参照）。ジャスモネートの抗癌活性を説明する機構が提案されている（同文献および図３７参照）。しかしながら、抗がん剤のこの新しいファミリーが直面する大きな問題は、化合物をインビボで投与することが困難なことである。ジャスモネートはエステルなので、インビボで投与した場合、通常標的癌細胞に到達する前に、例えば、エステラーゼによって代謝されるため、抗がん剤としての魅力があまりない。
【００８３】
本発明は、ナノ担持および／またはマイクロ担持されたジャスモネートの医薬組成物を提供する。本発明の組成物は「医薬」組成物であることを意図しており、つまり、それらが医薬用途に適していることを意味する。従って、本明細書で使用する用語「組成物」は、「医薬」についての明確な記載がなくとも医薬組成物を包含することを意味する。本発明の組成物は、好ましくは、インビボで標的細胞に到達する前のジャスモネートの分解に対して安定性を与える。本発明は、部分的に、ナノ担持および／またはマイクロ担持されたジャスモネート、特に、ナノ担持および／またはマイクロ担持されたＭＤＪが抗血管新生活性を示すという予想外の発見に基づく。また、本発明は、部分的に、ナノ担持および／またはマイクロ担持されたＭＤＪは、腫瘍細胞に対してナノ担持されたＭＪよりもかなり効果的、例えば、少なくとも１０3倍効果的であり、正常な細胞および血管に対する毒性はより低いという予想外の発見にも基づく。また、本発明は、部分的に、ナノ担持および／またはマイクロ担持されたジャスモネート、特に、ナノ担持および／またはマイクロ担持されたＭＤＪまたはＭＪは、用量または濃度の違いに基づき抗血管新生活性または血管新生活性のいずれかを示すという予想外の発見にも基づく。例えば、１ｎΜから約１０〜１００μＭという低濃度では、ナノ担持および／またはマイクロ担持されたＭＤＪは血管新生効果を示すが、一方１００μＭを超える濃度では、ナノ担持および／またはマイクロ担持されたＭＤＪは抗血管新生効果を示す。ＭＪでは、１ｎＭから約１μＭという低濃度でナノ担持および／またはマイクロ担持されたＭＪは血管新生効果を示し、一方、１μΜを超える濃度（例えば、２μΜ超または５μΜ超）ではナノ担持および／またはマイクロ担持されたＭＪは抗血管新生効果を示す。
【００８４】
上記の予想外の発見は、ナノ担持された／マイクロ担持されたジャスモネートが新規および有望な標的抗癌治療として使用されることを示唆している。
【００８５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈で明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。よって、例えば、「ジャスモネート化合物（単数形）」であれば、単一のジャスモネートのみならず、プロドラッグ、エステル、塩、それらの代謝産物を含む２以上の異なるジャスモネートの組合せまたは混合物をも包含する。
【００８６】
本明細書で使用する語句「例えば」、「例として」、「といった」、または「含む」といった語句は、対象をより一般的に明確化するための例として導入するという意味である。これらの例示は、本開示を理解するための一助としてのみ提供され、いかなる様式でも限定的であることを意味しない。
【００８７】
本発明の明細書および特許請求の範囲では、以下の用語を下記の定義に従って使用する。
【００８８】
本明細書で使用する語句「含有する」、「から形成される／成る」、「含む」、「組成を有する」、または「構造を有する」は、限定的であることを意図しておらず、文脈で明確に指示しない限り、一般的に用いられる「含む」という用語と同様に使用する。
【００８９】
本明細書で使用する用語「ナノキャリア」とは、標的細胞、組織、または臓器に有効成分（例えば、薬物）を担持および送達するのに適したキャリアまたはビヒクルを指し、そして、ビヒクルは、約１ナノメートル（ｎｍ）から約１０００ｎｍの範囲のサイズを有する。本明細書で使用する用語「マイクロキャリア」は、標的細胞、組織、または臓器に有効成分（例えば、薬物）を担持および送達するのに適したキャリアまたはビヒクルを指し、そして、ビヒクルは、約１ミクロンから約１００ミクロンの範囲のサイズを有する。一の実施形態では、マイクロキャリアは、ナノキャリアの集団から形成される、例えば、ＬＤＥマイクロキャリアはＬＤＥナノキャリアの集団から形成される。好ましくは、ナノキャリアまたはマイクロキャリアは、医薬として許容されるキャリアである。
【００９０】
本明細書で使用する用語「ナノ担持された／マイクロ担持された化合物」または用語「化合物を含有するナノキャリア／マイクロキャリア」とは、化合物に会合または結合したナノキャリア／マイクロキャリアの複合体を指す。会合または結合とは、化学結合（例えば、共有結合）、水素結合、ファンデルワールス力、クーロン相互作用等を介して成されるものである。一の実施形態では、化合物は、ナノキャリア／マイクロキャリア中にカプセル化されている。別の実施形態では、化合物は部分的にナノキャリア／マイクロキャリア中にカプセル化されているか、またはナノキャリア／マイクロキャリアの表面に存在する（例えば、ナノキャリア／マイクロキャリアの表面の一部として存在する、もしくは表面の外側に存在するが表面に付着しているかのいずれか）。
【００９１】
用語「エマルジョン」は、第二液（連続相）中に分散した第一液（分散相）の小球または粒子の懸濁液を指し、第一液は通常非混和性である。
【００９２】
本明細書で使用する用語「ナノエマルジョン」は、約１ｎｍから約５０μｍ（例えば、１ｎｍ〜５０μｍ、１ｎｍ〜４０μｍ、１ｎｍ〜３０μｍ、１ｎｍ〜２０μｍ、１ｎｍ〜１０μｍ、１〜５０００ｎｍ、１〜４０００ｎｍ、１〜３０００ｎｍ、１〜２０００ｎｍ、１〜１０００ｎｍ、１〜９００ｎｍ、１〜８００ｎｍ、１〜７００ｎｍ、１〜６００ｎｍ、１〜５００ｎｍ、１〜４００ｎｍ、１〜３００ｎｍ、１〜２００ｎｍ、１〜１５０ｎｍ、１〜１００ｎｍ、１〜９０ｎｍ、１〜８０ｎｍ、１〜７０ｎｍ、１〜６０ｎｍ、１〜５０ｎｍ、１〜４０ｎｍ、１〜３０ｎｍ、１〜２０ｎｍ、１〜１０ｎｍ、１〜５ｎｍ、５０〜１００ｎｍ、３〜１５０ｎｍ、または３〜２０ｎｍ）の範囲のサイズの分散粒子を有するエマルジョンを指す。ナノエマルジョンは、分散相のサイズが小さいため透明に見えがちである。
【００９３】
用語「ＬＤＥ」は、組成物および挙動において低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に類似するナノエマルジョン粒子を指す。例えば、一旦循環系に導入されると、様々な血漿タンパク質（例えば、アポＥ）が、ＬＤＥ粒子の表面上に吸着し、続いてＬＤＥがＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）を発現する細胞へと向かう。ＬＤＥは、タンパク質を含まず、そして典型的にはリン脂質単層によって囲まれたコレステリルエステルのコアから成る。ＬＤＥおよびそれらの調製物のより詳細な説明については、例えば、Ｇｉｎｓｂｕｒｇら（１９８２）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５７：８２１６〜８２２７；Μａｒａｎｈａｏら（１９９３）、Ｌｉｐｉｄｓ  ２８：６９１〜６９６；およびＦａｖｅｒｏら（２０１０）、Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  ４３：４３９〜４４４を参照のこと。本明細書で使用する用語「ＬＤＥ」は、例示の発明に応じて使用可能なリポソーム様ナノキャリアおよびまたはマイクロキャリアの一例を指す。他の適当なリポソーム様ナノキャリアおよび／またはマイクロキャリアを決定するのは、当該技術分野において通常のレベル内である。
【００９４】
用語「コレステリルエステル」は、コレステロールのエステルを指す。例えば、エステル結合が、脂肪酸のカルボキシレート基とコレステロールのヒドロキシル基との間に形成される。コレステリルエステルの例としては、コレステリルオレエート、コレステリルネルボネート等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
用語「リン脂質」とは、脂質二重層を形成する能力があるため全細胞膜の主成分となる脂質のクラスを指す。ほとんどのリン脂質は、ジグリセリド、リン酸基、およびコリンのような単純な有機分子を含有する。この法則の唯一の例外は、グリセロールの代わりにスフィンゴシンに由来する、スフィンゴミエリンである。リン脂質の例として、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスホイノシチド（例えば、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルイノシトール一リン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸、およびホスファチジルイノシトール三リン酸）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
本明細書に記載の化合物は、非芳香族二重結合および１以上の不斉中心を含有してもよい。従って、ラセミ体およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマー、ジアステレオマーの混合物、およびシスまたはトランス異性体の形態として生じ得る。そのような異性体の全ての形態を意図する。例えば、本明細書に記載のジャスモネート化合物は、不斉炭素に基づきそして光学的に純粋な任意の光学異性体、種々の光学異性体の任意の混合物、又はラセミ体の形態の全てを含む。ＭＤＪの立体異性体の例としては、例えば、（ｌＲ，２Ｒ）−ジヒドロメチルジャスモネート、（１Ｒ，２Ｓ）−ジヒドロメチルジャスモネート、（ｌＳ，２Ｒ）−ジヒドロメチルジャスモネート、および（１Ｓ，２Ｓ）−ジヒドロメチルジャスモネートが挙げられる。ジャスモン酸メチルの異性体の例として、シスまたはトランス（ｌＲ，２Ｒ）−ジャスモン酸メチル，シスまたはトランス（ｌＲ，２Ｓ）−ジャスモン酸メチル、シスまたはトランス（ｌＳ，２Ｒ）−ジャスモン酸メチル、およびシスまたはトランス（ｌＳ，２Ｓ）−ジャスモン酸メチルが挙げられる。
【００９７】
本発明は、本化合物中に存在する原子の同位体の全てを含むことを意図する。同位体には、同じ原子番号を有するが質量数が異なる原子を含む。一般的な例として、水素の同位体にはトリチウムおよび重水素が挙げられ、そして炭素の同位体にはＣ−１３およびＣ−１４が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
本明細書で使用する用語「アルキル」は、必ずしも必須ではないが、典型的に、１〜約２４個の炭素原子を有する分枝または非分枝の飽和炭化水素基を指し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、オクチル、デシル等、加えてシクロペンチルおよびシクロヘキシル等のシクロアルキル基が挙げられる。必ずしも必須ではないが、一般的に、本明細書のアルキル基は１〜約１８個の炭素原子を含むことがあり、当該アルキル基は１〜約１２の炭素原子を有することもある。用語「低級アルキル」は、１〜６個の炭素原子、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、または６個の炭素原子を有する基を意図する。
【００９９】
医薬組成物
また、本発明は、ジャスモネート化合物および少なくとも１つの医薬として許容される賦形剤またはキャリア、例えば、本明細書に記載のナノキャリア／マイクロキャリアを含む医薬組成物も提供する。
【０１００】
一の実施形態では、本発明の組成物に使用するナノキャリアは、シクロデキストリンから形成される。シクロデキストリン（ＣＤ）は、α−１，４−Ｃ−Ｏ−Ｃ鎖によって連結されたＤ−Ｌ（＋）−グルコースユニットから形成される環状オリゴ糖である。ＣＤは、酵素変換によりデンプンから製造される。天然のＣＤは、グルコース単位により形成され、例えば、α−、β−、およびγ−ＣＤはそれぞれ、６、７、および８グルコース単位からなる。より多くの本発明に適したＣＤの例が、例えば、ＷＯ２０１０／００６３９２号、ＵＳ２００８／０４４３６４号、およびＥＰ３９２６０８号に記載されている。
【０１０１】
別の実施形態では、本発明の組成物に使用するナノキャリア／マイクロキャリアは、ＬＤＥである。特に、本発明で使用するＬＤＥは、ホスファチジルコリン、オレイン酸、コレステロール、およびトリオレインを含む。他のリポソーム様キャリアを使用することもできる。
【０１０２】
別の実施形態では、本発明の組成物に使用するナノキャリアは、ＰＡＭＡＭといったデンドリマーから形成される。下の表は各世代の特徴としてＰＡＭＡＭデンドリマーのサイズを示している。より多くのデンドリマーの例が、例えばＷＯ２０１０／００６３９２号に記載されている。
【０１０３】
【表１】
2019077702.tif 000004
【０１０４】
更に別の実施形態では、ナノキャリア／マイクロキャリアはリポソームである（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞を標的とするリポソームを含む）。本発明の化合物のリポソーム製剤は、少なくとも１つのポリマー、油、少なくとも一つの表面活性剤および溶媒を含む。当業者は、任意の好適なポリマー、油、表面活性剤および／または溶媒を、リポソーム製剤のために用いることができることを認識するだろう。本発明での使用に適したリポソーム製剤を決定するのは、当該技術分野において通常の範囲内である。リポソーム製剤用のポリマーの例として、例えば、ポリカプロラクトン、ＰＨＢ−ポリヒドロキシ酪酸、ＰＭＭＡ−ポリ（メチルメタクリレート）、キトサン、およびβ−シクロデキストリンが挙げられる。油相に使用される油の例として、例えば、イソデシルオレエート、鉱油、およびＥＭＵ油が挙げられる。表面活性剤の例として、例えば、モノステアリン酸ソルビタン、レシチン（例えば、大豆レシチン）、およびポリソルベート８０が挙げられる。レシチンは、任意の天然および／または合成レシチンならびに／あるいはそれらの混合物であり得る。リポソーム製剤に使用される溶媒の例として、アセトン、エタノール、および超純水が挙げられるが、これらに限定されない。本発明で用いられるリポソームの非限定的な例の１つは、大豆または卵ホスファチジルコリン（またはレシチン）から形成されるリポソームである。これらは、当業者に公知の方法に従って、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、調製することができる。よって、使用するリポソーム製剤そのものは、治療中の癌に応じて選択することになるだろう。特定のリポソーム製剤は、ある種の癌に対し、他の製剤に比べて効きが良い。
【０１０５】
一の実施形態では、ナノキャリアのサイズは、１ｎｍから１０００ｎｍ、例えば、９００〜１０００ｎｍ、１〜９００ｎｍ、１〜８００ｎｍ、１〜７００ｎｍ、１〜６００ｎｍ、１〜５００ｎｍ、１〜４００ｎｍ、１〜３００ｎｍ、１〜２００ｎｍ、１〜１５０ｎｍ、１〜１００ｎｍ、１〜９０ｎｍ、１〜８０ｎｍ、１〜７０ｎｍ、１〜６０ｎｍ、１〜５０ｎｍ、１〜４０ｎｍ、１〜３０ｎｍ、１〜２０ｎｍ、１〜１０ｎｍ、１〜５ｎｍ、２〜３００ｎｍ、２０〜２００ｎｍ、５０〜１５０ｎｍ、または３．５〜１１ｎｍの範囲にある。
【０１０６】
一の実施形態では、マイクロキャリアのサイズは、２μｍから５０μｍ、例えば、２〜５μｍ、２〜１０μｍ、２〜１５μｍ、２〜２０μｍ、２〜２５μｍ、２〜３０μｍ、２〜４０μｍ、２〜５０μｍ、５〜２０μｍ、５〜１０μｍ、または７．５〜１０μｍの範囲にある。
【０１０７】
一の実施形態では、医薬組成物中のジャスモネート化合物は、ジャスモン酸、７−イソ−ジャスモン酸、９，１０−ジヒドロジャスモン酸、９，１０−ジヒドロ−イソジャスモン酸、２，３−ジデヒドロジャスモン酸、３，４−ジデヒドロジャスモン酸、３，７−ジデヒドロジャスモン酸、４，５−ジデヒドロジャスモン酸、４，５−ジデヒドロ−７−イソジャスモン酸、ククルビン酸、６−エピ−ククルビン酸、６−エピ−ククルビン酸−ラクトン、１２−ヒドロキシ−ジャスモン酸、１２−ヒドロキシ−ジャスモン酸−ラクトン、１１−ヒドロキシ−ジャスモン酸、８−ヒドロキシ−ジャスモン酸、ホモ−ジャスモン酸、ジホモ−ジャスモン酸、１１−ヒドロキシ−ジホモ−ジャスモン酸、８−ヒドロキシ−ジホモ−ジャスモン酸、ツベロン酸、ツベロン酸−Ｏ−β−グルコピラノシド、ククルビン酸−Ｏ−β−グルコピラノシド、５，６−ジデヒドロ−ジャスモン酸、６，７−ジデヒドロ−ジャスモン酸、７，８−ジデヒドロ−ジャスモン酸、シスジャスモン、ジヒドロジャスモン、およびこれらの低級アルキルエステルからなる群より選択される。好ましくは、本発明の組成物は、メチルジヒドロジャスモネートを含む。本発明に適したジャスモネート化合物の他の例は、例えば、ＷＯ０２／０８０８９０号およびＧｆｅｌｌｅｒら  Ｓｃｉ．  Ｓｉｇｎａｌ．２０１０，Ｖｏｌ．３，Ｉｓｓｕｅ１０９，ｐｐ．ｃｍ３に見ることができる。
【０１０８】
一の実施形態では、本発明の組成物は、１ｎＭから１００ｍＭ、例えば、１ｎＭから９９ｍＭ、１ｎＭから９０ｍＭ、１ｎＭから８０ｍＭ、１ｎＭから７０ｍＭ、１ｎＭから６０ｍＭ、１ｎＭから５０ｍＭ、１ｎＭから４０ｍＭ、１ｎＭから３０ｍＭ、１ｎＭから２０ｍＭ、１ｎＭから１０ｍＭ、１ｎＭから５ｍＭ、１ｎＭから１ｍＭ、１ｎＭから９００μＭ、１ｎＭから８００μＭ、１ｎＭから７００μＭ、１ｎＭから６００μＭ、１ｎＭから５００μＭ、１ｎＭから４００μＭ、１ｎＭから３００μＭ、１ｎＭから２００μＭ、１ｎＭから１００μＭ、１ｎＭから９０μＭ、１ｎＭから８０μＭ、１ｎＭから７０μＭ、１ｎＭから６０μＭ、１ｎＭから５０μＭ、１ｎＭから４０μＭ、１ｎＭから３０μＭ、１ｎＭから２０μＭ、１ｎＭから１０μＭ、１ｎＭから５μＭ、１ｎＭから１μＭ、１ｎＭから９００ｎＭ、１ｎＭから８００ｎＭ、１ｎＭから７００ｎＭ、１ｎＭから６００ｎＭ、１ｎＭから５００ｎＭ、１ｎＭから４００ｎＭ、１ｎＭから３００ｎＭ、１ｎＭから２００ｎＭ、１ｎＭから１００ｎＭ、１ｎＭから９０ｎＭ、１ｎＭから８０ｎＭ、１ｎＭから７０ｎＭ、１ｎＭから６０ｎＭ、１ｎＭから５０ｎＭ、１ｎＭから４０ｎＭ、１ｎＭから３０ｎＭ、１ｎＭから２０ｎＭ、１ｎＭから１０ｎＭ、１ｎＭから５ｎＭ、１ｎＭから１ｍＭ、１００ｎＭから１ｍＭ、１００ｎＭから１００μＭ、１〜１００μＭ、１０〜５０μＭ、２０〜３０μＭ、１００μΜから１０ｍＭ、１００μΜから１００ｍＭ、１〜１００ｍＭ、１〜１００ｎＭ、および５９〜６４ｎＭの範囲の濃度のジャスモネート化合物（例えば、ＭＤＪ）を有する。
【０１０９】
一の実施形態では、本発明の組成物は、１００ｍＭから１Μ、例えば、０．２Μ、０．３Μ、０．４Μ、０．５Μ、０．６Μ、０．７Μ、０．８Μ、０．９Μから１Ｍ、１００ｍＭから１Μ、２００ｍＭから７５０ｍＭ、または約０．８〜１Μの範囲の濃度のジャスモネート化合物（例えば、ＭＤＪ）を有する。
【０１１０】
一の実施形態では、この組成物を白血病の治療に用いるとき、該組成物に含まれるジャスモネート化合物（例えば、ＭＤＪ）の濃度は、１００μΜから５ｍＭ、１００μΜから４ｍＭ、１００μΜから３ｍＭ、１００μΜから２ｍＭ、１００μΜから１ｍＭ、１００μΜから０．５ｍＭ、０．０１ｍΜから約２ｍＭ、または約１ｍＭ、１０μΜから５ｍＭ、１０μΜから４ｍＭ、１０μΜから３ｍＭ、または１０μΜから２ｍＭの範囲にある。別の実施形態では、この組成物を固形腫瘍の治療に用いるとき、該組成物に含まれるジャスモネート化合物（例えば、ＭＤＪ）の濃度は、１ｎＭから１Μ（例えば、１ｎＭから０．５Ｍ、１ｎＭから０．１Ｍ、１ｎＭから５０ｍＭ、１ｎＭから１０ｍＭ、１ｎＭから５ｍＭ、１０ｎＭから１Ｍ、または１ｎΜから約１ｍＭ、または１μΜから１Ｍ、または１〜１０００ｎＭ、１〜５００ｎＭ、１〜２５０ｎＭ、約１〜１００ｎＭ、１〜５０ｎＭ、１〜１０ｎＭ、または１〜５ｎＭ）の範囲にある。
【０１１１】
ナノキャリアまたはマイクロキャリアは、ジャスモネート化合物に加えて、更に、非ジャスモンネート分子またはイオンを含有してもよい。例えば、２−アミノエチルリン酸二水素（またはホスホエタノールアミン）、３，７−ジメチル−２，６−オクタジエナール（またはシトラール）、サリチル酸メチル、アブシジン酸、天然アミノ酸、Ｃａ2+、Ｚｎ2+、またはこれらの誘導体もしくは類似体が挙げられる。３，７−ジメチル−２，６−オクタジエナールは、シスまたはトランス異性体のいずれかであり得る。これらの非ジャスモンネート分子またはイオンは、ジャスモネート化合物またはナノ／マイクロキャリアと会合または結合することができる。いくつかの実施形態では、非ジャスモネート化合物は、ジャスモネート化合物として同一のナノ／マイクロキャリアに含有させることができる。しかしながら、他の実施形態では、非ジャスモネート化合物は、ジャスモネート化合物とは異なるナノ／マイクロキャリアに含有させて、これらのキャリアの両方を同時に投与することができる。会合または結合とは、化学結合（例えば、共有結合）、水素結合、ファンデルワールス力、クーロン相互作用等を介して成されるものである。一の実施形態では、非ジャスモネート化合物は、ナノキャリア／マイクロキャリア中にカプセル化されている。別の実施形態では、化合物は部分的にナノキャリア／マイクロキャリア中にカプセル化されているか、またはナノキャリア／マイクロキャリアの表面に存在する（例えば、ナノキャリア／マイクロキャリアの表面の一部として存在する、もしくは表面の外側に存在するが表面に付着しているかのいずれか）。
【０１１２】
一の実施形態では、ナノ担持またはマイクロ担持されたジャスモネート化合物（例えば、ＭＪまたはＭＤＪ）は、例えばシトラールおよび／またはホスホリルエタノールアミン分子と共有結合させるといった合成的修飾を施すことができる。具体的には、反応は、ジャスモネート化合物の任意のカルボニル基、例えば、ジャスモネート化合物（例えば、ＭＪ又はＭＤＪ）のシクロペンチル環上のケトン（Ｅ１）またはジャスモネート化合物のエステル（Ｅ２）のカルボニル、で行うことができる。ジャスモネートのケトン（またはエステル基）とホスホリルエタノールアミンのアミン基（Ｒ１）との反応により、イミンまたはヘミアミナール（またはアミド）の形成が可能である。ジャスモネートとシトラールとの間の反応の収率は、まず、シトラールのアルデヒド基を還元して還元シトラール化合物（「Ｒ２」）を形成するか、または（Ｃ−６）二重結合を水和してＲ３を形成することにより改善できる。これらの予備的な工程によりＲ２またはＲ３中にヒドロキシル基がもたらされ、これらはジャスモネート化合物のケトン（Ｅ１）と反応してケタールもしくはエステルを形成し、または、ジャスモネート化合物のエステル（Ｅ２）基と反応して新しいエステルを形成する。
【０１１３】
これらの化合物、すなわち、ジャスモネート（例えば、ＭＪまたはＭＤＪ）、ホスホリルエタノールアミンＲｌ、シトラール、Ｒ２、およびＲ３間の反応により：Ｒ１−（Ｅ１）ＭＪ；Ｒ１−（Ｅ２）ＭＪ；Ｒ１−（Ｅ１）ＭＪ（Ｅ２）−Ｒｌ；Ｒ２−（Ｅ１）ＭＪ；Ｒ２−（Ｅ２）ＭＪ；Ｒ２−（Ｅ１）ＭＪ（Ｅ２）−Ｒ２；Ｒ３−（Ｅ１）ＭＪ；Ｒ３−（Ｅ２）ＭＪ；Ｒ３−（Ｅ１）ＭＪ（Ｅ２）−Ｒ３、並びにこれらの混合物、例えばＲ１−（Ｅ１）ＭＪ（Ｅ２）−Ｒ２；Ｒ２−（Ｅ１）ＭＪ（Ｅ２）−Ｒ１；Ｒ１−（Ｅ１）ＭＪ（Ｅ２）−Ｒ３；Ｒ３−（Ｅ１）ＭＪ（Ｅ２）−Ｒ１；Ｒ２−（Ｅ１）ＭＪ（Ｅ２）−Ｒ３；Ｒ３−（Ｅ１）ＭＪ（Ｅ２）−Ｒ２を含む生成物を生成できるが、これらに限定されない。一の実施形態では、１５のジャスモン酸メチルの誘導体分子が上記の方法によって合成された。
【０１１４】
「医薬組成物」とは、本発明のナノ担持および／またはマイクロ担持された化合物を対象への投与に適した形態で含有する製剤のことである。一の実施形態では、医薬組成物は、バルクまたは単位剤形である。単位剤形は、例えば、カプセル、ＩＶバッグ、錠剤、エアロゾル吸入器の単一ポンプ、またはバイアルを含む様々な形態のいずれかである。組成物の単位用量中の有効成分（例えば、開示されたナノ担持および／またはマイクロ担持された化合物またはそれらの塩、水和物、溶媒和物、もしくは異性体の製剤）の量は、有効な量であり、関与する特定の治療に応じて変化する。当業者は、患者の年齢および状態によって投与量を日常的に変更することが必要な場合があることを理解するであろう。投与量もまた、投与経路に依存するであろう。経口、肺、直腸、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、吸入、口腔、舌下、胸膜内、髄腔内、鼻腔内などを含む様々な経路が考えられる。本発明の化合物の局所または経皮投与用の剤形としては、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、および吸入剤が挙げられる。一の実施形態では、ナノ担持および／またはマイクロ担持された活性化合物を、無菌条件下で、医薬として許容されるキャリア（例えば、ナノキャリア／マイクロキャリア）及び必要な任意の保存剤、緩衝剤、または噴射剤と混合する。
【０１１５】
本明細書で使用する語句「医薬として許容される」とは、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なく、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適しており、妥当な利益／リスク比に見合う化合物、材料、組成物、キャリア、および／または剤形を意味する。
【０１１６】
「医薬として許容される賦形剤またはキャリアまたは溶媒」とは、一般に、安全、非毒性でありかつ生物学的そして他のいずれの基準でも不適切なものではない医薬組成物を調製するのに有用である賦形剤、キャリア、または溶媒を意味し、そしてヒトの医薬用途に加え獣医学的な用途にも許容される賦形剤を含む。ここで使用する「許容される賦形剤」には、１つまたは１つ以上のかかる賦形剤を含む。
【０１１７】
本発明の医薬組成物は、その意図する投与経路に適合するように調合される。投与経路の例としては、例えば、静脈内といった非経口、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、および経粘膜投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下用に用いられる溶液または懸濁液には、以下の成分を含むことができる：例えば、注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝液；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性調節剤である。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口製剤は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチック製の複数用量バイアルに封入することができる。
【０１１８】
本明細書で使用する用語「治療有効量」とは、同定された疾患または状態を治療、改善、または予防するため、あるいは検出可能な治療効果または阻害効果を発揮するための薬剤の量を指す。効果は、当技術分野で公知の任意のアッセイ方法によって検出できる。対象に対する正確な有効量は、対象の体重、大きさ、および健康状態；症状の性質および程度；治療薬及び投与用に選択した治療薬の組み合わせに依存するであろう。所与の状況に対する治療有効量は、臨床医の技術および判断の範囲内で通常の実験によって決定できる。好ましい態様において、治療すべき疾患または状態は、ウイルス感染である。
【０１１９】
任意の化合物（例えば、本明細書中に開示される、ナノ担持および／またはマイクロ担持された化合物）に関し、治療的有効量は、まず、例えば、新生細胞または動物モデル、通常はラット、マウス、ウサギ、イヌ、またはブタ等のいずれかの細胞培養アッセイにおいて推定することができる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するのに使用してもよい。そのような情報を、ヒトにおける有用な用量および投与経路を決定するために使用できる。予防的／治療的有効性および毒性を、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定してもよく、例えば、ＥＤ50（集団の５０％において治療的に有効な用量）およびＬＤ50（集団の５０％に対して致死的な用量）などが挙げられる。毒性効果および治療効果間の用量比が治療指数であり、これはＬＤ50／ＥＤ50として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。投与量は、この範囲内で、使用する剤形、患者の感受性、および投与経路に応じて変更してもよい。
【０１２０】
投与量および投与法は、十分な活性剤のレベルをもたらすため、または所望の効果を維持するために調整する。考慮され得る要因としては、疾患状態の重症度、対象の一般的健康状態、年齢、体重、性別、食事、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性、および治療への耐性／反応が挙げられる。長時間作用型医薬組成物を３〜４日ごと、毎週、または２週間に１回、特定の製剤の半減期および除去速度に応じて投与してもよい。
【０１２１】
本発明のナノ担持および／またはマイクロ担持された活性化合物を含有する医薬組成物は、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥プロセスなどの一般的に知られている方法で製造できる。医薬組成物は、ナノ担持および／またはマイクロ担持された活性化合物を医薬として使用できる製剤に加工するのを容易にする賦形剤および／または補助剤を含む医薬として許容されるキャリアの一つ以上を用いて従来の方法で製剤化してもよい。もちろん、適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
【０１２２】
注射用途に適した医薬組成物として、無菌注射溶液または分散液を即時調製するための滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与に適切なキャリアとして、生理食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射針を通過できる程度に流動的であるべきである。組成物は、製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、例えば、細菌および真菌といった微生物の混入作用が起こらないように保存しなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって維持できる。微生物の作用は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって防止できる。多くの場合、組成物中に例えば糖、マンニトールのようなポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムといった等張剤を含むことが好ましいであろう。組成物中に例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン等の吸収を遅らせる薬剤を含ませることにより、注射用組成物の持続吸収をもたらすことができる。
【０１２３】
無菌の注射用溶液は、上に列挙した成分の１つ又は組み合わせを有する適切な溶媒中に必要量のナノ担持および／またはマイクロ担持された活性化合物を加え、必要に応じろ過滅菌することにより調製できる。一般に、分散液は、基礎分散媒および上記に列挙したもののうち必要なその他の成分を含む滅菌ビヒクル中へナノ担持および／またはマイクロ担持された活性化合物を加えることにより調製する。滅菌注射溶液の調製に滅菌粉末を用いる場合、調製方法は、有効成分に加え、予め濾過滅菌した溶液由来の任意の所望の追加成分を粉末にする真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１２４】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または可食の医薬として許容されるキャリアを含む。それらは、ゼラチンカプセルに封入または錠剤に圧縮することができる。経口治療で投与する目的で、ナノ担持および／またはマイクロ担持された活性化合物を賦形剤と共に組み合わせ、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用できる。また、流体キャリアを用いて、経口組成物をマウスウォッシュとして使用するのに調製でき、流体キャリア中の化合物は、経口的に用いられ、口の中ですすがれ、そして吐き出されるかまたは飲み込まれる。薬学的に適合する結合剤および／またはアジュバント物質を組成物の一部として含むことができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、以下の成分または類似の性質の化合物のいずれかを含んでもよい：微結晶性セルロース、トラガカントゴム、またはゼラチンのような結合剤；デンプンまたはラクトースのような賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓのような潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素のような流動促進剤；スクロースまたはサッカリンのような甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバーなどの香味剤である。
【０１２５】
吸入投与用に、ナノ担持および／またはマイクロ担持された化合物は、例えば、二酸化炭素などのガスのような適切な噴射剤を含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０１２６】
経粘膜または経皮手段により全身投与をすることもできる。経粘膜または経皮投与用としての製剤には浸透すべきバリアに適切な浸透剤が使用される。このような浸透剤は当技術分野で一般に公知であり、例えば、経粘膜投与用としては、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは座薬を使用することによって達成され得る。経皮投与用としては、ナノ担持および／またはマイクロ担持された活性化合物は、当技術分野で一般に知られる軟膏、膏薬、ゲル、またはクリーム剤に製剤化される。
【０１２７】
ナノ担持および／またはマイクロ担持された活性化合物の医薬組成物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤等の、身体から急速に消失しないよう化合物を保護する医薬として許容されるキャリアを用いて調製することができる。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を使用することができる。このような製剤の調製方法は当業者には明らかであろう。また、材料は、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市場入手可能である。
【０１２８】
投与の容易化および投与量の均一化のために、経口または非経口組成物を単位剤形で製剤化すると特に有利である。本明細書で使用する単位剤形とは、治療されるべき対象の単位用量として適する物理的に別個の単位を指し；各単位には、必要な医薬キャリアとの関係で所望の治療効果を生じるように計算されたナノ担持および／またはマイクロ担持された活性化合物の所定量が含まれる。本発明の単位剤形の仕様は、ナノ担持および／またはマイクロ担持された活性化合物独自の特性および達成されるべき特定の治療効果により決定されそして直接的に依存する。
【０１２９】
医薬組成物は、投与のための説明書と一緒に容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。
【０１３０】
本発明の組成物に使用するジャスモネート化合物として、これらの塩が挙げられる。また、これらの形態の全てが本発明の範囲内であると意図する。
【０１３１】
本明細書で使用する「医薬として許容される塩」とは、親化合物がこれらの酸または塩基塩を形成することにより修飾される本発明の化合物の誘導体を指す。医薬として許容される塩の例として、アミンなどの塩基性残基の鉱酸または有機酸の塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩等が挙げられるが、これらに限定されない。医薬として許容される塩には、例えば、非毒性の無機または有機酸から成る、親化合物の従来の非毒性塩または四級アンモニウム塩が挙げられる。例えば、このような従来の非毒性塩としては、２−アセトキシ安息香酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、酢酸、アスコルビン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、重炭酸、炭酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、１，２−エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、グリコリルアルサニル酸（ｇｌｙｃｏｌｌｙａｒｓａｎｉｌｉｃ）、ヘキシルレゾルシン酸（ｈｅｘｙｌｒｅｓｏｒｃｉｎｉｃ）、ヒドラバム酸（ｈｙｄｒａｂａｍｉｃ）、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフトエ酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリルスルホン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ナプシル酸、硝酸、シュウ酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、リン酸、ポリガラクツロン酸、プロピオン酸、サリチル酸、ステアリン酸、スバセチン酸（ｓｕｂａｃｅｔｉｃ）、コハク酸、スルファミン酸、スルファニル酸、硫酸、タンニン酸、酒石酸、トルエンスルホン酸、及び一般のアミン酸、例えば、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、アルギニンなどから選択される無機及び有機酸から誘導されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】
医薬として許容される塩の他の例としては、ヘキサン酸、シクロシクロペンタンプロピオン酸、ピルビン酸、マロン酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４−メチルビシクロ−［２．２．２］−オクト−２−エン−１−カルボン酸、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、三級ブチル酢酸、およびムコン酸等が挙げられる。本発明はまた、親化合物中に存在する酸性プロトンが、金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、又はアルミニウムイオンによって置換されるか；あるいは有機塩基、例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミン、ジエチルアミン、ジエチルアミノエタノール、エチレンジアミン、イミダゾール、リジン、アルギニン、モルホリン、２−ヒドロキシエチルモルホリン、ジベンジルエチレンジアミン、トリメチルアミン、ピペリジン、ピロリジン、ベンジルアミン、テトラメチルアンモニウムヒドロキシド等と配位するかのいずれかのときに形成される塩にも及ぶ。
【０１３３】
医薬として許容される塩に対する全ての言いまわしは、本明細書で定義する場合、同じ塩の溶媒付加形態（溶媒和物）又は結晶形（多形）を含むことが理解されるべきである。
【０１３４】
また、本発明の医薬組成物において使用されるジャスモネート化合物は、例えば、医薬として許容されるエステル等のエステルとして調製できる。例えば、化合物中のカルボン酸官能基を、それに対応するエステル、例えば、メチル、エチル、または他のエステルに変換できる。また、化合物中のアルコール基を、それに対応するエステル、例えば、アセテート、プロピオネート、または他のエステルに変換できる。
【０１３５】
また、本発明の医薬組成物において使用されるジャスモネート化合物は、例えば、医薬として許容されるプロドラッグ等のプロドラッグとして調製できる。用語「プロ−ドラッグ」及び「プロドラッグ」は、本明細書において互換可能に使用され、インビボで活性な親薬剤を放出する任意の化合物を指す。プロドラッグは医薬品として望ましい品質（例えば、溶解性、バイオアベイラビリティ、製造性など）の多くを向上することが知られているので、本発明のナノ担持および／またはマイクロ担持された化合物はプロドラッグの形態で送達できる。よって、本発明は、本特許請求の範囲に記載の化合物のプロドラッグ、ならびに当該プロドラッグおよびこれを含有する組成物を送達する方法をも包含すると意図する。「プロドラッグ」とは、そのようなプロドラッグを対象に投与すると、本発明の活性な親薬剤をインビボで放出する任意の共有結合キャリアをも含むことを意図する。本発明におけるプロドラッグは、日常的な操作またはインビボのいずれかで当該修飾を切断できるように、親化合物に対し化合物中に存在する官能基を修飾することにより調製する。プロドラッグは、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、カルボキシ、またはカルボニル基が、インビボで切断するとそれぞれ遊離ヒドロキシル、遊離アミノ、遊離スルフヒドリル、遊離カルボキシ、または遊離カルボニル基を形成し得る任意の基に結合している本発明の化合物を含む。
【０１３６】
プロドラッグの例として、本発明の化合物中のエステル（例えば、酢酸エステル、ジアルキルアミノ酢酸エステル、ギ酸エステル、リン酸エステル、硫酸エステル、および安息香エステルの誘導体）、ヒドロキシ官能基のカルバメート（例えば、Ν、Ν−ジメチルアミノカルボニル）、カルボキシル官能基のエステル（例えば、エチルエステル、モルホリノエタノールエステル）、Ｎ−アシル誘導体（例えば、Ｎ−アセチル）Ｎ−マンニッヒ塩基、シッフ塩基、およびアミノ官能基のエナミノン、オキシム、アセタール、ケタール、並びにケトンおよびアルデヒド官能基のエノールエステル（Ｂｕｎｄｅｇａａｒｄ，  Ｈ．，  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ、ｐ１〜９２，  Ｅｌｅｓｅｖｉｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ（１９８５）参照）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】
また、本発明の医薬組成物において使用されるジャスモネート化合物は、これらの代謝産物であってもよく、例えば、酸および／または塩基性触媒作用から得られる代謝産物、例えば、シスジャスモン酸、トランスジャスモン酸、ヒドロキシメチルシスジャスモネート、ヒドロキシメチルトランスジャスモネート、ヒドロキシルシスジャスモン酸、ヒドロキシルトランスジャスモン酸、エステル交換反応から得たラクトン等；酸化反応から得た代謝物、例えば、ケトメチルシスジャスモネート、ケトメチルトランスジャスモネート、ヒドロキシメチルシスジャスモネート、ヒドロキシメチルトランスジャスモネート、酸化反応から得たジオール、酸化反応から得た立体異性体（例えば、鏡像異性体またはジアステレオマー）、酸化反応から得たエポキシド、および酸化反応から得たラクトン等；ジャスモン酸メチル、ジャスモン酸、およびジヒドロメチルジャスモネートの脱水物；ならびに細胞内プロセス、例えば、リン酸化（例えば、キナーゼを介するもの）または任意の受容体（例えばＡＫＲ２受容体およびＧ−タンパク質共役受容体）との反応、並びに細胞小器官との相互作用、を介して形成された代謝産物等が挙げられる。ＭＤＪ代謝物の例としては、ジャスモン酸メチル、ククルビン酸メチル、メチル７−イソ−ジャスモネート、２，３−ジデヒドロ−ＭＤＪ、３，４−ジデヒドロ−ＭＤＪ、３，７−ジデヒドロ−ＭＤＪ、４，５−ジデヒドロ−ＭＤＪ、１２−ヒドロキシ−ＭＤＪ、１１−ヒドロキシ−ＭＤＪ、８−ヒドロキシ−ＭＤＪ、ツベロン酸メチル、１２−Ｏ−グルコシル−ＭＤＪ、１１−Ｏ−グルコシル−ＭＤＪ、１２−Ｏ−グルコシル−ＭＪ、１１−Ｏ−グルコシル−ＭＪ、７，８−ジデヒドロ−ＭＤＪ、シスジャスモン、ジヒドロジャスモン、サリチル酸メチル、およびアブシジン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３８】
追加的にまたは代わりとして、他のジャスモネート関連化合物を本発明の医薬組成物に使用でき、例えば、リノレン酸（ＬＡ）由来のシクロペンタノンまたはシクロペンテノン系化合物から形成されたものが挙げられる（例えば、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  １００：６８１〜６９７，２００７；およびＡｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ＰｌａｎｔΜｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１９９７．  ４８：３５５〜８１参照）。
【０１３９】
ナノ担持および／またはマイクロ担持されたジャスモネート化合物、あるいはそれらの医薬として許容される塩、エステル、プロドラッグ、または代謝産物を含む医薬組成物は、経口、経鼻、経皮、肺、吸入、頬側、舌下、腹腔内、皮下、筋肉内、静脈内、直腸内、胸膜内、髄腔内、および非経口的に投与される。一の実施形態では、当該組成物は注射可能な組成物である。当業者は、特定の投与経路に利点があることを認識するであろう。
【０１４０】
投与レジメンは、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別、および健康状態；治療すべき病状の重症度；投与経路；患者の腎機能および肝機能；ならびに採用する特定の化合物またはその塩に応じて選択される。当該技術分野の医師または獣医は容易に、病状の進行を予防し、対抗し、または停止するために必要な薬物の有効量を決定し処方できる。本発明の方法において使用できる投与レジメンは、毎日、１週間に３回（断続的）、１週間に２回、毎週、または１４日に１回を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、投与レジメンは、毎月の投薬または６〜８週毎の投薬を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、投与量は、治療期間中に変化する。例えば、はじめの３〜７日間は、ナノ／マイクロキャリア中に１ｍＭから１Ｍ（例えば、１〜１０００ｍＭ、１〜９００ｍＭ、１〜８００ｍＭ、１〜７００ｍＭ、１〜６００ｍＭ、１〜５００ｍＭ、１〜４００ｍＭ、１〜３００ｍＭ、１〜２００ｍＭ、１〜１００ｍＭ、１〜５０ｍＭ、１〜４０ｍＭ、１〜３０ｍＭ、１〜２０ｍＭ、１〜１０ｍＭ、１００ｍＭから１Μ）の範囲の高濃度のジャスモネート化合物（例えば、ＭＤＪ）を投与してから、より低濃度（例えば、１００μΜから５ｍＭ、１００μΜから４ｍＭ、１００μΜから３ｍＭ、１００μΜから２ｍＭ、１００μΜから１ｍＭ、０．０１ｍＭから約２もしくは約１ｍＭ、１０μΜから５ｍＭ、１０μΜから４ｍＭ、１０μΜから３ｍＭ、または１０μΜから２ｍＭ）のナノ／マイクロ担持された化合物を投与しても良い。別の実施形態では、組成物を固形腫瘍の治療に用いるとき、該組成物に含まれるジャスモネート化合物（例えば、ＭＤＪ）の濃度は、癌の治療用に１ｎＭから１Μの範囲（例えば、１ｎＭから０．５Ｍ、１ｎＭから０．１Ｍ、１ｎＭから５０ｍＭ、１ｎＭから１０ｍＭ、１ｎＭから５ｍＭ、１０ｎＭから１Ｍ、または１ｎΜから約１ｍＭ、または１μΜから１Ｍ、あるいは１〜１０００ｎＭ、１〜５００ｎＭ、１〜２５０ｎＭ、約１〜１００ｎＭ、１〜５０ｎＭ、１〜１０ｎＭ、または１〜５ｎＭ）である。この投与レジメンは、特定の種類の癌（例えば、白血病）の治療では他の種類の癌に対するものより有効であってもよい。
あるいは、最初に低用量を投与し、続いて高用量のナノ／マイクロ担持ジャスモネートを投与してもよい。
【０１４１】
開示された本発明のナノ担持および／またはマイクロ担持された化合物の調合および投与の技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  １９th  ｅｄｉｔｉｏｎ，Μａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ（１９９５）で見ることができる。一の実施形態では、本明細書に記載のナノ担持および／またはマイクロ担持された化合物、およびそれらの医薬として許容される塩、プロドラッグ、代謝産物、またはエステルは、医薬として許容される賦形剤、溶媒、または希釈剤と組み合わせて医薬製剤に使用される。適切な医薬として許容される賦形剤として、不活性固体充填剤または希釈剤および滅菌水溶液または有機溶液が挙げられる。ナノ担持および／またはマイクロ担持された化合物は、そのような医薬組成物中に、本明細書に記載の範囲内で所望の投与量を供するのに十分な量で存在するであろう。
【０１４２】
ナノ担持またはマイクロ担持されたジャスモネートの合成方法
本明細書に記載のナノ担持またはマイクロ担持されたジャスモネート化合物およびそれらの組成物は、当該技術分野で公知の技術または本明細書に記載の方法を用いて調製できる。
【０１４３】
例えば、シクロデキストリンをナノキャリアとして用いる場合、本発明のナノ担持された化合物は、適切な溶液（例えば、水溶液）中で、好ましくは高温で、シクロデキストリンと目的のジャスモネート化合物を混合することによって調製できる。本発明の一実施形態では、このように形成されたナノキャリアおよびまたはマイクロキャリアは、１モルのシクロデキストリンあたり約１〜１００モル（例えば、１〜９０モル、１〜８０モル、１〜７０モル、１〜６０モル、１〜５０モル、１〜４０モル、１〜３０モル、１〜２０モル、１〜１０モル、または１〜５モル）のジャスモネート化合物を含有する。より詳細な説明は、例えば、ＵＳ２００８／０４４３６４号、ＥＰ３９２６０８号、およびＷＯ２００７／１４５６６３号で見ることができる。シクロデキストリンマイクロキャリアは、シクロデキストリンナノキャリアの集団から形成できる。
【０１４４】
別の例として、ＬＤＥ（またはリポソーム）をナノキャリアまたはマイクロキャリアとして用いる場合、本発明のナノ担持された又はマイクロ担持された化合物は、予め形成したＬＤＥ（またはリポソーム）における目的のジャスモネート化合物を適切な溶液（例えば、水溶液）中で室温より低い温度（例えば、約４℃）でインキュベートし、次いで得られたエマルジョンを、所望のＬＤＥに担持された（またはリポソームに担持された）ジャスモネート化合物を得るための適切な緩衝液で透析することによって調製できる。本発明の一実施形態では、このように形成されたナノキャリアおよびまたはマイクロキャリアは、１モルのＬＤＥ（またはリポソーム）あたり約１〜１００モル（例えば、１〜９０モル、１〜８０モル、１〜７０モル、１〜６０モル、１〜５０モル、１〜４０モル、１〜３０モル、１〜２０モル、１〜１０モル、または１〜５モル）のジャスモネート化合物を含有する。
【０１４５】
一の実施形態では、ＬＤＥナノキャリアを次のように調製する。まず、ホスファチジルコリン（例えば、４０ｍｇ）、コレステリルオレエート（例えば、２０ｍｇ）、トリオレイン（例えば、１ｍｇ）、およびコレステロール（例えば、０．５ｍｇ）からなる脂質混合物を４℃で１６時間真空乾燥させる。その後、ｐＨ８．０の０．０１Μ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中で、例えば、５１〜５５℃の温度範囲の窒素雰囲気下において、ブランソン装置４５０Ａ型（Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ａｒｒｕｄａ，Ｓａｏ  Ｐａｕｌｏ，Ｂｒａｚｉｌ）用いて１２５ワットの電力で３時間超音波照射を行い、脂質のエマルジョンを調製する。ＭＤＪをカプセル化するのに望ましい直径範囲またはサイズ範囲のＬＤＥを得るために、エマルジョンを二工程の遠心分離（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  ｒｏｔｏｒ  ＳＷ−４１による超遠心）で精製する。第一工程では、４℃で３０分間２００，０００ｇの遠心分離を行い、得られた上部チューブの画分を、吸引除去（１ｍＬ）して廃棄する。その後、残りの懸濁液中に、臭化カリウム（ＫＢｒ）を添加して密度を１．２１ｇ／ｍＬに調整する。第二遠心分離（４℃で２時間、２００，０００×ｇ）後、ＬＤＥをチューブの最上部から吸引により回収する。過剰のＫＢｒを、１０００倍量のｐＨ８の０．０１Μ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌを２回変えた透析により除去する。最後に、このエマルジョンを、層流中で０．２２ｍｍの気孔を有するミリポア膜濾過により滅菌し、そして、４℃で３０日まで保存する。懸濁液中のＬＤＥ粒子のサイズは、光散乱および顕微鏡測定によって決定できる。懸濁液中のＬＤＥ粒子の表面電位は、ゼータ電位測定装置ＺｅｔａＰＡＬＳ器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（Ｌｉｍａ＆Μａｒａｎｈａｏ，２００４）により測定できる。
【０１４６】
一の実施形態では、ジャスモネート化合物（例えば、ＭＤＪ）のＬＤＥキャリア中への取り込みを、次のように行う。ＭＤＪを有する５０ｍＬのエタノール溶液を５００ｍＬのＬＤＥエマルジョン（例えば、上記で調製したものなど）に添加して、１ｍＬあたり３ｍｇのＭＤＪ濃度を有する混合物を作製する。この混合物を１５分間室温で撹拌し、次いで４℃で７２時間インキュベートする。次いで、このインキュベートした混合物を、２００ｍＬの滅菌緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１Ｍ）に対し２回透析する。次いで、透析後のエマルジョンを、ＧＣ−ＭＳを用いて分析することでＬＤＥキャリア中にカプセル化または結合したＭＤＪの量を決定できる。
【０１４７】
特定の実施形態では、本発明のナノエマルジョンは、ジャスモネート化合物に加えて、ポリマー、例えば、平均分子量６５０００のポリマーポリ（ε−カプロラクトン）またはＰＣＬ、シトラール、ホスホリルエタノールアミン、モノステアリン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ（登録商標）６０）、およびポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）から選択される一つ以上の成分から形成される。エマルジョンは、Ｆｅｓｓｉら、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ  Ｄｅｌｉｖ  ４（４）：２９５〜３０２（１９８９）に記載された方法と同様の方法により調製することができる。簡単に言うと、油（例えば、１０．０ｇ）および活性化合物（例えば、ＭＤＪ）のみ、または水中（キャリア中に含有される内部の構成要素が）０．０５から０．５０ｇの範囲内の混合物中（例えば、４００ｍＬ）で、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（ＩＫＡ  Ｔ１０  ｂａｓｉｃ  Ｕｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘ（登録商標），Ｉｋａ−Ｗｅｒｋｅ，Ｓｔａｕｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、例えば、１５，０００ｒｐｍで１分間激しく撹拌して、油／水（Ｏ／Ｗ）エマルジョンを作成する。次いで例えば、ポリマー（例えば、０．２および２．０ｇの間のＰＣＬ）をアセトン（４００ｍＬ）に溶解することで調製した有機溶液を、蠕動ポンプ（ＰｕｍｐＰｒｏ  ＴＰΜ６００  ５５ＲＰＭ，Ｗａｔｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）を１０％で使用して適度な磁気攪拌の下でＯ／Ｗエマルジョン中に注ぐ。１０分間撹拌した後、例えば、水（２００ｍＬ）に１．０ｇのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を溶解することで調製した水溶液も、適度な磁気攪拌下でエマルジョン相に注いだ。蠕動ポンプは、再度、例えば１０％で使用する。添加終了後、反応混合物を更に、例えば、１０分間、撹拌してもよい。最後の工程で、有機溶媒を除去し、ナノエマルジョンの体積を減圧下で（例えば、Ｂｔｉｃｈｉ  Ｒ−２１，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄのようなロータリーエバポレーターを使用して）例えば５００ｍＬに濃縮する。第二段階、すなわち、エマルジョンにポリマー溶液を添加することは任意である。
【０１４８】
ナノ担持および／またはマイクロ担持された化合物を特徴づける方法として、半経験的手法を用いたＨＹＰＥＲＣＨＥΜソフトウェアを応用した理論的定性的構造の分析相関（ＱＳＡＲ）が挙げられる。この意味でＱＳＡＲは、ジャスモン酸またはメチルジヒドロジャスモネートおよび天然シクロデキストリン（ＣＤ）から形成されるナノ担持された化合物の安定性を推定するために用いられる。一の実施形態では、計算は、０．１ｋｃａｌ（ａｎｇｓｔｒｏｎ．ｍｏｌ）-1のｒｍｓ値でポラック−・リビエールの共役勾配法を用いたＡＭ１の半経験的手法を用いて行った。
【０１４９】
定性的に、ΔΗ（＝Ｅbinding）の測定値は、ナノ担持および／またはマイクロ担持された化合物の形成（すなわち、ナノ／マイクロキャリアおよびジャスモネート化合物の間の会合または結合）が起こるときの系の全エネルギーの最小値を反映する。
【０１５０】
したがって、Ｅbindingにより表される反応の安定性は、形成されたナノ担持および／またはマイクロ担持された化合物のエネルギーと、ナノ／マイクロキャリアおよび化合物の全エネルギーとの差分から推定できる。
【０１５１】
以下の表２は、ジャスモン酸またはメチルジヒドロジャスモネートと天然ＣＤ間の会合におけるＥbindingの計算結果を示す。
【０１５２】
【表２】
2019077702.tif 000005
【０１５３】
表２に示すように、α−ＣＤとメチルジヒドロジャスモネート間の複合体を除く他の全てのナノ担持された化合物は安定である。また、ジャスモネート化合物とβ−ＣＤ間の会合で最も安定なナノ担持された化合物が生成される。
【０１５４】
治療方法
本発明は、その過程において異常な血管新生により影響を受ける疾患（または「血管新生関連疾患」）を治療するための方法を提供する。この方法は、そのような治療の必要がある対象に、本発明のナノ担持および／またはマイクロ担持された化合物、あるいはその医薬として許容される塩、プロドラッグ、代謝産物、溶媒和物、またはそれらの立体異性体を治療有効量投与することを含む。
【０１５５】
本明細書で使用する「その必要がある対象」とは、異常な血管新生が何らかの作用を果たしている疾患を有する対象、または全体の人口に対しそのような疾患を発症するリスクが高い対象のことである。その必要がある対象は、前癌状態を有することがある。好ましくは、その必要がある対象は、癌を有する。「対象」には、哺乳動物が含まれる。哺乳動物は、例えば、ヒト、霊長類、鳥類、マウス、ラット、ニワトリ、犬、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラクダ、ヒツジ、又はブタ等の任意の哺乳動物であり得る。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０１５６】
血管新生関連疾患の一例は癌である。本明細書で用いる用語「癌」は、固形腫瘍ならびに血液がんおよび／または悪性疾患を含む。癌の例として、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、肛門直腸癌、肛門管の癌、虫垂癌、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、基底細胞癌、皮膚癌（非黒色腫）、胆道癌、肝臓外胆管癌、肝内胆管癌、膀胱癌、膀胱癌、骨および関節の癌、骨肉腫および悪性線維性組織球腫、脳癌、脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小脳星状細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、カルチノイド腫瘍、消化器の癌、神経系の癌、神経系リンパ腫、中枢神経系の癌、中枢神経系リンパ腫、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、リンパ系新生物、菌状息肉腫、セザリー症候群、子宮内膜癌、食道癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝臓外胆管癌、目癌、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃（胃腸）癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫、頭頸部癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、眼癌、島細胞腫瘍（内分泌膵臓）、カポジ肉腫、腎臓癌、腎性癌、腎臓癌、喉頭癌、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリー細胞白血病、口唇および口腔癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍマクログロブリン血症、髄芽腫、黒色腫、眼内（目）黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、悪性中皮腫、転移性扁平上皮頸部癌、口腔癌、舌癌、多発性内分泌腫瘍症候群、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、多発多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患、上咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、口腔癌、口腔咽頭癌、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣低悪性度腫瘍、膵癌、膵島細胞膵癌、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体芽腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、プラズマ細胞新生物／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌（多剤抵抗性前立腺癌を含む前立腺癌又は前立腺腺癌）、直腸癌、腎盂及び尿管、移行上皮癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、ユーイング肉腫腫瘍、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、子宮癌、子宮肉腫、皮膚癌（非黒色腫）、皮膚癌（黒色腫）、メルケル細胞皮膚癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃（胃腸）癌、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、腎盂および尿管および他の泌尿器の移行上皮癌、妊娠性絨毛腫瘍、尿道癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、子宮体がん、膣がん、外陰癌、およびウィルムス腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５７】
血管新生関連疾患他の例としては、眼疾患（例えば、加齢性黄斑変性症または眼の後部の血管新生関連疾患）、心臓血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症）、慢性炎症（例えば、リウマチ性関節炎またはクローン病）、糖尿病（例えば、糖尿病性網膜症）、乾癬、子宮内膜症、および肥満が挙げられる（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５２：２３７  ２６８，２００１参照）。
【０１５８】
本発明は、ウイルス、細菌、または真菌感染症といったＮＦ−κΒ関連疾患を治療するための方法を提供する。この方法は、そのような治療の必要がある対象に、本発明のナノ担持および／またはマイクロ担持された化合物、あるいはその医薬として許容される塩、プロドラッグ、代謝産物、溶媒和物、またはそれらの立体異性体を治療有効量投与することを含む。
【０１５９】
本明細書で使用する「治療する」または「治療」とは、疾患、状態、または障害に対抗する目的で患者の管理およびケアすることを言い、そしてその疾患、状態、または障害の症状もしくは合併症を緩和するために、あるいはその疾患、状態、または障害を排除するために、本発明のナノ担持および／またはマイクロ担持された化合物、あるいはその医薬上許容される塩、プロドラッグ、代謝産物、または溶媒和物を投与することを含む。
【０１６０】
本発明のナノ担持および／またはマイクロ担持された化合物、あるいはその医薬上許容される塩、プロドラッグ、代謝産物、または溶媒和物は、疾患、状態、または障害を予防するために使用する場合もある。本明細書で使用する「予防する」または「予防」とは、疾患、状態、または障害の症状または合併症の発症を低減または排除することを言う。
【０１６１】
本明細書で使用する用語「緩和する」とは、疾患の兆候または症状の重症度を減少させるプロセスを言うことを意味する。重要なのは、兆候または症状は解消されなくとも緩和できるということである。好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物の投与により、兆候または症状が、解消される必要がないにしても解消される。兆候または症状の重症度を低減するのに有効な投与量が見込まれる。例えば複数の箇所で起こる癌等の疾患については、複数の箇所のうち少なくとも一箇所において癌の重症度が低減されれば、兆候または症状の重症度が緩和されるということである。
【０１６２】
本明細書で言及する全ての特許、特許出願、および刊行物は、その全体を参照することにより援用する。しかしながら、明示定義を含む特許、特許出願、または刊行物を参照により援用する場合において、それらの明示定義は、それらが見られる当該援用特許、特許出願、または刊行物には適用されるが、本願の文中のその他部分、特に本願の特許請求の範囲には適用されないと理解すべきである。
【０１６３】
本発明をその好ましい特定の実施態様と共に説明したが、前述の説明ならびに以下の実施例は例示であり、本発明の範囲を限定するものでないという意図であることを理解すべきである。当該技術分野の当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更および均等物への置換が可能であると理解するであろうし、そして、更に他の態様、利点、および改変は、本発明が関係する当該技術分野の当業者にとって明らかであろう。
【０１６４】
特に明記しない限り、本明細書で使用される全てのパーセントおよび比率は、重量基準である。本発明の他の特徴および利点は、様々な実施例より明らかである。ここに挙げる実施例は、本発明の実施に有用な様々な成分および方法を例示するものである。これらの実施例は、請求する発明を限定するものではない。本開示に基づき、当業者は、本発明を実施するのに有用な他の成分および方法を特定および採用することができる。
【実施例】
【０１６５】
実施例１：ＬＤＥに担持されたΜＤＪの合成
まず、４０ｍｇのホスファチジルコリン、２０ｍｇのオレイン酸コレステロール、１ｍｇのトリオレイン、および０．５ｍｇのコレステロールからなる脂質混合物を、４℃で１６時間真空乾燥した。次いで、ｐＨ８．０の０．０１Μ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中で、５１〜５５℃の温度範囲の窒素雰囲気下において、ブランソン装置４５０Ａ型（Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ａｒｒｕｄａ，Ｓａｏ  Ｐａｕｌｏ，Ｂｒａｚｉｌ）用いて１２５ワットの電力で３時間超音波照射を行い、脂質のエマルジョンを調製した。ＭＤＪをカプセル化するのに望ましい直径範囲またはサイズ範囲のＬＤＥを得るために、エマルジョンを二工程の遠心分離（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  ｒｏｔｏｒ  ＳＷ−４１による超遠心）において精製した。第一工程では、４℃で３０分間２００，０００ｇの遠心分離を行い、得られた上部チューブの画分を、吸引除去（１ｍＬ）して廃棄した。その後、残りの懸濁液中に、臭化カリウム（ＫＢｒ）を添加して密度を１．２１ｇ／ｍＬに調整した。第二遠心分離（４℃で２時間、２００，０００×ｇ）後、ＬＤＥをチューブの最上部画分から吸引により回収した。過剰のＫＢｒを、１０００倍量のｐＨ８の０．０１Μ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを２回変えた透析により除去した。最後に、このエマルジョンを、層流中で０．２２ｍｍの気孔を有するミリポア膜濾過により滅菌し、そして、４℃で３０日間まで保存した。懸濁液中のＬＤＥ粒子のサイズを、光散乱および顕微鏡測定によって決定したところ、２９〜４００ｎｍであった。懸濁液中のＬＤＥ粒子の表面電位を、ゼータ電位測定装置ＺｅｔａＰＡＬＳ器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（Ｌｉｍａ＆Μａｒａｎｈａｏ，２００４）で測定したところ、略−５．４３ｍＶと−７．４２ｍＶの間であった。
【０１６６】
ＭＤＪを有する５０ｍＬのエタノール溶液を、上述の通り調製した５００ｍＬのＬＤＥエマルジョンに添加して、１ｍＬあたり３ｍｇのＭＤＪ濃度を有する混合物を作製した。この混合物を１５分間室温で撹拌し、次いで４℃で７２時間インキュベートした。次いで、このインキュベートした混合物を、２００ｍＬの滅菌、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に対し２回透析した。透析後のエマルジョンを、ＧＣ−ＭＳを用いて分析することでＬＤＥキャリア中にカプセル化または結合したＭＤＪの量を決定した。ΜＤＪに対するＬＤＥのモル比は１／１０および１／５の間であると決定された。
【０１６７】
実施例２：大豆ホスファチジルコリンリポソームに担持されたΜＤＪおよびポリマーに担持されたΜＤＪの合成
リポソームに担持されたΜＤＪ
蓋付の透明な瓶に、適切な量の非イオン性界面活性剤である硬化ヒマシ油ポリオキシエチレン４０（ＯＲＰＨ）（ＥＵＭＵＬＧＩＮ（登録商標）ＨＲＥ４０）および大豆ホスファチジルコリン（ＦＳ）（Ｅｐｉｋｕｒｏｎ（登録商標）２００）を、ＯＲＰＨ／ＦＳモル比が１：１になるように加えた。次いで１：１のモル比のオレイン酸ナトリウムおよびコレステロールを、オレイン酸ナトリウム／ＯＲＰＨモル比が１：５になるように加えた。得られた混合物を０．２２μｍの膜で濾過した。濾過した溶液を滅菌ボトルに添加し、次いでＭＤＪ（９６％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入）を加え、得られるナノエマルジョン１ｍＬあたり１０ｍｇの濃度となるようにした（この量はナノエマルジョン１ｍＬあたりのＭＤＪが７ｍｇからの２１ｍｇの間で変えてもよい）。ボルテックスによる攪拌と休止期間を交互にはさむことにより、均質化されたナノエマルジョンを生成した。具体的には、滅菌ボトル内の混合物を、不連続に動作するＳｏｎｉｃ（登録商標）Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（ｍｏｄｅｌ  ＸＬ２０２０ＴΜ  ２２０ワット）を使用して室温で２０分間、超音波処理した。超音波処理後、ナノエマルジョンを、１５分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離して、チタンロッドソニケータから放出された廃棄物を除去した。得られた混合物をｐＨ７．２のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（水相）に対して透析した。ナノエマルジョンのリポソームのサイズを測定したところ、５０〜５００ｎｍであった。また、ＭＤＪに対するリポソームのモル比を決定したところ、１／１０〜１／５の間であった。
【０１６８】
ポリマーに担持されたΜＤＪ／シトラール／ホスホリルエタノールアミン
平均分子量６５０００のポリ（ε−カプロラクトン）、モノステアリン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ（登録商標）６０）、およびポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）より入手した。使用した有機溶媒の全てはＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｅｃａｔｅｐｅｃ，Μｅｘｉｃｏ）から購入したＨＰＬＣグレードであった。超純水は、Μｉｌｌｉ−Ｑ  Ｓｙｓｔｅｍ（１８ΜΩ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ΜＡ，ＵＳＡ）により当方で製造した。シトラール（３，７−ジメチル−２，６−オクタジエナール）、ホスホリルエタノールアミンおよび／またはジャスモン酸メチルを含有するナノ粒子を次のようにして得た。まず、油（１０．０ｇ）および活性化合物のみ、または水中（キャリア中に含有される内部の構成要素が）０．０５から０．５０ｇの範囲内の混合物（４００ｍＬ）中で、１５，０００ｒｐｍのＵｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（ＩＫＡ  Ｔ１０  ｂａｓｉｃ  Ｕｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘ（登録商標），Ｉｋａ−Ｗｅｒｋｅ，Ｓｔａｕｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、１分間激しく撹拌して、油／水（ＯＡＶ）エマルジョンを作成した。第二段階では、ポリマー（０．２および２．０ｇの間）をアセトン（４００ｍＬ）に溶解することで調製される有機溶液を、蠕動ポンプ（ＰｕｍｐＰｒｏ  ＴＰΜ６００  ５５ＲＰＭ，Ｗａｔｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）を１０％で使用して適度な磁気攪拌の下でエマルジョン相に注いだ。１０分間撹拌した後、水（２００ｍＬ）に１．０ｇのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を溶解することで調製した水溶液も、適度な磁気攪拌下でエマルジョンに注いだ。蠕動ポンプを再度、１０％で使用した。添加終了後、反応混合物を更に１０分間撹拌した。最後の工程で、有機溶媒を除去し、ナノ粒子分散液の体積を減圧下で（例えば、Ｂｔｉｃｈｉ  Ｒ−２１，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄを使用して）５００ｍＬに濃縮した。第一段階で作成したＯ／Ｗエマルジョンは、ポリマーがなくとも安定していた。いくつかの異なるナノエマルジョンを調製して分析した。
【０１６９】
シトラール、ホスホリルエタノールアミン、およびジャスモネート化合物のうち１つのみを含有し、ポリマーを有さないナノエマルジョン；
【０１７０】
シトラール、ホスホリルエタノールアミン、およびジャスモネート化合物のうち任意の２つの混合物を含有し、ポリマーを有さないナノエマルジョン；
【０１７１】
３つの化合物、すなわち、シトラール、ホスホリルエタノールアミン、およびジャスモネート化合物を全て含有し、ポリマーを有さないナノエマルジョン；
【０１７２】
シトラール、ホスホリルエタノールアミン、およびジャスモネート化合物のうち１つのみを含有するポリマーナノ粒子；
【０１７３】
シトラール、ホスホリルエタノールアミン、およびジャスモネート化合物のうち任意の２つの混合物を含有するポリマーナノ粒子；
【０１７４】
３つの化合物、すなわち、シトラール、ホスホリルエタノールアミン、およびジャスモネート化合物を全て含有するポリマーナノ粒子；
【０１７５】
全てのナノエマルジョンは、高い絶対回収率（＞９０％）、封入効率（＞８５％）、そして使用した活性化合物（シトラール、ホスホリルエタノールアミン、およびΜＪまたはＭＤＪのようなジャスモネート化合物）の全てに対するコロイド安定性を示した。
【０１７６】
実施例３：シクロデキストリンに担持されたΜＤＪの合成
メチルジヒドロジャスモネートの水性またはアルコール溶液（１×１０-3体積モル濃度から１×１０-2体積モル濃度）に等量のシクロデキストリンを有するシクロデキストリン溶液を混合することにより、ΜＤＪ−シクロデキストリンナノエマルジョンを調製した。得られた混合物を、均質なエマルジョンが得られるまで撹拌した。
【０１７７】
実施例４：マウスで化学的に誘発した結腸腫瘍の治療用としてシクロデキストリンに担持されたＭＤＪの毒性試験および前臨床評価
上記実施例３で作成したシクロデキストリンに担持されたＭＤＪの効果を、マウスの結腸癌実験モデルにおいて調べた。アポトーシスおよび細胞増殖という腫瘍増殖に関連する２つの最も重要な事象について調査した。結腸腫瘍、隣接する非癌組織、および正常な結腸組織のアポトーシスおよび増殖の指標を決定した。アポトーシスは、アポトーシス核計数およびＣＡＳＰＡＳＥ−３免疫染色によって定量し、一方増殖はＰＣＮＡ免疫染色によって決定した。
【０１７８】
材料と方法
動物は国立衛生研究所（米国）の国立研究評議会の実験動物の管理および使用に関する委員会のガイドラインに従い保持した。マウスは、食物および水を不断給餌し、１２時間の明／暗サイクル下で広葉樹の寝具上に保持した。動物は実験の間、毎週体重を測定した。全ての実験は、ＵＳＰ動物倫理委員会によって承認された。
【０１７９】
簡単に言うと、Ｂａｌｂ／ｃマウスを週２回、２週間（ＸＸ）、発癌物質Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）の直腸内点滴注入により処理し、処理開始から２４週間後に屠殺した。実験終了の１０日前から、Ａ群の動物（ｎ＝１０）は、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪ（１０μＬの食塩水中に１体積モル濃度のΜＤＪ）を体重あたり６０グラムで毎日腹腔内に注射することにより処理した。Ｂ群の動物（ｎ＝１０）は、同じ用量のシクロデキストリンに担持されたＭＤＪを毎日直腸内点滴注入することで処理した。Ｃ群（ｎ＝１０）は、ＭＮＮＧで処理し、ＭＤＪ（１００μＬの生理食塩水中に１０％で希釈）を毎日腹腔内に注射した。Ｄ群の動物はＭＮＮＧで処理し、同じ用量のＭＤＪを毎日直腸内点滴注入した。対照のＥ群は、ＭＮＮＧ処理のみを行った。対照のＦおよびＧ群は、生理食塩水およびシクロデキストリンに担持されたＭＤＪをそれぞれ腹腔内および直腸内に投与した。対照のＨおよびＩ群には、生理食塩水およびＭＤＪをそれぞれ腹腔内および直腸内に投与した。シクロデキストリンに担持されたＭＤＪおよびＭＤＪの用量は、先に行った動物パイロット研究に基づくものであった。
【０１８０】
結腸を採取してＨ＆Ｅ用に組織学的処理を行い、化学的に誘発した腫瘍の病理組織学的な特徴を研究しアポトーシス指数をつけた。結腸腫瘍（Ｔ）、隣接する非腫瘍部位（ＮＴ）、および同じ処置群の非腫瘍ラットの巨視的に正常な結腸粘膜（Ｎ）を得た。免疫組織化学手法を実施し、増殖細胞性抗原（ＰＣＮＡ）染色による細胞増殖を調べ、アポトーシス小体の計数およびＣＡＳＰＡＳＥ−３染色の両方により細胞のアポトーシスを分析した。ＰＣＮＡ標識指数（ＰＣＮＡ−Ｌｉ）、アポトーシス指数（ＡＩ）、およびＣＡＳＰＡＳＥ-３標識指数（ＣＡＳＰＡＳＥ３−Ｌｉ）についての結果が示された。また、標準的な血液学および臨床化学パラメータもモニターした。
【０１８１】
アポトーシス指数の決定：アポトーシスは、アポトーシス核の計数により決定した。切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、切片あたりのアポトーシス細胞の数を評価した。アポトーシス細胞を認識するのに用いる基準は：サイズの収縮、周辺組織との接触の損失（古典名でいうとハローの形成時期に起こる）、および先に記載の核凝縮（Ｙｕら、Ｇｕｔ  ２００２，５１：４８０〜４８４）である。５つのランダムな視野中で少なくとも１０００細胞を計数し、次いでアポトーシスの特徴を有する細胞の割合（アポトーシス指数またはＡＩ）を算出した。アポトーシス核の数を３０のランダムに選択された領域におけるＣＡＳＰＡＳＥ−３免疫染色により得られたものと比較した。アポトーシス核の数およびＣＡＳＰＡＳＥ−３の結果の間には強い相関が見られた（ｒ＝０．８３、Ｐ＜０．００１）。
【０１８２】
増殖指数の決定：増殖は、先に記載のような増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）の免疫染色によりアッセイした。簡単に言うと、クエン酸緩衝液中でマイクロ波による抗原賦活後に、各試料からのパラフィン包埋切片を、ＰＣＮＡ抗体で標識した。陰性対照は一次抗体を非免疫血清に置き換えて実施した。スライドを、３，３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（ＤＡＢ，Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で発色させ、マイヤーヘマトキシリンで対比染色した。増殖指数（ＰＩ）は、計数した合計核に対するＰＧＶＡ陽性核の比率のパーセントとして表した。
【０１８３】
統計的分析：結果は、平均＋ＳＥとして表した。異なる治療群間の比較を、ボンフェローニの多重比較試験を用いた（分散分析）ＡＮＯＶＡにより行った。Ｐ＜０．０５を統計学的に有意とみなした。全ての統計的計算は、ＳＰＳＳ統計ソフトウェアパッケージ（バージョン１１．０、ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．）を用いて行った。
【０１８４】
結果
シクロデキストリンに担持されたＭＤＪの抗腫瘍効果
（ＭＤＪを腹腔内投与した）実験群ＣおよびＨは、早期兆候または腹膜炎のため外した。ＭＮＮＧで処理したマウスは全て結腸腫瘍を発症したが、一方、対照群のマウスはいずれも結腸癌を発症しなかった。結腸癌を発症したマウスあたりの腫瘍の平均数（４．６）について、群間で統計的に有意な差は認められなかった。アポトーシス指数は、一般的に、隣接する非腫瘍部および正常な結腸組織に比べ結腸腫瘍部のほうが高かった（Ｐ＜０．００５、ＡＮＯＶＡ）。各処置群における腫瘍の平均サイズ、並びに、ＡＩ、ＣＡＳＰＡＳＥ−Ｌｉ及びＰＣＮＡ−Ｌｉを以下の表３にまとめる。
【０１８５】
【表３】
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【０１８６】
要約すると、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪで処理した動物における結腸癌腫は、Ｅ群と比較した場合、ＰＣＮＡ染色の測定による分裂指数の有意な減少（４３％）を示した。更に、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射したシクロデキストリンに担持されたＭＤＪにより、（アポトーシス小体の計数およびＣＡＳＰＡＳＥ−３の発現の測定による）アポトーシス指数が顕著に３倍増加した。この群では、ＣＡＳＰＡＳＥ−３の発現が強く、そして腫瘍内に均一分布していた（図２）。しかしながら、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪの直腸内投与およびＭＤＪの直腸内投与と、上記の腫瘍マーカーの軽度だが有意な減少とが関連していたものの、組織病理学的分析により、ＣＡＳＰＡＳＥ−３の発現は粘膜上皮の表面に限定されていたことが示された（図３）。
【０１８７】
他の組織学的特徴により、ＡおよびＢ群において腫瘍に対する免疫防御が増加することが示唆される（腫瘍周辺のリンパ球の数が著しく増加したため計数はしていない）。
【０１８８】
発癌物質ＭＮＮＧで処理した動物およびΜＮＮＧ無処理の動物の両者において、ＭＤＪおよびシクロデキストリンに担持されたＭＤＪによる処理は、正常結腸粘膜および腫瘍に隣接する粘膜における細胞増殖およびアポトーシスにおける有意な変化とは関連がなかった。
【０１８９】
シクロデキストリンに担持されたＭＤＪの毒性効果の欠如
腫瘍においてシクロデキストリンに担持されたＭＤＪの効果が強いにもかかわらず、そしていくつかの挙動不安なシグナルがあったのであるが、組織病理学的分析ならびに標準血液学および臨床化学パラメータのいずれもにおいて、脳、肝臓、脾臓、腎臓、胃腸、および骨髄で毒性の兆候は観察されなかった。
【０１９０】
本研究では、組織サンプルにおけるアポトーシスを測定するための簡単かつ定量的な技術としてｃａｓｐａｓｅ−３活性の形態学的検出の使用を評価した。アポトーシス促進酵素であるｃａｓｐａｓｅ−３は内因性および外因性アポトーシス誘導経路の収束点で活性化する（Ｎａｋｏｐｏｕｌｏｕら、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ２００１，６９：２６６〜２７３）。本研究の目的は、それらの抗腫瘍効果の根底にある機構についてより多くの洞察を得るために、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪおよびＭＤＪで処理した後のマウスの結腸腫瘍および正常粘膜における細胞動態およびアポトーシス変化を特徴づけることである。本研究において、ＭＤＪではなくシクロデキストリンに担持されたＭＤＪを用いた処理と、マウスにおけるＭＮＮＧ誘導性の結腸腫瘍の平均サイズの縮小が関連していたことが実証された。シクロデキストリンに担持されたＭＤＪ（ｉ．ｐ．）を用いた処理により、結腸腫瘍における増殖が軽度に阻害されたが、隣接または離れた正常組織では起こらなかったことがわかった。更に、この処理だけが顕著なアポトーシスの誘導と関連しており、また、これは腫瘍のみで起こっており離れた正常結腸粘膜周辺では起こっていなかったことが注目される。興味深いことに、ＭＤＪ処理した動物の腫瘍において高い増殖指数が見られたので、ＭＤＪはおそらく上皮細胞に対する細胞毒性効果により粘膜に刺激を与えている可能性が示唆される。
【０１９１】
シクロデキストリンに担持されたＭＤＪを処理すると、その結果、著しいアポトーシス誘導および増殖の抑制の両方が一緒にもたらされた。対照的に、ＭＤＪは、結腸腫瘍における細胞増殖も阻害せず、アポトーシスの穏やかな増加も誘導しないことが見出された。これらの知見により、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪの抗腫瘍効果の根底にあるメカニズムは、ＭＤＪ処理群およびシクロデキストリンに担持されたＭＤＪ（ｉ．ｒ．）群では見られないシクロデキストリンに担持されたＭＤＪが有する一腫瘍のあらゆる部分に到達可能な能力に関連している可能性があることが示唆される。重要なことに、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪの阻害効果は、非腫瘍細胞には影響を与えず腫瘍細胞にはアポトーシスを誘導したという意味で、癌特異的であることが確認された。
【０１９２】
本研究により得られた結果により、全身に注入したシクロデキストリンに担持されたＭＤＪは、少なくとも実施した実験条件において、結腸腫瘍に到達可能で、そして、重大な副作用なく化学的に誘導された結腸腫瘍の増殖を低減可能であることが示された。
【０１９３】
実施例５：シクロデキストリンに担持されたΜＤＪによる癌のスイッチオフ
この実施例に記載の研究により、上記実施例３で作成したシクロデキストリンに担持されたＭＤＪが、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに異種移植したヒトＣａｃｏ２腫瘍の著しい収縮を誘発することが示された。更に、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪは、血管破壊を誘導し、血管新生および癌幹細胞を阻害した。マイクロアレイ解析により、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪは、同時に様々な重要なシグナル伝達経路に影響を与え、それは主にＮＦκＢ、ＨＩＦ−１、およびメタロチオネインの阻害を伴うものであることが示された。結果は、定量的リアルタイムＰＣＲ法、ウエスタンブロット法、サウスウエスタン組織化学分析、および免疫組織化学分析により確認した。
【０１９４】
雄ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（６〜８週齢）にＣａｃｏ２ヒト結腸癌細胞（１００μＬのＰＢＳ中１．５×１０6）を皮下注射した。一週間後、マウスを無作為に２群に分けた。４週間後、触知可能な腫瘍（２０〜２５ｍｍ2）が確立されたとき、ＧＴ群の腹腔内に１００μＬのシクロデキストリンに担持されたΜＤＪを一日一回、４日間注射し、対照群にはＰＢＳを投与した（ＧＣ群）。腫瘍の容積は以下の式に従って計算した：長さ2×幅／２、そして腫瘍をシクロデキストリンに担持されたＭＤＪによる処理開始後５日目に除去した。先に記載の方法に従って、腫瘍から全ＲＮＡを得て定量化し、ＲＮＡの質を評価した。遺伝子発現解析を、マイクロアレイ実験プロトコル（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ，約４００００プローブを含む）（Ｒｉｚｚａｔｔｉら、２００５）により行った。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑ−ＰＣＲ）を、標的遺伝子であるｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１、ＨＩＦ−１、メタロチオネインＤ３、およびＶＥＧＦＡについて行った。倍率の変化は、２−ΔＣｔ法を用いて計算した。ウエスタンブロット分析（ＷＢ）を、ＨＩＦ−１ａ（Ｎｏｖｕｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）およびＮＦ−ＫＢ  ｐ−５０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）について行った。β−チューブリン（ＣｌｏｎｅＫＭＸ−１１：３０００，Μｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、ローディングコントロールとして用いた。サウスウエスタン組織化学分析（ＳＷ）を行い、腫瘍組織標本におけるＮＦ−κＢをｉｎ  ｓｉｔｕで検出した。Ｈ＆Ｅ切片を組織病理学的分析に用いた。
免疫組織化学分析（ＩＨＣ）をＰＣＮＡ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｄｌ；ＣＡＳＰＡＳＥ−３、ＣＤ３１、ＶＥＧＦ、ＣＤ３４、ＣＯＸ−２、ＴＧＦβ、ＨＩＦ−１、ＣＤ１３３、Ｏｃｔ４およびＭＴについて行った。ＴＵＮＥＬアッセイも行った。群の正体を知らされていない二つの研究者班が、独立してサンプルを評価した。染色細胞および微小血管密度を評価した。データは、統計プログラムＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて分析し、その分析はマンホイットニー検定により行った。Ｐ＜０．０５の確率が統計的に有意であるとみなした。
【０１９５】
加えて、密接に関連し、それぞれが腫瘍の増殖を促進し、現在の癌治療に対する主要な抵抗システムを有すると現在考えられている腫瘍微小環境、血管新生、および癌幹細胞（ＣＳＣ）に影響を及ぼすか否かを検証することを目的とした。統計分析は、マンホイットニー検定により行った。
【０１９６】
ここに挙げる本研究の最も注目すべき発見は、実験期間中に対照動物（ＧＣ）の腫瘍では有意な増殖を示した（Ｐ＜０．０１）のに一方で、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪにより顕著な腫瘍収縮の効果が誘導されたことである（図４Ａ）。
巨視的に、対照腫瘍と比較して、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪで処理した動物の腫瘍は、色が薄く固い外層および柔らかい核を示した（図４Ｂおよび４Ｃ）。このこと、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪにより腫瘍の血液の灌流が起こったことを示唆する。
【０１９７】
異種移植した腫瘍のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）分析により、顕著な血管分布が示され、５種類の組織に分類できた：（１）分化に乏しく、多染色体性で、好塩基性、そして細胞質に乏しい丸形ないし卵形の細胞集団を有する腫瘍核；（２）凝固出血性壊死病巣；（３）「壊死周辺領域」（ＰＮ）と呼ばれる壊死病巣を取り囲む、新生偽柵状構造（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｐｓｅｕｄｏｐａｌｉｓａｄｅｓ  ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｆｏｃｉ）；（４）腫瘍の境界における浸潤性前線（ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｆｒｏｎｔ）；および（５）通常、紡錘形の細胞からなり、腫瘍核内および周辺のいずれにも広がる間質要素（図４Ｊ）。
【０１９８】
マイクロアレイ解析により、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪは、同時に、様々な重要なシグナル伝達経路に影響したことが示された（図６Ａおよび６Ｂ）。アレイ中４００００個の遺伝子のうち、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪによる処理により２０１６個の遺伝子のアップレギュレーションおよび１３０５個の遺伝子のダウンレギュレーション（２〜２６．３倍）が起こった。マスター転写因子は、機能が未知の新しい遺伝子と同様、変化を見せた。図２に要約したものは、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪで処理された動物の腫瘍において、未処理のものと比較し２倍またはそれ以上アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされた主な遺伝子である。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓシステムを用いて、最も重要な遺伝子と発現変化とを相関させ、そして、それらの遺伝子産物の相互作用によって分類すると、非常に連結したネットワークが出現した（図６Ｃおよび６Ｄ）。マイクロアレイの調査結果およびｑＰＣＲとの間で矛盾は認められなかった（図６Ｅ）。
【０１９９】
興味深いことに、例えば、ＰＰＡＲのような抗癌作用に関連することが知られている様々な遺伝子は、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪで処理した腫瘍ではアップレギュレーションされることが見出された。逆に、腫瘍増殖と関連しているいくつかの重要な遺伝子も、ＮＦκＢ、ＶＥＧＦ、ＡＫＴ、ＨＩＦ−１、及びＨｏｘのようにダウンレギュレーションされることが見出された。遺伝子発現の変化には、血管形成、炎症、アポトーシス、マトリックスメタロプロテアーゼ、細胞増殖、代謝、および薬物耐性に結びつく多数の経路が含まれていた。シクロデキストリンに担持されたＭＤＪによる腫瘍遺伝子発現の変化の全てを、ここでは説明することはできないが、血管形成および癌幹細胞の調節に関与するメカニズムのいくつかの最も重要な所見の主要部を、形態学的データと共に示すことはできる。
【０２００】
シクロデキストリンに担持されたΜＤＪの抗血管新生効果：シクロデキストリンに担持されたΜＤＪで処理した群は、対照のＧＣ群が示すものより２８４％も多くの出血性腫瘍壊死領域を示した（ｐ＜０．０１）（それぞれ図４Ｄおよび４Ｅ）。更に、腫瘍壊死は明らかに周辺部にある腫瘍の外側からでなく、主に腫瘍の中心から発生しており（図４Ｅ）、これは、血管新生が阻害されたのみでなく、血管破壊現象が発生した可能性があることを示唆している。確かに、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪは、内皮細胞（ＥＣ）の集合を管腔のある組織的な血管（図４Ｆおよび４Ｈ）に構成することを防げるので、これが、無秩序な血管成長の形成をもたらし、袋小路で終わる多くの毛細血管を有する明らかに機能不全の血管を多く形成することになる（図４Ｇおよび４Ｉ）。これらの観察事項は、ニワトリ胚におけるシクロデキストリンに担持されたＭＤＪによる血管密度の低減、および通常よりも漏出性で組織化されていない新血管の出芽について述べている先の調査結果と一致する（Ｂｒａｚ  Ｊ  Ｂｉｏｌ．  ２０１０；７０：４４３〜４４９）。
【０２０１】
ＳＷでは、ＧＴ腫瘍におけるＮＦκＢ特異的な染色をした血管数が非常に特異的な増加を示したが（４８５％；ｐ＜０．０１）、これは単に細胞損傷に対する反応性のシグナル伝達の表れである可能性がある（図７Ｆ）。これはまた、ＧＴ群においてアポトーシスマーカーであるＣＡＳＰＡＳＥ−３により陽性染色された微小血管が多数観察されたことと一貫する。更に、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪで処理したマウスの腫瘍には、対照マウスの腫瘍よりも少ないＶＥＧＦおよびＣＤ３１−陽性染色微小血管が含まれており、これは、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪは、腫瘍の血管新生を抑制することができるという考えと一致する（図４Ｎ、４Ｍおよび４Ｏ）。
【０２０２】
更に、ＧＴでは、骨髄由来の内皮前駆細胞のマーカーであるＣＤ３４陽性の細胞数の有意な減少を示した（図４Ｊ、４Ｋ、および４Ｌ）。この発見は、ＣＣＲＩ（ＣＣＬ９／１５受容体）のダウンレギュレーションがＭＡで観察されることを証明となり、ＣＤ３４（＋）未熟骨髄細胞（ｉＭＣＳ）を採用することに結びつく。Ｃｃｒｌが欠如すると、劇的にマウスの肝臓における腫瘍の増殖が抑制される（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ２０１０；１３０６３〜１３０６８）。
【０２０３】
シクロデキストリンに担持されたＭＤＪ処理により、核におけるｍＲＮＡ  ＴＫＢ１（ＮＡＫ）の高発現により増強されるｍＲＮＡ  ＩｋＢのアップレギュレーション（２５９９）とともにｐ６５／ＲｅｌＡに作用するＳＡＴ３及びＮＦ−κＢ経路をダウンレギュレーション（Ｆｃ−２５２４）することがマイクロアレイにより示された。ＷＢおよびＳＷ分析の両方で、ＮＦκＢのレベルが有意に減少したことを確認することにより、マイクロアレイの結果を検証した（図８）。ＮＦκＢのおよびＳｔａｔ３はいずれも、ＶＥＧＦおよび他の血管新生促進因子を増加させることにより、癌の進行における炎症および血管新生の間の関係を調整する主要な転写因子であると考えられている（ＣｕｒｒΜｏｌΜｅｄ．２０１０；１０：３６９〜３７３）。
【０２０４】
このアッセイでＴＧＦβはダウンレギュレーションされ、ＴＧＦＢＲ１及びＴＧＦＢＲ２はアップレギュレーションされることが発見された。ΜＡ分析におけるＴＧＦβのダウンレギュレーションは、ｑＰＣＲおよびＩＨＣにより確認された（図７Ｈ、７Ｉ、および７Ｊ）。ＴＧＦＲの調節は、部分的に、ＳＭＡＤ複合体調節の変化（ＳＭＡＤ２の活性化およびＳＭＡＤ３の抑制）、ならびにＥ２Ｆ７の活性化およびＥ２Ｆ６とＥ２Ｆ４の抑制に関連する可能性がある。これは、cyclin-Ｂ２およびＣＤＫ２ＡＰ１のアップレギュレーションに加え、cyclin-Ｃのダウンレギュレーションと関連する。ＴＧＦβはその他のメカニズムのうち、血管新生の刺激を通じて癌の進行を引き起こす（Ｔｉａｎら、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｆ３  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｈａｌｌｍａｒｋｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ．  ２０１０）。
【０２０５】
ｍＲＮＡ  ＨＩＦｌａサブユニット阻害剤の著しいダウンレギュレーション（ＨＩＦｌＡＮ，ＦＣ３．７１３）に加えて、低酸素シグナル伝達経路の重要な仲介物質である低酸素誘導因子１（ＨＩＦ−１）のダウンレギュレーション（Ｆｃ−２．４６４）がみられた。ＡＰＥＸ１のダウンレギュレーション（Ｆｃ−２．３８７）は、おそらくＨＩＦｌａの存在量の減少、そしておそらくマトリックスメタロペプチド複合体ＭＭＰ２およびＭＭＰ１４の転写の減少（Ｆｃ−３．１０８）（Ｆｃ３．８９０）に関連する。ＨＩＦｌの阻害は、検出不能なｍＲＮＡ  ＶＥＧＦ発現および血管新生誘導の低下に関連している可能性がある（ＦＥＢＳＪ．２００９：５０９〜５１８）。ＷＢ及びＩＨＣ分析により、マイクロアレイ及びｑＰＣＲでの知見が確認された（図７Ｋ、７Ｌ、７Ｎ、７Ｍ、７Ｏ）。
【０２０６】
おそらく核で検出不可能なｍＲＮＡ  ＳＴＡＴ５の存在に関連するであろうＰＰＡＲａ発現の重要な増加（Ｆｃ７．００７）がみられた。ｍＲＮＡ  ＰＰＡＲ−ｇａｍａ発現の欠如は、おそらくｃ−Ｆｏｓおよびｃ−Ｊｕｎのような転写因子の不存在と関連し、そしてこれは検出不可能なＣＯＸ−２  ｍＲＮＡが存在する原因であり、そしてＩＨＣによるＣＯＸ−２発現の急激な減少に応じたものである（図７Ｐ、７Ｑ、および７Ｒ）。ＰＰＡＲαの活性化は、ＣＤ３６ｅＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ２およびＡＢＣＡ１０のアップレギュレーションに結びつく可能性がある。このシグナル伝達経路は、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪが血管新生を阻害するもう一つのメカニズムを支援している、というのは、ＰＰＡＲアゴニストが、抗血管新生応答の強力な媒介物質であるからである。そしてＰＰＡＲアゴニストは現在、癌の治療における論理オプションとして研究中である（ＰＰＡＲ  Ｒｅｓ．２０１０；８１：４６０９）。
【０２０７】
よって、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪの血管破壊及び抗血管新生効果は、抗血管新生療法において複数の経路を標的とする傾向であるという提言に沿うものである。これは、単一の経路を遮断してもあまり効果的でなく、腫瘍細胞は抗血管新生薬に対する耐性を発展させるか、および／または他の血管新生メカニズムを採用するかいずれかを行うからである（ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ．２０１０；６０：２２２〜２４３）。
【０２０８】
シクロデキストリンに担持されたΜＤＪおよび癌幹細胞：癌幹細胞（ＣＳＣ）は、腫瘍の主な発生源であり（Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．  １９９９；１８７：６１〜８１）、腫瘍塊を含む分化細胞と比較し、細胞毒性剤および放射線治療によるアポトーシス誘導に対する耐性が細胞の再生および提示により増加している（ＣｕｒｒΜｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００８；３１７１〜３１８４）。したがって、ＣＳＣに着目した治療的アプローチは、現在、臨床における癌治療を改善するための関連戦略の代表的なものと考えられている（ＣｕｒｒΜｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００８；３１７１〜３１８４；Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１０；１２０：４１〜５０）。
【０２０９】
本研究では、患者の低生存率と相関する３種の腫瘍幹細胞の古典的なマーカー：ＣＤ１３３、Ｏｃｔ４、およびメタロチオネインを使用した（Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２０００；１９１：３０６〜３１２；Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ．２００９；１６：３４８８〜３４９８；Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．  Ｓｕｒｇ．２００２；２６：７２６〜７３１；Μｕｔａｔ  Ｒｅｓ．２００３；５３３：２０１〜２０９）。使用した３種の幹細胞マーカーは、対照腫瘍では主にＰＮ領域および腫瘍の浸潤前線領域で見られた（図８Ａ〜８Ｎ）。また、ＰＮ領域は、より強いＨＩＦ−１染色があった場所でもある。おそらくＰＮ領域はより低酸素環境を含みがちで、そして、低酸素によりＨＩＦ−１αが活性化されＣＤ１３３陽性細胞の自己再生活性が増強され、これによりそれらの細胞ががん幹細胞に転換され分化が阻害されることになる（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００９；４５：，３９４９〜３９５９）。興味深いことに、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪはＣＳＣ数の著しい下落と関連していたことが観察されたが、それにもかかわらず、この知見の基礎となるメカニズムは完全には解明されていない。血管変化による細胞壊死が直接その主要なメカニズムとなる可能性があるとするのはあまり妥当でない、というのは、ＣＳＣは低酸素状態に非常に耐性があるからである。
【０２１０】
対照腫瘍では、壊死領域の周辺（ＰＮ）に多数の円形のメタロチオネイン−過剰発現細胞（ＭＴＯＥＣ）が見られ、そして紡錘形のＭＴＯＥＣは、腫瘍の境界に並んでおり、相互に連結し新血管に密接に関与するコード内に組織化されている（図８Ｉ、Ｊ、Ｌ、Ｎ、およびＭ）。本研究において、マイクロアレイ解析により、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪに関連するＭＴ発現の下落が示され、このことはｑＰＣＲおよびＩＨＣにより検証された。更に、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪは、ＭＴＯＥＣの外観および空間組織化も強く阻害した（図８Ｉ〜８Ｎ）。これが、重要なことに、血管新生に負の影響を及ぼしている可能性がある、というのは、ＭＴは血管形成プロセスにおける主要な調節機能を有しているからである（Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Μｅｔａｂ．２０００；２０：１１７４〜１１８９）。
【０２１１】
ＣＳＣおよび内皮細胞間でシグナル伝達の主要なやりとりが存在し（Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００７；７：７３３〜７３６）、そしていくつかの腫瘍では、ＣＳＣは優先的に、腫瘍血管に隣接あるいは灌流が不十分な低酸素領域由来の特定の場所（ＣＳＣニッチ）に存在し、ＣＳＣはそこに適応する（Ｎａｔｕｒｅ２００６；４４１：１０７５〜１０７９）。ＣＳＣは、それ自体が血管新生因子を生成可能であり、そしてそれ自身、血管系により生産される因子に依存して自己再生および長期的な成長を維持している（Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１０；２：１３８〜１４６）。このため、ＣＳＣが酸化的ストレスから守るために低酸素ニッチを必要とすることを考慮して、ＣＳＣおよびそれらの微小環境を標的とする新規な癌治療法が、最近提案されている、というのは、活性酸素種はＣＳＣの枯渇をもたらすｐ３８−ＭＡＰＫ−媒介性増殖を誘導するからである（Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１０；２：１３８〜１４６；Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００８；５２２〜５２８）。これらの知見に基づくと、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪは、この種の治療にも適合するだとろうということが示唆される、というのは、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪは血管に関連したＣＳＣ数の減少に関連するのみならずＭＴＯＥＣの空間組織および新血管を破壊し、ＣＳＣニッチを乱すからである。シクロデキストリンに担持されたＭＤＪなどのマルチシグナル伝達分子の作用によって、ＣＳＣの表現型および生物学的挙動が逆転またはスイッチオフされている可能性はありえないことではないと推定される。
【０２１２】
シクロデキストリンに担持されたＭＤＪとアポトーシスの誘導：２種のよく知られたアポトーシスのマーカー、すなわち、ＴＵＮＥＬ法およびＣＡＳＰＡＳＥ−３で示されるように、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪで処理したマウスの腫瘍は、対照に比べてより多数のアポトーシス細胞を含んでいた（図８Ｏ〜８Ｔ）。おそらくこの知見は、これらの領域におけるＮＦκＢおよびＨＩＦ−１阻害に関連する、というのは、両因子はアポトーシスの強力な阻害剤だからである。これはまた、これらの領域におけるＣＳＣ数の減少に関連する可能性もある。ｃｙｃｌｉｎ  Ｄｌ発現の有意な増加にもかかわらず、ＰＣＮＡ染色により反映されるように、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪ処理による増殖指数への有意な効果はなかった（Ｐ＝０．１４）。
【０２１３】
生存／抗アポトーシス経路の活性化は、癌細胞の共通の特徴であり、細胞毒性剤に対する耐性と関連している。薬物治療に対する細胞応答に関与する生存経路は、主にはＰＩ３Ｋ／ＡｋｔおよびＲａｓ／ＭＡＰＫであり、これらは、また、成長因子によって活性化されるシグナル伝達を媒介し、そして細胞増殖、代謝、アポトーシス、および血管新生を含む重要なプロセスの調節における役割を果たす。我々の研究において、ｍＲＮＡ  ＡＫＴ１はダウンレギュレーションされており（ＦＣ−２０２１）、これはＡＫＴ複合体の高度なダウンレギュレーションと並行していた（Ｆｃ−２０２１；ΡΚΒα、ΡΚΒβ、ＲＡＣ、ＲＡＣα、ＰＫＢ／ＡＫＴ）。どうか、ＰＩ３Ｋ複合体の軽度なダウンレギュレーション（ＰＩＫ３ＡＰ１−１，８５６；ＰＩＫ３Ｃ３  １，５４９）がおそらくＧＡＢ複合体の活性化（ＧＡＢｌ  １，５１１およびＧＡＢ２  １，５６９）によるもので、対照におけるｐ６５／ＲｅＩＡの活性化を促進するものであるというデータを集め関連付けていただきたい。ＦＧＦＲＬ１およびＦＧＦＲ１のアップレギュレーション、ＰＩＫ３ＡＰ１およびＦＧＦ１３の抑制がＦＧＦＲ３の活性化およびＰＩ４Ｋ２Ａの順番に関係していた。これらのレギュレーションは全ておそらくＰＩ３Ｋ複合体のダウンレギュレーション（ＰＩＫ３ＡＰ１−１，８５６；ＰＩＫ３Ｃ３  １，５４９）に関連しており、これはおそらくＧＡＢ複合体の活性化（ＧＡＢｌ  １，５１１およびＧＡＢ２  １，５６９）そして主にＡＩＦＭ２およびＡＩＦＭ３複合体によって刺激されるｃａｓｐａｓｅ２および９の発現の阻害の減少によるものである。Ｗｎｔは、ＷＩＦ１によりダウンレギュレーションされＷｎｔ５Ａの著しい抑制を伴った。
【０２１４】
更に、ＭＡＰＫ複合体の重要なダウンレギュレーションもまた、主にΜＡＰ２Ｋｌ（Ｆｃ−３，１５５）、ΜＡＰＫＡＰＫ２（Ｆｃ−２，５０１）、ΜＡＰＫ１２（Ｆｃ−２，２４５）、ΜＡＰ４Ｋ３（Ｆｃ−２，１５３）、ΜＡＰ４Ｋ５（Ｆｃ−２，１４９）、およびＭＡＰＫ１４（Ｆｃ−２，０８２）について観察された。サイクリン複合体は、ＮＦ−κＢ複合体の調節に依存する可能性があるという結果を示した。よって、Ｄ３、Ａｌ、およびＢ２のようなサイクリン複合体は、ｃｙｃｌｉｎ  Ｃのダウンレギュレーション（ＦＣ−１７２７）にもかかわらず、アップレギュレーションされた（Ｆｃ３，７７５、１，５２８、および１，６７６）。同時に、サイクリン活性化に対する直接的なバランスを保ちつつ、ｐ1９ＩＮＫ４Ｄおよびｐｌ５ＩＮＫ４Ｂといった阻害剤複合体は活性化された（ＦＣ−１７２７）（１，５２３）。これは、ｍＲＮＡ  Ｃａｓｐａｓｅ３のスコアに変化がなかったにもかかわらず、ｔＢＩＤおよびＢＩΜの増加と同等の１３ｃ１ＸＬ（Ｆｃ−１，６０１）の減少、加えて、ｍＲＮＡ  ＢＩＤのアップレギュレーション（Ｆｃ１，５０５）、および最終的にＣａｓｐａｓｅ９およびＣａｓｐａｓｅ２の高度なアップレギュレーション（２，６３４３）（１，５３０）を伴っていた。ＳＣＩＤマウスは免疫不全なので、シクロデキストリンに担持されたΜＤＪによるアポトーシスの誘導および腫瘍増殖の抑制には、宿主の免疫機能を必要とせず、シクロデキストリンに担持されたΜＤＪの抗血管新生または直接腫瘍細胞殺傷効果によるものである可能性が最も高い。
【０２１５】
これは短期的な実験のため、治療に対する腫瘍防御システムを評価することは不可能であった。それにもかかわらず、ΜＴ、ＡＢＣＢ４、およびＨＳＰ７０（ＨＳＰＡ１Ａ）のような化学療法に対する抵抗性に関連した最も顕著な遺伝子のいくつかのダウンレギュレーション（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５；２６６１〜２６６８；Μｏｌｃｅｌｌ  ２００９；１５〜２７）により、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪで処理した腫瘍は、治療に対して重要な耐性を示さない可能性が非常に高い。
【０２１６】
シクロデキストリンに担持されたＭＤＪと腫瘍組織の構成：腫瘍組織は、通常、完全に非組織的で無秩序であると考えられている。それにもかかわらず、近年では、悪性腫瘍は、他の生物学的システムで知られた適応行動の進化に類似する多細胞性集団パターンを発達させることができる複雑に動的な自己組織化バイオシステムの表れであるという議論がされている。これは、集団的細胞移動が悪性腫瘍の浸潤の際に共通してみられるという証拠（ＢｉｏＥｓｓａｙｓ２００９；３１：１９０〜１９７）増加しつつあるように、環境条件の集団的感受および集団的意思決定を含む。よって、別の概念的に新たな戦略を提案し、細胞群の情報処理を「中断」するという目的に合うものになるだろう。つまり、細胞間コミュニケーションを治療的に停止または少なくとも大いに阻むことが可能なら、間違いなくこのシステムの全体が遅延するだろう。腫瘍細胞は、通常、主に浸潤最前線で血管の周辺および周囲の似通った構造と通じて吻合コードネットワークを形成するコード（ライン等）の中に自身を整列させることが対照において観察された（図４Ｆおよび４Ｈ）。興味深いことに、腫瘍組織の「崩壊」がシクロデキストリンに担持されたＭＤＪの効果によるものであることが発見された。ＧＴ群では、腫瘍細胞はかなり頻繁に脊髄組織を欠き、そして微小血管は歪められまたは遮断されており、そして、細胞組織の重要な損失の特徴である赤血球の漏出を示した（図４Ｇおよび４Ｉ）。また、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪは、組織的な腫瘍シグナル伝達系をオフにしている可能性があることが示唆され、これにはさらなる調査を必要とする。興味深いことに、マイクロアレイ解析において、以下のような組織の構造組織に関連するいくつかの重要な遺伝子についてシクロデキストリンに担持されたＭＤＪによるダウンレギュレーションが示された：いくつかの癌で高度に発現するタイトジャンクション構造の膜貫通タンパク質であるＣｌａｕｄｉｎ−４（ＣＬＤＮ４）（Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．２００９；１６２３〜１６３０）；ｅＩＦ４Ｅの阻害に対する腫瘍組織の感受性のため癌のアキレス腱であると考えられているＥＩＦ４Ｅ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８；６３１〜６３４）；転移形成に貢献している可能性のある細胞接着分子の新しいセットに近年含まれるＤＳＣ２（デスモソーム蛋白質）（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８；６８：６０９２〜６０９９）；腫瘍細胞の増殖および浸潤における役割を担うマトリックスメタロプロテアーゼＭＭＰ１３（Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ．２０１０；１２４１〜１２４７）；および、その発現が増加すると、標準的なＷＮＴシグナル伝達経路の活性および癌成長の拡大を阻害する可能性のあるＷｎｔ−５ａ（Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００９；２０９〜２１４）である。
【０２１７】
結論として、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪの抗癌効果は、単一の標的治療パラダイムでは説明できないのは明らかと思われる。シクロデキストリンに担持されたＭＤＪの効果を理解するためには、図９に示すように、生存のための戦いにおけるそれらの遺伝子応答に適応する腫瘍を多細胞生物として包括的に検討する必要がある。この適応におけるシクロデキストリンに担持されたＭＤＪの効果により、癌治療における新しいパラダイムに光が当たるかもしれない。ＪＡは、遺伝的な調節因子である。それは何百万年の間、植物の進化種で非常に保存されており、そして、成長および非常に様々な生物的攻撃に対する防御応答の間の複雑なバランスを調節する働きをし、それによって急速に変化する環境における植物の適応を最適にする（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．２００８；１１：４２８〜４３５）。
【０２１８】
図９において、黒矢印は低酸素に駆動されるシグナルを示し、青い点線は低酸素で駆動されるシグナルに対するシクロデキストリンに担持されたＭＤＪの妨害を示し、そして、青矢印はシクロデキストリンに担持されたＭＤＪの誘導を示す。腫瘍の増殖中に、増殖する組織の需要と血管による供給との間の協調が欠如すると、いくつかの腫瘍領域における酸素供給不足が起こる。最も影響を受けると無酸素環境となり、最終的に組織壊死を示す。これらの壊死病巣の周りに、壊死領域周辺部（ＰＮＡ）が存在し、これは、低酸素つまり薄い酸素濃度状態であり、この状態に細胞が適応しそして生存シグナル伝達が強烈に活性化されることにより生存が可能になる。そこで、我々はこの領域でＮＦκＢ、ＨＩＦ−１、ＴＧＦβ、ＣＯＸ−２の高発現を示すことを観察した。高レベルのこれらの分子は、順番に、組織の成長を刺激する増殖因子を放出し、アポトーシスを低減させ、そして血管新生を促進する幹細胞の表現型を活性化する。このような理由から、古典的な癌幹細胞（ＣＳＣ）マーカーであるＣＤ１３３、Ｏｃｔ４、およびＭＴに対し陽性細胞の多数でアポトーシス指数が減少していたことが分かった（ＴＵＮＥＬおよびＣａｓｐａｓｅ−３による）。よって、ＰＮＡは、腫瘍の増殖並びに低酸素および治療に対する耐性を刺激するシグナル伝達工場として働く。
【０２１９】
ＣＳＣはまた、浸潤最前線（ＩＦ）領域に蓄積し、血管の近くに移動して近隣組織への浸潤を支援することができる。ＣＳＣおよび内皮細胞の近くに、腫瘍の縁部における周辺分泌シグナル伝達ネットワークを確立する。この協力関係により、ＣＳＣによる刺激および腫瘍新生血管による比較的容易な血液供給の結果として、腫瘍細胞の浸潤性が向上する。
【０２２０】
この理論モデルでは、酸素正常領域における腫瘍細胞の腫瘍核は、幹細胞および組織成長因子の存在が少ないので、非常に穏やかな代謝および成長に留まる。これらの細胞は、ある種の予備軍となる。低酸素または他の侵略がそれらの細胞に達すれば、それらのいくつかはＣＳＣ表現型に切り替わる可能性があるが、大部分は腫瘍の進行に従い徐々に増殖して空間を満たすのみである。
【０２２１】
シクロデキストリンに担持されたΜＤＪは血管新生をブロックし、そして現存する血管を破壊して低酸素状態を増強し、これが腫瘍の生存および増殖のシグナル（ＨＩＦ−１、ＮＦκＢ、ＭＴ、ＭＡＰＫ、幹細胞因子）を引き起こす。それにもかかわらず、このことはシクロデキストリンに担持されたＭＤＪがこれらの主要なシグナル伝達系の少なくとも大部分を同時に阻害するという事実によって回避される。よって、腫瘍は、増強された低酸素状態に反応できず、そして徐々に腫瘍組織が広大な面積の壊死に置き換わり、腫瘍が事実上排除されるまで腫瘍の収縮に最適な条件を提供する。
【０２２２】
シクロデキストリンに担持されたＭＤＪが腫瘍に接触すると、血管新生を阻害しアポトーシスおよび血管破壊を誘発するだけでなく、腫瘍が低酸素および組織損傷を提示するときに腫瘍によって活性化される主要な生存シグナル伝達系を阻害する。よって、我々は、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪが、腫瘍血管系に直接的な影響を引き起こし、それが広大な壊死領域の形成を引き起こし、そして、腫瘍防御的シグナル伝達系の阻害と結びついていたことを観察した。
【０２２３】
ＣＳＣの数の減少は、少なくとも２つの主要な結果をもたらす。第一に、腫瘍はおそらく刺激因子の主要な供給源を失う。第二に、ＣＳＣは、癌治療および低酸素に対し非常に抵抗性なので、腫瘍は最初の衝撃から回復できず、そして治療に対する抵抗性を発達させることができない可能性が非常に高い。
【０２２４】
実施例６：インビトロでの血管新生アッセイおよびインビボでの鶏卵漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイ
使用細胞株：非腫瘍性のヒト臍帯内皮由来細胞（ＨＵＶＥＣ）および黒色腫Ｂ１６Ｆ１０マウス腫瘍の腫瘍細胞。ＨＵＶＥＣは、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  and Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ、ＦＣＦ−ＵＳＰのＤｕｌｃｉｎｅａ  Ｓａｅｓ  Ｐａｒｒａ  Ａｂｄａｌｌａ博士から提供され、Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞はＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  and Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＵＦＳＣａｒのΜａｒｃｉａ  Ｃｏｍｉｎｅｔｔｉ教授から提供された。両株を、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ中で増殖させた。２種類の細胞型の形態学的観察により、一般的なメカニズムが示唆された。血管新生に対する効果の予備調査も、ＨＵＶＥＣを用いてインビトロで行った。フローサイトメトリー（ヨウ化プロピジウム及びアクリジンオレンジ）による細胞周期の調査、共焦点顕微鏡（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）によるミトコンドリア活性の評価、およびＨＵＶＥＣによるＶＥＧＦおよびＰＧＥ２産生を測定し、細胞培養の上清について市販の抗体を用いたＥＬＩＳＡを行った。
【０２２５】
卵を用いた試験では、使用した卵白は、温度と湿度を制御した恒温インキュベーター内でインキュベートしたガルスガルスのものである。インキュベーションは、卵をｇｉｒａｇｅｍに置くまたは置かずに行った。この手順を管理するために卵殻膜の上面に印を付して用いた。インキュベーションの４日目に卵の外殻を７０％アルコールに浸した脱脂綿で慎重に洗浄した後、開卵した。開卵は、全ての卵について、孵化した所と同じ場所でプラスチックホルダーにて保持し上面に印を付してから、層流中で行った。実験手順は、２０世紀前半の方法を応用し、本プロジェクトに沿うように改善した。当該方法の記載事項を発展させた。
【０２２６】
開卵は、先端が尖ってカーブした外科鋏、マイクロ手術用の鉗子、透明テープ、処分用の容器、パスツールピペット、使い捨て注射針および注射器、卵用のプラスチックまたはボール紙を用いて行った。
【０２２７】
卵膜下の中身を得るため開卵する最初の操作を行った。上面に窓を開けるＰｏＤｅｓｔａの方法だと、卵の中身をこぼすことなく観察位置に残すことが可能である。３ｍＬシリンジと結合したＢＤ２５×８針を、初期角度を４５度にして、卵の気室を通りながらゆっくりと、高純度のアルブミンのみを吸引し採取できるおよその位置まで導入した。割れないように注意しながらドリルを使用した。卵黄または空気と同様に厚いアルブミンを除去しないようした、さもなくば、卵黄を吸い込み胚の位置が変わりそして空気を除去すると元の位置に戻るようなことになり、胚の生存が危うくなるからである。
【０２２８】
卵黄嚢の位置を低くしながらも胚が卵膜に接着しないように、そして開卵したら中身が見えるように各卵から約５ｍｌのアルブミンを取り除いた。アルブミンは、針挿入の開口部を閉鎖するための数ミリリットルを残して、適切な容器に廃棄した。孔を、自身の卵アルブミンで塞ぎ、その箇所をアルコールの液滴により凝結させた。漏れを防止するために注意を払うのは、孵化場での汚染の危険を最小にするために重要である。必要なら、そこで膜を観察するまでアルブミンをもう１滴孔に垂らしそこにアルコールを滴下してもよい。
【０２２９】
先端が尖ってカーブした鋏を用いて、卵殻を、グラファイト製の刀で慎重に穴をあけた。この箇所は、卵が発熱する際、表面上で最も高温になる部分である。ドリルでの開孔後、卵膜を割らないようにゆっくりと切断し「Ｕ」字状の切り込みを形成した。最後にクランプを用い膜の出発点まで導いてから引き抜き、窓の形成を終了した。この工程で注意すべきは、胚の損傷を防ぐようにはさみを導入し操作することである。胚が非常に若い場合、殻はより硬質であり、観察がより困難である。また、古い胚だと大きなＣＡＭおよびほとんどのＣＡＭは卵殻に付着しているので、操作中に損傷してしまうリスクが増加する。開卵するのに理想的な時間は、インキュベーションから４日というのが標準である。この間、損傷による中身の損失は回避され、そして卵殻の窓により、ＣＡＭの胚および胚体外組織ならびに動脈および静脈の配置の特徴を簡単に観察することが可能であった。
【０２３０】
窓は、胚を保護するための透明なテープで閉じた。卵は、インキュベーション温度に戻した。生命のこの段階では、胚は自身で熱を生産する能力を持っていないため、育雛の中断期間を最小限にする必要がある。適切な生育は、温度及び湿度の環境条件に依存する。
【０２３１】
窓の開けて閉じた後、全ての卵を典型的には初期条件と同じ条件のインキュベーター内に戻し、更に７日間保持した。この期間中に、インビボでの血管新生の検査、または腫瘍増殖の試験のための手順を行った。腫瘍細胞を接種した卵における血管新生の観察は、実質的に同じ血管新生検査モデルに従った。純粋なＭＤＪ（Ｓｉｇｍａ製、シス／トランス９６％純度）または上記の実施例３で作成したシクロデキストリンに担持されたＭＤＪへの曝露は８日目に行い、残りの卵は１４日目まで培養器中で保持した。黒色腫細胞の接種を４日目に行い、純粋ＭＤＪまたはシクロデキストリンに担持されたＭＤＪによる卵への処理は８日目に行い、残り１４日まで培養した。プロトコルの開発中に、接種および処理時間を調整した。画像の取得についての採取時の注意事項を全実験を通し標準化した。
【０２３２】
各検査に定める期間が終わるまでに、卵をインキュベーターから取り出し、胚の心拍がもはや見られなくなるまで、少なくとも半時間、冷蔵庫で冷却した。この現象の確認後、テープをはがし、ＣＡΜに少量の４％ホルムアルデヒドを滴下した。固定器を２０分間維持した。その後、膜を採取し新鮮なうちに処理した。得られた画像の品質が容器の内容物の適切な保存性に依存したものは、造影剤の注入に使用しなかった。
【０２３３】
簡単に固定した後、外殻を破り、不活性胚をシャーレに置いた。主要な血管を、胚の腹部で挿入部の近くに三つの結び目を作り木綿糸で縛った。ＣＡＭを他の組織から分離して引き離し、冷食塩水で素早く洗浄して不要な卵黄を取り除き、膜内に気泡、クラック、またはひだが形成しないよう最小限の流体を用いて顕微鏡スライド上に広げた。膜上に顕微鏡カバースリップを置いた後に観察を行い、形成された液膜中の気泡の形成を防いだ。拡大鏡を、明視野、フィルタなし、および多少の拡大倍率（通常、例えば、５〜１０倍の拡大を詳細な観察に採用）での観察用に調整した。各検査において、同じ条件、調節可能な照明、および白黒バランスを保ちながら、画像をＮｉｋｏｎ  ＳＭＺ１８００実体顕微鏡拡大鏡を取り付けたＤＳ−ＵＬカメラ用のＡＣＴ−２Ｕプログラムを用いて高解像度で取り込んだ後、ＴＩＦＦファイルにスキャンした。各回毎に、分析材料の画像を標準化するための照明及び色調整を維持して画像を取り込んだ。同じ倍率で暗視野画像用の調整を繰り返し行った。
【０２３４】
細部をより良く観察するために、同じ試料の各領域を、明視野および暗視野で撮像した。血管網の成長は、ＩｍａｇｅＪプログラムを用い、明視野像を二値化処理して分析した。この技術は、この可能性についても研究されていたが、明視野と暗視野の画像を組み合わせることにより計算に依存しない定量結果の収集を可能にした。この研究は、自己の収集および材料の前処理の改良に重要であった。次いで、可能な限り単純な解析アルゴリズムに置き換えて、二値画像を構築した。二値画像における背景画像に対し正規化された明視野の画像を処理する手順は、洗練かつ標準化された。ＩｍａｇｅＪ用のプラグインが開発され、二値化の閾値の調整を一回行う間に得られる画像の連続観察が可能になった。この共通アルゴリズム処理により各完全検査を分析し、そして二値化閾値を、順番に処理および分析した画像のバッチ毎に設定した。
【０２３５】
定性分析および追加ドキュメントについては、画像を３２×２５０×の倍率の対物光学顕微鏡Ｊｅｎａｍｅｄに取り付けたＣａｎｏｎ  ＰｏｗｅｒＳｈｏｔ  Ａ６４０カメラより得た。
【０２３６】
典型的な接種は、１０ｍＬ未満の体積の培養培地中、卵あたり２×１０4ｃｅｌｌｓで行った。黒色腫の増殖は、ＣＡＭ上の着色形成物を拡大鏡および顕微鏡下での目視により検査した。着色がまだほとんど目視できなくとも、拡大鏡および暗視野像における混濁物を観察して腫瘍細胞増殖の位置を決定した。細胞はチオニン又は０．１％トルイジンブルーで未固定の材料を染色した後に顕微鏡下で観察した。両方の色素は、酸とアルコールという違いがあるので正常組織とのコントラストが改善され、スライドのファイルが可能になった。アルコールによる材料の脱水により血管の直径が変化するので、現状得られる染色パターンの再現性および十分な質のコントラストが得られないため、この方法で染色した材料の定量分析は実施しなかった。
【０２３７】
次に、細胞培養で検査したＭＤＪおよびシクロデキストリンに担持されたＭＤＪの用量を、卵１個あたり６０ｍＬが一定量であると考えて、卵モデルに投与した。
【０２３８】
使用済みの卵を採取して測定したところ、６０ｍＬという平均体積は、試験期間を通じ１０％未満の標準偏差をもって維持されていた。処理は、検査の目的に応じ異なる方法で行った。実現可能性検査では、開卵前かつインキュベーションの三日目に採取したアルブミンに対し処理を行い、溶液を調製してから同じ針穴を通じて卵に戻す日まで３７℃に維持した。アルブミンの卵への再導入は、７日目に、流体圧力の増加およびその管外漏出を避けるために新たに一定量を取り除いてから行った。生存能力検査は、１０日間までモニターした。抗腫瘍効果の調査では、ＣＡＭに対する処理をインキュベーションの１１日目に単回用量で行った。ＣＡＭに対する処理の実現可能性は、アルブミンによる処理を行い生存率について比較した。
【０２３９】
インビボでの血管新生への効果により、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪの抗腫瘍作用の新しいプロファイルが明らかになった。
【０２４０】
ＭＤＪは、培養中の黒色腫細胞およびＨＵＶＥＣに対して毒性を有することが証明された。細胞培養物では、活性物質は非常に似通った濃度で抗血管新生及び抗癌作用を発揮することが発見された。各細胞種に対する毒性濃度を非常に明確に同定することが可能であった（図１０および１１）。毒性試験（ＭＴＴ）において、保存されたミトコンドリア活性による色素の減少は、１ｍＭ未満の濃度のＭＤＪでは一定の値に維持されていた。この挙動は、コンフルエントＨＵＶＥＣの細胞培養において非常に再現性があった。また、増殖曲線も、１ｍＭの未満の濃度で、約２０時間の折り畳み時間定数（ｆｏｌｄｉｎｇ  ｔｉｍｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）を示した。より高い濃度では、ミトコンドリア活性が損なわれ折り畳み時間が無限大になる傾向があった、すなわち、細胞は分裂を停止し死亡した。マウス黒色腫の培養物における結果も非常に似通っており、毒性濃度も非常に近似していた。
【０２４１】
毒性濃度のＭＤＪにより２つの細胞種の細胞形態が変化し、多核巨細胞および液胞の擬中心核の形成へつながった。
【０２４２】
これらのＭＤＪの形態に対する効果により、アポトーシスおよび自食作用の誘導が腫瘍細胞のみではなく、内皮でも発生する可能性があることが示唆され、フローサイトメトリーによるＨＵＶＥＣの細胞周期のより詳細な研究につながった（図１３）。この新しい結果により、毒性のターゲットが内皮細胞および腫瘍間で共通するという仮説が再確認された（図１３および表４）。
【０２４３】
加えて、血管成長因子ＶＥＧＦへの効果が実証された。
【０２４４】
【表４】
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【０２４５】
培養中の内皮細胞のミトコンドリアはＭＤＪの存在下で活性化したことが示された。この効果は、低密度プレートにおけるＭＴＴにおいて、最も明白であった（図１４）。これらの条件（１×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）下でも、高密度プレート（２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）下でも、ＨＵＶＥＣによるＰＧＥ２生産の増加はなかった。ＰＧＥ２の生産は、通常、これらの細胞の集合がコンフルエントになったときに起こるが、ＭＤＪの間接的な効果を媒介している可能もある。
【０２４６】
内皮細胞増殖に対する毒性効果が、インビトロおよびインビボでＣＡＭモデルにおいて実証された。
【０２４７】
黒色腫細胞が存在すると、卵の生存率が減少した。ＭＤＪは部分的に、この生存率を回復した。モデルにおけるＣＡＭの結果により、黒色腫の本体にこの有効成分が作用して用量依存的な退縮を起こすことが確認された。
【０２４８】
シクロデキストリンに担持されたΜＤＪの検査
シクロデキストリンに担持されたΜＤＪのインビトロ検査により、ＨＵＶＥＣおよびＢ１６Ｆ１０に対する活性化合物の細胞毒性は保存され、非常に低い用量で起こることが実証された（図２２）。ビヒクルは、製剤中に使用されるものと同等の濃度では不活性であった。また、シクロデキストリンに担持されたＭＤＪを、ＭＥ１００１ヒト癌細胞株および組織についても検査したところ、同様の細胞毒性が観察された。
【０２４９】
シクロデキストリンに担持されたＭＤＪをその後、インビボモデルで検査した。最初の研究で、血管構造に対する有効成分の用量の減少および黒色腫存在下での保護効果を確認した。
【０２５０】
実施例７：実施例２のリポソームに担持されたΜＤＪを用いたインビトロでの抗細胞増殖アッセイおよびインビボでの抗血管新生実験
実施例２で調製したリポソームに担持されたΜＤＪを９種の癌細胞株：ＵＡＣＣ６２−黒色腫、ΜＣＦ７−癌耐性、ＮＣＩＡＤＲ−多剤耐性乳癌、７８６０−腎臓癌、ＮＣ１４６０−肺癌、ＰＣＯ３−前立腺癌耐性、ＯＶＣＡＲ０３−卵巣癌、ＨＴ２９−結腸癌、Ｋ５６２−白血病、において検査した。これらの細胞株を実施例２で製造した種々の濃度のΜＤＪを有するナノエマルジョンで処理した。図２６に示すように、ＣＤに担持されたΜＤＪは、用量依存的に腫瘍増殖を阻害した。図２７は、インビボでの抗血管形成活性に対するナノキャリアのサイズの効果を示す。より具体的には、１００ｎｍのナノキャリアを有するナノエマルジョンは、５０ｎｍのナノキャリアを有するナノエマルジョンよりも優れた活性を示した。
【０２５１】
更に、図２８に示すように、リポソームのサイズが１００ｎｍ未満のとき、リポソームに担持されたＭＤＪにより抗細胞増殖活性の増強が示された。
【０２５２】
実施例８：インビトロ抗細胞増殖アッセイ
［この実施例は、ハーバード大学での研究について記述した原稿に基づく。］
ナノ担持されたＭＤＪ（ナノキャリアはＣＤ、リポソーム、またはＬＤＥ）につき、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から購入した以下の１１種の細胞株（３種の白血病、２種の乳癌、１種のマクロファージ、および５種の前立腺癌）において検査した。細胞は、ＡＴＣＣが提唱する各増殖培地（ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、または１０％ウシ胎児血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＦ１２−ｋ培地）中で増殖させた。細胞株の詳細について、以下の表５に示す。
【０２５３】
【表５】
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【０２５４】
ナノ担持されたＭＤＪ製剤をＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解し室温で保存した。製剤は、汚染回避のため使用前に０．２２ミクロンのフィルターで精製した。
【０２５５】
各細胞株から３００万の細胞を６ウェルプレートの３つのウェルに均等に分配し、一晩増殖させた。翌日、１μΜのΜＤＪを含有するナノ担持されたＭＤＪ製剤を、１つ目のウェルに加え、一方同じ濃度の空のナノキャリア（またはナノ粒子）を２つ目のウェルに加え、そして細胞を有する３つ目のウェルは、薬物または空ナノキャリアを加えずそのまま保持した（「対照」）。製剤のアポトーシス効果を、処理から６時間、１２時間、および２４時間後に倒立顕微鏡下で観察した。
【０２５６】
ナノ担持されたＭＤＪでは、検査癌細胞株におけるアポトーシス現象の優れた効果が示された。アポトーシス効果は検査した全ての細胞株において観察され、ＭＤＪ処理の６時間後に始まり、２４時間後にピークに達した。ＴＩＢ−５１２、ＣＲＬ−２８７６、およびＣＲＬ−２３１４のようないくつかの癌細胞株は、２４時間後に完全にまたはほぼ完全に死んでいた（図３８〜４０参照）が、他のものは平均６０％〜７０％の細胞死亡率を示した（図４１参照）。残りの細胞は、前アポトーシス段階にあった。この分子は、癌細胞のみを標的とする作用を有していることから、ナノキャリアの癌細胞への効果的な薬物送達剤としての可能性が示唆される。空のナノ粒子しか有さない対照細胞では、アポトーシスがほんのわずかに見られるか又は全く見られなかった。
【０２５７】
癌細胞は、健康な細胞に比べるとエネルギーを生成する方法が異なり、これはワールブルグ仮説としても知られている。この仮説では、癌細胞のエネルギーを生成するミトコンドリアは、健康な細胞が用いる酸化経路ではなく、非酸化経路を用いる。ＭＪは、癌細胞におけるミトコンドリアのこの異常を標的とし、シトクロムＣならびに他のプロテアーゼおよびカスパーゼの放出を引き起こすことが報告されている。ＭＪは、Ｈｅｐ３Ｂ肝癌細胞から単離されたミトコンドリアの膨潤を誘導することは可能だが、３Ｔ３非形質転換細胞または正常リンパ球から単離されたミトコンドリアでは可能でない。チトクロムＣの放出は、ミトコンドリア膜透過性遷移、膜の脱分極、浸透膨潤、従ってアポトーシスをもたらす。表５のリストに示すマクロファージ細胞株を非形質転換細胞として本研究に用いたが、アポトーシスの効果は広範囲に観察されなかった（図４２参照）。
【０２５８】
出願人が行った研究では、ナノ担持されたＭＤＪは、転写、翻訳、およびｐ５３とは独立した細胞毒性効果を発揮することが示唆されている（未公開）。先の研究（未公開）により、インビトロではＭＤＪのみでも同様の結果を示すが、インビボだとこの薬剤は非常に迅速に分解するので効果を見るには非常に高用量が必要であることが示された。ナノ粒子中の分子をカプセル化することにより、ＭＤＪがインビボで分解せず、癌細胞の治療に非常に低用量、例えば、カプセル化していない分子で用いた用量の１０００倍未満、で非常に効果的であったことが示された。
【０２５９】
均等
本発明は、その主旨または本質的な特徴から逸脱することなく他の特定の形態で実施することができる。前述の実施形態は、従って、本明細書に記載の本発明を限定するのではなく、むしろ全ての点で例示的なものと考えるべきである。本発明の範囲は、よって、上記の記載ではなく添付の特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内での全ての変更を含むことを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年2月4日(2019.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬として許容される溶媒、およびメチルジヒドロジャスモネート（ＭＤＪ）を含有する複数のナノキャリアまたはマイクロキャリアを含む医薬組成物であって、
ナノキャリアまたはマイクロキャリアは、リン脂質層に囲まれたコレステリルエステルのコアを含む合成ナノエマルジョン粒子（ＬＤＥ）から形成され；
ナノキャリアは、１ナノメートル（ｎｍ）から９００ｎｍの範囲のサイズを有する；あるいは
マイクロキャリアは、１ミクロンから１００ミクロンの範囲のサイズを有する；そして
医薬組成物は、１ｎＭから１Μの範囲の濃度のＭＤＪを有する、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記ナノキャリアはＬＤＥであり、そして３０ｎｍから５００ｎｍ、好ましくは５０ｎｍから１１０ｎｍの範囲のサイズを有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ＭＤＪの濃度の範囲は１ｎＭから１００μΜである、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＭＤＪの濃度の範囲は１０μΜから１００ｍＭである、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ＭＤＪの濃度の範囲は１００ｍＭから１Μである、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ナノキャリアまたはマイクロキャリアは、更に２−アミノエチルリン酸二水素、３，７−ジメチル−２，６−オクタジエナール、サリチル酸メチル、またはアブシジン酸を含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記医薬として許容される溶媒は、水、アルコール、またはそれらの混合物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ナノキャリアまたはマイクロキャリアは更に非ジャスモネート化合物を含有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
血管新生関連疾患の治療の必要がある対象における血管新生関連疾患を治療する方法において使用するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、場合により、前記血管新生関連疾患は、
ａ）癌であり、ここで好ましくは、前記血管新生関連疾患は、白血病、結腸癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、肝臓癌、皮膚癌、卵巣癌、黒色腫、または肉腫である、あるいは、
ｂ）炎症性疾患であり、ここで好ましくは、前記血管新生関連疾患
は炎症性腸疾患である、医薬組成物。
【請求項１０】
ＮＦ−κＢ関連疾患の治療の必要がある対象におけるＮＦ−κＢ関連疾患を治療する方法において使用するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、ここで好ましくは、前記ＮＦ−κＢ関連疾患は、ウイルス、細菌、または真菌感染症である、医薬組成物。
【外国語明細書】
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