(57)【要約】【課題】mTORシグナル伝達経路およびMAPKシグナル伝達経路の同時阻害剤、および該阻害剤を含むがんの予防または治療剤の提供。【解決手段】下の一般式（I)で表される構造を有するレスベラトロール二量体を有効成分として含むmTORシグナル伝達経路およびMAPKシグナル伝達経路の同時阻害剤：【化１】2019077657.tif 000009[式（I)中、R1およびR3は、それぞれ独立にH、OHおよびOCH3からなる群から選択され、R2はH、OH、OCH3およびOGlc（Glcはグルコース）からなる群から選択され、R4はH、CH3およびGlcからなる群から選択される]。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下の一般式（I)で表される構造を有するレスベラトロール二量体を有効成分として含むmTORシグナル伝達経路およびMAPKシグナル伝達経路の同時阻害剤：
【化１】
2019077657.tif 000008
[式（I)中、R1およびR3は、それぞれ独立にH、OHおよびOCH3からなる群から選択され、R2はH、OH、OCH3およびOGlc（Glcはグルコース）からなる群から選択され、R4はH、CH3およびGlcからなる群から選択される]。
【請求項２】
レスベラトロール二量体がGnetin C、Gnetin L、Gnemonoside A、Gnemonoside CおよびGnemonoside Dからなる群から選択される請求項１記載のmTORシグナル伝達経路およびMAPKシグナル伝達経路の同時阻害剤。
【請求項３】
レスベラトロール二量体がGnetin Cである、請求項２記載のmTORシグナル伝達経路およびMAPKシグナル伝達経路の同時阻害剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の阻害剤を含む、がんの予防または治療剤。
【請求項５】
がんがAMLである、請求項４記載のがんの予防または治療剤。
【請求項６】
経口投与用である、請求項４または５に記載のがんの予防または治療剤。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載のがんの予防または治療剤と、該治療剤以外のがんの化学療法剤との組合せ製剤。
【請求項８】
レスベラトロール二量体を含む、レスベラトロール二量体以外の化学療法剤と併用される医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の阻害剤を含む、がんの予防または治療用の飲食物。
【請求項１０】
がんがAMLである、請求項９記載のがんの予防または治療用の飲食物。
【請求項１１】
核型が、47,X-Y,del（1）（q32q42）,del（11）（q13q21）,+mar[27]monosomal Karyotypeを有するヒトAML細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの予防または治療剤に関し、特に急性骨髄性白血病（AML）の予防および治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性骨髄性白血病（AML）は造血前駆細胞の急速進行性クローン障害である。造血前駆細胞のクローン性異常増殖と、骨髄における未熟な芽球の蓄積を特徴とし、最終的に正常細胞の産生が妨げられる。AMLは、成人ではより多く見られる急性白血病であり、世界的には、急性白血病の中でも年間死亡者数が最も多い病型である。60歳未満では約40％で治癒が得られるが、60歳以上の患者での予後は不良である。多くのAML患者は多剤併用化学療法で完全寛解に到達するが、その約半数は3年以内に再発する。AML患者の予後に影響を与える重要な因子として年齢、全身状態が挙げられるが、中でも最も重要な予後予測因子は染色体核型である。AML患者における染色体核型は現在、良好群、中間群、不良群の3つに分類されている。複数の染色体異常を有するAMLは一般的に複雑核型といわれ、予後不良群に含まれる。中でも、「2つの常染色体のモノソミーまたは少なくとも1つの付加的な染色体構造異常を伴う1つのモノソミー」と定義されるmonosomal karyotype（AML-MK）は、他の複雑染色体核型を有するAML患者の4年間の全生存率が21％であるのに対し、4年全生存率が4％と悲惨であることから、AMLの中でも特別な一群として扱われている。
【０００３】
AMLの発症過程は複雑である。加齢とともに造血幹細胞に遺伝子異常が蓄積した結果発症することもある。白血病化に関与する重要な分子異常には、幹細胞の分化を調節する転写因子活性の低下や、細胞増殖を司るシグナル伝達経路の異常活性化などがある。例えば、哺乳類におけるラパマイシン（mTOR）やホスホイノシチド3-キナーゼ（PI3K）/AKT経路の異常活性化は、大多数のAML患者由来白血病細胞で認められる。また、細胞外シグナル調節キナーゼ1/2（ERK 1/2）の恒常的な活性化や高発現も、ほとんどのAML細胞で検出される。このため、PI3K/Akt/mTOR経路とRas/Raf/MEK/ERK経路はAMLのよい治療標的と考えられる（非特許文献１参照）。
【０００４】
しかし、これらの経路を抑制することは容易ではなく、過去のアプローチはいずれも無効であった。これは、AML細胞では複数のシグナル伝達経路が活性化されており、あるシグナル経路の阻害がしばしば他のシグナル経路の活性化を招くためである（非特許文献１および２参照）。したがって、効果的にAML細胞を死滅させるためには、複数のシグナル伝達経路を同時に阻害する薬剤の開発が必要である（非特許文献２参照）。
【０００５】
Gnetin C（レスベラトロール二量体）は、東南アジア原産の食用果実であるメリンジョの種子から単離されたスチルベンである。Gnetin Cに加えて、Gnetin L、Gnemonoside A、Gnemonoside CおよびGnemonoside Dを含むメリンジョ種子のエタノール抽出物は、フリーラジカルスカベンジャー活性（非特許文献３参照）、免疫調節効果（非特許文献４参照）、抗菌活性および抗血管新生特性（非特許文献５参照）を有することが報告されている。南西諸国では、Gnetin Cを豊富に含むメリンジョの葉、果物、種子などが長期にわたって摂取されてきていることから（非特許文献３参照）、Gnetin Cは安全の高い天然の有機物と考えられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ricciardi MR. J Mol Med (Berl) 2012;90:1133-44
【非特許文献２】McCubrey JA. et al., Oncotarget 2012;3:1068-111
【非特許文献３】Kato E. et al., J Agric Food Chem 2009;57:2544-9
【非特許文献４】Kato H. et al., Planta Med 2011;77:1027-34
【非特許文献５】Kunimasa K. et al., Mol Nutr Food Res 2011;55:1730-4
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、mTORシグナル伝達経路およびMAPKシグナル伝達経路の同時阻害剤、および該阻害剤を含むがんの予防または治療剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、MK陽性の患者白血病細胞にアポトーシスを誘導する抗腫瘍化合物のスクリーニングを行い、天然スチルベンであるGnetin C等のレスベラトロール二量体が、MK陽性AML細胞を強力に傷害することを見出した。その作用機序を検討したところ、Gnetin Cは、白血病細胞の生存に不可欠な2つのシグナルであるERK 1/2 MAPKシグナル伝達経路と、AKT/mTORシグナル伝達経路の両者を同時に阻害することが明らかになった。さらに、Gnetin Cと低濃度の化学療法薬との組み合わせは、AML細胞に対して相乗的な抗腫瘍効果を示した。また、MK陽性AML細胞株を用いた免疫不全マウスのAMLモデルにおいて、Gnetin Cは白血病の発症を阻害するだけなく、白血病細胞を死滅させ、生存率を改善することを明らかにした。以上のようにGnetin Cは、2つの異なるシグナル経路を遮断するというユニークな作用によって抗白血病作用を発揮することが明らかになったため、本特許を申請するに至った。
【０００９】
本発明は以下のとおりである。
[１]  下の一般式（I)で表される構造を有するレスベラトロール二量体を有効成分として含むmTORシグナル伝達経路およびMAPKシグナル伝達経路の同時阻害剤：
【化１】
2019077657.tif 000002
[式（I)中、R1およびR3は、それぞれ独立にH、OHおよびOCH3からなる群から選択され、R2はH、OH、OCH3およびOGlc（Glcはグルコース）からなる群から選択され、R4はH、CH3およびGlcからなる群から選択される]。
[２]  レスベラトロール二量体がGnetin C、Gnetin L、Gnemonoside A、Gnemonoside CおよびGnemonoside Dからなる群から選択される[１]のmTORシグナル伝達経路およびMAPKシグナル伝達経路の同時阻害剤。
[３]  レスベラトロール二量体がGnetin Cである、[２]のmTORシグナル伝達経路およびMAPKシグナル伝達経路の同時阻害剤。
[４]  [１]〜[３]のいずれかの阻害剤を含む、がんの予防または治療剤。
[５]  がんがAMLである、[４]のがんの予防または治療剤。
[６]  経口投与用である、[４]または[５]のがんの予防または治療剤。
[７]  [４]〜[６]のいずれかのがんの予防または治療剤と、該治療剤以外のがんの化学療法剤との組合せ製剤。
[８]  レスベラトロール二量体を含む、レスベラトロール二量体以外の化学療法剤と併用される医薬組成物。
[９]  [１]〜[３]のいずれかの阻害剤を含む、がんの予防または治療用の飲食物。
[１０]  がんがAMLである、[９]のがんの予防または治療用の飲食物。
[１１]  核型が、47,X-Y,del（1）（q32q42）,del（11）（q13q21）,+mar[27]monosomal Karyotypeを有するヒトAML細胞株。
【発明の効果】
【００１０】
Gnetin C等のレスベラトロール二量体は、がん細胞で活性化されているmTORシグナル伝達経路およびMAPKシグナル伝達経路の両方を同時に阻害することができる。その結果、がん細胞にアポトーシスを誘導し、がん細胞を傷害する。Gnetin C等のレスベラトロール二量体は、がんの予防または治療剤として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１−１】AML細胞に対するGnetin Cおよび種々の薬剤の抗腫瘍効果を示す図である。
【図１−２】AML細胞に対するGnetin Cの抗腫瘍効果を示す図である。
【図２−１】Gnetin Cによる白血病細胞株のアポトーシスの誘導効果を示す図である。
【図２−２】Gnetin Cにより処理した白血病細胞株のアネキシンV染色、ギムザ染色、Mitocapture試薬染色像を示す図である。
【図２−３】Gnetin Cによる原発性白血病細胞のアポトーシスの誘導効果を示す図である。
【図２−４】Gnetin CによるTHP-1、MV4およびHL-60細胞のアポトーシスの誘導効果を示す図である。
【図２−５】Gnetin CによるOUN1、KH88およびK562細胞のアポトーシスの誘導効果を示す図である。
【図３−１】Gnetin CによるAML-MT細胞の細胞周期への影響を示す図である。
【図３−２】Gnetin CによるAML細胞の細胞周期への影響を示す図である。
【図３−３】Gnetin CによるAML-MT細胞の細胞周期タンパク質の発現への影響を示す図である。
【図３−４】Gnetin CによるAML細胞の細胞周期タンパク質の発現への影響を示す図である。
【図４−１】AML細胞に対するGnetin Cの細胞傷害効果を示す図である。
【図４−２】骨髄単核細胞のコロニー形成能に対するGnetin Cの影響を示す図である。
【図５】Gnetin Cと化学療法薬との相乗作用を示す図である。
【図６−１】AML細胞におけるGnetin Cの分子標的の同定の結果を示す図である。
【図６−２】AML細胞におけるGnetin Cの分子標的の同定の結果を示す図である(デンシトメトリーデータ）。
【図６−３】同定された標的タンパク質に基づいて、Gnetin Cによって攪乱された経路を示す図である。
【図７】Gnetin CによるERK 1/2 MAPK経路の遮断を示す図である。
【図８−１】ウエスタンブロッティングにより、Gnetin CによるmTORシグナル伝達活性の遮断を示す図である。
【図８−２】フローサイトメトリーにより、Gnetin CによるmTORシグナル伝達活性の遮断を示す図である。
【図９−１】マウスAML異種移植モデルを用いた、生体内での実験の概要を示す図である。
【図９−２】マウスAML異種移植モデルにおける白血病発症率を示す図である。
【図９−３】マウスAML異種移植モデルから採取した末梢血サンプルのギムザ染色像を示す図である。
【図９−４】マウスAML異種移植モデルにおける経時的な体重変化を示す図である。
【図１０−１】Gnetin CのAML細胞に対する抗腫瘍作用を生体内で確認する実験の概要を示す図である。
【図１０−２】白血病細胞を投与したマウスにおける、Gnetin Cによる抗腫瘍効果を示す図である。
【図１０−３】Gnetin C処理マウスにおける、末梢血中、骨髄中および脾臓中のAML細胞の数を示す図である。
【図１０−４】Gnetin C処理マウスにおける、末梢血中、骨髄中および脾臓中の死細胞の割合を示す図である。
【図１０−５】Gnetin C処理マウスにおける、末梢血中、骨髄中および脾臓中の白血病細胞（hCD45 +)死細胞(7AAD +)の割合をフローサイトメトリーで示す図である。
【図１０−６】Gnetin C処理マウス由来の組織における白血病細胞の検出結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明は、mTORシグナル伝達経路およびMAPKシグナル伝達経路を同時に阻害する同時阻害剤である。該阻害剤は、がんの予防または治療剤として用いることができる。
【００１４】
該阻害剤は、レスベラトロール二量体を有効成分として含有する。レスベラトロール二量体は下記一般式（I)で表される構造を有する。
【００１５】
【化２】
2019077657.tif 000003
式（I)中、R1およびR3は、それぞれ独立にH、OHおよびOCH3からなる群から選択され、R2はH、OH、OCH3およびOGlc（Glcはグルコース）からなる群から選択され、R4はH、CH3およびGlcからなる群から選択される。
【００１６】
この中でも、下記のGnetin C、Gnetin L、Gnemoside A、Gnemoside CまたはGnemoside Dが好ましく、Gnetin Cがさらに好ましい。
Gnetin C         R1: H、R2: OH、R3: H、R4: H
C28H22O8
Gnetin L         R1: OCH3、R2: H、R3: OH、R4: H
C29H24O7
Gnemonoside A    R1: H、R2: OGlc、R3: H、R4: Glc
C40H42O16
Gnemonoside C    R1: H、R2: OGlc、R3: H、R4: H
C34H32O11、
Gnemonoside D    R1: H、R2: OH、R3: H、R4: Glc
C34H32O11
【００１７】
レスベラトロール二量体は、メリンジョ（Gnetum gnemon L.)の食用果実である種子、葉、果実等の抽出物から分離、精製することにより得ることができるスチルベンである。特に種子の抽出物を用いることが好ましい。例えば、クロマトグラフィーなど汎用的な分画技術を用いて精製することができる。例えば、メリンジョの種子からエタノール、メタノール、アセトン、ヘキサン、エーテル、酢酸エチル、クロロホルム、ブタノール、プロパノール等の有機溶媒を用いて抽出し、さらに疎水性相互作用を利用したクロマトグラフィーによりレスベラトロール二量体を分離、精製することができる。
【００１８】
メリンジョは、東南アジアから西太平洋諸島にかけて分布するグネツム科の雌雄異株の高木である。
また、レスベラトロール二量体は、合成により製造したものであってもよい。当業者ならば上記化学式に基づいて容易に合成することができる。
【００１９】
南西諸国では、Gnetin C等のレスベラトロール二量体リッチなメリンジョの葉、果物および種子が長期にわたって消費されてきているので、Gnetin Cは人間にとって安全と考えられる。Gnetin Cを投与したマウスにおいて重大な有害事象が起こらないことも、この化合物の安全性を示している。
【００２０】
mTOR（mammalian target of rapamycin)シグナル伝達経路は、AKT/mTORシグナル伝達経路とも呼び、セリン／スレオニンキナーゼであるmTORが関与している。リン酸化により活性化されたAKTがmTORを活性化（リン酸化）する経路であり、がん等の病態に関与する。mTORシグナル伝達経路を図６−３の左側に示す。
【００２１】
MAPK（mitogen-activated protein kinase）シグナル伝達経路は、ERK(extracellular signal-regulated kinase） 1/2 MAPKシグナル伝達経路とも呼び、ERK 1/2(ERK1・ERK2サブファミリー）等を含むセリン／スレオニンキナーゼであるMAPKが、増殖因子等により活性化され、活性化されたMAPKが他の転写因子等の基質をリン酸化し、増幅されたシグナルを核に伝えることによって、細胞増殖等を制御する経路である。推定されるMAPKシグナル伝達経路を図６−３の右側に示す。
【００２２】
AMLを含む多くのがんでmTORシグナル伝達経路およびMAPKシグナル伝達経路の両方が活性化されている。mTORシグナル伝達経路またはMAPKシグナル伝達経路の一方を阻害すると、通常はフィードバック機構により他方が活性化される。Gnetin Cは、mTORシグナル伝達経路およびMAPKシグナル伝達経路の両方を同時に阻害することにより、がん細胞のアポトーシスを誘導し、がん細胞を傷害する。
【００２３】
従って、Gnetin Cは、がんの予防剤または治療剤として用いることができる。本発明は、が、mTORシグナル伝達経路およびMAPKシグナル伝達経路の同時阻害剤であるGnetin Cをがん予防または治療剤として使用しようとするものである。
【００２４】
さらにGnetin Cは、がんの化学療法剤（抗がん剤）と併用することにより相乗的な治療効果を発揮する。併用が有用な可能性がある化学療法剤として、シタラビン（Ara−C)、ヒドロキシカルバミド（ヒドロキシ尿素（HU)）、メトトレキセート、アミノプテリン、６-メルカプトプリン、５-フルオロウラシル、カルモフール、ゲムシタビン等の代謝拮抗剤；L-アスパラギナーゼ（L-Asp)等の酵素製剤；アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ダクチノマイシン、アクチノマイシンD、クロモマイシン、ダウノマイシン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、ドノルビシン、エピルビシン、マイトマイシンC等の抗癌抗生物質；窒素マスタード（サイクロフォスファミド等）、ダカルバジン、カルムスチン（BCNU)、ブスルファン、イフォスファミド、塩酸ニムスチン、ロムスチン（CCNU）（ニトロソウレア剤）、ラニムスチン（MCNU)（ニトロソウレア剤）、プロカルバジン等のアルキル化製剤；ビンブラスチン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ドセタキセル、CPT-11（イリノテカン）、エトポシド等の植物アルカロイド剤；プレドニゾロン、デキサメサゾン、ヒドロコルチゾン等のホルモン製剤；レンチナン、ピシバニール、ベスタチン等の生物機能修飾物質；シスプラチン、カルボプラチン等のプラチナ製剤などが挙げられる。
【００２５】
この中でも、急性白血病の化学療法剤として知られているシタラビン（Ara-C)、ヒドロキシ尿素（HU)またはL-アスパラギナーゼ（L-Asp)をGnetin Cと併用すると、AML細胞に対する相乗的効果がみられる。本願発明は、Gnetin C等のレスベラトロール二量体と他の化学療法剤を組合せた組合せ製剤または組合せキットを包含する。さらに、本願発明は、Gnetin C等のレスベラトロール二量体以外の化学療法剤と併用される医薬組成物を包含する。Gnetin C等のレスベラトロール二量体とそれ以外の化学療法剤は、同時に投与しても、別々に投与してもよい。また、順次に投与してもよく、投与順は、Gnetin C等のレスベラトロール二量体が先でもよいし、それ以外の化学療法剤が先でもよい。
【００２６】
本発明の、予防または治療薬が対象とするがんとしては、AML、慢性骨髄性白血病（CML)、急性リンパ性白血病（ALL)、慢性リンパ性白血病（CLL)、悪性リンパ腫（ホジキンリンパ腫；ろ胞性リンパ腫、MALTリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、パーキットリンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫などの非ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫等の血液癌、並びに肝癌、肺癌、胃癌、膵癌、大腸癌、結腸癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮癌、乳癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、脳・神経腫瘍、皮膚癌、副腎癌、腎盂尿管癌、尿道癌、陰茎癌、精巣癌、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫等の固形癌（上皮細胞癌、非上皮細胞癌）を含むあらゆるがんが挙げられる。この中でも、白血病、特にAMLの予防または治療に有効であり、その中でも、2つの常染色体のモノソミーの存在または少なくとも1つの付加的な染色体構造異常を伴う1つのモノソミーによって定義されるmonosomal karyotypeのAMLに有効である。
【００２７】
本発明のmTORシグナル伝達経路およびMAPKシグナル伝達経路の同時阻害剤を含むがんの予防または治療剤である医薬組成物は、経口で投与しても、また静注、筋注、皮下投与、直腸投与、経皮投与等の非経口で投与してもよい。該医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤等を含んでいてもよい。また、着色料、香料、防腐剤などを含んでいてもよい。賦形剤としては例えば乳糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ソルビット、結晶セルロースなどが、滑沢剤としては例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、硬化植物油などが、結合剤としては例えばジメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが、崩壊剤としては例えばデンプン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン末、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、デキストリンなどが、それぞれ挙げられる。使用する際の形態は特に限定されず、カプセル状、粉末、粒状、タブレット状、液状などの形態とすることができる。
【００２８】
本発明のmTORシグナル伝達経路およびMAPKシグナル伝達経路の同時阻害剤は、サプリメントとして用いることができ、あるいは、飲食物に混合して飲食用組成物として用いることもできる。
【００２９】
サプリメントとして用いる場合、錠剤や顆粒の形態で用いることができ、他の有用成分と混合してもよい。
【００３０】
飲食用組成物として用いる場合、健康飲食品、特定保健用飲食品、機能性表示食品、栄養機能飲食品、健康補助飲食品等として供することが可能である。これらの飲食品には、がんを予防または改善する、腫瘍を予防または改善する等の機能を表示することができる。
【００３１】
飲食用組成物は、固形物、液状、粉末、顆粒状、ペースト状等の種々の形態であり、具体的には、例えば、清涼飲料、乳酸飲料、嗜好飲料、コーヒー、緑茶、紅茶、ウーロン茶などの飲料品；キャンディー、チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類などの菓子類；果実飲料、野菜飲料、ジャム類、ペースト類などの野菜・果実加工品；日本酒、焼酎、ワイン、中国酒、ウイスキー、ウオッカ、ブランデー、ジン、ラム、酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュールなどのアルコ−ル飲料；ヨーグルト、アイスクリーム、バター、チーズ、練乳、粉乳のなどの乳製品；ドレッシング、マヨネーズ、てんぷら油、サラダ油などの油脂加工品；しょうゆ、ソース、酢、みりん、ドレッシングタイプ調味料などの調味料；粉末ジュース、粉末スープ、インスタントコーヒー、即席麺類、即席カレー、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調理済みスープなどの乾燥飲食品、小麦粉加工品、でんぷん類加工品などの穀物加工品等が挙げられる。例えば飴、クッキー、チューインガム、ビスケットのような固形物として用いても、あるいは清涼飲料水、牛乳、ヨーグルト、シロップのような液状でもよい。飲食物とする場合、クエン酸、乳酸、カゼインなど、通常飲食物に使用される添加剤を配合することができる。
【００３２】
レスベラトロール二量体を含む、mTORシグナル伝達経路およびMAPKシグナル伝達経路の同時阻害剤を含む医薬組成物、サプリメントまたは飲食物等の飲食用組成物におけるレスベラトロール二量体の含有量は、その剤型に応じて異なるが、通常レスベラトロール二量体が、全組成物中の0.1〜50重量％、好ましくは0.1〜20重量％程度含まれていればよい。レスベラトロール二量体の場合の摂取量は、摂取者の年齢、性別、体重、症状の種類、症状の程度などを考慮して適宜増減できるが、一日当たりの摂取量が0.01〜250mg/kgになるように、飲食品の形態に合わせて設定するのが好ましい。１日１回または数回に分けて投与、摂食等により摂取すればよい。
【００３３】
本発明のレスベラトロール二量体を含有する医薬組成物、サプリメントまたは飲食物等の飲食用組成物は、ヒトを含む哺乳動物を対象とする。ヒト以外の哺乳動物としては、サルなどの霊長類、ラット、マウスなどのげっ歯類、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ等が挙げられる。
【００３４】
本発明は、ヒトAML-MK細胞株も包含する。該細胞株はヒトAML-MK患者の白血病患者から樹立したものである。患者の末梢血から採取した白血病細胞を、組換えヒトSCF（例えば、100ng/ml）、IL-3（例えば、100ng/ml）およびFLT-3L（例えば、50ng/ml）を含む培地で継代培養することにより樹立することができる。該細胞株において、CD38の発現が減弱し、CD34の発現が亢進している。該細胞株の核型は、47,X-Y,del（1）（q32q42）,del（11）（q13q21）,+mar[27]で表される。該細胞株は白血病の病態研究等あるいは治療方法の研究に有用である。
【実施例】
【００３５】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３６】
実施例における材料及び方法
試薬
プロテアーゼ阻害剤カクテル、ホスファターゼ阻害剤カクテル、抗αチューブリンおよび抗βアクチン抗体は、Sigmaから購入した。抗CDK3抗体はGenetexから購入し、抗CDK4および抗pAMPK 1/2（172/183）抗体はSanta Cruz Biotechnologyから購入した。抗ホスホMSK 1/2（S376 / S360）および抗RSK1（S380）は、R＆D Systems、Inc.から購入した。他のすべての抗体は、Cell Signaling Technologyから購入した。
【００３７】
細胞培養
AML細胞株MV4は、ATCC（Rockville、MD、USA）から購入した。AML細胞株THP1、U937およびHL60、ならびに慢性骨髄性白血病（CML）細胞株K562細胞は、健康科学研究資源銀行から購入した。BCR-ABL1陽性CML系統OUN1及びKH88細胞は、愛媛大学の安川教授から提供された。細胞を、10％FBSおよび1％ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地（37℃、5％CO2雰囲気）で培養し、定期的に試験し、マイコプラズマ汚染について陰性と確認した。この研究で使用された初発白血病細胞は新たに診断されたかまたは再発した様々なAML患者の、骨髄または末梢血から得られた（表1）。サンプルは、ヘルシンキ宣言に従って、そして金沢大学の倫理委員会によって承認された機関のガイドラインおよび研究に従って、すべての患者からインフォームドコンセントが得られた後、日常的な診断手技の間に得られた。Ficoll-Hypaque勾配遠心分離（Pharmacia Biotech）を用いて骨髄単核細胞および90％以上の白血病細胞を含む末梢血単核球を単離し、使用するまで等分し、凍結保存した。試験管内実験での使用のための凍結保存された芽球は、トリパンブルー染色によって実証されるように、生存可能な90％以上であった。これらの細胞を、100ng/mlの20％ウシ胎児血清（FBS）幹細胞因子（SCF）、100ng/mlのFms関連チロシンキナーゼ3リガンド（FLT3-L）、およびGM-CSFを補充した20ng/ml RPMI培地で培養した。メリンジョ抽出物（Kato E. et al., J Agric Food Chem 2009; 57:2544-9）から調製したGnetin Cは、ホソダ SHCから入手し、DMSOに可溶化した。白血病細胞を様々な濃度のGnetin Cまたは賦形剤で処理した。いくつかの実験では、健常人のヘパリン加末梢血検体から単離した末梢血単核球（n=3）および骨髄検体（n=3）を対照として用いた。
【００３８】
【表１】
2019077657.tif 000004
【００３９】
細胞生存率、アポトーシス試験および細胞周期分析
比色MTTアッセイを用いた細胞生存率の評価は、メーカーの取扱説明書（Roche）に従って行った。吸光度の強度は、MultiSkanマイクロプレートリーダー（Thermo Scientific）を用い、参照波長を620nmとし、490nmで測定した。すべての実験を3回実施し、細胞生存率を計算した（Sugimori N. et al., PloS One 2015;10:e0120709）。MK核型を有する白血病細胞の増殖を阻害することができる候補化合物のスクリーニングは、報告された抗腫瘍特性を有する様々な薬剤の存在下でAML-MK芽球を48時間培養することによって実施し、その後、細胞生存率をMTTアッセイによって評価し、Quoc Trung L. et al. PLoS One 2013:8;e55183に記載の方法で細胞抑制率を算出した。
【００４０】
Quoc Trung L. et al. PLoS One 2013:8;e55183に記載されているように、Gnetin Cまたは他の薬物の存在下または非存在下で培養した細胞中のアネキシンV染色（Invitrogen）に基づいて、またはミトコンドリアアポトーシス検出キットMitocapture BioVision Inc.（Milpitas）を用いて評価した。Gnetin C処理細胞および未処理細胞におけるギムザ染色は、公知の方法で行った。
【００４１】
ヒトホスホキナーゼ膜アレイ
Gnetin Cの潜在的標的のスクリーニングは、2つのプロテオームプロファイラー膜アレイ、ヒトホスホMAPKアレイキット（cat＃ARY002B）およびヒトホスホキナーゼアレイキット（cat＃ARY003B、R＆D Systems）を用いて行った。標的タンパク質の発現レベルと相関するスポット強度は、クイックスポット画像ソフトウェア（R＆D Systems）を用いて評価した。
【００４２】
フローサイトメトリー
白血病細胞における種々の細胞表面受容体の免疫染色は、蛍光標識したモノクローナル抗体（BD-Biosciences社）と細胞を共培養することにより行った。細胞内染色は、BDのCytofix/ Cytopermキット（BD Biosciences社）を用いて行った。KI-67は、PerCP Cy5.5抗ヒトKI-67モノクローナル抗体（BD Biosciences社）を用いて検出し、活性化mTORは抗ホスホmTOR抗体（Ser2448）、クローンD9C2（細胞シグナル伝達）を用いて検出し、続いてPE標識抗マウスIgG抗体（BD Biosciences）で染色した。データをBD FACSCANTO II機器（BD Biosciences）で取得し、FlowJoソフトウェアパッケージ、バージョン10.0.7を用いて分析した。
【００４３】
ウエスタンブロット分析
細胞は、所定の用量、時間でGnetin Cで処置した。処理後、M-PER（登録商標）Mammalian Protein Extraction Reagent（Pierce）中で細胞を溶解することによって全細胞タンパク質試料を調製し、抗体を用いてタンパク質を検出した。
【００４４】
動物実験
免疫不全マウス、57BL/6.Rag2null/Il2rgnull/NOD-Sirpa(Yamauchi T. et al., Blood 2013;121:1316-25)を用いた。金沢大学の病原体のない部屋で、加圧換気ケージに収容して動物を飼育した。6または8週齢の動物を使用した。本研究は、金沢大学の動物ケアおよび使用審査委員会によって正式に承認された。白血病は、Agliano A. et al., Int J Cancer 2008;123:2222-7によって記載された方法に従って、いくつかの変更を加えて誘導した。簡略すると、非照射マウスには、2×106の一次白血病AML-MT細胞またはAML細胞株（THP-1およびHL-60細胞）を腹腔内注射した。白血病は、フローサイトメトリーを用いて骨髄および末梢血検体中のヒト白血病細胞（HLA-ABC +またはhCD45 +細胞）を検出することによって診断した。既報の通り、ヒト17番染色体のアルファ-サテライト領域に特異的なプライマーを用いたPCRにより、早期に白血病の検出を行った（Agliano A. et al., Int J Cancer 2008;123:2222-7）。実験条件を至適化することによって、THP-1およびAML-MT細胞は、マウスに白血病様をより確実に発症させることが見出された。従って、それらを、生体内でのGnetin Cの抗白血病効果を調べる実験に用いた。マウスをGnetin Cに暴露するために、Gnetin Cをトウモロコシ油（Sigma）に溶解し、使い捨ての給餌針（Fuchigami Co）を用いて経口投与した。いくつかの実験では、賦形剤またはGnetin C投与の24時間後に採取したマウス末梢血から遠心分離によって血漿サンプルを単離した。Japan Clinical Laboratories Inc.で、Gnetin Cおよびその代謝産物であるGnetin Cモノグルクロニド（GC-MNG）の血漿レベルを測定した。
【００４５】
マウス組織の病理検査
マウスをエーテル麻酔下で安楽死させ、その器官を3.7％ホルマリン（Sigma）中で48時間固定した。パラフィン包埋前に20％EDTA（Sigma）を含有するリン酸緩衝ホルマリン（3.7％ホルマリン、pH7.4）中で脛骨および大腿骨を48時間脱石灰処理した。標準的な方法に従って、エタノールおよびキシレンシリーズを用いて組織を処理した。切片（4μm）をスライドに載せ、キシレンおよびエタノールシリーズを用いて標準法に従って処理した。脱パラフィン切片をヘマトキシリン-エオシン（H＆E）染色した。脱パラフィンした切片を、ヒトCD45およびMHCクラスIの免疫染色の前に、前処理のために95℃で20分間、Target Retrieval Solution（Dako Japan）中でインキュベートした。メタノール-過酸化水素中で、内因性ペルオキシダーゼ活性を20分間遮断し、正常なヤギ血清（1:10; Vector Lab、Burlingame、CA、USA）中で20分間培養した後、切片をヒトCD45に対する一次モノクローナル抗体（クローン2B11 + PD7/26、マウスIgG1kappa、Dako Japan）またはヒトMHCクラスIA、B、C（クローンEMR8-4、マウスIgG1、1μg/ml、北斗）と共に４℃でオーバーナイトでインキュベートし、次いでDako Envision-HRP（Dako Japan）を用いたベンジジン反応後、切片をヘマトキシリンで追加染色した。
【００４６】
抗白血病効果に関する各種薬剤のスクリーニング
Monosomal karyotype（MK）を有するAML芽球を20％FBS、SCF（100ng/ml）、GM-CSF（20ng/ml）およびFLT3リガンド（100ng/ml）を添加したRPMI培地で培養した。細胞を、96ウェル丸底プレートにn=3で播種した10,000細胞/ウェルずつで分注した。分注２時間後に、各種薬剤（5μL/ウェル）または賦形剤（0.05％DMSO）を添加し、細胞を48時間培養し、細胞生存率をMTTアッセイにて評価した。このスクリーニングのために選択された化合物は、生体内で白血病細胞および他の悪性細胞の細胞死を誘導すると報告された用量で用いた。以下の試薬を使用した：
パノビノスタット（50nM)、レスベラトロール(50μM)、シタラビン（500nM)、ドキソルビシン（500nM）、ボルテゾミブ（50nM）、アピゲニン（100μM）、L-アスパラギナーゼ（0.1IU）、メトトレキセート（250nM）、アスコルビン酸（5μM）、ヒドロキシ尿素（100μM）、エトポシド（15μM）、ベンホチアミン（15μM）、バルプロ酸（4mM）、ダサチニブ（5μM）、AG490（100μM）、Gnetin C（25μM）、ソラフェニブ（5μM）、Thymoquinone（2μg/ ml）、レチノイン酸（50nM）、Albendazol（0.5μM）（19μg）、ゲフィチニブ（5μM）（20μg）、マイトマイシン（5μM）、ラクトフェリン（100μg/ml）、チュニカマイシン（50ng/ml）、メナジオン（5μM）、ピオシアニン（0.5μg/ml）、SB202190（25μM)
ダサチニブ（Cayman)、ゲフィニチブ（Tocris Bioscience）、ピオシアニン（Enzo Life Sciences）およびGnetin C（Hosoda Nutritional）以外はSigma Aldrichより入手した。
【００４７】
各種薬剤の相乗効果の検討
IC50は、薬理学的分析ツールED50 v1.0（Yanada M.et al., J Clin Med 2016;5）を用いて評価した。Gnetin Cおよび他の薬剤の相乗効果は、Chou-Talalay法（Yanada M.et al., J Clin Med2016;5,Lechman ER. et al., Cancer Cells 2016;29:214-23）に基づくcooperative index（CI）に従って決定した。ここで、CIは、単剤処理/成長阻害併用処理の増殖阻害の合計である。CI<1、CI=1、およびCI>1のとき、効果は、それぞれ、相乗的、相加的、および拮抗的であると判断できる。FACS Canto IIフローサイトメーター（BD Biosciences）を用いて細胞周期分析を行った。
【００４８】
コロニーアッセイには、造血幹細胞移植のための骨髄採取時に、骨髄液を濾過した後に残った健常者（3人）の骨髄単核細胞と、4人のAML患者（AML 1、AML 2、AML 3、およびAML9）の骨髄細胞を用いた。1×104個の患者由来AML細胞または骨髄単核細胞を含むメチルセルロース溶液（MethoCult GF M3434, StemCell Technologies、Minato-Ku）を35mmペトリ皿中で培養した。Gnetin Cは、種々の濃度で、培養の開始時に添加した。対照として賦形剤（DMSO）のみを加えたものを同時に培養した。培養14日目に、40個以上の細胞からなるクラスターをAML芽球のコロニーとして倒立顕微鏡下でカウントした。同様に、健常者の骨髄単核細胞に由来する顆粒球-マクロファージ前駆細胞（CFU-GM）およびBFU-E: burst-forming-unit-erythroid（BFU-E）を、培養14日目に倒立顕微鏡下でカウントした。
【００４９】
Monosomal karyotypeを有するAML：症例提示
22歳の男性が、左胸水を伴う前縦隔腫瘤の評価のために当院に紹介された。患者は、衰弱、疲労および乾性咳嗽を伴う発熱と夜間の発汗に苦しんでいた。他の病院で行われた血液検査では、LDH（394 IU/L）およびsIL-2R（2,508 U/mL）高値がみられたため、悪性リンパ腫が疑われていた。血液学的疾患の病歴はなかった。患者の脈拍は100/分、SpO293％（室内空気）、呼吸数は26回/分であった。弾性硬のリンパ節が両側鎖骨窩に蝕知された。左下背部で呼吸音が減衰していた。血液検査（表２）では、66％の芽球を伴う白血球増加（25,680/μl）およびLDHの上昇（1047 IU/L）が確認された。FDG/PET-CT検査では、縦隔（SUVmax10）、胸膜、鎖骨窩・腋窩リンパ節および骨髄でのFDG摂取量の増加が示された。骨髄塗抹標本は、少数の赤芽球と74％の芽球を含む過形成骨髄であり、芽球は大型で単球様、青灰色の細胞質、および核：細胞質比の増加等から、急性白血病が示唆された。白血病細胞はCD4、CD33、およびCD56陽性であり、ミエロペルオキシダーゼ（MPO）染色も陽性であった。胸水から単離された白血病細胞もまたMPO陽性であった。白血病細胞の表面の免疫表現形は、CD33 +/- (78%)、 CD38 +/-（90％）、CD4 +/-（74.5％）、HLA-DR +/-（39.9％）、CD56 +/-（28％）、CD13 +/- (15.9%)、CD45 +/- (10%)、CD14 +/- (3%)、CD22 +/- (42.8%)、CD10 +/-（5％）、CD19-（5.8％）、CD34 +/-（3％）、CD20-（0.9％）、CD3-、CD5-、CD7-、CD8-、CD20-、CD21-、CD22-、CD25-およびCD41a-であった。染色体検査により、以下の核型であることが判明した。46XY,add（11）（q13）,add（16）（p11.2）[3] 45,idem,-Y [4] 44,idem,-Y,-15 [3] 45,idem,-15,-add（16）,+ add（16）（p11.2）[1] 46,XY [3]。
【００５０】
MLL（11q23）のFISH分析は陰性であり、BCR/ABLのPCRも陰性であった。これらの結果から、monosomal karyotypeを有するAMLと診断した。患者は、イダルビシン（IDR）およびシタラビン（Ara-C）による寛解導入療法レジメンを受けた。完全寛解に到達しなかったため、患者はIDR + Ara-Cの2回目の化学療法を受けた結果、骨髄中の芽球割合の減少（3％）はみられたが、縦隔およびリンパ節腫大は残存し、完全寛解は得られなかった。新たに白血病の皮膚浸潤も発症したため、サルベージ療法として高用量のAra-C含有レジメン（HD-AC）を受けた。皮膚白血病は一時的に改善し、FDG/PET-CT検査により、縦隔およびリンパ節病変の改善もみられた。しかし、2回目のHD-AC療法後の造血回復期間中に、骨髄中の芽球が80％まで急速に増加し、末梢血中に芽球も出現した。3回目のHD-AC療法により芽球数を一時的に減らしたのち、フルダラビン（Flu）と全身照射（TBI）による前処置後に、同胞からの末梢血幹細胞移植（R-PBSCT）を行った。GVHD予防目的に、シクロホスファミド、タクロリムス（FK506）およびMTXを使用した。移植後13日目までに好中球生着が確認されたが、移植後26日目に行われた骨髄検査の結果、多数の芽球が確認された。アザシチジン（AZA）による化学療法を行ったが、芽球数がさらに増加したため中止し、2回目の造血幹細胞移植を目指してミトキサントロン、エトポシド、中等量のAra-C（MECレジメン）による化学療法を行った。しかし、MEC療法も骨髄の芽球割合が90％であった。このためFlu/Mel/TBI（4Gy）で前処置を行ったのち、母親から末梢血幹細胞移植（PBSCT）を行った。患者は出血性膀胱炎を発症したが、その他の合併症なく経過し、15日目にはドナー細胞の生着と白血病の寛解が確認された。しかし、移植2ヵ月目の血液検査で40％の芽球が出現し、骨髄でも70％の芽球がみられた。3回目のMEC療法を行ったが、芽球の数は徐々に増加し、10日後に敗血症のため死亡した。
【００５１】
【表２】
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【００５２】
AML-MT細胞の樹立と維持
難治性で非常に活動性の高く、2回目の造血幹細胞移植後に再発したこのAML-MK患者から、2014年12月23日、末梢血を採取した。白血球数は90800/Lであり、95％が芽球であった。Lymphoprep(商標）で勾配分離した白血病細胞を、20％の非働化ウシ胎児血清（FBS）100 ng/mlのSCF、100 ng/mlのIL-3、50 ng/mlのFLT-3Lをそれぞれ含むRPMI-1640培地（Gibco/Thermo Scientific）に浮遊させ、37℃・5％CO2・湿度100％のインキュベーター内で培養した。細胞の濃度は、T10培養フラスコ中で1×106cells/mlに調整した。培養液は4日ごとに交換した。培養開始33日後、培地中の組換えSCFおよびIL-3は、それぞれ50ng/mlおよび20ng/mlに減じた。FLT-3Lは50ng/mlに維持した。細胞の一部をサイトカインを含まない培地に細胞を移したところ、48時間以内に細胞は死滅した。その後、この細胞はIL-3なしで生存することが観察されたが、細胞増殖が著しく劣るため、再度IL-3も加え、SCF、IL-3、FLT-3Lを含む培養培地にした。培養67日後、細胞増殖は安定した。細胞株が樹立されたため、以下のように形態学的および免疫表現型検討を行った。
【００５３】
Cytospinでスライドグラスに吸着させた細胞をGiemsa（MG）、ミエロペルオキシダーゼ（MPO）で染色した。患者の末梢血およびAML-MK細胞を蛍光色素結合抗体で染色し、フローサイトメトリーで細胞表面抗原を分析した。AML-MK細胞株は元の白血病細胞と同様の免疫表現型を示したが、AML-MK細胞ではCD38発現の低下とCD34発現の上昇がみられた（表３）。MPO染色はAML-MK細胞株でも陽性であった。顆粒は細胞の約35％に存在し、空胞はいくつかの細胞の細胞質に観察された。核はしばしば分葉し、1〜3個の核小体を持ち、微細なアズール好性顆粒を含んだ好塩基性の細胞質を持っていた。
【００５４】
AML-MK細胞が、本当に元の白血病細胞由来であることを確認するために、トリプシン-ギムザバンディング法（GTG）およびスペクトル核型分析（SKY）を用いた細胞遺伝学的分析を行った。分析には、17ヶ月試験管内で維持したものを用いた。21種の分裂中期細胞を分析し、核型を国際細胞遺伝学的命名法2016（Burgess MR. et al., Blood 2014;124:3947-55）に従って定義した。蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）およびSKYを公知の方法により実施した。GTG、DAPIバンディング、FISH、SKYから得られた細胞遺伝学的所見と合わせて、AML-MKの核型は、47,X-Y,del（1）（q32q42）,del（11）（q13q21）,+mar[27]と判明した。細胞遺伝学的分析により、AML-MKで検出されたdel（1）（q32q42）とdel（11）（q13q21）は、元の白血病芽球のものと同一であることが明らかになった。
AML-MK細胞は浮遊細胞のまま22ヶ月間以上に亘り、60〜72時間の倍加時間で連続的に増殖した。
【００５５】
【表３】
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【００５６】
データ分析
全てのデータは3回の実験の平均±標準偏差として報告した。結果はStudent-t検定を用いて解析し、マウスの生存率はKaplan-Meier法を用いて推定した。全ての分析は、GraphPad Prismソフトウェアパッケージ、バージョン5.02（San Diego）を用いて行った。P値<0.05を有意差ありと判定した。
【００５７】
実施例１  Monosomal karyotypeのAML細胞に対して細胞傷害性を示す薬剤のスクリーニング
複雑核型のAML細胞に対して細胞傷害活性を示す候補化合物を同定するために、抗癌特性を有する既報の一連の化合物を、種々の抗白血病薬に耐性であり、完全寛解未到達のAML-MK患者からのAML芽球中でスクリーニングした。
【００５８】
AML-MKを有する患者由来の白血病細胞を各条件で三つずつ分注し、Gnetin Cまたは細胞傷害性のある種々の薬剤で48時間処理した。次いで、細胞抑制率をMTTアッセイによって評価した。結果を図１−１に示す。AML-MK細胞において強力な抗増殖効果を示す唯一の化合物は、L-アスパラギナーゼ（L-Asp）、ボルテゾミブ、メトトレキセートおよびパノビノスタット（Panobinostat）以外に、天然に存在するスチルベンであるGnetin Cであった（図１−１）。
【００５９】
Gnetin Cの抗白血病薬としての可能性を探るために、9つの患者由来AML検体のパネルをスクリーニングした。Gnetin Cは、9つの検体のうちの8つにおいて、2.5μMから17μMの範囲のIC50で細胞増殖を阻害することができた（表４）。注目すべきことに、この化合物の増殖阻害能は、予後不良な細胞遺伝学的特徴を有する患者検体や再発白血病細胞においても観察されることから、Gnetin Cは、現在利用できる化学療法レジメンに抵抗性の患者に対して効果を示す可能性がある。
【００６０】
【表４】
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【００６１】
3人の異なる患者由来のAML細胞を、図１−２Aに示す濃度のGnetin Cと共に48時間培養し、細胞生存率をMTTアッセイによって評価した。結果を図１−２Aに示す。また、Gnetin C（17μM）で処理したAML 1およびAML 9細胞の細胞生存率をMTTアッセイにより24、48および72時間で評価した。結果を図１−２Bに示す。Gnetin Cは用量依存的（図１−２A）および時間依存的（図１−２B）に増殖阻害効果を示した。増殖阻害効果は24時間以内で顕著であり、処置後72時間以内に減弱した。
【００６２】
さらに、Gnetin Cの抗腫瘍効果を、CML細胞株であるK562、KH88およびOUN1、AML細胞株であるU937、HL-60、THP-1およびMV4を含む7種の骨髄系細胞株についても検討した。これらの細胞株を種々の濃度のGnetin Cで48時間処理し、細胞生存率をMTTアッセイで評価した。結果を図１−２Dおよび１−２Eに示す。用量依存的な増殖阻害効果が、検討した全てのAML細胞株において観察された（図１−２D）。一方、Gnetin Cは、検討した3つのCML細胞株に対して阻害活性を示さなかった（図１−２E）。
【００６３】
最後に、本化合物の安全性を確認するために、Gnetin Cの濃度を高くして（最大100μM）、健常人由来の末梢血単核細胞および３名の健常人の骨髄由来CD34陽性造血前駆細胞を48時間培養し、細胞生存率をMTTアッセイによって評価した。Gnetin Cは、AML細胞の増殖を効果的に阻害する濃度で、末梢血単核細胞の生存を損なうことはなかった。しかし、予想通り、非常に高い濃度（100μM）では、正常細胞の生存率が有意に低下した（図１−２Cおよび１−２F）。
【００６４】
実施例２  Gnetin CはAML細胞にアポトーシスおよび細胞周期の停止を誘導する
スクリーニング実験で使用した患者の白血病細胞（AML-MK）の特徴を維持するAML細胞株（AML-MT）を樹立した。本発明者らの知る限りでは、AML-MT細胞はFlt-3L、SCFおよびIL-3増殖因子に依存性でMK核型を持つ、初めての細胞株である。元のAML細胞と類似の表現型および核型を保持するAML-MT細胞は、免疫不全マウスに生着し、白血病を発症させる。AML-MT細胞およびAML-MT細胞源であるAML細胞を、図２−１に示す濃度のGnetin Cと共に48時間培養し、細胞生存率をMTTアッセイによって評価した。元の白血病細胞と同様に、AML-MT細胞はGnetin Cの細胞傷害作用に感受性を示した（図２−１）。
【００６５】
AML-MT細胞を図２−２に示す濃度のGnetin Cと共に24時間培養し、次いでアネキシンFITCで染色後、それらをフローサイトメトリー（上部パネル）により分析した。またはサイトスピンでスライドガラスに吸着させた細胞にギムザ染色を行い、細胞形態を光学顕微鏡（中央パネル）で評価した。AML-MT細胞を示された濃度のGnetin Cと共に12時間培養し、Mitocapture試薬で染色した細胞を蛍光顕微鏡（下のパネル）下で観察した。結果を図２−２に示す。AML細胞におけるGnetin Cの細胞増殖阻害能は、アネキシンV染色アッセイ（図２−２、上のパネル）およびGiemsa染色（図２−２、中央パネル）において、細胞膜突起、凝集したクロマチン、核の断片化および凝縮した好塩基性細胞質の痕跡を含む、アポトーシスの典型的な形態学的徴候を示した。これらは、患者由来AML細胞でみられたアポトーシス誘導と同様であった。興味深いことに、Gnetin C処理細胞では膜電位の有意な低下が認められた（図２−２、下のパネル）。このことは、Gnetin Cによって誘発される細胞アポトーシスは、AML細胞におけるミトコンドリア膜機能不全によるものであることを示唆している。
【００６６】
3人の患者由来AML細胞を、示された濃度のGnetin Cで36時間処理し、それらをアネキシンFITCで染色後、フローサイトメトリーにより分析した。その結果、Gnetin Cがアポトーシスを誘導する能力は、3人の異なる患者由来の患者由来AML細胞においても示された（図２−３）。
【００６７】
さらに、THP-1細胞を図２−４上に示す濃度のGnetin Cで48時間処理し、次いでそれらをアネキシンFITCで染色後、フローサイトメトリーで分析した。また、THP-1、HL-60、MV4、KH88、およびK562細胞を様々な濃度のGnetin Cで48時間処理し、同様にアネキシンFITCで染色後、フローサイトメトリーで解析した。さらに、OUN1細胞を、図２−５上に示す濃度のGnetin Cで48時間処理し、同じくアネキシンFITCで染色後、フローサイトメトリーで解析した。結果を図２−４および図２−５に示す。Gnetin Cは、MV4、HL-60およびTHP-1のAML系統の細胞株に対して一貫してアポトーシスを誘導したが（図２−４）、CML系統であるOUN1、KH88およびK562に対してはアポトーシスを誘導しなかった（図２−５）。
【００６８】
次に、AML-MT細胞を17μMのGnetin Cで12時間処理し、ヨウ化プロピジウムで染色後、DNA含量をフローサイトメトリーで分析した。また、AML 2、AML 3およびAML 9細胞を17μMのGnetin Cで24時間処理し、ヨウ化プロピジウムで染色後、DNA含量をフローサイトメトリーで分析した。これらの細胞周期解析により、Gnetin Cは白血病細胞の細胞周期をG1期に留めることが明らかになった（図３−１（AML-MT)および図３−２（Ａ:AML2、Ｂ:AML3、Ｃ:AML9)（* P <0.05vs UNT））。
【００６９】
さらに、AML-MT細胞を、図３−３に示す濃度のGnetin Cで12時間処理するか（図３−３Ａ）、または示された時間、17μMのGnetin Cで処理した（図３−３Ｂ）。全タンパク質抽出物を調製し、CDK1、CDK3、CDK4およびCDC42に特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティングに供した。さらに、AML芽球を同様に処理し、全タンパク質抽出物を調製し、CDK3、CDK4、p27およびCDC42に特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティングに供した。結果を図３−３および３−４（Ａ:AML2、Ｂ:AML3、Ｃ:AML9)に示す。サイクリン依存性キナーゼ3（CDK3）および細胞分裂制御タンパク質42ホモログ（CDC42）などの細胞周期調節タンパク質は、AML-MT細胞では恒常的に高発現されていたが、Gnetin C処理によって有意に発現が低下した。一方、CDK1、CDK2およびCDK4などの他の細胞周期調節タンパク質の発現には有意な変化は観察されなかった（図３−３および３−４）。
【００７０】
次に、AML細胞に対するGnetin Cの細胞傷害効果をさらに明らかにするために、コロニーアッセイを行った。4人のAML患者から得られた白血病細胞（5×104細胞/プレート）を、図４−１に示す濃度のGnetin Cまたは賦形剤で処理し、MethoCult H04034中で培養し、40個以上の細胞からなるコロニーを14日後に数えた。Gnetin Cで処理することにより、患者由来AML細胞のコロニー数は用量依存的に減少した（図４−１（Ａ:AML1、Ｂ:AML2、Ｃ:AML3、Ｄ:AML9)）。注目すべきことに、AML9細胞のコロニー形成能を阻害するためには、より高用量のGnetin Cが必要であった。これは、Gnetin Cの細胞傷害効果に対するこの患者検体の低感受性と一致していた。3人の健常者の骨髄単核細胞を、同じメチルセルロース培地を用いて培養したところ、20および40μMのGnetin C存在下では、BFU-EおよびCFU-GMコロニー数に有意な現象はみられなかった。しかし、80μM以上の高濃度では、BFU-E、CFU-GM共に有意に減少した（図４−２(Ａ:BFU-E、Ｂ:BFU-GM））。
【００７１】
実施例３  Gnetin Cは、化学療法薬との組み合わせで相乗作用を示した
Gnetin Cを、ヒドロキシ尿素（HU）やシタラビン（Ara-C）を含むAMLの治療薬物と組み合わせることの有用性を評価するために、AML-MT細胞をGnetin Cの存在下または非存在下で、低濃度のHU(20μM）、Ara-C（50μM）またはL-Asp(0.01IU/ml)と48時間共培養した。MTTアッセイによって細胞増殖を評価し、Gnetin Cと化学療法薬との間の相互作用を決定するためにcooperative index（CI）分析を行った。CI <1、CI = 1およびCI> 1の効果はそれぞれ、相乗的、相加的および拮抗的と定義した。Gnetin CとAra-C（図５Ａ）またはHU（図５Ｂ）との組み合わせは、これらの化合物の抗癌効果を顕著に増加させ、cooperative index（CI）は、使用されたほとんどの濃度で1未満であった。これは相乗効果があることを示している。興味深いことに、Gnetin Cをリンパ球性悪性腫瘍の治療に現在使用されており、最近ではAMLにおいても治療効果が示されているL-Asp（図５Ｃ）と組み合わせた場合にも、同様の相乗効果が観察された。
【００７２】
実施例４  AML細胞におけるGnetin Cの分子標的の同定
AMLにおけるGnetin Cの抗腫瘍メカニズムを同定するため、Gnetin C処理AML細胞からの全タンパク質抽出物を、多数のプロテインキナーゼおよびMAPK経路メンバーの活性型の発現を、膜アレイを用いて評価した。すなわち、AML-MT細胞を未処理のままにするか、または17μMのGnetin Cで4時間処理したのち、全タンパク質抽出物を調製し、ヒトリン酸化MAPKアレイ（図６−１）またはヒトリン酸化キナーゼ膜アレイ（図６−２）にて評価した。図６−１Ａおよび図６−２Ａに代表的な結果を示す。それぞれの２つのスポットは活性化されたタンパク質標的を表す。四角で強調した標的を図の下に記載した。図６−１Ｂおよび図６−２Ｂは、AML-MT細胞で検出可能な代表的な活性タンパク質のドット強度をデンシトメトリーで測定したデータを示す。図６−１および図６−２に示すように、Gnetin C処理は、AKT/mTOR経路に対する阻害効果と一致して、AML-MT細胞におけるp70SKおよびAKTの恒常的活性化を阻害した。さらに、ERK 1/2 MAPKの下流メンバーである活性化p90リボソームS6キナーゼ（RSK1）およびマイトジェンおよびストレス活性化プロテインキナーゼ（MSK 1/2）の恒常的に活性化も、AML-MT細胞のGnetin C処理により阻害された。以上のことから、Gnetin CはAML細胞におけるERK 1/2とAKT/mTORシグナル伝達の両方を標的とすると結論した。
【００７３】
図６−３に、同定された標的タンパク質に基づいて、Gnetin Cによって阻害される経路を示す。Gnetin Cによる阻害により、細胞周期の停止（Cell cycle arrest)が誘導され、アポトーシス（Apoptosis cell death)が誘導され、細胞増殖が制御（Growth inhibition）される。
【００７４】
実施例５  Gnetin Cは、AML細胞で構成的に活性されているERK 1/2 MAPK経路を遮断する
アレイスクリーニングの結果を検証するために、活性MAPKシグナル伝達メンバーの特異的抗体を用いてウエスタンブロットを行った。すなわち、AML-MT細胞を未処理（NC）のままにするか、または17μMのGnetin Cで30分、1,3,4または6時間処理した（GC）のちタンパク質抽出物を調製し、リン酸化ERKおよびERKに特異的な抗体を用いたウエスタンブロットを行った。さらに、AML-MT細胞をGnetin Cの存在下または非存在下で4時間培養し、タンパク質抽出物をリン酸化ERK、ERKおよびβ-アクチンに特異的な抗体を用いたウエスタンブロットを行った。その結果、AML-MT細胞中で恒常的に活性化されているERK 1/2キナーゼは、Gnetin C処理の3時間後に常に阻害されること、ERK処理後6時間でERK 1/2阻害がピークとなること(図７Ａ)、またGnetin C処理は、同時に起こるp38 MAPKおよびpJNK 1/2シグナル伝達に関与することが示された（図７Ａ）。JNK 1/2およびp38 MAPKシグナル伝達の活性化に加えて、ERK 1/2の阻害は、AML細胞にアポトーシスを誘発する他の薬剤によっても報告されている（Sugimori N. et al., Plos One 2015;10:e0120709、Konopleva M. et al., Leukemia 2005;19:1350-4）。Gnetin CのAML細胞傷害作用は用量依存的であり（図７Ｂ）、AML-MT以外にも、様々な患者由来AML細胞でも確認された（図７Ｃ）。一方、ERK 1/2シグナル系の恒常的活性化およびGnetin Cによるその阻害は、Gnetin Cに比較的耐性であったAML9細胞ではほとんど検出されなかったことから、ERK 1/2シグナル系の恒常的活性化は、Gnetin Cの細胞傷害効果に対する感受性と相関すると思われた。興味深いことに、通常はGnetin C処理によって誘導されるp38 MAPKの活性化は、今回検討したどのAML細胞でも観察されなかった(図７Ｃ)。AML 2およびAML 3細胞では、p38 MAPKではむしろ抑制されたことから、p38 MAPKの活性化は、Gnetin-Cによる細胞傷害効果には不必要と考えられた。
【００７５】
実施例６  Gnetin CはAML細胞において恒常的に活性化されているmTORシグナル伝達活性を遮断する
膜アレイからの知見を検証するために、本発明者らは次にmTORシグナル伝達に対するGnetin C処理の影響を評価した。すなわち、AML-MT細胞を未処理（NC）のまま、または17μMのGnetin Cで30分、1、3、4または6時間培養した（GC）。また、種々の濃度のGnetin Cで4時間培養した。タンパク質抽出物を調製し、p-AKT、AKTおよびp-P70SK6に特異的な抗体を用いたウエスタンブロットを行った。ウエスタンブロットにより、p70 SK6およびAKT mTORリン酸化の時間依存性および用量依存性阻害が示された（図８−１Ａおよび図８−１Ｂ）。さらに、未処理（NC）または17μMのGnetin C（GC）で4時間処理した種々の患者由来AML細胞から全タンパク質抽出物を調製し、p-AKT、AKTおよびp-P70SK6に特異的な抗体を用いたウエスタンブロットを行ったところ、種々の患者由来AML細胞においてもp70 SK6およびAKT mTORリン酸化の時間依存性および用量依存性阻害が認められた（図８−１Ｃ）。mTORに対するGnetin Cの効果は、さらに、er967上の活性型mTORを、特異的な抗体を用いたフローサイトメトリーにより評価した。すなわち、AML-MT細胞は未処理（対照）のままにするか、または17μMのGnetin Cで4時間培養した。次に、培養細胞を膜処理し、抗mTOR抗体または抗Ki67抗体に続いて蛍光標識抗マウス抗体とインキュベートし、フローサイトメトリーで分析した。3人のAML患者由来の細胞についても同様の処理を行った。Gnetin Cは、AML-MT細胞において活性型mTORの発現を阻害した（図８−２Ａおよび８−２Ｂ）。また、細胞増殖に密接に関連する細胞マーカーのKi-67タンパク質発現は、Gnetin C処理により低下した（図８−２Ａ、下パネル）。一方、AML9細胞ではmTORおよびp70SK6は恒常的に活性化されておらず、Gnetin C処理によるAKTの阻害もみられなかった。これは、Gnetin Cの細胞傷害効果に対する感受性が低いことと一致していた（図１−２Ｂおよび図８−１Ｃ）。これらの所見は、Gnetin Cの抗腫瘍効果がAKT/mTOR経路の遮断を伴うことを示している。
【００７６】
実施例７  Gnetin Cはマウスにおける白血病発症を抑制する
Gnetin Cが生体内でも有効であるかどうかを検討するために、AML-MTまたはNB4細胞を免疫不全マウスに腹腔内注射することによってマウスAML異種移植モデルを作製した。このモデルでは、白血病細胞の注射後3週間以内に全てのマウスが白血病を発症し、4〜5週間以内に死亡する。Gnetin Cが生体内で白血病の発症を防止するか否かを検討するために、白血病細胞を投与する免疫不全マウス（各群につきn=7）に対し1週間前からGnetin C(5mg/kg)または賦形剤を2日ごとに経口投与し、全試験期間（４週間）にわたり継続した（図９−１）。フローサイトメトリーを用いて、末梢血、骨髄および脾臓中のヒト白血病細胞を検出することにより、白血病を発症したマウスの割合を決定した。実験は3回繰り返した。白血病を発症し、5週間以内に死亡した賦形剤投与マウスとは対照的に、Gnetin C処理マウスでは白血病の発症が有意に遅延し、４０％のマウスは白血病を全く発症しなかった（図９−２および図９−３）。図９−３は、賦形剤処置およびGnetin C処理マウスから採取した末梢血サンプルの代表的なギムザ染色結果を示す。末梢血検体は、染色前に赤血球溶解を行った。賦形剤処理マウスでは顆粒球が非常に少なく、白血病細胞が多数見られるのに対して、Gnetin C処理マウスには正常顆粒球が存在し、白血病細胞がみられないことがわかった。Gnetin C処理マウスおよび賦形剤処理マウスの体重を5日ごとに測定したところ、Gnetin C投与は対照に比べて有意な体重減少を引き起こさなかった（図９−４）。このため、Gnetin Cおよびその主要な代謝産物の血漿レベルを正確に測定することができた。Gnetin CおよびGnetin Cモノグルクロニドの平均±S.E.M血漿レベルは、それぞれ175±156ng/mLおよび49±30.15ng/mLであった。
【００７７】
実施例８  Gnetin Cは、生体内におけるAML細胞に対する抗腫瘍作用を有する
次に、白血病細胞の注射から1週間後に薬物の投与を開始する治療モデルによる実験を実施した。すなわち、免疫不全マウス（1群当たりn = 7）に、ヒト白血病細胞を腹腔内注射した。注射から1週間後（試験期間の終了時まで）Gnetin C（5mg/kg）または賦形剤を2日毎に経口投与した（図１０−１）。このモデルでは、Gnetin Cはインビボで抗腫瘍効果を示し、マウスの生存を有意に延長した（図１０−２）。同じモデルを用いて、白血病細胞の注射後10日、21日および28日目にマウス臓器を回収し、Gnetin C処理マウスの臓器における白血病細胞の割合が対照群に比較して差があるかどうかを評価した。すなわち、白血病細胞の注射後56日目にGnetin Cまたは賦形剤で処理したマウスから、10、21および28日目に末梢血、脾臓および骨髄標本を回収し、単一細胞懸濁液を調製し、白血病細胞（hCD45 +）および視細胞（7AAD：7-amino-actinomycin D)の割合をフローサイトメトリーで評価した。Gnetin C処理マウスでは、賦形剤処理マウスと比較して、末梢血中および骨髄中のAML細胞の数が有意に減少していた（図１０−３、Ａ：血液、Ｂ：脾臓、Ｃ：骨髄）。さらに、Gnetin C処理マウスで検出された白血病細胞の多くは死細胞であったことから、Gnetin Cは生体内で白血病細胞死を誘導することが示唆された（図１０−４および図１０−５）。最後に、Gnetin Cの生体内での抗白血病効果を確認するために、マウス組織（脾臓および骨髄）標本にH＆E染色と免疫組織化学染色で評価した。白血病細胞による浸潤が強かった賦形剤処理マウス由来の骨髄および脾臓組織標本とは対照的に、Gnetin C処理マウス由来の組織では白血病細胞はみられなかった。(図１０−６）。
【００７８】
ディスカッション
本発明者らの知る限りでは、Gnetin CはAKT/mTORシグナル伝達経路およびMAPK ERK 1/2経路というAMLの２つの異なる細胞生存経路を同時に阻害することができる初めて見つかった天然起源スチルベンである。AML細胞においてアポトーシスを誘導した濃度のGnetin Cは、正常骨髄前駆細胞のコロニー形成を阻害しなかった。さらに、Gnetin Cの経口投与は、ヒト白血病のマウスモデルにおいて明らかな毒性示すことなく生体内での白血病細胞死を誘導し、生存期間を有意に延長した。
【００７９】
造血細胞におけるmTORの調節異常は白血病発症に関与していることが知られている。AKT/mTOR経路の異常な活性化は、AML患者の50〜80％において検出され、これらの患者の予後は極めて不良である。AKT、mTORおよびPI3Kの阻害剤のいくつかは、前臨床モデルにおいて有望な結果を示し、現在臨床開発中である。しかし、これらの薬剤を用いた過去の臨床試験はほとんどが失敗に終わっている。これまでの臨床試験により、MEK/ERK阻害剤によるAML細胞の治療は、PI3K/AKT/mTORのフィードバック活性化をもたらし、さらに、PI3K/AKT/mTOR阻害は逆にERK1/2の活性化を誘導することが報告されている。したがって、これらの薬剤の臨床試験が不成功に終わったのはフィードバックループの存在が原因と考えられる。
【００８０】
一方、最近の研究では、PI3K/AKT/mTORシグナル伝達の亢進は、細胞周期にある白血病前駆細胞に限定されていることが示されている。対照的に、再発の原因となる静止期白血病幹細胞ではPI3K/AKT/mTORのシグナル伝達系は抑制されている。このため、PI3K/AKT/mTOR阻害剤で白血病を治療したとしても、静止期にある白血病幹細胞は残存することが示唆される。今回の本発明者らの前臨床試験によりPI3K/AKT/mTORとMEK/ERK経路の同時阻害は強い抗白血病効果を示したことから、Gnetin Cを併用する抗白血病レジメンは白血病治療に有用と考えられる。最近の別の研究でも、ERK 1/2シグナル伝達の阻害が白血病幹細胞にアポトーシスを誘導することが示されている。したがって、Gnetin CによるAKT/mTORおよびERK 1/2経路の二重阻害は、白血病幹細胞の根絶にさらに有用と考えられる。
【００８１】
細胞質およびミトコンドリアにおいて異なる蛍光を発するカチオン性色素を用いることにより、我々はGnetin C処理AML細胞において膜電位が消失することを観察した。これはミトコンドリア膜機能不全と一致する所見であった。ミトコンドリア膜透過性遷移孔の開口は、プログラム細胞死の初期段階に特有な徴候である。結果として生じる膜電位の変化はイオンおよび小分子の通過を可能にし、呼吸鎖の脱共役およびシトクロムcのサイトゾルへの放出をもたらし、様々なアポトーシス経路を誘発する。AKT/mTOR経路は、IP3R、ヘキソキナーゼ2、およびホスホフリン酸性クラスターソーティングタンパク質2のAKT仲介リン酸化を介したミトコンドリア恒常性の調節に関与している。mTOR C2欠損は、ミトコンドリア関連小胞体膜（MAM）を破壊し、ミトコンドリア膜電位の上昇、ATP産生、およびカルシウムの取り込みを含むミトコンドリア欠陥を引き起こす。
【００８２】
MAPKは、構造タンパク質、酵素、転写因子および下流キナーゼを含む標的タンパク質をリン酸化することによって細胞機能を調節している。標的キナーゼの中で、RSKアイソフォームはERK 1/2によって活性化される。さらに、ERK 1/2は、MSK 1キナーゼとその密接に関連するアイソフォームMSK 2を活性化する。興味深いことに、AML患者、特にFLT3-L変異を有する患者では、MSK 1/2の恒常的活性化が報告されている。いくつかのMEK/ERK 1/2阻害剤が開発され、現在、80以上の臨床試験が進行中である。これらの試験のいくつかはAML患者を対象としてものである。
【００８３】
本実施例では、monosomal karyotypeを有するヒトAML細胞株の樹立に初めて成功した。ヒト白血病細胞株は、特定の分子および染色体異常を伴う細胞の、豊富かつ無制限の供給源となるので、白血病の分子メカニズムを解明し、かつ新規薬剤を開発するうえで非常に有用である。今回樹立したAML-MT細胞株は、患者の元の白血病細胞と類似の細胞遺伝学的特徴を持っており、マウスに白血病を誘発した。AML-MT細胞は、試験管内ではサイトカイン依存性である点も大きな特徴である。
【００８４】
Gnetin Cは臨床的に有望な薬剤であり、特に標準化学療法に抵抗性のAML患者に対して効果が期待できる。また、Gnetin CはAra-C、HUおよびL-Aspと相乗的に作用してAML細胞をより効果的に傷害することから、Gnetin Cと他の化学療法との組み合わせは、魅力的な治療となることが予想される。白血病細胞投与前のマウスにGnetin Cを投与したときに白血病発症を遅らせたという知見から、Gnetin Cは完全寛解を達成した患者における再発予防に有用な可能性がある。結論として、Gnetin Cは、AKT/mTORシグナル伝達およびERK1/2 MAPK経路が生存に必須であるAMLおよび他の悪性腫瘍に対する有望な治療薬と考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
Gnetin Cは、がんの予防または治療剤として有用である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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