(57)【要約】【課題】優れた生体適合性、生体組織に対する密着性あるいは接着性、低い生体分解吸収性等のＨＡｐの機能を維持したまま、健全な組織に悪影響を殆ど与えることのないマイルドな抗菌性を有するハイドロキシアパタイト誘導体粒子からなるハイドロキシアパタイト誘導体粒子群を提供する。【解決手段】抗菌材料として、ハイドロキシアパタイトの結晶構造中のカルシウムイオンの少なくとも一部が銀イオンに置換された抗菌性ハイドロキシアパタイト誘導体粒子、又は、ハイドロキシアパタイトの結晶構造中の水酸化物イオンの少なくとも一部がフッ化物イオンに置換された抗菌性ハイドロキシアパタイト誘導体粒子からなるハイドロキシアパタイト誘導体粒子群を使用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイドロキシアパタイトの結晶構造中のカルシウムイオンの少なくとも一部が銀イオンに置換された抗菌性ハイドロキシアパタイト誘導体粒子からなり、
前記抗菌性ハイドロキシアパタイト誘導体粒子のＸＲＤにより定量したハイドロキシアパタイト結晶相純度が９０％以上であり、
前記抗菌性ハイドロキシアパタイト誘導体粒子の粒子径が１０ｎｍ〜１，０００ｎｍの範囲内であり、
前記抗菌性ハイドロキシアパタイト誘導体粒子のａ軸の長さが９．４２４Å以上であることを特徴とする、ハイドロキシアパタイト誘導体粒子群。
【請求項２】
５．０×１０４個／μＬの所定の微生物と、銀イオン換算で２．４７ｍｍｏｌ／Ｌ以上の濃度で前記抗菌性ハイドロキシアパタイト誘導体粒子と、を共存させた分散液を調製し、当該分散液を培地にスポットし、３７℃で１日培養した後の殺菌率が９０％以上であり、
前記所定の微生物が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項１に記載のハイドロキシアパタイト誘導体粒子群。
【請求項３】
前記抗菌性ハイドロキシアパタイト誘導体粒子が、焼成ハイドロキシアパタイト誘導体粒子であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のハイドロキシアパタイト誘導体粒子群。
【請求項４】
前記抗菌性ハイドロキシアパタイト誘導体粒子のａ軸の長さが９．４４２Å以下であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のハイドロキシアパタイト誘導体粒子群。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイドロキシアパタイトの結晶構造の一部が他のイオンで置換された抗菌性ハイドロキシアパタイト誘導体粒子からなるハイドロキシアパタイト誘導体粒子群に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、溶媒中で単結晶一次粒子として存在し、分散性の高いセラミック粒子、特に生体適合性、生体組織に対する密着性あるいは接着性を有し、生体分解吸収性の低い、医療用材料に有用である単結晶ハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、以下、「ＨＡｐ」と称する。）を始めとするリン酸カルシウム焼成体粒子群（セラミック粒子群）が知られていた（例えば、特許文献１を参照）。このような単結晶ＨＡｐの用途としては、骨充填剤、歯科用充填剤、薬物徐放剤等の歯科用材料や、医療用材料や、菌体、酵母等の固定化担体、カラムクロマトグラフィー用充填剤、消臭剤等の吸着剤等や、ナノメートルサイズのドラッグデリバリーシステム（ナノＤＤＳ）等の各種用途が知られていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第５０４３４３６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ここで、ＨＡｐ等のリン酸カルシウム焼成体粒子群を、骨充填剤、歯科用充填剤、薬物徐放剤等の歯科用材料や、医療用材料や、タンパク質、アミノ酸、多糖類、生理活性物質等の固定化担体、カラムクロマトグラフィー用充填剤、消臭剤等の吸着剤等や、ナノメートルサイズのドラッグデリバリーシステム（ナノＤＤＳ）等の用途に利用する場合、抗菌作用が要求されるケースが多い。このようなケースでは、これまでは、例えば、Ａｇ等の抗菌性金属や当該金属のイオンやその他の抗菌成分をＨＡｐ等と混合する等して、単純に組み合わせて用いることが一般的であった。
【０００５】
しかしながら、上記のように、単にＡｇ等の抗菌性金属やその他の抗菌成分をＨＡｐと単純に組み合わせて用いた場合、抗菌性が強すぎるため、菌等に感染した組織のみならず、健全な組織にも悪影響を与える、という問題があった。
【０００６】
そこで、本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、優れた生体適合性、生体組織に対する密着性あるいは接着性、低い生体分解吸収性等のＨＡｐの機能を維持したまま、健全な組織に悪影響を殆ど与えることのないマイルドな抗菌性を有するハイドロキシアパタイト誘導体粒子からなるハイドロキシアパタイト誘導体粒子群を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、銀イオン（Ａｇ＋）またはフッ化物イオン（Ｆ−）をＨＡｐの結晶構造中に組み込むことにより、ＨＡｐの結晶構造の一部を銀イオンまたはフッ化物イオンで置換したＡｇ−ＨＡｐ、Ｆ−ＨＡｐといったＨＡｐ誘導体がマイルドな抗菌性を有することを見出した。また、本発明者らは、このようなマイルドな抗菌性を有するＨＡｐ誘導体の粒子からなるＨＡｐ誘導体粒子群を抗菌成分として用いることで、優れた生体適合性、生体組織に対する密着性あるいは接着性、低い生体分解吸収性等のＨＡｐの機能を維持したまま、健全な組織に悪影響を殆ど与えることのないマイルドな抗菌性を有する材料が得られることを見出した。以上のような知見に基づいて本発明が完成された。
【０００８】
すなわち、本発明は、ハイドロキシアパタイトの結晶構造中のカルシウムイオンの少なくとも一部が銀イオンに置換された抗菌性ハイドロキシアパタイト誘導体粒子からなることを特徴とする、ハイドロキシアパタイト誘導体粒子群（第１のハイドロキシアパタイト誘導体粒子群）である。
前記第１のハイドロキシアパタイト誘導体粒子群において、５．０×１０４個／μＬの所定の微生物と、銀イオン換算で２．４７ｍｍｏｌ／Ｌ以上の濃度で前記抗菌性ハイドロキシアパタイト誘導体粒子と、を共存させた分散液を調製し、当該分散液を培地にスポットし、３７℃で１日培養した後の殺菌率が９０％以上であることが好ましい。
前記第１のハイドロキシアパタイト誘導体粒子群において、前記抗菌性ハイドロキシアパタイト誘導体粒子のＸＲＤにより定量したハイドロキシアパタイト結晶相純度が９０％以上であることが好ましい。
また、本発明は、ハイドロキシアパタイトの結晶構造中の水酸化物イオンの少なくとも一部がフッ化物イオンに置換された抗菌性ハイドロキシアパタイト誘導体粒子からなることを特徴とする、ハイドロキシアパタイト誘導体粒子群（第２のハイドロキシアパタイト誘導体粒子群）である。
前記第２のハイドロキシアパタイト誘導体粒子群において、５．０×１０４個／μＬの所定の微生物と、フッ化物イオン換算で８９．３ｍｍｏｌ／Ｌ以上の濃度で前記抗菌性ハイドロキシアパタイト誘導体粒子と、を共存させた分散液を調製し、当該分散液を培地にスポットし、３７℃で１日培養した後の殺菌率が５０％以上であることが好ましい。
前記第２のハイドロキシアパタイト誘導体粒子群において、５．０×１０４個／μＬの所定の微生物と、フッ化物イオン換算で１７８．６ｍｍｏｌ／Ｌ以上の濃度で前記抗菌性ハイドロキシアパタイト誘導体粒子と、を共存させた分散液を調製し、当該分散液を培地にスポットし、３７℃で１日培養した後の殺菌率が９５％以上であることが好ましい。
前記第１及び第２のハイドロキシアパタイト誘導体粒子群において、前記抗菌性ハイドロキシアパタイト誘導体粒子が、焼成ハイドロキシアパタイト誘導体粒子であることが好ましい。
前記第１及び第２のハイドロキシアパタイト誘導体粒子群において、前記抗菌性ハイドロキシアパタイト誘導体粒子の粒子径が、１０ｎｍ〜１，０００ｎｍの範囲内であることが好ましい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ＨＡｐの結晶構造の一部を銀イオンまたはフッ化物イオンで置換したＡｇ−ＨＡｐ、Ｆ−ＨＡｐといったＨＡｐ誘導体の粒子からなるＨＡｐ誘導体粒子群を抗菌成分として用いることにより、ＨＡｐの機能を維持したままマイルドな抗菌性を有する材料を得ることができる。また、このようなマイルドな抗菌性により、菌等に感染していない健全な組織には殆ど悪影響を与えることなく、殺菌作用や静菌作用を発揮することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例で作製したＡｇ−ＨＡｐのＦＴＩＲスペクトルを示す図である。
【図２】実施例で作製したＡｇ−ＨＡｐのＸＲＤ回折パターンを示す図である。
【図３】実施例で作製したＡｇ−ＨＡｐのＳＥＭ画像（倍率２万倍）を示す写真である。
【図４】実施例におけるＡｇ−ＨＡＰ又はＦ−ＨＡｐを用いた抗菌性試験におけるサンプルの希釈方法を示す模式図である。
【図５】実施例で作製したＡｇ−ＨＡｐの抗菌性試験の結果を示す写真である。
【図６】実施例で作製したＦ−ＨＡｐのＸＲＤ回折パターンを示す図である。
【図７】市販のＦ−ＨＡｐのＳＥＭ画像（倍率２万倍）を示す写真である。
【図８】実施例で作製したＦ−ＨＡｐのＳＥＭ画像（倍率２万倍）を示す写真である。
【図９】実施例で作成したＦ−ＨＡｐと市販のＨＡｐ（３種類）耐酸性を表したグラフである。
【図１０】実施例におけるＮａＦを用いた抗菌性試験の方法を示す模式図である。
【図１１】実施例におけるＮａＦを用いた抗菌性試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、図面を参照しながら、本発明の好適な実施の形態について詳細に説明する。なお、本発明に係るＨＡｐ誘導体粒子群については、以下の順序で説明する。
１  ＨＡｐ誘導体粒子群の構成
２  抗菌作用の原理
３  ＨＡｐ誘導体粒子群の用途
【００１２】
≪ＨＡｐ誘導体粒子群の構成≫
初めに、本発明に係るＨＡｐ誘導体粒子群の構成について説明する。本発明に係るＨＡｐ誘導体粒子群は、ＨＡｐの結晶構造中に銀イオン又はフッ化物イオンを含むＨＡｐ誘導体粒子からなる。本発明者らが知見したところによれば、この銀イオン又はフッ化物イオンを含むＨＡｐ誘導体粒子群は、マイルドな抗菌性を有するものである。ここで、本明細書で言う「マイルドな抗菌性」とは、菌等に感染していない健全な組織には殆ど悪影響を与えることなく、菌等に対して殺菌作用や静菌作用を発揮することが可能な程度の抗菌性を意味する。言い換えると、「マイルドな抗菌性」とは、銀イオンを含むＨＡｐ誘導体に関しては、ＨＡｐ誘導体粒子群が抗菌性を発揮するために必要な銀イオン量が、銀イオン単独で抗菌性を発揮するために必要な銀イオン量と比較して非常に多く、抗菌活性が抑制されている場合を意味する。また、フッ化物イオンを含むＨＡｐ誘導体に関しては、ＨＡｐ誘導体粒子群が抗菌性を発揮するために必要なフッ化物イオン量が、広く抗菌性が認知されている銀イオンの濃度、及び、上記銀イオンを含むＨＡｐ誘導体中に含まれる銀イオン量と比較して非常に多く、抗菌活性が抑制されている場合を意味する。
【００１３】
なお、本発明に係るＨＡｐ誘導体粒子群が抗菌性を発現可能な微生物（ここでは、狭義の「微生物」だけでなく、ウイルスや菌類をも含む概念である。）としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ    ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ．  ｐｅｓｔｉｓ  ）、腸炎エルシニア  （Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、セラチア菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、プロテウス菌（Ｐｒｏｔｅｕｓ，  Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ，  Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、シトロバクター菌（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、コレラ菌  （Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、腸炎ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、セパシア菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）  ｃｅｐａｃｉａ）、レジオネラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、百日咳菌  （Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、淋菌  （Ｎｉｓｅｒｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌  （Ｎｉｓｅｒｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）カタル球菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  （Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ）  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、バクテロイド属菌等の細菌（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ：ＭＲＳＡ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ジフテリア菌  （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｒｉａｅ）、ノルカジア菌（Ｎｏｃａｒｄｉａ属菌  ）、腸内細菌エンテロバクテリア（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アシネトバクテリア菌（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属菌）、バンコマイシン耐性腸球菌（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、ＶＲＥ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、Ｂ群レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、アクネ菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ，  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、性行為感染症クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、歯周病菌（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ，  Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ，  Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ）などの細菌；白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ，  Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）、アスペルギルス菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、カンジダ菌（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコッカス菌（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）等の真菌類；インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ）  、肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、エイズウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）等のウイルス等が挙げられる。
【００１４】
また、本発明に係るＨＡｐ誘導体粒子群を抗菌材料として用いる場合には、ＨＡｐ誘導体粒子が水や有機溶媒等に溶解又は分散された液体状の抗菌材料であってもよく、ＨＡｐ誘導体粒子を顆粒状、塊状、シート状などに加工した固体状の抗菌材料であってもよく、ＨＡｐ誘導体粒子と他の材料とを混合したり、他の材料の表面にＨＡｐ誘導体粒子を偏在させたりした抗菌性を有する複合材料であってもよい。
【００１５】
本発明における抗菌性ＨＡｐ誘導体としては、ＨＡｐの結晶構造の一部が銀イオンに置換されたＡｇ−ＨＡｐと、ＨＡｐの結晶構造の一部がフッ化物イオンに置換されたＦ−ＨＡｐとがある。以下、Ａｇ−ＨＡｐとＦ−ＨＡｐについて詳細に説明する。
【００１６】
ここで、本発明で用いるＡｇ−ＨＡｐ及びＦ−ＨＡｐとしては、例えば、これらのＨＡｐ誘導体の粒子からなるＨＡｐ誘導体粒子群を医療用材料、高分子医療用材料に結合させる場合やクロマトグラフィー用の充填剤として利用する場合においては、生体内での安定性の向上や成形性を確保するため、ＨＡｐ誘導体粒子群を焼成して得られる焼成ＨＡｐ誘導体粒子群（焼成体）であることが好ましい。また、焼成ＨＡｐ誘導体粒子群（焼成体）は結晶質であり、このような結晶質の焼成体を抗菌材料として用いることで、よりマイルドな抗菌性を発揮することができる。このように、焼成体の方が未焼成体よりも抗菌性がマイルドである理由は明らかではないが、本発明者らは、未焼成体は非晶質であるため、イオンの溶出速度が早くなるため、短期間に集中して抗菌作用が発現する、また、抗菌作用の発現に必要なイオン濃度が一時的に高まるため、生体組織への損傷リスクが高くなり、さらには、抗菌作用の発現に必要なイオン濃度を維持できる期間が短くなるためと推測している。なお、この焼成体はセラミックであり、ここでのセラミックとしては、狭義のセラミックのみならず、いわゆる「ニューセラミック」あるいは「ファインセラミック」を含む広義のセラミックをも意味する。なお、焼成方法の詳細については後述する。
【００１７】
また、焼成ＨＡｐ誘導体の粒子の集合からなる焼成ＨＡｐ誘導体粒子群は、後述する融着防止剤の作用によって一次粒子同士の融着が防止されているために、その過半数が一次粒子の状態を維持している。よって、当該焼成ＨＡｐ誘導体粒子群を溶媒中に懸濁した際には、該焼成ＨＡｐ誘導体粒子群の過半数が単結晶からなる一次粒子、もしくは前記単結晶からなる一次粒子がイオン的相互作用にて集合化した粒子塊（単結晶一次粒子）で分散することができる。
【００１８】
さらに、焼成ＨＡｐ誘導体粒子群を医療用高分子基材に吸着させる場合は、分散性が高いことが重要である。また、クロマトグラフィー用充填剤として利用する場合は、表面積が高いことが重要である。本発明に係る焼成ＨＡｐ誘導体粒子群は、その過半数が単結晶からなる一次粒子、もしくは前記単結晶からなる一次粒子がイオン的相互作用にて集合化した粒子塊（単結晶一次粒子）であり、溶媒中で分散性が良く、二次粒子を形成していないためにその表面積も高い。したがって、本発明に係る焼成ＨＡｐ誘導体粒子群は、特に上記用途に好適に利用することができる。
【００１９】
ここで、焼成ＨＡｐ誘導体粒子が一次粒子で存在しているか否かを評価する方法としては、例えば、電子顕微鏡観察によって粒子径を測定した結果と、動的光散乱法により溶媒に懸濁した状態で粒子径を測定した場合の結果とを対比することにより、両者の結果がほぼ一致すれば、その焼成ＨＡｐ誘導体粒子群のほとんどが一次粒子の状態であると判断することができる。一方、電子顕微鏡観察による粒子径の測定結果より、動的光散乱法による粒子径測定の結果が大きくなれば、一次粒子同士の融着が起こり二次粒子を形成しているものと判断することができる。
【００２０】
なお、焼成ＨＡｐ誘導体粒子群を分散させる溶媒としては、焼成ＨＡｐ誘導体粒子を溶解しないものであれば特に限定されるものではない。例えば、水や、メタノール、エタノールなどのアルコール類、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン等のケトン類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のアミド類、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類、トルエン、キシレン、ヘキサン、ドデカン、シクロヘキサン等の炭化水素類、クロロベンゼン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、ジエチルエーテル、ジオキサン等のエーテル類等が挙げられ、これらの溶媒は、使用目的に応じて１種もしくは２種を選択して使用すればよい。
【００２１】
動的光散乱法から求めた粒子径分布図をもとに、電子顕微鏡から求めた一次粒子の粒子径とほぼ一致する粒子径である粒子の割合を求めることで、単結晶からなる一次粒子、もしくは前記単結晶からなる一次粒子がイオン的相互作用にて集合化した粒子塊（単結晶一次粒子）の割合が算出可能である。
【００２２】
焼成ＨＡｐ誘導体の原料、融着防止剤の種類、焼成の条件等によって異なる場合があるが、後述する本発明に係る焼成ＨＡｐ誘導体粒子群の製造方法によれば、少なくとも５０％以上が単結晶一次粒子として存在し、より好適な場合には６０％以上が単結晶一次粒子として存在し、最も好適な条件下においては７０％以上が単結晶一次粒子として存在させることができる。
【００２３】
また、焼成ＨＡｐ誘導体粒子を医療用高分子基材に吸着させる場合や、クロマトグラフィー用充填剤、医療用材料等に用いる場合においては、その粒子が微細（ナノメートルサイズ）であることが好ましい。かかる微細な（ナノメートルサイズの）焼成ＨＡｐ誘導体粒子群を製造するためには、後述する本発明に係る焼成ＨＡｐ誘導体粒子群の製造方法の一次粒子生成工程において、微細（ナノメートルサイズ）の一次粒子を作製しておけばよい。例えば、一次粒子生成工程において、１０ｎｍ〜１，０００ｎｍ、より好ましくは１５ｎｍ〜７００ｎｍ、最も好ましくは２０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲内の粒子径を有する一次粒子を作製しておくことで、１０ｎｍ〜１,０００ｎｍ、より好ましくは２０ｎｍ〜７００ｎｍ、最も好ましくは２５ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲内の一次粒子径を有する焼成ＨＡｐ誘導体粒子群を製造することができる。
【００２４】
また、焼成ＨＡｐ誘導体粒子群は、その粒子径が均一である（粒度分布が狭い）ことが好ましい。かかる粒子径が均一な（粒度分布が狭い）焼成ＨＡｐ誘導体粒子群を製造するためには、上記一次粒子生成工程において、粒子径が均一な（粒度分布が狭い）一次粒子群を作製しておけばよい。かかる粒子径が均一な（粒度分布が狭い）焼成ＨＡｐ誘導体粒子群は、例えば医療用高分子基材に吸着させる場合や、クロマトグラフィー用充填剤、医療用材料等に好適に利用可能である。
【００２５】
［Ａｇ−ＨＡｐ：構造］
Ａｇ−ＨＡｐは、銀イオンを結晶構造中に含んでおり、ＨＡｐの結晶構造中のカルシウムイオン（Ｃａ２＋）部分（少なくとも一部）が銀イオン（Ａｇ＋）に置換されたものである。言い換えると、Ａｇ−ＨＡｐは、銀イオンをＨＡｐのカルシウムイオンの位置にドープしたＨＡｐ誘導体である。このＡｇ−ＨＡｐは、銀イオンを含まないＨＡｐとは異なり抗菌性を有するものであり、また、銀イオンとＨＡｐとの単なる混合物と比較して抗菌性はマイルドなものとなる。なお、Ａｇ−ＨＡｐにおいて、ＨＡｐ結晶構造中のカルシウムイオンの少なくとも一部が銀イオンで置換されている場合、ＨＡｐ結晶構造中の水酸化物イオンの少なくとも一部が、フッ化物イオン又はその他の陰イオンで置換されていてもよい。
【００２６】
［Ａｇ−ＨＡｐ：合成方法］
上述したような特徴を有するＡｇ−ＨＡｐは、湿式法、乾式法、加水分解法、水熱法等の既知の製造方法によって製造することができる。以下の説明では、湿式法の一つである共沈法を用いてＡｇ−ＨＡｐを合成する方法を例に挙げ、Ａｇ−ＨＡｐの合成方法を述べる。なお、湿式法を含む化学反応法を用いることで、低温合成が可能となることから、化学組成を容易に制御でき、また、医学的処置における応用にも好適である。
【００２７】
本発明に係るＡｇ−ＨＡｐの製造方法は、少なくとも「一次粒子生成工程」を含んでいればよいが、この他、「混合工程」、「焼成工程」、「除去工程」を含んでいてもよい。なお、以下の説明においては、上記４工程を全て含んだ製造方法について説明する。
【００２８】
本発明に係るＡｇ−ＨＡｐの製造方法において、上記４工程は、例えば「１．一次粒子生成工程」→「２．混合工程」→「３．焼成工程」→「４．除去工程」の順で行われる。
【００２９】
（１．一次粒子生成工程）
ここで、「一次粒子」とは、ＨＡｐ誘導体粒子の製造工程の焼成前に、ＨＡｐ誘導体原料（フッ素、ＨＡｐ等）によって形成された粒子のことを意味する。すなわち、ＨＡｐ誘導体粒子の製造工程において、初めて形成された粒子のことを意味する。また、狭義には単結晶粒子のことを意味する。なお、本発明の説明において「一次粒子」とは、非晶質（アモルファス）の状態のもの、及びその後に焼成を行った焼成体の状態のものをも含む意味である。
【００３０】
これに対して、「二次粒子」とは、複数の「一次粒子」同士が、融着等の物理的結合、イオン結合又は共有結合等の化学的結合によって、結合して形成された状態の粒子を意味する。特に、一次粒子同士の結合の個数、結合後の形状等は限定されるものではなく、２つ以上の一次粒子が結合したもの全てを意味する。
【００３１】
特に、「単結晶一次粒子」とは、ＨＡｐ誘導体原料の単結晶からなる一次粒子、もしくは前記単結晶からなる一次粒子がイオン的相互作用にて集合化した粒子塊を意味する。なお、「イオン的相互作用にて集合化した粒子塊」とは、水もしくは有機溶媒を含む媒体にて分散させた場合にイオン的相互作用で自己集合する粒子塊であって、焼成により粒子間が溶融して多結晶化した二次粒子を含まないものである。
【００３２】
一次粒子生成工程は、上述した一次粒子を生成することができる工程であれば特に限定されるものではなく、製造するＨＡｐ誘導体の原料により適宜選択の上、採用すればよい。例えば、以下の方法によりＡｇ−ＨＡｐの一次粒子を生成することができる。まず、所定の溶媒に、銀（Ａｇ）源（銀化合物）及びカルシウム（Ｃａ）源（カルシウム化合物）を溶解させ、所定時間撹拌し、銀化合物溶液とカルシウム化合物溶液を調製する。同様に、所定の溶媒にリン（Ｐ）源（リン化合物）を溶解させ、所定時間撹拌し、リン化合物溶液を調製する。次に、銀化合物溶液とカルシウム化合物溶液を混合した後に、更に、リン化合物溶液を滴下、混合し、所定温度に加熱して撹拌する。その結果、Ａｇ−ＨＡｐの粒子が沈殿する。
【００３３】
Ａｇ−ＨＡｐの原料については、Ａｇ源としては、硝酸銀、過塩素酸銀、銀アンミン錯体、銀チオ硫酸錯体、銀シアノ錯体等、Ｃａ源としては、硝酸カルシウム（水和物も含む。）、水酸化カルシウム、硝酸カルシウム、塩化カルシウム等、Ｐ源としては、リン酸、リン酸二水素アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、リン酸アンモニウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム等を用いることができる。また、上記原料を溶解させる溶媒としては、上記原料が溶解するものであれば特に限定されるものではないが、例えば、水、エタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、トルエン等が挙げられる。上記Ａｇ源、Ｃａ源、Ｐ源、溶媒としては、上述した化合物を単独で使用してもよく、複数種混合して使用してもよい。
【００３４】
本発明に係るＨＡｐ誘導体粒子の製造方法は、上記の一次粒子生成工程によって生成した一次粒子の集合からなる一次粒子群を、融着等を防止しながら焼成してＨＡｐ誘導体粒子の集合からなるＨＡｐ誘導体粒子群を製造するものである。よって、当該一次粒子生成工程によって生成された一次粒子の状態（粒子径、粒度分布）が、最終生産物であるＨＡｐ誘導体粒子の状態（粒子径、粒度分布）にそのまま反映される。
【００３５】
また、本工程には生成した一次粒子を水等で洗浄する工程、遠心分離、ろ過等で一次粒子を回収する工程が含まれていてもよい。
【００３６】
（２．混合工程）
本混合工程は、上記工程で生成された一次粒子と、焼成時における一次粒子同士の融着を防止する融着防止剤とを混合する工程である。上記一次粒子生成工程によって得られた一次粒子群の粒子間に、予め融着防止剤を介在させておくことで、その後の焼成工程における一次粒子同士の融着を防止することができる。なお、本混合工程によって得られた一次粒子と融着防止剤との混合物を「混合粒子」と呼ぶこととする。
【００３７】
ここで、「融着防止剤」としては、一次粒子間の融着を防止できるものであれば特に限定されるものではないが、後の焼成工程の焼成温度において、不揮発性であることが好ましい。焼成温度条件下で不揮発性であるために、焼成工程中に一次粒子間から消失することは無く、一次粒子同士の融着を確実に防止することができるからである。ただし、焼成温度において１００％の不揮発性を有する必要は無く、焼成工程終了後に一次粒子間に１０％以上残存する程度の不揮発性であればよい。また、融着防止剤は、焼成工程終了後に熱により化学的に分解するものであってもよい。すなわち、焼成工程終了後に残存していれば、焼成工程の開始前後で、同一の物質（化合物）である必要は無い。
【００３８】
また、融着防止剤が、溶媒、特に水系溶媒に溶解する物質であることが好ましい。このように、融着防止剤として、溶媒に溶解する融着防止剤を用いることにより、融着防止剤が混在するＨＡｐ誘導体粒子群を純水等の水系溶媒に懸濁するだけで、融着防止剤（例えば、硝酸カルシウム、炭酸カルシウム等）を除去することができる。特に、水系溶媒に溶解する融着防止剤であれば、融着防止剤を除去する際に有機溶媒を用いる必要が無いため、除去工程に有機溶媒の使用に対応する設備、有機溶媒廃液処理が不要となる。それゆえ、より簡便にＨＡｐ誘導体粒子群から融着防止剤を除去することができる。上記溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えば、水系溶媒としては、水、エタノール、メタノール等が挙げられ、有機溶媒としては、アセトン、トルエン等が挙げられる。
【００３９】
また、上記水系溶媒は、融着防止剤の水への溶解性を上げるために、シュウ酸塩、エチレンジアミン、ビピリジン、エチレンジアミン四酢酸塩などのキレート化合物を含んでいてもよい。さらに、上記水系溶媒は、融着防止剤の水への溶解性を上げるために、塩化ナトリウム、硝酸アンモニウム、炭酸カリウム等の電解質イオンを含んでいてもよい。
【００４０】
上記融着防止剤の具体例としては、塩化カルシウム、酸化カルシウム、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、酢酸カルシウム、クエン酸カルシウム等のカルシウム塩（または錯体）、塩化カリウム、酸化カリウム、硫酸カリウム、硝酸カリウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、リン酸カリウム等のカリウム塩、塩化ナトリウム、酸化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム等のナトリウム塩等が挙げられる。
【００４１】
なお、本混合工程において一次粒子と融着防止剤とを混合させる方法については、特に限定されるものではなく、固体の一次粒子に固体の融着防止剤を混合後、ブレンダーを用いて混合する方法であってもよいし、融着防止剤の溶液中に一次粒子を分散させる方法であってもよい。ただし、固体と固体を均一に混合することは困難であるため、一次粒子間に均一かつ確実に融着防止剤を介在させるためには、後者が好ましい方法であるといえる。後者の方法を採用した場合は、一次粒子を分散させた融着防止剤溶液を乾燥させておくことが好ましい。一次粒子と融着防止剤が均一に混合された状態を長期にわたって持続することができるからである。
【００４２】
また、本混合工程は、側鎖にカルボキシル基、硫酸基、スルホン酸基、リン酸基、ホスホン酸基またはアミノ基のいずれかを有する高分子化合物を含む溶液と、上記一次粒子とを混合し、金属塩（アルカリ金属塩および／またはアルカリ土類金属塩および／または遷移金属塩）をさらに添加する工程であってもよい。この工程を採用することによって、高分子化合物がＨＡｐ誘導体表面に吸着することで融着防止剤混合過程におけるＨＡｐ誘導体同士の接触を確実に防ぐことができ、その後にカルシウム塩を添加することでＨＡｐ誘導体表面に確実に融着防止剤を析出させることが可能となる。なお、以下の説明において、側鎖にカルボキシル基、硫酸基、スルホン酸基、リン酸基、ホスホン酸基またはアミノ基のいずれかを有する高分子化合物のことを、単に「高分子化合物」と称する。
【００４３】
上記高分子化合物は、側鎖にカルボキシル基、硫酸基、スルホン酸基、リン酸基、ホスホン酸基またはアミノ基のいずれかを有する化合物であれば特に限定されるものではない。例えば、側鎖にカルボキシル基を有する高分子化合物としては、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、カルボキシメチルセルロース、スチレン−無水マレイン酸共重合体等が挙げられ、側鎖に硫酸基を有する高分子化合物としては、ポリアクリル酸アルキル硫酸エステル、ポリメタクリル酸アルキル硫酸エステル、ポリスチレン硫酸等が挙げられ、側鎖にスルホン酸基を有する高分子化合物としては、ポリアクリル酸アルキルスルホン酸エステル、ポリメタクリル酸アルキルスルホン酸エステル、ポリスチレンスルホン酸等が挙げられ、側鎖にリン酸基を有する高分子化合物としては、ポリアクリル酸アルキルリン酸エステル、ポリメタクリル酸アルキルリン酸エステル、ポリスチレンリン酸、ポリアクリロイルアミノメチルホスホン酸等が挙げられ、側鎖にホスホン酸基を有する高分子化合物としては、ポリアクリル酸アルキルホスホン酸エステル、ポリメタクリル酸アルキルホスホン酸エステル、ポリスチレンホスホン酸、ポリアクリロイルアミノメチルホスホン酸、ポリビニルアルキルホスホン酸等が挙げられ、側鎖にアミノ基を有する高分子化合物としては、ポリアクリルアミド、ポリビニルアミン、ポリメタクリル酸アミノアルキルエステル、ポリアミノスチレン、ポリペプチド、タンパク質等が挙げられる。なお当該混合工程においては、上記高分子化合物のいずれか１種類を用いればよいが、複数種類の高分子化合物を混合して用いてもよい。
【００４４】
なお、高分子化合物を含む溶液は、水溶液であることが好ましい。ＨＡｐ誘導体の焼成体粒子は強い酸性条件下で溶解してしまうからである。このとき、高分子化合物が含まれる水溶液のｐＨは、５以上１４以下でＨＡｐ誘導体粒子が不溶な条件あれば特に限定されるものではない。当該高分子化合物を含む水溶液は、高分子化合物を蒸留水、イオン交換水等に溶解し、アンモニア水溶液、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水溶液でｐＨを調整すればよい。
【００４５】
また、上記水溶液に含まれる高分子化合物の濃度は、０．００１％ｗ／ｖ以上５０％ｗ／ｖ以下が好ましく、０．００５％ｗ／ｖ以上３０％ｗ／ｖ以下がさらに好ましく、０．０１％ｗ／ｖ以上１０％ｗ／ｖ以下が最も好ましい。上記好ましい範囲未満であると一次粒子間に入り込む量が少なく、一次粒子同士の接触を阻止する割合が低くなる。また上記好ましい範囲を超えると、高分子化合物の溶解が困難となること、当該高分子化合物を含む溶液の粘度が高くなる等の操作性が悪くなるために好ましくない。
【００４６】
本発明における混合工程では、上記高分子化合物を含む溶液と、一次粒子とを混合する。かかる混合は、例えば、当該溶液中に一次粒子を投入し、撹拌操作等によって、当該一次粒子を分散させればよい。かかる操作によって、上記本発明に係るＨＡｐ誘導体粒子群の製造方法では、一次粒子の表面に上記高分子化合物が吸着し、カルボキシル基、硫酸基、スルホン酸基、リン酸基、ホスホン酸基またはアミノ基のいずれかを当該一次粒子の表面に付加することができる。このとき当該カルボキシル基、硫酸基、スルホン酸基、リン酸基、ホスホン酸基またはアミノ基は、溶液中でイオンの状態で存在している。
【００４７】
次に、高分子化合物を含む溶液と一次粒子とを混合した溶液に、金属塩（アルカリ金属塩および／またはアルカリ土類金属塩および／または遷移金属塩）をさらに添加すれば、上記一次粒子の表面に存在するカルボン酸イオン、硫酸イオン、スルホン酸イオン、リン酸イオン、ホスホン酸イオン、アミノイオンと、金属イオン（アルカリ金属イオンおよび／またはアルカリ土類金属イオンおよび／または遷移金属イオン）とが結合し、一次粒子の表面にカルボン酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、リン酸塩、ホスホン酸塩、アミノ酸塩が生じる。かかる金属（アルカリ金属および／またはアルカリ土類金属および／または遷移金属）のカルボン酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、リン酸塩、ホスホン酸塩、アミノ酸塩が、上記融着防止剤として機能する。したがって、金属（アルカリ金属および／またはアルカリ土類金属および／または遷移金属）のカルボン酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、リン酸塩、ホスホン酸塩、アミノ酸塩がその表面に生じた一次粒子は、いわゆる「混合粒子」である。なお、かかる金属（アルカリ金属および／またはアルカリ土類金属および／または遷移金属）のカルボン酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、リン酸塩、ホスホン酸塩、アミノ酸塩は沈殿するため、当該沈殿物を回収後、乾燥させて後述する焼成工程に供すればよい。前記乾燥は、例えば減圧条件下で、加熱して行う方法が挙げられる。なお、上記乾燥においては、乾燥温度を下げることができることから減圧条件下が好ましいが、大気圧条件下で行ってもよい。
【００４８】
上記アルカリ金属塩としては、特に限定されるものではないが、例えば、塩化ナトリウム、次亜塩素酸ナトリウム、亜塩素酸ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ酸ナトリウム、酸化ナトリウム、過酸化ナトリウム、硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、リン化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、塩化カリウム、次亜塩素酸カリウム、亜塩素酸カリウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ酸カリウム、酸化カリウム、過酸化カリウム、硫酸カリウム、チオ硫酸カリウム、セレン酸カリウム、亜硝酸カリウム、硝酸カリウム、リン化カリウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム等が利用可能である。
【００４９】
また、上記アルカリ土類金属塩としては、例えば、塩化マグネシウム、次亜塩素酸マグネシウム、亜塩素酸マグネシウム、臭化マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、ヨウ酸マグネシウム、酸化マグネシウム、過酸化マグネシウム、硫酸マグネシウム、チオ硫酸マグネシウム、セレン酸マグネシウム、亜硝酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、リン化マグネシウム、炭酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、塩化カルシウム、次亜塩素酸カルシウム、亜塩素酸カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、ヨウ酸カルシウム、酸化カルシウム、過酸化カルシウム、硫酸カルシウム、チオ硫酸カルシウム、セレン酸カルシウム、亜硝酸カルシウム、硝酸カルシウム、リン化カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム等が利用可能である。
【００５０】
また、上記遷移金属塩としては、例えば塩化亜鉛、次亜塩素酸亜鉛、亜塩素酸亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛、ヨウ酸亜鉛、酸化亜鉛、過酸化亜鉛、硫酸亜鉛、チオ硫酸亜鉛、セレン酸亜鉛、亜硝酸亜鉛、硝酸亜鉛、リン化亜鉛、炭酸亜鉛、水酸化亜鉛、塩化鉄、次亜塩素酸鉄、亜塩素酸鉄、臭化鉄、ヨウ化鉄、ヨウ酸鉄、酸化鉄、過酸化鉄、硫酸鉄、チオ硫酸鉄、セレン酸鉄、亜硝酸鉄、硝酸鉄、リン化鉄、炭酸鉄、水酸化鉄等が利用可能である。また、ニッケル化合物であってもよい。
【００５１】
なお、高分子化合物を含む溶液と一次粒子とを混合した溶液に添加する金属塩（アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、遷移金属塩）は、１種類であっても、２種類以上の混合物であってもよい。また、金属塩（アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、遷移金属）は、固体の状態としてもよいが、均一に添加することができること、および添加する濃度を制御することが可能である等の理由から水溶液として添加することが好ましい。また、添加する金属塩（アルカリ金属塩および／またはアルカリ土類金属塩および／または遷移金属塩）の量（濃度）は、一次粒子表面に存在するカルボン酸イオン、硫酸イオン、スルホン酸イオン、リン酸イオン、ホスホン酸イオン、アミノイオンと結合して、金属（アルカリ金属および／またはアルカリ土類金属および／または遷移金属）のカルボン酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、リン酸塩、ホスホン酸塩、アミノ酸塩が生じる条件であれば特に限定されるものではなく、適宜検討の上、決定すればよい。
【００５２】
ここで、上記工程によって一次粒子の表面に生じた金属（アルカリ金属および／またはアルカリ土類金属および／または遷移金属）のカルボン酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、リン酸塩、ホスホン酸塩、アミノ酸塩は、後述する焼成工程において熱分解を受け、金属（アルカリ金属および／またはアルカリ土類金属および／または遷移金属）の酸化物になる。例えば、一次粒子の表面にポリアクリル酸カルシウムが生じている場合は、焼成工程によって酸化カルシウムとなる。なお、当該金属酸化物（アルカリ金属酸化物および／またはアルカリ土類金属酸化物（例えば酸化カルシウム）および／または遷移金属酸化物）は水溶性であるため、後述する除去工程によって簡単に除去することが可能である。
【００５３】
また、ポリアクリル酸ナトリウムは水に可溶なため、本混合工程において融着防止剤としてそのまま利用可能であるが、ポリアクリル酸カルシウムは水に不溶なため、一旦ポリアクリル酸のみを一次粒子表面に吸着させた後に、カルシウム塩等を添加することで、ポリアクリル酸カルシウムを一次粒子表面に析出させるようにすることが好ましい。
【００５４】
（３．焼成工程）
本焼成工程は、上記混合工程によって得られた混合粒子を焼成温度に曝して、当該混合粒子に含まれる一次粒子をセラミックのＨＡｐ誘導体粒子（焼成体粒子）にする工程である。一次粒子の粒子間に融着防止剤が介在しているために、焼成工程における高温条件に曝された場合であっても一次粒子同士の融着を防止することができる。
【００５５】
当該焼成工程における焼成温度は、ＨＡｐ誘導体粒子の硬度が所望の硬度となるように適宜設定すればよく、例えば、１００℃〜１８００℃の範囲内がより好ましく、１５０℃〜１５００℃がさらに好ましく、２００℃〜１２００℃が最も好ましい。さらに、マイルドな抗菌性を発現させるという観点からは、焼成温度を５００℃以上とすることが好ましく、７００℃以上とすることがより好ましい。また、焼成時間については所望するＨＡｐ誘導体粒子の硬度等を基準に適宜設定すればよい。例えば、後述する実施例においては、７００℃で２時間焼成を行っている。
【００５６】
なお、本焼成工程に用いる装置等は特に限定されるものではなく、製造規模、製造条件等に応じて市販の焼成炉（電気炉等）を適宜選択の上、採用すればよい。
【００５７】
（４．除去工程）
本除去工程は、上述した焼成工程によって得られたＨＡｐ誘導体粒子群の粒子間に混在する融着防止剤を取り除く工程である。
【００５８】
除去の手段および手法については、上記混合工程において採用した融着防止剤に応じて適宜採用すればよい。例えば、溶媒溶解性を有する融着防止剤を用いた場合は、ＨＡｐ誘導体粒子を溶解しない溶媒（非溶解性）でかつ融着防止剤を溶解する（溶解性）溶媒を用いることによって、融着防止剤のみを溶解して除去することができる。用いる溶媒としては、上記要件を満たす溶媒であれば特に限定されるものではなく、水系溶媒であっても、有機溶媒であってもよい。例えば、水系溶媒としては、水、エタノール、メタノール等が挙げられ、有機溶媒としては、アセトン、トルエン等が挙げられる。
【００５９】
また、上記水系溶媒は、融着防止剤の水への溶解性を上げるために、シュウ酸塩、エチレンジアミン、ビピリジン、エチレンジアミン四酢酸塩等のキレート化合物を含んでいてもよい。さらに、上記水系溶媒は、融着防止剤の水への溶解性を上げるために、塩化ナトリウム、硝酸アンモニウム、炭酸カリウム等の電解質イオンを含んでいてもよい。
【００６０】
ただし、当該除去工程において有機溶媒の使用に対応する設備が不要となること、有機溶媒廃液処理が不要となること、製造作業の安全性が高いこと、環境に対するリスクが低いこと等の理由から、使用する溶媒は水系溶媒が好ましい。
【００６１】
ところで、溶媒を用いて融着防止剤を除去する場合は、焼成工程によって得られた融着防止剤を含むＨＡｐ誘導体（焼成体）粒子群を溶媒に懸濁させた後、ろ過または遠心分離によってＨＡｐ誘導体（焼成体）粒子のみを回収すればよい。本発明に係るＨＡｐ誘導体粒子群の製造方法において、上記操作は１回に限られるものではなく２回以上行ってもよい。上記操作を複数回行うことで、ＨＡｐ誘導体粒子間の融着防止剤の除去率がさらに向上する。ただし、製造工程が複雑になること、製造コストが高くなること、ＨＡｐ誘導体粒子の回収率が低下すること等の理由により、必要以上に多く上記操作を行うことは好ましくない。よって、上記操作の回数は、目標とする融着防止剤の除去率を基準に適宜決定することが好ましい。
【００６２】
なお、本工程には、さらに粒子径を均一にするために分級する工程が含まれていてもよい。
【００６３】
上記溶媒を用いて融着防止剤を除去する方法の他、融着防止剤に磁性体を用いることによって、マグネットを用いて融着防止剤を除去することができる。より具体的には、焼成工程によって得られた融着防止剤を含むＨＡｐ誘導体粒子（粗ＨＡｐ誘導体粒子）群を適当な溶媒（水等）に懸濁して分散させた後、当該懸濁液に磁力をかけ、融着防止剤のみをマグネットに吸着させ、吸着しなかったＨＡｐ誘導体粒子のみを回収する。また、特に溶媒に懸濁することなく、粗ＨＡｐ誘導体粒子をすりつぶして粉体にした後、マグネットによって融着防止剤を分離する方法であってもよい。ただし、懸濁液にした方がＨＡｐ誘導体粒子と融着防止剤が剥離しやすく、融着防止剤の除去率は高い。なお、この手法を適用することができるＨＡｐ誘導体粒子は、非磁性体または、弱磁性体であることが好ましい。
【００６４】
［Ａｇ−ＨＡｐ：同定方法］
上述したようにして合成されたＡｇ−ＨＡｐは、例えば、各種構造解析手法により同定することができる。例えば、Ｘ線回折装置（Ｘ−Ｒａｙ  Ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ：ＸＲＤ）を用いて測定した回折パターンと、既知のＡｇ−ＨＡｐの回折パターンとを比較し、これらの回折パターンがほぼ一致していれば、Ａｇ−ＨＡｐが得られていると同定することができる。なお、上記回折パターンにおけるピーク値から結晶格子の軸長を調べることができ、この軸長からカルシウムイオンが銀イオンに置換されていることを確認することもできる。
【００６５】
また、フーリエ変換型赤外分光分析（ＦＴＩＲ）によれば、得られたＡｇ−ＨＡｐに含まれる官能基を同定することができる。
【００６６】
また、合成したＡｇ−ＨＡｐを走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により観察することで、Ａｇ−ＨＡｐ粒子の表面形状や粒径を測定することができる。
【００６７】
また、合成したＡｇ−ＨＡｐを誘導結合プラズマ−原子発光分析法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）により分析することで、Ａｇ−ＨＡｐナノ結晶中の元素の組成比及び銀の量を求めることができる。
【００６８】
なお、Ａｇ−ＨＡｐの結晶構造中に、あまりに多くの銀イオンが含まれていると、金属銀がＨＡｐの結晶構造から析出し、Ａｇ−ＨＡｐの結晶構造を維持することができないおそれがある。すると、ＨＡｐ自体の特性（例えば、生体中での安定性、生体適合性、生体組織に対する密着性あるいは接着性等）が発揮されなくなる可能性もあるとともに、生体毒が生じる恐れがある。また、銀イオンが多すぎると、金属銀の析出に伴い、Ａｇ−ＨＡｐの結晶構造を構成するイオン種の比率が崩れ、リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）等の他の結晶層が生成し、Ａｇ−ＨＡｐ粒子の水溶性、生体中での代謝速度が高まりすぎるため、ＨＡｐ代替材料として使用する場合には不適である。さらに、結晶構造を維持することができないため、銀イオンの放出速度が高まり、マイルドな抗菌性を発揮できなくなってしまう。このような観点から、Ａｇ−ＨＡｐの結晶構造中のＡｇの置換割合（＝Ａｇ／（Ｃａ＋Ａｇ）×１００［ｍｏｌ％］）が、０．７５ｍｏｌ％未満であることが好適である。このようなＡｇの置換割合である場合には、Ａｇ−ＨＡｐ粒子のＸＲＤにより定量した（ＸＲＤの回折パターンから求めた）ハイドロキシアパタイト結晶相純度が９０％以上となる。ここで、ＸＲＤによる定量分析方法としては、一般に、リートベルト法、検量線法、回折積分強度比を用いた方法等が知られているが、本発明では、これらのいずれかの方法を用いて結晶相純度を求めることができる。
【００６９】
さらに、合成したＡｇ−ＨＡｐを誘導結合プラズマ発光分光分析装置（ＩＣＰ−ＡＥＳ）により分析することで、元素の組成比を求めることができる。
【００７０】
［Ａｇ−ＨＡｐ：抗菌力］
上述したようにして得られるＡｇ−ＨＡｐの抗菌力は、例えば、以下に述べる条件を満たすことが好ましい。すなわち、マイクロプレートリーダーで測定した吸光度の値が０．１（１０５個／μＬ）に濃度調整した所定の細胞を含む菌液と、該菌液と同体積のＮａＣｌ溶液にＡｇ−ＨＡｐ粒子を銀イオン換算で２．４７ｍｍｏｌ／Ｌ以上の濃度で分散させた溶液と、を混合した混合液を培地にスポットし、３７℃で１日培養した後の殺菌率が９０％以上であることが好ましい。これにより、本発明のＨＡｐ誘導体粒子群が、健全な組織に対しては悪影響を与えずに細菌等を静菌又は殺菌することが可能な、マイルドな抗菌性をより確実に発揮することができる。なお、ここでの「銀イオン換算の濃度」とは、抗菌力の評価に使用したＡｇ−ＨＡｐの組成（Ｃａ１０−ｘ・Ａｇｘ（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）からその式量を求め、この式量と、上記ＮａＣｌ溶液中のＡｇ−ＨＡｐのモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）とから算出された、上記ＮａＣｌ溶液中に含まれる銀イオンのモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）を意味する。
【００７１】
［Ｆ−ＨＡｐ：構造］
Ｆ−ＨＡｐは、フッ化物イオンを結晶構造中に含んでおり、ＨＡｐの結晶構造中の水酸化物イオン（ＯＨ−）部分（少なくとも一部）がフッ化物イオン（Ｆ−）に置換されたものである。言い換えると、Ｆ−ＨＡｐは、フッ化物イオンをＨＡｐの水酸化物イオンの位置にドープしたＨＡｐ誘導体である。このＦ−ＨＡｐは、フッ化物イオンを含まないＨＡｐとは異なり抗菌性を有するものであり、また、フッ化物イオンとＨＡｐの単なる混合物と比較して抗菌性はマイルドなものとなる。さらに、Ｆ−ＨＡｐは、高い耐酸性も有する。なお、Ｆ−ＨＡｐにおいて、ＨＡｐ結晶構造中の水酸化物イオンの少なくとも一部がフッ化物イオンで置換されている場合、ＨＡｐ結晶構造中のカルシウムイオンの少なくとも一部が、銀イオン又はその他の陽イオンで置換されていてもよい。
【００７２】
ここで、例えば、カテーテル等の医療機器は、体外と体内を繋いで、血液の輸血や排液といった医療行為に用いられるが、カテーテル等の材料として、一般に、シリコーン等の弾力性が優れた高分子材料が使用されているが、実際に長期間このデバイスを装着する場合、カテーテルと生体との接着部に隙間が生じ、細菌感染を引き起こすことが懸念されていた。そこで、近年、細菌感染を防止するのに有用な、高い分散性と結晶性を有するＨＡｐナノ単結晶を作製し、高分子基材にコーティングしたカテーテルの開発が行われている。これにより、生体とデバイスが密着し、刺入部からの細菌侵入を従来のカテーテルに比較して有意に抑制することが可能となる。しかしながら、経皮デバイスの周囲に極度の炎症が生じると、好中球やマクロファージなどの食細胞がこれを貪食し、食べた異物を溶かすために活性酸素やライソゾーム酵素を放出する。過酸化水素などの活性酸素は、プロトンを放出し炎症をおこした周囲が弱酸性となるため、酸に弱いＨＡｐが溶解することが危惧されている。
【００７３】
このような場合に、高分子基材の表面に、高い耐酸性を有するＦ−ＨＡｐをコーティングすることで、活性酸素等により溶解することを抑制することができる。また、Ｆ−ＨＡｐは、通常のＨＡｐに比べ耐酸性が向上し、かつマイルドな抗菌性を発現するため、本発明のＦ−ＨＡｐを歯科用材料として使用することで、う蝕を予防することができる。
【００７４】
［Ｆ−ＨＡｐ：合成方法］
上述したような特徴を有するＦ−ＨＡｐは、湿式法、乾式法、加水分解法、水熱法等の既知の製造方法によって製造することができる。以下の説明では、湿式法の一つである共沈法を用いてＦ−ＨＡｐを合成する方法を例に挙げ、Ｆ−ＨＡｐの合成方法を述べる。
【００７５】
本発明に係るＦ−ＨＡｐの製造方法は、少なくとも「一次粒子生成工程」を含んでいればよいが、この他、「混合工程」、「焼成工程」、「除去工程」を含んでいてもよい。なお、以下の説明においては、上記４工程を全て含んだ製造方法について説明する。
【００７６】
本発明に係るＦ−ＨＡｐの製造方法において、上記４工程は、例えば「１．一次粒子生成工程」→「２．混合工程」→「３．焼成工程」→「４．除去工程」の順で行われる。
【００７７】
（１．一次粒子生成工程）
ここで、「一次粒子」、「二次粒子」、「単結晶一次粒子」の定義については、Ａｇ−ＨＡｐと同様である。
【００７８】
一次粒子生成工程は、上述した一次粒子を生成することができる工程であれば特に限定されるものではなく、製造するＨＡｐ誘導体の原料により適宜選択の上、採用すればよい。例えば、以下の方法によりＦ−ＨＡｐの一次粒子を生成することができる。まず、所定の溶媒に、フッ素（Ｆ）源（フッ素化合物）及びカルシウム（Ｃａ）源（カルシウム化合物）を溶解させ、所定時間撹拌し、フッ素化合物溶液とカルシウム化合物溶液を調製する。同様に、所定の溶媒にリン（Ｐ）源（リン化合物）を溶解させ、所定時間撹拌し、リン化合物溶液を調製する。次に、フッ素化合物溶液とカルシウム化合物溶液を混合した後に、更に、リン化合物溶液を混合し、所定温度に加熱して撹拌する。その後、常温で更に所定時間撹拌する。その結果、Ｆ−ＨＡｐの粒子が沈殿する。
【００７９】
Ｆ−ＨＡｐの原料については、Ｆ源としては、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム等、Ｃａ源としては、硝酸カルシウム（水和物も含む。）、水酸化カルシウム、硝酸カルシウム、塩化カルシウム等、Ｐ源としては、リン酸、リン酸二水素アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム等を用いることができる。また、上記原料を溶解させる溶媒としては、上記原料が溶解するものであれば特に限定されるものではないが、例えば、水、エタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、トルエン等が挙げられる。上記Ａｇ源、Ｃａ源、Ｐ源、溶媒としては、上述した化合物を単独で使用してもよく、複数種混合して使用してもよい。
【００８０】
本発明に係るＨＡｐ誘導体粒子の製造方法は、上記の一次粒子生成工程によって生成した一次粒子の集合からなる一次粒子群を、融着等を防止しながら焼成してＨＡｐ誘導体粒子の集合からなるＨＡｐ誘導体粒子群を製造するものである。よって、当該一次粒子生成工程によって生成された一次粒子の状態（粒子径、粒度分布）が、最終生産物であるＨＡｐ誘導体粒子の状態（粒子径、粒度分布）にそのまま反映される。
【００８１】
また、本工程には生成した一次粒子を水等で洗浄する工程、遠心分離、ろ過等で一次粒子を回収する工程が含まれていてもよい。
【００８２】
（２．混合工程）
本混合工程は、上記工程で生成された一次粒子と、焼成時における一次粒子同士の融着を防止する融着防止剤とを混合する工程である。本混合工程については、上述したＡｇ−ＨＡｐの場合と同様であるので、詳細な説明を省略する。
【００８３】
（３．焼成工程）
本焼成工程は、上記混合工程によって得られた混合粒子を焼成温度に曝して、当該混合粒子に含まれる一次粒子をセラミックのＨＡｐ誘導体粒子（焼成体粒子）にする工程である。本焼成工程についても、上述したＡｇ−ＨＡｐの場合と同様であるので、詳細な説明を省略する。ただし、後述する実施例における焼成条件は、Ａｇ−ＨＡｐの場合と異なり、８００℃で１時間焼成を行っている。
【００８４】
（４．除去工程）
本除去工程は、上述した焼成工程によって得られたＨＡｐ誘導体粒子群の粒子間に混在する融着防止剤を取り除く工程である。本除去工程についても、上述したＡｇ−ＨＡｐの場合と同様であるので、詳細な説明を省略する。
【００８５】
［Ｆ−ＨＡｐ：同定方法］
上述したようにして合成されたＦ−ＨＡｐは、例えば、各種構造解析手法により同定することができる。例えば、Ｘ線回折装置（Ｘ−Ｒａｙ  Ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ：ＸＲＤ）を用いて測定した回折パターンと、既知のＦ−ＨＡｐの回折パターンとを比較し、これらの回折パターンがほぼ一致していれば、Ｆ−ＨＡｐが得られていると同定することができる。なお、上記回折パターンにおけるピーク値から結晶格子の軸長を調べることができ、この軸長から水酸化物イオンがフッ化物イオンに置換されていることを確認することもできる。
【００８６】
また、フーリエ変換型赤外分光分析（ＦＴＩＲ）によれば、得られたＦ−ＨＡｐに含まれる官能基を同定することができ、さらに、合成したＦ−ＨＡｐと市販されているＦ−ＨＡｐのＦＴＩＲのスペクトルを比較し、各官能基に帰属する吸収ピークがほぼ一致していれば、合成したものがＦ−ＨＡｐであると推測することができる。
【００８７】
また、合成したＦ−ＨＡｐを走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により観察することで、Ｆ−ＨＡｐ粒子の表面形状や粒径を測定することができる。
【００８８】
また、フッ素イオン濃度計を用いることで、合成したＦ−ＨＡｐ中のフッ化物イオンの濃度を測定することができ、当該フッ化物イオン濃度の測定値と、理論濃度（化学両論的に求めたＦ−ＨＡｐ中のフッ化物イオン濃度）との比から、ＨＡｐ中の水酸化物イオンのフッ化物イオン置換率を求めることもできる。
【００８９】
［Ｆ−ＨＡｐ：抗菌力］
上述したようにして得られるＦ−ＨＡｐの抗菌力は、例えば、以下に述べる条件を満たすことが好ましい。すなわち、マイクロプレートリーダーで測定した吸光度の値が０．１（１０５個／μＬ）に濃度調整した所定の細胞を含む菌液と、該菌液と同体積のＮａＣｌ溶液にＦ−ＨＡｐ粒子をフッ化物イオン換算で８９．３ｍｍｏｌ／Ｌ以上の濃度で分散させた溶液と、を混合した混合液を培地にスポットし、３７℃で１日培養した後の殺菌率が５０％以上であることが好ましい。これにより、本発明の抗菌剤が、健全な組織に対しては悪影響を与えずに細菌等を静菌することが可能な、マイルドな抗菌性をより確実に発揮することができる。さらに、マイクロプレートリーダーで測定した吸光度の値が０．１（１０５個／μＬ）に濃度調整した所定の細胞を含む菌液と、該菌液と同体積のＮａＣｌ溶液にＦ−ＨＡｐ粒子をフッ化物イオン換算で１７８．６ｍｍｏｌ／Ｌ以上の濃度で分散させた溶液と、を混合した混合液を培地にスポットし、３７℃で１日培養した後の殺菌率が９５％以上であることが好ましい。これにより、本発明の抗菌剤が、健全な組織に対しては悪影響を与えずに細菌等を殺菌することが可能な、マイルドな抗菌性をより確実に発揮することができる。なお、ここでの「フッ化物イオン換算の濃度」とは、抗菌力の評価に使用したＦ−ＨＡｐの組成（Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｆ２−ｙ（ＯＨ）ｙ）からその式量を求め、この式量と、上記ＮａＣｌ溶液中のＦ−ＨＡｐのモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）とから算出された、上記ＮａＣｌ溶液中に含まれるフッ化物イオンのモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）を意味する。
【００９０】
≪抗菌作用の原理≫
本発明に係る抗菌剤の作用機序は不明であるが、本発明者らは、上述したようにＨＡｐ誘導体をナノ粒子にした結果、数μｍ程度の大きさの菌の内部に取り込まれやすくなり、このようにして菌の内部に取り込まれたマイルドな抗菌性を有するＨＡｐ誘導体が、菌の内部から菌を静菌又は殺菌する作用を示すものと推測している。
【００９１】
≪抗菌剤の用途≫
本発明に係るＨＡｐ誘導体、特に、焼成ＨＡｐ誘導体は、生体活性が非常に高いため、医療分野において、例えば、骨充填剤、歯科用充填剤、薬物徐放剤等の歯科用材料または医療用材料として広く用いることができる。また、ＨＡｐ誘導体は、生体活性が高いので、特に医療用材料として好適に用いることができる。また、焼成ＨＡｐ誘導体粒子群は、菌体、酵母等の固定化担体、カラムクロマトグラフィー用充填剤、消臭剤等の吸着剤等に好適に用いることができる。さらに、本発明にＨＡｐ誘導体は、ナノメートルサイズのドラッグデリバリーシステム（ナノＤＤＳ）にもその利用が期待される。特に、本発明に係るＨＡｐ誘導体及びこれを含む抗菌剤は、これらの用途の中でも、抗菌性が要求される用途、例えば、体外と体内を繋いで、カテーテル、人工関節等の医療機器等の用途に好適に用いられる。
【実施例】
【００９２】
次に、本発明を実施例及び比較例により、更に具体的に説明するが、本発明は、これらの例によって何ら限定されるものではない。
【００９３】
≪Ａｇ−ＨＡｐ≫
初めに、Ａｇ−ＨＡｐを合成し、得られたＡｇ−ＨＡｐを同定した上で、当該Ａｇ−ＨＡｐの抗菌性について評価した結果を説明する。
【００９４】
＜Ａｇ−ＨＡｐの合成＞
湿式法の一つである共沈法を用いて、Ａｇ−ＨＡｐ｛Ｃａ１０−ｘＡｇｘ（ＰＯ４）６（ＯＨ）２（式中、ｘ＝０、０．１、０．２）｝ナノ単結晶の作製を行った。出発原料については、Ｃａ源として硝酸カルシウム四水和物｛Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ｝、Ｐ源としてリン酸二水素アンモニウム｛（ＮＨ４）２ＨＰＯ４｝、Ａｇ源として硝酸銀｛ＡｇＮＯ３｝を用い、脱イオン水中で混合しながら室温で合成された。具体的には以下のようにして行った。
【００９５】
（一次粒子生成工程）
硝酸カルシウム四水和物、硝酸銀、及びリン酸二水素アンモニウムとしては、いずれも和光純薬工業株式会社から購入したものを精製せずに用いた。また、ＨＡｐ中の銀含有量を確認するために、Ｃａ：Ａｇ＝８０：２０（モル％）のＡｇ含有ＨＡｐを調製した。すべての反応は１００℃の温度で行い、（Ｃａ２＋  ＋  Ａｇ＋）：ＰＯ４３−のモル比が１０：６となるように計算して反応物の量を定めた。
【００９６】
まず、８０ｍｍｏｌの硝酸カルシウム四水和物及び２０ｍｍｏｌの硝酸銀をそれぞれ３００ｍＬの脱イオン水と混合し、０．３Ｍの溶液（Ｃａ及びＡｇの硝酸塩溶液）を調製した。この溶液を油浴内において、１００℃で３０分間撹拌した。同様に、所定量のリン酸二水素アンモニウムを３００ｍＬの脱イオン水と混合し、０．２Ｍの溶液（リン溶液）を調製した。この溶液に２８％濃度のＮＨ４ＯＨを加えることによりｐＨを１０．０に調整し、室温で３０分間撹拌した。次いで、１００℃の温度に維持したＣａ及びＡｇの窒化物溶液に、リン溶液を一滴ずつ添加し、これらの溶液を混合した。リン溶液の添加が終了した後、混合物を２時間１００℃に維持した状態で撹拌した。撹拌（反応）中、溶液のｐＨが１０．０に保たれるように常にｐＨを調整した。リン溶液をＣａ及びＡｇの窒化物溶液に混合する前は、両者の溶液は透明であったが、リン溶液の添加量を増やすにつれ、混合溶液は徐々に白色になった。得られた混合溶液を１２時間放置した後、不純物イオン（ＮＨ４＋、ＮＯ３−）を取り除くために遠心分離法を用いて脱イオン水で３回洗浄した。洗浄後、混合物をろ過して湿ったケーク（Ａｇ−ＨＡｐケーク）を得た。湿ったケークを低圧ポンプにより十分に乾燥した後に、オーブン内に６０℃で一晩放置した。さらに、Ａｇ−ＨＡｐケークをめのう乳鉢と乳棒を用いて粉砕してＡｇ−ＨＡｐ粉体を得た。
【００９７】
（混合工程及び焼成工程）
次に、上記で得られたＡｇ−ＨＡｐ粉体の一部を融着防止剤を添加せずに焼成し、他の一部を融着防止剤と混合した後に焼成した。焼成は、るつぼ内にて７００℃で２時間行った。
【００９８】
（除去工程）
最後に、Ａｇ−ＨＡｐの焼成体にＮＨ４ＮＯ３溶液を加えることでｐＨを約７まで低下させた後に、遠心分離を用いて脱イオン水で洗浄した。洗浄後、Ａｇ−ＨＡｐの焼成体をろ過し、６０℃のオーブンで十分に乾燥させ、Ａｇ−ＨＡｐの焼成体のサンプルを得た。
【００９９】
＜Ａｇ−ＨＡｐの同定＞
上述のようにして得られたＡｇ−ＨＡｐのサンプルに関し、Ａｇ−ＨＡｐの同定として、フーリエ変換型赤外分光光度計（ＦＴＩＲ）による官能基分析、Ｘ線回折装置（ＸＲＤ）による結晶構造解析、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による表面形状及び粒径測定、並びに、誘導結合プラズマ−原子発光分析法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）による元素組成分析を行った。
【０１００】
（ＦＴＩＲによる官能基分析）
赤外分光測定による官能基の測定は、フーリエ変換型赤外分光光度計（パーキンエルマー（株）製、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ５０）を用いて行った。測定方法としてはＫＢｒ法を採用した。Ａｇ−ＨＡｐのサンプル１質量％に対して臭化カリウム（ＫＢｒ）粉末を９９質量％の比率で混合し、乳鉢を用いて十分にすりつぶし、均一に混合した粉末を拡散反射モードで測定波長範囲を４０００ｃｍ−１から４００ｃｍ−１、分解能４で積算回数は１６回で測定した。なお、Ｆ−ＨＡｐのサンプルとしては、（ａ）上記一次粒子生成工程で作製したＡｇ−ＨＡｐと、（ｂ）（ａ）のＡｇ−ＨＡｐを融着防止剤を添加せずに焼成したサンプルと、（ｃ）（ａ）のＡｇ−ＨＡｐを融着防止剤｛Ｃａ（ＮＯ３）２｝を添加して焼成したサンプルとを用いた。図１に、上記（ａ）〜（ｃ）のサンプルのＩＲスペクトルを示す。
【０１０１】
図１からわかるように、Ｐ−Ｏ結合に帰属される吸収ピークが、１０９５ｃｍ−１、１０３５ｃｍ−１、及び９６０ｃｍ−１付近に認められた。また、Ｏ−Ｐ−Ｏ結合に帰属されると考えられる吸収ピークが、６０６ｃｍ−１、５６１ｃｍ−１及び４７３ｃｍ−１付近に認められた。これらの吸収ピークから、いずれのサンプルもホスフェート基を含有していることが示唆された。
【０１０２】
また、ヒドロキシル基（水酸基）に帰属される吸収ピークが、３５７１ｃｍ−１および６２９ｃｍ−１付近に認められたことから、いずれのサンプルもヒドロキシル基を含有していることが示唆された。
【０１０３】
さらに、いずれのサンプルにおいても、Ｈ２Ｏ分子に帰属される２つのブロードな吸収ピークが、１６３０ｃｍ−１及び３４００ｃｍ−１付近に観察されたが、７００℃で２時間焼成することで大幅にピーク強度が小さくなっていることがわかった。
【０１０４】
加えて、図１に示すように、サンプル（ｂ）及び（ｃ）の方がサンプル（ａ）よりも、６３２及び３５７１ｃｍ−１のヒドロキシル基に帰属されるピーク強度と、９６２ｃｍ−１のホスフェート基に帰属されるピーク強度が増加していることから、焼成されたサンプルにおいて結晶性が増大していることが示唆された。なお、この結果は、後述するＸＲＤによる結果と一致している。
【０１０５】
また、サンプル（ａ）では、ヒドロキシル基に帰属されるピークがシャープではなかったのに対し、焼成されたサンプル（ｂ）及び（ｃ）では、ヒドロキシル基に帰属されるピークがシャープになったことから、焼成したサンプルでは、完全な結晶質のＡｇ−ＨＡｐが生成されていることが示唆された。なお、このことは、後述するＸＲＤの回折ピークにおいても観察された。
【０１０６】
（ＸＲＤによる結晶構造解析）
粉末Ｘ線回析装置（理学電機（株）製、ＲＡＤ−Ｘ）を用いて、作製したＡｇ−ＨＡｐの結晶構造解析を行った。ＸＲＤで使用したＸ線源としてはＣｕＫα線源（λ＝１．５４１８４１Å（オングストローム））を用い、出力は３０ｋＶ／１５ｍＡ、スキャンスピードは１．０°／ｍｉｎ、サンプリング幅は０．０１°、測定モードは連続の条件とした。図２に、作製したＡｇ−ＨＡｐのＸ線回析ピークを示す。なお、ピークの同定には、ＩＣＣＤ−ＰＤＦカード（００−００９−０４３２）のＨＡｐの標準データと、ＩＣＣＤ−ＰＤＦカード（０４−０７８３）の金属銀の標準データとを用いた。
【０１０７】
図２に示す作製したＡｇ−ＨＡｐは、主要なピークについては、ＩＣＣＤ−ＰＤＦカード（００−００９−０４３２）のＨＡｐデータ（標準ＨＡｐデータ）とほぼ一致した。また、図２に示すように、２θ＝３８．１°における金属銀のピークは、上記３種のサンプルのいずれにもほとんど観察されなかった。従って、上記方法で合成したＡｇ−ＨＡｐは、一次粒子生成直後及び焼成後（融着防止剤の有無に関わらず）のいずれにおいても、銀イオンがＨＡｐ結晶中にドープされていることがわかった。
【０１０８】
また、上記で測定したＸ線回折ピークに基づき、上記サンプル（ａ）〜（ｃ）の結晶格子の（２１１）面における半値全幅（ＦＷＨＭ：Ｆｕｌｌ  Ｗｉｄｔｈ  Ｈａｌｆ  Ｍａｘｉｍｕｍ）を下記表１に示す。なお、表１の上段から順にサンプル（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の結果を示している。なお、標準ＨＡｐデータにおける（２１１）面におけるピークは、２θ＝３１．７７３°であった。
【０１０９】
【表１】
2019077720.tif 000002
【０１１０】
一般に、Ｘ線回折ピークにおけるＦＷＨＭは、焼成温度を高くすればするほど減少し、且つ、粒子はより完全な結晶質になることが知られている。本実施例においては、焼成を行っていないサンプル（ａ）のＦＷＨＭよりも、７００℃で焼成温度したサンプル（ｂ）及び（ｃ）のＦＷＨＭが減少していることから、本実施例で焼成したＡｇ−ＨＡｐはより完全な結晶質になっていると言える。
【０１１１】
また、上記で測定したＸ線回折ピーク値から軸長を調べた。軸長は、上記で測定したＸＲＤピークから得られた２θの値に基づき、「単位格子ソフト（ｕｎｉｔ  ｃｅｌｌ  ｓｏｆｔ）」を用いることで計算することができる。その結果を表２に示す。なお、表２の上段から順に、ＨＡｐ標準データ、サンプル（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の結果を示している。
【０１１２】
【表２】
2019077720.tif 000003
【０１１３】
表２より、作製したＡｇ−ＨＡｐは、ａ軸がＨＡｐ標準データの軸長より長いことが確認できた。カルシウムイオンの半径（＝０．９９Å）より銀イオンの半径（＝１．２８Å）の方が大きいため、ＨＡｐのカルシウムイオンが銀イオンに置換されたことが示唆された。
【０１１４】
（ＳＥＭによる表面形状及び粒径測定）
作製したＡｇ−ＨＡｐの形態をＳＥＭを用いて観察した。作製したＡｇ−ＨＡｐのサンプル（ａ）〜（ｃ）のＳＥＭ画像を図３に示す。図３に示すように、一次粒子の状態のサンプル（ａ）では、各粒子が互いに近づいていることが観察された。すなわち、サンプル（ａ）は、不十分な結晶質（非晶質）であることがわかった。また、融着防止剤を添加せずに焼成したサンプル（ｂ）では、一次粒子同士が融着して大きな塊状となっていることが観察された。一方、融着防止剤を添加して焼成したサンプル（ｃ）では、一次粒子同士がほとんど融着されずに焼結され、球形又は棒状の粒子の混合物である（各粒子が互いに分離されている）ことが観察された。また、一次粒子の粒径は、融着防止剤の有無で殆ど変わらなかった。
【０１１５】
また、作製したＡｇ−ＨＡｐのサンプル（ａ）〜（ｃ）の平均粒径を動的光散乱法（ＥＬＳ、「大塚電子製ＥＬＳ−８０００」を用いた）により測定した。
【０１１６】
その結果、サンプル（ａ）の平均粒径が５０２．０ｎｍであったのに対して、融着防止剤を添加せずに焼成したサンプル（ｂ）の平均粒径は１６７１．８ｎｍと大きくなることがわかった。一方、融着防止剤を添加して焼成したサンプル（ｃ）の平均粒径は３７４．７ｎｍと小さかった。このことより、融着防止剤を用いない場合には、一次粒子同士が凝集、融着して二次粒子を形成し、粒径が大きくなることが示唆された。
【０１１７】
以上のことから、融着防止剤を用いてＦ−ＨＡｐの合成を行ったことにより、１次粒子及び２次粒子ともに小さいＦ−ＨＡｐが作製できたと考えられた。
【０１１８】
（ＩＣＰ−ＡＥＳによる元素組成分析）
Ａｇ−ＨＡｐ中の銀の組成比を、誘導結合プラズマ原子発光分光法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）により求めた。測定装置としては、Ｏｐｔｉｍａ  ２０００ＤＶ（株式会社パーキンエルマージャパン製）を用いた。ＩＣＰ測定用のサンプルとして、１００ｐｐｍのＡｇ−ＨＡｐ溶液を調製した。その結果を表３に示した。一次粒子の状態のサンプル（ａ）（表中の「ｓａｍｐｌｅ−１」に相当）中のＡｇは１．５％であるが、融着防止剤を添加して焼成したサンプル（ｃ）（表中の「ｓａｍｐｌｅ−３」に相当）のＡｇは０．５％であった。このＡｇの減少は、除去工程におけるＡｇ−ＨＡｐの洗浄に起因するものと推測された。
【０１１９】
【表３】
2019077720.tif 000004
【０１２０】
＜抗菌性評価＞
次に、上記で作成したＡｇ−ＨＡｐに対する抗菌性評価について説明する。以下の説明では、評価方法、評価結果の順に説明する。
【０１２１】
（評価方法）
作製したＡｇ−ＨＡｐを用いて、粉末添加法によりＡｇ−ＨＡｐの抗菌性を評価した。なお、Ａｇ−ＨＡｐの抗菌性はＥ．Ｃｏｌｉに対して行った．Ｅ．ｃｏｌｉは、インプラントに関連する感染の原因となりうる微生物であり、グラム陰性細菌の一種である。
【０１２２】
〔Ａｇ−ＨＡｐの洗浄〕
まず、抗菌性試験に使用するＡｇ−ＨＡｐ（Ｃａ９．９５Ａｇ０．０５（ＰＯ４）６（ＯＨ）２：式量＝１０１５．０）の洗浄を行った。乳鉢で十分に粉砕しチューブの中に入れたＡｇ−ＨＡｐ１０ｍｇに、７０％エタノールを１ｍＬ加えピペッティングした。その後１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを捨てた。これを２回繰り返し、次に１４０ｍＭのＮａＣｌで同様に洗浄を行った。
【０１２３】
〔菌の準備〕
菌液の濃度を調整するためにマイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。液体培養した菌を２０倍に希釈し、プレートに１５０μＬスポットし波長６００ｎｍにおける吸光度を測定した。バックグラウンドには１４０ｍＭのＮａＣｌを用いた。吸光度の値が０．１（１０５個／μＬ）になるよう菌液を希釈した。
【０１２４】
〔アッセイ〕
粉末添加法
１００μＬ  の１４０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液に分散させたＡｇ−ＨＡｐを含む溶液と、菌液１００μＬをチューブの中に入れ、ピペッティングし、１時間プチローターで撹拌を行い、Ａｇ−ＨＡｐと細菌とを接触させた。次いで、チューブ５本に１８０μＬずつＮａＣｌ溶液を入れたものを用意し、順番に（１）〜（５）と番号をつけ、１時間撹拌させた細菌とＡｇ−ＨＡｐの混合液２０μＬを（１）に入れ、ピペッティングして十分に撹拌した。次に（１）の溶液２０μＬを（２）に入れ、ピペッティングして十分に撹拌した。これを図４のように（２）から（３）、（３）から（４）・・・と同様の手順で繰り返し、細菌とＡｇ−ＨＡｐの混合液を希釈した（２０μＬを１８０μＬに加えているため、１０倍ずつ希釈していることになる）。さらに、１０倍ずつ５段階に希釈した溶液を濃度の薄い（５）から順番に５μＬずつ寒天培地のシャーレにスポットし、３７℃に設定したインキュベータで１日培養した。なお、抗菌性試験のコントロールとしてＢ社製ＨＡｐを使用した。以上のような評価を、１００μＬのＮａＣｌ溶液に分散させるＡｇ−ＨＡｐをそれぞれ上記サンプル（ａ）〜（ｃ）としたＮｏ．１〜Ｎｏ．３の溶液に対して行った。なお、ＮａＣｌ溶液中のＡｇ−ＨＡｐ濃度は、４９．３ｍｍｏｌ／Ｌ（５．０ｍｇ／１００μＬ）とした。
【０１２５】
（評価結果）
〔Ａｇ−ＨＡｐの抗菌性〕
上記粉末添加法によりＡｇ−ＨＡｐの抗菌性試験を行った結果を図５及び表４に示す。なお、図５の最上段にはコントロールとしてのＨＡｐの結果を示し、それ以下の段にはＡｇ−ＨＡｐの結果を示している。表４に記載の殺菌率は、コントロールのコロニー数に対するＡｇ−ＨＡｐのコロニー数の割合、すなわち、（Ｆ−ＨＡｐのコロニー数の減少数）／（コントロールのコロニー数）から求めた。その結果、全てのサンプル（ａ）〜（ｃ）において、すなわち、焼成の有無に関わらず、９０％以上の殺菌率を示した。なお、本抗菌性試験は、上記Ｎｏ．１〜Ｎｏ．３の溶液に対して、それぞれ３回ずつ（ｎ＝３）行った。また、図５には、ｎ＝３のうちの特定の１回の試験の結果を一例として示している。
【０１２６】
【表４】
2019077720.tif 000005
【０１２７】
ここで、本抗菌性試験に使用したＡｇ−ＨＡｐの組成は、Ｃａ９．９５Ａｇ０．０５（ＰＯ４）６（ＯＨ）２であることから、Ａｇイオン換算での濃度（Ａｇイオン濃度）は、４９．３ｍｍｏｌ×０．０５＝２．４７ｍｍｏｌ／Ｌである。一般に、Ａｇイオン単独での抗菌性としては、Ａｇイオン濃度が５〜１０ｐｐｂ（０．０９３×１０−３ｍｍｏｌ）であれば大腸菌に対して抗菌性を発現すると言われている。一方で、上記試験に示すように、Ａｇ−ＨＡｐとしての抗菌性を発現させるためには、Ａｇイオン換算で、２．４７ｍｍｏｌ／Ｌ必要となり、Ａｇイオン単独の場合と比較して、抗菌性を発現するためにより多くのＡｇイオンを必要とすることがわかった。このことから、Ａｇ−ＨＡｐの抗菌性は、Ａｇイオン単独の抗菌性と比較してマイルドであると言える。
【０１２８】
≪Ｆ−ＨＡｐ≫
次に、Ｆ−ＨＡｐを合成し、得られたＦ−ＨＡｐを同定した上で、当該Ｆ−ＨＡｐの耐酸性及び抗菌性について評価した結果を説明する。
【０１２９】
＜Ｆ−ＨＡｐの合成＞
湿式法の一つである共沈法を用いて、Ｆ−ＨＡｐナノ単結晶の作製を行った。出発原料については、Ｃａ源として硝酸カルシウム四水和物、Ｐ源としてリン酸、Ｆ源としてフッ化ナトリウムを用いた。具体的には以下のようにして行った。
【０１３０】
（一次粒子生成工程）
エタノール（９９．５％水溶液）２００ｍｌに硝酸カルシウム四水和物７．０３ｇとフッ化ナトリウム０．２５４ｇをそれぞれ溶解させ、窒素雰囲気下で３０分間撹拌した。同様に、エタノール５０ｍｌにリン酸２．０４ｇを溶解させ、窒素雰囲気下で３０分間撹拌した。次に、硝酸カルシウムにフッ化ナトリウムを一気に混合し、５分撹拌後リン酸を加え、ウォーターバスにて８０℃に保ったまま１時間撹拌し反応させた。その後、常温で１５時間撹拌を行った。撹拌後、遠心分離機を用いて６，５００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄み液を捨てた。純水を加え超音波照射を行い、沈殿した反応物を十分に分散させ、６，５００ｒｐｍで３分間遠心分離を行った。この精製を３回繰り返し、得られたサンプル（Ｆ−ＨＡｐ）を水に分散させた。
【０１３１】
（混合工程及び焼成工程）
上記で作製したＦ−ＨＡｐ  １．０ｇに対して、ポリアクリル酸１．０ｇを１００ｍｌの純水に溶解させ、アンモニア水（２８．０％）を用いてポリアクリル酸のｐＨが５になるように調製した（溶液Ａ）。その後、Ｆ−ＨＡｐ溶液を撹拌しながら、溶液Ａをペリスタポンプを用いて１分間１０ｍｌの割合で滴下した。さらに、５分間そのまま撹拌させた（溶液Ｂ）。同様に、作製したＦ−ＨＡｐ  １．０ｇに対して、硝酸カルシウム３．７ｇを３７０ｍｌの純水に溶解させた（溶液Ｃ）。溶液Ｂを撹拌しながら、溶液Ｃをぺリスタポンプを用いて１分間１０ｍｌの割合で滴下した。その後、混合液をアスピレータを用いて吸引濾過し、取り出したサンプルを１時間減圧乾燥した。乾燥させたサンプルを乳鉢で粉砕し、るつぼに入れ電気炉にて８００℃で１時間焼成した。炉冷後、焼成したＦ−ＨＡｐを乳鉢で粉砕した。
【０１３２】
（除去工程）
純水８００ｍｌに硝酸アンモニウム８．０ｇを溶解させ、窒素雰囲気下で３０分間撹拌した。焼成したＦ−ＨＡｐに溶液を加え、超音波照射を行い沈殿した反応物を十分に分散させ、８，５００ｒｐｍで３分間遠心分離を行った。上澄み液を捨てて硝酸水素アンモニウム水溶液を加え、以下、この精製を上澄み液のｐＨが中性になるまで４回繰り返した。さらに取り出したサンプルを、純水を用いて同様の方法で精製した。最後に、サンプルを１時間減圧乾燥させ、乳鉢で粉砕し回収した。
【０１３３】
＜Ｆ−ＨＡｐの同定＞
上述のようにして得られたＦ−ＨＡｐのサンプルに関し、Ｆ−ＨＡｐの同定として、Ｘ線回折装置（ＸＲＤ）による結晶構造解析、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による表面形状測定及び粒径測定（ＤＬＳ）による分散性評価、並びに、フッ素イオン濃度計による濃度分析を行った。
【０１３４】
（ＸＲＤによる結晶構造解析）
粉末Ｘ線回析装置（理学電機（株）製、Ｍｉｎｉ  Ｆｌｅｘ／ＨＣＭ）を用いて、作製したＦ−ＨＡｐの結晶構造解析を行った。ＸＲＤで使用したＸ線源としてはＣｕＫα線源（λ＝１．５４１８４１Å（オングストローム））を用い、出力は３０ｋＶ／１５ｍＡ、スキャンスピードは１．０°／ｍｉｎ、サンプリング幅は０．０１°、測定モードは連続の条件とした。図６に、作製したＦ−ＨＡｐのＸ線回析ピークを示す。なお、図６の上段がＦ−ＨＡｐのピークであり、下段がＪＣＰＤＳカードのＦ−ＨＡｐデータである。
【０１３５】
図６からわかるように、作製したＦ−ＨＡｐは、ＪＣＰＤＳカードのＦ−ＨＡｐデータ（標準データ）のピーク値とほぼ一致した。作製したＦ−ＨＡｐにおいて、Ｆ単体の回析パターンが検出されていないため、ＨＡｐの結晶構造の中にフッ化物イオンが置換されていると推測された。以上より、ＪＣＰＤＳカードのＦ−ＨＡｐデータと結晶構造が類似したＦ−ＨＡｐが作製できたと推測された。
【０１３６】
また、上記で測定したＸ線回折ピーク値から軸長を調べた。その結果を表５に示す。
【０１３７】
【表５】
2019077720.tif 000006
【０１３８】
表５より、作製したＦ−ＨＡｐは、ａ軸がＨＡｐ標準品の軸長より短いことが確認できた。水酸化物イオンの半径（＝１．３７Å）よりフッ化物イオンの半径（＝１．３３Å）の方が小さいため、ＨＡｐの水酸化物イオンがフッ化物イオンに置換されたことが分かった。
【０１３９】
（ＳＥＭによる表面形状測定及びＤＬＳによる分散性評価）
作製したＦ−ＨＡｐの形態をＳＥＭを用いて観察した。市販のＦ−ＨＡｐを図７に、作製したＦ−ＨＡｐのＳＥＭ画像を図８に示す。図７、８より、融着防止剤を用いて合成した（上記で作製した）Ｆ−ＨＡｐの方が、市販のＦ−ＨＡｐよりも１次粒子が小さく、均一な球体状であることが分かった。
【０１４０】
また、作製したＦ−ＨＡｐの分散性をＤＬＳによる平均粒径測定の結果から評価した。サンプル（作製したＦ−ＨＡｐ及び市販のＦ−ＨＡｐ）をエタノール中に分散させ、１重量％のエタノール分散体を調製した。調製後、四面セルにサンプル／エタノール分散体を加えた。解析条件として、解析手法：ＮＮＬＳ、表示項目：自己相関関数、散乱強度ヒストグラム、重量換算ヒストグラム、個数換算ヒストグラムとし、測定波長範囲：８５００ｃｍ−１〜１００ｃｍ−１とし粒径分布解析を行った。
【０１４１】
その結果、平均粒径は図８の市販のＦ−ＨＡｐが１７５０７．７±１１６１．０ｎｍであり、図８の作製したＦ−ＨＡｐが３１９．２±５１．３ｎｍであった。よって、融着防止剤を用いて合成したＦ−ＨＡｐの方が２次粒子が小さく、また、粒度分布も小さいことが分かった。
【０１４２】
以上のことから、融着防止剤を用いてＦ−ＨＡｐの合成を行ったことにより、１次粒子及び２次粒子ともに小さいＦ−ＨＡｐが作製できたと考えられた。
【０１４３】
（フッ素イオン濃度計による濃度分析）
フッ素イオン濃度計（笠原理化工業（株）製、Ｆ−１０Ｚ）を用いて、市販のＦ−ＨＡｐと作製したＦ−ＨＡｐのフッ化物イオン濃度を測定した。サンプル（市販のＦ−ＨＡｐ及び作製したＦ−ＨＡｐ）約５０ｍｇに、０．５Ｍ塩酸４ｍｌと純水１５ｍｌとを混ぜ合わせ、純水を容積が２５ｍｌになるまで加えた。しばらく溶液を振り混ぜた後、サンプルの溶解を確認し、溶解していなければ０．５Ｍの塩酸を加え溶かした。サンプルの入った溶液２５ｍｌとマスキング剤２ｍｌを１００ｍｌのメスフラスコに入れ、更に純水を加えて溶液が１００ｍｌになるよう調整した。超音波照射により溶液中の濃度を均一にした後、アンモニア水を加えてｐＨを５．０に調整した。表６にそれぞれのサンプルの理論濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）、測定濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）を示す。
【０１４４】
【表６】
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【０１４５】
表６より、作製したＦ−ＨＡｐの方がフッ化物イオン濃度が高いことが確認できた。理論濃度と測定濃度との比から水酸化物イオンのフッ化物イオンによる置換率は約９０％であると推測された。
【０１４６】
＜耐酸性評価＞
次に、上記で作成したＦ−ＨＡｐに対する耐酸性評価について説明する。以下の説明では、評価方法、評価結果の順に説明する。
【０１４７】
（評価方法）
作製したＦ−ＨＡｐの溶解点を調べるため耐酸性試験を行った。比較のために、Ａ社製Ｆ−ＨＡｐ、Ｂ社製ＨＡｐ、Ｃ社製ＨＡｐの３つを加えた合計４つのサンプルの耐酸性を評価した。
【０１４８】
まず、純水に０．０２ｍＭの塩酸溶液を加え、ｐＨの異なる溶媒（ｐＨ＝１．６、２．０、２．５、２．８、３．２、３．６、４．０、４．６）を準備した。ｐＨ調整した溶液５ｍＬにサンプル２ｍｇを加え、ボルテックスミキサーで１分間撹拌後、石英ガラスセルに移し、紫外・可視分光光度計（日本分光（株）製、Ｖ５５０）で吸光度を測定した。固定波長測定を選択し、測光モード：Ａｂｓ、レスポンス：Ｑｕｉｃｋ、バンド幅：２．０ｎｍ、測定波長：５９５ｎｍ、繰り返し回数：３、繰り返し間隔：０という条件で各サンプル、各濃度における測定を行った。測定した吸光度から透過度を求め、縦軸を透過度、横軸をｐＨとしたグラフを作成し、４つのサンプルの溶解点を比較した。グラフに漸近線を２本引き、その交点のｐＨを溶解点とした。作成したグラフを図９に示す。
【０１４９】
（評価結果）
図９より、Ｃ社製化学製とＢ社製のＨＡｐの溶解点はｐＨ＝４．０、Ａ社製のＦ−ＨＡｐの溶解点はｐＨ＝３．２、作製したＦ−ＨＡｐの溶解点はｐＨ＝２．９であった。よって、作製したＦ−ＨＡｐは、ＨＡｐと比較して耐酸性が高いことが確認できた。今回合成したＦ−ＨＡｐとＡ社製Ｆ−ＨＡｐの耐酸性の違いは、フッ素含有率の違いに由来するものと考えられた。
【０１５０】
＜抗菌性評価＞
次に、上記で作成したＦ−ＨＡｐに対する抗菌性評価について説明する。以下の説明では、評価方法、評価結果の順に説明する。
【０１５１】
（評価方法）
作製したＦ−ＨＡｐを用いて、粉末添加法によりＦ−ＨＡｐの抗菌性を評価した。なお、Ｆ−ＨＡｐの抗菌性は、大腸菌に対して行った。なお、フッ化ナトリウムを用いてフッ化物イオンの抗菌性も併せて評価した。フッ化物イオンの抗菌性評価については、表７に記載の７菌種に対して行った。
【０１５２】
【表７】
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【０１５３】
〔菌の準備〕
菌液の濃度を調整するためにマイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。液体培養した菌を２０倍に希釈し、プレートに１５０μＬスポットし波長６００ｎｍにおける吸光度を測定した。バックグラウンドには１４０ｍＭのＮａＣｌを用いた。吸光度の値が０．１（１０５個／μＬ）になるよう菌液を希釈した。
【０１５４】
〔アッセイ〕
粉末添加法
１００μＬ  の１４０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液に分散させたＦ−ＨＡｐ（Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｆ１．８（ＯＨ）０．２：式量＝１００８．２）を含む溶液と、菌液１００μＬをチューブの中に入れ、ピペッティングし、１時間プチローターで撹拌を行い、Ｆ−ＨＡｐと細菌とを接触させた。次いで、チューブ５本に１８０μＬずつＮａＣｌ溶液を入れたものを用意し、順番に（１）〜（５）と番号をつけ、１時間撹拌させた細菌とＦ−ＨＡｐの混合液２０μＬを（１）に入れ、ピペッティングして十分に撹拌した。次に（１）の溶液２０μＬを（２）に入れ、ピペッティングして十分に撹拌した。これを図４のように（２）から（３）、（３）から（４）・・・と同様の手順で繰り返し、細菌とＦ−ＨＡｐの混合液を希釈した（２０μＬを１８０μＬに加えているため、１０倍ずつ希釈していることになる）。さらに、１０倍ずつ５段階に希釈した溶液を濃度の薄い（５）から順番に５μＬずつ寒天培地のシャーレにスポットし、３７℃に設定したインキュベータで１日培養した。なお、抗菌性試験のコントロールとしてＢ社製ＨＡｐを使用した。以上のような評価を、１００μＬのＮａＣｌ溶液に分散させるＦ−ＨＡｐの含有量を変化させた実施例１〜７の溶液に対して行った。なお、上記Ｆ−ＨＡｐの組成式は、Ｆ−ＨＡｐサンプル中のフッ化物イオンの理論濃度１８．８ｍｇ／Ｌ（１００％フッ化物イオンに置換されていた場合）をベースに、作製したサンプルの実測値（１６．９ｍｇ／Ｌ）との比を計算し、元々のＨＡｐ；Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ２）と１００％フッ化物イオンに置換されたＦ−ＨＡｐ；Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｆ２より、理論量に不足したイオン種は、すべて水酸化物イオンに換算して求めた。
【０１５５】
フッ化ナトリウムを用いた抗菌性試験の方法
人体に害のない濃度の５０ｍＭのＮａＦ溶液を作製し、フィルトレーションを行い除菌した。それをオートクレーブしたＬＢ溶液と混合して５ｍＭ、０．５ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．００５ｍＭ、０ｍＭの５つの濃度の異なる混合液を作製し、プレートに流し込んでＮａＦ入りの寒天培地を用意した。液体培養させた細菌をＯＤ６００の値を１（１０６個／μＬ）として濃度のことなる５つのプレートに５μＬスポットし図１０のようにコンラージ棒で塗り広げた。その後３７℃に設定したインキュベータで１日培養した。
【０１５６】
（評価結果）
〔Ｆ−ＨＡｐの抗菌性〕
上記粉末添加法によりＦ−ＨＡｐの抗菌性試験を行った結果、菌液に加えるＦ−ＨＡｐ溶液の濃度を４９．６ｍｍｏｌ／Ｌ以上にすると５３．７〜９９．９％の抗菌性を確認することができた。その結果を表８に示す。なお、表８の上段にはコントロールとしてのＨＡｐの結果を示し、下段にはＦ−ＨＡｐの結果を示している。表８に記載の殺菌率は、コントロールのコロニー数に対するＦ−ＨＡｐのコロニー数の割合、すなわち、（Ｆ−ＨＡｐのコロニー数の減少数）／（コントロールのコロニー数）から求めた。
【０１５７】
【表８】
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【０１５８】
表８に記載のようにＦ−ＨＡｐの濃度を変えて抗菌性試験を行ったところ、全ての実施例において抗菌性を確認することができた。その殺菌率はＦ−ＨＡｐ濃度が９９．２ｍｍｏｌ／Ｌ以上で９８．０％〜９９．９％であった。
【０１５９】
Ｆ−ＨＡｐ濃度が４９．６ｍｍｏｌ／Ｌでは５３．７％の殺菌率がみられたため、Ｆ−ＨＡｐが４９．６ｍｍｏｌ／Ｌ以上の場合、静菌性を有すると言える。また、Ｆ−ＨＡｐが９９．２ｍｍｏｌ／Ｌ以上の場合、殺菌性を有すると言える。
【０１６０】
ここで、本抗菌性試験に使用したＦ−ＨＡｐの組成は、Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｆ１．８（ＯＨ）０．２であることから、Ｆ−ＨＡｐが抗菌性（静菌性）を発現するためのフッ化物イオン換算での濃度（フッ化物イオン濃度）は、４９．６ｍｍｏｌ×１．８＝８９．３ｍｍｏｌ／Ｌ以上（さらに殺菌率９５％以上の抗菌性を発現するためには、１７８．６ｍｍｏｌ／Ｌ以上）である。このフッ化物イオン濃度は、例えば、広く抗菌性が認知されている銀イオンが大腸菌に対する抗菌性を発現可能な濃度である５〜１０ｐｐｂ（０．０９３×１０−３ｍｍｏｌ）や、上記Ａｇ−ＨＡｐの抗菌性を発現可能な銀イオン濃度である２．４７ｍｍｏｌ／Ｌと比較して、抗菌性を発現するためにより高い（フッ化物）イオン濃度を必要とすることがわかった。このことから、Ｆ−ＨＡｐの抗菌性は、銀イオン単独の抗菌性、更にはＡｇ−ＨＡｐの抗菌性と比較してもマイルドであると言える。
【０１６１】
〔フッ化物イオンの抗菌性〕
上記方法で行ったフッ化ナトリウム用いた抗菌性試験の結果を図１１に示す。（１）がセレウス菌、（２）がサルモネラ菌、（３）が黄色ブドウ球菌、（４）が大腸菌、（５）が緑膿菌、（６）が肺炎桿菌、（７）が化膿レンサ球菌である。
【０１６２】
図１１に示すように、５つの濃度の異なるプレートを比較すると、（７）の化膿レンサ球菌が濃度が上がるにつれて薄くなっていることが確認できた。よって、フッ化物イオン自体は化膿レンサ球菌に対して抗菌性があることが分かった。ここで、フッ化物イオン自体は大腸菌に対しては抗菌性を有していないにも関わらず、Ｆ−ＨＡｐは大腸菌に対する抗菌性を有している理由は明らかではないが、Ｆ−ＨＡｐの抗菌性は、単にフッ化物イオン自体の抗菌性によるものではないことが推測された。このように、本試験及びＦ−ＨＡｐの抗菌性試験の結果から、フッ化物イオン単独では、抗菌性を発現可能な菌種と発現不可能な菌種があるが、Ｆ−ＨＡｐはフッ化物イオン単独では抗菌性を発現できない菌種（例えば、化膿レンサ球菌）に対しても抗菌性を発現できることがわかった。
【０１６３】
以上、図面を参照しながら本発明の好適な実施の形態について説明したが、本発明は上述した形態に限定されない。すなわち、特許請求の範囲に記載された発明の範囲内で当業者が想到し得る他の形態または各種の変更例についても本発明の技術的範囲に属するものと理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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