(57)【要約】      （修正有）【課題】超高熱菌由来の新たなメチル化酵素及びそれを用いた組換えベクターの製造方法の提供。【解決手段】本発明のメチル化酵素は、特定のアミノ酸配列からなるタンパク質からなり、主として、ＧＣＮＧＣ（Ｎは、アデニン、グアニン又はチミンである。）という部分配列を少なくとも１つ有する塩基配列１中の、前記部分配列における２番目のシトシンの少なくとも１つにメチル基を導入する活性を有する。このメチル化酵素の活性を応用して、対象遺伝子２が正しく挿入されたか否かを容易にスクリーニングし得る、対象遺伝子を含有する組換えベクターの製造方法も提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）よりなる群より選ばれるいずれかのタンパク質からなるメチル化酵素：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ塩基配列における少なくとも１つのシトシンにメチル基を導入する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列において、６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、かつ塩基配列における少なくとも１つのシトシンにメチル基を導入する活性を有するタンパク質。
【請求項２】
ＧＣＮＧＣという部分配列を少なくとも１つ有する塩基配列中の、前記部分配列における２番目のシトシンの少なくとも１つにメチル基を導入する活性を有し、前記Ｎは、アデニン、グアニン又はチミンである、請求項１記載のメチル化酵素。
【請求項３】
対象遺伝子を含有する組換えベクターの製造方法であって、
以下の（１）又は（２）：
（１）配列番号２で表されるＤＮＡ配列、
（２）配列番号２で表されるＤＮＡ配列と相同性が９０％以上の塩基配列であって、かつ塩基配列における少なくとも１つのシトシンにメチル基を導入する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、
を含有する第１の組換えベクターを製造するステップと；
第１の組換えベクターにおける上記（１）又は（２）のＤＮＡ配列の一部を切断するステップと；
前記切断された箇所に対象遺伝子を挿入して第２の組換えベクターを得るステップと；
を有する、上記組換えベクターの製造方法。
【請求項４】
上記ＤＮＡ配列の一部を切断するステップでは、第１の組換えベクターに含まれる配列番号２で表されるＤＮＡ配列の（ア）１１３５番目の塩基と１１３６番目の塩基との間、又は（イ）１３３０番目と１３３１番目との間、を切断する、請求項３記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチル化酵素及びそれを用いた組換えベクターの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
至適生育温度が８０℃以上である超好熱菌と呼ばれる菌類については、いわゆる古細菌であり、原始生命体に近いと推測されており、その酵素の利用が期待されている。例えば、アデニンをメチル化する超高熱菌由来の酵素が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第６０１２５６２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
真菌や真核生物のメチル化酵素については種々の研究がなされているが、超高熱菌をはじめとする古細菌のメチル化酵素については研究が進んでいるとは言い難く、また、その応用についての具体的な提案も見当たらないのが現状である。
【０００５】
上記事情を考慮し、本発明は、超高熱菌由来の新たなメチル化酵素及びそれを用いた組換えベクターの製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らが鋭意検討した結果、本発明を完成した。
本発明のメチル化酵素は、以下の（ａ）〜（ｃ）よりなる群より選ばれるいずれかのタンパク質からなる。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ塩基配列における少なくとも１つのシトシンにメチル基を導入する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列において、６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、かつ塩基配列における少なくとも１つのシトシンにメチル基を導入する活性を有するタンパク質。
【０００７】
好ましくは、本発明のメチル化酵素は、ＧＣＮＧＣという部分配列を少なくとも１つ有する塩基配列中の、前記部分配列における２番目のシトシンの少なくとも１つにメチル基を導入する活性を有する。ここで、前記Ｎは、アデニン、グアニン又はチミンである。なお、「前記部分配列における２番目のシトシンの少なくとも１つ」の意味は、メチル化の対象である塩基配列中にＧＣＮＧＣという部分配列が複数存在する場合に、それらＧＣＮＧＣという部分配列の少なくとも１つにおいて、その２番目のシトシンがメチル化される、ということである。
【０００８】
本発明では、対象遺伝子を含有する組換えベクターの新たな製造方法も提供する。本発明による組換えベクターの製造方法では、（１）配列番号２で表されるＤＮＡ配列、または（２）配列番号２で表されるＤＮＡ配列と相同性が９０％以上の塩基配列であって、かつ塩基配列における少なくとも１つのシトシンにメチル基を導入する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、を含有する第１の組換えベクターが製造され、得られた第１の組換えベクターにおける上記（１）又は（２）のＤＮＡ配列の一部が切断され、前記切断された箇所に対象遺伝子を挿入して第２の組換えベクターが得られる。前記第２の組み換えベクターが製造目的の組換えベクターである。
【０００９】
好ましくは、上記ＤＮＡ配列の一部を切断するステップでは、第１の組換えベクターに含まれる配列番号２で表されるＤＮＡ配列の（ア）１１３５番目の塩基と１１３６番目の塩基との間、又は（イ）１３３０番目と１３３１番目との間、が切断される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、耐熱性のメチル化酵素としてはたらき、とくに、遺伝子における「ＧＣＮＧＣ部分配列（ＮはＣ以外）」の二番目のシトシンを選択的にメチル化し得る新たなメチル化酵素が提供される。
【００１１】
さらに、本発明のメチル化酵素の応用例として、対象遺伝子を含む組換えベクターの製造方法も提供される。上述した製造方法によれば、得られた組換えベクターに対象遺伝子が挿入されたか否かを容易にスクリーニングすることができる。何故ならば、対象遺伝子が挿入されたのであれば、メチル化酵素のメチル化活性は失活し、宿主（大腸菌等）は増殖可能であるのに対し、対象遺伝子の挿入に失敗していれば、メチル化酵素のメチル化活性が残存し、宿主（大腸菌等）の増殖が妨げられるからである。したがって、本発明の製造方法においては、コロニー生成の有無を以って、対象遺伝子の挿入の成否を知ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明による組換えベクターの製造方法の説明図である。
【図２】本発明のメチル化酵素のメチル化活性の測定データである。
【図３】バイサルファイトシーケンス法による本発明のメチル化酵素のメチル化活性の測定データである。
【図４】本発明のメチル化酵素のメチル化活性の温度依存性を示す測定データである。
【図５】形質転換した大腸菌の培養結果の観察写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のメチル化酵素は、超好熱古細菌Aeropyrum pernix由来のタンパク質であり、配列番号１のアミノ酸配列をもつタンパク質からなる。前記アミノ酸配列については、６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であればよく、例えば、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されていてもよい。前記同一性については、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上である。
【００１４】
タンパク質のアミノ酸配列を求める方法は特に限定は無く、従来公知の方法を適宜採用することができる。
【００１５】
本発明のタンパク質は、他の塩基配列に対するメチル化活性をもつ。具体的には、本発明のタンパク質は、共存する塩基配列における少なくとも１つのシトシンにメチル基を導入することができる。一般的には、シトシンの５位の炭素に結合していた水素原子がメチル基に置換される。
【００１６】
本発明者らの新知見によれば、本発明のメチル化酵素のメチル化活性は、配列を認識する傾向があり、いわゆるｄｅ  ｎｏｖｏ型といわれる様式である。具体的には、共存する塩基配列が有するシトシンを無作為にメチル化するのではなく、シトシンを選択的にメチル化する。本発明のメチル化酵素は、遺伝子における「ＧＣＮＧＣ」という部分配列における二番目のシトシンを選択的にメチル化する。ここで、「Ｎ」はＣ（シトシン）以外の塩基を意味する。
【００１７】
本発明のメチル化酵素のメチル化活性における選択性は、後述の実施例において実証される。なお、本発明のメチル化酵素は、上述の「ＧＣＮＧＣ」という部分配列における五番目のシトシンや上述の「ＧＣＮＧＣ」という部分配列以外のシトシンをメチル化するものも包含する。本発明のメチル化酵素については、上述の「ＧＣＮＧＣ」という部分配列における五番目のシトシン及び上述の「ＧＣＮＧＣ」という部分配列以外のシトシンは、なるべくメチル化しないことが好ましく、メチル化する割合は、上述の「ＧＣＮＧＣ」という部分配列における五番目のシトシン及び上述の「ＧＣＮＧＣ」という部分配列以外のシトシンの全個数の好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下である。
【００１８】
本発明のメチル化酵素は、上述の「ＧＣＮＧＣ」という部分配列における二番目のシトシンをなるべく全てメチル化することが好ましく、本発明のメチル化酵素については、上述の「ＧＣＮＧＣ」という部分配列における二番目のシトシンの全個数の好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上のシトシンをメチル化する。
【００１９】
本発明のメチル化酵素のメチル化活性の評価方法は特に限定は無く、公知技術などを適宜参照することができる。例えば、ＭＴａｓｅ−Ｇｌｏ（商品名）Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙを用いた評価などが挙げられる。このアッセイは、様々なメチルトランスフェラーゼの活性を測定するための発光アッセイである。様々な種類のメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＡ、タンパク質、ＲＮＡ、低分子）は、メチル基供与基質としてＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を用いて、反応産物としてＳ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＭ）を生じさせる。上記アッセイを用いる評価法は、ＳＡＨを検出し、メチラーゼ活性を測定する解析法である。
【００２０】
本発明のメチル化酵素は、耐熱性があり、好ましくは、４０〜９５℃においてメチル化活性を呈する。
【００２１】
本発明のメチル化酵素は、対応する遺伝子をもつベクターから大腸菌などの増殖、タンパク質の発現誘導を介して得ることができる。前記遺伝子として、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡや、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡと相同性が９０％以上の塩基配列からなり、上述したメチル化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列をもつ遺伝子が挙げられる。前記相同性については、好ましくは９５％以上であり、より好ましくは９９％以上である。これら、「配列番号２で表される塩基配列」及び、「配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡと相同性が９０％以上の塩基配列からなり、上述したメチル化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列」をあわせて、「配列番号２で表される塩基配列等」と呼ぶ。
【００２２】
配列番号２で表される塩基配列は、超好熱古細菌Aeropyrum pernix由来のものであり、種々のベクター等に挿入することができる。例えば、配列番号２で表される塩基配列に対してＰＣＲを用いて制限酵素サイト（ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ）を付加し、発現用ベクターｐＣｏｌｄＩに挿入することによりベクターを構築することができる。配列番号２で表される塩基配列のＤＮＡを得る手段は特に限定は無く、人工遺伝子の合成に関する種々の技術を適宜用いることができる。
【００２３】
構築したベクターで大腸菌等を形質転換することができる。大腸菌としては市販のものを適宜用いることができ、例えば、タカラバイオ社製E. coli JM109などが挙げられる。なお、挿入した遺伝子がタンパク質を作ってしまう菌株を宿主とすると、本発明のメチル化酵素が宿主の増殖前に産生してしまい、宿主の増殖を阻害するおそれがある。よって、そのような菌株の使用は好ましくなく、そういった菌株としては、例えば、タカラバイオ社製E. coli DH5αなどが挙げられる。他方、上述のE. coli JM109などのように、ＩＰＴＧを塗布しない限りインサート由来のタンパク質を作製しない菌株が好ましい。そういった好ましい菌株として、E. coli DH5αなどの他に、例えば、E.coli HB101、E.coki Rosettaなどが挙げられる。
【００２４】
大腸菌を増殖させ、その後、発現誘導をかけて本発明のメチル化酵素を発現させることができる。それらの具体的な手法は、公知技術などを適宜参照することができる。なお、本発明のメチル化酵素の精製の際は、大腸菌を破砕した後、遠心した沈殿物（目的タンパク質は凝集しているため沈殿する）を、８５〜９５℃にて、５〜１５分間熱処理することにより可溶化させ、（A. pernixの至的な温度であるため、リフォールディングして本来の構造になったと推察される。）し、ベクター由来のタグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）をもとに精製することができる。
【００２５】
本発明のメチル化酵素の応用的な使用例として、本発明者らは以下に詳述する組換えベクターの製造方法を、本発明の実施形態の一つとして提案する。この組換えベクターの製造方法は、所望の遺伝子（以下、「対象遺伝子」と呼ぶ。）を含有する組換えベクターを製造する方法であり、以下、「本発明による組換えベクターの製造方法」と呼ぶ。
【００２６】
図１は、本発明による組換えベクターの製造方法の説明図である。
図１（Ａ）に示すように、本発明による組換えベクターの製造方法では、対象遺伝子の挿入に先立って、まず、「第１の組換えベクター」を製造する。第１の組換えベクターは、上記参照した配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡや、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡと相同性が９０％以上の塩基配列からなり、上述したメチル化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。前記相同性については、好ましくは９５％以上であり、より好ましくは９９％以上である。
【００２７】
第１の組換えベクターを得るための発現用ベクター（図１における符号３）としては、上記参照したｐＣｏｌｄＩなどを特に限定無く挙げることができる。発現用ベクターに配列番号２で表される塩基配列等（図１における符号１）を挿入する方法については、遺伝子工学分野の従来技術を適宜参照することができる。なお、図１（Ａ）における２つの矢印は、後述する、配列番号２で表される塩基配列等の切断を予定する箇所を示す。
【００２８】
次いで、図１（Ｂ）に示すように、得られた第１の組換えベクターに含まれる配列番号２で表される塩基配列等の一部を切断する。切断にあたっては、例えば、配列番号２で表される塩基配列等において切断したい塩基を境に反対向きのプライマーを使ってベクターごと遺伝子を増殖させる、いわゆるインバースＰＣＲの手法が用いられる。これによって、第１の組換えベクターに含まれる配列番号２で表される塩基配列等の所望の位置が切断されたベクターを得ることができる。図１における符号１１及び１２は、配列番号２で表される塩基配列等が切断された各々の断片を示す。
【００２９】
切断の際に用いるインバースＰＣＲについては、公知のものを適宜用いることができ、具体的には、例えば東洋紡社製のKOD DNAポリメラーゼなどが挙げられる。インバースＰＣＲの導入やベクターの増殖等については、従来技術を適宜参照することができる。
【００３０】
ここで、切断の際には、第１の組換えベクターに含まれる配列番号２で表される塩基配列の１１３５番目の塩基と１１３６番目の塩基との間を切断することが好ましい。１１３５番目付近の塩基配列の変化が、メチル化酵素の機能に影響を及ぼすからである。同様の理由から、別途好ましくは、配列番号２で表される塩基配列の１３３０番目の塩基と１３３１番目の塩基との間の切断である。
【００３１】
次いで、図１（Ｃ）に示すように、上述の切断された箇所に対象遺伝子（図１における符号２）を挿入する。このように、対象遺伝子を挿入したベクターを第２の組換えベクターと呼ぶ。第２の組換えベクターが、本発明による組換えベクターの製造方法によって得るべき組換えベクターである。
【００３２】
対象遺伝子の挿入の具体的な手法は特に限定は無く、従来技術を適宜参照することができる。例えば、他の制限酵素を用いることも可能であり、また、ＰＣＲ産物としてのベクターとインサートをそれぞれ増幅させた後ブラントエンド同士をリガーゼで結合させることも、ＴＡクローニングのような方法でも可能である。対象遺伝子については、特に限定は無く、第１の組換えベクターへ挿入可能であればよい。
【００３３】
このようにして得られた第２の組換えベクターで大腸菌等を形質転換し、培養することにより、対象遺伝子を増殖せしめることができる。このとき、ＩＰＴＧなどの添加により、本発明のメチル化酵素の発現を誘導し得る処理を施すことにより、以下に説明する理由により、対象遺伝子が正しく挿入されたか否かを容易にスクリーニングすることができる。
【００３４】
まず、図１（Ｃ）に示すように、上述した第２の組換えベクターが正常に製造されている場合、換言すると、対象遺伝子が正しくベクター内に挿入されている場合を想定する。この場合には、配列番号２で表される塩基配列等は分断されて、対象遺伝子が挿入されている。よって、ＩＰＴＧなどの添加により、本発明のメチル化酵素の発現を誘導しようとする処理を施したとしても、配列番号２で表される塩基配列等は分断されてしまっているから、本発明のメチル化酵素は失活している。本発明のメチル化酵素が失活していれば、宿主である大腸菌等のＤＮＡに対するメチル化は生じず、結果として、大腸菌等の増殖に支障をきたさないため、培地にコロニーが生成するなどの増殖が実現する。
【００３５】
他方、図１（Ｄ）に示すように、上述した第２の組換えベクターが正常に製造されなかった場合、換言すると、対象遺伝子がベクター内に挿入されずに、配列番号２で表される塩基配列等（符号１）が分断されないままである場合を想定する。この場合には、第２の組換えベクターは正常に生成せずに、配列番号２で表される塩基配列等が分断されないままで大腸菌等の宿主を形質転換することになる。よって、ＩＰＴＧなどの添加により、本発明のメチル化酵素の発現を誘導しようとする処理を施すと、配列番号２で表される塩基配列等に起因して本発明のメチル化酵素が産生されてメチル化活性を呈し、宿主である大腸菌等のＤＮＡに対するメチル化が生じて、結果として、大腸菌等が増殖できなくなる。そのため、培地にコロニーが生成しないため、作業を中止せざるを得なくなる。言い換えれば、対象遺伝子を欠いたままで増殖作業を続行するという無駄な作業を省くことができる。
【００３６】
メチル化活性の有無と宿主の増殖有無との関係を今一度整理すると以下のとおりである。メチル化酵素の活性が残存する場合は、宿主（大腸菌等）の遺伝子におけるシトシンがメチル化されるから、宿主（大腸菌等）の増殖が妨げられる。逆に、メチル化酵素の活性が無い場合は、宿主（大腸菌等）の増殖を妨げる要因が無いから、宿主（大腸菌等）は増殖可能である。
【００３７】
なお、クローニングの際に、目的配列がクローニングできたか否かを知ることは、従来は比較的に煩雑な手法が採られてきた。例えば、「ブルーホワイトセレクション」という形で、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）の配列の中にＭＣＳ（マルチクローングサイト）を置き、クローニングできていれば白いコロニー、できていなければ青いコロニーが得られることで判断する方法が従来技術として挙げられる。ここで、ＭＣＳは、制限酵素配列が集まっていて、ＭＳＣに目的の対象遺伝子が入れられる。この手法では、ｌａｃＺ発現誘導用の試薬（ＩＰＴＧ）と発色させるための基質（Ｘ−Ｇａｌ）が必要になる。これに対して、本発明のメチル化酵素の製造方法では、発色させる基質が必要ではなく、インサートが入ったコロニーを選別することができる。また、上述のブルーホワイトセレクションでは、ホワイトコロニーでもインサートを持っていないものがあり、結果が不安定であるのに対し、本発明の製造方法では、安定してインサートを有しているもののみを選択することができる点で優位である。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に記載された態様に限定されるわけではない。
【００３９】
１．ベクターの構築
本発明のＤＮＡメチル化酵素を大腸菌で発現させるために、配列番号２で表される塩基配列のＤＮＡを人工的に合成した。この実施例で使用した発現ベクターはｐＣｏｌｄＩである（タカラバイオ社製）。ｐＣｏｌｄＩはコールドショックベクターであり、大腸菌コールドショック遺伝子プロモーターを利用している。
【００４０】
得られた遺伝子配列についてＰＣＲ法を用いて、制限酵素サイト（ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ）を付加し、発現用ベクターｐＣｏｌｄＩに挿入してベクターを作製した。上述の合成遺伝子についてＰＣＲ法を施した。プライマーには、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩの制限酵素サイトと終止コドン（ＴＧＡＴＡＡ）を付加したものを使用し、ＰＣＲ後にアガロースゲル電気泳動した。ＰＣＲ産物を遠心分離により精製し、精製したＰＣＲ産物とｐＣｏｌｄＩとを制限酵素処理に施し、さらに、ゲル精製の処理を行った。その後、前記処理を行ったものを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘによりライゲーションし、形質転換のために、氷上のコンピテントセル（宿主としてのE. coli DH5αを含む。）に加え、氷上３０分間静置の後に、４２℃のウォーターバスでヒートショックに施し、再び冷やして、ＳＯＣ培地を添加し、アンピシリン塗布したＬＢ寒天培地に菌液を塗布して、３７℃にて培養した。
【００４１】
塩基配列を確認するために、上述の形質転換によって培地に生えてきたコロニーについて、コロニーＰＣＲを行った。その後、アガロースゲル電気泳動に供した。次いで、遠心分離によりプラスミドを抽出し、制限酵素処理を行って、サーマルサイクラーにかけて、ＤＮＡシーケンスを行った。
【００４２】
２．タンパク質の発現及び精製
大腸菌を増殖させ、その後、発現誘導をかけてタンパク質（本発明のメチル化酵素）を発現させた。大腸菌を破砕し、遠心した沈殿物を９０℃にて１０分間熱処理することにより可溶化し、ベクター由来のタグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）をもとに精製した。
【００４３】
タンパク質の発現誘導はコールドショックによって行った。具体的には、コロニーをピックアップして、前培養し、次いで、アンピシリンを加えたＬＢ培地で培養し（３７℃）、１６℃の水に置いて、ＩＰＴＧを加えて、さらに１６℃で一晩培養した。
【００４４】
大腸菌の破砕については、超音波破砕による破砕及び振とうによる破砕の両方を試み、どちらも適用可能であった。大腸菌の破砕後の加熱処理に次いで、遠心分離によって可溶化区分に対してＨｉｓ−Ｔａｇ精製を行った。
【００４５】
上記抽出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、分子量を評価した。具体的にはSDS-PAGEゲルを作製し、泳動させ、泳動したゲルをCBB染色液で着色し分子量のバンドを確認した。これにより、目的分子量５８．２  ｋＤａ付近にバンドが確認され、配列番号１で表されるアミノ酸配列をもつタンパク質の発現が確認された。
【００４６】
３．メチル化酵素としての活性評価
メチル化する対象のＤＮＡとして、タカラバイオ社製、λＤＮＡを原料とする、オリゴ二本鎖ＤＮＡ及びＧＣＮＧＣを比較的多く含む領域をＰＣＲによって増幅したものを用いて、上記得られたタンパク質のメチル化活性を評価した。メチル化の評価には、発光アッセイを利用するMTase-Glo(TM) Methyltransferase Assayを用い、必要に応じてバイサルファイトシーケンス法を用した。
【００４７】
評価用サンプルとして、上記Ｈｉｓ−ｔａｇ精製後のサンプルから遠心分離により限外濾過カラムを用いてタンパク質を回収した。オリゴ二本鎖ＤＮＡは、λＤＮＡ（一本鎖）を加熱して得た。オリゴ二本鎖ＤＮＡとは別に、λＤＮＡ上の、ＧＣＮＧＣ（但し、Ｎはシトシン以外である。）を比較的多く含む領域をＰＣＲによって増幅したもの（以下、「ＰＣＲによる増幅物」）を得た。これら、オリゴ二本鎖ＤＮＡ及びＰＣＲによる増幅物を、それぞれ、対象のＤＮＡとして用いた。
【００４８】
メチル化の評価は、マイクロチューブ中で、上記タンパク質、上記オリゴ二本鎖ＤＮＡ又はＰＣＴによる増幅物、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＭ）、バッファ及びＤ２Ｗを含む反応液中で、４０℃にて２時間（オリゴ二本鎖ＤＮＡの場合）又は６０℃にて一晩（ＰＣＲによる増幅物の場合）反応させた後に、メチル化活性を評価した。
【００４９】
オリゴ二本鎖ＤＮＡへのメチル化活性の評価は、MTase-Glo(TM) Methyltransferase Assayのプロトコルに従ってメチル化活性を評価した。なお、MTase-GloTM  Methyltransferase Assayでは、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）を検出し、メチラーゼ活性を測定する解析法である。ＳＡＨは、様々な種類のメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＡ、タンパク質、ＲＮＡ、低分子）からメチル基供与基質としてＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を用いることで得られる反応産物である。上記メチラーゼ反応後、ＳＡＨをＡＤＰに変換する(MT)ase-GloTMReagentを加える。次にMTase-Glo(MT) Detection Solutionを添加し、ＡＤＰをＡＴＰに変換し、ＡＴＰをルシフェラーゼ反応で検出する。発光の半減期は４時間であり、プレートタイプのルミノメーターで発光を測定できる。
【００５０】
他方、ＰＣＲによる増幅物へのメチル化活性の評価はバイサルファイトシーケンス法により行った。具体的には、上記反応後に、MethylEas(TM) Xceed Rapid DNA Bisulphite Modification Kitのプロトコルに従い、バイサルファイト処理をして、Ｅｐｉ  ｔａｑでバイサルファイト処理後のＤＮＡサンプルをＰＣＲし、ゲル切り精製後、ＴＡクローニングを行った。
【００５１】
図２は、オリゴ二本鎖ＤＮＡに対する、本発明のメチル化酵素のメチル化活性の測定データである。発光量の多寡がメチル化活性の高低を表す。図２（Ａ）は発光量のデータであり、図２（Ｂ）は、図２（Ａ）の横軸記載の略号に対応する塩基配列を表す。
【００５２】
図２に示されるように、本発明のメチル化酵素は、ＧＣＮＧＣのオリゴ二本鎖ＤＮＡに対して高いメチラーゼ活性を示した。このように、本発明のメチル化酵素は、オリゴ二本鎖ＤＮＡに含まれるＧＣＮＧＣの配列を認識していることが示唆された。
【００５３】
図３は、バイサルファイトシーケンス法による本発明のメチル化酵素のメチル化活性の測定データである。図３に示すように、ＧＣＡＧＣ、ＧＣＴＧＣの配列においては、メチル基転移率は１００％であり、ＧＣＣＧＣの配列では１７．９％であり、ＧＣＧＧＣの配列は６２．９％であった。また、いずれの塩基配列でも、ＧＣＮＧＣの２番目のシトシンにメチル基を転移していた。そして、全配列中、ＧＣＮＧＣ中の２番目のシトシン以外にはメチル基転移は確認されなかった。これらの結果から、本発明のメチル化酵素は、ＧＣＮＧＣを識別し、２番目のシトシンにメチル基を転移し、中でもＧＣＷＧＣ（但し、Ｗはアデニン又はチミンである。）に対して特に強い活性を持つことが示唆された。
【００５４】
さらに、温度変化に対する本発明のメチル化酵素の活性の変化を調べた。この実験では、メチル化する対象のＤＮＡとして、タカラバイオ社製、λＤＮＡをそのまま用いた。上記と同様の評価系において、反応温度を、２０℃、４０℃、６０℃及び８０℃にてそれぞれ評価した。反応時間は３０分間とした。
【００５５】
図４は、本発明のメチル化酵素のメチル化活性の温度依存性を示す測定データである。図４に示されるように、４０℃でＤＮＡメチラーゼ活性を示し、６０℃で最大となり、８０℃までメチラーゼ活性を示した。結果より６０℃が至適温度であることが示唆された。少なくとも４０〜８０℃においては本発明のメチル化酵素の活性が認められた。なお、高温域で活性が低くなるかのようなデータが得られることについては、メチル化酵素の活性低下という要因の他に、高温に起因するＤＮＡの変性という要因もあり得る点に留意を要する。
【００５６】
４．対象遺伝子を含有する組換えベクターの製造及び検証例
上記「１．ベクターの構築」の項目において製造したベクターについて、インバースＰＣＲを用いて、図１（Ｂ）に示すように、配列番号２の塩基配列の所定位置を分断した。分断箇所として、配列番号２の塩基配列の１１３５番目の塩基で分断するもの、配列番号２の１３３０番目の塩基で分断するもの、及び、塩基の分断をしないもの、の３種類を調製した。
【００５７】
インバースＰＣＲのプライマーは以下のとおりである。
配列番号２の塩基配列の１１３５番目の塩基で分断する場合：
Ｆｗは配列番号３、Ｆｖは配列番号４、
配列番号２の塩基配列の１３３０番目の塩基で分断する場合：
Ｆｗは配列番号５、Ｆｖは配列番号６。
【００５８】
上記調製した、所定位置の塩基で分断したベクター２種について、分断箇所に対象遺伝子を挿入することにより、組換えベクターを製造した。この実施例では対象遺伝子として、ＧＦＰ遺伝子を用いた。また、比較のために、分断した塩基に何も挿入せずに分断箇所をそのまま繋ぎなおしたものを、対象遺伝子の挿入に失敗したもののモデルとして調製した。
【００５９】
以上のように調製した各ベクターを用いて、上述したよう大腸菌（E. coli DH5α）を形質転換した。それぞれ、形質転換した大腸菌について、培地にて培養を行った。培地には、本発明のメチル化酵素の発現を促すＩＰＴＧを加えたものと、加えないものを用意した。
【００６０】
図５は、形質転換した大腸菌の培養結果の観察写真である。６枚の写真のうち、左側の３枚は、メチル化酵素の発現を促すＩＰＴＧを加えないものであり、右側の３枚は、メチル化酵素の発現を促すＩＰＴＧを加えたものである。６枚の写真のうち、上段２枚は、ＧＦＰ遺伝子を挿入しなかったものであり、中段２枚は、ＧＦＰ遺伝子を配列番号２の塩基配列の１１３５番目の塩基で分断したところに挿入したものであり、下段２枚は、ＧＦＰ遺伝子を配列番号２の塩基配列の１３３０番目の塩基で分断したところに挿入したものであり、
【００６１】
メチル化酵素の発現を促すＩＰＴＧを加えなかったものについては（図５の左側３枚）、いずれも大腸菌のコロニーが観察された。メチル化酵素が産生せず、大腸菌の増殖が妨げられなかったことが推察される。
【００６２】
ＧＦＰ遺伝子を挿入せず、かつ、ＩＰＴＧを加えたものについては（図５の右上の写真）、大腸菌のコロニーが観察されなかった。メチル化酵素が産生してメチル化活性が発現して、大腸菌の遺伝子におけるシトシンがメチル化され、結果として、大腸菌の増殖が妨げられたことが推察される。
【００６３】
ＧＦＰ遺伝子を挿入し、かつ、ＩＰＴＧを加えたものについては（図５の右側中段及び下段の写真）、大腸菌のコロニーが観察された。ＧＦＰ遺伝子の挿入により、メチル化酵素が消失し、大腸菌の増殖が妨げられなかったことが推察される。
【００６４】
このように、配列番号２の塩基配列を含むベクターを分断して対象遺伝子を挿入することにより、当該挿入が成功したか否かが、コロニー生成の有無により容易に判定できた。
【符号の説明】
【００６５】
１  塩基配列                    ２  対象遺伝子
３  発現用ベクター              １１、１２  切断後の塩基配列の断片
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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