(57)【要約】【課題】  本発明は、従来のシート状細胞培養物と比較して高い強度を有するが、同等の治療効果を有する医療用細胞培養物、当該医療用細胞培養物の製造方法、当該医療用細胞培養物を用いた疾患の処置方法などを提供することを目的とする。【解決手段】  接着細胞を含み、細胞が互いに連結して所定の形状に形成された医療用細胞培養物であって、該形状が、厚みのある周縁部を有するシート状または環状である、前記医療用細胞培養物を提供することにより、上記課題が解決された。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
接着細胞を含み、細胞が互いに連結して所定の形状に形成された医療用細胞培養物であって、該形状が、厚みのある周縁部を有するシート状である、前記医療用細胞培養物。
【請求項２】
厚みのある周縁部が、シート形状の周縁部の細胞と該周縁部の細胞と連結していない他の接着細胞とが連結することにより形成される、請求項１に記載の医療用細胞培養物。
【請求項３】
他の接着細胞が、周縁部の細胞と同一の細胞培養物を形成する細胞である、請求項２に記載の医療用細胞培養物。
【請求項４】
細胞培養物が、中央部に孔を有するものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医療用細胞培養物。
【請求項５】
接着細胞を含み、細胞が互いに連結して所定の形状に形成された医療用細胞培養物であって、該形状が、環状である、前記医療用細胞培養物。
【請求項６】
接着細胞が、筋芽細胞または心筋細胞を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医療用細胞培養物。
【請求項７】
生体内に移植するためのものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医療用細胞培養物。
【請求項８】
心臓疾患を処置するためのものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医療用細胞培養物。
【請求項９】
接着細胞が互いに連結して所定の形状を形成する医療用細胞培養物の製造方法であって、
（ｉ）接着細胞を含む細胞集団を、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で培養基材に播種するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で播種された細胞集団を細胞培養液中でシート化してシート状細胞培養物を形成するステップ
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で形成されたシート状細胞培養物の外縁部を剥離させるステップ
を含み、形状が、厚みのある周縁部を有するシート状細胞培養物である、前記製造方法。
【請求項１０】
さらに、
（ｉｖ）剥離させた外縁部を、該外縁部の細胞と連結していない他の接着細胞と連結させ、厚みのある周縁部を形成するステップ
を含む、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
さらに
（ｖ）中央部に孔を形成するステップ
を含む、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
さらに
（ｖ’）中央部を除去するステップ
を含み、形状が、環状である、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１３】
接着細胞が、筋芽細胞または心筋細胞を含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１４】
培養基材が、血清で被覆されている、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１５】
ステップ（ｉ）において、細胞集団が、７．５×１０５個／ｃｍ２〜３．０×１０６個／ｃｍ２の密度で播種される、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１６】
医療用細胞培養物の適用により改善される疾患を処置する方法であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医療用細胞培養物の有効量を、それを必要とする対象に適用するステップを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、環状または厚みのある周縁部を有するシート状に形成された医療用細胞培養物、当該医療用細胞培養物の製造方法、当該医療用細胞培養物を用いた疾患の処置方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患により損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、間葉系幹細胞、心臓幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の利用が試みられている（非特許文献１）。
【０００３】
このような試みの一環として、スキャフォールドを利用して形成した細胞構造物や、細胞をシート状に形成したシート状細胞培養物が開発されてきた（特許文献１、非特許文献２）。
シート状細胞培養物の治療への応用については、火傷などによる皮膚損傷に対する培養表皮シートの利用、角膜損傷に対する角膜上皮シート状細胞培養物の利用、食道ガン内視鏡的切除に対する口腔粘膜シート状細胞培養物の利用などの検討が進められており、その一部は臨床応用の段階に入っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００７−５２８７５５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Haraguchi et al., Stem Cells Transl Med. 2012 Feb;1(2):136-41
【非特許文献２】Sawa et al., Surg Today. 2012 Jan;42(2):181-4
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本開示は、環状または厚みのある周縁部を有するシート状に形成された医療用細胞培養物、当該医療用細胞培養物の製造方法、当該医療用細胞培養物を用いた疾患の処置方法などを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
シート状細胞培養物の臨床応用が進むにつれて、より高品質で取り扱いが容易であり、簡便に製造可能なシート状細胞培養物を提供することが求められるようになってきた。本発明者らは、シート状細胞培養物の改良について研究する中で、温度応答性培養皿を用いたシート状細胞培養物の形成のためのインキュベート中に、形成されたシート状細胞培養物が自然と、外縁部から徐々に剥離してしまうという現象に直面した。
【０００８】
本発明者らはかかる現象についてさらに研究を続けたところ、外縁部が剥離した状態でさらにインキュベートを続けると、剥離した外縁部が収縮して丸まり、そのまま癒着してしまうという新たな知見を見出した。この時丸まって癒着した部分はシート状に形成した部分よりも強度が高まり、取り扱いが簡便であるにもかかわらず、シート形状の場合と遜色ない細胞活性を有することを見出し、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明に下記に掲げるものに関する：
［１］接着細胞を含み、細胞が互いに連結して所定の形状に形成された医療用細胞培養物であって、該形状が、厚みのある周縁部を有するシート状である、前記医療用細胞培養物。
［２］厚みのある周縁部が、シート形状の周縁部の細胞と該周縁部の細胞と連結していない他の接着細胞とが連結することにより形成される、［１］の医療用細胞培養物。
［３］他の接着細胞が、周縁部の細胞と同一の細胞培養物を形成する細胞である、［２］の医療用細胞培養物。
［４］細胞培養物が、中央部に孔を有するものである、［１］〜［３］の医療用細胞培養物。
［５］接着細胞を含み、細胞が互いに連結して所定の形状に形成された医療用細胞培養物であって、該形状が、環状である、前記医療用細胞培養物。
【００１０】
［６］接着細胞が、筋芽細胞または心筋細胞を含む、［１］〜［５］の医療用細胞培養物。
［７］生体内に移植するためのものである、［１］〜［６］の医療用細胞培養物。
［８］心臓疾患を処置するためのものである、［１］〜［７］の医療用細胞培養物。
［９］接着細胞が互いに連結して所定の形状を形成する医療用細胞培養物の製造方法であって、
（ｉ）接着細胞を含む細胞集団を、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で培養基材に播種するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で播種された細胞集団を細胞培養液中でシート化してシート状細胞培養物を形成するステップ
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で形成されたシート状細胞培養物の外縁部を剥離させるステップ
を含み、形状が、厚みのある周縁部を有するシート状細胞培養物である、前記製造方法。
【００１１】
［１０］さらに、
（ｉｖ）剥離させた外縁部を、該外縁部の細胞と連結していない他の接着細胞と連結させ、厚みのある周縁部を形成するステップ
を含む、［９］の製造方法。
［１１］さらに
（ｖ）中央部に孔を形成するステップ
を含む、［１０］の製造方法。
［１２］さらに
（ｖ’）中央部を除去するステップ
を含み、形状が、環状である、［１０］の製造方法。
［１３］接着細胞が、筋芽細胞または心筋細胞を含む、［９］〜［１２］の製造方法。
［１４］培養基材が、血清で被覆されている、［９］〜［１３］の製造方法。
［１５］ステップ（ｉ）において、細胞集団が、７．５×１０５個／ｃｍ２〜３．０×１０６個／ｃｍ２の密度で播種される、［９］〜［１４］の製造方法。
［１６］医療用細胞培養物の適用により改善される疾患を処置する方法であって、［１］〜［８］の医療用細胞培養物の有効量を、それを必要とする対象に適用するステップを含む、前記方法。
【発明の効果】
【００１２】
本開示の医療用細胞培養物は、従来のシート状細胞培養物を改変して製造することができ、従来のシート状細胞培養物の細胞活性などを損なうことなく簡便に製造が可能である。また、従来のシート状細胞培養物と比較して高い強度を有するため、例えばつまんで持ち上げる、移植部位に縫合するといった移植等の操作におけるハンドリング性が向上した細胞培養物となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本開示の細胞培養物の写真図である。
【図２】図２は、本開示の製造方法におけるステップ（ｉｉ）、ステップ（ｉｉｉ）およびステップ（ｉｖ）を模式化した図である。ステップ（ｉｖ）においては、周縁部が積層されたシート状である態様を表す。
【図３】図３は、本開示の製造方法におけるステップ（ｉｖ）の異なる態様を表す模式図である。Ａは周縁部が管状構造で環を形成する態様を表す。Ｂは、周縁部が、外縁部が内側に巻き込まれて形成された管状構造で管を形成する態様を表す。
【図４】図４は、培養容器に入った状態の本開示の細胞培養物の一態様を表す模式図である。かかる態様において、本開示の細胞培養物は、多角形の周縁部を有する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。
【００１５】
本開示において「所定の形状に形成された細胞培養物」は、細胞が互いに連結して所定の形状、例えばシート状や環状になったものをいう。細胞同士は、直接（接着分子などの細胞要素を介するものを含む）および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。シート状細胞培養物は、１の細胞層から構成されるもの（単層）であっても、２以上の細胞層から構成されるもの（積層（多層）体、例えば、２層、３層、４層、５層、６層など）であってもよい。また、シート状細胞培養物は、細胞が明確な層構造を示すことなく、細胞１個分の厚みを超える厚みを有する３次元構造を有してもよい。例えば、シート状細胞培養物の垂直断面において、細胞が水平方向に均一に整列することなく、不均一に（例えば、モザイク状に）配置された状態で存在していてもよい。
【００１６】
「外縁部」という場合、例えばシート状細胞培養物などの細胞培養物の最も外端の縁部をいう。「周縁部」という場合、外縁部を含む細胞培養物の比較的外側の部分をいう。具体的には例えば、外縁部からシート状細胞培養物の中心までを結ぶ線分上において、外縁部から２０％まで、外縁部から１５％まで、好ましくは外縁部から１０％まで、さらに好ましくは外縁部から５％までの距離にあたる部分をいう。中央部は、細胞培養物の外縁部でも周縁部でもない部分を言う。したがって具体的には例えば外縁部からシート状細胞培養物の中心までを結ぶ線分上において、中心から８０％まで、中心から８５％まで、好ましくは中心から９０％まで、さらに好ましくは中心から９５％までの距離にあたる部分をいう。
【００１７】
所定の形状に形成された細胞培養物は、好ましくはスキャフォールド（支持体）を含まない。スキャフォールドは、その表面上および／またはその内部に細胞を付着させ、細胞培養物の物理的一体性を維持するために当該技術分野において用いられることがあり、例えば、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製の膜等が知られているが、本開示の所定の形状に形成された細胞培養物は、かかるスキャフォールドがなくともその物理的一体性を維持することができる。また、本開示のシート状細胞培養物は、好ましくは、細胞培養物を構成する細胞由来の物質のみからなり、それら以外の物質を含まない。
【００１８】
所定の形状に形成された細胞培養物を構成する細胞は、シート状や環状など所定の形状を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、接着細胞（付着性細胞）を含む。接着細胞は、例えば、接着性の体細胞（例えば、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞など）および幹細胞（例えば、筋芽細胞、心臓幹細胞などの組織幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞などの多能性幹細胞、間葉系幹細胞等）などを含む。体細胞は、幹細胞、特にｉＰＳ細胞から分化させたもの（ｉＰＳ細胞由来接着細胞）であってもよい。所定の形状に形成された細胞培養物を構成する細胞の非限定例としては、例えば、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞など）、間葉系幹細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、臍帯血由来のものなど）、心筋細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、上皮細胞（例えば、口腔粘膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞など）、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞など）、肝細胞（例えば、肝実質細胞など）、膵細胞（例えば、膵島細胞など）、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞等が挙げられる。ｉＰＳ細胞由来接着細胞の非限定例としては、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞などの内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞などが挙げられる。
【００１９】
本開示において「筋芽細胞」は、横紋筋細胞の前駆細胞であり、骨格筋芽細胞および心筋芽細胞を含む。
本開示において「骨格筋芽細胞」は、骨格筋に存在する筋芽細胞を意味する。骨格筋芽細胞は当該技術分野でよく知られており、骨格筋から任意の既知の方法（例えば、特開２００７−８９４４２号公報に記載の方法など）により調製することもできるし、商業的に入手することもできる（例えば、Lonza、Cat# CC-2580）。骨格筋芽細胞は、限定されずに、例えば、ＣＤ５６、α７インテグリン、ミオシン重鎖ＩＩａ、ミオシン重鎖ＩＩｂ、ミオシン重鎖ＩＩｄ（ＩＩｘ）、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、Ｍｙｆ６、ミオゲニン、デスミン、ＰＡＸ３などのマーカーにより同定することができる。特定の態様において、骨格筋芽細胞はＣＤ５６陽性である。さらに特定の態様において、骨格筋芽細胞はＣＤ５６陽性およびデスミン陽性である。骨格筋芽細胞は、骨格筋を有する任意の生物、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に由来してもよい。一態様において、骨格筋芽細胞は哺乳動物の骨格筋芽細胞である。特定の態様において、骨格筋芽細胞はヒト骨格筋芽細胞である。
【００２０】
本開示において「心筋芽細胞」は、心筋に存在する筋芽細胞を意味する。心筋芽細胞は当該技術分野でよく知られており、Ｉｓｌ１などのマーカーにより同定することができる。心筋芽細胞は、心筋を有する任意の生物、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に由来してもよい。一態様において、心筋芽細胞は哺乳動物の心筋芽細胞である。特定の態様において、心筋芽細胞はヒト心筋芽細胞である。
本開示において「心筋細胞」は、心筋細胞の特徴を有する細胞を意味し、心筋細胞の特徴としては、限定されずに、例えば、心筋細胞マーカーの発現、自律的拍動の存在などが挙げられる。心筋細胞マーカーの非限定例としては、例えば、ｃ−ＴＮＴ（cardiac troponin T）、ＣＤ１７２ａ（別名ＳＩＲＰＡまたはＳＨＰＳ−１）、ＫＤＲ（別名ＣＤ３０９、ＦＬＫ１またはＶＥＧＦＲ２）、ＰＤＧＦＲＡ、ＥＭＩＬＩＮ２、ＶＣＡＭなどが挙げられる。
【００２１】
所定の形状に形成された細胞培養物を構成する細胞は、所定の形状に形成された細胞培養物による治療が可能な任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯目動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギなどが含まれる。また、所定の形状に形成された細胞培養物を構成する細胞の種類の数は特に限定されず、１種類のみ細胞で構成されていてもよいが、２種類以上の細胞を用いたものであってもよい。所定の形状に形成された細胞培養物を形成する細胞が２種類以上ある場合、最も多い細胞の含有比率（純度）は、所定の形状の形成終了時において、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上である。
【００２２】
細胞は異種由来細胞であっても同種由来細胞であってもよい。ここで「異種由来細胞」は、細胞培養物が移植に用いられる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、サルやブタに由来する細胞などが異種由来細胞に該当する。また、「同種由来細胞」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト細胞が同種由来細胞に該当する。同種由来細胞は、自己由来細胞（自己細胞または自家細胞ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する細胞と、同種非自己由来細胞（他家細胞ともいう）を含む。自己由来細胞は、移植しても拒絶反応が生じないため、本開示においては好ましい。しかしながら、異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用することも可能である。異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用する場合は、拒絶反応を抑制するため、免疫抑制処置が必要となることがある。なお、本明細書中で、自己由来細胞以外の細胞、すなわち、異種由来細胞と同種非自己由来細胞を非自己由来細胞と総称することもある。本開示の一態様において、細胞は自家細胞または他家細胞である。本開示の一態様において、細胞は自家細胞である。本開示の別の態様において、細胞は他家細胞である。
【００２３】
＜１＞本開示の細胞培養物
本開示の一側面において、医療用途に用いられる所定の形状に形成された細胞培養物に関する。
本開示の一態様において、医療用細胞培養物は、接着細胞を含み、厚みのある周縁部を有するシート状に形成された医療用細胞培養物に関する。本開示の医療用細胞培養物に含まれ得る接着細胞としては、これに限定するものではないが、例えば上記した細胞が挙げられる。本開示の細胞培養物は、好ましくは少なくとも１種の接着細胞からなる。
【００２４】
本開示の医療用細胞培養物は、厚みのある周縁部を有するシート状に形成されていることを特徴とする。かかる特徴により、本開示の細胞培養物は、従来のシート状細胞培養物と比較してより機械的強度が高いなどの好ましい特性を有する。「機械的強度が高い」とは、対照シート状細胞培養物の機械的強度を基準として、限定されずに、例えば、約５％以上、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上または約１００％以上、機械的強度が高いことを意味する。シート状細胞培養物の機械的強度は種々の手法を用いて定量化することができる。シート状細胞培養物の機械的強度の測定方法は、例えば、特開2012-159408、特開2013-200234、特開2014-149214、特開2016-052272などに記載されている。
【００２５】
「厚みのある周縁部を有するシート状」とは、少なくとも一部、好ましくは中央部にシート状の形状を有し、かつ周縁部の厚みが中央部の厚みより厚いことを意味する。したがって、例えば中央部が単層のシート状であり、周縁部が積層されたシート状構造であってもよいし、中央部がシート状であり、周縁部が環状の構造であってもよい。また、中央部がシート状であり、周縁部が、外縁部が内側に巻き込まれるように形成された環状の構造であってもよい。好ましくは、中央部がシート状であり、周縁部が、外縁部が内側に巻き込まれるように形成された環状の構造である。
【００２６】
また、厚みのある周縁部を有するシート状細胞培養物の形状は、シート状である限りいかなる形状であってもよく、好ましくは円または多角形のシート形状である。シート形状が円形の場合、厚みのある周縁部は外周からほぼ均等な幅で形成され、積層や環状または外縁部が内側に巻き込まれて形成された環状となる。シート形状が多角形の場合、シート状細胞培養物の円周上に複数の頂点が形成される。隣り合う頂点同士の間の周縁部がほぼ直線となるように周縁部が形成される場合（すなわち、周縁部の外周が複数の直線により形成される場合）や、隣り合う頂点同士の間の周縁部がシート状細胞培養物の中央部に向かって突出した円弧を形成する場合（すなわち、周縁部の外周が複数の円弧により形成される場合）がある。
周縁部の厚みは、中央部より厚ければいかなる厚みであってもよく、また位置により厚みが異なってもよい。具体的には例えば、中央部の厚みが１〜３ｍｍである場合、周縁部の厚みは５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍ、１０ｍｍなどであってよい。
【００２７】
厚みのある周縁部は、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて形成してよく、例えば厚みのある三次元構造体の中央部をくりぬいて形成してもよいし、シート状細胞培養物の周縁部に細胞および／または細胞塊を播種したり、小さなシート状細胞培養物を積層したりして形成してもよい。好ましい一態様において、厚みのある周縁部は、シート状構造体の周縁部を形成する接着細胞に対して該周縁部を形成する接着細胞と直接連結していない他の接着細胞を接触させ、連結させることにより形成される。「周縁部を形成する接着細胞と直接連結していない他の接着細胞」としては、周縁部を形成する接着細胞と同一の細胞培養物を形成していない別の細胞であってもよいし、周縁部を形成する接着細胞と同一の細胞培養物を形成しているが直接連結されていない（すなわち隣接していない）接着細胞であってもよい。
【００２８】
本開示の好ましい一態様において、「周縁部を形成する接着細胞と直接連結していない他の接着細胞」は、周縁部を形成する接着細胞と同一の細胞培養物を形成しているが直接連結されていない接着細胞である。かかる態様の具体例としては、例えばシート状細胞培養物の外縁部の細胞がが、収縮や折れ曲がりなどにより同一のシートの別の周縁部の細胞と接触し、そのまま癒着することにより厚みのある周縁部を形成する場合などが挙げられる。
【００２９】
本開示の別の好ましい一態様において、細胞培養物は、中央部に孔を有している。孔の数は特に制限されず、１つであっても複数であってもよい。また、孔の大きさも、シート状細胞培養物の中央部の大きさ以下であれば特に制限されない。孔の形状も特に限定されないが、好ましい一態様において、外縁部の形状と同様の形状である。例えば細胞培養物の外縁部の形状が円形である場合、孔の形状も略円形であり、細胞培養物の外縁部の形状が多角形である場合、孔の形状も同様の多核形である。また、別の好ましい一態様において、細胞培養物の外縁部の形状にかかわらず、孔の形状は略円形である。厚みのある周縁部を有し中央部に孔を有さないシート状細胞培養物が形成された後、培養基材上に接着した中央部を培養基材から剥離する操作を加えることで中央部に孔があるシート状細胞培養物をえることができる。培養基材上で周縁部に厚みが形成されると中央部が周縁部に引っ張られ中央部が薄くなると共に張力がかかり孔が形成されやすくなると考えられる。このように形成された孔には糸をなどを通すことができる。
【００３０】
ある一態様において、孔の大きさは、中央部の大きさと一致している。この場合、本開示の細胞培養物は、中央部の構造を有さず、厚みのある周縁部のみからなる細胞培養物となる。したがって本開示の一態様において、接着細胞を含み、細胞が互いに連結して環状に形成された細胞培養物が包含される。かかる態様の細胞培養物の形状は、環状であれば円環であっても多角環であってもよい。また、環状に形成されていればシート状であってもドーナツ状のような立体的な構造であってもよいが、好ましくは単層のシート状ではない。
【００３１】
本開示の細胞培養物を形成する細胞については、上述の所定の形状に形成された細胞培養物を構成する細胞において詳述したものを同じである。細胞培養物には、少なくとも１種の細胞培養物を形成する細胞が含まれるが、２種以上の細胞培養物を形成する細胞を含んでもよいし、細胞培養物を形成する細胞以外の細胞を含んでもよい。本開示の一態様において、細胞培養物に含まれる少なくとも１種の細胞培養物を形成する細胞は筋芽細胞であり、好ましくは骨格筋芽細胞である。かかる態様において、細胞培養物にはさらに線維芽細胞が含まれ得る。本開示の別の一態様において、細胞培養物に含まれる少なくとも１種の細胞培養物を形成する細胞は心筋細胞である。本開示のさらに別の一態様において、細胞培養物に含まれる少なくとも１種の細胞培養物を形成する細胞は、間葉系幹細胞である。かかる態様において、細胞培養物にはさらに血管内皮細胞が含まれ得る。
【００３２】
上述のとおり、一態様において本開示の細胞培養物は、医療用途、特に生体内に移植する用途に用いることができるものである。したがって接着細胞は、本開示の細胞培養物による治療が可能な任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯目動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギなどが含まれ、好ましい一態様において本開示の細胞培養物に含まれる細胞は、ヒト由来である。また、本開示の細胞培養物に含まれる細胞は異種由来細胞であっても同種由来細胞であってもよい。
【００３３】
上述のとおり、好ましい一態様において本開示の細胞培養物は、筋芽細胞または心筋細胞を含む。近年筋芽細胞または心筋細胞で形成したシート状細胞培養物を移植して、心臓疾患を処置する試みが為されている。したがって本開示の細胞培養物もまた、心臓疾患の処置に用いることができる。
【００３４】
本開示の細胞培養物は、細胞培養物の適用により改善される疾患、例えば、組織の異常に関連する種々の疾患の処置に有用である。したがって、一態様において、本開示の細胞培養物は、細胞培養物の適用により改善される疾患、特に、組織の異常に関連する疾患の処置に用いるためのものである。本開示の細胞培養物は、従来のシート状細胞培養物に比べて高い機械的強度を有する以外は、これと同様の構成細胞固有の性質を有しているため、少なくとも従来の接着細胞を含むシート状細胞培養物による処置が可能な組織や疾患に適用することができる。処置の対象となる組織としては、限定されずに、例えば、心筋、食道、皮膚、膵臓、骨格筋などが挙げられる。また、処置の対象となる疾患としては、限定されずに、例えば、心疾患（例えば、心筋傷害（心筋梗塞、心外傷）、心筋症など）、食道疾患（例えば、食道手術（食道ガン除去）後の食道の炎症・狭窄の予防など）、皮膚疾患（例えば、皮膚損傷（外傷、熱傷）など）、膵臓疾患（例えば、膵液瘻など）、筋疾患（例えば、筋損傷、筋炎など）が挙げられる。本開示の細胞培養物が上記疾患に有用であることは、例えば、特許文献１、非特許文献１、Tanaka et al., J Gastroenterol. 2013;48(9):1081-9.などに記載されている。シート状細胞培養物は、注射可能な大きさに断片化し、これを処置が必要な部位に注射することで、単細胞懸濁液による注射よりも高い効果を得ることもできる（Wang et al., Cardiovasc Res. 2008;77(3):515-24）。したがって、本開示の細胞培養物についても、このような利用法が可能である。
【００３５】
一態様において、本開示の細胞培養物は実質的に無菌である。一態様において、本開示の細胞培養物は無菌である。一態様において、本開示の細胞培養物は、遺伝子操作されていない。別の態様において、本開示の細胞培養物は、遺伝子操作されたものである。遺伝子操作は、限定されずに、例えば、細胞培養物の生存性、生着能、機能などを高める遺伝子、および／または、疾患の治療に有用な遺伝子の導入を含む。導入される遺伝子としては、限定されずに、例えば、ＨＧＦ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子が挙げられる。
【００３６】
本開示の別の側面は、本開示の細胞培養物を含む、組成物（例えば、医薬組成物等）、移植片および医療製品など（以下、「組成物等」と総称することがある）に関する。
本開示の組成物等は、本開示の細胞培養物に加えて、種々の追加成分、例えば、薬学的に許容し得る担体や、細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などを含んでいてもよい。かかる追加成分としては、既知の任意のものを使用することができ、当業者はこれらの追加成分について精通している。また、本開示の組成物等は、細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などと併用することができる。一態様において、本開示の組成物等は、細胞培養物の適用により改善される疾患（例えば、組織の異常に関連する疾患など）の処置に用いるためのものである。処置の対象となる組織や疾患は、本開示の細胞培養物について上記したとおりである。
【００３７】
＜２＞本開示の製造方法
本開示の一側面は、（ｉ）接着細胞を含む細胞集団を、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で培養基材に播種するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で播種された細胞集団を細胞培養液中でシート化してシート状細胞培養物を形成するステップ
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で形成されたシート状細胞培養物の外縁部を剥離させるステップ
を含み、接着細胞が互いに連結して厚みのある周縁部を有するシート状を形成する医療用細胞培養物の製造方法に関する。
【００３８】
本開示の製造方法において、播種される細胞集団に含まれ得る接着細胞は、上記＜１＞において詳述したとおりである。
「細胞が実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度」とは、成長因子を実質的に含まない非増殖系の培養液で培養した場合に、シート状細胞培養物を形成することができる細胞密度を意味する。この播種密度は、成長因子を含む培養液を用いる手法におけるものよりも高いものであり、例えば細胞がコンフルエントに達する密度またはそれ以上であってもよい。
【００３９】
「コンフルエントに達する密度」とは、播種した際に、細胞が、培養容器の接着表面一面を覆うことが想定される程度の密度を指す。例えば、播種した際に、細胞が互いに接触することが想定される程度の密度、接触阻害が発生する密度、または接触阻害により細胞の増殖を実質的に停止する密度である。
【００４０】
一態様において、播種は、培養基材（例えば培養容器）への播種後、細胞が培養基材上に（培養容器内で）沈降した直後に、培養基材表面（例えば培養容器底面）上で互いに接する細胞の割合が全細胞の約９０％以上となる密度で行われる。「細胞が培養基材上に沈降した」とは、細胞が、培養基材上（例えば、培養容器内）に存在する液性媒体中を重力の作用により下降していき、培養基材表面（培養容器底面）に接触したり、他の細胞に接触したりして、それ以上下降できなくなった状態を意味する。播種密度が低い場合は、沈降した細胞の殆どは培養基材表面（培養容器底面）に接触した状態となるが、播種密度が高い場合、沈降した細胞が培養基材表面（培養容器底面）とは接触することなく、他の細胞に接触した状態となることがあり得る。細胞が培養基材上に沈降するのに要する時間は、培養基材上に存在する細胞培養液などの液性媒体の深さや粘度にも依存するが、例えば、通常の培養条件である、１．５〜３ｍｍの深さの細胞培養液が培養基材上に存在する場合は約５〜１０分である。したがって、培養基材上で互いに接する細胞の割合は、細胞培養液中に懸濁した細胞集団を培養基材に播種してから約５〜１０分後に、培養基材上の細胞を顕微鏡などで観察することにより決定することができる。細胞が互いに接しているか否かは、ある細胞の輪郭と他の細胞の輪郭との関係に基づいて決定することができる。例えば、ある細胞の輪郭の少なくとも一部が他の細胞の輪郭と接しているかまたは重なっている場合、細胞が互いに接していると決定することができる。また、ある細胞の輪郭の全周が、他の細胞の輪郭から離れている場合、細胞は互いに接していないと決定することができる。互いに接する細胞の割合は、例えば、１視野に含まれる全細胞数に占める互いに接する細胞の割合として算出することができる。この場合、視野ごとのばらつきによる影響を軽減するために、複数の視野（例えば、３〜５視野）における平均値をとることができる。また、計数する細胞の数を増やすことによっても、視野ごとのばらつきによる影響を軽減することができる。計数する細胞数は、拡大倍率を調節することで変更することができる。典型的には、例えば、２００倍の拡大倍率で約１０個以上（例えば、約１０〜２０個）を計数することにより、良好な計数結果を得ることができる。細胞の計数は手動で行っても、画像処理ソフトウェアなどを用いて機械的に行ってもよい。特定の態様において、培養基材上で互いに接する細胞の割合は、例えば、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上または約１００％であってもよい。なお、培養基材上で互いに接する細胞の割合は、特段の記載がない限り、細胞種を区別せずに求めることとする。
【００４１】
別の態様において、播種は、培養基材（例えば培養容器）への播種後、細胞が培養基材上に（培養容器内で）沈降した直後に、約７０％以上の細胞が培養基材表面（培養容器底面）に接触しない密度で行われる。培養基材表面に接触しない細胞の割合は、上記のように細胞の沈降速度を考慮すると、細胞培養液中に懸濁した細胞集団を培養基材に播種してから約５〜１０分後に、培養基材上の細胞を顕微鏡などで観察することにより決定することができる。細胞が培養基材表面に接触しているか否かは、例えば、倒立顕微鏡や位相差顕微鏡による観察や、焦点深度を浅くした顕微鏡による観察、ファイバースコープによる観察などに基づいて決定することができる。倒立顕微鏡を用いる場合、培養基材表面に接触している細胞の数を直接計数し、全播種細胞数に対する割合を求めることができる。焦点深度を浅くした顕微鏡を用いる場合、焦点距離を調節することで、所定の距離より近くにある細胞を培養基材表面に接触していない細胞として、および／または、所定の距離より遠くにある細胞を培養基材表面に接触している細胞として計数することができ、培養基材表面に接触しない細胞の割合は、所定の距離より近くにある細胞の数と所定の距離より遠くにある細胞の数との和に対する、所定の距離より近くにある細胞の数の割合として求めることができる。焦点距離は、例えば、培養基材表面から、細胞１個の厚みだけ近くに設定することで、培養基材表面に接触していない細胞と接触している細胞とを区別することができる。焦点深度は、例えば、細胞１個の厚みと等しいか、これに近い値（例えば、厚み±１〜２μｍ）に設定することができる。ファイバースコープを用いる場合、ファイバースコープを細胞が存在する液体媒体中に入れ、播種後の細胞を培養基材表面に対して斜め上方から、または、水平方向に観察することで、培養基材表面に接触していない細胞、および／または、培養基材表面に接触している細胞を計数することができる。培養基材表面に接触しない細胞の割合は、例えば、培養基材表面に接触していない細胞の数と培養基材表面に接触している細胞の数に対する培養基材表面に接触していない細胞の数の割合として求めることができる。なお、培養基材表面に接触しない細胞の割合は、特段の記載がない限り、細胞種を区別せずに求めることとする。 
【００４２】
さらに別の態様において、播種は、約７．１×１０５個／ｃｍ２〜約３．０×１０６個／ｃｍ２、約７．３×１０５個／ｃｍ２〜約２．８×１０６個／ｃｍ２、約７．５×１０５個／ｃｍ２〜約２．５×１０６個／ｃｍ２、約７．８×１０５個／ｃｍ２〜約２．３×１０６個／ｃｍ２、約８．０×１０５個／ｃｍ２〜約２．０×１０６個／ｃｍ２、約８．５×１０５個／ｃｍ２〜約１．８×１０６個／ｃｍ２、約９．０×１０５個／ｃｍ２〜約１．６×１０６個／ｃｍ２、７．５×１０５個／ｃｍ２〜３．０×１０６個／ｃｍ２などの密度で行うことができる。なお、これらの密度は、特段の記載がない限り、細胞集団に含まれる全ての細胞の合計密度であることとする。
【００４３】
培養基材は、細胞がその上で細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、種々の材質の容器、容器中の固形もしくは半固形の表面などを含む。容器は、培養液などの液体を透過させない構造・材料が好ましい。かかる材料としては、限定することなく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、金属（例えば、鉄、ステンレス、アルミニウム、銅、真鍮）等が挙げられる。また、容器は、少なくとも１つの平坦な面を有することが好ましい。かかる容器の例としては、限定することなく、例えば、細胞培養物の形成が可能な培養基材で構成された底面と、液体不透過性の側面とを備えた培養容器が挙げられる。かかる培養容器の特定の例としては、限定されずに、細胞培養皿、細胞培養ボトルなどが挙げられる。容器の底面は透明であっても不透明であってもよい。容器の底面が透明であると、容器の裏側から細胞の観察、計数などが可能となる。また、容器は、その内部に固形もしくは半固形の表面を有してもよい。固形の表面としては、上記のごとき種々の材料のプレートや容器などが、半固形の表面としては、ゲル、軟質のポリマーマトリックスなどが挙げられる。培養基材は、上記材料を用いて作製してもよいし、市販のものを利用してもよい。好ましい培養基材としては、限定することなく、例えば、シート状細胞培養物の形成に適した、接着性の表面を有する基材が挙げられる。具体的には、親水性の表面を有する基材、例えば、コロナ放電処理したポリスチレン、コラーゲンゲルや親水性ポリマーなどの親水性化合物を該表面にコーティングした基材、さらには、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックスや、カドヘリンファミリー、セレクチンファミリー、インテグリンファミリーなどの細胞接着因子などを表面にコーティングした基材などが挙げられる。また、かかる基材は市販されている（例えば、Corning(R) TC-Treated Culture Dish、Corningなど）。培養基材は全体または部分が透明であっても不透明であってもよい。
【００４４】
培養基材は、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で表面が被覆されていてもよい。かかる材料としては、限定されずに、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等）、Ｎ，Ｎ−ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド等）、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−プロペニル）−モルホリン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−モルホリン等）、またはビニルエーテル誘導体（例えば、メチルビニルエーテル）のホモポリマーまたはコポリマーからなる温度応答性材料、アゾベンゼン基を有する光吸収性高分子、トリフェニルメタンロイコハイドロオキシドのビニル誘導体とアクリルアミド系単量体との共重合体、および、スピロベンゾピランを含むＮ−イソプロピルアクリルアミドゲル等の光応答性材料などの公知のものを用いることができる（例えば、特開平２−２１１８６５、特開２００３−３３１７７参照）。これらの材料に所定の刺激を与えることによりその物性、例えば、親水性や疎水性を変化させ、同材料上に付着した細胞培養物の剥離を促進することができる。温度応答性材料で被覆された培養皿は市販されており（例えば、CellSeed Inc.のUpCell(R)）、これらを本開示の製造方法に使用することができる。
【００４５】
培養基材は、種々の形状であってもよいが、平坦であることが好ましい。また、その面積は特に限定されないが、例えば、約１ｃｍ２〜約２００ｃｍ２、約２ｃｍ２〜約１００ｃｍ２、約３ｃｍ２〜約５０ｃｍ２などであってよい。
培養基材は血清でコート（被覆またはコーティング）されていてもよい。血清でコートされた培養基材を用いることにより、より高密度のシート状細胞培養物を形成することができる。「血清でコートされている」とは、培養基材の表面に血清成分が付着している状態を意味する。かかる状態は、限定されずに、例えば、培養基材を血清で処理することにより得ることができる。血清による処理は、血清を培養基材に接触させること、および、必要に応じて所定期間インキュベートすることを含む。
【００４６】
血清としては、異種血清および／または同種血清を用いることができる。異種血清は、シート状細胞培養物を移植に用いる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する血清を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ウシやウマに由来する血清、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＦＣＳ）、仔ウシ血清（ＣＳ）、ウマ血清（ＨＳ）などが異種血清に該当する。また、「同種血清」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する血清を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト血清が同種血清に該当する。同種血清は、自己血清（自家血清ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する血清、およびレシピエント以外の同種個体に由来する同種他家血清を含む。なお、本明細書中で、自己血清以外の血清、すなわち、異種血清と同種他家血清を非自己血清と総称することもある。
培養基材をコートするための血清は、市販されているか、または、所望の生物から採取した血液から定法により調製することができる。具体的には、例えば、採取した血液を室温で約２０分〜約６０分程度放置して凝固させ、これを約１０００×ｇ〜約１２００×ｇ程度で遠心分離し、上清を採取する方法などが挙げられる。
【００４７】
培養基材上でインキュベートする場合、血清は原液で用いても、希釈して用いてもよい。希釈は、任意の媒体、例えば、限定することなく、水、生理食塩水、種々の緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなど）、種々の液体培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７など）等で行うことができる。希釈濃度は、血清成分が培養基材上に付着することができれば特に限定されず、例えば、約０．５％〜約１００％（ｖ／ｖ）、好ましくは約１％〜約６０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約５％〜約４０％（ｖ／ｖ）である。
【００４８】
インキュベート時間も、血清成分が培養基材上に付着することができれば特に限定されず、例えば、約１時間〜約７２時間、好ましくは約２時間〜約４８時間、より好ましくは約２時間〜約２４時間、さらに好ましくは約２時間〜約１２時間である。インキュベート温度も、血清成分が培養基材上に付着することができれば特に限定されず、例えば、約０℃〜約６０℃、好ましくは約４℃〜約４５℃、より好ましくは室温〜約４０℃である。
【００４９】
インキュベート後に血清を廃棄してもよい。血清の廃棄手法としては、ピペットなどによる吸引や、デカンテーションなどの慣用の液体廃棄手法を用いることができる。本開示の好ましい態様においては、血清廃棄後に、培養基材を無血清洗浄液で洗浄してもよい。無血清洗浄液としては、血清を含まず、培養基材に付着した血清成分に悪影響を与えない液体媒体であれば特に限定されず、例えば、限定することなく、水、生理食塩水、種々の緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなど）、種々の液体培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７など）等で行うことができる。洗浄手法としては、慣用の培養基材洗浄手法、例えば、限定することなく、培養基材上に無血清洗浄液を加えて所定時間（例えば、約５秒〜約６０秒間）撹拌後、廃棄する手法などを用いることができる。
【００５０】
本開示において、培養基材を、成長因子でコートしてもよい。ここで、「成長因子」は、細胞の増殖を、それがない場合に比べて促進する任意の物質を意味し、例えば、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）などを含む。成長因子による培養基材のコート手法、廃棄手法および洗浄手法は、インキュベーション時の希釈濃度が、例えば、約０．０００１μｇ／ｍＬ〜約１μｇ／ｍＬ、好ましくは約０．０００５μｇ／ｍＬ〜約０．０５μｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．００１μｇ／ｍＬ〜約０．０１μｇ／ｍＬである以外は、基本的に血清と同じである。
【００５１】
本開示において、培養基材を、ステロイド剤でコートしてもよい。ここで「ステロイド剤」は、ステロイド核を有する化合物のうち、生体に、副腎皮質機能不全、クッシング症候群などの悪影響を及ぼし得るものをいう。かかる化合物としては、限定されずに、例えば、コルチゾール、プレドニゾロン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン等が含まれる。ステロイド剤による培養基材のコート手法、廃棄手法および洗浄手法は、インキュベーション時の希釈濃度が、デキサメタゾンとして、例えば、約０．１μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約０．４μｇ／ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬ、より好ましくは約１μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬである以外は、基本的に血清と同じである。
【００５２】
培養基材は、血清、成長因子およびステロイド剤のいずれか１つでコートしても、これらの任意の組合わせ、すなわち、血清と成長因子、血清とステロイド剤、血清と成長因子とステロイド剤、または、成長因子とステロイド剤の組合わせでコートしてもよい。複数の成分でコートする場合、これらの成分を混合して同時にコートしてもよいし、別々のステップでコートしてもよい。
【００５３】
培養基材は、血清等でコートした後直ちに細胞を播種してもよいし、コートした後に保存しておき、その後細胞を播種することもできる。コートした基材は、例えば約４℃以下、好ましくは約−２０℃以下、より好ましくは約−８０℃以下に保つことにより長期間保存することができる。
培養基材への細胞の播種は、既知の任意の手法および条件で行うことができる。培養基材への細胞の播種は、例えば、細胞を培養液に懸濁した細胞懸濁液を培養基材（培養容器）に注入することにより行ってもよい。細胞懸濁液の注入には、スポイトやピペットなど、細胞懸濁液の注入操作に適した器具を用いることができる。
【００５４】
本開示の製造方法において、  播種した細胞をシート化するステップは、既知の任意の手法および条件で行うことができる。かかる手法の非限定例は、例えば、特許文献１、WO 2014/185517などに記載されている。細胞のシート化は、細胞同士が接着分子や、細胞外マトリックスなどの細胞間接着機構を介して互いに接着することにより達成されると考えられている。したがって、播種した細胞をシート化するステップは、例えば、細胞を、細胞間接着を形成する条件下で培養することにより達成することができる。かかる条件は、細胞間接着を形成することができればいかなるものであってもよいが、通常は一般的な細胞培養条件と同様の条件であれば細胞間接着を形成することができる。かかる条件としては、例えば、約３７℃、５％ＣＯ２での培養が挙げられる。また、培養は通常の圧力下（大気圧下、非加圧下）で行うことができる。培養は任意の大きさおよび形状の容器で行うことができる。シート状細胞培養物の大きさや形状は、培養容器の細胞付着面の大きさ・形状を調整すること、または、培養容器の細胞付着面に、所望の大きさ・形状の型枠を設置し、その内部で細胞を培養することなどにより任意に調節することができる。本明細書において、播種した細胞をシート化するための培養を、「シート化培養」と称することもある。シート化培養により、培養基材上（培養容器内）のシート状細胞培養物の厚みは減少する。すなわち、播種後、細胞が沈降した後、その後のシート化により培養基材上で細胞層の厚みは減少するが、シート状細胞培養物は培養基材からの剥離により収縮し、再び厚みを増す。シート化による厚みの減少は、播種直後の細胞層の厚みを１００％とすると、約９０％〜約７０％程度である。
【００５５】
本開示の一態様において、細胞の培養は、所定の期間内、好ましくは、筋芽細胞が分化に移行しない期間内に行われる。したがって、この態様において、筋芽細胞は、培養期間中、未分化の状態に維持される。筋芽細胞の分化への移行は、当業者に知られた任意の方法で評価することができる。例えば、骨格筋芽細胞の場合は、ＭＨＣの発現、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）活性、細胞の多核化、筋管の形成などを分化の指標とすることができる。培養期間は、例えば、約４８時間以内、約４０時間以内、約３６時間以内、約３０時間以内、約２６時間以内、約１２時間以内とすることができる。特定の態様において、培養期間は約２時間〜約３６時間、約２時間〜約３０時間、約２時間〜約２６時間、約２時間〜約１２時間、約４時間〜約３６時間、約４時間〜約３０時間、約４時間〜約２６時間、約４時間〜約１２時間、約６時間〜約３６時間、約６時間〜約３０時間、約６時間〜約２６時間、約６時間〜約１２時間などであってよい。
【００５６】
培養に用いる細胞培養液（単に「培養液」もしくは「培地」と称することもある）は、細胞の生存を維持できるものであれば特に限定されないが、典型的には、アミノ酸、ビタミン類、電解質を主成分としたものが利用できる。本開示の一態様において、培養液は、細胞培養用の基礎培地をベースにしたものである。かかる基礎培地には、限定されずに、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７などが含まれる。これらの基礎培地の多くは市販されており、その組成も公知となっている。 
基礎培地は、標準的な組成のまま（例えば、市販されたままの状態で）用いてもよいし、細胞種や細胞条件に応じてその組成を適宜変更してもよい。したがって、本開示に用いる基礎培地は、公知の組成のものに限定されず、１または２以上の成分が追加、除去、増量もしくは減量されたものを含む。 
【００５７】
基礎培地に含まれるアミノ酸としては、限定されずに、例えば、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリンなどが、ビタミン類としては、限定されずに、例えば、Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、リボフラビン、チアミン、ピリドキシン、ビオチン、リポ酸、ビタミンＢ１２、アデニン、チミジンなどが、そして、電解質としては、限定されずに、例えば、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＦｅＳＯ４、ＣｕＳＯ４、ＭｎＳＯ４、Ｎａ２ＳｉＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４、ＮａＶＯ３、ＮｉＣｌ２、ＺｎＳＯ４などがそれぞれ含まれる。基礎培地には、これらの成分のほか、Ｄ−グルコースなどの糖類、ピルビン酸ナトリウム、フェノールレッドなどのｐＨ指示薬、プトレシンなどを含んでもよい。 
【００５８】
本開示の一態様において、基礎培地に含まれるアミノ酸の濃度は、Ｌ−アルギニン：約６３．２ｍｇ／Ｌ〜約８４ｍｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン：約３５ｍｇ／Ｌ〜約６３ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン：約４．４ｍｇ／Ｌ〜約５８４ｍｇ／Ｌ、グリシン：約２．３ｍｇ／Ｌ〜約３０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン：約４２ｍｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン：約６６ｍｇ／Ｌ〜約１０５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン：約１０５ｍｇ／Ｌ〜約１３１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−リジン：約１４６ｍｇ／Ｌ〜約１８２ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン：約１５ｍｇ／Ｌ〜約３０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン：約３３ｍｇ／Ｌ〜約６６ｍｇ／Ｌ、Ｌ−セリン：約３２ｍｇ／Ｌ〜約４２ｍｇ／Ｌ、Ｌ−トレオニン：約１２ｍｇ／Ｌ〜約９５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン：約４．１ｍｇ／Ｌ〜約１６ｍｇ／Ｌ、Ｌ−チロシン：約１８．１ｍｇ／Ｌ〜約１０４ｍｇ／Ｌ、Ｌ−バリン：約９４ｍｇ／Ｌ〜約１１７ｍｇ／Ｌである。 
また、本開示の一態様において、基礎培地に含まれるビタミン剤の濃度は、Ｄ−パントテン酸カルシウム：約４ｍｇ／Ｌ〜約１２ｍｇ／Ｌ、塩化コリン：約４ｍｇ／Ｌ〜約１４ｍｇ／Ｌ、葉酸：約０．６ｍｇ／Ｌ〜約４ｍｇ／Ｌ、ｉ−イノシトール：約７．２ｍｇ／Ｌ、ナイアシンアミド：約４ｍｇ／Ｌ〜約６．１ｍｇ／Ｌ、リボフラビン：約０．００３８ｍｇ／Ｌ〜約０．４ｍｇ／Ｌ、チアミン：約３．４ｍｇ／Ｌ〜約４ｍｇ／Ｌ、ピリドキシン：約２．１ｍｇ／Ｌ〜約４ｍｇ／Ｌである。 
【００５９】
細胞培養液は、上記のほか、血清、成長因子、ステロイド剤成分、セレン成分などの１種または２種以上の添加物を含んでもよい。しかし、これらの成分が自己由来のものではない場合は、臨床においてはレシピエントに対するアナフィラキシーショック等の副作用要因となり得ることが否定できない製造工程由来不純物となり得るため、臨床への適用にあたってはかかる非自己由来成分を排除することが望ましい場合がある。したがって、本開示の好ましい態様において、細胞培養液は、これらの非自己由来の添加物の少なくとも１種の有効量を含まない。また、本開示のより好ましい態様において、細胞培養液は、これらの非自己由来の添加物の少なくとも１種を実質的に含まない。さらに、本開示の特に好ましい態様において、細胞培養液は、非自己由来の添加物を実質的に含まない。一態様において、細胞培養液は、基礎培地のみを含んでもよい。 
【００６０】
本開示の一態様において、細胞培養液は血清を実質的に含まない。血清を実質的に含まない細胞培養液のことを、本明細書中で「無血清培地」と呼ぶこともある。ここで、「血清を実質的に含まない」とは、培養液における血清の含量が、細胞培養物を生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度（例えば、細胞培養物中の血清アルブミン含量が約５０ｎｇ未満となる量）であること、好ましくは、培養液にこれらの物質を積極的に添加しないことを意味する。本開示においては、移植時の副作用を回避するために、細胞培養液は異種血清を実質的に含まないことが好ましく、非自己血清を実質的に含まないことがさらに好ましい。 
【００６１】
本開示の一態様において、細胞培養液は血清を含む。血清は、同種血清であっても異種血清であってもよい。特定の態様において、細胞培養液は自己血清を含む。血清でコートされた培養基材上で細胞を培養する場合、細胞培養液に含まれる血清（細胞の培養に用いる血清）は、培養基材をコートするために用いる血清と同じであっても異なってもよい。一態様において、細胞培養液に含まれる血清は、培養基材をコートするために用いる血清と同一であり、特定の態様において、該血清は自己血清である。血清は、本開示の製造方法に用いるためのものであってもよい。例えば、血清は、細胞の培養に用いるためのものであっても、培養基材をコートするためのものであってもよい。 
【００６２】
本開示の一態様において、細胞培養液は有効量の成長因子を含まない。ここで、「有効量の成長因子」とは、細胞の増殖を、成長因子がない場合に比べて、有意に促進する成長因子の量、または、便宜的に、当該技術分野において細胞の増殖を目的として通常添加する量を意味する。細胞増殖促進の有意性は、例えば、当該技術分野で知られた任意の統計学的手法、例えば、ｔ検定などにより適宜評価することができ、また、通常の添加量は当該技術分野の種々の公知文献から知ることができる。具体的には、細胞培養におけるＥＧＦの有効量は、例えば約０．００５μｇ／ｍＬ以上である。 
【００６３】
したがって、「有効量の成長因子を含まない」とは、本開示における培養液における成長因子の濃度がかかる有効量未満であることを意味する。例えば、細胞培養におけるＥＧＦの培養液中の濃度は、好ましくは約０．００５μｇ／ｍＬ未満、より好ましくは約０．００１μｇ／ｍＬ未満である。本開示の好ましい態様においては、培養液における成長因子の濃度は、生体における通常の濃度未満である。かかる態様においては、例えば、細胞培養におけるＥＧＦの培養液中の濃度は、好ましくは約５．５ｎｇ／ｍＬ未満、より好ましくは約１．３ｎｇ／ｍＬ未満、さらに好ましくは、約０．５ｎｇ／ｍＬ未満である。さらに好ましい態様において、本開示における培養液は、成長因子を実質的に含まない。ここで、実質的に含まないとは、培養液中の成長因子の含量が、細胞培養物を生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度であること、好ましくは、培養液に成長因子を積極的に添加しないことを意味する。したがって、この態様においては、培養液は、その中の他の成分、例えば血清などに含まれる以上の濃度の成長因子を含まない。 
【００６４】
本開示の一態様において、細胞培養液は、ステロイド剤成分を実質的に含まない。ここで「ステロイド剤成分」は、ステロイド核を有する化合物のうち、生体に、副腎皮質機能不全、クッシング症候群などの悪影響を及ぼし得るものをいう。かかる化合物としては、限定されずに、例えば、コルチゾール、プレドニゾロン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン等が含まれる。したがって、「ステロイド剤成分を実質的に含まない」とは、培養液におけるこれらの化合物の含量が、細胞培養物を生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度であること、好ましくは、培養液にこれらの化合物を積極的に添加しないこと、すなわち、培養液が、その中の他の成分、例えば血清などに含まれる以上の濃度のステロイド剤成分を含まないことを意味する。 
【００６５】
本開示の一態様において、細胞培養液は、セレン成分を実質的に含まない。ここで「セレン成分」は、セレン分子、およびセレン含有化合物、特に、生体内でセレン分子を遊離し得るセレン含有化合物、例えば、亜セレン酸などを含む。したがって、「セレン成分を実質的に含まない」とは、培養液におけるこれらの物質の含量が、細胞培養物を生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度であること、好ましくは、培養液にこれらの物質を積極的に添加しないこと、すなわち、培養液が、その中の他の成分、例えば血清などに含まれる以上の濃度のセレン成分を含まないことを意味する。具体的には、例えば、ヒトの場合、培養液中のセレン濃度は、ヒト血清中の正常値（例えば、１０．６μｇ／ｄＬ〜１７．４μｇ／ｄＬ）に、培地中に含まれるヒト血清の割合を乗じた値よりも低い（すなわち、ヒト血清の含量が約１０％であれば、セレン濃度は、例えば、約１．０μｇ／ｄＬ〜約１．７μｇ／ｄＬ未満である）。 
【００６６】
本開示の上記好ましい態様においては、生体に適用する細胞培養物を作製する場合に従来必要であった、成長因子、ステロイド剤成分、異種血清成分などの製造工程由来不純物を、洗浄などにより除去するステップが不要となる。したがって、本開示の方法の一態様は、この製造工程由来不純物を除去するステップを含まない。 
ここで、「製造工程由来不純物」とは、典型的には、製造各工程に由来する以下に列挙するものが含まれる。すなわち、細胞基材に由来するもの（例えば、宿主細胞由来タンパク質、宿主細胞由来ＤＮＡ）、細胞培養液に由来するもの（例えば、インデューサー、抗生物質、培地成分）、あるいは細胞培養以降の工程である目的物質の抽出、分離、加工、精製工程に由来するものなどである（例えば、医薬審発第５７１号参照）。 
【００６７】
シート状細胞培養物の外縁部の培養基材からの剥離は、細胞培養物がシート構造を保ったまま、少なくともシート状細胞培養物の外縁部が足場となっている培養基材から遊離（剥離）できれば特に限定されず、例えば、タンパク質分解酵素（例えばトリプシンなど）による酵素処理および／またはピペッティングなどの機械的処理によって行うことができる。また、細胞を、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で表面を被覆した培養基材上で培養して細胞培養物を形成した場合には、所定の刺激を加えることで、非酵素的に遊離することもできる。また、シートが形成された後そのままインキュベートし続けると、シート状細胞培養物の収縮力が培養基材と細胞との接着力を上回り、外縁部から自然と剥離し始めることがある。したがって剥離は、自然剥離が生じ始めるまでインキュベートすることにより達成してもよい。
【００６８】
例えば、細胞を温度応答性培養皿で培養して細胞培養物を形成した場合には、温度を温度応答性材料の水に対する下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）以下または上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）以上とする温度処理により、シート状細胞培養物を非酵素的に遊離することができる。かかる温度処理は、限定されずに、例えば、形成されたシート状細胞培養物が付着した培養基材を、ＬＣＳＴより高い温度の培養環境（例えば、約３７℃の温度のインキュベーター内など）から、ＬＣＳＴ以下の環境（例えば、インキュベーター外の室温環境など）に移行させることなどにより達成することができる。ＬＣＳＴ以下の環境への移行は、限定されずに、例えば、形成されたシート状細胞培養物が存在するＬＣＳＴより高い温度の培養液を、ＬＣＳＴ以下の温度の媒体（例えば、緩衝液（ＰＢＳ、ＨＢＳＳ等）や、培養液などの液体等）に置換することなどにより達成することができる。したがって、上記緩衝液等の媒体は、本開示の製造方法において、シート状細胞培養物を培養基材から非酵素的に遊離するために用いることができる。 
【００６９】
本開示の製造方法は、細胞集団を培養基材に播種するステップ（ｉ）の前に、細胞（細胞集団）を凍結するステップと凍結細胞を解凍するステップとを含んでもよい。細胞の凍結は、既知の任意の手法により行うことができる。かかる手法としては、限定されずに、例えば、容器内の細胞を、凍結手段、例えば、フリーザー、ディープフリーザー、低温の媒体（例えば、液体窒素等）に供することなどが挙げられる。凍結手段の温度は、容器内の細胞集団の一部、好ましくは全体を凍結させ得る温度であれば特に限定されないが、典型的には約０℃以下、好ましくは約−２０℃以下、より好ましくは約−４０℃以下、さらに好ましくは約−８０℃以下である。また、凍結操作における冷却速度は、凍結解凍後の細胞の生存率や機能を大きく損なうものでなければ特に限定されないが、典型的には４℃から冷却を始めて約−８０℃に達するまで約１時間〜約５時間、好ましくは約２時間〜約４時間、特に約３時間かける程度の冷却速度である。具体的には、例えば、約０．４６℃／分の速度で冷却することができる。かかる冷却速度は、所望の温度に設定した凍結手段に、細胞を含む容器を直接、または、凍結処理容器に収容して供することにより達成することができる。凍結処理容器は、容器内の温度の下降速度を所定の速度に制御する機能を有していてもよい。かかる凍結処理容器としては、既知の任意のもの、例えば、BICELL(R)（日本フリーザー）、プログラムフリーザーなどを用いることができる。 
【００７０】
凍結操作は、細胞を培養液や生理緩衝液などに浸漬させたまま行ってもよいが、細胞を凍結・解凍操作から保護するための凍結保護剤を培養液に加えたり、培養液を凍結保護剤を含む凍結保存液と置換するなどの処理を施したうえで行ってもよい。したがって、凍結ステップを含む本開示の製造方法は、培養液に凍結保護剤を添加するステップ、または、培養液を凍結保存液に置換するステップをさらに含んでもよい。培養液を凍結保存液に置換する場合、凍結時に細胞が浸漬している液に有効濃度の凍結保護剤が含まれていれば、培養液を実質的に全て除去してから凍結保存液を添加しても、培養液を一部残したまま凍結保存液を添加してもよい。ここで、「有効濃度」とは、凍結保護剤が、毒性を示すことなく、凍結保護効果、例えば、凍結保護剤を用いない場合と比べた、凍結解凍後の細胞の生存率、活力、機能などの低下抑制効果を示す濃度を意味する。かかる濃度は当業者に知られているか、ルーチンの実験などにより適宜決定することができる。 
【００７１】
凍結保護剤は、細胞に対して凍結保護作用を示すものであれば特に限定されずに、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、セリシン、プロパンジオール、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルデンプン、コンドロイチン硫酸、ポリエチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、アドニトール、ペルセイトール、ラフィノース、ラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールなどを含む。凍結保護剤は、単独で用いても、２種または３種以上を組み合わせて用いてもよい。 
【００７２】
培養液への凍結保護剤の添加濃度、または、凍結保存液中の凍結保護剤の濃度は、上記で定義した有効濃度であれば特に限定されず、典型的には、例えば、培養液または凍結保存液全体に対して約２％〜約２０％（ｖ／ｖ）である。しかしながら、この濃度範囲からは外れるが、それぞれの凍結保護剤について知られているか、実験的に決定した代替的な使用濃度を採用することもでき、かかる濃度も本開示の範囲内である。 
【００７３】
凍結した細胞を解凍するステップは、既知の任意の細胞解凍手法により行うことができ、典型的には、例えば、凍結した細胞を、解凍手段、例えば、凍結温度より高い温度の固形、液状もしくはガス状の媒体（例えば、水）、ウォーターバス、インキュベーター、恒温器などに供したり、または、凍結した細胞を、凍結温度より高い温度の媒体（例えば、培養液）で浸漬することにより達成されるが、これに限定されない。解凍手段または浸漬媒体の温度は、細胞を所望の時間内に解凍できる温度であれば特に限定されないが、典型的には約４℃〜約５０℃、好ましくは約３０℃〜約４０℃、より好ましくは約３６℃〜約３８℃である。また、解凍時間は、解凍後の細胞の生存率や機能を大きく損なうものでなければ特に限定されないが、典型的には約２分以内であり、特に約２０秒以内とすることで生存率の低下を大幅に抑制することができる。解凍時間は、例えば、解凍手段または浸漬媒体の温度、凍結時の培養液または凍結保存液の容量もしくは組成などを変化させて調節することができる。凍結した細胞は、任意の手法により凍結させた細胞を含み、その非限定例としては、例えば、上記の細胞を凍結するステップにより凍結された細胞などが挙げられる。一態様において、凍結した細胞は、凍結保護剤の存在下で凍結された細胞である。一態様において、凍結した細胞は、本開示の製造方法に用いるためのものである。 
【００７４】
本開示の製造方法は、凍結した細胞を解凍するステップの後、かつ、シート状細胞培養物を形成するステップ（ｉｉ）の前に、細胞を洗浄するステップを含んでいてもよい。細胞の洗浄は、既知の任意の手法により行うことができ、典型的には、例えば、細胞を洗浄液（例えば、血清や血清成分（血清アルブミンなど）を含むもしくは含まない、培養液（例えば、培地等）または生理緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ等）など）に懸濁し、遠心分離し、上清を廃棄し、沈殿した細胞を回収することにより達成されるが、これに限定されない。細胞を洗浄するステップにおいては、かかる懸濁、遠心分離、回収のサイクルを１回または複数回（例えば、２、３、４、５回など）行ってもよい。本開示の一態様において、細胞を洗浄するステップは、凍結した細胞を解凍するステップの直後、すなわち細胞集団を培養基材に播種するステップ（ｉ）の前に行われる。 
【００７５】
本開示の製造方法は、細胞集団を培養基材に播種するステップ（ｉ）の前に、細胞を増殖させるステップをさらに含んでもよい。細胞を増殖させるステップは、既知の任意の手法で行ってもよく、当業者は各種細胞の増殖に適した培養条件に精通している。 
【００７６】
一態様において、本開示の製造方法は、細胞に遺伝子を導入するステップを含まない。別の態様において、本開示の製造方法は、細胞に遺伝子を導入するステップを含む。導入する遺伝子は、対象とする疾患の処置に有用なものであれば特に限定されず、例えば、ＨＧＦ、ＶＥＧＦなどのサイトカインであってもよい。遺伝子の導入は、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、超音波導入法、電気穿孔法、パーティクルガン法、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクター利用する方法、マイクロインジェクション法などの既知の任意の方法を用いて行うことができる。細胞への遺伝子の導入は、限定されずに、例えば、細胞を凍結するステップの前に行うことができる。 
【００７７】
本開示の製造方法の一態様において、ステップ（ｉｉｉ）の後にさらに（ｉｖ）剥離させた外縁部を、該外縁部の細胞と連結していない他の接着細胞と連結させ、厚みのある周縁部を形成するステップを含む。かかるステップにおいては、外縁部の細胞と連結していない他の接着細胞を、外縁部の細胞と接触させ、細胞間の連結を形成させる。接触させる細胞は、必ずしも外縁部の細胞と同一のシート状細胞培養物を形成する細胞である必要はなく、また同種の細胞である必要もないが、好ましくは外縁部の細胞と同一のシート状細胞培養物を形成する細胞、特に周縁部の細胞である。接触は、例えば剥離された外縁部をシートの内側に折りたたむことなどにより達成することができる。
連結の形成は、上記シート化において詳述した培養条件と同様の条件を用いて行うことができる。
【００７８】
かかるステップ（ｉｖ）の典型的な例としては、少なくともシート状細胞培養物の外縁部が剥離された後、同様のインキュベート条件でインキュベートを続けることにより実施する。外縁部が剥離されたシート状細胞培養物は剥離した部分が収縮するが、この場合、外縁部から丸まるように収縮し、外縁部の細胞と周縁部の細胞との接触が生じる。そしてそのままインキュベートを続けることにより、接触した部分が癒着し、結果として厚みを有する周縁部を形成することができる。したがって好ましい一態様において、ステップ（ｉｖ）は、ピペッティングなどにより、培養容器中の液体を灌流させることなく、培養容器を静置することにより実施することができる。
【００７９】
本開示の製造方法の一態様において、さらに中央部のシート状構造に孔を形成するステップを含む。形成する孔の数や大きさは、中央部のシート状構造部分に形成できれば特に制限がない。孔の形成は、当該技術分野において既知の方法を用いて行うことができ、これに限定するものではないが、例えばシートを一部切り取る、孔を形成したい箇所にトリプシンなどのタンパク質分解酵素を作用させる、針やパンチなどで穴をあける、水流などでシートを破るなどの方法が挙げられる。
【００８０】
かかる態様において、最も大きな孔を形成する場合、中央部のシート状構造そのものを除去し、中央部全体を１つの孔とすることができる。したがって上記中央部のシート状構造に孔を形成するステップは、中央部のシート状構造を除去する態様を包含し得る。この場合、中央部のシート状構造が除去されるため、厚みのある周縁部のみからなる環状の細胞培養物が得られることとなる。
本開示の製造方法に用いられる細胞の種類など、その他の条件については、上記＜１＞において詳述したとおりである。
【００８１】
＜３＞本開示の治療方法
本開示の別の側面は、対象において医療用細胞培養物の適用により改善される疾患（例えば、組織の異常に関連する疾患など）を処置する方法であって、本開示の医療用細胞培養物または組成物等の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。本開示の処置方法の対象となる組織や疾患は、本開示の細胞培養物について上記したとおりである。また、本開示の処置方法においては、シート状細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などを、本開示のシート状細胞培養物または組成物等と併用することができる。
【００８２】
本開示の処置方法は、本開示の製造方法に従って、医療用細胞培養物を製造するステップをさらに含んでもよい。本開示の処置方法は、医療用細胞培養物を製造するステップの前に、対象から医療用細胞培養物を製造するための細胞または細胞の給源となる組織を採取するステップをさらに含んでもよい。一態様において、細胞または細胞の供給源となる組織を採取する対象は、医療用細胞培養物または組成物等の投与を受ける対象と同一の個体である。別の態様において、細胞または細胞の給源となる組織を採取する対象は、医療用細胞培養物または組成物等の投与を受ける対象とは同種の別個体である。別の態様において、細胞または細胞の給源となる組織を採取する対象は、医療用細胞培養物または組成物等の投与を受ける対象とは異種の個体（他家）である。
【００８３】
本開示において、用語「対象」は、任意の生物個体、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体を意味する。本開示において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、医療用細胞培養物の適用により改善される疾患（例えば、組織の異常に関連する疾患など）の処置が企図される場合には、典型的には当該疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。
【００８４】
また、用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、医療用細胞培養物の適用により改善される疾患（例えば、組織の異常に関連する疾患など）の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、当該疾患発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
【００８５】
本開示において、有効量とは、例えば、疾患の発症や再発を抑制し、症状を軽減し、または進行を遅延もしくは停止し得る量（例えば、医療用細胞培養物のサイズや重量、数など）であり、好ましくは、当該疾患の発症および再発を予防し、または当該疾患を治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、例えば、マウス、ラット、イヌまたはブタなどの実験動物や疾患モデル動物における試験などにより適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、処置の対象となる組織病変の大きさは、有効量決定のための重要な指標となり得る。
【００８６】
投与方法としては、典型的には組織への直接的な適用が挙げられるが、シート状細胞培養物の断片を用いる場合には、注射による投与が可能な種々の経路、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、局所、動脈内、門脈内、心室内、腹腔内等の経路から投与してもよい。
投与頻度は、典型的には１回の処置につき１回であるが、所望の効果が得られない場合には、複数回投与することも可能である。
【実施例】
【００８７】
本開示を以下の例を参照してより詳細に説明するが、これは本開示の特定の具体例を示すものであり、本開示はこれらに限定されるものではない。
例１．医療用細胞培養物の製造
（１）細胞集団の調製
成人大腿部から無菌的に採取した骨格筋組織から得られた細胞を培養フラスコに播種し、２０％ＦＢＳを含有するＭＣＤＢ１３１培地中で増殖させた。増殖させた細胞をタンパク質分解酵素液で培養フラスコから剥離させ、回収後、遠心分離により濃縮した。
【００８８】
（２）細胞培養物の作製
２０％ヒト血清を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地１ｍＬあたり細胞を６．０×１０６〜６．１×１０６個懸濁し、φ３．５ｃｍ温度応答性培養皿（UpCell(R)、セルシード製）に播種した。培養基材に播種した細胞を、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養し、４時間後に状態を確認したところ、シート状細胞培養物が形成されていた。そのままインキュベートを続けたところ、６時間後にはシート状細胞培養物の外縁部が剥離していることが確認された。さらにインキュベートを続けたところ、１２時間後には、中央部に孔を有するリング状の周縁部を有するシート状細胞培養物が、培養基材から剥離された状態で得られた（図１）。
【００８９】
本明細書に記載された本開示の種々の特徴は様々に組み合わせることができ、そのような組合せにより得られる態様は、本明細書に具体的に記載されていない組合せも含め、すべて本開示の範囲内である。また、当業者は、本開示の精神から逸脱しない多数の様々な改変が可能であることを理解しており、かかる改変を含む均等物も本開示の範囲に含まれる。したがって、本明細書に記載された態様は例示にすぎず、これらが本開示の範囲を制限する意図をもって記載されたものではないことを理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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