(57)【要約】【課題】耐虫性や耐菌性に優れ、無農薬での栽培も可能なクローン植物を得るための新規の組織培養技術の提供【解決手段】植物組織を組織培養することでクローン苗を生産する方法であって、竹炭の存在下で組織培養を行う工程を含むことを特徴とする、クローン苗生産方法。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物組織を組織培養することでクローン苗を生産する方法であって、
竹炭の存在下で組織培養を行う工程を含むことを特徴とする、クローン苗生産方法。
【請求項２】
竹炭を添加した固体培地上で組織培養を行うことを特徴とする、請求項１に記載のクローン苗生産方法。
【請求項３】
固体培地上に竹炭を含む組成物を積層した培地で組織培養を行うことを特徴とする、請求項２に記載のクローン苗生産方法。
【請求項４】
前記組織培養がカルス培養であることを特徴とする、請求項１〜３の何れか一項に記載のクローン苗生産方法。
【請求項５】
抗生物質の非存在下で組織培養を行うことを特徴とする、請求項１〜４の何れか一項に記載のクローン苗生産方法。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか一項に記載のクローン苗生産方法によりクローン苗を生産するクローン苗生産工程と、該クローン苗を土壌で栽培する栽培工程と、を含むことを特徴とする、クローン植物生産方法。
【請求項７】
前記栽培工程において殺虫剤及び殺菌剤から選ばれる農薬を用いないことを特徴とする、請求項６に記載のクローン植物生産方法。
【請求項８】
竹炭の存在下で組織培養を行う工程を含むことを特徴とする、植物に耐菌性及び／又は耐虫性を付与する方法。
【請求項９】
植物に耐菌性及び／又は耐虫性を付与するために用いられる、竹炭からなる組織培養用添加剤。
【請求項１０】
竹炭を含むことを特徴とする、植物の組織培養用の培地組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は植物の組織培養及び栽培技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物体から植物組織や細胞を採取し、これを培養する方法が知られている。このような組織培養法として、茎頂を培養する茎頂培養、葯を培養する葯培養、プロトプラストを培養するプロトプラスト培養などがある。
これらの組織培養法においては、採取した組織を一定の条件で培養することでカルスと呼ばれる細胞塊へ誘導する。カルスは、異常な細胞分裂など、由来となる細胞とは異なる性質を有し、また様々な組織を生み出す多分化能、時に不定胚を生み出す分化全能性を有する。
このカルスを培養する条件を調整することで、植物を再分化し新たな植物個体を得ることができる。この植物個体は、組織培養に用いた植物体と同一の遺伝情報を有するクローンである。
また、葉などの器官を培養する器官培養、未熟胚を培養する胚培養などが知られている。これらの方法によってもクローン植物を得ることができる。
【０００３】
組織培養の際の培地組成については様々な研究がなされている。一般的に、無機塩類、ビタミンＢ群、糖類の他、必要に応じてオーキシンやカイネチンなどの生長調節物質、アミノ酸、ココナットミルク、イーストエキスなどを加えたものが用いられている（例えば非特許文献１）。
【０００４】
組織培養用の培地への添加物として活性炭を用いることが知られている（特許文献１〜９など）。活性炭には吸着能があるため、培地中に放出される成長阻害物質を除去する目的や、有効成分を徐放する目的で培地へ添加される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１７−０５５６７０号公報
【特許文献２】特開２０１６−１４０３１８号公報
【特許文献３】特開２００５−２７８４９６号公報
【特許文献４】特開２００３−３１００７０号公報
【特許文献５】特開２００１−０２５３３０号公報
【特許文献６】特開平１１−３０８９３４号公報
【特許文献７】特開平０６−２３７６５８号公報
【特許文献８】特開平０５−２３６８３３号公報
【特許文献９】特表２００１−５１１６５２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「植物組織培養の方法」化学と生物, Vol. 6, No. 3, 178-184.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
組織培養においては無菌状態を維持する必要があり、その一環で抗生物質を培地に添加することが一般的に行われている。しかし、このような方法で得られたクローン植物は、組織培養工程において抗生物質に暴露されていた影響を受け、耐虫性や耐菌性に劣ることがある。そのため、クローン苗を土壌栽培する工程においては農薬の使用が必須となり、無農薬栽培を行うことが非常に困難であるという問題があった。
【０００８】
本発明はこのような問題を解決するため、耐虫性や耐菌性に優れ、無農薬での栽培も可能なクローン植物を得るための新規の組織培養技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決する本発明は、植物組織を組織培養することでクローン苗を生産する方法であって、
竹炭の存在下で組織培養を行う工程を含むことを特徴とする、クローン苗生産方法である。
本発明によれば、耐虫性や耐菌性の劣化という従来の組織培養技術の欠点を解決することができ、無農薬栽培にも適用可能なクローン植物を得ることができる。
【００１０】
本発明の好ましい形態では、竹炭を添加した固体培地上で組織培養を行う。
液体培地では培地中に酸素を行渡らせるため、また竹炭を培地中に分散するために攪拌の必要が生じるが、固体培地であれば攪拌のような操作を加えずに簡便に組織培養を行うことができる。
【００１１】
固体培地上に竹炭を含む組成物を積層した培地で組織培養を行う。このような簡易な培地構成であっても本発明は効果を有効に発揮する。
【００１２】
本発明の好ましい形態では、前記組織培養がカルス培養である。本発明を適用しカルスを再分化することで得られたクローン植物は耐虫性や耐菌性などの抵抗力に優れる。
【００１３】
本発明の好ましい形態では、抗生物質の非存在下で組織培養を行う。本発明によれば、抗生物質を加えずともコンタミネーションのリスクが低い。また、抗生物質不使用の形態とすることによって、より抵抗性に優れたクローン植物を得ることができる。
【００１４】
本発明は、上述のクローン苗生産方法によりクローン苗を生産するクローン苗生産工程と、該クローン苗を土壌で栽培する栽培工程と、を含むことを特徴とする、クローン植物生産方法にも関する。
本発明により生産されたクローン植物は抵抗性に優れる。
【００１５】
本発明の好ましい形態では、前記栽培工程において殺虫剤及び殺菌剤から選ばれる農薬を用いない。
上述したクローン苗生産されたクローン苗は抵抗性に優れるため、当該苗の栽培においては無農薬栽培が可能である。
【００１６】
また、本発明は竹炭の存在下で組織培養を行う工程を含むことを特徴とする、植物に耐菌性及び／又は耐虫性を付与する方法にも関する。
【００１７】
また、本発明は植物に耐菌性及び／又は耐虫性を付与するために用いられる、竹炭からなる組織培養用添加剤にも関する。
【００１８】
さらに本発明は竹炭を含むことを特徴とする、植物の組織培養のための培地組成物にも関する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、耐虫性や耐菌性などの抵抗力に優れたクローン植物を作出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】バナナの親株の株元から切り出した子株を表す図面代用写真。
【図２】バナナの子株の中心から切り出した生長組織を表す図面代用写真。
【図３】初代培養の結果、発生した発芽組織を切り出す様子を表す図面代用写真。
【図４】切り出した発芽組織を寒天培地に置床した様子を表す図面代用写真。
【図５】竹炭積層固体培地を表す図面代用写真。
【図６】竹炭積層固体培地上での組織培養の様子を撮影した図面代用写真。
【図７】竹炭積層固体培地上での組織培養の様子を撮影した図面代用写真。
【図８】竹炭積層固体培地上での組織培養の様子を撮影した図面代用写真。
【図９】無菌処理した土壌にクローン苗を移植した様子を表す図面代用写真。
【図１０】クローン苗を肥培管理しながら土壌栽培する様子を表す図面代用写真。
【図１１】育苗鉢で栽培中のクローン苗の様子を表す図面代用写真。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は植物組織を組織培養することでクローン苗、また、これを栽培することで得られるクローン植物を生産する方法に関する。
【００２２】
本発明を適用可能な植物の種類は限定されない。例えばパパイヤ科（Ｃａｒｉｃａｃｅａｅ）、パイナップル科（Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ）、バショウ科（Ｍｕｓａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、フトモモ科  Ｍｙｒｔａｃｅａｅ、カタバミ科（Ｏｘａｌｉｄａｃｅａｅ）、クワ科（Ｍｏｒａｃｅａｅ）、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）、アカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）、クスノキ科（Ｌａｕｒｅａｃｅａｅ）、トケイソウ科（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａｃｅａｅ）、ムクロジ科（Ｓａｐｉｎｄａｃｅａｅ）、フクギ科（Ｃｌｕｓｉａｃｅａｅ）、カキノキ科（Ｅｂｅｎａｃｅａｅ）、ミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）、バンレイシ科（Ａｎｎｏｎａｃｅａｅ）、ヤシ科（Ａｒｅｃａｃｅａｅ）、サボテン科（Ｃａｃｔａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）に属する植物への適用を例示することができる。
【００２３】
より具体的には、パパイヤ属（Ｃａｒｉｃａ）、アナナス属（Ａｎａｎａｓ）、バショウ属（Ｍｕｓａ）、ラカンカ属  Ｓｉｒａｉｔｉａ、バンジロウ属（Ｐｓｉｄｉｕｍ）、ゴレンシ属（Ａｖｅｒｒｈｏａ）、イチジク属（Ｆｉｃｕｓ）、カカオ属（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）、コーヒーノキ属（Ｃｏｆｆｅａ）、ニッケイ属（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ）、トケイソウ属（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ）、レイシ属（Ｌｉｔｃｈｉ）、フクギ属（Ｇａｒｃｉｎｉａ）、カキノキ属（Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ）、カシロミア属（Ｃａｓｉｍｉｒｏａ）、バンレイシ属（Ａｎｎｏｎａ）、ナツメヤシ属（Ｐｈｏｅｎｉｘ）、ヒモサボテン属（Ｈｙｌｏｃｅｒｅｕｓ）、サクラ属（Ｃｅｒａｓｕｓ）に属する植物などを例示することができる。
【００２４】
本発明を適用できる組織培養は限定されず、茎頂を培養する茎頂培養、葯を培養する葯培養、プロトプラストを培養するプロトプラスト培養、葉などの器官を培養する器官培養、未熟胚を培養する胚培養などが挙げられる。
特に茎頂培養、葯培養、プロトプラスト培養など、採取した植物組織をカルス誘導し、このカルスを再分化させることでクローン苗を生産する、いわゆるカルス培養に本発明を適用することが好ましい。
【００２５】
本発明は竹炭の存在下で組織培養を行う工程を含むことを特徴とする。本発明で用いる竹炭の形態は限定されないが好ましくは粉末状である。
竹炭としては真竹、孟宗竹、黒竹、篠竹、千島笹、圏紋竹、矢竹、おかめ笹、支那竹、蓬莱竹、淡竹、布袋竹、亀甲竹、四方竹、唐竹、隈笹、都笹、女竹など、何れの竹由来のものでも構わないが、好ましくは孟宗竹由来の竹炭である。
【００２６】
竹炭の製法も限定されず、炭化温度は好ましくは２００℃以上、より好ましくは５００℃以上、さらに好ましくは８００℃以上、さらに好ましくは１０００℃以上、さらに好ましくは１１００℃以上、さらに好ましくは１１００℃〜１３００℃である。
【００２７】
一般的に組織培養によりクローン苗を生産する工程は、組織からカルスを誘導するカルス誘導工程、カルスを培養するカルス培養工程、シュートを形成させるシュート形成過程、根を発生させる発根工程など、複数の工程を含む。本発明においては、何れの工程を竹炭存在下で行ってもよい。
【００２８】
組織培養における培地は、液体培地であっても固体培地であってもよい。生産する植物種、組織培養における各工程の目的などにより適宜選択できる。
培地の組成も特に限定されず、無機成分、ビタミン類、炭素源を含む一般的に植物の組織培養に用いられる基本培地、これに必要に応じてアミノ酸類、植物ホルモン類、ココナッツミルク、イーストエキスなどを加えた培地を用いることができる。
【００２９】
無機成分としては、窒素、リン、カリウム、硫黄、カルシウム、マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、モリブデン、塩素、ヨウ素、コバルト等の元素や、これらを含む無機塩が例示される。無機塩としては例えば、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、ホウ酸、三酸化モリブデン、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等やこれらの水和物が挙げられる。無機成分として、上記具体例の中から１種又は２種以上を選択して用いることができる。
【００３０】
炭素源としては、ショ糖等の炭水化物とその誘導体；脂肪酸等の有機酸；エタノール等の１級アルコール、などの化合物を使用することができる。炭素源として、上記具体例の中から１種又は２種以上を選択して用いることができる。
【００３１】
ビタミン類としては、例えば、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ４）、ピリドキサール、ピリドキサミン、パントテン酸カルシウム、イノシトール、ニコチン酸、ニコチン酸アミドおよび／またはリボフラビン（ビタミンＢ２）等を使用することができる。ビタミン類として、上記具体例の中から１種又は２種以上を選択して用いることができる。
【００３２】
アミノ酸類としては、例えば、グリシン、アラニン、グルタミン酸、システイン、フェニルアラニンおよび／またはリジン等を使用することができる。アミノ酸類として、上記具体例の中から１種又は２種以上を選択して用いることができる。
【００３３】
植物ホルモン類としては、例えば、オーキシン類、サイトカイニン類を使用することができる。
オーキシン類としては、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）、ｐ−クロロフェノキシ酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４Ｄ）、インドール酪酸（ＩＢＡ）およびこれらの誘導体等が例示され、これらから選択される１種以上または２種以上を組み合わせて用い得る。
また、サイトカイニン類としてはベンジルアデニン（ＢＡ）、カイネチン、ゼアチンおよびこれらの誘導体等が例示され、これらから選択される１種以上または２種以上を組み合わせて用い得る。
植物ホルモン類としては、オーキシン類のみ、サイトカイニン類のみ、又はオーキシン類とサイトカイニン類の両方を組み合わせて用いうる。
【００３４】
基本培地としては、例えば、ＭＳ培地、リンスマイヤースクーグ培地、ホワイト培地、ガンボーグのＢ−５培地、ニッチニッチ培地等を挙げることができる。
【００３５】
カルス誘導工程、カルス培養工程、シュート形成過程、発根工程など組織培養を構成する各工程における培地組成は、常法により植物ホルモン類の濃度調整などによって適宜設計することができる。
【００３６】
竹炭の存在下で液体培地により組織培養を行う場合には、竹炭を分散させた竹炭分散液体培地により培養を行うことが好ましい。竹炭分散液体培地を使用する場合には、液中に酸素を供給する必要があり、また、培地中に竹炭を均一に分散させる観点から、回転培養器や振とう培養器などにより培養を行うことが好ましい。
【００３７】
一方、固体培地は液体培地と異なり攪拌などの操作が必要ないので好ましい。本発明に用いる固体培地としては寒天、アガロース、カラギーナン、ゲランガム等のゲル化剤により固化した固体培地が好適に例示できる。
竹炭の存在下で固体培地により組織培養を行う場合には、竹炭を含有する固体培地を用意し、この竹炭含有固体培地上で培養を行ってもよい。
【００３８】
本発明においては、固体培地上に竹炭を含む組成物を積層した竹炭積層固体培地にて組織培養を行ってもよい。
「竹炭を含む組成物」としては竹炭が分散された水又は水溶液などの分散液組成物や、竹炭又は竹炭と竹炭以外の粉末からなる粉末組成物が挙げられる。
【００３９】
なお、本明細書においては上述した竹炭分散液体培地、竹炭含有固体培地、及び竹炭積層固体培地の何れの培地組成物を用いて培養を行っても良いが、竹炭積層固体培地が特に好ましく使用できる。
【００４０】
培地組成物全体に対する竹炭の含有量は、好ましくは１〜１０重量％、より好ましくは２〜５重量％、さらに好ましくは３〜４重量％であるが、これらの濃度範囲に限定されない。
【００４１】
一般的に組織培養においては例えばカルベニシリン、バンコマイシン、セフォタキシム等、種々の抗生物質を用いるが、本発明においては組織培養において抗生物質を用いないことが好ましい。本発明の方法によれば、抗生物質を用いずとも抵抗性に優れたクローン苗ないしクローン植物を得ることができる。
【００４２】
上述した方法で組織培養し、植物を再分化することで得られたクローン苗は土壌栽培に供することができる。クローン苗を栽培する栽培工程の具体的な方法は、植物の種類により常法により適宜選択することができる。
【００４３】
栽培工程においては一般的に農薬を用いることが多い。しかし、本発明の方法により生産されたクローン苗ないしクローン植物は抵抗力が付与されているため、殺虫剤や殺菌剤といった農薬を使用することなく、無農薬栽培に供することができる。
【実施例】
【００４４】
バナナの親株の株元より発生した子株を掘り上げ、これを切り出した（図１）。切り出した子株を輪切りにし、中心の生長組織を切り出し（図２）、これをアルコールで殺菌した。生長組織を初代培養し発芽させ（図３）、発生した芽を切り分け、これをバイオフラスコ中に敷いた寒天培地に置床した（図４）。発芽細胞が置床された寒天培地上に竹炭粉末を分散した水を添加し、竹炭積層固体培地とした（図５）。ここで使用した竹炭粉末は、孟宗竹を炭化温度１２００℃で炭化して得たものである。竹炭粉末は培地全体の３〜４重量％となるように添加した。また、竹炭積層固体培地には抗生物質を加えなかった。
【００４５】
竹炭積層固体培地上でバナナの発芽細胞の組織培養を継続した。組織培養過程でバナナが成長する様子を経時的に撮影した写真を図６〜８に示す。バナナのクローン苗の成長に伴い、バイオフラスコ中の竹炭粉末の量は減少した。これはバナナのクローン苗が竹炭粉末を細胞内に取り込んだためと考察される。
【００４６】
本試験例における組織培養の過程でバイオフラスコ中にはカビは発生しなかった。一方、比較例として、上記実施例と同一組成の寒天培地（竹炭粉末不添加・抗生物質不添加）を用いて同様に複数サンプルについて組織培養を行ったが、バイオフラスコ中にカビが発生するサンプルが生じてしまった。
【００４７】
この結果は、通常は抗生物質を使用しなければ組織培養においてコンタミネーションの問題が顕在化するが、竹炭存在下で組織培養を行うことにより、抗生物質を用いずともコンタミネーションの問題を解決できることを示している。
【００４８】
このようにして得た実施例のクローン苗を１６０℃のスチーム処理を行った無菌培養土に移し土壌栽培を行った（図９）。定植から１００日はバイオフラスコでの培養条件と同様の湿度に調整し、さらに紫外線を調整する目的で肥培管理して栽培を行った（図１０）。定植から１００日後に育苗鉢へ植え替え、直接太陽光に当たる環境に置き栽培を行った（図１１）。その後、着果、収穫まで問題なくバナナのクローン植物を栽培することができた。なお、この栽培過程では一切の農薬を用いなかった。
一方、同条件で土壌栽培した比較例のクローン植物は害虫や細菌の影響により枯死してしまった。
【００４９】
この結果は、竹炭存在下で組織培養を行うことで取得したクローン植物は、耐虫性や耐菌性といった抵抗性に優れ、無農薬栽培に供することができることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は植物の組織培養及び栽培方法に応用することができる。
【図１】
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【図２】
2019154284.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2019154284.tif 000012
【図１１】
2019154284.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月26日(2018.10.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物組織を組織培養することでクローン苗を生産する方法であって、
竹炭の存在下で組織培養を行う工程を含むことを特徴とする、クローン苗生産方法。
【請求項２】
竹炭を添加した固体培地上で組織培養を行うことを特徴とする、請求項１に記載のクローン苗生産方法。
【請求項３】
固体培地上に竹炭を含む組成物を積層した培地で組織培養を行うことを特徴とする、請求項２に記載のクローン苗生産方法。
【請求項４】
前記組織培養がカルス培養であることを特徴とする、請求項１〜３の何れか一項に記載のクローン苗生産方法。
【請求項５】
抗生物質の非存在下で組織培養を行うことを特徴とする、請求項１〜４の何れか一項に記載のクローン苗生産方法。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか一項に記載のクローン苗生産方法によりクローン苗を生産するクローン苗生産工程と、該クローン苗を土壌で栽培する栽培工程と、を含むことを特徴とする、クローン植物生産方法。
【請求項７】
前記栽培工程において殺虫剤及び殺菌剤から選ばれる農薬を用いないことを特徴とする、請求項６に記載のクローン植物生産方法。
【請求項８】
竹炭を含むことを特徴とする、植物の組織培養用の培地組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成31年1月15日(2019.1.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項８】
竹炭を含むことを特徴とする、植物の組織培養用の培地組成物（但し、抗生物質を含むものを除く）。