(57)【要約】【課題】より簡便に細胞培養基材上で培養された細胞を回収し得る、細胞の製造方法を提供する。【解決手段】基材本体と基材本体表面に配置された被膜とからなる細胞培養基材を有する培養容器を用いて、細胞培養基材の被膜上で細胞の培養を行い、次いで、溶媒を被膜に接触させて被膜上から細胞を剥離し、剥離した細胞を回収する細胞の製造方法であって、被膜が、シリコーン鎖、ポリオキシフルオロアルキレン鎖およびポリオキシアルキレン鎖からなる群から選択される鎖を有するポリマーから形成された膜であり、溶媒が所定の要件を満たす溶媒である、細胞の製造方法。【選択図】図１
2019154413.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材本体と前記基材本体表面に配置された被膜とからなる細胞培養基材を有する培養容器を用いて、前記細胞培養基材の前記被膜上で細胞の培養を行い、次いで、溶媒を前記被膜に接触させて前記被膜上から前記細胞を剥離し、剥離した細胞を回収する細胞の製造方法であって、
前記被膜が、シリコーン鎖、ポリオキシフルオロアルキレン鎖およびポリオキシアルキレン鎖からなる群から選択される鎖を有するポリマーから形成された膜であり、
前記溶媒が、以下の要件１または要件２を満たす溶媒であることを特徴とする細胞の製造方法。
要件１：前記溶媒と前記ポリマーとを体積比８０：２０で混合した試料Ｘを準備して、前記試料Ｘを２５℃で１時間撹拌した後、前記試料Ｘを２５℃で２４時間静置し、次に、前記試料Ｘの液面から深さ方向に向かって前記試料Ｘの全体積のうちの上部２０％を上部液と下部２０％を下部液として前記試料Ｘから分離して、前記上部液の比重Ｓ１および屈折率Ｒ１、並びに、前記下部液の比重Ｓ２および屈折率Ｒ２とが、式（Ａ）および式（Ｂ）の関係を満たす。
式（Ａ）    （比重Ｓ２−比重Ｓ１）／（比重Ｓ１）≦０．０２０
式（Ｂ）    ｛｜屈折率Ｒ１−屈折率Ｒ２｜／（屈折率Ｒ１および屈折率Ｒ２のうち小さい方）｝≦０．００２０
要件２：前記溶媒と前記ポリマーとを体積比２０：８０で混合した試料Ｙを準備して、前記試料Ｙを２５℃で１時間撹拌した後、前記試料Ｙを２５℃で２４時間静置し、次に、前記試料Ｙの液面から深さ方向に向かって前記試料Ｙの全体積のうちの上部２０％を上部液と下部２０％を下部液として前記試料Ｙから分離して、前記上部液の比重Ｓ３および屈折率Ｒ３、並びに、前記下部液の比重Ｓ４および屈折率Ｒ４とが、式（Ｃ）および式（Ｄ）の関係を満たす。
式（Ｃ）    （比重Ｓ４−比重Ｓ３）／（比重Ｓ３）≦０．０２０
式（Ｄ）    ｛｜屈折率Ｒ３−屈折率Ｒ４｜／（屈折率Ｒ３および屈折率Ｒ４のうち小さい方）｝≦０．００２０
【請求項２】
前記基材本体が、基板または粒状担体で構成され、
底部上に前記細胞培養基材が配置された前記培養容器内で細胞の培養を行う、請求項１に記載の細胞の製造方法。
【請求項３】
前記基材本体が、前記培養容器の底部の少なくとも一部を構成し、
底部表面に前記被膜を有する前記培養容器内で細胞の培養を行う、請求項１に記載の細胞の製造方法。
【請求項４】
液体培地が収容された前記培養容器内に、比重が１．０超である前記溶媒を添加し、前記被膜と前記溶媒とを接触させて細胞を剥離する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。
【請求項５】
前記溶媒が、含フッ素溶媒、炭化水素溶媒、および、シリコーン溶媒からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。
【請求項６】
前記ポリマーの転移温度が２５℃以下である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。
【請求項７】
基板および前記基板上に配置された被膜を有する細胞培養基材または粒状担体および粒状担体上に配置された被膜を有する細胞培養基材と、溶媒とを有する、細胞を製造するためのキットであって、
前記被膜が、シリコーン鎖、ポリオキシフルオロアルキレン鎖、および、ポリオキシアルキレン鎖からなる群から選択される鎖を有するポリマーから形成された膜であり、
前記溶媒が、以下の要件１または要件２を満たす溶媒である、キット。
要件１：前記溶媒と前記ポリマーとを体積比８０：２０で混合した試料Ｘを準備して、前記試料Ｘを２５℃で１時間撹拌した後、前記試料Ｘを２５℃で２４時間静置し、次に、前記試料Ｘの液面から深さ方向に向かって前記試料Ｘの全体積のうちの上部２０％を上部液と下部２０％を下部液として前記試料Ｘから分離して、前記上部液の比重Ｓ１および屈折率Ｒ１、並びに、前記下部液の比重Ｓ２および屈折率Ｒ２とが、式（Ａ）および式（Ｂ）の関係を満たす。
式（Ａ）    （比重Ｓ２−比重Ｓ１）／（比重Ｓ１）≦０．０２０
式（Ｂ）    ｛｜屈折率Ｒ１−屈折率Ｒ２｜／（屈折率Ｒ１および屈折率Ｒ２のうち小さい方）｝≦０．００２０
要件２：前記溶媒と前記ポリマーとを体積比２０：８０で混合した試料Ｙを準備して、前記試料Ｙを２５℃で１時間撹拌した後、前記試料Ｙを２５℃で２４時間静置し、次に、前記試料Ｙの液面から深さ方向に向かって前記試料Ｙの全体積のうちの上部２０％を上部液と下部２０％を下部液として前記試料Ｙから分離して、前記上部液の比重Ｓ３および屈折率Ｒ３、並びに、前記下部液の比重Ｓ４および屈折率Ｒ４とが、式（Ｃ）および式（Ｄ）の関係を満たす。
式（Ｃ）    （比重Ｓ４−比重Ｓ３）／（比重Ｓ３）≦０．０２０
式（Ｄ）    ｛｜屈折率Ｒ３−屈折率Ｒ４｜／（屈折率Ｒ３および屈折率Ｒ４のうち小さい方）｝≦０．００２０
【請求項８】
底部表面に配置された被膜を有する培養容器と、溶媒とを有する、細胞を製造するためのキットであって、
前記被膜が、シリコーン鎖、ポリオキシフルオロアルキレン鎖、および、ポリオキシアルキレン鎖からなる群から選択される鎖を有するポリマーから形成された膜であり、
前記溶媒が、以下の要件１または要件２を満たす溶媒である、キット。
要件１：前記溶媒と前記ポリマーとを体積比８０：２０で混合した試料Ｘを準備して、前記試料Ｘを２５℃で１時間撹拌した後、前記試料Ｘを２５℃で２４時間静置し、次に、前記試料Ｘの液面から深さ方向に向かって前記試料Ｘの全体積のうちの上部２０％を上部液と下部２０％を下部液として前記試料Ｘから分離して、前記上部液の比重Ｓ１および屈折率Ｒ１、並びに、前記下部液の比重Ｓ２および屈折率Ｒ２とが、式（Ａ）および式（Ｂ）の関係を満たす。
式（Ａ）    （比重Ｓ２−比重Ｓ１）／（比重Ｓ１）≦０．０２０
式（Ｂ）    ｛｜屈折率Ｒ１−屈折率Ｒ２｜／（屈折率Ｒ１および屈折率Ｒ２のうち小さい方）｝≦０．００２０
要件２：前記溶媒と前記ポリマーとを体積比２０：８０で混合した試料Ｙを準備して、前記試料Ｙを２５℃で１時間撹拌した後、前記試料Ｙを２５℃で２４時間静置し、次に、前記試料Ｙの液面から深さ方向に向かって前記試料Ｙの全体積のうちの上部２０％を上部液と下部２０％を下部液として前記試料Ｙから分離して、前記上部液の比重Ｓ３および屈折率Ｒ３、並びに、前記下部液の比重Ｓ４および屈折率Ｒ４とが、式（Ｃ）および式（Ｄ）の関係を満たす。
式（Ｃ）    （比重Ｓ４−比重Ｓ３）／（比重Ｓ３）≦０．０２０
式（Ｄ）    ｛｜屈折率Ｒ３−屈折率Ｒ４｜／（屈折率Ｒ３および屈折率Ｒ４のうち小さい方）｝≦０．００２０
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の製造方法、および、キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞の培養は、ガラス基材などの細胞培養基材の表面上にて行われていた。細胞培養基材上で培養した細胞を回収するためには、細胞を細胞培養基材表面から剥離する必要がある。細胞を細胞培養基材表面から剥離する方法として、細胞と細胞培養基材との間の結合を破壊する作用を有する物質（例えば、トリプシンのようなタンパク質分解酵素、化学薬品）を用いる酵素処理や化学薬品処理が挙げられる。しかし、これらの処理は手順が煩雑である。また、これらの処理を行うと、不純物が混入する場合がある点、および、細胞自体が変性し本来の機能が損なわれる場合がある点が指摘されている。
【０００３】
これらの欠点を解消するために、水に対する上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度が０〜８０℃である温度応答性ポリマーで支持体を被覆してなる細胞培養基材を用い、温度変化によって細胞を細胞培養基材表面から剥離する技術が提案されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平２−２１１８６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一方、特許文献１に記載の細胞培養基材を用いる方法においては、温度変化を実現するための温調設備が必要となり、簡便性という点では必ずしも満足できるものではなかった。
【０００６】
本発明は、上記実情を鑑みて、より簡便に細胞培養基材上で培養された細胞を回収し得る、細胞の製造方法の提供を課題とする。
また、本発明は、上記製造方法にて使用されるキットの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
（１）  基材本体と基材本体表面に配置された被膜とからなる細胞培養基材を有する培養容器を用いて、細胞培養基材の被膜上で細胞の培養を行い、次いで、溶媒を被膜に接触させて被膜上から細胞を剥離し、剥離した細胞を回収する細胞の製造方法であって、
被膜が、シリコーン鎖、ポリオキシフルオロアルキレン鎖およびポリオキシアルキレン鎖からなる群から選択される鎖を有するポリマーから形成された膜であり、
溶媒が、後述する要件１または要件２を満たす溶媒であることを特徴とする細胞の製造方法。
（２）  基材本体が、基板または粒状担体で構成され、
底部上に細胞培養基材が配置された培養容器内で細胞の培養を行う、（１）に記載の細胞の製造方法。
（３）  基材本体が、培養容器の底部の少なくとも一部を構成し、
底部表面に被膜を有する培養容器内で細胞の培養を行う、（１）に記載の細胞の製造方法。
（４）  液体培地が収容された培養容器内に、比重が１．０超である溶媒を添加し、被膜と溶媒とを接触させて細胞を剥離する、（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞の製造方法。
（５）  溶媒が、含フッ素溶媒、炭化水素溶媒、および、シリコーン溶媒からなる群から選択される、（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞の製造方法。
（６）  ポリマーの転移温度が２５℃以下である、（１）〜（５）のいずれかに記載の細胞の製造方法。
（７）  基板および基板上に配置された被膜を有する細胞培養基材または粒状担体および粒状担体上に配置された被膜を有する細胞培養基材と、溶媒とを有する、細胞を製造するためのキットであって、
被膜が、シリコーン鎖、ポリオキシフルオロアルキレン鎖、および、ポリオキシアルキレン鎖からなる群から選択される鎖を有するポリマーから形成された膜であり、
（８）  底部表面に配置された被膜を有する培養容器と、溶媒とを有する、細胞を製造するためのキットであって、
被膜が、シリコーン鎖、ポリオキシフルオロアルキレン鎖、および、ポリオキシアルキレン鎖からなる群から選択される鎖を有するポリマーから形成された膜であり、
溶媒が、後述する要件１または要件２を満たす溶媒である、キット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、より簡便に細胞培養基材上で培養された細胞を回収し得る、細胞の製造方法を提供できる。
また、本発明によれば、上記製造方法にて使用されるキットを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の細胞の製造方法の第１実施形態の工程Ａ１を説明するための図である。
【図２】被膜から細胞が剥離する機構を説明するための図であり、（Ａ）は被膜と溶媒とを接触させる前の被膜の一部拡大図であり、（Ｂ）は被膜と溶媒とを接触させた後の被膜の一部拡大図である。
【図３】試料Ｘ中の上部液および下部液を示す図である。
【図４】被膜と溶媒とを接触させる方法の一形態の手順を示す図である。
【図５】被膜と溶媒とを接触させた状態の図である。
【図６】被膜と溶媒とを接触させる方法の他形態の手順を示す図である。
【図７】被膜と溶媒とを接触させた状態の図である。
【図８】水と、水以外の溶媒とを用いて２相状態とした図である。
【図９】本発明の細胞の製造方法の第２実施形態の工程Ｂ１を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書における下記の用語の意味は以下の通りである。
ポリマーにおける「単位」は、モノマーが重合して形成された、該モノマー１分子に由来する原子団を意味する。単位は、重合反応によって直接形成された原子団であってもよく、重合反応によって得られたポリマーを処理して該原子団の一部が別の構造に変換された原子団であってもよい。
【００１１】
ポリマーの転移温度は、例えば、示差走査熱量計（ＤＳＣ）により測定できる。一般的に、転移温度とは、ＤＳＣで測定されるガラス転移温度Ｔｇまたは融点Ｔｍを意味する。ＤＳＣで測定する場合、Ｔｍは昇温時の吸熱ピークとして、Ｔｇはベースラインのシフトとして観測される。ポリマーはＤＳＣの測定において、Ｔｇのみを有する場合、Ｔｍのみを有する場合、並びに、ＴｇおよびＴｍの両方を有する場合がある。ポリマーの転移温度とは、ＤＳＣ測定において、ポリマーがＴｇおよびＴｍのいずれか一方のみを有する場合、ポリマーが有するＴｇまたはＴｍを意味し、ＴｇおよびＴｍの両方を有する場合は、ポリマーのＴｍを意味する。
【００１２】
後述する要件１および要件２において、上部液および下部液の比重の測定方法は、以下の通りである。
後述する手順によって得られる試料Ｘ中の上部液をマイクロシリンジで抜き取る。抜き取った上部液から、所定量（例えば、１ｍＬ）の試料を量りとって、その試料の質量を測定して、比重（ｇ／ｍＬ）を測定する操作を５回繰り返して、得られた５つの比重の値を算術平均して、要件１の上部液の比重Ｓ１とする。つまり、比重Ｓ１は、平均値に該当する。
後述する手順によって得られる試料Ｘ中の下部液をマイクロシリンジで抜き取る。抜き取った下部液から、所定量（例えば、１ｍＬ）の試料を量りとって、その試料の質量を測定して、比重（ｇ／ｍＬ）を測定する操作を５回繰り返して、得られた５つの比重の値を算術平均して、要件１の下部液の比重Ｓ２とする。つまり、比重Ｓ２は、平均値に該当する。
後述する手順によって得られる試料Ｙ中の上部液をマイクロシリンジで抜き取る。抜き取った上部液から、所定量（例えば、１ｍＬ）の試料を量りとって、その試料の質量を測定して、比重（ｇ／ｍＬ）を測定する操作を５回繰り返して、得られた５つの比重の値を算術平均して、要件２の上部液の比重Ｓ３とする。つまり、比重Ｓ３は、平均値に該当する。
後述する手順によって得られる試料Ｙ中の下部液をマイクロシリンジで抜き取る。抜き取った下部液から、所定量（例えば、１ｍＬ）の試料を量りとって、その試料の質量を測定して、比重（ｇ／ｍＬ）を測定する操作を５回繰り返して、得られた５つの比重の値を算術平均して、要件１の下部液の比重Ｓ４とする。つまり、比重Ｓ４は、平均値に該当する。
【００１３】
後述する要件１および要件２において、上部液および下部液の屈折率の測定方法は、以下の通りである。
後述する手順によって得られる試料Ｘ中の上部液をマイクロシリンジで抜き取る。抜き取った上部液から、５０μＬの試料を量りとって、屈折率測定を行う操作を５回繰り返して、得られた５つの屈折率の値を算術平均して、要件１の上部液の屈折率Ｒ１とする。つまり、屈折率Ｒ１は、平均値に該当する。
後述する手順によって得られる試料Ｘ中の下部液をマイクロシリンジで抜き取る。抜き取った下部液から、５０μＬの試料を量りとって、屈折率測定を行う操作を５回繰り返して、得られた５つの屈折率の値を算術平均して、要件１の下部液の屈折率Ｒ２とする。つまり、屈折率Ｒ２は、平均値に該当する。
後述する手順によって得られる試料Ｙ中の上部液をマイクロシリンジで抜き取る。抜き取った上部液から、５０μＬの試料を量りとって、屈折率測定を行う操作を５回繰り返して、得られた５つの屈折率の値を算術平均して、要件２の上部液の屈折率Ｒ３とする。つまり、屈折率Ｒ３は、平均値に該当する。
後述する手順によって得られる試料Ｙ中の下部液をマイクロシリンジで抜き取る。抜き取った下部液から、５０μＬの試料を量りとって、屈折率測定を行う操作を５回繰り返して、得られた５つの屈折率の値を算術平均して、要件２の下部液の屈折率Ｒ４とする。つまり、屈折率Ｒ４は、平均値に該当する。
なお、上記試料の屈折率の測定は、アッベ屈折計を用いて行う。アッベ屈折計は２５℃の室温下でチラーも２５℃に設定する。測定の際には、５０μＬの試料を試料台にセットし、揮発を防ぐため２秒以内に試料台の蓋を閉めて測定する。なお、試料の屈折率が１．３０以上の場合は、アッベ屈折率計ＮＡＲ−１Ｔ（ＡＴＡＧＯ社製）を用い、試料の屈折率が１．３０未満の場合は、アッベ屈折率計ＮＡＲ−１Ｔ・ＬＯ（ＡＴＡＧＯ社製）を用いて測定する。なお、上記屈折率は、波長５８９ｎｍにおける屈折率を意図する。
【００１４】
＜＜第１実施形態＞＞
本発明の細胞の製造方法（細胞の培養方法）の第１実施形態は、以下の工程Ａ１および工程２を有する。
工程Ａ１：底部上に細胞培養基材が配置された培養容器内で細胞の培養を行う工程
工程２：後述する要件１または要件２を満たす溶媒（以後、「特定溶媒」とも称する）を被膜に接触させて、被膜上から細胞を剥離して回収する工程
以下、本実施形態の手順について、図面を参照しながら、説明する。
【００１５】
＜工程Ａ１＞
工程Ａ１は、底部上に細胞培養基材が配置された培養容器内に収容された液体培地中で、かつ、細胞培養基材の被膜上で、細胞の培養を行う工程である。より具体的には、図１に示すように、液体培地Ｍが収容された培養容器１０の底部上に、基板１２と被膜１４とを有する細胞培養基材１６を配置して、被膜１４上で細胞Ｃを培養する工程である。本実施形態では、基板が、基材本体に該当する。
以下では、まず、本工程で使用される部材および材料について詳述し、その後、工程の手順について詳述する。
【００１６】
細胞培養基材は、基板と、基板上に配置された被膜とを有し、被膜上にて細胞の培養が行われる。
基板の具体例としては、ガラス基板、樹脂基板、金属基板が挙げられる。基板としては、取り扱い性の点から、ガラス基板が好ましい。
基板の板厚は、例えば、０．０１〜２０ｍｍである。
【００１７】
被膜は、シリコーン鎖、ポリオキシフルオロアルキレン鎖およびポリオキシアルキレン鎖からなる群から選択される鎖（以後、「特定鎖」ともいう）を有するポリマー（以後、「特定ポリマー」ともいう）から形成された膜である。
シリコーン鎖とは、シロキサン結合の繰り返し構造からなる高分子鎖であり、式（１）で表されるシリコーン鎖が好ましい。なお、（Ｓｉ（Ｒ１）２−Ｏ）で表される単位を、以下、「単位１」ともいう。
式（１）    −（Ｓｉ（Ｒ１）２−Ｏ）ｐ−
式（１）中、Ｒ１はアルキル基、ｐは２以上の整数を表す。アルキル基の炭素数は、１〜６が好ましく、１〜３がより好ましい。２つのＲは同一であっても、異なっていてもよい。
アルキル基は、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよい。
シリコーン鎖は、１種のみの単位１を含んでいてもよく、２種以上の単位１を含んでいてもよい。
２種以上の単位１としては、例えば、Ｒ１の炭素数の異なる２種以上の単位１、Ｒ１の炭素数が同じであってもＲ１の構造が異なる２種以上の単位１が挙げられる。なお、上記構造が異なるとは、例えば、直鎖状構造と分岐鎖構造との関係が該当する。
２種以上の単位１の結合順序としては、ランダム状、交互状、ブロック状が挙げられる。
シリコーン鎖中に含まれる単位１の繰り返し数ｐは、３〜１０００の整数が好ましく、５〜５００の整数がより好ましく、１０〜５００の整数がさらに好ましい。
シリコーン鎖としては、ポリジメチルシロキサン鎖が好ましい。
【００１８】
ポリオキシフルオロアルキレン鎖とは、複数のオキシフルオロアルキレン単位からなる高分子鎖であり、式（２）で表されるポリオキシフルオロアルキレン鎖が好ましい。なお、（Ｌ１−Ｏ）で表される単位を、以下、「単位２」ともいう。
式（２）    −（Ｌ１−Ｏ）ｒ−
Ｌ１は、１個以上のフッ素原子を有するフルオロアルキレン基を、ｒは２以上の整数を表す。フルオロアルキレン基は、ペルフルオロアルキレン基であってもよい。
フルオロアルキレン基の炭素数は、１〜６が好ましく、１〜４がより好ましい。
フルオロアルキレン基は、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよい。
ポリオキシフルオロアルキレン鎖は、１種のみの単位２を含んでいてもよく、２種以上の単位２を含んでいてもよい。
２種以上の単位２としては、例えば、Ｌ１の炭素数の異なる２種以上の単位２、Ｌ１の炭素数が同じであってもＬ１の構造が異なる２種以上の単位２が挙げられる。なお、上記構造が異なるとは、例えば、直鎖状構造と分岐鎖構造との関係が該当する。
２種以上の単位２の結合順序としては、ランダム状、交互状、ブロック状が挙げられる。
【００１９】
単位２の具体例としては、−ＣＦ２ＣＨＦＯ−、−ＣＨＦＣＦ２Ｏ−、−ＣＦ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＣＦ２Ｏ−、−ＣＦ２ＣＦ２ＣＨＦＯ−、−ＣＨＦＣＦ２ＣＦ２Ｏ−、−ＣＦ２ＣＦ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ２Ｏ−、−ＣＦ２Ｏ−、−ＣＦ２ＣＦ２Ｏ−、−ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２Ｏ−、−ＣＦ（ＣＦ３）ＣＦ２Ｏ−、−ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２Ｏ−、−ＣＦ（ＣＦ３）ＣＦ２ＣＦ２Ｏ−、−ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２Ｏ−、−ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２Ｏ−が挙げられる。
ポリオキシフルオロアルキレン鎖中に含まれる単位２の繰り返し数ｒは、２〜２００の整数が好ましく、５〜１５０の整数がより好ましく、５〜１００の整数がさらに好ましい。
ポリオキシフルオロアルキレン鎖としては、−（ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）ｒ−、−（ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）ｒ−、−｛（ＣＦ２Ｏ）ｒ１（ＣＨ２ＣＦ２Ｏ）ｒ２｝−、および、−（ＣＦ２ＣＦ２Ｏ−ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）ｒ／２−が好ましい。ただし、−｛（ＣＦ２Ｏ）ｒ１（ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）ｒ２｝−は、ｒ１個の（ＣＦ２Ｏ）とｒ２個の（ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）のランダム共重合鎖（ただし、ｒ１＋ｒ２＝ｒ）を表し、−（ＣＦ２ＣＦ２Ｏ−ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）ｒ／２−は、（ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）と（ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）との交互共重合鎖を表す。
なお、上記ポリオキシフルオロアルキレン鎖を有する特定ポリマーの具体例としては、信越シリコーン社のＫＹ−１８５、Ｘ−７１−１９５、Ｘ−７１−１９７、ＫＹ−１９００、ＫＹ−１９０３、ダイキン株式会社のＯＰＴＯＯＬ ＵＤ５０９が挙げられる。
【００２０】
ポリオキシアルキレン鎖とは、複数のオキシアルキレン単位からなる高分子鎖であり、式（３）で表されるポリオキシアルキレン鎖が好ましい。なお、なお、（Ｌ２−Ｏ）で表される単位を、以下、「単位３」ともいう。
式（３）    −（Ｌ２−Ｏ）ｓ−
Ｌ２は、アルキレン基を、ｓは２以上の整数を表す。
アルキレン基の炭素数は、１〜６が好ましく、３〜４がより好ましい。
アルキレン基は、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよい。
ポリオキシアルキレン鎖は、１種のみの単位３を含んでいてもよく、２種以上の単位３を含んでいてもよい。
２種以上の単位３としては、例えば、Ｌ２の炭素数の異なる２種以上の単位３、Ｌ２の炭素数が同じであってもＬ２の構造が異なる２種以上の単位３が挙げられる。なお、上記構造が異なるとは、例えば、直鎖状構造と分岐鎖構造との関係が該当する。
２種以上の単位３の結合順序としては、ランダム状、交互状、ブロック状が挙げられる。
【００２１】
単位３の具体例としては、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−が挙げられる。
ポリオキシアルキレン鎖中に含まれる単位３の繰り返し数ｓは、２〜２００の整数が好ましく、５〜１５０の整数がより好ましく、５〜１００の整数がさらに好ましい。
ポリオキシアルキレン鎖としては、−（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｓ−、および、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｓ２−が好ましい。ただし、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｓ２−は、ｓ１個の（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）とｓ２個の（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）のランダム共重合鎖、ブロック共重合鎖およびそれらの組合せからなる鎖（ただし、ｓ１＋ｓ２＝ｓ）を表し、Ｓ１＜Ｓ２であることが好ましい。
【００２２】
特定ポリマーは、特定鎖を１本だけ有していてもよい、複数本有していてもよい。なお、特定ポリマーが特定鎖を複数本有するとは、例えば、炭素原子や窒素原子などの原子を分岐点として特定鎖が上記原子に複数本結合している態様が挙げられる。
【００２３】
特定ポリマー中における特定鎖の含有割合としては、特定ポリマー全質量に対して、６０質量％以上が好ましく、８０質量％以上がより好ましい。上限は、１００質量％が挙げられ、１００質量％未満であってもよい。
【００２４】
特定ポリマーは、末端に基板（基材本体）と反応できる反応性基を少なくとも１つ有していてもよい。特定ポリマーが反応性基を有する場合、反応性基が基板と反応して、被膜と基板との間で共有結合が形成され、両者の密着性が向上する。
反応性基の数は、１つでもよいし、複数でもよい。例えば、線状の特定鎖の片末端側のみに１以上の反応性基を有していてもよく、線状の特定鎖の両末端側にそれぞれ１以上の反応性基を有していてもよい。
反応性基の具体例としては、式（４）で表される基、水酸基、カルボキシ基、チオール基、アミノ基、エポキシ基、アクリロイルオキシ基、メタクリロイルオキシ基が挙げられ、式（４）で表される基が好ましい。
式（４）    −Ｓｉ（Ｒ２）ｎ（Ｒ３）３−ｎ
Ｒ２は、１価の炭化水素基であり、１価の飽和炭化水素基が好ましい。Ｒ２の炭素数は、１〜６が好ましく、１〜３がより好ましく、１〜２が特に好ましい。
【００２５】
Ｒ３は、加水分解性基または水酸基である。
Ｒ３の加水分解性基は、加水分解反応により水酸基となる基である。すなわち、Ｓｉ−Ｒ３で表される基は、加水分解反応によりＳｉ−ＯＨで表されるシラノール基となる。シラノール基は、さらにシラノール基間で反応してＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合を形成する。また、シラノール基は、基材の表面の水酸基（基材−ＯＨ）と脱水縮合反応して、化学結合（基材−Ｏ−Ｓｉ）を形成できる。
Ｒ３の具体例としては、アルコキシ基、ハロゲン原子、アシル基、イソシアナート基が挙げられる。アルコキシ基としては、炭素数１〜４のアルコキシ基が好ましい。ハロゲン原子としては、塩素原子が好ましい。
【００２６】
ｎは、０〜２の整数である。
ｎは、０または１が好ましく、０が特に好ましい。Ｒ３が複数存在すると、被膜の基材への密着性がより強固になる。
ｎが１以下である場合、１分子中に存在する複数のＲ３は同じであっても異なっていてもよい。
【００２７】
特定ポリマーとしては、以下の式（５）で表されるポリマーが好ましい。
式（５）    （Ｒ４−Ｌ３）ｍ１−Ｌ４−Ｘｍ２
式（５）中、Ｒ４は不活性末端基である。不活性末端基の具体例としては、アルキル基、フルオロアルキル基、アルコキシ基、フルオロアルコキシ基、アリール基が挙げられる。
Ｌ３は、特定鎖である。特定鎖の定義は、上述の通りである。
ｍ１は１以上の整数、ｍ２は１以上の整数である。ｍ１は１または２が好ましく、ｍ２は１〜６が好ましく、１〜４がより好ましい。
Ｌ４は、ｍ１＋ｍ２価の連結基である。連結基の価数は２〜５が好ましく、２がより好ましい。なお、２価の連結基としては、たとえば、２価の炭化水素基（２価の飽和炭化水素基、２価の芳香族炭化水素基、アルケニレン基、アルキニレン基であってもよい。２価の飽和炭化水素基は、直鎖状、分岐鎖状または環状であってもよく、たとえば、アルキレン基が挙げられる。炭素数は１〜２０が好ましい。また、２価の芳香族炭化水素基は、炭素数５〜２０が好ましく、たとえば、フェニレン基が挙げられる。それ以外にも、炭素数２〜２０のアルケニレン基、炭素数２〜２０のアルキニレン基であってもよい。）、２価の複素環基、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（Ｒａ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓｉ（Ｒｂ）２−および、これらを２種以上組み合わせた基が挙げられる。ここで、Ｒａは、水素原子またはアルキル基（好ましくは炭素数１〜１０）である。Ｒｂは、アルキル基（好ましくは炭素数１〜１０）、または、フェニル基である。
Ｘは、反応性基である。反応性基の定義は、上述の通りである。
【００２８】
特定ポリマーの性状は、液体状であっても、固体状であってもよく、液状体が好ましい。液状体とは、２５℃において液状であることを意図する。
特定ポリマーの転移温度は、細胞の剥離がより進行しやすい点から、２５℃以下が好ましく、０℃以下がより好ましい。下限は、−１４０℃が挙げられる。
【００２９】
被膜は、基板上に固定されるのが好ましい。固定の形態としては、例えば、被膜が化学的に固定されている形態が挙げられる。このような化学的に固定される形態としては、より具体的には、被膜を構成する材料と基板とが共有結合を介して結合している形態が挙げられる。このような基板上に固定された被膜は、上述した、少なくとも１つの末端に基材と反応できる反応性基を有する特定ポリマーを用いて形成できる。
また、被膜は非共有結合を介して基板と結合していてもよい。非共有結合の具体例としては、静電相互作用、π−π相互作用が挙げられる。
【００３０】
被膜の形成方法の具体例としては、特定ポリマーを含む被膜形成用組成物を基板上に接触させ、必要に応じて硬化処理を施して、被膜を形成する方法が挙げられる。
被膜形成用組成物には、溶媒が含まれていてもよい。
被膜形成用組成物中の特定ポリマーの含有量は、被膜形成用組成物中の全固形分に対して、８０〜１００質量％が好ましい。全固形分とは、被膜を構成し得る成分であり、溶媒が含まれない。また、特定ポリマーのような被膜を構成し得る成分の性状が液体状であっても、固形分として計上する。
硬化処理としては、加熱処理や光照射処理が挙げられる。
【００３１】
被膜の膜厚は、細胞の剥離性の点から、３．０〜５０ｎｍが好ましく、４．５〜３０ｎｍがより好ましい。被膜の膜厚はＸ線反射率法（ＸＲＲ）を用いて評価できる。
【００３２】
被膜は、一対の主面を有する基板の少なくとも一方の主面上全面の配置されるのが好ましい。なお、被膜は、基板の全ての面上に配置されていてもよい。
なお、必要に応じて、基板と被膜との間には他の層が配置されていてもよい。例えば、両者の密着性を高めるための、両者の間にプライマー層が配置されていてもよい。
【００３３】
液体培地は、通常用いられる細胞培養培地から、培養する細胞に応じて適宜選択できる。細胞培養培地の具体例としては、ダルベッコ改変イーグル培地、ＭＥＭ−α、ＲＰＭＩ１６４０が挙げられる。
また、これらの液体培地に対しては、必要に応じて、血清、各種ビタミン、各種抗生物質などの細胞培養に適用可能な各種添加剤を添加してもよい。
なお、液体培地には、水が含まれる場合が多い。一般的に、液体培地は、栄養分を水に溶解させて得られる。
【００３４】
被膜上で培養される細胞の種類としては、ヒトを含む哺乳動物の細胞が挙げられ、例えば、体細胞、その前駆細胞、およびそれらの混合細胞が挙げられる。細胞の具体例としては、内皮細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、臍帯血由来幹細胞、歯髄幹細胞、心筋細胞、心臓壁細胞、肝細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、血管内皮細胞、肝前駆細胞、間葉系細胞、膵島細胞、軟骨細胞、上皮細胞が挙げられる。
なお、細胞としては、付着性細胞が好ましい。ここで付着性細胞とは、非浮遊性の細胞であり、細胞増殖に際して培養器面に対する接着依存性を示す細胞である。
【００３５】
培養容器は、その内部に液体培地を収容でき、かつ、その底部上に細胞培養基材が載置できるものであればよい。通常、培養容器は、少なくとも底部と、底部の周囲からのびる壁部とを少なくとも有する。
【００３６】
本工程の手順は被膜上で細胞が培養されればよく、代表例としては、まず、培養容器内の所定の位置に細胞培養基材を配置する。次に、所定の種類の細胞を所定数となるように培養容器内の細胞培養基材中の被膜上に播種し、さらに液体培地を培養容器内に加え、培養を行う。なお、液体培地を先に培養容器内に加えて、その後、細胞を播種してもよい。
【００３７】
細胞の培養条件は、細胞の種類に応じて適宜最適な条件を選択できる。例えば、培養温度は、通常、約３０〜４０℃が好ましく、約３７℃がより好ましい。培養は、例えば、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で行われ、ＣＯ２濃度は、例えば２〜５％である。培養時間は、例えば、１〜１０日間である。
なお、気体を供給しながら、細胞培養を行ってもよい。供給される気体の具体例としては、酸素、窒素、一酸化窒素、二酸化窒素、一酸化炭素、二酸化炭素、水素、硫化水素が挙げられる。
【００３８】
＜工程２＞
工程２は、被膜と特定溶媒とを接触させて、被膜上から細胞を剥離して回収する工程である。
被膜と特定溶媒とを接触させると、被膜の運動性が高まり、結果として被膜表面上から細胞が剥離され、細胞を容易に回収できる。
以下、一方の末端に基板と反応できる反応性基を有する特定ポリマーを用いて形成された被膜の場合を一例として、被膜上から細胞が剥離する機構について説明する。
図２（Ａ）に示すように、被膜１４が工程２で使用される特定溶媒と接触する前は、被膜１４中の一端が結合されたポリマーＰは縮まった状態であり、ポリマーＰの運動性は小さい。特に、通常、液体培地は水を含むため、被膜１４が液体培地と接触している場合、被膜中のポリマーＰは縮まった状態となりやすい。
次に、被膜１４と特定溶媒とを接触させると、図２（Ｂ）に示すように、被膜１４中のポリマーＰと特定溶媒との相溶性が高いため、ポリマーＰと特定溶媒とが相互作用して、被膜１４が膨潤し、ポリマーＰは広がった状態となる。つまり、被膜１４が特定溶媒と接触すると、ポリマーＰの運動性が高まる。このようにポリマーＰの運動性が高まると、結果として、被膜１４上にあった細胞Ｃが被膜１４上から離れる。
特定溶媒は、要件１および要件２のいずれか一方を満たす溶媒である。後段で詳述するように、要件１および要件２は、使用される溶媒と被膜を形成するポリマーとの相溶性の程度を示す要件であり、この要件を満たす特定溶媒を用いると、上述した機構により細胞の剥離が生じる。
【００３９】
本実施形態によれば、単に特定溶媒と被膜とを接触させて、細胞培養基材から細胞を容易に剥離・回収できる。つまり、従来技術のような温調設備のような特殊な設備を用意する必要がなく、簡便に、細胞を剥離・回収できる。
なお、上記図２においては、一方の末端が基板上に固定されたポリマーを含む被膜について説明したが、基板上に固定されていないポリマーを含む被膜を用いてもよい。
【００４０】
特定溶媒の種類は後段で詳述するが、被膜と特定溶媒との好適な組み合わせの具体例としては、ポリオキシフルオロアルキレン鎖を有するポリマーを用いて形成された被膜と含フッ素溶媒との組み合わせ、シリコーン鎖を有するポリマーを用いて形成された被膜とシリコーン溶媒との組み合わせ、シリコーン鎖を有するポリマーを用いて形成された被膜と含フッ素溶媒との組み合わせ、ポリオキシアルキレン鎖を有するポリマーを用いて形成された被膜と炭化水素溶媒との組み合わせ、ポリオキシアルキレン鎖を有するポリマーを用いて形成された被膜と含フッ素溶媒との組み合わせが挙げられる。
【００４１】
以下では、本工程で使用される材料について詳述し、その後、工程の手順について詳述する。
【００４２】
特定溶媒は、以下の要件１または要件２を満たす溶媒である。言い換えれば、特定溶媒と特定ポリマーとは、以下の要件１または要件２の関係を満たす。
要件１：溶媒とポリマーとを体積比８０：２０で混合した試料Ｘを準備して、試料Ｘを２５℃で１時間撹拌した後、試料Ｘを２５℃で２４時間静置し、次に、試料Ｘの液面から深さ方向に向かって試料Ｘの全体積のうちの上部２０％を上部液と下部２０％を下部液として試料Ｘから分離して、上部液の比重Ｓ１および屈折率Ｒ１、並びに、下部液の比重Ｓ２および屈折率Ｒ２とが、式（Ａ）および式（Ｂ）の関係を満たす。
式（Ａ）    （比重Ｓ２−比重Ｓ１）／（比重Ｓ１）≦０．０２０
式（Ｂ）    ｛｜屈折率Ｒ１−屈折率Ｒ２｜／（屈折率Ｒ１および屈折率Ｒ２のうち小さい方）｝≦０．００２０
要件２：溶媒とポリマーとを体積比２０：８０で混合した試料Ｙを準備して、試料Ｙを２５℃で１時間撹拌した後、試料Ｙを２５℃で２４時間静置し、次に、試料Ｙの液面から深さ方向に向かって試料Ｙの全体積のうちの上部２０％を上部液と下部２０％を下部液として試料Ｙから分離して、上部液の比重Ｓ３および屈折率Ｒ３、並びに、下部液の比重Ｓ４および屈折率Ｒ４とが、式（Ｃ）および式（Ｄ）の関係を満たす。
式（Ｃ）    （比重Ｓ４−比重Ｓ３）／（比重Ｓ３）≦０．０２０
式（Ｄ）    ｛｜屈折率Ｒ３−屈折率Ｒ４｜／（屈折率Ｒ３および屈折率Ｒ４のうち小さい方）｝≦０．００２０
【００４３】
要件１の手順としては、まず、溶媒とポリマーとを体積比８０：２０（溶媒：ポリマー＝８０：２０）で混合した試料Ｘを準備して、試料Ｘを２５℃で１時間撹拌した後、試料Ｘを２５℃で２４時間静置する。
ポリマーとしては、被膜の形成に用いた特定ポリマーを用いる。
溶媒とポリマーとの混合体積比は、８０：２０である。例えば、液体状のポリマー（特定ポリマー）を用いて、試料Ｘを５０ｍＬ準備する場合は、溶媒４０ｍＬとポリマー１０ｍＬとを混合する。また、例えば、液体状のポリマー（特定ポリマー）を用いて、試料Ｘを５ｍＬ準備する場合は、溶媒４ｍＬとポリマー１ｍＬとを混合する。
試料Ｘは、容器内に入れて静置する。容器としては、例えば、メスシリンダーが挙げられる。
【００４４】
次に、図３に示すように、試料Ｘ（試料Ｘ２０）の液面から深さ方向に向かって試料Ｘの全体積のうちの上部２０％を上部液２２、下部２０％を下部液２４として、試料Ｘから分離する。なお、液面側を上側とする。例えば、１００ｍＬの試料Ｘの場合、液面から２０ｍＬの位置までにある部分（溶液）を上部液と、８０ｍＬの位置から深さ方向にある部分（溶液）を下部液として、分離する。つまり、試料Ｘの全体積のうち試料Ｘの液面から深さ（底部）方向に向かって２０％分に対応する溶液を上部液、試料Ｘの全体積のうち試料Ｘの底部から液面方向に向かって２０％分に対応する溶液を下部液とする。
【００４５】
得られた上部液の比重Ｓ１および屈折率Ｒ１、並びに、下部液の比重Ｓ２および屈折率Ｒ２を測定し、以下の式（Ａ）および式（Ｂ）の関係を満たす溶媒を特定溶媒とする。
式（Ａ）    （比重Ｓ２−比重Ｓ１）／（比重Ｓ１）≦０．０２０
式（Ｂ）    ｛｜屈折率Ｒ１−屈折率Ｒ２｜／（屈折率Ｒ１および屈折率Ｒ２のうち小さい方）｝≦０．００２０
上記式（Ａ）によって、上部液の比重Ｓ１と下部液の比重Ｓ２との差の割合が算出される。溶媒とポリマーとの相溶性が高い場合は、両者は均一に混合し合うため、上部液の比重Ｓ１と下部液の比重Ｓ２とは略同じ値を示す。一方で、溶媒とポリマーとの相溶性が低い場合、それぞれ分離して存在しやすくなるため、上部液の比重Ｓ１と下部液の比重Ｓ２とは異なる数値を示しやすくなる。つまり、上記式（Ａ）で求められる値が小さいほど、溶媒とポリマーとの相溶性が高く、両者が接触した際に、上述した図２（Ｂ）に示したように、被膜中のポリマーの運動性が高まり、ポリマーが広がった状態となりやすく、結果として被膜上の細胞が剥離しやすくなる。
【００４６】
また、上記式（Ｂ）によって、上部液の屈折率Ｒ１と下部液の屈折率Ｒ２との差の割合が算出される。溶媒とポリマーとの相溶性が高い場合は、両者は均一に混合し合うため、上部液の屈折率Ｒ１と下部液の屈折率Ｒ２とは略同じ値を示す。一方で、溶媒とポリマーとの相溶性が低い場合、それぞれ分離して存在しやすくなるため、上部液の屈折率Ｒ１と下部液の屈折率Ｒ２とは異なる数値を示しやすくなる。つまり、上記式（Ｂ）で求められる値が小さいほど、溶媒とポリマーとの相溶性が高く、両者が接触した際に、上述した図２（Ｂ）に示したように、被膜中のポリマーの運動性が高まり、ポリマーが広がった状態となりやすく、結果として被膜上の細胞が剥離しやすくなる。
【００４７】
要件１においては、上記式（Ａ）および式（Ｂ）の両方の要件を満たすのが求められる。つまり、比重と屈折率との２つの点から、ポリマーと相溶性の高い特定溶媒を選択している。
なお、細胞の剥離がより容易である点から、式（Ａ）は式（Ａ−１）であることが好ましく、式（Ｂ）は式（Ｂ−１）であることが好ましい。つまり、特定溶媒は、式（Ａ−１）および式（Ｂ−１）の関係を満たすことが好ましい。
式（Ａ−１）    （比重Ｓ２−比重Ｓ１）／（比重Ｓ１）≦０．０１０
式（Ｂ−１）    ｛｜屈折率Ｒ１−屈折率Ｒ２｜／（屈折率Ｒ１および屈折率Ｒ２のうち小さい方）｝≦０．００１０
なお、上記式（Ａ）および式（Ａ−１）中の（比重Ｓ２−比重Ｓ１）／（比重Ｓ１）の下限値は０である。
また、上記式（Ｂ）および式（Ｂ−１）中の｛｜屈折率Ｒ１−屈折率Ｒ２｜／（屈折率Ｒ１および屈折率Ｒ２のうち小さい方）｝の下限値は０である。
【００４８】
要件２と要件１との違いは、溶媒とポリマーとを混合する際の体積比（溶媒：ポリマー）を２０：８０にしている点が挙げられる。
要件１は溶媒とポリマーとの混合物中における溶媒の含有割合が多い場合における溶媒とポリマーとの相溶性を示し、要件２は溶媒とポリマーとの混合物中におけるポリマーの含有割合が多い場合における溶媒とポリマーとの相溶性を示す。
上述したように特定ポリマーは液状である場合もあり、特定ポリマー自体が特定溶媒を溶かす材料となり得る。このような場合、要件２を満たす溶媒とポリマーとの組み合わせが有り得る。
つまり、要件１および要件２は、いずれも溶媒とポリマーとの相溶性の程度を指標であり、要件１は溶媒の使用量が多い場合、要件２はポリマーの使用量が多い場合における指標である。
【００４９】
要件２では、上述したように、溶媒とポリマーとを混合する際の体積比以外の点は、要件１と同様の手順によって、上部液の比重Ｓ３および屈折率Ｒ３、並びに、下部液の比重Ｓ４および屈折率Ｒ４を測定する。得られた比重Ｓ３、比重Ｓ４、屈折率Ｒ３、屈折率Ｒ４を用いて、上述した式（Ｃ）および式（Ｄ）の関係を満たす溶媒を特定溶媒とする。
なお、細胞の剥離がより容易である点から、式（Ｃ）は式（Ｃ−１）であることが好ましく、式（Ｄ）は式（Ｄ−１）であることが好ましい。つまり、特定溶媒は、式（Ｃ−１）および式（Ｄ−１）の関係を満たすことが好ましい。
式（Ｃ−１）    （比重Ｓ４−比重Ｓ３）／（比重Ｓ３）≦０．０１０
式（Ｄ−１）    ｛｜屈折率Ｒ３−屈折率Ｒ４｜／（屈折率Ｒ３および屈折率Ｒ４のうち小さい方）｝≦０．００１０
なお、上記式（Ｃ）および式（Ｃ−１）中の（比重Ｓ４−比重Ｓ３）／（比重Ｓ３）の下限値は０である。
また、上記式（Ｄ）および式（Ｄ−１）中の｛｜屈折率Ｒ３−屈折率Ｒ４｜／（屈折率Ｒ３および屈折率Ｒ４のうち小さい方）｝の下限値は０である。
【００５０】
特定溶媒の比重は、比重１．０超であってもよいし、比重１．０未満であってもよい。
後段で詳述するように、特定溶媒の比重によって、適宜最適な被膜との接触方法が選択される。
【００５１】
特定溶媒は、上記要件１または要件２を満たしている溶媒であればよく、含フッ素溶媒、炭化水素溶媒、または、シリコーン溶媒が好ましく、含フッ素溶媒がより好ましい。
また、特定溶媒は、１種のみを用いてもよいし、２種以上を合わせて用いてもよい。
【００５２】
含フッ素溶媒は、フッ素原子を含む溶媒であり、例えば、含フッ素アルカン、含フッ素オレフィン、含フッ素アルキルエーテル、含フッ素アルキルアミン、含フッ素芳香族化合物が挙げられる。
液体培地との相分離の点から、含フッ素溶媒中のフッ素原子の総含有率であるフッ素含量は、１５質量％以上が好ましく、３０質量％以上がより好ましい。また、フッ素含量は、８５質量％以下が好ましく、８０質量％以下がより好ましい。
【００５３】
含フッ素溶媒の２５℃における水に対する溶解度は、液体培地との相分離の点から、５０ｇ／Ｌ以下が好ましく、１０ｇ／Ｌ以下がより好ましく、５ｇ／Ｌ以下がさらに好ましい。水に対する溶解度の下限値は、例えば、０ｇ／Ｌである。
【００５４】
含フッ素アルカンは、直鎖状、分岐鎖状および環状のいずれであってもよい。含フッ素アルカンの炭素数は、５〜２０が好ましく、６〜１０がより好ましい。含フッ素アルカンはアルカンの水素原子のすべてがフッ素原子に置き換わったペルフルオロアルカンでもよいし、水素原子の一部がフッ素原子に置き換わったハイドロフルオロアルカンでもよい。
含フッ素アルカンの具体例としては、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロオクタン、ペルフルオロノナン、ペルフルオロデカン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン、ペルフルオロ（１，３−ジメチルシクロヘキサン）、ペルフルオロデカリン、１，１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６−トリデカフルオロオクタン、１，１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６−トリデカフルオロヘキサン、１，１，１，２，２，３，３，４，４−ノナフルオロヘキサン、１，１，１，２，２，３，４，５，５，５−デカフルオロペンタン、１，１，２，２，３，３，４−ヘプタフルオロシクロペンタン、３Ｍ社製のＦＣ−８７、ＦＣ−８４、ＦＣ−７７、ペルフルオロケロセンが挙げられる。
【００５５】
含フッ素オレフィンは、直鎖状、分岐鎖状および環状のいずれであってもよく、直鎖状または分岐鎖状が好ましい。含フッ素オレフィンの炭素数は、５〜２０が好ましく、６〜１０がより好ましい。含フッ素オレフィンに含まれる不飽和結合数は、１〜１０が好ましく、１〜５がより好ましい。含フッ素オレフィンはオレフィンの水素原子のすべてがフッ素原子に置き換わったペルフルオロオレフィンでもよいし、水素原子の一部がフッ素原子に置き換わったハイドロフルオロオレフィンでもよい。
含フッ素オレフィンの具体例としては、ペルフルオロシクロペンテン、ペルフルオロシクロヘキセン、ペルフルオロシクロヘプテン、ペルフルオロシクロオクテン、ペルフルオロシクロノネン、ペルフルオロシクロデセン、１−クロロ−３，３，３−トリフルオロプロペン、１−クロロ−２，３，３−トリフルオロプロペン、１，１，１，２，２，３，５，５，６，６，７，７，７−トリデカフルオロ−４−メトキシ−３−ヘプテンが挙げられる。
【００５６】
含フッ素アルキルエーテルは、酸素原子に結合する２つのアルキル基のうち少なくとも一方にフッ素原子が１以上置換していればよい。含フッ素アルキルエーテルを構成するフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基部分は、直鎖状、分岐鎖状および環状のいずれであってもよく、直鎖状または分岐鎖状が好ましい。含フッ素アルキルエーテルに含まれるアルキル基部分の炭素数は、５〜２０が好ましく、６〜１０がより好ましい。含フッ素アルキルエーテルに含まれるフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基部分は同一であっても、異なっていてもよい。含フッ素アルキルエーテルはアルキルエーテルの水素原子のすべてがフッ素原子に置き換わったペルフルオロアルキルエーテルでもよいし、水素原子の一部がフッ素原子に置き換わったハイドロフルオロアルキルエーテルでもよい。
含フッ素アルキルエーテルの具体例としては、１，１，２，２−テトラフルオロエチル−２，２，２−トリフルオロエチルエーテル、１−メトキシ−１，１，２，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン、１−エトキシ−１，１，２，２，３，３，４，４，４−ノナフルオロブタン、３−メトキシ−１，１，１，２，２，３，４，４，５，５，６，６，６−トリデカフルオロヘキサン、１−メトキシ−１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６，６−トリデカフルオロヘキサン、メチルノナフルオロイソブチルエーテル、エチルノナフルオロブチルエーテル、エチルノナフルオロイソブチルエーテル、１、１、１、２、２、３、４、５、５、５−デカフルオロ−３−メトキシ−４−（トリフルオロメチル）ペンタン、ＳＯＬＶＥＹ社製のＧＡＬＤＥＮ  ＨＴ５５、ＧＡＬＤＥＮ  ＨＴ７０、ＧＡＬＤＥＮ  ＨＴ９０、ＧＡＬＤＥＮ  ＺＴ１５０、ＧＡＬＤＥＮ  ＨＴ１７０、ＧＡＬＤＥＮ  ＺＴ１８０、ＧＡＬＤＥＮ  ＨＴ２００、ＦＯＭＢＬＩＮＥ  Ｙが挙げられる。
【００５７】
含フッ素アルキルアミンは、一級アミン、二級アミンおよび三級アミンのいずれでもよく、三級アミンが好ましい。含フッ素アルキルアミンは、窒素原子に結合するアルキル基のうちの少なくとも１つにフッ素原子が１以上置換していればよい。含フッ素アルキルアミンを構成するフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基部分は、直鎖状、分岐鎖状および環状のいずれであってもよく、直鎖状または分岐鎖状が好ましい。含フッ素アルキルアミンに含まれる１つのアルキル基部分の炭素数は、３〜５０が好ましく、９〜３０がより好ましい。含フッ素アルキルアミンに含まれるフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基部分が２以上ある場合、それらは同一であっても、異なっていてもよい。含フッ素アルキルアミンはアルキルアミンの水素原子のすべてがフッ素原子に置き換わったペルフルオロアルキルアミンでもよいし、水素原子の一部がフッ素原子に置き換わったハイドロフルオロアルキルアミンでもよい。
含フッ素アルキルアミンの具体例としては、ペルフルオロトリプロピルアミン、ペルフルオロトリブチルアミン、ペルフルオロトリペンチルアミン、ペルフルオロトリヘキシルアミン、ペルフルオロトリヘプチルアミン、ペルフルオロトリオクチルアミン、ペルフルオロトリノニルアミン、ペルフルオロトリデシルアミンが挙げられる。
【００５８】
含フッ素芳香族化合物は、芳香族化合物に少なくとも１以上のフッ素原子が置換している化合物である。含フッ素芳香族化合物の炭素数は、５〜３０が好ましく、６〜１０がより好ましい。含フッ素芳香族化合物は芳香族化合物中の水素原子のすべてがフッ素原子に置き換わった化合物でもよいし、水素原子の一部がフッ素原子に置き換わった化合物でもよい。
含フッ素芳香族化合物の具体例としては、モノフルオロベンゼン、ジフルオロベンゼン、トリフルオロベンゼン、テトラフルオロベンゼン、ペンタフルオロベンゼン、ヘキサフルオロベンゼンが挙げられる。
【００５９】
炭化水素溶媒は、炭素原子と水素原子とからなる溶媒であって、例えば、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素溶媒、ペンタン、ヘキサン、オクタン、デカン、２，２，４−トリメチルペンタン、２，２，３−トリメチルヘキサンなどの脂肪族炭化水素溶媒が挙げられる。
【００６０】
シリコーン溶媒の具体例としては、ジメチルシリコーンオイル、メチルフェニルシリコーンオイル、メチルハイドロジェンシリコーンオイルなどのストレートシリコーンオイル、環状ジメチルシリコーンなどの環状ポリシロキサンが挙げられる。
【００６１】
被膜と特定溶媒とを接触させる方法の具体例としては、図４に示すように、液体培地Ｍが収容された培養容器１０内に特定溶媒Ｓを添加する方法が挙げられる。この方法においては、図５に示すように、特定溶媒Ｓ中に細胞培養基材１６が浸漬するようになるまで、特定溶媒Ｓを培養容器１０内に添加する。上述したように、特定溶媒Ｓと接触した被膜１４中のポリマーの運動性が高まり、被膜１４上で培養された細胞Ｃが被膜１４上から剥離し、細胞を容易に回収できる。
なお、この方法で使用される特定溶媒Ｓとしては、液体培地Ｍよりも比重の大きい溶媒が選択される。より具体的には、特定溶媒Ｓとしては、比重が１．０超である特定溶媒が好ましい。このような特定溶媒Ｓが液体培地Ｍに加えられると、特定溶媒Ｓが液体培地Ｍよりも下層側に移動する。なお、上記比重は、１．２以上がより好ましく、２．１以下が好ましい。
この方法であれば、単に液体培地Ｍを含む培養容器中に特定溶媒Ｓを滴下するのみで、細胞を剥離でき、非常に簡便な方法といえる。
【００６２】
また、上記方法以外にも、図６に示すように、培養容器１０内の液体培地Ｍを一旦除去した後、図７に示すように、培養容器１０内に特定溶媒Ｓを添加して、特定溶媒Ｓ中に細胞培養基材１６を浸漬させて、特定溶媒Ｓと被膜１４とを接触させる方法も挙げられる。
この方法においては、細胞の回収が容易な点で、比重が１．０未満である特定溶媒を用いるのが好ましい。比重が１．０未満である特定溶媒を用いる場合、図７に示す特定溶媒Ｓ中にさらに水を添加すると、図８に示すように、特定溶媒Ｓが上相に水Ｗが下相に位置する相分離構造が得られる。このような相分離構造が形成されると、通常、細胞は水相に移動する。よって、この場合、遠心分離操作によって細胞を含む水相を容易に回収でき、細胞の回収効率性に優れる。なお、上記比重は、０．９５以下がより好ましく、０．６０以上が好ましい。
【００６３】
なお、回収された細胞の形態としては、細胞シート（細胞がシート状に集合したもの）であっても、個々の細胞がバラバラに分離したものであってもよい。
【００６４】
＜＜第２実施形態＞＞
本発明の細胞の製造方法の第２実施形態は、以下の工程Ｂ１および工程２を有する。
工程Ｂ１：液体培地が収容され、かつ、底部表面に被膜を有する培養容器内において、被膜上で細胞の培養を行う工程
工程２：被膜と、特定溶媒とを接触させて、被膜上から細胞を剥離して回収する工程
第１実施形態では被膜を支持する基板が用いられていたのに対して、第２実施形態では被膜が培養容器の底部表面に直接配置されている点以外は、同一の手順を実施するため、同一の手順（例えば、細胞の培養手順、工程２の構成）について説明を省略し、以下では、主に、第１実施形態との差異点について詳述する。
【００６５】
上述したように、本実施形態においては、培養容器と、培養容器の底部表面に配置された被膜とを有する被膜付き培養容器が用いられる。つまり、培養容器の底部の少なくとも一部が、基材本体に該当する。より具体的には、図９に示すように、培養容器１０の底部表面に被膜１４が配置されており、培養容器１０内には液体培地Ｍが収容されている。
被膜の構成は、第１実施形態と同様の構成である。
培養容器の底部表面に被膜を形成する方法の具体例としては、上述した第１実施形態で述べた方法が挙げられる。
【００６６】
なお、必要に応じて、培養容器と被膜との間には他の層が配置されていてもよい。例えば、両者の密着性を高めるための、両者の間にプライマー層が配置されていてもよい。
【００６７】
＜＜他の実施形態＞＞
上記第１実施形態においては、基板と基板上に配置された被膜とを有する細胞培養基材について述べたが、本発明において細胞培養基材は他の形態であってもよい。例えば、被膜を担持する担体の形状は、粒状であってもよい。つまり、細胞培養基材は、粒状担体と、粒状担体上に配置された被膜とを有する形態であってもよい。球状担体を含む粒状の細胞培養基材は、接着培養と浮遊培養の両方の側面を持つマイクロキャリア培養に好適に適用できる。
【００６８】
粒状担体は、その表面上に被膜が配置される、粒状の部材である。
粒状担体の形状の具体例としては、球状、楕円体状、立方体状、直方体状が挙げられる。
粒状担体の粒径は、マイクロキャリア培養への適用の点から、１００〜１０００μｍが好ましく、２００〜５００μｍがより好ましい。
粒状担体を構成する材料の具体例としては、樹脂、ガラス、金属、金属酸化物（ただし、ガラス以外）、金属窒化物が挙げられる。
粒状担体の具体例としては、ガラスビーズ、樹脂粒子、シリカビーズが挙げられる。
【００６９】
粒状担体上に配置される被膜の構成は、第１実施形態と同様の構成である。
また、粒状担体上に被膜を形成する方法の具体例としては、上述した第１実施形態で述べた方法が挙げられる。
なお、被膜は、粒状担体上の少なくとも一部に配置されていればよく、全面に配置されているのが好ましい。
【００７０】
＜＜キット＞＞
本発明は、細胞を製造するためのキットにも関する。
キットとしては、基板および基板上に配置された被膜を有する細胞培養基材と、特定溶媒とを有するキットが挙げられる。本キットは、上述した第１実施形態にて使用される。
細胞培養基材および特定溶媒の定義は、上述の通りである。
【００７１】
また、キットの他の形態としては、底部表面に配置された被膜を有する培養容器（上述した、被膜付き培養容器に該当）と、特定溶媒とを有するキットも挙げられる。本キットは、上述した第２実施形態にて使用される。
さらに、キットの他の形態としては、粒状担体および粒状担体上に配置された被膜を有する細胞培養基材と、特定溶媒とを有するキットも挙げられる。
【実施例】
【００７２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００７３】
＜ポリマー１の合成＞
国際公開第２０１３／１２１９８４号の例６に記載の方法を参照して、以下のポリマー１を合成した。
ポリマー１：ＣＦ３Ｏ−（ＣＦ２ＣＦ２Ｏ−ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）ｔ（ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）−ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｓｉ（ＯＣＨ３）３
ポリマー１のＮＭＲスペクトル：
１Ｈ−ＮＭＲ（３００．４ＭＨｚ、溶媒：重クロロホルム、基準：ＴＭＳ）  δ（ｐｐｍ）：０．６（２Ｈ）、１．６（２Ｈ）、２．８（１Ｈ）、３．３（２Ｈ）、３．５（９Ｈ）。
１９Ｆ−ＮＭＲ（２８２．７ＭＨｚ、溶媒：重クロロホルム、基準：ＣＦＣｌ３）  δ（ｐｐｍ）：−５６．２（３Ｆ）、−８４．１（５４Ｆ）、−８９．３（５４Ｆ）、−９１．３（２Ｆ）、−１２０．８（２Ｆ）、−１２６．６（５２Ｆ）、−１２７．２（２Ｆ）。
ｔの平均値：１３
ポリマー１の数平均分子量：４，９００。
なお、ポリマー１は室温２５℃では液状であった。またポリマー１を５℃／ｍｉｎの速度で−６０℃〜５０℃の温度範囲でＤＳＣ測定を行った。その結果昇温過程において−２℃と−２０℃に吸熱ピークが見られた。従って、ポリマー１の転移温度は２５℃以下であった。
【００７４】
＜細胞培養基材１の作製＞
ポリマー１および１，１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６−トリデカフルオロオクタンを用いて、ポリマー１の濃度が０．１質量％の溶液を調製した。スピンコーターを用いてガラス基板上に得られた溶液を塗布して製膜し、１２０℃で２０分間焼成した。次に、１，１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６−トリデカフルオロオクタンを含ませたＢＥＮＣＯＴ（登録商標、旭化成社製）を用いて、ガラス基板上の余剰分を拭き取り、過剰量の１，１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６−トリデカフルオロオクタンでガラス基板を洗浄して、その後、窒素気流で乾燥を行い、ガラス基板上に被膜１を有する細胞培養基材１を得た。細胞培養基材１の表面をＸＲＲで分析した結果、被膜１の厚さは５．９ｎｍであった。
２５℃、４０％ＲＨの環境下、細胞培養基材１の表面にイオン交換水の約２μＬを滴下して、接触角計（協和界面科学社製ＤＭ−５００）で接触角（水接触角）を測定した。接触角は１１６°であった。
【００７５】
＜細胞培養基材２の作製＞
スピンコーターを用いてガラス基板上にＸ―２２−１９６８（信越工業株式会社製）を塗布して製膜し、１２０℃で４時間焼成した。その後、ＩＰＡを含ませたＢＥＮＣＯＴ（登録商標、旭化成社製）を用いて、ガラス基板上の余剰分を拭き取り、過剰量のＩＰＡでガラス基板を洗浄して、その後、窒素気流で乾燥を行い、ガラス基板上に被膜２を有する細胞培養基材２を得た。細胞培養基材２の表面をＸＲＲで分析した結果、被膜２の厚さは４．７ｎｍであった。
２５℃、４０％ＲＨの環境下、細胞培養基材２の表面にイオン交換水の約２μＬを滴下して、接触角計（協和界面科学社製ＤＭ−５００）で接触角（水接触角）を測定した。接触角は１０６°であった。
Ｘ−２２−１９６８（信越工業株式会社製）をポリマー２として用いた。なお、ポリマー２には、シリコーン鎖が含まれていた。また、ポリマー２の末端には、反応性基として式（４）で表される基（Ｒ３：アルコキシ基）が含まれていた。
なお、ポリマー２は室温では液状であった。また、ポリマー２を５℃／ｍｉｎの速度で−６０℃〜５０℃の温度範囲でＤＳＣ測定を行った。その結果昇温過程において−４１℃に吸熱ピークが見られた。従って、ポリマー２の転移温度は２５℃以下であった。
【００７６】
＜実施例１＞
ＩＷＡＫＩ製のディッシュ（３５ｍｍ／ｎｏｎ―ｔｒｅａｔｅｄ  ｄｉｓｈ  型番１０００−０３５）に、２ｃｍ角にカットした細胞培養基材１を入れて、細胞培養基材１にＵＶを１５分間照射して、滅菌した。
次に、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を６．８万細胞／Ｄｉｓｈとなるよう播種し、ディッシュに液体培地（ＭＳＣＧＭ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔＴＭ（型番ＰＴ−３００１））を４ｍＬ添加した。次に、得られたディッシュをインキュベータ内にて、３７℃で２４時間置き、その後、インキュベータよりディッシュを取り出した。顕微鏡にディッシュを設置し、液体培地を２ｍＬピペットにより除去して含フッ素溶媒（特定溶媒１）２ｍＬをディッシュ内に滴下し、細胞培養基材１上の細胞の接着挙動の経時変化を観察した。
細胞培養基材１上の接着細胞が剥離すると、接着細胞が球状に変化するか、または、流されて細胞培養基材１上から無くなる。そこで、目視により、２０分後に、接着細胞が球状に変化する、または、流されて細胞培養基材１上から無くなる場合を「○」（良好）とし、５分後に接着細胞が球状に変化する、または、流されて細胞培養基材１上から無くなる場合を「◎」（優秀）、２０分後に変化がないものを「×」（不良）として、表１の「剥離性」欄に結果を示す。
【００７７】
＜実施例２、比較例１〜３＞
使用される細胞培養基材の種類、および、特定溶媒の種類を変更した以外は、実施例１と同様の手順に従って、細胞の培養を行い、上記と同様の剥離性の評価を実施した。
結果を以下の表１にまとめて示す。
なお、表１中の特定溶媒の種類は以下の通りである。
特定溶媒１：１，１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６−トリデカフルオロオクタン（比重：１．５６）
特定溶媒２：１，３−ジクロロ−１，１，２，２，３−ペンタフルオロプロパン（比重：１．５５）
【００７８】
＜実施例３〜５、比較例４＞
使用される細胞をヒト線維芽細胞ＴＩＧ３に、使用する液体培地をＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）に変更し、使用される細胞培養基材の種類、並びに、培養条件および播種密度を変更した以外は、実施例１と同様の手順に従って、細胞の培養を行い、上記と同様の剥離性の評価を実施した。
【００７９】
なお、表１中の「細胞培養基材の種類」欄は、使用した細胞培養基材の種類を表し、「１」〜「３」は、それぞれ「細胞培養基材１」〜「細胞培養基材３」を表す。なお、細胞培養基材３としては、ガラス基板を用いた。
また、表１中、各実施例および各比較例で使用された特定ポリマーおよび特定溶媒を用いて、上述した要件１および要件２に記載の手順を実施して得られる「（比重Ｓ２−比重Ｓ１）／（比重Ｓ１）」の値を「式（Ａ）」に、「｛｜屈折率Ｒ１−屈折率Ｒ２｜／（屈折率Ｒ１および屈折率Ｒ２のうち小さい方）｝」の値を「式（Ｂ）」に、「（比重Ｓ４−比重Ｓ３）／（比重Ｓ３）」の値を「式（Ｃ）」に、「｛｜屈折率Ｒ３−屈折率Ｒ４｜／（屈折率Ｒ３および屈折率Ｒ４のうち小さい方）｝」の値を「式（Ｄ）」に示す。
表１中の「相溶性」は、要件１または要件２を満たす場合を「○」、満たさない場合を「×」とする。
【００８０】
【表１】
2019154413.tif 000003
【００８１】
表１より、所定の被膜と特定溶媒とを用いる場合、細胞培養基材から細胞を容易に剥離でき、細胞を容易に製造できた。
【００８２】
なお、基板の代わりに、培養容器を用いて、実施例１と同様の操作を行ったところ、実施例１と同様の結果が得られた。つまり、被膜付き培養容器を用いた場合でも、所望の効果が得られた。
また、実施例１で回収した細胞を再播種した結果、細胞は剥離前と同等の接着性と増殖性を示した。
【００８３】
また、基板の代わりに、ガラスビーズ（粒径５００μｍ）を用いて、実施例１と同様の操作を行ったところ、実施例１と同様の結果が得られた。つまり、粒状の細胞培養基材を用いた場合でも、所望の効果が得られた。
【符号の説明】
【００８４】
１０    培養容器
１２    基板
１４    被膜
１６    細胞培養基材
２０    試料Ｘ
２２    上部液
２４    下部液
【図１】
2019154413.tif 000004
【図２】
2019154413.tif 000005
【図３】
2019154413.tif 000006
【図４】
2019154413.tif 000007
【図５】
2019154413.tif 000008
【図６】
2019154413.tif 000009
【図７】
2019154413.tif 000010
【図８】
2019154413.tif 000011
【図９】
2019154413.tif 000012