(57)【要約】      （修正有）【課題】BLV遺伝子検出において，より迅速かつ検出感度が高く，汎用性が期待できる検出方法の開発。【解決手段】配列番号１で示されるBLV遺伝子の塩基配列（GenBank accession No.LC1604083）の，4826番〜6373番の塩基配列（以下，「標的塩基配列」）から選ばれた任意の塩基配列，又はそれらと相補的な塩基配列を基に設計されたことを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマー。ならびに，これらオリゴヌクレオチドプライマーを用いたLAMP法などの核酸増幅方法。最も好ましくは，IPFとして配列番号８，OPFとして配列番号２，IPBとして配列番号９，OPBとして配列番号７で示されるプライマーセット１を用いることができる。【選択図】図１
2019180351.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるBLV遺伝子の塩基配列（GenBank accession No.LC1604083）の，4826番〜6373番の塩基配列（以下，「標的塩基配列」）から選ばれた任意の塩基配列，又はそれらと相補的な塩基配列を基に設計されたことを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項２】
標的塩基配列の3'末端側からF3c，F2c，F1cという塩基配列領域を，5'末端側からB3，B2，B1という塩基配列領域を選択し，
それぞれの相補的塩基配列をF3，F2，F1，そしてB3c，B2c，B1cとしたときに，
以下の(i)〜(iv)から選ばれた少なくとも１種の塩基配列からなる請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(i)  インナープライマーF（IPF）
(a)  標的塩基配列のF2領域を3'末端側に有し，5'末端側に標的塩基配列のF1c領域を有する塩基配列。
(ii)  アウタープライマーF（OPF）
(b)  標的塩基配列のF3領域を有する塩基配列。
(iii)  インナープライマーB（IPB）
(c)  標的塩基配列のB2領域を3'末端側に有し，5'末端側に標的塩基配列のB1c領域を有する塩基配列。
(iv)  アウタープライマーB（OPB）
(d)  標的塩基配列のB3領域を有する塩基配列。
【請求項３】
前記(i)ないし(iii)が，下記からなる請求項２に記載のオリゴヌクレオチドプライマー
(i)  インナープライマーF
(e)  5'−（配列番号３の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号４の塩基配列）−3'
(iii)  インナープライマーB
(f)   5'−（配列番号５の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号６の塩基配列）−3'
【請求項４】
前記(i)が配列番号８，(ii)が配列番号２，(iii)が配列番号９，(iv)が配列番号７である請求項３に記載のオリゴヌクレオチドプライマー
【請求項５】
前記請求項１ないし４において記載される配列番号２〜９で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた，少なくとも連続する15塩基を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項６】
請求項１ないし５に記載のオリゴヌクレオチドプライマーにおいて，IPF，OPB，IPB，OPBの4種類を少なくとも含むオリゴヌクレオチドプライマーセット
【請求項７】
さらに，下記を含む請求項６に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット  
(v)  ループプライマーF（LPF）；配列番号１０
(vi)  ループプライマーB（LPB）；配列番号１１
【請求項８】
請求項６ないし７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いて，BLV遺伝子の標的塩基配列の増幅反応を行うBLV遺伝子検出方法。
【請求項９】
BLV遺伝子の標的塩基配列の増幅反応がLAMP法である請求項８に記載のBLV遺伝子検出方法。
【請求項１０】
請求項６ないし７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いて，BLV遺伝子の標的塩基配列の増幅を検出することにより，BLV感染の有無を診断するBLV感染症の診断方法。
【請求項１１】
請求項６ないし７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含むBLV感染症診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，牛白血病ウイルス（BLV）遺伝子の検出方法に関する。さらに詳しくいうと本発明は，遺伝子の簡易，高感度かつ迅速な検出法を利用したBLV感染症の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
BLV（bovine leukemia virus）は，レトロウイルス科デルタレトロウイルス属（Retroviridae Deltaretrovirus）に分類され，地方病性牛白血病（enzootic bovine leukosis; EBL）の原因ウイルスである。
【０００３】
近年，牛白血病発症の届け出数およびBLV感染率がともに増加しており，農場でのBLV感染制御対策の実施が求められている。また，と畜場に出荷された牛は，食肉処理時に食肉衛生検査所の獣医師による検査を受け，異常の有無を確認される。この食肉衛生検査における牛白血病感染牛の摘発数も年々増加しているのが現状である。
【０００４】
しかしながら，BLVの感染や牛白血病の発症を防ぐワクチンおよび治療法は，現在，存在しない。加えて，BLV感染は，一度の感染が生涯持続してしまう。これより，農場で行えるBLV感染症の最大の対策は，新たな感染を防ぐことにある。加えて，BLV感染が発覚した後は，感染牛を経済的に可能な範囲で非感染牛に更新して農場の感染率を下げることとなる。
これらの事情から，感染状態の正確かつ迅速な把握は，BLV感染症対策を行うにあたって極めて重要となってくる。
現在，食肉衛生検査所における検査は，時間がかかり煩雑な病理組織学的診断に依存しているため，より迅速に結果を得ることができる遺伝子診断法の導入が強く望まれている。
【０００５】
BLV感染症を診断するための従来法は，主に抗BLV抗体の検出とBLV遺伝子の検出に分けられる。
抗BLV抗体の検出では，enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）法，受身赤血球凝集反応法，寒天ゲル内沈降反応法が用いられる。またBLV遺伝子の検出では，real-time polymerase chain reaction（リアルタイムPCR）法とnested PCR法が主に国内で使用されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Sabike I. I., Uemura R., Kirino Y., Mekata H., Sekiguchi S., Okabayashi T., Goto Y., Yamazaki W. Use of direct LAMP screening of broiler fecal samples for Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in the positive flock identification strategy. Frontiers in Microbiol, 7: 1582, pp. E1-E5 (2016).
【非特許文献２】Mekata H., Sekiguchi S, Konnai S, Kirino Y, Horii Y, Norimine J. Horizontal transmission and phylogenetic analysis of bovine leukemia virus in two districts of Miyazaki, Japan. J Vet Med Sci, 77:1115-20 (2015).
【非特許文献３】Mekata H., Sekiguchi S, Konnai S, Kirino Y, Honkawa K., Nonaka N., Horii Y, Norimine J. Evaluation of the natural perinatal transmission of bovine leukaemia virus. Vet Rec, 176:254 (2015).
【非特許文献４】Yamazaki W., V. Mioulet L. Murray M. Madi T. Haga N. Misawa Y. Horii D.P. King. Development and evaluation of multiplex RT-LAMP assays for rapid and sensitive detection of foot-and-mouth disease virus. J. Virological Methods, 192: 18-24 (2013).
【非特許文献５】Okuwa, Y., Miyamato-Hayashi, M., Tanaka, T., Hayakawa, Y., Inoshima, Y. Simple and rapid method for routine screening of bovine leukemia virus by loop-mediated isothermal amplification assay. J Vet Med Sci., 79(1):137-140 (2017).
【非特許文献６】Komiyama, C., Suzuki, K., Miura, Y., Sentsui, H. Development of loop-mediated isothermal amplification method for diagnosis of bovine leukemia virus infection. J Virol Methods., 157(2):175-179 (2009).
【非特許文献７】OIE (World organization for animal health).  Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Chapter 3. 6. 3. Development and optimization of nucleic detection assays (2014).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
抗BLV抗体検出は，ウイルス感染により生じる抗BLV抗体を検出することにより，比較的，簡易な手法により検出が可能な点において有用である。また，感染後期においては，ウイルス量が低下したり，消滅していることもあることから，そのような個体においても感染したことが確認できるという利点を有する。
しかしながら，感染初期の個体においては，ウインドウ期（ウイルス感染後，陽性と判定できるまでの抗体上昇あるいは病原体増幅に要する期間）が存在する。そのため，充分な抗BLV抗体上昇が確認できない，微量な感染BLVを正確に検出できないといった感染初期の個体においては，感染しているにもかかわらず，陰性と判断してしまうことが測定原理的に避けられないという問題がある（偽陰性判定）。
【０００８】
また，BLV遺伝子検出は，抗BVL抗体検出において検出できないような感染初期の個体であっても検出しうるという点において有用である。
しかしながら，比較的迅速に結果を得ることができるリアルタイムPCR法であっても，反応開始から判定までおよそ１時間を必要とし，また，検出感度を下回るウイルス量を有する検体の場合は偽陰性を示すことが問題となっている。
【０００９】
これらに加え，BLVは，塩基配列の多様性が存在することが知られており，これらを可能な限りカバーしうる検出手法が求められる。
【００１０】
上記事情を背景として本発明では，BLV遺伝子検出において，より迅速かつ検出感度が高く，汎用性が期待できる検出方法の開発を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明者らは，公共遺伝子配列データベースであるGeneBankより，260のBLV特異的塩基配列を抽出し，同領域に存在する塩基配列の多様性をカバーするようにプライマーセットを設計した。このプライマーを用いてLAMP法による検出を行えば，反応重要領域のミスマッチを避け，BLV遺伝子を確実に検出できることに想到したものである。
加えて発明者らは，BLVの代表株であるFLK株を使用して，設計したプライマーセットの特異性の検証を行った。その結果，この代表株塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し，LAMP法により増幅することで，BLV遺伝子を簡易，高感度かつ20分以内と迅速に検出できることを実験的に明らかにしたものである。
さらに発明者らは，牛血液100検体を用いて，従来法であるリアルタイムPCR法との性能比較試験を実施し，開発したプライマーを用いたLAMP法が，従来法よりも，高感度かつ迅速にBLV遺伝子を検出できることを実験的に明らかにしたものである。
【００１２】
すなわち，本発明は以下の構成からなる。
本発明の第一の構成は，配列番号１で示されるBLV遺伝子の塩基配列（GenBank accession No.LC1604083）の，4826番〜6373番の塩基配列（以下，「標的塩基配列」）から選ばれた任意の塩基配列，又はそれらと相補的な塩基配列を基に設計されたことを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００１３】
本発明の第二の構成は，標的塩基配列の3'末端側からF3c，F2c，F1cという塩基配列領域を，5'末端側からB3，B2，B1という塩基配列領域を選択し，それぞれの相補的塩基配列をF3，F2，F1，そしてB3c，B2c，B1cとしたときに，以下の(i)〜(iv)から選ばれた少なくとも１種の塩基配列からなる第一の構成に記載のオリゴヌクレオチドプライマーである。
(i)  インナープライマーF（IPF）
(a)  標的塩基配列のF2領域を3'末端側に有し，5'末端側に標的塩基配列のF1c領域を有する塩基配列。
(ii)  アウタープライマーF（OPF）
(b)  標的塩基配列のF3領域を有する塩基配列。
(iii)  インナープライマーB（IPB）
(c)  標的塩基配列のB2領域を3'末端側に有し，5'末端側に標的塩基配列のB1c領域を有する塩基配列。
(iv)  アウタープライマーB（OPB）
(d)  標的塩基配列のB3領域を有する塩基配列。
【００１４】
本発明の第三の構成は，前記(i)ないし(iii)が，下記からなる第二の構成に記載のオリゴヌクレオチドプライマーである。
(i)  インナープライマーF
(e)  5'−（配列番号３の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号４の塩基配列）−3'
(iii)  インナープライマーB
(f)   5'−（配列番号５の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号６の塩基配列）−3'
【００１５】
本発明の第四の構成は，前記(i)が配列番号８，(ii)が配列番号２，(iii)が配列番号９，(iv)が配列番号７である第三の構成に記載のオリゴヌクレオチドプライマーである。
本発明の第五の構成は，前記第一ないし第四の構成において記載される配列番号２〜９で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた，少なくとも連続する15塩基を含むオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００１６】
本発明の第六の構成は，前記第一ないし第五の構成に記載のオリゴヌクレオチドプライマーにおいて，IPF，OPB，IPB，OPBの4種類を少なくとも含むオリゴヌクレオチドプライマーセットである。
本発明の第七の構成は，さらに，下記を含む第六の構成に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットである。
(v)  ループプライマーF（LPF）；配列番号１０
(vi)  ループプライマーB（LPB）；配列番号１１
【００１７】
本発明の第八の構成は，第六ないし第七の構成いずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いて，BLV遺伝子の標的塩基配列の増幅反応を行うBLV遺伝子検出方法である。
本発明の第九の構成は，BLV遺伝子の標的塩基配列の増幅反応がLAMP法である第八の構成に記載のBLV遺伝子検出方法である。
本発明の第十の構成は，第六ないし第七の構成いずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いて，BLV遺伝子の標的塩基配列の増幅を検出することにより，BLV感染の有無を診断するBLV感染症の診断方法である。
本発明の第十一の構成は，第六ないし第七の構成いずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含むBLV感染症診断キットである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により，BLV遺伝子検出において，より迅速かつ検出感度が高く，汎用性が期待できる検出方法の提供が可能となった。
すなわち，本発明により，農場現場や食肉処理時における即時診断が可能となる上に，感染初期の個体をも正確に摘発できる。さらには，本発明により，従来よりも効率的かつ確実な牛白血病診断や摘発・淘汰が可能となり，同疾患の清浄化の推進や被害減少に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】LAMP法を用いた蛍光検出により，BLV遺伝子の測定検感度を測定した結果を示した図（1回目）。
【図２】LAMP法を用いた蛍光検出により，BLV遺伝子の測定検感度を測定した結果を示した図（２回目）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマー等について，説明を行う。
本発明は，BLV（bovine leukemia virus）遺伝子の検出に有用な塩基配列領域として，配列番号１で示されるBLV遺伝子の塩基配列（GenBank accession No.LC1604083）の4826番〜6373番の塩基配列（以下，「標的塩基配列」）を発明者らが発見したことに基づくものである。また，発明者らは，下記に示すオリゴヌクレオチドプライマー（以下，単に「プライマー」という）により，高感度かつ迅速な増幅が可能であることを確認し，BLV遺伝子の検出に有用なプライマーおよび検出方法等にかかる発明を完成させたものである。
本発明者らは，BLV遺伝子に由来する塩基配列より，配列番号１で示されるBLV遺伝子の塩基配列から，BLV遺伝子の特異的な塩基配列を迅速に増幅できるLAMP法のプライマーの塩基配列とその組み合わせを鋭意研究した結果，下記のプライマーセットを選定した。なお，配列番号８および配列番号９に存在する塩基配列「TTTT」はリンカーである。
１．プライマーセット（以下，「プライマーセット１」）
BLV-IPF-1:5'-GGCCARTAGATCTTAGGATAGCCA-TTTT-ACCTTTCTGTGCCAAGTCTCC-3' （配列番号８）
BLV-OPF-1:5'-CCATTGACCAAATACTAGAGGC-3' （配列番号２）
BLV-IPB-1:5'-GAGCCAGGGCCATGGTC-TTTT-CCCCACATAAGGGCATCG-3' （配列番号９）
BLV-OPB-1:5'-CAGTCGAACCGATCHGC-3' （配列番号７）
BLV-LPF-1:5'-TTACAGAGTCCAAGGTGTATC-3' （配列番号１０）
BLV-LPB-1:5'-CACATATGATTGCGAGCC-3' （配列番号１１）
なお，詳細は後述するが，IPFはインナープライマーF，OPFはアウタープライマーF，IPBがインナープライマーB，OPBがアウタープライマーB，LPFがループプライマーF，LPBがループプライマーBの略である。
【００２１】
標的塩基配列は，260種のBLVにおける保存性が高い部分として見出されたものであり，BLVの多様性をカバーし増幅しうる塩基配列領域である。
本発明におけるプライマーは，かかる標的塩基配列を増幅対象として設計しうる限り特に限定する必要はなく，PCR法やLAMP法などの核酸増幅方法に用いる際のプライマーとして使用することができる。
【００２２】
また，本発明のBLV遺伝子検出方法は，標的塩基配列を増幅しうる限り特に限定する必要はなく，種々の核酸増幅による検出方法を用いることができ，典型的には，PCR法やLAMP法を用いることができる。
以下では，本発明において特に好適な核酸増幅方法であるLAMP法を例にとり説明を行う。
【００２３】
LAMP法は，納富らが開発した，PCR法で不可欠とされる温度制御が不要な新しい核酸増幅法であり，ループ媒介等温増幅法（Loop-mediated isothermal amplification method，特許公報国際公開第00/28082号パンフレット）の略称として称される方法である。
LAMP法は，鋳型となるヌクレオチドに自身の3’末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに，このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより，等温での相補鎖合成反応を可能とする。また，LAMP法では，プライマーの3’末端が，常に試料に由来する領域に対してアニールしており，塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能することとなり，結果として，高感度かつ特異性の高い核酸増幅反応を可能とするものである。
【００２４】
LAMP法においては，核酸増幅の際，鋳型核酸の塩基配列の計6領域に対応したプライマーを必要とする。
すなわち，LAMP法では，3’末端側からF3c，F2c，F1cという領域，5’末端側からB3，B2，B1という領域，これら6つの塩基配列を認識する少なくとも４種類のプライマーを必要とする。これらのプライマーはそれぞれ，インナープライマーF及びB，アウタープライマーF及びBと呼ばれる。
また，F1c，F2c，F3cと相補的な塩基配列は，F1，F2，F3と呼ばれる。一方，B1，B2，B3と相補的な塩基配列は，B1c，B2c，B3cと呼ばれる。
なお，各プライマーにおけるFとは，標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し，合成起点を提供するプライマー表示である。一方，Bとは，標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し，合成起点を提供するプライマー表示である。
【００２５】
インナープライマーとは，標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」を認識し，かつ合成起点を与える塩基配列を3’末端に有し，同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を5’末端に有するオリゴヌクレオチドである。
また，「F2より選ばれた塩基配列」及び「F1cより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーF（以下，「IPF」），そして「B2より選ばれた塩基配列」と「B1cより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーB（以下，「IPB」）と呼ぶ。
IPFならびにIPBともに，典型的には，その3'末端側から，F2領域（又はB2領域），F1c領域（又はB1c領域）とした塩基配列とすればよい。また，F2領域とF1c領域の間には，増幅に関与しない非特異的塩基配列領域（リンカー）を有していてもよいことが技術常識として知られており，この非特異的領域を含んだ配列としてもよい。非特異的領域の配列の長さについては，増幅に影響を及ぼさない配列長とすればよく，典型的には50配列以下とすればよい。
【００２６】
一方，アウタープライマーとは，標的塩基配列上の「『ある特定のヌクレオチド配列領域』の3’末端側に存在する，ある特定のヌクレオチド配列領域」を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
また，「F3より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーF（以下，「OPF」），「B3より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーB（以下，「OPB」）と呼ぶ。
【００２７】
LAMP法の核酸増幅においては，インナープライマーとアウタープライマーに加え，さらにこれとは別のプライマー，すなわちループプライマーを用いることができる。
ループプライマー（Loop Primer）は，ダンベル構造の5’末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマーである。このプライマーを用いると，核酸合成の起点が増加し，反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる（特許文献国際公開第02/24902号パンフレット）。
ループプライマーの塩基配列は，上述のダンベル構造の5’末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的であれば，標的遺伝子の塩基配列あるいはその相補鎖から選ばれても良く，他の塩基配列でも良い。また，ループプライマーは１種類でも２種類でも良い。
【００２８】
本発明において，標的塩基配列を増幅のターゲットとして，その3’末端側からF3c，F2c，F1cの塩基配列領域，5’末端側からB3，B2，B1の塩基配列領域，これらそれぞれの塩基配列領域を選択する。また，これら選択された塩基配列領域と相補的な，F3，F2，F1の塩基配列領域，B3c，B2c，B1cの塩基配列領域，これらそれぞれの塩基配列領域を選択する。これら塩基配列領域を基に，下記のオリゴヌクレオチドプライマーを作製する。
(a)  3’末端側から，F2領域，非特異的塩基配列領域，F1c領域を有する塩基配列（IPF）。
(b)  F3領域を有する塩基配列（OPF）。
(c)  3’末端側から，B2領域，非特異的塩基配列領域，B1c領域を有する塩基配列（IPB）。
(d)  B3領域を有する塩基配列（OPB）。
【００２９】
なお，プライマーとして作製される塩基配列の長さは，各領域に対する感度や特異度ないしはプライマーとしての安定性を考慮し適宜調整することができるが，上記(b)ないし(d)に該当して作製するオリゴヌクレオチドプライマーは，10塩基以上とすることが好ましく，さらに好ましくは15塩基以上とすることができる。また，上記(a)ないし(c)に該当して作製するオリゴヌクレオチドプライマーは，20塩基以上とすることが好ましく，さらに好ましくは40塩基以上とすることができる。
【００３０】
本発明において，(a)に記載する塩基配列は，IPFに該当するものであり，例えば，下記(e)に基づき，作製することができる。
(e)  5’−（配列番号３の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号４の塩基配列）−3’
IPFについては，3’側からF2に相当する配列と，F1cに相当する配列を組み合わせて作製すればよい。また，F2に相当する塩基配列と，F1cに相当する塩基配列の間には，増幅に関与しない非特異的な塩基配列（リンカー）を有していてもよいことが技術常識として知られており，そのリンカーの長さとして特に限定する必要はないが，典型的には，塩基数50以下とすることができ，より好ましくは2〜50，さらに好ましくは3〜40，最も好ましくは4〜30の間で調整することができる。
【００３１】
本発明において，(c)に記載する塩基配列は，IPBに該当するものであり，例えば，下記(f)に基づき，作製することができる。
(f)  5’−（配列番号５の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号６の塩基配列）−3’
IPBについては，3’側からB2に相当する配列と，B1cに相当する配列を組み合わせて作製すればよい。また，IPF同様，IPBについても，B2に相当する塩基配列と，B1cに相当する塩基配列の間には，リンカーを有していてもよいことが技術常識として知られており，そのリンカーの長さとして特に限定する必要はないが，典型的には，塩基数50以下とすることができでき，より好ましくは2〜50，さらに好ましくは3〜40，最も好ましくは4〜30の間で調整することができる。
【００３２】
本発明において，前記(a)，(b)，(c)，(d)は，それぞれ配列番号８，配列番号２，配列番号９，配列番号７に記載の塩基配列として設計することが可能である。また，当然のことながら，前記(a)，(b)，(c)，(d)は，これらの塩基配列と相補的な塩基配列として設計してもよい。さらに前記(a)，(b)，(c)，(d)は，これらの塩基配列もしくは相補的な塩基配列における連続した塩基配列を含む場合であっても標的塩基配列を増幅しうるものであり，少なくとも連続する15塩基を含む塩基を含むオリゴヌクレオチドプライマーとして設計することができる。
【００３３】
本発明において，IPF，OPF，IPB，OPBを，LAMP法に用いる際のオリゴヌクレオチドプライマーの一つのセットとして用いることができ，これらに加え，ループプライマーを合わせて用いてもよい。これにより，核酸合成の起点が増加することとなり，反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる効果を有する。
ループプライマーは，LPFとして配列番号１０，LPBとして配列番号１１に記載の塩基配列のオリゴヌクレオチドプライマーを用いることができる。
【００３４】
さらに，本発明においては，単独のプライマーセットを用いて核酸増幅操作を行うこともできるし，複数を組み合わせて核酸増幅操作を行うこともできる。複数のプライマーセットを組み合わせて核酸増幅操作を行うことにより，BLV遺伝子塩基配列の多様性をよりカバーしうるとともに，検出感度や特異度，迅速性を向上させる効果を有する。
これらの組み合わせの例として，前述のプライマーセット１，または前記(a)ないし(f)で示されプライマーセット１とは異なる配列の組み合わせのプライマーセット，これらを組み合わせて，BLV遺伝子の検出を行うなどである。
【００３５】
続いてLAMP法の一連の流れについて説明を行う。
【００３６】
LAMP法によるBLV遺伝子検出のためには，検体試料が必要である。この検体試料としては，通常用いられるあらゆる検体試料を用いることが可能であり，例えば，ウイルス，ウイルスを含む培養細胞ならびに培養液，牛などの動物由来の検体などが挙げられる。この場合，動物由来の検体を検体試料として用いることがより好ましく，例えば血液，血清，体液，リンパ器官を含む組織抽出液，あるいはリンパ器官を含む組織拭い液ならびにリンパ器官を含む組織拭き取り検体を検体試料として用いることができる。これにより，迅速なBLV遺伝子検出が可能となるという効果を有する。
【００３７】
BLV遺伝子検出のための検体試料については，通常用いられる前処理を行い後述するLAMP法に用いる際の試料とすればよい。例えば，フェノール及びクロロホルムを用いた方法等一般的な核酸抽出・精製法はもちろん，既に市販されている抽出キット（例えばQiagen社のDNeasy Blood & Tissue Kit）を用いて得られた抽出核酸を検体とすればよい。
【００３８】
検体試料の準備ができたら，前述のプライマーセット１を用いて，核酸増幅のための操作を行う。この核酸増幅の際の操作として，例えば，反応Buffer中，少なくとも４種類のプライマー（IPF，IPB，OPF，OPB），鋳型依存性核酸合成酵素，デオキシヌクレオチド3リン酸などの基質を，60から68℃で15分から1時間程度インキュベートすればよい。また，上述の通り，ループプライマーをさらに用いることもできる。
【００３９】
核酸合成で使用する酵素は，鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定する必要はない。このような酵素としては，Bst DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント），Bca（exo-）DNAポリメラーゼ，Csa DNAポリメラーゼ，Gsp DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント），GspSSD DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント），Tin DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント），大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられ，好ましくはBst DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント）が挙げられる。
【００４０】
核酸増幅反応操作が終了したら，核酸増幅産物の検出を行う。核酸増幅産物の検出には，通常用いられるあらゆる検出方法を用いることができる。例えば，増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドを用いた検出や蛍光性インターカレーター法（特開2001-242169号公報），アガロースゲル電気泳動法による検出などである。アガロースゲル電気泳動法においてLAMP増幅産物は，塩基長の異なる多数のバンドがラダー（はしご）状に検出される。
加えて，LAMP法では目視による検出ができる場合があり，迅速なBLV遺伝子検出が必要な場合に好ましい。すなわち，LAMP法では，核酸の合成により基質が大量に消費され，副産物であるピロリン酸が，共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなり，反応液が肉眼で確認できる程度に白濁することからBLV遺伝子の検出が可能である。この場合，反応中の濁度上昇経過や反応終了後の濁度を光学的に観察できる分光光度計等の測定機器を用いて，BLV遺伝子の検出を確認することも可能である（国際公開第01/83817号パンフレット）。
【００４１】
本発明のプライマーを用いて核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類は，あらかじめパッケージングしてキット化することができる。具体的には，本発明のプライマーあるいはループプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド，核酸合成の基質となる４種類のdNTP，鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素，酵素反応に好適な条件を与える緩衝液や塩類，酵素や鋳型を安定化する保護剤，さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類がキットとして提供される。
【実施例】
【００４２】
＜＜実験例１，検出感度の確認＞＞
LAMP法とリアルタイムPCR法の検出感度の比較を行った。検出感度とは，１反応チューブあたりの検出可能な最小コピー数のことを示す。
【００４３】
＜実験方法＞
１．試料及び試薬の調製
(1)  試料の調製
BLVの代表株であるFLK株の抽出核酸を10倍ずつTE緩衝液で段階的に希釈を行い，コピー数を算出した上で，鋳型核酸として用いた。
すなわち，反応チューブ中のBLV核酸量が多いほど（希釈倍数が低いほど），反応溶液中における核酸増幅反応が容易に進むため，LAMP法においては蛍光強度が強くなりやすく，検出時間が短くなる。また，リアルタイムPCR法においては，検出サイクルが少なくなる。
(2)  リアルタイムPCR法に用いるプライマーと方法
リアルタイムPCR法で使用するプライマーとプローブとして，市販されている製品（タカラバイオ社製。「ウシ白血病ウイルス検出用Probe/Primer/Positive control」，「CycleavePCR Reaction Mix SP」）で使用されている組み合わせを用いた。
(3)  LAMP法に用いるプライマー
前述のプライマーセット１を用いた。
【００４４】
２．核酸増幅法による反応
(1)リアルタイムPCR法による反応
リアルタイムPCR反応は，製品に記載されている試薬および方法に従って実施し，所要時間は45分であった。2回実施し，少なくとも1回の蛍光強度（Fluorescence）値が増幅サイクル数35以内に閾値0.05を超えた検体を陽性と判定した。陽性の基準値として，OIE（世界動物保健機関）の推奨する増幅サイクル数35を採用した（非特許文献７）。
【００４５】
(2)  LAMP法による反応
LAMP法による増幅のため，最終反応溶液25μL中の各試薬濃度が下記になるよう調製した。なお，プライマーの合成は北海道システムサイエンス社に依頼し，簡易カラム精製したものを使用した。
【００４６】
［反応溶液組成］
15.0μL  Isothermal Master Mix for GenieIII（Optigene社製）
5.0μL  精製水
1.6μM IPF（配列番号８）
1.6μM IPB（配列番号９）
0.2μM OPF（配列番号２）
0.2μM OPB（配列番号７）
0.8μM LPF（配列番号１０）
0.8μM LPB（配列番号１１）
【００４７】
(3)  上記試薬20μLに，各濃度の試料溶液5.0μLを加え，最終反応溶液25.0μLとして，各LAMP反応を２回ずつ行った。専用チューブ内で67℃，30分間，リアルタイム蛍光測定装置GenieIII（Optigene社製）を用いて，リアルタイムに反応を検出した。リアルタイム蛍光測定装置GenieIIIに内蔵されているモニター上のグラフで反応結果をリアルタイムに視認した。２回実施し，少なくとも１回の蛍光強度（Fluorescence）が反応開始から20分以内に閾値2,000を超えた検体を陽性と判定した。
【００４８】
＜実験結果＞
１．実験結果のまとめを表１に示す。
【００４９】
【表１】
2019180351.tif 000003
【００５０】
２．図１および図２にLAMP法の実験結果を示す。図中，横軸は核酸増幅反応を行った時間（分）を示し，縦軸は蛍光強度を示す。核酸が増幅されればされるほど反応溶液中の蛍光強度が上昇することととなり，結果，対象となるウイルス遺伝子の検出をすることが可能となる。また，反応チューブ中のBLV核酸量が多いほど，核酸増幅反応が容易に進むとともに，蛍光強度の上昇が速く検出できる。逆にBLV核酸量が少ないほど，核酸増幅反応は進みにくくなるため蛍光強度の上昇が遅くなり，検出に時間がかかることになる。
【００５１】
３．前述のプライマーセット１をBLV代表株であるFLVに用いた際のLAMP法の検出限界を評価したところ，10-5希釈系列までが陽性と判定された。
４．比較として行ったリアルタイムPCR法では，10-4希釈系列までが陽性と判定された。５．両者の検出限界を比較した結果，LAMP法がリアルタイムPCR法よりも10倍優れていた。反応所要時間はリアルタイムPCR法では45分間を必要としたのに対し，LAMP法では20分であり，LAMP法のほうが迅速であった。
【００５２】
＜＜実験例２，診断能の確認＞＞
実験例１と同様の手法により，それぞれの核酸増幅能の診断性能を比較するために検討を行った。
【００５３】
＜実験方法＞
１．実験例１と同様の方法で行った。
２．対象検体として，20の抗BLV抗体非保有個体と80の抗BLV抗体保有個体からなる計100の牛血液検体を用いた。
【００５４】
＜実験結果＞
１．結果を表２に示す。
(1)  20の抗BLV抗体非保有個体においては，両法ともにすべて陰性を示した（いずれも診断的特異度は100％）。
(2)  一方，80の抗BLV抗体保有個体においては，LAMP法では66検体が陽性を示したのに対し（診断的感度は82.5％），リアルタイムPCR法では60検体のみが陽性を示した（診断的感度は75.0％）を示した。
(3)  また，判定所要時間はLAMP法では6分から20分であったのに対し，リアルタイムPCR法では30分から45分であった。
２．これらの結果から，LAMP法の方がリアルタイムPCR法よりも，診断的感度および判定所要時間ともに，優れたBLV遺伝子の検出性能を示した。
【００５５】
【表２】
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【図１】
2019180351.tif 000005
【図２】
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【配列表】
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