(57)【要約】【課題】骨芽細胞等の生着を促進することが可能な、又はバクテリアの付着抑制と、骨芽細胞等の細胞の生着促進と、を両立することが可能な複合体、及び複合体の製造方法を提供すること。【解決手段】チタン及びチタン合金の少なくとも一方を含む基材と、上記基材の表面の少なくとも一部を覆う有機層とを備え、上記有機層が、オキシアルキレン基及びホスフェート基を有する高分子を含有する、複合体を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
チタン及びチタン合金の少なくとも一方を含む基材と、当該基材の表面の少なくとも一部を覆う有機層とを備え、
前記有機層が、オキシアルキレン基及びホスフェート基を有する高分子を含有する、複合体。
【請求項２】
前記高分子が下記一般式（１）で表される構造単位を有する、請求項１に記載の複合体。
【化１】
2019180833.tif 000008
【請求項３】
ステント、インプラント、人工関節、人工骨又は整形外科用固定具に用いられる、請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項４】
金属を含む基材と、当該基材の表面の少なくとも一部を覆う有機層とを備え、
前記有機層が、オキシアルキレン基及びホスフェート基を有する高分子を含有し、
ステント、インプラント、人工関節、人工骨又は整形外科用固定具に用いられる、複合体。
【請求項５】
前記高分子が下記一般式（１）で表される構造単位を有する、請求項４に記載の複合体。
【化２】
2019180833.tif 000009
【請求項６】
複合体の製造方法であって、
チタン及びチタン合金の少なくとも一方を含む基材の表面を酸処理する第一工程と、
酸処理した基材の表面の少なくとも一部にオキシアルキレン基及びホスフェート基を有する高分子を含有する有機層を形成する第二工程と、を備える、複合体の製造方法。
【請求項７】
前記高分子が下記一般式（１）で表される構造単位を有する、請求項６に記載の製造方法。
【化３】
2019180833.tif 000010
【請求項８】
複合体の製造方法であって、
金属を含む基材の表面を酸処理する第一工程と、
酸処理した基材の表面の少なくとも一部にオキシアルキレン基及びホスフェート基を有する高分子を含有する有機層を形成する第二工程と、を備え、
前記複合体が、ステント、インプラント、人工関節、人工骨又は整形外科用固定具に用いられる、複合体の製造方法。
【請求項９】
前記高分子が下記一般式（１）で表される構造単位を有する、請求項８に記載の複合体の製造方法。
【化４】
2019180833.tif 000011
【請求項１０】
前記第二工程では、酸処理した基材の表面に、前記高分子を含有する溶液を接触させることで前記有機層を形成する、請求項６〜９のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記第一工程と前記第二工程との間に、酸処理した基材の表面をオゾン処理する工程を備える、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複合体、及び複合体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
チタン及びチタン合金は生体適合性に優れることから、インプラント等に使用されている。このような用途において、チタン及びチタン合金の骨組織への結合性を向上させる検討が行われている。例えば、特許文献１には、チタン又はチタン合金を原材料とする基材と、アパタイト及び有機構造体を含む表面層を有するインプラント材料が提案されている。
【０００３】
一方、非特許文献１では、アパタイト自体をポリマーで修飾して細菌の付着を抑制することが検討されている。具体的には、ヒドロキシアパタイト上に、バクテリア等の付着を抑制するためのポリマーコーティングを形成する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−３２９０６０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｘｉｎｎａｎ  Ｃｕｉ，  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｍｏｄｅｌ  Ｔｅｅｔｈ  ｂｙ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＰＥＧＭＡ−Ｐｈｏｓｍｅｒ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，”ＡＣＳ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＆  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ，２０１６，２，ｐ．２０５−２１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
金属を含むインプラント等が生体内に安定して定着するためには、骨芽細胞等の細胞が生着することも必要であることから骨芽細胞等の生着を促進することが求められている。また、バクテリア等の付着を抑制する作用を高めると、骨芽細胞等の細胞の生着も阻害されることが懸念される。このため、バクテリア等の付着抑制と、骨芽細胞等の生着の促進を両立し得る材料があれば有用であるとも考えられる。
【０００７】
本発明は、骨芽細胞等の生着を促進することが可能な、又はバクテリアの付着抑制と、骨芽細胞等の細胞の生着促進と、を両立することが可能な複合体、及び複合体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一側面は、チタン及びチタン合金の少なくとも一方を含む基材と、当該基材の表面の少なくとも一部を覆う有機層とを備え、上記有機層が、オキシアルキレン基及びホスフェート基を有する高分子を含有する、複合体を提供する。
【０００９】
上記複合体は、有機層に含まれる高分子がホスフェート基を有することで、チタン及びチタン合金の少なくとも一方を含む基材と強固に結合することができ、また、生体内におけるカルシウムイオン等を吸着し、骨芽細胞の複合体への生着を促進することができる。上記高分子がさらにオキシアルキレン基を有することで、バクテリア等の付着抑制効果を有することができる。
【００１０】
上記高分子が下記一般式（１）で表される構造単位を有してもよい。上記高分子が下記一般式（１）に示すような特定の官能基を有するポリメタクリレート構造を有することによって、バクテリア等の付着抑制と、骨芽細胞等の細胞の生着強化とをより高水準で両立することができる。
【００１１】
【化１】
2019180833.tif 000003
【００１２】
上述の複合体は、ステント、インプラント、人工関節、人工骨又は整形外科用固定具に用いられてもよい。ステント、インプラント、人工関節、人工骨及び整形外科用固定具等は、生体内に留置することから、炎症等の発生を抑制し、且つ生体への定着性を向上させることが望まれる。上述の複合体は、骨芽細胞等の細胞の生着促進、又はバクテリア等の付着抑制と、骨芽細胞等の細胞の生着促進とが両立されることから、炎症等が抑制され、生体への定着性が向上したものとなり、ステント、インプラント、人工関節、人工骨又は整形外科用固定具として用いることができる。
【００１３】
本発明の一側面は、金属を含む基材と、上記基材の表面の少なくとも一部を覆う有機層とを備え、上記有機層が、オキシアルキレン基及びホスフェート基を有する高分子を含有し、ステント、インプラント、人工関節、人工骨又は整形外科用固定具に用いられる、複合体を提供する。
【００１４】
上記複合体は、有機層に含まれる高分子がホスフェート基を有することで、金属を含む基材と強固に結合することができ、また、生体内におけるカルシウムイオン等を吸着し、骨芽細胞の複合体への生着を促進することができる。上記高分子がさらにオキシアルキレン基を有することで、バクテリア等の付着抑制効果を有することができる。
【００１５】
上記高分子が下記一般式（１）で表される構造単位を有してもよい。上記高分子が下記一般式（１）に示すような特定の官能基を有するポリメタクリルレート構造を有することによって、バクテリア等の付着抑制と、骨芽細胞等の細胞の生着強化とをより高水準で両立することができる。
【００１６】
【化２】
2019180833.tif 000004
【００１７】
本発明の一側面は、チタン及びチタン合金の少なくとも一方を含む基材の表面を酸処理する第一工程と、酸処理した基材の表面の少なくとも一部にオキシアルキレン基及びホスフェート基を有する高分子を含有する有機層を形成する第二工程と、を備える、複合体の製造方法を提供する。
【００１８】
上記複合体の製造方法によれば、チタン及びチタン合金の少なくとも一方を含む基材と強く結合した有機層を形成することができる。また、有機層を構成する上記高分子がオキシアルキレン基及びホスフェート基を有することで、バクテリア等の付着抑制と、骨芽細胞等の細胞の生着促進とを両立することが可能な複合体を製造することができる。
【００１９】
上記高分子が下記一般式（１）で表される構造単位を有してもよい。上記高分子が下記一般式（１）に示すような特定の官能基を有するポリメタクリルレート構造を有することによって、バクテリア等の付着抑制と、骨芽細胞等の細胞の生着強化とをより高水準で両立することが可能な複合体を製造することができる。
【００２０】
【化３】
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【００２１】
本発明の一側面は、複合体の製造方法であって、金属を含む基材の表面を酸処理する第一工程と、酸処理した基材の表面の少なくとも一部にオキシアルキレン基及びホスフェート基を有する高分子を含有する有機層を形成する第二工程と、を備え、上記複合体が、ステント、インプラント、人工関節、人工骨又は整形外科用固定具に用いられる、複合体の製造方法を提供する。
【００２２】
上記複合体の製造方法によれば、金属を含む基材と強く結合した有機層を基材上に形成することができ、インプラント等に有用な複合体を製造することができる。また、有機層を構成する上記高分子がオキシアルキレン基及びホスフェート基を有することで、バクテリア等の付着抑制と、骨芽細胞等の細胞の生着促進とを両立することが可能な複合体を製造することができる。
【００２３】
上記高分子が下記一般式（１）で表される構造単位を有してもよい。上記高分子を下記一般式（１）に示すような特定の官能基を有するポリメタクリルレート構造を有することによって、バクテリア等の付着抑制と、骨芽細胞等の細胞の生着強化とをより高水準で両立することができる。
【００２４】
【化４】
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【００２５】
上記第二工程では、酸処理した基材の表面に、上記高分子を含む溶液を接触させることで上記有機層を形成してもよい。高分子を含む溶液を接触させる方法とすることで、有機層をより容易に形成することができる。
【００２６】
上記第一工程と上記第二工程との間に、酸処理した基材の表面をオゾン処理する工程を備えてもよい。オゾン処理を行うことで、有機層をより強固に基材に結合させることができる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、骨芽細胞等の細胞の生着促進、又はバクテリアの付着抑制と、骨芽細胞等の細胞の生着促進と、を両立することが可能な複合体、及び複合体の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、複合体の一例を示す模式図である。
【図２】図２は、実施例１の複合体表面についてのＸＰＳスペクトルである。
【図３】図３は、ランダム共重合体がＴｉ合金ペレット上に結合された状態を示す模式図である。
【図４】図４は、Ｔｉ合金ペレット上への有機層形成の時間依存性を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例１で調製された複合体表面の蛍光顕微鏡写真である。
【図６】図６は、実施例１及び比較例２のバクテリア付着性試験の結果を示すグラフである。
【図７】図７は、実施例１及び比較例２のバクテリア付着性試験の結果を示すＳＥＭ画像である。
【図８】図８は、実施例１及び比較例２の細胞付着性試験の結果を示すグラフである。
【図９】図９は、実施例１及び比較例２の細胞付着性試験の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１０】図１０は、複合体上に析出したカルシウム濃度を示すグラフである。
【図１１】図１１は、複合体上に吸着したタンパク質に含まれる窒素濃度を示すフラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、場合により図面を参照して、本発明の実施形態について説明する。ただし、以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。
【００３０】
＜複合体＞
複合体の第一実施形態は、チタン及びチタン合金の少なくとも一方を含む基材と、上記基材の表面の少なくとも一部を覆う有機層とを備える。上記有機層は、オキシアルキレン基及びホスフェート基を有する含む高分子を含有する。図１は、複合体の一例を示す模式図である。複合体１００は、基材１０と、有機層２０とを備える。複合体は、例えば、生体用に用いられる材料であってよく、医療用に用いられる材料であってもよい。
【００３１】
基材１０は、チタン及びチタン合金の少なくとも一方を含む基材である。チタン合金は、ＡＳＴＭ及びＪＩＳ等に登録されている生体用チタン材料を用いることができる。チタン合金は、例えば、鉄（Ｆｅ）、クロム（Ｃｒ）、ニッケル（Ｎｉ）、ニオブ（Ｎｂ）、タンタル（Ｔａ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、モリブデン（Ｍｏ）等との合金であってよい。チタン合金としては、Ｔｉ−６Ａｌ−４Ｖ、Ｔｉ−６Ａｌ−４Ｖ  ＥＬＩ、Ｔｉ−６Ａｌ−２Ｎｂ−１Ｔａ、Ｔｉ−１５Ｚｒ−４Ｎｂ−４Ｔａ、Ｔｉ−６Ａｌ−７Ｎｂ、Ｔｉ−３Ａｌ−２．５Ｖ、Ｔｉ−１３Ｎｂ−１３Ｚｒ、Ｔｉ−１５Ｍｏ−５Ｚｒ−３Ａｌ、Ｔｉ−１２Ｍｏ−６Ｚｒ−２Ｆｅ、及びＴｉ−１５Ｍｏ等が挙げられる。
【００３２】
有機層２０は、オキシアルキレン基及びホスフェート基を有する高分子を含有する。有機層２０は、上記高分子のみからなってもよく、上記高分子の他に、例えば、コラーゲン等のタンパク質、アパタイト等を含んでもよい。有機層２０の厚さは、例えば、５〜５００００ｎｍであってよく、２０〜３００００ｎｍであってよく、又は１００〜２００００ｎｍであってよい。有機層２０は、基材１０の少なくとも一部を覆っていてよく、全面を覆っていてもよい。
【００３３】
上記高分子は、単独重合体であってもよく、共重合体であってもよい。共重合体としては、ランダム共重合体、交互共重合体、ブロック共重合体、又はグラフト重合体であってよい。上記高分子は、オキシアルキレン基及びホスフェート基以外の官能基を有してもよい。
【００３４】
オキシアルキレン基は、例えば、−（ＣｓＨ２ｓＯ）ｍＲ１で表される。ここで、ｓは、１〜６であってよく、又は１〜３であってよい。ここで、ｍは、複合体のバクテリア等の付着抑制と、骨芽細胞の生着促進とをより高度に両立する観点から、１〜７０であってよく、１〜５０であってよく、５〜５０であってよく、１０〜５０であってよく、又は２０〜４０であってよい。ここで、Ｒ１は、水素、メチル基及びエチル基のいずれかを示す。ここで、アルキレン基は、直鎖状であってもよく、又は分岐を有していてもよい。オキシアルキレン基としては、例えば、オキシメチレン基、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシブチレン基、オキシペンチレン基、及びオキシへキシレン基であってよい。
【００３５】
ホスフェート基は、例えば、−Ｒ２−ＰＯ（ＯＲ３）２、−（Ｒ２Ｏ）ｒ−ＰＯ（ＯＲ３）２、又は−Ｒ２−ＯＰＯ（ＯＲ３）２で表される。ここで、ｒは、１〜１０であってよく、２〜６であってよく、又は４〜６であってよい。ここで、Ｒ２は、直接結合、アルキレン基、及びアリール基からなる群より選択される少なくとも１種であってよい。Ｒ２がアルキレン基である場合、アルキレン基の炭素数は、例えば、１〜２０であってよく、１〜１５であってよく、１〜１０であってよく、１〜４であってよく、又は１〜２であってよい。アルキレン基は、直鎖状であってもよく、分岐を有していてもよい。ここで、Ｒ３は、水素原子、アルキル基、及びアリール基からなる群より選択される少なくとも１種であってよく、複数存在するＲ３は同一であっても、異なってもよい。Ｒ３がアルキル基である場合、例えば、直鎖状アルキル基、分岐状アルキル基、又は環状アルキル基であってよく、メチル基、エチル基、シクロヘキシル基であってよい。Ｒ２又はＲ３がアリール基である場合、アリール基は、例えば、フェニル基であってよい。
【００３６】
上記高分子において、オキシアルキレン基のモル数と、ホスフェート基のモル数との比（[オキシアルキレン基のモル数]／［ホスフェート基のモル数］）は、例えば、０．２〜１．０であってよく、０．４〜０．８であってよく、又は０．４〜０．６であってよい。オキシアルキレン基のモル数と、ホスフェート基のモル数との比が上記の数値範囲内であることによって、バクテリア等の付着抑制と、骨芽細胞の生着促進とをそれぞれより高水準で両立することができる。上記高分子が共重合体の場合、共重合体を合成する際のモノマーの組成比を調整することで、オキシアルキレン基のモル数と、ホスフェート基のモル数との比を調整できる。すなわち、オキシアルキレン基のモル数と、ホスフェート基のモル数との比は、共重合体におけるオキシアルキレン基を有する構造単位及びホスフェート基を有する構造単位の構成単位の比である。ここで、構造単位とは、重合体を得るための原料である重合性化合物に由来する構造を意味する。
【００３７】
上記高分子は、例えば、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリレート、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ乳酸、ポリエステル、又はポリスチレンに由来するものであってよい。上記高分子は、例えば、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリレート、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ乳酸、ポリエステル、及びポリスチレン等を主鎖骨格として有するものであってよい。
【００３８】
上記高分子の重量平均分子量は、例えば、１００００〜１００００００であってよく、１００００〜５０００００であってよく、１５０００〜３０００００であってよく、又は３００００〜１５００００であってよい。上記高分子の重量平均分子量が上記数値範囲内であることで、有機層が適度な強度を有し、基材の表面上に安定して有機層を維持することができる。本明細書において、重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによって測定される値を意味し、ポリスチレン換算値で表す。
【００３９】
上記高分子は、例えば、下記一般式（１）で示される高分子であってよい。下記一般式（１）は、オキシアルキレン基を有するメタクリレート及びホスフェート基を有するメタクリレートの共重合により得られるランダム共重合体の構造を示している。上記高分子が、下記一般式（１）に示すような特定の官能基を有するポリメタクリルレート構造を有することによって、上記高分子を容易に調製することが可能であり、且つバクテリア等の付着抑制と、骨芽細胞の生着促進とをそれぞれより高水準で両立することができる。
【００４０】
【化５】
2019180833.tif 000007
【００４１】
上記複合体においては、有機層に含まれる高分子がホスフェート基を有することで、チタン及びチタン合金の少なくとも一方を含む基材と有機層とが強く結合している。また、上記高分子がオキシアルキレン基を有することで、バクテリア等の付着抑制効果を有するとともに、上記高分子がホスフェート基を有することで、生体内におけるカルシウムイオン等を吸着することができる。このような作用によって、骨芽細胞等の細胞が複合体へ速やかに、又は強固に結合する、或いは、速やか且つ強固に結合することが可能となり、骨芽細胞等の細胞の生着が促進される。したがって、上記複合体は、例えば、ステント、インプラント、人工関節、人工骨及び整形外科用固定具等のいずれかに用いられてもよい。すなわち、上記複合体は、生体用複合体、又は医療用複合体であってよい。
【００４２】
複合体の第二実施形態は、金属を含む基材と、上記基材の表面の少なくとも一部を覆う有機層とを備える。上記有機層が、オキシアルキレン基及びホスフェート基を有する高分子を含有する。そして、当該複合体は、ステント、インプラント、人工関節、人工骨又は整形外科用固定具に用いられる。
【００４３】
第二実施形態において、基材は、金属を含む基材である。金属としては、例えば、チタン（Ｔｉ）、鉄（Ｆｅ）、クロム（Ｃｒ）、ニッケル（Ｎｉ）、ニオブ（Ｎｂ）、タンタル（Ｔａ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、モリブデン（Ｍｏ）等であってよく、これらの合金であってもよい。
【００４４】
第二実施形態に係る複合体と、第一実施形態に係る複合体とで重複する説明は省略する。第一実施形態に係る複合体と、第二実施形態に係る複合体とで、共通する部分については互いの説明内容を相互に適用することができる。
【００４５】
＜複合体の製造方法＞
複合体の製造方法の第一実施形態は、チタン及びチタン合金の少なくとも一方を含む基材の表面を酸処理する第一工程と、酸処理した基材の表面の少なくとも一部にオキシアルキレン基及びホスフェート基を有する高分子を含有する有機層を形成する第二工程と、を備える。
【００４６】
上述の複合体は、例えば、本実施形態に係る複合体の製造方法によって製造することができる。したがって、複合体の製造方法には、上述の複合体についての説明内容を適用することができる。また逆に、以下の複合体の製造方法についての説明内容は、上述の複合体に適用することもできる。
【００４７】
第一工程は、基材の表面を酸処理する工程である。第一工程において、チタン及びチタン合金の少なくとも一方を含む基材の表面に存在する金属酸化物（例えば、酸化チタン）の少なくとも一部を除去する。第一工程で使用する酸は、例えば、塩酸、硫酸、及び硝酸等の無機酸であってよく、濃硫酸であってよい。酸処理の時間は、例えば、１時間以上、２時間以上又は３時間以上であってよく、５時間以下であってよい。酸処理を行う温度は、例えば、２５℃以上、５０℃以上又は７５℃以上であってよく、１００℃以下又は９０℃以下であってよい。
【００４８】
第一工程において上記酸処理の前に、基材を水及び有機溶剤等で洗浄してもよい。基材表面に有機物等が付着していた場合、当該有機物等を除去することにより、酸処理の効率を上げることができる。水としては、蒸留水、及びイオン交換水等を用いることができる。有機溶剤としては、イソプロパノール等の低級アルコール、及びアセトン等を用いることができる。洗浄は、基材を水及び有機溶剤等に浸漬して行ってよく、超音波洗浄等で行ってもよい。洗浄後、酸処理の前に洗浄に用いた水及び有機溶剤等を除去するために、基材表面を乾燥してもよく、例えば、窒素雰囲気下で風乾等することで乾燥してもよい。
【００４９】
第二工程は、酸処理された基材酸処理された表面の少なくとも一部に上記高分子を含有する有機層を形成する工程である。有機層の形成方法は、例えば、上記高分子を溶融させて上記表面に塗布して形成してもよく、上記高分子を含む溶液を上記表面に接触させて、溶媒を除去することで形成してもよい。第二工程は、例えば、酸処理した上記基材の上記表面に、上記高分子を含む溶液に接触させることで上記有機層を形成してもよい。上記高分子を含む溶液における溶媒は、例えば、水及びエタノール等であってよい。
【００５０】
第二工程において、上記高分子を含む溶液を基材表面に接触させて有機層を形成させる場合、一定の温度で有機層の形成を行ってもよく、温度を変化させて有機層の形成を行ってもよい。第二工程は、例えば、酸処理した上記基材の上記表面に、上記高分子を含む溶液に接触させ、低温（例えば、２５℃以下）で３〜５時間維持した後、２５℃超で３〜５時間維持することで上記有機層を形成してもよい。有機層の形成は、より具体的には、例えば、１０℃で３時間、及び７５℃で３時間の条件で行ってもよい。有機層を形成した後は、溶媒を除去するために、水等で洗浄して、窒素雰囲気下で乾燥させてもよい。
【００５１】
上記高分子は、オキシアルキレン基を有する重合性化合物及びホスフェート基を有する重合性化合物を含む組成物の重合、オキシアルキレン基及びホスフェート基を有する重合性化合物を含む組成物の重合等によって得ることができる。重合方法は、各種ラジカル重合等の重合方法から適宜選択することができる。重合方法は、例えば、塊状重合法、溶液重合法、及び懸濁重合法等であってよい。重合開始剤としては、４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル等の過酸化物、及びベンゾフェノン等の光重合開始剤などが挙げられる。これらの重合開始剤は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用することができる。重合温度及び重合時間等の重合条件は、重合性組成物に含まれる単量体成分の種類、重合開始剤の種類、及び重合方法等によって、適宜選択することができる。
【００５２】
上記重合性化合物としては、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド、スチレン、及び乳酸等、並びにこれらの変性体等を用いることができる。
【００５３】
オキシアルキレン基を有する重合性化合物としては、例えば、ポリエチレングリコールメチルエーテル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールエチルエーテル（メタ）アクリレート、及びポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等があげられる。
【００５４】
ホスフェート基を有する重合性化合物としては、例えば、エチレングリコール（メタ）アクリレートホスフェート（別名：リン酸２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル）、リン酸２−（（メタ）アクリロイルオキシ）プロピル、（メタ）アクリル酸２−ホスホノエチル、（メタ）アタクリル酸２−（メトキシホスホニル）エチル、リン酸(２−（メタ）アクリロイルオキシエチル)フェニル等の（メタ）アクリレート誘導体、Ｎ−［２−（ホスホノオキシ）エチル］（メタ）アクリルアミド、２−（（メタ）アクリロイルアミノ）エチルホスホン酸等の（メタ）アクリルアミド誘導体、リン酸（４−ビニルフェニル）、リン酸メチル（４−ビニルフェニル）等のスチレン誘導体などが挙げられる。
【００５５】
オキシアルキレン基及びホスフェート基を有する重合性化合物としては、例えば、ホスホオキシポリオキシエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００５６】
上記複合体の製造方法においては、第一工程と第二工程との間に、酸処理した上記基材の上記表面を、オゾン処理、紫外線処理、コロナ処理、及びプラズマ処理等する工程を備えてもよく、紫外線処理及びオゾン処理等する工程を備えてもよい。オゾン処理、紫外線処理、コロナ処理、及びプラズマ処理等は、それぞれ単独であってよく、組み合わせてもよい。第一工程と第二工程との間に、酸処理した上記基材の上記表面に対して、上記のような活性化処理を行うことによって、第二工程において有機層の形成をより容易にできる。
【００５７】
オゾン処理、紫外線処理、コロナ処理、及びプラズマ処理等は、酸処理された上記基材上の上記表面の一部又は全部に対して行ってもよい。オゾン処理、紫外線処理、コロナ処理、及びプラズマ処理等は、例えば、窒素雰囲気下で行ってよい。
【００５８】
複合体の製造方法の第二実施形態は、金属を含む基材の表面を酸処理する第一工程と、酸処理した基材の表面の少なくとも一部にオキシアルキレン基及びホスフェート基を有する高分子を含有する有機層を形成する第二工程と、を備える。上記複合体は、ステント、インプラント、人工関節、人工骨又は整形外科用固定具に用いられる。すなわち、上記複合体は、生体用複合体、又は医療用複合体であってよい。
【００５９】
第二実施形態に係る複合体の製造方法と、第一実施形態に係る複合体の製造方法とで重複する説明は省略する。第一実施形態に係る複合体の製造方法と、第二実施形態に係る複合体の製造方法とで、共通する部分については第一実施形態に係る複合体の製造方法の説明内容を相互に適用することができる。
【００６０】
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例、及び比較例を参照して本発明の内容をより詳細に説明する。ただし、本発明は、下記の実施例に限定されるものではない。
【００６２】
＜＜複合体の製造＞＞
（実施例１）
［ポリ（ＰＥＧＭＡ−Ｐｈｏｓｍｅｒ）（ランダム共重合体）の重合］
０．５ｍＭのポリ（エチレングリコール）メチルエーテル  メタクリレート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、商品名：ＰＥＧＭＡ、分子量：５００Ｄａ）及び０.５ｍＭのエチレングリコールメタクリレートホスフェート（ＤＡＰ株式会社製、商品名：Ｐｈｏｓｍｅｒ）を１０ｍＬの水に溶解し、窒素雰囲気下で３０分間バブリングして酸素を除いた。この水溶液に、少量のメタノールに溶解した０．０１２８ｍｍｏｌの４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（和光純薬工業株式会社製、水溶系アゾ開始剤、商品名：Ｖ−５０１）を加えて、重合を開始した。
【００６３】
７０℃の条件下で１１時間、重合反応させることで、ランダム共重合体（以下、ポリ（ＰＥＧＭＡ−Ｐｈｏｓｍｅｒ）と記すこともある。）を合成した。１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲを用いて、得られたランダム共重合体がオキシエチレン基及びエチルホスフェート基を有していることを確認した。得られたランダム共重合体の[オキシアルキレン基のモル数]／［ホスフェート基のモル数］は１．０であった。また、得られたランダム共重合体の重量平均分子量は３５０００（分子量分布は１．８９）であった。
【００６４】
［基材上への有機層の形成（ランダム共重合体のＴｉ合金ペレットへの固定化）］
Ｔｉ合金ペレット（０．５ｃｍ×０．５ｃｍ×１．０ｍｍ、東京チタン株式会社製、商品名：Ｔｉ−６Ａｌ−４Ｖ）をイソプロパノール、アセトン、及び水の各溶液中で、３０分間ずつ超音波洗浄した。超音波洗浄したＴｉ合金ペレットを風乾した。その後、７５℃で１時間濃硫酸中に２時間浸漬して、Ｔｉ合金ペレット表面の金属酸化層を除去（酸エッチング）した。酸エッチングによって金属酸化層を除去した後、Ｔｉ合金ペレットを蒸留水で超音波洗浄（各５分間で３回洗浄）して、窒素の気流によって乾燥させた。
【００６５】
さらに、Ｔｉ合金ペレットの両面を各３０分間ずつ、ＵＶ処理及びＯ３処理した。ＵＶ処理及びＯ３処理の直後に、Ｔｉ合金ペレットを上記で得られたランダム共重合体の水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）に、７５℃で５時間、浸漬することで、Ｔｉ合金ペレット上にランダム共重合体からなる有機層を形成した。その後、Ｔｉ合金ペレットを水で洗浄し、窒素の気流で乾燥させることで、複合体を得た。Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ、株式会社島津製作所製、商品名：ＡＸＩＳ−ｕｌｔｒａ）を用いて、得られた複合体表面の元素分析を行った。元素分析は、Ｃ（１ｓ）、Ｏ（１ｓ）、Ｐ（２ｐ）、及びＴｉ（２ｐ）ピークの解析に基づいて行った。図２は、ＸＰＳスペクトルを示す。
【００６６】
図２に示すように、複合体に対するＸＰＳスペクトル（図２のｍｏｄｉｆｉｅｄで示されるスペクトル）と、上記ランダム共重合体の溶液に浸漬する前のＴｉ合金ペレットに対するＸＰＳスペクトル（図２のｒａｗで示されるスペクトル）とを比較すると、複合体に対するＸＰＳスペクトルにＰ（２ｐ）のピーク（１３３．５ｅＶ付近）が観察された。これにより、複合体が有機層を備えることが確認された。また、上記複合体では、Ｔｉ合金に含まれないＣ＝Ｏのピークが観測されることも確認した。このことからも、複合体が有機層を備えることが確認された。ランダム共重合体がＴｉ合金ペレット上に固定された複合体（有機層を備える複合体）の模式図を図３に示す。
【００６７】
（比較例１）
エチレングリコールメタクリレートホスフェートを用いずに、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテル  メタクリレートの単独重合を得たこと以外は、実施例１と同様にして重合体（以下、ポリ（ＰＥＧＭＡ）と記すこともある。）を合成した。有機層として、ポリ（ＰＥＧＭＡ）からなる層を形成することで、複合体を調製した。
【００６８】
（比較例２）
有機層を設けず、実施例１と同様にして、ＵＶ処理及びＯ３処理まで行ったＴｉ合金ペレットを、比較例２の評価サンプルとした。
【００６９】
＜＜複合体の評価＞＞
［複合体調製における有機層形成の時間依存性］
ＵＶ処理及びＯ３処理まで行ったＴｉ合金ペレットを、実施例１又は比較例１で調製した重合体の水溶液に浸漬する時間を変化させて、複合体調製時における有機層形成の時間依存性を評価した。図４に結果を示す。なお、比較のために、重合体を含まない水に上記Ｔｉ合金ペレットを浸漬させた結果も図４中に示す。
【００７０】
図４は、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）で観測したＣ＝Ｏ／Ｔｉのピーク強度比の上記浸漬時間の依存性を示している。Ｃ＝Ｏ／Ｔｉのピーク強度比からＴｉ合金ペレットの有機層による被覆率を決定した。図４に示す結果から、実施例１において調製したポリ（ＰＥＧＭＡ−Ｐｈｏｓｍｅｒ）は３時間程度でＴｉ合金ペレットの表面のほぼ９０％程度に吸着したことが確認された。また、１２時間後には、Ｔｉ合金ペレット表面の全面にポリ（ＰＥＧＭＡ−Ｐｈｏｓｍｅｒ）が吸着し、Ｔｉ合金ペレットの全面が有機層に被覆されることが確認された。
【００７１】
一方、比較例１で調製したポリ（ＰＥＧＭＡ）の場合、Ｔｉ合金ペレット表面への吸着が、実施例１で調製したポリ（ＰＥＧＭＡ−Ｐｈｏｓｍｅｒ）に比べてはるかに少ないことが確認された。以上の結果から、高分子がホスフェート基を有することにより、Ｔｉ合金ペレットの表面への吸着が促進されていることが確認された。図５に、蛍光分子によって有機層を構成する高分子を修飾して、蛍光顕微鏡で観察した結果を示す（左半分の領域が有機層を形成した領域を示し、右半分が有機層を形成していない領域を示す。）。図５に示す結果から、Ｔｉ合金ペレットの表面上に均一に有機層が形成されていることが確認された。
【００７２】
［複合体のバクテリア付着性試験］
バクテリア付着性試験を行い、複合体のバクテリア付着を抑制する性能を評価した。バクテリアとして、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）及びストレプトコッカス・ミュータンス菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）を用いた。大腸菌は、ＬＢブロス培地を用いて、細菌密度が約１０８ＣＦＵ／ｍＬになるまで３７℃の水浴中で１００ｒｐｍの条件下、振盪しながら培養した。ストレプトコッカス・ミュータンス菌は、ポリペプトン含有栄養培地（ポリペプトン：５ｇ／Ｌ、牛肉エキス：３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５ｇ／Ｌ）を用いて、細菌密度が約１０８ＣＦＵ／ｍＬになるまで３７℃の水浴中で１００ｒｐｍの条件下、振盪しながら培養した。また表皮ブドウ球菌は、ブロス培地（ＢＤ２３７５００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、細菌密度が約１０８ＣＦＵ／ｍＬになるまで３７℃の水浴中で１００ｒｐｍの条件下、振盪しながら培養した。大腸菌ＯＲＮ１７８、表皮ブドウ球菌（表皮ブドウ球菌）ＪＣＭ２４１４、及びストレプトコッカス・ミュータンス（ミュータンス菌）ＡＴＣＣ２５１７５は、理化学研究所バイオリソースセンターから購入したものを用いた。
【００７３】
実施例１で調製した複合体を７０％エタノールと脱イオン水とで洗浄して減菌処理した。その後、複合体を２４ウェル培養プレートに入れた。次に、大腸菌のＰＢＳ懸濁液を調製して、各ウェルに０．５ｍＬずつ添加した。ＰＢＳは、１３７ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、２．７ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）及び１．８ｍＭのリン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）を含み、ｐＨ７．４に調整されたものを使用した。その後、３７℃、２．５時間の条件下で、バクテリアを培養することで、複合体へのバクテリア付着性試験を行った。バクテリアの培養にかける時間を６時間及び２４時間に増やして、上記と同様にバクテリア付着性試験を行った。なお、６時間及び２４時間かけてバクテリアの培養を行う際には、２．５時間が経過した時点で培地１ｍＬを更に添加して試験を継続した。大腸菌に代えて、表皮ブドウ球菌及びストレプトコッカス・ミュータンス菌のそれぞれを用いて、複合体のバクテリア付着性試験を行った。試験結果の評価は、ＳＥＭ観察により行った。
【００７４】
＜ＳＥＭ観察＞
バクテリア付着性試験後の複合体をＰＢＳで穏やかに洗浄して、複合体に付着していないバクテリアを除去した。複合体の表面に付着したバクテリアを２．５％のグルタルアルデヒド水溶液を用いて、３７℃、２４時間かけて複合体に固定化させる処理を行った。この固定化処理の後、複合体を、ＰＢＳバッファーで２回洗浄した後、不要なグルタルアルデヒドを除去した。グルタルアルデヒドの除去は、１０％エタノール水溶液に５分間、３０％エタノール水溶液に５分間、５０％エタノール水溶液に５分間、６０％グルタルアルデヒド水溶液に５分間、７０％グルタルアルデヒドに５分間、８０％グルタルアルデヒド水溶液に５分間、９０％グルタルアルデヒド水溶液に１０分間、１００％エタノール（水なし）に１０分間、及び再度１００％エタノールに１０分間浸漬することによって行った。
【００７５】
上記のようにして、バクテリア中の水をエタノールに置換した後に、３７℃のインキュベーター中で一晩乾燥させた。複合体の表面に付着したバクテリアの数をＳＥＭによって観察した。結果を図６及び図７に示す。図６及び図７には、比較のために、比較例２のＴｉ合金ペレットを用いて同様のバクテリア付着性試験を行った結果を併記した。
【００７６】
図６は、バクテリア付着性試験の結果を示すグラフである。図７は、バクテリア付着性試験後の複合体表面を示すＳＥＭ観察画像である。図６に示す結果から、比較例２のＴｉ合金ペレットの表面には、大腸菌が付着して、時間の経過とともに大腸菌の付着面積の割合が増加することが確認された。また表皮ブドウ球菌及びストレプトコッカス・ミュータンス菌に対しても同様の傾向が確認された。一方、実施例１で調製した複合体では、大腸菌、表皮ブドウ球菌及びストレプトコッカス・ミュータンス菌のいずれのバクテリアも付着が非常に少ないことが確認された。
【００７７】
実施例１で調製した複合体には大腸菌の付着がほぼなく、表皮ブドウ球菌及びストレプトコッカス・ミュータンス菌の付着量をみても、比較例２のＴｉ合金ペレットと比較して約１０分の１程度となっており、バクテリアの付着が抑制されていることが確認された。
【００７８】
［複合体の細胞付着性試験（ｉｎ  ｖｉｔｒо）］
細胞付着性試験を行い、複合体の細胞生着を促進する性能を評価した。細胞として、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（マウス由来の骨芽細胞）を用いた。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、５％ＣＯ２に調製した培地を用いて、３７℃の条件下で２４時間、４８時間、又は７２時間、培養した。具体的には、１０％の組織培養用牛胎児血清（ＦＢＳ）及び２％のペニシリン−ストレプトマイシン溶液を補充した培地（Ｇｉｂｃｏ製、商品名：ＭＥＭα）を使用した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、東京医科歯科大学から提供されたものを用いた。
【００７９】
実施例１及び比較例２で調製した複合体を、７０％エタノールと脱イオン水とで洗浄して減菌処理した。その後、複合体を４８穴プレートに入れて、各ウェルに培養した細胞を１×１０４細胞/ウェルとなるように播種し、５％ＣＯ２の調整培地を加えて、３７℃、加湿雰囲気下で１日間かけて、細胞培養を行った。細胞培養にかける時間を２日間及び３日間として、同じ実験を行った。試験結果の評価は、蛍光顕微鏡観察によって行った。
【００８０】
＜細胞の染色＞
細胞接着性試験後の複合体をＰＢＳで穏やかに洗浄して、複合体に付着できていない細胞を除去した。複合体に付着した細胞を４％のホルムアルデヒドで１０分間かけて複合体に固定した。その後、ＰＢＳで各５分間、３回の洗浄を行った。次に、細胞を０．２％のオクチルフェノールエトキシレート（ダウ・ケミカル日本株式社製、商品名：Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で１０分間かけて透過処理した。次に、ＰＢＳで各５分間、３回の洗浄を行った。透過処理後の細胞を、ＰＢＳ中の２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３０分間の条件下で細胞培養を行い、非特異的なタンパク質−タンパク質相互作用をブロックした。さらに、ＰＢＳで各５分間、３回の洗浄を行った。
【００８１】
次に、アクチン染色のために、細胞を蛍光ファロイジン（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ社製、商品名：Ａｃｔｉ−ｓｔａｉｎ  ＴＭ  ４８８）を加えて、１時間培養することで、細胞骨格アクチンを可視化した。その後、ＰＢＳで各５分間、３回の洗浄を行った。フィブロネクチン（Ｆｎ）免疫染色では、細胞を一次抗体（ａｂ２４１３、Ａｂｃａｍ社製、ＰＢＳ（−）バッファー（希釈剤）で、１：２００に希釈）と共に１時間培養した後、ＰＢＳで各５分間、３回の洗浄を行った。次いで、二次抗体（ａｂ１５００７７、Ａｂｃａｍ社製、ＰＢＳ（−）バッファー（希釈剤）で、１：１０００に希釈）で４５分間染色して、ＰＢＳで各５分間の３回洗浄を行った。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いて細胞核を染色した。複合体上における全細胞形態及びＦｎ分布を、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ、Ｏｌｙｍｐｕｓ株式会社製、商品名：ＦｌｕｏＶｉｅｗ  ＦＶ１２００）によって観察した。結果を図８及び図９に示す。
【００８２】
図８は細胞付着性試験の結果である。図８は、複合体への細胞の付着量を単位面積当たりに換算した細胞付着量（×１０２／ｍｍ２）と、細胞の培養時間との関係を示している。図８に示す結果から、細胞の培養時間が増加するにつれて、複合体への細胞付着量が増加していることが確認された。実施例１の複合体では、比較例２のＴｉ合金ペレットと比較して、細胞の付着が促進されていることが確認できた。
【００８３】
図９は、細胞付着性試験の結果の一部を示す蛍光顕微鏡写真である。図９の（Ａ）は、細胞の培養時間が１日間の結果を示しており、図９の（Ｂ）は、細胞の培養時間が２日間の結果を示しており、また図９の（Ｃ）は、細胞の時間が３日間の結果を示している。実施例１の複合体を用いた場合、図９の（Ａ）に示す結果から、細胞がより多くの細胞骨格を発達させていることが確認できる。実施例１の複合体を用いた場合、図９の（Ｂ）に示す結果から、細胞はその細胞の周縁部により多くのラメラ構造を形成しており、紡錘形線維芽細胞様形状で伸長していることが確認された。実施例１の複合体を用いた場合、図９の（Ｃ）に示す結果から、細胞は完全に伸長しており、多数の糸状仮足及びラメリポディアを有するポリトナール形状で広がりを示し、細胞間接触も観察された。一方、比較例２のＴｉ合金ペレットではこのような傾向はみられなかった。図９に示す結果からも、実施例１で調製した複合体では、比較例２のＴｉ合金ペレットと比較して、細胞の付着が促進されていることが確認できた。
【００８４】
［複合体へのカルシウム析出、及びタンパク質吸着の観察］
口腔環境下における複合体の性能を評価するため、実施例１で調製した複合体を人工唾液溶液に浸漬して、複合体上へのカルシウム析出及びＦｎ吸着の観察を行った。人工唾液溶液は、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２、１．５ｍＭ）、リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４、０．９ｍＭ）、塩化カリウム（ＫＣｌ、１３０ｍＭ）、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３、１．０ｍＭ）、及び４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ）を含むバッファーを、水酸化カリウム（ＫＯＨ）を用いてｐＨ７．０に調整したものを用いた。この溶液を毎日交換しながら１４日間、３７℃でインキュベートした。１日間後、２日間後、７日間後及び１４日間後に、浸漬していた複合体を取出し、多量の水で洗浄した後、窒素の気流で乾燥させた。乾燥後の複合体の表面をＸＰＳで解析した。ＸＰＳスペクトルにおいてＣａ（２ｐ）のピークが観測され、Ｃａが析出していること確認した。検出されたＣａの濃度をまとめて、図１０に示す。図１０には、比較のため、比較例２のＴｉ合金ペレットを用いて同様の実験を行った結果を併記した。
【００８５】
２日間の人工唾液溶液に浸漬した複合体をタンパク質吸着実験に使用した。タンパク質として、フィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ：Ｆｎ、ヒト血漿由来、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用い、１０μｇ／ｍＬのＦｎ溶液（ＰＢＳ緩衝液に溶解）を調製した。調製したＦｎ溶液０．５ｍＬを複合体上に添加した。３７℃、１時間かけて培養した。その後、複合体をＰＢＳで２回洗浄し、さらに水で３回洗浄し、窒素の気流で乾燥させた。乾燥後の複合体の表面をＸＰＳで解析した。ＸＰＳスペクトルにおいてＮ（１ｓ）のピークが観測され、フィブロネクチンが吸着していることを確認した。検出された窒素濃度をまとめて、図１１に示す。図１１には、比較のため、比較例２のＴｉ合金ペレットを用いて同様の実験を行った結果を併記した。
【００８６】
図１０に示す結果から、実施例１で調製した複合体の方が、比較例２のＴｉ合金ペレットに比べて、カルシウムが早く析出していることが確認された。また、図１１に示す結果から、カルシウムの析出量が多いことで、複合体上へのタンパク質の付着量も増加することが確認された。骨芽細胞に対しても同様の傾向が得られるものと考えられ、実施例１で調製された複合材は、口腔環境下で使用されるインプラントとしても有用であることが確認された。
【符号の説明】
【００８７】
１０…基材、２０…有機層、１００…複合体。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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