(57)【要約】【課題】劣化した培地が培養容器に注入されることを防止する。【解決手段】培地１８が収容される培地容器１５と、細胞５３が収容され、培地容器１５から培地１８が供給される培養容器３６と、培養容器３６内の細胞５３を撮像する撮像装置５と、培養容器３６から使用済み培地１８が回収される廃液容器１６とを備える。培養容器３６は、培地容器１５から供給された培地１８を一旦貯留するバッファ室４８と、細胞５３が収容され、バッファ室４８に貯留された培地１８が供給される培養室４９とを備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地が収容される培地容器と、
細胞が収容され、前記培地容器から培地が供給される培養容器と、
前記培養容器内の細胞を撮像する撮像装置と、
前記培養容器から使用済み培地が回収される廃液容器と、
を備えた細胞培養観察システムであって、
培養容器は、
前記培地容器から供給された培地を一旦貯留するバッファ室と、
前記細胞が収容され、前記バッファ室に貯留された培地が供給される培養室と、
を備える、細胞培養観察システム。
【請求項２】
前記バッファ室は、前記培地容器から供給される培地を鉛直上方に向かわせる上昇流路を備える、請求項１に記載の細胞培養観察システム。
【請求項３】
前記バッファ室は、底面部分に固形物沈降部を有する、請求項１又は２に記載の細胞培養観察システム。
【請求項４】
前記バッファ室の上昇流路は、鉛直上方に向かって断面積が大きくなるように形成されている、請求項２に記載の細胞培養観察システム。
【請求項５】
前記バッファ室は、前記上昇流路により上方に向かった培地を下方に向かわせる下降流路をさらに備える、請求項２又は４に記載の細胞培養観察システム。
【請求項６】
前記固形物沈降部を撮像する固形物撮像装置と、
前記固形物撮像装置の撮像結果に基づいて、前記固形物沈降部に沈降している固形物の有無および変化量から培地の変性を判断する制御装置と、
をさらに備える、請求項３に記載の細胞培養観察システム。
【請求項７】
前記固形物沈降部を撮像する固形物撮像装置と、
前記固形物撮像装置の撮像結果に基づいて、前記固形物沈降部に沈降している固形物の形状および大きさから培地の変性を判断する制御装置と、
をさらに備える、請求項３に記載の細胞培養観察システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養観察システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、創薬分野では、細胞培養技術により作製した細胞や、細胞を集積して作製した細胞シートを用いて、薬効評価および安全性評価などを行う動物実験代替技術が開発されている。また、再生・細胞医療分野では、作製した細胞や細胞シートを移植する技術が開発されている。このような技術では、細胞や細胞シートの品質評価技術が重要である。
【０００３】
特に心筋においては、拍動状態の画像処理技術（特許文献１および２）、画像処理技術と染色技術との組合せ（特許文献３）、あるいは、電気刺激に対する拍動の応答（特許文献４）により、作製した細胞や細胞シートの品質が評価されている。また、薬剤投与に対する心筋の拍動状態変化等を観察することで、薬剤の生態への影響等を評価することを目指した様々な技術開発が行われている。
【０００４】
現状の多くの場合、細胞／細胞シートは、ＣＯ２インキュベータ内に設置された培養容器の複数の小室に載置された状態で数日から１週間程度の培養が行われている。培養容器は、１〜２日おきに手作業にてインキュベータから搬出され、培地が交換されている。その際、顕微鏡まで培養容器を搬出し、細胞の観察および評価を行っている。しかし、培養容器の搬出を人が行っているため、培養容器を正確に同じ位置で観察するのは難しい。しかも、培養容器の小室を全て観察するには非常に手間がかかる。また、培養容器の搬出時、培養容器に外力が作用して変形することがある。このため、シート状に積層した細胞が損傷したり、培養条件（温湿度、ＣＯ２濃度等）が変化したりして細胞が死滅することがある。そこで、ＣＯ２インキュベータ内において細胞の培養を継続しながら観察できるようにした培養観察装置が開発されている（特許文献５および６）。また、より長期の培養を可能にするため、断続的、継続的に培地を交換する培地交換機構を備えた培養観察装置が開発されている（特許文献７〜１０）。
【０００５】
通常、培地は冷凍・冷蔵保存され、使用の際に加温されて使用される。同様に、前述のような培地交換機構では培地を新鮮に保つため、培地容器を温調された培地チャンバ内に設置し、培養容器へ搬送する際に加温して使用することが多い。しかし、培養容器に培地溶液を搬送する経路には、培地溶液の無駄を少なくするために細径のチューブや狭い流路部を持つバルブ・ポンプ等の流体制御機器が用いられている。このため、チューブや流体制御機器内で培地溶液の滞留が発生しやすい。特に、流体制御機器は電気信号によって制御されており、また摺動部があって発熱するため、滞留部分で培地溶液が温められ、成分変性により固形物が発生する。また、加温の際に固形物を発生する場合も多い。固形物が培養容器まで搬送されると、液面・液中に浮遊又は細胞上に沈殿し、細胞観察やオートフォーカス動作が阻害される。
【０００６】
特に、培地溶液の交換を断続的に行う場合、培地溶液が加温されやすいチューブ内に長時間残存するため、成分変性により固形物が発生する可能性が高くなる。チューブ内に残存する培地溶液を排出するポンプを備えた構成も提案されているが（特許文献１１）、多量の無駄な培地溶液が発生し、装置の構成が複雑になる上、洗浄等を行わないためにチューブ内に残存する固形物が新鮮な培地と共に培養容器に搬送されるという問題が発生する。培養容器に搬送された固形物は液面、液中、細胞表面に堆積することで観察を阻害し、オートフォーカス動作で不具合を発生させる。また、固形物が多量に発生すれば、送液量が変化したり、さらには詰まりが発生したりする恐れがある。また同様に、ポンプ・バルブ等の摺動部からゴミが発生し、培養液中に浮遊することがあり、同様に観察とオートフォーカス動作を阻害する。培養観察装置では、培養容器経路の洗浄不要な（交換可能な）チューブポンプ（ぺリスタポンプ）を用いることが多いが、時間の経過とともにチューブ内壁が離脱するため培養液中にゴミを発生させる。
【０００７】
加えて、ポンプ等の流体制御機器による急激な圧力変動により気泡が発生し、培養容器に搬送されることで観察が阻害され、オートフォーカス動作に不具合が生じることがある。また、培養液を注入ノズルから液面に滴下する構成であると（特許文献１２）、滴下の際に気泡が発生する。
【０００８】
前述のゴミ問題を解決するために流路途中にフィルタを用いることが考えられるが、フィルタにゴミが詰まって流量が変化し、細胞への培地溶液の供給状態が変化するため好ましくない。
【０００９】
培地中で培養しながら長時間の観察を行う場合、時間経過と共に培地が劣化するため培地交換を行う必要がある。このため、顕微鏡には培地中で培養しながら観察を行い、さらに培地交換をすることが求められている。そこで、培地を保管する保管容器、保管容器内の培地を培養容器に注入するための配管、および培養容器内の培地を排出するための配管を備えた顕微鏡システムが提案されている。このような顕微鏡システムにおいては、顕微鏡は３７度に維持された保温ケースの内部に収納され、保管容器は保温ケースの外部に配置されている。
【００１０】
しかし、長時間の培養を行う場合、生体試料によっても異なるが、培地の交換頻度は１〜３日程度である。このため、保管容器から培養容器に至る配管内に停留する培地が、保温ケースの外部では常温、また保温ケースの内部では３７度の環境下に晒されて劣化する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０１３-２１９６１号公報
【特許文献２】特開２０１４‐０７５９９９号公報
【特許文献３】特許５８１８０８０号公報
【特許文献４】特開２０１３−９４１６８号公報
【特許文献５】特許５５３７８５５号公報
【特許文献６】特開２００６−１１４１５号公報
【特許文献７】特開２００６‐１７４８２８号公報
【特許文献８】特開２００４−１１３０９２号公報
【特許文献９】特開２０１４−１１３１０９号公報
【特許文献１０】特許５８４９４７０号公報
【特許文献１１】特許５８４９４７０号公報
【特許文献１２】特許５７４９４７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、劣化した培地が培養容器に注入されることを防止できる細胞培養観察システムを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、前記課題を解決するための手段として、
培地が収容される培地容器と、
細胞が収容され、前記培地容器から培地が供給される培養容器と、
前記培養容器内の細胞を撮像する撮像装置と、
前記培養容器から使用済み培地が回収される廃液容器と、
を備えた細胞培養観察システムであって、
培養容器は、
前記培地容器から供給された培地を一旦貯留するバッファ室と、
前記細胞が収容され、前記バッファ室に貯留された培地が供給される培養室と、
を備える、細胞培養観察システムを提供する。
【００１４】
この構成により、培養容器に注入する培地の流動方向に対して、賠償室の上流側に設けたバッファ室で固形物を沈降させることができる。このため、培養室内への固形物の侵入を防止し、撮像装置による培養室内の細胞の観察を正常に行うことが可能となる。
【００１５】
前記バッファ室は、前記培地容器から供給される培地を鉛直上方に向かわせる上昇流路を備えるのが好ましい。
【００１６】
この構成により、バッファ室の上昇流路では、重力に逆らう鉛直上方に向かって培地を流動させることができる。このため、培地での変性により固形物が発生したとしても、培地から受ける浮力と抗力の合計値に比べて重量の大きい固形物は沈降する。したがって、このような固形物が培養室へと侵入することを防止しやすくなる。
【００１７】
前記バッファ室は、底面部分に固形物沈降部を有するのが好ましい。
【００１８】
この構成により、固形物沈降部を目視等により観察するだけで、培地での変性の発生度合いを簡単に把握することができる。
【００１９】
前記バッファ室の上昇流路は、鉛直上方に向かって断面積が大きくなるように形成されているのが好ましい。
【００２０】
この構成により、上昇流路では、培地の流速がその流動方向に向かうに従って低下し、固形物に作用する抗力を小さくできる。このため、上昇流路で効果的に固形物を沈降可能となる。
【００２１】
前記バッファ室は、前記上昇流路により上方に向かった培地を下方に向かわせる下降流路をさらに備えるのが好ましい。
【００２２】
この構成により、下降流路では、培地に密度の低い気泡等が含まれていれば、これに作用する浮力が重力と抗力の合計値よりも大きくなり、培養室への侵入を防止することができる。
【００２３】
前記固形物沈降部を撮像する固形物撮像装置と、
前記固形物撮像装置の撮像結果に基づいて、前記固形物沈降部に沈降している固形物の有無および変化量から培地の変性を判断する制御装置と、
をさらに備えるのが好ましい。
【００２４】
前記固形物沈降部を撮像する固形物撮像装置と、
前記固形物撮像装置の撮像結果に基づいて、前記固形物沈降部に沈降している固形物の形状および大きさから培地の変性を判断する制御装置と、
をさらに備えるのが好ましい。
【００２５】
これらの構成により、培地が変性しているか否かを容易に判断することができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、培地の流動方向に対して、培養室の上流側にバッファ室を設けるようにしたので、このバッファ室で培地の変性により発生した固形物を底面側へと沈降させることができる。この結果、固形物が培養室に侵入することを防止し、撮像装置による観察を正常に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本実施形態に係る細胞培養観察システムの概略構成図である。
【図２】図１の細胞培養観察システムのブロック図である。
【図３】図１に示す培養容器の拡大断面図である。
【図４】本実施形態に係る細胞培養観察システムの処理内容を示すフローチャートである。
【図５】図４の観察処理を示すフローチャートである。
【図６】図１に示す撮像装置によって撮像する細胞の位置を示す概略図である。
【図７】他の実施形態に係る培養容器の拡大断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明に係る実施形態を添付図面に従って説明する。なお、以下の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用物、あるいは、その用途を制限することを意図するものではない。さらに、図面は模式的なものであり、各寸法の比率等は現実のものとは相違している。
【００２９】
図１は、本実施形態に係る細胞培養観察システムの概略構成図、図２はそのブロック図を示す。この細胞培養観察システムは、筐体１内の基台２上に設けた、培地チャンバ３、培養チャンバ４および撮像装置５のほか、雰囲気制御装置６、培地循環装置７および主制御装置８を備える。
【００３０】
筐体１は、培地チャンバ３、培養チャンバ４および撮像装置５を覆い、内部の雰囲気を安定させ、外部からの光の侵入を防止する。筐体１には、外部より所定のガスを供給可能なガス管９が貫通している。ガス管９は、筐体１内で、第１バルブ１０を有する第１配管１１と、第２バルブ１２を有する第２配管１３とに分岐している。第１配管１１は培地チャンバ３に接続されている。第２配管１３は培養チャンバ４に接続されている。これにより、培地チャンバ３と培養チャンバ４にガスをそれぞれ供給できるようになっている。ここでは、ガスとしてＣＯ２を供給するが、Ｎ２およびＯ２を供給可能な配管を並設してこれらのガスをも供給できるようにしてもよい。
【００３１】
培地チャンバ３は、基台２上の支持台１４に載置した培地容器１５と、廃液容器１６とを備える。培地容器１５と廃液容器１６は培地ケース１７によって覆われている。
【００３２】
培地容器１５内には培地１８が収容される。ここでは、培地１８として、DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）にFBS（Fetal bovine serum）とPenicillin-Streptomycin（抗生物質の一種）を添加して混ぜ合わせた液体培地が使用されている。DMEMには、細胞５３の維持に必要なアミノ酸や塩類が含有されている。FBSは、細胞５３の成長や増殖を促すために添加されるもので、通常、その添加量はDMEMの１０mass％とされている。Penicillin-Streptomycinは、培養細胞へのコンタミネーションを予防するために添加されるもので、通常、その添加量はDMEMの１mass％とされている。
【００３３】
培地容器１５の蓋には培地供給管１９の一端部が貫通している。培地供給管１９の他端部は培養チャンバ４に接続されている。培地供給管１９の途中には送液ポンプ２０が設けられている。送液ポンプ２０には、オリフィスのない（狭い流路が形成されていない）ペリスタポンプを使用するのが好ましい。また、培地容器１５の蓋には吸気管２１が貫通している。吸気管２１の途中にはフィルタ２２が設けられている。吸気管２１は、送液ポンプ２０を駆動して培養チャンバ４に培地１８を供給した際、培地チャンバ３の内部空間からガスを取り込み、培地容器１５内が減圧状態となるのを防止する。フィルタ２２は、取り込んだガスに含まれる塵等の異物を回収し、培地容器１５内の培地１８に混入するのを防止する。
【００３４】
廃液容器１６は、培養容器３６から余剰の培地１８を回収するためのものである。廃液容器１６の蓋には廃液排出管２３が貫通している。廃液排出管２３の途中には廃液ポンプ２４が設けられている。また、廃液容器１６の蓋には、排気管２５が貫通している。排気管２５の途中にはフィルタ２６が設けられている。排気管２５は、廃液ポンプ２４を駆動して培養チャンバ４から余剰の培地１８を回収した際、廃液容器１６内のガスを排出し、加圧状態となるのを防止する。フィルタ２６は、排出したガスに含まれる異物を回収し、培地チャンバ３内に飛散するのを防止する。
【００３５】
培地チャンバ３内には、培地チャンバＣＯ２センサ２７および培地チャンバ温度センサ２８が設けられている。培地チャンバＣＯ２センサ２７での検出濃度および培地チャンバ温度センサ２８での検出温度は雰囲気制御装置６に入力されている。雰囲気制御装置６は、検出濃度に基づいて第１バルブ１０の開閉を制御して培地チャンバ３内のＣＯ２濃度を調整し、検出温度に基づいて培地チャンバ温度調節器２９を駆動制御して培地チャンバ３内を培地１８の保存に適した低温に温調している。
【００３６】
なお、送液ポンプ２０と廃液ポンプ２４は共に、培地１８の送液量を抑えて少量を連続的に流動させるようにしている。これは、各ポンプ２０、２４による送液を間欠的に行うと、培地１８が滞留して固形物６９が発生する恐れがあるためである。
【００３７】
培養チャンバ４は、基台２から上方に延びる支持ブロック３０に固定されたテーブル３１に載置されている。培養チャンバ４は、チャンバ本体３２と、開閉可能な培養チャンバ蓋３３とを備え、これらによって周囲と熱的および光学的に遮断されている。チャンバ本体３２の底面部分は周辺部を除いて下面ガラスヒータ３４で構成されている。下面ガラスヒータ３４の温度は下面ガラス温度センサ３５によって検出され、その検出温度は雰囲気制御装置６に入力されている。下面ガラスヒータ３４上には培養容器３６が載置されている。なお、培養容器３６は、培養チャンバ蓋３３を開放することにより培養チャンバ４に搬入および搬出可能となっている。
【００３８】
培養チャンバ蓋３３は周辺部を除いて上面ガラスヒータ３７で構成されている。上面ガラスヒータ３７の温度は上面ガラス温度センサ３８によって検出され、その検出温度は雰囲気制御装置６に入力されている。上面ガラスヒータ３７は上面ガラス温度センサ３８での検出温度に基づいて、下面ガラスヒータ３４は下面ガラス温度センサ３５での検出温度に基づいてそれぞれ発熱し、培養容器３６内を所定温度に加熱する。
【００３９】
チャンバ本体３２の側壁には、培地供給管１９および廃液排出管２３が貫通し、第２配管１３が接続されている。第２配管１３によって供給されたガスで培養チャンバ４内が満たされる。
【００４０】
培養チャンバ４内にはこのほか、培養チャンバ温度センサ３９、培養チャンバ湿度センサ４０および培養チャンバＣＯ２センサ４１が設けられ、これらで検出される培養チャンバ４内の温度、湿度およびＣＯ２濃度が雰囲気制御装置６にそれぞれ入力されている。また、培養チャンバ４には培養チャンバ温度調節器４２と培養チャンバ湿度調節器４３がそれぞれ設けられている。培養チャンバ温度調節器４２は、培養チャンバ温度センサ３９での検出温度に基づいて培養チャンバ４内を培養に適した所定温度に調整する。また、培養チャンバ湿度調節器４３は、培養チャンバ湿度センサ４０での検出湿度に基づいて培養チャンバ４内を培養に適した所定湿度に調整する。なお、上面ガラスヒータ３７と下面ガラスヒータ３４は共に、撮像装置５による光を透過させて細胞５３の状態を観察できるように光透過性を有している。
【００４１】
培養容器３６は細胞５３を培養するためのものである。培養容器３６は、光透過性に優れた材料で形成するのが好ましく、例えば、PMMA（polymethyl methacrylate：ポリメタクリル酸メチル樹脂）・PC（polycarbonate：ポリカーボネート）・PS（polystyrene：ポリスチレン）・PET（polyethyleneterephthalate：ポリエチレンテレフタレート）・PP（polypropylene：ポリプロピレン）・PE（polyethylene：ポリエチレン）・PSF（polysulfone：ポリスルホン）等で形成できる。
【００４２】
図３に示すように、培養容器３６は、容器本体４４と、蓋体４５とからなる。容器本体４４には、第１凹部４６と第２凹部４７が形成されている。第１凹部４６と第２凹部４７は蓋体４５に覆われてバッファ室４８と培養室４９をそれぞれ構成する。蓋体４５は、僅かな隙間を持って第１凹部４６と第２凹部４７の上方開口部を閉鎖する。このため、バッファ室４８および培養室４９の内部空間と、培養チャンバ４の内部空間との間でガスが移動可能となっている。
【００４３】
第１凹部４６は平面視円形で、内側面が底面から上端開口に向かうに従って開口断面積が徐々に拡大するように形成されている。縦断面において、内側面と水平面との成す角度αは、α＜９０°を満足し、ここでは８５°に設定されている。
【００４４】
第１凹部４６の底面側側壁には横断面円形の培地供給穴５０が形成されている。培地供給穴５０には、培地ケース１７を貫通して延びる培地供給管１９の一端部が接続されている。培地供給管１９の他端部は培地容器１５の蓋を貫通している。送液ポンプ２０を駆動すると、培地容器１５内の培地１８が培地供給管１９を介してバッファ室４８内へと供給できるようになっている。
【００４５】
培養容器３６の底面からそれぞれ、第１凹部４６の底面までの高さをｈ０、培地供給穴５０の最下位置までの高さをｈ１としたとき、ｈ１＞ｈ０を満足するように、培地供給穴５０の位置が設定されている。これにより、第１凹部４６の底面には、培地供給穴５０から培養容器３６内に流入する培地１８の流動による影響を受けにくい領域、すなわち固形物沈降部５１が形成される。そして、固形物沈降部５１には後述する固形物６９が沈殿する。
【００４６】
第１凹部４６の側壁上方側には、第１凹部４６と第２凹部４７を連通する連通穴５２が形成されている。培養容器３６の底面から培地供給穴５０の最下位置までの距離をｈ３としたとき、ｈ３＞ｈ１を満足するように、培地供給穴５０の位置が設定されている。また、連通穴５２の流路断面積をＡ１とし、バッファ室４８の開口断面積の最小値（ここでは、底面での面積）をＡ２としたとき、Ａ１＜Ａ２を満足するように、連通穴５２およびバッファ室４８が形成されている。
【００４７】
このように、バッファ室４８では、培地供給穴５０が底面側に形成され、連通穴５２が上方側に形成されることにより、培地供給管１９を介してバッファ室４８内に供給された培地１８は、下方から上方に向かう流れを形成する。つまり、バッファ室４８は、培地１８を下方から上方に向かわせる上昇流路として機能し、培地１８で固形物６９が発生したとしても、この固形物６９は上昇流路の高低差（ｈ２−ｈ１）を重力に逆らって上昇しなければならなくなる。しかも、連通穴５２の流路断面積がバッファ室４８の開口断面積よりも小さく、バッファ室４８から培養室４９へと培地１８が流動しにくくなっている。したがって、培地１８で成分変性により固形物６９が発生したとしても、この固形物６９に作用する重力ａが、固形物６９に作用する抗力ｂと浮力ｃの合計値よりも大きくなる（ａ＞ｂ＋ｃ）。これにより、固形物６９を確実に固形物沈降部５１へと沈降させて培養室４９へと侵入することを防止できる。
【００４８】
また、バッファ室４８では、底面から上方に向かうに従って徐々に開口断面積が大きくなっている。このため、下方から上方に向かう培地１８の流速が徐々に低下する。これにより、固形物６９に作用する抗力を低下させ、さらに固形物６９が沈降しやすくなる。但し、バッファ室４８での高低差で固形物６９を沈降できるのであれば、開口断面積を変化させた構成は必ずしも必要なものではない。
【００４９】
第２凹部４７は平面視円形で、第１凹部４６と同様に、上方に向かうに従って徐々に開口断面積が大きくなるように形成され、全体として第１凹部４６よりも内径寸法が大きくなっている（すなわち容積が大きい）。第２凹部４７内には、培養の対象となる複数の細胞５３が収容されている。細胞５３を平面的に培養する場合、細胞５３は第２凹部４７の底面に直接載置する。細胞５３を立体的に培養する場合、第２凹部４７内に副容器５４を収容し、この副容器５４内に細胞５３を収容する（図３の例では、副容器５４を使用している。）。副容器５４の底面は培地１８が浸透可能な材質で構成する。そして、副容器５４を第２凹部４７の底面から上方に位置するように配置する。
【００５０】
第２凹部４７の上方側側壁には、連通穴５２とは反対側の位置に、横断面円形の培地排出穴５５が形成されている。培地排出穴５５には、培養チャンバ４のチャンバ本体３２を貫通して培地チャンバ３の廃液容器１６内に延びる廃液排出管２３が接続されている。培養容器３６の底面から培地排出穴５５の最下位置までの距離をｈ２としたとき、ｈ３＞ｈ２＞ｈ１を満足するように、培地排出穴５５の位置が設定されている。
【００５１】
このように、培養室４９では、バッファ室４８から培地１８が供給される連通穴５２に対して培地排出穴５５が反対側上方に形成されている。したがって、連通穴５２から供給された培地１８が逆流することなく、スムーズに一方向に流動し、培養容器３６内の余剰の培地１８が培地排出穴５５から廃液排出管２３を介して廃液容器１６へと排出される。
【００５２】
撮像装置５は、細胞５３を観察するためのもので、照明部５６、照明ミラー５７、照明用レンズ５８、対物レンズユニット５９、対物ミラー６０および受光部６１を備える。対物レンズユニット５９は、対物レンズ６２とＺステージ６３とからなる。Ｚステージ６３は支持ブロック３０に沿って昇降可能であり、培養容器３６に対して対物レンズ６２をＺ軸方向（図１中、上下方向：鉛直方向）に移動可能となっている。受光部６１にはＣＣＤ（charge-coupled device）が使用されている。また、撮像装置５は、培養容器３６をＸ軸およびＹ軸方向（水平方向）に移動させるＸステージ６４およびＹステージ６５を備える。Ｘステージ６４、Ｙステージ６５およびＺステージ６３はステージコントローラ６６によって駆動制御されるようになっている。
【００５３】
撮像装置５では、照明部５６から出射された光は照明ミラー５７、照明用レンズ５８、上面ガラスヒータ３７、培養容器３６の蓋体４５、細胞５３、培養容器３６、下面ガラスヒータ３４、対物レンズ６２、対物ミラー６０を介して受光部６１に入射される。受光部６１での検出結果は主制御装置８に送信され、そこで細胞５３の状態が観察（検出、分析）される。
【００５４】
雰囲気制御装置６は、培地チャンバ３内に設けた培地チャンバＣＯ２センサ２７および培地チャンバ温度センサ２８からそれぞれ入力される検出信号に基づいて、第１バルブ１０および培地チャンバ温度調節器２９を駆動制御する。そして、培地チャンバ３内を、主制御装置８で設定したＣＯ２濃度および雰囲気温度に調整する。また、雰囲気制御装置６は、培養チャンバ４内に設けた培養チャンバ温度センサ３９、培養チャンバ湿度センサ４０および培養チャンバＣＯ２センサ４１からそれぞれ入力される検出信号に基づいて、培養チャンバ温度調節器４２および培養チャンバ湿度調節器４３を駆動制御する。そして、培養チャンバ４内を、主制御装置８で設定したＣＯ２濃度、湿度および雰囲気温度に調整する。ここでは、ガスとしてＣＯ２濃度のみを調整するようにしたが、Ｎ２およびＯ２をも供給可能としている場合には、これらの濃度をも調整するようにしてもよい。
【００５５】
培地循環装置７は、送液ポンプ２０および廃液ポンプ２４を駆動制御して、主制御装置８で設定したタイミングで、所定量の培地１８を、培養チャンバ４内のバッファ室４８に供給し、培養室４９での余剰の培地１８を排出する。
【００５６】
主制御装置８は、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭおよびデータ記憶部などを備えるパーソナルコンピュータ（Personal computer：ＰＣ)である。主制御装置８には、ディスプレイなどの表示器６７およびキーボードなどの入力装置６８が接続されている。ＣＰＵは、各種の制御プログラムに従って処理を実行するプロセッサーである。ＲＯＭは、ＣＰＵにより実行されるＢＩＯＳ等のプログラムが予め記憶された不揮発性メモリである。ＲＡＭは、ＣＰＵによる各種の制御プログラムの展開およびデータの一時記憶に用いられる揮発性メモリ又は不揮発性メモリである。データ記憶部は、ＣＰＵに各種の処理を実行させるための各種のアプリケーションプログラムおよび各種のデータを記憶するハードディスクなどである。具体的に、主制御装置８は、撮像装置５、雰囲気制御装置６および培地循環装置７から各種信号を受信すると共に制御信号を出力し、各装置を駆動制御する。
【００５７】
次に、前記構成からなる細胞培養観察システムの動作について説明する。
【００５８】
図４に示すように、図示しないスイッチが操作される等により細胞培養観察システムが駆動（ＯＮ）状態になれば（ステップＳ１）、培地チャンバ３および培養チャンバ４の雰囲気制御処理を開始する（ステップＳ２）。
【００５９】
雰囲気制御処理は次のようにして行う。培地チャンバ３では、培地チャンバＣＯ２センサ２７での検出濃度に基づいて第１バルブ１０を開閉し、培地チャンバ３内のＣＯ２濃度を主制御装置８で設定された値に調整する。また、培地チャンバ温度センサ２８での検出温度に基づいて培地チャンバ温度調節器２９を駆動制御し、培地チャンバ３内の雰囲気温度を主制御装置８で設定された値に調整する。
【００６０】
一方、培養チャンバ４では、培養チャンバ４ＣＯ２センサでの検出濃度に基づいて第２バルブ１２を開閉し、培養チャンバ４内でのＣＯ２濃度を主制御装置８で設定された値に調整する。また、培養チャンバ温度センサ３９での検出温度に基づいて培養チャンバ温度調節器４２を駆動制御し、培養チャンバ４内の雰囲気温度を主制御装置８で設定された値に調整する。さらに、培養チャンバ湿度センサ４０での検出湿度に基づいて培養チャンバ湿度調節器４３を駆動制御し、培養チャンバ４内を主制御装置８で設定された値に調整する。
【００６１】
培地チャンバ３内が所望の温度およびガス濃度となり、培養チャンバ４内が所望の温度、湿度およびガス濃度となって雰囲気制御処理が完了すれば、表示器に「READY」と表示する（ステップＳ３）。このとき、培養チャンバ４が待機位置に位置しているか否かを判断し(ステップＳ４）、位置していればそのまま、位置していなければ待機位置に移動させる（ステップＳ５）。培養チャンバ４が待機位置に位置すれば、培養チャンバ蓋３３を開放し、培養チャンバ４内に培養容器３６を設置する。
【００６２】
培養チャンバ４内への培養容器３６の設置が完了すれば、培養容器３６内の細胞５３を観察するための設定（観察設定）を読み込む（ステップＳ６）。すなわち、入力装置によって入力された、培養容器３６内の観察位置、開始時間Ｔ０、撮影間隔Ｔ１、撮影回数Ｎ、送液速度Ｍおよび排液速度ｍの値を読み込む。
【００６３】
観察位置は培養室４９内に、例えば、図６に示すように、培養室４９内のＸ、Ｙ座標Ｘｎ、Ｙｎ（ｎ＝１〜５）の５点を指定する。Ｚ座標は全ての観察位置で共通であり、例えば、Ｚ０、Ｚ１、Ｚ２の３点を指定する。これにより、高さ方向で複数の画像を取得し、培養による高さ変動や厚みばらつきに対応させる。なお、前記実施形態では、培養室４９は１つとしたが、複数とした場合、同様にして各培養室４９内のＸＹ座標５点とＺ座標３点を指定すればよい。
【００６４】
観察設定が完了し、処理開始ボタンが操作されれば（ステップＳ７）、図５に示す観察処理を開始する（ステップＳ８）。
【００６５】
観察処理では、カウンタを初期化（ｎ＝０）とした後（ステップＳ８−１）、Ｘステージ６４およびＹステージ６５を駆動して、培養チャンバ４を雰囲気が安定している培養位置へと移動させる（ステップＳ８−２）。そして、待機時間（観察開始までの時間）Ｔ０が経過するまで待機する（ステップＳ８−３）。待機時間Ｔ０が経過すれば、Ｘステージ６４およびＹステージ６５を駆動して、培養チャンバ４を観察位置へと移動させ（ステップＳ８−４）、移動に伴う機械（培養容器３６）および液面（培養容器３６内の培地１８）の振動が収まるまで待機する（ステップＳ８−５）。振動が収まれば、観察点０〜５までの細胞観察（撮像）を開始する（ステップＳ８−６）。全ての点（ＸＹ座標５点とＺ座標３点）の撮像が完了すれば、カウンタｎに１を加算し（ステップＳ８−７）、カウンタｎが設定回数Ｎに到達したか否かを判断する（ステップＳ８−８）。カウンタｎが設定回数Ｎに到達していなければ、ステップＳ８−２に戻って前記処理を繰り返し、カウンタｎが設定回数Ｎに到達すれば観察処理を終了する。
【００６６】
前述のようにして細胞５３の観察を行うが、定期的に培養容器３６内の培地１８を交換する。培地１８の交換は、培地容器１５および廃液容器１６の設置完了後、前述の細胞培養観察システムの駆動前や観察設定前に行う。培地１８の交換では、送液ポンプ２０を駆動し、培地容器１５内の培地１８を培地供給管１９を介して培養容器３６内のバッファ室４８へと供給する。バッファ室４８では先に供給された培地１８が新たに供給された培地１８によって押し出されるようにして下方から上方へと流動し、連通穴５２を介して培養室４９へと流入する。培養室４９では、流入した新しい培地１８によって、培養中の培地１８が培地排出穴５５へと流動する。培地１８の供給は、培養室４９内の古い培地１８が全て交換されたと考えられる容量に到達するまで行う。
【００６７】
ところで、培地１８には、その滞留状況の違いに応じて、FBSや培地溶液中から生じる析出物などや、これらが凝集した凝集物などの固形物６９が発生することがある。培地チャンバ３や培養チャンバ４内は設定した温度に温調されており、培地１８から固形物６９が発生しにくい環境となっているが、培地チャンバ３から培養チャンバ４に至る培地供給管１９では温度が上昇し、培地１８の成分変性により固形物６９が発生する恐れがある。
【００６８】
本実施形態では、培養容器３６に供給する培地１８が、一旦、バッファ室４８に滞留された後、上昇流路を構成する培養室４９へと流入するように構成されている。しかも、バッファ室４８は上方に向かって開口断面積が大きくなっており、培地１８の流速を低下させる役割を果たしている。また、連通穴５２はバッファ室４８の開口断面積に比べて小さく、培地１８が流動しにくくなっている。したがって、たとえ培地１８の成分変性により固形物６９が発生し、バッファ室４８内に流入したとしても、この固形物６９は上向きに作用する浮力と抗力の合計値よりも、大きな力を下向きに作用させる重力に従って固形物沈降部５１へと沈殿し、培養室４９内に侵入することはない。
【００６９】
このように、バッファ室４８を設けることにより、培地容器１５から供給される培地１８が直接、培養室４９へと流入しないように構成することで、従来では抑制の難しい、培養室４９への固形物６９の侵入を効果的に防止することができる。
【００７０】
その後、固形物沈降部５１に固形物６９が沈殿してくるが、通常の培養期間中であれば清掃が必要となるほど沈殿量が多くはならない。そこで、培養期間が終了した時点で、固形物沈降部５１の清掃を行うようにすればよい。万一、想定外の沈殿量となった場合、使用している培養環境（培地１８など）が好ましくない条件であったと推察できる。この場合、細胞５３および培地１８を破棄し、新たに細胞５３をセットし直すようにすればよい。これにより、好ましくない条件のままで培養されて時間が浪費されるといったことがなくなる。
【００７１】
なお、本発明は、前記実施形態に記載された構成に限定されるものではなく、種々の変更が可能である。
【００７２】
前記実施形態では、バッファ室４８を上昇流路のみで構成したが、下降流路７３を備えた構成とすることもできる。例えば、図７では、バッファ室４８内に、底面から上方に延びる第１仕切板７０と、培養容器３６の蓋体４５から下部に伸びる第２仕切板７１を設け、培地供給穴５０から連通穴５２に至るまでに、第１上昇流路７２、下降流路７３および第２上昇流路７４を形成するようにしている。
【００７３】
この構成によれば、培地供給穴５０からバッファ室４８内に供給された培地１８は、一旦、第１上昇流路７２を流動し、前記実施形態と同様の原理により、たとえ固形物６９が発生したとしても、これを底面側へと沈降させることができる。また、培地１８は第１上昇流路７２で固形物６９を除去された後、さらに下降流路７３を上方から下方へと流動する。このため、たとえ培地１８中に気泡等が含有されていたとしても、下降流路７３を流動することで、気泡等に浮力が作用し、第２上昇流路７４に至ることがない。そして、培地１８が第２上昇流路７４を流動する際にも、残余の固形物６９が沈降する。したがって、培養室４９内に注入される培地１８には固形物６９や気泡等の不要物が含有されることがない。
【００７４】
前記実施形態では、バッファ室４８の底面部分である固形物沈降部５１に固形物６９が沈殿したことを目視によって確認し、清掃するか、あるいは、細胞５３や培地１８を交換するかなどを判断するようにしたが、別途、固形物撮像装置（図示せず）を設けて自動的に判断できるようにしてもよい。但し、固形物撮像装置は、固形物６９の撮像用に別途設けるようにしてもよいが、培地チャンバ３を水平方向に移動させ、既存の撮像装置５でバッファ室４８を撮像するようにしてもよい。
【００７５】
ここでは、固形物撮像装置によって得られた画像から、固形物６９の有無とその変化量に基づいて培地１８の変性が、細胞５３や培地１８の交換を必要とするものであるのか否かを判断するようにすればよい。具体的には、固形物６９が有ると判断された場合、その画像を記憶し、所定時間経過後に再度撮像された際の画像と比較する。比較した結果、固形物６９の沈殿範囲が広がっている、沈殿量が増えて反射率が変化しているなどの状態が検出されれば、細胞５３や培地１８の交換を必要とする状態であると判断すればよい。
【００７６】
また、固形物撮像装置によって得られた画像から、固形物６９の形状と大きさに基づいて培地１８の変性が、細胞５３や培地１８の交換を必要とするものであるのか否かを判断するようにしてもよい。具体的には、所定時間毎に固形物６９を撮像し、固形物６９の形状が変化している、あるいは、固形物６９の大きさが大きくなっていると判断された場合（ある基準値を超えて大きく変化している場合）、細胞５３や培地１８の交換を必要とする状態であると判断すればよい。
【００７７】
前記実施形態では、Ｘステージ６４およびＹステージ６５によって撮像装置５に対して培養チャンバ４を水平方向に移動させるようにしたが、培養チャンバ４に対して撮像装置５を水平移動させてもよし、両者を水平移動させてもよい。要は、培養チャンバ４と撮像装置５を相対的に水平移動できる構成であればよい。
【００７８】
前記実施形態では、Ｚステージ６３によって培養容器３６に対して対物レンズ６２を鉛直方向に移動させるようにしたが、対物レンズ６２に対して培養容器３６を昇降させてもよいし、両者を昇降させてもよい。要は、培養容器３６と対物レンズ６２を相対的に昇降できる構成であればよい。
【符号の説明】
【００７９】
１…筐体
２…基台
３…培地チャンバ
４…培養チャンバ
５…撮像装置
６…雰囲気制御装置
７…培地循環装置
８…主制御装置
９…ガス管
１０…第１バルブ
１１…第１配管
１２…第２バルブ
１３…第２配管
１４…支持台
１５…培地容器
１６…廃液容器
１７…培地ケース
１８…培地
１９…培地供給管
２０…送液ポンプ
２１…吸気管
２２…フィルタ
２３…廃液排出管
２４…廃液ポンプ
２５…排気管
２６…フィルタ
２７…培地チャンバＣＯ２センサ
２８…培地チャンバ温度センサ
２９…培地チャンバ温度調節器
３０…支持ブロック
３１…テーブル
３２…チャンバ本体
３３…培養チャンバ蓋
３４…下面ガラスヒータ
３５…下面ガラス温度センサ
３６…培養容器
３７…上面ガラスヒータ
３８…上面ガラス温度センサ
３９…培養チャンバ温度センサ
４０…培養チャンバ湿度センサ
４１…培養チャンバＣＯ２センサ
４２…培養チャンバ温度調節器
４３…培養チャンバ湿度調節器
４４…容器本体
４５…蓋体
４６…第１凹部
４７…第２凹部
４８…バッファ室
４９…培養室
５０…培地供給穴
５１…固形物沈降部
５２…連通穴
５３…細胞
５４…副容器
５５…培地排出穴
５６…照明部
５７…照明ミラー
５８…照明用レンズ
５９…対物レンズユニット
６０…対物ミラー
６１…受光部
６２…対物レンズ
６３…Ｚステージ
６４…Ｘステージ
６５…Ｙステージ
６６…ステージコントローラ
６７…表示器
６８…入力装置
６９…固形物
７０…第１仕切板
７１…第２仕切板
７２…第１上昇流路
７３…下降流路
７４…第２上昇流路
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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