(57)【要約】      （修正有）【課題】生物活性化合物の同定方法であり、薬草からの潜在的生物活性化合物をクロマトグラフィー後に再グループ化することにより同定することができる方法を提供する。【解決手段】以前の経験に従い治療効果の報告を有する薬草を選択する工程、煮沸又は化学的方法によって化合物を抽出する工程、及びクロマトグラフィーで化合物を分離する工程を含む方法。分離された化合物を異なる部分と再グループ化し、不活性部分を除去するためにインビボ及び／又はインビトロでさらに試験し、そしてそれ以上化合物を除去できなくなるまで同じプロセスを繰り返し、そして残りの化合物を合成又は精製して、それらをさまざまな剤形にし、そして疾患を治療するために利用する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬草の潜在的生物活性化合物を同定する方法であって：
以前の経験に基づいて薬草又は混合された薬草を選択する工程；
薬草から化合物を抽出し、生成した溶液を回収し、そして溶液を濃縮する工程；
濃縮された溶液においてクロマトグラフィーを実施し、抽出された化合物を分離する工程；
一連の試料管において分離された化合物を含む出力物を回収し、そして選択された試料を組み合わせて、各部分が複数（グループ）の化合物を含む複数の部分を生成する工程；
動物又は他の生物学的モデルにおいて所望の生物活性について部分を試験し、そしてさらなる試験のために潜在的な生物活性化合物（ＰＢＣ）を含むそれらの部分のみを選択する工程；
生物活性について陽性であると試験された部分において示された化合物を再グループ化し、そしてその新しいグループについて試験及び選択を繰り返す工程；
１つ又は複数のＰＢＣを含む化合物のグループを同定するために必要に応じて再グループ化、試験及び選択の工程を繰り返す工程；
同定された１つ又は複数のＰＢＣを化学的に分析する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
生物活性が病原体にとって有害である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
病原体が細菌である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
病原体がウイルスである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
病原体が真菌又は酵母である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
病原体が寄生虫である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
外来の生物有機体が原因でない病状の治療のために生物活性が有用である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬草の混合物から潜在的生物活性化合物を単離する方法に関する。
【０００２】
＜略語＞
「ＦＤＡ」又は「ＵＳ  ＦＤＡ」という用語は米国における食品及び医薬品を規制する米国政府機関であるアメリカ食品医薬品局を指す。
「ＨＰＬＣ」という用語は、高圧液体クロマトグラフィーを指す。
「ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ」という用語は、液体クロマトグラフィー−質量−質量分析を指す。
「ＰＢＣ」という用語は、潜在的な生物活性化合物を指す。
「ＴＣＭ」という用語は「伝統中国医薬」（Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）を指す。
【背景技術】
【０００３】
導入
薬草薬剤は長い歴史を持ち、様々な病状の治療に適用される。薬物治療について話す場合、最初の選択は西洋薬剤であり、それらのほとんどは米国のＦＤＡ規制に従って開発されてきた。この開発の利点は、有効性と安全性が十分に証明され、かつその品質と量の管理がうまく制御されていることである。
【０００４】
米国のボストンにあるタフツ大学（Ｔｕｆｔｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の２人の研究者が２０１４年に調査結果を発表した。研究者らは過去数十年に及ぶ薬物開発のデータを収集し、基礎科学から臨床試験までの期間は約１１年で１４億ドルの支出であり；臨床試験からＦＤＡの承認までの期間は約７〜８年で、その費用は約２４億ドルである。そのため、基礎科学からＦＤＡの医薬品承認までに平均１８年、３８億ドルを要する。多くの西洋人にとって、これが唯一の選択可能な方法である。
【０００５】
アジアや多くの第三世界の国々では、薬草薬剤が第二の選択肢である。伝統中国医薬（ＴＣＭ）は薬草薬剤の究極の発展である。中国を除いて他の場所での薬草薬剤は基本的に単一の薬草であり、ＴＣＭはそれ自身の理論を有し、施術者は１０〜２０の薬草の混合物を何度も用いて患者を治療する。
【０００６】
一つの薬草にさえ多くの化合物があり、そして混合した薬草にはさらに多くある。
【０００７】
多くのこれらの化合物の特性は未知である。科学者は薬草における生物活性化合物を研究するために多くの費用と時間を費やしているが、ほとんど成功していない。アルテミシニンはマラリアの治療のためのものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
医薬品の研究のために、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガス質量分析（ＧＣ−ＭＳ）、液体−質量−質量分析（ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ）などの多くの方法がある。しかしこれらの方法は化学成分の構造を決定することだけは可能であるが、該化合物の有効性及び安全性を明確に同定することができない。それゆえ薬草における化合物の有効性及び安全性をどのように同定するかは、医薬品の研究において常に障害となっている。
【０００９】
クロマトグラフィーが薬草の化合物を分離するために適用された多くの公表及び特許が存在するが、ＰＢＣが選択され、かつ非機能性化合物が除去された学術論文はない。
【００１０】
発明の概要
本発明はクロマトグラフィー後に再グループ化を用いることによりＰＢＣを迅速に同定するための方法を提供する。
【００１１】
クロマトグラフィーは混合された化合物の分離のための実験技術である。混合物を移動相に溶解し、それを固定相と呼ばれる別の物質に通過させる。混合物の様々な成分は異なる速度で移動し、それらが分離される。分離は移動相と固定相の間の異なる分配に基づく。
【００１２】
混合された薬草は数十の化合物を有し得、その多くは治療効果に関連しない。効果のない成分の多くを除くことができ、有効な又は有効な可能性のある成分のみを残せれば、西洋の薬剤のように化合物の品質と量を制御することが可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の目的を達成するために、下記の工程がとられる：
（１）：以前の経験に基づいて、ある疾患に対する薬草の併用を選択し、薬草に含む化合物を抽出する。抽出は煮沸又は化学的方法によって実施され得る；
（２）：クロマトグラフィーによりそれらを分離し、単離された化合物をグループ化する；
（３）：適切なビトロ又はビボのモデルを選択し、そしてグループ化された化合物を該化合物の効果を調べるために試験する；
（４）：再グループ化し、これ以上非ＰＢＣが取り除かれなくなるまで工程を繰り返す；
（５）：検出された生物活性化合物は患者の治療のために様々の形態の薬剤へ形成する；
（６）：患者の治療のために他の化合物を様々な形態の薬剤に混合する；
（７）：患者の疾患に基づいて患者を治療するために薬草又は西洋の薬剤の他の化合物とＰＢＣを混合する。
【００１４】
本発明は薬草の潜在的な生物活性化合物を同定する方法を提供し、以下の工程を含む：
以前の経験に基づく薬草又は混合された薬草を選択すること；全ての化学的化合物を抽出するために選択された薬草を調製し、化合物を濃縮し、濃縮した溶液をクロマトグラフィーに適用し、そして異なる試験管にて出力物を回収すること；いくつかの部分に溶液を組み合わせること；適切な動物又は他の生物学的モデルを用いて潜在的な生物活性を試験し、潜在的な生物活性化合物（ＰＢＣ）を含む試験管のみを維持すること；これ以上取り除くことができなくなるまで、上記の工程を繰り返すこと；残存ＰＢＣを化学的に分析すること；ＰＢＣを有する割合に基づいて治療の投薬計画を作成すること；栄養補助食品又は薬品としてのＰＢＣの併用剤で患者を治療すること；患者の応答に従い、ＰＢＣの量を調節し、治療の改善のために他の化合物を追加又は削除すること。
【００１５】
ＰＢＣが試験される生物活性特性は、細菌、ウイルス、酵母もしくは真菌、又は寄生虫などの病原性有機体に対する活性であり得る。
【００１６】
あるいは、ＰＢＣは、高血圧症、糖尿病性、癌などのような外来の生物有機体に起因しない医学的状態の治療に有効である生物活性特性について試験され得る。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、開示された方法によって同定された生物活性化合物；疾患の治療に使用するための開示された方法によって同定された生物活性化合物；及び前記生物活性化合物及び一種以上の製薬上許容される担体、結合剤又は賦形剤を含む医薬製剤を提供する。
【００１８】
詳細な説明
添付の図面を参照し、本発明の実施形態を実施例として説明する：
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本発明の一実施形態による潜在的生物活性化合物の検出プロセスを示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００２０】
実施形態１．本発明による薬草中の抗オピオイド依存活性を有するＰＢＣの発見
６種類の薬草（丹参（Ｓａｌｖｉａ  ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ）１４０グラム、アネモネ・アルタイカ（Ａｎｅｍｏｎｅ  ａｌｔａｉｃａｅ）９０グラム、ハカマウラボシ（Ｄｒｙｎａｒｉａ  ｆｏｒｔｕｎｅｉ）３０グラム、合歡皮（Ｃｏｒｔｅｘ  ａｌｂｉｚｚｉａ）３０グラム、ツルドクダミ（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ  Ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）２０グラム、ボルネオール（Ｂｏｒｎｅｏｌ）３．５グラム）の混合物を報告する。
【００２１】
６つの薬草を１，５００ｃｃの水と混ぜ合わせ、３０分間浸出し、１００℃で６０分間それらを沸騰させ、そして該溶液を瓶に注ぎ、そしてもう一度上記の手順を繰り返した。１００℃のオーブン中ですべての薬草の化合物を含む回収された溶液をわずか５〜１０ｃｃになるまで加熱した。
【００２２】
ＨＰＬＣによる上記溶液の分析では６１個の化合物を示し、カラムクロマトグラフィーにより得られた液体は１０部に分けられ、そして各グループ（化合物）は以下のように番号付けされる。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
第１の試験：薬草の化合物の安全量を決定した。
【００２５】
ＨＰＬＣにより回収された溶液の分析では、１０番目の際立ったピークを示し、それを参照として使用し、１０ｍｇ／ｍｌとして希釈した。マウスを２１日間１ｍｇ／ｍｌのモルヒネで開始した。
【００２６】
第２の試験：別々のグループの化合物を使用してマウスにおける有効性を試験した。有効性の定義。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
１．各グループに１０匹のマウス。
【００２９】
上記試験から、グループ２及び９は、完全なＰＢＣを含むことが示され、それは化合物７〜１２及び４９〜５４を有する。これらの化合物を再グループ化し、そして該試験の化合物の部分を使用して第３の試験を実行した。結果は次のとおりである：
【００３０】
【表３】
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【００３１】
試験３から、化合物９、１０、５１、５２がＰＢＣであり得ることが示される。これらの４つの化合物を試験し続けることで、さらなる除去の可能性を確認できる。ＬＣ−ＭＳ−ＭＳによるこれら４つの化合物の分析は、化合物９及び５１の商業的入手可能性を示し、これらの化合物１０、５２は精製又は合成により得られる。
【００３２】
オピオイド依存のある患者は、安定剤又はビタミンの割合によって化合物９、１０、５１、５２の混合物を用いて治療されるであろう。
【００３３】
実施形態２．クロマトグラフィーによる薬草中の抗大腸菌活性を有するＰＢＣの発見
複雑な尿路感染症（ＵＴＩ）は、すべての年齢層で発生する可能性があり、構造的又は機能的な尿路異常のいずれかに頻繁に関連する。最も頻繁に見られる微生物は大腸菌である。
【００３４】
薬草療法は、有効成分として、世界中の多数の病気を治療するために使用される植物の一部、又は植物材料、又はそれらの組み合わせを含む（ＷＨＯ、２００２）。
【００３５】
処方は以下の通りであった：通草（Ｔｏｎｇ  Ｃａｏ）（Ｓｔａｃｈｙｕｒｕｓ  ｈｉｍａｌａｉｃｕｓ  Ｈｏｏｋ．ｆ．ｅｔ  Ｔｈｏｍｓ）２０ｇ、滑石（Ｈｕａ  Ｓｈｉ）（Ｔａｌｃｕｍ）１５ｇ、赤芍（Ｃｈｉ  Ｓｈａｏ）（Ｐａｅｏｎｉａ  ｌａｃｔｉｆｌｏｒａ  Ｐａｌｌ）１５ｇ、茴香（Ｈｕｉ  Ｘｉａｎｇ）（Ｆｏｅｎｉｃｕｌｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  Ｍｉｌｌ）１５ｇ、官桂（Ｇｕａｎ  Ｇｕｉ）（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｓｓｉａ  Ｐｒｅｓｌ）１５ｇ、茘枝核（Ｌｉ  Ｚｈｉｈｅ）（Ｌｉｔｃｈｉ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ  Ｓｏｎｎ）１５ｇ、天葵子（Ｔｉａｎ  Ｋｕｉｚｉ）（Ｓｅｍｉａｑｕｉｌｅｇｉａ  ａｄｏｘｏｉｄｅｓ  （ＤＣ．）  ｍａｋｉｎｏ）１５ｇ、紫花地丁（Ｚｉｈｕａ  Ｄｉｄｉｎｇ）（Ｖｉｏｌａ  ｙｃｄｏｅｎｓｉｓ  Ｍａｋ．）２０ｇ、瞿麥（Ｊｕ  Ｍａｉ）（Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｓｕｐｅｒｂｕｓ  Ｌ．）１５ｇ、馬歯けん（Ｍａ  Ｃｈｉｘｉａｎ）（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  Ｌ）５０ｇ、蒲公英（Ｐｕ  Ｇｏｎｇｙｉｎｇ）（Ｈｅｒｂａ  ｔａｒａｘａｃｉ）３０ｇ。該生薬を８００ｍｌの水中で混合し、８００ｍｌの水中で該薬物を煎じた後に２００ｍｌの濃縮用液を得ることによって（１００℃で３０分間、２回）調合物を調製した。
【００３６】
ＨＰＬＣ分析では８８の化合物があり、これらの化合物は以下のように１１のグループに分けられる：
【００３７】
【表４】
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【００３８】
第１の試験は有効濃度を決定することである。
【００３９】
ＨＰＬＣ分析により、２０番目の化合物は安定であり、それにより参照化合物が選択された。第一段階は、凍結乾燥し、クロマトグラフィーにより回収された全ての液体のアリコートを一緒に粉末に低温凍結し、次いで粉末を希釈して化合物２０を５０ｍｇ／ｍｌにすることである。寒天を１、２、４ｍｌの該溶液と混合し、最終総量を５０ｍｌとした。寒天の上に大腸菌を塗り、３７℃のインキュベーターに２４時間入れる。２及び４ｍｌの該溶液を寒天と混合した場合に抗細菌活性が示されることが見出された。
【００４０】
抗細菌活性の基準は次の基準で設定される：９０％の１ｍｌあたりの大腸菌のコロニーが、大腸菌感染の治療のための一般的な抗生物質であるフルオロキノロン１ｍｇ／ｋｇで処理されたものに近い場合、基準を満たす。
【００４１】
第２の試験：化合物を次のようにグループ分けして試験を実施した。結果は次のとおりである：
【００４２】
【表５】
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【００４３】
上記試験から、３２の化合物（１〜３２）を有するグループ１〜４は完全なＰＢＣを含むことが示される。これらの化合物を再グループ化し、該試験の化合物の部分を使用して第３の試験を実行した。結果は次のとおりである：
【００４４】
【表６】
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【００４５】
上記の試験から、再グループ化合物は抗細菌活性を喪失させることが示される。これらの化合物をまた再グループ化して第４の試験を実施した。結果は次のとおりである：
【００４６】
【表７】
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【００４７】
上記の試験から、８つの化合物（１７〜２０、２５〜２８）を有する再グループ３の化合物は、抗細菌活性を含むことを示し、これらの化合物を再グループ化し、そして第５の試験を実施した。結果は次のとおりである：
【００４８】
【表８】
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【００４９】
ＬＣ−ＭＳ−ＭＳによるこれら４つの化合物の分析は、化合物１８及び２７の商業的入手可能性を示し、これらの化合物１７、２８は精製又は合成により得られる。
【００５０】
大腸菌感染症の患者は、安定剤との割合によって化合物１７、１８、２７、２８の混合物を用いて治療することができる。
【００５１】
同定されたＰＢＣはＦＤＡによって要求されるこれらの臨床試験を受けていないが、それらは動物モデル及び／又は微生物研究における適用において有効であることが示される。米国では、それらは医療用途で販売されない限り、ＦＤＡの承認なしにヒトに適用できる栄養補助食品である。
【００５２】
本発明により同定されたＰＢＣは、ＴＣＭの全ての特徴（低コスト、複数の相乗的化合物、短い開発期間）を有し、そのことはそれらの欠点（品質及び量的制御の欠如）の一部を克服する。本発明によって発見されたＰＢＣは、「第３の選択肢」であり得る。以下の表９は、これらの西洋医薬、ＴＣＭ、及び「第３の選択肢」の比較を示す。
【００５３】
【表９】
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【００５４】
西洋医薬の研究及び開発の費用は非常に高いため、患者は薬を利用するのに非常に高い費用を支払うことになる。新しい抗がん剤の一ヶ月の費用は数千米ドルになる可能性がある。アメリカのような裕福な国でさえ、多くの人はそれを買う余裕がなく、他の裕福でない人は言うまでもない。本発明によるＰＢＣの研究及び開発の費用は大幅に削減されるので、それらを摂取する患者の費用も同様であろう。高額な費用のために薬を服用する余裕がない患者にとっては、「第３の選択肢」が「第１の選択肢」又は「唯一の選択肢」となりうる。
【００５５】
上記の実施形態は本発明のいくつかの実施例であり、それらは本発明の適用を限定することを意図するものではない。本発明の思想及び原理と一致するようになされたいかなる修正、置換及び改良も本発明に含まれる。
【図１】
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