(57)【要約】【課題】標的核酸を高精度に検出することができる核酸検出方法の提供。【解決手段】標的核酸を含む核酸試料を、所定の核酸配列及び人工核酸配列と、標識分子とを有し、基体上に配された標的核酸検出用プローブに付与する標的核酸試料付与工程と、前記所定の核酸配列及び人工核酸配列が前記標的核酸と完全相補な二本鎖を形成可能な場合に形成される、前記所定の核酸配列及び人工核酸配列と前記標的核酸とによる完全相補な二本鎖に対し、前記完全相補な二本鎖を特異的に認識し、前記二本鎖におけるＤＮＡ鎖を分解する核酸分解酵素を付与して前記完全相補な二本鎖を認識し、前記二本鎖におけるＤＮＡ鎖を分解する核酸分解工程と、前記核酸分解酵素により分解され、前記基体から自由移動可能となった前記標識分子、及び、前記基体上に配された前記標的核酸検出用プローブにおける前記標識分子、のいずれかを検出する検出工程と、を含む標的核酸検出方法である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸を含む核酸試料を、
所定の核酸配列及び人工核酸配列と、標識分子とを有し、基体上に配された標的核酸検出用プローブに付与する標的核酸試料付与工程と、
前記所定の核酸配列及び人工核酸配列が前記標的核酸と完全相補な二本鎖を形成可能な場合に形成される、前記所定の核酸配列及び人工核酸配列と前記標的核酸とによる完全相補な二本鎖に対し、
前記完全相補な二本鎖を特異的に認識し、前記二本鎖におけるＤＮＡ鎖を分解する核酸分解酵素を付与して前記完全相補な二本鎖を認識し、前記二本鎖におけるＤＮＡ鎖を分解する核酸分解工程と、
前記核酸分解酵素により分解され、前記基体から自由移動可能となった前記標識分子、及び、前記基体上に配された前記標的核酸検出用プローブにおける前記標識分子、のいずれかを検出する検出工程と、
を含むことを特徴とする標的核酸検出方法。
【請求項２】
前記核酸分解酵素が、Ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅである請求項１に記載の標的核酸検出方法。
【請求項３】
請求項１から２のいずれかに記載の核酸検出方法に用いられる標的核酸検出用プローブであって、
所定の核酸配列及び人工核酸配列と、標識分子とを有することを特徴とする標的核酸検出用プローブ。
【請求項４】
結合性分子を有する請求項３に記載の標的核酸検出用プローブ。
【請求項５】
前記標識分子が、蛍光分子である請求項３から４のいずれかに記載の標的核酸検出用プローブ。
【請求項６】
前記標識分子が、荷電分子である請求項３から４のいずれかに記載の標的核酸検出用プローブ。
【請求項７】
前記人工核酸配列が、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、及びＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）の少なくともいずれかによる配列である請求項３から６のいずれかに記載の標的核酸検出用プローブ。
【請求項８】
前記標的核酸が、ＤＮＡ及びＲＮＡの少なくともいずれかである請求項３から７のいずれかに記載の標的核酸検出用プローブ。
【請求項９】
請求項３から８のいずれかに記載の標的核酸検出用プローブを基体上に有することを特徴とする標的核酸検出用デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸検出方法、並びに、それに用いる標的核酸検出用プローブ、及び標的核酸検出用デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸（デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）の総称）は、様々な生命現象に関わっていることが知られており、特定の塩基配列を有する核酸のコピー数は生命現象を反映していると考えられている。そのため、特定の塩基配列のコピー数を定量解析することにより生体状態を把握することが試みられている。
【０００３】
例えば、試料に含まれる特定の塩基配列を有する核酸（以下、標的核酸と称することがある）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅し、検出することにより、増幅前の標的核酸のコピー数を推定するリアルタイムＰＣＲ法が広く行われている。
【０００４】
また、標的核酸の数を定量する方法としては、例えば、標的核酸と相補的な配列と検出ドメインを有するプローブとのハイブリダイゼーションを利用し、酵素不要、核酸増幅不要の標的核酸の数を定量する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、標的核酸を高精度に検出することができる核酸検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
課題を解決するための手段としての本発明の核酸検出方法は、
標的核酸を含む核酸試料を、
所定の核酸配列及び人工核酸配列と、標識分子とを有し、基体上に配された標的核酸検出用プローブに付与する標的核酸試料付与工程と、
前記所定の核酸配列及び人工核酸配列が前記標的核酸と完全相補な二本鎖を形成可能な場合に形成される、前記所定の核酸配列及び人工核酸配列と前記標的核酸とによる完全相補な二本鎖に対し、
前記完全相補な二本鎖を特異的に認識し、前記二本鎖におけるＤＮＡ鎖を分解する核酸分解酵素を付与して前記完全相補な二本鎖を認識し、前記二本鎖におけるＤＮＡ鎖を分解する核酸分解工程と、
前記核酸分解酵素により分解され、前記基体から自由移動可能となった前記標識分子、及び、前記基体上に配された前記標的核酸検出用プローブにおける前記標識分子、のいずれかを検出する検出工程と、を含む。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によると、標的核酸を高精度に検出することができる核酸検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、核酸検出用プローブの一例を示す図である。
【図２】図２は、核酸検出用プローブのその他の一例を示す図である。
【図３】図３は、核酸検出用デバイスに用いられる本発明の核酸検出用プローブの一例を示す図である。
【図４】図４は、核酸試料を付与した核酸検出用デバイスにおける核酸検出用プローブと標的核酸との関係の一例を示す図である。
【図５】図５は、核酸分解酵素を付与した核酸検出用デバイスにおける核酸検出用プローブと、標的核酸と、核酸分解酵素との関係の一例を示す図である。
【図６】図６は、核酸分解酵素により処理された核酸検出用プローブと、標的核酸との関係の一例を示す図である。
【図７】図７は、本発明の核酸検出用デバイスの一例を示す図である。
【図８】図８は、本発明の核酸検出方法により処理された、核酸検出用デバイスの一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（核酸検出方法）
本発明の核酸検出方法は、
標的核酸を含む核酸試料を、
所定の核酸配列及び人工核酸配列と、標識分子とを有し、基体上に配された標的核酸検出用プローブに付与する標的核酸試料付与工程と、
前記所定の核酸配列及び人工核酸配列が前記標的核酸と完全相補な二本鎖を形成可能な場合に形成される、前記所定の核酸配列及び人工核酸配列と前記標的核酸とによる完全相補な二本鎖に対し、
前記完全相補な二本鎖を特異的に認識し、前記二本鎖におけるＤＮＡ鎖を分解する核酸分解酵素を付与して前記完全相補な二本鎖を認識し、前記二本鎖におけるＤＮＡ鎖を分解する核酸分解工程と、
前記核酸分解酵素により分解され、前記基体から自由移動可能となった前記標識分子、及び、前記基体上に配された前記標的核酸検出用プローブにおける前記標識分子、のいずれかを検出する検出工程と、
を含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
【００１０】
本発明者らは、標的核酸を高精度に検出することができる核酸検出方法について検討したところ、以下の知見を得た。
従来のポリメラーゼ連鎖反応を用いる技術では、増幅効率のわずかな変動や差の蓄積が検出結果に大きく影響してしまうという問題がある。さらに、標的核酸がＲＮＡの場合には、ｃＤＮＡへの変換が必要となり、定量解析においてはＲＮＡからｃＤＮＡへの変換効率を正確に検討する必要があり、元の標的核酸の量を正確に検出することが難しいという問題がある。そのため、ポリメラーゼ連鎖反応を用いる技術では、標的核酸を高精度に定量できないという問題がある。
さらに、上記特許文献１の技術では、標的核酸と相補的な塩基配列を有するプローブとのハイブリダイゼーションのみを利用して標的核酸を検出しているため、非特異的なハイブリダイゼーションによる誤検出を防ぐことができないという問題がある。そのため、標的核酸を高精度に定量することができないという問題がある。
【００１１】
本発明においては、標的核酸と核酸検出用プローブとの完全相補な二本鎖を特異的に認識し、ＤＮＡ鎖を特異的に分解する核酸分解酵素を用いることにより、核酸検出用プローブと部分的に相補的な所望の標的核酸と二本鎖を形成した場合における誤検出を防止することができるため、標的核酸を高精度に検出することができる。
【００１２】
なお、本発明において、核酸は、特に説明がない限りＤＮＡ、ＲＮＡなどを意味する。
【００１３】
本発明において、標的核酸とは、解析対象とする核酸を意味する。
標的核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＰＣＲ増幅産物、人工合成した塩基配列などが挙げられる。
【００１４】
＜標的核酸試料付与工程＞
標的核酸試料付与工程は、標的核酸を含む核酸試料を、所定の核酸配列及び人工核酸配列と、標識分子とを有し、基体上に配された標的核酸検出用プローブに付与する工程であり、標的核酸試料付与手段により好適に実施される。
【００１５】
基体上に配された標的核酸検出用プローブに核酸試料を付与する手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マイクロピペッター、インクジェット装置などが挙げられる。
【００１６】
−核酸試料−
核酸試料としては、標的核酸を含むものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
核酸試料としては、標的核酸の他に、例えば、水、緩衝剤、塩、界面活性剤、標的核酸以外の核酸などを含有していてもよい。
【００１７】
−標的核酸検出用プローブ−
標的核酸検出用プローブは、所定の核酸配列及び人工核酸配列と標識分子を有している。
【００１８】
−−所定の核酸配列及び人工核酸配列−−
所定の核酸配列及び人工核酸配列は、目的とする標的核酸が有する塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸及び人工核酸のキメラ核酸からなる。
【００１９】
所定の核酸配列及び人工核酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、一本鎖ＤＮＡ配列と人工核酸配列とを有する配列などが挙げられる。
【００２０】
−−−人工核酸配列−−−
人工核酸配列としては、人工核酸からなる塩基配列である。
人工核酸とは、自然界に存在することのない、非天然の核酸であり、人工的に合成した核酸類似体である。
核酸類似体としては、例えば、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）などが挙げられる。ＢＮＡとしては、例えば、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）などが挙げられる。これらは１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００２１】
人工核酸の合成方法としては、例えば、公知の核酸の化学合成法（例えば、「化学と教育」５７巻７号第３４６頁−３４７頁：２００９年など参照）である固相合成法などが挙げられる。
【００２２】
人工核酸は、標的核酸となるＤＮＡ又はＲＮＡに対する結合親和性が高いことが知られている。また、人工核酸はヌクレアーゼ（核酸分解酵素）耐性を有する。
【００２３】
−−標識分子−−
標識分子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光分子、荷電分子、放射性分子などが挙げられる。
【００２４】
蛍光分子としては、蛍光を発することができる分子であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光色素、蛍光タンパク質、蛍光標識された核酸分子などが挙げられる。
【００２５】
蛍光色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類などが挙げられる。これらのなかでも、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類が好ましい。
蛍光色素としては、市販品を用いることができる。市販品としては、フルオレセイン（ＦＬＯ）、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＮＥＤ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＶＩＣ（登録商標）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＲＯＸ、ＰＥＴ、ＡＢＹ（登録商標）、ＪＵＮ（登録商標）、ＭＵＳＴＡＮＧ  ＰＵＲＰＬＥ（登録商標）、などが挙げられる。これらは１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２６】
蛍光タンパク質としては、例えば、ＧＦＰなどが挙げられる。
【００２７】
荷電分子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、荷電した核酸などが挙げられる。
【００２８】
放射性分子としては、特に制限はなく、分子内に放射性同位体を含有するものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、３２Ｐを取り込んだ標的配列とは非相補的な配列を有する核酸断片、３５Ｓを含有するペプチドなどが挙げられる。
【００２９】
その他の部材としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、結合性分子などが挙げられる。
【００３０】
結合性分子としては、基体と標的核酸検出用プローブに付与することが可能であり、標的核酸検出用プローブを基体に結合させることができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アビジン、ビオチンなどが挙げられる。
なお、標的核酸検出用プローブを基体に結合させる手段としては、上記の他にも、例えば、標的核酸検出用プローブと基体とをチオール基のジスルフィド結合で結合する結合法などが挙げられる。
【００３１】
＜核酸分解工程＞
核酸分解工程は、所定の核酸配列及び人工核酸配列が標的核酸と完全相補な二本鎖を形成可能な場合に形成される、所定の核酸配列及び人工核酸配列と標的核酸とによる完全相補な二本鎖に対し、完全相補な二本鎖を特異的に認識し分解する核酸分解酵素を付与して完全相補な二本鎖を認識し分解する工程である。
【００３２】
核酸分解酵素を付与する手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マイクロピペッター、インクジェット装置などが挙げられる。
【００３３】
核酸分解酵素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、二本鎖核酸特異的分解酵素などが挙げられる。
二本鎖核酸特異的分解酵素としては、カムチャッカガニの肝臓に由来する二本鎖ＤＮＡ特異的分解酵素であるＤｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ（商品名：Ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ,ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ、Ｅｖｒｏｇｅｎ社製）などが好ましい。二本鎖核酸特異的分解酵素がＤｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅであると、完全相補な二本鎖と、一塩基のミスマッチを持つ（不完全相補）二本鎖とを区別して、完全相補な二本鎖のみを分解することができる。また、一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡには作用せず、二本鎖の核酸を特異的に認識し、二本鎖におけるＤＮＡ鎖を分解することが知られている。例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡの二本鎖核酸の場合には、二本鎖が分解され、ＤＮＡ−ＲＮＡなどのハイブリッド核酸の場合には、ＤＮＡ鎖の一本鎖のみが分解される。このため、標的核酸と標的核酸検出用プローブとの間に非特異的なハイブリダイゼーションが生じてしまった場合においても、非特異的なハイブリダイゼーションを生じた二本鎖には作用せず、完全相補な二本鎖のみを検出することができる。
【００３４】
＜検出工程＞
検出工程は、核酸分解酵素により分解され、基体から自由移動可能となった標識分子、及び、基体上に配された標的核酸検出用プローブにおける標識分子、のいずれかを検出する工程であり、検出手段により好適に実施することができる。
【００３５】
核酸分解酵素により分解され、基体から自由移動可能となった標識分子を検出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、基体から自由移動可能となった標識分子を回収し、回収した標識分子を検出する方法などが挙げられる。
また、核酸分解酵素により分解され、基体上に配された標的核酸検出用プローブにおける標識分子を検出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、核酸分解工程後に基体を洗浄し、基体上に残存した標識分子を検出する方法などが挙げられる。
【００３６】
検出手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分光蛍光光度計、電位測定器、放射線測定器などが挙げられる。
【００３７】
（標的核酸検出用プローブ）
本発明の標的核酸検出用プローブは、本発明の標的核酸検出方法に用いられる標的核酸検出用プローブであって、所定の核酸配列及び人工核酸配列と、標識分子とを有し、さらに必要に応じてその他の部材を有する。
【００３８】
−所定の核酸配列及び人工核酸配列−
所定の核酸配列及び人工核酸配列としては、本発明の標的核酸検出方法に記載のものと同様のものを用いることができるため、その説明を省略する。
【００３９】
−標識分子−
標識分子としては、本発明の標的核酸検出方法に記載のものと同様のものを用いることができるため、その説明を省略する。
【００４０】
−その他の部材−
その他の部材としては、本発明の標的核酸検出方法に記載のものと同様のものを用いることができるため、その説明を省略する。
【００４１】
（標的核酸検出用デバイス）
本発明の標的核酸検出用デバイスは、本発明の標的核酸検出用プローブを基体上に有し、更に必要に応じてその他の部材を有してなる。
【００４２】
基体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガラス、シリコン、アクリル、石英、ポリカーボネート、ポリスチレンなどが挙げられる。
【００４３】
基体には、結合性分子が特異的に結合する分子を表面に有していることが好ましい。
結合性分子としては、基体と標的核酸検出用プローブに付与することが可能であり、標的核酸検出用プローブを基体に結合させることができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アビジン、ビオチンなどが挙げられる。
なお、標的核酸検出用プローブを基体に結合させる手段としては、上記の他にも、例えば、標的核酸検出用プローブと基体とをチオール基のジスルフィド結合で結合する結合法などが挙げられる。
【００４４】
その他の部材としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、検出可能な標識分子の情報、並びに標的核酸検出用デバイスが有する標的核酸と相補的な核酸配列及び人工核酸配列の情報を有するバーコード、ＱＲコード（登録商標）、メモリ、ＩＣチップ、Ｒａｄｉｏ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（以下、「ＲＦＩＤ」とも称することがある）、色分け、印刷などが挙げられる。
【００４５】
以下、本発明の標的核酸検出方法について、本発明の標的核酸検出用プローブを有する標的核酸検出用デバイスを用いた実施形態を、図面を参照して詳細に説明する。なお、以下の説明においては、標的核酸としてＲＮＡを用いた場合について説明を行う。
【００４６】
＜実施形態＞
図１から図３は、標的核酸検出用プローブの一例を示す図である。
図１に示すように、標的核酸検出用プローブ１０は、標識分子１１と、所定の核酸配列１２及び人工核酸配列１３を有する一本鎖核酸である。また、図２に示すように、標的核酸検出用プローブ１０は、標識分子１１と逆側の末端に基体１５と結合するための、結合性分子１４を有していてもよい。結合性分子１４を有しているときには、基体１５表面に結合性分子１４と特異的に結合する分子を備えていることが好ましい。
図３に示すように、基体１５上に配される標的核酸検出用プローブ１０は、結合性分子１４を介して基体１５に固定されている。基体１５には、結合性分子１４と特異的に結合する分子を予め配しておくことで、標的核酸検出用プローブ１０を配する位置を制御することができる。
【００４７】
図４から図８は、本発明の核酸検出方法の一例を示す図である。
図４は、核酸試料を付与した標的核酸検出用プローブと標的核酸との関係の一例を示す図であり、図５は、核酸分解酵素を付与した標的核酸検出用プローブと、標的核酸と、核酸分解酵素との関係の一例を示す図であり、図６は、核酸分解酵素により処理された標的核酸検出用プローブと、標的核酸との関係の一例を示す図であり、図７は、標的核酸検出用デバイスの一例を示す図であり、図８は、本発明の核酸検出方法により処理された、核酸検出用デバイスの一例を示す図である。
【００４８】
図４に示すように、標的核酸検出用デバイスに標的核酸１６を含む核酸試料を付与すると、核酸試料中の標的核酸１６と、所定の核酸配列１２及び人工核酸配列１３を有する標的核酸検出用プローブ１０が二本鎖を形成可能な場合にハイブリダイゼーションする。このように、標的核酸１６は、核酸配列１２及び人工核酸配列１３の両方に対してハイブリダイゼーションする。
次に、完全相補の二本鎖核酸を特異的に認識し、二本鎖におけるＤＮＡ鎖を分解する核酸分解酵素１７を標的核酸検出用デバイスに付与すると、図５に示すように、標的核酸１６と完全相補の二本鎖を形成している核酸配列１２を分解する。このとき、標的核酸１６はＲＮＡであるため、核酸分解酵素１７によって分解されずに残存する。また、標的核酸１６と完全相補な二本鎖を形成している人工核酸配列１３においても、核酸分解酵素１７によって分解されない。このため、図６に示すように、標的核酸１６と完全相補な二本鎖を形成する核酸配列１２のみが分解され、標識分子１１が基体１５から遊離する。このとき、人工核酸配列１３の標的核酸１６への高い親和性により標的核酸１６が基体１５上に保持される。
【００４９】
次に、核酸分解工程を行った後に、基体１５から自由移動可能となった標識分子１１、又は、基体１５上に配された標的核酸検出用プローブ１０における標識分子１１、を検出するかのいずれかの方法を用いて検出することができる。ここでは、基体１５上に配された標的核酸検出用プローブ１０における標的分子１１を検出する方法を用いた場合を示す。
図７に示すように、核酸分解工程後には、標的核酸検出用プローブ１０は標識分子１１が遊離した後も基体１５上には存在するため、そのままではどの位置の核酸検出用プローブ１０において完全相補な二本鎖を形成しているかが分からないが、基体１５表面を洗浄し、標的核酸検出用プローブ１０から遊離した標識分子１１を洗い流すことで、図８に示すように、標的核酸１６が特異的にハイブリダイゼーションした標的核酸検出用プローブ１０のスポット１７が消色するため、このスポット１７の数を計数することにより、核酸試料中の標的核酸の量を定量することができる。
【００５０】
なお、本発明における核酸検出方法では、人工核酸を有する標的核酸検出用プローブを用いているため、一度ハイブリダイゼーションした標的核酸を核酸分解工程後にも保持し続けるため、同じ標的核酸がデバイス上の他の標的核酸検出用プローブに再度ハイブリダイゼーションし重複して検出することを防ぐことができる。そのため、精度の高い定量解析を行うことができる。
【００５１】
さらに、本発明の核酸検出方法では、完全相補の二本鎖核酸を特異的に認識して分解する二本鎖核酸分解酵素を用いるため、標的核酸検出用プローブと相補的でない標的核酸による非特異的なハイブリダイゼーションが生じてしまった場合には標的核酸検出用プローブが分解されないため、標的核酸を特異的に検出することができ、標的核酸を高精度に検出することができる。
【００５２】
本発明の態様としては、例えば、以下のとおりである。
＜１＞  標的核酸を含む核酸試料を、
所定の核酸配列及び人工核酸配列と、標識分子とを有し、基体上に配された標的核酸検出用プローブに付与する標的核酸試料付与工程と、
前記所定の核酸配列及び人工核酸配列が前記標的核酸と完全相補な二本鎖を形成可能な場合に形成される、前記所定の核酸配列及び人工核酸配列と前記標的核酸とによる完全相補な二本鎖に対し、
前記完全相補な二本鎖を特異的に認識し、前記二本鎖におけるＤＮＡ鎖を分解する核酸分解酵素を付与して前記完全相補な二本鎖を認識し、前記二本鎖におけるＤＮＡ鎖を分解する核酸分解工程と、
前記核酸分解酵素により分解され、前記基体から自由移動可能となった前記標識分子、及び、前記基体上に配された前記標的核酸検出用プローブにおける前記標識分子、のいずれかを検出する検出工程と、
を含むことを特徴とする標的核酸検出方法である。
＜２＞  前記核酸分解酵素が、Ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅである前記＜１＞に記載の標的核酸検出方法である。
＜３＞  前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の核酸検出方法に用いられる標的核酸検出用プローブであって、
所定の核酸配列及び人工核酸配列と、標識分子とを有することを特徴とする標的核酸検出用プローブである。
＜４＞  結合性分子を有する前記＜３＞に記載の標的核酸検出用プローブである。
＜５＞  前記標識分子が、蛍光分子である前記＜３＞から＜４＞のいずれかに記載の標的核酸検出用プローブである。
＜６＞  前記標識分子が、荷電分子である前記＜３＞から＜４＞のいずれかに記載の標的核酸検出用プローブである。
＜７＞  前記人工核酸配列が、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、及びＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）の少なくともいずれかによる配列である前記＜３＞から＜６＞のいずれかに記載の標的核酸検出用プローブである。
＜８＞  前記標的核酸が、ＤＮＡ及びＲＮＡの少なくともいずれかである前記＜３＞から＜７＞のいずれかに記載の標的核酸検出用プローブである。
＜９＞  前記＜３＞から＜８＞のいずれかに記載の標的核酸検出用プローブを基体上に有することを特徴とする標的核酸検出用デバイスである。
【００５３】
前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の標的核酸検出方法、前記＜３＞から＜８＞のいずれかに記載の標的核酸検出用プローブ、前記＜９＞に記載の標的核酸検出用デバイスによると、従来における前記諸問題、即ち、非特異的なハイブリダイゼーションによる誤検出を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。
【符号の説明】
【００５４】
１０            標的核酸検出用プローブ
１１            標識分子
１２            核酸配列
１３            人工核酸配列
１４            結合性分子
１５            基体
１６            標的核酸
１７            核酸分解酵素
【先行技術文献】
【特許文献】
【００５５】
【特許文献１】特表２０１７−５３５２６９号公報
【図１】
2019154396.tif 000003
【図２】
2019154396.tif 000004
【図３】
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【図４】
2019154396.tif 000006
【図５】
2019154396.tif 000007
【図６】
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【図７】
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【図８】
2019154396.tif 000010