(57)【要約】【課題】膵島移植後に膵島の移植片生存率を増大させる、膵島の生存をエキソビボで維持する、および血中グルコースレベルを正常化するために必要とされる移植される膵島の数を減少させる方法を提供すること。【解決手段】膵島移植を行う場合、膵島と幹細胞とをプレインキュベートするか、または膵島および幹細胞を互いに接触させて移植することによって、移植した膵島の移植片生存率を有意に改善し、血中グルコースレベルを正常化するために必要とされる移植される膵島の数を減少させることは、可能である。本発明はまた、膵島および幹細胞または幹細胞培養膵島からの馴化培地を含む膵島移植のための組成物を提供する。従って、上記組成物および方法は、糖尿病を処置するために有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、膵島移植後の膵島の移植片生存率を増大させる、膵島の生存をエキソビボで維持する、および血中グルコースレベルを正常化するために必要とされる移植される膵島の数を減少させる方法を提供する。膵島移植を行う場合、膵島と幹細胞とをプレインキュベートするか、または膵島および幹細胞を互いに接触させて移植することによって、移植される膵島の移植片生存率を有意に改善し、血中グルコースレベルを正常化するために必要とされる移植される膵島の数を減少させることは、可能である。本発明はまた、上記膵島および上記幹細胞または幹細胞培養膵島からの馴化培地を含む膵島移植のための組成物を提供する。従って、上記組成物および方法は、糖尿病を処置するために有用である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
今日まで、インスリン療法は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の処置のゴールドスタンダードと考えられている。にも拘わらず、制限は残っている（例えば、低血糖症ならびに慢性的な細小血管合併症および大血管合併症の頻繁なエピソード［Ｄｏｗｎｓ  ＣＡ，ら  （２０１５）  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６：  ５５４−５６５；Ｃａｍｐｂｅｌｌ
ＭＤ，ら  （２０１５）  ＢＭＪ  Ｏｐｅｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ  Ｃａｒｅ  ３：  ｅ００００８５］）。膵島移植は、Ｔ１Ｄ患者にとっての代替処置を提供する。欠点としては、死体の供給が制限されていること、数名のドナーが１回の移植に必要であること、および移植不全が挙げられる［Ｄａｏｕｄ  Ｊ，ら  （２０１０）  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １９：  １５２３−１５３５］。
【０００３】
移植後の膵島生存率を増大させようとする試みにおいて、膵島を、骨髄由来間葉性幹細胞（ＭＳＣ）と混合した（Ｒａｃｋｈａｍら，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，  （２０１１）  ５４：１１２７−１１３５）、（Ｂｏｒｇら，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  （２０１４）  ５７：５２２−５３１）、（Ｓｏｌａｒｉら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，  ３２  （２００９），  １１６−１２４）。しかし、長い集団倍加時間、早期老化、インビトロ拡大増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）の間のＤＮＡ損傷、および移植後の不十分な生着は、ＭＳＣ治療の欠点である［Ｗｅｉ  Ｘ，ら，  （２０１３）  Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｉｎ  ３４：  ７４７−７５４］。さらに、長期培養拡大増殖に伴って、ＭＳＣは、核型として異常になり得、これは、腫瘍形成のリスクを引き起こし得る。脂肪由来幹細胞がまた、適用されている（米国特許第９，０８９，５５０号）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第９０８９５５０号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｄｏｗｎｓ  ＣＡ，ら  （２０１５）  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６：  ５５４−５６５
【非特許文献２】Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＭＤ，ら  （２０１５）  ＢＭＪ  Ｏｐｅｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ  Ｃａｒｅ  ３：  ｅ００００８５
【非特許文献３】Ｄａｏｕｄ  Ｊ，ら  （２０１０）  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １９：  １５２３−１５３５
【非特許文献４】Ｒａｃｋｈａｍら，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，  （２０１１）  ５４：１１２７−１１３５
【非特許文献５】Ｂｏｒｇら，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  （２０１４）  ５７：５２２−５３１
【非特許文献６】Ｓｏｌａｒｉら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，  ３２  （２００９），  １１６−１２４
【非特許文献７】Ｗｅｉ  Ｘ，ら，  （２０１３）  Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｉｎ  ３４：  ７４７−７５４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明者らは、同系限界量膵島移植モデル（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｍａｓｓ  ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ）において別個のペレットまたは複合物ペレット（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｐｅｌｌｅｔ）として、未分化ヒト非内皮骨髄由来複能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）と哺乳動物膵島との共移植の治療効能を評価した。
【０００７】
本発明者らは、ヒトＭＡＰＣ（これは、免疫特権がなく、移植後に血管新生性増殖因子を分泌し得る）の共移植が膵島生着および生存性を改善し得る可能性を考慮した。膵島を、別個のペレットまたは複合物ペレットとして、ヒトＭＡＰＣありまたはなしで共移植した。実施例では、これを、同系アロキサン誘導性糖尿病Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腎被膜下に移植することによって行った。複合物ペレットとしての膵島−ヒトＭＡＰＣ共移植は、初期血糖コントロール、糖尿病改善率（ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｒａｔｅ）、耐糖能、および血清Ｃペプチド濃度によって測定される場合に、膵島のみの移植と比較して、膵島移植の転帰を有意に改善した。組織学上は、より高い血管／膵島比に加えて、より高い血管面積および密度を、膵島−ヒトＭＡＰＣ複合物のレシピエントにおいて検出した。
【０００８】
結論は、膵島とＭＡＰＣとの共移植が膵島移植片血管再生を増強し得、膵島移植片機能を改善し得ることであった。
【０００９】
よって、本発明は、移植後の膵島の移植片生存率を高めるための、被験体から単離された膵島を長期間培養するための、および血中グルコースレベルを正常化するために必要とされる移植される膵島の数を減少させるための、組成物および方法を提供する。
【００１０】
本明細書中の全ての組成物および方法において、幹細胞および／または膵島は、ヒトに由来し得る。
【００１１】
本発明は、幹細胞および膵島を含む膵島移植のための組成物を包含する。
【００１２】
本発明は、幹細胞を含む第１の細胞調製物および膵島を含む第２の細胞調製物を含む、膵島移植のためのキットを包含する。
【００１３】
本発明は、幹細胞および膵島を含む複合物ペレットを包含する。
【００１４】
本発明は、細胞培養培地中に幹細胞および膵島を含む組成物を包含する。
【００１５】
本発明は、膵島および幹細胞を含むバイオ医薬組成物（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を包含する。
【００１６】
本発明は、幹細胞が膵島に接着している複合物を包含する。
【００１７】
本発明は、膵島が幹細胞で被覆されている複合物を包含する。
【００１８】
本発明は、移植のために膵島を改善するための方法を包含し、上記方法は、膵島と幹細胞とを接触させる工程を包含する。上記方法は、幹細胞の存在下で膵島をエキソビボ培養する工程であり得る。上記方法はまた、膵島および幹細胞をインビボで（共移植におけるように）接触させる工程を包含し得る。エキソビボ方法では、上記細胞は、単に混合され得る（すなわち、一緒に培養される必要はない）。
【００１９】
本発明は、膵島生存能をエキソビボで改善するための方法を包含し、上記方法は、膵島と幹細胞とを接触させる工程を包含する。
【００２０】
上記膵島は、培養され拡大増殖された膵島細胞調製物であり得る。
【００２１】
上記膵島および幹細胞は、培養培地中で接触され得、そして所望の期間にわたって一緒に培養され得る。
【００２２】
上記膵島および幹細胞は、移植前に接触され得る。
【００２３】
本発明は、被験体への膵島投与の前に、膵島と幹細胞とをエキソビボで接触させることによって、膵島移植片生存性をインビボで改善するための方法を包含する。
【００２４】
本発明は、幹細胞および膵島を被験体に共投与することによって、膵島移植片生存性をインビボで改善するための方法を包含する。
【００２５】
具体的な例示される実施形態において、膵島  対  幹細胞の比は、５００：２５０，０００である。
【００２６】
本発明は、膵島および幹細胞のプレインキュベーションありまたはなしで、糖尿病の処置の必要性のある患者への膵島および幹細胞の同時投与を含む、膵島移植法を包含する。
【００２７】
本発明は、糖尿病を処置するための治療法を包含し、上記方法は、処置の必要性のある患者への上記複合物の投与を包含する。
【００２８】
本発明は、上記複合物を生成するための方法を包含し、上記方法は、上記幹細胞および上記膵島を共培養する工程を包含する。上記複合物はまた、接触を提供する物理的方法（例えば、上記膵島および幹細胞の遠心分離、被包化など）によって形成され得る。
【００２９】
本発明は、膵島の生存性を維持するための方法を包含し、上記方法は、幹細胞および膵島を共培養する工程を包含する。
【００３０】
本発明は、糖尿病の治療法を包含し、上記方法は、工程（Ａ）および工程（Ｂ）を包含する：
（Ａ）膵島および幹細胞を共培養して、上記膵島および上記幹細胞の複合物を形成する工程；ならびに
（Ｂ）上記複合物を、糖尿病の処置の必要性のある患者に投与する工程。
【００３１】
本発明は、膵島および幹細胞を含む非薬学的組成物を包含する。
【００３２】
本発明は、上記組成物が薬学的に受容可能な組成物である組成物を包含する。
【００３３】
本発明は、薬学的に受容可能なキャリアと混合された、膵島および幹細胞を含む組成物を包含する。
【００３４】
本発明は、幹細胞および膵島を混合することによって、組成物を作製するための方法を包含する。
【００３５】
本発明は、上記膵島が幹細胞とインビトロでプレインキュベートされている組成物を包含する。
【００３６】
全ての組成物および方法において、膵島は、膵臓β細胞によって置き換えられ得る。
【００３７】
上記幹細胞は、分泌される因子によって膵島に対して有益な効果を提供し得ることから、上記膵島は、上記幹細胞を培養することによって馴化されている培地とプレインキュベートされ得るかまたは上記培地とともに投与され得る。この培地は、よって、無細胞である。
【００３８】
本発明を用いると、幹細胞および膵島を混合し共移植することによって、または膵島移植のために幹細胞および膵島の複合物を使用することによって、膵島の移植片生存率は、改善され得る。結果として、移植に必要とされる膵島の量、移植の数を減少させ、膵島移植を通じて糖尿病を効果的に処置することは、可能である。
【００３９】
本発明は、移植に必要とされる膵島の数を減少させることを可能にする；従って、単一のドナーから得られる膵島が、複数のレシピエントに移植され得る。このことは、膵島のドナー不足を改善し、膵島移植を一般医療へと拡げるための革新的技術を提供する。
【００４０】
本発明は、幹細胞と膵島とを共培養することによって、膵島の生存を維持することを可能にする（すなわち、膵島の生存能を増大させる）。これらの膵島は、生きている身体から単離され得る。これは、膵島を、長期間にわたって膵島移植の準備ができている状態で貯蔵することを可能にする；そうすると、単一のドナーから単離される膵島が、より適切なレシピエントへと移植され得る。
【００４１】
さらに、膵島は、インスリンを分泌するそれらの能力を保持しながらインビトロで安定して培養され得ることから、膵島移植を行う前に免疫抑制剤をレシピエントに投与することは可能である。しかし、本発明の細胞は、免疫調節性であり得、免疫原性ではない可能性があるので、一実施形態において、膵島は、幹細胞自体以外には、免疫抑制剤なしで投与され得る。
【００４２】
細胞としては、胚性幹細胞ではなく、生殖細胞ではない、胚性幹細胞のいくつかの特徴を有するが、非胚性組織に由来し、そして本願に記載される効果を提供する細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記細胞は、これらの効果を自然に達成し得る（すなわち、遺伝的にまたは薬学的に改変されない）。しかし、天然の発現因子（ｎａｔｕｒａｌ
ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ）は、効力を増大させるために、遺伝的にまたは薬学的に改変され得る。一実施形態において、幹細胞は、ＨＬＡがマッチしていない、同種異系細胞であり得る。
【００４３】
上記細胞は、多能性マーカー（例えば、ｏｃｔ４）を発現し得る。それらはまた、拡大した複製能力と関連するマーカー（例えば、テロメラーゼ）を発現し得る。多能性の他の特徴は、１より多くの胚葉（例えば、外胚葉の、内胚葉の、および中胚葉の胚性胚葉（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｌａｙｅｒ）のうちの２つまたは３つ）の細胞型へと分化する能力を含み得る。上記細胞は、形質転換されることも腫瘍形成性であることもなしに、高度に拡大増殖され得、正常な核型をも維持し得る。一実施形態において、非胚性幹、非生殖細胞（ｎｏｎ−ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ，  ｎｏｎ−ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ）は、培養で所望の回数の細胞倍加を受けていてもよい。例えば、非胚性幹、非生殖細胞は、培養で少なくとも１０〜４０回の細胞倍加を受けていてもよい（例えば、３０〜３５回の細胞倍加）。ここで上記細胞は、形質転換されず、正常な核型を有する。上記細胞は、内胚葉の、外胚葉の、および中胚葉の胚系統のうちの２種の各々の少なくとも１種の細胞型へと分化し得、全３種への分化を含み得る。さらに、上記細胞は、腫瘍形成性ではない可能性がある（例えば、奇形腫を生じない）。細胞が形質転換されるかまたは腫瘍形成性であり、そして注入のために細胞を使用することが望ましい場合、このような細胞は、腫瘍への細胞増殖を防止する処置によるとおり、インビボで腫瘍を形成できないように無能力にされ得る。このような処置は、当該分野で周知である。
【００４４】
細胞としては、以下の番号付けした実施形態が挙げられるが、これらに限定されない：
【００４５】
１．単離され、拡大増殖された非胚性幹、非生殖細胞であって、上記細胞は、培養で少なくとも１０〜４０回の細胞倍加を受けており、ここで上記細胞はｏｃｔ４を発現し、形質転換されず、正常な核型を有する細胞。
【００４６】
２．テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、またはｓｏｘ−２のうちの１もしくはこれより多くをさらに発現する、上記１の非胚性幹、非生殖細胞。
【００４７】
３．内胚葉の、外胚葉の、および中胚葉の胚系統のうちの少なくとも２種のうちの少なくとも１種の細胞型へと分化し得る、上記１の非胚性幹、非生殖細胞。
【００４８】
４．テロメラーゼ、ｒｏｘ−１、またはｓｏｘ−２のうちの１もしくはこれより多くをさらに発現する、上記３の非胚性幹、非生殖細胞。
【００４９】
５．内胚葉の、外胚葉の、および中胚葉の胚系統のうちの各々の少なくとも１種の細胞型へと分化し得る、上記３の非胚性幹、非生殖細胞。
【００５０】
６．テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、またはｓｏｘ−２のうちの１もしくはこれより多くをさらに発現する、上記５の非胚性幹、非生殖細胞。
【００５１】
７．非胚性、非生殖組織の培養によって得られる、単離され拡大増殖された非胚性幹、非生殖細胞であって、上記細胞は、培養で少なくとも４０回の細胞倍加を受けており、ここで上記細胞は、形質転換されず、正常な核型を有する細胞。
【００５２】
８．ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、またはｓｏｘ−２のうちの１もしくはこれより多くを発現する、上記７の非胚性幹、非生殖細胞。
【００５３】
９．内胚葉の、外胚葉の、および中胚葉の胚系統のうちの少なくとも２種のうちの少なくとも１種の細胞型へと分化し得る、上記７の非胚性幹、非生殖細胞。
【００５４】
１０．ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、またはｓｏｘ−２のうちの１種もしくはこれより多くを発現する、上記９の非胚性幹、非生殖細胞。
【００５５】
１１．内胚葉の、外胚葉の、および中胚葉の胚系統のうちの各々の少なくとも１種の細胞型へと分化し得る、上記９の非胚性幹、非生殖細胞。
【００５６】
１２．ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、またはｓｏｘ−２のうちの１種もしくはこれより多くを発現する、上記１１の非胚性幹、非生殖細胞。
【００５７】
１３．単離され拡大増殖された非胚性幹、非生殖細胞であって、上記細胞は、培養で少なくとも１０〜４０回の細胞倍加を受けており、ここで上記細胞は、テロメラーゼを発現し、形質転換されず、そして正常な核型を有する細胞。
【００５８】
１４．ｏｃｔ４、ｒｅｘ−１、またはｓｏｘ−２のうちの１種もしくはこれより多くをさらに発現する、上記１３の非胚性幹、非生殖細胞。
【００５９】
１５．内胚葉の、外胚葉の、および中胚葉の胚系統のうちの少なくとも２種のうちの少なくとも１種の細胞型へと分化し得る、上記１３の非胚性幹、非生殖細胞。
【００６０】
１６．ｏｃｔ４、ｒｅｘ−１、またはｓｏｘ−２のうちの１種もしくはこれより多くをさらに発現する、上記１５の非胚性幹、非生殖細胞。
【００６１】
１７．内胚葉の、外胚葉の、および中胚葉の胚系統の各々のうちの少なくとも１種の細胞型へと分化し得る、上記１５の非胚性幹、非生殖細胞。
【００６２】
１８．ｏｃｔ４、ｒｅｘ−１、またはｓｏｘ−２のうちの１種もしくはこれより多くをさらに発現する、上記１７に記載の非胚性幹、非生殖細胞。
【００６３】
１９．内胚葉の、外胚葉の、および中胚葉の胚系統のうちの少なくとも２種のうちの少なくとも１種の細胞型へと分化し得る単離され拡大増殖された非胚性幹、非生殖細胞であって、上記細胞は、培養で少なくとも１０〜４０回の細胞倍加を受けている細胞。
【００６４】
２０．ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、またはｓｏｘ−２のうちの１種もしくはこれより多くを発現する、上記１９の非胚性幹、非生殖細胞。
【００６５】
２１．内胚葉の、外胚葉の、および中胚葉の胚系統の各々のうちの少なくとも１種の細胞型へと分化し得る、上記１９の非胚性幹、非生殖細胞。
【００６６】
２２．ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、またはｓｏｘ−２のうちの１種もしくはこれより多くを発現する、上記２１の非胚性幹、非生殖細胞。
【００６７】
本願の具体例の中で示される細胞のさらなる機能としては、血管新生の潜在能力およびある特定の血管新生タンパク質（ＶＥＧＦ、Ａ、Ｃ、およびＤ、ＰＩＧＦ、ｓＦｌｔ−１、ｂＦＧＦ、およびＩＬ８のうちの１種もしくはこれより多くが挙げられるが、これらに限定されない）を分泌する能力が挙げられる。
【００６８】
上記細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４５、ｇｌｙＡ、ＣＤ３４の発現を欠く。
【００６９】
一実施形態において、馴化培地は、幹細胞の代わりに使用される。
【００７０】
幹細胞は、分泌される分子によって本明細書で記載される効果を提供し得るので、幹細胞の投与に関して本明細書で記載される種々の実施形態は、上記分泌される分子（例えば、馴化培養培地中にあり得る）のうちの１種もしくはこれより多くの投与によって行われ得る。
【００７１】
上記細胞は、本明細書で記載される単離および培養条件によって調製され得る。具体的実施形態において、それらは、より高い血清と組み合わせた低酸素濃度を要する本明細書で記載される培養条件によって調製される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
幹細胞および膵島を含む組成物であって、ここで該幹細胞は、非胚性、非生殖性であり、テロメラーゼを発現し、腫瘍形成性ではなく、培養において４０回を超える倍加を受け得る、組成物。
（項目２）
培養培地中の、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記幹細胞および膵島は、薬学的に受容可能なキャリアと混合される、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記幹細胞および膵島は、複合物ペレットで存在し、該複合物ペレットにおいて、該膵島細胞および幹細胞は直接物理的に接触した状態にある、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記幹細胞は、前記膵島に接着するおよび／または前記膵島を被覆する、項目４に記載の複合物ペレット。
（項目６）
前記膵島および／または前記幹細胞は、培養において拡大増殖されている、項目１に記載の組成物。
（項目７）
幹細胞  対  膵島の比は、約２５００：１である、項目１に記載の組成物。
（項目８）
幹細胞の量および膵島の量は、糖尿病を有する被験体に投与される場合、該被験体における血中グルコースレベルを改善するために十分である、項目１に記載の組成物。
（項目９）
膵島および幹細胞を混合する工程を包含する、項目１に記載の組成物を作製するための方法。
（項目１０）
前記膵島および幹細胞は、複合物ペレットを形成する、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ペレットは、遠心分離によって形成される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ペレットは、共培養によって形成される、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
エキソビボでの膵島生存能を改善するための方法であって、該方法は、被験体への移植前に、膵島と幹細胞とを接触させる工程を包含し、ここで該幹細胞は、非胚性、非生殖性であり、テロメラーゼを発現し、腫瘍形成性ではなく、そして培養において４０回を超える倍加を受け得る、方法。
（項目１４）
前記幹細胞および膵島は、共被包化される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記膵島および幹細胞を、エキソビボで接触させる、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記エキソビボでの接触は、細胞培養においてである、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記膵島および／または前記幹細胞は、インビボで拡大増殖されている、項目１３に記載の方法。
（項目１８）
前記膵島および幹細胞を接触させて複合物ペレットを形成させる、項目１３に記載の方法。
（項目１９）
膵島および幹細胞を培養において一緒に播種する工程を包含する、項目１８に記載の複合物ペレットを作製するための方法。
（項目２０）
糖尿病を処置するための幹細胞および膵島組成物の使用であって、ここで該幹細胞は、非胚性、非生殖性であり、テロメラーゼを発現し、腫瘍形成性ではなく、そして培養において４０回を超える倍加を受け得る、使用。
【００７２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、よって変動し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを記載する目的のものであり、開示される発明の範囲（これは、特許請求の範囲によってのみ規定される）を限定することは意図しない。
【００７３】
上記節の標題は、本明細書において構成上の目的のみで使用され、記載される主題を限定する様式とは如何様にも解釈されない。
【００７４】
本願の方法および技術は、別段示されなければ、当該分野で周知の従来の方法、および本明細書全体を通じて引用されかつ考察される種々の一般的およびより具体的な参考文献に記載されるような従来の方法に従って一般に行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、ならびにＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照のこと。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１Ａ〜１Ｃ：ヒトＭＡＰＣの特徴付け。（Ａ）ヒト骨髄由来ＭＡＰＣの細胞表面マーカー発現。フローサイトメトリーヒストグラムは、陰性アイソタイプコントロール（影を付けた薄い灰色のピーク）と比較して、ヒトＭＡＰＣの特徴付けと関連する選択されたマーカー［ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ１０５］の発現レベル（影を付けた濃い灰色のピーク）を示す。（Ｂ）ヒトＭＡＰＣの培養培地を、炎症促進性パネル、サイトカインパネル、ケモカインパネル、血管新生パネルおよび血管炎症パネルを含むヒトバイオマーカー４０−Ｐｌｅｘキットで分析した。（Ｃ）漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイにおけるヒトＭＡＰＣの血管新生促進性特性（陰性コントロールとしてＢＳＡ、および陽性コントロールとしてＶＥＧＦ−Ａ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３〜９／群））。＊＊、Ｐ＜０．０１。
【００７６】
【図２】図２Ａ〜２Ｄ：  ヒトＭＡＰＣと共移植した限界膵島量（ｍａｒｇｉｎａｌ  ｉｓｌｅｔ  ｍａｓｓ）のインビボ機能。（Ａ）１５０個の膵島のみを移植した（コントロール；白いバー）または２５０，０００個のヒトＭＡＰＣとともに別個のペレット（ＳＥＰ、濃い灰色のバー）もしくは複合物ペレット（ＭＩＸ、薄い灰色のバー）として共移植した１５０個の膵島を移植したアロキサン誘導性糖尿病Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血中グルコース測定値。膵島のみの群（コントロール）に対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｂ）膵島移植後の治癒した（黒いバー）および治癒していない（灰色のバー）マウスのパーセンテージ。（Ｃ、Ｄ）移植の２週間後（Ｃ）および５週間後（Ｄ）での全てのマウスにおけるＩＰＧＴＴの曲線下面積（ＡＵＣ）および血中グルコース測定値。膵島のみの群（コントロール）に対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【００７７】
【図３ＡＢ】図３Ａ〜３Ｃ：  ヒトＭＡＰＣとともに共移植した膵島の移植の２週間後および５週間後の形態および組成。（Ａ）単離された膵島移植片におけるマウスインスリン、グルカゴン、およびソマトスタチンのｍＲＮＡレベルの箱ひげ図。データは、ハウスキーピング遺伝子と比較した、相対値として表される。統計分析を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｔ検定を使用して計算した。＊ｐ＜０．０５。（Ｂ）限界膵島量を単独でまたは別個のペレットもしくは複合物ペレットとしてヒトＭＡＰＣと組み合わせて移植したマウスに由来する移植片のβ細胞、α細胞およびδ細胞の容積の箱ひげ図。統計分析を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｔ検定を使用して計算した。（Ｃ）別個のペレット（ＳＥＰ）または複合ペレット（ＭＩＸ）として膵島−ヒトＭＡＰＣから構成される、または膵島のみ（コントロール）から構成される、移植の２週間後の膵島移植片中のマウスインスリン陽性細胞（白）、グルカゴン陽性細胞（赤）、およびソマトスタチン陽性細胞（緑）の分布。画像は、２〜６匹の異なる動物に由来する切片の代表である。スケールバーは、１００μｍである。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃ：  ヒトＭＡＰＣとともに共移植した膵島の移植の２週間後および５週間後の形態および組成。（Ａ）単離された膵島移植片におけるマウスインスリン、グルカゴン、およびソマトスタチンのｍＲＮＡレベルの箱ひげ図。データは、ハウスキーピング遺伝子と比較した、相対値として表される。統計分析を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｔ検定を使用して計算した。＊ｐ＜０．０５。（Ｂ）限界膵島量を単独でまたは別個のペレットもしくは複合物ペレットとしてヒトＭＡＰＣと組み合わせて移植したマウスに由来する移植片のβ細胞、α細胞およびδ細胞の容積の箱ひげ図。統計分析を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｔ検定を使用して計算した。（Ｃ）別個のペレット（ＳＥＰ）または複合ペレット（ＭＩＸ）として膵島−ヒトＭＡＰＣから構成される、または膵島のみ（コントロール）から構成される、移植の２週間後の膵島移植片中のマウスインスリン陽性細胞（白）、グルカゴン陽性細胞（赤）、およびソマトスタチン陽性細胞（緑）の分布。画像は、２〜６匹の異なる動物に由来する切片の代表である。スケールバーは、１００μｍである。
【００７８】
【図４】図４Ａ〜４Ｂ：複合物が限界膵島量糖尿病マウスモデルにおける移植片血管再生を促進する場合の、膵島とヒトＭＡＰＣとの共移植。（Ａ）単独で移植したマウス膵島または別個のペレット（ＳＥＰ）または複合物ペレット（ＭＩＸ）としてヒトＭＡＰＣとともに移植したマウス膵島からなる５週間の移植片の代表的切片。画像は、各移植群における３〜４匹の動物に関するインスリンおよびエンドムチン（血管）染色の代表である。スケールバーは、１００μｍである。（Ｂ）血管形態パラメーター評価を、材料および方法の節において記載されるように決定した。データは、平均±ＳＥＭである。統計分析は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｔ検定を使用して計算した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【００７９】
【図５】図５Ａ〜５Ｂ：移植レシピエントの非絶食時の血糖（Ｎｏｎ−ｆａｓｔｉｎｇ  ｇｌｙｃｅｍｉａ）および体重。（Ａ）血中グルコース濃度を、１５０個の同系膵島を、単独で移植したかまたは２５０，０００個のヒトＭＡＰＣとともに共移植したかのいずれかであるアロキサン誘導性糖尿病Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて５週間にわたってモニターした。移植の５週間後に各群の無作為に選択した動物において行った回復腎摘出術（ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｎｅｐｈｒｅｃｔｏｍｙ）は、高血糖症への１００％再発を生じた。（Ｂ）体重変化は、研究の期間の間中、種々の群間で有意に異ならなかった。各値は、平均±ＳＥＭを表す。
【００８０】
【図６】図６Ａ〜６Ｂ：移植の２週間後（Ａ）および５週間後（Ｂ）の血清インスリンおよびＣペプチド濃度。マウスに、１５０個の膵島のみ（白いバー）を、または１５０個の膵島と一緒にヒトＭＡＰＣを別個のペレット（ＳＥＰ、濃い灰色のバー）または複合物ペレット（ＭＩＸ、薄い灰色のバー）として移植した。膵島のみの群（コントロール）に対して＊＊ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
（発明の詳細な説明）
（定義）
「１つの、ある（ａ）」または「１つの、ある（ａｎ）」とは、本明細書において１つのまたは１つより多いこと；少なくとも１つを意味する。複数形が本明細書において使用される場合、それは、一般に、単数形を含む。
【００８２】
「細胞バンク」は、将来使用するために、成長させられ、貯蔵された細胞の産業的名称である。細胞は、アリコートに分けて貯蔵され得る。細胞は、貯蔵から外れて直接使用され得るか、または貯蔵後に拡大増殖され得る。これは、投与のために利用可能な細胞の「在庫がある」ので便利である。上記細胞は、直接投与してよいか、またはそれが貯蔵から放出された場合に適切な賦形剤と混合され得るように、薬学的に受容可能な賦形剤中で既に貯蔵されていてもよい。細胞は、凍結されてもよいし、生存能を保護する形態で、別の方法で貯蔵されてもよい。本発明の一実施形態において、細胞バンクが作られ、ここで上記細胞は、本願で記載される効果を達成するために増強された効力について選択されている。貯蔵から放出された後および投与の前に、上記細胞を効力について再びアッセイすることは好ましいことであり得る。このことは、本明細書で記載されるか、別の方法で、当該分野で公知の上記アッセイのうちのいずれかを使用して直接的または間接的に行われ得る。次いで、所望の効力を有する細胞は、投与され得る。バンクは、自己由来細胞（器官ドナーまたはレシピエントに由来する）を使用して作製され得る。あるいはバンクは、同種異系使用のための細胞を含み得る。
【００８３】
本発明に関して「共投与する」とは、２種もしくはこれより多くの薬剤を一緒に投与することを意味する。本発明の状況内では、一実施形態において、幹細胞および膵島は、同じ薬学的組成物において投与され、その結果、上記膵島および上記幹細胞は、この組成物中で互いに接触する。しかし、特に、局所投与の場合には、膵島または幹細胞は、最初に投与されてもよいし、次に膵島または幹細胞が、後に、しかし幹細胞が、膵島に対して有益な効果を生じるために膵島となお接触し得るような方法で投与されることは、可能である。幹細胞が、膵島に対して有益な効果を有する因子を含む細胞を培養することによって生成される馴化培地で置き換えられ得ることはまた、理解される。
【００８４】
「複合物ペレット」は、幹細胞および膵島の両方を、直接物理的に接触して含む組成物である。これらの複合物を含む薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中の幹細胞および膵島から本質的になる。膵島自体は、幹細胞で被覆され得る。幹細胞は、膵島に直接接着されてもよい。いくつかの実施形態において、実質的に膵島の表面全体が、幹細胞で被覆される。
【００８５】
上記複合物を生成するための方法は、細胞が投与される得かつ互いに接触したままであるように、細胞が一緒に混合される任意の方法を含む。上記方法は、幹細胞と膵島とを共培養するかまたは混合する工程から本質的になり得る。
【００８６】
複合物が形成され、この複合物は、膵島および幹細胞の両方を、それらが互いに物理的に接触して投与され得るような形態で含む。一実施形態において、膵島および幹細胞が投与前に培養される。例えば、それらは、プレート上に播種され得、所望の時間量にわたって培養され得る。時間は、短い持続時間（例えば、５分間）であってもよい。あるいは、時間は、より長くてもよい（例えば、２４時間までもしくはこれより長い）。目的が、幹細胞が膵島を被覆しこれに接着している複合物を提供することである場合には、培養物は、望まれる被覆／接着の程度が確認され得るように観察され得る。
【００８７】
複合物中に含まれる細胞の比および絶対量は、被験体の具体的状況に依存して変動し得るが、細胞がマルチウェルプレートへと播種される場合のいくつかの実施形態において、各ウェルは、約５０個の膵島および約１０，０００個の幹細胞を含み得る。膵島の量および膵島中の幹細胞は、好ましくは、正常グルコースレベル（これは、およそ１００ｍｇ／ｄＬの濃度である）を提供するように構成される。本願の実施例中の複合物は、約１５０個の膵島および２５０，０００個の幹細胞を含んだ。
【００８８】
いくつかの実施形態において、膵島および幹細胞は、投与の直前に複合物を形成するために使用される（すなわち、培養もしくは別の方法での重要な事前の接触はない）。よって、接触は、例えば、さらに５分未満にわたり得る（例えば、実施例中）。そのようにして形成される複合物は、次いで、糖尿病を処置するために（すなわち、血中グルコースレベルを改善するために）、膵島および上記細胞の共移植において使用され得る。
【００８９】
複合物は、当該分野で公知の方法（例えば、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５７：２３９３−２４０１  （２００８）、Ｉｔｏら，  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ８９：１４３８−１４４５  （２０１０）、Ｓａｋａｔａら，  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ８９：６８６−６９３  （２０２０）、Ｏｈｍｕｒａら，  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ９０：１３６６−１３７３  （２０１０）、Ｓｏｌａｒｉら，
Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３２：１１６−１２４  （２００９）、Ｒａｃｋｈａｍら，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ５４：１１２７−１１３５  （２０１１）、Ｂｏｒｇら，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ５７：５２２−５３１  （２０１４）、Ｈａｊｉｚｅｄｅｈ−Ｓａｆｆａｒら，  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ５：９３２２  （２０１５））によって形成され得る。上記のうちの全ては、複合物の生成を教示するために参考として援用される。これらの参考文献によって示されるように、膵島および他の細胞型の複合物の形成は、当該分野で公知の方法によって達成され得る。
【００９０】
幹細胞の数は、同数の膵島のみの投与と比較した場合、膵島の数あたりの改善されたグルコースレベルを提供する数である。よって、例えば、１００個の膵島がある特定の血中グルコースレベルを生じ、幹細胞の効果が、膵島のその数より少なくてその同じレベルを生じることであるか、または膵島のその数でよりよいグルコースレベルを生じることである場合、それは、「改善」を構成する。この最終目的は、正常範囲内の血中グルコースレベルを達成するために必要である膵島の数を減少させることである。
【００９１】
膵島は、約１，０００〜２，０００個の細胞（α細胞、β細胞、γ細胞を含む）を含む細胞集団である。膵島の単離は、当該分野で周知である方法（例えば、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら，  Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ５：２６３２−２６３９  （２００５）、この手順のために参考として援用される）によって行われ得る。
【００９２】
全ての方法および組成物において、完全な膵島の代わりに、培養された膵臓β細胞が、同じ効果を提供するために使用され得る。
【００９３】
「含んでいる、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、他の限定なく、必然的に、他の何が含まれ得るかに関するいかなる制限も除外もなしに、指示対象を含むことを意味する。例えば、「ｘおよびｙを含む組成物」とは、たとえどのような他の成分が上記組成物中に存在する可能性があろうが、ｘおよびｙを含む任意の組成物を包含する。同様に、ｘが上記方法において唯一の工程であるか、工程のうちの１つに過ぎないかに関わらず、たとえどのくらい多くの他の工程があろうが、工程の比較においてどの程度ｘが単純であろうが複雑であろうが、「工程ｘを包含する方法」は、ｘが実施される任意の方法を包含する。語根「含む（Ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」の語を使用する、「〜から構成される（Ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」および類似の語句は、「含んでいる、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の類義語として本明細書で使用され、同じ意味を有する。
【００９４】
「〜から構成される」は、含んでいる、含むの類義語である（上記を参照のこと）。
【００９５】
用語「接触する」とは、移植されるべき幹細胞および膵島に関連して使用される場合、上記膵島に曝される際に、上記幹細胞が上記膵島に物理的に触れていることを意味し得る。このような場合に、上記幹細胞は、上記膵島と直接接触した状態にある。他の場合には、上記幹細胞は、上記膵島と間接的に接触し得る。ここで上記幹細胞と上記膵島との間に１もしくはこれより多くの構造物（例えば、別の細胞）および／または流体（例えば、血液）が物理的に介在する。
【００９６】
「有効（な）量」とは、一般に、本願に記載される具体的な望ましい効果を達成する量を意味する。例えば、有効量は、有益なまたは所望の臨床結果を実現するために十分な量である。本発明の状況内では、一般に、所望の効果は、被験体に存在する膵島の効果の無いまたは病的な機能を補償する臨床的改善である。一実施形態において、上記被験体は糖尿病を有し、上記効果は、血中グルコースレベルを増大させるかまたは完全に正常化することである。有効量は、１回の投与において一度に全て、または数回の投与において上記有効量を提供する分割量において、提供され得る。有効量とみなされるものの正確な決定は、各被験体に関する因子の個々（疾患／欠損の重篤度、患者の健康状態、年齢などが挙げられる）に基づき得る。当業者は、当該分野で慣用的であるこれら考慮事項に基づいて、有効な量を決定し得る。本明細書で使用される場合、「有効用量」は、「有効量」と同じことを意味する。
【００９７】
よって、膵島の有効量は、被験体の臨床症状が改善される量である。そして幹細胞の有効量は、その改善された臨床転帰を提供する膵島を生じるために十分な量である。
【００９８】
「有効な経路」とは、一般に、所望の区画、系、または位置への薬剤の送達を提供する経路を意味する。例えば、有効な経路は、経路であって、有益なまたは望ましい臨床結果を実現するに十分な薬剤の量を、望ましい作用部位に提供するために該薬剤がそれを介して投与され得る経路である（本件では、有効な移植）。
【００９９】
用語「外因性」とは、幹細胞に関して使用される場合、一般に、被験体に対して外部にあり、有効な経路による移植が意図される膵島に曝されている（例えば、接触されている）幹細胞を指す。外因性幹細胞は、同じ被験体に由来してもよいし、異なる被験体に由来してもよい。一実施形態において、外因性幹細胞は、被験体から採取され、単離され、エキソビボで拡大増殖され、そして次いで、有効な経路による移植が意図された膵島に曝されている幹細胞を包含し得る。
【０１００】
用語「曝す」とは、１もしくはこれより多くの幹細胞と移植が意図された上記膵島とを接触させるという行為を包含し得る。上記膵島を接触させることは、エキソビボまたはインビボで行われ得る（例えば、幹細胞を被験体の中の膵島に、例えば、局所投与において提供することによって）。
【０１０１】
用語「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」の使用は、限定することを意図しない。
【０１０２】
「増大する、増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」または「増大、増加（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」は、生物学的事象を全体的に誘導すること、または該事象の程度を増大させることを意味する。
【０１０３】
用語「単離された」とは、インビボでは細胞（単数または複数）と会合している１個以上の細胞または１種以上の細胞成分と会合していない上記細胞（単数または複数）を指す。「富化された集団」とは、インビボでまたは初代培養において、１種以上の他の細胞型と比較して、所望の細胞の数の相対的増加を意味する。
【０１０４】
しかし、本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、本発明の細胞のみの存在を示すのではない。むしろ、用語「単離された」とは、本発明の細胞が、それらの天然の組織環境から取り出され、その通常の組織環境と比較した場合に、より高濃度で存在することを示す。よって、「単離された」細胞集団は、本発明の細胞に加えて複数の細胞型をさらに含んでいてもよく、さらなる組織成分を含んでいてもよい。これはまた、例えば、細胞倍加の観点で表され得る。細胞は、インビボでまたはその本来の組織環境（例えば、骨髄、末梢血、胎盤、臍帯、臍帯血など）でのその本来の数と比較して富化されているように、インビトロまたはエキソビボで、１０回、２０回、３０回、４０回またはそれより多くの倍加を受けている場合がある。
【０１０５】
「ＭＡＰＣ」とは、「複能性成体前駆細胞」の頭字語である。上記用語は、胚性幹細胞または生殖細胞ではないが、これらのいくつかの特徴を有する細胞をいう。ＭＡＰＣは、多くの代替の記載（そのうちの各々は、それらが発見されたときに細胞に新規性を付与した）において特徴付けられ得る。それらは、従って、それらの記載のうちの１もしくはこれより多くによって特徴付けられ得る。第１に、それらは、形質転換されること（腫瘍形成性）なしに、そして正常な核型を伴って、培養で拡大された複製能を有し得る。第２に、それらは、分化の際に、１種より多くの胚葉（例えば、２種の胚葉または３種全ての胚葉（すなわち、内胚葉、中胚葉および外胚葉）の細胞子孫を生じ得る。第３に、それらは胚性幹細胞または生殖細胞ではないが、それらは、ＭＡＰＣがＯｃｔ  ３／４（すなわち、Ｏｃｔ４、Ｏｃｔ  ３Ａ）のうちの１種もしくはこれより多くを発現し得るように、これらの原始的細胞型のマーカーを発現し得る。第４に、幹細胞のように、それらは、自己再生し得る、すなわち、形質転換されることなしに、拡大した複製能を有し得る。これは、これらの細胞がテロメラーゼを発現する（すなわち、テロメラーゼ活性を有する）ことを意味する。よって、「ＭＡＰＣ」といわれた細胞型は、その新規な特性のうちのいくつかを介して細胞を記載する代替の基本的特徴によって特徴付けられ得る。
【０１０６】
ＭＡＰＣにおける用語「成体」とは、非限定的である。それは、上記のとおりの非胚性体細胞を指す。ＭＡＰＣは、核型としては正常であり、インビボで奇形腫を形成しない。この頭字語は、広範な複製能を有し多能性マーカーを発現した、骨髄から単離された細胞を記載するために、米国特許第７，０１５，０３７号において最初に使用された。
【０１０７】
ＭＡＰＣは、ＭＳＣより原始的な前駆細胞集団を表す（Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ，  Ｃ．Ｍ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２：５０２−８  （２００２）、Ｊａｈａｇｉｒｄａｒ，  Ｂ．Ｎ．ら，  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ，  ２９：５４３−５６  （２００１）；  Ｒｅｙｅｓ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．  Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ，  Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，  ９３８：２３１−２３３  （２００１）；  Ｊｉａｎｇ，  Ｙ．ら，  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ，  ３０８９６−９０４  （２００２）；およびＪｉａｎｇ，  Ｙ．ら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１８：４１−９．  （２００２））。
【０１０８】
用語「ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）」は、米国特許第７，０１５，０３７号のＭＡＰＣに基づく細胞調製物（すなわち、上記で記載されるとおりの非胚性幹、非生殖細胞）に関する商品名である。ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）は、本願において開示される細胞培養法（特に、低酸素および高血清）に従って調製される。ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）は、高度に拡大増殖可能であり、核型としては正常であり、インビボで奇形腫を形成しない。それは、１種より多くの胚葉の細胞系列へと分化し得、テロメラーゼを発現し得る。
【０１０９】
「薬学的に受容可能なキャリア」は、本発明において使用される細胞および／または膵島のための任意の薬学的に受容可能な媒体である。このような媒体は、等張性、細胞代謝、ｐＨなどを維持し得る。上記媒体は、被験体への投与と適合性であり、従って、膵島および／または細胞送達ならびに処置のために使用され得る。
【０１１０】
「前駆細胞」は、それらの最終まで分化した子孫の特徴をうちの一部（しかし全てではない）を有する、幹細胞の分化の間に産生される細胞である。規定される前駆細胞（例えば、「心臓前駆細胞」）は、ある系列になることが約束されているが、特定のまたは最終まで分化した細胞型になることが約束されているわけではない。用語「前駆体」とは、頭字語「ＭＡＰＣ」において使用される場合、これら細胞を特定の系列に限定しない。前駆細胞は、上記前駆細胞より高度に分化している子孫細胞を形成し得る。
【０１１１】
用語「低下する」とは、本明細書で使用される場合、防止する、ならびに減少させることを意味する。
処置の状況において、「低下させる」ことは、欠損を防止することまたは改善することのいずれかのことである。これは、膵島欠損の原因または症状を含む。
【０１１２】
所望のレベルの効力を有する細胞を「選択」することは、細胞を（アッセイによってのように）同定すること、単離すること、および拡大増殖させることを意味し得る。これは、上記細胞が親細胞集団から単離されたその親細胞集団より高い効力を有する集団を作り得る。「親」細胞集団とは、上記選択された細胞が親細胞から分かれたその親細胞をいう。「親」とは、実際のＰ１→Ｆ１関係性（すなわち、子孫細胞）をいう。よって、細胞Ｘは、細胞ＸおよびＹの混合集団（ここでＸは、発現因子であり、Ｙはそうではない）から単離される場合、Ｘの単なる単離物は、増強された発現を有するとして分類されない。しかし、Ｘの子孫細胞がより高い発現因子である場合、その子孫細胞は、増強された発現を有するとして分類される。
【０１１３】
所望の効果を達成する細胞を選択するには、上記細胞が所望の効果を達成するかどうかを決定するためのアッセイと、それらの細胞を得ることを含むアッセイの両方が含まれる。上記細胞は、所望の効果が外因性導入遺伝子／ＤＮＡによって達成されないという点で、その効果を自然に達成し得る。しかし、有効な細胞は、上記効果を増大させる薬剤とともにインキュベートされるかまたはその薬剤に曝されることによって改善され得る。上記有効な細胞が細胞集団から選択されるその細胞集団は、上記アッセイを行う前にその効力を有することが公知でなくてもよい。上記細胞は、アッセイを行う前に、所望の効果を達成することが公知でなくてもよい。効果は、遺伝子発現および／または分泌に依存し得るので、上記効果を引き起こす遺伝子のうちの１つもしくはこれより多くに基づいても選択され得る。
【０１１４】
選択は、組織中の細胞からであり得る。例えば、この場合、細胞は、所望の組織から単離され、培養において拡大増殖され、所望の効果を達成するために選択され、その選択された細胞は、さらに拡大増殖される。
【０１１５】
選択はまた、エキソビボの細胞（例えば、培養細胞）からであり得る。この場合、上記培養細胞のうちの１もしくはこれより多くが、所望の効果を達成するためにアッセイされ、その得られた所望の効果を達成する細胞がさらに拡大増殖され得る。
【０１１６】
細胞はまた、所望の効果を達成する増強した能力について選択され得る。この場合、その増強した細胞が細胞集団から得られるその細胞集団は、既にその所望の効果を有している。増強した効果は、親集団におけるよりも１細胞あたりの平均量がより高いことを意味する。
【０１１７】
上記増強した細胞が親集団から選択されるその親集団は、実質的に均質（同じ細胞型）であり得る。この集団からかかる増強した細胞を得るための１方法は、単一の細胞または細胞プールを作り、これら細胞または細胞プールをアッセイして、上記増強した（より大きな）効果を天然に有するクローンを得（上記細胞を、上記効果を誘導または増大させる調節因子で処理することとは対照的に）、次いで、自然に増強したそれら細胞を拡大増殖させることである。
【０１１８】
しかし、細胞は、上記効果を誘導または増大させる１種もしくはこれより多い薬剤で処理され得る。従って、実質的に均質な集団が、上記効果を増強するために処理され得る。
【０１１９】
上記集団が実質的に均質でなければ、処理されるべき上記親細胞集団が、上記所望の細胞型の少なくとも１００個（ここで増強した効果が求められる）を含むことが好ましく、より好ましくは、上記細胞の少なくとも１，０００個、およびさらにより好ましくは、上記細胞の少なくとも１０，０００個を含むことが好ましい。処理後に、この亜集団は、公知の細胞選択技術によって不均質な集団から回収され得、所望であれば、さらに拡大増殖され得る。
【０１２０】
従って、効果の所望のレベルは、所定の先行集団におけるレベルより高いレベルであり得る。例えば、組織から初代培養へと置かれ、上記効果を生じることが具体的に設計されていない培養条件によって拡大増殖および単離された細胞は、親集団を提供し得る。このような親集団は、１細胞あたりの平均的効果を増強するように処理され得るか、または意図的な処理なしに、より高い程度の効果を発現する上記集団内の細胞（単数または複数）についてスクリーニングされ得る。次いで、このような細胞は、より高い（所望の）発現を有する集団を提供するために拡大増殖され得る。
【０１２１】
幹細胞の「自己再生」とは、複製娘幹細胞が幹細胞から生じたその幹細胞と同一の分化能を有する複製娘幹細胞を産生する能力を指す。この状況において使用される類似の用語は、「増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）」である。
【０１２２】
「幹細胞」とは、自己再生を経験し得（すなわち、同じ分化能を有する子孫）、そしてまた分化能がより制限された子孫細胞を生じ得る細胞を意味する。本発明の状況においては、幹細胞はまた、より分化した細胞を包含し、上記細胞は、例えば、核移入によって、より初期の幹細胞との融合によって、特定の転写因子の導入によって、または特定の条件下での培養によって、脱分化している。例えば、Ｗｉｌｍｕｔら，Ｎａｔｕｒｅ，３８５：８１０−８１３（１９９７）；Ｙｉｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，４１６：５４５−５４８（２００２）；Ｇｕａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，４４０：１１９９−１２０３（２００６）；Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｃｅｌｌ，１２６：６６３−６７６（２００６）；Ｏｋｉｔａら，Ｎａｔｕｒｅ，４４８：３１３−３１７（２００７）；およびＴａｋａｈａｓｈｉら，Ｃｅｌｌ，１３１：８６１−８７２（２００７）を参照のこと。
【０１２３】
分化はまた、特定の化合物の投与、または脱分化を引き起こすインビトロまたはインビボでの物理的環境への曝露によって、引き起こされ得る。幹細胞はまた、異常な組織（例えば、奇形癌およびいくつかの他の供給源（例えば、胚様体（これらは、胚性組織から得られるという点で胚性幹細胞と考えることができるが、内部細胞塊から直接得られるのではない））から得られ得る。幹細胞はまた、幹細胞機能と関連した遺伝子を非幹細胞（例えば、人工多能性幹細胞）へと導入することによって産生され得る。
【０１２４】
「被験体」とは、脊椎動物（例えば、哺乳動物（例えば、ヒト））を意味する。哺乳動物としては、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、およびブタが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２５】
用語「治療上有効な量」とは、哺乳動物における任意の治療的応答を生じることが決定された薬剤の量を指す。例えば、有効な治療剤は、上記親の生存力を長期化し得、そして／または明白な臨床的症状を阻害し得る。上記用語の意味内での治療上有効である処置は、本明細書で使用される場合、たとえ上記処置が疾患の転帰自体を改善しないとしても、被験体の生活の質を改善する処置を含む。このような治療上有効な量は、当業者によって容易に確認される。従って、「処置する」ことは、このような量を送達することを意味する。従って、処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）は、任意の病的症状を予防または改善し得る。一局面において、処置は、血中グルコースレベルを、すなわち、正常範囲に向かってまたは正常範囲に改善することを意味する。
【０１２６】
本発明の状況において、治療上有効な量は、膵島細胞の移植が臨床転帰（例えば、血中グルコースレベル）において改善を生じる程度まで、膵島細胞に有益に影響を及ぼす幹細胞のその量である。また、幹細胞の有効量は、移植前のエキソビボでの膵島細胞の生存力および／または移植後の被験体中での膵島の生存力を改善する量である。幹細胞の有効量はまた、治療転帰を達成するために被験体に膵島を共投与されるその量であり得る。よって、膵島の治療上有効な量はまた、移植に際してその改善された臨床転帰を達成し得る膵島の数である。幹細胞および膵島の有効量は、慣用的な経験的実験法によって決定され得る。
【０１２７】
用語「治療上有効な時間」とは、臨床的改善を達成する（すなわち、血中グルコースレベルを改善する）ために、膵島と幹細胞とを接触させるために必要な時間をいう。例えば、上記細胞および膵島がインビトロで（エキソビボで）接触される場合、有効な時間は、正の治療転帰を生じる膵島の改善された生存力を提供するその時間である。この時間は、５〜１０分、数時間もしくはさらにより長い時間までの範囲にあり得る。例は、１５〜３０分間、３０〜４５分間、および４５分間から１時間までである。幹細胞は、膵島と一緒に培養される場合、その時間は、より長く、例えば、２４時間もしくはこれより長くてよい。その時間は、幹細胞が膵島を被覆／膵島に接着するのにどの程度の時間がかかるかに依存する。
【０１２８】
用語「治療上有効な経路」とは、改善された臨床転帰を達成するために有効であり得る投与の経路をいう。治療上有効な経路は、膵島と混合された幹細胞が、膵島がそれらの有益な効果を生じ得るどのような部位でも共投与されることを意味する。局所投与（例えば、腎被膜下）は、一例である。しかし、膵島移植（幹細胞とともに）は、当該分野で公知の有効な経路のうちのいずれかによって行われ得る。ヒトにおいて、これは、門脈内移植を介してであり得る。
【０１２９】
所定の量の膵島に対して有益な効果を達成するための幹細胞の適切な量を決定するにあたって、膵島に、移植後に改善されたグリセミック指数（例えば、さらには正常なグリセミック指数）を達成する能力を提供することに基づいて経験的に決定される。本明細書で例示されるとおり、複合物の用量範囲は、２５０，０００〜５００，０００個  幹細胞であり得る。従って、これらの量は、送達法、病気の重篤度などに基づいて経験的に決定される必要がある。
【０１３０】
「処置する（ｔｒｅａｔ）、処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本発明に関して広く使用され、各々のこのような用語は、とりわけ、欠損、機能不全、疾患、または他の有害なプロセス（治療に干渉するものおよび／または治療から生じるものを含む）を予防、改善、阻害、または治癒することを包含する。
【０１３１】
「検証する」とは、確認することを意味する。本発明の状況において、細胞は、インビボまたはインビトロで膵島に有益に影響を与えるための所望の効力を有することが、確認される。これは、合理的な効能を期待して、次にその細胞を（処置、バンキング、薬物スクリーニングなどにおいて）使用できるようにするためのものである。よって、検証することとは、所望の活性を有することが元々見出されている／所望の活性を有するとして確立されている上記細胞が、実際に、その活性を保持していることを確認することを意味する。従って、検証は、元々の決定および追跡決定を包含する２事象プロセスでの立証事象（ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｅｖｅｎｔ）である。第２の事象は、本明細書で「検証」といわれる。
【０１３２】
膵島（これは、ランゲルハンス島ともいわれる）は、１００〜２００μｍのサイズを元々は有する細胞（または細胞の塊）である。それらの主要な構成細胞は、グルカゴンを分泌するα細胞、インスリンを分泌するβ細胞、ソマトスタチンを分泌するδ細胞、および膵臓ポリペプチドを分泌するＰＰ細胞を含む。移植されるべき膵島の起源（ドナー）は、レシピエントと同じ種の哺乳動物であり得、そして例えば、そのレシピエントがヒトである場合、ヒト由来の膵島が使用される。
【０１３３】
さらに、膵臓から膵島を単離するための方法の具体例としては、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を有し得る方法が挙げられる。さらに、ドナーがヒトである場合、当該分野で公知のＲｉｃｏｒｄｉ法に基づく方法が、例として例証され得る。
【０１３４】
（ｉ）コラゲナーゼなどの酵素は、膵臓に一様に浸透し、膵臓を膨張させる。本工程は、好ましくは、酵素反応が進行するのを防止するために、約４〜６℃の低温条件で行われる。
【０１３５】
（ｉｉ）その膨張した膵臓は、酵素反応を通じて消化される。その酵素反応を経る消化は、その膨張した膵臓を、酵素反応が進むことを可能にする温度（例えば、約３７℃）へと曝すことによって行われる。その膨張した膵臓を、酵素を使用して消化することに加えて、膵臓は、必要であれば、振動などを通じて機械的に分解され得る。
【０１３６】
（ｉｉｉ）密度勾配遠心分離を使用して、膵島は、酵素消化を通じて得られた細胞集団から単離される。密度勾配遠心分離において、膵島が得られ得る部分は、遠心分離の回転速度、密度勾配溶液のタイプなどに依存して適切に選択される。
【０１３７】
その単離された膵島は、必要であれば、適切な保存溶液中に貯蔵され得る。その単離された膵島は、好ましくは、培養され、幹細胞と一緒に貯蔵される。そうすることによって、その単離された膵島は、さらに長期間にわたって生きている状態で維持され得る。
【０１３８】
組成物は、幹細胞以外に、薬学的に受容可能でありかつ幹細胞に有害に影響を及ぼさないキャリアを含み得る。このようなキャリアの例としては、食塩水、ＰＢＳ、培養培地、タンパク質医薬（アルブミンが挙げられる）、膵島保存のための溶液などが挙げられる。
【０１３９】
幹細胞の投与用量は、移植経路、膵島とともに形成される複合物の存在、移植されるべき膵島の量、レシピエントの症状の重篤度などに従って適切であるように選択される。例えば、幹細胞が、膵島とともに複合物を形成しない状態で、膵島と一緒に混合され、腎被膜下、大網（ｇｒｅａｔｅｒ  ｏｍｅｎｔｕｍ）中、または皮下組織中の位置に、体重５０ｋｇを有するレシピエントへと注射される場合；単回の膵島移植のための投与用量は、例えば、５．０×１０７〜１．０×１０９  細胞であり、好ましくは、１．０×１０８〜５．０×１０８  細胞である。幹細胞が、体重５０ｋｇを有するレシピエントへと複合物の形態で門脈内に投与される場合；単回の膵島移植のための投与用量は、例えば、１．０×１０８〜２．０×１０９  細胞であり、好ましくは、５．０×１０８〜１．０×１０９
細胞である。従って、本発明は、１回の移植あたりの膵島の量を、上記の範囲内にすることを可能にする幹細胞の数を含み得る。
【０１４０】
幹細胞の投与用量および移植されるべき膵島の比はまた、移植経路、移植されるべき膵島の量、レシピエントの症状の重篤度などに応じて適切に選択される。例えば、幹細胞が膵島と混合され、腎被膜下、大網中、または皮下組織中の位置に注射される場合；幹細胞の数に対する移植される膵島の数の比に関して、幹細胞：膵島は、例えば、４００：１〜３０００：１または５００：１〜２０００：１であり、または好ましくは６００：１〜１５００：１である。さらに、幹細胞が門脈の中に注射される場合；幹細胞の数に対する移植される膵島の数の比に関して、幹細胞：膵島は、例えば、５００：１〜３５００：１または１０００：１〜３０００：１であり、または好ましくは１５００：１〜２５００：１である。これに基づいて細胞数に基づく比が得られ得る。なぜなら膵島は通常は、およそ１０００〜２０００個の膵島からなるからである。
【０１４１】
本発明の幹細胞と一緒に移植される膵島の量は、レシピエントの症状の重篤度などに応じて適切であるように選択される。一般に、体重５０ｋｇを有するレシピエントの単回の膵島移植のために移植される膵島の数は、その数が５．０×１０４〜１．０×１０７の範囲内である場合に通常は十分である。しかし、膵島の移植片生存率は、本発明の幹細胞を使用する場合に増大し得るので、単回の膵島移植のために移植される膵島の数が、５０ｋｇ成人患者に関して、１×１０５〜２×１０６、好ましくは５×１０５〜１．５×１０６、およびさらに好ましくは、１×１０６〜１．５×１０６へと低減される場合でさえ、十分なインスリン非依存性を得ることは可能である。移植される膵島のこのような数を用いると、単一のドナーから得られる膵島を複数のレシピエントへ移植することが可能になる。
【０１４２】
本発明の幹細胞が、移植されるべき膵島と一緒に投与される限りにおいて、投与様式において特段の制限は存在しない；そして幹細胞は、膵島と混合された状態で投与されてもよいし、幹細胞は、膵島が投与される前または投与後に単独で投与されてもよい。膵島の移植片生存をさらに改善するという観点から、好ましくは、幹細胞は、膵島と混合された状態で投与される、すなわち、幹細胞および膵島を混合することによって得られる細胞調製物を移植する、そしてより好ましくは、幹細胞は、後に記載される、膵島および幹細胞が互いに接着している複合物として投与される。
【０１４３】
本発明の幹細胞が、膵島の移植片生存を増強／改善し得る限りにおいて、その投与経路において特段の制限はなく、そして投与経路は、門脈などの血液中の直接注射（移植）、または非血管組織（例えば、皮下組織）中、大網中、腎被膜下などの移植であってよい。本発明の幹細胞が、後に記載される、膵島および幹細胞の複合物として投与される場合、門脈などの血液中の注射が好ましい；そして幹細胞が、膵島とは別個に投与される場合、腎被膜下、大網中または皮下組織中の位置での膵島および幹細胞の混合物の同時注射は、好ましい。
【０１４４】
本発明の幹細胞は、膵島移植片のインスリン機能が低下しているかまたは失われている患者（レシピエント）、例えば、膵島移植を必要とする１型糖尿病などの患者に投与されるが；幹細胞は、２型糖尿病（ｂｒｉｔｔｌｅ型）などの患者に適用されるという期待があり、そしてさらには、幹細胞は、糖尿病全体に適用される場合に有効であると期待される。好ましい患者は、膵島移植を必要とする１型糖尿病である。
【０１４５】
（膵島移植のためのバイオ医薬）
膵島移植のためのバイオ医薬は、本願に記載される幹細胞および移植されるべき膵島を含む。
【０１４６】
膵島移植のためのバイオ医薬は、その中で混合されている、上記の幹細胞および移植されるべき膵島を有し、混合物としてのこれらの細胞の共移植を可能にするバイオ医薬であり得る。さらに、膵島移植のためのバイオ医薬は、幹細胞が膵島に接着している、後に記載される複合物（「複合物移植片」または「複合物ペレット」といわれ得る）を含む、膵島移植のためのバイオ医薬であり得る。
【０１４７】
膵島移植のためのバイオ医薬は、幹細胞および移植されるべき膵島または上記の複合物以外に、薬学的に受容可能でありかつこれらの細胞に有害に影響を及ぼさないキャリアを含み得る。このようなキャリアの具体例としては、食塩水、ＰＢＳ、培養培地、タンパク質医薬（例えば、アルブミン）、膵島保存のための溶液などが挙げられる。
【０１４８】
膵島移植のためのバイオ医薬に関して、上記の記載はまた、幹細胞および膵島の投与量（移植量）、これらの細胞の比、バイオ医薬の投与法、バイオ医薬が投与される患者などに適用される。
【０１４９】
（幹細胞が膵島に接着している複合物）
【０１５０】
本発明は、幹細胞が膵島に接着している複合物（複合物移植片）に関する。
【０１５１】
幹細胞が膵島に直接接着している限りにおいて、上記複合物の構造において特段の制限は存在しない；そして好ましくは、上記複合物は、膵島のうちの少なくとも一部が幹細胞で覆われている構造を有する。より好ましくは、顕微鏡検査を通じて観察される場合、膵島の表面のうちの少なくとも（ｎｏｔ  ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ）３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、よりさらに好ましくは少なくとも７０％、さらにもっと好ましくは少なくとも８０％、およびさらによりもっと好ましくは少なくとも９０％が、幹細胞で覆われる。特に好ましくは、膵島の全表面が、幹細胞で覆われる。
【０１５２】
単一の複合物を形成する、幹細胞および膵島の数の比において、特段の制限は存在しない。しかし、通常は、上記複合物は、単一の膵島が多くの数の幹細胞で覆われる構造を有する。単一の膵島上に接着している幹細胞の数において、特段の制限は存在せず、例えば、その数は、通常は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも３０、さらに好ましくは少なくとも４０、およびよりさらに好ましくは少なくとも５０である。さらに、１個の膵島上に接着している幹細胞の数において、特段の制限は存在せず、そして全て覆うために必要とされる数を想定すると、その数は、通常は、例えば、５０００を超えない、好ましくは４５００を超えない、より好ましくは３０００を超えない、およびさらに好ましくは２５００を超えない。
【０１５３】
膵島および幹細胞を密接に接触して存在させることによって、本発明の複合物は、生存効果および移植片生存改善効果をより効果的に発揮し得る。より具体的には、幹細胞を使用する膵島移植の移植片生存率を改善するために、膵島が移植されて生存する位置に幹細胞を存在させること、そして膵島を生かすことは、好ましい。幹細胞は、複合物において膵島上に接着しているので、幹細胞は、上記複合物を形成する膵島が移植されて生存するその位置に必然的に存在する。これは、膵島の移植片生存を促進し、膵島の生存能を促進する。
【０１５４】
複合物において幹細胞が膵島へと接着されるその複合物を生成するための方法において、特段の制限は存在せず、そして例えば、その複合物は、膵島および幹細胞を共培養することによって得られ得る。複合物が形成される限りにおいて、培養時間において特段の制限は存在せず、そしてその時間は、通常は１０〜４８時間、好ましくは１８〜４８時間、およびより好ましくは２４〜３６時間である。
【０１５５】
複合物を形成するために、培養培地に添加される幹細胞および膵島の数の比において特段の制限は存在せず、そして通常は、膵島：幹細胞は、１：１０〜５０００、好ましくは１：１００〜４５００、より好ましくは１：３００〜４０００、さらに好ましくは１：５００〜３５００、およびさらにもっと好ましくは１：８００〜３０００である。
【０１５６】
（糖尿病の治療法および膵島移植法）
【０１５７】
本発明は、膵島および幹細胞を共投与し、糖尿病の処置を要する患者に膵島を移植することによる、糖尿病を処置するための方法を包含する。患者が糖尿病の処置を要する限りにおいて、患者において特段の制限は存在せず、そしてこのような患者の例としては、１型糖尿病、２型糖尿病などが挙げられる。好ましくは，上記患者は、糖尿病を処置するために膵島移植を要する１型糖尿病である。
【０１５８】
膵島および幹細胞の共投与は、単回の膵島移植手術においてそれらのうちの両方の投与を意味する。従って、共投与は、膵島および幹細胞の混合物の投与を包含するのみならず、膵島または幹細胞のいずれかを予め投与し、次いで、他方を投与することをも包含する。さらに、共投与はまた、複合物の投与を包含する。複合物の投与が好ましい。
【０１５９】
膵島の移植片生存が増強／改善され得る限りにおいて、膵島および幹細胞の投与経路において特段の制限は存在せず、そして例えば、その投与経路は、門脈などの血液中の注射、または非血管組織（例えば、皮下組織中、大網中、腎被膜下など）への直接注射であり得る。複合物として投与される場合、門脈などの中に細胞を注射することが好ましい；そして幹細胞が膵島とは別個に投与される場合、腎被膜下、大網中、または皮下組織中の位置での注射が好ましい。
【０１６０】
膵島および幹細胞を連続してまたは混合状態で投与する場合、単回の膵島移植のための投与用量は、上記で記載されるとおりである。治療効果が得られる限りにおいて、複合物状態（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｓｔａｔｅ）を投与する場合に、投与用量において特段の制限は存在しない。例えば、単回の膵島移植のために投与される複合物の数は、投与が体重５０ｋｇを有するレシピエントの門脈に行われる場合、通常は、５．０×１０４〜１．０×１０６の範囲内であり得る。しかし、膵島の移植片生存率は、本発明の幹細胞を使用する場合に増大し得るので、単回の膵島移植のために移植される複合物の数が、５０ｋｇ成人患者に関して１×１０５〜２×１０６、好ましくは５×１０５〜１．５×１０６、そしてさらに好ましくは１×１０６〜１．５×１０６へと低減される場合にすら、十分なインスリン非依存性を得ることは、可能である。移植される膵島のこのような数を用いると、単一のドナーから得られる膵島を複数のレシピエントへと移植することが可能になる。
【０１６１】
（幹細胞）
本発明は、好ましくは、脊椎動物種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、飼い慣らされた動物、家畜、および他の非ヒト哺乳動物）の幹細胞を使用して実施され得る。これらとしては、以下に記載される細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６２】
多くの転写因子および外因性サイトカインが同定されてきており、これらは、インビボでの幹細胞の効力の状態に影響を及ぼす。幹細胞の多能性に関与することが記載されるべき第１の転写因子は、Ｏｃｔ４である。Ｏｃｔ４は、ＰＯＵ（Ｐｉｔ−Ｏｃｔ−Ｕｎｃ）ファミリーの転写因子に属し、遺伝子の転写を活性化し得、プロモーター領域またはエンハンサー領域内で「オクタマーモチーフ」といわれるオクタマー配列を含み得るＤＮＡ結合タンパク質である。Ｏｃｔ４は、卵筒が形成されるまで受精接合子（ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｄ  ｚｙｇｏｔｅ）の卵割可能なステージの時期に発現される。Ｏｃｔ３／４の機能は、分化誘導遺伝子（すなわち、ＦｏｘａＤ３、ｈＣＧ）を抑制し、多能性を促進する遺伝子（ＦＧＦ４、Ｕｔｆ１、Ｒｅｘ１）を活性化することである。Ｓｏｘ２（高移動度群（ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ）（ＨＭＧ）ｂｏｘ転写因子のメンバーである）は、Ｏｃｔ４と協同して、上記内部細胞塊において発現される遺伝子の転写を活性化する。胚性幹細胞におけるＯｃｔ３／４発現が、特定のレベルの間で維持されることは、必須である。Ｏｃｔ４発現レベルの５０％超の過剰発現またはダウンレギュレーションは、それぞれ、初期の内胚葉／中胚葉または栄養外胚葉の形成とともに、胚性幹細胞の運命を変える。インビボでは、Ｏｃｔ４欠損胚は、胚盤胞ステージへと発達するが、上記内部細胞塊の細胞は、多能性ではない。代わりに、それら細胞は、胚体外栄養膜系列（ｅｘｔｒａｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｌｉｎｅａｇｅ）に沿って分化する。Ｓａｌｌ４（哺乳動物のＳｐａｌｔ転写因子）は、Ｏｃｔ４の上流の調節因子であり、従って、発生学の初期相の間にＯｃｔ４の適切なレベルを維持することは重要である。Ｓａｌｌ４レベルが、特定の閾値より下に低下する場合、栄養外胚葉細胞は、上記内部細胞塊へと異所性に拡大増殖する。多能性に必要とされる別の転写因子は、Ｎａｎｏｇであり、これは、ケルト族の「ティル・ナ・ノーグ（Ｔｉｒ  Ｎａｎ  Ｏｇ）」：常若の国に倣って名付けられた。インビボでは、Ｎａｎｏｇは、ぎっしりと詰まった桑実胚のステージから発現され、その後、内部細胞塊に規定され、着床ステージによってダウンレギュレートされる。Ｎａｎｏｇのダウンレギュレーションは、多能性細胞の制御されない拡大増殖を回避し、原腸形成の間に多系列分化を可能にするために重要であり得る。Ｎａｎｏｇヌル胚（５．５日で単離される）は、無秩序な胚盤胞からなり、主に、胚体外内胚葉を含み、識別可能な胚盤葉上層を含まない。Ｎａｎｏｇヌル胚（５．５日目で単離される）は、無秩序な胚盤胞からなり、主に、胚体外内胚葉を含み、識別可能な胚盤葉上層を含まない。
【０１６３】
（ＭＡＰＣの単離および増殖）
ＭＡＰＣ単離方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第７，０１５，０３７号を参照のこと。これらの方法は、ＭＡＰＣの特徴付け（表現型）とともに、本明細書に参考として援用される。ＭＡＰＣは、複数供給源（骨髄、胎盤、臍帯および臍帯血、筋肉、脳、肝臓、脊髄、血液または皮膚が挙げられるが、これらに限定されない）から単離され得る。従って、骨髄吸引物、脳生検または肝臓生検、および他の器官から得ること、ならびにこれら細胞において発現される（または発現されない）遺伝子に依存して（例えば、機能アッセイまたは形態アッセイ（例えば、上記参考の出願（本明細書に参考として援用される）において開示されているもの）によって）、当業者に利用可能な陽性選択または陰性選択の技術を使用して、上記細胞を単離することは可能である。
【０１６４】
ＭＡＰＣはまた、Ｂｒｅｙｅｒら，  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，  ３４：１５９６−１６０１  （２００６）およびＳｕｂｒａｍａｎｉａｎら，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；  Ｓ．  Ｄｉｎｇ  （編），  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ６３６：５５−７８  （２０１０）（これらの方法に関して参考として援用される）に記載される本発明者の改変法から得た。
【０１６５】
（米国特許第７，０１５，０３７号に記載されるヒト骨髄に由来するＭＡＰＣ）
ＭＡＰＣは、ＣＤ４５もグリコホリン−Ａ（Ｇｌｙ−Ａ）も発現しない。上記細胞の混合集団を、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ分離に供した。次いで、上記細胞を、抗ＣＤ４５抗体および抗Ｇｌｙ−Ａ抗体を使用して陰性選択に供し、ＣＤ４５＋細胞およびＧｌｙ−Ａ＋細胞の集団を除去し、次いで、残存する約０．１％の骨髄単核球を回収した。細胞をまた、フィブロネクチンコーティングしたウェルに播種し、２〜４週間にわたって下記のように培養して、ＣＤ４５＋細胞およびＧｌｙ−Ａ＋細胞を除去した。接着性骨髄細胞の培養物において、多くの接着性間質細胞が、細胞倍加３０回あたりで複製老化を経験し、細胞のより均質な集団が、拡大増殖し続け、長いテロメアを維持する。
【０１６６】
（さらなる培養法）
さらなる実験において、ＭＡＰＣが培養される密度は、約１００細胞／ｃｍ２または約１５０細胞／ｃｍ２〜約１０，０００細胞／ｃｍ２（約２００細胞／ｃｍ２〜約１５００細胞／ｃｍ２〜約２０００細胞／ｃｍ２を含む）まで変動し得る。上記密度は、種間で変動し得る。さらに、最適密度は、培養条件および細胞供給源に依存して変動し得る。培養条件および細胞の所定のセットについて最適な密度を決定することは、当業者の技術範囲内である。
【０１６７】
また、約１０％より低い（約１〜５％および特に、３〜５％を含む）有効大気酸素濃度が、培養中のＭＡＰＣの単離、増殖および分化の間のいずれのときにも使用され得る。
【０１６８】
細胞は、種々の血清濃度（例えば、約２〜２０％）下で培養され得る。ウシ胎仔血清が使用され得る。より高い血清が、より低い酸素分圧と組み合わせて使用され得る（例えば、約１５〜２０％）。細胞は、培養ディッシュへの接着前に選択される必要はない。例えば、Ｆｉｃｏｌｌ勾配後に、細胞は、直接播種され得る（例えば、２５０，０００〜５００，０００／ｃｍ２）。接着性のコロニーは拾いあげられ得、場合によってはプールされ得、拡大増殖され得る。
【０１６９】
実施例における実験手順で使用される一実施形態において、高血清（約１５〜２０％）および低酸素（約３〜５％）条件を、細胞培養に使用した。具体的には、コロニー由来の接着性細胞を播種し、約１７００〜２３００細胞／ｃｍ２の密度において、１８％血清および３％  酸素中で（ＰＤＧＦおよびＥＧＦとともに）継代した。
【０１７０】
ＭＡＰＣに特異的な一実施形態において、補充物は、ＭＡＰＣが１種より多くの胚系列（例えば、３種全ての系列）の細胞型へと分化する能力を維持することを可能にする細胞因子または細胞成分である。これは、未分化状態の特異的マーカー（例えば、Ｏｃｔ  ３／４（Ｏｃｔ  ３Ａ））および／または高度な拡大増殖能力のマーカー（例えば、テロメラーゼ）の発現によって示され得る。
【０１７１】
（薬学的処方物）
特定の実施形態において、上記細胞集団は、送達に適合した、および送達に適した（すなわち、生理学的に適合性の）組成物内に存在する。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、膵島への投与のための細胞の純度は、約１００％（実質的に均質）である。他の実施形態において、それは、９５％〜１００％である。いくつかの実施形態において、それは、８５％〜９５％である。特に、他の細胞との混合物にある場合、そのパーセンテージは、約１０％〜１５％、１５％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜９５％であり得る。あるいは単離／純度は、細胞倍加に関して表され得る（ここで細胞は、例えば、１０〜２０回、２０〜３０回、３０〜４０回、４０〜５０回、またはこれより多くの細胞倍加を受けている）。
【０１７３】
（投与）
ヒトまたは他の哺乳動物に対する用量（すなわち、細胞の数）は、当業者によって、過度の実験なくして、本開示、本明細書で引用された文書、および当該分野での知識から決定され得る。本発明の種々の実施形態に従って使用されるのに最適な用量は、多くの因子に依存し、それら因子としては以下が挙げられる：処置される疾患およびその病期；ドナーの種、ドナーの健康状態、性別、年齢、体重、および代謝速度；ドナーの免疫応答性；施されている他の治療；ならびに上記ドナーの病歴または遺伝子型から予期される潜在的合併症。パラメーターとしてはまた、以下が挙げられ得る：上記細胞が、同系であるのか、自己由来であるのか、同種異系であるのか、または異種であるのか；それらの効力；標的化すべき部位および／または分布；ならびにこのような上記部位の特徴（例えば、細胞への接近可能性）。さらなるパラメーターとしては、他の因子（例えば、増殖因子およびサイトカイン）との共投与が挙げられる。所定の状況における最適な用量はまた、上記細胞が処方される方法、それらが投与される方法（例えば、灌流、器官内など）、および上記細胞が、投与後の標的部位において局在化する程度を考慮に入れる。
【０１７４】
（組成物）
本発明はまた、本明細書に記載される効果のうちのいずれかを達成するための特定の効力を有する細胞集団に関する。上記のように、これら集団は、所望の効力を有する細胞を選択することによって確立される。これら集団は、他の組成物（例えば、特定の効力を有する集団を含む細胞バンク、および特定の所望の効力を有する細胞集団を含む薬学的組成物）を作製するために使用される。
【実施例】
【０１７５】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、膵島ドナーおよび移植レシピエントとして全ての手順において使用した。
【０１７６】
（ヒトＭＡＰＣの調製および特徴付け）
【０１７７】
（ＭＡＰＣ拡大増殖培地の調製）
【０１７８】
ＤＭＥＭを、ＭＣＤＢ−２０１溶液と６０：４０  容積：容積比で混合する。
【０１７９】
５００ｍＬ  基礎培地に、以下の試薬を補充する；
（ａ）１ｍＬの５００×インスリン−トランスフェリン−セレン。
（ｂ）２．５ｍＬの１００×リノール酸−ウシ血清アルブミン。
（ｃ）５ｍＬの１０，０００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン−ストレプトマイシン。
（ｄ）５ｍＬの１０−４Ｍ  Ｌ−アスコルビン酸。
（ｅ）１００μＬの５０μｇ／ｍＬ  ｈＰＤＧＦ。
（ｆ）２００μＬの２５μｇ／ｍＬ  ｈＥＧＦ。
（ｇ）１００μＬ  ０．２５ｍＭ  デキサメタゾン。
（ｈ）ウシ胎仔血清を１８％になるまで。
【０１８０】
（フィブロネクチンコーティング溶液の調製）
【０１８１】
１×フィブロネクチン（１００ｎｇ／ｍＬ）コーティング溶液を、５０μＬの０．１％
フィブロネクチンを５００ｍＬのＰＢＳへと希釈することによって作製する。その溶液を、４℃で貯蔵し得る。
【０１８２】
Ｔ７５培養フラスコを、少なくとも３０分間、３７℃、５．５％  ＣＯ２インキュベーター中で、５ｍＬ  コーティング溶液で被覆する。
【０１８３】
ウシ骨髄吸引物からのＭＡＰＣ単離
【０１８４】
新鮮な骨髄を使用し得るが、吸引物はまた、一晩貯蔵され得る。その吸引物を、等容積のＰＢＳが入った５０ｍＬ  遠心チューブへと移す。このうちの２０ｍＬを、２０ｍＬ  Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７の頂部に重層する。これを１，０００×ｇ、２０分間、室温で遠心分離する。その単核細胞層を集め、５０ｍＬへとＰＢＳで希釈する。これを、３５０×ｇで５分間、遠心分離する。その上清を除去し、上記細胞を、５０ｍＬのＰＢＳ中で再懸濁する。これを、３５０×ｇで５分間、遠心分離する。その上清を除去し、上記細胞を、およそ１〜２ｍＬのＰＢＳ中で再懸濁する。上記細胞を、１５ｍＬの培地中に密度０．５〜１．０×１０６細胞／ｃｍ２で、１×フィブロネクチン被覆Ｔ７５フラスコ上に播種する。上記細胞を、５．５％  ＣＯ２、５％  Ｏ２中、３７℃でインキュベートする。２４時間後、培地を除去し、細胞を約３回、５ｍＬのＰＢＳですすいで、非接着細胞を除去する。拡大増殖のために、１０ｍＬの新鮮な培地を添加する。上記細胞を、５〜８日間培養する。その培養培地を２〜３日ごとに交換する。細胞は、クローン性の拡大増殖を受け、明瞭な細胞クラスターとして目で見えるようになる。クローン性の拡大増殖したクラスターが５０〜７０％コンフルエントに（クラスター内で）達したときに、上記細胞を継代する。
【０１８５】
（ＭＡＰＣ継代培養および拡大増殖）
上記細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液で剥離する。その反応を、集めた拡大増殖培地を添加することによって停止させる。上記細胞を、５分間、３５０×ｇで遠心分離する。次いで、上記細胞をＭＡＰＣ拡大増殖培地中で再懸濁し、密度５００  細胞／ｃｍ２で１×フィブロネクチン被覆フラスコに播種する。次いで、それらを上記のようにインキュベートする。上記細胞を、１日おきに継代して、低密度で培養物を維持する。
【０１８６】
以下の指示が特に言及される。血清は、有意な生存能の源を提供し得る。最適血清濃度は、血清バッチの特徴に依存して変動し得る。よって、種々の血清ロットが、最適なＭＡＰＣ拡大増殖を支持するそれらの能力についてスクリーニングされる。適切なバッチからの多量の血清が、確保され得る。理想的には、ＭＡＰＣは、２００〜２，０００  細胞／ｃｍ２の間の密度で播種され、より高い密度は回避される。それらは、コンフルエント未満（３０〜７０％）において定期的に継代される。これらの条件を使用して、ＭＡＰＣは、１５〜２０継代（５０〜７０回の集団倍加）までにわたって慣用的に拡大増殖され得る。
【０１８７】
この研究において使用されるヒトＭＡＰＣ（ｎ＝２）を、上記のように骨髄から単離した。約２４回の細胞倍加において、上記細胞を「細胞バンク」として凍結した。次いで、上記細胞を解凍し、Ｕ．Ｓ．  ２０１２／０３０８５３１（バイオリアクター中でＭＡＰＣを拡大増殖させるための方法を開示するために参考として援用される）に記載されるとおり、Ｑｕａｎｔｕｍバイオリアクター中で約２７回の集団倍加まで拡大増殖させた。この閉じた自動化培養システムは、滅菌閉鎖ループ、コンピューター制御された培地およびガス交換機に接続された合成中空繊維バイオリアクターから構成される。このバイオリアクターは、拡大増殖表面積２．１ｍ２を生じる約１１，０００本の繊維を含む。このバイオリアクターをフィブロネクチンで被覆した後、細胞を、その中空繊維の内部に約２２００／ｃｍ２で播種し、ＭＡＰＣ培養培地中で拡大増殖させた。細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡを使用して５〜６日後に採取した（フィブロネクチンコーティング）。次いで、その採取した細胞を、バイオリアクター中で集団倍加がおよそ３３回まで拡大増殖させた。それらを、約４００／ｃｍ２で播種した。そのコーティングは、クリオプレピシテート（ｃｒｙｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）であった。それら細胞を（集団倍加３３回で）、本願において例示される実験で使用した。
【０１８８】
ヒトＭＡＰＣの表現型分析を、分化クラスター３（ＣＤ３）、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、Ｆｌｋ１、ＨＬＡ−ＡＢＣ、およびＨＬＡ−ＤＲを認識する蛍光色素結合体化抗体（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を使用して行った。獲得を、ＧａｌｌｉｏｓＴＭ  マルチカラーフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｓｕａｒｌｅｅ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用することによって行った。サンプルの分析のために、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．，  Ａｓｈｌａｎｄ，  ＯＲ）ソフトウェアを使用した。
【０１８９】
無細胞上清を、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、エオタキシン、エオタキシン−３、可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１（ｓＦｌｔ１）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、可溶性細胞内接着分子−１（ｓＩＣＡＭ−１）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−１α（ＩＬ１α）、ＩＬ１β、ＩＬ１０、ＩＬ１２  ｐ７０、ＩＬ１２／ＩＬ２３ｐ４０、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＦＮ−γ誘導性タンパク質−１０（ＩＰ−１０）、単球化学誘引物質タンパク質（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１（ＭＣＰ−１）、ＭＣＰ−４、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、マクロファージ炎症性タンパク質−１α（ＭＩＰ−１α）、ＭＩＰ−１β、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、胸腺および活性化調節ケモカイン（ｔｈｙｍｕｓ−  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）（ＴＡＲＣ）、Ｔｉｅ２、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、ＴＮＦ−β、可溶性血管細胞接着分子−１（ｓＶＣＡＭ−１）、血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）、ＶＥＧＦ−Ｃ、およびＶＥＧＦ−Ｄについて、マルチプレックス電気化学発光法（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）によって、製造業者のプロトコルに従ってアッセイした。
【０１９０】
ヒトＭＡＰＣの抗原性潜在能力を、記載されるように［Ｍｏｖａｈｅｄｉ  Ｂ，ら，  （２００８）  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５７：  ２１２８−２１３６］、ひよこ漿尿膜（ＣＡＭ）において試験した。
【０１９１】
（限界量同系膵島移植糖尿病モデル）
レシピエントにおいて糖尿病を誘導するために、アロキサン（９０ｍｇ／ｋｇ；  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の単回静脈内注射を、雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与し、動物を、２回連続非絶食時尾静脈血中グルコース濃度≧２００ｍｇ／ｄｌをＡｃｃｕＣｈｅｃｋ  Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｖｉｌｖｏｏｒｄｅ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって測定した後に、糖尿病であると見做した。移植前に、コラゲナーゼ消化によって単離した２〜３週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの膵島を洗浄し、計数し、場合によっては、ヒトＭＡＰＣと混合した［Ｂａｅｋｅ  Ｆ，ら，  （２０１２）
Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ５５：  ２７２３−２７３２］。その後、細胞ペレットを、シリコンマイクロチューブ（ｓｉｌｉｃｏｎ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｉｎｇ）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）に移し、５分間、１５００ｒｐｍにおいて遠心分離した。移植の間に、マウスに麻酔をかけ、左腎を、腰部切開（ｌｕｍｂａｒ  ｉｎｃｉｓｉｏｎ）によって露出させた。糖尿病レシピエントマウスに、１５０個の膵島のみを、１５０個の膵島および２５０，０００個のヒトＭＡＰＣを別個のペレット（ＳＥＰ）として、または１５０個の膵島および２５０，０００個のヒトＭＡＰＣを複合物ペレット（ＭＩＸ）として、腎被膜下に与えた。各レシピエントの尾静脈からの非絶食時血中グルコースレベルを、移植後第１週の間に毎日測定し、その後、週に３回測定した。マウスが、３回連続測定後に血中グルコースレベル＜２００ｍｇ／ｄＬを有する場合に、治癒したと見做した。全ての膵島移植を、無作為で全ての実験群において行った。膵島移植後の２週目および５週目に、移植片を有する腎臓を取り出し、４％  フォルムアルデヒド中で固定し、続いて、パラフィン包埋するか、またはＲＮＡ単離のために使用した。
【０１９２】
（生理学的研究）
耐糖能試験を、１６時間の絶食後に行った。マウスにＤ−グルコース（２ｇ／ｋｇ  体重）をｉｐ注射し、血中グルコースレベルを、示された時間に測定した。
【０１９３】
血清インスリンおよびＣペプチド決定のために、伏在静脈から血液を集めた。血清を遠心分離によって単離し、膵臓ホルモンのレベルを、超高感度酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ；Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＭＡ）によって決定した。
【０１９４】
（形態計測および免疫組織化学検査）
移植片を有する腎臓を、パラフィン包埋し、６μｍ切片を、全移植片領域から得た。インスリン（モルモット、Ｄａｋｏ  Ｂｅｌｇｉｕｍ  ｎｖ／ｓａ，  Ｈｅｖｅｒｌｅｅ，
Ｂｅｌｇｉｕｍ）、グルカゴン（マウス、Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）、ソマトスタチン（ラット、Ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）、およびエンドムチン（ラット、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）染色を使用して、Ｖｅｎｔａｎａシステム（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）の助けを借りて、それぞれ、β細胞量および血管密度を評価した。エンドムチン抗体は、マウス起源であってヒト起源ではないエンドムチンの検出に推奨される。
【０１９５】
β細胞および血管の容積の定量のために、全ての画像を、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ
ＴＥ２０００−Ｅ顕微鏡を使用し、４０×倍率対物レンズおよび大画像捕捉特徴を使用して捕捉した。その結果、各切片の移植片領域全体を、一度に示ことができた。膵島移植片の内分泌区画内のインスリン＋、グルカゴン＋およびソマトスタチン＋の面積、ならびにエンドムチン＋の面積を、記載されるように［Ｃｏｐｐｅｎｓ  Ｖ，ら  （２０１３）
Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ５６：  ３８２−３９０］、全移植片のうちのおよそ１５％（すなわち、５番目の切片毎）に、ＩｍａｇｅＪ／Ｆｉｊｉソフトウェアによって半自動的に測定した。血管／β細胞比を、（血管面積／インスリン＋面積）×１００％として計算した。血管密度を、膵島内血管／ｍｍ２の数字として計算した。
【０１９６】
（定量的ＰＣＲ）
膵島移植片ＲＮＡを、記載されるように［Ｄｉｎｇ  Ｌ，ら  （２０１５）  Ｃｅｌｌ
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２４：  １５８５−１５９８］単離し、１μｇのアリコートを、ｃＤＮＡへと逆転写した（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ；  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）。次いで、ｃＤＮＡを、Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘまたはＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と組み合わせた遺伝子特異的ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブのいずれかを使用して、遺伝子特異的順方向および逆方向プライマーを使用する定量的ＰＣＲに供した。プライマーおよびプローブの配列を、補足表１に列挙する。各定量的反応を、二連または三連で行い、各実験群の６〜１１匹のマウス由来の膵島移植片を、独立して試験した。相対的ｍＲＮＡ発現値を、ΔΔＣｔ法を使用して計算する。全てのサンプルを、ハウスキーピング遺伝子としてのアクチン（Ａｃｔｉｎｅ）、ＨＰＲＴおよびＲＰＬ２７の平均に対して正規化した。各標的遺伝子のバックグランド量を、非移植腎から計算した。結果を、平均±ＳＥＭとして表す。
【０１９７】
（統計）
統計を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）で計算した。カイ二乗検定を適用して、種々の群間の糖尿病改善率の間の有意差を確認した。全ての数値を、平均±ＳＥＭとして表した。有意性を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定またはＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を使用して決定し、ｐ＜０．０５の値を有意と見做した。
【０１９８】
（複合物混合物）
１５０個の膵島を３０μｌ  ＰＢＳ中でＭＡＰＣと混合し、この複合物を、シリコーンマイクロチューブへと移し、５分間、１５００ｒｐｍで遠心分離し、そのペレットを、腎被膜下に移植した。
【０１９９】
（結果）
【０２００】
（ヒトＭＡＰＣは、血管新生性増殖因子を分泌し、インビボＣＡＭアッセイにおいて新血管新生潜時能力を有する）
ヒトＭＡＰＣは、ＨＬＡ−ＡＢＣの低発現（＜２５％）を示し、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ３、Ｆｌｋ１／ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ、ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１、およびＣＤ３４の発現を欠いた（＜１％）。これらは、それぞれ、ＭＨＣクラスＩＩおよび共刺激分子、Ｔ細胞および内皮細胞の代表的細胞表面マーカーである（図１Ａ）。ヒトＭＡＰＣは、ＣＤ４４およびＣＤ１０５に関して陽性であった（＞９５％）［Ｒｅａｄｉｎｇ  ＪＬ，ら  （２０１３）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９０：  ４５４２−４５５２］。それらの表面マーカーシグナチャーは、幹細胞の任意の他の公知のクラスからそれらを区別する特有の表現型を規定する［Ｒｅａｄｉｎｇ  ＪＬ，ら  （２０１３）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９０：  ４５４２−４５５２］。
【０２０１】
ヒトＭＡＰＣの培養上清を、炎症促進性パネル、サイトカインパネル、ケモカインパネル、血管新生パネルおよび血管炎症パネルを含むヒトバイオマーカー４０−Ｐｌｅｘキットで分析した（図１Ｂ）。上記細胞は、多くの血管新生性増殖因子（ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ−Ａ、−Ｃおよび−Ｄ）、ＰｌＧＦ、ｓＦｌｔ−１、ｂＦＧＦ、およびＩＬ８が挙げられる）を産生した。他方で、上記細胞は、種々のサイトカイン（すなわち、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２ｐ７０、ＩＬ１２／ＩＬ２３ｐ４０、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７Ａ、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦ−β）およびケモカイン（エオタキシン、エオタキシン−３、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−４、ＭＤＣ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＴＡＲＣ）の無視できる程度の分泌を有した（データは示さず）。
【０２０２】
ヒトＭＡＰＣの新血管形成潜時能力を、ＣＡＭ血管新生モデルを使用して試験した。５μｇ  組換えヒトＶＥＧＦを接種すると、移植物に向かう血管の数が顕著に増大した（図１Ｃ）。１３日目には、５０μｇ  ＢＳＡを含むコントロール移植物と比較して、およそ４．５倍多くの血管が存在した。ヒトＭＡＰＣ（２．５×１０５）は、コントロールと比較して血管形成を３．５倍、有意に増大した（図１Ｃ）。
【０２０３】
（複合物ペレットとしての膵島−ヒトＭＡＰＣの共移植は、限界量膵島移植の転帰を改善する）
移植した膵島の数を、レシピエントのうちのおよそ５０％において正常血糖を達成するちょうど境目である「限界膵島量」を決定するために滴定した。５０個の同系Ｃ５７ＢＬ／６膵島の移植は、高血糖症を改善しなかった（７匹のマウスのうち０匹）のに対して、３００個の膵島が腎被膜下に移植された場合には、１００％（４匹のマウスのうち４匹）が正常血糖を達成した。本発明者らは、限界膵島数が、およそ１５０個の膵島であると評価した（４５匹のマウスのうち２５匹、５６％が移植後５週間で正常血中グルコース濃度を達成）。この膵島数を、さらなる実験のために選択した。
【０２０４】
次に、本発明者らは、別個のペレットまたは複合物ペレットとしてヒトＭＡＰＣとともに共移植した限界膵島量の転帰を調査し、移植した動物の血中グルコースレベルを５週間までモニターした。別個のペレット（ＳＥＰ）としての膵島とヒトＭＡＰＣとの共移植は、膵島のみを移植したマウスと比較して、平均血中グルコース濃度を僅かに改善した。興味深いことに、膵島−ヒトＭＡＰＣ複合物（ＭＩＸ）を受容したマウスは、２週間以上の全ての測定された時点で、よりよい血糖制御を有した（図２Ａ）。移植の３週間後に、膵島−ヒトＭＡＰＣ複合物を移植したマウスのうちの８１％（ＭＩＸ群において１６匹のマウスのうち１３匹）は、別個のペレットとして膵島−ヒトＭＡＰＣを移植したマウスのうちの５０％（ＳＥＰ群において２６匹のうち１３匹；ｐ＜０．０５）および膵島のみを移植したマウスにおいて４７％（コントロール群において４５匹のマウスのうちの２１匹；ｐ＜０．０５）と比較して、正常血糖であった（図２Ｂ）。観察期間の最後までに（移植後５週目）、膵島−ヒトＭＡＰＣを共移植したマウスのさらにより高い割合が、膵島のみを移植したマウスと比較して糖尿病を改善した（コントロール群において５６％に対して、ＭＩＸ群において９４％、ｐ＜０．０１およびＳＥＰ群において８５％、ｐ＜０．００１）。腎摘出術後、正常血糖の膵島レシピエントの血中グルコース濃度は、重篤な高血糖へと急速に進行した。これは、代謝的グルコース制御の改善が、移植した同系膵島から生じていたのであって、膵島レシピエントのアロキサン処置膵臓における残余の膵島の再生から生じていたのではないことを示す（図５Ａ）。さらに、０日目（コントロール群、ＳＥＰ群およびＭＩＸ群に関して、それぞれ２２．８±０．２７ｇ、２３．５±０．２ｇおよび２２．９±０．２１ｇ、ｎ＝４０〜５２）または移植後５週目（コントロール群、ＳＥＰ群およびＭＩＸ群に関して、それぞれ２５．６±０．３３ｇ、２６．２±０．３２ｇ、および２５．４±０．２７ｇ、ｎ＝４０〜５２）において、異なる実験群からの移植レシピエント間で、体重に有意差は存在しなかった（図５Ｂ）。
【０２０５】
血清マウスインスリンおよびＣペプチドレベルを、膵島移植片機能の指数として、移植後２週間および５週間測定した。移植後２週目で、インスリンおよびＣペプチド濃度は、種々の実験群間で有意に異ならなかった（図６Ａ）。しかし、移植後５週目では、Ｃペプチド値は、膵島のみのマウスからの値（コントロール群において２３２±５２ｐｍｏｌ／ｌ；ｎ＝１０）と比較して、別個のペレット（ＳＥＰ群において３０４±８０ｐｍｏｌ／ｌ；ｎ＝１０、ｐ＜０．０１）ならびに複合物ペレット（ＭＩＸ群において２８２±７７ｐｍｏｌ／ｌ；ｎ＝１０、ｐ＝０．０５）として膵島−ヒトＭＡＰＣを共移植したマウスにおいて有意に良好であった（図６Ｂ）。
【０２０６】
膵島移植物のインスリン分泌能を調査するために、一連の腹腔内耐糖能試験（ＩＰ−ＧＴＴ）を移植後２週目および５週目に行った。移植後２週目に、研究群の間でグルコースクリアランスに有意差はなかった。他方で、移植後５週目に、膵島−ヒトＭＡＰＣ複合物（ＭＩＸ）を共移植したマウスは、膵島およびヒトＭＡＰＣを別個のペレット（ＳＥＰ）としてまたは膵島のみ（コントロール）を移植したマウスより効率的にグルコースを除去した（図２Ｃ〜Ｄ）。ＩＰ−ＧＴＴの所見をさらに裏付けるために、曲線下面積（ＡＵＣ）を計算したところ、膵島およびヒトＭＡＰＣを別個のペレット（ＳＥＰ）として移植した群（ｐ＜０．０１）または膵島のみを移植した群（コントロール）（ｐ＜０．０１）と比較して、膵島−ヒトＭＡＰＣ複合物（ＭＩＸ）を移植した群との間で有意差があることが見出された（図２Ｃ〜Ｄ）。
【０２０７】
（膵島−ヒトＭＡＰＣ複合物を移植したマウスにおけるβ細胞およびα細胞容積、ならびに血管形成の増大）
共移植群および膵島のみの群からの移植片を、それらの遺伝子プロフィール、細胞構築および血管再生プロセスに関して評価した。インスリンおよびグルカゴンのｍＲＮＡ発現レベルは、移植の２週間後に、膵島のみの群（コントロール）のものと比較して、膵島−ヒトＭＡＰＣ複合物（ＭＩＸ）を共移植したマウスにおいてより高かった。この時点においてソマトスタチンｍＲＮＡ発現レベルに差異は全くなかった。移植後５週目に、研究した内分泌ホルモンの移植片内ｍＲＮＡレベルは、全ての群において匹敵した。これらの尺度（ｍｅａｓｕｒｅ）は、移植片の組織構造によって確証され、これは膵島のみを移植したマウス（コントロール）と比較して、膵島−ヒトＭＡＰＣ複合物（ＭＩＸ）を移植したマウスの移植片においてより高いインスリン陽性領域およびグルカゴン陽性領域を示した（図３Ｂ〜Ｃ）。
【０２０８】
血管形成を、エンドムチン発現（血管内皮細胞のマーカー）によって測定した。移植後の２週目に、移植片血管密度および面積、ならびにインスリン＋面積に対する血管面積の比は、研究した群間で異ならなかった。移植後の５週目に、増強された移植片血管再生は、別個のペレット（ＳＥＰ）として膵島−ヒトＭＡＰＣを移植したマウスまたは膵島のみ（コントロール）を移植したマウスと比較して、膵島−ヒトＭＡＰＣ複合物（ＭＩＸ）を共移植したマウスにおいて観察された。ＳＥＰ移植片において７０２±１０６血管／ｍｍ２および膵島のみの移植片において５１５±５２血管／ｍｍ２と比較して、ＭＩＸ移植片において、１２５６±２０３血管／ｍｍ２を検出した（ともにｐ＜０．０５；図４Ｂ）。新血管新生の別の指数、移植片血管面積は、ＳＥＰ移植片（２．０４±０．５７％、ｎ＝５）または膵島のみの移植片（１．２６±０．２５％；ｎ＝４、ｐ＜０．０５、図４Ｂ）においてより、ＭＩＸ移植片（４．８５±１．３２％、ｎ＝５）において有意に高かった。さらに、ＭＩＸ移植片を移植したマウスは、インスリン陽性面積あたりの血管の比が、ＳＥＰ移植片および膵島のみの移植片より高かった（０．０７９±０．０２７血管／膵島
対  ０．０１９±０．００６血管／膵島および０．０１４±０．００３血管／膵島、ともにｐ＜０．０１）（図４Ｂ）。
【０２０９】
【表１】
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Ｆ：順方向；  Ｒ：逆方向；  Ｐ；プローブ；  ＳＹＢＲ：Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ；  Ｃｑ（定量サイクル、Ｃｔ（閾値サイクル）ともいわれる）
【図１】
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【図２】
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【図３ＡＢ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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