(57)【要約】【課題】本発明の目的は、ケラチノサイトのオートファジー機能を利用したスクリーニング系や評価系を確立することであるである。【解決手段】メラノサイトとケラチノサイトを共培養し、共培養後のケラチノサイトのオートファジー活性を利用することによって、ケラチノサイトのオートファジー活性を増大又は抑制する物質のスクリーニングや、被験物質がケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす効果の評価が可能になる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を増大又は抑制する物質をスクリーニングする方法であって、
候補物質の存在下でケラチノサイトとメラノサイトを共培養する第１工程、
前記第１工程後のケラチノサイトにおけるオートファジー活性を測定する第２工程、及び
前記第２工程において、オートファジー活性を増大又は抑制した候補物質を、オートファジー活性促進剤又はオートファジー活性抑制剤として選定する第３工程
を含む、スクリーニング方法。
【請求項２】
前記第１工程が、多孔質膜を底部に有するカルチャーインサートを用いて培養容器を区切ってケラチノサイトとメラノサイトを隔てて共培養する工程であり、
ケラチノサイトとメラノサイトの内、一方の細胞をカルチャーインサートの内側表面の多孔質膜上に配し、他方の細胞をカルチャーインサートの外側表面の多孔質膜に担持させて行う、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記第１工程が、ケラチノサイトとメラノサイトが接触した状態で共培養される、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記第２工程において、オートファジー活性の測定がオートファジー小胞を選択的に染色することにより行われる、請求項１〜３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
被験物質が、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響を評価する方法であって、
被験物質の存在下でケラチノサイトとメラノサイトを共培養する第Ｉ工程、
前記第Ｉ工程後のケラチノサイトにおけるオートファジー活性を測定する第ＩＩ工程、及び
前記第ＩＩ工程において測定されたオートファジー活性に基づいて、被験物質がメラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響を判定する第ＩＩＩ工程、
を含む、評価方法。
【請求項６】
前記第Ｉ工程が、多孔質膜を底部に有するカルチャーインサートを用いて培養容器を区切ってケラチノサイトとメラノサイトを隔てて共培養する工程であり、
ケラチノサイトとメラノサイトの内、一方の細胞をカルチャーインサートの内側表面の多孔質膜上に配し、他方の細胞をカルチャーインサートの外側表面の多孔質膜に担持させて行う、請求項５に記載の評価方法。
【請求項７】
前記第Ｉ工程が、ケラチノサイトとメラノサイトが接触した状態で共培養される、請求項５に記載の評価方法。
【請求項８】
前記第ＩＩ工程において、オートファジー活性の測定がオートファジー小胞を選択的に染色することにより行われる、請求項５〜７のいずれかに記載の評価方法。
【請求項９】
メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子を同定する方法であって、
ケラチノサイトとメラノサイトを共培養する第ｉ工程、
前記第ｉ工程後の培養液中の分泌物質を特定する第ｉｉ工程、
前記第ｉｉ工程で特定された分泌物質の存在下で、ケラチノサイトを培養する第ｉｉｉ工程、
前記第ｉｉｉ工程後のケラチノサイトにおけるオートファジー活性を測定する第ｉｖ工程、及び
前記第ｉｖ工程において、オートファジー活性を抑制した分泌物質を、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子として同定する第ｖ工程
を含む、同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を増大又は抑制する物質のスクリーニング方法に関する。また、本発明は、被験物質が、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響を評価する方法に関する。更に、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚表皮におけるシミ、そばかす、くすみ、黒ずみ、肝斑、老人性色素斑等の色素沈着は、紫外線曝露、ホルモンの異常や物理的な刺激等が原因となってメラニンが過剰に形成され、これが皮膚内に沈着することによって生じることが分かっている。また、皮膚真皮において、コラーゲン合成機能の低下は、たるみ、しわ等の皮膚老化の要因になっていることが分かっている。従来、色素沈着や皮膚老化等の皮膚症状を予防又は改善できる成分の探索は精力的に行われており、様々な美容的又は薬学的効果を有する外用製剤が開発されている。
【０００３】
一方、近年、外用製剤の性能の向上に対する消費者の要望の高まりを受けて、より優れた効能を有する成分の新たな探索が求められている。また、優れた外用製剤の開発には、効能が知られている既知成分の機能性を検証する評価系を確立することも重要になっている。
【０００４】
従来、メラノサイト内で形成されたメラノソームがケラチノサイトに受け渡され、ケラチノサイト内にメラニン色素が留まって沈着することにより、皮膚のシミ等の暗色化（メラニン沈着）が促進されることが解明されている（例えば、非特許文献１参照）。そこで、皮膚組織に存在するメラノサイトとケラチノサイトの機能の解析を進めることは、優れた美白効果を有する成分のスクリーニング手法や、美白効果を有する既知成分の評価手法を確立する上で有効になる。
【０００５】
また、ケラチノサイトのオートファジーは、ケラチノサイトから受け渡されたメラノソームの分解や、コラーゲン合成機能の維持に寄与しており、ケラチノサイトのオートファジー活性の向上は、色素沈着や皮膚老化等の皮膚症状の予防又は改善につながることが分かっている。そこで、ケラチノサイトのオートファジー活性に影響を及ぼす要因を解明することは、外用製剤に使用される成分のスクリーニング方法や評価手法を確立する上で有効になる。
【０００６】
しかしながら、従来、メラノサイトがケラチノサイトに及ぼす影響については、メラノソームの受け渡し以外は十分に解明されておらず、ケラチノサイトとメラノサイトを使用したスクリーニング系や評価系は確立できていないのが現状である。また、従来、ケラチノサイトのオートファジー活性を指標としたスクリーニング系や評価系も確立できていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】石田森衛ら、「メラノソームの形成・成熟・輸送の仕組み」、顕微、Vol.48、No.1、26-32頁、2013年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ケラチノサイトのオートファジー機能は、メラノサイトから送り込まれたメラニンの分解、コラーゲン合成機能の維持等で重要な役割を果たしており、ケラチノサイトのオートファジー機能を利用したスクリーニング系や評価系を確立できれば、従来技術とは異なる指標に基づいて、外用製剤に使用される成分のスクリーニングや評価が可能になる。
【０００９】
そこで、本発明の目的は、ケラチノサイトのオートファジー機能を利用したスクリーニング系や評価系を確立することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、メラノサイトがケラチノサイトに及ぼす影響について検討を進めたところ、メラノサイトとケラチノサイトを共培養すると、ケラチノサイトのオートファジー活性が低下するという新たな知見を得た。そして、メラノサイトとケラチノサイトを共培養し、共培養後のケラチノサイトのオートファジー活性を利用することによって、ケラチノサイトのオートファジー活性を増大又は抑制する物質のスクリーニングや、被験物質がケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす効果の評価が可能になることを見出した。
【００１１】
更に、本発明者は、メラノサイトとケラチノサイトを共培養すると、ケラチノサイトのオートファジー活性が低下するという新たな知見に基づいて、当該共培養によってメラノサイトがケラチノサイトのオートファジー活性を低下させる物質を分泌していることを突き止めた、そして、本発明者は、メラノサイトが分泌する、ケラチノサイトのオートファジー活性を低下させる物質を特定できる試験系を見出した。
【００１２】
本発明は、これらの知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を増大又は抑制する物質をスクリーニングする方法であって、
候補物質の存在下でケラチノサイトとメラノサイトを共培養する第１工程、
前記第１工程後のケラチノサイトにおけるオートファジー活性を測定する第２工程、及び
前記第２工程において、オートファジー活性を増大又は抑制した候補物質を、オートファジー活性促進剤又はオートファジー活性抑制剤として選定する第３工程
を含む、スクリーニング方法。
項２．  前記第１工程が、多孔質膜を底部に有するカルチャーインサートを用いて培養容器を区切ってケラチノサイトとメラノサイトを隔てて共培養する工程であり、
ケラチノサイトとメラノサイトの内、一方の細胞をカルチャーインサートの内側表面の多孔質膜上に配し、他方の細胞をカルチャーインサートの外側表面の多孔質膜に担持させて行う、項１に記載のスクリーニング方法。
項３．  前記第１工程が、ケラチノサイトとメラノサイトが接触した状態で共培養される、項１に記載のスクリーニング方法。
項４．  前記第２工程において、オートファジー活性の測定がオートファジー小胞を選択的に染色することにより行われる、項１〜３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
項５．  被験物質が、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響を評価する方法であって、
被験物質の存在下でケラチノサイトとメラノサイトを共培養する第Ｉ工程、
前記第Ｉ工程後のケラチノサイトにおけるオートファジー活性を測定する第ＩＩ工程、及び
前記第ＩＩ工程において測定されたオートファジー活性に基づいて、被験物質がメラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響を判定する第ＩＩＩ工程、
を含む、評価方法。
項６．  前記第Ｉ工程が、多孔質膜を底部に有するカルチャーインサートを用いて培養容器を区切ってケラチノサイトとメラノサイトを隔てて共培養する工程であり、
ケラチノサイトとメラノサイトの内、一方の細胞をカルチャーインサートの内側表面の多孔質膜上に配し、他方の細胞をカルチャーインサートの外側表面の多孔質膜に担持させて行う、項５に記載の評価方法。
項７．  前記第Ｉ工程が、ケラチノサイトとメラノサイトが接触した状態で共培養される、項５に記載の評価方法。
項８．  前記第ＩＩ工程において、オートファジー活性の測定がオートファジー小胞を選択的に染色することにより行われる、項５〜７のいずれかに記載の評価方法。
項９．  メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子を同定する方法であって、
ケラチノサイトとメラノサイトを共培養する第ｉ工程、
前記第ｉ工程後の培養液中の分泌物質を特定する第ｉｉ工程、
前記第ｉｉ工程で特定された分泌物質の存在下で、ケラチノサイトを培養する第ｉｉｉ工程、
前記第ｉｉｉ工程後のケラチノサイトにおけるオートファジー活性を測定する第ｉｖ工程、及び
前記第ｉｖ工程において、オートファジー活性を抑制した分泌物質を、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子として同定する第ｖ工程
を含む、同定方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、メラノサイトとケラチノサイトを共培養することによってケラチノサイトのオートファジー活性が低下するという現象を利用した、外用製剤に使用される成分のスクリーニング方法や評価方法が提供される。具体的には、本発明のスクリーニング方法によれば、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を増大又は抑制する物質を選定することができる。また、本発明の評価方法によれば、機能が公知又は未知の被験物質について、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響を評価することができる。
【００１４】
更に、本発明の同定方法によれば、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子を同定することができ、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性の作用機序の解明等を進める上で福音をもたらし得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ケラチノサイトとメラノサイトとの共培養の実施態様の例を模式的に示した図である。
【図２】後述する第１実施態様（トランスウェル両面培養法）でラチノサイトとメラノサイトの共培養する際の手順の一例を模式的に示した図である。
【図３】実施例１において、ケラチノサイトとメラノサイトの共培養、及びケラチノサイトの単独培養を行った後に、ケラチノサイトのオートファジーを染色した結果である。
【図４】実施例１において、ビドリゲル膜でケラチノサイトとメラノサイトを隔てて共培養を行った後に、ケラチノサイトとメラノサイトを電子顕微鏡により観察した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、候補物質の中から、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を増大又は抑制する物質を選定する方法である。
具体的には、本発明のスクリーニング方法は、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を増大又は抑制する物質をスクリーニングする方法であって、候補物質の存在下でケラチノサイトとメラノサイトを共培養する第１工程、前記第１工程後のケラチノサイトにおけるオートファジー活性を測定する第２工程、及び前記第２工程において、オートファジー活性を増大又は抑制した候補物質を、オートファジー活性促進剤又はオートファジー活性抑制剤として選定する第３工程を含むことを特徴とする。以下、本発明のスクリーニング方法について工程毎に説明する。
【００１７】
［第１工程］
第１工程では、候補物質の存在下でケラチノサイトとメラノサイトを共培養する。具体的には、第１工程では、候補物質を含む培地中でケラチノサイトとメラノサイトの共培養が行われる。
【００１８】
候補物質とは、スクリーニングに供され、オートファジー活性促進剤又はオートファジー活性抑制剤に該当するか否かの判定に供される物質である。候補物質の種類については、特に制限されず、天然物、合成物、半合成物が挙げられる。候補物質として、具体的には、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、植物エキス、動物エキス、糖類（多糖、オリゴ糖、単糖等を含む）、脂質（リン脂質、糖脂質等を含む）、界面活性剤、その他の高分子有機化合物、その他の低分子有機化合物、無機化合物、その他の生体由来化合物、それらの修飾物、それらの誘導体等が挙げられる。候補物質は、１種の化合物のみからなるものであってもよく、また２種以上の化合物が含まれるものであってもよい。
【００１９】
ケラチノサイトとメラノサイトを共培養する際の候補物質の培地中濃度については、特に制限されないが、例えば０．００００１〜１０重量％程度に設定すればよい。また、候補物質の培地中濃度は、低濃度から高濃度に段階的に設定してもよい。
【００２０】
第１工程において、候補物質の添加は、ケラチノサイト及びメラノサイトが培養器内で接着した後に行うことが望ましい。
【００２１】
第１工程で使用するケラチノサイト及びメラノサイトの由来については、特に制限されないが、ヒトにおいてオートファジー活性を増大又は抑制する候補物質をより高精度にスクリーニングするという観点から、ヒト由来であることが好ましい。
【００２２】
共培養開始時のケラチノサイトとメラノサイトの細胞数の比率については、特に制限されないが、例えば、ケラチノサイト：メラノサイトの細胞数の比率として、５０：１〜０．５：１、好ましくは２０：１〜１：１、より好ましくは１０：１〜１：１が挙げられる。
【００２３】
共培養開始時のケラチノサイトとメラノサイトの細胞濃度については、特に制限されないが、培養面積あたりの細胞数として、例えば、ケラチノサイトが５×１０3〜１×１０6個／ｃｍ2、好ましくは１×１０4〜５×１０5個／ｃｍ2、より好ましくは２×１０4〜２×１０5個／ｃｍ2；メラノサイトが５×１０3〜５×１０5個／ｃｍ2、好ましくは１×１０4〜１×１０5個／ｃｍ2、より好ましくは２×１０4〜は４×１０4個／ｃｍ2が挙げられる。
【００２４】
第１工程で行われる共培養は、ケラチノサイトとメラノサイトが物理的に接触していない状態で行われる非接触型共培養であってもよく、ケラチノサイトとメラノサイトが互いに接触した状態で行われる接触型共培養であってもよい。
【００２５】
非接触型共培養は、ケラチノサイトとメラノサイトが隔てられて、両細胞が培地を共有できる状態で培養すればよい。具体的には、非接触型共培養としては、以下に示す第１実施態様〜第３実施態様が挙げられる。
第１実施態様：多孔質膜を底部に有するカルチャーインサートを用いて培養容器を区切ってケラチノサイトとメラノサイトを隔てて培養する方法（トランスウェル法）。
第２実施態様：底部に仕切壁が設けられて２つの領域に区画化されている培養容器を用いて、ケラチノサイトとメラノサイトを隔てて培養する方法。
第３実施態様：ケラチノサイトを収容する第１培養容器と、メラノサイトを収容する第２培養容器とを有し、当該第１培養容器の側面と当該第２培養容器の側面が培地を共有できるように連通している培養装置を用いて、ケラチノサイトとメラノサイトを隔てて培養する方法。
【００２６】
前記第１実施態様の具体例として、ケラチノサイトとメラノサイトの内、一方の細胞をカルチャーインサートの内側表面の多孔質膜上に配し、他方の細胞をカルチャーインサートの外側表面の多孔質膜に担持させて行う方法（以下、トランスウェル両面培養法）が挙げられる。
【００２７】
図１に前記第１実施態様（トランスウェル両面培養法）、第２実施態様、及び第３実施態様の模式図を示す。
【００２８】
これらの非接触型共培養の方法の中でも、前記第１実施態様によるトランスウェル両面培養法は、候補物質非存在下でケラチノサイトとメラノサイトとの共培養によりケラチノサイトのオートファジー活性を低下させ易く、ケラチノサイトのオートファジー活性に影響を及ぼし易い候補物質を選定し易くなるため、好適である。
【００２９】
前記第１実施態様で使用されるカルチャーインサートの多孔質膜の素材については、特に制限されず、トランスウェル法で通常使用されるものであればよい。具体的には、カルチャーインサートの多孔質膜の素材として、コラーゲン、ポリカーボネート、ポリエステル（ポリエチレンテレフタレート等）、ポリテトラフルオロエチレン等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはコラーゲンが挙げられる。
【００３０】
また、前記第１実施態様で使用されるカルチャーインサートの多孔質膜の孔径については、細胞を透過せず、且つ培地を透過可能であることを限度として、特に制限されないが、例えば、０．０１〜５０μｍ、好ましくは０．０１〜２０μｍ、より好ましくは０．０５〜１０μｍが挙げられる。
【００３１】
前記第１実施態様によるトランスウェル両面培養法では、カルチャーインサートの内側表面の多孔質膜にケラチノサイトを配し、当該カルチャーインサートの外側表面の多孔質膜にメラノサイトを担持させてもよく、また、配置されるケラチノサイトとメラノサイトがその逆であってもよい。メラノサイトはケラチノサイトに比べて多孔質膜に強固に担持され易いという特性を踏まえれば、カルチャーインサートの内側表面の多孔質膜にケラチノサイトを配し、当該カルチャーインサートの外側表面の多孔質膜にメラノサイトを担持させることが好ましい。
【００３２】
前記第１実施態様によるトランスウェル両面培養法において、カルチャーインサートの多孔質膜の内側表面と外側表面にそれぞれ細胞を担持又は配して共培養する方法としては、例えば、以下の手順で行うことができる。
(1)先ず、カルチャーインサートの外側表面の多孔質膜を上面にして、当該多孔質膜の外側表面の外周から上に延びるリング状ホルダーを装着して容器を形成し、一方の細胞の懸濁液を入れて培養することにより、当該細胞をカルチャーインサートの外側表面の多孔質膜に担持させる。
(2)次いで、培養液を除去して、前記リング状ホルダーを外し、カルチャーインサートをカルチャーインサートの受け皿となるプレート（コンパニオンプレート）に装着し、カルチャーインサート内に他方の細胞の懸濁液を入れて培養する。
【００３３】
参考のため、前記第１実施態様によるトランスウェル両面培養法によって共培養する手順の一例の模式図を図２に示す。なお、図２では、便宜上、カルチャーインサートの内側表面の多孔質膜にケラチノサイトが配され、当該カルチャーインサートの外側表面の多孔質膜にメラノサイトが担持されている状態になっているが、配置されるケラチノサイトとメラノサイトは、その逆であってもよい。
【００３４】
なお、前記第１実施態様によるトランスウェル両面培養法によって共培養するための装置としては、例えば、「ａｄ−ＭＥＤビドリゲル２」（関東化学株式会社製）として市販されている。当該市販品を使用して、前記第１実施態様でのトランスウェル両面培養法による共培養を簡易に行うことができる。
【００３５】
接触型共培養では、同一の培養容器内で、ケラチノサイトとメラノサイトが接触するように混合した状態で培養を行えばよい。図１に接触型共培養の模式図を示す。
【００３６】
第1工程で行われる共培養として、好ましくは、前記第１実施態様によるトランスウェル両面培養法での非接触型共培養、及び接触型共培養が挙げられる。このような共培養を採用することによって、メラノサイト共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性が低下し易くなり、ケラチノサイトのオートファジー活性に影響を及ぼす候補物質を高精度で選定することが可能になる。とりわけ、前記第１実施態様によるトランスウェル両面培養法での非接触型共培養は、共培養後にメラノサイトとケラチノサイトを分離できるので、第２工程におけるオートファジー活性の測定を簡便に行うことが可能になり、特に好適である。
【００３７】
共培養に使用される培地については、ケラチノサイトとメラノサイトが生育可能であることを限度として特に制限されないが、例えば、ヒト正常表皮角化細胞増殖用培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２）、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地等が挙げられる。共培養に使用される培地には、必要に応じて、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）等が含まれていてもよい。
【００３８】
候補物質存在下で共培養する際の培養時間については、採用する共培養の方法等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、４時間〜１か月程度、好ましくは２４時間〜２週間程度、より好ましくは３日間〜１週間程度が挙げられる。なお、培養期間中、候補物質が含まれる新鮮な培地で、必要に応じて培地交換を行ってもよい。
【００３９】
共培養時の培養雰囲気については、ケラチノサイトとメラノサイトが生育可能な条件に設定すればよいが、例えば、約５％のＣＯ2雰囲気下で、３６〜３８℃、好ましくは３７℃が挙げられる。
【００４０】
［第２工程］
第２工程では、前記第１工程後のケラチノサイトにおけるオートファジー活性を測定する。第２工程におけるオートファジー活性の測定は、定性的に行ってもよいが、候補物質についてオートファジー活性を増大又は抑制する程度をより正確に判断するために、定量的に行うことが望ましい。
【００４１】
ケラチノサイトにおけるオートファジー活性は、例えば、オートファジー小胞を選択的に染色する方法によって定量的又は定性的に測定することができる。オートファジー小胞を選択的に染色できるキットは、オートファジー検出キットとして市販されており、本発明では市販のオートファジー検出キットを使用して、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性を測定すればよい。
【００４２】
また、オートファジーには、選択的に分解される物質とオートファゴソームとを結ぶアダプタータンパク質が必要とされ、オートファジー活性が高い場合には、アダプタータンパク質の発現量が向上していることが知られている。従って、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性は、アダプタータンパク質量、又はアダプタータンパク質のｍＲＮＡ量を測定することによって定量的又は定性的に求めることもできる。アダプタータンパク質としては、具体的にはｐ６２等が挙げられる。また、アダプタータンパク質量は、例えば、免疫染色、ウエスタンブロッティング等により測定することができる。また、アダプタータンパク質のｍＲＮＡ量は、例えば、ケラチノサイトから抽出された全ＲＮＡに対してＰＣＲを行うことにより測定することができる。
【００４３】
また、オートファジーにおけるオートファゴソームの形成は、ＬＣ３やＡｔｇタンパク質が担っており、オートファジー活性が高い場合には、ＬＣ３タンパク質やＡｔｇタンパク質の発現量が向上していることが知られている。従って、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性は、ＬＣ３タンパク質量若しくはＡｔｇタンパク質量、又はＬＣ３タンパク質若しくはＡｔｇタンパク質のｍＲＮＡ量を測定することによって定量的又は定性的に求めることもできる。ＬＣ３タンパク質量及びＡｔｇタンパク質量は、例えば、免疫染色、ウエスタンブロッティング等により測定することができる。また、ＬＣ３タンパク質及びＡｔｇタンパク質のｍＲＮＡ量は、例えば、ケラチノサイトから抽出された全ＲＮＡに対してＰＣＲを行うことにより測定することができる。
【００４４】
第１工程において非接触型共培養を行った場合には、メラノサイトから隔てられているケラチノサイトに対して、そのまま又はケラチノサイトを一旦回収して、オートファジー活性を測定すればよい。
【００４５】
また、第１工程において接触型共培養を行った場合には、メラノサイトが混在している状態でケラチノサイトに対して、オートファジー小胞の選択的な染色、或はアダプタータンパク質及び／又はＡｔｇタンパク質に対する免疫染色を行い、オートファジー活性を可視化して、当該可視化の程度を求めればよい。当該可視化の程度は、ケラチノサイト及びメラノサイトをそれぞれ単独で候補物質非存在下で培養した場合（コントロール）との対比によって判定できる。
【００４６】
ケラチノサイトにおけるオートファジー活性の測定方法として、簡便性及び定量性の観点から、好ましくはオートファジー小胞を選択的に染色する方法が挙げられる。
【００４７】
［第３工程］
第３工程では、前記第２工程においてオートファジー活性を増大又は抑制した候補物質を、オートファジー活性促進剤又はオートファジー活性抑制剤として選定する。具体的には、前記第２工程においてオートファジー活性を増大した候補物質は、オートファジー活性促進剤として選定される。一方、前記第２工程においてオートファジー活性を抑制した候補選定は、オートファジー活性抑制剤として選択される。
【００４８】
第３工程において、オートファジー活性の増大又は抑制については、候補物質を添加することなく第１工程及び第２工程を実施したコントロールとの比較に基づいて判定できる。具体的には、前記コントロールに比べてオートファジー活性が高い候補物質はオートファジー活性を増大したと判定でき、前記コントロールに比べてオートファジー活性が低い候補物質はオートファジー活性を抑制したと判定できる。また、候補物質を添加することなく、且つケラチノサイトを単独で培養するように変更して第１工程及び第２工程を行った場合のオートファジー活性と同程度以上になっている候補物質は、オートファジー活性を増大させる作用が非常に高いと判定できる。
【００４９】
斯くしてオートファジー活性促進剤として選定された候補物質は、ケラチノサイトのオートファジー活性を増大する作用があり、美白効果、皮膚老化防止効果等が期待される成分として、化粧料等の外用製剤の分野での使用が期待される。オートファジー活性抑制剤として選定された候補物質は、ケラチノサイトのオートファジー活性を抑制する作用があり、サンタン効果が期待される成分として、化粧料等の外用製剤の分野での使用が期待される。また、オートファジー活性促進剤又はオートファジー活性抑制剤として選定された候補物質は、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性の作用機序の解明等における実験ツールとして使用することができる。
【００５０】
２．評価方法
本発明の評価方法は、機能が公知又は未知の被験物質について、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響を評価する方法である。
【００５１】
具体的には、本発明の評価方法は、被験物質が、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響を評価する方法であって、被験物質の存在下でケラチノサイトとメラノサイトを共培養する第Ｉ工程、前記第Ｉ工程後のケラチノサイトにおけるオートファジー活性を測定する第ＩＩ工程、及び前記第ＩＩ工程において測定されたオートファジー活性に基づいて、被験物質がメラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響を判定する第ＩＩＩ工程を含むことを特徴とする。以下、本発明の評価方法について工程毎に説明する。
【００５２】
［第Ｉ工程］
第Ｉ工程では、被験物質の存在下でケラチノサイトとメラノサイトを共培養する。
【００５３】
被験物質とは、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響を評価する対象となる物質である。被験物質は、美白効果や老化防止効果等の機能が知られている物質であってもよく、また、そのような機能が知られていない物質であってもよい。また、被験物質の種類については、特に制限されず、天然物、合成物、半合成物が挙げられる。被験物質として、具体的には、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、植物エキス、動物エキス、糖類（多糖、オリゴ糖、単糖等を含む）、脂質（リン脂質、糖脂質等を含む）、界面活性剤、その他の高分子有機化合物、その他の低分子有機化合物、無機化合物、その他の生体由来化合物、それらの修飾物、それらの誘導体等が挙げられる。被験物質は、１種の化合物のみからなるものであってもよく、また２種以上の化合物が含まれるものであってもよい。
【００５４】
第Ｉ工程において、候補物質の培地中濃度については、前記スクリーニング方法における第１工程の被験物質の培地中濃度と同様である。
【００５５】
第Ｉ工程において、使用するケラチノサイト及びメラノサイトの由来、これらの細胞の使用量、共培養方式、共培養の培養条件等は、前記スクリーニング方法における第１工程の場合と同様である。
【００５６】
［第ＩＩ工程］
第ＩＩ工程では、前記第Ｉ工程後のケラチノサイトにおけるオートファジー活性を測定する。
【００５７】
第ＩＩ工程において、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性の測定方法は、前記スクリーニング方法における第２工程の場合と同様である。
【００５８】
［第ＩＩＩ工程］
第ＩＩＩ工程では、前記第ＩＩ工程において測定されたオートファジー活性に基づいて、被験物質がメラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響を判定する。具体的には、前記第ＩＩ工程においてオートファジー活性を増大した被験物質は、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を増大する作用があると判定される。一方、前記第ＩＩ工程においてオートファジー活性を抑制した被験物質は、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を抑制する作用があると判定される。また、前記第ＩＩ工程においてオートファジー活性を増減させなかった被験物質は、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に影響を与えないと判定される。
【００５９】
第３工程において、オートファジー活性の増大又は抑制については、被験物質を添加することなく第１工程及び第２工程を実施したコントロールとの比較に基づいて判定できる。具体的には、前記コントロールに比べてオートファジー活性が高い被験物質はメラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を増大する作用があると判定できる。また、前記コントロールに比べてオートファジー活性が低い被験物質は、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を抑制する作用があると判定できる。更に、前記コントロールに比べてオートファジー活性が同等である被験物質は、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に影響を及ぼさないと判定できる。
【００６０】
更に、被験物質を添加することなく、且つケラチノサイトを単独で培養するように変更して第１工程及び第２工程を行った場合のオートファジー活性と同程度以上になっている被験物質は、オートファジー活性を増大させる作用が非常に高いと判定できる。
【００６１】
斯くしてメラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響を評価することにより、被験物質の香粧学的効果や薬学的効果を把握することが可能になる。
【００６２】
３．メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子を同定する方法
【００６３】
本発明の同定方法は、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子を同定するための方法である。
【００６４】
具体的には、本発明の同定方法は、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子を同定する方法であって、ケラチノサイトとメラノサイトを共培養する第ｉ工程、前記第ｉ工程後の培養液中の分泌物質を特定する第ｉｉ工程、前記第ｉｉ工程で特定された分泌物質の存在下で、ケラチノサイトを培養する第ｉｉｉ工程、前記第ｉｉｉ工程後のケラチノサイトにおけるオートファジー活性を測定する第ｉｖ工程、及び前記第ｉｖ工程において、オートファジー活性を抑制した分泌物質を、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子として同定する第ｖ工程を含むことを特徴とする。以下、本発明の同定方法について工程毎に説明する。
【００６５】
［第ｉ工程］
第ｉ工程では、ケラチノサイトとメラノサイトを共培養する。第ｉ工程において、使用するケラチノサイト及びメラノサイトの由来、これらの細胞の使用量、共培養方式、共培養の培養条件等は、候補物質を添加しないこと以外は前記スクリーニング方法における第１工程の場合と同様である。
【００６６】
［第ｉｉ工程］
第ｉｉ工程では、前記第ｉ工程後の培養液中の分泌物質を特定する。
【００６７】
前記第ｉ工程によって培養液中に認められる分泌物質は、メラノサイト共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子の候補になる。前記第ｉ工程によって培養液中に認められる分泌物質には、タンパク質、ペプチド、核酸、代謝産物等が含まれ得る。前記分泌物質の特定は、分泌物質の種類に応じた公知の手法で行い得る。
【００６８】
第ｉｉ工程において、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子の候補になる分泌物質を効率的に特定するという観点から、メラノサイトの非存在下でケラチノサイトを単独培養した第１コントロール、及びケラチノサイト及びの非存在下でメラノサイトを単独培養した第２コントロールとの比較を行うことが好ましい。具体的には、前記第１コントロールの培養液及び前記第２コントロールの培養液の双方と比較して、前記第ｉ工程後の培養液中で高い濃度で存在する分泌物質を特定することが好ましい。
【００６９】
［第ｉｉｉ工程］
第ｉｉｉ工程では、前記第ｉｉ工程で特定された分泌物質の存在下で、ケラチノサイトを培養する。
【００７０】
第ｉｉｉ工程において、前記第ｉｉ工程で特定された分泌物質の培地中濃度については、特に制限されないが、例えば、前記第ｉ工程後の培養液で認められた各分泌物質濃度と同程度に設定すればよい。
【００７１】
第ｉｉｉ工程で使用されるケラチノサイトの由来、ケラチノサイトの使用量、培養時間、培養雰囲気等については、前記スクリーニング方法における第１工程の場合と同様である。
【００７２】
［第ｉｖ工程］
第ｉｖ工程では、前記第ｉｉｉ工程後のケラチノサイトにおけるオートファジー活性を測定する。
【００７３】
第ｉｖ工程において、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性の測定方法は、前記スクリーニング方法における第２工程の場合と同様である。
【００７４】
［第ｖ工程］
第ｖ工程では、前記第ｉｖ工程においてオートファジー活性を抑制した分泌物質を、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子として同定する。
【００７５】
第ｖ工程において、分泌物質がオートファジー活性を抑制していることについては、分泌物質を添加することなく前記第ｉｉｉ工程及び第ｉｖ工程を実施したコントロールとの比較に基づいて判定できる。具体的には、前記コントロールに比べてオートファジー活性が低くなっている分泌物質は、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子として同定される。
【００７６】
斯くして、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子として同定された分泌物質は、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性の作用機序の解明等における実験ツールとして使用することができる。
【実施例】
【００７７】
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７８】
［実施例１］
ケラチノサイトとメラノサイトを用いて、前記第１実施態様によるトランスウェル両面培養法で非接触型共培養を行い、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性及びメラノソームの移行について分析した。試験方法、試験結果等は、以下に示す通りである。
【００７９】
１．試験方法
１−１．ケラチノサイトとメラノサイトの共培養
前記第１実施態様によるトランスウェル両面培養法での非接触型共培養は、ａｄ−ＭＥＤビドリゲル２（１２ウェルタイプ、関東化学株式会社製）を用いて行った。当該ａｄ−ＭＥＤビドリゲル２には、ビドリゲル膜（コラーゲン線維が高密度に折り重なった多孔質膜、孔径６７ｎｍ）を底部に有するカルチャーインサート、及び当該カルチャーインサートの受け皿となる１２ウェルプレートが備わっている。また、当該ａｄ−ＭＥＤビドリゲル２の付属品として供給を受けたオプションリング（リング状ホルダー）も使用した。当該オプションリングは、カルチャーインサートの外側表面のビドリゲル膜を上にした状態で、ビドリゲル膜の外側表面の外周から上に延びるように装着して、一時的にウェルを形成できるように構成されている。
【００８０】
先ず、カルチャーインサートにオプションリングを装着し、カルチャーインサートの外側表面のビドリゲル膜が底部、オプションリングが壁部を形成したウェル状にした。次いで、ＤｅｒｍａＬｉｆｅ  Ｍ  Ｃｏｍｐ  ｋｉｔ培地（クラボウ株式会社製）で懸濁したヒト正常メラノサイト（ＮＨＥＭ（ＮＢ）、クラボウ株式会社製）を２００００個／ウェルとなるように、オプションリングで壁部を形成したウェル内に播種し、３７℃、５％ＣＯ2の雰囲気で２日間培養し、カルチャーインサートの外側表面のビドリゲル膜にメラノサイトを担持させた。
【００８１】
次いで、ウェル内から培養液を除去した後にオプションリングを外し、ＤｅｒｍａＬｉｆｅ  Ｍ  Ｃｏｍｐ  ｋｉｔ培地を添加した１２ウェルプレートのウェルに、外側表面のビドリゲル膜にメラノサイトを担持させたカルチャーインサートを挿入して固定した。その後、カルチャーインサート内に、ＤｅｒｍａＬｉｆｅ  Ｍ  Ｃｏｍｐ  ｋｉｔ培地で懸濁したヒト正常ケラチノサイト（ＮＨＥＫ（ＮＢ）、クラボウ株式会社製）を２００００個／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ2の雰囲気で１週間又は２週間培養した。ケラチノサイトを播種してから１週間後に、ケラチノサイトのオートファジー活性の測定を行った。また、ケラチノサイトを播種してから２週間後に、ケラチノサイト及びメラノサイトについてメラニン量の測定及び電子顕微鏡観察を行った。
【００８２】
また、コントロール１として、メラノサイトを播種しなかったこと以外は、前記と同条件で培養（ケラチノサイトの単独培養）を行い、ケラチノサイトのオートファジー活性及びメラニン量を測定した。更に、コントロール２として、ケラチノサイトを播種しなかったこと以外は、前記と同条件で培養（メラノサイトの単独培養）を行い、メラノサイトのメラニン量を測定した。
【００８３】
１−２．ケラチノサイトのオートファジー活性の測定（定性的評価）
培養後にカルチャーインサートを１２ウェルプレートから取り出した。次いで、カルチャーインサートにオプションリングを装着し、カルチャーインサートの外側表面のメラノサイトが担持されているビドリゲル膜が底部、オプションリングが壁部を形成したウェル状にした。当該ウェル内にトリプシンＥＤＴＡ溶液（フェノールレッド不含、和光純薬工業株式会社製）を添加し、ビドリゲル膜からメラノサイトを剥離した。次いで、オプションリングを外し、カルチャーインサートの内のケラチノサイトに対して、オートファジー検出キット（「ＣＹＴＯ−ＩＤ  Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ」、ＥＮＺＯ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｓ製）を用いて、オートファジーを染色し、蛍光顕微鏡でＧｒｅｅｎフィルターを用いて染色の程度を観察した。
【００８４】
１−３．ケラチノサイトのオートファジー活性の測定（定量的評価）
培養後にカルチャーインサートを１２ウェルプレートから取り出した。カルチャーインサート内のケラチノサイトに対して、オートファジー検出キット（「ＣＹＴＯ−ＩＤ  Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ」、ＥＮＺＯ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｓ製）を用いて、オートファジー及び核を染色した。その後、カルチャーインサート内にトリプシンＥＤＴＡ溶液（フェノールレッド不含、和光純薬工業株式会社製）を添加し、ビドリゲル膜からケラチノサイトを剥離して回収し、９６ウェルプレートに入れた。次いで、プレートリーダーを用いて、オートファジー活性の蛍光強度（蛍光波長４８０ｎｍ、励起波長５３０ｎｍ）及び核の蛍光強度（蛍光波長３５５ｎｍ、励起波長４６５ｎｍ）を測定した。
【００８５】
次いで、オートファジー活性の蛍光強度を核の蛍光強度で除することにより、ケラチノサイト１細胞当たりのオートファジー活性値を算出した
【００８６】
１−４．ケラチノサイト及びメラノサイトのメラニン量の測定
培養後にカルチャーインサートを１２ウェルプレートから取り出した。次いで、カルチャーインサートにオプションリングを装着し、カルチャーインサートの外側表面のメラノサイトが担持されているビドリゲル膜が底部、オプションリングが壁部を形成したウェル状にした。当該ウェル内にトリプシンＥＤＴＡ溶液（フェノールレッド不含、和光純薬工業株式会社製）を添加し、ビドリゲル膜からメラノサイトを剥離して回収した。その後、オプションリングを外し、カルチャーインサート内にトリプシンＥＤＴＡ溶液（フェノールレッド不含、和光純薬工業株式会社製）を添加し、ビドリゲル膜からケラチノサイトを剥離して回収した。
【００８７】
回収した細胞の懸濁液を遠心分離に供して上清を除去した後に、各細胞に４Ｎの水酸化ナトリウム水溶液５０μｌを添加して細胞を溶解させ、細胞溶解液を調製した。次いで、細胞溶解液に含まれるメラニンを波長４５０ｎｍの吸光度を測定することによって求めた。
【００８８】
１−５．電子顕微鏡観察
培養後にカルチャーインサートを１２ウェルプレートから取り出した。次いで、一方面にケラチノサイトが担持され、他方面にメラノサイトが担持されているビドリゲル膜を取り出した。この状態のビドリゲル膜をパラホルムアルデヒドで固定化した後に、ビドリゲル膜を切断し、その横断面を電子顕微鏡（株式会社東海電子顕微鏡解析製）にて観察した。
【００８９】
２．試験結果
ケラチノサイトのオートファジーを染色した結果の像を図３に示し、ケラチノサイト１細胞当たりのオートファジー活性値の結果を表１に示す。この結果、ケラチノサイトとメラノサイトを共培養した場合には、コントロール１（ケラチノサイトの単独培養）の場合に比べて、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性が低下していることが明らかとなった。
【００９０】
【表１】
2019180324.tif 000002
【００９１】
ケラチノサイト及びメラノサイトのメラニン量を測定した結果を表２に示し、培養後にケラチノサイト及びメラノサイトが担持されているビドリゲル膜の横断面を電子顕微鏡で観察した像を図４に示す。表２から分かるように、ケラチノサイトとメラノサイトを共培養した場合には、ケラチノサイトのメラニン量がコントロール１（ケラチノサイトの単独培養）に比べて増大し、且つメラノサイトのメラニン量がコントロール２（メラノサイトの単独培養）に比べて減少していた。また、図４からも分かるように、ケラチノサイトとメラノサイトを共培養した場合には、ケラチノサイトが担持されている側でメラノソームの存在が多数認められた。即ち、本結果から、本試験で採用した共培養では、メラノソームがメラノサイトからケラチノサイトに受け渡されており、実際の皮膚組織内と同じ挙動を示すことが確認された。
【００９２】
【表２】
2019180324.tif 000003
【００９３】
［実施例２］
ケラチノサイトとメラノサイトを用いて、接触型共培養を行い、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性について分析した。試験方法、試験結果等は、以下に示す通りである。
【００９４】
１．試験方法
１−１．ケラチノサイトとメラノサイトの共培養
表３に示す条件で、ヒト正常ケラチノサイト（ＮＨＥＫ（ＮＢ）、クラボウ株式会社製）及びヒト正常メラノサイト（ＮＨＥＭ（ＮＢ）、クラボウ株式会社製）をシャーレに播種し、３７℃、５％ＣＯ2の雰囲気で３日間共培養を行った。なお、培地は、ＤｅｒｍａＬｉｆｅ  Ｍ  Ｃｏｍｐ  ｋｉｔ培地（クラボウ株式会社製）を使用した。
【００９５】
【表３】
2019180324.tif 000004
【００９６】
１−２．ケラチノサイトのオートファジー活性の測定（定量的評価）
培養後のシャーレから培地を除去した後、「ＣＹＴＯ−ＩＤ  Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ」、ＥＮＺＯ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｓ製）を用いて、オートファジー及び核を染色し、プレートリーダーを用いて、オートファジー活性の蛍光強度（蛍光波長４８０ｎｍ、励起波長５３０ｎｍ）及び核の蛍光強度（蛍光波長３５５ｎｍ、励起波長４６５ｎｍ）を測定した。次いで、オートファジー活性の蛍光強度を核の蛍光強度で除することにより、ケラチノサイト１細胞当たりのオートファジー活性値を算出した。
【００９７】
２．試験結果
結果を表４に示す。ケラチノサイトとメラノサイトを接触状態で共培養した場合には、ケラチノサイトを単独培養した場合（コントロールＡ１及びＡ２）に比べて、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性が低下していることが確認された。なお、メラノサイト（コントロールＢ）では、オートファジー活性は殆ど認められなかった。
【００９８】
【表４】
2019180324.tif 000005
【００９９】
［総合考察］
実施例１及び２によって、ケラチノサイトとメラノサイトを共培養すると、ケラチノサイトのオートファジー活性が低下することが確認された。ケラチノサイトは、オートファジーによって、メラノサイトから送り込まれたメラニンの分解、コラーゲン合成機能の維持等の重要な役割を果たしているので、実施例１及び２から、メラノサイトの共存下のケラチノサイトのオートファジー活性を指標とすることにより、外用製剤に使用される成分のスクリーニングや評価が可能になることが明らかとなった。
【０１００】
また、実施例１で採用した前記第１実施態様によるトランスウェル両面培養法での非接触型共培養では、実際の皮膚組織内の場合と同様に、メラノソームがメラノサイトからケラチノサイトに受け渡されており、当該非接触型共培養は、外用製剤に使用される成分のスクリーニングや評価において適した試験系であることも確認された。
【０１０１】
メラノサイトは、紫外線等のダメージに対しての防御機能としてメラノソームを生成してケラチノサイトへ送り込むことが知られている。一方、ケラチノサイトにとっては、メラノソームが異物であるため、送り込まれたメラノソームに対する排除機能が働き、オートファジーによりケラチノサイトが利用できる物質に変換することも知られている。このようなメラノサイトとケラチノサイトの機能を踏まえると、実施例１及び２において、ケラチノサイトとメラノサイトとの共培養により、ケラチノサイトのオートファジー活性が低下した結果は、メラノサイトは防御機能を高めるためにケラチノサイトのオートファジーを抑制する物質を分泌していることを強く示唆している。このようなケラチノサイトのオートファジー活性を低下させる物質を特定することは、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性の作用機序の解明等において有用である。
【図１】
2019180324.tif 000006
【図２】
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【図３】
2019180324.tif 000008
【図４】
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