(57)【要約】【課題】ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）のβ鎖に作用し、過酸化水素を生成することを特徴とするアマドリアーゼを提供し、それを用いたＨｂＡ1cの測定方法および測定試薬キットを提供する。【解決手段】αＦ６Ｐに対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有しＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端を酸化して過酸化水素を生成することを特徴とするアマドリアーゼを用いたＨｂＡ1cの測定方法および該アマドリアーゼを含む測定試薬キット。ＨｂＡ１ｃを迅速、簡便に、かつ、精度よく定量できる測定方法、測定キットを提供できる。【選択図】図４−１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料にヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼを作用させ、その作用によって生じる過酸化水素もしくは消費される酸素を測定することを特徴とする、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項２】
前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有し、かつ、以下の(i)〜(iii)からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i)  アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸配列の以下（ａ）から（j）よりなる群から選択される位置に対応する位置で当該アマドリアーゼのアミノ酸配列が１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有するアマドリアーゼ、
（ａ）配列番号１の６２位、
（ｂ）配列番号１の６３位、
（ｃ）配列番号１の１０２位、
（ｄ）配列番号１の１０６位、
（ｅ）配列番号１の１１０位、
（ｆ）配列番号１の１１３位、
（ｇ）配列番号１の３５５位、
（ｈ）配列番号１の４１９位、
（ｉ）配列番号１の６８位、
（ｊ）配列番号１の３５６位、
(ii)  前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位、４１９、６８位及び３５６位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなるアマドリアーゼ、
(iii)  前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、６３〜６５位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼ、
である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の以下（a）から（j）よりなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置に対応する位置のアミノ酸が以下の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼ、
（a）配列番号１の６２位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンである、
（b）配列番号１の６３位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジンである、
（c）配列番号１の１０２位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
（d）配列番号１の１０６位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、リジン又はアルギニンである、
（e）配列番号１の１１０位に対応する位置のアミノ酸がロイシン又はチロシンである、
（f）配列番号１の１１３位に対応する位置のアミノ酸がリジン又はアルギニンである、
（g）配列番号１の３５５位に対応する位置のアミノ酸がセリンである、
（h）配列番号１の４１９位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
(i) 配列番号１の６８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンである、
(j) 配列番号１の３５６位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される２以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される３以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される４以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される５以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される６以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼがコニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、またはペニシリウム(Penicillium)属由来である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項１１】
ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼがコニオカエタ  エスピー(Coniochaeta sp.)、ユーペニシリウム  テレナム(Eupenicillium terrenum)、ピレノケータ  エスピー(Pyrenochaeta sp.)、アルスリニウム  エスピー(Arthrinium sp.)、カーブラリア  クラベータ(Curvularia clavata)、ネオコスモスポラ  バシンフェクタ(Neocosmospora vasinfecta)、クリプトコッカス  ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、フェオスフェリア  ノドラム(Phaeosphaeria nodorum)、アスペルギルス  ニードランス(Aspergillus nidulans)、エメリセラ  ニードランス(Emericella nidulans)属、ウロクラディウム  エスピー(Ulocladium sp.)、またはペニシリウム ヤンシネラム(Penicillium janthinelum)もしくはペニシリウム クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）由来である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項１２】
ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、以下からなる群より選択されるアマドリアーゼである、請求項１に記載の試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。 
(i)  配列番号１４１又は１４３に示すアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加がなされたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ。 
(ii)  前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１４１又は１４３のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１４１の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼ。
【請求項１３】
アマドリアーゼがさらに、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下のアミノ酸、
（i）２６２位のアスパラギン、
（ii）２５７位のバリン、
（iii）２４９位のグルタミン酸
（iv）２５３位のグルタミン酸、
（v）３３７位のグルタミン、
（vi）３４０位のグルタミン酸、
（vii）２３２位のアスパラギン酸、
（viii）１２９位のアスパラギン酸、
（ix）１３２位のアスパラギン酸、
（x）１３３位のグルタミン酸、
（xi）４４位のグルタミン酸、
（xii）２５６位のグリシン、
（xiii）２３１位のグルタミン酸、及び
（xiv）８１位のグルタミン酸、
よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有し、かつ
場合によりカルボキシル末端からの3アミノ酸残基を欠失していてもよい、請求項３〜１２のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項１４】
以下の（１）および（２）の成分を含むことを特徴とする、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定用試薬キット。
（１）ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用して、過酸化水素を生成する作用を有するアマドリアーゼ。
（２）過酸化水素を測定するための試薬。
【請求項１５】
前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するものである、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有し、かつ、以下の(i)〜(iii)からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i)  アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸配列の以下（ａ）から（j）よりなる群から選択される位置に対応する位置で当該アマドリアーゼのアミノ酸配列が１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有するアマドリアーゼ、
（ａ）配列番号１の６２位、
（ｂ）配列番号１の６３位、
（ｃ）配列番号１の１０２位、
（ｄ）配列番号１の１０６位、
（ｅ）配列番号１の１１０位、
（ｆ）配列番号１の１１３位、
（ｇ）配列番号１の３５５位、
（ｈ）配列番号１の４１９位、
（ｉ）配列番号１の６８位、
（ｊ）配列番号１の３５６位、
(ii)  前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位、４１９、６８位及び３５６位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなるアマドリアーゼ、
(iii)  前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、６３〜６５位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼ、
である、請求項１４又は１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の以下（a）から（j）よりなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置に対応する位置のアミノ酸が以下の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼ、
（a）配列番号１の６２位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンである、
（b）配列番号１の６３位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジンである、
（c）配列番号１の１０２位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
（d）配列番号１の１０６位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、リジン又はアルギニンである、
（e）配列番号１の１１０位に対応する位置のアミノ酸がロイシン又はチロシンである、
（f）配列番号１の１１３位に対応する位置のアミノ酸がリジン又はアルギニンである、
（g）配列番号１の３５５位に対応する位置のアミノ酸がセリンである、
（h）配列番号１の４１９位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
(i) 配列番号１の６８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンである、
(j) 配列番号１の３５６位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される２以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される３以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される４以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される５以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される６以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用して、過酸化水素を生成する作用を有するアマドリアーゼが、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、またはペニシリウム(Penicillium)属由来である、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２４】
前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用して、過酸化水素を生成する作用を有するアマドリアーゼが、
(i)  配列番号１４１又は１４３に示すアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加がなされたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、または
(ii)  前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１４１又は１４３のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１４１の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼ
である、請求項１４〜２３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２５】
前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用して、過酸化水素を生成する作用を有するアマドリアーゼがさらに配列番号１に示すアミノ酸配列における以下のアミノ酸、
（i）２６２位のアスパラギン、
（ii）２５７位のバリン、
（iii）２４９位のグルタミン酸
（iv）２５３位のグルタミン酸、
（v）３３７位のグルタミン、
（vi）３４０位のグルタミン酸、
（vii）２３２位のアスパラギン酸、
（viii）１２９位のアスパラギン酸、
（ix）１３２位のアスパラギン酸、
（x）１３３位のグルタミン酸、
（xi）４４位のグルタミン酸、
（xii）２５６位のグリシン、
（xiii）２３１位のグルタミン酸、及び
（xiv）８１位のグルタミン酸、
よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有し、かつ
場合によりカルボキシル末端からの3アミノ酸残基を欠失していてもよい、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２６】
以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i)  アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における６８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンであるか、配列番号１に示すアミノ酸配列における３５６位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつα−フルクトシルヘキサペプチド（αＦ６Ｐ）に対する活性を有するアマドリアーゼ、
(ii)  前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６８位又は３５６位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii)  前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンであるか、配列番号１に示すアミノ酸配列における３５６位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつ、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、６３〜６５位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有し、αＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、およびその測定方法に用いられる測定用試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化タンパク質は、グルコースなどのアルドース（アルデヒド基を潜在的に有する単糖およびその誘導体）のアルデヒド基と、タンパク質のアミノ基が非酵素的に共有結合を形成し、アマドリ転移することにより生成したものである。タンパク質のアミノ基としてはアミノ末端のα−アミノ基、タンパク質中のリジン残基側鎖のε−アミノ基が挙げられる。生体内で生じる糖化タンパク質としては血液中のヘモグロビンが糖化された糖化ヘモグロビン、アルブミンが糖化された糖化アルブミンなどが知られている。
【０００３】
これら生体内で生じる糖化タンパク質の中でも、糖尿病の臨床診断分野において、糖尿病患者の診断や症状管理のための重要な血糖コントロールマーカーとして、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）が注目されている。ＨｂＡ１ｃは、へモグロビン「β鎖」のＮ末端（アミノ末端）のＶａｌ（バリン）の、α−アミノ基にグルコースが結合したタンパク質である。血液中のＨｂＡ１ｃ濃度は、過去の一定期間の平均血糖値を反映することから、ＨｂＡ１ｃの値は糖尿病の症状の診断や管理において重要な指標となっている。
【０００４】
このＨｂＡ１ｃを迅速かつ簡便に測定する方法として、従来、アマドリアーゼを用いる数種類の酵素的方法が知られている。
【０００５】
アマドリアーゼは、酸素の存在下で、イミノ２酢酸若しくはその誘導体（「アマドリ化合物」とも言う）を酸化して、グリオキシル酸若しくはα−ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、および過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素の総称である。アマドリアーゼは、ＨｂＡ１ｃを酵素的方法により測定するために有用な酵素として知られている。アマドリアーゼにより酸化される基質としては、例えば、α−フルクトシルバリルヒスチジン（以降αＦＶＨと表す）が知られている。
【０００６】
アマドリアーゼはこれまでに、細菌、酵母、真菌から見出されており、例えば、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フザリウム(Fusarium)属、アカエトミエラ(Achaetomiella)属、アカエトミウム(Achaetomium)属、シエラビア(Thielavia)属、カエトミウム(Chaetomium)属、ゲラシノスポラ(Gelasinospora)属、ミクロアスカス(Microascus)属、レプトスフェリア(Leptosphaeria)属、オフィオボラス(Ophiobolus)属、プレオスポラ(Pleospora)属、コニオケチジウム(Coniochaetidium)属、ピチア(Pichia)属、デバリオマイセス(Debaryomyces)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、アルスロバクター(Arthrobacter)属由来のアマドリアーゼが報告されている（例えば、特許文献１、６〜１５、非特許文献１〜９参照。）。これらの属のことを本明細書においてコニオカエタ(Coniochaeta)属等と呼ぶことがある。なお、上記報告例の中で、アマドリアーゼは、文献によってはケトアミンオキシダーゼやフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等の表現で記載されている場合もある。
【０００７】
上述のような各種のアマドリアーゼを用いて、ＨｂＡ１ｃを迅速かつ簡便に測定する方法としては、プロテアーゼまたはペプチダーゼ（以下、プロテアーゼ等という）の切り出し用酵素でＨｂＡ１ｃを分解し、ＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端より特定の測定用物質を遊離させ、遊離した測定用物質を、上述のようなアマドリアーゼを用いて定量する方法が知られている（例えば、特許文献１〜７参照）。
【０００８】
具体的には、ＨｂＡ１ｃを特定のプロテアーゼ等で分解し、そのβ鎖アミノ末端よりαＦＶＨを遊離させたのちに、遊離したαＦＶＨを定量する方法が知られており、この測定方法が、現在のＨｂＡ１ｃ酵素的測定法の主流となっている。
【０００９】
さらに、アマドリアーゼを用いたＨｂＡ１ｃの測定方法としては、ＨｂＡ１ｃをＧｌｕ−Ｃプロテアーゼを用いて消化し、糖化されたβ鎖アミノ末端のバリンを含む６アミノ酸からなるα−フルクトシルヘキサペプチド（α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸、以降αＦ６Ｐと表す）を遊離させたのちに、遊離したαＦ６Ｐを定量する方法がある（例えば、特許文献１６、１７参照。）。この方法は、ＩＦＣＣ（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine）により定められたＨｂＡ１ｃ測定法（非特許文献１０参照）に則った、酵素によるＨｂＡ１ｃの測定方法である。
【００１０】
しかしながら、前述のアマドリアーゼを用いたＨｂＡ１ｃの測定方法では、プロテアーゼまたはペプチダーゼ（以下、プロテアーゼ等という）によりＨｂＡ１ｃを消化し、そのβ鎖アミノ末端のバリンを含む糖化ペプチドを遊離させる工程を欠かすことはできない。したがって、ＨｂＡ１ｃの測定試薬キットには必ずプロテアーゼ等を処方する必要があるが、これは以下に述べる理由により本来好ましいことではない。
【００１１】
プロテアーゼ等はタンパク質を加水分解する作用を示すため、タンパク質である酵素もまたプロテアーゼ等により加水分解される。したがって、アマドリアーゼもまたプロテアーゼにより加水分解されて失活し、その結果、糖化ペプチドと酸素を消費して過酸化水素を生成する反応が阻害される。これに対する対処法としては、アマドリアーゼの処方量を増やし、アマドリアーゼが完全に失活する前に測定を終えることが考えられるが、アマドリアーゼの増量は、プロテアーゼ等がＨｂＡ1cよりもアマドリアーゼを優先的に加水分解することに繋がり、本来好ましくはない。
【００１２】
また、糖化ペプチドにアマドリアーゼを作用させて生じる過酸化水素を定量してＨｂＡ1cを測定する場合には、過酸化水素の定量にパーオキシダーゼを用いることがある。この場合、パーオキシダーゼもまたプロテアーゼ等により加水分解されて失活するため、好ましくない。
【００１３】
また別の側面として、酵素によるＨｂＡ１ｃ測定には自動分析装置を使用することが一般的であり、この場合、一つの試料を用いてＨｂＡ１ｃを始めとする様々な生体マーカーを同時測定する。この際、各生体マーカーは酵素もしくは抗体を利用して測定するため、プロテアーゼ等がコンタミネーションすると、各生体マーカー測定試薬に含まれる酵素もしくは抗体が加水分解され、ＨｂＡ１ｃ以外の生体マーカーが正確に測定できない恐れがある。したがって、自動分析装置にセットする試薬には、本来プロテアーゼ等が含まれていないことが好ましい。
【００１４】
以上の理由により、アマドリアーゼで直接ＨｂＡ１ｃのβ鎖を酸化して過酸化水素を生成させるアマドリアーゼと、それを利用したＨｂＡ１ｃ測定法が求められていたが、そのような酵素活性を示すアマドリアーゼはこれまでに見出されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第２００４／１０４２０３号
【特許文献２】国際公開第２００５／４９８５７号
【特許文献３】特開２００１−９５５９８号公報
【特許文献４】特公平０５−３３９９７号公報
【特許文献５】特開平１１−１２７８９５号公報
【特許文献６】国際公開第９７／１３８７２号
【特許文献７】特開２０１１−２２９５２６号公報
【特許文献８】特開２００３−２３５５８５号公報
【特許文献９】特開２００４−２７５０１３号公報
【特許文献１０】特開２００４−２７５０６３号公報
【特許文献１１】特開２０１０−３５４６９号公報
【特許文献１２】特開２０１０−５７４７４号公報
【特許文献１３】国際公開第２０１０／４１７１５号
【特許文献１４】国際公開第２０１０／４１４１９号
【特許文献１５】国際公開第２０１１／１５３２５号
【特許文献１６】国際公開第２００４／３８０３４号
【特許文献１７】国際公開第２００８／１０８３８５号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３１１，  １０４−１１，  ２００３
【非特許文献２】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  １０６，  ３５８−６６，  ２０１０
【非特許文献３】Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  １０２，  ２４１−３，  ２００６
【非特許文献４】Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７４，  ８１３−９，  ２００７
【非特許文献５】Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４２，  ４９９−５０５，  １９９６
【非特許文献６】Ｍａｒ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ６，  ６２５−３２，  ２００４
【非特許文献７】Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６６，  １２５６−６１，  ２００２
【非特許文献８】Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６６，  ２３２３−２９，  ２００２
【非特許文献９】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２７，  ２７−３２，  ２００５
【非特許文献１０】Ｊｅｐｐｓｓｏｎ  ＪＯ，  ｅｔ  ａｌ；Ａｐｐｒｏｖｅｄ  ＩＦＣＣ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＨｂＡ１ｃ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌａｂ．  Ｍｅｄ．  ４０，  ７８−８９，２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明が解決しようとする課題は、ＨｂＡ１ｃのβ鎖を酸化して過酸化水素を生成させるアマドリアーゼを見出し、それを利用したＨｂＡ1c測定法を構築することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、コニオカエタ(Coniochaeta)属等に由来するアマドリアーゼに数個のアミノ酸置換が導入された改変型アマドリアーゼが、ＨｂＡ１ｃを酸化して過酸化水素を生成させる活性を有することを見出し、それを利用したＨｂＡ1c測定法を実現して本発明を完成させた。
【００１９】
すなわち、本発明は以下を包含する。
【００２０】
[１]  試料にヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼを作用させ、その作用によって生じる過酸化水素もしくは消費される酸素を測定することを特徴とする、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。 
【００２１】
[２]  前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するものである、１に記載の方法。 
【００２２】
[３]  前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有し、かつ、以下の(i)〜(iii)からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i)  アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸配列の以下（ａ）から（j）よりなる群から選択される位置に対応する位置で当該アマドリアーゼのアミノ酸配列が１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有するアマドリアーゼ、
（ａ）配列番号１の６２位、
（ｂ）配列番号１の６３位、
（ｃ）配列番号１の１０２位、
（ｄ）配列番号１の１０６位、
（ｅ）配列番号１の１１０位、
（ｆ）配列番号１の１１３位、
（ｇ）配列番号１の３５５位、
（ｈ）配列番号１の４１９位、
（ｉ）配列番号１の６８位、
（ｊ）配列番号１の３５６位、
(ii)  前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位、４１９、６８位及び３５６位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなるアマドリアーゼ、
(iii)  前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、６３〜６５位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼ、
である、１又は２に記載の方法。 
【００２３】
[４]  前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の以下（a）から（j）よりなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置に対応する位置のアミノ酸が以下の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼ、
（a）配列番号１の６２位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンである、
（b）配列番号１の６３位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジンである、
（c）配列番号１の１０２位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
（d）配列番号１の１０６位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、リジン又はアルギニンである、
（e）配列番号１の１１０位に対応する位置のアミノ酸がロイシン又はチロシンである、
（f）配列番号１の１１３位に対応する位置のアミノ酸がリジン又はアルギニンである、
（g）配列番号１の３５５位に対応する位置のアミノ酸がセリンである、
（h）配列番号１の４１９位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
(i) 配列番号１の６８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンである、
(j) 配列番号１の３５６位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
である、３に記載の方法。
【００２４】
[５]  前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される２以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、４に記載の方法。
【００２５】
[６]  前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される３以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、５に記載の方法。 
【００２６】
[７]  前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される４以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、６に記載の方法。
【００２７】
[８]  前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される５以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、７に記載の方法。
【００２８】
[９]  前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される６以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、８に記載の方法。
【００２９】
[１０]  ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼがコニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、またはペニシリウム(Penicillium)属由来である、１〜９のいずれかに記載の試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【００３０】
[１１]  ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼがコニオカエタ  エスピー(Coniochaeta sp.)、ユーペニシリウム  テレナム(Eupenicillium terrenum)、ピレノケータ  エスピー(Pyrenochaeta sp.)、アルスリニウム  エスピー(Arthrinium sp.)、カーブラリア  クラベータ(Curvularia clavata)、ネオコスモスポラ  バシンフェクタ(Neocosmospora vasinfecta)、クリプトコッカス  ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、フェオスフェリア  ノドラム(Phaeosphaeria nodorum)、アスペルギルス  ニードランス(Aspergillus nidulans)、エメリセラ  ニードランス(Emericella nidulans)属、ウロクラディウム  エスピー(Ulocladium sp.)、またはペニシリウム ヤンシネラム(Penicillium janthinelum)もしくはペニシリウム クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）由来である、１〜１０のいずれかに記載の試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【００３１】
[１２]  ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、以下からなる群より選択されるアマドリアーゼである、１に記載の試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。 
(i)  配列番号１４１又は１４３に示すアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加がなされたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ。 
(ii)  前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１４１又は１４３のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１４１の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼ。
【００３２】
[１３]  アマドリアーゼがさらに、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下のアミノ酸、
（i）２６２位のアスパラギン、
（ii）２５７位のバリン、
（iii）２４９位のグルタミン酸
（iv）２５３位のグルタミン酸、
（v）３３７位のグルタミン、
（vi）３４０位のグルタミン酸、
（vii）２３２位のアスパラギン酸、
（viii）１２９位のアスパラギン酸、
（ix）１３２位のアスパラギン酸、
（x）１３３位のグルタミン酸、
（xi）４４位のグルタミン酸、
（xii）２５６位のグリシン、
（xiii）２３１位のグルタミン酸、及び
（xiv）８１位のグルタミン酸、
よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有し、かつ
場合によりカルボキシル末端からの3アミノ酸残基を欠失していてもよい、３〜１２のいずれかに記載の測定方法。
【００３３】
[１４]  以下の（１）および（２）の成分を含むことを特徴とする、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定用試薬キット。
（１）ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用して、過酸化水素を生成する作用を有するアマドリアーゼ。
（２）過酸化水素を測定するための試薬。
【００３４】
[１５]  前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するものである、１４に記載のキット。
【００３５】
[１６]  前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有し、かつ、以下の(i)〜(iii)からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i)  アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸配列の以下（ａ）から（j）よりなる群から選択される位置に対応する位置で当該アマドリアーゼのアミノ酸配列が１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有するアマドリアーゼ、
（ａ）配列番号１の６２位、
（ｂ）配列番号１の６３位、
（ｃ）配列番号１の１０２位、
（ｄ）配列番号１の１０６位、
（ｅ）配列番号１の１１０位、
（ｆ）配列番号１の１１３位、
（ｇ）配列番号１の３５５位、
（ｈ）配列番号１の４１９位、
（ｉ）配列番号１の６８位、
（ｊ）配列番号１の３５６位、
(ii)  前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位、４１９、６８位及び３５６位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなるアマドリアーゼ、
(iii)  前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、６３〜６５位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼ、
である、１４又は１５に記載のキット。
【００３６】
[１７]  前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の以下（a）から（j）よりなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置に対応する位置のアミノ酸が以下の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼ、
（a）配列番号１の６２位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンである、
（b）配列番号１の６３位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジンである、
（c）配列番号１の１０２位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
（d）配列番号１の１０６位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、リジン又はアルギニンである、
（e）配列番号１の１１０位に対応する位置のアミノ酸がロイシン又はチロシンである、
（f）配列番号１の１１３位に対応する位置のアミノ酸がリジン又はアルギニンである、
（g）配列番号１の３５５位に対応する位置のアミノ酸がセリンである、
（h）配列番号１の４１９位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
(i) 配列番号１の６８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンである、
(j) 配列番号１の３５６位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
である、１６に記載のキット。
【００３７】
[１８]  前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される２以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、１７に記載のキット。
【００３８】
[１９]  前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される３以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、１８に記載のキット。
【００３９】
[２０]  前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される４以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、１９に記載のキット。
【００４０】
[２１]  前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される５以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、２０に記載のキット。
【００４１】
[２２]  前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される６以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、２１に記載のキット。
【００４２】
[２３]  前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用して、過酸化水素を生成する作用を有するアマドリアーゼが、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、またはペニシリウム(Penicillium)属由来である、１４〜２２のいずれかに記載のキット。
【００４３】
[２４]  前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用して、過酸化水素を生成する作用を有するアマドリアーゼが、
(i)  配列番号１４１又は１４３に示すアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加がなされたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、または
(ii)  前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１４１又は１４３のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１４１の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼ
である、１４〜２３のいずれかに記載のキット。
【００４４】
[２５]  前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用して、過酸化水素を生成する作用を有するアマドリアーゼがさらに配列番号１に示すアミノ酸配列における以下のアミノ酸、
（i）２６２位のアスパラギン、
（ii）２５７位のバリン、
（iii）２４９位のグルタミン酸
（iv）２５３位のグルタミン酸、
（v）３３７位のグルタミン、
（vi）３４０位のグルタミン酸、
（vii）２３２位のアスパラギン酸、
（viii）１２９位のアスパラギン酸、
（ix）１３２位のアスパラギン酸、
（x）１３３位のグルタミン酸、
（xi）４４位のグルタミン酸、
（xii）２５６位のグリシン、
（xiii）２３１位のグルタミン酸、及び
（xiv）８１位のグルタミン酸、
よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有し、かつ
場合によりカルボキシル末端からの3アミノ酸残基を欠失していてもよい、１６〜２４のいずれかに記載のキット。
【００４５】
[２６]  以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i)  アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における６８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンであるか、配列番号１に示すアミノ酸配列における３５６位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつα−フルクトシルヘキサペプチド（αＦ６Ｐ）に対する活性を有するアマドリアーゼ、
(ii)  前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６８位又は３５６位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii)  前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンであるか、配列番号１に示すアミノ酸配列における３５６位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつ、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、６３〜６５位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有し、αＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ。
【００４６】
[２７]  ヘモグロビンＡ１ｃが、変性したヘモグロビンＡ１ｃである、[１]〜[１３]のいずれかに記載の方法。 
【００４７】
[２８]  変性が加熱処理、界面活性剤処理、酸若しくは塩基処理又はそれらの組み合わせによるものである、[２７]に記載の方法。
【００４８】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013-222774号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００４９】
本発明によれば、ＨｂＡ１ｃを迅速、簡便に、かつ、精度よく良好に定量できるアマドリアーゼを提供できる。このようなアマドリアーゼを用いれば、プロテアーゼ等を処方することなくＨｂＡ１ｃの酵素法による測定方法、測定キットを提供できる。本発明はプロテアーゼ等を処方する必要がないため、キットを簡素化でき、反応効率や測定精度を高めることができ、さらにはプロテアーゼ等による他のタンパク質試薬への望ましくない反応を回避できる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１−１】各種公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列における同一性を例示する１番目の図である。Co（Coniochaeta sp.）、Et（Eupenicillium terrenum）、Py（Pyrenochaeta sp.）、Ar（Arthrinium sp.）、Cc（Curvularia clavata）、Nv（Neocosmospora vasinfecta）のほか、Cn（Cryptococcus neoformans）、Pn（Phaeosphaeria nodorum）、An（Aspergillus nidulans）、En（Emericella nidulans）、Ul（Ulocladium sp.）及びPj（Penicillium janthinelum）をアライメントした。
【図１−２】図１−１のつづきである。
【図１−３】図１−２のつづきである。
【図１−４】図１−３のつづきである。
【図１−５】図１−４のつづきである。
【図２−１】各種公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列における同一性及び類似アミノ酸を例示する２番目の図である。Co、Et、Py、Ar、Cc、Nvのほか、Cn、Pn、An、En、Ul及びPjをアライメントした。
【図２−２】図２−１のつづきである。
【図２−３】図２−２のつづきである。
【図２−４】図２−３のつづきである。
【図２−５】図２−４のつづきである。
【図３】改変型アマドリアーゼを使用してＨｂＡ１ｃを測定した場合の、試料希釈液（試薬Ａ２）と測定用試薬を混合してからの経過時間と吸光度の関係を示す図である。３００秒が経過した時点でアマドリアーゼ溶液が添加される。
【図４−１】ＨｂＡ１ｃを含む試料をｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド溶液で希釈して、ＨｂＡ１ｃ測定を行った結果を示す図である。
【図４−２】ＨｂＡ１ｃを含む試料をｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトシド溶液で希釈して、ＨｂＡ１ｃ測定を行った結果を示す図である。
【図５】改変型アマドリアーゼを使用してＨｂＡ１ｃを測定した場合の、試料希釈液（試薬Ｄ１）と測定用試薬を混合してからの経過時間と吸光度の関係を示す図である。３００秒が経過した時点でアマドリアーゼ溶液が添加される。
【図６−１】ＨｂＡ１ｃを含む試料を、塩酸を含むｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド溶液（試薬Ｄ１）で希釈し、アマドリアーゼ２５を用いてＨｂＡ１ｃ測定を行った結果を示す図である。
【図６−２】ＨｂＡ１ｃを含む試料を、塩酸を含むポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル溶液（試薬Ｄ２）で希釈して、ＨｂＡ１ｃ測定を行った結果を示す図である。
【図６−３】ＨｂＡ１ｃを含む試料を、塩酸を含むｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド溶液（試薬Ｄ１）で希釈し、アマドリアーゼ２８を用いてＨｂＡ１ｃ測定を行った結果を示す図である。
【図７】改変型アマドリアーゼを使用してＨｂＡ１ｃを測定した場合の、試料希釈液（試薬Ｇ１）と測定用試薬を混合してからの経過時間と吸光度の関係を示す図である。３００秒が経過した時点でアマドリアーゼ溶液が添加される。
【図８−１】ＨｂＡ１ｃを含む試料を、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド溶液（試薬Ｇ１）で希釈して、ＨｂＡ１ｃ測定を行った結果を示す図である。
【図８−２】ＨｂＡ１ｃを含む試料を、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド溶液（試薬Ｇ２）で希釈して、ＨｂＡ１ｃ測定を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００５２】
（糖化タンパク質、ヘモグロビンA1c）
本発明における糖化タンパク質とは、非酵素的に糖化されたタンパク質を指す。糖化タンパク質は生体内、外を問わず存在し、生体内に存在する例としては、血液中の糖化ヘモグロビン、糖化アルブミンなどがあり、糖化ヘモグロビンの中でもヘモグロビンのβ鎖アミノ末端のバリンが糖化された糖化ヘモグロビンを特にヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）と言う。生体外に存在する例としては、タンパク質やペプチドと糖が共存する液状調味料などの飲食品や輸液などがある。
【００５３】
（糖化ペプチド、フルクトシルペプチド）
本発明における糖化ペプチドとは、糖化タンパク質由来の非酵素的に糖化されたペプチドを指し、ペプチドが直接非酵素的に糖化されたものや、プロテアーゼ等により糖化タンパク質が分解された結果生じたものや糖化タンパク質を構成する（ポリ）ペプチドが糖化されたものが含まれる。糖化ペプチドをフルクトシルペプチドと表記することもある。糖化タンパク質において、糖化を受けるペプチド側のアミノ基としては、アミノ末端のα−アミノ基、ペプチド内部のリジン残基側鎖のε−アミノ基などが挙げられるが、本発明における糖化ペプチドとは、より具体的には、α−糖化ペプチド（α−フルクトシルペプチド）である。α−糖化ペプチドは、Ｎ末端のα−アミノ酸が糖化された糖化タンパク質から何らかの手段、例えば、プロテアーゼ等による限定分解などにより遊離させて形成される。例えば、対象の糖化タンパク質がヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）である場合、該当するα−糖化ペプチドは、Ｎ末端が糖化されているＨｂＡ１ｃのβ鎖から切り出される糖化されたペプチドを指す。１４６残基のアミノ酸により構成されているＨｂＡ１ｃのβ鎖もまたα−糖化ペプチドに該当する。
【００５４】
ある実施形態において本発明のアマドリアーゼが作用する測定物質は、ＨｂＡ１ｃ、より具体的にはＨｂＡ１ｃのβ鎖である。別の実施形態において本発明のアマドリアーゼが作用する測定物質はＨｂＡ１ｃのβ鎖から切り出されるαＦ６Ｐであり、具体的には、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸である。別の実施形態において本発明のアマドリアーゼが作用する測定物質はαＦＶＨ（α−フルクトシルバリルヒスチジン）またはαＦＶ（α−フルクトシルバリン）である。
【００５５】
（アマドリアーゼ）
アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼともいい、酸素の存在下で、イミノ２酢酸若しくはその誘導体（アマドリ化合物）を酸化して、グリオキシル酸若しくはα−ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、および過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物若しくは植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母、若しくは細菌等から得ることができる。
【００５６】
本発明のアマドリアーゼはＨｂＡ１ｃに直接作用する。本明細書において、アマドリアーゼがＨｂＡ１ｃに直接作用する、とは、アマドリアーゼが、酸素の存在下で、ＨｂＡ１ｃのβ鎖のＮ末端のフルクトシル基に作用し、2-ケト-Dグルコースおよび過酸化水素、ヘモグロビンのβ鎖が生じることをいう。ただしこれは当該アマドリアーゼがＨｂＡ１ｃのβ鎖由来のフルクトシルペプチド、例えばαＦ６Ｐに反応することを排除するものではない。すなわち、ある実施形態において本発明のアマドリアーゼは、ＨｂＡ１ｃに直接作用するのみならず、ＨｂＡ１ｃのβ鎖由来のフルクトシルペプチド、例えばαＦ６Ｐに対しても反応性を有する。
【００５７】
（アマドリアーゼ改変体）
本発明は、配列番号１、配列番号３８、配列番号４０、配列番号５４、又は配列番号６２、又は配列番号８９、又は配列番号９９に示すアミノ酸配列を有する野生型アマドリアーゼに基づき作製される、αＦ６Ｐに対して反応性を有し、かつＨｂＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼの改変体を提供する。本明細書において改変体とは変異体と交換可能に用いられ、アマドリアーゼのアミノ酸配列を野生型の配列と比較したときに、一部のアミノ酸が置換、欠失又は付加されているものをいう。ここでいう付加には挿入も包含されるものとする。
【００５８】
本発明はさらに、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３又は配列番号１４５又は配列番号１４９に示すアミノ酸配列を有する野生型アマドリアーゼに基づき、αＦ６Ｐに対して反応性を有し、かつＨｂＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼの改変体を提供する。
【００５９】
また、本発明の知見に基づき、コニオカエタ(Coniochaeta)属等に由来する他の野生型アマドリアーゼに基づき、ＨｂＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼの改変体を取得することができる。
【００６０】
本発明のアマドリアーゼ改変体は、αＦ６Ｐに対して反応性を有し、かつＨｂＡ１ｃに直接作用する限り、酵素の他の特性を改変する変異をさらに有しうる。
【００６１】
（Coniochaeta sp. NISL 9330由来アマドリアーゼに基づく改変体）
ある実施形態において本発明のアマドリアーゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するコニオカエタ属由来のアマドリアーゼに基づき作製された、ＨｂＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼの改変体である。
【００６２】
配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５（一重変異体）、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、及び配列番号１６３（二重変異体）、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３（三重変異体）、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１７５、配列番号１８９（四重変異体）、配列番号１７７、配列番号１７９（五重変異体）、配列番号１４３、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８７、配列番号１９１（六重変異体）、配列番号１４１又は配列番号１８５（七重変異体）のアミノ酸配列と高い配列同一性（例えば、５０％以上、好ましくは６０％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上）のアミノ酸配列を有し、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼは、ＨｂＡ１ｃに直接作用しうる。例えば配列番号１４１のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼは、αＦ６Ｐに対する活性を有し、かつＨｂＡ１ｃに直接作用する。
【００６３】
配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５（一重変異体）、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、及び配列番号１６３（二重変異体）、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３（三重変異体）、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１７５、配列番号１８９（四重変異体）、配列番号１７７、配列番号１７９（五重変異体）、配列番号１４３、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８７、配列番号１９１（六重変異体）、配列番号１４１又は配列番号１８５（七重変異体）のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が改変若しくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有し、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼは、ＨｂＡ１ｃに直接作用しうる。ここで１又は数個のアミノ酸とは、全長が４００アミノ酸を超えるアミノ酸配列について言う場合は１〜１５個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１又は２個のアミノ酸をいう。また、１又は数個のアミノ酸とは、全長が２００〜４００アミノ酸の配列について言う場合は、１〜１０個、好ましくは１〜７個、好ましくは１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１又は２個のアミノ酸をいう。１又は数個のアミノ酸とは、全長が４０アミノ酸以上、２００アミノ酸未満の配列について言う場合は、１〜５個、好ましくは１〜４個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１又は２個のアミノ酸をいう。１又は数個のアミノ酸とは、全長が４０アミノ酸未満の配列について言う場合は、１又は２個のアミノ酸をいう。
【００６４】
また、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６（一重変異体）、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、及び配列番号１６４（二重変異体）、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４（三重変異体）、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１７６、配列番号１９０（四重変異体）、配列番号１７８、配列番号１８０（五重変異体）、配列番号１４４、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８８、配列番号１９２（六重変異体）、配列番号１４２又は配列番号１８６（七重変異体）に示す塩基配列に相補的な配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされ、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼはＨｂＡ１ｃに直接作用しうる。ここでストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションはSambrookら, Molecular Cloning第２版、（Cold Spring Harbor Laboratory press）やCurrent protocols in molecular biology（Frederick M. Ausubel ら, 編, 1987）等に記載されている。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（50％ホルムアミド、6〜10×SSC(0.15〜1.5M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS、10％ デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて約42℃〜約50℃でインキュベートし、その後0.1×SSC、0.1％ SDSを用いて約65℃〜約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。また別のストリンジェントな条件において、ハイブリダイゼーション液として50％ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いる条件を挙げることができる。
【００６５】
なお、本発明の変異体は、請求の範囲に記載された、基質特異性および／またはアミノ酸配列に関する条件を満たす限り、例えば、ユーペニシリウム属、ピレノケータ属、アルスリニウム属、カーブラリア属、ネオコスモスポラ属、クリプトコッカス属、フェオスフェリア属、アスペルギルス属、エメリセラ属、ウロクラディウム属、ペニシリウム属、フザリウム属、アカエトミエラ属、アカエトミウム属、シエラビア属、カエトミウム属、ゲラシノスポラ属、ミクロアスカス属、レプトスフェリア属、オフィオボラス属、プレオスポラ属、コニオケチジウム属、ピチア属、コリネバクテリウム属、アグロバクテリウム属、若しくはアルスロバクター属のような、他の生物種に由来するアマドリアーゼに基づき作製されたものでもよい。
【００６６】
Coniochaeta sp. NISL 9330由来アマドリアーゼ（配列番号１）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る。ここで、アマドリアーゼ改変体に関して用いる１又は複数のアミノ酸置換とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８のアミノ酸置換、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５のアミノ酸置換、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のアミノ酸置換、例えば１、２、３、４、５、６、７又は８つのアミノ酸置換をいう。ある実施形態ではアマドリアーゼ改変体に関して用いる１又は複数のアミノ酸置換は１、２、３、４、５、６、又は７つのアミノ酸置換である。  
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のグルタミン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４１９位のアラニン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５６位のアラニン
上記Coniochaeta sp. NISL 9330由来アマドリアーゼ（配列番号１）において、好ましくは、（ａ）６２位のアルギニンは、アラニン、アスパラギンまたはアスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンは、ヒスチジン又はアラニンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸は、リジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸は、アラニン、リジン、又はアルギニンへと置換される。好ましくは（ｅ）１１０位のグルタミンはロイシン又はチロシンへと置換される。好ましくは（ｆ）１１３位のアラニンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは（ｇ）３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１９位のアラニンはリジンへと置換されていてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５６位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。
【００６７】
Phaeosphaeria nodorum由来アマドリアーゼ（PnFX、配列番号３８）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のセリン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のリジン
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のグリシン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５１位のアラニン
（ｈ）４１６位のセリン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５２位のアラニン
上記Phaeosphaeria nodorum由来アマドリアーゼ（配列番号３８）において、場合により（ａ）６２位のセリンは置換されなくともよい。また、（ａ）６２位のセリンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。場合により（ｃ）１０２位のリジンは置換されなくともよい。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは１１０位のグリシンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは３５１位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１６位のセリンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５２位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。
【００６８】
Neocosmospora vasinfecta由来アマドリアーゼ（NvFX、配列番号５４）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のグリシン
（ｅ）１１０位のグルタミン酸
（ｆ）１１３位のリジン
（ｇ）３５５位のセリン
（ｈ）４２０位のアラニン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５６位のアラニン
上記Neocosmospora vasinfecta由来アマドリアーゼ（配列番号５４）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のグリシンはリジンへと置換される。好ましくは１１０位のグルタミン酸はロイシンへと置換される。場合により１１３位のリジンは置換されなくともよい。場合により３５５位のセリンは置換されなくともよい。場合により（ｈ）４２０位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５６位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。
【００６９】
Aspergillus nidulans由来アマドリアーゼ（AnFX、配列番号６２）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６１位のアルギニン
（ｂ）６２位のロイシン
（ｃ）１０１位のグルタミン酸
（ｄ）１０５位のグリシン
（ｅ）１０９位のリジン
（ｆ）１１２位のセリン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４２０位のアラニン
（ｉ）６７位のアスパラギン酸
（ｊ）３５６位のアスパラギン
上記Aspergillus nidulans由来アマドリアーゼ（配列番号６２）において、好ましくは（ａ）６１位のアルギニンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６２位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０１位のグルタミン酸はリジンと置換される。好ましくは（ｄ）１０５位のグリシンはリジンへと置換される。好ましくは１０９位のリジンはロイシンへと置換される。好ましくは１１２位のセリンはリジンへと置換される。好ましくは３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４２０位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６７位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５６位のアスパラギンはスレオニンへと置換されてもよい。
【００７０】
Eupenicillium terrenum由来アマドリアーゼ（配列番号４０）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のアスパラギン
（ｅ）１１０位のリジン
（ｆ）１１３位のスレオニン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４１９位のグリシン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５６位のアスパラギン
上記EFP-T5由来アマドリアーゼ（配列番号４０）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギンはリジンへと置換される。好ましくは１１０位のリジンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のスレオニンはリジンへと置換される。好ましくは３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１９位のグリシンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５６位のアスパラギンはスレオニンへと置換されてもよい。
【００７１】
Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９又は１４９）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のイソロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のセリン
（ｅ）１１０位のセリン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４２０位のアラニン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５６位のアスパラギン
上記Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（CnFX、配列番号８９又は１４９）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のイソロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のセリンはリジンへと置換される。好ましくは１１０位のセリンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４２０位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５６位のアスパラギンはスレオニンへと置換されてもよい。
【００７２】
Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のリジン
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のアラニン
（ｆ）１１３位のスレオニン
（ｇ）３５３位のアラニン
（ｈ）４１８位のアラニン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５４位のアラニン
上記Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。場合により（ｃ）１０２位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは１１０位のアラニンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のスレオニンはリジンへと置換される。好ましくは３５３位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１８位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５４位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。
【００７３】
Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のリジン
（ｄ）１０６位のアラニン
（ｅ）１１０位のグルタミン
（ｆ）１１３位のスレオニン
（ｇ）３５６位のアラニン
（ｈ）４２１位のアラニン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５７位のアラニン
上記Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。場合により（ｃ）１０２位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは（ｄ）１０６位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは１１０位のグルタミンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のスレオニンはリジンへと置換される。好ましくは３５６位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４２１位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５７位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。
【００７４】
Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のアラニン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５３位のアラニン
（ｈ）４１８位のアラニン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５４位のアラニン
上記Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは１１０位のアラニンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは３５３位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１８位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５４位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。
【００７５】
Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）と９５％のアミノ酸配列同一性を有するケトアミンオキシダーゼ（Cc95FX、配列番号９９）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のアラニン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５３位のアラニン
（ｈ）４１８位のセリン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５４位のアラニン
上記Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）と９５％のアミノ酸配列同一性を有するケトアミンオキシダーゼ（配列番号９９）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは１１０位のアラニンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは３５３位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１８位のセリンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５４位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。
【００７６】
Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６１位のアルギニン
（ｂ）６２位のロイシン
（ｃ）１０１位のグルタミン酸
（ｄ）１０５位のリジン
（ｅ）１０９位のアルギニン
（ｆ）１１２位のセリン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４２０位のアラニン
（ｉ）６７位のアスパラギン酸
（ｊ）３５６位のアスパラギン
上記Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）において、好ましくは（ａ）６１位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６２位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０１位のグルタミン酸はリジンへと置換される。場合により（ｄ）１０５位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは１０９位のアルギニンはロイシンへと置換される。好ましくは１１２位のセリンはリジンへと置換される。好ましくは３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４２０位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６７位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５６位のアスパラギンはスレオニンへと置換されてもよい。
【００７７】
Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のリジン
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のアラニン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５３位のアラニン
（ｈ）４１８位のアラニン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５４位のアラニン
上記Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。場合により（ｃ）１０２位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは１１０位のアラニンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは３５３位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１８位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５４位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。
【００７８】
Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のセリン
（ｅ）１１０位のリジン
（ｆ）１１３位のアスパラギン酸
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４１９位のセリン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５６位のアスパラギン
上記Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のセリンはリジンへと置換される。好ましくは１１０位のリジンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１９位のセリンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５６位のアスパラギンはスレオニンへと置換されてもよい。Penicillium chrysogenum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼについても同様である。
【００７９】
ある実施形態において、本発明のヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼは、好ましくは
基質としてヘモグロビンＡ１ｃのβ鎖を認識し、
作用としてヘモグロビンＡ１ｃのβ鎖を酸化して過酸化水素を生成し、
至適ｐＨ範囲をｐＨ６〜８の範囲に有し、
作用ｐＨ範囲をｐＨ５〜９の範囲に有し、
作用温度が２５〜４０℃であり、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での分子量が約４５〜５５ＫＤａ、例えば約４８〜５０ＫＤａであるものであり得る。
【００８０】
本発明のアマドリアーゼ変異体又は改変体からは、ＨｂＡ１ｃに対する活性を全く示さないアマドリアーゼは除くものとする。
【００８１】
（アマドリアーゼをコードする遺伝子の取得）
これらのアマドリアーゼをコードする遺伝子（以下、単に「アマドリアーゼ遺伝子」ともいう）を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、アマドリアーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷＩＬＥＹ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
【００８２】
次いで、上記アマドリアーゼのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーからアマドリアーゼ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ法）により、アマドリアーゼをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のアマドリアーゼ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。
【００８３】
このようにして得られたアマドリアーゼをコードする遺伝子の好ましい一例として、コニオカエタ属由来のアマドリアーゼ遺伝子（特開２００３−２３５５８５号公報）が挙げられる。
【００８４】
また、別の好ましい例として、Phaeosphaeria属由来のアマドリアーゼ遺伝子、Neocosmospora属由来のアマドリアーゼ遺伝子、Aspergillus属由来のアマドリアーゼ遺伝子、及びCryptococcus属由来のアマドリアーゼ遺伝子、及びCurvularia属由来のアマドリアーゼ遺伝子、及びEupenicillium属由来のアマドリアーゼ遺伝子が挙げられる。
【００８５】
これらのアマドリアーゼ遺伝子は、常法通り各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましい。例えば、Coniochaeta sp. NISL 9330株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７（国際公開第２００７／１２５７７９号）から、GenElute Plasmid Miniprep Kit（Sigma-Alcrich社製）を用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７を、抽出、精製して得ることができる。他の生物由来のアマドリアーゼ遺伝子についても、当業者であれば慣用法により、同様の手順でＤＮＡを取得することができる。具体的には、Eupenicillium terrenum ATCC 18547株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５（国際公開第２００７／１２５７７９号）を保持する大腸菌を培養し、GenElute Plasmid Miniprep Kitを用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５を、細胞から抽出、精製して得ることができる。また、Aspergillus nidulans FGSC A26株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＡｎＦＸ（国際公開第２０１２／０１８０９４号）を保持する大腸菌を培養し、GenElute Plasmid Miniprep Kitを用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＡｎＦＸを、抽出、精製して得ることができる。また、Cryptococcus neoformans由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ（国際公開第２０１２／０１８０９４号）を保持する大腸菌を培養し、GenElute Plasmid Miniprep Kitを用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸを、抽出、精製して得ることができる。また、Neocosmospora vasinfecta由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ（国際公開第２０１２／０１８０９４号）を保持する大腸菌を培養し、GenElute Plasmid Miniprep Kitを用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸを、抽出、精製して得ることができる。
【００８６】
（ベクター）
本発明において用いることのできるベクターとしては、上記プラスミドに限定されることなく、それ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋（Stratagene社製）等が好ましい。
【００８７】
（アマドリアーゼ遺伝子の変異処理）
アマドリアーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、アマドリアーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；または蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
【００８８】
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若しくは５−ブロモウラシル等を挙げることができる。
【００８９】
この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異をアマドリアーゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５〜１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０〜８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０〜１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、０２４〜３０、１９８９年６月号）。
【００９０】
蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １２，  ９４４１  （１９８４）：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １５４，  ３５０  （１９８７）：  Ｇｅｎｅ，  ３７，  ７３  （１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １３，  ８７４９  （１９８５）：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １３，  ８７６５  （１９８５）：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  １４，  ９６７９  （１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８２，  ４８８  （１９８５）：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １５４，  ３６７  （１９８７））等が挙げられる。
【００９１】
また、一般的なＰＣＲ法として知られる手法を用いることもできる（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  １，  １１（１９８９）参照）。なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法または酵素合成法により、直接所望の改変アマドリアーゼ遺伝子を合成することもできる。
【００９２】
上記方法により得られるアマドリアーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定若しくは確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ（Life Technologies社製）等を用いることにより行うことができる。
【００９３】
（形質転換・形質導入）
上述のように得られたアマドリアーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換または形質導入をすることができる。例えば、宿主として、エッシェリシア属に属する微生物、例えば得られた組換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌Ｋ−１２株、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＤＨ５α株（ともにタカラバイオ社製）等を形質転換またはそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得る。
【００９４】
（アミノ酸配列の相同性、同一性又は類似性）
アミノ酸配列の相同性、同一性又は類似性は、ＧＥＮＥＴＹＸ（GENETYX社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、またはＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（日立ソリューションズ社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント、またはCLUSTAL Wのマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、２以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、該２以上のアマドリアーゼにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。ここで２以上のアミノ酸配列について、同一性％とは、Blosum62等のアルゴリズムを利用して２以上のアミノ酸配列のアラインメントを行った際に、アラインメント可能であった領域の総アミノ酸数を分母とし、そのうち同一のアミノ酸によって占められる位置の数を分子としたときのパーセンテージをいう。故に、通常、２以上のアミノ酸配列に同一性が全く見られない領域がある場合、例えばＣ末端に同一性が全く見られない付加配列が一方のアミノ酸配列にある場合、当該同一性のない領域はアラインメント不可能であるため、同一性％の算出には利用されない。
【００９５】
また、２以上のアマドリアーゼにおいて類似であるアミノ酸の位置を調べることもできる。例えばCLUSTALWを用いて複数のアミノ酸配列をアライメントすることができ、この場合、アルゴリズムとしてBlosum62を使用し、複数のアミノ酸配列をアライメントしたときに類似（similar）と判断されるアミノ酸を類似アミノ酸と呼ぶことがある。本発明の変異体において、アミノ酸置換はこのような類似アミノ酸の間の置換によるものであり得る。こうしたアライメントにより、複数のアミノ酸配列について、アミノ酸配列が同一である領域及び類似アミノ酸によって占められる位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の相同性領域（保存領域）を決定できる。
【００９６】
本明細書において「相同性領域」とは、２以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、ある基準となるアマドリアーゼと比較対象のアマドリアーゼの対応する位置におけるアミノ酸が同一であるか又は類似アミノ酸からなる領域であって、連続する３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上又は１０以上のアミノ酸からなる領域をいう。例えば、図１では全長アミノ酸配列の配列同一性が７４％以上であるアマドリアーゼをアライメントした。このうち、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として第１０位〜３２位は同一又は類似アミノ酸からなり、よって相同性領域に該当する。同様に、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位は相同性領域に該当しうる。
【００９７】
好ましくは、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として、第１１位〜３２位、３６〜４１位、５０〜５２位、５４〜５８位、８４〜８６位、８８〜９０位、１４５〜１５０位、１５７〜１６８位、２０２〜２０５位、２０７〜２１２位、２１５〜２２５位、２３６〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、３４７〜３５４位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、及び４０５〜４１０位のアミノ酸配列からなる領域である。
【００９８】
さらに好ましくは、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として第１１〜１８位、２０〜３２位、５０〜５２位、５４〜５８位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７７〜２８６位、及び３７０〜３８３位のアミノ酸配列からなる領域である。
【００９９】
本発明のアマドリアーゼ変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼとアライメントしたときに５０％以上、好ましくは６０％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、αＦ６Ｐに対して高い反応性を有する。さらに、本発明のアマドリアーゼ変異体の相同性領域におけるアミノ酸配列は、配列番号１における相同性領域のアミノ酸配列と８０％、好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％、好ましくは９８％、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有する。
【０１００】
ある実施形態において、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号１４１のアマドリアーゼを基準として第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる領域、好ましくは第１１位〜３２位、３６〜４１位、５０〜５２位、５４〜５８位、８４〜８６位、８８〜９０位、１４５〜１５０位、１５７〜１６８位、２０２〜２０５位、２０７〜２１２位、２１５〜２２５位、２３６〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、３４７〜３５４位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、及び４０５〜４１０位のアミノ酸配列からなる領域、さらに好ましくは第１１〜１８位、２０〜３２位、５０〜５２位、５４〜５８位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７７〜２８６位、及び３７０〜３８３位のアミノ酸配列からなる領域である。
【０１０１】
ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは、
(i)  配列番号１４１に示すアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加がなされたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼであるか、または
(ii)  前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１４１のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１４１の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼである。ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは、前記(ii)に規定される相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９５％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼである。
【０１０２】
ある実施形態において本発明のアマドリアーゼは、上記に加え、又は上記とは独立に配列番号１に示すアミノ酸配列における以下のアミノ酸、
（i）６８位のアスパラギン酸、及び
（ii）３５６位のアラニン、
よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有する。
【０１０３】
ある実施形態において本発明のアマドリアーゼは、上記に加え、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下のアミノ酸、
（i）２６２位のアスパラギン、
（ii）２５７位のバリン、
（iii）２４９位のグルタミン酸
（iv）２５３位のグルタミン酸、
（v）３３７位のグルタミン、
（vi）３４０位のグルタミン酸、
（vii）２３２位のアスパラギン酸、
（viii）１２９位のアスパラギン酸、
（ix）１３２位のアスパラギン酸、
（x）１３３位のグルタミン酸、
（xi）４４位のグルタミン酸、
（xii）２５６位のグリシン、
（xiii）２３１位のグルタミン酸、及び
（xiv）８１位のグルタミン酸、
よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有する。さらなる実施形態において、本発明のアマドリアーゼは、上記に加え、場合によりカルボキシル末端からの3アミノ酸残基を欠失していてもよい。
【０１０４】
（アミノ酸に対応する位置の特定）
本発明において、あるベースとなるアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸が別の類似するアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸と対応する場合、これを対応するアミノ酸といい、そのアミノ酸の位置を対応する位置、又は相当する位置という。また、「アミノ酸の位置に対応する位置」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アマドリアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行う方法が挙げられる。アマドリアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各アマドリアーゼ配列における配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるアマドリアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
【０１０５】
なお、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６２位のアルギニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
【０１０６】
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では６２位のアルギニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）では６２位のセリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では６１位のアルギニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）では６１位のアルギニンである。
【０１０７】
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６３位のロイシンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６３位のロイシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
【０１０８】
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６３位のロイシンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では６３位のロイシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）では６３位のイソロイシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では６２位のロイシンである。
【０１０９】
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０２位のグルタミン酸に対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１０２位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
【０１１０】
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０２位のグルタミン酸に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では１０２位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では１０２位のリジン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）では１０１位のグルタミン酸である。
【０１１１】
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１０６位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
【０１１２】
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）では１０６位のアスパラギン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では１０６位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）では１０６位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）では１０６位のグリシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では１０６位のセリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では１０５位のリジン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）では１０５位のグリシンである。
【０１１３】
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１０位のグルタミンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１１０位のグルタミンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
【０１１４】
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１０位のグルタミンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では１１０位のリジン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では１１０位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）では１１０位のグルタミン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）では１１０位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）では１１０位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）では１１０位のグリシン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では１０９位のアルギニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）では、１０９位のリジンである。
【０１１５】
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１３位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１１３位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
【０１１６】
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１３位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）では１１３位のスレオニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では１１３位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）では１１３位のリジン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では１１２位のセリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では１１３位のアスパラギン酸である。
【０１１７】
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３５５位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
【０１１８】
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では３５５位のアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では３５３位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）では３５６位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）では３５５位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）では３５１位のアラニンである。
【０１１９】
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の４１９位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの４１９位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
【０１２０】
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の４１９位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）では４１９位のグリシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では４１８位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）では４２１位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では４２０位のアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）では４１６位のセリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では４１９位のセリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）では４２０位のアラニンである。
【０１２１】
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６８位のアスパラギン酸に対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６８位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
【０１２２】
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６８位のアスパラギン酸に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では６８位のアスパラギン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）及びAspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）では６７位のアスパラギン酸である。
【０１２３】
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３５６位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３５６位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
【０１２４】
すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３５６位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）では３５６位のアスパラギン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）では３５４位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）では３５７位のアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）では３５４位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）では３５６位のアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）では３５６位のアスパラギン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）では３５２位のアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）では３５６位のアスパラギン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では３５６位のアスパラギン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では３５４位のアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では３５６位のアスパラギンである。
【０１２５】
本発明のアマドリアーゼ変異体は、一重変異体であってもよいが、２以上のアミノ酸置換を有する多重変異体であってもよい。本発明者らは、配列番号１のアミノ酸配列における第６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、及び３５５位に対応する位置のアミノ酸を置換したアマドリアーゼが驚くべきことにＨｂＡ１ｃに対する活性を示すことを見出した。さらに本発明者らは、配列番号１のアミノ酸配列における第６８位及び３５６位に対応する位置のアミノ酸を置換したアマドリアーゼが驚くべきことにαＦ６Ｐに対する活性が増大することを見いだした。
【０１２６】
本明細書では、これらの位置（62/63/102/106/110/113/355/419及び68/356）の変異を、アマドリアーゼの基質特異性を変化させる変異又はアマドリアーゼの基質特異性を変化させるアミノ酸置換と呼ぶことがある。
【０１２７】
ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼはαＦ６Ｐに対する比活性（U/mg）が0.1U/mg以上、0.2U/mg以上、0.3U/mg以上、0.4U/mg以上、0.5U/mg以上、0.6U/mg以上、0.7U/mg以上、0.8U/mg以上、0.9U/mg以上、例えば1U/mg以上である。該アマドリアーゼは、基質特異性を変化させるアミノ酸置換を１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上又は１０以上、有しうる。このような本発明のアマドリアーゼは、ＨｂＡ１ｃに直接作用し、本発明のＨｂＡ１ｃ測定方法に用いることができる。
【０１２８】
ある実施形態において、αＦ６Ｐに対する比活性（U/mg）が0.1U/mg以上である本発明のアマドリアーゼは、アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、
（a）配列番号１の６２位のアルギニン、
（b）配列番号１の６３位のロイシン、
（c）配列番号１の１０２位のグルタミン酸、
（d）配列番号１の１０６位のアスパラギン酸、
（e）配列番号１の１１０位のグルタミン、
（f）配列番号１の１１３位のアラニン、
（g）配列番号１の３５５位のアラニン、
（h）配列番号１の４１９位のアラニン、
(i) 配列番号１の６８位のアスパラギン酸、及び
(j) 配列番号１の３５６位のアラニン、
からなる群より選択される位置に対応する位置のアミノ酸が１つまたはそれ以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、例えば１０、置換されたものであり得る。なお、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンに対応する位置」のアミノ酸は、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）では６２位のセリンである。これは配列番号１のアミノ酸配列から見れば６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がセリンとなった、すなわちセリンに置換されたものと同等である。したがって天然のアマドリアーゼとして、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）のような、配列番号１のアミノ酸配列の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がセリンであるアマドリアーゼも便宜上、本明細書では、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに（a）配列番号１の６２位のアルギニンに対応する位置にアミノ酸置換を有するアマドリアーゼに含めるものとする。
【０１２９】
ある実施形態において、αＦ６Ｐに対する比活性（U/mg）が0.1U/mg以上である本発明のアマドリアーゼは、配列番号１記載のアミノ酸の以下（a）から（j）よりなる群から選択される位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の１つまたはそれ以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、例えば１０が以下の各々に記載されるアミノ酸残基であり得る：
（a）配列番号１の６２位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンである、
（b）配列番号１の６３位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジンである、
（c）配列番号１の１０２位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
（d）配列番号１の１０６位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、リジン又はアルギニンである、
（e）配列番号１の１１０位に対応する位置のアミノ酸がロイシン又はチロシンである、
（f）配列番号１の１１３位に対応する位置のアミノ酸がリジン又はアルギニンである、
（g）配列番号１の３５５位に対応する位置のアミノ酸がセリンである、
（h）配列番号１の４１９位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
(i) 配列番号１の６８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンである、
(j) 配列番号１の３５６位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンである。
【０１３０】
（予備的な置換について）
アマドリアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列の第６０位に対応する位置のアミノ酸がセリンである場合、これをグリシンへと置換することによって、置換前にαＦＶＨ活性を示さなかった酵素が、置換後にαＦＶＨ活性を示すようになることが報告されている（特開２０１０−３５４６９号公報、国際公開第２０１２／０１８０９４号参照）。したがって、本発明に用いるアマドリアーゼの配列番号１の第６０位に対応する位置のアミノ酸がセリンである場合、これを予めグリシンへと置換しておくこともできる。あるいは、野生型において配列番号１の６０位に対応する位置がグリシンであるアマドリアーゼを用いて、上記配列番号１の第６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位及び４１９位に対応する位置並びに６８位及び３５６位に変異を導入してもよい。本発明のアマドリアーゼ変異体は、特に断らない限り、配列番号１の第６０位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであるものを包含する。例えば、Aspergillus nidulans由来アマドリアーゼは、配列番号１の６０位に対応する配列番号１４７中の第５９位のアミノ酸が野生型ではセリンであるが、これをグリシンに置換したもの（配列番号６２）を本発明の変異体のための基となるアマドリアーゼとして用いてもよい。Penicillium janthinellum(Pj)由来アマドリアーゼ（配列番号１２３）についても同様である。
【０１３１】
（さらなる予備的な置換について−界面活性剤耐性を向上させる変異）
本発明者らは、アマドリアーゼのアミノ酸残基を置換することによりその界面活性剤に対する耐性を向上させることができることを確認している。本発明のアマドリアーゼは、場合により、さらにこのようなアミノ酸置換を有しうる。
【０１３２】
界面活性剤耐性の向上をもたらすアミノ酸の置換として、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の置換が挙げられる。 
（１）２６２位のアスパラギンの置換、例えば、ヒスチジンへの置換。 
（２）２５７位のバリンの置換、例えば、システイン、セリン、スレオニンへの置換。 
（３）２４９位のグルタミン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（４）２５３位のグルタミン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（５）３３７位のグルタミンの置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（６）３４０位のグルタミン酸の置換、例えば、プロリンへの置換。 
（７）２３２位のアスパラギン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（８）１２９位のアスパラギン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（９）１３２位のアスパラギン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（１０）１３３位のグルタミン酸の置換、例えば、アラニン、メチオニン、リジン、アルギニンへの置換。 
（１１）４４位のグルタミン酸の置換、例えば、プロリンへの置換。 
（１２）２５６位のグリシンの置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（１３）２３１位のグルタミン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（１４）８１位のグルタミン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。
【０１３３】
界面活性剤耐性が向上したアマドリアーゼの変異体は、上記アミノ酸置換を少なくとも１つ有していればよく、複数のアミノ酸置換を有していてもよい。例えば、上記アミノ酸置換の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４を有しうる。
【０１３４】
なお、本明細書において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の４４位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの４４位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図１により特定することができる。
【０１３５】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは４４位のリジン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは４４位のプロリン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは４４位のプロリン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは４４位のプロリン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは４４位のプロリン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４４位のロイシン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは４４位のプロリン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４３位のプロリン、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは４３位のプロリン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４４位のプロリン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４４位のプロリンである。
【０１３６】
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の８１位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの８１位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
【０１３７】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは８１位のアスパラギン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは８１位のグルタミン酸、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは８１位のヒスチジン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは８１位のグルタミン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは８１位のアスパラギン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８１位のアスパラギン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは８１位のグルタミン酸、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８０位のアスパラギン、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは８０位のアスパラギン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８１位のグルタミン酸、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８１位のアスパラギンである。
【０１３８】
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１３３位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列の１３３位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
【０１３９】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは１３３位のグルタミン酸、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは１３３位のグルタミン酸、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは１３３位のアラニン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは１３３位のグルタミン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは１３３位のアラニン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３３位のグルタミン酸、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１３１位のグルタミン酸、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３２位のグルタミン酸、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１３２位のグルタミン酸、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３３位のリジン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３３位のアスパラギン酸である。
【０１４０】
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２５３位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列の２５３位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
【０１４１】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは２５３位のアラニン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２５１位のアラニン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２５３位のグルタミン酸、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２５１位のグルタミン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２５３位のバリン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５３位のグルタミン酸、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２４９位のアルギニン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５３位のアラニン、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５３位のアラニン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５１位のグルタミン酸、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５３位のグルタミンである。
【０１４２】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２５６位のグリシンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２５６位のグリシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
【０１４３】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは２５６位のアスパラギン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２５４位のアスパラギン酸、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２５６位のグリシン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２５４位のアスパラギン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２５６位のグリシン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５６位のグルタミン酸、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５２位のアスパラギン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５６位のアスパラギン、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５６位のアスパラギン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５４位のアスパラギン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５６位のアスパラギン酸である。
【０１４４】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２５７位のバリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２５７位のバリンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
【０１４５】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは２５７位のバリン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２５５位のスレオニン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２５７位のシステイン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２５５位のバリン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２５７位のシステイン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５７位のシステイン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５３位のセリン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５７位のスレオニン、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５７位のスレオニン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５５位のバリン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５７位のバリンである。
【０１４６】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２６２位のアスパラギンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２６２位のアスパラギンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
【０１４７】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは２６２位のアスパラギン酸、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２６０位のアスパラギン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２６２位のヒスチジン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２６０位のアスパラギン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２６２位のヒスチジン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６２位のアスパラギン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５８位のアスパラギン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６２位のアスパラギン酸、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２６２位のアスパラギン酸、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６０位のアスパラギン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６２位のアスパラギン酸である。
【０１４８】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３３７位のグルタミンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３３７位のグルタミンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
【０１４９】
すなわちＥｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは３３７位のリジン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは３３５位のリジン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは３３８位のグルタミン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは３３５位のスレオニン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは３３７位のリジン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３７位のリジン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３３３位のリジン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３７位のアスパラギン、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３３７位のアスパラギン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３５位のスレオニン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３７位のリジンである。
【０１５０】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３４０位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３４０位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
【０１５１】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは３４０位のグルタミン酸、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは３３８位のグルタミン酸、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは３４１位のグルタミン酸、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは３３８位のグルタミン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは３４０位のプロリン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３４０位のグルタミン酸、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３３６位のリジン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３４０位のグルタミン酸、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３４０位のグルタミン酸、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３８位のグルタミン酸、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３４０位のグルタミン酸である。
【０１５２】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１２９位のアスパラギン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１２９位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
【０１５３】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは１２９位のグルタミン酸、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２９位のセリン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１２７位のアスパラギン酸、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２８位のグルタミン酸、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１２８位のグルタミン酸、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２９位のグルタミン酸である。
【０１５４】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１３２位のアスパラギン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１３２位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
【０１５５】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは１３２位のグルタミン酸、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１３０位のアスパラギン酸、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３１位のアスパラギン酸、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１３１位のアスパラギン酸、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸である。
【０１５６】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２３１位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２３１位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
【０１５７】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは２３１位のグルタミン酸、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２２９位のグルタミン酸、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２２９位のグルタミン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２２７位のヒスチジン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２２９位のグルタミン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸である。
【０１５８】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２３２位のアスパラギン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２３２位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
【０１５９】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは２３２位のアスパラギン酸、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２３０位のアスパラギン酸、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２３２位のグルタミン酸、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２３０位のアスパラギン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２３２位のグルタミン酸、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３２位のグリシン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２２８位のグルタミン酸、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３２位のグルタミン酸、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２３２位のグルタミン酸、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３０位のアスパラギン酸、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３２位のアスパラギン酸である。
【０１６０】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２４９位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２４９位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
【０１６１】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは２４９位のリジン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２４７位のリジン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２４９位のヒスチジン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２４７位のグルタミン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２４９位のグルタミン酸、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４９位のグルタミン酸、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２４５位のグルタミン酸、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４９位のアラニン、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２４９位のアラニン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４７位のセリン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４９位のグルタミンである。
【０１６２】
本明細書ではこれらの位置（44位/133位/253位/257位/262位/337位/340位並びに249位/232位/129位/132位/256位/231位/81位）の変異を、アマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させる変異またはアマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させるアミノ酸置換と呼ぶことがある。ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは、基質特異性を変化させる変異に加え、さらに界面活性剤耐性を向上させる変異を有し得る。
【０１６３】
（さらなる予備的な欠失について−カルボキシル末端からの３アミノ酸残基の欠失）
本発明者らは以前に、アマドリアーゼのカルボキシル末端から、３アミノ酸残基を欠失させることにより、その熱安定性を向上させうることを報告した（国際公開第２０１３／１００００６号明細書を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは上記の置換に加え、さらにカルボキシル末端からの３アミノ酸残基を欠失していてもよい。
【０１６４】
（カルボキシル末端の欠失箇所に対応する位置）
「配列番号１記載のアマドリアーゼのカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置」とは、アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列のカルボキシル末端からの３アミノ酸残基を意味する。Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼにおける、この位置の３残基の配列は、４３５位のプロリン、４３６位のリジン及び４３７位のロイシンからなり、これらに対応する位置のアミノ酸配列も、上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
【０１６５】
すなわちＥｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３５位のアラニン、４３６位のヒスチジンおよび４３７位のロイシンからなり、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３８位のアラニン、４３９位のリジンおよび４４０位のロイシンからなり、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４５０位のヒスチジン、４５１位のリジンおよび４５２位のロイシンからなり、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３８位のセリン、４３９位のリジンおよび４４０位のロイシンからなり、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３５位のアラニン、４３６位のアスパラギンおよび４３７位のロイシンからなり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３６位のアラニン、４３７位のリジンおよび４３８位のメチオニンからなり、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３６位のアラニン、４３７位のリジンおよび４３８位のメチオニンからなり、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３９位のアラニン、４４０位のリジンおよび４４１位のロイシンからなり、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３５位のアラニン、４３６位のリジンおよび４３７位のロイシンからなる。
【０１６６】
本明細書ではアマドリアーゼに関するこれらのカルボキシル末端アミノ酸残基の欠失を、アマドリアーゼの熱安定性を向上させる欠失と呼ぶことがある。ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは、基質特異性を変化させる変異、界面活性剤耐性を向上させる変異に加え、熱安定性を向上させる欠失を有し得る。
【０１６７】
（アマドリアーゼの生産）
上記のようにして得られたアマドリアーゼの生産能を有する菌株を用いて、当該アマドリアーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
【０１６８】
すなわち、本発明は、アマドリアーゼの生産能を有する菌株を、アマドリアーゼタンパク質を発現しうる条件下で培養する工程、及び培養物又は培養液からアマドリアーゼを単離する工程を含む、アマドリアーゼの製造方法を提供する。この方法には、本発明のアマドリアーゼをコードする遺伝子を組み込んだベクターで形質転換された宿主細胞を用いることができる。ここでアマドリアーゼタンパク質を発現しうる条件とは、アマドリアーゼ遺伝子が転写、翻訳され、当該遺伝子によりコードされるポリペプチドが産生されることをいう。
【０１６９】
また、上記菌株を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
【０１７０】
また、培地に当該アマドリアーゼが作用し得る基質やその類似化合物、例えば糖化アミノ酸、糖化ペプチド類、糖化タンパク質分解物、若しくは糖化ヘモグロビンや糖化アルブミン等の糖化タンパク質を添加することにより目的の酵素の製造量を向上させることができる。
【０１７１】
培地の初発ｐＨは、ｐＨ７〜９に調整するのが適当である。培養は、２０〜４２℃の培養温度、好ましくは２５〜３７℃前後の培養温度で４〜２４時間、さらに好ましくは２５〜３７℃前後の培養温度で８〜１６時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
【０１７２】
培養終了後、該培養物よりアマドリアーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、またはリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、アマドリアーゼの粗酵素を得る。
【０１７３】
上記アマドリアーゼの粗酵素よりさらにアマドリアーゼ精製酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、スーパーデックス若しくはウルトロゲル等を用いるゲル濾過法、イオン交換性担体、疎水性担体、ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法、蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法、アフィニティクロマトグラフィー法、分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、またはこれらを組み合わせて実施することにより、精製されたアマドリアーゼ酵素標品を得ることができる。このようにして、所望のアマドリアーゼを得ることができる。
【０１７４】
（本発明のアマドリアーゼのＨｂＡ１ｃに対する反応性）
上記のような手段で得られるアマドリアーゼは、遺伝子改変等により、そのアミノ酸配列に変異を生じた結果、ＨｂＡ１ｃに直接作用しうる。
【０１７５】
本発明のアマドリアーゼはまた、改変前のものと比較してαＦ６Ｐに対する反応性が向上していてもよい。具体的には、改変前のものと比較して、「αＦＶＨに対する反応性」を１とした時の「αＦ６Ｐに対する反応性」の割合が増大していてもよい。
【０１７６】
例えば本発明のアマドリアーゼにおける、αＦＶＨに対する反応性を１とした時のαＦ６Ｐに対する反応性の割合を示すαＦ６Ｐ／αＦＶＨは、改変前に対して１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上向上していてもよい。
【０１７７】
また、本発明のアマドリアーゼにおける、αＦＶに対する反応性を１とした時のαＦ６Ｐに対する反応性の割合を示すαＦ６Ｐ／αＦＶは、改変前に対して１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上向上していてもよい。なお、「αＦＶに対する反応性」は「αＦＶ酸化活性」と表記することもある。
【０１７８】
ＨｂＡ１ｃに直接作用する本発明のアマドリアーゼの一例としては、例えば、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５）株により生産されるアマドリアーゼが挙げられる。このようなアマドリアーゼは、プロテアーゼ等でＨｂＡ１ｃを処理せずともＨｂＡ１ｃに直接作用することから試料中のＨｂＡ１ｃを直接測定する酵素測定系の実現を可能にし、産業利用上非常に有利である。
【０１７９】
（アマドリアーゼ活性の測定方法）
アマドリアーゼの活性の測定方法としては、種々の方法を用いることができるが、一例として、以下に、本発明で用いるアマドリアーゼ活性の測定方法について説明する。
【０１８０】
本発明におけるアマドリアーゼの酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や、酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。
【０１８１】
本発明におけるアマドリアーゼの活性測定には、断りの無い限り、αＦＶ、若しくはαＦＶＨ、またはαＦ６Ｐを基質として用いる。なお、酵素力価は、αＦＶ、若しくはαＦＶＨ、またはαＦ６Ｐを基質として測定した時、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義する。
【０１８２】
また、比活性（U/mg）は、酵素1mg当たりの酵素力価（U）である。例えばある酵素のαＦ６Ｐに対する比活性が０．１Ｕ／ｍｇであれば、酵素量を１０倍とすることで、比活性が１Ｕ／ｍｇの酵素と同じ酵素力価が得られることとなる。
【０１８３】
本明細書において、アマドリアーゼについて「αＦ６Ｐに対して反応性を有し」という場合、特に断らない限りこれはαＦ６Ｐに対する比活性（U/mg）が0.1U/mg以上、0.2U/mg以上、0.3U/mg以上、0.4U/mg以上、0.5U/mg以上、0.6U/mg以上、0.7U/mg以上、0.8U/mg以上、0.9U/mg以上、例えば1U/mg以上である態様を含むものとする。  αＦＶ、αＦＶＨ等の糖化ペプチドは、例えば、阪上らの方法に基づき合成、精製したものを用いることができる（特開２００１−９５５９８号公報参照）。例えば糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃで処理することにより、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）のβ鎖サブユニット由来のα−糖化ヘキサペプチド（フルクトシルＶａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ）が遊離する（Clin.Chem.,43,1994-1951(1997))。これをαＦ６Ｐ基質として使用することができる。また、このα−糖化ヘキサペプチドと同一物質である、合成基質フルクトシルＶａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ペプチド研究所製）を用いることもできる。
【０１８４】
Ａ：試薬の調製
（アマドリアーゼのαＦ６Ｐ、αＦＶＨまたはαＦＶに対する活性の測定用試薬の調製例）
（試薬１）：５Ｕ／ｍｌ  パーオキシダーゼ、０．４９ｍＭ  ４−アミノアンチピリンを含む０．１Ｍ  リン酸緩衝液  ｐＨ６．５
５．０ｋＵのパーオキシダーゼ（キッコーマン社製）、１００ｍｇの４−アミノアンチピリン（和光純薬工業社製）を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、１０００ｍｌに定容する。
【０１８５】
（試薬２）：１５ｍＭ  ＴＯＯＳ溶液
５００ｍｇのＴＯＯＳ（N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジンナトリウム、同仁化学研究所製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。
【０１８６】
（試薬３）：基質溶液（３０ｍＭ；  終濃度１ｍＭ）
αＦ６Ｐ（ペプチド研究所製）  ２５７．１ｍｇ、若しくはαＦＶＨ（キッコーマン社製）  １２４．９ｍｇ、若しくはαＦＶ（キッコーマン社製）  ８３．８ｍｇをイオン交換水に溶解し、１０ｍｌに定容する。
【０１８７】
Ｂ：活性測定法
（アマドリアーゼのαＦ６Ｐ、αＦＶＨまたはαＦＶに対する活性の測定方法の例）
２．７ｍｌの試薬１、１００μｌの試薬２、および１００μｌの酵素液を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、試薬３を１００μｌ加えて良く混ぜた後、分光光度計（Ｕ−３０１０Ａ、日立ハイテクノロジーズ社製）により、５５５ｎｍにおける吸光度の経時変化を観測し、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔAs）を測定する。なお、対照液は、１００μｌの試薬３の代わりに１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様にして、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔA0）を測定する。３７℃で１分間当たりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位(Ｕ)とし、下記の式に従って算出する。
【０１８８】
活性(U/ml)＝｛(ΔAs−ΔA0)×3.0×df｝÷(39.2×0.5×0.1)
ΔAs：反応液の1分間あたりの吸光度変化
ΔA0：対照液の1分間あたりの吸光度変化
39.2：反応により生成されるキノイミン色素のミリモル吸光係数(mM-1・cm-1)
0.5：1 molの過酸化水素による生成されるキノイミン色素のmol数
df：希釈係数
（熱処理ＨｂＡ１ｃの定量法の例）
以下のＨｂＡ１ｃ測定用試薬を調製する。
【０１８９】
試料：ＨｂＡ１ｃ溶液
ＨｂＡ１ｃ認証実用標準物質ＪＣＣＲＭ４２３（検査医学標準物質機構製）
総ヘモグロビン濃度１３３ｇ／ｌ、
ＨｂＡ１ｃ濃度３レベル（ＮＧＳＰ値  約５．６％、約７．７％、約１０．５％）
試薬Ａ１：試料前処理液
５．０％  ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（同仁化学研究所製）
試薬Ａ２：試料前処理液
５．０％  ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトシド（シグマアルドリッチ社製）
試薬Ｂ：ロイコ色素、パーオキシダーゼ溶液
１５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液  ｐＨ６．５
０．３０ｍＭ  Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４′− ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ−６４、和光純薬工業製）
１５Ｕ／ｍｌ  パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
試薬Ｃ１：アマドリアーゼ溶液
１２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液  ｐＨ６．５
１２０Ｕ／ｍｌの本発明のアマドリアーゼ(例えばＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５等)。
【０１９０】
（アマドリアーゼのＨｂＡ１ｃに対する活性の測定方法の例）
試薬Ａ１もしくは試薬Ａ２で３０倍希釈した試料（本明細書において試料希釈液と表記することがある）を高温で所定時間、例えば９８℃で２分間インキュベートした後、試料希釈液２５μｌを５０μｌの試薬Ｂに添加して３７℃で５分間インキュベートし、その後、２５μｌの試薬Ｃ１を添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させる。溶液中に過酸化水素が生じる場合、パーオキシダーゼの作用によりロイコ色素が発色し、７５１ｎｍの光の吸光度が増加する。試料のＨｂＡ１ｃ濃度に応じて得られた結果を基に、試料のＨｂＡ１ｃ濃度（ＮＧＳＰ値）と、過酸化水素の定量反応前後の７５１ｎｍの光の吸光度差ΔＡとをグラフにプロットすることができる。
【０１９１】
なお、ΔＡは下記の式に従って算出する。
【０１９２】
ΔＡ＝（試薬Ｃ１添加５分後の吸光度）−（試薬Ｃ１添加直前の吸光度×０．７５）
上記の例では、試薬Ｃ１添加により、反応液の容積が１．３３倍となるため、試薬Ｃ１添加直前の吸光度に０．７５を掛けたものを、試薬Ｃ１添加直後の吸光度と見なす。
【０１９３】
（酸処理ＨｂＡ１ｃの定量法の例）
以下の組成を有するＨｂＡ１ｃ測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ  Ｍａｊｅｓｔｙ  ＪＣＡ−ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用してＨｂＡ１ｃを測定する。
【０１９４】
試料：ＨｂＡ１ｃ溶液
ＨｂＡ１ｃ認証実用標準物質ＪＣＣＲＭ４２３（検査医学標準物質機構製）
総ヘモグロビン濃度１３３ｇ／ｌ、
ＨｂＡ１ｃ濃度３レベル（ＮＧＳＰ値  約５．６％、約７．７％、約１０．５％）
試薬Ｄ：試料前処理液
８．３％  ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（同仁化学研究所製）またはポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ５８、和光純薬工業製）
０．１Ｍ  塩酸
試薬Ｅ：ロイコ色素溶液
３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−リン酸カリウム緩衝液  ｐＨ９．０
２９０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液  ｐＨ６．５
０．１６ｍＭ  Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４′− ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ−６４、和光純薬工業製）
試薬Ｆ１：パーオキシダーゼ、アマドリアーゼ溶液
１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液  ｐＨ６．５
４０Ｕ／ｍｌ  パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
１８０Ｕ／ｍｌの本発明アマドリアーゼ（例えばＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５等）
試薬Ｄで３０倍希釈した試料２５μｌを、１２５μｌの試薬Ｅに添加して３７℃で５分間インキュベート後、５０μｌの試薬Ｆ１を添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させる。
【０１９５】
一例としてΔＡは下記の式に従って算出することができる。
【０１９６】
ΔＡ＝（試薬Ｆ１添加５分後の吸光度）−（試薬Ｆ１添加直前の吸光度×０．７５）
（界面活性剤処理ＨｂＡ１ｃの定量法の例）
以下の組成を有するＨｂＡ１ｃ測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ  Ｍａｊｅｓｔｙ  ＪＣＡ−ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用してＨｂＡ１ｃを測定する。
【０１９７】
試料：ＨｂＡ１ｃ溶液
ＨｂＡ１ｃ認証実用標準物質ＪＣＣＲＭ４２３（検査医学標準物質機構製）
総ヘモグロビン濃度１３３ｇ／ｌ、
ＨｂＡ１ｃ濃度３レベル（ＮＧＳＰ値  約５．６％、約７．７％、約１０．５％）
試薬Ｇ１：試料前処理液
０．８０％  テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（東京化成工業製）
試薬Ｇ２：試料前処理液
０．７０％  ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（東京化成工業製）
試薬Ｈ１：ロイコ色素溶液
１２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液  ｐＨ６．５
１．６％  ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（同仁化学研究所製）
０．１６ｍＭ  Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４′− ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ−６４、和光純薬工業製）
試薬Ｈ２：ロイコ色素溶液
１２０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液  ｐＨ６．５
１．６％  ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（同仁化学研究所製）
０．１６ｍＭ  Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４′− ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ−６４、和光純薬工業製）
試薬Ｉ１：パーオキシダーゼ、アマドリアーゼ溶液
１００ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液  ｐＨ６．５
４０Ｕ／ｍｌ  パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
１６０Ｕ／ｍｌ  本発明のアマドリアーゼ（例えばＣＦＰ−ＤＨ２等）
試薬Ｉ２：パーオキシダーゼ、アマドリアーゼ溶液
１００ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液  ｐＨ６．５
４０Ｕ／ｍｌ  パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
１６０Ｕ／ｍｌ  本発明のアマドリアーゼ（例えばＣＦＰ−ＤＨ２等）
試薬Ｇ１で２５倍希釈した試料２５μｌを、１２５μｌの試薬Ｈ１に添加して３７℃で５分間インキュベート後、５０μｌの試薬Ｉ１を添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させる。また、試料を試薬Ｇ２で２５倍希釈した場合は、希釈試料２５μｌを、１２５μｌの試薬Ｈ２に添加して３７℃で５分間インキュベートした後、５０μｌの試薬Ｉ２を添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた。
【０１９８】
一例としてΔＡは下記の式に従って算出することができる。
【０１９９】
ΔＡ＝（試薬Ｉ１またはＩ２添加５分後の吸光度）−（試薬Ｉ１またはＩ２添加直前の吸光度×０．７５）
（ＨｂＡ１ｃの測定）
ＨｂＡ１ｃを含む試料にＨｂＡ１ｃオキシダーゼ（アマドリアーゼ）を作用させる。作用時間は例えば、５秒以上、１０秒以上、又は２０秒以上、１８０分未満又は１５０分未満、例えば０．５〜１２０分間、好ましくは０．５〜６０分間、より好ましくは１〜３０分間とすることができる。作用時間が短すぎる場合、試料中のＨｂＡ１ｃを十分に測定しきれず、良好な測定が行えない。一方、作用時間が長すぎる場合には、測定時間が延長し、測定処理の効率が悪いという問題に加え、試料及び測定試薬が測定条件下に長くさらされる結果、試料中の基質あるいは試薬中の成分の分解、変性を招くという問題を生じる。さらに、特に微量測定系においては、長時間経過による乾燥に起因する試料容量の減少による濃度変化なども誤差の原因となり得る。ＨｂＡ１ｃオキシダーゼ作用時間を０．５〜６０分間、より好ましくは１〜３０分間、さらに好ましくは１〜１０分間とすることにより、迅速かつ良好にＨｂＡ１ｃを測定できる。作用温度は、用いる酵素の至適温度にもよるが、例えば、２０〜４５℃であり、通常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択できる。
【０２００】
本発明に使用するアマドリアーゼの好適な使用量は、試料溶液中に含まれる基質の量にもよるが、例えば、終濃度が、０．１〜５０Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．２〜１０Ｕ／ｍＬとなるように添加すればよい。作用させる際のｐＨは、アマドリアーゼの至適ｐＨを考慮し、反応に適したｐＨとなるように緩衝剤を用いて調整することが好ましいが、作用可能なｐＨであればこれに限定されない。例えば、ｐＨ３〜１１、特に好ましくはｐＨ５〜９、例えばｐＨ６〜８である。
【０２０１】
本発明の測定方法においては、酵素や試薬の安定化や反応性向上等の目的でｐＨを調節及び／又は維持するため、必要により適宜、各種の緩衝剤を使用することが好ましい。使用可能な緩衝剤としては、例えば、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、硼酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタミン酸塩、トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、フタル酸、酒石酸等が挙げられる。さらに必要により、溶解補助剤、安定化剤、反応性向上剤、ＨｂＡ１ｃ変性剤等として、界面活性剤（ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド、１−ドデシルピリジニウム塩、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム塩、テトラデシルトリメチルアンモニウム塩、ドデシルトリメチルアンモニウム塩、トリトンＸ−１００、ブリッジ３５、ブリッジ５８、ツイーン８０、コール酸塩、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、３−オキサトリデシル−α−Ｄ−マンノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトシド、トレハロースＣ８、トレハロースＣ１０、トレハロースＣ１２、トレハロースＣ１４、トレハロースＣ１６、ＢＩＧＣＨＡＰ、ｄｅｏｘｙ−ＢＩＧＣＨＡＰ、ＭＥＧＡ−８、ＭＥＧＡ−９、ＭＥＧＡ−１０、ヘキサデシルピリジニウム塩、オクタデシルトリメチルアンモニウム塩、デシルトリメチルアンモニウム塩、ノニルトリメチルアンモニウム塩、オクチルトリメチルアンモニウム塩、へキシルトリメチルアンモニウム塩、ドデシル硫酸ナトリウム等）、還元剤（ジチオスレイトール、メルカプトエタノール、Ｌ−システイン等）、牛血清アルブミン、糖類（グリセリン、乳糖、シュークロース等）等を適宜添加してもよい。
【０２０２】
本発明に用いる界面活性剤としては、本発明のＨｂＡ１ｃの測定方法を可能とする界面活性剤であれば特に制限は無く、非イオン性界面活性剤やイオン性の界面活性剤、例えば、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられる。本明細書において界面活性剤というとき、特に断らない限り、この表現は１以上の界面活性剤を包含するものとする。
【０２０３】
非イオン界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテルなどが挙げられる。
【０２０４】
カチオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩、ピリジニウム塩、例えばアルキルピリジニウム塩、ホスホニウム塩、例えばアルキルホスホニウム塩、イミダゾリウム塩、例えばアルキルイミダゾリウム塩、イソキノニウム塩、例えばアルキルイソキノニウム塩などが挙げられる。
【０２０５】
また本発明のカチオン性界面活性剤としては、以下の一般式で表される第四級アンモニウム塩（I)、ピリジニウム塩(II)やホスホニウム塩(III)が挙げられる。
【化１】
2019154447.tif 000003
【０２０６】
［式中、Ｒ１〜Ｒ４は、同一又は異なっていてもよく、置換若しくは非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキル、アルケニル、アリール又はベンジルを表し、Ｚ−は、１価の陰イオンを表す。］
【化２】
2019154447.tif 000004
【０２０７】
［式中、Ｒ５は、置換若しくは非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキルを表し、各Ｒａは、同一又は異なっていてもよく、水素原子又は置換若しくは非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキル、アルケニル、アリール又はベンジルを表し、ｎは１〜５の整数を表し、Ｚ−は、１価の陰イオンを表す。］
【化３】
2019154447.tif 000005
【０２０８】
［式中、Ｒ６〜Ｒ９は、同一又は異なっていてもよく、置換若しくは非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキル、アルケニル、アリール又はベンジルを表し、Ｚ−は、１価の陰イオンを表す。］
第四級アンモニウム塩としては、例えば、オクチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＯＴＡＣ）及びブロミド（ＯＴＡＢ）、デシルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド（ＤＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＴＴＡＣ）及びブロミド（ＴＴＡＢ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）及びブロミド、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド（ＳＴＡＢ）、エイコシルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、ベンジルドデシルジメチルアンモニウムクロリド及びブロミド（ＢＤＤＡＢ）、ベンジルテトラデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＢＤＴＡＣ）及びブロミド、ベンジルセチルジメチルアンモニウムクロリド（ＢＣＤＡＣ）及びブロミド、ジオクチルジメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、が挙げられる。
【０２０９】
ピリジニウム塩としては、例えば、１−デシルピリジニウムクロリド及びブロミド、１−ドデシルピリジニウムクロリド（１−ＤＰＣ）及びブロミド、１−テトラデシルピリジニウムクロリド及びブロミド、１−ヘキサデシルピリジニウムクロリド（１−ＣＰＣ）及びブロミド（１−ＣＰＢ）、Ｎ−セチル−２−メチルピリジニウムクロリド及びブロミド、Ｎ−セチル−３−メチルピリジニウムクロリド及びブロミド、Ｎ−セチル−４−メチルピリジニウムクロリド（４Ｍｅ−１−ＣＰＣ）及びブロミド、１−オクタデシルピリジニウムクロリド及びブロミド、１−エイコシルピリジニウムクロリド及びブロミドが挙げられる。
【０２１０】
ホスホニウム塩としては、例えば、テトラエチルホスホニウムクロリド及びブロミド、トリブチルメチルホスホニウムクロリド及びブロミド及びヨージド、テトラブチルホスホニウムクロリド及びブロミド、テトラ−ｎ−オクチルホスホニウムクロリド及びブロミド、トリブチルドデシルホスホニウムクロリド及びブロミド、トリブチルヘキサデシルホスホニウムクロリド及びブロミド（ＴＢＣＰＢ）、メチルトリフェニルホスホニウムクロリド及びブロミド及びヨージド、テトラフェニルホスホニウムクロリド及びブロミドが挙げられる。
【０２１１】
カチオン性界面活性剤の対となる陰イオンZ-は例えばCl-、Br-、I-等でありうる。
【０２１２】
アニオン性界面活性剤としては、例えば、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、アルファーオレフィンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、α−スルホ脂肪酸エステル塩及び天然脂肪酸のアルカリ金属塩などが挙げられる。このような界面活性剤としては例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。
【０２１３】
両性界面活性剤としては、例えば、アルキルジメチルアミンオキシド、アルキルカルボキシベタインなどが挙げられる。
【０２１４】
本発明は、アマドリアーゼの作用による生成物又は消費物を測定することによりＨｂＡ１ｃを測定する方法を提供するが、測定が容易な生成物であり、測定対象として好ましいものとして過酸化水素が挙げられる。アマドリアーゼの作用により生成した過酸化水素は、発色基質等によって検出してもよく、本発明に用いられる発色基質としては、４−アミノアンチピリンの他に、例えば、ＡＤＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン）、ＡＬＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン）、ＴＯＯＳ（N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジンナトリウム）、ＤＡ−６７（１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３、７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノシアジン）、ＤＡ−６４（Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４、４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミン）等が挙げられる。ＡＤＯＳ、ＡＬＯＳ、ＴＯＯＳは４−アミノアンチピリンと縮合した際に発色する。ＤＡ−６４、ＤＡ−６７は４−アミノアンチピリンを必要とせず、単独で処方するだけで発色する。いずれの場合も、発色反応はパーオキシダーゼにより触媒される。過酸化水素の測定は、一般に、過酸化水素を生成する工程と同時に行うことが好ましく、アマドリアーゼの作用時と同時に進行させることが好ましい。また、測定する消費物としては、溶存酸素が挙げられ、溶存酸素計等を用いて反応液中の溶存酸素量を測定することができる。
【０２１５】
本発明は、上述のアマドリアーゼと過酸化水素の測定用試薬、それに所望により緩衝剤等を添加したＨｂＡ１ｃ測定用試薬を提供する。この試薬中には、各種既知の成分、例えば、界面活性剤、塩類、緩衝剤、ｐＨ調製剤や防腐剤などを適宜選択して添加することができる。上述の本発明のＨｂＡ１ｃ測定用試薬は、各試薬を異なる容器に含むものとして調製すれば良く、例えば液状品及び液状品の凍結物あるいは凍結乾燥品として提供することもできる。また、これらの測定用試薬は、乾燥物又は溶解した状態で用いてもよく、薄膜上の担体、例えば、シート含浸性の紙等に含浸させて用いてもよい。また、測定用試薬に用いられる酵素類は、常法により固定化させて反復使用することもできる。ある実施形態において、本発明のＨｂＡ１ｃ測定用試薬は、糖化タンパク質からα−フルクトシルペプチドを切り出すためのプロテアーゼ等を含まない。
【０２１６】
本発明のＨｂＡ１ｃ測定用試薬の仕様や使用条件は、その含有成分等に応じて最適なものを選択すればよいが、例えば、測定を２０〜４５℃において行うよう設定することができる。測定に要する時間も種々の測定条件により適宜選択できるが、例えば、０．５〜６０分間、好ましくは、０．５〜３０分間、さらに好ましくは１〜１０分間が好ましい。例えば、上記測定試薬の発色の程度（吸光度変化量）を分光光度計により測定し、標準の吸光度と比較して、試料中に含まれる糖化ペプチドあるいは糖化蛋白質を測定することができる。測定には、通常の自動分析装置を用いることもできる。
【０２１７】
（ＨｂＡ１ｃの定量）
本発明のＨｂＡ１ｃ測定方法は、定性的であってもよいが、定量的な測定方法とすることもできる。ここでＨｂＡ１ｃの定量的測定方法とは、試料中のＨｂＡ１ｃの濃度を決定する方法をいう。すなわち本発明の一実施形態は、アマドリアーゼを使用することを含む、試料中のＨｂＡ１ｃの定量法を提供する。この定量法は、ＨｂＡ１ｃを含む試料と本発明のアマドリアーゼとを接触させる工程、及び該アマドリアーゼのＨｂＡ１ｃに対する作用による生成物又は消費物を測定する工程を含む。ここでのＨｂＡ１ｃは天然の状態であってもよく、または変性した状態であってもよい。該定量法について用いる接触とは、本発明のアマドリアーゼがＨｂＡ１ｃの酸化反応を触媒しうるように、該アマドリアーゼと試料とを物理的に一緒にするあらゆる態様を包含し、例えば溶液中で遊離の酵素とＨｂＡ１ｃを混合する場合のみならず、固相担体に担持された本発明のアマドリアーゼにＨｂＡ１ｃを含む溶液試料を添加又は滴下するような態様も包含する。
【０２１８】
本発明のＨｂＡ１ｃ測定方法に用いる試料は、糖化ヘモグロビンを含む可能性のあるあらゆる生物学的試料、例えば血液、体液、リンパ液等に由来する試料とすることができる。試料は適宜、加工処理されたものでありうる。
【０２１９】
アマドリアーゼとＨｂＡ１ｃとの反応効率を高めるためには、変性したＨｂＡ１ｃをアマドリアーゼとの反応に用いてもよい。変性ＨｂＡ１ｃは、適当な界面活性剤との混合により取得でき、熱処理により取得でき、または界面活性剤添加および熱処理により取得でき、あるいは酸・アルカリでの変性処理により取得できる。変性処理として界面活性剤添加と熱処理の両方を行う場合、その順序は任意である。熱処理はＨｂＡ１ｃの全部または一部を変性させるのに十分な温度及び時間で行われうる。処理温度は例えば６０℃以上、７０℃以上、８０℃以上、９０℃以上、例えば９８℃とすることができる。処理時間は温度にもよるが例えば１０秒以上、２０秒、３０秒以上、１分以上、または２分以上であり得る。界面活性剤の例は上述したとおりであり、これらを適当な濃度で添加しうる。
【０２２０】
用いるアマドリアーゼ変異体の酵素量及び反応時間（作用時間）を一定とし、添加するＨｂＡ１ｃの量を変化させた場合に、ＨｂＡ１ｃ添加量が減少するにつれて、検出される発光基質の吸光度も比例的に減少するＨｂＡ１ｃ濃度範囲を調べることで、当該アマドリアーゼを用いた場合の検出可能な最低ＨｂＡ１ｃ濃度を決定することができる。この濃度を本明細書において検出限界濃度ということがある。本発明のＨｂＡ１ｃ定量法では、ＨｂＡ１ｃの検出限界が、測定試料中のＨｂＡ１ｃ濃度又は血中糖化ヘモグロビン濃度よりも低くなるように酵素量及び反応時間を設定することが好ましい。
【０２２１】
本発明の定量的測定では、予め、濃度既知のＨｂＡ１ｃを含む対照の吸光度等の測定値から最小二乗法などの回帰分析を行うことによって検量線を作成しておくこともできる。作成した検量線に対し、ＨｂＡ１ｃ濃度が未知である試料の測定値をプロットすることで、当該試料中のＨｂＡ１ｃ濃度を定量できる。
【０２２２】
本発明者らは、Coniochaeta由来アマドリアーゼ変異体、例えばCFP-T7-H35を用いて、良好に試料中のＨｂＡ１ｃを定量できることを示した。これは驚くべき知見である。図４−１及び図４−２を参照されたい。CFP-T7-H35はまた、αＦ６Ｐに対する活性を示す。したがって当業者であれば、こうした知見に基づき、α−フルクトシルオリゴペプチド、例えばαＦ６Ｐに対する良好な活性を示す他のアマドリアーゼも同様にＨｂＡ１ｃに直接作用し、その定量的測定に用いることができる可能性がある、と理解する。例えばαＦ６Ｐなどのα−フルクトシルオリゴペプチドに対する比活性の高いアマドリアーゼは、同様にＨｂＡ１ｃに直接作用し、その定量測定用に用いることができる蓋然性が高い。また、当業者であればそのような定量的測定のための酵素量（酵素濃度）、反応時間等の条件を適宜設定することができる。
【０２２３】
（スクリーニング方法）
ある実施形態において、上記の（ＨｂＡ１ｃの測定）に記載の方法を用いて、あるアマドリアーゼがＨｂＡ１ｃに直接作用するか否か、決定することができる。候補となるアマドリアーゼとしては、種々の天然アマドリアーゼまたはそれらの改変体、例えばαＦＶ活性を有するアマドリアーゼ、αＦＶＨ活性を有するアマドリアーゼ、αＦ６Ｐ活性を有するアマドリアーゼ、α−フルクトシルペプチドに対する活性を示すアマドリアーゼまたはそれらの改変体、例えば上記の（アマドリアーゼの改変体）に記載のものが挙げられる。スクリーニングは96ウェルプレート等を用いて多数の候補を一度に処理しハイスループットにて迅速に行うことができる。候補アマドリアーゼがＨｂＡ１ｃに直接作用するかスクリーニングすることができる。または候補アマドリアーゼについて、まずαＦＶ活性、αＦＶＨ活性、αＦ６Ｐ活性等を有するか否か一次選抜を行い、次いで当該活性を有するものについてＨｂＡ１ｃに直接作用するか二次選抜してもよい。スクリーニングは生物試料から調製した粗酵素抽出液またはその精製物について行うことができる。また、α−フルクトシルペプチドに対する活性を示すアマドリアーゼの遺伝子を慣用法により取得し、遺伝子組換技術を用いて酵素を製造し、これを選抜に用いてもよい。慣用法とは、α−フルクトシルペプチドに対する活性を示すアマドリアーゼを精製し、そのアミノ酸配列を決定し、その配列情報を元にPCR用プライマーを設計して遺伝子を取得する方法や、公知のアマドリアーゼの配列情報を基にPCR用プライマーを設計してある生物のゲノムライブラリーやcDNAライブラリーから遺伝子を取得する方法が挙げられるがこれに限らない。上記の（アマドリアーゼをコードする遺伝子の取得）も参照されたい。取得したアマドリアーゼ遺伝子について慣用の遺伝子組換技術を用いて適当な変異を導入し、得られた変異体がＨｂＡ１ｃに直接作用するか調べることができる。また、取得したアマドリアーゼ遺伝子について遺伝子組換技術を用いて適当な変異を導入して鎖長の長いα−フルクトシルペプチド、例えばαＦ６Ｐに対する活性を示す改変体を作製し、次いでこれが例えばαＦ６Ｐに対して０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するかを調べ、かつ／又はＨｂＡ１ｃに直接作用するか調べることもできる。こうした改変体の作製に当たっては、配列番号１のアミノ酸配列の（ａ）６２位に対応する位置のアミノ酸を、アラニン、アスパラギンまたはアスパラギン酸へと置換すること、（ｂ）６３位に対応する位置のアミノ酸をヒスチジン又はアラニンへと置換すること、（ｃ）１０２位に対応する位置のアミノ酸をリジンへと置換すること、（ｄ）１０６位に対応する位置のアミノ酸をアラニン、リジン、又はアルギニンへと置換すること、（ｅ）１１０位に対応する位置のアミノ酸をロイシン又はチロシンへと置換すること、（ｆ）１１３位に対応する位置のアミノ酸をリジン又はアルギニンへと置換すること、（ｇ）３５５位に対応する位置のアミノ酸をセリンへと置換すること、および／または（ｈ）４１９位に対応する位置のアミノ酸をリジンへと置換すること（ｉ）６８位に対応する位置のアミノ酸をアスパラギンへと置換すること、および／または（ｊ）３５６位に対応する位置のアミノ酸をスレオニンへと置換することを参考にしてもよいが、導入する変異はこれに限られず、ランダムな突然変異を導入する手法を用いることもできる。変異導入と活性の確認を複数回繰り返し、よりα−フルクトシルペプチドまたはＨｂＡ１ｃに対する活性の高い変異体を取得することもできる。上記の（アマドリアーゼ遺伝子の変異処理）も参照されたい。
【０２２４】
用いるアマドリアーゼには、上記の界面活性剤耐性を向上させる変異を導入してもよく、かつ／又は上記の熱安定性を向上させる欠失を行ってもよい。また、ＨｂＡ１ｃに対する活性を有する限り、酵素のその他の特性を改変する変異を導入することもできる。
【０２２５】
本発明のＨｂＡ１ｃ測定用キットには、上述のＨｂＡ１ｃ測定用試薬に加え、必要に応じ、その他の公知の安定化剤や夾雑物質の消去系などを包含してもよい。ＨｂＡ1ｃに作用するプロテアーゼ等を使用しＨｂＡ1ｃを酵素法により測定することを目的とした、従来の各種の試薬やキットに用いられている技術を、適宜改変して本発明のアマドリアーゼを含むＨｂＡ１ｃ測定用キットに用いることができる。ただし、本発明のＨｂＡ１ｃ測定用キットはそのようなプロテアーゼ等を必要としない。すなわち、ある実施形態において、本発明のＨｂＡ１ｃ測定用キットは、ＨｂＡ１ｃからα−フルクトシルペプチドを切り出すためのプロテアーゼ等を含まない。
【０２２６】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【０２２７】
［実施例１］
（１）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡの調製
Coniochaeta属由来アマドリアーゼ遺伝子（配列番号２）の組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株（国際公開第２００７／１２５７７９号参照）を、３ｍｌのＬＢ−ａｍｐ培地［１％（ｗ／ｖ）バクトトリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン］に接種して、３７℃で１６時間振とう培養し、培養物を得た。
【０２２８】
この培養物を１０，０００×ｇで、１分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体より、GenElute Plasmid Miniprep Kit（Sigma-Aldrich社製）を用いて組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７を抽出して精製し、２．５μｇの組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを得た。
【０２２９】
（２）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡの部位特異的改変操作
得られた組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号３、４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
【０２３０】
すなわち、１０×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」−「５０℃、３０秒」−「６８℃、６分」のサイクルを３０回繰り返した。
【０２３１】
反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約６，０００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（NEW ENGLAND BioLabs社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、上記（１）と同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ（Life Technologies社製）を用いて決定し、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１）を得た。
【０２３２】
（３）各種改変型アマドリアーゼの生産
ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１）株を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地３ｍｌにおいて、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して、改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
【０２３３】
（４）αＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／αＦＶの測定
上述のＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１を含む酵素液を用いて、上記のＢ：活性測定法に示した方法により、αＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株から生産したＣＦＰ−Ｔ７を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、αＦＶ、αＦＶＨおよびαＦ６Ｐに対する酸化活性、ならびに、αＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／αＦＶを表１に示す。
【表１】
2019154447.tif 000006
【０２３４】
表１に示す通り、ＣＦＰ−Ｔ７は、αＦＶ酸化活性およびαＦＶＨ酸化活性は示したが、αＦ６Ｐ酸化活性は示さなかった。これにより、ＣＦＰ−Ｔ７はα−フルクトシルジペプチドに極めて特異性が高く、α−フルクトシルヘキサペプチドには作用しないことがわかった。
【０２３５】
一方、変異体ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１は、αＦＶ、αＦＶＨ酸化活性に加えて、αＦ６Ｐ酸化活性も示した。
【０２３６】
すなわち、ＣＦＰ−Ｔ７に対しＲ６２Ａのアミノ酸置換を導入することにより、ＣＦＰ−Ｔ７に新たにαＦ６Ｐ酸化活性を付与することができ、αＦ６Ｐに対する反応性（基質特異性）が向上していることが明らかとなった。 
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１  ＤＮＡを鋳型として、配列番号５〜８のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアラニンに置換され、かつ１１０位のグルタミンがロイシン、またはフェニルアラニン、若しくはチロシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ４）を得た。
【０２３７】
ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２、またはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３、若しくはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ４を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ４）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
【０２３８】
このようにして調製した粗酵素液を用いて、上記Ｂ：活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１）株から生産したＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、αＦＶ、αＦＶＨおよびαＦ６Ｐに対する酸化活性、ならびに、αＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／αＦＶを表２に示す。
【表２】
2019154447.tif 000007
【０２３９】
すなわち、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２、およびＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ４は、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１と比較して、αＦ６Ｐに対する反応性（基質特異性）がさらに増大していることが明らかとなった。
【０２４０】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２  ＤＮＡを鋳型として、配列番号４、配列番号９〜１２のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１１０位のグルタミンがロイシンに置換され、かつ６２位のアルギニンがアスパラギン、またはアスパラギン酸、またはグルタミン、若しくはグルタミン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２−６２Ｎ、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２−６２Ｑ、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２−６２Ｅ）を得た。
【０２４１】
ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２−６２Ｎ、またはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６、またはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２−６２Ｑ、若しくはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２−６２Ｅを形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２−６２Ｎ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２−６２Ｑ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２−６２Ｅ）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
【０２４２】
このようにして調製した粗酵素液を用いて、上記Ｂ：活性測定法に示した方法によりαＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２）株から生産したＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２を含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性を１００とした場合の、それぞれのアマドリアーゼを含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性比率は表３の通りとなった。
【表３】
2019154447.tif 000008
【０２４３】
すなわち、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２−６２Ｎ、およびＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６はＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２よりもαＦ６Ｐ酸化活性が向上していることが明らかとなった。なお６２位のアミノ酸がアルギニンである野生型酵素は表１のとおりαＦ６Ｐに対する活性を示さない。このような野生型酵素と比較すると、６２位のアルギニンをグルタミン又はグルタミン酸に置換した変異体も、それぞれ、αＦ６Ｐに対する活性が向上していることが分かる。第６２位に関し、αＦ６Ｐに対する活性を示した置換アミノ酸であるアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン及びグルタミン酸は比較的分子量の小さなアミノ酸である。したがって６２位を同様に分子量の小さいグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン及びプロリンに置換することにより同様にαＦ６Ｐ活性を有する改変アマドリアーゼが得られると考えられる。本明細書では、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン及びプロリンを総称して分子量の小さいアミノ酸と呼ぶことがある。
【０２４４】
ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２、またはＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６を含む粗酵素液を用いて、上記Ｂ：活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、各基質に対する酸化活性、ならびにαＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／ＦＶは表４の通りとなった。
【表４】
2019154447.tif 000009
【０２４５】
すなわち、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６はＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２よりも大幅にαＦ６Ｐ酸化活性が向上し、αＦ６Ｐへの反応性（基質特異性）が向上していることが明らかとなった。
【０２４６】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６  ＤＮＡを鋳型として、配列番号１３〜２４のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに置換され、さらに６４位のアルギニンがアラニン、またはグルタミン酸、若しくはヒスチジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ７、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ８、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ９）、および、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに置換され、さらに１０６位のアスパラギン酸がアラニン、またはリジン、若しくはアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１０、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１１、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１２）、及び、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに置換され、さらに１１３位のアラニンがリジン、若しくはアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１３、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１４）を得た。
【０２４７】
ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ７、またはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ８、またはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ９、またはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１０、またはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１１、またはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１２、またはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１３、若しくはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１４を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ７、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ８、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ９、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１０、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１１、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１２、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１３、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１４）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
【０２４８】
このようにして調製した粗酵素液を用いて、上記Ｂ：活性測定法に示した方法によりαＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６）株から生産したＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６を含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性を１００とした場合の、それぞれのアマドリアーゼを含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性は表５の通りとなった。
【表５】
2019154447.tif 000010
【０２４９】
すなわち、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１０、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１１、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１２、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１３、およびＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１４はＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６よりも全て大幅にαＦ６Ｐ酸化活性比率が向上し、一部のものでは飛躍的に向上した。
【０２５０】
ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１１、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１２、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１３、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１４を含む粗酵素液を用いて、上記Ｂ：活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、各基質に対する酸化活性、ならびにαＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／ＦＶは表６の通りとなった。
【表６】
2019154447.tif 000011
【０２５１】
すなわち、表６に示す通り、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１１、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１２、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１３、およびＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１４はＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６よりもαＦ６Ｐへの反応性（基質特異性）が大幅に向上していることが明らかとなった。
【０２５２】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１１  ＤＮＡを鋳型として、配列番号２１〜２４のオリゴヌクレオチド、及びＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ１０６位のアスパラギン酸がリジンに、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに置換され、さらに１１３位のアラニンがリジン、若しくはアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２１）を得た。
【０２５３】
ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０、若しくはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２１を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２１）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
【０２５４】
ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１１、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２１を含む粗酵素液を用いて、上記Ｂ：活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、各基質に対する酸化活性、ならびにαＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／ＦＶは表７の通りとなった。
【表７】
2019154447.tif 000012
【０２５５】
すなわち、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０およびＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２１は、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１１よりもαＦ６Ｐに対する反応性（基質特異性）が向上していることが明らかとなった。
【０２５６】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０  ＤＮＡを鋳型として、配列番号２５〜２９のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ１０６位のアスパラギン酸がリジンに、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに、かつ１１３位のアラニンがリジンに置換され、さらに６３位のロイシンがアラニン、またはアスパラギン酸、またはヒスチジン、若しくはリジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２４、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２５、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２７）を得た。
【０２５７】
ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２４、またはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２５、またはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６、若しくはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２７を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２４、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２５、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２７）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
【０２５８】
このようにして調製した粗酵素液を用いて、上記Ｂ：活性測定法に示した方法によりαＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０）株から生産したＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０を含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性を１００とした場合の、それぞれのアマドリアーゼを含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性は表８の通りとなった。
【表８】
2019154447.tif 000013
【０２５９】
すなわち、表８に示す通り、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２４、およびＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６はＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０よりもαＦ６Ｐ酸化活性が向上していることが明らかとなった。
【０２６０】
ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０、またはＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２４、若しくはＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６を含む粗酵素液を用いて、上記Ｂ：活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、各基質に対する酸化活性、ならびにαＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／αＦＶは表９の通りとなった。
【表９】
2019154447.tif 000014
【０２６１】
すなわち、表９に示す通り、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２４、およびＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６はＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０よりもαＦ６Ｐに対する反応性（基質特異性）が向上していることが明らかとなった。
【０２６２】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６  ＤＮＡを鋳型として、配列番号３０〜３３のオリゴヌクレオチド、及びＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ６３位のロイシンがヒスチジンに、かつ１０６位のアスパラギン酸がリジンに、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに、かつ１１３位のアラニンがリジンに置換され、さらに１０２位のグルタミン酸がリジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２８）、および配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ６３位のロイシンがヒスチジンに、かつ１０６位のアスパラギン酸がリジンに、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに、かつ１１３位のアラニンがリジンに置換され、さらに４１９位のアラニンがリジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２９）を得た。
【０２６３】
ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６、又はｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２８、若しくはｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２９を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２８、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２９）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
【０２６４】
このようにして調製した粗酵素液を用いて、上記Ｂ：活性測定法に示した方法によりαＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６）株から生産したＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６を含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性を１００とした場合の、それぞれのアマドリアーゼを含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性は表１０の通りとなった。
【表１０】
2019154447.tif 000015
【０２６５】
すなわち、表１０に示す通り、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２８、およびＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２９はＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６よりもαＦ６Ｐ酸化活性が向上していることが明らかとなった。
【０２６６】
ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６、又はＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２８、若しくはＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２９を含む粗酵素液を用いて、上記Ｂ：活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、各基質に対する酸化活性、ならびにαＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／αＦＶは表１１の通りとなった。
【表１１】
2019154447.tif 000016
【０２６７】
すなわち、表１１に示す通り、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２８、及びＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２９はＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６よりもαＦ６Ｐに対する反応性（基質特異性）が向上していることが明らかとなった。
【０２６８】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２８  ＤＮＡを鋳型として、配列番号３４〜３５のオリゴヌクレオチド、及びＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ６３位のロイシンがヒスチジンに、かつ１０２位のグルタミン酸がリジンに、かつ１０６位のアスパラギン酸がリジンに、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに、かつ１１３位のアラニンがリジンに置換され、さらに３５５位のアラニンがセリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５）を得た。
【０２６９】
ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して改変型アマドリアーゼであるＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
【０２７０】
このようにして調製した粗酵素液を用いて、上記Ｂ：活性測定法に示した方法によりαＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２８）株から生産したＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２６を含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性を１００とした場合の、それぞれのアマドリアーゼを含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性は表１２の通りとなった。
【表１２】
2019154447.tif 000017
【０２７１】
すなわち、表１２に示す通り、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５はＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２８よりもαＦ６Ｐ酸化活性が向上していることが明らかとなった。
【０２７２】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号４、１０のオリゴヌクレオチド、及びＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｄ）を得た。続いて、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｄを形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を作製した。
【０２７３】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５  ＤＮＡを鋳型として、配列番号１９３、配列番号１９４のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ６３位のロイシンがヒスチジンに、かつ１０２位のグルタミン酸がリジンに、かつ１０６位のアスパラギン酸がリジンに、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに、かつ１１３位のアラニンがリジンに、かつ３５５位のアラニンがセリンに置換され、さらに６８位のアスパラギン酸がアスパラギンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３６）を得た。
【０２７４】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３６  ＤＮＡを鋳型として、配列番号１９５、配列番号１９６のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ６３位のロイシンがヒスチジンに、かつ１０２位のグルタミン酸がリジンに、かつ１０６位のアスパラギン酸がリジンに、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに、かつ１１３位のアラニンがリジンに、かつ３５５位のアラニンがセリンに置換され、かつ６８位のアスパラギン酸がアスパラギンに置換され、さらに３５６位のアラニンがスレオニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７）を得た。
【０２７５】
ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３６の安定性を向上させた変異体を得るために、安定性向上効果のある変異を導入し、かつＣ末端から３アミノ酸を除いた、配列番号１９９で示す４３４アミノ酸からなる改変型ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３６（以降、ＣＦＰ−ＤＨ１と称する）を大腸菌で発現させることを試みた。そこで、配列番号１９９のアミノ酸配列をコードし、かつ大腸菌発現用にコドンを最適化した、配列番号２００で示す１３０５ｂｐの遺伝子（終止コドンＴＡＡを含む）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成により取得した。このとき、配列番号２００の５´末端、３´末端にはそれぞれＥｃｏＲＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加した。
【０２７６】
続いて、取得したＣＦＰ−ＤＨ１の遺伝子を大腸菌発現用のプラスミドにサブクローニングするために以下の手順を行った。まず、上記で全合成した遺伝子、およびｐＫＫ２２３−３  Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）をＥｃｏＲＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）の２種類の制限酵素で処理した後にライゲーションし、ｐＫＫ２２３−３  ＶｅｃｔｏｒのマルチクローニングサイトにＣＦＰ−ＤＨ１の遺伝子が挿入された組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−ＤＨ１  ＤＮＡを取得した。得られた組換え体プラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、上記（１）と同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ（Life Technologies社製）を用いて決定し、実際に、ｐＫＫ２２３−３ベクターのマルチクローニングサイトにＣＦＰ−ＤＨ１遺伝子が挿入された組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−ＤＨ１  ＤＮＡが得られたことを確認した。
【０２７７】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−ＤＨ１  ＤＮＡを鋳型として、配列番号２０１、配列番号２０２のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１９９記載のアミノ酸配列の３５６位のアラニンがスレオニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−ＤＨ２）を得た。
【０２７８】
［実施例２］
（各種アマドリアーゼの生産および精製）
（Coniochaeta属由来改変型アマドリアーゼの生産および精製）
Coniochaeta属由来の野生型アマドリアーゼ、および上記のようにして得られた改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｄ）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０）、および大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２１）、および大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地１２０ｍｌに植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液２４ｍｌを調製した。
【０２７９】
調製した粗酵素液を１．３５Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４を含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した１２ｍｌのＢｕｔｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｃ樹脂（東ソー社製）に吸着させ、次に１２０ｍｌの同緩衝液で樹脂を洗浄し、続いて８４ｍｌの１．０５Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４を含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で樹脂に吸着していたアマドリアーゼを溶出させ回収した。
【０２８０】
得られたアマドリアーゼを含む粗酵素液を透析チューブ（Spectra/Por MWCO: 12,000-14,000）に移し、１０倍量の５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中で透析する操作を三度繰り返し、アマドリアーゼを含む粗酵素液から（ＮＨ４）２ＳＯ４を完全に除去した。続いて、１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＳｃｒｅｅｎ  Ｃａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓ（ＧＥヘルスケア社製）にアマドリアーゼを含む粗酵素液をアプライしてアマドリアーゼを陰イオン交換樹脂に結合させた。その後、１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に含まれるＮａＣｌ濃度を０ｍＭから１６０ｍＭまで直線的に増加させることにより、樹脂に結合したタンパク質を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。得られたアマドリアーゼ活性を示す画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析により、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、ＣＦＰ−Ｔ７、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｄ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２１、およびｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５の精製標品とした。
【０２８１】
［実施例１］で得られた改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３６）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７）、および大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−ＤＨ２）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地２００ｍｌに植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液４０ｍｌを調製した。大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−ＤＨ２）の培養菌体のみ、２ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液４０ｍｌを調製した。
【０２８２】
Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）を充てんしたカラムを１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した後、調製したＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３６およびＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７を含む各粗酵素液をアプライしてアマドリアーゼを陰イオン交換樹脂に結合させた。その後、３０ｍＭのＮａＣｌ濃度を含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で２０カラム体積分送液し、夾雑タンパク質を溶出させた後、８０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で樹脂に結合したタンパク質を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。
【０２８３】
Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）を充てんしたカラムを２ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した後、調製したＣＦＰ−ＤＨ２を含む粗酵素液をアプライしてアマドリアーゼを陰イオン交換樹脂に結合させた。その後、４ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を２０カラム体積分送液し、夾雑タンパク質を溶出させた後、３０ｍＭのＮａＣｌを含む４ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂に結合したタンパク質を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。
【０２８４】
得られたそれぞれのアマドリアーゼ活性を示す画分を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ−３０Ｋ（ミリポア社製）により濃縮し、ＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００により精製した。樹脂の平衡化、溶出には１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を用いた。溶出した各フラクションの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、夾雑タンパク質を含んでいないフラクションを回収し、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３６、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７およびＣＦＰ−ＤＨ２の精製標品とした。
【０２８５】
（Aspergillus oryzae RIB40由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの生産および精製）
配列番号３６はAspergillus oryzae RIB40由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以降ＦＡＯＡｏ２と称する）のアミノ酸配列であり、配列番号３６のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号３７）を挿入した組換え体プラスミド（以降ｐＵＣ１９−ＦＡＯＡｏ２と称する）を大腸菌ＤＨ５αで発現させることにより、ＦＡＯＡｏ２が生産され、ＦＡＯＡｏ２がフルクトシルヘキサペプチドに対して作用することが示されている（国際公開第２００８／１０８３８５号公報参照）。
【０２８６】
上記ＦＡＯＡｏ２生産能を有する大腸菌ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−ＦＡＯＡｏ２）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
【０２８７】
調製した粗酵素液を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で樹脂を洗浄し、続いて１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で樹脂に吸着していたＦＡＯＡｏ２を溶出させ回収した。
【０２８８】
得られたＦＡＯＡｏ２粗酵素液を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  ２６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムにアプライして同緩衝液でＦＡＯＡｏ２を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、ＦＡＯＡｏ２の精製標品とした。
【０２８９】
（Phaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼの生産株の作製）
配列番号３８はPhaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ（以降ＰｎＦＸと称する）のアミノ酸配列である（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ, １０６, ３５８−３６６, ２０１０参照）。配列番号３８のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号３９）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成によりｃＤＮＡを全合成することで取得した。このとき、配列番号３９の５´末端、３´末端にはそれぞれＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩサイトを付加した。また、クローニングした遺伝子配列から予想されるアミノ酸配列全長は図１のＰｎＦＸの配列と一致していることを確認した。
【０２９０】
続いて、取得した配列番号３９の遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、上記で全合成した遺伝子をＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）の２種類の制限酵素で処理し、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）  Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入することで、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸを取得し、上記と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ）株を得た。
【０２９１】
（Phaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼの生産および精製）
上記のようにして得られたＰｎＦＸ生産能を有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ）株を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
【０２９２】
調製したＰｎＦＸの粗酵素液を前述の非特許文献（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ, １０６, ３５８−３６６, ２０１０）記載の方法に従い、精製した。すなわち、粗酵素液を硫酸アンモニウムにより分画し、１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で透析し、陰イオン交換クロマトグラフィー（本実施例ではＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いた）により精製し、ゲルろ過クロマトグラフィー（本実施例ではＨｉＬｏａｄ  ２６／６００  Ｓｕｅｐｒｄｅｘ  ２００を用いた）により精製した。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、ＰｎＦＸの精製標品とした。
【０２９３】
得られたＣＦＰ−Ｔ７、ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｄ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２１、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５、およびＦＡＯＡｏ２、およびＰｎＦＸの精製標品を用いて、αＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐを基質とした時の比活性を測定した。結果を表１３−１に示す。なお、比活性の算出に用いたタンパク質濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度を利用した紫外吸収法により測定した（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ． ４，   ２４１１−２３，  １９９５参照）。
【表１３−１】
2019154447.tif 000018
【０２９４】
得られたＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３６、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７およびＣＦＰ−ＤＨ２の精製標品を用いて、αＦ６Ｐを基質とした時の比活性を測定した。結果を表１３−２に示す。なお、比活性の算出に用いたタンパク質濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度を利用した紫外吸収法により測定した（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ． ４，   ２４１１−２３，  １９９５参照）。
【表１３−２】
2019154447.tif 000019
【０２９５】
精製したＣＦＰ−Ｔ７はαＦＶ、αＦＶＨを酸化する活性を示したが、αＦ６Ｐを酸化する活性は示さなかった。それに対し、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５はαＦＶ、αＦＶＨに加えてαＦ６Ｐの酸化活性も示し、αＦ６Ｐ酸化反応の比活性は４．２７Ｕ／ｍｇという高い水準に達した。
【０２９６】
ＣＦＰ−Ｔ７−６２Ｄ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２１のαＦ６Ｐに対する比活性はそれぞれ０．０１８Ｕ／ｍｇ、０．８５０Ｕ/ｍｇ、０．７９５Ｕ/ｍｇであり、宿主である大腸菌由来のプロテアーゼ／ペプチダーゼの影響を排除した測定方法においても、αＦ６Ｐに対する十分に高い反応性が示された。
【０２９７】
また、既報のαＦ６Ｐに対して反応性を示すアマドリアーゼである、ＦＡＯＡｏ２（国際公開第２００８／１０８３８５号参照）、およびＰｎＦＸ（国際公開第２０１１／１５３２６号参照、該当文献中ではＰ．ｎ  ＦＰＯＸと記載されている）のαＦ６Ｐに対する比活性は、それぞれ０．００２２Ｕ／ｍｇ、０．００９１Ｕ／ｍｇであった。本明細書に記載の手順で作製したＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼの改変体はこれら既報のαＦ６Ｐに対して反応性を示すアマドリアーゼの２倍（アマドリアーゼ２６／比較例３）から１９４０倍（アマドリアーゼ２５／比較例２）もの比活性を示した。すなわち、本明細書に記載の手順でαＦ６Ｐに対して高い反応性を示すアマドリアーゼを得ることができた。
【０２９８】
なお、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２０、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ２１が示すαＦ６Ｐ／αＦＶＨの値は、粗酵素液を用いて測定した場合と、精製酵素を用いて測定した場合の間で、大きな乖離は確認できなかった。
【０２９９】
ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３６、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７のαＦ６Ｐに対する比活性はそれぞれ４．６５Ｕ／ｍｇ、７．１９Ｕ/ｍｇであり、アミノ酸置換導入前のＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５の比活性（４．２７Ｕ/ｍｇ）と比較すると、アミノ酸置換を追加するごとに向上した。また、ＣＦＰ−ＤＨ２もまたＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５よりも高い比活性（５．３０Ｕ/ｍｇ）を示した（表１３−２）。
【０３００】
なお、ＣＦＰ−ＤＨ２に導入した変異（E44P/E133A/E253K/V257C/N262H/Q337K/E340P）について、本発明者らは、これがアマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させることを確認している。具体的には２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の当該アマドリアーゼに０．０４％のテトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＴＴＡＣ）を作用させても、変異を有しないCFP由来酵素の残存活性が２９．２％となるのに対し、変異（E44P/E133A/E253K/V257C/N262H/Q337K/E340P）を導入したものが１００％の残存活性を有することを確認している。これらの変異の効果は、特願２０１３−２２１５１５号及びＰＣＴ／ＪＰ２０１４／０７１０３６号明細書に記載されており、これらの文献は参照によりその全内容を本明細書に組み入れるものとする。またＣＦＰ−ＤＨ２におけるカルボキシル末端のアミノ酸配列の欠失について、本発明者らは、これがアマドリアーゼの熱安定性を向上させることを報告した。該欠失の効果は国際公開第２０１３／１００００６号明細書に記載されている。
【０３０１】
こうした変異を有しないアマドリアーゼは、界面活性剤処理後であっても活性が残存しており、適切な量の酵素を用いればＨｂＡ１ｃを測定することができる。また、界面活性剤耐性の向上したアマドリアーゼや熱安定性の向上したアマドリアーゼを用いれば、測定に必要な酵素量を低減することもできる。
【０３０２】
［実施例３］
（各種アマドリアーゼへの点変異導入）
上記の変異を導入することによりConiochaeta属由来のアマドリアーゼのαＦ６Ｐに対する反応性が上昇した。このことから、配列同一性に基づく公知の整列処理による情報を参考にして、その他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における対応する位置に同様な変異を導入することにより、同様にαＦ６Ｐに対する反応性の上昇が期待できる。そこで、実際にＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼ以外の複数のアマドリアーゼにも対応する位置に変異を導入した。
【０３０３】
１．Eupenicillium terrenum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子への点変異導入
配列番号４０はEupenicillium terrenum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ（以降ＥＦＰ−Ｔ５と称する）のアミノ酸配列であり、配列番号４０のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号４１）を挿入した組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５を保持する大腸菌により生産でき、ＥＦＰ−Ｔ５はαＦＶおよびαＦＶＨ酸化活性を示すことが確認されている（国際公開第２００７／１２５７７９号公報および国際公開第２００８／０１８０９４号公報参照）。
【０３０４】
ＥＦＰ−Ｔ５に基質特異性改善型変異を導入するために、組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５を鋳型にして、配列番号４２、４３の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＥＦＰ−Ｔ５変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号４０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に置換されたＥＦＰ−Ｔ５遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄ）を得た。
【０３０５】
続いて、上記と同様にして、ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄを鋳型とし、配列番号４４，４５の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号４０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギンがリジンに置換されたＥＦＰ−Ｔ５遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄ／１０６Ｋ）を得た。
【０３０６】
続いて、上記と同様にして、ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄ／１０６Ｋを鋳型とし、配列番号４６、４７の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号４０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギンがリジンに、１１０位のリジンがロイシンに置換されたＥＦＰ−Ｔ５遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）を得た。
【０３０７】
続いて、上記と同様にして、ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌを鋳型とし、配列番号４８，４９の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号４０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギンがリジンに、１１０位のリジンがロイシンに、１１３位のスレオニンがリジンに置換されたＥＦＰ−Ｔ５遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）を得た。
【０３０８】
続いて、上記と同様にして、ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋを鋳型とし、配列番号５０，５１の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号４０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギンがリジンに、１１０位のリジンがロイシンに、１１３位のスレオニンがリジンに、３５５位のアラニンがセリンに置換されたＥＦＰ−Ｔ５遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓ）を得た。
【０３０９】
さらに、上記と同様にして、ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓを鋳型とし、配列番号５２，５３の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号４０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、６３位のロイシンがヒスチジンに、１０６位のアスパラギンがリジンに、１１０位のリジンがロイシンに、１１３位のスレオニンがリジンに、３５５位のアラニンがセリンに置換されたＥＦＰ−Ｔ５遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓ）を得た。
【０３１０】
２．Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ遺伝子への点変異導入
配列番号５４はNeocosmospora vasinfecta由来ケトアミンオキシダーゼ（以降ＮｖＦＸと称する）のアミノ酸配列であり、配列番号５４のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号５５）を挿入した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸを保持する大腸菌により生産でき、ＮｖＦＸはαＦＶおよびαＦＶＨ酸化活性を示すことが確認されている（国際公開第２０１２／０１８０９４号公報参照）。
【０３１１】
ＮｖＦＸに基質特異性改善型変異を導入するために、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸを鋳型にして、配列番号５６、５７の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＮｖＦＸ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号５４記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に置換されたＮｖＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−６２Ｄ）を得た。
【０３１２】
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ−６２Ｄを鋳型とし、配列番号５８，５９の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号５４記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のグリシンがリジンに置換されたＮｖＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ）を得た。
【０３１３】
さらに、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋを鋳型とし、配列番号６０，６１の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号５４記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアルギニンがリジンに、１１０位のグルタミン酸がロイシンに置換されたＮｖＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）を得た。
【０３１４】
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）株を得た。
【０３１５】
３．Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子への点変異導入
配列番号６２はフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を付与するために５９位のセリンをグリシンへ置換したAspergillus nidulans由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以降ＡｎＦＸと称する）のアミノ酸配列であり、配列番号６２のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号６３）を挿入した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸを保持する大腸菌により生産でき、ＡｎＦＸはαＦＶおよびαＦＶＨ酸化活性を示すことが確認されている（国際公開第２０１２／０１８０９４号公報参照）。
【０３１６】
ＡｎＦＸに基質特異性改善型変異を導入するために、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸを鋳型にして、配列番号６４、６５の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＡｎＦＸ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ）を得た。
【０３１７】
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄを鋳型とし、配列番号６６，６７の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０５位のグリシンがリジンに置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／１０５Ｋ）を得た。
【０３１８】
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／１０５Ｋを鋳型とし、配列番号６８，６９の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０５位のグリシンがリジンに、１０９位のリジンがロイシンに置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ）を得た。
【０３１９】
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ）株を得た。
【０３２０】
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌを鋳型とし、配列番号１１２，７０の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０５位のグリシンがリジンに、１０９位のリジンがロイシンに、１１２位のセリンがリジンに置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ）を得た。
【０３２１】
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋを鋳型とし、配列番号７１，７２の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０５位のグリシンがリジンに、１０９位のリジンがロイシンに、１１２位のセリンがリジンに、３５５位のアラニンがセリンに置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓ）を得た。
【０３２２】
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓを鋳型とし、配列番号７３，７４の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に、６２位のロイシンがヒスチジンに、１０５位のグリシンがリジンに、１０９位のリジンがロイシンに、１１２位のセリンがリジンに、３５５位のアラニンがセリンに置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／６２Ｈ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓ）を得た。
【０３２３】
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／６２Ｈ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓを鋳型とし、配列番号７５，７６の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に、６２位のロイシンがヒスチジンに、１０１位のグルタミン酸がリジンに、１０５位のグリシンがリジンに、１０９位のリジンがロイシンに、１１２位のセリンがリジンに、３５５位のアラニンがセリンに置換された置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／６２Ｈ／１０１Ｋ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓ）を得た。
【０３２４】
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／６２Ｈ／１０１Ｋ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓ）株を得た。
【０３２５】
４．Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子への点変異導入
ＰｎＦＸに基質特異性改善型変異を導入するために、前述の様に調製した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸを鋳型にして、配列番号７７、７８の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＰｎＦＸ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号３８記載のアミノ酸配列の６２位のセリンがアスパラギン酸に置換されたＰｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ）を得た。
【０３２６】
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄを鋳型とし、配列番号７９、８０の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号３８記載のアミノ酸配列の６２位のセリンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに置換されたＰｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ）を得た。
【０３２７】
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋを鋳型とし、配列番号８１、８２の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号３８記載のアミノ酸配列の６２位のセリンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のグリシンがロイシンに置換されたＰｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）を得た。
【０３２８】
さらに、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌを鋳型とし、配列番号８３、８４の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号３８記載のアミノ酸配列の６２位のセリンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のグリシンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに置換されたＰｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）を得た。
【０３２９】
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）株を得た。
【０３３０】
さらに、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋを鋳型とし、配列番号８５，８６の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号３８記載のアミノ酸配列の６２位のセリンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のグリシンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに、３５１位のアラニンがセリンに置換されたＰｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓ）を得た。
【０３３１】
さらに、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓを鋳型とし、配列番号８７，８８の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号３８記載のアミノ酸配列の６２位のセリンがアスパラギン酸に、６３位のロイシンがヒスチジンに、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のグリシンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに、３５１位のアラニンがセリンに置換されたＰｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓ）を得た。
【０３３２】
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓ）株を得た。
【０３３３】
５．Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子への点変異導入
配列番号８９はCryptococcus neoformans由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以降ＣｎＦＸと称する）のアミノ酸配列であり、配列番号８９のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号９０）を挿入した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＣｎＦＸを保持する大腸菌により生産でき、ＣｎＦＸはαＦＶおよびαＦＶＨ酸化活性を示すことが確認されている（国際公開第２０１２／０１８０９４号公報参照）。
【０３３４】
ＣｎＦＸに基質特異性改善型変異を導入するために、前述の様に調製した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸを鋳型にして、配列番号９１、９２の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＣｎＦＸ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号８９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に置換されたＣｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−６２Ｄ）を得た。
【０３３５】
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−６２Ｄを鋳型とし、配列番号９３、９４の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号８９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のセリンがリジンに置換されたＣｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ）を得た。
【０３３６】
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋを鋳型とし、配列番号９５、９６の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号８９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のセリンがリジンに、１１０位のセリンがロイシンに置換されたＣｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）を得た。
【０３３７】
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌを鋳型とし、配列番号９７、９８の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号８９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のセリンがリジンに、１１０位のセリンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに置換されたＣｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）を得た。
【０３３８】
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）株を得た。
【０３３９】
６．Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアマドリアーゼ遺伝子への点変異導入
（Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアマドリアーゼの生産株の作製）
配列番号９９はCurvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼである（以降Ｃｃ９５ＦＸと称する）。配列番号９９のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号１００）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成によりｃＤＮＡを全合成することで取得した。このとき、配列番号１００の５´末端、３´末端にはそれぞれＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩサイトを付加した。
【０３４０】
続いて、取得した配列番号１００の遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、上記で全合成した遺伝子をＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）の２種類の制限酵素で処理し、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）  Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入することで、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸを取得し、上記と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ）株を得た。
【０３４１】
（Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアマドリアーゼ遺伝子への点変異導入）
Ｃｃ９５ＦＸに基質特異性改善型変異を導入するために、前述の様に調製した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸを鋳型にして、配列番号１０１、１０２の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＣｃ９５ＦＸ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号９９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に置換されたＣｃ９５ＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ）を得た。
【０３４２】
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄを鋳型とし、配列番号１０３、１０４の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに置換されたＣｃ９５ＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ）を得た。
【０３４３】
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋを鋳型とし、配列番号１０５、１０６の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のアラニンがロイシンに置換されたＣｃ９５ＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）を得た。
【０３４４】
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌを鋳型とし、配列番号１０７、１０８の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のアラニンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに置換されたＣｃ９５ＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）を得た。
【０３４５】
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋを鋳型とし、配列番号１０９、１１０の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のアラニンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに、３５３位のアラニンがセリンに置換されたＣｃ９５ＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５３Ｓ）を得た。
【０３４６】
続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５３Ｓを鋳型とし、配列番号１１１、１０２の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、６３位のロイシンがヒスチジンに、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のアラニンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに、３５３位のアラニンがセリンに置換されたＣｃ９５ＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５３Ｓ）を得た。
【０３４７】
そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５３Ｓ）株を得た。
【０３４８】
［実施例４］
（各種アマドリアーゼの生産および精製）
（Eupenicillium terrenum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼの生産および精製）
野生型のＥＦＰ−Ｔ５、および前述の様にして得られた改変型ＥＦＰ−Ｔ５を生産する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄ）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＴＥ１００Ｋ’−ＥＦＰ−Ｔ５−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓ）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
【０３４９】
調製した野生型または改変型ＥＦＰ−Ｔ５の粗酵素液に硫酸アンモニウムを３５％飽和濃度になるように添加して攪拌し、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して上清を回収した。続いて、得られた上清に硫酸アンモニウムを７０％飽和濃度になるように追加添加して攪拌し、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して上清を廃棄し、沈殿物を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた。
【０３５０】
得られた野生型または改変型ＥＦＰ−Ｔ５の粗酵素液を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で透析した後、同緩衝液で平衡化した４ｍｌのＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に供し、同緩衝液で樹脂に吸着しないタンパク質を溶出させた。続いて、得られた野生型または改変型ＥＦＰ−Ｔ５Ｍの粗酵素液を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で透析した後、同緩衝液で平衡化したＨｉＬｏａｄ  ２６／１０  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に同緩衝液で樹脂を洗浄し、続いて同緩衝液中のＮａＣｌの濃度を０ｍＭから１００ｍＭまで直線的に増加させながら樹脂に吸着していた野生型または改変型ＥＦＰ−Ｔ５を溶出させ回収した。
【０３５１】
得られた野生型、または改変型ＥＦＰ−Ｔ５を含む粗酵素液を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  ２６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムにアプライして同緩衝液で野生型または改変型ＥＦＰ−Ｔ５を溶出させ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性（アマドリアーゼ活性）を示す画分を回収した。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、野生型または改変型ＥＦＰ−Ｔ５の精製標品とした。
【０３５２】
（Neocosmospora vasinfecta由来ケトアミンオキシダーゼの生産および精製）
野生型のＮｖＦＸ、および前述の様にして得られた改変型ＮｖＦＸを生産する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ）、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
【０３５３】
調製した粗酵素液を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に２０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂を洗浄し、続いて３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂に吸着していた野生型または改変型ＮｖＦＸを溶出させ回収した。
【０３５４】
得られた野生型ＮｖＦＸ、または改変型ＮｖＦＸを含む粗酵素液を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  ２６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムにアプライして同緩衝液で野生型ＮｖＦＸ、または改変型ＮｖＦＸを溶出させ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性（アマドリアーゼ活性）を示す画分を回収した。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、野生型または改変型ＮｖＦＸの精製標品とした。
【０３５５】
（Aspergillus nidulans由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの生産および精製）
野生型のＡｎＦＸ、および前述の様にして得られた改変型ＡｎＦＸを生産する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ）および大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ−６１Ｄ／６２Ｈ／１０１Ｋ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓ）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
【０３５６】
調製した粗酵素液を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に２０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で樹脂を洗浄し、続いて１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で樹脂に吸着していた改変型ＡｎＦＸを溶出させ回収した。
【０３５７】
得られた改変型ＡｎＦＸを含む粗酵素液を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  ２６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムにアプライして同緩衝液で改変型ＡｎＦＸを溶出させ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性（アマドリアーゼ活性）を示す画分を回収した。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、改変型ＡｎＦＸの精製標品とした。
【０３５８】
（Phaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼの生産および精製）
前述の様にして得られた改変型ＡｎＦＸを生産する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＰｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）および大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＰｎＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓ）を、前述の、野生型ＰｎＦＸの精製方法に従い精製した。ＨｉＬｏａｄ  ２６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムによる精製終了後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、改変型ＰｎＦＸの精製標品とした。
【０３５９】
（Cryptococcus neoformans由来ケトアミンオキシダーゼの生産および精製）
野生型のＣｎＦＸ、および前述の様にして得られた改変型ＣｎＦＸを生産する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ）、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＣｎＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
【０３６０】
調製した粗酵素液を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に２０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂を洗浄し、続いて３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂に吸着していた野生型または改変型ＣｎＦＸを溶出させ回収した。
【０３６１】
得られた野生型ＣｎＦＸ、または改変型ＣｎＦＸを含む粗酵素液を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  ２６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムにアプライして同緩衝液で野生型ＣｎＦＸ、または改変型ＣｎＦＸを溶出させ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性（アマドリアーゼ活性）を示す画分を回収した。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、野生型または改変型ＣｎＦＸの精製標品とした。
【０３６２】
（Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアマドリアーゼの生産）
野生型のＣｃ９５ＦＸ、および前述の様にして得られた改変型Ｃｃ９５ＦＸを生産する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ）、および大腸菌ＪＭ１０９（ｐＥＴ２２ｂ−Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓ）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
【０３６３】
得られた各種アマドリアーゼの野生型酵素、および改変型酵素の精製標品を用いて、αＦ６Ｐを基質とした時の比活性を測定した。結果を表１４に示す。なお、比活性の算出に用いたタンパク質濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度を利用した紫外吸収法により測定した（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ． ４，   ２４１１−２３，  １９９５参照）。
【０３６４】
また、Ｃｃ９５ＦＸ、またはＣｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓを含む粗酵素液を用いて、上記Ｂ：活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、各基質に対する酸化活性、ならびにαＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／αＦＶは表１５の通りとなった。
【表１４】
2019154447.tif 000020
【表１５】
2019154447.tif 000021
【０３６５】
本明細書に記載の手順で作製した、Coniochaeta由来アマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７；比較例１）と比較してαＦ６Ｐに対する反応性を付与または増強するアミノ酸置換を各種のアマドリアーゼに導入した結果、予想通り、ＥＦＰ−Ｔ５、ＮｖＦＸ、ＡｎＦＸ、ＣｎＦＸにはαＦ６Ｐに対する反応性が新たに付与された。また、ＰｎＦＸは従来よりαＦ６Ｐに対する反応を僅かながら示したが、本明細書に記載のアミノ酸置換の導入によりαＦ６Ｐに対する比活性が１３．７倍向上した。
【０３６６】
また、本明細書に記載の手順で作製した、Coniochaeta由来アマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７；比較例１）と比較してαＦ６Ｐに対する反応性を付与または増強するアミノ酸置換を、本明細書に記載の手順で作製した、Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアマドリアーゼ（Ｃｃ９５ＦＸ；比較例８）に導入した結果、予想通り、Ｃｃ９５ＦＸにはαＦ６Ｐに対する反応性が新たに付与され、Ｃｃ９５ＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓでは、αＦ６Ｐ酸化活性がαＦＶＨ酸化活性を上回った。
【０３６７】
すなわち、本明細書に記載のＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ由来アマドリアーゼに対してαＦ６Ｐに対する反応性を付与または増強するするアミノ酸置換の効果は、Coniochaeta由来アマドリアーゼに対してのみ限定される訳ではなく、図１および図２に示した様なＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ由来アマドリアーゼと７４％以上の配列同一性を示すアマドリアーゼであれば、普遍的に同様にαＦ６Ｐに対する反応性が付与または増強された。
【０３６８】
表１４より、ＡｎＦＸに変異６１Ｄ／１０５Ｋ／１１０Ｌを導入したアマドリアーゼ３０はαＦ６Ｐに対して０．１以上の比活性を示した。すなわち、酵素に３重変異を導入することによりαＦ６Ｐに対して０．１以上の比活性を示す改変アマドリアーゼを取得することができた。またＰｎＦＸに６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋを導入したアマドリアーゼ３２もαＦ６Ｐに対して０．１以上の比活性を示した。すなわち、酵素に４重変異を導入することによりαＦ６Ｐに対して０．１以上の比活性を示す改変アマドリアーゼを取得することができた。また、変異をさらに導入することによりαＦ６Ｐに対する比活性をさらに向上させることができた。
【０３６９】
本明細書では、導入する置換の効果が累積することを示した。したがってアマドリアーゼのαＦ６Ｐに対する活性を向上させる変異は、ある特定の変異に限定されず、またある特定の組合せに限定されず、本明細書に示した６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位、４１９位、６８位及び３５６位、さらにはαＦ６Ｐに対する活性を向上させるこれ以外の位置の変異が任意の組合せとして使用可能である、と当業者であれば理解する。また実施例５〜７において後述するように、こうした、αＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼが、本発明のＨｂＡ１ｃ測定方法に使用できる、と当業者であれば理解する。
【０３７０】
以下の表に比較例と、本発明の変異体の、６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位及び４１９位のアミノ酸及び置換があれば置換後のアミノ酸の関係を示す。
【表１６】
2019154447.tif 000022
【表１７】
2019154447.tif 000023
【表１８】
2019154447.tif 000024
【表１９】
2019154447.tif 000025
【表２０】
2019154447.tif 000026
【表２１】
2019154447.tif 000027
【０３７１】
［実施例５］
（ＨｂＡ１ｃの定量）
以下の組成を有するＨｂＡ１ｃ測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ  Ｍａｊｅｓｔｙ  ＪＣＡ−ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用して下記の通りＨｂＡ１ｃの測定を実施した。
【０３７２】
試料：ＨｂＡ１ｃ溶液
ＨｂＡ１ｃ認証実用標準物質ＪＣＣＲＭ４２３−８（検査医学標準物質機構製）
総ヘモグロビン濃度１３３ｇ／ｌ、
ＨｂＡ１ｃ濃度３レベル（ＮＧＳＰ値  ５．５６％、７．７４％、１０．４８％）
試薬Ａ１：試料前処理液
５．０％  ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（同仁化学研究所製）
試薬Ａ２：試料前処理液
５．０％  ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトシド（シグマアルドリッチ社製）
試薬Ｂ：ロイコ色素、パーオキシダーゼ溶液
１５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液  ｐＨ６．５
０．３０ｍＭ  Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４′− ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ−６４、和光純薬工業製）
１５Ｕ／ｍｌ  パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
試薬Ｃ１：ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５溶液
１２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液  ｐＨ６．５
１２０Ｕ／ｍｌ（２８ｍｇ／ｍｌ）ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５（アマドリアーゼ２５）
試薬Ｃ２：ＣＦＰ−Ｔ７溶液
１２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液  ｐＨ６．５
２８ｍｇ／ｍｌ  ＣＦＰ−Ｔ７（比較例１）
試薬Ａ１もしくは試薬Ａ２で３０倍希釈した試料（以降試料希釈液と表記する）を９８℃で２分間インキュベートした後、試料希釈液２５μｌを５０μｌの試薬Ｂに添加して３７℃で５分間インキュベートした後、２５μｌの試薬Ｃ１または試薬Ｃ２を添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた。溶液中に過酸化水素が生じた場合、パーオキシダーゼの作用によりロイコ色素が発色し、７５１ｎｍの光の吸光度が増加する。一例として、試薬Ａ２と試薬Ｃ１を使用して測定を行った場合の、試料希釈液と試薬Ｂを混合してからの経過時間と吸光度の関係を図３に示したが、この場合、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５溶液（試薬Ｃ１）の添加直後から過酸化水素の生成に伴う吸光度上昇が確認できた。試料のＨｂＡ１ｃ濃度に応じて得られた結果を基に、試料のＨｂＡ１ｃ濃度（ＮＧＳＰ値）を横軸に、過酸化水素の定量反応前後の７５１ｎｍの光の吸光度差ΔＡを縦軸にプロットしたグラフを作成した。
【０３７３】
なお、ΔＡは下記の式に従って算出した。
【０３７４】
ΔＡ＝（試薬Ｃ１または試薬Ｃ２添加５分後の吸光度）−（試薬Ｃ１または試薬Ｃ２添加直前の吸光度×０．７５）
ここでは、試薬Ｃ１または試薬Ｃ２添加により、反応液の容積が１．３３倍となるため、試薬Ｃ１または試薬Ｃ２添加直前の吸光度に０．７５を掛けたものを、試薬Ｃ１または試薬Ｃ２添加直後の吸光度と見なした。試薬Ａ１を用いて試料を希釈した場合の結果を図４−１に、試薬Ａ２を用いて試料を希釈した場合の結果を図４−２に示した。
【０３７５】
試薬Ｃ１を用いた場合、ＨｂＡ１ｃ濃度とΔＡの間に良好な相関関係が成立した。それに対し、試薬Ｃ２を用いた場合、ＨｂＡ１ｃ濃度とΔＡの間に相関性は認められなかった。また、この傾向は試薬前処理液（試薬Ａ１、Ａ２）の種類によって影響を受けることはなかった。したがって、αＦ６Ｐ酸化活性を示すアマドリアーゼはＨｂＡ１ｃのβ鎖に対しても酸化活性を示し、プロテアーゼ等を処方することなく迅速かつ精確にＨｂＡ１ｃの定量を行えることが示された。
【０３７６】
［実施例６］
（酸で前処理したＨｂＡ１ｃの定量）
以下の組成を有するＨｂＡ１ｃ測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ  Ｍａｊｅｓｔｙ  ＪＣＡ−ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用して下記の通りＨｂＡ１ｃの測定を実施した。本実施例では、ＨｂＡ１ｃ試料の前処理液として酸性に調整した非イオン性界面活性剤溶液を用いた。 
試料：ＨｂＡ１ｃ溶液
ＨｂＡ１ｃ認証実用標準物質ＪＣＣＲＭ４２３−８（検査医学標準物質機構製）
総ヘモグロビン濃度１３３ｇ／ｌ、
ＨｂＡ１ｃ濃度３レベル（ＮＧＳＰ値  ５．５６％、７．７４％、１０．４８％）
または
ＨｂＡ１ｃ認証実用標準物質ＪＣＣＲＭ４２３−９ｂ（検査医学標準物質機構製）
総ヘモグロビン濃度１３３ｇ／ｌ、
ＨｂＡ１ｃ濃度３レベル（ＮＧＳＰ値  ５．６１％、７．７１％、１０．５５％）
試薬Ｄ１：試料前処理液
８．３％  ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（同仁化学研究所製）
０．１Ｍ  塩酸
試薬Ｄ２：試料前処理液
８．３％  ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ５８、和光純薬工業製）
０．１Ｍ  塩酸
試薬Ｅ：ロイコ色素溶液
３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−リン酸カリウム緩衝液  ｐＨ９．０
２９０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液  ｐＨ６．５
０．１６ｍＭ  Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４′− ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ−６４、和光純薬工業製）
試薬Ｆ１：パーオキシダーゼ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５溶液
１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液  ｐＨ６．５
４０Ｕ／ｍｌ  パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
１８０Ｕ／ｍｌ（４２ｍｇ／ｍｌ）ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５（アマドリアーゼ２５）
試薬Ｆ２ ：パーオキシダーゼ、ＥＦＰ−Ｔ５―６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓ
１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液  ｐＨ６．５
４０Ｕ／ｍｌ  パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
３０Ｕ／ｍｌ（２７ｍｇ／ｍｌ）ＥＦＰ−Ｔ５―６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓ溶液（アマドリアーゼ２８）
試薬Ｄ１もしくは試薬Ｄ２で３０倍希釈した試料２５μｌを、１２５μｌの試薬Ｅに添加して３７℃で５分間インキュベートした後、５０μｌの試薬Ｆ１を添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた。また、試薬Ｄ１で３０倍希釈した試料２５μｌを、１２５μｌの試薬Ｅに添加して３７℃で５分間インキュベートした後、５０μｌの試薬Ｆ２を添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた。一例として、試薬Ｄ１で希釈した試料と試薬Ｅを混合してからの経過時間と吸光度の関係を図５−１に示したが、この場合、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５溶液（試薬Ｆ１）の添加直後から過酸化水素の生成に伴う吸光度上昇が確認できた。各ＨｂＡ１ｃ試料の測定結果から、試料のＨｂＡ１ｃ濃度（ＮＧＳＰ値）を横軸に、過酸化水素の定量反応前後の７５１ｎｍの光の吸光度差ΔＡを縦軸にプロットしたグラフを作成した。
【０３７７】
なお、ΔＡは下記の式に従って算出した。
【０３７８】
ΔＡ＝（試薬Ｆ１まはたＦ２添加５分後の吸光度）−（試薬Ｆ１まはたＦ２添加直前の吸光度×０．７５）
ここでは、試薬Ｆ１またはＦ２添加により、反応液の容積が１．３３倍となるため、試薬Ｆ１またはＦ２添加直前の吸光度に０．７５を掛けたものを、試薬Ｆ１またはＦ２添加直後の吸光度と見なした。試薬Ｄ１およびＦ１を用いて試料を測定した場合の結果を図６−１に、試薬Ｄ２およびＦ１を用いて試料を測定した場合の結果を図６−２に、試薬Ｄ１およびＦ２を用いて試料を測定した場合の結果を図６−３に示した。
【０３７９】
試料の希釈に試薬Ｄ１および試薬Ｄ２のどちらを用いた場合でも、ＨｂＡ１ｃ濃度とΔＡの間に良好な相関関係が成立した。したがって、αＦ６Ｐ酸化活性を示すアマドリアーゼを用いて、変性させたＨｂＡ１ｃを測定する場合には、ＨｂＡ１ｃを酸処理により変性させても、迅速かつ精確にＨｂＡ１ｃの定量を行えることが示された。また、変性用の酸性溶液中に非イオン性界面活性剤を共存させる場合、非イオン性界面活性剤の種類は限定されないことも示された。さらに、異なる種に由来する改変アマドリアーゼを用いてＨｂＡ１ｃを直接測定することができたことから、ＨｂＡ１ｃを直接測定するためのアマドリアーゼは、αＦ６Ｐに対して一定の反応性を示すものであれば、特に限定されないこともまた示された。
【０３８０】
［実施例７］
（イオン性界面活性剤で前処理したＨｂＡ１ｃの定量）
以下の組成を有するＨｂＡ１ｃ測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ  Ｍａｊｅｓｔｙ  ＪＣＡ−ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用して下記の通りＨｂＡ１ｃの測定を実施した。本実施例では、ＨｂＡ１ｃ試料の前処理液としてイオン性界面活性剤溶液を用いた。 
試料：ＨｂＡ１ｃ溶液
ＨｂＡ１ｃ認証実用標準物質ＪＣＣＲＭ４２３−９ｂ（検査医学標準物質機構製）
総ヘモグロビン濃度１３３ｇ／ｌ、
ＨｂＡ１ｃ濃度３レベル（ＮＧＳＰ値  ５．６１％、７．７１％、１０．５５％）
試薬Ｇ１：試料前処理液
０．８０％  テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（東京化成工業製）
試薬Ｇ２：試料前処理液
０．７０％  ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（東京化成工業製）
試薬Ｈ１：ロイコ色素溶液
１２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液  ｐＨ６．５
１．６％  ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（同仁化学研究所製）
０．１６ｍＭ  Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４′− ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ−６４、和光純薬工業製）
試薬Ｈ２：ロイコ色素溶液
１２０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液  ｐＨ６．５
１．６％  ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（同仁化学研究所製）
０．１６ｍＭ  Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４′− ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ−６４、和光純薬工業製）
試薬Ｉ１：パーオキシダーゼ、ＣＦＰ−ＤＨ２溶液
１００ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液  ｐＨ６．５
４０Ｕ／ｍｌ  パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
１６０Ｕ／ｍｌ（５１ｍｇ／ｍｌ）ＣＦＰ−ＤＨ２（アマドリアーゼ３９）
試薬Ｉ２：パーオキシダーゼ、ＣＦＰ−ＤＨ２溶液
１００ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液  ｐＨ６．５
４０Ｕ／ｍｌ  パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
１６０Ｕ／ｍｌ  ＣＦＰ−ＤＨ２
試薬Ｇ１で２５倍希釈した試料２５μｌを、１２５μｌの試薬Ｈ１に添加して３７℃で５分間インキュベートした後、５０μｌの試薬Ｉ１を添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた。また、試料を試薬Ｇ２で２５倍希釈した場合は、希釈試料２５μｌを、１２５μｌの試薬Ｈ２に添加して３７℃で５分間インキュベートした後、５０μｌの試薬Ｉ２を添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた。一例として、試薬Ｇ１で希釈した試料を試薬Ｈ１を混合してからの経過時間と吸光度の関係を図７−１に示したが、この場合、ＣＦＰ−ＤＨ２溶液（試薬Ｉ１）の添加直後から過酸化水素の生成に伴う吸光度上昇が確認できた。各ＨｂＡ１ｃ試料の測定結果から、試料のＨｂＡ１ｃ濃度（ＮＧＳＰ値）を横軸に、過酸化水素の定量反応前後の７５１ｎｍの光の吸光度差ΔＡを縦軸にプロットしたグラフを作成した。
【０３８１】
なお、ΔＡは下記の式に従って算出した。
【０３８２】
ΔＡ＝（試薬Ｉ１またはＩ２添加５分後の吸光度）−（試薬Ｉ１またはＩ２添加直前の吸光度×０．７５）
ここでは、試薬Ｉ１またはＩ２の添加により、反応液の容積が１．３３倍となるため、試薬Ｉ１またはＩ２添加直前の吸光度に０．７５を掛けたものを、試薬Ｉ１またはＩ２添加直後の吸光度と見なした。試薬Ｇ１を用いて試料を希釈した場合の結果を図８−１に、試薬Ｇ２を用いて試料を希釈した場合の結果を図８−２に示した。
【０３８３】
試料の希釈に試薬Ｇ１および試薬Ｇ２のどちらを用いた場合でも、ＨｂＡ１ｃ濃度とΔＡの間に良好な相関関係が成立した。したがって、αＦ６Ｐ酸化活性を示すアマドリアーゼを用いて、変性させたＨｂＡ１ｃを測定する場合には、ＨｂＡ１ｃをイオン性界面活性剤により変性させても、迅速かつ精確にＨｂＡ１ｃの定量を行えることが示された。また、本測定を実施する際にはＨｂＡ１ｃの変性に用いるイオン性界面活性剤の種類は限定されないことも示された。
【０３８４】
上記のようにＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５は、野生型酵素（ＣＦＰ−Ｔ７）では基質とすることができなかったペプチド鎖長の長い糖化ペプチド（αＦ６Ｐ）も基質とした。このＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５を用いて、ＨｂＡ１ｃからαＦ６Ｐを切り出すためのプロテアーゼ等での処理工程を経ずに、ＨｂＡ１ｃの直接測定を試みたところ、驚くべきことに、実施例５に記載のとおり試料中のＨｂＡ１ｃ濃度を決定することができた。ＨｂＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼは現在までに発見されておらず、その報告例は全くない。したがって、αＦ６Ｐを基質とするアマドリアーゼがＨｂＡ１ｃに直接作用することは驚くべき知見である。
【０３８５】
しかしながら、αＦ６Ｐを基質とするアマドリアーゼがＨｂＡ１ｃに直接作用する例が上記実施例において実証された以上、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５と同様にαＦ６Ｐに対する活性を有する他のアマドリアーゼもまた、直接ＨｂＡ１ｃのβ鎖を基質とする可能性が示唆される。特にαＦ６Ｐに対する比活性の高いアマドリアーゼであれば、本発明のアマドリアーゼと同様にＨｂＡ１ｃに直接作用し、したがってＨｂＡ１ｃの定量測定に用いることができる蓋然性が高いと考えられる。
【０３８６】
これを検証したところ、実施例６に示すように、αＦ６Ｐに対する比活性が高いEFP-T5由来のアマドリアーゼ２８を用いた結果、この酵素もまたＨｂＡ１ｃに直接作用した（図６−３）。よってαＦ６Ｐに対する活性の高い本発明のアマドリアーゼと同様にＨｂＡ１ｃに直接作用し、したがってＨｂＡ１ｃの定量測定に用いることができることが実証された。他のαＦ６Ｐに対する比活性の高いアマドリアーゼについても同様と考えられる。上記では実験の便宜のために比活性が１．０Ｕ／ｍｇ以上の酵素を用いたが、当業者であれば、０．１Ｕ／ｍｇの比活性の酵素を１０倍量にて使用することもできる、と理解する。
【０３８７】
また、本発明の知見はαＦ６Ｐ活性を有するアマドリアーゼがＨｂＡ１ｃに直接作用しうることを示すに留まるものではなく、同様に、α−フルクトシルオリゴペプチド、例えばαＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ７Ｐ、αＦ８Ｐ、αＦ１０Ｐ、αＦ１６Ｐ等に対する活性を示すアマドリアーゼであれば同様にＨｂＡ１ｃに直接作用する可能性がある。
【０３８８】
以上のとおり、本発明のアマドリアーゼを用いたＨｂＡ１ｃ測定方法は、ＨｂＡ１ｃのプロテアーゼ等での処理を必要とせず、ＨｂＡ１ｃを迅速、簡便に、かつ、精度よく良好に定量できる。また、変性させたＨｂＡ１ｃを測定する場合、ＨｂＡ１ｃを変性させる手法は特に制限を受けることはない。これにより酵素法によるＨｂＡ１ｃの直接測定が実現し、産業上の利用価値が期待される。
【０３８９】
配列表の簡単な説明
配列番号１  Coniochaeta sp. NISL 9330アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号２  配列番号１のアマドリアーゼの塩基配列
配列番号３−３３  PCRプライマー
配列番号３４  PCRプライマー
配列番号３５  PCRプライマー
配列番号３６  Aspergillus oryzae RIB40  （FAOAo2）  アミノ酸配列
配列番号３７：  FAOAo2塩基配列
配列番号３８  Phaeosphaeria nodorum（PnFX）  アミノ酸配列
配列番号３９  PnFX塩基配列
配列番号４０  Eupenicillium terrenum（EFP-T5）アミノ酸配列
配列番号４１  EFP-T5塩基配列
配列番号４２−５３  PCRプライマー
配列番号５４  Neocosmospora vasinfecta（NvFX）アミノ酸配列
配列番号５５  NvFX塩基配列
配列番号５６−６１  PCRプライマー
配列番号６２  Ｓ５９Ｇ置換  Aspergillus nidulans（AnFX）  アミノ酸配列
配列番号６３  AnFX塩基配列
配列番号６４−８８  PCRプライマー
配列番号８９  Cryptococcus neoformans  （CnFX）  アミノ酸配列
配列番号９０  CnFX塩基配列
配列番号９１−９８  PCRプライマー
配列番号９９  Curvularia clavataケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアマドリアーゼ（Cc95FX）  アミノ酸配列
配列番号１００  Cc95FX塩基配列
配列番号１０１−１１２  PCRプライマー
配列番号１１３  Pyrenochaeta sp.(Py)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１１４  Pyrenochaeta sp.(Py)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１１５  Arthrinium sp.(Ar)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１１６  Arthrinium sp.(Ar)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１１７  Curvularia clavata(Cc)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１１８  Curvularia clavata(Cc)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１１９  Emericella nidulans(En)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１２０  Emericella nidulans(En)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１２１  Ulocladium sp.(Ul)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１２２  Ulocladium sp.(Ul)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１２３  Penicillium janthinellum(Pj)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１２４  Penicillium janthinellum(Pj)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１２５  Aspergillus fumigatus Amadoriase Iのアミノ酸配列
配列番号１２６  Amadoriase I塩基配列
配列番号１２７  Aspergillus oryzae FAOAo1アミノ酸配列
配列番号１２８  FAOAo1塩基配列
配列番号１２９  Aspergillus fumigatus Amadoriase IIアミノ酸配列
配列番号１３０  Amadoriase II塩基配列
配列番号１３１  Aspergillus terreus FAOD-Aアミノ酸配列
配列番号１３２  FAOD-A塩基配列
配列番号１３３  CFP-T7-H20（R62D、D106K、Q110L、A113K）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１３４  CFP-T7-H20塩基配列
配列番号１３５  PnFPOX（S62D、D106K、G110L、A113K）Phaeosphaeria nodorum アミノ酸配列
配列番号１３６  配列番号１３５のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１３７  (アマドリアーゼ２９)NvFX-62D/106K/110L（R62D、G106K、E110L）Neocosmospora vasinfectaアミノ酸配列
配列番号１３８  配列番号１３７のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１３９  (アマドリアーゼ３０)AnFX-61D/105K/109L(S59G、R61D、G105K、K1091L）Aspergillus nidulans  アミノ酸配列
配列番号１４０  配列番号１３９のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１４１  （アマドリアーゼ２５）CFP-T7-H35（R62D、L63H、E102K、D106K、Q110L、A113K、A355S）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１４２  CFP-T7-H35塩基配列
配列番号１４３  （アマドリアーゼ２８）EFP-T5-62D/63H/106K/110L/113K/355S  Eupenicillium terrenumアミノ酸配列
配列番号１４４  配列番号１４３のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１４５  Eupenicillium terrenum野生型アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１４６  Eupenicillium terrenum野生型アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１４７  AnFX  野生型アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１４８  AnFX  野生型アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１４９  CnFX  野生型アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１５０  CnFX  野生型アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１５１  （アマドリアーゼ１）CFP-T7-H1（R62A）Coniochaeta sp. アミノ酸配列
配列番号１５２  CFP-T7-H1塩基配列
配列番号１５３  （アマドリアーゼ２６）CFP-T7-62D（R62D)Coniochaeta sp. アミノ酸配列
配列番号１５４  CFP-T7-62D塩基配列
配列番号１５５（アマドリアーゼ２７）EFP-T5-R62D（R62D) Eupenicillium terrenum アミノ酸配列
配列番号１５６  EFP-T5-R62D塩基配列
配列番号１５７  （アマドリアーゼ２）CFP-T7-H2（R62A、Q110L）Coniochaeta sp. アミノ酸配列
配列番号１５８  CFP-T7-H2塩基配列
配列番号１５９  （アマドリアーゼ４）CFP-T7-H4（R62A、Q110Y）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１６０  CFP-T7-H4塩基配列
配列番号１６１  （アマドリアーゼ５）CFP-T7-H2-62N（R62N、Q110L）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１６２  CFP-T7-H2-62N塩基配列
配列番号１６３  （アマドリアーゼ６）CFP-T7-H6（R62D、Q110L）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１６４  CFP-T7-H6塩基配列
配列番号１６５  （アマドリアーゼ１２）CFP-T7-H10（R62D、D106A、Q110L）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１６６  CFP-T7-H10塩基配列
配列番号１６７  （アマドリアーゼ１３）CFP-T7-H11（R62D、D106K、Q110L）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１６８  CFP-T7-H11塩基配列
配列番号１６９  （アマドリアーゼ１４）CFP-T7-H12（R62D、D106R、Q110L）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１７０  CFP-T7-H12塩基配列
配列番号１７１  （アマドリアーゼ１５）CFP-T7-H13（R62D、Q110L、A113K）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１７２  CFP-T7-H13塩基配列
配列番号１７３  （アマドリアーゼ１６）CFP-T7-H14（R62D、Q110L、A113R）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１７４  CFP-T7-H14塩基配列
配列番号１７５  （アマドリアーゼ１８）CFP-T7-H21(R62D、D106K、Q110L、A113R)Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１７６  CFP-T7-H21塩基配列
配列番号１７７  （アマドリアーゼ１９）CFP-T7-H24（R62D、L63A、D106K、Q110L、A113K）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１７８  CFP-T7-H24塩基配列
配列番号１７９  （アマドリアーゼ２１）CFP-T7-H26（R62D、L63H、D106K、Q110L、A113K）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１８０  CFP-T7-H26塩基配列
配列番号１８１  （アマドリアーゼ２３）CFP-T7-H28（R62D、L63H、E102K、D106K、Q110L、A113K）  Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１８２  CFP-T7-H28塩基配列
配列番号１８３  （アマドリアーゼ２４）CFP-T7-H29（R62D、L63H、D106K、Q110L、A113K、A419K）  Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１８４  CFP-T7-H29塩基配列
配列番号１８５  （アマドリアーゼ３１）（AnFX-61D/62H/101K/105K/109L/112K/355S）Aspergillus nidulansアミノ酸配列
配列番号１８６  配列番号１８５のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１８７  （アマドリアーゼ３３）（PnFX-62D/63H/106K/110L/113K/351S）Phaeosphaeria nodorumアミノ酸配列
配列番号１８８  配列番号１８７のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１８９  （アマドリアーゼ３４）（CnFX-62D/106K/110L/113K）Cryptococcus neoformansアミノ酸配列
配列番号１９０  配列番号１８９のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１９１  （アマドリアーゼ３５）（Cc95FX-62D/63H/106K/110L/113K/353S）Curvularia clavataアミノ酸配列
配列番号１９２  配列番号１９１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１９３−１９８  ＰＣＲプライマー
配列番号１９９  CFP-DH1(Coniochaeta sp. NISL 9330由来)（改変型アマドリアーゼ３６、CFP-T7-H36）（CFP-T7-R62D/L63H/D68N/E102K/D106K/Q110L/A113K/A355S/E44P/E133A/E253K/V257C/N262H/Q337K/E340P/ΔP435/ΔK436/ΔL437）のアミノ酸配列
配列番号２００  配列番号１９９のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号２０１−２０２  ＰＣＲプライマー
配列番号２０３  CFP-DH2(Coniochaeta sp. NISL 9330由来)（アマドリアーゼ３９）のアミノ酸配列
配列番号２０４  配列番号２０３のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
【０３９０】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１−１】
2019154447.tif 000028
【図１−２】
2019154447.tif 000029
【図１−３】
2019154447.tif 000030
【図１−４】
2019154447.tif 000031
【図１−５】
2019154447.tif 000032
【図２−１】
2019154447.tif 000033
【図２−２】
2019154447.tif 000034
【図２−３】
2019154447.tif 000035
【図２−４】
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【図２−５】
2019154447.tif 000037
【図３】
2019154447.tif 000038
【図４−１】
2019154447.tif 000039
【図４−２】
2019154447.tif 000040
【図５】
2019154447.tif 000041
【図６−１】
2019154447.tif 000042
【図６−２】
2019154447.tif 000043
【図６−３】
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【図７】
2019154447.tif 000045
【図８−１】
2019154447.tif 000046
【図８−２】
2019154447.tif 000047
【配列表】
2019154447000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年7月11日(2019.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。