(57)【要約】      （修正有）【課題】標的核酸中の全てのシトシンが非メチル化されているか否かを簡便かつ定量的に検出することができる核酸検出方法の提供。【解決手段】標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して核酸試料を得る変換工程と、核酸試料からウラシル及びメチル化シトシンの少なくともいずれかを含む標的箇所を増幅して増幅核酸断片を得る増幅工程と、増幅核酸断片を環状化して環状化核酸断片を得る環状化工程と、環状化核酸断片に対し、（ａ）環状化核酸断片のセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質を用いる核酸伸長反応により伸長核酸断片を得る、（ｂ）環状化核酸断片のアンチセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質を少なくとも用いる核酸伸長反応により伸長核酸断片を得る、核酸伸長工程と、伸長核酸断片を検出する検出工程と、を含む核酸検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸中の全てのシトシンが非メチル化されているか否かを検出するための核酸検出方法であって、
前記標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して核酸試料を得る変換工程と、
前記核酸試料からウラシル及びメチル化シトシンの少なくともいずれかを含む標的箇所を増幅して増幅核酸断片を得る増幅工程と、
前記増幅核酸断片を環状化して環状化核酸断片を得る環状化工程と、
前記環状化核酸断片に対し、
（ａ）前記環状化核酸断片のセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを少なくとも用いる核酸伸長反応により伸長核酸断片を得る、
又は
（ｂ）前記環状化核酸断片のアンチセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを少なくとも用いる核酸伸長反応により伸長核酸断片を得る、
核酸伸長工程と、
前記伸長核酸断片を検出する検出工程と、を含むことを特徴とする核酸検出方法。
【請求項２】
前記標的核酸中の前記非メチル化シトシンが、ＣＧ配列のシトシンである請求項１に記載の核酸検出方法。
【請求項３】
前記伸長核酸断片の塩基長が、前記環状化核酸断片の長さ以上である請求項１から２のいずれかに記載の核酸検出方法。
【請求項４】
前記変換工程が、重亜硫酸塩を用いて行う請求項１から３のいずれかに記載の核酸検出方法。
【請求項５】
前記核酸試料を増幅する増幅手段が、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）である請求項１から４のいずれかに記載の核酸検出方法。
【請求項６】
前記環状化が、前記増幅核酸の両末端を共有結合することである請求項１から５のいずれかに記載の核酸検出方法。
【請求項７】
前記核酸伸長反応に用いるＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼである請求項１から６のいずれかに記載の核酸検出方法。
【請求項８】
前記伸長核酸断片を検出する検出手段が、アガロースゲル電気泳動である請求項１から７のいずれかに記載の核酸検出方法。
【請求項９】
前記伸長核酸断片を検出する検出手段が、リアルタイムＰＣＲである請求項１から７のいずれかに記載の核酸検出方法。
【請求項１０】
標的核酸中の全てのシトシンが非メチル化されているか否かを検出するための核酸検出装置であって、
前記標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して核酸試料を得る変換手段と、
前記核酸試料からウラシル及びメチル化シトシンの少なくともいずれかを含む標的箇所を増幅して増幅核酸断片を得る増幅手段と、
前記増幅核酸断片を環状化して環状化核酸断片を得る環状化手段と、
前記環状化核酸断片に対し、
（ａ）前記環状化核酸断片のセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを少なくとも用いる核酸伸長反応により伸長核酸断片を得る、
又は
（ｂ）前記環状化核酸断片のアンチセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを少なくとも用いる核酸伸長反応により伸長核酸断片を得る、
核酸伸長手段と、
前記伸長核酸断片を検出する検出手段と、を有することを特徴とする核酸検出装置。
【請求項１１】
請求項１から９の核酸検出方法に用いられる核酸検出キットであって、
標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換する変換試薬と、
変換により得られた核酸試料からウラシル及びメチル化シトシンの少なくともいずれかを含む標的箇所を増幅する増幅試薬と、
増幅により得られた増幅核酸断片を環状化する環状化試薬と、
環状化により得られた環状化核酸断片に対し、
（ａ）前記環状化核酸断片のセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを含み、核酸伸長反応を行う、
又は
（ｂ）前記環状化核酸断片のアンチセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを含み、核酸伸長反応を行う、
核酸伸長試薬と、
前記核酸伸長反応により得られた伸長核酸断片を検出する検出試薬と、を有することを特徴とする核酸検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸検出方法及び核酸検出装置、並びに、核酸検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物を構成する個々の細胞は、同一の塩基配列を有するにも関わらず、細胞種によって固有の性質（表現型）を示している。この表現型は、体細胞分裂の後も継承され、細胞固有の遺伝子発現パターンによって決定されていることがわかってきている。この遺伝子発現パターンの制御には、ＤＮＡのメチル化が重要な役割を担っている。
【０００３】
ＤＮＡのメチル化は、ほとんどの場合、シトシンに生じ、遺伝子の発現抑制をする。
動物のゲノムＤＮＡでは５’−ＣＧ−３’配列（「ＣＧ配列」、「シトシン−リン酸−グアニンサイト」、又は「ＣｐＧサイト」などと称することがある）中のシトシン（Ｃ）がメチル化されることがわかっている。
ゲノム中には、ＣｐＧサイトが高頻度に存在するＣｐＧアイランドと呼ばれる領域があり、ヒトではＣｐＧアイランド中のＣｐＧサイトの約６０％から約９０％がメチル化されていることが知られている。ＣｐＧアイランドは遺伝子の転写調節領域で多く発見されており、遺伝子の転写調節に重要な役割を果たしている。
【０００４】
近年、様々な疾病を分析するのに、その疾病に関与する遺伝子領域におけるシトシン（Ｃ）のメチル化パターンを解析することが試みられている。
メチル化パターンの解析方法としては、例えば、メチル化シトシンを有する標的核酸中のシトシンをウラシルに変換する変換処理を行い、変換処理を行った標的核酸をＰＣＲで増幅し、得られた増幅産物に対して、２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（ｄｄＣＴＰ）、又は２’，３’−ジデオキシグアノシン三リン酸（ｄｄＧＴＰ）を用いてＤＮＡ伸長反応を行い、解析することにより、標的核酸中のメチル化シトシンの位置を決定する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、標的核酸中の全てのシトシンが非メチル化されているか否かを簡便かつ定量的に検出することができる核酸検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
課題を解決するための手段としての本発明の核酸検出方法は、
標的核酸中の全てのシトシンが非メチル化されているか否かを検出するための核酸検出方法であって、
前記標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して核酸試料を得る変換工程と、
前記核酸試料からウラシル及びメチル化シトシンの少なくともいずれかを含む標的箇所を増幅して増幅核酸断片を得る増幅工程と、
前記増幅核酸断片を環状化して環状化核酸断片を得る環状化工程と、
前記環状化核酸断片に対し、
（ａ）前記環状化核酸断片のセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを少なくとも用いる核酸伸長反応により伸長核酸断片を得る、
又は
（ｂ）前記環状化核酸断片のアンチセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを少なくとも用いる核酸伸長反応により伸長核酸断片を得る、
核酸伸長工程と、
前記伸長核酸断片を検出する検出工程と、を含む。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によると、標的核酸中の全てのシトシンが非メチル化されているか否かを簡便かつ定量的に検出することができる核酸検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、変換工程における非メチル化シトシン及びメチル化シトシンの反応を示す図である。
【図２】図２は、標的核酸中の全てのＣｐＧサイト（５箇所）のシトシンが非メチル化シトシンである一例を示す図である。
【図３】図３は、変換工程により標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して得られた核酸試料の一例を示す模式図である。
【図４】図４は、増幅工程により核酸試料のＣｐＧサイトを含む領域を部分的に増幅した増幅核酸断片の一例を示す図である。
【図５】図５は、増幅核酸断片を環状化させた環状化核酸断片の一例を示す図である。
【図６】図６は、環状化核酸断片と環状化核酸断片のセンス鎖に対する伸長反応プライマーの一例を示す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、核酸伸長工程の一例を示す図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、核酸伸長工程の一例を示す図である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、核酸伸長工程の一例を示す図である。
【図８Ａ】図８Ａは、核酸伸長工程のその他の一例を示す図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、核酸伸長工程のその他の一例を示す図である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、核酸伸長工程のその他の一例を示す図である。
【図９】図９は、標的核酸中にメチル化シトシンを含む一例を示す図である。
【図１０】図１０は、変換工程により標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して得られた核酸試料の一例を示す図である。
【図１１】図１１は、増幅工程により核酸試料のＣｐＧサイトを含む領域を部分的に増幅した増幅核酸断片の一例を示す図である。
【図１２】図１２は、増幅核酸断片を環状化させた環状化核酸断片のセンス鎖の一例を示す図である。
【図１３】図１３は、環状化核酸断片と環状化核酸断片のセンス鎖に対する伸長反応プライマーの一例を示す図である。
【図１４】図１４は、核酸伸長工程の一例を示す図である。
【図１５】図１５は、図１２に示す、環状化核酸断片のアンチセンス鎖の一例を示す図である。
【図１６】図１６は、環状化核酸断片と環状化核酸断片のアンチセンス鎖に対する伸長反応プライマーの一例を示す図である。
【図１７】図１７は、核酸伸長工程の他の一例を示す図である。
【図１８】図１８は、増幅工程の一例を示す図である。
【図１９】図１９は、環状化工程の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（核酸検出方法及び核酸検出装置）
本発明の核酸検出方法は、
標的核酸中の全てのシトシンが非メチル化されているか否かを検出するための核酸検出方法であって、
前記標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して核酸試料を得る変換工程と、
前記核酸試料からウラシル及びメチル化シトシンの少なくともいずれかを含む標的箇所を増幅して増幅核酸断片を得る増幅工程と、
前記増幅核酸断片を環状化して環状化核酸断片を得る環状化工程と、
前記環状化核酸断片に対し、
（ａ）前記環状化核酸断片のセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを少なくとも用いる核酸伸長反応により伸長核酸断片を得る、
又は
（ｂ）前記環状化核酸断片のアンチセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを少なくとも用いる核酸伸長反応により伸長核酸断片を得る、
核酸伸長工程と、
前記伸長核酸断片を検出する検出工程と、を含み、さらに必要に応じてその他の工程を含む。
【００１０】
本発明の核酸検出装置は、
標的核酸中の全てのシトシンが非メチル化されているか否かを検出するための核酸検出装置であって、
前記標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して核酸試料を得る変換手段と、
前記核酸試料からウラシル及びメチル化シトシンの少なくともいずれかを含む標的箇所を増幅して増幅核酸断片を得る増幅手段と、
前記増幅核酸断片を環状化して環状化核酸断片を得る環状化手段と、
前記環状化核酸断片に対し、
（ａ）前記環状化核酸断片のセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを少なくとも用いる核酸伸長反応により伸長核酸断片を得る、
又は
（ｂ）前記環状化核酸断片のアンチセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを少なくとも用いる核酸伸長反応により伸長核酸断片を得る、
核酸伸長手段と、
前記伸長核酸断片を検出する検出手段と、を有し、更に必要に応じてその他の手段を有する。
【００１１】
本発明者らは、標的核酸中のシトシンがメチル化されているか否かを検出するための核酸検出方法について検討したところ、以下の知見を得た。
上記特許文献１に記載の技術では、ＰＣＲ法による標的核酸の増幅の後に、断片的に伸長核酸断片を増幅してから電気泳動を行い塩基長毎に分画し、標的配列中のメチル化シトシンの位置を決定するため、複数の反応効率を考慮する必要があり、非メチル化シトシンを含有する標的核酸を精度よく定量することができないという問題がある。
さらに、上記特許文献１の技術では、ＰＣＲ増幅反応、核酸伸長反応、及び電気泳動などの簡便な手法を組み合わせて行われているが、電気泳動によりメチル化シトシンの位置を決定するためには、数塩基の差を区別可能な分解能を有するバイオアナライザーなどの専用の装置を必要するため、簡便に行うことができないという問題がある。
【００１２】
本発明においては、標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換し、得られた核酸試料を少ないサイクル数でＰＣＲ増幅した後に、環状化処理を行うことにより、後の伸長反応において、１分子の鋳型につき１分子の伸長核酸断片を得ることができる。そのため、増幅が起こりやすい配列ほど効率よく増幅されてしまうＰＣＲの反応効率（ＰＣＲバイアスと称することもある）の影響を十分に小さくすることができ、標的核酸中のシトシンがメチル化されているか否かを簡便かつ定量的に検出することができる。なお、定量的とは、絶対定量でも相対定量でもよい。
【００１３】
なお、本発明において、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを使用することができる。
【００１４】
本発明において、標的核酸とは、解析対象とする核酸を意味する。
標的核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＰＣＲ増幅産物、人工合成した塩基配列などが挙げられる。
【００１５】
＜変換工程及び変換手段＞
変換工程は、標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して核酸試料を得る工程であり、変換手段により好適に実施することができる。
【００１６】
変換工程により変換された標的核酸は元の相補性を失うため、一本鎖核酸の状態になる。本発明では、核酸試料とは、解析対象となる塩基配列（標的配列）を有し、変換工程により一本鎖核酸となった核酸を意味する。
【００１７】
標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、重亜硫酸塩を用いるバイサルファイト法などが挙げられる。
また、変換工程には、後述する本発明の核酸検出キットにおける変換試薬を用いることが好ましい。
【００１８】
図１は、重亜硫酸のナトリウム塩を用いたバイサルファイト法による非メチル化シトシン及びメチル化シトシンの反応を示す図である。図１に示すように、非メチル化シトシンでは、重亜硫酸ナトリウムによる脱アミノ化反応が起こり、最終的にシトシンがウラシルに変換されるが、メチル化シトシンの場合、変換反応が生じず、メチル化シトシンが未反応のまま残存する。
【００１９】
＜増幅工程及び増幅手段＞
増幅工程は、核酸試料からウラシル及びメチル化シトシンの少なくともいずれかを含む標的箇所を増幅して増幅核酸断片を得る工程であり、増幅手段により好適に実施することができる。
【００２０】
標的箇所とは、解析対象となる塩基配列（標的配列）を含む、塩基配列を意味する。
【００２１】
増幅手段としては、核酸試料から標的箇所を増幅して増幅核酸断片を得ることができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、増幅装置、増幅試薬などが挙げられる。
増幅装置としては、例えば、サーマルサイクラーなどが挙げられる。
増幅試薬としては、後述する本発明の核酸検出キットに用いる増幅試薬を好適に用いることができる。具体的には、核酸試料のセンス鎖及びアンチセンス鎖に対するプライマー、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、及びｄｄＣＴＰなどの基質、ＤＮＡポリメラーゼ、金属塩などが挙げられる。増幅試薬は、本発明の核酸検出キットと同様のものを用いることができるため、後述する本発明の核酸検出キットにて詳細に説明する。
【００２２】
核酸試料の標的箇所を増幅し増幅核酸断片を得る方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＭＡＰ（Ｓｍａｒｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＲＰＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などが挙げられる。これらの中でも、ＰＣＲ法、ＲＣＡ法が好ましい。
【００２３】
増幅工程における増幅サイクル数としては、ＰＣＲバイアスによる影響を極力減少させることを考慮して、例えば、２０サイクル以下が好ましく、１０サイクル以下がより好ましい。
【００２４】
＜環状化工程及び環状化手段＞
環状化工程は、増幅核酸断片を環状化して環状化核酸断片を得る工程であり、環状化手段により好適に実施することができる。
【００２５】
環状化手段としては、増幅核酸断片の５’末端と３’末端を結合し、増幅核酸断片１分子毎に環状化核酸断片とすることができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、環状化試薬によって増幅核酸断片の５’末端と３’末端に供給結合を形成することなどが挙げられる。
環状化試薬としては、後述する本発明の核酸検出キットに用いる環状化試薬を好適に用いることができる。具体的には、増幅核酸断片の５’末端をリン酸化するキナーゼ、リガーゼなどが挙げられる。これらについては、本発明の核酸検出キットにて詳細に説明する。
また、環状化に際しては、後述する核酸伸長工程に使用する伸長反応プライマーを増幅核酸断片の５’末端及び３’末端の配列を含むように設計し、添加することにより、環状化構造をとりやすくすることができるため、環状化効率を向上させることができる。
【００２６】
＜核酸伸長工程及び核酸伸長手段＞
核酸伸長工程としては、環状化核酸断片に対し、
（ａ）環状化核酸断片のセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを少なくとも用いる核酸伸長反応により伸長核酸断片を得る、
又は
（ｂ）環状化核酸断片のアンチセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを少なくとも用いる核酸伸長反応により伸長核酸断片を得る、工程であり、核酸伸長手段によって好適に実施される。
【００２７】
環状化核酸断片のセンス鎖とは、環状化核酸断片（即ち、増幅核酸断片）における核酸試料に対応する塩基配列を有する鎖を意味する。
環状化核酸断片のアンチセンス鎖とは、環状化核酸断片（即ち、増幅核酸断片）における核酸試料に対応する塩基配列と相補的な塩基配列を有する鎖を意味する。
【００２８】
以下、核酸伸長工程における、（ａ）及び（ｂ）の工程について説明する。
（ａ）は、環状化核酸断片のセンス鎖を鋳型に用いて核酸伸長反応を行う場合である。標的核酸のセンス鎖の非メチル化シトシンは、変換工程でウラシルに、増幅工程でチミンに置換されており、標的核酸においてメチル化シトシンであった塩基はメチル化シトシンのまま残存している。この場合、標的核酸中のシトシンがメチル化されているか否かを検出するために、環状化核酸断片のセンス鎖の一部に相補的なセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄｄＧＴＰ（ジデオキシグアノシン三リン酸）を使用する。
ｄｄＧＴＰは、リボースの２位及び３位のヒドロキシ基を水素に置換したグアノシン三リン酸であり、３位の位置に酸素を有していないため、隣り合う５’側のリン酸との脱水縮合が行われず、核酸伸長反応が終結させることができる。標的核酸がメチル化シトシンを有している場合には、標的核酸のセンス鎖のメチル化シトシンと相補的な位置にｄｄＧＴＰが取り込まれ、核酸伸長反応を終結させる。そのため、標的核酸にメチル化シトシンを有する場合には、得られる伸長核酸断片は、鋳型となる環状化核酸断片の塩基長よりも短くなり、標的核酸に非メチル化シトシンのみを有する場合には、ｄｄＧＴＰが取り込まれることがないため、伸長反応を続ける限り、伸長させ続けることができ、鋳型となる環状化核酸断片の塩基長よりも長くなる。
【００２９】
（ｂ）は、環状化核酸断片のアンチセンス鎖を鋳型に用いて伸長反応を行う場合である。標的核酸のセンス鎖の非メチル化シトシンは、変換工程でウラシルに、増幅工程でチミンに置換されており、標的核酸においてメチル化シトシンであった塩基はメチル化シトシンのままである。この場合、環状化核酸断片のアンチセンス鎖では、標的核酸のセンス鎖のメチル化シトシンに対応する塩基は、グアニンであるのに対し、非メチル化シトシンに対応する塩基はアデニンに変換されている。標的核酸中のシトシンがメチル化されているか否かを検出するために、環状化核酸断片のアンチセンス鎖の一部に相補的なアンチセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄｄＣＴＰ（ジデオキシシチジン三リン酸）を使用する。
ｄｄＣＴＰを用いることにより、標的核酸がメチル化シトシンを有している場合には、標的核酸のメチル化シトシンに対応する位置にｄｄＣＴＰが取り込まれるため、伸長反応を標的核酸のメチル化シトシンに対応する位置で伸長反応を終結させることができる。これにより、標的核酸にメチル化シトシンを有する場合には、伸長核酸断片は環状化核酸断片の塩基長よりも短くなる。逆に、標的核酸に非メチル化シトシンのみを有する場合には、ｄｄＣＴＰが取り込まれることがないため、伸長反応を続ける限り伸長反応を続けることができるので、鋳型となる環状化核酸断片の塩基長よりも長い伸長核酸断片を得ることができる。
【００３０】
核酸伸長手段としては、後述する本発明の核酸検出キットに用いる核酸伸長試薬を好適に用いることができる。具体的には、環状化核酸断片のセンス鎖又はアンチセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するプライマー、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰなどの基質、ＤＮＡポリメラーゼ、塩などが挙げられる。これらについては、本発明の核酸検出キットにて詳細に説明する。
【００３１】
環状化核酸断片のセンス鎖又はアンチセンス鎖に対するプライマーとしては、環状化核酸断片の５’末端及び３’末端の配列を含むように設計することが好ましい。環状化核酸断片の５’末端及び３’末端の配列を含むように設計することにより、環状化工程における環状化効率を向上させることができる。また、環状化核酸断片の５’末端及び３’末端の配列を含むように設計することにより、環状化していない核酸断片への非特異的なアニーリングを防ぐことができるため、検出精度を向上させることができる。
【００３２】
核酸伸長工程における核酸伸長反応としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）反応などを好適に用いることができる。
ＲＣＡ反応を用いることにより、環状化核酸断片１分子から１分子のみ伸長核酸断片を得ることができるため、定量解析を行う上での校正要因を減少することができる。
【００３３】
伸長核酸断片の塩基長としては、環状化核酸断片の長さ以上であることが好ましく、環状化核酸断片の塩基長Ｘ（Ｘは塩基数）に対し、２Ｘ以上であることがより好ましく、１０Ｘ以上であることがより好ましい。
【００３４】
＜検出工程及び検出手段＞
検出工程は、伸長核酸断片を検出する工程であり、検出手段により好適に実施することができる。
【００３５】
検出手段としては、伸長核酸断片を検出することができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アガロースゲル電気泳動、リアルタイムＰＣＲなどが挙げられる。これらの中でも、アガロースゲル電気泳動が好ましい。アガロースゲル電気泳動であると、特別な機器や試薬を用意する必要がなく、簡便な方法で検出を行うことができる。
また、検出手段が、リアルタイムＰＣＲであると、標的核酸中の全てのＣｐＧサイトが非メチル化されている核酸断片をバイオマーカーとした経過観察や、サンプル間での比較検討が可能になる。
【００３６】
その他の検出手段としては、後述する本発明の核酸検出キットに用いる検出試薬を好適に用いることができる。検出試薬の詳細については、本発明の核酸検出キットにて詳細に説明する。
【００３７】
本発明では、増幅核酸断片を環状化することにより、核酸伸長反応により得られる伸長核酸断片と、鋳型となる環状化核酸断片との存在比を１対１に対応させることができるため、定量に必要な校正を少なくすることができ、定量性に優れる検出方法とすることができる。
さらに、増幅核酸断片を環状化することにより、核酸伸長工程において生成する伸長核酸断片の塩基長を鋳型となる環状化核酸断片の長さ以上とすることができるため、分解能の低い検出手段を用いることができるため、簡便に検出することができる。
【００３８】
以下、本発明の核酸検出方法について、図面を参照してさらに詳細に説明する。
【００３９】
図２から図８Ｃは、標的核酸中のシトシンが全て非メチル化シトシンである場合の本発明の核酸検出方法の一例を示す模式図である。
図２は、標的核酸中の全てのＣｐＧサイト（５箇所）のシトシンが非メチル化シトシンである一例を示す図であり、図３は、変換工程により標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して得られた核酸試料の一例を示す模式図であり、図４は、増幅工程により核酸試料のＣｐＧサイトを含む領域を部分的に増幅した増幅核酸断片の一例を示す図であり、図５は、増幅核酸断片を環状化させた環状化核酸断片の一例を示す図であり、図６は、環状化核酸断片と環状化核酸断片のセンス鎖に対する伸長反応プライマーの一例を示す図であり、図７Ａから７Ｃは、核酸伸長工程の一例を示す図であり、図８Ａから８Ｃは、核酸伸長工程の一例を示す図である。
【００４０】
図２に示すように、標的核酸中の全てのＣｐＧサイトのシトシンが非メチル化シトシンである場合、変換工程を行うことにより、図３のように、標的核酸中の全ての非メチル化シトシンがウラシルに変換される。なお、図３に図示しないＣｐＧサイト以外の非メチル化シトシンにおいても同様にウラシルへの変換反応が生じるため、標的核酸である二本鎖の相補性が失われ、１本鎖状態に解離する。さらに、図３の矢印に示す位置で鋳型と相補的に結合するプライマーを用いて、増幅工程を行うことにより、図４に示すような、標的核酸において非メチル化シトシンであった塩基が、チミンに置換された増幅核酸断片が得られる。
次に、得られた増幅核酸断片の５’末端と３’末端をリガーゼによって共有結合を形成させ、図５に示すような環状化核酸断片を得る。得られた環状化核酸断片のセンス鎖に対して、図６に示す、環状化核酸断片の５’末端及び３’末端の配列を有するセンス鎖用伸長核酸プライマーと、ＤＮＡポリメラーゼ、並びに基質としてｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄｄＧＴＰを用いて核酸伸長反応を行う。このとき、鋳型となる環状化核酸断片のセンス鎖は、変換工程及び増幅工程により、シトシンがチミンに変換されているため、伸長核酸断片にｄｄＧＴＰが取り込まれず、図７Ａに示すように、伸長核酸断片は伸長を開始した位置まで伸長を行うことができる。さらに、伸長反応を続けると、図７Ｂに示すようにポリメラーゼの鎖置換活性を用いて鋳型と合成したＤＮＡ鎖との水素結合を解離させつつ、新しいＤＮＡ鎖を合成する。そのため、図７Ｃに示すように、基質の枯渇などが生じない限り、反応時間に応じて伸長反応を継続させることができるため、伸長核酸断片の長さを任意に調整することができる。
また、図７Ａから７Ｃに示すように、伸長核酸断片は、鋳型となる環状化核酸断片１分子に対して、１分子のみ生成するため、定量解析において考慮すべき増幅効率などの要因を排除することができるため、簡便に定量を行うことができる。
【００４１】
図８Ａから図８Ｃは、図５から図７Ａにおいて環状化核酸断片のアンチセンス鎖に対する処理を行った場合を示す図である。図８Ａに示すように、環状化核酸断片のアンチセンス鎖は、変換工程及び増幅工程により、シトシンがアデニンに変換されている。図６と同様に、環状化核酸断片の５’末端及び３’末端の配列を有するアンチセンス鎖用伸長核酸プライマーと、ＤＮＡポリメラーゼ、を用いるが、基質としては、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄｄＣＴＰを用いて核酸伸長反応を行う。このときにおいても、鋳型となる環状化核酸断片のアンチセンス鎖は、変換工程及び増幅工程により、シトシンがアデニンに変換されているため、伸長核酸断片にｄｄＣＴＰが取り込まれず、図８Ｃに示すように、伸長核酸断片は伸長を開始した位置まで伸長を行うことができる。
【００４２】
図９から図１４は、標的核酸中にメチル化シトシンを有する場合に本発明の核酸検出方法の一例を示す模式図である。
図９は、標的核酸中にメチル化シトシンを有する一例を示す図であり、図１０は、変換工程により標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して得られた核酸試料の一例を示す図であり、図１１は、増幅工程により核酸試料のＣｐＧサイトを含む領域を部分的に増幅した増幅核酸断片の一例を示す図であり、図１１は、増幅核酸断片を環状化させた環状化核酸断片のセンス鎖の一例を示す図であり、図１３は、環状化核酸断片と環状化核酸断片のセンス鎖に対する伸長反応プライマーの一例を示す図であり、図１４は、核酸伸長工程の一例を示す図である。
【００４３】
図１０に示すように、標的核酸中にメチル化シトシンを有する場合、変換工程を行うことにより、標的核酸中の非メチル化シトシンはウラシルに変換され、メチル化シトシンは変換されない。さらに、図１０の矢印に示す位置で鋳型と相補的に結合するプライマーを用いて、増幅工程を行うことにより、図１１に示すような、標的核酸において非メチル化シトシンであった塩基がチミンに置換され、標的核酸においてメチル化シトシンがシトシンである増幅核酸断片が得られる。
次に、得られた増幅核酸断片の５’末端と３’末端をリガーゼによって共有結合させ、図１２に示すような環状化核酸断片を得る。得られた環状化核酸断片に対して、図１２に示す、環状化核酸断片の５’末端及び３’末端の配列を有するセンス鎖用伸長核酸プライマーと、ＤＮＡポリメラーゼ、並びに基質としてｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄｄＧＴＰを用いて核酸伸長反応を行う。このとき、鋳型となる環状化核酸断片のセンス鎖は、変換工程及び増幅工程において変換されなかったシトシンを有しているため、図１４に示すように、反応系に含まれるｄｄＧＴＰが環状化核酸断片のシトシンと相補的な位置に取り込まれると、伸長反応は終結する。このように、標的核酸断片にメチル化シトシンが含まれている場合においては、伸長核酸断片は鋳型となる環状化核酸断片の塩基長よりも短い断片となるので、標的核酸に非メチル化シトシンのみを含むものと区別することができる。
【００４４】
図１５から図１７は、標的核酸中にメチル化シトシンを有する場合に本発明の核酸検出方法を適用した他の一例を示す模式図である。
図１５は、図１２に示す、環状化核酸断片のアンチセンス鎖の一例を示す図であり、図１６は、環状化核酸断片と環状化核酸断片のアンチセンス鎖に対する伸長反応プライマーの一例を示す図であり、図１７は、核酸伸長工程の他の一例を示す図である。
【００４５】
図１５に示す、環状化核酸断片のアンチセンス鎖に対して、図１６に示す伸長反応プライマーと、基質としてｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄｄＣＴＰを用いて核酸伸長反応を行う。このとき、鋳型となる環状化核酸断片のアンチセンス鎖は、変換工程及び増幅工程により、センス鎖のメチル化シトシン部位と相補的な部位がグアニンとなっているため、図１７に示すように、反応系に含まれるｄｄＣＴＰが環状化核酸断片のグアニンと相補的な位置に取り込まれると、伸長反応は終結する。このように、標的核酸断片のアンチセンス鎖を鋳型に用いた場合においても、センス鎖を鋳型に用いた場合と同様に、非メチル化シトシンのみを含むものと区別することができる。
【００４６】
（核酸検出キット）
本発明の核酸検出キットは、本発明の核酸検出方法に用いられる核酸検出キットであって、
標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換する変換試薬と、
変換により得られた核酸試料からウラシル及びメチル化シトシンの少なくともいずれかを含む標的箇所を増幅する増幅試薬と、
増幅により得られた増幅核酸断片を環状化する環状化試薬と、
環状化により得られた環状化核酸断片に対し、
（ａ）前記環状化核酸断片のセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを含み、核酸伸長反応を行う、
又は
（ｂ）前記環状化核酸断片のアンチセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを含み、核酸伸長を行う、
核酸伸長試薬と、
核酸伸長反応により得られた伸長核酸断片を検出する検出試薬と、を有し、更に必要に応じてその他の試薬を有する。
【００４７】
−変換試薬−
変換試薬は、標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換する試薬である。
【００４８】
変換試薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、重亜硫酸塩などが挙げられる。
重亜硫酸塩としては、例えば、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００４９】
−増幅試薬−
増幅試薬は、変換により得られた核酸試料からウラシル及びメチル化シトシンの少なくともいずれかを含む標的箇所を増幅する試薬であり、その他の成分を含有する。
【００５０】
増幅試薬としては、核酸試料の標的箇所を増幅することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、通常のＰＣＲに用いられるＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰなどの基質などが挙げられる。
【００５１】
ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、かつ平滑末端を有する増幅核酸断片を生じるＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ウラシルを含む試料核酸からの増幅を行なうため、ウラシルを含む配列に対してもポリメラーゼ活性を有するものがよい。
【００５２】
ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、ＫＯＤ  −Ｍｕｌｔｉ＆Ｅｐｉ−（登録商標）（東洋紡株式会社製）、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）などが挙げられる。これらの中でもＫＯＤ  −Ｍｕｌｔｉ＆Ｅｐｉ−（登録商標）（東洋紡株式会社製）であると３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、平滑末端を有する増幅核酸断片を生じるため好ましい。
【００５３】
また、増幅核酸断片の平滑末端化を行う酵素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）などが挙げられる。
【００５４】
プライマーに使用できる核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、ＰＮＡ、ＢＮＡ、ＬＮＡなどの人工的に合成した核酸類似体（人工核酸とも称することがある）などの核酸などが挙げられる。
なお、プライマーとしては、あらかじめ５’末端がリン酸化されている５’末端リン酸化プライマーを用いることができる。プライマーに５’末端リン酸化プライマーを用いると、後述する環状化試薬の核酸の５’末端のリン酸化を行うリン酸化酵素を省略することができる。
【００５５】
増幅試薬としては、市販のＰＣＲキットを用いることができ、例えば、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）などが挙げられる。
【００５６】
−環状化試薬−
環状化試薬は、増幅核酸断片を環状化して環状化核酸断片を生成する試薬であり、その他成分を含有する。
環状化試薬は、増幅核酸断片を環状化して環状化核酸断片を生成することができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡリガーゼ、核酸の５’末端のリン酸化を行うリン酸化酵素などが挙げられる。
【００５７】
増幅試薬により増幅した増幅核酸断片の５’末端は水酸基が付加されており、３’末端の核酸と共有結合することができないので、増幅核酸断片の５’末端のリン酸化を行う必要がある。
なお、５’末端がリン酸化されている５’末端リン酸化プライマーを増幅試薬として用いた場合には、核酸の５’末端のリン酸化を行うリン酸化酵素を付与することを省略することができる。
【００５８】
核酸の５’末端のリン酸化を行うリン酸化酵素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｔ４  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）などが挙げられる。
【００５９】
ＤＮＡリガーゼとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）などが挙げられる。
【００６０】
−核酸伸長試薬−
核酸伸長試薬は、環状化により得られた環状化核酸断片に対し、
（ａ）前記環状化核酸断片のセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを含み、核酸伸長反応を行う、
又は
（ｂ）前記環状化核酸断片のアンチセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを含み、核酸伸長反応を行う試薬を含有し、その他の成分を含有する。
【００６１】
センス鎖用伸長反応プライマー及びアンチセンス鎖用伸長反応プライマーとしては、環状化核酸断片の５’末端及び３’末端の塩基配列をそれぞれ有するように設計することにより、環状化効率を向上させるために環状化試薬に混合してもよい。
【００６２】
その他の成分としては、核酸伸長反応を行う酵素、バッファー、水などが挙げられる。
【００６３】
核酸伸長反応を行う酵素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。
鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社製）などが挙げられる。
バッファーとしては、例えば、１０ｘ  Ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社製）などが挙げられる。
【００６４】
−検出試薬−
検出試薬は、核酸伸長反応により得られた伸長核酸断片を検出試薬である。
検出試薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、通常のアガロースゲル電気泳動法によるＤＮＡの検出に用いる試薬、通常のリアルタイムＰＣＲに用いることができる試薬などが挙げられる。
【実施例】
【００６５】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００６６】
標的核酸として、ヒト由来のＭｙｅｌｉｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＢＰ）遺伝子の部分配列からなる１７０塩基対（ｂｐ）の核酸断片（以下、ＭＢＰ１７０と称することがある）を用いた。このＭＢＰ１７０のアンチセンス鎖には、５’末端側から２７塩基目、３７塩基目、６７塩基目、７１塩基目、８８塩基目、１００塩基目、１３３塩基目にＣｐＧサイトのシトシンを７箇所有している(配列番号１参照)。
ＭＢＰ１７０のアンチセンス鎖を標的配列とし、７箇所全てのＣｐＧサイトのシトシンが非メチル化シトシンであるＭＢＰ１７０＿Ｕ７、及びＭＢＰ１７０の７箇所全てのＣｐＧサイトのシトシンがメチル化シトシンであるＭＢＰ１７０＿ｍ７をＤＮＡ合成により作製した。作製したＭＢＰ１７０＿Ｕ７、及びＭＢＰ１７０＿ｍ７を用いて、以下の工程による処理を行い、核酸を検出した。
【００６７】
＜変換工程＞
ＭＢＰ１７０＿Ｕ７及びＭＢＰ１７０＿ｍ７をそれぞれ１μｇずつエッペンドルフチューブにとり、蒸留水で２０μＬとする。ＭＢＰ１７０＿Ｕ７、及びＭＢＰ１７０＿ｍ７の溶解液に、３ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム２．２μＬを加え、３７℃、１５分間静置する。次に、３１ｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウム／５ｍＭヒドロキノン（ｐＨ５．０）を２２０μＬ加え、８０℃、４５分間静置する。
その後、カラム（商品名：ｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）に回収し、ｐＨ８．５〜１１．５の脱スルホン試薬を２０〜１００μＬ添加し、脱スルホン処理を行った。その後、カラム上で洗浄を洗浄バッファーによる洗浄を行なった後、溶出処理を行い、ＭＢＰ１７０＿Ｕ７の核酸試料Ｕ７、及びＭＢＰ１７０＿Ｕ７の核酸試料ｍ７を得た。
【００６８】
＜増幅工程＞
次に、核酸試料Ｕ７及びｍ７に対して、以下の反応液１、及び図１８に示す反応条件にしたがって、ＰＣＲ反応を行った。増幅した核酸はアガロースゲル電気泳動を用いて、所望の塩基長の核酸が得られていることを確認した。プライマーは５’末端にリン酸化修飾したものを用いた。
【００６９】
−反応液１−
・核酸試料                                    ：２．０μＬ
・Ｅｘ  Ｔａｑ＊１                            ：０．２５μＬ
・フォワードプライマー（配列番号２参照）      ：２ｐｍｏｌ
・リバースプライマー（配列番号３参照）        ：２ｐｍｏｌ
・１０ｘ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ＊１  ：５．０μＬ
・ｄＮＴＰ  ｍｉｘ＊１                        ：０．２μｍｏｌ／Ｌ  ｅａｃｈ
・Ｈ２Ｏ                                      ：ｕｐ  ｔｏ  ５０μＬ
＊１：タカラバイオ株式会社製
【００７０】
＜＜増幅核酸断片の平滑末端化＞＞
増幅工程にて用いたＤＮＡポリメラーゼのＥｘ  Ｔａｑによる増幅では、増幅核酸断片の３’末端にアデニンが付加されることが知られているため、以下に示す反応液２を用いて、平滑末端化を行った。
平滑末端化は、Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外の試薬を混合した溶液を７０℃、５分間静置し、Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを添加し、３７℃、５分間静置した後、ボルテックスを用いて激しく撹拌して行った。
【００７１】
−反応液２−
・増幅産物                                    ：２９μＬ
・１０ｘ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ＊２  ：４μＬ
・０．１％  ＢＳＡ＊３                        ：４μＬ
・Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ＊２      ：２μＬ
・２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ                ：１μＬ
・Ｈ２Ｏ                                      ：ｕｐ  ｔｏ  ５０μＬ
＊２：タカラバイオ株式会社製
＊３：タカラバイオ株式会社製
【００７２】
＜環状化工程＞
次に、５’末端のリン酸化を行った増幅核酸断片（平滑末端化リン酸化増幅核酸断片）に対して、５’末端及び３’末端の塩基配列の一部に対して相補的な塩基配列を有するセンス鎖用伸長反応プライマー（配列番号４参照）と、以下の反応液３とを用いて、図１９に示す反応条件にしたがって増幅核酸断片の環状化を行い、環状化核酸含有反応液を得た。
【００７３】
−反応液３−
・平滑末端化リン酸化増幅核酸断片              ：１〜２ｐｍｏｌ
・センス鎖用伸長反応プライマー                ：２ｐｍｏｌ
・Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ＊４              ：１７５ｕｎｉｔ
・２ｘ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ＊４    ：７．５μＬ
＊４：タカラバイオ株式会社製
【００７４】
＜核酸伸長工程＞
次に、得られた環状化核酸含有反応液を以下の反応液４の組成で調製し、３０℃、６〜１２時間反応させた後、６５℃、２０分間の条件にして伸長核酸反応を行い、伸長核酸断片を得た。
【００７５】
−反応液４−
・環状化核酸含有反応液                                  ：１〜２ｐｍｏｌ
・１０ｘ  Ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙ  ｂｕｆｆｅｒ＊５  ：１．０μＬ
・１ｍＭ  ｄｄＧＴＰ  ｍｉｘ＊５                          ：４．０μＬ
・Ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ＊５            ：０．２μＬ
・Ｈ２Ｏ                                                ：ｕｐ  ｔｏ  ５０μＬ
＊５：ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社製
＊５の組成：Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｓｅｔ（Ｓｉｇｍａ社製）、及びＤｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｓｅｔ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて、ｄｄＧＴＰ，ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰが１ｍＭとなるように蒸留水を用いて調製し、ｄｄＧＴＰ  ｍｉｘとした。
【００７６】
＜検出工程＞
核酸伸長工程で使用した反応試料２０μＬと色素液を混合して、電気泳動装置（製品名：Ｍｕｐｉｄ−２ｘ、タカラバイオ株式会社製）を用いてアガロースゲル電気泳動にかけ、２０分間、１０Ｖで電気泳動を行い、分子量マーカー（商品名：１Ｋｂ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ、Ｔｈｅｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて１７０ｍｅｒより大きいバンドを確認した。得られたバンドの濃度をＣＣＤイメージャーにより解析し、定量解析を行った。
【００７７】
本発明の態様としては、例えば、以下のとおりである。
＜１＞  標的核酸中の全てのシトシンが非メチル化されているか否かを検出するための核酸検出方法であって、
前記標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して核酸試料を得る変換工程と、
前記核酸試料からウラシル及びメチル化シトシンの少なくともいずれかを含む標的箇所を増幅して増幅核酸断片を得る増幅工程と、
前記増幅核酸断片を環状化して環状化核酸断片を得る環状化工程と、
前記環状化核酸断片に対し、
（ａ）前記環状化核酸断片のセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを少なくとも用いる核酸伸長反応により伸長核酸断片を得る、
又は
（ｂ）前記環状化核酸断片のアンチセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを少なくとも用いる核酸伸長反応により伸長核酸断片を得る、
核酸伸長工程と、
前記伸長核酸断片を検出する検出工程と、を含むことを特徴とする核酸検出方法である。
＜２＞  前記標的核酸中の前記非メチル化シトシンが、ＣＧ配列のシトシンである前記＜１＞に記載の核酸検出方法である。
＜３＞  前記伸長核酸断片の塩基長が、前記環状化核酸断片の長さ以上である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の核酸検出方法である。
＜４＞  前記変換工程が、重亜硫酸塩を用いて行う前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の核酸検出方法である。
＜５＞  前記核酸試料を増幅する増幅手段が、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）である前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の核酸検出方法である。
＜６＞  前記環状化が、前記増幅核酸の両末端を共有結合することである前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の核酸検出方法である。
＜７＞  前記核酸伸長反応に用いるＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼである前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の核酸検出方法である。
＜８＞  前記伸長核酸断片を検出する検出手段が、アガロースゲル電気泳動である前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の核酸検出方法である。
＜９＞  前記伸長核酸断片を検出する検出手段が、リアルタイムＰＣＲである前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の核酸検出方法である。
＜１０＞  標的核酸中の全てのシトシンが非メチル化されているか否か検出するための核酸検出装置であって、
前記標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して核酸試料を得る変換手段と、
前記核酸試料からウラシル及びメチル化シトシンの少なくともいずれかを含む標的箇所を増幅して増幅核酸断片を得る増幅手段と、
前記増幅核酸断片を環状化して環状化核酸断片を得る環状化手段と、
前記環状化核酸断片に対し、
（ａ）前記環状化核酸断片のセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを少なくとも用いる核酸伸長反応により伸長核酸断片を得る、
又は
（ｂ）前記環状化核酸断片のアンチセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを少なくとも用いる核酸伸長反応により伸長核酸断片を得る、
核酸伸長手段と、
前記伸長核酸断片を検出する検出手段と、を有することを特徴とする核酸検出装置である。
＜１１＞  前記＜１＞から＜９＞の核酸検出方法に用いられる核酸検出キットであって、
標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換する変換試薬と、
変換により得られた核酸試料からウラシル及びメチル化シトシンの少なくともいずれかを含む標的箇所を増幅する増幅試薬と、
増幅により得られた増幅核酸断片を環状化する環状化試薬と、
環状化により得られた環状化核酸断片に対し、
（ａ）前記環状化核酸断片のセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを含み、核酸伸長反応を行う、
又は
（ｂ）前記環状化核酸断片のアンチセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖用伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを含み、核酸伸長反応を行う、
核酸伸長試薬と、
前記核酸伸長反応により得られた伸長核酸断片を検出する検出試薬と、を有することを特徴とする核酸検出キットである。
【００７８】
前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の核酸検出方法、前記＜１０＞に記載の核酸検出装置、前記＜１１＞に記載の核酸検出キットによると、従来における前記諸問題を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００７９】
【特許文献１】特開２０１０−３５５３３号公報
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2019154309.tif 000009
【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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