(57)【要約】      （修正有）【課題】ニッキングエンザイムを利用した、シグナルの増幅系を有するホモジニアスアッセイ方法の提供。【解決手段】測定対象との会合部位と一本鎖ＤＮＡとを有するプローブＡ、及び測定対象との会合部位と一本鎖ＤＮＡとを有するプローブＢ、を用いた測定対象の測定方法であって、二重鎖形成配列がプローブＡ及びプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれている方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象との会合部位と一本鎖ＤＮＡとを有するプローブＡ、及び
測定対象との会合部位と一本鎖ＤＮＡとを有するプローブＢ、
を用いた測定対象の測定方法であって、
二重鎖形成配列がプローブＡ及びプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれており、
ニッキングエンザイム認識配列と増幅配列は、それぞれプローブＡ又はプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれており、以下の（ｉ）〜（ｖｉ）の工程を含む方法：
（ｉ）プローブＡの会合部位とプローブＢの会合部位を測定対象と会合させる工程、
（ｉｉ）プローブＡの二重鎖形成配列とプローブＢの二重鎖形成配列をハイブリダイズさせて、ＤＮＡの二重鎖を形成させる工程、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で形成させた二重鎖を起点としてＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡを伸長させることにより、ニッキングエンザイム認識配列の二重鎖を形成させる工程、
（ｉｖ）ニッキングエンザイムにより、下流の増幅配列の前にニックを形成する工程、
（ｖ）鎖置換ＤＮＡポリメラーゼよるニックからのＤＮＡ伸長反応により、一本鎖ＤＮＡの遊離、ニッキングエンザイム認識配列の二重鎖形成、及びニッキングエンザイムによるニック形成を繰り返し行う工程、
（ｖｉ）増幅したＤＮＡを検出する工程。
【請求項２】
請求項１で遊離した一本鎖ＤＮＡと二重鎖形成可能な第二の二重鎖形成配列を有するプローブＣを用いた測定方法であって、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を含む方法：
（ｉ）遊離一本鎖ＤＮＡと第二の二重鎖形成配列による二重鎖形成させる工程、
（ｉｉ）（ｉ）で形成させた二重鎖を起点としてＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡを伸長させることにより、ＲＮＡプロモーター配列、第二の二重鎖配列の二重鎖を形成させる工程、
（ｉｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼにより第二の増幅配列を鋳型としてＲＮＡを繰り返し合成する工程、
（ｉｖ）増幅したＲＮＡを検出する工程。
【請求項３】
ホモジニアス系で行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
一定温度条件下で行われる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニッキングエンザイムを利用した測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）の原理を用いた測定法は、臨床診断や基礎研究の分野で広く用いられている。しかし、ＥＬＩＳＡによる測定では、標識化合物の非特異吸着を除去するための洗浄工程（Ｂ／Ｆ分離）が必要であり、操作に時間がかかること、また洗浄操作に耐えることのできない弱い相互作用のホスト分子は使用できないなどの問題があった。そのため、Ｂ／Ｆ分離を必要としないホモジニアスアッセイ方法が、生物医学研究の現場でのハイスループットスクリーニングに用いられる（非特許文献１）。従来のホモジニアスアッセイにおける検出方法は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）、蛍光偏光（ＦＰ）などの手法を用いて検出される。これらの検出系は、ＥＬＩＳＡなどの酵素を用いた検出系と異なり、反応系中でシグナルの増幅が行われないため、検出感度が問題となることがあった。
【０００３】
例えば非特許文献２では、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）の抗原結合領域近傍に修飾した蛍光分子がタンパク中のトリプトファンによる消光を受けることを利用して、抗原結合により蛍光回復するプローブを開発している。また非特許文献３では、ホスト分子と蛍光色素のピレンで修飾された２つのＤＮＡ鎖が、ゲスト分子との会合により二重鎖形成をして、結果としてピレンが近接位にくることで、ピレン由来の発光のスイッチングが起こるプローブを開発している。これらの測定方法は、どちらもＢ／Ｆ分離を必要としないホモジニアスな系で機能するが、シグナル増幅系を有する測定系ではなかった。
【０００４】
シグナル増幅可能な、ホモジニアス測定系として特許文献１に記載の方法があげられる。特許文献１に記載の方法は分子間の会合をＲＮＡの増幅にのみ変換する方法であったが、一般的にＲＮＡはＤＮＡと比較して安定性が低いことが知られている。そのため、特許文献１に記載の測定方法を、ＲＮＡ分解酵素を多量に含む血液成分の測定に適応することは困難であると考えられた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１７−１１８８６０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】化学と生物  Ｖｏｌ．３８  Ｎｏ．８，  ２０００．５５５
【非特許文献２】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１１，１３３（４３），１７３８６
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２００８，１９，１１３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、シグナルの増幅が可能な、ホモジニアス測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題に鑑みてなされた本発明は、以下の態様を包含する。
（１）測定対象との会合部位と一本鎖ＤＮＡとを有するプローブＡ、及び
測定対象との会合部位と一本鎖ＤＮＡとを有するプローブＢ、
を用いた測定対象の測定方法であって、
二重鎖形成配列がプローブＡ及びプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれており、
ニッキングエンザイム認識配列と増幅配列は、それぞれプローブＡ又はプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれており、以下の（ｉ）〜（ｖｉ）の工程を含む方法：
（ｉ）プローブＡの会合部位とプローブＢの会合部位を測定対象と会合させる工程、
（ｉｉ）プローブＡの二重鎖形成配列とプローブＢの二重鎖形成配列をハイブリダイズさせて、ＤＮＡの二重鎖を形成させる工程、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で形成させた二重鎖を起点としてＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡを伸長させることにより、ニッキングエンザイム認識配列の二重鎖を形成させる工程、
（ｉｖ）ニッキングエンザイムにより、下流の増幅配列の前にニックを形成する工程、
（ｖ）鎖置換ＤＮＡポリメラーゼよるニックからのＤＮＡ伸長反応により、一本鎖ＤＮＡの遊離、ニッキングエンザイム認識配列の二重鎖形成、及びニッキングエンザイムによるニック形成を繰り返し行う工程、
（ｖｉ）増幅したＤＮＡを検出する工程。
（２）（１）で遊離した一本鎖ＤＮＡと二重鎖形成可能な第二の二重鎖形成配列を有するプローブＣを用いた測定方法であって、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を含む方法：
（ｉ）遊離一本鎖ＤＮＡと第二の二重鎖形成配列による二重鎖形成させる工程、
（ｉｉ）（ｉ）で形成させた二重鎖を起点としてＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡを伸長させることにより、ＲＮＡプロモーター配列、第二の二重鎖配列の二重鎖を形成させる工程、
（ｉｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼにより第二の増幅配列を鋳型としてＲＮＡを繰り返し合成する工程、
（ｉｖ）増幅したＲＮＡを検出する工程。
（３）ホモジニアス系で行われる、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）一定温度条件下で行われる、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
（１）測定方法
本発明の測定方法は、測定対象の有無を測定する定性測定であってもよく、また測定対象の量を測定する定量測定であってもよい。本発明の測定方法は、Ｂ／Ｆ分離を必要としない、いわゆるホモジニアス系で行われることが好ましい。
【００１１】
（２）プローブ
本発明に用いられるプローブＡ及びプローブＢは、測定対象との会合部位と一本鎖ＤＮＡを有するものである。会合部位とＤＮＡ鎖の結合は３’末端側、５’末端側のどちらで行っても良く、反応原理に応じて適宜選択すればよい。例えばプローブＡとプローブＢにおいて、一方のプローブは会合部位と一本鎖ＤＮＡの５’末端側とが結合しており、他方のプローブは会合部位と一本鎖ＤＮＡの３’末端側とが結合しているものをあげることができ、これは例えば後述の測定原理に用いることができる。
【００１２】
会合部位と一本鎖ＤＮＡとは直接結合されていてもよく、またスペーサー等を介して間接的に結合されていてもよい。その結合方法は特に限定されないが、例えば、非特許文献３に記載のように、会合部位をホスホロアミダイト化して、ＤＮＡ固相合成に組み込むことで一本鎖ＤＮＡと結合させてもよいし、固相合成により一本鎖ＤＮＡ鎖中にアミノ基、チオール基などの反応性の官能基を導入し、会合部位と反応させてもよい。スペーサーの種類も特に限定されないが、例えばポリオキシエチレン（ＰＥＧ）鎖をスペーサーとして用いてもよいし、ＤＮＡ鎖をスペーサーとして用いてもよい。このスペーサーとして用いられるＤＮＡ鎖は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖の場合は会合部位と結合している側のＤＮＡ鎖に二重鎖形成配列を有する一本鎖ＤＮＡが結合していてもよく、また反対に会合部位と結合しているＤＮＡ鎖の相補鎖側に二重鎖形成配列を有する一本鎖ＤＮＡが結合していてもよい。
【００１３】
（３）会合部位
会合部位は、プローブＡとプローブＢに含まれるものであり、測定対象と会合しうるものであればよく特に限定されない。例えば、会合部位としては、ホスト分子として用いられる小分子（シクロデキストリン、クラウンエーテル、ボロン酸など）や、測定対象と親和性を有するタンパク（レクチン、抗体など）または親和性を有する核酸（アプタマーなど）、アビジン又はビオチン等を用いればよい。プローブＡとプローブＢが共に測定対象に会合した状態をとることができる限り、プローブＡとプローブＢの会合部位は同一のものであっても異なっていてもよい。またプローブＡとプローブＢの会合部位は、測定対象に対してどちらを先に会合させてもよく、また同時に会合させてもよい。会合部位の修飾方法は特に限定されない。例えば小分子を修飾する際には、Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００５（３８）４７８０に記載の方法を用いることが可能である。ＤＮＡ固相合成時に３’末端にアミノ基を修飾しておき、スクシニミジルエステル化した小分子と反応させてもよいし、ホスホロアミダイト化した小分子を用いてＤＮＡ固相合成時に５’末側を修飾してもよい。
【００１４】
（４）二重鎖形成配列
本発明における二重鎖形成配列は、プローブＡとプローブＢの一本鎖ＤＮＡ中にそれぞれ存在するものであるが、それぞれの一本鎖ＤＮＡ中の位置は特に限定されるものではない。それらは互いに相補的な配列を有するものであり、そのＤＮＡ鎖長は特に限定されないが、好ましくは３〜１０塩基、さらに好ましくは４〜６塩基である。
【００１５】
（５）ニッキングエンザイム認識配列
本発明においてニッキングエンザイム配列は、プローブＡ又はプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれるものであるが、その位置は特に限定されるものではない。その配列は特に限定されず、ニッキングエンザイムに認識される配列であればよい。
【００１６】
（６）増幅配列
本発明における増幅配列は、プローブＡ又はプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれるものであるが、その位置は特に限定されるものではない。その配列はＤＮＡポリメラーゼの鋳型となるアンチセンス鎖又はセンス鎖であればよく、特に限定されない。
【００１７】
（７）検出
本発明におけるシグナルの検出は、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによって遊離されたＤＮＡ鎖を検出することで行えばよく、特に限定されない。例えばＤＮＡの検出にはモレキュラービーコンやＩＮＡＦプローブなどの配列特異的に結合し、蛍光変化する検出系を用いてもよいし、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎなどインターカレーター性の蛍光色素を用いてもよい。また、合成されるＤＮＡ配列がＤＮＡｚｙｍｅ活性を有するように配列を設計し、その酵素活性を測定することでシグナルの検出を行なってもよい。また核酸クロマトの方法を用いて、目視による検出を行ってもよい。
【００１８】
検出装置を必要とする場合は、リアルタイムＰＣＲ装置を用いてよい。また本実施例で用いた、ＴＲＣＲリアルタイムモニター（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０  東ソー製）を用いてもよい。
【００１９】
（８）酵素
本発明の測定方法に用いる酵素として、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ニッキングエンザイム活性を有する酵素、及びＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いることができる。測定原理１（図１に例示）においての必須酵素は、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、及びニッキングエンザイム活性を有する酵素である。測定原理２（図２に例示）においての必須酵素は、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ニッキングエンザイム活性を有する酵素、及びＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素である。ニッキングエンザイムは２本鎖ＤＮＡの１本のＤＮＡだけを切断するニッキングエンドヌクレアーゼを用いればよい。例えばＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔ７、Ｔ４などを用いてよく、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとしては、ｐｈｉ２９、Ｂｓｔ、Ｃｓａ、９６−７などを用いてよく、ニッキングエンザイムとしては、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩなどを用いてよく、ＲＮＡポリメラーゼとしては、Ｔ７、ＳＰ６などを用いてよい。特に本発明では、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼとしては９６−７を、ニッキングエンザイムとしてはＮｔ．ＡｌｗＩを、ＲＮＡポリメラーゼとしてはＴ７を用いることが好ましい。
【００２０】
（９）測定原理１
本発明の測定原理の一例を模式図（図１）に示す。プローブＡは一本鎖ＤＮＡの５’側末端に会合部位が結合し、一本鎖ＤＮＡの３’側に二重鎖形成配列を含み、プローブＢは一本鎖ＤＮＡの３’側末端に会合部位が結合し、一本鎖ＤＮＡの５’側に向かって二重鎖形成配列、ニッキングエンザイム認識配列、増幅配列を含む場合を例として説明するが、各プローブの構成、配列の順序はこれに限定されるものではない。なお（９−３）で用いられるＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有していてもいなくてもよく、例えば（９−５）で用いられる鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼと同一でもよい。
（９−１）プローブＡとプローブＢの会合部位を、測定対象物質と会合させる。
（９−２）その結果、プローブＡとプローブＢ中の二重鎖形成配列が、近接位置に配置されることとなり、ＤＮＡ二重鎖が形成される。
（９−３）（９−２）で形成されたＤＮＡ二重鎖を起点として、ＤＮＡポリメラーゼによって、ＤＮＡの伸長が行われ、その結果、ニッキングエンザイム認識配列の二重鎖、増幅配列の二重鎖が形成される。
（９−４）ニッキングエンザイム認識配列の二重鎖が形成されたことで、ニッキングエンザイムにより、下流の２本鎖ＤＮＡの１本のＤＮＡが切断される。
（９−５）１本のＤＮＡが切断された箇所（ニック）から、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が起こり、ニックより下流の１本鎖ＤＮＡが遊離する。
（９−６）ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応によりニッキングエンザイム認識配列が再び形成される。
（９−７）９−５，９−６が繰り返し行われ、繰り返し一本鎖ＤＮＡが遊離され、遊離したＤＮＡをモレキュラービーコンなどで検出する。
（１０）測定原理２
本発明の測定感度を上昇させるために、遊離するＤＮＡをプライマーにして、ＲＮＡプロモーター配列を含むプローブＣと二重鎖を形成させ、ＲＮＡ増幅反応を行うことも可能である。その測定原理の一例を模式図（図２）に示す。図２において、プローブＡ、プローブＢは（９）に記載ものを用い、プローブＣは一本鎖ＤＮＡの５’側末端から遊離ＤＮＡとの第二の二重鎖形成配列、ＲＮＡプロモーター配列、第二の増幅配列を含む場合を例として説明するが、各プローブの構成、配列の順序はこれに限定されるものではない。
（１０−１）（９−１）〜（９−７）に記載の方法で一本鎖ＤＮＡが繰り返し遊離される。
（１０−２）遊離した一本鎖ＤＮＡとプローブＣ上の第二の二重鎖形成配列の間で二重鎖が形成される。
（１０−３）（１０−２）で形成されたＤＮＡ二重鎖を起点として、ＤＮＡポリメラーゼによって、ＤＮＡの伸長が行われ、その結果、ＲＮＡプロモーター配列の二重鎖、第二の増幅配列の二重鎖が形成される。
（１０−４）ＲＮＡプロモーター配列の二重鎖が形成されたことで、ＲＮＡポリメラーゼによって、第二の増幅配列を鋳型としてＲＮＡ増幅が繰り返し行われる。
（１０−５）増幅したＲＮＡをモレキュラービーコンなどで検出する。
（１１）第二の二重鎖形成配列
本発明において第二の二重鎖形配列は測定感度を増幅するため、プローブＣを用いる測定原理２において必要な配列となる。第二の二重鎖形成配列は測定原理１により繰り返し合成される一本鎖ＤＮＡ配列の３’末端に相補的な配列を有すればよい。
（１２）第二の増幅配列
本発明において第二の増幅配列は測定感度を増幅するため、プローブＣを用いる測定原理２において必要な配列となる。第二の増幅配列はプローブＣのＲＮＡプロモーター配列の下流に位置し、ＲＮＡポリメラーゼによって増幅される配列の鋳型の配列であればよい。
（１３）ＲＮＡプロモーター配列
本発明においてプロモーター配列は、測定感度を増幅するため、プローブＣを用いる測定原理２において必要な配列となる。プロモーター配列はプローブＣに含まれるものであるが、その位置は特に限定されるものではない。その配列は特に限定されず、ＲＮＡポリメラーゼ存在下でＲＮＡへの転写を行うことが可能なプロモーターであればよい。具体的には、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーターなどがあげられる。特に、本発明ではＴ７プロモーターを用いることが好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
ホモジニアス系で行われる測定においても、シグナル増幅ができないために、目標の感度に達しないことがある。本発明の測定法では、ＤＮＡポリメラーゼ、及びニッキングエンザイムより合成、遊離された核酸を測定するため、シグナルを増幅して検出することが可能である。このため、高感度な測定が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の測定原理１の概要を示す図である。
【図２】本発明の測定原理２の概要を示す図である。
【図２】実施例１でストレプトアビジンの検出を行った際の時間あたりの蛍光強度変化
【実施例】
【００２３】
実施例１
以下、本発明の実施例を測定原理２（図２）における測定系において詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２４】
（１）プローブ作製
一本鎖ＤＮＡ（配列番号１）の５’末端にビオチン（会合部位）修飾したプローブＡ、一本鎖ＤＮＡ（配列番号２）の３’末端にビオチン（会合部位）修飾したプローブＢ、プローブＣ（配列番号３）は、それぞれグライナー社による受託合成により作製した。プローブＡにおけるＤＮＡ配列は二重鎖形成配列（配列番号１の５〜１０位）を含むように設計し、プローブＢにおけるＤＮＡ配列は二重鎖形成配列（配列番号２の２６〜３１位）、ニッキングエンザイム認識配列（配列番号２の２１〜２５位）、増幅配列（配列番号２の１〜１６位）を含むよう設計し、プローブＣにおけるＤＮＡ配列は、第二の増幅配列（配列番号３の１〜２０位）、ＲＮＡプロモーター配列（配列番号３の２１〜４８位）、第二の増幅配列（配列番号３の３７〜４８位）を含むよう設計した。
（２）蛍光プローブの作製
配列番号３のＤＮＡ配列の５’末端をＦＡＭ、３’末端をＢＨＱ１で修飾した蛍光プローブ（配列番号４）は、グライナー社による受託合成により作製した。
【００２５】
（３）ストレプトアビジンの測定
ビオチンと会合することで知られるストレプトアビジンをプローブＡ、プローブＢ、プローブＣ、蛍光プローブを用いて測定した。測定溶液中の酵素濃度、基質濃度などの詳細を以下に示す。
【００２６】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製）１４４Ｕ／ａｓｓａｙ、９６−７ＤＮＡポリメラーゼ（ニッポンジーン製）８Ｕ／ａｓｓａｙ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ  １０Ｕ／ａｓｓａｙ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼＢｕｆｆｅｒ（タカラバイオ製）、ＤＴＴ  ５ｍＭ、ＮＴＰ  ３ｍＭ、ｄＮＴＰ  ０．２５ｍＭ、ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ  ０．２Ｕ／ｕＬ、プローブＡ  ２００ｎＭ、プローブＢ  ２００ｎＭ、プローブＣ  ２００ｎＭ、蛍光プローブ  ３００ｎＭ。反応温度４２℃。
【００２７】
上記測定溶液中に図３に示す濃度のストレプトアビジンを添加し、蛍光プローブ由来の蛍光強度を時間経過ごとにＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０（東ソー製）を用いて測定した。結果を図３に示す。その結果、ストレプトアビジン濃度に応じて、時間あたりの蛍光強度の増幅が大きくなることが確認された。これは、ストレプトアビジンと各プローブ中のビオチンの会合によって形成されるニッキングエンザイム認識配列の二重鎖の量が増加したためと考えられる。
【００２８】
以上の結果から、本発明の方法により、測定対象を測定できることが確認された。
【図１】
2019180308.tif 000003
【図２】
2019180308.tif 000004
【図３】
2019180308.tif 000005
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年6月1日(2018.6.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
【図１】本発明の測定原理１の概要を示す図である。
【図２】本発明の測定原理２の概要を示す図である。
【図３】実施例１でストレプトアビジンの検出を行った際の時間あたりの蛍光強度変化