(57)【要約】【課題】複数の標的核酸を簡便に検出することができるプローブセットの提供。【解決手段】ｎ種（ｎは３以上の自然数）の標的核酸を検出するためのプローブセットであって、前記プローブセットは、所定の塩基配列と蛍光ピーク波長との組合せを備えた蛍光プローブをｍ種（ｍはｎよりも小さな自然数）含み、前記標的核酸に含まれる一の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有し、前記標的核酸に含まれる前記一の標的核酸とは異なる他の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有するプローブセット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｎ種（ｎは３以上の自然数）の標的核酸を検出するためのプローブセットであって、
前記プローブセットは、
所定の塩基配列と蛍光ピーク波長との組合せを備えた蛍光プローブをｍ種（ｍはｎよりも小さな自然数）含み、
前記標的核酸に含まれる一の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有し、
前記標的核酸に含まれる前記一の標的核酸とは異なる他の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有する
ことを特徴とするプローブセット。
【請求項２】
Ｘ（ｎｍ）（ただし、Ｘは正の実数）の蛍光ピーク波長を有する一の蛍光プローブに対して、Ｙ（ｎｍ）（ただし、Ｙは実数である）以上離れた他の蛍光ピーク波長を有する他の蛍光プローブを有する請求項１に記載のプローブセット。
【請求項３】
前記標的核酸が、ＤＮＡ及びＲＮＡの少なくともいずれかである請求項１から２のいずれかに記載のプローブセット。
【請求項４】
前記蛍光プローブが、前記蛍光プローブの所定の塩基配列の５’末端又は３’末端に蛍光物質を有し、かつ前記蛍光物質を有しない末端に蛍光物質の発光を抑制する消光物質を有する請求項１から３のいずれかに記載のプローブセット。
【請求項５】
ｎ種（ｎは３以上の自然数）の標的核酸を検出するための方法であって、
一の標的核酸と、請求項１から４のいずれかに記載のプローブセットと、を含む標的核酸含有試料を調製する標的核酸含有試料調製工程と、
前記標的核酸にハイブリダイゼーションした前記蛍光プローブ毎に、前記蛍光プローブに対する励起光を照射して前記蛍光プローブの蛍光を検出する検出工程と、
を含むことを特徴とする核酸検出方法。
【請求項６】
前記標的核酸含有試料を同一線上に並べて分画化して配し、前記標的核酸含有試料に対して前記励起光を照射して前記蛍光プローブの蛍光を検出する請求項５に記載の核酸検出方法。
【請求項７】
分画化された各分画に前記標的核酸含有試料を配し、前記標的核酸含有試料に対して同時に前記励起光を照射して前記蛍光プローブの蛍光を検出する請求項５に記載の核酸検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プローブセット、及びそれを用いた核酸検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、疾病に早期診断や治療効果の確認として、微量の体液からバイオマーカーとなる遺伝子などのコピー数変異を検出することが行われている。この検出には、目的とする塩基配列の絶対定量が可能なデジタルＰＣＲを用いた遺伝子発現解析が注目されている。
【０００３】
デジタルＰＣＲは、検量線を必要とせず、高感度かつ高精度な分析手法として、低濃度試料の定量や、遺伝子間での発現量の比較、レアバリアント解析などで活用されている。デジタルＰＣＲは、標的とする核酸が含まれている試料溶液を希釈して、多数の微小区画に分割し、分割した微小区画内でＰＣＲ反応を行うことで標的核酸の増幅を行い、増幅した標的核酸を蛍光検出により検出する方法である。このとき、ポアソン分布に基づき、微小区画に標的核酸が１分子又は１分子も入らないように試料溶液の濃度などの条件を調節し、標的核酸の増幅反応が行われた微小区画と、標的核酸の増幅反応が行われなかった微小区画を得ることができる。この標的核酸の増幅反応が行われた微小区画の数を計数することにより、試料溶液中に含まれる標的核酸の濃度を定量することができる。
さらに、デジタルＰＣＲを用いた検出において、複数の標的核酸を同じ反応系で検出するために、標的核酸毎に異なる蛍光ピーク波長を有するプローブを用いるマルチプレックス検出を行う技術が提案されてきている。
【０００４】
例えば、標的核酸を含む試料溶液を区画化して、複数の微小液滴を形成し、形成した微小液滴中の標的核酸の異なる標的領域にそれぞれ相補的な配列を有するプローブを用いて試料溶液中に含まれる標的核酸の複数の標的領域の検出を行う方法に用いるプローブについて提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、複数の標的核酸を簡便に検出することができるプローブセットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
課題を解決するための手段としての本発明のプローブセットは、
ｎ種（ｎは３以上の自然数）の標的核酸を検出するためのプローブセットであって、
前記プローブセットは、
所定の塩基配列と蛍光ピーク波長との組合せを備えた蛍光プローブをｍ種（ｍはｎよりも小さな自然数）含み、
前記標的核酸に含まれる一の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有し、
前記標的核酸に含まれる前記一の標的核酸とは異なる他の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によると、複数の標的核酸を簡便に検出することができるプローブセットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、標的核酸と、標的核酸に対する蛍光プローブの一例を示す図である。
【図２】図２は、標的核酸と、標的核酸に対する蛍光プローブの他の一例を示す図である。
【図３】図３は、標的核酸と、標的核酸に対する蛍光プローブの他の一例を示す図である。
【図４】図４は、標的核酸含有試料を調製する一例を示す図である。
【図５】図５は、微小区画の一例を示す概念図である。
【図６】図６は、微小区画の他の一例を示す概念図である。
【図７】図７は、微小区画の他の一例を示す概念図である。
【図８】図８は、微小区画の他の一例を示す概念図である。
【図９】図９は、検出工程の一例を示す図である。
【図１０】図１０は、図９に示す検出工程により得られた結果の一例を示す図である。
【図１１】図１１は、検出工程の他の一例及びその結果の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（プローブセット）
本発明のプローブセットは、
ｎ種（ｎは３以上の自然数）の標的核酸を検出するためのプローブセットであって、
前記プローブセットは、
所定の塩基配列と蛍光ピーク波長との組合せを備えた蛍光プローブをｍ種（ｍはｎよりも小さな自然数）含み、
前記標的核酸に含まれる一の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有し、
前記標的核酸に含まれる前記一の標的核酸とは異なる他の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有し、さらに必要に応じてその他の部位乃至成分を含む。
【００１０】
本発明者らは、複数の標的核酸を簡便に検出することができるプローブセットについて検討したところ、以下の知見を得た。
上記特許文献１に記載の技術では、標的核酸中の標的領域毎に異なる蛍光物質を用いて検出を行うため、１つの標的領域に対して１つの蛍光物質が必要であり、それに伴い、蛍光の検出に必要な検出器の数も蛍光物質と同数必要となるため、一度の解析に必要な検出器の数を確保することが難しいという問題がある。
また、上記特許文献１の技術では、同色の蛍光物質でも、蛍光プローブに有する蛍光物質の濃度を変更し、得られる蛍光強度により識別することが記載されているが、細かな濃度条件の検討が必要なため、簡便さが十分ではなく、同時に解析できる標的核酸の数も十分ではないという問題がある。
【００１１】
本発明のプローブセットにおいては、ｎ種（ｎは３以上の自然数）の標的核酸に対して、所定の塩基配列と蛍光ピーク波長との組合せを備えた蛍光プローブをｍ種（ｍはｎよりも小さな自然数）用いて、ｎ種（ｎは３以上の自然数）の標的核酸に含まれる一の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有し、さらに、標的核酸に含まれる一の標的核酸とは異なる他の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有する。本発明の構成とすることにより、使用する蛍光ピーク波長の数を増やすことなく、標的核酸を検出するために使用できる蛍光プローブの種類を増やすことができる。即ち、標的核酸の種類よりも少ない数の蛍光ピーク波長の数を用いて簡便にマルチプレックス検出をすることができる。
【００１２】
なお、本発明において、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを使用することができる。その他にもＰＮＡ、ＢＮＡ、ＬＮＡなどの人工的に合成した核酸類似体（人工核酸とも称することがある）なども使用することができる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１３】
本発明において、標的核酸とは、解析対象とする塩基配列を有する核酸分子を意味する。
標的核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ増幅産物、ＲＮＡ、人工合成したオリゴヌクレオチド、及びそれらの断片などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１４】
−蛍光プローブ−
蛍光プローブは、所定の塩基配列と蛍光ピーク波長との組合せを備えている。
【００１５】
所定の塩基配列としては、標的核酸と相補的な塩基配列を有していれば、塩基長、所定の塩基配列を構成する物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００１６】
塩基長としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、２０ｍｅｒ以上３５ｍｅｒ以下などが好ましい。塩基長を２０ｍｅｒ以上３５ｍｅｒ以下とすることにより検出の特異性を向上させることができる。
【００１７】
所定の塩基配列を構成する物質としては、標的核酸と相補的な塩基配列を構成することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを使用することができる。その他にもＰＮＡ、ＢＮＡ、ＬＮＡなどの人工的に合成した核酸類似体（人工核酸とも称することがある）なども使用することができる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１８】
蛍光ピーク波長としては、核酸修飾に用いることができる蛍光物質の蛍光ピーク波長であれば特に制限はなく、目的に応じて定義選択することができ、例えば、Ｘ（ｎｍ）（ただし、Ｘは正の実数）の蛍光ピーク波長の蛍光物質を有する一の蛍光プローブに対して、Ｙ（ｎｍ）以上離れた他の蛍光ピーク波長とすることが好ましい。Ｙ（ｎｍ）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１８（ｎｍ）とすることなどが挙げられる。蛍光ピーク波長が、Ｘ（ｎｍ）（ただし、Ｘは正の実数）の蛍光ピーク波長の蛍光物質を有する一の蛍光プローブに対して、Ｙ（ｎｍ）以上離れた他の蛍光ピーク波長であると、蛍光プローブの検出精度を向上させることができる。
【００１９】
蛍光物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フルオレセイン（ＦＬＯ）、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＮＥＤ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＶＩＣ（登録商標）、ＰＥＴ、ＡＢＹ（登録商標）、ＪＵＮ（登録商標）、ＭＵＳＴＡＮＧ  ＰＵＲＰＬＥ（登録商標）、などが挙げられる。これらの中でも、ＦＡＭ、ＲＯＸが好ましい。
【００２０】
蛍光プローブとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光プローブの所定の塩基配列の５’末端又は３’末端に蛍光物質を有し、かつ前記蛍光物質を有しない末端に蛍光物質の発光を抑制する消光物質を有するものなどが挙げられる。蛍光プローブの所定の塩基配列の５’末端又は３’末端に蛍光物質を有し、かつ前記蛍光物質を有しない末端に蛍光物質の発光を抑制する消光物質を有するものとしては、例えば、オリゴヌクレオチド（プローブ）の５’末端を蛍光物質、３’末端を消光物質（クエンチャー物質などと称することもある）で修飾したものなどが好ましい。具体的には、例えば、Ｔａｑ  ｍａｎ（登録商標）  ｐｒｏｂｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎなどの核酸プローブなどが挙げられる。
【００２１】
消光物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＭＧＢ、ＱＳＹ（登録商標）などが挙げられる。
【００２２】
本発明のプローブセットでは、ｎ種（ｎは３以上の自然数）の標的核酸に対して、所定の塩基配列と蛍光ピーク波長との組合せを備えた蛍光プローブをｍ種（ｍはｎよりも小さな自然数）含み、標的核酸に含まれる一の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有し、標的核酸に含まれる一の標的核酸とは異なる他の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有する。このことについて、図１から図３を参照して具体的に説明する。
【００２３】
図１から図３は、標的核酸と標的核酸に相補的な塩基配列を有する蛍光プローブとの関係を示す図である。
図１は、標的核酸１０１と、標的核酸１０１に対する蛍光プローブ１１１との関係の一例を示す図であり、図２は、標的核酸１０２と、標的核酸１０２に対する蛍光プローブ１１２との関係の一例を示す図であり、図３は、標的核酸１０３に対する蛍光プローブ１１３及び１１４との関係の一例を示す図である。
図１から図３に示すように、ここでは、３種の標的核酸１０１、標的核酸１０２、及び標的核酸１０３に対して、２種の蛍光物質１２１又は蛍光物質１２２が修飾された蛍光プローブを用いている。蛍光プローブ１１１には蛍光物質１２１が、蛍光プローブ１１２には蛍光物質１２２が、蛍光プローブ１１３には蛍光物質１２１が、蛍光プローブ１１４には蛍光物質１２２がそれぞれ修飾されている。蛍光物質１２１、１２２、及び１２３は互いに異なる蛍光ピーク波長を有する。
図１及び図２に示すように、標的核酸１０１に蛍光プローブ１１１が、標的核酸１０２に蛍光プローブ１１２がハイブリダイゼーション可能な塩基配列を有している。また、図３に示すように、標的核酸１０３に対して、異なる部位で２種の蛍光プローブ１１３及び蛍光プローブ１１４が同時にハイブリダイゼーション可能な塩基配列を有している。
このように、３種の標的核酸を２種の蛍光ピーク波長を有する蛍光プローブを用いて識別することができる。
【００２４】
以上より、ｎ種（ｎは３以上の自然数）の標的核酸に対して、所定の塩基配列と蛍光ピーク波長との組合せを備えた蛍光プローブをｍ種（ｍはｎよりも小さな自然数）含み、標的核酸に含まれる一の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有することにより、複数の標的核酸を簡便に検出することができる。
【００２５】
さらに、標的核酸に含まれる一の標的核酸とは異なる他の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有することにより、標的核酸を検出するバリエーションを増加させることができる。
【００２６】
ここで、ｎ種（ｎは３以上の自然数）の標的核酸に対して、所定の塩基配列と蛍光ピーク波長との組合せを備えた蛍光プローブをｍ種（ｍはｎよりも小さな自然数）含む蛍光プローブの種類について検討する。例えば、蛍光ピーク波長をＰとすると、３種の蛍光ピーク波長（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）を用いて、標的核酸を識別できる蛍光ピーク波長の組合せは、（Ｐ１／−／−）、（−／Ｐ２／−）、（−／−／Ｐ３）、（Ｐ１／Ｐ２／−）、（Ｐ１／−／Ｐ３）、（−／Ｐ２／Ｐ３）、及び（Ｐ１／Ｐ２／Ｐ３）の７種となる。このため、３種の蛍光ピーク波長を用いることにより、最大７種の標的核酸を識別することができる。
このことから、ｋ種（ｋはｎよりも小さな自然数）の蛍光ピーク波長を用いた場合に考えられる蛍光プローブの組合せは、最大で２ｋ−１種類となる。
【００２７】
このとき、解析対象となる標的核酸の数に対して、蛍光プローブの種類が少なくなる場合がある。例えば、標的核酸の種類が８種、蛍光ピーク波長の種類が３種である場合、３種の蛍光ピーク波長を用いた蛍光プローブの組合せは７種となり、８種の標的核酸を識別することができない。そのため、ｋ種の蛍光ピーク波長を用いてｎ種の標的核酸を検出する場合において、ｍ種類の蛍光プローブによりｎ種の標的核酸を検出するためには、ｋは、２ｋ−１≧ｎを満たすこと、即ち、ｋ≧ｌｏｇ２（ｎ＋１）（ｎは３以上の自然数、ｋはｎよりも小さな自然数）を満たすことが好ましい。
したがって、本発明のプローブセットは、一の標的核酸に対して２種以上の蛍光プローブを用いて検出を行うことにより、標的核酸の種類が増加した場合であっても、標的核酸の種類よりも少ない数の蛍光物質で簡便に検出をすることができる。
【００２８】
（核酸検出方法）
本発明の核酸検出方法は、
ｎ種（ｎは３以上の自然数）の標的核酸を検出するための方法であって、
一の標的核酸と、本発明のプローブセットと、を含む標的核酸含有試料を調製する標的核酸含有試料調製工程と、
前記標的核酸にハイブリダイゼーションした前記蛍光プローブ毎に、前記蛍光プローブに対する励起光を照射して前記蛍光プローブの蛍光を検出する検出工程と、
を含み、さらに必要に応じてその他の工程を含む。
【００２９】
＜標的核酸含有試料調製工程＞
標的核酸含有試料調製工程は、一の標的核酸と、本発明のプローブセットと、を含む標的核酸含有試料を調製する工程である。
【００３０】
一の標的核酸と、本発明のプローブセットと、を含む標的核酸含有試料を調整する工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、デジタルＰＣＲにおいてマイクロ流路を利用するＷａｔｅｒ  ｉｎ  Ｏｉｌドロップレットを作製する方法、及びマイクロナノサイズのウェルを利用する方法などが挙げられる。具体的には、例えば、ドロップレットジェネレーター（装置名：Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ、バイオ・ラッド製）を用いたドロップレット生成方法、特許第３７４６７６６号公報に記載の方法などが挙げられる。
【００３１】
図４は、マイクロ流路を用いて、一の標的核酸と、本発明のプローブセットと、を含む標的核酸含有試料を調製する一例を示す図である。図５から図８は、図４に示すマイクロ流路を用いて調整した標的核酸含有試料の一例を示す図である。
【００３２】
図４に示すように、複数の標的核酸を含む試料溶液を図の右側の流路から供給し、プローブセットを含む反応試薬を含有する試料溶液を左側の流路から供給し、最終的に１本の流路に合流させることにより、２種の試料溶液を混合する。混合した試料溶液は、図４の左下から右下に向けて供給する連続相の流体と図４の中央部で合流する。このとき、混合した試料溶液は、連続相の流体のせん断力により、ドロップレットとして微小区画に微小区画化される。
【００３３】
図５は、図４により生成された微小区画１４１の一例を示す図である。図５に示すように、微小区画１４１には、標的核酸１０１、蛍光プローブ１１１、１１２、１１３、及び１１４、並びに標的核酸の増幅に要するプライマーセット１５１、１５２、及び１５３を含有している。図６から図８においては、微小区画１４２、１４３、及び１４４に含まれる標的核酸がそれぞれ標的核酸１０２、１０３、なしの場合を示している。図５から図８に示す標的核酸１０１から１０３、及び蛍光プローブ１１１から１１４の対応関係は、図１から図３に示す関係と同様である。図５から図８に示すように、図４のマイクロ流路を用いて、微小区画内に標的核酸が１分子以下で入る条件にて生成した微小区画は、標的核酸が入っている、又は入っていないものとすることができる。
このように複数の標的核酸が含まれる試料溶液を微小区画化することにより、個々の微小区画で標的核酸の検出を行うことができる。
【００３４】
＜検出工程＞
検出工程は、標的核酸にハイブリダイゼーションした蛍光プローブ毎に、蛍光プローブに対する励起光を照射して蛍光プローブの蛍光を検出する工程であり、検出手段により好適に実施することができる。
【００３５】
蛍光プローブの蛍光を検出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光プローブがハイブリダイゼーション可能な標的配列の領域を含むように核酸増幅反応を行い蛍光プローブの蛍光物質を遊離させ、遊離した蛍光物質に対し励起光を照射して、蛍光物質が発する蛍光を検出する方法などが挙げられる。具体的には、例えば、Ｔａｑ  ｍａｎ（登録商標）  ｐｒｏｂｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎなどの核酸プローブを用いる検出方法などが挙げられる。
【００３６】
核酸増幅反応としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＭＡＰ（Ｓｍａｒｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＲＰＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＨＣＲ（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などが挙げられる。
【００３７】
蛍光プローブに対する励起光を照射する手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、指向性が高いレーザー、ＬＥＤ、ハロゲンランプ、水銀灯等の光源などが挙げられる。これらの中でも、指向性が高いレーザーが好ましい。ＬＥＤ、ハロゲンランプ、水銀灯等の光源を用いる場合は、特定の周波数をカットするフィルターを光学系に組み込むことで利用が可能である。
【００３８】
検出手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光顕微鏡、ＣＣＤカメラによる画像解析、光電子増倍管等の光センサによる電気信号等などが挙げられる。
【００３９】
蛍光を検出する方式としては、特に制限はなく、標的核酸含有試料を同一線上に並べて分画化して配し、標的核酸含有試料に対して励起光を照射して蛍光プローブの蛍光を検出するドロップレット方式と、分画化された各分画に標的核酸含有試料を配し、標的核酸含有試料に対して同時に励起光を照射して蛍光プローブの蛍光を検出するウェル方式が挙げられる。
【００４０】
検出工程では、標的核酸含有試料調製工程により分画化した標的核酸含有試料には、標的核酸を１分子含むか否かの状態であるため、分画化した標的核酸含有試料毎の蛍光の検出結果により、簡便に複数の標的核酸を検出することができる。
【００４１】
図９から図１１は、検出工程の一例を示す図である。図９から図１１では、ＰＣＲ法を用いるときの一例を示す。
分画化した標的核酸含有試料に含まれる標的核酸を検出するために、まず、分画化した標的核酸含有試料毎にＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲ反応により、分画化した標的核酸含有試料毎に含まれる標的核酸に対する相補的な塩基配列を有する蛍光プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションした後に分解され、蛍光物質が遊離し、蛍光を検出できるようになる。
【００４２】
図９は、ドロップレット方式による蛍光検出方式の一例を示す図である。図９に示すように、ドロップレット方式においては、生成したドロップレット（分画と称することもある）を同一線上（ライン上）に配することができる移動手段と、蛍光プローブの蛍光物質に対する励起光を照射する照射手段と、励起した蛍光物質から発せられる蛍光を検出する検出器を用いる。
移動手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マイクロ流路などが挙げられる。
【００４３】
例えば、図９に示すように、分画化した標的核酸含有試料を同一線上（ライン上）に並べて、分画化した標的核酸含有試料に蛍光プローブが有する蛍光物質に対する励起光を照射する。励起した蛍光物質から発せられる蛍光を分画毎に検出することにより、分画化した標的核酸含有試料毎に含まれる標的核酸の種類を特定する。
分画化した標的核酸含有試料に含まれる標的核酸の種類の特定は、図１０に示すように、蛍光Ａ’及び蛍光Ｂ’の検出器を同一線上（ライン上）に配し、供給される分画化した標的核酸含有試料に対して励起光Ａ及び励起光Ｂを順番に照射し、分画化した標的核酸含有試料毎に検出された蛍光の検出結果に基づいて、個々の分画化した標的核酸含有試料に含まれる標的核酸の種類を特定することができる。即ち、蛍光Ａ’のみ検出された分画は標的核酸１を、蛍光Ｂ’のみ検出された分画は標的核酸２を、蛍光Ａ’及び蛍光Ｂ’の両方を検出した分画は標的核酸３を含む分画であることが特定できる。
【００４４】
図１１は、ウェル方式による蛍光検出方式の一例を示す図である。図１１に示すように、ウェル方式においては、分画化した標的核酸含有試料を分画（ウェル）に配して、ウェルに配した標的核酸含有試料に対して同時に蛍光プローブが有する蛍光物質に対する励起光を蛍光物質の種類毎に照射する。励起した蛍光物質から発せられる蛍光を、ウェルの位置に応じて検出する。得られた複数の蛍光の検出結果を統合し、ウェル毎に含まれる標的核酸の種類を特定する。例えば、図１１に示すように、複数のウェルに標的核酸含有試料を配し、配した標的核酸含有試料の全てに対して励起光を同時に照射し、ウェル毎に検出された蛍光の検出結果に基づいて、個々のウェルに含まれる標的核酸の種類を特定することができる。即ち、蛍光Ａ’のみ検出されたウェルは標的核酸１を、蛍光Ｂ’のみ検出されたウェルは標的核酸２を、蛍光Ａ’及び蛍光Ｂ’の両方を検出したウェルは標的核酸３を含む分画であることが特定できる。
【００４５】
本発明の核酸検出方法は、本発明のプローブセットを用いることにより、複数の標的核酸を、簡便に検出することができるため、少ない検出器を用いる場合においてもマルチプレックス検出数を十分確保することができる。また、本発明の核酸検出方法は、分画化した標的核酸含有試料に含まれる標的核酸を１分子含むようにすることができるため、定量的な解析に用いることができる。
【００４６】
本発明の態様としては、例えば、以下のとおりである。
＜１＞  ｎ種（ｎは３以上の自然数）の標的核酸を検出するためのプローブセットであって、
前記プローブセットは、
所定の塩基配列と蛍光ピーク波長との組合せを備えた蛍光プローブをｍ種（ｍはｎよりも小さな自然数）含み、
前記標的核酸に含まれる一の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有し、
前記標的核酸に含まれる前記一の標的核酸とは異なる他の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有する
ことを特徴とするプローブセットである。
＜２＞  Ｘ（ｎｍ）（ただし、Ｘは正の実数）の蛍光ピーク波長を有する一の蛍光プローブに対して、Ｙ（ｎｍ）（ただし、Ｙは実数である）以上離れた他の蛍光ピーク波長を有する他の蛍光プローブを有する前記＜１＞に記載のプローブセットである。
＜３＞  前記標的核酸が、ＤＮＡ及びＲＮＡの少なくともいずれかである前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のプローブセットである。
＜４＞  前記蛍光プローブが、前記蛍光プローブの所定の塩基配列の５’末端又は３’末端に蛍光物質を有し、かつ前記蛍光物質を有しない末端に蛍光物質の発光を抑制する消光物質を有する前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のプローブセットである。
＜５＞  ｎ種（ｎは３以上の自然数）の標的核酸を検出するための方法であって、
一の標的核酸と、請求項１から４のいずれかに記載のプローブセットと、を含む標的核酸含有試料を調製する標的核酸含有試料調製工程と、
前記標的核酸にハイブリダイゼーションした前記蛍光プローブ毎に、前記蛍光プローブに対する励起光を照射して前記蛍光プローブの蛍光を検出する検出工程と、
を含むことを特徴とする核酸検出方法である。
＜６＞  前記標的核酸含有試料を同一線上に並べて分画化して配し、前記標的核酸含有試料に対して前記励起光を照射して前記蛍光プローブの蛍光を検出する前記＜５＞に記載の核酸検出方法である。
＜７＞  分画化された各分画に前記標的核酸含有試料を配し、前記標的核酸含有試料に対して同時に前記励起光を照射して前記蛍光プローブの蛍光を検出する前記＜５＞に記載の核酸検出方法である。
【００４７】
前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のプローブセット、前記＜５＞から＜７＞のいずれかに記載の核酸検出方法によると、従来における前記諸問題を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００４８】
【特許文献１】特開２０１２−５５３０５０号公報
【符号の説明】
【００４９】
１０１、１０２、１０３            標的核酸
１１１、１１２、１１３、１１４    蛍光プローブ
１２１、１２２、１２３            蛍光物質
１４１、１４２、１４３            標的核酸含有試料
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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