(57)【要約】【課題】クロム含有なめし皮廃棄物からコラーゲンを抽出する方法を提供する。【解決手段】本発明に係る方法は、脱色する工程、コラーゲン凝集物を得る工程、およびコラーゲン凝集物をコラーゲンに変換する工程を備える。また、本方法は、超臨界二酸化炭素反応器中での反応を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、クロム含有なめし皮廃棄物からコラーゲンを抽出する方法。
（１）酸脱色：前記クロム含有なめし皮廃棄物を、１．０〜５．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液に０．５〜３時間浸漬し；前記クロム含有なめし皮廃棄物を、水で３〜５回、ｐＨ＝５〜７にまで洗浄し；前記クロム含有なめし皮廃棄物を、０．１〜１．０ｍｏｌ／Ｌシュウ酸溶液に入れる、ここで、前記シュウ酸溶液の重量は、前記クロム含有なめし皮廃棄物の乾燥重量の２０〜５０倍である；前記クロム含有なめし皮廃棄物と前記シュウ酸溶液との混合物をホモジナイザに移し；前記ホモジナイザ内で前記混合物を３０〜５０℃で５〜４８時間攪拌し；前記混合物を５０００〜２００００Ｇの速度で遠心分離して第１沈殿物を収集し；当該第１沈殿物を０．１〜１．０ｍｏｌ／Ｌシュウ酸ナトリウム溶液中に拡散させる、ここで、前記シュウ酸ナトリウム溶液の重量は、前記クロム含有なめし皮廃棄物の乾燥重量の２０〜５０倍である；前記第１沈殿物と前記シュウ酸ナトリウム溶液との混合物を３０〜５０℃で２４〜１２０時間攪拌し；前記混合物を５０００〜２００００Ｇの速度で遠心分離して第２沈殿物を収集する、
（２）前記第２沈殿物を、０．１〜１．０ｍｏｌ／Ｌ酢酸−クエン酸溶液に入れる、ここで、前記酢酸−クエン酸溶液の重量は、前記クロム含有なめし皮廃棄物の乾燥重量の２０〜５０倍である；前記第２沈殿物と前記酢酸−クエン酸溶液との混合物を前記ホモジナイザに移し、当該混合物を攪拌する；第１の０．１〜１．０ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を前記混合物にｐＨ＝７．０〜７．５まで添加する；１．０ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム溶液を前記混合物に添加して、１０〜２４時間塩析する；前記混合物を５０００〜２００００Ｇの速度で１５〜３０分間遠心分離して第３沈殿物を収集し；当該第３沈殿物を０．１〜１．０ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液中に拡散させる、ここで、前記酢酸溶液の重量は、前記クロム含有なめし皮廃棄物の乾燥重量の２０〜５０倍である；蒸留水中で１０〜４８時間、透析し、凍結乾燥してコラーゲン凝集物を得る、そして
（３）前記コラーゲン凝集物を切断し；前記コラーゲン凝集物を第２の０．１〜１．０ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液に入れる、ここで、前記酢酸溶液の重量は、前記コラーゲン凝集物の２０〜５０倍である；コラーゲン凝縮物と酢酸溶液との前記混合物にペプシンを添加する、ここで、前記ペプシンの重量は前記コラーゲン凝集物の重量の０．５％〜２％である；前記混合物を、超臨界二酸化炭素反応器中で、０〜４２℃、８０〜１００気圧で５〜２４時間反応させ；第２の０．１〜１．０ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液を前記混合物にｐＨ＝７．０〜７．５まで添加し；１．０〜１．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを添加して１０〜２４時間塩析し；前記混合物を、５０００〜２００００Ｇの速度で１５〜３０分間遠心分離して第４沈殿物を収集し；当該第４沈殿物を０．１〜０．５ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液中で拡散し；蒸留水中で１０〜４８時間、透析し、凍結乾燥して前記コラーゲンを得る。
【請求項２】
前記クロム含有なめし皮廃棄物は、切断、トリミング、または、牛皮、羊皮もしくは豚皮のトリミング、からの廃棄物である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（２）の前記酢酸−クエン酸溶液は、２０：１〜２：１の酢酸−クエン酸比を有する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記超臨界二酸化炭素反応器中での前記反応は、４０〜４２℃、８０〜１００気圧で５〜２４時間行われる請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ここにその全体を参考文献として合体させる、２０１８年４月９日出願の中国出願第２０１８１０３１０４４３．９号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、皮革化学およびエンジニアリングの分野、より具体的には、クロム含有なめし皮廃棄物からコラーゲン凝集物およびコラーゲンを調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
クロム含有なめし皮廃棄物は、中国において一年に３００，０００トン以上にのぼると推定されている。皮革産業は、より厳しい環境保護規制を受けている。クロム含有なめし皮廃棄物のリサイクルはこれまで常に皮革産業における重要な研究課題であったし、また、それは現在の皮革産業の持続可能な発展のための唯一の道でもある。なめし皮廃棄物からコラーゲンを抽出し、このコラーゲンを処理して下流側製品（たとえば、たん白質フィルタ、木材接着剤、紙、など）へと処理することは、グリーンケミストリと持続可能な発展との要件を満たす。近年、コラーゲンに関する研究の深まりととともに、クロム含有なめし皮廃棄物から調製されたコラーゲンの利用分野は大きく拡大している。
【０００４】
現在、クロム含有なめし皮廃棄物からのコラーゲンの抽出には、まず、そのクロム含有なめし皮廃棄物の脱色が必要である。この脱色は、酸法、アルカリ法、酸化法、酵素法などが含まれる。一般的に使用されている方法は、酸法およびアルカリ法である。酸法の場合、脱色時間が長く、脱色効率は低い。アルカリ法の場合、脱色効率は高いが、形成されるクロム含有スラッジによって二次汚染が生じ、コラーゲン構造がダメージを受ける。酸法、アルカリ法、酵素法など、脱色後に廃棄物残滓からコラーゲンを抽出するための多くの方法がある。これらの方法は単体または組み合わせで使用することができる。皮革産業において、アルカリ法と酵素法との組み合わせが使用されてきたが、アルカリ法によってコラーゲン構造に大きなダメージが生じ、小分子量のコラーゲンしか得られない。したがって、クロム含有なめし皮廃棄物からコラーゲンを抽出する方法には、低脱色効率や得られるコラーゲンの低い分子量（分子量２０００ダルトン未満）といった問題が未だに存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
クロム含有なめし皮廃棄物からコラーゲンを抽出することの上述した問題に鑑みて、本発明は、強酸処理、機械的均質化、勾配酸方法によるインサイチュ（in-situ）脱色、弱酸処理、機械的拡散、精製、およびその他の手段を含む方法を構成する。この方法は、脱色時間を大幅に短縮し、脱色効率を改善する。そして、本方法は、反応媒体として、超臨界ＣＯ２流体を使用して超臨界反応器中でコラーゲン凝集物を（基材として）反応させることを含む。従来の方法と比較して、この方法によって得られるコラーゲンは、天然コラーゲンの構造と性質を保持しており、様々な用途に使用できる。このコラーゲンは、また、分子量が大きく、純度が高く、抽出率も高い。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一実施例において、本発明は、クロム含有なめし皮廃棄物からコラーゲンを抽出する方法を提供する。当該方法は、以下の工程を含む。
（１）酸脱色：これは、クロム含有なめし皮廃棄物を、１．０〜５．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液に０．５〜３時間浸漬し；クロム含有なめし皮廃棄物を、水で３〜５回、ｐＨ＝５〜７になるまで洗浄し；クロム含有なめし皮廃棄物を、０．１〜１．０ｍｏｌ／Ｌシュウ酸溶液に入れる、ここで、シュウ酸溶液の重量は、クロム含有なめし皮廃棄物の乾燥重量の２０〜５０倍である；クロム含有なめし皮廃棄物とシュウ酸溶液との混合物をホモジナイザに移し；ホモジナイザ内で混合物を３０〜５０℃で５〜４８時間攪拌し；混合物を５０００〜２００００Ｇの速度で遠心分離して第１沈殿物を収集し；当該第１沈殿物を０．１〜１．０ｍｏｌ／Ｌシュウ酸ナトリウム溶液中に拡散させる、ここで、シュウ酸ナトリウム溶液の重量は、クロム含有なめし皮廃棄物の乾燥重量の２０〜５０倍である；第１沈殿物とシュウ酸ナトリウム溶液との混合物を３０〜５０℃で２４〜１２０時間攪拌し；混合物を５０００２００００Ｇの速度で遠心分離して第２沈殿物を収集する；
（２）第２沈殿物を、０．１〜１．０ｍｏｌ／Ｌ酢酸−クエン酸溶液に入れる、ここで、酢酸−クエン酸溶液の重量は、クロム含有なめし皮廃棄物の乾燥重量の２０〜５０倍である；第２沈殿物と酢酸−クエン酸溶液との混合物をホモジナイザに移し、当該混合物を攪拌する；第１の０．１〜１．０ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を混合物にｐＨ＝  ７．０〜７．５になるまで添加する；１．０ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム溶液を混合物に添加して、１０〜２４時間塩析する；混合物を５０００〜２００００Ｇの速度で１５〜３０分間遠心分離して第３沈殿物を収集し；当該第３沈殿物を０．１〜１．０ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液中に拡散させる、ここで、酢酸溶液の重量は、クロム含有なめし皮廃棄物の乾燥重量の２０〜５０倍である；蒸留水中で１０〜４８時間、透析し、凍結乾燥してコラーゲン凝集物を得る、そして
（３）コラーゲン凝集物を切断し；コラーゲン凝集物を第２の０．１〜１．０ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液に入れる、ここで、酢酸溶液の重量は、コラーゲン凝集物の２０〜５０倍である；コラーゲン凝縮物と酢酸溶液との混合物にペプシンを添加する、ここで、ペプシンの重量はコラーゲン凝集物の重量の０．５〜２％である；混合物を、超臨界二酸化炭素反応器中で、４０〜４２℃、８０〜１００気圧で５〜２４時間反応させ；第２の０．１〜１．０ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液を混合物にｐＨ＝７．０〜７．５になるまで添加し；１．０〜１．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを添加して１０〜２４時間塩析し；混合物を、５０００〜２００００Ｇの速度で１５〜３０分間遠心分離して第４沈殿物を収集し；当該第４沈殿物を０．１〜０．５ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液中で拡散し；蒸留水中で１０〜４８時間、透析し、凍結乾燥してコラーゲンを得る。
【０００７】
別の実施例において、クロム含有なめし皮廃棄物は、切断、トリミング、または、牛皮、羊皮もしくは豚皮のトリミング、からの廃棄物である。
【０００８】
別の実施例において、工程（２）の酢酸−クエン酸溶液は、２０：１〜２：１の酢酸−クエン酸比を有する。
【０００９】
別実施例において、超臨界二酸化炭素反応器中での反応は、４０〜４２℃、８０〜１００気圧で５〜２４時間行われる。
【００１０】
従来の方法と比較して、本発明の方法には以下の利点がある。
【００１１】
（１）本発明の方法は、強酸処理、機械的均質化、勾配酸方法によるインサイチュ（in-situ）脱色、を含む。これは脱色時間を大幅に短縮し、脱色効率を改善する。
【００１２】
（２）本発明の方法によって調製されるコラーゲン凝集物は、コラーゲンファイバおよびコラーゲンファイバ束からなり、天然コラーゲンの構造および性質を保持している。コラーゲンは、優れた物理的特性、熱安定性、生体活性、および生分解性を有する。
【００１３】
（３）本発明の方法は、酸−酵素法を使用して、超臨界ＣＯ２流体反応媒体中で、コラーゲン凝集物を超臨界流体反応器内で反応させることを含む。これによって、コラーゲンの高純度と高抽出率とを同時には達成することができなかったという技術的問題を効果的に解決した。
【００１４】
（４）本発明の方法によって調製されたコラーゲンは、天然コラーゲンの構造と性質を保持しており、従来方法によって調製された物よりも大きな分子量（１０，０００ダルトン以上）を有する。当該コラーゲンは多様な用途で使用することができる。
【００１５】
コラーゲンの天然構造、コラーゲンの分子量は、従来方法によって調製されたコラーゲンよりも大きく（コラーゲンの分子量は１０Ｋ以上である）、その総合性能はより優れており、用途範囲はより広い。
【００１６】
なお、一般的記載と以下の詳細記載とは例示的、説明的なものであって、請求されている本発明の更なる説明を提供することを意図するものであると理解される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
その具体例が添付の図面に図示されている本発明の実施例について以下詳細に説明する。
【００１８】
〔実施例１〕
（１）酸インサイチュ脱色：２００ｇのクロム含有なめし皮廃棄物を１．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液中に１時間浸漬し、水で５回、ｐＨ＝６．７になるまで洗浄した。クロム含有なめし皮廃棄物を、５Ｌの０．５ｍｏｌ／Ｌシュウ酸溶液に入れた。クロム含有なめし皮廃棄物とシュウ酸溶液との混合物をホモジナイザに移し、４０℃で４８時間攪拌した。混合物を５０００Ｇの速度で遠心分離し、沈殿物を収集した。沈殿物を５Ｌの１．０ｍｏｌ／Ｌシュウ酸ナトリウム溶液中に拡散させた。沈殿物とシュウ酸ナトリウム溶液との混合物を３０℃で４８時間攪拌し、２００００Ｇの速度で遠心分離し、沈殿物を収集した。
【００１９】
（２）工程（１）の沈殿物を、４Ｌの０．２ｍｏｌ／Ｌ酢酸−クエン酸（１０：１のモル比）中に入れ、第２沈殿物と酢酸−クエン酸の混合物をホモジナイザに写し、低温（たとえば０℃）で攪拌した。１．０ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を混合物に添加し混合物のｐＨを７．０に調節した。混合物に１．０ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム溶液を添加し、混合物を１０時間塩析した。混合物を２００００Ｇの速度で３０分間遠心分離し、沈殿物を収集した。沈殿物を、４Ｌの０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液中に拡散し、蒸留水中で１０時間透析し、凍結乾燥してコラーゲン凝集物を得た。
【００２０】
（３）工程（２）のコラーゲン凝集物を細片に切断し、２Ｌの０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液に入れた。コラーゲン凝集物の重量の０．５％のペプシンを、コラーゲン凝集物と酢酸溶液との混合物に添加した。次に、この混合物を超臨界二酸化炭素反応器に移した。反応媒体として超臨界ＣＯ２流体を添加し、その混合物を４２℃、８５気圧で２４時間反応させた。反応完了後、１．０ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を混合物に添加してｐＨを７．０に調節した。次に、１．０ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液を混合物に添加し、混合物を１０時間、塩析した。混合物を５０００Ｇの速度で３０分間遠心分離して、沈殿物を収集した。当該沈殿物を、３Ｌの０．５ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液中に拡散させた。ｐＨ調節、塩析、遠心分離、および拡散の諸工程を、１回反復した。混合物を、蒸留水中で４８時間透析し、凍結乾燥して７６ｇのコラーゲン、３８％の収率を得た。当該コラーゲンの分子量の範囲は、１１．３Ｋ〜５０．６Ｋダルトンであり、中間分子量は３５．２Ｋダルトンである。
【００２１】
〔実施例２〕
（１）酸インサイチュ脱色：２００ｇのクロム含有なめし皮廃棄物を１．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液中に１時間浸漬し、水で５回、ｐＨ＝６．７になるまで洗浄した。クロム含有なめし皮廃棄物を、５Ｌの０．５ｍｏｌ／Ｌシュウ酸溶液に入れた。クロム含有なめし皮廃棄物とシュウ酸溶液との混合物をホモジナイザに移し、４０℃で４８時間攪拌した。混合物を、１００００Ｇの速度で遠心分離し、沈殿物を収集した。沈殿物を５Ｌの１．０ｍｏｌ／Ｌシュウ酸ナトリウム溶液中に拡散させた。沈殿物とシュウ酸ナトリウム溶液との混合物を５０℃で４８時間攪拌し、２００００Ｇの速度で遠心分離し、沈殿物を収集した。
【００２２】
（２）工程（１）の沈殿物を、５Ｌの０．５ｍｏｌ／Ｌ酢酸−クエン酸（１０：１のモル比）中に入れ、第２沈殿物と酢酸−クエン酸の混合物をホモジナイザに移し、低温（たとえば０℃）で攪拌した。０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を混合物に添加し、混合物のｐＨを７．０に調節した。混合物に０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム溶液を添加し、混合物を１０時間塩析した。混合物を１００００Ｇの速度で３０分間遠心分離し、沈殿物を収集した。沈殿物を、５Ｌの０．５ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液中に拡散し、蒸留水中で１０時間透析し、凍結乾燥してコラーゲン凝集物を得た。
【００２３】
（３）工程（２）のコラーゲン凝集物を細片に切断し、３Ｌの０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液に入れた。コラーゲン凝集物の重量の２％のペプシンを、コラーゲン凝集物と酢酸溶液との混合物に添加した。次に、この混合物を超臨界二酸化炭素反応器に移した。反応媒体として超臨界ＣＯ２流体を添加し、その混合物を４０℃、８０気圧で１２時間反応させた。反応完了後、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を混合物に添加してｐＨを７．０に調節した。次に、１．０ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液を混合物に添加し、混合物を１０時間、塩析した。混合物を５０００Ｇの速度で３０分間遠心分離して、沈殿物を収集した。当該沈殿物を、３Ｌの０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液中に拡散させた。ｐＨ調節、塩析、遠心分離、および拡散の諸工程を、１回反復した。混合物を、蒸留水中で４８時間透析し、凍結乾燥して８２ｇのコラーゲン、４１％の収率を得た。当該コラーゲンの分子量の範囲は、１５．７Ｋ〜４０．３Ｋダルトンであり、中間分子量は３１．７Ｋダルトンである。
【００２４】
〔実施例３〕
（１）酸インサイチュ脱色：２００ｇのクロム含有なめし皮廃棄物を１．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液中に１時間浸漬し、水で５回、ｐＨ＝６．７になるまで洗浄した。クロム含有なめし皮廃棄物を、５Ｌの０．５ｍｏｌ／Ｌシュウ酸溶液に入れた。クロム含有なめし皮廃棄物とシュウ酸溶液との混合物をホモジナイザに移し、４０℃で４８時間攪拌した。混合物を、１００００Ｇの速度で遠心分離し、沈殿物を収集した。沈殿物を５Ｌの１．０ｍｏｌ／Ｌシュウ酸ナトリウム溶液中に拡散させた。沈殿物とシュウ酸ナトリウム溶液との混合物を５０℃で２４時間攪拌し、２００００Ｇの速度で遠心分離し、沈殿物を収集した。
【００２５】
（２）工程（１）の沈殿物を、５Ｌの０．５ｍｏｌ／Ｌ酢酸−クエン酸（１０：１のモル比）中に入れ、第２沈殿物と酢酸−クエン酸の混合物をホモジナイザに移し、低温（たとえば０℃）で攪拌した。０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を混合物に添加し、混合物のｐＨを７．０に調節した。混合物に０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム溶液を添加し、混合物を１０時間塩析した。混合物を１００００Ｇの速度で３０分間遠心分離し、沈殿物を収集した。沈殿物を、５Ｌの０．５ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液中に拡散し、蒸留水中で１０時間透析し、凍結乾燥してコラーゲン凝集物を得た。
【００２６】
（３）工程（２）からのコラーゲン凝集物を細片に切断し、３Ｌの０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液に入れた。コラーゲン凝集物の重量の１．５％のペプシンを、コラーゲン凝集物と酢酸溶液との混合物に添加した。次に、この混合物を超臨界二酸化炭素反応器に移した。反応媒体として超臨界ＣＯ２流体を添加し、その混合物を４１℃、９０気圧で１２時間反応させた。反応完了後、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を混合物に添加してｐＨを７．０に調節した。次に、１．０ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液を混合物に添加し、混合物を１０時間、塩析した。混合物を５０００Ｇの速度で３０分間遠心分離して、沈殿物を収集した。当該沈殿物を、３Ｌの０．５ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液中に拡散させた。ｐＨ調節、塩析、遠心分離、および拡散の諸工程を、１回反復した。混合物を、蒸留水中で３６時間透析し、凍結乾燥して８８．８ｇのコラーゲン、３９．６％の収率を得た。当該コラーゲンの分子量の範囲は、２２．１Ｋ〜４９．０Ｋダルトンであり、中間分子量は３４．６Ｋダルトンである。
【００２７】
〔実施例４〕
ａ．コラーゲン抽出に影響する要素に基づいて、単一要素実験を設計した。クロム含有率とコラーゲン抽出率とを測定することによって、脱色における酸処理（ホモジナイザ内、シュウ酸溶液）の最適時間は２５時間であった。その結果を表１に示す。
【００２８】
表１：コラーゲンのクロム含有量および抽出率
【表１】
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【００２９】
ｂ．コラーゲン抽出の単一要因を最適化することによって、クロム含有なめし皮廃棄物からコラーゲンを抽出する、以下の工程を含む、最適方法が得られた。
【００３０】
（１）酸インサイチュ脱色：２００ｇのクロム含有なめし皮廃棄物を１．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液中に１時間浸漬し、水で５回、ｐＨ＝６．７になるまで洗浄した。クロム含有なめし皮廃棄物を、５Ｌの０．５ｍｏｌ／Ｌシュウ酸溶液に入れた。クロム含有なめし皮廃棄物とシュウ酸溶液との混合物をホモジナイザに移し、４０℃で２５時間攪拌した。混合物を、１００００Ｇの速度で遠心分離し、沈殿物を収集した。沈殿物を５Ｌの１．０ｍｏｌ／Ｌシュウ酸ナトリウム溶液中に拡散させた。沈殿物とシュウ酸ナトリウム溶液との混合物を５０℃で２４時間攪拌し、２００００Ｇの速度で遠心分離し、沈殿物を収集した。
【００３１】
（２）工程（１）の沈殿物を、５Ｌの０．５ｍｏｌ／Ｌ酢酸−クエン酸（２０：１のモル比）中に入れ、第２沈殿物と酢酸−クエン酸の混合物をホモジナイザに移し、低温（たとえば０℃）で攪拌した。０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を混合物に添加し、混合物のｐＨを７．０に調節した。混合物に０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム溶液を添加し、混合物を１０時間塩析した。混合物を１００００Ｇの速度で３０分間遠心分離し、沈殿物を収集した。沈殿物を、５Ｌの０．５ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液中に拡散し、蒸留水中で１０時間透析し、凍結乾燥してコラーゲン凝集物を得た。
【００３２】
（３）工程（２）のコラーゲン凝集物を細片に切断し、３Ｌの０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液に入れた。コラーゲン凝集物の重量の１．５％のペプシンを、コラーゲン凝集物と酢酸溶液との混合物に添加した。次に、この混合物を超臨界二酸化炭素反応器に移した。反応媒体として超臨界ＣＯ２流体を添加し、その混合物を４１℃、９０気圧で１２時間反応させた。反応完了後、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を混合物に添加してｐＨを７．０に調節した。次に、１．０ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液を混合物に添加し、混合物を１０時間、塩析した。混合物を５０００Ｇの速度で３０分間遠心分離して、沈殿物を収集した。当該沈殿物を、３Ｌの０．５ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液中に拡散させた。ｐＨ調節、塩析、遠心分離、および拡散の諸工程を１回、反復した。混合物を、蒸留水中で３６時間透析し、凍結乾燥して７９．１ｇのコラーゲン、４４．４％の収率を得た。当該コラーゲンの分子量の範囲は、１９．３Ｋ〜４８．８Ｋダルトンであり、中間分子量は３２．７Ｋダルトンである。
【００３３】
本発明の要旨または範囲から逸脱することなく、本発明において様々な改変および変更を行うことが可能であることが当業者にとって明白であろう。したがって、本発明は、それらが添付の請求項の範囲およびそれらの均等物に含まれる限りにおいて本発明のその様な改変および変更をカバーするものであることが意図される。