(57)【要約】【課題】アンジオテンシンペプチドを正確に定量可能な試料中のアンジオテンシンペプチドの量を測定するための方法及びアンジオテンシンペプチドの定量キットを提供する。【解決手段】試料中のアンジオテンシンペプチドの量を測定するための方法であって、前記試料に同位体標識アンジオテンシンペプチドを混合した後、前記試料から内因性アンジオテンシンペプチド及び前記同位体標識アンジオテンシンペプチドを精製する工程１と、前記精製された前記内因性アンジオテンシンペプチド及び前記同位体標識アンジオテンシンペプチドを、質量分析法を用いて検出し、定量する工程２と、を備える方法であり、アンジオテンシンペプチドの定量限界が０．１ｆｍｏｌ／μＬ以下である。アンジオテンシンペプチドの定量キットは、同位体標識アンジオテンシンペプチドと、変性剤と、を備える。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のアンジオテンシンペプチドの量を測定するための方法であって、
前記試料に同位体標識アンジオテンシンペプチドを混合した後、前記試料から内因性アンジオテンシンペプチド及び前記同位体標識アンジオテンシンペプチドを精製する工程１と、
前記精製された前記内因性アンジオテンシンペプチド及び前記同位体標識アンジオテンシンペプチドを、質量分析法を用いて検出し、定量する工程２と、
を備え、
アンジオテンシンペプチドの定量限界が０．１ｆｍｏｌ／μＬ以下であることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記アンジオテンシンペプチドがアンジオテンシン１、２、３、４、１−７、１−９、１−１２、アンジオテンシンＡ及びアラマンディンからなる群のうち少なくとも一つである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
２種類以上のアンジオテンシンペプチドの量を同時に測定する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程２において、三連四重極質量分析計を用いて、多重反応モニタリングを使用して検出する請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記多重反応モニタリングで２つ以上の質量遷移を検出し、定量する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記工程１において、前記試料から前記内因性アンジオテンシンペプチド及び前記同位体標識アンジオテンシンペプチドを液体クロマトグラフィーにより分離精製する請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記工程１において、前記試料から前記内因性アンジオテンシンペプチド及び前記同位体標識アンジオテンシンペプチドを固相抽出法により分離精製する請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記工程１において、前記試料が体液であり、
前記試料に変性剤を添加し、前記試料中のタンパク質を変性させて沈殿させ、前記沈殿物のうち、前記内因性アンジオテンシンペプチド及び前記同位体標識アンジオテンシンペプチドを再可溶化させて分離精製する請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記試料が腎臓由来の組織抽出液又は尿である請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
同位体標識アンジオテンシンペプチドと、
変性剤と、
を備えることを特徴とするアンジオテンシンペプチドの定量キット。
【請求項１１】
前記変性剤が、尿素、チオ尿素及びジチオスレイトールからなる群の少なくとも１つである請求項１０に記載のアンジオテンシンペプチドの定量キット。
【請求項１２】
さらに固相抽出カラムを備える請求項１０又は１１に記載のアンジオテンシンペプチドの定量キット。
【請求項１３】
２種類以上の同位体標識アンジオテンシンペプチドを備える請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のアンジオテンシンペプチドの定量キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のアンジオテンシンペプチドの量を測定するための方法及びアンジオテンシンペプチドの定量キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
レニンアンジオテンシン系（ｒｅｎｉｎ−ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ；ＲＡＳ）は生体の血圧調節で重要な役割を担い、中でも、アンジオテンシンペプチドはこの系の中心的役割を果たしているホルモンである。アンジオテンシンペプチドは、肝臓で主に産生されるアンジオテンシノーゲン（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｏｇｅｎ；ＡＧＴ）から、レニン（Ｒｅｎｉｎ）、アンジオテンシン変換酵素（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ；ＡＣＥ）等の酵素によって生成される。心臓、腎臓等の臓器の局所及び組織のＲＡＳは、全身のＲＡＳとは異なる機序で制御されていることが指摘されているが、未だ不明な点が多い。特に、腎臓のＲＡＳに関しては、アンジオテンシンペプチドの産生場所及び産生機序に関していくつか仮説があり、生理的な意義に関しても議論がなされている。よって、腎臓等の臓器、及び、血液、尿等の生体試料中のアンジオテンシンペプチドを正確に定量することは、組織のＲＡＳの病態への関与の解明に役立つと期待される。
【０００３】
現在、アンジオテンシンペプチドは、放射免疫測定法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＲＩＡ）（例えば、非特許文献１参照）、酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）等、抗体を使用する免疫測定法で定量されていることが多い。
【０００４】
また、その他の定量方法としては、液体クロマトグラフィー（ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＬＣ）及び質量分析法（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；ＭＳ）（以下、「ＬＣ／ＭＳ」と称する場合がある。）を組み合わせた測定法を用いて、腎臓、尿、血漿又は白色脂肪組織中のアンジオテンシンペプチドを定量した値が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００５】
また、特許文献１には、ＬＣ／ＭＳを用いて、血漿中のアンジオテンシンペプチドの量を測定することでレニン活性を測定する方法が開示されている。
さらに、特許文献２には、ＬＣ／ＭＳを用いて、血漿中の、ＲＡＳのアンジオテンシンペプチドの生成及び分解カスケードが平衡状態に達した際のアンジオテンシンペプチドの量を定量する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１６−０７５６９８号公報
【特許文献２】特表２０１５−５１８９６４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Navar L G et al., “Tubular Fluid Concentrations and Kidney Contents of Angiotensins I and II in Anesthetized Rats”, J. Am. Soc. Nephrol., vol.5, p1153-1158, 1994.
【非特許文献２】Ali Q et al., “Estimation of angiotensin peptides in biological samples by LC/MS method”, Anal Methods, vol.6, no.1, p215-222, 2014.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
抗体を使用する免疫測定法によるアンジオテンシンペプチドの定量法では、定量値が報告によって異なる。抗体は特定のアミノ酸配列を認識するが、各アンジオテンシンペプチドはアミノ酸配列の相同性が高いため、抗体の交差反応により正確な定量が困難である可能性が指摘されている。また、免疫測定法によるアンジオテンシンペプチドの定量法では、同時に複数種のアンジオテンシンペプチドを定量することが困難である。
また、ＬＣ／ＭＳを用いてアンジオテンシンペプチドを定量したこれまでの報告には、相対定量も含まれており、報告によって定量値が異なる。特に、試料として腎臓、尿、血漿又は白色脂肪組織を用い、ＬＣ／ＭＳを用いて、腎臓中のアンジオテンシンペプチドを定量したのは非特許文献２のみである。しかしながら、その定量値は、これまでの免疫測定法による定量値の約１０００倍であり、大きくかけ離れている。
さらに、特許文献１及び２では、ＬＣ／ＭＳを用いてアンジオテンシンペプチドの定量を行っているが、血漿のレニン活性の測定を目的としたもの、又は、少なくとも１５分以上インキュベーションした結果生じたアンジオテンシンペプチドの定量を目的としている。そのため、いずれも生体内の生理的及び病態生理学的なアンジオテンシンペプチドの定量法ではなく、定量法としての検証も不十分である。
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、アンジオテンシンペプチドを正確に定量可能な試料中のアンジオテンシンペプチドの量を測定するための方法及びアンジオテンシンペプチドの定量キットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る試料中のアンジオテンシンペプチドの量を測定するための方法は、試料中のアンジオテンシンペプチドの量を測定するための方法であって、前記試料に同位体標識アンジオテンシンペプチドを混合した後、前記試料から内因性アンジオテンシンペプチド及び前記同位体標識アンジオテンシンペプチドを精製する工程１と、前記精製された前記内因性アンジオテンシンペプチド及び前記同位体標識アンジオテンシンペプチドを、質量分析法を用いて検出し、定量する工程２と、を備える方法であり、アンジオテンシンペプチドの定量限界が０．１ｆｍｏｌ／μＬ以下である。
前記アンジオテンシンペプチドがアンジオテンシン１、２、３、４、１−７、１−９、１−１２、アンジオテンシンＡ及びアラマンディンからなる群のうち少なくとも一つであってもよい。
上記第１態様に係る方法において、２種類以上のアンジオテンシンペプチドの量を同時に測定してもよい。
前記工程２において、三連四重極質量分析計を用いて、多重反応モニタリングを使用して検出してもよい。
上記第１態様に係る方法において、前記多重反応モニタリングで２つ以上の質量遷移を検出し、定量してもよい。
前記工程１において、前記試料から前記内因性アンジオテンシンペプチド及び前記同位体標識アンジオテンシンペプチドを液体クロマトグラフィーにより分離精製してもよい。
前記工程１において、前記試料から前記内因性アンジオテンシンペプチド及び前記同位体標識アンジオテンシンペプチドを固相抽出法により分離精製してもよい。
前記工程１において、前記試料が体液であり、前記試料に変性剤を添加し、前記試料中のタンパク質を変性させて沈殿させ、前記沈殿物のうち、前記内因性アンジオテンシンペプチド及び前記同位体標識アンジオテンシンペプチドを再可溶化させて分離精製してもよい。
前記試料が腎臓由来の組織抽出液又は尿であってもよい。
【００１１】
本発明の第２態様に係るアンジオテンシンペプチドの定量キットは、同位体標識アンジオテンシンペプチドと、変性剤と、を備える。
前記変性剤が、尿素、チオ尿素及びジチオスレイトールからなる群の少なくとも１つであってもよい。
上記第２態様に係るアンジオテンシンペプチドの定量キットは、さらに固相抽出カラムを備えてもよい。
上記第２態様に係るアンジオテンシンペプチドの定量キットは、２種類以上の同位体標識アンジオテンシンペプチドを備えてもよい。
【発明の効果】
【００１２】
上記態様によれば、アンジオテンシンペプチドを正確に定量可能な試料中のアンジオテンシンペプチドの量を測定するための方法及びアンジオテンシンペプチドの定量キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】実施例１における検量線を示すグラフである。具体的には、血漿試料でのアンジオテンシン１の検量線を示すグラフである。
【図１Ｂ】実施例１における検量線を示すグラフである。具体的には、血漿試料でのアンジオテンシン２の検量線を示すグラフである。
【図２Ａ】実施例１における正常マウス（対照）、腎特異的メガリンノックアウトマウスＮｄｒｇ１Ｃｒｅ  ＥＲＴ２、ｍｅｇａｌｉｎ  ｌｏｘ／ｌｏｘ（以下、「ＮＤＲＧ１マウス」と称する）及びＡｐｏＥＣｒｅ、ｍｅｇａｌｉｎ  ｌｏｘ／ｌｏｘ（以下、「ＡｐｏＥマウス」と称する）の尿試料でのアンジオテンシン１の定量値を比較したグラフである。
【図２Ｂ】実施例１における正常マウス（対照）、ＮＤＲＧ１マウス及びＡｐｏＥマウスの尿試料でのアンジオテンシン２の定量値を比較したグラフである。
【図２Ｃ】実施例１における正常マウス（対照）、ＮＤＲＧ１マウス及びＡｐｏＥマウスの尿試料でのアンジオテンシン１−９の定量値を比較したグラフである。
【図２Ｄ】実施例１における正常マウス（対照）、ＮＤＲＧ１マウス及びＡｐｏＥマウスの尿試料でのアンジオテンシン１−７の定量値を比較したグラフである。
【図３】実施例１における正常マウス（対照）、ＮＤＲＧ１マウス及びＡｐｏＥマウスの血漿試料でのアンジオテンシン２の定量値を比較したグラフである。
【図４Ａ】実施例１における正常マウス（対照）、ＮＤＲＧ１マウス及びＡｐｏＥマウスの腎臓試料でのアンジオテンシン１の定量値を比較したグラフである。
【図４Ｂ】実施例１における正常マウス（対照）、ＮＤＲＧ１マウス及びＡｐｏＥマウスの腎臓試料でのアンジオテンシン２の定量値を比較したグラフである。
【図５Ａ】実施例２におけるアンジオテンシノーゲン投与又は非投与の正常マウス（対照）及びＮＤＲＧ１マウスの腎臓試料でのアンジオテンシン１−９の定量値を比較したグラフである。
【図５Ｂ】実施例２におけるアンジオテンシノーゲン投与又は非投与の正常マウス（対照）及びＮＤＲＧ１マウスの腎臓試料でのアンジオテンシン１−７の定量値を比較したグラフである。
【図６Ａ】実施例２におけるアンジオテンシノーゲン投与又は非投与の正常マウス（対照）及びＡｐｏＥマウスの腎臓試料でのアンジオテンシン１−９の定量値を比較したグラフである。
【図６Ｂ】実施例２におけるアンジオテンシノーゲン投与又は非投与の正常マウス（対照）及びＡｐｏＥマウスの腎臓試料でのアンジオテンシン１−７の定量値を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
≪試料中のアンジオテンシンペプチドの量を測定するための方法≫
本発明の一実施形態に係る試料中のアンジオテンシンペプチドの量を測定するための方法は、試料中のアンジオテンシンペプチドの量を測定するための方法であって、前記試料に同位体標識アンジオテンシンペプチドを混合した後、前記試料から内因性アンジオテンシンペプチド及び前記同位体標識アンジオテンシンペプチドを精製する工程１と、前記精製された前記内因性アンジオテンシンペプチド及び前記同位体標識アンジオテンシンペプチドを、質量分析法を用いて検出し、定量する工程２と、を備える方法であり、アンジオテンシンペプチドの定量限界が０．１ｆｍｏｌ／μＬ以下である。
【００１５】
本実施形態の方法によれば、アンジオテンシンペプチドを正確に定量することができる。
【００１６】
本実施形態の方法において、分析対象となるアンジオテンシンペプチドとしては、アンジオテンシノーゲンの酵素分解産物であればよく、特別な限定はない。アンジオテンシンペプチドとして具体的には、例えば、アンジオテンシン１、アンジオテンシン２、アンジオテンシン１−９、アンジオテンシン１−７、アンジオテンシン１−１２、アンジオテンシン３、アンジオテンシン４、アンジオテンシンＡ、アラマンディン等が挙げられ、これらに限定されない。
中でも、本実施形態の方法において、分析対象となるアンジオテンシンペプチドとしては、アンジオテンシン１、アンジオテンシン２、アンジオテンシン１−９、及びアンジオテンシン１−７からなる群のうち少なくとも一つであることが好ましい。
【００１７】
アンジオテンシン１、アンジオテンシン２、アンジオテンシン１−９、及びアンジオテンシン１−７のアミノ酸配列は以下に示すとおりである。
アンジオテンシン１：ＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬ（配列番号１）
アンジオテンシン２：ＤＲＶＹＩＨＰＦ（配列番号２）
アンジオテンシン１−９：ＤＲＶＹＩＨＰＦＨ（配列番号３）
アンジオテンシン１−７：ＤＲＶＹＩＨＰ（配列番号４）
【００１８】
上記アミノ酸配列が示すように各アンジオテンシンペプチドはアミノ酸の相同性が高い。そのため、従来の抗体を用いた免疫測定法では、抗体の交差反応により、正確な定量が困難であった。また、従来の抗体を用いた免疫測定法では、同時に複数種のアンジオテンシンペプチドを定量することは困難であった。これに対し、本実施形態の方法では、質量分析により定量を行うため、質量の差により、これらの各アンジオテンシンペプチドを識別して、正確に定量することができる。さらに、同時に複数種のアンジオテンシンペプチドを定量することも可能である。
【００１９】
また、これまで、ＬＣ／ＭＳを用いてアンジオテンシンペプチドを定量する方法では、抗体を用いた免疫測定法と比較して、定量値が大きくかけ離れていた。これは、試料の調製段階での酵素活性が十分に抑制されていなかったこと、試料の精製が不十分であったこと、質量分析法による定量方法の精度が不十分であった可能性が挙げられる。
これに対し、本願発明では、後述に示す試料の種類に応じた調製方法及び精製方法、並びに質量分析法を用いた高精度な定量方法を用いることで、アンジオテンシンペプチドを絶対定量することができる。
本実施形態の方法の工程１、２について、以下に詳細を説明する。
【００２０】
＜工程１＞
［混合工程］
まず、試料に同位体標識アンジオテンシンペプチドを混合する。このとき、既知の濃度の同位体標識アンジオテンシンペプチドを混合することで、後述の質量分析法により、試料に含まれる内因性アンジオテンシンペプチドを絶対定量することができる。また、試料の精製前に同位体標識アンジオテンシンペプチドを混合することで、試料中のアンジオテンシンペプチドの回収率を算出することができる。
本実施形態の方法に用いられる試料としては、動物、培養細胞又は培養組織から得られる生体試料であって、アンジオテンシンペプチドを含有し得るものであればよい。試料として具体的には、例えば、動物から摘出された組織若しくは培養組織由来の組織抽出液、培養細胞由来の細胞抽出液又は体液等が挙げられる。
【００２１】
前記組織又は培養組織としては、例えば、血管内皮、脳、肝臓、腎臓等が挙げられ、これらに限定されない。
前記培養細胞としては、例えば、上述の組織由来の細胞を株化したもの等が挙げられる。
【００２２】
前記体液としては、例えば、血液、血清、血漿、尿（例えば、原尿、蓄尿等）、バフィーコート、唾液、胆汁、脳脊髄液、涙液、痰、粘液、汗、膀胱洗浄液等が挙げられ、これらに限定されない。
【００２３】
全身のＲＡＳの解析を行う場合には、血液、血清、血漿等の全身を循環する体液を試料とすることが好ましい。
これに対し、組織のＲＡＳの解析を行う場合には、動物から摘出された組織若しくは培養組織由来の組織抽出液、培養細胞由来の細胞抽出液、又は、特定の組織に由来する体液を試料とすることが好ましい。
特定の組織に由来する体液として具体的には、例えば、腎臓のＲＡＳを解析するためには、尿（好ましくは、原尿）を用いればよい。
また、例えば、脳のＲＡＳを解析するためには、脳脊髄液を用いればよい。
また、例えば、肝・胆道系のＲＡＳを解析するためには、胆汁を用いればよい。
これまで、組織のＲＡＳの解析を行うために、組織におけるアンジオテンシンペプチドを絶対定量することが困難であった。これに対し、本実施形態の方法によれば、上述の試動物から摘出された組織若しくは培養組織由来の組織抽出液、培養細胞由来の細胞抽出液、又は、特定の組織に由来する体液を試料として用いて、それら試料の種類に応じた調製方法及び精製方法、並びに質量分析法を用いた高精度な定量方法を用いることで、組織におけるアンジオテンシンペプチドを絶対定量することができる。
【００２４】
また、試料の由来となる動物としては、哺乳動物であることが好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等が挙げられ、これらに限定されない。
【００２５】
本実施形態の方法に用いられる同位体標識アンジオテンシンペプチドとしては、１３Ｃ及び１５Ｎ同位体標識されたアミノ酸残基を有するものであればよい。１３Ｃ及び１５Ｎ同位体標識されたアミノ酸残基として具体的には、例えば、バリン、アルギニン、イソロイシン、ロイシン、リシン、フェニルアラニン、プロリン等が挙げられ、これらに限定されない。同位体標識アンジオテンシンペプチドにおいて、アミノ酸残基のうち１種が１３Ｃ及び１５Ｎ同位体標識されたアミノ酸残基に置換されていてもよく、２種以上が置換されていてもよい。
中でも、本実施形態の方法に用いられる同位体標識アンジオテンシンペプチドとしては、Ｎ末端から２番目のアルギニン残基の炭素原子が１３Ｃ同位体と置換され、窒素原子が１５Ｎ同位体と置換されたものであることが好ましい。この同位体標識アンジオテンシンペプチドは、天然アンジオテンシンペプチドと比較して約１０Ｄａの質量の増加をもたらす。
【００２６】
また、工程１において試料中には複数種の内因性アンジオテンシンペプチドが含まれている、そのため、試料中に含まれる複数種の内因性アンジオテンシンペプチドのうち特定の１種を定量する場合には、混合する同位体標識アンジオテンシンペプチドは当該定量する内因性アンジオテンシンペプチドに対応したものを１種類混合すればよい。
一方、試料中に含まれる複数種の内因性アンジオテンシンペプチドのうち２種類以上を定量する場合には、混合する同位体標識アンジオテンシンペプチドは当該定量する内因性アンジオテンシンペプチドに対応したものを２種類以上混合すればよい。試料に２種類以上の同位体標識アンジオテンシンペプチドを混合することで、後述の質量分析法により、同時に２種類以上の内因性アンジオテンシンペプチドの量を定量することができる。
【００２７】
［試料調製工程］
また、混合工程の前に、適宜、試料の調製を行えばよい。試料の調製方法は、試料の種類等に応じて、公知の方法を用いて、適宜行えばよい。
例えば、試料が動物から摘出された組織及び培養組織由来の組織抽出液、並びに培養細胞由来の細胞抽出液である場合、公知の方法（参考文献１：Navar L G et al., “Tubular Fluid Concentrations and Kidney Contents of Angiotensins I and II in Anesthetized Rats”, J. Am. Soc. Nephrol., vol.5, p1153-1158, 1994.）に従い、調製すればよい。
具体的には、まず、採取後の組織、培養細胞、又は培養組織を直ちに予め−８０℃に保冷しておいたメタノール内でホモジナイズする。得られたホモジネートに同位体標識アンジオテンシンペプチドを混合する。その後、余分なタンパク質及び細胞膜等を除去するために、遠心分離等を行い、その上清を得る。この上清にはメタノールが含まれるため、適宜加熱してメタノールを蒸発させる。得られた乾燥物はリン酸ナトリウム緩衝液等に溶解させて、試料として用いることができる。
【００２８】
上記組織抽出液又は細胞抽出液の調製方法は、これまで、ＲＩＡによるアンジオテンシンペプチドの定量を行う際に、用いられてきた。しかしながら、本発明者らは、今回初めて、質量分析法によるアンジオテンシンペプチドの定量を行う際に、組織抽出液又は細胞抽出液（後述の実施例に示すように、特に、腎臓由来の組織抽出液）の調製方法として、当該調製方法を適用したところ、アンジオテンシンペプチドの絶対定量を行うことができた。これは、組織、培養組織、及び培養細胞を採取後、直ちに−８０℃の低温のメタノールに保持することで、ＲＡＳに関与する酵素の活性を充分に抑制することができ、生体内でのアンジオテンシンペプチドの量を正確に定量することができるためであると推察される。
【００２９】
試料がプロテアーゼ等の酵素を含む体液（例えば、血液、血清、血漿、原尿等）である場合、血液等の体液を採取後、直ちにプロテアーゼ阻害剤を添加することが好ましい。これにより、ＲＡＳに関与する酵素の活性を充分に抑制することができ、生体内でのアンジオテンシンペプチドの量を正確に定量することができる。
プロテアーゼ阻害剤として具体的には、例えば、ＥＤＴＡ等の金属プロテアーゼ阻害剤；カプトプリル、リシノプリル等のアンジオテンシン変換酵素（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ；ＡＣＥ）阻害剤；アリスキレン等のレニン阻害剤等が挙げられ、これらに限定されない。これらのプロテアーゼ阻害剤を単独で添加してもよく、複数組み合わせて添加してもよい。中でも、ＲＡＳに関与する酵素の活性を充分に抑制するために、プロテアーゼ阻害剤を複数組み合わせて添加することが好ましい。
また、プロテアーゼ阻害剤を添加した後、血液等の体液に、同位体標識アンジオテンシンペプチドを混合すればよい。試料として血清、血漿等を用いる場合、公知の方法を用いて、プロテアーゼ阻害剤の添加及び同位体標識アンジオテンシンペプチドを混合後の血液から調製すればよい。
【００３０】
［精製工程］
次いで、同位体標識アンジオテンシンペプチドを混合した試料から、試料に含まれる内因性アンジオテンシンペプチド及び同位体標識アンジオテンシンペプチドを精製する。
精製方法は、試料の種類に応じて、公知の方法を適宜選択すればよい。
【００３１】
精製方法として具体的には、例えば、液体クロマトグラフィー（ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＬＣ）、固相抽出法等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、固相抽出法及びＬＣをこの順に行い、分離精製することが好ましい。
【００３２】
例えば、試料が体液である場合、固相抽出及びＬＣによる分離精製の前に、試料中のタンパク質を低減させるために、ペプチド抽出法による分離精製することが好ましい。
ペプチド抽出法としては、例えば、アルブミン除去処理法、アセトニトリル沈殿法、限外濾過法、ＤＳ法（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）等が挙げられる。中でも、ペプチド抽出法としては、ＤＳ法を用いることが好ましい。
これまで、ＤＳ法は、血漿等の体液を試料として、ＬＣ／ＭＳによるバイオマーカー（アンジオテンシンペプチドは除く）の探索や定量を行う際に、用いられてきた。しかしながら、本発明者らは、今回初めて、質量分析法によるアンジオテンシンペプチドの定量を行う際に、血漿、尿等の体液の分離精製方法として、ＤＳ法を適用したところ、数十μＬ等の微量の試料に含まれるアンジオテンシンペプチドの絶対定量を行うことができた。これは、ＤＳ法を用いることにより、試料中からアンジオテンシンペプチドをより高い回収率で得られたためであると推察される。
特に、血漿よりもタンパク質含有量が少ない体液試料（例えば、後述の実施例に示すように、尿）に対し、分離精製を行う場合には、限外濾過法を適用することが一般的である。これに対し、尿等のタンパク質をほとんど含まない体液試料に対し、ＤＳ法を用いて分離精製を行うことで、高い回収率を達成できることは、本発明者らにより、今回初めて見出されたものである。
すなわち、本実施形態の方法において、試料が体液である場合、ＤＳ法、固相抽出法、及びＬＣをこの順に行い、分離精製することが好ましい。
【００３３】
ＤＳ法を用いた試料の処理方法として具体的には、以下に示す手順で行えばよい。
まず、体液に変性剤を添加する。
変性剤としては、例えば、尿素、チオ尿素、ジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ；ＤＴＴ）等が挙げられ、これらに限定されない。これら変性剤を単独で用いてもよく、２種類以上組み合わせて用いてもよい。中でも、より効果的にタンパク質を変性できることから、尿素、チオ尿素、及びＤＴＴを組み合わせて用いることが好ましい。
【００３４】
次いで、変性剤を添加した体液を４℃程度に冷却したアセトン等の有機溶媒中にゆっくりと滴下する。滴下後、４℃程度で３０分以上３時間以下程度の時間をかけて混和し、試料中のタンパク質を変性させて沈殿させる。次いで、遠心分離等により分離し、上清を除去して沈殿物を得る。得られた沈殿物を、塩酸等の強酸及びアセトニトリル等の有機溶媒に懸濁する。懸濁後、４℃程度で、３０分以上３時間以下程度の時間をかけて混和し、変性されたタンパク質のうち、内因性アンジオテンシンペプチド及び同位体標識アンジオテンシンペプチドを再可溶化させる。次いで、遠心分離等により分離し、上清を得ることで、内因性アンジオテンシンペプチド及び同位体標識アンジオテンシンペプチドを分離精製することができる。このとき、上清には、アセトニトリルが含まれるため、必要に応じて乾燥によりアセトニトリルを蒸発させる。得られた乾燥物を適当な緩衝液に溶解させて、固相抽出又はＬＣによる分離精製に用いられる試料とすることができる。
【００３５】
（液体クロマトグラフィー（ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＬＣ））
なお、本明細書における「液体クロマトグラフィー（ＬＣ）」とは、流体が微粉化物質のカラム又は毛細管路を通して、均一に浸透するのに従い、流体溶液のうちの１つ以上の成分が選択的に遅延するプロセスを意味する。この遅延は、流体が固定相に対して移動するにしたがって、１つ以上の固定相とバルク流体（すなわち、移動相）との間に混合物の成分が分布する結果として生じる。
液体クロマトグラフィーとして具体的には、例えば、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）（高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）又は高スループット液体クロマトグラフィーとも称される）等が挙げられる。
【００３６】
液体クロマトグラフィー（ＬＣ）による分離精製において、アンジオテンシンペプチドの種類に応じて、公知のＬＣ装置及びカラムを適宜選択することができる。クロマトグラフィーカラムは、典型的には、媒体（すなわち、充填成分）を含み、化学部分の分離（すなわち、分画）を促進する。媒体は、微粒子を含んでいてもよい。
ＬＣによる分離精製方法として具体的には、例えば、試料（又は、予め精製された試料）は、流入ポートからカラムに導入される。次いで、溶媒又は溶媒混合物を用いて溶離され、流出ポートから排出され、生成された試料を得ることができる。
また、アンジオテンシンペプチドを溶離するために、異なる溶離モードが選択されてもよい。液体クロマトグラフィーの溶離モードとしては、例えば、勾配モード、等張モード、又は多型（すなわち、混合）モード等が挙げられる。
クロマトグラフィーの際、成分（本実施形態においては、アンジオテンシンペプチド）の分離は、溶離剤（「移動相」とも称される）、溶離モード、勾配条件、温度等の各種条件によって行われる。
【００３７】
（固相抽出法）
本明細書において、固相抽出（Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ＳＰＥ）とは、分析化学手法の一つであって、溶液又は懸濁液中の目的とする化合物と不純物とを物理又は化学的性質に基づいて分離する方法を意味する。例えば、移動相が固体相を通して、又は、その周囲を通過するに従い、移動相の望ましくない成分は、固相によって滞留され、移動相中の目的とする化合物が精製される。また、例えば、試料中の目的とする化合物は固体相によって滞留され、移動相の望ましくない成分を、固体相を通して又はその周囲を通過させてもよい。この場合、次いで、第２の移動相を使用して、さらなる処理又は分析のために、滞留された目的とする化合物を固相から溶離させればよい。
固相抽出カラムとしては、市販のものを用いてもよく、例えば、Ｍｏｎｏ  Ｓｐｉｎ（登録商標）シリーズ（ＧＬサイエンス製）等が挙げられる。
【００３８】
＜工程２＞
次いで、分離精製後の質量分析計に導入し、内因性アンジオテンシンペプチド及び同位体標識アンジオテンシンペプチドを検出及び定量する。
【００３９】
本明細書において、「質量分析法（Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；ＭＳ）」とは、分子をイオン化し、その質量によって化合物を同定する分析技術を意味する。
質量分析法として、具体的には、以下に示すように、分子の質量対電荷比（ｍ／ｚ）に基づいて、イオン化工程、検出工程、及び定量工程をこの順に行う。
【００４０】
［イオン化工程］
本実施形態の方法において、質量分析計で分析対象はイオン化されている必要がある。このため、分離精製後の試料に含まれる、内因性アンジオテンシンペプチド及び同位体標識アンジオテンシンペプチドは、質量分析計に導入する前にイオン化される。
【００４１】
内因性アンジオテンシンペプチド及び同位体標識アンジオテンシンペプチドをイオン化させる方法としては、例えば、電子イオン化、化学イオン化、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、光子イオン化、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、光イオン化、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）、高速原子衝撃（ＦＡＢ）、液体二次イオン化（ＬＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電界イオン化、電界脱離、サーモスプレー／プラズマスプレーイオン化、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）、粒子ビームイオン化等が挙げられる。
イオン化方法は、アンジオテンシンペプチドの種類、試料の種類、検出器の種類、正対負モードの選択等に基づいて、適宜選択することができる。
【００４２】
中でも、内因性アンジオテンシンペプチド及び同位体標識アンジオテンシンペプチドをイオン化させる方法としては、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）を用いることが好ましく、正モードにおいて、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を用いることがより好ましい。
【００４３】
［検出工程］
次いで、内因性アンジオテンシンペプチド及び同位体標識アンジオテンシンペプチドのイオンの量を、検出する。
具体的には、試料がイオン化された後、それによって生成された正荷電又は負荷電イオンを分析し、質量対電荷比を決定することができる。質量対電荷比を決定するための分析器としては、例えば、三連四重極質量分析器、四重極質量分析器、イオントラップ分析器、フーリエ変換分析器、オービトラップ分析器、飛行時間分析器等が挙げられる。
イオンは、いくつかの検出モードを使用して検出することができる。具体的には、例えば、イオンは、高選択性反応モニタリング（Ｈ−ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）、選択的イオンモニタリングモード（ＳＩＭ）等を使用して検出されてもよい。
【００４４】
中でも、内因性アンジオテンシンペプチド及び同位体標識アンジオテンシンペプチドのイオンの質量対電荷比は、三連四重極質量分析器を用いて、多重反応モニタリングを使用して検出されることが好ましい。
さらに、より正確に定量できることから、多重反応モニタリングを使用した際に、２つ以上の質量遷移を検出することが好ましい。
これにより、後述の定量工程に示すように、２つ以上の質量遷移から得られる質量プロットから２つ以上のピーク下面積を得て、さらに２つ以上のピーク下面積から２つ以上の定量値を計算し、それら定量値の平均値を算出することで、より高精度のアンジオテンシンペプチドの定量値を得ることができる。
【００４５】
また、三連四重極質量分析器は「タンデム質量分析器（ＭＳ／ＭＳ）」とも呼ばれ、ＭＳ技術の選択性を向上させることができる。この技術では、着目分子から生成される前駆体イオン（親イオンとも呼ばれる）は、ＭＳ装置内で濾過され、続いて前駆体イオンは断片化されて１つ以上の生成物イオン（娘イオンまたは断片イオンとも呼ばれる）を生じ、次にこれは第２のＭＳ手順において分析される。前駆体イオンを選択することで、特定の分子（本実施形態ではアンジオテンシンペプチド）によって生成されるイオンのみが分画チャンバを通過し、ここで不活性ガスの原子との衝突によって生成物イオンが生成する。前駆体及び生成物イオンの両方とも、所与の一連のイオン化／断片化条件下で、再現可能なように生成される。そのため、ＭＳ／ＭＳ技術は、非常に強力な分析ツールである。例えば、濾過／分画の組み合わせを使用して、干渉物質を排除することができ、生物学的試料等の複雑な試料において特に有用である。
【００４６】
［定量工程］
定量工程では、イオン化したターゲットペプチド（親イオン、すなわちアンジオテンシンペプチド）が解離して生じる娘イオンが検出された場合のみシグナルとして検出する。そのシグナルのピークから目的のアンジオテンシンペプチドの定量が可能になる。また、この時、定量を行うアンジオテンシンペプチドを同位体標識したペプチドを既知量加えて内部標準として用いることで、回収率及び絶対定量値を算出することが可能になる。
【００４７】
定量方法としてより具体的には、例えば、イオンの量のデータは、コンピュータに中継され、イオン数対時間のプロットとして生成される。このプロットされた質量クロマトグラムから、内因性アンジオテンシンペプチド（例えば、アンジオテンシン１）及び同位体標識アンジオテンシンペプチド（例えば、同位体標識アンジオテンシン１）のピーク下の面積を決定することができる。これらの面積を用いて、以下の式［１］から内因性アンジオテンシンペプチドの量を算出することができる。
試料中のアンジオテンシンペプチドの濃度
＝（試料のピーク下の面積／内部標準のピーク下の面積）×  内部標準の濃度・・・［１］
【００４８】
また、同位体標識アンジオテンシンペプチドを２種類以上混合させておくことで、同時に２種類以上のアンジオテンシンペプチドの絶対量を得ることができる。
【００４９】
＜好ましい実施形態＞
［試料：組織抽出液又は細胞抽出液］
本実施形態の方法において、試料が組織抽出液又は細胞抽出液である場合、好ましい実施形態としては、以下に示すとおりである。
まず、上述の組織抽出液又は細胞抽出液の調製方法を用いて、試料を調製し、同位体標識アンジオテンシンペプチドを混合する。次いで、混合物を固相カラムに通し、さらに、液体クロマトグラフィーにより分離精製する。次いで、分離精製物を三連四重極質量分析器に導入し、正モードにおいて、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）し、多重反応モニタリングを使用して、内因性アンジオテンシンペプチド及び同位体標識ペプチドの２つ以上の質量遷移を検出する。検出された内因性アンジオテンシンペプチド及び同位体標識ペプチドの２つ以上の質量遷移から質量クロマトグラムを作成し、それぞれ２つ以上のピーク下の面積を決定する。次いで、内因性アンジオテンシンペプチド及び同位体標識ペプチドの２つ以上のピーク下の面積から上述の式［１］を用いて、２つ以上の内因性アンジオテンシンペプチドの定量値を算出する。次いで、２つ以上の質量遷移（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）から得られる定量値の平均を定量値とし、最終定量値は同一試料を２回以上測定した場合の平均値をとる。
【００５０】
［試料：体液］
本実施形態の方法において、試料が体液である場合、好ましい実施形態としては、以下に示すとおりである。
まず、試料と同位体標識アンジオテンシンペプチドとを混合する。次いで、ＤＳ法を用いて分離精製する。次いで、混合物を固相カラムに通し、さらに、液体クロマトグラフィーにより分離精製する。次いで、分離精製物を三連四重極質量分析器に導入し、正モードにおいて、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）し、多重反応モニタリングを使用して、内因性アンジオテンシンペプチド及び同位体標識ペプチドの２つ以上の質量遷移を検出する。検出された内因性アンジオテンシンペプチド及び同位体標識ペプチドの２つ以上の質量遷移から質量クロマトグラムを作成し、それぞれ２つ以上のピーク下の面積を決定する。次いで、内因性アンジオテンシンペプチド及び同位体標識ペプチドの２つ以上のピーク下の面積から上述の式［１］を用いて、２つ以上の内因性アンジオテンシンペプチドの定量値を算出する。次いで、２つ以上の定量値の平均値を最終定量値とする。
【００５１】
［定量限界］
本実施形態の方法において、アンジオテンシンペプチドの定量限界（定量下限）は、０．５ｆｍｏｌ／μＬ以下であることが好ましく、０．１ｆｍｏｌ／μＬ以下であることがより好ましい。
一方、アンジオテンシンペプチドの定量上限は、例えば、３００ｆｍｏｌ／μＬ以上である。
【００５２】
なお、本明細書において、「定量限界（ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ；ＬＯＱ）」とは、測定が定量的に有意義となる点を意味する。この定量限界における検体応答は、２０％の精度及び８０〜１２０％の正確度によって、同定し、分離し、再現することができる。また、「定量上限」とは、検体応答の定量化可能な線形上限範囲を意味する。
【００５３】
≪アンジオテンシンペプチドの定量キット≫
本発明の一実施形態に係るアンジオテンシンペプチドの定量キットは、同位体標識アンジオテンシンペプチドと、変性剤と、を備える。
【００５４】
本実施形態の定量キットによれば、アンジオテンシンペプチドを正確に定量することができる。
【００５５】
本実施形態の定量キットに含まれる同位体標識アンジオテンシンペプチドとしては、上述の工程１において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、本実施形態の定量キットに含まれる同位体標識アンジオテンシンペプチドとしては、Ｎ末端から２番目のアルギニン残基の炭素原子が１３Ｃ同位体と置換され、窒素原子が１５Ｎ同位体と置換されたものであることが好ましい。この同位体標識アンジオテンシンペプチドは、天然アンジオテンシンペプチドと比較して約１０Ｄａの質量の増加をもたらす。
【００５６】
また、本実施形態の定量キットに含まれる同位体標識アンジオテンシンペプチドは１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。２種類以上の同位体標識アンジオテンシンペプチドを備えることで、同時に２種類以上のアンジオテンシンペプチドの量を定量することができる。
【００５７】
本実施形態の定量キットに含まれる変性剤としては、上述の工程１において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、本実施形態の定量キットに含まれる変性剤としては、尿素、チオ尿素、及びＤＴＴからなる群のうち少なくとも一つであることが好ましく、尿素、チオ尿素、及びＤＴＴからなる群のうち少なくとも２つであることがより好ましく、尿素、チオ尿素、及びＤＴＴであることがさらに好ましい。
【００５８】
本実施形態の定量キットは、さらに、固相抽出カラム等を備えていてもよい。固相抽出カラムを備えることで、ＬＣによる分離精製前の試料の精製度をより向上させることができる。
固相抽出カラムとしては、上述の工程１において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００５９】
本実施形態の定量キットは、さらに、ＬＣによる分離精製及び質量分析に用いられる溶媒、試薬、及び容器等を適宜備えていてもよい。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６１】
［実施例１］
１．試料の準備
被検体として、１２〜１５週齢の正常雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌより購入）、遺伝子組み換えマウスであるメガリン完全ノックアウト（ＫＯ）マウス（Ｎｄｒｇ１Ｃｒｅ  ＥＲＴ２、ｍｅｇａｌｉｎ  ｌｏｘ／ｌｏｘ）（以下、「ＮＤＲＧ１マウス」と称する場合がある）及びメガリン部分ＫＯマウス（ＡｐｏＥＣｒｅ、ｍｅｇａｌｉｎ  ｌｏｘ／ｌｏｘ）（以下、「ＡｐｏＥマウス」と称する場合がある）を使用した。
【００６２】
（１）尿の採取
解剖前２４時間蓄尿した尿を試料として使用した。なお、得られた尿は、低速遠心により、細胞成分等を除去し、上清を使用した。得られた上清は、凍結し、使用するまで−８０℃で保存した。
【００６３】
（２）血液の採取
呼気麻酔イソフルランを用いて、マウスを鎮静した後に、頸椎脱臼を行い、正中切開した。次いで、下大静脈から０．８ｍＬ採血した。なお、このとき、血液１ｍＬあたり、５００ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）５０μＬ、２ｍＭ  Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ ６．４５μＬ、合成プロテアーゼインヒビターコンプリート（Ｒｏｓｃｈｅ製１錠を２ｍＬの超純水で溶解）２５μＬ、２５ｍＭ  Ａｌｉｓｋｉｒｅｎ１０μＬを予め満たした１ｍＬのシリンジに直ちに採血した。次いで、血液は室温、８００×ｇで２０分遠心し、上清の血漿を集め、液体窒素で凍結した。得られた血漿は、使用するまで−８０℃で保存した。なお、得られた血漿において、オリエンタル酵母工業株式会社に依頼してＲＩＡ２抗体法によりレニン活性が十分に抑制されていることを確認した。また、血漿にアンジオテンシン１を添加し、アンジオテンシン２への変化量を測定することで、ＡＣＥ活性が十分に抑制されていることを確認した。
【００６４】
（３）腎臓の摘出
採血後、右腎を摘出し、被膜を除去して１／２にカットし、直ちに液体窒素で凍結した。左腎も摘出し、同様に処理し、凍結した。得られた腎臓は、使用するまで−８０℃で保存した。
【００６５】
２．工程１：アンジオテンシンペプチドの精製
（１）各試料からのアンジオテンシンペプチドの分離
・尿試料からのアンジオテンシンペプチドの分離
まず、４０μＬの尿に安定同位体標識のアンジオテンシンペプチド（１、２、１−９及び１−７）（アンジオテンシンペプチド１、２はＧｒａｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ製、アンジオテンシンペプチド１−９及び１−７はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）をそれぞれ１００ｆｍｏｌずつ添加した。なお、各アンジオテンシンペプチドのアミノ酸配列は配列番号１〜４に示すとおりである。次いで、サンプルの倍量の変性剤（７Ｍ尿素、２Ｍチオウレア、及び２０ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ））を添加した。次いで、混合液を４℃に冷やした２ｍＬのアセトンの中に、ゲルローディング用の細いチップを用いて一滴ずつゆっくりと添加した。添加後すぐに４℃で１時間混和した。次いで、４℃、１９０００×ｇで１５分遠心し、上清を捨てた。次いで、１ｍＬの１２ｍＭ塩酸（ＨＣｌ）及び８０％アセトニトリル（ＡＣＮ）の混合溶液を用いて、沈殿を再懸濁した。次いで、４℃で、２時間混和した。次いで、４℃、１９０００×ｇで１５分遠心し、上清を回収した。次いで、回収した上清を遠心乾燥機で乾燥させて、乾燥物を得た。得られた乾燥物を１ｍＬの０．２％トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ；ＴＦＡ）で再懸濁した。
【００６６】
・血漿試料からのアンジオテンシンペプチドの分離
まず、２０μＬの血漿に安定同位体標識のアンジオテンシンペプチド（１、２、１−７及び１−９、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）をそれぞれ１００ｆｍｏｌずつ添加した。次いで、サンプルの倍量の変性剤（７Ｍ尿素、２Ｍチオウレア、及び２０ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ））を添加した。次いで、混合液を４℃に冷やした２ｍＬのアセトンの中に、ゲルローディング用の細いチップを用いて一滴ずつゆっくりと添加した。添加後すぐに４℃で１時間混和した。次いで、４℃、１９０００×ｇで１５分遠心し、上清を捨てた。次いで、８００μＬの１２ｍＭ塩酸（ＨＣｌ）及び８０％アセトニトリル（ＡＣＮ）の混合溶液を用いて、沈殿を再懸濁した。次いで、４℃で、１時間混和した。次いで、４℃、１９０００×ｇで１５分遠心し、上清を回収した。次いで、回収した上清を遠心乾燥機で乾燥させて、乾燥物を得た。得られた乾燥物を１ｍＬの０．２％ＴＦＡで再懸濁した。
【００６７】
・腎臓試料からのアンジオテンシンペプチドの分離
まず、腎臓の湿重量を計測後、１／２にカットした右腎を２．５ｍＬのメタノール（−８０℃で予め冷やしたもの）内でホモジナイズした（条件：ＩＫＡホモジナイザー、３０秒）。なお、得られた腎臓のホモジネートにおいて、オリエンタル酵母工業株式会社に依頼してＲＩＡ２抗体法によりレニン活性が十分に抑制されていることを確認した。また、得られた腎臓のホモジネートにアンジオテンシン１を添加し、アンジオテンシン２への変化量を測定することで、ＡＣＥ活性が十分に抑制されていることを確認した。
次いで、得られたホモジネートに、内部標準として安定同位体標識アンジオテンシンペプチド（１、２、１−７及び１−９、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）をそれぞれ５００ｆｍｏｌずつ添加した。次いで、４℃、１４００×ｇで１５分遠心し、上清を１５ｍＬの耐熱ガラス試験管に採取した。次いで、８５℃に熱したヒートブロックで上清を含む試験管を加熱し、メタノールを蒸発させた。乾燥後、５００μＬのＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ含有、ｐＨ７．４)で再懸濁した。次いで、４℃、２１０００×ｇで２０分遠心し、上清を回収した。次いで、回収した上清に５００μＬの０．２％ＴＦＡを加え、合計約１ｍＬとした。
【００６８】
（２）各試料の脱塩及びペプチド分画
・尿試料及び腎臓試料の脱塩及びペプチド分画
次いで、（１）で得られた尿及び腎臓由来の再懸濁液をＭｏｎｏ  Ｓｐｉｎ（登録商標）  Ｃ１８（ＧＬサイエンス製）を用いて脱塩及びペプチド分画した。具体的な手順は以下に示すとおりである。
まず、Ｍｏｎｏ  Ｓｐｉｎ（登録商標）  Ｃ１８（ＧＬサイエンス製）に、溶媒又はサンプルを滴下し、４℃、１０００×ｇで１分間遠心した。溶媒及び試料の滴下した順番は以下に示すとおりである。
（カラムの平衡化）
５ｍＬ  メタノール
→５ｍＬ  ０．２％ＴＦＡ及び８０％ＡＣＮ混合液
→５ｍＬ  ０．２％ＴＦＡ
（試料の滴下）
→１ｍＬの（１）で得られた再懸濁液
（洗浄）
→５ｍＬ  ０．２％ＴＦＡ
（溶出）
→２ｍＬ  ０．２％ＴＦＡ及び３０％ＡＣＮ混合液
【００６９】
・血漿試料の脱塩及びペプチド分画
次いで、（１）で得られた血漿由来の再懸濁液をＭｏｎｏ  Ｓｐｉｎ（登録商標）  Ｃ１８（ＧＬサイエンス製）を用いて脱塩及びペプチド分画した。具体的な手順は以下に示すとおりである。
まず、Ｍｏｎｏ  Ｓｐｉｎ（登録商標）  Ｃ１８（ＧＬサイエンス製）に、溶媒又はサンプルを滴下し、４℃、１０００×ｇで１分間遠心した。溶媒及び試料の滴下した順番は以下に示すとおりである。
（カラムの平衡化）
５ｍＬ  メタノール
→５ｍＬ  ０．２％ＴＦＡ及び８０％ＡＣＮ混合液
→５ｍＬ  ０．２％ＴＦＡ
（試料の滴下）
→１ｍＬの（１）で得られた再懸濁液
（洗浄）
→５ｍＬ  ０．２％ＴＦＡ
→５ｍＬ  ０．２％ＴＦＡ及び１５％ＡＣＮ混合液
（溶出）
→２ｍＬ  ０．２％ＴＦＡ及び３０％ＡＣＮ混合液
【００７０】
（３）試料の最終調製
上述のＭｏｎｏ  Ｓｐｉｎ  Ｃ１８の処理で得られたアンジオテンシンペプチドを含んだ各溶出物を、遠心乾燥機で乾燥させた。次いで、腎臓試料は１００μＬ、尿及び血液試料はそれぞれ２０μＬの０．２％ＴＦＡで再懸濁し、液体クロマトグラフィーに使用する試料とした。
【００７１】
（４）液体クロマトグラフィーによる分離精製
・尿試料及び腎臓試料の液体クロマトグラフィーによる分離精製
液体クロマトグラフィー（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＬＣ）システムとしては、Ｅｋｓｉｇｅｎｔ（登録商標）  Ｅｘｓｐｅｒｔ  ｎａｎｏ ＬＣ ４００、Ｅｋｓｉｇｅｎｔ（登録商標）  Ｅｘｓｐｅｒｔ  ｃＨｉＰＬＣ（登録商標）を用いた。カラム温度は３０℃に設定し、Ｔｒａｐ  ａｎｄ  ｅｌｕｔｅ  ｍｏｄｅで使用した。
【００７２】
また、使用したカラム、移動相及び流速は以下に示すとおりである。
（カラム）
Ｔｒａｐ ｃｏｌｕｍｎ：Ｎａｎｏ  ｃＨｉＰＬＣ（登録商標）  Ｔｒａｐ  ｃｏｌｕｍｎ  ２００μｍ×０．５ｍｍ  ＣｈｒｏｍＸＰ  Ｃ１８−ＣＬ  ３μｍ  １２０Å（８０４−００００６）
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｏｌｕｍｎ：Ｎａｎｏ  ｃＨｉＰＬＣ（登録商標）  ｃｏｌｕｍｎ  ７５μｍ×１５ｃｍ  ＣｈｒｏｍＸＰ  Ｃ１８−ＣＬ  ３μｍ  １２０Å（８０４−００００１）
（移動相）
Ａ溶媒：０．１％ギ酸（ｆｏｒｍｉｃ  ａｃｉｄ；ＦＡ）
Ｂ溶媒：０．１％ＦＡ及び１００％ＡＣＮ混合液
（流速）
３００ｎＬ／ｍｉｎ
【００７３】
ＬＣによる分離精製の手順としては、以下に示すとおりである。
Ａ溶媒９８％、Ｂ溶媒２％で平衡化したＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｏｌｕｍｎへの（３）で最終調製された試料を導入した時間を０分とした。まず、Ｂ溶媒を３０分で３２％まで直線的に上昇させ、測定対象物であるアンジオテンシンペプチドを分離溶出した。次いで、そこから５分間でＢ溶媒を９０％まで上昇させた。次いで、５分間、Ａ溶媒１０％、Ｂ溶媒９０％を保ち、カラムを洗った。次いで、そこから０．１分間でＡ溶媒９８％、Ｂ溶媒２％まで戻し、６０分まで初期状態のＡ溶媒９８％、Ｂ溶媒２％で平衡化した。
【００７４】
・血漿試料の液体クロマトグラフィーによる分離精製
使用したＬＣシステム、カラム、移動相及び流速は、尿試料及び腎臓試料の液体クロマトグラフィーによる分離精製と同様である。
ＬＣによる分離精製の手順としては、以下に示すとおりである。
Ａ溶媒９０％、Ｂ溶媒１０％で平衡化したＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｏｌｕｍｎへの（３）で最終調製された試料を導入した時間を０分とした。まず、Ｂ溶媒を３０分で２８％まで直線的に上昇させ、測定対象物であるアンジオテンシンペプチドを分離溶出した。次いで、そこから５分間でＢ溶媒を９０％まで上昇させた。次いで、５分間、Ａ溶媒１０％、Ｂ溶媒９０％を保ち、カラムを洗った。次いで、そこから０．１分間でＡ溶媒９８％、Ｂ溶媒２％まで戻し、７０分までＡ溶媒９８％、Ｂ溶媒２％で平衡化した。
【００７５】
３．工程２：質量分析（アンジオテンシンペプチドのイオン化、検出及び定量）
質量分析計は、Ｓｃｉｅｘ社製のＴｒｉｐｌｅ  ＴＯＦ（登録商標）  ５６００＋をＰｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ｍｏｄｅで使用した。
【００７６】
・尿試料の解析方法
尿試料を用いたＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ、ＩＩ、１−９及び１−７の質量分析は以下の条件にて行った。
（質量分析の条件）
ＴＯＦ  ＭＳ質量範囲：２００〜１２００Ｄａ
Ｄｅｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ（ＤＰ）：８０Ｖ
Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｅｎｅｒｇｙ（ＣＥ）:１０Ｖ
ＴＯＦ−ＭＳ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ：０．２５秒
Ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｏｎ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ：０．１９９秒
Ｃｙｃｌｅ  ｔｉｍｅ：１．８９秒
合計１８９５サイクル
なお、衝突誘起解離反応の条件は、各アンジオテンシンペプチドの標準品を用いて最適化を行った。
また、各アンジオテンシンペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルの取得条件は以下の表１に示すとおりである。
【００７７】
【表１】
2019012015.tif 000002
【００７８】
・血漿試料及び腎臓試料の解析方法
血漿試料及び腎臓試料を用いたＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ及びＩＩの質量分析は以下の条件にて行った。
（質量分析の条件）
ＴＯＦ  ＭＳ質量範囲：４００〜１２５０Ｄａ
Ｄｅｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ（ＤＰ）：８０Ｖ
Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｅｎｅｒｇｙ（ＣＥ）:１０Ｖ
ＴＯＦ−ＭＳ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ：０．２５秒
Ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｏｎ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ：０．２０秒
Ｃｙｃｌｅ  ｔｉｍｅ：１．１秒
合計３２７２サイクル
なお、衝突誘起解離反応の条件は、各アンジオテンシンペプチドの標準品を用いて最適化を行った。
また、各アンジオテンシンペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルの取得条件は以下の表２に示すとおりである。
【００７９】
【表２】
2019012015.tif 000003
【００８０】
各試料について、生成されたイオンのうち、質量対電荷比が表３に示す値である前駆体イオン（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｉｏｎ）を選択するように設定された第１の四重極（Ｑ１）を通過させた。次いで、第２の四重極に流入するイオンをアルゴンガスと衝突させて、イオン画分を生成させた。次いで、Ｑ２で得られた各イオン画分のうち、質量対電荷比が表３に示す値である生成物イオン（Ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｏｎ）を選択するように設定された第３の四重極（Ｑ３）を通過させた。また、表３に示すように、前駆体イオン及び生成物イオンの組み合わせである質量遷移（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）として、アンジオテンシン１、１−９及び１−７は３つの質量遷移を組み、アンジオテンシン２は２つの質量遷移を組んだ。なお、各試料におけるアンジオテンシンペプチドの定量値は、この２つ又は３つの質量遷移から得られる定量値の平均値を用いた。
また、同時に、内部標準である安定同位体標識アンジオテンシンペプチドについても、質量対電荷比が表３に示す値である前駆体イオン及び生成物イオンを選択するようにして、同様に三連四重極質量分析を行った。
なお、表３中、「ｌｉｇｈｔ」が標識なしのアンジオテンシンペプチドを示し、「ｈｅａｖｙ」が安定同位体標識アンジオテンシンペプチドを示す。
【００８１】
【表３】
2019012015.tif 000004
【００８２】
また、各試料のＬＣ−ＭＳ／ＭＳのデータ取得及び解析ソフトウェアはＡｎａｌｙｓｔ（登録商標）  ＴＦ１．６（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ製）を使用した。さらに、ＭＲＭ−ＨＲ（登録商標）法における定量メソッドの構築及びｐｅａｋ  ａｒｅａ値の算出のためのソフトウェアとしてＳｋｙｌｉｎｅ（ＭａｃＣｏｓｓ  Ｌａｂ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を用いた。
なお、「ＭＲＭ−ＨＲ（登録商標）法」とは、選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）とほぼ同一の原理である方法である。具体的には、ＭＲＭ−ＨＲ（登録商標）法では、まず、あらかじめ定量したいペプチド（ターゲットペプチド）のイオンをＰｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｉｏｎとして選択し、その選択したＰｒｅｃｕｒｓｏｒ ｉｏｎのみに衝突誘起解離法（ＣＩＤ）と呼ばれる方法で、主にペプチド結合で開裂（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を起こし、そのＰｒｅｃｕｒｓｏｒ ｉｏｎに由来するＰｒｏｄｕｃｔ ｉｏｎを選択的に検出するという方法である。
具体的なデータ解析としては、まず、イオン数対時間のプロットを生成した。ピーク下の面積を測定し、内部標準である安定化同位体標識アンジオテンシンペプチド）の濃度（尿、血漿、腎臓試料いずれも２５ｆｍｏｌ／ｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ（５μＬ））を元に、以下の式［１］を用いて、試料の濃度を定量化した。
試料中のアンジオテンシンペプチドの濃度［fmol］
＝（試料のピーク下の面積／内部標準のピーク下の面積）×  内部標準の濃度・・・［１］
【００８３】
また、検量線を以下の方法を用いて作成し、内因性のアンジオテンシンペプチドが含まれているため、直線の傾きのみを定量値の算出に使用した。
まず、安定同位体標識アンジオテンシンペプチドを含まないｍａｔｒｉｘを作成し、内部標準として安定同位体標識アンジオテンシンペプチド（ｈｅａｖｙ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を一定量添加し、さらに濃度を振った標識なしのアンジオテンシンペプチド （ｌｉｇｈｔ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を添加して標準溶液を作成した。なお、標識なしの各アンジオテンシンペプチド（１、２、１−９及び１−７）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製を用いた。ｈｅａｖｙ ｐｅｐｔｉｄｅｓは、２５ｆｍｏｌ／ｏｎ  ｃｏｌｕｍｎとなるように添加した。なお、「ｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ」とは、導入量を意味し、この場合は５μＬである。また、ｌｉｇｈｔ ｐｅｐｔｉｄｅｓは、０、１、２．５、１０、５０、７５、及び１００ｆｍｏｌ／ｏｎ  ｃｏｌｕｍｎとなるように添加した。
次いで、ｌｉｇｈｔ ｐｅｐｔｉｄｅｓのｐｅａｋ  ａｒｅａ値、ｈｅａｖｙ ｐｅｐｔｉｄｅｓのｐｅａｋ  ａｒｅａ値の比をとり（ｌｉｇｈｔ／ｈｅａｖｙ）、横軸をｌｉｇｈｔ ｐｅｐｔｉｄｅｓの濃度、縦軸をｐｅａｋ  ａｒｅａ比（ｌｉｇｈｔ／ｈｅａｖｙ）として検量線を作成した。なお、各濃度標準溶液につき３回測定を行った。また、検量線は小二乗法を用いて作成し、検量線の直線性を評価した。
【００８４】
さらに、３回の測定のＳｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ（ＳＤ）、精度（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）及び真度（ａｃｃｕｒａｃｙ）を算出し、ＬＬＯＱ（ｌｏｗｅｒ  ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を評価した。ＬＬＯＱの評価項目としては、「ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ≦２０％及びａｃｃｕｒａｃｙ≦２０％を満たすこと」とした。
また、Ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓａｍｐｌｅとして、低濃度（２．５ｆｍｏｌ／ｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ）、中等濃度（５０ｆｍｏｌ／ｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ）、高濃度（７５ｆｍｏｌ／ｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ）の標準溶液を各５回ずつ測定し、ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ及びａｃｃｕｒａｃｙを評価した。評価項目としては、「ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ≦１５％及びａｃｃｕｒａｃｙ≦１５％を満たすこと」とした。
血漿試料でのアンジオテンシン１及び２の検量線を図１Ａ（アンジオテンシン１）及び図１Ｂ（アンジオテンシン２）に示す。なお、図１Ａ及び図１Ｂにおいて、「１ｓｔ」とは１回目の測定値、「２ｎｄ」とは２回目の測定値、「３ｒｄ」とは３回目の測定値を意味する。
【００８５】
図１Ａ（アンジオテンシン１）及び図１Ｂ（アンジオテンシン２）から、ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ≦２０％及びａｃｃｕｒａｃｙ≦２０％を満たすＬＬＯＱは、アンジオテンシン１（ＡｎｇＩ）では、０．５ｆｍｏｌ／ｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ、アンジオテンシン２（ＡｎｇＩＩ）では ０．５ｆｍｏｌ／ｏｎ  ｃｏｌｕｍｎであった。
またＱｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓａｍｐｌｅとして、低濃度（２．５ｆｍｏｌ／ｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ）、中等濃度（５０ｆｍｏｌ／ｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ）、高濃度（７５ｆｍｏｌ／ｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ）の標準溶液を各５回ずつ測定した結果、ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ≦１５％及びａｃｃｕｒａｃｙ≦１５％を満たすことが確認できた。
【００８６】
各試料に含まれるアンジオテンシンペプチドの定量結果を以下の表４に示す。また、正常マウス、メガリン完全ノックアウトマウス（ＮＤＲＧ１マウス）及びメガリン部分ノックアウトマウス（ＡｐｏＥマウス）間の各試料に含まれるアンジオテンシンペプチドを比較した結果を図２Ａ（尿中のアンジオテンシン１）、図２Ｂ（尿中のアンジオテンシン２）、図２Ｃ（尿中のアンジオテンシン１−９）、図２Ｄ（尿中のアンジオテンシン１−７）、図３（血漿中のアンジオテンシン１）、図４Ａ（腎臓中のアンジオテンシン１）及び図４Ｂ（腎臓中のアンジオテンシン２）に示す。なお、尿及び血漿中のアンジオテンシンペプチドの濃度は、ｆｍｏｌ／ｍＬで示し、腎臓中のアンジオテンシンペプチドの濃度は、ｆｍｏｌ／ｇで示した。また、表及び各図において、「ＮＤＲＧ１」はＮＤＲＧ１マウスの測定結果、「ＣｏｎＮ」はＮＤＲＧ１マウスの対照としたコントロール（正常）マウスの測定結果、「ＡｐｏＥ」はＡｐｏＥマウスの測定結果、「ＣｏｎＥ」はＡｐｏＥマウスの対照としたコントロール（正常）マウスの測定結果を示す。
【００８７】
【表４】
2019012015.tif 000005
【００８８】
表４及び図２Ａ〜図２Ｄから、尿試料からはアンジオテンシン１、２、１−９及び１−７の全てを検出することができた。また、正常マウスと比較して、ＮＤＲＧ１マウス及びＡｐｏＥマウス（特に、ＮＤＲＧ１マウス）のほうが各アンジオテンシンペプチドの含有量が多いことが明らかとなった。
また、血漿試料では、アンジオテンシンペプチド１、１−９及び１−７は定量下限未満であったが、アンジオテンシン２について検出することができた。また、正常マウス、ＮＤＲＧ１マウス及びＡｐｏＥマウスとでアンジオテンシン２の含有量に大きな差がないことが明らかとなった。
また、腎臓試料では、アンジオテンシンペプチド１−９及び１−７は定量下限未満であったが、アンジオテンシン１及び２について検出することができた。また、正常マウス、ＮＤＲＧ１マウス及びＡｐｏＥマウスとでアンジオテンシン２の含有量に大きな差がないことが明らかとなった。
【００８９】
［実施例２］
１．試料の準備
被検体として、１２〜１５週齢の正常雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌより購入）、遺伝子組み換えマウスであるメガリン完全ＫＯマウス（ＮＤＲＧ１マウス）及びメガリン部分ＫＯマウス（ＡｐｏＥマウス）を使用した。
【００９０】
（１）腎臓の摘出
正常マウス（対照）、ＮＤＲＧ１マウス及びＡｐｏＥマウスの一部に、５ｍｇ／ｍＬのマウス組換えアンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）を２００μＬ（すなわち、１ｍｇのＡＧＴ含有）腹腔内注射した。３０分後に頸椎脱臼を行い、正中切開した。
次いで、右腎を摘出し、被膜を除去して１／２にカットし、直ちに液体窒素で凍結した。左腎も摘出し、同様に処理し、凍結した。得られた腎臓は、使用するまで−８０℃で保存した。
【００９１】
２．工程１：アンジオテンシンペプチドの精製
（１）腎臓試料からのアンジオテンシンペプチドの分離
内部標準として安定同位体標識アンジオテンシン１−９及び１−７のみを用いた以外は、実施例１の（１）の「腎臓試料からのアンジオテンシンペプチドの分離」と同様の方法を用いて、アンジオテンシンペプチドを分離した。
【００９２】
（２）腎臓試料の脱塩及びペプチド分画
実施例１の（１）の「尿試料及び腎臓試料の脱塩及びペプチド分画」と同様の方法を用いて、脱塩及びペプチド分画した。
【００９３】
（３）腎臓試料のＬＣによる分離精製
実施例１の（３）の「尿試料及び腎臓試料の液体クロマトグラフィーによる分離精製」と同様の方法を用いて、アンジオテンシンペプチドを分離溶出した。
【００９４】
３．工程２：質量分析（アンジオテンシンペプチドのイオン化、検出及び定量）
実施例１の「３．工程２〜４：質量分析（アンジオテンシンペプチドのイオン化、検出及び定量）」の「尿試料の解析方法」の条件を参照しながら、同様の方法を用いて、各マウスの腎臓試料に含まれるＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  １−９及び１−７を質量分析し、定量した。結果を以下の表５及び表６に示す。また、正常マウス、メガリン完全ノックアウトマウス（ＮＤＲＧ１マウス）及びメガリン部分ノックアウトマウス（ＡｐｏＥマウス）間の腎臓試料に含まれるアンジオテンシンペプチドを比較した結果を図５Ａ（正常マウス及びＮＤＲＧ１マウスのアンジオテンシン１−９）、図５Ｂ（正常マウス及びＮＤＲＧ１マウスのアンジオテンシン１−７）、図６Ａ（正常マウス及びＡｐｏＥマウスのアンジオテンシン１−９）及び図６Ｂ（正常マウス及びＡｐｏＥマウスのアンジオテンシン１−９）に示す。
なお、表５、図５Ａ及び図５Ｂにおいて、「ｃｏｎ（ｄｉｓ）」とはＡＧＴ非投与の正常マウスでの測定結果を示し、「ｃｏｎ  ＡＧＴ＋（ｄｉｓ）」とはＡＧＴ投与した正常マウスでの測定結果を示し、「ＮＤＲＧ１（ｄｉｓ）」とはＡＧＴ非投与のＮＤＲＧ１マウスでの測定結果を示し、「ＮＤＲＧ１  ＡＧＴ＋（ｄｉｓ）」とはＡＧＴ投与したＮＤＲＧ１マウスでの測定結果を示す。
また、表６、図６Ａ及び図６Ｂにおいて、「ｃｏｎ（ｄｉｓ）」とはＡＧＴ非投与の正常マウスでの測定結果を示し、「ｃｏｎ  ＡＧＴ＋（ｄｉｓ）」とはＡＧＴ投与した正常マウスでの測定結果を示し、「ＡｐｏＥ（ｄｉｓ）」とはＡＧＴ非投与のＡｐｏＥマウスでの測定結果を示し、「ＡｐｏＥ  ＡＧＴ＋（ｄｉｓ）」とはＡＧＴ投与したＡｐｏＥマウスでの測定結果を示す。
【００９５】
【表５】
2019012015.tif 000006
【００９６】
【表６】
2019012015.tif 000007
【００９７】
表５、図５Ａ及び図５Ｂから、ＡＧＴを投与することで、正常マウス及びＮＤＲＧ１マウスのいずれにおいても、腎臓試料のアンジオテンシン１−９及び１−７の値が上昇することが確かめられた。
また、表６、図６Ａ及び図６Ｂから、ＡＧＴを投与することで、正常マウス及びＡｐｏＥマウスのいずれにおいても、腎臓試料のアンジオテンシン１−９及び１−７の値が上昇することが確かめられた。一方、ＡＧＴの非投与の正常マウス及びＡｐｏＥマウスでは、アンジオテンシン１−９及び１−７は定量下限未満であった。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本実施形態の方法及び定量キットによれば、アンジオテンシンペプチドを正確に定量することができる。
【図１Ａ】
2019012015.tif 000008
【図１Ｂ】
2019012015.tif 000009
【図２Ａ】
2019012015.tif 000010
【図２Ｂ】
2019012015.tif 000011
【図２Ｃ】
2019012015.tif 000012
【図２Ｄ】
2019012015.tif 000013
【図３】
2019012015.tif 000014
【図４Ａ】
2019012015.tif 000015
【図４Ｂ】
2019012015.tif 000016
【図５Ａ】
2019012015.tif 000017
【図５Ｂ】
2019012015.tif 000018
【図６Ａ】
2019012015.tif 000019
【図６Ｂ】
2019012015.tif 000020
【配列表】
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