(57)【要約】【課題】開胸手術といった侵襲的な手段によらずとも、血圧変動性増大の疾患モデルを提供しうる手段を提供する。【解決手段】ノルアドレナリンやフェニレフリンといったアドレナリンα１受容体刺激薬を非ヒト動物に投与することにより、血圧変動性を有するモデル動物を作製する。このようにして作製された血圧変動性モデル動物は、血圧変動性に対する予防および／または治療剤のスクリーニング等の用途に有用である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アドレナリンα１受容体刺激薬を非ヒト動物に投与することを含む、血圧変動性モデル動物の製造方法。
【請求項２】
前記アドレナリンα１受容体刺激薬が、ノルアドレナリンおよび／またはフェニレフリンである、請求項１に記載の血圧変動性モデル動物の製造方法。
【請求項３】
前記投与が持続投与である、請求項１または２に記載の血圧変動性モデル動物の製造方法。
【請求項４】
前記投与が５日間以上の持続投与である、請求項３に記載の血圧変動性モデル動物の製造方法。
【請求項５】
前記投与が皮下投与である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の血圧変動性モデル動物の製造方法。
【請求項６】
前記非ヒト動物がラットまたはマウスである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の血圧変動性モデル動物の製造方法。
【請求項７】
前記アドレナリンα１受容体刺激薬の酸化を防止するための物質を投与することをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の血圧変動性モデル動物の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法によって製造された血圧変動性モデル動物。
【請求項９】
収縮期血圧および／または拡張期血圧の日内変動における変動係数（ＣＶ）が９％以上である、請求項８に記載の血圧変動性モデル動物。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法によって製造された血圧変動性モデル動物、または請求項８もしくは９に記載の血圧変動性モデル動物に被験物質を投与すること、および、
前記血圧変動性モデル動物が有する血圧変動性に対する前記被験物質の効果を測定すること、
を含む、血圧変動性に対する予防および／または治療剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血圧変動性モデル動物およびその製造方法、並びにこれを用いた血圧変動性に対する予防および／または治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳卒中や心臓病等の心血管系疾患、および維持透析を含む腎臓疾患は、高血圧、脂質異常症、糖尿病、肥満等の生活習慣病（心血管危険因子）が基盤になり発症進展し、一旦発症すると患者の生活の質（ＱＯＬ）を著しく損なう疾患群である。未曾有の高齢化社会を迎える我が国においては、健康寿命の延伸の観点からも、これらの疾患群の予防対策の重要性は明確である。
【０００３】
心血管系疾患や腎臓疾患を予防するためには、生活習慣病（心血管危険因子）の治療が必須であり、近年、高血圧、脂質異常症、糖尿病に対する優れた治療薬が開発され上市されてきた。しかしながら、本邦における統計によると、心血管疾患の死亡率や維持透析患者数には、明確な減少傾向が観察されておらず、理由として複数の要因が指摘されている（非特許文献１および２を参照）。それらの要因の一つとして考えられているのが、血圧変動性の増大である。血圧変動性とは、一定時間における血圧値の動揺であり、血圧変動性増大が、新たな心血管危険因子であると報告されている（非特許文献３および４を参照）。しかしながら、どのような治療や薬剤が、血圧変動性を縮小して心血管・腎疾患リスクを低減するかが明確でなく、該当分野の課題になっている（非特許文献４を参照）。
【０００４】
近年、細胞培養等のインビトロの「非個体」実験系による有効薬剤の探索（スクリーニング）が広く行われているが、血圧変動性は「個体」の生命現象の一つであり、「非個体」実験系で変動性を観察することは不可能である。すなわち、血圧変動性に関する該当課題を解決（治療手段を確立）するためには、疾患動物モデルを用いて、有効薬剤の探索開発、および前臨床研究を行う必要がある。
【０００５】
従来、血圧変動性増大の疾患モデルとして、圧受容器除神経モデルが知られている（非特許文献５を参照）。このモデルにおいては、左右の頸動脈洞および大動脈を除神経することにより、血圧変動性が増大するモデルが得られる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】厚生労働省、平成２８年（２０１６）人口動態統計（確定数）の概況
【非特許文献２】一般社団法人  日本透析医学会、図説  わが国の慢性透析療法の現状、平成２９年１１月
【非特許文献３】Rothwell PM, et al. Lancet 2010; 375(9718): 895-905
【非特許文献４】Parati G, et al. Hypertension 2016; 67: 1102-1110
【非特許文献５】van Vliet BN, et al. Am J Physiol 1996; 271: R1759-R1769
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献５に記載されているような圧受容器除神経モデルにおいては、開胸手術による神経破壊がなされており、前臨床試験のための動物モデルとしては非生理的であり不適切である。このように、適切な動物モデルがなく、薬剤の有用性を判定する実験手段がないことが、血圧変動性増大に対する治療や薬剤の開発を困難にしているのが現状である。
【０００８】
そこで本発明は、開胸手術といった侵襲的な手段によらずとも、血圧変動性増大の疾患モデルを提供しうる手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、驚くべきことに、ノルアドレナリンやフェニレフリンといったアドレナリンα１受容体刺激薬を非ヒト動物に投与することにより、上記課題を解決可能な血圧変動性増大の疾患モデルが構築されうることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明に係る血圧変動性モデル動物の製造方法は、アドレナリンα１受容体刺激薬を非ヒト動物に投与することを含むことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、開胸手術といった侵襲的な手段によらずとも、血圧変動性増大の疾患モデルを提供することが可能である。本発明は、血圧変動性増大のモデル動物を提供するものであり、病態モデルとして有用である。本発明に係るモデル動物を用いることにより、血圧変動性を縮小させる薬剤の開発、ならびに既存の薬剤の血圧変動性増大に対する薬効評価が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、後述する実施例において測定された、ノルアドレナリン（NA）の投与前、投与7日後および投与14日後の24時間における収縮期血圧の記録データを、15分毎の血圧変動として示すグラフである。
【図２】図２は、後述する実施例において測定された、ノルアドレナリン（NA）の投与前、投与7日後および投与14日後の昼間および夜間のそれぞれにおける収縮期血圧および収縮期血圧の変動係数（CV）に関して、NA投与群（n=6）と非投与群（n=10）とを比較した結果を示すグラフである。
【図３】図３は、後述する実施例において測定された、ノルアドレナリン（NA）およびアゼルニジピンの投与前、投与7日後および投与14日後の24時間における収縮期血圧の記録データを、15分毎の血圧変動として示すグラフである。
【図４】図４は、後述する実施例において測定された、フェニレフリン塩酸塩（Phe）の投与前、投与7日後および投与14日後の24時間における収縮期血圧の記録データを、15分毎の血圧変動として示すグラフである。
【図５】図５は、後述する実施例において測定された、イソプロテレノール塩酸塩（Iso）の投与前、投与7日後および投与14日後の24時間における収縮期血圧の記録データを、15分毎の血圧変動として示すグラフである。
【図６】図６は、後述する実施例において測定された、ノルアドレナリン（NA）およびプラゾシンの投与前、投与7日後および投与14日後の24時間における収縮期血圧の記録データを、15分毎の血圧変動として示すグラフである。
【図７】図７は、後述する実施例において測定された、ノルアドレナリン（NA）およびアテノロールの投与前、投与7日後および投与14日後の24時間における収縮期血圧の記録データを、15分毎の血圧変動として示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を実施するための形態について説明する。ただし、下記の実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の技術的範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態もまた、本発明の技術的範囲に含まれる。
【００１４】
本発明の一形態は、アドレナリンα１受容体刺激薬を非ヒト動物に投与することを含む、血圧変動性モデル動物の製造方法に関するものである。
【００１５】
血圧変動性の増大は、高血圧症に高頻度に合併する病態であり、血圧変動性増大そのものが、心血管系疾患の独立した危険因子になる。これまでに、多くの降圧薬が開発され、高血圧症のモデル動物を用いた非臨床試験および臨床治験を経て上市されてきた。しかしながら、血圧変動性の増大に対する治療薬の開発はなされていないのが現状である。したがって、血圧変動性の増大の症状を呈する疾患モデル動物が提供できれば、血圧変動性の増大に対する治療薬の開発に対する大きな駆動力となるものと考えられる。
【００１６】
このような現状のもと、本発明者らは、驚くべきことに、アドレナリンα１受容体刺激薬を非ヒト動物に投与することにより、血圧変動性を有するモデル動物（血圧変動性モデル動物）の作製が可能となることを見出した。
【００１７】
血圧変動性モデル動物とするアドレナリンα１受容体刺激薬の投与対象は、非ヒト動物である。非ヒト動物の具体的な形態について特に制限はなく、アドレナリンα１受容体刺激薬の投与によって血圧変動性を示す非ヒト動物であればよい。例えば、非ヒト動物としては、実験動物として一般的に使用される非ヒト動物が挙げられるが、好ましくは非ヒト脊椎動物であり、より好ましくは非ヒト哺乳動物であり、さらに好ましくはげっ歯類である。本発明において好適に用いられる非ヒト動物として、具体的には、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ニワトリ、サル等を例示することができる。本発明で用いられる非ヒト動物は、好ましくはマウス、ラット、モルモット、またはハムスターであり、特に好ましくはラットまたはマウスであり、最も好ましくはラットである。特に、正常なラットの血圧はヒトの血圧と類似していることから、ラットを用いて作製された血圧変動性モデル動物は、ヒトにおける血圧変動性の予防および／または治療剤のスクリーニング方法に好適に用いられうる。なお、ラットの系統についても特に制限はなく、従来公知の知見が適宜参照されうるが、一例として、ウイスター系ラットが入手可能性などの観点からも好ましい。
【００１８】
血圧変動性モデル動物の作製に用いる非ヒト動物については、血圧の計測ならびに計測された血圧データを無線的に発信することが可能な血圧データ発信器を備えることが好ましい。これにより、血圧データの持続的な計測が可能となり、実験等にて定めた所定期間の血圧変動性の確認が可能となる。
【００１９】
血圧データ発信器については、血圧の計測ならびに計測された血圧データの無線的な発信が可能である限り特に限定する必要はなく、種々の機器・手段を採用することができる。
【００２０】
例えば、非侵襲的な手段として，パルスオキシメーターのような機器を用いて血圧を測定し，測定されたデータを無線的に発信するような手段を採用することができる。この場合、血圧データ発信器自体は、ベルトのような固定具を用いて，実験動物に固定すればよい。また、より好ましい方法として、外科処置を行い大動脈血管から直接血圧を測定するような侵襲的な機器を用いることもできる。これにより、実験動物がより自然でストレスのない行動をとることが可能となり、より自然で正確な血圧変動性データの取得が期待できる。このような機器として、例えば、テレメトリーシステム（Ponemah v.6、Data Science International社）が挙げられる。なお、血圧データ発信器については、心拍数など、その他のデータを同時に取得、発信しても構わない。
【００２１】
アドレナリンα１受容体刺激薬は、アドレナリンα１受容体を活性化させる薬剤であり、α１受容体作動薬、α１受容体作用薬、α１受容体アゴニスト、α１アゴニストなどとも称される。このアドレナリンα１受容体刺激薬は、α１受容体を選択的に刺激する薬剤であってもよいし、α１受容体のみならずα２受容体等の他のα受容体をも刺激する作用を有するものであってもよい。ここで、アドレナリンα１受容体刺激薬の具体例としては特に制限されず、従来公知の薬剤が用いられうるが、一例として、ノルアドレナリン、フェニレフリン、エチレフリン、メトキサミン、ミトドリン、フェニルプロパノラミン、ナファゾリン、キシロメタゾリンなどが挙げられる。なかでも、好ましくはノルアドレナリン（NA）またはフェニレフリン（Phe）が用いられる。なお、ノルアドレナリンは、Ｃ８Ｈ１１ＮＯ３の化学式を有するカテコールアミンであり、ノルエピネフリンとしても知られている。ノルアドレナリンは生体内に存在しており、シナプス伝達の間にノルアドレナリン作動性ニューロンから放出されて神経伝達物質として機能したり、副腎から血液に放出されてホルモンとして機能したりする物質である。さらに、フェニレフリンは、アドレナリンのカテコール骨格における水酸基を１つ欠く化合物であって、アドレナリンα１受容体に選択的に作用する刺激薬であり、カテコール−Ｏ−メチル基転移酵素（ＣＯＭＴ）による代謝を受けないことから作用時間はノルアドレナリンよりも長いという特徴がある。また、これらの薬剤は必要に応じて塩の形態で投与されてもよい。
【００２２】
アドレナリンα１受容体刺激薬は、非ヒト動物に対してそのまま投与されてもよいが、水溶液の形態で投与されることが好ましい。アドレナリンα１受容体刺激薬を水溶液の形態で投与する場合、当該水溶液におけるアドレナリンα１受容体刺激薬の濃度について特に制限はなく、好ましくは10〜100 mg/mL程度であり、より好ましくは40〜80 mg/mLである。なお、当該水溶液は、従来公知の種々の緩衝液であってもよい。
【００２３】
また、本発明に係る作製方法は、アドレナリンα１受容体刺激薬の酸化を防止するための物質（酸化防止剤）を投与することをさらに含んでもよい。このような構成とすることにより、投与される薬剤の酸化が防止され、所望の量の薬剤を確実に非ヒト動物に対して投与することが可能となる。具体的には、例えば、上述した薬剤の水溶液に対して、薬剤の酸化防止剤を同時に溶解させておくことが好ましい。このような酸化防止剤としては、例えば、還元型グルタチオン、Ｌ−アスコルビン酸、Ｎ−アセチルシステイン、α−トコフェロールなどが挙げられる。
【００２４】
非ヒト動物に対してアドレナリンα１受容体刺激薬（水溶液）を投与する際の投与形態についても特に制限はなく、血圧変動性を引き起こすことが可能な投与形態であればよい。例えば、単回投与、間欠投与、持続投与のいずれであってもよいが、血圧変動性を確実に引き起こすという観点からは、アドレナリンα１受容体刺激薬を持続投与することが好ましい。非ヒト動物に対してアドレナリンα１受容体刺激薬を持続投与する場合の投与期間についても特に制限はなく、好ましくは１日間以上、より好ましくは３日間以上、さらに好ましくは５日間以上、いっそう好ましくは７日間（１週間）以上、特に好ましくは１０日間以上、最も好ましくは１４日間（２週間）以上である。投与期間の上限値についても特に制限はないが、２８日間（４週間）以下程度であれば十分である。
【００２５】
非ヒト動物に対してアドレナリンα１受容体刺激薬（水溶液）を投与する際の投与経路についても特に制限はなく、種々の投与経路が採用可能であるが、非経口的な投与経路であることが好ましい。非経口的な投与経路としては、例えば、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与などが挙げられ、なかでも皮下投与が好ましい。
【００２６】
上述したように、本発明に係る血圧変動性モデル動物の製造方法によって製造された血圧変動性モデル動物は、例えばヒトにおける血圧変動性の予防および／または治療剤のスクリーニング方法に好適に用いられうる。すなわち、本発明の他の形態によれば、上述した本発明の一形態に係る製造方法によって製造された血圧変動性モデル動物が提供される。
【００２７】
当該形態に係る血圧変動性モデル動物は、血圧変動性を示す。具体的には、当該形態に係る血圧変動性モデル動物は、収縮期血圧および／または拡張期血圧の日内変動を示す。ここで、「収縮期血圧および／または拡張期血圧の日内変動を示す」とは、任意の２４時間の期間内において、アドレナリンα１受容体刺激薬を投与されていない正常動物と比較して、収縮期血圧および拡張期血圧の少なくとも一方（好ましくは、収縮期血圧および拡張期血圧の双方）の変動係数（CV）が有意に増大していることを意味する。なお、収縮期血圧および拡張期血圧の日内変動における変動係数（CV）の値は、後述する実施例の欄に記載の手法により算出するものとする。また、本形態に係る血圧変動性モデル動物における収縮期血圧および／または拡張期血圧の変動係数（CV）の具体的な値について特に制限はないが、好ましくは９％以上であり、より好ましくは１０％以上であり、さらに好ましくは１１％以上であり、特に好ましくは１２％以上である。この程度の変動係数（CV）を示す血圧変動性モデル動物は、例えばヒトにおける血圧変動性の予防および／または治療剤のスクリーニング方法に特に好適に用いられうる。
【００２８】
本発明のさらに他の形態によれば、上述した血圧変動性モデル動物を用いた血圧変動性の予防および／または治療剤のスクリーニング方法もまた、提供される。
【００２９】
具体的に、当該形態に係るスクリーニング方法は、上述した血圧変動性モデル動物に被験物質を投与すること、および、当該血圧変動性モデル動物が有する血圧変動性に対する当該被験物質の効果を測定することを含む。
【００３０】
ここで、被験物質としては、例えば、低分子化合物、天然有機高分子物質、天然の動植物の抽出物、ペプチドなどが挙げられる。なお、被験物質の投与量、投与形態、投与経路について特に制限はなく、当業者であれば技術常識を参酌して適宜設定することが可能である。
【００３１】
また、血圧変動性モデル動物が有する血圧変動性に対する上記被験物質の効果を測定する手法についても特に制限はないが、被験物質を投与された血圧変動性モデル動物における収縮期血圧および／または拡張期血圧の変動係数（CV）を指標とすることができる。この場合、血圧変動性モデル動物における収縮期血圧および／または拡張期血圧の変動係数（CV）の値が、被験物質の投与群において、被験物質の非投与群と比較して有意に減少しているときに、当該被験物質は血圧変動性の予防および／または治療剤として有用である可能性があると判断する。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例を用いて本発明についてより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の実施例のみに限定されることはない。なお、以下の実験はすべて、「宮崎大学動物実験規則」に基づき、宮崎大学動物実験委員会の承認のもと実施された（承認番号：2017-509）。
【００３３】
［動物および試薬等の入手］
以下の実験において用いられた動物および試薬等としては、下記の購入先より購入したものを用いた。
【００３４】
ウイスター系ラット：日本チャールズリバー株式会社
浸透圧ミニポンプ：alzet Model 2002、米国DURECT Corporation
ノルアドレナリン：A0906・東京化成工業株式会社
アゼルニジピン：A2433・東京化成工業株式会社
(R)−フェニレフリン塩酸塩：P0398・東京化成工業株式会社
イソプロテレノール塩酸塩（別名：イソプレナリン塩酸塩）：I0260・東京化成工業株式会社
プラゾシン塩酸塩：P0938・東京化成工業株式会社
アテノロール：A1414・東京化成工業株式会社
還元型グルタチオン：Code 17050-14・ナカライテスク株式会社
Ｌ−アスコルビン酸：Code 03420-52・ナカライテスク株式会社、
塩酸メデトミジン：日本全薬工業株式会社
ミダゾラム：サンド株式会社
酒石酸ブトルファノール：Meiji Seikaファルマ株式会社。
【００３５】
［血圧変動性モデル動物の作製例（１）］
６週齢の雄性ウイスター系ラットを購入し、２週間の馴化の後、テレメトリーシステム（Ponemah v.6、Data Science International社）を用いて血圧心拍数をモニターするための送信器（HD-S10：Data Science International社）の植え込み手術を実施した。具体的には、まず、塩酸メデトミジン0.15 mg/kg、ミダゾラム2 mg/kg、酒石酸ブトルファノール 2.5 mg/kgの腹腔内投与により全身麻酔し、痛み刺激に対する反応が消失していることを確認した。その後、開腹して後腹膜内の大動脈を露出させ、血圧心拍数モニター用の送信器（HD-S10）のカテーテルを腹部大動脈に挿入して固定した。次いで、送信器を腹腔内に留置し、腹壁の筋層を縫合しつつ送信器を腹壁に固定し、最後に皮膚を縫合して手術を終了した。これにより、無麻酔無拘束にて自由行動下での血圧および心拍数の測定を大動脈カテーテルから直接行うことを可能とした。
【００３６】
送信器植え込み手術の７日後、手術より十分に回復したことを確認し、テレメトリーシステムにて、血圧値および心拍数が正常域（収縮期血圧：100〜130 mmHg、収縮期血圧：70〜100 mmHg、心拍数：300〜450 mmHg）にあることを確認した。
【００３７】
一方、アドレナリンα１受容体刺激薬であるノルアドレナリンを60 mg/mLの濃度で含有する水溶液を調製した。この際、ノルアドレナリンの酸化防止を目的として、5 mM還元型グルタチオンおよび50 mg/L  Ｌ−アスコルビン酸の水溶液を用いて、ノルアドレナリンを溶解した。このようにして得られたノルアドレナリン水溶液を、浸透圧ミニポンプに充填し、30μg/時間/ラットの持続皮下投与となるように設定した。
【００３８】
続いて、ノルアドレナリンの持続皮下注射のための浸透圧ミニポンプの植え込み手術を実施した。具体的には、まず、塩酸メデトミジン0.15 mg/kg体重、ミダゾラム2 mg/kg体重、酒石酸ブトルファノール 2.5 mg/kg体重の腹腔内投与により全身麻酔し、痛み刺激に対する反応が消失していることを確認した。次いで、ラット背部の皮膚を切開し、ミニポンプ留置のための皮下ポケットを作製し、上記でノルアドレナリン水溶液を充填したミニポンプを皮下に留置した。このようにして、血圧変動性モデル動物を作製した。
【００３９】
［血圧データの取得および処理］
送信器からの血圧波形データは、15分毎に10秒間のデータとして専用の受信器により受信され、受信された血圧波形データはコンピュータに保存された。そして、受信された血圧波形データから、10秒間の血圧値および心拍数の平均値を算出し、その時点（ポイント）の血圧値および心拍数とした。（24時間で96ポイントの測定）。昼間（午前8時から午後8時まで）と夜間（午後8時から午前8時まで）に分けて、収縮期血圧、拡張期血圧および心拍数のそれぞれについて、48回測定の平均値の値から、標準偏差（SD）および変動係数（CV）を算出した。すなわち、15分毎の血圧変動のデータから、変動係数（CV）の値に基づいてその変動性の有無および程度を評価した。なお、統計処理には、IBM社の統計解析ソフトSPSS v25を用いた。また、ノルアドレナリン投与群と非投与群との比較には、一元配置分散分析（ANOVA）に基づいたScheffe検定を用いた。
【００４０】
［実験の結果］
（血圧経過および血圧変動）
収縮期血圧について、実際の記録例を図１に示す。図１の左欄に示すグラフから、ノルアドレナリン（NA）の持続皮下投与前において、ラットの収縮期血圧は、昼間および夜間ともに15分毎に一定の範囲で変動していることが示されている。また、NA持続皮下注射を開始して7日目および14日目には、収縮期血圧が若干上昇していることが確認されたが、収縮期血圧の変動幅が顕著に増大していることがわかる（図１の中欄および右欄）。なお、NA投与群の拡張期血圧においても、およそ同様の変動性増大が観察された。ここで、ラットは夜行性の動物であり、夜間に活動する一方で、昼間は殆ど活動せず大半の時間入眠している。にもかかわらず、本実験において作製されたモデル動物における血圧変動性の増大は昼間および夜間のいずれにおいても観察された。したがって、血圧の変動幅の増大は、ラットの身体活動とは無関係であることがわかる。なお、心拍数については、NA投与群と非投与群との間で有意な差は観察されなかった。
【００４１】
（血圧平均値および血圧値の変動係数の比較）
ノルアドレナリン（NA）の持続皮下投与前、投与7日後および投与14日後の収縮期血圧の平均値の経過を、昼間と夜間とに分けて下記の表１および表２、並びに図２に示す。なお、表１および表２の数値並びに図２のグラフは、NA投与群（ｎ＝６）およびNA非投与群（ｎ＝１０）についての平均±標準誤差として示されている。また、「**」は有意水準１％において有意であること（P<0.01）を示す。
【００４２】
【表１】
2019180411.tif 000003
【００４３】
【表２】
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【００４４】
表１および表２、並びに図２に示す結果から、ノルアドレナリン（NA）の持続投与群においては、非投与群と比較して、収縮期血圧が10〜20 mmHg程度上昇した。また、収縮期血圧の変動係数（CV）は、NA投与の7日後および14日後に、約2倍、有意に上昇していることがわかる。なお、拡張期血圧の変動係数（CV）についてもおよそ同様に上昇していた。
【００４５】
ここで、ラットの血圧値は、収縮期および拡張期ともにヒトと類似していることが知られているが、本実験において作製されたモデル動物が示す血圧の変動係数（CV）は、ヒトの血圧変動性増大の変動係数（CV）と類似している（Kikuya M, et al. Hypertension 2000; 36: 901-906）。したがって、本発明に係るモデル動物は、血圧変動性の疾患モデルとして有用性が高い。なお、ノルアドレナリン非投与群のラットの変動係数も、正常血圧のヒトと同様の値であった。
【００４６】
［ノルアドレナリンによる血圧変動性増大に及ぼすアゼルニジピンの影響］
上述した「血圧変動性モデル動物の作製例（１）」と同様の手法によりノルアドレナリンをラットに持続皮下投与しながら、これと並行して、カルシウム拮抗薬であるアゼルニジピンを10 mg/kg体重/dayの量で混餌により２週間経口投与した。
【００４７】
ここで、上記と同様にして収縮期血圧の日内変動を記録した結果を図３に示す。図３に示すグラフから、ノルアドレナリン（NA）の持続皮下投与によって惹起された血圧変動性の増大（図１）は、アゼルニジピンの投与によって抑制されたことがわかる。ここで、従来、高血圧に罹患した患者を対象にした臨床研究により、アゼルニジピン等の長時間作用型カルシウム拮抗薬は、患者における血圧変動性を縮小させる効果を有することが報告されている（Curr Hypertens Rep 2015; 17: 23）。そして、本発明に係る製造方法によって製造された血圧変動性モデル動物においても、その血圧変動性はカルシウム拮抗薬であるアゼルニジピンによって抑制されたことから、本発明に係る血圧変動性モデル動物は、ヒトにおける血圧変動性の疾患モデルとして有用であるといえる。
【００４８】
［血圧変動性モデル動物の作製例（２）］
アドレナリンα１受容体刺激薬として、ノルアドレナリンに代えて(R)−フェニレフリン塩酸塩（Phe）を用い、150μg/時間/ラットの持続皮下投与となるように設定したこと以外は上述した「血圧変動性モデル動物の作製例（１）」と同様の手法により、血圧変動性モデル動物の作製を試みた。
【００４９】
ここで、上記と同様にして収縮期血圧の日内変動を記録した結果を図４に示す。図４に示すグラフから、(R)−フェニレフリン塩酸塩（Phe）を持続皮下投与した場合であっても、ノルアドレナリンの場合と同様にして血圧変動性モデル動物の作製が可能であることがわかる。
【００５０】
［血圧変動性モデル動物の作製例（３）（比較例）］
ノルアドレナリンに代えて、アドレナリンβ受容体刺激薬であるイソプロテレノール塩酸塩（Iso）を用いたこと以外は上述した「血圧変動性モデル動物の作製例（１）」と同様の手法により、血圧変動性モデル動物の作製を試みた。
【００５１】
ここで、上記と同様にして収縮期血圧の日内変動を記録した結果を図５に示す。図５に示すグラフから、イソプロテレノール塩酸塩（Iso）を持続皮下投与した場合には、投与された動物における血圧変動性の増大は生じないことがわかる。
【００５２】
［ノルアドレナリンによる血圧変動性増大に及ぼすプラゾシンの影響］
上述した「血圧変動性モデル動物の作製例（１）」と同様の手法によりノルアドレナリンをラットに持続皮下投与しながら、これと並行して、アドレナリンα１受容体遮断薬であるプラゾシン塩酸塩を5 mg/ラット/dayの量で飲用水に溶解することにより２週間経口投与した。
【００５３】
ここで、上記と同様にして収縮期血圧の日内変動を記録した結果を図６に示す。図６に示すグラフから、ノルアドレナリン（NA）の持続皮下投与によって惹起された血圧変動性の増大（図１）は、プラゾシン塩酸塩の投与によって抑制されたことがわかる。
【００５４】
［ノルアドレナリンによる血圧変動性増大に及ぼすアテノロールの影響］
上述した「血圧変動性モデル動物の作製例（１）」と同様の手法によりノルアドレナリンをラットに持続皮下投与しながら、これと並行して、アドレナリンβ１受容体遮断薬であるアテノロールを50 mg/ラット/dayの量で飲用水に溶解することにより２週間経口投与した。
【００５５】
ここで、上記と同様にして収縮期血圧の日内変動を記録した結果を図７に示す。図７に示すグラフから、ノルアドレナリン（NA）の持続皮下投与によって惹起された血圧変動性の増大（図１）は、アテノロールの投与によって抑制されなかったことがわかる。
【００５６】
以上の結果をまとめると、(R)−フェニレフリン塩酸塩はアドレナリンα１受容体を選択的に刺激する刺激薬である。このように、(R)−フェニレフリン塩酸塩の投与によって血圧変動性の増大が見られたこと（図４）、アドレナリンβ受容体刺激薬であるイソプロテレノール塩酸塩の投与によっては血圧変動性の増大が見られなかったこと（図５）、アドレナリンα１受容体遮断薬であるプラゾシン塩酸塩の投与によってノルアドレナリン（NA）の投与によって生じた血圧変動性の増大が抑制されたこと（図６）、および、アドレナリンβ１受容体遮断薬であるアテノロールの投与によってはノルアドレナリン（NA）の投与によって生じた血圧変動性の増大が抑制されなかったこと（図７）などの結果から、ノルアドレナリン（NA）や(R)−フェニレフリン塩酸塩（Phe）によるモデル動物における血圧変動性の増大は、アドレナリンα１受容体が刺激されることによるものであることが確認された。したがって、ノルアドレナリンや(R)−フェニレフリン塩酸塩以外のアドレナリンα１受容体刺激薬を用いた場合であっても、上記と同様にして血圧変動性モデル動物の作製が可能であることが強く推認される。
【００５７】
本発明では、ノルアドレナリン（NA）またはフェニレフリン（Phe）といったアドレナリンα１受容体刺激薬を持続的に皮下注射した動物において、血圧が若干上昇し、血圧変動性が約２倍に増大していることが明らかとなった。血圧変動性増大は、高血圧に高頻度に合併する病態であるが、血圧値の上昇とは独立して、血圧値の変動性増大そのものが、心血管・腎臓疾患の危険因子になる（非特許文献３および４を参照）。これまでに、高血圧、脂質異常症、糖尿病、肥満等の危険因子（生活習慣病）を治療、あるいはコントロールするための薬剤が開発されて、生活習慣病の動物モデルを用いた前臨床試験、ならびに臨床治験を経て、生活習慣病治療薬として上市されてきた。しかしながら、増大した血圧変動性に対する治療薬の開発はなされていない。本発明は、血圧変動性増大のモデル動物を提供するものであり、病態モデルとして有用である。本発明に係るモデル動物を用いることにより、血圧変動性を縮小させる薬剤の開発、ならびに既存の薬剤の血圧変動性増大に対する薬効評価が可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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