(57)【要約】【課題】バキュロウイルスゲノムの提供。【解決手段】バキュロウイルスゲノムのうちlef-12遺伝子及びbro-e遺伝子が欠損された、バキュロウイルスゲノム。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バキュロウイルスのゲノムのうちlef-12遺伝子及びbro-e遺伝子が欠損された、バキュロウイルスゲノム。
【請求項２】
バキュロウイルスが、カイコ核多角体病ウイルスである請求項１に記載のゲノム。
【請求項３】
下記遺伝子地図を有する、請求項１又は２に記載のゲノム。
【化３】
2019180300.tif 000027
【請求項４】
以下の(a)又は(b)の塩基配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のゲノム。
(a) 配列番号１に示す塩基配列
(b) 配列番号１に示す塩基配列と99％以上100％未満の同一性を示す塩基配列
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のゲノムに、細菌人工染色体の塩基配列が導入されたバクミド化バキュロウイルスゲノム。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のゲノムを有するバキュロウイルス。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のゲノムに、目的タンパク質をコードする遺伝子が導入された、組換えバキュロウイルスゲノム。
【請求項８】
請求項７に記載の組換えバキュロウイルスゲノムを有する組換えバキュロウイルス。
【請求項９】
請求項８に記載の組換えバキュロウイルスを、宿主昆虫又は宿主昆虫細胞に感染させることにより得られる、昆虫又は昆虫細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の昆虫又は昆虫細胞を飼育又は培養し、目的タンパク質を発現させる工程と、目的タンパク質を回収する工程とを含む、目的タンパク質の製造方法。
【請求項１１】
宿主昆虫がカイコである請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バキュロウイルス標準株のゲノムからlef-12遺伝子及びbro-e遺伝子が欠損された、バキュロウイルスゲノム（欠損型ゲノム）、当該欠損型ゲノムを有するウイルスを用いたタンパク質の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
バキュロウイルスは、昆虫を主な宿主として感染する核多角体病ウイルス（Nucleopolyhedrovirus：NPV）であり、増殖過程で感染細胞の核内にポリヘドリン（Polyhedrin、多角体）と呼ばれる結晶構造のタンパク質を形成する。このポリヘドリン遺伝子を発現する強力なプロモーターの下流に目的タンパク質をコードする遺伝子を導入して組換えウイルスを作製すると、この組換えウイルスを昆虫又は昆虫細胞に感染させることで目的タンパク質を大量に生産させることができる。
【０００３】
核多角体病ウイルスを用いたタンパク質の発現系として、塩基対の数が、天然のカイコ（Bombyx mori）核多角体病ウイルス（BmNPV）の標準株のゲノムと比較して少なくとも18.31％低減され、感染性バキュロウイルス中に組み立てられているBmNPVゲノムを用いた発現系（特許文献１）、BmNPV標準株のDNAの多角体蛋白構造遺伝子部分に、その遺伝子の全部又は一部と、所望の蛋白の構造遺伝子を、結合手塩基配列を介してまたは介さずに連結した型の塩基配列を有する、組換カイコ核多角体病ウイルスを用いた発現系（特許文献２）が知られている。
しかしながら、標準株を用いた発現系では、バックグラウンドのタンパク質発現などが生じるため、相対的に発現強度が低下する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】特表2016-509484号公報
【非特許文献２】特開平7-289270号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、目的タンパク質を高生産させることが可能な、バキュロウイルス発現系を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、バキュロウイルス標準株のゲノムからlef-12遺伝子及びbro-e遺伝子が欠損された、欠損型バキュロウイルスゲノムを単離し、これを用いることにより目的タンパク質を高生産させることに成功し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）バキュロウイルスのゲノムのうちlef-12遺伝子及びbro-e遺伝子が欠損された、バキュロウイルスゲノム。
（２）バキュロウイルスが、カイコ核多角体病ウイルスである（１）に記載のゲノム。
（３）下記遺伝子地図を有する、（１）又は（２）に記載のゲノム。
【化１】
2019180300.tif 000002
（４）以下の(a)又は(b)の塩基配列を有する、（１）〜（３）のいずれか１項に記載のゲノム。
(a) 配列番号１に示す塩基配列
(b) 配列番号１に示す塩基配列と99％以上100％未満の同一性を示す塩基配列
（５）（１）〜（４）のいずれか１項に記載のゲノムに、細菌人工染色体の塩基配列が導入されたバクミド化バキュロウイルスゲノム。
（６）（１）〜（５）のいずれか１項に記載のゲノムを有するバキュロウイルス。
（７）（１）〜（５）のいずれか１項に記載のゲノムに、目的タンパク質をコードする遺伝子が導入された、組換えバキュロウイルスゲノム。
（８）（７）に記載の組換えバキュロウイルスゲノムを有する組換えバキュロウイルス。
（９）（８）に記載の組換えバキュロウイルスを、宿主昆虫又は宿主昆虫細胞に感染させることにより得られる、昆虫又は昆虫細胞。
（１０）（９）に記載の昆虫又は昆虫細胞を飼育又は培養し、目的タンパク質を発現させる工程と、目的タンパク質を回収する工程とを含む、目的タンパク質の製造方法。
（１１）宿主昆虫がカイコである（１０）に記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、目的タンパク質を高生産させることが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】バキュロウイルス（Q4株）ゲノムの遺伝子地図である。
【図２】実施例２におけるEGFPの蛍光強度を示すグラフである。
【図３】（ａ）は、実施例２におけるIL2発現のウエスタンブロット結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）の結果を数値化したグラフである。
【図４】（ａ）は、実施例２におけるST6Gal1発現のウエスタンブロット結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）の結果を数値化したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、標準株と比較してゲノムの塩基配列に違いを有する新規バキュロウイルス株（Alphabaculovirus Bombyx mori nucleopolyhedrovirus）のゲノムに関するものであり、新規バキュロウイルスゲノムに目的のタンパク質をコードする遺伝子（「目的タンパク質遺伝子」ともいう。）を導入し、当該導入したゲノムを有する組換えバキュロウイルスをカイコ幼虫等の宿主に感染させることにより、目的タンパク質を高生産させることを特徴とする。
本発明のバキュロウイルスは、バキュロウイルス科に属するウイルスであるが、本明細書では、「本発明のバキュロウイルス」、又は単に「本発明のウイルス」などと呼ぶこともある。
【００１１】
本発明の一態様は、バキュロウイルスのゲノムのうちlef-12遺伝子及びbro-e遺伝子が欠損された、バキュロウイルスゲノムである。バキュロウイルスゲノムは、カイコ核多角体ウイルスゲノム、例えばバキュロウイルス標準株（タイプストレイン）のゲノムに含まれる遺伝子のうち、lef-12遺伝子及びbro-e遺伝子が欠損したゲノムである。（本明細書において「欠損型ゲノム」ともいう。）
【００１２】
１．バキュロウイルスゲノムの単離
（１）ウイルスの採取
核多角体ウイルス（NPV）は、カイコの疾病である核多角体病の病原ウイルスとして知られている。NPVに感染したカイコ幼虫は、体色変化、環節間膜の隆起などの特異な外部病変の特徴を有し、最終的に破損した皮膚から白濁した体液を漏出する。この体液を膿汁と呼ばれる。これにより、カイコの核多角体病は膿病と呼ばれている。
上記膿病カイコからウイルスを採取する。
採取法は特に限定されるものではないが、膿病カイコの血液などから常法に従って採取すればよい。
採取したウイルスは、カイコ培養細胞に感染させて培養することにより維持することができる。
【００１３】
（２）ウイルスゲノムDNAの回収
上記採取されたウイルスからのゲノムDNAの回収は、例えば、ウイルス感染細胞を培養した後、培養上清から、PEG/NaCによるウイルス粒子の沈殿、SDS およびプロテアーゼ処理によるウイルス粒子の破壊、およびフェノール・クロロホルム処理によって抽出することにより回収する。
【００１４】
（３）ターゲティングベクターの作製
ウイルスゲノムを大腸菌での継続的な維持、および目的タンパク質遺伝子をBac-to-Bacシステムで導入可能にするために、Bacmid（バクミド）化を行う。
【００１５】
そのために、ポリヘドリン遺伝子を標的として遺伝子ターゲティングを行い、Bacmid（バクミド）に必要なDNA断片をウイルスゲノムに導入する。
ターゲティングベクターは、例えば次のようにして作製することができる。
BmNPV/T3（T3標準株）のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーとして 例えば5'AACAATGCGCGCGTTGTCGCATCTCAACAC-3'（配列番号２） 及び 5'-TAAACCTCAACCCGCTGCACCTTTAGACGA-3'（配列番号３）で示される核酸を用いて、miniF 断片及びバキュロウイルスの近接配列（orf134 および orf1629）を PCR によって増幅する。得られたPCR 断片をpBlueScriptSK+のEcoRV サイトにクローニングし、得られたベクターをターゲティングベクターとする。
【００１６】
（４）ウイルスゲノムのBacmid化及び配列決定
Bacmid（バクミド）とは、昆虫および昆虫細胞と大腸菌で複製可能なシャトルベクターであり、昆虫で増殖するバキュロウイルスのゲノムDNAに大腸菌内で自律複製するように細菌人工染色体（BAC）の配列（例えばmini-Fレプリコン）を導入したDNAである。ウイルスゲノムをBacmid化し、Bacmidを有する大腸菌を培養することにより、配列決定するためのDNAを調製することができる。
DNAの塩基配列は、シーケンサー解析を行うことにより、決定することができる。
【００１７】
決定されたゲノムDNAの塩基配列を配列番号１に示す。
なお、配列番号１に示す塩基配列は、Bacmid化の際に導入された塩基配列および欠失されたpolyhedrin遺伝子の塩基配列の情報は除外されている。
本発明は、(a) 配列番号１に示す塩基配列を有するゲノムのほか、(b) 配列番号１に示す塩基配列と98％以上100％未満の同一性を示す塩基配列を有するゲノムも提供する。
上記(a)に示すゲノムは、目的タンパク質遺伝子を組み込んだときに、T3標準株のゲノムよりも遺伝子を高発現させ、T3標準株が産生する目的タンパク質よりも多量に目的タンパク質を生産することができる。上記(b)に示すゲノムも(a)に示すゲノムと同様に、目的タンパク質遺伝子を組み込んだときに、T3標準株のゲノムよりも遺伝子を高発現させ、T3標準株が産生する目的タンパク質よりも多量に目的タンパク質を生産することができる。
配列番号１に示す塩基配列と98％以上100％未満の同一性を示す塩基配列としては、例えば、98.5％以上、99％以上、99.5％以上、99.7％以上、又は99.9％以上の同一性を有する塩基配列を挙げることができる。
【００１８】
本発明のゲノムは、バキュロウイルスT3標準株のゲノムDNAと比較して、lef-12遺伝子及びbro-e遺伝子が欠損したものである。T3標準株では、lef-12遺伝子及びbro-e遺伝子が存在するが、本発明のゲノムにはこれらの遺伝子が存在しない。本発明のゲノム（例えば配列番号１に示す塩基配列からなるゲノム）は、バキュロウイルスT3標準株のゲノムDNAと比較して1160か所の変異（欠失、置換、挿入等）を有しており（実施例、表１〜３）、T3標準株のゲノムDNAの塩基配列と比較すると、相互に2.3%の違いを有する。
【００１９】
また、配列番号１に示す塩基配列からなるゲノムの遺伝子地図を、以下に示す（図１）。
【化２】
2019180300.tif 000003
【００２０】
一旦本発明のゲノムDNAの塩基配列が決定された後は、本発明のゲノムDNAは、化学合成により、又はPCRにより取得することができる。
また、バキュロウイルスT3標準株のゲノムDNAを、上記lef-12遺伝子及びbro-e遺伝子を欠損させるようにターゲティングさせ、構築することができる。例えば、相同組換えを利用する方法等により行われる。
【００２１】
なお、本発明のバキュロウイルスゲノム又はバクミド化したバキュロウイルスゲノム（本明細書において「バクミド化バキュロウイルスゲノム」ともいう。）は、目的タンパク質遺伝子を組み込むためのベクターとして用いることができる。
【００２２】
さらに、本発明は、上述のバキュロウイルスゲノム又はバクミド化バキュロウイルスゲノムを有するバキュロウイルスを提供する。
【００２３】
２．組換えバキュロウイルスゲノムおよび組換えバキュロウイルス
本発明においては、さらに、上述のバキュロウイルスゲノム又はバクミド化バキュロウイルスゲノムに目的タンパク質遺伝子を導入することにより、組換えバキュロウイルスゲノムを作製することができる。得られた組換えバキュロウイルスゲノムは、目的タンパク質発現用ベクターとして用いることができる。
目的タンパク質発現用ベクターにおいて、目的タンパク質遺伝子が挿入される領域は、目的タンパク質が発現する限り特に限定されるものではない。例えば、ポリヘドリン遺伝子のプロモーター領域の下流が挙げられる。強力なポリヘドリン遺伝子プロモーターの制御下で目的タンパク質遺伝子が発現することができるため、大量の目的タンパク質を得ることができる。
【００２４】
組換えバキュロウイルスゲノムの作製方法としては、ウイルスゲノム及びトランスファーベクターを用いて相同組換えを利用する方法、バクミド化バキュロウイルスゲノム（Bacmid）にトランスポゾンを利用して大腸菌内で外来遺伝子を挿入する方法などがある。
【００２５】
相同組換えを利用する方法では、相同組換え用ベクターは、本発明の組換えバキュロウイルスゲノムを製造するためのトランスファーベクターとして用いることができる。
バキュロウイルスゲノムには、ポリヘドリンプロモーター配列、及びポリヘドリン遺伝子が含まれている。
トランスファーベクターは、ポリヘドリン遺伝子は有さないが、ポリヘドリンプロモーター、及びその下流に目的タンパク質遺伝子を有しており、ポリヘドリンプロモーターの上流、及び目的タンパク質遺伝子の下流に、バキュロウイルスゲノムと同じ塩基配列（相同配列）が含まれている。そしてポリヘドリンプロモーターの下流に目的タンパク質遺伝子を組み込んだトランスファープラスミドベクターを作製し、本発明のバキュロウイルスゲノムとトランスファープラスミドベクターとをコトランスフェクトすると、細胞内で相同組換えによりポリヘドリン遺伝子が目的タンパク質遺伝子に置換され、目的タンパク質遺伝子が組み込まれた組換えバキュロウイルスゲノムが作製される。
【００２６】
トランスファーベクターとしては、例えばFタンパク質をコードする遺伝子、マーカー遺伝子が組込まれたベクターを挙げることができる。またマーカー遺伝子としては、例えば蛍光タンパク質遺伝子（例えば、GFP、EGFP、ECFP、EYFP、DsRed2等）、βガラクトシダーゼ遺伝子、又は薬剤耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子）を挙げることができる。また、マーカー遺伝子以外に、プロモーター遺伝子、エンハンサー、タンパク質分泌シグナル、His-Tag、STREPII-tag、プロテアーゼ認識配列、又はpoly(A)付加シグナルなどのエレメントを単独で、又は適宜組み合わせて含めることもできる。
【００２７】
Bacmidを利用した方法は、前記の通りトランスポゾンによる部位特異的組換えを利用して大腸菌内で組換えバキュロウイルスを作製する方法であり、Bac-to-Bac バキュロウイルス発現システムとしてキット化されている（Invitrogen）。大腸菌に、Bacmid化したバキュロウイルスゲノムと目的タンパク質遺伝子を組み込んだトランスファーベクターを入れ、目的タンパク質遺伝子が挿入された組換えバキュロウイルスゲノムを大腸菌から精製することで組換えBacmidが作製される。
【００２８】
Bacmidには、大腸菌のトランスポゾンTn7の結合部位を挿入したマーカー遺伝子（例えばLacZ）を組み込むこともできる。Tn7の両端には反復配列が存在するので、便宜上、一端の反復配列をTn7L、他端の反復配列をTn7Rとする。当該反復配列の間（Tn7LとTn7Rとの間）にポリヘドリンプロモーター及び目的タンパク質遺伝子を導入したトランスファーベクター（ドナープラスミドという）を作製し、これを、トランスポザーゼを発現するプラスミド（ヘルパープラスミド）とともに大腸菌（マーカー遺伝子欠損大腸菌）に導入すると、トランスポザーゼの作用により、トランスファーベクター中の反復配列の間に存在する目的タンパク質遺伝子を含む領域がBacmidに転位し、組換えBacmidが生成する。大腸菌はマーカー遺伝子（上記の例ではLacZ）を欠いているので、転位が起こるとBacmid上のLacZが不活性化するため、発色基質を含む寒天プレート上では、白色のコロニーを形成する。転位が起きていない大腸菌は青色のコロニーを形成するため、両者を容易に区別することができる。その後、大腸菌から組換えBacmidを精製する。
【００２９】
組換えバキュロウイルスゲノム又は組換えバクミドを昆虫細胞にトランスフェクションすることにより、組換えバキュロウイルスを生成することができる。そして、組換えバキュロウイルスを宿主に感染させることにより目的タンパク質を生産することができる。生産された目的タンパク質は宿主（例えばカイコ）中に蓄積されるか、あるいは宿主体液中に放出されるため、これらのタンパク質を採取することにより、目的タンパク質を取得することができる。
【００３０】
本発明において、組換えバキュロウイルスの作製に使用するバキュロウイルスの種類としては、オートグラファカリフォニカ核多角体病ウイルス(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus:AcNPV)、カイコ核多角体病ウイルス(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus:BmNPV)、オルギア・シュードツガタ核多角体病ウイルス（Orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus:OpNPV）、マイマイガ核多角体病ウイルス(Lymantria disper multiple nucleopolyhedrovirus:LdNPV)などが挙げられる。
【００３１】
３．組換えバキュロウイルス感染の宿主細胞および目的タンパク質の生産
本発明は、上記組換えバキュロウイルスを、宿主昆虫または宿主昆虫細胞（例えば昆虫の培養細胞）に感染させることにより得られる昆虫または昆虫細胞を提供する。
【００３２】
宿主となる昆虫としては、鱗翅目昆虫が挙げられ、タンパク質の発現に適する限り特に限定されず、例えば、カイコ(Bombyx mori)などが挙げられる。なお、上記昆虫は、成虫、蛹及び幼虫のいずれの形態であってよい。また、鱗翅目昆虫の細胞としては、タンパク質の発現に適する細胞株であれば特に限定されず、例えばOyanagi-2、BmN、BmN4、Bme21、SpIm、Anpe、Sf9、Sf21などが挙げられる。
【００３３】
本発明の組換えバキュロウイルスを昆虫又は昆虫細胞に感染させる手段は特に限定されるものではない。昆虫に感染させる場合は、組換えバキュロウイルスを含む液を昆虫に注射する方法などが挙げられる。また、宿主昆虫細胞に感染させる場合は、組換えバキュロウイルスを含む液を細胞培養培地に添加すればよい。昆虫又は昆虫細胞に組換えバキュロウイルスを感染させてから５〜８日間飼育又は培養すると、宿主昆虫又は宿主昆虫細胞において、タンパク質が発現している。
【００３４】
本発明の組換えバキュロウイルスを用いて昆虫を利用した発現系、又は細胞を利用した発現系により、目的タンパク質を生産することができる。
本発明の目的タンパク質の製造方法は、上述の組換えバキュロウイルスを、昆虫又は昆虫細胞に感染させる工程、及び前記感染した昆虫若しくは昆虫の分泌物又は昆虫細胞若しくは培養液から目的タンパク質を回収する工程を含む。
【００３５】
本発明の製造方法において、目的タンパク質の回収は、通常の方法を用いることができる。
目的タンパク質を回収する試料としては、例えばカイコ幼虫の体液、脂肪体又は細胞、カイコ蛹の細胞、あるいは培養細胞又はその培養上清を用いることができる。
【００３６】
目的タンパク質が細胞内に生産される場合には、例えば、細胞を破砕した細胞破砕液を使用する。また、目的タンパク質が細胞外に生産される場合には、例えば、体液または培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により細胞を除去した体液または培養液を使用する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のタンパク質を単離精製することができる。
【００３７】
本発明において、目的タンパク質遺伝子としては、特に限定されるものではない。例えば、目的タンパク質として、酵素、ホルモン、ペプチド、サイトカイン、人工的にデザインされた融合タンパク質などが挙げられる。
ここで、「目的タンパク質をコードする遺伝子」又は「目的タンパク質遺伝子」は、標準株のバキュロウイルスゲノムに含まれているか否かにかかわらず、外部から導入した外来遺伝子を意味する。同一の遺伝子がバキュロウイルスゲノム内に存在しても外来遺伝子に該当する。
【００３８】
実施例
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
１．方法
（１）膿病蚕からのウイルスの採取
* 九州大学農学部付属指宿試験地で発生した膿病蚕を採取
* 膿病蚕よりウイルス粒子を含む血液を採取
* 回収した血液にフェニルチオ尿素粉末を褐変防止のために少量添加
【００４０】
（２）培養細胞でのウイルスの増殖
* 採取した血液を 1xPBS(-) で 2 - 5 倍程度に希釈し、濾過滅菌
* 濾過滅菌した希釈血液を T-25 フラスコで 80% コンフルエント状態のカイコ培養細胞 Oyanagi-2 の培養液に滴下し、培養細胞に感染
* IPL-41 培地を用いてウイルス感染細胞を 23℃で維持
【００４１】
（３）ウイルスゲノム DNA の回収
* 1 週間後に多核体の形成を確認後、培養上清を回収
* 培養上清に 5μg/ml になるように DNaseI および RNaseA を加えて 37℃、60 分処理し、Oyanagi-2 由来の核酸を消化
* 等量の PEG/NaCl (20% PEG6000, 2 M NaCl) を加え、氷上で 1 時間インキュベート
* 3,000 rpm、0℃で 20 分間の遠心分離を行い、ウイルス粒子を沈殿させる
* 上清を除き、1xPBS(-) で再懸濁
* EDTA と SDS をそれぞれ 10 mM および 0.1% (w/v) となるように加え、50μg/ml となるようにProteinase K を加えて、60℃で 15 分間インキュベート
* Tris-Phenol、PCI、Chloroform で各一回ずつ処理を行い、穏やかに抽出
* 水層を回収し、等量のイソプロパノールを加えて DNA を沈殿
* 14,000 rpm、30 分間遠心分離
* 上清を除き、70% EtOH で洗浄
* 上清を除き、乾燥させて少量の TE pH 8.0 に DNA を溶解
【００４２】
（４）ウイルスゲノム DNA のターゲティングベクターの作製
* BmNPV/T3 のゲノムDNA を鋳型とし、下記プライマーを用いて、miniF 断片及びバキュロウイルスの近接配列（orf134 および orf1629）をPCR によって増幅
5'-AACAATGCGCGCGTTGTCGCATCTCAACAC-3'（配列番号２）
5'-TAAACCTCAACCCGCTGCACCTTTAGACGA-3'（配列番号３）
* PCR 断片を pBlueScriptSK+ の EcoRV サイトにクローニング
【００４３】
（５）ウイルスゲノムの Bacmid 化
* 抽出したウイルスゲノム DNA と miniF 断片を含む pBlueScriptSK+ を Promega 社の FuGENE HD を用いて共に 24-well プレートに 5.0 x 104 で播種した Oyanagi-2 へ導入
* IPL-41 培地を用いて Oyanagi-2 細胞を 23℃で維持
* 培養細胞内での自然組換えにて miniF 断片をウイルスゲノム DNA に導入し、同時に polyhedrin 遺伝子を破壊
* 1 週間程度で培養上清を回収し、前述の方法でウイルスゲノムDNA を精製
* 精製したウイルスゲノム DNA を大腸菌 DH10B に形質転換
* カナマイシンを 50μg/ml で含む LB 寒天培地で大腸菌を培養
* 形成されたコロニーをプレートから全て掻き取り、アルカリ法で Bacmid を抽出
【００４４】
* 得られた Bacmid を Promega 社の FuGENE HD を用いて共に 24-well プレートに 5.0 x 104 で播種した Oyanagi-2 へ導入
* IPL-41 培地を用いて Bacmid 導入細胞を 23℃で維持
* 1 週間後に培養上清を回収し、前述の方法でウイルスゲノムDNA を精製
* 精製したウイルスゲノム DNA を大腸菌 DH10B に形質転換
* カナマイシンを 50μg/ml で含む LB 寒天培地で大腸菌を培養
【００４５】
* 大腸菌のコロニーを一つずつカナマイシンを 50μg/ml で含む LB 液体培地で培養し、大腸菌体より Bacmid をアルカリ法にて抽出
* 各 Bacmid クローンにレポーターとして EGFP を Bac-to-Bac システムで導入
* 各 Bacmid クローンを Promega 社の FuGENE HD を用いて共に 24-well プレートに 5.0 x 104 で播種した Oyanagi-2 へ導入
* IPL-41 培地を用いて Bacmid 導入細胞を 23℃で維持
* 培養上清を回収し、6-well プレート 80% コンフルエント状態の Oyanagi-2 の培養液に滴下
* IPL-41 培地を用いて Bacmid 導入細胞を 23℃で維持
【００４６】
* 培養上清を回収し、T-25 フラスコで 80% コンフルエント状態のカイコ培養細胞 Oyanagi-2 の培養液に滴下
* EGFP の蛍光でウイルスの増殖が確認できるもののうち、最も発現・増殖効率の高い株をゲノムシーケンスの対象として選抜
* 蛍光の観察された Bacmid を保持する大腸菌を保存
【００４７】
（６）ウイルスゲノムの塩基配列の次世代シーケンサー解析
* Bacmid を保持する大腸菌を LB 液体培地で培養
* Bacmid をアルカリ法にて抽出
* illumina 社のTruSeq DNA PCR-Free LT Sample Prep Kit を用いて、製品マニュアルに従いシーケンス用 DNA ライブラリを作製
* Miseq Reagent Kit v2 を用いて、DNA ライブラリの次世代シーケンサー解析を実施
【００４８】
（７）ウイルスゲノムの塩基配列のアセンブル
* Miseq より出力された配列データを FastQC を用いて品質を確認
* PRINSEQ を用いて、アダプター配列のコンタミを除去し、QC（品質チェック） を実施
* BmNPV/T3 のゲノムDNA と大腸菌 DH10B のゲノム DNA で相同性のある領域をマスクして、BWAツール（Burrows-Wheeler Alignment Tool）を用いて DH10B のゲノム DNA のインデックスを作製
* QC 後の配列データを上記の DH10B ゲノム DNA にマッピング
* DH10B ゲノム DNA にマッピングされなかった配列を回収
* 回収した配列をKmerGenie を用いて k-mer 解析し、アセンブルに最適な k-mer 長を推定
* 決定した k-mer 長（k=111）を用いて ABySS にてde novo assembly を実施
* 出力された配列データにギャップ領域がないことを確認
* これをバキュロウイルス Q4 株のゲノムの塩基配列（配列番号１）とした
【００４９】
（８）ウイルスゲノム DNA の多型のアノテーション
* アセンブルした Q4 株のゲノムの塩基配列を NCBI Refseq の BmNPV T3 株 (Accession No. NC_001962.1) のゲノムの塩基配列をリファレンスとして MAFFT を用いてアラインメント
* 自作の Python スクリプトで DNA 配列間の多型を VCF4 形式で出力
* T3 株のゲノムアノテーション情報を元に ANNOVAR で Q4 株の多型をアノテーション
* 表としてまとめた（表1〜表3）
* Q4 株は lef-12遺伝子および bro-e 遺伝子を欠損
【００５０】
【表１】
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【００５１】
【表２】
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【００５２】
【表３】
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【００５３】
（９）Q4 株ゲノム DNA のアノテーション
* T3 株の GFF3 形式のアノテーション情報を多型情報を元に Q4 株のアノテーション情報に変換
* これを Q4 株のゲノムアノテーション情報とし、遺伝子地図を作製した（図1）
【実施例２】
【００５４】
タンパク質発現
（１）カイコ培養細胞における Q4 株ゲノムのタンパク質発現性能試験
* polyhedrin プロモーターの下流に目的タンパク質遺伝子としてEGFP遺伝子を繋いだトランスファーベクターを作製し、これを、バクミド化T3株ゲノム又はバクミド化Q4株ゲノムとともにトランスフェクトし、組換えバキュロウイルスを作製
* 各ウイルス液の一部から DNA を抽出し、PCR にてゲノム DNA 量を計測
* ゲノム DNA 量でウイルス液のウイルス粒子数を揃え、各ウイルス液を Oyanagi-2 細胞の培養液に添加
* 23℃で 1 週間培養し、 24 時間ごとにレポーターの EGFP の蛍光強度にて発現量を計測（図2）
【００５５】
（２）カイコ幼虫における Q4 株ゲノムのタンパク質発現性能試験
* カイコ 30K タンパク質分泌シグナル、Hisx8-tag、STREPII-tag、TEV プロテアーゼ認識配列、ヒト IL2 もしくはヒト ST6Gal1 を polyhedrin プロモーターの下流に配置した遺伝子発現コンストラクトを、バクミド化T3株ゲノム又はバクミド化Q4株ゲノムとともにトランスフェクトし、組換えバキュロウイルスを作製
* カイコ 5 齢 3 日目幼虫に各組換えバキュロウイルス液を接種し、感染 72 時間後（72 hpi）に血清を回収
* 3 個体の血清を等量に混合したものを 1 サンプルとして Western blot により評価・定量
* 画像処理ソフトにてバンドの強度を数値化し、それぞれの株のタンパク質生産性能を評価（図3、4）
【００５６】
（３）結果
図２より、昆虫培養細胞におけるウイルス粒子の生産能力は、組換えに使用したT3株（標準株）ゲノムとQ4株（本発明のバキュロウイルス）ゲノムはほぼ同等であることが示された。
図３、４より、カイコ幼虫におけるタンパク質生産能力は、使用したウイルス株としてQ4株の方が、T3株よりも短期で大量に生産する能力を有することが示された。
なお、図２〜４において、「T3」は、バクミド化T3株ゲノムに、EGFP遺伝子、IL2遺伝子又はST6Gall遺伝子を挿入した組換えバキュロウイルスゲノムを有する組換えウイルスを表す。また「Q4」は、バクミド化Q4株ゲノムに、EGFP遺伝子、IL2遺伝子又はST6Gall遺伝子を挿入した組換えバキュロウイルスゲノムを有する組換えウイルスを表す。図は、これらの組換えウイルスをカイコ幼虫に感染させたときのEGFPの蛍光強度、又はIL2並びにST6Gallの生産結果を表す。
【配列表フリーテキスト】
【００５７】
配列番号２：合成DNA
配列番号３：合成DNA
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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