(57)【要約】【課題】細胞の内部に簡便に外来物質を導入することが可能なキャピラリーチップを提供すること。【解決手段】キャピラリーチップ２０は、細胞３０と外来物質３２とを含む分散液３６の供給部に接続される接続部２０Ａと、細胞３０を変形することによって細胞３０の内部に外来物質を導入する変形部２０Ｃと、を備える。キャピラリーチップ２０は、接続部２０Ａから変形部２０Ｃに向かって分散液が流通する流路２２を備える。変形部２０Ｃでは、流路２２の内壁２２Ａに細胞３０を接触させて細胞３０を変形させる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞と外来物質とを含む分散液の供給部に接続される接続部と、
細胞を変形することによって細胞の内部に外来物質を導入する変形部と、を備えるキャピラリーチップ。
【請求項２】
細胞を含む第１分散液を、外来物質を含む第２分散液に配合するキャピラリーチップであって、
第１分散液の供給部に接続される接続部と、細胞を変形する変形部と、を備え、
第１分散液を第２分散液に配合して、変形部で変形した細胞の内部に前記外来物質を導入するキャピラリーチップ。
【請求項３】
接続部から変形部に向かって分散液が流通する流路を備え、
変形部では、流路の内壁に細胞が接触して細胞が変形する、請求項１又は２に記載のキャピラリーチップ。
【請求項４】
変形部は細胞が同時に接触する対向面を備えており、
細胞は当該対向面に接触して変形する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキャピラリーチップ。
【請求項５】
対向面の間隔は３０μｍ以下である、請求項４に記載のキャピラリーチップ。
【請求項６】
接続部から変形部に向かって細くなるようにテーパー状に形成された流路を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキャピラリーチップ。
【請求項７】
一つの管体で構成される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のキャピラリーチップ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のキャピラリーチップと、分散液の供給部と、を備え、細胞に外来物質を導入する装置。
【請求項９】
キャピラリーチップに細胞と外来物質とを含む分散液を供給して流通させる工程、を有し、
分散液を流通させながら細胞を変形することによって細胞の内部に外来物質を導入する、外来物質の導入方法。
【請求項１０】
キャピラリーチップに細胞を含む第１分散液を供給し流通させながら細胞を変形する第１工程と、
前記キャピラリーチップを流通した第１分散液を、外来物質を含む第２分散液に配合して、第１工程で変形した細胞の内部に外来物質を導入する第２工程と、を有する、外来物質の導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、キャピラリーチップ及びこれを備える装置、並びに細胞への外来物質の導入方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞に遺伝子又は高分子等の外来物質を導入する技術としては、例えば、ウイルスベクターを用いる方法と、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法等の非ウイルスベクター系の方法が知られている。ウイルスベクターを用いる方法はウイルスが有している細胞侵入機構を利用するものである。具体的には標的となる細胞内に導入する遺伝子が組み込まれたウイルスベクターを作製し、細胞を感染させる。このようにして、標的細胞内に遺伝子等の外来物質を導入する。
【０００３】
一方、リポフェクション法では、リポソームが細胞膜と結合して細胞内に取り込まれるエンドサイトーシス現象によって標的細胞内に外来物質を導入する。エレクトロポレーション法は、高電圧パルスを細胞に印加し、細胞膜に形成された小孔から外来物質を導入する方法である。マイクロインジェクション法は、ガラス針を細胞に直接穿刺して標的細胞内に外来物質を注入する方法である。
【０００４】
外来物質を導入する別の技術として、非特許文献１では、高分子シートにレーザー光でマイクロ流路を形成し、当該マイクロ流路に細胞と外来物質である蛍光分子とを含む分散液を流通させることによってシェア応力を付与する技術が提案されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】“Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics”, Biotechnol Bioeng. 2008 March 1; 99(4): 846-854.doi:10.1002/bit.21651.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ウイルスベクターを用いる従来の外来物質の導入技術は、例えば、導入できる外来物質が遺伝子に限られる場合もあるし、導入効率が低くなる場合もある。また、従来の非ウイルスベクター系の方法は、例えば、導入操作に手間を要したり、熟練を必要としたりするものが多く、細胞生存率が低くなる場合もある。また、上記非特許文献１の技術は、装置構成が複雑であるうえに、導入効率を十分に高くすることができない。このため、シンプルな装置構成でありながら、細胞に簡便に外来物質を導入する技術を実現することが望まれる。
【０００７】
そこで、本開示は、一つの側面において、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することが可能なキャピラリーチップを提供することを目的とする。本開示は、別の側面において、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することが可能な装置を提供することを目的とする。本開示は、また別の側面において、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することが可能な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、一つの側面において、細胞と外来物質とを含む分散液の供給部に接続される接続部と、細胞を変形することによって細胞の内部に外来物質を導入する変形部と、を備えるキャピラリーチップを提供する。
【０００９】
上記キャピラリーチップは、供給部に接続される接続部と外来物質を導入する変形部とを備える。このようなキャピラリーチップは、複雑な構造にする必要がなく、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することができる。
【００１０】
本開示は、別の側面において、細胞を含む第１分散液を、外来物質を含む第２分散液に配合するキャピラリーチップであって、第１分散液の供給部に接続される接続部と、細胞を変形する変形部と、を備え、第１分散液を第２分散液に配合して、変形部で変形した細胞の内部に外来物質を導入するキャピラリーチップを提供する。
【００１１】
細胞は変形部で変形した後も、暫くの間は細胞膜の透過性が高い状態が継続する。したがって、変形部で変形した後に、細胞を含む第１分散液を、外来物質を含む第２分散系に配合すると、細胞の内部に外来物質を導入することができる。このようなキャピラリーチップも、複雑な構造にする必要がなく、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することができる。
【００１２】
上記キャピラリーチップは、接続部から変形部に向かって分散液が流通する流路を備え、変形部では、流路の内壁に細胞が接触して細胞を変形してもよい。これによって、十分円滑に細胞内に外来物質を導入することができる。
【００１３】
上記キャピラリーチップの変形部は、細胞が同時に接触する対向面を備えており、細胞は変形部において当該対向面に接触して変形してもよい。キャピラリーチップの変形部がこのような対向面を備えることによって、細胞を大きく変形させることが可能となり、外来物質の導入効率を十分に高くすることができる。対向面の間隔は３０μｍ以下であってもよい。これによって、様々な細胞を十分に変形させ、外来物質の導入効率を十分に高くすることができる。
【００１４】
上記キャピラリーチップは、接続部から変形部に向かって細くなるようにテーパー状に形成された流路を有していてもよい。このようにテーパー状に形成された流路を有することによって、分散液が流路を流通しやすくなり、細胞を一層円滑に変形することができる。
【００１５】
上記キャピラリーチップは一つの管体で構成されてもよい。これによって、キャピラリーチップ及びこれを備える装置の構造を一層簡素化することができる。また、キャピラリーチップと供給部との接続を容易にすることができる。
【００１６】
本開示は、別の側面において、上述のいずれかのキャピラリーチップと、分散液の供給部と、を備え、細胞に外来物質を導入する装置を提供する。このような装置は、複雑な構造にしなくても、細胞に簡便に外来物質を導入することができる。
【００１７】
本開示は、また別の側面において、キャピラリーチップに細胞と外来物質とを含む分散液を供給して流通させる工程、を有し、分散液を流通させながら細胞を変形することによって細胞の内部に外来物質を導入する、外来物質の導入方法を提供する。この方法によれば、分散液を流通させながら細胞の内部に外来物質を導入することができる。このように、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することができる。
【００１８】
本開示は、また別の側面において、キャピラリーチップに細胞を含む第１分散液を供給し流通させながら細胞を変形する第１工程と、キャピラリーチップを流通した第１分散液を、外来物質を含む第２分散液に配合して、第１工程で変形した細胞の内部に外来物質を導入する第２工程と、を有する、外来物質の導入方法を提供する。
【００１９】
細胞は第１工程で変形した後も、暫くの間は細胞膜の透過性が高い状態が継続する。したがって、第１工程で変形した後に、第２工程で細胞を含む第１分散液を、外来物質を含む第２分散液に配合すると、細胞の内部に外来物質を導入することができる。このように、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することができる。
【発明の効果】
【００２０】
本開示では、一つの側面において、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することが可能なキャピラリーチップを提供することができる。本開示では、別の側面において、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することが可能な装置を提供することができる。本開示では、また別の側面において、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することが可能な方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、一実施形態に係るキャピラリーチップとこれを備える装置を示す模式図である。
【図２】図２は、一実施形態に係るキャピラリーチップを用いて細胞に外来物質を導入する方法を説明するための図である。
【図３】図３は、一実施形態に係るキャピラリーチップを用いて細胞に外来物質を導入する別の方法を説明するための図である。
【図４】図４（Ａ）は、一実施形態に係るキャピラリーチップの断面図である。図４（Ｂ）は一実施形態に係るキャピラリーチップを先端部側からみたときの図である。
【図５】図５は、別の実施形態に係るキャピラリーチップとこれを備える装置を示す模式図である。
【図６】図６は、実施例１で調製した分散液に含まれるヒト前立腺ガン細胞株（ＰＣ−３）の直径の度数分布図である。
【図７】図７は、ガラス管、ガラス管を引っ張り加工して得られる中間体、及びキャピラリーチップを示す写真である。
【図８】図８は、実施例で用いた装置のうち、キャピラリーチップとその周辺部材の接続構造を示す模式図である。
【図９】図９は、実施例で用いた装置の写真である。
【図１０】図１０は、実施例１で観察した位相差顕微鏡の画像を示す写真である。
【図１１】図１１（ａ）は、実施例１で観察したＴＲＩＴＣフィルタ（蛍光：５８２〜６３７ｎｍ）の画像の写真を二値化画像処理したものである。図１１（ｂ）は、実施例１で観察したＦＩＴＣフィルタ（蛍光: ５１２〜５５８ｎｍ）の画像の写真を二値化画像処理したものである。図１１（ｃ）は、実施例１で作製した図１１（ａ）と図１１（ｂ）の合成画像の写真を二値化画像処理したものである。
【図１２】図１２に、実施例１及び実施例２における細胞の生存率（％）及び外来物質の導入効率（％）の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、場合により図面を参照して、幾つかの実施形態を説明する。ただし、以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。説明において、同一要素又は同一機能を有する要素には同一符号を用い、場合により重複する説明は省略する。また、上下左右等の位置関係は、特に断らない限り、図面に示す位置関係に基づくものとする。更に、各要素の寸法比率は図示の比率に限られるものではない。
【００２３】
図１は、本開示の一実施形態に係るキャピラリーチップ２０とこれを備える装置１００を示す模式図である。装置１００は、細胞３０に外来物質を導入する装置である。キャピラリーチップ２０は、基端部側にある接続部２０Ａにおいて、細胞３０と外来物質とを含む分散液３６の供給部１０と接続されている。キャピラリーチップ２０は供給部１０に着脱可能に取り付けられている。キャピラリーチップ２０は、着脱可能に供給部１０と接続されていることから、容易に交換することができる。キャピラリーチップ２０はディスポーザブルタイプであってもよい。キャピラリーチップ２０の流路２２は、先端部２０Ｂの方が接続部２０Ａよりも細くなっている。
【００２４】
供給部１０は、所定量の分散液３６が導入されるシリンジ１４と、シリンジ１４の先端側において、シリンジ１４に分散液３６を導入するとともに、シリンジ１４に導入された分散液３６をキャピラリーチップ２０側に流出する流路をなす連結部１６と、シリンジ１４内に分散液を吸引するとともに、分散液３６をキャピラリーチップ２０側に吐出するプランジャ１２と、を備える。
【００２５】
プランジャ１２の先端１２Ａには、シリンジ１４とプランジャ１２の間の気密性を保つため、例えばゴム部材を有していてもよい。この場合、プランジャ１２を駆動してシリンジ１４に対するプランジャ１２の挿入長さを変えると、ゴム部材の側部がプランジャ１２の内壁面上を摺動する。このようにして、シリンジ１４への分散液３６の導入及びキャピラリーチップ２０の先端部２０Ｂの吐出口からの分散液３６の吐出の操作を行うことができる。プランジャ１２の駆動は、例えばマイクロシリンジポンプを用いてもよい。
【００２６】
供給部１０は、シリンジ１４のように分散液３６の量を精密に計量するものに限定されない。例えばスポイトのように、所定の範囲で分散液３６を計量する計量部であってもよい。供給部１０は、供給部１０の内部において分散液３６を収容するものに限定されず、供給部１０に接続される別の部材に分散液３６を収容して分散液３６を計量するものであってもよい。供給部１０は、分散液３６を吸引及び吐出する機能を有していてもよい。これによって、装置１００の構造を十分にシンプルなものにすることができる。
【００２７】
キャピラリーチップ２０と供給部１０における連結部１６との接続は、特に限定されず、例えばねじ接合で双方が直接接続されていてもよいし、図示しない継ぎ手又は接続冶具を介して接続されていてもよい。シリンジ１４への分散液３６の導入は、連結部１６からキャピラリーチップ２０を取り外した状態で連結部１６の先端を分散液中に入れ、プランジャ１２を連結部１６側とは反対側に移動させることによって行うことができる。その後、キャピラリーチップ２０の接続部２０Ａと連結部１６の先端とを接続して、プランジャ１２を連結部１６側に移動させる。これによって、シリンジ１４内の分散液３６が連結部１６及びキャピラリーチップ２０内の流路２２における変形部２０Ｃを流通した後、キャピラリーチップ２０の先端部２０Ｂから吐出される。
【００２８】
図２は、キャピラリーチップ２０を用いて細胞３０に外来物質３２を導入する方法を説明するための図である。図１においてシリンジ１４に導入された分散液３６は、溶媒３４と溶媒３４中に分散された細胞３０及び外来物質３２とを含む。分散液３６は、プランジャ１２の連結部１６側への移動に伴って、図２の流路２２内を下方に向かって流通する。流路２２は、基端部側にある接続部２０Ａから先端部２０Ｂ側に向かって細くなるようにテーパー状に形成された部分を有する。
【００２９】
流路２２内を下方に向かって移動した細胞３０Ａは、変形部２０Ｃにおいて、流路２２を形成する内壁２２Ａに接触して変形する。内壁２２Ａは、細胞３０Ａと同時に接触する対向面２５，２５を備える。細胞３０Ａは対向面２５，２５に接触することによって大きく変形する。細胞３０Ａは変形に伴って、細胞膜４２に可逆的な損傷が生じ、損傷部分から外来物質３２が細胞３０Ａ（細胞３０Ｂ）内に導入される。
【００３０】
外来物質３２が導入された細胞３０Ｂは、キャピラリーチップ２０の先端部２０Ｂから外部に吐出される。外部に吐出された細胞３０Ｃの細胞膜４２の損傷は、時間の経過とともに回復する。キャピラリーチップ２０の先端部２０Ｂから外部に吐出された後も、細胞膜４２の損傷が回復するまでは、細胞３０Ｃの内部に外来物質３２の導入が継続されてもよい。このようにして、外来物質３２が導入された細胞４０が得られる。
【００３１】
外来物質３２は、細胞３０とは異なるものであり、細胞３０に元々含まれていないものを用いることができる。外来物質３２としては、例えば、タンパク質等の高分子化合物、ＲＮＡ及びＤＮＡ等が挙げられる。細胞３０も特に限定されず、例えば、ヒト、動植物及び微生物に含まれる細胞が挙げられる。細胞３０は、例えばガン細胞であってもよい。
【００３２】
上述のように、細胞３０に外来物質３２を導入する技術は、再生医療に用いられる細胞の作製（ｉＰＳ細胞の作製等）、遺伝子操作技術によるバイオ医薬品の生産、農業分野における遺伝子組み換え作物の作製、付加機能を持った細胞（例えば、特定の物質に対して発光する細胞等）の作製による新規産業の創生等に活用することができる。
【００３３】
図３は、キャピラリーチップ２０を用いて細胞３０に外来物質３２を導入する別の方法（変形例）を説明するための図である。図３のキャピラリーチップ２０も、図１に示すように接続部２０Ａにおいて供給部１０と接続されている。ただし、供給部１０からは、細胞３０を含む第１分散液３６ａが供給される点で、図２で説明した方法とは異なっている。すなわち、第１分散液３６ａは、溶媒３４と溶媒３４中に分散された細胞３０を含む。第１分散液は外来物質を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。第１分散液３６ａは、プランジャ１２の連結部１６側への移動に伴って、図３の流路２２内を下方に向かって流通する。
【００３４】
流路２２内を下方に向かって移動した細胞３０Ａは、変形部２０Ｃにおいて、流路２２を形成する内壁２２Ａに接触して変形する。変形した細胞３０Ｂは変形に伴って、細胞膜４２に可逆的な損傷が生じる。変形した細胞３０Ｂを含む第１分散液３６ａは、溶媒３４と溶媒３４中に分散された外来物質３２を含む第２分散液３７に配合される。配合後も、暫くの間は、細胞３０Ｂは変形に伴って生じた損傷部分を有している。このため、配合後に、第２分散液３７に含まれる外来物質３２が、損傷部分から細胞３０Ｂ内に導入される。
【００３５】
外来物質３２が導入された細胞３０Ｃの細胞膜４２の損傷は、時間の経過とともに回復する。このようにして、外来物質３２が導入された細胞４０が得られる。なお、第１分散液３６ａと第２分散液３７における溶媒は同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【００３６】
図４（Ａ）は円管を加工して得られたキャピラリーチップ２０を、中心軸を通るように長手方向に沿って切断したとき断面図であり、図４（Ｂ）はキャピラリーチップ２０を先端部２０Ｂ側からみたときの図である。キャピラリーチップ２０は、接続部２０Ａ側に一定の内径φ２を有する円筒部２１と、接続部２０Ａ側から先端部２０Ｂ側に向かって細くなるように流路２２の内壁２２Ａがテーパー状に形成されているテーパー部２３とを有する。テーパー部２３を有することによって、細胞３０の変形を円滑に行うことができる。テーパー部２３の長さＬは特に限定されず、１０μｍ〜１ｍｍであってもよいし、５０〜５００μｍであってもよい。
【００３７】
従来のキャピラリーチップの先端部における流路の内径φ１は、閉塞を防止するために、細胞３０の直径φ３よりも大きくする必要があった。しかしながら、キャピラリーチップ２０の先端部２０Ｂにおける流路２２の内径φ１は、細胞３０の直径φ３よりも小さくなっている。接続部２０Ａにおける流路２２の内径φ２は、細胞３０の内径φ３よりも大きくなっている。すなわち、キャピラリーチップ２０の内径φ１及び内径φ２と、細胞３０の直径φ３には以下の関係式（１）が成立する。
【００３８】
φ１＜φ３＜φ２      （１）
内径φ１は、様々な細胞３０を十分に変形させ、外来物質３２の導入効率を十分に高くする観点から、例えば３０μｍ以下であってもよく、２５μｍ以下であってもよい。内径φ１は、細胞３０の生存率を高くする観点から、５μｍ以上であってもよく、７μｍ以上であってもよい。内径φ２は、例えば０．１〜５ｍｍであってもよく、０．５〜３ｍｍであってもよい。細胞の生存率及び外来物質の導入効率の双方を高くする観点から、内径φ１に対する直径φ３の比率（φ３／φ１）は、例えば１．１〜３であってもよく、１．２〜２．５であってもよい。本開示では、細胞３０が真球形状ではない場合、細胞３０を同一体積の真球に換算し、当該真球の直径を直径φ３とすることができる。
【００３９】
流路２２における分散液３６の流通方向に垂直な断面の形状が真円形状ではない場合、間隔φ１及びφ２は、それぞれ、先端部２０Ｂ及び接続部２０Ａにおける開口における対向面の間隔のうち、最小の間隔と定義される。この場合も、上記関係式（１）が成立する。例えば、流路２２の分散液３６の流通方向に垂直な断面の形状が楕円形状である場合、間隔φ１及びφ２は、それぞれ、先端部２０Ｂ及び接続部２０Ａにおける開口の短軸の長さに相当する。間隔φ１及びφ２の数値範囲及び比率（φ３／φ１）の数値範囲は、上述の内径φ１及びφ２と同じであってよい。
【００４０】
細胞３０は、流路２２の変形部２０Ｃを通過する際に流路２２の内壁２２Ａの対向面に接触して変形すると、細胞３０の細胞膜４２に可逆的な損傷が生じ、損傷部分から外来物質３２が細胞３０内に導入される。したがって、標的となる細胞３０の種類に応じて、内径φ１及びφ２（間隔φ１及びφ２）の大きさを設定してもよい。分散液３６は、キャピラリーチップ２０の流路２２を接続部２０Ａから先端部２０Ｂに向かう方向にのみ流通し、その反対方向には流通しない。これによって、細胞３０による先端部２０Ｂの閉塞を抑制することができる。
【００４１】
キャピラリーチップ２０は、一つの管体で構成されていてもよい。細胞３０に外来物質３２を導入する装置１００は、供給部１０と、接続部２０Ａ側において供給部１０と接続されるキャピラリーチップ２０とを備える。このように、キャピラリーチップ２０と装置１００は、シンプルな装置構成を有している。供給部１０を操作してキャピラリーチップ２０の先端部２０Ｂから分散液を吐出するという簡便な操作で、細胞３０の内部に外来物質３２を導入することができる。キャピラリーチップ２０を供給部１０と着脱可能に接続する構成とすれば、キャピラリーチップ２０及び装置１００は、様々な細胞及び外来物質を用いて実験を繰り返し行う際に極めて有用である。
【００４２】
キャピラリーチップ２０の形状は図４のものに限定されない。例えば、接続部２０Ａと先端部２０Ｂが、内径が長手方向に沿って一定である円筒部で構成され、接続部２０Ａと先端部２０Ｂとの間に接続部２０Ａから先端部２０Ｂに向かって流路が細くなるテーパー部２３を有していてもよい。
【００４３】
図５は、別の実施形態に係るキャピラリーチップ２０ａとこれを備える装置２００を示す模式図である。装置２００は、供給部１０ａと、供給部１０ａに着脱可能に接続されるキャピラリーチップ２０ａとを備える。キャピラリーチップ２０ａは、先端部２０Ｂ側の流路２２が、接続部２０Ａ側の流路２２よりも細くなっている。供給部１０は、例えばマイクロピペットであり、細胞と外来物質とを含む分散液を所定量計量する。
【００４４】
装置２００では、次の手順で外来物質を細胞内に導入することができる。まず、供給部１０ａの先端に細胞の直径よりも大きい内径を有する流路が形成された通常のチップ７０を装着する。そして、チップ７０の先端を分散液中に浸漬した後、供給部１０ａを操作して所定量の分散液をチップ７０内に吸入する。その後、チップ７０にかぶせるようにしてキャピラリーチップ２０ａを装着する。その後、図５に示すように供給部１０ａを操作して、キャピラリーチップ２０ａから分散液を吐出する。
【００４５】
キャピラリーチップ２０ａから分散液を吐出する際、少なくとも先端部２０Ｂにおける流路２２の内壁に細胞が接触して細胞が変形する。これによって、細胞膜に可逆的な損傷が生じ、細胞膜の損傷部分から外来物質が細胞の内部に導入される。
【００４６】
装置２００は、通常用いられるマイクロピペットの先端にキャピラリーチップ２０ａを取り付けたシンプルな構造にすることができる。このような装置２００は、実験者にとって利便性が高く、極めて高い汎用性を有する。
【００４７】
本開示のマイクロピペット及びこれを備える装置は上述の実施形態に限定されない。本開示のマイクロピペット及びこれを備える装置によれば、標的となる細胞の内部に簡便に外来物質を導入することができる。また、外来物質を導入する際の細胞の生存率及び外来物質の導入効率を十分に高くすることもできる。細胞の生存率は、例えば３０％以上であってもよく、５０％以上であってもよく、７０％以上であってもよい。外来物質の導入効率は、例えば２０％以上であってもよく、５０％以上であってもよく、６０％以上であってもよい。
【００４８】
本開示の一実施形態に係る外来物質の導入方法は、装置１００又は装置２００を用いて行うことができる。この導入方法は、キャピラリーチップ２０（２０ａ）の接続部２０Ａに接続された供給部１０（１０ａ）を用いて、細胞と外来物質とを含む分散液を計量する計量工程と、キャピラリーチップ２０（２０ａ）の接続部から先端部に向かって分散液を流通させ、キャピラリーチップ２０（２０ａ）の先端部から分散液を吐出する吐出工程と、を有する。
【００４９】
吐出工程では、キャピラリーチップ２０（２０ａ）の流路の内壁に細胞を接触させ細胞を変形することによって細胞の内部に外来物質を導入する。この導入方法は、吐出工程において、分散液３６を流通させながら細胞を変形させて細胞の内部に外来物質を導入する。したがって、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することができる。
【００５０】
外来物質の導入方法は、上述のキャピラリーチップ２０（２０ａ）、及び装置１００（２００）の説明内容に基づいて行うことができる。したがって、上述のキャピラリーチップ２０（２０ａ）、及び装置１００（２００）の説明内容は、外来物質の導入方法に適用することができる。例えば、吐出工程では、流路の内壁における対向面に細胞を同時に接触させて細胞を変形し、細胞の内部に外来物質を導入することができる。
【００５１】
本開示の別の実施形態に係る外来物質の導入方法は、装置１００又は装置２００を用いて行うことができる。この導入方法は、キャピラリーチップ２０（２０ａ）の接続部２０Ａに接続された供給部１０（１０ａ）を用いて、細胞を含む第１分散液を計量する計量工程と、キャピラリーチップ２０（２０ａ）に細胞を含む第１分散液を供給し、流路２２を流通させながら細胞を変形する変形工程と、キャピラリーチップ２０（２０ａ）を流通した第１分散液を、外来物質を含む第２分散液に配合して、変形工程で変形した細胞の内部に外来物質を導入する導入工程と、を有する。
【００５２】
変形工程では、キャピラリーチップ２０（２０ａ）の流路の内壁に細胞を接触させ細胞を変形させて細胞膜に損傷を与える。その後、導入工程において、損傷した細胞を含む第１分散液を、外来物質を含む第２分散液に配合し、細胞の内部に外来物質を導入する。したがって、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することができる。
【００５３】
この外来物質の導入方法も、上述のキャピラリーチップ２０（２０ａ）、及び装置１００（２００）の説明内容に基づいて行うことができる。したがって、上述のキャピラリーチップ２０（２０ａ）、及び装置１００（２００）の説明内容は、外来物質の導入方法に適用することができる。例えば、変形工程では、流路の内壁における対向面に細胞を同時に接触させて細胞を変形することができる。
【００５４】
以上、幾つかの実施形態を説明したが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。例えば、キャピラリーチップの吐出口側から分散液を吸引することによって、分散液を流通させ、変形部において外来物質を細胞に導入してもよい。
【実施例】
【００５５】
実施例を参照して本発明の内容をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５６】
（実施例１）
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ）及び１００Ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリンと１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含む最小必須培地（ＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ）を用いて、ヒト前立腺ガン細胞株（ＰＣ−３）を直径１００ｍｍの組織培養皿（Ｆａｌｃｏｎ）において培養した。空気と二酸化炭素を、９５体積％：５体積％の割合で含む加湿雰囲気中において、３７℃で培養してコンフルエントに達した細胞を、０．０５重量％のトリプシンと０．０５３ｍＭのＥＤＴＡ・４Ｎａを含む溶液（Ｇｉｂｃｏ）を用いて剥離及び分散させた。細胞を遠心沈殿して上清を廃棄した後、細胞をカルシウム及びマグネシウムを含むハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ，Ｇｉｂｃｏ）に懸濁し、細胞を含む懸濁液を得た。
【００５７】
懸濁液中の細胞の濃度を３〜５×１０５個／ｍｌに調製した。調製した懸濁液に、ヨウ化プロピジウム（６６８ダルトン）を含む溶液（ヨウ化プロピジウム濃度：１μｇ／ｍｌ）を添加し、細胞と外来物質としてヨウ化プロピジウムを含む分散液を得た。
【００５８】
図６は、分散液に含まれる細胞の直径の度数分布図である。位相差顕微鏡を用いて位相差画像を観察し、その写真を用いて２５１個の生存細胞を選択してそれぞれの直径を測定した。その結果、平均直径は１８．４９μｍであり、標準偏差は２．１６μｍであった。位相差画像では、生存細胞の形状はほぼ球状（画像において円状）であった。
【００５９】
次に、分散液を用いて、標的細胞に外来物質を導入する実験を以下の手順で行った。株式会社  成茂科学器械研究所製のガラス管（型番：ＧＣ−１．５，円管形状，外径：１．５ｍｍ，内径：０．９ｍｍ，長さ：９０ｍｍ）を、マイクロピペットプーラー（株式会社  成茂科学器械研究所製、製品名：ＰＣ−１０）を用いて引っ張り加工して、キャピラリーチップを作製した。加工前、加工中、及び加工後の写真を図７の（ａ），（ｂ），（ｃ）にそれぞれ示す。ガラス管を引っ張り加工することによって得られるキャピラリーチップは、図７の（ｃ）に示すとおり、先端部側の方が、接続部側よりも細くなっている。
【００６０】
加工して得られたキャピラリーチップを、デジタルマイクロスコープ（株式会社キーエンス製、商品名：ＶＨＸ−１０００）で１０００倍に拡大して撮影し、流路の形状及び先端部における流路の開口サイズを確認した。その結果、キャピラリーチップの流路は、図４（Ａ）に示すような接続部２０Ａから先端部２０Ｂに向かって細くなるようにテーパー状に形成された部分を有していた。また、先端部２０Ｂにおける流路２２の開口は円形を呈しており、その内径φ１は１０±０．２μｍであった。
【００６１】
このようにして作製したキャピラリーチップ２０を、市販のシリンジ（テルモ株式会社製）の先端側に、チューブ５１、一対の翼５５及び注射針５６を備える翼付静注針５０（テルモ株式会社製、商品名：ＳＶ−２３ＤＬＫ）を用いて取り付けた。具体的には、図８に示すように注射針５６をキャピラリーチップ２０の接続部２０Ａ側から装入してパラフィンフィルム５４（Ｂｅｍｉｓ製）を用いて仮止めし、漏れ防止剤５２でキャピラリーチップ２０と翼付静注針５０との接続部を密封した。このようにして図９に示すような、細胞に外来物質を導入する装置を作製した。キャピラリーチップ２０の先端部２０Ｂを、Ｆａｌｃｏｎ社製の培養皿８０（容量：３５ｍｌ）の側壁に設けたドリル穴８２に挿通させ、先端部２０Ｂから吐出される分散液を培養皿８０に回収できるようにした。
【００６２】
吸入口１９を開放し、プランジャ１２を引き出して、シリンジ１４に細胞とヨウ化プロピジウムを含む分散液を導入した。マイクロシリンジポンプ（（株）三商、商品名：ＩＣ３２１０）を用いて、プランジャ１２を駆動した。当初は先端部２０Ｂからの吐出量が１００μＬ／分となるようにプランジャ１２を駆動して内部に残存する空気を排出した。その後、吐出量が１０μＬ／分となるようにプランジャ１２を駆動してキャピラリーチップ２０の先端部２０Ｂから分散液を吐出した。分散液の吐出を約１０分間継続して行って、約１００μｌの分散液（実験サンプル）を培養皿に回収した。回収したサンプルは、室温で約２分間静置した後、細胞膜を回復させるために３７℃で３０分間インキュベートした。
【００６３】
生存細胞を緑色蛍光で標識する生存プローブとして、１μＬのカルセイン−ＡＭ（１μｇ／ｍＬ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、上述のサンプルに加えた。次いで、当該サンプルを再び３０分間インキュベートして、カルセイン−ＡＭの吸収及び蛍光発光を可能にした。
【００６４】
ヨウ化プロピジウムとカルセイン−ＡＭによる蛍光を検出するために蛍光観察セット付き位相差顕微鏡（株式会社ニコン製、装置名：ＥＣＬＩＰＳＥ  ＴＥ３００）を用いて各サンプルを観察した。１０倍の倍率対物レンズを用い、各サンプルについて６つの視野領域を写真撮影した。図１０に示す位相差顕微鏡画像（倍率：２０倍）では、生存細胞４０と死細胞３３（細胞破片）が確認された。
【００６５】
図１１（ａ）は、ＴＲＩＴＣフィルタ（蛍光：５８２〜６３７ｎｍ）の画像の写真を二値化画像処理したものである。この画像では、ヨウ化プロピジウムが取り込まれた細胞が確認された。ヨウ化プロピジウムの赤色の蛍光を発光する細胞は、キャピラリーチップによってヨウ化プロピジウムが取り込まれた生存細胞と死亡細胞の両方を含んでいた。
【００６６】
図１１（ｂ）は、ＦＩＴＣフィルタ（蛍光: ５１２〜５５８ｎｍ）の画像の写真を二値化画像処理したものである。この画像では、カルセイン−ＡＭによる緑色の蛍光を発光する細胞が確認された。カルセイン−ＡＭは、細胞内に拡散し、細胞内のエステラーゼと結合して、緑色の蛍光を発光する。このため、緑色の蛍光を発光する細胞は生存していることを意味する。
【００６７】
６つの視野領域における位相差顕微鏡画像の写真（例えば、図１０の写真）を用いて、細胞の総数（Ａ）を計測した。６つの視野領域におけるＦＩＴＣフィルタの画像の写真（例えば、図１１（ｂ）の二値化画像処理前の写真）を用いて、生存する細胞の個数（Ｂ）を計測した。６つの視野領域におけるＴＲＩＴＣフィルタの画像の写真（例えば、図１１（ａ）の二値化画像処理前の写真）を用いて、ヨウ化プロピジウムが取り込まれた細胞の個数（Ｃ）を計測した。
【００６８】
６つの視野領域におけるＦＩＴＣフィルタの画像及びＴＲＩＴＣフィルタの画像を、画像処理ソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ、パブリックドメインライセンス、アメリカ国立衛生研究所）を使用して、合成画像を得た。図１１（ｃ）は、当該合成画像の写真を二値化画像処理したものである。この合成画像の写真（例えば、図１１（ｃ）の二値化画像処理前の写真）を用いて、赤と緑の両方の蛍光を発光する細胞の個数（Ｄ）を求めた。この細胞の個数（Ｄ）は、ヨウ化プロピジウムが導入された生存細胞の個数に相当する。
【００６９】
６つの視野領域のそれぞれにおける細胞の総数（Ａ）、死細胞の個数、生存細胞の個数（Ｂ）、ヨウ化プロピジウムが取り込まれた細胞の個数（Ｃ）、及び、ヨウ化プロピジウムが導入された生存細胞の個数（Ｄ）は、表１に示すとおりであった。表１には、以下の式で求められる細胞の生存率（％）及び外来物質の導入効率（％）も合わせて示した。
【００７０】
細胞の生存率（％）＝生存細胞の個数（Ｂ）／細胞の総数（Ａ）×１００
外来物質の導入効率（％）＝細胞の個数（Ｄ）／細胞の総数（Ａ）×１００
【００７１】
同様の実験を及び計測を、合計４つの実験サンプルについて行った。結果は表１に示すとおりであった。表１に示す４つの実験サンプルの計測値に基づいて、細胞の生存率（％）及び外来物質の導入効率（％）を求めた。その結果、細胞の生存率（％）は３９．４％であり、外来物質の導入効率は２７．９％であった。
【００７２】
【表１】
2019154314.tif 000003
【００７３】
（実施例２）
実施例１と同様にして、先端部２０Ｂにおける流路２２の開口の内径φ１が１５±０．２μｍであるキャピラリーチップを作製した。このキャピラリーチップを用いたこと以外は、実施例１と同様にして細胞にヨウ化プロピジウムを導入する操作を行い、実施例１と同様にして計測を行った。
【００７４】
実施例２では、合計３つの実験サンプルについて実験を及び計測を行った。結果は表２に示すとおりであった。表２に示す３つの実験サンプルの計測値に基づいて、細胞の生存率（％）及び外来物質の導入効率（％）を求めた。その結果、細胞の生存率（％）は７７．０％であり、外来物質の導入効率は６１．７％であった。
【００７５】
【表２】
2019154314.tif 000004
【００７６】
図１２に、実施例１及び実施例２における細胞の生存率（％）及び外来物質の導入効率（％）の結果を示す。図１２に示すとおり、実施例１においては２０％以上の確率で、実施例２においては６０％以上の確率で生存細胞に外来物質を導入することができた。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本開示によれば、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することが可能なキャピラリーチップが提供される。また、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することが可能な装置が提供される。また、細胞の内部に簡便に外来物質を導入することが可能な方法が提供される。
【符号の説明】
【００７８】
１０，１０ａ…供給部、１２…プランジャ、１２Ａ…先端、１４…シリンジ、１６…連結部、１９…吸入口、２０…キャピラリーチップ、２０，２０ａ…キャピラリーチップ、２０Ａ…接続部、２０Ｂ…先端部、２０Ｃ…変形部、２１…円筒部、２２…流路、２２Ａ…内壁、２３…テーパー部、２５…対向面、３０，３０Ａ，３０Ｂ，３０Ｃ，４０…細胞（生存細胞）、３２…外来物質、３４…溶媒、３６…分散液、４２…細胞膜、５０…翼付静注針、５４…パラフィンフィルム、５６…注射針、５２…漏れ防止剤、７０…チップ、１００，２００…装置。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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