(57)【要約】【課題】  骨組織を修復するために、骨誘導性をもつ化合物デキサメタゾンを含有するリン酸カルシウムナノ粒子を導入した生体吸収性足場材料、およびその製造方法を提供すること。【解決手段】  生体吸収性の高分子多孔質体と、デキサメタゾンを含有するリン酸カルシウムナノ粒子と複合化する。得られた複合多孔質足場材料は特定の形状を保持できるものであり、生体親和性を有し、かつ骨の形成及び再生誘導を可能にする特性を有する。したがって、本材料は骨欠損部位に埋め込んで骨組織を再生する再生医療用に好適である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体吸収性高分子からなる多孔質体と、
前記多孔質体に位置するデキサメタゾン含有ナノ粒子とを含み、
前記デキサメタゾンは少なくとも生体吸収性のリン酸カルシウムに含有される、複合多孔質足場材料。
【請求項２】
前記リン酸カルシウムは、前記デキサメタゾンを内包する、請求項１に記載の複合多孔質足場材料。
【請求項３】
前記ナノ粒子の粒径は、１ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の範囲である、請求項１または２に記載の複合多孔質足場材料。
【請求項４】
前記ナノ粒子は、球状、ロッド状、スター状、紡錘状、三角柱、直方体および立方体からなる群から選択される形状を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の複合多孔質足場材料。
【請求項５】
前記生体吸収性高分子は、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、キトサンコンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸の共重合体、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（グリセロールセバシン酸）からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の複合多孔質足場材料。
【請求項６】
前記多孔質体は、孔径が１０μｍ以上１０００μｍ以下の範囲である空孔を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の複合多孔質足場材料。
【請求項７】
前記生体吸収性高分子は、架橋されている、請求項１〜６のいずれかに記載の複合多孔質足場材料。
【請求項８】
前記複合足場材料の１ｃｍ３あたりのナノ粒子の含有量は、１ｍｇ以上５００ｍｇ以下の範囲である、請求項１〜７のいずれかに記載の複合多孔質足場材料。
【請求項９】
前記ナノ粒子におけるデキサメタゾンの含有率は、１ｗｔ％以上７０ｗｔ％以下の範囲である、請求項１〜８のいずれかに記載の複合多孔質足場材料。
【請求項１０】
前記ナノ粒子におけるデキサメタゾンの含有率は、１８ｗｔ％以上５０ｗｔ％以下の範囲である、請求項９に記載の複合多孔質足場材料。
【請求項１１】
前記ナノ粒子と前記生体吸収性高分子とは、重量比で、２：１以上１：２以下の範囲を満たす、請求項１〜１０のいずれかに記載の複合多孔質足場材料。
【請求項１２】
前記デキサメタゾンは、生体吸収性のリン酸カルシウムとハイドロキシアパタイトとの混合物に含有される、請求項１〜１１のいずれかに記載の複合多孔質足場材料。
【請求項１３】
デキサメタゾン含有ナノ粒子と生体吸収性高分子とを混合し、多孔質化する工程であって、前記デキサメタゾンは少なくとも生体吸収性のリン酸カルシウムに含有される、工程を包含する、請求項１〜１２の何れかに記載の複合多孔質足場材料の製造方法。
【請求項１４】
前記多孔質化する工程は、前記ナノ粒子と前記生体吸収性高分子との混合物を凍結乾燥する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
空孔形成剤を使用し、空孔を形成する、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記空孔形成剤は氷である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記硬質化する工程は、発泡成形法、空孔形成剤除去法および相分離法からなる群から方法を用いる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記多孔質化する工程に続いて、前記生体吸収性高分子を架橋する工程をさらに包含する、請求項１３〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記ナノ粒子と前記生体吸収性高分子とは、重量比で、２：１以上１：２以下の範囲を満たすように混合される、請求項１３〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記ナノ粒子と前記生体吸収性高分子とは、重量比で、１．５：１以上１：１．５以下の範囲を満たすように混合される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病気や事故等によって損傷を受けたり、失われたりした骨組織を修復するために、骨誘導性をもつ化合物デキサメタゾンを含有する複合多孔質足場材料、および、その製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトやその他脊椎動物の骨組織が欠損した場合、欠損がある程度の大きさまでは、その治療として患者自身の腸骨や脾骨等を使用する自家骨組織や同種骨組織の移植が行われてきた。しかしながら、採取することができる自家骨組織の大きさには限界があり、又同種骨組織を移植しようとする場合には、免疫拒絶の問題があり、この点を解決されないと、これらの治療は十分に活用することができない。現在のところ、これらの解決策がないことから、これに代わる新しい治療方法が検討されている。その具体的方法としては、生体組織工学的手法を用いた骨組織の再生・再構築が注目されている。生体組織工学では、組織を再生・再構築する際、細胞の足場となる材料、すなわち足場材料が用いられる。足場材料は、細胞の増殖、分化、細胞外マトリックスの分泌などの機能を維持し、また、新生骨組織の形状を保持する役割を果す。骨欠損の治療効果を高めるためには、足場材料内で骨が形成される骨誘導性、および生体内の自然骨内に埋入したとき、足場材料表面に沿って骨が形成され、足場材料と骨が結合して一体となる骨伝導性が重要である。
【０００３】
足場材料は、組織の再生とともに吸収され、最終的には組織に置換される必要がある。通常、足場材料の基材として用いられるのは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、乳酸とグリコール酸との共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）などの生体吸収性合成高分子や、コラーゲン、ゼラチン、キトサン、アルギン酸などの天然高分子が挙げられる。また、リン酸三カルシウム、リン酸八カルシウム等の生体吸収性セラミックスも用いられる。ただし、これらの材料を単独に用いたとしても、骨形成の点で満足する結果を得ることはできない。骨形成を促進するためには、足場材料中の細胞に骨誘導性のシグナルを持続的に供給できるような仕組みが必要である。
【０００４】
骨誘導性をもつ足場材料の先行研究例として、非特許文献１、２には、生体吸収性高分子とデキサメタゾンの混合物から作製した多孔質足場材料、ナノファイバーメッシュがそれぞれ示されている。多孔質足場材料の基材として成形加工性やハンドリング性にすぐれた生体吸収性高分子が用いられているが、骨伝導を促進する成分が含まれていないため、生体に移植した場合に周辺組織と強固に固定されることは期待できない。また、骨誘導性に加えて骨伝導性も有する多孔質足場材料の先行研究例として、非特許文献３、４には、生体吸収性高分子の微粒子にデキサメタゾンを担持し、ハイドロキシアパタイトからなる多孔質体の空孔表面に物理吸着させた多孔質材料が示されている。しかし、セラミックスを基材としているため、生体吸収性高分子からなる多孔質体と比較して、成形加工性やハンドリング性に乏しい。しかもハイドロキシアパタイトは生体吸収性を持たないため、生体の骨組織に置き換わることはない。細胞が侵入するための多孔質構造を持ち、骨誘導性と骨伝導性の両方を備えた成形加工性の高い足場材料が望まれている。
【０００５】
また、デキサメタゾンを含有する別の生体組織補填材が開発されている（例えば、特許文献１を参照）。特許文献１によれば、コラーゲン等のハイドロゲル内にリン酸カルシウム微粒子およびデキサメタゾンを含有する生体組織補填材が提供される。しかしながら、当該発明のハイドロゲルは直径１〜１０００μｍの球状であり、しかもそれらが互いに結合しているわけではないため、組織欠損部位に埋植しても漏出してしまう懸念がある。また、前記ハイドロゲルは細胞が侵入できる多孔質構造をもたないため、細胞が接着できるのはハイドロゲル表面に限られてしまう。そこで、組織が再生されるまで組織欠損部位で形状を保持することができ、かつ細胞が侵入するための多孔質構造をもつ材料が望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２７９００７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｙｏｏｎ  ＪＪ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ２４，  ２３２３−２３２９  （２００３）．
【非特許文献２】Ｍａｒｔｉｎｓ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ３１，  ５８７５−５８８５  （２０１０）．
【非特許文献３】Ｊｕｎ  Ｓｉｋ  Ｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  １５３，  １３３−１４０  （２０１１）．
【非特許文献４】Ｓｏｎ  ＪＳ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．  Ａ．，  ９９，  ６３８−６４７  （２０１１）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上から、本発明の課題は、生体吸収性を持ち、生体親和性に優れ、かつ骨の形成誘導を行うとともに、骨伝導性にもすぐれた多孔質足場材料およびその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、高分子多孔質体にデキサメタゾン含有リン酸カルシウムナノ粒子を導入して得られた構造体が、特定の形状を保持できるものであり、生体親和性を有し、かつ、骨の形成及び再生誘導を可能にする特性を有するものであることを見出して、本発明を完成させた。
【００１０】
本発明による複合多孔質足場材料は、生体吸収性高分子からなる多孔質体と、前記多孔質体に位置するデキサメタゾン含有ナノ粒子とを含み、前記デキサメタゾンは少なくとも生体吸収性のリン酸カルシウムに含有され、これにより上記課題を解決する。
前記リン酸カルシウムは、前記デキサメタゾンを内包してもよい。
前記ナノ粒子の粒径は、１ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の範囲であってもよい。
前記ナノ粒子は、球状、ロッド状、スター状、紡錘状、三角柱、直方体および立方体からなる群から選択される形状を有してもよい。
前記生体吸収性高分子は、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、キトサンコンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸の共重合体、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（グリセロールセバシン酸）からなる群から選択されてもよい。
前記多孔質体は、孔径が１０μｍ以上１０００μｍ以下の範囲である空孔を有してもよい。
前記生体吸収性高分子は、架橋されていてもよい。
前記複合足場材料の１ｃｍ３あたりのナノ粒子の含有量は、１ｍｇ以上５００ｍｇ以下の範囲であってもよい。
前記ナノ粒子におけるデキサメタゾンの含有率は、１ｗｔ％以上７０ｗｔ％以下の範囲であってもよい。
前記ナノ粒子におけるデキサメタゾンの含有率は、１８ｗｔ％以上５０ｗｔ％以下の範囲であってもよい。
前記ナノ粒子と前記生体吸収性高分子とは、重量比で、２：１以上１：２以下の範囲を満たしてもよい。
前記デキサメタゾンは、生体吸収性のリン酸カルシウムとハイドロキシアパタイトとの混合物に含有されてもよい。
本発明による上述の複合多孔質足場材料の製造方法は、デキサメタゾン含有ナノ粒子と生体吸収性高分子とを混合し、多孔質化する工程であって、前記デキサメタゾンは少なくとも生体吸収性のリン酸カルシウムに含有される、工程を包含し、これにより上記課題を解決する。
前記多孔質化する工程は、前記ナノ粒子と前記生体吸収性高分子との混合物を凍結乾燥してもよい。
空孔形成剤を使用し、空孔を形成してもよい。
前記空孔形成剤は氷であってもよい。
前記硬質化する工程は、発泡成形法、空孔形成剤除去法および相分離法からなる群から方法を用いてもよい。
前記多孔質化する工程に続いて、前記生体吸収性高分子を架橋する工程をさらに包含してもよい。
前記ナノ粒子と前記生体吸収性高分子とは、重量比で、２：１以上１：２以下の範囲を満たすように混合されてもよい。
前記ナノ粒子と前記生体吸収性高分子とは、重量比で、１．５：１以上１：１．５以下の範囲を満たすように混合されてもよい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の複合多孔質足場材料は、生体吸収性高分子からなる多孔質体と、そこに位置するデキサメタゾン含有ナノ粒子とを含むので、骨組織の欠損部位に移植される細胞を多孔質体内に侵入させ、細胞を効率的に骨分化させることができる。また、デキサメタゾン含有ナノ粒子は多孔質体に位置するため、ナノ粒子が拡散し、デキサメタゾンが骨欠損部位に供給される効率の低下を抑制できる。さらに、デキサメタゾンを骨組織が再生される間に徐放させることも可能である。加えて、デキサメタゾンを担持するナノ粒子は生体吸収性のリン酸カルシウムを含有するため、骨伝導性に優れる。また、多孔質体およびデキサメタゾン含有ナノ粒子のいずれもが生体吸収性を有し、生体親和性に優れる材料である。
【００１２】
本発明の複合多孔質足場材料の製造方法は、デキサメタゾン含有ナノ粒子と生体吸収性高分子とを混合し、多孔質化する工程であって、デキサメタゾンは少なくとも生体吸収性のリン酸カルシウムに含有される、工程を包含し、上述の複合多孔質足場材料が得られる。本発明の方法によれば、複雑な工程や特別の装置を不要とするため、実用に即している。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の複合多孔質足場材料を模式的に示す図。
【図２】参考例１の生成物のＴＥＭ像を示す図
【図３】実施例１の足場材料１のＳＥＭ像を示す図
【図４】実施例２の足場材料２のＳＥＭ像を示す図
【図５】実施例３の足場材料３のＳＥＭ像を示す図
【図６】実施例１〜３の足場材料１〜３から徐放されるデキサメタゾンの徐放量の時間依存性を示す図
【図７】実施例１〜３の足場材料１〜３を用いて再生した骨組織の外観を示す図
【図８】実施例１〜３の足場材料１〜３を用いて再生した骨組織のヘマトキシリン・エオジン染色像を示す図
【図９】実施例１〜３の足場材料１〜３を用いて再生した骨組織の免疫染色像を示す図
【図１０】比較例４の足場材料４を用いて再生した骨組織の免疫染色像を示す図
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、図面を参照しながら本発明の複合多孔質足場材料およびその製造方法について説明する。
図１は、本発明の複合多孔質足場材料を模式的に示す図である。
【００１５】
本発明の複合多孔質足場材料（以降では単に本発明の足場材料と称する）１００は、生体吸収性高分子からなる多孔質体１１０と、多孔質体１１０に位置するデキサメタゾン（ＤＥＸ）含有ナノ粒子１２０とを含む。デキサメタゾンは、少なくとも生体吸収性のリン酸カルシウムに含有される。本発明の足場材料１００は、多孔質体１１０およびナノ粒子１２０のいずれも生体吸収性を有する材料からなるため、全体として生体親和性に優れる。本発明の足場材料１００は、デキサメタゾンを含有するため、骨誘導性に優れるが、デキサメタゾンがナノ粒子１２０に担持され、それが多孔質体１１０に位置するので、骨組織の欠損部位に移植される細胞を多孔質体１１０内に侵入させ、効率的に細胞を骨分化することができる。加えて、ナノ粒子１２０が拡散することがないので、デキサメタゾンの骨欠損部位への供給効率の低下を抑制できる。さらに、デキサメタゾンは徐放されるので、骨組織を長期間にわたって再生できる。ＤＥＸを担持するナノ粒子１２０は少なくともリン酸カルシウムから構成され、骨伝導性に優れる。すなわち、本発明の足場材料１００は、生体吸収性および生体親和性に優れ、かつ、骨の形成誘導を行うとともに、骨伝導性にも優れる。
【００１６】
好ましくは、本発明の足場材料１００において、ナノ粒子１２０は、リン酸カルシウムがデキサメタゾンを内包してなる。これにより、長期間の徐放を可能とする。本明細書において、内包は、リン酸カルシウムがデキサメタゾンを少なくとも部分的に包囲していることを意図する。
【００１７】
本発明の足場材料１００の外形寸法に特に制限はなく、適応部位によって適宜定めればよいが、例示的には、最大辺長が０．１ｍｍ以上２００ｍｍ以下、好ましくは２ｍｍ以上１００ｍｍ以下の範囲を有する。
【００１８】
本発明の足場材料１００は、多孔質体１１０を含有するため、空孔１３０を備える。空孔１３０の空孔径は、好ましくは、１０μｍ以上１０００μｍ以下の範囲を有する。空孔径が１０μｍ未満の場合は、播種した細胞や周辺骨組織の細胞は空孔内に侵入することができない。空孔径が１０００μｍを超えると、細胞由来の細胞外マトリックスによって空孔が充填される効率が著しく低下する。さらに好ましくは、空孔径は２０μｍ以上８００μｍ以下とするのがよい。これにより、骨分化を促進できる。図１では、空孔１３０は球形を有するが、空孔１３０の形状は球形に限らない。製造方法によっては、球形以外の形状を有してもよい。
【００１９】
本発明の足場材料１００の気孔率は、通常５〜９９．９％、好ましくは２０〜９９．９％である。気孔率が５％未満の場合は、空孔の連通性が著しく減少し、細胞を均一に分布させることができない。
【００２０】
本発明の足場材料１００において、多孔質体１１０を構成する生体吸収性高分子（以降では単に高分子と称する）は、生体吸収性を有する限り特に制限はないが、好ましくは、コラーゲン、ゼラチン、キチン、ヒアルロン酸、キトサン、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、ヒドロネクチン、ラミニン、アルギン酸やケラチンのような天然高分子を挙げることができる。また、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコール酸と乳酸の共重合体、ポリ（グリセロールセバシン酸）、ポリリンゴ酸などのポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリ−β−ヒドロキシカルボン酸などの合成高分子を挙げることができる。
【００２１】
中でも、好ましくは、高分子は、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、キトサンコンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸の共重合体、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（グリセロールセバシン酸）からなる群から選択される。これらの高分子は、生体親和性に特に優れる。
【００２２】
さらに好ましくは、高分子は、ウシ、ブタ、サケ、トリ等の動物由来のコラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチンおよびラミニンからなる群から選択される天然高分子であり、これらの高分子を１種類、あるいは２種類以上を混合してから用いることができる。これらの中で、細胞親和性に特にすぐれた高分子としてコラーゲン、あるいは、コラーゲンを主成分とする混合物が最も望ましい。本願明細書において、主成分とする量は、コラーゲンを５０ｗｔ％以上含有するものをいう。
【００２３】
高分子は、架橋されていてもよい。これにより、多孔質体１１０が安定化する。特に、高分子がゼラチンやコラーゲンに代表される水溶性生体吸収性高分子である場合、架橋による効果が大きい。高分子がポリ乳酸やポリグリコール酸に代表される水不溶性生体吸収性高分子を用いた場合には、架橋は必ずしも必要ではない。
【００２４】
ナノ粒子１２０において、デキサメタゾンは少なくとも生体吸収性のリン酸カルシウムに含有されるが、具体的には、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）、リン酸八カルシウム（ＯＣＰ）が挙げられる。リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）は、β、α、α’、γ相の１種類、あるいは、２種類以上の相からなるものを用いることが可能であるが、目的に応じて適当なものを選ぶ。デキサメタゾンは、リン酸カルシウムに加えて、その他の塩基性のリン酸カルシウムに含有されてもよい。例示的には、β−リン酸三カルシウムとハイドロキシアパタイトとの二相性リン酸カルシウムがある。
【００２５】
ナノ粒子１２０の形状は、ナノ粒子１２０が多孔質体１１０に位置できる限り特に制限はないが、例示的には、球状、ロッド状、スター状、紡錘状、三角柱、直方体および立方体からなる群から選択される形状であってよい。これらの形状であれば、ナノ粒子１２０を多孔質体１１０に分散させて位置させることができる。
【００２６】
ナノ粒子１２０の粒径（平均粒径）は、１ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の範囲を有する。粒径が１ｎｍ未満の場合、デキサメタゾンを含有させることができない場合がある。粒径が１０００ｎｍを超えると、多孔質体と複合化する際に、粒子の均一分散性が低下する。好ましくは、粒径は１ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲である。これにより、ナノ粒子が均一に多孔質体に位置することができる。さらに好ましくは、粒径は５ｎｍ以上５０ｎｍ以下の範囲である。これにより、十分なデキサメタゾンを含有させ、多孔質体に均一に分散させることができる。
【００２７】
なお、本願明細書において、粒径（平均粒径）は、所定数（例えば１００個）の粒子の長軸と短軸とから求める２軸平均径とする。なお、長軸および短軸とは、電子顕微鏡や篩などによって幾何学的に求めた値であってもよいし、沈降法によって間接的に求めた値であってもよい。あるいは、粒子の形状によっては、体積基準の粒度分布から求めてもよい。
【００２８】
ナノ粒子１２０におけるデキサメタゾンの含有率は、好ましくは、１ｗｔ％以上７０ｗｔ％以下の範囲である。デキサメタゾンの含有率が、１ｗｔ％未満である場合、デキサメタゾンの供給が十分でなく、骨分化誘導の効果が小さくなる場合がある。デキサメタゾンの含有率が７０ｗｔ％を超えると、リン酸カルシウムでデキサメタゾンを包囲できない場合がある。デキサメタゾンの含有率は、さらに好ましくは、１８ｗｔ％以上５０ｗｔ％以下の範囲である。この範囲であれば、骨形成に十分な量のデキサメタゾンを細胞に持続的に供給することができ、高い骨誘導効率が得られる。
【００２９】
本発明の足場材料１００の１ｃｍ３あたりのナノ粒子１２０の含有量は、好ましくは、１ｍｇ以上５００ｍｇ以下の範囲である。ナノ粒子１２０の含有量が１ｍｇ未満である場合、足場材料１００におけるナノ粒子１２０の分布密度が低すぎ、デキサメタゾンの供給が十分でなく、骨分化誘導の効果が小さくなり得る。また十分な骨伝導性が得られない場合がある。ナノ粒子１２０の含有量が５００ｍｇを超えると、すべてのナノ粒子１２０を多孔質体１１０に安定に保持するのは困難である。また成形加工性も低下し、所定の空孔を有する足場材料１００を得られない場合があり得る。
【００３０】
本発明の足場材料１００の１ｃｍ３あたりのナノ粒子１２０の含有量は、さらに好ましくは、５ｍｇ以上５０ｍｇ以下の範囲である。この範囲であれば、骨分化の効果が高くなる。本発明の足場材料１００の１ｃｍ３あたりのナノ粒子１２０の含有量は、なおさらに好ましくは、５ｍｇ以上２０ｍｇ以下の範囲である。この範囲であれば、成型加工性もよく、細胞を確実に骨分化させ、かつ十分な骨伝導性を得ることができる。なお、複合多孔質足場材料中のリン酸カルシウムナノ粒子の含有量を高精度に求めることは困難であるため、簡易的に、複合多孔質足場材料の作製に用いたリン酸カルシウムナノ粒子の仕込み量と同じと仮定してもよい。
【００３１】
本発明の足場材料１００において、好ましくは、ナノ粒子１２０と高分子１１０と（ナノ粒子１２０：高分子１１０）は、質量比で２：１以上１：２以下の範囲を満たす。１：２よりも高分子１１０が多くなると、デキサメタゾンが十分でなく骨分化の効果が小さくなる。２：１よりもナノ粒子１２０が多くなると、ナノ粒子１２０を均一に高分子１１０に位置できない場合がある。さらに好ましくは、ナノ粒子１２０と高分子１１０とは、質量比で１．５：１以上１：１．５以下の範囲を満たす。この範囲であれば、細胞を確実に骨分化させ、十分な骨伝導性を得ることができる。なお、足場材料１００におけるナノ粒子１２０と高分子１１０との質量比を高精度に求めることは困難であるため、簡易的に、製造時のナノ粒子および高分子の仕込み量と同じとみなすことができる。
【００３２】
本発明による複合多孔質足場材料１００は、生体親和性が優れ、かつ、骨の形成及び再生誘導を可能にする。本発明の足場材料１００を、人又は動物の骨組織が欠損した部位に埋め込み、含有されるデキサメタゾンを徐放することによって、足場材料１００の空孔内に侵入した各種細胞の骨分化誘導し、再生・再構築できる。あるいは、本発明の足場材料１００の空孔に骨組織、骨細胞等を接触させ、含有されるデキサメタゾンを徐放することによって、足場材料１００の空孔内に侵入した各種細胞の骨分化誘導し、再生・再構築できる。このようにして、本発明の足場材料１００を用いれば、生体内および生体外で各種骨組織の修復と再構築を行うことが可能となる。
【００３３】
次に、本発明の複合多孔質足場材料の例示的な製造方法を説明する。
本発明の足場材料の製造方法は、デキサメタゾンを含有する生体吸収性のリン酸カルシウムからなるナノ粒子と、生体吸収性高分子（高分子）とを混合し、多孔質化する工程を包含する。ここで、高分子は、図１を参照して説明したとおりであるため、省略する。
【００３４】
デキサメタゾンを含有する生体吸収性のリン酸カルシウムからなるナノ粒子は、調製してもよいし、入手可能であれば市販されているものであってもよい。例示的なナノ粒子の製造方法は、デキサメタゾンを溶解する溶液と、カルシウムの酸塩と、リン酸塩とを混合し、加熱反応させればよい。デキサメタゾンを溶解する溶液は、デキサメタゾンを水、エタノールに代表されるアルコール等のプロトン性極性溶媒に溶解させた溶液であり、例えば、０．０５Ｍ以上１０Ｍ以下の範囲の濃度に調製される。カルシウムの酸塩は、例えば、硝酸カルシウム四水和物であり、０．１Ｍ以上１Ｍ以下の濃度の水溶液に調製される。リン酸塩は、例えば、リン酸水素二ナトリウムであり、０．１Ｍ以上１Ｍ以下の濃度の水溶液に調製される。これらを混合し、４０℃以上８０℃以下の温度に加熱・攪拌し、反応させる。その後、反応で得られたスラリーを室温で１０時間以上４８時間以下の時間エージングすればよい。なお、混合後、水酸化アンモニウム等によりｐＨを８以上１２以下に制御してもよい。このようにして得られるデキサメタゾンを含有するナノ粒子は、図１を参照して説明したとおりであるため、省略する。
【００３５】
ナノ粒子と高分子とは、重量比で、２：１以上１：２以下となるように混合される。これにより、高分子にナノ粒子を分散させ、位置させることができる。より好ましくは、ナノ粒子と高分子とは、重量比で、１．５：１以上１：１．５以下となるように混合される。これにより、上述の足場材料の１ｃｍ３あたりのナノ粒子の含有量を満たす足場材料を製造できる。
【００３６】
ナノ粒子と高分子との混合物の多孔質化は、発泡剤を利用する発泡成形法、空孔形成剤除去法、相分離法等が用いて行われる。このとき高分子は、そのまま用いてもよいし、高分子が均一に溶解する任意の溶媒に溶解させて用いてもよい。例えば、高分子がコラーゲン等の天然高分子である場合、エタノール等のアルコールに代表されるプロトン性極性溶媒を用いることができる。空孔形成剤除去法を採用する場合には、後述する空孔形成剤が高分子と均一に混合されることから、溶媒に溶解させることが好ましい。また、相分離法を採用する場合には、高分子を溶媒に溶解させておけば、相分離を容易に生じさせることができるので、好ましい。
【００３７】
（１）発泡形成法
発泡剤を利用する発泡成形法では、ナノ粒子と高分子との混合物（以降では単に混合物と称する）に発泡剤を添加し、必要に応じて圧力をかけた状態で加熱する。加熱に伴い発泡剤の作用により、空泡が形成され、本発明の複合多孔質足場材料が得られる。
【００３８】
発泡剤は、上述の混合物（溶融体または混合溶液と呼んでもよい）に混合された状態で発泡作用を発する任意の固体またはガスを使うことができるが、固体の発泡剤は、例示的には、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、重炭酸ナトリウムなどの塩の粒子または結晶体であり、ガスの発泡剤は、例示的には、二酸化炭素、窒素、水素、アルゴン、ヘリウムなどの不活性ガスである。なお、ガスの発泡剤を用いる場合には混合物に直接吹き込んで発泡させればよい。
【００３９】
発泡剤を添加する場合には、発泡させる程度、および、得られる空泡の大きさ等に応じて発泡剤とその量を適宜定めることができる。発泡の際には必要に応じて適宜加圧することができる。発泡の温度は、固体の発泡剤を用いる場合には発泡剤からガスを発生することができる温度が採用される。
【００４０】
（２）空孔形成除去法
空孔形成剤除去法では、水溶性の糖質や塩の粉末或いは結晶等を空孔形成剤とし、これを混合物と混合し、通常乾燥に付して、高分子の中に空孔形成剤を取り込み、ついでこの空孔形成剤を除去すれば、本発明の複合多孔質足場材料が得られる。空孔形成剤を添加する場合には、空孔形成剤の大きさや形状を適宜選択することによって、得られる空泡の大きさや形状を制御できる。
【００４１】
空孔形成剤が、塩化ナトリウム又は塩化カリウムからなる中性塩や、ブトウ糖、砂糖などの水溶性糖質や、酒石酸ナトリウム、アスパラギン酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウム等の有機酸塩である場合、水等の溶剤で洗浄すれば、溶解し、除去される。溶剤は、空孔形成剤を溶解するが、高分子を溶解しないものであれば特に制限はない。空孔形成剤が水溶性の塩や水溶性の糖である場合、水で容易に溶解除去される。
【００４２】
空孔形成剤として、氷からなる氷微粒子を用いることもできる。この場合も、氷微粒子を混合物と混合し、凍結乾燥させれば、氷微粒子が除去され、本発明の複合多孔質足場材料が得られる。凍結乾燥は、好ましくは、真空減圧下において行われる。
【００４３】
（３）相分離法
相分離法では、溶媒に溶解した高分子の溶液を温度変化により濃厚相と希薄相とに相分離し、相分離した溶液を凍結乾燥すると、本発明の複合多孔質足場材料が得られる。相分離を行う条件は、高分子の種類、溶媒の種類、高分子溶液の濃度により異なり、当業者であればこれらを考慮して条件を設定する。この際に温度を徐々に下げる方法と、温度を急に下げる方法と、高分子溶液の曇り温度で一定期間保持してから温度を急に下げる方法がある。これらの条件を適宜設定することにより、得られる複合多孔質足場材料の空孔径や空孔形状を制御できる。
【００４４】
以上の操作において、生体吸収性高分子からなる多孔質体と、そこに位置するデキサメタゾン含有ナノ粒子であって、少なくとも生体吸収性のリン酸カルシウムを含有するナノ粒子とを含む、複合多孔質足場材料を製造できる。
【００４５】
多孔質化する工程に続いて、高分子を架橋する工程を行ってもよい。これにより、多孔質体の構造を安定させ、強固な足場材料を提供できる。上述したように、ゼラチンやコラーゲンに代表される水溶性生体吸収性高分子を用いた場合には、架橋は必要だが、ポリ乳酸やポリグリコール酸に代表される水不溶性生体吸収性高分子を用いた場合には、架橋は必ずしも必要ではない。用いられる架橋方法としては、従来公知のものが何れも使用できる。一般的に蒸気法や溶液法を用いることができる。
【００４６】
架橋方法として蒸気法を採用する場合、上記の架橋剤をガス状にして用いるのが好ましい。具体的には、足場材料を一定温度で一定濃度の架橋剤、または、その水溶液で飽和した架橋剤蒸気の雰囲気下で一定時間架橋を行う。蒸気法で用いられる架橋剤としては、従来公知のものが何れも使用できる。好ましく使用される架橋剤は、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドのようなアルデヒド類、特にグルタルアルデヒドである。架橋温度は、足場材料が溶解せず、かつ、架橋剤の蒸気が形成できる範囲内であればよく、通常、２０℃〜５０℃に設定される。架橋時間は、架橋剤の種類や架橋温度にもよるが、足場材料の生体吸収性を阻害せず、かつ、生体への移植時にこのものが溶解しないような架橋固定化が行われる範囲で行うのが望ましい。好ましい架橋時間は１０分から１２時間程度である。
【００４７】
架橋方法として溶液法を採用する場合、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩のようなカルボジイミド、アルデヒド類、エポキシ類などの架橋剤とＮ−ヒドロキシコハク酸イミドなどの活性化剤とを用いて架橋する。未架橋の足場材料は水に溶解するので、これらの架橋剤をエタノールと水との混合溶媒に溶解させて架橋する。エタノール対水の体積比は９９／１から１／９９までである。架橋温度は４℃から４０℃で、望ましくは室温である。架橋剤の濃度は５ｍＭ〜５００ｍＭで、望ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭである。活性化剤の濃度は５ｍＭ〜５００ｍＭで、望ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭである。
【００４８】
蒸発法または溶液法による架橋する工程後、得られた足場材料を洗浄し、架橋を停止してもよい。具体的には、最後の架橋反応後の足場材料を室温で純水に浸漬して洗浄し、これを１回の洗浄として３回繰り返す。洗浄後、未反応の活性官能基を失活させるため、複合多孔質足場材料をグリシン水溶液に浸漬する。グリシン水溶液の濃度は０．０１Ｍ〜１．０Ｍで、望ましいのは０．０５Ｍ〜０．３Ｍである。浸漬温度は４℃〜３７℃で、望ましくは４〜３０℃である。浸漬時間は１時間〜２４時間で、望ましくは４時間〜１２時間である。
【００４９】
上述の多孔質化する工程後、または、架橋する工程後、得られた足場材料を洗浄し、乾燥させてもよい。例示的には、３０分間純水での洗浄を３回以上繰り返す。洗浄後、５Ｐａ以下の減圧下で４８時間凍結乾燥を行う。
【００５０】
次に具体的な実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明がこれら実施例に限定されないことに留意されたい。
【実施例】
【００５１】
［参考例１］
実施例に先立って、実施例で使用するデキサメタゾンの含有量が異なる３種類のナノ粒子を製造した。ここで、ナノ粒子は、少なくとも生体吸収性リン酸カルシウムを含有した。
【００５２】
１．５ｍｇ、３．０ｍｇおよび４．５ｍｇのデキサメタゾン（シグマアルドリッチ合同会社）をそれぞれ２ｍＬのエタノール（和光純薬株式会社）に溶解し、デキサメタゾンのエタノール溶液を調製した。調製したデキサメタゾンのエタノール溶液を硝酸カルシウム四水和物溶液（シグマアルドリッチ合同会社）に添加し、硝酸カルシウム四水和物の濃度が０．５Ｍで溶液の総体積が５０．０ｍＬなるように調製した。デキサメタゾンを含む０．５Ｍ硝酸カルシウム四水和物溶液５０．０ｍＬを０．５Ｍリン酸水素二アンモニウム溶液（シグマアルドリッチ合同会社）３３．４ｍＬに１５０ｍＬ／ｈの速度で滴下した。この混合溶液を５５℃で撹拌しながら、水酸化アンモニウム溶液（シグマアルドリッチ合同会社）を滴下して反応溶液のｐＨを９．５に調整した。その後、撹拌しながら、５５℃の水浴中で３０分間反応した。反応で得られた生成物のスラリーを室温で３６時間保持して熟成（ａｇｉｎｇ）した。この溶液を８０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で５回以上洗浄した。
【００５３】
得られた生成物の形態を、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、型番ＪＥＭ−２１００Ｆ、日本電子株式会社）で観察した。結果を図２に示す。
【００５４】
図２は、参考例１の生成物のＴＥＭ像を示す図である。
【００５５】
図２には、デキサメタゾン４．５ｍｇを用いて得られる生成物の低倍率のＴＥＭ像（Ａ）と高倍率のＴＥＭ像（Ｂ）とを示す。図２によれば、生成物は、ロッド状の形状を有するナノ粒子であり、長軸は２５ｎｍ以上７０ｎｍ以下の範囲であり、短軸は４ｎｍ以上２０ｎｍ以下の範囲であり、長軸および短軸から算出される２軸平均径は、１３．５ｎｍ以上４５ｎｍ以下の範囲を有することが分かった。また、ナノ粒子の表面の形態は一様であり、同一材料で覆われていることが示唆される。図示しないが、デキサメタゾンを１．５ｍｇおよび３．０ｍｇ用いて得られる生成物も同様の形状を有することを確認した。以降では、デキサメタゾンをそれぞれ１．５ｍｇ、３．０ｍｇおよび４．５ｍｇ用いて得られた生成物を、ナノ粒子（ＤＥＸ１．５）、ナノ粒子（ＤＥＸ３．０）およびナノ粒子（ＤＥＸ４．５）と称する。
【００５６】
また、ナノ粒子（ＤＥＸ４．５）の表面の組成を粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）法により分析したところ、ナノ粒子（ＤＥＸ４．５）の表面は、主相がβ−リン酸三カルシウムであり、第二相がハイドロキシアパタイトであった。
【００５７】
さらに、ナノ粒子にデキサメタゾンが内包されていることを確認するため、紫外・可視分光光度計を用い、２４２ｎｍにおける既知濃度のデキサメタゾン溶液の検量線から評価した。具体的には、エタノールで洗浄して表面のデキサメタゾンを除去したナノ粒子（ＤＥＸ４．５）を塩酸で分解し、この溶液の２４２ｎｍのピーク強度を測定した。一方、比較のため、デキサメタゾンを含有しないナノ粒子（後述する比較例４で使用）の表面にデキサメタゾンを吸着させ、表面をエタノールで洗浄した後に塩酸で分解し、この溶液の２４２ｎｍのピーク強度を測定した。その結果、ナノ粒子（ＤＥＸ４．５）を分解した溶液の吸光ピーク強度は、デキサメタゾンを表面に吸着させたナノ粒子のそれと比較すると、顕著に大きかった。このことから、ナノ粒子（ＤＥＸ４．５）において、β−リン酸三カルシウムとハイドロキシアパタイトとの二相性リン酸カルシウムが、デキサメタゾンを内包していることが示唆される。
【００５８】
ナノ粒子（ＤＥＸ１．５）、ナノ粒子（ＤＥＸ３．０）およびナノ粒子（ＤＥＸ４．５）におけるデキサメタゾンの含有量と含有率を測定した。ナノ粒子それぞれ１０ｍｇを０．３ｍＬの１Ｍ  ＨＣｌ（和光純薬株式会社）に溶解した。次いで、これらの溶液に１．７ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ナカライテスク株式会社）を添加して溶液を希釈した。希釈した溶液の試料中のデキサメタゾン量は紫外・可視分光光度計を用い、２４２ｎｍで、既知濃度のデキサメタゾン溶液の検量線を用いて測定した。これによって、デキサメタゾンの含有量を計算した。ナノ粒子（ＤＥＸ１．５）、ナノ粒子（ＤＥＸ３．０）およびナノ粒子（ＤＥＸ４．５）おけるデキサメタゾンの含有量ならびに含有率は、それぞれ、２２５  ±  ２６、３８２  ±  ２１および４６０  ±  ３５  ｎｇ／ｍｇ、ならびに、２２．５、３８．２および４６．０ｗｔ％であった。これらの結果を簡単のため、表１にまとめる。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
［実施例１］
実施例１では、参考例１におけるナノ粒子（ＤＥＸ１．５）と、生体吸収性高分子としてコラーゲンとを用いた複合多孔質足場材料を製造した。
【００６１】
ブタ由来Ｉ型コラーゲン（新田ゼラチン株式会社）を１０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液に溶かし、２．５（ｗｔ／ｖ）％のコラーゲン水溶液を調製した。調製したコラーゲンを−５℃の低温チャンバー内で２時間静置し、コラーゲン溶液の温度を−５℃で平衡化した。次いで、ナノ粒子（ＤＥＸ１．５）を純水に分散し、エタノールの体積濃度が１０（ｖ／ｖ）％になるようにエタノールを添加し、粒子濃度が１００ｍｇ／ｍＬのナノ粒子（ＤＥＸ１．５）のエタノール水溶液を調製した。ナノ粒子（ＤＥＸ１．５）のエタノール水溶液を、−５℃の低温チャンバー内の温度に移動し、２時間静置し、温度を−５℃に調整した。
【００６２】
空孔形成剤である氷微粒子を作製するため、液体窒素の入った容器に純水を噴霧し、水滴を凍結させた。凍結物を−１５℃の低温チャンバーに容器ごと移した。そのまま低温チャンバー内で約２時間静置することによって、液体窒素を気化させた。次に、低温チャンバー内で公称５００μｍの目開きをもつ篩と公称４２５μｍの目開きをもつ篩を用いて大きさ４２５μｍ〜５００μｍ氷を篩い分けた。低温チャンバー内の温度を−５℃に変更し、作製した氷微粒子を２時間静置し、氷微粒子の温度を−５℃に調整した。
【００６３】
２．５（ｗ／ｖ）％コラーゲン溶液１１ｍＬと、３ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬのナノ粒子（ＤＥＸ１．５）のエタノール水溶液とを−５℃で混合し、ナノ粒子を均一に懸濁したナノ粒子（ＤＥＸ１．５）／コラーゲンの混合溶液を調製した。ここで、ナノ粒子（ＤＥＸ１．５）とコラーゲンとは、重量比で、１：１となるように混合された。この混合溶液に氷微粒子１２．５ｇ（１５．４ｍＬに相当）を添加し、１：１（体積ｍＬ対重量ｇ）の比率で−５℃の低温チャンバー内で混合した。氷微粒子が混合溶液内で均一に分散するようによく攪拌した。
【００６４】
続いて、この混合溶液と氷微粒子との混合物を、あらかじめ冷却しておいたシリコーン型枠（内寸法６５ｍｍ×３５ｍｍ×厚み５ｍｍ）に充てんした。この混合物を−１２℃で１２時間静置した後、さらに−８０℃で６時間静置することにより、混合物を凍結させた。凍結物を室温、２日間凍結乾燥を行うことにより、複合多孔質足場材料を得た。
【００６５】
次いで、得られた複合多孔質足場材料においてコラーゲンを架橋した。架橋反応液として、５０ｍＭの１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、株式会社ペプチド研究所）と２０ｍＭのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ、和光純薬株式会社）の８０％エタノール水溶液を用いた。複合多孔質足場材料を架橋液に浸漬させ、室温（２５℃）で２０ｒｐｍの速度で振とうしながら、８時間架橋反応を行った。
【００６６】
架橋反応後の複合多孔質足場材料を室温で１時間超純水に浸漬し、これを１回の洗浄として３回繰り返した。続いて、得られた生成物を０．１Ｍのグリシン水溶液に室温で８時間浸漬した後、１時間、純水での洗浄を３回繰り返した。洗浄後、２日間凍結乾燥を行い、最終製造物の複合多孔質足場材料を得た。なお、以降では、分かり易さのために、実施例１で製造した複合多孔質足場材料を足場材料１と称する。
【００６７】
足場材料１の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ、Ｓ−４８００、株式会社日立ハイテクノロジーズ）で観察した。結果を図３に示す。また、ＳＥＭ像から空孔径を求め、足場材料１ｃｍ３当たりのナノ粒子の含有量（ｍｇ）を求めた。結果を表２に示す。
【００６８】
足場材料１から徐放されるデキサメタゾンの量を調べた。徐放量の測定には、生検パンチで直径６ｍｍ、高さ３ｍｍの円柱状にくり抜いた足場材料１を６個用いた。デキサメタゾンの徐放量は次のようにして測定した。６個の足場材料１を１本の試験管に入れ、ＰＢＳを６ｍＬ加えて浸漬した。この試験管を３７℃、６０ｒｐｍで振とうし、所定の時間経過した時点で上澄み１００μＬをサンプリングし、これを徐放量測定に用いた。残りの足場材料／溶液にＰＢＳを１００μＬ補充して引き続き振とうした。振とう時間は、０．５、１、２、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３５日間であった。サンプリングした溶液の吸光度を紫外・可視分光光度計（Ｖ−６６０、日本分光株式会社）で測定し、既知濃度のデキサメタゾン溶液から作成した検量線から、徐放されたデキサメタゾンの濃度を求めた。デキサメタゾンの濃度及び溶液の体積からデキサメタゾンの重量を計算し、累積徐放量で表した。デキサメタゾン累積徐放量をリン酸カルシウムナノ粒子へのデキサメタゾン内包量で除し、徐放されたデキサメタゾンの割合を求めた。この一連の実験を３回繰り返し、平均値を求めた。結果を図６および表３に示す。
【００６９】
次に、足場材料１を用いて骨組織を再生した。骨組織の再生には、生検パンチで直径６ｍｍ、高さ３ｍｍの円柱状にくり抜き、エチレンオキシドガスで２２時間滅菌処理した足場材料１を用いた。滅菌した足場材料１をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマアルドリッチジャパン合同会社）中に浸漬し、３７℃で４時間インキュベートすることによって平衡化した。ヒト間葉系幹細胞（ロンザジャパン株式会社）をＤＭＥＭ中に分散させ、２×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍＬの懸濁液を調製し、この細胞懸濁液８５μＬ（細胞数１．７×１０５個）をこの足場材料１の上面に滴下した。５％  ＣＯ２、３７℃で３時間培養した後、複合多孔質足場材料を上下反転させ、その上面に細胞懸濁液８５μＬを滴下した。播種した細胞数は合計３．４×１０５個であった。細胞を播種した足場材料１を、１０ｍＭ  β−グリセロホスフェート（シグマアルドリッチジャパン合同会社）を添加したＤＭＥＭ中にて、３７℃、５％  ＣＯ２で１週間ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養した後、６週齢のヌードマウスの背中皮下に６、１２週間移植した。移植後の外観を観察した。結果を図７（Ａ）および（Ｂ）に示す。
【００７０】
足場材料１に侵入した細胞を観察するため、ヘマトキシリン・エオジン染色を行い、観察した。結果を図８（Ａ）〜（Ｃ）に示す。さらに、骨組織の形成をタンパク質レベルで調べるために、移植１２週間の移植物に対して、骨分化関連タンパク質であるＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ  Ｉ）とオステオカルシン（ＯＣＮ）の免疫染色を行った。結果を図９（Ａ）および（Ｂ）に示す。
【００７１】
さらに、骨組織の形成を遺伝子レベルで調べるために、移植１２週間後の移植物に対して、骨分化マーカー遺伝子であるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、骨シアロタンパク質２（ＩＢＳＰ）、ｒｕｎｔ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−２（ＲＵＮＸ２）、骨形成因子２（ＢＭＰ−２）の各発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。足場材料１の骨分化マーカー遺伝子の発現を、デキサメタゾンを含有しない足場材料（後述する比較例４）と比較した。結果を表４に示す。
【００７２】
［実施例２］
実施例２では、参考例１におけるナノ粒子（ＤＥＸ３．０）と、生体吸収性高分子としてコラーゲンとを用いた複合多孔質足場材料を製造した。ナノ粒子（ＤＥＸ１．５）に代えて、ナノ粒子（ＤＥＸ３．０）を用いた以外は、実施例１と同様の手順であるため、説明を省略する。実施例２で製造した複合多孔質足場材料を足場材料２と称する。
【００７３】
足場材料２について、実施例１と同様に、ＳＥＭ観察を行い、空孔径および足場材料１ｃｍ３当たりのナノ粒子の含有量（ｍｇ）を求めた。結果を図４および表２に示す。実施例１と同様に、足場材料２から徐放されるデキサメタゾンの量を調べた。結果を図６に示す。実施例１と同様に、足場材料２を用いて骨組織を再生した。移植後の外観を観察し、ヘマトキシリン・エオジン染色および免疫染色を行った。結果を図７（Ｃ）、（Ｄ）、図８（Ｄ）〜（Ｆ）および図９（Ｃ）、（Ｄ）に示す。実施例１と同様に、足場材料２を用いた骨分化マーカー遺伝子の発現を調べた。結果を表４に示す。
【００７４】
［実施例３］
実施例３では、参考例１におけるナノ粒子（ＤＥＸ４．５）と、生体吸収性高分子としてコラーゲンとを用いた複合多孔質足場材料を製造した。ナノ粒子（ＤＥＸ１．５）に代えて、ナノ粒子（ＤＥＸ４．５）を用いた以外は、実施例１と同様の手順であるため、説明を省略する。実施例３で製造した複合多孔質足場材料を足場材料３と称する。
【００７５】
足場材料３について、実施例１と同様に、ＳＥＭ観察を行い、空孔径および足場材料１ｃｍ３当たりのナノ粒子の含有量（ｍｇ）を求めた。結果を図５および表２に示す。実施例１と同様に、足場材料３から徐放されるデキサメタゾンの量を調べた。結果を図６に示す。実施例１と同様に、足場材料３を用いて骨組織を再生した。移植後の外観を観察し、ヘマトキシリン・エオジン染色および免疫染色を行った。結果を図７（Ｅ）、（Ｆ）、図８（Ｇ）〜（Ｉ）および図９（Ｅ）、（Ｆ）に示す。実施例１と同様に、足場材料３を用いた骨分化マーカー遺伝子の発現を調べた。結果を表４に示す。
【００７６】
［比較例４］
比較例４では、デキサメタゾンを含有しないナノ粒子と、生体吸収性高分子としてコラーゲンとを用いた複合多孔質足場材料を製造した。デキサメタゾンを含有しないナノ粒子は、参考例１において、デキサメタゾンを用いない以外は同様にして製造した。ナノ粒子（ＤＥＸ１．５）に代えて、デキサメタゾンを含有しないナノ粒子を用いた以外は、実施例１と同様の手順であるため、説明を省略する。比較例４で製造した複合多孔質足場材料を足場材料４と称する。
【００７７】
実施例１と同様に、足場材料４を用いて骨組織を再生した。移植後の外観を観察し、免疫染色を行った。結果を図１０に示す。実施例１と同様に、足場材料４を用いた骨分化マーカー遺伝子の発現を調べた。
【００７８】
以上の結果を説明する。
図３は、実施例１の足場材料１のＳＥＭ像を示す図である。
図４は、実施例２の足場材料２のＳＥＭ像を示す図である。
図５は、実施例３の足場材料３のＳＥＭ像を示す図である。
【００７９】
図３（Ａ）、図４（Ａ）および図５（Ａ）によれば、本発明の足場材料１〜３は、いずれも、氷微粒子のサイズを反映した球状の空孔構造およびそれが連通した空隙からなる多孔質構造を有することが分かった。図３（Ｂ）、図４（Ｂ）および図５（Ｂ）は、高倍率の観察結果であるが、空孔壁面にはナノ粒子に相当する粒子状のものが観察された。
【００８０】
【表２】
2019072378.tif 000004
【００８１】
表２によれば、足場材料１〜３における空孔径は、用いた氷微粒子の大きさおよび形状を反映していることが確認された。足場材料１〜３の外体積１ｃｍ３当たりのナノ粒子の含有量は、次のようにして計算した。コラーゲン水溶液（１１ｍＬ）とナノ粒子のエタノール溶液（３ｍＬ）との混合溶液（１４ｍＬ）の凍結後の体積は、１５．４ｍＬ（水が氷に状態変化すると体積が１．１倍増加するため）となる。凍結した混合溶液（１５．４ｍＬ）と氷微粒子（１５．４ｍＬ）との合計体積は、３０．８ｍＬとなり、凍結乾燥後の足場材料の外体積は３０．８ｃｍ３とみなせる。３００ｍｇのナノ粒子を用いたため、外体積１ｃｍ３あたりのナノ粒子は、３００／３０．８〜９．７ｍｇ／ｃｍ３となる。
【００８２】
図６は、実施例１〜３の足場材料１〜３から徐放されるデキサメタゾンの徐放量の時間依存性を示す図である。
【００８３】
図６によれば、実施例１〜３の足場材料１〜３のいずれも、デキサメタゾンの徐放が３５日間にわたって観察され、デキサメタゾンの徐放を可能にすることが示された。また、デキサメタゾンの徐放量は、足場材料に含有されるナノ粒子中のデキサメタゾン濃度の増加にともなって増加した。
【００８４】
表３に示すように、インキュベーション後の足場材料１〜３からの累積デキサメタゾン放出量は、それぞれ、３３９．９  ±  ３５．８ｎｇ、  ５５３．５  ±  ３８．３ｎｇ、７１２．５  ±  ５７．１  ｎｇ（以上、足場材料１個あたりの量）であった。足場材料１〜３におけるデキサメタゾンの含有量に対して、徐放したデキサメタゾンの累積割合（％）を計算した。３５日間後、足場材料１〜３から放出したデキサメタゾンの累積割合は、それぞれ、７６．２  ±  ６．８％、７２．４  ±  ５．７  ％、７９．１  ±  ７．０  ％であった。このことから、本発明の足場材料は、少なくとも１か月にわたってデキサメタゾンを徐放でき、骨組織の再生に有利であることが示された。見やすさのために、これらの結果を表３に示す。
【００８５】
【表３】
2019072378.tif 000005
【００８６】
図７は、実施例１〜３の足場材料１〜３を用いて再生した骨組織の外観を示す図である。
【００８７】
図７（Ａ）および（Ｂ）は、足場材料１を用い、１２週間移植した骨組織の外観であり、図７（Ｃ）および（Ｄ）は、足場材料２を用い、１２週間移植した骨組織の外観であり、図７（Ｅ）および（Ｆ）は、足場材料３を用い、１２週間移植した骨組織の外観である。図７（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）は、足場材料１〜３を上面から撮影した様子であり、図７（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｆ）は、足場材料１〜３を側面から撮影した様子である。
【００８８】
図７ではグレースケールで示すが、移植物（骨組織）は全体に赤色を帯びており、骨組織が形成したことを確認した。特に明度が暗く示される部分は、毛細血管であり、本発明の足場材料が骨組織の再生に有効であることが分かった。また、移植後１２週間経過後も、移植前の寸法を維持していることが分かった。
【００８９】
図８は、実施例１〜３の足場材料１〜３を用いて再生した骨組織のヘマトキシリン・エオジン染色像を示す図である。
【００９０】
図８（Ａ）〜（Ｃ）は、足場材料１を用い、１２週間移植した骨組織の染色像であり、図８（Ｄ）〜（Ｆ）は、足場材料２を用い、１２週間移植した骨組織の染色像であり、図８（Ｇ）〜（Ｉ）は、足場材料３を用い、１２週間移植した骨組織の染色像である。図８（Ａ）、（Ｄ）、（Ｇ）は、足場材料１〜３の縦横断面全体であり、図８（Ｂ）、（Ｅ）、（Ｈ）は、図８（Ａ）、（Ｄ）、（Ｇ）の拡大像であり、図８（Ｃ）、（Ｆ）、（Ｉ）は、図８（Ｂ）、（Ｅ）、（Ｈ）のさらなる拡大像である。
【００９１】
図８（Ａ）、（Ｄ）、（Ｇ）によれば、全体に染色（グレースケールにおいて明度が暗く示される領域に相当する）されており、細胞が空孔内に侵入していること、侵入した細胞が足場材料に一様に分布していること、細胞外マトリックスが一様に堆積していることが示された。
【００９２】
図８（Ｃ）、（Ｆ）、（Ｉ）において、矢印（→）は、新生血管を示し、アスタリスク（＊）は、新生骨を示す。このことから、本発明の足場材料を用いれば、骨組織の再生が可能であることが示された。
【００９３】
図９は、実施例１〜３の足場材料１〜３を用いて再生した骨組織の免疫染色像を示す図である。
図１０は、比較例４の足場材料４を用いて再生した骨組織の免疫染色像を示す図である。
【００９４】
図９（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、足場材料１を用い、１２週間移植した骨組織のＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ  Ｉ）とオステオカルシン（ＯＣＮ）の免疫染色像であり、図９（Ｃ）、（Ｄ）は、足場材料２を用い、１２週間移植した骨組織のＣｏｌ  ＩとＯＣＮの免疫染色像であり、図９（Ｅ）、（Ｆ）は、足場材料３を用い、１２週間移植した骨組織（移植物）のＣｏｌ  ＩとＯＣＮの免疫染色像である。図１０（Ａ）、（Ｂ）は、足場材料４を用い、１２週間移植した骨組織のＣｏｌ  ＩとＯＣＮの免疫染色像である。
【００９５】
図９および図１０は、グレースケールで示すが、明度が暗く示される領域が、抗Ｃｏｌ  Ｉ抗体、抗ＯＣＮ抗体によって染色されたことを示す。図９によれば、足場材料１〜３を用いた移植物は、抗Ｃｏｌ  Ｉ抗体、抗ＯＣＮ抗体によって染色された。特に、図９と図１０とを比較すると、足場材料１〜３の染色像は、足場材料４のそれと比較して濃く染色された。このことから、本発明の足場材料１の移植物の骨分化の度合いは、足場材料４に対して有意に高いことが示された。
【００９６】
足場材料１〜３を用いた移植物における骨分化マーカー遺伝子の発現レベルを、足場材料４を用いたそれと比較した結果を表４に示す。
【００９７】
【表４】
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【００９８】
表４によれば、足場材料１〜３の移植物では、足場材料４のそれと比較して、骨分化マーカー遺伝子の発現が少なくとも約２倍亢進していることが示された。このことからも、本発明の足場材料は、より高い効率で骨組織を再生することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明の複合多孔質足場材料は、骨組織の欠損部位に移植される、細胞を多孔質内に侵入させることができるので、細胞を効率的に骨分化させることができる。しかも、デキサメタゾン含有ナノ粒子は多孔質体に担持されているため、ナノ粒子がすばやく拡散してデキサメタゾンを骨欠損部位に供給する効率が低下してしまうことを防ぐだけでなく、骨組織が再生される間、ナノ粒子に担持されたデキサメタゾンを徐放することが可能である。複合多孔質足場材料を欠損部位の形状にすることにより、欠損部位に応じた形状の骨組織を再生する。よって、本発明の複合多孔質足場材料は骨再生医療にきわめて有効である。
【符号の説明】
【０１００】
１００  複合多孔質足場材料
１１０  多孔質体
１２０  ナノ粒子
１３０  空孔
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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