(57)【要約】【課題】  従来とは異なる遺伝子変異を有する糖尿病のモデル動物を提供する。【解決手段】  インスリン2遺伝子の少なくとも一方のアレルに変異を有し、変異型プレプロインスリンを発現する非ヒト動物であって、前記変異型プレプロインスリンが、マウスのプレプロインスリンの104番目のグルタミンに相当するグルタミンが欠失しているプレプロインスリンであることを特徴とする非ヒト動物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン2遺伝子の少なくとも一方のアレルに変異を有し、変異型プレプロインスリンを発現する非ヒト動物であって、前記変異型プレプロインスリンが、マウスのプレプロインスリンの104番目のグルタミンに相当するグルタミンが欠失しているプレプロインスリンであることを特徴とする非ヒト動物。
【請求項２】
非ヒト動物が、1型糖尿病の病態を示すことを特徴とする請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項３】
非ヒト動物が、免疫不全を呈することを特徴とする請求項１又は２に記載の非ヒト動物。
【請求項４】
非ヒト動物が、Rag2遺伝子及びJak3遺伝子がともに欠損していることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項５】
非ヒト動物が、マウス、ラット、ブタ、マーモセット、ウサギ、又はカニクイザルであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリン2遺伝子に変異を有し、糖尿病の病態を示す非ヒト動物に関する。この非ヒト動物は、糖尿病、特に1型糖尿病のモデル動物として有用である。
【背景技術】
【０００２】
インスリンは、血中グルコースの恒常性を調節する機能を有する内分泌膵臓から分泌される。新生児糖尿病は、膵臓β細胞の機能に関与するタンパク質産物をコードする多数の遺伝子における変異から生じる一遺伝子型の糖尿病である。これらの遺伝子の中で、インスリン遺伝子の変異は、ヒトにおいて永続性新生児糖尿病（PND）を引き起こすことが確認されている（参考文献１、２、３、及び４）。
【０００３】
マウスでは、インスリン遺伝子変異を有するAkita Ins2C96Y及びMunich Ins2 + / C95Sマウスモデルが常染色体優性遺伝型を示す早期発症糖尿病になることが報告されている（非特許文献１及び２）。これらのマウスモデルは、肥満又は膵島炎を伴わない高血糖を示し、膵β細胞の機能不全を主要な異常として示す。表現型は、ヒトのPNDに似ており、従って、移植研究のモデルとしてだけでなく、β細胞の機能不全の研究のために広く使用されるモデルとして役立つ。受精卵に遺伝子を導入することにより、Akitaマウスのブタのモデルなどの実験動物が作製されている（参考文献７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Yoshioka, M., Kayo, T., Ikeda, T. & Koizumi, A. Diabetes 46, 887-894 (1997)
【非特許文献２】Herbach, N. et al. Original Article. Diabetes (2007) doi:10.2337/db06-0658.ENU
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように、Akita マウス（Akita Ins2C96Y）など糖尿病の病態を示すモデル動物は既に幾つか知られている。しかし、糖尿病の病態は多様であることから、それに合わせ、より多くの種類のモデル動物が求められている。
【０００６】
本発明は、このような背景の下になされたものであって、従来とは異なる遺伝子変異を有する糖尿病のモデル動物を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、インスリン2遺伝子の変異により、104番目のグルタミンが欠失したプレプロインスリンを発現するマウスが、糖尿病の病態を示すことを見出し、この知見に基づき、本発明を完成した。
【０００８】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（５）を提供するものである。
（１）インスリン2遺伝子の少なくとも一方のアレルに変異を有し、変異型プレプロインスリンを発現する非ヒト動物であって、前記変異型プレプロインスリンが、マウスのプレプロインスリンの104番目のグルタミンに相当するグルタミンが欠失しているプレプロインスリンであることを特徴とする非ヒト動物。
【０００９】
（２）非ヒト動物が、1型糖尿病の病態を示すことを特徴とする（１）に記載の非ヒト動物。
【００１０】
（３）非ヒト動物が、免疫不全を呈することを特徴とする（１）又は（２）に記載の非ヒト動物。
【００１１】
（４）非ヒト動物が、Rag2遺伝子及びJak3遺伝子がともに欠損していることを特徴とする（１）乃至（３）のいずれかに記載の非ヒト動物。
【００１２】
（５）非ヒト動物が、マウス、ラット、ブタ、マーモセット、ウサギ、又はカニクイザルであることを特徴とする（１）乃至（４）のいずれかに記載の非ヒト動物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、インスリン2遺伝子に変異を有し、糖尿病の病態を示す非ヒト動物を提供する。この非ヒト動物は、糖尿病のモデル動物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Kumaマウス樹立に関する図。糖尿病性Ins2 + / Q104del（Kuma）マウスを樹立した。Kuma変異は、BRJバックグラウンドの下で作製された。Kumaマウスは3塩基対（CAG; c.310-312del；もしくはAGC: 311-313）の欠失を示した。Kuma変異のジェノタイピングは、ゲノムPCR及びPvuII制限酵素消化によって行うことができた。（A）野生型及びKumaマウスの配列決定は、Kumaマウスの3塩基対（CAG あるいはAGC、どちらが欠失しても同じ配列になる。）欠失を明らかにした。（B）Kuma変異は、RT-PCR、続いて制限酵素PvuII消化によって同定することができた。野生型断片はPvuIIによって消化され、425bp及び248bpのバンドを生じた。これに対し、Kuma変異マウスでは、PvuII部位が失われているので、ヘテロ接合性Kuma変異は、670bpで、より大きなバンドを示した。（C）Kuma変異周辺のIns2遺伝子の配列を示す。使用されたプライマー対は、下線で示されたプライマー部位の下の順方向及び逆方向の矢印によって示される。赤い大文字はタンパクコードする領域（CDS）を示す。ゲノムPCRによって増幅された断片の配列を太字で示す。2つのPvuII認識部位は緑色の文字で示されている。Kuma変異（CAG欠失）部位は、赤色のボックスで示されている。(D) マウス、ラット、ヒト、ブタ、マーモセット、及びウサギのプレプロインスリンのアミノ酸配列が示されている。
【図２】血中グルコース値及び体重に関する図。Kumaマウスは非肥満糖尿病マウスである。BRJの野生型（BRJ WT）及びIns2 + / Q104del（Kuma）マウス（雄及び雌の両方）の週齢に依存した血中グルコース値(A)及び体重(B)を示す。ヘテロ接合性の雄又は雌マウスの血中グルコース値は、有意に高い値を示した。しかしながら、体重の差は、BRJ WTとヘテロ接合性変異マウスとの間では観察されなかった。データは、箱ひげ図として示される。上位四分位数、中央値、下位四分位数がボックスに表示される。上下のひげは最大値と最小値を示す。WTマウスの値と比較したKumaヘテロ接合性マウスにおける値の有意差を、Kruskal-Wallis post-hoc Stell-Dwassの検定によって分析した。有意差は§P <0.05又は§§ P <0.01として示されている。
【図３】ブドウ糖負荷試験に関する図。Kumaマウスは、ヘテロ個体において耐糖能異常を示した。(A）ブドウ糖負荷試験は、BRJ WT及びヘテロ接合性Kumaマウスを用いて行った。マウスは、9週齢の雄（左パネル）と雌（右パネル）を用いた。（B）Aに示す結果のAUC（曲線下面積）をプロットした。雄及び雌のKumaヘテロ接合性マウスにおける耐糖能異常が観察された。有意差は* P <0.05又は** P <0.01として示されている。A）及びB）では平均±SEM（平均の標準誤差）として示される。図３Aはone-way ANOVA post-hoc Bonferroni’s testで検定した。図３Bは対応のないStudent's t-test で検定した。
【図４】インスリン反応性試験に関する図。インスリン抵抗性の有無及びインスリン分泌低下を示すKumaマウスは、インスリン療法によって血中グルコースを正常に戻すことができた。（A）4週齢又は（B）10週齢の雄のBRJ WT及びKumaマウスはインスリンに正常に反応した血糖降下を示した。時間0からの血中グルコースの相対値として示されている。平均±SEMが示されている。（C）グルコース投与後に測定されたインスリン分泌は、ヘテロ接合性Kumaマウスにおいて、障害されている。（D-F）インスリンインプラントで処置されたヘテロ接合性Kumaマウスは、高血糖が是正される。(D)15週齢の雌のヘテロ接合性Kumaマウスの血中グルコース値を、Linbit移植前の2ヶ月間測定した。このマウスは高血糖を示し、Linbitを移植した。Linbit移植時に、高血糖の急速な是正が観察された。各線は個々のヘテロ接合性Kumaマウスを表す。灰色のボックスは、マウスがLinbitを移植された時間ウィンドウを示す。(E）1ヵ月のLinbit処理後、ヘテロ接合性Kumaマウスは、IPGTTに供され、正常なブドウ糖耐性を示した。(F）10週齢の雄のヘテロ接合性Kumaマウスの血中グルコースを2週から測定した。このマウスは高血糖を示し、Linbitを移植した。移植の際に、高血糖の急速な是正が観察された。Linbit除去後、高血糖の再発が観察された。各ドットは個々のマウスを表す。各水平線は、血中グルコース値の中央値を示す。
【図５】膵島構造に関する図。Kumaマウスは異常な膵島構造を示した。10週齢の雄のWT及びKumaマウスから切り離された膵臓を免疫組織化学に供して、膵島におけるインスリン（緑色）及びグルカゴン（赤色）の発現を検出した。（A）BRJ WTマウスは正常なインスリン発現膵島を示し、グルカゴンを発現するα細胞は膵島の周辺に存在していた。（B）Kumaマウスでは、膵島の数が減り、膵島の大きさが小さくなった。また、インスリン発現細胞は減少した。グルカゴンを発現するα細胞は、膵島の内部に散在した。代表的な写真が表示される。 DAPIは、核染色（青）である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に非ヒト動物は、インスリン2遺伝子の少なくとも一方のアレルに変異を有し、変異型プレプロインスリンを発現する非ヒト動物であって、前記変異型プレプロインスリンが、マウスのプレプロインスリンの104番目のグルタミンに相当するグルタミンが欠失していることを特徴とするものである。
【００１６】
対象とする動物は、ヒト以外の動物であれば特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ブタ、マーモセット、ウサギ、カニクイザルなどを挙げることができる。
【００１７】
本発明の非ヒト動物は、インスリン2遺伝子に変異を有し、これにより、変異型プレプロインスリンを発現する（以下、このインスリン2遺伝子の変異を「本発明の変異」という場合がある。）。変異型プレプロインスリンは、マウスのプレプロインスリンの104番目のグルタミンに相当するグルタミンが欠失している。ここで、「マウスのプレプロインスリンの104番目のグルタミンに相当するグルタミン」とは、対象とする動物のプレプロインスリンのアミノ酸配列とマウスのプレプロインスリンのアミノ酸配列を、アミノ酸配列の同一性に基づいて整列させた場合に、マウスのプレプロインスリンの104番目のグルタミンに対応するグルタミンを意味する。「マウスのプレプロインスリンの104番目のグルタミンに相当するグルタミン」は、マウスでは、当然104番目のグルタミンであるが、図1Dに示すように、ラットとウサギでは104番目のグルタミンであり、ブタとマーモセットでは102番目のグルタミンである。多くの動物におけるプレプロインスリンのアミノ酸配列は知られているので、上記以外の動物における「マウスのプレプロインスリンの104番目のグルタミンに相当するグルタミン」は、当業者であれば容易に特定することができる。
【００１８】
インスリン2遺伝子に変異は、少なくとも一方のアレルにあればよく、必ずしも両方のアレルにある必要はない。
【００１９】
本発明の非ヒト動物は、耐糖能異常やインスリン投与による高血糖の改善といった1型糖尿病の病態を示すことから、1型糖尿病のモデル動物として利用することができる。後述する実施例では、1型糖尿病の病態は、マウスにおいてしか確認されていないが、プレプロインスリンのアミノ酸配列は種間で同一性が高く、また、「マウスのプレプロインスリンの104番目のグルタミンに相当するグルタミン」も種間でよく保存されていることから、他の動物も同様の病態を示すと考えられる。また、本発明の変異と同様に、インスリン2遺伝子の変異であって糖尿病の病態を生じさせるAkita変異は、マウスだけでなく、ブタにも同様の病態を生じさせることが知られている（参考文献７）。このことも、本発明の変異がマウス以外の動物においても1型糖尿病の病態を生じさせ得ることの根拠である。
【００２０】
近年ヒトiPS細胞由来膵β細胞の移植による糖尿病の治療について研究が行われているが、本発明の非ヒト動物は、このような膵β細胞の治療効果を調べるのに最適である。しかし、本発明の非ヒト動物が正常な免疫機能を持つ場合、異種移植による拒絶反応が生じる。従って、本発明の非ヒト動物は、このような拒絶反応の生じない免疫不全を呈する動物であることが好ましい。免疫不全は、各種免疫細胞（T細胞、B細胞、NK細胞、NKT細胞など）の異常又は欠損によって生じるものでよく、T細胞、B細胞、NK細胞、及びNKT細胞の完全欠損又は減少によって生じる免疫不全が好ましい。このような免疫不全を呈する動物としては、熊本大学によって樹立されたBRJマウスが知られている（参考文献８、WO2013/145331）。このマウスは、T細胞、B細胞、NK細胞が完全欠損し、NKT細胞が減少している。BRJマウスは、BALB/cマウスのRag2遺伝子及びJak3遺伝子の両方を欠損させたマウスであり、これらの二つの遺伝子の欠損によって前述したような免疫細胞の欠損が生じる。本発明の非ヒト動物も、BRJマウス同様、Rag2遺伝子及びJak3遺伝子がともに欠損していることが好ましい。
【００２１】
本発明の非ヒト動物は、公知の遺伝子改変技術、例えば、ゲノム編集を用いて、インスリン2遺伝子に本発明の変異を導入することによって作製することができる。また、野生型のインスリン2遺伝子PvuIIによって切断されるが、インスリン2遺伝子に本発明の変異が導入されると、この制限酵素に耐性を示すようになるので、PvuIIによる切断の有無によって、実際に本発明の変異がインスリン2遺伝子に導入されたかどうかを判断することができる。本発明の非ヒト動物が免疫不全を呈するようにするためには、免疫不全に関与する遺伝子を改変してもよいが（例えば、Rag2遺伝子及びJak3遺伝子のノックアウト）、免疫不全を呈する動物（例えば、BRJマウス）に本発明の変異を導入すればよい。
【００２２】
本発明の非ヒト動物は、1型糖尿病のモデル動物として利用することができる。また、本発明の非ヒト動物が免疫不全を呈する場合には、ヒト由来の細胞を移植することができるので、ヒト膵β細胞を移植し、その治療効果を調べるために用いることができる。
【実施例】
【００２３】
以下に、実施例により本発明をさらに詳細に述べるが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００２４】
（Ａ）結果
（１）BRJバックグラウンド下における糖尿病Kumaマウスの作製
ヒト細胞のマウスへの移植を可能にするために、重度の免疫不全を呈するBRJ（BALB/ cバックグラウンドのRag2 / Jak3二重欠損マウス）（参考文献８）にインスリン2遺伝子の変異を導入しようと試みた。CRISPR / Cas9システム（参考文献９及び１０）を用い、元々Ins2 + / C96Y（Akita）変異を生じるように設計された遺伝子編集を利用した。100塩基の一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ssODNs）のエレクトロポレーション（参考文献１１）によって、インビトロで転写されたCas9 mRNAとgRNAを、Akita変異を有するIns2遺伝子の標的とするBRJマウスの受精卵に導入した。しかし、Akita変異を得る代わりに、Gln（Q）欠失（p.Q104del）をもたらすIns2遺伝子（c.310_312del）の3塩基（CAG）欠損を得た（図1A）。そのF1雌マウスは、糖尿病の1つの症状である多尿を示した。本発明者は、Ins2 + / Q104del変異をKuma変異と命名し、この変異を有するマウスをKumaマウスと命名した。Kumaマウスのジェノタイピングのために、断片を増幅するゲノムPCRシステムを確立した。このシステムはp.Q104del変異体におけるPvuII制限酵素部位の欠損を利用するものである（図1B）。変異アレルはPvuIIの消化に対して耐性があり、このため、670bpのより大きなバンドが変異アレルにおいて検出され得る（図1B）。変異部位周辺のゲノム配列を図1Cに示す。欠失した3塩基（AGC）は赤いボックスで強調表示される。マウス、ラット、ヒト、ブタ、マーモセット及びウサギのIns2のアミノ酸配列の比較は、このp.Q104が高度に保存された残基であることが明らかにする（図1C）。
【００２５】
糖尿病の表現型を、WT及びKumaマウスにおける週齢の増加とともに調べた。非空腹時血糖を測定した。Kumaマウスは、ヘテロ接合性の雄及び雌の両方において、3週以降の若い時期から高血糖を示した（図2A）。雌のヘテロ接合性Kumaマウスは、雄のヘテロ接合性Kumaマウスと比較してより軽度の高血糖症を示した。雄及び雌のヘテロ接合性Kumaマウスの体重を週齢に従って測定したところ、Kumaマウスは非肥満であることが示された（図2B）。従って、この結果から、Kumaマウスが非肥満永続性新生児糖尿病を示すことが明らかとなる。
【００２６】
（２）Kumaマウスの示す膵臓β細胞機能の障害
糖尿病の表現型を詳細に調べるために、ブドウ糖負荷試験を行った。9週齢の雄及び雌のヘテロ接合性Kumaマウスは、対照BRJ野生型マウスと比較して耐糖能異常を示した（図3A）。雄及び雌の両方においてヘテロ接合性Kumaマウスの曲線下面積は、対照野生型マウスと比較して有意に高く（図3B）、これにより、これらのマウスが耐糖能異常であることが示される。
【００２７】
本発明者はインスリン反応性試験を行った。その結果、4週齢の雄のヘテロ接合体は正常なインスリンに対する反応性を示した（図4A）。10週齢のマウスは、30分間の血糖値は対照野生型マウスよりも有意に高かったものの、正常なインスリン反応性を示した（図4B）。次に、グルコース投与後のインスリン分泌を試験した。グルコースの静脈注射後の血中インスリン濃度を測定した。ヘテロ接合性のKumaマウスは、野生型マウスのインスリン分泌に比べて低いインスリン分泌を示した（図4C）。次に、インスリンの持続放出を可能にするインスリンインプラントであるLinbitを用いてインスリンの投与を試みた。15週齢の雌のヘテロ接合性KumaマウスにLinbitを移植すると、Kumaマウスの高血糖は急速に正常血糖になり、これは1ヶ月間持続した（図4D）。Linbitの移植から1ヶ月後に、マウスを腹腔内ブドウ糖負荷試験（IPGTT）に供し、マウスが正常な耐糖能を示すことを観察した（19週齢）。この結果から、高血糖及び耐糖能異常が可逆的であり、インスリン投与によって治癒され得ることが示された（図4E）。10週齢の雄のヘテロ接合性KumaマウスにLinbitを移植する別の実験でも、血中高血糖の是正が示された。Linbitを除去すると、高血糖の再発が観察された（図4F）。
【００２８】
（３）Kumaマウスが示す異常な膵島構造と低下したインスリン分泌
次に、Kumaマウスの膵島構造を調べた。インスリン又はグルカゴンに対する抗体を用いた10週齢の野生型及びヘテロ接合性Kumaマウス膵臓の免疫染色により、ヘテロ接合性Kumaマウスでは、膵島の数が少なく、サイズが小さいことが明らかとなった（図5）。Kumaマウスの膵島の構造もまた変化していた。BRJ野生型対照マウスでは、β細胞は膵島の中心に存在し、グルカゴン発現細胞は周辺でより多く見出された（図5A）。しかし、雄のヘテロ接合性Kumaマウスでは、インスリンを発現するβ細胞はα細胞と混ざっており、α細胞はもはや周辺には存在せず、膵島の内部にランダムに存在した（図5B）。β細胞の数もヘテロ接合性Kumaマウスにおいて減少していた。これらの結果は、変異マウスの膵島におけるβ細胞量の喪失及び内分泌細胞の変化した組織化を示す。
【００２９】
（Ｂ）考察
新生児糖尿病は、生後6ヶ月以内に診断される早期発症型糖尿病であり、持続型の永続性新生児糖尿病（PND）及び再発寛解型の一過性新生児糖尿病に分類することができる（参考文献１及び２）。KCNJ11もしくはABCC8の活性化変異、カリウムATP感受性（KATP）チャネルサブユニットKir6.2及びSUR1をコードする遺伝子の変異、又はプレプロインスリン（INS）遺伝子のヘテロ接合性変異などの一遺伝子変異は、PNDに関連する主要な原因であることが知られている（参考文献１及び２）。INS遺伝子変異は、高血糖につながる不十分なインスリン分泌をもたらした。51以上のインスリン遺伝子変異がヒトにおいて一遺伝子性の糖尿病を引き起こすことが確認されている（参考文献１４）。変異の大部分は、プロインスリン分子の折りたたみを破壊すると予測された。このような破壊は、小胞体（ER）ストレス及びβ細胞アポトーシスを引き起こす（参考文献３及び１４）。
【００３０】
この研究で、本発明者は、重度の免疫不全BRJマウスモデル（参考文献８）にIns2 p.Q104del（Kuma）変異を生じさせた。Kumaマウスは非肥満であり、出生時に正常血糖を示したが、3週齢の若い年齢で糖尿病を発症した。この変異は常染色体優性遺伝であり、ヒトのPNDの糖尿病に似ている。ヘテロ接合性Kumaマウスは、グルコース刺激への応答時における減少したインスリン分泌に起因する耐糖能異常を示した。β細胞量は、出生から初期においては変化しなかったが、10週齢後に変化した膵島構造、並びに減少した膵島数及びベータ細胞量を示した。本発明者は、10週でKumaマウスにおいてインスリン反応性が正常であることを見出した。本発明者はKumaマウスにインスリンインプラントを投与し、これがインスリン抵抗性からマウスを救うことができることを見出した。Ins遺伝子のQ104は種間でよく保存されているが、本発明者の報告は、新生児糖尿病を誘発するこの変異を初めて報告したものである。
【００３１】
Kumaマウスは、Akitaマウスの表現型に似ている。Akitaマウスは、2型糖尿病の表現型を発現し、高血糖と関連するインスリン抵抗性を示す（参考文献１５）。INSC94Yトランスジーンを導入することによって作製されたトランスジェニックブタモデルも、インスリン抵抗性を含む同様の表現型を示した。Kumaマウスでは、インスリン抵抗性は10週齢では明らかではなかったが、後でインスリン抵抗性を発症する可能性がある。本発明者は、Kuma変異が、インスリン遺伝子及びβ細胞量の維持のための分子メカニズムの研究のためだけでなく、高血糖下でのインスリン抵抗性の発達のための魅力的なモデルとして役立つと信じている。膵切除によりインスリン欠乏型糖尿病を誘導する他の方法は、高度に侵襲的であり、ストレプトゾトシン処理などによる化学的糖尿病誘発はマウスの系統及び年齢によって変動する結果を示し、また低用量で可逆的である（参考文献１６〜１８）。対照的に、Kumaマウスは、Akitaマウス（参考文献１９）と同様に、安定した糖尿病を示した。以上をまとめると、BRJマウスにおけるKuma変異は、ヒトiPS細胞から生成された移植されたβ細胞の機能性を試験するための良好なモデルとして有用である。Kuma変異は、異なる種間でよく保存されており、他の実験動物におけるPNDモデルを生成するために使用されるだろう。
【００３２】
（Ｃ）材料と方法
（１）動物
Rag2 / Jak3二重欠損（BRJ）マウスのBALB/cライン（参考文献８）を用いた。熊本大学又は東京工業大学の施設ガイドラインに従って、動物実験施設で、BRJ又はKuma（Ins2 + / Q104del）マウスを飼育し、モニタリングした。新たに開発されたKumaマウスは、ヘテロ接合性の雌を野生型の雄のBRJマウスと交配させるか、又は体外受精によって維持する。すべての動物の処置は、東京工業大学又は熊本大学での動物のケア及び使用に関するガイドラインに従って行われた。マウスは絶食時を除いて食物と水に自由にアクセスできるようにした。ジェノタイピングは、図1Cに示すプライマー対を使用してインスリン（Ins）2遺伝子のゲノムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）分析を用いて行った。増幅したPCR断片をPvuII制限酵素切断に付した。変異マウスはPvuIIに対して耐性であることが確認された。2時間絶食させたマウスにおける空腹時血中グルコース値及び体重を2週齢以降測定した。測定は、尾部を切開することにより、ポータブルグルコースモニター（Life check sensor、Gunze、Tokyo、Japan）又は血糖値測定装置ANTSENSE III（Horiba、Kyoto）を用いて行った。
【００３３】
（２）Kumaマウスの作製
hCas9のin vitro転写のためのpUC-T7-hCas9及びgRNAのin vitro転写のためのpSKII+T7-gRNAは、伊川博士（大阪大学）から得た（参考文献１２）。Cas9 mRNAは、mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit（Life Technologies、Carlsbad、CA、USA）を用いて、線状化プラスミドからin vitroで転写され、MEGAClearキット（Life Technologies）を用いて精製された。sgRNAは、Akita変異の3'隣接領域におけるGCATCTGCTCCCTCTACCAGC（tgg）（配列番号８）を指向するように設計された。sgRNAのインビトロ転写のためのプラスミドを構築するために、一対のオリゴヌクレオチド（5'-agggGCATCTGCTCCCTCTACCAGC -3'（配列番号９）/ 5'-aaacGCTGGTAGAGGGAGCAGATGC-3'（配列番号１０））をアニールし、BbsI消化したpSKII + T7_gRNAベクターにクローニングした。MEGAshortscript T7転写キット（AM1354; Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA）を製造元の手順に従って使用して、XbaI消化ベクターを用いてin vitro転写を行った。以下の配列を有するssODNを使用した：CTTGGCACTGGAGGTGGCCCAGCAGAAGCGTGGCATTGTAGATCAGTGCTACACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAGACC（配列番号１１）。エレクトロポレーションは、BTX ECM2001エレクトロセルフュージョン・エレクトロポレーションシステム（The Harvard Bioscience、Inc.、USA）を使用して行った。Opti-MEM I Reduced Serum Medium（31985062; Thermo Fisher Scientific）に、400ng /μLのsgRNA、800ng /μLのCas9 mRNA及び400ng /μLのssODNを溶かしたエレクトロポレーション溶液15μLを、1.0 mmのギャップ（45-0104; BTX、Holliston、MA）のガラスマイクロスライドに入れ、その中に受精卵を１列に並べ、4回の方形パルス（30Vで1秒間隔で1ミリ秒パルス）を加えた。エレクトロポレーションされた受精卵を一晩インキュベートし、2細胞胚を擬似妊娠雌マウスの卵管に移植した。244個のエレクトロポレーションされたBRJ卵から、77匹の子孫が得られた。当初、本発明者はFnu4HI制限酵素消化によるAkita変異を検出するつもりであった。しかし、Akita変異を有する変異マウスは得られず、代わりに塩基配列解析により、3塩基対のCAG（c.310-312）欠失変異体（雄）（下線部）が得られたことが明らかとなった。ファウンダーマウスはBRJの雌と交配し、18匹の子孫のうち2匹の雌が元の変異を継承していた。Ins2 p.Q104del変異は、Kuma変異と命名された。
【００３４】
（３）Kuma変異のジェノタイピングのためのゲノムPCR
ジェノタイピングは、マウスの尾から抽出したDNAを用い、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅によって行った。ジェノタイピングのために、以下のプライマー対を用いてIns2遺伝子のPCR分析を行った：5'-AGGGGTCCTTGGTGGTAGTAACTT-3 '（配列番号１２）及び5'-CAGGAGAAAACTGGGGATGC-3'（配列番号１３）。増幅された断片をPvuII（認識部位5'-CAGCTG-3'）で切断し、1％アガロースを用いて分析した。WTアレルは248bp及び425bpのバンドを与えるのに対し、変異アレルは670bpのバンドを与える（図1B）。
【００３５】
（４）インスリン療法
インスリン治療は、徐放性インスリンインプラントであるLinbit（約0.1U / d /インプラント; Linshin Canada、Inc.、Scarborough、カナダ）の移植を介して実施された。これらのインスリンインプラントは、インスリンと微小再結晶パルミチン酸との混合物からなり、毎日のインスリン注射よりもより恒常的な血中グルコース値を達成するインスリンの徐放を可能にする。
【００３６】
イソフルラン（Merck animal health、New Jersey、USA）麻酔の後、インスリンインプラントを、首筋に皮下移植することによって導入した。インスリンインプラントは、体重20g未満のマウスに対し2つのインプラント又は体重20-25gのマウスに対し3つのインプラントの割合で導入した。血清グルコース値をモニターし、インスリン療法の2週間後にインスリン治療動物を実験に使用した。インスリン療法の4週間後、インスリンインプラントを除去した。
【００３７】
（５）免疫組織化学
組織試料を4％ホルムアルデヒドで固定し、30％スクロースで凍結保護し、厚さ10μmの切片に切断した。以下の抗体を使用した：モルモット抗インスリン（Dako Denmark A / S、Glostrup、Denmark; 1：1000）、マウス抗グルカゴン（Sigma-Aldrich; 1：1000）、Alexa488ヤギ抗モルモット ブタIgG（Life Technologies; 1：1000）及びAlexa568ヤギ抗マウスIgG（Life Technologies; 1：1000）。組織切片を4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI; Roche Diagnostics、Basel、Switzerland）で対比染色した。
【００３８】
（６）酵素結合免疫測定法によるインスリン分泌測定
16時間絶食させたマウスに、2.0g kg-1でグルコースを腹腔内注射により投与した。後眼窩血液をグルコース注射の15分後に採取し、インスリンELISA（Shibayagi、Japan）を用いて血漿結合インスリンを製造者の指示に従って測定した。
【００３９】
（７）腹腔内ブドウ糖負荷試験（IPGTT）
移植から9週間後にIPGTTを実施した。16時間絶食させたマウスを使用した。2g / kg体重で25％グルコース溶液（Wako、Osaka、Japan）の腹腔内投与後、投与前（0分）、投与から15分、30分、60分、90分及び120分後に、血中グルコース値を測定した。
【００４０】
（８）腹腔内インスリン反応性試験（ITT）
インスリン感受性の評価としてインスリン反応性を決定するために、マウスを6時間絶食させ、次いでインスリン溶液（2.0Uインスリン/ kg体重、HUMULIN R（通常のヒトインスリン注射、USP [rDNA origin])、Eli Lilly、インディアナポリス、IN）の腹腔内注射で投与した。グルコース値は、上記のIPGTTのようにモニターした。
【００４１】
（９）統計
データは、平均±SEM（平均の標準誤差）あるいは箱ひげ図の中間値として示される。2つの群間の差異を、Kruskal-Wallis post-hoc Stell-Dwassによる多重検定、one-way ANOVA post-hoc Bonferroniによる多重検定、あるいは対応のないStudent's t-testによって分析した。有意差は、§P < 0.05, §§P < 0.01（Kruskal-Wallis post-hoc Stell-Dwassによる多重検定）* P <0.05又は** P <0.01として示され、図の説明に記載されている。
【００４２】
〔参考文献〕
1. Aguilar-Bryan, L. & Bryan, J. Neonatal diabetes mellitus. Endocr. Rev. 29, 265-291 (2008).
2. Stoy, J. et al. Clinical and molecular genetics of neonatal diabetes due to mutations in the insulin gene. Rev. Endocr. Metab. Disord. 11, 205-215 (2010).
3. Liu, M. et al. INS-gene mutations: from genetics and beta cell biology to clinical disease. Mol. Aspects Med. 42, 3-18 (2015).
4. Colombo, C. et al. Seven mutations in the human insulin gene linked to permanent neonatal / infancy-onset diabetes mellitus. Online 118, (2008).
5. Yoshioka, M., Kayo, T., Ikeda, T. & Koizumi, A. A novel locus, Mody4, distal to D7Mit189 on chromosome 7 determines early-onset NIDDM in nonobese C57BL/6 (Akita) mutant mice. Diabetes 46, 887-894 (1997).
6. Herbach, N. et al. Original Article. Diabetes (2007). doi:10.2337/db06-0658.ENU
7. Renner, S. et al. Permanent neonatal diabetes in INSC94Y transgenic pigs. Diabetes 62, 1505-1511 (2013).
8. Ono, A. et al. Comparative study of human hematopoietic cell engraftment into Balb/c and C57BL/6 strain of rag-2/Jak3 double-deficient mice. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 2-7 (2011).
9. Mali, P. et al. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9 Prashant. Science (80-. ). 339, 823-826 (2013).
10. Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-23 (2013).
11. Yoshimi, K. et al. SsODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).
12. Mashiko, D. et al. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Sci. Rep. 3, 1-6 (2013).
13. Iafusco, D. et al. Permanent diabetes mellitus in the first year of life. Diabetologia 45, 798-804 (2002).
14. Liu, M., Hodish, I., Rhodes, C. J. & Arvan, P. Proinsulin maturation, misfolding, and proteotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 15841-6 (2007).
15. Hong, E.-G. et al. Nonobese, insulin-deficient Ins2Akita mice develop type 2 diabetes phenotypes including insulin resistance and cardiac remodeling. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 293, E1687-96 (2007).
16. Hayashi, K., Kojima, R. & Ito, M. Strain differences in the diabetogenic activity of streptozotocin in mice. Biol. Pharm. Bull. 29, 1110-9 (2006).
17. Kataoka, M. et al. Recovery from diabetes in neonatal mice after a low-dose streptozotocin treatment. Biochem. Biophys. Res. Commun. 430, 1103-8 (2013).
18. Junod, A., Lambert, A. E., Stauffacher, W. & Renold, A. E. Diabetogenic action of streptozotocin: relationship of dose to metabolic response. J. Clin. Invest. 48, 2129-2139 (1969).
19. Kikawa, K. et al. Beneficial effect of insulin treatment on islet transplantation outcomes in akita mice. PLoS One 9, (2014).
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、糖尿病のモデル動物に関するものなので、このような動物を使用する産業分野において利用可能である。
【図１】
2019180315.tif 000002
【図２】
2019180315.tif 000003
【図３】
2019180315.tif 000004
【図４】
2019180315.tif 000005
【図５】
2019180315.tif 000006
【配列表】
2019180315000001.app