(57)【要約】【課題】組換えタンパク質を生産する動物細胞の培養過程で製造された組換えタンパク質のガラクトシル化を効果的に調節する方法を提供する。【解決手段】目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程において、前記動物細胞の培養液の浸透圧を特定の培養日に上昇させる工程を含む、ガラクトシル化が調節された目的の組換えタンパク質の製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程において、前記動物細胞の培養液の浸透圧を特定の培養日に上昇させる工程を含む、ガラクトシル化が調節された目的の組換えタンパク質の製造方法。
【請求項２】
前記培養が流加培養、回分培養、連続培養、または灌流培養により行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記浸透圧を上昇させる工程が、本培養開始日（０日目）を基準として、本培養１日目から１０日目のいずれか１日に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記浸透圧を上昇させる工程が、本培養開始日（０日目）を基準として、１日目、４日目、７日目、及び１０日目のいずれか１日に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記浸透圧を上昇させる工程が、本培養開始日（０日目）を基準として、４日目又は７日目に行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記浸透圧を上昇させる工程が、培養液の最終浸透圧を４６０〜５００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲に調節するように行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記浸透圧を上昇させる工程が、前記動物細胞の培養液に塩化ナトリウム又は塩化カリウムを補充する方法及びグルコースを培養液に添加する方法からなる群から選択される少なくとも１つの方法により行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記組換えタンパク質が抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ガラクトシル化が減少した抗体集団を製造するための、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記浸透圧を上昇させる工程が、目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程中に単回で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程において、前記動物細胞の培養液の浸透圧を特定の日に上昇させる工程を含む、目的の組換えタンパク質のガラクトシル化を調節する方法。
【請求項１２】
目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程において、前記動物細胞の培養液にアスパラギンを補充する工程を含む、ガラクトシル化が調節された目的の組換えタンパク質の製造方法。
【請求項１３】
前記アスパラギンが、アスパラギン濃縮液又はアスパラギンを含む培養培地の形態である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アスパラギンを補充する工程が、目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程において、培養過程の特定の時点で複数回行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記アスパラギンを補充する工程が、本培養開始日（０日目）を基準とし、培養４日目から１０日目の間に行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アスパラギンを補充する工程が、本培養開始日（０日目）を基準とし、培養４日目、７日目、及び１０日目に行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記アスパラギンを補充する工程が、動物細胞の培養液のアスパラギンの最終濃度を２７．６〜３３．６ｍＭの範囲に調節するようにアスパラギンを補充することにより行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記アスパラギンを補充する工程が、動物細胞の培養液のアスパラギンの最終濃度を３３．６ｍＭに調節するようにアスパラギンを補充することにより行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アスパラギンを補充する工程が、動物細胞の培養液のアスパラギンの最終濃度を、順に６ｍＭ、１２ｍＭ及び１８ｍＭに調節するようにアスパラギンを３回補充することにより行われる、請求項１２又は１７に記載の方法。
【請求項２０】
目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程において、前記動物細胞の培養液にアスパラギンを補充する工程を含む、目的の組換えタンパク質のガラクトシル化を調節する方法。
【請求項２１】
目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程において、前記動物細胞の培養液の浸透圧を上昇させ、培養液にアスパラギンを補充する工程を含む、ガラクトシル化が調節された目的の組換えタンパク質の製造方法。
【請求項２２】
前記浸透圧を上昇させる工程及びアスパラギンを補充する工程が、同時に又は順次行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記浸透圧を上昇させる工程が、前記動物細胞の培養液に塩化ナトリウム又は塩化カリウムを補充する方法及びグルコースを培養液に添加する方法からなる群から選択される少なくとも１つの方法により行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記浸透圧を上昇させる工程が、培養液中の最終浸透圧が４６０〜５００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲になるように行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記アスパラギンを補充する工程が、動物細胞の培養液のアスパラギンの最終濃度を２７．６〜３３．６ｍＭの範囲に調節するようにアスパラギンを補充するものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記組換えタンパク質が抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
目的の組換え抗体のガラクトシル化を調節し、かつ前記方法で製造された抗体集団の酸性異性抗体（酸性バリアント）の含有量を調節するための、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程において、前記動物細胞の培養液の浸透圧を上昇させるステップを含む、ガラクトシル化（galactosylation）が調節された目的の組換えタンパク質の製造方法又は目的の組換えタンパク質のガラクトシル化を調節する方法と、目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程において、前記動物細胞の培養液にアスパラギンを補充するステップを含む、ガラクトシル化が調節された目的の組換えタンパク質の製造方法又は目的の組換えタンパク質のガラクトシル化を調節する方法と、目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程において前記動物細胞の培養液の浸透圧を上昇させ、アスパラギンを補充するステップを含む、ガラクトシル化が調節された目的の組換えタンパク質の製造方法又は目的の組換えタンパク質のガラクトシル化を調節する方法と、前記方法で製造された、ガラクトシル化が調節された目的の組換えタンパク質とに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体とは、抗原と結合して抗原の作用を妨害したり、抗原を除去することのできるタンパク質を意味し、治療用抗体市場が大きな潜在力を有することが明らかになるにつれて、抗体の効率的な発現と大量生産のための研究が盛んに行われるようになった。このような抗体の生産における重要なポイントの１つは、製造された抗体集団の均質性である。特に、モノクローナル抗体の生産においては、一定かつ再現可能なモノクローナル抗体の糖プロファイル（glycoform profile）が重要である。しかし、細胞培養過程で様々な変数により生産されるモノクローナル抗体の糖化プロファイルに影響を及ぼすことがある。よって、製造された抗体集団の糖化や異性抗体の含有量などを一定に調節する方法の開発が求められている。
【０００３】
モノクローナル抗体の商業生産過程における重要な課題の１つは、各バッチで生産されたモノクローナル抗体の品質を一貫して維持することである。モノクローナル抗体生産工程においてチェックしなければならない品質は限りなく多様であるが、抗体のガラクトシル化はその中で最も重要な１つであるといえる。このガラクトシル化はモノクローナル抗体の最も重要な作用機序（ＭＯＡ）の１つであるＣＤＣ（complement dependent cytotoxicity）過程に影響を与えると知られているからである。前記ガラクトシル化は、ガラクトース（Galactose）をグリコシル化連鎖反応の構成単位として用い、これをガラクトシルトランスフェラーゼ（galactosyltransferase）によりＮ−アセチルグルコサミン（N-acetylglucosamine）糖の次に付加することにより行われる。このようなガラクトシル化を調節する方法としてマンガン又はガラクトースを培養液に付加する方法などが提案されているが（特許文献１）、抗体のガラクトシル化を調節する方法の開発が依然として求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２／０２７６６３１号明細書
【特許文献２】米国特許第６０９０３８２号明細書
【特許文献３】韓国登録特許第１０−１０３８１２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
こうした背景の下、本発明者らは、組換えタンパク質を生産する動物細胞の培養過程で製造された組換えタンパク質のガラクトシル化を効果的に調節する方法を開発すべく鋭意努力した結果、組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程における特定の培養時点で動物細胞培養液の浸透圧を上昇させるか、又はアスパラギンを補充すると、生産される組換えタンパク質のガラクトシル化を効果的に調節できることを確認した。また、動物細胞培養液の浸透圧上昇と同時にアスパラギンを補充すると、浸透圧上昇による酸性異性抗体の含有量の減少を伴うことなくガラクトシル化を調節できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程において、前記動物細胞の培養液の浸透圧を上昇させるステップを含む、ガラクトシル化（galactosylation）が調節された目的の組換えタンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
【０００７】
また、本発明は、目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程において、前記動物細胞の培養液の浸透圧を上昇させるステップを含む、目的の組換えタンパク質のガラクトシル化を調節する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
さらに、本発明は、目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程において、前記動物細胞の培養液にアスパラギンを補充するステップを含む、ガラクトシル化が調節された目的の組換えタンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
【０００９】
さらに、本発明は、目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程において、前記動物細胞の培養液にアスパラギンを補充するステップを含む、目的の組換えタンパク質のガラクトシル化を調節する方法を提供することを目的とする。
【００１０】
さらに、本発明は、目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程において、前記動物細胞の培養液の浸透圧を上昇させ、アスパラギンを補充するステップを含む、ガラクトシル化が調節された目的の組換えタンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
【００１１】
さらに、本発明は、目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程において、前記動物細胞の培養液の浸透圧を上昇させ、アスパラギンを補充するステップを含む、目的の組換えタンパク質のガラクトシル化を調節する方法を提供することを目的とする。
【００１２】
さらに、本発明は、前記方法で製造された目的の組換えタンパク質を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法は、目的の組換えタンパク質のガラクトース含有量を所望の範囲に効果的に調節できるという利点がある。また、浸透圧上昇とアスパラギン添加の両方を用いる本発明の方法は、ガラクトースだけでなく、酸性異性抗体の含有量も調節できるという効果を有するので、目的抗体集団の製造に効果的に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】アダリムマブのバイオシミラーの発現ベクターを示す図である。
【図２】流加培養期間中の塩化ナトリウム水溶液の注入時点を示す図である。
【図３】流加培養期間中のアスパラギンの注入時点を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
前記目的を達成するための本発明の一態様は、目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程において、前記動物細胞の培養液の浸透圧を上昇させるステップを含む、ガラクトシル化が調節された目的の組換えタンパク質の製造方法である。
【００１６】
具体的に、前記方法は、目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程において、前記動物細胞の培養液の浸透圧を特定の培養日に上昇させるステップを含む、ガラクトシル化が調節された目的の組換えタンパク質の製造方法である。
【００１７】
本発明において、前記培養は流加培養（fed-batch culture）であるが、これに限定されるものではない。
【００１８】
本発明における「流加培養（fed-batch culture）」とは、基本培地又は生産培地で培養を開始し、その後細胞成長期又は抗体生産期の任意の時期に、フィーディング培地を培養物に連続的又は非連続的に供給しながら行う細胞培養を意味する。
【００１９】
本発明における「細胞培養培地」又は「培養培地」とは、多細胞有機体又は組織の外部である人工的な試験管内の環境における細胞の維持、成長、増殖又は膨張のための栄養素の溶液を意味する。細胞培養培地は特定の細胞培養用に最適化されてもよく、その例としては、細胞成長をサポートするために調製された基本培養培地、モノクローナル抗体の生産を促進するために調製された細胞培養生産培地、栄養素を高濃度で濃縮して作製した濃縮培地が挙げられる。栄養素、培地成分とは、細胞培養培地を構成する構成成分を意味するもので、本発明においては互用される。
【００２０】
具体的に、「基本培養培地」又は「基本培地」とは、細胞の成長をサポートすることができる最小限の培地を意味する。基本培地は、標準無機塩、例えば亜鉛、鉄、マグネシウム、カルシウム及びカリウムだけでなく、微量元素、ビタミン、エネルギー源、緩衝（Buffer）システム及びアミノ酸を供給する。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、基本培地イーグル（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２培地が基本培地として挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
また、具体的に、「細胞培養生産培地」又は「生産培地」とは、生物反応器においてモノクローナル抗体の発現を最大化する目的で用いられる培地を意味する。生産培地は、基本培地と同じものであってもよく、異なるものであってもよく、異なるものの場合は、基本培地自体を濃縮したり、基本培地に特定成分を追加する方法で作製することができる。
【００２２】
本発明における「フィーディング（feeding）培地」及び「追加培養培地」とは、特定の栄養素又は複数の栄養素からなる培地であり、これらはそれぞれ基本培地の濃縮産物であってもよい。培養する細胞に応じてフィーディング培地の構成成分や濃度を多様に作製することができる。
【００２３】
前記培養過程における細胞成長期とは、接種後の細胞成長が急激に進む時期を意味する。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の場合、温度は３５〜３７℃、ｐＨは７．０〜７．３の範囲で最も活発に細胞数が増加することが知られている。本発明においては、細胞成長期の培養パラメータとして、温度は３６．５℃、ｐＨは ７．１又は７．０であった。
【００２４】
前記「接種」とは、細胞培養を始めるために培地を注入し、その培地に細胞を注入することを意味する。ここで、培地は、細胞を注入する前に予め注入しておいてもよく、細胞と同時に細胞反応器に注入してもよい。通常、動物細胞の大規模な培養においては、培地を予め注入して温度と酸素飽和度を一定の設定範囲に維持してから細胞を注入する。
【００２５】
前記「抗体生産期」とは、モノクローナル抗体の生産を最大化するために培養プロセスの変化を適用する時期を意味する。ここで、生産を最大化するためのプロセスの変化には、温度や溶存酸素を下げたり、培地を交換する作業が全て含まれる。
【００２６】
本発明においては、浸透圧の上昇時点に応じて組換えタンパク質を発現する動物細胞から生産される組換えタンパク質のガラクトシル化の変化の程度が変わり得ることが確認された。すなわち、培養期間中に徐々に浸透圧を上昇させた場合は、浸透圧を上昇させない群とガラクトシル化の程度に大きな差がないのに対して、培養期間中に特定の培養時点で浸透圧を上昇させた場合は、Ｇ０Ｆ含有量が大きく上昇する結果を示し、ガラクトシル化を調節、具体的にはガラクトシル化を抑制又は低減できることが確認された。
【００２７】
また、本発明において、前記浸透圧を上昇させるステップは、目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の本培養過程で行われることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２８】
本発明における「本培養」とは、モノクローナル抗体の生産が実際に行われる培養ステップを意味する。細胞１バイアルで開始された培養過程の最後のステップであり、本培養が終了すると生産されたモノクローナル抗体の精製過程が後続する。本培養以前の培養体積を段階的に増加させる目的のシード（seed）培養とは区別される。
【００２９】
前記浸透圧を上昇させるステップは、動物細胞の本培養過程における特定の培養時点で行うことができ、具体的には、本培養開始日（０日）を基準とし、本培養１日目から１０日目のいずれかの培養日に行ってもよく、より具体的には、本培養開始日（０日）を基準とし、１日、４日、７日及び１０日目のいずれかの培養日に行ってもよく、さらに具体的には、本培養開始日（０日）を基準とし、４日目又は７日目に行ってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
また、前記浸透圧を上昇させるステップは、目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程中に単回で行ってもよい。
【００３１】
さらに、前記浸透圧を上昇させるステップは、培養液の最終浸透圧が４６０〜５００ｍＯｓｍ／ｋｇになるように行ってもよく、より具体的には、前記浸透圧の上昇は培養液の最終浸透圧が４６０〜４８０ｍＯｓｍ／ｋｇになるように行ってもよいが、これらに限定されるものではない。前記培養液中の最終浸透圧とは、培養終了時点の浸透圧を意味するものであるが、特にこれに限定されるものではない。
【００３２】
さらに、前記浸透圧を上昇させるステップは、培養液の浸透圧上昇目標が４００〜４４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、より具体的には４３０〜４４０ｍＯｓｍ／ｋｇであってもよいが、これらに限定されるものではない。前記培養液の浸透圧上昇目標とは、浸透圧を上昇させるステップを行う時点で上昇させようとする浸透圧の程度を意味するが、特にこれに限定されるものではない。
【００３３】
さらに、前記浸透圧上昇は、前記動物細胞の培養液に塩化ナトリウム又は塩化カリウムを補充する方法及びグルコースを培養液に添加する方法からなる群から選択される少なくとも１つの方法で行ってもよく、より具体的には塩化ナトリウムを培養液に補充する方法で行ってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
前記塩化ナトリウムを培養液に補充する方法は、流加培養中、特定日に４Ｍ塩化ナトリウム水溶液を培養液に加えて浸透圧を所定のレベルまで上昇させる方法で行ってもよいが、これに限定されるものではない。塩化ナトリウム水溶液を加えることにより培養液、さらには細胞内の浸透圧が上昇すると、β−ガラクトシダーゼの活性が増加することによりモノクローナル抗体のガラクトシル化が抑制され得る。
【００３５】
本発明における「培養物」又は「培養液」とは、培養中のシェーカーフラスコ又は生物反応器内に入れられた、細胞の入った液体を意味する。前記培養物及び培養液は互用される。また、動物細胞の存在有無によって培養液と培養培地は区別される。
【００３６】
本発明における前記組換えタンパク質は、抗体であってもよく、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００３７】
本発明における「モノクローナル抗体（monoclonal antibody）」とは、単一抗体形成細胞が産生する抗体を意味し、１つの抗原決定基を認識する。
【００３８】
本発明の抗体には、これらに限定されるものではないが、当該分野において通常に用いられる治療用抗体の全てを含んでもよく、具体的にはアダリムマブであることが好ましい。
【００３９】
また、前記抗体は、全長抗体及び抗体断片の形態がどちらも含まれる概念であり、前記抗体断片の種類としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄなどが挙げられる。前記Ｆｖには、二重ジスルフィドＦｖ（ｄｓＦｖ）及び単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）の形態がどちらも含まれる。Ｆｄとは、Ｆａｂ断片に含まれる重鎖部分を意味する。
【００４０】
前記目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞には、前記組換えタンパク質を発現する天然型又は形質転換細胞が制限なく含まれる。本発明の目的上、ガラクトース含有量調節の対象となる組換えタンパク質を発現する動物細胞であってもよく、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ）やマウス骨髄腫細胞株（ＮＳＯ）であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
また、モノクローナル抗体のガラクトシル化を調節するために、培養パラメータの最適化と基本培養培地の濃縮、最適化された追加培養培地のフィーディングステップが含まれてもよい。
【００４２】
すなわち、所望のモノクローナル抗体のガラクトシル化の範囲を設定し、保有する細胞株が発現するモノクローナル抗体のガラクトシル化を分析し、その後ガラクトシル化の変更要求の程度に応じて前述したモノクローナル抗体のガラクトシル化を調節する方法を共に適用することができる。
【００４３】
具体的には、調節されたガラクトシル化が行われるモノクローナル抗体の生産のための培養器の運用において、実現可能な変更の例としては、溶存酸素（ＤＯ）、酸性度（ｐＨ）、培養温度、Ａｇｉｔａｔｉｏｎなどの培養パラメータの最適化が挙げられる。具体的には、細胞成長期において、温度は３６．５℃、溶存酸素は３０％、酸性度は７．０で培養し、抗体生産期においての温度は３０℃、溶存酸素は３０％、酸性度は７．０を適用して培養した従来の方法から、抗体生産期における温度を２８℃に、溶存酸素を２０％に、酸性度を６．９に変更して培養すると、モノクローナル抗体のガラクトシル化の調節が可能であることが確認された。
【００４４】
また、ガラクトシル化の調節のために、基本培養培地を濃縮して用いてもよい。具体的には、動物由来のタンパク質がない培養培地を用いることにより、流加培養用に開発された基本培地をモノクローナル抗体のガラクトシル化の変化のために最適化してもよい。詳細には、基本培養培地を濃縮、具体的に０．８倍又は１．４倍濃縮した培地を本培養に用いると、モノクローナル抗体のガラクトシル化の調節が可能であった。
【００４５】
さらに、ガラクトシル化の調節のために、追加培養培地を最適化してもよい。本発明においては、追加培養培地の濃度調節、追加培養培地に添加される金属成分の濃度の最適化により、ガラクトシル化を減少させた。
【００４６】
前記方法により製造した目的の組換えタンパク質のガラクトシル化は、Ｑ−ＴＯＦやＵＰＬＣ機器を用いたＮ−グリカンプロファイル（N-glycan profile）分析により測定することができる。Ｎ−グリカンプロファイル分析に提供される情報は、Ｇ０Ｆ含有量、ＧＩ（Galactosylation Index）、ＮＧＨＣ（non-glycosylated Heavy Chain）、非フコシル化（afucosylation）パーセント、マンノース含有量（High mannose contents）と様々であるが、本発明においてはＧ０Ｆ含有量の変化について主に言及している。
【００４７】
また、本発明の方法は、ガラクトシル化が減少した抗体集団を製造するためのものであってもよい。すなわち、保有する細胞株が発現するモノクローナル抗体のガラクトシル化を分析し、その後分析した値に比べて低いレベルのガラクトシル化が行われる抗体集団を製造する場合に適用される方法である。
【００４８】
本発明における「抗体集団」とは、様々な糖鎖含有量を有する抗体を含む抗体群を意味し、本発明の目的上、前記抗体集団とは、ガラクトシル化抗体を目的とする割合で含む、ガラクトシル化が調節された抗体群を意味する。
【００４９】
本発明の他の態様は、目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程において、前記動物細胞の培養液の浸透圧を上昇させるステップを含む、目的の組換えタンパク質のガラクトシル化を調節する方法である。
【００５０】
前記方法及び各用語については前述した通りである。
【００５１】
具体的に、前記方法は、目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程において、前記動物細胞の培養液の浸透圧を特定の培養日に上昇させるステップを含んでもよく、具体的な内容については前述した通りである。
【００５２】
本発明の他の態様は、目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程において、前記動物細胞の培養液にアスパラギンを補充するステップを含む、ガラクトシル化が調節された目的の組換えタンパク質の製造方法である。
【００５３】
前記用語については前述した通りである。
【００５４】
本発明においては、目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程において、前記動物細胞の培養液にアスパラギンを補充すると、目的の組換えタンパク質のガラクトシル化を調節できることが確認された。
【００５５】
具体的に、前記アスパラギンは、アスパラギン濃縮液又はアスパラギンを含む培養培地の形態で添加してもよい。
【００５６】
また、前記アスパラギンの補充は、目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程における特定の培養時点で複数回行ってもよい。ここで、前記アスパラギンの補充は、本培養開始日（０日）を基準とし、培養４日目から１０日目の間に行ってもよく、具体的には、本培養開始日（０日）を基準とし、培養４日、７日及び１０日目に全て行うことにより、培養液中のアスパラギンの濃度を徐々に上昇させてもよい。
【００５７】
アスパラギンを単回で補充すると、培養液中のＮＨ４＋濃度が急激に高くなって細胞成長が遅延し、結局は最終タンパク質発現量の減少をもたらすという欠点があるが、本願発明によりアスパラギンをフィーディング時に分けて添加すると、このような欠点を示すことなく、ガラクトシル化を調節して目的とする量のタンパク質生産を達成することができるという利点がある。
【００５８】
前記アスパラギンの補充は、動物細胞の培養液中のアスパラギン最終濃度が２７．６〜３３．６ｍＭになるように行ってもよい。
【００５９】
具体的には、動物細胞の培養液中のアスパラギン最終濃度が３３．６ｍＭになるようにアスパラギンを補充してもよく、一例として、動物細胞の培養液中のアスパラギン濃度がさらに６〜１８ｍＭに高くなるようにアスパラギンを補充してもよく、より具体的な例として、動物細胞の培養液中のアスパラギン濃度を６ｍＭ、１２ｍＭ及び１８ｍＭずつ順次 に高めることによりアスパラギンを３回補充してもよいが、これらに限定されるものではない。
【００６０】
この方法を動物細胞に適用すると、アンモニウムイオン（ＮＨ４＋）の生成が誘導されて細胞内のアンモニウムイオン濃度が増加するので、トランスゴルジ体のｐＨが増加してβ−ガラクトシルトランスフェラーゼの活性が低下することにより、モノクローナル抗体のガラクトシル化が阻害される。
【００６１】
また、前記と同様に、モノクローナル抗体のガラクトシル化を調節するために、培養パラメータの最適化と基本培養培地の濃縮、最適化された追加培養培地のフィーディングステップを含んでもよい。
【００６２】
すなわち、所望のモノクローナル抗体のガラクトシル化の範囲を設定し、保有する細胞株が発現するモノクローナル抗体のガラクトシル化を分析し、その後ガラクトシル化の変更要求の程度に応じて前述したモノクローナル抗体のガラクトシル化を調節する方法を共に適用することができる。
【００６３】
本発明のさらに他の態様は、目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程において、前記動物細胞の培養液にアスパラギンを補充するステップを含む、目的の組換えタンパク質のガラクトシル化を調節する方法である。
【００６４】
前記方法及び各用語については前述した通りである。
【００６５】
本発明のさらに他の態様は、目的の組換えタンパク質を発現する動物細胞の培養過程において、前記動物細胞の培養液の浸透圧を上昇させ、アスパラギンを補充するステップを含む、ガラクトシル化が調節された目的の組換えタンパク質の製造方法である。
【００６６】
前記用語については前述した通りである。
【００６７】
本発明においては、目的の組換えタンパク質のモノクローナル抗体を発現する動物細胞の培養過程において、動物細胞培養液の浸透圧を上昇させながらアスパラギンを添加すると、浸透圧上昇によるガラクトシル化が減少すると同時に、浸透圧上昇により減少する酸性異性抗体の含有量がアスパラギンの添加により増加することが確認された。
【００６８】
前記方法において、前記浸透圧の上昇及びアスパラギンの補充は、同時又は順次に行ってもよい。例えば、塩化ナトリウムを補充する方法などで培養液中の浸透圧を上昇させてからアスパラギンを補充してもよく、アスパラギンを補充してから塩化ナトリウムの添加などの方法で培養液中の浸透圧を上昇させてもよく、アスパラギンの補充と培養液中の浸透圧上昇を同時に行ってもよい。
【００６９】
ここで、浸透圧の上昇は前述した方法を用いて行ってもよい。
【００７０】
前記浸透圧上昇は、培養液中の最終浸透圧が４６０〜５００ｍＯｓｍ／ｋｇになるように行ってもよく、前記アスパラギンの補充は、動物細胞の培養液中のアスパラギン最終濃度が２７．６〜３３．６ｍＭになるように行ってもよい。
【００７１】
また、前記組換えタンパク質は抗体、具体的にはモノクローナル抗体であってもよく、前記のような本発明の方法により、目的組換え抗体のガラクトシル化の調節と同時に、前記方法で製造された抗体集団の酸性異性抗体の含有量を調節することができる。すなわち、浸透圧上昇によりガラクトシル化を減少させると同時に、浸透圧上昇により減少する酸性異性抗体の含有量を、アスパラギンの添加により増加させることができる。
【００７２】
よって、前記方法を用いると、目的の抗体集団のガラクトシル化の程度を調節できると共に、目的の抗体集団の酸性異性抗体の含有量も調節できるという利点がある。
【００７３】
前記酸性異性抗体は異性抗体の一種である。異性抗体とは、主活性抗体の一部のアミノ酸が脱アミノや酸化により変形した抗体を意味し、酸性異性抗体及び塩基性異性抗体の種類が含まれる。例えば、アミノ酸のうちアスパラギン（asparagine）が脱アミノされてアスパラギン酸（aspartate）になった異性抗体、アミノ酸のうちメチオニン（methionine）が酸化されて硫酸メチオニン（methionine sulfate）になった異性抗体などが挙げられる。また、重鎖のＮ末端にグルタメート（glutamate）が存在する場合は、前記グルタメートが五角形環構造を形成してピログルタメート（pyroglutamate）に変形された異性抗体が含まれる。
【００７４】
このような異性抗体の分析は、クロマトグラフィーなどを用いて行うことができ、本発明においては陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー分析により行った。モノクローナル抗体自体の特性に応じて、酸性（acidic）、主活性（main）、塩基性（basic）異性体の含有量は非常に多様である。モノクローナル抗体を発現する細胞株の培養条件（培養パラメータ、生産培地など）に応じて、モノクローナル抗体の電荷異性抗体の含有量が変化する。よって、前記方法によれば、ガラクトース含有量の調節と共に、酸性異性抗体の含有量を所望の範囲に調節できるという利点がある。
【実施例】
【００７５】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。しかし、下記の実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７６】
実施例１：浸透圧の人為的上昇によるガラクトシル化の調節
流加培養中に培養液の浸透圧を上昇させる方法は様々である。過剰量のグルコースを培養液に添加する方法、塩化カリウム又は塩化ナトリウム水溶液を培養液に添加する方法などがある。本発明においては、浸透圧上昇のための代表的な方法である、４Ｍ塩化ナトリウム水溶液を培養液に添加する方法を用いた。
【００７７】
製造方法及び培地の組成についての説明
本発明において、培養液に対する浸透圧上昇やアスパラギン追加を適用したモノクローナル抗体はアダリムマブのバイオシミラー抗体であり、アダリムマブはアボット社（Ａｂｂｏｔｔ）が開発したリウマチ関節炎、クローン病の治療剤である。特許文献２のアダリムマブ抗体の重鎖と軽鎖のアミノ酸シーケンスを参照して、アダリムマブのバイオシミラーＤＮＡを重合酵素連鎖反応により増幅、生成し、その後自社が開発したベクターであるｐＧＬ３ ＣＵＣＢｉｎのプロモーターを用いてｐＣＢ−Ａｍ２．７７＿ｖ５．４（図１）を作製し、これをＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞株に形質転換してアダリムマブのバイオシミラー発現細胞株を作製した。自社が開発したｐＣＵＣＢｉｎは、特許文献３（新たな融合プロモーター及びそれを含む組換えベクター）で言及されたベクターの１つである。
【００７８】
本発明に用いた培養培地は、基本培養培地、生産培地（本培養培地）、追加培養培地（フィーディング培地）の３種類である。
【００７９】
基本培養培地は、継代培養を目的として用いられる培地である。生産培地は、継代培養後の本格的な抗体生産のために行われる培養（本培養）に用いられる培地であり、基本培養培地において特定成分を強化したり、新たな成分を追加することにより作製することができる。本発明においては、１．４倍に強化した基本培養培地を生産培地として用いた。追加培養培地は、培養中の細胞成長促進及び抗体発現量の増加を目的として追加される培養培地である。本発明においては、３．３倍に強化した基本培養培地を追加培養培地として用いた。基本培養培地、生産培地、追加培養培地は、全てＩＭＤＭ（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）から改変された培地であり、培地構成成分は表１の通りである。
【００８０】
【表１】
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【００８１】
本発明に用いた抗体の製造方法は、生物反応器を用いた動物細胞培養であり、動物細胞培養とは、動物細胞を培養培地で成長させて特別な措置（例えば、温度を下げる）により抗体を発現させる過程である。培養方法は、回分培養、流加培養、連続培養、灌流培養など様々であるが、本発明に用いたアダリムマブのバイオシミラー細胞株の培養方式は流加培養である。流加培養は、生産培地で培養を行いながら、特定の日に追加培養培地を１回又は２回以上追加して行う培養方式である。
【００８２】
実施例に用いた流加培養方法は、共通して培養１、４、７、１０日目に生産培地のその時点の培養液量の５％に相当する量の追加培養培地を４回にわたって追加するものである。
【００８３】
実施例１．１：浸透圧上昇時点によるガラクトシル化の変化
２５０ｍＬシェーカーフラスコを用いて、実際には３０ｍＬの規模で流加培養を行った。流加培養のフィーディング戦略と塩化ナトリウム水溶液の追加時点は図２の通りである。浸透圧３２０ｍＯｓｍ／ｋｇで開始した培養物に４Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液をフィーディングすることにより、人為的に浸透圧を４３０ｍＯｓｍ／ｋｇまで上昇させて最終浸透圧が４５０ｍＯｓｍ／ｋｇになるようにした。追加培養培地を培養１日目に１次フィーディングし、３日経過毎に追加フィーディングを行って計４回フィーディングしたが、そのうち１回又は４回に分けて（培養期間中に徐々に浸透圧を上昇させる）４Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液を添加して培養物の浸透圧を上昇させて培養を行い、その後モノクローナル抗体の発現量とガラクトシル化を分析した。その結果を下記表２に示す。
【００８４】
【表２】
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【００８５】
その結果、表２に示すように、４Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液をフィーディングする時点によってモノクローナル抗体のガラクトシル化に差があった。シェーカーフラスコ培養の場合、培養過程中に溶存酸素（ＤＯ）と酸性度（ｐＨ）を直接調節することは困難であるので、実験条件間のＧ０Ｆの差が大きくないことがある。しかし、生物反応器の培養においては、溶存酸素と酸性度を直接調節することができるので、Ｇ０Ｆの差を最大化することができる。
【００８６】
実施例１．２：浸透圧の上昇範囲の差によるモノクローナル抗体のガラクトシル化の変化
実施例１．１は、培養物の浸透圧を上昇させる時点によってモノクローナル抗体のガラクトシル化が変化することを示すものであった。追加フィーディング培地の２次フィーディング（培養４日目）と３次フィーディング（培養７日目）時に塩化ナトリウム水溶液をフィーディングした場合にＧ０Ｆが最も大きく増加した。さらに、培養物の浸透圧上昇レベルの差がモノクローナル抗体のガラクトシル化に及ぼす影響を調べるために、２次シェーカーフラスコ流加培養を行った。培養初期の浸透圧は３２０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、浸透圧の上昇目標に応じて異なる量の４Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液を１次シェーカーフラスコ培養と同様に培養４日目又は７日目に培養液に加えて培養を行い、その後モノクローナル抗体の発現量とガラクトシル化を分析した。
【００８７】
【表３】
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【００８８】
培養液の浸透圧上昇レベルによってモノクローナル抗体のガラクトシル化は様々であった。培養中に培養物の浸透圧を４８０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上に上昇させると、Ｇ０Ｆ含有量は逆に減少した。すなわち、モノクローナル抗体のＧ０Ｆ含有量を最大に増加させるための浸透圧の適正範囲が存在した（培養中に４００〜４８０ｍＯｓｍ／ｋｇまで上昇させる）。
【００８９】
実施例１．３：生物反応器（バイオリアクター）での確認実験
１、２次シェーカーフラスコ培養結果に基づいて、生物反応器で確認実験を行った結果、浸透圧の上昇条件によるモノクローナル抗体のガラクトシル化の変化が再確認された。
【００９０】
１．４Ｌ生物反応器において、実際には１Ｌの規模で、２次フィーディング時（培養４日目）にそれぞれ４Ｍ塩化ナトリウム水溶液を培養物に添加することにより、人為的に浸透圧を４４０、５００、５２３ｍＯｓｍ／ｋｇまで上昇させてから培養を行った。
【００９１】
【表４】
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【００９２】
２次フィーディング時に培養液の浸透圧を５００ｍＯｓｍ／ｋｇ以上に上昇させると（最終浸透圧５４９，５６７ｍＯｓｍ／ｋｇ）、逆にＧ０Ｆ含有量が減少した。２次フィーディング時の浸透圧を４４０ｍＯｓｍ／ｋｇまで上昇させた生物反応器においては、Ｇ０Ｆの含有量が７１．８％であった。
【００９３】
実施例２：アスパラギン添加による培養液の過剰なアンモニウム生成
本出願人の培養結果によれば（表５）、過剰量のアスパラギンを培養液に添加すると、培養液中のアンモニウムイオン（ＮＨ４＋）濃度が飛躍的に増加した。過剰量のアスパラギン添加により間接的に培養液中のＮＨ４＋濃度を増加させる方法でモノクローナル抗体のガラクトシル化を調節することができる。
【００９４】
【表５】
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【００９５】
実施例２．１：アスパラギン濃縮溶液を添加する流加培養
２５０ｍＬシェーカーフラスコを用いて、実際には３０ｍＬの規模で流加培養を行った。流加培養のフィーディング戦略とアスパラギン注入時点は図３の通りである。アスパラギン濃縮溶液は２００ｍＭに作製した。追加培養培地の注入時点は培養１、４、７、１０日目であり、アスパラギン濃縮溶液の追加は２次フィーディング時点（培養４日目）からフィーディングする度に行った（計３回）。培養を行い、その後モノクローナル抗体の発現量とガラクトシル化を分析した。
【００９６】
【表６】
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【００９７】
フィーディングによりアスパラギンを培養液に添加するほどＧ０Ｆ含有量が増加した。添加するアスパラギンの濃度を増加させるほど培養液中の最終ＮＨ４＋濃度は増加した。１．４×生産培地に比べて１×生産培地のほうがアスパラギンの投入によるＧ０Ｆ含有量増加幅が大きかった。アスパラギンを培養初期に一気に添加すると培養初期からＮＨ４＋濃度が高くなって細胞成長が遅延し、結局は最終抗体発現量が減少するので、アスパラギンをフィーディング時に分けて添加する方式を採用した。
【００９８】
実施例２．２：過剰量のアスパラギンを含む追加培養培地のフィーディング
シェーカーフラスコ流加培養とは異なり、生物反応器流加培養においては、アスパラギン濃縮溶液を別に作製するのではなく、追加培養培地に含めた。アスパラギンをフィーディングする度に６ｍＭ追加投入する計画を立て、１２０ｍＭアスパラギンが添加された追加培養培地を作製し、その後これをフィーディングした。１．４Ｌ生物反応器において、実際には１Ｌの規模で培養を行い、その後モノクローナル抗体の発現量とガラクトシル化を分析した。
【００９９】
【表７】
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【０１００】
アスパラギンが過剰添加された追加培養培地を用いたバッチにおいて、Ｇ０Ｆ含有量が１０．２％増加した。アスパラギンを過剰添加した培養液のＮＨ４＋濃度が９．９ｍＭ増加することを考慮すると、モノクローナル抗体のガラクトシル化減少が培養液中のＮＨ４＋濃度変化に起因することが分かる。浸透圧は、アスパラギンを過剰添加した培養液において５８ｍＯｓｍ／ｋｇ増加した。
【０１０１】
実施例３：人為的な浸透圧上昇とアスパラギン添加の組み合わせ
流加培養中に浸透圧の人為的上昇又はアスパラギン添加を適用することにより、モノクローナル抗体のＧ０Ｆ含有量を上昇させることができた。モノクローナル抗体のガラクトシル化及び電荷異性抗体（charge variants）に及ぼす影響を調べるために、人為的な浸透圧上昇とアスパラギン添加の組み合わせを適用した。
【０１０２】
実施例３．１：浸透圧上昇とアスパラギン添加を同時に適用した生物反応器実験
１．４Ｌ生物反応器において、実際には１Ｌの規模で浸透圧の人為的上昇又は浸透圧上昇とアスパラギン添加を同時に適用して流加培養を行った。浸透圧上昇とアスパラギン添加を同時に適用した生物培養器の場合、アスパラギンの投入（追加培養培地に１２０ｍＭアスパラギンを追加する）による浸透圧上昇効果を考慮して、培養物の浸透圧を４２３ｍＯｓｍ／ｋｇまで上昇させた。培養を行い、その後モノクローナル抗体の発現量とガラクトシル化を分析した。
【０１０３】
【表８】
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【０１０４】
浸透圧のみ適用した場合と、浸透圧とアスパラギンを組み合わせてプロセスに適用した場合の２つの条件において、Ｇ０Ｆの差は大きくなかったがＧ０Ｆ含有量がさらに増加した。アスパラギンを添加した培養物の場合は、添加しない培養物に比べて酸性異性抗体（acidic variant）の比重が減少したが（表６，表７）、浸透圧とアスパラギンを組み合わせて適用すると、酸性異性抗体は逆に増加した。
【０１０５】
Ｇ０Ｆ含有量を増加させるために、浸透圧の人為的上昇、アスパラギンの添加、浸透圧の人為的上昇と同時にアスパラギンの添加の方法を適用することができるが、Ｇ０Ｆ含有量の調節だけでなく、電荷プロファイル（charge profile）中の酸性異性抗体の比重を増加させようとする場合は、浸透圧上昇とアスパラギン添加を同時に適用する戦略が有用であると判断される。
【０１０６】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。これに関連して、前記実施例はあくまで例示的なものであり、制限的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【外国語明細書】
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