(57)【要約】【課題】本発明は、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）遺伝子表現抑制組成物を製造するためのわさび葉抽出物の使用が提供される。【解決手段】本発明のわさび葉抽出物は、水、アルコール類、又はアルコール／水混合物を溶媒としてわさび葉を抽出することで製造される。当該わさび葉抽出物は、皮膚メラニン細胞におけるＭＩＴＦの遺伝子表現を抑制することで、メラニンの生成を減少できる。それによって、皮膚の色素沈着の改善、シミ及び日光性黒子を薄くする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）遺伝子表現抑制組成物を製造するためのわさび葉抽出物の使用であって、
前記わさび葉抽出物は溶媒でわさび葉を抽出して得られることを特徴とする、わさび葉抽出物の使用。
【請求項２】
前記溶媒は、水、アルコール類、又はアルコール／水混合物であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記溶媒及び前記わさび葉の液固比は５〜２０：１〜５であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記抽出は５０〜１００℃で行われることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記わさび葉抽出物は、さらに濾過工程及び濃縮工程を経て得られることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記わさび葉抽出物は、濃度が０．５ｍｇ／ｍＬ以上のわさび葉水抽出物であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記わさび葉抽出物は、皮膚の局所に投与する方法で投与されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記ＭＩＴＦ遺伝子表現抑制組成物は、医薬品、ケア用品、又は化粧品であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
前記ＭＩＴＦ遺伝子表現抑制組成物は、クリーム、ローション、分散液、フォーム、ゲル、軟膏、パウダー、湿布、又はパックの形で使用されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
前記ＭＩＴＦ遺伝子表現抑制組成物は、さらに保湿剤、美白剤、角質除去剤、又はそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、わさび葉抽出物の使用、特にはＭＩＴＦ遺伝子表現抑制組成物を製造するためのわさび葉抽出物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
わさびの学名はＥｕｔｒｅｍａ  ｊａｐｏｎｉｃａであり、わさびは「山葵」とも呼ばれ、アブラナ科ワサビ属の植物である。わさびは強い刺激味を有する。しかし、舌を刺激するトウガラシの辛さと異なり、わさびの辛さは副鼻腔を刺激する。わさびは、日本の谷の川の近傍によく見られ、その他の品種としてＷａｓａｂｉ  ｋｏｒｅａｎａ及びＷａｓａｂｉ  ｔｅｔｓｕｉｇｉがある。市販品として、一般にＷａｓａｂｉ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｄａｒｕｍａ及びＷａｓａｂｉ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｍａｚｕｍａという２種類のわさびが販売されている。
【０００３】
わさび葉は食用できて、わさび茎と同等の辛さを有する。わさび葉の料理方法として、お酢に一晩漬けてわさびサラダを作るか、醤油で料理してご飯と一緒に食べるか、又はおつまみ又は巻き寿司の材料として食べるか、また、衣をつけて揚げて天ぷらにする等が挙げられる。
【０００４】
小眼球症関連転写因子（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌａｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  、ＭＩＴＦ）は、皮膚のメラニン細胞成長に必要な転写因子であり、メラニン生成に関与する他のタンパク質の遺伝子、例えば、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、チロシナーゼ関連タンパク質−１（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１、ＴＹＲＰ１）、及びドーパクロムトートメラーゼ（ｄｏｐａｃｈｒｏｍｅ  ｔａｕｔｏｍｅｒａｓｅ、ＤＣＴ）等遺伝子の表現をコントロールできる。
【０００５】
スキンホワイトニングの目的を達成するために、安全且つメラニン細胞成長を有効に抑制できる新規組成物の開発が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）遺伝子表現抑制組成物を製造するためのわさび（Ｅｕｔｒｅｍａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）葉抽出物の使用を提供することにある。前記わさび葉抽出物は、わさび葉を溶媒で抽出して得られる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一つの実施形態として、
・前記溶媒が水、アルコール類、又はアルコール／水混合物である。
・前記溶媒及び前記わさび葉の液固比が５〜２０：１〜５である。
・前記抽出が５０〜１００℃で行われる。
・前記わさび葉抽出物は、さらに濾過工程及び濃縮工程を経て得られる。
【０００８】
本発明の一つの実施形態として、前記わさび葉抽出物は濃度が０．５ｍｇ／ｍＬ以上であるわさび葉水抽出物である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明において、水、アルコール類、又はアルコール／水混合物を溶媒として抽出して得られるわさび葉抽出物は、皮膚メラニン細胞におけるＭＩＴＦ遺伝子の表現を抑制することで、メラニンの生成を減少でき、最終的にスキンホワイトニングの効果を達成できる。それによって、皮膚の色素沈着の改善、シミ及び日光性黒子を薄くする。そのため、本発明のわさび葉抽出物は、ＭＩＴＦ遺伝子表現及びメラニン生成を抑制する組成物の製造に用いられる。前記組成物は、クリーム、ローション、分散液、フォーム、ゲル、軟膏、パウダー、湿布、又はパックの形で使用できる。また、前記組成物は、皮膚の局所に投与する医薬品、ケア用品、又は化粧品とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】わさび葉抽出物によって処理された黒色腫細胞におけるＭＩＴＦ遺伝子の相対表現量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、図面により本発明の実施形態を説明する。下記に挙げられる実施例により本発明の技術的特徴及びその応用を説明するが、本発明の範囲をこれらに限定するものではない。当業者は本発明の精神及びその範囲を逸脱しない範囲内で変更、修飾することができる。本発明の範囲はその請求の範囲によって規定されている。
【００１２】
本発明は、ＭＩＴＦ遺伝子表現抑制組成物を製造するためのわさび葉抽出物の使用を提供する。本発明のわさび葉抽出物は、溶媒でわさび葉を抽出して得られる。前記溶媒は、水、アルコール類、又はアルコール／水混合物である。前記溶媒及び前記わさび葉の液固比は５〜２０：１〜５である。また、前記抽出は５０〜１００℃で行われる。メラニン生成関連遺伝子表現量の分析から、本発明のわさび葉抽出物により黒色腫細胞におけるＭＩＴＦ遺伝子の表現量を低減することを証明できる。
【００１３】
［定義］
本明細書に記載の数値が近似値であり、全ての実験データは、前後２０％の範囲、好ましくは１０％の範囲、より好ましくは５％の範囲を表す。
【００１４】
［材料及び方法］
［材料］
Ｇｉｂｃｏから購入したＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）、商品番号１２１００−０３８；ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳと略称）、商品番号１０４３８−０２６；ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、商品番号１５１４０−１２２；リン酸塩緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ溶液と略称）、商品番号１４２００−０７５；細胞溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）、０．１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ、ＰＭＳＦ）及び１％のポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を含む０．１Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．８）。
【００１５】
［細胞培養］
下記実施例において、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）から購入したマウス皮膚黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）細胞株Ｂ１６Ｆ１０  （ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６４７５）を使用してインビトロ毒性試験を行う。Ｂ１６Ｆ１０細胞を３７℃、５％の二酸化炭素の条件で１０％のＦＢＳ及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンのＤＭＥＭ培地に添加して培養する。以下、細胞培地と称する。
【００１６】
［遺伝子表現量の分析］
本発明において、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ｑＰＣＲと略称）によって細胞におけるメラニン生成関連遺伝子の表現量を測定する。以下、その工程を簡単に説明する。
１．ＲＮＡ抽出キット（ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｇｅｎｅａｉｄ）を利用して細胞からＲＮＡを抽出する。
２．逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用してＲＮＡ  （２０００ｎｇ）を相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写する。
３．リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応器Ｓｔｅｐ  Ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ（ＡＢＩ）、及びｑＰＣＲキット（ＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  ＦＡＳＴ  ｑＰＣＲ  Ｋｉｔｓ（２ｘ）、ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｑＰＣＲ反応を行う。前記ｑＰＣＲ反応に用いられるプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）は、目標遺伝子とするＭＩＴＦ遺伝子のフォワードプライマー（５’−ＧＣＣＴＣＣＡＡＧＣＣＴＣＣＧＡＴＡＡＧ−３’、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）及びリバースプライマー（５’−ＧＣＡＣＴＣＴＣＴＧＴＴＧＣＡＴＧＡＡＣＴ−３’、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、並びに内部対照とするβアクチン（ＡＣＴＢ）遺伝子のフォワードプライマー（５’−ＣＡＴＧＴＡＣＧＴＴＧＣＴＡＴＣＣＡＧＧＣ−３’、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）及びリバースプライマー（５’−ＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴ−３’、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を含む。反応条件として、変性温度が９５℃であり、アニーリング温度が６０℃であり、伸長温度が６５℃であり、且つ４０サイクル行う。
４．前記ｑＰＣＲ反応によって得られた融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）を分析する。
５．２−ΔΔＣＴの方法によりＭＩＴＦ遺伝子の相対表現量を測定する。前記方法は、ＡＣＴＢ遺伝子のサイクルしきい値（ＣＴ）を内部標準遺伝子のサイクルしきい値として、下式によって相対的な倍数変化を計算する。
ΔＣＴ＝実験群又は比較群の目標遺伝子のＣＴ−内部標準のＣＴ
ΔΔＣＴ＝実験群のΔＣＴ−比較群のΔＣＴ
倍数変化＝２−ΔΔＣＴ平均値
６．Ｅｘｃｅｌ（登録商標）ソフトウェアのＳＴＤＥＶ関数を利用して各遺伝子の相対表現量の標準偏差を計算して、片側スチューデントのＴ検定（ＴＴＥＳＴ）によって統計的な差を計算する。
【００１７】
［実施例１］
［わさび葉抽出物の準備］
実施例を挙げて本発明のわさび葉抽出物の製造方法を説明する。まず、わさび葉を洗浄、乾燥し、粉砕機でわさび葉を粗砕する。続いて、水、アルコール類、又はアルコール／水混合物を溶媒としてわさび葉粗砕物を抽出する。前記溶媒は好ましくは水である。前記溶媒及びわさび葉粗砕物を液固比が５〜２０：１〜５となるように均一に混合する。抽出温度は５０〜１００℃であり、好ましくは７５〜９５℃である。本実施例において、抽出時間は０．５〜３時間である。
【００１８】
上記抽出工程により得られたわさび葉抽出物を室温まで冷却した後、４００メッシュ（ｍｅｓｈ）のフィルターで濾過することで、残余固形分を除去する。前記濾過したわさび葉抽出物をさらに４５〜７０℃で減圧濃縮することで、濃縮生成物を得る。下記実施例において、濃縮したわさび葉抽出物を利用して細胞実験を行う。固体のわさび葉抽出物を得るために、前記減圧濃縮したわさび葉抽出物を噴霧乾燥により溶媒を除去することで、わさび葉抽出物パウダーを得られる。
【００１９】
［実施例２］
［わさび葉抽出物によりメラニン生成関連遺伝子表現をコントロールする］
本発明のわさび葉抽出物により皮膚メラニン細胞におけるメラニン生成関連遺伝子表現をコントロールする効果を検証するために、本実施例において、わさび葉抽出物によってマウス皮膚黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０を処理した後、そのメラニン生成関連遺伝子表現量の変化をｑＰＣＲで測定する。まず、２ｍＬ細胞培地を有する６ウェルプレートの各ウェルに、１．５×１０５細胞／ウェルとなるように黒色腫細胞を接種し、３７℃で特定時間において培養する。その後、０．５ｍｇ／ｍＬのわさび葉水抽出物により細胞を４８時間処理する。その後、処理された細胞を収集してｑ−ＰＣＲを行う。比較群の黒色腫細胞はわさび葉水抽出物で処理しなかった。
【００２０】
図１に上記黒色腫細胞における小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）遺伝子の相対表現量を示す。図１において、縦軸の遺伝子相対表現量は比較群細胞におけるＭＩＴＦ遺伝子に対するＲＮＡ表現量の倍数を示す。ＭＩＴＦがメラニン細胞の分裂及び増殖に関与し、その遺伝子表現もメラニン生成と正相関の関係となる。図１によれば、比較群と比べて、黒色腫細胞に濃度０．５ｍｇ／ｍＬのわさび葉水抽出物を投与することで、ＭＩＴＦ遺伝子表現量が約３１％まで顕著に低減できる。当該結果から分かるように、本発明のわさび葉抽出物により皮膚メラニン細胞におけるＭＩＴＦの遺伝子表現を抑制することで、メラニン生成を減少できる。
【００２１】
結論として、本発明において、水、アルコール類、又はアルコール／水混合物を溶媒として抽出して得られるわさび葉抽出物は、皮膚メラニン細胞におけるＭＩＴＦの遺伝子表現を抑制することで、皮膚のメラニン生成及び色素沈着を減少でき、最終的にスキンホワイトニングの効果を達成できる。よって、本発明のわさび葉抽出物は、ＭＩＴＦ遺伝子表現及びメラニン生成を抑制する組成物、例えば、皮膚の局所に投与する医薬品、ケア用品、又は化粧品の製造に用いられる。前記組成物はクリーム、ローション、分散液、フォーム、ゲル、軟膏、パウダー、湿布、又はパックの形で使用できる。前記組成物は、さらに保湿剤、美白剤、角質除去剤、又はそれらの組み合わせを含むことができる。
【図１】
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【配列表】
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