(57)【要約】【課題】癌に罹患している患者に投与する方法であって、この方法は、（ａ）ＩＬ−２Ｒβ活性化量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ選択的作動薬；及び（ｂ）ＣＴＬＡ−４経路阻害量の抗ＣＴＬＡ−４抗体又はＰＤ−１経路阻害量の抗ＰＤ−１抗体のステップを含む方法を提供すること。【解決手段】本発明の１つ又は複数の実施形態において、方法が提供され、本方法は、（ａ）ＩＬ−２Ｒβ活性化量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ選択的作動薬；及び（ｂ）ＣＴＬＡ−４経路阻害量の抗ＣＴＬＡ−４抗体又はＰＤ−１経路阻害量の抗ＰＤ−１抗体を癌患者に投与するステップを含む。明確にしておくと、この方法におけるステップの順序に関して、特に指示されない限り本方法はこのステップの順序に限定されず、ステップ（ａ）がステップ（ｂ）の実施前、その実施後又はその実施と同時に実施されてもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１４年１０月２９日に出願されたインド特許出願第３０８７／ＤＥＬ／２０１４号明細書、及び２０１４年２月２１日に出願されたインド特許出願第４９９／ＤＥＬ／２０１４号明細書に対する優先権の利益を主張するものであり、これらの特許出願の開示は全体として参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は（特に）癌化学療法の分野に関し、長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβ選択的作動薬を別の薬理活性剤と併用して患者に投与することによる、癌に罹患している個体の治療を含む。
【背景技術】
【０００３】
インターロイキン２受容体（ＩＬ−２Ｒ）は、リンパ球などの特定の免疫細胞の表面上に発現するヘテロ三量体タンパク質であって、ＩＬ−２サイトカインに結合し、且つそれに応答する。ＩＬ−２受容体は３つのサブユニット、即ちＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、及びＩＬ−２Ｒγで構成され、ＩＬ−２Ｒα及びＩＬ−２Ｒβの各々はＩＬ−２に結合親和性を有するが、一方ＩＬ−２Ｒγは、単独では認め得るほどの親和性を有しない。Ｔｈｅｚｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １７（１０）：４８１−４８６。さらに、ＩＬ−２Ｒαβヘテロ二量体は、いずれの鎖単独と比べてもＩＬ−２との結合時の会合速度が速く、解離速度が遅い。Ｌｉｐａｒｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１２（５）：３１６−３２１。
【０００４】
免疫応答の抑制に関与するＣＤ４＋調節性Ｔ細胞は、ＩＬ−２Ｒαβ型のＩＬ−２Ｒを優先的に発現する。従って、ＩＬ−２Ｒαβの作動薬である化合物の投与は免疫応答を抑制すると予想し得る。
【０００５】
免疫応答の増強に関与するＣＤ８＋記憶Ｔ細胞は、ＩＬ−２Ｒβ型のＩＬ−２Ｒを優先的に発現する。従って、ＩＬ−２Ｒβの作動薬である化合物の投与は免疫応答を（例えばＣＤ８＋記憶Ｔ細胞の増殖を高めることによって）増強すると予想し得る。
【０００６】
従って、ＩＬ−２Ｒβ選択的作動薬の投与は、そうすることにより調節性Ｔ細胞の免疫抑制効果が低下する一方でＣＤ８＋記憶Ｔ細胞が増加し、それによって患者自身の免疫系が癌細胞の排除に動員されると予想されるため、特定の癌に罹患している患者にとって有益となり得る。最適には、かかるＩＬ−２Ｒβ選択的作動薬は投与後に比較的長い曝露も呈し得るため、治療に対する患者の反応がさらに向上し得る。
癌の治療におけるＩＬ−２Ｒβ選択的作動薬の投与による癌患者の免疫系の動員（これは直接の免疫活性化である）は、免疫抑制経路の拮抗薬（例えば、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１の拮抗薬）を投与することによってさらに増強し得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔｈｅｚｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １７（１０）：４８１−４８６
【非特許文献２】Ｌｉｐａｒｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１２（５）：３１６−３２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明は、（特に）より有効性の高い癌治療を提供する継続的必要性に対し、例えば、癌に罹患している患者にＩＬ−２Ｂβ選択的作動薬を薬理学ベースの免疫抑制経路拮抗薬と併用して投与することにより対処しようとするものである。
【０００９】
この及び当該技術分野における他の必要性が本発明によって対処される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の１つ又は複数の実施形態において、方法が提供され、本方法は、（ａ）ＩＬ−２Ｒβ活性化量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ選択的作動薬；及び（ｂ）ＣＴＬＡ−４経路阻害量の抗ＣＴＬＡ−４抗体又はＰＤ−１経路阻害量の抗ＰＤ−１抗体を癌患者に投与するステップを含む。明確にしておくと、この方法におけるステップの順序に関して、特に指示されない限り本方法はこのステップの順序に限定されず、ステップ（ａ）がステップ（ｂ）の実施前、その実施後又はその実施と同時に実施されてもよい。
【００１１】
以下の説明及び特許請求の範囲に、本発明のさらなる実施形態を示す。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
癌に罹患している患者に投与する方法であって、（ａ）ＩＬ−２Ｒβ活性化量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ選択的作動薬；及び（ｂ）ＣＴＬＡ−４経路阻害量の抗ＣＴＬＡ−４抗体又はＰＤ−１経路阻害量の抗ＰＤ−１抗体のステップを含む方法。
（項目２）
前記患者がヒトである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記癌が固形癌である、項目１又は２に記載の方法。
（項目４）
前記固形癌が、乳癌、卵巣癌、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌、悪性黒色腫、肝癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、甲状腺癌、腎癌、胆管癌、脳癌、子宮頸癌、上顎洞癌、膀胱癌、食道癌、ホジキン病及び副腎皮質癌からなる群から選択される、項目１又は２に記載の方法。
（項目５）
前記癌が結腸癌である、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記癌が乳癌である、項目３に記載の方法。
（項目７）
ステップ（ａ）がステップ（ｂ）を行う前に行われる、項目１又は２に記載の方法。
（項目８）
（ａ）がステップ（ｂ）を行った後に行われる、項目１又は２に記載の方法。
（項目９）
ステップ（ａ）及び（ｂ）が同時に行われる、項目１又は２に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＣＴ２６腫瘍モデルに対する抗ＣＴＬＡ−４抗体との併用における受容体選択的長時間作用型ＩＬ−２作動薬の有効性試験（この試験は実施例２にさらに記載される）に関連した、それぞれ平均腫瘍容積、相対腫瘍容積及び体重のプロットである。
【図２】ＣＴ２６腫瘍モデルに対する抗ＣＴＬＡ−４抗体との併用における受容体選択的長時間作用型ＩＬ−２作動薬の有効性試験（この試験は実施例２にさらに記載される）に関連した、それぞれ平均腫瘍容積、相対腫瘍容積及び体重のプロットである。
【図３】ＣＴ２６腫瘍モデルに対する抗ＣＴＬＡ−４抗体との併用における受容体選択的長時間作用型ＩＬ−２作動薬の有効性試験（この試験は実施例２にさらに記載される）に関連した、それぞれ平均腫瘍容積、相対腫瘍容積及び体重のプロットである。
【図４】ＥＭＴ６腫瘍モデルに対する抗ＣＴＬＡ−４抗体との併用における受容体選択的長時間作用型ＩＬ−２作動薬の有効性試験（この試験は実施例３にさらに記載される）に関連した、それぞれ３０日間の平均腫瘍容積、１０６日間の平均腫瘍容積、及び体重のプロットである。
【図５】ＥＭＴ６腫瘍モデルに対する抗ＣＴＬＡ−４抗体との併用における受容体選択的長時間作用型ＩＬ−２作動薬の有効性試験（この試験は実施例３にさらに記載される）に関連した、それぞれ３０日間の平均腫瘍容積、１０６日間の平均腫瘍容積、及び体重のプロットである。
【図６】ＥＭＴ６腫瘍モデルに対する抗ＣＴＬＡ−４抗体との併用における受容体選択的長時間作用型ＩＬ−２作動薬の有効性試験（この試験は実施例３にさらに記載される）に関連した、それぞれ３０日間の平均腫瘍容積、１０６日間の平均腫瘍容積、及び体重のプロットである。
【図７】ＥＭＴ６腫瘍モデルに対する抗ＣＴＬＡ−４抗体を伴うＰｒｏｌｅｕｋｉｎと比較した抗ＣＴＬＡ−４抗体との併用における受容体選択的長時間作用型ＩＬ−２作動薬の有効性試験（この試験は実施例４にさらに記載される）に関連した、それぞれ腫瘍容積及び体重のプロットである。
【図８】ＥＭＴ６腫瘍モデルに対する抗ＣＴＬＡ−４抗体を伴うＰｒｏｌｅｕｋｉｎと比較した抗ＣＴＬＡ−４抗体との併用における受容体選択的長時間作用型ＩＬ−２作動薬の有効性試験（この試験は実施例４にさらに記載される）に関連した、それぞれ腫瘍容積及び体重のプロットである。
【図９】ＥＭＴ６腫瘍モデルに対する抗ＣＴＬＡ−４抗体との併用における受容体選択的長時間作用型ＩＬ−２作動薬のフローサイトメトリー解析を含む有効性試験（この試験は実施例５にさらに記載される）に関連した、１１日間のそれぞれ腫瘍容積及び体重のプロットである。
【図１０】ＥＭＴ６腫瘍モデルに対する抗ＣＴＬＡ−４抗体との併用における受容体選択的長時間作用型ＩＬ−２作動薬のフローサイトメトリー解析を含む有効性試験（この試験は実施例５にさらに記載される）に関連した、１１日間のそれぞれ腫瘍容積及び体重のプロットである。
【図１１】各々、実施例５にさらに記載されるフローサイトメトリー解析に対応する免疫細胞集団のそれぞれ腫瘍及び脾臓のグラフを含む。
【図１２】各々、実施例５にさらに記載されるフローサイトメトリー解析に対応する免疫細胞集団のそれぞれ腫瘍及び脾臓のグラフを含む。
【図１３】ＣＴ２６腫瘍モデルに対する抗ＰＤ−１抗体との併用における受容体選択的長時間作用型ＩＬ−２作動薬の有効性試験（この試験は実施例６にさらに記載される）に関連した、それぞれ平均腫瘍容積及び体重のプロットである。
【図１４】ＣＴ２６腫瘍モデルに対する抗ＰＤ−１抗体との併用における受容体選択的長時間作用型ＩＬ−２作動薬の有効性試験（この試験は実施例６にさらに記載される）に関連した、それぞれ平均腫瘍容積及び体重のプロットである。
【図１５】実施例７にさらに記載される３フェーズ再攻撃試験のフェーズＩ後の平均腫瘍容積及び体重の２つのプロットを示す。
【図１６】実施例７にさらに記載される３フェーズ再攻撃試験のフェーズＩ後の相対平均腫瘍容積及び体重変化の２つのプロットを示す。
【図１７】実施例７にさらに記載される３フェーズ再攻撃試験のフェーズＩＩ後の相対体重変化のプロットを示す。
【図１８】実施例７にさらに記載される３フェーズ再攻撃試験のフェーズＩＩ後の平均腫瘍容積及び体重の２つのプロットを示す。
【図１９】実施例７にさらに記載される３フェーズ再攻撃試験のフェーズＩＩＩ後の平均腫瘍容積のプロットを示す。
【図２０】実施例７にさらに記載される３フェーズ再攻撃試験のフェーズＩＩＩの体重変化及び相対体重変化の２つのプロットを示す。
【図２１】実施例７にさらに記載される３フェーズ再攻撃試験の経過にわたる平均腫瘍容積及び個々の腫瘍容積の２つのプロットを示す。
【図２２】実施例８にさらに記載されるＲＳＬＡＩＬ−２及び抗ＣＴＬＡ−４併用試験に関連して０日目〜１１日目の平均腫瘍容積及び体重の２つのプロットを示す。
【図２３】実施例８にさらに記載されるＲＳＬＡＩＬ−２及び抗ＣＴＬＡ−４併用試験に関連して０日目〜１１日目の相対平均腫瘍容積及び体重の２つのプロットを示す。
【図２４】実施例８にさらに記載されるＲＳＬＡＩＬ−２及び抗ＰＤ−１併用試験に関連して０日目〜１１日目の平均腫瘍容積及び体重の２つのプロットを示す。
【図２５】実施例８にさらに記載されるＲＳＬＡＩＬ−２及び抗ＰＤ−１併用試験に関連して０日目〜１１日目の相対平均腫瘍容積及び体重の２つのプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈上特に明確に指示されない限り複数の指示対象が含まれる。
【００１４】
本発明の記載及び特許請求の範囲においては、以下に記載する定義に従い以下の用語を使用する。
【００１５】
「水溶性非ペプチドポリマー」は、室温で水に対して少なくとも３５％（重量基準）可溶であり、好ましくは７０％超（重量基準）、より好ましくは９５％超（重量基準）可溶であるポリマーを指す。典型的には、「水溶性」ポリマーの未ろ過水溶液調製物は、ろ過後の同じ溶液によって透過される光の量の少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９５％を透過する。しかしながら、水溶性ポリマーは水に対して少なくとも９５％（重量基準）可溶であるか又は水に対して完全に可溶であることが最も好ましい。「非ペプチド性」であることに関して、ポリマーは、それが有するアミノ酸残基が３５％未満（重量基準）であるとき非ペプチド性である。
【００１６】
用語「単量体」、「単量体サブユニット」及び「単量体ユニット」は、本明細書では同義的に使用され、ポリマーの基本構造単位の１つを指す。ホモポリマーの場合、単一の繰り返し構造単位がポリマーを形成する。コポリマーの場合、２つ以上の構造単位が−あるパターンで又はランダムに−繰り返すことでポリマーを形成する。本発明との関連において使用される好ましいポリマーはホモポリマーである。水溶性非ペプチドポリマーは、連続的に結合された１つ以上の単量体を含んで単量体の鎖を形成する。
【００１７】
「ＰＥＧ」又は「ポリエチレングリコール」は、本明細書で使用されるとき、任意の水溶性ポリ（エチレンオキシド）を包含することが意図される。特に指示されない限り、「ＰＥＧポリマー」又はポリエチレングリコールは、実質的に全ての（好ましくは全ての）単量体サブユニットがエチレンオキシドサブユニットであるものであり、しかしながらポリマーは、例えばコンジュゲーション用に、個別のエンドキャッピング部分又は官能基を含有してもよい。本発明で使用されるＰＥＧポリマーは、１つ又は複数の末端酸素が例えば合成変換中に置換されたか否かに応じて、以下の２つの構造のうちの一方を含み得る：「−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−」又は「−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−１ＣＨ２ＣＨ２−」。前述のとおり、ＰＥＧポリマーについては、変量（ｎ）は約３〜４０００の範囲であり、末端基及びＰＥＧ全体の構造は様々であり得る。
【００１８】
ポリマーの幾何学的配置又は全体構造に関して「分枝状」は、分岐点から延在する２つ以上のポリマー「アーム」を有するポリマーを指す。
【００１９】
「生理学的に切断可能な」又は「加水分解性の」又は「分解性の」結合とは、生理学的条件下で水と反応する（即ち加水分解される）比較的不安定な結合である。結合が水中で加水分解する傾向は、所与の分子内で２つの原子をつなぐ一般的な種類の結合に依存するのみならず、それらの原子に結合した置換基にもまた依存し得る。加水分解に不安定な又は弱い適切な結合としては、限定はされないが、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、ペプチド、オリゴヌクレオチド、チオエステル、及びカーボネートが挙げられる。
【００２０】
「酵素分解性の結合」は、１つ以上の酵素により分解を受ける結合を意味する。
【００２１】
「安定な」結合（ｌｉｎｋａｇｅ）又は結合（ｂｏｎｄ）は、水中で実質的に安定な化学結合、即ち、長期間にわたり生理学的条件下でいかなる認め得る程度の加水分解も受けない結合を指す。加水分解に安定な結合の例としては、限定はされないが、以下が挙げられる：炭素−炭素結合（例えば脂肪族鎖中の）、エーテル類、アミド類、ウレタン類、アミン類など。概して、安定な結合は、生理学的条件下で１日約１〜２％未満の加水分解速度を呈するものである。代表的な化学結合の加水分解速度は、多くの標準的な化学テキストブックを参照することができる。
【００２２】
「実質的に」又は「本質的に」とは、ほぼ全体的にまたは完全に、例えば、ある所与の分量の９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上、なおもさらにより好ましくは９９．９％以上を意味し、９９．９９％以上が最も好ましい。
【００２３】
「薬学的に許容可能な賦形剤」又は「薬学的に許容可能な担体」は、患者に有意な有害毒性効果を引き起こさない本発明の組成物に含まれ得る成分を指す。
【００２４】
用語「患者」は、本明細書に記載されるとおりの本発明の化合物の投与によって予防又は治療することのできる病態に罹患している又はそれに罹り易い生物を指し、ヒト及び動物の両方を含む。
【００２５】
上記に指摘したとおり、本発明は、（特に）癌に罹患している患者に投与する方法に関し、本方法は、（ａ）ＩＬ−２Ｒβ活性化量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ選択的作動薬；及び（ｂ）ＣＴＬＡ−４経路阻害量の抗ＣＴＬＡ−４抗体又はＰＤ−１経路阻害量の抗ＰＤ−１抗体のステップを含む。ステップ（ａ）及びステップ（ｂ）の投与に関して、これらの投与ステップはいずれの順序でも（並びに同時に）実施することができ、本発明はこの点で限定されない。本発明の１つ又は複数の実施形態では、ステップ（ａ）の投与がステップ（ｂ）の投与の前に行われ得る。本発明の１つ又は複数の実施形態では、ステップ（ｂ）の投与がステップ（ａ）の投与の前に行われ得る。１つ又は複数の実施形態では、ステップ（ａ）及び（ｂ）の投与の両方が同時に行われ得る。さらに、１つ又は複数の実施形態では、ステップ（ａ）及び／又は（ｂ）は繰り返し投与され得る。加えて、又は複数の実施形態において、ステップ（ａ）及び（ｂ）は１回のみ行われ得る。
【００２６】
本明細書に記載される治療方法は、患者ケアを監督する臨床医がその治療方法を有効であると見なす限り継続され得る。その治療方法が有効であることの指標となる非限定的なパラメータには、以下が含まれる：腫瘍縮小（重量及び／又は容積の点で）；個別の腫瘍コロニーの数の減少；腫瘍消失；及び無進行生存。
【００２７】
特許請求される方法における治療コースに関連する例示的時間の長さには、約１週間；２週間；約３週間；約４週間；約５週間；約６週間；約７週間；約８週間；約９週間；約１０週間；約１１週間；約１２週間；約１３週間；約１４週間；約１５週間；約１６週間；約１７週間；約１８週間；約１９週間；約２０週間；約２１週間；約２２週間；約２３週間；約２４週間；約７ヵ月；約８ヵ月；約９ヵ月；約１０ヵ月；約１１ヵ月；約１２ヵ月；約１３ヵ月；約１４ヵ月；約１５ヵ月；約１６ヵ月；約１７ヵ月；約１８ヵ月；約１９ヵ月；約２０ヵ月；約２１ヵ月；約２２ヵ月；約２３ヵ月；約２４ヵ月；約３０ヵ月；約３年；約４年及び約５年が含まれる。
【００２８】
長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ選択的作動薬の投与頻度に関して、当業者は適切な頻度を決定することが可能であろう。例えば、臨床医は、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ選択的作動薬を比較的低頻度で（例えば２週間に１回）投与し、患者が忍容性を示すことに伴い投薬間の期間を徐々に短縮することに決めてもよい。抗ＣＴＬＡ−４抗体及び抗ＰＤ−１抗体の投与頻度に関して、これらの薬剤の頻度も同様にして決定することができる。加えて、一部の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ選択的作動薬、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体は高次臨床試験中であるか、或いは市販されているため、適切な投与頻度を把握するため文献を参照することもまた可能である（治療レジメンの併用効果を考慮して幾らかの調整が必要となり得ることに留意する）。
【００２９】
本明細書に記載される方法は、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ選択的作動薬の投与を含む。この点で、本発明は、その作動薬が同じインビトロモデルにおけるＩＬ−２Ｒαβに対する結合親和性の少なくとも５倍高い（より好ましくは少なくとも１０倍高い）ＩＬ−２Ｒβに対するインビトロ結合親和性を呈し、且つＩＬ−２（生体内消失ＩＬ−２に基づく半減期）より少なくとも１０倍長い有効生体内半減期を有する限り、いかなる特定の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ選択的作動薬にも限定されない。例として、標準としてＩＬ−２に対する結合親和性を計測することが可能である。この点で、本開示の実施例１において言及されるＲＳＬＡＩＬ−２は、ＩＬ−２Ｒαβに対する親和性についてＩＬ−２の約６０分の１の低さを呈するが、親和性ＩＬ−２ＲβについてはＩＬ−２の約５分の１の低さに過ぎない。
【００３０】
長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ選択的作動薬の非限定的な例は、国際公開第２０１２／０６５０８６号パンフレットに記載される。例示的長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ選択的作動薬は、本願の実施例１で言及されるＲＳＬＡＩＬ−２である。この点で、ＲＳＬＡＩＬ−２は、以下の式に包含される化合物：
【化１】
2019077723.tif 000002
（式中、ＩＬ−２はＩＬ−２の残基である）、及びその薬学的に許容可能な塩を含む組成物である。１つ又は複数の実施形態において、この組成物は、１０％以下（モル量基準で）、好ましくは５％以下（モル量基準で）の以下の式に包含される化合物
【化２】
2019077723.tif 000003
（式中、ＩＬ−２はＩＬ−２の残基であり、（ｎ）は１、２、３、７及び＞７からなる群から選択される整数である）、及びその薬学的に許容可能な塩を含む。
【００３１】
本明細書に記載される方法は、抗ＣＴＬＡ−４抗体又は抗ＰＤ−１抗体の投与を含む。抗ＣＴＬＡ−４抗体に関して、これらは公知であり、トレメリムマブ及びイピリムマブが含まれる。抗ＰＤ−１抗体に関して、これらは公知であり、ニボルマブ及びランブロリズマブ、ＡＭＰ−２２４、ＭＤＰＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６及びＭＳＢ００１０７１８Ｃが含まれる。
【００３２】
所与の化合物が抗ＣＴＬＡ−４抗体又は抗ＰＤ−１抗体として作用し得るかどうかを決定するためのアッセイは、当業者が常法の実験によって決定することができる。
【００３３】
本明細書に記載される方法において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ選択的作動薬は、ＩＬ−２Ｒβ活性化量で患者に投与される。当業者は、どのくらいの所与の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ選択的作動薬がＩＬ−２Ｒβにおいて臨床的に有意味な作動活性をもたらすのに十分であるかを決定することができる。例えば、当業者は文献を参照してもよく、及び／又は一連の漸増量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ選択的作動薬を投与して、どの量がＩＬ−２Ｒβの臨床的作動活性をもたらすかを決定してもよい。
【００３４】
しかしながら、１つ以上の例において、ＩＬ−２Ｒβ活性化量は以下の範囲の１つ以上に包含される量である：約０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ；約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．１ｍｇ／ｋｇ；約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ；約２ｍｇ／ｋｇ〜約９００ｍｇ／ｋｇ；約３ｍｇ／ｋｇ〜約８００ｍｇ／ｋｇ；約４ｍｇ／ｋｇ〜約７００ｍｇ／ｋｇ；約５ｍｇ／ｋｇ〜約６００ｍｇ／ｋｇ；約６ｍｇ／ｋｇ〜約５５０ｍｇ／ｋｇ；約７ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ；約８ｍｇ／ｋｇ〜約４５０ｍｇ／ｋｇ；約９ｍｇ／ｋｇ〜約４００ｍｇ／ｋｇ；約５ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ；約２ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇ；約５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ；約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ；及び約１０ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ。
【００３５】
本明細書に記載される方法において、ＣＴＬＡ−４経路阻害量の抗ＣＴＬＡ−４抗体が投与され、又はＰＤ−１経路阻害量の抗ＰＤ−１抗体が投与される。当業者は、どのくらいの所与の抗ＣＴＬＡ−４抗体又は抗ＰＤ−１抗体がそれぞれＣＴＬＡ−４経路又はＰＤ−１経路の臨床的に有意味な阻害をもたらすのに十分であるかを決定することができる。例えば、当業者は文献を参照してもよく、及び／又は一連の漸増量の抗ＣＴＬＡ−４抗体又は抗ＰＤ−１抗体を投与して、どの量がＣＴＬＡ−４経路又はＰＤ−１経路の臨床的に有意味な阻害をもたらすかを決定してもよい。
【００３６】
しかしながら、１つ以上の例において、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１経路阻害量は以下の範囲の１つ以上に包含される量である：約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ；約２ｍｇ／ｋｇ〜約９００ｍｇ／ｋｇ；約３ｍｇ／ｋｇ〜約８００ｍｇ／ｋｇ；約４ｍｇ／ｋｇ〜約７００ｍｇ／ｋｇ；約５ｍｇ／ｋｇ〜約６００ｍｇ／ｋｇ；約６ｍｇ／ｋｇ〜約５５０ｍｇ／ｋｇ；約７ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ；約８ｍｇ／ｋｇ〜約４５０ｍｇ／ｋｇ；約９ｍｇ／ｋｇ〜約４００ｍｇ／ｋｇ；約５ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ；約２ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇ；約５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ；約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ；及び約１０ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ。
【００３７】
確認のために言えば、それぞれＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１経路阻害量の抗ＣＴＬＡ−４抗体又は抗ＰＤ−１抗体に関して本明細書で使用されるとき、阻害の量及び程度は大きく異なり、それらの一方と長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ選択的作動薬との併用がなおも有効であり得る。例えば、それぞれＣＴＬＡ−４又はＰＤ−１経路をごく最小限だけ阻害する抗ＣＴＬＡ−４抗体又は抗ＰＤ−１抗体の量は、特許請求される本発明の方法が臨床的に意味のある応答を生じさせる限りはなおも本明細書で使用されるときの阻害量であり得る。同様に、ＩＬ−２Ｒβで十分に長期間にわたりごく最小限の作動薬活性を呈する長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ選択的作動薬の量は、特許請求される本発明の方法が臨床的に意味のある応答を生じさせる限りはなおも長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ選択的作動薬であり得る。ある場合には、（例えば）相乗的反応に起因して、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβ選択的作動薬の存在下ではＣＴＬＡ−４又はＰＤ−１経路の阻害は最小限だけ要求され得るに過ぎない。さらに他の場合には、（例えば）相乗的反応に起因して、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１経路阻害の存在下ではＩＬ−２Ｒβの作動薬活性は最小限だけ要求され得る。
【００３８】
実際の投与用量は、対象の年齢、体重、及び全身状態並びに治療下の病態の重症度、医療専門家の判断、及び投与されるコンジュゲートに応じて異なり得る。
【００３９】
本発明は、（特に）本化合物による治療に応答する病態に罹患している患者の治療に有用な方法を提供する。例えば、患者は、個別の薬剤単独にも、また併用にも応答し得るが、併用に対する応答性がより高い。さらなる例として、患者は個別の薬剤の一つに対して非応答性であり得るが、併用には応答する。さらに別の例として、患者はいずれの個別の薬剤単独に対しても非応答性であり得るが、併用には応答する。
【００４０】
本方法は、治療有効量の活性薬剤を注射によって投与するステップを含む。肺内、鼻内、頬側、直腸、舌下及び経皮など、他の投与方法もまた企図される。本明細書で使用されるとき、用語「非経口」には、皮下、静脈内、動脈内、腹腔内、心臓内、くも膜下腔内、及び筋肉内注射、並びに点滴注射が含まれる。本方法の各薬理成分は別々に投与することができる。或いは、２つの薬理成分の投与が同時であることが所望される（及び２つの薬理成分が互いに及び所与の製剤で適合する）場合、単一剤形／製剤の投与（例えば、両方の薬理活性剤を含有する静脈内製剤の静脈内投与）によって同時投与を実現することができる。当業者は、２つの所与の薬理成分が互いに及び所与の製剤で適合するかどうかを常法の試験によって決定することができる。
【００４１】
先述の方法は、この方法によって治癒又は予防し得る任意の病態に罹患している患者の治療に用いることができる。例示的病態は、癌、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫及び白血病である。
【００４２】
本明細書において参照される全ての論文、書籍、特許、特許公報及び他の刊行物は、全体として参照により援用される。本明細書の教示と参照によって援用される技術との間に不一致が生じた場合、その教示の意味及び本明細書の定義が（特に本明細書に添付される特許請求の範囲で用いられる用語に関して）優先するものとする。例えば、本願及び参照によって援用される刊行物が同じ用語を別様に定義する場合、定義が載せられている文書の教示の範囲内でその用語の定義が維持されるものとする。
【実施例】
【００４３】
本発明は特定の好ましい具体的な実施形態と併せて説明されているが、前述の説明並びに以下の例は例示を意図するもので、本発明の範囲を限定する意図はないことが理解されるべきである。本発明が関係する技術分野の当業者には、本発明の範囲内の他の態様、利点及び変形例が明らかであろう。
【００４４】
実施例２〜７において言及される抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ＵＣ１０−４Ｆ１０−１１ハイブリドーマ細胞株（ＡＴＣＣ）から精製した抗マウスＣＬＴＡ−４抗体に相当する。細胞をＰＦＨＭ−ＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１×１０５〜１×１０６細胞／ｍＬの密度に維持した。精製前に培地を遠心して細胞を取り除いた。培地のｐＨをＮａＯＨで８に調整し、水で希釈することによりその伝導率を７ｍＳ／ｃｍに低下させた。ｐＨ／伝導率を調整した培地をＱ−ＦＦカラムにロードし、ＮａＣｌ勾配を用いて抗マウスＣＬＴＡ−４抗体を溶出させた。
【００４５】
抗ＣＴＬＡ−４のその抗原に対する親和性を表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって決定し、２０ｐＭであると決定された。
【００４６】
抗ＰＤ−１はＢｉｏＸｃｅｌｌから購入した。これは、以下の特性を有する溶液として入手された：濃度：４．７６ｍｇ／ｍＬ；エンドトキシン：＜０．６３ＥＵ／ｍｇ；配合：ＰＢＳ  ｐＨ７；純度：＞９５％；アイソタイプ：ラットＩｇＧ２ａ；及び消衰係数：１．３３。抗ＰＤ−１のその抗原に対する親和性を表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって計測し、１ｎＭであることが分かった。購入した抗体の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣによって確かめ、さらなるワークアップなしに有効性試験に十分な純度であると決定された。
【００４７】
実施例１
ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳによるｒＩＬ−２のＰＥＧ化
ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳによるｒＩＬ−２のＰＥＧ化については、以前、国際公開第２０１２／０６５０８５号パンフレットの実施例２に報告されている。そこでは、合成によって４ｍｅｒ、３ｍｅｒ、２ｍｅｒ及び１ｍｅｒの混合物が生じることが報告された。しかしながら、反応物をさらに分析すると、より高度な結合（例えば、５ｍｅｒ、６ｍｅｒ及び７ｍｅｒ）もまた生成されたことが明らかになった。本合成は、ｍＰＥＧ２−Ｃ２−ｆｍｏｃ−２０Ｋ−ＮＨＳによってＩＬ−２をＰＥＧ化するスケールアップした手法に相当する。
【００４８】
１．４４ｍｇ／ｍｌの精製ｒＩＬ−２（１０６．４ｍＬ）を第１の容器に入れ、続いて５３．６ｍＬの製剤化緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５、５％トレハロース）を加えた。ｐＨを測ると４．６２であり、温度を測ると２１．２℃であった。ＰＥＧ試薬のＣ２−ＰＥＧ２−ＦＭＯＣ−ＮＨＳ−２０Ｋ（国際公開第２００６／１３８５７２号パンフレットに記載されるとおり利用可能）（１３．１ｇ）を第２の容器に入れ、続いて７３．３ｍＬの２ｍＭ  ＨＣｌを加えた。得られた溶液を手動で２５分間かき混ぜた。第１の容器にホウ酸ナトリウム（０．５Ｍ、ｐＨ９．８）を加えてｐＨを約９．１に上昇させ、次にＰＥＧ試薬が入った第２の容器を１〜２分間かけて第１の容器に加えた。次に８．１ｍＬの２ｍＭ  ＨＣｌを第２の容器に入れることによってリンスステップを行い、第１の容器に加えた。コンジュゲーション反応では、最終的なｒＩＬ−２濃度は０．６ｍｇ／ｍＬであり、ホウ酸ナトリウム濃度は１２０ｍＭであり、ｐＨは９．１±０．２であり、温度は２０〜２２℃であった。試薬の活性（置換レベル）を調整した後のＰＥＧ試薬とｒＩＬ−２とのモル比は３５：１である。コンジュゲーション反応を３０分間進行させ、次に７５ｍＬの２Ｎ酢酸を使用した酸性化反応（ここではｐＨが４．０１に降下する）で停止させた。反応の生成物を水で希釈し、希釈したＰＥＧ化ｒＩＬ−２溶液を０．２ミクロンフィルタを使用してろ過した。ろ過した生成物は滅菌容器に入れる。
【００４９】
その後、ＳＰセファロースＦＦ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填したクロマトグラフィーカラムに溶液をロードすることにより、希釈したＰＥＧ化ｒＩＬ−２溶液を精製した。洗浄ステップ後、塩化ナトリウム勾配を用いてＰＥＧ化ｒＩＬ−２を溶出させる。１ｍｅｒ、２ｍｅｒ又は３ｍｅｒを含む画分は取り除き、一方、４ｍｅｒ、５ｍｅｒ、６ｍｅｒ、７ｍｅｒ及び任意のそれより高度なＰＥＧ化を含む画分はプールし、それにより主として４ｍｅｒ、５ｍｅｒ及び６ｍｅｒを有する組成物を得る（８ｍｅｒ及びそれより高度なＰＥＧ化は、クロマトグラフィーに関連する洗浄ステップの間に取り除かれることが分かった）。この組成物が、実施例２〜６に関連して使用されるものであり、それらの実施例の中では「ＲＳＬＡＩＬ−２」と称する。
【００５０】
この例に記載される手法を用いると、４ｍｅｒ、５ｍｅｒ及び６ｍｅｒの収率は（１ｍｅｒ、２ｍｅｒ及び３ｍｅｒの低下を相伴って）増加することが分かった。
【００５１】
実施例２
雌ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴ２６腫瘍モデルに対する抗ＣＴＬＡ−４抗体との併用におけるＲＳＬＡＩＬ−２の有効性の判定
この試験の目的は、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴ２６マウス結腸癌腫瘍モデルで抗ＣＴＬＡ−４抗体との併用におけるＲＳＬＡＩＬ−２の抗腫瘍活性を判定することであった。
【００５２】
各群に１２匹の動物を含む５群とした。０、４、９及び１４日目に治療される媒体対照群、２つの単剤群（０、４、９、１４及び１８日目に治療される抗ＣＴＬＡ−４抗体又は０及び９日目に治療されるＲＳＬＡＩＬ−２）及び２つの併用免疫療法群（抗ＣＴＬＡ−４抗体＋ＲＳＬＡＩＬ−２）（ここで一方の群の抗ＣＴＬＡ−４抗体（０、４、９、１４及び１８日目に投与）の治療はＲＳＬＡＩＬ−２（０、４及び９日目に投与）と同じ時点で開始し、及び他方の群については、ＲＳＬＡＩＬ−２治療開始（４、１３及び２２日目に投与）の４日前に開始した）を組み入れた。この試験の治療開始は、２×１０６細胞／部位で０．１ｍＬ注入容積のＣＴ２６細胞接種の７日後に行った。腫瘍細胞は腹部に皮下注射した。それに応じてＳｔｕｄｙＬｏｇ（登録商標）ソフトウェアによって生成された無作為化に基づき動物を分配した。治療日（０日目）の平均腫瘍容積は１１１±９ｍｍ３〜１１５±１０ｍｍ３（平均値±ＳＥＭ）の範囲であった。
【００５３】
腫瘍容積（ｍｍ３単位）及び体重（グラム単位）を週２〜３回モニタした。治療スケジュールの詳細と共にそれぞれ図１及び図２に提供する。試験開始時の個々の腫瘍容積に対して計算した、且つ成長率として提供される標準化値である対応する相対腫瘍値を図１（０日目〜３０日目）に要約する。無腫瘍動物は腫瘍再増殖に関して１０６日間モニタし、体重は治療開始から測った。
【００５４】
１１日目（媒体対照動物がいた最後の日）の媒体対照動物と治療動物との腫瘍容積をチューキーの事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  バージョン６．０３  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって比較すると、全ての治療群が媒体対照群と有意に異なることが示された。
【００５５】
１１日目（対照動物がいた最後の日）に、以下の式を用いることによって平均腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）を評価した：
％ＴＧＩ＝（１−（相対腫瘍容積（％）治療群÷相対腫瘍容積（％）対照群）×１００
【００５６】
抗ＣＴＬＡ−４抗体（群２）で治療した腫瘍について５３％及びＲＳＬＡＩＬ−２群（群３）について５８％の平均阻害があった。併用免疫療法共投与（０日目に同じ時点で開始したＲＳＬＡＩＬ−２及び抗ＣＴＬＡ−４抗体）は７４％の阻害を生じた。抗ＣＴＬＡ−４抗体を０日目に開始して、及びＲＳＬＡＩＬ−２治療を４日目に開始した併用免疫療法（群５）は、８８％のこれらの治療の中で最も高い阻害を生じた。
【００５７】
群４の１２匹中１匹（１／１２匹）の動物が１４日目までに無腫瘍であった。合計４匹の動物が２８日目までに無腫瘍であった。群５では、２匹（２／１２匹）の動物が１４日目までに無腫瘍であり、合計８匹の動物が２５日目までに無腫瘍であった。表１を参照のこと。群４及び群５のこれらの動物は全て、試験終了（治療開始から１０６日）まで無腫瘍のままであった。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
治療日の平均体重は１７．４±０．３ｇ〜１８．２±０．３ｇ（平均値±ＳＥＭ）の範囲であった。いずれの治療群からも、治療フェーズ中のベースラインを下回る有意な平均体重減少は観察されなかった（図３）。
【００６０】
実施例３
雌ＢＡＬＢ／ｃマウスのＥＭＴ６腫瘍モデルに対する抗ＣＴＬＡ−４抗体との併用におけるＲＳＬＡＩＬ−２の有効性の判定
この試験の目的は、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスのＥＭＴ６マウス乳癌腫瘍モデルに対する抗ＣＴＬＡ−４抗体との併用におけるＲＳＬＡＩＬ−２の抗腫瘍活性を判定することであった。
【００６１】
各群に各々１２匹の動物を含む５群とした。０、４、９及び１４日目に治療される媒体対照群、２つの単剤群（０、４、９、１４及び１８日目に治療される抗ＣＴＬＡ−４抗体又は０及び９日目に治療されるＲＳＬＡＩＬ−２）及び２つの併用免疫療法群（抗ＣＴＬＡ−４抗体＋ＲＳＬＡＩＬ−２）（ここで一方の群の抗ＣＴＬＡ−４抗体（０、４、９、１４及び１８日目に投与）の治療はＲＳＬＡＩＬ−２（０、４及び９日目に投与）と同じ時点で開始し、及び他方の群については、ＲＳＬＡＩＬ−２治療開始（４、１３及び２２日目に投与）の４日前に開始した）を組み入れた。この試験の治療開始は、２×１０６細胞／部位で０．１ｍＬ注入容積のＥＭＴ６細胞接種の７日後に行った。腫瘍細胞は腹部に皮下注射した。それに応じてＳｔｕｄｙＬｏｇ（登録商標）ソフトウェアによって生成された無作為化に基づき動物を分配した。治療日（０日目）の平均腫瘍容積は１４４±８ｍｍ３〜１４７±１０ｍｍ３（平均値±ＳＥＭ）の範囲であった。
【００６２】
腫瘍容積（ｍｍ３単位）及び体重（グラム単位）を週２〜３回モニタした。腫瘍容積データは治療スケジュールの詳細と共に図４（０日目〜３０日目）に提供する。無腫瘍動物は腫瘍再増殖に関して治療開始から１０６日間モニタした（これは図５に提供する）。
【００６３】
１８日目（媒体対照動物がいた最後の日）の媒体対照動物と治療動物との腫瘍容積をチューキーの事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  バージョン６．０３  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって比較すると、媒体対照（群１）と群２（抗ＣＴＬＡ−４抗体治療）及び群５（０日目に開始した抗ＣＴＬＡ−４抗体＋４日目に開始したＲＳＬＡＩＬ−２）との間に有意な差が示された。群１（媒体対照）と群３（ＲＳＬＡＩＬ−２単独）及び群４（両治療ともに０日目に開始したＲＳＬＡＩＬ−２＋抗ＣＴＬＡ−４抗体）との間には、統計学的差異は認められなかった。
【００６４】
１８日目（対照動物がいた最後の日）に、以下の式を用いることによって平均腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）を評価した：
％ＴＧＩ＝（１−（相対腫瘍容積（％）治療群÷相対腫瘍容積（％）対照群）×１００
【００６５】
抗ＣＴＬＡ−４抗体（群２）で治療した腫瘍について５５％及びＲＳＬＡＩＬ−２群（群３）について２２％の平均阻害があった。併用免疫療法共投与（０日目に同じ時点で開始したＲＳＬＡＩＬ−２及び抗ＣＴＬＡ−４抗体）は２７％の阻害を生じた。抗ＣＴＬＡ−４抗体を０日目に開始して、及びＲＳＬＡＩＬ−２治療を４日目に開始した併用免疫療法（群５）は、９２％のこれらの治療の中で最も高い阻害を生じた。媒体対照群の１匹の動物の腫瘍は１１日目までに完全に自然退縮したことが観察された。それにも関わらず、平均腫瘍容積は、この群をまとめて試験から除外した１８日目までに１７８９ｍｍ３±１９６（平均値±ＳＥ、Ｎ＝１２匹）であった。群４の１２匹中１匹の動物もまた１８日目までに無腫瘍であった。この群の残りの動物の平均腫瘍容積は、群全体を試験から除外した時点（１８日目）で１３６１±２１４ｍｍ３であった。
【００６６】
群５の１２匹中５匹（５／１２匹）の動物が１４日目までに無腫瘍であった。合計１０匹の動物が１８日目までに無腫瘍であった。１０匹全ての動物が試験終了（治療開始から１０６日）まで無腫瘍のままであった。表２を参照のこと。
【００６７】
【表２】
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【００６８】
治療日の平均体重は１７．８±０．３ｇ〜１８．４±０．４ｇ（平均値±ＳＥＭ）の範囲であった（図６）。いずれの治療群からも、有意な体重減少は観察されなかった。
【００６９】
実施例４
雌ＢＡＬＢ／ｃマウスのＥＭＴ６腫瘍モデルに対する抗ＣＴＬＡ−４抗体を伴うＰｒｏｌｅｕｋｉｎ治療と比較した抗ＣＴＬＡ−４抗体との併用におけるＲＳＬＡＩＬ−２の有効性の判定
この試験の目的は、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスのＥＭＴ６マウス乳癌腫瘍モデルに対する抗ＣＴＬＡ−４抗体との併用におけるＲＳＬＡＩＬ−２の抗腫瘍活性を判定し、それをＰｒｏｌｅｕｋｉｎと比較することである。
【００７０】
各１０匹の動物を含む７群とした。抗体対照（群１）０、４、８及び１３日目に投与）及び３つの単剤群を組み入れた。これらの単剤群は、０、４、８、１３及び１８日目に投与した抗ＣＴＬＡ−４抗体（群２）、０〜４日目、次に７〜１１日目に投与したＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（群３）及び０及び９日目に投与したＲＳＬＡＩＬ−２（群４）であった。また、３つの併用免疫療法群も組み入れた。抗ＣＴＬＡ−４抗体をＰｒｏｌｅｕｋｉｎと共に使用する併用免疫療法群（群５）及び異なる治療スケジュールで抗ＣＴＬＡ−４抗体をＲＳＬＡＩＬ−２と共に使用する２つの併用治療群（群６及び群７）。群６について、抗ＣＴＬＡ−４抗体レジメンは４日目に開始して９日目及び１３日目に再び投与し、一方、ＲＳＬＡＩＬ−２は０日目に開始して９日目に再び投与した。群７の抗ＣＴＬＡ−４抗体療法は０日目に開始して４、８及び１３日目に再び投与し、一方、ＲＳＬＡＩＬ−２は４日目に開始して１３日目及び２２日目に再び投与した。治療開始（０日目）は、マウスに対する２×１０６細胞／部位で０．１ｍＬ注入容積のＥＭＴ６細胞接種の７日後に指定した。腫瘍細胞は腹部に皮下注射した。それに応じて０日目にＳｔｕｄｙＬｏｇ（登録商標）ソフトウェアによって生成された無作為化に基づき動物を分配した。治療日の平均腫瘍容積は１５９±７ｍｍ３〜１７０±８ｍｍ３（平均値±ＳＥ）の範囲であった。
【００７１】
腫瘍容積（ｍｍ３単位）及び体重（グラム単位）を週２〜３回モニタした。それぞれ図７及び図８に提供する（０日目〜２８日目）。無腫瘍動物の再増殖及び健康状態を（治療開始から）９９日間モニタした。
【００７２】
１８日目（媒体対照動物がいた最後の日）の対照動物と治療動物との腫瘍容積をチューキーの事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  バージョン６．０３  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって比較すると、群５（抗ＣＴＬＡ−４抗体＋Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）及び群７（抗ＣＴＬＡ−４抗体＋ＲＳＬＡＩＬ−２）のみが対照と有意に異なることが示された。しかしながら、対照とは有意に異なるものの、これらの２つの治療群の互いの平均腫瘍容積に有意な差はなかった。
【００７３】
１８日目（対照動物がいた最後の日）に、以下の式を用いることによって平均腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）を評価した：
％ＴＧＩ＝（１−（相対腫瘍容積（％）治療群÷相対腫瘍容積（％）対照群）×１００
【００７４】
抗ＣＴＬＡ−４抗体治療単独（群２）について２７％の平均阻害があった。腫瘍成長の阻害はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（群３）によって２４％及びＲＳＬＡＩＬ−２（群４）によって５％であり、抗ＣＴＬＡ−４抗体及びＰｒｏｌｅｕｋｉｎによる併用免疫療法（群５）は２６％の阻害を生じ、抗ＣＴＬＡ−４抗体を伴うＲＳＬＡＩＬ−２治療（群６）は２％の阻害をもたらした一方、群７（ＲＳＬＡＩＬ−２を伴う抗ＣＴＬＡ−４抗体）は９４％の阻害を生じた。
【００７５】
幾つかの動物は１８日目までに無腫瘍であったことが観察された。群５に３匹（３／１０匹）、群６に１匹（１／１０匹）及び群７に５匹（５／１０匹）あった。試験終了（９９日目）までに、群５、群６及び群７の無腫瘍動物の総数はそれぞれ４／１０匹、１／１０匹及び７／１０匹であった。表３を参照のこと。
【００７６】
【表３】
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【００７７】
実施例５
雌ＢＡＬＢ／ｃマウスのＥＭＴ６腫瘍モデルに対する抗ＣＴＬＡ−４抗体との併用におけるＲＳＬＡＩＬ−２を調べる有効性試験（フローサイトメトリー解析のため０、３及び１１日目に試料採取）
前出の併用ＲＳＬＡＩＬ−２及び抗ＣＴＬＡ−４抗体有効性試験は、ＥＭＴ６マウス乳房モデルにおける相乗作用を示唆している。この試験の目的は、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスのＥＭＴ６マウス乳癌腫瘍モデルに対する抗ＣＴＬＡ−４抗体との併用におけるＲＳＬＡＩＬ−２の抗腫瘍活性を判定／評価することであった。加えて、併用による有効性に関与する免疫集団を同定するため、治療開始後０、３及び１１日目に組織（腫瘍及び脾臓）を採取し、処理した。組織に浸潤した免疫細胞の同定及び定量化は、フローサイトメトリー解析によって判定した。治療群間で結果を比較した。
【００７８】
インビボフェーズ
この試験では、各群３〜１０匹の動物を含む６治療群とした。抗体対照、０、４、及び８日目に１００ｕｇ／マウスで投与されるＩｇＧ２ａ（群１）；４及び８日目に１００ｕｇ／マウスで投与される抗ＣＴＬＡ−４抗体治療（群２）；４日目〜８日目に０．５ｍｇ／ｋｇで投与されるＰｒｏｌｅｕｋｉｎ治療（群３）；及び４日目に０．８ｍｇ／ｋｇで単回投与されるＲＳＬＡＩＬ−２治療（群５）を組み入れた。また、抗ＣＴＬＡ−４抗体（０、４、及び８日目に投与される１００ｕｇ／マウス）とＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（４日目〜８日目に投与される０．５ｍｇ／ｋｇ）との併用（群４）又はＲＳＬＡＩＬ−２（４日目に投与される０．８ｍｇ／ｋｇ）との併用（群６）で治療される３群も組み入れた。
【００７９】
治療は、動物に２×１０６細胞／部位でＥＭＴ６マウス乳癌細胞（０．１ｍＬ）を腹部領域に皮下接種した７日後に開始した。マウスは腫瘍容積に従い治療群に分配した。
【００８０】
０日目（未処置対照）、３日目（群１及び群６）に動物を犠牲にして組織（腫瘍及び脾臓）を採取し、この時点で群６の３日目の動物には抗ＣＴＬＡ−４抗体のみが投与されており、ＲＳＬＡＩＬ−２の追加は４日目に開始し、治療開始後１１日目にも試料採取した（全ての群）。各採取日に３匹の動物を選択した。選択された動物は、インタクトな腫瘍（非壊死）及びその日の群平均腫瘍容積を最も良く近似する容積を有した。
【００８１】
平均腫瘍容積は未処置群について治療０日目に１６４±１０ｍｍ３であった。３日目、平均腫瘍容積は群１及び群６についてそれぞれ２８２±７ｍｍ３及び３３３±２６ｍｍ３（平均値±ＳＥＭ）であった。１１日目、平均腫瘍容積は群１について８４３±１３８ｍｍ３、群２について１０５９±１３５ｍｍ３、群３について８１４±７０ｍｍ３、群４について８３２±２６２ｍｍ３、群５について６２０±１０３ｍｍ３、及び群６について２５５±１１ｍｍ３（平均値±ＳＥＭ）であった。図９を参照のこと。
【００８２】
動物の体重を少なくとも週１回測った。治療日（０日目）の平均体重は、群１、群２、群３、群４、群５、及び群６について、それぞれ１８．９±０．３、１８．６±０．３、１９．２±０．２、１８．７±０．２、１７．８±０．３、１８．９±０．３グラムであった。３日目、群１及び群６の平均体重はそれぞれ１９．１±０．７及び１９±０．３グラムであった。１１日目の平均体重は、群１、群２、群３、群４、群５、及び群６について、それぞれ１９．８±０．２、１９．４±０．２、１９．９±０．２、２０±０．５、１９．６±０．４及び１９．５±０．４グラム（平均値±ＳＥＭ）であった。図１０を参照のこと。
【００８３】
エキソビボフェーズ
採取した組織試料を、メスを使用して手作業で細かく刻み、続いて３７℃でインキュベートして１３分間酵素消化させた。消化緩衝液の成分は、ＰＢＳ／ＢＳＡ中２．５ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＩ型（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、２．５ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ型（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、及びＯ．５ｍｇ／ｍｌ  ＤＮアーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）であった。インキュベーション後、１０％ＦＢＳ（熱失活；ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を含有するウェイマスＭＢ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を添加することによって消化をクエンチし、７０ｕＭナイロンフィルタ（Ｆａｌｃｏｎ）でろ過して単一細胞懸濁液を得た。細胞をＨＢＳＳで洗浄して遠心し、次に新鮮なＨＢＳＳ中に再懸濁した。各試料からカウント用のアリコートを取り、次にｅＦｌｏｕｒ−４５０生細胞染色剤で染色した。次に試料を９６ディープウェルプレートにプレーティングし、染色してフローサイトメトリー解析用に収集した。
【００８４】
腫瘍及び脾臓細胞試料は初めに固定可能生細胞指示薬で処理し、次に生存免疫細胞、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ１２２、Ｆｏｘｐ３（内部染色）、ＤＸ５及びＮＫｐ４６表面抗原に関して染色した。
【００８５】
試料（治療群につき３つ）の各々について生存免疫細胞の総量をカウントし、治療群の各々についての脾臓に関するＣＤ４＋、ＴＲＥＧ＋細胞、ＣＤ８＋、記憶エフェクターＣＤ８＋細胞、全ＮＫ細胞、成熟ＮＫ細胞（これは腫瘍組織の１立方ミリメートルに正規化した）の全イベントのゲーティング／収集並びに総細胞カウントに使用した。一次カウントをフローサイトメーター読取りの要約生データから導出し、ＦｌｏｗＪｏを使用して分析した。
【００８６】
フローサイトメトリー
０日目に３匹の未処置動物を犠牲にした。３日目に群１（アイソタイプ対照の投与を受けた）及び群６（抗ＣＴＬＡ−４抗体治療のみの投与を受けた）の３匹の動物を犠牲にし、及び治療開始後１１日目に全ての群１〜６の３匹の動物を犠牲にした。
【００８７】
図１１及び図１２に、それぞれ腫瘍及び脾臓における１１日目のデータのグラフ表示を見ることができる。
【００８８】
抗ＣＴＬＡ−４抗体単独で治療したとき、ＣＤ４＋又は調節性Ｔ細胞集団（３日目〜１１日目）に差はない。抗ＣＴＬＡ−４抗体による前治療と、続くＰｒｏｌｅｕｋｉｎ又はＲＳＬＡＩＬ−２治療ではＣＤ４＋集団が増加する；しかしながら、調節性Ｔ細胞集団に差はない（抗ＣＴＬＡ−４抗体対抗ＣＴＬＡ−４抗体＋ＲＳＬＡＩＬ−２又はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ）。ＲＳＬＡＩＬ−２＋抗ＣＴＬＡ−４抗体対ＲＳＬＡＩＬ−２単独においてＣＤ４＋細胞に差はない；しかしながら、ＲＳＬＡＩＬ−２＋抗ＣＴＬＡ−４抗体ではＲＳＬＡＩＬ−２と比較したとき調節性Ｔ細胞集団が減少する。ＲＳＬＡＩＬ−２＋抗ＣＴＬＡ−４抗体群に、説明のつかないＣＤ４＋細胞の大集団がある；これらの結果は、これらの細胞の大多数がＴｒｅｇではないことを示唆している。
【００８９】
抗ＣＴＬＡ−４抗体による前治療と、続くＲＳＬＡＩＬ−２治療では、ＣＤ８＋集団（Ｐ＝０．００７８）、記憶エフェクターＣＤ８細胞（Ｐ＝０．００５８）が有意に増加する（両側ｔ検定  抗ＣＴＬＡ−４抗体＋ＲＳＬＡＩＬ−２対抗ＣＴＬＡ−４）。加えて、ＲＳＬＡＩＬ−２＋抗ＣＴＬＡ−４抗体では、ＲＳＬＡＩＬ−２単独と比較したときＣＤ８＋及び記憶エフェクターＣＤ８細胞が有意に増加する。
【００９０】
抗ＣＴＬＡ−４抗体単独は、全ＮＫ細胞集団に何ら傾向のある効果を有しなかった；しかしながら、成熟ＮＫ細胞は有意に減少した（Ｐ＝０．０２７８  ３日目から１１日目まで）。抗ＣＴＬＡ−４抗体による前治療と、続くＲＳＬＡＩＬ−２治療では、全ＮＫ集団及び成熟ＮＫ細胞集団が増加する。ＲＳＬＡＩＬ−２群と比較したとき、ＲＳＬＡＩＬ−２＋抗ＣＴＬＡ−４抗体群における成熟ＮＫ細胞に差はない。
【００９１】
実施例６
雌ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴ２６マウス結腸癌腫瘍成長に対するＲＳＬＡＩＬ−２及び抗ＰＤ−１抗体による併用免疫療法の有効性
この試験の目的は、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴ２６マウス結腸癌腫瘍モデルに対するＲＳＬＡＩＬ−２及び抗ＰＤ−１抗体による併用免疫療法の抗腫瘍活性を判定することであった。
【００９２】
各１０匹の動物を含む４群とした。媒体対照群（群１）、抗ＰＤ−１抗体治療群、ＲＳＬＡＩＬ−２治療群（群３）及び初めに抗ＰＤ−１抗体（２００ｕｇ）で数日治療し、且つ４日後にＲＳＬＡＩＬ−２（０．８ｍｇ／ｋｇ）で治療した併用治療群を組み入れた。マウスに対し、２×１０６細胞／部位で０．１ｍＬ注入容積のＣＴ２６細胞を腹部に皮下移植した。治療は腫瘍細胞接種の７日後に開始した（０日目）。それに応じて０日目にＳｔｕｄｙＬｏｇ（登録商標）ソフトウェアによって生成された無作為化に基づき動物を分配した。治療日（０日目）の平均腫瘍容積は１２３±５ｍｍ３〜１２７±６ｍｍ３（平均値±ＳＥ）の範囲であった。
【００９３】
腫瘍容積（ｍｍ３単位）及び体重（グラム単位）を週２〜３回モニタした。それぞれ図１３及び図１４に提供する。この試験は１６日間モニタした。
【００９４】
１２日目（媒体対照動物がいた最後の日）の対照動物と治療動物との腫瘍容積をチューキーの事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  バージョン６．０３  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって比較すると、全ての治療群の腫瘍容積が未治療対照と有意に異なることが示された。
【００９５】
以下の式を使用してパーセント腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）を計算した：
％ＴＧＩ＝（１−（相対腫瘍容積（％）治療群÷相対腫瘍容積（％）対照群）×１００
【００９６】
抗ＰＤ−１抗体（群２）及びＲＳＬＡＩＬ−２（群３）でそれぞれ５５％及び５８％の平均腫瘍成長阻害が観察された。両方の治療を併用して受けた群（群４）の腫瘍成長阻害は８３％と観察された。群４の５匹（５／１０匹）の動物が、試験終了時に０日目のその初期容積より小さい容積の腫瘍を有した。
【００９７】
非線形二次多項式分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  バージョン６．０３  ｆｏｒ
Ｗｉｎｄｏｗｓ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して平均腫瘍容積四倍化時間（ＴＶＱＴ）（腫瘍がその初期容積の４倍に成長するのにかかる日単位の時間）を内挿することにより、腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）を評価した。平均腫瘍容積四倍化時間は対照腫瘍について５．２日、群３（抗ＰＤ−１抗体）について７．６日、群３（ＲＳＬＡＩＬ−２）について８．２日及び併用免疫療法群（群４）について１５．６であった。群２、群３及び群４の平均腫瘍成長遅延はそれぞれ２．４日、３．０日及び１０．４日であった。表４を参照のこと。
【００９８】
【表４】
2019077723.tif 000007
【００９９】
０日目の平均体重は１７．５±０．２ｇ〜１８．１±０．２ｇ（平均値±ＳＥＭ）の範囲であった（図１３）。群２の１匹の動物（これは１２日目に試験から除外した）を除いては、有意な体重減少は観察されなかった（図１４）。剖検により、肺腔に転移性病変が明らかになった。
【０１００】
抗ＰＤ−１及びＲＳＬＡＩＬ−２の併用を受けた動物では、いずれかの単剤で治療した動物と比べてより高い腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）及び腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）が観察された。
【０１０１】
実施例７
再攻撃試験：
ＲＳＬＡＩＬ−２及び抗ＣＴＬＡ−４による有効な併用免疫療法後のＥＭＴ６マウス乳癌腫瘍による無腫瘍動物の再攻撃
この例の目的は、ＥＭＴ６乳癌腫瘍を移植したマウスをＲＳＬＡＩＬ−２及び市販のげっ歯類抗ＣＴＬＡ−４チェックポイント遮断抗体を使用した併用免疫療法で治療したときの有効性の程度及び持続時間を判定することであった。既に実施例２〜６で実証されたとおり、この併用によって有意な無腫瘍動物が生じ、ＥＭＴ６腫瘍細胞又はＣＴ２６腫瘍細胞で無腫瘍動物を再攻撃することによって、この併用が腫瘍特異的応答を誘発する能力が判定される。
【０１０２】
この再攻撃試験は３フェーズで行った。
【０１０３】
本試験の最初のパート（「フェーズＩ」）は、ＥＭＴ６（マウス乳癌）腫瘍を有する８０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。１０匹（１０／８０匹）の動物を無作為に選択し、抗体対照群（１００μｇ、０、４、９、１３日目  ｉ．ｐ．）に割り当てた。残りの動物（７０／８０匹）は、抗ＣＴＬＡ−４  ｉ．ｐ．（１００μｇ、０、４、９、１３及び１８日目）とＲＳＬＡＩＬ−２  ｉ．ｖ．（０．８ｍｇ／ｋｇ、４、１３及び２２日目）との併用で治療した。
【０１０４】
治療開始（０日目）は、２×１０６細胞／部位で腹部に皮下注射した０．１ｍＬ注入容積のＥＭＴ６細胞接種の７日後に指定した。治療開始時の平均腫瘍容積は媒体対照群及び治療群についてそれぞれ２０６±１５及び２２２±８（平均値±ＳＥ）であった。
【０１０５】
フェーズＩは４８日目までモニタした。腫瘍容積（ｍｍ３単位）及び体重（グラム単位）を週２〜３回計測し、図１５に提供した。試験開始時（０日目）の個々の腫瘍容積に対して計算した、且つ成長率として提供される標準化値である対応する相対腫瘍容積、及び体重の相対変化を図１６に要約する。
【０１０６】
本試験のフェーズＩの結果は、１４日目（全ての対照動物がいた最後の日）の対照動物（６９８％）と治療動物（１８９％）との間の平均相対腫瘍容積を用いて計算し、次にウェルチ補正係数による対応のないｔ検定（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  バージョン６．０３  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて比較したところ、７３％の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）（Ｐ＜０．０００１）を示した。
【０１０７】
併用免疫療法に完全奏効を呈しなかったフェーズＩにおける動物（Ｎ＝３９匹）の平均腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）は１２．７日（Ｐ＜０．０００１）であった。二次多項式非線形回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）で内挿された個々の腫瘍の４００％に成長するまでの時間を用いることにより、腫瘍容積四倍化時間（ＴＶＱＴ）を計算した。無腫瘍動物（完全奏効レスポンダー）はＴＧＤの評価に入れなかった。
【０１０８】
フェーズＩでは、１回目及び２回目のＲＳＬＡＩＬ−２投与の約５日後に治療動物に粗い被毛（僅か）が観察された。粗い被毛は３回目の投与後には観察されなかった。有意な体重減少は観察されなかった（図１６）。
【０１０９】
本試験のフェーズＩの結果の概要を表５に提供する。
【０１１０】
【表５】
2019077723.tif 000008
【０１１１】
本試験の次のパート（「フェーズＩＩ」）は４９日目に開始した。合計４０匹の動物（１０匹の年齢適合未処置動物及びＲＳＬＡＩＬ−２＋抗ＣＴＬＡ−４併用免疫療法に完全奏効を示した３０匹の動物）を３群に使用し、表６に記載するとおり分配した。
【０１１２】
【表６】
2019077723.tif 000009
【０１１３】
４９日目、動物にＥＭＴ６又はＣＴ２６のいずれかの腫瘍細胞（０．１ｍＬ媒体中２×１０６個）を腹部領域に皮下注射して移植した。
【０１１４】
本試験のフェーズＩＩの結果は、接種５日後（５４日目）に動物における腫瘍の取込み及び成長が明らかであったことを示した。群１（年齢適合未処置）及び群２（ＣＴ２６で再攻撃したＥＭＴ６無腫瘍動物）の全ての動物が、それぞれ１６７±２２及び１７７±１１（平均値±ＳＥ）の平均容積の腫瘍を担持していた。群３（ＥＭＴ６で再攻撃したＥＭＴ６無腫瘍動物）では、接種５日後の腫瘍取込み率が８５％に過ぎないことが観察された。他の群と比べて腫瘍容積が比較的小さいことが観察された。平均腫瘍容積は６２±８ｍｍ３であった。再攻撃の１７日後にこの群の２０匹中１４匹（７０％）の動物が無腫瘍であり（ＥＭＴ６腫瘍移植を完全に拒絶した）、フェーズＩＩの終了（１０９日目）まで無腫瘍のままであった。
【０１１５】
フェーズＩでの併用免疫療法後の、ＣＴ２６腫瘍で再攻撃したＥＭＴ６無腫瘍動物である群２の動物は、再攻撃１４日後の平均腫瘍容積が１２５７±２０１（平均値±ＳＥ）及び１０００ｍｍ３容積に成長するまでの平均時間が１３．６±０．８であった。腫瘍成長はフェーズＩの療法の影響を受けないように見えたことから、免疫応答の腫瘍型特異性が示唆される。表７に提供される本試験のフェーズＩＩの結果の概要を参照のこと。
【０１１６】
群１の１匹の動物が１４日目に止息していることが分かった。剖検から、肺に転移性病変と見られるもの（組織学による検証はしていない）及び胸腔に血の混じった体液が明らかになった。これの他には、他の臨床所見又は有意な体重減少は認められなかった。図１７を参照のこと。
【０１１７】
年齢適合未処置動物（１５４１±１４４ｍｍ３）とＥＭＴ６で再攻撃したＥＭＴ６無腫瘍動物（１９２±１０７）との平均腫瘍容積（図１８）を移植の２１日後に比較し、ＴＧＩ（８７．５％）を評価した。
【０１１８】
ベースライン腫瘍容積出発点がなかったため、ＴＶＱＴは評価することができなかった。その代わり、腫瘍担持動物の各々について１０００ｍｍ３容積になるまでの腫瘍成長時間を（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍの二次多項式非線形回帰分析を使用して）内挿することによって評価を補助し、腫瘍成長遅延を近似した。１０００ｍｍ３腫瘍容積に成長するまでにかかる時間（日）は、群１及び群２についてそれぞれ１６．９±１日及び１３．６±０．８日（平均値±ＳＥ）であった。群３においてはＥＭＴ６再攻撃を完全には拒絶しなかった動物（６／２０匹）のみについて１０００ｍｍ３成長時間を評価し、これは３０．３±５．５であった。これらの動物の１０００ｍｍ３になるまでの腫瘍成長の平均遅延は、１３．４日であると計算された。
【０１１９】
【表７】
2019077723.tif 000010
【０１２０】
本試験の最後のパート（フェーズＩＩＩ）は１０９〜１６８日目の間と指定された。フェーズＩＩからのＥＭＴ６再攻撃を完全に拒絶した動物（Ｎ＝１４匹）を２×１０６ＥＭＴ６腫瘍細胞で再接種／再攻撃し（１０９日目）（群２）、５９日間モニタした。年齢適合動物（Ｎ＝５匹）もまた対照（群１）として同じ時点で接種した。
【０１２１】
本試験の最後のパートから、接種の３日後に腫瘍の取込み及び成長が明らかであったことが観察され、平均腫瘍容積は群１及び群２についてそれぞれ１０１±１４及び６９±６であった。２回目の再攻撃を受けた動物は腫瘍細胞移植の２１日後に完全に無腫瘍であった（完全に拒絶した）一方、その年齢適合対応動物の５匹全てが１５５０±４０１ｍｍ３の平均腫瘍容積を有した。群２の動物は試験終了（１６８日目）まで無腫瘍のままで、有意な体重減少は観察されなかった。
【０１２２】
この試験は、ＥＭＴ６マウス乳癌腫瘍におけるＲＳＬＡＩＬ−２及び抗ＣＴＬＡ  ４を使用した併用免疫療法の有効性（フェーズＩ）、並びに治療に良好に応答する動物における応答の持続性及び特異性、並びに療法の長期効果（フェーズＩＩ及びフェーズＩＩＩ）を実証している。本試験の初めから終わりまでの概要及び各フェーズの個々の腫瘍成長については図２１を参照のこと。
【０１２３】
実施例８
インビボ枯渇試験：
ＲＳＬＡＩＬ−２と抗ＣＴＬＡ−４又は抗ＰＤ−１とによる有効な併用免疫療法後に細胞傷害性免疫細胞集団がＥＭＴ６マウス乳癌腫瘍に対する抗腫瘍免疫に及ぼす寄与の評価
この例の目的は、ＲＳＬＡＩＬ−２をＣＴＬＡ−４又はＰＤ−１の抗体遮断による免疫チェックポイント阻害と併用したときの抗腫瘍有効性に対するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球の相対的寄与を評価することであった。
【０１２４】
この試験には、ＥＭＴ６（マウス乳癌）腫瘍を担持する５８匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを利用した。１０匹（１０／５８匹）の動物を無作為に選択し、媒体対照群（０、４、８日目、ｉ．ｐ．）に割り当てた。８匹（８／５８匹）の動物を、抗ＣＴＬＡ−４  ｉ．ｐ．（１００μｇ  ０、４、及び８日目）とＲＳＬＡＩＬ−２  ｉ．ｖ．（０．８ｍｇ／ｋｇ  ４日目）との併用を受ける治療群に割り当てた。８匹（８／５８匹）の動物をＣＤ８枯渇群に割り当て、この群は、ＲＳＬＡＩＬ−２及び抗ＣＴＬＡ−４の治療に加えて、ラット抗マウスＣＤ８ａの連続注射（１００μｇ  ｉ．ｐ．、−２、０、７日目）によってＣＤ８  Ｔ細胞を枯渇させた。８匹（８／５８匹）のさらなる動物をＮＫ枯渇群に割り当て、この群は、ＲＳＬＡＩＬ−２及び抗ＣＴＬＡ−４の治療に加えて、ウサギ抗ウシアシアロＧＭ１の連続注射（５０μｌ  ｉ．ｐ．、−２、０、７日目）によってＮＫ細胞を枯渇させた。
【０１２５】
８匹（８／５８匹）の動物を、抗ＰＤ−１  ｉ．ｐ．（１００μｇ、０、４、及び８日目）及びＲＳＬＡＩＬ−２  ｉ．ｖ．（０．８ｍｇ／ｋｇ、４日目）の併用を受ける治療群に割り当てた。８匹（８／５８匹）の動物をＣＤ８枯渇群に割り当て、この群は、ＲＳＬＡＩＬ−２及び抗ＰＤ−１の治療に加えて、ラット抗マウスＣＤ８ａの連続注射（１００μｇ  ｉ．ｐ．、−２、０、７日目）によってＣＤ８  Ｔ細胞を枯渇させた。８匹（８／５８匹）のさらなる動物をＮＫ枯渇群に割り当て、この群は、ＲＳＬＡＩＬ−２及び抗ＰＤ−１の治療に加えて、ウサギ抗ウシアシアロＧＭ１の連続注射（５０μｌ  ｉ．ｐ．、−２、０、７日目）によってＮＫ細胞を枯渇させた。
【０１２６】
治療開始（０日目）は、２×１０６細胞／部位で腹部に皮下注射した０．１ｍＬ注入容積のＥＭＴ６細胞接種の７日後に指定し、試験期間は１１日間とした。腫瘍容積（ｍｍ３単位）及び体重（グラム単位）を週２〜３回計測した。表８は、各群の初期腫瘍容積及び１１日目の平均相対腫瘍容積を提供する。ＲＳＬＡＩＬ−２と抗ＣＴＬＡ−４とによる併用については、腫瘍容積及び体重を図２２に提供し、一方、０日目からの相対腫瘍容積及びパーセント体重変化を図２３に提供する。ＲＳＬＡＩＬ−２と抗ＰＤ−１とによる併用については、腫瘍容積及び体重を図２４に提供し、一方、０日目からの相対腫瘍容積及びパーセント体重変化を図２５に提供する。
【０１２７】
本試験の結果は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びチューキーの多重比較事後検定（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  バージョン６．０３  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ、ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を利用して１１日目の対照動物（５５３％）及び治療動物（１２８％）の平均相対腫瘍容積を用いて計算すると、ＲＳＬＡＩＬ−２及び抗ＣＴＬＡ−４治療群において７６．９％（ｐ＜０．０５）の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を示した。
【０１２８】
ＲＳＬＡＩＬ−２及び抗ＣＴＬＡ−４の治療を、細胞傷害性ＣＤ８  Ｔ細胞のインビボ枯渇を生じさせる中和ＣＤ８ａ抗体の連続注射と併用したとき、その結果は治療有効性の消失であり、１１日目に５２０％の平均相対腫瘍容積及び５．９８％の腫瘍成長阻害となった（媒体対照と比較して統計的有意性に達しなかった）。
【０１２９】
ＲＳＬＡＩＬ−２及び抗ＣＴＬＡ−４の治療を、ＮＫ細胞のインビボ枯渇を生じさせる中和抗アシアロＧＭ１抗体の連続注射と併用したとき、その結果は治療有効性の消失であり、１１日目に４８３％の平均相対腫瘍容積及び１２．７％の腫瘍成長阻害となった（媒体対照と比較して統計的有意性に達しなかった）。
【０１３０】
ＲＳＬＡＩＬ−２を抗ＰＤ−１と併用したとき、１００日目の平均相対腫瘍容積は２８５％であり、４８．５％の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）をもたらした（ｐ＜０．０５）。
【０１３１】
ＲＳＬＡＩＬ−２及びＰＤ−１の治療を中和ＣＤ８ａ抗体の連続注射と併用したとき、その結果は治療有効性の消失であり、１１日目に５３９％の平均相対腫瘍容積及び２．５３％の腫瘍成長阻害となった（媒体対照と比較して統計的有意性に達しなかった）。
【０１３２】
ＲＳＬＡＩＬ−２及び抗ＰＤ−１の治療を中和抗アシアロＧＭ１抗体の連続注射と併用したとき、その結果は治療有効性の消失であり、１１日目に３６４％の平均相対腫瘍容積及び３４．２％の腫瘍成長阻害となった（媒体対照と比較して統計的有意性に達しなかった）。
【０１３３】
ＲＳＬＡＩＬ−２からは、抗ＣＴＬＡ−４又は抗ＰＤ−１と併用したとき、又はこの治療をＣＤ８又は抗アシアロＧＭ１抗体アブレーションの追加と併用したとき有意な体重減少は観察されなかったが、抗アシアロＧＭ１との併用では、ＲＳＬＡＩＬ−２及び抗ＣＴＬＡ−４の投与も受ける群において２匹の動物が試験８日目に止息していることが分かり、ＲＳＬＡＩＬ−２及び抗ＰＤ−１の投与も受ける群において３匹の動物が試験８日目に止息していることが分かった。
【０１３４】
【表８】
2019077723.tif 000011
【０１３５】
この試験は、ＥＭＴ６マウス乳癌腫瘍におけるＲＳＬＡＩＬ−２及び抗ＣＴＬＡ−４又はＲＳＬＡＩＬ−２及び抗ＰＤ−１を使用した併用免疫療法の有効性を実証している。加えて、ＮＫ細胞及びＣＤ８  Ｔ細胞のインビボ枯渇後の抗腫瘍有効性の喪失は、この有効性における両方の細胞型の役割を示唆している。
【図１】
2019077723.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2019077723.tif 000020
【図１０】
2019077723.tif 000021
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
2019077723.tif 000035
【図２５】
2019077723.tif 000036
【外国語明細書】
2019077723000001.pdf