(57)【要約】【課題】インクジェット法により吐出された細胞が着弾した際のダメージを軽減し、着弾した細胞の位置の精度が低下することなく、かつ細胞の乾燥を抑制することができる細胞配置プレートの製造方法を提供する。【解決手段】細胞非接着性材料による層に複数の孔部が形成された構造層を基体の平面上に積層する工程と、前記孔部内に、前記孔部から露出する前記基体における前記平面を被覆液で被覆する工程と、前記被覆液で被覆された前記平面に細胞懸濁液を吐出する工程と、を含む細胞配置プレートの製造方法である。【選択図】図９Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞非接着性材料による層に複数の孔部が形成された構造層を基体の平面上に積層する工程と、
前記孔部内に、前記孔部から露出する前記基体における前記平面を被覆液で被覆する工程と、
前記被覆液で被覆された前記平面に細胞懸濁液を吐出する工程と、
を含むことを特徴とする細胞配置プレートの製造方法。
【請求項２】
前記孔部内に、細胞接着性材料を付着させる工程を更に含む、請求項１に記載の細胞配置プレートの製造方法。
【請求項３】
前記細胞接着性材料が、前記孔部の側面と接触していない、請求項２に記載の細胞配置プレートの製造方法。
【請求項４】
前記構造層における前記孔部から露出する前記基体における前記平面が、インクジェット法で吐出される細胞懸濁液の液滴の着弾面である、請求項１から３のいずれかに記載の細胞配置プレートの製造方法。
【請求項５】
前記細胞非接着性材料が撥水性材料又はケイ素含有材料である、請求項１から４のいずれかに記載の細胞配置プレートの製造方法。
【請求項６】
前記被覆液の最小厚みが５μｍ以上である、請求項１から５のいずれかに記載の細胞配置プレートの製造方法。
【請求項７】
前記被覆液が細胞培養培地である、請求項１から６のいずれかに記載の細胞配置プレートの製造方法。
【請求項８】
互いに隣接する前記孔部のピッチ間隔が３００μｍ以下である、請求項１から７のいずれかに記載の細胞配置プレートの製造方法。
【請求項９】
前記孔部内に配された細胞数が、平均値に対して±２０％となる前記孔部が８０％以上である、請求項１から８のいずれかに記載の細胞配置プレートの製造方法。
【請求項１０】
細胞非接着性材料による層に複数の孔部が形成された構造層を基体の平面上に積層する工程と、
前記孔部内に、細胞接着性材料を付着させる工程と、
前記孔部内に、前記孔部から露出する前記基体における前記平面を被覆液で被覆する工程と、
を含むことを特徴とする細胞保持用部材の製造方法。 
【請求項１１】
少なくとも平面を有する基体における前記平面上に、
細胞非接着性材料で形成され、かつ複数の孔部を有する構造層を有し、
前記孔部内に、細胞接着性材料が付着していることを特徴とする細胞保持用部材。
【請求項１２】
前記孔部内に、前記孔部から露出する前記基体における前記平面を被覆する被覆液を有する、請求項１１に記載の細胞保持用部材。
【請求項１３】
前記細胞接着性材料が、前記孔部の側面と接触していない、請求項１２に記載の細胞保持用部材。
【請求項１４】
前記構造層における前記孔部から露出する前記基体における前記平面が、インクジェット法で吐出されるインク液滴の着弾面である、請求項１１から１３のいずれかに記載の細胞保持用部材。
【請求項１５】
前記被覆液の最小厚みが５μｍ以上である、請求項１１から１４のいずれかに記載の細胞保持用部材。
【請求項１６】
互いに隣接する前記孔部のピッチ間隔が３００μｍ以下である、請求項１１から１５のいずれかに記載の細胞保持用部材。
【請求項１７】
請求項１１から１６のいずれかに記載の細胞保持用部材と、
前記細胞保持用部材における複数の前記孔部内に配された細胞と、
を有することを特徴とする細胞配置プレート。
【請求項１８】
前記孔部内に配された細胞数が、平均値に対して±２０％となる前記孔部が８０％以上である、請求項１７に記載の細胞配置プレート。
【請求項１９】
前記孔部に配された細胞がインクジェット法により吐出してなる、請求項１７から１８のいずれかに記載の細胞配置プレート。
【請求項２０】
前記孔部に配された細胞の種類が、２種以上である、請求項１７から１９のいずれかに記載の細胞配置プレート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞配置プレートの製造方法、細胞保持用部材の製造方法、細胞保持用部材、及び細胞配置プレートに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、幹細胞技術の進展に伴い、複数の細胞からなる組織体を人工的に形成する技術の開発が行われている。組織体を人工的に形成する上で細胞を任意に配置する技術は必要であるため、既に様々な取り組みがなされており、細胞シート法、スフェロイド積層法、ゲル押し出し法、インクジェット法などが知られている。
【０００３】
これらの中でも、インクジェット法による細胞の配置技術は、複数の細胞種を任意の細胞数で任意の箇所に制御することに優れ、組織体を人工的に形成できる有望な技術の１つと考えられていることから様々な提案がされている。
例えば、基板上に細胞のマイクロパターンを形成するために、細胞接着性材料を基板上にインクジェット法によりパターン状に配置した細胞固定化基板が提案さている（例えば、特許文献１及び２参照）。
また、細胞培養基板に用いる粘着剤層の構成材料の溶出を防止するために、基板上に粘着剤層、接着層、細胞培養層、保護層を有する細胞培養基板において、粘着剤層の露出表面を保護層で被覆した細胞培養基板などが提案されている（例えば、特許文献３参照）。
さらに、細胞集合体を細胞接着性表面に精密に配置する技術として、貫通孔が形成された第一基板と、細胞非接着性の第二基板とによってウェルが構成されており、各ウェル内に細胞を播種し、細胞集合体を１つ形成した後、細胞接着性表面に転写する細胞集合体形成器具が開示されている（特許文献４参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、インクジェット法により吐出された細胞が着弾した際のダメージを軽減し、着弾した細胞の位置の精度が低下することなく、かつ細胞の乾燥を抑制することができる細胞配置プレートの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
課題を解決するための手段としての本発明の細胞配置プレートの製造方法は、細胞非接着性材料による層に複数の孔部が形成された構造層を基体の平面上に積層する工程と、前記孔部内に、前記孔部から露出する前記基体における前記平面を被覆液で被覆する工程と、前記被覆液で被覆された前記平面に細胞懸濁液を吐出する工程と、を含む。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、インクジェット法により吐出された細胞が着弾した際のダメージを軽減し、着弾した細胞の位置の精度が低下することなく、かつ細胞の乾燥を抑制することができる細胞配置プレートの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】図１Ａは、レーザー加工により構造層に孔部を形成する前の状態の一例を示す説明図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、孔部が形成された構造層を基体上に配置した状態の一例を示す説明図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、穴部が形成された構造層を基体上に配置した状態の他の一例を示す説明図である。
【図２】図２は、液滴形成装置の一例を示す概略断面図である
【図３】図３は、吐出信号及び抑制信号の一例を示す説明図である。
【図４Ａ】図４Ａは、液滴形成装置の動作の一例を示す説明図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、液滴形成装置の動作の一例を示す説明図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、液滴形成装置の動作の一例を示す説明図である。
【図５Ａ】図５Ａは、吐出信号及び抑制信号の他の一例を示す説明図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、吐出信号及び抑制信号の他の一例を示す説明図である。
【図６】図６は、液滴形成装置を複数搭載した細胞保持部材製造装置の一例を示す概略図である。
【図７】図７は、細胞接着性材料インクを吐出する動作の一例を示す説明図である。
【図８Ａ】図８Ａは、被覆液を吐出する動作の一例を示す説明図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、被覆液を吐出する動作の一例を示す説明図である。
【図９Ａ】図９Ａは、細胞インクを吐出する動作の一例を示す説明図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、細胞インクを吐出する動作の一例を示す説明図である。
【図１０】図１０は、従来のインクジェット法による細胞インクを吐出する動作の一例を示す説明図である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、実施例１における構造層をレーザー加工して形成した孔部を示す写真である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、実施例１における構造層をレーザー加工して形成した孔部を示す画像である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、実施例２における構造層をレーザー加工して形成した孔部を示す写真である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、実施例２における構造層をレーザー加工して形成した孔部を示す画像である。
【図１３】図１３は、実施例７における細胞接着性材料インクを吐出する動作を示す説明図である。
【図１４】図１４は、実施例８における細胞インクを吐出する動作を示す説明図である。
【図１５】図１５は、実施例９において細胞インクを２種類に染色して配置した際の写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
（細胞保持用部材）
本発明の細胞保持用部材は、少なくとも平面を有する基体における平面上に、細胞非接着性材料で形成され、かつ複数の孔部を有する構造層を有し、孔部内に、孔部から露出する基体における平面を被覆する被覆液を有し、更に必要に応じてその他の部材を有する。換言すると、本発明の細胞保持用部材は、細胞非接着性材料による層に複数の孔部を形成した構造層を、少なくとも平面を有する基体における平面上に積層し、孔部内に、孔部から露出する基体における平面を被覆する被覆液を添加してなり、更に必要に応じてその他の部材を有する。
【０００９】
本発明の細胞保持用部材は、本発明者らが従来技術から知見した問題点に基づくものである。
例えば、従来の細胞接着性材料を基板上にインクジェット法によりパターン状に配置した細胞固定化基板では、細胞接着性材料をインクジェット法により基板上にパターニングしているだけであり、細胞を孔部毎に分けて保持することができないため、細胞同士の合一が生じてしまう可能性があるという問題がある。
また、従来の細胞培養基板では、細胞を細胞接着層に直接着弾させるため、インクジェット法により吐出された細胞が着弾した際にダメージを受けやすいという問題がある。
さらに、従来の細胞集合体形成器具では、細胞を播種することが前提であることから、複数の種類の細胞を所望の位置に配置することが困難であるため、組織体の製造が困難であるという問題がある。
【００１０】
本発明の細胞保持用部材では、基体に複数の孔部を有する構造層を有することにより、複数の孔部に細胞懸濁液が吐出されると孔部毎に細胞を分けて保持できるため、着弾した液滴が合一して細胞の位置がずれることを抑制することができる。
また、本発明の細胞保持用部材では、孔部内に着弾した細胞懸濁液を保持することにより、大気と接する細胞懸濁液の表面積を少なくすることができるため、細胞の乾燥を抑制することができる。
さらに、本発明の細胞保持用部材では、孔部内に、孔部から露出する基体における平面を被覆する被覆液を有することにより、インクジェット法により吐出された細胞が着弾した際のダメージを軽減し、かつ細胞の乾燥を抑制することができる。
本発明の細胞保持用部材は、細胞を含む細胞懸濁液を孔部に保持することに好適に用いる。
【００１１】
＜細胞懸濁液＞
細胞懸濁液としては、細胞を含んでいれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パターニングする細胞と、細胞を分散させる分散媒とを含み、更に必要に応じてその他の成分を含む。
なお、「細胞懸濁液」を「細胞インク」あるいは単に「インク」と称することがある。
【００１２】
＜＜細胞＞＞
細胞は、その種類等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、分類学的に、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞を問わず、全ての細胞について使用することができる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００１３】
真核細胞としては、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、動物細胞が好ましく、細胞が細胞集合体を形成する場合は、細胞と細胞とが互いに接着し、物理化学的な処理を行わなければ単離しない程度の細胞接着性を有する接着性細胞がより好ましい。
【００１４】
接着性細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分化した細胞、未分化の細胞などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
分化した細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞；星細胞；クッパー細胞；血管内皮細胞；類道内皮細胞、角膜内皮細胞等の内皮細胞；繊維芽細胞；骨芽細胞；砕骨細胞；歯根膜由来細胞；表皮角化細胞等の表皮細胞；気管上皮細胞；消化管上皮細胞；子宮頸部上皮細胞；角膜上皮細胞等の上皮細胞；乳腺細胞；ペリサイト；平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞；腎細胞；膵ランゲルハンス島細胞；末梢神経細胞、視神経細胞等の神経細胞；軟骨細胞；骨細胞などが挙げられる。接着性細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、又はそれらを何代か継代させたものでもよい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
未分化の細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞；単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞；ｉＰＳ細胞などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
原核細胞としては、例えば、真正細菌、古細菌などが挙げられる。
【００１５】
分散媒としては、後述する被覆液と同様に、細胞培養用の培地や緩衝液が好ましい。分散媒としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水などが挙げられる。
【００１６】
その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、湿潤剤、細胞間距離調整材料、分散剤、ｐＨ調整剤などが挙げられる。
【００１７】
湿潤剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゲル状多糖類などが挙げられる。
ゲル状多糖類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アルギン酸カルシウム、ジェランガム、アガロース、グァーガム、キサンタンガム、カラギーナン、ペクチン、ローカストビーンガム、タマリンドガム、ダイユータンガム、カルボキシメチルセルロースなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、アルギン酸カルシウムが好ましい。
アルギン酸カルシウムは、アルギン酸のカルボキシル基にカルシウムイオンが結合した塩であり、カルシウムイオンは２価であるため、２つのカルボキシル基にまたがるかたちで結合（イオン架橋）して増粘することにより、細胞インクの乾燥を抑制することができる。このときカルシウムイオンは分散媒中に含まれており、乾燥による濃縮で過剰になったカルシウムイオンと結合すると考えられ、浸透圧を調整する役割も期待できる。
【００１８】
細胞間距離調整材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、生体適合性を有するものが好ましい。
【００１９】
＜吐出＞
細胞インクの液滴を基体に吐出させる手段としては、インクジェット方式による液滴吐出手段が好ましい。
インクジェット方式による液滴吐出手段としては、例えば、細胞インクを加圧する圧力発生手段として圧電素子を用いて細胞インクの容積を変化させて液滴を吐出させる、いわゆるピエゾ方式（例えば、特公平２−５１７３４号公報参照）、発熱抵抗体を用いて細胞インクを加熱して気泡を発生させる、いわゆるサーマル方式（例えば、特公昭６１−５９９１１号公報参照）、振動板と電極とを対向配置し、振動板と電極との間に発生させる静電力によって振動板を変形させることで、細胞インクの容積を変化させて液滴を吐出させる静電方式（例えば、特開平６−７１８８２号公報参照）などが挙げられる。
【００２０】
吐出速度としては、特に制限はなく、適宜選択することができるが、０．１ｍ／ｓ以上１０ｍ／ｓ以下が好ましい。吐出速度が０．１ｍ／ｓ以上１０ｍ／ｓ以下であると、孔部内の被覆液の最小厚みが少なくとも５μｍあれば着弾時の細胞のダメージを低減することができる。
吐出速度を求める方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、インク液滴の細胞数を計数するために飛翔中のインク液滴を撮影する場合には、撮影画像のコマの時間間隔とインク液滴の移動距離とにより算出する方法などが挙げられる。
【００２１】
１回の吐出で形成される液滴に含まれる細胞数としては、特に制限はなく、適宜選択することができるが、１個以上２個以下が好ましい。１回の吐出で形成される液滴に含まれる細胞数が１個以上２個以下であると、インクジェットヘッドのノズルに細胞が詰まることによる不吐出が発生しにくくなる。また、細胞数のばらつきが少ないため、各孔部の細胞濃度のばらつきも低減することができる点で有利である。
【００２２】
＜基体＞
基体の形状としては、少なくとも平面を有していれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、平面状が好ましい。基体の形状が平面状であると、即ち基体が基板であると、加工がしやすい点で有利である。
ここで、平面とは、広汎な意味合いで平らであり、孔部が形成された構造層が積層された際に孔部に液体が注入されても漏れない程度の平面度を有することを意味し、微視的に凹凸を有していてもよい。平面の範囲としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、孔部の底面に該当する範囲が平面であることが好ましい。
【００２３】
基体の構造としては、後述する構造層を有していれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２４】
基体の大きさとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２５】
基体の材質としては、細胞非接着性材料であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、下記に記載の有機材料や無機材料などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞接着性材料を吸着しやすいものが好ましい。基体の材質が細胞接着性材料を吸着しやすいと、孔部の底部に該当する基体に細胞接着性材料を吐出させた場合には、細胞接着性材料を安定した状態で付着させることができる。
【００２６】
−細胞非接着性材料−
細胞非接着性とは、少なくとも、使用する細胞接着性材料よりも目的の細胞に対し、接着性が低いことを意味する。
細胞非接着性の計測方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、材料上に培養された細胞に対して、針状のＡＦＭ探針を挿入し引き上げて、細胞を基板より剥離することにより、探針にかかる負荷をＡＦＭで測定し、材料に対する細胞の接着性を測定・評価する方法などが挙げられる。他の方法としては、例えば、簡易的には材料上で培養した細胞に対し、純水等を流して、その前後での細胞の材料上への接着剥離率で評価する方法などが挙げられる。
【００２７】
細胞非接着性材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、撥水性材料が好ましい。細胞非接着性材料が撥水性材料であると、細胞がより接着しにくくなる点で有利である。
また、細胞非接着性材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ケイ素含有材料が好ましい。
ケイ素含有材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、生体適合性の点からポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が好ましい。
【００２８】
有機材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ＴＡＣ（トリアセチルセルロース）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、ウレタンアクリレート等のアクリル系材料、セルロース、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などのシリコーン系材料などが挙げられる。
無機材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガラス、セラミックスなどが挙げられる。
【００２９】
細胞接着性材料としては、例えば、細胞外基質から選ばれる蛋白質などが挙げられる。
細胞外基質から選ばれる蛋白質としては、例えば、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、ビトロネクチン、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）配列含有ペプチド、ＹＩＧＳＲ（チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン）配列含有ペプチド、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチンなどが挙げられる。加えて、細胞外基質から選ばれる蛋白質としては、例えば、上記材料の混合物、マトリゲル、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ、フィブリンなどが挙げられる。これらの中でも、コラーゲンが好ましい。コラーゲンは多様な種類が存在するが、濃度や温度によって増粘することが知られており、細胞インク中に含ませることで、細胞インクの濃度が上昇した際に細胞インクを増粘させることができる。さらに、細胞外基質から選ばれる蛋白質としては、例えば、ポリリジン等の塩基性高分子、アミノプロピルトリエトキシシラン等の塩基性化合物なども挙げられる。
細胞接着性材料を吐出する場合には、細胞接着性材料を含有する溶液にして吐出させてもよい。この場合、溶液には生体親和性粒子が含有されていてもよい。
【００３０】
生体親和性粒子としては、細胞等の生体と親和性を有すれば特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、ゼラチン粒子、コラーゲン粒子などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
生体親和性粒子がゼラチン粒子である場合、ゼラチン粒子の原料であるゼラチンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、商品名：ＡＰＨ−２５０（新田ゼラチン株式会社製）などが挙げられる。
粒子状であるゼラチン粒子は、基体への細胞の接着性を向上することができ、非粒子状であるゼラチンと比較すると、長期間、細胞に分解されることなく組織体中に存在することができる。そのため、ゼラチン粒子には、細胞の接着性を向上させ、さらに、長期にわたって、細胞の栄養源として利用されるという利点がある。
【００３１】
また、生体親和性粒子としては、その構造中において架橋剤により架橋されていることが好ましい。架橋剤により架橋されることにより、生体親和性粒子のキュムラント径を小さくすることができ、細胞接着性材料を含有する溶液において、細胞の増殖を促進することができる。
【００３２】
架橋剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド等のアルデヒド；エチレンプロピレンジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル等のグリシジルエーテル；ヘキサメチレンジイソシアネート、α−トリジンイソシアネート、トリレンジイソシアネート、ナフチレン−１，５−ジイソシアネート、４，４−ジフェニルメタンジイソシアネート、トリフェニルメタン−４，４，４−トリイソシアネート等のイソシアネート；グルコン酸カルシウム、（１Ｓ，２Ｒ，６Ｓ）−２−ヒドロキシ−９−（ヒドロキシメチル）−３−オキサビシクロ［４．３．０］ノナ−４，８−ジエン−５−カルボン酸メチル（ゲニピン）、ポリフェノールと西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酸化剤との組合せ、スクシンイミド基を有する化合物などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、アルデヒドが好ましく、グルタルアルデヒドがより好ましい。
【００３３】
架橋剤の含有量としては、生体親和性粒子の原料全量に対して、１質量％以上２０質量％以下が好ましく、２質量％以上１０質量％以下がより好ましい。架橋剤の含有量が１質量％以上２０質量％以下であると、生体親和性粒子のキュムラント径を小さくすることができ、細胞接着性材料を含有する溶液において、細胞の増殖を促進することができる。
生体親和性粒子の含有量としては、細胞接着性材料を含有する溶液全量に対して、０．５質量％以上１０質量％以下が好ましく、１質量％以上５質量％以下がより好ましい。生体親和性粒子の含有量が０．５質量％以上１０質量％以下であると、三次元の細胞集合体である組織体に十分細胞を接着し、細胞の増殖を促進することができる。
【００３４】
細胞接着性材料を付着させる範囲としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、孔部の底部（基体）の全部又は一部などが挙げられるが、底部の中央近傍が好ましい。細胞接着性材料を付着させる範囲が底部の中央近傍であると、孔部の壁面（側面）に細胞が付着しにくくなるため、基体上に形成する細胞数制御を高精度にすることができる。
【００３５】
−細胞接着性材料を含有するサンプル液の調製例−
純水製造装置（商品名：ＧＳＨ−２０００、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて得られた純水に、生体親和性粒子を濃度０．５質量％で分散させる。測定用の液量は５ｍＬ、分散はスターラーを用いて２０ｍｍ回転子を２００ｒｐｍ、約一日撹拌することでサンプル液を調製することができる。
【００３６】
−測定条件−
・溶媒：水（屈折率：１．３３１４、２５℃における粘度：０．８８４ｍＰａ・ｓ（ｃＰ）、ＮＤフィルターにより最適光量調整は適宜設定）
・測定プローブ：濃厚用プローブ
・測定ルーチン：測定：２５℃で１８０秒間→測定：２５℃で６００秒間（本体側を３５℃に変更すると次第に液温が２５℃から３５℃になる。その間の粒子径変化をモニタ）→測定：３５℃で１８０秒間
【００３７】
＜＜構造層＞＞
構造層の形状としては、複数の孔部の少なくともいずれかを有していれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
構造層の平均厚みとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０μｍ以上が好ましい。構造層の平均厚みが１０μｍ以上であると、細胞インクが入る容量を確保できる点や、構造層を基板上に積層する際に取扱いやすくなる点で有利である。
【００３８】
構造層の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、単層構造、積層構造などが挙げられる。積層構造としては、例えば、マスキングテープを積層したものなどが挙げられる。この場合、マスキングテープとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、粘着層が薄くて粘着力が弱いものが好ましい。マスキングテープの粘着層が薄くて粘着力が弱いものであると、積層したマスキングテープをレーザー加工で孔部を設けても孔部の壁面が粘着層でベタベタしにくくなる点で有利である。また、マスキングテープの材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ポリエチレンが好ましい。
【００３９】
構造層の大きさとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、基体の大きさと同様の大きさなどが挙げられる。
【００４０】
構造層の材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、基体の材質で例示したものなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞非接着性材料が好ましく、三次元の組織体を作製する場合には基体から剥離し易い材料がより好ましい。また、構造層の材質は、基体の材質と同一であってもよいし、異なってもよい。
【００４１】
−孔部−
孔部としては、貫通孔形状であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４２】
孔部の平面視した際の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、円形、楕円形、三角形、四角形などが挙げられる。
【００４３】
孔部の壁面（側面）の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、円筒状、テーパー状、凹凸状などが挙げられる。
【００４４】
孔部の形成方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、レーザー加工、フォトリソによる加工、ドリルによる加工、金型によるモールド成形などが挙げられる。これらの中でも、レーザー加工が好ましい。孔部の形成方法がレーザー加工であると、所望の組織体を形成できるパターン形状を簡易にかつ微細に形成可能な点や、構造層に直接接触して加工しないことから生体適合性を得やすい点で有利である。
【００４５】
複数の孔部の配置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、所望の組織体を形成できるパターン形状に対応するようにしてもよい。
互いに隣接する孔部の中心間距離、即ち孔部のピッチ間隔としては、３００μｍ以下が好ましい。孔部のピッチ間隔が３００μｍ以下であると、着弾した細胞が合一しにくくなり、細胞の吐出位置の精度を保持できる点で有利である。
【００４６】
構造層における孔部から露出する基体における平面は、インクジェット法で吐出されるインク液滴の着弾面となる。
【００４７】
基体及び構造層は、細胞インクが接触するため滅菌されていることが好ましい。
【００４８】
＜被覆液＞
被覆液としては、孔部内に、孔部から露出する基体における平面を被覆可能であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、細胞培養用の培地、緩衝液が好ましい。
培地は、組織体の形成と維持に必要な成分を含み、乾燥を防ぎ浸透圧などの外部環境を整える溶液であり、培地として知られているものであれば適宜選択して使用することができる。細胞を常時培地液内に浸しておく必要がない場合には、細胞インクから培地は適宜除去することができる。
緩衝液は、細胞や目的に合わせｐＨを調整するためのものであり、公知のものを適宜選択して使用することができる。
【００４９】
被覆液の粘度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、高いほうが好ましい。被覆液の粘度が高いと、着弾時に細胞が受けるダメージを軽減させやすくなり、また細胞の乾燥を抑制しやすくなる点で有利である。
【００５０】
被覆液の最小厚みとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５μｍ以上が好ましい。被覆液の最小厚みが５μｍ以上であると、細胞インクが着弾した際に細胞が死滅する割合を低減できる点で有利である。
被覆液の最小厚みの求め方としては、例えば、分光干渉レーザー変位計（ＳＩ−Ｆ０１、株式会社キーエンス製）を用いて、被覆液の厚みをランダムに１０点測定した結果の最小値を被覆液の最小厚みとする方法などが挙げられる。
【００５１】
被覆液を孔部に注入する方法としては、例えば、被覆液を播種する方法、インクジェット法により注入する方法などが挙げられる。これらの中でも、インクジェット法により注入する方法が好ましい。インクジェット法により注入する方法であると、孔部に注入する被覆液の液量のばらつきを低減できる点で有利である。
【００５２】
上述では構造層に貫通孔形状である孔部を有するとしたが、これに限ることなく、構造層に一端開口有底形状である穴部を有するようにしてもよい。換言すると、本発明の細胞保持用部材は、細胞非接着性材料による層に複数の穴部を形成し、穴部内に、穴部の底面を被覆する被覆液を添加してなるようにしてもよい。この場合には、穴部内に、穴部の底面を被覆する被覆液を有する。また、構造層における穴部の底面が、インクジェット法で吐出されるインク液滴の着弾面となる。なお、構造層を有さずに基体に穴部を形成してもよい。
【００５３】
（細胞保持用部材の製造方法）
細胞保持用部材の製造方法は、細胞非接着性材料による層に複数の孔部が形成された構造層を基体の平面上に積層する工程と、孔部内に、細胞接着性材料を付着させる工程と、孔部内に、孔部から露出する基体における平面を被覆液で被覆する工程と、を含む。
【００５４】
（細胞配置プレートの製造方法）
細胞配置プレートの製造方法は、細胞非接着性材料による層に複数の孔部が形成された構造層を基体の平面上に積層する工程と、孔部内に、孔部から露出する基体における平面を被覆液で被覆する工程と、被覆液で被覆された平面に細胞懸濁液を吐出する工程と、を含む。また、細胞配置プレートの製造方法は、孔部内に、細胞接着性材料を付着させる工程を更に含むようにしてもよい。
【００５５】
＜細胞保持用部材の作製方法＞
［構造層の孔部形成］
図１Ａは、レーザー加工により構造層に孔部を形成する前の状態の一例を示す説明図である。
図１Ａに示すように、構造層１１０のレーザー入射側表面にマスクフィルムＭなどを貼り合わせることで、レーザー加工時に発生する加工粉などを抑制することができるため、細胞培養時の細胞生存率を向上させることができる。また、構造層１１０よりレーザーの吸収が高いマスクフィルムＭを用いることで、加工性を向上することができるため、より微細な加工が可能になり、細胞解像度を向上することができる。
また、構造層１１０を有機材料で形成する場合、各孔部１２０の高さのばらつきを低減するためにガラス等の平面性が確保されている治具Ｊに塗布した後、熱硬化などによりバルクを作製する。治具Ｊをガラスとし、構造層１１０として生体適合性が優れているＰＤＭＳを用いるときは、治具Ｊと構造層１１０が熱で接着しないように、その間にポリイミド系材料などの干渉材Ｉを設けることが好ましい。
【００５６】
［構造層を基体に配置］
図１Ｂは、孔部が形成された構造層を基体上に配置した状態の一例を示す説明図である。
図１Ｂに示すように、基体１３０に対して構造層１１０の位置合わせが必要な場合には、基体１３０と構造層１１０にアライメントマークＬを形成して位置合わせを行う。この際に、カメラなどを使用すると高精度な位置合わせが可能になる。また、三次元の組織体の場合においても各構造層１１０を基体１３０と位置合わせをすることにより、各孔部１２０（細胞）の位置を合わせることが可能になる。
なお、構造層に形成した貫通孔形状の孔部を、一端開口有底形状である穴部にした場合には、図１Ｃに示すようになる。
【００５７】
（細胞保持部材）
本発明の細胞保持部材は、上述の細胞保持用部材に細胞を保持させたものである。
本発明の細胞保持部材は、上述の細胞保持用部材と、細胞保持用部材における孔部内又は穴部内に配された細胞とを有し、更に必要に応じてその他の部材を有する。換言すると、細胞保持用部材における孔部内又は穴部内に、インクジェット法により細胞を吐出してなり、更に必要に応じてその他の工程を含む。
【００５８】
保持する細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、孔部内又は穴部内に配された細胞の種類が２種以上であることが好ましい。
また、細胞接着性材料を予め孔部に吐出しておいてもよい。
【００５９】
細胞保持部材は、細胞配置プレートとすることが好ましい。
ここで、細胞配置プレートとは、どの孔部にどの種類の細胞が入っているのかが既知であるプレートを意味する。細胞保持部材が細胞配置プレートであると、所定の薬品でスクリーニングする際に、実験者のスキルなどに左右されず、実験条件がブレにくい結果を得やすい点で有利である。また、細胞配置プレートは、一般的なウェルと比較してサイズを小さくできることから、スクリーニングする際に所定の薬品の使用量を少なくすることができる。
【００６０】
細胞の培養時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、細胞接着性材料と密着させるという観点から２４時間以上が好ましい。
【００６１】
＜その他の部材＞
その他の部材としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、細胞保持用部材及び細胞保持部材を覆う保護カバーが好ましい。保護カバーがあると、コンタミを抑制できる点や積み重ねができる点で有利である。
保護カバーとしては、例えば、シート状のカバー、孔部を密閉する蓋などが挙げられる。
【００６２】
［細胞保持部材の作製方法］
以下、図面を参照しながら、細胞保持部材の作製方法について説明する。各図面において、同一構成部分には同一符号を付し、重複した説明を省略する場合がある。
【００６３】
＜液滴形成装置＞
図２は、液滴形成装置の一例を示す概略断面図である。なお、以下では「液滴形成装置」を「インクジェットヘッド」と称することもある。
図２に示すように、液滴形成装置１は、液を収容する液室２と、吐出孔（ノズル）３ａが形成されたメンブレン３と、圧電素子４と、圧電素子４に駆動信号を出力する駆動部５とを有する。
なお、本実施形態では、便宜上、液室２の液面が存在する側を上側、圧電素子４が存在する側を下側とする。また、各部位において、液室２が存在する側の面を上面、圧電素子４が存在する面を下面とする。
【００６４】
液室２は、底部にメンブレン３を有し、細胞インクＡを収容可能である。
細胞インクＡとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
液室２の材質としては、例えば、金属、シリコン、セラミックなどが挙げられる。
液室２の大きさとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
液室２に収容可能な細胞インクＡの量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１μＬ〜１ｍＬとしてもよく、細胞インクＡが細胞を分散させた細胞懸濁液などである場合には、１μＬ〜５０μＬとしてもよい。
【００６５】
メンブレン３は、液室２の底部として配置されており、液室２の下面の端部に固定されている。メンブレン３の略中心には、貫通孔である吐出孔３ａが形成されており、液室２に収容された細胞インクＡがメンブレン３の変形により吐出孔３ａから液滴Ｄとして吐出される。
メンブレン３は、圧電素子４により変形させられる。
【００６６】
メンブレン３を平面視したときの形状は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、円形、楕円状、四角形などが挙げられ、液室２の底部の形状に応じたものが好ましい。
メンブレン３の材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、金属材料、セラミック材料、高分子材料などが挙げられ、ある程度の硬さがある材質であることが好ましい。メンブレン３の材質がある程度の硬さがあると、メンブレン３が容易に振動せず、また振動を抑制しやすい。
金属材料としては、例えば、ステンレス鋼、ニッケル、アルミニウムなどが挙げられる。
セラミック材料としては、例えば、二酸化ケイ素、アルミナ、ジルコニアなどが挙げられる。
【００６７】
吐出孔３ａは、本実施形態では、メンブレン３の略中心に実質的に真円状に形成されている。
吐出孔３ａの形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真円状などが挙げられる。
吐出孔３ａの形状が真円状の場合、吐出孔３ａの直径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２０μｍ以上２００μｍ以下が好ましい。吐出孔３ａの直径が好ましい範囲であると、吐出される液滴形状の安定化の点で有利である。
【００６８】
圧電素子４は、メンブレン３の下面側に配置されている。
圧電素子４の形状としては、メンブレン３の形状に合わせた形状が好ましい。例えば、メンブレン３を平面視したときの形状が円形である場合には、吐出孔３ａの周囲に平面形状が円環状（リング状）の圧電素子４を配置することが好ましい。
【００６９】
圧電素子４は、例えば、圧電材料の上面及び下面に電圧を印加するための電極を設けた構造であり、圧電素子４の上下電極に電圧を印加することによって紙面横方向に圧縮応力が加わりメンブレン３を変形あるいは振動させることができる。
圧電材料としては、例えば、ジルコン酸チタン酸鉛、ビスマス鉄酸化物、ニオブ酸金属物、チタン酸バリウム、これらに金属や異なる酸化物を加えた材料などが挙げられる。
【００７０】
なお、本実施形態では、圧電素子４がメンブレン３を変形させるようにしたが、これに限ることなく、他の態様としてもよい。他の態様としては、例えば、メンブレン３上にメンブレン３とは線膨張係数が異なる材料を貼り付け、加熱することによって線膨張係数の差を利用してメンブレン３を変形させてもよい。この態様の場合には、線膨張係数の異なる材料の近傍にヒータを配置し、ヒータのＯＮ／ＯＦＦによりメンブレン３を変形あるいは振動させることが好ましい。
【００７１】
駆動部５は、駆動信号として吐出信号Ｐｊを圧電素子４に出力することができる。駆動部５は、吐出信号Ｐｊを圧電素子４に出力することにより、メンブレン３を変形させ、液室２に収容された細胞インクＡを液滴Ｄとして吐出することができる。なお、メンブレン３の変形を所定の周期に設定した吐出信号Ｐｊで行うことにより、メンブレン３を共振振動させて吐出させることもできる。
【００７２】
また、駆動部５は、駆動信号として抑制信号Ｐｓを圧電素子４に出力することができる。駆動部５は、液滴Ｄを吐出した後の圧電素子４に抑制信号Ｐｓを出力することにより、メンブレン３の残留振動を抑制することができる。これにより、液滴形成装置１は、残留振動が自然に減衰するのを待たずに、メンブレン３の残留振動を速やかに抑制できるため、単位時間あたりの吐出回数を増加させることができる。さらに、液滴形成装置１は、液滴が分離するサテライトや細かく飛び散るミストなどの残留振動に起因する不具合の発生を減少させることができるため、より微小な液滴量の制御も可能になる。
【００７３】
［液滴形成装置による液滴形成過程（動作）］
液滴形成装置が液滴を形成する過程について説明する。
図３は、吐出信号及び抑制信号の一例を示す説明図である。図４Ａ〜図４Ｃは、液滴形成装置の動作の一例を示す説明図である。
図３に示す吐出信号Ｐｊ及び抑制信号Ｐｓが圧電素子４に出力された場合には、図４Ａ〜図４Ｃに示すように液滴Ｄを形成するとともに、メンブレン３の残留振動を抑制することができる。
【００７４】
まず、図３に示した吐出信号Ｐｊが出力されると、図４Ａに示すようにメンブレン３が急激に変形することにより、液室２に収容された細胞インクＡが吐出孔３ａから下側に押し出される。
【００７５】
吐出信号Ｐｊとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。吐出信号Ｐｊとしては、メンブレン３で細胞インクＡをより低い電圧で吐出させる点で、メンブレン３の固有振動周期Ｔ０に基づく信号が好ましい。本実施形態では、吐出信号Ｐｊの出力時間、即ち印加電圧を上昇させる時間をＴ０／２とすることにより、メンブレン３で細胞インクＡをより低い電圧で吐出させることができる。
メンブレン３の固有振動周期Ｔｏは、例えば、レーザドップラー振動計（ＬＶ−１８００、株式会社小野測器製）を用いて測定することができる。
【００７６】
次に、図３に示した一定の電圧が圧電素子４に印加されている時間、即ち吐出信号Ｐｊの出力が終了してから抑制信号Ｐｓの出力を開始するまでの間隔時間Ｔｉでは、図４Ｂに示すように吐出孔３ａからの液滴Ｄが成長する。この間隔時間Ｔｉでは、メンブレン３は、吐出時に変形したことによる振動が残留する。
【００７７】
そして、図３に示した抑制信号Ｐｓが出力されると、図４Ａに示すようにメンブレン３が元の状態に戻る際に、液滴Ｄが形成されるとともに、メンブレン３の残留振動が抑制される。
【００７８】
抑制信号Ｐｓとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、メンブレン３の固有振動周期Ｔｏに基づく信号が好ましい。抑制信号Ｐｓがメンブレン３の固有振動周期Ｔｏに基づく信号であると、メンブレン３の残留振動を低いエネルギーで、かつ短時間で抑制することができる。
抑制信号Ｐｓの電圧は、吐出信号Ｐｊの最大電圧以下にする。抑制信号Ｐｓの電圧が吐出信号Ｐｊの最大電圧を超えると、抑制信号Ｐｓにより不要な振動が発生し、残留振動の長期化を招きやすくなる。
【００７９】
なお、上述では、図３に示すパルス状の駆動信号のうち、立ち上がり時の電圧信号を吐出信号とし、立ち下がり時の電圧信号を抑制信号としたが、これに限ることなく、例えば、吐出信号及び抑制信号を図５Ａ及び図５Ｂに示すようにしてもよい。
【００８０】
図５Ａに示すように、吐出信号Ｐｊとしては、例えば、三角波、正弦波、矩形波、ローパスフィルタを介してエッジを緩やかにした三角波などとしてもよい。この場合には、三角波などの周期をメンブレン３の固有振動周期Ｔｏに合わせることが好ましい。
抑制信号Ｐｓとしては、メンブレン３の固有振動周期Ｔｏに基づく信号であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、三角波、正弦波、矩形波、ローパスフィルタを介してエッジを緩やかにした三角波などとしてもよい。この場合には、三角波などの周期をメンブレン３の固有振動周期Ｔｏに合わせるようにする。
【００８１】
また、図５Ｂに示すように、液滴形成装置１は、抑制信号Ｐｓを一回出力するだけではメンブレン３の残留振動を抑制できない場合には、複数の抑制信号Ｐｓを出力してもよい。この場合にも、三角波などの周期をメンブレン３の固有振動周期Ｔｏに合わせるようにする。
【００８２】
［液滴形成装置を搭載した細胞保持部材製造装置］
図６は、液滴形成装置を複数搭載した細胞保持部材製造装置の一例を示す概略図である。
図６に示すように、細胞保持部材製造装置２００には、少なくとも基体を固定するステージ部４０と、細胞インクを吐出する液滴形成装置１及び液滴形成装置１１と、被覆液吐出ヘッド２１と、細胞接着性材料吐出ヘッド３１とが搭載されている。
被覆液吐出ヘッド２１は、駆動部２２と、被覆液を保持する液室２３とを有する。また、細胞接着性材料吐出ヘッド３１は、駆動部３２と、細胞接着性材料インクを保持する液室３３とを有する。
なお、各装置及び各ヘッドの数量は、必要に応じて変更してもよい。
細胞接着性材料吐出ヘッド３１としては、液滴形成装置１を用いてもよいし、その他のインクジェットヘッドを用いてもよい。
その他のインクジェットヘッドとしては、例えば、産業用インクジェットヘッド（ＭＨ２４２０）などがあげられる。また、インクジェットヘッドを保持する保持部材と、ステージとインクジェットヘッドの相対位置を制御する機構部も搭載してもよい。
【００８３】
（組織体の製造方法の説明）
−細胞接着性材料インクの調製−
細胞接着性材料を純水などへ溶解させ、細胞接着性材料インクＢを調液する。このとき、細胞接着性材料の含有量としては、０．００１％〜５％が好ましく、０．００５％〜１％がより好ましい。細胞接着性材料の含有量が好ましい範囲であると、細胞接着機能が発現しやすく、またインクジェット法により吐出しやすくなる点で有利である。
また、必要に応じて、湿潤剤、分散剤、ｐＨ調整剤などその他の添加材料を含有してもよく、沸点が室温から９０℃程度であれば、さらに好ましい。
【００８４】
−孔部への細胞接着性材料インク吐出−
細胞と基体１３０の接着性と向上させるために、基体１３０の表面に細胞接着性材料を配置する。細胞接着性材料を配置する方法としては、全面に播種する方法や、図６の製造装置２００を用いて孔部１２０に吐出する方法などが挙げられる。これらの中でも、所望の位置に正確に吐出できる観点から、図６の製造装置２００を用いる方法が好ましい。
【００８５】
図７は、細胞接着性材料インクを吐出する動作の一例を示す説明図である。
図７に示すように、細胞接着性材料吐出ヘッド３１を用いて、細胞接着性材料インクＢを孔部１２０に吐出することにより、細胞接着性材料をパターン形状に沿って、定量に制御することが可能である。このとき、細胞接着性材料インクＢがノズルから吐出できれば、駆動信号に特に制限はない。なお、構造層を基体に積層する前に細胞接着性材料を配置しても構わない。
【００８６】
−孔部への被覆液注入−
図８Ａは、被覆液を吐出する動作の一例を示す説明図である。
図８Ａに示すように、被覆液吐出ヘッド２１を用いて、基体１３０を底面とする孔部１２０に被覆液Ｃを吐出することにより、被覆液Ｃをパターン形状に沿って、定量に制御することが可能である。なお、被覆液Ｃがノズルから吐出できれば、駆動信号に特に制限はない。なお、図８Ｂに示すように、被覆液Ｃを吐出する前に細胞接着性材料インクＢを吐出することが好ましい。
このように、細胞吐出ヘッド１から細胞インクＡと吐出する前に、細胞の乾燥抑制、基板着弾時の細胞への衝撃抑制のために、予め、孔部１２０に被覆液Ｃを注入しておく。
【００８７】
−孔部への細胞インク注入−
図９Ａ及び図９Ｂは、細胞インクを吐出する動作の一例を示す説明図である。
図９Ａ及び図９Ｂに示すように、細胞吐出ヘッド１を用いて、基体１３０を底面とする孔部１２０に細胞インクＡを吐出することにより、細胞インクＡをパターン形状に沿って、定量に制御することが可能である。
細胞吐出ヘッド１からの細胞インクＡの液滴吐出速度を０．１ｍ／ｓ、１．０ｍ／ｓ、及び１０ｍ／ｓとしたときの、被覆液Ｃの液深さと細胞生存率の関係を以下の基準により評価した。結果を表１に示した。
○：  孔部あたりの細胞の生存率の平均が７５％以上
×：  孔部あたりの細胞の生存率の平均が７５％未満
【００８８】
【表１】
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【００８９】
表１の結果から、吐出速度が０．１ｍ／ｓから１０ｍ／ｓの範囲内においては、吐出速度にかかわらず液厚みが５μｍ程度であっても孔部１２０に被覆液Ｃを注入しておくことで、被覆液Ｃがない場合と比較して細胞生存率が大幅に向上することが確認された。
細胞の乾燥抑制、及び着弾時の細胞への衝撃抑制を考慮すると被覆液Ｃの液量を多くしたほうが効果的だが、孔部１２０で保持できる細胞インクＡが相対的に減少し、細胞密度が低下してしまうため、所望の組織体の形状に応じて被覆液Ｃの液量を調製してもよい。
【００９０】
細胞吐出ヘッド１から細胞インクＡを孔部１２０に吐出する。隣接液滴の合一は、構造層１１０の隔壁があるために抑制される。また、同一箇所への液滴数を増やすことが可能になるので細胞密度も増やすことが可能になる。また、孔部１２０に被覆液Ｃが注入されているため、基体１３０への着弾の際の細胞への影響が抑制される。また、被覆液Ｃを組織体の形成と維持に必要な成分を含み、かつ、乾燥を防ぎ浸透圧などの外部環境を整える溶液にすることで細胞生存率を向上することができ、組織体の拡大化、複雑化にも対応できる。
また、上記工程を繰り返すことで三次元の複雑な組織体の構築も可能になる。構造層１１０を各層構成ごとに剥離するか残すかについては、組織体構築の用途や構造層の生体適合性によるため限定はしない。
【００９１】
ここで、従来のインクジェット法による細胞インクを吐出する動作の一例を示す説明図を図１０に示す。
図１０に示すように、細胞は細胞インク内に分散されているため、細胞解像度、細胞密度を上げていくと基体１３０に液滴を着弾させた際、隣接液滴との間隔が近いと液滴同士が合一してしまい、細胞位置、細胞数が狙いから外れる。このため、複数の細胞種が合一した場合には、組織体の品質が低下する。また、細胞吐出ヘッド１から吐出した細胞インクの液滴が基体１３０に直接衝突するため、細胞がダメージを受ける可能性が高い。また、細胞インクＡは吐出後から大気に晒されて乾燥が始まるため、組織体の拡大化、複雑化により先に吐出した細胞の乾燥が進み、細胞生存率が悪化することが考えられる。
【実施例】
【００９２】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００９３】
（実施例１）
＜構造層への孔部形成〜細胞接着性材料形成＞
スライドガラス上に厚さ７０μｍのマスキングテープ（Ｎ−３８０、日東電工株式会社製）を４枚重ねて（厚さ２８０μｍ）貼り付けた後、レーザー加工機（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｈ１０−１０６ＱＷ  Ｊ８０−８ｓｓ４２  Ｈｉｐｐｏ）を用いて、図１１Ａ及び図１１Ｂに示すようなφ１００μｍの孔部を１５０μｍピッチで構造層を形成した。また、基体としての評価基板との位置合わせができるようにφ１００μｍのアライメントマークも形成した。
次に、４枚重ねのマスキングテープをスライドガラスから剥離した後、評価基板のアライメントマークとマスキングテープのアライメントマークで位置合わせを行い、所望の評価基板を形成した。
そして、細胞接着性材料としてマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ基底膜マトリックス）を重量比０．１％となるように細胞接着性材料溶液で調製した。細胞接着性溶液を細胞接着性材料吐出ヘッドの液室に充填して、ノズルから液滴を各孔部に９００ｐＬ（３００ｐＬ×３滴）吐出し、乾燥して細胞接着性材料を形成した。
【００９４】
＜細胞インクの調製＞
緑色蛍光染料（商品名：Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）の濃度でジメチルスルホキシドに溶解させ、無血清ダルベッコ変法イーグル培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）と混合し、濃度１０μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）の蛍光染料含有無血清培地を調製した。
【００９５】
次に、培養したＮＩＨ／３Ｔ３細胞（Ｃｌｏｎｅ  ５６１１，  ＪＣＲＢ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ）のディッシュに蛍光染料含有無血清培地を５ｍＬ添加し、インキュベーター（ＫＭ−ＣＣ１７ＲＵ２、パナソニック株式会社製、３７℃、５体積％ＣＯ２環境）内で３０分間培養した。その後、アスピレータを用いて、上澄みを除去した。ディッシュにリン酸緩衝生理食塩水（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、以下「ＰＢＳ（−）」とも称する）を５ｍＬ加え、アスピレータでＰＢＳ（−）を吸引除去し、表面を洗浄した。ＰＢＳ（−）による洗浄作業を２回繰り返した後、０．０５質量％トリプシン−０．０５質量％ＥＤＴＡ溶液（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）をディッシュ１枚あたり２ｍＬ加え、前記インキュベーター内にて５分間加温し、ディッシュから細胞を剥離したのち、１０質量％ウシ胎児血清（以下「ＦＢＳ」とも称す）及び１質量％抗生物質（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  Ｍｉｘｅｄ  Ｓｔｏｃｋ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００ｘ）、ナカライテスク株式会社製）を含むＤ−ＭＥＭを４ｍＬ加え、前記トリプシンを失活させた細胞インクを５０ｍｌ遠沈管１本に移し、遠心分離（商品名：Ｈ−１９ＦＭ、ＫＯＫＵＳＡＮ社製、１，２００ｒｐｍ、５分間、５℃）を行い、アスピレータを用いて上清を除去した。除去後、遠沈管に１０質量％ＦＢＳ及び１質量％抗生物質を含むＤ−ＭＥＭを２ｍＬ添加し、穏やかにピペッティングを行い、細胞を分散させ細胞インクを得た。  
【００９６】
涯細胞インクから１０μＬをエッペンドルフチューブに取り出し、培地を７０μＬ添加後、１０μＬを別のエッペンドルフチューブに取り出し、０．４質量％トリパンブルー染色液１０μＬを加えてピペッティングを行った。染色した細胞インクから１０μＬ取り出してＰＭＭＡ製プラスチックスライドに乗せ、商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（インビトロジェン社製）を用いて細胞数を計測して細胞数を求めることで、細胞数を計測した細胞インクを得た。前記分散媒としてＰＢＳ（−）を用いた。前記ＰＢＳ（−）に湿潤剤としてグリセリン（分子生物学用グレード、和光純薬）を質量比０．５％となるよう溶解させ、前記ＮＩＨ／３Ｔ３細胞インクを６×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬとなるよう前記分散媒へ分散させて細胞インクを得た。
【００９７】
＜孔部への被覆液注入〜細胞パターン形成＞
次に、細胞接着性材料が形成された上記評価基板の孔部に被覆液として培地（１０質量％ＦＢＳ及び１質量％抗生物質を含むＤ−ＭＥＭ）を被覆液吐出ヘッドの液室に充填して、ノズルから液滴を各孔部に３００ｐＬ（３００ｐＬ×１滴）吐出した（液深さ４０μｍ）。
続けて、調製した細胞インクを細胞吐出ヘッドの液室に充填し、ノズル径から液滴を各孔部に液滴速度１．０ｍ／ｓで、細胞数１０個狙いとして１，５００ｐＬ（３００ｐＬ×５滴）吐出した。
最後の細胞インクが着弾した後、１０分間静置した後、インキュベーター（ＫＭ−ＣＣ１７ＲＵ２、パナソニック株式会社製、３７℃、５体積％ＣＯ２環境））内で２４時間培養した。
前記得られた細胞パターンに対し、以下に示す評価を実施した。
【００９８】
［細胞パターンの形状精度（パターンの解像度の評価）］
細胞パターンの形状の精度を、蛍光顕微鏡（ＣＫＸ４１、オリンパス製）を用いて以下の基準により評価した。
○：細胞接着パターンのピッチが３００μｍ以下
×：細胞接着パターンのピッチが３００μｍより大きい
【００９９】
［所定の細胞接着部へ所定数の細胞を配置できる確率（細胞数の制御の評価）］
φ１００μｍの各孔部に保持されている細胞数を、蛍光画像をもとに算出し、以下の基準により評価した。評価対象は、細胞数１０個を狙って吐出した全ての孔部とした。
○：  細胞数が狙いの数に対して±２０％以下となる孔部が８０％以上
×：  細胞数が狙いの数に対して±２０％以下となる孔部が８０％未満
なお、本実施例では、狙いの数としたが、細胞数の平均値としてもよい。
【０１００】
［配置した細胞数が所望の数となっている確率（細胞密度の評価）］
φ１００μｍの各孔部に保持されている細胞の数を、蛍光画像をもとに算出し、以下の基準により評価した。評価対象は、細胞数１０個を狙って吐出した２０の孔部とした。
○：  細胞数が８個以上であった孔部が８０％以上
×：  細胞数が８個以上であった孔部が８０％未満
【０１０１】
［着弾した細胞の所定時間経過後における生存率（細胞の生存率の評価）］
１０分間静置した細胞パターンに対し、死細胞の核染色剤としてプロピジウムイオダイド（Ｃｅｌｌｓｔａｉｎ−ＰＩ、同仁化学研究所）を蒸留水へ１ｍｇ／ｍＬで溶解させたストック溶液を、５ｍＬに１０μＬとなるよう添加した。その後、インキュベーターで１０分間培養した後、蛍光顕微鏡を用いて各孔部に存在する死細胞の割合を算出、以下の基準により評価した。評価対象は、細胞数１０個を狙って吐出した２０の孔部とした。
○：  孔部あたりの細胞の生存率の平均が７５％以上
×：  孔部あたりの細胞の生存率の平均が７５％未満
【０１０２】
（実施例２）
実施例１において、構造層をマスキングテープからＰＤＭＳに変更した以外は、実施例１と同様に評価した。結果を表２に示す。
ＰＤＭＳのバルク形成方法は、スライドガラス（松波硝子工業株式会社製  ＭＩＣＲＯ  ＳＬＩＤＥ  ＧＬＡＳＳ  Ｓ１１１２）に主剤と硬化剤を１０：１で混合脱泡したＰＤＭＳ（東レ・ダウコーニング製、ＳＹＬＧＡＲＤ１８４）を塗布して、７０℃２時間で加熱硬化を実施した。また、構造層のＰＤＭＳをレーザー加工により、図１２Ａ及び図１２Ｂに示すような孔部を形成した。
【０１０３】
（実施例３）
実施例２において、細胞接着性材料を質量比０．０５％コラーゲン（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  Ｔｙｐｅ１−Ａ、新田ゼラチン）に変更した以外は、実施例２と同様に評価した。結果を表２に示す。
【０１０４】
（実施例４）
実施例２において、細胞接着性材料をフィブリンに変更した以外は、実施例２と同様に評価した。前記フィブリンはフィブリノーゲン（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｐｌａｓｍａ  Ｆ８６３０，ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）質量比０．２％とトロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｐｌａｓｍａ  Ｔ４６４８，ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）質量比０．２％を混合させたのち、室温で一晩静置して得た。結果を表２に示す。
【０１０５】
（実施例５）
実施例２において、細胞接着性材料をＲＧＤペプチド（生化学用、和光純薬工業）に変更した以外は、実施例２と同様に評価した。結果を表２に示す。
【０１０６】
（実施例６）
実施例２において、細胞接着性材料を質量比２％のゼラチン微粒子（ＡＰＨ−２５０、新田ゼラチン製）に変更した以外は、実施例２と同様に評価した。結果を表２に示す。
【０１０７】
（実施例７）
実施例２において、細胞接着性材料の各孔部への液滴数を１滴に変更した以外は、実施例２と同様に評価した。結果を表２に示す。
また、図１３は、実施例７における細胞接着性材料インクを吐出する動作の一例を示す説明図である。
図１３に示すように、基板に着弾する細胞接着性材料量を調整することで孔部の隔壁側面への細胞接着性材料の形成を抑制できる。これにより、吐出された細胞がすべて基板上に形成できるため、基板上に形成する細胞数制御を更に高精度にすることができる。
また、基板上に形成された細胞を顕微鏡で観察する際に、液のメニスカスが要因でばらついていた隔壁側の測定誤差も抑制することができる。
【０１０８】
（実施例８）
実施例２において、孔部の形状が、基板側の表面の開口面積が他方側の開口面積よりも小さく形成されている以外は、実施例２と同様に評価した。結果を示す。
また、図１４は、実施例８における細胞インクを吐出する動作を示す説明図である。
図１４に示すように、細胞解像度、細胞密度を維持したまま、液滴吐出側の孔部面積を広くすることが可能になり、細胞吐出ヘッドにおける着弾位置ばらつきによる細胞数ばらつきを抑制することが可能になる。
【０１０９】
（実施例９）
実施例２において、ＮＩＨ／３Ｔ３を分散させた細胞インク１と、Ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ＣＣ−２５０９、Ｌｏｎｚａ、以下「ＮＨＤＦ」と称す）を分散させた細胞インク２を用意し、構造層の孔部に交互に配置した複数細胞の評価を実施した以外は、実施例２と同様に評価した。
細胞インク２は、細胞をＮＨＤＦに、染料を赤色蛍光染料（Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  ＲＥＤ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）に変更した以外は、細胞インク１と同様にして調製した。結果を表２に示す。また、細胞インクを２種類に染色して配置した際の写真を図１５に示す。
【０１１０】
また、実施例９では、複数の種類の細胞を扱っていることから、細胞が接着している状態でのパターン精度を、蛍光顕微鏡（ＣＫＸ４１、オリンパス社製）を用いて以下の基準で評価を行った。
○：交互に配置された細胞パターンが３００μｍ以下のピッチ
×：交互に配置された細胞パターンが３００μｍより大きいピッチ
【０１１１】
（比較例１）
実施例９において、構造層を基板に配置しなかった以外は、実施例９と同様にして評価した。結果を表２に示す。
比較例１では、構造層に形成した孔部がないため、隣接液滴が合一してしまい。狙いの接着位置に細胞を接着できないため、狙いの細胞解像度、細胞密度でパターン形成できなかった。また、被覆液も保持できないため、基板への衝突により細胞生存率も達成できなかった。
【０１１２】
（比較例２）
実施例９において、被覆液を形成しなかった以外は、実施例９と同様にして評価した。結果を表２に示す。
比較例２では、構造層に形成した孔部があるため、細胞解像度、細胞数制御、細胞密度に加えて複数細胞のパターニングも達成することができたが、細胞の乾燥対策と衝撃抑制のための被覆液がないため、細胞生存率で基準を達成することができなかった。
【０１１３】
（比較例３）
実施例９において、細胞をインクジェット法にて配置する代わりに、細胞インクをＮＩＨ／３Ｔ３とＮＨＤＦそれぞれ用意して手作業により、それぞれ５×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬずつ、計１×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬとなるよう播種したこと以外は、実施例９と同様にして評価した。結果を表２に示す。
比較例３では、インクジェット法により細胞を配置しないと、播種の位置精度が悪くなるため、狙った孔部に正確に細胞を配置することができず、隣接孔部や構造層上などの孔部外に細胞が配置され、隣接孔部の液滴と干渉して合一されてしまうことにより、細胞数制御の基準を達成できなかった。加えて、複数細胞パターンもＮＩＨ／３Ｔ３とＮＨＤＦが合一してしまい基準を達成できなかった。
なお、比較例３は、細胞を播種する前の状態である「細胞保持用部材」としては、実施例に該当する。
【０１１４】
【表２】
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【０１１５】
以上説明したように、本発明の細胞保持用部材では、基体に複数の孔部を有する構造層を有することにより、複数の孔部に細胞懸濁液が吐出されると孔部毎に細胞を分けて保持できるため、着弾した液滴が合一して細胞の位置がずれることを抑制することができる。
また、本発明の細胞保持用部材では、孔部内に着弾した細胞懸濁液を保持することにより、大気と接する細胞懸濁液の表面積を少なくすることができるため、細胞の乾燥を抑制することができる。
さらに、本発明の細胞保持用部材では、孔部内に、孔部から露出する基体における平面を被覆する被覆液を有することにより、インクジェット法により吐出された細胞が着弾した際のダメージを軽減し、かつ細胞の乾燥を抑制することができる。
【０１１６】
本発明の態様としては、例えば、以下のとおりである。
＜１＞  細胞非接着性材料による層に複数の孔部が形成された構造層を基体の平面上に積層する工程と、
前記孔部内に、前記孔部から露出する前記基体における前記平面を被覆液で被覆する工程と、
前記被覆液で被覆された前記平面に細胞懸濁液を吐出する工程と、
を含むことを特徴とする細胞配置プレートの製造方法である。
＜２＞  前記孔部内に、細胞接着性材料を付着させる工程を更に含む、前記＜１＞に記載の細胞配置プレートの製造方法である。
＜３＞  前記細胞接着性材料が、前記孔部の側面と接触していない、前記＜２＞に記載の細胞配置プレートの製造方法である。
＜４＞  前記構造層における前記孔部から露出する前記基体における前記平面が、インクジェット法で吐出される細胞懸濁液の液滴の着弾面である、前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の細胞配置プレートの製造方法である。
＜５＞  前記細胞非接着性材料が撥水性材料又はケイ素含有材料である、前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の細胞配置プレートの製造方法である。
＜６＞  前記被覆液の最小厚みが５μｍ以上である、前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の細胞配置プレートの製造方法である。
＜７＞  前記被覆液が細胞培養培地である、前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の細胞配置プレートの製造方法である。
＜８＞  互いに隣接する前記孔部のピッチ間隔が３００μｍ以下である、前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の細胞配置プレートの製造方法である。
＜９＞  前記孔部内に配された細胞数が、平均値に対して±２０％となる前記孔部が８０％以上である、前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の細胞配置プレートの製造方法である。
＜１０＞  細胞非接着性材料による層に複数の孔部が形成された構造層を基体の平面上に積層する工程と、
前記孔部内に、細胞接着性材料を付着させる工程と、
前記孔部内に、前記孔部から露出する前記基体における前記平面を被覆液で被覆する工程と、
を含むことを特徴とする細胞保持用部材の製造方法である。
＜１１＞  少なくとも平面を有する基体における前記平面上に、
細胞非接着性材料で形成され、かつ複数の孔部を有する構造層を有し、
前記孔部内に、細胞接着性材料が付着していることを特徴とする細胞保持用部材である。
＜１２＞  前記孔部内に、前記孔部から露出する前記基体における前記平面を被覆する被覆液を有する、前記＜１１＞に記載の細胞保持用部材である。
＜１３＞  前記細胞接着性材料が、前記孔部の側面と接触していない、前記＜１２＞に記載の細胞保持用部材である。
＜１４＞  前記構造層における前記孔部から露出する前記基体における前記平面が、インクジェット法で吐出されるインク液滴の着弾面である、前記＜１１＞から１３＞のいずれかに記載の細胞保持用部材である。
＜１５＞  前記被覆液の最小厚みが５μｍ以上である、前記＜１１＞から＜１４＞のいずれかに記載の細胞保持用部材である。
＜１６＞  互いに隣接する前記孔部のピッチ間隔が３００μｍ以下である、前記＜１１＞から＜１５＞のいずれかに記載の細胞保持用部材である。
＜１７＞  前記＜１１から＜１６＞のいずれかに記載の細胞保持用部材と、
前記細胞保持用部材における複数の前記孔部内に配された細胞と、
を有することを特徴とする細胞配置プレートである。
＜１８＞  前記孔部内に配された細胞数が、平均値に対して±２０％となる前記孔部が８０％以上である、前記＜１７＞に記載の細胞配置プレートである。
＜１９＞  前記孔部に配された細胞がインクジェット法により吐出してなる、前記＜１７＞から＜１８＞のいずれかに記載の細胞配置プレートである。
＜２０＞  前記孔部に配された細胞の種類が、２種以上である、前記＜１７＞から＜１９＞のいずれかに記載の細胞配置プレートである。
【０１１７】
前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の細胞配置プレートの製造方法、前記＜１０＞に記載の細胞保持用部材の製造方法、前記＜１１＞から＜１６＞のいずれかに記載の細胞保持用部材、及び前記＜１７＞から＜２０＞のいずれかに記載の細胞配置プレートによれば、従来における前記諸問題を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０１１８】
【特許文献１】特開２０１２−１８７０７２号公報
【特許文献２】特開２００９−１３１２４０号公報
【特許文献３】特開２０１３−０９９２７１号公報
【特許文献４】特開２０１０−２３３４５６号公報
【符号の説明】
【０１１９】
１、１１    液滴形成装置（細胞吐出ヘッド）
２１    被覆液吐出ヘッド
３１    細胞接着性材料吐出ヘッド
１００    細胞保持用部材
１１０    構造層
１２０    孔部
１２１    穴部
１３０    基体
Ａ    細胞インク（インク）
Ｂ    細胞接着性材料インク
Ｃ    被覆液
Ｌ    アライメントマーク
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2019180394.tif 000011
【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2019180394.tif 000018
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
2019180394.tif 000020
【図１０】
2019180394.tif 000021
【図１１Ａ】
2019180394.tif 000022
【図１１Ｂ】
2019180394.tif 000023
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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