(57)【要約】【課題】アジュバントとして利用可能な、新規のＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子およびその利用を提供すること。【解決手段】ＴＬＲリガンド複合体と、金属ナノ粒子とを含み、ＴＬＲリガンド複合体は、ＴＬＲリガンドと、第１のリンカー化合物とを有し、第１のリンカー化合物は、その一端にてＴＬＲリガンドと結合し、その他端にて金属ナノ粒子に固定化されている、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子とする。【選択図】図１９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＬＲリガンド複合体と、金属ナノ粒子とを含み、
上記ＴＬＲリガンド複合体は、ＴＬＲリガンドと、主鎖に炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖を備えた第１のリンカー化合物とを有し、
上記第１のリンカー化合物の主鎖は、その一端に上記ＴＬＲリガンドと結合したアミノ基またはカルボニル基を有し、その他端に硫黄原子を含む第１の炭化水素構造を有しており、
上記第１の炭化水素構造が上記金属ナノ粒子に固定化されていることを特徴とする、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子。
【請求項２】
糖鎖リガンド複合体をさらに含み、
上記糖鎖リガンド複合体は、糖鎖と、主鎖に炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖を備えた第２のリンカー化合物とを有し、
上記第２のリンカー化合物の主鎖は、その一端に上記糖鎖と結合したアミノ基またはカルボニル基を有し、その他端に硫黄原子を含む第２の炭化水素構造を有しており、
上記第２の炭化水素構造が上記金属ナノ粒子に固定化されていることを特徴とする、請求項１に記載のＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子。
【請求項３】
上記ＴＬＲリガンドは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９に対する結合能を有することを特徴とする、請求項１または２に記載のＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子。
【請求項４】
上記糖鎖は、グルコース、ガラクトース、マンノース、硫酸化糖およびシアル酸からなる群から選択される１つの化合物からなる単糖、または上記群から選択される２つ以上の化合物を含むオリゴ糖もしくは多糖であることを特徴とする、請求項２に記載のＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載のＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子を含むことを特徴とする、アジュバント組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンは、ウイルスや細菌などの病原体の感染や感染症の重症化を防ぐために世界中で広く利用されている。ワクチンの接種では、弱毒化または不活化した病原体を用いて感染による免疫応答を人工的に誘導し、それにより抗体産生能や細胞傷害性を有する細胞を誘導することにより、効率的に感染症を予防することができる。近年は、ワクチン接種による感染症予防と同様のメカニズムを利用し、がん特異的に発現する抗原を用いたがんの予防および治療ワクチンの開発も活発に行われている。
【０００３】
ワクチンの接種において、抗原の免疫原性が低く、ワクチンの効果が十分に得られないことがしばしば問題となっている。このような場合、ワクチンの効果を増強するアジュバント（免疫活性化剤）の利用が必要である。現在、アジュバントとして水酸化アルミニウムなどが認可されているが、既存のアジュバントでは効果が限定的で、免疫活性化能が不十分な場合があり、より効果的なアジュバントが求められている。
【０００４】
ヒトの免疫システムは、自然免疫と獲得免疫とに大別され、自然免疫では、体内に進入した病原体に対して非特異的な最初の防御反応を行う。一方、獲得免疫では、既に感染した病原体に対して特異的でより強力な防御反応を行う。近年の自然免疫研究の発展から、ワクチンが十分な効果を発揮するためには、自然免疫を活性化し、効率的に獲得免疫を誘導することが重要だと考えられている。そこで、自然免疫を活性化するＴｏｌｌ様受容体（以下、ＴＬＲ（Toll-like Receptor）と称する）に結合するリガンドが新規アジュバントとして注目されている（非特許文献１、２）。
【０００５】
現在、ヒトでは１０種類のＴＬＲが同定されており、ＴＬＲ７の合成低分子リガンドであるイミキモドが尖圭コンジローマや悪性黒色腫の治療薬として臨床利用されている（非特許文献３）。しかし、イミキモドは全身投与後のサイトカイン放出症候群の誘発や薬物動態の問題によりその利用が皮膚への局所投与に限定されている。
【０００６】
発明者らはこれまでに、ＴＬＲ７の合成低分子リガンドを多糖類などの高分子担体に修飾することで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫活性化能が１０〜１０００倍向上し、アジュバントとして有用であることを見出している（非特許文献４、５）。また、これらの高分子担体は複数の官能基を有するため、ＴＬＲリガンドだけでなく、抗原分子などの様々な化合物を同時に修飾することも可能である。抗原分子と、ＴＬＲリガンド等のアジュバントとなる分子とを、単一の担体分子に修飾することで、ワクチン効果が向上することが報告されており、様々な化合物を修飾できる担体分子は、アジュバントの効果を向上させるだけでなく、幅広い疾患に対するワクチン開発のための有力な分子基盤になると期待できる（非特許文献６、７、８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第５２７８９９２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Akira, S., Takeda, K., Nat Rev Immunol. 4：499-511（2004）
【非特許文献２】Hussein, W.M. et al., Expert Opin. Ther. Patents. 24：453-470（2014）
【非特許文献３】Hemmi, H., et al., Nat Immunol. 3：196-200（2002）
【非特許文献４】Chan, M., et al., Bioconj. Chem. 20：1194-2000（2009）
【非特許文献５】Shinchi, H., et al., Bioconj. Chem. 26：1713-1723（2015）
【非特許文献６】Khan, S., et al., J. Biol. Chem. 282：21145-21159（2007）
【非特許文献７】Schlosser, E., Vaccine. 26：1626-1637（2008）
【非特許文献８】Zom. G.G., Adv. Immunol. 114：177-201（2012）
【非特許文献９】Nakamura-Tsuruta S., et al., J. Biochem. 143：833-839（2008）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＴＬＲ７をはじめとする数種類のＴＬＲは、主に細胞内のエンドソーム画分に局在するため、ＴＬＲリガンドの安全性と免疫活性化能とを向上させるためには、ＴＬＲリガンドを効率的に細胞内へ輸送することが求められる。この要求を満たすため、上述した従来技術では、多糖類またはタンパク質などの高分子担体を利用していた。
【００１０】
しかし、従来技術のように、ＴＬＲリガンドや抗原化合物等の複数の化合物を高分子担体に修飾する場合、修飾する化合物に複数の官能基が存在すると、任意の結合様式で化学修飾することは容易ではない。そのため、複数の化合物を、任意の結合様式で、単一の分子に簡便に修飾可能な新たな担体分子の探索が求められる。すなわち従来技術は、さらなる改善の余地があるものであった。
【００１１】
本発明の一実施形態は、上述した従来技術に存在した改善点に鑑みてなされたものであって、その目的は、アジュバントとして利用可能な、新規のＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子およびその利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らはこのような背景に立脚して研究を開始し、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の開発を行ってきた。具体的には、本発明者らが今までに開発してきた、糖鎖固定化ナノ粒子の製造技術（特許文献１、非特許文献９）をさらに改良した。その結果、チオール基を有するリンカー化合物を用いることにより様々な化合物を簡便に固定化可能な金属ナノ粒子を担体として使用することにより、新規のＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の開発に成功した。
【００１３】
すなわち本発明の一実施形態は、以下の構成を含むものである。
〔１〕ＴＬＲリガンド複合体と、金属ナノ粒子とを含み、上記ＴＬＲリガンド複合体は、ＴＬＲリガンドと、主鎖に炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖を備えた第１のリンカー化合物とを有し、上記第１のリンカー化合物の主鎖は、その一端に上記ＴＬＲリガンドと結合したアミノ基またはカルボニル基を有し、その他端に硫黄原子を含む第１の炭化水素構造を有しており、上記第１の炭化水素構造が上記金属ナノ粒子に固定化されていることを特徴とする、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子。
〔２〕糖鎖リガンド複合体をさらに含み、上記糖鎖リガンド複合体は、糖鎖と、主鎖に炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖を備えた第２のリンカー化合物とを有し、上記第２のリンカー化合物の主鎖は、その一端に上記糖鎖と結合したアミノ基またはカルボニル基を有し、その他端に硫黄原子を含む第２の炭化水素構造を有しており、上記第２の炭化水素構造が上記金属ナノ粒子に固定化されていることを特徴とする、〔１〕に記載のＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子。
〔３〕上記ＴＬＲリガンドは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９に対する結合能を有することを特徴とする、〔１〕または〔２〕に記載のＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子。
〔４〕上記糖鎖は、グルコース、ガラクトース、マンノース、硫酸化糖およびシアル酸からなる群から選択される１つの化合物からなる単糖、または上記群から選択される２つ以上の化合物を含むオリゴ糖もしくは多糖であることを特徴とする、〔２〕に記載のＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子。
〔５〕〔１〕〜〔４〕の何れか１つに記載のＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子を含むことを特徴とする、アジュバント組成物。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、ＴＬＲリガンドを介してＴＬＲと特異的に結合することができる。その結果、当該ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、免疫応答を増強する作用を有する。
【００１５】
本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、細胞毒性が低く、生体に対しても安全に利用できるものであるため、極めて実用的である。
【００１６】
本発明の一実施形態は、また、ＴＬＲ７を介した自然免疫応答を誘導可能なアジュバントを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド複合体（１Ｖ２０９−ＴＴＤＤＡ−ＴＡ）の合成経路を示す図である。
【図２】本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド複合体（１Ｖ２０９−ｍＰＤＡ−ＴＡ）の合成経路を示す図である。
【図３】本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド複合体（１Ｖ２０９−ＥＤＡ−ＴＡ）の合成経路を示す図である。
【図４】糖鎖リガンド複合体（Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ）の合成経路を示す図である。
【図５】本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＧｌｃ−ＧＮＰ）のコロイド溶液を示す図である。
【図６】本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＧｌｃ−ＧＮＰ）の透過型電子顕微鏡画像と平均粒径を示す図である。
【図７】本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＧｌｃ−ＧＮＰ）をＤＬＳで測定したときの平均粒径を示す図である。
【図８】本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＧｌｃ−ＧＮＰ）のＰｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅによるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図９】本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＧｌｃ−ＧＮＰ）溶液のＲＡＷ２６４．７細胞への添加によって産生された、ＴＮＦαの産生量を示す図である。
【図１０】（ａ）は、本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＧｌｃ−ＧＮＰ）溶液のヒト末梢血単核細胞（以下、ｈＰＢＭＣと称す）への添加によって産生された、ＴＮＦ−αの産生量を示す図であり、（ｂ）は、本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＧｌｃ−ＧＮＰ）溶液のｈＰＢＭＣへの添加によって産生された、ＩＦＮ−αの産生量を示す図である。
【図１１】糖鎖リガンド複合体（Ｍａｎα１−６Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ）の合成経路を示す図である。
【図１２】本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）のＰｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅによるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図１３】本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）のＨＰＬＣ解析の結果を示す図である。
【図１４】本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）の透過型電子顕微鏡画像と平均粒径を示す図である。
【図１５】本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）をＤＬＳで測定したときの平均粒径を示す図である。
【図１６】本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）溶液のＪ７７４Ａ．１細胞への添加によって産生された、ＩＬ−６の産生量を示す図である。
【図１７】本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）溶液のマウス骨髄由来樹状細胞（以下、ｍＢＭＤＣと称す）への添加によって産生された、ＩＬ−６の産生量を示す図である。
【図１８】本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）溶液のｈＰＢＭＣへの添加によって産生された、ＴＮＦ−αの産生量を示す図である。
【図１９】（ａ）は、オボアルブミン（以下、ＯＶＡと称す）と本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）溶液とのマウスへの投与によって産生された、ＩｇＧ１抗体の産生量を示す図であり、（ｂ）は、ＯＶＡと本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−Ｍａｎ−ＧＮＰ）溶液とのマウスへの投与によって産生された、ＩｇＧ２ｃ抗体の産生量を示す図である。
【図２０】ＯＶＡと本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）溶液とのマウスへの投与後の、マウス体重に対する脾臓の重さの割合を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能である。また、異なる実施形態または実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態または実施例についても、本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。
【００１９】
なお、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上（Ａを含みかつＡより大きい）Ｂ以下（Ｂを含みかつＢより小さい）」を意図する。
【００２０】
［１．ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子］
本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、ＴＬＲリガンド複合体と、金属ナノ粒子とを含み、上記ＴＬＲリガンド複合体は、ＴＬＲリガンドと、主鎖に炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖を備えた第１のリンカー化合物とを有し、上記第１のリンカー化合物の主鎖は、その一端に上記ＴＬＲリガンドと結合したアミノ基またはカルボニル基を有し、その他端に硫黄原子を含む第１の炭化水素構造を有しており、上記第１の炭化水素構造が上記金属ナノ粒子に固定化されているものである。
【００２１】
本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、上記構成を有するため、ＴＬＲリガンドを介してＴＬＲと特異的に結合することができる。また、本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、ＴＬＲが存在する細胞内小胞にＴＬＲリガンドを高濃度に輸送できる。これらの結果、当該ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、免疫応答を増強する作用を有する。
【００２２】
また、本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、上記構成を有するため、細胞毒性が低く、生体に対しても安全に利用できるものであるため、極めて実用的であるという利点を有する。
【００２３】
さらに、本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、上記構成を有するため、ＴＬＲを介した自然免疫応答を誘導可能なアジュバントを提供することができる。
【００２４】
本明細書において、「ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子」とは、以下に詳述するＴＬＲリガンド複合体および糖鎖リガンド複合体のそれぞれと金属ナノ粒子とを結合させてなるものである。なお、金属ナノ粒子は後述するように製造してもよいし、市販のものを使用してもよい。
【００２５】
（１−１．ＴＬＲリガンド複合体）
本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の構成要素であるＴＬＲリガンド複合体は、ＴＬＲリガンド、および、任意の金属ナノ粒子と結合することのできる第１のリンカー化合物、から構成されている。上記ＴＬＲリガンドは、自然免疫応答を活性化し得るＴＬＲと、特異的に結合することができる。
【００２６】
本明細書において、ＴＬＲリガンドと結合する前の化合物であって、ＴＬＲリガンド複合体において第１のリンカー化合物となり得る化合物を、第１のリンカー化合物前駆体とも称する。
【００２７】
（ＴＬＲリガンド）
ＴＬＲリガンドとは、ＴＬＲに対して結合能を有する化合物または分子を意図する。ヒトでは、ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０の１０種類のＴＬＲが同定されており、それぞれのＴＬＲに対して、同一のまたは異なるＴＬＲリガンドが存在する。本発明の一実施形態において、ＴＬＲリガンドとしては、何れのＴＬＲに対するリガンドも使用できる。ＴＬＲリガンドとしては、天然由来リガンド（微生物、ウイルスおよびＴＬＲを発現している生物由来のリガンド）であってもよく、合成リガンドであってもよい。ＴＬＲリガンドとしては、公知のリガンドを用いることができる。
【００２８】
ＴＬＲリガンドは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９に結合して、ＴＬＲの活性を誘起するものであることが好ましい。すなわち、ＴＬＲリガンドは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９に対する結合能を有することが好ましい。ＴＬＲリガンドは、ＴＬＲ４またはＴＬＲ７に対する結合能を有し、ＴＬＲ４またはＴＬＲ７に結合して、ＴＬＲの活性を誘起するものであることがより好ましく、ＴＬＲ７に対する結合能を有し、ＴＬＲ７に結合して、ＴＬＲの活性を誘起するものであることがさらに好ましい。
【００２９】
上記構成によると、得られるＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、免疫応答をより増強する作用を有する。また、上記構成によると、得られるＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、ＴＬＲを介した自然免疫応答をより効果的に誘導可能なアジュバントを提供することができる。
【００３０】
ＴＬＲリガンドは、第１のリンカー化合物を介して金属ナノ粒子に固定化された状態で、ＴＬＲと結合することによりＴＬＲの活性を誘起してもよい。ＴＬＲが存在する細胞内小胞にＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子が輸送された後、ＴＬＲリガンドまたはＴＬＲリガンド複合体は、金属ナノ粒子から遊離してもよい。すなわち、ＴＬＲリガンドは、金属ナノ粒子から遊離したＴＬＲリガンドそのものまたはＴＬＲリガンド複合体の状態で、ＴＬＲと結合することによりＴＬＲの活性を誘起してもよい。
【００３１】
本発明の一実施形態において、用いられ得るＴＬＲリガンドとしては、（ｉ）ＴＬＲ４に対するＴＬＲリガンド（以下、ＴＬＲ４リガンドとも称する）であるモノホスホリルリピッドＡ（下記化学式（１））、４−（（３−ニトロ−５−フェノキフェニル）アミノ）キナゾリン−２−カルボン酸（4−（（3−nitro−5−phenoxyphenyl）amino）quinazoline−2−carboxylic acid）（下記化学式（２））、（ｉｉ）ＴＬＲ７に対するＴＬＲリガンド（以下、ＴＬＲ７リガンドとも称する）であるイミキモド（下記化学式（３））および１Ｖ２０９（下記化学式（４））、（ｉｉｉ）ＴＬＲ８に対するＴＬＲリガンド（以下、ＴＬＲ８リガンドとも称する）であるＶＴＸ−２３３７（下記化学式（５））およびチアゾロキノリン誘導体（下記化学式（６））、並びに（ｉｖ）ＴＬＲ７および８に対するＴＬＲリガンドであるＣＬ０９７（下記化学式（７））およびＲ８４８（下記化学式（８））などが挙げられる。これらは全て合成リガンドである。本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、ＴＬＲリガンドを１種類のみを含んでいてもよく、２種類以上を組み合わせて含んでいてもよい。
【００３２】
これらの中でも、ＴＬＲリガンドの免疫増強活性を失うことなく第１のリンカー化合物にＴＬＲリガンドを容易に導入できることから、本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、下記化学式（４）で表される１Ｖ２０９を含むことが特に好ましい。
【００３３】
【化１】
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【００３４】
【化２】
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【００３５】
【化３】
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【００３６】
【化４】
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【００３７】
【化５】
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【００３８】
【化６】
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【００３９】
【化７】
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【００４０】
【化８】
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【００４１】
ＴＬＲリガンドは、縮合剤の存在下で、第１のリンカー化合物前駆体のアミノ基（例えば、−ＮＨ２基）またはカルボキシ基（−ＣＯＯＨ基）を介して、第１のリンカー化合物前駆体に容易に導入され得る。ＴＬＲリガンドは、第１のリンカー化合物前駆体と結合後、ＴＬＲへの結合親和性を失わないものを指す。なお、カルボキシ基はカルボキシル基と称される場合もあり、カルボキシ基とカルボキシル基は同義である。
【００４２】
ＴＬＲリガンドは、カルボキシ基を有することが好ましい。上記構成によると、縮合剤の存在下で生じる、ＴＬＲリガンドのカルボキシ基と第１のリンカー化合物前駆体のアミノ基との反応（縮合反応またはアミド化反応とも称する。）によって、当該アミノ基を介して、第１のリンカー化合物前駆体により容易にＴＬＲリガンドを導入することが可能である。
【００４３】
カルボキシ基を有するＴＬＲリガンドと第１のリンカー化合物前駆体との縮合反応によって得られるＴＬＲリガンド複合体は、第１のリンカー化合物とＴＬＲリガンドとがアミノ基を介して結合している構造（例えばアミド結合）、を有する。カルボキシ基を有するＴＬＲリガンドとしては、ＴＬＲ７リガンドである１Ｖ２０９が挙げられる。
【００４４】
上記「カルボキシ基を持つＴＬＲリガンド」とは、分子末端にカルボキシ基を有するＴＬＲリガンドであれば、特に限定されるものではないが、リンカー化合物と結合後、ＴＬＲへの結合親和性を失わないものを指す。
【００４５】
ＴＬＲリガンドは、アミノ基を有していてもよい。上記構成によると、縮合剤の存在下で生じる、ＴＬＲリガンドのアミノ基と第１のリンカー化合物前駆体のカルボキシ基との反応（アミド化反応）によって、当該カルボキシ基を介して、第１のリンカー化合物前駆体に容易にＴＬＲリガンドを導入することが可能である。
【００４６】
アミノ基を有するＴＬＲリガンドと第１のリンカー化合物前駆体との縮合反応によって得られるＴＬＲリガンド複合体は、第１のリンカー化合物とＴＬＲリガンドとがカルボニル基を介して結合している構造（例えばアミド結合）、を有する。
【００４７】
アミノ基を持つＴＬＲリガンドとしては、特に限定されるものではないが、分子末端にアミノ基を有し、かつ、リンカー化合物と結合後、ＴＬＲへの結合親和性を失わないものが挙げられる。
【００４８】
ＴＬＲリガンドと第１のリンカー化合物前駆体とのアミド化反応（縮合反応）に用いる縮合剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、ＨＡＴＵ、ＣＯＭＵ、およびＥＤＣ等を挙げることができる。
【００４９】
（第１のリンカー化合物）
第１のリンカー化合物は、主鎖に炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖を備えており、当該主鎖は、その一端に上記ＴＬＲリガンドと結合したアミノ基またはカルボニル基を有し、その他端に硫黄原子（Ｓ）を含む第１の炭化水素構造を有している。
【００５０】
第１のリンカー化合物の主鎖に含まれる炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖は、炭素および水素からなる炭化水素鎖、または、一部の炭素および／または水素が他の原子または置換基に置き換わった炭化水素鎖を意図する。すなわち、上記炭化水素誘導鎖とは、炭化水素鎖の主鎖構造である炭素−炭素結合（Ｃ−Ｃ結合）の一部が、炭素−窒素結合（Ｃ−Ｎ結合）、炭素−酸素結合（Ｃ−Ｏ結合）、およびアミド結合（ＣＯ−ＮＨ結合）などに置き換わっていてもよいものを指す。
【００５１】
硫黄原子を含む第１の炭化水素構造（以下、単に第１の炭化水素構造とも称する）とは、炭素および水素からなる炭化水素構造であり、一部の炭素が硫黄に置き換わっている炭化水素構造を意図する。第１の炭化水素構造は、鎖状（直鎖、および枝分かれ鎖の両方を含む）であってもよく、環状であってもよく、または、鎖状構造および環状構造の両方の構造を含んでいてもよい。
【００５２】
第１の炭化水素構造は、Ｓ−Ｓ結合またはＳＨ基を含む炭化水素構造を備えていることが好ましい。換言すると、第１のリンカー化合物は、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）またはチオール基（ＳＨ基）が含まれている第１の炭化水素構造を主鎖の他端に有していることが好ましい。
【００５３】
上記構成によると、金属ナノ粒子に含まれる金属と第１のリンカー化合物に含まれる硫黄（Ｓ）との間に形成される金属−硫黄結合を介して、第１のリンカー化合物を容易に金属ナノ粒子に固定化することができるという利点を有する。それ故に、上記構成によると、第１のリンカー化合物は、金属ナノ粒子上に１種類以上のＴＬＲリガンドを集合化して配列することができる。金属ナノ粒子とジスルフィド結合またはＳＨ基中の硫黄との間で形成される金属−硫黄結合は、金属と第１のリンカー化合物との結合を強固にすることができる。金属ナノ粒子として金ナノ粒子を用いる場合、上記金属−硫黄結合は、Ａｕ−Ｓ結合である。
【００５４】
第１のリンカー化合物前駆体は、一端にアミノ基を有することが好ましい。上記構成によると、アミノ基を介して、ＴＬＲリガンドを第１のリンカー化合物前駆体に簡便に導入することができる。換言すれば、第１のリンカー化合物前駆体がその一端にアミノ基を有する場合、当該アミノ基は、第１のリンカー化合物の主鎖の一端に含まれるＴＬＲリガンドと結合したアミノ基となり得る。上記アミノ基は、修飾されているアミノ基（例えばアセチル基、メチル基、ホルミル基等で修飾されたアミノ基）または芳香族アミノ基であってもよいし、未修飾のアミノ基であってもよい。
【００５５】
第１のリンカー化合物前駆体は、一端にカルボキシ基を有していてもよい。上記構成によると、カルボキシ基を介して、ＴＬＲリガンドを第１のリンカー化合物前駆体に簡便に導入することができる。換言すれば、第１のリンカー化合物前駆体がその一端にカルボキシ基を有する場合、当該カルボキシ基は、第１のリンカー化合物の主鎖の一端に含まれるＴＬＲリガンドと結合したカルボニル基となり得る。
【００５６】
第１のリンカー化合物前駆体としては、下記化学式（９）にて表される構造を有する化合物が好適に用いられ得る：
【００５７】
【化９】
2019077686.tif 000011
【００５８】
（化学式（９）中、ｐ，ｑはそれぞれ独立して０以上６以下の整数であり、Ｘは、末端にアミノ基または芳香族アミノ基を有するとともに、主鎖に炭素−窒素結合を有していてもよい炭化水素誘導鎖を、１鎖、２鎖または３鎖含んでなる構造であり、Ｙは、硫黄原子または硫黄原子を含む炭化水素構造であり、Ｚは、炭素−炭素結合または炭素−酸素結合をもつ直鎖または分岐を持つ構造である。）。
【００５９】
上記Ｘに含まれ得る芳香族アミノ基の芳香環は、炭化水素のみで構成されていてもよく、炭素以外の元素を含む複素環であってもよい。上記Ｘは、下記の化学式（１０）、化学式（１１）、化学式（１２）、化学式（１３）、化学式（１４）または化学式（１５）にて表される構造を備えることが好ましい：
【００６０】
【化１０】
2019077686.tif 000012
【００６１】
【化１１】
2019077686.tif 000013
【００６２】
（化学式（１０）および化学式（１１）中、ｍ１〜ｍ５はそれぞれ独立して０以上６以下の整数である）
【００６３】
【化１２】
2019077686.tif 000014
【００６４】
【化１３】
2019077686.tif 000015
【００６５】
【化１４】
2019077686.tif 000016
【００６６】
（化学式（１４）中、ｎ３は１以上１００以下の整数である。）
【００６７】
【化１５】
2019077686.tif 000017
【００６８】
上記Ｚは、下記の化学式（１６）または化学式（１７）であってもよい：
【００６９】
【化１６】
2019077686.tif 000018
【００７０】
【化１７】
2019077686.tif 000019
【００７１】
（化学式（１６）および化学式（１７）中、ｎ１およびｎ２はそれぞれ１以上６以下の整数である。）。
【００７２】
第１のリンカー化合物前駆体としては、下記の化学式（１８）、化学式（１９）、化学式（２０）、化学式（２１）、化学式（２２）、化学式（２３）、化学式（２４）、化学式（２５）または化学式（２６）にて表される構造を有する化合物がより好適に用いられ得る：
【００７３】
【化１８】
2019077686.tif 000020
【００７４】
【化１９】
2019077686.tif 000021
【００７５】
【化２０】
2019077686.tif 000022
【００７６】
【化２１】
2019077686.tif 000023
【００７７】
【化２２】
2019077686.tif 000024
【００７８】
【化２３】
2019077686.tif 000025
【００７９】
【化２４】
2019077686.tif 000026
【００８０】
【化２５】
2019077686.tif 000027
【００８１】
【化２６】
2019077686.tif 000028
【００８２】
（化学式（１８）、化学式（１９）、化学式（２０）、化学式（２１）、化学式（２３）および化学式（２６）中、ｍ１〜ｍ５はそれぞれ独立して０以上６以下の整数であり、ｎ１およびｎ２はそれぞれ独立して１以上６以下の整数であり、ｎ３は１以上１００以下の整数であり、ｑは０以上６以下の整数である。）。
【００８３】
上記の化学式（１８）、化学式（１９）、化学式（２０）、化学式（２１）または化学式（２２）にて表される構造を有する化合物は、例えば、チオクト酸（α−リポ酸とも称される。）と、芳香族アミノ基末端が保護基によって保護されたアミン化合物と、の縮合反応を行い、上記芳香族アミノ基末端の保護基を脱保護することによって製造され得る。
【００８４】
上記の化学式（２３）、化学式（２４）または化学式（２５）にて表される化合物は、例えば、チオクト酸とジアミノ化合物の一末端のアミノ基との縮合反応を行うことによって製造され得る。具体的には、チオクト酸とジアミノ化合物との縮合反応により、チオクト酸のカルボキシ基とジアミノ化合物の一末端のアミノ基とが縮合し、アミド結合が形成されることによって、上記の化学式（２３）、化学式（２４）または化学式（２５）にて表される化合物を得ることができる。チオクト酸とジアミノ化合物との縮合反応にジアミノ化合物を供する前に、ジアミノ化合物の一末端のアミノ基を、保護基によって保護してもよい。この場合、縮合反応後に、保護基によって保護されたアミノ基の保護基を脱保護することにより、上記の化学式（２３）、化学式（２４）または化学式（２５）にて表される化合物を得ることができる。
【００８５】
上記化学式（２６）にて表される構造を有する化合物は、例えば、γ−メルカプト酪酸の２量体と、２分子の芳香族アミノ基末端が保護基によって保護されたアミン化合物との縮合反応を行い、上記芳香族アミノ基末端の保護基を脱保護することによって製造され得る。
【００８６】
上記チオクト酸は、
【００８７】
【化２７】
2019077686.tif 000029
【００８８】
にて表される構造を備えている。また、上記アミン化合物は、保護基によって保護された芳香族アミノ基末端を有するものであれば特に限定されるものではない。
【００８９】
上記保護基とは、アミノ基（例えば芳香族アミノ基のアミノ基、またはジアミノ化合物の一末端のアミノ基）が上記縮合反応によって反応しないように導入される置換基である。このような保護基は、特に限定されるものではないが、例えば、ｔ−ブトキシカルボニル基（−ＣＯＯＣ（ＣＨ３）３基；以下、Ｂｏｃ基とも称する。）、ベンジル基、アリルカルバメート基（−ＣＯＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、Ａｌｌｏｃ基）等を挙げることができる。
【００９０】
上述したような第１のリンカー化合物前駆体を用いて、ＴＬＲリガンド複合体を製造することができる。具体的には、縮合剤の存在下で、第１のリンカー化合物前駆体に含まれる（例えば上記Ｘに含まれる）アミノ基または芳香族アミノ基を介して、ＴＬＲリガンドを第１のリンカー化合物前駆体に導入することにより、ＴＬＲリガンド複合体を得ることができる。
【００９１】
第１のリンカー化合物前駆体としては、上記チオクト酸を使用してもよい。具体的には、縮合剤の存在下で、チオクト酸（第１のリンカー化合物前駆体）に含まれるカルボキシ基を介して、ＴＬＲリガンドをチオクト酸に導入することにより、ＴＬＲリガンド複合体を得ることができる。
【００９２】
このようにして得られたＴＬＲリガンド複合体は、第１のリンカー化合物に含まれる（例えば上記Ｙに含まれる）硫黄（Ｓ）と、金属ナノ粒子に含まれる金属との間に形成される金属−硫黄結合を介して、強固にかつ簡便に金属ナノ粒子に固定化され得る。このため、ＴＬＲリガンドを金属ナノ粒子表面に容易に固定化することができる。
【００９３】
（１−２．金属ナノ粒子）
金属ナノ粒子としては、ナノ粒子であり、かつ少なくとも粒子の表面が無機金属成分で覆われている限り、その他の構成は特に限定されない。金属ナノ粒子において、好適に用いられる金属成分としては、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｃｄ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ａｇ、Ｇａ、Ａｓ、Ｉｎ、Ｔｅ、Ｓ、Ａｕなどが挙げられるがこれらに限定されない。金属ナノ粒子の表面は、一種類の金属成分で覆われていてもよく、二種以上の金属成分で覆われていてもよい。これら金属成分の中でも、生物に対する活性が低く、かつ生物に対する毒性が低いことから、Ａｕが好ましい。
【００９４】
金属ナノ粒子の内部（表面以外の部分ともいえる）は、金属以外の材料から構成されていてもよい。金属以外の材料としては、例えば、ガラス、水晶、シリコン（例えば酸化珪素）、ポリマー樹脂（例えばポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネートなど）および炭素（グラファイト）などが挙げられる。
【００９５】
本明細書中において、「ナノ粒子」は水溶液中で分散してコロイド溶液を形成するものが意図される。よって、ナノ粒子の平均粒子径は、０．５〜４００ｎｍの範囲内であることが好ましく、０．５ｎｍ〜１００ｎｍの範囲内であることがより好ましく、１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲内であることがさらに好ましく、１ｎｍ〜２０ｎｍの範囲内であることが特に好ましい。平均粒子径が、（ｉ）０．５ｎｍ以上である場合、低い製造コストでナノ粒子を製造できるため実用的であり、（ｉｉ）４００ｎｍ以下である場合、粒子の分散安定性が経時的に変化しないという利点を有する。本明細書において、上記平均粒子径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって測定した平均粒子径をいう。
【００９６】
（１−３．ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子による免疫増強活性）
本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、ＴＬＲに対する結合を介した免疫増強活性を有することが好ましい。免疫増強活性とは、生物（個体、臓器、細胞などを含む）が有する免疫応答を増強し得る活性を意図する。上記免疫応答は、自然免疫に対する免疫応答であってもよく、獲得免疫に対する免疫応答であってもよい。
【００９７】
ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、ＴＬＲに対する結合を介して、免疫応答を活性化し得る分子の産生を増加させる効果を有することが好ましい。免疫応答を活性化し得る分子としては、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α等が挙げられる。
【００９８】
ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、免疫応答を活性化した結果として、抗体の産生を増加させる効果を有することが好ましい。上記抗体としては、例えば哺乳類ではＩｇＡおよびそのサブクラス、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびそのサブクラス、並びにＩｇＭが挙げられる。
【００９９】
（１−４．ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の製造方法）
本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、特に限定されないが、例えば、金属ナノ粒子を含む溶液と、上述した構成を有するＴＬＲリガンド複合体を含む溶液との混和によって得ることができる。上記混和により、ＴＬＲリガンド複合体の硫黄原子（Ｓ）が、金属ナノ粒子の表面上の金属と金属−硫黄結合によって結合する。
【０１００】
金属ナノ粒子として金ナノ粒子を用いる場合を例に挙げ、さらに具体的に説明する。この場合、金ナノ粒子の溶液に上記ＴＬＲリガンド複合体を含む溶液を添加する。これによって、ＴＬＲリガンド複合体のＳ−Ｓ結合を、金ナノ粒子の表面上の金−硫黄結合に変換することにより、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子として、ＴＬＲリガンド複合体を固定化した金ナノ粒子を得ることができる。
【０１０１】
なお、金属が塩として溶液に含まれているときは、上記ＴＬＲリガンド複合体と混和する前に、還元剤を用いて金属を還元しておくことが好ましい。これにより、金属とＴＬＲリガンド複合体との結合を形成しやすくすることができる。還元剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、クエン酸およびその塩類、アスコルビン酸およびその塩類、リン、タンニン酸およびその塩類、エタノール、ヒドラジン等を用いることができる。
【０１０２】
上述した方法により得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、水溶液中で分散する特徴を有している。すなわち、上述した方法は、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子のコロイド溶液を調製する方法でもある。
【０１０３】
ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子を調製するために用いる金属、ＴＬＲリガンド複合体、および任意で還元剤、の各々の混合比は、特に限定されるものではない。金属が塩化金酸またはその塩類である場合を例に挙げて、混合溶液中の各成分の濃度について説明する。
【０１０４】
混合溶液における、塩化金酸またはその塩類の最終濃度は０．１ｍＭ〜１０ｍＭであることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭであることがより好ましく、０．１ｍＭ〜１ｍＭであることがさらに好ましい。混合溶液における、還元剤の最終濃度は、塩化金酸またはその塩類のモル濃度の３〜１０倍モル濃度であることが好ましく、４〜５倍モル濃度であることがさらに好ましい。混合溶液における、ＴＬＲリガンド複合体の最終濃度は、０．０１ｍＭ〜１ｍＭであることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭであることがより好ましく、０．１ｍＭ〜１ｍＭであることがさらに好ましい。
【０１０５】
金属ナノ粒子およびＴＬＲリガンド複合体を含む溶液に用いる溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えば、超純水、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、メタノール、およびこれらの混合溶媒等を挙げることができる。また、上述した方法によって得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子をさらに透析または遠心濾過することにより、低分子の塩等の成分を除くことができる。これにより、溶液状態で安定なＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子を得ることができる。
【０１０６】
本発明の一実施形態では、１種類の第１のリンカー化合物前駆体と、１種類のＴＬＲリガンドとを用いて製造された、１種類のＴＬＲリガンド複合体のみを金属ナノ粒子に固定化して、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子としてもよい。
【０１０７】
本発明の一実施形態では、１種類の第１のリンカー化合物前駆体と、２種類以上のＴＬＲリガンドとを用いて製造された、２種類以上のＴＬＲリガンド複合体を金属ナノ粒子に固定化して、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子としてもよい。
【０１０８】
本発明の一実施形態では、２種類の第１のリンカー化合物前駆体と、１種類以上のＴＬＲリガンドとを用いて製造された、２種類以上のＴＬＲリガンド複合体を金属ナノ粒子に固定化して、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子としてもよい。
【０１０９】
（１−５．糖鎖リガンド複合体）
本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、糖鎖リガンド複合体をさらに含むことが好ましい。上記糖鎖リガンド複合体は、糖鎖と、主鎖に炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖を備えた第２のリンカー化合物とを有し、上記第２のリンカー化合物の主鎖は、その一端に上記糖鎖と結合したアミノ基またはカルボニル基を有し、その他端に硫黄原子を含む第２の炭化水素構造を有しており、上記第２の炭化水素構造が上記金属ナノ粒子に固定化されているものである。すなわち、上記糖鎖リガンド複合体は、金属ナノ粒子に固定化されている。
【０１１０】
本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、上述の構成を有する糖鎖リガンド複合体をさらに含有することによって、糖鎖リガンド複合体の金属ナノ粒子への固定化を通して、金属ナノ粒子に固定化したＴＬＲリガンド複合体の局所密度を好適に調整することができる。
【０１１１】
すなわち、ＴＬＲリガンド複合体と糖鎖リガンド複合体とを、金属ナノ粒子に共固定化することによって、金属ナノ粒子に固定化したＴＬＲリガンド複合体の局所密度が調整されたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子もまた、本発明の一実施形態の範囲内である。
【０１１２】
本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、また、上述の構成を有する糖鎖リガンド複合体をさらに含有することによって、後述する実施例に示すように、ＴＬＲリガンド固定化金属ナノ粒子の親水性を増すことができる。したがって、水中で安定に分散し、さらに糖鎖が持つ特徴も有するＴＬＲリガンド固定化金属ナノ粒子を得ることができる。
【０１１３】
本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、また、上述の構成を有する糖鎖リガンド複合体をさらに含有することによって、免疫応答をより増強する作用を有し得る。免疫応答をより増強可能な理由としては、以下のような理由が考えられるが、本発明の一実施形態は当該理由によって制限されるものではない。
【０１１４】
すなわち、樹状細胞およびマクロファージなどの抗原提示細胞の細胞膜表層には、外来異物を捕捉するためのマンノース受容体、マクロファージガラクトースレクチンなどのＣ型レクチン受容体、などの糖鎖受容体が発現している。そのため、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子が糖鎖リガンド複合体をさらに含有することにより、抗原提示細胞にＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子を効率的に輸送できるようになる。その結果、免疫応答がより増強されるものと考えられる。本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、上述の構成を有する糖鎖リガンド複合体をさらに含有することによって、より効果的なアジュバントを提供できると期待できる。
【０１１５】
本明細書において、糖鎖と結合する前の化合物であって、糖鎖リガンド複合体において第２のリンカー化合物となり得る化合物を、第２のリンカー化合物前駆体とも称する。
【０１１６】
（糖鎖）
本発明の一実施形態で用いられ得る糖鎖としては、１つ以上の糖を有する限り、その他の構成は特に限定されない。すなわち、糖鎖には、単糖も含まれる。糖鎖は、糖がグリコシド結合によって複数結合した化合物であってもよい。すなわち、糖鎖には、オリゴ糖または多糖も含まれる。
【０１１７】
糖鎖は、公知の方法により、第２のリンカー化合物前駆体のアミノ基（例えば、−ＮＨ２基）またはカルボキシ基（−ＣＯＯＨ基）を介して、第２のリンカー化合物前駆体に容易に導入され得る。第２のリンカー化合物前駆体により容易に導入することができることから、糖鎖は還元末端を有することが好ましい。上記構成によると、糖鎖の還元末端と第２のリンカー化合物前駆体のアミノ基との還元アミノ化反応により、当該アミノ基を介して、第２のリンカー化合物前駆体により容易に糖鎖を導入することが可能である。
【０１１８】
上記還元アミノ化反応の具体例を以下に説明する。すなわち、平衡によって生じる糖鎖中のアルデヒド基（−ＣＨＯ基）またはケトン基（−ＣＲＯ基、ここでＲは炭化水素基）と、第２のリンカー化合物前駆体のアミノ基（例えば、−ＮＨ２基）とが反応する。そして、この反応によって形成されたシッフ塩基を引き続き還元することによって、アミノ基を介して、第２のリンカー化合物前駆体により容易に糖鎖を導入することができる。還元末端を有する糖鎖と第２のリンカー化合物前駆体との還元アミノ化反応によって得られる糖鎖リガンド複合体は、第２のリンカー化合物と糖鎖とがアミノ基を介して結合している構造（例えばアミド結合）、を有する。
【０１１９】
上記「還元末端を有する糖鎖」とは、アノマー炭素原子が置換を受けていない単糖、オリゴ糖鎖、または多糖鎖などが挙げられる。上記還元末端を有する糖鎖とは、還元糖鎖であるともいえる。
【０１２０】
糖鎖は、還元末端を有していなくてもよく、例えば末端にアルキルアミン、またはアミノ基など有していてもよい。上記構成によると、縮合剤の存在下で生じる、糖鎖のアルキルアミンまたはアミノ基と第１のリンカー化合物前駆体のカルボキシ基との反応によって、当該カルボキシ基を介して、第１のリンカー化合物前駆体に容易に糖鎖を導入することが可能である。
【０１２１】
アルキルアミンまたはアミノ基を有する糖鎖と第１のリンカー化合物前駆体との縮合反応によって得られる糖鎖リガンド複合体は、第１のリンカー化合物と糖鎖とがカルボニル基を介して結合している構造（例えばアミド結合）、を有する。
【０１２２】
糖鎖が、オリゴ糖または多糖である場合、同一の糖からなる単一オリゴ糖または多糖であってもよいし、種々の糖もしくはその誘導体からなる複合糖であってもよい。上記糖鎖を構成する単糖、オリゴ糖または多糖は、いずれも、自然界から単離および精製して得られる種々の天然の糖であってもよく、人工的に合成された糖であってもよい。上記単糖またはオリゴ糖は、多糖を分解して得られたものであってもよい。上記オリゴ糖または多糖は、糖により形成された直鎖状の構造を有していてもよく、糖により形成された枝分かれした構造（分枝構造）を有していてもよい。また、糖鎖としては、市販のものを利用することもできる。
【０１２３】
糖鎖を構成する糖としては、特に限定されるものではないが、グルコース、ガラクトース、マンノース、マルトース、イソマルトース、ラクトース、パノース、セロビオース、メリビオース、マンノオリゴ糖鎖、キトオリゴ糖鎖、ラミナリオリゴ糖鎖、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルクロン酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、などの還元末端を有する糖が好適に用いられ得る。また、シアリルラクトース等のシアル酸を有する糖、およびデキストラン硫酸などの硫酸化糖（硫酸基を有する糖）も好適に用いられ得る。
【０１２４】
具体的には糖鎖としては、Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ、Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ、Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ、Ｇｌｃα１−６Ｇｌｃ、Ｇｌｃα１−６Ｇｌｃα１−６Ｇｌｃ、Ｇｌｃβ１−３Ｇｌｃβ１−３Ｇｌｃ、Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃ、Ｇｌｃβ１−６Ｇｌｃ、Ｇａｌα１−６Ｇｌｃ、Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−６Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−４［Ｆｕｃα１−２］ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｍａｎα１−２Ｍａｎ、Ｍａｎα１−３Ｍａｎα１−６Ｍａｎ、Ｍａｎα１−６Ｍａｎ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｆｕｃα１−６Ｇｌｃ、Ｆｕｃβ１−６Ｇｌｃ、Ｘｙｌβ１−６Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃα１−６Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、ＧａｌＮＡｃα１−６Ｇｌｃ、ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＳ６Ｓα１−４ＩｄｏＡ２Ｓβ１−６Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｇｌｃ、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ4Ｓβ１−６Ｇｌｃ、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ６Ｓβ１−６Ｇｌｃ、ＧｌｃＡ２Ｓβ１−３ＧａｌＮＡｃ６Ｓβ１−６Ｇｌｃ、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓβ１−６Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＳ６Ｓα１−４ＩｄｏＡ２Ｓα１−６Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＳα１−４ＩｄｏＡ２Ｓα１−６Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＳ６Ｓα１−４ＧｌｃＡ２Ｓβ１−６Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＳα１−４ＧｌｃＡβ１−６Ｇｌｃ等を挙げることができる。
【０１２５】
なお、本明細書において、略語「Ｇｌｃ」はグルコース（Glucose）を、略語「Ｇａｌ」はガラクトース（Galactose）を、略語「Ｍａｎ」はマンノース（Mannose）を、略語「Ｆｕｃ」はフコース（Fucose）を、略語「Ｘｙｌ」はキシロース（Xylose）を、略語「ＮＡｃ」はＮ−アセチル（N-Acetyl）を、略語「Ｉｄｏ」はイドース（Idose）を、略語「Ｎｅｕ５Ａｃ」はＮ−アセチルノイラミン酸（N-Acetylneuraminic acid）を、略語「GｌｃＡ」はグルクロン酸（Glucuronic  acid）を、略語「ＩｄｏＡ」はイズロン酸（Iduronic aid）を、糖鎖の化学式中に表される「Ｓ」はスルフォニル（硫酸基）をそれぞれ表す。例えば、ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ４Ｓβ１−６Ｇｌｃにおける「４Ｓ」は４−Ｏ−硫酸を表す。
【０１２６】
また、糖鎖の化学式における「α」または「β」は、還元末端側の糖の水酸基がαまたはβの立体構造で隣り合う糖の水酸基と結合していることを示す。例えば、「α１−４」は還元末端側の糖の１位水酸基がαの立体構造で隣り合う糖の4位の水酸基と結合していることを示す。
【０１２７】
上記糖鎖は、グルコース、ガラクトース、マンノースおよびシアル酸からなる群から選択される１つの化合物からなる単糖、または上記群から選択される２つ以上の化合物を含むオリゴ糖もしくは多糖であることが好ましい。上記構成によると、得られるＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、免疫応答をさらに増強する作用を有し得る。
【０１２８】
本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、糖鎖を１種類のみを含んでいてもよく、２種類以上を組み合わせて含んでいてもよい。
【０１２９】
（第２のリンカー化合物）
第２のリンカー化合物は、主鎖に炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖を備えており、当該主鎖は、その一端に上記糖鎖と結合したアミノ基またはカルボニル基を有し、その他端に硫黄原子（Ｓ）を含む第２の炭化水素構造を有している。
【０１３０】
第２のリンカー化合物の主鎖に含まれる炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖、および第２の炭化水素構造の態様は、それぞれ第１のリンカー化合物の主鎖に含まれる炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖、および第１の炭化水素構造の態様と同様であってもよい。すなわち、上記（第１のリンカー化合物）の項の説明を適宜援用できる。第２の炭化水素構造の態様が、第１の炭化水素構造の態様と同様である場合、第２のリンカー化合物は、金属ナノ粒子上に２種類以上の糖鎖を集合化して配列することができる。
【０１３１】
第２のリンカー化合物前駆体は、一端にアミノ基を有することが好ましい。上記構成によると、アミノ基を介して、糖鎖を第２のリンカー化合物前駆体に簡便に導入することができる。換言すれば、第２のリンカー化合物前駆体がその一端にアミノ基を有する場合、当該アミノ基は、第２のリンカー化合物の主鎖の一端に含まれる糖鎖と結合したアミノ基となり得る。上記アミノ基は、修飾されているアミノ基（例えばアセチル基、メチル基、ホルミル基等で修飾されたアミノ基）または芳香族アミノ基であってもよいし、未修飾のアミノ基であってもよい。上述したように、糖鎖は、好ましくは、糖鎖と第２のリンカー化合物との還元アミノ化反応によって製造され得る。還元アミノ化反応の最適条件であるｐＨ３〜４においては、アミノ基がプロトン化されないことが必要である。そのため、芳香族との共役によってｐＨ３〜４でも非共有電子対が窒素原子上に存在する芳香族アミノ基が好ましい。
【０１３２】
第２のリンカー化合物前駆体は、一端にカルボキシ基を有していてもよい。上記構成によると、カルボキシ基を介して、糖鎖を第２のリンカー化合物前駆体に簡便に導入することができる。換言すれば、第２のリンカー化合物前駆体がその一端にカルボキシ基を有する場合、当該カルボキシ基は、第２のリンカー化合物の主鎖の一端に含まれる糖鎖と結合したカルボニル基となり得る。第２のリンカー化合物前駆体としては、上記チオクト酸を使用してもよい。
【０１３３】
第２のリンカー化合物前駆体としては、第１のリンカー化合物前駆体と同様のものを使用できる。すなわち、第２のリンカー化合物前駆体の態様としては、上記（第１のリンカー化合物）の項の第１のリンカー化合物前駆体に関する説明を適宜援用できる。本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子において、第２のリンカー化合物前駆体と第１のリンカー化合物前駆体は同一であってもよく、異なっていてもよい。
【０１３４】
上述したような第２のリンカー化合物前駆体を用いて、糖鎖リガンド複合体を製造することができる。具体的には、第２のリンカー化合物前駆体に含まれる（例えば上記Ｘに含まれる）アミノ基または芳香族アミノ基を介して、還元アミノ化反応などにより、糖鎖を第２のリンカー化合物前駆体に導入して、糖鎖リガンド複合体を得ることができる。
【０１３５】
このようにして得られた糖鎖リガンド複合体は、第２のリンカー化合物に含まれる（例えば上記Ｙに含まれる）硫黄（Ｓ）と、金属ナノ粒子に含まれる金属との間に形成される金属−硫黄結合を介して、強固にかつ簡便に金属ナノ粒子に固定化され得る。このため、糖鎖を金属ナノ粒子表面に容易に固定化することができる。
【０１３６】
（糖鎖リガンド複合体の固定化方法）
糖鎖リガンド複合体を金属ナノ粒子に固定化する方法としては、特に限定されないが、例えば、金属ナノ粒子を含む溶液と、上述した構成を有する糖鎖リガンド複合体を含む溶液との混和によって得ることができる。上記混和により、ＴＬＲリガンド複合体の硫黄原子（Ｓ）が、金属ナノ粒子の表面上の金属と金属−硫黄結合によって結合する。金属ナノ粒子として金ナノ粒子を用いる場合を例に挙げ、さらに具体的に説明する。この場合、金ナノ粒子の溶液に還元剤処理した上記糖鎖リガンド複合体を含む溶液を添加する。これによって、糖鎖リガンド複合体のＳ−Ｓ結合を、金ナノ粒子の表面上の金−硫黄結合に変換することにより、糖鎖リガンド複合体が固定化された金ナノ粒子を得ることができる。
【０１３７】
糖鎖リガンド複合体の還元処理に用いられる還元剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの塩類および陽イオン成分が異なる塩類等を挙げることができる。
【０１３８】
糖鎖リガンド複合体を金属ナノ粒子に固定化する方法としては、上記（１−４．ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の製造方法）の項に記載された、ＴＬＲリガンド複合体を金属ナノ粒子に固定化する方法と同様の方法が用いられてもよい。それ故に、金属が塩として溶液に含まれているときは、糖鎖と混和する前に、上述したように還元剤を用いて金属を還元しておくことが好ましい。
【０１３９】
糖鎖リガンド複合体を金属ナノ粒子に固定化するために用いられる金属、糖鎖リガンド複合体、および還元剤、の各々の混合比は、特に限定されるものではない。金属が塩化金酸またはその塩類である場合を例に挙げて、混合溶液中の各成分の濃度について説明する。混合溶液における、塩化金酸またはその塩類の最終濃度は０．１ｍＭ〜１０ｍＭであることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭであることがより好ましく、０．１ｍＭ〜１ｍＭであることがさらに好ましい。混合溶液における、糖鎖リガンド複合体の最終濃度は、０．１ｍＭ〜１０ｍＭであることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭであることがより好ましく、０．１ｍＭ〜１ｍＭであることがさらに好ましい。混合溶液における、還元剤の最終濃度は、糖鎖リガンド複合体のモル濃度の３〜１０倍モル濃度であることが好ましく、５〜１０倍モル濃度であることがより好ましく、８〜１０倍モル濃度であることがさらに好ましい。
【０１４０】
金属ナノ粒子および糖鎖リガンド複合体を含む溶液に用いる溶媒としては、ＴＬＲリガンド複合体を金属ナノ粒子に固定化するときに用いられ得る溶媒と同様の溶媒を用いることができる。
【０１４１】
糖鎖リガンド複合体の金属ナノ粒子に対する固定化は、ＴＬＲリガンド複合体の金属粒子に対する固定化前に行われてもよく、固定化後に行われてもよく、固定化と同時に行われてもよい。すなわち、ＴＬＲリガンド複合体と糖鎖リガンド複合体とを一緒に金属ナノ粒子に固定化することにより、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子を製造してもよい。
【０１４２】
本発明の一実施形態では、１種類以上のＴＬＲリガンド複合体を固定化した金属ナノ粒子に対して、１種類の第２のリンカー化合物前駆体と１種類の糖鎖とを用いて製造された、１種類の糖鎖リガンド複合体のみをさらに固定化して、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子としてもよい。
【０１４３】
本発明の一実施形態では、１種類以上のＴＬＲリガンド複合体を固定化した金属ナノ粒子に対して、１種類の第２のリンカー化合物前駆体と２種類以上の糖鎖とを用いて製造された、２種類以上の糖鎖リガンド複合体をさらに固定化して、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子としてもよい。
【０１４４】
本発明の一実施形態では、１種類以上のＴＬＲリガンド複合体を固定化した金属ナノ粒子に対して、２種類の第２のリンカー化合物前駆体と１種類以上の糖鎖とを用いて製造された、２種類以上の糖鎖リガンド複合体をさらに固定化して、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子としてもよい。
【０１４５】
［２．アジュバント組成物］
本発明の一実施形態に係るアジュバント組成物は、上記［１．ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子］の項で説明したＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子を含んでいる。アジュバント組成物は、例えば水などの溶媒にＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子を含んでなる溶液であってもよい。ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は水中における分散性が良好であるため、アジュバント組成物の溶液を得るための溶媒として、水を使用できる。
【０１４６】
アジュバント組成物は、任意で、緩衝剤、ｐＨ調整剤、塩類、安定化剤、賦形剤、酸化防止剤などをさらに含んでいてもよい。
【０１４７】
水などの溶媒に、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子および任意で他の物質を分散させることにより、容易にアジュバント組成物の溶液を製造することができる。
【０１４８】
アジュバント組成物は、生物、並びに生物由来の組織および細胞などに投与することにより、生物、並びに生物由来の組織および細胞などにおける免疫応答を活性化することができる。
【０１４９】
アジュバント組成物の投与方法は、特に限定されるものではないが、例えば哺乳動物に投与する場合、静脈注射、腹腔内注射、皮内注射、皮下注射、筋肉注射などの方法が挙げられる。
【０１５０】
アジュバント組成物の投与量、投与期間、投与間隔などは、目的とする免疫応答の活性状態に合わせて適宜設定され得る。
【０１５１】
なお、本発明は以下のように構成することも可能である。
【０１５２】
本発明の一実施形態に係る金ナノ粒子は、ＴＬＲリガンドと、糖鎖と、主鎖に炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖を備えたリンカー化合物とからなり、上記リンカー化合物の主鎖が、その一端に上記ＴＬＲリガンドと結合したアミノ基を有し、その他端に硫黄原子を含む炭化水素構造を備えているＴＬＲリガンド誘導体と、金ナノ粒子と、を含有し、上記炭化水素構造が金ナノ粒子に固定化されてなる。
【０１５３】
本発明の一実施形態に係る金ナノ粒子は、上記ＴＬＲリガンドが、ＴＬＲ４またはＴＬＲ７に結合して、ＴＬＲの活性を誘起するものである。
【０１５４】
本発明の一実施形態に係る金ナノ粒子は、上記糖鎖が、グルコースまたはガラクトースまたはマンノースまたはシアル酸からなる単糖またはオリゴ糖または多糖である。
【実施例】
【０１５５】
以下、本発明の一実施形態を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【０１５６】
以下の実施例における各測定方法または評価方法は以下の通りである。
【０１５７】
（ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の透過型電子顕微鏡画像の取得方法および平均粒径の測定方法）
ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子をグリッド（コロジオン膜貼付メッシュ、４００メッシュ、Ｃｕ、日新ＥＭ社製）に載せ、余分な水分を除去後、減圧下で乾燥させた。得られたグリッドをサンプルステージに載せ、ＨＴ７７００（日立ハイテクノロジーズ社製）の測定部へ入れ、透過型電子顕微鏡画像を撮影した。得られた画像から、ソフトウェアＩｍａｇｅＪを用いて平均粒子径を測定した。
【０１５８】
（ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）法による平均粒径の測定方法）
ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子を石英セルに移し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ（マルバーン社製）の測定部へ入れ、流体力学的粒径を測定した。
【０１５９】
（ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳの測定方法）
ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）を、メタノール溶液（水／メタノールの１／１溶液）に溶解し、ＤＨＢＡ溶液を調製した。ＤＨＢＡ溶液におけるＤＨＢＡの濃度は１０ｍｇ／ｍＬとした。得られたＤＨＢＡ溶液１０μＬと製造例６および７で得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の水溶液１μＬとを混合し、混合液１μＬを測定プレートに載せ、自然乾燥させた。その後、測定プレートをＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ−ＰＲＯ（Applied Biosystems，CA，USA）の測定部へ入れ、質量分析を行った。
【０１６０】
（ＨＰＬＣによる、金属ナノ粒子に固定化されたＴＬＲリガンド複合体の定量方法）
ミクロチューブにＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の水溶液１００μＬを入れ、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子を凍結乾燥した。続いて、得られた凍結乾燥物にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１０μＬと、シアン化カリウム水溶液（８００ｍＭ）３０μＬを加えて、混合物を２時間撹拌した。その後、混合物にＤＭＳＯ１０μＬをさらに加え、混合物をＨＰＬＣ分析に供した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。カラム：Inertsil（登録商標）ODS-3、粒子径：φ４．６μｍ、カラム長：１５０ｍｍ、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、溶出液：０〜５分（５０％メタノール水溶液）、５〜１５分（５０％メタノール水溶液の後、７０％メタノール水溶液）、１５〜２５分（７０％メタノール水溶液）、２５〜３５分（７０％メタノール水溶液の後、メタノール）、３５〜４０分（メタノール）。
【０１６１】
得られた結果におけるピーク面積から金属ナノ粒子（具体的には金ナノ粒子を使用しており、図および表中、ＧＮＰと示す）に固定化されたＴＬＲリガンド複合体の量を算出した。検量線の作成のために、標準試料として、ＴＬＲ７リガンド複合体（１Ｖ２０９−ＴＴＤＤＡ−ＴＡ、１Ｖ２０９−ｍＰＤＡ−ＴＡ、または１Ｖ２０９−ＥＤＡ−ＴＡ）の６．３μＭ〜５０μＭの溶液を用い、上記と同様にＨＰＬＣを行った。得られた結果におけるピーク面積から検量線を作成し、当該検量線を用いて、金属ナノ粒子に固定化されたＴＬＲリガンド複合体の量を算出した。
【０１６２】
以下の製造例では、ＴＬＲリガンドとして、ＴＬＲに対するリガンドである１Ｖ２０９を使用した。１Ｖ２０９は、非特許文献４に記載の方法によって、製造した。
【０１６３】
［製造例１：ＴＬＲリガンド複合体（１Ｖ２０９−ＴＴＤＤＡ−ＴＡ）の合成］
図１は、本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド複合体（１Ｖ２０９−ＴＴＤＤＡ−ＴＡ）の合成経路を示す図である。１Ｖ２０９−ＴＴＤＤＡ−ＴＡでは、ジアミノ化合物である４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン（ＴＴＤＤＡ）とチオクト酸との縮合反応により、上記化学式（２３）にて表される第１のリンカー化合物前駆体を作製した。得られた第１のリンカー化合物前駆体に１Ｖ２０９を導入してＴＬＲリガンド複合体である１Ｖ２０９−ＴＴＤＤＡ−ＴＡを得た。具体的な合成経路を以下に説明する。
【０１６４】
まず、図１に示すように、ＴＴＤＤＡ（図１中、式（ａ）として示す）の一末端をＢｏｃ基で保護することによって、式（ｂ）に示す化合物を粗収率７６％で調製した。
【０１６５】
続いて、ＨＡＴＵ（縮合剤）およびトリエチルアミンの存在下、ジメチルホルムアミド中で、式（ｂ）に示す化合物のアミノ基にチオクト酸を縮合し、式（ｃ）に示す化合物を粗収率６２％で調製した。
【０１６６】
その後、式（ｃ）に示す化合物のＢｏｃ基を、トリフルオロ酢酸を用いて脱保護することで、化学式（２３）にて表される第１のリンカー化合物前駆体を得た。
【０１６７】
次に、ＨＡＴＵおよびトリエチルアミンの存在下、ジメチルホルムアミド中で、化学式（２３）にて表される第１のリンカー化合物前駆体のアミノ基に、１Ｖ２０９を縮合し、式（ｄ）に示すＴＬＲリガンド複合体（１Ｖ２０９−ＴＴＤＤＡ−ＴＡ）を収率４３％で得た。
【０１６８】
得られたＴＬＲリガンド複合体（１Ｖ２０９−ＴＴＤＤＡ−ＴＡ）のスペクトルデータは以下の通りである。
ＨＲ  ＭＳ：ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ（理論値）Ｃ３４Ｈ５１Ｎ７Ｏ８Ｓ２Ｎａ＋：７７２．３１３３；ｆｏｕｎｄ（実測値）：７７２．３１３６[Ｍ＋Ｎａ]＋。
【０１６９】
［製造例２：ＴＬＲリガンド複合体（１Ｖ２０９−ｍＰＤＡ−ＴＡ）の合成］
図２は、本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド複合体（１Ｖ２０９−ｍＰＤＡ−ＴＡ）の合成経路を示す図である。１Ｖ２０９−ｍＰＤＡ−ＴＡでは、ジアミノ化合物であるｍ−フェニレンジアミン（ｍＰＤＡ）とチオクト酸との縮合反応により、上記化学式（２４）にて表される第１のリンカー化合物前駆体を作製した。得られた第１のリンカー化合物前駆体に１Ｖ２０９を導入してＴＬＲリガンド複合体である１Ｖ２０９−ｍＰＤＡ−ＴＡを得た。具体的な合成経路を以下に説明する。
【０１７０】
まず、図２に示すように、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）の存在下、ジメチルホルムアミド中で、ｍＰＤＡ（図１中、式（ｅ）として示す）のアミノ基にチオクト酸を縮合し、化学式（２４）にて表される第１のリンカー化合物前駆体を収率９９％で調製した。
【０１７１】
その後、ＨＡＴＵおよびトリエチルアミンの存在下、ジメチルホルムアミド中で、得られた化学式（２４）にて表される第１のリンカー化合物前駆体のアミノ基に、１Ｖ２０９を縮合し、式（ｆ）に示すＴＬＲリガンド複合体（１Ｖ２０９−ｍＰＤＡ−ＴＡ）を収率１８％で得た。
【０１７２】
得られたＴＬＲリガンド複合体（１Ｖ２０９−ｍＰＤＡ−ＴＡ）のスペクトルデータは以下の通りである。
ＨＲ  ＭＳ：ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ（理論値）Ｃ３０Ｈ３５Ｎ７Ｏ５Ｓ２Ｎａ＋：６６０．２０３３；ｆｏｕｎｄ（実測値）：６６０．２０３９[Ｍ＋Ｎａ]＋。
【０１７３】
［製造例３：ＴＬＲリガンド複合体（１Ｖ２０９−ＥＤＡ−ＴＡ）の合成］
図３は、本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド複合体（１Ｖ２０９−ＥＤＡ−ＴＡ）の合成経路を示す図である。１Ｖ２０９−ＥＤＡ−ＴＡでは、ジアミノ化合物であるエチレンジアミン（ＥＤＡ）とチオクト酸との縮合反応により、上記化学式（２５）にて表される第１のリンカー化合物前駆体を作製した。得られた第１のリンカー化合物前駆体に１Ｖ２０９を導入してＴＬＲリガンド複合体である１Ｖ２０９−Ｅ−ＴＡを得た。具体的な合成経路を以下に説明する。
【０１７４】
まず、図３に示すように、ＨＡＴＵおよびトリエチルアミンの存在下、ジメチルホルムアミド／クロロホルム混合溶媒中で、ＥＤＡ（図１中、式（ｇ）として示す）のアミノ基にチオクト酸を縮合し、化学式（２５）にて表される第１のリンカー化合物前駆体を調製した。
【０１７５】
その後、ＨＡＴＵおよびトリエチルアミンの存在下、ジメチルホルムアミド中で、得られた化学式（２５）にて表される第１のリンカー化合物前駆体のアミノ基に、１Ｖ２０９を縮合し、式（ｈ）に示すＴＬＲリガンド複合体（１Ｖ２０９−ＥＤＡ−ＴＡ）を収率２３％で得た。
【０１７６】
得られたＴＬＲリガンド複合体（１Ｖ２０９−ＥＤＡ−ＴＡ）のスペクトルデータは以下の通りである。
ＨＲ  ＭＳ：ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ（理論値）Ｃ２６Ｈ３５Ｎ７Ｏ５Ｓ２Ｈ＋：５９０．２２１４；ｆｏｕｎｄ：５９０．２２１４[Ｍ＋Ｈ]＋。
［製造例４：αグルコースを含有する糖鎖リガンド複合体（Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ）の合成］
図４は、糖鎖リガンド複合体（Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ）の合成経路を示す図である。Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏは、化学式（２４）にて表される第２のリンカー化合物前駆体に、糖鎖としてマルトース一水和物を導入して得られた。具体的な合成経路を以下に説明する。なお、Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ中に表される「ｍｏｎｏ」は、化学式（２４）にて表される第２のリンカー化合物前駆体を表している。
【０１７７】
図４に示すように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムおよび酢酸の存在下、ジメチルアセトアミド水溶液中で、化学式（２４）にて表される第２のリンカー化合物前駆体のアミノ基に、還元アミノ化反応により、マルトース一水和物を縮合し、式（ｊ）に示す糖鎖リガンド複合体（Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ）を収率３０％で得た。
【０１７８】
得られた糖鎖リガンド複合体（Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ）のスペクトルデータは以下の通りである。
ＨＲ  ＭＳ：ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ（理論値）Ｃ２６Ｈ４２Ｎ２Ｏ１１Ｓ２Ｋ：６６１．１８６２；ｆｏｕｎｄ（実測値）：６６１．２０８５[Ｍ＋Ｋ]＋。
【０１７９】
［製造例５：αマンノースおよびαグルコースを含有する糖鎖リガンド複合体（Ｍａｎα１−６Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ）の合成］
図１１は、糖鎖リガンド複合体（Ｍａｎα１−６Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ、以下単にαＭａｎとも称する）の合成経路を示す図である。Ｍａｎα１−６Ｇｌｃ−ｍｏｎｏは、化学式（２４）にて表される第２のリンカー化合物前駆体に、糖鎖として、合成糖であるＭａｎα１−６Ｇｌｃを導入して得られた。具体的な合成経路を以下に説明する。
【０１８０】
図１１に示すように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムおよび酢酸の存在下、ジメチルアセトアミド水溶液中で、化学式（２４）にて表される第２のリンカー化合物前駆体のアミノ基に、還元アミノ化反応により、Ｍａｎα１−６Ｇｌｃを縮合し、式（ｋ）に示す糖鎖リガンド複合体（Ｍａｎα１−６Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ）を収率９４％で得た。
【０１８１】
得られた鎖リガンド複合体（Ｍａｎα１−６Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ）のスペクトルデータは以下の通りである。
ＨＲ  ＭＳ：ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ（理論値）Ｃ２６Ｈ４２Ｎ２Ｏ１１Ｓ２Ｎａ：６４５．２１２６；ｆｏｕｎｄ（実測値）：６４５．２１２２[Ｍ＋Ｎａ]＋。
【０１８２】
［製造例６：ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＧｌｃ−ＧＮＰ）の調製］
１５ｍＬのコニカルチューブに２０ｍＭの塩化金酸ナトリウム（ナカライテスク社製）水溶液１２５μＬを加え、超純水１２５０μＬをさらに加えた。得られた溶液に、５０ｍＭの水素化ホウ素ナトリウム（ナカライテスク社製）水溶液２５０μＬを加え、遮光下、室温で混合物を１０分間激しく撹拌した。
【０１８３】
次に、（ｉ）製造例１で調製しＴＬＲリガンド複合体（１Ｖ２０９−ＴＴＤＤＡ−ＴＡ）と製造例４で調製した糖鎖リガンド複合体（Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ）との５ｍＭ混合溶液（５０％ジメチルスルホキシド水溶液）２５０μＬ、および（ｉｉ）ジメチルスルホキシド６２５μＬを上記コニカルチューブ内に加え、遮光下、室温でコニカルチューブを３０分間撹拌した。ここで、上記混合溶液中の、ＴＬＲリガンド複合体と糖鎖リガンド複合体とのモル比（ＴＬＲリガンド複合体のモル：糖鎖リガンド複合体のモル）は、３：７、１：９、１：１９、または１：３９とした。
【０１８４】
これにより、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子のコロイド水溶液を得た。得られたコロイド溶液を図５に示す。
【０１８５】
図５は、本発明の一実施形態のＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＧｌｃ−ＧＮＰ）のコロイド水溶液を示す図である。図５では、上記混合溶液中の、ＴＬＲリガンド複合体と糖鎖リガンド複合体とのモル比を、３：７、１：９、１：１９、または１：３９になるように調製した場合に得られた、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子のコロイド溶液が示されている。
【０１８６】
その後、得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子のコロイド水溶液を透析により精製した。すなわち、分画分子量３５００の透析膜を用い、１０％ＤＭＳＯ水溶液（１Ｌ）中で２回、超純水（１Ｌ）中で２回透析し、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＧｌｃ−ＧＮＰ）の水溶液を得た。上記混合溶液中の、ＴＬＲリガンド複合体と糖鎖リガンド複合体とのモル比を、１：９になるように調製した場合に得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子について、透過型電子顕微鏡画像および平均粒径の測定結果を図６に示し、ＤＬＳで測定したときの平均粒径の測定結果を図７に示す。
【０１８７】
図６は、本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＧｌｃ−ＧＮＰ）の透過型電子顕微鏡画像と、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子における金属ナノ粒子（ＧＮＰ）の平均粒径を示す図である。図７は、本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＧｌｃ−ＧＮＰ）を動的光散乱（ＤＬＳ）法で測定したときの平均粒径を示す図である。図７に示すように、ＤＬＳ測定（使用機器：Zetasizer Nano ZS90、Malvern Instruments、Worcestershire、UK）によれば、得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＧｌｃ−ＧＮＰ）の平均粒子径は８．６ｎｍであった。
【０１８８】
また、得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＧｌｃ−ＧＮＰ）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳに供した。結果を図８に示す。
【０１８９】
図８は、本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＧｌｃ−ＧＮＰ）のＰｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅによるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析の結果を示す図である。図８に示すように、製造例１で調製したＴＬＲリガンド複合体（１Ｖ２０９−ＴＴＤＤＡ−ＴＡ）と同じ質量数を有するピーク（ｍ／Ｚ値）、および製造例４で調製した糖鎖リガンド複合体（Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ）と同じ質量数を有するピーク（ｍ／Ｚ値）が得られ、金属ナノ粒子にＴＬＲリガンド複合体および糖鎖リガンド複合体が固定化されていることが確認された。
【０１９０】
［製造例７：ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）の調製］
１５ｍＬのコニカルチューブに２０ｍＭの塩化金酸ナトリウム（ナカライテスク社製）水溶液１２５μＬを加え、超純水１２５０μＬをさらに加えた。得られた溶液に、５０ｍＭの水素化ホウ素ナトリウム（ナカライテスク社製）水溶液２５０μＬを加え、遮光下、室温で混合物を１０分間激しく撹拌した。
【０１９１】
次に、（ｉ）製造例１、２または３で調製しＴＬＲリガンド複合体（１Ｖ２０９−ＴＴＤＤＡ−ＴＡ、１Ｖ２０９−ｍＰＤＡ−ＴＡ、または１Ｖ２０９−ＥＤＡ−ＴＡ）と製造例５で調製した糖鎖リガンド複合体（Ｍａｎα１−６Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ）との１．５ｍＭ混合溶液（５０％ジメチルスルホキシド水溶液）２５０μＬ、および（ｉｉ）ジメチルスルホキシド６２５μＬを上記コニカルチューブ内に加え、遮光下、室温でコニカルチューブを３０分間撹拌した。ここで、上記混合溶液中の、ＴＬＲリガンド複合体と糖鎖リガンド複合体とのモル比（ＴＬＲリガンド複合体のモル：糖鎖リガンド複合体のモル）は、１：９、１：１９、または１：３９とした。
【０１９２】
これにより、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子のコロイド水溶液を得た。その後、得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子のコロイド水溶液を透析により精製した。すなわち、分画分子量３５００の透析膜を用い、１０％ジメチルスルホキシド水溶液（１Ｌ）中で２回、超純水（１Ｌ）中で２回透析し、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）の水溶液を得た。得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳに供した。結果を図１２に示す。
【０１９３】
また、得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子について、ＨＰＬＣを用いて測定した金属ナノ粒子におけるＴＬＲ７リガンド複合体の固定化量の測定結果を図１３に示し、透過型電子顕微鏡画像および平均粒径の測定結果を図１４に示し、ＤＬＳで測定したときの平均粒径の測定結果を図１５に示す。さらに、図１３から得られる金属ナノ粒子におけるＴＬＲ７リガンド複合体の固定化量の結果を表１として示す。
【０１９４】
図１２は、本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）のＰｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅによるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析の結果を示す図である。図１３は、本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）のＨＰＬＣ解析の結果を示す図である。図１４は、本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の透過型電子顕微鏡画像とＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子における金属ナノ粒子（ＧＮＰ）の平均粒径を示す図である。図１５は、本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子を動的光散乱（ＤＬＳ）法で測定したときの平均粒径を示す図である。
【０１９５】
図１２の（ａ）、図１３の（ｄ）、図１４の（ａ）および図１５の（ａ）は、ＴＬＲリガンド複合体（図中、ＴＬＲ７Ｌと表記）として１Ｖ２０９−ＴＴＤＤＡ−ＴＡを使用した場合に得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の結果を示している。図１２の（ｂ）、図１３の（ｅ）、図１４の（ｂ）および図１５の（ｂ）は、ＴＬＲリガンド複合体として１Ｖ２０９−ｍＰＤＡ−ＴＡを使用した場合に得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の結果を示している。図１２の（ｃ）、図１３の（ｆ）、図１４の（ｃ）および図１５の（ｃ）は、ＴＬＲリガンド複合体として１Ｖ２０９−ＥＤＡ−ＴＡを使用した場合に得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の結果を示している。
【０１９６】
図１２において、（ｘ）はナトリウムイオン（Ｎａ＋）が結合した糖鎖リガンド複合体（Ｍａｎα１−６Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ）を示しており、（ｙ）はカリウムイオン（Ｋ＋）が結合した糖鎖リガンド複合体（Ｍａｎα１−６Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ）を示しており、（ｚ）はナトリウムイオン（Ｎａ＋）が結合したＴＬＲリガンド複合体を示している。
【０１９７】
図１３の（ａ）は、標準試料である、ＴＬＲ７リガンド複合体（１Ｖ２０９−ＴＴＤＤＡ−ＴＡ）の５０μＭの溶液を用いたときの結果を示している。図１３の（ｂ）は、標準試料として、ＴＬＲ７リガンド複合体（１Ｖ２０９−ｍＰＤＡ−ＴＡ）の５０μＭの溶液を用いたときの結果を示している。図１３の（ｃ）は、標準試料として、ＴＬＲ７リガンド複合体（１Ｖ２０９−ＥＤＡ−ＴＡ）の５０μＭの溶液を用いたときの結果を示している。
【０１９８】
また、図１２、図１３、図１４および図１５では、混合溶液中の、ＴＬＲリガンド複合体（図中、ＴＬＲ７Ｌと表記）と糖鎖リガンド複合体（図中、αＭａｎと表記）とのモル比（ＴＬＲ７Ｌ：αＭａｎ）が、１：９、１：１９、または１：３９の場合に得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子を示している。また、図１３において、検出されたＴＬＲリガンド複合体のピークを矢印で示している。
【０１９９】
図１２に示すように、製造例１、２または３で調製したＴＬＲリガンド複合体（１Ｖ２０９−ＴＴＤＤＡ−ＴＡ、１Ｖ２０９−ｍＰＤＡ−ＴＡ、または１Ｖ２０９−ＥＤＡ−ＴＡ）と同じ質量数を有するピーク（ｍ／Ｚ値）、および製造例５で調製した糖鎖リガンド複合体（Ｍａｎα１−６Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ）と同じ質量数を有するピーク（ｍ／Ｚ値）が得られ、金属ナノ粒子にＴＬＲリガンド複合体および糖鎖リガンド複合体が固定化されていることが確認された。また、混合溶液中の、ＴＬＲリガンド複合体の濃度の減少に依存して、ＴＬＲリガンド複合体のピーク（ｚ）が減少した。
【０２００】
図１３および表１に示すように、混合溶液中の、ＴＬＲリガンド複合体と糖鎖リガンド複合体とのモル比（ＴＬＲ７Ｌ：αＭａｎ）、すなわちＴＬＲリガンド複合体の濃度に依存して、金属ナノ粒子に固定化されるＴＬＲリガンド複合体の量が増加した。従って、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）の調製時、混合溶液におけるＴＬＲリガンド複合体の濃度を変化させることにより、金属ナノ粒子に対するＴＬＲリガンド複合体の固定化量を調節できることが分かった。
【０２０１】
【表１】
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【０２０２】
また、図１５の（ｂ）に示すように、ＴＬＲリガンド複合体として１Ｖ２０９−ｍＰＤＡ−ＴＡを使用し、かつＴＬＲリガンド複合体と糖鎖リガンド複合体とのモル比（ＴＬＲ７Ｌ：αＭａｎ）が、１：９の場合に得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、平均粒径が９０ｎｍであった。これは、得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子が水中で凝集体を形成していることを示唆するものである。なお、得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）の水への分散性は、固定化したＴＬＲリガンド複合体によって若干異なるものであった。
【０２０３】
具体的には、ＴＬＲリガンド複合体として１Ｖ２０９−ｍＰＤＡ−ＴＡを使用し、かつＴＬＲリガンド複合体と糖鎖リガンド複合体とのモル比（ＴＬＲ７Ｌ：αＭａｎ）が１：９の場合に得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、時間経過と共に沈殿したことを確認した。このことから、ＴＬＲリガンド複合体として１Ｖ２０９−ｍＰＤＡ−ＴＡを使用した場合、金属ナノ粒子における１Ｖ２０９−ｍＰＤＡ−ＴＡの固定化量が多くなると水への分散性を保てなくなることが分かった。
【０２０４】
［比較製造例１：糖鎖リガンド複合体（Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ）のみを固定化した金属ナノ粒子（αＧｌｃ−ＧＮＰ）の調製］
１５ｍＬコニカルチューブに超純水１８７５μＬと２０ｍＭの塩化金酸ナトリウム水溶液１２５μＬを加え、これら原料を混合した。続いて、得られた混合物を激しく攪拌しながら５０ｍＭの水素化ホウ素ナトリウム水溶液２５０μＬを加え、遮光下、室温で混合物を１０分間撹拌した。次に、１．５ｍＭの糖鎖リガンド複合体（Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ）水溶液２５０μＬを上記コニカルチューブ内に加え、室温で混合物を３０分間撹拌した。その後、超純水（１Ｌ）中で３回透析（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）７、ＭＷＣＯ＝３，５００）し、αＧｌｃ−ＧＮＰの水溶液を得た。
【０２０５】
［比較製造例２：糖鎖リガンド複合体（Ｍａｎα１−６Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ）のみを固定化した金属ナノ粒子（αＭａｎ−ＧＮＰ）の調製］
１５ｍＬコニカルチューブに超純水１８７５μＬと２０ｍＭの塩化金酸ナトリウム水溶液１２５μＬを加え、これら原料を混合した。続いて、得られた混合物を激しく攪拌しながら５０ｍＭの水素化ホウ素ナトリウム水溶液２５０μＬを加え、遮光下、室温で混合物を１０分間撹拌した。次に、１．５ｍＭの糖鎖リガンド複合体（Ｍａｎα１−６Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ）水溶液２５０μＬを上記コニカルチューブ内に加え、室温で混合物を３０分間撹拌した。その後、超純水（１Ｌ）中で３回透析（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）７、ＭＷＣＯ＝３，５００）し、αＭａｎ−ＧＮＰの水溶液を得た。
【０２０６】
〔試験例１：ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＧｌｃ−ＧＮＰ）の免疫増強活性の測定（１）〕
製造例６で調製したＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＧｌｃ−ＧＮＰ）の免疫増強活性の評価には、マウスマクロファージ由来細胞株であるＲＡＷ２６４．７細胞を用いた。免疫増強活性の評価は、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子によって誘導されたサイトカイン（ＴＮＦ−α）の産生量を、ＥＬＩＳＡ法を用いて定量することで行った。具体的な試験方法は以下の通りである。
【０２０７】
まず、９６ウェルプレートに、１ウェルあたりの細胞数が１×１０４個になるように細胞懸濁液を１５０μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩インキュベートした。本明細書において、「一晩」は約１６時間を意図する。
【０２０８】
次に、製造例６で調製したＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子について、金属ナノ粒子に固定化されたＴＬＲリガンド複合体の量を上述した方法に従い、定量した。そして、固定化されたＴＬＲリガンド複合体の濃度が４０μＭになるように、製造例６で調製したＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の水溶液を調製した。得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の水溶液を、３倍ずつ連続希釈し、上記９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１８時間インキュベートした。
【０２０９】
ここで、（ｉ）金属ナノ粒子に固定化していないＴＬＲリガンド複合体（１Ｖ２０９−ＴＴＤＤＡ−ＴＡ）の水溶液（４０μＭ）を３倍ずつ連続希釈した溶液、または（ｉｉ）αＧｌｃ−ＧＮＰの水溶液（６５μＭ）も、上記９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１８時間インキュベートした。
【０２１０】
その後、以下の手順に沿って、ＥＬＩＳＡ法を行った。培養上清１５０μＬを別の９６ウェルプレートに移し、そのうち５０μＬを抗ＴＮＦ−α抗体が固定化されたＥＬＩＳＡプレートに移した。ＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩インキュベート後、培養上清を除去し、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含有するＰＢＳ（以下、０．０５％ＰＢＳ／Ｔと称する）溶液で各ウェルを３回洗浄した。続いて、ビオチン標識抗ＴＮＦ−α抗体を各ウェルに５０μＬずつ加え、室温で１時間インキュベートした。抗体溶液を除去後、０．０５％ＰＢＳ／Ｔで各ウェルを３回洗浄し、ＨＲＰ修飾ストレプトアビジン溶液５０μＬを加えた。室温で３０分間インキュベート後、０．０５％ＰＢＳ／Ｔで各ウェルを５回洗浄した。その後、ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ナカライテスク社製）５０μＬを加え、化学発光を観察後、１Ｍのｏ−Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ Ａｃｉｄ溶液５０μＬを加えて化学発光を停止した。その後、速やかに、ＥＬＩＳＡプレートをプレートリーダーに供し、４５０ｎｍの吸光度で測定した。ＥＬＩＳＡプレートを用いた上述の操作をＥＬＩＳＡとも称する。
【０２１１】
なお、濃度既知の組み換えＴＮＦ−α（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて、同様にＥＬＩＳＡを行い、検量線を作成した。
【０２１２】
培養上清中のＴＮＦ−αの産生量は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７ソフトウェアを用いて解析した。結果を図９に示す。
【０２１３】
図９は、本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＧｌｃ−ＧＮＰ）溶液のＲＡＷ２６４．７細胞への添加によって産生された、ＴＮＦαの産生量を示す図である。図９では、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子製造時に、混合溶液中の、ＴＬＲリガンド複合体（図中、ＴＴＤＤＡと表記）と糖鎖リガンド複合体（図中、αＧｌｃと表記）とのモル比（ＴＴＤＤＡ：αＧｌｃ）が、１：９、１：１９、または１：３９とした場合に得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の結果を示している。これら、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子はそれぞれＴＴＤＤＡ：αＧｌｃ＝１：９、ＴＴＤＤＡ：αＧｌｃ＝１：１９、またはＴＴＤＤＡ：αＧｌｃ＝１：３９と表記している。図９において、横軸は、添加したＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子またはＴＬＲリガンド複合体の濃度から算出される、実質的に添加されたＴＬＲ７リガンド（図中、ＴＬＲ７  ａｇｏｎｉｓｔと表記）の量（μＭ）を示している。
【０２１４】
図９に示すように、ＥＬＩＳＡ法で培養上清中のＴＮＦ−αを定量したところ、Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏのみを固定化した金属ナノ粒子（αＧｌｃ−ＧＮＰ）では、ＴＮＦ−αの産生が確認されなかったが、ＴＬＲリガンド複合体を固定化した金属ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＧｌｃ−ＧＮＰ）では、ＴＬＲ７リガンドの濃度依存的なＴＮＦ−αの産生が確認された。
【０２１５】
図９に示すように、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子製造時における、混合溶液中の、ＴＬＲリガンド複合体と糖鎖リガンド複合体とのモル比は、ＴＮＦ−αの産生量（すなわちＴＬＲ７の活性化の程度）に影響を与えないことが示唆された。なお、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子製造時における、混合溶液中の、ＴＬＲリガンド複合体と糖鎖リガンド複合体とのモル比は、結果として、単一の金属ナノ粒子に固定化されたＴＬＲ７リガンドの数に影響を与え得る。
【０２１６】
〔試験例２：ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＧｌｃ−ＧＮＰ）の免疫増強活性の測定（２）〕
ヒト末梢血単核球（human peripheral blood mononuclear cell；ｈＰＢＭＣとも称する）を用いて、製造例６で調製したＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＧｌｃ−ＧＮＰ）の免疫増強活性の評価を行った。免疫増強活性の評価は、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子によって誘導されたサイトカイン（ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−α）の産生量を、ＥＬＩＳＡ法を用いて定量することで行った。具体的な試験方法は以下の通りである。
【０２１７】
まず、９６ウェルプレートに、１ウェルあたりの細胞数が２×１０５個になるように細胞懸濁液を１５０μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩インキュベートした。
【０２１８】
次に、金属ナノ粒子に固定化されたＴＬＲリガンド複合体の量を上述した方法に従い、定量した。そして、固定化されたＴＬＲリガンド複合体の濃度が４０μＭになるように、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の水溶液を調整した。得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の水溶液を、２．５倍ずつ連続希釈し、上記９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１８時間インキュベートした。ここで、（ｉ）金属ナノ粒子に固定化していないＴＬＲリガンド複合体（１Ｖ２０９−ＴＴＤＤＡ−ＴＡ）の水溶液（４０μＭ）を２．５倍ずつ連続希釈した溶液、または（ｉｉ）αＧｌｃ−ＧＮＰの水溶液（１５μＭ）も、上記９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１８時間インキュベートした。
【０２１９】
続いて、上記試験例１と同様に、ＥＬＩＳＡ法を行い、培養上清中のＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−αの産生量を定量した。なお、ＩＦＮ−αの定量では、抗ＴＮＦ−α抗体に代えて抗マウスＩＦＮ−α抗体を使用し、ビオチン標識抗ＴＮＦ−α抗体およびＨＲＰ修飾ストレプトアビジン溶液に代えて、ＨＲＰ標識抗マウスＩＮＦ−α抗体を使用した。結果を図１０に示す。
【０２２０】
図１０では、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子製造時の、ＴＬＲリガンド複合体と糖鎖リガンド複合体とのモル比が、１：９とした場合に得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の結果を示している。図１０では、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子を添加した場合の結果は、ＧＮＰ（１：９）で示されており、金属ナノ粒子に固定化していないＴＬＲリガンド複合体を添加した結果は、ｌｉｇａｎｄとして示されている。また一番右端の列には、αＧｌｃ−ＧＮＰを用いた結果が示されている。なお、ＴＬＲリガンド複合体として１Ｖ２０９−ＥＤＡ−ＴＡを用いたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子については、ＩＦＮ−αの産生量は定量しておらず、図１０中、「Ｎｏｔ  Ｔｅｓｔｅｄ」と図示されている。
【０２２１】
図１０の（ａ）は、本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＧｌｃ−ＧＮＰ）溶液のｈＰＢＭＣへの添加によって産生された、ＴＮＦ−αの産生量を示す図であり、図１０の（ｂ）は、本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＧｌｃ−ＧＮＰ）溶液のｈＰＢＭＣへの添加によって産生された、ＩＦＮ−αの産生量を示す図である。
【０２２２】
図１０より、ＴＮＦ−αの産生能は、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子を添加した場合と、金属ナノ粒子に固定化されていないＴＬＲリガンド複合体を添加した場合とを比較して、大きく変わらなかった。しかし、ＩＦＮ−αは、金属ナノ粒子に固定化されていないＴＬＲリガンド複合体を添加した場合にはほとんど産生されないのに対して、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子を添加した場合は、多く産生された。すなわち、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子には、高いＩＦＮ−α産生能があることを見出した。これらの結果は、ＩＦＮ−αを多くことを特徴とする形質細胞用樹状細胞（ｐＤＣ）にＴＬＲリガンドが輸送されたことを示唆しており、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、ＰＢＭＣ中の樹状細胞をターゲティングできることが示唆された。
【０２２３】
以上の結果から、ＴＬＲリガンドとしてＴＬＲ７リガンドである１Ｖ２０９を含むＴＬＲリガンド複合体を固定化した金属ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＧｌｃ−ＧＮＰ）は、免疫増強活性を有していることが明らかとなった。
【０２２４】
〔試験例３：ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）の免疫増強活性の測定（１）〕
マウスマクロファージ細胞株であるＪ７７４Ａ．１細胞を用いて、製造例７で調製したＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）の免疫増強活性の評価を行った。ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子としては、ＴＬＲリガンド複合体として１Ｖ２０９−ＴＴＤＤＡ−ＴＡを使用したものを使用した。免疫増強活性の評価は、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子によって誘導されたサイトカイン（ＩＬ−６）の産生量を、ＥＬＩＳＡ法を用いて定量することで行った。具体的な試験方法は以下の通りである。
【０２２５】
まず、９６ウェルプレートに、１ウェルあたりの細胞数が４×１０４個になるように細胞懸濁液を１５０μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩インキュベートした。
【０２２６】
次に、金属ナノ粒子に固定化されたＴＬＲリガンド複合体の量を上述した方法に従い、定量した。そして、固定化されたＴＬＲリガンド複合体の濃度が８μＭになるように、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の水溶液を調整した。得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の水溶液を、３倍ずつ連続希釈し、上記９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１８時間インキュベートした。
【０２２７】
ここで、（ｉ）金属ナノ粒子に固定化していないＴＬＲリガンド複合体（１Ｖ２０９−ＴＴＤＤＡ−ＴＡ）の水溶液（４０μＭ）を３倍ずつ連続希釈した溶液、または（ｉｉ）αＭａｎ−ＧＮＰの水溶液（６５μＭ）も、上記９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１８時間インキュベートした。
【０２２８】
その後、以下の手順に沿って、ＥＬＩＳＡ法を行った。まず、９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレートにＣｏａｔｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒで２５０倍希釈した抗マウスＩＬ−６抗体５０μＬを加え、４℃で一晩インキュベートした。抗体溶液を除去後、Ｔｗｅｅｎ２０を１％含むＰＢＳ溶液（以下、１％ＰＢＳ／Ｔと称する。）３００μＬで各ウェルを３回洗浄した。その後、１％ウシ血清アルブミン−ＰＢＳ溶液（以下、ブロッキングバッファーとも称する。）３００μＬをウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間インキュベートした。ブロッキングバッファーを除去後、１％ＰＢＳ／Ｔ３００μＬで各ウェルを３回洗浄した。
【０２２９】
続いて、ブロッキングバッファー２５μＬと、上記Ｊ７７４Ａ．１細胞の培養上清２５μＬをＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間インキュベートした。同時に、検量線を作成するために、培養上清に代えて、濃度既知の組み換えマウスＩＬ−６（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を用い、同様の条件でインキュベートした。
【０２３０】
各ウェル中の溶液を除去後、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルを１％ＰＢＳ／Ｔで５回洗浄し、ブロッキングバッファーで１０００倍希釈したビオチン標識抗マウスＩＬ−６抗体を各ウェルに５０μＬずつ加え、室温で２時間インキュベートした。抗体溶液を除去後、１％ＰＢＳ／Ｔ３００μＬで各ウェルを３回洗浄し、ブロッキングバッファーで１，０００倍希釈したＨＲＰ修飾ストレプトアビジン溶液５０μＬを加え、室温で１時間インキュベートした。ＨＲＰ修飾ストレプトアビジン溶液を除去後、各ウェルを１％ＰＢＳ／Ｔ３００μＬで５回洗浄した。その後、ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ５０μＬを各ウェルに加え、化学発光を観察後、１Ｍのｏ−Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ Ａｃｉｄ溶液５０μＬを加えて化学発光を停止した。その後、速やかに、ＥＬＩＳＡプレートをプレートリーダーに供し、４５０ｎｍの吸光度で測定した。
た。
【０２３１】
培養上清中のＩＬ−６の産生量は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７ソフトウェアを用いて解析した。結果を図１６に示す。
【０２３２】
〔試験例４：ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）の免疫増強活性の測定（２）〕
マウス骨髄由来樹状細胞（mouse bone marrow derived dendritic cell；ｍＢＭＤＣとも称する）を用いて、製造例７で調製したＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）の免疫増強活性の評価を行った。免疫増強活性の評価は、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子によって誘導されたサイトカイン（ＩＬ−６）の産生量を、ＥＬＩＳＡ法を用いて定量することで行った。具体的な試験方法は以下の通りである。
【０２３３】
まず、９６ウェルプレートに、１ウェルあたりの細胞数が１×１０５個になるように細胞懸濁液を１５０μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩インキュベートした。
【０２３４】
次に、金属ナノ粒子に固定化されたＴＬＲリガンド複合体の量を上述した方法に従い、定量した。そして、固定化されたＴＬＲリガンド複合体の濃度が８μＭになるように、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の水溶液を調整した。得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の水溶液を、３倍ずつ連続希釈し、上記９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１８時間インキュベートした。ここで、（ｉ）金属ナノ粒子に固定化していないＴＬＲリガンド複合体（１Ｖ２０９−ＴＴＤＤＡ−ＴＡ）の水溶液（４０μＭ）を３倍ずつ連続希釈した溶液、または（ｉｉ）αＭａｎ−ＧＮＰの水溶液（６５μＭ）も、上記９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１８時間インキュベートした。
【０２３５】
続いて、上記試験例３と同様に、ＥＬＩＳＡ法を行い、培養上清中のＩＬ−６の産生量を定量した。結果を図１７に示す。
【０２３６】
図１６および１７では、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子製造時に、混合溶液中の、ＴＬＲリガンド複合体（図中、ＴＬＲ７Ｌと表記）と糖鎖リガンド複合体（図中、αＭａｎと表記）とのモル比（ＴＬＲ７Ｌ：αＭａｎ）が、１：９、１：１９、または１：３９とした場合に得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の結果を示している。これら、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子はそれぞれＴＬＲ７Ｌ：αＭａｎ＝１：９、ＴＬＲ７Ｌ：αＭａｎ＝１：１９、またはＴＬＲ７Ｌ：αＭａｎ＝１：３９と表記している。図１６および１７において、横軸は、添加したＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子またはＴＬＲリガンド複合体の濃度から算出される、実質的に添加されたＴＬＲ７リガンド（図中、ＴＬＲ７  ｌｉｇａｎｄと表記）の量（μＭ）を示している。
【０２３７】
図１６は、本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）溶液のＪ７７４Ａ．１細胞への添加によって産生された、ＩＬ−６の産生量を示す図である。また、図１７は、本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）溶液のｍＢＭＤＣへの添加によって産生された、ＩＬ−６の産生量を示す図である。図１７の（ａ）は、ＴＬＲリガンド複合体として１Ｖ２０９−ＴＴＤＤＡ−ＴＡを使用した結果を示しており、図１７の（ｂ）は、ＴＬＲリガンド複合体として１Ｖ２０９−ｍＰＤＡ−ＴＡを使用した結果を示しており、図１７の（ｃ）は、ＴＬＲリガンド複合体として１Ｖ２０９−ＥＤＡ−ＴＡを使用した結果を示している。
【０２３８】
図１６および図１７の結果から、以下のようなことが分かった。すなわち、Ｊ７７４Ａ．１細胞を用いた試験では、金属ナノ粒子に固定化していないＴＬＲリガンド複合体を添加した場合と比較して、いずれのＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子を添加した場合も、細胞におけるＩＬ−６の産生能が著しく低下した。一方、ｍＢＭＤＣを用いた試験では、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子を添加した場合に、ＴＬＲリガンド複合体の構造または固定化量に大きく依存せず、ＴＬＲリガンド複合体の濃度依存的な、ＩＬ−６の産生が観測された。また、ｍＢＭＤＣを用いた試験では、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子を添加した場合には、金属ナノ粒子に固定化していないＴＬＲリガンド複合体を添加した場合と比較して、５〜１０倍ほどのＩＬ−６産生が観測された。また、陰性コントロールに用いたαＭａｎ−ＧＮＰではＩＬ−６が産生されなかった。従って、いずれのＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子も高いサイトカイン産生能を有することが示された。
【０２３９】
細胞に応じてＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）のサイトカイン産生能が異なるのは、エンドサイトーシスによるＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の取り込み能の違いによるものと考えられる。先行研究[非特許文献５]において、１Ｖ２０９の多糖への修飾によるサイトカイン産生能の向上は、エンドサイトーシスにより効率的に細胞内に移行することで起こることが示唆されている。一方、１Ｖ２０９は、単独ではエンドサイトーシスではなく、細胞膜を透過して細胞内に移行すると考えられるので、Ｊ７７４Ａ．１細胞およびやｍＢＭＤＣなどに対するサイトカイン産生能は大きく変わらない。
【０２４０】
したがって、Ｊ７７４Ａ．１細胞を用いた場合にＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰのサイトカイン産生能が著しく低下したのは、Ｊ７７４Ａ．１細胞にマンノースに対する受容体があまり発現しておらず、エンドサイトーシスによる細胞内への移行がほとんど行われなかったためだと考えられる。一方、ｍＢＭＤＣには多くのマンノース受容体が発現しており、ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰを多く取り込むことができたためにサイトカイン産生能が向上したと考えられる。
【０２４１】
〔試験例５：ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）の免疫増強活性の測定（３）〕
ｈＰＢＭＣを用いて、製造例７で調製したＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）の免疫増強活性の評価を行った。免疫増強活性の評価は、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子によって誘導されたサイトカイン（ＴＮＦ−α）の産生量を、ＥＬＩＳＡ法を用いて定量することで行った。具体的な試験方法は以下の通りである。
【０２４２】
まず、９６ウェルプレートに、１ウェルあたりの細胞数が２×１０５個になるように細胞懸濁液を１５０μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩インキュベートした。
【０２４３】
次に、金属ナノ粒子に固定化されたＴＬＲリガンド複合体の量を上述した方法に従い、定量した。そして、固定化されたＴＬＲリガンド複合体の濃度が８μＭになるように、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の水溶液を調整した。得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の水溶液を、３倍ずつ連続希釈し、上記９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１８時間インキュベートした。ここで、（ｉ）金属ナノ粒子に固定化していないＴＬＲリガンド複合体（１Ｖ２０９−ＴＴＤＤＡ−ＴＡ）もしくはＴＬＲリガンド（１Ｖ２０９）の水溶液（４０μＭ）をそれぞれ３倍ずつ連続希釈した溶液、（ｉｉ）αＭａｎ−ＧＮＰの水溶液（０．３μＭ）、または（ｉｉｉ）０．２５％ＤＭＳＯ溶液（表中、Ｖｅｈｉｃｌｅと表記）も、上記９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１８時間インキュベートした。
【０２４４】
続いて、上記試験例３と同様に、ＥＬＩＳＡ法を行い、培養上清中のＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−αの産生量を定量した。なお、ＴＮＦ−αの定量では、試験例３における、（ｉ）Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒで２５０倍希釈した抗マウスＩＬ−６抗体に代えて、ＰＢＳで２５０倍に希釈した抗マウスＴＮＦ−α抗体を使用し、（ｉｉ）ブロッキングバッファーで１０００倍希釈したビオチン標識抗マウスＩＬ−６抗体に代えて、ブロッキングバッファーで２５０倍希釈したビオチン標識抗マウスＴＮＦ−α抗体を使用した。結果を図１８に示す。
【０２４５】
図１８では、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子製造時の、ＴＬＲリガンド複合体（１Ｖ２０９−ＴＴＤＤＡ−ＴＡ（ＴＬＲ７Ｌ））と糖鎖リガンド複合体とのモル比（ＴＬ７Ｌ：αＭａｎ）が、１：９とした場合に得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子の結果を示している。図１８において、横軸は、添加したＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子もしくはＴＬＲリガンド複合体の濃度から算出される、実質的に添加されたＴＬＲ７リガンド、または添加したＴＬＲリガンド（図中、ＴＬＲ７  ｌｉｇａｎｄと表記）の量（μＭ）を示している。また、ＶｅｈｉｃｌｅにはＴＬＲリガンド（１Ｖ２０９）は含まれていないが、便宜上、右端（ＴＬＲ７ ｌｉｇａｎｄが４０μＭの位置）に図示している。
【０２４６】
図１８は、本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）溶液のｈＰＢＭＣへの添加によって産生された、ＴＮＦ−αの産生量を示す図である。
【０２４７】
図１８より、ＴＮＦ−αの産生量は、金属ナノ粒子に固定化されていないＴＬＲリガンド複合体を添加した場合と比較して、ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子を添加した場合に、約１０倍高くなることが分かった。
【０２４８】
〔試験例６：ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）の免疫増強活性の測定（４）〕
ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）のインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）での免疫増強活性を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌、７週齢）を用いて評価した。ＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子としては、ＴＬＲリガンド複合体として１Ｖ２０９−ＴＴＤＤＡ−ＴＡを使用し、かつ製造時のＴＬＲリガンド複合体と糖鎖リガンド複合体とのモル比を１：９とした場合に得られたＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子を使用した。具体的な試験方法は下記の通りである。
【０２４９】
モデルタンパク質抗原であるＯＶＡ（２０ｎｇ）とアジュバントとなるＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子または１Ｖ２０９（ＴＬＲ７リガンド：０．０２〜２ｎｍｏｌ）を０日目および１４日目に皮内注射によりマウスに投与後、３５日目に眼窩静脈叢により採血し、血中の抗ＯＶＡＩｇＧ１抗体および抗ＯＶＡＩｇＧ２ｃ抗体の産生価を評価した。結果を図１９に示す。
【０２５０】
アジュバントの陽性コントロールには、１Ｖ２０９−ｄｅｘｔｒａｎ（ＴＬＲ７リガンド：０．２ｎｍｏｌ）を用い、陰性コントロールにはＰＢＳを使用した。なお、１Ｖ２０９−ｄｅｘｔｒａｎは、非特許文献５に従い、調製した。
【０２５１】
また、３５日目に、マウスから脾臓を採取し、マウス体重に対する脾臓の重さの割合を求めた。結果を図２０に示す。
【０２５２】
図１９の（ａ）は、ＯＶＡと本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）溶液とのマウスへの投与によって産生された、ＩｇＧ１抗体の産生量を示す図であり、図１９の（ｂ）は、ＯＶＡと本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−Ｍａｎ−ＧＮＰ）溶液とのマウスへの投与によって産生された、ＩｇＧ２ｃ抗体の産生量を示す図である。図２０は、ＯＶＡと本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）溶液とのマウスへの投与後の、マウス体重に対する脾臓の重さの割合を示す図である。
【０２５３】
図１９より、上述のように、ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰをアジュバントに用いてＯＶＡをマウスに免疫し、３５日後の血中の抗体価を評価したところ、ＴＬＲ７リガンドの濃度依存的に、ＯＶＡに対するＩｇＧ２ｃ抗体の抗体価が上昇し、１Ｖ２０９単体に比べて有意に高い免疫増強活性があることが分かった。また、液性免疫に関与するＩｇＧ１抗体の抗体価は大きく向上しなかったが、細胞性免疫に関与するＩｇＧ２ｃ抗体の産生価が有意に上昇したことから、ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰは細胞性免疫の誘導能が高いことが示唆された。これは、陽性コントロールとして用いた１Ｖ２０９−ｄｅｘｔｒａｎと同様の結果であった。
【０２５４】
また、図２０より、１Ｖ２０９−ｄｅｘｔｒａｎをアジュバントに使用した場合、脾臓の肥大が観察された。一方、ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰではほとんど脾臓の肥大は観察されなかったことから、ＴＬＲ７リガンドをαマンノースと共に金属ナノ粒子（金ナノ粒子、ＧＮＰ）に固定化することで、抗原提示細胞に効率的にＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰを輸送できるようになり、副作用を抑えてＴＬＲ７リガンドの免疫増強活性を向上できることが示唆された。これらの結果から、本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子（ＴＬＲ７Ｌ−αＭａｎ−ＧＮＰ）がアジュバントとして有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０２５５】
本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、上述したように、免疫応答を増強する作用を有する。それ故に、本発明の一実施形態に係るＴＬＲリガンド固定化ナノ粒子は、ワクチンの効果を増強し得るアジュバントとして、医療現場での利用可能性が大いに期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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