(57)【要約】【課題】ＴＥＲＴ遺伝子の発現調節メカニズムを利用した肝癌細胞または肝癌幹細胞を抑制する候補化合物のスクリーニング方法に関する。また、本願発明は、細胞から採取した試料において肝臓癌細胞または肝癌幹細胞を検出する方法および体細胞から採取した試料において、肝臓癌を検出する際に使用する肝癌検出／診断用プライマーセットを提供する。【解決手段】ＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域であって、該領域に少なくとも１つのＧＣモチーフあるいは少なくとも１つのＴＥＡＤモチーフあるいは両方を備えるプロモータ領域のｃＤＮＡと、とマーカー遺伝子のｃＤＮＡとを含むベクターで形質転換した細胞を用いる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域であって、該領域に少なくとも１つのＧＣモチーフあるいは少なくとも１つのＴＥＡＤモチーフあるいは両方を備えるプロモータ領域のｃＤＮＡと、マーカー遺伝子のｃＤＮＡとを含むベクター。
【請求項２】
前記ＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域において、ヒトＴＥＲＴ（ｈＴＥＲＴ）遺伝子の配列においてＣ２２８に相当する位置にＴの変異がある、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記ＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域がヒト由来であって、Ｃ２２８Ｔの変異を備える、請求項１に記載のベクター。
【請求項４】
前記ＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域が配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を備えるプロモータ領域である、請求項１のベクター。
【請求項５】
前記ＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域が配列番号１の配列を備えるプロモータ領域である、請求項１のベクター。
【請求項６】
前記ＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域がヒト由来であって、転写開始点からの１６９ｂｐ下流から３６ｂｐ上流の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を備えるプロモータ領域である、請求項１のベクター。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載のベクターで形質転換された細胞。
【請求項８】
前記細胞がヒトまたは動物由来の肝細胞、肝幹細胞、肝癌細胞、肝癌幹細胞のいずれかである、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
更に、好適なベクターを用いて、少なくとも１つのＧＣモチーフあるいは少なくとも１つのＴＥＡＤモチーフあるいは両方に作用する遺伝子に相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を導入した、請求項７に記載の細胞。
【請求項１０】
前記遺伝子がｃ７ｏｒｆ４３あるいはｃ１５ｏｒｆ５５あるいは両方である、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
請求項９に記載の細胞に候補化合物を接触させる方法を含む、肝癌抑制効果のある化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１２】
更に、少なくとも１つのＧＣモチーフあるいは少なくとも１つのＴＥＡＤモチーフあるいは両方に作用する遺伝子の発現を測定する工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子がｃ７ｏｒｆ４３あるいはｃ１５ｏｒｆ５５あるいは両方である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項７または８に記載の細胞を含む、肝癌抑制効果のある化合物のためのスクリーニングキット。
【請求項１５】
更に、ｃ７ｏｒｆ４３あるいはｃ１５ｏｒｆ５５あるいは両方の発現を検出するためのプライマーセットを含む、請求項１４に記載のスクリーニングキット。
【請求項１６】
被験者からの体細胞・癌細胞成分として、ＲＮＡを含む試料を得る工程と、
前記ＲＮＡを含む試料から逆転写酵素でｃＤＮＡを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いたＰＣＲを行い、ｃ７ｏｒｆ４３もしくはｃ１５ｏｒｆ５５もしくは両方の発現を検出する工程とを含む、細胞における造腫瘍性の発現を測定する方法。
【請求項１７】
細胞におけるｈＴＥＲＴ遺伝子の発現を測定するためのキットであって、被験者由来の体細胞成分からＲＮＡを抽出するための試薬、
前記ＲＴ−ＰＣＲにて所定のｃＤＮＡを増幅するための試薬、
前記ＲＴ−ＰＣＲにてｃ７ｏｒｆ４３もしくはｃ１５ｏｒｆ５５もしくは両者、あるいはいずれかもしくは両者のプロモータ領域を増幅するための上流および下流プライマー、を含む測定キット。
【請求項１８】
上記上流プライマーが配列番号２（ｃ１５ｏｒｆ５５：Ｆｏｒｗａｒｄ：ＡＧＧＣＧＧＴＧＴＧＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴ）または配列番号３（ｃ７ｏｒｆ４３：Ｆｏｒｗａｒｄ：ＧＴＧＴＧＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＡＴ）に記載の塩基配列で示され、且つ下流側プライマーが、それぞれ配列番号４（ｃ１５ｏｒｆ５５：Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＴＧＣＴＣＣＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＧＡＣ）または配列番号５（ｃ７ｏｒｆ４３：Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＧＣＡＧＡＣＧＡＣＧＧＡＧＴＣＣＡＧ）に記載の塩基配列で示されるプライマーセット。
【請求項１９】
肝硬変、肝癌、または肝切除後の肝臓の状態を診断するための方法であって、
被験者由来の体細胞成分からのＲＮＡのみを抽出する工程、
前記ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにて所定のｃＤＮＡを増幅する工程、を含み、
前記ＲＴ−ＰＣＲにて増幅されるｃＤＮＡがｃ７ｏｒｆ４３もしくはｃ１５ｏｒｆ５５もしくは両者である、方法。
【請求項２０】
前記ｃＤＮＡについてのプライマーが配列番号２（ｃ１５ｏｒｆ５５：Ｆｏｒｗａｒｄ：ＡＧＧＣＧＧＴＧＴＧＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴ）または配列番号３（ｃ７ｏｒｆ４３：Ｆｏｒｗａｒｄ：ＧＴＧＴＧＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＡＴ）に記載の塩基配列で示され、且つ下流側プライマーが、それぞれ配列番号４（ｃ１５ｏｒｆ５５：Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＴＧＣＴＣＣＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＧＡＣ）または配列番号５（ｃ７ｏｒｆ４３：Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＧＣＡＧＡＣＧＡＣＧＧＡＧＴＣＣＡＧ）からなる組み合せである、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＥＲＴ遺伝子の発現調節に関する。より具体的には、ＴＥＲＴ遺伝子の発現調節メカニズムを利用した肝癌細胞または肝癌幹細胞を抑制する候補化合物のスクリーニング方法に関する。また、該スクリーニング方法に使用するキットも包含する。また、本願発明は、細胞から採取した試料において肝臓癌細胞または肝癌幹細胞を検出する方法および体細胞から採取した試料において、肝臓癌を検出する際に使用する肝癌検出用プライマーセットに関する。特に早期に肝臓癌細胞の存在の有無を診断できる、ヒトまたは動物の肝臓由来試料において肝臓癌細胞または肝癌幹細胞を検出する方法および該方法に用いるプライマー検出セットに関する。
【背景技術】
【０００２】
日本において、毎年、新たに３００，０００件の癌の症例が診断されている。また、日本において、４人から５人に一人が、癌また癌治療に関連した合併症で死亡している。このため、癌治療又は癌治療に関連した合併症の治療の改善に相当な努力が継続して行われている。
また、癌は早期に発見されると治療率が高いことから、癌を早期に発見でき、精度の高い癌の診断方法の開発や改善が行われている。
即ち、大部分の癌患者は、その癌又は癌治療に関連した合併症腫瘍によっては死亡しない。癌患者の多くは手にした癌、即ち、元の腫瘍細胞から分かれて、元の腫瘍細胞が存在している部位とは別の部位に移動する悪性腫瘍から形成される複数の腫瘍コロニーに負けるのである。
したがって、患者の初期の腫瘍が発見・検出でき、そのような初期の腫瘍を、内科的切除や、内科的抗がん治療、手術、放射線治療、抗がん剤による化学療法、及び、これらの組み合せにより、縮小したり、除去できれば、患者は、癌を克服したり、延命することができる確率が非常に高くなる。
【０００３】
しかしながら、患者の腫瘍の早期発見・検出が困難であり、また、悪性腫瘍を特徴づける、転移性コロニーは、その検出が困難であり、除去も困難である、という現状があり、臨床的観点から言えば、癌治療は困難なものとなっている、という現状がある。
【０００４】
ところで、癌の転移は、以下に示すような複雑な出来事を含む。
１）最初の癌の発生から周囲組織への癌の拡張。
２）体腔および血管中への腫瘍細胞の浸透。
３）循環系により腫瘍細胞が離れた部位への輸送・放出。
４）滞留部位における腫瘍細胞の組織への再侵入。
５）新たな部位における腫瘍の生存と、腫瘍増殖をするための血管形成等の新たな環境への適用。
【０００５】
即ち、腫瘍細胞は、初期の段階で、周囲組織に侵入し、組織バリアを破壊するので、腫瘍細胞は、固形腫瘍の発達の非常に初期段階（即ち、腫瘍が１０４個以上１０６個以下の腫瘍細胞を含む時点）において、組織空間及び毛細血管中に侵入し、結局は、血液中に免疫担当細胞により排除されたり、免疫担当細胞の殺傷機能により細胞死するか休眠状態となる。
これは、このような段階では、腫瘍細胞は、異所性環境において未だに生き残ることができず、また、成長することができないからである。
【０００６】
ところで、本願発明者等の知る限り、このような初期段階の小さな腫瘍を検出する検出方法は未だ開発されていない。
現時点では、腫瘍がある程度大きくなった場合に、特定タイプの癌の診断に使用可能な高感度方法が開発されているにすぎない。
【０００７】
そのような診断方法としては、例えば乳房中の２×１０８個の乳腫瘍細胞を検出できる乳癌の場合、その初期段階においては、腫瘍細胞の大部分の流出細胞が死ぬとされている。しかしながら、腫瘍細胞が、１０６個以上１０９個まで増殖すると、何世代かに渡り、遺伝子的に不安的な腫瘍細胞のクローンは、更に、遺伝子レベルの変化を遂げ、より迅速に増殖する攻撃的な変異細胞を生じうる、そして、このような変異細胞は、二次腫瘍として生着する可能性が非常に高い。
【０００８】
しかしながら、上述したように、現状では、癌の診断は、初期段階ではありえないため、例えば、膵臓、胃、卵巣、腎臓、肺、肝臓などの大部分の癌は、通常１０１０個から１０１２個の腫瘍細胞が存在するような、癌の非常に後期の段階において行われており、この時点においては、腫瘍が既に周囲組織に侵入し、転移している可能性がある。
【０００９】
従来は、癌の初期段階における癌診断ができないこと、根治治療が困難なこと、癌転移の複雑さ、化学療法に用いる薬剤の副作用や、癌患者の治療に対する欲求不満を考慮して、治療方針を立て癌の転移又は再発に対する治療効果をモニターするための試験の開発が行われてきた。
そして、最近２０数年にわたる研究結果として、種々の診断試験方法が開発され、その有用性が評価されてきている。
【００１０】
最近１０年間において、ある一つの腫瘍マーカーが癌の早期の検出に有用であると期待され、その臨床応用に向けた研究開発が継続されてきた。
即ち、このある一つの腫瘍マーカーとは「テロメレース（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）」である。このテロメレース（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）は、９０％の癌腫で生産し且つ発現する悪性腫瘍特異的抗原（酵素）であり、その活性が１９９４年に発されて以来（Ｋｉｍ  ＮＷ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３；２６６：２０１１−２０１５（１９９４）を参照）、その後、遺伝子の発見および機能解析が行われてきたが、その特異性にも関わらず、臨床応用に関しては、腫瘍形成、移転後の切除組織からの検出に留まり、現行の臨床検査のように血液中から簡易に検出することができなかった。また、このテロメレース（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）はたとえ、検出できても混入しわずかに再生し発現している他の細胞（リンパ球など）の影響が無視できず、定性的に検出することが正確にはできなかった。
【００１１】
テロメラーゼの酵素活性を制御するサブユニットであるテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）は、正常細胞には発現せず、癌細胞だけで高発現している。また、肝細胞癌では、ＴＥＲＴのプロモータ領域と呼ばれる遺伝子発現制御領域に変異が高頻度で生じており、ＴＥＲＴ遺伝子発現上昇の原因となっている。
特に、肝細胞癌の発症過程においてＴＥＲＴ遺伝子プロモータ領域の変異は、低頻度ではあるものの癌化する前段階というかなり初期にすでに認められ、ＴＥＲＴは癌の進展だけでなく早期の肝癌過程においても重要な役割を持つことが示唆されている。（非特許文献１）
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開公報２００５／０４９８６４
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｎａｔｌ  Ｊ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，  ２０１４，  ６０；１９８３−１９９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
既存のテロメラーゼ阻害剤は副作用など問題により、癌治療薬としての承認には至っていない。
肝癌の早期に変異が確認されるＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域の発現の調節に関与する因子を検出することができたら、現在よりももっと早期に肝癌を診断することに資すると考えらえている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
即ち本願発明は以下の態様を含む。
［１］ＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域であって、該領域に少なくとも１つのＧＣモチーフあるいは少なくとも１つのＴＥＡＤモチーフあるいは両方を備えるプロモータ領域のｃＤＮＡと、とマーカー遺伝子のｃＤＮＡとを含むベクター。
［２］前記ＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域において、ヒトＴＥＲＴ（ｈＴＥＲＴ）遺伝子の配列においてＣ２２８に相当する位置にＴの変異がある、［１］に記載のベクター。
［３］前記ＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域がヒト由来であって、Ｃ２２８Ｔの変異を備える、［１］に記載のベクター。
［４］前記ＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域が配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を備えるプロモータ領域であることを特徴とする、［１］のベクター。
［５］前記ＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域が配列番号１の配列を備えるプロモータ領域であることを特徴とする、［１］のベクター。
［６］前記ＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域がヒト由来であって、転写開始点からの１６９ｂｐ下流から３６ｂｐ上流の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を備えるプロモータ領域であることを特徴とする、［１］のベクター。
［７］［１］乃至［６］のいずれか一項に記載のベクターで形質転換された細胞。
［８］前記細胞がヒトまたは動物由来の肝細胞、肝幹細胞、肝癌細胞、肝癌幹細胞のいずれかである、［７］に記載の細胞。
［９］更に、好適なベクターを用いて、少なくとも１つのＧＣモチーフあるいは少なくとも１つのＴＥＡＤモチーフあるいは両方に作用する遺伝子に相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を導入した、［７］に記載の細胞。
［１０］前記遺伝子がｃ７ｏｒｆ４３あるいはｃ１５ｏｒｆ５５あるいは両方である、［９］に記載の細胞。
［１１］［９］に記載の細胞に候補化合物を接触させる方法を含む、肝癌抑制効果のある化合物をスクリーニングする方法。
［１２］更に、少なくとも１つのＧＣモチーフあるいは少なくとも１つのＴＥＡＤモチーフあるいは両方に作用する遺伝子の発現を測定する工程を含む、［１１］に記載の方法。
［１３］前記遺伝子がｃ７ｏｒｆ４３あるいはｃ１５ｏｒｆ５５あるいは両方である、［１１］に記載の方法。
［１４］［７］または［８］に記載の細胞を含む、肝癌抑制効果のある化合物のためのスクリーニングキット。
［１５］更に、ｃ７ｏｒｆ４３あるいはｃ１５ｏｒｆ５５あるいは両方の発現を検出するためのプライマーセットを含む、［１４］に記載のスクリーニングキット。
［１６］被験者からの体細胞・癌細胞成分として、ＲＮＡを含む試料を得る工程と、
前記ＲＮＡを含む試料から逆転写酵素でｃＤＮＡを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いたＰＣＲを行い、ｃ７ｏｒｆ４３もしくはｃ１５ｏｒｆ５５もしくは両方の発現を検出する工程とを含む、細胞における造腫瘍性の発現を測定する方法。
［１７］細胞におけるｈＴＥＲＴ遺伝子の発現を測定するためのキットであって、被験者由来の体細胞成分からＲＮＡを抽出するための試薬、
前記ＲＴ−ＰＣＲにて所定のｃＤＮＡを増幅するための試薬、
前記ＲＴ−ＰＣＲにてｃ７ｏｒｆ４３もしくはｃ１５ｏｒｆ５５もしくは両者、あるいはいずれかもしくは両者のプロモータ領域を増幅するための上流および下流プライマー、を含む測定キット。
［１８］上記上流プライマーが配列番号２（ｃ１５ｏｒｆ５５：Ｆｏｒｗａｒｄ：ＡＧＧＣＧＧＴＧＴＧＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴ）または配列番号３（ｃ７ｏｒｆ４３：Ｆｏｒｗａｒｄ：ＧＴＧＴＧＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＡＴ）に記載の塩基配列で示され、且つ下流側プライマーが、それぞれ配列番号４（ｃ１５ｏｒｆ５５：Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＴＧＣＴＣＣＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＧＡＣ）または配列番号５（ｃ７ｏｒｆ４３：Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＧＣＡＧＡＣＧＡＣＧＧＡＧＴＣＣＡＧ）に記載の塩基配列で示されるプライマーセット。
［１９］肝硬変、肝癌、または肝切除後の肝臓の状態を診断するための方法であって、
被験者由来の体細胞成分からのＲＮＡのみを抽出する工程、
前記ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにて所定のｃＤＮＡを増幅する工程、を含み、
前記ＲＴ−ＰＣＲにて増幅されるｃＤＮＡがｃ７ｏｒｆ４３もしくはｃ１５ｏｒｆ５５もしくは両者であることを特徴とする、方法。
［２０］前記ｃＤＮＡについてのプライマーが配列番号２（ｃ１５ｏｒｆ５５：Ｆｏｒｗａｒｄ：ＡＧＧＣＧＧＴＧＴＧＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴ）または配列番号３（ｃ７ｏｒｆ４３：Ｆｏｒｗａｒｄ：ＧＴＧＴＧＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＡＴ）に記載の塩基配列で示され、且つ下流側プライマーが、それぞれ配列番号４（ｃ１５ｏｒｆ５５：Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＴＧＣＴＣＣＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＧＡＣ）または配列番号５（ｃ７ｏｒｆ４３：Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＧＣＡＧＡＣＧＡＣＧＧＡＧＴＣＣＡＧ）からなる組み合せである、［１９］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本願発明者らの検討により、肝細胞癌組織において所定のプロモータ部位、ｃ７ｏｒｆ４３またはｃ１５ｏｒｆ５５または両者は、ＴＥＲＴ遺伝子の発現を亢進させる機能が明らかになった。さらに、そのメカニズムとして、ｃ７ｏｒｆ４３およびｃ１５ｏｒｆ５５は、それぞれＨｉｐｐｏシグナル経路および転写因子Ｓｐｌを介して、ＴＥＲＴ遺伝子発現を制御している可能性が示唆された。
更に、本願発明者らはｃ７ｏｒｆ４３またはｃ５ｏｒｆ５５をそれぞれ肝細胞癌に導入して過剰発現させると細胞増殖能が亢進し、また、逆にこれらの遺伝子の発現を低下させるとＴＥＲＴの発現が低下し、特にｃ１５ｏｒｆ５５の発現制御は細胞増殖能の低下をもたらすことを明らかにした。
また、肝細胞癌の臨床検体を用いた検討により、両遺伝子は肝硬変などの前癌病変部ですでに正常肝組織よりも高発現しており、肝発癌過程早期のＴＥＲＴ発現上昇に寄与している可能性が示唆された。
本願発明により、ｃ７ｏｒｆ４３またはｃ１５ｏｒｆ５５あるいは両方を抑制する薬剤（低分子化合物あるいは核酸医薬品）はこれまでにない作用機序によってテロメラーゼ活性を抑制することが可能な癌治療薬として期待ができる。このような薬剤は、肝細胞癌治療だけでなく、発癌や再発への予防薬への応用も期待できる。また両遺伝子発現は、肝細胞癌のスクリーニングや、予後・再発、薬剤効果判定などの診断技術に応用できる可能性が考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１はｈＴＥＲＴプロモータ領域を組み込んだベクターの一部およびｈＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ配列の一部を示す図である。ｈＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域の塩基配列等の詳細はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）のデータベースであるＧｅｎＢａｎｋで確認することができる。
【図２】図２はｈＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域および蛍光タンパク質のｃＤＮＡを含むプラスミドベクターの概略図である。
【図３】図３は図２のプロモータで形質転換したＨｅｐＧ２細胞を示す。
【図４】図４はｃ７ｏｒｆ４３のｃＤＮＡを含むベクターの概略図を示す。ｃ７ｏｒｆ４３の塩基配列等の詳細はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）のデータベースであるＧｅｎＢａｎｋで確認することができる。
【図５】図５はｃ１５ｏｒｆ５５のｃＤＮＡを含むベクターの概略図を示す。ｃ１５ｏｒｆ５５の塩基配列等の詳細はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）のデータベースであるＧｅｎＢａｎｋで確認することができる。
【図６】図６ＡＢは本願発明のｈＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域発現調節遺伝子をノックダウンした時のｈＴＥＲＴ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示す図である。Ａは図４および図５のベクターで本願発明のｈＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域発現調節遺伝子を組み込んだ細胞ではｈＴＥＲＴの発現が対照に対して高くなる。しかしながら、これらの遺伝子をノックダウンすると、相対的なｍＲＮＡ発現が低下することが明らかとなった。このことは、ｈＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域の活性にこれらの因子が関与していることを示している。
【図７】図７は本発明のｈＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域発現調節遺伝子を過剰発現させたＨｅｐＧ２細胞を培養したときのコロニー形成の結果である。
【図８】図８はＲＮＡ干渉により、本発明のＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域調節遺伝子をノックダウンすると、ｃ１５ｏｒｆ５５をノックダウンした系ではコロニー形成が抑制され、ｃ７ｏｒｆ４３をノックダウンした系では細胞が積み重なって増殖することを抑制した。
【図９】図９は本発明のＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域調節遺伝子が作用するｈＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域上のモチーフを特定した結果を示す。
【図１０】図１０は肝癌患者の肝臓で本発明のＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域調節遺伝子の発現を指標に肝臓の状態を判断した結果を示す。肝癌患者の肝臓の非癌部および癌部において、発現調節遺伝子の発現に差はなかった。このことは、被験者生検検査において、癌部の診断における重要なマーカーとなり得る。
【図１１】図１１は肝癌患者の肝臓の非癌部の状態を、本発明のＴＥＲＴ遺伝子プロモータ領域遺伝子（ｃ７ｏｒｆ４３またはｃ１５ｏｒｆ５５または両者）の発現を調べ、チャイルドピュースコアとすり合わせた結果を示す。Ｃ１５の発現はスコアが進むにつれて強くなるが、Ｃ７ではスコア７より発現が高くなっている。両遺伝子の発現パターンと作用には異なるメカニズムがあることを示唆するものである。スコア８は検体が少ないため結果を記載していない。このことは、本発明のＴＥＲＴ遺伝子プロモータ領域調節遺伝子の発現がチャイルドピュースコアにとって替わる肝臓の状態を診断するツールとして有効であることを示している。
【図１２】図１２は患者由来肝臓の癌部と非癌部との生検試料を本発明のＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域調節遺伝子の発現量を調べ、ｈＴＥＲＴの発現量とすり合わせた結果を示す。ＡからＤのいずれにおいても、ｈＴＥＲＴの発現量と本発明のＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域調節遺伝子の発現量に相関がみられた。
【本願発明の効果】
【００１８】
ｃ７ｏｒｆ４３またはｃ１５ｏｒｆ５５または両者の遺伝子発現を検出することにより、早期に肝癌の診断を行うことを可能とする。また、これらの遺伝子の発現を検出することにより、肝硬変の進行の診断も可能となるばかりでなく、肝硬変から肝癌へ移行する可能性を予測することができる。また、ｃ７ｏｒｆ４３またはｃ１５ｏｒｆ５５または両者の遺伝子発現を阻害することにより、癌の進行を遅くすることが可能となるばかりでなく、発癌自体を抑制することも可能である。したがって、本願発明を利用することにより、ＴＥＲＴ遺伝子発現を介しての悪性腫瘍の発症を抑える核酸医薬品を提供することもできる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書において、「ＴＥＲＴ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）」とは、約９０％の悪性腫瘍において発現する悪性腫瘍（癌）特異的抗原（酵素）であるテロメレースの活性中心に位置するサブユニットの一つであり、特にヒトのＴＥＲＴをｈＴＥＲＴと称する。例えば、マウスのＴＥＲＴをｍＴＥＲＴと称する。本実施形態では、ＴＥＲＴとして、ＴＥＲＴポリペプチドの遺伝子多型体やスプライシングバリアントなどを用いることもできる。テロメレースは、その活性が１９９４年に発見されて以来、遺伝子の発見及び機能解析が行われてきたが、その臨床応用に関しては、腫瘍形成、転移後の切除組織中からの検出に留まり、血液中から簡易に検出することができなかった。２０００年には、乳癌患者の血液からｈＴＥＲＴの定性的検出に関する報告がなされたが（Ｃｈｅｎ  ＸＱ，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６：  ３８２３−３８２６  （２０００））、その感度は６０％以下であり、臨床応用にはほど遠かった。
【００２０】
本願発明において「プロモータ領域」の語は下流の核酸の転写を開始する調節配列を意味する。本願発明において、「プロモータ領域」はＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域である。更に、本願発明において、該プロモータ領域はヒトＴＥＲＴ（ｈＴＥＲＴ）遺伝子のプロモータ領域、あるいはマウスＴＥＲＴプロモータ領域でもよい。更に、本願発明において、ＴＥＲＴプロモータ領域には、本願発明者らにより発見されたこの領域の発現および活性化を調節する因子（調節因子）による調節作用に影響のない範囲にて、変異を含んでいてもよい。また、該領域はＣ２２８Ｔの変異を含んでいてもよい。
また、該発明においてプロモータ領域はＴＥＲＴ遺伝子の転写開始点の数ｋｂｐ上流、具体的には、ＴＥＲＴ遺伝子の転写開始点の、５０３６ｂｐ上流、または１２６３ｂｐ上流、または６７３ｂｐ上流、または３６３ｂｐ上流、または２６４ｂｐ上流、または１６９ｂｐ上流、または５８ｂｐ上流から、転写開始点の１００ｂｐ下流まで、好ましくは５８ｂｐ下流、好ましくは３６ｂｐ下流までを含む。
本願発明において重要なのは、以下で説明するように、ＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域中に発現および活性化に関与する部位が発明者らにより同定されたことである。また、本願発明者らによりＴＥＲＴ遺伝子のプロモータの発現および活性化をコントロールする遺伝子が同定された。
なお、ＴＥＲＴ遺伝子プロモータ配列は既知の配列であり、たとえばヒトＴＥＲＴ遺伝子配列はＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿０００００５．１０に記載がある。
【００２１】
本明細書で用いる「発現ベクター」の用語は、好適な宿主細胞でタンパク質を発現させることのできる好適な制御配列に動作可能に結合されているタンパク質コード領域を含むＤＮＡ構築体を言う。ある実施態様においては、その様な制御配列は転写を行うプロモータ、ｍＲＮＡを生成するために転写を制御する任意のオペレータ配列、ｍＲＮＡ上の好適なリボソーム結合部位をコードする配列及びエンハンサー及び転写及び翻訳の終了を制御する配列を含む。
このベクターは、プラスミド、ファージ粒子、又は単に可能性のある遺伝子挿入でもよい。一旦好適な宿主細胞に形質転換されると、ベクターは複製して、独立的に宿主細胞ゲノムの機能を果たす、又は幾つかのケースにおいて、ゲノム自信に取り込まれる。このプラスミドが現在最も一般的なベクターの形態であることから、本明細書において、「プラスミド」、「発現プラスミド」、及び「ベクター」の語は同じ意味に用いる。しかしながら、当業者において、等しい機能を提供する、及び等しい機能である、又は等しい機能となりうる他の発現ベクターの形態も含むことを意図する。
【００２２】
本願発明のＴＥＲＴ遺伝子プロモータ領域調節遺伝子とは、本願発明者らによりＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域の発現および活性化を調節することが発見された遺伝子を意味する。具体的には、ヒトゲノムにおいてはｃ７ｏｒｆ４３およびｃ１５ｏｒｆ５５である。これまで、ＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域の変異が肝癌のイニシエーションに関連することは報告がされている。本願発明者らは、該プロモータ領域の発現および活性化に関連する遺伝子を同定することに成功した。これらの遺伝子は、プロモータ領域中のＴＥＡＤモチーフおよびＧＣモチーフにアプローチする経路または因子の活性化に関与している。例えば、プロモータ領域に関与すると思われる転写因子の活性を、阻害剤等により抑制することはこれまで試みられている。しかしながら、本願発明のように、プロモータ領域の発現および活性化に深く関与する因子はこれまで同定されていなかった。このような因子が明者らにより初めて同定されたことにより、プロモータ領域の発現調整が初めて可能となった。
【００２３】
本願発明において、ｃ７ｏｒｆ４３は、７番目の染色体の中の４３番目のオープンリーディングフレームを意味する。このアサインは、ヒトゲノムを基準としての記載であるが、例えばマウスにおいて、同様の働きをする遺伝子は５番目の遺伝子上にあることが確認されている。ｃ７ｏｒｆ４３の塩基配列等の詳細はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）のデータベースであるＧｅｎＢａｎｋで確認することができる。ｃ７ｏｒｆ４３に相当する機能を有する遺伝子はマウスに限らず哺乳動物全般に存在していることは当業者の知識の範囲内である（“Ｃ７ｏｒｆ４３−Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  （ＨＧ−Ｕ１３３Ａ）”．  ＮＣＢＩ  ＧＥＯ  Ｐｒｏｆｉｌｅｓ．  Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ  ２  Ａｐｒｉｌ  ２０１５．  “Ｃ７ｏｒｆ４３−Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｎｏｒｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ”．  ＮＣＢＩ  ＧＥＯ  Ｐｒｏｆｉｌｅｓ．  Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ  ２  Ａｐｒｉｌ  ２０１５．）。本明細書において、ｃ７ｏｒｆ４３は遺伝子を意味し、該遺伝子発現により提供されるタンパク質をＣ７と記載する。本願発明者らにより該遺伝子はＨｉｐｐｏ経路を介してＴＥＡＤモチーフを活性化させることが示唆された。
【００２４】
ここにおいて、オープンリーディングフレーム（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ；  ＯＲＦ）とは、ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列をアミノ酸に翻訳した場合に終了コード配列（Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｃｏｄｏｎ；  終止コドン）を含まない読み取り枠（Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ）がオープンな（Ｏｐｅｎ）状態にある（即ち、タンパク質に翻訳される可能性がある）塩基配列を指す。
【００２５】
本発明において、「ＴＥＡＤモチーフ」の語は、ＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域にある所定の塩基配列を意味する。該モチーフはＨｉｐｐｏ経路により活性化が調節される。Ｈｉｐｐｏ経路は、ショウジョウバエ及び脊椎動物において臓器の発達を適切に制御するのに必須な、保存されているシグナル経路であることが明らかとなっている（Ｈａｌｄｅｒ，２０１１，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｊａｎ；１３８（１）：９−２２）。Ｈｉｐｐｏ経路の非活性化状態では、下流の転写共役因子ＹＡＰ１（ＹＥＳ関連タンパク質１）／ＴＡＺ（ＹＡＰ１のパラログであるＰＤＺ結合モチーフを有する転写共役因子）がＴＥＡＤモチーフに結合し、細胞増殖や細胞分裂に関わる標的遺伝子の発現を誘導することにより細胞増殖を促進する。一方、Ｈｉｐｐｏ経路が活性化されると、ＭＳＴキナーゼカスケードを介して、ＹＡＰ１／ＴＡＺをリン酸化することにより、これを核外に排除するとともに、タンパク質崩壊に導き、細胞増殖を負に制御する。（特開２０１７−２１４３０４）
本願発明者らにより、ＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域に該領域の活性化に関与するＴＥＡＤモチーフの存在が初めて確認された。具体的には、該モチーフは、ｈＴＥＲＴ遺伝子の転写開始点の１６９番目の塩基から下流５８番目の塩基の間に２か所あることが見出された。また、これらのモチーフの活性化はｃ７ｏｒｆ４３に依存していることも明らかとなった。このことにより、本願発明を利用することで、Ｈｉｐｐｏ経路を非活性化させ、癌細胞などの増殖を抑制することが可能となった。また、ｃ７ｏｒｆ４３を過剰発現させることにより、肝癌細胞の新たな細胞系統を作り出すことも可能となる。このような細胞系統は肝細胞癌に対して抗癌効果、または制癌効果のある化合物をスクリーニングすることが可能となる。また、被験細胞においてｃ７ｏｒｆ４３の発現を検出することによりヒトまたは動物において肝癌罹患の可能性あるいは、肝癌処置後の再発の可能性、状態等を予測することができる。
【００２６】
本願発明において、ｃ１５ｏｒｆ５５は、１５番目の染色体の中の５５番目のオープンリーディングフレームを意味する。このアサインは、ヒトゲノムを基準としての記載である。ＮＵＴＭ１とも言われており染色体転座によって生じるＢＲＤ４との融合遺伝子が癌と関わりがあることが報告されている（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ａ．  Ｆｒｅｎｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６３，３０４−３０７，  Ｊａｎｕａｒｙ  １５，  ２００３）。ｃ１５ｏｒｆ５５に相当する機能を有する遺伝子はマウスに限らず哺乳動物全般に存在していることは当業者の知識の範囲内である。ｃ１５ｏｒｆ５５の塩基配列等の詳細はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）のデータベースであるＧｅｎＢａｎｋで確認することができる。
本明細書において、ｃ１５ｏｒｆ５５は遺伝子配列を示し、該遺伝子発現により提供されるタンパク質をＣ１５と記載する。本発明においてｃ１５ｏｒｆ５５により活性化されるＧＣモチーフがｈＴＥＲＴプロモータ領域の転写開始点より上流に存在することが発明者らにより初めて確認された。
【００２７】
本発明において、ＧＣモチーフは、真核生物の転写開始点の上流に位置するＧとＣを多く含む保存されている部位を意味し、ＣＧリッチＤＮＡエレメントあるいはＧＣボックスとも言われている。この部位に、カルボキシル末端側に３個のＣ２Ｈ２  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒを持つ転写因子Ｓｐ１が結合することにより転写が亢進することが知られている。本願発明者らにより、ＴＥＲＴプロモータ領域に該領域の活性化に関与するＧＣモチーフの存在が初めて確認された。具体的には、該モチーフは、ｈＴＥＲＴ遺伝子の転写開始点の５８番目の塩基から下流３６番目の塩基の間に２か所あることが見出された。また、該モチーフの活性化はｃ１５ｏｒｆ５５に依存していることも明らかとなった。このことにより、本願発明を利用することで、即ち、転写開始因子であるｃ１５ｏｒｆ５５をノックダウンすることで、ＴＥＲＴ遺伝子プロモータ領域の発現を抑制し、癌細胞などの増殖を抑制することが可能となった。また、ｃ１５ｏｒｆ５５を過剰発現させることにより、肝癌細胞の新たな細胞系統を作り出すことも可能となる。また、被験細胞におけるｃ１５ｏｒｆ５５の発現を検出することにより肝癌罹患の可能性あるいは、肝癌処置後の再発の可能性、状態等を予測することができる。
【００２８】
本明細書で用いる「動作可能に結合されている」の用語はそれらの要素が機能的に関連することを可能にする要素の配置を言う。例えば、プロモータは、もしそれが配列の転写を制御する場合、プロモータはコード配列に動作可能に結合されていると言う。
【００２９】
本明細書で用いる「選択マーカー」の用語は導入された核酸又はベクターを含むこれらの宿主の選択を容易にする宿主中で発現をさせることのできるタンパク質を言う。選択マーカーの例には抗菌剤（例えば、ヒグロマイシン、ブレオマイシン又はクロラムフェニコール）及び／又は宿主細胞で栄養的利益の様な代謝上の利益を与える遺伝子を含むがこれに限定されるものではない。
【００３０】
本発明において、レポータ遺伝子とは、発現を確認する遺伝子の下流に組み込まれたマーカー配列を意味する。通常、レポータ遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子、及び他の蛍光タンパク質由来の遺伝子である。
【００３１】
本明細書で用いる「由来する」の用語は「から生ずる」、「得られた」、又は「から得られる」、及び「から分離された」を含む。
【００３２】
本明細書で用いる「回収された」、「単離された」、及び「分離された」の用語はそれが天然に関連している少なくとも一つの成分から取り出されたタンパク質、細胞、核酸又はアミノ酸について言う。
【００３３】
本明細書で用いる「軽質転換された」、「安定的に形質転換された」及び「トランスジェニック」の用語は、細胞に関して言う場合、細胞がゲノムに統合された又は複数世代にわたり維持されたエピソームプラスミドとして非天然（例えば、異種の）核酸配列を持つ細胞を言う。
【００３４】
本明細書で用いる「発現」の用語は遺伝子の核酸配列に基づき生成されるポリペプチドの生成プロセスを言う。このプロセスは転写及び翻訳を含む。
【００３５】
本明細書で用いる「導入する」の用語は核酸配列を細胞に挿入する場合について言う場合、「トランスフェクション」、「形質転換」、又は「軽質導入」を意味し、核酸配列を真核細胞又は原核細胞に組み入れることに関する場合を含み、その場合核酸配列は細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、又はミトコンドリアＤＮＡ）に組み入れられ、自律複製単位に変換され又は一時的に発現される（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）。
【００３６】
本明細書で用いる「ハイブリダイズする」（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の用語は技術分野で知られている塩基対合を通して一つの核酸のラセン構造が相補的ラセン構造と一体になるプロセスを言う。２つの配列が中程度から高ストリンジェンシーなハイブリッド条件及び洗浄条件で互いに特異的にハイブリッドする場合、核酸は対応核酸配列に「選択的にハイブリッドすることが可能」（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ）であると考えられる。中程度から高ストリンジェンシーなハイブリッド条件は当業者に良く知られている（Ａｕｓｕｂｅｌ他，「分子生物学における簡単な手順の紹介」（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）第３版，  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｈｏｂｏｋｅｎ，  ＮＪ  ［１９９５］；  及び  Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、「分子のクローニング」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）、実験室マニ−ュアル，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  ［２００１］を参照）。高ストリンジェンシーなハイブリッド条件の例には５０％ホルムアルデヒド中約４２℃で，５Ｘ  ＳＳＣ，５Ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液，０．５％  ＳＤＳ  及び１００  ｕｇ／ｍｌ  非変性担体  ＤＮＡでハイブリッド化させ、続いて室温で２Ｘ  ＳＳＣ及び０．５％  ＳＤＳで２度洗浄し、そして４２  ℃の０．１  Ｘ  ＳＳＣ及び０．５％  ＳＤＳ中で更に２度洗浄することを含む。
【００３７】
また、本実施形態における「核酸」とは、天然に存在する塩基、糖及び糖間結合からなる核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡの双方を含む）のことをいい、そのオリゴマー（例えば、２から１００塩基程度）及びポリマー（例えば、１００塩基以上）を含む総称である。本実施形態における核酸は、同様に機能する天然に存在しないモノマー、蛍光分子等や放射性同位体で標識されたモノマー、あるいはこれらを含むオリゴマー又はポリマーを含む。
【００３８】
また、本実施形態における「ｍＲＮＡ」や「ｃＤＮＡ」は、必ずしも完全長である必要は無く、腫瘍の診断など、それぞれの使用目的に応じた鎖長と特異性とを有するｍＲＮＡやｃＤＮＡであればよい。
【００３９】
また、本実施形態における「プライマー」とは、逆転写反応もしくは核酸増幅反応において、鋳型とハイブリダイズし、逆転写反応もしくは核酸増幅反応を開始するのに必要な核酸のことをいう。逆転写反応もしくは核酸増幅反応において、標的の鋳型とハイブリダイズし、その後の反応を行えるように、好ましくは特異的な生成物（鎖長あるいは配列において）を生成可能なように、より好ましくはプライマー自身がその鋳型特異的な配列を含むように、設計される。また、一般的なプライマーは、これに限られないが、通常、１５塩基−１００塩基、好ましくは１５塩基−３５塩基の鎖長を有するように設計される。
【００４０】
このようなプライマーは、プライマーのＧＣ（グアニン・シトシン）の比率や、融解温度などの当業者によく知られた技術常識、並びにＢＬＡＳＴ等の公知のプログラム及びデータベースを用いることにより、当業者には容易に設計可能である。また、各種プライマー設計ソフトウェアを用いてもよく、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＴＭ（パーキン・エルマー、アプライドバイオシステムズ）やＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（富士通株式会社；ＬＡＭＰ法用）を用いて設計することもできる。その際、プライマーの３’側の領域は鋳型鎖に対し相補的であることが好ましいが、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することも可能である。
【００４１】
また、例えば核酸増幅法としてＩＣＡＮ法を用いる場合などにおいては、プライマーはＤＮＡだけでなくＲＮＡを含むか、あるいは必要に応じてＲＮＡのみで構成されていてもよい。また、用いる核酸増幅方法／核酸検出方法に応じて、プライマーは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ配列、ステムループ構造部位、制限酵素配列などの様々な機能配列を更に含んでもよい。特に本発明に好適なプライマーについては、後述する。
【００４２】
また、本実施形態において、「特異的にハイブリダイズする」とは、ある核酸に対し、別の核酸が水素結合等を介し、相補的に結合し、比較対照とすべき核酸には同条件では結合しない状態をいう。必ずしも、「他の全ての核酸に対して結合しない」必要性は無く、使用目的に応じた特異性を有していればよい。例えば、ＴＥＲＴ遺伝子のｍＲＮＡの検出においては、試料中に含まれる他のｍＲＮＡに対して無視できるほどにしか弱く結合しない核酸は、「特異的にハイブリダイズする」核酸であるということができる。
【００４３】
ハイブリダイズの条件は、その核酸の使用目的に応じて選択することができる。例えば、ＰＣＲに用いるプライマーとしての核酸であれば、ＰＣＲでのアニーリング時の条件でハイブリダイズするように選択される。好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズするものが選択される。
【００４４】
また、本実施形態における「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を含む条件、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるものや、その適宜改変したものが挙げられるが、これに限られない。また、ハイブリダイゼーション条件の温度については、用いる核酸増幅反応あるいはハイブリダイズ反応に応じて定めることができるが、例えば、４２℃、４３℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、６８℃、７０℃、７２℃である。
【００４５】
また、本実施形態において、「核酸増幅」法としては、標的の核酸を増幅させる方法として公知のものならば、何れの方法を用いてもよいが、プライマー及びプライマーセットを用いる方法として、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法あるいはその他の核酸の協奏的核酸増幅方法が用いられる。特にＲＮＡを増幅する際には、逆転写酵素によってＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、それと同時或いはそれに引き続いて、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによって標的ＲＮＡ由来の核酸産物を増幅させるＲＴ−ＰＣＲ法（Ｋｉｎｅｔｉｃ  ＲＴ−ＰＣＲ法など）、ＲＴ−ＬＡＭＰ法あるいはその他の核酸の協奏的ＲＮＡ増幅方法が用いられる。
【００４６】
更に、核酸増幅法としては、上記のＬＡＭＰ法に加え、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法、ＩＣＡＮ法、ＴＲＣ法等を用いることもでき、当業者であれば、それぞれの方法の試薬やキット等の通常用いられる用い方に従って、これらの方法を実施することができる。
【００４７】
さらに、本発明のＲＴ−ＰＣＲ反応（逆転写反応と核酸増幅反応）としては、Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲを用いることもできる。Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲとは、ＲＴでのインキュベーションからＰＣＲでのサイクリングまで、チューブの開閉や試薬の添加を行うことなく、ワンステップで迅速かつ簡便にＲＴ−ＰＣＲを行うことができるＲＴ−ＰＣＲ法のことであり、当該技術分野ではＯｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲのための様々なキット、プロトコールが使用可能であり（例えば、ＱＩＡＧＥＮのＯｎｅＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲＭｉｘなど）、適宜それらを選択して実施することができる。
【００４８】
また、本実施形態において、増幅産物の検出法としては、核酸を検出するための方法として公知のものならば、何れの方法を用いてもよい。例えば、増幅後の核酸を電気泳動して検出しても、検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション法を用いて検出してもよいが、多数検体処理、自動化、再現性や二次汚染等の点で有利なインターカレーター性蛍光色素を用いてもよい。
【００４９】
増幅核酸の検出方法は、上記に限られず、例えば、ＬＡＭＰ法では、副産物のピロリン酸マグネシウムによる白濁を指標に検出してもよく、増幅核酸を直接測定しない方法等であっても、それぞれの核酸増幅方法に適用可能な公知の増幅産物検出方法であれば、何れの方法でも用いることができる。
【００５０】
本実施形態に係る「同一性」とは、配列を比較することにより決定される、２以上の核酸の間の関係を言い、核酸の塩基配列間の適合によって決定されるような配列一致性の程度を意味する。「同一性」に関するパラメータは、既知の方法により容易に計算可能である。この際に、同一の塩基（チミンとウラシンも同一とみなす）を有するＤＮＡとＲＮＡとは結合特性が非常に近いため、同一の核酸塩基として定義される。同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えば、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の提供するＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２ＳＥＱ又はＡＬＩＧＮのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能であるが、簡便には、ＢＬＡＳＴ２ＳＥＱにおいて標準的な初期パラメータを用いて計算された値を用いることもできる。
【００５１】
本願の一つの実施形態は、ＴＥＲＴ遺伝子を安定的に発現する細胞およびそのためのベクターを提供する。該細胞を提供するために用いるベクターは、ＴＥＲＴ遺伝子の所定のプロモータ領域を含む。好ましくは、ｈＴＥＲＴ遺伝子の所定のプロモータ領域を含む。通常、遺伝子の転写開始点を１位とした場合、ここから５ｋｂｐ程度上流までにプロモータ領域が存在すると推定されている。本発明において、発明者らはヒトＴＥＲＴ遺伝子の転写開始点の下流５０３６ｂｐから上流３６ｂｐの下流側を適宜狭めて検討を行った結果、転写開始点から１６９ｂｐ下流から３６ｂｐ上流の間に、ｈＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域に該遺伝子の発現に有意に作用をする部位があることを特定した。このような部位をベクター、好ましくはプラスミドベクターを使い細胞、好ましくは肝癌細胞を形質転換すると、ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現を有意にかつ安定して発現させることが可能となる。このように形質転換された細胞は、肝癌の治療に有効な化合物をスクリーニングすることに役立つ。
【００５２】
他の側面において、本発明は、発現調節遺伝子を含むベクターを提供する。該側面において、前述のようにＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域を安定に発現する細胞に、発現調節遺伝子、好ましくはｃ７ｏｒｆ４３、好ましくはｃ１５ｏｒｆ５５、あるいは両者を更なるベクター、好ましくはウイルスベクターで導入する。
本願発明において、ウイルスベクターの種類は重要ではない、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルス等を適宜選択することができる。好適なウイルスベクターの選択は当業者の知識の範囲内である。
該ベクターで発現調節遺伝子を導入された細胞は、ＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域が活性化され、ＴＥＲＴ遺伝子の発現量が高くなる。好ましくは、ＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域のＴＥＡＤモチーフおよびＧＣモチーフが、それぞれｃ７ｏｒｆ４３、ｃ１５ｏｒｆ５５、あるいはこれらに相当する遺伝子により活性化されることでＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域が活性化される。従って、本願発明に係る発現調節遺伝子を含むベクターは、自然発生的なメカニズムで癌化する肝癌細胞の作製に有効である。
【００５３】
他の側面において、本発明は、発現調節遺伝子を含むベクターで形質転換した細胞を提供する。このような細胞は、自然発生的メカニズムで癌化する肝癌細胞であることから、実際に生体内で癌の進行を遅くしたり、癌を抑制する効果を奏する化合物のスクリーニングが可能となる。
【００５４】
他の側面において、本発明は、ＴＥＲＴ遺伝子の発現を予測する方法を提供する。前述のように、本願発明によりＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域の発現および活性化に影響を与える発現調節遺伝子が本願発明者らにより特定された。本側面では、ＴＥＲＴ遺伝子の発現を活性化させるプロモータ領域に影響を与える発現調節遺伝子を被験試料から検出する。プロモータ領域の変異は肝癌の初期に認められること、及び本願発明者らにより肝癌患者の肝臓の非癌部においても本願発明に係る発現調節遺伝子を検出していることから、本願発明により、組織学的には癌化が起こっていない試料においても癌化の可能性を予測することができる。
【００５５】
他の側面において、本発明は、ＴＥＲＴ遺伝子の発現を予測するためのキットを提供する。該キットは、本願発明に係る発現調節遺伝子のｃＤＮＡを含む。例えば、被験試料から抽出されたｍＲＮＡに上記ｃＤＮＡがハイブリダイズするか否かを確認することにより、被験試料中のｈＴＥＲＴ遺伝子の発現を予測することが可能となる。従って、本側面におけるＴＥＲＴ遺伝子発現を予測するキットは、被験試料からｍＲＮＡを抽出するための試薬、発現調節遺伝子のｃＤＮＡ、ハイブリダイゼーションに必要な試薬、およびこれらを増幅する試薬を含む。
【００５６】
他の側面において、本発明は、ＴＥＲＴ遺伝子の発現を抑制する方法を提供する。
該方法は、本願発明に係る発現調節遺伝子の発現をこれらのｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡで抑制する。この態様によれば、ＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域を不活性化することにより、ＴＥＲＴ遺伝子の発現を抑制し、肝癌を抑制することができる。
ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）は２１−２３塩基対から成る低分子二本鎖ＲＮＡが１つのループ構造を介して一本鎖としてつながった形のＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡはＲＮＡ干渉と呼ばれる現象に関与しており、ｍＲＮＡの破壊によって配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。本実施形態では、本願発明の発現調節遺伝子の塩基配列の一部分に対応する２１−２３塩基対を含む二本鎖ＲＮＡが１つのループ構造を介して、一本鎖としてつながった形のｓｈＮＲＡを含むことが好ましい。このようなヘアピン構造を有するｓｈＲＮＡを含むことが好ましい。
このようなヘアピン構造を有するｓｈＲＮＡであれば、本願発明の発現調節遺伝子の発現を効果的に抑制することができ、その結果、肝癌を抑制する効果が得られる。
また、ＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域の発現、活性に影響する本願発明の発現調節遺伝子は、肝硬変から肝癌への進行を効果的に抑制することが可能となる。
ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）とは２１−２３塩基対から成る低分子二本鎖ＲＮＡである。ｓｉＲＮＡはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象に関与しており、ｍＲＮＡの破壊によって配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
そのため、本願発明は本願発明に係る発現調節遺伝子の塩基配列の一部に対応する２１−２３塩基対を含む二本鎖ＲＮＡからなるｓｉＲＮＡであれば本願発明の発現調節遺伝子の発現を効果的に抑制することができ、その結果その結果、肝癌を抑制する効果が得られる。
また、ＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域の発現、活性に影響する本願発明の発現調節遺伝子は、肝硬変から肝癌への進行を効果的に抑制することが可能となる。
アンチセンスＲＮＡとは、標的ｍＲＮＡに相補的な配列を持つアンチセンスＲＮＡである。このように標的ｍＲＮＡに相補的な配列を持つアンチセンスＲＮＡを、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズさせると、標的ｍＲＮＡが翻訳されることを妨げるので、標的ｍＲＮＡの発現を抑制することになる。なお、同様の現象は、標的ＲＮＡに相補的な配列を持つアンチセンスＤＮＡでも可能である。
そのため、本願発明に係る発現調節遺伝子の塩基配列の少なくとも一部（全部でもよい）に対応するアンチセンスＲＮＡを含むことが好ましい。このようなアンチセンスＲＮＡであれば、本願発明の発現調節遺伝子の発現を効果的に抑制することができ、その結果肝癌の進行を遅らせる、肝癌を抑制する、肝癌を予防する効果が得られる。
また、ＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域の発現、活性に影響する本願発明の発現調節遺伝子は、肝硬変から肝癌への進行を効果的に抑制することが可能となる。
ｃ７ｏｒｆ４３およびｃ１５ｏｒｆ５５を発現する核酸組成物をヒト細胞に送達させる方法として、リポソーム／ポリソーム／化学的形質移入ＤＮＡ組換え、電気穿孔法、遺伝子銃による貫入（ｇｅｎｅ  ｇｕｎ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）、トランスポゾン／レトロトランスポゾン挿入（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ／ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）、ジャンピング遺伝子組み込み（ｊｕｍｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション（ｍｉｃｒｏ−ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ウィルス感染（ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、レトロウィルス／レンチウィルス感染（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ／ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、及びこれらの組み合わせから選ばれる非遺伝子導入方法又は遺伝子導入方法が用いられる。
【００５７】
他の側面において、本発明は、ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現を抑制するためのキットを提供する。該側面において、本願発明に係るキットは、本願発明に係る発現調節遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡを含む。これらを細胞あるいは生体内の標的組織に届ける要素を含む。届けるＲＮＡまたはＤＮＡの種類に応じて輸送要素を選択することは当業者の知識の範囲内である。
【００５８】
他の側面において、本発明は、肝細胞、肝癌幹細胞、肝癌細胞、肝硬変に有用な化合物をスクリーニングするためのシステムを提供する。該システムは、それぞれの細胞に本願発明の発現調節遺伝子を遺伝子導入するための手段、本願発明の発現調節遺伝子を導入した細胞と候補化合物とを培養する手段、および培養した細胞からＴＥＲＴプロモータ発現または本願発明の発現調節遺伝子の発現を検出する手段を含む。
【００５９】
他の側面において、本発明は、肝細胞、肝癌幹細胞、肝癌細胞、肝硬変に有用な化合物の薬効を評価するためのシステムを提供する。該システムは、それぞれの細胞に本願発明の発現調節遺伝子を遺伝子導入するための手段、本願発明の発現調節遺伝子を導入した細胞と候補化合物とを培養する手段、および培養した細胞の増殖、癌遺伝子発現、組織学的手段、ＴＥＲＴ遺伝子プロモータ発現を評価する。
【００６０】
他の側面において、本発明は、本発明の方法、キット、システムに用いる、核酸配列のセットを提供する。
【００６１】
本発明に係る他の実施形態は、上述の診断キットを含む製造品である。この製造品は容器及び容器に備え付けられるラベル又はパッケージ挿入物を含む。容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等を含み、ガラス又はプラスチックなどの適切な素材から選択される。容器は、本発明に係る診断キットを含む組成物を収容し、場合によっては無菌のアクセスポートを有し得る形態も可能である（例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バイアルであってよい）。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌又は腫瘍の診断のために使用されることを示す。ラベル又はパッケージ挿入物は、診断に用いる際の注意書きを更に含む。製造品はさらに、コントロール試料、各種緩衝液、希釈液、フィルター、針、シリンジ及び注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）等を含む付加的な容器を具備してもよい。
【００６２】
本実施形態に係る肝臓癌、または肝臓がんの罹患予測を判定するための診断薬（キット）は、ｃ７ｏｒｆ４３、ｃ１５ｏｒｆ５５からなる群から選ばれる１つ以上の遺伝子の発現量を測定するための試薬を含む、診断薬である。この構成によれば、テロメアーゼのプロモータ領域の活性化調節効果を有することが後述する実施例において実証されているｃ７ｏｒｆ４３、ｃ１５ｏｒｆ５５のいずれかの発現量を測定するための試薬を含むため、被験者の生体内にあるｃ７ｏｒｆ４３、ｃ１５ｏｒｆ５５のいずれかの発現量を測定するための診断薬として利用できる。
ここで診断薬の使用方法は特に限定しないが、例えば、被験者の生体内における細胞、血液、血清、体液、または病理切片等と、標準的な細胞等において、ｃ７ｏｒｆ４３、ｃ１５ｏｒｆ５５のいずれかまたは両者の発現量を検定、比較することで診断が可能である。例えば、これらの発現量が所定の閾値を超えていれば、被験者が肝臓がんを患っている、あるいは将来的に患う可能性が高いと判定することができる。一方これらの発現量が所定の閾値を下回れば被験者が肝癌細胞を有していないまたは、将来的に肝癌を患う可能性が低いと判断することができる。この閾値は、例えば健常者の発現量の平均値の０．０６や２．９に設定してもよく、０．１１や５．８以上に設定してもよく、０．３や１６７．０以上に設定してもよく、５．１や５７．６倍以上に設定してもよい。また、この閾値は、例えば健常者の発現量の平均値よりも標準偏差の２倍以上大きい場合に設定してもよく、標準偏差の５倍以上大きい場合に設定しても良く、標準偏差の１０倍以上大きい場合に設定してもよい。あるいは被験者の生体内におけるｃ７ｏｒｆ４３、ｃ１５ｏｒｆ５５、のいずれかあるいは両者の発現量が、例えば健常者の発現量に比べて有意差が認められるほど大きいかどうかで判断してもよい。有意差があるかどうかに判定としては、例えば母集団が正規分布に従うと仮定できる場合にはパラメトリックス検定であるスチューデントのｔ検定において有意差があれば好ましい。即ち、スチューデントのｔ検定で片側検定でＰ＜０．０５となればよく、より好ましくは、片側検定でＰ＜０．０３となればよく、最も好ましくは片側検定でＰ＜０．０１となればよい。なおスチューデントのｔ検定は特に片側検定に限定するわけではなく、両側検定で行っても良い。さらに、母集団が正規分布に従うと仮定できない場合には、ノンパラメトリックス検定として、マン・ホイットニーのＵ検定等を行って有意差の有無を検定してもよい。
被験者の生体内におけるｃ７ｏｒｆ４３、ｃ１５ｏｒｆ５５のいずれかの発現量を測定するための試薬は、特に限定するものではないが、例えば被験者の生検サンプルから抽出されたＲＮＡにおいて、ｃ７ｏｒｆ４３、ｃ１５ｏｒｆ５５の塩基配列に相補的な塩基配列を含むプローブを用いて測定することができる。この方法を用いれば、被験者の生体内におけるｃ７ｏｒｆ４３、ｃ１５ｏｒｆ５５のいずれかのｍＲＮＡの発現量を好適に測定することができる。また、これらのプローブは、蛍光色素はたは放射線同位元素で標識されていることが好ましい。このように標識すれば、簡便な方法で感度良くこれらのｍＲＮＡの発現量を測定することができる。
最も、被験者の生体内におけるｃ７ｏｒｆ４３、ｃ１５ｏｒｆ５５のいずれかの発現量の測定のための試薬は、ｃ７ｏｒｆ４３、ｃ１５ｏｒｆ５５から選ばれる１つ以上の遺伝子がコードするタンパク質の発現量を測定するための試薬であってもよい。
【００６３】
本実施形態において、本発明のＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域調節遺伝子を過剰発現させた肝細胞は、肝癌になりやすくなる。すなわち、このような肝細胞、あるいは肝癌細胞に候補化合物を接触させて、これらの遺伝子の発現を観察することにより、よりＨＣＣの初期に効果のある化合物をスクリーニングすることができる。
【００６４】
また、所定の被験者の生検試料について、投与する薬剤の効果があるか、を候補化合物の投与後のこれらの遺伝子の発現を確認することにより、候補医薬品と個人の効果についても予測することができる。
【００６５】
なお、上述の実施形態により説明される各種の方法やプライマーセット等は、本願発明を限定するものではなく、例示することを意図して開示されているものである。本願発明の技術的範囲は、特許請求の範囲の記載により定められるものであり、当業者は、特許請求の範囲に記載された発明の技術的範囲において種々の設計的変更が可能である。
【００６６】
例えば、本発明のプライマーセットをＬＡＭＰ法などに用いる場合、ＴＥＲＴ遺伝子のｍＲＮＡ上で、この配列の外を標的とするプライマーを更に含む、４対のプライマーからなるプライマーセットとすることもできる。このように、それぞれの核酸増幅法の必要性に応じて、更に付加的なプライマーを有してもよく、そのような付加的なプライマーの数や配列等は、それぞれの核酸増幅法に応じて、常法に従い容易に設計することができる。これらの変形例も、本願発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００６７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これは一例であり、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。
【実施例１】
【００６８】
本願発明のＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域調節遺伝子の同定について記載する。例示的に本実施例ではヒトＴＥＲＴ遺伝子およびそのプロモータ領域について述べるが、ＴＥＲＴ遺伝子およびそのプロモータ領域については、各種動物において知られており、当業者は適宜変更して本願発明を用いることができる。
【００６９】
ＴＥＲＴ遺伝子プロモータ領域調節遺伝子の同定
ルシフェラーゼ遺伝子を備えたプラスミドベクター（ｐＧＬ４．１０［Ｌｕｃ２］）にｈＴＥＲＴ遺伝子プロモータ領域の転写開始点の上流約５ｋｂｐから下流５８ｂｐまでを組み込み、該ベクターでＨｅｐＧ２細胞を形質転換した。ｈＴＥＲＴ遺伝子プロモータ領域の塩基配列の詳細はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）のデータベースであるＧｅｎＢａｎｋで確認することができる。得られた細胞はｈＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域を安定に発現する。マーカー遺伝子（ＲＦＰ）とピューロマイシン耐性遺伝子を備えるレンチウイルスヒトｓｈＲＮＡライブラリー（ａｂｍ  Ｉｎｃ．）で該ＨｅｐＧ２細胞を形質転換し、蛍光強度と抗生物質耐性とを指標とするフラクタル分析を行い、ｈＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域の発現が抑制されている細胞から、ｃ７ｏｒｆ４３およびｃ１５ｏｒｆ５５のｓｈＲＮＡを同定した。このことから、これらの遺伝子がｈＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域の発現に関与していることが示唆された。
【実施例２】
【００７０】
本実施例では、ｃ７ｏｒｆ４３およびｃ１５ｏｒｆ５５がｈＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域に働きかけるメカニズムを解明するための試験を説明する。
ｈＴＥＲＴプロモータ領域を含むプラスミドベクターの構築。
公知の核酸合成法を用いて、既知の配列である、ｈＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域において、転写開始点の上流５０３６ｂｐから下流３６ｂｐ（ｈＴＥＲＴプロモータ＃１）、転写開始点の上流１２６３ｂｐから下流３６ｂｐ（ｈＴＥＲＴプロモータ＃２）、転写開始点の上流６７３ｂｐから下流３６ｂｐ（ｈＴＥＲＴプロモータ＃３）、転写開始点の上流２６４ｂｐから下流３６ｂｐ（ｈＴＥＲＴプロモータ＃４）、転写開始点の上流１６９ｂｐから下流３６ｂｐ（ｈＴＥＲＴプロモータ＃４）、および転写開始点の上流５８ｂｐから下流３６ｂｐ（ｈＴＥＲＴプロモータ＃５）を合成した。その下流にレポータ遺伝子、ポリＡシグナル配列およびｈＴＥＲＴｃＤＮＡの上流に構成物質耐性遺伝子を結合した発現カセットを含むプラスミドベクターを構築した。
また、ｈＴＥＲＴプロモータ領域はＣ２２８Ｔの変異を有している配列も用いた。該変異は本分野において既知のものである。
（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｄａｍ／ＬｉｆｅＴｅｃｈ／Ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ＰＤＦｓ／ｊｐ／ｏｈｔｅｒｓ／ｔａｑｍａｎ−ｄｐｃｒ−ｔｅｒｔ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐｏｓｔｅｒ−ｊｐ．ｐｄｆ）
ＨｅｐＧ２細胞に前記５つのプラスミドベクターをそれぞれ導入した。
形質転換された細胞はピューロマイシンによる薬剤選択によって得た。
ｃ７ｏｒｆ４３およびｃ１５ｏｒｆ５５をそれぞれ図４および５に示すベクター（ｐｃＤＮＡ６−ｃ７ｏｒｆ４３、ｐｃＤＮＡ６−ｃ１５ｏｒｆ５５）を用いて上記形質転換細胞に導入した。プロモータ活性は蛍光強度を指標にしたルシフェラーゼ遺伝子の発現により測定した。具体的には、溶解液により細胞内から溶出させたルシフェラーゼ酵素と、その基質であるルシフェリンを混合することで発光反応を行い、その発光量からルシフェラーゼ遺伝子発現量を算出した。
プロモータ領域の転写開始点の上流５０３６ｂｐから２６４ｂｐまではｃ７ｏｒｆ４３およびｃ１５ｏｒｆ５５のそれぞれを組み込んだ細胞において、プロモータ領域の活性が上昇していた。ｃ７ｏｒｆ４３では、上流１６９ｂｐから対照（遺伝子を導入していない以外は同様のベクターでトランスフェクションした細胞）とプロモータ領域の活性について統計的有意差がなくなったことから、上流１６９ｂｐと５８ｂｐの間に、ｃ７ｏｒｆ４３が作用する配列があることが示唆された。
また、ｃ１５ｏｒｆ５５は、一番大きな転写開始点上流５０３６ｂｐを含む一番大きなフラグメントから転写開始点５８塩基上流を含む一番小さなフラグメントにおいても、プロモータ領域が活性化されていた。従って、転写開始点の５８塩基上流から転写開始点の３６塩基下流の間にｃ１５ｏｒｆ５５の作用する部分があることが示唆された。
ｃ７ｏｒｆ４３およびｃ１５ｏｒｆ５５のそれぞれの作用部位があると示唆された、上流１６９ｂｐと５８ｂｐの間および転写開始点の５８塩基上流から転写開始点の３６塩基下流の間の配列をｐｃＤＮＡ６−ｃ７ｏｒｆ４３、ｐｃＤＮＡ６−ｃ１５ｏｒｆ５５により解析した結果、上流１６９ｂｐと５８ｂｐの間にはＴＥＡＤモチーフの配列が、５８塩基上流から転写開始点の３６塩基下流の間にはＧＣモチーフの配列があることが示唆された。（図９Ａ）
このことを確認するために、５８塩基上流から転写開始点の３６塩基下流の間を二つに分けて、それぞれＧＣモチーフ＃１およびＧＣモチーフ＃２とした。これらのモチーフを含むベクターを作成し（それぞれＧＣ  ｍｏｔｉｆ  ＃１およびＧＣ  ｍｏｔｉｆ  ＃２とする。）ＨｅｐＧ２細胞を形質転換させた後、ｃ１５ｏｒｆ５５のｃＤＮＡを、該ＨｅｐＧ２細胞に導入した。培養した後に、プロモータ領域の活性を蛍光強度を測定することにより評価した。結果を図９Ｂに示す。いずれのフラグメントを組み込んだＨｅｐＧ２細胞においても活性が対照に比べ上昇した。ことから、これらのフラグメントにはＧＣモチーフが含まれていること、ｃ１５ｏｒｆ５５より発現されるＣ１５はＧＣモチーフを介してプロモータ領域の活性を上げていることが明らかとなった。
１２６塩基上流から転写開始点の５８塩基上流の間を、６つのフラグメントに分けて、それぞれＴＥＲＴフラグメント＃１〜ＴＥＲＴフラグメント＃６とした。これらのフラグメントを含むベクターを作成し（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ＃１−＃６）ＨｅｐＧ２細胞を形質転換させた後、ｃ７ｏｒｆ４３のｃＤＮＡを、該ＨｅｐＧ２細胞に導入した。培養した後に、プロモータ領域の活性を蛍光強度を測定することにより評価した。結果を図９Ｃに示す。７つのフラグメントのうち、ＴＥＲＴフラグメント＃３およびＴＥＲＴフラグメント＃６において、プロモータ領域の活性が高くなっていた。このことは、いずれのフラグメントを組み込んだＨｅｐＧ２細胞においても活性が対照に比べ上昇したことから、これらのフラグメントにはＴＥＲＴモチーフが含まれていること、ｃ７ｏｒｆ４３より発現されるＣ７はＴＥＲＴモチーフを介してプロモータ活性を上げていることが明らかとなった。（図９Ａ、Ｂ、およびＣ）
ＧＣモチーフ＃１について、ＳＰ１阻害剤であるミトラマイシンの存在下でプロモータ活性を測定したところ、濃度依存的にプロモータ活性が低下した。このことは、Ｃ１５はＧＣモチーフへのＳＰ１の結合を亢進させることを示唆している。（図９Ｅ）
また、野生型のプロモータおよびプロモータ領域に変異（Ｃ２８８Ｔ）のあるｈＴＥＲＴ遺伝子プロモータ領域を備えるＨｅｐＧ２細胞にｃ１５ｏｒｆ５５およびｃ７ｏｒｆ４３をそれぞれ導入した細胞においてプロモータ活性を測定したところ、Ｃ１５を発現した細胞では野生型と変異型の双方において、プロモータ領域の活性を上げたのに対して、Ｃ７を発現した細胞では、変異がある場合にのみプロモータ領域の活性が高くなった。
このことは、ｃ１５ｏｒｆ５５は腫瘍前からプロモータ領域の活性を高めることに関与しており、ｃ７ｏｒｆ４３腫瘍形成後に、プロモータ領域の活性を高めることに関与していることを示唆している。（図９Ｄ）
本実施例より、被験患者からの生検試料において本発明のｈＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域調整遺伝子の発現を検出することにより、該生検試料が癌化しているのか、または将来にわたり癌化の可能性があるのかを効果的に判定することが可能となる。
【実施例３】
【００７１】
ＨｅｐＧ２細胞へのｃ７ｏｒｆ４３の導入およびｃ７ｏｒｆ４３を過剰発現する細胞の作製：結果（図４、６Ａ、７）
ｃ７ｏｒｆ４３を発現するプラスミドＤＮＡ（図４）をＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００を用いてＨｅｐＧ２細胞に導入し、抗生物質（ブラストサイジン）による薬剤選択によって、ｃ７ｏｒｆ４３を過剰発現する形質転換細胞を得た。
図６Ａは、ｃ７ｏｒｆ４３を過剰発現させた形質転換細胞におけるｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの発現量をハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨで補正した値を示している。対照（ＦＬＡＧ）に比べ、ｈＴＥＲＴ発現量が有意に亢進していた。
この形質転換細胞を培養ディッシュに播種し、トリバンブルー排除法によって精細胞数を計数した。また７２時間培養した後、細胞を顕微鏡下で撮影し、ディッシュ上を細胞が占める相対面積を画像解析ソフトＩｍａｇｅ  Ｊにより解析した。
結果を図７に記す。ｃ７ｏｒｆ４３を過剰発現（ＯＥ−ｃ７ｏｒｆ４３）した細胞はＨｅｐＧ２細胞の細胞数が高くなっている。しかしながら、ｃ７ｏｒｆ４３は対照と面積が差がない結果となった。このことは、ｃ７ｏｒｆ４３において、細胞が上に積み重なるようにして増殖していることを示している。
本実施例により作製された細胞に、候補化合物を接触させ、ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現、細胞増殖能を測定することにより、肝癌の初期に効果のある化合物を効果的にスクリーニングすることが可能となる。
【実施例４】
【００７２】
ＨｅｐＧ２細胞へのｃ１５ｏｒｆ５５の導入およびｃ１５ｏｒｆ５５を過剰発現する細胞の作製：結果（図５、６Ａ、７）
ｃ１５ｏｒｆ５５を発現するプラスミドＤＮＡ（図５）をＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００を用いてＨｅｐＧ２細胞に導入し、抗生物質（ブラストサイジン）による薬剤選択によって、ｃ１５ｏｒｆ５５を過剰発現する形質転換細胞を得た。
図６Ａは、ｃ１５ｏｒｆ５５を過剰発現させた形質転換細胞におけるｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの発現量をハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨで補正した値を示している。対照（ＦＬＡＧ）に比べ、ｈＴＥＲＴ発現量が有意に亢進していた。
この形質転換細胞を培養ディッシュに播種し、トリバンブルー排除法によって精細胞数を計数した。また７２時間培養した後、細胞を顕微鏡下で撮影し、ディッシュ上を細胞が占める相対面積を画像解析ソフトＩｍａｇｅ  Ｊにより解析した。
結果を図７に記す。ｃ１５ｏｒｆ５５を過剰発現（ＯＥ−ｃ１５ｏｒｆ５５）した細胞はＨｅｐＧ２細胞の細胞数が高くなっている。ｃ１５ｏｒｆ５５は増殖した細胞が広く培地を覆っており、増殖能が高くなっていることを示している。
本実施例により作製された細胞に、候補化合物を接触させ、ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現、細胞増殖能を測定することにより、肝癌の初期に効果のある化合物を効果的にスクリーニングすることが可能となる。
【実施例５】
【００７３】
ｃ７ｏｒｆ４３をノックダウンした（肝癌）細胞の作製：結果（図６Ｂ）（図８）
あらかじめデザインされているｃ７ｏｒｆ４３を標的とするｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを購入し（ａｂｍ  Ｉｎｃ．）、ＨｅｐＧ２細胞に感染させた後、ピューロマイシンによる薬剤選択によって、ｃ７ｏｒｆ４３がノックダウンした形質転換細胞を得た。
図６Ｂは、ｃ１５ｏｒｆ５５あるいはｃ７ｏｒｆ４３をノックダウンさせた形質転換細胞におけるｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの発現量をハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨで補正した値を示している。対象に比べ、ｈＴＥＲＴ発現量が有意に低下していた。
この形質転換細胞を培養ディッシュに播種し、クリスタルバイオレッド染色によってコロニー数を計数した。コロニーサイズを画像解析ソフトＩｍａｇｅ  Ｊにより解析した。
結果：結果を図１０に記す。ｃ７ｏｒｆ４３をノックアウトした細胞は、コロニー数が対象と変化がなかった。また、コロニーの面積は対照よりも広くなっていた。このことはｃ７ｏｒｆ４３のノックダウンによって、細胞が横に拡がるように増殖していることを示している。
【実施例６】
【００７４】
ｃ１５ｏｒｆ５５をノックダウンした（肝癌）細胞の作製：結果（図６Ｂ）（図８）
あらかじめデザインされているｃ１５ｏｒｆ５５を標的とするｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを購入し（ａｂｍ  Ｉｎｃ．）、ＨｅｐＧ２細胞に感染させた後、ピューロマイシンによる薬剤選択によって、ｃ１５ｏｒｆ５５がノックダウンした形質転換細胞を得た。
図６Ｂは、ｃ１５ｏｒｆ５５をノックダウンさせた形質転換細胞におけるｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの発現量をハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨで補正した値を示している。対象に比べ、ｈＴＥＲＴ発現量が有意に低下していた。
この形質転換細胞を培養ディッシュに播種し、クリスタルバイオレッド染色によってコロニー数を計数した。コロニーサイズを画像解析ソフトＩｍａｇｅ  Ｊにより解析した。結果を図１０に記す。ｃ１５ｏｒｆ５５をノックアウトした細胞はコロニー数およびコロニー面積も対照と比較して有意に高くなっていた。
【実施例７】
【００７５】
肝癌患者由来試料における本願発明のｈＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域調節遺伝子の発現（図１０）
肝癌患者より肝癌切除時に肝癌部分および非癌部を切除した。それぞれのサンプルから、ＲＮＡを抽出し、表に記載のプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲにてｃ７ｏｒｆ４３とｃ１５ｏｒｆ５５の発現をｍＲＮＡの発現を指標に検討した。その結果を図１０に示す。
【表１】
2019180285.tif 000003
表１において、ｃ１５ｏｒｆ５５  Ｆｏｒｗａｒｄの配列を配列番号２、ｃ１５ｏｒｆ５５  Ｒｅｖｅｒｓｅの配列を配列番号３、ｃ７ｏｒｆ４３  Ｆｏｒｗａｒｄの配列を配列番号４、およびｃ７ｏｒｆ４３  Ｒｅｖｅｒｓｅの配列を配列番号５とする。
図１０より、ＨＣＣ患者からの肝臓切除サンプルにおいて、癌部でも非癌部でも両遺伝子の発現が、正常な肝臓と比較して高い結果となった。このことは、被験者生検検査において、これらの遺伝子発現が重要なマーカーとなり得ることが明らかとなった。
本実施例から、肝臓の生検検査において、表１に記載のプライマーを含む肝癌細胞の診断キットとなり得る。
【実施例８】
【００７６】
調節遺伝子の発現を指標とする肝硬変スコアの判定（図１１）
肝硬変患者の生検サンプルにおけるｃ７ｏｒｆ４３とｃ１５ｏｒｆ５５の発現を検討した。肝硬変患者の非癌部の生検サンプルからＲＮＡを抽出し、表１に記載のプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲにてｃ７ｏｒｆ４３とｃ１５ｏｒｆ５５の発現をｍＲＮＡの発現を指標に検討した。
生検サンプルからのＲＮＡ抽出は、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を用い、添付文章のプロトコールに従って行った。
その結果を図１１に示す。
ｃ１５ｏｒｆ５５の発現は、スコアと比例して高くなっていったが、ｃ７ｏｒｆ４３の発現はチャイルドピュースコアが７になり始めて優位に高くなることが明らかとなった。
このことは、癌患者の非癌部の肝臓組織においてそれぞれの遺伝子において、発現して作用するタイミングが異なることを示唆している。
本実施例により、本発明のｈＴＥＲＴ遺伝子のプロモータ領域調節遺伝子の発現を測定することは様々な指標を総合的に判断しなければならないチャイルドピュースコアに代わり、より簡単な方法で判定する方法が提供された。
【実施例９】
【００７７】
非癌部からの癌化予測方法（図１２）
患者由来肝臓の癌部と非癌部におけるｈＴＥＲＴの発現量を本発明の調節遺伝子の発現から予測することが可能となった。
ｃ１５ｏｒｆ５５とｃ７ｏｒｆ４３の発現は前述のように、表１に記載のプライマーからＲＴ−ＰＣＲにて発現量を求めた。癌部および非癌部におけるｈＴＥＲＴの発現量は、ｈＴＥＲＴｍＲＮＡの発現を測定した。（この測定にあたり、特許４７６１０４６号の配列番号３および４を援用し、本明細書において配列番号６および７とする。）
ＡからＤのいずれにおいても、ｈＴＥＲＴの発現量とｃ１５ｏｒｆ５５とｃ７ｏｒｆ４３の発現量に相関がみられた。
このことは、本願発明のｃ１５ｏｒｆ５５とｃ７ｏｒｆ４３の発現量を検出するプライマーを含むＲＴ−ＰＣＲ実行可能なキットにおいて、非癌部からの生検サンプルにて肝臓の癌化の予測が可能であることを召している。

【図１】
2019180285.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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