(57)【要約】【課題】自己免疫疾患の治療を提供すること。【解決手段】明細書に記載の発明。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１３年３月１５日出願の米国特許出願第６１／８００，３５４号の利益を主張するものであり、本出願の全教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
主題の技術は、概して、自己免疫疾患または状態、具体的には、脱毛症等の脱毛をもたらす自己免疫疾患または状態を治療するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
脱毛症は、毛髪が抜ける状態である。脱毛症における脱毛は、頭髪だけに限定されず、体のどこにでも起こり得る。通常は命に関わるものではないが、外見に関連する問題により深刻な精神的苦痛を伴うため、脱毛症の治療のための優れた薬剤及び予防のための優れた薬剤が所望されている。さらに、脱毛症は、毛色の退色を伴うことが多いため、脱毛症に伴う毛色の退色の予防のための薬剤及び治療のための薬剤が所望されている。さらに、脱毛症は、毛髪が細くなる、または毛髪が短くなる等の毛質の低下を伴うことが多いため、脱毛症に伴う毛質の低下の予防のための薬剤及び治療のための薬剤が所望されている。
【０００４】
脱毛症の種類に関しては、円形脱毛症、アンドロゲン性脱毛症、閉経後脱毛症、女性型脱毛症、脂漏性脱毛症、粃糠性脱毛症、老人性脱毛症、癌化学療法薬誘導性脱毛症、放射線被曝による脱毛症、抜毛癖、産褥性脱毛症等がある。
【０００５】
これらの種類の脱毛症は、同じ脱毛の症状を有するが、異なる原因に基づいており、その治療法はそれぞれ異なる。特に、男性ホルモンの作用に基づくアンドロゲン性脱毛症、及び免疫疾患であると疑われる円形脱毛症は、非常に異なる疾患である。さらに、産褥性脱毛症、女性型脱毛症、脂漏性脱毛症、粃糠性脱毛症、老人性脱毛症、癌化学療法薬誘導性脱毛症、及び放射線被曝による脱毛症は、それぞれ異なる原因を有し、任意の効果的な治療法はほとんど存在しないと考えられている。
【０００６】
円形脱毛症は、明確な輪郭を持つコインサイズの円形〜斑点状脱毛域（複数可）が、多くの場合に任意の自覚症状または前駆症状等がなく突然発生し、続いて自然回復が発生しない場合、それらは徐々に面積が増加し、難治性になる脱毛症である。円形脱毛症は、自己免疫疾患であると疑われているが、その原因は未だ発見されておらず、既知の明確な治療方法はない。
【０００７】
円形脱毛症は、橋本病、白斑、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、もしくは重症筋無力症によって表される甲状腺疾患等の自己免疫疾患、または気管支喘息、アトピー性皮膚炎、もしくはアレルギー性鼻炎等のアトピー性疾患に関連することが知られている。
【０００８】
アンドロゲン性脱毛症（ＡＧＡ）は、男性ホルモン感受性毛包に作用して産毛を形成する脱毛症であり、男性の約半分及び女性の１０％〜２０％に発生する。遺伝的素因がアンドロゲン性脱毛症の大きな要因であると考えられ、男性のアンドロゲン性脱毛症において、前頭部及び頭頂部の頭髪は細く短くなり、また産毛に変わり、最終的に額の生え際が後退し、頭頂部の頭髪が抜ける。一方、女性のアンドロゲン性脱毛症では、一般的に生え際は変わらないが、頭全体、特に頭頂部及び前頭部の毛髪が細くなる。フィナステリドは、男性のアンドロゲン性脱毛症患者の約４分の１を改善するに過ぎず、また女性に対するフィナステリドの投与は禁忌であるため、フィナステリドを女性のアンドロゲン性脱毛症に使用することはできない。
【０００９】
産褥性脱毛症は、成長期がエストロゲンによって維持されていた毛髪が、出産により一度に休止期に入り、脱毛が増加する脱毛症である。産褥性脱毛症の脱毛は、通常は産後約２ヶ月で始まり、産後約６ヶ月まで続き、高齢出産でない限り、それは通常１年以内に回復するため、ほとんどの場合、治療は特に必要ないが、毛髪が自然に回復しない場合がある。
【００１０】
女性型脱毛症は、血流中のアンドロゲンの量に対して女性ホルモンエストロゲンの量の減少により発生すると考えられる脱毛症である。それは、閉経後に発生することが多く、この場合、閉経後脱毛症とも呼ばれる。女性型脱毛症は、ホルモン補充療法によって改善され得るが、多くの場合に難治性である。
【００１１】
脂漏性脱毛症は、頭皮での過剰な皮脂分泌によって引き起こされる脱毛症であり、毛穴がそれによって閉塞されて毛穴の周りまたは毛根内に炎症を引き起こし、毛髪が抜け落ちる。脂漏性脱毛症は、毛髪を洗浄することによって皮脂を除去することで、ある程度改善されるが、それは容易に再発し、難治性を呈する。
【００１２】
粃糠性脱毛症は、毛穴を閉塞するふけによって引き起こされ、したがって炎症を引き起こす脱毛症である。粃糠性脱毛症は、過度の洗髪によって引き起こされることが多く、寛解は、洗髪の回数を減少させるか、または弱い洗浄力を有するシャンプーを使用することによって実現されるが、それは容易に再発し、難治性である。
【００１３】
抜毛癖は、抜毛障害による脱毛症である。抜毛癖は、病的な不安に起因する症状であり、行動療法または心理療法によって治療することができる。
【００１４】
老人性脱毛症は、性別に関わらず老化により、頭髪の全てを含む全身の体毛が徐々に薄くなる脱毛症である。これは、加齢により多くの人々に現れる自然現象であると考えられ、現時点で特に治療の標的ではない。しかしながら、平均寿命の上昇に伴い、高齢者の生活の質を改善するための社会的要求が増大しているため、改善が所望されている。
【００１５】
癌化学療法薬誘導性脱毛症は、癌化学療法薬を用いる抗癌治療の副作用である脱毛症である。頭だけでなく、眉毛、まつ毛、鼻毛、腋毛、及び陰毛を含む全ての領域における脱毛によって引き起こされる患者のショックは、それが事前に説明されている場合でも深遠である。これは癌化学療法の実施も妨げているため、この治療の必要性が高い。同様に、放射線被爆に伴う脱毛症もまた、細胞分裂を阻害することによって癌細胞が選択的に死滅するという点では、癌化学療法薬誘導性脱毛症と同じ機序に基づいて発生する脱毛症である。したがって、癌化学療法に伴う脱毛症を治療することができる薬剤は、放射線被爆に伴う脱毛症を治療することもできる。
【００１６】
加えて、抗甲状腺薬、抗凝固剤、タリウム、向精神薬、またはβ遮断薬等の薬剤の副作用による脱毛症、真菌による脱毛症、下垂体機能不全、甲状腺機能低下症、または甲状腺機能亢進症等の内分泌疾患による脱毛症、栄養障害、低アルブミン血症、悪液質、鉄欠乏性貧血、亜鉛欠乏、ホモシスチン尿症、または肝硬変等の代謝疾患による脱毛症、毒性脱毛症、高熱、出産、大手術、突然の体重減少、または重病等による脱毛症が知られており、それらは、そのそれぞれの原因を除去することによって取り組まれることができる。
【００１７】
これらの種類の脱毛症の中で、女性型脱毛症、脂漏性脱毛症、及び粃糠性脱毛症は、そのそれぞれの原因を除去することによってある程度取り組むことができるが、それらは簡単に再発し、難治性である。さらに、女性型脱毛症の原因はホルモンバランスに関連していると考えられるが、ホルモン補充療法は、更年期障害、骨粗鬆症、及び高脂血症に対して示されていても、女性型脱毛症に対しては示されていない。ホルモン補充療法によって癌が引き起こされる可能性があるため、ホルモン補充療法は、女性型脱毛症を治療する目的で行われない。また、アンドロゲン性脱毛症に関して、適切な治療法は未だ存在せず、また円形脱毛症に関しては、その原因でさえほとんど理解されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｏｌｔｖａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｃｌ−２  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇ，Ｂａｘ，ｔｈａｔ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．Ｃｅｌｌ，７４：６０９−６１９，１９９３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
上記のように、脱毛症の種類のうち、治療が困難な脱毛症の種類は、円形脱毛症及びアンドロゲン性脱毛症であり、特に円形脱毛症については、任意の効果的な治療方法がほとんど存在しない。また、産褥性脱毛症、女性型脱毛症、粃糠性脱毛症、老人性脱毛症、及び癌化学療法薬誘導性脱毛症に対する治療法はほとんどない。
【００２０】
脱毛を治療するための治療薬を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
主題の技術は、概して、脱毛を治療するため、または毛髪の成長を刺激するための組成物及び方法に関する。
【００２２】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕明細書に記載の発明
に関する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、自己免疫疾患の治療が提供され得る。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
１．概要
主題の技術は、概して、脱毛を治療するため、または毛髪の成長を刺激するための組成物及び方法に関する。
【００２５】
本明細書に記載及び例示されるように、円形脱毛症等の脱毛は、毛包を標的とする自己免疫疾患に起因することが多い状態である。プロアポトーシスタンパク質を（例えば、炎症部位または脱毛部位に）送達することによって、毛包の寛容原性アポトーシスは、プロアポトーシスタンパク質によって誘導される。結果として、自己抗原（複数可）を含むアポトーシス小胞が産生され、次いで、毛包に特異的な調節応答を誘導する。調節応答は、自己抗原（複数可）に対する免疫寛容を誘導し、それにより毛包細胞を攻撃する異常な自己免疫応答を低減する。
【００２６】
２．定義
本出願において指定された様々な範囲の数値の使用は、特に明記しない限り、記載された範囲内の最小値及び最大値が両方とも「約」という語によって先行されたかのように近似値として記載されている。記載された範囲を超える、及び下回るわずかな変動は、その範囲内の値と実質的に同じ結果を実現するために使用することができる。範囲の開示は、列挙された最小値と最大値の間のあらゆる値を含む連続範囲、ならびにそのような値によって形成され得る任意の範囲として意図される。したがって、当業者は、多くのこのような比率、範囲、及び比率の範囲が本明細書に提示されたデータ及び数値から明確に導出され得、全てが主題の技術の様々な実施形態を表すことを理解するであろう。
【００２７】
本開示で使用される場合、「自己抗原」という用語は、本開示を参照して当業者に理解されるように、自己免疫反応に見られるような自己抗体の産生を刺激する内因性抗原、ならびにそのような内因性抗原の一部、または完全な内因性抗原と同じ反応を誘発する修飾された内因性抗原を意味し、含む。例えば、本開示の文脈において、炭酸脱水酵素ＩＩ、クロモグラニン、コラーゲン、ＣＹＰ２Ｄ６（シトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーデバイス４００、ポリペプチド６）、グルタミン酸脱炭酸酵素、分泌グルタミン酸脱炭酸酵素５５、ｈＣＤＲ１、ＨＳＰ６０、ＩＡ２、ＩＧＲＰ、インスリン、ミエリン塩基性タンパク質、ｈＮｉｎｅｉｎ、Ｒｏ  ６０ｋＤａ、ＳＯＸ−１０（遺伝子１０を含有するＳＲＹボックス）、ＺｎＴ８等が自己抗原である。上記の自己抗原のいずれか１つの抗原性断片も包含される。
【００２８】
「約」という用語は、ここで使用される場合、値の＋／−５％を指す。
【００２９】
タンパク質の「機能的断片」という用語は、完全長タンパク質の一部分であり、完全長タンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有する、または実質的に同じ機能を実行する（例えば、同じ酵素反応を実行する）ペプチド断片を指すを指す。例えば、プロアポトーシスタンパク質の機能的断片は、細胞のアポトーシスを促進することができる。
【００３０】
「高メチル化」という用語（時に「メチル化」と略記される）は、ＤＮＡに関連して使用される場合、ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも約３０％（好ましくは少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％）がメチル化されていることを意味する。例えば、全ＣｐＧの６０％〜９０％がメチル化された哺乳動物ＤＮＡは、高メチル化されている。
【００３１】
「低メチル化」という用語（時に「非メチル化」と略記される）は、ＤＮＡに関連して使用される場合、ＣｐＧジヌクレオチドの約１５％以下（好ましくは、約１０％以下、約７．５％以下、または約５％以下、または約３％、または約１％以下）がメチル化されている。例えば、全ＣｐＧの５％〜１５％がメチル化された細菌ＤＮＡは、低メチル化されている。
【００３２】
「メチル化」レベルは、ＤＮＡに関連して使用される場合、ＤＮＡ分子の総ＣｐＧジヌクレオチドのうちのメチル化されたＣｐＧジヌクレオチドの割合を指す。
【００３３】
「制御される」という用語は、「操作可能に結合される」という意味であり、一方の機能が他方によって影響されるような別の核酸断片上の核酸配列の会合を指す。例えば、コード配列は、プロモーターがそのコード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、プロモーターによって「制御される」（すなわち、コード配列は、プロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センス配向またはアンチセンス配向で調節配列に操作可能に結合され得る。
【００３４】
３．プロアポトーシスタンパク質をコードするポリヌクレオチド
一態様において、本発明は、プロアポトーシスタンパク質、またはその機能的断片をコードする配列を含み、ポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドの約３０％〜約６０％がメチル化されている、ポリヌクレオチドを提供する。
【００３５】
別の態様において、本発明は、プロアポトーシスタンパク質、またはその機能的断片をコードする配列を含み、ポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化レベルが、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム中のＣｐＧジヌクレオチドの平均メチル化レベルと比較して約２倍〜約４倍高い、ポリヌクレオチドを提供する。
【００３６】
Ａ．メチル化レベル
脊椎動物におけるＤＮＡメチル化は、通常ＣｐＧ部位で起こる。このメチル化は、５−メチルシトシンへのシトシンの変換をもたらす。Ｍｅ−ＣｐＧの形成は、酵素ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによって触媒される。哺乳動物において、全ＣｐＧの６０％〜９０％がメチル化されている。ヒトＤＮＡは、ＣｐＧ部位の約８０％〜９０％がメチル化されている。
【００３７】
細菌ＤＮＡは、哺乳動物ＤＮＡと比較して、低レベルのメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有する。哺乳動物の免疫系は、外来ＤＮＡを同定し、細菌性病原体による脅威に応答するための信号として、細菌ＤＮＡのこの機能を使用する。
【００３８】
したがって、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、好ましくは、哺乳動物対象に投与された場合、細菌性病原体として認識されないように高メチル化されている。例えば、ポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、約３０％〜約７０％、約３０％〜約６５％、約３０％〜約６０％、約３０％〜約５５％、約３０％〜約５０％、約３０％〜約４５％、約３０％〜約４０％、約２５％〜約６０％、約２５％〜約５５％、約２５％〜約５０％がメチル化されている。
【００３９】
あるいは、ポリヌクレオチドのメチル化レベルは、全体のＣｐＧジヌクレオチドメチル化レベルをベースラインと比較することによって決定することができる。適切なベースラインメチル化レベルは、野生型細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））からの細菌ＤＮＡ（例えば、細菌ゲノム）の平均ＣｐＧジヌクレオチドメチル化レベルである。例えば、ポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化レベルは、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム中のＣｐＧジヌクレオチドの平均メチル化レベル、または野生型大腸菌からのプラスミド等のエピソームＤＮＡ中のＣｐＧジヌクレオチドの平均メチル化レベルと比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、或いは約１．５倍〜約６倍、約２倍〜約５倍、または約２倍〜約４倍高くなり得る。野生型細菌株中のＣｐＧジヌクレオチドの平均メチル化レベルは、一般に既知であるか、または確認可能である。
【００４０】
本明細書に記載のポリヌクレオチドのメチル化レベル、または野生型細菌のベースライン平均メチル化レベルは、当技術分野において既知の方法を使用して決定することもできる。例えば、国際公開第２０１１１０９５２９号は、ＤＮＡ試料中のＤＮＡ配列のメチル化のまん延を検出するための方法を開示する。Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｂｙ  Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６（６）：ｅ２１０３４．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２１０３４も参照されたい。
【００４１】
所望のメチル化レベルのポリヌクレオチドを作製する方法は、複数の方法によって実現され得る。例えば、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１２／５６７６１号は、構成的プロモーターによって制御されたメチラーゼをコードする改変ポリヌクレオチド配列を含む細菌株を開示し、該改変ポリヌクレオチドは、該細菌の染色体ＤＮＡに安定に組み込まれている。この細菌株は、所望のメチル化レベルを有するポリヌクレオチドを産生するために使用され得る。例えば、メチル化のレベルは、細菌宿主におけるメチラーゼの発現レベルを調節することによって（例えば、異なる強度のプロモーターを使用することによって）調節することができる。インビトロでメチル化を使用してもよい。例えば、Ｗｙｎｇａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａｔ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １８，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ２４３−２５０，ＤＯＩ：１０．１３８５／１−５９２５９−２１１−２：２４３を参照されたい。
【００４２】
Ｂ．プロアポトーシスタンパク質
プロアポトーシスタンパク質は、アポトーシスによる細胞死の機序を直接的または間接的に活性化することができるタンパク質を指す。
【００４３】
適切なプロアポトーシスタンパク質としては、例えば、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｍ、Ｐｕｍａ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｎｏｘａ、Ｂｍｆ、Ｈｒｋ、Ｂｉｄ、ＦＡＳ、カスパーゼ変異体（修飾カスパーゼ）、スルビビン変異体（修飾スルビビンタンパク質）、細胞死受容体４（ＤＲ４）、細胞死受容体５（ＤＲ５）、ＦＡＳ受容体、及び腫瘍壊死因子受容体が挙げられる。これらのプロアポトーシスタンパク質のうちのいずれか１つの機能的断片も包含される。
【００４４】
本明細書に記載の例示的なプロアポトーシスタンパク質が特徴付けられている。
【００４５】
Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーは、アポトーシス経路の最も明確に定義された調節因子の一部を表す。Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｃｅｄ−９、Ｂｃｌ−ｗ等を含むＢｃｌ−２ファミリーの一部のメンバーは、細胞の生存を促進するが、Ｂａｘ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、及びＢｉｍを含む他のメンバーは、アポトーシスを増強することが示されている（Ａｄａｍｓ  ａｎｄ  Ｃｏｒｙ，１９９８）。Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーの生物学的機能としては、二量体の形成（Ｏｌｔｖａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｃｌ−２  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇ，Ｂａｘ，ｔｈａｔ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．Ｃｅｌｌ，７４：６０９−６１９，１９９３．）、プロテアーゼ活性化（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ａ  ｎｏｖｅｌ  ＦＡＤ  Ｄ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ＩＣＥ／ＣＥＤ−３−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ，ｉｓ  ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ−１）ｄｅａｔｈ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｃｅｌｌ  １９９６；８５：８１７−８２７）、ミトコンドリア脱分極、反応性酸素中間体の生成（Ｈｏｃｋｅｎｂｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｃｌ−２  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ  ｔｏ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｃｅｌｌ，７５：２４１−２５１，１９９３）、カルシウム流出の規制（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  Ｂｃｌ−２  ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｃａ２＋  ｆｌｕｘｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：６５６９−６５７３，１９９４；Ｈｕｉｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｂｙ  Ｂｃｌ−２．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３８：１２１９−１２２８，１９９７）、及び孔形成が挙げられる。
【００４６】
Ｂｃｌ−２ファミリーには、２つの保存領域内にクラスタ化された顕著な相同性がある：Ｂｃｌ−２相同ドメイン１及び２（ＢＨ１及びＢＨ２）（Ｏｌｔｖａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｂｏｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｂｃｌ−ｘ，ａ  ｂｃｌ−２−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈａｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．Ｃｅｌｌ．１９９３  Ａｕｇ．２７；７４（４）：５９７−６０８、Ｋｏｚｏｐａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＣＬ１，ａ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｈａｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｔｏ  ＢＣＬ２．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９３  Ａｐｒ．１５；９０（８）：３５１６−２０、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａ１，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅａｒｌｙ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｇｅｎｅ  ｗｉｔｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｔｏ  ｂｃｌ−２．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３  Ａｕｇ．１５；１５１（４）：１９７９−８８）。ＢＨ１及びＢＨ２とは異なるＢａｘ中の別の保存ドメインは、ＢＨ３と呼ばれ、細胞死及びタンパク質結合機能を媒介する。プロアポトーシスタンパク質のサブセットは、ＢＨ３ドメインのみを含有し、この特定のドメインがアポトーシスの促進において一意的に重要であり得ることを暗示する（Ｄｉａｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＢＡＤ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｂ  Ｈ−３  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｍｕｔａｎｔ  ＢＣＬ−２  ａｎｄ  ＢＣＬ−ＸＬ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７  Ｄｅｃ．５；２７２（４９）：３０８６６−７２）。
【００４７】
Ｂｃｌ−２ファミリーの２１ｋＤａ細胞死促進メンバーであるＢａｘは、異なる細胞系のＢｃｌ−２と共免疫沈降したタンパク質として最初に同定された（Ｏｌｔｖａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。Ｂａｘの過剰発現は、広範囲の細胞毒性結果に応答して細胞死を促進する。Ｂａｘタンパク質のアミノ酸配列の決定は、それがＢｃｌ−２に対して高度に相同性であることを示した。Ｂａｘ遺伝子は、６つのエクソンから構成され、代替転写産物を産生し、その優勢形態は、１．０ｋｂ  ｍＲＮＡをコードし、Ｂａｘａと指定される。Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−２ファミリーのいくつかの他のメンバーと同様に、Ｂａｘタンパク質は、高度に保存された領域、ＢＨ１、ＢＨ２、及びＢＨ３ドメインを有し、これらのタンパク質の配列のハイドロパシー分析は、免疫応答遺伝子Ｃ末端部における疎水性膜貫通セグメントの存在を示す（Ｏｌｔｖａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。Ｂａｘは、任意の明らかな組織特異性なしに広く発現される。
【００４８】
Ｂａｘのスプライス変異体であるＢａｘ−αも報告されている。
【００４９】
Ｂａｋは、多種多様な細胞型において発現され、酵母中のＢｃｌ−２相同体Ｂｃｌ−ｘ２に結合する。Ｂａｋ内のドメインは、細胞傷害活性及びＢｃｌ−ｘ１への結合に必要かつ十分であるとして同定された。さらに、ＢＨ１及びＢＨ２とは異なるこのドメインに類似した配列は、Ｂａｘ及びＢｉｐｌ中で同定された。このドメインは、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーと相互作用する、複数の細胞死調節タンパク質の機能を媒介するために重要である。
【００５０】
Ｂａｄは、ＢＨ１及びＢＨ２ドメインの主要なアミノ酸モチーフを有する。Ｂａｄは、他のファミリーメンバーの内在性膜位置を占める古典的なＣ末端シグナルアンカー配列を欠いている。Ｂａｄは、Ｂｃｌ−ＸＬならびにＢｃｌ−２と選択的に二量体化するが、Ｂａｘ、Ｂｃｌ−Ｘｓ−Ｍｃｌ１、Ａ１またはそれ自体とは二量体化しない。Ｂａｄは、Ｂｃｌ−ＸＬの細胞死抑制作用を逆転させるが、Ｂｃｌ−２の細胞死抑制作用は逆転させない。
【００５１】
Ｂｉｋ、Ｂｃｌ−２ファミリーの別のメンバーは、細胞生存促進タンパク質、Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−ＸＬ、ならびにウイルス生存促進タンパク質、エプスタイン・バーウイルス−ＢＨＲＦ１及びアデノウイルスＥ１Ｂ−１９ｋＤａと相互作用する。一過性トランスフェクションアッセイにおいて、Ｂｉｋは、Ｂｃｌ−２ファミリーの他のプロアポトーシスメンバーであるＢａｘ及びＢａｋと同様の方法で細胞死を促進する。Ｂｉｋのこのプロアポトーシス活性は、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、ＥＢＶ−ＢＨＲＦ１及びＥＩＢ−１９ｋＤａタンパク質の共発現によって抑制され得、Ｂｉｋが細胞抗アポトーシスタンパク質及びウイルス抗アポトーシスタンパク質の両方に共通の標的であり得ることを示唆している。Ｂｉｋは、Ｂｃｌ−２ファミリーに特徴的なＢＨ１及びＢＨ２保存ドメインに対して明らかな相同性を含んでいないが、Ｂａｘ及びＢａｋと９個のアミノ酸ドメイン（ＢＨ３）を共有し、これらのタンパク質の細胞死促進活性の重要な決定因子であり得る。
【００５２】
ＰＵＭＡ（アポトーシスのｐ５３上方制御調節因子）は、ｐ５３による活性化の標的である。遺伝子は、ｐ５３の活性化後に細胞中で誘導される２つのＢＨ３ドメイン含有タンパク質（ＰＵＭＡ−α及びＰＵＭＡ−β）をコードする。ＰＵＭＡ−α及びＰＵＭＡ−βは、同様の活性を示し、それらは、Ｂｃｌ−２に結合し、シトクロムｃの放出を誘導するようにミトコンドリアに局在し、プログラムされた細胞死の迅速な誘導を活性化する。ＰＵＭＡ発現のアンチセンス阻害は、ｐ５３に対するアポトーシス応答を低減させ、ＰＵＭＡは、シトクロムｃ／Ａｐａｆ−１依存性経路を介したｐ５３誘導性細胞死を媒介する役割を果たしている可能性がある。例えば、Ｎａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００１  Ｍａｒ；７（３）：６８３−９４を参照されたい。
【００５３】
ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質Ｂｉｍは、ミトコンドリア上のＢａｘ／Ｂａｋオリゴマー化を誘導するプロアポトーシスタンパク質である。例えば、Ｇｏｇａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＩＭ，ａ  ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｖｉａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｅ２Ｆ１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｓｕｒｖｉｖａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１２．３８６１０２ｊｂｃ．Ｍ１１２．３８６１０２を参照されたい。
【００５４】
ｐ５３による内因性アポトーシス経路の活性化は、プロアポトーシスＢｃｌ−２タンパク質、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、または両方の転写を必要とすることが多い。Ｎｏｘａが粒子状物質に誘導される細胞死及び肺炎症に必要であることが報告されている。
【００５５】
Ｂｍｆは、アノイキスにより活性化されたミオシンＶアクチンモーター複合体との相互作用によって調節される、プロアポトーシスＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質である。
【００５６】
ＢＨ３−ｏｎｌｙファミリーメンバーＨＲＫ（ＤＰ５としても知られる）は、アポトーシス調節に関与する。Ｈｒｋ遺伝子発現は、中枢神経系及び末梢神経系の細胞及び組織に限定されることが見出された。
【００５７】
ＢＨ３相互作用ドメイン死アゴニスト、またはＢＩＤ遺伝子は、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーのプロアポトーシスメンバーである。アポトーシスシグナル伝達に応答して、ＢＩＤは、別のＢｃｌ−２ファミリータンパク質Ｂａｘと相互作用し、オルガネラ膜、主にミトコンドリア外膜へのＢａｘの挿入につながる。Ｂａｘは、ミトコンドリア電位依存性アニオンチャネル、ＶＤＡＣの開口と相互作用し、誘導すると考えられている。あるいは、証拠の増加は、活性化Ｂａｘ及び／またはＢａｋが、オリゴマー孔ＭＡＣを外膜に形成することを示唆している。これは、多くの場合ミトコンドリア外膜透過化と称される、ミトコンドリアからのシトクロムｃ及び他のプロアポトーシス因子（ＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯ等）の放出をもたらし、カスパーゼの活性化につながる。これは、ＢＨ３ドメインのみを含有するプロアポトーシスＢｃｌ−２タンパク質の一部に共通する役割であるＢａｘの直接活性化因子としてＢＩＤを定義する。
【００５８】
Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬまたはＣＤ９５Ｌ）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するＩＩ型膜貫通タンパク質である。その受容体との結合は、アポトーシスを誘導する。Ｆａｓリガンド／受容体相互作用は、免疫系の調節及び癌の進行において重要な役割を果たす。
【００５９】
アポトーシス抗原１（ＡＰＯ−１またはＡＰＴ）としても知られるＦＡＳ受容体（ＦａｓＲ）、表面抗原分類９５（ＣＤ９５）または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー６（ＴＮＦＲＳＦ６）は、ヒトにおいてＴＮＦＲＳＦ６遺伝子によりコードされるタンパク質である。Ｆａｓ受容体は、プログラム細胞死（アポトーシス）につながる細胞の表面上の細胞死受容体である。これは２つのアポトーシス経路のうちの一方であり、もう一方はミトコンドリア経路である。ＦａｓＲは、ヒトの１０番染色体及びマウスの１９番染色体上に位置している。進化によって関連する類似配列（オルソログ）は、ほとんどの哺乳動物に見られる。
【００６０】
カスパーゼ、またはシステイン−アスパラギン酸プロテアーゼもしくはシステイン依存性アスパラギン酸指向プロテアーゼは、アポトーシス（プログラム細胞死）、壊死、及び炎症において重要な役割を果たすシステインプロテアーゼのファミリーである。１２個のカスパーゼがヒトにおいて同定されている。２種類のアポトーシスカスパーゼ、開始剤（アピカル）カスパーゼ及びエフェクター（執行型）カスパーゼがある。開始剤カスパーゼ（例えば、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、及びＣＡＳＰ１０）は、エフェクターカスパーゼの不活性なプロ型を切断し、それによりそれらを活性化する。エフェクターカスパーゼ（例えば、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７）は、次いで、細胞内の他のタンパク質基質を切断し、アポトーシス過程をトリガする。このカスケード反応の開始は、カスパーゼ阻害物質により調節される。白斑のいくつかの症例において過剰発現され、ＮＡＬＰ１変異によって引き起こされる関連自己免疫疾患であるＣＡＳＰ４及びＣＡＳＰ５は、ＣＡＳＰ１と協調してＴ細胞の成熟に関与する炎症性酵素であるため、現在、ＭｅＳＨにおいて開始剤またはエフェクターに分類されていない。プロアポトーシス活性を保持するカスパーゼの変異体も本明細書において企図される。
【００６１】
アポトーシスリピート含有のバキュロウイルス阻害物質５またはＢＩＲＣ５とも呼ばれるスルビビンは、ヒトにおいてＢＩＲＣ５遺伝子によりコードされるタンパク質である。ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０２９０６９．１．スルビビンは、アポトーシス阻害物質（ＩＡＰ）ファミリーのメンバーである。スルビビンタンパク質は、カスパーゼ活性化を阻害するように機能し、それによりアポトーシスまたはプログラム細胞死の負の調節をもたらす。抗アポトーシス活性を無効にするスルビビンの変異体が本明細書において企図される。
【００６２】
細胞死受容体４（ＤＲ４）は、いくつかの癌細胞を死滅させることができる、ＴＲＡＩＬと呼ばれる別のタンパク質に結合する、特定の細胞の表面上のタンパク質である。癌細胞上の細胞死受容体４の量または活性の増加は、より多くの細胞を死滅させることができる。ＤＲ４、ＴＲＡＩＬ受容体１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、及び腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ａとも呼ばれる。
【００６３】
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１０ｂは、ＤＲ５、ＣＤ２６２、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＩＣＫ２、ＴＲＩＣＫＢ、ＺＴＮＦＲ９、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＩＣＫ２Ａ、ＴＲＩＣＫ２Ｂ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＫＩＬＬＥＲ／ＤＲ５としても知られている。タンパク質は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであり、細胞内デスドメインを含有する。この受容体は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＮＦＳＦ１０／ＴＲＡＩＬ／ＡＰＯ−２Ｌ）により活性化され得、アポトーシスシグナルを変換する。マウスは、ヒトにおけるこの遺伝子の機能の解明に不可欠となっている相同遺伝子、ｔｎｆｒｓｆ１０ｂを有する。ＦＡＤＤ欠損マウスを用いた研究は、デスドメイン含有アダプタータンパク質であるＦＡＤＤが、このタンパク質により媒介されるアポトーシスに必要であることを示唆した。
【００６４】
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、または細胞死受容体は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合する三量体サイトカイン受容体である。受容体は、応答（例えば、アポトーシス、炎症）の結果を決定する際に重要である、アダプタータンパク質（ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ、ＲＩＰ等）と協働する。
【００６５】
本明細書に記載のプロアポトーシスタンパク質のプロアポトーシス断片を使用することもできる。プロアポトーシスのプロアポトーシス断片は、プロアポトーシスの完全長配列ではないが、その一部分を含み、プロアポトーシス活性を保持する。
【００６６】
プロアポトーシスタンパク質またはその断片は、プロアポトーシス活性を有する天然に存在するタンパク質、または天然に存在するタンパク質の活性変異体であり得る。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「活性変異体」とは、プロアポトーシス活性を保持する変異体ペプチドを指す。活性変異体は、基準プロアポトーシスタンパク質とはアミノ酸配列が異なるが、プロアポトーシス活性を保持する。プロアポトーシスタンパク質またはその断片の活性変異体としては、天然に存在する変異体（例えば、対立遺伝子型）及び天然に存在することが知られていない変異体が挙げられる。
【００６８】
一般に、プロアポトーシス断片は、プロアポトーシスタンパク質の機能的ドメインを含むことができる。
【００６９】
概して、基準ポリペプチド及び活性変異体の配列が全体的に密接に類似し、多くの領域で同一であるように、差異は限定されている。プロアポトーシスタンパク質またはその断片の活性変異体、及び基準プロアポトーシスタンパク質またはその断片は、１つ以上のアミノ酸置換、付加、欠失、切断、融合、またはそれらの任意の組み合わせによってアミノ酸配列が異なり得る。好ましくは、アミノ酸置換は保存的置換である。保存的アミノ酸置換は、第１アミノ酸のものと類似している化学的及び／または物理的特性（例えば、電荷、構造、極性、疎水性／親水性）を有する第２アミノ酸による第１アミノ酸の置換を指す。保存的置換は、以下の基内の別のアミノ酸による１つのアミノ酸の置換を含む：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、及びヒスチジン（Ｈ）；アスパラギン酸塩（Ｄ）及びグルタミン酸塩（Ｅ）；アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、及びＥ；アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）、及びグリシン（Ｇ）；Ｆ、Ｗ、及びＹ；Ｃ、Ｓ、及びＴ。
【００７０】
プロアポトーシスタンパク質またはその断片の活性変異体は、適切な方法を使用して、例えば、直接合成、突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発、スキャニング突然変異誘発）、及び組換えＤＮＡ技術の他の方法によって調製され得る。適切なアポトーシスアッセイを使用して、活性変異体が同定され、かつ／または選択され得る。
【００７１】
プロアポトーシスタンパク質またはその断片を含む融合タンパク質も企図される。融合タンパク質は、自然界に見られるようにプロアポトーシスタンパク質中に存在しない第２部分（融合パートナー）に共有結合（例えば、ペプチド結合）を介して連結された第１部分として、プロアポトーシスタンパク質、その断片、またはその活性変異体を含むポリペプチドを包含してもよい。融合タンパク質は、適切な方法を使用して、例えば、直接合成、組換えＤＮＡ技術等によって調製され得る。
【００７２】
本発明は、プロアポトーシスタンパク質、その断片、またはその変異体をコードする核酸にも関する。
【００７３】
Ｃ．自己抗原
任意に、本明細書に記載の組成物は自己抗原を含んでよい。自己抗原は、同じポリヌクレオチドによって、または第２のポリヌクレオチドによってコードされ得る。好ましくは、自己抗原は皮膚または毛包内に存在する。
【００７４】
４．ポリヌクレオチドの送達
負に帯電した高分子量の分子である、ポリヌクレオチドは、リン脂質細胞膜を自然に通過することが困難である。それ故に、一方にウイルスベクター、もう一方に天然または合成の化学的及び／または生化学的ベクターを含む遺伝子導入を許すために、様々なベクターが使用される。
【００７５】
ウイルスベクター（レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等）は、特に膜を通過するために非常に有効であるが、病原性、組換え、複製、免疫原性等の多数の危険性を提示する。化学的及び／または生化学的ベクターは、これらのリスクを回避することを可能にする。それらは、例えば、カチオン（リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン等）であり、ＤＮＡを有する沈殿物を形成することによって作用し、次に沈殿物が細胞によって「貪食」され得る。それらは、ＤＮＡが組み込まれ、細胞膜と融合するリポソームでもあり得る。合成遺伝子導入ベクターは、一般に、複雑なＤＮＡが正の表面電荷を運ぶ粒子を一緒に形成することができるカチオン性脂質またはポリマーである。これらの粒子は、細胞膜の負電荷と相互作用し、次に後者を通過することができる。このようなベクターの例としては、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標））またはＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ、リポフェクチン（商標））が挙げられ得る。キメラタンパク質も開発されており、それらは膜受容体に結合し、エンドサイトーシスにより細胞内で複合体を生じさせるリガンドに連結されたＤＮＡを凝縮する、ポリカチオン部分で構成されている。したがって、導入遺伝子のインビボ生物学的利用能を改善するために、組織または特定の細胞集団を「標的する」ことは理論的に可能である。
【００７６】
ウイルスベクターは、組換えウイルスの形態で宿主細胞に送達され得る。組換えウイルスベクターは、任意の適切な手順によって、例えば、組換えウイルスベクターをパッケージング細胞系にトランスフェクトすることによって、ウイルスコートまたはカプシドにパッケージングされ得る。任意の適切なパッケージング細胞系が、組換えウイルスを生成するために使用され得る。レトロウイルスに適したパッケージング系としては、ＰＡ３１７細胞、ψ−２細胞、ＣＲＥ細胞、ＣＲＩＰ細胞、Ｅ−８６−ＧＰ細胞、及び２９３ＧＰ細胞の誘導体が挙げられる。２９３系細胞は、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスに使用することができる。神経芽細胞腫細胞は、単純ヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス１型に使用することができる。場合によっては、（新しいビリオンの産生のために不足しているタンパク質を提供する）ヘルパーウイルスは、本明細書に記載の組換えウイルスを産生するために必要とされ得る。
【００７７】
プロアポトーシスタンパク質をコードする核酸分子、またはそのフラグメントは、非ウイルスベースの核酸送達系を使用して送達することもできる。例えば、核酸を標的細胞に送達する方法は、米国特許第６，４１３，９４２号、同第６，２１４，８０４号、同第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号、同第５，７６３，２７０号、及び同第５，６９３，６２２号に記載されている。
【００７８】
本明細書に記載の核酸分子は、米国特許第５，５８０，８５９号、同第５，５４９，１２７号、同第５，２６４，６１８号、同第５，７０３，０５５号に記載されるように、対象または細胞への送達前にリポソーム中にパッケージングされ得る。核酸の送達のための担体としてのリポソームの使用に関する概説は、Ｈｕｇ  ａｎｄ  Ｓｌｅｉｇｈｔ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０９７：１−１７、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１０１，ｐｐ．５１２−２７、ｄｅ  Ｌｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １０（１４）：１２２１−３１を参照されたい。代表的なリポソームとしては、血清タンパク質の非特異的結合を低減し、循環時間を延長するために、任意にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングされたカチオン性リポソームが挙げられるが、これらに限定されない。Ｋｏｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）、Ｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）、及びＫｉｒｐｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）を参照されたい。米国特許第６，２００，５９８号に開示されているような温度感応性リポソーム、例えばＴＨＥＲＭＯＳＯＭＥＳ（商標）を使用することもできる。ベクター−リポソーム複合体の使用は、米国特許第５，８５１，８１８号に記載されている。リポソームは、当技術分野で知られている様々な技術のいずれかによって調製することができる。例えば、Ｂｅｔａｇｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ（１９９３）、Ｊａｎｏｆｆ（１９９９）、Ｌａｓｉｃ＆Ｍａｒｔｉｎ（１９９５）、Ｎａｂｅｌ（１９９７）、及び米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５５１，４８２号、同第６，１９７，３３３号、及び同第６，１３２，７６６号を参照されたい。
【００７９】
核酸は、Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．３９４：４８３−４９１によって記載されたものと同様の渦巻型脂質組成物中で送達することもできる。米国特許第４，６６３，１６１号、及び同第４，８７１，４８８号も参照されたい。例えば、プラスミドベクターは、リポフェクタミン２０００と複合体化され得る。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  １２（２）：３１４−３２０。
【００８０】
金及びタングステン等の微粒子担体を用いる遺伝子銃送達系は、核酸（例えば、組換えウイルスベクター及び非ウイルスベクター）を送達するために使用されてもよい。これらの粒子は、ベクターでコーティングされ、一般に減圧下で、「遺伝子銃」からの火薬放電を使用して高速に加速される。例えば、米国特許第４，９４５，０５０号、同第５，０３６，００６号、同第５，１００，７９２号、同第５，１７９，０２２号、同第５，３７１，０１５号、及び同第５，４７８，７４４号を参照されたい。
【００８１】
多種多様な他の方法を使用し、本明細書に記載の核酸を送達することができる。そのような方法としては、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリリジンもしくはポリオルニチン媒介トランスフェクション、またはリン酸ストロンチウム、ベントナイト及びカオリンを含むケイ酸アルミニウム、酸化クロム、ケイ酸マグネシウム、タルク等の他の不溶性無機塩を使用する沈降が挙げられる。トランスフェクションの他の有用な方法としては、エレクトロポレーション、ソノポレーション、プロトプラスト融合、ペプトイド送達、またはマイクロインジェクションが挙げられる。遺伝子導入に有用な送達系の概説については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｆｏｒ  ａ  ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ；ａｎｄ  Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．（１９９０）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５：１６３−８７を参照されたい。エレクトロポレーションを使用してＤＮＡを送達する例示的な方法は、米国特許第６，１３２，４１９号、同第６，４５１，００２号、同第６，４１８，３４１号、同第６，２３３，４８３号、米国特許公開第２００２／０１４６８３１号、及び国際公開第００／４５８２３号に記載されている。
【００８２】
５．薬学的組成物及び治療の方法
主題の技術の一態様は、脱毛を治療する方法、治療における本明細書に記載のポリヌクレオチドの使用、及び治療のための薬剤の製造における本明細書に記載のポリヌクレオチドの使用を説明する。治療という用語は、症状の非存在下での予防的治療、ならびに疾患または疾患の症状を軽減した治療を含む。
【００８３】
主題の技術は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む薬学的組成物を提供する。任意に、核酸（例えば、リポソーム）を送達するための送達系が提供されてもよい。この送達系は、核酸と共に薬学的組成物に製剤化され得るか、または（例えば、キットの別個の容器中に）別個に供給され得る。別個に提供される場合、送達系は、投与前に核酸と混合され得る。
【００８４】
本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、一般に、インビボ投与に適した組成物中に製剤化される。そのような組成物は、一般に、薬剤の製剤化及び対象へのその投与に許容され得る担体を含む。そのような許容される担体は、当技術分野で周知であり、例えば、水等の水性溶液または生理的緩衝食塩水、またはグリコール、グリセロール、オリーブ油または注入可能な有機エステル等の油のような他の溶媒またはビヒクルが挙げられる。許容される担体は、例えば、複合体の吸収を安定化または増加させるために作用する生理学的に許容される化合物を含有することができる。そのような生理学的に許容される化合物としては、例えば、グルコース、スクロース、またはデキストラン等の炭水化物、アスコルビン酸またはグルタチオン等の抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、または他の安定化剤もしくは賦形剤が挙げられる。当業者であれば、生理学的に許容される化合物を含む許容される担体の選択が、例えば、経口的または非経口的（静脈内等）及び注入、挿管、または当技術分野で既知の他のそのような方法であり得る、治療剤の物理化学的特性及び組成物の投与経路に依存することを知っているだろう。薬学的組成物は、診断試薬、栄養物質、毒素、または治療剤、例えば、癌化学療法薬等の第２試薬を含むこともできる。
【００８５】
本明細書に記載のポリヌクレオチドは、水中油型エマルジョン、マイクロエマルジョン、ミセル、混合ミセル、リポソーム、ミクロスフェア、または他のポリマーマトリックス内等の封入材料内に組み込むことができる（例えば、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．１９８４）、Ｆｒａｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，６：７７（１９８１）を参照）。例えば、リン脂質または他の脂質からなるリポソームは、作製及び投与が比較的簡単な非毒性の生理学的に許容される代謝可能な担体である。「ステルス」リポソーム（例えば、米国特許第５，８８２，６７９号、同第５，３９５，６１９号、及び同第５，２２５，２１２号を参照）は、本発明の方法において有用な組成物を調製するために特に有用なそのような封入材料の一実施例であり、他の「マスクされた」リポソームを同様に使用することができ、そのようなリポソームは、治療剤が循環中に滞留する時間を延長する。カチオン性リポソームは、例えば、特定の受容体またはリガンドで修飾することもできる（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９１：２５８０−２５８５（１９９３）、参照により本明細書に組み込まれる）。加えて、ポリヌクレオチドは、例えば、アデノウイルス−ポリリジンＤＮＡ複合体を使用して細胞に導入され得る（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：６８６６−６８６９（１９９３）を参照）。
【００８６】
一態様において、主題の技術は、円形脱毛症を治療する方法を提供し、それを必要とする対象に有効量のポリヌクレオチドを投与することを含み、該ポリヌクレオチドは、プロアポトーシスタンパク質をコードする配列、またはその機能的断片を含み、ポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドの約３０％〜約６０％がメチル化されている。
【００８７】
別の態様において、主題の技術は、円形脱毛症を治療する方法を提供し、それを必要とする対象に有効量のポリヌクレオチドを投与することを含み、該ポリヌクレオチドは、プロアポトーシスタンパク質をコードする配列、またはその機能的断片を含み、ポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化レベルは、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム中のＣｐＧジヌクレオチドの平均メチル化レベルと比較して約２倍〜約４倍高い。
【００８８】
対象は、アレルギー性疾患または自己免疫疾患の病歴を有する、または共存する脱毛症対象であり得る。
【００８９】
円形脱毛症は、通常の円形脱毛症、完全脱毛症、全身性脱毛症、または蛇行状脱毛症であり得る。
【００９０】
本明細書に記載の組成物は、白髪、産毛の形成を治療するため、または脂漏性頭皮もしくはふけの発生を阻害するための薬剤として用いることもできる。
【００９１】
一態様において、主題の技術は、毛包からの毛幹の成長を刺激する方法を提供し、それを必要とする対象に有効量のポリヌクレオチドを投与することを含み、該ポリヌクレオチドは、プロアポトーシスタンパク質をコードする配列、またはその機能的断片を含み、ポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドの約３０％〜約６０％がメチル化されている。
【００９２】
一態様において、主題の技術は、毛包からの毛幹の成長を刺激する方法を提供し、それを必要とする対象に有効量のポリヌクレオチドを投与することを含み、該ポリヌクレオチドは、プロアポトーシスタンパク質をコードする配列、またはその機能的断片を含み、ポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化レベルは、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム中のＣｐＧジヌクレオチドの平均メチル化レベルと比較して約２倍〜約４倍高い。
【００９３】
一態様において、主題の技術は、該脱毛が自己免疫疾患に起因する、脱毛を治療する方法を提供し、それを必要とする対象に有効量のポリヌクレオチドを投与することを含み、該ポリヌクレオチドは、プロアポトーシスタンパク質をコードする配列、またはその機能的断片を含み、ポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドの約３０％〜約６０％がメチル化されている。
【００９４】
一態様において、主題の技術は、毛包からの毛幹の成長を刺激する方法を提供し、それを必要とする対象に有効量のポリヌクレオチドを投与することを含み、該ポリヌクレオチドは、プロアポトーシスタンパク質をコードする配列、またはその機能的断片を含み、ポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化レベルは、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム中のＣｐＧジヌクレオチドの平均メチル化レベルと比較して約２倍〜約４倍高い。
【００９５】
多くの場合、脱毛は、自己免疫状態に起因し得る。脱毛をもたらし得る例示的な自己免疫疾患としては、例えば、慢性円板状エリテマトーデス、限局性強皮症、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、白斑、サットン母斑、自己免疫甲状腺疾患、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、または重症筋無力症が挙げられる。
【００９６】
アンドロゲン性脱毛症もまた、脱毛をもたらし得る。アンドロゲン性脱毛症は男性において、またはアンドロゲン性脱毛症は女性において起こり得る。
【００９７】
有効量が、それを必要とする対象に投与される。「有効量」または「治療上有効な量」は、疾患の症状を低減／改善するために十分な量等の、投与条件下で所望の治療効果または予防効果を実現するために十分な量である。
【００９８】
本明細書に記載のポリヌクレオチドを含有する組成物の投与経路は、分子の化学構造に部分的に依存するであろう。例えば、ポリペプチド及びポリヌクレオチドは、消化管内で分解され得るため、それらは、経口投与される場合に特に有用ではない。しかしながら、例えば、内因性プロテアーゼによる分解を受けにくくするか、または消化管を通してより吸収できるようにするためにポリペプチドを化学修飾する方法は、本明細書に開示されているか、またはそうでなければ当該技術分野において既知である（例えば、Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（上記）１９９５、Ｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｒｏｏｋ（上記）１９９５を参照）。加えて、ポリペプチドは、Ｄ−アミノ酸を使用して調製され得るか、またはドメインの構造を模倣する有機分子であるペプチド模倣体に基づく、もしくはビニル性ペプトイド等のペプトイドに基づく１つ以上のドメインを含み得る。
【００９９】
本明細書に開示される組成物は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、眼窩内、関節包内の、腹腔内、直腸内、嚢内等の経口もしくは非経口を含む様々な経路によって、または例えば、皮膚パッチを使用する受動的な皮膚吸収もしくは経皮イオン導入を使用する促進された皮膚吸収によって個体に投与され得る。さらに、組成物は、注入、挿管によって経口または局所的に投与することができ、後者は、例えば、軟膏の直接適用によって受動的であり得るか、または例えば、鼻内噴霧もしくは鼻吸入剤を使用して能動的であり得、その場合に組成物の一成分は、適切な推進剤である。薬学的組成物は、病的状態の部位に、例えば、脱毛が発生している、または発生する可能性がある頭皮に、投与することもできる。
【０１００】
好ましい投与経路は、皮下、皮内、または経皮のうちの少なくとも１つを含む。組成物は、脱毛部位、例えば、前頭部または頭頂部に投与され得る。
【０１０１】
本発明の方法を実施する際に投与されるポリヌクレオチドの総量は、ボーラスとして、もしくは比較的短い期間にわたっての注入によってのいずれかで、単一用量として対象に投与され得るか、または複数の用量が長期間にわたって投与される分割治療プロトコルを使用して投与され得る。当業者であれば、対象における病的状態を治療するための組成物の量が、対象の年齢及び一般的健康状態、ならびに投与経路及び施される治療の回数を含む多くの要素に依存していることを認識しているであろう。これらの要素を考慮して、当業者であれば、必要に応じて特定用量を調整するであろう。一般に、組成物の製剤化ならびに投与経路及び頻度は、第Ｉ相及び第ＩＩ相臨床試験を用いて最初に決定される。
【０１０２】
様々な実施形態において、この方法が１つまたは複数の免疫抑制剤を投与することを含む場合、その１つまたは複数の免疫抑制剤は、同時に、別個に、または連続的に投与することができる。
【０１０３】
様々な実施形態において、１つまたは複数の免疫抑制剤は、コルチコステロイド、グルココルチコイド、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、アザチオプリン（ＡＺＡ）、メトトレキサートシクロスポリン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、ミコフェノール酸（ＭＰＡ）、タクロリムス（ＦＫ５０６）、シロリムス（［ＳＲＬ］ラパマイシン）、エベロリムス（セルチカン）、ミゾリビン、レフルノミド、デオキシスペルグアリン、ブレキナール、アゾジカルボンアミド、ビタミンＤ類似体（ＭＣ１２８８及びビスインドリルマレイミドＶＩＩＩ等）、抗リンパ球グロブリン、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ムロモナブ−ＣＤ３、オルソクローン  ＯＫＴ３）、抗インターロイキン（ＩＬ）−２受容体（抗ＣＤ２５）抗体、（ダクリズマブ、ゼネパックス、バシリキシマブ、シミュレクト）、抗ＣＤ５２抗体（アレムツズマブ、カンパス−１Ｈ）、抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ、リツキサン）、抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）試薬（インフリキシマブ、レミケード、アダリムマブ、ヒュミラ）、ＬＦＡ−１阻害物質（エファリズマブ、ラプティバ）等からなる群から選択され得る。
【０１０４】
一態様において、主題の技術は、プロアポトーシスタンパク質、またはその機能的断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドの約３０％〜約６０％は、円形脱毛症を治療する用途のためにメチル化されている。
【０１０５】
一態様において、主題の技術は、プロアポトーシスタンパク質、またはその機能的断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化レベルは、円形脱毛症を治療する用途のために、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム中のＣｐＧジヌクレオチドの平均メチル化レベルと比較して約２倍〜約４倍高い。
【０１０６】
一態様において、主題の技術は、プロアポトーシスタンパク質、またはその機能的断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドの約３０％〜約６０％は、毛包からの毛幹の成長を刺激する用途のためにメチル化されている。
【０１０７】
一態様において、主題の技術は、プロアポトーシスタンパク質、またはその機能的断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化レベルは、毛包からの毛幹の成長を刺激する用途のために、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム中のＣｐＧジヌクレオチドの平均メチル化レベルと比較して約２倍〜約４倍高い。
【０１０８】
一態様において、主題の技術は、プロアポトーシスタンパク質、またはその機能的断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドの約３０％〜約６０％は、脱毛を治療する用途のためにメチル化され、該脱毛は、自己免疫疾患に起因する。
【０１０９】
一態様において、主題の技術は、プロアポトーシスタンパク質、またはその機能的断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化レベルは、脱毛を治療する用途のために、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム中のＣｐＧジヌクレオチドの平均メチル化レベルと比較して約２倍〜約４倍高く、該脱毛は、自己免疫疾患に起因する。
【実施例】
【０１１０】
以下の実施例は、主題の技術のさらなる例示を提供し、主題の技術の範囲を限定することを意図しない。
実施例
【０１１１】
実施例１．円形脱毛症の治療のためのＤＮＡワクチンの使用
プロアポトーシスタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ構成体を作製する。プロアポトーシスタンパク質は、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｍ、Ｐｕｍａ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｎｏｘａ、Ｂｍｆ、Ｈｒｋ、Ｂｉｄ、ＦＡＳ、カスパーゼ変異体、またはスルビビン変異体から選択される。プラスミドは、ＣｐＧジヌクレオチドを高メチル化する細菌株から、及びＣｐＧジヌクレオチドを高メチル化しない（すなわち、低メチル化）細菌株から単離される。高メチル化ＤＮＡ構成体の場合、プロアポトーシスタンパク質をコードする遺伝子／ｃＤＮＡのプロモーター制御の転写は、ＣｐＧ高メチル化、例えば、ＳＶ４０プロモーターによって不活性化されない。非高メチル化構成体の場合、プロモーターは、任意の誘導性または構成的プロモーター、例えば、ＣＭＶまたはＬＴＲプロモーターであり得る。
【０１１２】
プラスミドＤＮＡ構成体のそれぞれ、または２つの構成体の様々な比率の異なる組み合わせは、次に、例えば、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスモデルを使用して、円形脱毛症を治療するために皮膚に送達される。ＤＮＡは、健康な皮膚（すなわち、毛髪を有する）に皮内送達されるか、または脱毛を示す患部に直接送達されるかのいずれかである。ＤＮＡ量は、治療１回当たり１マイクログラム〜２００マイクログラム以上の範囲であり得、治療は、毛髪の成長が観察されるまで週１回送達される。あるいは、ＤＮＡは、細胞トランスフェクションを促進するナノ粒子または微小粒子にパッケージングした後に、経皮的に送達され得る。
【０１１３】
加えて、プラスミドＤＮＡ構成体は、毛包に存在する自己抗原をコードすることもできる。この場合、ＤＮＡは、毛包の形成を促進する毛包または幹細胞を有していない皮膚に注入されることができる。
【０１１４】
主題の技術は、その詳細な説明に関連して説明してきたが、前述の説明は例示することが意図され、主題の技術の範囲を限定するものではないことを理解されたい。主題の技術の他の態様、利点、及び修正は、以下に記載の特許請求の範囲内である。本明細書は、本明細書内で引用された参考文献の教示に照らして最も完全に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明の実施形態の例示を提供し、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者であれば、多くの他の実施形態が本発明に包含されることを容易に認識する。本開示において引用される全ての刊行物、特許、及び配列は、参照によりそれら全体が組み込まれる。参照により組み込まれる資料が矛盾するか、または本明細書と一致しない場合は、本明細書は、いかなるそのような資料にも優先する。本明細書における任意の参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術であることを認めるものではない。
【０１１５】
当業者は、定型的なの実験のみを使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の実施形態によって包含されることが意図される。
【０１１６】
付録：配列
１．ヒトＢＡＸをコードするヌクレオチド配列
【化１】
2019077715.tif 000002
【化２】
2019077715.tif 000003
【０１１７】
本発明の態様として、以下のものが挙げられる。
［１］毛包からの毛幹の成長を刺激する方法であって、それを必要とする対象に有効量のポリヌクレオチドを投与することを含み、
前記ポリヌクレオチドが、プロアポトーシスタンパク質、またはその機能的断片をコードする配列を含み、前記ポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化レベルが、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム中のＣｐＧジヌクレオチドの平均メチル化レベルと比較して約２倍〜約４倍高い、前記方法。
［２］毛包からの毛幹の成長を刺激する方法であって、それを必要とする対象に有効量のポリヌクレオチドを投与することを含み、
前記ポリヌクレオチドが、プロアポトーシスタンパク質、またはその機能的断片をコードする配列を含み、前記ポリヌクレオチドの前記ＣｐＧジヌクレオチドの約３０％〜約６０％がメチル化されている、前記方法。
［３］前記プロアポトーシスタンパク質が、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｍ、Ｐｕｍａ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｎｏｘａ、Ｂｍｆ、Ｈｒｋ、Ｂｉｄ、ＦＡＳ、カスパーゼ、及びそれらの機能的断片からなる群から選択される、［１］または［２］に記載の前記方法。
［４］前記プロアポトーシスタンパク質が、ＢＡＸまたはその機能的断片である、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の前記方法。
［５］前記ポリヌクレオチドが、皮下または皮内のうちの少なくとも一方で投与される、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の前記方法。
［６］前記ポリヌクレオチドが、脱毛の部位に投与される、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の前記方法。
［７］前記ポリヌクレオチドが、細菌中で産生され、前記細菌が、構成的プロモーターによって制御される改変メチラーゼコード配列を含み、前記改変メチラーゼコード配列が、前記細菌の染色体ＤＮＡに安定に組み込まれる、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の前記方法。
［８］前記細菌が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、［７］に記載の前記方法。
［９］前記メチラーゼが、ＣｐＧメチラーゼである、［７］に記載の前記方法。
［１０］円形脱毛症を治療する方法であって、それを必要とする対象に有効量のポリヌクレオチドを投与することを含み、
前記ポリヌクレオチドが、プロアポトーシスタンパク質、またはその機能的断片をコードする配列を含み、前記ポリヌクレオチドの前記ＣｐＧジヌクレオチドの約３０％〜約６０％がメチル化されている、前記方法。
［１１］円形脱毛症を治療する方法であって、それを必要とする対象に有効量のポリヌクレオチドを投与することを含み、
前記ポリヌクレオチドが、プロアポトーシスタンパク質、またはその機能的断片をコードする配列を含み、前記ポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化レベルが、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム中のＣｐＧジヌクレオチドの平均メチル化レベルと比較して約２倍〜約４倍高い、前記方法。
［１２］前記プロアポトーシスタンパク質が、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｍ、Ｐｕｍａ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｎｏｘａ、Ｂｍｆ、Ｈｒｋ、Ｂｉｄ、ＦＡＳ、カスパーゼ、及びそれらの機能的断片からなる群から選択される、［１０］または［１１］に記載の前記方法。
［１３］前記プロアポトーシスタンパク質が、ＢＡＸまたはその機能的断片である、［１０］〜［１２］のいずれか１項に記載の前記方法。
［１４］前記ポリヌクレオチドが、皮下または皮内のうちの少なくとも一方で投与される、［１０］〜［１３］のいずれか１項に記載の前記方法。
［１５］前記ポリヌクレオチドが、脱毛の部位に投与される、［１０］〜［１４］のいずれか１項に記載の前記方法。
［１６］前記ポリヌクレオチドが、細菌中で産生され、前記細菌が、構成的プロモーターによって制御される改変メチラーゼコード配列を含み、前記改変メチラーゼコード配列が、前記細菌の染色体ＤＮＡに安定に組み込まれる、［１０］〜［１５］のいずれか１項に記載の前記方法。
［１７］前記細菌が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、［１６］に記載の前記方法。
［１８］前記メチラーゼが、ＣｐＧメチラーゼである、［１６］に記載の前記方法。
［１９］脱毛を治療する方法であって、前記脱毛が自己免疫疾患に起因し、それを必要とする対象に有効量のポリヌクレオチドを投与することを含み、
前記ポリヌクレオチドが、プロアポトーシスタンパク質、またはその機能的断片をコードする配列を含み、前記ポリヌクレオチドの前記ＣｐＧジヌクレオチドの約３０％〜約６０％がメチル化されている、前記方法。
［２０］脱毛を治療する方法であって、前記脱毛が自己免疫疾患に起因し、それを必要とする対象に有効量のポリヌクレオチドを投与することを含み、
前記ポリヌクレオチドが、プロアポトーシスタンパク質、またはその機能的断片をコードする配列を含み、前記ポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化レベルが、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム中のＣｐＧジヌクレオチドの平均メチル化レベルと比較して約２倍〜約４倍高い、前記方法。
［２１］前記対象が、脱毛症を有するか、または脱毛症になりやすい、［１９］または［２０］に記載の前記方法。
［２２］前記脱毛症が、円形脱毛症、アンドロゲン性脱毛症、産褥性脱毛症、女性型脱毛症、脂漏性脱毛症、粃糠性脱毛症、抜毛癖、老人性脱毛症、癌化学療法薬誘導性脱毛症、またはそれらの組み合わせを含む、［２１］に記載の前記方法。
［２３］前記自己免疫疾患が、慢性円板状エリテマトーデス、限局性強皮症、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、白斑、サットン母斑、自己免疫甲状腺疾患、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、重症筋無力症、またはそれらの組み合わせを含む、［１９］〜［２２］のいずれか１項に記載の前記方法。
［２４］前記プロアポトーシスタンパク質が、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｍ、Ｐｕｍａ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｎｏｘａ、Ｂｍｆ、Ｈｒｋ、Ｂｉｄ、ＦＡＳ、カスパーゼ、及びそれらの機能的断片からなる群から選択される、［１９］〜［２３］のいずれか１項に記載の前記方法。
［２５］前記プロアポトーシスタンパク質が、ＢＡＸまたはその機能的断片である、［１９］〜［２４］のいずれか１項に記載の前記方法。
［２６］前記ポリヌクレオチドが、皮下または皮内のうちの少なくとも一方で投与される、［１９］〜［２５］のいずれか１項に記載の前記方法。
［２７］前記ポリヌクレオチドが、脱毛の部位に投与される、［１９］〜［２６］のいずれか１項に記載の前記方法。
［２８］前記ポリヌクレオチドが、細菌中で産生され、前記細菌が、構成的プロモーターによって制御される改変メチラーゼコード配列を含み、前記改変メチラーゼコード配列が、前記細菌の染色体ＤＮＡに安定に組み込まれる、［１９］〜［２７］のいずれか１項に記載の前記方法。
［２９］前記細菌が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、［２８］に記載の前記方法。
［３０］前記メチラーゼが、ＣｐＧメチラーゼである、［２８］に記載の前記方法。
［３１］プロアポトーシスタンパク質、またはその機能的断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドの前記ＣｐＧジヌクレオチドの約３０％〜約６０％が、円形脱毛症を治療する用途のためにメチル化されている、前記ポリヌクレオチド。
［３２］プロアポトーシスタンパク質、またはその機能的断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化レベルが、円形脱毛症を治療する用途のために、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム中のＣｐＧジヌクレオチドの平均メチル化レベルと比較して約２倍〜約４倍高い、前記ポリヌクレオチド。
［３３］プロアポトーシスタンパク質、またはその機能的断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドの前記ＣｐＧジヌクレオチドの約３０％〜約６０％が、毛包からの毛幹の成長を刺激する用途のためにメチル化されている、前記ポリヌクレオチド。
［３４］プロアポトーシスタンパク質、またはその機能的断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化レベルが、毛包からの毛幹の成長を刺激する用途のために、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム中のＣｐＧジヌクレオチドの平均メチル化レベルと比較して約２倍〜約４倍高い、前記ポリヌクレオチド。
［３５］プロアポトーシスタンパク質、またはその機能的断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドの前記ＣｐＧジヌクレオチドの約３０％〜約６０％が、脱毛を治療する用途のためにメチル化され、前記脱毛が、自己免疫疾患に起因する、前記ポリヌクレオチド。
［３６］プロアポトーシスタンパク質、またはその機能的断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化レベルが、脱毛を治療する用途のために、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム中のＣｐＧジヌクレオチドの平均メチル化レベルと比較して約２倍〜約４倍高く、前記脱毛が、自己免疫疾患に起因する、前記ポリヌクレオチド。
【配列表】
2019077715000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月22日(2019.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む、自己抗原に対する寛容原性免疫応答の誘導における皮内使用のための医薬組成物であって、
（ａ）該第１のポリヌクレオチドは、自己抗原またはその抗原性断片をコードする配列を含み、該第１のポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも約５０％はメチル化されており；
（ｂ）該第２のポリヌクレオチドは、ＢＡＫ、ＢＡＸ、ＢＩＭ、細胞死受容体４（ＤＲ４）、細胞死受容体５（ＤＲ５）、もしくはＦＡＳ受容体から選択されるプロアポトーシスタンパク質またはその機能的プロアポトーシス断片をコードする配列を含み、該第２のポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドの約１５％以下はメチル化されている、医薬組成物。
【請求項２】
該自己抗原が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、橋本病、白斑、重症筋無力症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎またはアレルギー性鼻炎からなる群より選択される自己免疫疾患に関連するものである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
該自己抗原が、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、ＧＡＤの分泌形態（ｓＧＡＤ）、またはその自己抗原性断片である、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項４】
該第２のポリヌクレオチドが、ＢＡＸまたはその機能的プロアポトーシス断片をコードする配列を含む、請求項１〜３いずれか記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＢＡＸが、配列番号：１に示すポリヌクレオチドによりコードされる、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
該医薬組成物が、該自己免疫疾患の部位に投与するためのものである、請求項２〜５いずれか記載の医薬組成物。
【請求項７】
自己免疫疾患の自己抗原に対する寛容原性免疫応答を誘導するための医薬の製造における組成物の使用であって、該組成物は、
（ａ）第１のポリヌクレオチド、ここで、該第１のポリヌクレオチドは、自己抗原またはその抗原性断片をコードする配列を含み、該第１のポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも約５０％はメチル化されている；および
（ｂ）第２のポリヌクレオチド、ここで、該第２のポリヌクレオチドは、ＢＡＫ、ＢＡＸ、ＢＩＭ、細胞死受容体４（ＤＲ４）、細胞死受容体５（ＤＲ５）、もしくはＦＡＳ受容体から選択されるプロアポトーシスタンパク質またはその機能的プロアポトーシス断片をコードする配列を含み、該第２のポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドの約１５％以下はメチル化されている、
を含む、使用。
【請求項８】
該自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、橋本病、白斑、重症筋無力症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎またはアレルギー性鼻炎からなる群より選択される、請求項７記載の使用。
【請求項９】
該自己抗原が、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、ＧＡＤの分泌形態（ｓＧＡＤ）、またはその自己抗原性断片である、請求項７または８記載の使用。
【請求項１０】
該第２のポリヌクレオチドが、ＢＡＸまたはその機能的プロアポトーシス断片をコードする配列を含む、請求項７〜９いずれか記載の使用。
【請求項１１】
ＢＡＸが、配列番号：１に示すポリヌクレオチドによりコードされる、請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
該組成物が、皮内投与される、請求項７〜１１いずれか記載の使用。
【請求項１３】
該組成物が、該自己免疫疾患の部位に投与される、請求項７〜１２いずれか記載の使用。
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月9日(2019.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む、自己抗原に対する寛容原性免疫応答の誘導における皮内使用のための医薬組成物であって、
（ａ）該第１のポリヌクレオチドは、自己抗原またはその抗原性断片をコードする配列を含み、該第１のポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも約５０％はメチル化されており；
（ｂ）該第２のポリヌクレオチドは、ＢＡＫ、ＢＡＸ、ＢＩＭ、細胞死受容体４（ＤＲ４）、細胞死受容体５（ＤＲ５）、もしくはＦＡＳ受容体から選択されるプロアポトーシスタンパク質またはその機能的プロアポトーシス断片をコードする配列を含み、該第２のポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドの約１５％以下はメチル化されている、医薬組成物。
【請求項２】
該自己抗原が、自己免疫疾患に関連するものである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
該自己免疫疾患が、慢性円板状エリテマトーデス、限局性強皮症、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、サットン母斑、自己免疫甲状腺疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、橋本病、白斑、重症筋無力症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎またはアレルギー性鼻炎からなる群より選択される、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
該自己抗原が、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、ＧＡＤの分泌形態（ｓＧＡＤ）、またはその自己抗原性断片である、請求項１〜３いずれか記載の医薬組成物。
【請求項５】
該第２のポリヌクレオチドが、ＢＡＸまたはその機能的プロアポトーシス断片をコードする配列を含む、請求項１〜４いずれか記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＢＡＸが、配列番号：１に示すポリヌクレオチドによりコードされる、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
該医薬組成物が、該自己免疫疾患の部位に投与するためのものである、請求項２〜６いずれか記載の医薬組成物。
【請求項８】
自己免疫疾患の自己抗原に対する寛容原性免疫応答を誘導するための医薬の製造における組成物の使用であって、該組成物は、
（ａ）第１のポリヌクレオチド、ここで、該第１のポリヌクレオチドは、自己抗原またはその抗原性断片をコードする配列を含み、該第１のポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも約５０％はメチル化されている；および
（ｂ）第２のポリヌクレオチド、ここで、該第２のポリヌクレオチドは、ＢＡＫ、ＢＡＸ、ＢＩＭ、細胞死受容体４（ＤＲ４）、細胞死受容体５（ＤＲ５）、もしくはＦＡＳ受容体から選択されるプロアポトーシスタンパク質またはその機能的プロアポトーシス断片をコードする配列を含み、該第２のポリヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドの約１５％以下はメチル化されている、
を含む、使用。
【請求項９】
該自己免疫疾患が、慢性円板状エリテマトーデス、限局性強皮症、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、サットン母斑、自己免疫甲状腺疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、橋本病、白斑、重症筋無力症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎またはアレルギー性鼻炎からなる群より選択される、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
該自己抗原が、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、ＧＡＤの分泌形態（ｓＧＡＤ）、またはその自己抗原性断片である、請求項８または９記載の使用。
【請求項１１】
該第２のポリヌクレオチドが、ＢＡＸまたはその機能的プロアポトーシス断片をコードする配列を含む、請求項８〜１０いずれか記載の使用。
【請求項１２】
ＢＡＸが、配列番号：１に示すポリヌクレオチドによりコードされる、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
該組成物が、皮内投与される、請求項８〜１２いずれか記載の使用。
【請求項１４】
該組成物が、該自己免疫疾患の部位に投与される、請求項８〜１２いずれか記載の使用。