(57)【要約】【課題】 本発明は、培養後分注、保存、および／または予備冷却して凍結保存を行い、用時解凍して使用に供する培養細胞を調製する方法において、凍結解凍後の細胞の生存率や機能を損なわない方法を提供することを目的とする。【解決手段】  凍結用の細胞懸濁液を調製する方法であって、細胞懸濁液を調製後、冷蔵しながら保存するステップを含む方法【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結用の細胞懸濁液を調製する方法であって、細胞懸濁液を調製後、冷蔵しながら保存するステップを含む方法。
【請求項２】
保存の時間が３０〜６０分である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞懸濁液の密度が１０７ｃｅｌｌｓ/ｍｌ以上である、請求項１または２に記載の方法。 
【請求項４】
凍結保存用容器に分注するステップを更に含み、冷蔵しながら保存するステップは、細胞懸濁液を含む凍結保存用容器を、凍結処理容器中に格納し冷蔵しながら保存するステップである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
凍結処理容器の冷蔵温度が２〜８℃である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
細胞懸濁液を含む凍結保存用容器を、凍結処理容器中に格納し、冷蔵保存ステップに引き続いて予備冷却するステップを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
分注ステップが、使用に供する培養細胞を調製するためのステップである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
増殖培養ステップ、凍結保存するステップ、解凍ステップ、洗浄ステップ、およびシート状細胞培養物の形成ステップのいずれか一つ以上をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
自動化された装置において行う、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
培養細胞が骨格筋芽細胞、心筋細胞、線維芽細胞またはリンパ球のいずれかである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
培養細胞、疾病、傷病の治療に用いるものである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
凍結用の細胞懸濁液を調製する方法であって、細胞懸濁液を調製後、冷蔵
しながら保存するステップを含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患により損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、間葉系幹細胞、心臓幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の利用が試みられている（非特許文献１）。
【０００３】
例えば、特許文献１には、動物の心筋組織中への骨格筋芽細胞又は心筋細胞の導入による、動物における安定な心筋細胞性移植体の形成において使用するための、生存可能な骨格筋芽細胞又は生存可能な心筋細胞を含む細胞組成物について記載されている。
【０００４】
骨格筋芽細胞の移植により心機能の低下が防止されるメカニズムについてはまだ明らかではないが、概要としては、移植された骨格筋芽細胞が心筋内で筋線維を形成し、その弾力性により周囲の正常な心筋の動きを機械的に助けて心機能の更なる低下を防ぐこと、または移植された骨格筋芽細胞がＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）などのサイトカインを分泌し、その効果によるものなどが考えられている。
【０００５】
この骨格筋芽細胞は骨格筋に含まれ、骨格筋からの分離後に培養を行うことで細胞数を確保し、心筋組織の壊死部分に移植される。
培養細胞を凍結保存する従来の方法は、例えば、容器内の細胞を、凍結手段、例えば、フリーザー、ディープフリーザー、低温の媒体（例えば、液体窒素等）に供することなどが挙げられ、凍結手段の温度は、典型的には０℃以下、好ましくは−８０℃以下である。（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３６４７８６６号公報
【特許文献２】特許第５６３４６４６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈａｒａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ., Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ. ２０１２ Ｆｅｂ;１(２):１３６-４１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、これらの従来の方法は、凍結解凍後の細胞の生存率や機能を損なう等の問題があることに着目した。すなわち、本発明は、培養後分注、保存、および／または予備冷却して凍結保存を行い、用時解凍して使用に供する培養細胞を調製する方法において、凍結解凍後の細胞の生存率や機能を損なわない方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を進める中、凍結ステップの前に、冷蔵保存ステップおよび/または予備冷却ステップを行うことで凍結後の細胞の生存率や機能を損なわないことを見出し、さらに研究を進めた結果、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は以下に関する。
（１）凍結用の細胞懸濁液を調製する方法であって、細胞懸濁液を調製後、冷蔵しながら保存するステップを含む方法。
（２）保存の時間が３０〜６０分である、（１）に記載の方法。
（３）細胞懸濁液の密度が１０７ｃｅｌｌｓ/ｍｌ以上である、（１）または（２）に記載の方法。 
（４）凍結保存用容器に分注するステップを更に含み、冷蔵しながら保存するステップは、細胞懸濁液を含む凍結保存用容器を、凍結処理容器中に格納し冷蔵しながら保存するステップである、（１）〜（３）に記載の方法。
【００１０】
（５）凍結処理容器の冷蔵温度が２〜８℃である、（４）に記載の方法。
（６）細胞懸濁液を含む凍結保存用容器を、凍結処理容器中に格納し、冷蔵保存ステップに引き続いて予備冷却するステップを含む、（１）〜（５）に記載の方法。
（７）分注ステップが、使用に供する培養細胞を調製するためのステップである、（１）〜（６）に記載の方法。
（８）増殖培養ステップ、凍結保存するステップ、解凍ステップ、洗浄ステップ、およびシート状細胞培養物の形成ステップのいずれか一つ以上をさらに含む、（１）〜（７）に記載の方法。
（９）自動化された装置において行う、（１）〜（８）に記載の方法。
（１０）培養細胞が骨格筋芽細胞、心筋細胞、線維芽細胞またはリンパ球のいずれかである、（１）〜（９）に記載の方法。
（１１）培養細胞、疾病、傷病の治療に用いるものである、（１）〜（１０）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
分注から冷凍までの間に様々なステップ、すなわち、保存、予備冷却などが不可避的にある中で、これらのステップを適切に管理制御しなければ好適シートを作成することは困難であるところ、本発明の方法により、細胞保存液による細胞への傷害を防止することができ、凍結後に解凍した細胞の生存率や機能が保持される利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、冷蔵保存ステップにおける、冷蔵保存時間（min)と、バイアビリティ（％）、回収生細胞数（×１０７cells)、および回収全細胞数との関係を示したグラフである。
【図２】図２は、冷蔵保存ステップにおける、冷蔵保存時間（min)と、バイアビリティ（％）、回収生細胞数（×１０７cells)、および回収全細胞数との関係を、冷蔵保存と室温保存で比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願、公開された出願および他の出版物は、その全体を参照により本明細書に援用する。
【００１４】
凍結用の細胞懸濁液を調製する方法であって、細胞懸濁液を調製後、冷蔵
しながら保存するステップを含む方法に関する。
本発明の他の側面は、  凍結用の細胞懸濁液を調製する方法であって、細胞懸濁液の凍結前に冷却しながら保存するステップを含む方法に関する。
【００１５】
本発明に用いることができる培養細胞は、培養し得るものであれば特に制限はないが、例えば接着細胞（付着性細胞）を含む。接着細胞は、例えば、接着性の体細胞（例えば、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞など）および幹細胞（例えば、筋芽細胞、心臓幹細胞などの組織幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ）細胞などの多能性幹細胞、間葉系幹細胞等）などを含む。体細胞は、幹細胞、特にｉＰＳ細胞から分化させたものであってもよい。シート状細胞培養物を形成し得る細胞の非限定例としては、例えば、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞など）、間葉系幹細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、臍帯血由来のものなど）、心筋細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、上皮細胞（例えば、口腔粘膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞など）、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞など）、肝細胞（例えば、肝実質細胞など）、膵細胞（例えば、膵島細胞など）、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞等が挙げられる。好ましくは骨格筋芽細胞、心筋細胞等であるがこれに限定されない。ｉＰＳ細胞由来接着細胞の非限定例としては、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞などが挙げられる。培養細胞は非接着性の細胞を含む。非接着性の細胞としては、免疫療法などに用いるリンパ球（Tリンパ球、Bリンパ球）、樹状細胞などの免疫細胞、白血球などの血液細胞を含む。培養細胞は遺伝子導入された細胞であってもよい。
【００１６】
本発明において「筋芽細胞」は、横紋筋細胞の前駆細胞であり、骨格筋芽細胞および心筋芽細胞を含む。
本発明において「骨格筋芽細胞」は、骨格筋に存在する筋芽細胞を意味する。骨格筋芽細胞は当該技術分野でよく知られており、骨格筋から任意の既知の方法（例えば、特開２００７−８９４４２号公報に記載の方法など）により調製することもできるし、商業的に入手することもできる（例えば、Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ# ＣＣ-２５８０）。骨格筋芽細胞は、限定されずに、例えば、ＣＤ５６、α７インテグリン、ミオシン重鎖ＩＩａ、ミオシン重鎖ＩＩｂ、ミオシン重鎖ＩＩｄ（ＩＩｘ）、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、Ｍｙｆ６、ミオゲニン、デスミン、ＰＡＸ３などのマーカーにより同定することができる。
【００１７】
特定の態様において、骨格筋芽細胞はＣＤ５６陽性である。さらに特定の態様において、骨格筋芽細胞はＣＤ５６陽性およびデスミン陽性である。骨格筋芽細胞は、骨格筋を有する任意の生物、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に由来してもよい。一態様において、骨格筋芽細胞は哺乳動物の骨格筋芽細胞である。特定の態様において、骨格筋芽細胞はヒト骨格筋芽細胞である。
【００１８】
本発明において「心筋芽細胞」は、心筋に存在する筋芽細胞を意味する。心筋芽細胞は当該技術分野でよく知られており、Ｉｓｌ１などのマーカーにより同定することができる。心筋芽細胞は、心筋を有する任意の生物、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に由来してもよい。一態様において、心筋芽細胞は哺乳動物の心筋芽細胞である。特定の態様において、心筋芽細胞はヒト心筋芽細胞である。
【００１９】
本開示において「心筋細胞」は、心筋細胞の特徴を有する細胞を意味し、心筋細胞の特徴としては、限定されずに、例えば、心筋細胞マーカーの発現、自律的拍動の存在などが挙げられる。心筋細胞マーカーの非限定例としては、例えば、ｃ−ＴＮＴ（cardiac troponin T）、ＣＤ１７２ａ（別名ＳＩＲＰＡまたはＳＨＰＳ−１）、ＫＤＲ（別名ＣＤ３０９、ＦＬＫ１またはＶＥＧＦＲ２）、ＰＤＧＦＲＡ、ＥＭＩＬＩＮ２、ＶＣＡＭなどが挙げられる。
【００２０】
所定の形状に形成された細胞培養物を構成する細胞は、所定の形状に形成された細胞培養物による治療が可能な任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯目動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギなどが含まれる。また、所定の形状に形成された細胞培養物を構成する細胞の種類の数は特に限定されず、１種類のみ細胞で構成されていてもよいが、２種類以上の細胞を用いたものであってもよい。所定の形状に形成された細胞培養物を形成する細胞が２種類以上ある場合、最も多い細胞の含有比率（純度）は、所定の形状の形成終了時において、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上である。
【００２１】
細胞は異種由来細胞であっても同種由来細胞であってもよい。ここで「異種由来細胞」は、シート状細胞培養物が移植に用いられる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、サルやブタに由来する細胞などが異種由来細胞に該当する。また、「同種由来細胞」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト細胞が同種由来細胞に該当する。同種由来細胞は、自己由来細胞（自己細胞または自家細胞ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する細胞と、同種非自己由来細胞（他家細胞ともいう）を含む。自己由来細胞は、移植しても拒絶反応が生じないため、本発明においては好ましい。しかしながら、異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用することも可能である。異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用する場合は、拒絶反応を抑制するため、免疫抑制処置が必要となることがある。なお、本明細書中で、自己由来細胞以外の細胞、すなわち、異種由来細胞と同種非自己由来細胞を非自己由来細胞と総称することもある。本発明の一態様において、細胞は自家細胞または他家細胞である。本発明の一態様において、細胞は自家細胞である。本発明の別の態様において、細胞は他家細胞である。  
【００２２】
本発明において、冷蔵保存するステップは、凍結する前であれば、いつ行ってもよいが、例えば凍結する直前に行ってもよいし、冷蔵した後、凍結する前に予備冷却するステップを加えてもよい。
【００２３】
本発明において「冷蔵」とは、一般的な意味を表し、冷蔵する行為そのものを指し、実際の細胞の温度は問わないが、たとえば０℃〜１０℃であって、対象物が凍結しない温度が挙げられ、好ましくは２〜８℃であるがこれに限定されない。冷蔵とはある一定の温度の範囲（例えば、０℃〜１０℃の範囲）で温度が上昇しないように温度を維持することを含む。また冷蔵には、常温から冷蔵温度まで降下する時間を含む場合もあり、必ずしも２〜８℃に到達する必要はない。ここで「常温」とは、一般的な意味を表し、例えば１５〜２５℃であるがこれに限定されない。
本発明において「冷蔵しながら保存する」とは前記の冷蔵する行為を行いながら保存することを指し、「保存」とは一定時間または期間に同じ場所へ置くことを言い、保存の条件に特に制限はなく、静置であっても振盪下であってもよい。
【００２４】
本発明において用いられる分注容器（凍結保存用チューブ）は、該細胞が保存できれば特に限定されず、たとえばクライオチューブ（Ｎｕｎｃ社）等市販の凍結保存用チューブを用いることができる。容量は特に限定されないが、例えば１〜１０ｍｌが好ましく、１〜２ｍｌのものが好適に用いられる。材質は特に限定されず、金属、プラスチック、ガラス等を用いることができるが、例えば、ポリプロピレン等のプラスチックが好適に用いられる。
本発明において、冷蔵保存する時間は特に限定されないが、例えば、解凍後の細胞のバイアビリティを高く保つためには、１２０分以下、好ましくは９０分以下、さらに好ましくは６０分以下、最も好ましくは３０分以下である。冷蔵保存時間が１２０分を超えると、解凍後の細胞のバイアビリティの低下を招く場合がある。
【００２５】
本発明の一の態様において、冷蔵保存するステップは、凍結する前に、例えば１〜９.０×１０７ｃｅｌｌｓ/ｍｌの高密度の細胞懸濁液を、凍結用チューブに常温で分注した後、例えば６０分間、好ましく約３０分間より短く、あらかじめたとえば２〜８℃の冷蔵温度まで冷蔵しておいたＢＩＣＥＬＬ等の凍結処理容器の中に格納し、室温で保存することによって行うことができる。この場合凍結処理容器中の細胞懸濁液の濃度はその冷蔵時間によって冷蔵温度まで降下しない場合があってもよい。また細胞懸濁液の温度の効果速度は、例えば１５℃から８℃までの場合、６０分〜３０分で約０．１２（６０分）〜０．２３（３０分）℃/分、２５℃〜８℃までの場合、６０分〜３０分で約０.２８(６０分）〜０．５７（３０分）℃/分であるがこれに限定されない。これにより、室温で同じ時間放置する場合に比べて、細胞へのダメージが軽減される効果を得ることができる。
【００２６】
本発明の培養細胞を調製する方法は、細胞懸濁液を含む凍結保存用容器を、凍結処理容器中に格納し、冷蔵保存ステップに引き続いて予備冷却するステップを含んでもよい。
【００２７】
本発明において、「冷却」とは、冷却しながら保存する行為を指し、該細胞を凍結する前に、細胞懸濁液を冷却しながら一定時間保持することを言い、冷却温度は特に限定されないが、例えば０℃〜１０℃、０℃〜８℃、２℃〜８℃、または２℃〜４℃等であって細胞が凍結しない温度が好適である。冷却とはある一定の温度の範囲（例えば、０℃〜１０℃の範囲）で温度が維持または低下するように設定することを含む。冷却は凍結ステップの前に予備的におこなわれることがあり、予備冷却と呼ばれる。予備冷却を行う時間は、特に限定されないが、たとえば３０分〜１２０分、好ましくは４０分〜１００分、より好ましくは約６０分等である。３０分より短いか、あるいは１２０分より長いと細胞への障害を抑えることができない場合がある。
【００２８】
本発明において該細胞懸濁液の細胞密度に特に制限はないが、１．０〜９．０×１０７ｃｅｌｌｓ/ｍｌの比較的高密度であるのが好ましく、好ましくは約２．０〜５．０×１０７ｃｅｌｌｓ/ｍｌ、より好ましくは約３．０×１０７ｃｅｌｌｓ/ｍｌである。 
【００２９】
本発明において、冷却ステップは冷蔵保存ステップに続いて行ってもよいし、冷蔵保存ステップを経ずに行ってもよいが、好ましくは冷蔵保存ステップを経た後予備冷却ステップを行うことによって、スムーズに予備冷却に導くことができる。
【００３０】
本発明の他の態様において、冷蔵保存ステップに引き続いて、予備冷却ステップを行ってもよい。予備冷却ステップは、例えば冷蔵保存ステップで使用した凍結保存用チューブが格納されたＢＩＣＥＬＬを引き続き使用して、細胞懸濁液を冷凍する前に一定時間、例えば３０分〜１２０分、好ましくは４０分〜１００分、より好ましくは約６０分間、冷却温度、例えば０〜１０℃に維持することにより行うことができる。冷却手段は特に限定されないが、例えば冷却温度に設定した市販の冷蔵庫の冷蔵室にＢＩＣＥＬＬごと保管してもよい。このステップにより、つぎに細胞懸濁液を凍結する場合に、急激な凍結による細胞の障害を防止することができる。
【００３１】
本発明の培養細胞を調製する方法は、凍結保存用容器に分注するステップを更に含み、冷蔵しながら保存するステップは、細胞懸濁液を含んでいてもよい。
分注は既知の方法で行えばよいが、たとえば細胞に影響が少ない短時間、例えば、複数の凍結保存用チューブに均等に分注する方法も用いられる。
本発明において「分注」とは、一般的な意味を表し、分けて注ぐ操作であれば特に限定されないが、たとえば細胞に影響が少ない短時間に、複数の凍結保存用チューブに均等に分注する方法が用いられる。本発明において「均等」とは各チューブの細胞密度が、均一であることを意味する。本発明において「均一」とは、たとえば細胞密度の差が３０％以内、好ましくは２０％以内、より好ましくは１５％以内、さらに好ましくは１０％以内が挙げられるが、これに限定されない。
【００３２】
本発明において、一度の操作で分注する凍結保存チューブの本数は特に制限されず、分注する凍結保存チューブ１本あたりの用量にも依存するが、例えば１ｍｌずつを分注する場合、１５本以下、好ましくは１０本以下、より好ましくは６本以下である。一度の操作で分注する時間は、特に限定されないが、好ましくは５分以内、より好ましくは３分以内、さらにより好ましくは１分以内である。分注速度としては、特に制限されないが、例えば６本の凍結保存チューブに１ｍｌずつ分注する場合、１ｍＬあたり１分半以内、好ましくは２５秒以内で分注するのが好ましい。これより遅いと均等に細胞個数を保つことができない場合がある。
【００３３】
本発明の別の側面において、増殖培養ステップをさらに含んでいてもよい。
これらの細胞を増殖培養する方法は、特に限定されず、培養する細胞によって既知の方法を用いることができる。使用する培地は、特に限定されないが、たとえばＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７培地等に適宜、抗生物質、バッファー、、ウシ血清等の動物血清を必要に応じて加えればよい。培養ｐＨ、温度等の培養条件は特に限定されず、選択された細胞に応じて増殖に適した条件を設定すればよいが、動物細胞の場合は、例えばｐＨ６．０〜８．０、好ましくはｐＨ７.２-７.４で行われる場合がある。これらの培養に用いる培養基材は、細胞が増殖し得るものであれば特に限定されず、例えば、種々の材質の容器、容器中の固形もしくは半固形の表面などを含む。容器は、培養液などの液体を透過させない構造・材料が好ましい。かかる材料としては、限定することなく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、金属（例えば、鉄、ステンレス、アルミニウム、銅、真鍮）等が挙げられる。また、容器は、少なくとも１つの平坦な面を有することが好ましい。かかる容器の例としては、限定することなく、例えば、細胞培養物の形成が可能な培養基材で構成された底面と、液体不透過性の側面とを備えた培養容器が挙げられる。かかる培養容器の特定の例としては、限定されずに、細胞培養皿、細胞培養ボトルなどが挙げられる。容器の底面は透明であっても不透明であってもよい。容器の底面が透明であると、容器の裏側から細胞の観察、計数などが可能となる。また、容器は、その内部に固形もしくは半固形の表面を有してもよい。固形の表面としては、上記のごとき種々の材料のプレートや容器などが、半固形の表面としては、ゲル、軟質のポリマーマトリックスなどが挙げられる。培養基材は、上記材料を用いて作製してもよいし、市販のものを利用してもよい。
【００３４】
本発明の一側面において、さらに凍結保存するステップを含んでいてもよい。本発明における細胞の凍結は、既知の任意の手法により行うことができる。かかる手法としては、限定されずに、例えば、容器内の細胞を、凍結手段、例えば、フリーザー、ディープフリーザー、低温の媒体（例えば、液体窒素等）に供することなどが挙げられる。凍結手段の温度は、容器内の細胞集団の一部、好ましくは全体を凍結させ得る温度であれば特に限定されないが、典型的には０℃以下、好ましくは−２０℃以下、より好ましくは−４０℃以下、さらに好ましくは−８０℃以下である。また、凍結操作における冷却速度は、凍結解凍後の細胞の生存率や機能を大きく損なうものでなければ特に限定されないが、典型的には４℃から冷却を始めて−８０℃に達するまで１〜５時間、好ましくは２〜４時間、特に約３時間かける程度の冷却速度である。具体的には、例えば、０．４６℃／分の速度で冷却することができる。かかる冷却速度は、所望の温度に設定した凍結手段に、細胞を含む容器を直接、または、凍結保存用容器に収容して供することにより達成することができる。凍結保存用容器は、容器内の温度の下降速度を所定の速度に制御する機能を有していてもよい。かかる凍結保存用容器としては、既知の任意のもの、例えば、ＢＩＣＥＬＬ(Ｒ)（日本フリーザー）などを用いることができる。
【００３５】
凍結操作は、細胞を培養液や生理緩衝液などに浸漬させたまま行ってもよいが、細胞を凍結・解凍操作から保護するための凍結保護剤を培養液に加えたり、培養液を凍結保護剤を含む凍結保存液と置換するなどの処理を施したうえで行ってもよい。したがって、本発明の調製方法は、培養液に凍結保護剤を添加するステップ、または、培養液を凍結保存液に置換するステップをさらに含んでもよい。培養液を凍結保存液に置換する場合、凍結時に細胞が浸漬している液に有効濃度の凍結保護剤が含まれていれば、培養液を実質的に全て除去してから凍結保存液を添加しても、培養液を一部残したまま凍結保存液を添加してもよい。ここで、「有効濃度」とは、凍結保護剤が、毒性を示すことなく、凍結保護効果、例えば、凍結保護剤を用いない場合と比べた、凍結解凍後の細胞の生存率、活力、機能などの低下抑制効果を示す濃度を意味する。かかる濃度は当業者に知られているか、ルーチンの実験などにより適宜決定することができる。
【００３６】
本発明に用いる凍結保護剤は、細胞に対して凍結保護作用を示すものであれば特に限定されずに、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、セリシン、プロパンジオール、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルデンプン、コンドロイチン硫酸、ポリエチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、アドニトール、ペルセイトール、ラフィノース、ラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールなどを含む。凍結保護剤は、単独で用いても、２種または３種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３７】
培養液への凍結保護剤の添加濃度、または、凍結保存液中の凍結保護剤の濃度は、上記で定義した有効濃度であれば特に限定されず、典型的には、例えば、培養液または凍結保存液全体に対して２〜２０％（ｖ／ｖ）である。しかしながら、この濃度範囲からは外れるが、それぞれの凍結保護剤について知られているか、実験的に決定した代替的な使用濃度を採用することもでき、かかる濃度も本発明の範囲内である。
【００３８】
本発明の一側面において、解凍（融解）ステップをさらに含んでいてもよい。
本発明において、凍結した細胞の解凍は、既知の任意の細胞解凍手法により行うことができ、典型的には、例えば、凍結した細胞を、解凍手段、例えば、凍結温度より高い温度の固形、液状もしくはガス状の媒体（例えば、水）、ウォーターバス、インキュベーター、恒温器などに供したり、または、凍結した細胞を、凍結温度より高い温度の媒体（例えば、培養液）で浸漬することにより達成されるが、これに限定されない。解凍手段または浸漬媒体の温度は、細胞を所望の時間内に解凍できる温度であれば特に限定されないが、典型的には４〜５０℃、好ましくは３０℃〜４０℃、より好ましくは３６〜３８℃である。また、解凍時間は、解凍後の細胞の生存率や機能を大きく損なうものでなければ特に限定されないが、典型的には２分以内であり、特に２０秒以内とすることで生存率の低下を大幅に抑制することができる。解凍時間は、例えば、解凍手段または浸漬媒体の温度、凍結時の培養液または凍結保存液の容量もしくは組成などを変化させて調節することができる。解凍時間は、例えば、解凍手段または浸漬媒体の温度、凍結時の培養液または凍結保存液の容量もしくは組成などを変化させて調節することができる。凍結した細胞は、任意の手法により凍結させた細胞を含み、その非限定例としては、例えば、上記の細胞を凍結するステップにより凍結された細胞などが挙げられる。一態様において、凍結した細胞は、凍結保護剤の存在下で凍結された細胞である。一態様において、凍結した細胞は、本開示の製造方法に用いるためのものである。 
【００３９】
本発明の培養細胞を調製する方法は、洗浄ステップを含んでもよい。
細胞の洗浄は、既知の任意の手法により行うことができ、典型的には、例えば、細胞を洗浄液（例えば、血清や血清成分（血清アルブミンなど）を含むもしくは含まない、培養液（例えば、培地等）または生理緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ等）など）に懸濁し、遠心分離し、上清を廃棄し、沈殿した細胞を回収することにより達成されるが、これに限定されない。細胞を洗浄するステップにおいては、かかる懸濁、遠心分離、回収のサイクルを１回または複数回（例えば、２、３、４、５回など）行ってもよい。本開示の一態様において、細胞を洗浄するステップは、凍結した細胞を解凍するステップの直後、すなわち細胞集団を培養基材に播種するステップの前に行われる場合がある。 洗浄はさらにウシ等の動物由来血清を除去する目的で行われることがある。
本開示の製造方法は、さらに細胞を増殖させるステップをさらに含んでもよい。細胞を増殖させるステップは、既知の任意の手法で行ってもよく、当業者は各種細胞の増殖に適した培養条件に精通している。 
【００４０】
本発明において、解凍後に本細胞を用いてシート状細胞培養物を形成するステップをさらに含んでいてもよい。
播種した細胞のシート化は、既知の任意の手法および条件で行うことができる。かかる手法の非限定例は、例えば、特許文献１、ＷＯ ２０１４/１８５５１７などに記載されている。細胞のシート化は、細胞同士が接着分子や、細胞外マトリックスなどの細胞間接着機構を介して互いに接着することにより達成されると考えられている。したがって、播種した細胞のシート化は、例えば、細胞を、細胞間接着を形成する条件下で培養することにより達成することができる。かかる条件は、細胞間接着を形成することができればいかなるものであってもよいが、通常は一般的な細胞培養条件と同様の条件であれば細胞間接着を形成することができる。かかる条件としては、例えば、約３７℃、５％ＣＯ２での培養が挙げられる。また、培養は通常の圧力下（大気圧下、非加圧下）で行うことができる。培養は任意の大きさおよび形状の容器で行うことができる。シート状細胞培養物の大きさや形状は、培養容器の細胞付着面の大きさ・形状を調整すること、または、培養容器の細胞付着面に、所望の大きさ・形状の型枠を設置し、その内部で細胞を培養することなどにより任意に調節することができる。本明細書において、播種した細胞をシート化するための培養を、「シート化培養」と称することもある。シート化培養により、培養基材上（培養容器内）のシート状細胞培養物の厚みは減少する。すなわち、播種後、細胞が沈降した後、その後のシート化により培養基材上で細胞層の厚みは減少するが、シート状細胞培養物は培養基材からの剥離により収縮し、再び厚みを増す。シート化による厚みの減少は、播種直後の細胞層の厚みを１００％とすると、約９０％〜約７０％程度である。
【００４１】
シート化のためのインキュベート時間は、シートが形成され得る時間であれば特に限定されない。シートが形成され得る時間は、播種された細胞集団に含有される細胞の種類（特にシート形成細胞の種類）や細胞の状態により変化し得るが、例えばシート形成細胞として骨格筋芽細胞を含む細胞集団を播種した場合、２時間程度でシートが形成され得る。したがって一態様において、シート化のためのインキュベート時間は、２時間以上であり得る。
【００４２】
上述のとおり本発明者らは、シート状細胞培養物が形成された後、形成されたシート状細胞培養物が自然に培養基材から剥離する前に人為的に剥離することにより、剥離後遊離したシート状細胞培養物に癒着防止の処理を施すことで、製造されたシート状細胞培養物を高品質に保つことが可能であることを見出したものである。したがってシート化のためのインキュベートは、シート状細胞培養物が自然剥離されるより前に終了される。インキュベート開始から自然剥離が開始されるまでの時間は、播種された細胞集団に含有される細胞の種類（特にシート形成細胞の種類）や細胞の状態により変化し得るが、例えばシート形成細胞として骨格筋芽細胞を含む細胞集団を播種した場合、６〜１２時間程度で自然剥離が生じる場合が多い。したがって本開示の一態様において、シート化のためのインキュベート時間の上限は１２時間、１１．５時間、１１時間、１０時間、９時間、８時間、７時間、６時間、５時間または４時間であり得る。
【００４３】
したがって本開示の製造方法において、シート化のためのインキュベート時間は、２〜１２時間、２〜１１．５時間、２〜１１時間、２〜１０時間、２〜９時間、２〜８時間、２〜７時間、２〜６時間、２〜５時間または２〜４時間であり得る。
【００４４】
培養に用いる細胞培養液（単に「培養液」もしくは「培地」と称することもある）は、細胞の生存を維持できるものであれば特に限定されないが、典型的には、アミノ酸、ビタミン類、電解質を主成分としたものが利用できる。本開示の一態様において、培養液は、細胞培養用の基礎培地をベースにしたものである。かかる基礎培地には、限定されずに、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７などが含まれる。これらの基礎培地の多くは市販されており、その組成も公知となっている。
基礎培地は、標準的な組成のまま（例えば、市販されたままの状態で）用いてもよいし、細胞種や細胞条件に応じてその組成を適宜変更してもよい。したがって、本開示に用いる基礎培地は、公知の組成のものに限定されず、１または２以上の成分が追加、除去、増量もしくは減量されたものを含む。
【００４５】
基礎培地に含まれるアミノ酸としては、限定されずに、例えば、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリンなどが、ビタミン類としては、限定されずに、例えば、Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、リボフラビン、チアミン、ピリドキシン、ビオチン、リポ酸、ビタミンＢ１２、アデニン、チミジンなどが、そして、電解質としては、限定されずに、例えば、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＦｅＳＯ４、ＣｕＳＯ４、ＭｎＳＯ４、Ｎａ２ＳｉＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４、ＮａＶＯ３、ＮｉＣｌ２、ＺｎＳＯ４などがそれぞれ含まれる。基礎培地には、これらの成分のほか、Ｄ−グルコースなどの糖類、ピルビン酸ナトリウム、フェノールレッドなどのｐＨ指示薬、プトレシンなどを含んでもよい。
【００４６】
本開示の一態様において、基礎培地に含まれるアミノ酸の濃度は、Ｌ−アルギニン：約６３．２ｍｇ／Ｌ〜約８４ｍｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン：約３５ｍｇ／Ｌ〜約６３ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン：約４．４ｍｇ／Ｌ〜約５８４ｍｇ／Ｌ、グリシン：約２．３ｍｇ／Ｌ〜約３０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン：約４２ｍｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン：約６６ｍｇ／Ｌ〜約１０５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン：約１０５ｍｇ／Ｌ〜約１３１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−リジン：約１４６ｍｇ／Ｌ〜約１８２ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン：約１５ｍｇ／Ｌ〜約３０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン：約３３ｍｇ／Ｌ〜約６６ｍｇ／Ｌ、Ｌ−セリン：約３２ｍｇ／Ｌ〜約４２ｍｇ／Ｌ、Ｌ−トレオニン：約１２ｍｇ／Ｌ〜約９５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン：約４．１ｍｇ／Ｌ〜約１６ｍｇ／Ｌ、Ｌ−チロシン：約１８．１ｍｇ／Ｌ〜約１０４ｍｇ／Ｌ、Ｌ−バリン：約９４ｍｇ／Ｌ〜約１１７ｍｇ／Ｌである。
また、本開示の一態様において、基礎培地に含まれるビタミン剤の濃度は、Ｄ−パントテン酸カルシウム：約４ｍｇ／Ｌ〜約１２ｍｇ／Ｌ、塩化コリン：約４ｍｇ／Ｌ〜約１４ｍｇ／Ｌ、葉酸：約０．６ｍｇ／Ｌ〜約４ｍｇ／Ｌ、ｉ−イノシトール：約７．２ｍｇ／Ｌ、ナイアシンアミド：約４ｍｇ／Ｌ〜約６．１ｍｇ／Ｌ、リボフラビン：約０．００３８ｍｇ／Ｌ〜約０．４ｍｇ／Ｌ、チアミン：約３．４ｍｇ／Ｌ〜約４ｍｇ／Ｌ、ピリドキシン：約２．１ｍｇ／Ｌ〜約４ｍｇ／Ｌである。
【００４７】
細胞培養液は、上記のほか、血清、成長因子、ステロイド剤成分、セレン成分などの１種または２種以上の添加物を含んでもよい。しかし、これらの成分が自己由来のものではない場合は、臨床においてはレシピエントに対するアナフィラキシーショック等の副作用要因となり得ることが否定できない製造工程由来不純物となり得るため、臨床への適用にあたってはかかる非自己由来成分を排除することが望ましい場合がある。したがって、本開示の好ましい態様において、細胞培養液は、これらの非自己由来の添加物の少なくとも１種の有効量を含まない。また、本開示のより好ましい態様において、細胞培養液は、これらの非自己由来の添加物の少なくとも１種を実質的に含まない。さらに、本開示の特に好ましい態様において、細胞培養液は、非自己由来の添加物を実質的に含まない。一態様において、細胞培養液は、基礎培地のみを含んでもよい。
【００４８】
本開示の一態様において、細胞培養液は血清を実質的に含まない。血清を実質的に含まない細胞培養液のことを、本明細書中で「無血清培地」と呼ぶこともある。ここで、「血清を実質的に含まない」とは、培養液における血清の含量が、シート状細胞培養物を生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度（例えば、シート状細胞培養物中の血清アルブミン含量が約５０ｎｇ未満となる量）であること、好ましくは、培養液にこれらの物質を積極的に添加しないことを意味する。本開示においては、移植時の副作用を回避するために、細胞培養液は異種血清を実質的に含まないことが好ましく、非自己血清を実質的に含まないことがさらに好ましい。
【００４９】
本開示の一態様において、細胞培養液は血清を含む。血清は、同種血清であっても異種血清であってもよい。特定の態様において、細胞培養液は自己血清を含む。血清でコートされた培養基材上で細胞を培養する場合、細胞培養液に含まれる血清（細胞の培養に用いる血清）は、培養基材をコートするために用いる血清と同じであっても異なってもよい。一態様において、細胞培養液に含まれる血清は、培養基材をコートするために用いる血清と同一であり、特定の態様において、該血清は自己血清である。血清は、本開示の製造方法に用いるためのものであってもよい。例えば、血清は、細胞の培養に用いるためのものであっても、培養基材をコートするためのものであってもよい。
【００５０】
本開示の一態様において、細胞培養液は有効量の成長因子を含まない。ここで、「有効量の成長因子」とは、細胞の増殖を、成長因子がない場合に比べて、有意に促進する成長因子の量、または、便宜的に、当該技術分野において細胞の増殖を目的として通常添加する量を意味する。細胞増殖促進の有意性は、例えば、当該技術分野で知られた任意の統計学的手法、例えば、ｔ検定などにより適宜評価することができ、また、通常の添加量は当該技術分野の種々の公知文献から知ることができる。具体的には、細胞培養におけるＥＧＦの有効量は、例えば約０．００５μｇ／ｍＬ以上である。
【００５１】
したがって、「有効量の成長因子を含まない」とは、本開示における培養液における成長因子の濃度がかかる有効量未満であることを意味する。例えば、細胞培養におけるＥＧＦの培養液中の濃度は、好ましくは約０．００５μｇ／ｍＬ未満、より好ましくは約０．００１μｇ／ｍＬ未満である。本開示の好ましい態様においては、培養液における成長因子の濃度は、生体における通常の濃度未満である。かかる態様においては、例えば、細胞培養におけるＥＧＦの培養液中の濃度は、好ましくは約５．５ｎｇ／ｍＬ未満、より好ましくは約１．３ｎｇ／ｍＬ未満、さらに好ましくは、約０．５ｎｇ／ｍＬ未満である。さらに好ましい態様において、本開示における培養液は、成長因子を実質的に含まない。ここで、実質的に含まないとは、培養液中の成長因子の含量が、シート状細胞培養物を生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度であること、好ましくは、培養液に成長因子を積極的に添加しないことを意味する。したがって、この態様においては、培養液は、その中の他の成分、例えば血清などに含まれる以上の濃度の成長因子を含まない。
【００５２】
本開示の一態様において、細胞培養液は、ステロイド剤成分を実質的に含まない。ここで「ステロイド剤成分」は、ステロイド核を有する化合物のうち、生体に、副腎皮質機能不全、クッシング症候群などの悪影響を及ぼし得るものをいう。かかる化合物としては、限定されずに、例えば、コルチゾール、プレドニゾロン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン等が含まれる。したがって、「ステロイド剤成分を実質的に含まない」とは、培養液におけるこれらの化合物の含量が、シート状細胞培養物を生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度であること、好ましくは、培養液にこれらの化合物を積極的に添加しないこと、すなわち、培養液が、その中の他の成分、例えば血清などに含まれる以上の濃度のステロイド剤成分を含まないことを意味する。
【００５３】
本開示の一態様において、細胞培養液は、セレン成分を実質的に含まない。ここで「セレン成分」は、セレン分子、およびセレン含有化合物、特に、生体内でセレン分子を遊離し得るセレン含有化合物、例えば、亜セレン酸などを含む。したがって、「セレン成分を実質的に含まない」とは、培養液におけるこれらの物質の含量が、シート状細胞培養物を生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度であること、好ましくは、培養液にこれらの物質を積極的に添加しないこと、すなわち、培養液が、その中の他の成分、例えば血清などに含まれる以上の濃度のセレン成分を含まないことを意味する。具体的には、例えば、ヒトの場合、培養液中のセレン濃度は、ヒト血清中の正常値（例えば、１０．６μｇ／ｄＬ〜１７．４μｇ／ｄＬ）に、培地中に含まれるヒト血清の割合を乗じた値よりも低い（すなわち、ヒト血清の含量が約１０％であれば、セレン濃度は、例えば、約１．０μｇ／ｄＬ〜約１．７μｇ／ｄＬ未満である）。
【００５４】
本開示の上記好ましい態様においては、生体に適用する細胞培養物を作製する場合に従来必要であった、成長因子、ステロイド剤成分、異種血清成分などの製造工程由来不純物を、洗浄などにより除去するステップが不要となる。したがって、本開示の方法の一態様は、この製造工程由来不純物を除去するステップを含まない。
【００５５】
ここで、「製造工程由来不純物」とは、典型的には、製造各工程に由来する以下に列挙するものが含まれる。すなわち、細胞基材に由来するもの（例えば、宿主細胞由来タンパク質、宿主細胞由来ＤＮＡ）、細胞培養液に由来するもの（例えば、インデューサー、抗生物質、培地成分）、あるいは細胞培養以降の工程である目的物質の抽出、分離、加工、精製工程に由来するものなどである（例えば、医薬審発第５７１号参照）。
本発明において、該細胞懸濁液はウシ胎児血清等の動物由来血清等を含まない場合がある。このような該細胞懸濁液は、該細胞がヒトに用いられる場合、ウシ胎児血清等の動物由来血清等の夾雑物からのヒト感染性のウィルス混入リスクを低減することができる。
【００５６】
本発明の培養細胞が用いられる疾病、傷病等は特に限定されないが、例えば処置の対象となる組織としては、限定されずに、例えば、心筋、角膜、網膜、食道、皮膚、関節、軟骨、肝臓、膵臓、歯肉、腎臓、甲状腺、骨格筋、中耳などが挙げられる。また、処置の対象となる疾患としては、限定されずに、例えば、心疾患（例えば、心筋傷害（心筋梗塞、心外傷）、心筋症など）、角膜疾患（例えば、角膜上皮幹細胞疲弊症、角膜損傷（熱・化学腐食）、角膜潰瘍、角膜混濁、角膜穿孔、角膜瘢痕、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼類天疱瘡など）、網膜疾患（例えば、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症など）、食道疾患（例えば、食道手術（食道ガン除去）後の食道の炎症・狭窄の予防など）、皮膚疾患（例えば、皮膚損傷（外傷、熱傷）など）、関節疾患（例えば、変形性関節炎など）、軟骨疾患（例えば、軟骨の損傷など）、肝疾患（例えば、慢性肝疾患など）、膵臓疾患（例えば、糖尿病など）、歯科疾患（例えば、歯周病など）、腎臓疾患（例えば、腎不全、腎性貧血、腎性骨異栄養症など）、甲状腺疾患（例えば、甲状腺機能低下症など）、筋疾患（例えば、筋損傷、筋炎など）、中耳疾患（例えば、中耳炎など）が挙げられる。
【００５７】
本発明の用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、組織の異常に関連する疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、当該疾患発症の予防または再発の防止などを含む、医学的および獣医学的に許容される種々の目的の介入を包含する。
【００５８】
本発明において、解凍後に本細胞を用いてシート状細胞培養物を製造する場合は、既知の任意の方法（例えば、特表２００７-５２８７５５号公報、特開２０１０−０８１８２９、特開２０１１−１１０３６８など参照）で製造することができる。
【実施例】
【００５９】
例１：予備冷却前の冷蔵保存が細胞に与える影響
（１）細胞懸濁液の調製
ヒト骨格筋芽細胞を１〜５×１０７cells/mLになるよう凍結保護剤を含む凍結保存液に懸濁し、凍結保存容器に１mLずつ分注した。
（２）冷蔵保存
あらかじめ２〜８℃に冷蔵した凍結処理容器（ＢＩＣＥＬＬ）に凍結保存容器を格納し、一定時間２〜８℃で冷蔵した。
（３）予備冷却
凍結保存容器を含む凍結処理容器を２〜８℃で３０〜６０分間冷却した。
（４）凍結保存
細胞保存容器を含む細胞処理容器を−８０℃設定のフリーザーに入れ、細胞を凍結した。
（５）融解
凍結保存した細胞を融解し、血球計算盤を用いて細胞数を計数し、バイオアビリティ、回収生細胞数、および回収全細胞数と冷蔵時間との関係を比較した。
【００６０】
その結果、細胞懸濁液を保存液に置換後、予備冷却開始までの冷蔵時間を６０分以内に限定することで、凍結保存細胞融解後のバイアビリティおよび回収生細胞率低下を抑制できることを確認した（図１）。
【００６１】
例２：冷蔵保存の温度の違いが細胞へ与える影響
予備冷却前の冷蔵保存を室温保存とした以外は例１と同様の条件で細胞を凍結した。凍結した細胞を融解し、血球計算盤を用いて細胞数を計数し、バイアビリティ、回収生細胞数、生細胞回収率を例１の結果と比較した。
その結果、バイアビリティ、回収生細胞数、生細胞回収率とも、予備冷却前に冷蔵保存した方が、室温保存した場合に比べて、良好な結果が得られた（図２）。
【００６２】
【表１】
2019154359.tif 000003
【００６３】
【表２】
2019154359.tif 000004
【００６４】
例３：予備冷却が細胞へ与える影響の検討
ヒト骨格筋芽細胞を１〜５×１０７ｃｅｌｌｓ/ｍＬになるよう凍結保護剤を含む凍結保存液に懸濁し、凍結保存容器６本に０．６ｍＬずつ分注した。分注後、３本については凍結処理容器（ＢＩＣＥＬＬ）に入れ、そのまま−８０℃設定のフリーザーで６時間冷却した後、液体窒素下で１時間凍結保存を行った。
【００６５】
残り３本については、分注後、冷却遠心機を０℃に設定し、１時間のインキュベーションを行った。その後、−８０℃設定のフリーザーで６時間冷却した後、液体窒素下で１時間凍結保存を行った。
その結果、表３に示す通り、凍結保存の前に予備冷却ステップを行うことで、バイアビリティおよび生細胞回収率の改善が見られた。
【００６６】
【表３】
2019154359.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の方法によって調整された細胞は、凍結融解後であっても生存率や機能を損なわないため、医療用途等に非常に有用である。
【図１】
2019154359.tif 000006
【図２】
2019154359.tif 000007