(57)【要約】      （修正有）【課題】癌およびCNSの疾患の将来の発症のための早期マーカー、ならびにこれらの疾患の治療および予防のための標的としてのHCBI、MSBI、MSSIおよびCMI配列を提供すること。【解決手段】MSBI1.176またはMSBI2.176ポリ核酸の一部を含むオリゴヌクレオチドプライマー、及びオリゴヌクレオチドプローブであって、ヌクレオチド配列を含む特定の単離物の核酸を特異的に配列決定または特異的に増幅するためのプライマー、及びプローブ配列。更に、該MSBI1.176またはMSBI2.176ポリ核酸含有発現ベクターを含む宿主細胞、該宿主細胞により生産された抗体の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)図1(c)もしくは1(d)に示されるヌクレオチド配列；
(b) (a)のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列；または
(c)上述のヌクレオチド配列のいずれかと比較して、遺伝子コードの縮重の結果重複するヌクレオチド配列
を含む、MSBI1.176またはMSBI2.176ポリ核酸。
【請求項２】
請求項１記載のMSBI1.176またはMSBI2.176ポリ核酸の一部を含むオリゴヌクレオチドプライマーであって、請求項１に規定されるヌクレオチド配列を含む特定の単離物の核酸を特異的に配列決定または特異的に増幅するためのプライマーとして作用し得る、プライマー。
【請求項３】
請求項１記載のMSBI1.176またはMSBI2.176ポリ核酸の一部を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、請求項１に規定されるヌクレオチド配列を含む特定の単離物の核酸の特異的検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして作用し得る、プローブ。
【請求項４】
原核生物、真核生物またはウイルスの転写調節因子および翻訳調節因子に操作可能に連結される、請求項１〜３いずれか記載のMSBI1.176またはMSBI2.176ポリ核酸を含む、発現ベクター。
【請求項５】
請求項４記載の発現ベクターで形質転換または改変される宿主細胞。
【請求項６】
請求項１記載のMSBI1.176またはMSBI2.176ポリ核酸によりコードされるポリペプチド。
【請求項７】
請求項６記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
(a)任意に試料ポリ核酸を抽出する工程、(b)少なくとも1つの請求項２記載のプライマー、任意に標識されたプライマーを用いて上述のポリ核酸を増幅する工程、および(c)増幅されたポリ核酸を検出する工程を含む、生物学的試料中の請求項１記載のMSBI1.176またはMSBI2.176ポリ核酸の検出のための方法。
【請求項９】
(a)任意に試料ポリ核酸を抽出する工程、(b)上述のポリ核酸と、少なくとも1つの請求項３記載のプローブ、任意に、標識されたプローブをハイブリダイズさせる工程、および(c)ハイブリダイズさせたポリ核酸を検出する工程を含む、生物学的試料中の請求項１記載のMSBI1.176またはMSBI2.176ポリ核酸の検出のための方法。
【請求項１０】
(a)請求項６記載のポリペプチドまたは請求項７記載の抗体の存在および/または濃度について生物学的試料を接触させる工程、ならびに(b)前記抗体および/または前記ポリペプチドの間に形成される免疫学的複合体を検出する工程を含む、生物学的試料中に存在する請求項６記載のポリペプチドまたは請求項７記載の抗体を検出するための方法。
【請求項１１】
請求項１記載のMSBI1.176またはMSBI2.176ポリ核酸の発現を低減または阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、あるいは前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１２】
請求項７記載の抗体もしくはその抗原結合断片または請求項１１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、および適切な医薬担体を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HCBI(健常畜牛血液単離物(Healthy Cattle Blood Isolate))、MSBI(多発性硬化症脳単離物(Multiple Sclerosis Brain Isolate))、MSSI(多発性硬化症血清単離物(Multiple Sclerosis Serum Isolate))およびCMI(牛乳単離物(Cow Milk Isolate))ヌクレオチド配列、ならびに前記ヌクレオチド配列の一部を含むプローブおよびプライマー、ならびに前記ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対する抗体に関する。最終的に、本発明は、癌およびCNSの疾患などの疾患の将来の発症のための早期マーカーならびにこれらの疾患の治療および予防のための標的としての前記化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
最近10年間に行われたいくつかの疫学的分析により、異なる方法で加工された「赤身」肉(燻製または風乾された肉、および生で、半調理済みで、または焼いて消費されるソーセージの成分としての肉を含む)の長期間の消費は、結腸癌のリスク因子であるとみなされ得るということが示されている(World Cancer Report 2007, zur Hausen 2012)。「白身」肉(鳥肉/魚)とは対照的に、「赤身」肉は、牛肉、豚肉、マトン、ラムおよびヤギ肉を含むとみなされる。
【０００３】
これまで、ロースト、グリル、バーベキュー、燻製および風乾の際に生じる化学的発癌性物質は、癌のリスク因子にされていた。しかしながら、鳥肉/魚の料理の別の方法の際にも化学的発癌性物質が同等の濃度で産生されるという事実はしばしば無視されていた。したがって、このことは、直腸癌の発症に関してこれらの化学物質が排他的な役割を担うという仮定を支持するものではない。また、現在の疫学的分析では、牛肉が主要なリスク因子であることが示唆されるので、さらなる種特異的な、推定で感染性の因子が、この種類の癌の誘発に寄与していると仮定されている(zur Hausen, 2012)。家畜化されたウシの品種の世界的な広がりの分析と、結腸癌の世界的な発病率の相関の結果は、コブウシ、スイギュウまたはヤクの系統ではなく、欧州/アジアの畜牛(Bos taurus)に由来するウシの品種の肉の消費が、主要なリスク因子として重要であり得ることを示唆すると思われる(zur Hausen, 2015)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Int J Cancer 2012; 130:2475-2483
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そのため、本発明にある技術的な課題は、癌またはCNSの疾患などの疾患に関連し得る特定のヌクレオチド配列を同定することであり、診断および治療のための手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の簡単な説明
前記技術的な課題の解決は、特許請求の範囲において特徴付けられる態様を提供することにより達成される。
【０００７】
本発明を生じる実験の間に、血清中の存在も「赤身」肉における感染性因子の存在を示すという仮定から始まり、感染性因子について畜牛の血清をスクリーニングした。健常なウシ由来の血清をスクリーニングし、新規のウイルス性核酸成分を単離し得た。これらの成分のいくつかのDNA配列およびオープンリーディングフレームは、ヒツジ、畜牛およびヒトの伝染性海面状脳障害(TSE)、TSE疾患について既に記載された2つの配列と、見覚えのある関係を示した。
【０００８】
TSE単離物は、癌誘導において重要な役割を果たすことも疑われており(Manuelidis, 2011)、そのため、記載されるウイルス配列が、癌、具体的に結腸癌および乳癌、さらにホジキン病および他の疾患、ならびにCNSの疾患(多発性硬化症MS、筋萎縮性側索硬化症、伝染性海綿状脳症/プリオン関連疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病)などの疾患の発症に関連し得ることを推定することが妥当である。
【０００９】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕(a)図1(c)もしくは1(d)に示されるヌクレオチド配列；
(b) (a)のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列；または
(c)上述のヌクレオチド配列のいずれかと比較して、遺伝子コードの縮重の結果重複するヌクレオチド配列
を含む、MSBI1.176またはMSBI2.176ポリ核酸、
〔２〕〔１〕記載のMSBI1.176またはMSBI2.176ポリ核酸の一部を含むオリゴヌクレオチドプライマーであって、〔１〕に規定されるヌクレオチド配列を含む特定の単離物の核酸を特異的に配列決定または特異的に増幅するためのプライマーとして作用し得る、プライマー、
〔３〕〔１〕記載のMSBI1.176またはMSBI2.176ポリ核酸の一部を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、〔１〕に規定されるヌクレオチド配列を含む特定の単離物の核酸の特異的検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして作用し得る、プローブ、
〔４〕原核生物、真核生物またはウイルスの転写調節因子および翻訳調節因子に操作可能に連結される、〔１〕〜〔３〕いずれか記載のMSBI1.176またはMSBI2.176ポリ核酸を含む、発現ベクター、
〔５〕〔４〕記載の発現ベクターで形質転換または改変される宿主細胞、
〔６〕〔１〕記載のMSBI1.176またはMSBI2.176ポリ核酸によりコードされるポリペプチド、
〔７〕〔６〕記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、
〔８〕(a)任意に試料ポリ核酸を抽出する工程、(b)少なくとも1つの〔２〕記載のプライマー、任意に標識されたプライマーを用いて上述のポリ核酸を増幅する工程、および(c)増幅されたポリ核酸を検出する工程を含む、生物学的試料中の〔１〕記載のMSBI1.176またはMSBI2.176ポリ核酸の検出のための方法、
〔９〕(a)任意に試料ポリ核酸を抽出する工程、(b)上述のポリ核酸と、少なくとも1つの〔３〕記載のプローブ、任意に、標識されたプローブをハイブリダイズさせる工程、および(c)ハイブリダイズさせたポリ核酸を検出する工程を含む、生物学的試料中の〔１〕記載のMSBI1.176またはMSBI2.176ポリ核酸の検出のための方法、
〔１０〕(a)〔６〕記載のポリペプチドまたは〔７〕記載の抗体の存在および/または濃度について生物学的試料を接触させる工程、ならびに(b)前記抗体および/または前記ポリペプチドの間に形成される免疫学的複合体を検出する工程を含む、生物学的試料中に存在する〔６〕記載のポリペプチドまたは〔７〕記載の抗体を検出するための方法、
〔１１〕〔１〕記載のMSBI1.176またはMSBI2.176ポリ核酸の発現を低減または阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、あるいは前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むベクター、
〔１２〕〔７〕記載の抗体もしくはその抗原結合断片または〔１１〕記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、および適切な医薬担体を含む、医薬組成物
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、癌およびCNSの疾患の将来の発症のための早期マーカー、ならびにこれらの疾患の治療および予防のための標的としてのHCBI、MSBI、MSSIおよびCMI配列が提供され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
図1〜4についての略語：Rep=複製タンパク質；CP=カプシドタンパク質
CMI：牛乳単離物
HCBI：健常畜牛血液単離物
MSCI：MS脳単離物
MSSI：MS血清単離物
Sphinx：可変(X)潜在物の遅延進行型隠れ感染(slow progressive hidden infection of variable (X) latency)
【図１】群1-ウシ血清、牛乳および多発性硬化症(MS)脳試料(死後)からの単離物-全てはSphinx1.76と関連する  (a) HCBI6.252 (2522bp)(健常畜牛血液単離物；CMI1.252(牛乳単離物)と同一)。  (b) HCBI6.159 (1591bp)：HCBI6.252の欠失は見かけ上HCBI6.159を生じた-両方は、バック 対 バックプライマー、すなわち環状DNAであり人工物ではない、を使用してウシ血清から独立して回収(rescued)された。このことは、これらの感染性生物が2つの形態-互いに関連するかまたは相補的である大および小分子を有することを示し得た。  (c) MSBI1.176(多発性硬化症脳単離物)(1766bp)-Sphinx1.76と98%類似  (d) MSBI2.176(1766bp)-MSB1.176と同じMS脳試料から単離された  (e) CMI1.252 (2523bp)(牛乳単離物；HCBI6.252と同一)  (f) CMI2.214 (2148bp)  (g) CMI3.168 (1687bp)  (h) CMI4.158 (1583bp)  該単離物は全てSphinx1.76の複製遺伝子に対して設計されたバック 対 バックプライマーを使用して生成された。プライマー(いくつかの単離物は両方のプライマーペアを独立して適用することで2回単離された)。Nn(フォワードGGATTAATGCCAATGATCC)、Xn(リバースCTTTGCCTGTTTCTCTCG)、および/またはNo(フォワードGAGGACGAATTAATATTACAAGTC)、Xo(リバースGTTCTCGTTTTCTTGGTAA)
【図２】群2：Sphinx2.36と関連する単離物HCBI7.228(2280bp)(健常畜牛血液単離物)。この試料は、バック 対 バックプライマーを使用してウシ血清からPCRにより生成された  プライマー：Nd(フォワードCAGATTGCAAAGCCTGTAATTCAT)、Xd(リバースCTAAGGCAGATCAACACAGGGATA)
【図３】群3：ウシ血清および多発性硬化症血清およびMS脳試料(死後)由来の単離物-公知のssDNAウイルスと遠く関連する  (a) HCBI8.215(2152bp)および(b) HCBI9.212(2121bp)(健常畜牛血液単離物)ならびに(c) MSSI2.225(2259bp)(多発性硬化症血清単離物)のヌクレオチド配列。MSSI2.225と同一の配列(MSBI3.224)もMS脳試料から単離した。これらのHCBI単離物を以下のように生成した：Optiprep勾配遠心分離で血清試料を超遠心分離に供した。勾配を分画し、画分からDNAを抽出し、ローリングサークル増幅に供した。生成物をBamHIまたはEcoRI酵素で消化した。生成物をクローニングして配列決定した。それぞれの勾配クローンに対して設計したバック 対 バックプライマーを用いて元のDNA試料の増幅により完全なゲノムを得た。完全なゲノムは全体で配列決定した。MSSI単離物(およびMS脳由来のクローンMSBI3.224)を得て、MS血清およびMS脳から抽出したDNAのローリングサークル増幅後、制限酵素消化、生成物のクローニングおよびその後、配列決定を行った。元のクローンに対して設計されたバック 対 バックプライマーを用いた増幅により完全なゲノムを得た。完全なゲノムは全体で配列決定した。
【図４】群4-サイクロバクター種プラスミドと遠く関連する：MSSI1.162および推定オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列。MS-血清単離物MSSI1.162(群4)は、複数のMS血清試料のローリングサークル増幅により生成した。生成物を制限酵素HindIIIで消化してクローニングし、配列決定した。
【図５】単離物の4つの群のゲノム組織化(organisation)。単離物は、Sphinx1.76ゲノム(群1)、Sphinx2.36(群2)、myco様ゲミサーキュラーウイルスes(群3)およびサイクロバクター種プラスミド(群4)に対するそれらの配列類似性に従ってグループ分けした。  (A) 群1  (B) 群2、3および4
【図６】8個の単離物とSphinx1.76の間の複製遺伝子/iteron様反復領域の整列
【図７】ヘルペス型ゲノムおよびBMF(bovine milk factor)因子を有する異なる種類の脳細胞の潜在的感染の模式的概略
【図８】ヘルペスおよびBMF DNAを同時に感染させた細胞におけるヘルペスDNAの自発的再活性化。BMFの増幅およびヘルペスDNA複製の阻害。
【図９】免疫系による外来抗原の認識、T細胞応答の模式的概略
【図１０】早期病変における小血管の周囲の単核炎症性細胞。リンパ球、単核球、血漿細胞および場合によってマクロファージ。
【図１１】左、病変(プラーク)、右、正常白質の年齢進行。病変(矢印)および間期にマクロファージが存在する。
【図１２】多発性硬化症の病因概念の模式的概略。ヘルペス型ウイルスの役割のための例としてEBVを使用する。
【図１３】MS病因の試験的模式図
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の詳細な説明
本出願において、多発性硬化症および癌の病因についての新規の概念が提示される：ウイルスの増殖と牛乳(または血清)因子(Bovine Milk (or serum) Factor)(BMF)の増幅されたDNAの相互作用
【００１３】
序論
多発性硬化症(MS)の発病率は、世界のいくつかの部分で増加している(Kurtzke, 2000, Alcalde-Cabero et al., 2013に概説)。この増加は主に、環境要因による。高リスク領域から低リスク領域への移住者は、移住時に少なくとも15歳である場合にのみ、出生地のMSリスクを保持し、しばしば早期幼少期に獲得した感染のためであると解釈される(Kurtzke, 2000に概説)。症例および地理的疫学の集合も広く議論されている：MSの発病率の増加は、都市化に関連して、女性において注目された(Kotzamani et al., 2012)。
【００１４】
脱髄は、MS病変の独特の特徴である。ミエリンタンパク質消失、プラークの位置および拡大、希突起膠細胞崩壊のパターン、ならびに補体活性化の免疫病理学的証拠に基づいて定義される4つの根本的に異なる脱髄のパターンが発見された(Lucchinetti et al., 2000, Metz et al., 2014)。疾患の所定の時点で、脱髄のパターンは患者間で不均一であったが、同じ患者由来の複数の活性病変内では均一であり、異なる寄与因子の可能性が指摘された。
【００１５】
リスク因子の2つは特に注意すべきものであると思われる：比較的一定の結果は、異なる主なヘルペス群ウイルス、および潜在的に他の乳製品を含む新鮮な牛乳の消費の可能性のある役割を示す(下記参照)。また、ビタミンD不足もリスク因子としての役割を担う。
【００１６】
-ウイルス性リスク因子
明らかに全てのヘルペスウイルス型は、以下の議論に関連のあると思われる2つの特性を共有する：
潜伏期におけるウイルスの残存の間に、部分的に特異的な遺伝子機能により調節され、部分的には後生的な機構によっても調節される自発的な再活性化が起こり得る(Nicoll et al., 2012, Grinde, 2013に概説)。再活性化はまた、トランスホーミング増殖因子βなどの細胞外サイトカインとの相互作用によっても誘発され得る。
【００１７】
病原性ヘルペスウイルス型を有する事実上全てのヒトについて、溶解サイクルの自発的な誘導が観察された。EBV陽性バーキットリンパ腫および鼻咽腔癌におけるエプスタイン-バールウイルス構造タンパク質に対する高抗体力価(Henle, W. and Henle, G., 1977に概説)は、本明細書において一例となり得る。ヒトヘルペスウイルス6型、水痘-帯状疱疹ウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびその他のものの再活性化はまれな事象ではなく、いくつかの異なる細胞型に影響を及ぼし得る(Hu Knox et al. , 2000)。
【００１８】
ヘルペスウイルス感染の第2の顕著な特徴は、潜伏期において種々の二本鎖または一本鎖小DNAを含む細胞の感染時に、種々の二本鎖または一本鎖小DNAウイルスゲノムの増幅を示すことである。これは、ヒトおよびサルポリオーマウイルス、JCおよびSV40、ヒトおよびウシパピローマウイルス、ならびに一本鎖アデノ随伴(AAV)およびAnello-/TT-ウイルスについて注目されている(Schlehofer and zur Hausen, 1990, Heilbronn et al., 1993, Borkosky et al., 2012)。これらの試験に使用されるヘルペス群ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、ヒトサイトメガロウイルスおよびエプスタイン-バールウイルスであった。潜伏期小ウイルスDNAゲノムの増幅を誘導する能力は、アデノ-およびワクシニアウイルスにも共有される(Schlehofer and zur Hausen, 1990)。パルボウイルスのヘルペス-およびアデノウイルス誘導増幅の補助的な効果は、アデノ随伴ウイルスについて集中的に試験された。後者の複製は、この補助的な効果に依存すると思われるが、小ウイルスDNAの優先的な増幅のためにヘルペスまたはアデノウイルス複製の減少をもたらす(Schlehofer et al., 1983, Matz et al., 1984, Bantel-Schaal and zur Hausen, 1988, Schmitt et al., 1989, Schlehofer and zur Hausen, 1990, Heilbronn et al., 1990a, Heilbronn et al., 1990b)。
【００１９】
ヘルペス群ウイルスの自発的誘導および潜在的な小ウイルスDNAの増幅は、MS発症の下にある機構のその後の仮定の基礎を形成する。
【００２０】
-牛乳因子(Bovine milk factor)
いくつかの報告により、非低温殺菌牛乳の消費とMS発症の関連が記されたが(Murray TJ. 1976, Sepcic et al., 1993, Malosse and Perron, 1993)、他のものでは、特に人生の早期に消費する場合、リスク因子としての牛乳の長期間の消費が強調された(Agranoff and Goldberg, 1974, Christensen, 1975, Warren, 1984, Butcher, 1976, 1986, Winer et al., 2001, Munger et al., 2011a)。
【００２１】
牛乳中にMS発症のリスクを増加させる特異的な因子が存在する場合、あるものは長期間の母乳養育の保護的な役割を予想し得る。長期間の母乳養育期(6か月以上の間)は、MS発症について保護的な効果を有することが実際に繰り返し報告されている(Christensen , 1975, Warren, 1984, Tarrats et al., 2002, Conradi et al., 2013)。牛乳因子の存在は、MSの発症についての特定の遺伝的素因も除外していない。MSについての単一遺伝子による素因は、BRCA1の付近への染色体局在化において報告されている(Holzmann et al., 2013)。
【００２２】
-ビタミンD不足
MSの開始についてビタミンD不足の役割が繰り返し示唆されている(Ascherio et al. 2012, 2013に概説)。
【００２３】
ビタミンD不足とエプスタイン-バールウイルス再活性化の説得力のある関係は、トランスホーミング増殖因子β(TGF-β)によるEBV再活性における初期の研究に由来する。血清因子、精製され標識されたエプスタイン-バールウイルス誘導因子(EIF)(Bauer et al., 1982)は、下記のTGF-β分子と同一であることが明らかにされた(Frolik et al., 1983, Bauer et al., 1991)。次いで、TGF-βは、活性化されたビタミンD受容体により負の方向に調節される(Isik et al., 2012, Ito et al., 2013, Zerr et al., 2014)。これは、MSおよび増悪の季節関連優先的開始を非常によく説明し得た。
【００２４】
低ビタミンDとEBV再活性化の関係はさらに、多発性硬化症の臨床的発現前の低ビタミンDとエプスタイン-バールウイルスに対する免疫反応性の増大の関連(Munger et al., 2011b, Decard et al., 2012)およびEBV陽性健常対照と比較したEBV陽性MS患者の高いEVC排出速度(Yea et al., 2013)を説明する研究によりさらに支持される。
【００２５】
したがって、CNSの疾患(例えばMS)および癌(例えば結腸癌および乳癌)の両方について、少なくとも2つの因子：ビタミンD不足、ならびに種々のヘルペス群ウイルス、主にエプスタイン-バールウイルス(EBV)、ヒトヘルペスウイルス6型、および水痘-帯状疱疹ウイルスの再活性化が潜在的病因論的寄与因子として示唆されている。本発明によると、本発明の畜牛血清および市販の乳製品由来のいくつかの新規の型の小環状一本鎖DNA、おそらくウイルス起源の同定は、統一の考えを示す。本発明者らは、本発明において、ヘルペス群ウイルスおよび小一本鎖または二本鎖DNAウイルスによる細胞の共感染により、部分的なヘルペスウイルスの阻害を有する小ウイルスDNAの実質的な増幅が生じることを説明している。日常的な畜牛血清および牛乳において同定される分子のいくつかは、プリオン関連脳病変において報告されるDNAとは遠く関係し、多発性硬化症を有する患者の2つの検視病変において発見された。ともに潜在的に残留するヘルペスウイルスゲノムの再活性化によるこれらの一本鎖DNA分子の増幅は、それらの増幅および罹患した脳細胞の破壊をもたらす局所的な免疫応答の誘起を生じ得た。このモデルは部分的に、多発性硬化症の南北の発病率の勾配を説明し得、ビタミンD不足およびヘルペスウイルス再活性化に関連すると思われる(図12および13参照)。
【００２６】
また、MS脳および血清由来の単離物の全長ゲノムを単離して、再環状化し、その後ヒト細胞株293TTにトランスフェクションした。3日目にトランスフェクションした細胞を回収し、miRNA Easy Kit (Qiagen)を使用して全RNAを抽出した。試料をさらに精製して(DNase消化、リボソーム除去)、高速RNA配列決定に供した。RNA転写産物を、MSBI1.176、MSBI2.176(群1)、MSSI2.225(群3)およびMSSI1.162(群4)について得た。RNA転写産物は明確に、単離物がヒト細胞中で複製されることを示す。
【００２７】
本発明者らは、乳癌および結腸癌についても、ビタミンD不足およびヘルペスウイルス再活性化をリスク因子として考える。多発性硬化症の病因について上述される同じ細胞内の二重の潜在的感染の再活性化は、そのためこれらの癌の病因においても特に重要な役割を担い得る。
【００２８】
したがって、本発明者らは、多発性硬化症(MS)、また他の下記の疾患が
・2つの異なる感染因子による同じ細胞の潜在的感染、最初の事象として、そのうちの1つは、最も可能性が高いヘルペス型ウイルス(特に、EBV、HHV-6、VZV、さらにHSV、HHV-7)であり、もう一方は、牛乳消費(牛乳因子-BMF)によりもたらされる。それぞれは、個々の細胞に潜在的に感染するが、しばしば同じ細胞中で、両方の因子のゲノムが生じる；
・第2の前提条件として、ヘルペス型ウイルス、最も頻繁にはエプスタイン-バールウイルス(EBV)(それだけではない)の溶解サイクルへの再活性化。EBVについて、このことはおそらく活性化されたビタミンD受容体により負の方向に調節されるトランスホーミング増殖因子β(TGFβ)のレベルの増加に関連する；
・第3の事象として、ヘルペス型DNA合成の部分的な抑制およびBMF粒子の形成を生じるか、またはその核酸を、神経接続を介して隣接する細胞へと拡散するBMFの増幅；
・これはBMFタンパク質を発現する隣接する細胞の感染に続く；
・最後に、BMFに対するT細胞応答により、罹患した細胞の破壊およびMSの場合はプラーク形成が誘導される。このことは、中枢静脈および早期の病変における集中的に局在化した免疫応答から共通して始まる病変の焦点があてられた外観の臨床的な観察を支持する、
により生じると考える。
【００２９】
牛乳または乳製品内に存在する因子の伝達は、ヒト脳細胞における潜在的な感染およびその後、ヘルペスウイルスDNAまたはヘルペスウイルス様DNAの共潜伏および自発的な誘導の場合は、これらの因子の増幅を引き起こし得る。有力なBMF候補因子を、実施例2〜5および添付の図面に記載する。
【００３０】
畜牛血清中(実施例2〜5参照)、市販の乳試料中、ならびに十分に発達したMS病変およびMS血清中のSphinx配列、Anello-、Circo-およびゲミサーキュラーウイルス(Gemycircularvirus)属、ならびにサイクロバクター種に関連する推定環状一本鎖DNAの存在は、MS病因についての概念の発展を可能にする。これは、ヘルペス型ウイルス、最も顕著にはEBV、小二本鎖および一本鎖DNAウイルスを増幅する性質、ウイルス性牛乳因子、ビタミンD不足、EBVが誘導するTGFβの特性ならびにMS開始および疾患の経過における増悪の部分的な季節依存の関連性の観察を一体化する。この概念を、図7〜13に模式的に概略する。
【００３１】
同じ細胞または近くに隣接する細胞の、ヘルペスウイルスゲノムおよび推定BMF、その後のヘルペスウイルス再活性化および次いで一本鎖DNAの優先的な増幅の誘発因子による初期の二重潜在的感染は、第1の事象として規定される。潜伏EBV感染の場合、ビタミンD不足およびその後のEBV誘導因子としてのTNF-βの上方調節は、上方調節についての重要な誘発因子であり得る。ウイルス抗原を発現する隣接細胞のおそらく不全型の感染は、活性T細胞応答および罹患した細胞の破壊を生じる。MS開始およびMS憎悪の新たなラウンドの頻繁に記載される季節性、繰り返し報告されるMS発病率の北から南への勾配は、太陽光曝露、ビタミンDレベルとTGFβ濃度の負の相関、およびEBV再活性化の程度を反映するはずである。
【００３２】
したがって、本発明者らは、潜伏形態における影響を受けやすい正常ヒト脳細胞においても異なるBMF配列の存在も予測する。BMF単離物の顕著な不均一性は、ヒトにおけるMSの病理学的な特徴についてのその変化の反映も見出し得る(Lucchinetti et al., 2000, Metz et al., 2014)。ヒトパピローマウイルス病原性についての特定の類似において、実際に「高い」および「低い」リスク型が同定されたとしても、これは特に驚くべきことではなかった(zur Hausen, 1985)。後者はBMF陽性細胞のヘルペス型ウイルスによる潜在的な共感染および後者の自発的な誘導を必要とすべきであるので、これらの保有因子の大部分は、MSを発症させない。これはまれな事象であるが、頻繁なヘルペスウイルス再活性化を生じる条件下で増加するはずである。
【００３３】
最終的な点として、この概念を、ビタミンD不足の条件下で高い頻度で生じる他の起こり得る自己免疫疾患および特定の癌に適用することも重要であるはずである。癌が懸念される限り、これは具体的に、結腸癌および乳癌、起こり得るものとして、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌および肺癌の原因となる。
【００３４】
インスリン依存性真性糖尿病のリスクは、牛乳消費およびビタミンD不足と繰り返し結び付けられている(Scott, 1990, in Grant, 2006, in Hyppoenen et al, 2010に概説)。後者のシステムは、MS状況と特に緊密であると思われる。
【００３５】
したがって、本発明は、
(a)図1〜4のいずれかに示されるヌクレオチド配列；
(b)(a)のヌクレオチド配列に対して少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列；
(c)(a)もしくは(b)のヌクレオチド配列の断片；
(d)(a)、(b)もしくは(c)のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列；または
(e)上述のヌクレオチド配列のいずれかと比較して遺伝子コードの縮重の結果重複するヌクレオチド配列
を含む、HCBI、MSBI、MSSIまたはCMIポリ核酸に関する。
【００３６】
用語「ポリ核酸」は、一本鎖または二本鎖の核酸配列をいう。ポリ核酸は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたは修飾ヌクレオチドからなり得るか、または診断もしくは治療の目的に適合され得る。ポリ核酸はまた、例えばクローニング目的に使用され得る二本鎖cDNAクローンを含み得る。
【００３７】
本発明のHCBI、MSBI、MSSIまたはCMIポリ核酸は、周知の常套的な方法に従って、例えば(a)試料から全DNAまたはRNAを単離して、(b)ハイブリダイゼーションまたはPCRによりHCBI、MSBI、MSSIまたはCMI配列を検出し、(c)HCBI、MSBI、MSSIまたはCMI配列をベクターにクローニングすることにより調製することができる。
【００３８】
1つ以上のヌクレオチドの欠失および/または挿入、特に1つ以上のコドンの挿入または欠失のいずれかを、主にオリゴヌクレオチドの末端(3'または5'のいずれか)に含み、本発明のポリ核酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を示す、本発明のポリ核酸の配列バリアントも本発明に含まれる。図1〜4に示される配列と類似の本発明のポリ核酸配列は、配列特異的プライマーによる増幅、高いかもしくは低いストリンジェントな条件下での配列特異的プローブを用いたハイブリダイゼーション、HCBI、MSBI、MSSIもしくはCMIの遺伝子情報の配列決定などの当該技術分野で公知の手段のいずれかにより特徴付けられ得、かつ単離され得る。
【００３９】
本発明はまた、複製タンパク質をコードする複製遺伝子を有する上述の本発明のヌクレオチド配列の断片を提供する。自律的複製ヌクレオチド配列は、自律的複製を誘導し得る複製遺伝子またはその断片のヌクレオチド配列を含む。複製タンパク質は、一本鎖DNA誘導一本鎖切断を複製起点またはその近位で結合するエンドヌクレアーゼを示す(Wolds, 1997)。当業者は、過度な実験を有することなく、自律的複製を誘導し得るかかる断片を誘導し得る。かかる断片は、少なくとも45、少なくとも55または少なくとも65ntの長さを有し得る。
【００４０】
当業者は、どの核酸配列が図1〜4のヌクレオチド配列に関係するか、またはどの断片が自律的に複製し得るかを、標準的なアッセイにより容易に決定し得る。
【００４１】
本発明はまた、上述のヌクレオチド配列のいずれかと比較して、遺伝子コードの縮重の結果重複するポリ核酸配列を提供する。これらのバリアントポリ核酸配列は、アミノ酸が由来するポリ核酸と同じアミノ酸配列をコードする。
【００４２】
本発明のHCBI、MSBI、MSSIまたはCMIポリ核酸は、染色体外エピソームとして存在し得るか、宿主ゲノム内に取り込まれ得るかおよび/または宿主細胞DNAに連結し得る。
【００４３】
本発明はまた、先に規定されるポリ核酸の一部を含むかまたはそれからなるオリゴヌクレオチドプライマーに関し、前記プライマーは、本発明のHCBI、MSBI、MSSIもしくはCMIポリ核酸を特異的に配列決定するためまたは特異的に増幅するためのプライマーとして作用し得る。
【００４４】
用語「プライマー」は、コピーされる核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成のための開始点として作用し得る一本鎖DNAオリゴヌクレオチド配列をいう。該プライマーの長さおよび配列は、該伸長産物の合成の誘導を可能にするようなものでなければならない。好ましくは、該プライマーは約5〜50ヌクレオチドである。具体的な長さおよび配列は、必要とされるDNAまたはRNA標的の複雑さ、ならびに温度およびイオン強度などのプライマー使用の条件に依存する。
【００４５】
増幅プライマーは適切な増幅を保証するために対応する鋳型配列と正確に適合する必要はないという事実は、文献中に十分に記載される。使用される増幅方法は、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、核酸配列ベース増幅(NASBA)、転写ベース増幅システム(TAS)、鎖置換増幅(SDA)もしくはQbレプリカーゼによる増幅、またはプライマー伸長を使用して核酸分子を増幅するための任意の他の適切な方法であり得る。増幅の間に、増幅産物は、標識されたプライマーを使用することまたは標識されたヌクレオチドを取り込むことのいずれかにより標識され得る。
【００４６】
標識は同位体(32P、35S等)または非同位体(ビオチン、ジゴキシゲニン等)であり得る。増幅反応は20〜70回、有利には25〜45回反復される。
【００４７】
当該技術分野で公知の種々の配列決定反応を使用して、ウイルス遺伝子情報を直接配列決定し得、かつ試料の配列を対応するアミノ酸配列に翻訳することによりORFを決定し得る。例示的配列決定反応としては、サンガーまたはマキサムおよびギルバートにより開発された技術に基づくものが挙げられる。種々の自動化配列決定手順は、質量分析による配列決定を含む目的のアッセイを実行する際に、利用され得ることも企図される(例えばPCT公開公報WO 94/16101参照)。例えばわずか2つまたは3つの核酸塩基の出現が配列決定反応において決定されること必要とすることは当業者に明らかである。
【００４８】
好ましくは、これらのプライマーは約5〜50ヌクレオチド長、より好ましくは約10〜25ヌクレオチドである。少なくとも13塩基の長さを有するプライマーが最も好ましい。
【００４９】
本発明はまた、上述のHCBI、MSBI、MSSIもしくはCMIポリ核酸の一部を含むまたはそれからなるオリゴヌクレオチドプローブにも関し、前記プローブは、本発明によるHCBI、MSBIまたはCMIポリ核酸の特異的検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして機能し得る。
【００５０】
該プローブは標識され得るかまたは固相支持体に結合され得る。
【００５１】
用語「プローブ」は、検出されるHCBI、MSBI、MSSIまたはCMIポリ核酸の標的配列に相補的な配列を有する一本鎖配列特異的オリゴヌクレオチドをいう。
【００５２】
好ましくは、これらのプローブは約5〜50ヌクレオチド長であり、より好ましくは約10〜25ヌクレオチドである。少なくとも13塩基を有するプローブが最も好ましい。
【００５３】
用語「固相支持体」は、オリゴヌクレオチドプローブが連結し得る任意の物質をいい得るが、ただし該プローブは、ハイブリダイゼーション特性を保持し、かつハイブリダイゼーションのバックグラウンドレベルが低いままである。通常、固相支持体は、マイクロタイタープレート、膜(例えばナイロンまたはニトロセルロース)またはマイクロスフィア(ビーズ)である。膜への適用または固定の前に、固定化を容易にするためまたはハイブリダイゼーション効率を向上するために核酸プローブを修飾することが都合よくあり得る。かかる修飾は、ホモポリマー尾部付加を含み得、脂肪族基、NH2基、SH基、カルボキシル基などの異なる反応基と連結するかまたはビオチンもしくはハプテンと連結する。
【００５４】
プライマーまたはプローブとして使用される本発明のオリゴヌクレオチドはまた、ホスホロチオエート、アルキルホスホリエートもしくはペプチド核酸などのヌクレオチドアナログを含み得るかもしくはそれからなり得るか、または挿入因子(intercalating agents)を含み得る。これらの修飾は、必要とされる特異性および感度を得るためにオリゴヌクレオチドが使用されるべき条件に関する適合を必要とする。しかしながら、実際の結果は、未修飾のオリゴヌクレオチドを用いて得られるものと本質的に同じである。
【００５５】
ハイブリダイゼーション速度、ハイブリッド形成の可逆性、オリゴヌクレオチド分子の生物学的安定性などの特徴に正の方向に影響するためにこれらの修飾の導入は有利であり得る。
【００５６】
本発明のポリ核酸は、任意の種類の組成物に含まれ得る。前記組成物は、診断的、治療的または予防的な用途のためのものであり得る。
【００５７】
本発明はまた、原核生物、真核生物またはウイルスの転写および翻訳調節因子に操作可能に連結される、上述の本発明のHCBI、MSBI、MSSIまたはCMIポリ核酸を含む組み換え発現ベクター、ならびにかかるベクターを含む宿主細胞に関する。
【００５８】
用語「ベクター」は、プラスミド、コスミド、人工染色体、ファージ、またはウイルス、またはトランスジェニック非ヒト動物を含み得る。HCBI、MSBI、MSSIまたはCMI組み換え分子、BCGまたはアデノウイルスベクターおよび鳥類ポックス(avipox)組み換えウイルスが、ワクチン開発に特に有用であり得る。
【００５９】
本発明の文脈中で使用される用語「組み換え発現」は、本発明のポリペプチドが、以下に詳細に述べられるように、原核生物、または下等もしくは高等真核生物中で組み換え発現法により産生されることをいう。
【００６０】
用語「宿主細胞」は、組み換えベクターもしくは他の転移ポリヌクレオチドについての受容体として使用され得るかまたは使用されており、かつトランスフェクトされた起源細胞の子孫を含み得る細胞をいう。
【００６１】
単一親細胞の子孫が、天然、偶発的または意図的な変異もしくは組み換えのために、形態またはゲノムまたは全DNA相補性において、起源の親と必ずしも完全に同一である必要はないことが理解される。
【００６２】
用語「下等真核生物」は、酵母、真菌等の宿主細胞をいう。下等真核生物は一般的に(必ずしもそういうわけではない)、単細胞である。好ましい下等真核生物は、酵母、特にサッカロミセス、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)、クルイウェロマイセス(Kluiveromyces)、ピキア(例えばピキア・パストリス)、ハンゼヌラ(Hansenula)(例えばハンゼヌラ・ポリモルフ(Hansenula polymorph))、シュワニオマイセス(Schwaniomyces)、シゾサッカロマイセス、ヤロウイア(Yarowia)、ジゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)等の種である。サッカロミセス・セレビシエ、S.カールスベルゲンシス(S. carlsbergensis)およびK.ラクティス(K. lactis)は、最も一般的に使用される酵母宿主であり、都合の良い真菌宿主である。
【００６３】
用語「高等真核生物」は、哺乳動物、爬虫類、昆虫等の高等動物由来の宿主細胞をいう。現在の好ましい高等真核生物宿主細胞は、チャイニーズハムスター(例えばCHO)、サル(例えばCOSおよびVero細胞)、乳児ハムスター腎臓(BHK)、ブタ腎臓(PK15)、ウサギ腎臓13細胞(RK13)、ヒト骨肉腫細胞株143B、ヒト細胞株HeLaおよびHep G2、293TT細胞株等のヒト肝癌細胞株(Buck et al., 2004)および昆虫細胞株(例えばスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda))由来である。宿主細胞は、懸濁またはフラスコ培養、組織培養、臓器培養等中に提供され得る。代替的に、宿主細胞は、トランスジェニック非ヒト動物でもあり得る。
【００６４】
用語「原核細胞」は、大腸菌、ラクトバチルス、ラクトコッカス、サルモネラ、連鎖球菌、枯草菌またはストレプトミセスなどの宿主をいう。これらの宿主細胞も本発明に企図される。
【００６５】
ベクター配列中に挿入された所望の配列をコードするHCBI、MSBI、MSSIまたはCMI DNAの区分は、シグナル配列に結合されてもよい。前記シグナル配列は、非HCBI、MSBI、MSSIまたはCMI供給源由来のものであってもよいが、本発明の特に好ましい構築物は、タンパク質のそれぞれの開始点の前に、HCBI、MSBI、MSSIまたはCMIゲノム中に見られるシグナル配列を含む。
【００６６】
高等真核生物は、ベクターで形質転換され得るか、または組み換えウイルス、例えば組み換えワクシニアウイルスで感染され得る。外来DNAをワクシニアウイルス内に挿入するための技術およびベクターは、当該技術分野で周知であり、例えば相同組み換えを利用する。種々のウイルスプロモーター配列、あり得るものとしてターミネーター配列およびポリ(A)付加配列、あり得るものとしてエンハンサー配列およびあり得るものとして増幅配列は全てが哺乳動物発現に必要とされ、当該技術分野で利用可能である。ワクシニアは、宿主細胞タンパク質の発現を停止させるので特に好ましい。ヒトの予防接種のためには、鳥類ポックスおよびアンカラ改変ウイルス(Ankara Modified Virus)(AMV)が特に有用なベクターである。
【００６７】
ヘルパー依存的ウイルス発現ベクターであるバキュロウイルスキンウワバ核多角体病ウイルス(AcNPV)由来の昆虫発現転移ベクターも公知である。この系由来の発現ベクターは、通常、不均一な遺伝子の発現を誘導するための強力なポリヘドリン遺伝子プロモーターを使用する。不均一なDNAをバキュロウイルスの所望の部位に導入するための異なるベクターおよび方法は、バキュロウイルス発現のために当業者に利用可能である。昆虫細胞により認識される翻訳語修飾のための異なるシグナルも当該技術分野で公知である。
【００６８】
本発明はまた、上述のHCBI、MSBI、MSSIまたはCMIポリ核酸によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または実質的に同様でありかつ生物学的に同等であるその一部もしくはアナログに関する。
【００６９】
用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーをいい、特定の長さの産物をいわない。したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質が、ポリペプチドの定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等をいわないか、または除外する。例えばアミノ酸の1つ以上のアナログ(例えば天然にはないアミノ酸、ペプチド核酸(PNA)等を含む)を含むポリペプチド、置換された結合を有するポリペプチド、ならびに天然に存在するものおよび天然には存在しないものの両方の当該技術分野で公知の他の修飾が、該定義に含まれる。
【００７０】
本発明のポリペプチドは、好ましくは少なくとも3、好ましくは4または5個の連続したHCBI、MSBI、MSSIまたはCMIアミノ酸、6または7、しかしながら好ましくは少なくとも8個の連続したHCBI、MSBI、MSSIまたはCMIアミノ酸、少なくとも10または少なくとも15個を含む。
【００７１】
本発明のポリペプチド、特に断片は、古典的な化学合成により調製することができる。該合成は、均一な溶液または固相中で実施され得る。本発明のポリペプチドは、組み換えDNA技術の手段によっても調製できる。本発明はまた、(a)先に定義されるポリ核酸またはその一部が適切な制御因子の調節の下で挿入された適切な細胞宿主の組み換えベクターを用いた形質転換、(b)前記形質転換された細胞宿主を、前記挿入物の発現が可能な条件下で培養する工程、および(c)前記ポリペプチドを回収する工程を含む、先に定義された組み換えポリペプチドを産生するための方法に関する。
【００７２】
本発明はまた、少なくとも1つの先に定義されるポリペプチドでの免疫の際に生じる抗体に関し、該抗体は、前記ポリペプチドのいずれかと特異的に反応性であり、かつ好ましくはモノクローナル抗体である。用語「抗体」は、好ましくは、本質的に異なるエピトープ特異性を有するプールされたモノクローナル抗体、および別個のモノクローナル抗体調製物からなる抗体に関する。モノクローナル抗体は、当業者に周知の方法により、例えば、本発明のHCBI、MSBI、MSSIもしくはCMIポリ核酸またはその断片によりコードされるポリペプチドを含む抗原から作製される。本明細書で使用する場合、用語「抗体」(Ab)または「モノクローナル抗体」(Mab)は、タンパク質に特異的に結合可能な完全な分子および抗体断片(例えばFabおよびF(ab')2断片など)を含むことを意味する。FabおよびF(ab')2断片は、完全な抗体のFc断片を欠き、循環からより迅速に除去され、完全な抗体よりも低い非特異的組織結合を有し得る。したがって、これらの断片、およびFABまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物が好ましい。さらに、本発明の目的に有用な抗体は、キメラ抗体、一本鎖抗体およびヒト化抗体を含む。
【００７３】
本発明はまた、細胞媒介性免疫応答を使用した診断的アプローチおよび治療的アプローチに関する。
【００７４】
好ましくは、抗体またはその抗原結合断片は、検出可能な標識を有する。該抗体/断片は、例えば放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素により、直接または間接的に標識され得る。当業者は、抗体への結合のための他の適切な標識を理解するか、または通常の実験を使用して、かかるものを確かめる。
【００７５】
本発明はまた、本発明のHCBI、MSBIもしくはCMIポリ核酸またはポリペプチドの存在の決定における使用のための診断キットに関し、該キットは、本発明のプライマー、プローブおよび/または抗体を含む。該キットは、当業者に周知の任意の形式を有し得、例えばELISA系キットであり得る。
【００７６】
本発明はまた、(a)任意に試料ポリ核酸を抽出する工程、(b)少なくとも1つの上述のプライマー、任意に標識されたプライマーにより上述のポリ核酸を増幅する工程、および(c)該増幅されたポリ核酸を検出する工程を含む、生物学的試料中の本発明のHCBI、MSBI、MSSIまたはCMIポリ核酸の検出のための方法に関する。
【００７７】
用語「ポリ核酸」はまた、分析鎖(analyte strand)とも称され得、一本鎖または二本鎖ポリ核酸分子に対応する。
【００７８】
用語「標識された」は標識された核酸の使用をいう。これは、増幅もしくは標識されたプライマーのポリメラーゼ工程中に、または当業者に公知の任意の他の方法により取り込まれる標識されたヌクレオチドまたは標識されたプライマーの使用を含み得る。
【００７９】
本発明はまた、(a)任意に試料ポリ核酸を抽出する工程、(b)上述のポリ核酸と少なくとも1つの上述のプローブをハイブリダイズさせる工程、および(c)ハイブリダイズしたポリ核酸を検出する工程を含む、生物学的試料中の本発明のHCBI、MSBI、MSSIまたはCMIポリ核酸の検出のための方法に関する。
【００８０】
ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、ストリンジェントなものであると理解され、一般的に当該技術分野で公知である。しかしながら、ハイブリダイゼーション溶液(SSC、SSPE等)によると、これらのプローブは、十分な特異性を得るために適切な温度でハイブリダイズされるべきである。
【００８１】
ハイブリダイゼーション溶液(SSC、SSPE等)によると、これらのプローブは、十分な特異性を得るためにそれらの適切な温度でストリンジェントにハイブリダイズされるべきである。しかしながら、DNAプローブのわずかな修飾、それらの末端(3'または5'のいずれか)での1つもしくはいくつかのヌクレオチドの付加もしくは欠失のいずれか、またはいくつかの必要不可欠ではないヌクレオチド(すなわち種類を区別するのに必要不可欠ではないヌクレオチド)の他のもの(修飾ヌクレオチドまたはイノシンを含む)による置換により、これらのプローブまたはそれらのバリアントは、同じハイブリダイゼーション条件(すなわち同じ温度および同じハイブリダイゼーション溶液)で特異的にハイブリダイズするようになり得る。より特異的なハイブリダイゼーション結果を得るために使用するプローブの量(濃度)を変えることも有益であり得る。GC含量に関係なく同じ長さのプローブが、同じ適切な温度、TMACI溶液中で特異的にハイブリダイズすることは、この文脈中で注意すべきである。
【００８２】
オリゴヌクレオチドプローブと試料中のHCBI、MSBI、MSSIまたはCMIポリ核酸配列の間で形成されるハイブリッドを検出するための本発明の目的のための適切なアッセイ方法は、従来のドット-ブロット形式、サンドイッチハイブリダイゼーションまたはリバースハイブリダイゼーションなどの当該技術分野で公知であるアッセイ形式のいずれかを含み得る。例えば、検出は、標識されていない増幅された試料を膜に結合させ、膜を少なくとも1つの標識されたプローブと適切なハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件下で一体化し、結合したプローブの存在をモニタリングするドットブロット形式を使用して行われ得る。
【００８３】
代替的かつ好ましい方法は、増幅された配列が標識を含む「リバース」ドットブロット形式である。この形式において、標識されていないオリゴヌクレオチドプローブは、固相支持体に結合して、適切でストリンジェントなハイブリダイゼーションおよびその後の洗浄条件下で標識された試料に曝露される。試料のポリ核酸と本発明のオリゴヌクレオチドプローブの間のハイブリッドの形成をあてにする任意の他のアッセイ方法が使用され得ることも理解される。
【００８４】
本発明はまた、本発明のHCBI、MSBI、MSSIもしくはCMIポリ核酸にコードされるポリペプチドまたは生物学的試料中に存在する該ポリペプチドに対する抗体を検出するための方法に関し、該方法は、(a)先に定義されるかかるポリペプチドまたは抗体の存在について生物学的試料を接触させる工程、および(b)前記抗体と前記ポリペプチド間で形成された免疫複合体を検出する工程を含む。
【００８５】
本発明の免疫アッセイ法は、本発明の新規で特有のポリペプチド配列の異なるドメイン由来の抗原を利用し得る。例えば単一または特異的なオリゴマー抗原、二量体抗原、および単一または特異的なオリゴマー抗原の組合せを使用することは本発明の範囲内にある。本発明のHCBI、MSBI、MSSIまたはCMI抗原は、公知の抗原を使用して抗体または細胞媒介性免疫応答を検出する実質的に任意のアッセイ形式において使用され得る。したがって、本発明はまた、HCBI、MSBI、MSSIまたはCMI抗原に対する細胞媒介性免疫応答の検出およびHCBI、MSBI、MSSIまたはCMI抗原に対する細胞媒介性免疫応答に基づく治療的干渉の適用を包含する。
【００８６】
当然、HCBI、MSBI、MSSIまたはCMIのコンホメーションエピトーブを変性するアッセイ形式を避けるべきであるかまたは適合するべきである。これらのアッセイの全ての共通の特徴は、抗原とHCBI、MSBI、MSSIまたはCMI抗体を含むことが疑われる身体成分を、抗原が該成分中に存在する任意のかかる抗体と結合することを可能にする条件下で接触させることである。かかる条件は、典型的に、過剰な抗原を使用した、生理学的温度、pHおよびイオン強度である。抗原と検体のインキュベーション後に抗原を含む免疫複合体の検出を行う。
【００８７】
免疫アッセイの設計は、多くの変形についての主題であり、多くの形式は当該技術分野で公知である。例えば、プロトコルは、固相支持体または免疫沈澱を使用し得る。ほとんどのアッセイは、標識された抗体またはポリペプチドの使用を含み、該標識は、例えば酵素、蛍光、化学発光、放射性または色素分子であり得る。免疫複合体からシグナルを増幅するアッセイも公知であり、その例は、ビオチンおよびアビジン、またはストレプトアビジンを使用するアッセイ、ならびにELISAアッセイなどの酵素標識および酵素媒介性免疫アッセイである。
【００８８】
該免疫アッセイは、標準型または競合型の不均一な形式であるかまたは均一な形式であり得る。不均一な形式において、ポリペプチドは典型的に、固相マトリックスまたは支持体に結合され、インキュベーション後の試料とポリペプチドの分離が容易になる。使用され得る固相支持体の例は、ニトロセルロース(例えば、膜またはマイクロタイターウェル形式)、ポリ塩化ビニル(例えば、シートまたはマイクロタイターウェル)、ポリスチレンラテックス(例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレート、ポリビニリジンフルオライド(Immunolonとして公知)、ジアゾ化紙、ナイロン膜、活性ビーズおよびプロテインAビーズである。抗原ポリペプチドを含む固相支持体は、典型的に試験試料と分離した後、かつ結合抗体の検出の前に洗浄される。標準形式および競合形式は、共に当該技術分で公知である。
【００８９】
不均一な形式において、試験試料を溶液中の抗原と合わせてインキュベートする。例えば、これは、形成される任意の抗原-抗体複合体を沈殿させる条件下であり得る。これらのアッセイについて、標準および競合形式の両方は、当該技術分野で公知である。
【００９０】
標準形式において、抗体-抗原複合体中のHCBI、MSBI、MSSIまたはCMI抗体の量は直接モニタリングされる。これは、抗HCBI、MSBI、MSSIまたはCMI抗体上のエピトープを認識する(標識された)抗異種(例えば抗ヒト)抗体が複合体形成により結合するかどうかを決定することにより達成され得る。競合形式において、試料中のHCBI、MSBI、MSSIまたはCMI抗体の量は、複合体中の標識された抗体(または他の競合リガンド)の公知の量の結合に対する競合効果をモニタリングすることにより推定される。
【００９１】
抗HCBI、MSBI、MSSIまたはCMI抗体を含む形成された複合体(または競合アッセイの場合は競合抗体の量)は、形式に依存して任意のいくつかの公知の技術により検出される。例えば、複合体中の標識されないHCBI、MSBI、MSSIまたはCMI抗体は、標識(例えば酵素標識)と複合体化された抗異種Igのコンジュゲートを使用して検出され得る。
【００９２】
免疫沈澱または凝集アッセイ形式において、HCBI、MSBI、MSSIまたはCMI抗原と抗体の間の反応により、溶液または懸濁液から沈殿し、沈殿の可視の層またはフィルムを形成する網目構造が形成される。試験標本中に抗HCBI、MSBI、MSSIまたはCMI抗体が存在しない場合、可視の沈澱は形成されない。
【００９３】
現在、3つの特異的な型の粒子凝集(PA)アッセイが存在する。これらのアッセイは、支持体に被覆される場合に種々の抗原に対する抗体の検出に使用される。このアッセイの1つの型は、赤血球(RBC)に対する受動吸着抗原(または抗体)により感作される、RBCを使用した赤血球凝集アッセイである。存在する場合、身体成分中に存在する特異的な抗原/抗体の添加は、精製された抗原で被覆されたRBCの凝集を引き起こす。
【００９４】
赤血球凝集アッセイにおいて非特異的反応の可能性を排除するために、PAにおけるRBCの代わりに2つの人工の担体を使用し得る。これらの最も一般的なものはラテックス粒子である。
【００９５】
選択される固相としては、ポリマービーズまたはガラスビーズ、ニトロセルロース、マイクロ粒子、反応トレイのマイクロウェル、試験管および磁性ビーズが挙げられ得る。シグナルを生成する化合物としては、酵素、発光化合物、色原体、放射性因子および化学発光化合物が挙げられ得る。酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびβガラクトシダーゼが挙げられる。エンハンサー化合物の例としては、ビオチン、抗ビオチンおよびアビジンが挙げられる。エンハンサー化合物結合メンバーの例としてはビオチン、抗ビオチンおよびアビジンが挙げられる。
【００９６】
上述の方法は、患者細胞内のゲノム下(subgenomic)HCBI、MSBI、MSSIまたはCMIポリヌクレオチド配列自体または特定の宿主遺伝子または遺伝子断片に結合する該ポリヌクレオチドの存在の有害な効果による癌または自己免疫疾患などの疾患を発症するリスクを評価するために有用であり、かつ適切な対処的手段をとることを可能にする。
【００９７】
したがって、本発明はまた、本発明のHCBI、MSBI、MSSIまたはCMIウイルスポリ核酸に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはiRNAに関する。
【００９８】
適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはiRNAの作製は、所望の効果、例えばポリペプチドの発現の抑制が生じるようにアンチセンス相互作用を引き起こすためのHCBI、MSBI、MSSIまたはCMIポリ核酸内の部位(1つ以上)の決定を含む。好ましい遺伝子内部位は、(a)遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)の翻訳開始もしくは終結コドンを包含する領域、または(b)「ループ」もしくは「ふくらみ(bulge)」である、すなわち二次構造の一部ではないmRNAの領域である。1つ以上の標的部位が同定されると、標的に十分相補的、すなわち十分な特異性を伴って充分良好にハイブリダイズし、所望の効果を生じるオリゴヌクレオチドが選択される。本発明の文脈において「ハイブリダイゼーション」は、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基の間のワトソン-クリック、Hoogsteenまたは逆Hoogsteen水素結合であり得る水素結合を意味する。本明細書で使用する場合「相補的」は、2つのヌクレオチド間で正確な対を形成するための能力をいう。例えば、オリゴヌクレオチドの特定の位置のヌクレオチドがDNAまたはRNA分子の同じ位置のヌクレオチドと水素結合し得る場合、オリゴヌクレオチドと、DNAまたはRNAはその位置で互いに相補的であるとみなされる。それぞれの分子内の十分な数の対応する位置が互いに水素結合し得るヌクレオチドにより占められる場合、オリゴヌクレオチドと、DNAまたはRNAは互いに相補的である。したがって、「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」は、オリゴヌクレオチドと、DNAまたはRNA標的の間で安定かつ特異的な結合が生じるような相補性または正確な対形成の十分な程度を示すために使用される用語である。当該技術分野において、特異的にハイブリダイズ可能であるためにはアンチセンス化合物の配列はその標的核酸の配列と100%相補的である必要はないということが理解される。アンチセンス化合物は、化合物と標的DNAまたはRNA分子の結合が標的DNAまたはRNAの通常の機能を干渉して、能力の消失を引き起こす場合、アンチセンス化合物は特異的にハイブリダイズ可能であり、特異的な結合が望まれる条件下、すなわち治療的処置の場合にアンチセンス化合物と非標的配列の非特異的な結合を回避するような十分な程度の相補性がある。
【００９９】
「オリゴヌクレオチド」(特にアンチセンス化合物の文脈において)は、リボ核酸(RNA)もしくはデオキシリボ核酸(DNA)またはそれらの模倣物のオリゴマーまたはポリマーをいう。この用語は、天然に存在するヌクレオ塩基、糖類およびヌクレオシド間(骨格)共有結合ならびに同様に機能する天然には存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドで構成されるオリゴヌクレオチドを含む。例えば高められた細胞取り込み、高められた核酸標的についての親和性およびヌクレアーゼの存在下での増加した安定性などの所望の性質のために、かかる修飾または置換されたオリゴヌクレオチドはしばしば、天然形態よりも好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンス化合物の好ましい形態であるが、本発明は、以下に記載されるようなオリゴヌクレオチド模倣物を含むが限定されない他のオリゴマーアンチセンス化合物を包含する。本発明のアンチセンス化合物は、約8〜約50のヌクレオ塩基(すなわち約8〜約50の連結したヌクレオシド)を含む。特に好ましいアンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、約15〜約25ヌクレオ塩基を含むものがさらに好ましい。アンチセンス化合物は、リボザイム、外部誘導配列(EGS)、オリゴヌクレオチド(オリゴザイム)、および標的核酸にハイブリダイズしてその発現を阻害する他の短い触媒性RNAまたは触媒性オリゴヌクレオチドを含む。アンチセンス化合物はまた、センス配列およびアンチセンス配列を含むiRNAを含み、ここで該センスおよびアンチセンス配列は、RNA二本鎖を形成し、アンチセンス配列は、本発明のHCBI、MSBI、MSSIまたはCMIポリ核酸のヌクレオチド配列に十分に相補的なヌクレオチド配列を含む。
【０１００】
代替的に、本発明は、例えば哺乳動物宿主中で、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの転写を可能にするベクターを提供する。好ましくは、かかるベクターは、遺伝子治療に有用なベクターである。遺伝子治療に有用な好ましいベクターは、ウイルスベクター、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペス単純ウイルス、ワクシニア、またはレトロウイルスなどのRNAウイルスである。好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウスまたはトリレトロウイルスの誘導体である。本発明において使用し得るかかるレトロウイルスベクターの例は、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMuLV)、Harveyマウス肉腫ウイルス(HaMuSV)、マウス乳癌ウイルス(MuMTV)およびラウス肉腫ウイルス(RSV)である。最も好ましくは、マウスベクターと比較してより広範囲の宿主を提供するテナガザル白血病ウイルス(GaLV)などの非ヒト霊長類レトロウイルスベクターが使用される。組み換えレトロウイルスは不完全であるので、感染粒子を産生するためには補助が必要である。かかる補助は、例えばLTR内の調節配列の制御下のレトロウイルスの構造遺伝子の全てをコードするプラスミドを含むヘルパー細胞株を使用することにより提供され得る。適切なヘルパー細胞株は当業者に周知である。該ベクターはさらに、形質導入された細胞を同定できるような選択マーカーをコードする遺伝子を含む。さらに、レトロウイルスベクターは、標的特異的になるように修飾され得る。これは、例えば糖、糖脂質、またはタンパク質、好ましくは抗体をコードするポリヌクレオチドを挿入することにより達成され得る。当業者は、標的特異的ベクターを産生するためのさらなる方法を知っている。さらに適切なベクターおよびインビトロまたはインビボ遺伝子治療のための方法が、文献に記載され、当業者に公知である；例えば、WO 94/29469またはWO 97/00957参照。本発明のHCBI、MSBI、MSSIまたはCMIポリヌクレオチド配列はまた、再編成されたHCBI、MSBI、MSSIもしくはCMI配列またはキメラHCBI、MSBI、MSSIもしくはCMI宿主細胞DNA配列いずれか単独で構成される適切なベクター自体としても機能し得る。さらに、本発明のヌクレオチド配列は、人工染色体の構築のためにも使用され得る。
【０１０１】
標的器官のみでの発現を達成するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドの転写のためのDNA配列は、組織特異的プロモーターに連結されて遺伝子治療に使用され得る。かかるプロモーターは当業者に周知である。
【０１０２】
オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は一般に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するといわれる。RNAおよびDNAの通常の連結または骨格は、3'〜5'ホスホジエステル結合である。本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の具体例としては、修飾された骨格または天然にはないヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドとしては、骨格内にリン原子を保持するもの、および骨格内にリン原子を有さないものが挙げられる。安定性の増加を生じ得る修飾されたオリゴヌクレオチド骨格は、当業者に公知であり、好ましくはかかる修飾はホスホロチオエート結合である。
【０１０３】
好ましいオリゴヌクレオチド模倣物は、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されたオリゴヌクレオチド模倣物であり、ペプチド核酸(PNA)と称される。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換される。ヌクレオ塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。
【０１０４】
修飾されたオリゴヌクレオチドはまた、1つ以上の置換または修飾された糖部分を含み得る。好ましいオリゴヌクレオチドは、2'位置に、以下：OH；F；0-、S-もしくはN-アルキル；0-、S-もしくはN-アルケニル；0-、S-もしくはN-アルキニル；またはO-アルキル-O-アルキルの1つを含み、ここで該アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、C1〜C10アルキルまたはC2〜C10アルケニルおよびアルキニルで置換され得るかまたは置換され得ない。特に好ましい修飾糖部分は、2'-O-メトキシエチル糖部分である。
【０１０５】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ヌクレオ塩基修飾または置換を含み得る。修飾されたヌクレオ塩基は、5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン等の他の合成および天然ヌクレオ塩基を含み、これらの修飾は核酸二重鎖の安定性を増加することが示されているので5-メチルシトシン置換が好ましい。
【０１０６】
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布もしくは細胞取り込みを高める1つ以上の部分またはコンジュゲートを化学的に連結することを含む。かかる部分としては、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、ポリアミン、もしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分などの脂質部分が挙げられる。
【０１０７】
本発明はまた、キメラ化合物であるアンチセンス化合物を含む。「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、本発明の文脈において、アンチセンス化合物、特に、2つ以上の化学的に区別される領域を含み、それぞれが少なくとも1つのモノマー単位、すなわちオリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチドで構成されるオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的に、少なくとも1つの領域を含み、該オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに、ヌクレアーゼ分解に対する増加した耐性、増加した細胞取り込み、および/または標的核酸についての増加した結合親和性を付与するように修飾される。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、RNA:DNAまたはRNA:RNAハイブリッドを切断し得る酵素のための基質として機能し得る。例えば、RNase Hは、RNA:DNA 二本鎖のRNA鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。そのためRNase Hの活性化は、RNA標的の切断を生じ、それにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を大きく高める。結果的に、キメラオリゴヌクレオチドを使用した場合、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、しばしばより短いオリゴヌクレオチドと同等の結果を得ることができる。本発明のキメラアンチセンス化合物は、上述の2つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび/またはオリゴヌクレオチド模倣物の複合構造として形成され得る。かかる化合物はまた、当該技術分野においてハイブリッドまたはギャップマーと称されている。
【０１０８】
本発明はまた、本発明の抗体またはアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび適切な賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物に関する。好ましくは医薬組成物において上述の化合物は、薬学的に許容され得る担体と合される。「薬学的に許容され得る」は、有効成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、投与される宿主に対して毒性ではない任意の担体を包含することを意味する。適切な医薬担体の例は当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝化食塩水溶液、水、エマルジョン、例えば油/水エマルジョン、種々の湿潤剤、滅菌溶液等が挙げられる。かかる担体は従来の方法により配合され、活性化合物が有効用量で被験体に投与され得る。
【０１０９】
「有効用量」は、疾患を予防するかまたは疾患の経過および重症度に影響し、かかる病理の低減もしくは寛解をもたらすのに十分な有効成分の量をいう。これらの疾患または障害を治療および/または予防するのに有用な「有効用量」は、当業者に公知の方法を用いて決定され得る。
【０１１０】
適切な組成物の投与は、異なる方法、例えば、静脈内、腹腔内、経口、皮下、筋内、局所または皮内の投与により実施され得る。当然、投与経路は、治療の種類および医薬組成物に含まれる化合物の種類に依存する。投与計画(dosage regimen)は、かかりつけ医および他の臨床的要因により決定される。医学分野で周知のように、任意の一患者への投薬は、多くの要因、例えば患者のサイズ、体表面積、年齢、性別、投与される具体的な化合物、投与の時間および経路、治療の種類、一般的な健康状態および同時に投与される他の薬物に依存する。
【０１１１】
本発明の好ましい態様において、予防/治療され得る疾患は癌、好ましくは乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌、ホジキン病、結腸直腸癌もしくは結腸癌、またはCNSの疾患、好ましくはアルツハイマー病もしくは多発性硬化症(MS)、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、または伝染性の海面状脳症/プリオン関連疾患である。また、MSと真性糖尿病の間のリスク因子の類似性のための、後者の症状も含まれる。用語「癌」および「CNSの疾患」はまた、前記疾患の早期病期を含む。
【０１１２】
本発明はまた、HCBI、MSBI、MSSIまたはCMI感染に対して哺乳動物を免疫するためのワクチンに関し、該ワクチンは、先に定義される少なくとも1つのポリペプチドまたはHCBI、MSBI、MSSIもしくはCMIポリ核酸または対応するVLP(ウイルス様粒子)またはペプチド/タンパク質/DNA複合体を、薬学的に許容され得る担体中に含む。これは、動物(特に畜牛)およびそれらの製品(例えば牛乳および乳製品)における分子的および免疫学的試験も含む。
【０１１３】
これは、これらの因子の構造成分の分析に由来する標的化治療のための小化学物質も含み得る。
【０１１４】
「ワクチン」は、HCBI、MSBI、MSSIまたはCMIに対する防御を引き出し得る免疫原性組成物であり、部分的または完全である。ワクチンは、すでに感染した個体の治療にも有用であり、この場合は治療ワクチンと称される。
【０１１５】
用語「治療薬」は、HCBI、MSBI、MSSIもしくはCMI感染またはこの感染に関連する疾患を治療し得る組成物をいう。用語「有効量」は、投与を受けた個体において免疫応答を誘導するか、またはそうでなければ意図する系において(例えばイムノアッセイ)免疫反応を直接誘導するのに十分なエピトープ保有ポリペプチドの量をいう。好ましくは、有効量は、先に定義された治療に影響するのに十分である。正確な必要量は用途に応じて変わる。ワクチン用途またはポリクローナル抗血清/抗体の産生のためには、例えば有効量は、個体の種、年齢および一般的な状態、治療される症状の重症度、選択される具体的なポリペプチドおよびその投与形態等に応じて変化し得る。有効量は比較的大きく、重大でない範囲で見られる。適切な有効量は、通常の実験を使用し容易に決定され得る。HCBI、MSBI、MSSIまたはCMIにより引き起こされる疾患の予防用のタンパク質の好ましい範囲は、0.01〜100μg/用量、好ましくは0.1〜50μg/用量である。十分な免疫応答、その後HCBI、MSBI、MSSIまたはCMI感染およびHCBI、MSBIまたはCMI関連疾患のそれぞれに対する防御を達成するために、個体ごとに数回の投薬が必要な場合がある。
【０１１６】
薬学的に許容され得る担体としては、それ自体でワクチンを受けた個体に対して有害な抗体の産生を誘導しない任意の担体が挙げられる。適切な担体は、典型的に大きく、ゆっくり代謝される、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、多量体アミノ酸およびアミノ酸コポリマーなどのマクロ分子である。かかる担体は当業者に周知である。
【０１１７】
組成物の有効性を高めるための好ましいアジュバントとしては、限定されないが、水酸化アルミニウム(alum)、米国特許第4,606,918に見られるN-アセチル-ムラミル-L-トレオニル-D-イソグルタミン(thr-MDP)、N-アセチル-ノルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン(nor-MDP)、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1'-2'-ジパルミトイルsn-グリセロ-3-ヒドロキシ-ホスホリルオキシ)-エチルアミン(MTP-PE)および細菌から抽出された3つの成分、モノホスホリル脂質A、トレハロースジマイコレートおよび細胞壁骨格(MPL+TDM+CWS)を2%スクアラン/Tween 80エマルジョン中に含むRIBIが挙げられる。該3成分MPL、TDMまたはCWSのいずれかは、単独または2つずつ合わせても使用され得る。さらにStimulon(Cambridge Bioscience, Worcester, MA)またはSAF-1(Syntex)などのアジュバントを使用してもよい。さらに、非ヒト用途および研究目的では完全フロイントアジュバント(CFA)および不完全フロイントアジュバント(IFA)を使用してもよい。
【０１１８】
免疫原性組成物は典型的に、水、食塩水、グリセロール、エタノール等の薬学的に許容され得るビヒクルを含む。さらに湿潤剤または乳化剤、pH緩衝化物質、保存剤等の補助物質がかかるビヒクルに含まれ得る。
【０１１９】
典型的に、免疫原性組成物は、注射用剤として、液体溶液または液体懸濁剤のいずれかとして調製される。注射の前に液体ビヒクルにおける溶液または懸濁液に適した固形物も調製され得る。該製剤はまた、高められたアジュバント効果のためにリポソーム中で乳化され得るかまたは封入され得る。タンパク質はまた、サポニン、例えばQuil A (ISCOMS)と共に免疫刺激複合体中に一体化され得る。
【０１２０】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、「十分な量」または「免疫学的に有効な量」の本発明のタンパク質および必要に応じて上述の成分の任意の他のものを含む。「免疫学的に有効な量」は、単回投与または連続投与の一部のいずれかの個体へのかかる量の投与が、上述のように治療に有効であることを意味する。この量は、治療される個体の健康および身体の状態、個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望の防御の程度、ワクチンの配合、治療医師の医学的状況の評価、ならびに他の関連のある要因に応じて変化する。この量は、常套的な追跡を通じて決定され得る比較的広い範囲に当てはまることが予想される。通常、該量は、0.01〜1000μg/用量、より具体的には0.1〜100μg/用量で変化する。
【０１２１】
以下の実施例は、説明と意図するが、本発明の限定を意図するものではない。かかる実施例は、使用され得るものの典型であるが、代替的に、当業者に公知の他の方法を利用してもよい。
【実施例】
【０１２２】
実施例1
材料および方法
(A)密度沈降勾配によるウシ血清の分画、その後のクローニング
最初に、合計120のウシ血清由来の5つの血清のプールを、先のベンゾナーゼ処理に供して全ての遊離DNAおよびRNAを除去した後、Optiprep-(イオジキサノール)-密度勾配超遠心分離に供した(Buck et al., 2005)。タンパク質結合DNAを画分から抽出し(Qiagen PCR Purification Kit)、1μl DNA/画分を、50μM Exo-耐性ランダムプライマー(Thermo Scientific)、3.2μmol各dNTP(Takara)および10U phi29ポリメラーゼ(Biolabs)の溶液中RCA(ローリングサークル増幅)に供した。制限消化産物(EcoR1またはBamH1)をアガロースゲル電気泳動で分離して、溶出し、ベクターpUC19にクローニングした後、配列決定を行った。
【０１２３】
(B)血清、牛乳または脳組織から抽出したDNAのローリングサークル増幅：牛乳およびMS患者由来の死後の脳組織および血清からフェノール-クロロホルムによりDNAを抽出した。全血清試料由来のDNAを、High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche)を使用して抽出した。得られた画分(上記参照)のタンパク質結合画分由来のDNA上のランダムプライマーを用いたRCA(ローリングサークル増幅)、制限消化、クローニングおよび配列決定。使用した隣接するプライマーを、個々の単離したDNA配列およびSphinx1.76またはSphinx2.36の複製遺伝子のいずれかに対して設計し、単一のウシ血清および牛乳、ならびに多発性硬化症患者由来の血清および死後の多発性硬化症脳試料由来のRCA増幅したDNAに対して、逆PCRにおいて使用した。
【０１２４】
実施例2
多発性硬化症の病因についての概念：
ウシ血清、牛乳および多発性硬化症脳由来の環状DNA分子(ウシ因子)の単離(群1)
結腸癌の疫学は、欧州/アジア系の畜牛由来の赤身肉中に存在する感染性因子の関与を示唆し(zur Hausen, 2012; zur Hausen, 2015)、牛乳消費が多発性硬化症に重要な役割を果たすことが疑われている。これらの推定因子を単離するための試みにおいて、120頭の健常な5歳のウシ由来の血清を、University of Leipzigの獣医学部から得て、環状エピソームDNAの存在について分析した。第1の単離物HCBI6.252(健常畜牛血液単離物)(2522bp)およびHCBI6.159(1591bp)は、プリオン関連症状に関連する動物の脳病変中で見られた配列に関するDNAについての遠い関連性を示した(Manuelidis, 2011)。そのため、本発明者らは、MS患者由来の8個の血清(再発患者由来)、2個のCSFおよび1個のPBMC、ならびに死後の脳組織由来の12個の生検を、Sphinx関連配列について同時に分析した。Sphinx1.76 (1758bp、受託番号HQ444404) に関する2個の環状DNA分子MSBI1.176(多発性硬化症脳単離物)(1766bp)およびMS2.176(1766bp)を、MS脳試料から単離した。牛乳の消費後にMSリスクの増加が見られるので、本発明者らは、関連DNAの存在について、市販の低温殺菌牛乳を調査した。実際に、本発明者らは、合計4個の牛乳試料(CMI1.252(牛乳単離物)、CMI2.214、CMI3.168およびCMI4.158)からエピソーム一本鎖DNA分子を単離した(HCBI6.252とCMI1.252はほとんど同じである)。これは、これらの因子の牛乳排出が実際に起こっていることを示した。
【０１２５】
本発明者らは、全てのヒトおよびウシ試料に対する逆PCRについて、Sphinx1.76上で設計した2つのプライマーペアを使用した。これらのプライマーペアは：フォワード5'-GGATTAATGCCAATGATCC-3'(nt721-739)、リバース5'-CGAGAGAAACAGGCAAAG-3'(nt703-720)およびフォワード5'-GAGGACGAATTAATATTACAAGTC-3'(nt868-891)、リバース5'-TTACCAAGAAAAGCGAGAAC-3'(nt848-867)であった。得られた配列は全て、Sphinx1.76単離物と、遠く類似する(79%〜98%の範囲)。HCBI6.159は、それらの重複配列が同じであるので、見かけ上HCBI6.252の欠失から生じたものであった(HCBI6.252におけるnt1129-2060の欠失)。HCBI6.159はHCBI6.252から独立して単離されたため、これが人工的である可能性は非常に低い。MSBI1.176は、Sphinx1.76と98%同一であるが、単一配列の性質(パターン)の違いは、これらを2つの別個の因子とみなし得るものであった。Sphinx1.76構築物は、本発明者らの研究室では利用できなかったので、実験室の汚染により得られなかった。本発明者らは、同じ脳生検から第2の非常に遠いSphinx1.76関連(しかしサイズは同じである)環状DNA分子MSBI2.176を単離した。
【０１２６】
群1の単離物の大きいORFは、それらの間で高い類似性を有する複製タンパク質をコードする(ProtSweep, del Val et al., 2007)。別の共通の特徴は、iteron様タンデムリピート(それぞれの単離物中3x22nt + 17/18ntの反復)の存在である。この反復領域の整列により、コアにおけるわずか一つのヌクレオチドの変化が示される(図6)。これらのiteron様リピートは、Repタンパク質についての結合部位を構成し得る(Chattoraj, 2000, Dziewit et al., 2013)。
【０１２７】
ヌクレオチド配列受託番号：8個の単離物の完全配列を、以下の受託番号でEMBL Databankに寄託した：
CMI1.2522    受託番号LK931487
CMI2.214    受託番号LK931488
CMI3.168    受託番号LK931489
CMI4.158    受託番号LK931490
MSBI1.17    受託番号LK931491
MSBI2.176    受託番号LK931492
HCBI6.252    受託番号LK931493
HCBI6.159    受託番号LK931494
【０１２８】
この文脈において、Manuelidisに記載される同様の配列は主にCNSにおいて見られるので、CNSの疾患(例えば、多発性硬化症MS、筋萎縮性側索硬化症、伝染性海綿状脳症/プリオン関連疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病)も非常に興味深いものであった。
【０１２９】
実施例3
ウシ血清由来のウシ因子の同定(群2)
ウシ血清由来のDNAを抽出して、次いでDNAのローリングサークル増幅を行った。Sphinx2.36の複製遺伝子(2364bp、受託番号HQ444405)(Manuelidis 2011)に対して設計した隣接するプライマー(フォワード(nt2313-2336) 5'CTAATGCAGATCAACACAGGGATA-3'およびリバース(nt2312-2291) 5'-GAATTACAGGCTTTGCAATCTG-3')を使用したPCR増幅により、1つの環状DNA単離物HCBI7.228(2280bp、受託番号LK931498)(群2)が得られた。
【０１３０】
実施例4
一本鎖DNAウイルス、myco-様ゲミサーキュラーウイルスesの新規の群に遠く関連するウシ血清および多発性硬化症血清からの配列の単離(群3)
多くの環状ssDNAウイルスは、メタゲノミック(metagenomic)分析により最近同定された(Rosario et al., 2012a)。ゲミサーキュラーウイルスesの群は、真菌、種々の動物の糞および植物の葉から単離された(Rosario et al., 2012b; Sikorski et al. 2013)。本発明者らは、このウイルス群に遠く関連する3つの新規のウイルスのゲノムの単離を報告する。
【０１３１】
2つの配列HCBI8.215 (2152bp)およびHCBI9.2112 (2121bp)は、ウシ血清プールの密度勾配分画後に単離された。制限消化(BamH1およびEcoR1)後に得られた断片をpUC19にクローニングした。それらの全長ゲノムは、隣接するプライマーを使用して逆PCRにより検証された。隣接するプライマーおよび逆PCRを用いて回収した(rescued)1つの多発性硬化症血清単離物MSSI2.225は、畜牛血清から単離したmyco-様ゲミサーキュラーウイルスes(HCBI8.215およびHCBI9.212)と関連した。本発明者らは続いて、死後のMS罹患脳組織から配列MSBI3.224を単離し、これはMSSI2.225と同一であることが明らかになった。
【０１３２】
3つ全ての単離物のゲノム組織化により、負の鎖(negative strand)上でコードされる推定のスプライシングされた複製タンパク質および正の鎖(positive strand)上でコードされるコートタンパク質(CP)が明らかにされた。CPは、アルギニンリッチであり、TTV ORF1タンパク質との類似性はDomainSweep分析により示された(del Val et al., 2007)。それぞれの推定ローリングサークルモチーフI、IIおよびIIIならびにWalker Bモチーフは以下のように同定された：HCBI8.215 (LLTYA、HLHAFVD、YAIKD；VFDDI)、HCBI9.212 (LLKMP、HYHIYLG、YVGKD；VFDDI)およびMSSI2.225 (LLTYP、HLHAFVD、YAIKD；IFDDF)。GRSモチーフは、それぞれAVFDVGGFHPNISITK、TAFDYFGAHGNIKSIRおよびRAFDVEGCHPNVSPSRであった。HCBI8.215およびMSSI2.225の両方についてのnonaヌクレオチドモチーフは(TAATGTTAT)およびHCBI9.212について(TAATATTAT)である。
【０１３３】
これら3つの単離物は、それらのカプシドタンパク質がアネロウイルス(Anelloviridae)ファミリー由来のTTウイルスのORF1と類似性を有するので、おそらくウイルスの新規の群を構築し、ゲミサーキュラーウイルスesと同様に植物ウイルスファミリージェミニウイルス(Geminiviridae)のものではない。動物および疾患を有するヒト組織に直接由来するこれら3つのゲミサーキュラーウイルス関連ゲノムの単離は、多発性硬化症などの疾患についていくつかの疫学的関連性を有するように関連付ける。
HCBI8.215    受託番号LK931483
HCBI9.212    受託番号LK931484
MSSI2.225    受託番号LK931485
【０１３４】
実施例5
ヒト血清由来の細菌プラスミド関連環状DNA(群4)
サイクロバクター種は、食物汚染として頻繁に存在し、脳、脳脊髄液および血液を含むヒト組織から単離された。これは日和見的ヒト病原体とみなされる(Caspar et al., 2013; Lloyd-Puryear et al., 1991)。本発明者らは、再発中の多発性硬化症患者から得られた血清由来の環状DNA分子の単離、MSSI1.162を報告する。
【０１３５】
多発性硬化症を有する患者の血清から抽出されたDNAに対してローリングサークル増幅および制限消化を行った。得られた断片をベクターpUC19にクローニングした。最初に同定された配列に対して設計されたプライマーを使用して逆PCR増幅により全長ゲノムを検証した：フォワードプライマー5'-GACTTCTGATTGATTGATGCCTG-3'およびリバース5'-CCTGTTGAATACCGCTTAAATACT-3'。全ての産物はプライマーウォーキングにより配列決定した。MSSI1.162(多発性硬化症血清単離物)(1627bp)(受託番号LK931486)は、BlastN分析により、サイクロバクター種PRwf-1のpRWF102プラスミドに対して66%のヌクレオチド類似性を有する。大きなORFにコードされる推定タンパク質(321アミノ酸)は、ProtSweepによる分析の際に、大腸菌の複製タンパク質ファミリーに対して弱い類似性を示す(del Val et a., 2007)。
【０１３６】
この新規の単離物は、公知のサイクロバクター種およびそのプラスミドとわずかに遠く関連する。そのためこれは、まだ知られていないヒト病原菌であり得る。
【０１３７】
概要：
健常なウシの血清中の推定感染性因子およびそれらの核酸の存在は、赤身肉中にも同様の粒子が存在することを示唆するはずである。
【０１３８】
本発明者らは、畜牛血清および牛乳ならびにMS脳組織および血清から13個の新規の一本鎖DNA分子を単離した。これらの単離物を、Sphinx1.76ゲノム(群1)、Sphinx2.36ゲノム(群2)、myco-様ゲミサーキュラーウイルスes(群3)およびサイクロバクター種プラスミド(群4)に対する配列類似性に従って4群に分ける。それらのゲノム組織化を図5A、Bに示す。全配列の主要な特徴は複製関連タンパク質をコードするORFの存在である。
【０１３９】
全ての単離物は、一本鎖DNAのRCA増幅の偏りのために一本鎖DNAであると推定される(del Solar et al., 1998)。この時点での単離物の分類学的分類は可能ではない。群3のみが、myco-様ゲミサーキュラーウイルスesと明確に関連すると定義され得る。この比較的新規のウイルスの群は、メタゲノミクス(metagenomics)により同定され、主に、多様な動物および昆虫の糞、ならびに植物および真菌から単離された。これらは、植物のジェミニウイルス(Geminiviruses)といくつかの特徴を共有する(Sikorski et al., 2013)。動物またはヒトの組織からの単離は依然として説明されていない。本願に記載される3つ全ての単離物の推定複製関連タンパク質は、ヒト一本鎖TTウイルスと類似性を有するアルギニンリッチ領域を有する。
【０１４０】
かかる因子によるヒト細胞の感染は、ヒトTTウイルスとは全く異なる強い免疫反応を誘起するはずであり、垂直伝達の妥当な証拠が得られている(zur Hausen and de Villiers, 2014に概説)。これにより、人生の最初の15年間のMS発症についての環境要因に対する高い罹患率が説明され得た：主な感染は、最初に、複数回(rounds)の複製およびおそらくは血球細胞を介するBMFの拡散を引き起こし得、最終的に潜在性の脳細胞感染を引き起こし得る。この最初の感染は、おそらくはその後の複数回の感染において脳への進入前に因子を中和する免疫応答を誘導するはずである。本明細書において、該単離物は、推定牛乳因子(BMF)についての優れた候補であると思われることが報告される。
【０１４１】
群1においてサイズの高い変動性が注目された。環状単離物HCBI6.159は、HCBI6.252からの931ヌクレオチドの欠失により生じたものであると思われる。該単離物は全て、複製遺伝子を有し、共通してiteron様反復領域を有する(Dziewit et al., 2013)。8個の単離物とSphinx1.76の間のこの領域の整列により中心的な同一のコアが明らかになる(図6)。群2および4の単離物は反復領域を有さない。
【０１４２】
「Sphinx」配列(Manuelidis, 2011)は、細菌アシネトバクターのプラスミド配列に対して高い相動性を示す(Vallenet et al., 2008; Longkumer et al., 2013)。本発明で得られた配列も、対応するプラスミド配列に対して顕著な相同性を示す。アシネトバクターからは多くのプラスミドが単離されて配列決定されているが、本発明で報告されたウシおよびヒトの配列に正確に対応するものはほとんどない。興味深いことに、英国の科学者のグループは、アシネトバクタータンパク質に対するが多発性硬化症に苦しむ患者から得られた他の細菌性抗原に対するものではない抗体の選択的な形成の増加について指摘した数年間にわたる血清学的データを公表した(概説記事：Ebringer et al., 2012参照)。これらの結果はChapmanのグループによっては確認されなかった(Chapman et al., 2005)。しかしながら、Chapmanのグループは異なる系統のアシネトバクター(アシネトバクター・カルコアセチクス(Acinetobacter calcoaceticus))を使用したことを強調する必要がある。3つの系統のアシネトバクター(アシネトバクター・ルオウィイ(Acinetobacter lwoffii)、A.ラジオエシステンス(A. radioesistens)および特定の単離物、A. 11171)についてEbringerのグループは、明確な結果を得た。しかしながら、A. junii 17908について得られた結果はより印象が薄く、有意な反応性はほとんど検出可能ではなかった(Hughes et al., 2001)。これらの結果は、本発明者らが系統特異的な反応性を扱っており、この血清反応性は、本発明において得られたDNA配列に対して相同性を示す系統特異的なプラスミドによることを示唆する。
【０１４３】
単離物MSSI1.162(群4)は、サイクロバクター種のプラスミドに対して類似性を有する。Pyschrobacter種は、日和見的ヒト病原体であるとみなされており(Caspar et al., 2013)、髄膜炎の症例から単離されている(Lloyd-Puryear et al., 1991)。これらの細菌は、肉の冷凍保存中およびその後の汚染菌であることが繰り返し報告されており(de Filippis et al., 2013)、牛乳および種々のチーズから頻繁に単離された(Coton et al., 2012)。
【０１４４】
Manuelidisが「大」(2.36)および「小」(1.76) Sphinxとして標識された2つの「Sphinx構造」を報告したことに注目することは興味深い。本発明の配列のほとんどは、その単離物とは実質的に異なったが、本発明者らは、同じプローブから大および小Sphinx様配列も得た。環状HCBI6.159は、HCBI6.252からの931ヌクレオチドの欠失により生じたものであると思われる。他のより大きな単離物が単離されなかったより小さな対応物を有し得るということを排除することはできない。しかしながら、本発明において見出された2つの構造が、同じタンパク質コート内に維持されるかまたはそれらが互いに相補的であるかを決定する必要が残っている。
【０１４５】
畜牛血清由来の同一の一本鎖環状核酸のたとえ一部であっても、類似の市販の牛乳および顕症期MS組織のDNAの単離は、上述の概念の利益を示す。
【０１４６】
参考文献
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【０１４７】
参考文献(実施例2〜5)
【０１４８】
【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【０１４９】
本発明の態様として、以下のものが挙げられる。
［１］(a)図1〜4のいずれかに示されるヌクレオチド配列；
(b) (a)のヌクレオチド配列と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列；
(c) (a)もしくは(b)のヌクレオチド配列の断片；
(d) (a)、(b)もしくは(c)のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列；または
(e)上述のヌクレオチド配列のいずれかと比較して、遺伝子コードの縮重の結果重複するヌクレオチド配列
を含む、HCBI、MSBI、MSSIまたはCMIポリ核酸。
［２］［１］記載のHCBI、MSBI、MSSIまたはCMIポリ核酸の一部を含むオリゴヌクレオチドプライマーであって、［１］におけるヌクレオチド配列を含む特定のHCBI、MSBI、MSSIまたはCMI単離物の核酸を特異的に配列決定または特異的に増幅するためのプライマーとして作用し得る、プライマー。
［３］［１］記載のHCBI、MSBI、MSSIまたはCMIポリ核酸の一部を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、［１］のヌクレオチド配列を含む特定のHCBI、MSBI、MSSIまたはCMI単離物の核酸の特異的検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして作用し得る、プローブ。
［４］原核生物、真核生物またはウイルスの転写調節因子および翻訳調節因子に操作可能に連結される、［１］〜［３］いずれか記載のHCBI、MSBI、MSSIまたはCMIポリ核酸を含む、発現ベクター。
［５］［４］記載の発現ベクターで形質転換または改変される宿主細胞。
［６］［１］記載のHCBI、MSBI、MSSIまたはCMIポリ核酸によりコードされるポリペプチド。
［７］［６］記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
［８］癌、CNSの疾患または糖尿病の素因または早期病期の診断のための診断組成物の調製のための、［２］記載のプライマー、［３］記載のプローブ、［６］記載のポリペプチド、または［７］記載の抗体もしくはその断片の使用。
［９］癌が、乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌または直腸癌であり、CNSの疾患が、多発性硬化症MS、筋萎縮性側索硬化症、伝染性海面状脳症/プリオン関連疾患、パーキンソン病またはアルツハイマー病である、［８］記載の使用。
［１０］(a)任意に試料ポリ核酸を抽出する工程、(b)少なくとも1つの［２］記載のプライマー、任意に標識されたプライマーを用いて上述のポリ核酸を増幅する工程、および(c)増幅されたポリ核酸を検出する工程を含む、生物学的試料中の［１］記載のHCBI、MSBI、MSSIまたはCMIポリ核酸の検出のための方法。
［１１］(a)任意に試料ポリ核酸を抽出する工程、(b)上述のポリ核酸と、少なくとも1つの［３］記載のプローブ、任意に、標識されたプローブをハイブリダイズさせる工程、および(c)ハイブリダイズさせたポリ核酸を検出する工程を含む、生物学的試料中の［１］記載のHCBI、MSBI、MSSIまたはCMIポリ核酸の検出のための方法。
［１２］(a)先に定義されるかかるポリペプチドまたは抗体の存在および/または濃度について該生物学的試料を接触させる工程、および(b)前記抗体および/または前記ポリペプチドの間に形成される免疫学的複合体を検出することを含む、生物学的試料中に存在する［６］記載のポリペプチドまたは［７］記載の抗体を検出するための方法。
［１３］［１］記載のHCBI、MSBI、MSSIもしくはCMIポリ核酸の発現を低減または阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、あるいは前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むベクター。
［１４］［７］記載の抗体もしくはその抗原結合断片または［１６］記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、および適切な医薬担体を含む、医薬組成物。
［１５］［１］記載のHCBI、MSBI、MSSIもしくはCMIポリ核酸、または［６］記載のポリペプチドを含むワクチン。
［１６］VLPまたはタンパク質/DNAまたはポリペプチド/DNA複合体または特異的タンパク質または弱毒化された感染性因子を含む、［１５］記載のワクチン。
［１７］癌、CNSの疾患または糖尿病の予防または治療のための医薬の開発のための先導成分(lead component)としての［１］記載のHCBI、MSBI、MSSIもしくはCMIポリ核酸の使用。
［１８］癌が、乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌または直腸癌であり、CNSの疾患が、多発性硬化症MS、筋萎縮性側索硬化症、伝染性海面状脳症/プリオン関連疾患、パーキンソン病またはアルツハイマー病である、［１７］記載の使用。
【図１ａ−１】
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【図１ａ−２】
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【図１ａ−３】
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【図１ａ−４】
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【図１ａ−５】
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【図１ａ−６】
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【図１ｂ−１】
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【図１ｂ−２】
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【図１ｂ−３】
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【図１ｂ−４】
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【図１ｃ−１】
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【図１ｃ−２】
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【図１ｃ−３】
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【図１ｃ−４】
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【図１ｃ−５】
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【図１ｄ−１】
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【図１ｄ−２】
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【図１ｄ−３】
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【図１ｄ−４】
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【図１ｄ−５】
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【図１ｄ−６】
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【図１ｅ−１】
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【図１ｅ−２】
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【図１ｅ−３】
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【図１ｅ−４】
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【図１ｅ−５】
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【図１ｆ−１】
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【図１ｆ−２】
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【図１ｆ−３】
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【図１ｆ−４】
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【図１ｆ−５】
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【図１ｆ−６】
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【図１ｇ−１】
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【図１ｇ−２】
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【図１ｇ−３】
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【図１ｇ−４】
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【図１ｇ−５】
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【図１ｇ−６】
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【図１ｇ−７】
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【図１ｈ−１】
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【図１ｈ−２】
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【図１ｈ−３】
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【図１ｈ−４】
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【図１ｈ−５】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図３ａ−１】
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【図３ａ−２】
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【図３ａ−３】
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【図３ａ−４】
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【図３ａ−５】
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【図３ａ−６】
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【図３ａ−７】
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【図３ａ−８】
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【図３ａ−９】
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【図３ｂ−１】
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【図３ｂ−２】
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【図３ｂ−３】
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【図３ｂ−４】
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【図３ｂ−５】
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【図３ｂ−６】
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【図３ｂ−７】
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【図３ｃ−１】
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【図３ｃ−２】
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【図３ｃ−３】
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【図３ｃ−４】
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【図３ｃ−５】
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【図３ｃ−６】
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【図３ｃ−７】
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【図３ｃ−８】
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【図３ｃ−９】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
2019141042000001.app