(57)【要約】【課題】ＢＡＦＦ及びＢ７ＲＰ１に特異的なタンパク質及びその使用の提供。【解決手段】ＢＡＦＦ及びＢ７ＲＰ１に特異的な二重特異性タンパク質、そのようなタンパク質をコードする核酸、そのようなタンパク質を作製する方法、及びそのようなタンパク質の使用が、本明細書に記載される。ＢＡＦＦ媒介性のヒトＢ細胞の増殖を阻害することができ、かつＢ７ＲＰ１媒介性のヒトＴ細胞の増殖を阻害することができる、二重特異性タンパク質が本明細書に記載される。二重特異性タンパク質は、異なるアミノ酸配列を有する２つの免疫グロブリン重鎖と、異なるアミノ酸配列を有する２つの免疫グロブリン軽鎖とを含むＩｇＧ抗体を含むことができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／７８０，２６０号及び２０１４年２月２１日に出願された同第６１／９４２，７７６号の利益を主張するものであり、それらの各々は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書に記載の二重特異性分子は、タンパク質治療薬の分野に属する。
【背景技術】
【０００３】
大抵の治療用タンパク質は、単一の標的タンパク質に高い特異性で結合し、そうすることにより、この単一の標的タンパク質の活性を妨げる。そのタンパク質は、治療されるヒト疾患を媒介する１つ以上の生物学的経路の一部であり得、したがって、治療用タンパク質は疾患の進行を阻害し得る。しかしながら、治療用タンパク質の有効性は、全ての患者にとって完璧であることは滅多にない。治療用タンパク質の不完全な有効性は、場合によっては疾患の複雑性によるものであるかもしれない。例えば、いくつかの疾患は、複数の生物学的経路によって媒介される場合があるか、または異なる生物学的経路が、臨床的に定義される同じ状態を有する異なる患者において疾患活動性を媒介する上で中心的な役割を果たす場合がある。よって、いくつかの疾患において、少なくとも２つの生物学的経路を同時に阻害することが有利であり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ヒトＢ７関連タンパク質１（Ｂ７ＲＰ１、ＧＬ５０及びＴ細胞共刺激分子（ＩＣＯＳＬＧ）としても知られる）及びヒトＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ、瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバー１３ｂ（ＴＮＦＳＦ１３Ｂ）としても知られる）の両方に結合して生物学的活性を阻害することができる二重特異性タンパク質が本明細書に提供される。ＢＡＦＦは、Ｂ細胞の生存に関与し、Ｂ７ＲＰ１は、Ｔ細胞の共刺激に関与する。したがって、両方のタンパク質の活性を阻害するタンパク質は、Ｂ細胞及びＴ細胞の両方の活性を妨げる。
【０００５】
ＢＡＦＦ媒介性のヒトＢ細胞の増殖を阻害することができ、かつＢ７ＲＰ１媒介性のヒトＴ細胞の増殖を阻害することができる、二重特異性タンパク質が本明細書に記載される。二重特異性タンパク質は、異なるアミノ酸配列を有する２つの免疫グロブリン重鎖と、異なるアミノ酸配列を有する２つの免疫グロブリン軽鎖とを含むＩｇＧ抗体を含むことができる。ＩｇＧ抗体は、ＢＡＦＦ媒介性のヒトＢ細胞の増殖及びＢ７ＲＰ１媒介性のヒトＴ細胞の増殖を阻害することができる。ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体であってもよく、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体であってもよい。二重特異性タンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含むことができる。さらに、二重特異性タンパク質は、配列番号１５またはその変異体を含む重鎖可変領域と、配列番号１４またはその変異体を含む軽鎖可変領域とを含むことができる。そのような変異体配列は、参照配列と比較してアミノ酸１００個当たり１０個以下の単一アミノ酸の欠失、挿入、または置換を含むことができる。
【０００６】
代替の実施形態において、ＢＡＦＦ媒介性のヒトＢ細胞の増殖を阻害することができ、かつＢ７ＲＰ１媒介性のヒトＴ細胞の増殖を阻害することができる二重特異性タンパク質は、（ａ）式Ａ−Ｌ１−Ｐ−Ｌ２−Ｐを有するアミノ酸配列を含むポリペプチド（式中、Ａは、ＩｇＧ抗体の免疫グロブリン重鎖であり、Ｌ１は、存在しないかまたは３〜４０アミノ酸長の第１のリンカーであり、Ｐは、１０〜４０アミノ酸長のＢＡＦＦ結合ペプチドであり、Ｌ２は、存在しないかまたは５〜５０アミノ酸長のペプチドリンカーである）と、（ｂ）免疫グロブリン軽鎖とを含むことができる。（ａ）の免疫グロブリン重鎖及び（ｂ）の免疫グロブリン軽鎖は、Ｂ７ＲＰ１に結合することができ、かつ／またはＢ７ＲＰ１媒介性のヒトＴ細胞の増殖を阻害することができる、（ａ）のポリペプチドの２つの分子及び（ｂ）の軽鎖の２つ分子を含むＩｇＧ抗体を形成することができる。免疫グロブリン重鎖は、Ｌ１のすぐ上流で、そのＣ末端のリジンを欠損している場合がある。ＩｇＧ抗体は、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体であってもよい。ＢＡＦＦ結合ペプチドＰは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列を有することができる。Ｌ１は、配列番号４、３７、３８、３９、または４０のアミノ酸配列を有することができる。Ｌ２は、配列番号５、６、または７のアミノ酸配列を有することができる。二重特異性タンパク質は、配列番号８（ＲＡＳＱＧＩＳＮＷＬＡ）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９（ＡＡＳＳＬＱＳ）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１０（ＱＱＹＤＳＹＰＲＴ）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１１（ＳＹＷＭＳ）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２（ＹＩＫＱＤＧＮＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３（ＥＧＩＬＷＦＧＤＬＰＴＦ）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含むことができる。二重特異性タンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域及び／または配列番号１５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含むことができる。二重特異性タンパク質は、配列番号１９のアミノ酸配列またはその変異体、及び配列番号１７または１８のアミノ酸配列またはその変異体を含むことができる。そのような変異体配列は、参照配列と比較してアミノ酸１００個当たり１０個以下の単一アミノ酸の欠失、挿入、または置換を含むことができる。
【０００７】
さらなる態様において、（ａ）配列番号１７または配列番号１８のアミノ酸配列またはその変異体を含むポリペプチドと、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列またはその変異体を含む別のポリペプチドとを含む二重特異性タンパク質が本明細書に記載される。そのような変異体配列は、参照配列と比較してアミノ酸１００個当たり１０個以下の単一アミノ酸の欠失、挿入、または置換を含むことができる。二重特異性タンパク質は、ＢＡＦＦ媒介性のヒトＢ細胞の増殖及びＢ７ＲＰ１媒介性のヒトＴ細胞の増殖を阻害することができる。二重特異性タンパク質は、（ａ）のポリペプチドの２つの分子と、（ｂ）のポリペプチドの２つの分子とを含む四量体であってもよい。
【０００８】
別の実施形態において、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含むリンカーを含むタンパク質が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、このタンパク質は、ＢＡＦＦ媒介性のヒトＢ細胞の増殖及び／またはＢ７ＲＰ１媒介性のヒトＴ細胞の増殖を阻害することができる。そのようなタンパク質は、配列番号１、配列番号１４、及び／または配列番号１５のアミノ酸配列を含むことができる。そのようなタンパク質は、配列番号６または７によって分離される配列番号１の少なくとも２つのコピーを含むアミノ酸配列を含むことができる。さらなる実施形態において、そのようなタンパク質は、免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖を含むことができ、配列番号６または７は、重鎖のＣ末端の下流に存在してもよい。そのような実施形態において、配列番号６または７は、重鎖及び軽鎖によって結合されるもの以外のタンパク質に結合するペプチドと隣接してもよい。
【０００９】
さらに、本明細書に記載の二重特異性タンパク質のいずれか、または配列番号６もしくは７のアミノ酸配列、及び生理学的に許容される賦形剤を含むタンパク質を含む薬学的組成物が本明細書に記載される。
【００１０】
また、本明細書に記載の二重特異性タンパク質または配列番号６もしくは配列番号７を含むタンパク質のうちの１つに含まれる任意のポリペプチドをコードする核酸も本明細書に記載される。二重特異性タンパク質に含まれるポリペプチドをコードする例示的な核酸として、例えば、配列番号５５、５６、６０、６１、６２、及び６３が特に挙げられる。そのような核酸を含むベクター、ならびにそのようなベクター及び／または核酸を含有する宿主細胞が記載される。さらに、本明細書に記載の二重特異性タンパク質のいずれかをコードする核酸を含有する宿主細胞を核酸が発現される条件下で培養することと、細胞集団または培養培地からタンパク質を回収することとを含む、二重特異性タンパク質を作製する方法が本明細書に記載される。宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、または大腸菌等の細菌細胞であってもよい。
【００１１】
別の態様において、治療有効量の本明細書に記載の二重特異性タンパク質のいずれか、またはそのような二重特異性タンパク質を含む薬学的組成物を患者に投与することを含む、ループス腎炎を含む全身性エリテマトーデスを治療するための方法が本明細書に記載される。別の治療薬は、二重特異性タンパク質の前、後、またはそれと同時に患者に投与することができる。他の治療薬は、副腎皮質ステロイド、抗マラリア薬、レチノイン酸、ＮＳＡＩＤ、シクロホスファミド、デヒドロエピアンドロステロン、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、クロラムブシル、メトトレキサート、タクロリムス、ダプソン、サリドマイド、レフルノミド、またはシクロスポリンであってもよい。
【００１２】
さらなる態様において、治療有効量の本明細書に記載の二重特異性タンパク質のいずれか、または本明細書に記載の二重特異性タンパク質を含む薬学的組成物を患者に投与することを含む治療方法が本明細書に記載され、患者は、ＡＮＣＡ陽性血管炎、関節リウマチ（ＲＡ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、天疱瘡、類天疱瘡、亜急性皮膚エリテマトーデス（ＳＣＬＥ）、多発性硬化症、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、重症筋無力症、グッドパスチャー症候群、糸球体腎炎、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、シェーグレン症候群、全身性硬化症、橋本甲状腺炎、グレーブス病、アジソン病、及び多発性内分泌腫瘍症（ＭＥＮ）からなる群から選択される疾患を有する。
【００１３】
別の態様において、本明細書に記載の二重特異性タンパク質のいずれかまたは配列番号６もしくは配列番号７を含むタンパク質を含む薬学的組成物が本明細書に記載される。薬学的組成物は、例えば、全身性エリテマトーデスまたはループス腎炎の治療のためであってもよい。
【００１４】
別の態様において、本明細書に提供される二重特異性タンパク質のいずれかの薬物としての使用が記載される。
本発明の実施形態の一部の例が以下の項目として示される。
（項目１）
ＢＡＦＦ媒介性のヒトＢ細胞の増殖を阻害することができ、
Ｂ７ＲＰ１媒介性のヒトＴ細胞の増殖を阻害することができる、二重特異性タンパク質。
（項目２）
前記二重特異性タンパク質は、異なるアミノ酸配列を有する２つの免疫グロブリン重鎖と、異なるアミノ酸配列を有する２つの免疫グロブリン軽鎖と、を含むＩｇＧ抗体を含む、項目１に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目３）
前記ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１抗体である、項目２に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目４）
前記ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ２抗体である、項目２に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目５）
前記ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ４抗体である、項目２に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目６）
前記二重特異性タンパク質は、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体である、項目１〜５のいずれか１項に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目７）
配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む、項目１〜６のいずれか１項に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目８）
配列番号１５を含む重鎖可変領域と、配列番号１４を含む軽鎖可変領域と、を含む、項目７に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目９）
（ａ）式Ａ−Ｌ１−Ｐ−Ｌ２−Ｐを有するアミノ酸配列を含むポリペプチド（式中、Ａは、ＩｇＧ抗体の免疫グロブリン重鎖であり、Ｌ１は、存在しないかまたは３〜４０アミノ酸長の第１のリンカーであり、Ｐは、１０〜４０アミノ酸長のＢＡＦＦ結合ペプチドであり、Ｌ２は、存在しないかまたは５〜５０アミノ酸長のペプチドリンカーである）と、
（ｂ）免疫グロブリン軽鎖と、を含む、項目１に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目１０）
（ａ）の前記免疫グロブリン重鎖及び（ｂ）の前記免疫グロブリン軽鎖は、Ｂ７ＲＰ１に結合することができる、（ａ）の前記ポリペプチドの２つの分子及び（ｂ）の前記軽鎖の２つ分子を含むＩｇＧ抗体を形成する、項目９に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目１１）
前記免疫グロブリン重鎖は、Ｌ１のすぐ上流で、そのＣ末端のリジンを欠損している、項目９または１０に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目１２）
前記ＩｇＧ抗体は、ヒトまたはヒト化抗Ｂ７ＲＰ１ＩｇＧ１抗体である、項目９〜１１のいずれか１項に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目１３）
前記抗Ｂ７ＲＰ１抗体は、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ２抗体である、項目９〜１１のいずれか１項に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目１４）
前記抗Ｂ７ＲＰ１抗体は、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ４抗体である、項目９〜１１のいずれか１項に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目１５）
Ｐは、配列番号１のアミノ酸配列（ＬＰＧＣＫＷＤＬＬＩＫＱＷＶＣＤＰＬ）を有する、項目９〜１４のいずれか１項に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目１６）
Ｌ１は、配列番号４０のアミノ酸配列（ＧＧＧＧＧ）を有する、項目９〜１５のいずれか１項に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目１７）
Ｌ２は、配列番号５のアミノ酸配列を有する、項目９〜１６のいずれか１項に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目１８）
Ｌ２は、配列番号７のアミノ酸配列を有する、項目１７に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目１９）
Ｌ２は、配列番号６のアミノ酸配列を有する、項目１７に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目２０）
配列番号８（ＲＡＳＱＧＩＳＮＷＬＡ）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９（ＡＡＳＳＬＱＳ）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１０（ＱＱＹＤＳＹＰＲＴ）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１１（ＳＹＷＭＳ）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２（ＹＩＫＱＤＧＮＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３（ＥＧＩＬＷＦＧＤＬＰＴＦ）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む、項目９〜１９のいずれか１項に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目２１）
配列番号１４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、項目９〜２０のいずれか１項に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目２２）
配列番号１５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、項目９〜２１のいずれか１項に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目２３）
（ｂ）の前記免疫グロブリン軽鎖は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む、項目１５〜２２のいずれか１項に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目２４）
（ａ）の前記ポリペプチドは、配列番号１７または１８のアミノ酸配列を含む、項目１５〜２３のいずれか１項に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目２５）
（ａ）配列番号１７または配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、
（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む別のポリペプチドと、を含む、二重特異性タンパク質。
（項目２６）
（ａ）の前記ポリペプチドの２つの分子と、（ｂ）の前記ポリペプチドの２つの分子とを含む四量体である、項目２５に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目２７）
（ａ）の前記ポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む、項目２５または２６に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目２８）
（ｂ）の前記ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、項目２５または２６に記載の前記二重特異性タンパク質。
（項目２９）
配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含むリンカーを含む、タンパク質。
（項目３０）
ＢＡＦＦ媒介性のヒトＢ細胞の増殖を阻害することができ、かつＢ７ＲＰ１媒介性のヒトＴ細胞の増殖を阻害することができる、項目２９に記載の前記タンパク質。
（項目３１）
配列番号１、配列番号１４、及び／または配列番号１５のアミノ酸配列を含む、項目３０に記載の前記タンパク質。
（項目３２）
項目１〜２８のいずれか１項に記載の前記二重特異性タンパク質、または項目３０もしくは３１に記載の前記タンパク質、及び生理学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
（項目３３）
項目１〜２８のいずれか１項に記載の前記二重特異性タンパク質、または項目３０もしくは３１に記載の前記タンパク質をコードする、核酸。
（項目３４）
項目３３に記載の前記核酸を含む、ベクター。
（項目３５）
項目３３に記載の前記核酸及び／または項目３４に記載の前記ベクターを含有する、宿主細胞。
（項目３６）
項目３５に記載の前記宿主細胞を核酸が発現される条件下で培養することと、
細胞集団または培養培地からタンパク質を回収することと、を含む、二重特異性タンパク質の作成方法。
（項目３７）
前記宿主細胞は、哺乳動物細胞である、項目３６に記載の前記方法。
（項目３８）
前記宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である、項目３７に記載の前記方法。
（項目３９）
前記宿主細胞は、大腸菌細胞である、項目３６に記載の前記方法。
（項目４０）
治療有効量の項目１〜２８のいずれか１項に記載の前記二重特異性タンパク質、項目３０もしくは３１に記載の前記タンパク質、または項目３２に記載の前記薬学的組成物を患者に投与することを含む、全身性エリテマトーデスの治療方法。
（項目４１）
別の治療薬が、二重特異性タンパク質の前、後、またはそれと同時に患者に投与され、
他の治療薬は、副腎皮質ステロイド、抗マラリア薬、レチノイン酸、ＮＳＡＩＤ、シクロホスファミド、デヒドロエピアンドロステロン、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、クロラムブシル、メトトレキサート、タクロリムス、ダプソン、サリドマイド、レフルノミド、またはシクロスポリンである、項目４０に記載の前記方法。
（項目４２）
前記他の治療薬は、ミコフェノール酸モフェチル、副腎皮質ステロイド、抗マラリア薬、メトトレキサート、またはアザチオプリンである、項目４１に記載の前記方法。
（項目４３）
治療有効量の項目１〜２８のいずれか１項に記載の前記二重特異性タンパク質、項目３０もしくは３１に記載の前記タンパク質、または項目３２に記載の前記薬学的組成物を患者に投与することを含み、前記患者は、ＡＮＣＡ陽性血管炎、関節リウマチ（ＲＡ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、天疱瘡、類天疱瘡、亜急性皮膚エリテマトーデス（ＳＣＬＥ）、多発性硬化症、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、重症筋無力症、グッドパスチャー症候群、糸球体腎炎、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、シェーグレン症候群、全身性硬化症、橋本甲状腺炎、グレーブス病、アジソン病、及び多発性内分泌腫瘍症（ＭＥＮ）からなる群から選択される疾患を有する、治療方法。
（項目４４）
項目１〜２８のいずれか１項に記載の前記二重特異性タンパク質、または項目２９〜３１のいずれか１項に記載の前記タンパク質の薬物としての使用。
（項目４５）
項目１〜２８のいずれかに記載の前記二重特異性タンパク質、または項目３０もしくは３１に記載の前記タンパク質を含む、全身性エリテマトーデスの治療のための薬学的組成物。
（項目４６）
項目１〜２８のいずれかに記載の前記二重特異性タンパク質、または項目３０もしくは３１に記載の前記タンパク質を含む、ループス腎炎の治療のための薬学的組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＢＡＦＦ及びＢ７ＲＰ１に結合する二重特異性タンパク質の図。一番上の行にわたって、各構築物の識別子を列挙する。２番目の行にわたって、各構築物の構造に関連する短い説明的な語句を示す。一番下の行は、各構築物の構造の図である。白抜きの楕円は、免疫グロブリン重鎖または軽鎖の定常領域を表す。中に横線が入った楕円は、免疫グロブリン重鎖または軽鎖可変（ＶＨまたはＶＬ）領域を表す。小さな、黒い四角及びループは、ＢＡＦＦ結合ペプチドを表す。ヒンジ領域は、太い縦線として示され、ジスルフィド架橋は、太い横線として示される。図１の「Ｇ４Ｓ」の配列は、配列番号７２に開示される。
【図２Ａ】ヒトＢ細胞増殖アッセイにおける二重特異性タンパク質の活性。図２Ａ（上）及び２Ｂ（下）に示すデータは、実施例１に記載されるように実行したＢ細胞増殖アッセイからのものである。両方のパネルにおいて、Ｘ軸は、アッセイ混合物中に含有される二重特異性タンパク質の濃度（ｌｏｇ［ｎＭ］）を示し、Ｙ軸は、３Ｈ−チミジンの取り込み量（カウント毎分（ｃｐｍ））を示す。各記号の意味は、アッセイした各タンパク質毎に識別子によって示される。識別子の意味は、図１に示され、実施例１で説明される。
【図２Ｂ】ヒトＢ細胞増殖アッセイにおける二重特異性タンパク質の活性。図２Ａ（上）及び２Ｂ（下）に示すデータは、実施例１に記載されるように実行したＢ細胞増殖アッセイからのものである。両方のパネルにおいて、Ｘ軸は、アッセイ混合物中に含有される二重特異性タンパク質の濃度（ｌｏｇ［ｎＭ］）を示し、Ｙ軸は、３Ｈ−チミジンの取り込み量（カウント毎分（ｃｐｍ））を示す。各記号の意味は、アッセイした各タンパク質毎に識別子によって示される。識別子の意味は、図１に示され、実施例１で説明される。
【図３】ヒトＴ細胞増殖アッセイにおける二重特異性タンパク質の活性。示されるデータは、実施例１に記載されるように実行したＴ細胞増殖アッセイからのものである。Ｘ軸は、アッセイ混合物中の二重特異性またはαＢ７ＲＰ１抗体の濃度（ｌｏｇ［ｎＭ］）を示し、Ｙ軸は、Ｂ７ＲＰ１阻害剤を用いない場合のＴ細胞３Ｈ−チミジンの取り込みと比較して、示される濃度のＢ７ＲＰ１阻害剤の存在下におけるＴ細胞の３Ｈ−チミジン取り込みのパーセント（対照のパーセント）を示す。試験した各タンパク質の識別子が示される。
【図４】ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）で刺激したヒト扁桃細胞によるサイトカイン放出。方法は実施例１に記載される。Ｙ軸は、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）キットを製造者の指示に従って使用して測定した種々のサイトカインについて検出されたシグナルのレベルを示す。細胞は、αＢ７ＲＰ１（レーン１）、Ｐ７４２９３（レーン２）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（レーン３）、またはヒトＩｇＧ（レーン４）のいずれかで処理した。アッセイしたサイトカインを図中に示す。
【図５】マウスにおける二重特異性構築物の薬物動態プロファイル。マウスにおいてＰ７１６１７、Ｐ７１６１９、Ｐ７１６２１、Ｐ７１６２２、Ｐ７４２９３、及びＰ７４２９４のｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態特性を評価する方法が実施例１に記載される。実施例１で説明するように、２つの異なるアッセイによって二重特異性タンパク質を検出した：一方では、タンパク質のＦｃ部分のみを検出し（黒塗りのダイヤによって示されるデータポイント；Ｆｃアッセイ）、一方では、タンパク質のＦｃ及びＢＡＦＦ結合部分の両方を検出した（黒塗りの四角によって示されるデータポイント；インタクトアッセイ）。Ｘ軸は、注射後の時間（時間）を示し、Ｙ軸は、血清中で検出されたタンパク質の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。注射した構築物を各パネルに示す。
【図６Ａ】ＢＡＦＦ及びＢ７ＲＰ１に結合するマウス代替物二重特異性分子（「マウス代替物」）によるマウスＢ細胞増殖の阻害。アッセイは、実施例２に記載されるように行った。マウス代替物は、実施例２で説明するように、抗体の免疫グロブリン重鎖のＣ末端に付着したＢＡＦＦ結合ペプチドの２つのコピーを有する抗マウスＢ７ＲＰ１  ＩｇＧ抗体を含む。陽性対照は、ＢＡＦＦ結合ペプチボディ（「αＢＡＦＦ」）であった。マウス代替物及びαＢＡＦＦからのデータを、それぞれ黒塗りの丸及び四角で示す。Ｘ軸は、アッセイにおけるこれらの試験タンパク質の濃度（ｌｏｇ［ｐＭ］）を示し、Ｙ軸は、３Ｈ−チミジンの取り込み（ｃｐｍ）を示す。
【図６Ｂ】マウス代替物によるＢ７ＲＰ１のマウスＴ細胞への結合の阻害。アッセイは、実施例２に記載されるように行った。抗マウスＢ７ＲＰ１  ＩｇＧ抗体（「抗ｍＢ７ＲＰ１」）を陽性対照として用いた。マウス代替物及び抗ｍＢ７ＲＰ１からのデータを、それぞれ黒塗りの丸及び四角によって示す。Ｘ軸は、アッセイにおけるこれらの試験タンパク質の濃度（ｌｏｇ［ｐＭ］）を示し、Ｙ軸は、Ｔ細胞に結合したマウスＢ７ＲＰ１−Ｆｃの％を示す。
【図７】マウスに対するヒツジ赤血球の投与が免疫学的パラメータに与えるｉｎ  ｖｉｖｏ効果。この図に示す全ての結果は、実施例２に記載されるアッセイからのものである。次の通りに各バーの中を埋めることによってマウスを処理したタンパク質を示す：白抜き：抗ｍＢ７ＲＰ１；縦線：αＢＡＦＦ、横線：抗ｍＢ７ＲＰ１及びαＢＡＦＦ、斜め線：マウス代替物、市松模様：ｍＩｇＧ１、及び黒塗り（下のパネルのみ）：ＳＢＲＣを投与しなかったマウス。上のパネル：ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を投与したマウスにおける脾臓Ｂ細胞のパーセンテージ。Ｙ軸は、Ｂ細胞である脾臓からの細胞のパーセントを示す。中央パネル：ＳＲＢＣを投与したマウスにおけるメモリーＴ細胞である脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージ。下のパネル：ＳＲＢＣを投与したマウスからの血清中の抗ＳＢＲＣ抗体のレベル
【図８Ａ】種々のタンパク質で処理したＮＺＢ／ＮＺＷマウスの蛋白尿。方法は実施例２に記載される。各群のマウスの処理を次の通り示す：黒塗りの丸：リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）；黒塗りの四角：マウスＩｇＧ１（アイソタイプ対照、５ｍｇ／ｋｇ）；白抜きの四角：抗ｍＢ７ＲＰ１（４．６８ｍｇ／ｋｇ）；黒塗りの上向きの三角αＢＡＦＦ（１．８８ｍｇ／ｋｇ）；白抜きの上向きの三角：αＢＡＦＦ（１．８８ｍｇ／ｋｇ）及び抗ｍＢ７ＲＰ１（４．６８ｍｇ／ｋｇ）；及び白抜きの下向きの三角：マウス代替物（５ｍｇ／ｋｇ）。Ｘ軸はマウスの年齢（月齢）を示し、Ｙ軸は蛋白尿、すなわち、尿中≧３００ｍｂ／ｄＬのタンパク質を呈するマウスのパーセントを示す。
【図８Ｂ】種々のタンパク質で処理した８．５ヶ月齢のＮＺＢ／ＮＺＷマウスにおける二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に対する抗体のレベル。方法は実施例２に記載される。Ｘ軸は、マウスを処理した分子（複数可）の同一性を次のように示す：１：抗ｍＢ７ＲＰ１（４．６８ｍｇ／ｋｇ）、２：αＢＡＦＦ（１．８８ｍｇ／ｋｇ）、３：αＢＡＦＦ（１．８８ｍｇ／ｋｇ）及び抗ｍＢ７ＲＰ１（４．６８ｍｇ／ｋｇ）、４：マウス代替物二重特異性（５ｍｇ／ｋｇ）、及び５：ｍＩｇＧ１（アイソタイプ対照；５ｍｇ／ｋｇ）。Ｙ軸は、検出された抗ｄｓＤＮＡ抗体のレベルを陽性対照のパーセンテージとして示す。各点は、一匹のマウスからのデータを示す。
【図９Ａ】ＮＺＢ／ＮＺＷマウスにおける抗ｄｓＤＮＡ  ＩｇＧのレベル。方法は実施例２に記載される。種々の群のマウスからのデータは、次のように特定される：１：抗ｍＢ７ＲＰ１（１４ｍｇ／ｋｇ）を投与したマウス、２：αＢＡＦＦ（５．６ｍｇ／ｋｇ）を投与したマウス；３：抗ｍＢ７ＲＰ１（１４ｍｇ／ｋｇ）及びαＢＡＦＦ（５．６ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせを投与したマウス；４：マウス代替物（１５ｍｇ／ｋｇ）を投与したマウス、５：ｍＩｇＧアイソタイプ対照（１５ｍｇ／ｋｇ）を投与したマウス、及び６：ＰＢＳを投与したマウス。レーン１、３、及び４の上のアスタリスクは、これらのレーンのデータとレーン５（ｍＩｇＧ）からのデータとの間の有意な（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．０００１）差を示す。
【図９Ｂ】蛋白尿を有する各群のＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１マウスのパーセンテージ。方法は実施例２に記載される。種々の群のマウスからのデータは、次のように特定される：白抜きの四角：抗ｍＢ７ＲＰ１（１４ｍｇ／ｋｇ）を投与したマウス、黒塗りの上向きの三角：αＢＡＦＦ（５．６ｍｇ／ｋｇ）を投与したマウス、白抜きの上向きの三角：抗ｍＢ７ＲＰ１（１４ｍｇ／ｋｇ）及びαＢＡＦＦ（５．６ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせを投与したマウス、白抜きの下向きの三角：マウス代替物（１５ｍｇ／ｋｇ）を投与したマウス；黒塗りの四角：ｍＩｇＧアイソタイプ対照（１５ｍｇ／ｋｇ）を投与したマウス；及び黒塗りの丸：ＰＢＳを投与したマウス。マウス代替物と抗ｍＢ７ＲＰ１（ｐ＜０．０１）、αＢＡＦＦ（ｐ＜０．０００１）、及びｍＩｇＧ（ｐ＜０．０００１）との間に有意な差が検出された。処理が行われた時間枠を示す。
【図１０】ＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１マウスの腎臓スコア。実施例２で説明するように、腎臓は、マウスが死亡した時（試験終了前に起こった場合）、または試験終了時に回収した。腎臓スコアは、実施例２に記載されるように決定した：より高いスコアは、より重症な腎疾患を意味する。各群のマウスの平均と適切なエラーバーを示す。マウスの群は次の処理を受けた：１）抗ｍＢ７ＲＰ１（１４ｍｇ／ｋｇ）、縦線が入ったバー；２）αＢＡＦＦ（５．６ｍｇ／ｋｇ）、横線が入ったバー；３）抗ｍＢ７ＲＰ１（１４ｍｇ／ｋｇ）及びαＢＡＦＦ（５．６ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせ、窓枠格子の入ったバー；４）マウス代替物（１５ｍｇ／ｋｇ）、市松模様パターンの入ったバー；５）ｍＩｇＧ（１５ｍｇ／ｋｇ）、黒い背景に白い点がついたバー；及び６）ＰＢＳ、黒塗りのバー。アスタリスクは、ｍＩｇＧで処理したマウスからの有意な差を示す：ｐ値＜０．０５（＊）または＜０．００１（＊＊＊）。
【図１１】マウスのコラーゲン誘導性関節炎に対するＢＡＦＦ及び／またはＢ７ＲＰ１の阻害効果。方法は実施例４に記載される。５つの群のマウスを次に示す試験物質で処理した：ｍＩｇＧ、実線で接続された黒い四角；ＰＢＳ、破線で接続された黒い四角；抗ｍＢ７ＲＰ１、破線で接続された黒丸；αＢＡＦＦ、実線で接続された白丸；及び抗ｍＢ７ＲＰ１及びαＢＡＦＦの組み合わせ、実線で接続された黒丸。上のパネルは、種々の群の関節炎の発生率を示し、下のパネルは、群の平均関節炎スコアを示す。各パネル内の縦の下向きの矢印は、ウシコラーゲンを用いた２回目の免疫化の時間を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
【表Ａ−１】
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【表Ａ−２】
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【表Ａ−３】
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【表Ａ−４】
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【００１７】
Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ；ＢＬＹＳ、ＴＡＬＬ１、ＴＨＡＮＫ、またはＴＮＦＳＦ１３Ｂとしても知られる）及びＢ７関連タンパク質１（Ｂ７ＲＰ１；ＩＣＯＳリガンド、ＩＣＯＳＬ、ＬＩＣＯＳ、Ｂ７相同体２、Ｂ７Ｈ２、及びＧＬ５０としても知られる）の両方に結合して阻害する二重特異性タンパク質、それらの二重特異性タンパク質をコードする核酸、ならびにそれらのタンパク質を作製及び使用する方法が、本明細書に提供される。二重特異性タンパク質は、ＢＡＦＦ媒介性のＢ細胞の増殖及びＢ７ＲＰ１媒介性のＴ細胞増殖の両方を阻害することができる。別の態様において、二重特異性タンパク質は、Ｂ７ＲＰ１のＴ細胞への結合を阻害することができる。そのような二重特異性タンパク質は、２つの異なる免疫グロブリン重鎖及び２つの異なる免疫グロブリン軽鎖を含むＩｇＧ抗体であってもよく、一方の重鎖／軽鎖対がＢＡＦＦに結合し、他方がＢ７ＲＰ１に結合する。代替として、二重特異性タンパク質のＢ７ＲＰ１結合タンパク質は、２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖を含むＩｇＧ抗体を含むことができ、二重特異性タンパク質のＢＡＦＦ結合タンパク質は、任意選択的に、免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖のＮ末端、免疫グロブリン重鎖のカルボキシ末端、ならびに／または免疫グロブリン重鎖のＣＨ２及び／もしくはＣＨ３領域を介して、抗Ｂ７ＲＰ１抗体に融合していてもよい１つ以上のＢＡＦＦ結合ペプチドを含むことができる。
【００１８】
定義
本明細書で意味する「抗体」は、重鎖及び／または軽鎖免疫グロブリン可変領域を含むタンパク質である。
【００１９】
本明細書で意味する「二重特異性」タンパク質は、いくつかの実施形態においてタンパク質である２つの異なる分子に特異的に結合することができるタンパク質である。例えば、いくつかの実施形態において、二重特異性タンパク質は、ＢＡＦＦ及びＢ７ＲＰ１の両方に結合することができる。
【００２０】
患者が、同じ一般的な時間枠の間に、任意選択的に全く同時に、２つ以上の治療薬を投与される場合、患者は、２つ以上の治療薬を用いた「同時」治療を受けている。例えば、患者が、１つの治療薬を継続的に毎日投与され、同様に、別の治療薬を継続的に１ヶ月に１回投与される場合、その患者は、これらの２つの薬物を同時に投与されていることになる。同様に、各々、２週間毎に投与されるが、同じ日には投与されない２つの異なる治療薬を投与される患者も、２つの治療薬を用いた同時治療を受けていることになる。さらに、１つの治療薬を継続的に１週間に１回、そして別の治療薬を１日１回３日間のみ投与される患者は、これら２つの治療薬を用いて短期間の治療を受けていることになる。
【００２１】
本明細書で意味する「Ｆｃ領域」は、１つ以上のジスルフィド結合によって結合された２つのポリペプチド鎖からなる二量体であり、各鎖がヒンジ領域の一部または全部と、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとを含む。ポリペプチド鎖の各々は、「Ｆｃポリペプチド鎖」と称される。より具体的には、本発明とともに使用されることが企図されるＦｃ領域はＩｇＧ  Ｆｃ領域であり、哺乳動物、例えば、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域であってもよい。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域の中で、少なくとも２つの対立遺伝子型が知られている。Ｆｃポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、哺乳動物のＦｃポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、２０、１５、１２、１０、８、５、または３個以下の単一アミノ酸の置換、挿入、または欠失だけ哺乳動物のＦｃポリペプチドのアミノ酸配列と異なり得る。代替としてまたは加えて、Ｆｃポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、既知のまたは天然に存在するＦｃポリペプチド鎖の配列とは、配列のアミノ酸１００個当たり１０個以下の単一アミノ酸の１０挿入、欠失、または置換だけ異なり得る。いくつかの実施形態において、そのような変異体は、ホモ二量体よりも多くのヘテロ二量体の形成を促進する「ヘテロ二量体を形成する変化」であり得る。Ｆｃポリペプチド鎖内の特定の位置に言及する際、下の表１のヒトＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド鎖のアライメントに示されるように、ＥＵ番号付けシステム（Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９６９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６３：７８−８５）が使用される。
【表１】
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【００２２】
いくつかの位置に、天然に存在する多型が生じ得る。例えば、上に示すＩｇＧ２配列の２８２位のメチオニンは、より典型的には、天然に存在するＩｇＧ２配列においてバリンである。同様に、ＩｇＧ３配列の２９６位のチロシンもフェニルアラニンであってもよい。
【００２３】
「ヘテロ二量体を形成する変化」は、一般的に、ヘテロ二量体性の重鎖二量体、すなわち、同一のアミノ酸配列を有しない二量体化された重鎖の形成を促進する、ＣＨ３領域内の２つの異なるＩｇＧ重鎖における変化を指す。ヘテロ二量体を形成する変化は非対称であってもよく、すなわち、特定の変化を有する１つの重鎖が、異なる変化を有する別の重鎖と対を形成することができる。これらの変化は、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成に不利である。そのような対になったヘテロ二量体を形成する変化の一例は、いわゆる「ノブ・アンド・ホール」置換である。例えば、米国特許第７，６９５，９３６号及び米国特許出願公開第２００３／００７８３８５号を参照されたく、そのような突然変異について記載するその一部が、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で意味する、一対のノブ・アンド・ホール置換を含有する重鎖−重鎖対は、一方の重鎖に１つの置換、そして他方の重鎖に別の置換を含有する。例えば、以下のノブ・アンド・ホール置換は、未修飾の重鎖に見られるものと比較してヘテロ二量体形成を増加させることが分かった：１）一方の鎖にＹ４０７Ｔ、他方の鎖にＴ３６６Ｙ；２）一方の鎖にＹ４０７Ａ、他方の鎖にＴ３６６Ｗ；３）一方の鎖にＦ４０５Ａ、他方の鎖にＴ３９４Ｗ；４）一方の鎖にＦ４０５Ｗ、他方の鎖にＴ３９４Ｓ；５）一方の鎖にＹ４０７Ｔ、他方の鎖にＴ３６６Ｙ；６）一方の鎖にＴ３６６Ｙ及びＦ４０５Ａ、他方の鎖にＴ３９４Ｗ及びＹ４０７Ｔ；７）一方の鎖にＴ３６６Ｗ及びＦ４０５Ｗ、他方の鎖にＴ３９４Ｓ及びＹ４０７Ａ；８）一方の鎖にＦ４０５Ｗ及びＹ４０７Ａ、他方の鎖にＴ３６６Ｗ及びＴ３９４Ｓ；ならびに９）Ｆｃの一方のポリペプチドにＴ３６６Ｗ、他方のポリペプチドにＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ。本明細書で意味する、Ｆｃポリペプチドの突然変異は、次のように表示される。ＥＵ番号付けシステム（Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９６９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６３：７８−８５に提示される）を用いて、通常、ＣＨ３領域内の所与の位置に存在するアミノ酸（１文字コードを使用）は、その後にＥＵ位置番号が記載され、続いて、その位置に存在する代替のアミノ酸が記載される。例えば、Ｙ４０７Ｔは、通常はＥＵ位置４０７に存在するチロシンが、スレオニンに置換されることを意味する。明確にするために、ＥＵの番号付けシステムを下の表１に示す。代替として、またはそのような変化に加えて、新しいジスルフィド架橋を形成する置換がヘテロ二量体の形成を促進することができる。例えば、米国特許出願公開第２００３／００７８３８５号を参照されたく、そのような突然変異について記載するその一部が、参照により本明細書に組み込まれる。ＩｇＧ１Ｆｃ領域内のそのような変化は、例えば、以下の置換を含む：一方のＦｃ−ポリペプチド鎖にＹ３４９Ｃ、他方のポリペプチド鎖にＳ３５４Ｃ；一方のＦｃ−ポリペプチド鎖にＹ３４９Ｃ、他方のポリペプチド鎖にＥ３５６Ｃ；一方のＦｃ−ポリペプチド鎖にＹ３４９Ｃ、他方のポリペプチド鎖にＥ３５７Ｃ；一方のＦｃ−ポリペプチド鎖にＬ３５１Ｃ、他方のポリペプチド鎖にＳ３５４Ｃ；一方のＦｃ−ポリペプチド鎖に��３９４Ｃ、他方のポリペプチド鎖にＥ３９７Ｃ；または一方のＦｃ−ポリペプチド鎖にＤ３９９Ｃ、他方のポリペプチド鎖にＫ３９２Ｃ。同様に、例えば、ＣＨ３−ＣＨ３界面において、１つ以上の残基の電荷を変化させる置換は、ＷＯ２００９／０８９００４に説明されるようなヘテロ二量体の形成を強化することができ、そのような置換について記載するその一部が、参照により本明細書に組み込まれる。そのような置換は、本明細書において「電荷対置換」と称され、１対の電荷対置換を含有するＦｃ領域は、一方の重鎖に１つの置換、そして他方の重鎖に異なる置換を含有する。電荷対置換の一般的な例として以下が挙げられる：１）一方の鎖にＲ４０９Ｄ、Ｒ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、またはＫ４０９Ｅ、他方の鎖にＤ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒ；２）一方の鎖にＮ３９２Ｄ、Ｎ３９２Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、またはＫ３９２Ｅ、他方の鎖にＤ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒ；３）一方の鎖にＫ４３９ＤまたはＫ４３９Ｅ、他方の鎖にＥ３５６Ｋ、Ｅ３５６Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、またはＤ３５６Ｒ；及び４）一方の鎖にＫ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅ、他方の鎖にＥ３５７ＫまたはＥ３５７Ｒ。さらに、両方の鎖における置換Ｑ３５５Ｄ、Ｑ３５５Ｅ、Ｒ３５５Ｄ、Ｒ３５５Ｅ、Ｋ３６０Ｄ、またはＫ３６０Ｒは、他のヘテロ二量体を形成する変化とともに使用される場合、ヘテロ二量体を安定させることができる。特定の電荷対置換は、単独でまたは他の電荷対置換とともに使用することができる。単一対の電荷対置換及びそれらの組み合わせの特定の例として以下が挙げられる：１）一方の鎖にＫ４０９Ｅ、他方の鎖にＤ３９９Ｋ；２）一方の鎖にＫ４０９Ｅ、他方の鎖にＤ３９９Ｒ；３）一方の鎖にＫ４０９Ｄ、他方の鎖にＤ３９９Ｋ；４）一方の鎖にＫ４０９Ｄ、他方の鎖にＤ３９９Ｒ；５）一方の鎖にＫ３９２Ｅ、他方の鎖にＤ３９９Ｒ；６）一方の鎖にＫ３９２Ｅ、他方の鎖にＤ３９９Ｋ；７）一方の鎖にＫ３９２Ｄ、他方の鎖にＤ３９９Ｒ；８）一方の鎖にＫ３９２Ｄ、他方の鎖にＤ３９９Ｋ；９）一方の鎖にＫ４０９Ｄ及びＫ３６０Ｄ、他方の鎖にＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ；１０）一方の鎖にＫ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｄ、他方の鎖にＤ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋ；１１）一方の鎖にＫ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄ、他方の鎖にＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、及びＥ３５７Ｋ；１２）一方の鎖にＫ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄ、他方の鎖にＤ３９９Ｋ；１３）一方の鎖にＫ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄ、他方の鎖にＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ；１４）一方の鎖にＫ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄ、他方の鎖にＤ３９９Ｋ及びＤ３５７Ｋ；１５）一方の鎖にＫ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｄ、他方の鎖にＤ３９９Ｋ及びＤ３５７Ｋ；１６）一方の鎖にＤ３９９Ｋ、他方の鎖にＫ４０９Ｄ及びＫ３６０Ｄ、ならびに１７）一方の鎖にＫ４０９Ｄ及びＫ４３９Ｄ、他方の鎖にＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ。これらのヘテロ二量体を形成する変化のいずれも、本明細書に記載の免疫グロブリンＩｇＧ重鎖の一部であり得る。
【００２４】
本明細書で意味する「ヒト」抗体またはタンパク質は、ヒト起源の核酸配列によってコードされる抗体またはタンパク質である。ヒト抗体もしくはタンパク質は、培養した非ヒト細胞中で作製することができるか、またはヒト抗体もしくはタンパク質をコードする核酸分子が導入されたトランスジェニック生物においてｉｎ  ｖｉｖｏで作製することができる。代替として、ヒト抗体もしくはタンパク質は、培養したヒト細胞中で作製することができるか、またはヒトにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで作製することができる。
【００２５】
本明細書で意味する「ＩｇＧ抗体」は、大抵の天然に存在するＩｇＧ抗体に存在する免疫グロブリンドメイン、すなわち、重鎖可変（ＶＨ）領域、第１の重鎖定常（ＣＨ１）領域、ヒンジ領域、第２の重鎖定常（ＣＨ２）領域、及び第３の重鎖定常（ＣＨ３）領域を含む免疫グロブリン重鎖と、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び軽鎖定常（ＣＬ）領域を含む軽鎖とから本質的になる抗体である。そのような免疫グロブリンドメインの多数の配列は、科学文献を通して、例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎ．Ｉ．Ｈ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に報告されている。本明細書で意味するＩｇＧ抗体は、２つの重鎖及び２つの軽鎖から本質的になる四量体である。ラクダ及びサメに見られるもの等の免疫グロブリン重鎖を２つのみ含み、免疫グロブリン軽鎖は含まない天然に存在する抗体（例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７−３０２；Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５−９０；Ｓｔｒｅｌｔｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １４：２９０１−２９０９）は、本明細書で意味する「ＩｇＧ抗体」ではない。ＩｇＧ抗体は、ヒト抗体であってもよいか、または別の種に由来してもよい。さらに、ＩｇＧ抗体は、天然に存在するＩｇＧ抗体の重鎖または軽鎖のアミノ酸配列と比較して、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または５個以下の単一アミノ酸の置換、挿入、及び／または欠失を含有することができる。
【００２６】
「免疫グロブリン重鎖」は、天然起源の核酸配列によってコードされる免疫グロブリン重鎖と比較して、４０、３０、２５、２０、１５、１０、または５個以下の単一アミノ酸の挿入、欠失、または置換を含有するＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＤ抗体またはその変異体の重鎖を指す。「免疫グロブリンＩｇＧ重鎖」は、天然起源の核酸配列によってコードされるＩｇＧ重鎖のアミノ酸配列と比較して、４０、３０、２５、２０、１５、１０、または５個以下の単一アミノ酸の挿入、欠失、または置換を含有するＩｇＧ抗体またはその変異体からの重鎖に限定される。免疫グロブリン重鎖は、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、及びＣＨ３領域を含む多数の異なる領域またはドメインから本質的になる。いくつかの他のアイソタイプ、すなわち、ＩｇＭ及びＩｇＡにおいて、ＣＨ３領域から下流にさらなる領域が含まれる。その中に含まれる免疫グロブリン重鎖及び領域は、例えば、Ｃａｒａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｒａ，Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｐｐ．２８３−３１４  ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ，Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３（参照により本明細書に組み込まれる）に概説される。さらに、免疫グロブリン重鎖の小領域の多数の配列が当該技術分野で既知である。例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｎ．Ｉ．Ｈ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１を参照されたい。いくつかの場合において、免疫グロブリン重鎖及びいくつかの非免疫グロブリン配列を含むポリペプチド鎖が、本明細書において「重鎖」と称される。
【００２７】
本明細書で意味する「免疫グロブリン軽鎖」は、ヒト抗体または別の種由来の抗体のκまたはλ鎖である。同様に、本明細書で意味する免疫グロブリン軽鎖の中に含まれるのは、天然起源の核酸配列によってコードされる免疫グロブリン軽鎖と比較して、２０、１５、１０、または５個以下の単一アミノ酸の挿入、欠失、及び／または置換を有するタンパク質である。免疫グロブリン軽鎖は、例えば、Ｃａｒａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  ａｎｄ
Ｃａｐｒａ，Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｐｐ．２８３−３１４  ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ，Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３（参照により本明細書に組み込まれる）に概説される。免疫グロブリン軽鎖は、ＶＬ領域及びＣＬ領域を含有する。これらの領域の多数の配列が当該技術分野で既知である。例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ
Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｎ．Ｉ．Ｈ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１を参照されたい。いくつかの場合において、免疫グロブリン軽鎖及びいくつかの非免疫グロブリン配列を含むポリペプチド鎖が、本明細書において「軽鎖」と称される。
【００２８】
本明細書で意味する「免疫グロブリン可変領域」は、ヒト起源であってもよいか、または別の種に由来してもよいＶＨまたはＶＬ領域である。免疫グロブリン可変領域は、例えば、Ｃａｒａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｒａ，Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｐｐ．２８３−３１４  ｉｎ
Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ，Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３（参照により本明細書に組み込まれる）に概説される。同様に、本明細書で意味する免疫グロブリン可変領域の中に含まれるのは、天然起源の核酸配列によってコードされる免疫グロブリン可変領域と比較して、２０、１５、１０、または５個以下の単一アミノ酸の挿入、欠失、及び／または置換を有するタンパク質である。免疫グロブリン可変領域は、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び相補性決定領域３（ＣＤＲ３）として知られる３つの超可変領域を含有する。これらの領域は、抗体の抗原結合部位を形成する。ＣＤＲは、可変性のより低いフレームワーク領域（ＦＲ１−ＦＲ４）内に埋め込まれている。可変領域内におけるこれらの小領域の順序は次の通りである：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。免疫グロブリン可変領域の多数の配列が当該技術分野で既知である。例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｎ．Ｉ．Ｈ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１を参照されたい。
【００２９】
ＣＤＲは、次のようにＶＨ領域配列内に位置してもよい。ＣＤＲ１は、成熟なＶＨ領域のおよそ残基３１で始まり、通常、約５〜７アミノ酸長であり、ほぼ必ずＣｙｓ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ（配列番号２０）に先行される（「Ｘｘｘ」は任意のアミノ酸である）。重鎖ＣＤＲ１に続く残基は、ほぼ必ずトリプトファンであり、しばしば、Ｔｒｐ−Ｖａｌ、Ｔｒｐ−Ｉｌｅ、またはＴｒｐ−Ａｌａである。１４個のアミノ酸が、ほぼ必ずＣＤＲ１の最後の残基とＣＤＲ２の最初の残基との間に存在し、ＣＤＲ２は、典型的には１６〜１９個のアミノ酸を含有する。ＣＤＲ２は、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（配列番号２１）によって直前に先行されてもよく、Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ｉｌｅ／Ａｌａがその直後に続いてもよい。他のアミノ酸は、ＣＤＲ２に先行してもまたは続いてもよい。３２個のアミノ酸が、ほぼ必ずＣＤＲ２の最後の残基とＣＤＲ３の最初の残基との間に存在し、ＣＤＲ３は、約３〜２５残基長であってもよい。Ｃｙｓ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘは、ほぼ必ずＣＤＲ３の直前に先行し、Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｘｘｘ−Ｇｌｙ（配列番号２２）がほぼ必ずＣＤＲ３の後に続く。
【００３０】
軽鎖ＣＤＲは、次のようにＶＬ領域内に位置してもよい。ＣＤＲ１は、成熟な抗体のおよそ残基２４で始まり、通常、約１０〜１７残基長である。ほぼ必ずＣｙｓが先行する。ＣＤＲ１の最後の残基とＣＤＲ２の最初の残基との間には、ほぼ必ず１５個のアミノ酸があり、ＣＤＲ２は、ほぼ必ず７残基長である。ＣＤＲ２は、典型的には、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ、またはＩｌｅ−Ｐｈｅに先行される。ＣＤＲ２とＣＤＲ３との間には、ほぼ必ず３２個の残基があり、ＣＤＲ３は、通常、約７〜１０アミノ酸長である。ＣＤＲ３は、ほぼ必ずＣｙｓに先行され、通常、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｘｘｘ−Ｇｌｙ（配列番号２３）が続く。
【００３１】
本明細書で意味する「リンカー」は、２つのポリペプチドを連結するペプチドである。リンカーは、１〜８０アミノ酸長であってもよい。いくつかの実施形態において、リンカーは、２〜４０、３〜３０、または３〜２０アミノ酸長であってもよい。いくつかの実施形態において、リンカーは、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５アミノ酸長以下のペプチドであってもよい。他の実施形態において、リンカーは、５〜２５、５〜１５、１０〜２０、または２０〜３０アミノ酸長であってもよい。他の実施形態において、リンカーは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０アミノ酸長であってもよい。多くの場合、リンカーは、遊離システイン残基を欠いており（すなわち及びしたがってジスルフィド結合には関与していない）、またＮ−グリコシル化部位を含有しない（すなわち、Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ：Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸であり得る）。
【００３２】
本明細書で意味する「ペプチボディ」は、Ｆｃ領域に融合した１つ以上の生物学的に活性なペプチドである。Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２），ｍＡｂｓ  ４（５）：５８６−５９１（ペプチボディの構造及びその作製方法について説明するその一部が、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００３３】
本明細書で意味する「ペプチド」は、グリコシル化されていてもいなくてもよく、かつ／または修飾されたアミノ酸を含有してもしなくてもよい短いアミノ酸配列からなるポリペプチドである。ペプチドは、２〜７５アミノ酸長であってもよい。いくつかの実施形態において、ペプチドは、３〜６０、３〜５０、３〜４０、３〜３０、または３〜２０アミノ酸長である。他の実施形態において、ペプチドは、５〜２５、５〜１５、１０〜２０、または２０〜３０アミノ酸長であってもよい。他の実施形態において、ペプチドは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０アミノ酸長であってもよい。
【００３４】
疾患を治療するために使用される薬物の「治療有効量」は、疾患の重症度を軽減するか、疾患もしくはその治療に関連する１つ以上の症状の重症度を軽減するか、または治療された状態の後に特定の頻度で起こり得るより深刻な症状もしくはより深刻な疾患の発症を遅延させることができる量である。
【００３５】
本明細書に記載の任意の疾患の「治療」は、疾患の少なくとも１つの症状の緩和、疾患の重症度の軽減、またはいくつかの場合において、疾患を伴い得るか、もしくは少なくとも１つの他の疾患を引き起こし得るより深刻な症状への疾患進行の遅延もしくは予防を包含する。治療は、疾患が完全に治癒したことを意味する必要はない。有用な治療剤は、疾患の重症度を軽減するか、疾患もしくはその治療に関連する１つ以上の症状の重症度を軽減するか、または治療された状態の後に特定の頻度で起こり得るより深刻な症状もしくはより深刻な疾患の発症を遅延させるだけでよい。例えば、疾患が炎症性腸疾患である場合、治療として使用される治療剤は、腸内の個別の炎症部位の数を減少させることができるか、または罹患した腸の全体的な程度を低減することができる。それは、疼痛及び／もしくは腫脹を軽減するか、下痢、便秘、もしくは嘔吐等の症状を軽減するか、かつ／または腸の穿孔を予防することができる。患者の状態は、バリウム注腸もしくは注腸後に行われるＸ線、内視鏡検査、大腸内視鏡検査、及び／または生検等の標準的技術によって評価することができる。適切な手技は、患者の状態及び症状に従って異なる。同様に、治療される疾患が全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である場合、後に説明するように、スコアリングのためのＳＬＥＤＡＩ指数を使用して疾患活動性を評価することができる。
【００３６】
ＢＡＦＦ及びＢ７ＲＰ１に結合する二重特異性タンパク質
Ｂ７ＲＰ１及びＢＡＦＦに結合し、かつ／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＢ７ＲＰ１媒介性Ｔ細胞増殖及びＢＡＦＦ媒介性Ｂ細胞増殖を阻害することができる二重特異性タンパク質が本明細書に開示される。本明細書に記載の二重特異性タンパク質が結合するＢＡＦＦ及びＢ７ＲＰ１タンパク質は、ヒトタンパク質であってもよく、かつ／または、特に、カニクイザル、アカゲザル、チンパンジー、マウス、及び／もしくはウサギ等の別の種由来のタンパク質であってもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の二重特異性タンパク質は、例えば、ヒト（ホモ・サピエンス）及びカニクイザル（マカク・ファシキュラリス）の両方のＢ７ＲＰ１及びＢＡＦＦタンパク質に結合することができる。
【００３７】
いくつかの実施形態において、これらの二重特異性タンパク質は、Ｂ７ＲＰ１結合部分及びＢＡＦＦ結合部分が、各々、免疫グロブリンＩｇＧ重鎖及び免疫グロブリン軽鎖から本質的になる二重特異性ＩｇＧ抗体であってもよい。そのため、そのような二重特異性抗体は、２つの異なる免疫グロブリン重鎖及び２つの異なる免疫グロブリン軽鎖を含有する。これら２対の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖は、一緒になって、完全な二重特異性ＩｇＧ抗体を形成する。二重特異性ＩｇＧ抗体は、当該技術分野で既知であり、また、二重特異性抗体の多くの他の形態も既知である。例えば、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，ｐｐ．１−２８  ｉｎ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｕｒｇ，２０１１（これらの抗体について記載するその一部が、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。形態に関係なく、ＢＡＦＦ及びＢ７ＲＰ１に結合することができる抗体は、本明細書において企図される。二重特異性ＩｇＧ抗体は、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体であってもよく、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプの抗体であってもよい。いくつかの実施形態において、二重特異性ＩｇＧ抗体は他の部分に接合されてもよい。抗ＢＡＦＦ及び抗Ｂ７ＲＰ１抗体のアミノ酸配列は、当該技術分野で既知である。例えば、米国特許第７，７３７，１１１号及び米国特許出願公開第２０１１／０１１７０９３号を参照されたい。そのような抗体について記載するこれらの文書の一部が、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、そのような二重特異性抗体は、ヘテロ四量体の二重特異性ＩｇＧ抗体の形成を促進する電荷対置換を含む、上に定義したような「ヘテロ二量体を形成する変化」を含むことができる。
【００３８】
他の実施形態において、本明細書に記載の二重特異性タンパク質は、免疫グロブリンＩｇＧ重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を含むＢ７ＲＰ１に結合する抗体と、ＢＡＦＦに結合するペプチドとを含む融合タンパク質であってもよい。ＢＡＦＦ結合ペプチドは、１個、または２、３、４、５、６、７、８個、もしくは最大１６個のコピー等の複数のコピーとして存在することができる。ＢＡＦＦ結合ペプチドは、他の多くの可能な種の中でも特に、マウス、カニクイザル、及び／またはヒト等の種に由来するＢＡＦＦタンパク質に結合してもよい。抗体は、抗Ｂ７ＲＰ１  ＩｇＧ抗体であってもよく、任意選択的に、ヒト及び／またはカニクイザルのＢ７ＲＰ１に結合するヒトまたはヒト化抗体であってもよい。いくつかの実施形態において、リンカーは、抗Ｂ７ＲＰ１  ＩｇＧ抗体の重鎖のＣ末端に付着してもよく、第１のＢＡＦＦ結合ペプチド、別のリンカー、及び第２のＢＡＦＦ結合ペプチドがその後に続いてもよい。任意選択的にリンカーが散在した状態で、第３、第４、第５、第６、第７、第８、または最大第１６までのＢＡＦＦ結合ペプチドが、これら２つの後に続くことができる。代替としてまたは加えて、１、２、３、４、５、６、７、または８個のＢＡＦＦ結合ペプチドを、抗Ｂ７ＲＰ１抗体のいずれかの場所、例えば、免疫グロブリン重鎖もしくは免疫グロブリン軽鎖のＮ末端、またはＣＨ２もしくはＣＨ３領域内のループ領域内に挿入することができる。ＩｇＧ抗体は、ヒトまたはマウス抗体等の哺乳動物の抗体であってもよい。抗Ｂ７ＲＰ１抗体は、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体であってもよい。抗Ｂ７ＲＰ１  ＩｇＧ抗体を含むそのような二重特異性融合タンパク質において、二重特異性タンパク質は、配列番号１７または配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖とを含むことができる。配列番号１７または１８と比較して、３０、２５、２０、１５、１０、５、または３個以下の単一アミノ酸の挿入、欠失、または置換を含有するアミノ酸配列を有する重鎖を含む変異体が企図される。同様に、配列番号１９と比較して、２０、１５、１０、８、７、５、または３個以下の単一アミノ酸の挿入、欠失、または置換を含有するアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖を含む変異体も企図される。そのような二重特異性タンパク質は、配列番号１７または１８のアミノ酸配列またはその変異体を含む２つのポリペプチドと、配列番号１９のアミノ酸配列またはその変異体を含む２つの軽鎖とを含む四量体であってもよい。
【００３９】
前述のような二重特異性融合タンパク質のＢＡＦＦ結合ペプチド部分は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列を含むことができる。そのようなＢＡＦＦ結合ペプチドは、米国特許第７，７３７，１１１号に記載されており、その関連する部分が、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、二重特異性タンパク質に存在するそのようなＢＡＦＦ結合ペプチドのコピーが１、２、３、４、５、６、７、８、９，１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個存在してもよい。ＢＡＦＦ結合ペプチドは、抗Ｂ７ＲＰ１抗体のカルボキシ末端に、例えば、リンカーを介して付着してもよい。例えば、抗Ｂ７ＲＰ１  ＩｇＧ抗体のカルボキシ末端の後に、例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙのアミノ酸配列（配列番号４）を有するリンカーが続いてもよい。他の適切なリンカーの例として、他の多くのリンカーの中でも特に、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３７）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号３８）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（配列番号３９）、及びＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号４０）が挙げられる。このリンカーの後にＢＡＦＦ結合ペプチドが続いてもよい。ＢＡＦＦ結合ペプチドの後に、例えば、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号２４のアミノ酸配列を含む別のリンカーが続いてもよい。他のリンカーを用いることもできる。このリンカーの後に、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む別のＢＡＦＦ結合ペプチドが続いてもよい。
【００４０】
すぐ上に記載した二重特異性融合タンパク質において、または前述の二重特異性ヘテロ四量体のＩｇＧ抗体において、ＶＬ領域は、それぞれ、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含有することができる。ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ抗体のＶＬ領域は、配列番号１４のアミノ酸配列またはその変異体を含むことができ、ＶＨ領域は、配列番号１５のアミノ酸配列またはその変異体を含むことができる。そのような変異体配列は、参照配列と比較してアミノ酸１００個当たり１０個以下の単一アミノ酸の欠失、挿入、または置換を含むことができる。
【００４１】
リンカーを含むタンパク質
それらを含有するタンパク質に好ましい物理的特性を付与する、配列番号５、６、または７のアミノ酸配列を有するリンカーが本明細書に提供される。後述する実施例１に示されるように、２つの特定のリンカー、すなわち、配列番号６及び配列番号７のアミノ酸配列を有するリンカーの使用が、二重特異性分子の発現、安定性、及び粘性等の特性に好ましい影響を与えた。したがって、これらのリンカーを含有する様々なタンパク質は、他のリンカーを含有する同様のタンパク質と比較して、そのような好ましい特性を有する可能性がある。
【００４２】
二重特異性タンパク質の治療的使用
本明細書に記載のＢＡＦＦ及びＢ７ＲＰ１に結合する二重特異性タンパク質は、様々な適応症、特に、自己抗体によって駆動される状態ならびに／またはＴ細胞及びＢ細胞の両方によって媒介される状態の治療薬として使用することができる。そのような状態は、例えば、ＳＬＥ、ループス、腎炎、ＡＮＣＡ陽性血管炎、関節リウマチ（ＲＡ）、皮膚筋炎、多発性筋炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、及びセリアック病等の消化管疾患、天疱瘡、類天疱瘡、及び亜急性皮膚エリテマトーデス（ＳＣＬＥ）等の皮膚の状態、多発性硬化症及び慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）等の神経系の疾患、重症筋無力症等の神経筋疾患、グッドパスチャー症候群及び糸球体腎炎等の腎臓に関与する疾患、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、及び自己免疫性好中球減少症等の血液学的状態、慢性活動性肝炎及び原発性胆汁性肝硬変等の肝臓の状態、シェーグレン症候群、全身性硬化症、ならびに橋本甲状腺炎、グレーブス病、アジソン病、及び複数の内分泌性自己免疫不全（一般的に、糖尿病、甲状腺機能低下症、アジソン病、及び性腺機能不全）を含む内分泌状態を含む。本明細書に記載の二重特異性タンパク質の治療有効量は、これらの状態のいずれかを治療するために該状態に罹患する患者に投与することができる。
【００４３】
一実施形態において、ＢＡＦＦ媒介性Ｂ細胞増殖及びＢ７ＲＰ１媒介性Ｔ細胞増殖を阻害することができる二重特異性タンパク質は、ＳＬＥに罹患する患者を治療するために使用することができる。ＳＬＥは、核自己抗原に対する自己反応性を特徴とする未知の原因の自己免疫疾患である。その臨床症状は非常に多様であるため、それが本当に単一の疾患であるのか、または一群の関連疾患であるのかが疑わしい。Ｋｏｔｚｉｎ（１９９６）Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｃｅｌｌ  ８５：３０３−３０６；Ｒａｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｉｓｅｎｂｅｒｇ（２００８），Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５８：９２９−９３９。症状は以下を含み得る：倦怠感、疲労、発熱、食欲不振、及び体重減少等の全身症状；成人の急性、一過性の顔面皮疹、水疱症、及び、頭頸部の慢性かつ外観を損なう皮疹を含む多様な皮膚症状；関節炎；筋肉痛及び／または筋力低下；僧帽弁肥厚、疣贅、逆流、狭窄、心膜炎、及び虚血性心疾患を含む循環器症状（これらのうちのいくつかは、脳卒中、側線性疾患、心不全、感染性心内膜炎、または弁不全に至る可能性がある）；ＳＬＥにおける罹患率の主要原因である腎炎；認知障害、うつ病、精神病、昏睡、発作性疾患、偏頭痛、及び他の頭痛症状を含む神経症状、無菌性髄膜炎、舞踏病、脳卒中、及び脳神経障害；白血球減少症、血小板減少症、漿膜炎、貧血、凝固異常、脾腫、及びリンパ節腫脹を含む血液学的症状；ならびに種々の消化管異常。Ｉｄ；Ｖｒａｔｓａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｌｕｐｕｓ  Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ，”Ｃｈａｐｔｅｒ３９  ｉｎ  Ｓａｍｔｅｒ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２００１。症状の重症度及び疾患の経過は、大きく異なる。ＳＬＥは、致命的であり得る。
【００４４】
ＳＬＥ患者は、既存のＳＬＥの治療薬を用いた治療の前、後、またはそれと同時に、ＢＡＦＦ及びＢ７ＲＰ１を阻害する二重特異性タンパク質を用いて治療することができる。そのような既存のＳＬＥの治療薬は、プレドニゾン、プレドニゾロン、及びメチルプレドニゾロン等の副腎皮質ステロイド、ヒドロキシクロロキン、キナクリン、及びクロロキン等の抗マラリア薬、レチノイン酸、アスピリン、及び他の非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、シクロホスファミド、デヒドロエピアンドロステロン、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、クロラムブシル、メトトレキサート、タクロリムス、ダプソン、サリドマイド、レフルノミド、シクロスポリン、ベリムマブ、リツキシマブ等の抗ＣＤ２０抗体、ならびにアバタセプト等の融合タンパク質を含む。
【００４５】
ＳＬＥ患者の疾患活動性は、全身性エリテマトーデス疾患活動性指数（ＳＬＥＤＡＩ）等の手段を用いて評価することができ、これは、重症度に従って重み付けされる以下の症状を考慮に入れて疾患活動性のスコアを提供する：発作、精神病、器質性脳症候群、視覚障害、脳神経障害、ループス頭痛、血管炎、関節炎、筋炎、尿円柱、血尿、蛋白尿、膿尿、新たな皮疹、脱毛症、粘膜潰瘍、胸膜炎、心膜炎、低補体、ＤＮＡ結合の増加、発熱、血小板減少症、及び白血球減少症。Ｂｏｍｂａｒｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ａｒｔｈｒ．＆  Ｒｈｅｕｍ．３５（６）：６３０−６４０（その関連する部分が、参照により本明細書に組み込まれる）。本明細書に記載の治療は、ＳＬＥＤＡＩによって測定されるようなＳＬＥの症状を軽減または排除する上で有用であり得る。本明細書に記載の治療の方法は、本明細書に記載の二重特異性タンパク質を用いた治療を開始する前の同じ患者のベースライン値と比較して患者のＳＬＥＤＡＩスコアを改善することができる。
【００４６】
ＳＬＥにおける疾患活動性を評価するための別の方法は、イギリス諸島ループス評価群（ＢＩＬＡＧ）指数であり、これは、医師の治療意図の原理に基づくＳＬＥ患者の疾患活動性評価システムである。Ｓｔｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ
Ｄｉｓ．５５：７５６−７６０；Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｑ．Ｊ．Ｍｅｄ．８６：４４７−４５８。ＢＩＬＡＧについて記載するこれらの参考文献の一部が、参照により本明細書に組み込まれる。ＢＩＬＡＧスコアは、全身（発熱及び疲労等）、皮膚粘膜（他の多くの症状の中でも特に皮疹及び脱毛症）、神経（他の多くの症状の中でも特に発作、偏頭痛、及び精神症状）、筋骨格（関節炎等）、心肺（心不全及び肺機能低下等）、血管炎及び血栓症、腎臓（腎炎等）、ならびに血液の８つの器官に基づく系の各々において、別個の数値及びアルファベットの疾患活動性スコアを与えることによって割り当てられる。同上。本明細書に記載の治療は、ＢＩＬＡＧ指標によって測定されるようなＳＬＥの症状を軽減もしくは排除する上で、または本明細書に記載の二重特異性タンパク質を用いた治療を開始する前のベースライン値と比較して患者のＢＩＬＡＧスコアを高める上で有用であり得る。
【００４７】
ＢＡＦＦ媒介性のＢ細胞の増殖及びＢ７ＲＰ１媒介性のＴ細胞の増殖を阻害する本明細書に記載の二重特異性タンパク質は、関節リウマチ（ＲＡ）を治療するためにも使用することができる。ＲＡは、全身症状を伴う疾患であると同時に、特に関節に関連する症状を伴う慢性疾患である。症状は一般的に滑膜炎を含み、有痛性の間接腫脹、ならびに正常レベルより高いリウマトイド因子、抗シトルリン化タンパク質（抗ＣＣＰ）抗体、及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）等の種々の検査所見の異常、そして赤血球沈降速度（ＥＳＲ）の亢進をもたらす。あまり一般的ではない症状は、例えば、腱、靭帯、血管、心臓、及び肺に関与する種々の関節外症状を含む。疾患活動性は、しばしば、様々な指標を用いて測定することができる。例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２），Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｃａｒｅ  ＆  Ｒｅｓ．６４（５）：６４０−６４７（そのような指標について記載する部分が、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。そのようなスコアリング指標に含まれる要素は、圧痛のある関節の数、腫脹関節の数、機能性評価、及びＣＲＰ、ＥＳＲ等の種々の臨床所見を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態において、ＲＡに罹患する患者は、ＲＡに現在使用されている薬物を用いた治療の前、後、またはそれと同時に、ＢＡＦＦ媒介性Ｂ細胞増殖及びＢ７ＲＰ１媒介性Ｔ細胞増殖を阻害する二重特異性タンパク質を用いて治療することができる。関節リウマチ（ＲＡ）に現在使用されている治療薬は、特に、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（アスピリン及びシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤等）、疾患修飾性抗炎症薬（ＤＭＡＲＤ）（メトトレキサート、レフルノミド及びスルファサラジン等）、抗マラリア薬（ヒドロキシクロロキン等）、シクロホスファミド、Ｄ−ペニシラミン、アザチオプリン、金塩、腫瘍壊死因子阻害剤（エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、及びセルトリズマブペゴール等）、リツキシマブ等のＣＤ２０阻害剤、アナキンラ等のＩＬ−１アンタゴニスト、トシリズマブ等のＩＬ−６阻害剤、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ（トファシチニブ等））の阻害剤、アバタセプト、ならびに副腎皮質ステロイドを含む。
【００４９】
ＢＡＦＦ媒介性のＢ細胞の増殖及びＢ７ＲＰ１媒介性のＴ細胞の増殖を阻害する、治療有効量の本明細書に記載の二重特異性タンパク質は、クローン病または潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患を治療するためにも使用することができる。クローン病は、口腔から肛門までの消化管のあらゆる部分の異常な炎症を伴うが、ほとんどの患者において、異常な炎症は、回結腸、小腸、及び結腸−肛門直腸領域に限定される。典型的には、炎症は非連続性である。一般的な症状は、腹痛、食欲不振、体重減少、発熱、下痢、膨満感及び／または右下腹部の圧痛、便秘、嘔吐、ならびに肛門周囲の不快感及び分泌を含む。他の起こり得る症状は、特に、末梢関節炎、発達遅滞、上強膜炎、アフタ性口内炎、結節性紅斑、壊疽性膿皮症、腎結石、尿希釈及びアルカリ化障害、吸収障害、ならびに胆石を含む。例えば、Ｓｔｒｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＩＩＩ，Ｃｈ．３５（２００１）；Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ３，Ｃｈ．３１（１９９９）を参照されたい。クローン病に罹患する患者から単離したマクロファージは、増大量のＩＬ−１２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及び他の炎症性サイトカインを産生する。
【００５０】
潰瘍性大腸炎は、時にクローン病と区別することが困難であるが、いくつかの点においてクローン病と異なる。第１に、潰瘍性大腸炎は一般的に結腸に限定されるが、クローン病は消化管のあらゆる場所に起こり得る。第２に、炎症が腸の壁または消化管の他の場所を完全に貫通し得るクローン病とは異なり、潰瘍性大腸炎は、主として腸の表層のみの炎症を伴う。最後に、潰瘍性大腸炎は、クローン病に典型的である不連続な炎症部位ではなく、典型的に連続した炎症領域を伴う。クローン病と同様に、潰瘍性大腸炎は主として都市部に見られる。また、家族性集積の症例が存在することから、潰瘍性大腸炎には遺伝的要因が関与している可能性が高い。自己抗体は、クローン病患者よりも潰瘍性大腸炎患者においてより多く観察される。自己抗体は、しばしば結腸上皮細胞の成分を標的とする。中でも最も一般的なのは、カタラーゼ、α−エノラーゼ、及びラクトフェリンに特異性を示す抗好中球細胞質抗体である。いくつかの場合において、そのような抗体は、結腸微生物と交差反応する。
【００５１】
臨床試験において、クローン病の活動性は、クローン病活動性指標（ＣＤＡＩ）を用いてスコア化されることが多い。ＣＤＡＩは、（１）１日当たりの水様便または軟便の回数、（２）１日当たりの腹痛の程度の患者による評価、（３）一般状態の患者による評価（４）関節炎、紅彩炎、ブドウ膜炎、結節性紅斑、壊疽性膿皮症、アフタ性口内炎、裂肛、痔瘻もしくは膿瘍、他の瘻孔、または発熱を含む他の症状の患者による報告、（５）ロモティルまたは他の下痢用のアヘン剤服用についての患者による報告、（６）腹部腫瘤、（７）ヘマトクリット値、及び（８）体重を含む８つの因子に基づいて疾患活動性スコアを提供する。例えば、Ｂｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６），Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．７０：４３９−４４４，（その関連する部分が、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００５２】
潰瘍性大腸炎の症状は変動的である。それらは、下痢、しぶり腹、腹部疝痛、便中の血液及び粘液、発熱、ならびに直腸出血を含み得る。潜在的に生命を脅かす状態である中毒性巨大結腸症（結腸が、約６センチメートルを超えて拡張し、その筋緊張を喪失し得るかつ／または穿孔し得る）も起こり得る。潰瘍性大腸炎に付随し得る他の症状は、末梢関節炎、強直性脊椎炎、仙腸関節炎、前部ブドウ膜炎、結節性紅斑、壊疽性膿皮症、上強膜炎、自己免疫性肝炎、原発性硬化性胆管炎、硬変、ならびに小児における成長及び発達遅延を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態において、クローン病または潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に罹患する患者は、既存のＩＢＤの治療薬を用いた治療の前、後、またはそれと同時に、ＢＡＦＦ及びＢ７ＲＰ１に結合する二重特異性タンパク質を用いて治療することができる。ＩＢＤの既存の治療薬は、例えば、スルファサラジン、５−アミノサリチル酸及びその誘導体（オルサラジン、バルサラジド、及びメサラミン等）、抗ＴＮＦ抗体（インフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、及びセルトリズマブペゴールを含む）、経口または非経口投与用副腎皮質ステロイド（プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ブデソニド、またはヒドロコルチゾンを含む）、副腎皮質刺激ホルモン、抗生物質（メトロニダゾール、シプロフロキサシン、またはリファキシミンを含む）、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、シクロスポリン、タクロリムス、ならびにサリドマイドを含む。
【００５４】
二重特異性タンパク質をコードする核酸
Ｂ７ＲＰ１媒介性Ｔ細胞増殖及びＢＡＦＦ媒介性Ｂ細胞増殖を阻害することができる二重特異性タンパク質をコードする核酸が本明細書に提供される。例えば、配列番号５２は、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＬ領域をコードし、配列番号５３は、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＨ領域をコードする。同様に、配列番号５５及び５６は、２つのＢＡＦＦ結合ペプチドに融合された抗Ｂ７ＲＰ１抗体の重鎖を含むポリペプチドである配列番号１７及び１８のアミノ酸配列をそれぞれコードする。配列番号５７は、前述のヘテロ四量体の二重特異性ＩｇＧ抗体または二重特異性融合タンパク質の一部であり得る抗Ｂ７ＲＰ１抗体の軽鎖をコードする。本明細書に記載の任意のアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列が企図される。同様に、本明細書に開示される配列に対するサイレント変異を含むか、または前述のアミノ酸配列変異体をコードするヌクレオチド配列変異体も、本発明の範囲内に含まれる。より具体的には、アミノ酸１００個当たり１０個以下の単一アミノ酸の挿入、欠失、または置換だけ本明細書に開示されるアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が企図される。
【００５５】
本明細書に記載の二重特異性タンパク質をコードする核酸配列は、本明細書に提供されるアミノ酸配列及び当該技術分野の知識に基づいて当業者によって決定され得る。特定のアミノ酸配列をコードするクローン化されたＤＮＡセグメントを生成する従来の方法の他に、特に、ＤＮＡ  ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＢｌｕｅＨｅｒｏｎ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ，ＵＳＡ）等の企業が、現在、任意の所望の配列の化学合成された遺伝子サイズのＤＮＡを注文に応じて日常的に生産しており、そのようなＤＮＡを生成するプロセスの合理化を行っている。コドン使用頻度は、選択した系における発現を最適化するように調整することができる。
【００５６】
ＢＡＦＦ及びＢ７ＲＰ１に結合する二重特異性タンパク質の作製方法
本明細書に記載の二重特異性タンパク質をコードする核酸は、核酸を発現させる宿主細胞に適切なベクターに挿入することができる。これらの核酸は、当該技術分野で周知のいずれの方法によって宿主細胞に導入されてもよい。使用することができる宿主細胞は、他の多くの細胞の中でも特に、大腸菌を含む細菌、出芽酵母またはピキア・パストリスを含む酵母、ヨトウガ細胞を含む昆虫細胞、植物細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト肝細胞癌細胞、及び２９３細胞を含む哺乳動物細胞を含む。これらの宿主細胞は、導入した核酸が発現するような、かつ培養上清もしくは細胞集団から二重特異性タンパク質を回収できるような条件下で培養することができる。
【００５７】
一般的に、宿主細胞に核酸を導入するために用いられる手順は、核酸が導入される宿主細胞に依存し得る。細菌に核酸を導入する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、電気穿孔または塩化カルシウムによる形質転換が一般的に使用される。酵母に核酸を導入する方法も当該技術分野で周知であり、例えば、酢酸リチウム及びポリエチレングリコールを使用した形質転換法を含む。哺乳動物細胞に異種ポリヌクレオチドを導入する方法は当該技術分野で周知であり、限定されないが、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、ポリヌクレオチド（複数可）のリポソームへの封入、及び核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションを含む。
【００５８】
いずれの宿主細胞に使用される発現ベクターも、ＤＮＡ複製、ベクターを含有する宿主細胞の選択、及び外来性ヌクレオチド配列の発現に必要な配列を含有することができる。そのような配列は、典型的に、以下のヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含むことができる：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、複製終結配列、ドナー及びアクセプタースプライシング部位を含有する完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現させるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択可能マーカー要素。種々の宿主細胞における発現に適した多数の発現ベクターが当該技術分野で既知であり、市販されている。
【００５９】
薬学的組成物、投薬、及び投与方法
本明細書に記載の二重特異性タンパク質を含む薬学的組成物が提供される。そのような組成物は、生理学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤等の１つ以上のさらなる構成成分とともに、治療有効量の二重特異性タンパク質を含むことができる。そのようなさらなる構成成分は、多くの可能性の中でも特に、緩衝剤、炭水化物、ポリオール、アミノ酸、キレート剤、安定剤、及び／または防腐剤を含むことができる。多くのそのようなさらなる構成成分は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（その関連する部分が、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。
【００６０】
本明細書に記載の二重特異性タンパク質の投薬は、所望の効果を達成するように調整することができる。多くの場合、治療される疾患の慢性性質のために反復投与が必要とされる。例えば、本明細書に記載の二重特異性タンパク質は、週に２回、週に１回、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０週毎に１回、または２、３、４、５、もしくは６ヶ月毎に１回投与することができる。各投与日に投与される二重特異性タンパク質の量は、約０．００３６ｍｇ〜約７００ｍｇであってもよい。代替として、用量は、推定される患者の皮膚表面に従って較正されてもよく、各用量は、約０．００２μｇ／ｍ２〜約３５０ｍｇ／ｍ２であってもよい。別の代替例において、用量は、患者の体重に従って較正されてもよく、各用量は、約０．００００５１ｍｇ／ｋｇ〜約１０．０ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【００６１】
二重特異性タンパク質、またはそれらの分子を含有する薬学的組成物は、いずれの実行可能な方法によって投与されてもよい。経口投与では、ある特殊な配合または状況が存在しない場合、胃の酸性環境においてタンパク質の加水分解が生じるため、タンパク質を含む治療薬は、通常、非経口経路によって、例えば注射によって投与される。皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、病巣内、及び腹膜内のボーラス注射が可能な投与経路である。また二重特異性タンパク質は、注入、例えば、静脈内または皮下注入によっても投与することができる。特に、皮膚に関与する疾患の場合、局所投与も可能である。代替として、二重特異性タンパク質は、粘膜との接触によって、例えば、鼻腔内、舌下、膣内もしくは直腸投与、または吸入剤としての投与によって投与することができる。代替として、二重特異性タンパク質を含む特定の適切な薬学的組成物は、経口投与することができる。
【００６２】
本発明を一般論として上述してきたが、以下の実施例を限定ではなく例示の目的で提供する。
【実施例】
【００６３】
実施例１：ヒトの治療用途のためのＢＡＦＦ／Ｂ７ＲＰ１二重特異性分子の設計及び試験
この一連の実験の目的は、（１）ＢＡＦＦ媒介性Ｂ細胞増殖及びＢ７ＲＰ１媒介性Ｔ細胞増殖を阻害し、（２）生物学的アッセイにおいて高度に活性であり、（３）好ましい生物物理学的特性を有する二重特異性分子を発見することであった。ヒトＢＡＦＦを抗ヒトＢ７ＲＰ１  ＩｇＧ抗体（抗ｈｕＢ７ＲＰ１）に結合させるペプチドの融合のための多数の概略的設計を図１に示す。ＢＡＦＦ結合ペプチドの配列は、配列番号１に提供され、抗ｈｕＢ７ＲＰ１の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の配列は、それぞれ、配列番号２５及び配列番号１９に提供される。
【００６４】
どの設計が、生物学的活性を保持しながら最良の生物物理学的特性を有するかを決定するために、図１に図示する二重特異性分子を作製し、試験を行った。ある構築物において、リンカー（配列番号２４のアミノ酸配列を有する「１Ｋリンカー」）が介在するＢＡＦＦ結合ペプチドの２つのタンデムコピーを、抗ｈｕＢ７ＲＰ１の免疫グロブリン重鎖（Ｐ７１６１７）または免疫グロブリン軽鎖（Ｐ７１６１８）のいずれかのＮ末端に融合した。図１を参照されたい。Ｐ７１６１７重鎖のアミノ酸配列は配列番号２６に提供され、Ｐ７１６１７の軽鎖のアミノ酸配列は、抗ｈｕＢ７ＲＰ１の免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列と同じである（配列番号１９）。Ｐ７１６１８軽鎖のアミノ酸配列は配列番号２７に提供され、Ｐ７１６１８の重鎖のアミノ酸配列は、抗ｈｕＢ７ＲＰ１の免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列と同じである（配列番号２５）。２つのＢＡＦＦ結合ペプチドの間に上記１Ｋリンカー（配列番号２４のアミノ酸配列を有する：Ｐ７１６１９）または５Ｘ（Ｇ４Ｓ）リンカー（配列番号７１）を用いて、ＢＡＦＦ結合ペプチドの２つのタンデムコピーを、抗ｈｕＢ７ＲＰ１の免疫グロブリン重鎖（配列番号２５のアミノ酸配列を有する）のＣ末端にも融合した（Ｐ７１６２０）。これら２つの融合構築物の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１６（Ｐ７１６１９）及び配列番号２８（Ｐ７１６２０）に提供される。構築物Ｐ７１６２１において、抗体のＣＨ３ドメインの配列番号２５のアミノ酸配列（抗ｈｕＢ７ＲＰ１抗体の免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列）の残基３５８と３５９の間に、１Ｋリンカーが介在するＢＡＦＦ結合ペプチドの２つのタンデムコピーを挿入した。Ｐ７１６２１構築物の重鎖の配列は、配列番号２９に提供される。構築物Ｐ７１６２２において、ＢＡＦＦ結合ペプチドを抗ｈｕＢ７ＲＰ１の免疫グロブリン重鎖のＣＨ３ドメイン（配列番号２５の残基３５８と３５９の間に挿入し、ＢＡＦＦ結合ペプチドの第２のコピーを重鎖のＣ末端に融合した。Ｐ７１６２２の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号３０に提供される。構築物Ｐ７１６２３において、１つのＢＡＦＦ結合ペプチドをＣＨ２領域（配列番号２５の残基２６８と２６９の間）に挿入し、第２のＢＡＦＦ結合ペプチドをＣＨ３領域（配列番号２５の残基３５８と３５９の間）に挿入した。配列番号３１は、Ｐ７１６２３の重鎖のアミノ酸配列である。構築物Ｐ７１６１９〜Ｐ７１６２３は全て、抗ｈｕＢ７ＲＰ１の免疫グロブリン軽鎖を有する（配列番号１９）。
【００６５】
構築物Ｐ７４２９３及びＰ７４２９４において、構築物Ｐ７１６１９のＢＡＦＦ結合ペプチドの２つのタンデムコピー間のリンカーを修飾した。Ｐ７４２９３及びＰ７４２９４の重鎖のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１７及び配列番号１８に提供される。これらの構築物の免疫グロブリン軽鎖もまた、配列番号１９のアミノ酸配列を有する。
【００６６】
前述の構築物をコードする核酸を次のように作製した。ＢＡＦＦ結合ペプチドの２つのコピー及び免疫グロブリン重鎖または軽鎖可変領域を含む、Ｎ末端ＢＡＦＦペプチド融合物（Ｐ７１６１７及びＰ７１６１８）のＮ末端部分をコードする核酸を合成的に作製した。これらを、都合のよい制限エンドヌクレアーゼ部位を介して、適切なベクター内の免疫グロブリン重鎖または軽鎖定常領域をコードする核酸に連結した。重鎖定常領域Ｃ末端融合物（Ｐ７１６１９及びＰ７１６２０）をコードする核酸、Ｆｃループ挿入物（Ｐ７１６２１及びＰ７１６２３）、及びＦｃループ挿入／Ｃ末端融合物（Ｐ７１６２２）は、全て合成的に作製し、都合のよい制限エンドヌクレアーゼ部位を介して重鎖可変領域を含有するベクター内に連結した。
【００６７】
前述の種々の二重特異性構築物を、一過性にトランスフェクトした２９３細胞及び安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の両方で発現させた。融合タンパク質を精製し、生物学的活性について試験した。これら２つの異なる種類の宿主細胞で産生されたタンパク質において違いは観察されなかった。
【００６８】
ＢＡＦＦ媒介性のヒト一次Ｂ細胞増殖アッセイにおいて、二重特異性分子のＢＡＦＦ阻害活性について試験した。端的に述べると、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）からのヒトＢ細胞キットＩＩを使用して、負の選択を用いて末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からヒトＢ細胞を精製した。５０ｎｇ／ｍｌヒトＢＡＦＦタンパク質、２μｇ／ｍｌヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、及び様々な濃度の前述の二重特異性タンパク質のうちの１つの存在下、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉａ（ＭＥＭ）及び熱失活させた１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中、９６ウェルのマイクロタイタープレートにて、約１０５精製したＢ細胞を５％ＣＯ２中３７℃で４８時間培養した。抗ＢＡＦＦペプチボディを陽性対照として用いた（「αＢＡＦＦ」は、２つのポリペプチド鎖を含有するホモ二量体であり、各々がＦｃポリペプチドに融合された２つのＢＡＦＦ結合ペプチドを含む）。αＢＡＦＦ分子は、米国特許第７，２５９，１３７号に詳しく記載されており、このホモ二量体の１つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は配列番号３２に提供される。αＢＡＦＦについて記載する米国特許第７，２５９，１３７号の一部が、参照により本明細書に組み込まれる。増殖は、インキュベーションの最後の１８時間の間の放射性３Ｈ−チミジンの取り込みよって測定した。結果を図２Ａ及び２Ｂに示す。
【００６９】
図２Ａのデータは、２つのＣ末端融合構築物（Ｐ７１６１９及びＰ７１６２０）が、ＢＡＦＦ媒介性Ｂ細胞増殖の阻害において互いに同等であり、この実験で試験した他の全ての融合構築物よりも強力であることを示している。Ｐ７１６２０は、凝集する傾向にあり、それは治療用タンパク質において非常に望ましくない特性であるため、それ以上探究しなかった。図２Ｂのデータは、Ｐ７１６１９が、ＢＡＦＦ媒介性Ｂ細胞増殖の阻害において、前述のこの構築物の若干修飾された２つの形態（Ｐ７４２９３及びＰ７４２９４）及び陽性対照（αＢＡＦＦ）に匹敵することを示す。したがって、試験した二重特異性構築物の中でも特に、Ｐ７１６１９、Ｐ７１６２０、Ｐ７４２９３、及びＰ７４２９４は、このＢＡＦＦ媒介性Ｂ細胞増殖アッセイにおいて相当な活性を有し、試験した全ての他の構築物よりも良好な活性を有していた。
【００７０】
Ｐ７１６１９、Ｐ７４２９３、及びＰ７４２９４のＢ７ＲＰ１阻害活性を、ヒトＢ７ＲＰ１−Ｆｃ媒介性Ｔ細胞増殖アッセイを用いてアッセイした。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）からのＰａｎ  Ｔ細胞単離キットを使用して健常なヒトドナー由来のＰＢＭＣから一次ヒトＴ細胞を精製し、様々な濃度の前述の二重特異性タンパク質またはＩｇＧ２抗ヒトＢ７ＲＰ１抗体（本明細書において「αＢ７ＲＰ１」と称される）の存在下で、プレート結合抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）抗体及びＢ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質（３μｇ／ｍＬ）で刺激した。４８時間後に３Ｈ−チミジンを細胞に加え、２４時間後に３Ｈチミジンの取り込みを測定した。試験した全ての二重特異性抗体が同様のＩＣ５０を有しており、これはαＢ７ＲＰ１のものと同様であった（図３）。したがって、これらのデータは、ＢＡＦＦ結合ペプチドの抗ｈｕＢ７ＲＰ１抗体への接合が、抗体がＢ７ＲＰ１活性を阻害する能力にほとんど影響を及ぼさなかったことを示唆している。
【００７１】
ヘテロ二量体性の二重特異性抗体Ｐ７４２９３及びＰ７４２９４のＢＡＦＦ及びＢ７ＲＰ１への結合親和性を、Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）；Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ）によって測定した。両方の抗体が、ヒトＢＡＦＦ（約３０ｐＭのＫｄを有する）及びヒトＢ７ＲＰ１（約４０ｐＭのＫｄを有する）に対して高い結合親和性を有する。下の表２を参照されたい。さらに、これらの二重特異性はどちらも、ヒトＢＡＦＦと比較してカニクイザルＢＡＦＦに対して同様の結合親和性を有し、ヒトＢ７ＲＰ１と比較してカニクイザルＢ７ＲＰ１に対して同様の結合親和性を有する。表２。
【表２】
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【００７２】
ヒト細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ系においてＰ７４２９３の活性をさらに評価するために、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）によって活性化したヒト扁桃細胞のサイトカイン産生を種々の試験分子の存在下で評価した。端的に述べると、ヒト扁桃細胞を組織から単離し、以下の分子のうちの１つの存在下においてＳＥＢ（１μｇ／ｍＬ）で刺激した：（１）αＢ７ＲＰ１、（２）Ｐ７４２９３、（３）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（陽性対照）、または（４）ヒトＩｇＧ（陰性対照）。７２時間の培養後、細胞上清を回収し、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙからのキットを製造者の指示に従って使用してサイトカインレベルをアッセイした。結果を図４に示す。
【００７３】
図４の全パネルにおいてそれぞれバー１、２、及び３であるαＢ７ＲＰ１、Ｐ７４２９３、及びＣＴＬＡ４−Ｉｇの３つ全てが、ＩＬ−１７、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、及びＩＦＮγの放出を阻害した。ＩＬ−２の放出は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇによってのみ阻害された。したがって、αＢ７ＲＰ１及び抗ＢＡＦＦ／Ｂ７ＲＰ１二重特異性Ｐ７４２９３は、ＳＥＢで活性化したヒト扁桃細胞によるサイトカイン分泌に対して同等かつ特異的な効果を及ぼした。
【００７４】
３つのヘテロ二量体性の二重特異性タンパク質、すなわち、Ｐ７１６１９、Ｐ７４２９３、及びＰ７４２９４を、さらなる特性について調査した。これらのタンパク質を産生する宿主細胞の培養物からのタンパク質力価は、Ｐ７１６１９が産生されるレベルの約２倍のレベルでＰ７４２９３及びＰ７４２９４が産生されたことを示唆していた。またＰ７４２９３及びＰ７４２９４は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価したところ、４０℃で２週間保存した後にＰ７１６１９よりも安定であった。Ｐ７４２９３が、保存開始時及び４週間の保存後に透明な溶液を形成したのに対し、Ｐ７４３９４を含有する溶液は全ての時点で濁っていた。Ｐ７４２９３及びＰ７４２９４の溶液は、Ｐ７１６１９の溶液よりも粘性が低かった。したがって、Ｐ７４２９３及びＰ７４２９４は、Ｐ７１６１９よりも高いレベルで発現し、また、試験した濃度範囲においてＰ７１６１９よりも安定であり、粘性がより低かった。これらの分子間の最も顕著な違いは、２つのＢＡＦＦ結合ペプチド間のリンカーにある。これらのデータは、Ｐ７４２９３及びＰ７４２９４（配列番号６及び７）のリンカーが、これらの分子に改善された特性を付与できることを示唆している。
【００７５】
記載される二重特異性分子の薬物動態特性をマウスにおいて評価した。オスＣＤ−１マウスに単回静脈内（ＩＶ）用量（５ｍｇ／ｋｇ）の二重特異性融合タンパク質Ｐ７１６１７、Ｐ７１６１９、Ｐ７１６２１、Ｐ７１６２２、Ｐ７４２９３、またはＰ７４２９４を投与した。投薬前、及び投薬後０．５、２、８、２４、４８、７２、９６、１６８、２４０、３３６、４０８、５０４時間に血清試料を採取した。血清中の二重特異性分子の濃度を２つのＥＬＩＳＡ法によって決定した：一方はＦｃ部分の存在を検知し、一方は、Ｆｃ部分及びＢＡＦＦ結合ペプチド部分の両方の存在を検知した。Ｆｃ部分の測定のために、ビオチン化した抗Ｆｃ抗体を捕捉試薬として使用し、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７で標識した抗Ｆｃ抗体を決定試薬として使用した。二重特異性のＢＡＦＦ結合部分及びＦｃ部分を検出するために、ビオチン化したＢＡＦＦタンパク質を捕捉試薬として使用し、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７で標識した抗Ｆｃ抗体を決定試薬として使用した。重鎖のＮ末端（Ｐ７１６１７）、Ｃ末端（Ｐ７１６１９、Ｐ７４２９３、及びＰ７４２９４）、またはＣＨ３ドメイン（Ｐ７１６２１）に融合したＢＡＦＦ結合ペプチドの２つのタンデムコピーを有する二重特異性タンパク質は、マウスにおいて非常に類似したＰＫプロファイルを有する。図５。ＢＡＦＦ結合ペプチドの一方のコピーがＣＨ３ドメインに挿入され、別のコピーが重鎖のＣ末端に融合された二重特異性タンパク質（Ｐ７１６２２）は、他の二重特異性タンパク質と比較してより低い曝露量を有していた。図５。さらに、２つの異なるＥＬＩＳＡアッセイが同様の二重特異性タンパク質の血清中濃度をもたらしたことから、ｉｎ  ｖｉｖｏでは二重特異性タンパク質の顕著な切断は起こらなかったことが示唆される。
【００７６】
Ｐ７４２９３及びＰ７４２９４ヘテロ二量体二重特異性抗体の薬物動態パラメータ及び薬力学的パラメータも、カニクイザルにおける単回投与試験によって評価した。未処理のオスカニクイザル（ｎ＝４）に、Ｐ７４２９３（１０ｍｇ／ｋｇ）の単回ボーラス静脈内投与もしくは皮下投与、またはＰ７４２９４（１０ｍｇ／ｋｇ）の単回皮下投与を行った。どちらの二重特異性分子も、ＩｇＧ抗体と同様のＰＫプロファイルを有する。Ｐ７４２９３及びＰ７４２９４、ならびに抗ｈｕＢ７ＲＰ１について観察された薬物動態パラメータを下の表３に報告する。
【表３】
2019141084.tif 000009
【００７７】
表３のデータは、Ｐ７４２９３及びＰ７５２９４の薬物動態パラメータが互いに同等であり、また抗ｈｕＢ７ＲＰ１抗体のパラメータに匹敵することを示している。
【００７８】
実施例２：マウス二重特異性代理分子の設計及び試験
マウスにおける前臨床試験を実施するために、マウスＢ７ＲＰ１及びマウスＢＡＦＦに結合することができるマウス代替物二重特異性分子（これ以降、「マウス代替物」）を構築した。実施例１に記載した二重特異性構築物を構築するために使用した抗ｈｕＢ７ＲＰ１抗体はマウスＢ７ＲＰ１に結合しないが、これらの構築物に使用したＢＡＦＦ結合ペプチドは、ヒト及びマウス両方のＢＡＦＦに結合する。データは示さず。マウス代替物は、マウス免疫グロブリン定常領域及びラット抗マウスＢ７ＲＰ１免疫グロブリン可変領域のキメラである、拮抗性ＩｇＧ抗マウスＢ７ＲＰ１抗体（本明細書において「抗ｍＢ７ＲＰ１」と称される）を含む。抗ｍＢ７ＲＰ１の使用は、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２：１４２１（１Ｂ７−Ｖ２と表記される）に記載されている。マウス代替物は、短いリンカー（５アミノ酸長）を介して抗ｍＢ７ＲＰ１の免疫グロブリン重鎖のＣ末端に融合されたＢＡＦＦ結合ペプチド（配列番号１）の２つのコピーを有する。ＢＡＦＦ結合ペプチドの２つのコピーは、２３アミノ酸長の別のリンカーによって分離される。重複ＰＣＲを用いてマウス代替物の重鎖をコードする核酸を作製し、αＢＡＦＦのＢＡＦＦ結合部位をコードする核酸を、１Ｂ７−Ｖ２、すなわち、抗ｍＢ７ＲＰ１の重鎖をコードする核酸の下流末端に結合した。
【００７９】
ＢＡＦＦ媒介性Ｂ細胞増殖アッセイにおいて、マウス代替物によるＢＡＦＦ阻害を評価した。製造者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）の指示に従ってＭＡＣＳ  ＣＤ４３（ｌｙ−４８）Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓを用いて、負の選択によりＣ５７ＢＬ／６脾臓から、またはＢ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用してＰＢＭＣから、マウスＢリンパ球を単離した。精製したＢ細胞を様々な濃度のマウス代替物またはαＢＡＦＦの存在下で０．１μｇ／ｍｌ抗ＩｇＭ及び２００ｎｇ／ｍｌ  ＢＡＦＦで刺激した。４日目の３Ｈ−チミジンの取り込みによってＢ細胞増殖を測定した。マウス代替物及びαＢＡＦＦのＩＣ５０は、それぞれ０．５９ｎＭ及び０．７３ｎＭであった。図６Ａを参照されたい。このように、マウス代替物は、αＢＡＦＦの能力に匹敵する能力でＢＡＦＦを効果的に阻害した。
【００８０】
マウス代替物によるＢ７ＲＰ１のその受容体への結合の阻害を測定するために、最初に、抗ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ）抗体で被覆したマイクロタイターウェルでマウス脾細胞を２４時間インキュベートすることによりマウス脾細胞を活性化し、それらのＢ７ＲＰ１受容体の発現を増強した。活性化した脾細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次いで、種々の濃度のマウス代替物の存在下で５μｇ／ｍｌのビオチン化ｍｕＢ７ＲＰ１：Ｆｃとともに４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、次いで、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）接合抗マウスＣＤ３抗体及びストレプトアビジン−フィコエリトリン（ストレプトアビジン−ＰＥ）でさらに２０分間染色した。フローサイトメトリーによりＢ７ＲＰ１−ＦｃのＴ細胞への結合を分析した。マウス代替物及び抗ｍＢ７ＲＰ１のＩＣ５０は、それぞれ４．０１ｐＭ及び２．８ｐＭであった。図６Ｂを参照されたい。したがって、このアッセイにおいて、マウス代替物の活性は抗ｍＢ７ＲＰ１の活性と同様であった。このように、マウス代替物はＢＡＦＦ及びＢ７ＲＰ１の両方を阻害する。
【００８１】
ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）で免疫化したマウスにおいて、マウス代替物のｉｎ  ｖｉｖｏでの薬力学的効果を評価した。端的に述べると、０日目に、ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢）に一次免疫を施し、２８日目に、０．２ｍｌのＰＢＳ中２×１０８ＳＲＢＣを用いて腹腔内注射により追加免疫を投与した。０日目から３３日目まで、５ｍｇ／ｋｇの次の分子の１つでマウス（各分子につきｎ＝５）を週に２回処理した：マウス代替物；αＢＡＦＦ；抗ｍＢ７ＲＰ１；またはマウスＩｇＧ１。ＳＢＲＣを用いた処理は行ったが他の処理は施さなかったマウスが、陽性対照としての役割を果たした。３４日目にマウスを屠殺し、血清及び脾臓を回収した。
【００８２】
脾臓内のＢ細胞及びメモリーＴ細胞の割合を測定するために、セルストレーナーを通して脾臓組織を粉砕することにより脾細胞を回収した。脾細胞を非標識抗ＣＤ１６／３２でプレインキュベートして、抗体のＦＣγ受容体（ＦｃγＲ）への非特異的結合をブロックした。ＰＥ標識抗Ｂ２２０（Ｂ細胞に発現される）で染色することによりＢ細胞の割合を決定した。ＦＩＴＣ接合抗ＣＤ４４、ＰＥ接合抗ＣＤ６２Ｌ、ＡＰＣ接合抗ＣＤ４、及びＰｅｒＣＰ接合抗ＣＤ３で染色することにより、メモリーＴ細胞（ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２ＬｌｏＣＤ４  Ｔ細胞）の割合を決定した。全ての染色抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。Ｂ細胞及びＴ細胞の両方の決定のために、ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）フローサイトメーターを用いてフローサイトメトリーを行い、フローサイトメトリーデータ分析用のＦＬＯＷＪＯ（登録商標）（ＴｒｅｅＳｔａｒ  Ｉｎｃ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）ソフトウェアを使用してデータを分析した。結果を図７に示す。
【００８３】
血清中の抗ＳＢＲＣ抗体のレベルを測定するために、１０μｇ／ｍｌのＳＲＢＣ可溶性抗原で被覆したマイクロタイタープレートを、処理マウスからの希釈した血清とともに室温で２時間インキュベートした。ＨＲＰ接合ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ及びＩｇＭ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を用いて、結合した血清由来のＳＲＢＣ特異的Ｉｇを検出した。ＳＵＲＥＢＬＵＥ（商標）ＴＭＢマイクロウェル用ペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を製造者の指示に従って使用して基質反応を行い、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して光学濃度を読み取った。陽性対照として、いずれの処理も行っていないＳＲＢＣ免疫化マウスからの血清混合物の段階希釈物を各プレートに加え、これらのウェルの読み取り値から標準曲線を構築した。他の試料の抗ＳＢＲＣ抗体のレベルを、この陽性対照のパーセンテージとして図７に報告する。
【００８４】
Ｂ細胞である脾細胞のパーセンテージは、マウスＩｇＧ１で処理したマウスにおいて観察されたパーセンテージと比較して、マウス代替物で処理したマウスにおいて少なかった。図７（上のパネル）。同様の反応がαＢＡＦＦまたはαＢＡＦＦ及び抗ｍＢ７ＲＰ１で処理したマウスにおいて観察されたが、抗ｍＢ７ＲＰ１単独で処理したマウスには観察されなかった。図７（上のパネル）。メモリーＴ細胞に関して、マウス代替物、抗ｍＢ７ＲＰ１、または抗ｍＢ７ＲＰ１及びαＢＡＦＦで処理したマウスは、ｍｕＩｇＧ１で処理したマウスに観察された割合と比較してメモリーＴ細胞の割合が少なかった。図７（中央パネル）。対照的に、αＢＡＦＦを用いた処理は、ｍｕＩｇＧ処理で観察されたものと比較して脾臓内のメモリーＴ細胞集団を変化させなかった。図７（中央パネル）。マウス代替物はまた、血清中の抗ＳＲＢＣ抗体レベルの強力な減少も示したが、これは、ＳＲＢＣを注射しなかったマウスにおいて、抗ｍＢ７ＲＰ１または抗ｍＢ７ＲＰ１及びαＢＡＦＦで処理した場合に観察されたものと同様であった。図７（下のパネル）。αＢＡＦＦ単独で処理したマウスにおいて、ｍＩｇＧ１処理で観察されたレベルと比較して抗ＳＲＢＣ抗体レベルの中程度の阻害が観察された。図７（下のパネル）。これらのデータは、マウス代替物が、ｉｎ  ｖｉｖｏでマウスのＢ細胞及びＴ細胞区画において二重の阻害効果を有することを示している。
【００８５】
試験した分子の各々について２つの異なる用量を用いて、マウス代替物が疾患に与える影響をＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１ループスモデルにおいて評価した。以下の投与計画の各々を用いて、メスＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１マウス（４．５月齢、ｎ＝２０）を、１８週間、腹腔内注射により週２回処理した：５もしくは１５ｍｇ／ｋｇマウス代替物
【化１】
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；４．６８もしくは１４ｍｇ／ｋｇ抗ｍＢ７ＲＰ１
【化２】
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；１．８８もしくは５．６ｍｇ／ｋｇαＢＡＦＦ
【化３】
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；αＢＡＦＦ（１．８８もしくは５．６ｍｇ／ｋｇ）及び抗ｍＢ７ＲＰ１（４．６８もしくは１４ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせ；マウスＩｇＧ１（１５ｍｇ／ｋｇ；アイソトープ対照）；またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（陰性対照）。ＡＬＢＵＳＴＩＸ（登録商標）（Ｂａｙｅｒ，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）を使用して、５月齢から開始して２週間毎に尿中の蛋白尿を測定した。蛋白尿出現率は、２回の連続した測定において少なくとも３００ｍｇ／ｄｌの濃度の尿蛋白を有するマウスのパーセンテージとして表した。ＥＬＩＳＡにより血清抗ｄｓＤＮＡ  ＩｇＧレベルを測定した。８つの異なる種類の病変、すなわち、糸球体毛細血管増殖、メサンギウム細胞過形成、メサンギウム基質の増生、糸球体係蹄接着、部分的な上皮過形成、間質性腎炎、尿細管拡張／蛋白円柱、及び尿細管萎縮／間質性線維症の腎組織試料の調査により、全てのマウスの腎疾患に関するスコアリングを行った。各種類の病変に、可能な最大スコア３２で０〜５の重症度スコアを与えた。各群のマウスのスコアを平均化した。生存を監視した。
【００８６】
１２月齢の時点で、いずれかの用量レベルのマウス代替物で処理したマウスは、蛋白尿を発症しなかった。対照的に、試験した両方の用量レベルのマウスＩｇＧ１またはＰＢＳで処理したマウスの１００％が蛋白尿を呈した。図８Ａ及び９Ｂ。より低い用量レベルの抗ｍＢ７ＲＰ１及びαＢＡＦＦで処理したマウスのそれぞれ約６０％及び３５％、より高い用量レベルの抗ｍＢ７ＲＰ１及びαＢＡＦＦで処理したマウスのそれぞれ約５０％及び２５％が、蛋白尿を発症した。図８Ａ及び９Ｂ。さらに、両方の用量レベルのマウス代替物による処理が、ｍｕＩｇＧ１で処理した陰性対照と比較して抗ｄｓＤＮＡ  ＩｇＧの血清レベルに有意な減少をもたらした。図８Ａ及び９Ｂ。二重特異性処理はまた、ｍＩｇＧ及びＰＢＳ対照群と比較して生存率を著しく改善した。データは示さず。しかしながら、実験終了時には、二重特異性処理と単剤処理との間で生存率に明らかな違いは観察されなかった。
【００８７】
腎疾患の重症度に関する組織学的スコアリングのために、試験が終了する前に死亡したマウスを含む全ての処理マウスからの腎臓を回収した。αＢＡＦＦ、αＢＡＦＦ及び抗ｍＢ７ＲＰ１の組み合わせ、またはマウス代替物で処理したマウスの群は、ｍＩｇＧ１で処理した対照群と比較して有意により低い腎疾患に関するスコアを有していた。図１０。代理二重特異性または組み合わせで処理した群もまた、単剤処理群と比較して腎臓病理の軽減傾向を示した：これは、前述の蛋白尿の結果と十分に相関する結果であった。図１０を図８Ａ及び９Ｂと比較されたい。要約すると、マウス代替物による、またはαＢＡＦＦ及び抗ｍＢ７ＲＰ１を用いた併用処理によるＢＡＦＦ及びＢ７ＲＰ１の二重阻害は、ＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１ループスモデルにおいて疾患の発症及び進行を予防する上で、ＢＡＦＦ（αＢＡＦＦ）のみまたはＢ７ＲＰ１（抗ｍＢ７ＲＰ１）のみの阻害よりも効果的であった。
【００８８】
ＢＡＦＦ及びＢ７ＲＰ１の両方の阻害がマウスのコラーゲン誘導性関節炎の症状を効果的に阻害することができるかどうかを判定するために、次の実験を行った。オスＤＢＡマウスを、０日目に２ｘフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）中に乳化した１００μｇのウシＩＩ型コラーゲンで免疫化し、２１日目にフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）中のウシＩＩ型コラーゲンで追加免疫した。０日目から開始して４１週の試験過程の間、マウスを試験物質のうちの１つで週２回処理した。関節炎の症状を示す各群のマウスのパーセンテージ、及び各群の平均関節炎スコアを各時点で評価した。各四肢を検査し、各四肢に０〜３のスコアを割り当てることにより関節炎スコアを決定した（より腫脹した及び／またはより炎症性の高い四肢はより高いスコア）。そのため、最大関節炎スコアの合計は１２である。マウスは、いずれかの四肢に少なくとも１の関節炎スコアを有する場合に関節炎を有するとカウントした。
【００８９】
結果を図１１に示す。これらのデータは、αＢＡＦＦ及び抗ｍＢ７ＲＰ１の組み合わせ（実線で接続された黒丸）が、αＢＡＦＦ（実線で接続された白抜きの丸）または抗ｍＢ７ＲＰ１（破線で接続された黒丸）いずれか単独よりも、関節炎の症状を抑制する上ではるかに効果的であったことを示している。ｍＩｇＧ（実線で接続された黒い四角）またはＰＢＳ（破線で接続された黒い四角）で処理した陰性対照群は、最も高い割合の関節炎の発生頻度及び最も高い関節炎スコアを有していた。これらの結果は、ＢＡＦＦ及びＢ７ＲＰ１の両方を阻害することが、これらの経路のうちの一方のみを阻害することとは対照的に、関節リウマチ等の自己免疫性及び／または炎症性の関節炎状態の効果的な治療であり得ることを示唆している。
【図１】
2019141084.tif 000013
【図２Ａ】
2019141084.tif 000014
【図２Ｂ】
2019141084.tif 000015
【図３】
2019141084.tif 000016
【図４】
2019141084.tif 000017
【図５】
2019141084.tif 000018
【図６Ａ】
2019141084.tif 000019
【図６Ｂ】
2019141084.tif 000020
【図７】
2019141084.tif 000021
【図８Ａ】
2019141084.tif 000022
【図８Ｂ】
2019141084.tif 000023
【図９Ａ】
2019141084.tif 000024
【図９Ｂ】
2019141084.tif 000025
【図１０】
2019141084.tif 000026
【図１１】
2019141084.tif 000027
【配列表】
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