(57)【要約】【課題】アンペロプシンを有効成分とする推算糸球体濾過量の低下抑制用組成物及び腎機能低下を抑制するための組成物を提供すること。【解決手段】アンペロプシンを有効成分として含有する推算糸球体濾過量低下予防・抑制用組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンペロプシンを有効成分として含有する推算糸球体濾過量低下抑制用又は推算糸球体濾過量低下予防用組成物。
【請求項２】
アンペロプシンを１０質量％以上含有する推算糸球体濾過量低下抑制用又は推算糸球体濾過量低下予防用組成物。
【請求項３】
藤茶抽出物を含有する推算糸球体濾過量低下抑制用又は推算糸球体濾過量低下予防用の組成物。
【請求項４】
アンペロプシンを１０質量％以上含有する請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
アンペロプシンを１０質量％以上含有する腎機能低下予防・抑制用の組成物。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンペロプシンを有効成分として含有する推算糸球体濾過量および腎機能の低下予防・抑制用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓は生体の老廃物を排泄するための役割を担う重要な器官である。組織学的には、左右の腎臓にそれぞれ約１００−１２０万個のネフロンがあり、ネフロンは腎小体と尿細管（腎細管）から構成されている。さらに腎小体は糸球体およびボーマン嚢、尿細管は近位尿細管、ヘンレループおよび遠位尿細管からそれぞれ構成されている。これらの組織は、それぞれ重要な機能を有しているが、中でも糸球体は老廃物の排出に重要な役割を果たしている。ヒトの腎臓は１つ１５０ｇ程度の重さしかないが、臓器の重量あたりの血液流出入量としては、心臓の約５倍、脳の約８倍もあり、臓器のなかで最も血液の流れる量が多い臓器である（腎臓に流れる血液量は毎分１〜１.２Ｌ程度）。腎臓には様々な働きがあるが、最も重要な働きは血液成分を調節し細胞を含め体内に行き渡っている体液の「質」と「量」を保ち、身体のバランスを保つことである。この働きは、生体の恒常性維持（ホメオスタシス）には必要不可欠である。
【０００３】
糸球体濾過量の低下は、腎臓機能の低下に直結する。腎機能の低下は、腎不全に発展する危険性をはらんでおり、慢性腎不全は糸球体濾過量（ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ、ＧＦＲ）の低下をもたらす。糸球体濾過量は、腎臓機能を示す重要な指標の１つとして用いられており、クレアチニンクリアランス、イヌリンクリアランスなどのクリアランス試験によって測定される。尿素窒素（ＢＵＮ）も腎臓機能を反映するが、外的因子の影響を受けない点で、クレアチニンクリアランスが腎臓機能の指標としてより優れている。また、古くからイヌリンクリアランスが糸球体濾過量の標準測定法とされてきたが、イヌリンが日本では医薬品として認可されておらずかつ高価であり、さらにその測定法が煩雑なため、日本では、内因性クレアチニンクリアランスが一般的に用いられている。したがって、クレアチニンクリアランスの低下は腎臓機能の低下を示し、腎臓機能障害の指標となる。
糸球体濾過量は、単位時間当たりに腎臓のすべての糸球体により濾過される血漿量のことで、単位はｍＬ／分、またはＬ／日である。糸球体濾過量を厳密に測定するにはイヌリンクリアランスを用いるが、医療の現場ではクレアチニンクリアランスまたはｅＧＦＲ（ｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ＧＦＲ；推算糸球体濾過量）で代用することが多い。単位はｍＬ／分／１．７３ｍ２である。腎不全では糸球体で濾過ができなくなっているため、推算糸球体濾過量を測定することでその進行度を知ることができる。そのため、慢性腎不全においては人工透析を導入する目安ともなる。
通常糸球体濾過量は正常値から減少するのみで上昇することはないが、糖尿病性腎症の初期では一時的に上昇することが知られている。
【０００４】
このようなことから、糸球体濾過量の改善を目的として、腎不全の治療剤や治療の効果評価がおこなわれている（特許文献１、特許文献２、特許文献３）。
【０００５】
このような背景にあって、本発明者らは、天然物や天然抽出物について、推算糸球体濾過量低下を抑制させる物質の探索を行っている。そして、中国や東南アジア地域の伝統的な食品である藤茶に推算糸球体濾過量低下を抑制する作用が存在することを発見した。藤茶には様々な薬効が存在することが知られている。その作用は、急性肝炎などの肝臓疾患治療効果（特許文献４）、抗菌効果（特許文献５）、色素退色防止作用（特許文献６）など多岐に渡っている。しかし藤茶に推算糸球体濾過量の低下を抑制し、腎不全を改善治療する作用が存在することは、食経験の長い食品でありながらこれまでまったく知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００４／０９８６１１号
【特許文献２】特開２００７−３２７９２１号公報
【特許文献３】特開２０１２−２３６８２０号公報
【特許文献４】特開２００３−０２６５８４号公報
【特許文献５】特開２００２−１５９５６６号公報
【特許文献６】特開２００２−０６５２０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、上記のような背景技術をもとに研究を行い、藤茶抽出物が強い推算糸球体濾過量の低下予防・抑制作用を有し、腎機能低下の予防・抑制作用を有していることを発見した。そして、さらに研究を進めたところ、推算糸球体濾過量の低下抑制作用を示す物質が藤茶中に含まれるフラボノイドの一種であるアンペロプシンであることを見出し、本発明をなした。
すなわち、本発明の課題はアンペロプシンを有効成分とする推算糸球体濾過量の低下予防・抑制用組成物及び腎機能低下予防・抑制するための組成物を提供することにある。さらには、推算糸球体濾過量の低下予防・抑制用飲食品及び腎機能低下を予防・抑制するための飲食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の主な構成は以下の通りである。
（１）アンペロプシンを有効成分として含有する推算糸球体濾過量低下抑制用又は推算糸球体濾過量低下予防用組成物。
（２）アンペロプシンを１０質量％以上含有する推算糸球体濾過量低下抑制用又は推算糸球体濾過量低下予防用組成物。
（３）藤茶抽出物を含有する推算糸球体濾過量低下抑制用又は推算糸球体濾過量低下予防用の組成物。
（４）アンペロプシンを１０質量％以上含有する（３）に記載の組成物。
（５）アンペロプシンを１０質量％以上含有する腎機能低下予防・抑制用の組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によりあらたな推算糸球体濾過量の低下予防・抑制用組成物が提供される。また腎機能低下予防・抑制用組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ヒトに対するアンペロプシン投与の影響を評価するプラセボ対照並行群間二重盲検比較試験による推算糸球体濾過量の経時変化を示すグラフである。
【図２】動物試験における尿中クレアチニンの分析結果を示すグラフである。
【図３】食塩負荷マウス、食塩負荷アンペロプシン投与マウスの尿中アンペロプシン量を比較するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、アンペロプシンを有効成分として含有する推算糸球体濾過量の低下予防・抑制用組成物に係る発明である。
藤茶は、ブドウ科蛇葡萄属の植物であり、中国名を顕歯蛇葡萄という。学名は、Ampelopsis grossedentataである。主には中国の広西、広東、雲南、貴州、湖南、湖北、江西、福建などの省並びに自治区に分布している。中国の広西、湖南などの省や自治区の壮族や瑶族の人々がこの茎および葉から作った飲料を常用しており、風邪、のどの痛みなどにも利用されている。アンペロプシンは、藤茶の示す肝臓疾患の治療作用や抗菌作用の活性本体として特定されている。
【００１２】
アンペロプシンは、下記の式で表される。
【００１３】
【化１】
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【００１４】
アンペロプシンは、例えば、藤茶（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｇｒｏｓｓｅｄｅｎｔａｔａ）、大叶蛇葡萄（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｍｅｇａｌｏｐｈｙｌｌａ）、広東蛇葡萄（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｃａｎｔｏｎｉｅｎｓｉｓ）、ケンポナシ（Ｈｏｖｅｎｉａ  ｄｕｌｃｉｓ）、オノエヤナギ（Ｓａｌｉｘ  ｓａｃｈａｌｉｎｅｎｓｉｓ）、ヨレハマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔａ）、アフリカブラックウッド（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｈｌｅｕｍ  ａｆｒｉｃａｎｕｍ）及びカツラ（Ｃｅｒｃｉｄｉｐｈｙｌｌｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）から選ばれる植物の抽出物から単離精製することができる。これらの中でも、藤茶が好ましい。
【００１５】
具体的には、Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ属植物である藤茶（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｇｒｏｓｓｅｄｅｎｔａｔａ）から、下記のようにしてアンペロプシンを得ることができる。
すなわち、乾燥させた藤茶の枝葉部を含水エタノールで抽出した抽出物を濃縮し、例えば多孔性樹脂（ＤＩＡＩＯＮ（登録商標）ＨＰ−２０）を用いたカラムクロマトグラフィーにかけ、８０容量％含水メタノールで溶出される分画にアンペロプシンが得られる。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーや再結晶により、更に精製することができる。精製されたアンペロプシンは、試薬としても販売されており、これを用いることもできる。
【００１６】
本発明の組成物としては、上記のアンペロプシンを１０質量％以上含有するものであれば使用可能である。このような組成物を藤茶から得るためには以下のような操作を行う。
乾燥した藤茶の葉又は茎の粉砕物又は粉末を抽出原料とし、水又は親水性有機溶媒若しくはこれらの混合溶媒に投入し、室温乃至溶媒の沸点以下の温度で任意の装置を用いて抽出することにより得ることができる。
【００１７】
抽出に用いる有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、イソプロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられる。
また、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。なお、水と親水性有機溶媒との混合系溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して３０〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１０〜４０質量部、多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１０〜９０質量部添加することが好ましい。
【００１８】
抽出溶媒を満たした処理槽に、藤茶の乾燥・粉砕物を投入し、必要に応じて時々撹拌しながら、３０分〜２時間静置して可溶性成分を溶出した後、ろ過して固形物を除去し、この抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出物が得られる。抽出溶媒量は、抽出原料の通常５〜１５倍量（質量比）であることが好ましく、抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常５０〜９５℃で１〜４時間程度である。また、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いる場合には、通常４０〜８０℃で３０分〜４時間程度である。
【００１９】
得られた抽出液から抽出溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られる。更に乾燥すれば、固形の抽出物が得られる。本発明においては、アンペロプシンの含有量が１０質量％以上、好ましくは２０質量％以上であれば、上記抽出液又はその濃縮液の状態であっても良い。これらは、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂、液―液向流分配などの方法により精製してから用いても構わない。
したがって、上記の藤茶から抽出し、アンペロプシンの濃度を高めた抽出物も本発明の組成物として使用可能である。
【００２０】
組成物中のアンペロプシンの含有量は、ＨＰＬＣなど公知の分析方法で分析することができる。定量方法の概略は次のとおりである。
・試料溶液の調製
試料（抽出物）約２０ｍｇを精秤し、蒸留水を加えて超音波処理して溶解し、正確に５０ｍＬとする。この溶液２ｍＬを５０ｍＬに正確に希釈し、試料溶液とする。
・標準溶液の調製と検量線作成  
標準品（Ｄｉｈｙｄｒｏｍｙｒｉｃｅｔｉｎ  ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）２．００ｍｇを精秤し、１００％アセトニトリルを適量加えて超音波処理して溶解し、さらにアセトニトリルを加えて正確に２５ｍＬとし、アンペロプシン標準原液８０μｇ／ｍＬを調製する。この標準原液を蒸留水にて正確に５倍希釈して、１６μｇ／ｍＬアンペロプシン標準溶液を調製する。ＨＰＬＣへの注入量を１０、２０、４０μＬとし、アンペロプシンのピークに基づいて検量線を作成する。
・ＨＰＬＣ測定条件
下記表１の条件に設定する。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
本発明の推算糸球体濾過量低下予防・抑制用組成物は、そのまま、あるいは各種賦形剤を添加して製剤化する。製剤としては顆粒剤、錠剤、カプセル剤を例示することができる。
また組成物をそのまま飲食品として用いること、あるいは製剤化したものを医薬又は飲食品として用いることもできる。
なお製剤化に当たっては、賦形剤やその他の有効成分を本発明の組成物の目的を阻害しない範囲で使用することができる。具体的には、シクロデキストリン、へミセルロース、リグニン、グアーガム、コンニャクマンナン、イサゴール、アルギン酸、寒天、カラギーナン、キチン、カルボキシルメチルセルロース、ポリデキストロースなどの食物繊維や増粘剤、食用油、カルシウム、鉄、ナトリウム、亜鉛、銅、カリウム、リン、マグネシウム、ヨウ素、マンガン、セレンなどのミネラル；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ナイアシン、葉酸、パントテン酸などの脂溶性又は水溶性のビタミン群、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、リン脂質、アラビアガム、キサンタンガム、トラガカントガム、ローカストビーンガムなどの乳化剤や分散剤、増量剤、保存料・酸化防止剤、風味調整剤や香料、塩化ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、グリシン、コハク酸、乳酸ナトリウムなどの呈味料、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、アジピン酸、フマル酸、リンゴ酸などの酸味料、マルチトール、アスパルテームなどの低カロリー甘味料、着色剤などである。
なお本発明の推算糸球体濾過量低下予防・抑制用組成物には、アンペロプシンを１０〜２５００ｍｇ、好ましくは５０〜３００ｍｇ、特に好ましくは１００〜２００ｍｇを含有するように調製する。
【実施例】
【００２３】
＜藤茶抽出物の製造例＞
以下に本発明の組成物の製造例及びこの組成物を用いた試験例を示し、本発明をさらに説明する。
＜製造例＞
乾燥藤茶の重量に対して１０倍量の７０％エタノールで抽出物を得た。その後、抽出物を濃縮させ活性炭を用いて不純物を取り除きながら濾過をした。濃縮物にγシクロデキストリンを適当量配合し、噴霧乾燥で本発明の組成物を製造した。これを粉砕し、推算糸球体濾過量低下予防・抑制用組成物とした。
【００２４】
＜ヒト試験＞
ヒトにおける推算糸球体濾過量に与える影響を試験した。
１．試験方法
（１）試験品（以下「被験食品」）
被験食品はアンペロプシン１５０ｍｇ含有カプセル剤（藤茶エキス末５００ｍｇ）、プラセボとしてデンプン５００ｍｇ含有カプセル剤を用いた。
（２）試験対象者
無作為に選抜されたボランティアを対象とし、次の選択基準に適合する者を選抜した。
１）選択基準
（１）スクリーニング検査での血圧（収縮期）が１３０ｍｍＨｇ以上１６０ｍｍＨｇ        未満である者
（２）同意取得時の年齢が２０歳以上８０歳未満の検査実施所への通所が可能な者
（３）ＢＭＩが１８．５ｋｇ／ｍ２以上３０．０ｋｇ／ｍ２未満の者
（４）文書同意を取得した者
【００２５】
２）除外基準
（１）重度な消化器疾患、肝疾患、腎疾患、循環器疾患、血液疾患、内分泌系疾患、        または悪性新生物が疑われる者、またはその既往がある者
（２）腎障害、左室肥大と診断された者
（３）二次性高血圧症の者
（４）ブドウ科の植物にアレルギーを引き起こす恐れのある者
（５）現在降圧薬服薬中、もしくは医師による降圧治療を受けている者
（６）試験期間中、医師による治療または投薬を受ける予定のある者
（７）試験期間中、特定保健用食品、機能性表示食品及びその他のサプリメントを摂        取する予定のある者
（８）試験期間中、食生活（食事回数、食事内容、アルコール摂取量）が変化する可        能性のある者
（９）試験期間中、生活習慣を変更する可能性のある者（夜間勤務、長期の旅行、転        勤など）
（１０）現在喫煙中、もしくは過去１年以内に喫煙歴のある者
（１１）スクリーニング検査における随時尿検査で推定１日塩分摂取量が男性で８．０        ｇ未満、女性で７．０ｇ未満の者
（１２）妊娠中あるいは妊娠の可能性のある女性または授乳中の女性
（１３）試験期間中に他の臨床試験に参加する予定のある者
（１４）その他、担当医師が不適当と判断した者
【００２６】
（３）評価項目
１）主要評価項目
推算糸球体濾過量
推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）は、次の計算式で求める。
男性：eGFR (ml/分/1.73 ｍ2) = 194×Cr-1.094×年齢-0.287
女性：eGFR (ml/分/1.73 ｍ2) = 194×Cr-1.094×年齢-0.287×0.739
【００２７】
２）安全性評価項目
有害事象、臨床検査値
【００２８】
（４）投与試験
１）試験デザイン
プラセボ対照並行群間二重盲検比較試験
【００２９】
２）試験期間（１４週間）
藤茶エキス末摂取前を初期観察期とする。その後、被験者を無作為に２群に振り分け、藤茶エキス末５００ｍｇもしくはプラセボを１２週間摂取させる。
試験施設への来院はスクリーニング検査、摂取開始日、摂取４週後、摂取８週後、摂取１２週後の５回とする。
試験期間    初期観察期・摂取期を全１４週間とする。
【００３０】
３）摂取方法
選択、除外基準に抵触しないことを確認した上で、１日１回朝食後に前記の被験食品（藤茶エキス末）又はプラセボ摂取を開始する。
摂取期間    １２週間
摂取方法    １日１回３粒を朝食後に経口摂取
観察期間    摂取期間前後各１週間
【００３１】
４）併用薬剤・併用療法
併用薬剤の使用及び併用療法は原則禁止とする。但し、医師の判断により必要に応じて治療を開始することができる。薬剤などの使用状況について使用薬物・用量・期間等について調査する。
【００３２】
５）調査項目
（１）背景調査
スクリーニング検査で年齢、性別、現病歴、既往歴、生活歴（喫煙、飲酒、服薬状況、健康食品の使用の使用状況）を調査する。
【００３３】
（２）血液検査
一般血液検査（白血球、赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣ、血小板数）、一般生化学検査（ＴＧ、ＴＣ、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、血糖、ＨｂＡ１ｃ（ＮＧＳＰ）、γ−ＧＴＰ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、総ビリルビン、総蛋白、アルブミン、Ａ／Ｇ比、ＡＬＰ、ＬＤＨ、ＣＰＫ、クレアチニン、尿酸、尿素窒素、Ｎａ、Ｋ、Ｃｌ、ＬＡＰ）、キマーゼ、レニン、アルドステロンを測定する。
血液検査については、空腹時採血とし、スクリーニング検査と摂取１２週後検査の計２回行う。
尿検査についてはスポット尿を用い、尿中Ｎａ及び尿中Ｃｒを測定する。推定１日食塩摂取量を算出し、塩分摂取量の経時的変化を観察するため、毎月検査する。また、スクリーニング検査のみ安全性確認のため尿中アルブミンを測定する。
【００３４】
（３）胸写・負荷心電図、ＡＢＩ、ＰＷＶ
スクリーニング検査で安全性確認のため実施する。心電図測定における負荷方法は階段の昇降とする。
【００３５】
（４）食事調査
来院日に検査前日の食事内容を調査する。
【００３６】
（５）日誌
飲酒内容、食生活の変化、体調の変化、試験食品の摂取状況を調査する。
【００３７】
６）中止基準
・被験者より中止の申し出があった場合
・有害事象で担当医師が試験を継続することが好ましくないと判断した場合
・その他、試験責任医師が中止を必要と判断した場合
【００３８】
７）有害事象
（１）有害事象の重症度
・軽度  ：日常的活動が妨げられない程度の有害事象
・中等度：日常的活動が妨げられる程度の有害事象
・重度  ：日常的活動が不能となる有害事象
【００３９】
（２）重篤な有害事象
・死亡に至るもの
・生命を脅かすもの
注：その事象の発現時点において患者が死の危険にさらされている場合をいい、仮にもっと重度であれば死を招いたかもしれないという意味ではない。
・治療のため入院または入院期間の延長が必要となるもの
・永続的または顕著な障害・機能不全に陥るもの
・先天異常を来すもの
・その他の医学的に重要な状態と判断される事象又は反応
【００４０】
（３）試験食品との関連性
・なし：試験食品との間に合理的な可能性がない場合
・あり：試験食品との間に少なくとも合理的な可能性があり、因果関係が否定できない場合
・不明：試験食品との因果関係が情報不足のため判定できない場合
【００４１】
（４）転帰
有害事象の転帰を以下の６段階で判定する。
・回復
・軽快
・未回復
・回復したが後遺症あり
・死亡
・不明
【００４２】
（５）重篤な有害事象が発生した際の報告
重篤である有害事象が発生し、試験責任者が当該有害事象を知った後、速やかに試験実施機関の長に報告し、試験担当者に連絡するとともに、重篤な有害事象に関する報告書を作成し、試験実施機関の長に提出する。
【００４３】
８）統計解析
二元配置分散分析を実施する。
【００４４】
２．試験実施症例数
最終解析可能症例数を各群６症例で両群合わせて１２症例とする。
【００４５】
３．試験結果
試験結果を図１に示す。
被験食品摂取群（藤茶）は、投与１２週間経過後も推算糸球体濾過量の低下が起こらなかった。一方プラセボ群は推算糸球体濾過量の低下を示した。被験食摂取群とプラセボ群の比較の結果、１２週間後には、両群間で有意な差が観察された。
アンペロプシンを含有する藤茶エキス摂取群、プラセボ摂取群の比較の結果、藤茶摂取群は推算糸球体濾過量が維持され、プラセボ群は低下することを確認できた。また有害な事象は観察されず、途中中止の被験者はいなかった。
以上のプラセボ対照並行群間二重盲検比較試験の結果、アンペロプシンは糸球体濾過量の経時的な低下を予防・抑制することから、腎機能低下を予防・抑制することが期待できる。
【００４６】
＜動物試験＞
マウスを用いた動物試験によりアンペロプシンが腎機能に及ぼす効果を確認するため、食塩投与によるクレアチニン量の変化を確認した試験例を以下に示す。
１．試験方法
（１）試験品          ：藤茶エキス（以下「藤茶」という。）（１ｇあたりアンペロプシン３００ｍｇ含有）
（２）使用動物
種                ：マウス
系統              ：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ
微生物学的グレード：ＳＰＦ
性別              ：雄
入手時の週齢      ：６週齢
投与時の週齢      ：７週齢
使用動物数        ：１８匹
供給源            ：日本エスエルシー株式会社
【００４７】
（３）検疫及び馴化
検疫・馴化期間    ：入手日を含めて６日間
観察及び測定      ：入手時に動物の健康状態を肉眼的に確認して異常の認められない動物を飼育室に収容し、試験と同様の飼育条件及び飼育環境下で６日間検疫・馴化飼育した。検疫・馴化期間中は、毎日の一般状態観察及び入手日と検疫終了日に電子天秤（ＵＷ４２００Ｓ、(株)島津製作所）を用いて体重測定を行った。検疫・馴化期間中の一般状態に全例異常はみられず、体重増加も良好であった。
【００４８】
（４）識別方法
個体識別          ：入手時にフェルトペンで尾根部に個体識別番号を表記した。群分け後は仮番号と本番号との対応表を用いて識別した。
【００４９】
（５）飼料
種類              ：固型飼料ＭＦ
供給源            ：オリエンタル酵母工業株式会社
給餌方法          ：飼料をステンレス製給餌器に入れ自由摂取させた。
【００５０】
（６）飲水
１）検疫馴化期間中及び投与開始前
種類              ：水道水
給水方法          ：水道水を透明ポリカーボネイト製給水瓶に入れ、金属製ノズルを介して自由摂取させた。
２）投与開始後
種類              ：２％食塩水
調製方法          ：電子天秤にて塩化ナトリウム１６０ｇを秤量し、蒸留水（全自動蒸留水製造装置アクエリアス、ＧＳＨ−５００、アドバンテック東洋(株)）に溶かして８０００ｍＬとした。
給水方法          ：透明ポリカーボネイト製給水瓶に入れ、金属製ノズルを介して自由摂取させた。
【００５１】
（７）試験群構成
１群６匹を用い、下記表２に示す３群を設定した。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
（８）供試動物の抽出及び群分け方法
投与開始前日に検疫・馴化期間中の体重増加が順調で一般状態にも異常を認めない動物から層別無作為割付法（一層：体重、二層：収縮期血圧）に従って３群に群分けした。
【００５４】
（９）試験日数
試験日数は、試験品投与開始日を「Ｄａｙ０」と定義した。
【００５５】
（１０）体重測定
測定頻度          ：Ｄａｙ  −１、７、１４、２１及び２８
検査匹数          ：１８匹
測定方法          ：電子天秤（ＵＷ４２００Ｓ、(株)島津製作所）を用いて測定した。
【００５６】
（１１）試験品の投与方法
投与経路          ：経口投与
投与匹数          ：１８匹
投与量            ：６００ｍｇ／ｋｇ
投与容量          ：１０ｍＬ／ｋｇ（最新の体重にて投与量を算出した）
投与方法          ：ポリプロピレン製ディスポーザブル注射筒及びマウス用胃ゾンデを用いて強制投与した。
投与回数          ：１回／日の２８日間（Ｄａｙ０〜Ｄａｙ２７）。
【００５７】
（１２）摂水量の測定
測定頻度          ：投与開始日以降、３日に一度の割合で測定した。
実施匹数          ：１８匹
測定方法          ：電子天秤（ＵＷ４２００Ｓ、(株)島津製作所）を用いて測定した。
【００５８】
（１３）採尿
採取頻度          ：投与開始前及びＤａｙ２６〜２７
実施匹数          ：１８匹
採取・処理方法    ：代謝ケージを用い、２４時間の尿を採取した。尿は回収し電子天秤（ＡＧ２０４ＤＲ、メトラー・トレド株式会社）を用いて重量を測定後、超低温槽で凍結保存した。
【００５９】
（１４）尿中クレアチニンの測定
尿中クレアチニンは、オリエンタル酵母工業株式会社で富士フイルム和光純薬（株）製のLタイプワコー  CRE・Mを使用して測定
【００６０】
（１５）統計学的処理
測定値は、群ごとの平均±標準誤差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．）で表し、コントロール１．水道水負荷群、コントロール２．２％食塩水負荷群、藤茶＋２％食塩水負荷群の有意差検定を実施した。
【００６１】
２．試験結果
（１）体重
試験群のいずれの動物も順調な体重増加を示した。
【００６２】
（２）摂水量
試験群のコントロール１．水道水負荷群とコントロール２．２％食塩水負荷群を比較すると、コントロール２．２％食塩水負荷群はＤａｙ４から最終測定日（Ｄａｙ２５）まで飲水量が有意な高値（ｐ＜０．０１）を示した。コントロール１．水道水負荷群と藤茶＋２％食塩水負荷群を比較すると、藤茶＋２％食塩水負荷群はＤａｙ  ４から最終測定日（Ｄａｙ  ２５）まで飲水量が高値を示した。コントロール２．２％食塩水負荷群と藤茶＋２％食塩水負荷群を比較すると、差は認められなかった。
【００６３】
（３）尿中クレアチニン量
腎機能マーカーの一つである尿中クレアチニン量の測定結果を、統計処理のため図２、図３に分けてに示す。
投与Ｄａｙ  ２７では、コントロール１．水道水負荷群とコントロール２．２％食塩水負荷群を比較すると、尿中クレアチニン量は、コントロール２．２％食塩水負荷群で高値＜０．０５）を示した（図２）。コントロール１．水道水負荷群と２％食塩水＋藤茶群を比較すると、差は認められなかった（図２）。
コントロール２．２％食塩水群と２％食塩水＋藤茶群を比較すると、２％食塩水＋藤茶群で低値（Ｐ＜０．１）を示した（図３）。
この結果は、２％食塩水の飲水負荷によって誘発される腎機能障害を藤茶が抑制し、尿中クレアチニン値が低下したと判断できる。すなわちアンペロプシンを含む組成物は、腎機能低下予防・抑制作用を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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