(57)【要約】【課題】  会合性に優れ、水中で崩壊しにくい糖質素材を製造する技術を提供すること。【解決手段】Neageliアミロデキストリンを熱水または熱水溶液中で溶解または懸濁した後、有機溶媒またはその水溶液を添加することにより、再結晶物を回収する段階を含む工程；及び、前工程で得られた再結晶物を熱水中に溶解または懸濁した後、有機溶媒またはその水溶液を添加することにより、目的物を再結晶物として回収する工程を１回以上行う工程；を含むことを特徴とし、かつ、少なくとも１回の再結晶段階において、溶媒中のエタノールまたはメタノール濃度が60％（v/v）以下であることを特徴とする、会合性に優れる糖質素材の製造法、並びに、当該製造法により得られた、グルコース重合度が20以上である分岐型糖鎖を95％以上の純度で含有する新規糖質素材。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
工程１）澱粉をその糊化開始温度未満の温度条件下、硫酸または塩酸を含む酸性水溶液中で加水分解した後、固形物画分を回収し、アミロデキストリンを得る工程；
工程２）得られたアミロデキストリンを熱水または熱水溶液中で溶解または懸濁した後、有機溶媒またはその水溶液を添加することにより、再結晶物を回収する段階を含む工程；及び、
工程３）前工程で得られた再結晶物を熱水中に溶解または懸濁した後、有機溶媒またはその水溶液を添加することにより、目的物を再結晶物として回収する工程を１回以上行う工程；
を含むことを特徴とし、かつ、
前記工程２から前記工程３の中の少なくとも１回の再結晶段階において、有機溶媒がエタノールまたはメタノールであり、溶媒中のエタノールまたはメタノール濃度が60％（v/v）以下であることを特徴とする、会合性に優れる糖質素材の製造法。
【請求項２】
澱粉がモチ性澱粉である、請求項１に記載の製造法。
【請求項３】
前記有機溶媒がメタノールまたはエタノールである、請求項１または２に記載の製造法。
【請求項４】
前記有機溶媒がエタノールのみであり、かつ、前記「熱水または熱水溶液」が熱水のみである、請求項１〜３のいずれかに記載の製造法。
【請求項５】
再結晶時の温度がマイナス5℃〜プラス40℃である、請求項１〜４のいずれかに記載の製造法。
【請求項６】
前記工程３の後に、糖質素材の鎖の構造を改変する工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の製造法。
【請求項７】
前記「改変」が、糖転移活性をもつ糖質加水分解酵素及び糖質加リン酸分解酵素のうち少なくとも１種類を用いて糖を結合させることである、請求項６に記載の製造法。
【請求項８】
前記「改変」が、糖質素材の還元末端を修飾することである、請求項６または７に記載の製造法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかの製造法により得られた新規糖質素材。
【請求項１０】
グルコース重合度が20以上である分岐型糖鎖を、イオン交換−パルスドアンペロメトリ検出によるピーク面積比で９５％以上の純度で含有する新規糖質素材であって、その1％(w/v)溶液を16Mメタノール存在下で25℃で静置したときに660nmにおける吸光度が1.0となるのに要する時間が20分間以内である、新規糖質素材。
【請求項１１】
請求項９または１０記載の糖質素材を、水を含む溶媒に溶解した後に静置することにより、これを会合させることを特徴とする、固形物の製造法。
【請求項１２】
請求項９または１０記載の糖質素材を、水を含む溶媒に溶解した後に、他の素材が混在する状態で静置することにより、会合させることを特徴とする、請求項１１に記載の製造法。
【請求項１３】
前記「他の素材」が、請求項９または１０記載の糖質素材と相互作用する、澱粉、アミロース、アミロペクチン、またはこれらの誘導体である、請求項１２に記載の製造法。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれかの製造法により得られる固形物。
【請求項１５】
グルコース重合度が20以上である分岐型糖鎖が、分子内で二重らせん構造をとり、当該二重らせん構造同士が会合してなる固形物であることを特徴とする固形物。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の固形物を含有してなる、剛性、弾性、粘性、生分解性、崩壊性、及び成分徐放性のうち少なくとも一つの物性が改変された生分解性素材。
【請求項１７】
請求項１４または１５に記載の固形物を含有してなる、剛性、弾性、粘性、消化性、崩壊性、及び成分徐放性のうち少なくとも一つの物性が改変された食品。
【請求項１８】
請求項９または１０記載の糖質素材及び請求項１４または１５記載の固形物のうち少なくとも１種類を、水を含む溶媒に溶解した後に、溶質が再会合する際の挙動を解析することを特徴とする、会合特性の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は会合性に優れて水中で崩壊しにくい糖質素材とその製造技術に関する。 
【背景技術】
【０００２】
澱粉は、加熱とともに水を吸収して糊化しゲル状になることで、食品形状を安定化し多様な食感・質感を与えるとともに、消化性制御を可能とする。その一方で、澱粉ゲルの形状は経時的に変化（老化）し、上記品質を劣化させる。
【０００３】
このような糊化、ゲル化及び老化は、澱粉を構成するアミロース及びアミロペクチンが関与する複数種類の相互作用によって引き起こされる。翻すと、この相互作用を高度に制御することで、これらの現象を制御でき、それによって食品品質の向上、新食品・非食品素材の開発などに道を拓くことができる。
【０００４】
しかしながら、複数の相互作用が同時に起こる澱粉を用いて、関係ない特性を制御しながら特定の作用のみを強調することは極めて困難である。このため、澱粉のもつ相互作用に係る化学構造のみを取り出し、素材として産業に役立てるための研究が行われてきた。
【０００５】
例えば、ゲスト分子の包接能をもつサイクロデキストリン、分子シャペロン活性をもつシクロアミロースなどの機能性分子は、澱粉一本鎖のもつ機能を取り出した素材とみなされる。
【０００６】
それに対して、澱粉を構成する糖鎖による複雑な相互作用のうち、二本の直鎖が二重らせん構造を形成しその複数本が会合するような、二本鎖同士の会合構造に着目した食品・非食品用途の素材は存在しない。二重らせんによる会合構造は、生澱粉の結晶を構成する主構造でもあり、水中での構造安定性が高い。
【０００７】
もしも、二重らせん構造のみを抽出した素材が得られれば、水中で高次構造を形成させるためのツールとして、直接、他の物質との会合構造物、あるいは化学修飾による誘導体化を経て、食品・非可食製品分野に活用できるものと期待される。特に、新食感を安定的に表現する際には、濡れた状態でも安定な構造物を与える素材へのニーズは高い。
【０００８】
澱粉を糊化温度より低温で酸加水分解することで、結晶性の高い二重らせん構造物の会合体を溶媒不溶画分として回収できることは、19世紀から知られており、用いる酸の違いによってNaegeliのアミロデキストリンあるいはLintnerized Starchと呼ばれてきた。
非特許文献１では、馬鈴薯澱粉由来のNaegeliアミロデキストリンを用いた構造解析により、それが左回りの二重らせん構造を有することが提唱された。
【０００９】
その後、非特許文献２では、Naegeliアミロデキストリンを熱ピリジン水溶液に溶解した後メタノールを添加し、二段階の工程により沈殿物を回収することで、3つの画分に分離できることが示され、この中で、中間画分（F2）が分枝した糖鎖を主成分とすることが明らかにされた。
【００１０】
また、非特許文献３では、F2画分の会合特性に関する研究が報告されている。この中では、F2画分を16Mメタノール中で会合させる際の挙動を濁度測定によりモニターし、分枝を有しない構造物に富むF3画分と比較して、F2画分での濁度増加速度が際立っていることが示されており、会合物の結晶構造も確認されている。
【００１１】
非特許文献３が示す様に、二本の鎖に二重らせん構造を形成させるためには、孤立する一本鎖分子を二本で会合させるよりも、分枝のある一分子内で主鎖と側鎖を会合させる方が効率的に進む。F2（論文中ではBD）画分は、F3画分を凌ぐ会合力を有していることから、この画分を会合性素材として活用することができるものと期待される。
【００１２】
しかしながら、F2画分には、本来F3画分に来るべき糖鎖を含めて不純物が多く混入しており、会合速度低下や望ましくない構造での会合が起こる可能性が懸念されることから、F2画分が会合性素材として産業で活用された例は知られていない。また、この純度の問題は、会合特性をもつ素材の構造を改変・誘導体化する際にも影響を及ぼす。
【００１３】
さらに、非特許文献２では、70％メタノール中で室温で数日かける方法、または4℃水から蒸発させる方法で、F2およびF3画分の再結晶を行っているが、ピリジンを用いずにF2とF3を分画することはできないと述べており、この方法によるF2およびF3画分の純度上昇は期待できない。
また、F2画分の生産工程では、ピリジンやメタノールなどの食品製造時における使用が困難な薬剤を用いることから、生成物の用途が限定される問題がある。
【００１４】
一方、水存在下で強固な構造物を与えるような食品素材は、生鮮食品以外に殆ど存在しない。ナタデココ、ゼラチンのような水和ゲルは高濃度条件下で安定構造物となるが、強度が十分に確保できないことから、例えば梨の果実のようなシャリシャリした食感をもつ加工食品の製造は困難である。現状では、濡れてもシャリシャリするような食感の提供は、生鮮食品を除き、事実上、冷凍物や油脂が融解する、または乾燥物が吸水するまでの短時間での表現にほぼ限定される。このような中で、新食感その他の機能を表現する際の、濡れた状態でも安定な構造物を与える可食性素材へのニーズは高い。
【００１５】
Naegeliアミロデキストリンのような二重らせん構造物の会合構造は、水中での安定性が高く、水中での強固な構造物を形成するための重要な素材として期待される。その一方で、これらの会合構造物は、澱粉の糊化開始温度となる60〜80℃の温度帯で吸水・解離することから、高温条件下での用途が制限される。二重らせん構造物の鎖長が長い場合には、安定性が高くなると期待されるが、天然澱粉の酸加水分解によって長鎖同士の二重らせん構造物を得ることは困難である。 
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Keiji Kainumaら著, Biopolymers, 第11巻, 第11号, 1972年11月発行, 第2241頁−第2250頁
【非特許文献２】Shoichi Kikumotoら著, Journal of the Japanese Society of Starch Science, 第30巻, 第1号, 1983年発行, 第69頁−第75頁
【非特許文献３】Kanefumi Kitaharaら著, Carbohydrate Polymers, 第33巻, 第2−3号, 1997年6月−7月発行，第187頁−第194頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の課題は、F2画分から分岐型糖鎖を精製し、より会合性に優れ、水中で崩壊しにくい糖質素材を製造する技術を提供することである。
また、本発明の課題は、Naegeliアミロデキストリンからピリジン、メタノールを使用せずに分岐型糖鎖を精製する技術を提供することである。
また、本発明の課題は、分岐型糖鎖の鎖長を伸長し、安定性を向上させるための処理技術を提供することである。 
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、以下の（１）〜（１８）に関するものである。
（１）工程１）澱粉をその糊化開始温度未満の温度条件下、硫酸または塩酸を含む酸性水溶液中で加水分解した後、固形物画分を回収し、アミロデキストリンを得る工程；
工程２）得られたアミロデキストリンを熱水または熱水溶液中で溶解または懸濁した後、有機溶媒またはその水溶液を添加することにより、再結晶物を回収する段階を含む工程；及び、
工程３）前工程で得られた再結晶物を熱水中に溶解または懸濁した後、有機溶媒またはその水溶液を添加することにより、目的物を再結晶物として回収する工程を１回以上行う工程；
を含むことを特徴とし、かつ、
前記工程２から前記工程３の中の少なくとも１回の再結晶段階において、有機溶媒がエタノールまたはメタノールであり、溶媒中のエタノールまたはメタノール濃度が60％（v/v）以下であることを特徴とする、会合性に優れる糖質素材の製造法。
（２）澱粉がモチ性澱粉である、前記（１）に記載の製造法。
（３）前記有機溶媒がメタノールまたはエタノールである、前記（１）または（２）に記載の製造法。
（４）前記有機溶媒がエタノールのみであり、かつ、前記「熱水または熱水溶液」が熱水のみである、前記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造法。
（５）再結晶時の温度がマイナス5℃〜プラス40℃である、前記（１）〜（４）のいずれかに記載の製造法。
（６）前記工程３の後に、糖質素材の鎖の構造を改変する工程を含む、前記（１）〜（５）のいずれかに記載の製造法。
（７）前記「改変」が、糖転移活性をもつ糖質加水分解酵素及び糖質加リン酸分解酵素のうち少なくとも１種類を用いて糖を結合させることである、前記（６）に記載の製造法。
（８）前記「改変」が、糖質素材の還元末端を修飾することである、前記（６）または（７）に記載の製造法。
（９）前記（１）〜（８）のいずれかの製造法により得られた新規糖質素材。
（１０）グルコース重合度が20以上である分岐型糖鎖を、イオン交換−パルスドアンペロメトリ検出によるピーク面積比で９５％以上の純度で含有する新規糖質素材であって、その1％(w/v)溶液を16Mメタノール存在下で25℃で静置したときに660nmにおける吸光度が1.0となるのに要する時間が20分間以内である、新規糖質素材。
（１１）前記（９）または（１０）記載の糖質素材を、水を含む溶媒に溶解した後に静置することにより、これを会合させることを特徴とする、固形物の製造法。
（１２）前記（９）または（１０）記載の糖質素材を、水を含む溶媒に溶解した後に、他の素材が混在する状態で静置することにより、会合させることを特徴とする、前記（１１）に記載の製造法。
（１３）前記「他の素材」が、前記（９）または（１０）記載の糖質素材と相互作用する、澱粉、アミロース、アミロペクチン、またはこれらの誘導体である、前記（１２）に記載の製造法。
（１４）前記（１１）〜（１３）のいずれかの製造法により得られる固形物。
（１５）グルコース重合度が20以上である分岐型糖鎖が、分子内で二重らせん構造をとり、当該二重らせん構造同士が会合してなる固形物であることを特徴とする固形物。
（１６）前記（１４）または（１５）に記載の固形物を含有してなる、剛性、弾性、粘性、生分解性、崩壊性、及び成分徐放性のうち少なくとも一つの物性が改変された生分解性素材。
（１７）前記（１４）または（１５）に記載の固形物を含有してなる、剛性、弾性、粘性、消化性、崩壊性、及び成分徐放性のうち少なくとも一つの物性が改変された食品。
（１８）前記（９）または（１０）記載の糖質素材及び前記（１４）または（１５）記載の固形物のうち少なくとも１種類を、水を含む溶媒に溶解した後に、溶質が再会合する際の挙動を解析することを特徴とする、会合特性の評価方法。 
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、F2画分から分岐型糖鎖を精製し、より会合性に優れ、水中で崩壊しにくい糖質素材を製造する技術が提供される。当該技術により、F2画分から会合性が大幅に向上された高機能素材を製造することができる。
【００２０】
また、本発明によれば、Naegeliアミロデキストリンからピリジン、メタノールを使用せずに分岐型糖鎖を精製する技術が提供される。当該技術により、食品製造工程への適合性が向上しており、常法で得たF2画分よりも会合性に優れた糖質素材を製造することができる。
【００２１】
また、本発明によれば、分岐型糖鎖の鎖長を伸長し、安定性を向上させるための処理技術が提供される。当該技術により、鎖長重合度が増加し、熱安定性が向上された分岐型糖鎖を得ることができる。 
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】精製F2画分における分岐型糖鎖（F2）と直鎖型糖鎖（F3）の回収率に及ぼすエタノール濃度と静置温度の影響を示すグラフである。図中、縦軸は回収率（＝［精製F2画分中のF2又はF3（g）／精製前のF2画分（g）］×100、単位は質量％）を示し、横軸はエタノール濃度（容量％）を示す。
【図２】精製F2画分における分岐型糖鎖（F2）と直鎖型糖鎖（F3）の回収率に及ぼすメタノール濃度と静置温度の影響を示すグラフである。図中、縦軸は回収率（＝［精製F2画分中のF2又はF3（g）／精製前のF2画分（g）］×100、単位は質量％）を示し、横軸はメタノール濃度（容量％）を示す。
【図３】精製F2画分のHPAEC-PAD分析結果を精製回数で比較した図である。図中、縦軸は検出器の応答（nC）を示し、横軸は溶出時間（分）を示し、「×n」は10％(v/v)エタノール条件での精製回数を示す。矢印は当該ピークに対応するグルコース重合度（DP）を示す。
【図４Ａ】精製前のF2画分のイソアミラーゼ分解後のHPAEC-PAD分析結果である。図中、縦軸は検出器の応答（nC）を示し、横軸は溶出時間（分）を示す。
【図４Ｂ】10％(v/v)エタノール条件で４回精製したF2画分のイソアミラーゼ分解後のHPAEC-PAD分析結果である。図中、縦軸は検出器の応答（nC）を示し、横軸は溶出時間（分）を示す。
【図５】16Mメタノール水溶液中での会合挙動に対するF2画分精製の影響を示すグラフである。図中、縦軸は濁度（660nmにおける吸光度）を示し、横軸は測定時間（分）を示し、「×n」は精製回数を示す。
【図６】Naegeliアミロデキストリンのエタノール水溶液による精製物のHPAEC-PAD分析結果を精製回数で比較した図である。図中、縦軸は検出器の応答（nC）を示し、横軸は溶出時間（分）を示し、「×n」は10％(v/v)エタノール条件での精製回数を示す。
【図７】Naegeliアミロデキストリンのエタノール水溶液による精製物の16Mエタノール中での会合挙動を示すグラフである。図中、縦軸は660nmにおける吸光度を示し、横軸は測定時間（分）を示し、「×n」は10％(v/v)エタノール条件での精製回数を示す。
【図８】精製F2画分のホスホリラーゼ処理後のHPAEC-PAD分析結果である。図中、縦軸は検出器の応答（nC）を示し、横軸は溶出時間（分）を示す。下段（図中の「伸長処理」）がホスホリラーゼを用いた伸長処理後の結果であり、上段（図中の「酵素不添加」）がホスホリラーゼ不添加の対照区の結果である。
【図９】1回精製したF2画分の水中での会合挙動を示すグラフである。図中、縦軸は濁度（660nmにおける吸光度）を示し、横軸は測定時間（分）を示す。●は精製F2画分の濃度3.0％、○は2.5％、▲は2.0％、△は1.5％、■は1.25％(いずれもw/v)、における結果をそれぞれ示す。
【図１０】クラスターデキストリン（CCD）を0.025％(w/v)添加したときの16Mメタノール水溶液中での精製F2画分の会合遅延効果を示す図である。図中、縦軸は濁度（660nmにおける吸光度）を示し、横軸は測定時間（分）を示す。
【図１１】クラスターデキストリン（CCD）添加による水中での精製F2画分の会合遅延効果を示す図である。図中、縦軸は濁度（660nmにおける吸光度）を示し、横軸は測定時間（分）を示す。●は精製F2画分2.5％、○は精製F2画分2.5％＋CCD 0.125％、▲は精製F2画分2.5％＋CCD 0.25％、◇は精製F2画分2.5％＋CCD 0.5％、□はCCD 0.5％(いずれもw/v)、における結果をそれぞれ示す。
【図１２】糊化した米澱粉と精製F2画分との相互作用による糖溶出量の減少を示す図である。図中、縦軸はグルコース濃度（μg/ml）を示し、棒グラフは左から0.1％、0.2％(w/v)F2水溶液、澱粉糊化液、澱粉糊化液＋0.1％(w/v)F2水溶液の相互作用がないと仮定した際の計算値、澱粉糊化液＋0.1％(w/v)F2水溶液の混合液の実測値、澱粉糊化液＋0.2％(w/v)F2水溶液の相互作用がないと仮定した際の計算値、澱粉糊化液＋0.2％(w/v)F2水溶液の混合液の実測値、を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る会合性に優れる糖質素材の製造法は、必須工程として、
澱粉を酸加水分解することによりアミロデキストリンを得るための工程１と、
上記アミロデキストリンから分岐型糖鎖を抽出するための工程２と、
得られた分岐型糖鎖を主成分とする画分を精製するための工程３と、
を含むことを特徴とするものである。
【００２４】
本発明に係る新規糖質素材は、極めて高純度の分岐型糖鎖からなり、水中でも溶解せず、高い安定性を示すことを特徴とするものである。また、水を含む溶媒中で会合させることにより、分岐型糖鎖が二重らせん構造同士で会合してなる、水中不溶な固形物を生成する。 
【００２５】
［工程１（アミロデキストリン調製工程）］
工程１は、澱粉をその糊化開始温度未満の温度条件下、硫酸または塩酸を含む酸性水溶液中で加水分解した後、固形物画分を回収し、アミロデキストリンを得る工程である。
【００２６】
本発明においてアミロデキストリンとは、一般に「Naegeliアミロデキストリン」と呼ばれるものを指し、澱粉を硫酸または塩酸で加水分解することにより得られる固形物画分であるが、異なる酸を用いる「Lintnerized Starch」と実質的に同義である。
【００２７】
本発明においてアミロデキストリンの調製時における原料としては、各種澱粉、またはその供給原料となる植物体の一部または微生物を用いることができる。
澱粉の種類については、粳（うるち）と糯（モチ）のどちらでも良いが、アミロデキストリンは、澱粉に含まれるアミロペクチン部分から調製されるため、糯澱粉（モチ性澱粉）を原料とすることで収率の上昇が期待される。
【００２８】
澱粉原料としては、コーン、ソルガム、馬鈴薯、甘藷、米、コムギ、大麦、キャッサバ、サゴ、小豆などに由来するものを使うが、澱粉がアミロペクチンを主成分とするものであることから、その他の植物または微生物由来の澱粉や植物茎葉部に蓄積する澱粉も使用することができる。その他、糊化・老化を経た変性澱粉を基質（澱粉）として用いてもよい。
【００２９】
本発明においてアミロデキストリンの調製法としては、例えば上述した非特許文献２の方法が挙げられるが、澱粉の糊化開始温度未満で酸処理を行い、非晶質部分を中心に加水分解・除去するという工程であることが重要である。
【００３０】
具体的な加水分解処理条件としては、以下の通りである。
基質（澱粉）濃度は限定しないが、製造効率を考えると1％〜20％（いずれもw/v）の範囲に収めることが望ましい。
酸性水溶液としては、硫酸または塩酸の水溶液を用いることが望ましい。
【００３１】
酸濃度については限定しないが、硫酸の場合は1％〜40％、好適には10％〜20％（いずれもw/w）の範囲内となるようにするのが望ましく、塩酸の場合は1％〜36％、好適には10％〜20％（いずれもw/w）の範囲内となるようにするのが望ましい。
反応効率向上のため、加水分解反応の途中で酸を追加あるいは溶液交換することも可能である。
【００３２】
温度条件は、使用する澱粉の糊化開始温度未満であればよいが、15℃〜50℃の範囲内にあることがより望ましく、より望ましくは27℃〜47℃の範囲内である。
静置状態でも反応は進むが、反応効率向上のためには攪拌を行うことが望ましい。
反応時間は限定しないが、1時間〜60日間の範囲内にあることが望ましく、より望ましくは５日間〜４５日間の範囲内である。
【００３３】
本発明においてアミロデキストリンは、水不溶の澱粉を酸加水分解した際の固形物画分（固形分）として得られる。大部分は静置した際の沈殿部として得られるものの、一部の固形分は液相内で浮遊分散することが知られている。
したがって、固形物画分（固形分）の回収方法としては、例えば静置後の沈殿部を回収する方法とすることもできるが、収率を確保すべき場合には、液相に浮遊分散する固形分を遠心分離、濾過等の方法で回収することが望ましい。
【００３４】
アミロデキストリンを固形分として回収した後には、必ずしも酸を除く必要はないが、排水処理、溶媒回収などの工程効率化を考慮した場合、可能な限り酸を除くことが望ましい。
その方法は限定されないが、固形分を水で洗浄し、遠心分離、濾過等の方法で固形分を再回収する方法、50％(v/v)エタノール等の有機溶剤の水溶液を加えて沈殿形成を促し、デカンテーション等の方法で固形分を回収する方法、酸をアルカリで中和した後に塩を洗浄除去する方法などが考えられる。
【００３５】
このようにして得られたアミロデキストリンは、そのまま次の工程２に供することもできるが、メタノール等の有機溶媒で洗浄することにより夾雑物を除去する工程や、減圧乾燥、低温常圧乾燥などの方法で乾燥する工程を行うこともできる。
本発明は、このようにして得られるアミロデキストリンを原料として精製される画分に関するものである。 
【００３６】
［工程２（分岐型糖鎖抽出工程）］
工程２は、得られたアミロデキストリンを熱水または熱水溶液中で溶解または懸濁した後、有機溶媒またはその水溶液を添加することにより、再結晶物を回収する段階を含む工程である。
【００３７】
まず、上記工程１で得られたアミロデキストリンを、加熱した水または水溶液中に溶解または懸濁させる。
ここにおいて、加熱した水（熱水）または水溶液（熱水溶液）の温度としては、加えたアミロデキストリンの全量が溶解する温度とすることができ、例えば80℃〜100℃とすることができる。
加熱した水溶液（熱水溶液）としては、例えばピリジン水溶液を挙げることができる。ピリジン水溶液の濃度は、40％〜60％、好ましくは48％〜52％とすることができる。
ただし、特に食品製造用途に用いる糖質素材を製造する場合には、ピリジン水溶液を用いず、熱水のみを用いることが望ましい。
【００３８】
このようにして得られたアミロデキストリンの溶液または懸濁液には、分岐型糖鎖の他に、直鎖型糖鎖などの分岐型糖鎖の会合を阻害する成分や、夾雑物も含まれている。
したがって、次の再結晶段階に先立って分岐型糖鎖の濃度を上昇させるため、アミロデキストリンの溶液または懸濁液から直鎖型糖鎖などの阻害成分や夾雑物を沈殿除去することが望ましい。
【００３９】
具体的な方法としては、予め55℃以下まで冷却したアミロデキストリンの溶液または懸濁液に対し、遠心処理すること、あるいは、有機溶媒またはその水溶液を、当該有機溶媒の濃度が50％〜60％、好ましくは53％〜58％（いずれもv/v）となるように添加して、10分間〜３時間反応させた後に、自然沈降または遠心処理を行うことによって、会合阻害成分や夾雑物を沈殿物として除去する方法などが挙げられる。
ここにおいて、有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトンなどが挙げられる。
【００４０】
ただし、このような沈殿除去は必ずしも必要ではなく、その後に行う精製工程によっても分岐型糖鎖の純度を向上することは十分可能である。
【００４１】
次に、アミロデキストリンの溶液または懸濁液（あるいは沈殿除去した後の溶液）に対し、有機溶媒またはその水溶液を添加することにより、分岐型糖鎖を再結晶させる。
なお、有機溶媒またはその水溶液を添加する際に、溶液または懸濁液が高温である場合は、予め55℃以下まで放冷または冷却してから添加することが望ましい。
有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどが挙げられる。
【００４２】
再結晶の方法としては、溶液または懸濁液における有機溶媒の濃度を上昇させる方法や、溶液または懸濁液の温度を下げる方法が挙げられる。
したがって、有機溶媒またはその水溶液の添加量としては、溶液または懸濁液における有機溶媒の濃度が、メタノールの場合は60％〜80％、好ましくは65％〜75％、エタノールの場合は50％〜70％、好ましくは55％〜65％（いずれもv/v）となるような量とすることができる。
【００４３】
再結晶させる際の温度条件としては、上記の「熱水または熱水溶液」の温度よりも低く、かつ、溶媒の一部が凝固し始める温度よりも高い範囲であればよいが、具体的には、マイナス5℃〜プラス40℃の範囲、好適には0℃〜10℃、さらに好適には2℃〜6℃の範囲内であることが望ましい。
なお、このような温度範囲まで冷却する手段としては、特に限定されない。
【００４４】
上記の条件で５時間〜４日間程度静置することにより、分岐型糖鎖を再結晶させることができる。
このようにして得られる再結晶物の回収方法としては、自然沈降後のデカンテーション、遠心分離、膜分離等の公知の固液分離技術を用いることができる。
【００４５】
上記により得られた再結晶物（分岐型糖鎖を主成分とする画分）は、そのまま次の工程３に用いることができるが、メタノール等の有機溶媒で洗浄することにより夾雑物を除去する工程や、減圧乾燥、低温常圧乾燥などの方法で乾燥する工程を行うこともできる。 
【００４６】
［工程３（分岐型糖鎖精製工程）］
工程３は、前工程で得られた再結晶物を熱水中に溶解または懸濁した後、有機溶媒またはその水溶液を添加することにより、目的物を再結晶物として回収する工程を１回以上行う工程である。
【００４７】
工程２において回収された固形分（再結晶物）は、もう１回またはもう複数回（好ましくは２回以上、より好ましくは３回以上、さらに好ましくは４回以上）、熱水中に溶解または懸濁し、有機溶媒またはその水溶液を添加し、沈殿物または再結晶物を得るという一連の精製工程を経ることで、その中に存在する会合性素材（分岐型糖鎖）の純度を向上できる。
【００４８】
本工程において、加熱した水（熱水）の温度としては、80℃〜100℃とすることができる。
本工程において、有機溶媒またはその水溶液を添加する際に、溶液または懸濁液が高温である場合は、予め55℃以下まで放冷または冷却してから添加することが望ましい。
【００４９】
有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどが挙げられるが、特に食品製造用途に用いる糖質素材を製造する場合には、上記工程２における再結晶段階も含めて、エタノールのみを用いることが好ましい。
本工程を複数回行う場合には、「有機溶媒またはその水溶液」として、単一種類の溶媒を用いても、回ごとに異なる溶媒を用いても良い。
【００５０】
本工程において、有機溶媒またはその水溶液の添加量としては、溶液または懸濁液における有機溶媒の濃度が、メタノールの場合は5％〜60％、好ましくは8％〜40％、より好ましくは8％〜20％、エタノールの場合は5％〜60％、好ましくは8％〜40％、より好ましくは8％〜20％（いずれもv/v）となるような量とすることができる。
【００５１】
本発明では、前記工程２から本工程３の沈殿物または再結晶物の回収工程のうち、少なくとも一回について、沈殿物または再結晶物の形成時においてエタノール水溶液またはメタノール水溶液を用いることを特徴とする。
このとき、エタノール水溶液の濃度は60％(v/v)以下、メタノール水溶液の濃度は60％(v/v)以下の範囲に入ることが望ましい。この濃度範囲よりも高い場合には、目的物の精製度向上の鈍化が懸念される。
【００５２】
この沈殿物または再結晶物の回収を複数回行う場合には、単一種類の有機溶媒を用いても、回ごとに異なる有機溶媒を用いても良い。この工程における有機溶媒として、エタノールのみを用いることが可能であり、本発明の会合性糖質素材を食品素材として製造する際の工程への負荷が低減できる。
【００５３】
本工程３において、再結晶させる際の温度条件としては、上記の「熱水」の温度よりも低く、かつ、溶媒の一部が凝固し始める温度よりも高い範囲であればよいが、具体的には、マイナス5℃〜プラス40℃の範囲、好適には0℃〜10℃、さらに好適には2℃〜6℃の範囲内であることが望ましい。
なお、このような温度範囲まで冷却する手段としては、特に限定されない。
【００５４】
本工程において、上記の条件で５時間〜４日間程度静置することにより、分岐型糖鎖を再結晶させることができる。
このようにして得られる再結晶物の回収方法としては、自然沈降後のデカンテーション、遠心分離、膜分離等の公知の固液分離技術を用いることができる。
【００５５】
上記により得られた再結晶物（精製された分岐型糖鎖画分）は、そのまま本発明の糖質素材として用いることや、次の精製工程に用いることができるが、メタノール等の有機溶媒で洗浄することにより夾雑物を除去する工程や、減圧乾燥、低温常圧乾燥などの方法で乾燥する工程を行うこともできる。 
【００５６】
［新規糖質素材］
本発明の会合性に優れる新規糖質素材は、このようにして得られた沈殿物または再結晶物として回収・精製される。
この新規糖質素材は、グルコース重合度が20以上である分岐型糖鎖を、イオン交換−パルスドアンペロメトリ検出によるピーク面積比で９５％以上の純度で含有する新規糖質素材であって、それを16Mメタノール存在下で25℃で静置したときに660nmにおける吸光度が1.0となるのに要する時間が20分間以内であることを特徴とするものである。
【００５７】
本発明の新規糖質素材は、熱水または加熱水溶液中に溶解した後、必要に応じて冷却して、水、メタノール水溶液等の溶媒に置換した後に静置しておくと、濁度が上昇し沈殿の形成が観察できる。
この現象は、非特許文献３で報告されている。非特許文献３中で二重らせん構造に富むフラクション2（F2またはBD）が示す濁度上昇挙動と比較して、本発明の会合性糖質素材は、有機溶剤（具体的にはピリジン）の使用を抑えられることを特徴としている。
そして、本発明では、精製度を高めるための工程（上記工程３）を提供することで、必要に応じて会合性糖質素材に一層優れた特性を示すことが可能となる。 
【００５８】
［新規糖質素材の改変］
非特許文献３では、基質濃度1.0％(w/v)、溶媒として16モル濃度のメタノール水溶液を用いて25℃で静置した際に、分光光度計（Klett社、「Photoelectric colorimeter」）で＃66フィルター（640〜700 nm相当）を使用して濁度を測定した際に、濁度0.5に相当するTurbidity250程度まで上昇するまでの時間を約20分間と評価している。
【００５９】
一方、本発明の会合性糖質素材は、非特許文献３のF2画分に比べて分岐型糖鎖の純度を著しく向上できるため、誘導体化により特性を改変することが可能となる。
二重らせん構造をもつ一分子をモデルとして誘導体化戦略を考える場合、一つには、分子中の一本の鎖または両方の鎖の長さを改変することができる。
本反応は、既知の有機合成法、糖質加水分解酵素の糖転移反応による合成法、糖転移酵素による酵素合成法、糖質加リン酸分解酵素による酵素合成法などの方法を用いることが可能である。
【００６０】
二本鎖の両方を伸ばした場合には、二重らせんが安定化し、熱による構造変化が起こりにくくなることから、熱安定性の機能性材料としての用途が期待される。一本だけを伸ばした場合には、分子内で二重らせんが形成した後に、長さの差分として一本鎖部分が突出する構造を形成するものと期待される。
【００６１】
また、グルコース残基またはマルトオリゴ糖残基の代わりに、他の糖質残基または非糖質残基を非還元末端側に結合させることで、二重らせん構造の形成をさせつつ、非還元末端側に情報を提示することが可能となる。
【００６２】
もう一つの誘導体化戦略としては、還元末端の修飾が考えられる。還元末端は、還元アミノ化修飾法をはじめとして様々な方法により修飾が可能である。蛍光ラベル、ビオチン化、アミノ酸、ペプチドや蛋白質などとの複合体の形成により、二重らせんの形成能力と会合能力をもつ新規物質の合成が可能となる。
【００６３】
本発明での会合性素材は、必要に応じて誘導体化を経て、澱粉等、相互作用を有すると期待される物質との作用特性を解析するためのプローブとして使用できる。
特に、還元末端をラベルした分子は、相互作用の位置を顕微学的に解析する際などに有用性を発揮すると期待される。本発明の成果を用いれば、このような解析のためのキットを提供できる。
本発明によれば、既知の方法により新規糖質素材の還元末端をラベルしてなる分子を含む、糖質の相互作用の位置を顕微学的に解析するためのキットを提供することができる。
【００６４】
今ひとつの戦略として、二本鎖の水酸基をラベルする方法が考えられる。
グルコース残基がα−１，４結合で繋がる鎖には、2、3位と6位に水酸基が存在する。このうちの１つまたは複数種類の水酸基を修飾することができる。特に、6位の第1級水酸基は糖転移、化学的酸化等による誘導体合成を行いやすいと考えられる。
【００６５】
本発明においては、前記製造法の工程３の後に、すなわち、前記製造法により得られた新規糖質素材に対して、糖質素材の鎖の構造を改変する工程を行うことができる。
この「改変」としては、具体的には、新規糖質素材に対し、糖転移活性をもつ糖質加水分解酵素、糖質加リン酸分解酵素などの酵素を作用させることで、糖鎖に糖を結合させる方法や、新規糖質素材の還元末端の修飾（蛍光ラベル化、ビオチン化、アミノ酸、ペプチドや蛋白質などとの複合体の形成など）等が挙げられる。
これらの改変工程は、既知の方法により行うことができる。
なお、本発明において「新規糖質素材」とは、上記のような改変後の糖質素材をも含むものである。 
【００６６】
［糖質素材の会合により得られる固形物］
本発明の固形物は、グルコース重合度が20以上である分岐型糖鎖（すなわち、本発明の新規糖質素材）が、分子内で二重らせん構造をとり、当該二重らせん構造同士が会合してなる固形物であることを特徴とするものである。
この固形物は、本発明の新規糖質素材を、水を含む溶媒に溶解した後に５時間〜４日間程度静置することで、これを会合させることにより製造することができる。
【００６７】
ここにおいて、新規糖質素材を溶解する際は、溶媒を80℃〜100℃程度に加熱して完全に溶解することが望ましい。そうすることにより、糖鎖の二重らせんが完全にほどけるためである。
静置する際の温度条件としては、上記の溶解時の温度よりも低く、かつ、溶媒の一部が凝固し始める温度よりも高い範囲であればよいが、具体的には、マイナス5℃〜プラス40℃の範囲、好適には0℃〜10℃、さらに好適には2℃〜6℃の範囲内であることが望ましい。
なお、このような温度範囲まで冷却する手段としては、特に限定されない。 
【００６８】
また、本発明においては、本発明の新規糖質素材を、水を含む溶媒に溶解した後に静置することで、他の素材が混在する状態で会合させることによって、会合速度や粒子径といった会合特性を任意に制御したり、新規糖質素材を含む超分子を製造したりすることが可能である。
ここにおいて、「他の素材」としては、本発明の新規糖質素材と相互作用する、澱粉（糊化または老化した変性澱粉も含む。）、アミロース、アミロペクチン、またはこれらの誘導体などが挙げられる。
なお、「水を含む溶媒」としては、特に限定されないが、例えば水、メタノール水溶液、エタノール水溶液、アセトンなどが挙げられる。
【００６９】
本発明の会合性糖質素材は、上述したとおり、水または有機溶媒の水溶液中で会合することが特徴である。
本会合現象を制御することで、粒子径を制御した素材を調製できる。例えば、会合する前の会合性素材の溶液または懸濁液を脂質中に高度に分散させた状態で静置し、会合させることで、微粒子の形成が可能となる。
【００７０】
また、会合特性に影響を与える共存物質の存在下で会合させることで、会合速度や粒子径を制御したり、本発明での会合性素材を含む超分子を製造したりすることができる。
また、本発明での会合性素材の溶液または懸濁液を微細な隙間や流路に流し込み、その後、会合させることにより、隙間や流路の閉塞が可能となる。
会合性素材が会合すると常温での水溶性が低いことから、水浸透性や構造変化の精密制御が可能となる。
【００７１】
本発明の会合性糖質素材と澱粉を含む素材との関係については、未糊化または老化後のアミロペクチンの二重らせん、老化後のアミロース二重らせん等との相互作用により、老化の促進または老化の抑制に寄与すると考えられる。その効果は、添加量、添加方法、添加時期、保存温度などに影響されることが示唆される。
したがって、本発明の新規糖質素材あるいはそれを会合させてなる固形物は、食品や非食品の密度、剛性、粘性、弾性、品質安定性、消化性、生分解性、調理加工時の物性変化、機能性成分の保持性・徐放性、崩壊性等を変化させるために使用することができる。
そして、新規糖質素材の会合後に水溶性が大きく低減する特性を利用し、生分解性のフィルムやプラスチックへの応用が可能となる。
【００７２】
本発明によれば、新規糖質素材あるいはそれを会合させてなる固形物を含有してなる、密度、剛性、粘性、弾性、品質安定性、消化性、生分解性、調理加工時の物性、機能性成分の保持性・徐放性、崩壊性等の物性が改変された生分解性素材、あるいは食品を提供することができる。
【００７３】
さらに、本発明によれば、本発明の新規糖質素材及びそれを会合させてなる固形物のうち少なくとも１種類を、水を含む溶媒に溶解した後に、溶質が再会合する際の挙動を解析することを特徴とする、会合特性の評価方法が提供される。 
【実施例】
【００７４】
以下に本発明の詳細を試験例として説明する。これらにより、本発明の内容は何ら制限を受けない。 
【００７５】
試験例１「F2画分の精製条件の検討」
NaegeliアミロデキストリンおよびF2画分の調製は、基本的に上記非特許文献２の方法に準じて行った。
【００７６】
5Lの三角フラスコに2Lの16％(w/w)硫酸水溶液を入れ、撹拌しながら100gの糯米澱粉を加えた。当該三角フラスコを毎分60回転する振とう恒温器に入れ、37℃にて35日間保温することにより加水分解処理を行った。保温後の溶液を5000×g、10分間、25℃で遠心処理して上清を取り除き、残った沈殿を洗浄水のpHが7程度になるまで10回程度水洗浄し、さらに70％(v/v)メタノール水溶液、100％メタノールで順次洗浄した後、風乾することによりNaegeliアミロデキストリンを得た。
【００７７】
上記で調製したNaegeliアミロデキストリン10gに、200mLの50％(v/v)ピリジン水溶液を加え、ホットスターラーで撹拌しながら穏やかに沸騰する温度（100℃程度）で加熱することにより、Naegeliアミロデキストリンを完全に溶解させた。この溶液を50℃程度に冷まし、メタノールを55％(v/v)となるように加えた後、30分間撹拌した。撹拌後の溶液を3000×g、15分間、25℃で遠心処理して沈殿を取り除き、残った上清にメタノールを75％(v/v)となるように加え、一晩室温（約25℃）で撹拌した後、3000×g、15分間、25℃で遠心処理して沈殿を回収した。
【００７８】
上記で回収した沈殿に水を50mL加え、撹拌しながら100℃で加熱して沈殿を完全に溶解した後、50℃程度に冷まし、メタノール150mLを70％(v/v)となるように撹拌しながらゆっくり加え、3日間室温（約25℃）で静置した。静置後の溶液を3000×g、15分間、25℃で遠心処理して沈殿を回収した。当該沈殿を70％(v/v)メタノール水溶液、100％メタノールで順次洗浄した後、風乾することにより分岐型糖鎖を主成分とするF2画分を得た。
【００７９】
次に、F2画分の精製条件（エタノール濃度、静置温度）を検討した。
F2画分を精製するため、上記で調製したF2画分を200mg/mlとなるように水に懸濁し、撹拌しながら100℃で加熱して完全に溶解させた。沈殿回収に及ぼすエタノール濃度と静置温度の影響を評価するため、最終的にF2画分が100mg/ml、エタノール濃度が0〜60％(v/v)となるように、25℃程度に冷ました上記溶液にエタノールと水を加えて、4℃、25℃、40℃にて16時間静置した。静置後の溶液を8000×g、10分間、25℃で遠心して沈殿を回収し、当該沈殿を100％エタノールで洗浄した後、風乾することにより精製後のF2画分を得た。
精製後のF2画分の質量を測定し、回収率（（精製後のF2画分／精製前のF2画分）×100％）を計算した。
【００８０】
精製したF2画分中の分岐型糖鎖（F2）と直鎖型糖鎖（F3）の存在比の算出のため、上記精製物を高速液体クロマトグラフィーとパルスドアンペロメトリ検出器の組み合わせ（HPAEC-PAD）により分析した。
各精製物を0.1％(w/v)となるように水に加えて加熱することで完全に溶解した溶液を、孔径0.22μmのフィルターを通過させてクロマトグラフィーの試料とした。
【００８１】
クロマトグラフィーは、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のイオンクロマトグラフICS-5000＋システムを用い、以下の条件で行った。カラムは、陰イオン交換カラムDionex CarboPac PA1（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、カラムφ4×250mmにガードカラムφ4×50mmをつけて用いた。25μlの試料を導入し、溶離液は、0.1M水酸化ナトリウム水溶液中で酢酸ナトリウム濃度を50mMから500mMまで60分間かけて上昇させるプログラムを用いて、1ml/分の流量で流した。
検出には金電極を用いたパルスドアンペロメトリ検出器を用いた。サーモフィッシャーサイエンティフィック社のダイオネクスクロメレオンクロマトグラフィーデータシステムソフトウェアによりクロマトグラフィーの制御及び分析を実施した。
【００８２】
糖鎖の重合度が長いほど溶出時間が遅くなることを利用して、試料中の糖鎖の重合度を同定した。グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースの標準品を用いて、それぞれの溶出時間を確認した。また、標準品の存在しないそれ以上の重合度を有する糖鎖については、溶出時間で順次ピークの割り当てを行い、同定に用いた。
直鎖の糖鎖と、分岐を有する糖鎖では溶出時間にずれが生じるため、これを利用して直鎖型糖鎖（F3）と分岐型糖鎖（F2）を区別できる。全体のピーク面積の合計を100％としたときの、直鎖型糖鎖（F3）と分岐型糖鎖（F2）それぞれに相当するピークの合計面積を算出し、それに基づいてF3、F2の存在比を算出した。
【００８３】
上記のようにして、エタノール濃度と静置温度が沈殿回収率に及ぼす影響を評価した。結果を図１に示した。図１中、縦軸は回収率（＝［精製F2画分中のF2又はF3（g）／精製前のF2画分（g）］×100、単位は質量％）を示し、横軸はエタノール濃度（容量％）を示す。なお、精製F2画分中のF2又はF3の質量は、精製後に得られた沈殿質量に、上記で算出したF2又はF3の存在比を乗じることで算出した。
その結果、エタノール濃度が高いほど回収率が上昇すること、エタノール濃度が高いほどF2対F3の存在比（F2/F3）が下がること、そして、静置温度が低いほど回収率が高いこと、が示された。
このことから、全体の回収率を高く保ちながら、F2の存在比を高めたい場合、エタノール濃度10％(v/v)で4℃の条件下で静置して沈殿させるのが最も好適であることが示された。
【００８４】
同様に、上記においてエタノールの代わりにメタノールを用いて、メタノール濃度と静置温度の影響を評価した。結果を図２に示した。図２中、縦軸は回収率（＝［精製F2画分中のF2又はF3（g）／精製前のF2画分（g）］×100、単位は質量％）を示し、横軸はメタノール濃度（容量％）を示す。なお、精製F2画分中のF2又はF3の質量は、精製後に得られた沈殿質量に、上記で算出したF2又はF3の存在比を乗じることで算出した。
その結果、エタノールと同様に、メタノールを用いた場合も、メタノール濃度が高いほど回収率は上昇すること、メタノール濃度が高いほどF2対F3の存在比（F2/F3）が下がること、そして、静置温度が低いほど回収率が高いこと、が示された。
このことから、メタノールを用いた精製においても、全体の回収率を高く保ちながら、F2の存在比を高めたい場合、メタノール濃度10％(v/v)で4℃の条件下で静置して沈殿させるのが最も好適であることが示された。 
【００８５】
試験例２「繰り返し精製の効果の評価」
試験例１の結果に基づき、エタノール濃度10％(v/v)、4℃で静置して沈殿させる条件の下、F2画分の精製を１回、２回、３回又は４回繰り返して行った。各精製物について、試験例１と同様にして回収率の算出およびHPAEC-PAD分析を行い、また16Mメタノール中での会合性の評価を行った。
【００８６】
16Mメタノール中での会合性の評価は、基本的に上記非特許文献３の方法に準じて行った。非特許文献３では、分岐型糖鎖の二重らせんによる会合構造の形成を濁度（吸光度660nm）により測定している。
すなわち、試験例１で調製した５種類のデキストリン（F2画分、1〜4回精製F2画分）をそれぞれ2.5％(w/v)になるように水に懸濁し、加熱することにより完全溶解した。当該溶液を放冷して室温（約25℃）まで冷却後、0.1mlを96穴マイクロプレートのウェルに入れ、そこに0.1625mlの100％メタノールを加えて（メタノール終濃度：16M）よく懸濁し、室温（約25℃）にて濁度の測定を行った。濁度測定には、マイクロプレートリーダーを用いて、660nmにおける吸光度を20秒ごとに測定し、吸光度変化を追跡した。
【００８７】
また、精製したF2画分が分岐型糖鎖からなることを確認するため、イソアミラーゼを用いて分岐（α-1,6結合）を切断した後、試験例１と同様にしてHPAEC-PAD分析を行った。
0.1％(w/v)の精製F2画分、50mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.0）及び0.1％(w/v)アジ化ナトリウムを含む溶液1mlに、イソアミラーゼ（Megazyme社製）5Uを加え、40℃で16時間反応させた。反応後の溶液を孔径0.22μmのフィルターを通過させてクロマトグラフィーの試料とした。HPAEC-PAD分析は試験例１と同様に行った。
結果を図３〜５に示した。
【００８８】
F2画分の繰り返し精製により、回収率は、精製前の粗F2画分の質量に対し、1回精製で56％、2回で47％、3回で41％、4回で35％となった。
図３は、精製F2画分のHPAEC-PAD分析結果を精製回数で比較した図である。図中、縦軸は検出器の応答（nC）を示し、横軸は溶出時間（分）を示し、「×n」は10％(v/v)エタノール条件での精製回数を示す。矢印は当該ピークに対応するグルコース重合度（DP）を示す。
その結果、F2画分で確認される２つの大きなピーク群のうち、精製を繰り返すごとに、溶出時間の短い（左側の）ピーク群の比率が下がり、溶出時間の長い（右側の）ピーク群の比率が上昇することが示された。
【００８９】
上記の各ピーク群の成分を確認するため、精製前（図４Ａ）と４回精製後（図４Ｂ）のF2画分をイソアミラーゼで分解した後にHPAEC-PAD分析した結果を図４Ａ及び図４Ｂに示した。図中、縦軸は検出器の応答（nC）を示し、横軸は溶出時間（分）を示す。
その結果、イソアミラーゼ分解前は２つの山（ピーク群）が確認されるが、分解後には後半（右側の）のピーク群が消失することが示された。このことにより、前半の（左側の）ピーク群は主に直鎖型糖鎖、後半の（右側の）ピーク群は主に分岐型糖鎖に由来することが示唆された。
また、10％(v/v)エタノール条件で精製を繰り返すことで、直鎖型糖鎖の比率が低下し、主として分岐型糖鎖となることが示された（図３）。
図３のピーク面積の比率から試験例１と同様にして算出した分岐型糖鎖（F2）の比率は、精製前の粗F2画分の成分比に依存するが、精製前のF2画分で79％であったものが、1回精製で88％、2回で92％、3回で94％、4回で95％まで上昇した。
【００９０】
図５は、16Mメタノール水溶液中での会合挙動に対するF2画分精製の影響を示すグラフである。図中、縦軸は濁度（660nmにおける吸光度）を示し、横軸は測定時間（分）を示し、「×n」は精製回数を示す。
その結果、10％(v/v)エタノール条件で精製を繰り返すことで、濁度上昇（会合構造の形成）までに必要な時間が大幅に短縮されること、そして、会合速度も飛躍的に上昇すること、が示された。精製により、直鎖型糖鎖や二重らせん構造の会合を阻害する成分が除去され、分岐型糖鎖による会合性（会合しやすさ）が向上したためと考えられる。
【００９１】
以上の結果から、F2画分を10％(v/v)エタノールで精製することにより、分岐型糖鎖の比率が上昇し、会合性が上昇することが示唆された。 
【００９２】
試験例３「食品製造に適用可能な高機能素材の精製」
酸加水分解後のNaegeliアミロデキストリンを精製する際、ピリジン−メタノール系ではなく、エタノール水溶液で分画精製を行うことにより、食品製造に適合した新規糖質素材を製造した。
【００９３】
Naegeliアミロデキストリンの調製は、前述の試験例１の方法で行った。
調製したNaegeliアミロデキストリン5gに25mLの水を加え、時々撹拌しながら100℃で加熱することにより完全に溶解した。この溶液を25℃程度に冷まし、3000×g、15分間、25℃で遠心処理して沈殿を取り除き、残った上清にエタノールを60％(v/v)となるようにゆっくり加え、25℃で一晩（約16時間）静置した。静置後の溶液を3000×g、15分間、25℃で遠心処理して沈殿を回収した。
【００９４】
次いで、上記で回収した沈殿を10％(v/v)エタノール条件下で精製した。
回収した沈殿に水を18mL加え、撹拌しながら100℃まで加熱することにより完全に溶解した。この溶液を25℃程度に冷まし、エタノール2mL（エタノール終濃度：10％(v/v)）を撹拌しながらゆっくり加え、4℃で一晩（約16時間）静置した。
上記の遠心、沈殿回収、加水、加熱、溶解、エタノール沈殿という一連の精製工程を1サイクルとして、精製を3サイクル繰り返した。最後のエタノール沈殿後に、3000×g、15分間、25℃で遠心処理して沈殿を回収し、得られた沈殿を70％(v/v)エタノール水溶液、100％エタノールで順次洗浄した後、風乾することにより、精製物を得た。
【００９５】
このようにして3回精製した各精製物と精製前のNaegeliアミロデキストリンについて、上記試験例１、２の方法に従って、HPAEC-PAD分析、および16Mメタノール中での会合性の評価を行った。3回精製後に回収した精製物の、Naegeliアミロデキストリンの質量に対する収率（回収率）は、14.6質量％であった。
【００９６】
HPAEC-PAD分析の結果を図６に示した。
図６は、Naegeliアミロデキストリンのエタノール水溶液による精製物のHPAEC-PAD分析結果を精製回数で比較した図である。図中、縦軸は検出器の応答（nC）を示し、横軸は溶出時間（分）を示し、「×n」は10％(v/v)エタノール条件での精製回数を示す。
その結果、一番上の精製前のNaegeliアミロデキストリン（図中の「NA」）では直鎖型糖鎖に由来する左側のピーク群の比率が大きいのに対し、10％(v/v)エタノール条件での精製を繰り返すにつれて左側のピーク群の比率が下がり、分岐型糖鎖に由来する右側のピーク群の比率が上昇することが示された。このことから、エタノール水溶液での沈殿（精製）の回数を多くするほど、分岐型糖鎖の存在比が上がることが示された。
図６のピーク面積の比率から試験例１と同様にして算出した、精製前のNaegeliアミロデキストリン（NA）における分岐型糖鎖の存在比が62％であったものが、1回精製で73％、2回精製で84％、3回精製で92％まで上昇した。
【００９７】
また、精製物の16Mメタノール中での会合性の評価の結果を図７に示した。
図７は、Naegeliアミロデキストリンのエタノール水溶液による精製物の16Mメタノール中での会合挙動を示すグラフである。図中、縦軸は660nmにおける吸光度を示し、横軸は測定時間（分）を示し、「×n」は10％(v/v)エタノール条件での精製回数を示す。
その結果、エタノール水溶液での沈殿（精製）の回数を多くするほど、濁度（吸光度660nm）上昇（＝二重らせんによる会合構造の形成）に必要な時間が短縮されること、そして、会合速度も飛躍的に上昇すること、が示された。吸光度が1.0となるのに必要な時間で比較すると、Naegeliアミロデキストリン（図中の「NA」）で36分間かかるところが、1回精製で19.5分間、2回精製で9分間、3回精製で5.5分間となり、精製回数が多くなるほど短い時間で沈殿が生じることが示された。精製により、直鎖型糖鎖や二重らせん構造の会合を阻害する成分が除去され、分岐型糖鎖による会合性（会合しやすさ）が向上したためと考えられる。
【００９８】
以上のことから、水とエタノールのみを使用してNaegeliアミロデキストリンを精製した場合でも、分岐型糖鎖の比率と会合性（会合しやすさ）を上昇させることが可能であることが示された。上記のようにしてピリジン水溶液やメタノールを用いずに製造された新規の高機能糖質素材は、食品製造工程への適合性が向上している。 
【００９９】
試験例４「高機能素材の修飾による会合特性の向上」
高機能素材として、試験例２で調製した分岐型糖鎖（F2）の存在比が95％である、4回精製したF2画分を用いた。分岐画分の調製および精製は試験例２で前述の通り行った。この高機能素材52mgに対し、シュクロースホスホリラーゼを0.2U/ml、グリコーゲンホスホリラーゼを0.2U/ml、25倍量のシュクロース、40mMのリン酸二ナトリウム、1mMのジチオスレイトール、及び2mMのEDTA、を含む20mM MOPS（4-Morpholinepropane-1-sulfonic acid）水溶液を10ml加え、37℃で3日間、1分間当たり60往復の往復振とうさせることにより酵素反応させた。反応後の溶液に3倍の液量のメタノールを加えて反応を停止させ、生じた沈殿を回収した後、70％(v/v)メタノール、100％メタノールで順次洗浄し、乾燥、回収した。
【０１００】
このようにして回収した沈殿物は、100℃までの加熱では水に溶解しなかったため、0.1M水酸化ナトリウムに溶解し、試験例１と同様にしてHPAEC-PAD分析を行った。また、対照として、酵素（シュクロースホスホリラーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ）を添加しないMOPS水溶液を用いたこと以外は上記と同様に調製した沈殿物を用いて、HPAEC-PAD分析を行った。その結果を図８に示した。
【０１０１】
図８は、精製F2画分のホスホリラーゼ処理後のHPAEC-PAD分析結果である。図中、縦軸は検出器の応答（nC）を示し、横軸は溶出時間（分）を示す。下段（図中の「伸長処理」）がホスホリラーゼを用いた伸長処理後の結果であり、上段（図中の「酵素不添加」）がホスホリラーゼ不添加の対照区の結果である。
その結果、酵素不添加の画分でピーク高さの最も高い鎖長の重合度が25であったものが、酵素処理を行うことにより重合度が36程度まで増加した。このことから、ホスホリラーゼ処理により分岐型糖鎖の鎖長が、重合度で10程度伸長したことが示された。
【０１０２】
また、上記で得られた沈殿物を水に懸濁して加熱した場合、酵素不添加物では約80℃で溶解したが、伸長処理したものは100℃でも溶解しなかった。このことから、高機能素材を酵素（ホスホリラーゼ）処理することにより、溶解に必要な温度が100℃以上に向上したことが示唆された。
【０１０３】
さらに、これらの沈殿物に対して、示差走査熱量測定を行った。示差走査熱量測定はPerkin-Elmer社のDSC8000システムを用い、以下の条件で行った。
70μl容量のサンプルパンに、沈殿物約10mgと3倍量の水を加え、密閉した後、サンプル温度を4℃から140℃まで10℃/分で上昇させたときの熱量変化を測定した。解析にはPerkin-Elmer社のPyrisソフトウェアを用い、沈殿物の糊化温度を算出した。
その結果、糊化温度は酵素不添加物で60℃であったのに対し、伸長処理物では110℃に上昇していた。
【０１０４】
以上のことから、加リン酸酵素処理による誘導体化により、分岐型糖鎖の鎖長が伸長して二重らせんが安定化し、熱による構造変化が起こりにくい（熱安定性が高い）糖質素材を作製できることが示された。 
【０１０５】
試験例５「F2画分の水中での会合挙動の評価」
試験例２の図５に示した通り、精製したF2画分は室温で16Mメタノール中での会合性が上昇していることが示されているが、この素材がメタノールのみならず水中でも会合性を示すことを確認した。
【０１０６】
試験例２と同様にして10％(v/v)エタノール条件下で1回精製したF2画分を試料として、水中での会合性を評価した。ここにおいて、分岐型糖鎖の二重らせんによる会合構造の形成を濁度（吸光度660nm）により測定した。
精製F2画分を3.0％(w/v)となるように水に懸濁し、100℃で加熱し、完全溶解した。この溶液が室温(約25℃)に冷めた後、1.25％(w/v)〜3.0％(w/v)となるように水で希釈し、当該希釈液0.1mlを96穴マイクロプレートのウェルに入れ、4℃にて静置し、一定時間毎に濁度の測定を行った。濁度測定には、マイクロプレートリーダーを用いて、660nmにおける吸光度を測定し、吸光度変化を追跡した。その結果を図９に示した。
図９は、1回精製したF2画分の水中での会合挙動を示すグラフである。図中、縦軸は濁度（660nmにおける吸光度）を示し、横軸は測定時間（分）を示す。●は精製F2画分の濃度3.0％、○は2.5％、▲は2.0％、△は1.5％、■は1.25％(いずれもw/v)、における結果をそれぞれ示す。
その結果、1回精製F2画分は、4℃程度の低温では水中でも会合性を示し、濃度が高いほど会合性が高いことが示された。
【０１０７】
さらに、試験例２と同様にして10％(v/v)エタノール条件下で1〜4回精製したF2画分を、それぞれ20％(w/v)となるように水に懸濁し、100℃で加熱し、完全溶解した。この溶液が室温(約25℃)に冷めた後、2％(w/v)〜20％(w/v)となるように水で希釈し、当該希釈液0.1mlを96穴マイクロプレートのウェルに入れ、4℃、15℃、25℃で静置し、24時間後に倒立型光学顕微鏡で観察して沈殿物の粒径を測定した。
その結果、一定濃度（20％(w/v)）で静置温度を変化させたときの沈殿の平均粒径は、4℃で静置したときには2.6μm、15℃で2.2μm、25℃で3.1μmとなり、静置温度が低いと粒径が小さくなることが示された。また、一定温度（15℃）で濃度を変化させたときの沈殿の平均粒径は、濃度10％(w/v)のときに2.9μm、5％(w/v)のときに2.1μmとなり、濃度が低いときには粒径が小さくなることが示された。
【０１０８】
このことから、会合させる温度（静置温度）と濃度を調整することによって、会合性素材の粒子径の制御が可能となることが示された。また、マイクロプレートごと倒立型光学顕微鏡での観察をおこなうことで、粒子形状への影響などを評価することが可能であることが示された。 
【０１０９】
試験例６「分岐型糖鎖を用いた会合阻害物質の探索・評価」
試験例２と同様にして作製した1回精製F2画分を用いて、会合特性に影響を及ぼす物質の探索を行った。
例えば、高度に分岐した環状デキストリンであるクラスターデキストリン（江崎グリコ（株））について、16Mメタノール中および水中での1回精製F2画分の会合特性に及ぼす影響評価を行った。
【０１１０】
16Mメタノール中での会合性の評価は、試験例２の方法で行った。
水中での会合性の評価は、次の通り行った。評価したい物質（クラスターデキストリン）の任意の濃度の水溶液を作製し、当該水溶液0.025mlを96穴マイクロプレートのウェルに入れた。次に、1回精製F2画分を3.125％(w/v)となるように水に懸濁し、100℃で加熱し、完全に溶解した。室温(約25℃)に冷ました後、当該溶液0.1mlを、上記した評価したい物質（クラスターデキストリン）の入っているマイクロプレートのウェルに入れ、ピペッティングでよく撹拌して、4℃に静置した。一定時間毎に660nmにおける吸光度（濁度、会合構造の形成の指標）を測定し、吸光度変化を追跡した。
【０１１１】
これらの結果を図１０および図１１に示した。
図１０は、クラスターデキストリン（CCD）を0.025％(w/v)添加したときの16Mメタノール水溶液中での精製F2画分の会合遅延効果を示す図である。図中、縦軸は濁度（660nmにおける吸光度）を示し、横軸は測定時間（分）を示す。
図１１は、クラスターデキストリン（CCD）添加による水中での精製F2画分の会合遅延効果を示す図である。図中、縦軸は濁度（660nmにおける吸光度）を示し、横軸は測定時間（分）を示す。●は精製F2画分2.5％、○は精製F2画分2.5％＋CCD 0.125％、▲は精製F2画分2.5％＋CCD 0.25％、◇は精製F2画分2.5％＋CCD 0.5％、□はCCD 0.5％(いずれもw/v)、における結果をそれぞれ示す。
その結果、クラスターデキストリンを添加することで、メタノール中、水中いずれにおいても濁度（吸光度660nm）の上昇が遅くなり、会合速度が低下していることが示された。
【０１１２】
このように、分岐型糖鎖に対する会合阻害作用をもつ物質の探索、濃度依存性の評価を小規模で行うことが可能であることが示された。 
【０１１３】
試験例７「分岐型糖鎖と澱粉系素材との相互作用」
米澱粉（コシヒカリ由来）を2％(w/v)となるように水に懸濁し、撹拌しながら100℃で加熱し、糊化させた。次に、試験例２と同様にして作製したF2画分１回精製物を、0.2％または0.4％（いずれもw/v）となるように水に混合して加温して完全に溶解し、分岐型糖鎖F2水溶液とした。上記の澱粉糊化液に分岐型糖鎖F2水溶液（0.2％または0.4％（いずれもw/v））を等容量加え、ボルテクスミキサーでよく撹拌した後、4℃で21時間保存した。これを12000×gで5分間遠心分離し、得られた上清部の糖濃度をフェノール硫酸法により測定した。その結果を図１２に示した。
【０１１４】
図１２は、糊化した米澱粉と精製F2画分との相互作用による糖溶出量の減少を示す図である。図中、縦軸はグルコース濃度（μg/ml）を示し、棒グラフは左から0.1％、0.2％(w/v)F2水溶液、澱粉糊化液、澱粉糊化液＋0.1％(w/v)F2水溶液の相互作用がないと仮定した際の計算値、澱粉糊化液＋0.1％(w/v)F2水溶液の混合液の実測値、澱粉糊化液＋0.2％(w/v)F2水溶液の相互作用がないと仮定した際の計算値、澱粉糊化液＋0.2％(w/v)F2水溶液の混合液の実測値、の結果を示す。また、▼は澱粉糊化液とF2水溶液の相互作用がないと仮定した際の計算値、すなわち、澱粉糊化液とF2水溶液それぞれ単独で測定した糖濃度を単純に合計した値を示す。
【０１１５】
図１２から、澱粉の糊化液から溶出する糖質とF2（分岐型糖鎖）由来の成分が相互作用しないと仮定した際のグルコース濃度の計算値と比較して、澱粉糊化液とF2水溶液を混合した場合には、遊離した糖の量が減少していることが示された。この結果から、澱粉由来成分とF2（分岐型糖鎖）による相互作用が起こることで、共存しない条件では遊離状態にある糖が遠心分離後の沈殿部に移行した、つまり、F2の会合性が上昇したことが示唆された。
【０１１６】
このことから、糊化澱粉由来の成分が、分岐型糖鎖の会合性を高める作用を有することが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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