(57)【要約】      （修正有）【課題】グリコサミノグリカンをキャリアーにしたデリバリーシステムの提供。【解決手段】グリコサミノグリカンに由来する基と、カルボキシ基及びヒドロキシ基の少なくとも一方を有する生理活性物質に由来する基とがスペーサーを介する共有結合で連結され、スペーサーが生理活性物質に由来する基との共有結合の分解速度に応じて選択される、グリコサミノグリカン誘導体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコサミノグリカンに由来する基と、カルボキシ基及びヒドロキシ基の少なくとも一方を有する生理活性物質に由来する基とが、スペーサーを介する共有結合で連結されたグリコサミノグリカン誘導体に含まれるスペーサーを、生理活性物質に由来する基とスペーサーとの共有結合の分解速度に応じて選択することを含む、グリコサミノグリカン誘導体からの生理活性物質の遊離速度の制御方法。
【請求項２】
グリコサミノグリカンに由来する基と、カルボキシ基及びヒドロキシ基の少なくとも一方を有する生理活性物質に由来する基とがスペーサーを介する共有結合で連結され、スペーサーが生理活性物質に由来する基との共有結合の分解速度に応じて選択される、グリコサミノグリカン誘導体 。
【請求項３】
グリコサミノグリカンが、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、へパラン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項２に記載のグリコサミノグリカン誘導体。
【請求項４】
生理活性物質が、非ステロイド性抗炎症薬、ステロイド、抗リウマチ薬、抗アレルギー薬、高脂血症治療薬及びβ刺激薬からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項２又は請求項３に記載のグリコサミノグリカン誘導体。
【請求項５】
生理活性物質に由来する基とスペーサーとが、エステル結合で共有結合している請求項２〜請求項４のいずれか１項に記載のグリコサミノグリカン誘導体。
【請求項６】
グリコサミノグリカンに由来する基とスペーサーとが、アミド結合で共有結合している請求項２〜請求項５のいずれか１項に記載のグリコサミノグリカン誘導体。
【請求項７】
スペーサーがアミノアルコール、アミノ酸及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物に由来する２価以上の基である、請求項２〜請求項６のいずれか１項に記載のグリコサミノグリカン誘導体。
【請求項８】
スペーサーが下記一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸に由来する２価の基である、請求項２〜請求項７のいずれか１項に記載のグリコサミノグリカン誘導体。
−ＨＮ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＲ１１Ｒ１２−ＣＲ１３Ｒ１４−ＣＯ−  （Ｉ）
（式中、ｍは０〜１２の整数を示す。Ｒ１１〜Ｒ１４はそれぞれ独立に、水素原子、電子吸引基、電子供与基又は立体障害性基を示す）
【請求項９】
スペーサーが下記一般式（ＩＩ）で表されるアミノアルコールに由来する２価の基である、請求項２〜請求項７のいずれか１項に記載のグリコサミノグリカン誘導体。
−ＨＮ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＲ２１Ｒ２２−ＣＲ２３Ｒ２４−Ｏ−  （ＩＩ）
（式中、ｎは０〜１２の整数を示す。Ｒ２１〜Ｒ２４はそれぞれ独立に、水素原子、電子吸引基、電子供与基又は立体障害性基を示す）
【請求項１０】
スペーサーが、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、システイン、プロリン、β−アラニン及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸に由来する２価以上の基、又はアミノプロパノール、アミノエタノール及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種のアミノアルコールに由来する２価以上の基である、請求項２〜請求項７のいずれか１項に記載のグリコサミノグリカン誘導体。
【請求項１１】
請求項２〜請求項１０のいずれか１項に記載のグリコサミノグリカン誘導体を含む医薬組成物。
【請求項１２】
請求項２〜請求項１０のいずれか１項に記載のグリコサミノグリカン誘導体を含む放出制御製剤。
【請求項１３】
請求項２〜請求項１０のいずれか１項に記載のグリコサミノグリカン誘導体を含む持続型疼痛抑制剤。
【請求項１４】
カルボキシ基及びヒドロキシ基の少なくとも一方を有する生理活性物質を準備することと、
生理活性物質に由来する基と共有結合を形成するスペーサーを該共有結合の分解速度に応じて選択することと、
生理活性物質に由来する基とグリコサミノグリカンに由来する基とをスペーサーを介して共有結合することと、
を含むグリコサミノグリカン誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコサミノグリカン誘導体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グリコサミノグリカン（以下、ＧＡＧともいう）は、生体内に存在する化合物であり、これを医薬品あるいは医療機器として使用している例は多くある。これまでにＧＡＧに薬物を化学的に導入したグリコサミノグリカン誘導体（以下、ＧＡＧ誘導体ともいう）を医薬品あるいは医療機器に応用しようとした技術がいくつか知られている（例えば、特許第４７９２２９４号明細書及び国際公開第９９／５９６０３号参照）。
薬物をＧＡＧに導入する目的は、（１）ＧＡＧをキャリアーとして目的部位にデリバーさせる、（２）高分子のＧＡＧを用いることで患部に滞留させ薬物を放出させる、（３）ＧＡＧ自体の機能、薬理作用を利用するなどが考えられる。
適用する疾患は種々あるが、疾患によっては早期に薬物を放出させることが必要な疾患、あるいは長期間の放出が必要な疾患、あるいはその中間に位置する微妙な放出速度が必要な疾患などがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第４７９２２９４号明細書
【特許文献２】国際公開第９９／５９６０３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
薬物導入ＧＡＧ誘導体を患部に投与する場合、その疾患において比較的早期に薬物の放出が必要にも拘わらず、薬物放出速度が遅い薬物導入ＧＡＧ誘導体を投与すれば、その薬物導入ＧＡＧ誘導体は、適切なタイミングで薬物導入される前に代謝、排出されてしまい意味をなさない。逆に、比較的長期の薬物放出が必要とされる患部に薬物放出速度の早い薬物ＧＡＧ誘導体を投与した場合、長期間に亘る持続的治療効果は期待できない。
しかしながら、これまで開発された薬物導入ＧＡＧ誘導体は、適用領域で求められる放出の速度とその化合物の適性がたまたま合致したときに効果を発揮し、積極的に放出速度を制御する試みはなされてこなかった。
【０００５】
そこで本発明は、薬物の構造に大きく依存せずに薬物遊離速度を制御することが可能で、適用される疾患に応じて適切な速度で、導入された薬物が遊離される薬物導入されたグリコサミノグリカン誘導体及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記目的を考慮し、疾患に応じて適切な速度で薬物を遊離可能な薬物導入されたグリコサミノグリカン誘導体を開発すべく鋭意検討した。その結果、ＧＡＧにスペーサーを介して薬物（以下、生理活性物質ともいう）を導入し、そのスペーサーの構造を種々工夫することにより、薬物の構造に大きく依存することなく薬物の遊離速度が制御できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
【０００７】
＜１＞  グリコサミノグリカンに由来する基と、カルボキシ基及びヒドロキシ基の少なくとも一方を有する生理活性物質に由来する基とが、スペーサーを介する共有結合で連結されたグリコサミノグリカン誘導体に含まれるスペーサーを、生理活性物質に由来する基とスペーサーとの共有結合の分解速度に応じて選択することを含む、グリコサミノグリカン誘導体からの生理活性物質の遊離速度の制御方法である。
＜２＞  グリコサミノグリカンに由来する基と、カルボキシ基及びヒドロキシ基の少なくとも一方を有する生理活性物質に由来する基とがスペーサーを介する共有結合で連結され、スペーサーが生理活性物質に由来する基との共有結合の分解速度に応じて選択される、グリコサミノグリカン誘導体である。
＜３＞  グリコサミノグリカンが、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、へパラン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種である、前記＜２＞に記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
＜４＞  生理活性物質が、非ステロイド性抗炎症薬、ステロイド、抗リウマチ薬、抗アレルギー薬、高脂血症治療薬及びβ刺激薬からなる群より選択される少なくとも１種である、前記＜２＞又は＜３＞に記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
＜５＞  生理活性物質に由来する基とスペーサーとが、エステル結合で共有結合している前記＜２＞〜＜４＞のいずれか１つに記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
＜６＞  グリコサミノグリカンに由来する基とスペーサーとが、アミド結合で共有結合している前記＜２＞〜＜５＞のいずれか１つに記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
＜７＞  スペーサーがアミノアルコール、アミノ酸及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物に由来する２価以上の基である、前記＜２＞〜＜６＞のいずれか１つに記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
＜８＞  スペーサーが下記一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸に由来する２価の基である、前記＜２＞〜＜７＞のいずれか１つに記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
−ＨＮ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＲ１１Ｒ１２−ＣＲ１３Ｒ１４−ＣＯ−  （Ｉ）
（式中、ｍは０〜１２の整数を示す。Ｒ１１〜Ｒ１４はそれぞれ独立に、水素原子、電子吸引基、電子供与基又は立体障害性基を示す）
＜９＞  スペーサーが下記一般式（ＩＩ）で表されるアミノアルコールに由来する２価の基である、前記＜２＞〜＜７＞のいずれか１つに記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
−ＨＮ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＲ２１Ｒ２２−ＣＲ２３Ｒ２４−Ｏ−  （ＩＩ）
（式中、ｎは０〜１２の整数を示す。Ｒ２１〜Ｒ２４はそれぞれ独立に、水素原子、電子吸引基、電子供与基又は立体障害性基を示す）
＜１０＞  スペーサーが、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、システイン、プロリン、β−アラニン及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸に由来する２価以上の基、又はアミノプロパノール、アミノエタノール及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種のアミノアルコールに由来する２価以上の基である、前記＜２＞〜＜７＞のいずれか１つに記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
＜１１＞  前記＜２＞〜＜１０＞のいずれか１つに記載のグリコサミノグリカン誘導体を含む医薬組成物である。
＜１２＞  前記＜２＞〜＜１０＞のいずれか１つに記載のグリコサミノグリカン誘導体を含む放出制御製剤である。
＜１３＞  前記＜２＞〜＜１０＞のいずれか１つに記載のグリコサミノグリカン誘導体を含む持続型疼痛抑制剤である。
＜１４＞  カルボキシ基及びヒドロキシ基の少なくとも一方を有する生理活性物質を準備することと、生理活性物質に由来する基と共有結合を形成するスペーサーを該共有結合の分解速度に応じて選択することと、生理活性物質に由来する基とグリコサミノグリカンに由来する基とをスペーサーを介して共有結合することと、を含むグリコサミノグリカン誘導体の製造方法である。
＜１５＞  グリコサミノグリカンに由来する基と、カルボキシ基及びヒドロキシ基の少なくとも一方を有する生理活性物質に由来する基とがスペーサーを介する共有結合で連結されたグリコサミノグリカン誘導体であって、
グリコサミノグリカンが、コンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸であり、
生理活性物質が、非ステロイド性抗炎症薬であり、
生理活性物質に由来する基とスペーサーとが、エステル結合で共有結合しており、
グリコサミノグリカンに由来する基とスペーサーとが、アミド結合で共有結合しており、
スペーサーが下記一般式（ＩＩ）で表されるアミノアルコールに由来する２価の基である、グリコサミノグリカン誘導体である。
−ＨＮ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＲ２１Ｒ２２−ＣＲ２３Ｒ２４−Ｏ−  （ＩＩ）
（式中、ｎは０〜１２の整数を示す。Ｒ２１〜Ｒ２４はそれぞれ独立に、水素原子又は立体障害性基を示す）
＜１６＞  生理活性物質が、ジクロフェナクである、前記＜１５＞に記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
＜１７＞  前記Ｒ２１〜Ｒ２４の１又は２以上が立体障害性基である、前記＜１５＞又は＜１６＞に記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
＜１８＞  前記Ｒ２１〜Ｒ２４の１又は２以上がメチル基である、前記＜１５＞又は＜１６＞に記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
＜１９＞グリコサミノグリカンに由来する基と、カルボキシ基及びヒドロキシ基の少なくとも一方を有する生理活性物質に由来する基とがスペーサーを介する共有結合で連結されたグリコサミノグリカン誘導体であって、
グリコサミノグリカンが、コンドロイチン硫酸であり、
生理活性物質が非ステロイド性抗炎症薬、であり、
生理活性物質に由来する基とスペーサーとが、エステル結合で共有結合しており、
グリコサミノグリカンに由来する基とスペーサーとが、アミド結合で共有結合しており、
スペーサーが下記一般式（ＩＩ）で表されるアミノアルコールに由来する２価の基である、グリコサミノグリカン誘導体である。
−ＨＮ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＲ２１Ｒ２２−ＣＲ２３Ｒ２４−Ｏ−  （ＩＩ）
（式中、ｎは０〜１２の整数を示す。Ｒ２１〜Ｒ２４はそれぞれ独立に、水素原子又は電子吸引基を示す）
＜２０＞  生理活性物質が、ケトプロフェンである、前記＜１９＞に記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
＜２１＞  前記Ｒ２１〜Ｒ２４の１又は２以上が電子吸引基である、前記＜１９＞又は＜２０＞に記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
＜２２＞  前記Ｒ２１〜Ｒ２４の１又は２以上がフッ素である、前記＜１９＞又は＜２０＞に記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
＜２３＞  前記＜１５＞〜＜２２＞のいずれか１つに記載のグリコサミノグリカン誘導体を含む医薬組成物である。
＜２４＞  前記＜１５＞〜＜２２＞のいずれか１つに記載のグリコサミノグリカン誘導体を含む疼痛抑制剤である。
＜２５＞  グリコサミノグリカン誘導体における生理活性物質の導入率が、３％〜５０％である前記＜２４＞に記載の疼痛抑制剤である。
＜２６＞  グリコサミノグリカン誘導体における生理活性物質の導入率が、５％〜３５％である前記＜２４＞に記載の疼痛抑制剤である。
＜２７＞  グリコサミノグリカン誘導体における生理活性物質の導入率が、１０％〜３０％である前記＜２４＞に記載の疼痛抑制剤である。
＜２８＞  ＜１３＞及び＜２４＞〜＜２７＞が溶液である疼痛抑制剤。この場合において、グリコサミノグリカン誘導体の含有量が、溶液全体の０．５％（ｗ／ｖ％）〜１０％（ｗ／ｖ％）である前記＜１３＞及び＜２４＞〜＜２７＞のいずれか１つに記載の疼痛抑制剤である。
＜２９＞  グリコサミノグリカン誘導体の含有量が、溶液全体の０．７％（ｗ／ｖ％）〜１．８％（ｗ／ｖ％）である前記＜１３＞及び＜２４＞〜＜２７＞のいずれか１つに記載の疼痛抑制剤である。
＜３０＞  グリコサミノグリカン誘導体の含有量が、溶液全体の１％（ｗ／ｖ％）〜７％（ｗ／ｖ％）である前記＜１３＞及び＜２４＞〜＜２７＞のいずれか１つに記載の疼痛抑制剤である。
＜３１＞  ３日以上の投与間隔で投与される、前記＜１３＞及び＜２４＞〜＜３０＞のいずれか１つに記載の疼痛抑制剤である。
＜３２＞  ７日以上の投与間隔で投与される、前記＜１３＞及び＜２４＞〜＜３０＞のいずれか１つに記載の疼痛抑制剤である。
＜３３＞  １０日以上の投与間隔で投与される、前記＜１３＞及び＜２４＞〜＜３０＞のいずれか１つに記載の疼痛抑制剤である。
＜３４＞  １４日以上の投与間隔で投与される、前記＜１３＞及び＜２４＞〜＜３０＞のいずれか１つに記載の疼痛抑制剤である。
＜３５＞  疼痛抑制効果が、投与後３日間またはそれ以上持続するものである前記＜１３＞及び＜２４＞〜＜３４＞のいずれか１つに記載の疼痛抑制剤である。
＜３６＞  疼痛抑制効果が、投与後７日間またはそれ以上持続するものである前記＜１３＞及び＜２４＞〜＜３４＞のいずれか１つに記載の疼痛抑制剤である。
＜３７＞  疼痛抑制効果が、投与後１０日間またはそれ以上持続するものである前記＜１３＞及び＜２４＞〜＜３４＞のいずれか１つに記載の疼痛抑制剤である。
＜３８＞  疼痛抑制効果が、投与後１４日間またはそれ以上持続するものである前記＜１３＞及び＜２４＞〜＜３４＞のいずれか１つに記載の疼痛抑制剤である。
＜３９＞  前記＜１３＞及び＜２４＞〜＜３８＞のいずれか１つに記載の疼痛抑制剤であって、筋肉内注射用の疼痛抑制剤である。
＜４０＞  筋肉痛の治療用である前記＜１３＞及び＜２４＞〜＜３９＞のいずれか１つに記載の疼痛抑制剤である。
＜４１＞  グリコサミノグリカン誘導体からの生理活性物質の遊離速度が、ｐＨ７．５、３６℃のリン酸緩衝生理食塩液中において、０．１〜３０％／日である、＜２＞〜＜１０＞及び＜１５＞〜＜２２＞のいずれか１つに記載のグリコサミノグリカン誘導体である。
＜４２＞  グリコサミノグリカン誘導体からの生理活性物質の遊離速度が、ｐＨ７．５、３６℃のリン酸緩衝生理食塩液中において、０．１〜３０％／日である、＜１１＞又は＜２３＞に記載の医薬組成物である。
＜４３＞  グリコサミノグリカン誘導体からの生理活性物質の遊離速度が、ｐＨ７．５、３６℃のリン酸緩衝生理食塩液中において、０．１〜３０％／日である、＜１３＞及び＜２４＞〜＜４０＞のいずれか１つに記載の疼痛抑制剤である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、薬物の構造に大きく依存せずに薬物遊離速度を制御することが可能で、適用される疾患に応じて適切な速度で、導入された薬物が遊離される薬物導入されたグリコサミノグリカン誘導体及びその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＧＡＧ誘導体投与後の肺組織中の薬物含量推移を示すグラフである。
【図２】ＧＡＧ誘導体投与後の血漿中の薬物濃度推移を示すグラフである。
【図３】硝酸銀誘発ラット筋肉障害疼痛モデルにおけるＮＳＡＩＤ導入ＧＡＧ誘導体の疼痛スコアに対する作用を示すグラフである。
【図４】硝酸銀誘発ラット筋肉障害疼痛モデルにおけるＮＳＡＩＤ導入ＧＡＧ誘導体の筋圧痛閾値に対する作用を示すグラフである。
【図５】硝酸銀誘発ラット筋肉障害疼痛モデルにおけるケトプロフェン結合コンドロイチン硫酸の疼痛スコアに対する作用を示すグラフである。
【図６】硝酸銀誘発ラット筋肉障害疼痛モデルにおけるケトプロフェン結合コンドロイチン硫酸の筋圧痛閾値に対する作用を示すグラフである。
【図７】硝酸銀誘発ラット筋肉障害疼痛モデルにおけるジクロフェナク結合ヒアルロン酸の疼痛スコアに対する作用を示すグラフである。
【図８】硝酸銀誘発ラット筋肉障害疼痛モデルにおけるジクロフェナク結合ヒアルロン酸の筋圧痛閾値に対する作用を示すグラフである。
【図９】カラゲニン誘発ラット筋肉障害モデルにおけるジクロフェナク結合ヒアルロン酸の筋圧痛閾値に対する作用を示すグラフである。
【図１０】カラゲニン誘発ラット筋肉障害モデルにおけるジクロフェナク結合ヒアルロン酸の筋圧痛閾値に対する作用を示すグラフである。
【図１１】カラゲニン誘発ラット筋障害疼痛モデルにおけるジクロフェナク結合コンドロイチン硫酸の筋圧痛閾値に対する作用を示すグラフである。
【図１２】カラゲニン誘発ラット筋障害疼痛モデルにおけるジクロフェナク結合コンドロイチン硫酸の筋圧痛閾値に対する作用を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。さらに組成物中の各成分の含有量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
【００１１】
＜グリコサミノグリカン誘導体＞
本実施形態のグリコサミノグリカン誘導体は、グリコサミノグリカンに由来する基と、カルボキシ基及びヒドロキシ基の少なくとも一方を有する生理活性物質（以下、薬物ともいう）に由来する基とがスペーサーを介する共有結合で連結され、該スペーサーが生理活性物質に由来する基とスペーサーとの共有結合の分解速度に応じて選択されることを特徴とする、薬物導入されたグリコサミノグリカン誘導体である。
本実施形態のグリコサミノグリカン誘導体は、薬物の構造に大きく依存せずに薬物放出速度を制御することが可能で、適用される疾患に応じて適切な速度で薬物を放出することができる。これにより、早期の薬物放出が必要な疾患、あるいは長期間の薬物徐放の必要な疾患等のいずれにも応用が可能である。又、グリコサミノグリカン誘導体を含む医薬組成物の形態も注射薬、粉末製剤等に応用可能であり、高脂血症等の様々な疾患、関節炎、喘息、腰痛、疼痛制御などに利用可能である。
更に本実施形態によれば、あらゆる温度条件でも薬物遊離速度を制御することが可能であり、また薬物放出される期間についても、秒、分、時間、日、月、年単位に関わらず薬物遊離速度を制御することが可能である。
【００１２】
ＧＡＧ誘導体は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）に由来する基と、生理活性物質に由来する基と、グリコサミノグリカンに由来する基及び生理活性物質に由来する基を共有結合で連結するスペーサーとを有する。ＧＡＧ誘導体においては、スペーサーと生理活性物質に由来する基との間の共有結合が分解（好ましくは加溶媒分解）することで生理活性物質が遊離して放出される。ＧＡＧ誘導体は必要に応じてその他の置換基を更に有していてもよい。またＧＡＧ誘導体がカルボキシ基、硫酸基等の酸性基を有する場合、塩を形成していない遊離酸の状態であっても、また薬学的に許容されうる塩の状態であってもよい。
【００１３】
薬学的に許容されうる塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属イオンとの塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属イオンとの塩などが挙げられる。ＧＡＧ誘導体は、生体への適用性及び親和性の観点から、薬学的に許容されうるアルカリ金属イオンとの塩であることが好ましく、ナトリウム塩であることがより好ましい。
【００１４】
ＧＡＧ誘導体において、ＧＡＧに由来する基と生理活性物質に由来する基とが、スペーサーを介する共有結合で連結されたとは、スペーサーが２価以上の基であって、ＧＡＧに由来する基と生理活性物質に由来する基のそれぞれがスペーサーと共有結合することで、ＧＡＧに由来する基と生理活性物質に由来する基とがスペーサーを介して連結されている状態を意味する。
ＧＡＧ誘導体においては、ＧＡＧに由来する基に、１つのスペーサーを介して２以上の生理活性物質に由来する基が共有結合していてもよい。１つのスペーサーに共有結合する生理活性物質に由来する基の数は少なくとも１であれば、特に制限されない。スペーサーは２価以上の基であれば、特に制限されないが、２価の基であることが好ましい。
【００１５】
生理活性物質に由来する基とスペーサーとの共有結合は、ＧＡＧ誘導体からの生理活性物質の遊離速度制御の観点から、生体中で分解可能な共有結合であって、縮合反応によって形成される共有結合であることが好ましく、エステル結合又はアミド結合であることがより好ましく、エステル結合であることが更に好ましい。ＧＡＧ誘導体においては、生理活性物質に由来する基とスペーサーとの共有結合が分解（好ましくは加溶媒分解）することで生理活性物質が遊離する。ＧＡＧに由来する基とスペーサーとの共有結合が分解した後に生理活性物質に由来する基とスペーサーとの共有結合が分解して生理活性物質が遊離してもよい。
【００１６】
ここで、ＧＡＧに由来する基とは、ＧＡＧ分子からヒドロキシ基及び水素原子からなる群より選ばれる少なくとも１つを取り除いて形成される基である。また、生理活性物質に由来する基とは、生理活性物質からヒドロキシ基及び水素原子からなる群より選ばれる少なくとも１つを取り除いて形成される基である。なお、ＧＡＧ分子又は生理活性物質からヒドロキシ基又は水素原子が取り除かれる位置は特に限定されない。例えば、ヒドロキシ基が取り除かれる場合、ＧＡＧ分子又は生理活性物質が有することがあるカルボキシ基又は硫酸基からヒドロキシ基が取り除かれることが好ましく、カルボキシ基からヒドロキシ基が取り除かれることがより好ましい。また例えば、水素原子が取り除かれる場合、ＧＡＧ分子又は生理活性物質が有することがあるヒドロキシ基又はアミノ基から水素原子が取り除かれることが好ましい。
【００１７】
生理活性物質の遊離速度は公知の測定方法により測定することができる。例えば、所定のｐＨを有するリン酸緩衝液中にＧＡＧ誘導体を溶解し、所定の温度で一定時間毎（例えば１日毎）に溶液をサンプリングし、サンプリングされた溶液中の生理活性物質の遊離率より遊離速度を求めることができる。
【００１８】
ＧＡＧ誘導体を構成するＧＡＧ分子は、アミノ糖とウロン酸又はガラクトースとがグリコシド結合した２糖からなる構造単位が、グリコシド結合で連結した繰り返し構造を有するものであれば特に制限さない。
ＧＡＧ分子を構成するアミノ糖としては、Ｄ−グルコサミン、α−Ｄ−ガラクトサミン等を挙げることができる。またウロン酸としては、β−Ｄ−グルクロン酸、α−Ｌ−イズロン酸等を挙げることができる。
ＧＡＧ分子は硫酸基が付加した構造であってもよい。硫酸基は、ヒドロキシ基に付加していてもアミノ基に付加していてもよい。
ＧＡＧ分子は１種単独でも２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１９】
ＧＡＧ分子として例えば、コンドロイチン硫酸（以下、ＣＳともいう）、ヒアルロン酸（以下、ＨＡともいう）、へパリン、へパラン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸及びこれらの誘導体等を挙げることができる。
これらの中でも、ＧＡＧ分子は、ＧＡＧ誘導体からの生理活性物質の遊離速度制御の観点から、構成単位中にカルボキシ基及び硫酸基からなる群より選択される少なくとも一方の反応性官能基を有するＧＡＧ分子であることが好ましく、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、へパリン、へパラン硫酸及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種であることが更に好ましい。
【００２０】
ＧＡＧ分子の分子量は特に制限されず、ＧＡＧ分子を構成する単糖分子の種類、目的等に応じて適宜選択される。ＧＡＧ分子の重量平均分子量は例えば、１０，０００〜５，０００，０００又は１０ｋＤａ〜５，０００ｋＤａとすることができ、１５，０００〜２，０００，０００又は１５ｋＤａ〜２，０００ｋＤａであることが好ましく、２０，０００〜１，５００，０００又は２０ｋＤａ〜１，５００ｋＤａであることがより好ましい。ＧＡＧ分子の重量平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを用いる常法により測定することができる。
【００２１】
ＧＡＧ分子としてヒアルロン酸を用いる場合、ヒアルロン酸の重量平均分子量は特に限定されず、目的（例えば、適用疾患）等に応じて適宜選択することができる。重量平均分子量は例えば、１０，０００〜５，０００，０００又は１０ｋＤａ〜５，０００ｋＤａとすることができ、製造効率上の観点から、５０，０００〜３，０００，０００又は５０ｋＤａ〜３，０００ｋＤａであることが好ましく、２００，０００〜１，５００，０００又は２００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａであることがより好ましい。更には適用疾患等に応じてその分子量を選択してもよい。
【００２２】
ＧＡＧ分子としてコンドロイチン硫酸を用いる場合、その種類は特に限定されず、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ等のいずれのコンドロイチン硫酸を用いることも可能である。コンドロイチン硫酸の種類は、目的（例えば、適用疾患）等により適宜選択してもよい。コンドロイチン硫酸の重量平均分子量は特に限定されず、目的等に応じて適宜選択することができる。重量平均分子量は例えば、１０，０００〜１００，０００又は１０ｋＤａ〜１００ｋＤａであることが好ましく、１０，０００〜６０，０００又は１０ｋＤａ〜６０ｋＤａであることがより好ましく、１０，０００〜４０，０００又は１０ｋＤａ〜４０ｋＤａであることが更に好ましい。
【００２３】
ＧＡＧ誘導体は少なくとも１種の生理活性物質に由来する基を有している。生理活性物質は、カルボキシ基及びヒドロキシ基の少なくとも一方を有する化合物である。これによりＧＡＧ誘導体からの遊離速度制御を容易に行うことができる。
【００２４】
ＧＡＧ誘導体を構成する生理活性物質の種類は特に限定されず、目的等に応じて適宜選択することができる。生理活性物質の有する生理活性としては、疾患の治療、予防等を目的とする生理活性でも、検査等を目的とする生理活性であってもよい。生理活性として具体的には例えば、ステロイド様活性、非ステロイド性抗炎症活性、抗リウマチ活性、抗アレルギー活性、β刺激活性、テオフィリン様活性、抗ウィルス活性、抗コリン活性、抗菌活性、抗高脂血症活性、去痰活性、抗酸化活性、インターフェロン様活性、局所麻酔用活性等を挙げることができる。
【００２５】
生理活性物質として具体的には、ステロイド、非ステロイド性抗炎症化合物（ＮＳＡＩＤｓ）、抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤｓ）、抗アレルギー薬、β刺激薬、抗コリン薬、気管支拡張薬、抗ウィルス薬、抗菌薬、高脂血症治療薬、去痰薬、抗酸化薬、インターフェロン薬及び局所麻酔薬等を挙げることができ、ステロイド、非ステロイド性抗炎症化合物、抗リウマチ薬、抗アレルギー薬、β刺激薬及び高脂血症治療薬からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【００２６】
ステロイドの種類は特に限定されず、目的等に応じて適宜選択することができる。ステロイドとして具体的には、ベタメタゾン、プレドニゾロン、ブデソニド、フルチカゾンが例示され、これらからなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。これらのステロイドは、適用する疾患、ステロイド自身の活性強度、副作用の影響等を考慮して選択されることが好ましい。
【００２７】
非ステロイド性抗炎症化合物（ＮＳＡＩＤｓ）の種類は特に限定されず、目的等に応じて適宜選択することができる。非ステロイド性抗炎症化合物として具体的には、メフェナム酸、ジクロフェナク、フェンブフェン、インドメタシン、フェルビナク、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェンが挙げられ、これらからなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
【００２８】
気管支拡張薬の種類は特に限定されず、目的等に応じて適宜選択することができる。気管支拡張薬としては、β刺激薬、テオフィリン薬（キサンチン誘導体）、副交感神経遮断薬を挙げることができる。
β刺激薬として具体的には、ツロブテロールが挙げられる。また、キサンチン誘導体として具体的には、プロキシフィリンが例示される。副交感神経遮断薬としては、後述する抗コリン薬が例示される。
【００２９】
抗アレルギー薬の種類は特に限定されず、目的等に応じて適宜選択することができる。抗アレルギー薬としては、化学伝達物質遊離抑制薬、ヒスタミン拮抗薬、トロンボキサン合成阻害薬、トロンボキサン拮抗薬、ＴＨ２サイトカイン阻害薬、ロイコトリエン拮抗薬が例示される。
トロンボキサン拮抗薬として具体的には、セラトロダストが例示される。ロイコトリエン拮抗薬として具体的には、モンテルカストが例示される。
【００３０】
抗コリン薬の種類は特に限定されず、目的等に応じて適宜選択することができる。抗コリン薬として具体的には、イプラトロピウムが例示される。
【００３１】
高脂血症治療薬の種類は特に限定されず、目的等に応じて適宜選択することができる。高脂血症治療薬として具体的には、ベザフィブラートが例示される。
【００３２】
ＧＡＧ誘導体におけるスペーサーは、ＧＡＧに由来する基と生理活性物質に由来する基とを共有結合で連結し、生理活性物質に由来する基との共有結合の分解速度に応じて選択される２価以上の基である。ＧＡＧ誘導体においては、生理活性物質の遊離速度制御の観点から、ＧＡＧに由来する基とスペーサー及び生理活性物質に由来する基とスペーサーの少なくとも一方は、エステル結合で共有結合していることが好ましく、生理活性物質に由来する基とスペーサーとがエステル結合で共有結合していることがより好ましく、ＧＡＧに由来する基とスペーサーとがアミド結合で共有結合し、生理活性物質に由来する基とスペーサーとがエステル結合で共有結合していることが更に好ましい。
【００３３】
スペーサーが生理活性物質に由来する基との共有結合の分解速度に応じて選択されるとは、例えば、スペーサーと生理活性物質に由来する基との共有結合の種類（例えば、エステル結合、アミド結合、カーボネート結合、ウレタン結合等）を選択又は採用すること、スペーサーの長さを選択又は採用すること、スペーサーと生理活性物質に由来する基との共有結合に直接又は間接的に結合する炭素原子上の置換基の有無を選択又は採用すること、スペーサーと生理活性物質に由来する基との共有結合に直接又は間接的に結合する炭素原子上の置換基の種類（例えば、電子吸引基、電子供与基、立体障害性基等）を選択又は採用することなどを含む。
【００３４】
スペーサーを形成する化合物（以下、スペーサー形成分子ともいう）は分子構造中に、カルボキシ基、ヒドロキシ基及びアミノ基からなる群より選択される２以上の反応性官能基と当該２以上の反応性官能基を連結する連結基とを有していることが好ましい。
ここでカルボキシ基、ヒドロキシ基及びアミノ基からなる群より選択される２以上の反応性官能基は、ＧＡＧ分子及び生理活性物質の構造に応じて適宜選択される。例えば、ＧＡＧ分子が反応性官能基としてカルボキシ基を有する場合、スペーサー形成分子はこれに対応してヒドロキシ基又はアミノ基を有することが好ましく、アミノ基を有することがより好ましい。ＧＡＧ分子が反応性官能基としてヒドロキシ基を有する場合、スペーサー形成分子はこれに対応してカルボキシ基を有することが好ましい。
一方、生理活性物質がカルボキシ基を有する場合、スペーサー形成分子はこれに対応してアミノ基又はヒドロキシ基を有することが好ましく、ヒドロキシ基を有することがより好ましい。また生理活性物質がヒドロキシ基を有する場合、スペーサー形成分子はこれに対応してカルボキシ基を有することが好ましい。
【００３５】
スペーサー形成分子は、ＧＡＧ誘導体からの生理活性物質の遊離速度制御の観点から、カルボキシ基とアミノ基と連結基とを有する化合物（好ましくはアミノ酸）、ヒドロキシ基とアミノ基と連結基とを有する化合物（好ましくはアミノアルコール）、２以上のカルボキシ基と連結基とを有する化合物（好ましくはジカルボン酸）、カルボキシ基とヒドロキシ基と連結基とを有する化合物（好ましくはヒドロキシ酸）及び２以上のヒドロキシ基と連結基とを有する化合物（好ましくはジオール化合物）からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましく、カルボキシ基とアミノ基と連結基とを有する化合物（好ましくはアミノ酸）、及びヒドロキシ基とアミノ基と連結基とを有する化合物（好ましくはアミノアルコール）２以上のカルボキシ基と連結基とを有する化合物（好ましくはジカルボン酸）からなる群より選択される少なくとも１種であることがより好ましい。
【００３６】
したがってＧＡＧ誘導体は、ＧＡＧ誘導体からの生理活性物質の遊離速度制御の観点から、「カルボキシ基を有するＧＡＧ分子、ヒドロキシ基を有する生理活性物質及びアミノ基とカルボキシ基とを有するスペーサー形成分子」の組合せ、「カルボキシ基を有するＧＡＧ分子、ヒドロキシ基を有する生理活性物質及びヒドロキシ基とカルボキシ基とを有するスペーサー形成分子」の組合せ、「カルボキシ基を有するＧＡＧ分子、カルボキシ基を有する生理活性物質及びアミノ基とヒドロキシ基とを有するスペーサー形成分子」の組合せ、並びに「カルボキシ基を有するＧＡＧ分子、カルボキシ基を有する生理活性物質及び２以上のヒドロキシ基を有するスペーサー形成分子」の組合せ、「ヒドロキシ基を有するＧＡＧ分子、ヒドロキシ基を有する生理活性物質及び２以上のカルボキシ基を有するスペーサー形成分子」の組合せ、並びに「ヒドロキシ基を有するＧＡＧ分子、カルボキシ基を有する生理活性物質及びカルボキシ基とヒドロキシ基とを有するスペーサー形成分子」の組合せからなる群より選択される構成分子の組合せから構成される化合物であることが好ましく、「カルボキシ基を有するＧＡＧ分子、ヒドロキシ基を有する生理活性物質及びアミノ基とカルボキシ基とを有するスペーサー形成分子」の組合せ、並びに「カルボキシ基を有するＧＡＧ分子、カルボキシ基を有する生理活性物質及びアミノ基とヒドロキシ基とを有するスペーサー形成分子」の組合せからなる群より選択される構成分子の組合せから構成される化合物であることがより好ましい。
【００３７】
スペーサー形成分子が有する連結基は、２以上の反応性官能基を共有結合で連結可能な２価以上の基であれば特に制限はされない。連結基としては例えば、炭素数２〜１２の脂肪族炭化水素に由来する２価以上の基、炭素数６〜１０の芳香族炭化水素に由来する２価以上の基、これらの組み合わせ等を挙げることができる。脂肪族炭化水素に由来する２価以上の基とは、脂肪族炭化水素分子から２以上の水素原子を取り除いて形成される炭化水素基であり、水素原子が取り除かれる位置は特に制限されない。芳香族炭化水素に由来する２価以上の基とは、芳香族炭化水素分子から２以上の水素原子を取り除いて形成される芳香族基であり、水素原子が取り除かれる位置は特に制限されない。
連結基は、抗原性抑制の観点から、反応性官能基間の長さが原子数１２以下であることが好ましく、原子数２〜６であることがより好ましい。
【００３８】
連結基は置換基を有していてもよい。連結基が置換基を有することで、ＧＡＧ誘導体における生理活性物質の遊離速度を所望の範囲により容易に制御することができる。すなわち、生理活性物質の構造に大きく依存せずに、ＧＡＧ誘導体からの生理活性物質の遊離速度をより容易に制御することが可能となる。
連結基が有する置換基の位置は、例えば、生理活性物質に由来する基とスペーサーとの共有結合（好ましくは、エステル結合）の安定性が影響をうける位置であればよく、具体的には、生理活性物質に由来する基に結合する反応性官能基のα位及びβ位からなる群より選ばれる少なくとも１ヵ所であることが好ましい。置換基の数は目的に応じて選択可能であり、例えば１〜４であることが好ましく、１〜２であることがより好ましい。例えば置換基が２つの場合、置換位置はα位とβ位とであっても、α位のみ又はβ位のみであってもよい。
【００３９】
連結基が有する置換基の種類は、例えば、ＧＡＧ誘導体における生理活性物質の遊離速度制御の観点から、電子吸引基、電子供与基及び立体障害性基からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【００４０】
例えば、連結基に導入する置換基が電子吸引基であると、生理活性物質に由来する基とスペーサーとの共有結合が無置換の場合よりも分解しやすくなり、生理活性物質の遊離速度が速くなる傾向がある。したがって、電子吸引基の電子吸引性の強さ、例えば電気陰性度、ハメット定数等を指標として電子吸引基を選択することにより、生理活性物質の遊離速度を所望の範囲に容易に調整することが可能である。すなわち、強い電子吸引基を選択することで遊離速度をより大きくすることができる傾向がある。具体的には、フッ素、塩素、臭素のようなハロゲン原子を導入する場合、電気陰性度の高い順（Ｆ＞Ｃｌ＞Ｂｒ）に生理活性物質の遊離速度は速くなる傾向がある。
【００４１】
電子吸引基は、連結基に導入可能であれば特に制限されず、通常用いられる電子吸引基から適宜選択することができる。電子吸引基として具体的には、フッ素、塩素、臭素等のハロゲン原子、アルキル及びアリールスルホキシド基、アルキル及びアリールスルホン基、スルホン酸基、アセタミド基、カルボキシ基、アルキル及びアリールカルボニルオキシ基（エステル基）、フルオロメチル基、ジメチルアミノ基などを例示することができる。これらの中でもハロゲン原子、アルキルカルボニルオキシ基からなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
【００４２】
連結基に導入する置換基が電子供与基であると、生理活性物質に由来する基とスペーサーとの共有結合が無置換の場合よりも分解し難くなり、生理活性物質の遊離速度が低下する傾向がある。電子供与基は、例えば、ハメット定数を指標として選択することができる。
【００４３】
電子供与基は、連結基に導入可能であれば特に制限されず、通常用いられる電子供与基から適宜選択することができる。電子供与基として具体的には、アルケン基、アルキン基等をあげることができる。
【００４４】
連結基に導入する置換基が立体障害性基であると、生理活性物質の遊離速度が低下する傾向がある。立体障害性基は、例えばスペーサー形成分子がアミノ酸の場合、アミノ酸の疎水性指標（Hydropathy index）を指標として選択することもできる。
【００４５】
立体障害性基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基等の直鎖状アルキル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等の分岐鎖アルキル基、シクロヘキシル基等の環状アルキル基、フェニル基等のアリール基などを挙げることできる。これらの中でも分岐鎖アルキル基、環状アルキル基等が好ましい。
【００４６】
連結基における置換基は、電子吸引基、電子供与基及び立体障害性基のそれぞれに明確に区別できるわけではないが、ハメット定数、疎水性指標等を指標として、置換基を選択することで遊離速度を制御することができる。
更に、電子吸引基及び電子供与基の両方を導入して遊離速度を微調整することも可能であるし、電子吸引性又は電子供与性と立体障害性とを併せ持つ置換基を導入して遊離速度を微調整することも可能である。
【００４７】
生理活性物質の遊離速度の制御とは、スペーサーの構造により、遊離速度を速くしたり、遅くしたりすることを含む。例えば、遊離速度の制御方法において、遊離速度を速くする場合には、電子吸引基の置換基を有するスペーサーを選択すればよく、遊離速度を遅くする場合には、電子供与基及び立体障害性基から選択される少なくとも１つの置換基を有するスペーサーを選択すればよい。スペーサーは電子吸引基、電子供与基及び立体障害性基からなる群より選ばれる置換基を導入せずにそのまま使用することもできる。
【００４８】
スペーサーによる生理活性物質の遊離速度の制御は、生理活性物質におけるスペーサーとの結合位置の選択と組み合わせてもよい。具体的には例えば、生理活性物質としてステロイドを用いる場合、一般に１１位のヒドロキシ基を介して生成したエステル結合は立体障害により殆ど加水分解しないため、ＧＡＧ誘導体に導入した生理活性物質であるステロイドがほとんど遊離しないと考えられる。しかし、上述したスペーサーからエステル結合の加水分解を促進するようなスペーサーを適宜選択することで、ＧＡＧ誘導体からステロイドを遊離させることが可能となる。また例えば、２１位のヒドロキシ基を介してエステル結合を生成した場合と比較して遊離持続時間が延長され、ステロイドによる作用持続時間を延長することができる。
すなわちスペーサーの構造を選択することで、ＧＡＧ誘導体に適用可能な生理活性物質の範囲を拡張することができる。
【００４９】
スペーサー形成分子は、特に制限されないが、アミノ酸、アミノアルコール、ジカルボン酸、ヒドロキシ酸、ジオール化合物及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましく、アミノ酸、アミノアルコール、ジカルボン酸及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種であることがより好ましく、アミノ酸、アミノアルコール及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種であることが更に好ましい。
【００５０】
生理活性物質がヒドロキシ基を有する場合、スペーサー形成分子は、アミノ酸、ジカルボン酸、ヒドロキシ酸及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましく、アミノ酸、ジカルボン酸及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種であることがより好ましく、アミノ酸及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種であることが更に好ましい。
生理活性物質がカルボキシ基を有する場合、スペーサー形成分子は、アミノアルコール、ヒドロキシ酸、ジオール化合物及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましく、アミノアルコール及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種であることがより好ましい。
【００５１】
スペーサー形成分子としてのアミノ酸は、アミノ基とカルボキシ基とを有する化合物であれば特に制限はなく、天然由来のアミノ酸であってもよく、合成アミノ酸であってもよい。
アミノ酸として具体的には、グリシン、アラニン、β−アラニン、アルギニン、アスパラギン、セリン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、プロリン、チロシン、トリプトファン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、ヒスチジン、ノルバリン、ノルロイシン、イソセリン、オルニチン、アミノ酪酸、アミノ吉草酸、アミノヘプタン酸、アミノオクタン酸、アミノデカン酸、アミノウンデカン酸、アミノドデカン酸、及びこれらの構造異性体を挙げることができる。
これらの中でも、グリシン、β−アラニン、アミノ酪酸、アミノ吉草酸、アミノヘプタン酸、アミノオクタン酸、アミノデカン酸、アミノウンデカン酸、アミノドデカン酸等のω−アミノ脂肪酸を好ましく用いることができる。なお、これらのω−アミノ脂肪酸は置換基を有していてもよく、カルボキシ基のα位又はβ位に置換基を有していることが好ましい。ω−アミノ脂肪酸の炭素数は特に制限されないが、遊離速度制御の観点から、３以上であることが好ましく、３〜１２であることがより好ましく、３〜６であることが更に好ましい。なお、ω−アミノ脂肪酸の炭素数はカルボキシ基のカルボニル炭素を含む総炭素数を意味する。
【００５２】
アミノ酸の誘導体としては、２−フルオロ−３−アミノ−プロパン酸、２−クロロ−３−アミノ−プロパン酸、２−ブロモ−３−アミノ−プロパン酸等のカルボキシ基に隣接するα位炭素の水素原子がハロゲンに置換されたハロゲン化誘導体、２−メチル−２−アミノプロパン酸、ジエチルグリシン等のカルボキシ基に隣接するα位炭素の水素原子がアルキル鎖に置換されたアルキル置換誘導体、１１−アミノ−３，６，９−トリオキサウンデカン酸等のエーテル結合を有するアミノ酸が例示される。
アミノ酸誘導体として、前述のアミノ酸から選択されて、組み合わされたジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドを用いてもよい。
【００５３】
アミノアルコールとして具体的には、アミノエタノール、アミノプロパノール、アミノブタノール、アミノヘキサノール等の脂肪族アミノアルコール；アミノフェニルエタノール、アミノベンジルアルコール等のアミノアリールアルキルアルコール；これらの構造異性体を挙げることができる。
【００５４】
アミノアルコールの誘導体としては、例えば、３−アミノ−２−フルオロ−１−プロパノール、４−アミノ−３−フルオロ−１−ブタノール等のヒドロキシ基から数えて１〜２番目に隣接するα位炭素又はβ位炭素の水素原子がハロゲンに置換されたハロゲン化アミノアルコールを挙げることができる。
【００５５】
ジカルボン酸として具体的には、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸等の脂肪族ジカルボン酸；フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸等の芳香族ジカルボン酸；これらの構造異性体などを挙げることができる。
【００５６】
ジカルボン酸の誘導体としては、タルトロン酸、酒石酸、イソクエン酸、クエン酸、シトラマル酸、リンゴ酸等が例示される。
【００５７】
ヒドロキシ酸としては、グリコール酸、乳酸、２−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、γ−ヒドロキシ酪酸、２−ホスホグリセリン酸、３−ホスホグリセリン酸、ロイシン酸、リシノール酸、セレブロン酸、これらの構造異性体などを挙げることができる。
【００５８】
ヒドロキシ酸の誘導体としては、リンゴ酸、グリセリン酸、タルトロン酸、酒石酸、パントイン酸、メバロン酸等が例示される。
【００５９】
ＧＡＧ誘導体におけるスペーサーは、ＧＡＧ誘導体からの生理活性物質の遊離速度制御の観点から、アミノ酸、アミノアルコール、ジカルボン酸及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種に由来する２価以上の基であることが好ましく、アミノ酸、アミノアルコール及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１種に由来する２価以上の基であることがより好ましい。
【００６０】
ＧＡＧ誘導体におけるスペーサーが、アミノ酸又はその誘導体に由来する２価の基である場合、スペーサーは、下記一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸に由来する２価の基であることが好ましい。一般式（Ｉ）で表されるスペーサーは、生理活性物質がヒドロキシ基を有する場合に好適に適用することができる。
【００６１】
−ＨＮ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＲ１１Ｒ１２−ＣＲ１３Ｒ１４−ＣＯ−  （Ｉ）
式中、ｍは０〜１２の整数を示す。Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４はそれぞれ独立に、水素原子、電子吸引基、電子供与基又は立体障害性基を示す。ｍは、０〜８であることが好ましく、０〜４であることがより好ましい。また、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４の基はその全部又は一部において、同一であっても異なっていてもよい。
【００６２】
電子吸引基、電子供与基及び立体障害性基の詳細については既述の通りである。一般式（Ｉ）で表されるスペーサーにおけるＲ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４を適宜選択することで、ＧＡＧ誘導体からの生理活性物質の遊離速度を制御することができる。したがって、Ｒ１１〜Ｒ１４の少なくとも１つは、電子吸引基、電子供与基又は立体障害性基であることが好ましい。
例えば、Ｒ１１〜Ｒ１４の少なくとも１つをハロゲン原子等の電子吸引基とすれば、結合強度が弱まるため生理活性物質が遊離され易くなり、遊離速度は速くなる。
【００６３】
エステル結合の分解速度への影響は、Ｒ１１及びＲ１２よりもＲ１３又はＲ１４に電子吸引基を導入する方が大きくなり、更に電子吸引性の強さ、例えば電気陰性度に合わせて電子吸引基を選択することにより生理活性物質の遊離速度を調整することが可能である。すなわち一般に電気陰性度が大きい置換基を導入すれば遊離速度は速くなる傾向がある。
【００６４】
Ｒ１１〜Ｒ１４として導入する電子吸引基は導入可能であればどのような電子吸引基でもよく、ハロゲン原子、アルキル及びアリールスルホキシド基、アルキル及びアリールスルホン基、スルホン酸基、アセタミド基、カルボキシ基、アルキルオキシカルボニル基等が例示される。
例えばＲ１３又はＲ１４としてフッ素、塩素、臭素のようなハロゲン原子を導入すると上述の理由により電気陰性度の高い順（Ｆ＞Ｃｌ＞Ｂｒ）に生理活性物質の遊離速度は大きくなる。
【００６５】
逆にＲ１３又はＲ１４として電子供与基を導入すれば生理活性物質の遊離速度をより低下させることが可能である。Ｒ１３又はＲ１４の電子供与基は電子を供与できる構造ならば特に限定されない。
【００６６】
更に生理活性物質の遊離速度を低下させるためには、スペーサーにメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基等の直鎖状アルキル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等の分岐鎖アルキル基、シクロヘキシル基等の環状アルキル基、フェニル基等のアリール基などを導入することで立体障害を起こさせ、遊離速度を低下させることも可能である。
Ｒ１１（又はＲ１２）及びＲ１３（又はＲ１４）を、各々電子吸引基及び電子供与基とすることで遊離速度を微調整することも可能である。更に電子吸引性又は電子供与性と立体障害性とを併せ持つ置換基をＲ１１〜Ｒ１４とすることで、遊離速度を微調整することも可能である。
【００６７】
一般式（Ｉ）で表されるスペーサーとして具体的には下記表１に示すスペーサーを例示することができるが、本実施形態はこれらに限定されない。なお、下記表１中、Ｈは水素原子、Ｆはフッ素原子、Ｃｌは塩素原子、Ｂｒは臭素原子、ＯＨはヒドロキシ基、ＯＴｓはトルエンスルホニルオキシ基を表す。
【００６８】
【表１】
2019059951.tif 000002
【００６９】
ＧＡＧ誘導体におけるスペーサーが、アミノアルコール又はその誘導体に由来する２価の基である場合、スペーサーは、下記一般式（ＩＩ）で表されるアミノアルコールに由来する２価の基であることが好ましい。一般式（ＩＩ）で表されるスペーサーは、生理活性物質がカルボキシ基を有する場合に好適に適用することができる。
【００７０】
−ＨＮ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＲ２１Ｒ２２−ＣＲ２３Ｒ２４−Ｏ−  （ＩＩ）
式中、ｎは０〜１２の整数を示す。Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３及びＲ２４はそれぞれ独立に、水素原子、電子吸引基、電子供与基又は立体障害性基を示す。ｎは、０〜８であることが好ましく、０〜４であることがより好ましい。また、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３及びＲ２４の基はその全部又は一部において、同一であっても異なっていてもよい。
【００７１】
電子吸引基、電子供与基及び立体障害性基の詳細については既述の通りである。一般式（ＩＩ）で表されるスペーサーにおけるＲ２１、Ｒ２２、Ｒ２３及びＲ２４を適宜選択することで、ＧＡＧ誘導体からの生理活性物質の遊離速度を制御することができる。したがって、Ｒ２１〜Ｒ２４の少なくとも１つは、電子吸引基、電子供与基又は立体障害性基であることが好ましい。
【００７２】
例えば、Ｒ２１又はＲ２２の少なくとも１つをハロゲン原子等の電子吸引基としたスペーサーを用いることで生理活性物質の遊離速度は速くなる。Ｒ２１又はＲ２２における電子吸引基は導入可能であればどのような電子吸引基でもよく、ハロゲン原子、アルキル及びアリールスルホキシド基、アルキル及びアリールスルホン基、スルホン酸基、アセタミド基、カルボキシ基、アルキルオキシカルボニル基等が例示される。
【００７３】
例えば、Ｒ２１を電気陰性度の高いハロゲン原子に、Ｒ２２を水素原子とした誘導体では生理活性物質の遊離速度は速くなる。更にＲ２１及びＲ２２をともにハロゲン原子とすることで遊離速度はより大きくなる。更にエステル結合により近いＲ２３又はＲ２４を電子吸引基とすることにより更に薬物放出を速めることも可能である。
【００７４】
逆にＲ２１又はＲ２２を電子供与基とすることで生理活性物質の遊離速度をより低下させることが可能である。Ｒ２１又はＲ２２の電子供与基は電子を供与できる構造ならば特に限定されない。
【００７５】
Ｒ２３又はＲ２４にアルキル基等を導入し、スペーサー形成分子のヒドロキシ基を２級あるいは３級のヒドロキシ基とすることで遊離速度は遅くなる。更にＲ２３又はＲ２４にメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基等の直鎖状アルキル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等の分岐鎖アルキル基、シクロヘキシル基等の環状アルキル基、フェニル基等のアリール基などを導入することで立体障害を起こさせ、遊離速度を低下させることも可能である。
【００７６】
Ｒ２１〜Ｒ２４から選ばれる２つを電子吸引基及び電子供与基とすることで遊離速度を微調整することも可能である。更にＲ２１〜Ｒ２４を、電子吸引性又は電子供与性と立体障害性とを併せ持つ置換基をすることで遊離速度を微調整することも可能である。
【００７７】
一般式（ＩＩ）で表されるスペーサーとして具体的には下記表２に示すスペーサーを例示することができるが、本実施形態はこれらに限定されない。なお、下記表２中、Ｈは水素原子、Ｆはフッ素原子、Ｃｌは塩素原子、Ｂｒは臭素原子、Ｍｅはメチル基、ＣＯＯＥｔはエトキシカルボニル基を表す。
【００７８】
【表２】
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【００７９】
ＧＡＧ誘導体におけるスペーサーは、生理活性物質の遊離速度制御の観点から、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、システイン、プロリン、オルニチン、β−アラニン及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸に由来する２価以上の基、又はアミノプロパノール、アミノエタノール及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種のアミノアルコールに由来する２価以上の基であることが好ましい。
【００８０】
ＧＡＧ誘導体におけるＧＡＧに由来する基を構成する２糖からなる構成単位の含有数と、生理活性物質に由来する基の含有数との比率は、特に限定されない。当該比率は、ＧＡＧが有するカルボキシ基の総モル数に対する生理活性物質に由来する基のモル数の比率（以下、導入率ともいう）で表すことができる。導入率は、特に限定されないが、例えば、１％〜１００％が例示される。
なお、生理活性物質の含有比率は、生理活性物質の用途、種類、効果の強さ及び水に対する溶解性等の生理活性物質の性質並びにスペーサーの種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、生理活性物質の含有量が１回の投与あたり１μｇ〜１００ｍｇとなるように調製されることが好ましい。
【００８１】
ＧＡＧ誘導体は、単一種のＧＡＧ分子と単一種の生理活性物質とを組み合わせて構成されたものであっても、単一種のＧＡＧ分子と２種以上の生理活性物質とを組み合わせて構成されたものであっても、２種以上のＧＡＧ分子と単一種の生理活性物質とを組み合わせて構成されたものであってもよい。
【００８２】
ＧＡＧ誘導体による生理活性物質遊離速度の制御できる期間は、秒、分、時間、月、年単位等であり、特に限定されないが、１週間以上制御できることが好ましく、２週間以上制御できることがより好ましく、１か月以上制御できることがさらに好ましく、６か月以上制御できることが極めて好ましく、１年以上制御できることが特に好ましい。
【００８３】
ＧＡＧ誘導体からの生理活性物質の遊離速度は特に制限されず、目的等に応じて適宜選択できる。ＧＡＧ誘導体からの生理活性物質の遊離速度は例えば、ｐＨ７．５、３６℃のリン酸緩衝生理食塩液中において、０．１〜３０％／日、０．２〜２０％／日、０．３〜１０％／日、０．３〜５％／日、０．３％〜４％／日、０．３〜３％／日、０．３〜２％／日、０．３〜１％／日、０．５〜５％／日、０．５〜４％／日、０．５〜３％／日、０．５〜２％／日、０．５〜１％／日、０．６〜５％／日、０．６〜４％／日、０．６〜３％／日、０．６〜２％／日、０．６〜１％／日であってよい。ここで生理活性物質の遊離速度とは、遊離率（％）の一日あたりの変化量であり、横軸に時間を、縦軸にＧＡＧ誘導体に含まれる生理活性物質に由来する基の総モル数（１００％）に対する生理活性物質の遊離量（モル）の割合である遊離率（％）を取った場合、グラフの傾きとして定義される。したがって、遊離速度が測定期間中に一定値を維持する場合には、グラフは単調増加の直線となり、例えば、ｐＨ７．５、３６℃の１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩液中、１０日間で、多糖誘導体が含むすべての生理活性物質が遊離した場合、遊離速度は１０％／日と表現される。一方、遊離速度が一定値を取らずに経時的に低下する場合（グラフは上に凸で単調増加する緩やかなカーブを示す）は、初期の立ち上がり期間（例えば、３日間）の遊離率変化を直線近似して遊離速度を算出する。
なお、生理活性物質の遊離量は生理活性物質の種類に応じて適宜選択される方法によって測定される。
【００８４】
本実施形態のＧＡＧ誘導体の構成及び技術思想は、ＧＡＧ以外の多糖にも応用することができる。ＧＡＧ以外の多糖としては、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、キトサン、キチン、セルロース及びこれらの誘導体等を挙げることができる。
【００８５】
＜グリコサミノグリカン誘導体の製造方法＞
本実施形態のグリコサミノグリカン誘導体の製造方法は、
（１）カルボキシ基又はヒドロキシ基を有する生理活性物質を準備することと、
（２）生理活性物質に由来する基と共有結合を形成するスペーサーを該共有結合の分解速度に応じて選択することと、
（３）生理活性物質に由来する基とグリコサミノグリカンに由来する基とをスペーサーを介して共有結合することと、を含む製造方法である
ＧＡＧ誘導体を構成するスペーサーが、生理活性物質に由来する基との共有結合の分解速度に応じて選択されることで、生理活性物質の構造に大きく依存せずに、その遊離速度を制御することが可能となる。
【００８６】
工程（１）では、所望の生理活性を有する物質を公知の生理活性物質から適宜選択して準備してもよく、公知の手法で所望の生理活性物質を製造して準備してもよい。
工程（２）では、生理活性物質の遊離速度が所望の範囲となるようにスペーサーを形成するスペーサー形成分子を選択することが好ましい。スペーサー形成分子は生理活性物質とエステル結合を形成する反応性官能基であるヒドロキシ基又カルボキシ基と、ＧＡＧと共有結合（好ましくは、アミド結合）を形成する反応性官能基（好ましくは、アミノ基）と、２つの反応性官能基を連結し、生理活性物質とのエステル結合の分解速度を制御するように選択される連結基とを有する。例えば、スペーサー形成分子が有する置換基を適宜選択することにより、所望の分解速度を達成することができる。スペーサー形成分子の選択方法の詳細は既述の通りである。
【００８７】
工程（３）では、準備した生理活性物質と、選択したスペーサー形成分子と、ＧＡＧとを用いてＧＡＧ誘導体を製造する。工程（３）は、例えば以下の工程を含むことができる。
（３ａ）生理活性物質が有するカルボキシ基又はヒドロキシ基と、スペーサー形成分子の反応性官能基とをエステル結合させることと、
（３ｂ）ＧＡＧ分子が有するカルボキシ基をスペーサー形成分子の反応性官能基と縮合して共有結合させることと、を含む製造方法。
【００８８】
（３ａ）の工程では、生理活性物質が有するカルボキシ基又はヒドロキシ基とスペーサー形成分子の反応性官能基（好ましくはヒドロキシ基又はカルボキシ基）とを通常用いられるエステル化方法によってエステル結合させる。このときスペーサー形成分子のＧＡＧ分子と結合する予定の反応性官能基は、必要に応じて通常用いられる方法で保護しておいてもよい。
エステル化方法としては例えば、水溶性カルボジイミド（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤を用いる方法、対称酸無水物法、混合酸無水物法、活性エステル法などの方法を挙げることができる。エステル化方法の反応条件は適用するエステル化方法に応じて適宜選択される。
【００８９】
（３ｂ）の工程では、ＧＡＧ分子が有するカルボキシ基とスペーサー形成分子の反応性官能基（好ましくは、アミノ基）とを縮合して共有結合させる。縮合方法は、形成される共有結合に応じて、通常用いられる方法から適宜選択すればよい。このときスペーサー形成分子の生理活性物質と結合する予定の反応性官能基は、必要に応じて通常用いられる方法で保護しておいてもよい。
工程（３ａ）と工程（３ｂ）の順番は特に制限されない。製造効率の観点から、工程（３ａ）の後に工程（３ｂ）を行うことが好ましい。
【００９０】
ＧＡＧ誘導体の製造方法は、工程（３）に先立ってグリコサミノグリカンを準備する工程を更に含んでいてもよい。グリコサミノグリカンは特に制限されず、ＧＡＧ誘導体の目的等に応じて公知のグリコサミノグリカンから選択してもよく、目的に応じて新たに製造したものであってもよい。
【００９１】
本実施形態の製造方法の構成及び技術思想はＧＡＧ以外の多糖にも応用することができる。ＧＡＧ以外の多糖としては、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、キトサン、キチン、セルロース及びこれらの誘導体等を挙げることができる。
【００９２】
＜グリコサミノグリカン誘導体からの生理活性物質の遊離速度の制御方法＞
本実施形態のグリコサミノグリカン誘導体からの生理活性物質の遊離速度の制御方法は、グリコサミノグリカンに由来する基と、カルボキシ基及びヒドロキシ基の少なくとも一方を有する生理活性物質に由来する基とが、スペーサーを介する共有結合で連結されたグリコサミノグリカン誘導体に含まれるスペーサーを、生理活性物質に由来する基とスペーサーとの共有結合の分解速度に応じて選択することを含むことを特徴とする。
ＧＡＧ誘導体を構成するスペーサーが、生理活性物質に由来する基との共有結合の分解速度に応じて選択されることで、生理活性物質の構造に大きく依存せずに、その遊離速度を制御することが可能となる。
【００９３】
ＧＡＧ誘導体の詳細については既述の通りである。またスペーサーを生理活性物質に由来する基との共有結合の分解速度に応じて選択することは、スペーサーを形成するスペーサー形成分子が有する置換基を選択することを含むことが好ましい。これにより生理活性物質の遊離速度を所望の範囲により容易に制御することができる。なお、スペーサー形成分子の選択方法の詳細は既述の通りである。
【００９４】
遊離速度を制御する温度条件は、特に限定されず、保存容器や標的組織等に応じて適宜設定することができる。具体的な温度としては、０℃〜９０℃、より具体的には、２℃〜８０℃、４℃〜７０℃、２５℃〜６０℃等が挙げられる。
【００９５】
遊離速度の制御できる期間は、秒、分、時間、月、年単位等、特に限定されないが、１週間以上制御できることが好ましく、２週間以上制御できることがより好ましく、１か月以上制御できることがさらに好ましく、６か月以上制御できることが極めて好ましく、１年以上制御できることが特に好ましい。
【００９６】
生理活性物質の遊離速度の制御方法の構成及び技術思想はＧＡＧ以外の多糖にも応用することができる。ＧＡＧ以外の多糖としては、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、キトサン、キチン、セルロース及びこれらの誘導体等を挙げることができる。
【００９７】
＜医薬組成物＞
本実施形態の医薬組成物は、上記グリコサミノグリカン誘導体の少なくとも１種を含む。医薬組成物は、ＧＡＧ誘導体を１種単独で含んでいても２種以上を組み合わせて含んでいてもよい。２種以上のＧＡＧ誘導体を含む場合、同一の生理活性物質と２種以上の異なるＧＡＧとをそれぞれ組み合わせた２種以上のＧＡＧ誘導体の組み合わせであっても、同一のＧＡＧと２種以上の異なる生理活性物質とをそれぞれ組み合わせた２種以上のＧＡＧ誘導体の組み合わせであってもよい。
医薬組成物におけるＧＡＧ誘導体の含有量は特に制限されず、目的等に応じて適宜選択することができる。
【００９８】
医薬組成物は、ＧＡＧ誘導体に加えて、薬学的に許容されうる賦形剤等のその他の成分を更に含んでいてもよい。その他の成分としては、薬学的に許容されうる賦形剤の他、界面活性剤、生理活性物質、安定化剤、等張化剤、液状媒体、緩衝剤等を挙げることができる。生理活性物質はＧＡＧ誘導体から遊離する生理活性物質と同一であっても、異なっていてもよい。
【００９９】
本実施形態の医薬組成物が対象とする疾患は特に制限されない。ＧＡＧ誘導体が有する生理活性物質に由来する基を適宜選択することで種々の疾患に適用することができる。また、ＧＡＧ誘導体は生理活性物質の遊離速度が制御可能であることから、生体への投与前には安定で且つ投与後は生体内で適用症に合わせた適切な薬物遊離速度を達成することができる。更にＧＡＧ誘導体は、薬物をＧＡＧにスペーサーを介して共有結合させることによって、例えば、持続型効果を期待することができる。一般に持続型効果は、疾患によってその期待される持続時間が異なってくる。又、慢性疾患などにおいては、現状では、効果持続のため頻回投与を余儀なくされ、それに伴う副作用、あるいは、煩雑さなどが伴い、アドヒアランスの低下を引き起こしたりすることもあるため投与回数の低減、すなわち効果の持続性を求められることもある。
本実施形態の医薬組成物は、所望の生理活性を有する薬物を用いて、所望の遊離速度が達成されるように制御されたＧＡＧ誘導体を含むことから、種々の慢性疾患に適用可能で、アドヒアランスの向上に資するものである。
【０１００】
医薬組成物は、ＧＡＧ誘導体を含むことで、標的組織において生理活性物質を徐々に遊離することができる。すなわち、ＧＡＧ誘導体はこれを含む放出制御製剤を構成することができる。
【０１０１】
医薬組成物による生理活性物質遊離速度の制御できる期間は、秒、分、時間、月、年単位等、特に限定されないが、１週間以上制御できることが好ましく、２週間以上制御できることがより好ましく、１か月以上制御できることがさらに好ましく、６か月以上制御できることが極めて好ましく、１年以上制御できることが特に好ましい。
【０１０２】
本実施形態の医薬組成物の構成及び技術思想はＧＡＧ以外の多糖にも応用することができる。ＧＡＧ以外の多糖としては、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、キトサン、キチン、セルロース及びこれらの誘導体等を挙げることができる。
【０１０３】
医薬組成物の標的組織における効果の持続性は、標的組織に応じて評価することができる。
例えば、標的組織が肺である場合、一般に肺胞被覆層のｐＨは弱アルカリ性（ｐＨ７．５前後）であることが知られているため、評価対象の医薬組成物をｐＨ約７．５に調製した１０ｍＭリン酸緩衝液中に溶解し、３６℃で１週間保管した際の生理活性物質の遊離率により、効果の持続性を評価することができる。
また、標的組織が鼻腔である場合、一般にアレルギー性鼻炎に罹患している患者の鼻腔粘液ｐＨは弱アルカリ性（ｐＨ８．０前後）であることが知られているため、評価対象の医薬組成物をｐＨ約８．０に調製した１０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、３６℃で１週間保管した際の生理活性物質の遊離率により、効果の持続性を評価することができる。
【０１０４】
医薬組成物は、例えば、呼吸器投与に用いられる。すなわち医薬組成物は経肺投与、経鼻投与等の態様で使用されることが好ましい。
この場合、医薬組成物の形態は、呼吸器への投与が可能な形態であればよく、粉体、液体、懸濁液等のいずれの形態であってもよい。
投与方法については、使用者自らの吸気により、若しくは外部装置が発生する気流を用いて、又はその両方を用いて投与する方法、ネブライザーを用いて投与する方法等を挙げることができる。
【０１０５】
呼吸器に投与された医薬組成物は、生理活性物質とＧＡＧとがスペーサーを介して共有結合したままで呼吸器の標的組織に到達、付着する。その後、スペーサーと生理活性物質との間の共有結合が徐々に分解することで、長時間（例えば２４時間以上）に渡って、生理活性物質が徐放される。
【０１０６】
呼吸器投与が適用可能な標的組織としては肺組織（肺胞、終末細気管支、細気管支、気管支を含む）、鼻腔（副鼻腔、前頭洞、篩骨洞、上顎洞、蝶形骨洞、上鼻甲介、中鼻甲介、下鼻甲介を含む）が例示される。
【０１０７】
医薬組成物は例えば、呼吸器疾患の治療に好適に適用することができるが、医薬組成物の用途は呼吸器疾患の治療に限られるものではなく、呼吸器疾患の予防の他、生理活性物質の種類に応じてその他の疾患の治療、予防、診断等の用途に適用することができる。
医薬組成物を呼吸器疾患の治療又は予防に用いる場合、呼吸器疾患としては、気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ウィルス感染症、急性アレルギー疾患、慢性アレルギー疾患等が例示される。
【０１０８】
医薬組成物は、例えば、気管支喘息に好適に適用することができる。
気管支喘息（喘息）は、アレルギー反応などで気道過敏性が亢進し、気道の閉塞が起こり、呼吸が苦しくなる病気である。現在、喘息治療の中心になるのは、吸入ステロイドを用いた長期管理薬と発作時に処方される気管支拡張薬を用いた治療を組み合わせることが主になっている。喘息は、前述のように気道の慢性炎症と定義されるため、発作発現前にも喘息患者には気道炎症が見られる。このため強い抗炎症作用を作用機序とするステロイドを発作前から長期管理薬として継続的に吸入することにより慢性的な気道の炎症を抑え、喘息症状を大きく改善することが可能になった。
【０１０９】
一方、吸入ステロイドの抗炎症作用の持続時間は短く、１日に１〜８回程度の吸入が必要であり、長期管理薬をして毎日服用する患者にとっては非常に煩雑であり、このことがアドヒアランスの低下を引き起こすこともある。
そこでＧＡＧにステロイドを化学的に導入したステロイド導入ＧＡＧ誘導体を長期管理薬として用いることにより、１回の吸入だけ数日間の長期の抗炎症効果の持続が可能になり、毎日数回の吸入の必要がなくなり、その煩雑さも解消され、患者のアドヒアランス向上も期待できる。
この場合、ＧＡＧ誘導体が有するスペーサーの構造を変えることにより投与間隔、つまり抗炎症作用の持続時間を延ばすことも短くすることも可能であり、更に選択するステロイドにより抗炎症作用の強弱をコントロールすることも可能である。
【０１１０】
医薬組成物の喘息以外のその他の適用として具体的には例えば、関節炎治療薬としての適用、筋障害への適用、腰痛症治療薬への適用、筋・筋膜性疼痛症候群への適用、筋肉痛への適用等が挙げられる。
投与方法としては、例えば、関節内投与、筋肉内投与等が挙げられる。
例えば非ステロイド性抗炎薬（ＮＳＡＩＤｓ）を生理活性物質としてＧＡＧに導入した生理活性物質の遊離速度が制御可能なＮＳＡＩＤｓ導入ＧＡＧ誘導体には、関節炎や腰痛等への長期持続的な疼痛抑制及び抗炎症作用を期待できる。
すなわち、上記グリコサミノグリカン誘導体は、生理活性物質として例えばＮＳＡＩＤｓが導入されることで、これを含む疼痛抑制剤や持続型の疼痛抑制剤を構成することができる。
【０１１１】
本実施形態の疼痛抑制剤におけるＧＡＧ誘導体の含有量は、特に制限されないが、溶液全体の０．５％（ｗ／ｖ％）〜１０％ （ｗ／ｖ％）であるものが好ましく、０．７％（ｗ／ｖ％）〜 ８％（ｗ／ｖ％）であるものがより好ましく、１％（ｗ／ｖ％）〜５％（ｗ／ｖ％）であるものがより好ましく、１％（ｗ／ｖ％）、又は、５％（ｗ／ｖ％）であるものが更に好ましい。
【０１１２】
ＧＡＧ分子としてヒアルロン酸を用いる場合、本実施形態の疼痛抑制剤におけるＧＡＧ誘導体の含有量は、特に制限されないが、溶液全体の０．５％（ｗ／ｖ％）〜３％ （ｗ／ｖ％）であるものが好ましく、０．７％（ｗ／ｖ％）〜 １．８％（ｗ／ｖ％）であるものがより好ましく、１％（ｗ／ｖ％）であるものが更に好ましい。
【０１１３】
ＧＡＧ分子としてコンドロイチン硫酸を用いる場合、本実施形態の疼痛抑制剤におけるＧＡＧ誘導体の含有量は、特に制限されないが、溶液全体の０．５％（ｗ／ｖ％）〜１０％ （ｗ／ｖ％）であるものが好ましく、１％（ｗ／ｖ％）〜 ７％（ｗ／ｖ％）であるものがより好ましく、１％（ｗ／ｖ％）、又は、５％（ｗ／ｖ％）であるものが更に好ましい。
【０１１４】
ＧＡＧ誘導体に導入可能なＮＳＡＩＤｓとしては、カルボキシ基及びヒドロキシ基の少なくとも一方を有する化合物、すなわち、メフェナム酸、ジクロフェナク、フェンブフェン、インドメタシン、フェルビナク、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェンが挙げられる。
【０１１５】
ＮＳＡＩＤｓのカルボキシ基を利用してＧＡＧと結合させる場合、スペーサーとしてアミノアルコール及びその誘導体が用いられ、ＧＡＧとはアミド結合、ＮＳＡＩＤｓとはエステル結合にて共有結合することが好ましい。既述のようにスペーサーの構成を選択することでＮＳＡＩＤｓの遊離速度を制御することが可能である。
【０１１６】
ＮＳＡＩＤｓ導入されたＧＡＧ誘導体は、慢性腰痛、筋・筋膜性疼痛症候群等の筋肉痛に対する筋注用局所徐放性鎮痛剤としての使用も考えられる。
慢性腰痛は慢性疼痛の中で最も頻繁に観察され、炎症性疼痛と神経障害性疼痛が混合した原因部位の特定可能な特異的腰痛と、痛みの原因部位の特定が困難な、時に社会心理的要因と強く関連した非特異的腰痛に分類でき、その症状、原因に応じ特異的腰痛、非特異的腰痛のどちらに対しても生理活性物質の遊離速度調整が可能なＮＳＡＩＤｓ導入ＧＡＧ誘導体を用いることが可能である。
【０１１７】
筋・筋膜性疼痛症候群（Ｍｙｏｆａｓｃｉａｌ  Ｐａｉｎ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＭＰＳ）とは、画像検査や血液検査では異常を認めず、筋肉に痛みや「こり」が長期間（２〜３箇月間以上）にわたって続く病態をいう。ＭＰＳの症状は通常１〜２箇所の筋肉に限局しており罹患筋にトリガーポイントと呼ばれる硬結部（筋硬結）を触知するのが特徴である。筋硬結は、筋肉に対する過負荷により筋肉内に微小損傷が生じ、その微小損傷が筋肉に痙攣を発生させ、筋肉が収縮、硬直することで、この中に物理的に力を加えると痛みを強く感じる圧痛点が認められ、その中でも特に周辺を含めた広範囲に関連痛を発生させる圧痛点を発痛点（トリガーポイント）と呼ぶ。トリガーポイントの好発部位は、頸部〜肩甲部、腰背部及び大腿部などである。
【０１１８】
治療法には、ＮＳＡＩＤｓ（内服、外用）、筋弛緩薬、抗うつ薬、抗痙攣薬等による治療、上述のトリガーポイントに局所麻酔薬、ネオビタカイン（登録商標）（疼痛治療剤（ジブカイン塩酸塩、サリチル酸ナトリウム及び臭化カルシウムの合剤））、ステロイド、ノイロトロピン（登録商標）を注射するトリガーポイント注射治療等が用いられている。
特にＭＰＳ治療に汎用される局所麻酔薬のトリガーポイント注射は一定の鎮痛効果は得られるものの、有効期間は長くて１〜２日程度であり、治療頻度が高い。そのため、通院回数の減らせる持続性鎮痛剤のニーズは高い。また、薬物療法として、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）、筋弛緩薬、抗うつ薬などが投薬されているが、効果は低いのが現状である。また、治療対象患者には高齢者が多く、局所麻酔薬は、徐脈、不整脈等の心血管系及び呼吸抑制など中枢神経系の副作用もあり、持続性と安全性を併せ持った局所疼痛治療剤が求められており、リリースコントロール可能なＮＳＡＩＤｓ導入ＧＡＧ誘導体は、当該用途に適している。
【０１１９】
ＮＳＡＩＤｓ導入ＧＡＧ誘導体は、上述のように腰痛症等の背部痛、筋・筋膜性疼痛症候群等の筋肉痛に対する筋注用局所徐放性鎮痛剤としての使用に適している。例えば、筋注薬の場合、ＧＡＧ誘導体は比較的早く代謝消失するため、該適用において比較的薬物遊離速度が緩やかなものを使用した場合、必要な薬物量を放出する前に代謝消失されてしまい効果が発現されない場合がある。このような場合には、スペーサーに電子吸引基を導入した比較的薬物遊離速度が速いＮＳＡＩＤｓ導入ＧＡＧ誘導体を用いることで適切に薬物が遊離され持続的な効果を発現することが可能になる
又、上記腰痛症、筋・筋膜性疼痛症候群等の筋肉痛に対する筋注用局所徐放性鎮痛剤は、薬物としてＮＳＡＩＤｓでなくステロイドを用いたステロイド導入ＧＡＧ誘導体を用いることも可能である。
【０１２０】
本実施形態の疼痛抑制剤の投与間隔は特に制限されない。投与間隔は例えば、３日以上とすることが好ましく、７日以上であることがより好ましく、１０日以上であることが更に好ましく、１４日以上であることが特に好ましい。すなわち、本実施形態の疼痛抑制剤の疼痛抑制効果は例えば、投与後３日間またはそれ以上持続することが好ましく、投与後７日間またはそれ以上持続することがより好ましく、投与後１０日間またはそれ以上持続することが更に好ましく、投与後１４日間またはそれ以上持続することが特に好ましい。
【０１２１】
本発明は、上記グリコサミノグリカン誘導体（以下、「第一のグリコサミノグリカン誘導体」ともいう）に加えて、以下に示す生理活性物質が結合していない第二のグリコサミノグリカン誘導体を包含するものである。すなわち本発明は以下の態様を包含する。
＜１ａ＞  グリコサミノグリカンに由来する基と、
グリコサミノグリカンに由来する基と共有結合し、電子吸引基、電子供与基及び立体障害性基からなる群より選択される少なくとも１種の置換基並びに生理活性物質と共有結合可能な反応性官能基を有するスペーサー形成基と、を有する第二のグリコサミノグリカン誘導体である。
＜２ａ＞  反応性官能基が、ヒドロキシ基、カルボキシ基及びこれらの誘導体から選択される少なくとも１種の基であり、生理活性物質との共有結合がエステル結合である前記＜１ａ＞に記載の第二のグリコサミノグリカン誘導体
＜３ａ＞  グリコサミノグリカンに由来する基と、スペーサー形成基とは、アミド結合で共有結合している前記＜１ａ＞又は＜２ａ＞に記載の第二のグリコサミノグリカン誘導体である。
＜４ａ＞  スペーサー形成基が、アミノアルコール、アミノ酸及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種に由来する基である、前記＜１ａ＞〜＜３ａ＞のいずれか１つに記載の第二のグリコサミノグリカン誘導体である。
＜５ａ＞  スペーサー形成基が、下記一般式（Ｉａ）で表されるアミノ酸に由来する基である、前記＜１ａ＞〜＜４ａ＞のいずれか１つに記載の第二のグリコサミノグリカン誘導体である。
−ＨＮ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＲ１１Ｒ１２−ＣＲ１３Ｒ１４−ＣＯＯＨ  （Ｉａ）
（式中、ｍは０〜１２の整数を示す。Ｒ１１〜Ｒ１４はそれぞれ独立して、水素原子、電子吸引基、電子供与基又は立体障害性基を示す）
＜６ａ＞  スペーサー形成基が、下記一般式（ＩＩａ）で表されるアミノアルコールに由来する基である、前記＜１ａ＞〜＜４ａ＞のいずれか１つに記載の第二のグリコサミノグリカン誘導体。
−ＨＮ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＲ２１Ｒ２２−ＣＲ２３Ｒ２４−ＯＨ  （ＩＩａ）
（式中、ｎは０〜１２の整数を示す。Ｒ２１〜Ｒ２４はそれぞれ独立して、水素原子、電子吸引基、電子供与基又は立体障害性基を示す）
＜７ａ＞  グリコサミノグリカンが、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、へパラン硫酸及びケラタン硫酸からなる群より選択される少なくとも１種である、前記＜１ａ＞〜＜６ａ＞のいずれか１つに記載の第二のグリコサミノグリカン誘導体である。
＜８ａ＞  前記＜１ａ＞〜＜７ａ＞のいずれか１つに記載の第二のグリコサミノグリカン誘導体と、生理活性物質とが共有結合してなる第一のグリコサミノグリカン誘導体。
＜９ａ＞  前記＜８ａ＞に記載の第二のグリコサミノグリカン誘導体を含む放出制御製剤。
【０１２２】
一般式（Ｉａ）におけるｍ及びＲ１１〜Ｒ１４は、一般式（Ｉ）におけるｍ及びＲ１１〜Ｒ１４とそれぞれ同義である。また、一般式（ＩＩａ）におけるｍ及びＲ２１〜Ｒ２４は、一般式（ＩＩ）におけるｍ及びＲ２１〜Ｒ２４とそれぞれ同義である。
前記第二のグリコサミノグリカン誘導体を用いることで、生理活性物質の遊離速度を制御可能にすることができる。
【実施例】
【０１２３】
以下、本発明を実施例及び試験例により具体的に詳説する。しかしながら、これにより本発明の技術的範囲が限定されるべきものではない。なお、遊離率と導入率を除き、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。
【０１２４】
＜実施例１＞  ベタメタゾン−コンドロイチン硫酸の調製
１−１．  Ｂｏｃ−β−アラニンとベタメタゾンの縮合反応
Ｂｏｃ−β−アラニン  １ｇ（１．０ｅｑ，５．２９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（ＤＣＭ）１８ｍＬ及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１２ｍＬに溶解し、ベタメタゾン  ２．０７ｇ（１．０ｅｑ，５．２９ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）  １９４ｍｇ（０．３ｅｑ，１．５９ｍｍｏｌ）を加えた。その後、氷冷下、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ、東京化成工業社製）  １．１１ｇ（１．１ｅｑ，５．８１ｍｍｏｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、トルエン及び水を用いて分液抽出を３回行い、集めた有機層を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで６０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とするＢｏｃ−β−アラニン−ベタメタゾンを３．１８ｇ得た。なお、Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基を意味する。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.05(3H, s), 1.13(3H, m), 1.20(1H, m),1.46(9H, s), 1.58-1.61(4H, m), 1.99(1H, m), 2.05(1H, m), 2.15(2H, m), 2.38(1H, dd), 2.42(1H, dd), 2.52(1H, m), 2.62(2H, t), 2.75(1H, m), 3.38(2H, t), 4.25(1H, m), 4.95(2H, s), 6.09(1H, s), 6.29(1H, d), 7.50(1H, d).
【０１２５】
１−２．  Ｂｏｃ−β−アラニン−ベタメタゾンの脱Ｂｏｃ化反応
Ｂｏｃ−β−アラニン−ベタメタゾン２ｇをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）  ２０ｍＬに溶解し、氷冷下、４Ｍ  塩酸／酢酸エチル（ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ）  １５ｍＬを加えて７時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とするβ−アラニン−ベタメタゾン塩酸塩を１．２ｇ得た。（２工程収率７３％）
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ1.08(3H, s), 1.12(3H, m), 1.20(1H, m),1.54-1.62(4H, m), 1.98-2.18(4H, m), 2.38(1H, dd), 2.42(1H, dd), 2.52(1H, m), 2.75(1H, m), 2.91(2H, t), 3.30(2H, t), 4.27(1H, m), 5.10(2H, dd), 6.11(1H, s), 6.30(1H, d), 7.42(1H, d).
【０１２６】
１−３．  β−アラニン−ベタメタゾン塩酸塩のコンドロイチン硫酸への導入
コンドロイチン硫酸（重量平均分子量約４０ｋＤａ）  １ｇを注射用水（ＷＦＩ）  １００ｍＬ及びエタノール（ＥｔＯＨ）  １００ｍＬに溶解し、β−アラニン−ベタメタゾン塩酸塩を１９９ｍｇ（０．２ｅｑ，  ０．４０ｍｍｏｌ）加えた。その後、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリドｎ水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）を１８７ｍｇ（０．２ｅｑ，  ０．４０ｍｍｏｌ）加えて終夜攪拌した。その後、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）７５０ｍｇを加えて３時間攪拌し、酢酸４００μＬ、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）  ３ｇを順次加えた。３０分攪拌後、９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩを２００ｍＬ加えて沈殿形成し、上清を捨てて９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄を２回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的とするＧＡＧ誘導体（以下、コンジュゲートともいう）として、ＣＳ−ベタメタゾンが７６０ｍｇ得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、１７％であった。
【０１２７】
＜実施例２＞  ベタメタゾン（Ｆ）−コンドロイチン硫酸の調製
ベタメタゾン（Ｆ）−コンドロイチン硫酸（スペーサー形成分子にα−フルオロ−β−アラニンを用いたベタメタゾン−コンドロイチン硫酸  コンジュゲート）の調製をスキーム２に示す。
α−フルオロ−β−アラニン塩酸塩１を原料とし、１のアミノ基をｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基で保護することで化合物２とした後にベタメタゾンとの縮合反応に付して化合物３を得た。続いて化合物３のＢｏｃ基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体４へと変換し、コンドロイチン硫酸への導入を行ってコンジュゲート５を合成した。
【０１２８】
スキーム２
【化１】
2019059951.tif 000004
【０１２９】
２−１．  α−フルオロ−β−アラニン塩酸塩のＢｏｃ化反応
α−フルオロ−β−アラニン塩酸塩１  ６００ｍｇ（１．０ｅｑ，４．１８ｍｍｏｌ）をｔｅｒｔ−ブタノール  ２４ｍＬ及び１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）  １２ｍＬに溶解し、氷冷下、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（Ｂｏｃ２Ｏ）  １．１９ｇ（１．３ｅｑ，５．４３ｍｍｏｌ）を加えた。その後、室温にて終夜攪拌した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にて原料の消失を確認後、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮し、酢酸エチル及び１Ｍ塩酸（ＨＣｌ）を用いて分液抽出を３回行い、集めた有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物２を８６５ｍｇ得た（収率９９％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45(9H, s), 3.64-3.79(2H, br), 4.98(1H, br), 5.05(1H, br).
【０１３０】
２−２．  化合物２とベタメタゾンの縮合反応
化合物２  ５００ｍｇ（１．０ｅｑ，２．４１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ  ３０ｍＬに溶解し、ベタメタゾン  ９４７ｍｇ（１．０ｅｑ，２．４１ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ  ８９ｍｇ（０．３ｅｑ，０．７２ｍｍｏｌ）を加えた。その後、氷冷下、ＷＳＣ  ６９４ｍｇ（１．５ｅｑ，３．６２ｍｍｏｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、トルエン及び水を用いて分液抽出を３回行い、集めた有機層を飽和塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで６０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物３を１．４ｇ得た（収率９９％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.04(3H, d), 1.16(4H, m), 1.46(9H, s), 1.84-2.01(6H, m), 2.31-2.65(7H, m), 3.60-3.72(2H, m), 4.41(1H, d), 4.95-5.20(3H, m), 6.12(1H, s), 6.35(1H，d), 7.21(1H, d).
【０１３１】
２−３．  化合物３の脱Ｂｏｃ化反応
化合物３  ２５０ｍｇをジクロロメタン（ＤＣＭ）  ２０ｍＬに溶解し、氷冷下、４Ｍ塩酸／酢酸エチル（ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ）  １６ｍＬを加えて３時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする導入前駆体４を１８８ｍｇ得た（収率８２％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ1.04-1.80(13H, m)1.95-2.20(4H, m), 2.31-2.80(4H, m), 3.60-3.72(2H, m), 4.20(1H, m), 5.01(1H, m), 5.35(1H, m), 6.02(1H, s), 6.28(1H，d), 7.33(1H, d).
【０１３２】
２−４．  導入前駆体４のコンドロイチン硫酸への導入
コンドロイチン硫酸（重量平均分子量約４０ｋＤａ）  １ｇを注射用水（ＷＦＩ）  ８０ｍＬ及びＥｔＯＨ  ８０ｍＬに溶解し、導入前駆体４を３４９ｍｇ（０．３４ｅｑ，０．６８ｍｍｏｌ）加えた。その後、ＤＭＴ−ＭＭを３１７ｍｇ（０．３４ｅｑ，０．６８ｍｍｏｌ）加えて終夜攪拌した。その後、ＮａＣｌ  ３ｇを加えて３０分攪拌し、９０％エタノール（ＥｔＯＨ）／ＷＦＩ  １６０ｍＬを加えて沈殿形成し、上清を捨てて９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄を２回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物５が１．０８ｇ得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、１６％であった。
【０１３３】
＜実施例３＞  ベタメタゾン（Ｃｌ）−コンドロイチン硫酸の調製
ベタメタゾン（Ｃｌ）−コンドロイチン硫酸（スペーサー形成分子にα−クロロ−β−アラニンを用いたベタメタゾン−コンドロイチン硫酸  コンジュゲート）の調製をスキーム３に示す。
フタルイミド６及び２−クロロアクリロニトリル７を反応させて化合物８とした後にこれを加水分解条件に付し、α−クロロ−β−アラニン塩酸塩９を得た。続いてα−クロロ−β−アラニン塩酸塩９のアミノ基をＢｏｃで保護して化合物１０へと変換し、ベタメタゾンとの縮合反応を行って化合物１１を得た。さらに化合物１１のＢｏｃ基を酸性条件下除去してアミン塩酸塩である導入前駆体１２へ導き、コンドロイチン硫酸への導入を行い、コンジュゲート１３を合成した。
【０１３４】
スキーム３
【化２】
2019059951.tif 000005
【０１３５】
３−１．  化合物８の合成
フタルイミド６  ５ｇ（１．０ｅｑ，３３．４ｍｍｏｌ）にメタノール４０ｍＬ、トリエチルアミン  ２．４ｍＬ（０．５ｅｑ，１６．７ｍｍｏｌ）及び２−クロロアクリロニトリル７  ５．４ｍＬ（２．０ｅｑ，６６．８ｍｍｏｌ）を加えて還流下、１５時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、溶液を室温まで冷却し、沈殿物をメタノールで洗浄し、吸引ろ過した。この沈殿物を減圧乾燥した結果、目的とする化合物８を５．９ｇ得た（収率７５％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ4.26(2H, dd), 4.95(1H, t), 7.80(2H, dd), 7.92(2H, dd).
【０１３６】
３−２．  α−クロロ−β−アラニン塩酸塩９の合成
化合物８  ３００ｍｇに濃塩酸１０ｍＬを加えて還流下、１５時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、溶液を室温まで冷却し、沈殿物を吸引ろ過した。得られた溶液を減圧乾燥して析出した固体をアセトンで洗浄し、再度吸引ろ過した。この固体を減圧乾燥した結果、目的とするα−クロロ−β−アラニン塩酸塩９を１９２ｍｇ得た（収率９７％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ3.49(1H, dd), 3.60(1H, dd), 4.68(1H, t).
【０１３７】
３−３．  α−クロロ−β−アラニン塩酸塩９のＢｏｃ化反応
α−クロロ−β−アラニン塩酸塩９  １６８ｍｇ（１．０ｅｑ，１．０５ｍｍｏｌ）をｔｅｒｔ−ブタノール  ６ｍＬ及び１Ｍ  ＮａＯＨ  ３ｍＬに溶解し、氷冷下Ｂｏｃ２Ｏ  ３００ｍｇ（１．３ｅｑ，１．３７ｍｍｏｌ）を加えた。その後、室温にて終夜攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮し、酢酸エチル及び１Ｍ  ＨＣｌを用いて分液抽出を３回行い、集めた有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物１０を２３５ｍｇ得た（収率ｑｕａｎｔ．）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.49(9H, s), 3.64(1H, br), 4.41-5.10(2H, br).
【０１３８】
３−４．  化合物１０とベタメタゾンの縮合反応
化合物１０  ２３０ｍｇ（１．０ｅｑ，１．０３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ  １０ｍＬ、ＤＣＭ１０ｍＬに溶解し、ベタメタゾン  ４０４ｍｇ（１．０ｅｑ，１．０３ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ  ６３ｍｇ（０．５ｅｑ，０．５１ｍｍｏｌ）を加えた。その後、氷冷下、ＷＳＣ  ２９７ｍｇ（１．５ｅｑ，１．５５ｍｍｏｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、トルエン及び水を用いて分液抽出を３回行い、集めた有機層を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで６０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物１１を６２５ｍｇ得た（収率ｑｕａｎｔ．）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.04-1.15(7H, m), 1.46(9H, s), 1.65(4H, m), 1.95-2.23(6H, m), 2.36-2.65(5H, m) 3.78(1H, m), 4.30-4.49(3H, m), 4.95(1H, m), 6.11(1H, s), 6.35(1H，d), 7.17(1H, d).
【０１３９】
３−５．  化合物１１の脱Ｂｏｃ化反応
化合物１１  ２００ｍｇをＤＣＭ  ９ｍＬに溶解し、氷冷下、４Ｍ  ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ  ６ｍＬを加えて２時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮し、ジエチルエーテルを用いて濃縮物を洗浄した結果、目的とする導入前駆体１２を１４６ｍｇ得た（収率８１％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ1.04-1.70(13H, m), 2.01-2.17(5H, m), 2.36(1H, m), 2.45(2H, m), 2.89(1H, m),4.28(1H, m), 5.15(2H, m), 6.11(1H, s), 6.30(1H，d), 7.41(1H, d).
【０１４０】
３−６．  導入前駆体１２のコンドロイチン硫酸への導入（可溶化処理３時間）
コンドロイチン硫酸（重量平均分子量約４０ｋＤａ）  ２００ｍｇをＷＦＩ  ２０ｍＬ及びＥｔＯＨ  ２０ｍＬに溶解し、導入前駆体１２を１２０ｍｇ（０．５６ｅｑ，０．２２ｍｍｏｌ）加えた。その後、ＤＭＴ−ＭＭを７５ｍｇ（０．５６ｅｑ，０．２２ｍｍｏｌ）加えて終夜攪拌した。その後、反応溶液を２等分し、以下（１）、（２）の操作を実施した。
（１）  可溶化処理あり３時間：ＮａＨＣＯ３  ７５ｍｇを加えて３時間攪拌し、酢酸４０μＬ、ＮａＣｌ  ３００ｍｇを順次加えた。３０分攪拌後、９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩを４０ｍＬ加えて沈殿形成し、上清を捨てて９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄を２回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物１３が９０ｍｇ得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、１４％であった。
（２）  可溶化処理なし：  ＮａＣｌ  ３００ｍｇを加えて３０分攪拌し、９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩを４０ｍＬ加えて沈殿形成し、上清を捨てて９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄を２回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物１３が９７ｍｇ得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、３２％であった。
【０１４１】
＜実施例４＞：ベタメタゾン（Ｂｒ）-コンドロイチン硫酸の調製
ベタメタゾン（Ｂｒ）−コンドロイチン硫酸（スペーサー形成分子にα−ブロモ−β−アラニンを用いたベタメタゾン−コンドロイチン硫酸  コンジュゲート）の調製をスキーム４に示す。
ＤＬ−イソセリン１４のアミノ基をＢｏｃで保護、化合物１５とした後にカルボキシル基をメチルエステル化して化合物１６に変換した。これに対し二級水酸基をトシル化（化合物１７）し、続いてリチウムブロミドと反応させてα位にブロモ基を導入した化合物１８へと導いた。さらにメチルエステルの加水分解を行なって化合物１９を合成し、ベタメタゾンとの縮合（化合物２０）、Ｂｏｃ基の脱保護（導入前駆体２１）、コンドロイチン硫酸への導入を行い、コンジュゲート２２を合成した。
【０１４２】
スキーム４
【化３】
2019059951.tif 000006
【０１４３】
４−１．  化合物１５の合成
ＤＬ−イソセリン１４  １ｇ（１．０ｅｑ，９．５２ｍｍｏｌ）をｔｅｒｔ−ブタノール  ４０ｍＬ及び１Ｍ  ＮａＯＨ  ２０ｍＬに溶解し、氷冷下Ｂｏｃ２Ｏ  ２．７ｇ（１．３ｅｑ，１２．３７ｍｍｏｌ）を加えた。その後、室温にて終夜攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮し、酢酸エチル及び１ＭＨＣｌを用いて分液抽出を３回行い、集めた有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物１５を１．９５ｇ得た（収率１００％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45(9H, s), 3.51-3.65(2H, m), 4.32(1H, m), 5.10(1H, br).
【０１４４】
４−２．  化合物１６の合成
化合物１５  ８００ｍｇ（１．０ｅｑ，３．９０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ  ５ｍＬに溶解し、氷冷下、炭酸カリウム  ５９３ｍｇ（１．１ｅｑ，４．２９ｍｍｏｌ）及びヨウ化メチル（１．１ｅｑ，４．２９ｍｍｏｌ）を加えた。その後、遮光下室温にて終夜攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、トルエン及び水を用いて分液抽出を３回行い、集めた有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物１６を７２４ｍｇ得た（収率８２％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.48(9H, s), 3.26(1H, br), 3.50(2H, d), 3.80(3H, s), 4.28(1H, dd), 4.88(1H, br).
【０１４５】
４−３．  化合物１７の合成
化合物１６  ６６０ｍｇ（１．０ｅｑ，３．０１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ２３ｍＬに溶解し、トリエチルアミン  １．４７ｍＬ（３．５ｅｑ，１０．５４ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ  １８４ｍｇ（０．５ｅｑ，１．５１ｍｍｏｌ）を加えた。その後、氷冷下、トシルクロライド  １．７２ｇ（３．０ｅｑ，９．０３ｍｍｏｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、ＤＣＭ及び水を用いて分液抽出を３回行い、集めた有機層を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した。この反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）化合物１７を１．０８ｇ得た（収率９６％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45(9H, s), 2.45(3H, s), 3.52-3.66(2H, m), 3.77(3H, s), 4.80(1H, dd), 4.98(1H, br), 7.35(2H, d), 7.82(2H, d).
【０１４６】
４−４．  化合物１８の合成
化合物１７  ６９０ｍｇ（１．０ｅｑ，１．８４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ  ７ｍＬに溶解し、リチウムブロマイド（５．０ｅｑ，９．２２ｍｍｏｌ）を加えて５０℃にて終夜攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、酢酸エチル及び水を用いて分液抽出を３回行い、集めた有機層を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した。この反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、（ヘキサン：酢酸エチル＝７：１）化合物１８を３００ｍｇ得た（収率５８％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.48(9H, s), 3.65(2H, dd), 3.80(3H, s), 4.38(1H, dd), 5.01(1H, br).
【０１４７】
４−５．  化合物１９の合成
化合物１８  ４００ｍｇ（１．０ｅｑ，１．４２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ  １４ｍＬ、水  ７ｍＬに溶解し、氷冷下、水酸化リチウム一水和物（１．３ｅｑ，１．８５ｍｍｏｌ）を加えて室温にて２時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、１Ｍ  ＨＣｌ、ジエチルエーテル、水を用いて分液抽出を３回行い、集めた有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した結果、化合物１９を３８０ｍｇ得た（収率９９％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.48(9H, s), 3.67(2H, m), 4.18(1H, br), 4.42(1H, dd), 5.09(1H, br).
【０１４８】
４−６．  化合物１９とベタメタゾンの縮合反応
化合物１９  ４２２ｍｇ（１．０ｅｑ，１．５８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ  １８ｍＬ、ＤＣＭ１８ｍＬに溶解し、ベタメタゾン  ５８９ｍｇ（０．９５ｅｑ，１．５０ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ  ９６ｍｇ（０．５ｅｑ，０．７９ｍｍｏｌ）を加えた。その後、氷冷下、ＷＳＣ  ６０６ｍｇ（２．０ｅｑ，３．１６ｍｍｏｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、トルエン及び水を用いて分液抽出を３回行い、集めた有機層を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで６０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物２０を９６１ｍｇ得た（収率９５％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ1.11-1.84（22H, m）, 2.04-2.10(5H, m), 2.30-2.50(3H, m), 2.60(1H,m), 3.53(1H, m), 4.39(2H, m), 4.50(1H, m), 5.01(1H, m), 6.11(1H, s), 6.33(1H，d), 7.18(1H, d).
【０１４９】
４−７．  化合物２０の脱Ｂｏｃ化反応
化合物２０  ８１９ｍｇをＤＣＭ  ２０ｍＬ、ＡｃＯＥｔ  ５２ｍＬに溶解し、氷冷下、４Ｍ  ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ  ４８ｍＬを加えて２時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮し、ジエチルエーテルを用いて濃縮物を洗浄した結果、目的とする導入前駆体２１を５８９ｍｇ得た（収率８０％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ1.11-1.48（11H, m）, 1.67(2H, m), 2.04-2.17(5H, m)2.20-2.61(3H, m), 2.89(1H, m)3.55(2H, m), 4.25(1H, m), 4.45(1H, d), 6.10(1H, s), 6.30(1H，d), 7.43(1H, d).
【０１５０】
４−８．  導入前駆体２１のコンドロイチン硫酸への導入
コンドロイチン硫酸（重量平均分子量約４０ｋＤａ）  １００ｍｇをＷＦＩ  ８ｍＬ及びＥｔＯＨ  ８ｍＬに溶解し、導入前駆体２１を２４ｍｇ（０．２１ｅｑ，０．０４ｍｍｏｌ）加えた。その後、ＤＭＴ−ＭＭを２０ｍｇ（０．２１ｅｑ，０．０４ｍｍｏｌ）加えて終夜攪拌した。その後、ＮａＣｌ  ３００ｍｇを加えて３０分攪拌し、９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩを２０ｍＬ加えて沈殿形成し、上清を捨てて９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄を２回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物２２が１０５ｍｇ得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、１５％であった。
【０１５１】
＜実施例５＞  ＣＳ（Ｃｌ）−フェンブフェンの合成
ＣＳ（Ｃｌ）−フェンブフェンの合成をスキーム５に示す。
３−アミノ−１，２−プロパンジオール（２３）を原料とし、２３のアミノ基をＢｏｃで保護することで化合物２４とした後に１級水酸基をベンジル化し、化合物２５を得た。続いて化合物２５の２級水酸基に対しトシル化を施し化合物２６へと導いて、さらにトシル基をクロロ基に変換した。このクロロ体である化合物２７に水酸化パラジウムを用いた水素添加を行なうことで脱ベンジル体である化合物２８とし、これとフェンブフェンを縮合した。フェンブフェン縮合体である化合物２９はＢｏｃ基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体３０へと変換し、ＣＳへの導入を行ってコンジュゲート３１とした。
【０１５２】
スキーム５
【化４】
2019059951.tif 000007
【０１５３】
【化５】
2019059951.tif 000008
【０１５４】
５−１．  ３−アミノ−１，２−プロパンジオールのＢｏｃ化反応
３−アミノ−１，２−プロパンジオール２３  ３ｇ（１．０ｅｑ，３２．９３ｍｍｏｌ）をｔｅｒｔ−ＢｕＯＨ  ２０ｍＬ及び１Ｍ  ＮａＯＨ  ２０ｍＬに溶解し、氷冷下Ｂｏｃ２Ｏ  ７．１９ｇ（１．０ｅｑ，３２．９３ｍｍｏｌ）のｔｅｒｔ−ＢｕＯＨ溶液  ２０ｍＬを加えた。その後、室温にて５時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、エバポレーターで５０℃水浴中、減圧濃縮し、１Ｍ  ＨＣｌを用いて反応溶液を中和した。その中和液に酢酸エチル及び水を加えて分液抽出を３回行い、集めた有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物２を６．３ｇ得た（収率ｑｕａｎｔ．）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45（9H, s), 2.68-2.71(1H, br), 2.75-2.81(1H, br), 3.20(2H, dd), 3.63(2H, dd), 3.71(1H, m)4.91(1H, br).
【０１５５】
５−２．  化合物２４のベンジル化反応
化合物２４  １．９１ｇ（１．０ｅｑ，  ９．９６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ  ２０ｍＬに溶解し、水素化ナトリウム  ２５１ｍｇ（１．０５ｅｑ，１０．４６ｍｍｏｌ）を加えて室温で１５分撹拌した。その後、氷冷下ベンジルブロミド１．２４ｍＬ（１．０５ｅｑ，１０．４６ｍｍｏｌ）を加え、室温にて終夜撹拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、氷冷下飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で反応溶液をクエンチし、酢酸エチル及び水を用いて分液抽出を３回行った。集めた有機層は飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、エバポレーターで４０℃水浴中減圧濃縮した。この反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）目的とする化合物２５を２．３ｇ得た（収率８１％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.44（9H, s), 3.18(1H, m),  3.29(1H, m), 3.32(1H, br), 3.45(1H, dd),  3.54(1H, dd),  3.63(1H, m), 4.57(2H, s, ),  4.91(1H, br), 7.26-7.31(5H, m).
【０１５６】
５−３．  化合物２５のトシル化反応
化合物２５  １．１４ｇ（１．０ｅｑ，４．０６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  ４０ｍＬに溶解した後にトリエチルアミン１．４ｍＬ（２．５ｅｑ，１０．１４ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ  ２４８ｍｇ（０．５ｅｑ，２．０３ｍｍｏｌ）、トシルクロリド１．５５ｇ（２．０ｅｑ，８．１１ｍｍｏｌ）を氷冷下加え、室温にて終夜撹拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、氷冷下飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で反応溶液をクエンチし、ＤＣＭ及び水を用いて分液抽出を３回行った。集めた有機層は飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、エバポレーターで４０℃水浴中減圧濃縮した。この反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）目的とする化合物２６を１．４ｇ得た（収率８０％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.55（9H, s), 2.44(3H, s), 3.35(1H, m), 3.51(1H, m), 3.53(2H, d), 4.10(1H, m), 4.39(2H, dd), 7.20-7.79(9H, m).
【０１５７】
５−４．  化合物２６のクロル化反応
化合物２６  ４２５ｍｇ（１．０ｅｑ，  ０．９８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ  ４ｍＬに溶解し、リチウムクロリド２０７ｍｇ（５．０ｅｑ，４．８９ｍｍｏｌ）を加え、室温にて終夜撹拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、氷冷下飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で反応溶液をクエンチし、トルエン及び水を用いて分液抽出を３回行った。集めた有機層は飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、エバポレーターで６０℃水浴中減圧濃縮した。この反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、（ヘキサン：酢酸エチル＝９：１）目的とする化合物２７を１５８ｍｇ得た（収率５４％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.44（9H, s), 3.37-3.64(4H, m), 4.14(1H, m), 4.59(2H, dd), 7.29-7.38(5H, m).
【０１５８】
５−５．  化合物２７の脱ベンジル化反応
化合物２７  １００ｍｇ（１．０ｅｑ，０．３３ｍｍｏｌ）をＡｃＯＥｔ  ２ｍＬ及びＥｔＯＨ１ｍＬに溶解して２０％水酸化パラジウム７０ｍｇ（０．３ｅｑ，０．１０ｍｍｏｌ）を加え、水素を３回添加した後、室温にて終夜撹拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、反応溶液をセライトろ過し、エバポレーターで５０℃水浴中減圧濃縮した結果、目的とする化合物２８を６９ｍｇ得た（収率９８％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45（9H, s), 3.34(1H, m), 3.58(1H, m), 3.74(1H, m), 3.87(1H, m), 4.01(1H, m), 5.01(1H, br).
【０１５９】
５−６．  化合物２８とフェンブフェンの縮合反応
化合物２８  ６５ｍｇ（１．０ｅｑ，０．３１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  ４ｍＬ及びＤＭＦ  １ｍＬに溶解し、フェンブフェン  ８３ｍｇ（１．０５ｅｑ，０．３３ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ  １９ｍｇ（０．５ｅｑ，０．１６ｍｍｏｌ）を加えた。その後、氷冷下、ＷＳＣ  １１９ｍｇ（２．０ｅｑ，０．６２ｍｍｏｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、氷冷下飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で反応溶液をクエンチし、トルエン及び水を用いて分液抽出を３回行った。集めた有機層は飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで６０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物２９を１３９ｍｇ得た（収率１００％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45（9H, s), 2.84(2H, m), 3.40-3.42(3H, m), 3.53(1H, m), 4.20(1H, m), 4.35(2H, m), 5.01(1H, br), 7.16-8.07(9H,m).
【０１６０】
５−７．  化合物２９の脱Ｂｏｃ化反応
化合物２９  １３８ｍｇをＤＣＭ  ５ｍＬに溶解し、氷冷下、４ＭＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ  ２ｍＬを加えて２．５時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、エバポレーターで４０℃水浴中減圧濃縮し、残留物をジエチルエーテルで洗浄した結果、目的とする導入前駆体３０を１１５ｍｇ得た。（収率９７％）
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ2.82(2H, dt), 3.52(2H, m), 3.68(2H, m), 3.82(1H, m), 4.40(2H, m), 7.43-8.13(9H, m).
【０１６１】
５−８−１．導入前駆体３０のＣＳへの導入（０．２２当量仕込み）
ＣＳ（重量平均分子量約４０ｋＤａ）  ２００ｍｇをＷＦＩ  １６ｍＬ及びＥｔＯＨ  １６ｍＬに溶解し、導入前駆体３０を３３ｍｇ（０．２２ｅｑ，０．０８７ｍｍｏｌ）及びＤＭＴ−ＭＭを４１ｍｇ（０．２２ｅｑ，０．０８７ｍｍｏｌ）加えて終夜攪拌した。その後ＮａＣｌを６００ｍｇ、９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩを８０ｍＬ加えて沈殿形成し、上清を捨てて９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄を２回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物３１が１９８ｍｇ得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、１５％であった。
【０１６２】
５−８−２．導入前駆体３０のＣＳへの導入（０．２８当量仕込み）
ＣＳ（重量平均分子量約４０ｋＤａ）  ２００ｍｇをＷＦＩ  １６ｍＬ及びＥｔＯＨ  １６ｍＬに溶解し、導入前駆体８を４３ｍｇ（０．２８ｅｑ，０．１１ｍｍｏｌ）及びＤＭＴ−ＭＭを５２ｍｇ（０．２８ｅｑ，０．１１ｍｍｏｌ）加えて終夜攪拌した。その後ＮａＣｌを６００ｍｇ、９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩを８０ｍＬ加えて沈殿形成し、上清を捨てて９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄を２回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物３１が１９８ｍｇ得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、１９％であった。
【０１６３】
＜実施例６＞  ＣＳ（Ｆ）−フェンブフェンの合成
ＣＳ（Ｆ）−フェンブフェンの合成をスキーム６に示す。
化合物２５の水酸基をフッ素へ変換し化合物３２とした後にベンジル基の脱保護を実施して化合物３３を得た。これにフェンブフェンを縮合させて化合物３４へと変換し、続いて脱Ｂｏｃ化を施して導入前駆体３５とした。最後に導入前駆体３５をＣＳへ導入し、コンジュゲート３６を得た。
【０１６４】
スキーム６
【化６】
2019059951.tif 000009
【０１６５】
６−１．  化合物２５のフッ化反応
化合物２５  １．５ｇ（１．０ｅｑ，５．３４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  １８ｍＬに溶解した後にトリエチルアミン７．３ｍＬ（１０．０ｅｑ，５３．４ｍｍｏｌ）、Ｄｅｏｘｏ−Ｆｌｕｏｒｏ  ２．９５ｍＬ（３．０ｅｑ，１６．０１ｍｍｏｌ）を氷冷下加え、室温にて終夜撹拌した。ＴＬＣにて新たなスポットを確認後、氷冷下飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で反応溶液をクエンチし、ＤＣＭ及び水を用いて分液抽出を３回行った。集めた有機層は飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、エバポレーターで４０℃水浴中減圧濃縮した。この反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１）目的とする化合物３２を４０８ｍｇ得た。（収率２７％）
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.44（9H, s), 3.42(2H, m), 3.65(2H, m), 4.56(2H, dd), 4.70(1H, m), 4.83(1H, br), 7.20-7.36(5H, m).
【０１６６】
６−２．  化合物３２の脱ベンジル化反応
化合物３２  ２５ｍｇ（１．０ｅｑ，０．０９ｍｍｏｌ）をＡｃＯＥｔ  ２ｍＬ及びＥｔＯＨ  １ｍＬに溶解して２０％水酸化パラジウム１９ｍｇ（０．３ｅｑ，０．０３ｍｍｏｌ）を加え、水素を３回添加した後、室温にて終夜撹拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、反応溶液をセライトろ過し、エバポレーターで５０℃水浴中減圧濃縮した結果、目的とする化合物３３を１７ｍｇ得た（収率９７％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45（9H, s), 3.39-3.55(4H, m), 3.73(1H, m).
【０１６７】
６−３．  化合物３３とフェンブフェンの縮合反応
化合物３３  １５ｍｇ（１．０ｅｑ，０．０８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  ３ｍＬ及びＤＭＦ  １ｍＬに溶解し、フェンブフェン  ２１ｍｇ（１．０５ｅｑ，０．０８ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ  ４．７ｍｇ（０．５ｅｑ，０．０４ｍｍｏｌ）を加えた。その後、氷冷下、ＷＳＣ  ３０ｍｇ（２．０ｅｑ，０．１６ｍｍｏｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、氷冷下飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で反応溶液をクエンチし、トルエン及び水を用いて分液抽出を３回行った。集めた有機層は飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで６０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物３４を３２ｍｇ得た（収率９５％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45（9H, s), 2.80(2H, dt), 3.37-3.53(6H, m), 4.33(1H, m), 7.41-8.07(9H,m).
【０１６８】
６−４．  化合物３４の脱Ｂｏｃ化反応
化合物３４  １４２ｍｇをＤＣＭ  ５ｍＬに溶解し、氷冷下、４Ｍ  ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ  ２ｍＬを加えて２時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、エバポレーターで４０℃水浴中減圧濃縮し、残留物をジエチルエーテルで洗浄した結果、目的とする導入前駆体３５を１１５ｍｇ得た（収率９５％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ2.82(2H, m), 3.26(2H, t), 3.45(2H, m), 3.67(2H, m), 4.40(1H, m), 7.43-8.13(9H,m).
【０１６９】
６−５−１．  導入前駆体３５のＣＳへの導入（０．２４当量仕込み）
ＣＳ（重量平均分子量約４０ｋＤａ）  ２００ｍｇをＷＦＩ  １６ｍＬ及びＥｔＯＨ  １６ｍＬに溶解し、導入前駆体３５を３５ｍｇ（０．２４ｅｑ，０．０９５ｍｍｏｌ）及びＤＭＴ−ＭＭを４５ｍｇ（０．２４ｅｑ，０．０９５ｍｍｏｌ）加えて終夜攪拌した。その後ＮａＣｌを６００ｍｇ、９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩを９０ｍＬ加えて沈殿形成し、上清を捨てて９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄を２回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物３６が１９５ｍｇ得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、９％であった。
【０１７０】
６−５−２．  導入前駆体３５のＣＳへの導入（０．２６当量仕込み）
ＣＳ（重量平均分子量約４０ｋＤａ）  ２００ｍｇをＷＦＩ  １６ｍＬ及びＥｔＯＨ  １６ｍＬに溶解し、導入前駆体８を４３ｍｇ（０．２６ｅｑ，０．１０３ｍｍｏｌ）及びＤＭＴ−ＭＭを４９ｍｇ（０．２６ｅｑ，０．１０３ｍｍｏｌ）加えて終夜攪拌した。その後ＮａＣｌを６００ｍｇ、９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩを９０ｍＬ加えて沈殿形成し、上清を捨てて９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄を２回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物３６が１９６ｍｇ得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、１２％であった。
【０１７１】
＜実施例７＞  ＣＳ（Ｆ，Ｆ）−フェルビナク（以下、ＦＢ−（Ｆ，Ｆ）−ＣＳともいう）の合成
ＣＳ（Ｆ，Ｆ）−フェルビナクの合成をスキーム７に示す。
化合物３７を出発原料とし、一方のエチルエステルを加水分解して化合物３８を得た。化合物３８のエチルエステルにベンジルアミンを反応させてアミド体である化合物３９とし、続いてアミド、カルボン酸を同時に還元して化合物４０を合成した。さらに化合物４０のベンジル基を脱保護後、Ｂｏｃ基へのアミノ保護基変換を実施し、化合物４２とフェルビナクとの縮合反応に付した。さらに、フェルビナク縮合体である化合物４３のＢｏｃ基を脱保護し導入前駆体４４へと導き、最後にＣＳへ導入して、コンジュゲート４５を得た。
【０１７２】
スキーム７
【化７】
2019059951.tif 000010
【０１７３】
７−１−１．  化合物３７から化合物３９への変換
化合物３７  ５ｇ（１．０ｅｑ，２５．４９ｍｍｏｌ）をメタノール  ４０ｍＬに溶解し、そこに水酸化カリウム１．４３ｇ（１．０ｅｑ，２５．４９ｍｍｏｌ）のメタノール溶液  ３０ｍＬを滴下した。室温下３時間半撹拌し、ＴＬＣにて原料の消失を確認後、ベンジルアミン８．４ｍＬ（３．０ｅｑ，７６．４７ｍｍｏｌ）を加えて５５℃で終夜撹拌した。その後、反応溶液をエバポレーターで減圧濃縮し、析出した固体にジエチルエーテルを加えて洗浄ろ過した。洗浄した固体は１Ｍ  ＨＣｌに溶解させ、酢酸エチルを用いて分液抽出を３回実施した。集めた有機層は飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮し、残渣物（化合物３９）を得た。これはこのまま次の還元反応に付した。
【０１７４】
７−１−２．  化合物３９の還元反応
化合物３９  ４．９ｇ（１．０ｅｑ，２１．３５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ  ３５ｍＬに溶解し、ジメチルスルフィドボラン  ８．２ｍＬ（４．０ｅｑ，８５．４１ｍｍｏｌ）にＴＨＦ１５ｍＬを加えた溶液を０℃で滴下した。０℃下、１時間攪拌した後に室温にて３時間半攪拌し、さらにその後５５℃にて終夜攪拌した。ＴＬＣにて新たなスポットを確認後、１Ｍ  ＨＣｌを用いてクエンチし、酢酸エチル及び水を用いて分液抽出を３回行った。集めた有機層は１Ｍ  ＮａＯＨ水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した。この反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）目的とする化合物４０を２．５ｇ得た（化合物３７から３工程収率４８％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ3.12(2H, dd), 3.87-3.93(4H, m), 7.26-7.37(5H,m).
【０１７５】
７−２−１．  化合物４０の脱ベンジル化
化合物４０  １．０４ｇ（１．０ｅｑ，５．１７ｍｍｏｌ）をメタノール  ９ｍＬに溶解し、１０％パラジウム炭素５５０ｍｇ及びギ酸アンモニウム１．６３ｇ（５．０ｅｑ，２５．８６ｍｍｏｌ）を加えて６５℃で５時間撹拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、セライトろ過し、１Ｍ  ＨＣｌをろ液に滴下してｐＨ約３に調整した。その後、エバポレーターでメタノールを除去し、酢酸エチルを用いて２回洗浄した。得られた水層に１Ｍ  ＮａＯＨを加えてｐＨ約１０に調整し、化合物４１の水溶液を得た。これはこのまま次のＢｏｃ化反応に付した。
【０１７６】
７−２−２．  化合物４１のＢｏｃ化
化合物４１の水溶液５０ｍＬにＴＨＦ５０ｍＬを加え、０℃下、Ｂｏｃ２Ｏを１．１３ｇ（１．０ｅｑ，５．１７ｍｍｏｌ）反応させた。終夜攪拌後、ＴＬＣで原料の消失を確認し、エバポレーターを用いてＴＨＦを除去した。残渣液に酢酸エチルを加えて分液抽出を３回行い、集めた有機層は飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮したところ固体が得られ、これをヘキサンで洗浄した結果、目的とする化合物４２を１．０８ｇ得た（化合物１８から２工程収率９９％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.46（9H, s), 3.54(2H, ddd), 3.67(2H, ddd), 3.95(1H, m), 4.98(1H, br).
【０１７７】
７−３．  化合物４２とフェルビナクの縮合反応
化合物４２  ３００ｍｇ（１．０ｅｑ，１．４２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  １０ｍＬ及びＤＭＦ  １ｍＬに溶解し、フェルビナク  ３１７ｍｇ（１．０５ｅｑ，１．４９ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ  ５２ｍｇ（０．３ｅｑ，０．４２６ｍｍｏｌ）を加えた。その後、氷冷下、ＷＳＣ  ５４５ｍｇ（２．０ｅｑ，２．８４ｍｍｏｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、氷冷下飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で反応溶液をクエンチし、トルエン及び水を用いて分液抽出を３回行った。集めた有機層は飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで６０℃水浴中、減圧濃縮した結果、残渣物（化合物４３）を５７０ｍｇ得た（収率９９％）。これはこのまま次の脱Ｂｏｃ化に用いた。
【０１７８】
７−４．  化合物４３の脱Ｂｏｃ化反応
化合物４３  ５７０ｍｇをＤＣＭ  １５ｍＬに溶解し、氷冷下、４Ｍ  ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ  ６ｍＬを加えて３時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、エバポレーターで４０℃水浴中減圧濃縮し、残留物をジエチルエーテルで洗浄した結果、目的とする導入前駆体４４を４７１ｍｇ得た（収率９８％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ3.45(2H, m), 3.83(2H, s), 4.52(2H, dd), 4.62(2H, br), 7.36-7.64(9H,m).
【０１７９】
７−５−１．  導入前駆体４４のＣＳへの導入（０．２８当量仕込み）
ＣＳ（重量平均分子量約４０ｋＤａ）  ２００ｍｇをＷＦＩ  １６ｍＬ及びＥｔＯＨ  １６ｍＬに溶解し、導入前駆体４４を３４ｍｇ（０．２８ｅｑ，０．１１１ｍｍｏｌ）及びＤＭＴ−ＭＭを５２ｍｇ（０．２８ｅｑ，０．１１１ｍｍｏｌ）加えて終夜攪拌した。その後ＮａＣｌを６００ｍｇ、９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩを９０ｍＬ加えて沈殿形成し、上清を捨てて９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄を２回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物４５が２０２ｍｇ得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、１３％であった。
【０１８０】
７−５−２．  導入前駆体４４のＣＳへの導入（０．２４当量仕込み）
ＣＳ（重量平均分子量約４０ｋＤａ）  ２００ｍｇをＷＦＩ  １６ｍＬ及びＥｔＯＨ  １６ｍＬに溶解し、導入前駆体４４を２９ｍｇ（０．２４ｅｑ，０．０９５ｍｍｏｌ）及びＤＭＴ−ＭＭを４５ｍｇ（０．２４ｅｑ，０．０９５ｍｍｏｌ）加えて終夜攪拌した。その後ＮａＣｌを６００ｍｇ、９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩを９０ｍＬ加えて沈殿形成し、上清を捨てて９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄を２回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物４５が２００ｍｇ得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、１２％であった。
【０１８１】
＜実施例８＞  ＣＳ（Ｆ，Ｆ）−インドメタシン（以下、ＩＭ−（Ｆ，Ｆ）−ＣＳともいう）の合成
ＣＳ（Ｆ，Ｆ）−インドメタシンの合成をスキーム８に示す。
化合物１とインドメタシンを縮合し、化合物２とした後にＢｏｃ基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体３へと変換し、ＣＳへの導入を行ってコンジュゲート４とした。
【０１８２】
スキーム８
【化８】
2019059951.tif 000011
【０１８３】
８−１．  化合物１とインドメタシンの縮合反応
化合物１  １００ｍｇ（１．０ｅｑ，０．４７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  １０ｍＬに溶解し、インドメタシン１７８ｍｇ（１．０５ｅｑ，０．５０ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ  １７ｍｇ（０．３ｅｑ，０．１４ｍｍｏｌ）を加えた。その後、氷冷下、ＷＳＣ  １８２ｍｇ（２．０ｅｑ，０．９５ｍｍｏｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、氷冷下飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で反応溶液をクエンチし、ＤＣＭ及び水を用いて分液抽出を３回行った。集めた有機層は飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物２を２６０ｍｇ得た（収率ｑｕａｎｔ．）。
【０１８４】
８−２．  化合物２の脱Ｂｏｃ化反応
化合物２  ２６０ｍｇをＤＣＭ  ７ｍＬに溶解し、氷冷下、４Ｍ  ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ  ３ｍＬを加えて２．５時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、エバポレーターで４０℃水浴中減圧濃縮し、残留物をジエチルエーテルで洗浄した結果、目的とする導入前駆体３を２２３ｍｇ得た（収率９７％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ2.36(3H, s), 3.51(2H, m), 3.84(3H, s), 3.90(2H, s), 4.55(2H, m), 6.72-7.71(7H, m).
【０１８５】
８−３．  導入前駆体３のＣＳへの導入（０．３当量仕込み）
ＣＳ（重量平均分子量約２０ｋＤａ）  ６３９ｍｇをＷＦＩ  １３ｍＬ及びＥｔＯＨ  １３ｍＬに溶解し、導入前駆体３を１８６ｍｇ（０．３ｅｑ，０．４１ｍｍｏｌ）及びＤＭＴ−ＭＭを１７９ｍｇ（０．３ｅｑ，０．４１ｍｍｏｌ）加えて終夜攪拌した。続いてＮａＣｌ  ６２０ｍｇを加え、この溶液を９５％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ  ６０ｍＬに滴下することで沈殿形成し、上清を捨てて９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄及び９５％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄を２回ずつ実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物４が７３６ｍｇ得られた。１Ｈ−ＮＭＲにて導入率を求めた結果、２８％であった。
【０１８６】
＜実施例９＞  ＣＳ（Ｆ，Ｆ）−ケトプロフェン（以下、ＫＰ−（Ｆ，Ｆ）−ＣＳともいう）の合成
ＣＳ（Ｆ，Ｆ）−ケトプロフェンの合成をスキーム９に示す。
化合物１とケトプロフェンを縮合し、化合物５とした後にＢｏｃ基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体６へと変換し、ＣＳへの導入を行ってコンジュゲート７とした。
【０１８７】
スキーム９
【化９】
2019059951.tif 000012
【０１８８】
９−１．  化合物１とケトプロフェンの縮合反応
化合物１  １００ｍｇ（１．０ｅｑ，０．４７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  ３ｍＬに溶解し、ケトプロフェン１２７ｍｇ（１．０５ｅｑ，０．５０ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ  １７ｍｇ（０．３ｅｑ，０．１４ｍｍｏｌ）を加えた。その後、氷冷下、ＷＳＣ  １８２ｍｇ（２．０ｅｑ，０．９５ｍｍｏｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、氷冷下飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で反応溶液をクエンチし、ＤＣＭ及び水を用いて分液抽出を３回行った。集めた有機層は飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物５を２１０ｍｇ得た（収率９９％）。
【０１８９】
９−２．  化合物５の脱Ｂｏｃ化反応
化合物５  ２１０ｍｇをＤＣＭ  ７ｍＬに溶解し、氷冷下、４Ｍ  ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ  ３ｍＬを加えて３．５時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、エバポレーターで４０℃水浴中減圧濃縮し、残留物をジエチルエーテルで洗浄した結果、目的とする導入前駆体６を１７７ｍｇ得た（収率９８％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ1.58(3H, d), 3.51(2H, m), 4.03(1H, q), 4.53(2H, m), 7.53-7.87(9H, m).
【０１９０】
９−３．  導入前駆体６のＣＳへの導入（０．３当量仕込み）
ＣＳ（重量平均分子量約２０ｋＤａ）  ７１６ｍｇをＷＦＩ  １４ｍＬ及びＥｔＯＨ  １４ｍＬに溶解し、導入前駆体６を１６４ｍｇ（０．３ｅｑ，０．４７ｍｍｏｌ）及びＤＭＴ−ＭＭを２００ｍｇ（０．３ｅｑ，０．４７ｍｍｏｌ）加えて終夜攪拌した。続いてＮａＣｌ  ８７０ｍｇを加え、この溶液を９５％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ  ５５ｍＬに滴下することで沈殿形成し、上清を捨てて９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄及び９５％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄を２回ずつ実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物７が７８４ｍｇ得られた。１Ｈ−ＮＭＲにて導入率を求めた結果、３２％であった。
【０１９１】
＜実施例１０＞  ＣＳ（Ｆ，Ｆ）−フルルビプロフェンの合成
ＣＳ（Ｆ，Ｆ）−フルルビプロフェンの合成をスキーム１０に示す。
化合物１とフルルビプロフェンを縮合し、化合物８とした後にＢｏｃ基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体９へと変換し、ＣＳへの導入を行ってコンジジュゲート１０とした。
【０１９２】
スキーム１０
【化１０】
2019059951.tif 000013
【０１９３】
１０−１．  化合物１とフルルビプロフェンの縮合反応
化合物１  １００ｍｇ（１．０ｅｑ，０．４７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  １０ｍＬに溶解し、フルルビプロフェン１２２ｍｇ（１．０５ｅｑ，０．５０ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ  １７ｍｇ（０．３ｅｑ，０．１４ｍｍｏｌ）を加えた。その後、氷冷下、ＷＳＣ  １８２ｍｇ（２．０ｅｑ，０．９５ｍｍｏｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、氷冷下飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で反応溶液をクエンチし、ＤＣＭ及び水を用いて分液抽出を３回行った。集めた有機層は飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物８を２１１ｍｇ得た（収率ｑｕａｎｔ．）。
【０１９４】
１０−２．  化合物８の脱Ｂｏｃ化反応
化合物８  ２１０ｍｇをＤＣＭ  ７ｍＬに溶解し、氷冷下、４Ｍ  ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ  ３ｍＬを加えて２．５時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、エバポレーターで４０℃水浴中減圧濃縮し、残留物をジエチルエーテルで洗浄した結果、目的とする導入前駆体９を１６７ｍｇ得た（収率９３％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ1.20(3H, d), 3.51(2H, m), 3.99(1H, q), 4.53(1H, dt), 7.19-7.56(8H, m).
【０１９５】
１０−３．  導入前駆体９のＣＳへの導入（０．３当量仕込み）
ＣＳ（重量平均分子量約２０ｋＤａ）  ５９６ｍｇをＷＦＩ  １２ｍＬ及びＥｔＯＨ  １２ｍＬに溶解し、導入前駆体９を１３３ｍｇ（０．３ｅｑ，０．３９ｍｍｏｌ）及びＤＭＴ−ＭＭを１６７ｍｇ（０．３ｅｑ，０．３９ｍｍｏｌ）加えて終夜攪拌した。続いてＮａＣｌ  ７５０ｍｇを加え、この溶液を９５％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ  ５０ｍＬに滴下することで沈殿形成し、上清を捨てて９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄及び９５％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄を２回ずつ実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物１０が６４９ｍｇ得られた。１Ｈ−ＮＭＲにて導入率を求めた結果、３３％であった。
【０１９６】
＜実施例１１＞  ＣＳ（Ｈ）−ケトプロフェン（以下、ＫＰ−ＣＳともいう）の合成
ＣＳ（Ｈ）−ケトプロフェンの合成をスキーム１１に示す。
アミノプロパノール１１をスペーサーとし、アミノ基をＢｏｃ保護した後、ケトプロフェンとの縮合反応に付して化合物１３とした。続いてＢｏｃ基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体１４へと変換し、ＣＳへの導入を行ってコンジュゲート１５とした。
【０１９７】
スキーム１１
【化１１】
2019059951.tif 000014
【０１９８】
１１−１．  化合物１１のＢｏｃ化
化合物１１  ５ｇ（１．０ｅｑ，  ６６．６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  １２０ｍＬに溶解し、氷冷下、Ｂｏｃ２Ｏ  １４．５ｇ（１．０ｅｑ，６６．６ｍｍｏｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、反応溶液をエバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物１２を１１．７ｇ得た（収率ｑｕａｎｔ．）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45(9H, s), 1.65(2H, m), 2.94(1H, br), 3.30(2H, m), 3.66(2H, m), 4.76(1H, br).
【０１９９】
１１−２．  化合物１２とケトプロフェンの縮合反応
化合物１２  １．０７ｇ（１．０ｅｑ，  ６．０９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  １２ｍＬに溶解し、ケトプロフェン１．５５ｇ（１．０ｅｑ，  ６．０９ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ  ７４ｍｇ（０．１ｅｑ，  ０．６１ｍｍｏｌ）を加えた。その後、氷冷下、ＷＳＣ  ２．３４ｇ（２．０ｅｑ，  １２．２ｍｍｏｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、酢酸エチル及び水を用いて分液抽出を３回行った。集めた有機層は５％クエン酸水溶液、５％ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物１３を２．１８ｇ得た（収率８７％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45(9H, s), 1.54(3H, d), 1.77(2H, m), 3.11(2H, m), 3.80(1H, q), 4.14(2H, m), 4.69(1H, br), 7.42-7.83(9H, m).
【０２００】
１１−３．  化合物１３の脱Ｂｏｃ化反応
化合物１３  ２．１８ｇをＤＣＭ  ７０ｍＬに溶解し、氷冷下、４Ｍ  ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ  ３０ｍＬを加えて２時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、エバポレーターで４０℃水浴中減圧濃縮し、残留物をジエチルエーテルで洗浄した結果、目的とする導入前駆体１４を１．８１ｇ得た（収率９８％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ1.53(3H, d), 1.95(2H, m), 2.91(2H, t), 3.91(1H, q), 4.19(2H, t), 7.51-7.78(9H, m).
【０２０１】
１１−４．  導入前駆体１４のＣＳへの導入（０．３当量仕込み）
ＣＳ（重量平均分子量約２０ｋＤａ）  ２．５ｇをＷＦＩ  ５０ｍＬ及びＥｔＯＨ  ５０ｍＬに溶解し、導入前駆体１４を５１８ｍｇ（０．３ｅｑ，１．６６ｍｍｏｌ）及びＤＭＴ−ＭＭを６９９ｍｇ（０．３ｅｑ，１．６６ｍｍｏｌ）加えて終夜攪拌した。続いてＮａＣｌ  ２．５ｇを加え、白濁する直前まで９５％ＥｔＯＨを加えた。この溶液を９５％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ  １５０ｍＬに滴下することで沈殿形成し、上清を捨てて９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄及び９５％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄を２回ずつ実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物７が２．６ｇ得られた。１Ｈ−ＮＭＲにて導入率を求めた結果、２６％であった。
【０２０２】
＜実施例１２＞  ＣＳ（Ｆ）−ケトプロフェン（以下、ＫＰ−（Ｆ）−ＣＳともいう）の合成
ＣＳ（Ｆ）−ケトプロフェンの合成をスキーム１２に示す。
化合物１６とケトプロフェンを縮合し、化合物１７とした後にＢｏｃ基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体１８へと変換し、ＣＳへの導入を行ってコンジュゲート１９とした。
【０２０３】
スキーム１２
【化１２】
2019059951.tif 000015
【０２０４】
１２−１．  化合物１６とケトプロフェンの縮合反応
化合物１６  １００ｍｇ（１．０ｅｑ，０．５２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  ５ｍＬに溶解し、ケトプロフェン１３８ｍｇ（１．０５ｅｑ，０．５４ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ  ３１ｍｇ（０．５ｅｑ，０．２６ｍｍｏｌ）を加えた。その後、氷冷下、ＷＳＣ  １９９ｍｇ（２．０ｅｑ，１．０４ｍｍｏｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、氷冷下飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で反応溶液をクエンチし、ＤＣＭ及び水を用いて分液抽出を３回行った。集めた有機層は飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物１７を２１８ｍｇ得た（収率９８％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.43(9H, s), 1.54(3H, d), 3.25-3.41(2H, m), 3.85(1H, q), 4.18-4.33(2H, m), 4.78(1H, br), 7.42-7.81(9H, m).
【０２０５】
１２−２．  化合物１７の脱Ｂｏｃ化反応
化合物１７  ２３７ｍｇをＤＣＭ  ７ｍＬに溶解し、氷冷下、４Ｍ  ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ  ３ｍＬを加えて２時間攪拌したその後室温にてさらに１時間攪拌し、ＴＬＣにて原料の消失を確認後、エバポレーターで４０℃水浴中減圧濃縮した。残留物をジエチルエーテルで洗浄した結果、目的とする導入前駆体１８を１６９ｍｇ得た（収率９１％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ1.50(3H, d), 3.10-3.28(2H, m), 3.96(1H, q), 4.26-4.47(2H, m), 4.92(1H, m), 7.40-7.80(9H, m).
【０２０６】
１２−３．  導入前駆体１８のＣＳへの導入（０．３当量仕込み）
ＣＳ（重量平均分子量約２０ｋＤａ）  ７６０ｍｇをＷＦＩ  １５ｍＬ及びＥｔＯＨ  １５ｍＬに溶解し、導入前駆体１８を１６６ｍｇ（０．３ｅｑ，  ０．４５ｍｍｏｌ）及びＤＭＴ−ＭＭを２１３ｍｇ（０．３ｅｑ，  ０．４５ｍｍｏｌ）加えて終夜攪拌した。続いてＮａＣｌ  ７６０ｍｇを加え、この溶液を９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ  ９０ｍＬに滴下することで沈殿形成し、上清を捨てて９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄及びＥｔＯＨ洗浄を２回ずつ実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物１９が７５０ｍｇ得られた。１Ｈ−ＮＭＲにて導入率を求めた結果、３０％であった。
【０２０７】
＜実施例１３＞  ＣＳ（Ｆ，Ｆ）−メフェナム酸の合成
ＣＳ（Ｆ，Ｆ）−メフェナム酸の合成をスキーム１３に示す。
化合物１とメフェナム酸を縮合し、化合物２０とした後にＢｏｃ基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体２１へと変換し、ＣＳへの導入を行ってコンジュゲート２２とした。
【０２０８】
スキーム１３
【化１３】
2019059951.tif 000016
【０２０９】
１３−１．  化合物１とメフェナム酸の縮合反応
化合物１  ３０２ｍｇ（１．０ｅｑ，１．４３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  １５ｍＬに溶解し、メフェナム酸３４６ｍｇ（１．０ｅｑ，１．４３ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ  １７ｍｇ（０．１ｅｑ，０．１４ｍｍｏｌ）を加えた。その後、氷冷下、ＷＳＣ  ５５０ｍｇ（２．０ｅｑ，２．８７ｍｍｏｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、酢酸エチル及び水を用いて分液抽出を３回行った。集めた有機層は５％クエン酸水溶液、５％ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した（トルエン：酢酸エチル＝１５：１）結果、目的とする化合物２０を２５２ｍｇ得た（収率４１％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45(9H, s), 2.16(3H, s), 2.33(3H, s), 3.70(2H, m), 4.55(2H, t), 4.91(1H, br), 6.66(2H,m), 7.03-7.28(3H,m), 7.97(1H,d), 9.02(1H,s).
【０２１０】
１３−２．  化合物２０の脱Ｂｏｃ化反応
化合物２０  ２３５ｍｇをＤＣＭ  １ｍＬに溶解し、氷冷下、４Ｍ  ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ  ３ｍＬを加えて２．５時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、エバポレーターで４０℃水浴中減圧濃縮し、残留物をジエチルエーテルで洗浄した結果、目的とする導入前駆体２１を１９２ｍｇ得た（収率９６％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ2.14(3H, s), 2.31(3H, s), 3.57(2H, t), 4.63(2H, t), 6.66(2H,m), 7.08(3H,m), 7.91(1H,d), 8.99(1H,s).
【０２１１】
１３−３．  導入前駆体２１のＣＳへの導入（０．３当量仕込み）
ＣＳ（重量平均分子量約２０ｋＤａ）  ８６３ｍｇをＷＦＩ  １７ｍＬ及びＥｔＯＨ  １７ｍＬに溶解し、導入前駆体２１を１９１ｍｇ（０．３ｅｑ，０．５２ｍｍｏｌ）及びＤＭＴ−ＭＭを２４４ｍｇ（０．３ｅｑ，０．５２ｍｍｏｌ）加えて終夜攪拌した。続いてＮａＣｌ  ２．６ｇを加えたところ、ゴム状沈殿が形成されたので、これにＥｔＯＨ  ７０ｍＬを加えて沈殿を出し切り、得られた沈殿にＷＦＩ  ５０ｍＬ、ＥｔＯＨ  １０ｍＬを加えて再溶解した。その後、ＥｔＯＨ  ４０ｍＬ、ＮａＣｌ  １００ｍｇ、ＥｔＯＨ  １３０ｍＬを順次加えた。この溶液を９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ  ８５ｍＬに半量滴下し、その後ＥｔＯＨ  １００ｍＬ、残り半量の反応液を滴下して沈殿形成し、上清を捨てて９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄及びＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄を２回ずつ実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物７が８２５ｍｇ得られた。１Ｈ−ＮＭＲにて導入率を求めた結果、３０％であった。
【０２１２】
＜実施例１４＞  ＣＳ（Ｆ，Ｆ）−ロキソプロフェンの合成
ＣＳ（Ｆ，Ｆ）−ロキソプロフェンの合成をスキーム１４に示す。
ロキソプロフェン２３を以下の手順で活性体であるｔｒａｎｓ−ＯＨ型化合物２６に変換し、ＣＳ（Ｆ，Ｆ）−フルルビプロフェン等と同様の手順でＣＳコンジュゲート３２を合成した。
【０２１３】
スキーム１４
【化１４】
2019059951.tif 000017
【０２１４】
【化１５】
2019059951.tif 000018
【０２１５】
【化１６】
2019059951.tif 000019
【０２１６】
１４−１．  化合物２３から化合物２５への変換
化合物２３  ５ｇ（１．０ｅｑ，  １６．４ｍｍｏｌ）にトルエン及び１Ｍ  ＨＣｌを加えて分液抽出を３回行った。集めた有機層は飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後にエバポレーターで６０℃水浴中、減圧濃縮した。得られた化合物２４はそのままメチルエステル化反応に付した。化合物２４含有の濃縮液をＭｅＯＨ  １００ｍＬに溶解し、ＤＭＡＰ  ４０２ｍｇ（０．２ｅｑ，３．２９ｍｍｏｌ）を加え、その後、氷冷下ＷＳＣ  ６．２９ｇ（２．０ｅｑ，３２．９ｍｍｏｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、酢酸エチル及び水を用いて分液抽出を３回行った。集めた有機層は５％クエン酸水溶液、５％ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物２５を４．２７ｇ得た（収率ｑｕａｎｔ．）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.48(3H, d), 1.50-1.98(4H, m), 2.07-2.37(4H, m), 2.53(1H, m), 3.66(3H, s), 3.69(1H, q), 7.11-7.26(4H,m).
【０２１７】
１４−２．  化合物２５の還元反応
化合物２５  ２ｇ（１．０ｅｑ，７．７１ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ  ６０ｍＬに溶解し、氷冷下、水素化ホウ素ナトリウム  ４１７ｍｇ（３．４ｅｑ，２６．５ｍｍｏｌ）を加え、２時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、酢酸エチル及び水を用いて分液抽出を３回行った。集めた有機層は５％クエン酸水溶液、５％ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物２６を１．０９ｇ得た（収率５４％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δ1.14(1H, m), 1.43(3H, d), 1.45-1.90(6H, m), 2.28(1H, dd), 2.76(1H, dd), 3.58(3H, s), 3.65(1H, m), 3.74(1H, q), 7.11-7.20(4H, m).
【０２１８】
１４−３．  化合物２６のシリル化反応
化合物２６  １．０９ｇ（１．０ｅｑ，４．１７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  １０ｍＬ、ＤＭＦ  ３ｍＬに溶解し、氷冷下、トリイソプロピルシリルクロリド  １．７８ｇ（２．２ｅｑ，１２．８ｍｍｏｌ）及びイミダゾール  １．０９ｇ（３．８ｅｑ，１６．０ｍｍｏｌ）を加え、終夜攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、氷冷下水でクエンチし、酢酸エチル及び水を用いて分液抽出を３回行った。集めた有機層は５％クエン酸水溶液、５％ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した（ヘキサン：酢酸エチル＝２０：１）結果、目的とする化合物２８を１．６５ｇ得た（収率９５％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.00(21H, m)1.20(1H, m), 1.47(3H, d), 1.51-2.10(6H, m), 2.29(1H, dd), 2.78(1H, dd), 3.65(3H, s), 3.68(1H, m), 3.95(1H, q), 7.11-7.20(4H, m).
【０２１９】
１４−４．  化合物２８の加水分解反応
化合物２７  １．６５ｇ（１．０ｅｑ，３．９４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ  ４５ｍＬ、Ｈ２Ｏ  １５ｍＬ、ＥｔＯＨ  ５０ｍＬに溶解し、氷冷下、水酸化リチウム一水和物  ４４２ｍｇ（２．６ｅｑ，１０．５ｍｍｏｌ）を加え、終夜攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、氷冷下水でクエンチし、ジエチルエーテル及び１Ｍ  ＨＣｌを用いて分液抽出を３回行った。集めた有機層は飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した（クロロホルム：アセトン＝３：１）結果、目的とする化合物２９を１．４７ｇ得た（収率９２％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.00(21H, m), 1.21(1H, m), 1.49(3H, d), 1.51-2.10(6H, m), 2.29(1H, dd), 2.78(1H, dd), 3.70(1H, m), 3.95(1H, q), 7.11-7.20(4H, m).
【０２２０】
１４−５．  化合物１と化合物２９の縮合反応
化合物１  ３０６ｍｇ（１．０ｅｑ，１．４５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  ６ｍＬに溶解し、化合物２８  ５８７ｍｇ（１．０ｅｑ，１．４５ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ  ２０ｍｇ（０．１ｅｑ，０．１６ｍｍｏｌ）を加えた。その後、氷冷下、ＷＳＣ  ５７６ｍｇ（２．０ｅｑ，２．９０ｍｍｏｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、酢酸エチル及び水を用いて分液抽出を３回行った。集めた有機層は５％クエン酸水溶液、５％ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１）結果、目的とする化合物３０を７８１ｍｇ得た（収率９０％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.00(21H, m), 1.21(1H, m), 1.45(9H, s), 1.51(3H, d), 1.51-2.10(6H, m), 2.29(1H, dd), 2.82(1H, dd),  3.49(2H, m), 3.72(1H, m), 3.95(1H, q),  4.28(2H, m), 4.70(1H, br), 7.11-7.23(4H, m).
【０２２１】
１４−６．  化合物３０の脱Ｂｏｃ化反応
化合物３０  ７８１ｍｇ（１．０ｅｑ，１．３１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  ２ｍＬに溶解し、氷冷下、４Ｍ  ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ  １０ｍＬを加えて５時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、エバポレーターで４０℃水浴中減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した（クロロホルム：メタノール＝１：１）結果、目的とする導入前駆体３１を１５７ｍｇ得た（収率３２％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.21(1H, m), 1.51(3H, d), 1.51-2.12(6H, m), 2.51(1H, m), 2.65(1H, m), 3.07(2H, m), 3.75(1H, m),  3.86(1H, m), 4.20-4.57(2H, m), 7.11-7.23(4H, m).
【０２２２】
１４−７．  導入前駆体３１のＣＳへの導入（０．３当量仕込み）
ＣＳ（重量平均分子量約２０ｋＤａ）  ７５０ｍｇをＷＦＩ  １４ｍＬ及びＥｔＯＨ  １４ｍＬに溶解し、導入前駆体３１を１５６ｍｇ（０．３ｅｑ，０．４１ｍｍｏｌ）及びＤＭＴ−ＭＭを１９４ｍｇ（０．３ｅｑ，０．４１ｍｍｏｌ）加えて終夜攪拌した。続いてＮａＣｌ  ７０ｍｇ、ＥｔＯＨ  １３ｍＬを加え、この溶液の半量を２４ｍＬの９０％ＥｔＯＨに滴下した。続いてＥｔＯＨ  ３０ｍＬと反応液残り半量を加えて沈殿形成し、上清を捨てて９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄及びＥｔＯＨ洗浄を２回ずつ実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物３２が６０９ｍｇ得られた。１Ｈ−ＮＭＲにて導入率を求めた結果、約３１％であった。
【０２２３】
＜実施例１５＞  ジクロフェナク（１-アミノ-２-プロパノール）−コンドロイチン硫酸（以下、ＤＦ−（Ｍｅ）−ＣＳともいう）の調製
ジクロフェナク−（１−アミノ−２−プロパノール）−コンドロイチン硫酸（スペーサーに１−アミノ−２−プロパノールを用いたジクロフェナク−コンドロイチン硫酸コンジュゲート）の調製をスキーム１５に示す。１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ−２−プロパノール（１）を原料とし、水酸基をＢｒ化して化合物２とした後にジクロフェナクナトリウムと縮合して化合物３を得た。続いてＢｏｃ基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体４へと変換し、コンドロイチン硫酸への導入を行ってコンジュゲート５を合成した。
【０２２４】
スキーム１５
【化１７】
2019059951.tif 000020
【０２２５】
１５−１．  １−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ−２−プロパノール（１）のＢｒ化反応
１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ−２−プロパノール（１）  １０００ｍｇ（１．０ｅｑ，  ５．７１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  １０ｍＬに溶解し、氷冷下、四臭化炭素（ＣＢｒ４）  ２８５２ｍｇ（１．５ｅｑ，８．６０ｍｍｏｌ）とトリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３）  ２２５６ｍｇ（１．５ｅｑ，８．６０ｍｍｏｌ）を加えて３０分攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、氷水を加えて２０分攪拌し、酢酸エチルで分液抽出した。有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後にエバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１）、化合物２を８７６ｍｇ得た（収率６４％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) 1.45(9H, s), 1.68(3H, d), 3.27-3.33(1H, m), 3.56(1H, br), 4.21(1H, br), 4.96(1H, br).
【０２２６】
１５−２．  化合物２とジクロフェナクナトリウムとの縮合反応
化合物２  ８７６ｍｇ（１．０ｅｑ，３．６８ｍｍｏｌ）とジクロフェナクナトリウム１１７０ｍｇ（１．０ｅｑ，３．６８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ  １０ｍＬに溶解し、６０℃下、３昼夜攪拌した。酢酸エチル及び５％重曹水を用いて分液抽出し、有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ヘキサン：酢酸エチル＝６：１）、化合物３を８８９ｍｇ得た（収率５３％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) 1.25(3H, d), 1.40(9H, s), 3.18-3.23(1H, m), 3.35(1H, br), 3.79(1H, d), 3.83(1H, d), 4.62(1H, br), 5.02(1H, br), 6.56(1H, d), 6.82(1H, s), 6.94-7.00(2H, m), 7.12(1H, t), 7.22(1H, d), 7.34(2H, d).
【０２２７】
１５−３．  化合物３の脱Ｂｏｃ化反応
化合物３  ６３６ｍｇをＤＣＭ  １．５ｍＬに溶解し、氷冷下、４Ｍ  ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ  ３ｍＬを加えて３時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、ジエチルエーテルとヘキサンを加えて沈殿とし、減圧下溶媒留去した結果、目的とする導入前駆体４を５３９ｍｇ得た（収率９９％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) 1.22(3H, d), 2.90(1H, dd), 3.29(1H, dd), 3.88(1H, d), 4.01(1H, d), 5.22(1H, m), 6.50(1H, d), 6.71(1H, s), 6.89-6.97(2H, m), 7.08(1H, t), 7.33(2H, d).
【０２２８】
１５−４．  導入前駆体４のコンドロイチン硫酸への導入
コンドロイチン硫酸（重量平均分子量約２０ｋＤａ）  １５００ｍｇをＷＦＩ  ２４ｍＬ及びＥｔＯＨ  ２４ｍＬに溶解し、導入前駆体  ４  ２７９ｍｇ（０．２４ｅｑ，０．７２ｍｍｏｌ）の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  ６ｍＬ、ＤＭＴ−ＭＭ  ３３８ｍｇ（０．２４ｅｑ，０．７２ｍｍｏｌ）  の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  ６ｍＬを加えて終夜攪拌した。その後、ＮａＣｌ  １５０ｍｇのＷＦＩ溶液  ０．６ｍＬを加え、９０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ  ９０ｍＬ及びＥｔＯＨ  １１０ｍＬを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を９０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ、ＥｔＯＨにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物５が１４６０ｍｇ得られた。１Ｈ−ＮＭＲにて導入率を求めた結果、２２％であった。
【０２２９】
＜実施例１６＞  ジクロフェナク（セリンエチルエステル）−コンドロイチン硫酸（以下、ＤＦ−（Ｓｅｒ）−ＣＳともいう）の調製
ジクロフェナク（セリンエチルエステル）−コンドロイチン硫酸（スペーサーにセリンエチルエステルを用いたジクロフェナク−コンドロイチン硫酸コンジュゲート）の調製をスキーム１６に示す。Ｂｏｃ−Ｌ−セリン（１）を原料とし、カルボキシル基をエチルエステルとして化合物２とした後にジクロフェナクナトリウムと縮合して化合物３を得た。続いてＢｏｃ基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体４へと変換し、コンドロイチン硫酸への導入を行ってコンジュゲート５を合成した。
【０２３０】
スキーム１６
【化１８】
2019059951.tif 000021
【０２３１】
１６−１．  Ｂｏｃ−Ｌ−セリン（１）のエチルエステル化
Ｂｏｃ−Ｌ−セリン  ５０１ｍｇ（１．０ｅｑ，２．４４ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ  ２５ｍＬに溶解し、ＷＳＣ  ９４１ｍｇ（２．０ｅｑ，４．９１ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ  ３４ｍｇ（０．１ｅｑ，０．２８ｍｍｏｌ）を加えて室温下３昼夜攪拌した。反応液を濃縮し、酢酸エチルに溶解後に５％クエン酸水溶液、５％重曹水で分液抽出した。有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後にエバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物２を３９４ｍｇ得た（収率６９％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.31(3H, t), 1.46(9H, s), 3.92-3.97(2H, m), 4.12(2H, q), 4.37(1H, br), 5.42(1H, br).
【０２３２】
１６−２．  化合物２とジクロフェナクとの縮合反応
化合物２  １３０ｍｇ（１．０ｅｑ，０．５６ｍｍｏｌ）とジクロフェナク  ３３２ｍｇ（２．０ｅｑ，１．１２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  ５ｍＬとＤＭＦ  ０．５ｍＬに溶解し、ＤＭＡＰ  １５ｍｇ（０．２ｅｑ，０．１２ｍｍｏｌ）とＷＳＣ  ３２６ｍｇ（３．０ｅｑ，１．７０ｍｍｏｌ）を加えて室温下終夜攪拌した。さらにジクロフェナク  １６５ｍｇ（１．０ｅｑ，０．５６ｍｍｏｌ）とＷＳＣ  １６３ｍｇ（１．５ｅｑ，０．８５ｍｍｏｌ）を加えて室温下終夜攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、５％クエン酸水溶液、５％重曹水を用いて分液抽出し、有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）、化合物３を含む画分３４１ｍｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.21(3H, t), 1.46(9H, s), 3.81(1H, d), 3.83(1H, d), 4.11-4.18(2H, m), 4.40(1H, dd), 4.52(1H, dd), 4.58(1H, bt), 5.29(1H, br), 6.55(1H, d), 6.78(1H, s), 6.94-7.00(2H, m), 7.12(1H, t), 7.20(1H, d), 7.35(2H, d).
【０２３３】
１６−３．  化合物３の脱Ｂｏｃ化反応
化合物３を含む画分３４１ｍｇをＤＣＭ  １ｍＬに溶解し、氷冷下、４Ｍ  ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ  ３ｍＬを加えて２時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、ジエチルエーテルとヘキサンを加えて沈殿とし、減圧下溶媒留去した結果、目的とする導入前駆体４を１５８ｍｇ得た（化合物２から導入前駆体４の２工程、収率６０％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.25(3H, t), 3.86(1H, d), 3.92(1H, d), 4.17-4.29(3H, m), 4.60-4.68(2H, m), 6.53(1H, d), 6.96(1H, t), 7.01(1H, t), 7.23(1H, d), 7.36(2H, d).
【０２３４】
１６−４．  導入前駆体４のコンドロイチン硫酸への導入
コンドロイチン硫酸（重量平均分子量約２０ｋＤａ）  ４４６ｍｇをＷＦＩ  ８ｍＬ及びＥｔＯＨ  ８ｍＬに溶解し、導入前駆体４  ９５ｍｇ（０．２４ｅｑ，０．２１ｍｍｏｌ）の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  ２ｍＬ、ＤＭＴ−ＭＭ  １０１ｍｇ（０．２４ｅｑ，０．２１ｍｍｏｌ）  の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  ２ｍＬを加えて終夜攪拌した。その後、ＮａＣｌ  ５０ｍｇのＷＦＩ溶液  ０．２ｍＬを加え、９０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ  ３０ｍＬ及びＥｔＯＨ  ３７ｍＬを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を９０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ、ＥｔＯＨにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物５が３５８ｍｇ得られた。１Ｈ−ＮＭＲにて導入率を求めた結果、２４％であった。
【０２３５】
＜実施例１７＞  ジクロフェナク（トレオニンエチルエステル）−コンドロイチン硫酸（以下、ＤＦ−（Ｔｈｒ）−ＣＳともいう）の調製
ジクロフェナク（トレオニンエチルエステル）−コンドロイチン硫酸（スペーサーにトレオニンエチルエステルを用いたジクロフェナク−コンドロイチン硫酸コンジュゲート）の調製をスキーム１７に示す。Ｂｏｃ−Ｌ−トレオニン（１）を原料とし、カルボキシル基をエチルエステルとして化合物２とした後にジクロフェナクナトリウムと縮合して化合物３を得た。続いてＢｏｃ基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体４へと変換し、コンドロイチン硫酸への導入を行ってコンジュゲート５を合成した。
【０２３６】
スキーム１７
【化１９】
2019059951.tif 000022
【０２３７】
１７−１．  Ｂｏｃ−Ｌ−トレオニン  １のエチルエステル化
Ｂｏｃ−Ｌ−トレオニン  ３０００ｍｇ（１．０ｅｑ，１３．７ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ  １５０ｍＬに溶解し、ＷＳＣ  ５２７４ｍｇ（２．０ｅｑ，２７．５ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ  １６６ｍｇ（０．１ｅｑ，１．３６ｍｍｏｌ）を加えて室温下終夜攪拌した。反応液を濃縮し、酢酸エチルに溶解後に５％クエン酸水溶液、５％重曹水で分液抽出した。有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後にエバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物２を２１４９ｍｇ得た（収率６４％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.26(3H, d), 1.30(3H, t), 1.46(9H, s), 1.93(1H, d), 4.22-4.26(3H, m), 4.37(1H, br)5.28(1H, br).
【０２３８】
１７−２．  化合物２とジクロフェナクとの縮合反応
化合物２  ２３３ｍｇ（１．０ｅｑ，０．９４ｍｍｏｌ）とジクロフェナク  ８３９ｍｇ（３．０ｅｑ，２．８３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  ９ｍＬとＤＭＦ  １．５ｍＬに溶解し、ＤＭＡＰ  ３６ｍｇ（０．３ｅｑ，０．２９ｍｍｏｌ）とＷＳＣ  ８２０ｍｇ（４．５ｅｑ，４．２８ｍｍｏｌ）を加えて室温下終夜攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、５％クエン酸水溶液、５％重曹水を用いて分液抽出し、有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）、化合物３  ２４２ｍｇを得た（収率４９％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.12(3H, t), 1.34(3H, d), 1.49(9H, s), 3.73(1H, d), 3.79(1H, d), 3.97-4.04(2H, m), 4.43(1H, dd), 5.22(1H, br), 6.55(1H, d), 6.80(1H, s), 6.94-6.98(2H, m), 7.11(1H, t), 7.18(1H, d), 7.34(2H, d).
【０２３９】
１７−３．  化合物３の脱Ｂｏｃ化反応
化合物３  ２４２ｍｇをＤＣＭ  ０．５ｍＬに溶解し、氷冷下、４Ｍ  ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ  ２ｍＬを加えて徐々に室温としながら１．５時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、ジエチルエーテルとヘキサンを加えて沈殿とし、減圧下溶媒留去した結果、目的とする導入前駆体４を２０６ｍｇ得た（収率９７％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.11(3H, t), 1.65(3H, d), 3.92(1H, d), 3.96(1H, d), 3.98-4.16(2H, m), 4.17(1H, s), 5.55-5.60(1H, m), 6.48(1H, d), 6.85-6.88(2H, m), 6.96(1H, t), 7.06(1H, d), 7.31-7.32(3H, m).
【０２４０】
１７−４．  導入前駆体４のコンドロイチン硫酸への導入
コンドロイチン硫酸（重量平均分子量約２０ｋＤａ）  ５００ｍｇをＷＦＩ  ８ｍＬ及びＥｔＯＨ  ８ｍＬに溶解し、導入前駆体  ４  １１１ｍｇ（０．２４ｅｑ，０．２４ｍｍｏｌ）の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  ２ｍＬ、ＤＭＴ−ＭＭ  １１３ｍｇ（０．２４ｅｑ，０．２４ｍｍｏｌ）  の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  ２ｍＬを加えて終夜攪拌した。その後、ＮａＣｌ  ５０ｍｇのＷＦＩ溶液  ０．２ｍＬを加え、９０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ  ３０ｍＬ及びＥｔＯＨ  ３７ｍＬを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を９０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ、ＥｔＯＨにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物５が３６８ｍｇ得られた。１Ｈ−ＮＭＲにて導入率を求めた結果、２４％であった。
【０２４１】
＜実施例１８＞  ジクロフェナク（１−アミノ−３，３−ジメチルブタン−２−オール）−コンドロイチン硫酸の調製
ジクロフェナク（１−アミノ−３，３−ジメチルブタン−２−オール）−コンドロイチン硫酸（スペーサーに１−アミノ−３，３−ジメチルブタン−２−オールを用いたジクロフェナク−コンドロイチン硫酸コンジュゲート）の調製をスキーム１８に示す。１−アミノ−３，３−ジメチルブタン−２−オールをＢｏｃ化して化合物２とした後にジクロフェナクと縮合して化合物３を得た。続いてＢｏｃ基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体４へと変換し、コンドロイチン硫酸への導入を行ってコンジュゲート５を合成した。
【０２４２】
スキーム１８
【化２０】
2019059951.tif 000023
【０２４３】
１８−１．  １−アミノ−３，３−ジメチルブタン−２−オール  １のＢｏｃ化
１−アミノ−３，３−ジメチルブタン−２−オール  １  ２００２ｍｇ（１．０ｅｑ，１７．１ｍｍｏｌ）をＷＦＩ  １５ｍＬ及び１，４−ジオキサン  １０ｍＬに溶解し、Ｂｏｃ２Ｏ  ３７７１ｍｇ（１．０ｅｑ，１７．１ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液  ３０ｍＬを加えて室温下２３時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物２を３６６３ｍｇ得た（収率９９％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ0.93(9H, s), 1.45(9H, s), 2.98(1H, br), 3.31-3.34(1H, m), 3.38-3.42(1H, m), 4.88(1H, br).
【０２４４】
１８−２．  化合物２とジクロフェナクとの縮合反応
化合物２  ２１０ｍｇ（１．０ｅｑ，０．９７ｍｍｏｌ）とジクロフェナク  ８６３ｍｇ（３．０ｅｑ，２．９１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  ９ｍＬとＤＭＦ  １．５ｍＬに溶解し、ＤＭＡＰ  ３９ｍｇ（０．３ｅｑ，０．３２ｍｍｏｌ）とＷＳＣ  ７４７ｍｇ（４．０ｅｑ，３．９０ｍｍｏｌ）を加えて室温下終夜攪拌した。さらにジクロフェナク  ８６４ｍｇ（３．０ｅｑ，２．９２ｍｍｏｌ）とＷＳＣ  ７６１ｍｇ（４．０ｅｑ，３．９７ｍｍｏｌ）を加えて室温下終夜攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、５％クエン酸水溶液、５％重曹水を用いて分液抽出し、有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）、化合物３  ２０８ｍｇを得た（収率４３％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ0.91(9H, s), 1.35(9H, s), 3.15-3.21(1H, m), 3.46-3.50(1H, m), 3.85(2H, s), 4.54(1H, br), 3.81(1H, d ), 6.55(1H, d), 6.81(1H, s), 6.94-6.99(2H, m), 7.11(1H, t), 7.23(1H, d), 7.34(2H, d).
【０２４５】
１８−３．  化合物３の脱Ｂｏｃ化反応
化合物３  ２０８ｍｇをＤＣＭ  ０．５ｍＬに溶解し、氷冷下、４Ｍ  ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ  ３ｍＬを加えて徐々に室温としながら１時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、ジエチルエーテルとヘキサンを加えて沈殿とし、減圧下溶媒留去した結果、目的とする導入前駆体４を１２５ｍｇ得た（収率６９％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ0.74(9H, s), 2.82(1H, t), 3.05(1H, d), 3.96(1H, d), 4.10(1H, d), 5.07(1H, d), 6.48-6.52(2H, m), 6.91-6.96(2H, m), 7.06-7.09(1H, m), 7.31(2H, d), 7.39(1H, d).
【０２４６】
１８−４．  導入前駆体４のコンドロイチン硫酸への導入
コンドロイチン硫酸（重量平均分子量約２０ｋＤａ）  ２００ｍｇをＷＦＩ  ３．２ｍＬ及びＥｔＯＨ  ３．２ｍＬに溶解し、導入前駆体４  ４１ｍｇ（０．２４ｅｑ，９５．７μｍｏｌ）の５０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  ０．８ｍＬ、ＤＭＴ−ＭＭ  ４５ｍｇ（０．２４ｅｑ，９５．７μｍｏｌ）の５０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  ０．８ｍＬを加えて終夜攪拌した。その後、ＮａＣｌ  ２０ｍｇのＷＦＩ溶液  ８０μＬを加え、９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ  １２ｍＬ及びＥｔＯＨ  １５ｍＬを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ、ＥｔＯＨにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物５が２２８ｍｇ得られた。１Ｈ−ＮＭＲにて導入率を求めた結果、２４％であった。
【０２４７】
＜実施例１９＞  ジクロフェナク（１−アミノ−２−ブタノール）−コンドロイチン硫酸の調製
ジクロフェナク（１−アミノ−２−ブタノール）−コンドロイチン硫酸（スペーサーに１−アミノ−２−ブタノールを用いたジクロフェナク−コンドロイチン硫酸  コンジュゲート）の調製をスキーム１９に示す。１−アミノ−２−ブタノール（１）をＢｏｃ化して化合物２とした後にジクロフェナクと縮合して化合物３を得た。続いてＢｏｃ基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体４へと変換し、コンドロイチン硫酸への導入を行ってコンジュゲート５を合成した。
【０２４８】
スキーム１９
【化２１】
2019059951.tif 000024
【０２４９】
１９−１．  １−アミノ−２−ブタノール  １のＢｏｃ化
１−アミノ−２−ブタノール（１）  ２１４２ｍｇ（１．０ｅｑ，２４．０ｍｍｏｌ）をＷＦＩ  ３０ｍＬ及び１，４−ジオキサン  ２０ｍＬに溶解し、Ｂｏｃ２Ｏ  ５２４４ｍｇ（１．０ｅｑ，２４．０ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液  ３０ｍＬを加えて室温下２０時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物２を４６０６ｍｇ得た（収率ｑｕａｎｔ．）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ0.96(3H, t), 1.42-1.59(11H, m), 2.99-3.04(1H, m), 3.30-3.33(1H, m), 3.70(1H, br), 4.90(H, br).
【０２５０】
１９−２．  化合物２とジクロフェナクとの縮合反応
化合物２  ３３０ｍｇ（１．０ｅｑ，１．７４ｍｍｏｌ）とジクロフェナク１５５４ｍｇ（３．０ｅｑ，５．２５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  ５ｍＬとＤＭＦ  １．５ｍＬに溶解し、ＤＭＡＰ  ６４ｍｇ（０．３ｅｑ，０．５２４ｍｍｏｌ）とＷＳＣ  １３４６ｍｇ（４．０ｅｑ，７．０２ｍｍｏｌ）を加えて室温下終夜攪拌した。さらにジクロフェナク  １５５２ｍｇ（３．０ｅｑ，５．２４ｍｍｏｌ）とＷＳＣ  １３２７ｍｇ（４．０ｅｑ，６．９２ｍｍｏｌ）を加えて室温下終夜攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、５％クエン酸水溶液、５％重曹水を用いて分液抽出し、有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）、化合物３  ６３３ｍｇを得た（収率７８％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ0.88(3H, t), 1.39(9H, s), 1.60-1.63(2H, m), 3.19-3.24(1H, m), 3.38-3.40(1H, m), 3.81(1H, d), 3.85(1H, d), 4.57(H, br), 4.88-4.92(1H, m), 6.56(1H, d), 6.81(1H, s), 6.94-7.00(2H, m), 7.12(1H, t), 7.24(1H, d), 7.35(2H, d).
【０２５１】
１９−３．  化合物３の脱Ｂｏｃ化反応
化合物３  ６３３ｍｇをＤＣＭ  １ｍＬに溶解し、氷冷下、４Ｍ  ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ  ５ｍＬを加えて１４０分攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、ジエチルエーテルとヘキサンを加えて沈殿とし、減圧下溶媒留去した結果、目的とする導入前駆体４を４６９ｍｇ得た（収率８６％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ0.77(3H, t), 1.39(9H, s), 2.91(1H, dd), 3.01(1H, d), 3.92(1H, d), 4.02(1H, d), 5.12(1H, br), 6.50(1H, d), 6.67(1H, s), 6.89-6.97(2H, m), 7.05-7.09(1H, m), 7.30-7.33(3H, m).
【０２５２】
１９−４．  導入前駆体４のコンドロイチン硫酸への導入
コンドロイチン硫酸（重量平均分子量約２０ｋＤａ）  ２００ｍｇをＷＦＩ  ３．２ｍＬ及びＥｔＯＨ  ３．２ｍＬに溶解し、導入前駆体  ４  ３９ｍｇ（０．２４ｅｑ，９５．６μｍｏｌ）の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  ０．８ｍＬ、ＤＭＴ−ＭＭ  ４５ｍｇ（０．２４ｅｑ，９５．５μｍｏｌ）  の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  ０．８ｍＬを加えて終夜攪拌した。その後、ＮａＣｌ  ２０ｍｇのＷＦＩ溶液  ８０μＬを加え、９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ  １２ｍＬ及びＥｔＯＨ  １５ｍＬを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を９０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ、ＥｔＯＨにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物５が２３０ｍｇ得られた。１Ｈ−ＮＭＲにて導入率を求めた結果、２４％であった。
【０２５３】
＜実施例２０＞  ジクロフェナク（２−アミノ−１−シクロヘキシルエタン−１−オール）−コンドロイチン硫酸の調製
ジクロフェナク（２−アミノ−１−シクロヘキシルエタン−１−オール）−コンドロイチン硫酸（スペーサーに２−アミノ−１−シクロヘキシルエタン−１−オールを用いたジクロフェナク−コンドロイチン硫酸コンジュゲート）の調製をスキーム２０に示す。２−アミノ−１−シクロヘキシルエタン−１−オール（１）をＢｏｃ化して化合物２とした後にジクロフェナクと縮合して化合物３を得た。続いてＢｏｃ基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体４へと変換し、コンドロイチン硫酸への導入を行ってコンジュゲート５を合成した。
【０２５４】
スキーム２０
【化２２】
2019059951.tif 000025
【０２５５】
２０−１．  ２−アミノ−１−シクロヘキシルエタン−１−オール１のＢｏｃ化
２−アミノ−１−シクロヘキシルエタン−１−オール（１）  ７０５ｍｇ（１．０ｅｑ，４．９２ｍｍｏｌ）をＷＦＩ  １０ｍＬ及び１，４−ジオキサン  １５ｍＬに溶解し、Ｂｏｃ２Ｏ  １０７４ｍｇ（１．０ｅｑ，４．９２ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液  １５ｍＬを加えて室温下１８時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物２を１１８９ｍｇ得た（収率９９％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.19-1.25(5H, m), 1.36-1.37(1H, m), 1.45(9H, s), 1.66-1.68(2H, m), 1.73-1.78(2H, m), 1.85(1H, d), 3.02-3.08(1H, m), 3.34-3.38(1H, m), 3.41-3.42(1H, m),  4.88(1H, br).
【０２５６】
２０−２．  化合物２とジクロフェナクとの縮合反応
化合物２  ２９１ｍｇ（１．０ｅｑ，１．２０ｍｍｏｌ）とジクロフェナク  １０６３ｍｇ（３．０ｅｑ，３．５９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  ９ｍＬとＤＭＦ  １．５ｍＬに溶解し、ＤＭＡＰ  ４３ｍｇ（０．３ｅｑ，０．３６ｍｍｏｌ）とＷＳＣ  ９２１ｍｇ（４．０ｅｑ，４．８１ｍｍｏｌ）を加えて室温下終夜攪拌した。さらにジクロフェナク  １０６５ｍｇ（３．０ｅｑ，３．５９ｍｍｏｌ）とＷＳＣ  ９２４ｍｇ（４．０ｅｑ，４．８２ｍｍｏｌ）を加えて室温下終夜攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、５％クエン酸水溶液、５％重曹水を用いて分液抽出し、有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）、化合物３  ４０７ｍｇを得た（収率６５％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ0.96-1.17(5H, m), 1.38(9H, s), 1.54-1.69(6H, m), 3.22-3.27(1H, m), 3.40-3.43(1H, m),  3.83(2H, d), 4.52(1H, br), 4.80(1H, t), 6.56(1H, d), 6.78(1H, s), 6.94-7.00(2H, m), 7.12(1H, t), 7.23(1H, d), 7.34(2H, d).
【０２５７】
２０−３．  化合物３の脱Ｂｏｃ化反応
化合物３  ４０７ｍｇをＤＣＭ  １ｍＬに溶解し、氷冷下、４Ｍ  ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ  ４ｍＬを加えて徐々に室温としながら１時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、ジエチルエーテルとヘキサンを加えて沈殿とし、減圧下溶媒留去した結果、目的とする導入前駆体４を１２５ｍｇ得た（収率９３％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ2.93(1H, t), 3.01(1H, d), 3.93(1H, d), 4.03(1H, d), 5.04(1H, Br), 6.49(1H, d), 6.61(1H, s), 6.90-6.97(2H, m), 7.06-7.09(1H, m), 7.31-7.35(3H, m).
【０２５８】
２０−４．  導入前駆体４のコンドロイチン硫酸への導入
コンドロイチン硫酸（重量平均分子量約２０ｋＤａ）  ２００ｍｇをＷＦＩ  ３．２ｍＬ及びＥｔＯＨ  ３．２ｍＬに溶解し、導入前駆体４  ４４ｍｇ（０．２４ｅｑ，９６．１μｍｏｌ）の５０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  ０．８ｍＬ、ＤＭＴ−ＭＭ  ４５ｍｇ（０．２４ｅｑ，９５．９μｍｏｌ）  の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  ０．８ｍＬを加えて終夜攪拌した。その後、ＮａＣｌ  ２０ｍｇのＷＦＩ溶液  ８０μＬを加え、９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ  １２ｍＬ及びＥｔＯＨ  １５ｍＬを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ、ＥｔＯＨにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物５が２３４ｍｇ得られた。１Ｈ−ＮＭＲにて導入率を求めた結果、２４％であった。
【０２５９】
＜実施例２１＞  ジクロフェナク（４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルエステル）−コンドロイチン硫酸の調製
ジクロフェナク（４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルエステル）−コンドロイチン硫酸（スペーサーに４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルエステルを用いたジクロフェナク−コンドロイチン硫酸コンジュゲート）の調製をスキーム２１に示す。Ｂｏｃ−４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸（１）をエチルエステル化して化合物２とした後にジクロフェナクと縮合して化合物３を得た。続いてＢｏｃ基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体４へと変換し、コンドロイチン硫酸への導入を行ってコンジュゲート５を合成した。
【０２６０】
スキーム２１
【化２３】
2019059951.tif 000026
【０２６１】
２１−１．  Ｂｏｃ−４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸（１）のエチルエステル化
Ｂｏｃ−４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸（１）  ５０３ｍｇ（１．０ｅｑ，２．２９ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ  １００ｍＬに溶解し、ＷＳＣ  ８８０ｍｇ（２．０ｅｑ，４．５９ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ  ２８ｍｇ（０．１ｅｑ，０．２３ｍｍｏｌ）を加えて室温下１７時間攪拌した。反応液を濃縮し、酢酸エチルに溶解後に５％クエン酸水溶液、５％重曹水で分液抽出した。有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後にエバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）、目的とする化合物２を３９７ｍｇ得た（収率７０％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.28(3H, t), 1.45(9H, s), 2.44-2.53(2H, m), 3.09-3.15(1H, m), 3.34(1H, br), 4.10(1H, br), 4.18(2H, dd), 4.95(1H, br).
【０２６２】
２１−２．  化合物２とジクロフェナクとの縮合反応
化合物２  ３９７ｍｇ（１．０ｅｑ，１．６０ｍｍｏｌ）とジクロフェナク  １４２５ｍｇ（３．０ｅｑ，４．８１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  ６ｍＬとＤＭＦ  ２．５ｍＬに溶解し、ＤＭＡＰ  ６０ｍｇ（０．３ｅｑ，０．４９ｍｍｏｌ）とＷＳＣ  １２２７ｍｇ（４．０ｅｑ，６．４０ｍｍｏｌ）を加えて室温下終夜攪拌した。さらにジクロフェナク  １４２５ｍｇ（３．０ｅｑ，４．８１ｍｍｏｌ）とＷＳＣ  １２２７ｍｇ（４．０ｅｑ，６．４０ｍｍｏｌ）を加えて３昼夜攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、５％クエン酸水溶液、５％重曹水を用いて分液抽出し、有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（トルエン：アセトン＝１５：１）、化合物３  ５０３ｍｇを得た（収率６０％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.17(3H, t), 1.40(9H, s), 2.62-2.65(2H, m), 3.35-3.41(2H, m), 3.79(1H, d), 3.83(1H, d), 4.02-4.07(2H, m), 4.64(1H, br), 5.31-5.34(1H, m), 6.54(1H, d), 6.75(1H, s), 6.93-7.00(2H, m), 7.12(1H, t), 7.21(1H, dd), 7.34(2H, d).
【０２６３】
２１−３．  化合物３の脱Ｂｏｃ化反応
化合物３  ４９１ｍｇをＤＣＭ  ３ｍＬに溶解し、氷冷下、４Ｍ  ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ  ５ｍＬを加えて徐々に室温としながら１４０分攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、ジエチルエーテルとヘキサンを加えて沈殿とし、減圧下溶媒留去した結果、目的とする導入前駆体４を３９３ｍｇ得た（収率９１％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.11(3H, t), 2.57(2H, dt), 3.06(1H, dd), 3.14(1H, d), 3.88(1H, d), 3.93-4.00(2H, m), 4.02(1H, d), 4.51(1H, br), 6.47(1H, d), 6.58(1H, s), 6.90(1H, t), 6.96(1H, t), 7.06(1H, t), 7.30-7.32(3H, m).
【０２６４】
２１−４．  導入前駆体４のコンドロイチン硫酸への導入
コンドロイチン硫酸（重量平均分子量約２０ｋＤａ）  ２００ｍｇをＷＦＩ  ３．２ｍＬ及びＥｔＯＨ  ３．２ｍＬに溶解し、導入前駆体  ４  ３８ｍｇ（０．２０ｅｑ，８１．２μｍｏｌ）の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  ０．８ｍＬ、ＤＭＴ−ＭＭ  ４５ｍｇ（０．２０ｅｑ，  ７９．７μｍｏｌ）  の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  ０．８ｍＬを加えて終夜攪拌した。その後、ＮａＣｌ  ２０ｍｇのＷＦＩ溶液  １００μＬを加え、９０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ  １２ｍＬ及びＥｔＯＨ  １５ｍＬを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を９０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ、ＥｔＯＨにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物５が２０９ｍｇ得られた。１Ｈ−ＮＭＲにて導入率を求めた結果、２０％であった。
【０２６５】
＜実施例２２＞  ジクロフェナク（１−アミノ−３，３−ジメチルブタン−２−オール）−ヒアルロン酸の調製
上記１８−３．記載の導入前駆体をヒアルロン酸に導入した。
ヒアルロン酸  ６６ｍｇをＷＦＩ  ６．５５ｍＬ及びＥｔＯＨ  ６．５５ｍＬに溶解し、導入前駆体  ７．１ｍｇ（０．１０ｅｑ，１６．３μｍｏｌ）の５０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  ０．３ｍＬ、ＤＭＴ−ＭＭ  ７．７ｍｇ（０．１０ｅｑ，１６．４μｍｏｌ）の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  ０．３３ｍＬを加えて終夜攪拌した。その後５％重曹水  ０．９８ｍＬを加え、４時間後に酢酸にて中和し、ＮａＣｌ  ０．３３ｇを溶解させ、ＥｔＯＨを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ、ＥｔＯＨにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物５が６３ｍｇ得られた。１Ｈ−ＮＭＲにて導入率を求めた結果、１１％であった。
【０２６６】
＜実施例２３＞  ジクロフェナク（１−アミノ−２−ブタノール）−ヒアルロン酸
上記１９−３．記載の導入前駆体をヒアルロン酸に導入した。
ヒアルロン酸（重量平均分子量約９００ｋＤａ）  １００ｍｇをＷＦＩ  １０ｍＬ及びＥｔＯＨ  １０ｍＬに溶解し、導入前駆体  １０．１ｍｇ（０．１０ｅｑ，２５．０μｍｏｌ）の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  ０．５ｍＬ、ＤＭＴ−ＭＭ  １１．７ｍｇ（０．１０ｅｑ，２５．０μｍｏｌ）  の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  ０．５ｍＬを加えて終夜攪拌した。その後５％重曹水  １．５ｍＬを加え、４時間後に酢酸にて中和し、ＮａＣｌ  ０．５ｇを溶解させ、ＥｔＯＨを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を９０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ、ＥｔＯＨにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物５が９７ｍｇ得られた。１Ｈ−ＮＭＲにて導入率を求めた結果、１２％であった。
【０２６７】
＜実施例２４＞  ジクロフェナク（２−アミノ−１−シクロヘキシルエタン−１−オール）−ヒアルロン酸
上記２０−３．記載の導入前駆体をヒアルロン酸に導入した。
ヒアルロン酸（重量平均分子量約９００ｋＤａ）  １００ｍｇをＷＦＩ  １０ｍＬ及びＥｔＯＨ  １０ｍＬに溶解し、導入前駆体  １１．４ｍｇ（０．１０ｅｑ，２４．９μｍｏｌ）の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  ０．５ｍＬ、ＤＭＴ−ＭＭ  １１．７ｍｇ（０．１０ｅｑ，２５．０μｍｏｌ）  の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  ０．５ｍＬを加えて終夜攪拌した。その後５％重曹水  １．５ｍＬを加え、４時間後に酢酸にて中和し、ＮａＣｌ  ０．５ｇを溶解させ、ＥｔＯＨを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を９０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ、ＥｔＯＨにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物５が９８ｍｇ得られた。１Ｈ−ＮＭＲにて導入率を求めた結果、１１％であった。
【０２６８】
＜実施例２５＞  ジクロフェナク（４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルエステル）−ヒアルロン酸
上記２１−３．記載の導入前駆体をヒアルロン酸に導入した。
ヒアルロン酸（重量平均分子量約９００ｋＤａ）  ２００ｍｇをＷＦＩ  ２０ｍＬ及びＥｔＯＨ  ２０ｍＬに溶解し、導入前駆体  ２３．３ｍｇ（０．１０ｅｑ，５０．５μｍｏｌ）の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  １ｍＬ、ＤＭＴ−ＭＭ  ２４．９ｍｇ（０．１１ｅｑ，５３．１μｍｏｌ）  の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  １ｍＬを加えて終夜攪拌した。その後５％重曹水  ３ｍＬを加え、４時間後に酢酸にて中和し、ＮａＣｌ  １ｇを溶解させ、ＥｔＯＨを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を９０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ、ＥｔＯＨにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物５が１８７ｍｇ得られた。１Ｈ−ＮＭＲにて導入率を求めた結果、１１％であった。
【０２６９】
＜実施例２６＞  ジクロフェナク（１−アミノ−２−プロパノール）−ヒアルロン酸（以下、ＤＦ−(Ｍｅ)−ＨＡともいう）の調製
上記１５−３．記載の導入前駆体をヒアルロン酸に導入した。
ヒアルロン酸（重量平均分子量約９００ｋＤａ）  ２００ｍｇをＷＦＩ  ２０ｍＬ及びＥｔＯＨ  ２０ｍＬに溶解し、導入前駆体  ３８．０ｍｇ（０．２０ｅｑ，９７．５μｍｏｌ）の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  １．５ｍＬ、ＤＭＴ−ＭＭ  ４５．４ｍｇ（０．１９ｅｑ，９６．７μｍｏｌ）の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  １．５ｍＬを加えて終夜攪拌した。その後５％重曹水  ３ｍＬを加え、４時間後に酢酸にて中和し、ＮａＣｌ  １ｇを溶解させ、ＥｔＯＨを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を９０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ、ＥｔＯＨにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物５が２００ｍｇ得られた。１Ｈ−ＮＭＲにて導入率を求めた結果、１９％であった。
【０２７０】
＜実施例２７＞  ジクロフェナク（セリンエチルエステル）−ヒアルロン酸
上記１６−３．記載の導入前駆体をヒアルロン酸に導入した。
ヒアルロン酸（重量平均分子量約９００ｋＤａ）  ２００ｍｇをＷＦＩ  ２０ｍＬ及びＥｔＯＨ  ２０ｍＬに溶解し、導入前駆体  ４３．４ｍｇ（０．１９ｅｑ，９６．９μｍｏｌ）の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  １．５ｍＬ、ＤＭＴ−ＭＭ  ４５．９ｍｇ（０．２０ｅｑ，９７．８μｍｏｌ）  の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  １．５ｍＬを加えて終夜攪拌した。その後５％重曹水  ３ｍＬを加え、４時間後に酢酸にて中和し、ＮａＣｌ  １ｇを溶解させ、ＥｔＯＨを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を９０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ、ＥｔＯＨにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物５が２１５ｍｇ得られた。１Ｈ−ＮＭＲにて導入率を求めた結果、２０％であった。
【０２７１】
＜実施例２８＞  ジクロフェナク（トレオニンエチルエステル）−ヒアルロン酸
上記１７−３．記載の導入前駆体をヒアルロン酸に導入した。
ヒアルロン酸（重量平均分子量約９００ｋＤａ）  ２００ｍｇをＷＦＩ  ２０ｍＬ及びＥｔＯＨ  ２０ｍＬに溶解し、導入前駆体  ４４．７ｍｇ（０．１９ｅｑ，９６．８μｍｏｌ）の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  １．５ｍＬ、ＤＭＴ−ＭＭ  ４５．９ｍｇ（０．２０ｅｑ，９７．８μｍｏｌ）  の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  １．５ｍＬを加えて終夜攪拌した。その後５％重曹水  ３ｍＬを加え、４時間後に酢酸にて中和し、ＮａＣｌ  １ｇを溶解させ、ＥｔＯＨを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を９０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ、ＥｔＯＨにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物５が２２７ｍｇ得られた。１Ｈ−ＮＭＲにて導入率を求めた結果、２１％であった。
【０２７２】
＜実施例２９＞  ２１−アラニル−ベタメタゾン導入コンドロイチン硫酸の調製
２９−１．  ２１−Ｂｏｃ−アラニル−ベタメタゾンの調製
Ｂｏｃ−アラニン  ０．９６４ｇを、ジクロロメタン  １０ｍＬ及びジメチルホルムアミド１５ｍＬに溶解し、ベタメタゾン  ２ｇを加えた。０℃に冷却した後、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン  １８６．８ｍｇ及び水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）  １．２７ｇを加え、室温にて終夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止した。トルエン及び水を用いて分液抽出し、有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を減圧下留去し、目的とする化合物２９−１を得た（２．７２ｇ，９８％）
【０２７３】
２９−２．  ２１−アラニル−ベタメタゾンの調製
化合物２９−１  ２．７２ｇを、テトラフドロフラン１５ｍＬに溶解し、０℃に冷却した後、４Ｍ塩酸／酢酸エチル  １００ｍＬを加えて、室温で３時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、溶媒を減圧下留去し、目的とする導入前駆体である化合物２９−２を得た（１．９８ｇ，８６％）。
【０２７４】
２９−３．  ２１−アラニル−ベタメタゾン導入コンドロイチン硫酸の調製
コンドロイチン硫酸ナトリウム（重量平均分子量約２０ｋＤａ）  １ｇに、蒸留水  １５ｍＬを加え３０分撹拌し溶解した。エタノール１５ｍＬを徐々に加え、溶液を均一に撹拌した後に、化合物２９−２  １８５．０ｍｇをエタノール／蒸留水＝１／１溶液  ５ｍＬに溶解し加えた。ついで、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリドｎ水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）  １１０．７ｍｇをエタノール／蒸留水＝１／１溶液  ５ｍＬに溶解し加え、終夜撹拌した。塩化ナトリウム  １ｇを加えた後、反応溶液を、９０％エタノール／蒸留水  ２００ｍＬ中に加えて、沈殿を形成し静置した。上清を除いた後に、９０％エタノール／蒸留水  １５０ｍＬを加え５分間撹拌洗浄し、再度静置した。同様の洗浄をさらに２回実施した後、ガラスフィルターでろ過し、得られた沈殿を加温減圧下（４０℃，７５ｍｍＨｇ）終夜乾燥することでＧＡＧ誘導体として、目的とするコンジュゲートである化合物２９−３（０．９０ｇ）を得た。１Ｈ−ＮＭＲを測定したところ、導入率は１８％であった。
【０２７５】
＜実施例３０＞  ２１−グリシル−ベタメタゾン導入コンドロイチン硫酸の調製
３０−１．  ２１−Ｂｏｃ−グリシル−ベタメタゾンの調製
Ｂｏｃ−グリシン  １．３４ｇを、ジクロロメタン  ２０ｍＬ及びジメチルホルムアミド  ２０ｍＬに溶解し、ベタメタゾン  ３ｇを加えた。０℃に冷却した後、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン  ２８０．２ｍｇ及び水溶性カルボジイミド  １．９１ｇを加え、室温にて終夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止した。トルエン及び水を用いて分液抽出し、有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を減圧下留去し、目的とする化合物３０−１を得た（３．３５ｇ，８２％）。
【０２７６】
３０−２．  ２１−グリシル−ベタメタゾンの調製
化合物３０−１  ３．３５ｇを、テトラフドロフラン  ２０ｍＬに溶解し、０℃に冷却した後、４Ｍ  塩酸／酢酸エチル  １００ｍＬを加えて、室温で１時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、溶媒を減圧下留去し、目的とする導入前駆体である化合物３０−２を得た（２．６９ｇ，９５％）。
【０２７７】
３０−３．  ２１−グリシル−ベタメタゾン導入コンドロイチン硫酸の調製
コンドロイチン硫酸ナトリウム（重量平均分子量約２０ｋＤａ）  １ｇに、蒸留水  １５ｍＬを加え３０分撹拌し溶解した。エタノール  １５ｍＬを徐々に加え、溶液を均一に撹拌した後に、化合物３０−２  ２２４．３ｍｇをエタノール／蒸留水＝１／１溶液  ５ｍＬに溶解し加えた。ついで、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリドｎ水和物  １１０．７ｍｇをエタノール／蒸留水＝１／１溶液  ５ｍＬに溶解し加え、終夜撹拌した。塩化ナトリウム  １ｇを加えた後、反応溶液を、９０％エタノール／蒸留水  ２００ｍＬ中に加えて、沈殿を形成し静置した。上清を除いた後に、９０％エタノール／蒸留水  １５０ｍＬを加え５分間撹拌洗浄し、再度静置した。同様の洗浄をさらに２回実施した後、ガラスフィルターでろ過し、得られた沈殿を加温減圧下（４０℃，７５ｍｍＨｇ）終夜乾燥することでＧＡＧ誘導体として、目的とするコンジュゲートである化合物３０−３（０．６１ｇ）を得た。１Ｈ−ＮＭＲを測定したところ、導入率は２０％であった。
【０２７８】
＜実施例３１＞  ２１−イソロイシル−ベタメタゾン導入コンドロイチン硫酸の調製
３１−１．  ２１−（Ｂｏｃ−イソロイシル）−ベタメタゾンの調製
Ｂｏｃ−イソロイシン  １．７７ｇを、ジクロロメタン  ２０ｍＬ及びジメチルホルムアミド  ２０ｍＬ  に溶解し、ベタメタゾン  ３ｇを加えた。０℃に冷却した後、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン  ２８０．２ｍｇ及び水溶性カルボジイミド  １．９１ｇを加え、室温にて終夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止した。トルエン及び水を用いて分液抽出し、有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を減圧下留去し、目的とする化合物３１−１を得た（３．９６ｇ，８７％）。
【０２７９】
３１−２．  ２１−イソロイシル−ベタメタゾンの調製
化合物１７  ３．９６ｇを、テトラフドロフラン  ２０ｍＬに溶解し、０℃に冷却した後、４Ｍ  塩酸／酢酸エチル  １００ｍＬを加えて、室温で１時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて原料の消失を確認後、溶媒を減圧下留去し、目的とする導入前駆体である化合物３１−２を得た（３．３６ｇ，９９％）。
【０２８０】
３１−３．  ２１−イソロイシル−ベタメタゾン導入コンドロイチン硫酸の調製
コンドロイチン硫酸ナトリウム（重量平均分子量約２０ｋＤａ）  １ｇに、蒸留水  １５ｍＬを加え３０分撹拌し溶解した。エタノール  １５ｍＬを徐々に加え、溶液を均一に撹拌した後に、化合物３１−２  ２０１．９ｍｇをエタノール／蒸留水＝１／１溶液  ５ｍＬに溶解し加えた。ついで、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリドｎ水和物  １１０．７ｍｇをエタノール／蒸留水＝１／１溶液  ５ｍＬに溶解し加え、終夜撹拌した。塩化ナトリウム  １ｇを加えた後、反応溶液を、９０％エタノール／蒸留水  ２００ｍＬ中に加えて、沈殿を形成し静置した。上清を除いた後に、９０％エタノール／蒸留水  １５０ｍＬを加え５分間撹拌洗浄し、再度静置した。同様の洗浄をさらに２回実施した後、ガラスフィルターでろ過し、得られた沈殿を加温減圧下（４０℃，７５ｍｍＨｇ）終夜乾燥することで多糖誘導体として、目的とするコンジュゲートである化合物３１−３（０．７６ｇ）を得た。この１Ｈ−ＮＭＲを測定したところ、導入率は１５％であった。
【０２８１】
＜実施例３２＞  ジクロフェナク−（２−アミノエタノール）−コンドロイチン硫酸の調整（ＤＦ−ＣＳの合成）
３２―１．  Ｂｏｃ-アミノエチルブロマイドの調製
３−ブロモエチルアミン臭化水素酸塩  ２．１５５ｇ（１０．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン  ２０ｍｌに溶解し、氷冷下でトリエチルアミン  １．４６３ｍｌ（１０．５ｍｍｏｌ）を加え、さらにＢｏｃ２Ｏ  ２．２９９ｇ（１０．５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液５ｍｌを加え撹拌した。室温で９０分間撹拌した後、酢酸エチルを加え、５％クエン酸水溶液、水、飽和食塩水で順次分液洗浄した。硫酸ナトリウムで脱水後、溶媒を減圧留去した。標記化合物  ２．２８７ｇ（９７％）を得た。
【０２８２】
３２―２．  ジクロフェナク−２−アミノエタノール塩酸塩の合成
（１）Ｂｏｃ−アミノエタノール-ジクロフェナク
３２―１．で得られたＢｏｃ−アミノエチルブロマイド  ２．２８７ｇ（１０．２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液５ｍｌを氷冷し、ジクロフェナクナトリウム  ３．２５５ｇ（１０．２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液６ｍｌを加え、室温で一晩撹拌した。６０℃で１１時間撹拌し、室温で一晩撹拌した。酢酸エチルを加え、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で順次分液洗浄した。硫酸ナトリウムで脱水後、酢酸エチルを減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝２０：１、０．５％トリエチルアミン）で精製し、標記化合物を２．６７５ｇ（６０％）得た。
【０２８３】
（２）ジクロフェナク−２−アミノエタノール塩酸塩
（１）で得られたＢｏｃ−アミノエタノール−ジクロフェナク２．１０８ｇ（４．８０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン５ｍｌに溶解し、氷冷下で４Ｍ塩酸／酢酸エチル２０ｍｌを加えて２．５時間撹拌した。ジエチルエーテル、ヘキサンを加えて沈殿させ、沈殿を減圧乾燥した。標記化合物を１．７７５ｇ（９８％）得た。
【０２８４】
３２―３−１  ジクロフェナク−（２−アミノエタノール）−コンドロイチン硫酸の調製（ＤＦ−ＣＳの合成）
コンドロイチン硫酸（重量平均分子量約２０ｋＤａ）  １０００ｍｇをＷＦＩ  １００ｍｌ及びＥｔＯＨ  １００ｍｌに溶解し、ジクロフェナク−２−アミノエタノール塩酸塩を１８６ｍｇ（０．２５ｅｑ，０．５０ｍｍｏｌ）、及びＤＭＴ−ＭＭを２３２ｍｇ（０．２５ｅｑ，０．５０ｍｍｏｌ）加えて終夜攪拌した。その後、ＮａＨＣＯ３  ７５０ｍｇを加えて攪拌しｐＨ９になったことを確認後、攪拌を停止して３時間静置した。次いで酢酸４００μｌ、ＮａＣｌ  ３ｇを順次加えて３０分攪拌し、９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩを２００ｍｌ加えて沈殿形成した。最後に懸濁液の上清を捨てて９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄を２回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、ジクロフェナク−（２−アミノエタノール）−コンドロイチン硫酸（ＤＦ−ＣＳ）が１．０８ｇ得られた。ＮＭＲで導入率を求めた結果、２５％であった。
【０２８５】
３２―３−２  ジクロフェナク−（２−アミノエタノール）−ヒアルロン酸の調製（ＤＦ−ＨＡの合成）
ヒアルロン酸（重量平均分子量約９００ｋＤａ）  １０００ｍｇにＷＦＩ  １００ｍｌを加え、３時間攪拌して溶解した。その後ＥｔＯＨ  １００ｍｌを追加し、さらに３０分攪拌した。続いてジクロフェナク−（２−アミノエタノール塩酸塩  １７８ｍｇ（０．１９ｅｑ，０．４７ｍｍｏｌ）の５０％ＥｔＯＨ溶液５ｍｌ及びＤＭＴ−ＭＭ  ２２２ｍｇ（０．１９ｅｑ，０．４７ｍｍｏｌ)の５０％ＥｔＯＨ溶液５ｍｌ加えて終夜攪拌した。その後、ＮａＨＣＯ３  ７５０ｍｇ水溶液１５ｍｌを加えて攪拌しｐＨ９になったことを確認後、攪拌を停止して３時間静置した。次いで次いで酢酸４００μｌ、ＮａＣｌ  ３ｇを順次加えて３０分攪拌し、９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩを４６５ｍｌ加えて沈殿形成した。最後に懸濁液の上清を捨てて９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄を２回、９５％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄及びＥｔＯＨ洗浄を各１回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、ジクロフェナク−（２−アミノエタノール）−ヒアルロン酸（ＤＦ−ＨＡ）が１．０４ｇ得られた。カルバゾール硫酸法で導入率を求めた結果、１７％であった。
【０２８６】
＜実施例３３＞  ＣＳ−フェンブフェンの合成
ＣＳ−フェンブフェンの合成を下記スキームに示す。化合物３２とフェンブフェンとを縮合し、化合物３３とした後に保護基を除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体３４へと変換し、ＣＳへの導入を行ってコンジュゲート３５とした。
【０２８７】
【化２４】
2019059951.tif 000027
【０２８８】
３３−１．  化合物３２とフェンブフェンの縮合反応
化合物３２  ６５３ｍｇ（１．０ｅｑ，４．０１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  ８ｍＬに溶解し、フェンブフェン  １．０２ｇ（１．０ｅｑ，４．０１ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ  ９８ｍｇ（０．２ｅｑ，０．８０ｍｍｏｌ）を加えた。その後、氷冷下、ＷＳＣ  ８４６ｍｇ（１．１ｅｑ，４．４１ｍｍｏｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。ＴＬＣにて新たなスポットを確認後、氷冷下飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で反応溶液をクエンチし、ＤＣＭ及び水を用いて分液抽出を３回行った。集めた有機層は５％クエン酸水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物３３を得た。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45(9H, s), 2.80(2H, t), 3.37(2H, t), 3.41(2H, m), 4.19(2H, m), 4.99(1H, br), 7.38-8.09(9H, m).
【０２８９】
３３−２．  化合物３３の脱Ｂｏｃ化反応
化合物３３  １．５ｇをＤＣＭ  １０ｍＬに溶解し、氷冷下、４Ｍ  ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ  ４０ｍＬを加えて２．５時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、エバポレーターで４０℃水浴中減圧濃縮し、残留物をヘキサンで洗浄した結果、目的とする導入前駆体３４を１．２７ｇ得た（２工程収率９５％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ2.84(2H, t), 3.28(2H, t), 3.47(2H, m), 4.37(2H, m), 7.38-8.09(9H, m).
【０２９０】
３３−３．  導入前駆体３４のＣＳへの導入
ＣＳ（重量平均分子量約４０ｋＤａ）  １ｇをＷＦＩ  １００ｍＬ及びＥｔＯＨ  １００ｍＬに溶解し、導入前駆体３４を２００ｍｇ（０．３ｅｑ，０．５９６ｍｍｏｌ）及びＤＭＴ−ＭＭを２８０ｍｇ（０．３ｅｑ，０．５９６ｍｍｏｌ）加えて終夜攪拌した。その後ＮａＨＣＯ３溶液（７５０ｍｇ／１５ｍＬ）を加えて１時間攪拌し、酢酸  ４００μＬ、ＮａＣｌ  ３ｇ、９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ  ２００ｍＬを順次加えて沈殿形成した。続いて懸濁液の上清を捨てて９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄及びＥｔＯＨ洗浄を２回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物としてコンジュゲート３５が１．０７ｇ得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、１７％であった。
【０２９１】
＜実施例３４＞  ＣＳ−フェルビナクの合成
ＣＳ−フェルビナクの合成を下記スキームに示す。化合物３２とフェルビナクとを縮合し、化合物３６とした後に保護基を除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体３７へと変換し、ＣＳへの導入を行ってコンジュゲート３８とした。
【０２９２】
【化２５】
2019059951.tif 000028
【０２９３】
３４−１．  化合物３２とフェルビナクの縮合反応
化合物３２  １ｇ（１．０ｅｑ，６．１３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  １５ｍＬ及びＤＭＦ  １０ｍＬに溶解し、フェルビナク  １．３ｇ（１．０ｅｑ，６．１３ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ  ２２５ｍｇ（０．３ｅｑ，１．８４ｍｍｏｌ）を加えた。その後、氷冷下、ＷＳＣ  １．２９ｇ（１．１ｅｑ，６．７５ｍｍｏｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。ＴＬＣにて新たなスポットを確認後、氷冷下飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で反応溶液をクエンチし、ＤＣＭ及び水を用いて分液抽出を３回行った。集めた有機層は１Ｍ塩酸、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄し、その後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた溶液をエバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した結果、目的とする化合物３６を２．２ｇ得た（収率９８％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.45（9H, s), 3.39(2H, t), 3.69(2H, s), 4.18(2H, t), 4.70(1H, br), 7.33-7.59(9H, m).
【０２９４】
３４−２．  化合物３６の脱Ｂｏｃ化反応
化合物３６  ２ｇをＤＣＭ  ７ｍＬに溶解し、氷冷下、４Ｍ  ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ  １７ｍＬを加えて３時間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、エバポレーターで４０℃水浴中減圧濃縮し、残留物をヘキサンで洗浄した結果、目的とする導入前駆体３７を１．４５ｇ得た（収率８８％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ3.28(2H, t), 3.81(2H, s), 4.38(2H, t), 7.33-7.64(9H, m)
【０２９５】
３４−３．  導入前駆体３７のＣＳへの導入
ＣＳ（重量平均分子量約４０ｋＤａ）  １ｇをＷＦＩ  １００ｍＬ及びＥｔＯＨ  １００ｍＬに溶解し、導入前駆体３７を１７４ｍｇ（０．３ｅｑ，０．５９６ｍｍｏｌ）及びＤＭＴ−ＭＭを２８０ｍｇ（０．３ｅｑ，０．５９６ｍｍｏｌ）加えて終夜攪拌した。その後ＮａＨＣＯ３溶液（７５０ｍｇ／１５ｍＬ）を加えて１時間攪拌し、酢酸  ４００μＬ、ＮａＣｌ  ３ｇ、９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ  ２００ｍＬを順次加えて沈殿形成した。続いて懸濁液の上清を捨てて９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ洗浄及びＥｔＯＨ洗浄を２回実施した。得られた沈殿を終夜減圧乾燥したところ、目的物としてコンジュゲート３８が１．０８ｇ得られた。カルバゾール硫酸法にて導入率を求めた結果、１５％であった。
【０２９６】
＜実施例３５＞  ベザフィブラート（アミノエタノール）−コンドロイチン硫酸の調製
ベザフィブラート（アミノエタノール）−コンドロイチン硫酸（スペーサーにアミノエタノールを用いたベザフィブラート−コンドロイチン硫酸コンジュゲート）の調製を下記スキームに示す。Ｂｏｃアミノエタノールとベザフィブラートを縮合し、続いてＢｏｃ基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体４へと変換し、コンドロイチン硫酸への導入を行ってコンジュゲート５を合成した。
【０２９７】
【化２６】
2019059951.tif 000029
【０２９８】
３５−１．  Ｂｏｃアミノエタノールとベザフィブラートの縮合
化合物２  １７４ｍｇ（１．０ｅｑ，０．９３ｍｍｏｌ）とベザフィブラート  ３３６ｍｇ（１．０ｅｑ，０．９３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  １．５ｍＬとＤＭＦ  １．５ｍＬに溶解し、ＤＭＡＰ  １１ｍｇ（０．１ｅｑ，０．０９ｍｍｏｌ）とＷＳＣ  ２７５ｍｇ（１．５ｅｑ，１．４３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  １．５ｍＬに溶解した液を加えて室温下終夜攪拌した。さらにベザフィブラート  ３３５ｍｇ（１．０ｅｑ，０．９３ｍｍｏｌ）とＷＳＣ  ２８５ｍｇ（１．５ｅｑ，１．４９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  １．０ｍＬに溶解した液を加えて室温下終夜攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、５％クエン酸水溶液、５％重曹水を用いて分液抽出し、有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）、化合物３  ４７７ｍｇを得た（収率８８％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ1.40(9H, s), 1.62(6H,s), 2.87(2H,t), 3.27(2H,br), 3.66(2H,br), 4.20(2H,br), 4.41(1H,br), 6.13(1H,br), 6.80(2H,br), 7.09(2H,br), 7.37(2H,br), 7.62(2H,br),
３５−２．  化合物３の脱Ｂｏｃ化反応
化合物３  ４７７ｍｇをＤＣＭ  １ｍＬに溶解し、氷冷下、４Ｍ  ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ  ４ｍＬを加えて８０分間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、ジエチルエーテルを加えて沈殿とし、ジエチルエーテルで洗浄した結果、目的とする導入前駆体４を４０１ｍｇ得た（収率９６％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ1.58(6H,s), 2.85(2H,t), 3.20(2H,t), 3.55(2H,t), 4.34(2H,t), 6.82(2H,dd), 7.17(2H,dd), 7.46(2H,dd), 7.74(2H,dd),
３５−３．  導入前駆体４のコンドロイチン硫酸への導入
コンドロイチン硫酸（重量平均分子量約２０ｋＤａ）  ２００ｍｇをＷＦＩ  ３．２ｍＬに溶解し、導入前駆体４  ３５ｍｇ（０．２０ｅｑ，７９．８μｍｏｌ）とＤＭＴ−ＭＭ  ３９ｍｇ（０．２０ｅｑ，８２．１μｍｏｌ）  をＥｔＯＨ  ４．０ｍLとＷＦＩ  ０．８ｍＬに溶解した液を加えて１８時間撹拌した。その後、２０％  ＮａＣｌ溶液  １００μＬを加え、９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ  １２ｍＬ及びＥｔＯＨ  １５ｍＬを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ、ＥｔＯＨにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物５（化合物３５−１）が２０８ｍｇ得られた。１Ｈ−ＮＭＲにて導入率を求めた結果、２２％であった。
３５−４．  ベザフィブラート（アミノエタノール）−ヒアルロン酸の調製
実施例３５に記載の導入前駆体４をヒアルロン酸に導入した。
ヒアルロン酸（重量平均分子量約９００ｋＤａ）  ２００ｍｇをＷＦＩ  ２０ｍＬ及びＥｔＯＨ  ２０ｍＬに溶解し、導入前駆体  ２２．１ｍｇ（０．１０ｅｑ，５０．１μｍｏｌ）の５０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  １ｍＬ、ＤＭＴ−ＭＭ  ２４．８ｍｇ（０．１０ｅｑ，５２．９μｍｏｌ）の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  １ｍＬを加えて終夜攪拌した。その後５％重曹水  ３ｍＬを加え、４時間後に酢酸にて中和し、ＮａＣｌ  １ｇを溶解させ、ＥｔＯＨを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ、ＥｔＯＨにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物５（化合物３５−２）が１９０ｍｇ得られた。１Ｈ−ＮＭＲにて導入率を求めた結果、１３％であった。
【０２９９】
＜実施例３６＞  ベザフィブラート（２−アミノ−１−シクロヘキシルエタン−１−オール）−コンドロイチン硫酸の調製
ベザフィブラート（２−アミノ−１−シクロヘキシルエタン−１−オール）−コンドロイチン硫酸（スペーサーに２−アミノ−１−シクロヘキシルエタン−１−オールを用いたベザフィブラート−コンドロイチン硫酸コンジュゲート）の調製を下記スキームに示す。２−アミノ−１−シクロヘキシルエタン−１−オールのＢｏｃ化体とベザフィブラートを縮合し、続いてＢｏｃ基を酸性条件下除去することでアミン塩酸塩である導入前駆体４へと変換し、コンドロイチン硫酸への導入を行ってコンジュゲート５を合成した。
【０３００】
【化２７】
2019059951.tif 000030
【０３０１】
３６−１．  ２−アミノ−１−シクロヘキシルエタン−１−オールのＢｏｃ化体とベザフィブラートの縮合
化合物２  ２０１ｍｇ（１．０ｅｑ，０．８３ｍｍｏｌ）とベザフィブラート  ３００ｍｇ（１．０ｅｑ，０．８３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  １．５ｍＬとＤＭＦ  １．５ｍＬに溶解し、ＤＭＡＰ  １０ｍｇ（０．１ｅｑ，０．０８ｍｍｏｌ）とＷＳＣ  ２４４ｍｇ（１．５ｅｑ，１．２７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  １．５ｍＬに溶解した液を加えて室温下終夜攪拌した。さらにベザフィブラート  ３０１ｍｇ（１．０ｅｑ，０．８３ｍｍｏｌ）とＷＳＣ  ２４５ｍｇ（１．５ｅｑ，１．２８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  １．０ｍＬに溶解した液を加えて室温下終夜攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、５％クエン酸水溶液、５％重曹水を用いて分液抽出し、有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。その後、硫酸マグネシウムで乾燥し、エバポレーターで４０℃水浴中、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（トルエン：酢酸エチル＝３：１）、化合物３  ３７５ｍｇを得た（収率７７％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ0.94-1.17(5H, m), 1.41(9H, br), 2.86(2H,br), 3.13-3.19(3H,m), 3.63-3.68(2H,m), 4.32(1H,s), 4.79(1H,m), 6.15(1H,s), 6.78-6.83(2H,m), 7.09(2H,d), 7.37(2H,d), 7.62-7.77(2H,m)
３６−２．  化合物３の脱Ｂｏｃ化反応
化合物３  ３７５ｍｇをＤＣＭ  １ｍＬに溶解し、氷冷下、４Ｍ  ＨＣｌ／ＡｃＯＥｔ  ４ｍＬを加えて８０分間攪拌した。ＴＬＣにて原料の消失を確認後、ジエチルエーテルを加えて沈殿とし、ジエチルエーテルで洗浄した結果、目的とする導入前駆体４を３０９ｍｇ得た（収率９２％）。
１Ｈ−ＮＭＲの帰属を以下に示す。
1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ0.97-1.03(6H,m), 1.61-1.71(6H,m), 2.85(2H,t), 3.10(2H,m), 3.48-3.58(3H,m), 4.83-4.91(1H,m), 6.84(2H,d), 7.17(2H,d), 7.46(2H,dd), 7.75(2H,dd)
３６−３．  導入前駆体４のコンドロイチン硫酸への導入
コンドロイチン硫酸（重量平均分子量約２０ｋＤａ）  ２００ｍｇをＷＦＩ  ３．２ｍＬに溶解し、導入前駆体４  ４２ｍｇ（０．２０ｅｑ，７９．７μｍｏｌ）とＤＭＴ−ＭＭ  ３８ｍｇ（０．２０ｅｑ，８１．０μｍｏｌ）  をＥｔＯＨ  ４．０ｍLとＷＦＩ  ０．８ｍＬに溶解した液を加えて１８時間撹拌した。その後、２０％  ＮａＣｌ溶液  １００μＬを加え、９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ  １２ｍＬ及びＥｔＯＨ  １５ｍＬを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ、ＥｔＯＨにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物５（化合物３６−１）が２１５ｍｇ得られた。１Ｈ−ＮＭＲにて導入率を求めた結果、２０％であった。
【０３０２】
３６−４．  ベザフィブラート（２−アミノ−１−シクロヘキシルエタン−１−オール）−ヒアルロン酸の調製
実施例３６に記載の導入前駆体４をヒアルロン酸に導入した。
ヒアルロン酸（重量平均分子量約９００ｋＤａ）  ２００ｍｇをＷＦＩ  ２０ｍＬ及びＥｔＯＨ  ２０ｍＬに溶解し、導入前駆体  ２６．３ｍｇ（０．１０ｅｑ，５０．２μｍｏｌ）の５０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  １ｍＬ、ＤＭＴ−ＭＭ  ２３．７ｍｇ（０．１０ｅｑ，５０．５μｍｏｌ）の５０％  ＥｔＯＨ／ＷＦＩ溶液  １ｍＬを加えて終夜攪拌した。その後５％重曹水  ３ｍＬを加え、４時間後に酢酸にて中和し、ＮａＣｌ  １ｇを溶解させ、ＥｔＯＨを加えて沈殿形成した。得られた沈殿を９０％ＥｔＯＨ／ＷＦＩ、ＥｔＯＨにて順次洗浄し、終夜減圧乾燥したところ、目的物５（化合物３６−２）が１９２ｍｇ得られた。１Ｈ−ＮＭＲにて導入率を求めた結果、１３％であった。
【０３０３】
＜試験例Ａ１＞  ベタメタゾン（Ｘ）−コンドロイチン硫酸のｉｎ  ｖｉｔｒｏリリース試験（Ｘ＝Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｈ）
実施例１〜実施例４にて合成したベタメタゾン−コンドロイチン硫酸（コンジュゲート）について、以下の条件でｉｎ  ｖｉｔｒｏリリース試験（薬物遊離試験）を行った。
（１）  リン酸２水素ナトリウム２水和物（ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）及びリン酸水素２ナトリウム１２水和物（Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ）を用いてｐＨ５．３、６．３、７．０、７．５、８．１、９．２の溶液を調製した。
（２）  （１）で調製した各溶液に０．０５％になるようにコンジュゲートを溶解した。
（３）  ３６℃にて保存、１日毎にサンプリングを行い、ＨＰＬＣ（ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィー）にてコンジュゲートとベタメタゾン単体のピーク面積比率を確認した。
【０３０４】
【化２８】
2019059951.tif 000031
【０３０５】
Ａ１−１．リリース試験溶液の調製
リン酸２水素ナトリウム２水和物（ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）  ７８０ｍｇ（５．０ｍｍｏｌ）及びリン酸水素２ナトリウム１２水和物（Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ）  １．７９ｇ（５．０ｍｍｏｌ）をそれぞれＷＦＩ  ５００ｍＬに溶解し、ＮａＨ２ＰＯ４溶液、Ｎａ２ＨＰＯ４溶液とした。この２つの溶液を以下の比率で混合し、リリース試験溶液Ａ〜Ｆとした。
【０３０６】
【表３】
2019059951.tif 000032
【０３０７】
Ａ１−２．ベタメタゾン−コンドロイチン硫酸（ベタメタゾン（Ｈ）−コンドロイチン硫酸）  リリース試験
ベタメタゾン−コンドロイチン硫酸  ５ｍｇをリリース試験溶液Ａ〜Ｆ１０ｍＬそれぞれに溶解し、３６℃のＨＰＬＣオートサンプラー内で保存し、一日ごとにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定を実施した。溶解後、０日目（初期値）から６日目まで測定した。
ＨＰＬＣ条件は以下の通り。
分析時間：４０分
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエント：ｉｓｏｃｌａｔｉｃ
溶媒：アセトニトリル（ＨＰＬＣ用）：生理食塩液＝１：２
検出：フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）を用い、ベタメタゾンの極大吸収波長（２４０ｎｍ）におけるベタメタゾン−コンドロイチン硫酸及び遊離ベタメタゾンの比率を面積％で測定した。
温度：３６℃
【０３０８】
【表４】
2019059951.tif 000033
【０３０９】
Ａ１−３．ベタメタゾン（Ｆ）−コンドロイチン硫酸  リリース試験
ベタメタゾン（Ｆ）−コンドロイチン硫酸  ５ｍｇをリリース試験溶液Ａ〜Ｆ１０ｍＬそれぞれに溶解し、３６℃のＨＰＬＣオートサンプラー内で保存し、一日ごとにＳＥＣ測定を実施した。溶解後、０日目（初期値）から６日目まで測定した。ＨＰＬＣ条件はＡ１−２と同じである。
【０３１０】
【表５】
2019059951.tif 000034
【０３１１】
Ａ１−４．ベタメタゾン（Ｃｌ）−コンドロイチン硫酸  リリース試験
ベタメタゾン（Ｃｌ）−コンドロイチン硫酸  ５ｍｇをリリース試験溶液Ａ〜Ｆ１０ｍＬそれぞれに溶解し、３６℃のＨＰＬＣオートサンプラー内で保存し、一日ごとにＳＥＣ測定を実施した。溶解後、０日目（初期値）から６日目まで測定した。ＨＰＬＣ条件はＡ１−２と同じである。
【０３１２】
【表６】
2019059951.tif 000035
【０３１３】
Ａ１−５．ベタメタゾン（Ｂｒ）−コンドロイチン硫酸  リリース試験
ベタメタゾン（Ｂｒ）−コンドロイチン硫酸  ２ｍｇをリリース試験溶液Ａ〜Ｆ４ｍＬそれぞれに溶解し、３６℃のＨＰＬＣオートサンプラー内で保存し、一日ごとにＳＥＣ測定を実施した。溶解後、０日目（初期値）から６日目まで測定した。ＨＰＬＣ条件はＡ１−２と同じである。
【０３１４】
【表７】
2019059951.tif 000036
【０３１５】
Ａ１−６．ベタメタゾン（Ｘ）−コンドロイチン硫酸  リリース速度比較
Ｃ液（ｐＨ７．０）、Ｄ液（ｐＨ７．５）における各コンジュゲートのリリース速度の比較を以下に示す。
【０３１６】
【表８】
2019059951.tif 000037
【０３１７】
【表９】
2019059951.tif 000038
【０３１８】
表８及び９で示す通り、カルボン酸のα位炭素の置換基がハロゲン原子の場合、リリースの速さはフッ素＞塩素＞臭素＞＞水素であり、電気陰性度の強さ(フッ素＞塩素＞臭素＞＞水素)と相関する結果が得られた。
【０３１９】
＜試験例Ａ２＞  ＣＳ（Ｘ）−フェンブフェン及びフェルビナクのｉｎ  ｖｉｔｒｏリリース試験（Ｘ＝Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、Ｆ，Ｆ）
実施例５〜７で合成した各コンジュゲート３１、３６、４５並びに実施例３３で合成したＣＳ−フェンブフェン（ＣＳとフェンブフェンを無置換のアミノエタノールで連結したコンジュゲート）及び実施例３４で合成したＣＳ−フェルビナク（ＣＳとフェルビナクを無置換のアミノエタノールで連結したコンジュゲート）について、以下の条件でｉｎ  ｖｉｔｒｏリリース試験を行った。
（１）  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ及びＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを用いてｐＨ５．３、６．３、７．０、７．５、８．１、９．２の溶液をそれぞれ調製した。
（２）  （１）で調製した各溶液に０．０５％になるようにコンジュゲートを溶解した。
（３）  ３６℃にて保存、１日毎にサンプリングを行い、ＨＰＬＣ（ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィー）にてコンジュゲートとフェンブフェン及びフェルビナク単体のピーク面積比率を確認した。
【０３２０】
【化２９】
2019059951.tif 000039
【０３２１】
【化３０】
2019059951.tif 000040
【０３２２】
Ａ２−１．リリース試験溶液の調製
ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ  ７８０ｍｇ（５．０ｍｍｏｌ）及びＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  １．７９ｇ（５．０ｍｍｏｌ）をそれぞれＷＦＩ  ５００ｍＬに溶解し、ＮａＨ２ＰＯ４溶液、Ｎａ２ＨＰＯ４溶液とした。この２つの溶液を以下の比率で混合し、リリース試験溶液Ａ〜Ｆとした。
【０３２３】
【表１０】
2019059951.tif 000041
【０３２４】
Ａ２−２．ＣＳ−フェンブフェン及びＣＳ−フェルビナクのリリース試験
ＣＳ−フェンブフェン、ＣＳ−フェルビナク  各５ｍｇ程度をリリース試験溶液Ａ〜Ｆそれぞれに濃度が０．０５％になるように溶解し、３６℃  ＨＰＬＣオートサンプラー内で保存して一日ごとにＳＥＣ測定を実施した。溶解後、０日目（初期値）から６日目又は7日目までについて、フェンブフェン及びフェルビナクの遊離率（％）をそれぞれ測定した。フェンブフェンの遊離率を表１１に、フェルビナクの遊離率を表１２にそれぞれ示した。
ＨＰＬＣ条件は以下の通り。
分析時間：４０分
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
グラジェント：ｉｓｏｃｌａｔｉｃ
溶媒：アセトニトリル（ＨＰＬＣ用）：生理食塩液＝１：２
検出：ＰＤＡを用い、各極大吸収波長（フェンブフェン：２８５ｎｍ、フェルビナク：２５３ｎｍ）におけるＣＳ−コンジュゲート及び遊離薬物の比率を面積％で測定した。
温度：３６℃
【０３２５】
【表１１】
2019059951.tif 000042
【０３２６】
【表１２】
2019059951.tif 000043
【０３２７】
Ａ２−３．ＣＳ（Ｃｌ）−フェンブフェン  リリース試験
ＣＳ（Ｃｌ）−フェンブフェン  ３ｍｇ程度をリリース試験溶液Ａ〜Ｆそれぞれに濃度が０．０５％になるように溶解し、３６℃のＨＰＬＣオートサンプラー内で保存して一日ごとにＳＥＣ測定を実施した。溶解後、０日目（初期値）から６日目までフェンブフェンの遊離率（％）を測定した。ＨＰＬＣ条件はＡ２−２と同じである。結果を下表に示した。
【０３２８】
【表１３】
2019059951.tif 000044
【０３２９】
Ａ２−４．ＣＳ（Ｆ）−フェンブフェン  リリース試験
ＣＳ（Ｆ）−フェンブフェン  １０ｍｇ程度をリリース試験溶液Ａ〜Ｆそれぞれに濃度が０．０５％になるように溶解し、３６℃のＨＰＬＣオートサンプラー内で保存して一日ごとにＳＥＣ測定を実施した。溶解後、０日目（初期値）から６日目までフェンブフェンの遊離率（％）を測定した。ＨＰＬＣ条件はＡ２−２と同じである。結果を下表に示した。
【０３３０】
【表１４】
2019059951.tif 000045
【０３３１】
Ａ２−５．ＣＳ（Ｆ，Ｆ）−フェルビナク  リリース試験
ＣＳ（Ｆ，Ｆ）−フェルビナク  １０ｍｇ程度をリリース試験溶液Ａ〜Ｆそれぞれに濃度が０．０５％になるように溶解し、３６℃のＨＰＬＣオートサンプラー内で保存して一日ごとにＳＥＣ測定を実施した。溶解後、０日目（初期値）から７日目までフェルビナクの遊離率（％）を測定した。ＨＰＬＣ条件はＡ２−２と同じである。結果を下表に示した。
【０３３２】
【表１５】
2019059951.tif 000046
【０３３３】
Ａ２−６．ＣＳ−フェンブフェン  コンジュゲート間のリリース速度比較
上記で得られた結果について、ＣＳ−フェンブフェン、ＣＳ（Ｃｌ）−フェンブフェン及びＣＳ（Ｆ）−フェンブフェンのｐＨ６．９及びｐＨ７．５におけるフェンブフェンの遊離率の比較を下表に示した。
【０３３４】
【表１６】
2019059951.tif 000047
【０３３５】
Ａ２−７．ＣＳ−フェルビナク  コンジュゲート間のリリース速度比較
上記で得られた結果について、ＣＳ−フェルビナク及びＣＳ（Ｆ，Ｆ）−フェルビナクのｐＨ６．９及びｐＨ７．５におけるフェルビナクの遊離率の比較を下表に示した。
【０３３６】
【表１７】
2019059951.tif 000048
【０３３７】
＜試験例Ａ３＞  実施例８〜１４で得られたコンジュゲートのリリース試験
Ａ３−１．リリース試験溶液の調製
ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ  ７８０ｍｇ（５．０ｍｍｏｌ）及びＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  １．７９ｇ（５．０ｍｍｏｌ）をそれぞれＷＦＩ  ５００ｍＬに溶解し、ＮａＨ２ＰＯ４溶液、Ｎａ２ＨＰＯ４溶液とした。この２つの溶液を以下の比率で混合し、リリース試験溶液Ａ〜Ｆとした。
【０３３８】
【表１８】
2019059951.tif 000049
【０３３９】
Ａ３−２．各コンジュゲート  リリース試験
各コンジュゲートそれぞれ５ｍｇ程度をリリース試験溶液Ａ〜Ｆそれぞれに濃度が０．０５％になるように溶解し、３６℃のＨＰＬＣオートサンプラー内で保存して一日ごとにＳＥＣ測定を実施した。溶解後、０日目（初期値）から７日目まで測定した。結果を下表に示した。表中の「−」は未測定であることを示す
なお、ＨＰＬＣ条件は以下の通りであった。
分析時間：４０分
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
グラジェント：ｉｓｏｃｌａｔｉｃ
溶媒：アセトニトリル（ＨＰＬＣ用）：生理食塩液＝１：２
検出：ＰＤＡを用い、各極大吸収波長におけるＣＳ−コンジュゲートに含まれる薬物及び遊離薬物の比率を面積％で測定した。
温度：３６℃
【０３４０】
【表１９】
2019059951.tif 000050
【０３４１】
【表２０】
2019059951.tif 000051
【０３４２】
【表２１】
2019059951.tif 000052
【０３４３】
【表２２】
2019059951.tif 000053
【０３４４】
【表２３】
2019059951.tif 000054
【０３４５】
【表２４】
2019059951.tif 000055
【０３４６】
【表２５】
2019059951.tif 000056
【０３４７】
Ａ３−３．ＣＳ−ケトプロフェン  コンジュゲート間のリリース速度比較
上記で得られた結果について、ＣＳ（Ｈ）−ケトプロフェン、ＣＳ（Ｆ）−ケトプロフェン及びＣＳ（Ｆ，Ｆ）−ケトプロフェンのｐＨ６．９及びｐＨ７．５におけるフェルビナクの遊離率の比較を下表に示した。
【０３４８】
【表２６】
2019059951.tif 000057
【０３４９】
＜試験例Ａ４＞  実施例１５〜１７で得られたコンジュゲートのリリース試験
上記で合成したジクロフェナク（１−アミノ−２−プロパノール）−コンドロイチン硫酸（Ａ４−１）、ジクロフェナク（セリンエチルエステル）−コンドロイチン硫酸（Ａ４−２）、ジクロフェナク（トレオニンエチルエステル）−コンドロイチン硫酸（Ａ４−３）の各コンジュゲートについて、以下の条件でリリース試験を行った。
【０３５０】
２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０に各コンジュゲートを０．１％濃度で溶解し分注した。溶解直後に、初期状態（保存０日）として溶液に存在した遊離ジクロフェナク成分量、及び塩基性にて強制分解したジクロフェナクエステル量についてＯＤＳ−ＨＰＬＣにて定量分析した。他の分注液を溶解直後から３６℃の保存条件に付し、１、２、４、８日後にジクロフェナクエステルの分解量を同様に定量分析した。こうして得られた各時点での遊離ジクロフェナク成分量と、上記の強制分解による遊離ジクロフェナク成分量の比の値から、遊離率（％）を算出した。
【０３５１】
ＨＰＬＣ試料の前処理にはＯＡＳＩＳ  ＨＬＢを用い、アセトニトリル溶出画分を分析した。結果を下表に示した。
ＨＰＬＣ条件は以下のとおり。
カラム：ＴＳＧｇｅｌ  ＯＤＳ−１００Ｚ（４．６×１５０），
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
温度：３５℃
グラジエント：アセトニトリル／２０ｍＭリン酸ナトリウム＝０．４０（０ｍｉｎ）―０．６８（２１ｍｉｎ）
【０３５２】
【表２７】
2019059951.tif 000058
【０３５３】
＜試験例Ａ５＞  実施例１８〜２１で得られたコンジュゲートのリリース試験  
上記で合成したジクロフェナク（１-アミノ-３，３-ジメチルブタン-２-オール）-コンドロイチン硫酸（Ａ５−１）、ジクロフェナク（１-アミノ-２-ブタノール）-コンドロイチン硫酸（Ａ５−２）、ジクロフェナク（２-アミノ-１-シクロヘキシルエタン-１-オール）-コンドロイチン硫酸（Ａ５−３）、ジクロフェナク（４-アミノ-３-ヒドロキシ酪酸エチルエステル）-コンドロイチン硫酸（Ａ５−４）について、上記試験例Ａ４と同様の条件でリリース試験を行った。結果を下表に示した。
【０３５４】
【表２８】
2019059951.tif 000059
【０３５５】
＜試験例Ａ６＞  実施例２２〜２５で得られたコンジュゲートのリリース試験  
上記で合成したジクロフェナク（１−アミノ−３，３−ジメチルブタン−２−オール）−ヒアルロン酸（Ａ６−１）、ジクロフェナク（１−アミノ−２−ブタノール）−ヒアルロン酸（Ａ６−２）、ジクロフェナク（２−アミノ−１−シクロヘキシルエタン−１−オール）−ヒアルロン酸（Ａ６−３）、ジクロフェナク（４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルエステル）−ヒアルロン酸（Ａ６−４）について、上記試験例Ａ４と同様の条件でリリース試験を行った。結果を下表に示した。
【０３５６】
【表２９】
2019059951.tif 000060
【０３５７】
＜試験例Ａ７＞  実施例２６〜２８で得られたコンジュゲートのリリース試験
上記で合成したジクロフェナク（１−アミノ−２−プロパノール）−ヒアルロン酸、ジクロフェナク（セリンエチルエステル）−ヒアルロン酸、ジクロフェナク（トレオニンエチルエステル）−ヒアルロン酸について、以下の条件でリリース試験を行った。
【０３５８】
クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．１に各コンジュゲートを１％濃度で溶解し分注した。溶解直後に、初期状態（保存０日）として溶液に存在した遊離ジクロフェナク成分量をＯＤＳ−ＨＰＬＣにて定量分析した。他の分注液を溶解直後から４０℃の保存条件に付し、４週間後にジクロフェナクエステルの分解量を同様に定量分析し、溶液中の遊離ジクロフェナク含有量を算出した。結果を下表に示した。なお、ＨＰＬＣ試料の前処理方法は以下の通りであった。
【０３５９】
保存溶液  １ｇに１ｍＬのメタノールを加えて希釈し、２０ｍＬまでアセトニトリルを加えてヒアルロン酸成分を析出させた。得られた上清をＨＰＬＣ試料とした。
ＨＰＬＣ条件は以下のとおり。
カラム：ＴＳＧｇｅｌ  ＯＤＳ−１００Ｚ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
温度：３５℃
グラジエント：アセトニトリル／２０ｍＭリン酸ナトリウム＝０．４０（０ｍｉｎ）〜０．６８（２１ｍｉｎ）
【０３６０】
【表３０】
2019059951.tif 000061
【０３６１】
＜試験例Ａ８＞  実施例２９〜３１で得られたコンジュゲートのリリース試験
（スペーサーの違いによる遊離特性の変化）
化合物２９−３、３０−３及び３１−３を５ｍｇ／１０ｍＬ（０．０５ｗ／ｗ％）となるよう各ｐＨの緩衝液に溶解したのち、３６℃恒温槽中で１週間加温し、その間の薬物遊離率（％）を試験例Ａ１と同様に評価した。評価結果を以下に示す。
【０３６２】
【表３１】
2019059951.tif 000062
【０３６３】
＜試験例Ａ９＞  実施例２６、３２で得られたコンジュゲートのリリース試験
上記で合成したジクロフェナク（１−アミノ−２−プロパノール）−ヒアルロン酸、ジクロフェナク−（２−アミノエタノール）−ヒアルロン酸について、以下の条件でリリース試験を行った。
クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．１に各コンジュゲートを１％濃度で溶解し分注した。溶解直後に、初期状態（保存０日）として溶液に存在した遊離ジクロフェナク成分量をＯＤＳ−ＨＰＬＣにて定量分析した。他の分注液を溶解直後から６０℃、４０℃及び２５℃の保存条件に付し、各時間経過後にジクロフェナクエステルの分解量を同様に定量分析した。こうして得られた各時点での遊離ジクロフェナク成分量と、上記の強制分解による遊離ジクロフェナク成分量の比から、遊離率（％）を算出した。なお、ＨＰＬＣ試料の前処理にはＯＡＳＩＳ  ＨＬＢを用い、アセトニトリル溶出画分を分析した。
ＨＰＬＣ条件は以下のとおり。
カラム：ＴＳＧｇｅｌ  ＯＤＳ−１００Ｚ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
温度：３５℃
グラジエント：アセトニトリル／２０ｍＭリン酸ナトリウム＝０．４０（０ｍｉｎ）〜０．６８（２１ｍｉｎ）
【０３６４】
６０℃
【表３２】
2019059951.tif 000063
【０３６５】
４０℃
【表３３】
2019059951.tif 000064
【０３６６】
２５℃
【表３４】
2019059951.tif 000065
【０３６７】
＜試験例Ａ１０＞
実施例３５及び３６で合成したベザフィブラート（２−アミノエタノール）−コンドロイチン硫酸及びベザフィブラート（２−アミノ−１−シクロヘキシルエタン−１−オール）−コンドロイチン硫酸について、以下の条件でリリース試験を行った。
２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０に各コンジュゲートを０．１％濃度で溶解し分注した。溶解直後に初期状態（保存０日）として溶液に存在した遊離ベザフィブラート成分量、及び塩基性にて強制分解したベザフィブラートエステル量についてＯＤＳ−ＨＰＬＣにて定量分析した。ほかの分注液を溶解直後から３６℃の保存条件に付し、１、４、８、１６及び２４日後にベザフィブラートエステルの分解量を同様に定量分析した。こうして得られた各時点での遊離ベザフィブラート成分量と、上記の強制分解による遊離ベザフィブラート成分量の比の値から、遊離率（％）を算出した。なお、ＨＰＬＣ試料の前処理にはＯＡＳＩＳ  ＨＬＢを用い、アセトニトリル溶出画分を分析した。
ＨＰＬＣ条件は以下のとおり。
カラム：ＴＳＧｇｅｌ  ＯＤＳ−１００Ｚ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
温度：３５℃
グラジエント：アセトニトリル／２０ｍＭリン酸ナトリウム＝０．４６
【０３６８】
【表３５】
2019059951.tif 000066
【０３６９】
＜試験例Ｂ１＞  正常ラットにおける各種ベタメタゾン結合コンドロイチン硫酸の気管内投与後の肺組織中残留試験
１）試験系
試験系には、ＢＮ／ＣｒｌＣｒｌｊラット  （日本チャールス・リバー株式会社、５週齢）を用いた。
２）試験物質
試験物質には、各種ハロゲン導入ベタメタゾン結合コンドロイチン硫酸（Ｆ導入：ベタメタゾン（Ｆ）−ＣＳ、Ｂｅｔａ−Ｆ−ＣＳ；Ｃｌ導入：ベタメタゾン（Ｃｌ）−ＣＳ、Ｂｅｔａ−Ｃｌ−ＣＳ）及びハロゲン非導入ベタメタゾン結合コンドロイチン硫酸（ベタメタゾン（Ｈ）−ＣＳ、Ｂｅｔａ−Ｈ−ＣＳ）を用い、ベタメタゾン濃度が３ｍｇ／ｍＬとなるよう、りん酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）にて調製したものを用いた。また、りん酸ベタメタゾンをＰＢＳで３ｍｇ／ｍＬとなるよう懸濁した比較用の試験物質を調製した。
３）試験物質の投与
各試験物質の投与は、試験系を全身麻酔下で背位固定し、気管内投与用ゾンデ（ＭｉｃｒｏＳｐｒａｙｅｒ(R)Ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ＩＡ−１Ｂ、Ｐｅｎｎ−Ｃｅｎｔｕｒｙ製）を用いて１００μＬの用量で気管内投与した。全身麻酔は、小動物用麻酔器（ＴＫ−４、バイオマシナリー製）に充填したイソフルラン（フォーレン（登録商標）、大日本製薬株式会社製）の吸入麻酔（濃度３．０％、流量２．０Ｌ／ｍｉｎ）を用いた。
４）肺組織中ベタメタゾン含量測定
試験物質投与後、４、２４、４８、７２及び１６８時間にペントバルビタール麻酔下でハサミとピンセットを用いて肺組織を採取した。なお、評価時点毎３例にて実施した。得られた肺組織は、ポリプロピレン製チューブへ採取したのち、その重量を測定した。ギ酸アンモニウム水溶液（ｐＨ６．０）：メタノール（３：２，ｖ／ｖ）を４０倍量の割合（１ｇ：４０ｍＬ）で加え、ヒスコトロンホモジナイザーを用いて、氷冷下で約１分間ホモジネートした。得られた肺組織ホモジネートを測定試料とした。得られた測定試料は、測定するまで冷凍保存（−２０℃設定）した。肺組織中ベタメタゾン含量は、測定試料をクロロホルム・メタノール抽出し、Ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  （ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）にて測定した。
５）薬物動態パラメータ
得られた肺組織中ベタメタゾン含量より、薬物動態パラメータを算出した。各薬物動態パラメータは平均肺組織中含量推移より算出した。平均肺組織中含量は、測定値が定量下限値未満（＜１０ｎｇ／ｇ）の個体があった場合、０を代入して算出した。ＡＵＣ０−ｔ算出における時間ｔ（ｈｒ）は、定量可能な最終時点とした。なお、薬物動態パラメータの算出にはＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｖｅｒ  ５．２．１のＮｏｎ−ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｍｏｄｅｌ解析を用いた。
６）結果
結果を図１及び下表に示した。正常ラットにベタメタゾン結合コンドロイチン硫酸を気管内投与した際、最終評価時点である投与後１６８時間まで、投与局所において、ベタメタゾンの曝露が認められた。投与後１６８時間までの曝露量は、Ｂｅｔａ−Ｆ−ＣＳが最も高値を示した。一方、ベタメタゾン単剤は、投与後４８時間までしか曝露は認められなかった（定量下限値：１０ｎｇ／ｇ）。正常ラットにベタメタゾン結合コンドロイチン硫酸気管内投与後のベタメタゾンの消失半減期は、２９．５〜１２８．０時間であった。一方、ベタメタゾン単剤を気管内投与した際の肺組織中ベタメタゾン含量の消失半減期は、８．７時間であった。
【０３７０】
【表３６】
2019059951.tif 000067
【０３７１】
＜試験例Ｂ２＞  正常ラットにおける各種ベタメタゾン結合コンドロイチン硫酸気管内投与後の全身曝露試験
各種ベタメタゾン結合コンドロイチン硫酸気管内投与後の全身曝露は、試験例Ｂ１における各試験物質投与ラットにおける血漿中濃度より評価した。
１）血漿中ベタメタゾン濃度測定
試験物質投与後０．５、１、２、４、８、２４、４８、７２及び１６８時間に、ヘパリン処理した２７Ｇの注射針付きのテルモシリンジを用いて頸静脈より３００μＬ採血し、血液をＰＰ製容器（１．５ｍＬ、アシスト製）へ採取した。その後、血液を速やかに遠心分離（１８００×ｇ、４℃、１５ｍｉｎ）した。得られた血漿１００μＬをＰＰ製容器（１．５ｍＬ、アシスト製）に移し、９００μＬのギ酸アンモニウム水溶液（ｐＨ６．０）：メタノール（１：２，ｖ／ｖ）を添加し、攪拌した。これを測定試料とし、測定をするまで、冷凍保存（−２０℃設定）した。血漿中ベタメタゾン濃度は、測定試料をクロロホルム・メタノール抽出し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにて測定した。
２）薬物動態パラメータ
得られた血漿中ベタメタゾン濃度より、薬物動態パラメータを算出した。各薬物動態パラメータは平均血漿中含量推移より算出した。平均血漿中濃度は、測定値が定量下限値未満（＜５ｎｇ／ｍＬ）の個体があった場合、０を代入して算出した。なお、薬物動態パラメータの算出にはＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｖｅｒ  ５．２．１のＮｏｎ−ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｍｏｄｅｌ解析を用いた。
３）結果
結果を図２及び下表に示した。正常ラットにベタメタゾン結合コンドロイチン硫酸を気管内投与した際の最高血漿中ベタメタゾン濃度は、ベタメタゾン単剤投与時と比較し、低値（約１／３〜１／１００）を示した。
【０３７２】
【表３７】
2019059951.tif 000068
【０３７３】
＜試験例Ｂ３＞  硝酸銀誘発ラット筋障害疼痛モデルにおける非ステロイド性抗炎症薬結合コンドロイチン硫酸の作用検討
Ｂ３−１．目的
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）を導入したコンドロイチン硫酸誘導体を評価することを目的に、当該モデルにおけるケトプロフェン結合コンドロイチン硫酸（ＫＰ−（Ｆ，Ｆ）−ＣＳ）、インドメタシン結合コンドロイチン硫酸（ＩＭ−（Ｆ，Ｆ）−ＣＳ）、フェルビナク結合コンドロイチン硫酸（ＦＢ−（Ｆ，Ｆ）−ＣＳ）及びジクロフェナク結合コンドロイチン硫酸（ＤＦ−ＣＳ）の鎮痛作用を評価した。
【０３７４】
Ｂ３−２．方法
起炎剤には０．１ｍｏｌ／Ｌ硝酸銀溶液を０．２２μｍフィルターでろ過したものを用いた。全身麻酔には小動物用麻酔器（ＴＫ−４、株式会社バイオマシナリー）に充填したイソフルランの吸入麻酔（濃度３．０％、流量２．０  Ｌ／ｍｉｎ）を用いた。
ラット（Ｃｒｊ：ＳＤ系（ＳＰＦ）、雄性、５週齢）を全身麻酔下で背位固定し、左腓腹筋周辺を広くバリカンで剃毛した。注射部位周辺を７０％アルコールで噴霧消毒し、インスリン皮下投与用針付注射筒（マイジェクター（登録商標）、テルモ株式会社）を用いて０．１  ｍｏｌ／Ｌ硝酸銀溶液を１００  μＬ／ｓｉｔｅの容量でラットの左腓腹筋内側に筋肉内投与し、硝酸銀誘発ラット筋肉障害疼痛モデルを作製した。
【０３７５】
各々、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）を溶媒とする下記を被験物質として調製した。
試験物質：
（１）ＰＢＳ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）
（２）１％（ｗ／ｖ％）ジクロフェナク結合コンドロイチン硫酸（ＤＦ−ＣＳ）
（３）５％（ｗ／ｖ％）フッ素導入インドメタシン結合コンドロイチン硫酸（ＩＭ−（Ｆ，Ｆ）−ＣＳ）
（４）５％（ｗ／ｖ％）フッ素導入ケトプロフェン結合コンドロイチン硫酸（ＫＰ−（Ｆ，Ｆ）−ＣＳ）
（５）５％（ｗ／ｖ％）フッ素導入フェルビナク結合コンドロイチン硫酸（ＦＢ−（Ｆ，Ｆ）−ＣＳ）
【０３７６】
０．１ｍｏｌ／Ｌ硝酸銀溶液投与後２４時間に、ラットを５群に群分けし、各群に被験物質あるいはＰＢＳを投与した。投与方法は、疼痛惹起物質と同様、イソフルランによる吸入麻酔下、腓腹筋周囲を７０％アルコールで噴霧消毒し、２９Ｇインスリン皮下投与用針付注射筒を用いて１００μＬ／ｓｉｔｅの容量で左腓腹筋内側に筋肉内投与した。
試験物質投与後２４、４８及び７２時間に、各個体の歩行状態をブラインド下で肉眼観察し、以下の基準に従って４段階にスコア化した。結果は図３に示す。
図３において、結果は、平均疼痛スコア±標準誤差（各群例数＝８）によって示した。また、＊＊＊及び＊は、パラメトリックＴｕｋｅｙ検定において、それぞれ＊＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５（ｖｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。
【０３７７】
（基準）
スコア０：正常
スコア１：軽度の跛行
スコア２：重度の跛行
スコア３：三足歩行
【０３７８】
また、試験物質投与後２４、４８及び７２時間のスコア評価後のラットをブラインド下で軍手内で保持し、左腓腹筋内側頭の皮膚上から、鈍な先端のプローブを取り付けたラット鎮痛効果測定装置（Ｒａｎｄａｌｌ−Ｓｅｌｉｔｔｏ法、室町機械株式会社）を用いて加圧した。逃避行動などの痛み行動が出現した際の錘移動距離を小数点以下１桁まで読み取った。この操作を計３回繰り返し、中央値を筋圧痛閾値とした。結果は図４に示す。
図４において、結果は、平均刺激圧スコア±標準誤差（各群例数＝８）によって示した。また、＊＊＊及び＊は、パラメトリックＴｕｋｅｙ検定において、それぞれ＊＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５（ｖｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。
【０３７９】
Ｂ３−４．結果
図３より、１％ＤＦ−ＣＳ、５％ＩＭ−（Ｆ，Ｆ）−ＣＳ  、５％ＫＰ−（Ｆ，Ｆ）−ＣＳ  はＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意に疼痛スコアを改善した。一方、５％ＦＢ−（Ｆ，Ｆ）−ＣＳは、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較し有意な差は認められなかったもののＣｏｎｔｒｏｌ群と比較していずれの評価時点においても低値であった。
また、図４より、１％ＤＦ−ＣＳ、５％ＩＭ−（Ｆ，Ｆ）−ＣＳ  、５％ＫＰ−（Ｆ，Ｆ）−ＣＳ  及び５％ＦＢ−（Ｆ，Ｆ）−ＣＳは、いずれもＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意に筋圧痛閾値を上昇させた。それらの化合物間に明確な違いは認められなかった。
【０３８０】
＜試験例Ｂ４＞  硝酸銀誘発ラット筋障害疼痛モデルにおけるケトプロフェン結合コンドロイチン硫酸の作用検討
Ｂ４−１．目的
スペーサーの結合様式の異なるケトプロフェン結合コンドロイチン硫酸（ＫＰ−ＣＳ、ＫＰ−（Ｆ）−ＣＳ及びＫＰ−（Ｆ，Ｆ）−ＣＳ）の鎮痛作用を比較し、リリース速度の差異が薬効に与える影響を検証することを目的とした。
【０３８１】
Ｂ４−２．方法
上記試験例Ｂ３の実験手順に準じ実験を行い、下記試験物質に関する評価を行った。
試験物質：
（１）ＰＢＳ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）
（２）５％（ｗ／ｖ％）ケトプロフェン結合コンドロイチン硫酸溶液（ＫＰ−ＣＳ）
（３）５％（ｗ／ｖ％）フッ素導入ケトプロフェン結合コンドロイチン硫酸溶液（ＫＰ−（Ｆ）−ＣＳ）
（４）５％（ｗ／ｖ％）フッ素導入ケトプロフェン結合コンドロイチン硫酸溶液（ＫＰ−（Ｆ，Ｆ）−ＣＳ）
【０３８２】
上記試験例Ｂ３と同様に各個体の歩行状態をブラインド下で肉眼観察し、以下の基準に従って４段階にスコア化した。結果は図５に示す。
図５において、結果は、平均疼痛スコア±標準誤差（各群例数＝１０）によって示した。また、＊＊＊及び＊＊は、パラメトリックＤｕｎｎｅｔｔ検定において、それぞれ＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１（ｖｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。
【０３８３】
（基準）
スコア０：正常
スコア１：軽度の跛行
スコア２：重度の跛行
スコア３：三足歩行
【０３８４】
また、上記試験例Ｂ３と同様にブラインド下でラット鎮痛効果測定装置を用いて加圧し、筋圧痛閾値を評価した。結果は図６に示す。
図６において、結果は、平均刺激圧スコア±標準誤差（各群例数＝１０）によって示した。また、＊＊＊は、パラメトリックＤｕｎｎｅｔｔ検定において、＊＊＊ｐ＜０．００１（ｖｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。
【０３８５】
Ｂ４−３．結果
図５より、ＫＰ−（Ｆ）−ＣＳ及びＫＰ−（Ｆ，Ｆ）−ＣＳ群はＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意な疼痛スコアの改善作用を示した。一方、ＫＰ−ＣＳ群は、投与後１日に僅かにスコアが低値であったもののその作用は弱く、Ｃｏｎｔｒｏｌ群との間に有意な差は見られなかった。
図６より、ＫＰ−（Ｆ）−ＣＳ及びＫＰ−（Ｆ，Ｆ）−ＣＳ群は、いずれもＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意に筋圧痛閾値を上昇させた。その２群間に差は見られなかった。一方、ＫＰ−ＣＳ群とＣｏｎｔｒｏｌ群との間に有意な差は見られず、それらは投与後３日間ほぼ同様に推移した。
【０３８６】
Ｂ４−４．結論
５％ＫＰ−（Ｆ）−ＣＳ及び５％ＫＰ−（Ｆ，Ｆ）−ＣＳはいずれも３日間の鎮痛作用を示した。一方、５％ＫＰ−ＣＳは、疼痛スコアの改善作用及び圧疼痛閾値の上昇作用を示さなかった。別途、ｉｎ  ｖｉｔｒｏリリース試験において、ＫＰ−（Ｆ，Ｆ）−ＣＳ  ＞  ＫＰ−（Ｆ）−ＣＳ  ＞  ＫＰ−ＣＳの順でＫＰのリリースが早くなることが確認されており、結合体からリリースされたＫＰが鎮痛作用を発揮していると推察された。
【０３８７】
＜試験例Ｂ５＞  硝酸銀誘発ラット筋障害疼痛モデルにおける結合様式の異なるジクロフェナク結合ヒアルロン酸の作用検討
Ｂ５−１．目的
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）を導入したヒアルロン酸誘導体の結合様式の違いによる薬効への影響を検証することを目的に、当該モデルにおけるジクロフェナク結合ヒアルロン酸（ジクロフェナク−アミノエタノール−ヒアルロン酸：ＤＦ−ＨＡ） 、立体障害基導入ジクロフェナク結合ヒアルロン酸（ジクロフェナク−（１−アミノ−２−プロパノール）−ヒアルロン酸：ＤＦ−（Ｍｅ）−ＨＡ）の鎮痛作用を評価した。
【０３８８】
Ｂ５−２．方法
起炎剤には０．１ｍｏｌ／Ｌ硝酸銀溶液を０．２２μｍフィルターでろ過したものを用いた。全身麻酔には小動物用麻酔器（ＴＫ−４、株式会社バイオマシナリー）に充填したイソフルランの吸入麻酔（濃度３．０％、流量２．０Ｌ／ｍｉｎ）を用いた。
ラット（Ｃｒｊ：ＳＤ系（ＳＰＦ）、雄性、５週齢）を全身麻酔下で背位固定し、左腓腹筋周辺を広くバリカンで剃毛した。注射部位周辺を７０％アルコールで噴霧消毒し、インスリン皮下投与用針付注射筒（マイジェクター（登録商標）、テルモ株式会社）を用いて０．１ｍｏｌ／Ｌ硝酸銀溶液を１００μＬ／ｓｉｔｅの容量でラットの左腓腹筋内側に筋肉内投与し、硝酸銀誘発ラット筋肉障害疼痛モデルを作製した。
【０３８９】
各々、クエン酸緩衝液を溶媒とする下記を被験物質として調製した。
試験物質：
（１）クエン酸緩衝液（Ｃｏｎｔｒｏｌ）
（２）１％（ｗ／ｖ％）ジクロフェナク結合ヒアルロン酸（ＤＦ−ＨＡ）
（３）１％（ｗ／ｖ％）立体障害基導入ジクロフェナク結合ヒアルロン酸（ＤＦ−(Ｍｅ)−ＨＡ）
【０３９０】
０．１  ｍｏｌ／Ｌ硝酸銀溶液投与後２４時間に、ラットを３群に群分けし、各群に被験物質あるいはクエン酸緩衝液を投与した。投与方法は、疼痛惹起物質と同様、イソフルランによる吸入麻酔下、腓腹筋周囲を７０％アルコールで噴霧消毒し、２９Ｇインスリン皮下投与用針付注射筒を用いて１００μＬ／ｓｉｔｅの容量で左腓腹筋内側に筋肉内投与した。
試験物質投与後２４、４８及び７２時間に、各個体の歩行状態をブラインド下で肉眼観察し、以下の基準に従って４段階にスコア化した。結果は図７に示す。
図７において、結果は、平均疼痛スコア±標準誤差（各群例数＝８）によって示した。また、＊＊及び＊は、パラメトリックＴｕｋｅｙ検定において、それぞれ＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５（ｖｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。
【０３９１】
（基準）
スコア０：正常
スコア１：軽度の跛行
スコア２：重度の跛行
スコア３：三足歩行
【０３９２】
また、試験物質投与後２４、４８及び７２時間のスコア評価後のラットをブラインド下で軍手内で保持し、左腓腹筋内側頭の皮膚上から、鈍な先端のプローブを取り付けたラット鎮痛効果測定装置（Ｒａｎｄａｌｌ−Ｓｅｌｉｔｔｏ法、室町機械株式会社）を用いて加圧した。逃避行動などの痛み行動が出現した際の錘移動距離を小数点以下１桁まで読み取った。この操作を計３回繰り返し、中央値を筋圧痛閾値とした。結果は図８に示す。
図８において、結果は、平均刺激圧スコア±標準誤差（各群例数＝８）によって示した。また、＊＊＊は、パラメトリックＴｕｋｅｙ検定において、＊＊＊ｐ＜０．００１（ｖｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。
【０３９３】
Ｂ５−３．結果
図７より、１％ＤＦ−ＨＡ及び１％ＤＦ−(Ｍｅ)−ＨＡはＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意に疼痛スコアを改善した。化合物間に明確な違いは認められなかった。
また、図８より、１％ＤＦ−ＨＡ及び１％ＤＦ−(Ｍｅ)−ＨＡは、いずれもＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意に筋圧痛閾値を上昇させた。それらの化合物間の作用に明確な違いは認められず、投与後３日間ほぼ同様に推移した。
【０３９４】
Ｂ５−４．結論
１％ＤＦ−ＨＡ及び１％ＤＦ−(Ｍｅ)−ＨＡはいずれも３日間の鎮痛作用を示した。それらの化合物間の作用に有意な差は認められず、それらの投与後３日間の鎮痛作用は同様と考えられた。
【０３９５】
＜試験例Ｂ６＞  カラゲニン誘発ラット筋障害疼痛モデルにおけるジクロフェナク結合ヒアルロン酸の作用検討
Ｂ６−１．目的
ジクロフェナク結合ヒアルロン酸ナトリウム（ＤＦ−ＨＡ）の筋肉内投与における鎮痛作用についてその持続性を検証することを目的に、当該モデルにおけるＤＦ−ＨＡの投与１０日後の鎮痛作用を評価した。
【０３９６】
Ｂ６−２．方法
クエン酸緩衝液を溶媒とする下記を被験物質として調製した。
試験物質：
（１）クエン酸緩衝液（Ｃｏｎｔｒｏｌ）
（２）１％（ｗ／ｖ％）ジクロフェナク結合ヒアルロン酸（ＤＦ−ＨＡ）
【０３９７】
起炎剤には１０ｍｇ／ｍＬカラゲニン溶液を用いた。全身麻酔には小動物用麻酔器（ＴＫ−４、株式会社バイオマシナリー）に充填したイソフルランの吸入麻酔（濃度３．０％、流量２．０Ｌ／ｍｉｎ）を用いた。
ラット（Ｃｒｊ：ＳＤ系（ＳＰＦ）、雄性、８週齢）を全身麻酔下で背位固定し、左腓腹筋周辺を広くバリカンで剃毛した。注射部位周辺を７０％アルコールで噴霧消毒し、インスリン皮下投与用針付注射筒（マイジェクター（登録商標）、テルモ株式会社）を用いて各試験物質を１００μＬ／ｓｉｔｅの容量でラットの左腓腹筋内側に筋肉内投与した。
試験物質投与後１０日に、各群に１０  ｍｇ／ｍＬカラゲニン溶液を投与した。投与方法は、試験物質と同様、イソフルランによる吸入麻酔下、腓腹筋周囲を７０％アルコールで噴霧消毒し、２９Ｇインスリン皮下投与用針付注射筒を用いて１００μＬ／ｓｉｔｅの容量で左腓腹筋内側に筋肉内投与した。
カラゲニン溶液投与後３時間に、各個体におけるＰＡＭ鎮痛効果測定装置（バイオリサーチセンター株式会社）による投与部位の刺激圧評価を行った。具体的には、投与部位（腓腹筋内側頭）への圧刺激によって、ラットが逃避反応（足の引っ込み行動、鳴き声、身震いなど）を示した際の刺激圧（Ｎ（ニュートン））を測定した。結果は図９に示す。
図９において、結果は、平均刺激圧±標準誤差（各群例数＝７）によって示した。また、＊は、ｔ検定において、＊ｐ＜０．０５（ｖｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。
【０３９８】
Ｂ６−３．結果
図９より、１０日前に筋肉内投与された１％ＤＦ−ＨＡはＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意に筋圧痛閾値を上昇させた。
【０３９９】
Ｂ６−４．結論
筋肉内投与された１％ＤＦ−ＨＡは投与後１０日間の鎮痛作用を示すことが明らかとなった。
【０４００】
＜試験例Ｂ７＞  カラゲニン誘発ラット筋障害疼痛モデルにおける結合様式の異なるジクロフェナク結合ヒアルロン酸ナトリウムの作用検討
Ｂ７−１．目的
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）を導入したヒアルロン酸誘導体の結合様式の違いによる薬効持続性への影響を検証することを目的に、当該モデルにおけるジクロフェナク結合ヒアルロン酸（ジクロフェナク−アミノエタノール−ヒアルロン酸：ＤＦ−ＨＡ）、立体障害基導入ジクロフェナク結合ヒアルロン酸（ジクロフェナク−（１−アミノ−２−プロパノール）−ヒアルロン酸：ＤＦ−（Ｍｅ）−ＨＡ）の投与後１４日の鎮痛作用を評価した。
【０４０１】
Ｂ７−２．方法
各々、クエン酸緩衝液を溶媒とする下記を被験物質として調製した。
試験物質：
（１）クエン酸緩衝液（Ｃｏｎｔｒｏｌ）
（２）１％（ｗ／ｖ％）ジクロフェナク結合ヒアルロン酸（ＤＦ−ＨＡ）
（３）１％（ｗ／ｖ％）立体障害基導入ジクロフェナク結合ヒアルロン酸（ＤＦ−(Ｍｅ)−ＨＡ）
【０４０２】
起炎剤には１０ｍｇ／ｍＬカラゲニン溶液を用いた。全身麻酔には小動物用麻酔器（ＴＫ−４、株式会社バイオマシナリー）に充填したイソフルランの吸入麻酔（濃度３．０％、流量２．０Ｌ／ｍｉｎ）を用いた。
ラット（Ｃｒｊ：ＳＤ系（ＳＰＦ）、雄性、７週齢）を全身麻酔下で背位固定し、左腓腹筋周辺を広くバリカンで剃毛した。注射部位周辺を７０％アルコールで噴霧消毒し、インスリン皮下投与用針付注射筒（マイジェクター（登録商標）、テルモ株式会社）を用いて各試験物質を１００μＬ／ｓｉｔｅの容量でラットの左腓腹筋内側に筋肉内投与した。
試験物質投与後１４日に、各群に１０ｍｇ／ｍＬカラゲニン溶液を投与した。投与方法は、試験物質と同様、イソフルランによる吸入麻酔下、腓腹筋周囲を７０％アルコールで噴霧消毒し、２９Ｇインスリン皮下投与用針付注射筒を用いて１００μＬ／ｓｉｔｅの容量で左腓腹筋内側に筋肉内投与した。
カラゲニン溶液投与後３時間に、各個体におけるＰＡＭ鎮痛効果測定装置（バイオリサーチセンター株式会社）による投与部位の刺激圧評価を行った。具体的には、投与部位（腓腹筋内側頭）への圧刺激によって、ラットが逃避反応（足の引っ込み行動、鳴き声、身震いなど）を示した際の刺激圧（Ｎ（ニュートン））を測定した。結果は図１０に示す。
図１０において、結果は、平均刺激圧±標準誤差（各群例数＝１０）によって示した。
【０４０３】
Ｂ７−３．結果
図１０より、１４日前に筋肉内投与された１％ＤＦ−ＨＡは筋圧痛閾値の上昇作用を示さず、Ｃｏｎｔｒｏｌ群との間に有意な差は認められなかった。一方、１％ＤＦ−（Ｍｅ）−ＨＡはＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意に（ｔ検定においてｐ＜０．０５（ｖｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ））筋圧痛閾値を上昇させた。
【０４０４】
Ｂ７−４．結論
筋肉内投与された１％ＤＦ−ＨＡの鎮痛作用は１４日未満であるのに対し、１％ＤＦ−（Ｍｅ）−ＨＡは１４日間の鎮痛作用を示すことが明らかとなった。ＤＦ−（Ｍｅ）−ＨＡのＤＦ−ＨＡと比較した薬効の持続性が明確となった。
【０４０５】
以上から、本実施形態のＧＡＧ誘導体は、薬物の構造に大きく依存せずに薬物遊離速度を制御することが可能であることが分かる。また、投与位置において所望の期間の薬物放出が可能であることが分かる。
【０４０６】
＜試験例Ｂ８＞  カラゲニン誘発ラット筋障害疼痛モデルにおけるジクロフェナク結合コンドロイチン硫酸の作用検討
Ｂ８−１．目的
ジクロフェナク結合コンドロイチン硫酸（ジクロフェナク−（２−アミノエタノール）−コンドロイチン硫酸： ＤＦ−ＣＳ）の筋肉内投与における鎮痛作用についてその持続性を検証することを目的に、当該モデルにおけるＤＦ−ＣＳの投与７日後の鎮痛作用を評価した。
【０４０７】
Ｂ８−２．方法
ＰＢＳを溶媒とする下記を試験物質として調製した。
試験物質：
（１）ＰＢＳ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）
（２）１％（ｗ／ｖ％）ジクロフェナク結合コンドロイチン硫酸（ＤＦ−ＣＳ）
【０４０８】
起炎剤には１０ｍｇ／ｍＬカラゲニン溶液を用いた。全身麻酔には小動物用麻酔器（ＴＫ−４、株式会社バイオマシナリー）に充填したイソフルランの吸入麻酔（濃度３．０％、流量２．０Ｌ／ｍｉｎ）を用いた。
ラット（Ｃｒｊ：ＳＤ系（ＳＰＦ）、雄性、９週齢）を全身麻酔下で背位固定し、左腓腹筋周辺を広くバリカンで剃毛した。注射部位周辺を７０％アルコールで噴霧消毒し、インスリン皮下投与用針付注射筒（マイジェクター（登録商標）、テルモ株式会社）を用いて試験物質を１００μＬ／ｓｉｔｅの容量でラットの左腓腹筋内側に筋肉内投与した。
試験物質投与後７日に、各群に１０  ｍｇ／ｍＬカラゲニン溶液を投与した。投与方法は、試験物質と同様、イソフルランによる吸入麻酔下、腓腹筋周囲を７０％アルコールで噴霧消毒し、２９Ｇインスリン皮下投与用針付注射筒を用いて１００μＬ／ｓｉｔｅの容量で左腓腹筋内側に筋肉内投与した。
カラゲニン溶液投与後３時間に、各個体におけるＰＡＭ鎮痛効果測定装置（バイオリサーチセンター株式会社）による投与部位の刺激圧評価を行った。具体的には、投与部位（腓腹筋内側頭）への圧刺激によって、ラットが逃避反応（足の引っ込み行動、鳴き声、身震いなど）を示した際の刺激圧（Ｎ（ニュートン））を測定した。結果は図１１に示す。
図１１において、結果は、平均刺激圧±標準誤差（各群例数＝６又は７）によって示した。また、＊は、ｔ検定において、＊ｐ＜０．０５（ｖｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。
【０４０９】
Ｂ８−３．結果
図１１より、７日前に筋肉内投与された１％ＤＦ−ＣＳはＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意に筋圧痛閾値を上昇させた。
【０４１０】
Ｂ８−４．結論
筋肉内投与された１％ＤＦ−ＣＳは投与後７日間の鎮痛作用を示すことが明らかとなった。
【０４１１】
＜試験例Ｂ９＞  カラゲニン誘発ラット筋障害疼痛モデルにおけるジクロフェナク結合コンドロイチン硫酸の作用検討
Ｂ９−１．目的
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）を導入したコンドロイチン硫酸誘導体の結合様式の違いによる薬効持続性への影響を検証することを目的に、当該モデルにおける、スペーサーの結合様式の異なるジクロフェナク結合コンドロイチン硫酸（ＤＦ−（Ｍｅ）−ＣＳ、ＤＦ−（Ｔｈｒ）−ＣＳ及びＤＦ−（Ｓｅｒ）−ＣＳ）の投与後１０日の鎮痛作用を評価した。
【０４１２】
Ｂ９−２．方法
ＰＢＳを溶媒とする下記を試験物質として調製した。
試験物質：
（１）ＰＢＳ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）
（２）１％（ｗ／ｖ％）ジクロフェナク−（１−アミノ−２−プロパノール）−コンドロイチン硫酸（ＤＦ−（Ｍｅ）−ＣＳ）
（３）１％（ｗ／ｖ％）ジクロフェナク（トレオニンエチルエステル）−コンドロイチン硫酸（ＤＦ−（Ｔｈｒ）−ＣＳ）
（４）１％（ｗ／ｖ％）ジクロフェナク（セリンエチルエステル）−コンドロイチン硫酸（ＤＦ−（Ｓｅｒ）−ＣＳ）
【０４１３】
上記試験例Ｂ６の実験手順に準じ実験を行った。結果を図１２に示す。
図１２において、結果は、平均刺激圧±標準誤差（各群例数＝８）によって示した。また、＊は、ｔ検定において、＊ｐ＜０．０５（ｖｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。
【０４１４】
Ｂ９−３．結果
図１２より、１０日前に筋肉内投与された１％ＤＦ−（Ｍｅ）−ＣＳはＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意に筋圧痛閾値を上昇させた。
【０４１５】
Ｂ９−４．結論
筋肉内投与された１％ＤＦ−（Ｍｅ）−ＣＳは投与後１０日間の鎮痛作用を示すことが明らかとなった。
【０４１６】
以上より、グリコサミノグリカンにスペーサーを介して連結する生理活性物質としてジクロフェナクを選択した場合、スペーサー形成分子であるアミノアルコールが有する連結基に導入される置換基を、電子吸引基としたときに比べ、立体障害性基としたときの方が、当該グリコサミノグリカン誘導体による疼痛抑制効果が持続することが示された。
【０４１７】
日本国特許出願２０１３−１４４３６４号（出願日：２０１３年７月１０日）及び日本国特許出願２０１３−１４４３６５号（出願日：２０１３年７月１０日）の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。
【図１】
2019059951.tif 000069
【図２】
2019059951.tif 000070
【図３】
2019059951.tif 000071
【図４】
2019059951.tif 000072
【図５】
2019059951.tif 000073
【図６】
2019059951.tif 000074
【図７】
2019059951.tif 000075
【図８】
2019059951.tif 000076
【図９】
2019059951.tif 000077
【図１０】
2019059951.tif 000078
【図１１】
2019059951.tif 000079
【図１２】
2019059951.tif 000080
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月12日(2018.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコサミノグリカンと、カルボキシ基及びヒドロキシ基の少なくとも一方を有する生理活性物質とがスペーサーを介する共有結合で連結されたグリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容されうる塩であって、
前記グリコサミノグリカンが、コンドロイチン硫酸であり、
前記生理活性物質と前記スペーサーとが、エステル結合で共有結合し、
前記グリコサミノグリカンと前記スペーサーとが、アミド結合で共有結合し、
前記スペーサーが下記一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸に由来する２価の基、または下記一般式（ＩＩ）で表されるアミノアルコールに由来する２価の基であり；
−ＨＮ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＲ１１Ｒ１２−ＣＲ１３Ｒ１４−ＣＯ−  （Ｉ）
（式中、ｍは０〜１２の整数を示す。Ｒ１１及びＲ１２はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、スルホン酸基、アセタミド基、カルボキシ基、フルオロメチル基、ジメチルアミノ基、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、tert-ブチル基、シクロヘキシル基、又はフェニル基を示し、Ｒ１３及びＲ１４は水素原子を示す）；
−ＨＮ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＲ２１Ｒ２２−ＣＲ２３Ｒ２４−Ｏ−  （ＩＩ）
（式中、ｎは０〜１２の整数を示す。Ｒ２１及びＲ２２はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、スルホン酸基、アセタミド基、カルボキシ基、フルオロメチル基、ジメチルアミノ基、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、tert-ブチル基、シクロヘキシル基、又はフェニル基を示し、Ｒ２３及びＲ２４は水素原子を示す）；
ｐＨ７．５、３６℃のリン酸緩衝生理食塩液中における前記グリコサミノグリカン誘導体からの前記生理活性物質の遊離速度が、０．１〜１０％／日である、グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容されうる塩。
【請求項２】
グリコサミノグリカンと、生理活性物質と、前記グリコサミノグリカン及び前記生理活性物質を共有結合で連結するスペーサーとを有する、グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容されうる塩であって、
前記グリコサミノグリカンが、コンドロイチン硫酸であり、
前記生理活性物質がヒドロキシ基を有し、前記スペーサーを形成する化合物は当該ヒドロキシ基に対応してカルボキシ基を有し、前記生理活性物質と前記スペーサーとがエステル結合で共有結合し、
前記スペーサーを形成する化合物は前記コンドロイチン硫酸のカルボキシ基に対応してアミノ基を有し、前記グリコサミノグリカンと前記スペーサーとがアミド結合で共有結合し、
前記スペーサーを形成する化合物が、当該スペーサーの前記カルボキシ基及び前記アミノ基を連結する連結基を有し、当該カルボキシ基と当該アミノ基との間の長さが原子数２〜１２であり、
前記連結基は置換基を有していてもよく（ただし、当該置換基の位置が前記エステル結合のα位である場合を除く）、当該置換基はハロゲン原子、スルホン酸基、アセタミド基、カルボキシ基、フルオロメチル基、ジメチルアミノ基、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、tert-ブチル基、シクロヘキシル基、及びフェニル基からなる群から選択され、
ｐＨ７．５、３６℃のリン酸緩衝生理食塩液中におけるグリコサミノグリカン誘導体からの前記生理活性物質の遊離速度が、０．１〜１０％／日である、グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容されうる塩。
【請求項３】
グリコサミノグリカンと、生理活性物質と、前記グリコサミノグリカン及び前記生理活性物質を共有結合で連結するスペーサーとを有する、グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容されうる塩であって、
前記グリコサミノグリカンが、コンドロイチン硫酸であり、
前記生理活性物質がカルボキシ基を有し、前記スペーサーを形成する化合物は当該カルボキシ基に対応してヒドロキシ基を有し、前記生理活性物質と前記スペーサーとがエステル結合で共有結合し、
前記スペーサーを形成する化合物は前記コンドロイチン硫酸のカルボキシ基に対応してアミノ基を有し、前記グリコサミノグリカンと前記スペーサーとがアミド結合で共有結合し、
前記スペーサーを形成する化合物が、当該スペーサーの前記ヒドロキシ基及び前記アミノ基を連結する連結基を有し、当該ヒドロキシ基と当該アミノ基との間の長さが原子数２〜１２であり、
前記連結基は置換基を有していてもよく（ただし、当該置換基の位置が前記エステル結合のα位である場合を除く）、当該置換基はハロゲン原子、スルホン酸基、アセタミド基、カルボキシ基、フルオロメチル基、ジメチルアミノ基、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、tert-ブチル基、シクロヘキシル基、及びフェニル基からなる群から選択され、
ｐＨ７．５、３６℃のリン酸緩衝生理食塩液中におけるグリコサミノグリカン誘導体からの前記生理活性物質の遊離速度が、０．１〜１０％／日である、グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容されうる塩。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のグリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容されうる塩を含む医薬組成物。