(57)【要約】【課題】  水素の持続的生産方法、及び、水素生成装置を備えた建物を提供すること。【解決手段】  含窒素物質の存在下、ニトロゲナーゼを発現するヘテロシストを有する藍藻を培地中で培養することを含み、上記ニトロゲナーゼが、窒素固定能力が欠損または低下したものである、水素の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
含窒素物質の存在下、ニトロゲナーゼを発現するヘテロシストを有する藍藻を培地中で培養することを含み、
前記ニトロゲナーゼが、窒素固定能力が欠損または低下したものである、水素の製造方法。
【請求項２】
前記含窒素物質が、硝酸ナトリウムを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記含窒素物質の添加量が、培養液全量に対して０．１〜２ｍＭである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
水素を活用した発電ユニットを備えた建物であって、
藍藻を用いて水素を生成し、前記水素を上記発電ユニットに供給する水素生成装置を備え、
前記藍藻は、含窒素物質の存在下、ニトロゲナーゼを発現するヘテロシストを有し、前記ニトロゲナーゼは窒素固定活性が欠損または低下したものである、建物。
【請求項５】
前記水素生成装置は、前記藍藻を培養する培地を備えた水素生成部と、前記水素生成部に含窒素物質を供給する窒素供給部とを備えた、請求項４に記載の建物。
【請求項６】
前記発電ユニットの排熱を利用して温水を生成する給湯ユニットを更に備えた、請求項４又は５に記載の建物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、藍藻による水素の持続的生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
水素は近年、環境負荷の少ないエネルギー源として注目され、主に燃料電池システムを利用した自動車の開発も進んでいる。水素は、主に天然ガス、石油等の化石燃料から生産されているため、化石燃料の代替エネルギーとなるために新たな水素の生産方法の開発が期待されている。
【０００３】
藍藻（ラン色細菌、シアノバクテリアともいう。）は、ニトロゲナーゼによる水素生成能力を有しており、水素供給源の有力候補の１つである。
【０００４】
藍藻は、十数個の細胞につき１個の割合で異型細胞（ヘテロシスト）を形成している。ヘテロシストは外膜の外側に糖脂質の膜（バリア）を形成しており、外部からの酸素の流入を防いでいる。また、ヘテロシストは通常、細胞分裂を行わず、酸素発生を伴う光合成もしない。ニトロゲナーゼは、酸素により不活性化しやすい性質を有しており、細胞内酸素濃度を低く保つことができるヘテロシスト内でその活性を維持している。
【０００５】
一方、栄養細胞は、光合成により二酸化炭素と水を消費して、酸素と糖を生産する。生産された糖はヘテロシストに移送された後に代謝されて、ニトロゲナーゼによる窒素固定のための還元力源として利用される。窒素固定で得られた窒素栄養は、栄養細胞に供給され、藍藻の生長、生命維持のために利用される。また、ニトロゲナーゼによる窒素固定反応では、水素ガスが窒素栄養とともに生産される。
【０００６】
窒素固定反応は、以下のメカニズムで進行することが知られている。下記式（１）に示すように、培地中の窒素栄養が欠乏すると、ニトロゲナーゼの働きにより大気中の窒素分子１モルを取り込んで、２モルのアンモニアへと変換し（窒素固定活性）、それに伴い１モルの水素分子を副産物として生成する。この還元反応では、１電子につき２つのＡＴＰを消費する。
Ｎ２＋８ｅ−＋８Ｈ＋＋１６ＡＴＰ  →  Ｈ２＋２ＮＨ３＋１６（ＡＴＰ＋Ｐｉ）  （１）
【０００７】
一方、窒素ガスを含まない気相条件下（例えば、アルゴンガス雰囲気下）では、窒素分子を取り込むことができず、下記式（２）に示すように、式（１）と同量の電子とＡＴＰを消費して４モルの水素分子を生成させる。すなわち、ニトロゲナーゼは、窒素ガスの非存在下であると、窒素ガスの存在下よりも４倍の水素ガスを発生させる。
８ｅ−＋８Ｈ＋＋１６ＡＴＰ  →  ４Ｈ２＋１６（ＡＴＰ＋Ｐｉ）  （２）
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】H.Masukawa et al. Appl. Environ. Microbiol.Oct. 2010, p6741-6750.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上記式（１）に示す反応では、今後予想される水素エネルギーの需要に対して水素の生成効率が充分ではない。また、上記式（２）に示す反応では、窒素を除去した環境を整備する必要があり、大規模な設備が必要となり得る。
【００１０】
また、本発明者らは、窒素ガスの非存在下で藍藻を培養し続けると、水素の生産効率が低下する問題点を見出した。
【００１１】
そこで、本発明は、水素の持続的生産方法、及び、水素生成装置を備えた建物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、以下の［１］〜［１２］を提供する。
［１］含窒素物質の存在下、ニトロゲナーゼを発現するヘテロシストを有する藍藻を培地中で培養することを含み、上記ニトロゲナーゼは窒素固定活性が欠損または著しく低下したものである、水素の製造方法。
［２］上記藍藻が変異ニトロゲナーゼを発現しており、上記変異が、Ｑ１９３Ｓ、Ｑ１９３Ｌ、Ｑ１９３Ｈ、Ｑ１９３Ｋ、Ｈ１９７Ｔ、Ｈ１９７Ｆ、Ｈ１９７Ｑ、Ｙ２３６Ｔ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ２８４Ｈ及びＦ３８８Ｈからなる群から選択される、少なくとも１つである、［１］に記載の方法。
［３］上記藍藻が、取り込み型ヒドロゲナーゼの欠損株である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］上記含窒素物質が、硝酸ナトリウムを含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］上記含窒素物質の添加量が、培養液全量に対して０．１〜２ｍＭである、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］上記培養が、窒素ガスを含む気相条件下で実施される、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］上記培養が、１００〜７００μmol photons/m2/s(PAR)の光強度の光条件下で実施される、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］上記光条件が、培養中に、１５０〜７００μmol photons/m2/s(PAR)の光強度の範囲を含むように変化する、［７］に記載の方法。
［９］培養中に、所定の期間で、上記培地の一部を交換する、［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］上記培養液が水溶性高分子を含有する、［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］上記水溶性高分子がゲランガムを含む、［１０］に記載の方法。
［１２］二酸化炭素を含むガスを間欠的にバブリングすることを含む、［１］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］藍藻を用いて水素を生成する水素生成装置であって、上記藍藻は、含窒素物質の存在下、ニトロゲナーゼを発現するヘテロシストを有し、上記ニトロゲナーゼは窒素固定活性が欠損または著しく低下したものである、水素生成装置。
［１４］上記藍藻が変異ニトロゲナーゼを発現しており、上記変異が、Ｑ１９３Ｓ、Ｑ１９３Ｌ、Ｑ１９３Ｈ、Ｑ１９３Ｋ、Ｈ１９７Ｔ、Ｈ１９７Ｆ、Ｈ１９７Ｑ、Ｙ２３６Ｔ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ２８４Ｈ及びＦ３８８Ｈからなる群から選択される、少なくとも１つである、［１３］に記載の装置。
［１５］上記藍藻が、取り込み型ヒドロゲナーゼの欠損株である、［１３］又は［１４］に記載の装置。
［１６］上記含窒素物質が、硝酸ナトリウムを含む、［１３］〜［１５］のいずれかに記載の装置。
［１７］上記含窒素物質を、培養液全量に対して０．１〜２ｍＭとなるように添加する、［１３］〜［１６］のいずれかに記載の装置。
［１８］窒素ガスを含む気相条件下で培養する、［１３］〜［１７］のいずれかに記載の装置。
［１９］１００〜７００μmol photons/m2/s(PAR)の光強度の光条件下で培養する、［１３］〜［１８］のいずれかに記載の装置。
［２０］上記培養中に、１５０〜７００μmol photons/m2/s(PAR)の範囲を含むように光強度を変化させる、［１９］に記載の装置。
［２１］培養中に、所定の期間で、上記培地の一部を交換する、［１３］〜［２０］のいずれかに記載の装置。
［２２］上記培養液が水溶性高分子を含有する、［１３］〜［２１］のいずれかに記載の装置。
［２３］上記水溶性高分子がゲランガムを含む、［２２］に記載の装置。
［２４］二酸化炭素を含むガスを間欠的にバブリングする、［１３］〜［２３］のいずれかに記載の装置。
［２５］水素を活用した発電ユニットを備えた建物であって、藍藻を用いて水素を生成し、上記水素を上記発電ユニットに供給する水素生成装置を備え、上記藍藻は、含窒素物質の存在下、ニトロゲナーゼを発現するヘテロシストを有し、上記ニトロゲナーゼは窒素固定活性が欠損または低下したものである、建物。
［２６］上記水素生成装置は、上記藍藻を培養する培地を備えた水素生成部と、上記水素生成部に含窒素物質を供給する窒素供給部とを備える、［１２］に記載の建物。
［２７］上記発電ユニットの排熱を利用して温水を生成する給湯ユニットを更に備えた、［１３］又は［１４］に記載の建物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る方法によれば、特定の条件下で藍藻を培養することにより、水素を持続的に生成することができる。また、本発明によれば、藍藻が水素の生成と光合成を持続的に行うことにより、石油等の化石燃料を必要とせずに電気エネルギーと温水を生産することができ、二酸化炭素の削減にも寄与することができることから、環境問題の解決にも有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（ａ）累積水素発生量の経時変化を示すグラフと（ｂ）窒素栄養濃度と酸素発生量を示すグラフである。
【図２】異なる光強度条件下での窒素栄養の添加と累積水素発生量の関係を示すグラフである。
【図３】培地交換と累積水素発生量を示すグラフである。
【図４】（ａ）連続光照射下での水素及び酸素発生量を示すグラフと（ｂ）ＣＯ２吸収と細胞濁度を示すグラフである。
【図５】本発明の一実施形態に係る水素生成装置を備えた建物を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の一実施形態は、含窒素物質の存在下、ニトロゲナーゼを発現するヘテロシストを有する藍藻を培地中で培養することを含み、上記ニトロゲナーゼは窒素固定活性が欠損または低下したものである、水素の製造方法である。
【００１６】
（藍藻）
本実施形態で使用される藍藻は、変異ニトロゲナーゼを発現している。変異ニトロゲナーゼは、窒素固定活性が抑制するように変異を施されているため、窒素ガスの存在下で培養したとしても、栄養細胞に供給するのに十分な窒素栄養を自ら作り出すことができない。藍藻のゲノム情報はＣｙａｎｏＢａｓｅ（http://bacteria.kazusa.or.jp/cyanobase/）から入手することができる。藍藻は、例えば、Anabaena sp. PCC 7120、Nostoc punctiformeATCC 29133及びAnabaena variabilis ATCC 29413等を元にして、ニトロゲナーゼに変異を導入したものであってもよい。好ましい藍藻としては、糸状性藍藻のAnabaena sp.である。藍藻は、クロロフィルａ、カロテノイド、フィコシアノビリン、フィコエリスロビリン等の光合成色素を有する。
【００１７】
ニトロゲナーゼは、その活性部位に、モリブデン、鉄及び硫黄を含む金属クラスター（Ｍｏ型ニトロゲナーゼ）、バナジウム、鉄及び硫黄を含む金属クラスター（Ｖ型ニトロゲナーゼ）、又は、鉄を含む金属クラスター（Ｆｅ型ニトロゲナーゼ）を備える。ニトロゲナーゼの窒素固定活性は、これら金属クラスターと、当該金属クラスターの近傍にあり、かつ高度に保存されたアミノ酸残基とによって、制御されている。例えば、藍藻Anabaena sp. PCC 7120は、ｎｉｆＨでコードされるＦｅタンパクと、ｎｉｆＤ及びｎｉｆＫでコードされるＭｏＦｅタンパクを有している。Ｆｅタンパクは、［４Ｆｅ−４Ｓ］シングルクラスターを含むホモダイマーであり、ＭｏＦｅタンパクへのＡＴＰ従属的に電子を供与するように機能している。
【００１８】
本明細書において、「窒素固定活性が欠損または低下している」とは、その変異ニトロゲナーゼの窒素固定活性が、野生型ニトロゲナーゼ（全ての変異を導入する前のニトロゲナーゼ）の窒素固定活性を基準として低下していることを意味する。本発明で使用する変異ニトロゲナーゼは、その窒素固定活性が、野生型ニトロゲナーゼの窒素固定活性を基準として３０％以下に低下していることが好ましく、２０％以下に低下していることがより好ましく、１５％以下に低下していることが特に好ましい。
【００１９】
窒素固定活性を欠損または著しく低下させる変異は、上述の金属クラスター近傍のアミノ酸残基に変異を導入することで達成することができる。好ましい変異ニトロゲナーゼは、例えば、Ｑ１９３、Ｈ１９７、Ｙ２３６、Ｒ２８４及びＦ３８８のいずれか１つ以上のアミノ酸残基に変異を導入したニトロゲナーゼであり、より好ましくは、以下の（ａ）〜（ｋ）に示す変異を含むニトロゲナーゼである。（ａ）〜（ｋ）に示す変異を含むニトロゲナーゼであれば、窒素固定活性を十分に抑制できており、かつ水素生産活性も高い。
（ａ）１９３番目のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）に置換する（Ｑ１９３Ｓ）
（ｂ）１９３番目のグルタミン（Ｑ）残基をロイシン（Ｌ）に置換する（Ｑ１９３Ｌ）
（ｃ）１９３番目のグルタミン（Ｑ）残基をヒスチジン（Ｈ）に置換する（Ｑ１９３Ｈ）
（ｄ）１９３番目のグルタミン（Ｑ）残基をリシン（Ｋ）に置換する（Ｑ１９３Ｋ）
（ｅ）１９７番目のヒスチジン（Ｈ）残基をトレオニン（Ｔ）に置換する（Ｈ１９７Ｔ）
（ｆ）１９７番目のヒスチジン（Ｈ）残基をフェニルアラニン（Ｆ）に置換する（Ｈ１９７Ｆ）
（ｇ）１９７番目のヒスチジン（Ｈ）残基をグルタミン（Ｑ）に置換する（Ｈ１９７Ｑ）
（ｈ）２３６番目のチロシン（Ｙ）残基をトレオニン（Ｔ）に置換する（Ｙ２３６Ｔ）
（ｉ）２８４番目のアルギニン（Ｒ）残基をトレオニン（Ｔ）に置換する（Ｒ２８４Ｔ）
（ｊ）２８４番目のアルギニン（Ｒ）残基をヒスチジン（Ｈ）に置換する（Ｒ２８４Ｈ）
（ｋ）３８８番目のフェニルアラニン（Ｆ）残基をヒスチジン（Ｈ）に置換する（Ｆ３８８Ｈ）
【００２０】
本実施形態で使用される藍藻は、更にヘテロシスト形成の調節遺伝子を改変し、ヘテロシストの形成頻度を高めた藍藻であると好ましい。
【００２１】
（培養液）
培養液は、藍藻の培養に一般的に使用される培地又はその希釈液であればよい。培養液の具体的な例としては、ＢＧ１１培地、ＢＧ１１０培地（ＢＧ１１培地から硝酸ナトリウムを除いた培地）、Ａｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ａｒｎｏｎ培地（ＡＡ培地）であってもよい。好ましい培養液は、ＢＧ１１０培地であり、ＡＡ培地等を添加してもよい。含窒素物質を多く含む培地では、ニトロゲナーゼ活性が低下する場合があり、ＢＧ１１０培地、ＡＡ培地等の含窒素物質を含まない培養液が好ましい。
【００２２】
培養液は、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、硫酸塩等の栄養塩類を含有することが好ましい。培養を長期間継続させると、水素発生量が低下することがある。培養液に栄養塩類を補充してもよい。また、培養液の一部を定期的に又は不定期的に新たな培養液に交換することが好ましい。交換時に使用する新たな培養液は、培養開始時に使用した培養液と同じ組成であればよい。培養液の一部を交換することにより、藍藻から放出される老廃物を除去することが可能である。培養液の一部を交換することにより、水素生産を更に長期間持続させることが可能である。
【００２３】
培養液は、水溶性高分子を含有することが好ましい。藍藻は培養槽中で、自重により、徐々に底部に沈殿していく傾向がある。培養液が水溶性高分子を含有することによって培養液の粘度が高まり、藍藻の沈殿をより遅くすることができる。
【００２４】
また、藍藻が糸状性藍藻（例えば、Anabaena sp.）である場合、藍藻の沈殿を抑制するために、培養液をゆっくりと撹拌したり、二酸化炭素を含むガスをバブリングすることがある。窒素栄養が不足した藍藻（特に、糸状性藍藻）は、細胞間の連結部が弱体化しており、撹拌又はバブリングによって藍藻フィラメントが剪断され断片化しやすい傾向がある。本実施形態に係る方法によれば、含窒素物質を適切に補充することにより、藍藻フィラメントの剪断を抑制することができる。
【００２５】
水溶性高分子は、培養液の粘度を高めることができ、藍藻の培養を阻害しないものであればよい。水溶性高分子としては、例えば、ゲランガム、寒天が挙げられる。好ましい水溶性高分子は、ゲランガムである。
【００２６】
水溶性高分子の含有量は、ゲランガムでは濃度が０．０１％〜０．１％（ｗｔ．／ｖｏｌ．）となるように調整すればよい。好ましいゲランガム濃度は０．０１％〜０．０６％（ｗｔ．／ｖｏｌ．）であり、より好ましい濃度は０．０４％〜０．０６％（ｗｔ．／ｖｏｌ．）である。
【００２７】
（含窒素物質）
本明細書において、「含窒素物質」とは、窒素原子を有し、藍藻の生長及び生命維持のための栄養となり得る化合物を意味する。含窒素物質は藍藻の栄養源としての役割を有するため、単純に「窒素栄養」ともいう。含窒素物質としては、例えば、硝酸リチウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸ルビジウム、硝酸セシウム、硝酸マグネシウム、硝酸カルシウム、硝酸ストロンチウム等の硝酸塩、尿素、アンモニア等が挙げられる。好ましい含窒素物質は、アルカリ金属の硝酸塩であり、特に好ましくは硝酸ナトリウムである。
【００２８】
含窒素物質の添加量は、０．１ｍＭ〜３ｍＭとなるように添加すればよく、０．２〜２ｍＭとなるように添加することが好ましく、０．３〜１．８ｍＭとなるように添加することがより好ましく、０．４〜１．６ｍＭとなるように添加することが特に好ましい。含窒素物質の濃度が３ｍＭより濃くなると、水素発生量が低下する傾向があり、０．１ｍＭより薄くなると、水素生成量が低下する傾向がある。
【００２９】
また、図１（ｂ）に示すように、酸素発生量は、含窒素物質の添加量と正の相関を示す。すなわち、含窒素物質の添加量は、藍藻の光合成によって発生した酸素量に基づいて調整することができる。例えば、含窒素物質の添加量は、３〜５日内で発生した酸素量が０．４〜１２ｍＬになるように含窒素物質を添加してもよい。含窒素物質の添加は、好ましくは酸素発生量が０．８〜８ｍＬ、１．２〜７．２ｍＬ又は１．６〜６．４ｍＬとなるように調整すればよい。
【００３０】
含窒素物質を添加する頻度は、例えば、２〜５日に一度であればよく、３〜５日に一度であってもよい。酸素発生量が上記範囲内となるように、含窒素物質の添加量及び頻度を調整すればよい。
【００３１】
（光強度）
藍藻は、一般的に、光強度が低い環境での培養を好む性質があり、光強度の高い環境下では水素発生量が低下しやすい傾向がある。藍藻にとって最適な光強度（最適光）は、約１００μmol photons/m2/s(PAR)である。ＰＡＲとは、光合成有効照射を意味する。図２に示すように、光強度が高い環境下では、最適な光強度の環境下と比較して水素発生量が約２０％まで低下する。したがって、従来の藍藻を用いた水素の製造方法では、光強度が低く、かつ光強度が高くならない環境下で実施しなければならない。
【００３２】
また、太陽光の光強度は、天候（例えば、晴天、曇天、雨天）、季節（例えば、太陽の高度）等の種々の要因によって、常に変化し得るため、太陽光を利用して水素生産を行うためには、一定の光強度の環境下で実施できる設備が必要となる。
【００３３】
本実施形態に係る方法によれば、光強度が１００〜７００μmol photons/m2/s(PAR)である環境下で培養した場合であっても、十分な量の水素生産を持続させることができる。そのため、一定の光強度の環境を提供する設備を必要とせず、より持続的に水素を製造することが可能である。本実施形態に係る方法は、特に光強度が１５０〜７００μmol photons/m2/s(PAR)である環境になり得る環境下でも、継続的に水素を生産することが可能である。
【００３４】
（間欠バブリング）
本実施形態に係る方法では、二酸化炭素を含むガスをバブリングしてもよい。バブリングは、より多量の二酸化炭素を含むガスを間欠的に行うことが好ましい。例えば、二酸化炭素ガスの導入速度を高めることにより、間欠バブリングを実施してもよい。従来の藍藻の培養方法では、微量の二酸化炭素ガスを継続的にバブリングし続けることがある。これは、培養液中に二酸化炭素を供給するとともに、藍藻が培養液中で徐々に沈殿していくのを抑制することを目的としている。本実施形態に係る方法では、含窒素物質を添加することにより、藍藻フィラメントの弱体化を抑制することができ、物理的な力を加えても藍藻フィラメントが剪断しにくい。二酸化炭素を含むガスの間欠的バブリングにより、通常の量よりも多量のガスを一度に導入することで、藍藻の沈殿抑制効果をより高めることができる。二酸化炭素ガスを含むガスの導入速度は、１００〜５００ｍｌ／分であることが好ましく、２００〜３５０ｍｌ／分であることがより好ましい。
【００３５】
（水素生成装置）
本発明の第二実施形態は、水素生成装置である。本実施形態に係る水素生成装置の使用例を、図５に例示する。水素生成装置１０は、水素生成部１と窒素供給部２を備える。水素生成部１は、藍藻を培養する培養槽、除湿器、ガス採取部３、及びポンプ４を含み、これらがラインＬ１、Ｌ３、Ｌ４で接続されている。培養槽内で生じた水素ガスは、収集され、除湿器で湿気を取り除かれた後、ガス採取部３へと移送される。窒素供給部２は、水素生成部１内の培養槽に隣接するように配置され、ラインＬ５を通じて含窒素物質を培養槽に添加する。
【００３６】
水素生成部１の培養槽内には、藍藻を培養する培養液が充填されており、上部に発生したガスが貯留するヘッドスペースを有している。水素生成部１は、複数の培養槽を備えていてもよい。培養槽は、光が効率的に照射されるように配置されていることが好ましい。培養槽の底部には、二酸化炭素を含むガスを供給するバブリング装置を備えていてもよい。また、培養槽のヘッドスペースには、藍藻が生産した水素ガスだけでなく、光合成により発生した酸素ガス、バブリングに使用した二酸化炭素ガスも貯留する。
【００３７】
培養槽の形状は、受光面の面積が広い形状であればよく、円筒形、立方体形、直方体形であってもよい。また、培養槽は、水平方向の長さよりも垂直方向の長さが長いほうが好ましい。垂直方向の長さがより長いと、二酸化炭素を含むガスを培養槽にバブリングする際に、より効率的にガスを培養液全体に行き渡らせることができる。
【００３８】
ポンプ４は、適度にガスを加圧してライン内を循環させる。ヘッドスペースに貯留したガスは、除湿器を通じて湿気を取り除かれる。除湿後のガスの組成を調査するために、発生したガスの一部をガス採取部３からサンプリングする。サンプリングしたガスの酸素濃度から、藍藻による酸素発生量を算出してもよい。酸素発生量に基づき、含窒素物質の添加量を調整することができる。また、ガス採取部３の下流に位置するラインに、二酸化炭素センサー及び／又は酸素センサーを設けてもよい。ガス採取部３を通過したガスは、再度、ポンプ４により水素生成部１へ供給される。ガスは培養槽の底部から供給され、培養液中を通気して、培養槽上部のヘッドスペースへと放出される。
【００３９】
窒素供給部２は、培養槽の底部又は上部にラインを介して接続される。ガス採取部３又は酸素センサーを利用して算出した酸素発生量にしたがい、含窒素物質の添加量を設定することができる。含窒素物質は、固体として添加してもよく、水溶液等の形態で添加してもよい。
【００４０】
（建物）
本発明の第三実施形態は、水素を活用した発電ユニット３０と、水素生成装置１０と、を備える建物４０である。本実施形態に係る建物の模式図を図５に示す。水素生成装置１０で生成された水素は、ラインＬ２を通じてタンク２０に一旦貯留される。タンク２０に貯留したガスは、発電ユニット３０内のエンジン又はタービンに移送され、発電に利用される。水素生成装置１０は、第二実施形態における水素生成装置と同様の構成を有しており、水素生成部１と窒素供給部２を有する。
【００４１】
建物４０は、人工的に建築された物体であれば、特に制限されない。建物は、住宅であってもよく、産業用設備であってもよい。産業用設備としては、例えば、工場、市場、商業用ビル、駅、空港ビル、漁港、堤防、灯台、ダム、発電所、橋、陸橋、高速道路、小売店、百貨店、電波塔、倉庫、学校、宿泊所、車庫などが挙げられる。
【００４２】
発電ユニット３０で発電する際に生じた排熱は、更に給湯ユニットに供されて、水を加熱させてもよい。発電時に生じる排熱を利用することで、効率的に建物に電気エネルギーと温水の両方を供給することができる。すなわち、本実施形態に係る建物によれば、太陽光エネルギーを利用し、二酸化炭素を消費しながら、現代の生活に不可欠な電気エネルギーと温水を簡便かつ持続的に生産できるという効果を奏する。しかも、本実施形態によれば、石油等の化石燃料を必要とせず、二酸化炭素の削減にも寄与することができ、ひいては環境問題の解決にも有効である。
【実施例】
【００４３】
本発明について、以下により詳細に述べる。
【００４４】
１．藍藻の作成
（１）細胞の培養
藍藻は、含窒素物質を添加していない、Ａｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ａｒｎｏｎ液体培地を８倍希釈した培地（ＡＡ／８培地）中、もしくは希釈しないＡＡ寒天培地中、又は含窒素物質を添加したＢＧ１１液体培地中で、３０℃、３０〜１００μmol photons/m2/sの光強度（光合成活性照射）の条件下で、回転式振盪機で振盪しながら、培養した。含窒素物質として、ＡＡ／８液体培地には５ｍＭ  ＮａＮＯ３、ＡＡ寒天培地には１０ｍＭ  ＮａＮＯ３、ＢＧ１１液体培地には、１７．６ｍＭ  ＮａＮＯ３を添加した。窒素固定条件では、これらの含窒素物質を添加しないＡＡ／８液体培地、ＡＡ寒天培地またはＢＧ１１０液体培地中で培養した。
大腸菌株は、３７℃で、ｌｙｓｏｇｅｎｙ  ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）液体培地中で振とう培養、または寒天培地上で培養した。
大腸菌ＨＢ１０１（プラスミドｐＲＬ６２３）及びＪ５３（ＲＰ４）は、三親接合法を介した接合により、Anabaena細胞へ可動性プラスミドを導入するために使用した。
【００４５】
（２）プラスミド及びAnabaena変異体の構築
使用したプラスミドは、表１〜３に示すとおりである。表１〜３中、Ａｐｒはアンピシリン耐性を示し、Ｃｍｒはクロラムフェニコール耐性を示し、Ｅｍｒはエリスロマイシン耐性を示し、Ｋｍｒはカナマイシン耐性を示し、Ｎｍｒはネオマイシン耐性を示し、Ｓｍｒはストレプトマイシン耐性を示し、Ｓｐｒはスペクチノマイシン耐性を示し、Ｔｃｒはテトラサイクリン耐性を示す。藍藻変異株の選抜及び培養のために、次の抗生物質（最終濃度）を使用した。エリスロマイシン（５μｇ／ｍｌ）、ネオマイシン（２５μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（２μｇ／ｍｌ）、スペクチノマイシン（２μｇ／ｍｌ）。大腸菌株の選抜及び培養のために、次の抗生物質（最終濃度）を使用した。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）、エリスロマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）。
本明細書において、「ｐＨＭ１８−Ｑ１９３Ｈ」等の記載は、プラスミドｐＨＭ１８において、１９３番目のグルタミン（Ｑ）がヒスチジン（Ｈ）に変異した変異プラスミドであることを意味し、複数の変異プラスミドを包括的に「ｐＨＭ１８−Ｑ１９３Ｈ／Ｋ／Ｓ／Ｌ」等と表現する場合がある。
【表１】
2019208416.tif 000002
2019208416.tif 000003
【表２】
2019208416.tif 000004
2019208416.tif 000005
【表３】
2019208416.tif 000006
【００４６】
使用したプライマーペアは、表４及び表５に示すとおりである。変異導入したコドン部位をイタリックで示す。
【表４】
2019208416.tif 000007
【表５】
2019208416.tif 000008
2019208416.tif 000009
【００４７】
ｎｉｆ領域のクローニングは、以下の手順で行った。
まず、ｎｉｆＤが変異体で置換され、かつ、導入した変異の存在と望まない変異の不存在を確認するのを容易にするために、ｎｉｆＤ−ｎｉｆＫ遺伝子間領域に、ＢａｍＨＩサイトを導入した。
プラスミドＨｉｎｄＩＩＩ−ｃｕｔ  ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）にＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（１．５ｋｂ）を連結させて、ｐＨＭ３を得た。ｐＨＭ３のｍｏｂ領域を含むＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＤｒａＩで消化したプラスミドｐＡＣＹＣ１７７に連結させて、プラスミドｐＨＭ５を得た。
また、プライマーペア（ｎｉｆＮＸ−Ｆ及びｎｉｆＮＸ−Ｒ）を用いてＰＣＲ法で増幅したｎｉｆＮ３’−ｎｉｆＸ５’を含むフラグメントを、制限酵素ＳｍａＩで消化したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）にクローニングして、プラスミドｐＨＭ４を得た。得られたｐＨＭ４のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントを、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＨＭ５に連結させて、プラスミドｐＨＭ６を得た。ｐＨＭ６を三親接合法によりAnabaena野生株へ導入した。その大腸菌と藍藻の混合液を２５μｇ／ｍｌネオマイシンと含窒素物質を添加したＡＡ寒天培地上に広げ、藍藻の染色体内にプラスミドｐＨＭ６が相同的組換え（シングルクロスオーバー）により組み込まれたシングルクロスオーバー株を選抜し、ＡｎＮｉｆＮＸ株とした。
【００４８】
ＡｎＮｉｆＮＸ株からヘテロシストを単離したｎｉｆＤ切断要素欠損ゲノムＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後、自己連結により環状化した。得られた環状化ＤＮＡを、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’に導入し、カナマイシン処理により選抜して、プラスミドｐＨＭ７を得た。カナマイシン処理では、カナマイシン（Ｋｍ）５０μｇを含有するＬＢ寒天プレート上で培養した。
次に、プラスミドｐＨＭ７のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメント（ｎｉｆＤ３’−ｎｉｆＫ−ＯＲＦ−ｎｉｆＥＮ−ｎｉｆＸ５’を含む）を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＨＭ１に連結して、プラスミドｐＨＭ１０を得た。得られたｐＨＭ１０のＸｂａＩフラグメント（ｎｉｆＵ３’−ｎｉｆＨＤＫ−ＯＲＦ−ｎｉｆＥ５’を含む）を自己連結により環状化して、ｐＨＭ１１を得た。
一方、プライマーペア（ｎｉｆＵＨ−Ｆ１及びｎｉｆＵＨ−Ｒ）を用いてＰＣＲ法で増幅したｎｉｆＵ３’−ｎｉｆＨ５’を含むフラグメントを、制限酵素ＥｃｏＲＶで消化したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）にクローニングして、ｐＨＭ１２ａを得た。
ｐＨＭ１１のＭｕｎＩ−ＸｂａＩフラグメント（ｎｉｆＨＤＫ−ＯＲＦ−ｎｉｆＥ５’を含む）を、制限酵素ＭｕｎＩ及びＸｂａＩで消化したプラスミドｐＨＭ１２ａに連結させて、プラスミドｐＨＭ１３を得た。
【００４９】
（３）ｎｉｆＤの特定部位における変異
ｎｉｆＤへの変異の導入は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ｋｉｔ（製品名：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．社製）と、表５に示すプライマーペアを用いて実施した。
【００５０】
（Ｑ１９３、Ｈ１９７、Ｙ２３６及びＲ２８４の変異）
ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ法を用いて作製したｎｉｆＤ３’−ＢａｍＨＩ−ｎｉｆＫ５’を含むフラグメントを、制限酵素ＥｃｏＲＶで消化したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）にクローニングすることにより、プラスミドｐＨＭ１４を得た。
得られたプラスミドｐＨＭ１４由来のＥｃｏＲＩ−Ｂｓｐ１４０７Ｉフラグメント（ｎｉｆＤ３’−ＢａｍＨＩ−ｎｉｆＫ５’を含む）を、プラスミドｐＨＭ１３の同じ領域に連結することにより、対応する領域（但し、ＢａｍＨＩサイトは欠損している）と置換して、プラスミドｐＨＭ１５を得た。プラスミドｐＨＭ１５のＸｂａＩ−ＸｈｏＩ領域（ｎｉｆＵ３’−ｎｉｆＨＤＫ−ＯＲＦ−ｎｉｆＥ５’を含む）を、制限酵素ＸｂａＩ及びＳａｌＩで消化したプラスミドｐＳＦＩに連結させ、プラスミドｐＨＭ１６を得た。
プラスミドｐＨＭ１６由来のＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（ｎｉｆＤの内部フラグメントを含む）を、制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）にクローニングすることにより、プラスミドｐＨＭ１８を得た。プラスミドｐＨＭ１８は、Anabaena sp. PCC 7120のＮｉｆＤ領域の１１２〜３８８番目の残基（A.vinelandiiのＮｉｆＤ領域の１１０〜３８１番目の残基に対応する。）をコードしており、変異対象となるアミノ酸残基（Ｑ１９３、Ｈ１９７、Ｙ２３６、Ｒ２８４）を含んでいる。プラスミドｐＨＭ１８をテンプレートとして用いて、Ｑ１９３、Ｈ１９７、Ｙ２３６、及びＲ２８４に対応するアミノ酸残基に点変異を行い、変異体プラスミドｐＨＭ１８−Ｑ１９３Ｈ、ｐＨＭ１８−Ｑ１９３Ｋ、ｐＨＭ１８−Ｑ１９３Ｓ、ｐＨＭ１８−Ｑ１９３Ｌ、ｐＨＭ１８−Ｈ１９７Ｆ、ｐＨＭ１８−Ｈ１９７Ｑ、ｐＨＭ１８−Ｈ１９７Ｔ、ｐＨＭ１８−Ｙ２３６Ｔ、ｐＨＭ１８−Ｒ２８４Ｈ、ｐＨＭ１８−Ｒ２８４Ｔをそれぞれ得た。変異は、ＤＮＡシークエンシングにより確認した。
【００５１】
プラスミドｐＨＭ１６のＳａｌＩ−ＳａｃＩフラグメント（ｎｉｆＵ３’−ｎｉｆＨＤＫ−ＯＲＦ−ｎｉｆＥ５’を含む）を、制限酵素ＸｈｏＩ及びＳａｃＩで消化したプラスミドｐＲＬ２７１に連結して、プラスミドｐＨＭ１９を得た。プラスミドｐＵＣ４ＫのＳａｌｌフラグメント（ｎｐｔ遺伝子を含む）を、制限酵素Ｓａｌｌで消化したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）にクローニングすることにより、プラスミドｐＨＭ１７ｂを得た。使用する変異体で置き換えた後に、野生型のｎｉｆＤが残留する可能性を排除するために、プラスミドｐＨＭ１７ｂのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（ｎｐｔ−ｂｅａｒｉｎｇカセットを含む）を、制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＨＭ１６に連結させることでｎｉｆＤの内部配列を置換して、プラスミドｐＨＭ２０を得た。
プラスミドｐＨＭ２０のｎｐｔ−ｂｅａｒｉｎｇカセットをｐＨＭ１８−Ｑ１９３Ｈ／Ｋ／Ｓ／Ｌ、ｐＨＭ１８−Ｈ１９７Ｆ／Ｑ／Ｔ、ｐＨＭ１８−Ｙ２３６Ｔ、ｐＨＭ１８−Ｒ２８４Ｈ／Ｔの各ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとそれぞれ置換させることにより、ｐＨＭ２０−Ｑ１９３Ｈ／Ｋ／Ｓ／Ｌ、ｐＨＭ２０−Ｈ１９７Ｆ／Ｑ／Ｔ、ｐＨＭ２０−Ｙ２３６Ｔ、ｐＨＭ２０−Ｒ２８４Ｈ／Ｔを得た。
【００５２】
（Ｆ３８８の変異）
プラスミドｐＨＭ１６由来のＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（ｎｉｆＤ３’を含む）を、制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）にクローニングすることにより、プラスミドｐＨＭ２２を得た。プラスミドｐＨＭ２２は、ＮｉｆＤ領域の１１２番目から末端までの残基をコードしており、変異対象となるアミノ酸残基（Ｆ３８８）を含んでいる。プラスミドｐＨＭ２２をテンプレートとして用いて、Ｆ３８８に対応するアミノ酸残基に点変異を行い、変異体プラスミドｐＨＭ２２−Ｆ３８８Ｈを得た。変異は、ＤＮＡシークエンシングにより確認した。プラスミドｐＨＭ２０のｎｐｔ−ｂｅａｒｉｎｇカセットをｐＨＭ２２−Ｆ３８８Ｈの各ＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩフラグメントと置換させることにより、ｐＨＭ２０−Ｆ３８８Ｈを得た。
【００５３】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）のＳｍａＩサイトに、ｐＨＭ１２ａ内にあるのと同じＰＣＲフラグメント（ｎｉｆＵ３’−ｎｉｆＨ５’を含む）をクローニングして、プラスミドｐＨＭ２３を得た。
一方、ｐＵＣ４ＫのＰｓｔＩフラグメント（ｎｐｔ−ｂｅａｒｉｎｇカセットを含む）を、プラスミドｐＨＭ２３のＰｓｔｌサイトに連結させて、プラスミドｐＨＭ２４ａを得た。
プラスミドｐＨＭ２のＥｃｏＲＶ−ＣｌａＩフラグメント（１．２ｂｐ、ＯＲＦ３’−ｎｉｆＥ５’を含む）を、制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＣｌａＩで消化したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）にクローニングして、プラスミドｐＨＭ２５を得た。
得られたプラスミドｐＨＭ２４ａのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（２．４ｋｂ、ｎｉｆＵ３’−ｎｉｆＨ５’−ｎｐｔを含む）を、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＨＭ２５に連結させて、プラスミドｐＨＭ２６を得た。プラスミドｐＨＭ２６のＳａｃＩ−ＳａｌＩフラグメント（３．５ｋｂ、ｎｉｆＵ３’−ｎｉｆＨ５’−ｎｐｔ−ＯＲＦ３’−ｎｉｆＥ５’を含む）を、制限酵素Ｓａｃｌ及びＳａｌＩで消化したプラスミドｐＲＬ２７１に連結させて、プラスミドｐＨＭ２７を得た。ｐＨＭ２７を三親接合法によりAnabaena株（ΔＨｕｐ株）へ導入した。その大腸菌と藍藻の混合液を５μｇ／ｍｌエリスロマイシンと含窒素物質を添加したＡＡ寒天培地上に広げ、藍藻の染色体内にプラスミドｐＨＭ２７が相同的組換え（シングルクロスオーバー）により組み込まれたシングルクロスオーバー株を選抜した。さらに、シングルクロスオーバー株のクロモソーム中からプラスミド配列を除去し、ｎｉｆＨＤＫ−ＯＲＦ領域がｎｐｔ遺伝子に完全置換されたダブルクロスオーバー株の選抜は、スクロース含有培地で致死性を付与するｓｕｃＢ遺伝子を利用して次のように行った。シングルクロスオーバー株を２５μｇ／ｍｌネオマイシンと含窒素物質を添加したＡＡ／８液体培地で約一週間培養し、その培養液の一部を採り、５％スクロース、含窒素物質と２５μｇ／ｍｌネオマイシンを含むＡＡ寒天培地に薄く広げて、光強度５０μmol photons/m2/s(PAR)の条件下で３週間培養した。ダブルクロスオーバーによる相同的組換えにより、プラスミド配列内のｓｕｃＢ遺伝子が除去されると、スクロース含有培地上で生育できるようになり、所望のダブルクロスオーバー株を単離できる。そのダブルクロスオーバー株（ΔＮｉｆΔＨｕｐ株）がスクロース耐性、ネオマイシン耐性、エリスロマイシン感受性であることを寒天培地上で確認した。さらに、ΔＮｉｆΔＨｕｐクロモソーム中のｎｉｆＨＤＫ−ＯＲＦ領域が削除されたかどうかは、ｎｉｆＵＨ、ｎｉｆＤ１及びｎｐｔ（カナマイシン耐性／ネオマイシン耐性（Ｋｍｒ／Ｎｍｒ））遺伝子のプローブを用いたサザンブロット法と、３種類のプライマーペア（ｎｉｆＤ−Ｆ１／ｎｉｆＤ−Ｒ２のペア、ｎｉｆＫ−Ｆ／ｎｉｆＫ−Ｒのペア、ｎｉｆＨＤＫ−ＯＲＦ−Ｆ／ｎｉｆＨＤＫＯＲＦ−Ｒのペア）を用いたＰＣＲ法によって確認した。
最後に、ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ法によって、塩基配列ＧＧＡＡＣＣを塩基配列ＧＧＡＴＣＣに変換し、ＢａｍＨＩ制限酵素部位を導入した。すなわち、プラスミドｐＨＭ１３を鋳型として、２種類のプライマーペア（ｎｉｆＤ−Ｆ２／ｎｉｆＤＫ−ＢａｍＨＩ−ＲとｎｉｆＤＫ−ＢａｍＨＩ−Ｆ／ｎｉｆＫ−Ｒ）を用いてそれぞれ生成させた２つのＰＣＲフラグメントを、ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ法用のメガプライマーとして使用し、最終的に制限酵素ＥｃｏＲＶで消化したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）にクローニングすることにより、プラスミドｐＨＭ１４を得た。
所望の特定部位を得るために、ＸｂａＩ−ｎｉｆＵ３’−ｎｉｆＨＤＫ−ＯＲＦ−ｎｉｆＥ５’−ＸｈｏＩ配列をｐＳＦＩに形質導入して得られたＳａｃＩ−ＳａｌＩフラグメントを、プラスミドｐＲＬ２７１に導入して、プラスミドｐＨＭ１９を得た。同様に、ｎｉｆＤ領域に所望の変異を有するＳａｃＩ−ＳａｌＩフラグメントを、プラスミドｐＲＬ２７１に導入し、プラスミドｐＲＬ３４１８、ｐＲＬ３４１９、ｐＲＬ３４２１、ｐＲＬ３４２３、ｐＲＬ３４２８、ｐＲＬ３４３３、ｐＲＬ３４３６、ｐＲＬ３４４４、ｐＲＬ３４４８、ｐＲＬ３４５２及びｐＲＬ３４６３を得た。
ｐＨＭ１９を三親接合法によりΔＮｉｆΔＨｕｐ株に形質導入することにより、窒素固定化能を有するエリスロマイシン耐性（Ｅｍｒ）リコンビナント株（シングルクロスオーバー株）を回収し、ＡｎＮｉｆＨΔＨｕｐとした。
コロニーハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、及びプローブの検出を行った。ｎｉｆＵＨ、ｎｉｆＤ１及びｎｐｔ遺伝子のハイブリダイゼーション用プローブは、表４に記載のプライマーペア（ｎｉｆＵＨ−Ｆ２／ｎｉｆＵＨ−Ｒ、ｎｉｆＤ−Ｆ１／ｎｉｆＤ−Ｒ１及びＫｍＮｍ−Ｆ／ＫｍＮｍ−Ｒ）を用いたＰＣＲ増幅により合成した。プラスミドｐＨＭ４、ｐＨＭ１２ａ、ｐＨＭ１４及びｐＨＭ２３の構築は、シークエンシングにより確認した。
【００５４】
（４）変異ニトロゲナーゼを発現したAnabaena sp.変異株の構築
ＡｎＮｉｆＨΔＨｕｐの作成と同様に、ｐＨＭ２０−Ｑ１９３Ｈ／Ｋ／Ｓ／Ｌ、ｐＨＭ２０−Ｈ１９７Ｆ／Ｑ／Ｔ、ｐＨＭ２０−Ｙ２３６Ｔ、ｐＨＭ２０−Ｒ２８４Ｈ／Ｔ、ｐＨＭ２０−Ｆ３８８ＨのＳａｃＩ−ＳａｌＩフラグメントを、プラスミドｐＲＬ２７１に導入した。得られたプラスミドを、三親接合法によりＡｎａｂａｅｎａ株（ΔＮｉｆΔＨｕｐ）に導入し、５μｇ／ｍｌエリスロマイシンと含窒素物質を添加したＡＡ寒天培地上で、ｎｉｆＤ領域に所望の変異を有するシングルクロスオーバー株を選抜した。クロスオーバーの位置は、表４に示すプライマーを用いてＰＣＲ増幅することによって、ｎｉｆＵＨ領域内であることを確かめた。
次に、シングルクロスオーバー株のクロモソーム中からプラスミド配列を除去し、ｎｐｔ遺伝子がｎｉｆＤ領域に所望の変異を有するｎｉｆＨＤＫ−ＯＲＦ遺伝子に完全置換されたダブルクロスオーバー株を得るため、ｓｕｃＢ遺伝子を利用した選抜を次のように行った。含窒素物質を含まないＡＡ／８液体培地で、シングルクロスオーバー株を約一週間培養し、その培養液の一部を採り、５％スクロースと含窒素物質を含むＡＡ寒天培地に薄く広げて、光強度５０μmol photons/m2/s(PAR)の条件下で培養した。得られたダブルクロスオーバー株がスクロース耐性、ネオマイシン感受性、及びエリスロマイシン感受性であることを寒天培地上で確認した。さらに、そのクロモソーム中のｎｐｔ遺伝子が所望の変異を有するｎｉｆＨＤＫ−ＯＲＦ遺伝子に完全置換されたかどうかは、２種類のプライマーペア（ｎｉｆＳＵＨ−Ｆ／ｎｉｆＳＵＨ−ＲのペアとＯＲＦｎｉｆＥ−Ｆ／ＯＲＦｎｉｆＥ−Ｒのペア）を用いたＰＣＲ法によって確認した。以上の方法でAnabaena sp.株から、ｎｉｆＤ領域にＱ１９３ＳまたはＲ２８４Ｈの変異を有するニトロゲナーゼを発現した２種類のニトロゲナーゼ変異株を作成し、それぞれＱ１９３ＳまたはＲ２８４Ｈと呼ぶ。
【００５５】
２．水素の生成
Anabaenaニトロゲナーゼ変異株は、室温２８℃、植物育成灯（製品名：Ｔｙｐｅ  ＦＬ  ４０  ＳＢＲ−Ａ、ＮＥＣライティング株式会社製）を用いた連続光照射条件下（光強度９０−１００μmol photons/m2/s (PAR)）で、５００ｍｌのＢＧ１１液体培地（１７．６ｍＭ  ＮａＮＯ３を含む）で、空気を通気しながら２−３日培養し、その後、１％ＣＯ２を含む空気を通気しながら培養した。この培養液から細胞を遠心（４，０００×ｇ、２−３ｍｉｎ）により回収し、窒素化合物を含まないＢＧ１１０液体培地で２回洗った後、同じ培地に懸濁した。メタノール抽出によりクロロフィルａ（Ｃｈｌａ）濃度を定量し、ＢＧ１１液体培地で５−２０μｇ／ｍｌとなるように初期細胞量を調整した。その懸濁液５ｍＬを、内容積３２．５ｍｌのガスクロマトグラフィー用バイアルに入れ、ブチルゴム栓で密閉した。初期気相（組成：１１％ＣＯ２を含む窒素ガス、体積：２７．５ｍｌ）の条件で、１００μmol photons/m2/s(PAR)の光強度の連続光照射下で、回転式振盪機で振盪しながら培養した。ヘッドスペースに蓄積した水素を経時的にガスクロマトグラフィーにより測定した。気相は３−５日毎に初期気相に更新し、更新後に再び生産された水素量は累積して評価した。
ヘッドスペース中の水素濃度は、Ｒｔ−Ｍｓｉｅｖｅ  ５Ａ  ＰＬＯＴ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｉ．Ｄ．  ０．５３ｍｍ×５０ｍ，  Ｒｅｓｔｅｋ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，ＵＳＡ）を用いて、熱伝導度型検出器（ＴＣＤ）を備えたガスクロマトグラフィー（製品名：Shimadzu GC-2010 Plus、株式会社島津製作所製）により測定した。
【００５６】
３．含窒素物質（窒素栄養）の添加を伴う培養系での水素生産活性
使用した藍藻は、１９３番目のグルタミンをセリンに置き換えた変異ニトロゲナーゼ（Ｑ１９３Ｓ）または２８４番目のアルギニンをヒスチジンに置き換えた変異ニトロゲナーゼ（Ｒ２８４Ｈ）を発現したAnabaena sp.株である。Ｃｈｌａ濃度が５μｇ／ｍｌとなるように初期細胞量を調整した培養液５ｍＬを、初期気相（組成：１１％ＣＯ２を含む窒素ガス、体積：２７．５ｍｌ）の条件で、１００μmol photons/m2/s(PAR)の光強度の連続光照射下で培養した。
【００５７】
培養日数と累積水素発生量の関係を図１（ａ）に示す。図１（ａ）中の矢印は、含窒素物質を添加した時期を示す。実施例１〜３における含窒素物質の添加量は、それぞれ１、１．５、２ｍＭであり、比較例１では含窒素物質を添加しなかった（添加量：０ｍＭ）。
比較例１では、培養３日目から累積水素発生量が増加せず、水素生成が停止した。一方、実施例１〜３では、累積水素発生量が継続的に増加しており、水素生成が長期間継続していることが理解できる。
また、比較例２は、窒素ガスに代えてアルゴンガスを気相として使用して培養した結果である。比較例２は、比較例１と同様の結果を示した。
【００５８】
図１（ｂ）は、添加した含窒素物質（窒素栄養）の濃度と酸素発生量の会計を示すグラフである。酸素は藍藻の栄養細胞における光合成によって、生産される。添加した含窒素物質の濃度と酸素発生量には正の相関関係が観測された。
【００５９】
４．光強度と窒素栄養の添加
使用した藍藻は、１９３番目のグルタミンをセリンに置き換えた変異ニトロゲナーゼ（Ｑ１９３Ｓ）を発現したAnabaena sp.株である。Ｃｈｌａ濃度が２０μｇ／ｍｌとなるように初期細胞量を調整した培養液５ｍｌを、初期気相（組成：１１％ＣＯ２を含む窒素ガス、体積：２７．５ｍｌ）の条件で、所定の光強度の連続光照射下で培養し、毎日ヘッドスペースの気相置換を行い、４日分の累積水素発生量を測定した。
実施例４、５及び比較例３、４について、含窒素物質の添加量及び光強度の条件を表６に示す。実施例４及び５では、培養開始直後と培養２日目に硝酸ナトリウムを１．５ｍＭとなるように添加した。一般的に、１００μmol photons/m2/s(PAR)の光強度は、藍藻にとって最適な光強度に相当し、１６０μmol photons/m2/s(PAR)の光強度は、藍藻にとって強い光強度に相当する。
【表６】
2019208416.tif 000010
【００６０】
結果を図２に示す。比較例３と比較例４の比較により、強光条件下では水素発生量が顕著に低下することが理解できる。窒素栄養を添加することにより、強光条件下においても、充分な水素生成を行うことが可能であることが理解できる。
【００６１】
５．培地の交換
使用した藍藻は、２８４番目のアルギニンをヒスチジンに置き換えた変異ニトロゲナーゼ（Ｒ２８４Ｈ）を発現したAnabaena sp.株である。Ｃｈｌａ濃度が２０μｇ／ｍｌとなるように初期細胞量を調整した培養液５ｍｌを、初期気相（組成：１１％ＣＯ２を含む窒素ガス、体積：２７．５ｍｌ）の条件で、ＬＥＤ照明（製品名：３ｉｎ１ＬＥＤ照明ユニット、株式会社日本医化器械製作所製）を用いて所定の光強度の光照射下で培養し、毎日ヘッドスペースの気相置換を行い、累積水素発生量を経時的に測定した。
硝酸ナトリウム（含窒素物質）の添加量は、添加する間隔が１日あたり０．５ｍＭとなるように調整した（例えば、添加する間隔が３日間である場合、硝酸ナトリウムの添加量は１．５ｍＭである。）。また、光照射条件は１２時間毎に明暗（照射と非照射）を繰り返し、照射時の光強度は３００μmol photons/m2/s(PAR)である。
約７日間に１回、培養液中の培地の半分量を、新たなＢＧ１１０培地で交換した。
【００６２】
結果を図３に示す。図３中の矢印は、培地交換を行った時期を示す。培地交換を行うことにより、累積水素発生量の増加率の低下が抑制された。
【００６３】
６．大規模培養系における連続光条件下で培養したときの気相の変動
使用した藍藻は、２８４番目のアルギニンをヒスチジンに置き換えた変異ニトロゲナーゼ（Ｒ２８４Ｈ）を発現したAnabaena sp.株である。３台の円筒形培養槽（各培養槽には、０．０１〜０．０４％のゲランガムを含有する培養液９ｌを含む。）を並列に連結し、ガス採取部、ポンプ、窒素供給部を備えた水素生成装置を設計した。水素生成装置は、ガス採取部とポンプの間にアルミニウムバッグを更に備えており、発生したガスを貯留することができる。アルミニウムバッグを含む水素生成装置の総容積は、３４ｌである。気相のバックグラウンドガスには、窒素ガスを使用した。
上記水素生成装置を用いて、ガスを循環させることにより、水素生産を行った。ＬＥＤを用いて、光強度を１００μmol photons/m2/s(PAR)に調整した光を各円筒形培養槽の両側から連続的に照射した。含窒素物質（窒素栄養）の添加量は、測定した酸素発生量に基づいて算出し、図４に示すとおり、含窒素物質を毎日添加した。
【００６４】
また、光合成により高められた気相中の酸素濃度を下げるために、培養１日目と４日目に気相の置換を行った。すなわち、培養開始から１日経った後に、培養槽内の気相を交換し、３日間培養を継続した後に、次の気相の交換を行った。また、二酸化炭素ガスを含むガスを間欠的にバブリングすることにより、培養液を撹拌した。バブリングは、２５０ｍｌ／分の速度で二酸化炭素ガスを含むガスを１分間導入した後、１９分間微量の二酸化炭素ガスを含むガスを導入することで行った。
【００６５】
結果を図４に示す。０．１ｍＭの硝酸ナトリウムを添加してから１日間、予備培養した後に気相交換を実施した時点を、水素生産の開始（ｄａｙ１）と位置づけた。水素生産の開始から、徐々に水素濃度と酸素濃度が上昇し、４日目（ｄａｙ４）に気相交換を行うことにより、水素濃度と酸素濃度は顕著に低下した（図４（ａ））。気相交換で採取されたガスは、アルミニウムバッグ内に貯留された。この期間の二酸化炭素濃度と培養液の濁度（ＯＤ７５０）を図４（ｂ）に示す。予備培養の間に、藍藻が光合成を行うことにより、気相中の二酸化炭素濃度は徐々に低下した。ｄａｙ１で気相交換することにより、二酸化炭素濃度は増加し、また徐々に低下する傾向が観察された。二酸化炭素を含むガスの間欠バブリングによって、培養液中に溶存する二酸化炭素濃度は増加した。一方、培養液の濁度は、０．６付近で定常状態となった。濁度が一定の値で維持されることにより、より長期間の持続的な水素生産が可能であると推測された。
【符号の説明】
【００６６】
１…水素生成部、２…窒素供給部、３…ガス採取部、４…ポンプ、１０…水素生成装置、２０…タンク、３０…発電ユニット、４０…建物、Ｌ１〜Ｌ５…ライン。
【図１】
2019208416.tif 000011
【図２】
2019208416.tif 000012
【図３】
2019208416.tif 000013
【図４】
2019208416.tif 000014
【図５】
2019208416.tif 000015
【配列表】
2019208416000001.app