(57)【要約】      （修正有）【課題】皮膚や腸管などのバリア機能を高め、免疫系の向上などにおいても重要なサイトカインである、インターロイキン−２２の産生を誘導するバチルス属細菌の提供。【解決手段】受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５８３、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５８４、または、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５９０で寄託されている微生物などのバチルス属細菌、該バチルス属細菌を含有するインターロイキン−２２産生誘導剤、および、該バチルス属細菌を含有する皮膚バリア機能増強剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン−２２の産生を誘導するバチルス属細菌。
【請求項２】
Ｂ細胞の生存能を向上させる能力及びＢ細胞の活性化能を有する請求項１に記載のバチルス属細菌。
【請求項３】
食品を由来とする請求項１または２に記載のバチルス属細菌。
【請求項４】
味噌または納豆を由来とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のバチルス属細菌。
【請求項５】
バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）及びバチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）からなる群より選択される少なくとも１つに属する請求項１〜４のいずれか一項に記載のバチルス属細菌。
【請求項６】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５８３のバチルス属細菌、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５８４のバチルス属細菌、または受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５９０のバチルス属細菌である請求項１〜５のいずれか一項に記載のバチルス属細菌。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のバチルス属細菌を含有するインターロイキン−２２産生誘導剤。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のバチルス属細菌を含有する皮膚バリア機能増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バチルス属細菌、インターロイキン−２２産生誘導剤、皮膚バリア機能増強剤に関する。更に詳しくは、インターロイキン−２２の産生を誘導するバチルス属細菌、インターロイキン−２２産生誘導剤、皮膚バリア機能増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、サイトカインの一群であるインターロイキンとして、インターロイキン−１０やインターロイキン−１２などの複数のものが知られており、インターロイキン−２２（ＩＬ−２２）もその一つとして報告されている。
【０００３】
このインターロイキン−２２は、インターロイキン−１０ファミリーに属するサイトカインであり、皮膚や腸管などのバリア機能を高めるなどの機能が報告されており、免疫系の向上などにおいても重要なサイトカインの一つである。
【０００４】
ここで、例えばインターロイキン−１２の産生量を高めて免疫機能の向上を図るために、バチルス属細菌の一種である納豆菌（枯草菌）を有効成分として含有させた機能性食品が報告されている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第５０９０７５４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
この特許文献１に記載の機能性食品は、納豆菌（枯草菌）を利用してインターロイキン−１２の産生量を高めるというものであり、インターロイキン−２２の産生を高める（誘発する）という効果については今までに報告されていない。
【０００７】
このようなことから、インターロイキン−２２の産生を誘発することができる細菌を見出すことが求められており、特に、摂取し易い細菌であるという要請もある。
【０００８】
本発明は、インターロイキン−２２の産生を誘導するバチルス属細菌を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、以下に示すバチルス属細菌が提供される。
【００１０】
［１］  インターロイキン−２２の産生を誘導するバチルス属細菌。
【００１１】
［２］  Ｂ細胞の生存能を向上させる能力及びＢ細胞の活性化能を有する前記［１］に記載のバチルス属細菌。
【００１２】
［３］  食品を由来とする前記［１］または［２］に記載のバチルス属細菌。
【００１３】
［４］  味噌または納豆を由来とする前記［１］〜［３］のいずれかに記載のバチルス属細菌。
【００１４】
［５］  バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）及びバチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）からなる群より選択される少なくとも１つに属する前記［１］〜［４］のいずれかに記載のバチルス属細菌。
【００１５】
［６］  受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５８３のバチルス属細菌、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５８４のバチルス属細菌、または受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５９０のバチルス属細菌である前記［１］〜［５］のいずれかに記載のバチルス属細菌。
【００１６】
［７］  前記［１］〜［６］のいずれかに記載のバチルス属細菌を含有するインターロイキン−２２産生誘導剤。
【００１７】
［８］  前記［１］〜［６］のいずれかに記載のバチルス属細菌を含有する皮膚バリア機能増強剤。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のバチルス属細菌は、インターロイキン−２２の産生を誘発するものであり、インターロイキン−２２の産生不足に起因する疾患の予防などに用いられるインターロイキン−２２産生誘導剤の有効成分となり得るものである。
【００１９】
本発明のインターロイキン−２２産生誘導剤は、インターロイキン−２２の産生を誘発するものであり、インターロイキン−２２の産生不足に起因する疾患の予防などに用いられるインターロイキン−２２産生誘導剤の有効成分となり得るものである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ｂ細胞におけるインターロイキン−２２の産生誘導能を有する菌株のスクリーニング結果を示すグラフである。
【図２】Ｂ細胞におけるインターロイキン−２２の産生誘導能を有する菌株のスクリーニング結果を示すグラフである。
【図３】全脾臓細胞におけるインターロイキン−２２の産生誘導能を有する菌株のスクリーニング結果を示すグラフである。
【図４】全脾臓細胞におけるインターロイキン−２２の産生誘導能を有する菌株のスクリーニング結果を示すグラフである。
【図５】Ｂ細胞の活性化能について示すグラフである。
【図６】Ｂ細胞の活性化能について示すグラフである。
【図７】ＩＬ−２２の産生誘導能についてフローサイトメトリーによる測定を行った際の結果を示す図である。
【図８】実施例５における経表皮水分損失量（ＴＥＷＬ）の測定結果を示すグラフである。
【図９】実施例６における経表皮水分損失量（ＴＥＷＬ）の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明は以下の実施の形態に限定されるものではない。即ち、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、当業者の通常の知識に基づいて、以下の実施の形態に対し適宜変更、改良等が加えられたものも本発明の範囲に属することが理解されるべきである。
【００２２】
［１］バチルス属細菌：
本発明のバチルス属細菌は、インターロイキン−２２（ＩＬ−２２）の産生を誘導するものである。ここで、例えばバチルス属細菌の一種である枯草菌は、日本の食生活に古くから関わりのある微生物であり、例えば、日本の伝統的発酵食品である納豆の製造（発酵）には、枯草菌の一種である納豆菌が関わっている。また、味噌や醤油の諸味にも枯草菌が含まれていることが多く、従来、これら発酵食品を食することで枯草菌も摂取されてきた。このように例えば枯草菌は、摂取する際の安全性が高く（即ち、食品適性が高く）、また、培養が簡単であるため製造し易いという利点もある。なお、バチルス（Bacillus）属は、好気性の有胞子性菌であり、代表種は枯草菌（Bacillus subtilis）である。納豆菌は枯草菌の一種として分類される。
【００２３】
「インターロイキン−２２」は、角化細胞を増殖し、皮膚のターンオーバーを促進させることができることから、美肌素材、抗菌素材などの用途に好適に用いることが期待できる。更に、インターロイキン−２２は、組織修復、細胞生存・増殖、粘膜バリア防御に関わるものであり、アトピー性皮膚炎などの皮膚疾患や、脂肪肝疾患、ディフィシル菌（Clostridium difficile）などによる感染症の予防・治療などの用途が期待できる。
【００２４】
更に、本発明のバチルス属細菌は、Ｂ細胞の生存能を向上させる能力及びＢ細胞の活性化能を有するものであることが好ましい。
【００２５】
ここで、Ｂ細胞は、液性免疫に中心的な役割を果たし、病原体など異物（抗原）に対して抗体を産生できる唯一の細胞であるが、枯草菌などのバチルス属細菌による作用に関しては知られていない。また、Ｂ細胞は、Ｔ細胞に抗原を提示する細胞で、活性化Ｔ細胞の維持に必要不可欠な細胞であることが知られている。そのため、Ｂ細胞の働きを強めることは、Ｔ細胞の働きをも補強することとなり、免疫賦活効果を免疫系の細胞全体で強めることにもなる。本発明において「Ｂ細胞の活性化能」とは、抗体産生の能力と抗原提示の能力の両方が活性化することをいう。
【００２６】
そして、抗体を産生して異物を攻撃できるＢ細胞の働きを人為的に強化するなど直接コントロールできることができれば、抗体による働きが影響するアレルギー疾患や感染症、自己免疫疾患などの免疫系疾患の予防や緩和、治療につながっていくことが期待できる。
【００２７】
本明細書において「Ｂ細胞の生存能を向上させる能力を有する」とは、Ｂ細胞が持つ「生存する能力」を高める性質を有することを意味する。より具体的には、実験用マウス脾臓細胞を用い、バチルス属細菌を添加していない試料中における、総細胞の数に対する生存するＢ細胞の数の割合を基準（基準値１００）としたとき、バチルス属細菌を添加した試料中における、総細胞の数に対する生存するＢ細胞の数の割合の値（測定値）が、１００超となることをいう。「総細胞の数」はフローサイトメトリーにより定量して求められ、「生存するＢ細胞（生細胞）の数」は、抗Ｂ２２０抗体に反応する細胞をＢ細胞とし、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）核染色液で染色されず、抗Ｂ２２０抗体に反応する細胞を定量することにより求められる。
【００２８】
なお、「Ｂ細胞の生存能を有する」とは、上記の通りであるが、具体的には、実施例２に示す方法によって得られる値（測定値）が、１００超となることをいう。
【００２９】
本明細書において「Ｂ細胞の活性化能を有する」とは、Ｂ細胞を活性化させる能力（性質）を有することを意味する。より具体的には、実験用マウス脾臓細胞を用い、バチルス属細菌を添加していない試料中における、活性化しているＢ細胞の数と活性化していないＢ細胞の数との比を基準（基準値１００）としたとき、バチルス属細菌を添加した試料中における、活性化しているＢ細胞の数と活性化していないＢ細胞の数との比の値（測定値）が、１００超となることをいう。なお、「活性化しているＢ細胞の数」は、抗Ｂ２２０抗体と抗ＣＤ８６抗体の両方に反応した細胞の数をフローサイトメトリーにより測定して求められる。「活性化していないＢ細胞の数」は、抗ＣＤ８６抗体とは反応せずに、抗Ｂ２２０抗体と反応した細胞の数をフローサイトメトリーにより測定して求められる。
【００３０】
なお、「Ｂ細胞の活性化能を有する」とは、上記の通りであるが、具体的には、実施例１に示す方法によって得られる測定値が、１００超となることをいう。
【００３１】
本発明のバチルス属細菌は、食品を由来とするものであることがよく、具体的には、味噌由来のもの、納豆由来のものであることがよい。このように古くから食経験のある食品（特に発酵食品）由来の微生物であることにより、摂取する際における安全性が更に優れることになる。
【００３２】
ここで、味噌由来のバチルス属細菌とは、味噌の醸造工程で単離される枯草菌などのバチルス属細菌ということもできる。「味噌の醸造工程で単離される」バチルス属細菌とは、味噌醸造工程における「蔵」、「室（ムロ）」、「桶」などに定着しているバチルス属細菌のことをいう。更には、味噌の仕込みから熟成工程において生育（生存）可能なバチルス属細菌をいう。なお、本発明において、味噌由来のバチルス属細菌は、味噌の醸造工程で直接単離したものに限らず、味噌から単離し、その後に培養（継代培養）されたものも含む。また、納豆由来のバチルス属細菌（枯草菌）とは、納豆の製造工程で単離されるバチルス属細菌ということができ、市販（製品）の納豆から単離される枯草菌（バチルス属細菌）のことも含む。
【００３３】
本発明のバチルス属細菌は、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）及びバチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）からなる群より選択される少なくとも１つに属するものであることがよい。バチルス・サブチルス（枯草菌）やバチルス・コアギュランス（コアギュランス菌、有胞子性乳酸菌の一種でもある）は、日本の食生活に古くから関わりのある微生物であり、摂取する際の安全性が高い（即ち、食品適性が高い）ためである。また、これらは培養が簡単であるため製造し易いという利点がある。
【００３４】
［１−１］好ましいバチルス属細菌：
本発明のバチルス属細菌は、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５８３のバチルス属細菌（菌株）（菌株名「ｓｃ−０９」）（以下、この菌株を「コアギュランス菌ｓｃ−０９」と記す場合がある）、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５８４のバチルス属細菌（菌株）（菌株名「ｂｓ−３０」）（以下、この菌株を「枯草菌ｂｓ−３０」と記す場合がある）、または、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５９０のバチルス属細菌（菌株）（菌株名「ｂｓ−３４」）（以下、この菌株を「枯草菌ｂｓ−３４」と記す場合がある）であることが好ましい。
【００３５】
これらのバチルス属細菌は、味噌を由来とするため、摂取する際の安全性が高く、Ｂ細胞に直接作用してＢ細胞における生存能及び活性化能を発揮し、免疫系を賦活化することができる（即ち、良好な免疫賦活作用を有する）。更に、これらのバチルス属細菌は、ＩＬ−２２の産生誘導能が非常に優れている。なお、上記のバチルス属細菌は、Ｔ細胞にも作用することができ、更に、樹状細胞などにも作用することが考えられる。
【００３６】
ここで、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５８３のバチルス属細菌、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５８４のバチルス属細菌、及び受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５９０のバチルス属細菌は、いずれも独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託されている。
【００３７】
本発明のバチルス属細菌は、上記のように、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５８３のバチルス属細菌、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５８４のバチルス属細菌、または、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５９０のバチルス属細菌が好ましく、ＩＬ−２２の産生誘導能がより優れているのは、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５８３のバチルス属細菌である。
【００３８】
そして、「好ましいバチルス属細菌」のうち、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５８３のバチルス属細菌（菌株名「ｓｃ−０９」）は、味噌由来のバチルス・コアギュランス（コアギュランス菌）であって、ＩＬ−２２産生誘導能が非常に高く優れている。つまり、ＩＬ−２２の産生を高めたいときに採用することが最も好適である。また、このコアギュランス菌ｓｃ−０９は、嫌気条件下でも培養が可能であり、高温域（４５〜６０℃）でも増殖可能であるため、一般的な細菌が成育し難い高温域（４５〜６０℃）で培養することで、選択的に培養することができ、更に、簡易な培養施設での製造が可能である。また、胞子形成能があるため、胞子化させることで保管などの種菌（スターター）の取扱いも容易である。
【００３９】
「好ましいバチルス属細菌」のうち、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５８４のバチルス属細菌（菌株名「ｂｓ−３０」）、及び受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５９０のバチルス属細菌（菌株名「ｂｓ−３４」）は、いずれも味噌由来のバチルス・サブチルス（枯草菌）であって、通気性の良い、室温２５℃〜４５℃程度の環境下で旺盛に増殖できる。また、７ｗ／ｖ％程度の塩分濃度でも生育が可能で、塩分を含む培地で培養することで、一般的な細菌の生育を抑えることができるため、製造が容易である。つまり、簡易な培養設備での製造が可能であるということができる。また、胞子形成能があるため、胞子化させることで保管などの種菌（スターター）の取扱いも容易である。
【００４０】
このようなことから、本発明のバチルス属細菌は、高温（４５℃以上、更には５０℃以上）で生育可能な細菌であることも好ましい。高温での培養ができることにより、上述の通り他の雑菌が混入しにくく（他の雑菌による汚染が生じ難く）なるので、培養が容易になる。
【００４１】
［２］バチルス属細菌の調製方法：
本発明のバチルス属細菌は、培養後、殺菌などの処理を行って調製することができる。具体的には、培養終了後、遠心分離などの手段により培地成分を取り除き、洗浄・精製する。そして、加熱殺菌を行い、その後、凍結乾燥・減圧乾燥・熱風乾燥などの手段により乾燥・濃縮する。このようにして、本発明のバチルス属細菌を調製することができる。
【００４２】
なお、加熱殺菌は、特に制限はないが、具体的にはオートクレーブ殺菌（１２１℃、２０分）または同程度の殺菌が好ましい。
【００４３】
［３］インターロイキン−２２（ＩＬ−２２）産生誘導剤：
本発明のＩＬ−２２産生誘導剤は、本発明のバチルス属細菌を含有するものである。このＩＬ−２２産生誘導剤は、ＩＬ−２２の産生を誘導することができる。なお、バチルス属細菌の中には、枯草菌などのように従来から発酵食品とともに食されているものもあり、安全性が高いものもあるため、枯草菌などを用いる場合、本発明のＩＬ−２２産生誘導剤は、安全性を高くすることができる。
【００４４】
本発明のＩＬ−２２産生誘導剤は、本発明のバチルス属細菌を有効成分として含有する限りその含有割合は特に制限はない。なお、本発明のＩＬ−２２産生誘導剤は、本発明のバチルス属細菌以外にその他の成分として、難消化性デキストリン、オリゴ糖、デキストリン、二酸化ケイ素などを含有することができる。
【００４５】
なお、本発明のＩＬ−２２産生誘導剤は、本発明のバチルス属細菌を培養した際に得られる培養物、菌体（栄養細胞及び胞子のどちらであってもよい）、または、菌体成分を含有するものであってもよい。
【００４６】
なお、本発明のＩＬ−２２産生誘導剤は、そのもの自体を、飲食品、サプリメント、医薬品などとしてもよいし、飲食品、サプリメント、医薬品などに添加して用いることもできる。飲食品としては、特に制限はなく、例えば、味噌、即席味噌汁、調理味噌（味噌加工品）、金山寺味噌などのなめ味噌、醤油、つゆ、調味ソース、調味たれ、ご飯の素、惣菜、あま酒（糀飲料）等が挙げられる。
【００４７】
［４］皮膚バリア機能増強剤：
本発明の皮膚バリア機能増強剤は、本発明のバチルス属細菌を含有するものである。この皮膚バリア機能増強剤は、ＩＬ−２２の産生を誘導し、経表皮からの水分蒸発を抑えることができる。即ち、皮膚上皮のタイトジャンクション（Tight junction：密着接合）が強固になり、皮膚のバリア機能を増強（即ち向上）させることができる。このように皮膚のバリア機能を向上させると、肌の潤いを保つことができ、乾燥肌や敏感肌を引き起こし難くすることができる。また、病原体の侵入などの外的刺激（病原体の侵入の他には、例えば、紫外線を受けることによる刺激、アレルゲン、化学物質、埃などと接触することによる刺激、乾燥環境下に晒されることによる刺激など）から肌を守ることができる。
【００４８】
ここで、皮膚の表皮層は、紫外線、アレルゲン、化学物質、病原体などの上記などの外的な刺激から生体を防御するバリア機能を担っているが、皮膚上皮のタイトジャンクションが緩み、皮層のバリア機能が十分に機能しなくなると、外的な刺激から肌を守ることができなくなる。その結果、肌荒れ、しみ、シワ、ハリの低下、肌のたるみなどの問題の原因となる。このようなことから、皮膚のバリア機能を正常に保ち、このバリア機能が低下している場合には、その機能を向上させることが重要になる。本発明の皮膚バリア機能増強剤は、本発明のバチルス属細菌を含有することによって、このバチルス属細菌がＩＬ−２２の産生を誘導し、その結果、皮膚のバリア機能が発揮される（経表皮水分損失を防ぐ効果が発揮される）。
【００４９】
なお、経表皮からの水分蒸発量が大きいと（即ち、経表皮水分損失量（TransEpidermal Water Loss（ＴＥＷＬ）が大きいと）、皮膚（特に表皮層）が乾燥状態となる他、皮膚による十分な保護機能が発揮されずに、紫外線、アレルゲン、化学物質、病原体などの外的な刺激が皮膚の内部に悪影響（シミの発生や痒みなど）を与えることになる。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５１】
（実施例１）
＜ＩＬ−２２の測定試験＞
味噌及び納豆からそれぞれバチルス属細菌を収集し、得られた各バチルス属細菌を培養、殺菌処理し、実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の脾臓細胞に添加して培養し、培養後における、ＩＬ−２２の産生量を測定した。なお、試験に用いた菌株は、表１，表２に記載している。以下、ＩＬ−２２の測定試験について具体的に説明する。
【００５２】
（１）バチルス属細菌の分離及び同定：
味噌及び味噌の醸造工程よりバチルス属細菌の収集を行い、また、市販の納豆からもバチルス属細菌を分離した。分離培地は、標準寒天培地（日水製薬社製）を用い、３０℃及び４５℃で、１〜２日間静置培養し、得られたコロニーから純粋分離して菌を収集した。また、コアギュランス菌（Bacillus coagulans）を選択的に得るために、炭酸カルシウムを添加したラクトバシラスＭＲＳ寒天培地（和光純薬社製）を用い、５０℃で１〜３日間嫌気培養して、周囲の炭酸カルシウムが溶解しているコロニーを収集した。
【００５３】
分離したバチルス属細菌は、グラム染色を行い、顕微鏡で観察をして、グラム染色陽性の桿菌であることと、胞子形成をするかの確認を行った。
【００５４】
また、分離した菌体からＤＮＡを抽出し、１６Ｓ  ｒＤＮＡをプライマー１０Ｆ（５’−ＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡ−３’）及びプライマー１５００Ｒ（５’−ＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’）を用いて、ＰＣＲで増幅した後、得られたＰＣＲ産物の配列分析によって菌種の同定を行った。なお、解析方法の詳細は、第十七改正日本薬局方  参照情報「遺伝子解析による微生物の迅速同定法」に準じた。
【００５５】
収集したバチルス属細菌は７２株であり、そのうち、枯草菌（納豆菌を含む）が４０株、コアギュランス菌が２０株含まれていた。
【００５６】
（２）菌体懸濁液（バチルス属細菌懸濁液）の調製：
分離・同定したバチルス属細菌は、ニュートリエントブロス培地（和光純薬社製）を用いて、３０℃で１〜３日間振とう培養した。但し、コアギュランス菌には、ラクトバチリＭＲＳブロス（和光純薬社製）を用い、５０℃で１〜３日静置培養した。
【００５７】
培養後、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌処理をして菌株毎の培養液を得た。
【００５８】
次に、得られた各培養液を、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。その後、それぞれ集菌して、蒸留水で３回洗浄した後、蒸留水で懸濁し、凍結乾燥して菌体を得た。その後、得られた菌体のそれぞれについて、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１ｍｇ／ｍＬになるように懸濁して、各菌株の菌体懸濁液を調製した。
【００５９】
（３）細胞浮遊液の調製：
実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の脾臓から採取した細胞を５０ｍＬコニカルチューブ（ＦＡＬＣＯＮ社製）に集め、５ｍＬの赤血球溶解バッファー（０．１５５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ，０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）を加えて細胞を懸濁させた。その後、これにｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）５ｍＬを加えて１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。その後、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄して、細胞浮遊液を調製した。
【００６０】
（４）細胞培養：
２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞浮遊液を基本培地で調整し、調整後の細胞浮遊液を、２４ｗｅｌｌマイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に１ｍＬずつ播種して、２×１０６ｃｅｌｌｓ／１ｍＬ／ｗｅｌｌとした。なお、基本培地は、所定のＬ−グルタミン酸（０．３ｇ／Ｌ）加ＲＰＭＩ  １６４０（ナカライテスク社製）に、５５℃で３０分間加熱して非働化した牛胎児血清（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を培地中で９（ｗ／ｖ）％になるように添加したものを用いた。上記「所定のＬ−グルタミン酸（０．３ｇ／Ｌ）加ＲＰＭＩ  １６４０」は、ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液（培地中に１００Ｕ／ｍＬ−１００μｇ／ｍＬ、ナカライテスク社製）及び２−メルカプトエタノール（培地中に５０μＭ、ナカライテスク社製）を加えたＬ−グルタミン酸（０．３ｇ／Ｌ）加ＲＰＭＩ  １６４０である。
【００６１】
その後、これに各菌体懸濁液（１ｍｇ／ｍＬ）を１０μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間培養した。なお、コントロールも用意した。このコントロールは、調整後の細胞浮遊液に菌体懸濁液を添加せずに、菌体を添加した場合と同一条件（３７℃、５％ＣＯ２の条件）で２日間培養したものとした。
【００６２】
（５）ＩＬ−２２の測定：
２日間（４８時間）の培養中の４２時間の培養後から、培養液にＢＤ  ＧｏｌｇｉＳｔｏｐＴＭ（ＢＤ社製）を０．６７μＬずつ加えて混合した。その後、更に、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で６時間培養した。
【００６３】
その後、２４ｗｅｌｌマイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）で培養した細胞培養液を１．５ｍＬリアクションチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社製）に移し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収した。その後、回収した細胞をＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏｐｅｒｍＴＭ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＤ社製）を用いて固定と透過を行った。この操作はＦｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの添付の説明書に従った。
【００６４】
Ｂ細胞の染色には、ｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体（ＴＯＮＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用し、更に、ＩＬ−２２の染色には、ＰＥ標識抗ＩＬ−２２抗体（ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。また、Ｂ細胞の活性化状態を測定するために、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８６抗体（ＴＯＮＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた。
【００６５】
染色反応は、冷蔵（５℃）で６０分間静置して行った。その後、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収して、０．５ｍＬのＰＢＳに懸濁して測定用試料を得た。
【００６６】
なお、測定は、フローサイトメトリー（ミルテニーバイオテク社製  ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いた。
【００６７】
そして、解析は、ＦＣＳデータ解析ソフト  ＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ社製）を用いた。
【００６８】
＜結果＞（１）脾臓Ｂ細胞におけるＩＬ−２２産生細胞量の測定：
Ｂ２２０陽性細胞をＢ細胞として、脾臓Ｂ細胞中のＩＬ−２２陽性細胞の割合（ＩＬ−２２＋，Ｂ２２０＋／Ｂ２２０＋）を各測定用試料で求めた。
【００６９】
コントロール（菌体懸濁液を添加しなかったもの）におけるＢ細胞中のＩＬ−２２陽性細胞の割合を基準（１００）とし、各測定用試料の相対値を算出して、Ｂ細胞のＩＬ−２２産生細胞量の値とした（表１，表２中、「ＩＬ−２２産生誘導能（脾臓Ｂ細胞）」と記す）。
【００７０】
なお、各測定用試料を１回測定した上で、測定値が高かった測定用試料については、更に測定を２〜６回繰り返して行い、平均値（Ｘ−）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表１、表２に示す。
【００７１】
（２）全脾臓細胞におけるＩＬ−２２産生細胞量の測定：
全脾臓細胞中のＩＬ−２２陽性細胞の割合（「ＩＬ−２２陽性細胞／全脾臓細胞」）を各測定用試料で求めた。
【００７２】
コントロール（菌体懸濁液を添加しなかったもの）における脾臓細胞中のＩＬ−２２陽性細胞の割合を基準（１００）とし、各測定用試料の相対値を算出して、全脾臓細胞のＩＬ−２２産生細胞量の値とした（表１，表２中、「ＩＬ−２２産生誘導能（全脾臓細胞）」と記す）。
【００７３】
上記「（１）Ｂ細胞におけるＩＬ−２２産生細胞量の測定」と同様に、各測定用試料を１回測定した上で、測定値が高かった測定用試料については、更に上記（１）の場合と同様に測定を繰り返して行い、平均値（Ｘ−）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表１、表２に示す。
【００７４】
（３）Ｂ細胞の活性化能の測定：
Ｂ細胞中のＣＤ８６陽性細胞の割合（ＣＤ８６＋，Ｂ２２０＋／ＣＤ８６−，Ｂ２２０＋）を求めた。そして、コントロール（菌体懸濁液を添加しなかったもの）におけるＢ細胞中のＣＤ８６陽性細胞の割合を基準（１００）とし、Ｂ細胞の活性化能の値を算出した（表１，表２中、「Ｂ細胞の活性化能」と示す）。
【００７５】
なお、上記「（１）Ｂ細胞におけるＩＬ−２２産生細胞量の測定」及び「（２）全脾臓細胞におけるＩＬ−２２産生細胞量の測定」を繰り返して行った測定用試料については、Ｂ細胞の活性化能の測定も同様に繰り返し、平均値（Ｘ−）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表１、表２に示す。
【００７６】
（４）生育温度の確認：
また、分離した各菌株の生育温度の確認を行った。具体的には、ニュートリエントブロス培地（和光純薬社製）を試験管（直径１８ｍｍ×１８０ｍｍ）に１０ｍＬずつ入れ、培養栓（シリコセン、信越ポリマー社製）をして、オートクレーブ（１２１℃、２０分間）で滅菌処理した培地を用意した。コロニーを一白金耳ずつ３本の培地に摂取し、それぞれ３０℃、４５℃、５５℃で静置培養した。コントロールとして、菌を摂取しないものを用意した。培養２日後に目視確認（培地の濁り及び、沈殿の有無の確認）を行い、十分に増殖したかの判定を行った。判定基準は、増殖した場合を「○」とし、増殖しなかった場合を「×」とした。
【００７７】
生育温度の確認の結果を表１，表２に示す（表１，表２中、「培養温度」の欄に示す）。いずれの菌株も、３０℃の培養で増殖した。
【００７８】
【表１】
2019141036.tif 000002
【００７９】
【表２】
2019141036.tif 000003
【００８０】
（５）ＩＬ−２２の産生誘導菌のスクリーニング結果：
各菌種のスクリーニング結果は、以下のようになった（表１，表２、図１〜図６参照）。
【００８１】
全ての菌株（７２菌株）でＩＬ−２２の産生が上昇（１．１倍以上）した。これらの中でも、味噌由来のバチルス属細菌（例えば、表１中、菌株名「ｂｓ−３０」、「ｂｓ−３４」、「ｓｃ−０９」で示す）は、Ｂ細胞のうちのＩＬ−２２産生細胞の量がコントロールに比べて７〜１０倍であり、また、脾臓細胞全体における結果でも、コントロールに比べてＩＬ−２２産生細胞の量が約６倍となった。ＩＬ−２２の産生細胞の量が特に高くなる菌株について表３に示す。
【００８２】
【表３】
2019141036.tif 000004
【００８３】
＜まとめ＞
ＩＬ−２２は、バチルス属細菌の菌体（殺菌菌体）による刺激で誘導され、その誘導の程度は菌株により差があることが分かった。バチルス属細菌は、ＩＬ−２２産生誘導能を有すると考えられた。
【００８４】
ＣＤ４＋Ｔ細胞やＮＫ細胞などがＩＬ−２２を産生することは知られているが、ＩＬ−２２がＢ細胞中で産生されることは、これまでに報告がない。なお、上記結果からすると、本発明のバチルス属細菌を用いた場合、これらの菌体の刺激により、脾臓細胞中で特にＢ細胞からのＩＬ−２２産生が増加していた。
【００８５】
なお、図７は、実施例１におけるフローサイトメトリーにおける測定の一例であり、縦軸がＢ２２０の発現を示し、横軸がインターロイキン−２２の発現を示し、左側から順にコントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）、「ｂｓ−３４」の菌株（枯草菌ｂｓ−３４）を添加した場合（「＋  ｂｓ−３４」と記す）、「ｓｃ−０９」の菌株（コアギュランス菌ｓｃ−０９）を添加した場合（「＋  ｓｃ−０９」と記す）について示している。
【００８６】
また、ＩＬ−２２の産生誘導能が高いバチルス属細菌（菌株）は、Ｂ細胞の活性化能も高い傾向にあった。一方で、Ｂ細胞の活性化能が高い菌が必ずしもＩＬ−２２について高い産生誘導能を有するとは限られなかった。
【００８７】
このことから、菌体の刺激によってＢ細胞を活性化させることができるバチルス属細菌の一部は、ＩＬ−２２の産生誘導能も有することが分かった。なお、Ｂ細胞が活性化された状態であると、免疫を賦活化する効果も期待できることになる。
【００８８】
なお、本実施例では、Ｂ２２０陽性細胞に着目してＢ細胞について解析したが、ＩＬ−２２の産生誘導能が高い乳酸菌について、Ｂ２２０陽性細胞に代えてＣＤ１９陽性細胞（ｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体（ＴＯＮＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用）で解析した場合にも同様の結果が得られた。このことからも、所定の菌株によってＢ細胞からのＩＬ−２２産生誘導能が向上し、更に、Ｂ細胞の活性化能が向上されることが確認できた。
【００８９】
（実施例２）
＜細胞の生存能及び細胞の活性化能の測定試験＞
実施例１でＩＬ−２２の産生誘導能の高かった枯草菌ｂｓ−３０、枯草菌ｂｓ−３４、及びコアギュランス菌ｓｃ−０９について、殺菌処理後の菌体を、実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の「脾臓細胞と共培養」して、脾臓細胞全体の生存能、脾臓Ｂ細胞と脾臓Ｔ細胞の生存能、及び脾臓Ｂ細胞と脾臓Ｔ細胞の活性化能を調査した。以下、試験内容について具体的に説明する。
【００９０】
（１）菌体懸濁液の調製：
実施例１で調製したバチルス属細菌懸濁液と同様のものを使用した。
【００９１】
（２）細胞浮遊液の調製：
実施例１と同様に調製した。
【００９２】
（３）細胞培養：
２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞浮遊液を基本培地で調整し、調整後の細胞浮遊液を、４８ｗｅｌｌマイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に０．５ｍＬずつ播種して、１×１０６ｃｅｌｌｓ／０．５ｍＬ／ｗｅｌｌとした。
【００９３】
その後、これに各菌体懸濁液（１ｍｇ／ｍＬ）を５μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間培養した。なお、コントロールは、調整後の細胞浮遊液に菌体懸濁液を添加せずに、菌体を添加した場合と同一条件（３７℃、５％ＣＯ２の条件）で２日間培養したものとした。
【００９４】
（４）細胞の生存能及び細胞の活性化能の測定：
４８ｗｅｌｌマイクロプレートで培養していた細胞培養液を１．５ｍＬリアクションチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社製）に移し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収した。その後、回収した細胞をｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）０．２ｍＬに懸濁し、以下の４つの抗体を１μＬずつ加え、冷蔵（５℃）で６０分間静置した。
【００９５】
添加した４つの抗体は、ｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体（ＴＯＮＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８６抗体（ＴＯＮＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ５１０標識抗ＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、及びＰＥ標識抗ＣＤ６９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）であった。
【００９６】
静置後、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収して、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）０．５ｍＬに懸濁した。その後、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）核染色液（コスモバイオ社製）を０．５μＬ加えて測定用試料を得た。この測定用試料についてフローサイトメトリー（ミルテニーバイオテク社製  ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて測定を行った。なお、解析は、ＦＣＳデータ解析ソフト  ＦｌｏｗＪｏ  （ＦｌｏｗＪｏ，  ＬＬＣ社製）を用いた。
【００９７】
（細胞生存能）
測定用試料のうち、ＰＩ検出された細胞（ＰＩ核染色液で染色された細胞）を死細胞とみなし、カウントされた細胞数（総細胞数）からの差を生細胞の数とした。そして、総細胞中の生細胞の割合（生細胞の数／総細胞の数×１００）を算出した。同様に、コントロール（菌体懸濁液を添加しなかったもの）における、総細胞中の生細胞の割合を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出して細胞の生存能（細胞生存能）の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値（Ｘ−）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表４に示す。本実施例において「平均値（Ｘ−）」は、６回の試験（ｎ＝６）による平均値である。
【００９８】
（Ｂ細胞の生存能）
Ｂ細胞の細胞表面マーカーであるｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体（ＴＯＮＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）にてＢ細胞を検出した。生細胞のうちのＢ細胞の数（ＰＩ検出されなかった細胞のうちのＢ２２０陽性細胞）と、総細胞の数との商（総細胞の数に対する生存するＢ細胞の数の割合）を算出した。同様に、コントロール（菌体懸濁液を添加しなかったもの）における、総細胞の数に対する生存するＢ細胞の数の割合を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出してＢ細胞の生存能の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値（Ｘ−）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表４に示す。
【００９９】
（Ｔ細胞の生存能）
Ｔ細胞の細胞表面マーカーであるＢｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ５１０標識抗ＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）にてＴ細胞を検出した。生細胞のうちのＴ細胞の数（ＰＩ検出されなかった細胞のうちのＣＤ４陽性細胞）と、総細胞の数との商（総細胞の数に対する生存するＴ細胞の数の割合）を算出した。同様に、コントロール（菌体懸濁液を添加しなかったもの）における、総細胞の数に対する生存するＴ細胞の数の割合を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出してＴ細胞の生存能の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値（Ｘ−）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表４に示す。
【０１００】
（Ｂ細胞の活性化能）
Ｂ細胞の細胞表面マーカーであるｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体と、Ｂ細胞の活性化マーカーであるＡＰＣ標識抗ＣＤ８６抗体によって、Ｂ２２０及びＣＤ８６を発現するＢ細胞を検出し、カウントした。そして、Ｂ細胞（Ｂ２２０陽性細胞）のうち、活性化しているＢ細胞（ＣＤ８６＋，Ｂ２２０＋）と活性化していないＢ細胞（ＣＤ８６−，Ｂ２２０＋）の商（活性化しているＢ細胞／活性化していないＢ細胞の比の値）を算出した。同様に、コントロール（菌体懸濁液を添加しなかったもの）における、活性化しているＢ細胞（ＣＤ８６＋，Ｂ２２０＋）と活性化していないＢ細胞（ＣＤ８６−，Ｂ２２０＋）の商を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出してＢ細胞の活性化能の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値（Ｘ−）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表４に示す。
【０１０１】
（Ｔ細胞の活性化能）
Ｔ細胞の細胞表面マーカーであるＢｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ５１０標識抗ＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）と、Ｔ細胞の活性化マーカーであるＰＥ標識抗ＣＤ６９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）によって、ＣＤ４及びＣＤ６９を発現する細胞を検出し、その数を数えた。そして、Ｔ細胞（ＣＤ４陽性細胞）のうち、活性化しているＴ細胞（ＣＤ６９＋，ＣＤ４＋）と活性化していないＴ細胞（ＣＤ６９−，ＣＤ４＋）の商（活性化しているＴ細胞／活性化していないＴ細胞の比の値）を算出した。同様に、コントロール（菌体懸濁液を添加しなかったもの）における、活性化しているＴ細胞（ＣＤ６９＋，ＣＤ４＋）と活性化していないＴ細胞（ＣＤ６９−，ＣＤ４＋）の商を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出してＴ細胞の活性化能の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値（Ｘ−）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表４に示す。
【０１０２】
【表４】
2019141036.tif 000005
【０１０３】
＜結果＞
本実施例の結果によって、実施例１で選択したＩＬ−２２の産生誘導能が高いバチルス属細菌の菌株は、Ｂ細胞の活性化能が高いだけでなく、Ｂ細胞の生存能を向上させる能力も高いことが分かった。更に、Ｔ細胞の生存能を向上させる能力及びＴ細胞の活性化能も高いことが分かった。
【０１０４】
なお、本実施例では、Ｂ２２０陽性細胞に着目してＢ細胞について解析したが、Ｂ２２０陽性細胞に代えてＣＤ１９陽性細胞（ｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体（ＴＯＮＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用）で解析した場合にも同様の結果が得られた。このことからも、上記所定の菌株によってＢ細胞の生存能を向上させることができ、更にＢ細胞を活性化させることができることが確認できた。
【０１０５】
（実施例３）
＜Ｂ細胞の生存能及びＢ細胞の活性化能の測定試験＞
実施例１でＩＬ−２２の産生誘導能が高かった枯草菌ｂｓ−３０、枯草菌ｂｓ−３４、及びコアギュランス菌ｓｃ−０９について、殺菌処理後の菌体を、実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の「脾臓由来のＢ細胞（Ｂ２２０陽性細胞）と共培養」して、脾臓Ｂ細胞の生存能を向上させる能力及び脾臓Ｂ細胞の活性化能（Ｂ細胞を活性化させる能力）を調査した。以下、測定試験について具体的に説明する。
【０１０６】
（１）菌体懸濁液の調製：
実施例１で調製したバチルス属細菌懸濁液と同様のものを使用した。
【０１０７】
（２）Ｂ細胞浮遊液の調製：
実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の脾臓から採取した細胞を５０ｍＬコニカルチューブ（ＦＡＬＣＯＮ社製）に集め、５ｍＬの赤血球溶解バッファー（０．１５５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ，０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）を加えて細胞を懸濁させた。その後、これにｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）５ｍＬを加えて１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。その後、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄して、細胞浮遊液を調製した。
【０１０８】
基本培地で懸濁後、ビオチン−抗Ｂ２２０抗体（ＴＯＮＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加えて、冷蔵（５℃）して３０分間静置した。
【０１０９】
静置後、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で懸濁した。その後、磁気ビーズであるＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｐｌｕｓ・ＤＭ（日本ＢＤ社製）を加えて、冷蔵（５℃）して３０分間静置した。
【０１１０】
その後、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１回洗浄した後、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に再度懸濁して、ラウンドチューブに移した。
【０１１１】
その後、ＢＤ  ＩＭａｇ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（日本ＢＤ社製）にて細胞分離を行い、磁石に引き寄せられている細胞を「Ｂ細胞（Ｂ２２０陽性細胞）」として回収（ポジティブ細胞分画）した。回収した細胞を基本培地に懸濁して、Ｂ細胞浮遊液を調製した。なお、得られたＢ細胞浮遊液は、血球計算板を用いて細胞数を計測した。
【０１１２】
（３）細胞培養：
２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＢ細胞浮遊液を基本培地で調整し、調整後のＢ細胞浮遊液を、２４ｗｅｌｌマイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に１ｍＬずつ播種して、２×１０６ｃｅｌｌｓ／１ｍＬ／ｗｅｌｌとした。その後、各菌体懸濁液を１０μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間培養した。なお、調整後のＢ細胞浮遊液に菌体（菌体懸濁液）を添加せずに、菌体を添加した水準と同一条件（３７℃、５％ＣＯ２の条件）で２日間培養したものをコントロールとした。
【０１１３】
（４）Ｂ細胞の生存能及びＢ細胞の活性化能の測定：
培養後、フローサイトメトリー（ミルテニーバイオテク社製  ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて、各試料（細胞培養液）についてＢ細胞の生存能の測定（生存するＢ細胞の量の測定）及びＢ細胞の活性化能の測定（活性化されたＢ細胞の量の測定）を行った。
【０１１４】
まず、２４ｗｅｌｌマイクロプレートで培養していた細胞培養液を１．５ｍＬリアクションチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社製）に移し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収した。その後、回収した細胞をｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）０．１ｍＬに懸濁し、ｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体（ＴＯＮＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）とＡＰＣ標識抗ＣＤ８６抗体（ＴＯＮＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を０．５μＬずつ加え、冷蔵（５℃）で６０分間静置した。
【０１１５】
静置後、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収して、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）０．５ｍＬに懸濁した。その後、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）核染色液（コスモバイオ社製）を０．５μＬ加えて測定用試料を得た。この測定用試料についてフローサイトメトリーを用いて測定を行った。なお、解析は、ＦＣＳデータ解析ソフト  ＦｌｏｗＪｏ  （ＦｌｏｗＪｏ，  ＬＬＣ社製）を用いた。
【０１１６】
（Ｂ細胞の生存能）
測定用試料のうち、ＰＩ検出された細胞（ＰＩ核染色液で染色された細胞）を死細胞とみなし、カウントされた細胞数（総細胞数）からの差をＢ細胞の生細胞数とした。そして、総細胞中の生細胞の割合（生細胞の数／総細胞の数×１００）を算出した。同様に、コントロール（バチルス属細菌懸濁液を添加しなかったもの）における、総細胞中の生細胞の割合を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出してＢ細胞の生存能（細胞生存能）の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値（Ｘ−）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表５の「Ｂ細胞の生存能」に示す。本実施例において「平均値（Ｘ−）」は、４回の試験（ｎ＝４）による平均値である。
【０１１７】
（Ｂ細胞の活性化能）
Ｂ細胞の細胞表面マーカーであるｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体と、Ｂ細胞の活性化マーカーであるＡＰＣ標識抗ＣＤ８６抗体によって、Ｂ２２０及びＣＤ８６を発現するＢ細胞を検出し、その数を数えた。そして、Ｂ細胞（Ｂ２２０陽性細胞）のうち、活性化しているＢ細胞（ＣＤ８６＋，Ｂ２２０＋）と活性化していないＢ細胞（ＣＤ８６−，Ｂ２２０＋）の商（活性化しているＢ細胞の数と活性化していないＢ細胞の数との比）を算出した。同様に、コントロール（菌体懸濁液を添加しなかったもの）における、活性化しているＢ細胞（ＣＤ８６＋，Ｂ２２０＋）と活性化していないＢ細胞（ＣＤ８６−，Ｂ２２０＋）の商を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出してＢ細胞の活性化能の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値（Ｘ−）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表５の「Ｂ細胞の活性化能」に示す。
【０１１８】
【表５】
2019141036.tif 000006
【０１１９】
＜結果＞
本実施例の結果によって、実施例１により選択した「ＩＬ−２２の産生誘導能が高い菌株」は、Ｂ細胞に直接作用して、Ｂ細胞の生存能を向上させることができ、Ｂ細胞を活性化させることが更に確認できた。
【０１２０】
（実施例４）
＜Ｂ細胞のＩＬ−２２産生誘導能の測定試験＞
実施例１でＩＬ−２２の産生誘導能の高かった枯草菌ｂｓ−３０、枯草菌ｂｓ−３４、及びコアギュランス菌ｓｃ−０９について、殺菌処理後の菌体を、実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の「脾臓由来のＢ細胞（Ｂ２２０陽性細胞）と共培養」して、ＩＬ−２２産生誘導能を調査した。以下、測定試験について具体的に説明する。
【０１２１】
（１）菌体懸濁液の調製：
実施例１で調製したバチルス属細菌懸濁液と同様のものを使用した。
【０１２２】
（２）Ｂ細胞浮遊液の調製：実施例３と同様に調製した。
【０１２３】
（３）細胞培養：実施例３と同様に培養した。
【０１２４】
（４）ＩＬ−２２の測定：
４２時間の培養後、培養液にＢＤ  ＧｏｌｇｉＳｔｏｐＴＭ（ＢＤ社製）を０．６７μＬずつ加えて混合した。その後、更に、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で６時間培養した。
【０１２５】
その後、２４ｗｅｌｌマイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）で培養した細胞培養液を１．５ｍＬリアクションチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社製）に移し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収した。その後、回収した細胞をＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏｐｅｒｍＴＭ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＤ社製）を用いて固定及び透過処理を行った。この操作はＦｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの添付の説明書に従った。
【０１２６】
Ｂ細胞の染色には、ｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体（ＴＯＮＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用した。また、ＩＬ−２２の染色には、ＰＥ標識抗ＩＬ−２２抗体（ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。
【０１２７】
染色反応は、冷蔵（５℃）で６０分間静置して行った。その後、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収して、０．５ｍＬのｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に懸濁して測定用試料を得た。この測定用試料についてフローサイトメトリーを用いて測定を行った。なお、解析は、ＦＣＳデータ解析ソフト  ＦｌｏｗＪｏ  （ＦｌｏｗＪｏ，  ＬＬＣ社製）を用いた。
【０１２８】
Ｂ細胞中のＩＬ−２２陽性細胞の割合（ＩＬ−２２＋，Ｂ２２０＋／Ｂ２２０＋）を各測定用試料で求め、コントロール（菌体懸濁液を添加しなかったもの）におけるＢ細胞中のＩＬ−２２陽性細胞の割合を基準（１００）とし、各測定用試料の相対値を算出して、Ｂ細胞のＩＬ−２２産生細胞量の値とした。なお、試験は繰り返して行い、平均値（Ｘ−）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を表５の「ＩＬ−２２産生誘導能」に示す。本実施例において「平均値（Ｘ−）」は、４回の試験（ｎ＝４）による平均値である。
【０１２９】
＜結果＞
本実施例の結果によって、実施例１により選択した「ＩＬ−２２の産生誘導能が高い菌株」は、Ｂ細胞に直接作用して、ＩＬ−２２を産生するＢ細胞を増加させていることが分かった。
【０１３０】
（実施例５）
＜給餌試験（正常マウス）＞
ＩＬ−２２の産生誘導能の高かった「コアギュランス菌ｓｃ−０９」の殺菌処理後の菌体を実験用マウスに摂取させ、その後、皮膚の状態を測定（経表皮水分損失量（TransEpidermal Water Loss（ＴＥＷＬ））した。また、あわせてＩＬ−２２を投与した群（表１１中、「ＩＬ−２２投与群」）と、ＩＬ−２２の中和抗体を投与した群（表１１中、「菌体摂取／抗ＩＬ−２２抗体投与群」）も用意し、ＩＬ−２２の接種による皮膚の変化も確認した。
【０１３１】
（１）バチルス属細菌配合飼料の調製：
通常のマウス用飼料に、殺菌処理しその後凍結乾燥したコアギュランス菌ｓｃ−０９の菌体を１ｗ／ｗ％の割合で配合した飼料（バチルス属細菌配合飼料）を調製した。なお、通常のマウス用飼料としては、マウス飼育繁殖用飼料ＣＥ−２（日本クレア社製）を用いた。
【０１３２】
（２）給餌飼育：
通常の実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）（８週齢・雌）１２匹を４群に分け（各群３匹ずつ）、そのうちの２群にバチルス属細菌配合飼料を与え、残りの２群にはバチルス属細菌の菌体を含まない通常のマウス用飼料を与えて、２１日間飼育をした。
【０１３３】
バチルス属細菌の菌体を含まない通常のマウス用飼料を与えた２つの群のうちの一方には、給餌開始１４日目と１７日目に、それぞれ、ＩＬ−２２の組換え体タンパク質である「リコンビナントＩＬ−２２（ＴＯＮＢＯ社製  リコンビナントマウスＩＬ−２２（Recombinant Mouse IL-22））」を尾静脈注射（それぞれ２μｇ／匹）した。上記２つの群のうち、「リコンビナントＩＬ−２２」を尾静脈注射した群を「ＩＬ−２２投与群」と言うこととし、「リコンビナントＩＬ−２２」を尾静脈注射（投与）しない群を「コントロール群」ということとした。
【０１３４】
また、バチルス属細菌配合飼料を与えた２つの群のうちの一方には、給餌開始から１４日目と１７日目に、それぞれ、ＩＬ−２２中和抗体として「抗ＩＬ−２２抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製  ＩＬ−２２モノクローナル抗体）」を尾静脈注射（それぞれ２０μｇ／匹）した。上記２群のうち、「抗ＩＬ−２２抗体」を尾静脈注射した群を「菌体摂取／抗ＩＬ−２２抗体投与群」と言うこととし、「抗ＩＬ−２２抗体」を尾静脈注射（投与）しない群を「菌体摂取群」ということとした。
【０１３５】
（３）経表皮水分損失量（ＴＥＷＬ）の測定：
給餌開始から２１日目に、各群のマウスの背部における皮膚の経表皮水分損失量（ＴＥＷＬ）を測定した。本測定に際して、前日（２０日目）にマウスの背部を剃毛処理した。ＴＥＷＬの測定は、ＣＯＲＴＥＸ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社製の皮膚測定装置「ＤｅｒｍａＬａｂ（登録商標）」にて行った。各マウスにおいてＴＥＷＬの測定は３回ずつ行い、平均値を求め、更に、各群の平均値と標準偏差を求めた。表６，図８には、経表皮水分損失量（ＴＥＷＬ）の結果を示す。コントロール群とその他の各群の数値について、F検定を行い、分散に有意差があるか否かの確認を行った。その後、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定（これは、等分散を仮定した２標本による検定である）を行った。
【０１３６】
【表６】
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【０１３７】
表６、図８の結果から明らかなように、菌体摂取群（「Bacillus coagulans  ｓｃ−０９」を摂取し、「抗ＩＬ−２２抗体」を投与しない群）は、コントロール群に比べて、ＴＥＷＬが低く、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定の結果、ｐ＜０．０１（ｐ＝０．０００４）となり、有意水準１％で有意差が認められた。
【０１３８】
なお、表６から分かるように、ＩＬ−２２投与群（乳酸菌配合飼料は与えずに、ＩＬ−２２を投与した群）は、コントロール群に比べて、ＴＥＷＬが低く、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ t検定の結果、ｐ＜０．０１（ｐ＝０．００３）となり、有意水準１％で有意差が認められた。また、「菌体摂取／抗ＩＬ−２２抗体投与群」は、菌体摂取群に比べて、ＴＥＷＬが高く（即ち、皮膚からの水分の蒸散量が多く）、コントロール群と比べてもＴＥＷＬが高く、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定の結果、ｐ＜０．０１（ｐ＝０．００３）となり、有意水準１％で有意差が認められた。なお、各群のマウスは、目視上では皮膚の性状に変化は確認されなかった。
【０１３９】
このように本実施例からすると、菌体摂取群ではＴＥＷＬが低くなることが分かり、本発明のバチルス属細菌を摂取することで皮膚のバリア機能が高まることが分かった。
【０１４０】
なお、ＩＬ−２２を投与することでもＴＥＷＬが低下するものの、一方で、ＩＬ−２２の中和抗体を投与（尾静脈注射）することでＴＥＷＬが上昇することから（表６，図８参照）、ＩＬ−２２が皮膚のバリア機能を高めていることが確認された。そして、菌体摂取による皮膚のバリア機能の向上は、菌体を摂取したことに起因した刺激に基づくものであり、菌体によるＩＬ−２２の産生誘導に拠るものである可能性が考えられる。
【０１４１】
（実施例６）
＜給餌試験（無菌マウス）＞
ＩＬ−２２の産生誘導能の高かった「枯草菌ｂｓ−３４」の殺菌処理後の菌体を無菌マウスに摂取させ、その後、皮膚の状態を測定（経表皮水分損失量（TransEpidermal Water Loss（ＴＥＷＬ））した。
【０１４２】
（１）菌体配合飼料の調製：
通常のマウス用飼料に、殺菌処理しその後凍結乾燥した枯草菌ｂｓ−３４の菌体を１ｗ／ｗ％の割合で配合した飼料（バチルス属細菌配合飼料）を調製した。なお、通常のマウス用飼料としては、マウス飼育繁殖用飼料ＣＥ−２（日本クレア社製）を用いた。
【０１４３】
（２）給餌飼育：
無菌マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌ［Ｇｆ］）（８週齢・雌）１０匹を、バチルス属細菌配合飼料を与える群（菌体摂取群）と、菌体を含まない通常のマウス用飼料を与える群（コントロール群）とに５匹ずつ分け、無菌環境下で１ヶ月飼育をした。
【０１４４】
（３）経表皮水分損失量（ＴＥＷＬ）の測定：
給餌開始から１ヶ月後に背部の皮膚におけるＴＥＷＬを測定した。なお、測定直前に、小動物用バリカンでマウスの背部の毛を刈ってから測定した。ＴＥＷＬの測定は、ＣＯＲＴＥＸ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社製の皮膚測定装置「ＤｅｒｍａＬａｂ（登録商標）」にて行った。ＴＥＷＬの測定は、各マウスにつき３回ずつ行い、平均値と標準偏差を求めた。結果を、表７，図９に示す。コントロール群と菌体摂取群の数値について、Ｆ検定を行い、分散に有意差があるか否かの確認を行った。その後、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定を行った。
【０１４５】
【表７】
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【０１４６】
菌体摂取群は、コントロール群（バチルス属細菌配合飼料を摂取しない群）に比べて、ＴＥＷＬが有意に低く、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定の結果、ｐ＜０．０１（ｐ＝０．００１）となり、有意水準１％で有意差が認められた。このように本実施例からも、菌体摂取群ではＴＥＷＬが低くなることが分かり、本発明のバチルス属細菌を摂取することで皮膚のバリア機能が高まることが分かった。
【０１４７】
以上のように、本発明のバチルス属細菌は、ＩＬ−２２の産生誘導能が高いことが分かった。更に、本発明のバチルス属細菌は、Ｂ細胞に直接作用することによってＢ細胞の生存能を向上させる能力を有し、Ｂ細胞の活性化能（Ｂ細胞を活性化させる能力）を有することが分かった。そして、この結果からすると、本発明のバチルス属細菌は、免疫賦活作用を有することが分かる。また、本発明のバチルス属細菌は、皮膚のバリア機能を増強する（高める）ことが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
本発明のバチルス属細菌は、飲食品、サプリメント、医薬品などに添加してＩＬ−２２を産生させるＩＬ−２２産生誘導剤の有効成分（更には、皮膚バリア機能増強剤の有効成分）として採用したり、そのものを飲食品、サプリメント、医薬品などとしたりすることができる。飲食品としては、例えば、味噌、即席味噌汁、調理味噌（味噌加工品）、金山寺味噌などのなめ味噌、醤油、つゆ、調味ソース、調味たれ、ご飯の素、惣菜、あま酒（糀飲料）等が挙げられる。
【受託番号】
【０１４９】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５８３、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５８４、及び受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５９０
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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