(57)【要約】【課題】糖鎖中のラクトンを迅速に安定化する。【解決手段】試料の調製方法は、糖鎖を含む試料の調製方法であって、糖鎖に含まれるシアル酸の少なくとも一部をラクトン化するラクトン化反応を行うことと、試料に、ラクトン化されているシアル酸と反応させるアンモニア、アミンおよびこれらの塩からなる群から選択される少なくも一つを含む、アミド化反応溶液を加え、ラクトン化されているシアル酸のラクトンをアミド化するアミド化反応を行うことと、を備える。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖を含む試料の調製方法であって、
前記糖鎖に含まれるシアル酸の少なくとも一部をラクトン化するラクトン化反応を行うことと、
前記試料に、ラクトン化されている前記シアル酸と反応させるアンモニア、アミンおよびこれらの塩からなる群から選択される少なくも一つを含む、アミド化反応溶液を加え、前記ラクトン化されている前記シアル酸のラクトンをアミド化するアミド化反応を行うことと、
を備える試料の調製方法。
【請求項２】
請求項１に記載の試料の調製方法において、
前記ラクトン化反応の後、前記試料から前記ラクトン化反応に用いたラクトン化反応溶液を除去するための操作を行うことをさらに備える試料の調製方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の試料の調製方法において、
前記アミド化反応は、前記試料を前記アミド化反応溶液と接触させることのみにより行われる試料の調製方法。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか一項に記載の試料の調製方法において、
前記アミド化反応溶液は前記ラクトンと反応させる脱水縮合剤を含まない、試料の調製方法。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか一項に記載の試料の調製方法において、
前記試料に前記アミド化反応溶液を加えた後、前記試料と脱水縮合剤とを反応させる操作を行わない、試料の調製方法。
【請求項６】
請求項１から５までのいずれか一項に記載の試料の調製方法において、
前記アミド化反応を行うために前記試料と前記アミド化反応溶液とを接触させる時間は３０分より短い試料の調製方法。
【請求項７】
請求項１から６までのいずれか一項に記載の試料の調製方法において、
前記アミンは第一級アミンである、試料の調製方法。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか一項に記載の試料の調製方法において、
前記アミンはアルキル基を含む、試料の調製方法。
【請求項９】
請求項８に記載の試料の調製方法において、
前記アルキル基は分枝を有しない、試料の調製方法。
【請求項１０】
請求項１から９までのいずれか一項に記載の試料の調製方法において、
前記アミンはアリル基およびヒドロキシ基の少なくとも一つを含む、試料の調製方法。
【請求項１１】
請求項１から１０までのいずれか一項に記載の試料の調製方法において、
前記アミド化反応溶液のｐＨは、８．０以上である、試料の調製方法。
【請求項１２】
請求項１から１１までのいずれか一項に記載の試料の調製方法において、
前記ラクトン化反応を行う際に、前記試料に、前記糖鎖に含まれる前記シアル酸と反応させる脱水縮合剤を含むラクトン化反応溶液を加え、前記シアル酸の少なくとも一部をラクトン化する、試料の調製方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の試料の調製方法において、
前記ラクトン化反応溶液は、前記糖鎖に含まれる前記シアル酸と反応させる求核剤をさらに含み、
前記求核剤は、前記アミド化反応で用いられた前記アンモニアおよび前記アミンとは質量が異なり、
前記試料に前記ラクトン化反応溶液を加え、前記シアル酸の結合様式に基づいて、前記シアル酸の一部をラクトン化し、前記シアル酸の他の一部に前記求核剤の少なくとも一部を結合させる、試料の調製方法。
【請求項１４】
請求項１から１３までのいずれか一項に記載の試料の調製方法において、
前記ラクトン化反応において、α２，３−シアル酸、α２，８−シアル酸、およびα２，９−シアル酸からなる群から選択される少なくとも一つの前記シアル酸がラクトン化される試料の調製方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の試料の調製方法において、
前記試料に前記ラクトン化反応溶液を加え、α２，３−シアル酸をラクトン化し、α２，６−シアル酸に前記求核剤の一部を結合させる、試料の調製方法。
【請求項１６】
請求項１から１５までのいずれか一項に記載の試料の調製方法において、
前記試料と前記アミド化反応溶液との接触は、前記試料が固相担体に結合または吸着した状態で行われる、試料の調製方法。
【請求項１７】
請求項１から１６までのいずれか一項に記載の試料の調製方法において、
前記アミド化反応溶液の溶媒は、有機溶媒を含む、試料の調製方法。
【請求項１８】
請求項１から１７までのいずれか一項の試料の調製方法により試料を調製することと、
調製した前記試料を分析することと
を備える分析方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の分析方法において、
調製した前記試料は、質量分析およびクロマトグラフィの少なくとも一つにより分析される分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料の調製方法および分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シアル酸は生体内に数多く存在する糖である。シアル酸は、生体内においてタンパク質と結合された糖鎖に含まれ、糖鎖の末端（非還元末端）に存在することが多い。従って、シアル酸は、このような糖タンパク質分子において分子の外側に配置され他の分子から直接認識されるため、重要な役割を担っている。
【０００３】
シアル酸は、隣接する糖との間の結合様式（ｌｉｎｋａｇｅ  ｔｙｐｅ）が異なる場合がある。例えば、ヒトのＮ型糖鎖では主にα２，３−およびα２，６−、Ｏ型糖鎖やスフィンゴ糖脂質ではこれらに加えてα２，８−およびα２，９−の結合様式が知られている。このような結合様式の違いにより、シアル酸は異なる分子から認識され、異なる役割を有し得る。また、がん化に伴い、発現する糖タンパク質におけるシアル酸の結合様式が変化することも知られており、がんのバイオマーカーとしての利用も期待される。さらに、糖鎖修飾によるバイオ医薬品の効果への影響が知られており、バイオ医薬品の品質管理においても、シアル酸の結合様式の解析は重要である。
【０００４】
しかしながら、シアル酸を含有するシアリル糖鎖の質量分析による解析は、シアル酸が負電荷を有し正イオンモードではイオン化しにくいことや、シアル酸が分解しやすいことから容易ではない。それに加え、シアル酸の結合様式を区別して解析することは、シアル酸の結合様式によって分子量が変化しないため、さらに難しくなる。
【０００５】
シアル酸の結合様式を区別して解析するため、結合様式特異的な修飾を行う化学修飾法が提案されている。このような化学修飾法では、α２，３−シアル酸がα２，６−シアル酸よりも脱水縮合剤により分子内脱水を起こしやすい性質を利用し、α２，３−シアル酸を分子内脱水によりラクトン化すると同時に、α２，６−シアル酸をアルコールまたはアミン等の求核剤と反応させる。これによりシアル酸の結合様式によって異なる質量の分子が生成されるから、質量分析によりシアル酸の結合様式を区別して解析することができる。
【０００６】
しかし、α２，３−シアル酸のラクトンは不安定であり、水に溶解しただけでも分解が始まり、４８時間程度でかなりの割合が分解される可能性もある。従って、ラクトンの分解による定量性の悪化を避けるために、ラクトンを修飾して安定化することが行われている。
【０００７】
特許文献１および非特許文献１では、遊離糖鎖にイソプロピルアミンと脱水縮合剤とを含む溶液を加え、α２，３−シアル酸をラクトン化し、α２，６−シアル酸をアミド化している。この後、ラクトンを加水分解してアミド化するために試料にメチルアミン塩酸塩を含む溶液および脱水縮合剤を含む溶液を順次加え、２時間反応させている。
【０００８】
非特許文献２では、組織切片上の糖タンパク質にジメチルアミンと脱水縮合剤とを含む溶液を加え、α２，３−シアル酸をラクトン化し、α２，６−シアル酸をアミド化している。この後、非特許文献２の図１（Ｂ）に示されるように、ラクトンを加水分解してアミド化するためにアンモニア水を加え２時間反応させている。
【０００９】
非特許文献３では、固相担体に結合させた糖タンパク質にエタノールと脱水縮合剤とを含む溶液を加え、α２，３−シアル酸をラクトン化し、α２，６−シアル酸をエステル化している。この後、非特許文献２の図解（Ｓｃｈｅｍｅ）１（ｂ）に示されるように、ラクトンを加水分解するためにｐＨ１０のＴｒｉｓ緩衝液を試料に加え１時間反応させ、その後メチルアミン塩酸塩と脱水縮合剤とを含む溶液を試料に加えて３０分間反応させている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第６１３５７１０号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Nishikaze T, Tsumoto H, Sekiya S, Iwamoto S, Miura Y, Tanaka K. "Differentiation of Sialyl Linkage Isomers by One-Pot Sialic Acid Derivatization for Mass Spectrometry-Based Glycan Profiling," Analytical Chemistry,（米国）, ACS Publications, 2017年2月21日、Volume 89, Issue 4, pp.2353-2360
【非特許文献２】Holst S, Heijs B, de Haan N, van Zeijl RJ, Briaire-de Bruijn IH, van Pelt GW, Mehta AS, Angel PM, Mesker WE, Tollenaar RA, Drake RR, Bovee JV, McDonnell LA, Wuhrer M. "Linkage-Specific in Situ Sialic Acid Derivatization for N-Glycan Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissues," Analytical Chemistry,（米国）, ACS Publications, 2016年6月7日、Volume 88, Issue 11, pp.5904-5913
【非特許文献３】Li H, Gao W, Feng X, Liu BF, Liu X. "MALDI-MS analysis of sialylated N-glycan linkage isomers using solid-phase two step derivatization method," Analytica Chimica Acta,（オランダ国）, Elsevier B.V., 2016年6月14日、Volume 924, pp.77-85
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記先行技術文献の方法では、ラクトンを加水分解により開環してから、開環により生じたカルボキシ基を脱水縮合剤の存在下でアミンと反応させることを意図していたため、反応のための時間が長く、操作が煩雑であった。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の好ましい実施形態による試料の調製方法は、糖鎖を含む試料の調製方法であって、前記糖鎖に含まれるシアル酸の少なくとも一部をラクトン化するラクトン化反応を行うことと、前記試料に、ラクトン化されている前記シアル酸と反応させるアンモニア、アミンおよびこれらの塩からなる群から選択される少なくも一つを含む、アミド化反応溶液を加え、前記ラクトン化されている前記シアル酸のラクトンをアミド化するアミド化反応を行うことと、を備える。
さらに好ましい実施形態では、前記ラクトン化反応の後、前記試料から前記ラクトン化反応に用いたラクトン化反応溶液を除去するための操作を行うことをさらに備える。
さらに好ましい実施形態では、前記アミド化反応は、前記試料を前記アミド化反応溶液と接触させることのみにより行われる。
さらに好ましい実施形態では、前記アミド化反応溶液は前記ラクトンと反応させる脱水縮合剤を含まない。
さらに好ましい実施形態では、前記試料に 前記アミド化反応溶液を加えた後、前記試料と脱水縮合剤とを反応させる操作を行わない。
さらに好ましい実施形態では、前記アミド化反応を行うために前記試料と前記アミド化反応溶液とを接触させる時間は３０分より短い。
さらに好ましい実施形態では、前記アミンは第一級アミンである。
さらに好ましい実施形態では、前記アミンはアルキル基を含む。
さらに好ましい実施形態では、前記アルキル基は分枝を有しない。
さらに好ましい実施形態では、前記アミンはアリル基およびヒドロキシ基の少なくとも一つを含む。
さらに好ましい実施形態では、前記アミド化反応溶液のｐＨは、８．０以上である。
さらに好ましい実施形態では、前記ラクトン化反応を行う際に、前記試料に、前記糖鎖に含まれる前記シアル酸と反応させる脱水縮合剤を含むラクトン化反応溶液を加え、前記シアル酸の少なくとも一部をラクトン化する。
さらに好ましい実施形態では、前記ラクトン化反応溶液は、前記糖鎖に含まれる前記シアル酸と反応させる求核剤をさらに含み、前記求核剤は、前記アミド化反応で用いられた前記アンモニアおよび前記アミンとは質量が異なり、前記試料に前記ラクトン化反応溶液を加え、前記シアル酸の結合様式に基づいて、前記シアル酸の一部をラクトン化し、前記シアル酸の他の一部に前記求核剤の少なくとも一部を結合させる。
さらに好ましい実施形態では、前記ラクトン化反応において、α２，３−シアル酸、α２，８−シアル酸、およびα２，９−シアル酸からなる群から選択される少なくとも一つの前記シアル酸がラクトン化される。
さらに好ましい実施形態では、前記試料に前記ラクトン化反応溶液を加え、α２，３−シアル酸をラクトン化し、α２，６−シアル酸に前記求核剤の一部を結合させる。
さらに好ましい実施形態では、前記試料と前記アミド化反応溶液との接触は、前記試料が固相担体に結合または吸着した状態で行われる。
さらに好ましい実施形態では、前記アミド化反応溶液の溶媒は、有機溶媒を含む。
本発明の好ましい実施形態による分析方法は、上述の試料の調製方法により試料を調製することと、調製した前記試料を分析することとを備える。
さらに好ましい実施形態では、調製した前記試料は、質量分析およびクロマトグラフィの少なくとも一つにより分析される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、より迅速に糖鎖中のラクトン化された分子を安定化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、一実施形態に係る分析方法の流れを示すフローチャートである。
【図２】図２は、α２，３−シアリルグライコペプチドから遊離した糖鎖をラクトン化反応およびアミド化反応に供した後、反応生成物に対し負イオンモードで質量分析を行って得たマススペクトルであり、（ａ）は、アミド化反応の際のメチルアミン濃度が１％の場合のマススペクトルであり、（ｂ）はアミド化反応の際のメチルアミン濃度が１０％の場合のマススペクトルである。
【図３】図３は、アミド化反応の際のメチルアミン水溶液の濃度と、アミド化される効率との関係を示すグラフである。
【図４】図４は、アミド化反応の際のアミンの種類と、各反応生成物の生成比とを示すグラフである。
【図５】図５は、アミド化反応の際のアミンの種類および溶媒と、各反応生成物の生成比とを示すグラフである。
【図６】図６は、アミド化反応の際のｐＨと、各反応生成物の生成比とを示すグラフである。
【図７】図７は、糖タンパク質フェツインから遊離した糖鎖をラクトン化反応およびアミド化反応に供した後、反応生成物に対し質量分析を行って得たマススペクトルである。
【図８】図８は、スフィンゴ糖脂質ジシアロガングリオシドＧＤ１ａ（上段）およびＧＤ１ｂ（下段）から遊離させたα２，８−シアル酸を含む糖鎖をラクトン化反応およびアミド化反応に供した後、反応生成物に対し質量分析を行って得たマススペクトルである。
【図９】図９は、α２，３−シアリルグライコペプチドから遊離した糖鎖をラクトン化反応に供した後、ＨＩＬＩＣ担体に結合させ、溶出の前後でアミド化反応に供した場合の、各反応生成物の生成比を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明する。発明者らは、シアル酸がラクトン化された試料に対し、ラクトン化されているシアル酸と反応させるアンモニア、アミンおよびこれらの塩からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含むアミド化反応溶液を加えることにより、迅速なアミド化を引き起こすことができることを見出した。
【００１７】
図１は、本実施形態の試料の調製方法に係る分析方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ１００１において、糖鎖を含む試料が用意される。
【００１８】
糖鎖を含む試料は、特に限定されず、遊離糖鎖、糖ペプチドおよび糖タンパク質、ならびに糖脂質からなる群から選択される少なくとも一つの分子を含むことができる。本実施形態の試料の調製方法は、糖鎖に形成されたラクトンの修飾に用いられ、特にシアル酸の結合様式の解析に好適に用いられるため、試料中の糖鎖は、Ｎ−結合型糖鎖やＯ−結合型糖鎖、糖脂質型糖鎖等、末端にシアル酸を有する可能性がある糖鎖を含むことが好ましい。試料中の糖鎖は、α２，３−シアル酸、α２，８−シアル酸およびα２，９−シアル酸の少なくとも一つを含むことが好ましい。
【００１９】
試料が遊離糖鎖を含む場合には、糖タンパク質や糖ペプチド、糖脂質から遊離させた糖鎖を用いることができる。糖鎖を糖タンパク質や糖ペプチド、糖脂質から遊離させる方法としては、Ｎ‐グリコシダーゼやＯ‐グリコシダーゼ、エンドグリコセラミダーゼなどを用いた酵素処理、ヒドラジン分解、アルカリ処理によるβ脱離等の方法を用いることができる。糖ペプチドおよび糖タンパク質のペプチド鎖からＮ‐結合型糖鎖を遊離させる場合は、ペプチド‐Ｎ‐グリコシダーゼＦ(PNGase F)やペプチド‐Ｎ‐グリコシダーゼＡ(PNGase A)、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Endo M）等による酵素処理が好適に用いられる。また、糖鎖の還元末端のピリジルアミノ化（PA化）等の修飾を適宜行うことができる。酵素処理の前に、後述する糖ペプチドまたは糖タンパク質のペプチド鎖の切断を行ってもよい。
【００２０】
試料が糖ペプチドおよび／または糖タンパク質を含む場合、後述の「糖ペプチドおよび糖タンパク質の副反応の抑制について」の部分で述べるように、ペプチド部分の副反応を抑えるための処理を適宜行うことができる。また、糖ペプチドまたは糖タンパク質のペプチド鎖のアミノ酸の残基数が多いものは、酵素的切断等により、ペプチド鎖を切断して用いることが好ましい。例えば、質量分析用の試料を調製する場合、ペプチド鎖のアミノ酸残基数は３０以下が好ましく、２０以下がより好ましく、１５以下がさらに好ましい。一方、糖鎖が結合しているペプチドの由来を明確とすることが求められる場合には、ペプチド鎖のアミノ酸残基数は２以上が好ましく、３以上がより好ましい。
【００２１】
糖ペプチドまたは糖タンパク質のペプチド鎖を切断する場合の消化酵素としては、トリプシン、Ｌｙｓ‐Ｃ、アルギニンエンドペプチダーゼ、キモトリプシン、ペプシン、サーモリシン、プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ等が用いられる。これらの消化酵素の２種以上を組み合わせて用いてもよい。ペプチド鎖の切断の際の条件は特に限定されず、使用する消化酵素に応じた適宜のプロトコールが採用される。この切断の前に、試料中のタンパク質およびペプチドの変性処理やアルキル化処理が行われてもよい。変性処理やアルキル化処理の条件は特に限定されない。
なお、上記ペプチド鎖の切断処理は、本実施形態の試料の調製方法により糖鎖に含まれるラクトンをアミド化した後に行ってもよい。また、酵素的切断では無く、化学的切断等によりペプチド鎖を切断してもよい。
ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３に進む。
【００２２】
（ラクトン化反応）
ステップＳ１００３において、試料をラクトン化のための反応溶液（以下、ラクトン化反応溶液と呼ぶ）と接触させ、糖鎖に含まれるシアル酸の少なくとも一部をラクトン化するラクトン化反応を行う（以下、ラクトン化反応と記載した場合、特に言及が無い限り、ステップＳ１００３のラクトン化反応を指す）。ラクトン化反応では、α２，３−シアル酸、α２，８−シアル酸およびα２，９−シアル酸が好適にラクトン化される。ラクトン化反応溶液は、脱水縮合剤を含む。
【００２３】
以下の説明では、シアル酸の結合様式を区別して解析を行う場合を例に説明する。この場合、ラクトン化反応溶液は、脱水縮合剤に加え、さらにアルコール、アミンおよびこれらの塩からなる群から選択される少なくとも一つを含む求核剤を含む。
【００２４】
シアル酸の結合様式に基づいて選択的に脱水反応または求核反応を起こすように、脱水縮合剤および求核剤の種類や濃度が調整される。α２，３−シアル酸のカルボキシ基の分子内脱水で生じるラクトンは六員環であり、α２，６−シアル酸のカルボキシ基の分子内脱水により生じ得るラクトンは七員環となる。従って、七員環より安定な六員環を生じるα２，３−シアル酸はα２，６−シアル酸よりラクトン化されやすい。また、α２，３−シアル酸のカルボキシ基はα２，６−シアル酸のカルボキシ基に比べて立体障害が比較的大きい位置にあるため、大きな分子は、α２，６−シアル酸と比べると、α２，３−シアル酸とは反応しづらい。このようなシアル酸の結合様式による分子構造の違いに基づいて、シアル酸の結合様式により異なる修飾がされるように脱水縮合剤および求核剤の種類や濃度が調整される。
【００２５】
（ラクトン化反応における脱水縮合剤）
脱水縮合剤は、カルボジイミドを含むことが好ましい。カルボジイミドを用いると、脱水縮合剤としてホスホニウム系脱水縮合剤（いわゆるBOP試薬）やウロニウム系脱水縮合剤を用いた場合に比べて、立体障害が大きい部位に存在するカルボキシ基がアミド化されにくいからである。カルボジイミドの例としては、Ｎ，Ｎ’‐ジシクロへキシルカルボジイミド(DCC)、Ｎ‐（３‐ジメチルアミノプロピル）‐Ｎ’‐エチルカルボジイミド(EDC)、Ｎ，Ｎ’‐ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、１‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐３‐エチルカルボジイミド(BEC)、Ｎ，Ｎ’‐ジ‐ｔｅｒｔ‐ブチルカルボジイミド、１，３‐ジ‐ｐ‐トルイルカルボジイミド、ビス（２，６‐ジイソプロピルフェニル）カルボジイミド、ビス（トリメチルシリル）カルボジイミド、１，３‐ビス（２，２‐ジメチル‐１，３‐ジオキソラン‐４‐イルメチル）カルボジイミド(BDDC)や、これらの塩が挙げられる。
【００２６】
（ラクトン化反応における添加剤）
脱水縮合剤による脱水縮合を促進させ、かつ副反応を抑制するために、カルボジイミドに加えて、求核性の高い添加剤を用いることが好ましい。求核性の高い添加剤としては、１‐ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、１‐ヒドロキシ‐７‐アザ‐ベンゾトリアゾール(HOAt)、４‐（ジメチルアミノ）ピリジン(DMAP)、２‐シアノ‐２‐（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル(CHA)、Ｎ‐ヒドロキシ‐スクシンイミド(HOSu)、６‐クロロ‐１‐ヒドロキシ‐ベンゾトリアゾール(Cl-HoBt)、Ｎ‐ヒドロキシ‐３，４‐ジヒドロ‐４‐オキソ‐１，２，３‐ベンゾトリアジン(HOOBt)等が好ましく用いられる。
【００２７】
（ラクトン化反応における求核剤）
求核剤として用いられるアミンは、炭素原子を２個以上含む第一級および／または第二級のアルキルアミンを含むことが好ましい。第一級のアルキルアミンは、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、ｓｅｃ‐ブチルアミン、ｔｅｒｔ‐ブチルアミン等が好ましい。第二級アルキルアミンは、ジメチルアミン、エチルメチルアミン、ジエチルアミン、プロピルメチルアミン、イソプロピルメチルアミン等が好ましい。α２，３−シアル酸のカルボキシ基のように立体障害が大きい部位に存在するカルボキシ基がアミド化されにくいようにする観点から、イソプロピルアミンのような分枝アルキル基を有するアミンを用いることが好ましい。ラクトン化反応溶液の求核剤にアミンを用いた場合、シアル酸の結合様式に基づいて、α２，６−シアル酸等の一部のシアル酸のカルボキシ基がアミド化される。
【００２８】
求核剤として用いられるアルコールは、特に限定されず、例えばメタノールおよびエタノール等を用いることができる。ラクトン化反応溶液の求核剤にアルコールを用いた場合、シアル酸の結合様式に基づいて、α２，６−シアル酸等の一部のシアル酸のカルボキシ基がエステル化される。
なお、求核剤は、上述の求核剤の塩を含んでもよい。
【００２９】
（ラクトン化反応を行う相）
ラクトン化反応は、液相でも固相でも実施できる。液相で反応を行う場合、ジメチルスルホキシド(DMSO)やジメチルホルムアミド（DMF）等の非水系溶媒中で反応を行うことが好ましい。非水溶媒中で反応を行うことにより、副反応が抑制される傾向があり、糖ペプチドや糖タンパク質を試料とする場合に好適である。液相反応における各成分の濃度は特に限定されず、脱水縮合剤やアミンの種類等に応じて適宜に決定できる。ラクトン化反応溶液の脱水縮合剤の濃度は、例えば、１ｍＭ〜５Ｍが好ましく、１０ｍＭ〜３Ｍがより好ましい。カルボジイミドとHOAtやHOBt等の求核性の高い添加剤とを併用する場合は、それぞれの濃度が上記範囲であることが好ましい。ラクトン化反応溶液のアミンの濃度は、０．０１〜２０Ｍが好ましく、０．１Ｍ〜１０Ｍがより好ましい。ラクトン化反応の際の反応温度は、−２０℃〜１００℃程度が好ましく、−１０℃〜５０℃がより好ましい。
【００３０】
固相でラクトン化反応を行う場合、固相担体は、糖鎖、糖ペプチド、糖タンパク質等を固定可能であれば、特に限定されない。例えば、糖ペプチドや糖タンパク質を固定するためには、エポキシ基、トシル基、カルボキシ基、アミノ基等をリガンドとして有する固相担体を用いることができる。また、糖鎖を固定するためには、ヒドラジド基やアミノオキシ基等をリガンドとして有する固相担体を用いることができる。試料を固相担体に固定した状態で反応を行うことにより、ラクトン化反応後のラクトン化反応溶液の除去等がより容易となる。
【００３１】
ステップＳ１００３が終了したら、ステップＳ１００５に進む。
なお、ラクトン化反応後の試料からラクトン化反応溶液を除去するための操作を行うことが好ましい。ラクトン化反応溶液を除去するための操作は、固相担体に結合させた糖鎖から遠心等により反応溶液を分離し、洗浄溶液を用いて洗浄したり、遠心濃縮により試料を乾固させたり等、ラクトン化反応に必要な成分の濃度が十分低くなれば適宜特に限定されない。
【００３２】
（アミド化反応）
ステップＳ１００５において、試料を、ラクトンをアミド化するための反応溶液（以下、アミド化反応溶液と呼ぶ）と接触させ、ラクトン化されているシアル酸のラクトンをアミド化するアミド化反応（以下、アミド化反応と記載した場合、特に言及が無い限り、ステップＳ１００５のアミド化反応を指す）が行われる。発明者らは、従来行われていた、加水分解によりラクトンを開環してからカルボキシ基をアミド化する技術的な常識とは全く異なり、ラクトンを迅速に直接アミド化する方法を見出した。この反応は後述のように無水条件下でも好適に行われるため、加水分解とは異なる反応であり、アミノ基とラクトンとの相互作用に基づくアミノリシスと考えられる。以下では、無水条件下でも可能な、アンモニア、アミンまたはこれらの塩によるラクトンの開環およびアミド化をアミノリシスと呼ぶ。
【００３３】
アミド化反応溶液は、アンモニア、アミンおよびこれらの塩からなる群から選択される少なくとも一つが含まれる。アミンを用いる場合、ラクトン化反応溶液に用いたアミンと異なるアミンを用いるか、安定同位体による修飾等で質量を異ならせる。アミド化反応には脱水縮合剤は必要でなく、含まなくてよい。好ましくは、アミド化反応は、試料をアミド化反応溶液と接触させることのみにより行われる。
なお、アミド化反応には脱水縮合剤は必要ではないが、アミド化反応溶液に脱水縮合剤が含まれていてもよい。例えば、ステップＳ１００３で試料に加えたラクトン化反応溶液を除去しないで、アンモニア、アミンまたはこれらの塩を加えることにより、アミド化反応溶液を調製してもよい。このように、アミド化反応では、簡便な操作でラクトンを安定化させ得る。
【００３４】
（アミド化反応におけるアミン）
アミド化反応溶液に含まれるアミンは、第一級アミンが好ましく、直鎖炭化水素基を有する第一級アミンがより好ましく、直鎖アルキル基を有する第一級アミンがさらに好ましい。アミド化反応溶液に含まれるアミンは、直鎖アルキル基を有する第一級アミンとしては、炭素数が１０以下の第一級アミンが好ましく、炭素数が７以下の第一級アミンがより好ましく、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、ペンチルアミンがさらに好ましく、メチルアミンが最も好ましい。アミド化反応溶液に含まれるアミンが分枝（以下、「分枝」は炭化水素鎖の分枝を示す）を有しない直鎖状の構造を有していたり、炭素数が少ない方が、より効率的にラクトンがアミド化されるため好ましい。
【００３５】
アミド化反応溶液に含まれるアミンが不飽和鎖式炭化水素基を有する第一級アミンの場合、当該不飽和鎖式炭化水素基は二重結合を含むことが好ましく、当該不飽和鎖式炭化水素基はアリル（Allyl）基を含むことがより好ましく、当該アミンはアリルアミン（Allylamine）が最も好ましい。アミド化反応溶液に含まれるアミンはヒドロキシ基を含む第一級アミンでもよく、この場合、エタノールアミンが好ましい。後述の実施例では、アミド化反応溶液に含まれるアミンがアリル基またはヒドロキシ基を含む場合の例を示したが、この例に特に限定されることなく、アミド化反応溶液に含まれるアミンはアルキル基以外の様々な官能基を含んでもよい。糖鎖がアミド化反応の結果このような官能基を含むように修飾されることにより、当該修飾を受けた糖鎖を、質量分析だけではなく、クロマトグラフィ等によってもより分離しやすくなる。
なお、アミド化反応溶液は、上述のアミンの塩を含んでもよい。
【００３６】
（アミド化反応溶液の濃度）
アミド化反応溶液におけるアンモニア、アミンおよびこれらの塩の濃度は、０．１Ｍ（Ｍはｍｏｌ／ｌ）以上が好ましく、０．３Ｍ以上がより好ましく、０．５Ｍ以上がさらに好ましく、１．０Ｍ以上がさらに好ましく、３．０Ｍ以上が最も好ましい。好適な例として、アミド化反応溶液は、アンモニアまたは第一級アミン、特にメチルアミンを含み、当該アンモニアまたはメチルアミン等の第一級アミンの濃度は、０．１Ｍ以上が好ましく、０．３Ｍ以上がより好ましく、０．５Ｍ以上がさらに好ましく、１．０Ｍ以上がさらに好ましく、３．０Ｍ以上が最も好ましい。アミド化反応溶液の濃度が高いほど、より確実にラクトンのアミド化を行うことができる。
【００３７】
（アミド化反応溶液の溶媒）
アミド化反応溶液の溶媒は、水系溶媒でも有機溶媒でもよいが、ラクトンの加水分解を防いで迅速なアミド化を確実に起こす観点から水含有量が少ない方が好ましい。アミド化反応溶液の溶媒は、水含有量を抑える脱水操作が加えられた脱水溶媒が好ましく、無水溶媒がさらに好ましい。アミド化反応溶液の溶媒は、メタノールおよびアセトニトリルの少なくとも一つを含むことが好ましい。
なお、アミド化反応溶液は水を相当量含んでいてもよく、アミド化反応溶液の溶媒は水でもよい。
【００３８】
（アミド化反応溶液のｐＨ）
アミド化反応溶液のｐＨは、７．７以上が好ましく、８．０以上がより好ましく、８．８以上がさらに好ましく、１０．３以上が最も好ましい。アミド化反応溶液のｐＨが高くなると、より確実にラクトンがアミド化されるため好ましい。
【００３９】
（アミド化反応を起こすための時間）
アミド化反応は、数秒〜数分以内に完了する。従って、アミド化反応によりラクトンをアミド化するために、試料をアミド化反応溶液と接触させる時間（以下、反応時間と呼ぶ）は、１時間未満が好ましく、３０分未満がより好ましく、１５分未満がさらに好ましく、５分未満がさらに好ましく、１分未満が最も好ましい。好適には、試料をアミド化反応溶液で洗浄したり、担体等に保持されている試料に対して一時的に通液するだけでもよい。また、試料とラクトン化反応溶液との接触が終了した後、試料とアミド化反応溶液との接触が終了するまでの時間は、１時間半未満が好ましく、１時間未満がより好ましく、３０分未満がさらに好ましい。このように、アミド化反応は短時間に完了するため、不安定なラクトンが分解し糖鎖の解析における定量性が損なわれることを防ぐことができる。また、アミド化反応の反応時間を短く設定することで、より効率的に試料の解析を行うことができる。
【００４０】
（アミド化反応における試料の状態について）
アミド化反応は、液相でも固相でも行うことができる。試料とアミド化反応溶液を接触させることができれば、アミド化反応を起こす際の試料の状態は特に限定されないが、試料に含まれる糖鎖を固相担体に結合または吸着された状態でアミド化反応溶液を接触させることが好ましい。
【００４１】
ラクトン化反応の場合と同様、固相で反応を行う場合、固相担体としては、糖鎖、糖ペプチド、糖タンパク質等を固定可能なものであれば、特に制限なく用いることができる。例えば、糖ペプチドや糖タンパク質を固定するためには、エポキシ基、トシル基、カルボキシ基、アミノ基等をリガンドとして有する固相担体を用いることができる。また、糖鎖を固定するためには、ヒドラジド基やアミノオキシ基等をリガンドとして有する固相担体を用いることができる。また、アミド化後のイオン化効率等の観点から、糖鎖を親水性相互作用クロマトグラフィ（以下、ＨＩＬＩＣと呼ぶ）用の担体、すなわち固定相に吸着させることも好ましく、このＨＩＬＩＣ用の担体はアミド基を含むことがさらに好ましい。
【００４２】
固相担体に固定された試料に、アミド化反応溶液を作用させてアミド化を行った後は、化学的手法や酵素反応等により、担体から試料を遊離させて回収すればよい。例えば、担体に固定された糖タンパク質や糖ペプチドを、PNGase F等のグリコシダーゼやトリプシン等の消化酵素により酵素的に切断し回収してもよく、ヒドラジド基を有する固相担体に結合している糖鎖を、弱酸性溶液により遊離させて回収してもよい。ＨＩＬＩＣでは、アセトニトリル等を溶媒としたアミド化反応溶液によりアミド化反応を行い、水等の水系溶液により試料を溶出することができる。
【００４３】
試料を固相担体に固定した状態で反応を行うことにより、反応溶液の除去や脱塩精製がより容易となり、試料の調製を簡素化できる。また、固相担体を用いる場合、糖タンパク質や糖ペプチドの状態で試料を固定し、アミド化反応後に、PNGase F等のグリコシダーゼ等による切断を行えば、アミド化反応後の試料を遊離糖鎖として回収することもできる。
なお、ラクトン化した試料をＨＩＬＩＣにより精製して溶出させた後にアミド化反応に供してもよい。加水分解が起こりにくいようにＨＩＬＩＣ用の担体を洗浄する溶媒を適宜調整することが好ましい。
【００４４】
発明者らは、本実施形態の試料の調製方法の好適な一例として、実施例に示したように、固相担体に吸着された糖鎖に対してアミノリシスが起こることを見出した。
【００４５】
上述した調製方法により、試料中の糖鎖が、α２，３−、α２，８−およびα２，９−シアル酸を含む場合には、ステップＳ１００３のラクトン化反応において、それぞれのシアル酸がラクトン化され、ステップＳ１００５のアミド化反応によりラクトン化されたシアル酸がアミド化されて安定化することになる。
ステップＳ１００５が終了したら、ステップＳ１００７に進む。
【００４６】
ステップＳ１００７において、試料を質量分析および／またはクロマトグラフィにより分析する。上述のラクトン化反応およびアミド化反応により、α２，６−シアル酸のようにラクトン化されにくい糖鎖と、α２，３−シアル酸、α２，８−シアル酸、α２，９−シアル酸等のラクトン化され得る糖鎖とでは質量が異なっている。従って、質量分析によりこれらの糖鎖をシアル酸の結合様式に基づいて分離することができる。
【００４７】
質量分析におけるイオン化の方法は特に限定されず、マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、エレクトロスプレー（ＥＳＩ）法、ナノエレクトロスプレーイオン化（ｎａｎｏ−ＬＳＩ）法等を用いることができる。イオン化の方法は特にＭＡＬＤＩ法が好ましい。質量分析におけるイオン化では、正イオンモードおよび負イオンモードのいずれを用いてもよい。質量分析は、多段階で行ってもよく、これによりシアル酸の結合様式以外の糖鎖の構造や、ペプチド鎖の構造を解析することができる。
【００４８】
また、ラクトン化反応およびアミド化反応の結果生じた修飾体の特性に基づいて、クロマトグラフィ等の質量分析以外の分析方法等で分析を行ってもよい。液体クロマトグラフィに用いるカラムは特に限定されず、Ｃ３０、Ｃ１８、Ｃ８、Ｃ４等の疎水性逆相カラムやカーボンカラム、ＨＩＬＩＣ用の順相カラムなどを適宜用いることができる。液体クロマトグラフィを行った後、質量分析により測定を行うことがより精密に試料中の成分の分析を行う上で好ましい。この場合、液体クロマトグラフからの溶出液をオンライン制御で質量分析計において直接イオン化することがより好ましい。
ステップＳ１００７が終了したら、処理を終了する。
【００４９】
（糖ペプチドおよび糖タンパク質の副反応の抑制について）
糖ペプチドまたは糖タンパク質にラクトン化反応溶液およびアミド化反応溶液を加え、上述のようにシアル酸を修飾した場合、糖ペプチドまたは糖タンパク質に含まれるアミノ酸の側鎖や、主鎖の末端にあるアミノ基やカルボキシ基との間で分子内脱水縮合等の副反応が起こる場合がある。この場合、分析対象の糖鎖に対応するマススペクトルのピークが分かれてしまい、解析が難しくなってしまう問題があった。
【００５０】
発明者らは、ペプチド部分の副反応は主にアミノ基の存在に由来することを明らかにし、シアル酸修飾の前にアミノ基を化学修飾などで先にブロックしておくことで、シアル酸修飾時にペプチド部分の副反応を抑制出来ることを明らかにした。詳細は、以下の文献を参照されたい：Takashi Nishikaze, Sadanori Sekiya, Shinichi Iwamoto, Koichi Tanaka. “A Universal Approach to linkage-Specific Derivatization for Sialic Acids on Glycopeptides,” Journal of The American Society for Mass Spectrometry, 2017年6月, Volume 28, Issue 1 Supplement, ポスター番号MP091。本実施形態に係るアミド化反応による修飾もこれと同様に糖ペプチドおよび糖タンパク質に用いることができる。すなわち、糖ペプチドまたは糖タンパク質に対してジメチルアミド化やグアニジル化などのアミノ基をブロックする反応を行い、次いでラクトン化反応を行い、次にアミド化反応よる迅速アミド化を行う。このとき、シアル酸の結合様式に応じてラクトンを形成させる手法を用いれば、シアル酸の結合様式を識別することもできる。
【００５１】
なお、糖ぺプチドの中にはアミノ酸配列に基づく特性上副反応を生じ難いものがある。例えば、ＩｇＧのＦｃ領域をトリプシン等の消化酵素により消化することによって生成した糖ペプチドは、リジンを有さず、Ｎ末端のアミノ基も脱水縮合剤の存在下で速やかに環化脱水してピログル化する。その結果、アミノ基が存在しなくなるので、ジメチルアミド化やグアニジル化など事前のアミノ基のブロッキングは必要ない。このような糖ペプチドに関しては、アミノ基のブロッキングを行わずにラクトン化反応を行い、生じたラクトンをアミド化反応によってアミド化することにより解析に足るマススペクトルを得ることが可能となる。
【実施例】
【００５２】
以下に、本実施形態に係る実施例を示すが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。なお、以下において、％の記載は特に言及が無い限り重量％を示す。
【００５３】
＜アミド化反応におけるアミンの濃度の検討＞
試料としてα２，３−シアル酸が結合されたシアリルグライコペプチド（α２，３−ＳＧＰ；伏見製薬所）からPNGase Fにより糖鎖を切り出して遊離させたものを用いた。シアリルグライコペプチドは、数残基のペプチドに糖鎖が結合されたものである。試料はヒドラジド基をリガンドとして有するビーズからなる固相担体（BlotGlyco; 住友ベークライト）に結合させた。糖鎖の固相担体への結合は、糖鎖精製キットBlotGlycoの標準プロトコールに準じて行った。
【００５４】
糖鎖が結合した後の担体を、２００μＬのDMSOで3回洗浄した。その後、イソプロピルアミンを含む１００μＬのラクトン化反応溶液（2M イソプロピルアミン塩酸塩、500mM EDC-HCl、500mM HOBt）を加え、800rpmで軽く攪拌しながら一時間反応させた。（これにより、α２，６−シアル酸はイソプロピルアミドに、α２，３−シアル酸はラクトン体に変換される。）遠心により反応溶液を除去した後、２００μＬのメタノールで1回洗浄を行った。その後、２００μＬのメチルアミン水溶液（濃度0.1%〜10%）で3回洗浄することでラクトンのアミド化反応を行った。次いで２００μＬのメタノールで2回、および２００μＬの水で3回洗浄を行った。その後、標準プロトコールに準じた方法で反応後の糖鎖試料を担体から遊離させ、Stage Tip Carbonで脱塩精製を行い、遠心濃縮（SpeedVac（サーモフィッシャーサイエンティフィック））により乾固させた。Stage Tip Carbonは、エムポアディスクカーボン（３Ｍ製）を、直径約1mmに切り抜き、２００μＬのチップに詰めたカーボンカラムである。乾固した試料を１０μＬの水に再溶解させ、１μＬをフォーカスプレートに滴下し、マトリックスとして50% アセトニトリル（ACN）に溶解させた100mM 3AQ/CA、2mM硫酸アンモニウムを０．５μＬ加えた後、７５℃のヒートブロック上で1.5時間反応させ、3AQによる糖鎖の還元末端のラベル化を行った。反応終了後、プレートを室温まで冷却し、MALDI-QIT-TOF-MS (AXIMA-Resonance, Shimadzu/Kratos) により、負イオンモードで飛行時間型の質量分析を行った。
【００５５】
図２は、1%(a)及び10%(b)のメチルアミン水溶液をアミド化反応溶液としてアミノリシスを起こした場合のマススペクトルを示す図である。試料であるα２，３−ＳＧＰから遊離させたα２，３−Ａ２−ｇｌｙｃａｎは、上述のラクトン化反応溶液によって分子内脱水縮合しラクトン体に変換させた。ここでは、その後、脱水縮合剤は用いずにメチルアミン溶液でヒドラジドビーズを洗浄しているだけだが、もともとラクトンであった構造がメチルアミド化していることがわかる（m/z 2471.9のピークに相当）。m/z  2360.9に観測されるピークは一箇所メチルアミンが結合することなくカルボキシ基になっているものである。このピークはラクトンのアミノリシスではなく加水分解が起こった糖鎖に対応すると推測される。10%メチルアミン水溶液を用いたアミド化反応では、この加水分解に由来するピークはさらに小さくなり、ほぼ完全にアミノリシスのみが起きていた。
【００５６】
図３は、アミド化反応溶液におけるメチルアミンの濃度に対する、マススペクトル上のピークのシグナル強度から算出した、加水分解が起きたシアル酸とアミノリシスが起きたシアル酸との割合（アミノリシス効率）を示すグラフである。メチルアミン溶液の濃度が1%の場合でも十分なアミノリシスが起こっているが、より高濃度のメチルアミンを含むアミド化反応溶液を用いることでアミノリシスをさらに効率よく起こせていることが分かる。
【００５７】
＜アミド化反応におけるアミンの種類の検討＞
図４は、アミン濃度についての上記検討と略同じ条件で、アミド化反応溶液としてそれぞれ3Mのアンモニア水またはアルキルアミン水溶液（メチルアミンの場合、10％濃度に相当）を用いてアミド化反応を行った際の生成比を示すグラフである。
【００５８】
図４の結果を見ると、アンモニアおよび分枝を持たない第一級アルキルアミンの場合、効率よくアミノリシスを起こせているが、イソプロピルアミン、tert-ブチルアミンなど分枝を持ったアルキルアミンはアミノリシス効率が低く、加水分解（-COOH生成）が優位であった。また、アミド化反応溶液に第三級アミンを用いた場合はもとより脱水縮合剤下でも反応しないため、加水分解のみが起こっているが、第二級アミンを用いた場合もあまり反応せず、加水分解が優位に起こった。また、アリルアミンとエタノールアミンについてはアミノリシスが優位に起こった。従って、少なくとも炭化水素鎖部分に分枝を持たない第一級アミンであれば他の官能基が含まれていてもよく、二重結合やヒドロキシ基が含まれていても良いことがわかった。以上から、アミノリシスを起こすためには炭素鎖に分枝を持たない第一級アミンが特に適することが分かる。
【００５９】
＜アミド化反応における溶媒の検討＞
図５は、上記検討と略同じ条件で、アミド化反応溶液として90% ACNに溶解した1.2Mメチルアミン、メタノールに溶解した3Mメチルアミン、または、ACNに溶解した3M エタノールアミン等を用いた場合の生成比を示すグラフである。
【００６０】
図５の結果を見ると、いずれの場合も高い割合でアミノリシスが起こっており、アミド化された糖鎖に対応するピークが優位に観測された。水を実質的に含まない状態であるメタノールやACNに溶解したアミンでも問題なくアミド化が起こったことから、ラクトンが一時的に加水分解してからアミド化しているわけではなく、アミンが直接ラクトンに作用することによりアミド化するアミノリシスが起こっていることが強く示唆された。水を実質的に含まない条件では、加水分解がより抑えられ、水溶媒では5%程度のシアル酸で加水分解が起こってしまうエタノールアミンをアミド化反応溶液に用いた場合でもほぼ完全にアミド化された。
【００６１】
＜アミド化反応におけるｐＨの検討＞
図６は、上記検討と略同じ条件で、アミド化反応溶液として3M メチルアミン水溶液と 3M メチルアミン塩酸塩水溶液を任意の割合で混合した溶液を用いた場合の生成比を示すグラフである。図６の”MA”はメチルアミン水溶液、”MA-HCl”はメチルアミン塩酸塩水溶液をそれぞれ示す。
【００６２】
本検討では、試料にアミド化反応溶液を加えた後でも一部の条件ではα２，３−シアル酸がラクトンを有したまま残ることが想定された。従って、不安定なラクトンをより定量的に評価するため、試料にアミド化反応溶液を加えアミド化反応を行った後、２００μＬのH2Oで2回、２００μＬのACNで2回洗浄し、その後ACNに溶解した3M エタノールアミンを含むアミド化反応溶液でもう一度アミド化反応を行った。この二段階で行ったアミド化反応の条件下では、第一段階のアミド化反応でアミド化したもの（メチルアミド化体で検出）、加水分解したもの（-COOHで検出）、およびラクトンのまま残っていたもの（エタノールアミンとのアミド化体で検出）が明確に区別できる。なお、本検討でのアミド化反応はこれまでのように２００μＬのアミド化反応溶液で3回洗浄するのではなく、１００μＬのアミド化反応溶液を加えて2分間700rpmで攪拌することで行った。
【００６３】
図６の結果を見ると、アミド化反応溶液を加えなかった場合（”without aminolysis”）や3Mメチルアミン塩酸塩溶液（pH 4.7）をアミド化反応溶液とした場合、アミノリシスはほとんど起こらず、シアル酸は実質的に全てラクトンのままであった。アミド化反応溶液を調製する際のメチルアミン溶液の割合を増やしてpHを上げると、シアル酸は徐々に加水分解とアミノリシスが起きるようになり、シアル酸はpH 8.8で90%程度アミド化し、pH 10.3以上のアミド化反応溶液では実質的に全てアミド化された。
【００６４】
＜ｆｅｔｕｉｎ（フェツイン）から遊離した糖鎖を試料としたアミド化反応の検討＞
糖タンパク質のフェツインを、20mM 重炭酸アンモニウム、10mM DTT, 0.02% SDSに溶解し、１００℃で3分間処理して、変性・還元させた。その後、室温に冷却し、PNGase Fを加えて、３７℃で終夜インキュベーションし、糖鎖を遊離させた。翌日、１００℃で3分間熱処理を行い、PNGase Fを失活させることにより酵素反応を停止させた。
【００６５】
遊離した糖鎖は上記検討と同じようにヒドラジドビーズへの結合とイソプロピルアミンを含むラクトン化反応溶液を用いた結合様式特異的修飾を行い、次いで10%メチルアミン水溶液によるアミド化反応を行った。ビーズからの溶出や質量分析での検出は上記検討と同様の方法で行われた。
【００６６】
図７は、フェツインから遊離した糖鎖のマススペクトルである。各ピークに対応して示された数字は、左側の数字がピークに対応する分子が含むα２，３−シアル酸の数を示し、右側の数字が当該分子が含むα２，６−シアル酸の数を示す。加水分解による生成物や未反応体は検出されず、ラクトン化されたシアル酸が効率よくメチルアミド化されていることが分かる。このマススペクトルと特許文献１や非特許文献１で報告されたマススペクトルとを比較すると、脱水縮合剤を用いたアミド化反応を行わなくても、アミノリシスによりラクトンが効率よく直接メチルアミド化されていることがわかる。
【００６７】
＜糖脂質型糖鎖を試料としたアミド化反応の検討＞
試料としてスフィンゴ糖脂質であるHuman Disialoganglioside（ジシアロガングリオシド）GD1a および GD1b（HyTest）を使用した。0.2% Tritonx100 を含む 50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)４５μＬに上記糖脂質を溶解し、６０℃で20分間温置した後、Endoglycoceramidase I （以下の文献を参考に放線菌から精製したもの；Ishibashi Y, Nakasone T, Kiyohara M, Horibata Y, Sakaguchi K, Hijikata A, Ichinose S, Omori A, Yasui Y, Imamura A, Ishida H, Kiso M, Okino N, and Ito M. “A novel endoglycoceramidase hydrolyzes oligogalactosylceramides to produce galactooligosaccharides and ceramides,” Journal of Biological Chemistry, 2007年, Volume 282, pp.11386-11396）を ５μＬ加え、３７℃で16時間糖鎖脱離反応を行った。
【００６８】
遊離させた糖脂質型糖鎖は上記検討と同様にBlotGlyco標準プロトコールに従って、ヒドラジド担体への結合、余剰ヒドラジド基のキャッピングを行い、次いでイソプロピルアミンを用いたシアル酸の結合様式特異的修飾を行った。次に、1%メチルアミン水溶液２００μＬで3回洗浄することでアミド化反応を行った後、２００μＬのDMSOで3回、２００μＬのメタノールで3回、および２００μＬの水で3回ヒドラジド担体を洗浄した。その後、担体からの遊離と同時に高感度化試薬aoWRを用いて糖鎖の還元末端を標識した。その後HILIC担体により過剰試薬を除去し、2,5-dihydroxybenzoic acid (2,5-DHB) をマトリックスとしてMALDI法により試料をイオン化し、正イオンモードで飛行時間型質量分析（MALDI-TOF MS）によりマススペクトルを取得した。
【００６９】
図８は、得られた糖脂質型糖鎖のマススペクトルを示す図である。上段がスフィンゴ糖脂質ジシアロガングリオシドGD1aから遊離された糖鎖のマススペクトルであり、下段がジシアロガングリオシドGD1bから遊離された糖鎖のマススペクトルである。α２，３−シアル酸を二箇所に有するGD1a糖鎖の場合、m/z 1746にシグナルが観測された。これは、二箇所のα２，３−シアル酸が両方ともメチルアミド化された質量に相当する。このことから、アミノリシスにより糖脂質型糖鎖もラクトンを経由して同様にメチルアミド化されることがわかる。また、GD1b型の場合もGD1a型と同様にm/z 1746にシグナルが観測され、二箇所のシアル酸が共にメチルアミド化されていた。GD1b型は、α２，３−シアル酸と当該α２，３−シアル酸に結合したα２，８−シアル酸とを持つリニア型ポリシアル酸構造を有するが、両方のシアル酸がメチルアド化したことから、本発明によるアミノリシスはα２，８−シアル酸から生じたラクトンでも問題なく進行することが示唆される。
【００７０】
＜ＨＩＬＩＣ担体上でのアミド化反応の検討＞
α２，３−ＳＧＰを20mM 重炭酸アンモニウムに溶解し、PNGase Fを加えて３７℃で終夜インキュベーションすることで糖鎖を遊離させた。翌日、１００℃で3分間熱処理を行い、PNGase Fを失活させることにより酵素反応を停止させた。その後、StageTip Carbonにて脱塩処理を行い、SpeedVacによりエッペンドルフチューブ内に乾固させた。
【００７１】
その後、２０μＬのイソプロピルアミンを含むラクトン化反応溶液（2M イソプロピルアミン塩酸塩、500mM EDC-HCl、500mM HOBt）を加え、2000rpmで攪拌しながら一時間反応させた。（これにより、α２，６−シアル酸はイソプロピルアミドに、α２，３−シアル酸はラクトン体に変換される。）この後、１２０μＬ ACNで希釈し、GL Tip Amide (GL science) に加え4000xgで遠心することで通液し糖鎖をアミド基を含むＨＩＬＩＣ用の担体に吸着させた。その後、２０〜２００μＬの90% ACN 4% メチルアミン溶液をアミド化反応溶液として通液しアミド化反応を行った。さらに90% ACN 0.1% TFA  １００μＬを2回通液させることで洗浄し、最後に２０μＬ H2Oを2回通液して糖鎖を溶出させ、溶出液をSpeedVacで乾固した。その後、さらにStage Tip Carbonで脱塩操作を行い、上記検討のようにオンターゲット3AQ化を行い、質量分析を行った。
【００７２】
図９の(a)~(d)は、各アミド化反応溶液の量と、生成比を示すグラフである。(a)~(d)の全ての場合においてほぼ完全にアミノリシスが進行していることが確認された。アミド化反応溶液を２０μＬまで減らした状態では、担体がアミド化反応溶液に触れている時間は長くとも数十秒程度と考えられ、アミノリシスの反応は極めて迅速に起こっていることが示唆される。
【００７３】
＜ＨＩＬＩＣを用いた精製後のアミド化反応の検討＞
上記検討と同様の操作によりα２，３−ＳＧＰから糖鎖を切りだして遊離させ、当該糖鎖にイソプロピルアミンを含むラクトン化反応溶液を加え反応させ、ACNを加えて希釈しHILIC担体上に吸着させた。その後、90% ACN 0.1% TFA溶液１００μＬを2回通液させることで洗浄し、最後にH2O ２０μＬを2回通液して糖鎖を溶出させた。ここに、40%メチルアミン水溶液６．７μＬを加え終濃度10%となるメチルアミンのアミド化反応溶液とし、軽く攪拌したあと室温で2分間静置してアミド化反応を行った。その後、SpeedVacにより溶媒を除き、さらにStage Tip Carbonで脱塩操作を行い、上記検討のようにオンターゲット3ＡＱ化を用いて質量分析を行った。
【００７４】
結果は図９(e) に示した。試料中のラクトンは概ねメチルアミド化されているが、加水分解による生成物も検出された。これは、HILIC担体によってイソプロピルアミンを含むラクトン化反応溶液が取り除かれた後、担体を洗浄するプロセスにおいてラクトンが一部加水分解していたためと解釈できる。従って、HILIC担体から溶出された試料にアミド化反応溶液を加えても良いが、実質的に全てのラクトンにアミノリシスを起こし、反応効率を最大化する観点からは、試料をHILIC担体に吸着させた状態でアミド化反応溶液を加えることが好ましい。
【００７５】
本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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