(57)【要約】【課題】エクソン２標的Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物の組換えアデノ随伴ウイルスによる送達の提供。【解決手段】本発明は、ＤＭＤエクソン２の重複から生じるデュシェンヌ筋ジストロフィーを治療するためのポリヌクレオチドを組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）によって送達することに関する。本発明は、ｒＡＡＶ生成物と、デュシェンヌ筋ジストロフィーの治療においてｒＡＡＶを用いる方法とを提供する。本発明は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２の重複を包含しているＤＭＤを防止するための、進行を遅延させるための、且つ／または治療するための方法及び生成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照により本明細書に完全に組み込まれる、２０１３年４月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／８１４，２５６号の出願日の利益を主張する。
発明の分野
【０００２】
本発明は、ＤＭＤエクソン２の重複から生じるデュシェンヌ筋ジストロフィーを治療するためのポリヌクレオチドを組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）によって送達することに関する。本発明は、ｒＡＡＶ生成物と、デュシェンヌ筋ジストロフィーの治療においてｒＡＡＶを用いる方法とを提供する。配列リストの参照による組み込み
【０００３】
本出願は、開示の別の部分として、参照により本明細書に完全に組み込まれる、コンピュータで読取り可能な形態（ファイル名：４７６９９ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；１０，１６２バイト−ＡＳＣＩＩテキストファイル、２０１４年４月１８日に作成）を含む。
【背景技術】
【０００４】
筋ジストロフィー（ＭＤｓ）は一群の遺伝子病である。前記群は、運動を制御する骨格筋の進行性の筋力低下及び変性を特徴とする。ＭＤのいくつかの型は幼少期または小児期に発症し、他の型は、中年またはそれ以降まで発症しない場合がある。前記障害は、筋力低下の分布及び程度（ＭＤのいくつかの型は心筋にも影響を及ぼす）、発病年齢、進行速度、及び遺伝パターンが様々である。
【０００５】
ＭＤの一つの型は、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である。これは、新生児男性５０００人に１人に発症する筋ジストロフィーの最も一般的で重篤な小児期型である。ＤＭＤは、骨格筋及び心筋、ならびに消化管及び網膜におけるジストロフィンタンパク質（４２７ＫＤａ）の欠損を導くＤＭＤ遺伝子における突然変異が原因である。ジストロフィンは、筋細胞膜を伸張性収縮から保護するだけでなく、筋細胞膜に近接しているいくつかのシグナリングタンパク質も固定する。ＤＭＤの多くの臨床例は、ＤＭＤ遺伝子の欠失変異と関連がある。ＤＭＤ遺伝子同定後の多くの一連の研究にもかかわらず、治療のオプションは限定されている。コルチコステロイドは、歩行運動の延長にも明らかに有益であるが、有益性は長期の副作用で相殺される。２０年以上前に報告された最初の管理された無作為二重盲検試験は、プレドニゾンを使用して有益性を示した［Ｍｅｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．，  ３２０：  １５９２−１５９７  （１９８９）］。以降の報告は、ナトリウム節約型ステロイドであるデフラザコートを用いて、等しい有効性を示した［Ｂｉｇｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｅｄｉａｔｒ．，  １３８：  ４５−５０  （２００１）］。最近の研究でも、エクソンスキッピングによって、６分間歩行テスト（６ＭＷＴ）での歩行距離の延長という有効性が示されている。これまでのところ、公開された臨床試験は、エクソン５１をスキップすることによってリーディングフレームが回復される突然変異のみに関して有益性を報告してきた［Ｃｉｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ，  ３７８：  ５９５−６０５  （２０１１）  及びＧｏｅｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３６４：  １５１３−１５２２  （２０１１）］。二重盲検無作為治療試験の報告でのみ、有望な結果が、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）であるエテプリルセンで示された。これらのすべてのエクソンスキッピング試験において、所見の共通点は、最初に適度に改善した後に、歩行能力が横ばいになることである。
【０００６】
２０１２年３月２９日に公開された米国特許出願公開第２０１２／００７７８６０号；２０１３年３月２１日に公開された同第２０１３／００７２５４１号；及び２０１３年２月２１日に公開された同第２０１３／００４５５３８号もまた参照されたい。
【０００７】
欠失変異とは対照的に、ＤＭＤエクソン重複は、ジストロフィン異常症患者の不偏サンプルにおいて病原性突然変異の約５％を占めるが［Ｄｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １３４（３）：  ２９５−２９８  （２００５）］、突然変異のいくつかのカタログでは、重複数はもっと高い［Ｆｌａｎｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｍｕｔａｔ．，  ３０（１２）：  １６５７−１６６６  （２００９）におけるＵｎｉｔｅｄ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎｏｐａｔｈｙ  Ｐｒｏｊｅｃｔによって公開されたものを包含し、それは１１％であった］。
【０００８】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、長さ約４．７ｋｂで、１４５ヌクレオチドの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を包含している。ＡＡＶの複数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は公知である。例えば、ＡＡＶ−１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００２０７７で提供され；ＡＡＶ−２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，４５：  ５５５−５６４{１９８３）で提供され；ＡＡＶ−３の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登
録番号ＮＣ＿１８２９で提供され；ＡＡＶ−４の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１８２９で提供され；ＡＡＶ−５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０８５７１６で提供され；ＡＡＶ−６の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００  １８６２で提供され；ＡＡＶ−７及びＡＡＶ−８ゲノムの少なくとも一部分は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９で提供され（ＡＡＶ−８に関する米国特許第７，２８２，１９９号及び同第７，７９０，４４９号を参照されたい）；ＡＡＶ−９ゲノムは、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７８：  ６３８１−６３８８  （２００４）で提供され；ＡＡＶ−１０ゲノムは、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  １３（１）：  ６７−７６  （２００６）で提供され；そしてＡＡＶ−１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ３３０（２）：  ３７５−３８３  （２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（３３０（２））で提供される。ここからウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色体組込みを指示するシス作用性配列が、ＡＡＶ  ＩＴＲｓ内に含有されている。３つのＡＡＶプロモーター（ｐ５、ｐ１９、及びｐ４０、これらの相対的なマップ上の位置により命名された）は、ｒｅｐおよびｃａｐの遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部のオープンリーディングフレームの発現を駆動する。１つのＡＡＶイントロンのディファレンシャルスプライシング（ヌクレオチド２１０７及び２２２７における）と関連する２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）により、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）が生成する。Ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムを複製する役割を果たす複数の酵素的特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連するカプシドタンパク質の生成を担う。１つのコンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ上の位置９５に位置している。ＡＡＶの生活環および遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，
１５８：  ９７−１２９  （１９９２）で検討されている。
【０００９】
ＡＡＶは、例えば遺伝子療法において外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的な独特の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞障害性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、無変化であって無症候性である。更に、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞に感染し、ｉｎ  ｖｉｖｏで多くの異なる組織を標的にする可能性がある。更に、ＡＡＶは、分裂及び非分裂の細胞にゆっくりと形質導入し、そして転写活性な核エピソーム（染色体外因子）として、それらの細胞の寿命の間、本質的に生き残ることができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミド中のクローン化ＤＮＡと同様に感染性であり、それにより、組換えゲノムの構築が実行可能となる。更に、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成及びゲノム組込みを指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲｓ内に含有されているので、（複製タンパク質及び構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ−ｃａｐをコードする）ゲノムの内部の約４．３ｋｂのいくらかまたはすべてを、外来ＤＮＡで置換することができる。ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質はトランスで提供することができる。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定で頑丈なウイルスである点にある。ＡＡＶは、アデノウイルスを不活性化するために用いられる条件（５６℃〜６５℃で数時間）に耐えるので、ＡＡＶの冷却保存はそれ程重要ではない。ＡＡＶは凍結乾燥することさえもできる。最後に、ＡＡＶ感染細胞は重複感染に耐性ではない。
【００１０】
ＡＡＶ８様ＡＡＶは、ｒｈ．７４と呼ばれ、様々なタンパク質をコードするＤＮＡを送達する。Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，１７：  ２０９−２２０（２００７）  及びＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ２９６：４７６−４８８（２００９）は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに関する細胞傷害性Ｔ細胞ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼのｒｈ．７４発現に関するものである。Ｒｏｄｉｎｏ−Ｋｌａｐａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，１８（１）：  １０９−１１７  （２０１０）は、血管四肢灌流（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｌｉｍｂ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）によるＡＡＶ  ｒｈ．７４の送達後における、マイクロ・ジストロフィンＦＬＡＧタンパク質タグ融合のＡＡＶ  ｒｈ．７４発現を記載している。
筋ジストロフィーは、個人、家族、及び地域に深刻な影響を与える確立された治療の無い一群の疾患である。コストは計り知れない。個人は、精神的緊張、及び自尊心の喪失と関連のある生活の質の低下に苦しむ。四肢機能の損失から生じる極度の肉体的問題により、日常生活の活動において困難が生じる。家族力動は、経済的損失及び対人関係の問題によって損なわれる。影響を受ける同胞は疎遠になり、配偶者間の不和は、特に、筋ジストロフィーに対する負担が親のパートナーの１人に負わせられる場合は、しばしば離婚となる。治療を見つけ出そうと探し求める負担は、しばしば、生活のすべての面を損ない且つ要求する、生涯にわたって続く非常に集中した苦労となる。家族を越えて、地域は、特別な教育、特別な輸送、そして再発性の呼吸器感染及び心臓合併症を治療するために繰り返し起こる入院の費用における筋ジストロフィー集団のハンディキャップに対処する更なる施設へのニーズを介して、経済的負担を分担する。経済的な負担は、州及び納税地域にまで負担を広げている連邦政府機関によって分担される。
従って、ＤＭＤを包含する筋ジストロフィーの治療に関して当該技術分野においてニーズが依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２／００７７８６０号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１３／００７２５４１号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１３／００４５５３８号明細書
【特許文献４】米国特許第７，２８２，１９９号明細書
【特許文献５】米国特許第７，７９０，４４９号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｍｅｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．，  ３２０：  １５９２−１５９７  （１９８９）
【非特許文献２】Ｂｉｇｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｅｄｉａｔｒ．，  １３８：  ４５−５０  （２００１）
【非特許文献３】Ｃｉｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ，  ３７８：  ５９５−６０５  （２０１１）
【非特許文献４】Ｇｏｅｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３６４：  １５１３−１５２２  （２０１１）
【非特許文献５】Ｄｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １３４（３）：  ２９５−２９８  （２００５）
【非特許文献６】Ｆｌａｎｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｍｕｔａｔ．，  ３０（１２）：  １６５７−１６６６  （２００９）
【非特許文献７】Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，４５：  ５５５−５６４{１９８３）
【非特許文献８】Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７８：  ６３８１−６３８８  （２００４）
【非特許文献９】Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  １３（１）：  ６７−７６  （２００６）
【非特許文献１０】Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ３３０（２）：  ３７５−３８３  （２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（３３０（２））
【非特許文献１１】Ｍｕｚｙｃｚｋａ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １５８：  ９７−１２９  （１９９２）
【非特許文献１２】Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，１７：  ２０９−２２０（２００７）
【非特許文献１３】Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ２９６：４７６−４８８（２００９）
【非特許文献１４】Ｒｏｄｉｎｏ−Ｋｌａｐａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，１８（１）：  １０９−１１７  （２０１０）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
説明
本発明は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２の重複を包含しているＤＭＤを防止するための、進行を遅延させるための、且つ／または治療するための方法及び生成物を提供する。本方法は、Ｕ７核内低分子ＲＮＡと、エクソン２標的アンチセンス配列とをコードするポリヌクレオチド構築物、すなわち「エクソン２標的Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物」のための送達ベクターとしてＡＡＶを用いることを包含している。例えば、ポリヌクレオチド構築物は、ｒＡＡＶ  ｒｈ．７４のゲノム、ｒＡＡＶ６のゲノム、またはｒＡＡＶ９のゲノムに挿入される。ＡＡＶ  ｒｈ．７４ゲノムのポリヌクレオチド配列は図７に配列番号１で示してある。
【００１４】
エクソン２標的アンチセンス配列としては、例えば、
Ｕ７Ｂ      ＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＴＴＣＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＴＡ（配列番号３）；
Ｕ７Ａｌｏｎｇ      ＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＴｃｔａ（配列番号４）；
Ｕ７Ａｓｈｏｒｔ      ＡＧＡＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＴｃｔａ（配列番号５）；及びＵ７Ｃ      ＧＣＡＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＧＧＴＡＡＧＡＡＴ（配列番号６）
が挙げられるが、それらに限定されない。
【００１５】
一つの態様では、患者のＤＭＤを改善する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、患者にｒＡＡＶを投与する工程を含み、ここで、ｒＡＡＶのゲノムはエクソン２標的Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物を含む。
【００１６】
更に別の態様では、本発明は、ＤＭＤと関連のあるジストロフィー症状の進行を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、患者にｒＡＡＶを投与する工程を含み、ここで、ｒＡＡＶのゲノムはエクソン２標的Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物を含む。
【００１７】
なお更に別の態様では、ＤＭＤに罹患している患者の筋肉機能を改善する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、患者にｒＡＡＶを投与する工程を含み、ここで、ｒＡＡＶのゲノムはエクソン２標的Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物を含む。場合によっては、筋肉機能の改善は、筋力の改善である。筋力の改善は、当該技術分野で公知の技術によって、例えば最大自発的等尺性収縮テスト（ＭＶＩＣＴ）によって測定する。場合によっては、筋肉機能の改善は、立っている時と歩いている時の安定性の改善である。筋力の改善は、当該技術分野で公知の技術によって、例えば６分間歩行テスト（６ＭＷＴ）または時限階段昇降テストによって測定する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、動物（ヒトが挙げられるが、それに限定されない）にエクソン２標的Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物を送達する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、患者に対するｒＡＡＶの工程を含み、ここで、ｒＡＡＶのゲノムはエクソン２標的Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物を含む。
【００１９】
上記下記の本発明の方法の細胞形質導入効率は、少なくとも約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５％であり得る。
【００２０】
本発明の前記方法のいくつかの実施形態では、ウイルスのゲノムは自己相補的ゲノムである。本方法のいくつかの実施形態では、ｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ  ＤＮＡを欠いている。本方法のいくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、図９に開示してある例示ゲノムを含むＳＣ  ｒＡＡＶ  Ｕ７＿ＡＣＣＡである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶはｒＡＡＶ  ｒｈ．７４である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶはｒＡＡＶ６である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶはｒＡＡＶ９である。
【００２１】
更に別の態様では、本発明は、ＡＡＶ  ｒｈ．７４カプシドを含むｒＡＡＶと、例示のエクソン２標的Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物Ｕ７＿ＡＣＣＡを含むゲノムとを提供する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ  ＤＮＡを欠いている。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは自己相補的ゲノムを含む。本方法のいくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、図９に開示してある例示ゲノムを含むＳＣ
ｒＡＡＶ  Ｕ７＿ＡＣＣＡである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶはｒＡＡＶ  ｒｈ．７４である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶはｒＡＡＶ６である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶはｒＡＡＶ９である。
【００２２】
本発明の組換えＡＡＶゲノムは、少なくとも１つのエクソン２標的Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物の側方に位置している１つ以上のＡＡＶ  ＩＴＲｓを含む。段落番号００１２に記載されているエクソン２標的アンチセンス配列のそれぞれを含むエクソン２標的Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物を有するゲノムが、段落番号００１２に記載されているエクソン２標的アンチセンス配列の２つ以上のそれぞれの可能な組み合わせを含むエクソン２標的Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物を有するゲノムと同様に、特に企図される。例示的実施形態を含むいくつかの実施形態では、Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチドは、それ自身のプロモーターを包含している。ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ  ＤＮＡは、任意のＡＡＶ血清型由来であってもよく、そのために、組換えウイルスは、例えばＡＡＶ血清型のＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０及びＡＡＶ−１１（これらに限定されない）から誘導することができる。上記背景技術のセクションで言及したように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は当該技術分野で公知である。本発明のいくつかの実施形態では、プロモーターＤＮＡは、筋肉に特異的な制御エレメントであり、例えば、アクチン及びミオシンの遺伝子ファミリー由来の制御エレメント、例えばｍｙｏＤ遺伝子ファミリー［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５１：  ７６１−７６６  （１９９１）を参照されたい］、筋細胞に特異的なエンハンサー結合因子ＭＥＦ−２［Ｃｓｅｒｊｅｓｉ  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １１：  ４８５４−４８６２  （１９９１）］、ヒト骨格アクチン遺伝子由来の制御エレメント［Ｍｕｓｃａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ７：  ４０８９−４０９９  （１９８７）］、心臓アクチン遺伝子、筋肉クレアチンキナーゼ配列エレメント［Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９：３３９３−３３９９  （１９８９）］及びマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ＭＣＫ）エレメント、デスミンプロモーター、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子及び遅筋トロポニンＩ遺伝子に由来する制御エレメント：低酸素誘導核因子［Ｓｅｍｅｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８：  ５６８０−５６８４  （１９９１）］、糖質コルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）を包含するステロイド誘導エレメント及びプロモーター［Ｍａｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０：  ５６０３−５６０７  （１９９３）を参照されたい］及び他の制御エレメントが挙げられるが、それらに限定されない。
【００２３】
本発明のＤＮＡプラスミドは、本発明のｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、感染性ウイルス粒子中にｒＡＡＶゲノムを構築するために、ＡＡＶ（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠損アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）のヘルパーウイルスによる感染を許容し得る細胞へ導入される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、及びヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を作製する技術は、当該技術分野では標準的である。ｒＡＡＶの作製では、以下の成分：すなわちｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離している（すなわち、ｒＡＡＶゲノム中には存在していない）ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、及びヘルパーウイルス機能が、単細胞（パッケージング細胞と本明細書では呼ぶ）内に存在していることが必要である。ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子は、任意のＡＡＶ血清型由来であってもよく、それ故に、組換えウイルスは、ＡＡＶ血清型のＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０及びＡＡＶ−１１を包含するが、それらに限定されないｒＡＡＶゲノムＩＴＲｓに比べて、異なるＡＡＶ血清型から誘導することができ、また、異なるＡＡＶ血清型由来であってもよい。同起源の成分を使用することが、特に企図される。偽型ｒＡＡＶの作製は、例えば、参照により本明細書に完全に組み込まれるＷＯ  ０１／８３６９２で開示されている。
【００２４】
パッケージング細胞を作製する方法は、ＡＡＶ粒子作製のためにすべての必要な成分を安定して発現する細胞株を作製することである。例えば、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐを欠いているｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離しているＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、そして選択可能なマーカー、例えばネオマイシン抵抗性遺伝子を含むプラスミド（または複数のプラスミド）を細胞のゲノムに組み込む。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓ６．  ＵＳＡ，  ７９：２０７７−２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｇｅｎｅ，  ２３：６５−７３）のような手順によって、または直接平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ  ＆  Ｃａｒｔｅｒ，  １９８４，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５９：４６６１−４６６６）によって、細菌性プラスミド中に導入してきた。次いで、そのパッケージング細胞株を、アデノウイルスのようなヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、その細胞が、ｒＡＡＶの大量作製用に選択可能であり且つ適している点にある。適当な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノム及び／またはｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞中に導入するために、プラスミドではなく、アデノウイルスまたはバキュロウイルスを使用する。
【００２５】
ｒＡＡＶ作製の一般的な原則は、例えばＣａｒｔｅｒ，  １９９２，  Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １５３３−５３９；及びＭｕｚｙｃｚｋａ，  １９９２，  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５８：９７−１２９で検討されている。様々なアプローチは、Ｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４：２０７２  （１９８４）；  Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：６４６６  （１９８４）；  Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏ１．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５：３２５１  （１９８５）；  ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６２：１９６３  （１９８８）；及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ７：３４９  （１９８８）．  Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６３：３８２２−３８２８）；  米国特許Ｎｏ．  ５，１７３，４１４；  ＷＯ  ９５／１３３６５及び対応する米国特許Ｎｏ．  ５，６５８．７７６  ；  ＷＯ  ９５／１３３９２；  ＷＯ  ９６／１７９４７；  ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００；  ＷＯ  ９７／０９４４１  （ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）；  ＷＯ  ９７／０８２９８  （ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）；  ＷＯ  ９７／２１８２５  （ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）；  ＷＯ  ９７／０６２４３  （ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）；  ＷＯ  ９９／１１７６４；  Ｐｅｒｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．
（１９９５）  Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：１２４４−１２５０；  Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：６０９−６１５；  Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：１１２４−１１３２；米国特許Ｎｏ．  ５，７８６，２１１；  米国特許Ｎｏ．  ５，８７１，９８２；及び米国特許Ｎｏ．  ６，２５８，５９５に記載されている。前記文書は、参照により本明細書に完全に組み込まれるものであって、前記文書のそれらのセクションにおいて特に重点的に記載されていることはｒＡＡＶの作製である。
【００２６】
従って、本発明は、感染性ｒＡＡＶを作製するパッケージング細胞を提供する。一つの実施形態では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、及びＰｅｒＣ．６細胞（同族の２９３株）のような癌細胞を安定的に形質転換することができる。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換された癌細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎臓細胞）、ＭＲＣ−５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ−３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎培養細胞）及びＦＲｈＬ−２細胞（アカゲザル胎仔肺細胞）である。
【００２７】
当該技術分野で標準の方法によって、例えばカラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によって、ｒＡＡＶを精製することができる。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製する方法は、当該技術分野で公知であり、例えばＣｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  １０（６）：  １０３１−１０３９  （１９９９）；  Ｓｃｈｅｎｐｐ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．，  ６９  ４２７−４４３  （２００２）；米国特許Ｎｏ．  ６，５６６，１１８及びＷＯ  ９８／０９６５７で開示されている方法が挙げられる。
【００２８】
別の実施形態では、本発明は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物を企図している。本発明の組成物は、薬学的に許容される担体にｒＡＡＶを含む。組成物は、希釈剤のような他の成分も含んでよい。許容可能な担体及び希釈剤は、レシピエントに非毒性であり、好ましくは使用される投与量及び濃度で不活性なものであって、例えば、緩衝剤、例えばホスフェート、シトレート、及び他の有機酸；抗酸化物質、例えばアスコルビン酸；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；単糖類、二糖類、及び他の炭水化物、例えばブドウ糖、マンノース、またはデキストリン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトールまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；及び／または非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ、プルロニックまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【００２９】
無菌の注射可能な溶液は、適当な溶媒中において、必要量のｒＡＡＶを、上記した様々な他の成分と混合することによって調製し、必要であれば、その後、ろ過滅菌する。一般的には、分散液は、滅菌された活性成分を、塩基性分散媒と、上記した成分のうち必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクル中に配合することにより調製する。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分と任意の所望の追加成分との粉末を、予めろ過滅菌したそれらの溶液から得る真空乾燥法及び凍結乾燥法である。
【００３０】
本発明の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与の方式、治療目的、個体、及び標的とされる細胞型（１種または複数種）に応じて変化し、当該技術分野で標準の方法によって測定することができる。ｒＡＡＶの力価は、１ｍｌあたり、約１ｘ１０６，約１ｘ１０７，約１ｘ１０８，約１ｘ１０９，約１ｘ１０１０，約１ｘ１０１１，約１ｘ１０１２，約１ｘ１０１３〜約１ｘ１０１４以上のデオキシリボヌクレアーゼ耐性粒子（ＤＲＰ）であり得る。投与量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位（すなわち、それぞれ、１ｘ１０７  ｖｇ、１ｘ１０８  ｖｇ、１ｘ１０９  ｖｇ、１ｘ１０１０
ｖｇ、１ｘ１０１１  ｖｇ、１ｘ１０１２  ｖｇ、１ｘ１０１３  ｖｇ、１ｘ１０１４
ｖｇ）で表すこともできる。
【００３１】
ｒＡＡＶを用いて標的細胞（例えば骨格筋）にｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入する方法が、本発明によって企図される。本方法は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物の有効な用量または有効な複数用量を、それを必要とする動物（ヒトを包含している）に投与する工程を含む。前記用量を、ＤＭＤの発症前に投与する場合、投与は予防的である。前記用量を、ＤＭＤの発症後に投与する場合、投与は治療的である。本発明の実施形態では、有効用量は、治療されるＤＭＤと関連のある少なくとも１つの症状を緩和し、ＤＭＤへの進行を遅らせるかまたは予防し、障害／疾患状態の進行を遅らせるかまたは予防し、疾患の広がりを縮小させ、結果として、疾患の（部分的または全体的な）緩解をもたらし、且つ／または生存を延ばす用量である。
【００３２】
組成物の有効用量は、例えば、筋肉内、非経口、静脈内、経口、頬、鼻、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、または膣が挙げられるが、それらに限定されない、当該技術分野で標準の経路によって投与することができる。投与の経路（１つまたは複数）及び本発明のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（詳しくは、ＡＡＶ  ＩＴＲｓ及びカプシドタンパク質）の血清型は、治療される感染及び／または疾患状態、及び標的細胞／組織（１つまたは複数）を考慮して、当業者によって、選択且つ／または適合させることができる。いくつかの実施形態では、投与経路は筋肉内である。いくつかの実施形態では、投与経路は静脈内である。
【００３３】
また、併用療法も本発明によって企図される。ここで使用される組み合わせは、同時治療または連続治療を包含している。標準内科療法（例えば、コルチコステロイド及び／または免疫抑制剤）による本発明方法の組み合わせは、上記した背景技術で記載した療法などの他の療法との組み合わせとして特に企図される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】Ｄｕｐ２マウスにおける筋肉の組織構造及び免疫蛍光検査分析を示している図である。
【図２】Ｄｕｐ２マウスにおける筋肉のウェスタンブロットからの免疫ブロット法を示している図である。
【図３】エクソンスプライスエンハンサーで指示されるＡＯＮによって誘導されたＭｙｏＤ分化転換された筋芽細胞における重複エクソン２のスキッピングは、３９％の野生型転写物をもたらすことを示している図である。１列あたりの投与量はｎモルで示してある（２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００）。変動する転写物の量は、各列の下に最大の陰影をつけて示してある。ＴＢ＝形質移入バッファー。ＮＳＭ＝正常な骨格筋。エクソン２重複、ｗｔ、及びエクソン２欠失のパーセンテージは、各列の下に示してある。
【図４】エクソンスキッピングへのＵ７ｓｎＲＮＡベクターによるアプローチを例示している図である。Ｕ７ｓｎＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡを標的にする担体として使用される。Ｕ７ｓｎＲＮＡは、核細胞質輸送（ｎｕｃｌｅｏｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｅｘｐｏｒｔ）のために使用されるループ、Ｕ７ｓｎＲＮＡと標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡとの間の効率的な構築物のために使用されるＳｍタンパク質を結合するための認識配列、及びｐｒｅ−ｍＲＮＡを標的とするアンチセンス配列から構成されている。Ｕ７ｓｎＲＮＡは、それ自身のプロモーター及び３’下流配列を有する。次いで、そのＵ７カセットは、ＡＡＶプラスミド中にクローンされてベクターを作製する。
【図５】例示のエクソン２標的Ｕ７ｓｎＲＮＡ構築物をＤｕｐ２不死化ヒト線維筋芽細胞に形質導入するためにＳＣ  ｒＡＡＶベクターを使用するエクソンスキッピング実験に関するＲＴ−ＰＣＲの結果を示している図である。
【図６】Ｄｕｐ２マウスにおいて、Ｕ７＿ＡＣＣＡ  ＳＣ  ｒＡＡＶを、筋肉内注射によって送達するｉｎ  ｖｉｖｏでのエクソンスキッピング実験の結果を示している。
【図７Ａ】ｒｈ７４ゲノム配列（配列番号１）を示している図である。ここで、ヌクレオチド２１０〜２１４７はＲｅｐ７８遺伝子オープンリーディングフレームであり、８８２〜２０８はＲｅｐ５２オープンリーディングフレームであり、２０７９〜２０８１はＲｅｐ７８停止であり、２１４５〜２１４７はＲｅｐ７８停止であり、１７９７〜１８００はスプライスドナーサイトであり、２０９４〜２０９７はスプライスアクセプターサイトであり、２１２１〜２１２４はスプライスアクセプターサイトであり、１７４〜１８１は予想されるｐ５プロモーター＋１であり、１４５〜１５１はｐ５  ＴＡＴＡボックスであり、７５８〜７６１は予想されるｐ１９プロモーター＋１であり、７３２〜７３８はｐ１９ＴＡＴＡボックスであり、１７１１〜１７１６はｐ４０ＴＡＴＡボックスであり、２０９８〜４３１４はＶＰ１  Ｃａｐ遺伝子オープンリーディングフレームであり、２５０９〜２５１１はＶＰ２開始であり、２７０７〜２７０９はＶＰ３開始であり、そして４３２８〜４３３３はポリＡシグナルである。
【図７Ｂ】同上
【図７Ｃ】同上
【図７Ｄ】同上
【図７Ｅ】同上
【図７Ｆ】同上
【図７Ｇ】同上
【図７Ｈ】同上
【図７Ｉ】同上
【図７Ｊ】同上
【図７Ｋ】同上
【図８】例示エクソン２標的Ｕ７ｓｎＲＮＡのＡＡＶゲノム挿入物を有するプラスミドの地図を示している図である。
【図９】図８のプラスミドのＡＡＶゲノム挿入物のＤＮＡ塩基配列（配列番号２）を示している図である。
【図１０】ＭＬＰＡプローブのおおよその位置を示している縦棒を示している図である。
【図１１】ｍｄｘｄｕｐ２（Ｄｕｐ２）マウスの作製で使用されるベクターの概略図である。
【図１２ａｂｃ】Ｄｕｐ２マウスへのＡＡＶ１  Ｕ７−ＡＣＣＡの筋肉内送達の結果を示している図である。
【図１２ｄｅ】Ｄｕｐ２マウスへのＡＡＶ１  Ｕ７−ＡＣＣＡの筋肉内送達の結果を示している図である。
【図１３ａｂ】Ｄｕｐ２マウスモデルにおけるＡＡＶ９  Ｕ７＿ＡＣＣＡの静脈内注射の結果を示している図である。
【図１３ｃｄ】Ｄｕｐ２マウスモデルにおけるＡＡＶ９  Ｕ７＿ＡＣＣＡの静脈内注射の結果を示している図である。
【図１３ｅｆ】Ｄｕｐ２マウスモデルにおけるＡＡＶ９  Ｕ７＿ＡＣＣＡの静脈内注射の結果を示している図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
実施例
以下の実施例によって本発明の態様及び実施形態を例示する。
実施例１
ＡＡＶ  ｒｈ．７４の単離
【００３６】
ユニークなＡＡＶ血清型を、線形ローリングサークル増幅（Ｌｉｎｅａｒ  Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）と呼ばれる新規な技術を使用して、アカゲザルリンパ節から単離した。ＬＲＣＡプロセスを使用して、二本鎖で環状のＡＡＶゲノムを、数匹のアカゲザルから増幅した。前記方法は、ｐｈｉ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ及びＡＡＶ特異的プライマーを用いて、等温ローリングサークル増幅によって、環状ＡＡＶゲノムを増幅する能力に基づいている。ＬＲＣＡ生成物は、環状ＡＡＶゲノムの隣接頭−尾配列であり、それから、全長ＡＡＶ  Ｒｅｐ−Ｃａｐ分子クローンが単離された。４つの単離物の配列を決定し、Ｒｅｐ及びＣａｐ  ＯＲＦｓに関して予想されるアミノ酸配列をアラインし、既に公開されている血清型（表）と比較した。ＶＰ１タンパク質配列を分析し、ＮＨＰ  ＡＡＶ同源系統群Ｄ、Ｅ、及びＡＡＶ  ４様ウイルス単離物に対する相同性を明らかにした。Ｒｅｐ７８（表の上部）ＯＲＦの分析から、ＡＡＶ１に対する強い相同性（９８〜９９％）が認められた。
【表１】
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【００３７】
１つのマカク組織標本（ｒｈ４２６−Ｍ）は、ＡＡＶ８と９３％の配列同一性を共有するｒｈ．７４と称される分岐ＡＡＶ８様単離物を作製した。ｒｈ．７４ゲノムのヌクレオチド配列は図７に配列番号１で示してある。
【００３８】
ｒｈ．７４カプシド遺伝子配列を、ＡＡＶ２由来のＲｅｐ遺伝子を含有するＡＡＶヘルパープラスミド中にクローンして、組換えＡＡＶベクター作製のためのベクター複製機能を提供した。
実施例２
ＤＭＤモデル
ＤＭＤエクソン２重複のモデルとしては、例えば、以下のようなｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルが挙げられる。
ｍｄｘｄｕｐ２マウスモデル
【００３９】
Ｄｍｄ座の中にエクソン２の重複を有するマウスを開発した。エクソン２重複突然変異は、最も一般的なヒト重複突然変異であり、比較的重篤なＤＭＤを発症させる。
【００４０】
最初に、Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｍｕｔａｔ．，２７（９）：  ９３８−９４５（２００６）により、１１の異なるヒトエクソン２重複の最大範囲を、ＭＬＰＡ及びロングレンジＰＣＲによって調べた。結果は図１０に示してある。図１０では、各縦棒は、ＭＬＰＡプローブのおおよその位置を示している。陰影のついたカラムは、同定された２つのホットスポット領域を示しており；それらを用いて、マウスにおけるエクソン２カセットの相同性によって挿入物の位置を決定した。
【００４１】
挿入ベクターの地図は図１１に示してある。地図では、数は、クローニング部位及びエクソン及び制限酵素認識部位の相対位置を示している。ｎｅｏカセットは、遺伝子と同じ方向に存在し、挿入ポイントは、正確に、イントロン２の３２２０７／３２２０８ｂｐである。挿入されたエクソン２の両側には少なくとも１５０ｂｐの追加のイントロン配列が維持され、Ｅ２領域は１７７５〜２１９５ｂｐである。エクソン２及びイントロン２のサイズは、それぞれ６２ｂｐ及び２０９５７２ｂｐである。
【００４２】
エクソン２構築物を有するベクターで雄のＣ５７ＢＬ／６ＥＳ細胞に形質移入し、次いでＰＣＲによって挿入を確認した。１つの良好なクローンを、１２のアルビノＢＬ／６胚盤胞で見出し、増幅し、そして注射した。注射された胚盤胞は、レシピエントマウス中に移植された。キメラ雄由来のジストロフィン遺伝子を、ＰＣＲによってチェックし、次いでＲＴ−ＰＣＲによってチェックした。コロニーを増殖させた。コロニーはホモ接合性に増殖されたいくつかの雌のマウスを包含している。
【００４３】
図１及び図２は、４週齢のヘミ接合ｍｄｘｄｕｐ２マウス由来の筋肉にはジストロフィン発現が実質的に無いことを証明している。（図２で見られるように、発現の痕跡は、エクソン１特異的Ｍａｎｅｘ１Ａ抗体ではなくＣ末端抗体を用いて、検出することができ、我々が既に記載したエクソン６交互翻訳開始部位からの極めて少量の翻訳と一致している）
不死化された条件誘導性のｆｉｂｒｏＭｙｏＤ細胞株
【００４４】
哺乳動物線維芽細胞におけるＭｙｏＤ遺伝子の発現は、筋系譜への細胞の分化転換をもたらす。そのような細胞は、筋管に更に分化することができ、それらは、筋肉遺伝子、例えばＤＭＤ遺伝子を発現する。
【００４５】
テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下でＭｙｏＤを条件的に発現する不死化細胞株が生成した。これは、テトラサイクリン誘導性ＭｙｏＤを、レンチウイルスの原発性線維芽細胞株に安定的に形質移入し、そしてヒトテロメラーゼ遺伝子（ＴＥＲ）を含有させることによって達成される。得られた安定株は、ドキシサイクリンによる処置によってＭｙｏＤ発現を開始させることができる。そのような細胞株は、エクソン２の重複を有するＤＭＤ患者から作製された。
【００４６】
前記の株を使用して、Ｄｒ．  Ｓｔｅｖｅ  Ｗｉｌｔｏｎ  （パース、オーストラリア）により提供された２’−Ｏ−メチルアンチセンスオリゴマー（ＡＯＮｓ）を用いる二重スキッピング（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ）を示した。複数の細胞株を試験した。例示の細胞株からの結果は、図３に示してある。
一過性ＭｙｏＤ形質移入初代細胞株
【００４７】
アデノウイルス−ＭｙｏＤを一過性形質移入された初代線維芽細胞株を用いて原理の証明実験を行った。アデノウイルス構築物は細胞ゲノムで集積されなかった、それでも、ＭｙｏＤは一過性に発現された。得られたＤＭＤ発現は、エクソンスキッピング実験を行うのに十分であった（しかし再現性は安定的に形質移入された株の方が有利である）。
実施例３
エクソン２重複突然変異に関するＵ７ｓｎＲＮＡ媒介スキッピングの効果
【００４８】
複製エクソンのウイルス媒介エクソンスキッピングのための生成物及び方法を開発した。前記の生成物及び方法は、Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，
３０６（５７０２）：  １７９６−１７９９  （２００４）  またはＧｏｙｅｎｖａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  ２０（６）：  １７９６０１７９９  （２００４）に記載されているＵ７ｓｎＲＮＡ系に比べて改良された。
【００４９】
Ｕ７ｓｎＲＮＡは、所定の標的エクソンでのスプライシングを干渉するための標的アンチセンス配列を包含するように改良された（図４）。詳しくは、４つの新しいエクソン２標的配列は、実施例２で説明したＡＯＮ研究の結果に基づいて設計した。
Ｕ７Ｂ      ＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＴＴＣＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＴＡ（配列番号：３）
Ｕ７Ａｌｏｎｇ      ＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＴｃｔａ（配列番号：４）
Ｕ７Ａｓｈｏｒｔ      ＡＧＡＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＴｃｔａ（配列番号：５）
Ｕ７Ｃ      ＧＣＡＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＧＧＴＡＡＧＡＡＴ（配列番号：６）
エクソン２標的配列を包含するＵ７ｓｎＲＮＡ構築物を作製した。各Ｕ７ｓｎＲＮＡ構築物は標的配列のうちの１つを包含していた。選択された他のエクソンを標的にしたＵ７ｓｎＲＮＡ構築物も（上記したＭｙｏＤ−転化分化された細胞株研究に基づいて）作製した。次いで、Ｕ７ｓｎＲＮＡ構築物のうちの１つ以上を包含しているゲノムを有する自己相補的（ＳＣ）ＡＡＶベクターを作製した。
【００５０】
細胞培養での実験のために、またＤｕｐ２マウスでの筋肉内注射のために、ｒＡＡＶ１ベクターを利用した。ＨＥＫ２９３細胞において、アデノウイルスを用いないトリプルプラスミドＤＮＡ形質移入（ＣａＰＯ４沈殿）方法による、所望のベクターゲノムを含むプラスミドを使用する改良クロスパッケージングアプローチによって、所望のＡＡＶ血清型の組換えＳＣ  ＡＡＶベクターを作製した［Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７６：７９１−８０１  （２００２）］。ベクターは、既に記載したものと同様な方式で、ＡＡＶヘルパープラスミド及びアデノウイルスヘルパープラスミドで共同形質移入することによって、作製した［Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ．
Ｔｈｅｒ．，  １０：１５２８−１５３４  （２００３）］。アデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＡｄｈｅｌｐｅｒ）は、高力価ｒＡＡＶを作製するのに必要なアデノウイルス５型Ｅ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６、及びＶＡ  Ｉ／ＩＩ  ＲＮＡ遺伝子を発現する。
【００５１】
ベクターは、既に記載した線形ＮａＣｌ塩勾配を用いて、連続イオジキサノール勾配精製及び陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによって、浄化された２９３細胞溶解物から精製した［Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，  １０：１０３１−１０３９  （１９９９）］。ベクターゲノム（ｖｇ）の力価は、既に記載したように、Ｐｒｉｓｍ  ７５００  Ｔａｑｍａｎ検出器システム（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用している特定のプライマー／プローブセットによってＱＰＣＲに基づく検出を使用して、測定した。ベクターストックの力価は１〜１０  ｘ  １０１２ｖｇ／ｍＬであった。
【００５２】
最初のエクソンスキッピング分析は、Ｄｕｐ２不死化ヒト線維筋芽細胞に形質導入するためのＳＣ  ｒＡＡＶベクターを使用してＲＴ−ＰＣＲによって行った。ドキシサイクリンの制御下で筋系細胞へと転化分化することができたＤｕｐ  ２不死化ヒト線維芽細胞を、テロメラーゼ発現ベクター及びテトラサイクリン誘導性−ＭｙｏＤ発現ベクターの両方で形質導入することにより、作製した。次いで、変換させたヒト線維筋芽細胞（ＦＭ）を、エクソン２アンチセンス配列を組み込んでいる異なるＵ７構築物を有するＳＣ  ｒＡＡＶで形質導入した。
【００５３】
３つの異なるアンチセンス配列を有するＳＣ  ｒＡＡＶ．１Ｕ７構築物に関するＲＴ−ＰＣＲの結果は図５に示してある。図５において、「（４Ｃ）」は、Ｕ７構築物の４つのコピーがベクターゲノム中に包含されたことを示しており、「＋」は、より高用量を示しており、「Ｕ７＿ＡＣＣＡ  Ａ＝Ａｌｏｎｇ」は、４つのエクソン２標的Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物、ちなわち第一Ｕ７Ａｌｏｎｇ構築物、第一Ｕ７Ｃ構築物、第二Ｕ７Ｃ構築物及び第二Ｕ７Ａｌｏｎｇ構築物を順番に含むベクターゲノム（図８のプラスミドマップに示してあり、その配列、すなわち配列番号２は、図９に提示してある）を示している。図に示されているように、あらゆる他のベクター構築物と比較して、Ｕ７＿ＡＣＣＡ  Ａ−Ａｌｏｎｇ  ＳＣ  ｒＡＡＶ（本明細書の他のところではＵ７＿ＡＣＣＡ  ＳＣ  ｒＡＡＶ１と省略してある）は、より高いパーセンテージのエクソン２スキップを達成した。
【００５４】
次の実験では、エクソンスキッピング効率をｉｎ  ｖｉｖｏで分析した。最も効果的なＡＡＶ−Ｕ７ベクターであるＵ７＿ＡＣＣＡ  ＳＣ  ｒＡＡＶ１は、Ｄｕｐ２マウスで筋肉内注射用に選択した。結果は、図６（Ａ〜Ｄ）に示してあり、ここで、（Ａ）は、ジストロフィン染色を示しており、そこでは、タンパク質発現は、回復され、多くの筋線維の膜に適当に限局され；（Ｂ）タンパク質の回復は、ウェスタンブロットによって確認された。ＲＴ−ＰＣＲは、（Ｃ）Ｄｕｐ２マウスにおける用量依存性のシングルスキッピングまたはダブルスキッピング、ならびに（Ｄ）野生型マウスにおける効率的スキッピングを示している。
【００５５】
従って、高効率のＡＡＶ媒介Ｕ７ｓｎＲＮＡは、エクソン２をスキップし、筋線維鞘下のジストロフィンを回復させるように設計した。心機能；ＥＤＬ及び横隔膜力評価；そして踏み車及び握力試験を、未処置及び処置されたマウス間で比較する。注射された筋肉内で検出可能なジストロフィン発現の程度に基づいて、Ｕ７＿ＡＣＣＡ  ＳＣ  ｒＡＡＶを、更なる実験のために選択し、１Ｅ１１  ｖｇ／ｋｇでの第１コホートに静脈内に送達し、次いで第２コホートにおいて１対数高く投薬した。注射は４週間行い、動物を、上記したように、１０及び２４週において、生理学的アセスメントによって、また組織病理学によって評価した（１コホート当たり動物ｎ＝８）。
実施例４
ＡＡＶ１によるＵ７−ＡＣＣＡの筋肉内送達は、Ｄｕｐ２マウスにおいて有意なＮ短縮型ジストロフィン発現をもたらす。
【００５６】
図９のゲノム挿入物を含むｒＡＡＶ１は、実施例３記載の方法によって作製した。次いで、ＡＡＶ．１Ｕ７−ＡＣＣＡを、筋肉内注射によってＤｕｐ２マウスに投与した。
【００５７】
５ｅ１１ｖｇ  ＡＡＶ．１Ｕ７−ＡＣＣＡのＴＡ筋肉内注射の４週間後にＤＭＤ  ｍＲＮＡについて行ったＲＴ−ＰＣＲは、Ｄｕｐ２動物におけるエクソン２の両方のコピーのほとんど完全なスキッピングを示した［図１２（ａ）］。
【００５８】
感染１ヵ月後に行ったＣ末端の抗体（ＰＡ１−２１０１１、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いる免疫ブロット法は、Ｄｕｐ２及び対照Ｂｌ６マウスの両方でＮ短縮型イソホルム（星印）の有意な発現を示した［図１２（ｂ）］。Ｕ７−ＡＣＣＡを注射されたＢｌ６雄で誘導されるタンパク質は、Ｄｕｐ２で処置された動物で発現されたものと同じ大きさであり、このタンパク質と全長イソホルムとの間の大きさの差を確認した。
【００５９】
ジストロフィン、β−ジストログリカン、及びニューロン一酸化窒素合成酵素の免疫蛍光染色は、ジストロフィン関連複合体のメンバーの回復を示した［図１２（ｃ）］。
【００６０】
未処置のＤｕｐ２動物における強縮性収縮後の正規化された単位面積当たりの力（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒｃｅ）は、Ｂｌ６マウスに比べて、有意に小さかった。ＡＡＶ１．Ｕ７−ＡＣＣＡの単独またはプレドニゾン併用の筋肉内注射は、Ｂｌ６マウスで認められたものと有意な差がないレベルまで有意に力を増大させた。未処置Ｄｕｐ２マウスと、プレドニゾンを併用して処置されたマウス（Ｄｕｐ２＋ＰＤＮ）との間に有意差は観察されなかった［図１２（ｄ）］。このアッセイのために、正規化された単位面積当たりの力を、公開されているプロトコル［Ｈａｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  １１０：  １６５６−１６６３  （２０１１）］を用いて評価した。
【００６１】
処置は、公開されているプロトコル（Ｈａｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．、前掲書）によって評価されるように、反復伸張性収縮後の力の喪失からＤｕｐ２の筋肉を有意に保護した。ＡＡＶ１．Ｕ７−ＡＣＣＡ単独でのＤｕｐ２マウスの処置は、未処置のＤｕｐ２マウスと比較して、統計的に有意な改善をもたらした。ＡＡＶ１．Ｕ７−ＡＣＣＡとプレドニゾンとの組み合わせは、収縮＃３〜＃１０後に、力保持において、対照Ｂｌ６マウスと比較して有意差はなかった［図１２（ｅ）］。
実施例５
Ｄｕｐ２マウスモデルにおけるＡＡＶ９−Ｕ７＿ＡＣＣＡの静脈内注射は、Ｎ短縮型イソホルムの有意な発現と、筋力不足の矯正をもたらす。
【００６２】
注射された筋肉内で検出可能なジストロフィン発現の程度に基づいて、我々は、更なる実験のために、静脈内にＵ７＿ＡＣＣＡ  ＳＣ  ｒＡＡＶを送達するように選択し、また、公知の組織内分布特性に基づいて血清型ｒＡＡＶ９を選択した。
【００６３】
図９のゲノム挿入物を含むｒＡＡＶ９は実施例３記載の方法で作製した。次いで、ＡＡＶ．９Ｕ７−ＡＣＣＡをＤｕｐ２マウスに投与した。第１コホートには、３．３Ｅ１１２
ｖｇ／ｋｇで尾静脈を介して注射した。注射は４週齢で行った。
【００６４】
ＡＡＶ９．Ｕ７−ＡＣＣＡ（３．３Ｅ１２  ｖｇ／ｋｇ）の尾静脈注射１ヵ月後に、５匹の異なるＤｕｐ２マウスの筋肉についてＲＴ−ＰＣＲを行った［図１３（ａ）］。複数の転写物（標識されたＤｕｐ２、ｗｔ、及びＤｅｌ２）の存在によって証明されるように、Ｕ７−ＡＣＣＡによる処置は、試験されたすべての筋肉においてエクソン２の１つまたは両方のコピーを強制的にスキップすることができた。（ＴＡ：前脛骨筋；Ｇａｓ：腓腹筋；ハートマーク：心臓；Ｔｒｉ：三頭筋；ｄｉａ：横隔膜）
【００６５】
注射１ヵ月後に５つの異なる筋肉について行ったＣ末端抗体（ＰＡ１−２１０１１、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いるウェスタンブロットは、すべての試験された筋肉でジストロフィンの存在を示した［図１３（ｂ）］。
【００６６】
同じサンプルに関してジストロフィンのＣ末端抗体（ＰＡ１−２１０１１、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用する免疫染色では、筋細胞膜において、ジストロフィンの発現及びその適切な限局化が確認された［図１３（ｃ）］。
【００６７】
前肢と後肢両方の握力を評価することにより、ＡＡＶ９．Ｕ７−ＡＣＣＡで処置されたＤｕｐ２動物では、握力が完全に矯正されていることが分かった［図１３（ｄ）］。このアッセイは、公開されているプロトコル［Ｓｐｕｒｎｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｓｃｌｅ  ＆  Ｎｅｒｖｅ，  ３９，  ５９１−６０２  （２００９）］を使用して行った。
【００６８】
強縮性収縮後の正規化された単位面積当たりの力及び全体の力は、公開されているプロトコル［Ｈａｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．、前掲書］を用いて、未処置のＤｕｐ２動物［図１３（ｅ）］と比較すると、筋力において、改善を示した。
【００６９】
心臓乳頭筋は、公開されているプロトコルを用いると、処置された動物［図１３（ｆ）］では、筋長依存的な力生成において改善を示した［Ｊａｎｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ２８９（６）：Ｈ２３７３−２３７８  （２００５）］。
【００７０】
本発明を、特定の実施形態によって説明してきたが、当業者は、変更及び改良を考えるだろうことが理解される。而して、特許請求の範囲で見られる限定のみを本発明に設定するべきである。
【００７１】
本出願で引用されるすべての文書は、前記文書が引用される内容に対する特別な注意をもって参照により本明細書に完全に組み込まれる。
本発明の実施形態において、例えば、以下の項目が提供される。
（項目１）
必要に応じてＤＭＤエクソン２重複を有する患者のデュシェンヌ筋ジストロフィーを改善する方法であって、前記患者に対して組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与する工程を含み、ここで前記ｒＡＡＶのゲノムが少なくとも１つのエクソン２標的Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物を含む、前記方法。
（項目２）
必要に応じてＤＭＤエクソン２重複を有する患者のデュシェンヌ筋ジストロフィーと関連のあるジストロフィー症状の進行を阻害する方法であって、前記患者に対してｒＡＡＶを投与する工程を含み、ここで前記ｒＡＡＶのゲノムが少なくとも１つのエクソン２標的Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物を含む、前記方法。
（項目３）
ＤＭＤエクソン２重複と関連のあるデュシェンヌ筋ジストロフィーに罹患している患者の筋肉機能を改善する方法であって、前記患者に対してｒＡＡＶを投与する工程を含み、ここで前記ｒＡＡＶのゲノムが少なくとも１つのエクソン２標的Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物を含む、前記方法。
（項目４）
前記筋肉機能の改善が、筋力の改善である項目３記載の方法。
（項目５）
前記筋肉機能の改善が、立っている時と歩いている時の安定性の改善である項目３記載の方法。
（項目６）
前記ウイルスゲノムが、自己相補的ゲノムである項目１〜５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記エクソン２標的Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物が、Ｕ７Ａｌｏｎｇ、Ｕ７Ａｓｈｏｒｔ、Ｕ７Ｂ、Ｕ７Ｃ、またはそれらの２種以上の組み合わせである項目１〜６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記組換えアデノ随伴ウイルスが、ＳＣ  ｒＡＡＶ  Ｕ７＿ＡＣＣＡである項目１〜７のいずれかに記載の方法。
（項目９）
ＤＭＤエクソン２重複を有する患者に対してエクソン２標的Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物を送達する方法であって、前記患者に対してｒＡＡＶを投与する工程を含み、ここで前記ｒＡＡＶのゲノムが少なくとも１つのエクソン２標的Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物を含む、前記方法。
（項目１０）
前記ｒＡＡＶのゲノムが、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ  ＤＮＡを欠いている項目８記載の方法。
（項目１１）
前記ウイルスゲノムが、自己相補的ゲノムである項目９記載の方法。
（項目１２）
前記組換えアデノ随伴ウイルスが、ＳＣ  ｒＡＡＶ  Ｕ７＿ＡＣＣＡである項目９、１０または１１記載の方法。
（項目１３）
前記組換えアデノ随伴ウイルスが、組換えＡＡＶ  ｒｈ７４ウイルス、組換えＡＡＶ６ウイルスまたは組換えＡＡＶ９ウイルスである項目１２の方法。
（項目１４）
少なくとも１つのエクソン２標的Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物を含むゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
（項目１５）
ＡＡＶ  ｒｈ．７４カプシド、ＡＡＶ６カプシドまたはＡＡＶ９カプシド；及び少なくとも１つのエクソン２標的Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物を含むゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
（項目１６）
前記ゲノムが、順番に、４つのエクソン２標的Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物：第一Ｕ７Ａｌｏｎｇ、第一Ｕ７Ｃ、第二Ｕ７Ｃ、及び第二Ｕ７Ａｌｏｎｇを含む項目１４または項目１５記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
（項目１７）
前記ｒＡＡＶのゲノムが、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ  ＤＮＡを欠いている項目１４、１５、または１６記載のｒＡＡＶ。
（項目１８）
前記ゲノムが、自己相補的ゲノムである項目１４、１５、または１６記載のｒＡＡＶ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図７Ｋ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａｂｃ】
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【図１２ｄｅ】
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【図１３ａｂ】
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【図１３ｃｄ】
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【図１３ｅｆ】
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【配列表】
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