(57)【要約】      （修正有）【課題】ＶＰ３領域における表面露出リジン、セリン、トレオニン、及び／又は、チロシン残基の１つ又は組み合わせの改変を含む、ＡＡＶキャプシドタンパク質の提供。【解決手段】特定の配列を有するＡＡＶ  ＶＰ３タンパク質であり、ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオン、並びに、前記ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸分子及びｒＡＡＶベクター。有利なことに、前記ｒＡＡＶベクター及びｒＡＡＶビリオンは、野生型ｒＡＡＶベクター及び野生型ｒＡＡＶビリオンと比較した場合、対象の様々な細胞、組織、及び、臓器の形質導入において改善された効率を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含むＡＡＶ  ＶＰ３タンパク質：
（ａ）配列番号２の野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質のＫ２５８、Ｋ３２１、Ｋ４５９、Ｋ４９０、Ｋ５０７、Ｋ５２７、Ｋ５７２、Ｋ５３２、Ｋ５４４、Ｋ５４９、Ｋ５５６、Ｋ６４９、Ｋ６５５、Ｋ６６５、またはＫ７０６に対応する位置での非リジンアミノ酸残基；
（ｂ）配列番号８の野生型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質のＫ５３０、Ｋ５４７、またはＫ５６９に対応する位置での非リジンアミノ酸残基；
（ｃ）配列番号２の野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質のＳ２６１、Ｓ２６４、Ｓ２６７、Ｓ２７６、Ｓ３８４、Ｓ４５８、Ｓ４６８、Ｓ４９２、Ｓ４９８、Ｓ５７８、Ｓ６５８、Ｓ６６２、Ｓ６６８、Ｓ７０７、またはＳ７２１に対応する位置での非セリンアミノ酸残基；
（ｄ）配列番号２の野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質のＴ２５１、Ｔ３２９、Ｔ３３０、Ｔ４５４、Ｔ４５５、Ｔ５０３、Ｔ５５０、Ｔ５９２、Ｔ５８１、Ｔ５９７、Ｔ４９１、Ｔ６７１、Ｔ６５９、Ｔ６６０、Ｔ７０１、Ｔ７１３、またはＴ７１６に対応する位置での非トレオニンアミノ酸残基；および／または
（ｅ）配列番号２の野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質のＹ２５２、Ｙ２７２、Ｙ４４４、Ｙ５００、Ｙ７００、Ｙ７０４、またはＹ７３０に対応する位置での非チロシンアミノ酸残基。
【請求項２】
配列番号２の野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質のＫ４５９、Ｋ４９０、Ｋ５３２、Ｋ５４４、またはＫ５５６に対応する位置で非リジンアミノ酸残基を含む、請求項１に記載のＡＡＶ  ＶＰ３タンパク質。
【請求項３】
配列番号８の野生型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質のＫ５３０、Ｋ５４７、またはＫ５６９に対応する位置で非リジンアミノ酸残基を含む、請求項１または請求項２に記載のＡＡＶ  ＶＰ３タンパク質。
【請求項４】
配列番号２の野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質のＫ５４４およびＫ５６６に対応する位置で非リジンアミノ酸残基を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のＡＡＶ  ＶＰ３タンパク質。
【請求項５】
非リジンアミノ酸残基が、グルタミン酸（Ｅ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、またはイソロイシン（Ｉ）から選択される、前記請求項のいずれかに記載のＡＡＶ  ＶＰ３タンパク質。
【請求項６】
配列番号２の野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質のＫ２５８、Ｋ３２１、Ｋ４５９、Ｋ４９０、Ｋ５０７、Ｋ５２７、Ｋ５７２、Ｋ５３２、Ｋ５４４、Ｋ５４９、Ｋ５５６、Ｋ６４９、Ｋ６５５、またはＫ７０６に対応する位置でグルタミン酸（Ｅ）アミノ酸残基を含む、前記請求項のいずれかに記載のＡＡＶ  ＶＰ３タンパク質。
【請求項７】
配列番号２の野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質のＫ５４４およびＫ５６６に対応する位置でグルタミン酸（Ｅ）アミノ酸残基を含む、前記請求項のいずれかに記載のＡＡＶ  ＶＰ３タンパク質。
【請求項８】
配列番号８の野生型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質のＫ５３０、Ｋ５４７、またはＫ５６９に対応する位置でグルタミン酸（Ｅ）アミノ酸残基を含む、前記請求項のいずれかに記載のＡＡＶ  ＶＰ３タンパク質。
【請求項９】
配列番号２の野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質のＳ６６２に対応する位置で非セリンアミノ酸残基を含む、前記請求項のいずれかに記載のＡＡＶ  ＶＰ３タンパク質。
【請求項１０】
非セリンアミノ酸残基が、バリン（Ｖ）、アスパラギン酸（Ｄ）、またはヒスチジン（Ｈ）から選択される、前記請求項のいずれかに記載のＡＡＶ  ＶＰ３タンパク質。
【請求項１１】
配列番号２の野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質のＳ６６２に対応する位置でバリン残基を含む、前記請求項のいずれかに記載のＡＡＶ  ＶＰ３タンパク質。
【請求項１２】
前記請求項のいずれかに記載のＡＡＶ  ＶＰ３タンパク質をコードする、単離された核酸分子。
【請求項１３】
請求項１から１１のいずれか一項のタンパク質をコードする、または請求項１２の単離された核酸分子を含む、ＡＡＶベクター。
【請求項１４】
ベクターの形質導入効率が、対応する非改変野生型ＡＡＶベクターのものと比較して、少なくとも５倍高い、請求項１３に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１５】
アデノ随伴ウイルス粒子または感染性ｒＡＡＶビリオン内に含まれる、請求項１３または請求項１４に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１６】
（ａ）請求項１から１１のいずれか一項に記載のＡＡＶ  ＶＰ３タンパク質、請求項１２に記載の単離された核酸分子、または請求項１３から１５のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター；および（ｂ）医薬的に許容可能なバッファー、希釈剤、または媒体を含む、組成物。
【請求項１７】
哺乳動物の疾患、傷害、障害、外傷または機能障害の１以上の症状を診断する、予防する、治療する、または寛解させるためのキット内に含まれる、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
診断または治療における使用のための、あるいは、哺乳動物における、癌、糖尿病、自己免疫疾患、腎臓病、循環器疾患、膵臓病、腸疾患、肝臓病、神経疾患、神経筋障害、神経運動欠損、神経骨格障害、神経障害、感覚神経機能不全、脳卒中、虚血、摂食障害、α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠損症、バッテン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、骨疾患、外傷、または肺疾患の１以上の症状を、治療する、予防する、または寛解させることにおける使用のための、請求項１６または請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
哺乳動物における、疾患、障害、機能障害、傷害、異常状態、先天性欠損、または外傷の１以上の症状を、診断する、治療する、予防する、または寛解させるための医薬の製造における、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２０】
有効量の、請求項１３から１５のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを含む組成物を、集団の１以上の細胞内に導入することを含む、哺乳動物の細胞の集団を形質導入する方法。
【請求項２１】
ＡＡＶベクターが、配列番号２の野生型ＡＡＶ２  ＶＰ３タンパク質のＫ４５９、Ｋ４９０、Ｋ５３２、Ｋ５４４、またはＫ５５６、あるいは配列番号８の野生型ＡＡＶ８  キャプシドタンパク質のＫ５３０、Ｋ５４７、またはＫ５６９に対応する位置で、非リジンアミノ酸残基を含むＶＰ３タンパク質を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
非リジンアミノ酸残基が、グルタミン酸（Ｅ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、またはイソロイシン（Ｉ）である、請求項２０または請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
非リジンアミノ酸残基がグルタミン酸（Ｅ）である、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
宿主細胞が哺乳動物の細胞である、請求項２０から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
宿主細胞が、内皮細胞、上皮細胞、血管細胞、肝臓細胞、肺細胞、心臓細胞、膵臓細胞、腸細胞、腎臓細胞、筋肉細胞、骨細胞、樹状細胞、心細胞、神経細胞、血液細胞、脳細胞、線維芽細胞、または癌細胞である、請求項２０から２４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願第１３／８４０，２２４号（係属中）、および２０１２年５月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／６４７，３１８号（係属中）に基づく利益を主張する。本発明はまた、２００９年１２月３１日に出願された米国特許出願第１２／５９５／１９６号（２０１３年５月２１日に、米国特許第８，４４５，２６７号として発行）、２００８年４月８日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５９６４７号（国内移行段階）、２００７年４月９日に出願された米国仮特許出願第６０／９１０，７９８号（期限切れ）、２０１３年３月２９日に出願された米国特許出願第１３／８５４，０１１号（係属中）；および２０１３年４月２日に出願された米国特許出願第１３／８５５，６４０号（係属中）に関連する。上記出願の各々の内容は、それらの出典を表すことにより、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府資金による研究または開発の記載
適用無し。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子治療の分野での主な進歩は、治療用遺伝物質を送達するためにウイルスを使用することにより達成された。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、その低い免疫原性および非分裂細胞を効率的に形質導入する能力により、遺伝子治療のための非常に効率的なウイルスベクターとしてかなり注目されている。ＡＡＶは様々な細胞および組織の種類を感染させると示されており、また、ヒトの遺伝子治療における使用のためにこのウイルスシステムを適応させるために、著しい進歩が最近十年間の間に得られている。
【０００４】
その正常な「野生型」形態では、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ＤＮＡは、長さ約４６００ヌクレオチド（ｎｔ）の一本鎖分子として、ウイルスキャプシド内にパッケージングされている。ウイルスによる細胞の感染に続き、細胞の分子機構が単一のＤＮＡ鎖を二本鎖形態に変換する。
【０００５】
ＡＡＶには遺伝子送達媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）としてのその使用に好都合である多くの特性を有する：１）野生型ウイルスはヒトの病態に全く関連していない；２）組換え形態は天然のウイルスコード配列を含有していない；かつ持続性の遺伝子導入発現が多くの適用で観察されている。遺伝子治療の主な障害の一つ、ベクター由来および導入遺伝子由来エピトープに対する細胞性免疫応答における免疫競合の誘導は、複製欠損および組換えＡＡＶにより発現されるウイルスタンパク質の欠如により、克服できる。
【０００６】
組換えアデノ随伴ウイルスベクターの形質導入効率は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで、異なる細胞および組織において大幅に変化する。組織的研究がＡＡＶの生活環の基本段階を解明するために行なわれた。例えば、上皮成長因子受容体タンパク質チロシンキナーゼ（ＥＧＦＲ−ＰＴＫ）によってチロシン残基でリン酸化される、細胞タンパク質、ＦＫＢＰ５２は、ＡＡＶ第二鎖ＤＮＡ合成、その結果としてｉｎ  ｖｉｔｒｏならびにｉｎ  ｖｉｖｏでの導入遺伝子発現を阻害することが実証されている。ＥＧＦＲ−ＰＴＫシグナル伝達が、ユビキチン／プロテアソーム経路介在性細胞内輸送ならびにＡＡＶベクターのＦＫＢＰ５２介在性二本鎖ＤＮＡ合成を調節することが実証されている。それらの研究では、ＥＧＦＲ−ＰＴＫシグナル伝達の阻害がＡＡＶキャプシドタンパク質のユビキチン化の減少につながり、それがＡＡＶベクターのプロテアソーム介在性分解を制限することにより核輸送を促進する、これはＡＡＶキャプシド上のチロシン残基のＥＧＦＲ−ＰＴＫ介在性リン酸化を含意する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ＶＰ３領域における表面露出リジン、セリン、トレオニンおよび／またはチロシン残基の１つまたは組み合わせの改変を含む、ＡＡＶキャプシドタンパク質を提供する。また、本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオン、ならびに本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸分子およびｒＡＡＶベクターも提供する。有利なことに、本発明のｒＡＡＶベクターおよびビリオンは、野生型ｒＡＡＶベクターおよびビリオンと比較した場合、対象の様々な細胞、組織および臓器の形質導入において改善された効率を有する。
【０００８】
一実施形態では、本発明は、ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、ＡＡＶキャプシドタンパク質のＶＰ３領域が、野生型ＡＡＶのキャプシドタンパク質［例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０；かつ、一実施形態では、好ましくは野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２）］のＶＰ３領域におけるリジン残基に対応する位置で非リジン残基を含み、野生型ＡＡＶタンパク質のＶＰ３領域におけるリジン残基がＫ２５８、Ｋ３２１、Ｋ４５９、Ｋ４９０、Ｋ５０７、Ｋ５２７、Ｋ５７２、Ｋ５３２、Ｋ５４４、Ｋ５４９、Ｋ５５６、Ｋ６４９、Ｋ６５５、Ｋ６６５、およびＫ７０６の１以上、またはそれらの任意の組み合わせである、核酸分子を提供する
【０００９】
一実施形態では、野生型ＡＡＶ２キャプシド配列のＫ５３２に対応する表面露出リジンが改変される。一実施形態では、ＡＡＶキャプシドの表面露出リジンがグルタミン酸（Ｅ）またはアルギニン（Ｒ）に改変される。特定の実施形態では、野生型ＡＡＶ２キャプシド配列のＫ５３２に対応する表面露出リジンがアルギニンに改変される（Ｋ５３２Ｒ）。
【００１０】
ある実施形態では、野生型ＡＡＶ２キャプシド配列のＫ４９０、Ｋ５４４、Ｋ５４９、およびＫ５５６に対応する１以上の表面露出リジン残基が改変される。ある特定の実施形態では、野生型ＡＡＶ２キャプシド配列のＫ４９０、Ｋ５４４、Ｋ５４９、およびＫ５５６に対応する１以上の表面露出リジンがグルタミン酸（Ｅ）に改変される。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、野生型ＡＡＶ２キャプシドのＫ５４４およびＫ５５６残基に対応する表面露出リジン残基がグルタミン酸（Ｅ）に改変される、ＡＡＶ２ベクターを提供する。
【００１２】
ある実施形態では、野生型ＡＡＶ８キャプシド配列のＫ５３０、Ｋ５４７、およびＫ５６９に対応する１以上の表面露出リジン残基が改変される。ある特定の実施形態では、野生型ＡＡＶ２キャプシド配列のＫ５３０、Ｋ５４７、およびＫ５６９に対応する１以上の表面露出リジン残基がグルタミン酸（Ｅ）に改変される。
【００１３】
一実施形態では、ＡＡＶキャプシドの表面露出リジン、セリン、トレオニンおよび／またはチロシン残基の組み合わせが改変され、ここで改変は、野生型ＡＡＶキャプシド配列の［例えば、配列番号１−１０の１以上；かつ、特定の実施形態では、野生型ＡＡＶ２配列のキャプシドタンパク質（配列番号２）の］
（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ）
（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ＋Ｔ５５０Ｖ）
（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ＋Ｔ６５９Ｖ）
（Ｔ４９１Ｖ＋Ｔ５５０Ｖ＋Ｔ６５９Ｖ）
（Ｙ４４０Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ）
（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ＋Ｓ６６２Ｖ）、および／または
（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ＋Ｔ５５０Ｖ＋Ｔ６５９Ｖ）
に対応する位置で起こる。
【００１４】
関連する実施形態では、本発明は本明細書に開示されるベクターおよび組成物を使用するための方法を提供し、かつ開示されたウイルスベクター構築物を用いる、対象の１以上の細胞、１以上の組織、および／または１以上の臓器、特に、哺乳動物のものの形質導入のためのプロセスをさらに提供する。全体的かつ一般的な意味で、そのような方法は一般に、ウイルスベクターで少なくとも第一の細胞または第一の細胞集団を形質転換するのに十分な量および時間で、有効量の、本発明のｒＡＡＶベクターおよび／もしくは感染性ＡＡＶウイルス粒子、または組換えＡＡＶビリオンを含む、本質的にそれらからなる、またあるいはそれらからなる少なくとも第一の組成物を、対象の適切な宿主細胞内に導入する段階を少なくとも含む。特定の実施形態では、本発明のベクター、ビリオン、または感染性ウイルス粒子は、好ましくは、対象の選択された宿主細胞に１以上の核酸セグメントを導入するためのベクターとして有用である。好ましくは、宿主細胞は哺乳動物の宿主細胞であり、ヒト宿主細胞が本明細書に記載される組換えベクターおよびビリオンのための標的として特に好ましい。ある実施形態では、そのようなベクターは、例えば、本明細書に記載され提供されるベクター、ウイルス、または感染性ビリオンの１以上によって形質転換された哺乳動物の宿主細胞において発現できる、対象の１以上の遺伝子を含む１以上のポリヌクレオチドを含む、選択された治療剤および／または診断剤をコードする１以上の単離されたＤＮＡセグメントさらに含む。
【００１５】
一態様では、本発明は、哺乳動物の細胞および組織に１以上の有益または治療的産物をコードする遺伝物質を送達する方法において有用な、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ビリオン、ウイルス粒子、およびそれらの医薬製剤を含む組成物をさらに提供する。特に、本発明の組成物および方法は、１以上の哺乳動物の疾患の症状の治療、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、および／または寛解（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）におけるそれらの使用を通して、当技術分野において著しい進歩を提供する。多くの様々な疾病、障害、および機能障害の治療における使用のための新規かつ改善されたウイルスベクター構築物を提供することにより、本教示からヒト遺伝子治療が特に利益を得ることが期待されている。
【００１６】
別の態様では、本発明は、ベクター構築物が送達された哺乳動物における１以上の障害の予防、治療、および／または寛解のための１以上の哺乳動物の治療剤をコードする、改変されたｒＡＡＶベクターに関する。特に、本発明は、哺乳動物の疾患、機能障害、傷害および／または障害の１つ以上の症状の治療、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）および／または寛解における使用のための、１以上の哺乳動物の治療剤（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、酵素、抗体、抗原結合断片、ならびにバリアント、および／またはそれらの活性断片を含むが、これらに限定されない）をコードするｒＡＡＶベースの発現構築物を提供する。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、細胞における１以上の内因性生物学的過程の活性を変化させる、阻害する、低減させる、妨げる、除去する、または障害する１以上の治療剤をコードする、少なくとも第一の核酸セグメントを含む、遺伝的に改変されたｒＡＡＶベクターに関する。特定の実施形態では、そのような治療剤は、１以上の代謝過程、機能障害、障害あるいは疾患の効果を選択的に阻害するまたは低減させるものであってもよい。ある実施形態では、欠陥は、治療が望まれる哺乳動物への傷害または外傷（ｔｒａｕｍａ）によって引き起こされ得る。他の実施形態では、欠陥は、内因性生体化合物の過剰発現によって引き起こされ得る、一方、他の実施形態ではさらに；欠陥は、１以上の内因性生体化合物の過小発現または欠如によって引き起こされ得る。
【００１８】
ベクターでトランスフェクトされた特定の細胞への、外因性タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入のために、そのようなベクターの使用が意図される場合、例えば、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、抗体、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴもしくはポリヌクレオチドを含む、コードされた治療剤を産生するために、ベクターを含む細胞においてポリヌクレオチドを発現する、少なくとも第一の異種プロモーターの下流に作動可能に配置され、かつその制御下にある、少なくとも第一の外因性ポリヌクレオチドを、ベクターに組み込むことにより、本明細書に開示される改変されたＡＡＶベクターを採用し得る。そのような構築物は、対象の治療剤を発現するために１以上の異種プロモーターを採用し得る。そのようなプロモーターは、構成的、誘導性、または細胞もしくは組織特異的であってもよい。例示的なプロモーターには、ＣＭＶプロモーター、β−アクチンプロモーター、ハイブリッドＣＭＶプロモーター、ハイブリッドβ−アクチンプロモーター、ＥＦ１プロモーター、Ｕ１ａプロモーター、Ｕ１ｂプロモーター、Ｔｅｔ−誘導性プロモーター、ＶＰ１６−ＬｅｘＡプロモーター、ジョイント特異的（ｊｏｉｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）プロモーターおよびヒト特異的プロモーターを含むが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明の遺伝的に改変されたｒＡＡＶベクターまたは発現系はまた、ｒＡＡＶベクターにクローニングされた異種遺伝子の転写を変化させるまたは達成する（ｅｆｆｅｃｔ）ために、１以上のエンハンサー、調節エレメント、転写エレメントを含む、本質的にそれらからなる、またはそれらからなる第二の核酸セグメントをさらに含み得る。例えば、本発明のｒＡＡＶベクターは、少なくとも第一のＣＭＶエンハンサー、合成エンハンサー、または細胞もしくは組織特異的エンハンサーを含む、本質的にそれらからなる、またはそれらからなる第二の核酸セグメントをさらに含み得る。第二の核酸セグメントはまた、１以上のイントロン配列、転写後調節エレメントなどをさらに含み得る、本質的にそれらからなり得る、またはそれらからなり得る。本発明のベクターおよび発現系はまた、便利な制限部位でのｒＡＡＶベクターへの１以上の選択された遺伝要素、ポリヌクレオチドなどの挿入を容易にするために、１以上のポリリンカーまたはマルチプル制限部位／クローニング領域を含む、本質的にそれらからなる、またはそれらからなる第三の核酸セグメントを任意にさらに含み得る。
【００２０】
本発明の態様では、本明細書に開示される１以上の改善されたｒＡＡＶベクター内に含まれる外因性ポリヌクレオチドは、好ましくは、哺乳動物起源のものであり、ヒト、霊長類、マウス、ブタ、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ、エピン（ｅｐｉｎｅ）、ヤギまたはオオカミ起源のポリペプチドおよびペプチドをコードするポリヌクレオチドが特に好ましい。
【００２１】
上述の通り、外因性ポリヌクレオチドは、好ましくは、１以上のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、酵素、抗体、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、もしくはアンチセンスポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ分子、またはこれらの治療剤の２以上の組み合わせである。実際に、外因性ポリヌクレオチドは、所望され得るように、そのような分子の２以上、またはそのような分子の複数をコードし得る。組み合わせ遺伝子治療が望まれる場合、２以上の異なる分子が単一のｒＡＡＶ発現系から産生されてもよく、またあるいは、選択された宿主細胞が、２以上の固有のｒＡＡＶ発現系であって、その各々が治療剤をコードする１以上の別個のポリヌクレオチドを含み得るものでトランスフェクトされてもよい。
【００２２】
他の実施形態では、本発明はまた、治療的および／または予防的遺伝子治療計画のための、ヒトなどの哺乳動物への投与のために製剤化された、それ自身もまた１以上の希釈剤、バッファー、生理学的溶液または医薬的賦形剤内に含まれ得る、感染性アデノ随伴ウイルス粒子もしくはビリオン、または複数のそのような粒子内に含まれる、遺伝的に改変されたｒＡＡＶベクターを提供する。そのようなベクター、ウイルス粒子、ビリオン、およびそれらの複数はまた、選択された家畜（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ）、珍しい（ｅｘｏｔｉｃ）動物もしくは家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ  ａｎｉｍａｌ）、コンパニオンアニマル（ペットなどを含む）、ならびに非ヒト霊長類、動物標本かそうでなければ捕獲標本（ｃａｐｔｉｖｅ  ｓｐｅｃｉｍｅｎ）などへの、獣医学的投与に許容可能な、賦形剤製剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）において提供され得る、ここで、そのようなベクターの使用および関連する遺伝子治療は、そのような動物への投与上の有益な効果を生むために示される。
【００２３】
本発明はまた、開示されるｒＡＡＶベクター、ウイルス粒子、またはビリオンの少なくとも１つを含む宿主細胞に関する。そのような宿主細胞は、特に哺乳動物の宿主細胞であり、ヒト宿主細胞が特に非常に好ましく、かつ単離されていても、細胞または組織培養中でもいずれであってもよい。遺伝的に改変された動物モデルの場合、形質転換された宿主細胞は、非ヒト動物自体の体内に含まれていてもよい。
【００２４】
ある実施形態では、１以上の開示されたｒＡＡＶベクターを含む、組換え非ヒト宿主細胞、および／または単離された組換えヒト宿主細胞の作成もまた、例えば、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターの大規模量の産生のための手段を含む、様々な診断用かつ研究用プロトコールのために有用であると考えられる。そのようなウイルス産生方法は、特に、遺伝子治療ツールとして有用であるために非常に高い力価のウイルスストックを要求するものを含む、既存の方法の改善であると考えられる。本発明者らは、本方法の１つの非常に重要な利点は、適切なレベルでトランスフェクション率をまだ保持する、哺乳動物の形質導入プロトコールにおけるより低い力価のウイルス粒子を利用する能力であると考える。
【００２５】
１以上の開示されたｒＡＡＶベクター、発現系、感染性ｒＡＡＶ粒子、または宿主細胞を含む組成物はまた、本発明の一部分、特に、治療における使用のため、かつ１以上の哺乳動物の疾患、障害、機能障害、または外傷の治療のための医薬の製造における使用のための、少なくとも第一の医薬的に許容可能な賦形剤をさらに含む、それらの組成物を形成する。そのような医薬組成物は、１以上の希釈剤、バッファー、リポソーム、脂質、脂質複合体を任意にさらに含み得る；また、チロシン改変ｒＡＡＶベクターはミクロスフェアまたはナノ粒子内に含まれ得る。ヒトもしくは他の動物の臓器または組織または複数の細胞もしくは組織内への、筋肉内、静脈内、または直接注入に適した医薬製剤が特に好ましい、しかしながら、本明細書に開示される組成物はまた、例えば、体内の１以上の臓器、組織、または細胞の種類内への直接注入に適している製剤を含む、哺乳動物体内の目立たない領域への投与における有用性を見出しうる。そのような注入部位には、脳、関節もしくは関節包、滑膜もしくはサブサイノビアム（ｓｕｂｓｙｎｏｖｉｕｍ）組織、腱、靭帯、軟骨、骨、関節周囲筋もしくは哺乳動物の関節の関節窩、ならびに、例えば、腹腔内（ｉｎｔｒａａｂｄｏｍｉｎａｌ）、胸腔内（ｉｎｔｒａｔｈｏｒａｓｃｉｃ）、血管内、もしくは脳室内送達を介するウイルスベクターの導入を含む、患者体内の心臓、肝臓、肺、膵臓、腸、脳、膀胱、腎臓、もしくは他の部位などの臓器への直接投与を含むが、これらに限定されない。
【００２６】
本発明の他の態様は、例えば、筋肉内、静脈内、関節内、または選択された哺乳動物の１以上の細胞、組織もしくは臓器への直接注入によるなどの、適切な手段による哺乳動物への投与が意図されるベクターの医薬製剤などの、本明細書に開示される１以上のｒＡＡＶベクターを含む、本質的にそれらからなる、またはそれらからなるアデノ随伴ウイルスビリオン粒子、組成物、および宿主細胞に関する。典型的には、そのような組成物は、以下に記載される医薬的に許容可能な賦形剤と共に製剤され得る、かつ治療が望まれる選択された臓器、組織、および細胞への投与を促進するために、１以上のリポソーム、脂質、脂質複合体、ミクロスフェアまたはナノ粒子製剤を含み得る。
【００２７】
開示されたｒＡＡＶベクター、ビリオン、ウイルス粒子、形質転換された宿主細胞またはそのようなものを含む医薬組成物の１以上；および治療的、診断的、または臨床的実施形態においてキットを用いるための指示書を含むキットもまた、本開示の好ましい態様を示す。そのようなキットは、１以上の試薬、制限酵素、ペプチド、治療薬、医薬化合物、または宿主細胞への、もしくは動物への組成物の送達のための手段（例えば、注射器、注射剤（ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ）、等）をさらに含み得る。そのようなキットは、疾患、欠損症、機能障害および／または傷害の症状を治療する、予防する、または寛解させるための治療キットであってもよく、かつ改変されたｒＡＡＶベクター構築物、発現系、ビリオン粒子、または複数のかかる粒子、および治療的および／または診断的医療計画においてキットを用いるための指示書を含んでもよい。そのようなキットはまた、市販のための、あるいは、例えばウイルス学者、医療専門家、等を含む他者による使用のための、大量のウイルスベクター自体（それにコードされる治療剤の有無にかかわらず）の産生のために、大規模産生方法において用いてもよい。
【００２８】
本発明の別の重要な態様は、脊椎動物などの、動物における様々な疾患、機能障害、または欠損症を予防する、治療するまたは寛解させるための医薬の製造における、本明細書に記載される、開示されたｒＡＡＶベクター、ビリオン、発現系、組成物、および宿主細胞の使用の方法に関する。そのような方法は、一般に、それを必要とする哺乳動物、またはヒトへ、１以上の開示されたベクター、ビリオン、ウイルス粒子、宿主細胞、組成物、またはそれらの複数を、罹患した動物におけるそのような疾患、機能障害、または欠損症の症状を予防、治療または和らげるのに十分な量および時間で、投与することを含む。方法はまた、そのような状態を有する疑いがある動物の予防的治療、または診断後、あるいは症状の発症の前のいずれかに、そのような状態を発症する危険があるそれらの動物へそのような組成物を投与することを包含する。
【００２９】
上述の通り、外因性ポリヌクレオチドは、好ましくは、１以上のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、リボザイム、もしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはこれらの組み合わせをコードする。実際に、外因性ポリヌクレオチドは、所望され得るように、そのような分子の２以上、またはそのような分子の複数をコードし得る。組み合わせ遺伝子治療が望まれる場合、２以上の異なる分子が単一のｒＡＡＶ発現系から産生されてもよく、またあるいは、選択された宿主細胞が、２以上の固有のｒＡＡＶ発現系であって、その各々が少なくとも２つのそのような分子をコードする固有の異種ポリヌクレオチドを提供するものでトランスフェクトされてもよい。
【００３０】
他の実施形態では、本発明はまた、１以上の医薬媒体内に含まれる、感染性アデノ随伴ウイルス粒子内に含まれる、かつ治療的、および／または予防的遺伝子治療計画のために、ヒトなどの哺乳動物への投与のために製剤化され得る、開示されたｒＡＡＶベクターに関する。そのようなベクターはまた、選択された家畜（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ）、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ  ａｎｉｍａｌ）、ペット、等への獣医学的投与に許容可能である医薬製剤に提供され得る。
【００３１】
本発明はまた、開示されたｒＡＡＶベクターおよび発現系を含む宿主細胞、特に哺乳動物の宿主細胞に関し、ヒト宿主細胞が特に好ましい。
【００３２】
１以上の開示されたｒＡＡＶベクター、発現系、感染性ＡＡＶ粒子、宿主細胞を含む組成物はまた、本発明の一部分、特に、医薬の製造およびそのようなｒＡＡＶベクターの治療的投与を含む方法における使用のための、少なくとも第一の医薬的に許容可能な賦形剤をさらに含む組成物を形成する。そのような医薬組成物は、任意に、リポソーム、脂質、脂質複合体をさらに含んでもよい；あるいは、ｒＡＡＶベクターはミクロスフェアまたはナノ粒子内に含まれてもよい。ヒトの臓器もしくは組織への筋肉内、静脈内、または直接注入に適している医薬製剤が特に好まれる。
【００３３】
本発明の他の態様は、例えば、適切な手段を介する、例えば、選択された哺乳動物の細胞、組織または臓器への筋肉内、静脈内、もしくは直接投与による、哺乳動物への投与を対象としたベクターの医薬製剤などの、本明細書に開示される１以上のＡＡＶベクターを含む、組換えアデノ随伴ウイルスビリオン粒子、組成物、および宿主細胞に関する。典型的には、そのような組成物は、以下に記載される医薬的に許容可能な賦形剤と共に製剤され得る、かつ治療が望まれる、選択された臓器、組織、および細胞への投与を促進するために、１以上のリポソーム、脂質、脂質複合体、ミクロスフェアまたはナノ粒子製剤を含み得る。
【００３４】
１以上の開示されたベクター、ビリオン、宿主細胞、ウイルス粒子または組成物；および（ｉｉ）治療的、診断的、または臨床的実施形態においてキットを用いるための指示書を含むキットもまた、本開示の好ましい態様を示す。そのようなキットは、１以上の試薬、制限酵素、ペプチド、治療薬、医薬化合物、または宿主細胞への、もしくは動物への組成物の送達のための手段、例えば、注射器、注射剤（ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ）、等、をさらに含み得る。そのようなキットは、特定の疾患の症状を治療するまたは寛解させるための治療キットであってもよく、かつ本明細書に記載される改変されたｒＡＡＶベクター構築物、発現系、ビリオン粒子、または治療用組成物の１以上、ならびにキットを使用するための指示書を含む。
【００３５】
本発明の別の重要な態様は、哺乳動物における様々なポリペプチド欠損症の症状を治療するまたは寛解させるための医薬の製造における、本明細書に記載される、開示されたベクター、ビリオン、発現系、組成物、および宿主細胞の使用の方法に関する。そのような方法は、一般に、それを必要とする哺乳動物、またはヒトへ、１以上の開示されたベクター、ビリオン、宿主細胞、または組成物を、罹患した哺乳動物におけるそのような欠損症の症状を治療するまたは寛解させるのに十分な量および時間で、投与することを含む。方法はまた、そのような状態を有する疑いがある動物の予防的治療、または診断後、あるいは症状の発症の前のいずれかに、そのような状態を発症する危険があるそれらの動物へそのような組成物を投与することを包含する。
【００３６】
配列の簡単な説明
配列番号１は、野生型アデノ随伴ウイルス血清型１（ＡＡＶ１）のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列である；
配列番号２は、野生型アデノ随伴ウイルス血清型２（ＡＡＶ２）のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列である；
配列番号３は、野生型アデノ随伴ウイルス血清型３（ＡＡＶ３）のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列である；
配列番号４は、野生型アデノ随伴ウイルス血清型４（ＡＡＶ４）のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列である；
配列番号５は、野生型アデノ随伴ウイルス血清型５（ＡＡＶ５）のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列である；
配列番号６は、野生型アデノ随伴ウイルス血清型６（ＡＡＶ６）のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列である；
配列番号７は、野生型アデノ随伴ウイルス血清型７（ＡＡＶ７）のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列である；
配列番号８は、野生型アデノ随伴ウイルス血清型８（ＡＡＶ８）のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列である；
配列番号９は、野生型アデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列である；
配列番号１０は、野生型アデノ随伴ウイルス血清型１０（ＡＡＶ１０）のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列である；
配列番号１１は、本発明による有用なオリゴヌクレオチドプライマー配列である；かつ
配列番号１２は、本発明による有用なオリゴヌクレオチドプライマー配列である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、哺乳動物の宿主細胞内のＡＡＶ２輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）に関する例示的な図式モデルを示す；
【図２Ａ−１】図２Ａ−１、図２Ａ−２、図２Ａ−３、図２Ｂ−１、図２Ｂ−２、図２Ｂ−３、図２Ｃ−１、図２Ｃ−２、図２３−３、図２Ｄ−１  図２Ｄ−２、および図２Ｄ−３は野生型ＡＡＶ１−１０キャプシドのアミノ酸アラインメントを示す。図２Ａ−１および図２Ａ−２は野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシド（配列番号１から配列番号１０）のアミノ酸配列アラインメントを示す。図２Ｂ−１、図２Ｂ−２、および図２Ｂ−３は、野生型ＡＡＶ１−１２キャプシドにおける保存された表面露出（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｘｐｏｓｅｄ）リジン残基、ならびにアミノ酸改変の形態を示す。ＡＡＶ１−１２間で保存されているリジン残基は太字で示される。図２Ｃ−１から図２Ｃ−３は、野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシドのアミノ酸アラインメント、ならびにＡＡＶ１−１０キャプシド間で保存されている表面露出チロシン残基を示す（保存された表面露出残基は太字で示される）。図２Ｄ−１から図２Ｄ−３は、野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシドのアミノ酸アラインメント、ならびにＡＡＶ１−１０キャプシド間で保存されている表面露出セリンおよびトレオニン残基を示す（保存された表面露出残基は太字で示される）；
【図２Ａ−２】図２Ａ−１、図２Ａ−２、図２Ａ−３、図２Ｂ−１、図２Ｂ−２、図２Ｂ−３、図２Ｃ−１、図２Ｃ−２、図２３−３、図２Ｄ−１  図２Ｄ−２、および図２Ｄ−３は野生型ＡＡＶ１−１０キャプシドのアミノ酸アラインメントを示す。図２Ａ−１および図２Ａ−２は野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシド（配列番号１から配列番号１０）のアミノ酸配列アラインメントを示す。図２Ｂ−１、図２Ｂ−２、および図２Ｂ−３は、野生型ＡＡＶ１−１２キャプシドにおける保存された表面露出（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｘｐｏｓｅｄ）リジン残基、ならびにアミノ酸改変の形態を示す。ＡＡＶ１−１２間で保存されているリジン残基は太字で示される。図２Ｃ−１から図２Ｃ−３は、野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシドのアミノ酸アラインメント、ならびにＡＡＶ１−１０キャプシド間で保存されている表面露出チロシン残基を示す（保存された表面露出残基は太字で示される）。図２Ｄ−１から図２Ｄ−３は、野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシドのアミノ酸アラインメント、ならびにＡＡＶ１−１０キャプシド間で保存されている表面露出セリンおよびトレオニン残基を示す（保存された表面露出残基は太字で示される）；
【図２Ａ−３】図２Ａ−１、図２Ａ−２、図２Ａ−３、図２Ｂ−１、図２Ｂ−２、図２Ｂ−３、図２Ｃ−１、図２Ｃ−２、図２３−３、図２Ｄ−１  図２Ｄ−２、および図２Ｄ−３は野生型ＡＡＶ１−１０キャプシドのアミノ酸アラインメントを示す。図２Ａ−１および図２Ａ−２は野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシド（配列番号１から配列番号１０）のアミノ酸配列アラインメントを示す。図２Ｂ−１、図２Ｂ−２、および図２Ｂ−３は、野生型ＡＡＶ１−１２キャプシドにおける保存された表面露出（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｘｐｏｓｅｄ）リジン残基、ならびにアミノ酸改変の形態を示す。ＡＡＶ１−１２間で保存されているリジン残基は太字で示される。図２Ｃ−１から図２Ｃ−３は、野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシドのアミノ酸アラインメント、ならびにＡＡＶ１−１０キャプシド間で保存されている表面露出チロシン残基を示す（保存された表面露出残基は太字で示される）。図２Ｄ−１から図２Ｄ−３は、野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシドのアミノ酸アラインメント、ならびにＡＡＶ１−１０キャプシド間で保存されている表面露出セリンおよびトレオニン残基を示す（保存された表面露出残基は太字で示される）；
【図２Ｂ−１】図２Ａ−１、図２Ａ−２、図２Ａ−３、図２Ｂ−１、図２Ｂ−２、図２Ｂ−３、図２Ｃ−１、図２Ｃ−２、図２３−３、図２Ｄ−１  図２Ｄ−２、および図２Ｄ−３は野生型ＡＡＶ１−１０キャプシドのアミノ酸アラインメントを示す。図２Ａ−１および図２Ａ−２は野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシド（配列番号１から配列番号１０）のアミノ酸配列アラインメントを示す。図２Ｂ−１、図２Ｂ−２、および図２Ｂ−３は、野生型ＡＡＶ１−１２キャプシドにおける保存された表面露出（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｘｐｏｓｅｄ）リジン残基、ならびにアミノ酸改変の形態を示す。ＡＡＶ１−１２間で保存されているリジン残基は太字で示される。図２Ｃ−１から図２Ｃ−３は、野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシドのアミノ酸アラインメント、ならびにＡＡＶ１−１０キャプシド間で保存されている表面露出チロシン残基を示す（保存された表面露出残基は太字で示される）。図２Ｄ−１から図２Ｄ−３は、野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシドのアミノ酸アラインメント、ならびにＡＡＶ１−１０キャプシド間で保存されている表面露出セリンおよびトレオニン残基を示す（保存された表面露出残基は太字で示される）；
【図２Ｂ−２】図２Ａ−１、図２Ａ−２、図２Ａ−３、図２Ｂ−１、図２Ｂ−２、図２Ｂ−３、図２Ｃ−１、図２Ｃ−２、図２３−３、図２Ｄ−１  図２Ｄ−２、および図２Ｄ−３は野生型ＡＡＶ１−１０キャプシドのアミノ酸アラインメントを示す。図２Ａ−１および図２Ａ−２は野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシド（配列番号１から配列番号１０）のアミノ酸配列アラインメントを示す。図２Ｂ−１、図２Ｂ−２、および図２Ｂ−３は、野生型ＡＡＶ１−１２キャプシドにおける保存された表面露出（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｘｐｏｓｅｄ）リジン残基、ならびにアミノ酸改変の形態を示す。ＡＡＶ１−１２間で保存されているリジン残基は太字で示される。図２Ｃ−１から図２Ｃ−３は、野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシドのアミノ酸アラインメント、ならびにＡＡＶ１−１０キャプシド間で保存されている表面露出チロシン残基を示す（保存された表面露出残基は太字で示される）。図２Ｄ−１から図２Ｄ−３は、野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシドのアミノ酸アラインメント、ならびにＡＡＶ１−１０キャプシド間で保存されている表面露出セリンおよびトレオニン残基を示す（保存された表面露出残基は太字で示される）；
【図２Ｂ−３】図２Ａ−１、図２Ａ−２、図２Ａ−３、図２Ｂ−１、図２Ｂ−２、図２Ｂ−３、図２Ｃ−１、図２Ｃ−２、図２３−３、図２Ｄ−１  図２Ｄ−２、および図２Ｄ−３は野生型ＡＡＶ１−１０キャプシドのアミノ酸アラインメントを示す。図２Ａ−１および図２Ａ−２は野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシド（配列番号１から配列番号１０）のアミノ酸配列アラインメントを示す。図２Ｂ−１、図２Ｂ−２、および図２Ｂ−３は、野生型ＡＡＶ１−１２キャプシドにおける保存された表面露出（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｘｐｏｓｅｄ）リジン残基、ならびにアミノ酸改変の形態を示す。ＡＡＶ１−１２間で保存されているリジン残基は太字で示される。図２Ｃ−１から図２Ｃ−３は、野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシドのアミノ酸アラインメント、ならびにＡＡＶ１−１０キャプシド間で保存されている表面露出チロシン残基を示す（保存された表面露出残基は太字で示される）。図２Ｄ−１から図２Ｄ−３は、野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシドのアミノ酸アラインメント、ならびにＡＡＶ１−１０キャプシド間で保存されている表面露出セリンおよびトレオニン残基を示す（保存された表面露出残基は太字で示される）；
【図２Ｃ−１】図２Ａ−１、図２Ａ−２、図２Ａ−３、図２Ｂ−１、図２Ｂ−２、図２Ｂ−３、図２Ｃ−１、図２Ｃ−２、図２３−３、図２Ｄ−１  図２Ｄ−２、および図２Ｄ−３は野生型ＡＡＶ１−１０キャプシドのアミノ酸アラインメントを示す。図２Ａ−１および図２Ａ−２は野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシド（配列番号１から配列番号１０）のアミノ酸配列アラインメントを示す。図２Ｂ−１、図２Ｂ−２、および図２Ｂ−３は、野生型ＡＡＶ１−１２キャプシドにおける保存された表面露出（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｘｐｏｓｅｄ）リジン残基、ならびにアミノ酸改変の形態を示す。ＡＡＶ１−１２間で保存されているリジン残基は太字で示される。図２Ｃ−１から図２Ｃ−３は、野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシドのアミノ酸アラインメント、ならびにＡＡＶ１−１０キャプシド間で保存されている表面露出チロシン残基を示す（保存された表面露出残基は太字で示される）。図２Ｄ−１から図２Ｄ−３は、野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシドのアミノ酸アラインメント、ならびにＡＡＶ１−１０キャプシド間で保存されている表面露出セリンおよびトレオニン残基を示す（保存された表面露出残基は太字で示される）；
【図２Ｃ−２】図２Ａ−１、図２Ａ−２、図２Ａ−３、図２Ｂ−１、図２Ｂ−２、図２Ｂ−３、図２Ｃ−１、図２Ｃ−２、図２３−３、図２Ｄ−１  図２Ｄ−２、および図２Ｄ−３は野生型ＡＡＶ１−１０キャプシドのアミノ酸アラインメントを示す。図２Ａ−１および図２Ａ−２は野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシド（配列番号１から配列番号１０）のアミノ酸配列アラインメントを示す。図２Ｂ−１、図２Ｂ−２、および図２Ｂ−３は、野生型ＡＡＶ１−１２キャプシドにおける保存された表面露出（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｘｐｏｓｅｄ）リジン残基、ならびにアミノ酸改変の形態を示す。ＡＡＶ１−１２間で保存されているリジン残基は太字で示される。図２Ｃ−１から図２Ｃ−３は、野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシドのアミノ酸アラインメント、ならびにＡＡＶ１−１０キャプシド間で保存されている表面露出チロシン残基を示す（保存された表面露出残基は太字で示される）。図２Ｄ−１から図２Ｄ−３は、野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシドのアミノ酸アラインメント、ならびにＡＡＶ１−１０キャプシド間で保存されている表面露出セリンおよびトレオニン残基を示す（保存された表面露出残基は太字で示される）；
【図２Ｃ−３】図２Ａ−１、図２Ａ−２、図２Ａ−３、図２Ｂ−１、図２Ｂ−２、図２Ｂ−３、図２Ｃ−１、図２Ｃ−２、図２３−３、図２Ｄ−１  図２Ｄ−２、および図２Ｄ−３は野生型ＡＡＶ１−１０キャプシドのアミノ酸アラインメントを示す。図２Ａ−１および図２Ａ−２は野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシド（配列番号１から配列番号１０）のアミノ酸配列アラインメントを示す。図２Ｂ−１、図２Ｂ−２、および図２Ｂ−３は、野生型ＡＡＶ１−１２キャプシドにおける保存された表面露出（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｘｐｏｓｅｄ）リジン残基、ならびにアミノ酸改変の形態を示す。ＡＡＶ１−１２間で保存されているリジン残基は太字で示される。図２Ｃ−１から図２Ｃ−３は、野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシドのアミノ酸アラインメント、ならびにＡＡＶ１−１０キャプシド間で保存されている表面露出チロシン残基を示す（保存された表面露出残基は太字で示される）。図２Ｄ−１から図２Ｄ−３は、野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシドのアミノ酸アラインメント、ならびにＡＡＶ１−１０キャプシド間で保存されている表面露出セリンおよびトレオニン残基を示す（保存された表面露出残基は太字で示される）；
【図２Ｄ−１】図２Ａ−１、図２Ａ−２、図２Ａ−３、図２Ｂ−１、図２Ｂ−２、図２Ｂ−３、図２Ｃ−１、図２Ｃ−２、図２３−３、図２Ｄ−１  図２Ｄ−２、および図２Ｄ−３は野生型ＡＡＶ１−１０キャプシドのアミノ酸アラインメントを示す。図２Ａ−１および図２Ａ−２は野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシド（配列番号１から配列番号１０）のアミノ酸配列アラインメントを示す。図２Ｂ−１、図２Ｂ−２、および図２Ｂ−３は、野生型ＡＡＶ１−１２キャプシドにおける保存された表面露出（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｘｐｏｓｅｄ）リジン残基、ならびにアミノ酸改変の形態を示す。ＡＡＶ１−１２間で保存されているリジン残基は太字で示される。図２Ｃ−１から図２Ｃ−３は、野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシドのアミノ酸アラインメント、ならびにＡＡＶ１−１０キャプシド間で保存されている表面露出チロシン残基を示す（保存された表面露出残基は太字で示される）。図２Ｄ−１から図２Ｄ−３は、野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシドのアミノ酸アラインメント、ならびにＡＡＶ１−１０キャプシド間で保存されている表面露出セリンおよびトレオニン残基を示す（保存された表面露出残基は太字で示される）；
【図２Ｄ−２】図２Ａ−１、図２Ａ−２、図２Ａ−３、図２Ｂ−１、図２Ｂ−２、図２Ｂ−３、図２Ｃ−１、図２Ｃ−２、図２３−３、図２Ｄ−１  図２Ｄ−２、および図２Ｄ−３は野生型ＡＡＶ１−１０キャプシドのアミノ酸アラインメントを示す。図２Ａ−１および図２Ａ−２は野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシド（配列番号１から配列番号１０）のアミノ酸配列アラインメントを示す。図２Ｂ−１、図２Ｂ−２、および図２Ｂ−３は、野生型ＡＡＶ１−１２キャプシドにおける保存された表面露出（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｘｐｏｓｅｄ）リジン残基、ならびにアミノ酸改変の形態を示す。ＡＡＶ１−１２間で保存されているリジン残基は太字で示される。図２Ｃ−１から図２Ｃ−３は、野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシドのアミノ酸アラインメント、ならびにＡＡＶ１−１０キャプシド間で保存されている表面露出チロシン残基を示す（保存された表面露出残基は太字で示される）。図２Ｄ−１から図２Ｄ−３は、野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシドのアミノ酸アラインメント、ならびにＡＡＶ１−１０キャプシド間で保存されている表面露出セリンおよびトレオニン残基を示す（保存された表面露出残基は太字で示される）；
【図２Ｄ−３】図２Ａ−１、図２Ａ−２、図２Ａ−３、図２Ｂ−１、図２Ｂ−２、図２Ｂ−３、図２Ｃ−１、図２Ｃ−２、図２３−３、図２Ｄ−１  図２Ｄ−２、および図２Ｄ−３は野生型ＡＡＶ１−１０キャプシドのアミノ酸アラインメントを示す。図２Ａ−１および図２Ａ−２は野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシド（配列番号１から配列番号１０）のアミノ酸配列アラインメントを示す。図２Ｂ−１、図２Ｂ−２、および図２Ｂ−３は、野生型ＡＡＶ１−１２キャプシドにおける保存された表面露出（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｘｐｏｓｅｄ）リジン残基、ならびにアミノ酸改変の形態を示す。ＡＡＶ１−１２間で保存されているリジン残基は太字で示される。図２Ｃ−１から図２Ｃ−３は、野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシドのアミノ酸アラインメント、ならびにＡＡＶ１−１０キャプシド間で保存されている表面露出チロシン残基を示す（保存された表面露出残基は太字で示される）。図２Ｄ−１から図２Ｄ−３は、野生型ＡＡＶ１−１０血清型キャプシドのアミノ酸アラインメント、ならびにＡＡＶ１−１０キャプシド間で保存されている表面露出セリンおよびトレオニン残基を示す（保存された表面露出残基は太字で示される）；
【図３Ａ】図３Ａおよび図３Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞における様々なキナーゼ阻害剤のｓｓＡＡＶおよびｓｃＡＡＶ媒介性ＥＧＦＰ発現に対する効果を示す。感染前１時間、阻害剤で細胞を前処置し、次いで１×１０３ｖｇｓ／細胞で形質導入した。図３Ａ：感染後４８時間で蛍光顕微鏡により導入遺伝子発現を検出した。図３Ｂ：本明細書に記載されるように３視野からの画像を解析した。＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．００１  対ＷＴ  ＡＡＶ２；
【図３Ｂ】図３Ａおよび図３Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞における様々なキナーゼ阻害剤のｓｓＡＡＶおよびｓｃＡＡＶ媒介性ＥＧＦＰ発現に対する効果を示す。感染前１時間、阻害剤で細胞を前処置し、次いで１×１０３ｖｇｓ／細胞で形質導入した。図３Ａ：感染後４８時間で蛍光顕微鏡により導入遺伝子発現を検出した。図３Ｂ：本明細書に記載されるように３視野からの画像を解析した。＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．００１  対ＷＴ  ＡＡＶ２；
【図４Ａ】図４Ａおよび図４Ｂは、個々の部位特異的ＡＡＶ２キャプシド変異を有する２９３細胞の形質導入後のＥＧＦＰ発現の解析を示す。ＡＡＶ２キャプシドにおける１５個の表面露出セリン（Ｓ）の各々をバリン（Ｖ）で置換し、導入遺伝子発現を媒介するその効率を評価した。図４Ａ：１×１０３ｖｇｓ／細胞のＭＯＩでの感染後４８時間でのＥＧＦＰ発現解析。図４Ｂ：セリン変異ＡＡＶ２ベクターの各々の形質導入効率の定量。＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．００１  対ＷＴ  ＡＡＶ２；
【図４Ｂ】図４Ａおよび図４Ｂは、個々の部位特異的ＡＡＶ２キャプシド変異を有する２９３細胞の形質導入後のＥＧＦＰ発現の解析を示す。ＡＡＶ２キャプシドにおける１５個の表面露出セリン（Ｓ）の各々をバリン（Ｖ）で置換し、導入遺伝子発現を媒介するその効率を評価した。図４Ａ：１×１０３ｖｇｓ／細胞のＭＯＩでの感染後４８時間でのＥＧＦＰ発現解析。図４Ｂ：セリン変異ＡＡＶ２ベクターの各々の形質導入効率の定量。＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．００１  対ＷＴ  ＡＡＶ２；
【図５】図５は、野生型（ＷＴ）ＡＡＶ２ベクターと比べた様々なセリン−バリン変異ＡＡＶ２ベクターのパッケージングおよび形質導入効率を示す。簡単には、ベクターパッケージングおよび感染力アッセイが、変異−ＡＡＶベクターの各々について少なくとも２回実施された。パッケージング効率は定量的ＰＣＲ解析により決定された。形質導入効率は蛍光強度により概算された。＊試験されたＭＯＩでは蛍光は検出されなかった；
【図６Ａ】図６Ａおよび図６Ｂは、導入遺伝子発現を媒介する際の、異なるアミノ酸とのＡＡＶ２キャプシドにおける位置６６２でのセリン置換の効果の評価を示す。以下の８個のセリン変異体が異なるアミノ酸を用いて生成された：Ｓ６６２→バリン（Ｖ）、Ｓ６６２→アラニン（Ａ）、Ｓ６６２→アスパラギン（Ｎ）、Ｓ６６２→アスパラギン酸（Ｄ）、Ｓ６６２→ヒスチジン（Ｈ）、Ｓ６６２→イソロイシン（Ｉ）、Ｓ６６２→ロイシン（Ｌ）、およびＳ６６２→フェニルアラニン（Ｆ）、そして２９３細胞におけるそれらの形質導入効率が解析された。図６Ａ：１×１０３ｖｇｓ／細胞のＭＯＩでの２９３細胞の感染後４８時間でのＥＧＦＰ発現解析。図６Ｂ：セリン変異ＡＡＶ２ベクターの各々の形質導入効率の定量。＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．００１  対ＷＴ  ＡＡＶ２；
【図６Ｂ】図６Ａおよび図６Ｂは、導入遺伝子発現を媒介する際の、異なるアミノ酸とのＡＡＶ２キャプシドにおける位置６６２でのセリン置換の効果の評価を示す。以下の８個のセリン変異体が異なるアミノ酸を用いて生成された：Ｓ６６２→バリン（Ｖ）、Ｓ６６２→アラニン（Ａ）、Ｓ６６２→アスパラギン（Ｎ）、Ｓ６６２→アスパラギン酸（Ｄ）、Ｓ６６２→ヒスチジン（Ｈ）、Ｓ６６２→イソロイシン（Ｉ）、Ｓ６６２→ロイシン（Ｌ）、およびＳ６６２→フェニルアラニン（Ｆ）、そして２９３細胞におけるそれらの形質導入効率が解析された。図６Ａ：１×１０３ｖｇｓ／細胞のＭＯＩでの２９３細胞の感染後４８時間でのＥＧＦＰ発現解析。図６Ｂ：セリン変異ＡＡＶ２ベクターの各々の形質導入効率の定量。＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．００１  対ＷＴ  ＡＡＶ２；
【図７】図７は、野生型（ＷＴ）ＡＡＶ２ベクターと比べた様々なアミノ酸で交換された、本発明の一態様の例示的なセリン変異ベクターのパッケージングおよび形質導入効率を図示する。パッケージングおよび感染力アッセイは本明細書に記載されるように実行された。Ｖ＝バリン；Ａ＝アラニン；Ｄ＝アスパラギン酸；Ｆ＝フェニルアラニン  Ｈ＝ヒスチジン；Ｎ＝アスパラギン；Ｌ＝ロイシン；およびＩ＝イソロイシン；
【図８Ａ】図８Ａおよび図８Ｂは、様々な細胞種におけるｐ３８  ＭＡＰＫ活性とＡＡＶ２−Ｓ６６２Ｖベクターの形質導入効率の相関関係の解析を示す。図８Ａ：２９３、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｈ２．３５およびｍｏＤＣｓにおけるＷＴ−およびＳ６６２Ｖ−ＡＡＶ２ベクターの形質導入効率の定量。図８Ｂ：ｐ−ｐ３８  ＭＡＰＫ発現レベルに対する異なる細胞株由来の溶解物のウェスタンブロット解析。総ｐ３８  ＭＡＰＫおよびＧＡＰＤＨレベルが測定され、ローディング対照として用いられた。＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．００１  対ＷＴ  ＡＡＶ２；
【図８Ｂ】図８Ａおよび図８Ｂは、様々な細胞種におけるｐ３８  ＭＡＰＫ活性とＡＡＶ２−Ｓ６６２Ｖベクターの形質導入効率の相関関係の解析を示す。図８Ａ：２９３、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｈ２．３５およびｍｏＤＣｓにおけるＷＴ−およびＳ６６２Ｖ−ＡＡＶ２ベクターの形質導入効率の定量。図８Ｂ：ｐ−ｐ３８  ＭＡＰＫ発現レベルに対する異なる細胞株由来の溶解物のウェスタンブロット解析。総ｐ３８  ＭＡＰＫおよびＧＡＰＤＨレベルが測定され、ローディング対照として用いられた。＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．００１  対ＷＴ  ＡＡＶ２；
【図９Ａ】図９Ａ、図９Ｂ、および図９Ｃは、本発明の一態様による、単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣｓ）におけるＡＡＶベクター媒介性導入遺伝子発現を示す。図９Ａは、ＥＧＦＰ発現に対するＪＮＫおよびｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤の効果、ならびに位置６６２でのセリン残基の部位特異的置換を示す。図９Ｂは、感染および成熟の開始後４８時間での、図９Ａにおけるデータの定量を提供する。図９Ｃは、ＭＯＩ  ５×１０４ｖｇｓ／細胞での、本発明による１つの特定のベクター−ＡＡＶ２−Ｓ６６２−を感染させたｍｏＤＣｓにおける、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６などの共刺激マーカー（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍａｒｋｅｒｓ）の発現の代表的解析を示す。サイトカインで刺激され、本明細書に記載されるように生成されたｉＤＣｓ（未成熟樹状細胞）、およびｍＤＣｓ（成熟樹状細胞）が、それぞれ陰性および陽性対照として用いられた。代表例が示される。＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．００１  対ＷＴ  ＡＡＶ２；
【図９Ｂ】図９Ａ、図９Ｂ、および図９Ｃは、本発明の一態様による、単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣｓ）におけるＡＡＶベクター媒介性導入遺伝子発現を示す。図９Ａは、ＥＧＦＰ発現に対するＪＮＫおよびｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤の効果、ならびに位置６６２でのセリン残基の部位特異的置換を示す。図９Ｂは、感染および成熟の開始後４８時間での、図９Ａにおけるデータの定量を提供する。図９Ｃは、ＭＯＩ  ５×１０４ｖｇｓ／細胞での、本発明による１つの特定のベクター−ＡＡＶ２−Ｓ６６２−を感染させたｍｏＤＣｓにおける、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６などの共刺激マーカー（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍａｒｋｅｒｓ）の発現の代表的解析を示す。サイトカインで刺激され、本明細書に記載されるように生成されたｉＤＣｓ（未成熟樹状細胞）、およびｍＤＣｓ（成熟樹状細胞）が、それぞれ陰性および陽性対照として用いられた。代表例が示される。＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．００１  対ＷＴ  ＡＡＶ２；
【図９Ｃ】図９Ａ、図９Ｂ、および図９Ｃは、本発明の一態様による、単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣｓ）におけるＡＡＶベクター媒介性導入遺伝子発現を示す。図９Ａは、ＥＧＦＰ発現に対するＪＮＫおよびｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤の効果、ならびに位置６６２でのセリン残基の部位特異的置換を示す。図９Ｂは、感染および成熟の開始後４８時間での、図９Ａにおけるデータの定量を提供する。図９Ｃは、ＭＯＩ  ５×１０４ｖｇｓ／細胞での、本発明による１つの特定のベクター−ＡＡＶ２−Ｓ６６２−を感染させたｍｏＤＣｓにおける、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６などの共刺激マーカー（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍａｒｋｅｒｓ）の発現の代表的解析を示す。サイトカインで刺激され、本明細書に記載されるように生成されたｉＤＣｓ（未成熟樹状細胞）、およびｍＤＣｓ（成熟樹状細胞）が、それぞれ陰性および陽性対照として用いられた。代表例が示される。＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．００１  対ＷＴ  ＡＡＶ２；
【図１０】図１０は、Ｋ５６２細胞におけるｈＴＥＲＴ−特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）殺傷活性の解析を図示する。ＣＴＬｓは、切断型ヒトテロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）をコードするＡＡＶ２−Ｓ６６２ＶベクターよるｍｏＤＣｓの形質導入後に生成された。ＡＡＶ２−Ｓ６６２Ｖ−ＥＧＦＰベクター導入ｍｏＤＣｓを用いて、非特異的ＣＴＬｓを生成した。３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニン（ＤｉＯＣ１８（３））、緑色蛍光膜染色、で前染色された１×１０５標的Ｋ５６２細胞が、異なるＣＴＬの割合で、一晩共培養された（この実施例において、８０：１、５０：１、２０：１、１０：１、および５：１）。膜透過性核酸対比染色、ヨウ化プロピジウム、を添加して、障害された原形質膜を有する細胞をラベルした。殺傷された、二重染色陽性細胞のパーセンテージがフローサイトメトリーにより解析された；
【図１１Ａ】図１１Ａおよび図１１Ｂは、表面露出セリン残基の部位特異的変異誘発が、本発明の一態様により調製された例示的なｓｃＡＡＶベクターにおいて、２９３細胞の形質導入効率を増大したことを実証する；
【図１１Ｂ】図１１Ａおよび図１１Ｂは、表面露出セリン残基の部位特異的変異誘発が、本発明の一態様により調製された例示的なｓｃＡＡＶベクターにおいて、２９３細胞の形質導入効率を増大したことを実証する；
【図１２Ａ】図１２Ａおよび図１２Ｂは、表面露出トレオニン残基の部位特異的変異誘発が、本発明の一態様により調製された例示的なｓｃＡＡＶベクターにおいて、２９３細胞の形質導入効率を増大したことを明らかにする；
【図１２Ｂ】図１２Ａおよび図１２Ｂは、表面露出トレオニン残基の部位特異的変異誘発が、本発明の一態様により調製された例示的なｓｃＡＡＶベクターにおいて、２９３細胞の形質導入効率を増大したことを明らかにする；
【図１３Ａ】図１３Ａおよび図１３Ｂは、表面露出セリン、トレオニンおよび／またはチロシン残基の例示的な組み合わせの部位特異的変異誘発もまた、特定の例示的なｓｃＡＡＶベクターが本明細書に記載される方法により調製され使用された時に、Ｈ２．３５細胞の形質導入効率を著しく増大したことを図示する；
【図１３Ｂ】図１３Ａおよび図１３Ｂは、表面露出セリン、トレオニンおよび／またはチロシン残基の例示的な組み合わせの部位特異的変異誘発もまた、特定の例示的なｓｃＡＡＶベクターが本明細書に記載される方法により調製され使用された時に、Ｈ２．３５細胞の形質導入効率を著しく増大したことを図示する；
【図１４Ａ】図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄ、および図１４Ｅはｉｎ  ｖｉｖｏでのマウスにおけるＡＡＶベクター誘導性先天性免疫応答を示す。図１４Ａは、先天性免疫メディエーターの遺伝子発現プロファイリングが実施されたことを示し、かつＢａｙ１１有りのＡＡＶベクター（斜線または白色の棒グラフ）をＢａｙ１１無しのＡＡＶベクター（黒色または灰色の棒グラフ）と比較して、２時間の時点での遺伝子発現における倍率変化についてのデータが示される。最小閾値倍率増加（ｍｉｎｉｍａｌ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｆｏｌｄ−ｉｎｃｒｅａｓｅ）（黒色横線）は２．５であった。図１４Ｂは、Ｂａｙ１１の事前投与有りまたは無しでの、モック注入またはｓｃＡＡＶベクターでの注入後９時間のマウスからの肝臓ホモジネートのウェスタンブロット解析を示す。ＡＡＶ曝露に対する応答におけるＮＦ−κＢシグナル伝達の検出のために抗ｐ５２抗体を用いることにより、サンプルが解析された。抗β−アクチン抗体をローディング対照として用いた。図１４Ｃは、ＮＦ−κＢ阻害剤の非存在下または存在下での例示的なＡＡＶベクターに対する体液性応答を示す。抗ＡＡＶ２  ＩｇＧ２ａレベルが、Ｂａｙ１１の事前投与有りまたは無しで、ｓｃＡＡＶベクターでの注入後１０日のマウスからの末梢血において決定された（それぞれｎ＝４）。図１４Ｄは、尾静脈を介する、各１×１０１１ｖｇｓのＷＴ−ｓｃＡＡＶ−ＥＧＦＰまたはＴＭ−ｓｃＡＡＶ−ＥＦＧＰベクター／動物の注入後１０日のマウス肝細胞における導入遺伝子発現を示す。図１４Ｅは、図１４Ｄに表された研究からの代表的なデータの定量的解析を図示する；
【図１４Ｂ】図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄ、および図１４Ｅはｉｎ  ｖｉｖｏでのマウスにおけるＡＡＶベクター誘導性先天性免疫応答を示す。図１４Ａは、先天性免疫メディエーターの遺伝子発現プロファイリングが実施されたことを示し、かつＢａｙ１１有りのＡＡＶベクター（斜線または白色の棒グラフ）をＢａｙ１１無しのＡＡＶベクター（黒色または灰色の棒グラフ）と比較して、２時間の時点での遺伝子発現における倍率変化についてのデータが示される。最小閾値倍率増加（ｍｉｎｉｍａｌ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｆｏｌｄ−ｉｎｃｒｅａｓｅ）（黒色横線）は２．５であった。図１４Ｂは、Ｂａｙ１１の事前投与有りまたは無しでの、モック注入またはｓｃＡＡＶベクターでの注入後９時間のマウスからの肝臓ホモジネートのウェスタンブロット解析を示す。ＡＡＶ曝露に対する応答におけるＮＦ−κＢシグナル伝達の検出のために抗ｐ５２抗体を用いることにより、サンプルが解析された。抗β−アクチン抗体をローディング対照として用いた。図１４Ｃは、ＮＦ−κＢ阻害剤の非存在下または存在下での例示的なＡＡＶベクターに対する体液性応答を示す。抗ＡＡＶ２  ＩｇＧ２ａレベルが、Ｂａｙ１１の事前投与有りまたは無しで、ｓｃＡＡＶベクターでの注入後１０日のマウスからの末梢血において決定された（それぞれｎ＝４）。図１４Ｄは、尾静脈を介する、各１×１０１１ｖｇｓのＷＴ−ｓｃＡＡＶ−ＥＧＦＰまたはＴＭ−ｓｃＡＡＶ−ＥＦＧＰベクター／動物の注入後１０日のマウス肝細胞における導入遺伝子発現を示す。図１４Ｅは、図１４Ｄに表された研究からの代表的なデータの定量的解析を図示する；
【図１４Ｃ】図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄ、および図１４Ｅはｉｎ  ｖｉｖｏでのマウスにおけるＡＡＶベクター誘導性先天性免疫応答を示す。図１４Ａは、先天性免疫メディエーターの遺伝子発現プロファイリングが実施されたことを示し、かつＢａｙ１１有りのＡＡＶベクター（斜線または白色の棒グラフ）をＢａｙ１１無しのＡＡＶベクター（黒色または灰色の棒グラフ）と比較して、２時間の時点での遺伝子発現における倍率変化についてのデータが示される。最小閾値倍率増加（ｍｉｎｉｍａｌ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｆｏｌｄ−ｉｎｃｒｅａｓｅ）（黒色横線）は２．５であった。図１４Ｂは、Ｂａｙ１１の事前投与有りまたは無しでの、モック注入またはｓｃＡＡＶベクターでの注入後９時間のマウスからの肝臓ホモジネートのウェスタンブロット解析を示す。ＡＡＶ曝露に対する応答におけるＮＦ−κＢシグナル伝達の検出のために抗ｐ５２抗体を用いることにより、サンプルが解析された。抗β−アクチン抗体をローディング対照として用いた。図１４Ｃは、ＮＦ−κＢ阻害剤の非存在下または存在下での例示的なＡＡＶベクターに対する体液性応答を示す。抗ＡＡＶ２  ＩｇＧ２ａレベルが、Ｂａｙ１１の事前投与有りまたは無しで、ｓｃＡＡＶベクターでの注入後１０日のマウスからの末梢血において決定された（それぞれｎ＝４）。図１４Ｄは、尾静脈を介する、各１×１０１１ｖｇｓのＷＴ−ｓｃＡＡＶ−ＥＧＦＰまたはＴＭ−ｓｃＡＡＶ−ＥＦＧＰベクター／動物の注入後１０日のマウス肝細胞における導入遺伝子発現を示す。図１４Ｅは、図１４Ｄに表された研究からの代表的なデータの定量的解析を図示する；
【図１４Ｄ】図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄ、および図１４Ｅはｉｎ  ｖｉｖｏでのマウスにおけるＡＡＶベクター誘導性先天性免疫応答を示す。図１４Ａは、先天性免疫メディエーターの遺伝子発現プロファイリングが実施されたことを示し、かつＢａｙ１１有りのＡＡＶベクター（斜線または白色の棒グラフ）をＢａｙ１１無しのＡＡＶベクター（黒色または灰色の棒グラフ）と比較して、２時間の時点での遺伝子発現における倍率変化についてのデータが示される。最小閾値倍率増加（ｍｉｎｉｍａｌ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｆｏｌｄ−ｉｎｃｒｅａｓｅ）（黒色横線）は２．５であった。図１４Ｂは、Ｂａｙ１１の事前投与有りまたは無しでの、モック注入またはｓｃＡＡＶベクターでの注入後９時間のマウスからの肝臓ホモジネートのウェスタンブロット解析を示す。ＡＡＶ曝露に対する応答におけるＮＦ−κＢシグナル伝達の検出のために抗ｐ５２抗体を用いることにより、サンプルが解析された。抗β−アクチン抗体をローディング対照として用いた。図１４Ｃは、ＮＦ−κＢ阻害剤の非存在下または存在下での例示的なＡＡＶベクターに対する体液性応答を示す。抗ＡＡＶ２  ＩｇＧ２ａレベルが、Ｂａｙ１１の事前投与有りまたは無しで、ｓｃＡＡＶベクターでの注入後１０日のマウスからの末梢血において決定された（それぞれｎ＝４）。図１４Ｄは、尾静脈を介する、各１×１０１１ｖｇｓのＷＴ−ｓｃＡＡＶ−ＥＧＦＰまたはＴＭ−ｓｃＡＡＶ−ＥＦＧＰベクター／動物の注入後１０日のマウス肝細胞における導入遺伝子発現を示す。図１４Ｅは、図１４Ｄに表された研究からの代表的なデータの定量的解析を図示する；
【図１４Ｅ】図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄ、および図１４Ｅはｉｎ  ｖｉｖｏでのマウスにおけるＡＡＶベクター誘導性先天性免疫応答を示す。図１４Ａは、先天性免疫メディエーターの遺伝子発現プロファイリングが実施されたことを示し、かつＢａｙ１１有りのＡＡＶベクター（斜線または白色の棒グラフ）をＢａｙ１１無しのＡＡＶベクター（黒色または灰色の棒グラフ）と比較して、２時間の時点での遺伝子発現における倍率変化についてのデータが示される。最小閾値倍率増加（ｍｉｎｉｍａｌ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｆｏｌｄ−ｉｎｃｒｅａｓｅ）（黒色横線）は２．５であった。図１４Ｂは、Ｂａｙ１１の事前投与有りまたは無しでの、モック注入またはｓｃＡＡＶベクターでの注入後９時間のマウスからの肝臓ホモジネートのウェスタンブロット解析を示す。ＡＡＶ曝露に対する応答におけるＮＦ−κＢシグナル伝達の検出のために抗ｐ５２抗体を用いることにより、サンプルが解析された。抗β−アクチン抗体をローディング対照として用いた。図１４Ｃは、ＮＦ−κＢ阻害剤の非存在下または存在下での例示的なＡＡＶベクターに対する体液性応答を示す。抗ＡＡＶ２  ＩｇＧ２ａレベルが、Ｂａｙ１１の事前投与有りまたは無しで、ｓｃＡＡＶベクターでの注入後１０日のマウスからの末梢血において決定された（それぞれｎ＝４）。図１４Ｄは、尾静脈を介する、各１×１０１１ｖｇｓのＷＴ−ｓｃＡＡＶ−ＥＧＦＰまたはＴＭ−ｓｃＡＡＶ−ＥＦＧＰベクター／動物の注入後１０日のマウス肝細胞における導入遺伝子発現を示す。図１４Ｅは、図１４Ｄに表された研究からの代表的なデータの定量的解析を図示する；
【図１５Ａ】図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、および図１５Ｄは、Ｔ４７ＤおよびＴ４７Ｄ＋ｈＨＧＦＲ細胞におけるＡＡＶ３媒介性導入遺伝子発現を図示する。図１５Ａ：等しい数のＴ４７ＤおよびＴ４７Ｄ＋ｈＨＧＦＲ細胞を、同一条件下で、様々な示された感染多重度のｓｃＡＡＶ３−ＣＢＡｐ−ＥＧＦＰベクターに感染させた。導入遺伝子発現は、感染後７２時間で蛍光顕微鏡により決定された。図１５Ｂ：Ｔ４７Ｄ＋ｈＨＧＦＲ細胞を−−５μｇ／ｍＬのｈＨＧＦの非存在下または存在下で−−２，０００ｖｇｓ／細胞のｓｃＡＡＶ３で形質導入した。導入遺伝子発現は上記のように決定した。図１５Ｃ：ＨＧＦＲキナーゼ特異的阻害剤、ＢＭＳ−７７７６０７（ＢＭＳ）、のＡＡＶ３媒介性導入遺伝子発現に対する効果が示される。Ｔ４７ＤおよびＴ４７Ｄ＋ｈＨＧＦＲ細胞を、２時間モック処理またはＢＭＳで前処置した。全細胞溶解物を調製し、様々な示された一次抗体を用いてウェスタンブロットで解析した。β−アクチンをローディング対照として用いた。図１５Ｄ：ＷＴならびに単一、二重および三重チロシン変異ＡＡＶ３ベクターの形質導入効率が示される。Ｈｕｈ７細胞を、同一条件下で、ＷＴまたは様々な示されたＹ−Ｆ変異ｓｃＡＡＶ３−ＣＢＡｐ−ＥＧＦＰベクターで形質導入した；
【図１５Ｂ】図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、および図１５Ｄは、Ｔ４７ＤおよびＴ４７Ｄ＋ｈＨＧＦＲ細胞におけるＡＡＶ３媒介性導入遺伝子発現を図示する。図１５Ａ：等しい数のＴ４７ＤおよびＴ４７Ｄ＋ｈＨＧＦＲ細胞を、同一条件下で、様々な示された感染多重度のｓｃＡＡＶ３−ＣＢＡｐ−ＥＧＦＰベクターに感染させた。導入遺伝子発現は、感染後７２時間で蛍光顕微鏡により決定された。図１５Ｂ：Ｔ４７Ｄ＋ｈＨＧＦＲ細胞を−−５μｇ／ｍＬのｈＨＧＦの非存在下または存在下で−−２，０００ｖｇｓ／細胞のｓｃＡＡＶ３で形質導入した。導入遺伝子発現は上記のように決定した。図１５Ｃ：ＨＧＦＲキナーゼ特異的阻害剤、ＢＭＳ−７７７６０７（ＢＭＳ）、のＡＡＶ３媒介性導入遺伝子発現に対する効果が示される。Ｔ４７ＤおよびＴ４７Ｄ＋ｈＨＧＦＲ細胞を、２時間モック処理またはＢＭＳで前処置した。全細胞溶解物を調製し、様々な示された一次抗体を用いてウェスタンブロットで解析した。β−アクチンをローディング対照として用いた。図１５Ｄ：ＷＴならびに単一、二重および三重チロシン変異ＡＡＶ３ベクターの形質導入効率が示される。Ｈｕｈ７細胞を、同一条件下で、ＷＴまたは様々な示されたＹ−Ｆ変異ｓｃＡＡＶ３−ＣＢＡｐ−ＥＧＦＰベクターで形質導入した；
【図１５Ｃ】図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、および図１５Ｄは、Ｔ４７ＤおよびＴ４７Ｄ＋ｈＨＧＦＲ細胞におけるＡＡＶ３媒介性導入遺伝子発現を図示する。図１５Ａ：等しい数のＴ４７ＤおよびＴ４７Ｄ＋ｈＨＧＦＲ細胞を、同一条件下で、様々な示された感染多重度のｓｃＡＡＶ３−ＣＢＡｐ−ＥＧＦＰベクターに感染させた。導入遺伝子発現は、感染後７２時間で蛍光顕微鏡により決定された。図１５Ｂ：Ｔ４７Ｄ＋ｈＨＧＦＲ細胞を−−５μｇ／ｍＬのｈＨＧＦの非存在下または存在下で−−２，０００ｖｇｓ／細胞のｓｃＡＡＶ３で形質導入した。導入遺伝子発現は上記のように決定した。図１５Ｃ：ＨＧＦＲキナーゼ特異的阻害剤、ＢＭＳ−７７７６０７（ＢＭＳ）、のＡＡＶ３媒介性導入遺伝子発現に対する効果が示される。Ｔ４７ＤおよびＴ４７Ｄ＋ｈＨＧＦＲ細胞を、２時間モック処理またはＢＭＳで前処置した。全細胞溶解物を調製し、様々な示された一次抗体を用いてウェスタンブロットで解析した。β−アクチンをローディング対照として用いた。図１５Ｄ：ＷＴならびに単一、二重および三重チロシン変異ＡＡＶ３ベクターの形質導入効率が示される。Ｈｕｈ７細胞を、同一条件下で、ＷＴまたは様々な示されたＹ−Ｆ変異ｓｃＡＡＶ３−ＣＢＡｐ−ＥＧＦＰベクターで形質導入した；
【図１５Ｄ】図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、および図１５Ｄは、Ｔ４７ＤおよびＴ４７Ｄ＋ｈＨＧＦＲ細胞におけるＡＡＶ３媒介性導入遺伝子発現を図示する。図１５Ａ：等しい数のＴ４７ＤおよびＴ４７Ｄ＋ｈＨＧＦＲ細胞を、同一条件下で、様々な示された感染多重度のｓｃＡＡＶ３−ＣＢＡｐ−ＥＧＦＰベクターに感染させた。導入遺伝子発現は、感染後７２時間で蛍光顕微鏡により決定された。図１５Ｂ：Ｔ４７Ｄ＋ｈＨＧＦＲ細胞を−−５μｇ／ｍＬのｈＨＧＦの非存在下または存在下で−−２，０００ｖｇｓ／細胞のｓｃＡＡＶ３で形質導入した。導入遺伝子発現は上記のように決定した。図１５Ｃ：ＨＧＦＲキナーゼ特異的阻害剤、ＢＭＳ−７７７６０７（ＢＭＳ）、のＡＡＶ３媒介性導入遺伝子発現に対する効果が示される。Ｔ４７ＤおよびＴ４７Ｄ＋ｈＨＧＦＲ細胞を、２時間モック処理またはＢＭＳで前処置した。全細胞溶解物を調製し、様々な示された一次抗体を用いてウェスタンブロットで解析した。β−アクチンをローディング対照として用いた。図１５Ｄ：ＷＴならびに単一、二重および三重チロシン変異ＡＡＶ３ベクターの形質導入効率が示される。Ｈｕｈ７細胞を、同一条件下で、ＷＴまたは様々な示されたＹ−Ｆ変異ｓｃＡＡＶ３−ＣＢＡｐ−ＥＧＦＰベクターで形質導入した；
【図１６】図１６は、ＡＡＶ２−Ｋ５４４Ｅ、ＡＡＶ２−Ｋ５５６Ｅ、ＡＡＶ２−Ｋ５４４／５６６Ｅ、およびＡＡＶ２−Ｙ４４４／５００／７３０Ｆによる導入遺伝子発現の定量を示す；
【図１７】図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃ、図１７Ｄおよび図１７Ｅは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの初代肝細胞におけるＷＴ−およびリジン変異ｓｃＡＡＶ８ベクターの形質導入効率を図示する（Ｃ５７ＢＬ／６マウス；１×１０１０  ｓｃＡＡＶ−２−ＣＢＡｐ−Ｆｌｕｃベクター；尾静脈注入；２週間）（実験２）；
【図１８】図１８は、本発明の一態様による、ＡＡＶ８−Ｋ５３０Ｅ、ＡＡＶ８−Ｋ５４７Ｅ、およびＡＡＶ８−Ｋ５６９Ｅによる導入遺伝子発現の定量化を示す。
【図１９Ａ】図１９Ａおよび図１９Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの初代肝細胞におけるＷＴ−およびリジン変異ｓｃＡＡＶ２ベクターの形質導入効率を図示する（Ｃ５７ＢＬ／６マウス；１×１０１０  ｓｃＡＡＶ−２−ＣＢＡｐ−ＥＧＦＰベクター；尾静脈注入；２週間）；
【図１９Ｂ】図１９Ａおよび図１９Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの初代肝細胞におけるＷＴ−およびリジン変異ｓｃＡＡＶ２ベクターの形質導入効率を図示する（Ｃ５７ＢＬ／６マウス；１×１０１０  ｓｃＡＡＶ−２−ＣＢＡｐ−ＥＧＦＰベクター；尾静脈注入；２週間）；
【図２０Ａ】図２０Ａおよび図２０Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの初代肝細胞を含む研究における、本発明の一態様による、ＷＴ−および例示的なリジン−またはチロシン−置換変異ｓｃＡＡＶ２ベクターの形質導入効率を示す（Ｃ５７ＢＬ／６マウス；１×１０１０  ｓｃＡＡＶ−２−ＣＢＡｐ−Ｆｌｕｃベクター；尾静脈注入；２週間）；
【図２０Ｂ】図２０Ａおよび図２０Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの初代肝細胞を含む研究における、本発明の一態様による、ＷＴ−および例示的なリジン−またはチロシン−置換変異ｓｃＡＡＶ２ベクターの形質導入効率を示す（Ｃ５７ＢＬ／６マウス；１×１０１０  ｓｃＡＡＶ−２−ＣＢＡｐ−Ｆｌｕｃベクター；尾静脈注入；２週間）；
【図２１】図２１Ａ、図２１Ｂ、図２１Ｃ、図２１Ｄ、図２１Ｅ、図２１Ｆ、図２１Ｇ、図２１Ｈ、および図２１Ｉは、本発明の一態様による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨｅＬａ細胞におけるＷＴ−および例示的なリジン−変異キャプシドを含有するｓｃＡＡＶ２ベクターの形質導入効率を示す（２，０００ｖｇｓ／細胞；４８時間）；
【図２２】図２２Ａ、図２２Ｂ、図２２Ｃ、図２２Ｄ、図２２Ｅ、図２２Ｆ、図２２Ｇ、図２２Ｈ、および図２２Ｉは、表面露出セリン、トレオニンおよび／またはチロシン残基の組み合わせの部位特異的変異誘発が、本発明の一態様による、ｓｃＡＡＶベクターによる単球由来樹状細胞の形質導入効率を増大することを示す；
【図２３】図２３Ａ、図２３Ｂ、図２３Ｃ、図２３Ｄ、図２３Ｅ、および図２３Ｆは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨｅＬａおよびＨＥＫ２９３細胞における本明細書に開示される方法により調製された例示的なＡＡＶ２リジン変異体の形質導入効率を示す（ＭＯＩ  ２０００）。遺伝子発現における相対的倍率増加（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｆｏｌｄ−ｉｎｃｒｅａｓｅ）はインサートとして示される；
【図２４】図２４は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのマウス肝細胞におけるＷＴ−および例示的なリジン変異キャプシドを発現するｓｃＡＡＶ８ベクターの形質導入効率を示す（Ｃ５７ＢＬ／６マウス；１×１０１０  ｓｃＡＡＶ−２−ＣＢＡｐ−Ｆｌｕｃベクター；尾静脈注入；２週間）（実験１）；および
【図２５】図２５は、特定のリジン置換キャプシドタンパク質変異体を発現する例示的なＡＡＶ８ベクターによる導入遺伝子発現の定量化を示す。代表的な構築体ＡＡＶ８−Ｋ５３０Ｅ、ＡＡＶ８−Ｋ５４７Ｅ、およびＡＡＶ８−Ｋ５６９Ｅが示される。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
実施形態の説明
本発明は、ＶＰ３領域における表面露出リジン、セリン、トレオニンおよび／またはチロシン残基の１つまたは組み合わせの改変を含む、ＡＡＶキャプシドタンパク質を提供する。また、本明細書に開示される１以上のＡＡＶキャプシドタンパク質変異を含むｒＡＡＶビリオン、ならびに本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸分子およびｒＡＡＶベクターも提供される。有利なことに、本発明のｒＡＡＶベクターおよびビリオンは、野生型のｒＡＡＶベクターおよびビリオンと比較した場合、対象の様々な細胞、組織および臓器の形質導入において改善された効率を有する、かつ／あるいはベクターに対する宿主免疫応答を低減させる。
【００３９】
一実施形態では、本発明は、ＡＡＶキャプシドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、ＡＡＶキャプシドタンパク質のＶＰ３領域が、野生型ＡＡＶ［例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０；かつ、一つの特定の例示的実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２）］のキャプシドタンパク質のＶＰ３領域における１以上のリジン残基に対応する１以上の位置で非リジン残基を含み、野生型ＡＡＶのＶＰ３領域における１以上のリジン残基が図２Ａおよび図２Ｂに図示される１以上のリジン残基から選択される、核酸分子を提供する。
【００４０】
特定の実施形態では、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質［例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２）］のＫ２５８、Ｋ３２１、Ｋ４５９、Ｋ４９０、Ｋ５０７、Ｋ５２７、Ｋ５７２、Ｋ５３２、Ｋ５４４、Ｋ５４９、Ｋ５５６、Ｋ６４９、Ｋ６５５、Ｋ６６５、およびＫ７０６からなる群から選択される１以上のリジン残基に対応する、１以上の表面露出リジン残基が改変される。
【００４１】
一実施形態では、野生型ＡＡＶ２キャプシド配列のＫ５３２に対応する表面露出リジン残基が改変される。一実施形態では、ＡＡＶキャプシドの表面露出リジン残基がグルタミン酸（Ｅ）またはアルギニン（Ｒ）へと改変される。一つの特定の実施形態では、野生型ＡＡＶ２キャプシド配列のＫ５３２に対応する表面露出リジン残基がアルギニンへと改変される（Ｋ５３２Ｒ）。
【００４２】
ある実施形態では、野生型ＡＡＶ２キャプシド配列のＫ４９０、Ｋ５４４、Ｋ５４９、およびＫ５５６に対応する１以上の表面露出リジン残基が改変される。ある特定の実施形態では、野生型ＡＡＶ２キャプシド配列のＫ４９０、Ｋ５４４、Ｋ５４９、およびＫ５５６に対応する１以上の表面露出リジン残基がグルタミン酸（Ｅ）へと改変される。
【００４３】
一実施形態では、本発明は、野生型ＡＡＶ２キャプシドのＫ５４４およびＫ５５６残基に対応する表面露出リジン残基がグルタミン酸（Ｅ）へと改変される、ＡＡＶ２ベクターを提供する。
【００４４】
ある実施形態では、野生型ＡＡＶ８キャプシド配列のＫ５３０、Ｋ５４７、およびＫ５６９に対応する１以上の表面露出リジン残基が改変される。ある特定の実施形態では、野生型ＡＡＶ２キャプシド配列のＫ５３０、Ｋ５４７、およびＫ５６９に対応する１以上の表面露出リジン残基がグルタミン酸（Ｅ）またはアルギニン（Ｒ）へと改変される。
【００４５】
また、本発明は、有効量の、本発明のｒＡＡＶベクターおよび／またはビリオンを含む組成物を、細胞内に導入することを含む、対象の細胞、組織、および／または臓器の形質導入のための方法を提供する。
【００４６】
ＡＡＶキャプシドの表面露出リジン、セリン、トレオニンおよび／またはチロシン残基のリン酸化は、ベクターのユビキチン化／プロテアソーム分解をもたらすことができる。セリン／トレオニンプロテインキナーゼは、細胞分化、転写調節、および発生を含む多種多様な細胞内プロセスに関与する。ウイルスキャプシドの表面露出セリンおよび／またはトレオニン残基のリン酸化は、ベクターのプロテアソーム媒介性分解を誘導し、かつベクター形質導入効率を低減させる。細胞性上皮成長因子受容体タンパク質チロシンキナーゼ（ＥＧＦＲ−ＰＴＫ）もまた、表面チロシン残基でキャプシドをリン酸化し、それゆえ、核輸送およびそれに続く組換えＡＡＶ２ベクターによる導入遺伝子発現にマイナスの影響を与える。
【００４７】
ＡＡＶキャプシド上の表面露出リジン、セリン、トレオニンおよび／またはチロシン残基が同定される（図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、および図２Ｄ）。例えば、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質のＶＰ３領域は、様々な表面露出リジン（Ｋ）残基（Ｋ２５８、Ｋ３２１、Ｋ４５９、Ｋ４９０、Ｋ５０７、Ｋ５２７、Ｋ５７２、Ｋ５３２、Ｋ５４４、Ｋ５４９、Ｋ５５６、Ｋ６４９、Ｋ６５５、Ｋ６６５、Ｋ７０６）、表面露出セリン（Ｓ）残基（Ｓ２６１、Ｓ２６４、Ｓ２６７、Ｓ２７６、Ｓ３８４、Ｓ４５８、Ｓ４６８、Ｓ４９２、Ｓ４９８、Ｓ５７８、Ｓ６５８、Ｓ６６２、Ｓ６６８、Ｓ７０７、Ｓ７２１）、表面露出トレオニン（Ｔ）残基（Ｔ２５１、Ｔ３２９、Ｔ３３０、Ｔ４５４、Ｔ４５５、Ｔ５０３、Ｔ５５０、Ｔ５９２、Ｔ５８１、Ｔ５９７、Ｔ４９１、Ｔ６７１、Ｔ６５９、Ｔ６６０、Ｔ７０１、Ｔ７１３、Ｔ７１６）、および表面露出チロシン残基（Ｙ２５２、Ｙ２７２、Ｙ４４４、Ｙ５００、Ｙ７００、Ｙ７０４、Ｙ７３０）を含有する。図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、および図２Ｄに示されるように、キャプシドのこれらの表面露出リジン、セリン、トレオニンおよび／またはチロシン残基はＡＡＶ１−１２間で高度に保存されている。
【００４８】
表面露出リジン、セリン、トレオニンおよび／またはチロシン残基の部位特異的変異誘発が実施された、結果は、表面露出残基の１つまたは組み合わせの改変または置換が、ＡＡＶベクターがユビキチン化およびプロテアソーム媒介性分解段階を迂回できるようにし、それによって高効率の形質導入を備える新規ＡＡＶベクターを得ることができることを示す。ＡＡＶキャプシドの表面露出チロシン残基の置換は、ベクターがユビキチン化を逃れるのを可能にし、それゆえ、プロテアソーム媒介性分解を阻害する。リン酸化されたＡＡＶベクターはそれらの非リン酸化対応物と同じくらい効率的に細胞に侵入できたが、それらの形質導入効率は著しく低減した。一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）および自己相補的ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の両方の形質導入効率が減少したため、この低減は、ウイルスの二本鎖ＤＮＡ合成が損なわれたことに起因するものではなかった。
【００４９】
表面露出チロシン残基における点突然変異を含有する組換えＡＡＶベクターは、野生型（ＷＴ）ＡＡＶベクターと比較した場合、より低用量でより高い形質導入効率を与える。
【００５０】
さらに、本発明によると、（ｉ）ＡＡＶ２キャプシド上の１５個の表面露出セリン（Ｓ）残基のバリン（Ｖ）残基での部位特異的変異誘発は、ＷＴ  ＡＡＶ２ベクターと比較して、Ｓ４５８Ｖ、Ｓ４９２Ｖ、およびＳ６６２Ｖ変異ベクターの改善された形質導入効率を引き起こす；（ｉｉ）Ｓ６６２Ｖ変異ベクターは、初代ヒト単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣｓ）、従来のＡＡＶベクターによる形質導入を容易に受けることができない細胞種、を効率的に形質導入する；（ｉｉｉ）Ｓ６６２Ｖ変異体によるｍｏＤＣｓの高効率な形質導入は、これらの細胞において表現型変化を全く誘導しない；かつ（ｉｖ）切断型ヒトテロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）遺伝子を有する組換えＳ６６２Ｖ−ｒＡＡＶベクターを形質導入されたＤＣｓは、迅速で特異的なＴ細胞クローン増殖および強力なＣＴＬｓの生成をもたらし、Ｋ５６２細胞の特異的な細胞溶解を引き起こす。結果は、本発明のセリン改変ｒＡＡＶ２ベクターがｍｏＤＣｓの高効率な形質導入をもたらすことを実証する。
【００５１】
腫瘍免疫療法のセッティングでは、Ｔ細胞活性化およびＣＤ８  Ｔ細胞応答の効力および寿命が、治療結果を決定する際の重要な要因である。本発明によると、セリン変異ＡＡＶ２ベクターによるｍｏＤＣの増大した形質導入効率がＴ細胞の優れたプライミングをもたらした。臨床研究からヒトテロメラーゼが多数の癌患者について広く発現されている拒絶抗原の魅力的な候補であることが示されているため、ヒトテロメラーゼが特異的な標的として用いられた。また、Ｓ６６２Ｖ変異ベクターの形質導入効率は、ＪＮＫおよびｐ３８  ＭＡＰＫの特異的阻害剤での細胞の前処置によりさらに増大し、ＡＡＶ２キャプシド上の１以上の表面露出トレオニン（Ｔ）残基がこれらのキナーゼによりリン酸化される可能性が最も高いことを示す。
【００５２】
組換えＡＡＶベクターおよびビリオン
本発明の一態様は、ＶＰ３領域における表面露出リジン、セリン、トレオニンおよび／またはチロシン残基の１つまたは組み合わせの改変を含む、ＡＡＶキャプシドタンパク質を提供する。本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオン、ならびに本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸分子およびｒＡＡＶベクターもまた提供される。有利なことに、本発明のｒＡＡＶベクターおよびビリオンは、野生型のｒＡＡＶベクターおよびビリオンと比較した場合、対象の様々な細胞、組織および臓器の形質導入において改善された効率を有する。
【００５３】
一実施形態では、本発明は、ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、ＡＡＶキャプシドタンパク質がＶＰ３領域における表面露出リジン、セリン、トレオニンおよび／またはチロシン残基の１つまたは組み合わせの改変を含む、核酸分子を提供する。有利なことに、表面露出リジン、セリン、トレオニンおよび／またはチロシン残基の改変は、ＡＡＶベクターのユビキチン化のレベルを防止または低減し、それによってプロテアソーム媒介性分解のレベルを防止または低減する。また、本発明による表面露出リジン、セリン、トレオニンおよび／またはチロシン残基の改変は形質導入効率を改善する。
【００５４】
一実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、ＡＡＶキャプシドタンパク質のＶＰ３領域が以下の特性の１つまたは組み合わせを含む、核酸分子：
（ａ）
（ｉ）野生型ＡＡＶ（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２（配列番号２）のキャプシドタンパク質）のキャプシドタンパク質のＶＰ３領域におけるリジン残基に対応する１以上の位置の非リジン残基、ここで野生型ＡＡＶのＶＰ３領域における前記リジン残基はＫ２５８、Ｋ３２１、Ｋ４５９、Ｋ４９０、Ｋ５０７、Ｋ５２７、Ｋ５７２、Ｋ５３２、Ｋ５４４、Ｋ５４９、Ｋ５５６、Ｋ６４９、Ｋ６５５、Ｋ６６５、およびＫ７０６からなる群から選択され、前記非リジン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；および／または
（ｉｉ）野生型ＡＡＶ（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２））のキャプシドタンパク質のＶＰ３領域におけるリジン残基に対応する１以上の位置の化学修飾されたリジン残基、ここで野生型ＡＡＶのＶＰ３領域における前記リジン残基はＫ２５８、Ｋ３２１、Ｋ４５９、Ｋ４９０、Ｋ５０７、Ｋ５２７、Ｋ５７２、Ｋ５３２、Ｋ５４４、Ｋ５４９、Ｋ５５６、Ｋ６６５、Ｋ６４９、Ｋ６５５、およびＫ７０６からなる群から選択され、前記化学修飾されたリジン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；
（ｉｉｉ）野生型ＡＡＶ（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ８のキャプシドタンパク質（配列番号８））のキャプシドタンパク質のＶＰ３領域におけるリジン残基に対応する１以上の位置の非リジン残基、ここで野生型ＡＡＶのＶＰ３領域における前記リジン残基はＫ５３０、Ｋ５４７、およびＫ５６９からなる群から選択され、前記非リジン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；および／または
（ｉｖ）野生型ＡＡＶ（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ８のキャプシドタンパク質（配列番号８））のキャプシドタンパク質のＶＰ３領域におけるリジン残基に対応する１以上の位置の化学修飾されたリジン残基、ここで野生型ＡＡＶのＶＰ３領域における前記リジン残基はＫ５３０、Ｋ５４７、およびＫ５６９からなる群から選択され、前記化学修飾されたリジン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；
（ｂ）
（ｉ）野生型ＡＡＶ（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２））のキャプシドタンパク質のＶＰ３領域におけるセリン残基に対応する１以上の位置の非セリン残基、ここで野生型ＡＡＶのＶＰ３領域における前記セリン残基はＳ２６１、Ｓ２６４、Ｓ２６７、Ｓ２７６、Ｓ３８４、Ｓ４５８、Ｓ４６８、Ｓ４９２、Ｓ４９８、Ｓ５７８、Ｓ６５８、Ｓ６６２、Ｓ６６８、Ｓ７０７、およびＳ７２１からなる群から選択され、前記非セリン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；および／または
（ｉｉ）野生型ＡＡＶ（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２））のキャプシドタンパク質のＶＰ３領域におけるセリン残基に対応する１以上の位置の化学修飾されたセリン残基、ここで野生型ＡＡＶのＶＰ３領域における前記セリン残基はＳ２６１、Ｓ２６４、Ｓ２６７、Ｓ２７６、Ｓ３８４、Ｓ４５８、Ｓ４６８、Ｓ４９２、Ｓ４９８、Ｓ５７８、Ｓ６５８、Ｓ６６２、Ｓ６６８、Ｓ７０７、およびＳ７２１からなる群から選択され、前記化学修飾されたセリン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；
（ｃ）
（ｉ）野生型ＡＡＶ（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２））のキャプシドタンパク質のＶＰ３領域におけるトレオニン残基に対応する１以上の位置の非トレオニン残基、ここで野生型ＡＡＶのＶＰ３領域における前記トレオニン残基はＴ２５１、Ｔ３２９、Ｔ３３０、Ｔ４５４、Ｔ４５５、Ｔ５０３、Ｔ５５０、Ｔ５９２、Ｔ５８１、Ｔ５９７、Ｔ４９１、Ｔ６７１、Ｔ６５９、Ｔ６６０、Ｔ７０１、Ｔ７１３、およびＴ７１６からなる群から選択され、前記非トレオニン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；および／または
（ｉｉ）野生型ＡＡＶ（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２））のキャプシドタンパク質のＶＰ３領域におけるトレオニン残基に対応する１以上の位置の化学修飾されたトレオニン残基、ここで野生型ＡＡＶのＶＰ３領域における前記トレオニン残基はＴ２５１、Ｔ３２９、Ｔ３３０、Ｔ４５４、Ｔ４５５、Ｔ５０３、Ｔ５５０、Ｔ５９２、Ｔ５８１、Ｔ５９７、Ｔ４９１、Ｔ６７１、Ｔ６５９、Ｔ６６０、Ｔ７０１、Ｔ７１３、およびＴ７１６からなる群から選択され、前記化学修飾されたトレオニン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；ならびに／または
（ｄ）
（ｉ）野生型ＡＡＶ（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２））のキャプシドタンパク質のＶＰ３領域におけるチロシン残基に対応する１以上の位置の非チロシン残基、ここで野生型ＡＡＶのＶＰ３領域における前記チロシン残基はＹ２５２、Ｙ２７２、Ｙ４４４、Ｙ５００、Ｙ７００、Ｙ７０４、およびＹ７３０からなる群から選択され、前記非チロシン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；および／または
（ｉｉ）野生型ＡＡＶ（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２））のキャプシドタンパク質のＶＰ３領域におけるチロシン残基に対応する１以上の位置の化学修飾されたチロシン残基、ここで野生型ＡＡＶのＶＰ３領域における前記チロシン残基はＹ２５２、Ｙ２７２、Ｙ４４４、Ｙ５００、Ｙ７００、Ｙ７０４、およびＹ７３０からなる群から選択され、前記化学修飾されたチロシン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない。
【００５５】
別の実施形態では、本発明は、ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、ＶＰ３領域における表面露出リジン、セリン、トレオニンおよび／またはチロシン残基の１以上が以下のように改変される核酸分子を提供する：
（ａ）
（ｉ）ＶＰ３領域における少なくとも１つのリジン残基が化学修飾される、あるいは非リジン残基へと改変される、ここで改変された残基は野生型ＡＡＶキャプシド配列（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２））のＫ２５８、Ｋ３２１、Ｋ４５９、Ｋ４９０、Ｋ５０７、Ｋ５２７、Ｋ５７２、Ｋ５３２、Ｋ５４４、Ｋ５４９、Ｋ５５６、Ｋ６４９、Ｋ６５５、またはＫ７０６に対応し、前記非リジン残基または前記化学修飾されたリジン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；および／または
（ｉｉ）ＶＰ３領域における少なくとも１つのリジン残基が化学修飾される、あるいは非リジン残基へと改変される、ここで改変された残基は野生型ＡＡＶキャプシド配列（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ８のキャプシドキャプシドタンパク質（配列番号８））のＫ５３０、Ｋ５４７、またはＫ５６９に対応し、前記非リジン残基または前記化学修飾されたリジン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；
（ｂ）ＶＰ３領域における少なくとも１つのセリン残基が化学修飾される、あるいは非セリン残基へと改変される、ここで改変された残基は野生型ＡＡＶキャプシド配列（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２））のＳ２６１、Ｓ２６４、Ｓ２６７、Ｓ２７６、Ｓ３８４、Ｓ４５８、Ｓ４６８、Ｓ４９２、Ｓ４９８、Ｓ５７８、Ｓ６５８、Ｓ６６２、Ｓ６６８、Ｓ７０７、またはＳ７２１に対応し、前記非セリン残基または前記化学修飾されたセリン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；
（ｃ）ＶＰ３領域における少なくとも１つのトレオニン残基が化学修飾される、あるいは非トレオニン残基へと改変される、ここで改変された残基は野生型ＡＡＶキャプシド配列（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドキャプシドタンパク質（配列番号２））のＴ２５１、Ｔ３２９、Ｔ３３０、Ｔ４５４、Ｔ４５５、Ｔ５０３、Ｔ５５０、Ｔ５９２、Ｔ５８１、Ｔ５９７、Ｔ４９１、Ｔ６７１、Ｔ６５９、Ｔ６６０、Ｔ７０１、Ｔ７１３、またはＴ７１６に対応し、前記非トレオニン残基または前記化学修飾されたトレオニン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；ならびに
（ｄ）ＶＰ３領域における少なくとも１つのチロシン残基が化学修飾される、あるいは非チロシン残基へと改変される、ここで改変された残基は野生型ＡＡＶキャプシド配列（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドキャプシドタンパク質（配列番号２））のＹ２５２、Ｙ２７２、Ｙ４４４、Ｙ５００、Ｙ７００、Ｙ７０４、またはＹ７３０に対応し、前記非チロシン残基または前記化学修飾されたチロシン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない。
【００５６】
本発明はまた、１以上の表面露出リジン、セリン、トレオニンおよび／またはチロシンの改変を有するＡＡＶ  ＶＰ３キャプシドタンパク質を提供する。一実施形態では、本発明は、以下の特性の１つまたは組み合わせを含むＡＡＶ  ＶＰ３キャプシドタンパク質を提供する：
（ａ）
（ｉ）野生型ＡＡＶ（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２））のキャプシドタンパク質のＶＰ３領域におけるリジン残基に対応する１以上の位置の非リジン残基、ここで野生型ＡＡＶのＶＰ３領域における前記リジン残基はＫ２５８、Ｋ３２１、Ｋ４５９、Ｋ４９０、Ｋ５０７、Ｋ５２７、Ｋ５７２、Ｋ５３２、Ｋ５４４、Ｋ５４９、Ｋ５５６、Ｋ６４９、Ｋ６５５、Ｋ６６５、およびＫ７０６からなる群から選択され、前記非リジン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；および／または
（ｉｉ）野生型ＡＡＶ（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２））のキャプシドタンパク質のＶＰ３領域におけるリジン残基に対応する１以上の位置の化学修飾されたリジン残基、ここで野生型ＡＡＶのＶＰ３領域における前記リジン残基はＫ２５８、Ｋ３２１、Ｋ４５９、Ｋ４９０、Ｋ５０７、Ｋ５２７、Ｋ５７２、Ｋ５３２、Ｋ５４４、Ｋ５４９、Ｋ５５６、Ｋ６４９、Ｋ６５５、Ｋ６６５、およびＫ７０６からなる群から選択され、前記化学修飾されたリジン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；
（ｉｉｉ）野生型ＡＡＶ（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ８のキャプシドタンパク質（配列番号８））のキャプシドタンパク質のＶＰ３領域におけるリジン残基に対応する１以上の位置の非リジン残基、ここで野生型ＡＡＶのＶＰ３領域における前記リジン残基はＫ５３０、Ｋ５４７、およびＫ５６９からなる群から選択され、前記非リジン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；および／または
（ｉｖ）野生型ＡＡＶ（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ８のキャプシドタンパク質（配列番号８））のキャプシドタンパク質のＶＰ３領域におけるリジン残基に対応する１以上の位置の化学修飾されたリジン残基、ここで野生型ＡＡＶのＶＰ３領域における前記リジン残基はＫ５３０、Ｋ５４７、およびＫ５６９からなる群から選択され、前記化学修飾されたリジン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；
（ｂ）
（ｉ）野生型ＡＡＶ（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２））のキャプシドタンパク質のＶＰ３領域におけるセリン残基に対応する１以上の位置の非セリン残基、ここで野生型ＡＡＶのＶＰ３領域における前記セリン残基はＳ２６１、Ｓ２６４、Ｓ２６７、Ｓ２７６、Ｓ３８４、Ｓ４５８、Ｓ４６８、Ｓ４９２、Ｓ４９８、Ｓ５７８、Ｓ６５８、Ｓ６６２、Ｓ６６８、Ｓ７０７、およびＳ７２１からなる群から選択され、前記非セリン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；および／または
（ｉｉ）野生型ＡＡＶ（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２））のキャプシドタンパク質のＶＰ３領域におけるセリン残基に対応する１以上の位置の化学修飾されたセリン残基、ここで野生型ＡＡＶのＶＰ３領域における前記セリン残基はＳ２６１、Ｓ２６４、Ｓ２６７、Ｓ２７６、Ｓ３８４、Ｓ４５８、Ｓ４６８、Ｓ４９２、Ｓ４９８、Ｓ５７８、Ｓ６５８、Ｓ６６２、Ｓ６６８、Ｓ７０７、およびＳ７２１からなる群から選択され、前記化学修飾されたセリン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；
（ｃ）
（ｉ）野生型ＡＡＶ（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２））のキャプシドタンパク質のＶＰ３領域におけるトレオニン残基に対応する１以上の位置の非トレオニン残基、ここで野生型ＡＡＶのＶＰ３領域における前記トレオニン残基はＴ２５１、Ｔ３２９、Ｔ３３０、Ｔ４５４、Ｔ４５５、Ｔ５０３、Ｔ５５０、Ｔ５９２、Ｔ５８１、Ｔ５９７、Ｔ４９１、Ｔ６７１、Ｔ６５９、Ｔ６６０、Ｔ７０１、Ｔ７１３、およびＴ７１６からなる群から選択され、前記非トレオニン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；および／または
（ｉｉ）野生型ＡＡＶ（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２））のキャプシドタンパク質のＶＰ３領域におけるトレオニン残基に対応する１以上の位置の化学修飾されたトレオニン残基、ここで野生型ＡＡＶのＶＰ３領域における前記トレオニン残基はＴ２５１、Ｔ３２９、Ｔ３３０、Ｔ４５４、Ｔ４５５、Ｔ５０３、Ｔ５５０、Ｔ５９２、Ｔ５８１、Ｔ５９７、Ｔ４９１、Ｔ６７１、Ｔ６５９、Ｔ６６０、Ｔ７０１、Ｔ７１３、およびＴ７１６からなる群から選択され、前記化学修飾されたトレオニン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；ならびに／または
（ｄ）
（ｉ）野生型ＡＡＶ（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２））のキャプシドタンパク質のＶＰ３領域におけるチロシン残基に対応する１以上の位置の非チロシン残基、ここで野生型ＡＡＶのＶＰ３領域における前記チロシン残基はＹ２５２、Ｙ２７２、Ｙ４４４、Ｙ５００、Ｙ７００、Ｙ７０４、およびＹ７３０からなる群から選択され、前記非チロシン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；および／または
（ｉｉ）野生型ＡＡＶ（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２））のキャプシドタンパク質のＶＰ３領域におけるチロシン残基に対応する１以上の位置の化学修飾されたチロシン残基、ここで野生型ＡＡＶのＶＰ３領域における前記チロシン残基はＹ２５２、Ｙ２７２、Ｙ４４４、Ｙ５００、Ｙ７００、Ｙ７０４、およびＹ７３０からなる群から選択され、前記化学修飾されたチロシン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない。
【００５７】
別の実施形態では、本発明は、ＶＰ３領域における１以上の表面露出リジン、セリン、トレオニンおよび／またはチロシン残基が以下のように改変されている、ＡＡＶキャプシドタンパク質を提供する：
（ａ）
（ｉ）ＶＰ３領域における少なくとも１つのリジン残基が化学修飾される、あるいは非リジン残基へと改変される、ここで改変された残基は野生型ＡＡＶキャプシド配列（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２））のＫ２５８、Ｋ３２１、Ｋ４５９、Ｋ４９０、Ｋ５０７、Ｋ５２７、Ｋ５７２、Ｋ５３２、Ｋ５４４、Ｋ５４９、Ｋ５５６、Ｋ６４９、Ｋ６５５、Ｋ６６５、またはＫ７０６に対応し、前記非リジン残基または前記化学修飾されたリジン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；および／または
（ｉｉ）ＶＰ３領域における少なくとも１つのリジン残基が化学修飾される、あるいは非リジン残基へと改変される、ここで改変された残基は野生型ＡＡＶキャプシド配列（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ８のキャプシドキャプシドタンパク質（配列番号８））のＫ５３０、Ｋ５４７、またはＫ５６９に対応し、前記非リジン残基または前記化学修飾されたリジン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；
（ｂ）ＶＰ３領域における少なくとも１つのセリン残基が化学修飾される、あるいは非セリン残基へと改変される、ここで改変された残基は野生型ＡＡＶキャプシド配列（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２））のＳ２６１、Ｓ２６４、Ｓ２６７、Ｓ２７６、Ｓ３８４、Ｓ４５８、Ｓ４６８、Ｓ４９２、Ｓ４９８、Ｓ５７８、Ｓ６５８、Ｓ６６２、Ｓ６６８、Ｓ７０７、またはＳ７２１に対応し、前記非セリン残基または前記化学修飾されたセリン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；
（ｃ）ＶＰ３領域における少なくとも１つのトレオニン残基が化学修飾される、あるいは非トレオニン残基へと改変される、ここで改変された残基は野生型ＡＡＶキャプシド配列（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドキャプシドタンパク質（配列番号２））のＴ２５１、Ｔ３２９、Ｔ３３０、Ｔ４５４、Ｔ４５５、Ｔ５０３、Ｔ５５０、Ｔ５９２、Ｔ５８１、Ｔ５９７、Ｔ４９１、Ｔ６７１、Ｔ６５９、Ｔ６６０、Ｔ７０１、Ｔ７１３、またはＴ７１６に対応し、前記非トレオニン残基または前記化学修飾されたトレオニン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない；ならびに
（ｄ）ＶＰ３領域における少なくとも１つのチロシン残基が化学修飾される、あるいは非チロシン残基へと改変される、ここで改変された残基は野生型ＡＡＶキャプシド配列（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドキャプシドタンパク質（配列番号２））のＹ２５２、Ｙ２７２、Ｙ４４４、Ｙ５００、Ｙ７００、Ｙ７０４、またはＹ７３０に対応し、前記非チロシン残基または前記化学修飾されたチロシン残基はＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさない。図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、および図２Ｄに示されるように、キャプシドタンパク質のＶＰ３領域に位置する表面露出リジン、セリン、トレオニンおよび／またはチロシン残基はＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１−１２）間で高度に保存されている。一実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、ＡＡＶ血清型がＡＡＶ１から１２から選択される、核酸分子。ある実施形態では、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質は配列番号１−１０から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００５８】
一つの特定の実施形態では、核酸分子は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ２）は非病原性ヒトパルボウイルスである。組換えＡＡＶ２ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで、多種多様な細胞および組織を形質導入することが知られており、嚢胞性線維症、アルファ−１アンチトリプシン欠損症、パーキンソン病、バッテン病、および筋ジストロフィーなどの多数の疾患の遺伝子治療のための第Ｉ／ＩＩ相臨床試験において現在用いられている。
【００５９】
一実施形態では、本発明は、野生型ＡＡＶ２キャプシドの１以上のアミノ酸残基が以下のように改変されることを除いて、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を含む、ＡＡＶキャプシドタンパク質を提供する：
（ａ）非リジン残基または化学修飾されたリジン残基がＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさないように、Ｋ２５８、Ｋ３２１、Ｋ４５９、Ｋ４９０、Ｋ５０７、Ｋ５２７、Ｋ５７２、Ｋ５３２、Ｋ５４４、Ｋ５４９、Ｋ５５６、Ｋ６４９、Ｋ６５５、Ｋ６６５、およびＫ７０６からなる群から選択される野生型ＡＡＶ２キャプシド配列の少なくとも１つのリジン残基が、前記非リジン残基へと改変される、あるいは前記リジン残基が前記化学修飾される；
（ｂ）非セリン残基または化学修飾されたセリン残基がＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさないように、Ｓ２６１、Ｓ２６４、Ｓ２６７、Ｓ２７６、Ｓ３８４、Ｓ４５８、Ｓ４６８、Ｓ４９２、Ｓ４９８、Ｓ５７８、Ｓ６５８、Ｓ６６２、Ｓ６６８、Ｓ７０７、およびＳ７２１からなる群から選択される野生型ＡＡＶ２キャプシド配列の少なくとも１つのセリン残基が、前記非セリン残基へと改変される、あるいは前記リジン残基が前記化学修飾される；
（ｃ）非トレオニン残基または化学修飾されたトレオニン残基がＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさないように、Ｔ２５１、Ｔ３２９、Ｔ３３０、Ｔ４５４、Ｔ４５５、Ｔ５０３、Ｔ５５０、Ｔ５９２、Ｔ５８１、Ｔ５９７、Ｔ４９１、Ｔ６７１、Ｔ６５９、Ｔ６６０、Ｔ７０１、Ｔ７１３、およびＴ７１６からなる群から選択される野生型ＡＡＶ２キャプシド配列の少なくとも１つのトレオニン残基が、前記非トレオニン残基へと改変される、あるいは前記トレオニン残基が前記化学修飾される；かつ／または
（ｄ）非チロシン残基または化学修飾されたチロシン残基がＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさないように、Ｙ２５２、Ｙ２７２、Ｙ４４４、Ｙ５００、Ｙ７００、Ｙ７０４、およびＹ７３０からなる群から選択される野生型ＡＡＶ２キャプシド配列の少なくとも１つのチロシン残基が、前記非チロシン残基へと改変される、あるいは前記チロシン残基が前記化学修飾される。一実施形態では、非リジン残基または改変されたリジン残基がＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさないように、野生型ＡＡＶキャプシド配列（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２））のＫ５３２、Ｋ４５９、Ｋ４９０、Ｋ５４４、Ｋ５４９、Ｋ５５６、Ｋ５２７、Ｋ４９０、Ｋ１４３、またはＫ１３７から選択されるリジン残基に対応する表面露出リジンが、非リジン残基へと改変される、かつ／または前記化学修飾される。
【００６０】
別の実施形態では、本発明は、野生型ＡＡＶ８キャプシドのＫ５３０、Ｋ５４７、およびＫ５６９に対応する１以上の表面露出リジンが非リジン残基（グルタミン酸（Ｅ）、アルギニン（Ｒ）など）に改変される、かつ／または化学修飾されることを除いて、野生型ＡＡＶ８のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列（配列番号８）を含むＡＡＶキャプシドタンパク質であって、ここで前記非リジン残基または前記改変されたリジン残基がＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさないものである、ＡＡＶキャプシドタンパク質を提供する。ある実施形態では、ＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化を避けるために、ＡＡＶ配列の表面露出リジンがグルタミン酸（Ｅ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、またはイソロイシン（Ｉ）へと改変される。
【００６１】
本発明はまた、本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質（例えば、ＶＰ３）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
【００６２】
一つの特定の実施形態では、野生型ＡＡＶ２キャプシド配列のＫ５３２に対応する表面露出リジン残基が改変される。一実施形態では、ＡＡＶキャプシドの表面露出リジン残基がグルタミン酸（Ｅ）またはアルギニン（Ｒ）へと改変される。一つの特異的な実施形態では、野生型ＡＡＶ２キャプシド配列のＫ５３２に対応する表面露出リジン残基がアルギニンへと改変される（Ｋ５３２Ｒ）。
【００６３】
一実施形態では、野生型ＡＡＶ２キャプシド配列のリジン位置に対応するＡＡＶキャプシドの少なくとも１つの表面露出リジンが、図２Ｂに示されるように改変される。
【００６４】
一実施形態では、非セリン残基または改変されたセリン残基がＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさないように、野生型ＡＡＶキャプシド配列（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２））のＳ６６２、Ｓ２６１、Ｓ４６８、Ｓ４５８、Ｓ２７６、Ｓ６５８、Ｓ３８４、またはＳ４９２から選択されるセリン残基に対応する少なくとも１つの表面露出セリン残基が、前記非セリン残基へと改変される、かつ／または前記化学修飾される。
【００６５】
一つの特定の実施形態では、野生型ＡＡＶ２キャプシド配列のＳ６６２に対応する表面露出セリン残基が改変される。一実施形態では、ＡＡＶキャプシドの表面露出セリン残基がバリン（Ｖ）、アスパラギン酸（Ｄ）、またはヒスチジン（Ｈ）へと改変される。一つの特定の実施形態では、野生型ＡＡＶ２キャプシド配列のＳ６６２に対応する表面露出セリン残基がバリンへと改変される（Ｓ６６２Ｖ）。
【００６６】
一実施形態では、非トレオニン残基または改変されたトレオニン残基がＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさないように、野生型ＡＡＶキャプシド配列［例えば、配列番号１−１０；かつ、特定の実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２）］のＴ４５５、Ｔ４９１、Ｔ５５０、Ｔ６５９、またはＴ６７１から選択されるトレオニン残基に対応する表面露出トレオニン残基が、前記非トレオニン残基へと改変される、かつ／または前記化学修飾される。
【００６７】
一つの特定の実施形態では、野生型ＡＡＶ２キャプシド配列のＴ４９１に対応する表面露出トレオニン残基が改変される。一実施形態では、ＡＡＶキャプシドの表面露出トレオニン残基がバリン（Ｖ）へと改変される。一つの特定の実施形態では、野生型ＡＡＶ２キャプシド配列のＴ４９１に対応する表面露出トレオニン残基がバリンへと改変される（Ｔ４９１Ｖ）。
【００６８】
一実施形態では、ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶキャプシド配列［例えば、配列番号１−１０；かつ、特定の実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２）］の（Ｔ５５０Ｖ＋Ｔ６５９Ｖ＋Ｔ４９１Ｖ）に対応する位置で表面露出トレオニン残基の改変を含む。一実施形態では、非チロシン残基または改変されたチロシン残基がＡＡＶベクターのリン酸化および／またはユビキチン化をもたらさないように、野生型ＡＡＶキャプシド配列（例えば、配列番号１−１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２））のＹ２５２、Ｙ２７２、Ｙ４４４、Ｙ５００、Ｙ７０４、Ｙ７２０、Ｙ７３０、またはＹ６７３から選択されるチロシン残基に対応する表面露出チロシン残基が、前記非チロシン残基へと改変される、かつ／または前記化学修飾される。
【００６９】
一実施形態では、ＡＡＶキャプシドの表面露出チロシン残基がフェニルアラニン（Ｆ）へと改変される。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶキャプシド配列［例えば、配列番号１から配列番号１０；かつ、特定の実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２）］の（Ｙ７３０Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ４４４Ｆ）に対応する位置で表面露出チロシン残基の改変を含む。
【００７０】
一実施形態では、ＡＡＶキャプシドの表面露出リジン、セリン、トレオニンおよび／またはチロシン残基の組み合わせが改変され、ここで改変は野生型ＡＡＶキャプシド配列［例えば、配列番号１から配列番号１０；一実施形態では、野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質（配列番号２）］の（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ）、（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ＋Ｔ５５０Ｖ）、（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ＋Ｔ６５９Ｖ）、（Ｔ４９１Ｖ＋Ｔ５５０Ｖ＋Ｔ６５９Ｖ）、（Ｙ４４０Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ）、（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ＋Ｓ６６２Ｖ）、および／または（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ＋Ｔ５５０Ｖ＋Ｔ６５９Ｖ）に対応する位置で起こる。また、本発明の核酸分子によってコードされるＡＡＶキャプシドタンパク質も提供される。
【００７１】
一実施形態では、本発明は、本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンを提供する。一実施形態では、ｒＡＡＶベクターおよびビリオンは、野生型のｒＡＡＶベクターおよびビリオンと比較した場合、形質導入効率を増強した。別の実施形態では、ｒＡＡＶベクターおよびビリオンは、対象の細胞、組織、および／または臓器の効率的な形質導入が可能である。
【００７２】
一実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、プロモーター、および任意に他の調節因子に作動可能に連結された導入遺伝子（異種核酸分子ともいわれる）をさらに含む。一実施形態では、導入遺伝子は対象の治療剤をコードする。
【００７３】
例示的なプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、デスミン（ＤＥＳ）、ベータ−アクチンプロモーター、インスリンプロモーター、エノラーゼプロモーター、ＢＤＮＦプロモーター、ＮＧＦプロモーター、ＥＧＦプロモーター、成長因子プロモーター、軸索特異的プロモーター、樹状突起特異的プロモーター、脳特異的プロモーター、  海馬特異的プロモーター、腎臓特異的プロモーター、エラフィンプロモーター、サイトカインプロモーター、インターフェロンプロモーター、成長因子プロモーター、アルファ−１アンチトリプシンプロモーター、脳特異的プロモーター、神経細胞特異的プロモーター、中枢神経系細胞特異的プロモーター、末梢神経系細胞特異的プロモーター、インターロイキンプロモーター、セルピンプロモーター、ハイブリッドＣＭＶプロモーター、ハイブリッド．ベータ．−アクチンプロモーター、ＥＦ１プロモーター、Ｕ１ａプロモーター、Ｕ１ｂプロモーター、Ｔｅｔ−誘導性プロモーターおよびＶＰ１６−ＬｅｘＡプロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含むが、これらに限定されない、１以上の異種、組織特異的、構成的または誘導性プロモーターを含む。例示的な実施形態では、プロモーターは哺乳動物またはトリベータ−アクチンプロモーターである。
【００７４】
例示的なエンハンサー配列は、ＣＭＶエンハンサー、合成エンハンサー、肝臓特異的エンハンサー、血管特異的エンハンサー、脳特異的エンハンサー、神経細胞特異的エンハンサー、肺特異的エンハンサー、筋肉特異的エンハンサー、腎臓特異的エンハンサー、膵臓特異的エンハンサー、および膵島細胞特異的エンハンサーからなる群から選択される１以上を含むが、これらに限定されない。
【００７５】
例示的な治療剤は、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗原結合断片、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドからなる群から選択される剤を含むが、これらに限定されない。
【００７６】
例示的な実施形態では、本発明のｒＡＡＶベクターは、アドレナリンアゴニスト、抗アポトーシス因子、アポトーシス阻害剤、サイトカイン受容体、サイトカイン、細胞毒、赤血球生成剤（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、糖タンパク質、成長因子、成長因子受容体、ホルモン、ホルモン受容体、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、キナーゼ、キナーゼ阻害剤、神経成長因子、ネトリン、神経活性ペプチド、神経活性ペプチド受容体、神経性因子（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、神経性因子受容体、ニューロピリン、神経栄養因子、ニューロトロフィン、ニューロトロフィン受容体、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸アンタゴニスト、プレキシン、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、プロテインデカルボキシラーゼ、プロテインキナーゼ、プロテインキナーゼ阻害剤、タンパク質分解性タンパク質（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、タンパク質分解性タンパク質阻害剤、セマフォリンａ、セマフォリン受容体、セロトニン輸送タンパク質、セロトニン取り込み阻害剤、セロトニン受容体、セルピン、セルピン受容体、および腫瘍抑制因子からなる群から選択される治療用タンパク質またはポリペプチドをコードする。
【００７７】
ある適用では、改変された高形質導入効率ベクターは、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、Ｇ−ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ゴナドトロピン、ＩＦＮ、ＩＦＧ−１、Ｍ−ＣＳＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＥＤＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−Ｂ２、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、プロラクチン、ソマトトロピン、ＸＩＡＰ１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１０（１８７Ａ）、ウイルス性ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、およびＩＬ−１８からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸セグメントを含み得る。そのような治療剤は、ヒト、マウス、トリ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ、エピン（ｅｐｉｎｅ）、ヤギ、オオカミ（ｌｕｐｉｎｅ）または霊長類起源のものであってもよい。
【００７８】
本発明による有用な組換えＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓ）または自己相補的（ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）（ｓｃ）ＡＡＶベクターを含む。
【００７９】
本発明のｒＡＡＶベクターはまた、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、エピン（ｅｐｉｎｅ）、ヤギおよびオオカミ（ｌｕｐｉｎｅ）の宿主細胞を含む、単離された哺乳動物の宿主細胞内にあってもよい。ｒＡＡＶベクターは、ヒト内皮細胞、上皮細胞、血管細胞、肝細胞、肺細胞、心臓（ｈｅａｒｔ）細胞、膵臓細胞、腸細胞、腎臓細胞、心（ｃａｒｄｉａｃ）細胞、癌もしくは腫瘍細胞、筋肉細胞、骨細胞、神経細胞、血液細胞、または脳細胞などの、単離された哺乳動物の宿主細胞内にあってもよい。
【００８０】
治療用途
本発明の別の態様は、対象の細胞、組織、および／もしくは臓器の効率的な形質導入のための、かつ／または遺伝子治療における使用のための、本発明のｒＡＡＶベクターおよびビリオンの使用に関する。
【００８１】
一実施形態では、本発明は、有効量の本発明のｒＡＡＶベクターおよび／またはビリオンを含む組成物を細胞内に導入することを含む、対象の細胞、組織、および／または臓器の形質導入のための方法を提供する。
【００８２】
ある実施形態では、本発明のｒＡＡＶベクターおよびビリオンは、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、エピン（ｅｐｉｎｅ）、ヤギおよびオオカミ（ｌｕｐｉｎｅ）の宿主細胞を含む哺乳動物の宿主細胞の形質導入のために用いられる。ある実施形態では、本発明のｒＡＡＶベクターおよびビリオンは、内皮細胞、上皮細胞、血管細胞、肝臓細胞、肺細胞、心臓細胞、膵臓細胞、腸細胞、腎臓細胞、筋肉細胞、骨細胞、樹状細胞、心細胞、神経細胞、血液細胞、脳細胞、線維芽細胞、または癌細胞の形質導入のために用いられる。
【００８３】
一実施形態では、本発明のｒＡＡＶベクターおよび／またはビリオンを用いて、対象の細胞、組織、および／または臓器が形質導入される。
【００８４】
本明細書で用いられる用語「対象」は、本発明の組成物での治療が提供できる、霊長類などの哺乳動物を含む、生物を記載する。開示される治療方法から利益を得ることができる哺乳動物の種は、類人猿（ａｐｅ）；チンパンジー；オランウータン；ヒト；サル（ｍｏｎｋｅｙ）；イヌおよびネコなどの飼い慣らされた動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ  ａｎｉｍａｌ）；ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、およびニワトリなどの家畜；ならびにマウス、ラット、モルモット、およびハムスターなどの他の動物を含むが、これらに限定されない。
【００８５】
また、本発明は、疾患の治療のための方法であって、有効量の、本発明のｒＡＡＶベクターおよび／またはビリオンを含む組成物を、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【００８６】
本明細書で用いられる用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」およびその任意の文法的変形（例えば、治療する（ｔｒｅａｔ）、治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）、および治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）等）は、疾患または状態の症状を緩和する；ならびに／または、疾患または状態の進行、重症度、および／もしくは範囲を低減する、抑制する、阻害する、和らげる、寛解させるもしくは影響を及ぼすことを含むが、これらに限定されない。
【００８７】
本明細書で用いられる用語「有効量」は、疾患または状態を治療するまたは寛解させることができる、あるいは、意図された治療効果を生じることができる量を指す。
【００８８】
本発明はまた、疾患、障害または機能障害の治療、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）および／もしくは予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）、ならびに／またはそのような疾患、障害または機能障害の１以上の症状の寛解を含むが、これらに限定されない、疾患、障害、機能障害、傷害または外傷の症状を治療する、予防する、または寛解させるための医薬の製造における、本明細書に開示される組成物の使用を提供する。ｒＡＡＶウイルスベースの遺伝子治療が特定の有用性を見出し得る例示的な状態は、癌、糖尿病、自己免疫疾患、腎臓病、循環器疾患、膵臓病、腸疾患、肝臓病、神経疾患、神経筋障害、神経運動欠損（ｎｅｕｒｏｍｏｔｏｒ  ｄｅｆｉｃｉｔ）、神経骨格障害（ｎｅｕｒｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）、神経障害（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ）、感覚神経機能不全（ｎｅｕｒｏｓｅｎｓｏｒｙ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）、脳卒中、アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠損症、バッテン病、虚血、摂食障害、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、骨疾患、および肺疾患を含むが、これらに限定されない。
【００８９】
本発明はまた、哺乳動物におけるそのような疾患、傷害、障害、または機能障害の症状を治療するまたは寛解させるための方法を提供する。そのような方法は、一般に、それを必要とする哺乳動物へ、１以上の本発明のｒＡＡＶベクターおよびビリオンを、哺乳動物におけるそのような疾患、傷害、障害、または機能障害の症状を治療するまたは寛解させるのに十分な量および時間で、投与する段階を少なくとも含む。
【００９０】
そのような治療計画は、１以上の組成物の、筋肉内、静脈内、皮下、くも膜下腔内、腹腔内、または治療中の対象の臓器もしくは組織への直接注入による投与を介する、ヒト治療において、特に意図される。
【００９１】
本発明はまた、それを必要とする哺乳動物に、治療有効量の本発明のｒＡＡＶ組成物を、ｒＡＡＶベクター内に含まれる１以上の核酸セグメントによりコードされる、治療有効量の所望の治療剤を患者に提供するのに十分な量および時間で、提供するための方法を提供する。好ましくは、治療剤は、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗原結合断片、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドからなる群から選択される。
【００９２】
医薬組成物
本発明はまた、治療的または医薬的に許容可能な担体と組み合わせることができる形で活性成分を含む治療または医薬組成物を提供する。本発明の遺伝子構築物は、様々な組成物に調製されてもよく、かつヒトまたは動物対象への投与のための適切な医薬媒体に製剤化されてもよい。
【００９３】
本発明のｒＡＡＶ分子およびそれらを含む組成物は、様々な障害、特に、例えば骨関節炎、リウマチ性関節炎、および関連する障害を含む関節の疾患、障害、および機能障害の症状の治療、制御、および寛解のための新規かつ有用な治療薬を提供する。
【００９４】
本発明はまた、１以上の開示されたｒＡＡＶベクター、発現系、ビリオン、ウイルス粒子；または哺乳動物の細胞を含む組成物を提供する。後述の通り、そのような組成物は、医薬的賦形剤、バッファー、または希釈剤をさらに含んでもよく、かつ動物、特にヒトへの投与のために製剤化されてもよい。そのような組成物は、リポソーム、脂質、脂質複合体、ミクロスフェア、マイクロ粒子、ナノスフェア、またはナノ粒子を任意にさらに含んでもよく、あるいは、それを必要とする対象の細胞、組織、臓器、または身体への投与のために製剤化されてもよい。そのような組成物は、癌、腫瘍、もしくは他の悪性増殖、神経欠損機能障害（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｅｆｉｃｉｔ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）、自己免疫疾患、関節疾患、心臓（ｃａｒｄｉａｃ）もしくは肺疾患、虚血、脳卒中、脳血管発作（ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｃｃｉｄｅｎｔ）、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）；糖尿病および／または膵臓の他の病気；心循環系疾患または機能障害（例えば、低血圧症、高血圧症、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、血管損傷または疾患を含む）；神経疾患（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、テイ・サックス病、およびパーキンソン病、物忘れ、トラウマ（ｔｒａｕｍａ）、運動障害、神経障害（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、ならびに関連した障害を含む）；胆道、腎臓または肝臓疾患もしくは機能障害；筋骨格または神経筋疾患（例えば、関節炎、麻痺、嚢胞性線維症（ＣＦ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋ジストロフィー（ＭＤ）、等を含む）などの疾患または障害をもたらす状態を例えば含む、例えば、ペプチド欠損症、ポリペプチド欠損症、ペプチド過剰発現、ポリペプチド過剰発現などの状態の寛解、予防、および／または治療におけるなどの、様々な治療における使用のために製剤化され得る。
【００９５】
一実施形態では、哺乳動物に投与されるｒＡＡＶベクターおよび／またはビリオン粒子の数は、およそ１０３から１０１３粒子／ｍｌの範囲であり、あるいは、例えば約１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、または１０１３粒子／ｍｌなど、それらの間の任意の値であり得る。一実施形態では、１０１３粒子／ｍｌより多くのｒＡＡＶベクターおよび／またはビリオン粒子が投与される。ｒＡＡＶベクターおよび／またはビリオン粒子は、単一用量として投与することができ、あるいは、治療されている特定の疾患または障害の治療を達成するのに必要な場合、２以上の投与に分けることができる。ほとんどのｒＡＡＶベースの遺伝子治療計画において、発明者らは、従来の遺伝子治療プロトコールに比べて、改変キャプシドｒＡＡＶベクターを用いる時、より低い力価の感染性粒子が必要とされるだろうと確信している。
【００９６】
ある実施形態では、本発明は、単独または１以上の他の治療様式との組み合わせにおける、特に、ヒトに影響を及ぼすヒト細胞、組織、および疾患の治療のための、細胞または動物への投与のための医薬的に許容可能な溶液における、本明細書に開示される１以上のｒＡＡＶベースの組成物の製剤に関する。
【００９７】
所望であれば、１以上の治療遺伝子産物を発現する核酸セグメント、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＰＮＡ組成物は、治療用ポリペプチド、生物活性断片、またはそれらのバリアントの１以上の全身または局所投与を含む、例えば、タンパク質もしくはポリペプチドもしくは様々な医薬的に活性な剤などの他の剤と組み合わせて投与されてもよい。実際、追加の剤が標的細胞または宿主組織との接触時に著しい悪影響を引き起こさないなら、含まれ得る他の成分に対する制限は事実上存在しない。ｒＡＡＶベースの遺伝的組成物（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、それゆえ、特定の場合に必要とされる様々な他の剤と一緒に送達され得る。そのような組成物は、宿主細胞または他の生物学的供給源から精製されてもよく、あるいは本明細書に記載されるように化学的に合成されてもよい。同様に、そのような組成物は、置換または誘導体化されたＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボザイム、触媒ＲＮＡ分子、またはＰＮＡ組成物等をさらに含んでもよい。
【００９８】
医薬的に許容可能な賦形剤および担体溶液の製剤は、例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、関節内、筋肉内投与および製剤を含む、本明細書に記載される特定の組成物を用いるための適切な用量および治療計画の開発があるように、当業者によく知られている。
【００９９】
典型的には、有効成分のパーセンテージは、もちろん、変化してもよく、かつ好都合には、約１または２％の間、かつ総製剤の重量または用量の約７０％または８０％以上であるが、これらの製剤は、少なくとも約０．１％以上の活性化合物を含有しうる。当然、個々の治療上有用な組成物における活性化合物の量は、適切な用量が化合物の任意の単位用量において得ることができるような方法で、調製される。溶解度、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品貯蔵期間、ならびに他の薬理学的考慮点などの因子は、そのような医薬製剤を調製する当業者により熟慮され、ゆえに、様々な用量および治療計画が望ましいことがある。
【０１００】
ある状況において、皮下、眼球内、硝子体内（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌｌｙ）、非経口、皮下、静脈内、脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｌｙ）、筋肉内、くも膜下腔内、経口、腹腔内、経口または経鼻吸入により、あるいは直接注入による１以上の細胞、組織、または臓器への直接注入により、本明細書に開示される適切に製剤化された医薬組成物におけるＡＡＶベクターベースの治療構築物を送達することが望ましいだろう。投与方法はまた、米国特許第５，５４３，１５８号、第５，６４１，５１５号および／または第５，３９９，３６３号（各々、それらの出典を表すことによりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）に記載される様式を含み得る。遊離塩基または医薬的に許容可能な塩としての活性化合物の溶液は、無菌の水に調製してもよく、あるいはヒドロキシプロピルセルロースなどの１以上の界面活性剤と適切に混合してもよい。分散液（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物において、および油中において調製され得る。保存および使用の通常の条件の下、これらの調製物は、微生物の成長を防止するために防腐剤を含有する。
【０１０１】
注射可能な使用に適切なＡＡＶベースのウイルス組成物の医薬品形態は、無菌の水溶液もしくは分散液および無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための無菌の粉末を含む（米国特許第５，４６６，４６８号、その出典を表すことによりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）。全ての場合において、形態は無菌でなくてはならず、かつ容易な注射器使用可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、かつ細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、等）、それらの適切な混合物、および／または植物油を含有する、溶媒または分散媒（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合は必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。
【０１０２】
用語「担体」は、化合物が共に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体を指す。そのような医薬担体は、鉱物油などの石油、ピーナッツ油、大豆油、およびごま油などの植物油、動物油、または合成起源の油のものを含む、水および油などの無菌の液体とすることができる。生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、液体担体として採用できる。
【０１０３】
本発明の組成物は、肺、鼻腔内、経口、吸入、静脈内などの非経口、局所、経皮、皮内、経粘膜、腹腔内、筋肉内、嚢内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）、眼窩内、心臓内、経気管、皮下、表皮下（ｓｕｂｃｕｔｉｃｕｌａｒ）、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）注入を含むが、これらに限定されない、標準的な経路により、治療される対象へ投与できる。好ましい実施形態では、組成物は、鼻腔内、肺、または経口経路を介して投与される。
【０１０４】
注射用水溶液の投与のために、例えば、溶液を適切に緩衝することができ、必要に応じて、液体希釈剤は最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、採用できる無菌の水性媒体は、本開示に照らして当業者に公知であろう。例えば、１回用量は、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解してもよいし、１０００ｍｌの皮下注入液に加えられるか、注入予定部位に注入されるかのいずれかであってもよい（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”  １５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐａｇｅｓ  １０３５−１０３８  ａｎｄ  １５７０−１５８０を参照のこと）。用量のいくらかの変動が、治療される被験体の状態に応じて必然的に発生するだろう。投与責任者は、いずれにせよ、個々の対象に適切な用量を決定するだろう。さらに、ヒトへの投与のために、調製物は、無菌性、発熱性、およびＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｓｔａｎｄａｒｄｓによって必要とされる一般的な安全性および純度の基準を満たす必要がある。
【０１０５】
無菌注射溶液は、活性ＡＡＶベクター送達型治療用ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を、上記に列挙した他の成分のいくつかと適切な溶媒中に必要量を組み込むことによって、必要に応じて、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、基本的な分散媒および上に列挙したもの由来の必要な他の成分を含有する無菌媒体に、様々な無菌活性成分を組み込むことによって調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め濾過滅菌したその溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る真空乾燥技術および凍結乾燥技術である。
【０１０６】
本明細書に開示されるＡＡＶベクター組成物はまた、中性または塩形態で製剤化してもよい。医薬的に許容可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）を含み、それは、例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等などの有機酸と形成されている。遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、ならびに、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等などの有機塩基から誘導できる。製剤化の際、溶液は、投与製剤に適合する方法で、かつ治療的に有効であるような量で投与されるであろう。製剤は、注射可能な溶液、薬物放出カプセル等などの様々な剤形で容易に投与される。
【０１０７】
ＡＡＶ組成物の量およびそのような組成物の投与の時間は、本教示の利益を有する当業者の知識の範囲内であろう。しかしながら、治療有効量の開示された組成物の投与は、そのような治療を受けている患者に治療上の利益を提供するように、例えば、感染性粒子の十分な数の単回注入などの、単回投与によって達成され得る可能性がある。あるいは、いくつかの状況では、そのような組成物の投与を監督する医師によって決定され得るように、比較的短い、または、比較的長い期間にわたって、ＡＡＶベクター組成物の複数回、または連続的な投与を提供することが望ましい。
【０１０８】
発現ベクター
本発明は、様々なＡＡＶベースの発現系、およびベクターを意図する。一実施形態では、好ましいＡＡＶ発現ベクターは、治療用ペプチド、タンパク質、またはポリペプチドをコードする少なくとも第一の核酸セグメントを含む。別の実施形態では、本明細書に開示される好ましいＡＡＶ発現ベクターは、アンチセンス分子をコードする少なくとも第一の核酸セグメントを含む。別の実施形態では、プロモーターが機能的ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボザイムまたはアンチセンスＲＮＡをコードする配列領域に作動可能に連結される。
【０１０９】
発現ベクターおよび最終的にポリペプチドコード領域が作動可能に連結されるプロモーターの選択は、所望の機能特性、例えば、位置およびタンパク質発現のタイミング、ならびに形質転換される宿主細胞に直接依存する。これらは、組換えＤＮＡ分子を構築する技術に固有の既知の制限である。しかしながら、本発明の実施に有用なベクターは、それが作動可能に連結された機能的ＲＮＡの発現を指向し得る。
【０１１０】
相補的粘着末端または平滑末端を介してベクターにＤＮＡを作動可能に連結するために、様々な方法が開発されてきた。例えば、相補的ホモポリマー領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｔｒａｃｔ）は、挿入されるＤＮＡセグメントおよびベクターＤＮＡに追加できる。ベクターおよびＤＮＡセグメントは、次いで、組換えＤＮＡ分子を形成する相補的ホモポリマーテール間の水素結合によって結合される。
【０１１１】
本発明による治療剤を発現するために、１以上のプロモーターの制御下で、治療剤をコードする核酸セグメントを含むチロシン改変ｒＡＡＶ発現ベクターを調製してもよい。プロモーター「の制御下」に配列をもたらすために、選択されたプロモーターの約１〜約５０ヌクレオチド「下流」（すなわち、３’）の間に、一般に、転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端を配置する。「上流」プロモーターはＤＮＡの転写を刺激し、コードされたポリペプチドの発現を促進する。これが、この文脈における「組換え発現」の意味である。特に好ましい組換えベクター構築物は、ｒＡＡＶベクターを含むものである。そのようなベクターは、本明細書に詳細に記載されている。
【０１１２】
そのようなベクターの使用が、ベクターでトランスフェクトされた特定の細胞への１以上の異種タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、リボザイム、および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入のために意図されている場合、コードされたペプチド、タンパク質、ポリペプチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを産生するためにベクターを含む細胞において、ポリヌクレオチドを発現する、少なくとも第一の異種プロモーターの下流に作動可能に配置され、かつその制御下にある、少なくとも第一の異種ポリヌクレオチドをさらに含むために、ｒＡＡＶベクターまたはベクターを遺伝的に改変することによる本明細書に開示されるチロシン改変ｒＡＡＶベクターを採用し得る。そのような構築物は、構成的、誘導性、または細胞特異的プロモーターである異種プロモーターを採用し得る。例示的なそのようなプロモーターは、例えば、ＣＭＶプロモーター、．ベータ．−アクチンプロモーター、ハイブリッドＣＭＶプロモーター、ハイブリッド．ベータ．−アクチンプロモーター、ＥＦ１プロモーター、Ｕ１ａプロモーター、Ｕ１ｂプロモーター、Ｔｅｔ−誘導性プロモーター、ＶＰ１６−ＬｅｘＡプロモーター、等を含む、ウイルス、哺乳動物、およびトリプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【０１１３】
ベクターまたは発現系はまた、ｒＡＡＶのベクターの中にクローニングされた異種遺伝子の転写を変更するまたは達成する（ｅｆｆｅｃｔ）ために、１以上のエンハンサー、調節エレメント、転写エレメントを含んでもよい。例えば、本発明のｒＡＡＶのベクターは、少なくとも第一のＣＭＶエンハンサー、合成エンハンサー、または細胞もしくは組織特異的エンハンサーをさらに含んでもよい。異種ポリヌクレオチドはまた、１以上のイントロン配列を含んでもよい。
【０１１４】
治療キット
本発明はまた、特定のｒＡＡＶ−ポリヌクレオチド送達製剤の製剤化において、かつ対象への、特にヒトへの投与のための治療剤の調製において採用され得る、医薬的に許容可能な賦形剤、担体、希釈剤、アジュバント、および／または他の成分と共に、本明細書に開示される遺伝的に改変されたｒＡＡＶベクター組成物の１以上を含む。特に、そのようなキットは、対象におけるそのような障害の治療におけるウイルスベクターを使用するための指示書と組み合わせて、１以上の開示されたｒＡＡＶ組成物を含み得、また典型的には、便利な商業包装のために調製した容器をさらに含むことができる。
【０１１５】
したがって、本明細書に開示される医薬組成物の投与のための好ましい動物は、哺乳動物、特にヒトを含む。他の好ましい動物はマウス、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、およびネコが含まれる。組成物は、部分的にまたは著しく精製されたｒＡＡＶ組成物を、単独で、あるいは、天然または組換え供給源から得ることができる、あるいは、天然に得ることができる、もしくは化学合成され得る、またはそのようなさらなる活性成分をコードするＤＮＡセグメントを発現する組換え宿主細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生される、１以上のさらなる活性成分と組み合わせて含み得る。
【０１１６】
少なくとも１つの本明細書に開示される組成物および治療剤として組成物を使用するための指示書を含む治療キットもまた調製され得る。そのようなキットのための容器手段は、典型的には、開示されたｒＡＡＶの組成物が配置され得る、好ましくは適切に等分され得る、少なくとも一つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段を含み得る。第二の治療用ポリペプチド組成物も提供される場合、キットは、この第二の組成物が配置され得る第二の別個の容器を含んでもよい。あるいは、複数の治療的生物活性組成物は、単一の医薬組成物に調製してもよく、バイアル、フラスコ、シリンジ、ボトル、または他の適切な単一の容器手段などの、単一の容器手段中に包装してもよい。本発明のキットはまた、典型的には、例えば、所望のバイアルが保持されている射出またはブロー成形プラスチック容器などの、市販のために厳重に密封して（ｉｎ  ｃｌｏｓｅ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）バイアルを含有するための手段を含むだろう。
【０１１７】
４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムを保護することができる、非エンベロープ型、Ｔ−１正二十面体格子（ｉｃｏｓａｈｅｄｒａｌ  ｌａｔｔｉｃｅ）内の６０個の個々のキャプシドタンパク質サブユニットの超分子集合（Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）は、ヘルパー依存性ヒトパルボウイルス、アデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ２）のライフサイクルにおける重要なステップである。成熟した２０ｎｍ直径のＡＡＶ２粒子は、１：１：１８の割合でＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３（それぞれ、８７、７３、および６２ｋＤａの分子量）と名付けられた三つの構造タンパク質から構成される。粒子を含む６０個のキャプシドタンパク質のその対称性と、これらの分子量推定値に基づくと、３個がＶＰ１タンパク質であり、３個がＶＰ２タンパク質であり、かつ５４個がＶＰ３タンパク質である。
【０１１８】
生物学的機能的等価物
改変は、特に、様々な疾患および障害の治療、予防、および予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）のための、選択された哺乳動物の細胞、組織、および臓器への、治療用遺伝子構築物の改善された送達、ならびに、そのような疾患の症状の寛解のための手段に関して、望ましい特性を有する機能的なウイルスベクターを得るために、本明細書において記載される改善されたｒＡＡＶビリオンを提供するための、かつｒＡＡＶベクター介在性遺伝子治療を介する対象の異種治療的および予防的ポリペプチドの発現を促進するための、野生型のｒＡＡＶベクターのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造への変化である。上述のように、本発明の重要な態様の一つは、開示されたｒＡＡＶ構築物によりコードされる１以上の治療剤をコードする特定のヌクレオチド配列への１以上の変異の作成である。特定の状況では、結果として生じるポリペプチド配列はこれらの変異により変更され、あるいは他の場合には、ポリペプチドの配列は、哺乳動物系における遺伝子治療を達成する（ｅｆｆｅｃｔ）ための改善された特性を有する改変されたベクターを産生するために、コードポリヌクレオチドにおいて１以上の変異によって変更されない。
【０１１９】
例えば、あるアミノ酸は、例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位などの、構造の相互作用結合能力のかなりの損失無しに、タンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。タンパク質の生物学的機能活性を規定するのはタンパク質の相互作用能力および性質であるので、あるアミノ酸配列置換はタンパク質配列、および当然その基礎となるＤＮＡコード配列において作成でき、かつそれにもかかわらず、同様の特性を有するタンパク質を得ることができる。それゆえ、様々な変化が、それらの生物学的有用性または活性のかなりの損失なしに、本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列において作成され得ることが、本発明者らによって企図される。
【０１２０】
そのような変更を行う際に、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮され得る。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際の疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、一般に当技術分野で理解されている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２、出典明示により本明細書に組み込まれる）。アミノ酸の相対的ハイドロパシー特性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ）が得られたタンパク質の二次構造に寄与し、それが他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原、等とタンパク質の相互作用を定義することが認められている。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標を割り当てられている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）、これらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
【０１２１】
例示的な定義
本発明による、ポリヌクレオチド、核酸セグメント、核酸配列等は、ＤＮＡ（ゲノムもしくはゲノム外ＤＮＡを含むが、これらに限定されない）、遺伝子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＲＮＡｓ（ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡを含むが、これらに限定されない）、ヌクレオシド、および天然の供給源から得られた、化学合成された、あるいは、人の手によって全体的または部分的に調製または合成された核酸セグメントを含むが、これらに限定されない。
【０１２２】
別段の定義がない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および組成物は、本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および組成物は本明細書に記載される。本発明の目的のため、以下の用語が以下に定義される：
【０１２３】
本明細書で用いられる用語「プロモーター」は、転写を調節する核酸配列の領域（単数）または領域（複数）を指す。
【０１２４】
本明細書で用いられる用語「調節エレメント」は、転写を調節する核酸配列の領域（単数）または領域（複数）を砂州。例示的な調節エレメントは、エンハンサー、転写後エレメント、転写制御配列、等を含むが、これらに限定されない。
【０１２５】
本明細書で用いられる用語「ベクター」は、宿主細胞中で複製することができる（通常はＤＮＡで構成される）、かつ／または結合したセグメントの複製をもたらすように別の核酸セグメントが作動可能に連結できる核酸分子を指す。プラスミド、コスミド、またはウイルスが典型的なベクターである。
【０１２６】
本明細書中で用いられる用語「実質的に対応する」、「実質的に相同」、または「実質的に同一」は、核酸またはアミノ酸配列の特徴であって、選択された核酸またはアミノ酸配列が、選択された参照核酸またはアミノ酸配列と比較して少なくとも約７０または約７５パーセントの配列同一性を有するものである特徴を意味する。より典型的には、選択された配列および参照配列は、少なくとも約７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４または８５パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５パーセントの配列同一性を有する。より好ましくは、なお高度に相同な配列は、多くの場合、選択された配列とそれが比較される参照配列との間で、少なくとも約９６、９７、９８、または９９パーセントの配列同一性よりも大きく共有する。
【０１２７】
配列同一性のパーセンテージは、比較される配列の全長にわたって計算してもよく、または選択された参照配列の約２５％未満ほどをしめる小さな欠失または付加を除外することによって計算してもよい。参照配列は、遺伝子もしくはフランキング配列の一部分、または染色体の反復部分などの、より大きな配列のサブセットであってもよい。しかしながら、２以上のポリヌクレオチド配列の配列相同性の場合には、参照配列は、典型的には少なくとも約１８〜２５ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約２６から３５ヌクレオチド、さらにより典型的には少なくとも約４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドほどを含む。
【０１２８】
望ましくは、高度に相同なフラグメントが望まれる、２つの配列間のパーセント同一性の程度は、例えば、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５（８）：２４４４−８、Ａｐｒｉｌ  １９８８）によって記載されたＦＡＳＴＡプログラム解析などの、当業者によく知られている配列比較アルゴリズムの１以上により容易によって決定されるように、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは約９０％または９５％以上である。
【０１２９】
本明細書で用いられる用語「作動可能に連結された」は、連結されている核酸配列が、典型的には近接している（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）、または実質的に近接している、かつ２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合には、近接し、リーディングフレームにあることを指す。しかしながら、エンハンサーは、数キロベースおよび可変の長さであり得るイントロン配列によりプロモーターから分離される場合に一般に機能するので、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは、作動可能に連結されるが、近接していなくてもよい。
【実施例】
【０１３０】
本発明を実施するための手順および実施形態を例示する実施例は以下の通りである。実施例は限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１３１】
材料および方法：
細胞および抗体：ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から入手し、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）および抗生物質（Ｌｏｎｚａ）を補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において単層培養として維持した。白血球除去由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥＨｅａｔｈＣａｒｅ）上で精製し、無血清ＡＩＭ−Ｖ培地（Ｌｏｎｚａ）で再懸濁し、そして半接着細胞画分を、組換えヒトＩＬ−４（５００Ｕ／ｍＬ）およびＧＭ−ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と７日間インキュベートした。細胞成熟は、４８時間、１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−α、１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−１、１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−６、および１ｍｇ／ｍＬ  ＰＧＥ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含むサイトカイン混合物で開始した。ＥＧＦＰ発現の前に、細胞を、それらが成熟樹状細胞（ｍＤＣ）の典型的な表現型を満たすことを確保するために、共刺激分子の発現について特徴付けた（ＣＤ８０、ＲＰＥ、マウスＩｇＧ１；ＣＤ８３、ＲＰＥ、マウスＩｇＧ１；ＣＤ８６、ＦＩＴＣ、マウスＩｇＧ１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
【０１３２】
部位特異的変異誘発：以前に述べられたように（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９）、Ｔｕｒｂｏ（登録商標）Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、二段階ＰＣＲをプラスミドｐＡＣＧ２で実施した。簡単に言えば、第一段階では、２つのＰＣＲ伸長反応が、別々のチューブでフォワードおよびリバースＰＣＲプライマーについて３サイクル実施された。第二段階では、二つの反応を混合し、ＰＣＲ反応をさらに１５サイクル、続いて１時間のＤｐｎＩ消化を実施した。プライマーは、変異した残基の各々について、セリンから（ＴＣＡまたはＡＧＣ）バリン（ＧＴＡまたはＧＴＣ）への変更を導入するように設計された。
【０１３３】
組換えＡＡＶベクターの産生：ｃｈｉｃｋｅｎ（登録商標）−アクチンプロモーターにより駆動されるＥＧＦＰ遺伝子を含有する組換えＡＡＶ２ベクターを、以前に述べられたように（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ、２００２）生成した。簡単に言えば、ＨＥＫ２９３細胞を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、直鎖、ＭＷ  ２５，０００、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクション後７２時間、細胞を回収し、ベクターをイオジキサノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）勾配遠心分離およびイオン交換カラムクロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ  Ｓｐ  Ｈｐ  ５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製した。次いで、ウイルスを濃縮し、遠心スピンコンセントレーター（Ａｐｏｌｌｏ、１５０−ｋＤａカット−オフ、２０−ｍＬ容量、ＣＬＰ）を用いてバッファーを乳酸リンゲルに３サイクル交換した（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１）。１０μＬの精製ウイルスをＤＮＡｓｅ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２時間３７℃で、次いで、さらに２時間プロテイナーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で５６℃で処置した。反応混合物をフェノール／クロロホルムにより、その後クロロホルム処理により精製した。パッケージ化されたＤＮＡを、２０μｇ  グリコーゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下、エタノールで沈殿させた。ＤＮＡｓｅ  Ｉ耐性ＡＡＶ粒子の力価を、ＣＢＡプロモーターに特異的な、以下のプライマー対を用いるＲＴ−ＰＣＲによって決定した：
フォワード  ５’-ＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧ-３’  （配列番号１１）
リバース  ５’-ＣＴＴＧＧＣＡＴＡＴＧＡＴＡＣＡＣＴＴＧＡＴＧ-３’  （配列番号１２）
およびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
【０１３４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組換えＡＡＶベクター形質導入アッセイ：ＨＥＫ２９３または単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣｓ）を、それぞれ、１，０００ｖｇｓ／細胞または２，０００ｖｇｓ／細胞でＡＡＶ２ベクターで形質導入し、４８時間インキュベートした。あるいは、細胞を、５０μＭの選択的セリン／トレオニンキナーゼ阻害剤、２−（２−ヒドロキシエチルアミノ）−６−アミノヘキシルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル−９−イソプロピルプリン（ＣａＭＫ−ＩＩに対して）、アントラ［１，９−ＣＤ］ピラゾール−６（２Ｈ）−オン、１，９−ピラゾロアントロン（ＪＮＫに対して）、および４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＭＡＰＫに対して）（ＣＫ５９、ＪＮＫ阻害剤２、ＰＤ  ９８０５９、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で、形質導入前１時間、前処置した。導入遺伝子の発現は、視野当たりの緑色蛍光（ｐｉｘｅｌ２）の総面積（平均±ＳＤ）として、または以前に述べられたように（Ｍａｒｋｕｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１；  Ｊａｙａｎｄｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１）フローサイトメトリーにより、評価した。分散分析を用いて、試験結果および統計的に有意であると決定された対照を比較した。
【０１３５】
ウェスタンブロット解析：ウェスタンブロット解析は以前に述べられたように（Ａｓｌａｎｉｄｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００７）実施した。細胞を遠心分離によって回収し、ＰＢＳで洗浄し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＿ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ノニデットＰ−４０、１０％グリセロール、１０ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、およびプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤混合物（セット２および３、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を補充した１ｍＭ  ＥＧＴＡを含有する溶解バッファーに再懸濁した。懸濁液を氷上で１時間インキュベートし、３０分間１４，０００ｒｐｍで４℃で遠心分離により清澄化した。タンパク質濃度についての正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）に続いて、サンプルを１２％ポリアクリルアミド／ＳＤＳ電気泳動を用いて分離し、ニトロセルロース膜に移し、そして一次抗体、抗ｐ−ｐ３８  ＭＡＰＫ  （Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）ウサギｍＡｂ、総ｐ３８  ＭＡＰＫウサギｍＡｂおよびＧＡＰＤＨウサギｍＡｂ（１：１０００、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）、続いて二次ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体（１：１０００、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いてプローブした。
【０１３６】
特異的細胞傷害性Ｔリンパ球生成および細胞毒性アッセイ：単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣｓ）を上述のように生成した。未成熟ＤＣを、ヒトテロメラーゼｃＤＮＡをコードするＡＡＶ２−Ｓ６６２Ｖベクター（Ｋａｒｉｎａ  Ｋｒｏｔｏｖａ博士、フロリダ大学）で感染させ、２つの重複ＯＲＦ−ｈＴＥＲＴ８３８−２２２９およびｈＴＥＲＴ２０４２−３４５４に、各々ＭＯＩ  ２，０００ｖｇｓ／細胞で分離した。次いで、サプリメントでの刺激を細胞に受けさせ、成熟を誘導した。４８時間後、ｈＴＥＲＴを発現する成熟ＤＣを回収し、２０：１の比でＰＢＭＣと混合した。ＣＴＬは、２５ｃｍ２フラスコにおいて、２０×１０６個の細胞で、組換えヒトＩＬ-１５（２０ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ-７（２０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地中で培養した。新鮮なサイトカインを２日ごとに添加した。プライミング７日後、細胞を回収し、殺傷アッセイ（ｋｉｌｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）（Ｈｅｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）のために用いた。殺傷曲線を生成し、以前に述べられたように（Ｍａｔｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７）特異的細胞溶解を生存／死細胞比のＦＡＣＳ分析により決定した。ヒト不死化骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２を標的として用いた。
【０１３７】
統計分析：結果を平均±ＳＤとして表した。群間の差は、スチューデントのｔ検定のグループ化−対応のない両側分布を用いて同定した。Ｐ値＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。
【０１３８】
実施例１−特異的な細胞性セリン／トレオニンキナーゼの阻害はｒＡＡＶ２ベクターの形質導入効率を増大させる
細胞性上皮成長因子受容体タンパク質チロシンキナーゼ（ＥＧＦＲ−ＰＴＫ）活性の阻害、ならびに７個の表面露出チロシン残基の部位特異的変異誘発は、これらの残基のリン酸化を防止することにより、ＡＡＶ２ベクターの形質導入効率を著しく増大させ、それによってベクターのユビキチン化およびそれに続くプロテアソーム介在性分解を回避した。ＡＡＶ２キャプシドはまた、様々な細胞型および組織において広く発現されている細胞性セリン／トレオニンキナーゼにより潜在的にリン酸化できる、１５個の表面露出セリン残基を含有する。
【０１３９】
そのようなキナーゼ活性の阻害が、表面露出セリン残基のリン酸化を防止し、それゆえ、ＡＡＶ２ベクターの細胞内輸送および核輸送を改善できるかどうかを調べるために、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣＡＭＫ−ＩＩ）、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ｐ３８  ＭＡＰＫ）などの、いくつかの市販の細胞性セリン／トレオニンキナーゼの特異的阻害剤が用いられた。ＨＥＫ２９３細胞を、２−（２−ヒドロキシエチルアミノ）−６−アミノヘキシルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル−９−イソプロピルプリン（ＣａＭＫ−ＩＩに対して）、アントラ［１，９−ＣＤ］ピラゾール−６（２Ｈ）−オン、１，９−ピラゾロアントロン（ＪＮＫに対して）、および４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ｐ３８  ＭＡＰＫに対して）などの特異的阻害剤で、１時間、様々な濃度で前処置した。細胞を、その後、細胞当たり１，０００ベクターゲノム（ｖｇｓ）で、一本鎖（ｓｓ）または自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶ２ベクターのいずれかで形質導入した。
【０１４０】
これらの結果は、５０μＭの濃度ですべての阻害剤が、ｓｓＡＡＶ２およびｓｃＡＡＶ２ベクターの形質導入効率を著しく増大させ、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤が最も効率的であったことを示す（図３Ａおよび図３Ｂ）。結果は、形質導入効率の増大が、改善されたウイルスの第二鎖ＤＮＡ合成（ｓｅｃｏｎｄ−ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）よりも、ベクターキャプシドのリン酸化の防止に起因したことを示す。
【０１４１】
実施例２−表面露出セリン残基の部位特異的変異誘発はベクター介在性導入遺伝子発現を改善する
ＡＡＶ２キャプシドは、３つのキャプシドＶＰのウイルスタンパク質３（ＶＰ３）共通領域において、５０個のセリン（Ｓ）残基を含有し、その１５残基（Ｓ２６１、Ｓ２６４、Ｓ２６７、Ｓ２７６、Ｓ３８４、Ｓ４５８、Ｓ４６８、Ｓ４９２、Ｓ４９８、Ｓ５７８、Ｓ６５８、Ｓ６６２、Ｓ６６８、Ｓ７０７、Ｓ７２１）が表面に露出している。１５個のＳ残基の各々を、前述のように部位特異的変異誘発によりバリン（Ｖ）残基に置換した。ほとんどの変異体は、Ｓ２６１Ｖ、Ｓ２７６Ｖ、およびＳ６５８Ｖを除いて、これらは〜１０倍低い力価で生成され、かつＳ２６７ＶおよびＳ６６８Ｖは検出可能なレベルのＤＮＡｓｅ  Ι−耐性ベクター粒子を全く生じなかった、ＷＴ  ＡＡＶ２ベクターに類似の力価で生成できた。Ｓ４６８ＶおよびＳ３８４Ｖ変異体の力価はＷＴ  ＡＡＶ２ベクターより〜３−５倍高かった。Ｓ−Ｖ変異ベクターの各々が２９３細胞における形質導入効率について評価された。
【０１４２】
図４Ａおよび図４Ｂに示されるこれらの結果は、１５個の変異体のうち、Ｓ６６２Ｖ変異体がそのＷＴ対応物よりも〜２０倍より効率的に２９３細胞を形質導入したことを示した。Ｓ４５８ＶおよびＳ４９２Ｖ変異ベクターの形質導入効率は、それぞれ、〜４および２倍に増大した。ＷＴ  ＡＡＶ２ベクターよりも高い力価で産生された、Ｓ４６８ＶおよびＳ３８４Ｖ変異体の形質導入効率は、同一の感染多重度（ＭＯＩ）で、変わらないままであった（Ｓ４６８Ｖ）か、〜１０倍低減した（Ｓ３８４Ｖ）かのいずれかであった。様々なセリンからバリンへ変異したＡＡＶ２ベクターの形質導入効率が、図５に要約されている。驚くべきことに、形質導入効率の更なる増大は、二重変異（Ｓ４５８Ｖ＋Ｓ６６２ＶおよびＳ４９２Ｖ＋Ｓ６６２Ｖ）のいずれかを含有するベクターにおいて、または三重変異（Ｓ４５８Ｖ＋Ｓ４９２Ｖ＋Ｓ６６２Ｖ）を含有していたベクターにおいて、全く観察されなかった。
【０１４３】
実施例３−様々なアミノ酸でのＳ６６２の置換
位置６６２でのＳからＶへの置換に加えて、以下の７つの変異体もまた異なるアミノ酸置換を用いて作製された：Ｓ６６２→アラニン（Ａ）、Ｓ６６２→アスパラギン（Ｎ）、Ｓ６６２→アスパラギン酸（Ｄ）、Ｓ６６２→ヒスチジン（Ｈ）、Ｓ６６２→イソロイシン（Ｉ）、Ｓ６６２→ロイシン（Ｌ）、およびＳ６６２→フェニルアラニン（Ｆ）。これらの変異ベクターの各々の形質導入効率もまた、上記のものに類似する２９３細胞において評価した。
【０１４４】
結果は、図６Ａおよび図６Ｂに示され、かつ図７に要約されるように、他の変異体と比較した場合、ＶでのＳの置換が、ベクター力価を変更せずに、最も効率的な変異体の産生をもたらしたことを示している。Ｎ、Ｉ、Ｌ、またはＦでのＳの置換は、形質導入効率に著しい影響を与えず、〜１０倍パッケージング効率を減少させ、一方で、ＤまたはＨでの置換は、ベクター力価に影響を与えずに、それぞれ〜８倍および〜４倍形質導入効率を増大させた。ＳからＡへの置換は、ＷＴ  ＡＡＶ２ベクターと比較して、最大〜５倍ウイルス力価を増大させ、かつ〜３倍導入遺伝子発現を増強した。位置６６２でのセリン変異体の力価および感染性における観察された変動性（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）は、ＡＡＶ２パッケージング効率およびその生物学的活性の両方を調節することにおいてアミノ酸の各々がつとめる重要な役割を示唆する。
【０１４５】
実施例４−Ｓ６６２Ｖベクターの形質導入効率は様々な細胞型におけるｐ３８  ＭＡＰＫの活性と相関した
Ｓ６６２Ｖベクター介在性導入遺伝子発現は、以下の細胞型を用いて検査される：（ｉ）ＮＩＨ３Ｔ３（マウス胚線維芽細胞）、（ｉｉ）Ｈ２．３５（マウス胎児肝細胞）、（ｉｉｉ）ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌細胞）、および（ｉｖ）初代ヒト単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣｓ）。これらの細胞型を、同一条件下で、細胞あたり２０００  ｖｇｓのＭＯＩでＷＴ  ｓｃＡＡＶ２−ＥＧＦＰまたはＳ６６２Ｖ  ｓｃＡＡＶ２−ＥＧＦＰベクターで形質導入した。ＥＧＦＰ遺伝子発現を、ＨｅＬａ、２９３およびｍｏＤＣｓについて感染後（ｐ．ｉ．）４８時間で、かつＨ２．３５およびＮＩＨ３Ｔ３細胞についてｐ．ｉ．５日で評価した。
【０１４６】
結果は、図８Ａに示されるように、ＷＴおよびＳ６６２Ｖ変異ベクター間の形質導入効率の絶対値差分（ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）は、〜３倍から（Ｈ２．３５細胞において）〜２０倍（２９３細胞において）の範囲であったが、変異ベクターは試験した各細胞型において一貫してより効率的であったことを示す。
【０１４７】
ＷＴおよび変異ベクターの形質導入効率の観察された差が、細胞性ｐ３８  ＭＡＰＫの発現および／または活性のレベルの変動に起因するかどうかを調べるために、各細胞型から調製した細胞溶解物を特異的抗体でプローブされたウェスタンブロットで分析し、総ｐ３８  ＭＡＰＫおよびホスホ−ｐ３８  ＭＡＰＫレベルを検出した。ＧＡＰＤＨをローディング対照として使用した。
【０１４８】
結果は、図８Ｂに示されるように、ｐ３８  ＭＡＰＫタンパク質レベルは同様であったが、キナーゼ活性は、リン酸化のレベルによって決定されるように、異なる細胞型の間で著しく変動し、かつＳ６６２Ｖ変異ベクターの形質導入効率は、ｐ３８  ＭＡＰＫ活性とほぼ相関したことを示す。結果はＡＡＶ２ベクターのｐ３８  ＭＡＰＫ介在性リン酸化を示す。さらに、ＷＴ−ＡＡＶ２ベクターによる形質導入は、２９３細胞またはｍｏＤＣｓのいずれかにおいて、ｐ３８  ＭＡＰＫのリン酸化のアップレギュレーションをもたらさなかった；これは、ＡＡＶがｍｏＤＣｓにおいて強力な表現型の変化を誘導しないことを示す。
【０１４９】
実施例５−ｍｏＤＣｓのＳ６６２Ｖ変異ベクター介在性形質導入は表現型変化を引き起こさなかった
ＭＡＰＫファミリーメンバーは、ＡＰＣの発生および成熟に重要な役割を果たす。この実施例では、健康なドナーの白血球除去から単離されたｍｏＤＣｓを、上述の通り、５０μＭの選択的キナーゼ阻害剤で処置し、次いでＷＴ  ｓｃＡＡＶ２−ＥＧＦＰベクターで形質導入した。ｐ．ｉ．２時間で、細胞をサプリメント（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、Ｉｌ−６、ＰＧＥ２）で処置し、成熟を誘導した。ｐ．ｉ．４８時間で蛍光顕微鏡によりＥＧＦＰ導入遺伝子発現を評価した。
【０１５０】
結果は、ＪＮＫおよびｐ３８  ＭＡＰＫの特異的阻害剤でのｍｏＤＣｓの前処置が、それぞれ、ＥＧＦＰ発現レベルを約２倍および約３倍増大させ、かつ形質導入効率が、Ｓ６６２Ｖ変異ベクターで〜５倍増強したことを示す（図９Ａ、図９Ｂ、および図９Ｃ）。
【０１５１】
これらのキナーゼの阻害は、以前に、樹状細胞の成熟を防止することが報告されているので、ＤＣにおいて表現型変化を誘導するＳ６６２Ｖ変異体の能力も調べた。簡単に言えば、ｍｏＤＣを細胞当たり最大５０，０００ｖｇｓのより一層高いＭＯＩで感染させ、ｐ．ｉ．４８時間で回収し、かつ表面共刺激分子のアップレギュレーションについて蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）により分析した。ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６などのＤＣ成熟マーカーのフローサイトメトリー分析は、ＷＴ  ＡＡＶ２ベクターと同様、Ｓ６６２Ｖ変異ベクターもまたｍｏＤＣｓの成熟を誘導しなかったことを示した（図９Ｃ）。結果は、本発明に従って調製されたキャプシド−変異ＡＡＶベクターが低い免疫原性を示したことを示した。
【０１５２】
実施例６−ＡＡＶ２−Ｓ６６２Ｖベクターで形質導入されたｍｏＤＣによるｈＴＥＲＴ特異的ＣＴＬの生成
ｍｏＤＣにおけるセリン変異ＡＡＶ２ベクター介在性導入遺伝子発現が、ＷＴ−ＡＡＶ２と比較して著しく改善されたので、本研究は、Ｓ６６２Ｖ−搭載ｍｏＤＣｓの、細胞傷害性Ｔリンパ球の生成および標的細胞の効率的な特異的殺傷を刺激する能力を実証する。ヒトテロメラーゼがほとんどの癌細胞で発現されるユニークな抗癌標的として認識されていることを考え、ニワトリβ−アクチンプロモーターの制御下の切断型ヒトテロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）遺伝子をクローニングし、ＤＮＡをＡＡＶ２  Ｓ６６２Ｖ変異体にパッケージングした。最大２５％のＣＤ８陽性細胞を含有する非接着性末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｓ６６２Ｖベクターにより送達されるｍｏＤＣ／ｈＴＥＲＴで一回刺激した。不死化骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２を、細胞媒介性細胞傷害（ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）の二色蛍光アッセイに用いて、その後減少するエフェクター対ターゲット細胞比（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ  ｒａｔｉｏ）を備える殺傷曲線を生成した。
【０１５３】
図１０に示される結果は、ｈＴＥＲＴを搭載したｍｏＤＣが、ＧＦＰを発現するｍｏＤＣと比較して特異的なＴ細胞クローン増殖および殺傷活性を効率的に刺激できたことを示した。これらの結果はまた、キャプシド−変異ｒＡＡＶ−ベクターベースの送達方法が、様々な哺乳動物のワクチン接種方法において用いることができることを示した。
【０１５４】
実施例７−表面露出チロシン、セリン、および／またはトレオニン残基の部位特異的変異誘発によって得られた高効率ｒＡＡＶ２
ＡＡＶベクターは、現在、治療遺伝子の持続的な発現を達成するために、様々な組織を標的とするための送達媒体として、多数の臨床試験で使用されている。しかしながら、治療効果を観察するには多くのベクター用量が必要とされる。十分量のベクターの産生は課題であり、ベクターに対する免疫応答を起こすリスクも有する。それゆえ、低用量で高い形質導入効率を有する新規ＡＡＶベクターを開発することが重要である。
【０１５５】
細胞性上皮成長因子受容体タンパク質チロシンキナーゼ（ＥＧＦＲ−ＰＴＫ）は、主にチロシン残基でのＡＡＶ２キャプシドのリン酸化に起因して、組換えＡＡＶ２ベクターからの導入遺伝子の発現にマイナスの影響を与える。チロシン−リン酸化キャプシドは、その後、ＡＡＶベクターの形質導入効率にマイナスの影響を与える、宿主プロテアソーム機構により分解される。ＪＮＫおよびｐ３８  ＭＡＰＫセリン／トレオニンキナーゼの選択的阻害剤は形質導入効率を改善し、これは、ある表面露出セリンおよび／またはトレオニン残基のリン酸化がＡＡＶベクターの形質導入効率を低下させることを示す。
【０１５６】
野生型ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質への部位特異的変異誘発が実施された。図１１Ａ、図１１Ｂ、図１２Ａ、および図１２Ｂに示されるように、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質のセリン（Ｓ６６２Ｖ）およびトレオニン（Ｔ４９１Ｖ）変異は、その後、ＡＡＶベクターの形質導入効率を増大させた。
【０１５７】
セリン（Ｓ６６２Ｖ）およびトレオニン（Ｔ４９１Ｖ）変異を最高のパフォーマンスの単一（Ｙ７３０Ｆ）および三重（Ｙ７３０Ｆ）チロシン変異と組み合わせて、以下のベクターを生成した：（ｉ）３つの二重（Ｓ６６２Ｖ＋Ｔ４９１Ｖ；Ｙ７３０Ｆ＋Ｓ６６２Ｖ；Ｙ７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ）；（ｉｉ）１つの三重（Ｓ６６２Ｖ＋Ｙ７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ）；（ｉｉｉ）２つの四重（Ｙ７３０＋５００＋４４４Ｆ＋Ｓ６６２Ｖ；Ｙ７３０＋５００＋４４Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ）；および（ｉｖ）１つの五重（Ｙ７３０＋５００＋４４４０Ｆ＋Ｓ６６２Ｖ＋Ｔ４９１Ｖ）。変異ベクターの各々の形質導入効率を、初代マウス肝細胞系Ｈ３．２５を用いて評価した。
【０１５８】
図１３Ａおよび図１３Ｂに示されるように、ＡＡＶ２四重変異（Ｙ７３０＋５００＋７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ）ベースのベクターは、対応する非改変野生型（ＷＴ）ＡＡＶ２ベクターのものに対しておよそ３０倍、かつＡＡＶ２三重変異（Ｙ７３０＋５００＋４４４Ｆ）ベースのベクターにより産生されるものに対しておよそ３倍、形質導入効率を増大させた。単一（Ｙ７３０Ｆ）または三重チロシン変異（Ｙ７３０Ｆ＋５００＋４４４Ｆ）ベクターのいずれかとＳ６６２Ｖ変異を組み合わせることは、形質導入効率にマイナスの影響を与えた。
【０１５９】
遺伝的に改変された樹状細胞（ＤＣｓ）は広範に研究されており、癌患者におけるそれらの有効性を評価する多数の第Ｉ相および第ＩＩ相臨床試験が開始されている。しかしながら、ＤＣローディング（ＤＣ  ｌｏａｄｉｎｇ）のための現在の方法は、細胞生存率、抗原提示の寿命に関する不確実性、および患者のハプロタイプによる制限の点で不十分である。ＡＡＶベクターの種々の一般に使用される血清型によるＤＣｓの異なるサブセットの形質導入の成功が実証され、ＡＡＶベースの抗腫瘍ワクチンの潜在的な利点が議論されている。しかしながら、特異性および形質導入効率の点での、ＤＣｓへの組換えＡＡＶベクターによる遺伝子導入のさらなる改善が、抗腫瘍ワクチンとして使用される場合に有意な影響を達成するために必要とされている。
【０１６０】
セリン／トレオニンプロテインキナーゼは、ウイルスキャプシド上の表面露出セリンおよび／またはトレオニン残基をリン酸化することにより、ＡＡＶベクター介在性導入遺伝子発現を負に調節でき、ベクターをプロテアソーム介在性分解のための標的とすることができる。表面露出セリンおよびトレオニン残基のリン酸化の防止は、ベクターがリン酸化およびそれに続くユビキチン化を回避できるようにし、それゆえ、プロテアソーム分解を防止した。
【０１６１】
部位特異的変異誘発を野生型ＡＡＶベクターの１５個の表面露出セリン（Ｓ）残基の各々に実施した。結果は、野生型ＡＡＶ２ベクターと比較した場合、バリン（Ｖ）へのＳ６６２の置換が、最大６倍Ｓ６６２Ｖ変異体の形質導入効率を増大させたことを示している。また、部位特異的変異誘発を、Ｖを用いて、野生型ＡＡＶ２ベクターの１７個の表面露出トレオニン（Ｔ）の各々に実施した（Ｔ２５１Ｖ、Ｔ３２９Ｖ、Ｔ３３０Ｖ、Ｔ４５４Ｖ、Ｔ４５５Ｖ、Ｔ５０３Ｖ、Ｔ５５０Ｖ、Ｔ５９２Ｖ、Ｔ５８１Ｖ、Ｔ５９７Ｖ、Ｔ４９１Ｖ、Ｔ６７１Ｖ、Ｔ６５９Ｖ、Ｔ６６０Ｖ、Ｔ７０１Ｖ、Ｔ７１３Ｖ、Ｔ７１６Ｖ）。Ｔ−Ｖ変異ベクターの各々の形質導入効率を、２，０００ｖｇｓ／細胞のＭＯＩで、初代ヒト単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣｓ）を用いて評価した。１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−α、１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ-１、１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ-６、および１ｍｇ／ｍＬ  ＰＧＥ２を含むサイトカイン混合物での成熟の後、ＥＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡下で感染後４８時間に分析した。成熟樹状細胞（ｍＤＣｓ）の典型的な表現型を満たすことを確保するために、細胞を、共刺激分子（ＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６）の発現について特徴付けた。
【０１６２】
図１４Ａおよび図１４Ｂに示されるように、以下のＴ残基（Ｔ４５５Ｖ、Ｔ４９１Ｖ、Ｔ５５０Ｖ、Ｔ６５９Ｖ、Ｔ６７１Ｖ）の変異は、最大５倍、ｍｏＤＣｓの形質導入効率を増加させ、Ｔ４９１Ｖ変異体は本研究で試験されたものの中で最も高い形質導入効率を示すものであった。
【０１６３】
Ｔ残基の複数の変異が形質導入効率をさらに向上させることができるかどうかを調べるために、以下のＡＡＶ２変異体も生成した：（ｉ）野生型ＡＡＶ２ベクターに対して二重の変異を有する４つのＡＡＶ２ベクター（Ｔ４５５Ｖ＋Ｔ４９１Ｖ；Ｔ５５０Ｖ＋Ｔ４９１Ｖ；Ｔ６５９Ｖ＋Ｔ４９１Ｖ；Ｔ６７１Ｖ＋Ｔ４９１Ｖ）；（ｉｉ）２つの三重変異ＡＡＶ２ベクター（Ｔ４５５Ｖ＋Ｔ４９１Ｖ＋Ｔ５５０ＶおよびＴ５５０Ｖ＋Ｔ６５９Ｖ＋Ｔ４９１Ｖ）；ならびに（ｉｉｉ）１つの四重変異ＡＡＶ２ベクター（Ｔ４５５Ｖ＋Ｔ５５０Ｖ＋Ｔ６５９Ｖ＋Ｔ４９１Ｖ）。結果は、これらの複数変異ベクターのいくつかが、樹状細胞の形質導入効率を増大させることを示し、かつ三重変異体（Ｔ５５０Ｖ＋Ｔ６５９Ｖ＋Ｔ４９１Ｖ）が、特に、最適な形質導入効率を有することが示された（対応する非修飾、野生型ＡＡＶ２ベクターのものよりもおよそ１０倍！）。これらの結果は、多数の適切なキャプシド変異ベクターを生成するために、「混合および適合（ｍｉｘ−ａｎｄ−ｍａｔｃｈ）」様式で様々な組み合わせ変異体を作ることにより、さらに増強された。１つのそのような組み合わせ−−最高のパフォーマンスのセリン置換（Ｓ６６２Ｖ）変異を最高のパフォーマンスのトレオニン（Ｔ４９１Ｖ）置換と組み合わせることは、個々の単一変異のいずれかと比較して、さらにおよそ８倍まで形質導入効率を増強した。
【０１６４】
実施例８−ＡＡＶ２キャプシド上のユビキチン結合リジン残基の標的変異誘発はその形質導入効率を改善する
血友病の臨床試験から得られるデータから、高用量のＡＡＶベクターの肝臓遺伝子導入が、強力な適応免疫応答の素因となることが、今ではよく認識されている。したがって、より低用量のベクターが持続的な表現型補正（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）を達成し、かつベクター関連免疫毒性を制限するのを可能にする、新規な戦略を開発する必要がある。
【０１６５】
本実施例は、ＶＶＡ２キャプシドタンパク質のＶＰ３領域の表面露出リジン残基が宿主ユビキチンリガーゼの直接的な目標であり、かつこれらのリジン残基の変異誘発がＡＡＶベクターの形質導入効率を改善することを示す。
【０１６６】
ユビキチン化予測ソフトウェア（ＵｂＰｒｅｄ）を用いるｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析は、野生型ＡＡＶ２キャプシドの７個のリジン残基（Ｋ３９、Ｋ１３７、Ｋ１４３、Ｋ１６１、Ｋ４９０、Ｋ５２７およびＫ５３２）がユビキチン化され得ると同定した。ＡＡＶ２  Ｒｅｐ／Ｃａｐコードプラスミドにおけるリジンからアルギニンへの変異を実行し、ＥＧＦＰ［ｓｃＡＡＶ−ＣＢａ−ＥＧＦＰ］を発現する組換え自己相補的ＡＡＶ２ベクターの高度精製ストックを、７個のリジン変異プラスミドの各々において生成した。リジン変異ベクターの物理的粒子力価は、野生型（ＷＴ）ｓｃＡＡＶベクターに匹敵していた（〜０．５−１×１０１２ｖｇｓ／ｍＬ）、これは、これらの変異が、変異キャプシドの構造またはパッケージング能力に影響を及ぼさなかったことを示唆する。
【０１６７】
ＷＴまたは７個のリジン変異キャプシドを含有するｓｃＡＡＶベクターを、次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでそれらの形質導入の可能性について評価した。およそ８×１０４  ＨｅＬａ細胞またはＨＥＫ２９３細胞を、モック感染または５００、２０００もしくは５０００ｖｇｓ／細胞を含む種々の感染多重度（ＭＯＩ）でＡＡＶを感染させた。感染後４８時間で、導入遺伝子（ＥＧＦＰ）の発現を蛍光顕微鏡により、かつフローサイトメトリーにより測定した。
【０１６８】
図１５）に示される結果は、ＷＴ−ＡＡＶ２ベクターと比較した場合、Ｋ５３２Ｒ変異ベクターがｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨｅＬａ細胞（１８Ｘ）およびＨＥＫ２９３（９Ｘ）細胞の両方において遺伝子発現を著しく増大させたことを示す。Ｋ５３２Ｒベクターの増大した形質導入効率は、試験した３つの異なるＭＯＩの間で一貫しており、ＷＴベクターに対して１０倍の平均増大であった。
【０１６９】
実施例９−ｉｎ  ｖｉｖｏでの古典的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）および代替（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）ＮＦ−κＢ経路のＡＡＶベクター介在性活性化
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターでのＨｅＬａ細胞の感染は、ＮＦ−κＢ、細胞性免疫および炎症応答の中心的調節因子、の代替経路の活性化をもたらす。また、古典的経路ではなく代替経路の活性化は、これらの細胞におけるＡＡＶ介在性導入遺伝子発現を調節する。
【０１７０】
本実施例は、マウスにおける肝臓指向性ＡＡＶ介在性遺伝子導入におけるＮＦ−κＢの役割を明らかにする。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＡＡＶ介在性遺伝子導入は、古典的および代替ＮＦ−κＢ経路の連続的な活性化をもたらす。これらの経路は、主に炎症（古典的）または適応応答（代替経路）を駆動すると考えられている。野生型（ＷＴ）またはチロシン三重変異（ＴＭ）キャプシドを有するＡＡＶ２ベクターは、２時間以内に古典的ＮＦ−κＢ経路を活性化し、前炎症性サイトカインおよびケモカインの発現をもたらした（図１４Ａ）。この一過性のプロセスは、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）依存性であり、抗原提示細胞によるベクターゲノムの初期感知（ｉｎｉｔｉａｌ  ｓｅｎｓｉｎｇ）をおそらく反映している。ベクター送達９時間後に調製された肝臓ホモジネートのウェスタンブロット分析（図１４Ｂ）は、肝細胞への遺伝子導入におそらく由来する、代替ＮＦ−κＢ経路の核ｐ５２タンパク質成分の存在量を示した。
【０１７１】
遺伝子導入前のＮＦ−κＢ阻害剤Ｂａｙ１１の投与は、効率的に両方の経路の活性化を阻止した。これは、炎症誘発性先天性免疫応答を防止し、また、抗ＡＡＶキャプシド抗体形成の勢いを弱めた（図１４Ｃ）。重要なことに、Ｂａｙ１１はＷＴおよびＴＭ  ＡＡＶ２ベクターの両方によって介在される長期の導入遺伝子発現を妨害しなかった（図１４Ｄ）。これらの結果は、ベクター投与前のＮＦ−κＢ阻害剤での一過性の免疫抑制が、（先天性応答によって引き起こされる）炎症を除去し、また適応応答を制限したことを実証した。
【０１７２】
実施例１０−最適化ｒＡＡＶ３ベクターの開発：ヒト肝臓癌細胞の高効率形質導入のメカニズム
１０個の一般に使用されるＡＡＶ血清型のうち、ＡＡＶ３は不十分に細胞および組織に形質導入することが報告されている。しかしながら、本発明者らは、ＡＡＶベクターが非常に効率的に、確立されたヒト肝芽腫（ＨＢ）およびヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞株ならびに初代ヒト肝細胞に形質導入することを発見した。ＡＡＶ３はウイルスの侵入のために細胞受容体／共受容体としてヒトＨＧＦＲを利用する。
【０１７３】
本実施例は、ｈＨＧＦＲの細胞外ならびに細胞内キナーゼドメインの両方がＡＡＶ３ベクター侵入およびＡＡＶ３介在性導入遺伝子発現に関与することを示す。結果は、（ｉ）ＡＡＶ３ベクター介在性形質導入が、Ｔ４７Ｄ細胞、検出不可能なレベルの内因性ｈＨＧＦＲを発現するヒト乳癌細胞株において、安定的なトランスフェクションおよびｈＨＧＦＲの過剰発現の後、著しく増大した（図１５Ａ）；（ｉｉ）ｈＨＧＦＲ関連チロシンキナーゼ活性がＡＡＶ３ベクターの形質導入効率にマイナスの影響を与える（図１５Ｂ、図１５Ｃ）；（ｉｉｉ）プロテアソーム阻害剤の使用が、ＡＡＶ３ベクター介在性形質導入を著しく改善する；（ｉｖ）ＡＡＶ３キャプシド上の特定の表面露出チロシン残基の部位特異的変異誘発が、改善された形質導入効率を引き起こす；ならびに（ｖ）２つのチロシン変異の特定の組み合わせが、導入遺伝子発現の程度をさらに改善する（図１５Ｄ）ことを示す。これらのＡＡＶ３ベクターは、ヒトにおける肝臓癌の遺伝子治療のために有用であり得る。
【０１７４】
実施例１１−表面露出リジン残基の部位特異的変異誘発は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのマウス肝細胞におけるｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ８ベクターの改善された形質導入効率を引き起こす
ユビキチン−プロテアソーム経路は、これらのベクターの導入効率にマイナスの影響を与える、組換えＡＡＶ２ベクターの細胞内輸送において重要な役割を果たしている。ユビキチン化のための最初のシグナルは、ＡＡＶ２キャプシド上の特定の表面露出チロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）、およびトレオニン（Ｔ）残基のリン酸化である；これらの残基のいくつかの除去は野生型（ＷＴ）ＡＡＶ２ベクターの形質導入効率を著しく増大させる。
【０１７５】
本実施例は、表面露出リジン残基の部位特異的変異誘発がＡＡＶ２キャプシドのユビキチン化を防止し、それが細胞性プロテアソーム機構によるベクター分解を防止し、それによって選択された哺乳動物の細胞に治療用または診断用ポリヌクレオチドを送達するための改善されたベクターを産生することを表す。
【０１７６】
グルタミン酸（Ｅ）での表面露出リジン（Ｋ）残基（Ｋ２５８、Ｋ４９０、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｋ５４４、５４９、およびＫ５５６）における単一変異を有するＡＡＶ２ベクターを調製し、分析した。ＥＧＦＰレポーター遺伝子を発現するＫ４９０Ｅ、Ｋ５４４Ｅ、Ｋ５４９Ｅ、およびＫ５５６Ｅ  ｓｃＡＡＶ２ベクターの形質導入効率は、対応する未修飾ＷＴ  ＡＡＶ２ベクターと比較して、５倍も増大した（図１６参照）。本研究で分析された例示的な構築物のうち、リジン置換変異体の間で、Ｋ５５６Ｅ単一変異が最も高い形質導入効率を有した（Ｈｅｌａ細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで２，０００ｖｇｓ／細胞の形質導入率を有する）。１×１０１０ｖｇｓの各ベクターがｉｎ  ｖｉｖｏでＣ５７ＢＬ／６マウスに静脈内送達されたときも同様の結果が得られ、肝細胞における導入遺伝子の発現が注射後２週に評価された。１×１０１０ｖｇｓ／動物のホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）レポーター遺伝子を発現するＷＴまたはリジン変異ｓｓＡＡＶ２ベクターのいずれかの静脈内送達後の注入２週間後の生物発光イメージングは、これらの結果をさらに裏付けた。
【０１７７】
重要なことに、最も効率的な単一アミノ酸残基変異の２つを組み合わせて、二重変異（Ｋ５４４Ｅ＋Ｋ５５６Ｅ）を生成した。ｉｎ  ｖｉｖｏでのマウス肝細胞におけるこの二重変異ｓｓＡＡＶ２−Ｆｌｕｃベクターの形質導入効率は、単一変異のいずれかと比べて〜２倍、かつＷＴ、非改変ｓｓＡＡＶ２−Ｆｌｕｃ対照ベクターと比べて〜１０倍、増大した。
【０１７８】
ＡＡＶ８ベクターは、非常によくマウス肝細胞に形質導入することが以前に示されている。表面露出Ｋ残基のいくつかもまたこの血清型において保存されているので、Ｋ５３０Ｅ−、Ｋ５４７Ｅ−、またはＫ５６９Ｅ−変異を有するｓｓＡＡＶ８−Ｆｌｕｃベクターも生成した。ｉｎ  ｖｉｖｏでのマウス肝細胞におけるＫ５４７ＥおよびＫ５６９Ｅ  ｓｓＡＡＶ８−Ｆｌｕｃベクターの形質導入効率は、ＷＴ  ｓｓＡＡＶ８ベクターと比較して、それぞれ、〜３倍および〜２倍増大した（図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃ、図１７Ｄ、図１７Ｅ、および図１８）。
【０１７９】
結果（図１９Ａ、図１９Ｂ、図２０Ａおよび図２０Ｂ、図２１Ａ−図２１Ｉ、図２２Ａ−図２２Ｉ、図２３Ａ−図２３Ｆ、図２４、ならびに図２５において、本明細書に要約される）は、表面露出リジン残基を標的とすることがまた、ヒト細胞の増大した形質導入のための新規な改善されたＡＡＶベースのウイルスベクター、および重要なことに遺伝子治療に有用な新規なターゲッティングベクターを作成するのに役立ち得るということを実証した。
【０１８０】
参考文献：
以下の参考文献は、本明細書に記載されたものを補足する例示的な手順または他の詳細を提供する程度に、出典明示により本明細書に具体的に組み込まれる。
【表１】
2019141076.tif 000002
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【０１８１】
本明細書に記載される実施例および実施形態は例示目的のみのものであり、かつ、それらに照らして様々な変形や変更が当業者に示唆され、本願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれると理解されるべきである。
【０１８２】
各文献が、出典明示により組み込まれることが個々にかつ具体的に示され、その全体が本明細書に説明された場合と同程度に、本明細書で引用される刊行物、特許出願および特許を含む全ての参考文献は、出典明示により組み込まれる。
【０１８３】
本発明を説明する文脈で使用される用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および類似の指示対象は、本明細書において特に指定のない限り、あるいは文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方をカバーするように解釈されるべきである。
【０１８４】
本明細書における範囲の記載は、本明細書において特に指定のない限り、範囲内に入るそれぞれ別個の値を個々に言及する簡便な方法としての機能を果たすことを単に意図し、かつそれぞれ別個の値は、それが個々に本明細書に記載されているかのように、本明細書に組み込まれる。
【０１８５】
本明細書に記載される全ての方法は、本明細書において特に指定のない限り、あるいは文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で行うことができる。
【０１８６】
本明細書に提供される、任意のおよび全ての例、または例示的な言葉（例えば、「など」）の使用は、本発明をより明らかにすることを単に意図し、特に指定のない限り、本発明の範囲を限定するものではない。明細書中の言葉は、明示的に述べられていない限り、任意の要素が本発明の実施に不可欠であることを示すと解釈されるべきではない。
【０１８７】
要素（単数）および要素（複数）に関する「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語を用いる、本発明の任意の態様または実施形態の本明細書における記載は、特に明記のない限り、あるいは文脈と明らかに矛盾しない限り、その特定の要素（単数）および要素（複数）「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」、「から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、または「を実質的に含む（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」発明の同様の態様または実施形態のサポートを提供することを意図する（例えば、特定の要素を含んでいる本明細書に記載される組成物は、特に明記のない限り、あるいは文脈と明らかに矛盾しない限り、その要素からなる組成物も記載していると理解されるべきである。
【０１８８】
本明細書に開示され、特許請求された組成物および方法の全ては行うことができ、本開示に照らして過度の実験をすることなく実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、組成物および方法に対して、および本明細書に記載される方法の段階または段階の連続において変形を適用できることは当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的および生理学的の両方に関連するある物質が、同一または類似の結果を達成しつつ、本明細書に記載される薬剤の代わりに使用され得る。当業者に明らかなそのような類似の置換および改変は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲および概念内にあるとみなされる。
【図１】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ａ−３】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
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【図２Ｂ−３】
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【図２Ｃ−１】
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【図２Ｃ−２】
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【図２Ｃ−３】
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【図２Ｄ−１】
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【図２Ｄ−２】
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【図２Ｄ−３】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年5月14日(2019.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に本明細書に記載され、実施例および図面を参照して説明される発明。
【外国語明細書】
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