(57)【要約】【課題】変異型蛋白質、及び該変異型蛋白質を発現し円形脱毛を発症する遺伝子改変マウスの提供。【解決手段】配列番号１で表されるアミノ酸配列の591位のアルギニンが、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシンに置換されたアミノ酸配列からなる変異型蛋白質、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列の591位のアルギニンが、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシンに置換されたアミノ酸配列において、該591位のアミノ酸以外の１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変異型蛋白質。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の591位のアルギニンが、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシンに置換されたアミノ酸配列からなる変異型蛋白質、又は
配列番号１で表されるアミノ酸配列の591位のアルギニンが、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシンに置換されたアミノ酸配列において、該591位のアミノ酸以外の１〜数個のアミノ酸が置換若しくは欠失、又は１〜数個のアミノ酸が挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変異型蛋白質。
【請求項２】
請求項１に記載の変異型蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１に記載の変異型蛋白質を発現し、円形脱毛を発症する遺伝子改変マウス。
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子改変マウスに脱毛症の治療薬の候補又は予防薬の候補を投与する工程を含む、脱毛症の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法。
【請求項５】
請求項３に記載の遺伝子改変マウスに脱毛症の改善用又は予防用の化粧品の候補を塗布する工程を含む、脱毛症の改善用又は予防用の化粧品のスクリーニング方法。
【請求項６】
配列番号８に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６に記載のＤＮＡをマウスへ導入する工程を含む、請求項３に記載の遺伝子改変マウスの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型蛋白質、及び該変異型蛋白質を発現し円形脱毛を発症する遺伝子改変マウスに関する。
【背景技術】
【０００２】
円形脱毛症は頭皮に円形の脱毛斑を生ずる症状であり、その治療法が研究されている。研究で用いられる円形脱毛症モデルマウスとして、「C3H/HeJマウス」が知られている（非特許文献１、２）。該マウスは、元来、脱毛症のモデルマウスとして作られたものではなく、自然発生的に見出されたマウスを交配して系統を確立したものである。該マウスは、生後５か月でメスの0.25％、オスの0.035％が脱毛するが、選択的な交配により20％に増加する。しかしながら、このマウスの脱毛要因となる遺伝子は突き止められていない。
しかしながら、この「C3H/HeJマウス」が世界でも唯一の円形脱毛症モデルマウスであり、それ以外の円形脱毛症モデルマウスは知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Sundberg et. al., J. Invest. Dermatol., 102(6), 847-56 (1994)
【非特許文献２】McElwee et. al., Clin. Exp. Dermatol., 27(5), 410-7 (2002)
【非特許文献３】Harms et al., Curr. Protoc. Hum. Genet., 83:15, 7, 1-27 (2014)
【非特許文献４】Miura et al., Sci. Rep., 5:12799 (2015)
【非特許文献５】Peereboom-Wynia et al., Clin. Exp. Dermatol., 14(1), 47-50 (1989)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、簡便な方法で作製できる変異型蛋白質、及び該変異型蛋白質の発現を維持し円形脱毛を発症する遺伝子改変マウスの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、マウスCCHCR1蛋白質の591位のアルギニン（Arg）が、フェニルアラニン（Phe）、トリプトファン（Trp）又はチロシン（Tyr）に置換された変異型蛋白質が発現することにより、マウスが円形脱毛を発症することを見出して、本発明を完成させた。本発明は下記の通りである。
【０００６】
〔１〕配列番号１で表されるアミノ酸配列の591位のアルギニンが、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシンに置換されたアミノ酸配列からなる変異型蛋白質、又は
配列番号１で表されるアミノ酸配列の591位のアルギニンが、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシンに置換されたアミノ酸配列において、該591位のアミノ酸以外の１〜数個のアミノ酸が置換若しくは欠失、又は１〜数個のアミノ酸が挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変異型蛋白質。
〔２〕〔１〕に記載の変異型蛋白質をコードするＤＮＡ。
〔３〕〔１〕に記載の変異型蛋白質を発現し、円形脱毛を発症する遺伝子改変マウス。
〔４〕〔３〕に記載の遺伝子改変マウスに脱毛症の治療薬の候補又は予防薬の候補を投与
する工程を含む、脱毛症の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法。
〔５〕〔３〕に記載の遺伝子改変マウスに脱毛症の改善用又は予防用の化粧品の候補を塗布する工程を含む、脱毛症の改善用又は予防用の化粧品のスクリーニング方法。
〔６〕配列番号８に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
〔７〕〔６〕に記載のＤＮＡをマウスへ導入する工程を含む、〔３〕に記載の遺伝子改変マウスの作製方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、簡便な方法で作製できる変異型蛋白質、及び該変異型蛋白質の発現を維持し円形脱毛を発症する遺伝子改変マウスが提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】各動物種におけるCCHCR1蛋白質の一部分のアミノ酸配列を整列させた図である。
【図１Ｂ】図１Ａに記載された各動物種におけるCCHCR1蛋白質の構造予測の結果を示した図である。
【図１Ｃ】本発明の一実施態様におけるヒトハプロタイプ解析の結果を示す図である。
【図１Ｄ】本発明の一実施態様におけるヒトハプロタイプ解析の結果を示す図である。
【図１Ｅ】本発明の一実施態様におけるヒトハプロタイプ解析の結果を示す図である。
【図１Ｆ】本発明の一実施態様におけるヒトハプロタイプ解析の結果を示す図である。
【図２】本発明の一実施例で作製したマウスの背部を示した写真である（図面代用写真）。
【図３】ａ、ｂともに、本発明の一実施例で作製したマウスの背部の皮膚表面を示した写真である（図面代用写真）。
【図４】本発明の一実施例で作製したマウスの背部の皮膚表面を示した顕微鏡像である（図面代用写真）。
【図５】本発明の一実施例で作製したマウスの背部の毛幹の走査型電子顕微鏡像である（図面代用写真）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
＜変異型蛋白質＞
本発明の一実施態様に係る変異型蛋白質は、マウスCCHCR1蛋白質のアミノ酸配列（配列番号１）の591位のアルギニン（Arg）が、フェニルアラニン（Phe）、トリプトファン（Trp）又はチロシン（Tyr）に置換されたアミノ酸配列からなる。
【００１０】
該変異型蛋白質は、前記置換がされ、マウスが該変異型蛋白質を発現して円形脱毛を発症する限り、該変異型蛋白質のアミノ酸配列と80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上同一性を有するアミノ酸配列からなる変異型蛋白質であってもよい。
このような変異型蛋白質としては、該変異型蛋白質のアミノ酸配列において、591位のアミノ酸以外の１〜数個のアミノ酸が置換又は欠失したアミノ酸配列からなる変異型蛋白質や、該変異型蛋白質のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変異型蛋白質が挙げられる。
１〜数個とは、好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜３０個、よりさらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個、格段に好ましくは１〜３個である。アミノ酸がＮ末端側及び／又はＣ末端側に付加される場合も同様である。
【００１１】
置換は保存的置換が好ましく、保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換することを指す。保存的置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。
【００１２】
挿入されるアミノ酸配列としては、マウスが円形脱毛を発症する限り、特に制限されない。また、付加されるアミノ酸配列としては、マウスが円形脱毛を発症する限り特に制限されないが、例えば、蛍光蛋白質や、発現の定量や分離に用いるためのタグ蛋白質となるように、由来の異なるアミノ酸配列でもよい。蛍光蛋白質であれば、例えば、マウス生体内で発現した該蛋白質の追跡や発現量の検討ができる。また、タグ蛋白質であれば、生体外に取り出して発現量の検討や分離精製ができる。いずれも、常法に従って行うことができる。
【００１３】
尚、CCHCR1蛋白質には、いくつかのコイルドコイルドメインが含まれると推定されている。図１Ａに示すように、ハツカネズミ（Mus musculus）のCCHCR1蛋白質の591位のアルギニン（Arg）は多くの動物種で保存されている。Hap01はヒトのハプロタイプの一つであり、該アミノ酸を矢印で示している。Hap26もヒトのハプロタイプの一つだが、構造予測によれば、Hap26のように、587位のアルギニン（Arg）がトリプトファン（Trp）に置換されると、該残基が含まれるドメインのコイルドコイル構造を構成しうる確率が大きく減衰することがわかった（図１Ｂの矢印）。これは、コイルドコイル構造中のアラニン、グルタミン酸、リジン、及びアルギニンが芳香族アミノ酸に置換されると、該構造が構成されにくくなるためであると考えられる。
尚、図１Ａにおいて、Hap26の配列を配列番号11、Hap01の配列を配列番号12、Pan troglodytesの配列を配列番号13、Macaca mulatttaの配列を配列番号14、Canis lupus familiarisの配列を配列番号15、Bos taurusの配列を配列番号16、Mus musculusの配列を配列番号17、Xenopus tropicalisの配列を配列番号18とする。
【００１４】
ここで、下記研究により、上記Hap26が円形脱毛症患者で遺伝統計学的に有意に多いハプロタイプであることが示された。
円形脱毛症患者171個体と健常者560個体とを用い、ヒトMHC領域内における22座位のマイクロサテライトを用いて、円形脱毛症に関連する変異の解析を実施した。この結果、D6S2811のアリル208にて最も強い関連を示した（OR = 3.41, CI95% = 1.94-5.99, P = 3.39×10-5）（図１Ｃ）。ペアワイズ連鎖不平衡解析によれば、MHC領域において長く強い連鎖不平衡が確認された。D6S2811からD6S2930までの３座位でのハプロタイプの中で、円形脱毛症に強く関連するハプロタイプが一つ見いだされた（MShap01, OR = 3.78, CI95% = 2.00-7.16, P = 6.57×10-5）。
次に、円形脱毛症の原因変異を同定するために、リスクハプロタイプを有する５個体ならびにこれを持たない７個体を対象に、4.97 MbのMHC領域（chr6: 28477797-33451433, hg19）をシークエンシングした。すべてのリスクハプロタイプはヘテロ接合であるため、
円形脱毛症の原因変異はヘテロ接合であることが期待されたところ、合計12個体には77,040個の変異が認められ、そのうちヘテロ接合の変異は3,895個であった。このうち５個のリスクハプロタイプのみに共通して観察される変異は16個であり、遺伝子上にあってアミノ酸置換を伴う変異は、cchcr1遺伝子上に見いだされた一つの変異のみであった（rs142986308とする。）。さらに、これら16個の変異は651.7 kbの領域にわたり、互いに強い連鎖不平衡を示していた（図１Ｄ）。
次に、全個体を用いて全エクソンをシークエンシングしたところ、rs142986308のみが５個体すべてに共有され、優位な関連を示した（OR = 3.41, CI95% = 1.94-5.99, P = 3.39×10-5）。
さらに、rs142986308のcchcr1内に見出された24個のSNVにてハプロタイプ解析を行ったところ、アリルＴを有する上記Hap26のみが統計学的有意性を示し（OR = 3.41, CI95% = 1.94-5.99, P = 3.39×10-5）、さらに、すべてハプロタイプの中でrs142986308のアリルＴを有するハプロタイプはHap26のみであった（図１Ｅ）。
尚、図１Ｅにおいて、Hap01の配列を配列番号19、Hap02の配列を配列番号20、Hap03の配列を配列番号21、Hap04の配列を配列番号22、Hap05の配列を配列番号23、Hap06の配列を配列番号24、Hap07の配列を配列番号25、Hap08の配列を配列番号26、Hap09の配列を配列番号27、Hap10の配列を配列番号28、Hap11の配列を配列番号29、Hap12の配列を配列番号30、Hap13の配列を配列番号31、Hap14の配列を配列番号32、Hap15の配列を配列番号33、Hap16の配列を配列番号34、Hap17の配列を配列番号35、Hap18の配列を配列番号36、Hap19の配列を配列番号37、Hap20の配列を配列番号38、Hap21の配列を配列番号39、Hap22の配列を配列番号40、Hap23の配列を配列番号41、Hap24の配列を配列番号42、Hap25の配列を配列番号43、Hap26の配列を配列番号44とする。
さらに、円形脱毛症と関連を示す５個のアリル（コアアリル）で、EHH (extended haplotype homozygosity)を実施した（図１Ｆ）。rs142986308のアリルＴを含むハプロタイプでは、最も長い（93.7 kb）rs1576 とD6S2931の間でEHH値１を示した。これはHap26が近年その頻度を患者集団で増加させていたことを表している。また、近接した座位に患者群で頻度が上昇しているアリルは、この影響によるヒッチハイキング効果によるものと考えられる。
このように、Hap26は、円形脱毛症患者で遺伝統計学的に有意に多いハプロタイプであり、これに含まれるrs142986308のアリルＴが円形脱毛症の原因変異である。このことから、587位のアルギニンに相当する591位のアルギニンがトリプトファンに置換されたマウスは、ヒト円形脱毛症のモデルマウスとして有効である。
【００１５】
マウス生体内で前記変異型蛋白質を発現させる方法としては、特に制限されないが、CRISPR-Cas9システムが好ましい。その詳細は、後述する＜遺伝子改変マウス＞欄に記載する。
【００１６】
マウス生体外で前記変異型蛋白質を発現させる方法としては特に制限されず、例えば、従来の遺伝子工学手法が挙げられる。具体的には、後述する＜前記変異型蛋白質をコードするＤＮＡ＞欄に記載する、前記変異型蛋白質をコードするＤＮＡを作製し、該ＤＮＡを用いて組換え発現ベクターを構築し、宿主に導入して発現させ、精製することなどが挙げられる。
【００１７】
＜前記変異型蛋白質をコードするＤＮＡ＞
本発明の他の実施態様は、前記変異型蛋白質をコードするＤＮＡである。前記変異型蛋白質をコードしていればその塩基配列は特段制限されない。前記変異型蛋白質を構成する各アミノ酸をコードするコドンは公知であるため、各アミノ酸をコードするＤＮＡの塩基配列は当業者であれば特定することができる。
【００１８】
＜遺伝子改変マウス＞
本発明の他の実施態様は、前記変異型蛋白質を発現し、円形脱毛を発症する遺伝子改変マウスである。
本実施態様におけるマウスの系統は、所望の遺伝子改変が行える系統であれば制限されない。例えばC57BL/6N系統マウスなどが挙げられる。
【００１９】
遺伝子改変の態様は、マウスが前記変異型蛋白質を発現し、円形脱毛を発症する限り制限はないが、CRISPR-Cas9システムによる遺伝子改変が好ましい。
CRISPR-Cas9システムの好ましい態様として実施例欄に記載された態様が挙げられるが、マウス生体内で前記変異型蛋白質が発現される限りその態様に限定されない。
Cas9 mRNAの配列設計、単鎖ガイドRNA（sgRNA）の配列設計、及び一本鎖DNA (ssODN)の配列設計は、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列の591位のアルギニンをトリプトファンに置換する場合には、(a)cchcr1遺伝子の1,936塩基目のＣ（シトシン）がＴ（チミン）に置換され、かつ、(b)1,938塩基目のＴ（チミン）がＧ（グアニン）に置換されるように設計すればよく、常法に基づくことができる。
尚、これらはゲノムDNA上でみれば、それぞれ、(a)マウス17番染色体の35,528,927番目のＣ（シトシン）がＴ（チミン）に置換され、35,528,929番目のＴ（チミン）がＧ（グアニン）に置換されている場合と、(b)35,528,927番目のＧ（グアニン）がＡ（アゲニン）に置換され、35,528,929番目のＡ（アデニン）がＣ（シトシン）に置換されている場合とに対応するものである。
配列番号１で表されるアミノ酸配列の591位のアルギニンをフェニルアラニン又はチロシンに置換する場合にも、それぞれの場合に対応するようにcchcr1遺伝子の塩基を置換すればよい。
マウスの遺伝子改変は常法に従えばよく、好ましい態様として挙げられるのは、実施例欄に記載された態様であるが、当該態様に限定されない。
【００２０】
＜脱毛症の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法＞
本発明の他の実施態様は、脱毛症の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法である。
本実施態様に係るスクリーニング方法は、前記遺伝子改変マウスに脱毛症の治療薬の候補又は予防薬の候補を投与する工程を含む。
該脱毛症としては、男性型脱毛症、女性男性型脱毛症（びまん性脱毛症）、円形脱毛症、牽引性脱毛症、分娩後脱毛症、粃糠性脱毛症、脂漏性脱毛症が挙げられる。好ましくは円形脱毛症である。
該治療薬又は予防薬には、該治療薬又は予防薬の有効成分などの素材も含まれる。また、投与には摂取だけでなく外用剤等の場合の塗布も含まれる。
【００２１】
該候補を脱毛症の治療薬として決定するのは、該候補が投与されたマウスにおいて、投与前の脱毛巣面積よりも投与後の脱毛巣面積が小さくなった場合であり、好ましくは、投与後の脱毛巣面積が投与前の脱毛巣面積の50％以下になった場合であり、より好ましくは、脱毛が全くみられなくなった場合である。
このような効果がみられるまでの時間は、初回の投与から短時間であることが好ましく、例えば、６か月以内、好ましくは３か月以内、より好ましくは１か月以内である。
このようにして決定された脱毛症の治療薬は、脱毛症にまだ罹患していない対象や罹患する可能性が高い対象などに対する脱毛症の予防薬としても用いられる。
【００２２】
該候補の剤形は特に制限されない。例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、粉剤、カプセル剤、液剤、注射剤、外用剤（例えば、軟膏剤、クリーム剤等）、坐剤、徐放剤等が挙げられる。このうち好ましい剤形としては、患部に直接投与できる点や、投与が容易な点、全身副作用発生の可能性が低減する点などから外用剤である。
【００２３】
このほか、本実施態様に係るスクリーニング方法における手順は、脱毛症の治療薬又は
予防薬の開発や一般的な医薬の開発において行われている従来法の手順に従うことができる。
【００２４】
＜脱毛症の改善用又は予防用の化粧品のスクリーニング方法＞
本発明の他の実施態様は、脱毛症の改善用又は予防用の化粧品のスクリーニング方法である。
本実施態様に係るスクリーニング方法は、前記遺伝子改変マウスに脱毛症の改善用又は予防用の化粧品の候補を塗布する工程を含む。
該脱毛症としては、男性型脱毛症、女性男性型脱毛症（びまん性脱毛症）、円形脱毛症、牽引性脱毛症、分娩後脱毛症、粃糠性脱毛症、脂漏性脱毛症が挙げられる。好ましくは円形脱毛症である。
該化粧品には、該化粧品の脱毛症の改善用途又は予防用途における有効成分などの素材も含まれる。
【００２５】
該候補を脱毛症の改善用の化粧品として決定するのは、該候補が塗布されたマウスにおいて、塗布前の脱毛巣面積よりも塗布後の脱毛巣面積が小さくなった場合であり、好ましくは、塗布後の脱毛巣面積が塗布前の脱毛巣面積の50％以下になった場合であり、より好ましくは、脱毛が全くみられなくなった場合である。
このような効果がみられるまでの時間は、初回の塗布から短時間であることが好ましく、例えば、６か月以内、好ましくは３か月以内、より好ましくは１か月以内である。
このようにして決定された脱毛症の改善用の化粧品は、脱毛症をまだ発症していない対象や発症する可能性が高い対象などに対する脱毛症の予防用の化粧品としても用いられる。
【００２６】
該候補の剤形は特に制限されない。例えば、水やエタノール系の溶液製剤、ジェルやエッセンス等の可溶化製剤、エアゾール等の噴射形式製剤などが挙げられる。また、シャンプーやリンス、トリートメント、コンディショナー等の洗い流す製剤であってもよい。
【００２７】
このほか、本実施態様に係るスクリーニング方法における手順は、脱毛症の改善用又は予防用の化粧品の開発や一般的な化粧品の開発において行われている従来法の手順に従うことができる。
【実施例】
【００２８】
以下に実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２９】
一例として、配列番号１で表されるアミノ酸配列の591位のアルギニン（Arg）がトリプトファン（Trp）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型蛋白質を発現するマウスを作製するための方法として、CRISPR-Cas9システムを用いた方法を記載する。本実施例では、該システムを用いて、マウス胚のCCHCR1遺伝子において、配列番号１で表されるアミノ酸配列の591位のアルギニン（Arg）をコードする塩基配列を編集した。
【００３０】
［Cas9 mRNAの準備］
非特許文献３に記載の方法に従い、pBGKプラスミドを用いてCas9 mRNAを準備した。
【００３１】
［単鎖ガイドRNA (sgRNA)の準備］
CHOPCHOP（https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/）を用いて下記２種の単鎖ガイドRNA (sgRNA)を準備した。
guide1: GCTGTGTCAGCTCCTGACGGAGG（配列番号２）
guide2: GGAAGCTGCCAGCCTCCGTCAGG（配列番号３）
上記sgRNA合成のための鋳型は、pUC57-sgRNAベクター（プラスミドバンクaddgene、#51132）を鋳型とし下記プライマーセットを用いたPCRで増幅した。
sgRNA 1用：5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTGTGTCAGCTCCTGACGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3'（配列番号４）、及び5'-AAAAAAAGCACCGACTCGG-3'（配列番号５）
sgRNA 2用：5'-TAATACGACTCACTATAGGGGAAGCTGCCAGCCTCCGTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3'（配列番号６）、及び5'-AAAAAAAGCACCGACTCGG-3'（配列番号７）
PCR後の電気泳動ゲルから精製したPCR産物（400 ng）をMEGAshortscript T7 Kit (Ambion社)によるRNA合成に用いた。その手順はキットに添付されたマニュアルに従った。
MEGAclear Kit (Ambion社)を用いてCas9 mRNAとsgRNAを精製し、Ultrafree-MC filter （HV; 0.45μmポアサイズ、ミリポア社）を通して、後述するマウス受精卵へのマイクロインジェクションする際に、針が目詰まり（clogging）しないようにした。
【００３２】
［一本鎖DNA (ssODN)の準備］
下記一本鎖DNA (ssODN)の合成をIDT (Integrated DNA Technologies社)に委託した。
5'-CAGCAGTTGGAGGCAGCACGTCGGGGCCAGCAGGAGAGCACGGAGGAAGCTGCCAGCCTCtGgCAGGAGCTGACACAGCAGCAGGAAATCTACGGGCAAGGTGTGGGGGCGTGGCGGTGTGTG-3'（配列番号８）
【００３３】
［受精卵へのマイクロインジェクション］
C57BL/6N系統マウスの受精卵（１細胞期）に10 ng/μl Cas9 mRNA、10 ng/μl sgRNA、及び20 ng/μl ssODNをマイクロインジェクションした。その後、該受精卵をKSOM培地で一晩培養し、非特許文献４の方法に従って、偽妊娠のICR系統雌マウスの卵管に２細胞期胚を移植した。
【００３４】
［結果］
（遺伝子型）
作製したマウスの耳からイヤーパンチにより組織を取得し、180 μlの50 mM NaOH溶液を加え、95℃で10分間インキュベートした。20 μlの1 M Tris-HCl (pH 8.0)で中和し遠心してPCRのためにライセートを得た。PCRは、1 μlのライセート、0.2 UのKOD FX Neo (TOYOBO社)、5 μlの２×PCRバッファ、2 μlのdNTP（各2 mM)、及び0.2 μM（終濃度）の各プライマーを含む10 μlの反応量で行った。ForwardプライマーとしてAGCTGAGTGCCCACCTGAT（配列番号９）、ReverseプライマーとしてTGTGTCTCAGTGCTGCCTTC（配列番号10）を用いた（いずれもgreiner bio-one社に合成を委託したものである。）。PCR条件は、はじめに94℃で２分間の熱変性をし、その後、98℃で10秒間と60℃で25秒間を35サイクルとした。遺伝子配列の決定は、従来のサンガー法に従って行った。
その結果、cchcr1遺伝子の1,936塩基目のＣ（シトシン）がＴ（チミン）に置換され、1,938塩基目のＴ（チミン）がＧ（グアニン）に置換されていることが確認された。
【００３５】
（肉眼観察）
作製されたマウスの約50％は、生後４〜８か月後に、その背部にパッチ状の脱毛を示した（図２）。脱毛が確認されたマウスの中には、時間経過とともにその脱毛部位が拡大したマウスも多かったが、初期の脱毛のままのマウスも見られた。また、脱毛したマウスの雌と雄の比は４：１であった。
脱毛した皮膚表面を観察すると、黒いスポット（白丸で囲った部分）や折れた毛髪（白色の矢印）、先細りの毛髪（黒色の矢印）が認められた（図３ａ及び図３ｂ）。これらは円形脱毛症患者に特徴的な脱毛皮膚表面である。尚、図３ａは倍率20倍、図３ｂは倍率32倍の画像である。また、脱毛領域に毛包が確認され、リンパ球浸潤などの兆候は観察されなかった（図４）。
【００３６】
（走査型電子顕微鏡観察）
毛幹を走査型電子顕微鏡（SEM）で観察した結果を図５に示す。作製したマウスでは、
黒いスポットや折れた毛髪、先細りの毛髪など、角質の構造異常や毛幹の平板化などの異常が観察された。この構造異常は脱毛していないマウスでも認められ、すなわちこの遺伝子改変マウスのすべてで認められた構造異常である。そしてこのような角質の構造異常はヒトの円形脱毛症患者でも観察されるものである（非特許文献５）。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明は、円形脱毛症の治療法の研究に利用できる。また、円形脱毛症の治療薬や予防薬、円形脱毛症の改善用又は予防用の化粧品の開発に利用できる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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