(57)【要約】      （修正有）【課題】疾患患者のサンプルから特定の生体分子を精製し、及び特定の疾患についてのバイオマーカーを同定するために、疾患に関連するある特定の生体分子と結合するオリゴヌクレオチド・アプタマーを使用する方法の提示。【解決手段】核酸ライブラリーから、ある疾患に関連した生体分子に対して高い結合親和性を有し、疾患に関連したものではない他の生体分子に対しては結合親和性が無いアプタマーを選択するための磁気支援高速アプタマー選択（ＭＡＲＡＳ）を使用する方法、疾患患者のサンプルから疾患に関連するある特定の生体分子を精製するための捕捉リガンドとして、得られたアプタマーを使用する方法、更に、仮想フィルタとして振動磁場範囲を印加することによって特定の結合親和性範囲を有する生体分子を精製するための捕捉リガンドとして、得られたアプタマーを使用する方法。【選択図】図２
2019208506.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アプタマーを選択する方法であって、選択した各アプタマーは、ポジティブ・サンプルとネガティブ・サンプルとを識別することができ、以下を含む：
ａ）ランダム配列ライブラリーと呼ばれるランダムなヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドのライブラリーを用意し、及び前記ランダム配列ライブラリーを加熱し、そして急冷して（quenching）二次又は三次構造の形成を誘導すること； 
ｂ）ネガティブ・サンプル(j) と結合した複数の磁性粒子（NS-MPs(j)）を調製すること、ここで、前記磁性粒子（MPs）はナノ粒子（MNPs）又はマイクロ粒子（MMPs）であり、及び j は 1 から J までの値の可変整数であり、J 種類のうちの各種類のネガティブ・サンプル(j) は、互いに異なる種類のネガティブ・サンプルである；
ｃ）j が 1 に等しい場合は工程ａ）由来の、又は j が 1 より大きい場合は前のラウンドの工程ｄ）由来の、前記ランダム配列ライブラリーを、第 1 の PBS 緩衝液中で、工程ｂ）由来の NS-MPs(j) と共にインキュベートしてオリゴヌクレオチドを NS-MPs(j) に結合させること、ここで、前記ランダム配列ライブラリーは、NS-MPs(j) と 1 つずつインキュベートするか、又は前記ランダム配列ライブラリーは、異なる NS-MPs(j) の全部と 1 つのバッチでインキュベートする；
ｄ）磁気スタンドを用いる第 1 の磁気分離を行うことによって、NS-MPs(j) に結合したオリゴヌクレオチドを除去し、j が J に等しい場合は工程ｅ）に向けて、又は j が J 未満である場合は次のラウンドの工程ｃ）のランダム配列ライブラリーとして、NS-MPs(j) に結合していないオリゴヌクレオチドを含む上清を取っておくこと、ここで、工程ｃ）においてランダム配列ライブラリーを NS-MPs(j) と 1 つずつインキュベートする場合は、前記工程ｃ）及びｄ）を J 回行い、そして、繰り返しの間、次のラウンドに向けて j を 1 ずつ増加させる、又は、工程ｃ）においてランダム配列ライブラリーを異なる NS-MPs(j) の全部と 1 つのバッチでインキュベートする場合は、前記工程ｃ）及びｄ）を 1 回行う；
ｅ）ポジティブ・サンプル(i)（PS-MPs(i)）と結合した複数の磁性粒子を調製し、i が 1 に等しい場合は工程ｄ）由来の、又は i が 1 より大きい場合は前のラウンドの工程ｉ）由来の、オリゴヌクレオチドを含む上清を、PS-MPs(i) とインキュベートし、PS-MPs(i) に結合したオリゴヌクレオチドを含む結合混合物を形成させること、ここで前記磁性粒子（MPs）は MNPs 又は MMPs であり、I 種類のうちの各種類のポジティブ・サンプル(i) は、互いに異なる種類のポジティブ・サンプルであり、i は 1 から I までの値の可変整数である；
ｆ）磁気スタンドを用いる第 2 の磁気分離を行うことによって、PS-MPs(i) に結合したオリゴヌクレオチドを含む結合混合物を回収し、PS-MPs(i) に結合していないオリゴヌクレオチドを含む上清は除去し、及びこの回収した PS-MPs(i) に結合したオリゴヌクレオチドを含む結合混合物を第 2 の PBS 緩衝液中に再分散させること；
ｇ）工程ｆ）で得られた、再分散させた結合混合物を、下限結合周波数 fL 及び／又は下限結合強度 HL の第 1 の振動磁場で MARAS に供して、PS-MPs(i) に対する第 1 の結合親和性より低い結合親和性のオリゴヌクレオチドを PS-MPs(i) から解離させ、次に、磁気スタンドを用いる第 3 の磁気分離を行うことによって、PS-MPs(i) から解離させたオリゴヌクレオチドを含む上清を除去し、PS-MPs(i) に結合したオリゴヌクレオチドを含む結合混合物を回収すること；
ｈ）工程ｇ）で得られた、回収した PS-MPs(i) に結合したオリゴヌクレオチドを含む結合混合物を第 3 の PBS 緩衝液中に再分散させる；
ｉ）工程ｈ）で得られた、再分散させた結合混合物を、上限結合周波数 fU 及び／又は上限結合強度 HU の第 2 の振動磁場で MARAS に供して、PS-MPs(i) に対する第 2 の結合親和性より低い結合親和性のオリゴヌクレオチドを PS-MPs(i) から解離させ、次に、磁気スタンドを用いる第 4 の磁気分離を行うことによって、i が I に等しい場合は工程ｊ）に向けて、i が I よりも小さい場合は次のラウンドの工程ｅ）に向けて、PS-MPs(i) に対する第 2 の結合親和性より低い結合親和性のオリゴヌクレオチドを含む上清を回収し、PS-MPs(i) に対して第 2 の結合親和性より高い結合親和性で PS-MPs(i) に結合したオリゴヌクレオチドを含む残りの結合混合物を除去する、ここで、fL≦fU 及び／又は HL≦HU であり、fL=fU 及び HL=HU を同時に使用することを除外する、
又は、工程ｈ）で得られた、再分散させた結合混合物である PS-MPs(i) から、PS-MPs(i) に対する第 1 の結合親和性より高い結合親和性のオリゴヌクレオチドを溶出し、及び、磁気スタンドを用いる第 5 の磁気分離を行うことによって、i が I に等しい場合は工程ｊ）に向けて、若しくは i が I よりも小さい場合は次のラウンドの工程ｅ）に向けて、PS-MPs(i) に対する第 1 の結合親和性より高い結合親和性のオリゴヌクレオチドを含む上清を回収する、
ここで、前記工程ｅ）‐ｉ）を 1 ラウンドとして、I 回の繰り返し、繰り返しの間、次のラウンドに向けて i を 1 ずつ増加させる、又は、ポジティブ・サンプルの組成が固定されていて既知である場合、前記工程ｅ）‐ｉ）を 1 回行い、及びここで、第 2 の結合親和性は第 1 の結合親和性より高い；並びに、
ｊ）ポジティブ・サンプルとネガティブ・サンプルとを識別することができるアプタマーとしてのオリゴヌクレオチドを得る。
【請求項２】
工程ｂ）が、J 種類のネガティブ・サンプル(j) を用意し、J 種類のネガティブ・サンプル(j) を複数の磁性粒子と別々に結合させて J 種類の NS-MPs(j) を形成すること；及び、
工程ｅ）が、I 種類のポジティブ・サンプル(i) を用意し、I 種類のポジティブ・サンプル(i) を複数の磁性粒子と別々に結合させて I 種類の PS-MPs(i) を形成すること； 
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記 J 種類のネガティブ・サンプル(j) 又は前記 I 種類のポジティブ・サンプル(i) を前記磁性粒子と別々に結合させることが、前記磁気粒子及び前記 J 種類のネガティブ・サンプル(j) 又は前記 I 種類のポジティブ・サンプル(i) にそれぞれ付いている結合対を介して、前記 J 種類のネガティブ・サンプル(j) 又は前記 I 種類のポジティブ・サンプル(i) を前記磁性粒子に結合させることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記結合対がストレプトアビジン及びビオチンから構成され、そして前記ストレプトアビジンが前記磁性粒子と結合し、かつ前記ビオチンが前記 J 種類のネガティブ・サンプル(j) 又は前記 I 種類のポジティブ・サンプル(i) と結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記再分散させた結合混合物を、下限結合周波数 fL 及び／又は下限結合強度 HL の第 1 の振動磁場で MARAS に供する工程ｇ）が、下限結合周波数 fL及び／又は下限結合強度 HL の第 1 の回転磁場又は第 1 の交互磁場を印加することによって、MARAS を行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記再分散させた結合混合物を、上限結合周波数 fU 及び／又は上限結合強度 HU の第 2 の振動磁場で MARAS に供する工程ｉ）が、上限結合周波数 fU及び／又は上限結合強度 HU の第 2 の回転磁場又は第 2 の交互磁場を印加することによって、MARAS を行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ポジティブ・サンプルをネガティブ・サンプルから識別することができ、ポジティブ・サンプル中の少なくとも 1 種類の標的生体分子と結合することができるアプタマーを使用して、ポジティブ・サンプルから少なくとも 1 種類の標的生体分子を精製する方法であって、以下を含む： 
ａ）前記アプタマーを用意し、ここで前記アプタマーを第 1 の PBS 緩衝液中に分散させて、加熱し、そして急冷して（quenching）二次又は三次構造の形成を誘導すること； 
ｂ）N 種類のポジティブ・サンプル(n) を用意し、ここで、各ポジティブ・サンプルは少なくとも 1 種類の標的生体分子を含み、n は 1 から N の値の可変整数である；
ｃ）ポジティブ・サンプル(n) から少なくとも 1 種類の標的生体分子を精製するための精製試薬としてのアプタマー磁性粒子結合複合体を形成するために、工程ａ）のアプタマーと結合した、複数の磁性粒子を調製すること、ここで、前記磁性粒子（MPs）はナノ粒子（MNPs）又はマイクロ粒子（MMPs）である；
ｄ）少なくとも 1 種類の標的生体分子を精製するプロセスの中で、磁性粒子‐アプタマー‐生体分子結合混合物を形成するために、n が 1 に等しい場合は工程ｃ）由来の、又は n が 1 より大きい場合は前のラウンドの工程ｉ）由来の、前記精製試薬を、工程ｂ）由来のポジティブ・サンプル(n) と共にインキュベートすること；
ｅ）非特異的な結合親和性及び低い結合親和性等を含む、最初の（第 0 の）結合親和性よりも低い結合親和性でアプタマーに結合した生体分子を、前記磁性粒子‐アプタマー‐生体分子結合混合物から解離させるために、工程ｄ）由来の磁性粒子‐アプタマー‐生体分子結合混合物を、最初の場周波数 f0 及び／又は最初の場強度 H0 の最初の（第 0 の）振動磁場に供すること；
ｆ）磁気スタンドを用いる第 1 の磁気分離を行うことにより、工程ｅ）で残った磁性粒子‐アプタマー‐生体分子結合混合物を回収し、前記磁性粒子‐アプタマー‐生体分子結合混合物から解離した生体分子、若しくは結合していない生体分子を含む上清を除去し、回収した磁性粒子‐アプタマー‐生体分子結合混合物を第 2 の PBS 緩衝液中に再分散させること； 
ｇ）第 (m-1) の結合親和性よりも高く、第 m の結合親和性よりも低い結合親和性でアプタマーに結合した生体分子を、前記磁性粒子‐アプタマー‐生体分子結合混合物から解離させるために、m が 1 の場合は工程ｆ）由来の、又は m が 1 より大きい場合は前のラウンドの工程ｈ）由来の、再分散させた磁性粒子‐アプタマー‐生体分子結合混合物を、第 m の場周波数 fm 及び／又は第 m の場強度 Hm の第 m の振動磁場に供すること、ここで、第 (m-1) の結合親和性は第 m の結合親和性より低く、そして m は 1 から M までの値の可変整数である；
ｈ）磁気スタンドを用いる第 2 の磁気分離を行うことにより、残っている磁性粒子‐アプタマー‐生体分子結合混合物を回収し、工程ｊ）に向けての分離成分(m) として、工程ｇ）において前記磁性粒子‐アプタマー‐生体分子結合混合物から解離させた生体分子を含む上清を取っておき、及び、m が M と等しい場合は工程ｉ）に向けて、又は m が M 未満の場合は次のラウンドの工程ｇ）に向けて、回収した磁性粒子‐アプタマー‐生体分子結合混合物を第 3 の PBS 緩衝液中に再懸濁すること、
ここで、前記磁性粒子‐アプタマー‐生体分子結合混合物中の全ての生体分子がアプタマーから解離し、この磁性粒子‐アプタマー‐生体分子結合混合物がアプタマー磁性粒子結合複合体に戻るまで、工程ｇ）‐ｈ）のプロセスを M 回繰り返し、繰り返しの間、次のラウンドに向けて m を 1 ずつ増加させる、又は、もし、特定の種類の標的生体分子についての適切な振動磁場範囲（f(m-1)、H(m-1)、f(m) 及び H(m)）が既知の場合、工程ｇ）‐ｈ）のプロセスを 1 回行う、ここで、f(m-1)≦f(m) 及び／又は H(m-1)≦H(m) であり、f(m)=f(m-1) 及び H(m)=H(m-1) を同時に使用することが除外される；
ｉ）次のポジティブ・サンプル(n) から少なくとも 1 種類の標的生体分子を精製するために、精製試薬として、工程ｈ）由来の回収し再分散させたアプタマー磁性粒子結合複合体を使用すること、又は工程ｃ）の方法に従って新たな精製試薬を再調製すること、及び工程ｄ）‐ｉ）のプロセスを N 回繰り返し、繰り返しの間、次のラウンドに向けて n を 1 ずつ増加させ、並びに加えた振動磁場条件は、各繰り返されるラウンドの間、変更しないままである；並びに
ｊ）M 種類の精製した標的生体分子を得るための工程ｄ）‐ｉ）のプロセスを、N 回順次繰り返すことの工程ｈ）から得られた、M 種類の、対応する分離成分(m) を集めること。
【請求項８】
アプタマー磁性粒子結合複合体を形成するための、アプタマーと結合した複数の磁性粒子を調製する工程ｃ）が：
前記アプタマーを用意し、前記アプタマーを前記磁性粒子と結合させて、結合対を介したアプタマー磁性粒子結合複合体を形成し、ここで前記結合対はストレプトアビジン及びビオチンから構成され、そして前記ストレプトアビジンは前記磁性粒子と結合し、かつ前記ビオチンは前記アプタマーと結合する、
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記磁性粒子‐アプタマー‐生体分子結合混合物を最初の場周波数 f0 及び／又は最初の場強度 H0 の最初の（第 0 の）磁場に供する工程ｅ）が、前記磁性粒子‐アプタマー‐生体分子結合混合物から、非特異的な結合親和性及び低い結合親和性等を含む、最初の結合親和性より低い結合親和性でアプタマーに結合した生体分子を、磁気支援的に除去するために、最初の場周波数 f0 及び／若しくは最初の場強度 H0 の最初の（第 0 の）回転磁場又は最初の（第 0 の）交互磁場を印加することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記再分散させた磁性粒子‐アプタマー‐生体分子結合混合物を、第 m の場周波数 fm 及び／又は第 m の場強度 Hm の第 m の振動磁場に供する工程ｇ）が、前記磁性粒子‐アプタマー‐生体分子結合混合物から、第 (m-1) の結合親和性より高く、第 m の結合親和性よりも低い結合親和性でアプタマーに結合した生体分子を、磁気支援的に除去するために、第 m の場周波数 fm 及び／又
は第 m の場強度 Hm の第 m の回転磁場又は第 m の交互磁場を印加することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ポジティブ・サンプルをネガティブ・サンプルから識別することができ、ポジティブ・サンプル中にある少なくとも 1 種類の標的生体分子と結合することができるリガンドを使用して、ポジティブ・サンプルから少なくとも 1 種類の標的生体分子を精製する方法であって、以下を含む方法：
ａ）リガンドを用意して、前記リガンドを、ポジティブ・サンプルから少なくとも 1 種類の標的生体分子を精製するための精製試薬として、第 1 の PBS 緩衝液中に分散させること； 
ｂ）N 種類のポジティブ・サンプル(n) を用意し、ここで各ポジティブ・サンプル(n) は少なくとも 1 種類の標的生体分子を含み、n は 1 から N までの値の可変整数である；
ｃ）精製プロセス中に、前記リガンドと前記ポジティブ・サンプル(n) 中にある少なくとも 1 種類の標的生体分子との少なくとも 1 種類の結合対を介して、リガンド‐生体分子結合混合物を形成するために、工程ｂ）由来のポジティブ・サンプル(n) を、n が 1 に等しい場合は工程ａ）由来の精製試薬と、又は n が 1 より大きい場合は前のラウンドの工程ｇ）由来の精製試薬とインキュベートすること；
ｄ）前記リガンドに対して、結合していない、及び第 0 の結合親和性よりも低い結合親和性を有する結合対で非特異的に結合している生体分子を、前記リガンド‐生体分子結合混合物から、除去し、残りのリガンド‐生体分子結合混合物を回収するために、少なくとも 1 種類の結合対の結合親和性を選択することができる仮想フィルタに、工程ｃ）由来のリガンド‐生体分子結合混合物を供すること、ここで、前記仮想フィルタは、少なくとも 1 種類の結合対の結合親和性範囲の選択性を変えることができる；
ｅ）前記リガンド‐生体分子結合混合物から、工程ｈ）に向けての第 m の種類の標的生体分子を分離して回収し、残りのリガンド‐生体分子結合混合物を工程ｆ）に向けて取っておくために、m が 1 に等しい場合は工程ｄ）由来の、又は m が 1 より大きい場合は前のラウンドの工程ｆ）由来の、前記リガンド‐生体分子結合混合物を、第 (m-1) の結合親和性よりも高く選択した第 m の結合親和性を有する仮想フィルタに供する、ここで、第 m の種類の標的生体分子及び前記リガンドとによって形成される結合対は、第 (m-1) の結合親和性よりも高く、及び第 m の結合親和性よりも低い結合親和性を有し、そして第 (m-1) の結合親和性は、第 m の結合親和性より低い；
ｆ）前記リガンド‐生体分子結合混合物の生体分子が完全に解離し、前記リガンド‐生体分子結合混合物がリガンドに戻るまで、工程ｅ）におけるリガンド‐生体分子結合混合物中のリガンド及び少なくとも 1 種類の標的生体分子によって形成された少なくとも 1 種類の結合対の（仮想フィルタによって選択された）結合親和性を徐々に増加させ、工程ｅ）からｆ）のプロセスを M ラウンド繰り返し、繰り返しの間、次のラウンドに向けて m を 1 ずつ増加させる、又は、リガンド‐生体分子結合混合物中のリガンドと特定の種類の標的生体分子との間の結合対の適切な範囲の結合親和性が既知である場合は、前記結合対に関して適切な範囲の結合親和性を有する仮想フィルタを使用して、工程ｅ）からｆ）までのプロセスを 1 回行う；
ｇ）次のポジティブ・サンプル(n) から少なくとも 1 種類の標的生体分子を精製するために、精製試薬として、第 2 の PBS 緩衝液中に工程ｆ）由来のリガンドを再分散すること、又は、工程ａ）の方法に従って精製試薬を再調製すること、及び、工程ｃ）からｇ）のプロセスを N ラウンド繰り返し、繰り返しの間、次のラウンドに向けて n を 1 ずつ増加させ、並びに各ポジティブ・サンプル(n) の精製に用いた仮想フィルタの条件は変更しないままである；並びに、
ｈ）M 種類の精製した標的生体分子を得るために、順次行うプロセス工程ｃ）からｇ） N ラウンドある工程ｅ）から得られた、M 種類の、対応する第 m の種類の標的生体分子を集めること。
【請求項１２】
工程ｃ）のリガンド‐生体分子結合混合物が、前記リガンドと少なくとも 1 種類の標的生体分子とによって少なくとも 1 種類の結合対を形成することを含み、ここで、前記リガンドと少なくとも 1 種類の標的生体分子のうちの各種類とによって形成された結合対の結合親和性が互いに異なる、請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも 1 種類の結合対が、以下の対：抗体‐抗原、DNA/RNA アプタマー‐捕捉された生体分子、及びssDNA とその相補鎖、を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記リガンド‐生体分子結合混合物を、少なくとも 1 種類の結合対の結合親和性範囲を選択することができる仮想フィルタに供する工程ｄ）において、前記仮想フィルタの選択メカニズムが、前記リガンド‐生体分子結合混合物に対する力学的な力、流体力学的な力、遠心力、電磁力、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポジティブ・サンプルから、少なくとも 1 種類の標的生体分子を精製する方法のための精製試薬として前記リガンドを使用することが、前記ポジティブ・サンプルから、少なくとも 1 種類の標的生体分子を精製する方法の固体支持体の固定表面に前記リガンドを結合させることを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポジティブ・サンプルから、少なくとも 1 種類の標的生体分子を精製する方法のための精製試薬として前記リガンドを使用することが、前記ポジティブ・サンプルから、少なくとも１つの種類の標的生体分子を精製する方法のために、複数の磁性粒子又は誘電粒子を用意し、前記リガンドを水溶液中に懸濁した前記磁性粒子又は誘電粒子に結合させること、を含み、ここで、前記磁性粒子又は誘電粒子はナノ粒子又はマイクロ粒子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポジティブ・サンプルから、少なくとも 1 種類の標的生体分子を精製する方法のために、前記リガンドを水溶液中に懸濁した前記磁性粒子又は誘電粒子に結合させた後、回収手段により、前記リガンドと結合した前記磁性粒子又は誘電粒子を回収することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記回収手段が、幾何学的トラッピング（geometric trapping）、又は勾配磁場若しくは勾配電場による捕捉を含む、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広く、ポジティブ・サンプル（疾患患者のサンプル）とネガティブ・サンプル（非疾患患者のサンプル）との間にある差異を見出すために、ポジティブ選択及びネガティブ選択の設計並びに核酸ライブラリーにおける構造多様性を使用すること、これら 2 つを識別することができるアプタマーを選択するために、磁気支援迅速アプタマー選択（magnetic assisted rapid aptamer selection (MARAS)）法を使用すること、及び前記アプタマーに結合したいくつかの特定の疾患に関連した生体分子をポジティブの特性を有するサンプル（疾患に関連したバイオマーカーを見つけるために同定されるはずである）から精製するための捕捉リガンドとして選択したアプタマーを使用すること、の方法に関する。特に、本発明は、核酸ライブラリーからのアプタマーの選択方法に関し、選択されたアプタマーは、疾患患者のサンプルと非疾患患者のサンプルとの間の差異を識別することが可能であり、この差異物（疾患患者のサンプル由来の疾患に関連した生体分子）を精製するための捕捉リガンドとして使用されることがある。一方、本発明は、この差異物（疾患患者のサンプル由来の疾患に関連した生体分子）を精製するための捕捉リガンドとしてのこのアプタマーの使用方法を記載する。
【背景技術】
【０００２】
全タンパク質から標的タンパク質を精製すること、及び標的タンパク質を同定することは、全タンパク質から標的タンパク質を分離して、その後に解析するために、適切なタンパク質精製技術に頼らなければならない。一般的なタンパク質精製技術は、以下である：（1）膜分離は、ほとんどのプロセスで、分離するという目的を達成するためにタンパク質の分子サイズを使用する；（2）クロマトグラフィーは、タンパク質の分子サイズ、電荷、極性、及び異なる親和性を使用し、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）、アフィニティー・クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、及び高性能（高圧力）液体クロマトグラフィーに分けられる；及び（3）磁気分離はそれ自身の磁気特性を利用する。標的タンパク質に特異的に結合することができる分子（DNA、抗体、又はペプチド）は、磁性粒子の表面に固定化され、前記標的タンパク質に結合する。磁石を用いて磁気分離を行うことにより、全タンパク質から前記標的タンパク質を迅速に得ることができ、分離の効果を得ることができる。前記標的タンパク質の分子量が非標的タンパク質の分子量に近い場合、上記（1）及び（2）の精製方法では、標的タンパク質と非標的タンパク質とが混ざり合うことになり、純度が落ちる結果となり、例えば、膜分離は、分離するタンパク質を予備精製する方法として、使用される；そして（3）磁気分離法は、総タンパク質から標的タンパク質を迅速に分離することができるが、磁気ビーズから標的タンパク質を外すためには、通常、高濃度の塩で洗浄（溶出）する。この溶出工程は時間がかかり、タンパク質活性の低下を引き起こすことがある。更に、前記磁気分離法は、タンパク質を結合するためのツールとして、抗体をしばしば必要とする。抗体は高価であり、保存は容易ではなく、そして効力は異なり、その結果、タンパク質精製のコストは過度に高くなる。そのため、実用化を推進することは容易ではない。
【０００３】
がん関連バイオマーカーを発見することに、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、定量的免疫-PCR（QI-PCR）、タンパク質マイクロアレイ、二次元ゲル電気泳動、質量解析、シャット・ガン・プロテオミクス、質量解析と組み合わせた同位体コード・アフィニティ・タギング（isotope-code affinity tagging combined with mass spectrometry (ICAT)）、又は、画像解析媒体支援レーザー脱離／イオン化画像質量解析（image analysis medium-assisted laser desorption/ionization-image mass spectrometry (MALDI-IMS)）、オリゴヌクレオチド・アプタマー等の方法が使用されている。上記の実験方法は、すべて高フラックスの特性（high-flux characteristics）を有し、腫瘍患者と非腫瘍正常者との間のタンパク質又は RNA 発現の差を解析することができる。しかしながら、上記の実験方法は、専門的な技術、大量の労力、時間、消耗品、及び機器解析に関して高額になる操作を必要とする。しかしながら、高い親和性、及び特異性を有する適切なモノクローナル抗体が存在しないか、または標的生体分子がどういうものであるかが未知である場合、上記の方法によってタンパク質精製をおこなうことができず、その結果、バイオマーカーを同定することができない。
【０００４】
標的生体分子に結合するオリゴヌクレオチドが折り畳まれることによって形成される多様な構造を生成する核酸ライブラリーを構成しているオリゴヌクレオチドの多様性を利用することによって、標的生体分子に対する高い結合親和性、及び高い特異性を有するアプタマーを、核酸ライブラリーから選択するために競合メカニズムを適用する。上記のアプタマーを、モノクローナル抗体から置き換えるために使用することがある。一方、標的生体分子がどういうものかが知られていない場合でも、核酸ライブラリー中にあるオリゴヌクレオチドが折り畳まれることによって形成される構造の多様性を利用すると、異なる特性を有するサンプル（疾患患者及び非疾患患者）を識別することができるアプタマーを選択することができる
【０００５】
結合ポケットを含むアプタマーは、ミクロ分子（有機分子、イオン、ペプチド、タンパク質、核酸等）から巨大分子、更には細胞全体、ウイルス、寄生虫又は組織に至るまで多様に拡がる、様々な標的解析物に高い特異性と親和性で結合する。標的解析物に対して、アプタマーの配列が同定されたら、アプタマー全体を化学合成によって製造することができる。更に、官能基で修飾されたアプタマーは、様々な生物学的用途においてそれらの安定性を高めることができるが、オリゴヌクレオチド（アプタマー）にとっては有害であることがある。アプタマーは、病原性悪性細胞又は組織を標的とし、そして抗体を代替するための優れたツールである可能性を有するだけでなく、精製、診断薬、バイオセンサー及び抗感染薬にも適用することができる。アプタマーは多くの態様に対して可能性があるので、標的解析物に対して高い親和性及び特異性を有する適切なアプタマーを迅速に選択する簡単な、効率的な選択方法（磁気支援迅速アプタマー選択（Magnetic-Assisted Rapid Aptamer Selection (MARAS)））が開発されてきている。2017 年 3 月 8 日に発行された中国特許（ZL 2014 1 0570602.0）に示された MARAS の詳細な説明は、2016 年 11 月 4 日に発行された前の日本国特許（特許番号 6034840）と同じであり、参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の一部をなすものである。
【０００６】
MARAS は選択サイクルを必要とせず、単純、迅速、効率的な直接選択法であり、アプタマー適用の範囲を広げることができる、標的に対するアプタマーの高い結合親和性、及び特異性を確実にする、開発プラットフォームである。この方法は、標的分子と結合した磁性粒子を核酸ライブラリーと共にインキュベートすることであり、オリゴヌクレオチドの一部は標的分子と会合して磁性粒子結合複合体を形成する。水溶液中の磁性粒子結合複合体は、磁場によって磁性粒子に発生する磁気牽引力を介して、MARAS の振動磁場の作用下で移動し、それによって前記磁性粒子結合複合体の振動運動が生じる。前記磁性粒子結合複合体が水溶液中を移動すると、運動方向と反対の方向に粘性力が生じる。これら 2 つの力の相互作用の下で、標的分子の磁性粒子への結合、及びアプタマーの標的分子への結合は、前記アプタマーを選択するための競合的メカニズムを提供する伸張力を受ける。選択の競合メカニズムによって、標的分子に対して高い結合親和性及び特異性を有するアプタマーが選択される。同時に、前記アプタマーと前記標的分子との間の結合親和性（又は平衡解離定数）を、標的分子に対して所望の結合親和性を有するアプタマーを得るために印加する振動磁場の条件を使用することによって、選択することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、疾患患者と非疾患患者のサンプルの違いを識別し、そして疾患に関連した生体分子を精製することができるアプタマーを選択するように、アプタマーを選択する方法及びアプタマーを用いて生体分子を精製する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のいくつかの態様は、患者のサンプルと非患者のサンプルとを識別することができるアプタマーを選択するために MARAS を使用する選択方法に関する。この方法は、核酸ライブラリーのオリゴヌクレオチドが折りたたまれることによって形成される構造的多様性を利用し、ポジティブ（疾患患者）サンプル中の、ある疾患に関連する生体分子に結合し、ポジティブ及びネガティブ（非疾患患者）のサンプル中の、疾患に関連したものではない生体分子には結合しない、アプタマーを核酸ライブラリーから選択する。更に、得られたアプタマーを、ポジティブ・サンプルとネガティブ・サンプルとを識別するために使用する。
【０００９】
本発明は、核酸ライブラリーから、ポジティブ・サンプルとネガティブ・サンプルを識別することができるアプタマーを選択するために、生体‐機能化磁性粒子（bio-functionalized magnetic particles）を利用するアプタマー選択方法を提供する。
【００１０】
本発明のいくつかの態様は、ポジティブの特性を有するサンプルから、ある疾患に関連した生体分子を精製するための捕捉リガンドとして、ポジティブ・サンプル及びネガティブ・サンプルを識別することができる、得られたアプタマーを使用する方法に関する。
【００１１】
本発明は、ポジティブの特性を有するサンプルから、ある疾患に関連した生体分子を精製するための方法を提供し、その方法は、ポジティブの特性を有するサンプルから、ある疾患に関連した生体分子を精製するための、ある疾患に関連した生体分子に対する精製試薬を形成するために、生体‐機能化磁性粒子に結合した捕捉リガンドとしてアプタマーを使用する。
【００１２】
本発明の上記及び他の特徴及び利点を理解可能にするために、図面を伴う例示的な実施形態を、以下で詳細に説明する。
【発明の効果】
【００１３】
要約すると、EGFR 変異を有する、及び有さない NSCLC 疾患患者のサンプルを識別することができるアプタマーを、MARAS プラットフォームを使用することによって核酸ライブラリーから選択することができ、その選択手順によって得られる、捕捉リガンドとしてアプタマーを使用する精製試薬を更に調製する。疾患に関連する生体分子を、前記精製試薬を使用することによって、ポジティブの特性を有するサンプルから精製することができ、磁場範囲を印加することによってシミュレートされて、アプタマーに対して固定範囲の結合親和性を有している生体分子を濾過することができる、仮想フィルタを使用する。次いで、質量解析法を用いて配列決定をし、精製した生体分子がどういうものであるかを確認することがある。対応するモノクローナル抗体によって更に検証されれば、生体分子は EGFR 変異を伴う NSCLC 疾患のバイオマーカーとして発見されるかもしれない。本発明において開示されるバイオマーカー発見手順は、周知の生化学関連技術（例えば、PCR、q-PCR、電気泳動、及び質量解析）の他に、 2 つの主要部分を含む：（1）MARAS プラットフォームを用いて、核酸ライブラリーから、疾患患者のサンプルを識別することができるアプタマーを選択すること、及び（2）印加する磁場範囲によってシミュレートされる仮想フィルタを用いて、ポジティブの特性を有するサンプルから、捕捉リガンドとしてのアプタマー（得られたアプタマー）に対する一定の結合親和性範囲を有する生体分子を精製すること。前者では、個々の患者のサンプルの組成が異なる可能性があるので、複数の非疾患患者のサンプルをネガティブ選択サンプルとして使用して、検出及び精製中の偽ポジティブの影響を減少させるために、核酸ライブラリーから、非疾患患者のサンプルの疾患に関連したものではない成分に結合したオリゴヌクレオチドを除去する。更に、複数のポジティブ患者サンプルをポジティブ選択に使用する。その結果、検出及び精製中の偽ネガティブの影響が低減するために、選択により得られたアプタマーは、全てのポジティブ患者サンプルに共通して存在する生体分子にのみ結合することができる。それ故に、得られたアプタマーは、疾患患者と非疾患患者とを識別することができるようになる。そして後者では、使用する仮想フィルタは、印加した振動磁場によって、捕捉リガンド（選択によって得られたアプタマー）と生体分子によって形成される結合対に伸張力を与え、上限及び下限のカットオフ振動磁場を印加する場合、精製される生体分子の捕捉リガンドに対する結合親和性の範囲は、上限及び下限カットオフ振動磁場によって規定される。もし、印加する振動磁場範囲が異なる場合、精製される生体分子の捕捉リガンドに対する結合親和性の範囲は異なるであろう。即ち、異なる生体分子が精製される。多数のポジティブの特性を有する患者のサンプルを仮想フィルタによって精製して、十分な量の個々の生体分子を得、そしてその精製物から分離した個々の成分を、質量解析シークエンシングを行うために濃縮する。更に、本特許明細書に開示されている、振動磁場範囲を適用することによってシミュレートされる仮想フィルタに関する精製技術はまた、ポジティブの特性を有するサンプルから未知又は既知の生体���子（標的）を精製するためにも使用でき、その精製手順を実行することによって、精製した生体分子の活性は低下しない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
添付の図面は、本発明を更に理解できるようにするために含まれ、本明細書中に組み込まれてその一部を構成する。図面は、本発明の実施形態を例示し、その説明と共に、本発明の原理を説明するのに役立つ。
【図１】図１は、本発明の技術に従って、MARAS 法を使用して、疾患患者と非疾患患者とを識別することができるアプタマーを選択するための選択方法を概略的に示す。
【図２】図２は、本発明の技術に従って、ポジティブ・サンプルとネガティブ・サンプルとを区別することができるアプタマーを、捕捉リガンドとして、ポジティブの特性を有するサンプルから、ある疾患に関連した生体分子を精製するための、振動磁場範囲によってシミュレートされた仮想フィルタと組み合わせて使用する、精製方法を概略的に示す。
【図３】図３Ａは、本発明の実施形態による、回転磁場磁気支援高速アプタマー選択（rotating magnetic field magnetic-assisted rapid aptamer selection (RO-MARAS)）の方法についての実験設定の概略図である。図３Ｂは、本発明の実施形態による、交互磁場磁気支援高速アプタマー選択（alternating magnetic field magnetic-assisted rapid aptamer selection (AC-MARAS)）の方法についての実験設定の概略図である。
【図４】図４Ａ‐４Ｃは、EGFR 変異非小細胞肺がん（NSCLC）の疾患患者のポジティブ・サンプルとネガティブ・サンプルとを識別することができる、3 種類の得られたアプタマーを、本発明の実施形態による、定量リアル‐タイム PCR（q-PCR）によって、逆検証した結果を示す。
【図５】図５Ａ‐５Ｃは、EGFR 変異の NSCLC の疾患患者のポジティブ・サンプルとネガティブ・サンプルとを識別することができる、3 種類の得られたアプタマーに関して、本発明の実施形態による、q-PCR によって、いくつかのブラインド試験サンプルを用いた、ブラインド試験サンプル解析をした結果を示す。
【図６】図６は、本発明の実施形態による捕捉リガンドとして Aptamer37 を用いて、EGFR 変異 NSCLC 患者のポジティブの特性を有するブラインド試験サンプルから精製された、ある未知の解析物のポリアクリルアミド・ゲル電気泳動のブロッティング画像を示す。
【図７】図７Ａ‐７Ｃは、本発明の実施形態による捕捉リガンドとしての Aptamer37 によって、EGFR 変異 NSCLC 患者のポジティブの特性を有するブラインド試験サンプルから精製された未知の解析物を MALDI-TOF 質量解析装置によって測定した、ゲル・ブロットの 3 つの生体分子バンドについてのスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の内容は、主に 2 つの部分を含む、即ち、MARAS 法によって、核酸ライブラリーから、ポジティブ・サンプル（疾患患者のサンプル）とネガティブ・サンプル（非疾患患者のサンプル）とを識別することができるアプタマーを、選択すること、及び得られたアプタマーを捕捉リガンドとして使用して、ポジティブの特性を有するサンプルから疾患に関連したバイオマーカーを精製すること、である。以下はこれら 2 つの部分の詳細な説明である。
【００１６】
本発明のいくつかの態様は、ポジティブ・サンプル（疾患患者のサンプル）とネガティブ・サンプル（非疾患）を識別することができるアプタマーを、MARAS 法を用いて、核酸ライブラリーから選択するための、構造的多様性を生み出すための核酸ライブラリーの中にある多様に構成されたオリゴヌクレオチドの使用に関する。ポジティブ選択及びネガティブ選択についての計画及び実施を通して、得られたアプタマーは、ポジティブ・サンプル中の、ある疾患に関連する生体分子にのみ結合するが、ポジティブ及びネガティブ・サンプル中の、疾患に関連しない生体分子には結合しない。更に、ポジティブ・サンプルとネガティブ・サンプルを識別することができるアプタマーは、核酸ライブラリーから選択される。同時に、アプタマー選択プロセスを検証するために、得られたアプタマーを、前記プロセスが妥当であることを検証するために、前記選択プロセスで使用されたポジティブ・サンプル及びネガティブ・サンプルの逆検証用の検出プローブとして使用する。更に、臨床診断において適用可能であることを検証するために、得られたアプタマーを、既存の病理学的データを有するブラインド試験サンプル（ポジティブ又はネガティブ選択には使用されないサンプル）を用いるブラインド試験サンプル解析のための検出プローブとして使用する。ブラインド試験サンプル解析を行い、その結果を既知の病理学的データと比較し、得られたアプタマーがポジティブ・ブラインド試験サンプルとネガティブ・ブラインド試験サンプルとを識別することができるかを調べる。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、ポジティブの特性を有するサンプルから、いくつかの疾患に関連した生体分子を精製するために、及びその精製された生体分子を同定して疾患に関連したバイオマーカーであることを確認するために、印加する振動磁場範囲を操作することによってシミュレートされた仮想フィルタを用いて、精製試薬中の捕捉リガンドとして、ポジティブ・サンプルとネガティブ・サンプルとを識別することができるアプタマーを使用する方法に関する。精製過程中に精製される生体分子を精製前には知ることができないので、これらの生体分子と得られたアプタマーとの間の結合親和性（又は平衡解離定数）を、予め測定することはできない。更に、生体分子の精製過程及びアプタマーの選択過程の間、磁性粒子結合複合体の構造、即ち、標的‐アプタマー‐磁性粒子とアプタマー‐標的‐磁性粒子とは、それぞれ異なる。従って、MARAS の同じ振動磁場によって誘導される、アプタマーと生体分子との間の結合に作用する伸張力は、前記複合体の最も外側の成分（標的とアプタマー）にある違いにより異なる。従って、精製に使用されるべき振動磁場の条件を、精製前には知ることができない。しかしながら、MARAS 選択によって得られるアプタマーと標的生体分子との間の結合親和性は、印加した振動磁場の条件の関数であり、印加する磁場周波数、及び/又は磁場強度が大きければ大きいほど、得られるアプタマーと標的生体分子との間の結合親和性はより高くなる（平衡解離定数はより低くなる）。従って、MARAS によって、前記アプタマーと前記標的生体分子によって形成される結合対の結合親和性を選択するのためのメカニズムが提供される。本発明の別の態様は、アプタマーと標的生体分子とによって形成される結合対について、その結合親和性を MARAS が選択することができるという特徴を利用することによって、及びポジティブの特性を有するサンプルから生体分子を精製するために、振動磁性体の周波数／強度範囲を操作することによって、サンプルから未知の生体分子を精製するための技術を開示する。そのうち、異なる周波数／強度範囲の振動磁場を用いて精製された生体分子は、得られたアプタマーに対して異なる結合親和性範囲を有し、それによってポジティブの特性を有するサンプルからある疾患に関連した生体分子を精製する。
【００１８】
疾患患者のサンプル（ポジティブの特性を有するサンプル）から、ある疾患に関連した生体分子を精製することを実証する前に、精製のための捕獲リガンドとして使うために、核酸ライブラリーから、疾患患者のサンプル（ポジティブ選択サンプル）と非疾患患者のサンプル（ネガティブ選択サンプル）とを識別できるアプタマーを選択しなければならない。本発明では、MARAS によって得られたアプタマーを、本発明の実現可能性を検証するために、疾患患者のサンプル（ポジティブの特性を有するサンプル）から、ある疾患に関連した生体分子を精製するための捕捉リガンドとして、更に使用する。図１に示すように、上記の特徴を有するアプタマーを選択する（又は生成する）方法の手順を概略的に示す。図１に示す手順では、4 つの主要部分が関与する：（1）材料準備；（2）ネガティブ選択；（3）ポジティブ選択；及び（4）PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅、クローニング、シークエンシング、逆検証、及びブラインド・サンプル解析等を含む後解析。4 つの主要部分の方法又は工程の詳細を以下に説明する。
【００１９】
材料調製の過程では、J 種類の非疾患患者のサンプルをネガティブ選択サンプル（ネガティブ・サンプル）として用意し、I 種類の疾患患者のサンプルをポジティブ選択サンプル（ポジティブ・サンプル）として用意し、そして K 種類の患者のサンプル（疾患患者及び非疾患患者のサンプルを含む）をブラインド試験サンプル解析のためのサンプル（ブラインド試験サンプル）として用意する。これらのサンプルを個々にビオチン化し、続いてストレプトアビジンで被覆した磁性粒子（SA-MPs）に結合させて、ネガティブ・サンプル‐磁性粒子（NS-MPs(j)）、ポジティブ・サンプル‐磁性粒子子（PS-MPs(i)）、及びブラインド試験サンプル‐磁性粒子（BS-MPs(k)）を形成させる。NS-MPs、PS-MPs、及び BS-MPs の下付き文字 j、i、及び k は、それぞれ、1 から始まり J、I、及び K までの独立した正の整数である。なお、アプタマー生成の選択過程及び逆検証過程、ブラインド・サンプル解析、及びアプタマーに基づく試薬を用いた生体分子の精製等を含む実施形態全体において、用いる磁性粒子（MPs）は磁性ナノ粒子（MNPs）に限定されない。磁性マイクロ粒子（MMPs）を使用しても、MARAS 法の実験における結果と同様の、その後の実験における結果となる。核酸ライブラリーには、PCR 増幅のために両端にプライマーを隣接させたランダム化オリゴヌクレオチドが含まれる。Lab-フォアワード・プライマー及び Lab-リバース・プライマーとして名前を付けた一組のプライマーを、PCR 増幅中に、オリゴヌクレオチド変性領域にアニーリングさせるために使用する。ユニバーサル T7 プライマーを用いて前記選択したアプタマーの配列決定をする。
【００２０】
ネガティブ選択に関しては、前記核酸ライブラリーを最初にリン酸緩衝液（リン酸緩衝食塩水、PBS、pH7.4）に溶解し、95 ℃に加熱し（5 分）、4 ℃に急冷し（2 分）、次いでオリゴヌクレオチドが特定の二次又は三次構造を形成するように室温に置く（60 分）。その後、前記核酸ライブラリーを NS-MPs(1) とインキュベートする。インキュベーション後、磁気分離を行い、結合した混合物を取り除き、NS-MPs(1) に結合していないで残っているオリゴヌクレオチドを含む上清を回収する。次いで、回収した上清を次の NS-MPs(2) とインキュベートし、それぞれ J 種類の NS-MPs(j) を使用した J 種類のネガティブ選択がすべて完了するまで、前記プロセスを繰り返す。ネガティブ選択を複数ラウンド行うことの目的は、個々のネガティブ・サンプルの組成は異なると考えることであり、その結果、選択したアプタマーが疾患患者のサンプルと非疾患患者のサンプルとを識別するための性能を高めるために、選択したアプタマーと J 種類全てのネガティブ・サンプル中にある生体分子との間で結合が生じる可能性が最小になる。同じ原理を、検出感度を高めるために、イムノアッセイ用のアプタマーを選択することに適用することができ、イムノアッセイ用に選択したアプタマーは、対象の解析物にのみ結合し、イムノアッセイを行っている際に起こる可能性のある偽ポジティブの検出は減る。理論的には、より多くのネガティブ選択の操作が行われるほど（J が大きいほど）、イムノアッセイ中に達成できる感度が高くなり（偽ポジティブの検出がより少なくなる）、そして疾患患者及び非疾患患者についての識別率が高くなる。ネガティブ選択後の最終上清を回収し、次のポジティブ選択に使用する。或いは、個々の NS-MPs(j) を使用する複数ラウンドのネガティブ選択の代わりに、J 種類全ての NS-MPs(j) を混合した NS-MPs を使用して 1 回のネガティブ選択を行っても同じ結果が得られる。しかしながら、混合した NS-MPs を用いると、PBS 緩衝液中の MPs の濃度が高くなり過ぎ、そして MPs が凝集しやすくなり、これが選択に悪影響を及ぼすことに留意しなければならない。他方、生物系では、特定の生体分子が疾患患者と非疾患患者の両方のサンプル中に存在し、濃度だけが異なって存在することがある。非疾患患者のサンプルに含まれる特定の生体分子の濃度が疾患患者のサンプルに含まれる濃度よりはるかに低い場合、その特定の生体分子はまた、疾患を診断するためのバイオマーカーの役割も果たすことがある。この場合、前記ネガティブ・サンプルはこれらの特定の生体分子を含み、そしてアプタマー選択におけるネガティブ選択プロセスは、これらの特定の生体分子に結合し得るオリゴヌクレオチドのいくつかを排除することになり、それによって、選択の効率を低下させる。しかしながら、本発明のネガティブ選択は、前記ネガティブ・サンプル中で、特定の生体分子の濃度が非常に低く、使用する核酸ライブラリーに含まれるオリゴヌクレオチドの総量が多いので、選択される最終アプタマーの収率に影響を及ぼさない。
【００２１】
ポジティブ選択に関しては、ネガティブ選択から回収した上清を PBS 緩衝液中で PS-MPs(1) とインキュベートする。インキュベーション後、磁気分離を行い、結合していないオリゴヌクレオチドを含む上清を捨てる一方、結合した混合物を回収する。回収した結合混合物を PBS 緩衝液に分散させる。結合混合物の溶液を、より低いカットオフ周波数 fL 及び／又はより低いカットオフ強度 HL の第 1 の振動磁場の MARAS に供し、第 1 の振動磁場によって誘起される伸張力よりも小さい PS-MPs(1) に対する結合親和性を有するオリゴヌクレオチドの一部を、結合混合物から解離させる。解離したオリゴヌクレオチドを含む上清を磁気分離により除去し、そして回収した結合混合物を PBS 緩衝液中に再分散させる。次に、上限カットオフ周波数 fU 及び／又は上限カットオフ強度 HU の第 2 の振動磁場を結合混合物の溶液に加え、PS-MPs(1) のオリゴヌクレオチドと生体分子によって形成される結合対についての結合親和性範囲が所望のものである、PS-MPs(1) に結合するオリゴヌクレオチドを解離させる。ここで、前記所望の範囲は、第 1 の振動磁場によって引き起こされる伸張力よりも大きく、第 2 の振動磁場によって引き起こされる伸張力よりも小さい結合親和性である。磁気分離を行い、前記結合混合物を除去し、PS-MPs(1) に対する結合親和性範囲が所望のものであるオリゴヌクレオチドを含む上清を回収する。次いで、前記上清を次のポジティブ・サンプル（PS-MPs(2)）と共にインキュベートし、そして I 種類の PS-MPs(i) を使用して I 種類ポジティブ選択がそれぞれすべて完了するまで、この手順を繰り返す。最終上清に含まれるオリゴヌクレオチドは所望のアプタマーである。ポジティブ選択を複数ラウンド行うことの目的は、個々のポジティブ・サンプルの組成は異なると考えることであり、その結果、得られたアプタマーは、I 種類のポジティブ・サンプルの全てに含まれる共通スパイス（spices）の生体分子にのみ結合し、得られたアプタマーの患者サンプルに関する識別力が増し、その識別時における偽ネガティブが減る。次いで、ポジティブ選択手順後のアプタマーを含む上清を、PCR 増幅、クローニング、シークエンシング、逆検証、及びブラインド試験サンプルについてのブラインド試験サンプル解析等の次の後解析を行うために回収する。ネガティブ選択及びポジティブ選択等を含む、疾患患者のサンプル（ポジティブ選択サンプル）及び非疾患患者のサンプル（ネガティブ選択サンプル）を識別することができるアプタマーを作製するための手順を図１に概略的に示す。上記の目的のために、振動磁場の印加中に、印加する振動磁場の周波数（f）及び強度（H）に制約が課される、すなわち、fL≦fU 及び／又は HL≦HU である。ここで、等式は共存できない、すなわち、fL＝fU 及び HL＝HU を同時に適用することができない。使用する振動磁場は、回転磁場、交互磁場、又は楕円形磁場であることがある。加えて、ポジティブ選択の各ラウンドについて、使用する振動磁場（fL、HL、fU 及び HU）は厳密に同じである必要はなく、前記振動磁場は PS-MPs(i) に対する高い結合親和性を有するアプタマーが得られさえすれば十分である。上記の中国の発明特許（ZL 2014 1 0570602.0）は、必要とされる結合親和性（平衡解離定数）の範囲、及び PCR 増幅、クロ���ニング及びシークエンシング等を含む後解析の詳細、に従って振動磁場範囲を選択するための参考文献となる。或いは、ポジティブ選択の各ラウンドにおいて、より低いカットオフ周波数 fL 及び／又はより低いカットオフ強度 HL の第 1 の振動磁場を印加した後、回収した結合混合物を再分散、加熱、溶出、磁気分離及び精製し、次のラウンドのポジティブ選択、又は後解析のためのオリゴヌクレオチドを含む上清を得る。そして、得られたアプタマーによって形成される結合対の生体分子に対する結合親和性は、第 1 の振動磁場によって誘発される伸張力よりも大きい。次いで、選択によって得られたアプタマーを PCR 増幅、クローニング及びシークエンシングに供する。又、これらのアプタマーは、ネガティブ選択サンプル及びポジティブ選択サンプルを用いる逆検証のための検出プローブとして用いられる。更に、MARAS 法の手順における場合と同様に、ポジティブ選択の前のネガティブ選択、又はネガティブ選択の前のポジティブ選択において、アプタマーの選択結果は同様である。本発明によって開示される技術において、ポジティブ選択及びネガティブ選択の順序はアプタマーの選択の結果に影響を及ぼさない。得られたアプタマーは検証されると（逆検証）、ブラインド・サンプル解析用の検出プローブとして、又はポジティブの特性を有するサンプルから特定の疾患に関連したバイオマーカーを精製するための精製試薬の捕捉リガンドとして使用することができる。
【００２２】
ネガティブ・サンプルの組成が固定されている場合は、ネガティブ選択に必要なサンプルは 1 種類のみであり（J = 1）、ターゲット生体分子が固定されている場合は、ポジティブ選択に必要なサンプルは 1 種類のみである（I = 1）、ことを記載しておくことは価値がある。例えば、前者が、腫瘍細胞培養液から特定の腫瘍細胞関連代謝産物を同定又は精製したいという場合、正常細胞培養液をネガティブ・サンプルとして使用することがある。その培養液は管理された環境で生成され、その組成は固定されているので、1 種類のネガティブ選択サンプルのみが必要とされる。後者は、イムノアッセイのための検出プローブとして、又はどういうものであるかが既知である生体分子をサンプルから精製するための捕捉リガンドとして、使用する、特定の標的生体分子（標的）に対して高い特異性、及び結合親和性を有するアプタマーを選択するために使用される。前記標的又は標的生体分子は固定されていて既知であるので、既知の標的又は標的生体分子のみを、ポジティブ選択のためのポジティブ・サンプルとして使用する必要があり、その結果、単一のポジティブ選択のみが必要とされる。
【００２３】
更に、アプタマー選択のために MARAS によって提供される競合メカニズムは、アプタマーと生体分子によって形成される結合対に対して伸張力を加えることに基づいているので、限定されるものではないが、力学的な力（例えば、水溶液中で振動磁場によって駆動される、磁性粒子及びアプタマー‐生体分子からなる結合複合体の動き；アプタマー‐生体分子複合体が固定基板に付着している、又は捕捉されている場合（例えば、流路）、激しく洗浄されることによって誘起される流体力学的な力；及び、アプタマー‐生体分子複合体が固定基板に付着している、又はラボ‐オン‐ア‐ディスク（lab-on-a-disc）中に捕捉されている場合（例えば、流路）、アプタマー‐生体分子複合体を回転させることによって引き起こされる遠心力、等）、電磁的な力（例えば、磁性体を用いた場合における勾配磁場により誘起される静磁力（static magnetic force）、帯電体を用いた場合における電場により誘起される静電力（static electric force））、或いは上記力の任意の組み合わせ、等を含む、結合対に伸張力を及ぼすことができる任意の方法又は設備を、アプタマー選択のための競合メカニズムを提供する MARAS に似せて使用することができる。
【００２４】
逆検証及びブラインド試験サンプル解析は、ELISA、リアル‐タイム定量的 PCR（q-PCR）又は比濁解析等の一般的な医学的診断において一般的に使用される技術によって実施することができる。以下の実験は、q-PCR 法による逆検証及びブラインド・サンプル解析用の検出プローブとして、MARAS によって得られたアプタマーを使用する工程を簡単に説明する。最初に、過剰に加えたアプタマーを、上記のように、PBS 緩衝液中で加熱及び急冷して特定の二次又は三次構造を形成させ、逆検証サンプル‐磁性粒子（J 種類の NS-MPs(j) 及び I 種類の PS-MPs(i)）及びブラインド試験サンプル‐磁性粒子（Ｋ種類の BS-MPs(k)）と共に個々にインキュベートし、続いて磁気分離を行う。結合していないアプタマーを含む上清を除去し、そして磁性粒子結合複合体を得る。その結合複合体を PBS 緩衝液で洗浄して非特異的結合を完全に除去し、次に脱イオン水で分散及び加熱して、磁性粒子結合複合体に結合したアプタマーを溶出させる。磁気分離を行って磁気粒子を除去し、溶出したアプタマーを含む上清を得る。最後に、上清に含まれるアプタマーの量を二連の q-PCR によって測定し、相対的な発現として示す。ブラインド・サンプル解析において、非特異的結合の可能性を最小にするために、アプタマーと生体分子とによって形成される結合対に対して、第１の振動磁場によって引き起こされる伸張力よりも小さい、生体分子への結合親和性を有するアプタマーを、磁性粒子結合複合体から解離させ、更に非特異的な結合を除く為に磁気分離によって取り除くことを目的として、アプタマー選択のために使用した第 1 の振動磁場条件（より低いカットオフ周波数 fL、及び／又はより低いカットオフ強度 HL）を、インキュベーション後に加えることがある、ことを記載しておくことは重要である。
【００２５】
本発明においては、上記の手順によって得られたアプタマーを捕獲リガンドとして用いて、疾患患者のサンプル（ポジティブの特性を有するサンプル）から、ある疾患に関連した生体分子を精製する精製方法を、疾患に関連するある特定の生体分子に結合する捕捉リガンドとしてのアプタマーと結合する磁性粒子からなる磁性粒子結合複合体に振動磁場を印加することによって、行い、アプタマーと生体分子によって形成される結合対に対して伸張力を生じさせ、その結果、特定の結合親和性範囲を有する特定の生体分子を前記磁性粒子結合粒子から解離させ、磁気分離によって前記上清を回収し、前記アプタマーに対して特定の結合親和性範囲を有する特定の生体分子を得る。精製過程での磁性粒子結合複合体（標的‐アプタマー‐磁性粒子）とアプタマー選択過程での磁性粒子結合複合体（アプタマー‐標的‐磁性粒子）の構造は異なるため、同じ振動磁場下では、アプタマーと生体分子によって形成される結合対に誘起される伸張力（水溶液中の磁性粒子結合複合体の運動方向とは反対の粘性力によって規定される）は、結合複合体の最外層の成分（標的 vs アプタマー）が異なるために、異なる。従って、精製に使用されるべき振動磁場条件を精製前には知ることができない。理論的には、結合した複合体の最外層の成分が大きいほど、アプタマーと生体分子によって形成された結合対に、同じ振動磁場によって、より大きな伸張力が誘導される。一般に、精製対象の生体分子のサイズはアプタマーより大きいので、精製中に、前記アプタマーと前記生体分子によって形成される結合対に、同じ振動磁場によって誘導される伸張力は、アプタマー選択中のものより大きい。他方、精製対象の生体分子に対するアプタマーの結合親和性は固定されている。従って、精製中にアプタマーから精製対象の生体分子を解離させるのに必要な振動磁場条件は、アプタマーの選択中にアプタマーを生体分子から解離させるための振動磁場条件よりも低いと予想される。従って、本発明においては、振動磁場条件を走査する方法、即ち、結合親和性を走査する方法を、行い、アプタマーに対する結合親和性範囲が異なる疾患に関連した生体分子を取得及び精製することができる。他方、特定の疾患を有する患者のサンプル（ポジティブの特性を有するサンプル）の量は限られている可能性があるので、上記の工程に従って精製される生体分子の量は、質量解析装置によって配列決定して、それがどういうものであるかを確認するのには十分ではない可能性がある。従って、同じ振動磁場条件を、同じ疾患を有する異なる患者のサンプル（異なる、ポジティブの特性を有するサンプル）に適用して結合親和性範囲の走査を行い、前記アプタマーに対して同じ結合親和性範囲を有する、複数の疾患患者のサンプル由来の、精製された生体分子を集めて、それがどういうものであるかを確認するために質量分析解析を行うことがある。
【００２６】
精製試薬は精製前に調製しなければならない。前記精製試薬の調製のために、以前に検証したアプタマーを前記精製試薬のための捕捉リガンドとして使用する。過剰量のビオチン化アプタマーを PBS 緩衝液に溶解し、上記のように、加熱し、そして急速に冷却して特定の二次又は三次構造を形成させる。そのアプタマー溶液をSA-MPs と共にインキュベートし、磁気的に分離して、磁性粒子に結合していないアプタマーを含む上清を除去し、磁性粒子結合複合体を得る。その磁性粒子結合複合体を精製試薬として PBS 緩衝液に分散させる。精製試薬の調製後、疾患に関連する未知の生体分子を、q-PCR によるブラインド・サンプル解析で、前記アプタマーに対して高い相対発現レベルであるブラインド試験サンプルから、精製するために、その精製試薬を使用することができる。サンプル中にある疾患に関連する未知の生体分子を精製するためのフローチャートを図２に示す。
【００２７】
図２は、アプタマーのブラインド・サンプル解析において、q-PCR の結果が高い相対発現レベルである N 種類のサンプル（ポジティブの特性を有するサンプル）を最初に選択し、精製対象のポジティブの特性を有するサンプルとして使用し、続いてそのポジティブの特性を有するサンプル(1) を前記精製試薬とインキュベートすることを示す。磁気分離を行い、精製試薬中にあるアプタマーと結合した磁性粒子と結合していない部分を含む上清を除去し、磁性粒子結合複合体を回収する。回収した結合複合体を数回洗浄し、そして PBS 緩衝液で分散する。次に、周波数 f0 及び強度 H0 である最初（第 0 の）の振動磁場を磁性粒子結合複合体の分散溶液に印加して、最初（第 0 の）の結合親和性より低い結合親和性を有する（即ち、非特異的に、又は低い結合親和性でアプタマーに結合している）一部の生体分子を解離させる。解離させた部分を含む上清を再び磁気分離により除去し、そして磁性粒子結合複合体を回収し、数回洗浄し、そして PBS 緩衝液で分散させる。ここで、最初の結合親和性は、最初の振動磁場により、アプタマーと生体分子によって形成される結合対に誘導される伸張力により規定される。再び、周波数 f1 及び／又は強度 H1 を有する第 1 の振動磁場を、磁性粒子結合複合体の分散溶液に印加する。その結果、前記アプタマーに対して最初の結合親和性と第 1 の結合親和性との間の結合親和性を有する一部の生体分子は磁性粒子結合複合体から解離し、磁気分離を行って、分離した画分を含む上清（分離成分(1)）を回収する。一方、磁性粒子結合複合体を回収し、及び PBS 緩衝液中に分散し、そして 、周波数 f2 及び／又は強度 H2である第 2 の振動磁場を加え、そして、M 種類全ての分離成分の精製、及び回収が完了するまで、ポジティブの特性を有するサンプル(1) について精製手順を繰り返す。ここで、第 1 の結合親和性は、第 1 の振動磁場によって誘導され、前記アプタマー及び生体分子によって形成される結合対に対する伸張力によって規定される。最初及び第 1 の振動磁場によって規定される結合親和性の範囲を、上記範囲内のアプタマーに対する結合親和性を有する生体分子を選択するための仮想フィルタ(1) と見なすことがある。言い換えれば、任意のポジティブの特性を有するサンプル(n) に関する未知の生体分子を精製する手順に対して、合計 M ラウンドを実行する、即ち、M 種類の仮想フィルタが使用される。ポジティブの特性を有するサンプル(1) の分離成分(M) を精製して回収する最終ラウンドの後、前記磁性粒子結合複合体を PBS 緩衝液中に分散し、そして精製試薬として使用する、又は次のポジティブの特性を有するサンプルのための上記の調製方法に従って、調製試薬を再調製する。次に、ポジティブの特性を有するサンプル(2) を精製試薬とインキュベートして、次のポジティブの特性を有するサンプル(2) の精製を行い、N 種類全てのポジティブの特性を有するサンプルのうちの M 種類の分離成分が完全に精製、回収されるまで、ポジティブの特性を有するサンプル(n) の精製手順を繰り返す。上記の精製手順によれば、回収された分離成分(m) の全てにある生体分子は、第 (m-1) の振動磁場（fm-1、Hm-1）、及び第 m の振動磁場（fm、Hm）を加えることによって、前記アプタマーと前記生体分子によっ��形成される結合対に誘導される伸張力の間の、捕捉リガンドとしてのアプタマーに対する、結合親和性範囲を有する。これは、振動磁場を印加して、アプタマーと生体分子によって形成される結合対に伸張力を生じさせ、ポジティブの特性を有するサンプルから、前記アプタマーに対して特定の範囲の結合親和性を有する生体分子を濾過して回収することであり、それによって、ポジティブの特性を有するサンプルから、前記アプタマーに対する結合親和性が特定の範囲にある生体分子を精製することができる。それを仮想フィルタと見なすことがある。加えて、上述のように、精製中に精製対象の生体分子を前記アプタマーから離すのに必要な振動磁場の条件は、アプタマー選択中に前記生体分子から前記アプタマーを離すのに必要な振動磁場条件よりも小さい。従って、精製過程で使用される最も高い振動磁場条件（第 M の振動磁場： fM 及び HM ）を、アプタマー選択過程で使用される第 2 の振動磁場（fU 及び HU）によって規定することがある。更に、磁性粒子結合複合体中の全ての生体分子は解離しているため、最終的に回収された残りの磁性粒子結合複合体は生体分子を全く含まず、次のポジティブの特性を有するサンプルの精製試薬として提供されることがある。更に、この仮想フィルタの機能を実現するためには、印加する振動磁場は以下の制約を満たさなければならない： fm-1≦fm 及び／又は Hm-1≦Hm、そして等しい周波数及び強度を同時に印加することはできない、例えば、fm=fm-1 及び Hm=Hm-1を同時に適用することはできない。更に、前記アプタマーを前記捕捉リガンドとして使用して、N 種類全てのポジティブの特性を有するサンプルから精製した、個々の分離成分(m) が同じ結合親和性範囲を有するためには、使用する仮想フィルタの振動磁場条件は、N 種類全てのポジティブの特性を有するサンプルについての精製プロセス全体を通して一定でなければならない。
【００２８】
ここで注目に値するのは、振動磁場によって誘導される力学的な力（伸張力）のみが精製過程の中で加えられることであり、この力が非常に弱いということである（特定の結合の強度を使用して推定するならば、前記力は約 pN のレベルあたりである）。温度及び化学的な影響が全くないので、前記精製した生体分子の活性は、精製プロセスによって低下することはなく、この方法によって精製した生体分子はその活性を保持することがある。この仮想フィルタを、どういうものであるかが未知、又は既知の生体分子を精製するのに使用することがある。前者は、精製のための捕捉リガンドとしてアプタマーを選択すること、及び得られたアプタマーを使用して、前記サンプルから、どういうものであるかが未知の生体分子を精製すること、等を含み、本明細書で記載した方法で実施することがある。後者は比較的簡単である。アプタマーを選択している間に、生体分子がどういうものであるかを知るので、ポジティブ選択サンプルとして、この生体分子を使用することのみが必要であり、並びに 1 ラウンドのポジティブ選択が、検出のための検出プローブとして、及び本明細書で開示の仮想フィルタを使用する精製のための捕捉リガンドとして使用しうるアプタマーを選択するために、必要とされる。サンプルから特定の生体分子を精製する手順を 1 回行った場合、生体分子の精製中に印加する振動磁場範囲（第 (m-1) の磁場と第 m の磁場）は既知である。従って、前記サンプルからこの特定の生体分子を精製するための捕捉リガンドとして、同じアプタマーを使用する、その後の精製に対しては、振動磁場を調べることを実行する必要はなく、この既知の範囲の振動磁場を適用することのみが必要である（即ち、M 種類の仮想フィルタを使用せずに、僅か 1 種類の仮想フィルタのみが必要である）。
【００２９】
前記アプタマーと前記生体分子によって形成される結合対の結合親和性の範囲に従って設計される仮想フィルタは、前記結合対に伸張力を加えるメカニズムに基づいているので、前記結合対に前記伸張力を発生させることができる任意の方法や設備を、上記記載の振動磁場と同様のメカニズムを生み出す仮想フィルタ（限定されるものではないが、力学的な力（例えば、水溶液中の磁性粒子とアプタマー‐生体分子からなる結合複合体、振動磁場によって駆動される動きによって誘導される伸張力を介する；アプタマー‐生体分子複合体が固定基板に付着している、又は捕捉されている（例えば、流路）場合に、激しく洗浄されることによって誘起される流体力学的な力；アプタマー‐生体分子複合体が固定基板に、又はディスク・ラボラトリー（disc laboratory）（ラボ‐オン‐ア‐ディスク（lab-on-a-disc））中の捕捉（例えば、流路）に付着している、アプタマー‐生体分子複合体の回転によって誘導される遠心力）、電磁的な力（例えば、磁性体を用いた場合における勾配磁場により誘起される静磁力、帯電体を用いた場合における電場により誘起される静電力）、或いは上記力の任意の組み合わせ、等を含む）として使用できることにも言及する価値がある。結合親和性の選択範囲に基づいた仮想フィルタのメカニズムを働かせるために、振動磁場を変化させることによって生成される伸張力の範囲、流路内の緩衝液洗浄速度を変えることによって生成される流体力学的な力の範囲、ディスク・ラボラトリ（disc laboratory）を異なる回転速度で回転させることによって生成される遠心力の範囲、勾配磁場及び／又は電場の強さを変えることによって発生する電磁的な力の範囲、を使用することがある。結合親和性範囲を選択するメカニズムを、アプタマーを選択する際に、所望の範囲の結合親和性を有するアプタマーを選択するのに使用することがあり、生体分子を精製する際に、アプタマーに対して特定の範囲の結合親和性を有する生体分子を除去する、及び回収するためにも使用することがある、ということに留意するべきである。
【００３０】
全ての選択したポジティブの特性を有するサンプルに対して、仮想フィルタによる精製が完了し、N 種類のポジティブの特性を有するサンプルのうちの M 種類の分離成分を回収した後、ポジティブの特性を有するサンプル全てに由来する対応する分離成分（同じ磁場範囲で回収された分離成分）を集め、集めた分離成分中に含まれる生体分子がどういうものであるかを、その後同定する。集めた M 種類の分離成分の溶液全体は、PBS 緩衝液及び精製した生体分子を含み、ここで、生体分子の全量は質量解析装置による解析を行うのに十分であるが（ポジティブの特性を有するサンプルの数 N によって決まる）、生体分子の濃度は非常に低いので、集めた分離成分を、まず最初に濃縮する。次に、M 種類の濃縮した、分離成分を別々にポリアクリルアミド・ゲル電気泳動に供し、ゲル・ブロット上の生体分子バンドの分布を観察する。最後に、精製した生体分子の配列決定をするために、所望の生体分子バンドを切り出して質量解析装置によって解析する。
【００３１】
本発明によって開示される精製手順によって得られる生体分子は、疾患に関連した特異的な生体分子であり、その疾患のバイオマーカーとして使用することがある。実際には、複数のアプタマーが同じ生体分子に特異的に結合することがある、又は 1 種のアプタマーが複数の生体分子に、結合親和性は異なるが、特異的に、結合することがある。前者は精製及び同定の結果に何ら影響を及ぼさないが、後者は、アプタマーに対して異なる結合親和性を有する生体分子を分離するための精製を目的とした仮想フィルタを使用することによって、精製及び同定の結果に何ら悪影響を及ぼさない。しかし、精製結果に悪影響を及ぼす条件が発生する可能性もある。アプタマーが、複数の生体分子に結合し、そして同じ結合親和性を有することがある（例えば、異なる生体分子が、そのアプタマーへの、同じ適合部分を有する）。同時に、異なる生体分子のサイズが類似している（異なる種類の生体分子を、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によって分離することはできない）。この場合、前記精製手順によって、これらの異なる生体分子を分離することができず、異なるアプタマーを精製に使用しなければならない。上記の状況を考慮すると、アプタマーを選択する際に、複数のアプタマーを選択しておき、そしてポジティブの特性を有するサンプルについて本発明に開示される精製及び質量解析装置の解析を繰り返して、疾患の診断に使用する可能性のある複数のバイオマーカーを確認することが、実際的である。
【実施例】
【００３２】
＜疾患に関連したバイオマーカーの精製と同定：上皮成長因子受容体の変異を伴う非小細胞肺がんに関する症例研究＞
本発明によれば、本発明は特定の疾患に関するバイオマーカーの発見手順に関する。本発明は、核酸ライブラリーから、疾患患者及び非疾患患者のサンプルを識別することができるアプタマーを選択するための選択方法、及び前記選択により得られたアプタマーを捕捉リガンドとして使用することによって、ポジティブの特性を有するサンプル中でどういうものであるかが未知である生体分子を精製する方法を主に含む。これら2つの方法をそれぞれ図１と図２に示す。以下では、 EGFR 突然変異についての NSCLC という疾患の血清サンプルに関連する未知のバイオマーカーの精製及び同定を、本発明の特定の内容を説明するための例として使用する。非小細胞肺がんの場合、EGFR 変異はチロシン・キナーゼ・ドメインの 4 つのエクソン（エクソン 18-21）に位置し、その中でエクソン 19 及び 21 に集中していて、疾患患者の大多数を占めていて、エクソン 19 のコドン 746-752 のアミノ酸の欠失変異（エクソン 19 欠失変異：45 ％）及びエクソン 21 のコドン 858 のアミノ酸の T-G 置換のミスセンス変異（エクソン 21 ミスセンス変異：40 ％）等が含まれる。この実施例は、EGFR 変異型 NSCLC 患者（EXON 19 及び L-858R 等を含む）によって例示される。その主な目的は、EGFR 変異を有する NSCLC の疾患バイオマーカーの発見及び詳細を提示することよりも寧ろ、アプタマーを選択する手順、及び生体分子を精製する手順等を含む、本特許出願で開示されている技術を詳細に説明することである。従って、患者の血清から上記疾患のバイオマーカーの可能性があるものとして、他の生体分子を精製するために、複数のアプタマーを使用する代わりに、選択によって得られた 1 つのアプタマーのみを使用して前記の精製手順を実証する。更に、電気泳動ブロット上の全ての生体分子バンドについて、質量分析の解析をして、精製したサンプルの全てについて、それがどういうものであるかを確認する代わりに、いくつかの生体分子バンドのみを選択する。更に、これらの生体分子が、上記の疾患に対するバイオマーカーとして役立つということの妥当性は、対応するモノクローナル抗体によって、更に検証はしない。
【００３３】
MARAS の実験設定
MARAS プラットフォームを利用して得られたアプタマーを使用して、ポジティブ・サンプルとネガティブ・サンプルとを識別することができ、ポジティブの特性を有するサンプルから生体分子を精製することができるアプタマーを選択する方法における、振動磁場を提供する実験設定を以下に記載する。その実験設定は、振動磁場を生成するための少なくとも 2 組のコイル 100 と、電力増幅器 200、及び信号発生器 300 とを含み、LABVIEW コンピュータ・プログラムで動作する。MARAS に用いられる振動磁場は、回転磁場-MARAS（RO-MARAS）の場合のような回転磁場でも、交互磁場-MARAS（AC-MARAS）の場合のような交互磁場でもよい。RO-MARAS では、回転磁場は、直交して配置した 2 組のヘルムホルツコイル 100 によって発生される。LABVIEW プログラム 300 は、NI BNC-2110 キャプチャ・ボックス（capture box）を介して、2 つの信号、cos(ωt) 及び sin(ωt) を、2 チャンネル電力増幅器 200 に送信するために使用される。そして、これら 2 つの信号を等しく増幅し、2 組のコイルを同時に駆動させて回転磁場を発生させる。実験設定を図３Ａに概略的に示す。この図では、サンプルを 2 組のヘルムホルツ・コイル 100 の中心線の交点に配置する。しかしながら、他の代わりの設定を用いて回転磁場を発生させることもある。AC-MARAS では、図３Ｂに概略的に示されるように、信号発生器 300 及び電流発生器ユニット 200 によって駆動される単一の励起ソレノイド 100 によって磁場が発生し、ここでは、サンプルはソレノイド 100 の内側に配置される。なお、前記コンピュータ・プログラムが 1 組のヘルムホルツ・コイルに 1 つの信号のみを送って AC 磁場を発生させる場合には、図３Ａの設定を AC-MARAS にも使用することができる。更に、交互磁場を生成するために他の代わりの設定を使用することもある。更に、図３Ａで図示する構成を使用して、信号発生器 300 からの正弦波信号及び余弦波信号に対して、電力増幅器 200 の異なる増幅率を使用することによって、発生させることができる楕円形磁場等、他の種類の振動磁場も適用可能である。この例では、回転磁場は RO-MARAS プラットフォームによって印加され、使用される電力増幅器の仕様によって制限される。アプタマーの選択手順及び生体分子の精製手順において、印加するすべての回転磁場の強度は 14 ガウスに固定する。更に、磁性粒子は、その表面上に生物学的分子があるので、それらは磁場の作用下で互いに容易に凝集してより大きな分子クラスターになり、これが沈殿を引き起こす。従って、アプタマーの選択及び生体分子の精製中に振動磁場を印加する過程において、沈殿したクラスターを、再分散させるために、2.5 分毎にピペッティングすることによって攪拌する。
【００３４】
材料調製
MARAS プラットフォームを用いてアプタマーを選択する手順を実施する前に、材料を調製することが必要である。その材料調製は、ランダム核酸ライブラリーを調製すること、及びポジティブ選択サンプル、ネガティブ選択サンプル、及びブラインド試験サンプルを調製することを含む。これらの調製手順を、次のセクションにまとめる。
【００３５】
核酸ライブラリとプライマー
最初の核酸ライブラリーの長さは、ランダム化した 20-量体（20-mer）の中央部（N20）、及び両端で 2 つの 20-量体の固定部分のプライマーからなる、60-量体（60-mer）である。化学合成し、及びポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（PAGE）によって精製した、核酸ライブラリーのオリゴヌクレオチドは、(5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N20-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’) （配列番号：１）である。1 組のプライマー、ラベル・フォアワード（label forward） (Lab-F: 5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3') （配列番号：２）及びラベル・リバース（label reverse）(Lab-R: 5'-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3') （配列番号：３）、を PCR 増幅の際に、前記オリゴヌクレオチドの5’ 及び 3’ 変性領域にアニーリングするように使用する。上記と同じ配列を有する 5’-ビオチン標識プライマー、Lab-ビオチン-F 及び Lab-ビオチン-R を用いて、二本鎖 PCR 産物からビオチン‐フォアワード一本鎖オリゴヌクレオチド及びフォアワード一本鎖オリゴヌクレオチドをそれぞれ単離する。ユニバーサル T7 プライマー(T7: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3') （配列番号：４）を用いて、選択したアプタマーであるオリゴヌクレオチドの配列決定する。ライブラリー及びプライマー等を含む全てのオリゴヌクレオチドは MDBio 社（MDBio、台湾）から購入する。異なる長さ及び配列のランダム核酸ライブラリー、及びそれらの対応するプライマーを、本発明の結果を変えることなく使用することがある、ことを記載しておく。
【００３６】
ビオチン化した血清‐蛋白質を結合させた磁性ナノ粒子試薬の調製
この実施例の実験では、EGFR 変異（EXON 19(2) 及び L-858R(3) 等を含む）を有する NSCLC 患者の血清の 5 例のポジティブ選択サンプル（I=5）；EGFR 変異のない NSCLC 患者血清の 5 例のネガティブ選択サンプル（J=5）；を使用する。更に、生検病理学的解析によって確認された、EGFR 変異を有さない、及び EGFR 変異を有する、それぞれ、18 例及び 20 例の NSCLC 患者の血清を、ブラインド試験サンプル解析のためのブラインド試験サンプル（K=38）として使用する。使用した NSCLC 患者の血清サンプルの臨床データを表１及び２に記載する。
【００３７】
【表１】
2019208506.tif 000003
【００３８】
【表２−１】
2019208506.tif 000004
【表２−２】
2019208506.tif 000005
【００３９】
上記の表１及び２の個々の臨床血清サンプル中のタンパク質の量を、バイオ‐ラッド（Bio-Rad）タンパク質アッセイ（バイオ‐ラッド社（Bio-Rad）、台湾）を用いて、酵素免疫アッセイ解析器（ELISA リーダ、モレキュラー・デバイス社、台湾（ELISA Reader、Molecular Devices、Taiwan））で、570 nm の吸光度で、個々に測定する。各サンプルの総タンパク質量を 100 μg になるように調整し、ビオチン化キット（EZ-Link（商標）スルホ-NHS-ビオチン化キット、サーモ・サイエンティフィック社（Thermo Scientific）； Nanosep（登録商標）遠心装置、ライフ・サイエンス社（Life Science）、米国）をビオチン化に使用する。製造業者の指示書に従って個々の臨床血清サンプルのタンパク質をビオチンで標識し、続いて 50 μL のストレプトアビジンで被覆した生体‐機能化磁性ナノ粒子試薬（SA-MNP 試薬）とビオチン化血清サンプルを 4 ℃でインキュベートして、16 時間以上反応させ、5 例のポジティブ選択サンプル、5 例のネガティブ選択サンプル、38 例のブラインド試験サンプル試薬（PS-MNP、NS-MNP、及び BS-MNP 試薬）等を含む、ビオチン化血清タンパク質‐磁性ナノ粒子試薬（サンプル試薬）を調製し、それらを、その先の実験のために 4 ℃で冷蔵庫で保存した。SA-MNPs を PBS 緩衝液に分散させて SA-MNP 試薬を形成し、Magqu バイオテクノロジー社（Magqu Biotechnology（Magqu、台湾））から購入する。試薬中の SA-MNPs の平均流体力学的直径は 50 nm であり、SA-MNP の濃度は 0.3 emu/g である。SA-MNPs 及びサンプル-MNPs（PS-MNPs、NS-MNPs、及び BS-MNPs 等を含む）を使用する前に、これらの試薬を磁気的に分離し、以降の実験のために PBS 緩衝液で少なくとも 2 回洗浄する必要がある。
【００４０】
RO-MARAS による疾患患者を識別することができるアプタマーを選択するための手順
1 nM の一本鎖核酸ライブラリーを 100 μL の PBS 緩衝液に溶解し、次いで上記のように、加熱し、急冷して、特定の二次構造又は三次構造を形成させる。完了後、予め調製した 5 種類のネガティブ選択サンプル試薬を PBS 緩衝液で 2 回洗浄し、磁気的に分離して NS-MNPs（ネガティブ選択サンプル）を別々に得る。NS-MNPs(1) 及び一本鎖核酸ライブラリーをロータリー・ミキサーに入れて、1 時間よく混合する。磁気スタンドで磁気分離を行い、上清を取り置き、NS-MNPs(1) 中にある任意のタンパク質に結合するオリゴヌクレオチドを除去する。次に、残りのオリゴヌクレオチドを含む回収した上清を次のネガティブ選択サンプルである NS-MNPs(2) とインキュベートし、上記の工程を、残りの NS-MNPs(2) から NS-MNPs(5) までについてのネガティブ選択が完了する J（5）回、順次繰り返す。最終上清を DNA 抽出ミニプレップ・システム（DNA Extraction Miniprep System）（Gel/PCR DNA 単離システム（Gel/PCR DNA Isolation System）、バイオジーン（Viogene）、台湾）を用いて精製し、100 μL の PBS 緩衝液中に再分散して、ネガティブ選択を完了させる。
【００４１】
次に、ポジティブ選択を行う。前記のネガティブ選択及び精製を行った後の残りのオリゴヌクレオチドを含む再分散上清を、上記のように、加熱し、急冷して、前記オリゴヌクレオチドが特定の二次構造又は三次構造を形成するようにし、上記で調製した 5 種類のポジティブ選択サンプル試薬を PBS 緩衝液で 2 回洗浄し、磁気的に分離して PS-MNPs（ポジティブ選択サンプル）を別々に得る。ネガティブ選択をした後の残りの核酸ライブラリーの上清を、次いで、EGFR 変異の NSCLC 患者のポジティブ選択サンプル（PS-MNPs(1)）とインキュベートし、1 時間ロータリー・ミキサーに置いて、続いて磁気分離をする。上清を除去した後、PS-MNPs(1) 及びオリゴヌクレオチド結合混合物を回収し、数回洗浄し、そして PBS 緩衝液（100 μL）で溶解する。次に、その結合混合物の溶液を、MARAS 選択のために、特定の回転磁場条件（磁場周波数：27 KHz、磁場強度：14 ガウス）に供し、PS-MNPs(1) に対する結合親和性が低いオリゴヌクレオチドを除去する。磁性ナノ粒子は、表面に生体分子があるため、互いに凝集しやすく、大きなクラスターを形成して沈殿するため、2.5 分毎にピペッティングして磁性粒子結合混合物を攪拌する。次に、磁気分離を行い上清を除去する。PS-MNPs(1) 及びオリゴヌクレオチド結合混合物を回収し、PBS 緩衝液で数回洗浄する。PS-MNPs(1) 及びオリゴヌクレオチド結合混合物上に残っているオリゴヌクレオチドは、 PS-MNPs(1) 上に結合したタンパク質に対して強い結合親和性を有する所望のオリゴヌクレオチドである。前記結合混合物を 20 μL の ddH2O で分散させ、次いで 95 ℃で 10 分間加熱してオリゴヌクレオチドを解離させる。解離したオリゴヌクレオチドを含む回収した上清に対して磁気分離を行い、次いでこれを DNA 抽出ミニプレップ・システムで精製し、100 μL の PBS 緩衝液で再分散し、上記のように、加熱し、急冷して、前記オリゴヌクレオチドが特定の二次構造又は三次構造を形成するようにする。その構造を形成させた後、前記オリゴヌクレオチドを PS-MNPs(2) と共にインキュベートし、上記のポジティブ選択工程を、残りの PS-MNPs(2) から PS-MNPs(5) までについてのポジティブ選択が完了する I（5）回、順次繰り返す。最終的に得られたオリゴヌクレオチドは、NS-MNPs(j)（j=1 から 5）上にあるタンパク質全てと結合するわけではなく、PS-MNPs(i)（i=1 から 5）に共通して含まれるタンパク質にのみ、高い結合親和性を持って結合するアプタマーである。実験手順を図１に示す。図中の右側のループはネガティブ選択のループである。この時点では、必ずしも MARAS を使用する必要はなく、5 種類全てのネガティブ選択サンプルの NS-MNPs に結合する一本鎖オリゴヌクレオチドを除外することのみが必要である。次に、左側にポジティブ選択ループがある。この時点では、強い結合親和性を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを PS-MNPs 上に残すために、MARAS による競合的メカニズムを使用する。次に、これらの一本鎖オリゴヌクレオチド（アプタマー）を、加熱することによって MNPs から溶出させ、その後の実験のために精製する。5 種類のネガティブ選択サンプル及び 5 種類のポジティブ選択サンプルを使用することによって、主に、選択したアプタマーの特異性及び感度が改善されると同時に、その後に検出する、及び精製する際の、偽ネガテ���ブ及び偽ポジティブの問題が軽減される。
【００４２】
オリゴヌクレオチド・アプタマー配列のシークエンシング
選択されたアプタマーを、Lab-F 及び Lab-R プライマーを使用する PCR によって増幅し、その PCR 反応を、1.25 単位の DNA ポリメラーゼ（インビトロジェン・ライフ・テクノロジー社（Invitrogen Life Technologies）、グランド・アイランド、ニューヨーク、米国）、0.1 mM dNTPs、0.5 mM MgSO4 及び 0.5 nM プライマーを含有して行い、以下の条件：94 ℃ で 10 分；94 ℃ で 40 秒、57 ℃ で 40 秒、72 ℃ で 40 秒、35 サイクル；72 ℃ で 10 分、で実施する。その PCR 産物を DNA 抽出ミニプレップ・システム（DNA Extraction Miniprep System）を用いて精製する。その精製した生成物を pGEM-T Easy ベクター（プロメガ社（Promega）、マディソン、ウィスコンシン、米国）にサブクローニングする。クローニング手順は製造業者の指示書に従って行う。無作為に選択した 3 つのコロニーのプラスミドを、高速プラスミド・ミニ・キット（High-Speed Plasmid Mini Kit）（ジーンエイド社（Geneaid）、台北、台湾）を用いて精製する。前記プラスミドは、アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems）の PRISM 3730 DNA 自動シークエンサー及びビッグ・ダイ（Big Dye）ターミネーター・サイクル・シークエンシング・キット（フォスター・シティ（Foster City）、カリフォルニア州、米国）を用いて、配列決定する。MARAS 法によって選択したアプタマーは、EGFR 変異 NSCLC の疾患に関連した生体分子に結合する。PCR 増幅及びコロニー形成の後、そのシークエンシングの結果を表３に記載する。
【００４３】
【表３】
2019208506.tif 000006
【００４４】
選択したフォアワード一本鎖アプタマーの調製
選択したアプタマーが実際に選択対照群（ポジティブ選択サンプル及びネガティブ選択サンプル）に結合できるかどうかを確認するためには、PS-MNPs 及び NS-MNPs を用いて、選択したアプタマーを逆検証することが必要である。表３に記載の 3 つのアプタマーのオリゴヌクレオチド・プラスミドを、プライマーとして Lab-F/Lab-ビオチン-R を用いた PCR 増幅用の鋳型として用い（反応条件は上記と同じ）、増幅産物を、DNA 抽出ミニプレップ・システムを用いて精製し、個々に、100 μL の PBS 緩衝液に再分散させた。次いで、前記 PCR 産物を SA-MNPs と 2 時間インキュベートし、SA-MNPs に結合していない上清を磁気分離によって除去し、磁性ナノ粒子結合複合体を 100 μL の PBS 緩衝液に分散させる。新たに調製した 0.15 M の NaOH を 4 分間添加してオリゴヌクレオチドの二本鎖結合を破壊する。磁気分離後、上清を回収し、ビオチン化リバース一本鎖オリゴヌクレオチドと結合した磁気粒子を除去する。回収した上清を 100 mL の 100 ％アルコールに添加し、-80 ℃の冷凍庫に 2 時間入れ、次いで 12,000 rpm で 15 分間遠心分離し、上清を除去し、そして 1 mL の 75 % アルコールを添加する。塩を同じ速度での 15 分間の遠心分離により除去する。上清を除去した後、それを 70 ℃の乾燥浴に置き、残っている水分及びアルコールを蒸発させる。乾燥後、100 μL の PBS 緩衝液を添加して沈殿物を溶解し、精製されたフォアワード一本鎖アプタマーを得る。この一本鎖アプタマーの精製後、分光光度計（NanoDrop 2000c、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社（Thermo Fisher Scientific）、ウィルミントン、デラウェア、米国）を用いてその濃度を測定し、3 つのアプタマーを、その後の逆検証及びブラインド・サンプル解析において使用するために、PBS 緩衝液中で 10 nM の固定濃度に個々に希釈する。
【００４５】
選択したアプタマーと選択対照群の結合に関する q-PCR による逆検証
10 nM の濃度に希釈した 100 μL の 3 つのアプタマー（Aptamer37、Aptamer44、及び Aptamer48）を上記のように加熱、及び急冷して特定の二次構造又は三次構造を形成させ、選択対照群、5 種類の PS-MNPs(i)（i=1〜5）及び 5 種類の NS-MNPs(j)（j=1〜5）と一緒に、室温で 60 分間、それぞれ別々にインキュベートする。磁気分離を行って上清を除去し、次いで磁性粒子結合複合体を回収し、PBS 緩衝液で数回洗浄して未結合アプタマーを完全に除去する。最後に、前記磁性粒子結合複合体を 10 μL の ddH2O で分散させ、95 ℃で 10 分間加熱してアプタマーと磁性粒子との間の結合を壊し、アプタマーを含む上清を磁気分離によって回収する。
【００４６】
次いで、アプタマーを含む回収した上清中のアプタマーの量を、二連で q-PCR（StepOne（商標）リアル‐タイム PCR システム、アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems））によって測定し、各サイクルで放出される蛍光強度を解析する。放出された強度がシステム・プリセットの閾値（閾値）に達すると、PCR のサイクル数は Ct（閾値サイクル）に設定され、その結果、生じた Ct 値は上清中に最初に存在下アプタマーの量に反比例する。各 q-PCR 反応混合物は 10 μL であり、これには、5 μL の SYBR グリーン PCR マスター・ミックス（アプライド・バイオシステムズ社）、0.5 μL の Lab-F/Lab-R（0.5 nM）、及び 4 μL の上記の回収した上清が含まれる。この反応条件は以下の通りである：95 ℃で 5 分。94 ℃で 40 秒、60 ℃で 40 秒、そして72 ℃で 40 秒、40 サイクル；94 ℃で 10 分。Ct 値によりアプタマーの量を推定するための公式は：オリゴヌクレオチドの相対的発現レベル＝2-Ct 、である。
【００４７】
選択されたアプタマーが実際に EGFR の変異を伴う、又は伴わない NSCLC 患者の血清を同定することができるかどうかを確認するために、逆検証を行って前記選択手順を確認する。その結果は、図４Ａ‐４Ｃに示す通りである。これらの図は、3 つの選択されたアプタマーが選択対照群へ結合する量が相対的な発現レベルに対応し、そして EGFR の変異を伴う、及び伴わない NSCLC 患者の選択サンプルの間に有意差があることを示す。このようにして、図１のフローチャートに開示したアプタマーを選択する方法を実行することの妥当性が確認される。
【００４８】
得られたアプタマーについての q-PCR 法によるブラインド試験サンプルのブラインド試験解析
更に、 3 つのアプタマーをブラインド・サンプル解析により解析して、ブラインド試験サンプル中にアプタマーが結合し得る未知の生体分子が存在するかどうかを調べるが、これを同様に、二連の q-PCR 法により行う（反応条件は上記と同じ）。まず最初に、PBS 緩衝液中の 100 μL の固定濃度（10 nM）のアプタマーを上記のように加熱し、次いで急冷して、特定の二次構造又は三次構造を形成させ、次いで各 BS-MNPs(k)（k=1〜38）と個別にインキュベートする。均一に混合した後、その混合溶液を室温に 60 分間置き、上清を磁気分離により除去し、次いで BS-MNP 結合複合体を数回洗浄し、100 μL の PBS 緩衝液中に分散させる。前記BS-MNP 結合複合体の溶液を、10 分間、特定の回転磁場（磁場周波数：27 KHz、磁場強度：14 ガウス）に供し、BS-MNPs(k) に非特異的に、及び低い結合親和性で結合したアプタマー部分を BS-MNP(k) から解離させる。解離したアプタマーを含む上清を除去し、そして磁気分離によって、 BS-MNP (k) 結合複合体を得る。最後に、BS-MNP(k) 結合複合体を 10 μL の ddH2O 中に再分散させ、95 ℃で 10 分間加熱してアプタマーと磁性粒子との間の結合を壊す。磁気分離を行って、磁性粒子を除去し、上清を回収する。次に、回収した上清中の各個々の BS-MNPs(k) の生体分子に結合したアプタマーの量を、上記のように二連で q-PCR によって解析し、相対的発現レベルとして表す。
【００４９】
逆検証により選択、及び検証したアプタマー（Aptamer37、Aptamer44、及び Aptamer48）を更に、ブラインド試験サンプルのブラインド・サンプル解析に使用する、即ち、選択対照群以外の NSCLC 患者の血清を用いて調製した BS-MNPs をブラインドで解析し、その結果を q-PCR 解析の相対的な発現レベルによって表す。その q-PCR の結果を、ブラインド試験群の NSCLC 患者の血清の生検病理解析の結果と比較する。その結果を図５Ａ‐５Ｃに示す。この結果から、各アプタマーは、異なるブラインド試験サンプルに対して、異なる結合度を有することが分かり、異なる患者の血清サンプル中にある未知の生体分子に対して、各アプタマーの結合量が異なることを示している。又、ポジティブ・ブラインド試験サンプルの相対的発現は、ネガティブ・ブラインド試験サンプルの相対的発現よりも一般的に高く、そして各個々のアプタマーの相対的発現が高いポジティブ・ブラインド試験サンプルは同一ではないことを、見いだすこともできる。前者は、選択したアプタマーによって、EGFR 変異がある NSCLC 患者と EGFR 変異が無い NSCLC 患者とを識別することができることを示す。一方で、後者は、ポジティブ患者の血清中にある、個々のアプタマーが結合した生体分子は、異なることがあることを示す。更に、ネガティブ・ブラインド試験サンプル中にある全てのアプタマーはまた、ポジティブ・ブラインド試験サンプルと比較して、より低く、及び異なる程度の相対的発現を有する（これは、ネガティブ及びポジティブ・ブラインド試験サンプル中に、アプタマーが結合する生体分子が存在していることによるはずである）。しかしながら、ポジティブ患者の血清中のこれらの生体分子の濃度は、ネガティブ患者の血清中のそれよりはるかに高い。いくつかのブラインド試験サンプルの血清は使い切ってしまったために、ブラインド試験サンプルに結合した、いくつかのアプタマーに関する q-PCR による相対的発現データは無いことを記載しておかなければならない。又、あるポジティブ・ブラインド試験サンプルについてのアプタマーの相対的発現は低いが、それはおそらく、完全な医療記録がないために確認することができない治療後の患者について、ポジティブ・ブラインド試験サンプルが集められたためである。しかし、これら 2 つの状況は結果の解釈には影響しない。更に、ブラインド・サンプル解析における BS-MNPs に結合する個々のアプタマーの相対的発現を、年齢、性別、がんのステージ、喫煙の有無、及び EGFR 変異等を含む患者の臨床データの要因とを、統計解析としてマン‐ホイットニー（Mann-Whitney） U 検定を用いて、比較する。その比較結果を表４に示す。その表から明らかなように、選択したアプタマーは、EGFR 変異の有無と有意に相関し（p-値＜0.05）、臨床データにおける他の要因とは有意には相関しない。統計解析の結果によって、選択したアプタマーが、EGFR 変異を伴う NSCLC 患者のサンプルと EGFR 変異を伴わない NSCLC 患者のサンプルとを識別することができることが、更に検証される。
【００５０】
【表４】
2019208506.tif 000007
【００５１】
ポジティブの特性を有するサンプル中にある未知のバイオマーカーの精製
この例では、Aptamer37 アプタマーを捕捉リガンドとして使用して、ポジティブの特性を有するブラインド試験サンプルから、NSCLC における EGFR 変異のバイオマーカーとして役立つことがある生体分子を精製することを実証する。Aptamer37 に対して高い相対的発現を有するポジティブの特性を有するサンプル（患者番号：22、31、177、及び 396）を、精製のために選択する。精製試薬は精製前に調製しなければならない。その試薬を、以下のようにして調製する。
【００５２】
捕捉リガンドとして選択したアプタマー（Aptamer37）を用いた精製試薬の調製
前記アプタマー（Aptamer37）を鋳型にして、Lab-biotin-F/Lab-R を用いて PCR 反応を行う。その PCR 反応条件は上記の通りである。反応後、PCR 産物を DNA 抽出ミニプレップ・システム（DNA Extraction Miniprep System）を用いて精製し、100 μL の PBS 緩衝液で再分散し、続いて SA-MNPs を 2 時間添加する。前記 PCR 産物は、フォアワード一本鎖の 5-末端がビオチン化されている、フォアワード鎖及びリバース鎖がハイブリダイズした二本鎖アプタマーであるので、その二本鎖アプタマーは SA-MNPs に結合する。磁気分離を行って SA-MNPs に結合していない物質を含む上清を除去し、磁性粒子結合複合体を得る。次いで、結合した複合体を 100 μL の PBS 緩衝液に分散させ、新たに調製した 0.15 M NaOH を 4 分間添加してアプタマーの二本鎖結合を破壊する。磁気分離によって上清（リバース一本鎖アプタマーを含む）を除去した後、磁性ナノ粒子とフォアワード一本鎖アプタマーの結合複合体を 100 μL の PBS 緩衝液を用いて再分散し、アプタマー精製試薬の調製を完了し、その後に使用するために 4 ℃で冷蔵庫で保管する。
【００５３】
ポジティブの特性を有するブラインド試験サンプル中にある、疾患に関連した未知のバイオマーカーの精製
本精製例では、上記で調製したアプタマー精製試薬を使用して、疾患患者のポジティブの特性を有するブラインド試験試験サンプル（22、31、177、及び 396）から、EGFR 変異を有する NSCLC の疾患に関連する、どういうものであるのかが未知のタンパク質を精製する。この実験では、上記のアプタマー精製試薬を使用して、血清中の未知のバイオマーカーを、1 回当たり、及び複数回のラウンドあたり少ない量で精製する。ポジティブの特性を有するブラインド試験サンプル（ポジティブの特性を有するサンプル(1)）の血清 100 μL を、室温で 1 時間、予め調製したアプタマー精製試薬と混合し、次いで磁気分離を行って上清を除去し、そしてアプタマー磁性ナノ粒子結合複合体を回収する。その結合複合体を PBS 緩衝液で数回洗浄して、結合していないが管壁に残っている他の物質を洗い流し、次いで 100 μL の PBS 緩衝液に分散させる。その結合複合体の溶液を、14 ガウス（H0）の固定磁場強度、及び 3 KHz（f0）の磁場周波数の最初の回転磁場に、10 分間、供し、沈殿した磁性粒子クラスターを、上記のように 2.5 分毎にピペッティングすることによって、再分散させる。磁気分離を行って、アプタマー磁性ナノ粒子結合複合体から解離した画分を含む上清を回収し、残ったアプタマー磁性ナノ粒子結合複合体を得て、回転磁場を印加することによる精製手順を行う。図２に示すように、最初の回転磁場（f0、H0）を主に使用して、非特異的に、又は低い結合親和性でアプタマーに結合する生体分子は除去されること、そしてこの実施形態においては、この画分の上清もまた得て、その後に電気泳動を行って、この工程が、その後に精製及び質量分析の解析を行うために、ポジティブの特性を有するサンプル中にある、多数の干渉性の生体分子を排除することができること、が実証される。得られたアプタマー磁性ナノ粒子結合複合体を 100 μL の PBS 緩衝液中に分散し、続いて次のラウンドで、14 ガウス（H1）の磁場強度、及び 6 KHz（f1）の磁場周波数の回転磁場を、10 分間、印加する。沈殿した磁性粒子クラスターを、上記のように 2.5 分毎にピペッティングすることによって、再分散させる。アプタマー磁性ナノ粒子結合複合体から解離した画分（分離成分(1)）を含む上清を、磁気分離により回収し、残ったアプタマー磁性ナノ粒子結合複合体を得て、次の回転磁場（f2、H2）を印加することによる次のラウンドの精製手順を行うために、ポジティブの特性を有するサンプル(1) として、100 μL の PBS 緩衝液中に分散させる。同じ精製手順を繰り返して（磁場条件：6 K、9 K、12 K、15 K、18 K、21 K、24 K、27 KHz；14 ガウス）、各フラクション（m, m=1 から M(=8)）を回収する。同じポジティブの特性を有するサンプル(1) について、最終ラウンド（M）の精製の後、得られたアプタマー磁性ナノ粒子結合複合体を 100 μL の PBS 緩衝液中に分散させ、そして引き続き精製手順を行うためのアプタマー精製試薬として使用し、全てのポジティブの特性を有するサンプルについての精製手順が完了するまで（n、n=1 から N）、次のポジティブの特性を有するサンプル(2) に関して、前記精製手順を繰り返し行う。すべてのポジティブの特性を有するサンプル(n) についての精製手順を完了した後、各ポジティブの特性を有するサンプル(n) の精製手順から回収された、対応��る分離成分(m) の各セットをプールし、最後に Microsep（登録商標） アドヴァンス遠心装置（MCP003C41 3K、ポール（PALL）、台湾）を別々に使用して、各群の分離成分(m) を濃縮し、その後にポリアクリルアミドのゲル電気泳動を行う。その精製工程を図２に示す。
【００５４】
未知のタンパク質についてのポリアクリルアミド・ゲル電気泳動
この電気泳動を、ゲル・キャスティング及び CAVOY MP-8000 Mini P-4 垂直電気泳動システム（サイエンティフィック・バイオテク社（Scientific Biotech Corp.）、台湾）の電気泳動装置を用いて行う。その装置を組み立てた後、特定濃度の分離ゲル溶液を添加し、そして適量のアルコールを添加してゲル表面を平らにする。分離ゲルが固化した後、上層のアルコールを流し出し、濾紙で乾燥させた後、スタッキング・ゲル溶液を添加する。次に、適切なサイズのコーム（comb）を挿入し、そのゲルが固化した後に電気泳動タンクに入れ、ランニング緩衝液（10x ランニング緩衝液）を注入する。濃縮後の分離成分(m) と標準分子量のタンパク質マーカーを、5x サンプル緩衝液と 3:1 の比で別々に混合し、次いで、それぞれ 98 ℃で 10 分間加熱し、そしてゲルのコギング中にのせる。電気泳動を、80 ボルトの固定電圧で開始する。タンパク質サンプルが分離ゲルにまで移動したら、電圧を 100 ボルトに上げて電気泳動を行う。青い色素がゲルの底にまで移動したら、電気泳動を終了する。そのゲル・フィルムを取り出し、脱イオン水で 3 回洗浄し、次いでタンパク質染料（インスタント・ブルー、ジーンマーク（GeneMark）、台湾）で 1 時間染色し、続いてインスタント・ブルー溶液を除去する。そのゲル・フィルムを脱イオン水で脱染色する。水が変色しなくなったら、ゲル・フィルム上のタンパク質バンドの分布を観察することができるようになり、そして最終的に、所望のタンパク質サイズのバンドを配列決定のために切り出す。使用した全てのゲル及び緩衝溶液を表５に示す。各周波数範囲で回収した上清（その周波数範囲で精製されたタンパク質又はバイオマーカー）を濃縮した後、図６に示すように、磁場周波数を適用することによりシミュレートする仮想フィルタを用いて精製したタンパク質の電気泳動結果を、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によって得ることができる。図６は、Aptamer37 を用いて、周波数範囲を走査することによって精製した結果を示す。図６では、最初の列はタンパク質マーカー（PM）、2 番目の列は除外対象の多数の干渉性の生体分子（<3 KHz；14 ガウス）、3 番目から 9 番目の列は分離成分(1)（3-6 KHz；14 ガウス）から分離成分(7)（21-24KHz；14 ガウス）である。最後の分離成分(8) は、生体分子がないので並べて置いていない。2 番目の列は、ポジティブの特性を有するサンプルから、多数の干渉性の生体分子を、最初の磁場（磁場条件：f0＝3 KHz、H0＝14 ガウス）を印加することによって、排除することができることを示す一方、他の列（列 3〜9）は、仮想フィルタとして磁場周波数範囲を使用することによって、ポジティブの特性を有するサンプルから、EGFR 変異を有する NSCLC の疾患に関連する可能性があるバイオマーカーを精製することができることを示す。
【００５５】
【表５】
2019208506.tif 000008
【００５６】
ゲル電気泳動での未知のタンパク質の質量解析装置によるシークエンシング
アプタマー精製試薬によって精製された特定の単一タンパク質バンドを、Bruker autoflex（登録商標）III MALDI-TOF 質量解析装置（ブルカ―社（Bruker）、台湾）を用いた質量解析を行うために、Biochem（登録商標）Biotechnology（登録商標）（オールバイオ・サイエンス社（AllBio Science Inc.）、台湾）によって行う。この場合、質量解析用に 3 つのタンパク質バンドのみを、例示的に選択する。
【００５７】
上記の図６中で、矢印で示している 3 つの精製タンパク質バンドを質量解析装置によって解析したスペクトルをそれぞれ図７Ａ‐７Ｃに示す。その結果をタンパク質データベースと比較する。最初のバンドの比較結果はスコア 82 の仮想タンパク質 I308_05599（52 KDa）、2 番目のバンドはスコア 78 の仮想タンパク質 G7K_6558-t1（58 KDa）、そして 3 番目のバンドはスコア 73 のスコアを持つ ABC トランスポーター（72 KDa）である。
【００５８】
本発明の範囲又は趣旨から逸脱することなく、本発明の構造に様々な修正及び変形を加えることができることは、当業者にとって明らかであろう。上記を考慮して、本発明が添付の特許請求の範囲及びそれらの均等物の範囲内にある限り、本発明は、本発明の修正形態及び変形形態を網羅することが意図される。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
アプタマーを選択する方法、及び本発明のアプタマーを用いて生体分子を精製する方法を、疾患に関連したバイオマーカーを同定する際に適用することができる。
【符号の説明】
【００６０】
100：コイル
200：電力増幅器
300：信号発生器
【図１】
2019208506.tif 000009
【図２】
2019208506.tif 000010
【図３Ａ】
2019208506.tif 000011
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
2019208506.tif 000020
【図７Ｂ】
2019208506.tif 000021
【図７Ｃ】
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【配列表】
2019208506000001.app
【外国語明細書】
2019208506000001.pdf