(57)【要約】      （修正有）【課題】筋ジストロフィー、特にデュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を治療するための方法および組成物の提供。【解決手段】ＤＭＤに関する少なくとも１つの症状または特徴が、強度、重症度、もしくは頻度において減少されるように、または遅延された発症を有するように、ＤＭＤを患っている個体またはＤＭＤに罹患しやすい個体に、有効量の組換えフォリスタチンタンパク質を投与する。組換えフォリスタチンタンパク質が、野生型ヒトフォリスタチンタンパク質と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む。組換えフォリスタチンタンパク質が、前記野生型ヒトフォリスタチンタンパク質と比較した場合に１つ以上の欠失、突然変異、または挿入を含む。組換えフォリスタチンタンパク質がＦｃドメインに融合されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を治療する方法であって、
ＤＭＤに関する少なくとも１つの症状または特徴が、強度、重症度、もしくは頻度において減少されるように、または遅延された発症を有するように、ＤＭＤを患っている個体またはＤＭＤに罹患しやすい個体に有効量の組換えフォリスタチンタンパク質を投与すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、野生型ヒトフォリスタチンタンパク質
2019059730.tif 000045
と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、前記野生型ヒトフォリスタチンタンパク質  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、前記野生型ヒトフォリスタチンタンパク質  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、前記野生型ヒトフォリスタチンタンパク質  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、前記野生型ヒトフォリスタチンタンパク質  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と同一のアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、前記野生型ヒトフォリスタチンタンパク質と比較した場合に１つ以上の欠失、突然変異、または挿入を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸残基２１２〜２８８の欠失を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、
2019059730.tif 000046
と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と同一のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記組換えフォリスタチンタンパク質がＦｃドメインに融合されている、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｆｃドメインが、
2019059730.tif 000047
と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１のＴｈｒ  ２５０、Ｍｅｔ  ２５２、Ｓｅｒ  ２５４、Ｔｈｒ  ２５６、Ｔｈｒ  ３０７、Ｇｌｕ  ３８０、Ｍｅｔ  ４２８、Ｈｉｓ  ４３３、および／またはＡｓｎ  ４３４に対応する１つ以上の位置において１つ以上の変異を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、リンカーを介して前記Ｆｃドメインに融合されている、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記リンカーが、３〜１００個のアミノ酸を含むペプチドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記リンカーが、
2019059730.tif 000048
（ＧＡＧリンカー、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記リンカーが、
2019059730.tif 000049
（ＧＡＧ２リンカー、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記リンカーが、
2019059730.tif 000050
（ＧＡＧ３リンカー、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８
2019059730.tif 000051
と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０
2019059730.tif 000052
と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記組換えフォリスタチンタンパク質が哺乳動物細胞から生成される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物細胞がＨＴ１０８０細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記組換えフォリスタチンタンパク質が全身投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記全身投与が、静脈内投与、皮内投与、吸入投与、経皮（局所）投与、眼内投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与、および／または経粘膜投与から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記全身投与が静脈内投与である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記全身投与が皮下投与である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記全身投与が経口投与である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、隔月、毎月、３週間毎、隔週、毎週、毎日、または不定間隔で投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、表１から選択される１つ以上の骨格筋に送達される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、横隔膜、三頭筋、ヒラメ筋、前脛骨筋、ひ腹筋、長指伸筋、腹直筋、および／または四頭筋から選択される１つ以上の標的組織に送達される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記組換えフォリスタチンタンパク質が心臓に送達される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、１つ以上の標的組織に送達され、該標的組織が、心臓、ならびに、横隔膜、三頭筋、ヒラメ筋、前脛骨筋、ひ腹筋、長指伸筋、腹直筋、および／または四頭筋を含む骨格筋から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記組換えフォリスタチンタンパク質の前記投与が、筋再生、筋強度の増加、柔軟性の増加、運動範囲の増加、体力の向上、易疲労感の減少、血流の増加、認知力の改善、肺機能の改善、炎症抑制、筋線維症の減少、および／または、筋壊死の減少をもたらす、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記組換えフォリスタチンタンパク質の前記投与が、筋線維症および／または壊死の減少をもたらす、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＤＭＤに関する少なくとも１つの症状または特徴が、筋消耗、筋衰弱、筋脆弱、筋壊死、筋線維症、関節拘縮、骨格変形、心筋症、嚥下障害、腸および膀胱の機能障害、筋虚血、認知機能障害、行動機能障害、社会化機能障害、脊柱側弯症、ならびに呼吸機能障害からなる群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
フォリスタチンポリペプチドと、
Ｆｃドメインと、
該フォリスタチンポリペプチドを該Ｆｃドメインに結合させるリンカーと
を含む組換えフォリスタチン融合タンパク質であって、
該フォリスタチンポリペプチドが、野生型ヒトフォリスタチンタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含み、さらに該組換えフォリスタチン融合タンパク質が、アクチビン、ミオスタチン、および／またはＧＤＦ−１１に結合することができ、かつ、約０．５日〜１０日間の範囲のインビボ半減期を有する、組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項４１】
前記フォリスタチンポリペプチドが、前記野生型ヒトフォリスタチンタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項４０に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項４２】
前記フォリスタチンポリペプチドが、前記野生型ヒトフォリスタチンタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項４０に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項４３】
前記フォリスタチンポリペプチドが、前記野生型ヒトフォリスタチンタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する、請求項４０に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項４４】
前記フォリスタチンポリペプチドが、前記野生型ヒトフォリスタチンタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と同一のアミノ酸配列を有する、請求項４０に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項４５】
前記フォリスタチンポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸残基２１２〜２８８の欠失を含む、請求項４０に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項４６】
フォリスタチンポリペプチドと、
Ｆｃドメインと、
該フォリスタチンポリペプチドを該Ｆｃドメインに結合させるリンカーと
を含む組換えフォリスタチン融合タンパク質であって、
該フォリスタチンポリペプチドが、
2019059730.tif 000053
と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含み、
さらに、該組換えフォリスタチン融合タンパク質が、アクチビン、ミオスタチン、および／またはＧＤＦ−１１に結合することができ、かつ約０．５日〜１０日間の範囲のインビボ半減期を有する、組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項４７】
前記ＦｃドメインがＩｇＧ１  Ｆｃドメインである、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項４８】
前記Ｆｃドメインが、
2019059730.tif 000054
と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項４９】
前記Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１のＴｈｒ  ２５０、Ｍｅｔ  ２５２、Ｓｅｒ  ２５４、Ｔｈｒ  ２５６、Ｔｈｒ  ３０７、Ｇｌｕ  ３８０、Ｍｅｔ  ４２８、Ｈｉｓ  ４３３、および／またはＡｓｎ  ４３４に対応する１つ以上の位置において１つ以上の変異を含む、請求項４８に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項５０】
前記リンカーが、３〜６０個のアミノ酸を含むペプチドである、請求項４０〜４９のいずれか一項に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項５１】
前記リンカーが、
2019059730.tif 000055
（ＧＡＧリンカー；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項５０に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項５２】
前記リンカーが、
2019059730.tif 000056
（ＧＡＧ２リンカー；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項５０に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項５３】
前記リンカーが、
2019059730.tif 000057
（ＧＡＧ３リンカー；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項５０に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項５４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８
2019059730.tif 000058
と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項４０〜５３のいずれか一項に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項５５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０
2019059730.tif 000059
と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項４０〜５３のいずれか一項に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項５６】
請求項４０〜５０のいずれか一項に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項５７】
請求項５６に記載の核酸を含む、細胞。
【請求項５８】
請求項４０〜５５のいずれか一項に記載の組換えフォリスタチン融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１３年１月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／７５６，９９６号および２０１３年１２月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／９１５，７３３号からの優先権を主張するものであり、これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、筋ジストロフィーのＸ連鎖劣性遺伝型であり、結果として筋肉変性および最終的に死をもたらす。この障害は、細胞膜のジストログリカン複合体（ＤＧＣ）に構造的安定性を提供する筋組織内の重要な構造成分であるタンパク質ジストロフィンをコードする、ヒトＸ染色体上に位置するジストロフィン遺伝子における突然変異によって引き起こされる。ジストロフィンは、細胞質内部のアクチンフィラメントネットワークおよび細胞外マトリックスを連結し、筋線維に物理的な強度を提供する。したがって、ジストロフィンの変化または不在は、異常な筋線維膜機能を結果としてもたらす。男性女性共に突然変異を保有し得るが、少年は典型的には、早期障害および死亡を伴う重症の表現型を有し、これに対して突然変異を保有する女性は典型的には、はるかに軽度の表現型を呈する。
【０００３】
現在、ＤＭＤに対する既知の治療法はない。遺伝子療法およびコルチコステロイドの様々な投与プロトコールを含む多くの治療的手段が検討されてきた。これらの治療法のいくつかは、ある特定の徴候および症状を遅延させ得るが、現在のところＤＭＤ患者にとって満足のいく治療選択肢は存在しない。
【発明の概要】
【０００４】
本発明はとりわけ、フォリスタチンタンパク質療法に基づいて、筋ジストロフィー、特にデュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）および／またはベッカー筋ジストロフィーを治療するための改善された方法および組成物を提供する。下記の実施例を含む本明細書に記載するように、本発明者らは、組換えフォリスタチンタンパク質（例えば、フォリスタチン−Ｆｃ組換え融合タンパク質）のＤＭＤ動物モデルへの全身投与が、全身にわたる様々な組織中で有効な筋成長を結果としてもたらし、ＤＭＤの特徴的な症状である筋線維症および／または壊死を減少させることを初めて立証した。加えて、本発明者らは、本発明によるフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質が、最大約５日間の延長された血清半減期を有することも立証した。いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、予期せぬ長い血清半減期は、優れたインビボ有効性に寄与することができたと考えられる。実際、本発明の以前においては、フォリスタチンは、両者共に筋成長の重要な負の調節因子であるミオスタチンおよびアクチビンの調節物質であることが知られていた。しかしながら、本発明の以前においては、フォリスタチンは特に短い血清半減期を有することが報告されていて、これがフォリスタチンをタンパク質治療薬として開発するための大きなハードルを構成していた。例えば、典型的な市販の野生型フォリスタチン（ＦＳ３１５）タンパク質は、約１時間の血清半減期を有する。Ｆｃ融合タンパク質は、血清半減期を延長するために使用されてきていた。しかしながら、Ｆｃドメインの大きなサイズおよびフォリスタチンタンパク質の比較的小さいサイズのために、Ｆｃドメインのフォリスタチンタンパク質への直接融合は、野生型フォリスタチンタンパク質の正常な構造および機能を妨げ得ると考えられた。報告されたフォリスタチンの良好でない薬物動態学的特性／薬力学的特性（ＰＫ／ＰＤ）およびフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質に関連する不確実性は、科学者および臨床医がフォリスタチンをＤＭＤまたは他の筋ジストロフィーのためのタンパク質療法としてさらに開発することをはばんできた。実際、本発明の以前においては、遺伝子療法は、ＤＭＤのためのフォリスタチンをベースとした療法の焦点であった。本発明者らによって示されたこの予想外に優れたインビボ有効性および半減期は、フォリスタチンがＤＭＤの治療のための有効なタンパク質治療薬であり得ることを初めて確立するものである。
【０００５】
一態様では、本発明は、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療法を提供し、本方法は、ＤＭＤに関する少なくとも１つの症状または特徴が、強度、重症度、もしくは頻度において減少されるように、または遅延した発症を有するように、ＤＭＤを患っている個体またはＤＭＤに罹患しやすい個体に、組換えフォリスタチンタンパク質の有効量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＤＭＤに関する少なくとも１つの症状または特徴は、筋消耗、筋衰弱、筋脆弱、関節拘縮、骨格変形、筋肉の脂肪浸潤、非収縮性組織による筋肉の置換え（例えば、筋線維症）、筋壊死、心筋症、嚥下障害、腸および膀胱の機能障害、筋虚血、認知機能障害（例えば、学習困難、神経行動学的異常の高いリスク、認知障害）、行動機能障害、社会化機能障害、脊柱側弯症、ならびに呼吸機能障害から選択される。
【０００６】
いくつかの実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、野生型ヒトフォリスタチンタンパク質
2019059730.tif 000002
と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、野生型ヒトフォリスタチンタンパク質  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、野生型ヒトフォリスタチンタンパク質  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、野生型ヒトフォリスタチンタンパク質  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、野生型ヒトフォリスタチンタンパク質  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、野生型ヒトフォリスタチンタンパク質  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と同一のアミノ酸配列を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、野生型ヒトフォリスタチンタンパク質と比較した場合に１つ以上の欠失、突然変異、または挿入を含む。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸残基２１２〜２８８（ドメイン３に対応する）の欠失を含む。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、ヘパリン結合部位を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本発明は、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療法を提供し、本方法は、ＤＭＤに関する少なくとも１つの症状または特徴が、強度、重症度、もしくは頻度において減少されるように、または遅延した発症を有するように、ＤＭＤを患っている個体またはＤＭＤに罹患しやすい個体に、組換えフォリスタチンタンパク質の有効量を投与することを含み、この組換えフォリスタチンタンパク質は、
2019059730.tif 000003
と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と同一のアミノ酸配列を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ＤＭＤに関する少なくとも１つの症状または特徴は、筋消耗、筋衰弱、筋脆弱、筋肥大、筋偽肥大、関節拘縮、骨格変形、心筋症、嚥下障害、腸および膀胱の機能障害、筋虚血、認知機能障害、行動機能障害、社会化機能障害、脊柱側弯症、ならびに呼吸機能障害からなる群から選択される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、Ｆｃドメインに融合されている。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＦｃドメインは、
2019059730.tif 000004
と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、または１４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、または１４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、４、または１４と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、好適なＦｃドメインは、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の結合を改善し、長期の血清半減期を結果として生じる１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、好適なＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１のＴｈｒ  ２５０、Ｍｅｔ  ２５２、Ｓｅｒ  ２５４、Ｔｈｒ  ２５６、Ｔｈｒ  ３０７、Ｇｌｕ  ３８０、Ｍｅｔ  ４２８、Ｈｉｓ  ４３３、および／またはＡｓｎ  ４３４に対応する１つ以上の位置において１つ以上の変異を含む。特定の実施形態では、好適なＦｃドメインは、変異Ｈ４３３Ｋ（Ｈｉｓ４３３Ｌｙｓ）および／またはＮ４３４Ｆ（Ａｓｎ４３４Ｐｈｅ）を含有する。特定の実施形態では、好適なＦｃドメインは、Ｈ４３３Ｋ（Ｈｉｓ４３３Ｌｙｓ）およびＮ４３４Ｆ（Ａｓｎ４３４Ｐｈｅ）の変異を組み込んでいる以下に示す配列を含む：
2019059730.tif 000005
。
【００１５】
いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、リンカーを介してＦｃドメインに融合される。いくつかの実施形態では、リンカーは３〜１００個のアミノ酸を含むペプチドである。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＡＬＥＶＬＦＱＧＰからなるリンカーではない。いくつかの実施形態では、リンカーは、１０〜１００個、１０〜９０個、１０〜８０個、１０〜７０個、１０〜６０個、１０〜５０個、１０〜４０個、１０〜３０個、１０〜２０個、１０〜１５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、
2019059730.tif 000006
（ＧＡＧリンカー、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、
2019059730.tif 000007
（ＧＡＧ２リンカー、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、
2019059730.tif 000008
（ＧＡＧ３リンカー、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と同一の配列を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明は、フォリスタチンポリペプチド、Ｆｃドメイン、およびフォリスタチンポリペプチドをＦｃドメインに結合する、少なくとも１０個（例えば、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５個）のアミノ酸の長さを有するリンカーを含む、組換えフォリスタチン融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、フォリスタチンポリペプチド、Ｆｃドメイン、およびフォリスタチンポリペプチドをＦｃドメインに結合するリンカーを含む、組換えフォリスタチン融合タンパク質を提供し、このリンカーは、ＡＬＥＶＬＦＱＧＰからなるリンカーではない。いくつかの実施形態では、好適なフォリスタチンポリペプチドは、野生型ヒトフォリスタチンタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチン融合タンパク質は、アクチビン、ミオスタチン、および／またはＧＤＦ−１１に結合することができ、かつ約０．５日〜１０日間のインビボ半減期を有する。
【００１７】
特定の実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８
2019059730.tif 000009
と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
【００１８】
特定の実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０
2019059730.tif 000010
と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
【００１９】
特定の実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、
2019059730.tif 000011
と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、哺乳動物細胞から生成される。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＨＴ１０８０細胞である。
【００２１】
本発明の実施形態は、様々な経路で送達され得ることを理解されたい。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、全身投与される。いくつかの実施形態では、全身投与は、静脈内投与、皮内投与、吸入投与、経皮（局所）投与、眼内投与、筋肉内投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与、および／または経粘膜投与から選択される。
【００２２】
実施形態は、多数の投与レジメンによって投与されてもよい。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、隔月、毎月、３週間毎、隔週、毎週、毎日、または不定間隔で投与される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、横紋筋（例えば、骨格筋、心筋）から選択される１つ以上の標的組織に送達される。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、心臓に送達される。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、骨格筋に送達される。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、表１から選択される１つ以上の骨格筋に送達される。いくつかの実施形態では、横紋筋（例えば、骨格筋）は、三頭筋、前脛骨筋、ヒラメ筋、ひ腹筋、二頭筋、僧帽筋、三角筋、四頭筋、および横隔膜からなる群から選択される。
【００２４】
いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質の投与は、筋再生、線維症の縮小、筋強度の増加、柔軟性の向上、運動範囲の増加、体力の向上、易疲労感の減少、血流の増加、認知力の改善、肺機能の改善、炎症抑制、筋線維症、および／または、壊死の減少をもたらす。
【００２５】
別の態様では、本発明は、本明細書で記載される様々な方法で使用される組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、フォリスタチンポリペプチド、Ｆｃドメイン、およびフォリスタチンポリペプチドをＦｃドメインに結合させるリンカーを含む、組換えフォリスタチン融合タンパク質を提供し、このフォリスタチンポリペプチドは、野生型ヒトフォリスタチンタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチン融合タンパク質は、アクチビン、ミオスタチン、および／またはＧＤＦ−１１に結合することができる。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチン融合タンパク質は、約２日間を超える（例えば、約２．５日間を超える、約３日間を超える、約３．５日間を超える、約４日間を超える、約４．５日間を超える、約５日間を超える、約５．５日間を超える、約６日間を超える）インビボ半減期を有する。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチン融合タンパク質は、約２〜１０日間の範囲（例えば、約２．５〜１０日間、約３〜１０日間、約３．５〜１０日間、約４〜１０日間、約４．５〜１０日間、約５〜１０日間、約３〜８日間、約３．５〜８日間、約４〜８日間、約４．５〜８日間、約５〜８日間、約３〜６日間、約３．５〜６日間、約４〜６日間、約４．５〜６日間、約５〜６日間の範囲）のインビボ半減期を有する。いくつかの実施形態では、インビボ半減期は、マウス、ラット、非ヒト霊長類、および／またはヒトのうちの１つ以上で測定される。いくつかの実施形態では、フォリスタチンポリペプチドは、野生型ヒトフォリスタチンタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、フォリスタチンポリペプチドは、野生型ヒトフォリスタチンタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、フォリスタチンポリペプチドは、野生型ヒトフォリスタチンタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、フォリスタチンポリペプチドは、野生型ヒトフォリスタチンタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、フォリスタチンポリペプチドは、野生型ヒトフォリスタチンタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、フォリスタチンポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸残基２１２〜２８８（ドメイン３に対応する）の欠失を含有する。種々の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドは、硫酸ヘパリン結合部位を含有する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本発明は、フォリスタチンポリペプチド、Ｆｃドメイン、およびフォリスタチンポリペプチドをＦｃドメインに結合させるリンカーを含む、組換えフォリスタチン融合タンパク質を提供し、このフォリスタチンポリペプチドは、
2019059730.tif 000012
と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチン融合タンパク質は、アクチビン、ミオスタチン、および／またはＧＤＦ−１１に結合することができる。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチン融合タンパク質は、約２日間を超える（例えば、約２．５日間を超える、約３日間を超える、約３．５日間を超える、約４日間を超える、約４．５日間を超える、約５日間を超える、約５．５日間を超える、約６日間を超える）インビボ半減期を有する。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチン融合タンパク質は、約２〜１０日間の範囲（例えば、約２．５〜１０日間、約３〜１０日間、約３．５〜１０日間、約４〜１０日間、約４．５〜１０日間、約５〜１０日間、約３〜８日間、約３．５〜８日間、約４〜８日間、約４．５〜８日間、約５〜８日間、約３〜６日間、約３．５〜６日間、約４〜６日間、約４．５〜６日間、約５〜６日間の範囲）のインビボ半減期を有する。いくつかの実施形態では、インビボ半減期は、マウス、ラット、非ヒト霊長類、および／またはヒトのうちの１つ以上で測定される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、
2019059730.tif 000013
と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、好適なＦｃドメインは、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の結合を改善し、長期の半減期を結果としてもたらす１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１のＴｈｒ  ２５０、Ｍｅｔ  ２５２、Ｓｅｒ  ２５４、Ｔｈｒ  ２５６、Ｔｈｒ  ３０７、Ｇｌｕ  ３８０、Ｍｅｔ  ４２８、Ｈｉｓ  ４３３、および／またはＡｓｎ  ４３４に対応する１つ以上の位置において１つ以上の変異を含む。特定の実施形態では、好適なＦｃドメインは、変異Ｈ４３３Ｋ（Ｈｉｓ４３３Ｌｙｓ）および／またはＮ４３４Ｆ（Ａｓｎ４３４Ｐｈｅ）を含有する。特定の実施形態では、好適なＦｃドメインは、Ｈ４３３Ｋ（Ｈｉｓ４３３Ｌｙｓ）およびＮ４３４Ｆ（Ａｓｎ４３４Ｐｈｅ）の変異を組み込んでいる以下に示す配列を含む：
2019059730.tif 000014
。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本発明による組換えフォリスタチン融合タンパク質は、リンカーを介するＦｃ融合が、ヘパリンへの結合の欠如を維持することを含めて、フォリスタチンの同族のリガンドへの結合特性を実質的に変更しないように、リンカーを含む。いくつかの実施形態では、好適なリンカーは、３〜６０個のアミノ酸を含むペプチドである。いくつかの実施形態では、好適なリンカーは、少なくとも１０個（例えば、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５個）のアミノ酸を含むペプチドである。いくつかの実施形態では、好適なリンカーは、
2019059730.tif 000015
（ＧＡＧリンカー、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、好適なリンカーは、
2019059730.tif 000016
（ＧＡＧ２リンカー、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、好適なリンカーは、
2019059730.tif 000017
（ＧＡＧ３リンカー、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の配列を含む。
【００３１】
特定の実施形態では、本発明により提供される組換えフォリスタチン融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、９、１０、１１、１６、または１７と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載される組換えフォリスタチン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載される組換えフォリスタチン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載される組換えフォリスタチン融合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物を提供する。
【００３３】
本願で使用される、用語「約（ａｂｏｕｔ）」および「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、等価なものとして使用される。約／およそが付いているまたは付いていない、本願で使用されるいかなる数字も、関連技術分野における当業者によって理解される任意の通常の変動を包含することが意図される。
【００３４】
本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下に続く詳細な説明において明らかである。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施形態を示してはいるが、例示として提供されているにすぎず、限定するものではない。本発明の範囲内に入る種々の変更および修正は、詳細な説明から当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
図面は、例示目的のためのものにすぎず、限定目的のものではない。
【図１】ＦＳ３１５−Ｆｃが、市販の可溶性アクチビン受容体（ｓＡｃｔＲＩＩＢ）と比較して、Ｓｍａｄ  １／５／８経路を通るＢＭＰ−９またはＢＭＰ−１０シグナル伝達を阻害しないことを図示する例示的結果を示す。図１Ａは、ＢＭＰ−９阻害アッセイ法の例示的結果を示し、図１Ｂは、ＢＭＰ−１０阻害アッセイ法の例示的結果を示す。
【図２】ＦＳ３１５−Ｆｃが、ミオスタチン媒介性およびアクチビン媒介性Ｓｍａｄ  ２／３シグナル伝達を阻害することを図示する例示的結果を示す。図２Ａは、ミオスタチン阻害アッセイ法の例示的結果を示し、図２Ｂは、アクチビンＡ阻害アッセイ法の例示的結果を示す。
【図３】組織全体にわたるＰＫプロファイルを図示する例示的結果を示す。例示的なフォリスタチン−Ｆｃタンパク質は、マウス血清中で約５日間の血清半減期（図３Ａ）、および２〜５日間の組織半減期（図３Ｂ）を有する。
【図４】１ｍｇ／ｋｇのＦＳ３１５−ｍＦｃへの４週間および１０週間の曝露後ならびに８ｍｇ／ｋｇのＦＳ３１５−ｍＦｃへの６週間の曝露後の、四頭筋（図４Ａ）、ひ腹筋（図４Ｂ）、前脛骨筋（図４Ｃ）、および三頭筋（図４Ｄ）の筋肉重量に及ぼす例示的フォリスタチン−Ｆｃタンパク質の効果を図示する例示的結果を示す。筋肉重量は、ベースラインの体重に修正されている。
【図５】経時的な血清フォリスタチンレベルに及ぼす例示的フォリスタチン−Ｆｃタンパク質の効果を図示する例示的結果を示す。図５Ａは、１ｍｇ／ｋｇのＦＳ３１５−ｍＦｃで１０週間にわたって処置した後の血清中のレベルを示し、図５Ｂは、８ｍｇ／ｋｇのＦＳ３１５−ｍＦｃで６週間にわたって処置した後の血清中のレベルを示す。
【図６】ＦＳ３１５−ｍＦｃ、ｓＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ、またはＰＢＳ対照への曝露後のひ腹筋の筋肉重量に及ぼす例示的フォリスタチン−Ｆｃタンパク質の効果を図示する例示的結果を示す。
【図７】体重に及ぼすフォリスタチン野生型および変異体の効果を図示する例示的結果を示す。パネルＡは、経時的な各群中の動物の例示的平均体重を示し、パネルＢは、注射後６週目における各群中の動物の例示的平均体重を示す。
【図８】注射後２週目における注射された筋肉の重量に及ぼすフォリスタチン変異体の効果を図示する例示的結果を示す。パネルＡは、注射されたひ腹筋の質量を示し、一方パネルＢは、注射された四頭筋の質量を示す。
【図９】注射後２週目の注射された筋肉および注射部位から離れた筋肉に及ぼすドメイン３欠失の効果を図示する例示的結果を示す。左側四頭筋は注射の部位であり、一方、右側四頭筋は、反対側の動物内部の対照筋である。
【図１０】注射後４週目の注射部位中および注射部位から遠位にある特定の筋肉の重量に及ぼすフォリスタチン変異体の効果を図示する例示的結果を示す。パネルＡ（ひ腹筋）およびパネルＢ（四頭筋）は、注射された筋肉である。パネルＣ（前脛骨筋）、パネルＤ（三頭筋）、およびパネルＥ（横隔膜）は、注射部位から遠位にある筋肉である。
【図１１】注射後４週目の注射された筋肉および注射部位から離れた筋肉に及ぼすドメイン３欠失の効果を図示する例示的結果を示す。左側四頭筋は、注射の部位であり、一方、右側四頭筋は、反対側の動物内部の対照筋である。
【図１２】注射後２週目における（Ａ）四頭筋、（Ｂ）ひ腹筋、（Ｃ）前脛骨筋、（Ｄ）三頭筋、および（Ｅ）横隔膜中の注射された筋肉および遠位筋肉の双方の線維サイズに及ぼすフォリスタチン変異体の効果を図示する例示的結果を示す。
【図１３】注射後４週目における（Ａ）四頭筋、（Ｂ）ひ腹筋、（Ｃ）前脛骨筋、（Ｄ）三頭筋、および（Ｅ）横隔膜中の注射された筋肉および遠位筋肉の双方の線維サイズに及ぼすフォリスタチン変異体の効果を図示する例示的結果を示す。
【図１４】注射後６週目における（Ａ）四頭筋、（Ｂ）ひ腹筋、（Ｃ）前脛骨筋、（Ｄ）三頭筋、および（Ｅ）横隔膜中の注射された筋肉および遠位筋肉の双方の線維サイズに及ぼすフォリスタチン変異体の効果を図示する例示的結果を示す。
【図１５】４週間の曝露後の（Ａ）Ｃ５７マウスおよび（Ｂ）ｍｄｘマウスのひ腹筋中の筋線維の直径に及ぼす例示的フォリスタチン−Ｆｃタンパク質の効果を立証する例示的結果を示す。
【図１６】ビヒクル対照動物と比較した、２、４、６、または８週間の曝露後の処置されたＣ５７マウスの体重に及ぼす例示的フォリスタチン−Ｆｃタンパク質の効果を立証する例示的結果を示す。
【図１７】４および８週間の曝露後のビヒクル対照動物を超える増加パーセントとしての処置動物の三頭筋および四頭筋の重量に及ぼす例示的フォリスタチン−Ｆｃタンパク質の効果を立証する例示的結果を示す。
【図１８】４および８週間の曝露後のビヒクル対照動物を超える増加パーセントとしての処置動物の三頭筋および四頭筋の筋線維の直径に及ぼす例示的フォリスタチン−Ｆｃタンパク質の効果を立証する例示的結果を示す。
【図１９】１、３、４、６、または８週間の曝露後の、週２回の皮下注射によって融合タンパク質を投与された動物の血清中のフォリスタチン−Ｆｃタンパク質の例示的なレベルを示す。パネル（Ａ）は、４週間の曝露後に安楽死させた動物からの結果を示し、パネル（Ｂ）は、８週間の曝露後に安楽死させた動物からの結果を示す。
【図２０】６または１２週間の曝露後の、ビヒクル対照動物と比較した、処置動物の四頭筋中の線維症の３つのマーカー：α−平滑筋アクチン、コラーゲン三重へリックスリピート含有１タンパク質（ｃｔｈｒｃ１）、およびＩ型コラーゲンのｍＲＮＡ発現に及ぼすフォリスタチン−Ｆｃタンパク質の効果を立証する例示的結果を示す。
【図２１】ビヒクルまたはフォリスタチン−Ｆｃタンパク質で６週間処置されたｍｄｘマウスの四頭筋および三頭筋組織の例示的なＨＥ染色切片を示す。Ｃ５７対照マウスの四頭筋および三頭筋からの例示的なＨＥ染色も示されている。
【図２２】ビヒクルまたはフォリスタチン−Ｆｃタンパク質で１２週間処置されたｍｄｘマウスの四頭筋、三頭筋、および横隔膜組織の例示的なＩ型コラーゲン染色切片を示す。Ｃ５７対照マウスの四頭筋、三頭筋、および横隔膜からの例示的なＩ型コラーゲン染色も示されている。
【図２３】対側性ビヒクル対照筋肉と比較した、４週間処置されたＣ５７ＢＬ／１０マウスの筋肉重量に及ぼす、２つのフォリスタチン変異体、ＦＳ３１５−ｍＦｃ融合タンパク質およびｄＦＳＤ３−ｍＦｃ変異体融合タンパク質のうちの１つの週２回の筋肉内注射の効果を立証する例示的結果を示す。
【図２４】ＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｍＦｃおよびＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｈＦｃ融合タンパク質が、ＣＡＧＡ−ルシフェラーゼアッセイ法において（Ａ）ミオスタチンおよび（Ｂ）アクチビンシグナル伝達を未変性ＦＳ３１５と同程度まで阻害することを立証する例示的結果を示す。これと比較して、９個のアミノ酸のリンカーを含有するＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ＦＳ３１５−ｈＦｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．により製造、カタログ番号１０６８５−Ｈ０２Ｈ）は、強力さが非常に劣っている。
【図２５】１０ｍｇ／ｋｇのタンパク質を単回皮下（ＳＣ）注射で投与されたラットの血清中のＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｈＦｃタンパク質のレベルを示す。算出された血清半減期は、３．５日間であった。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
定義
本発明をより容易に理解するために、ある特定の用語が、まず初めに以下に定義される。以下の用語および他の用語についての追加の定義は、明細書全体を通して記載されている。
【００３７】
動物：本明細書で使用される用語「動物」は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階におけるヒトを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階における非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は哺乳動物（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、および／またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物には、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類、および／または寄生虫類が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、動物は、形質転換動物、遺伝子操作された動物、および／またはクローンであってもよい。
【００３８】
およそまたは約：本明細書で使用される、１つ以上の目的とする値に適用される「およそ」または「約」は、記載された参照値に類似する値を指す。ある特定の実施形態では、用語「およそ」または「約」は、特に明記しない限りまたは文脈から明白でない限り、記載された参照値のいずれかの方向（超えるまたは未満）において、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満内に入る値の範囲を指す（このような数値が可能性のある値の１００％を超える場合を除く）。
【００３９】
生物学的利用能：本明細書で使用される用語「生物学的利用能」は、一般的には、対象の血流に到達する投与された用量の百分率を指す。
【００４０】
生物学的に活性：本明細書で使用される句「生物学的に活性」は、生物システムにおいて、特に生物体において活性を有する任意の作用物質の特性を指す。例えば、生物体に投与される場合にこの生物体に及ぼす生物学的効果を有する作用物質は、生物学的に活性とみなされる。ペプチドが生物学的に活性である特定の実施形態では、ペプチドの生物学的活性の少なくとも１つを共有するそのペプチドの一部は、典型的には「生物学的に活性な」部分と呼ばれる。
【００４１】
心筋：本明細書で使用される用語「心筋」は、心臓の壁で見られる一種の不随意横紋筋、特に心筋層を指す。
【００４２】
担体または希釈剤：本明細書で使用される用語「担体」および「希釈剤」は、薬学的製剤の調製用に有用な薬学的に許容される（例えば、ヒトへの投与のために安全でかつ非毒性）担体または希釈物質を指す。例示的な希釈剤としては、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル溶液、またはデキストロース溶液が挙げられる。
【００４３】
フォリスタチンまたは組換えフォリスタチン：本明細書で使用される用語「フォリスタチン（ＦＳ）」または「組換えフォリスタチン」は、特に断らない限り、実質的なフォリスタチン生物学的活性を保持する任意の野生型および修飾フォリスタチンタンパク質（例えば、アミノ酸突然変異、欠失、挿入を含むフォリスタチンタンパク質、および／または融合タンパク質）を指す。欠失の非限定的例は、ドメイン３欠失（ΔＤ３またはｄＦＳＤ３）である。融合タンパク質の非限定的な例は、Ｆｃ融合タンパク質である。
【００４４】
機能的等価物または誘導体：本明細書で使用される用語「機能的等価物」または「機能的誘導体」は、アミノ酸配列の機能的誘導体の文脈の中では、元の配列のものに実質的に類似する生物学的活性（機能または構造のいずれかの）を保持する分子を意味する。機能的誘導体または等価物は、天然の誘導体であってもよいか、または合成して調製される。例示の機能的誘導体は、タンパク質の生物学的活性が保存されている限り、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列を含む。置換するアミノ酸は、望ましくは、置換されたアミノ酸のものに類似する化学的物理的特性を有する。望ましい類似する化学的物理的特性としては、電荷、嵩高さ、疎水性、親水性等における類似性が挙げられる。
【００４５】
融合タンパク質：本明細書で使用される用語「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」は、２つ以上の本来別個のタンパク質の結合によって、またはそれらの部分の結合によって生成されたタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、リンカーまたはスペーサーが各タンパク質の間に存在するであろう。
【００４６】
半減期：本明細書で使用される用語「半減期」は、タンパク質濃度または活性などの量が、期間の開始時に測定されたその値の半分まで低下するのに必要とされる時間である。
【００４７】
肥大：本明細書で使用される用語「肥大」は、器官または組織の構成細胞の拡大に起因する器官または組織の体積における増加を指す。
【００４８】
改善する、増加させる、または減少させる：本明細書で使用される「改善する」、「増加させる」、もしくは「減少させる」、または文法的等価物は、本明細書に記載される治療の開始よりも前の同一の個体における測定値、または本明細書に記載される治療の不在下の１人の対照対象（または複数の対照対象）における測定値などのベースライン測定値に対する値を示す。「対照対象」は、処置されている対象と同一の型の疾患に罹患した対象であり、処置されている対象とほぼ同一の年齢である。
【００４９】
インビトロ：本明細書で使用される用語「インビトロ」は、多細胞生物内でよりはむしろ人工的な環境、例えば、試験管内または反応容器内、細胞培養中等で起こる事象を指す。
【００５０】
インビボ：本明細書で使用される用語「インビボ」は、ヒトおよび非ヒト動物などの多細胞生物内で発生する事象を指す。細胞に基づく系に関しては、この用語は、生細胞内で（例えば、インビトロ系とは対照的に）発生する事象を指すよう使用されてもよい。
【００５１】
リンカー：本明細書で使用される用語「リンカー」は、融合タンパク質においては、天然タンパク質中の特定の位置において出現するもの以外のアミノ酸配列を指し、通常、２つのタンパク質部分間で柔軟であるように、またはα−へリックスなどの構造を挿置するように設計される。リンカーは、スペーサーとも呼ばれる。リンカーまたはスペーサーは、典型的には、それ自体で生物学的機能を有することはない。
【００５２】
ポリペプチド：本明細書で使用される用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して一緒に結合されたアミノ酸の連続的な鎖を指す。この用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を指すよう使用されるが、当業者であれば、この用語が長大な鎖に限定されるものではなく、ペプチド結合を介して一緒に結合される２つのアミノ酸を含む最小の鎖を指すこともできることを理解するであろう。当業者には既知であるように、ポリペプチドは、加工処理および／または修飾されてもよい。本明細書で使用される用語「ポリペプチド」および「ペプチド」は互換的に使用される。
【００５３】
予防する：本明細書で使用される用語「予防する」または「予防」は、疾患、障害、および／または状態の発生に関連して使用される場合、疾患、障害、および／または状態を発症するリスクを減少させることを指す。「リスク」の定義を参照されたい。
【００５４】
タンパク質：本明細書で使用される用語「タンパク質」は、別個の単位として機能する１つ以上のポリペプチドを指す。単一のポリペプチドが、別個に機能する単位であり、別個の機能する単位を形成するために、他のポリペプチドとの永久的または一時的な物理的結合を必要としないならば、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、互換的に使用されてもよい。別個の機能的単位が、互いに物理的に結合する２つ以上のポリペプチドから構成されているならば、用語「タンパク質」は、物理的に結合され、別個の単位として一緒に機能する複数のポリペプチドを指す。
【００５５】
リスク：文脈から理解されるように、疾患、障害、および／または状態の「リスク」は、特定の個体が疾患、障害、および／または状態（例えば、筋ジストロフィー）を発症する可能性を含む。いくつかの実施形態では、リスクは百分率として表される。いくつかの実施形態では、リスクは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％から最大１００％である。いくつかの実施形態では、リスクは、基準試料または基準試料の群に関連するリスクに対するリスクとして表される。いくつかの実施形態では、基準試料または基準試料の群は、疾患、障害、状態、および／または事象（例えば、筋ジストロフィー）の既知のリスクを有する。いくつかの実施形態では、基準試料または基準試料の群は、特定の個体と比較できる個体から得られる。いくつかの実施形態では、相対的リスクは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上である。
【００５６】
横紋筋：本明細書で使用される用語「横紋筋」は、顕微鏡を用いると横紋状の外観をもたらす筋組織の細胞内収縮性単位、サルコメアの規則的配列を有する多核性筋組織で、随意制御下にあるものを指す。典型的には、横紋筋は、心筋、骨格筋、および鰓弓筋であり得る。
【００５７】
平滑筋：本明細書で使用される用語「平滑筋」は、単元性および多元性筋を含む不随意的に制御される、非横紋筋を指す。
【００５８】
対象：本明細書で使用される用語「対象」は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類）を指す。ヒトは、出産前および出産後の形態を含む。多くの実施形態において、対象はヒトである。対象は患者でもあり得、患者は診断および疾患の治療を求めて医薬提供者の元を訪れるヒトを指す。用語「対象」は、「個体」または「患者」と互換的に使用される。対象は、疾患もしくは障害に罹患し得るかまたは疾患もしくは障害に罹患しやすいが、疾患または障害の症状を示してもまたは示さなくともよい。
【００５９】
実質的に：本明細書で使用される用語「実質的に」は、関心の特徴または特性の全体的なもしくはほぼ全体的な範囲または程度を示している質的な条件を指す。生物学的分野における当業者であれば、生物学的および化学的現象は、完結することならびに／もしくは完結まで進むことがあるにしてもごくまれであること、または絶対的結果を成し遂げるかもしくは回避することがあるとしてもごくまれであることを理解するであろう。したがって用語「実質的に」は、多くの生物学的および化学的現象において固有の潜在的な完結性の欠如をとらえるために本明細書で使用される。
【００６０】
実質的に相同性：句「実質的に相同性」は、本明細書ではアミノ酸または核酸配列間の比較を指すために使用される。当業者であれば理解されるように、２つの配列は、それらが対応する位置において相同の残基を含有するならば、一般的に「実質的に相同性」であるとみなされる。相同の残基は、同一の残基であってもよい。あるいは、相同の残基は、適切に類似した構造的および／または機能的特徴を有するならば、同一でなくともよい。例えば、当業者には周知であるように、ある特定のアミノ酸は、典型的には「疎水性」もしくは「親水性」アミノ酸として、および／または「極性」もしくは「非極性」側鎖を有するものとして分類される。同一のタイプの別のものに対する１つのアミノ酸の置換は、多くの場合「相同な」置換とみなされてもよい。
【００６１】
当該技術分野において周知であるように、アミノ酸または核酸配列は、ヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮ、およびアミノ酸配列についてはＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ならびにＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラム中で利用可能なものを含む種々のアルゴリズムのいずれかを用いて比較されてもよい。例示のこのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，"Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ"，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；およびＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。相同な配列を同定することに加えて、上述のプログラムは、典型的には、相同性の程度の指示を提供する。いくつかの実施形態では、それらの対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上が、残基の関連のあるストレッチにわたって相同であるならば、２つの配列は実質的に相同であるとみなされる。いくつかの実施形態では、関連のあるストレッチは、完全配列である。いくつかの実施形態では、関連のあるストレッチは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００個、またはそれ以上の残基である。
【００６２】
実質的に同一性：句「実質的に同一性」は、アミノ酸または核酸配列間の比較を指すために本明細書で使用される。当業者であれば理解されるように、２つの配列は、それらが対応する位置において同一の残基を含有するならば、一般的に「実質的に同一性」であるとみなされる。当該技術分野において周知であるように、アミノ酸または核酸配列は、ヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮ、およびアミノ酸配列についてはＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ならびにＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどのコンピュータプログラム中で利用可能なものを含む種々のアルゴリズムのいずれかを用いて比較されてもよい。例示のこのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；およびＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。同一の配列を同定することに加えて、上述のプログラムは、典型的には、同一性の程度の指示を提供する。いくつかの実施形態では、それらの対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上が、残基の関連のあるストレッチにわたって同一であるならば、２つの配列は実質的に同一であるとみなされる。いくつかの実施形態では、関連のあるストレッチは、完全配列である。いくつかの実施形態では、関連のあるストレッチは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００個、またはそれ以上の残基である。
【００６３】
患っている：疾患、障害、および／または状態を「患っている」個体は、疾患、障害、および／または状態と診断されているか、または疾患、障害、および／または状態の１つ以上の症状を示す。
【００６４】
罹患しやすい：疾患、障害、および／または状態に「罹患しやすい」個体は、疾患、障害、および／または状態と診断されてはいない。いくつかの実施形態では、疾患、障害、および／または状態に罹患しやすい個体は、疾患、障害、および／または状態の症状を示していなくともよい。いくつかの実施形態では、疾患、障害、状態、または事象（例えば、ＤＭＤ）に罹患しやすい個体は、以下のうちの１つ以上によって特徴付けられてもよい：（１）疾患、障害、および／または状態の発症に関連する遺伝子突然変異、（２）疾患、障害、および／または状態の発症に関連する遺伝子多型、（３）疾患、障害、および／または状態に関連するタンパク質の発現および／または活性の増加および／または減少、（４）疾患、障害、状態および／または事象の発症に関連する習慣および／または生活様式、（５）移植を行ったことがあること、移植を行う予定があること、または移植を必要としていること。いくつかの実施形態では、疾患、障害、および／または状態に罹患しやすい個体は、疾患、障害、および／または状態を発症するであろう。いくつかの実施形態では、疾患、障害、および／または状態に罹患しやすい個体は、疾患、障害、および／または状態を発症しないと考えられる。
【００６５】
標的組織：本明細書で使用される「標的組織」は、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）などの処置されることになる疾患に罹患している任意の組織を指す。いくつかの実施形態では、標的組織は、筋消耗、骨格変形、心筋症、および呼吸機能障害を含めるがこれらに限定されない疾患に関連する病変、症状、または特徴を表すこれらの組織を含む。
【００６６】
治療的有効量：本明細書で使用される、治療薬の用語「治療的有効量」は、疾患、障害、および／もしくは状態を患っている対象または、疾患、障害、および／もしくは状態に罹患しやすい対象に投与されるとき、疾患、障害、および／または状態の症状の発症を治療、診断、予防、および／または遅延するのに十分な量を意味する。治療的有効量は、典型的には、少なくとも１つの単位用量を含む投与レジメンによって投与されることを当業者であれば理解するであろう。
【００６７】
治療：本明細書で使用される用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、または「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、特定の疾患、障害、および／もしくは状態の１つ以上の症状もしくは特徴を部分的にもしくは完全に緩和し、改善し、軽減し、抑制し、予防し、該症状もしくは該特徴の発症を遅延し、該症状もしくは該特徴の重篤度を減少させ、かつ／または該症状もしくは該特徴の発症率を減少させるために用いられる任意の方法を指す。治療は、疾患に関連する病理所見を示すリスクを減少させる目的で、疾患の徴候を示さない対象および／または疾患の初期徴候のみを示す対象に投与されてもよい。
【００６８】
特定の実施形態の詳細な説明
本発明はとりわけ、タンパク質治療薬としてのフォリスタチンに基づいて、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）および／またはベッカー筋ジストロフィーを含む筋ジストロフィーを治療するための方法および組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＤＭＤに関する少なくとも１つの症状または特徴が、強度、重症度、もしくは頻度において減少されるように、または遅延された発症を有するように、有効量の組換えフォリスタチンタンパク質を、ＤＭＤを患っている個体またはＤＭＤに罹患しやすい個体に投与することを含む、ＤＭＤの治療法を提供する。
【００６９】
本発明の種々の態様が、以下のセクションで詳細に記載されている。セクションの用途は、本発明を限定することを意味するものではない。各セクションは、本発明のいかなる態様にも適用することができる。本願では、別途記載がない限り、「または」の使用は、「および／または」を意味する。
【００７０】
デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）
ＤＭＤは、体全体にわたる筋肉の進行性変質および筋肉関連機能の喪失によって特徴付けられる疾患である。本発明は、筋肉を再生し、線維症、炎症ならびにＤＭＤに関連する他の症状もしくは特徴および種々の筋組織における他の筋ジストロフィーを治療するための方法および組成物を提供することが企図される。いくつかの実施形態では、対象の提供された方法および組成物の使用は、その対象の線維症および／または壊死の減少をもたらす。
【００７１】
筋組織
動物では、２つの主要なタイプの筋組織の横紋筋および平滑筋が存在する。本明細書で使用される用語「横紋筋」は、反復するサルコメアを含有する筋組織を指す。横紋筋は、随意制御下にあり、骨格に付着する傾向があるが、心筋などの一部の例外があり、心筋は、横紋筋のいくつかの特性を有するが、随意制御下にはない。一般的に、横紋筋は身体の随意運動を可能にし、四頭筋、ひ腹筋、二頭筋、三頭筋、僧帽筋、三角筋、および他多数を含める主要筋肉群を含む。横紋筋は、非常に長い傾向があり、多くの横紋筋は、独立して機能することができる。しかしながら、一部の横紋筋は、口、肛門、心臓、および食道の上部にあるものを含めて、骨格に付着しない。
【００７２】
一方平滑筋は、非常に異なる構造を有する。別個の骨格付着部分を有する一連の長い筋肉というよりはむしろ、平滑筋は平滑筋細胞間の機械的結合を有する連続シートに編成される傾向にある。平滑筋は、多くの場合、中空器官の壁内に位置し、通常、随意制御下にはない。特定の器官の内側を覆っている平滑筋は、同一の荷重を支持し、同時に収縮せねばならない。平滑筋は、少なくともある程度は、運動および／または位置もしくは圧力の変化によって引き起こされる中空器官上の荷重における変化を処理するよう機能する。この二重の役割は、平滑筋が横紋筋のように収縮することが可能であるべきのみならず、持続する荷重に対して器官の寸法を維持するために、平滑筋が持続して収縮せねばならないことを意味する。平滑筋の例は、血管、膀胱、直腸などの胃腸管の内側を覆っているものである。
【００７３】
筋肉の強度は、筋肉の細胞の数ならびにサイズおよびそれらの解剖学的配置に依存する。既存の筋原線維のサイズの増加（肥大）および／またはより多くの筋細胞の形成（過形成）のいずれかによる筋線維の直径の増加は、筋肉の力発生能力を増加させるであろう。
【００７４】
筋肉は、位置または機能によって分類されてもよい。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、１つ以上の顔の筋肉、１つ以上の咀嚼のための筋肉、１つ以上の舌および頚部の筋肉、１つ以上の胸部の筋肉、１つ以上の胸帯ならびに腕部の筋肉、１つ以上の腕ならびに肩の筋肉、１つ以上の腹側および背側前腕の筋肉、１つ以上の手の筋肉、１つ以上の脊柱起立筋、１つ以上の骨盤帯および脚部の筋肉、ならびに／または１つ以上の前脚および足の筋肉を標的とする。
【００７５】
いくつかの実施形態では、顔の筋肉としては、毛様体筋、瞳孔散大筋、虹彩括約筋などの内眼筋；耳介、側頭頭頂筋、アブミ骨筋、鼓膜張筋などの耳筋；鼻根筋、鼻筋、鼻孔開大筋、鼻中隔下制筋、眼角筋などの鼻筋；口角挙筋、口角下制筋、口輪筋、頬筋、大頬骨筋および小頬骨筋、広頬筋、上唇挙筋、下唇下制筋、笑筋、オトガイ筋、ならびに／または皺眉筋などの口の筋肉が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
いくつかの実施形態では、咀嚼の筋肉としては、咬筋、側頭筋、内側翼突筋、外側翼突筋が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、舌および頚の筋肉としては、オトガイ舌筋、茎突舌筋、口蓋舌筋、舌骨舌筋、顎二腹筋、茎突舌骨筋、顎舌骨筋、オトガイ舌骨筋、肩甲舌骨筋、胸骨舌骨筋、胸骨甲状筋、甲状舌骨筋、胸鎖乳突筋、前斜角筋、中斜角筋、および／または後斜角筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
いくつかの実施形態では、胸部、胸帯および腕部の筋肉としては、鎖骨下筋、大胸筋、小胸筋、腹直筋、外腹斜筋、内腹斜筋、腹横筋、横隔膜、外肋間筋、内肋間筋、前鋸筋、僧帽筋、肩甲挙筋、大菱形筋、小菱形筋、広背筋、三角筋、肩甲下筋、棘上筋、棘下筋、大円筋、小円筋、および／または烏口腕筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
いくつかの実施形態では、腕および肩の筋肉としては、上腕二頭筋長頭、上腕二頭筋短頭、上腕三頭筋長頭、上腕三頭筋外側頭、上腕三頭筋内側頭、肘筋、円回内筋、回外筋、および／または上腕筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
いくつかの実施形態では、腹側および背側前腕筋としては、腕撓骨筋、橈側手根屈筋、尺側手根屈筋、長掌筋、尺側手根伸筋、長橈側手根伸筋、短橈側手根伸筋、指伸筋、小指伸筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
いくつかの実施形態では、手の筋肉としては、母指球筋、短母指外転筋、短母指屈筋、母指対立筋、小指球筋、小指外転筋、短小指屈筋、小指対立筋、掌側骨間筋、背側骨間筋、および／または中様筋などの手の内筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
いくつかの実施形態では、脊柱起立筋としては、頚部筋肉(ｃｅｒｖｉｃａｌｉｓ)、棘筋、最長筋、および／または腸肋筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
いくつかの実施形態では、骨盤帯および脚部の筋肉としては、大腰筋、腸骨筋、大腿方形筋、長内転筋、短内転筋、大内転筋、薄筋、縫工筋、大腿直筋、外側広筋、内側広筋、中間広筋などの大腿四頭筋、ひ腹筋、長腓側（腓骨）筋、ヒラメ筋、大臀筋、中臀筋、小臀筋、膝屈曲筋：大腿二頭筋長頭、膝屈曲筋：大腿二頭筋短頭、膝屈折筋：半腱様筋、膝屈曲筋：半膜様筋、大腿筋膜張筋、恥骨筋、および／または前脛骨筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
いくつかの実施形態では、前脚および足の筋肉としては、長指伸筋、長母指伸筋、短腓骨筋、足底筋、後脛骨筋、長母指屈筋、短指伸筋、短母指伸筋、母指外転筋、短母指屈筋、小指外転筋、短小指屈筋、小指対立筋、短指伸筋、足の中様筋、足底方形筋もしくは副趾屈筋、短指屈筋、背側骨間筋、および／または底側骨間筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
例示的な筋肉標的を表１にまとめる。
【００８５】
（表１）
2019059730.tif 000018
2019059730.tif 000019
2019059730.tif 000020
2019059730.tif 000021
【００８６】
筋ジストロフィー
筋ジストロフィーは、虚弱かつ障害性の運動に至る筋肉の変性を引き起こす一群の遺伝性障害である。全ての筋ジストロフィーの主要な特徴は、これらが本質的に進行性であることである。筋ジストロフィーとしては、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー筋ジストロフィー、エメリー−ドライフス筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー、肢帯筋ジストロフィー、ならびに、筋強直性ジストロフィー１型の先天的な型を含む筋強直性ジストロフィー１型および２型が挙げられるが、これらに限定されない。一部の筋肉または全ての筋肉が罹患している筋ジストロフィーのタイプによって症状は異なり得る。筋ジストロフィーの例示的な症状としては、運動機能の発達の遅延、１つ以上の筋群の使用の困難、嚥下、発語もしくは飲食の困難、よだれ落ち、眼瞼下垂、頻繁な転倒、筋もしくは筋群の成人としての強度の低下、筋サイズの低下、身体の虚弱もしくは変更された生体工学に起因する歩行障害、筋肥大、筋偽肥大、筋肉の脂肪浸潤、非収縮性組織による筋肉の置換え（例えば、筋線維症）、筋壊死、および／または認知機能障害もしくは行動障害／精神障害が挙げられる。
【００８７】
筋ジストロフィーのための既知の治療法はないが、対症療法および疾患修飾法の両方を含むいくつかの支持療法が使用されている。コルチコステロイド、理学療法、装着装具、車椅子、またはＡＤＬならびに肺機能のための他の補助的医療装置が、筋ジストロフィーにおいて通常使用される。筋強直性ジストロフィーでは、不整脈からの突然死を予防するために、心臓ペースメーカーが使用される。筋強直症（弛緩不能）の症状を改善する抗筋強直剤は、メキシリチンを含み、場合によってはフェニトイン、プロカインアミド、およびキニーネを含む。
【００８８】
デュシェンヌ筋ジストロフィー
デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、筋変性および最終的に死をもたらす筋ジストロフィーのＸ連鎖劣性遺伝型である。ＤＭＤは、近位筋力の低下、異常歩行、ひ腹（下腿）筋の偽肥大、およびクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の上昇によって特徴付けられる。多くのＤＭＤ患者は、５歳頃に診断され、この時点で症状／徴候が典型的にはより明白になる。罹患した個体は、典型的には、１０〜１３歳頃に歩行できなくなり、心呼吸障害のために、２０代の半ばから後半にまたはその前に死亡する。
【００８９】
疾患ＤＭＤは、細胞膜のジストログリカン複合体（ＤＧＣ）に構造的安定性を提供する筋組織内の重要な構造成分であるタンパク質ジストロフィンをコードする、ヒトＸ染色体上に位置するジストロフィン遺伝子における、突然変異によって引き起こされる。ジストロフィンは、細胞質内部のアクチンフィラメントネットワークおよび細胞外マトリックスを連結し、筋線維に物理的な強度を提供する。したがって、ジストロフィンの変更または不在は、異常な筋線維膜の引裂きおよび筋線維の壊死をもたらす。男女共に突然変異を保有し得るが、女性が、疾患の重度の徴候を呈することは稀である。
【００９０】
ＤＭＤの主な症状は、典型的には、随意筋が最初に冒されることを伴い、特に股、骨盤領域、大腿、肩の筋肉、下腿筋を冒す、筋消耗に関連する筋力低下である。筋力低下はまた、腕、頸部、および他の領域でも生じる。下腿は多くの場合腫大する。徴候および症状は、通常６歳前に現れ、幼児期という早期に現れる場合もある。他の身体的症状としては、自分自身で歩行するための能力の遅延、歩行、足踏み、または走ることの進行性の困難、ならびに歩行する能力の最終的な喪失（通常、１５歳まで）、頻繁な転倒、易疲労感、運動機能（走ること、ホッピング、ジャンプ）の困難、臀部屈筋の短縮に至る腰椎前弯の増加、筋線維の短縮と線維症とが結合組織で生じることによるアキレス腱の拘縮および膝屈曲筋機能障害、筋線維変形、脂肪および結合組織による筋線維の置換えによって引き起こされる舌筋および下腿筋の偽肥大（腫大）、神経行動障害（例えば、ＡＤＨＤ）、学習障害（失読症）、ならびに特定の認知機能（特に、短期言語性記憶）における非進行性の低下のより高いリスク、骨格変形（場合によっては脊柱側弯症を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
組換えフォリスタチンタンパク質
本明細書で使用される、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、任意の野生型および実質的なフォリスタチンの生物学的活性を保持する修飾フォリスタチンタンパク質（例えば、アミノ酸突然変異、欠失、挿入を有するフォリスタチンタンパク質、および／または融合タンパク質）を含む。典型的には、組換えフォリスタチンタンパク質は、組換え技術を用いて生成される。しかしながら、天然資源から精製されるまたは化学的に合成されるフォリスタチンタンパク質（野生型または修飾型）が、本発明によって使用することができる。典型的には、好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、約１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、２日間、２．５日間、３日間、３．５日間、４日間、４．５日間、５日間、５．５日間、６日間、６．５日間、７日間、７．５日間、８日間、８．５日間、９日間、９．５日間、もしくは１０日間のまたはこれらよりも長いインビボ半減期を有する。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、０．５日〜１０日間、１日〜１０日間、１日〜９日間、１日〜８日間、１日〜７日間、１日〜６日間、１日〜５日間、１日〜４日間、１日〜３日間、２日間〜１０日間、２日間〜９日間、２日間〜８日間、２日間〜７日間、２日間〜６日間、２日間〜５日間、２日間〜４日間、２日間〜３日間、２．５日間〜１０日間、２．５日間〜９日間、２．５日間〜８日間、２．５日間〜７日間、２．５日間〜６日間、２．５日間〜５日間、２．５日間〜４日間、３日間〜１０日間、３日間〜９日間、３日間〜８日間、３日間〜７日間、３日間〜６日間、３日間〜５日間、３日間〜４日間、３．５日間〜１０日間、３．５日間〜９日間、３．５日間〜８日間、３．５日間〜７日間、３．５日間〜６日間、３．５日間〜５日間、３．５日間〜４日間、４日間〜１０日間、４日間〜９日間、４日間〜８日間、４日間〜７日間、４日間〜６日間、４日間〜５日間、４．５日間〜１０日間、４．５日間〜９日間、４．５日間〜８日間、４．５日間〜７日間、４．５日間〜６日間、４．５日間〜５日間、５日間〜１０日間、５日間〜９日間、５日間〜８日間、５日間〜７日間、５日間〜６日間、５．５日間〜１０日間、５．５日間〜９日間、５．５日間〜８日間、５．５日間〜７日間、５．５日間〜６日間、６日間〜１０日間、７日間〜１０日間、８日間〜１０日間、９日間〜１０日間のインビボ半減期を有する。
【００９２】
フォリスタチン（ＦＳ）は、下垂体細胞卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の分泌を抑制することができるタンパク質因子として、濾胞液から最初に単離された。ＦＳは、少なくとも一部分はアクチビンの結合および中性化によって、ＦＳＨ全体にその影響を及ぼす。
【００９３】
Ｃ末端における選択的スプライシングによって生成された、ＦＳに関する少なくとも２つのイソ型：ＦＳ２８８およびＦＳ３１５が存在する。２８８個のアミノ酸のイソ型は、それぞれ約７３〜７５個のアミノ酸の３つの１０システインＦＳドメインを含むタンパク質の主要な部分（残基６４〜２８８）を伴い、アクチビン結合に重要な疎水性残基を含有する６３個のアミノ酸Ｎ末端領域から構成される特徴的な構造を有する。Ｎ末端からＣ末端までのこれらの１０システインドメインは、それぞれドメイン１、ドメイン２、およびドメイン３と呼ばれる。ＦＳ３１５イソ型は、余分なエクソンによってコードされるＣ末端の酸性伸長を通して生成される。ＦＳ２８８は、ヘパリン結合ドメインの存在のために、組織定着の傾向があるが、ＦＳ３１５は、潜在的にヘパリン結合ドメインが伸長したＣ末端によって覆われているために、循環形態の傾向がある。
【００９４】
ＦＳは、インビトロでミオスタチンおよびアクチビンの両方を阻害すること、ならびにこの阻害はマウスではインビボで肥大をもたらし得ることが示されている（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｍａｓｓ  ｂｙ  Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｎｓ，（２０１０），ＭＯＬ．ＥＮＤＯＣＲＩＮＯＬ．，２４（１０）：１９９８−２００８；Ｇｉｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｈ    Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｎ，（２００９），Ｊ．ＰＨＹＳＩＯＬ．ＥＮＤＯＣＲＩＮＯＬ．，２９７（１）：Ｅ１５７−Ｅ１６４）。特定の理論にとらわれることを望むものではないが、この観察された効果は、少なくとも一部分は、ＦＳがミオスタチンおよびアクチビンによるＳｍａｄ２／３経路の活性化を防止することに起因し得る。Ｓｍａｄ２／３経路の活性化は、筋成長の負の調節をもたらすことが示されている（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｈｅａｌｉｎｇ  Ａｆｔｅｒ  Ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ，（２０１１），ＭＵＳＣＵＬＯＳＫＥＬＥＴＡＬ  ＰＡＴＨＯＬＯＧＹ，１７９（２）：９１５−９３０）。
【００９５】
典型的な野生型または天然起源のヒトＦＳ３１５およびＦＳ２８８タンパク質のアミノ酸配列を表２に示す。
【００９６】
（表２）例示的なヒトフォリスタチンイソ型
2019059730.tif 000022
【００９７】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、ヒトＦＳ３１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）である。本明細書に開示されるように、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、ヒトフォリスタチンタンパク質についての正規アミノ酸配列を表している。いくつかの実施形態では、フォリスタチンタンパク質は、ＦＳ２８８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）などのスプライスイソ型であってもよい。いくつかの実施形態では、好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、野生型または天然起源のタンパク質の相同体または類似体であってもよい。例えば、ヒト野生型または天然起源のフォリスタチンタンパク質の相同体または類似体は、実質的なフォリスタチンタンパク質活性を保持しながら、野生型または天然起源のフォリスタチンタンパク質（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と比較した場合に１つ以上のアミノ酸またはドメイン置換、欠失、および／または挿入を含有してもよい。したがって、いくつかの実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、ヒトＦＳ３１５フォリスタチンタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同である。いくつかの実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、ヒトＦＳ３１５フォリスタチンタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一のアミノ酸配列を有する。
【００９８】
ヒトフォリスタチンタンパク質の相同体または類似体は、当業者に既知のポリペプチド配列を変更するための方法、例えばこのような方法を編集している参考文献中に見出されるものに従って調製することができる。当業者であれば理解されるように、２つの配列は、それらが対応する位置において相同な残基を含有するならば、一般的に「実質的に相同」とみなされる。相同の残基は、同一の残基であってもよい。あるいは、相同の残基は、非同一の残基であってもよく、これはほぼ類似した構造および／または機能的特性を有するであろう。例えば、当業者に周知であるように、ある特定のアミノ酸は、典型的には、「疎水性」もしくは「親水性」アミノ酸として、および／または「極性」もしくは「非極性」側鎖を有するものとして分類される。１つのアミノ酸の同一タイプの別のものへの置換は、多くの場合、「相同」置換とみなされてもよい。いくつかの実施形態では、アミノ酸の保存的置換は、次の群内のアミノ酸で行われた置換を含む：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。いくつかの実施形態では、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換が行われるタンパク質の相対的な電荷またはサイズ特性を改変することがないアミノ酸置換を指す。
【００９９】
当該技術分野において周知であるように、アミノ酸配列または核酸配列は、ヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮ、およびアミノ酸配列についてはＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ならびにＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラム中で利用可能なものを含む種々のアルゴリズムのいずれかを用いて比較されてもよい。例示のこのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，"Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ"，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；およびＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。相同の配列を同定することに加えて、上述のプログラムは、典型的には、相同性の程度の指示を提供する。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、野生型ヒトフォリスタチンタンパク質と比較した場合に１つ以上のアミノ酸欠失、挿入、または置換えを含有する。例えば、好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＹ１８５および／またはＬ１９１に対応する位置においてアミノ酸置換を含有してもよい。
【０１０１】
ドメイン欠失変異体
いくつかの実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、野生型ヒトフォリスタチンタンパク質と比較した場合に１つ以上のドメイン欠失、挿入、または置換え（例えば、ドメインスワッピング）を含有する。例えば、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、ドメイン１、２、および／または３に対応するアミノ酸配列の欠失、挿入、および／または置換えを含有してもよい。ある特定の実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、以下に示す、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１アミノ酸残基２１２〜２８８（ドメイン３に対応する）の欠失を含む：
2019059730.tif 000023
。
【０１０２】
好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、実質的なフォリスタチンタンパク質活性を保持しながら、好適なフォリスタチンドメイン欠失変異体（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）と比較した場合に１つ以上のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を含有する好適なドメイン欠失変異体の相同体または類似体であってもよいことが企図される。したがって、いくつかの実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同または同一のアミノ酸配列を有する。
【０１０３】
フォリスタチン融合タンパク質
好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、融合タンパク質形状であり得ることが企図される。例えば、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、フォリスタチンドメインと、例えば、フォリスタチンタンパク質の安定性、効力、および／または送達を向上するかもしくは増加させることによって、または免疫原性、クリアランス、もしくは毒性を減少させるかもしくは排除することによって、フォリスタチンの治療的効果を典型的に促進することができる別のドメインまたは部分との間の融合タンパク質であってもよい。このようなフォリスタチン融合タンパク質に好適なドメインまたは部分としては、Ｆｃドメイン、ＸＴＥＮドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
Ｆｃドメイン
いくつかの実施形態では、好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、ＦｃＲｎ受容体に結合するＦｃドメインまたはその一部分を含有する。非限定的な例として、好適なＦｃドメインは、ＩｇＧなどの免疫グロブリンサブクラス由来であってもよい。いくつかの実施形態では、好適なＦｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４由来である。いくつかの実施形態では、好適なＦｃドメインは、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ由来である。特に好適なＦｃドメインは、ヒトまたはヒト化抗体由来であるものを含む。いくつかの実施形態では、好適なＦｃドメインは、修飾ヒトＦｃ部分などの修飾Ｆｃ部分である。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、好適なＦｃドメインは、以下に示すアミノ酸配列を含む：
2019059730.tif 000024
。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、好適なＦｃドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同または同一のアミノ酸配列を有する。
【０１０７】
ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の改善された結合は、長期の血清半減期をもたらすことが企図される。したがって、いくつかの実施形態では、好適なＦｃドメインは、ＦｃＲｎへの結合の改善に導く１つ以上のアミノ酸突然変異を含む。ＦｃＲｎへの結合の改善をもたらすＦｃドメイン内の種々の突然変異が当該技術分野において既知であり、本発明の実施に適応することができる。いくつかの実施形態では、好適なＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１のＴｈｒ  ２５０、Ｍｅｔ  ２５２、Ｓｅｒ  ２５４、Ｔｈｒ  ２５６、Ｔｈｒ  ３０７、Ｇｌｕ  ３８０、Ｍｅｔ  ４２８、Ｈｉｓ  ４３３、および／またはＡｓｎ  ４３４に対応する１つ以上の位置において１つ以上の変異を含む。
【０１０８】
例えば、好適なＦｃドメインは、Ｈ４３３Ｋ（Ｈｉｓ４３３Ｌｙｓ）および／またはＮ４３４Ｆ（Ａｓｎ４３４Ｐｈｅ）の突然変異を含有してもよい。非限定的な例として、好適なＦｃドメインは、突然変異Ｈ４３３Ｋ（Ｈｉｓ４３３Ｌｙｓ）およびＮ４３４Ｆ（Ａｓｎ４３４Ｐｈｅ）を含有してもよい。突然変異を組み込んでいる例示的なＦｃドメイン配列を、以下に示す：
2019059730.tif 000025
。
【０１０９】
Ｆｃドメイン中に含まれ得る追加のアミノ酸置換としては、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２７７，３７５号、同第８，０１２，４７６号、および同第８，１６３，８８１号に記載されているものを含む。
【０１１０】
リンカーまたはスペーサー
フォリスタチンドメインは、Ｆｃドメインに直接的にまたは間接的に連結してもよい。いくつかの実施形態では、好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、フォリスタチンドメインとＦｃドメインとを結合するリンカーまたはスペーサーを含有する。アミノ酸リンカーまたはスペーサーは、一般的に、２つのタンパク質部分間で柔軟であるように、またはα−へリックスなどの構造を挿置するように設計される。リンカーまたはスペーサーは、比較的短いこともあるか、または長いこともある。典型的には、リンカーまたはスペーサーは、例えば、長さが３〜１００個（例えば、５〜１００、１０〜１００、２０〜１００、３０〜１００、４０〜１００、５０〜１００、６０〜１００、７０〜１００、８０〜１００、９０〜１００、５〜５５、１０〜５０、１０〜４５、１０〜４０、１０〜３５、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０個）のアミノ酸を含有する。いくつかの実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、長さが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００個のアミノ酸と等しいかまたはこれらよりも長い。典型的には、より長いリンカーは、立体障害を減少させることができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシンとセリン残基の混合物を含有するであろう。いくつかの実施形態では、リンカーは、スレオニン、プロリン、および／またはアラニン残基をさらに含んでもよい。したがって、いくつかの実施形態では、リンカーは、１０〜１００個、１０〜９０個、１０〜８０個、１０〜７０個、１０〜６０個、１０〜５０個、１０〜４０個、１０〜３０個、１０〜２０個、１０〜１５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＡＬＥＶＬＦＱＧＰからなるリンカーではない。
【０１１１】
非限定的な例として、本発明に好適なリンカーまたはスペーサーとしては、
2019059730.tif 000026
が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
好適なリンカーまたはスペーサーはまた、上記の例示的なリンカー、例えばＧＡＧリンカー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＧＡＧ２リンカー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、またはＧＡＧ３リンカー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同または同一のアミノ酸配列を有するものも含む。いくつかの実施形態による使用に好適な追加のリンカーは、２０１２年３月２日に出願されその開示が全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第２０１２０２３２０２１号で見ることができる。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、フォリスタチンポリペプチドのその同族のリガンド（例えば、アクチビン、ミオスタチン、ヘパリン等）のいずれかに結合する能力に実質的に影響を及ぼすことなく、フォリスタチンポリペプチドをＦｃドメインに結合させるリンカーが提供される。いくつかの実施形態では、リンカーは、ヘパリンへのフォリスタチンペプチドの結合が、フォリスタチンポリペプチド単独と比較した場合に変更されていないように提供される。例えば、いくつかの実施形態では、フォリスタチンポリペプチドはＦＳ３１５ポリペプチドであり、これは、フォリスタチンポリペプチドがアクチビンと結合しない限り、通常ヘパリンとは結合しない。いくつかのこのような実施形態では、リンカーは、ＦＳ３１５ポリペプチド単独と比較して増加した、ＦＳ３１５ポリペプチドのヘパリン結合をもたらさないように提供される。
【０１１４】
例示的なフォリスタチン融合タンパク質
特定の実施形態では、好適な組換えフォリスタチン融合タンパク質は、フォリスタチンポリペプチド、Ｆｃドメイン、およびフォリスタチンポリペプチドをＦｃドメインと結合させるリンカーを含み、このフォリスタチンポリペプチドは、野生型ヒトＦＳ３１５タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）またはドメイン３欠失ＦＳ３１５タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。典型的には、好適な組換えフォリスタチン融合タンパク質は、アクチビンおよびミオスタチンに結合することができる。いくつかの実施形態では、好適な組換えフォリスタチン融合タンパク質は、約０．５日〜６日間（例えば、約０．５日〜５．５日間、約０．５日〜５日間、約１日〜５日間、約１．５〜５日間、約１．５〜４．５日間、約１．５〜４．０日間、約１．５〜３．５日間、約１．５〜３日間、約１．５〜２．５日間、約２〜６日間、約２〜５．５日間、約２〜５日間、約２〜４．５日間、約２〜４日間、約２〜３．５日間、約２〜３日間）の範囲のインビボ半減期を有する。いくつかの実施形態では、好適な組換えフォリスタチン融合タンパク質は、約２〜１０日間の範囲（例えば、約２．５〜１０日間、約３〜１０日間、約３．５〜１０日間、約４〜１０日間、約４．５〜１０日間、約５〜１０日間、約３〜８日間、約３．５〜８日間、約４〜８日間、約４．５〜８日間、約５〜８日間、約３〜６日間、約３．５〜６日間、約４〜６日間、約４．５〜６日間、約５〜６日間の範囲）のインビボ半減期を有する。
【０１１５】
非限定的な例として、好適なフォリスタチンＦｃ融合タンパク質は、以下に示すアミノ酸配列を有してもよい：
2019059730.tif 000027
。
【０１１６】
他の非限定的な例として、好適なフォリスタチンＦｃ融合タンパク質は、以下に示すアミノ酸配列を有してもよい：
2019059730.tif 000028
。
【０１１７】
さらに他の非限定的な例として、好適なフォリスタチンＦｃ融合タンパク質は、以下に示すアミノ酸配列を有してもよい：
2019059730.tif 000029
。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、好適な組換えフォリスタチンＦｃ融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、９、１０、１１、１６、または１７と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同または同一のアミノ酸配列を有する。
【０１１９】
フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、ホモダイマーまたはモノマー形態を含む種々の形態で提供されてもよいことが企図される。例えば、好適なホモダイマー形態は、両方のＦｃポリペプチド鎖のＮ末端に取り付けた融合パートナー（例えば、フォリスタチンポリペプチドプラスリンカー）のＣ末端を有するように設計されてもよい。好適なモノマー形態は、１つのＦｃダイマーに融合された融合パートナー（例えば、フォリスタチンポリペプチドプラスリンカー）のＣ末端を有するよう設計されてもよい。モノマー形態は、立体障害を減少する場合がある。
【０１２０】
本明細書で使用される、本明細書で同定された基準タンパク質配列（例えば、基準フォリスタチンタンパク質配列）に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列させ、必要であればギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後に、かつ、いずれの保存的置換も配列同一性の一部としては考慮せずに、基準配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のための整列は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当該技術分野における熟練の範囲内の種々の方法で達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大の整列を達成することが必要とされる任意のアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメータを決定することができる。好ましくは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２ソフトウェアが、アミノ酸配列同一性を決定するために使用される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６６，４６０−４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメータを使用し、その大部分は、デフォルト値に設定されている。調整可能なパラメータは、次の値で設定される：重複スパン＝１、重複フラクション＝０．１２５、ワールド閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰスコア（Ｓ）およびＨＳＰ  Ｓ２パラメータは動的値であり、特定の配列の組成に応じて、プログラムそれ自体により確立されているが、最小値は調整されてもよく、上記のように設定される。
【０１２１】
組換えフォリスタチンタンパク質の産生
本発明の好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、任意の利用可能な方法によって産生されることができる。例えば、組換えフォリスタチンタンパク質は、組換えフォリスタチンタンパク質をコードする核酸を発現するよう操作された宿主細胞系を利用することによって組換え的に産生されてもよい。これに代えてまたはさらに、組換えフォリスタチンタンパク質は、内因性遺伝子を活性化することによって産生されてもよい。これに代えてまたはさらに、組換えフォリスタチンタンパク質は、化学合成によって部分的または完全に調製されてもよい。
【０１２２】
タンパク質が組換え的に産生される場合、任意の発現系を使用することができる。少しではあるが例を挙げれば、既知の発現系は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、卵子、バキュロウイルス、植物、酵母、または哺乳動物細胞を含む。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、本発明に好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、哺乳動物細胞中で産生される。本発明により使用され得る哺乳動物細胞の非限定的な例として、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫細胞系（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ番号８５１１０５０３）、ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６，ＣｒｕＣｅｌｌ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ヒト胚腎臓細胞系（懸濁培養物中の増殖用にサブクローン化されたＨＥＫ２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９，１９７７）、ヒト線維肉腫細胞系（例えば、ＨＴ１０８０）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ２１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６，１９８０）、マウスセリトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１，１９８０）、サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８，１９８２）、ＭＲＣ  ５細胞、ＦＳ４細胞、およびヒト肝細胞癌系（Ｈｅｐ  Ｇ２）が挙げられる。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒト細胞から産生される組換えフォリスタチンタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＨＯ細胞またはＨＴ１０８０細胞から産生される組換えフォリスタチンタンパク質を提供する。
【０１２５】
典型的には、組換えフォリスタチンタンパク質を発現するよう操作された細胞は、本明細書に記載される組換えフォリスタチンタンパク質をコードする導入遺伝子を含むことができる。組換えフォリスタチンタンパク質をコードする核酸は、調節配列、遺伝子制御配列、プロモーター、非コード配列、および／または組換えフォリスタチンタンパク質を発現するための他の適切な配列を含有することができることを理解するべきである。典型的には、コード領域は、これらの核酸成分の１つ以上と作動可能に結合している。
【０１２６】
導入遺伝子のコード領域は、特別な細胞型のためのコドン使用を最適化するために、１つ以上のサイレント突然変異を含んでもよい。例えば、フォリスタチン導入遺伝子のコドンは、脊椎動物の細胞中の発現用に最適化されてもよい。いくつかの実施形態では、フォリスタチン導入遺伝子のコドンは、哺乳動物細胞中の発現用に最適化されてもよい。いくつかの実施形態では、フォリスタチン導入遺伝子のコドンは、ヒト細胞中の発現用に最適化されてもよい。
【０１２７】
薬学的組成物および投与
本発明は、本明細書に記載される組換えフォリスタチンタンパク質および生理学的に許容される担体もしくは賦形剤を含有する薬学的組成物をさらに提供する。
【０１２８】
好適な薬学的に許容される担体としては、水、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロースもしくはデンプンなどの炭水化物、マンニトール、スクロース、もしくは他のもの、デキストロースなどの糖類、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香料油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。所望される場合、薬学的調製物は、活性化合物と有害に反応しないまたはそれらの活性を妨げない補助剤（例えば、滑沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩、緩衝液、着色剤、風味剤、および／または芳香剤等）と混合させることができる。好ましい実施形態では、静脈内投与に好適な水溶性担体が使用される。
【０１２９】
好適な薬学的組成物または医薬は、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。組成物は、液体溶液、懸濁液、乳化剤、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤、または粉剤であり得る。組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドなどの担体を有する坐剤として製剤化することもできる。経口製剤は、例えば、薬学的グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的担体を含むことができる。
【０１３０】
薬学的組成物または医薬は、ヒトへの投与に適合した薬学的組成物としてルーチン的な手順に従って製剤化され得る。例えば、いくつかの実施形態では、静脈投与用の組成物は、典型的には、無菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合には、この組成物は、可溶化剤、および注射部位の痛みを和らげるための局所麻酔剤を含むこともできる。一般的に、成分は個別にあるいは一緒に混合された単一用量形態として、例えば活性剤の量を示すアンプルまたは小容器のような気密封入容器内で凍結乾燥粉もしくは無水濃縮物として供給される。この組成物を輸注によって投与する場合には、それを無菌薬学的グレードの水、生理食塩水、またはデキストロース／水を含有する輸注ビンで調剤してもよい。この組成物が注射によって投与される場合には、成分が投与前に混合され得るように、注射用の無菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０１３１】
本明細書に記載される組換えフォリスタチンタンパク質は、中性形態または塩形態として製剤化されてもよい。薬学的に許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等由来であるものなどの遊離アミノ酸で形成されたもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等由来であるものなどの遊離カルボキシル基で形成されたものを含む。
【０１３２】
投与の経路
本明細書に記載される組換えフォリスタチンタンパク質（または本明細書に記載される組換えフォリスタチンタンパク質を含有する組成物もしくは医薬）は、任意の適切な経路によって投与される。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質またはこれを含有する薬学的組成物は、全身投与される。全身投与は、静脈内投与、皮内投与、吸入投与、経皮（局所）投与、眼内投与、筋肉内投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与、および／または経粘膜投与から選択される。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質またはそれを含有する薬学的組成物は、皮下投与される。本明細書で使用される「皮下組織」は、皮膚のすぐ下の疎な不規則的な結合組織の層として定義される。例えば、皮下投与は、限定されるものではないが大腿部、腹部、臀部、または肩甲骨部を含む領域に組成物を注射することによって行うことができる。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質またはそれを含有する薬学的組成物は、静脈内投与される。いくつかの実施形態では組換えフォリスタチンタンパク質またはそれを含有する薬学的組成物は、経口投与される。所望される場合、２つ以上の経路が同時に使用されてもよい。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、投与は、個体において局所的効果のみをもたらすが、一方他の実施形態では、個体の複数の部分にわたる効果、例えば全身的効果をもたらす。典型的には、投与は組換えフォリスタチンタンパク質の１つ以上の標的組織への送達をもたらす。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、心臓、脳、脊髄、横紋筋（例えば、骨格筋）、平滑筋、腎臓、肝臓、肺、および／または脾臓を含むがこれらに限定されない１つ以上の標的組織に送達される。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は心臓に送達される。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、横紋筋、特に骨格筋に送達される。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、三頭筋、前脛骨筋、ヒラメ筋、ひ腹筋、二頭筋、僧帽筋、三角筋、四頭筋、および／または横隔膜に送達される。
【０１３４】
投与形態および投与レジメン
いくつかの実施形態では、組成物は、特定の所望の転帰に関連付けられている（例えば、デュシェンヌ筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィーを治療するまたはそのリスクを減少させることに関連付けられている）治療的有効量で、および／または投与レジメンに従って投与される。
【０１３５】
本発明による投与されることになる特定の用量または量は、例えば、所望される転帰の性状および／もしくは程度に、投与の経路および／もしくはタイミングの特徴に、ならびに／または１つ以上の特性（例えば、体重、年齢、既往歴、遺伝的特徴、生活習慣パラメータ、心欠損の重症度および／もしくは心欠損のリスクのレベル等、またはこれらの組み合わせ）に依存して変化してもよい。このような用量または量は、当業者によって決定されることができる。いくつかの実施形態では、適切な用量または量は、標準的診断技術に従って決定される。これに代えてまたはさらに、いくつかの実施形態では、適切な用量または量は、投与されることになる望ましいまたは最適な用量範囲または量を特定する助けとなるために、１つ以上のインビボまたはインビトロアッセイ法の使用を通して決定される。
【０１３６】
様々な実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、治療的有効量で投与される。一般的に、治療的有効量は、対象に対して有意な利益を達成する（例えば、基礎疾患または状態を治療、調節、治癒、予防、および／または軽減する）のに十分なものである。いくつかの特定の実施形態では、投与されることになる適切な用量または量は、インビトロまたは動物モデル試験システム由来の用量反応曲線から推定されてもよい。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、提供される組成物は、薬学的製剤として提供される。いくつかの実施形態では、薬学的製剤は、デュシェンヌ筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィーの発生率またはリスクの低下の達成に関連付けた投与レジメンに従う投与のための単位用量の量であるかまたは該単位用量の量を含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換えフォリスタチンタンパク質を含む製剤は、単回用量として投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換えフォリスタチンタンパク質を含む製剤は、規則的な間隔で投与される。本明細書で使用される「間隔」での投与は、治療的有効量が定期的に（１回投与とは区別されて）投与されることを示す。間隔は、標準的な診療技術によって決定され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換えフォリスタチンタンパク質を含む製剤は、隔月、毎月、月２回、３週間毎、隔週、毎週、週２回、週３回、毎日、１日２回、または６時間毎に投与される。１つの個体に対する投与間隔は、一定間隔である必要はないが、個体の要求に応じて経時的に適宜変化してもよい。
【０１３９】
本明細書で使用される用語「隔月」は、２ヶ月につき１回（すなわち、２ヶ月毎に１回）を意味し、用語「毎月」は、１ヶ月につき１回の投与を意味し、用語「３週間毎」は、３週につき１回（すなわち、３週間毎に１回）の投与を意味し、用語「週２回」は、２週につき１回（すなわち、２週間毎に１回）投与を意味し、用語「毎週」は、１週につき１回の投与を意味し、用語「毎日」は、１日につき１回の投与を意味する。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換えフォリスタチンタンパク質を含む製剤は、規則的な間隔で無期限に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換えフォリスタチンタンパク質を含む製剤は、規則的な間隔で所定の期間にわたって投与される。
【０１４１】
併用療法
いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、筋ジストロフィーの治療用に現在使用されている１つ以上の既知の治療薬（例えば、コルチコステロイド）と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、既知の治療薬は、その標準的なまたは承認された投与レジメンおよび／またはスケジュールに従って投与される。いくつかの実施形態では、既知の治療薬は、その標準的なまたは承認された投与レジメンおよび／またはスケジュールと比較した場合に変更されているレジメンに従って投与される。いくつかの実施形態では、このような変更されたレジメンは、１つ以上の単位用量が量で変更されている（例えば、減少または増加されている）という点で、および／または投与が頻度で変更されている点で（例えば、単位用量間の１つ以上の間隔が広げられ、結果的により低い頻度をもたらすか、または間隔が狭められ、結果的により高い頻度をもたらすという点で）、標準的なまたは承認された投与レジメンとは異なる。
【実施例】
【０１４２】
実施例１．フォリスタチンはミオスタチンおよびアクチビンを特異的に標的化する
この実施例は、ＤＭＤを治療するためのタンパク質治療薬としてのフォリスタチンの安全性を評価するために、標的および非標的リガンドへのフォリスタチン結合を例示説明する。理論に拘束されることを望むものではないが、ミオスタチンおよびアクチビンによるＳｍａｄ２／３経路の活性化は、筋原性タンパク質発現の阻害をもたらすことが企図される。その結果として、筋芽細胞は筋肉に分化することができない。したがって、ミオスタチンおよびアクチビンは、筋再生のための有望な標的と考えられる。しかしながら、可溶性アクチビン受容体ＩＩＢ型（ｓＡｃｔＲＩＩＢ）などの多くのミオスタチンおよびアクチビン拮抗物質もまた、ある特定の構造的類似性のために、骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ）に結合する。ＢＭＰ、特にＢＭＰ−９およびＢＭＰ−１０は、身体全体にわたって組織構造を構築する中心的形態発生シグナルと考えられている。このようなＢＭＰの阻害は、望ましくない病理学的状態に導く場合がある。以下に詳細に記載されるように、この実施例で記載される実験データは、フォリスタチンが、ミオスタチンおよびアクチビンを高い親和性で特異的に標的化し、非標的ＢＭＰには有意な親和性では結合しないことを裏付けている。したがって、この実施例は、フォリスタチンが、ｓＡｃｔＲＩＩＢなどの他のミオスタチン調節物質と比較して望ましくない的外れの効果が少ない安全なタンパク質治療薬であり得ることを立証している。
【０１４３】
具体的には、市販のフォリスタチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓにより製造されたＦＳ３１５、ならびにＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌにより製造されたフォリスタチン−ＦｃヒトキメラＦＳ３１５−ｈＦｃ）、およびＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｍＦｃ融合タンパク質を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ法を用いてアクチビン、ミオスタチン、ならびにＢＭＰに対する結合親和性および動態を評価した。簡単に言うと、ＦＳ３１５を、ＣＭ５チップに固定し、ヒトまたはマウス抗体捕捉キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質が捕捉された。アミンカップリングの後に、アクチビン、ミオスタチン、またはＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ−２、−４、−６、−７、−９、−１０、およびＧＤＦ−１１）の一連の濃度を、２５℃で可溶性分析物として添加した。ｓＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃを対照として使用した。結合親和性（Ｋｄ）および動態を、標準的な方法を用いて決定した。例示的な結果を表３に示す。
【０１４４】
（表３）例示的な結合親和性および動態データ
2019059730.tif 000030
ＮＭ＝良好でないカーブフィッティングまたは基準チップへの高い結合性のために測定不能
【０１４５】
表３に示すように、フォリスタチン（例えば、ＦＳ３１５またはＦＳ３１５−Ｆｃ）は、標的のミオスタチンおよびアクチビンと高い親和性で結合するが、ＢＭＰ−９および−１０には結合せず（Ｋｄが測定不能であるかまたは１０−７Ｍを超える）、一方ｓＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃは、ミオスタチン、アクチビン、およびＢＭＰに同様な親和性で結合する。驚くべきことにかつ重要なことに、Ｆｃ融合体は、フォリスタチンの主要な標的のミオスタチンへの親和性を少なくとも１０倍まで増加させる。
【０１４６】
加えて、ルシフェラーゼレポーターアッセイ法を用いて、フォリスタチンがミオスタチンおよびアクチビンシグナル伝達（Ｓｍａｄ２／３経路）を特異的に阻害するが、ＢＭＰシグナル伝達（Ｓｍａｄ１／５／８経路）を阻害しないかどうかをさらに決定した。具体的には、ＢＭＰ応答要素（ＢＲＥ）−ルシフェラーゼアッセイ法を用いて、ルシフェラーゼシグナルの減少を測定することによって、フォリスタチンがＳｍａｄ１／５／８経路を阻害することができるかどうかを決定した（Ｋｏｒｃｈｙｎｓｋｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｉｄ１  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ，（２００２），Ｊ  ＢＩＯＬ  ＣＨＥＭ．，２７７（７）：４８８３−４８９１）。ＣＡＧＡ−ルシフェラーゼアッセイ法を用いて、ルシフェラーゼシグナルの減少を測定することによって、フォリスタチンがＳｍａｄ２／３経路を阻害することができるかどうかを決定した（Ｄｅｎｎｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｍａｄ３  ａｎｄ  Ｓｍａｄ４  ｔｏ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ＴＧＦβ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−ｔｙｐｅ  １  ｇｅｎｅ，（１９９８），ＥＭＢＯ  Ｊ，１７（１１）：３０９１−３１００）。簡単に言うと、ＨＥＫ２９３細胞を、ＢＲＥ（ＢＲＥ−Ｉｄｌ−ｌｕｃ）もしくはＣＡＧＡ−ルシフェラーゼ（ｐ（ＣＡＧＡ）１２−ＭＬＰ−ｌｕｃベクター）構築物およびウミシイタケルシフェラーゼ構築物（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｐＧＬ４．７４［ｈＲｌｕｃ／ＴＫ］）のいずれかで一晩同時導入した。翌日に、細胞を、フォリスタチンの一連の濃度の有無で、ミオスタチンならびにアクチビンで（Ｓｍａｄ２／３経路誘導用、ＣＡＧＡ−ルシフェラーゼレポーター）、またはＢＭＰ−９ならびにＢＭＰ−１０で（Ｓｍａｄ１／５／８経路誘導用、ＢＲＥ−ルシフェラーゼレポーター）処置した。一晩のインキュベーションの後に、ウミシイタケ対照に正規化された値で、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ  Ａｓｓａｙキットを使用して、ルシフェラーゼシグナルを決定した。この実験では、天然フォリスタチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびフォリスタチンＦｃ融合タンパク質（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ＦＳ３１５−ｈＦｃ、ＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｍＦｃ）を試験した。ＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｍＦｃを以下に示す。
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【０１４７】
ＢＲＥ−ルシフェラーゼアッセイ法の例示的な結果を図１に示す。ＦＳ３１５−Ｆｃは、Ｓｍａｄ１／５／８経路を通るＢＭＰ−９または−１０シグナル伝達を阻害しない。
【０１４８】
ＣＡＧＡ−ルシフェラーゼアッセイ法の例示的な結果を図２に示す。ＦＳ３１５およびＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｍＦｃの両方共に、Ｓｍａｄ２／３の活性化物質として知られる生理学的に適切なレベルのミオスタチン（１．２ｎＭ）およびアクチビン（０．４ｎＭ）の投与後に観察されたＳｍａｄ２／３誘導の量と比較して、０．１ｎＭ以上の用量においてＳｍａｄ２／３シグナル伝達の強力な阻害を示した。これらの結果は、フォリスタチンが、ミオスタチンおよびアクチビン活性の強力かつ特異的な阻害物質であることを示している。Ｆｃ融合体の存在は、天然ＦＳ３１５分子とＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｍＦｃ融合タンパク質との間の類似の阻害曲線によって示されるように、フォリスタチンの効力に悪影響を及ぼさなかった。予想外かつ重要なことに、本発明によるＦｃ融合タンパク質は、フォリスタチンの主要な標的ミオスタチンへの結合親和性を著しく増加させる（例えば、表３に示すように、少なくとも１０倍）。
【０１４９】
実施例２．フォリスタチン融合タンパク質ＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｍＦｃは延長された血清半減期を有する
本発明者らの発明の以前には、フォリスタチンをタンパク質治療薬として開発する上での懸念材料である、フォリスタチンが短い血清半減期を有することが報告されていた。例えば、典型的な市販のＦＳ３１５タンパク質は、約１時間の血清半減期を有する。この実施例では、ＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｍＦｃ融合タンパク質のインビボ半減期を決定し、これは著しく延長された血清半減期を有する。
【０１５０】
具体的には、刷り込み制御配列（ＩＣＲ）マウスをモデルとして選択し、Ｉ１２５標識ＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｍＦｃを、１．０ｍｇ／ｋｇ（約２μＣｉ／動物）で皮下投与した。投与後に、注射後１０日間まで、血清および組織の試料を採取した。試料採取された組織は、甲状腺、肝臓、腎臓、肺、脾臓、横隔膜、心臓、四頭筋、および三頭筋であった。血清試料の例示的な結果を図３Ａに示す。見られるように、ＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｍＦｃの血清半減期は、約５日間であり、これは、当該技術分野において知られている短いフォリスタチン血清半減期（約１時間）と比較した場合、驚くほど長い。種々の組織に対するＰＫプロファイルの例示的な結果を図３Ｂおよび表４に示す。フォリスタチン−Ｆｃの半減期は、甲状腺を除いて、全組織で２〜５日間であった。さらにまた、延長された組織半減期プロファイルは予想外である。
【０１５１】
延長されたインビボ半減期のデータは、フォリスタチンがＤＭＤの治療のために有効なタンパク質治療薬であり得ることをさらに裏付けている。
【０１５２】
（表４）例示的なＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｍＦｃのインビボＰＫデータ
2019059730.tif 000032
【０１５３】
実施例３．ＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｍＦｃのインビボ有効性
この実施例は、フォリスタチン（例えば、ＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｍＦｃ）のデュシェンヌ筋ジストロフィーのｍｄｘマウスモデルへの投与が、１ｍｇ／ｋｇの低用量でも筋肉量の増加の傾向をもたらすことを立証する。この実施例では、用語「ＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｍＦｃ」、「ＦＳ３１５−Ｆｃ」、および「ＦＳ３１５−ｍＦｃ」が互換的に使用されている。
【０１５４】
具体的には、本試験では、４５匹のｍｄｘマウスを、空ビヒクル、０ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、または８ｍｇ／ｋｇのＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｍＦｃで処置した。ビヒクル群中または処置群中の動物は、試験継続期間中に１週間毎に２回の皮下（肩甲骨間）注射を受け、フォリスタチン融合タンパク質レベルを、後眼窩試料採取を通して評価した。
【０１５５】
ビヒクル処置された対照動物の半数を、１ｍｇ／ｋｇのＦＳ３１５−Ｆｃ群と共に屠殺し、未処置対照動物と一緒にビヒクル処置された残りの動物は、８ｍｇ／ｋｇ処置群と共に屠殺した。例示的な処置スケジュールを表５ＡおよびＢに示す。
【０１５６】
（表５）ｍｄｘマウスにおける例示的な注射および試料採取スケジュール
５Ａ：１ｍｇ／ｋｇのＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｍＦｃ処置過程
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５Ｂ：８ｍｇ／ｋｇのＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｍＦｃ処置過程
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【０１５７】
１ｍｇ／ｋｇのＦＳ３１５−Ｆｃ群に対するビヒクル処置における筋肉重量に関する例示的なデータを図４に示す。具体的には、図４は、１ｍｇ／ｋｇによる処置の４週後ならびに１０週後、および８ｍｇ／ｋｇによる処置の６週後の四頭筋（図４Ａ）、ひ腹筋（図４Ｂ）、前脛骨筋（図４Ｃ）、および三頭筋（図４Ｄ）についてのグラム単位での筋肉重量を示す。筋肉重量データは、ベースラインの体重で調整されている。
【０１５８】
投与後のフォリスタチンの循環レベルの例示的なデータを図５に示す。具体的には、図５Ａは、１ｍｇ／ｋｇの週２回注射で処置された動物の血清中のＦＳ３１５−ｍＦｃのレベルを示し、図５Ｂは、８ｍｇ／ｋｇで週２回処置された動物の血清中のＦＳ３１５−ｍＦｃのレベルを示す。
【０１５９】
図４〜５に示すように、ＦＳ３１５−ＦｃがＤＭＤの動物モデルにおいて筋肉量を増加させることを明確に示唆している。
【０１６０】
実施例４．組換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質のインビボ有効性
この実施例は、フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質の投与が、インビボで筋肥大（例えば、筋肉量および筋線維の直径の増加）をもたらすことを立証する。
【０１６１】
本試験では、Ｃ５７ＢＬ／１０マウスおよびｍｄｘマウスの両方が、ＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｍＦｃをひ腹筋に注射された（筋肉内注射、ＩＭ）。具体的には、各マウスは、週２回、両側に１本ずつ２本の注射を受けた。左側ひ腹筋は、合計で注射当たり２０μｇのタンパク質となるようにＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｍＦｃの１ｍｇ／ｍＬ溶液２０μＬを受けた。右側ひ腹筋は、２０μＬのＰＢＳを受けた（ビヒクル対照）。注射は週２回、合計で４週間行われた。最終の注射から２４時間後に、マウスを屠殺し、ひ腹筋を注意深く切除し、秤量した。可溶性アクチビンＩＩＢ型受容体−Ｆｃマウスキメラ（ｓＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を同一用量で投与した群が、陽性対照として含まれた。加えて、未処置マウスが、陰性対照として含まれた。
【０１６２】
図６は、２０μｇのＦＳ３１５−ｍＦｃまたはｓＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃで週２回処置された後の、Ｃ５７対照マウスおよびｍｄｘマウスの双方における筋肉量の大幅な増加を示している。図６で示された試験設計および数値データを以下の表６に示す。
【０１６３】
（表６）筋肉重量
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＊本実施例で使用されたすべてのフォリスタチン構築物はＧＡＧ３リンカーを含有する。
＊＊Ｐ値は、対応ｔ検定から得て、ボンフェローニ補正を行う（６つの統計的試験について補正する）。
【０１６４】
筋線維の直径を、注射したひ腹筋のディジタル全スライドスキャンを通して決定した。試料を１０％の中性緩衝化生理食塩水中で固定し、加工処理してパラフィンに埋め込み、５μｍ切片に切断し、筋肉の細胞膜を染色する方法であるＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８結合麦芽凝集素（ＷＧＡ）で染色した。走査画像を画像解析ソフトウェア（ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅおよびＩｍａｇｅＰｒｏ  Ｐｌｕｓ）を使用して解析した。各筋線維については、筋線維の重心を通過する筋線維の断面長さを２度の間隔で測定することによって、平均直径を決定した。
【０１６５】
図６によると、図１５は、ＦＳ３１５−ｍＦｃで処置されたひ腹筋の筋線維直径における増加を立証している。この増加は、Ｃ５７（野生型(ＷＴ)、図１５Ａ）およびｍｄｘマウス（図１５Ｂ）の両方で生じた。より大きな直径への移行の立証は、筋肉重量の増加が筋肥大の結果であることを示唆している。表７は、例示的な平均直径変化および対応する統計的分析の概要である。
【０１６６】
（表７）
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【０１６７】
使用された統計的モデルは、各動物において行われた複数の測定を説明することができる階層的線形モデル（ＨＬＭ）であった。各系統および処置群内の未処置と処置脚部との間の差は非常に有意である（ｐ＜０．０００１、これが筋肉重量データを確証する）。
【０１６８】
これらのデータは、フォリスタチン、特にフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質が、筋成長を誘導でき、ＤＭＤに関連する筋委縮を治療できることを立証している。
【０１６９】
実施例５．例示的なフォリスタチン変異体のインビボ有効性
実施例２〜４に示した野生型フォリスタチンＦＳ３１５タンパク質に基づくインビボ半減期および有効性のデータは、フォリスタチンがＤＭＤのための有効なタンパク質療法として使用することができることを立証している。この実施例は、タンパク質治療薬がフォリスタチン変異体に基づいて開発することできることも立証する。
【０１７０】
具体的には、例示的なフォリスタチンドメインの欠失または点突然変異を、以下の表８に記載されるように生成し、変異体と野生型フォリスタチンとの間の比較を容易にするために、十分に確立されたＩＭ／ＡＡＶ送達系を使用して、それらの筋再生効力について試験した。
【０１７１】
本試験では、合計で３５匹の３〜４週齢のＣ５７マウスを全体で７つの群で使用した。５つのフォリスタチン変異体が試験され（表８）、野生型ＦＳ３１５および空ベクターを対照として使用して、７つの群がそれぞれ５匹のマウスから形成された。ＦＳ３１５をコードする遺伝子は、細胞からの分泌の際に切断されるシグナルペプチドを表す追加の２９個のアミノ酸を有する。したがって、ＦＳ３１５およびＦＳ３４４は、同一の野生型構築物を指し、以下の実施例では互換的に使用される。
【０１７２】
（表８）例示的なフォリスタチン変異体の有効性スクリーニング
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【０１７３】
フォリスタチン変異体を、動物1体当たり約１×１０１１のウイルス粒子の用量でＡＡＶ９ベクターを用いて、単回の片側の注射によって、左側四頭筋および左側ひ腹筋に投与した。注射後２、４、および６週間で、次のエンドポイントを試験した：血清中および尿中のフォリスタチンレベル、マウスの体重、個々の筋肉の重量（注射した筋肉および遠位筋群）、ならびに組織学的検査（例えば、線維の数、サイズ、およびタイプ等）。反対側の筋肉は、本試験についての動物内コンパレータとして役立った。
【０１７４】
図７に示すように、野生型ＦＳ３１５およびドメイン３欠失変異体の両方が、空ベクター対照と比較して、体重を有意に増加させた。特に、試験されたドメイン３欠失フォリスタチン変異体は、注射後早くも３週間で体重を増加させた。
【０１７５】
図８は、注射後２週間の同側および反対側の双方の（Ａ）ひ腹筋および（Ｂ）四頭筋の例示的な平均筋肉重量を示している。示した野生型ＦＳ３１５およびドメイン３欠失フォリスタチン変異体の両方は、注射後２週までに同側の筋肉量を有意に増加させた（図８）。特に、ＦＳ３１５およびｄＦＳＤ３で注射した筋肉は、空ベクターと比べて重量で６０％〜７０％大きかった（図８）。ｄＦＳＤ３で注射した、切り取った四頭筋は、２週目で反対側の未処置の筋肉よりも顕著に大きかった（図９）。
【０１７６】
４週目には、ドメイン３が欠失されたフォリスタチンおよび野生型フォリスタチンは、注射された筋肉および遠位の筋肉の両方で筋肉量を増加させた。図１０を参照されたい。２週目で観察されたように、ｄＦＳＤ３は、未処置側と比べて注射された筋肉において著しく大きな筋肉量を伴い、４週目に有意な肥大効果を引き起こした（図１１）。ＥＬＩＳＡにより決定された血清中のフォリスタチンレベルは、野生型およびｄＦＳＤ３処置マウスのものと同様であり、２、４、および６週間で平均して３０ｎｇ／ｍＬであった（データ図示せず）。
【０１７７】
筋線維サイズもまた、標準的な組織学的および免疫組織化学的方法を使用して、注射後２、４、および６週目で注射された筋肉と遠位筋肉の両方で決定した。例示的な２、４、および６週目の結果をそれぞれ図１２、１３、および１４に示す。全ての統計は、グラフパッドプリズムにおいてＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いる一元配置分散分析を使用して行った。誤差棒はＳＥＭを表す。
【０１７８】
図１２に示すように、注射された筋肉では２週目に、筋線維肥大が、ＦＳ３４４（２３％）、ｄＦＳＤ３（３０％）、Ｙ１８５Ａ、およびＬ１９１Ｄ群においては四頭筋で、ならびにＦＳ３４４（１７％）およびｄＦＳＤ３（２５％）群においてはひ腹筋で観察された。遠位筋群では、筋線維肥大は、ｄＦＳＤ２（１２％）群においては前脛骨筋（ＴＡ）で観察された。三頭筋または横隔膜では、肥大は観察されなかった。
【０１７９】
図１３に示すように、注射された筋肉では４週目に、筋線維肥大が、ＦＳ３４４（４１％）、ｄＦＳＤ３（５０％）、ｄＦＳＤ１１３、およびＬ１９１Ｄ群においては四頭筋で、ならびにＦＳ３４４（４２％）、ｄＦＳＤ２、ｄＦＳＤ３（７３％）、ｄＦＳＤ１１３、Ｙ１８５Ａ、およびＬ１９１Ｄ群においてはひ腹筋で観察された。遠位筋群では、筋線維肥大は、ｄＦＳＤ３（１０％）群においては前脛骨筋で、ならびにＦＳ３４４（２３％）およびｄＦＳＤ２（２９％）群においては横隔膜で観察された。三頭筋では、肥大は観察されなかった。
【０１８０】
図１４に示すように、注射された筋肉では６週目に、筋線維肥大が、ＦＳ３４４（４１％）、ｄＦＳＤ３（３０％）、Ｙ１８５Ａ群においては四頭筋で、およびＦＳ３４４（９０％）、ｄＦＳＤ３（４９％）、Ｙ１８５Ａ、Ｌ１９１Ｄ群においてはひ腹筋で観察された。遠位筋群では、筋線維肥大は、ＦＳ３４４（２６％）、ｄＦＳＤ３（４１％）、ｄＦＳＤ１１３、Ｙ１８５Ａ、およびＬ１９１Ｄ群においては前脛骨筋で観察され、ならびにｄＦＳＤ３（３５％）群においては横隔膜で観察された。最小の肥大が三頭筋で観察された。
【０１８１】
まとめると、これらの結果は、タンパク質治療薬がフォリスタチン変異体に基づいて開発され得ることを示している。例えば、フォリスタチンドメインの欠失または点突然変異は、筋再生有効性を保持または向上させることができる。上記のように、ドメイン３の欠失は、ＤＭＤを治療するために特に有用なフォリスタチン変異体であり得る。
【０１８２】
実施例６．ＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｍＦｃの全身的有効性
実施例４に示したように、ＦＳ３１５−ｍＦｃのひ腹筋への注射は、対照筋肉に対比して筋肉量の増加をもたらした。この実施例は、ＦＳ３１５−ｍＦｃの全身的注射もまた、注射の部位から遠位の種々の部位において筋成長を誘導することができることを示す。この実施例で使用された全てのフォリスタチン構築物は、ＧＡＧ３リンカーを含有する。
【０１８３】
動物の数の半分が、ＰＢＳの皮下（肩甲骨間）注射を１週間に２回、８週にわたって受け（対照）、他の半分の数の動物が、１０ｍｇ／ｋｇのＦＳ３１５−ｍＦｃの皮下（肩甲骨間）注射を１週間に２回、８週間にわたって受けて、合計で２０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスを本試験で使用した。最後の注射後２４時間で動物を屠殺し、左側ならびに右側の四頭筋、ひ腹筋、前脛骨筋、および三頭筋の重量を測定し、同時に動物の全体重も測定した。以下の表９は、この実施例についての実験計画をまとめている。
【０１８４】
（表９）実験計画
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【０１８５】
図１６は、試験の８週間の過程を通しての例示的な体重データを示す。見ることができるように、ＦＳ３１５−ｍＦｃ処置動物についての体重は、ビヒクル処置対照動物よりも有意に大きく、これは２週目から始まり、８週間の試験全体を通して継続した。図１７は、例示的な筋肉重量データを表す。ＦＳ３１５−ｍＦｃで処置されたマウスからの三頭筋は、早くも４週目にビヒクル対照と比べて重量が有意に大きかった。８週間の処置後に、三頭筋および四頭筋群の両方は、ビヒクルと比べて重量の有意な増加を示した（図１７）。筋線維サイズを、実施例４に記載される方法によって決定した。図１８は、４週目および８週目の三頭筋および四頭筋群についての筋線維直径におけるパーセント増加を示している。両方の筋群は、４週目および８週目の双方で、ＦＳ３１５−ｍＦｃによる処置後により大きな筋線維サイズに向かう移行を立証した。
【０１８６】
加えて、血清フォリスタチンレベルが、皮下注射後に増加した。例えば、処置された（週２回の皮下注射によって）マウスの血清中のＦＳ３１５−ｍＦｃレベルを図１９に示す。ＦＳ３１５−ｍＦｃレベルは、ＦＳ３１５−ｍＦｃ注射から血清採集までの時間（２４時間）に一致する４週目および８週目の屠殺時点で採集された血清において最も高かった。これらの時点では、ＦＳ３１５−ｐｍＦｃの血清レベルは、約２００ｎｇ／ｍＬの平均値となった。ＦＳ３１５−ｍＦｃ注射後３日目に、隔週で後眼窩出血を採集し、ＦＳ３１５−ｍＦｃの血清レベルは、約３０〜５０ｎｇ／ｍＬの平均値となった。
【０１８７】
これらのデータは、ＦＳ３１５−ｍＦｃの全身的注射（例えば、皮下注射）が体全体にわたる種々の筋肉において筋成長を効果的に誘導できることを立証している。
【０１８８】
実施例７．ＤＭＤマウスモデルにおけるフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質の全身的有効性
この実施例は、ＤＭＤ疾患モデルにおける全身的有効性を更に立証する。特に、以下に示すように、ＦＳ３１５−ｍＦｃの全身的注射は、筋壊死および／または線維症などの種々の特徴的なＤＭＤ症状の進行を効果的に低下させた。この実施例で使用される全てのフォリスタチン構築物は、ＧＡＧ３リンカーを含有する。
【０１８９】
ｍｄｘマウスモデルは、ＤＭＤのための候補療法の概念立証を裏付けるための前臨床モデルとして広範囲に使用されている。ｍｄｘマウスの下肢筋群および横隔膜の両方が、年齢とともに増加する傾向がある広汎性病変を示している。このような病変は、筋肉中の炎症性浸潤、壊死、および線維症の領域によって特徴付けられる。ＦＳ３１５−ｍＦｃが、筋肉中の線維症の進行に及ぼすその効果を評価するために、このモデルにおいて試験された。週２回、１２週間にわたって、２０匹の動物がＰＢＳの皮下注射を受け、３０匹の動物が１０ｍｇ／ｋｇのＦＳ３１５−ｍＦｃの皮下注射を受けて、合計で５０匹のｍｄｘマウスをこの実施例で使用した（表１０参照）。最後の注射後２４時間で動物を屠殺し、壊死および線維症の分析用に組織を採集した（表１１を参照）。
【０１９０】
（表１０）実験計画
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【０１９１】
（表１１）組織採集および加工処理
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【０１９２】
図２０は、ＲＮＡレベルにおける線維性タンパク質発現に及ぼすＦＳ３１５−ｍＦｃの例示的な効果を示している。具体的には、コラーゲンＩ型、α−平滑筋アクチン、およびコラーゲン三重へリックスリピート含有１タンパク質のＲＴ−ＰＣＲは、週２回の皮下処置後に早くも６週間で、これらの線維症関連タンパク質の発現において有意な減少を立証した。
【０１９３】
表１２および１３は、筋肉組織切片における壊死の組織病理学的評価（ＨＥ染色切片の評価によって決定される）および線維症の組織病理学的評価（ＦＳ３１５−ｍＦｃ処置ｍｄｘマウスの筋肉中のＩ型コラーゲン染色筋肉切片の評価によって決定される）を要約する。ＦＳ３１５−ｍＦｃおよびビヒクル処置群については、それぞれ群当たり１５匹および１０匹の総数の動物がいた。表１２に示すように、ＦＳ３１５−ｍＦｃ処置は、下肢筋肉中の壊死の発生率を週２回の注射の開始から早くも６週間で有意に減少させた。この壊死の減少は、四頭筋および三頭筋を通るＨＥ切片の画像で図示されている（図２１）。筋肉組織切片のＩ型コラーゲン染色によって裏付けられる線維症の発生率は、ＦＳ３１５−ｍＦｃ処置の１２週間後に有意に減少した（表１３も参照）。このコラーゲン沈着における減少は、Ｉ型コラーゲン染色筋肉切片の画像で図示されている（図２２）。
【０１９４】
本試験の結果は、ＦＳ３１５−ｍＦｃが、限定されるものではないが、筋壊死および／または線維症を含むＤＭＤマウスモデルにおける異常のある筋肉病変の進行を効果的に減少させることによってＤＭＤを有効に治療できることを立証している。
【０１９５】
（表１２）ＦＳ３１５−ｍＦｃ処置ｍｄｘマウス筋肉中の壊死の発生率（ｐ値は、フィッシャー直接確率法を用いてビヒクルとＦＳ３１５−ｍＦｃとの間の有意性の程度を示す）
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調べた筋総面積において、最小：＜５％；中程度：＜３０％；顕著：＞３０％
【０１９６】
（表１３）線維症の発生率（ｐ値は、フィッシャー直接確率法を用いてビヒクルとＦＳ３１５−ｍＦｃとの間の有意性の程度を示す）
2019059730.tif 000042
調べられた筋総面積おいて、最小：約１％；中程度：＜５％；顕著：＞５％
【０１９７】
実施例８．組換えフォリスタチンドメイン３欠失Ｆｃ融合タンパク質のインビボ有効性
この実施例は、フォリスタチンドメイン３欠失（ｄＦＳＤ３）Ｆｃ融合タンパク質が、野生型フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質と同様にインビボの筋成長を効果的に誘導したことを立証する。この実施例で使用される全てのフォリスタチン構築物は、ＧＡＧ３リンカーを含有する。
【０１９８】
具体的には、実施例５に記載されるドメイン３が欠失された構築物を、ＦＳ３１５−ｍＦｃに使用されたものと同一のｍＦｃに融合させた。加えて、同一のＧＡＧ３リンカー配列を、ｄＦＳＤ３をｍＦｃに融合させるために使用した。実施例４に記載される通りに、Ｃ５７ＢＬ／１０マウスは、ひ腹筋に直接、両方の融合タンパク質を注射された。２０μｇの融合タンパク質の週２回の４週間にわたる注射後にマウスを屠殺し、反対側のひ腹筋は同一容量のＰＢＳを受けた。最終の注射後２４時間で、処置マウスを屠殺し、注射されたひ腹筋を注意深く注射し、秤量した。図２３に示したように、ｄＦＳＤ３−ＧＡＧ３−ｍＦｃ融合タンパク質は、ビヒクル対照を超える筋肉量における有意な増加に導き、この増加は、ＦＳ３１５−ｍＦｃで観察されたものと同様であった。この実施例は、フォリスタチンドメイン３欠失Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ｄＦＳＤ３−ＧＡＧ３−ｍＦｃ）が、インビボで活性であり、ＤＭＤ治療のための別の有望な治療薬候補物質であることを示している。
【０１９９】
実施例９．フォリスタチン機能に及ぼすより長いリンカーの利点
この実施例は、より長いリンカー、特に少なくとも１０個のアミノ酸を含有するリンカーが、フォリスタチン機能に予期せぬ地点を提供することを立証する。具体的には、この実施例は、５７個のアミノ酸のリンカーを含有するＦＳ３１５−ＧＡＧ３−Ｆｃ融合タンパク質（ネズミおよび／またはヒトＦｃ）が、９個のアミノ酸のリンカーＡＬＥＶＬＦＱＧＰを含有する、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．カタログ番号１０６８５−Ｈ０２Ｈ）から得た市販のＦＳ３１５−ｈＦｃ融合タンパク質と比べて、ミオスタチンおよびアクチビンを阻害するその能力においてより強力であることを示している。シグナル伝達アッセイ法に使用されたミオスタチンおよびアクチビンの濃度は、１．２ｎＭであった。図２４および表１４に示すように、ＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｍＦｃおよびＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｈＦｃ融合タンパク質は、ＣＡＧＡ−ルシフェラーゼアッセイ法においてミオスタチンおよびアクチビンシグナル伝達を天然ＦＳ３１５と同程度まで阻害する。これと比較して、市販のＦＳ３１５−ｈＦｃ融合タンパク質（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）は、非常に強力さが劣っている。計算されたＩＣ５０値は以下の通りである。
【０２００】
（表１４）Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達についてのＣＡＧＡ−ルシフェラーゼレポーターアッセイ法におけるミオスタチンおよびアクチビンのフォリスタチン阻害に関する例示的なＩＣ５０値
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【０２０１】
特定の理論にとらわれることを望むものではないが、ＦＳ３１５タンパク質とＦｃ領域との間のより長いリンカー（例えば、この特定の構築物ＦＳ３１５−ＧＡＧ３−Ｆｃ中の５７個のアミノ酸のリンカー）は、非常に短いリンカー（例えば、９個のアミノ酸）を有する融合タンパク質と比べて、ＦＳ３１５のより天然に近い構造を可能にすることができ、標的リガンドへの結合およびシグナル伝達の阻害を天然のＦＳ３１５で観察されたものと同程度まで可能にする。これと比較して、市販のＦＳ３１５−ｈＦｃタンパク質は、ＦｃとＦＳ３１５タンパク質との間のはるかに少ない分離を伴う、９個のアミノ酸の非常に短いリンカーを有し、ＦＳ３１５構造および生理学的活性に及ぼす有害な影響を潜在的に引き起こす。
【０２０２】
実施例１０．フォリスタチン融合タンパク質ＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｈＦｃは延長された血清半減期を有する
この実施例では、提供されたフォリスタチン融合タンパク質、特により長いリンカーを有するもの（例えば、少なくとも１０個のアミノ酸を有するリンカー）が、延長された血清半減期を有することを立証した。具体的には、まず初めに、ＧＡＧ３リンカーを有するヒトＦｃに融合されたＦＳ３１５（ＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｈＦｃ）が、スプラーグドーリーラットに１０ｍｇ／ｋｇの単回用量で皮下投与されるとき、延長された血清半減期を有することをここで立証した。投与後に、１５分間〜５日間の範囲の時点で血清を採集した。血清試料中でヒトＦＳ３１５を捕捉し、無傷の融合タンパク質のヒトＦｃドメインを検出するＭｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイ法を使用して、ＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｈＦｃをラットの血清中で測定した。ラット血清中のＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｈＦｃのレベルを図２５に示す。ＰＫパラメータを表１５にまとめる。
【０２０３】
（表１５）ＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｈＦｃインビボＰＫデータ
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【０２０４】
要約して言えば、上記実施例は、提供された変異体を含めるフォリスタチンが、例えば、全身的投与によって、ＤＭＤ疾患モデルで筋肥大の誘導ならびに筋壊死および線維症の減衰において高度に有効であることを立証している。したがって、フォリスタチンおよび提供された変異体は、ＤＭＤの治療のために有効な治療薬であり得る。
【０２０５】
等価物および範囲
当業者であれば、ルーチンの実験法以上のものを用いなくとも、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態には多くの均等物があることを認識するか、または確認できると考えられる。本発明の範囲は、上記の説明に限定されるよう意図されておらず、むしろ以下の特許請求の範囲に記載されているものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2019059730.tif 000075
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
2019059730000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月28日(2018.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に明細書本文に記載し且つ図面に示した通りの、組換えフォリスタチンタンパク質を含む薬学的組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチンタンパク質は、リンカーを介してＦｃドメインに融合される。いくつかの実施形態では、リンカーは３〜１００個のアミノ酸を含むペプチドである。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＡＬＥＶＬＦＱＧＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）からなるリンカーではない。いくつかの実施形態では、リンカーは、１０〜１００個、１０〜９０個、１０〜８０個、１０〜７０個、１０〜６０個、１０〜５０個、１０〜４０個、１０〜３０個、１０〜２０個、１０〜１５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、
2019059730.tif 000085
（ＧＡＧリンカー、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、
2019059730.tif 000086
（ＧＡＧ２リンカー、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、
2019059730.tif 000087
（ＧＡＧ３リンカー、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と同一の配列を含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明は、フォリスタチンポリペプチド、Ｆｃドメイン、およびフォリスタチンポリペプチドをＦｃドメインに結合する、少なくとも１０個（例えば、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５個）のアミノ酸の長さを有するリンカーを含む、組換えフォリスタチン融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、フォリスタチンポリペプチド、Ｆｃドメイン、およびフォリスタチンポリペプチドをＦｃドメインに結合するリンカーを含む、組換えフォリスタチン融合タンパク質を提供し、このリンカーは、ＡＬＥＶＬＦＱＧＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）からなるリンカーではない。いくつかの実施形態では、好適なフォリスタチンポリペプチドは、野生型ヒトフォリスタチンタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えフォリスタチン融合タンパク質は、アクチビン、ミオスタチン、および／またはＧＤＦ−１１に結合することができ、かつ約０．５日〜１０日間のインビボ半減期を有する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
[本発明1001]
デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を治療する方法であって、
ＤＭＤに関する少なくとも1つの症状または特徴が、強度、重症度、もしくは頻度において減少されるように、または遅延された発症を有するように、ＤＭＤを患っている個体またはＤＭＤに罹患しやすい個体に有効量の組換えフォリスタチンタンパク質を投与すること
を含む、方法。
[本発明1002]
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、野生型ヒトフォリスタチンタンパク質
2019059730.tif 000088
と少なくとも70％同一のアミノ酸配列を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、前記野生型ヒトフォリスタチンタンパク質  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1と少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1004]
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、前記野生型ヒトフォリスタチンタンパク質  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1と少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、前記野生型ヒトフォリスタチンタンパク質  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、前記野生型ヒトフォリスタチンタンパク質  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1と同一のアミノ酸配列を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、前記野生型ヒトフォリスタチンタンパク質と比較した場合に1つ以上の欠失、突然変異、または挿入を含む、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1のアミノ酸残基212〜288の欠失を含む、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、
2019059730.tif 000089
と少なくとも70％同一のアミノ酸配列を含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：2と少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：2と少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む、本発明1009の方法。
[本発明1012]
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：2と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む、本発明1009の方法。
[本発明1013]
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：2と同一のアミノ酸配列を含む、本発明1009の方法。
[本発明1014]
前記組換えフォリスタチンタンパク質がＦｃドメインに融合されている、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記Ｆｃドメインが、
2019059730.tif 000090
と少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む、本発明1015の方法。
[本発明1016]
前記Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ1のＴｈｒ  250、Ｍｅｔ  252、Ｓｅｒ  254、Ｔｈｒ  256、Ｔｈｒ  307、Ｇｌｕ  380、Ｍｅｔ  428、Ｈｉｓ  433、および／またはＡｓｎ  434に対応する1つ以上の位置において1つ以上の変異を含む、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、リンカーを介して前記Ｆｃドメインに融合されている、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記リンカーが、3〜100個のアミノ酸を含むペプチドである、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記リンカーが、
2019059730.tif 000091
（ＧＡＧリンカー、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：5）と少なくとも80％同一の配列を含む、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記リンカーが、
2019059730.tif 000092
（ＧＡＧ2リンカー、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：6）と少なくとも80％同一の配列を含む、本発明1018の方法。
[本発明1021]
前記リンカーが、
2019059730.tif 000093
（ＧＡＧ3リンカー、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：7）と少なくとも80％同一の配列を含む、本発明1018の方法。
[本発明1022]
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：8
2019059730.tif 000094
と少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：10
2019059730.tif 000095
と少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記組換えフォリスタチンタンパク質が哺乳動物細胞から生成される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記哺乳動物細胞がＨＴ1080細胞である、本発明1024の方法。
[本発明1027]
前記組換えフォリスタチンタンパク質が全身投与される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1028]
前記全身投与が、静脈内投与、皮内投与、吸入投与、経皮（局所）投与、眼内投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与、および／または経粘膜投与から選択される、本発明1027の方法。
[本発明1029]
前記全身投与が静脈内投与である、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記全身投与が皮下投与である、本発明1028の方法。
[本発明1031]
前記全身投与が経口投与である、本発明1001〜1026のいずれかの方法。
[本発明1032]
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、隔月、毎月、3週間毎、隔週、毎週、毎日、または不定間隔で投与される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、表1から選択される1つ以上の骨格筋に送達される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1034]
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、横隔膜、三頭筋、ヒラメ筋、前脛骨筋、ひ腹筋、長指伸筋、腹直筋、および／または四頭筋から選択される1つ以上の標的組織に送達される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1035]
前記組換えフォリスタチンタンパク質が心臓に送達される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1036]
前記組換えフォリスタチンタンパク質が、1つ以上の標的組織に送達され、該標的組織が、心臓、ならびに、横隔膜、三頭筋、ヒラメ筋、前脛骨筋、ひ腹筋、長指伸筋、腹直筋、および／または四頭筋を含む骨格筋から選択される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1037]
前記組換えフォリスタチンタンパク質の前記投与が、筋再生、筋強度の増加、柔軟性の増加、運動範囲の増加、体力の向上、易疲労感の減少、血流の増加、認知力の改善、肺機能の改善、炎症抑制、筋線維症の減少、および／または、筋壊死の減少をもたらす、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1038]
前記組換えフォリスタチンタンパク質の前記投与が、筋線維症および／または壊死の減少をもたらす、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1039]
前記ＤＭＤに関する少なくとも1つの症状または特徴が、筋消耗、筋衰弱、筋脆弱、筋壊死、筋線維症、関節拘縮、骨格変形、心筋症、嚥下障害、腸および膀胱の機能障害、筋虚血、認知機能障害、行動機能障害、社会化機能障害、脊柱側弯症、ならびに呼吸機能障害からなる群から選択される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1040]
フォリスタチンポリペプチドと、
Ｆｃドメインと、
該フォリスタチンポリペプチドを該Ｆｃドメインに結合させるリンカーと
を含む組換えフォリスタチン融合タンパク質であって、
該フォリスタチンポリペプチドが、野生型ヒトフォリスタチンタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1）と少なくとも70％同一のアミノ酸配列を含み、さらに該組換えフォリスタチン融合タンパク質が、アクチビン、ミオスタチン、および／またはＧＤＦ−11に結合することができ、かつ、約0．5日〜10日間の範囲のインビボ半減期を有する、組換えフォリスタチン融合タンパク質。
[本発明1041]
前記フォリスタチンポリペプチドが、前記野生型ヒトフォリスタチンタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1）と少なくとも80％同一のアミノ酸配列を有する、本発明1040の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
[本発明1042]
前記フォリスタチンポリペプチドが、前記野生型ヒトフォリスタチンタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1）と少なくとも90％同一のアミノ酸配列を有する、本発明1040の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
[本発明1043]
前記フォリスタチンポリペプチドが、前記野生型ヒトフォリスタチンタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1）と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を有する、本発明1040の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
[本発明1044]
前記フォリスタチンポリペプチドが、前記野生型ヒトフォリスタチンタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1）と同一のアミノ酸配列を有する、本発明1040の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
[本発明1045]
前記フォリスタチンポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1のアミノ酸残基212〜288の欠失を含む、本発明1040の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
[本発明1046]
フォリスタチンポリペプチドと、
Ｆｃドメインと、
該フォリスタチンポリペプチドを該Ｆｃドメインに結合させるリンカーと
を含む組換えフォリスタチン融合タンパク質であって、
該フォリスタチンポリペプチドが、
2019059730.tif 000096
と少なくとも70％同一のアミノ酸配列を含み、
さらに、該組換えフォリスタチン融合タンパク質が、アクチビン、ミオスタチン、および／またはＧＤＦ−11に結合することができ、かつ約0．5日〜10日間の範囲のインビボ半減期を有する、組換えフォリスタチン融合タンパク質。
[本発明1047]
前記ＦｃドメインがＩｇＧ1  Ｆｃドメインである、本発明1040〜1046のいずれかの組換えフォリスタチン融合タンパク質。
[本発明1048]
前記Ｆｃドメインが、
2019059730.tif 000097
と少なくとも80％同一のアミノ酸配列を有する、本発明1040〜1046のいずれかの組換えフォリスタチン融合タンパク質。
[本発明1049]
前記Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ1のＴｈｒ  250、Ｍｅｔ  252、Ｓｅｒ  254、Ｔｈｒ  256、Ｔｈｒ  307、Ｇｌｕ  380、Ｍｅｔ  428、Ｈｉｓ  433、および／またはＡｓｎ  434に対応する1つ以上の位置において1つ以上の変異を含む、本発明1048の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
[本発明1050]
前記リンカーが、3〜60個のアミノ酸を含むペプチドである、本発明1040〜1049のいずれかの組換えフォリスタチン融合タンパク質。
[本発明1051]
前記リンカーが、
2019059730.tif 000098
（ＧＡＧリンカー；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：5）と少なくとも80％同一の配列を含む、本発明1050の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
[本発明1052]
前記リンカーが、
2019059730.tif 000099
（ＧＡＧ2リンカー；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：6）と少なくとも80％同一の配列を含む、本発明1050の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
[本発明1053]
前記リンカーが、
2019059730.tif 000100
（ＧＡＧ3リンカー；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：7）と少なくとも80％同一の配列を含む、本発明1050の組換えフォリスタチン融合タンパク質。
[本発明1054]
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：8
2019059730.tif 000101
と少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む、本発明1040〜1053のいずれかの組換えフォリスタチン融合タンパク質。
[本発明1055]
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：10
2019059730.tif 000102
と少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む、本発明1040〜1053のいずれかの組換えフォリスタチン融合タンパク質。
[本発明1056]
本発明1040〜1050のいずれかの組換えフォリスタチン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
[本発明1057]
本発明1056の核酸を含む、細胞。
[本発明1058]
本発明1040〜1055のいずれかの組換えフォリスタチン融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下に続く詳細な説明において明らかである。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施形態を示してはいるが、例示として提供されているにすぎず、限定するものではない。本発明の範囲内に入る種々の変更および修正は、詳細な説明から当業者には明らかになるであろう。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
リンカーまたはスペーサー
フォリスタチンドメインは、Ｆｃドメインに直接的にまたは間接的に連結してもよい。いくつかの実施形態では、好適な組換えフォリスタチンタンパク質は、フォリスタチンドメインとＦｃドメインとを結合するリンカーまたはスペーサーを含有する。アミノ酸リンカーまたはスペーサーは、一般的に、２つのタンパク質部分間で柔軟であるように、またはα−へリックスなどの構造を挿置するように設計される。リンカーまたはスペーサーは、比較的短いこともあるか、または長いこともある。典型的には、リンカーまたはスペーサーは、例えば、長さが３〜１００個（例えば、５〜１００、１０〜１００、２０〜１００、３０〜１００、４０〜１００、５０〜１００、６０〜１００、７０〜１００、８０〜１００、９０〜１００、５〜５５、１０〜５０、１０〜４５、１０〜４０、１０〜３５、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０個）のアミノ酸を含有する。いくつかの実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、長さが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００個のアミノ酸と等しいかまたはこれらよりも長い。典型的には、より長いリンカーは、立体障害を減少させることができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシンとセリン残基の混合物を含有するであろう。いくつかの実施形態では、リンカーは、スレオニン、プロリン、および／またはアラニン残基をさらに含んでもよい。したがって、いくつかの実施形態では、リンカーは、１０〜１００個、１０〜９０個、１０〜８０個、１０〜７０個、１０〜６０個、１０〜５０個、１０〜４０個、１０〜３０個、１０〜２０個、１０〜１５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＡＬＥＶＬＦＱＧＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）からなるリンカーではない。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
非限定的な例として、好適なフォリスタチンＦｃ融合タンパク質は、以下に示すアミノ酸配列を有してもよい：
2019059730.tif 000103
。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
他の非限定的な例として、好適なフォリスタチンＦｃ融合タンパク質は、以下に示すアミノ酸配列を有してもよい：
2019059730.tif 000104
。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９９】
実施例９．フォリスタチン機能に及ぼすより長いリンカーの利点
この実施例は、より長いリンカー、特に少なくとも１０個のアミノ酸を含有するリンカーが、フォリスタチン機能に予期せぬ地点を提供することを立証する。具体的には、この実施例は、５７個のアミノ酸のリンカーを含有するＦＳ３１５−ＧＡＧ３−Ｆｃ融合タンパク質（ネズミおよび／またはヒトＦｃ）が、９個のアミノ酸のリンカーＡＬＥＶＬＦＱＧＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）を含有する、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．カタログ番号１０６８５−Ｈ０２Ｈ）から得た市販のＦＳ３１５−ｈＦｃ融合タンパク質と比べて、ミオスタチンおよびアクチビンを阻害するその能力においてより強力であることを示している。シグナル伝達アッセイ法に使用されたミオスタチンおよびアクチビンの濃度は、１．２ｎＭであった。図２４および表１４に示すように、ＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｍＦｃおよびＦＳ３１５−ＧＡＧ３−ｈＦｃ融合タンパク質は、ＣＡＧＡ−ルシフェラーゼアッセイ法においてミオスタチンおよびアクチビンシグナル伝達を天然ＦＳ３１５と同程度まで阻害する。これと比較して、市販のＦＳ３１５−ｈＦｃ融合タンパク質（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）は、非常に強力さが劣っている。計算されたＩＣ５０値は以下の通りである。