(57)【要約】【課題】レジオネラ属菌による汚染度を迅速かつ簡便に評価する。【解決手段】液体試料におけるレジオネラ属菌による汚染度の評価方法であって、レジオネラ属菌に特異的な核酸を指標として、前記液体試料に含まれるレジオネラ属菌を検出する第一工程と、レジオネラ属菌の宿主となり得る原生動物に特異的な核酸を指標として、前記液体試料に含まれる原生動物を検出する第二工程と、前記第一工程におけるレジオネラ属菌の検出結果と、前記第二工程における原生動物の検出結果に基づいて、前記液体試料におけるレジオネラ属菌による汚染度を評価する第三工程と、を包含する、レジオネラ属菌による汚染度の評価方法が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料におけるレジオネラ属菌による汚染度の評価方法であって、
レジオネラ属菌に特異的な核酸を指標として、前記液体試料に含まれるレジオネラ属菌を検出する第一工程と、
レジオネラ属菌の宿主となり得る原生動物に特異的な核酸を指標として、前記液体試料に含まれる原生動物を検出する第二工程と、
前記第一工程におけるレジオネラ属菌の検出結果と、前記第二工程における原生動物の検出結果に基づいて、前記液体試料におけるレジオネラ属菌による汚染度を評価する第三工程と、
を包含する、レジオネラ属菌による汚染度の評価方法。
【請求項２】
前記第一工程において、パルサー法、ＬＡＭＰ法、又はＰＣＲ法によって前記レジオネラ属菌を検出する、請求項１に記載のレジオネラ属菌による汚染度の評価方法。
【請求項３】
前記第二工程において、パルサー法、ＬＡＭＰ法、又はＰＣＲ法によって前記原生動物を検出する、請求項１又は２に記載のレジオネラ属菌による汚染度の評価方法。
【請求項４】
前記原生動物が、Vermamoeba属及びVannella属からなる群より選ばれた少なくとも１つである、請求項１〜３のいずれかに記載のレジオネラ属菌による汚染度の評価方法。
【請求項５】
前記レジオネラ属菌が、Legionella pneumophila、Legionella oakridgensis、Legionella drozanskii、Legionella maceachernii、Legionella oakridgensis、及びLegionella londiniensisからなる群より選ばれた少なくとも１つである、請求項１〜４のいずれかに記載のレジオネラ属菌による汚染度の評価方法。
【請求項６】
前記液体試料が、空調冷却塔水又は循環式浴槽水から採取されたものである、請求項１〜５のいずれかに記載のレジオネラ属菌による汚染度の評価方法。
【請求項７】
前記第一工程においてレジオネラ属菌の検出結果が陰性であり、かつ前記第二工程において原生動物の検出結果が陰性である場合に、前記液体試料におけるレジオネラ属菌による汚染を陰性と評価する、請求項１〜６のいずれかに記載のレジオネラ属菌による汚染度の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体試料におけるレジオネラ属菌による汚染度の評価方法に関する。本発明は、レジオネラ属菌による汚染度を迅速かつ簡便に評価できるものである。
【背景技術】
【０００２】
レジオネラ（Legionella）属菌（レジオネラ菌）は好気性グラム陰性桿菌であり、自然界では土壌や湖沼河川などに広く生息している。また人工環境では、空調冷却塔や循環ろ過式浴槽などの水利用設備で検出されることがある。レジオネラ属菌は、主に高齢者、臓器移植患者、糖尿病患者、など易感染宿主が罹患する日和見感染症の原因と考えられ、院内感染もしばしば起こし、暴露量が多いと健常者も肺炎になることが知られている。
【０００３】
レジオネラ属菌の検査方法として一般に採用されているのは、培養法である。そして、人工環境水中のレジオネラ属菌の基準に関しては、浴槽水等では１０ＣＦＵ／１００ｍＬ未満（公衆浴場における水質基準等に関する指針（厚生労働省））、冷却塔水では１００ＣＦＵ／１００ｍＬ未満（レジオネラ症防止指針）、との基準が示されている。しかし、検査についての公定法は示されておらず、いくつかの参考とされるマニュアル的なものは存在しているが、未だ標準化されていない。
【０００４】
培養法以外のレジオネラ属菌の検出法としては、ＰＣＲ法、パルサー法等の核酸を指標とした方法（例えば、特許文献１、非特許文献１）が知られており、検出用の試薬キットも市販されている。その他、レジオネラ属菌に特異的な抗体を用いた方法も知られている（例えば、特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−０６１４８２号公報
【特許文献２】特開２０１７−１３３９５１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】森中りえか、原口浩幸、布藤聡、「比色系パルサー法による温泉のレジオネラの検出について」、日本温泉科学会大会講演要旨集、第６６巻、第９０頁、２０１３年８月２６日発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
レジオネラ属菌の検査法（培養法）として行政が推奨している「レジオネラ症防止指針（第３版）」では、フィルターの選択等の詳細な記述がなく、手技が複雑で、技量の差が検査結果のばらつきとなる。例えば、厚労科研（Ｈ２５−健危−一般−００９）の「レジオネラ属菌検査法の安定化に向けた取り組み」において、地方衛生研究所６８機関に対して同一の試料を提供し、レジオネラ属菌検査の外部精度管理を行った結果が報告されている。これによると、「３０００ＣＦＵ／１００ｍＬ」とされる試料の検査結果が、機関によって０−４８００ＣＦＵ／１００ｍＬの範囲でばらつく結果となり、これは、培養法の精度管理の難しさを表している。
【０００８】
またレジオネラ属菌は特殊な培地でしか生育できず、また生育速度が非常に遅い。そのため、培養法によるレジオネラ属菌の検査では、検査結果が出るまで通常は一週間以上かかり、迅速性と簡便性に劣るという問題も有している。
【０００９】
そこで本発明は、従来の培養法に代わる、あるいは培養法を補完する、レジオネラ属菌による汚染度を簡便かつ迅速に評価する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、レジオネラ属菌がアメーバ等の原生動物に寄生して増殖することに着目した。そして、人工環境下で採取した水試料を用い、レジオネラ属菌と原生動物を対象としたメタゲノム解析を実施した。その結果、レジオネラ属菌の検出に加えて、レジオネラ属菌の宿主となり得る原生動物の検出を行うことによって、水試料におけるレジオネラ属菌による汚染度を迅速かつ簡便に評価できるとの結論に至り、本発明を完成した。
【００１１】
本発明の１つの様相は、液体試料におけるレジオネラ属菌による汚染度の評価方法であって、レジオネラ属菌に特異的な核酸を指標として、前記液体試料に含まれるレジオネラ属菌を検出する第一工程と、レジオネラ属菌の宿主となり得る原生動物に特異的な核酸を指標として、前記液体試料に含まれる原生動物を検出する第二工程と、前記第一工程におけるレジオネラ属菌の検出結果と、前記第二工程における原生動物の検出結果に基づいて、前記液体試料におけるレジオネラ属菌による汚染度を評価する第三工程と、を包含する、レジオネラ属菌による汚染度の評価方法である。
【００１２】
好ましくは、前記第一工程において、パルサー法、ＬＡＭＰ法、又はＰＣＲ法によって前記レジオネラ属菌を検出する。
【００１３】
好ましくは、前記第二工程において、パルサー法、ＬＡＭＰ法、又はＰＣＲ法によって前記原生動物を検出する。
【００１４】
好ましくは、前記原生動物が、Vermamoeba属及びVannella属からなる群より選ばれた少なくとも１つである。
【００１５】
好ましくは、前記レジオネラ属菌が、Legionella pneumophila、Legionella oakridgensis、Legionella drozanskii、Legionella maceachernii、Legionella oakridgensis、及びLegionella londiniensisからなる群より選ばれた少なくとも１つである。
【００１６】
好ましくは、前記液体試料が、空調冷却塔水又は循環式浴槽水から採取されたものである。
【００１７】
好ましくは、前記第一工程においてレジオネラ属菌の検出結果が陰性であり、かつ前記第二工程において原生動物の検出結果が陰性である場合に、前記液体試料におけるレジオネラ属菌による汚染を陰性と評価する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、液体試料におけるレジオネラ属菌による汚染度を迅速かつ簡便に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例で行ったレジオネラ属菌の遺伝子解析結果を表す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明のレジオネラ属菌による汚染度の評価方法は、少なくとも、下記の第一工程、第二工程、及び第三工程を包含する。
【００２１】
第一工程は、液体試料に含まれるレジオネラ属菌を検出する工程である。そして検出方法として、レジオネラ属菌に特異的な核酸を指標とする方法を用いる。本検出方法には培養法は含まれない。
核酸を指標とする方法としては特に限定はなく、例えば、パルサー（ＰＡＬＳＡＲ; Probe alternation link self‐assembly reaction）法、ＬＡＭＰ（Loop-mediated Isothermal Amplification）法、ＰＣＲ（Polymerase chain reaction）法、等の公知の方法を採用することができる。特に好ましくは、パルサー法が採用される。
指標とする核酸は、ＤＮＡとＲＮＡのいずれでもよい。なお、ＲＮＡ（例えば１６Ｓ ｒＲＮＡ）を指標とすることにより、レジオネラ属菌の死菌の影響を低減することができる。
【００２２】
レジオネラ属菌の検出は、定性的に行ってもよいし、定量的に行ってもよい。定量的に行う場合には、例えば、予め設定した基準値との比較によりレジオネラ属菌の有無を判断することができる。例えば、検出値が基準値以下であればレジオネラ陰性、基準値を超える場合にはレジオネラ陽性、と判断することができる。
【００２３】
検出対象とするレジオネラ属菌の例としては、Legionella pneumophila、Legionella oakridgensis、Legionella drozanskii、Legionella maceachernii、Legionella oakridgensis、及びLegionella londiniensisからなる群より選ばれた少なくとも１つが挙げられる。
【００２４】
L. pneumophila等のレジオネラ属菌に特異的な核酸配列の情報は、公知のデータベースから取得できる。これらの情報を基にして、レジオネラ属菌に特異的な核酸配列の一部に相補的に結合し得るオリゴヌクレオチドを設計し、L. pneumophila等のレジオネラ属菌検出用のプライマーやプローブとして用いることができる。
【００２５】
例えば、ＬＥＧ（genus Legionella 16S rRNA gene）とＬｍｉｐ（L. pneumophila macrophage infectivity potentiator gene）の有無をＰＣＲ法で調べ、両遺伝子を持つものをL. pneumophilaと、ＬＥＧだけ持つものをLegionella sp.と推定することができる。ＬＥＧ特異的プライマー対として、ＬＥＧ ４４８Ａ（配列番号１）とＬＥＧ ８５４Ｂ（配列番号２）が挙げられる（山本啓之ら，日本臨床，５０ 特別号: ３９４−３９９，１９９２）。Ｌｍｉｐ特異的プライマー対として、Ｌｍｉｐ Ｌ９２０（配列番号３）とＬｉｍｐ Ｒ１５４８（配列番号４）が挙げられる（Mahbubani MH et al., Molecular and Cellular Probes, 4: 175-187, 1990）。
【００２６】
第二工程は、レジオネラ属菌の宿主となり得る原生動物を特異的に検出する工程である。そして検出方法として、前記原生動物に特異的な核酸を指標とする方法を用いる。本検出方法には培養法は含まれない。
核酸を指標とする方法としては特に限定はなく、例えば、上記したパルサー法、ＬＡＭＰ法、ＰＣＲ法、等の公知の方法を採用することができる。特に好ましくは、パルサー法が採用される。
指標とする核酸は、ＤＮＡとＲＮＡのいずれでもよい。なお、ＲＮＡ（例えば１８Ｓ ｒＲＮＡ）を指標とすることにより、死んだ原生動物の影響を低減することができる。
【００２７】
原生動物の検出は、定性的に行ってもよいし、定量的に行ってもよい。定量的に行う場合には、例えば、予め設定した基準値との比較により原生動物の有無を判断することができる。例えば、検出値が基準値以下であれば原生動物陰性、基準値を超える場合には原生動物陽性、と判断することができる。
【００２８】
前記原生動物は、レジオネラの宿主となり得るものであれば特に限定はない。例えば、Vermamoeba属やVannella属に属する原生動物を検出対象とすることができる。
【００２９】
Vermamoeba属やVannella属等の原生動物に特異的な核酸配列の情報は、公知のデータベースから取得できる。これらの情報を基にして、標的となる原生動物に特異的な核酸配列の一部に相補的に結合し得るオリゴヌクレオチドを設計し、原生動物検出用のプライマーやプローブとして用いることができる。なお、分類不明の原生動物であっても、その核酸配列が分かれば、検出用のプライマーやプローブを設計することができる。
【００３０】
Vermamoeba属に特異的なＰＣＲ用プライマー対として、ＨＶ１２２７Ｆ（配列番号５）とＨＶ１７２８Ｒ（配列番号６）が挙げられる（Kuiper MW et al., Appl Environ Microb. 2006;72(9):5750_6）。Vannella属に特異的なＰＣＲ用プライマー対として、Ｇ−ＦＯＲ（配列番号７）とＧ−ＲＥＶ（配列番号８）が挙げられる（Dykova I et al., Eur J Protistol, Volume 41, Issue 3, 18 August 2005, Pages 219-230）。
【００３１】
本発明においては、第一工程と第二工程の実施順序は問わない。すなわち、第一工程の次に第二工程を行ってもよく、第二工程の次に第一工程を行ってもよい。第一工程と第二工程を同時並行で行ってもよい。
【００３２】
第三工程では、第一工程におけるレジオネラ属菌の検出結果と、第二工程における原生動物の検出結果に基づいて、液体試料におけるレジオネラ属菌による汚染度を評価する。例えば、第一工程でレジオネラ陽性、第二工程で原生動物陽性の場合は、液体試料はレジオネラ属菌に汚染されている（汚染度＋＋）と評価することができる。
例えば、第一工程でレジオネラ陽性、第二工程で原生動物陰性の場合は、液体試料はレジオネラ属菌に汚染されている（汚染度＋）と評価することができる。
例えば、第一工程でレジオネラ陰性、第二工程で原生動物陽性の場合は、液体試料はレジオネラ属菌に汚染されている疑いがある（汚染度±）と評価することができる。
例えば、第一工程でレジオネラ陰性、第二工程で原生動物陰性の場合は、液体試料はレジオネラ属菌に汚染されていない（汚染度−、陰性）と評価することができる。この場合には、通常行われる培養法によるレジオネラ検査を省略できる可能性がある。
【００３３】
本発明で用いる液体試料としては、空調冷却塔水や循環式浴槽水から採取したものが挙げられる。その他、噴水、水泳用プール、ジャグジー、シャワー、給湯設備、加湿器内や空気清浄機内の水、等が挙げられる。
【００３４】
本発明の方法によるレジオネラ属菌による汚染度の評価手順の一例を挙げる。
まず、検査対象となる空調冷却塔水や循環式浴槽水等から水検体（液体試料）を採取する。
次に、第一工程として、レジオネラ属菌の核酸に特異的なプライマーやプローブを作製する。例えば、L. pneumophilaに特異的なプライマーやプローブを作製する。上述のように、L. pneumophilaの核酸配列情報は公知であり、この情報からプライマーやプローブを設計する。これらのプライマーやプローブを用いてパルサー法、ＬＡＭＰ法、ＰＣＲ法等を行い、水検体中におけるレジオネラ属菌の有無を判定する。なお、市販のレジオネラ検出用キットを用いてもよい。
【００３５】
同様に、第二工程として、レジオネラ属菌の宿主となり得る原生動物の核酸に特異的なプライマーやプローブを作製する。例えば、Vermamoeba属やVannella属に分類される原生動物の核酸に特異的なプライマーやプローブを作製する。上述のように、Vermamoeba属やVannella属の核酸配列情報は公知であり、この情報からプライマーやプローブを設計する。これらのプライマーやプローブを用いてパルサー法、ＬＡＭＰ法、ＰＣＲ法等を行い、水検体中における所望の原生動物の有無を判定する。
【００３６】
第三工程として、第一工程と第二工程の結果を基にして、水検体の汚染度を評価する。例えば、第一工程と第二工程の結果がいずれも陰性である場合に、水検体のレジオネラ属菌による汚染が陰性と評価する。
【００３７】
上述したように、本発明は、培養法によるレジオネラ検査の要否判断にも応用することができる。例えば、本発明の方法によってレジオネラ属菌による汚染が陰性と評価された場合には、培養法によるレジオネラ検査を省略するという判断が可能となる。これにより、培養法を行うべき試料を絞り込むことができ、時間とコストを削減することが可能となる。
【００３８】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
（１）水検体の採取
複数の循環式浴槽施設から水検体（液体試料）を採取した。計８種の検体を取得した（検体番号９〜１６）。
【００４０】
（２）メタゲノム解析
各検体から混合ゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲにて１６Ｓ ｒＲＮＡ領域（細菌解析用）と１８Ｓ ｒＲＮＡ領域（原生動物解析用）を増幅した。１６Ｓ ｒＲＮＡ領域増幅用プライマーとして５１５Ｆ（配列番号９）と８０６Ｒ（配列番号１０）を用いた。１８Ｓ ｒＲＮＡ領域増幅用プライマーとして１３８９Ｆ（配列番号１１）と１５１０Ｒ（配列番号１２）を用いた。次世代シーケンス解析装置（ＭｉＳｅｑTM）を用いて、既知のｒＲＮＡ配列データベースを参照して検索を行い、水検体中の細菌および原生動物の存在を解析した。
【００４１】
（３）培養法によるレジオネラ検査
各検体について、別途、培養法によるレジオネラ検査を行った。試料１００ｍＬあたりの生育コロニー数（ＣＦＵ／１００ｍＬ）を測定した。
【００４２】
（４）結果
検体番号９〜１６の集計した遺伝子解析結果を図１に示す。すなわち、検体中には種々の微生物のＤＮＡが検出され、レジオネラ属菌のＤＮＡも検出された。レジオネラ属菌のＤＮＡをさらに解析すると、種不明のレジオネラ属菌（Legionella sp.）を除いて、L. pneumophilaのＤＮＡが高頻度に検出された。またLegionella sp.については、Legionella sp. LHG-1BW4のＤＮＡが高頻度に検出された。
【００４３】
各検体について、１６Ｓ ｒＲＮＡ解析によりヒットしたレジオネラ属菌を表１に示す。表１に示すように、各検体においてL. pneumophilaのＤＮＡが高頻度に検出された。さらに、L. oakridgensis、L. drozanskii、L. maceachernii、L. oakridgensis、L. londiniensisのＤＮＡも検出された。
【００４４】
各検体について、１８Ｓ ｒＲＮＡ解析によりヒットした原生動物を表２に示す。表２に示すように、各検体においてVermamoeba属とVannella属のＤＮＡが高頻度に検出された。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
【表２】
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【図１】
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【配列表】
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