(57)【要約】      （修正有）【課題】がんを有する患者を治療するためのＭＤＭ２阻害剤を含む医薬の提供。【解決手段】患者由来の試料においてＭＤＭ２、ＸＰＣ、ＢＢＣ３及びＣＤＫＮ２ＡのｍＲＮＡ発現レベルを測定すること、及びＭＤＭ２阻害剤に対する患者の応答を予測するためのバイオマーカーとして四遺伝子シグネチャースコアを計算するために、そのｍＲＮＡ発現レベルを使用することを含み、ｉ）同じがんを有する患者由来の一つ又は一組の標準値と比較して；又はｉｉ）治療開始前に同じ患者から採取された一つ又は複数の試料と比較して治療開始後に採取された；又はｉｉｉ）正常な細胞又は組織由来の一つ又は一組の標準値と比較して；患者由来の試料の高い四遺伝子シグネチャースコアは、ＭＤＭ２阻害剤による治療に対して感受性であることが予測される方法により、ＭＤＭ２阻害剤による治療に対して感受性であることが予測されたか又は応答性が示された患者に投与される医薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療法に対するがん患者の応答性を予測する方法であって、ＢＡＸ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＥＤＡ２Ｒ、ＸＰＣ、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＴＲＩＡＰ１、ＢＢＣ３、ＣＣＮＧ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、又はＣＤＫＮ２Ａからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子のレベルを検出すること、及びそのレベルを、ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用の阻害剤である化合物に対する患者の応答を予測するためのバイオマーカーとして使用することを含む方法。
【請求項２】
バイオマーカーとしてＭＤＭ２遺伝子を使用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
応答が患者のがん治療法に対する応答であり、バイオマーカーが患者から採取された一つ又は複数の試料中においてインビトロで測定される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ａ）患者から試料を採取すること；
ｂ）試料中の、請求項１に記載の前記少なくとも一つの遺伝子のレベルを測定すること；
ｃ）患者由来のレベルを、同じがんを有する患者由来の標準値と比較すること；及び
ｄ）ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用の阻害剤として作用する化合物を投与すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
化合物が、式
2019059737.tif 000046
の４−｛［２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−４−（４−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−３−（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−シアノ−５−（２，２−ジメチル−プロピル）−ピロリジン−２−カルボニル］−アミノ｝−３−メトキシ−安息香酸である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
化合物が、式：
2019059737.tif 000047
の４−｛［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−（４−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−シアノ−５−（２，２−ジメチル−プロピル）−ピロリジン−２−カルボニル］−アミノ｝−３−メトキシ−安息香酸  １−ｍＰＥＧ−カルボニルオキシ−エチル  エステル（ｍＰＥＧ、平均ＭＷ、〜２０００）である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
化合物が、
2019059737.tif 000048
（Ａ）
である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも一つの遺伝子のレベルがｍＲＮＡ発現量である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＭＤＭ２を含む四遺伝子シグネチャーが、ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用の阻害剤として作用する化合物を用いた治療に対するがん患者の応答を予測するためのバイオマーカーとして使用される、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記四遺伝子シグネチャーが、ＭＤＭ２、ＸＰＣ、ＢＢＣ３及びＣＤＫＮ２Ａからなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
四遺伝子シグネチャーが、ＭＤＭ２、ＸＰＣ、ＢＢＣ３を含む三つの遺伝子の上方制御と、ＣＤＫＮ２Ａの下方制御とからなることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
がんが、乳がん、前立腺がん、子宮頸がん、卵巣がん、胃がん、結腸直腸がん、膵臓がん、肝臓がん、脳腫瘍、神経内分泌がん、肺がん、腎臓がん、血液悪性腫瘍、メラノーマ及び肉腫からなる群より選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１３】
がんが急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
治療に先立って採取された患者由来の試料中のＭＤＭ２のレベルが、一つ又は一組の標準値と比較して高い場合に、ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用の阻害剤として作用する化合物に対して感受性であることが予測される、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
ｉ）同じがんを有する患者由来の一つ又は一組の標準値と比較して；又は
ｉｉ）治療開始前に同じ患者から採取された一つ又は一組の試料と比較して治療開始後に採取された；又は
ｉｉｉ）正常な細胞又は組織由来の一つ又は一組の標準値と比較して；
一つ又は複数の試料中のより高いＭＤＭ２レベルから
ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用の阻害剤として作用する化合物を用いた治療に対して感受性であることが予測される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用の阻害剤として作用する化合物を用いた治療に対するがん患者の応答を予測するための方法であって：
ａ）患者から前もって取得された試料中の、ＢＡＸ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＥＤＡ２Ｒ、ＸＰＣ、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＴＲＩＡＰ１、ＢＢＣ３、ＣＣＮＧ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、又はＣＤＫＮ２Ａからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子のレベルを測定し、このレベルを表す一つ又は複数の値を取得する工程；及び
ｂ）工程ａ）の一つ又は複数の値を、一つ又は一組の標準値と比較する工程
を含む方法。
【請求項１７】
患者由来の試料中におけるＭＤＭ２のレベルを測定してこのレベルを表す一つ又は複数の値を取得すること、及びＭＤＭ２−ｐ５３相互作用の阻害剤として作用する化合物を用いて患者を治療することを含む、このような治療を必要とする患者においてがんを治療する方法。
【請求項１８】
患者由来の試料中の、ＭＤＭ２、ＸＰＣ、ＢＢＣ３及びＣＤＫＮ２Ａのレベルを測定してこれらレベルを表す一つ又は複数の値を取得すること、及びＭＤＭ２−ｐ５３相互作用の阻害剤として作用する化合物を用いて患者を治療することを更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ａ）治療に先立って患者から取得された試料中の、ＭＤＭ２、ＸＰＣ、ＢＢＣ３及びＣＤＫＮ２ＡのｍＲＮＡ発現量を測定すること；
ｂ）ａ）で取得された発現量を用いて、患者のシグネチャースコアとして表される値を計算すること；
ｃ）ｂ）から得られた前記患者のシグネチャースコアを、基準レベルと比較すること；及び
ｄ）患者のシグネチャースコアが前記基準レベルを上回るとき、前記患者を、前記ＭＤＭ２阻害剤を含む治療法に応答する可能性が高いと同定すること
を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用の阻害剤として作用する前記化合物が、請求項５に記載の化合物４−｛［２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−４−（４−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−３−（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−シアノ−５−（２，２−ジメチル−プロピル）−ピロリジン−２−カルボニル］−アミノ｝−３−メトキシ−安息香酸である、請求項１７、１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用の阻害剤として作用する前記化合物が、請求項６に記載の化合物４−｛［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−（４−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−シアノ−５−（２，２−ジメチル−プロピル）−ピロリジン−２−カルボニル］−アミノ｝−３−メトキシ−安息香酸  １−ｍＰＥＧ−カルボニルオキシ−エチル  エステル（ｍＰＥＧ、平均ＭＷ、〜２０００）である、請求項１７、１８又は１９に記載の方法。
【請求項２２】
ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用の阻害剤として作用する前記化合物が、請求項７に記載の化合物（Ａ）である、請求項１７、１８又は１９に記載の方法。
【請求項２３】
がんに罹患した患者における、ＭＤＭ２阻害剤を含む治療法の有効性をモニタリングするためのインビトロ法であって、
ａ）治療に先立って患者から取得された試料中の、ＭＤＭ２、ＸＰＣ、ＢＢＣ３及びＣＤＫＮ２ＡのｍＲＮＡ発現量を測定すること；
ｂ）ａ）で取得された発現量を用いて、治療に先立つ患者のシグネチャースコアとして表される値を計算すること；
ｃ）工程ａ）及びｂ）を、前記ＭＤＭ２阻害剤を用いた治療の開始後に繰り返すこと；及び
ｄ）治療の開始後に取得されたシグネチャースコアを、治療に先立って取得された同スコアと比較すること
を含み、治療後の方がシグネチャースコアが高い場合に、治療に対する患者の応答性が示され、したがって治療の継続が推奨される、方法。
【請求項２４】
ＭＤＭ２阻害剤が、請求項５、６又は７に記載の方法に使用される化合物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用の阻害剤として作用する化合物を用いた治療に対する応答を予測するためのキットであって；
ａ）試料中の、ＢＡＸ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＥＤＡ２Ｒ、ＸＰＣ、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＴＲＩＡＰ１、ＢＢＣ３、ＣＣＮＧ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、又はＣＤＫＮ２Ａからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子のレベルを測定するための試薬；及び
ｂ）コンパレーターモジュール
を備えるキット。
【請求項２６】
前記少なくとも一つの遺伝子のレベルがｍＲＮＡ発現量である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
ＭＤＭ２阻害剤が、請求項５、６又は７に記載の方法に使用される化合物である、請求項２５又は２６に記載のキット。
【請求項２８】
実質的に本明細書に記載される新規の手順、方法、及び使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ＴＰ５３遺伝子は、がんの発達の間の保護に重要な役割を果たす腫瘍抑制タンパク質をコードする。Ｐ５３は、Ｐ５３が細胞周期を制御し、したがってがんの予防に関与する腫瘍抑制因子として働く多細胞生物体において極めて重要である。更に、Ｐ５３は、アポトーシス、ＤＮＡ修復及び老化といった細胞周期のコントロールに関与する複数の遺伝子を制御する転写因子である。
【０００２】
非ストレス条件下では、ｐ５３タンパク質のレベルは、ＭＤＭ２の転写がｐ５３によって駆動される負のフィードバックループを介して、ＭＤＭ２（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｍｉｎｕｔｅ  ２）により制御される。ＭＤＭ２タンパク質はＴＰ５３タンパク質に結合し、そのトランス活性化ドメインをブロックする。ＭＤＭ２は、ユビキチン依存性分解のためのｐ５３をマーキングするｐ５３ユビキチンリガーゼとして機能することもできる。
【０００３】
ＭＤＭ２を過剰発現する細胞では、Ｐ５３は活性化されておらず、そのため増殖停止及びアポトーシスが効率よく行われない。Ｐ５３−ＭＤＭ２相互作用の遮断は、Ｐ５３機能を回復させる可能性があり、がん治療の新規アプローチとなりうるものである。ＭＤＭ２アンタゴニストによる腫瘍細胞の治療は、遺伝子転写の活性化、並びに細胞周期の停止及びアポトーシスの誘導を含め、ｐ５３に、その下流の機能を媒介させるはずである。
【０００４】
ＴＰ５３変異は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）では稀であり、通常はこれら悪性腫瘍の発生において最も重要であるとは考えられない。しかしながら、ＭＤＭ２がＡＭＬに頻繁に過剰発現されることが判明しており、ＭＤＭ２は、ｐ５３機能の抑止により腫瘍形成能及びアポトーシスへの抵抗性を増強することができる。野生型ｐ５３を含むＡＭＬ細胞株及び１６の一次ＡＭＬ試料が、ｐ５３依存性アポトーシスの誘発により、ＭＤＭ２アンタゴニスト（阻害剤）に応答することが判明している。これら発見は、ＡＭＬの治療戦略としてｐ５３−ＭＤＭ２相互作用を標的とすることの論理的根拠を支持するものである。
【０００５】
提案される薬物の作用機序に基づき、機能性ｐ５３タンパク質及び関連する経路エフェクター分子の存在は、このクラスの薬物が有効となるために必要である。すべての患者が機能性ｐ５３タンパク質及び関連する経路エフェクター分子を有するわけではない。患者が治療の恩恵を受けることができるかどうか更によく決定するために、治療に最も応答性の高い患者を同定するための予測分子テストを発見する必要がある。ＭＤＭ２アンタゴニストに対する応答能を評価するための一つの手法は、ＴＰ５３遺伝子が変異するかどうかを評価することである。しかしながら、これは、がんにおいて多数の変異がＴＰ５３に見られるという事実により複雑になっている。これら変異のすべてがｐ５３タンパク質の活性に干渉するわけではないことが、更にＴＰ５３変異テストの解釈を複雑にしている。加えて、野生型ＴＰ５３細胞株及び患者の、ＭＤＭ２アンタゴニストに対する応答には幅がある。したがって、容易に解釈できる診断ツールに基づいてＭＤＭ２アンタゴニストに対する応答性を予測可能にすることは、ＭＤＭ２アンタゴニストの臨床開発において、未だ満たされていない需要である。このために、ｐ５３経路の活性を反映する遺伝子発現シグネチャーの開発が、ＭＤＭ２アンタゴニスト療法に最も応答性の高い患者を選択する手段を提供するであろう。
【発明の概要】
【０００６】
一態様では、本発明は、がん患者の、治療法に対する応答を予測する方法に関し、この場合の患者治療法は、ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用の阻害剤として作用する化合物を用いた治療を含み、前記方法は：
ａ）対象から前もって取得した試料中のレベルを測定し、このレベルを表す一又は複数の値を得る工程；及び
ｂ）工程ａ）の一又は複数の値を、一又は一組の基準値と比較する工程
を含む。
【０００７】
ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用の阻害剤として作用する化合物（ＭＤＭ２−阻害剤、ＭＤＭ２−アンタゴニストは、当技術分野で既知である。ＭＤＭ２−阻害剤及びその作製方法は、例えば、米国特許第８３５４４４４Ｂ２号、並びに国際公開第２００７／０６３０１３号、国際公開第２０１０／０３１７１３号及び国際公開第２０１１／０９８３９８号に開示されており、これらはその全体が本明細書に包含される。更なるＭＤＭ２−阻害剤が国際公開第２０１３／１３５６４８号に開示されており、これはその全体が本明細書に包含される。
米国特許第８３５４４４４Ｂ２号、並びに国際公開第２０１０／０３１７１３号、国際公開第２０１１／０９８３９８号は、例えば、式Ｉ、ＩＩ及びＩＩａの化合物を開示している。
2019059737.tif 000002
国際公開第２０１３／１３５６４８号は、例えば式ＩＩＩの化合物を開示している。
2019059737.tif 000003
ＩＩＩ
【０００８】
一態様では、本発明は、がん患者の、治療法に対する応答を予測する方法に関し、この場合の患者治療法は、ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用の阻害剤として作用する化合物、好ましくは、具体的に米国特許第８３５４４４４Ｂ２号の実施例、又は国際公開第２００７／０６３０１３号、国際公開第２０１０／０３１７１３号、国際公開第２０１１／０９８３９８号及び国際公開第２０１３／１３５６４８号に開示されたＭＤＭ２−阻害剤を用いた治療を含む。
更なる態様では、本発明は、それを必要とする患者において、腫瘍性疾患、がんを治療する方法に関し、この方法は、患者由来の試料中におけるレベルを測定し、このレベルを表す一又は複数の値を得ること、及び上記に定義された一般式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される誘導体を用いて対象を治療することを含む。
ＭＤＭ２応答に基づいて治療可能である可能性のある「腫瘍性疾患」は、がんである。一実施態様では、がんは、乳がん、前立腺がん、子宮頸がん、卵巣がん、胃がん、結腸直腸がん（すなわち、結腸がん及び直腸がんを含む）、膵臓がん、肝臓がん、脳腫瘍、神経内分泌がん、肺がん、腎臓がん、血液悪性腫瘍、メラノーマ並びに肉腫からなる群より選択される。別の実施態様では、がんは、血液悪性腫瘍、前立腺がん、乳がん、子宮頸がん、卵巣がん、結腸直腸がん、メラノーマ及び肺がんからなる群より選択される。また別の実施態様では、がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、又は骨髄異型性症候群（ＭＤＳ）、又は骨髄増殖性疾患（ＭＰＮ）である。
【０００９】
また別の態様では、本発明は、上記に定義された式の化合物又は薬学的に許容されるその誘導体に対する応答を予測するための、試料中のレベルの測定に必要な試薬を含むキットに関する。更に好ましくは、キットは、試料中の応答のレベルの比較対象となる一又は複数の標準値を含む、コンパレーターモジュールも含む。キットは、捕獲性の試薬を含んでもよい。
【００１０】
更に好ましくは、キットは、ＭＤＭ２阻害剤、好ましくは、具体的に米国特許第８３５４４４４Ｂ２号、又は国際公開第２００７／０６３０１３号、国際公開第２０１０／０３１７１３号、国際公開第２０１１／０９８３９８号及び国際公開第２０１３／１３５６４８号に開示されているＭＤＭ２−阻害剤；又は式ＩＩａ又はＩＩＩによる化合物；又は本明細書に開示される特定のＭＤＭ２−阻害剤を含む。
【００１１】
本発明は、ＭＤＭ２アンタゴニスト療法に最も応答性が高いと思われる患者を同定するインビトロ及び臨床データに基づいて、遺伝子発現シグネチャー（ｍＲＮＡ）パネルを同定する。ｍＲＮＡシグネチャーは、少なくとも三つの遺伝子、具体的には、ＭＤＭ２、ＸＰＣ（色素性乾皮症、相補群Ｃ）、ＢＢＣ３（ＢＣＬ２結合成分３）の上方制御と、ＣＤＫＮ２Ａ（サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ）の下方制御とを特徴とする。
【００１２】
本発明は、ＭＤＭ２アンタゴニストに対する応答を同定するための４遺伝子発現シグネチャー（ｍＲＮＡ）を同定する。
【００１３】
本発明は、ＭＤＭ２アンタゴニストによる患者のがんの治療をモニタリングするための４遺伝子発現シグネチャー（ｍＲＮＡ）も同定する。
【００１４】
ＭＤＭ２、ＢＢＣ３、ＣＤＫＮ２Ａ、及びＸＰＣのベースライン発現量は、治療法に抵抗性の患者由来の臨床検体と細胞株を区別する複合スコアを生成し、治療法に感受性（応答性）のものを同定する。
【００１５】
したがって、本発明は、ＭＤＭ２アンタゴニスト療法に対する感受性を同定するための方法に関する。更に、本発明は、遺伝子シグネチャー（ｍＲＮＡ）パネル、具体的にはＭＤＭ２を、更に具体的には４遺伝子発現系含むパネルにより予め患者の感受性をテストすることによって、ＭＤＭ２アンタゴニストを用いてがん患者を治療するための方法に関する。
【００１６】
本発明は更に、がん、特にＡＭＬに対するＭＤＭ２アンタゴニスト療法の有効性を決定するうえでｍＲＮＡ値を利用する予測シグネチャーを提供する。
【００１７】
本発明は、ＭＤＭ２アンタゴニストを用いて患者を治療しようとするときの、患者の、疾患、特にがん、具体的には急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に対する患者の応答を決定するための予測メカニズムとしての、少なくともＭＤＭ２遺伝子を含む遺伝子パネルの使用に関する。
【００１８】
具体的には、本発明は、ＭＤＭ２アンタゴニストを用いて患者を治療しようとするときの、疾患、特にＡＭＬに対する患者の応答を決定するための、四遺伝子パネルの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】発明を構成する作業の順序を示す概要である。
【図２】インビトロでのＭＤＭ２アンタゴニスト応答ｍＲＮＡシグネチャーである。上：最も感受性の高い（ＩＣ５０＜＝１）及び抵抗性の高い（ＩＣ５０＞＝１０）細胞株のＭＤＭ２アンタゴニスト応答に関連付けられた、四つの遺伝子ｍＲＮＡのヒートマップ（オリジナルにおいて、カラー版のグリーンは低発現に、赤は高発現に対応している）。最も感受性の高い細胞株について、ＭＤＭ２、ＸＰＣ及びＢＢＣ３は高発現を、ＣＤＫＮ２Ａは低発現を、それぞれ示す。各細胞株について、ＴＰ５３変異の特徴はヒートマップの上部にある（白＝野生型）。天然のｌｏｇ  ＩＣ５０値は下部に示されている。下：最も感受性の高い（ＩＣ５０＜＝１）及び抵抗性の高い（ＩＣ５０＞＝１０）細胞株の４遺伝子ｍＲＮＡシグネチャーの箱ひげ図。
【図３】ＡＭＬ治験におけるＭＤＭ２アンタゴニスト応答ｍＲＮＡシグネチャーである。上：評価された２８名の患者のＭＤＭ２アンタゴニスト応答に関連付けられた、四つの遺伝子ｍＲＮＡのヒートマップ（オリジナルのカラー版における赤は高発現に対応している）。各患者について、ＴＰ５３変異の特徴はヒートマップの上部にある（白＝野生型）。臨床効果グループは下部に示されている。下：評価された２８の患者の４遺伝子ｍＲＮＡシグネチャーのスコアの箱ひげ図。
【図４Ａ】ＡＭＬ治験における三つのバイオマーカー／ビオシグネチャーの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）。四遺伝子ｍＲＮＡシグネチャーのスコアはＡＵＣ０．８２を示し、ＭＤＭ２  ｍＲＮＡの単一のバイオマーカーはＡＵＣ０．５を示し；Ｐ５３変異状態バイオマーカーはＡＵＣ０．５２を示した。
【図４Ｂ】ＡＭＬ治験における三つのバイオマーカー／ビオシグネチャーの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）。四遺伝子ｍＲＮＡシグネチャーのスコアはＡＵＣ０．８２を示し、ＭＤＭ２  ｍＲＮＡの単一のバイオマーカーはＡＵＣ０．５を示し；Ｐ５３変異状態バイオマーカーはＡＵＣ０．５２を示した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
一実施態様では、本発明による方法に使用されるＭＤＭ２−阻害剤は、いずれかのＭＤＭ２−阻害剤、好ましくは、具体的に米国特許第８３５４４４４Ｂ２号、又は国際公開第２００７／０６３０１３号、国際公開第２０１０／０３１７１３号、国際公開第２０１１／０９８３９８号及び国際公開第２０１３／１３５６４８号に開示されているＭＤＭ２−阻害剤である。
【００２１】
一実施態様では、本発明による方法に使用されるＭＤＭ２−阻害剤は、式Ｉ
2019059737.tif 000004
［式中、
Ｘは、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、シアノ、ニトロ、エチニル、シクロプロピル、メチル、エチル、イソプロピル、ビニル及びメトキシからなる群より選択され、
Ｙは、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＯＨ、ニトロ、低級アルキル、シクロアルキル、低級アルコキシ、低級アルケニル、シクロアルケニル、低級アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、ＣＯＯＲ’、ＯＣＯＲ’、ＣＯＮＲ’Ｒ”、ＮＲ’ＣＯＲ”、ＮＲ”ＳＯ２Ｒ’、ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”及びＮＲ’Ｒ”からなる群より独立して選択される一つ〜四つの基であり、ここで
Ｒ’及びＲ”は、Ｈ、低級アルキル、置換低級アルキル、低級シクロアルキル、置換低級シクロアルキル、低級アルケニル、置換低級アルケニル、低級シクロアルケニル、置換低級シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、又は置換複素環から独立して選択され、
Ｒ’とＲ”  が独立して結合し、置換若しくは無置換シクロアルキル、置換若しくは無置換シクロアルケニル、置換若しくは無置換ヘテロアリール又は置換若しくは無置換複素環から選択される環状構造を形成する場合、
Ｒ１及びＲ２の一方は、低級アルキル、
置換低級アルキル、低級アルケニル、置換低級アルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、及び置換シクロアルケニルからなる群より選択され、他方は水素又は低級アルキルであり、
Ｒ３は又は低級アルキルであり、
Ｒ４及びＲ５の一方は、低級アルキル、置換低級アルキル、低級アルケニル、置換低級アルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、及び置換シクロアルケニルからなる群より選択され、他方は水素であり、
Ｒ６及びＲ７は、（ＣＨ２）ｎ−Ｒ’、（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ’Ｒ”、（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ’ＣＯＲ”、（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ’ＳＯ２Ｒ”、（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ、（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ’、（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＮＲ’Ｒ”、（ＣＨ２）ｎ−ＯＲ’、（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’、（ＣＨ２）ｎ−ＳＯＲ’、（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ２Ｒ’、（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＲ’、（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３Ｈ、（ＣＨ２）ｎ−ＳＯＮＲ’Ｒ”、（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ’、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＲ’、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ’Ｒ”、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ’ＣＯＲ”、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ’ＳＯ２Ｒ”、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ’、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＮＲ’Ｒ”、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ２Ｒ’、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＲ’、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯＮＲ’Ｒ”、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、（ＣＨ２）ｐ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ’、（ＣＨ２）ｐ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ、（ＣＨ２）ｐ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＲ’、（ＣＨ２）ｐ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ’Ｒ”、（ＣＨ２）ｐ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ’ＣＯＲ”、（ＣＨ２）ｐ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ’ＳＯ２Ｒ”、（ＣＨ２）ｐ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ、（ＣＨ２）ｐ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ’、（ＣＨ２）ｐ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＮＲ’Ｒ”、（ＣＨ２）ｐ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ２Ｒ’、（ＣＨ２）ｐ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＲ’、（ＣＨ２）ｐ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯＮＲ’Ｒ”、（ＣＨ２）ｐ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”、−ＣＯＲ’、−ＳＯＲ’及びＳＯ２Ｒ’からなる群より選択され、ここでＲ’及びＲ’’は上記の通りであり、
ｍ、ｎ及びｐは、独立して０から６である］
の化合物、並びに
その薬学的に許容される塩及びエステルである。
【００２２】
この実施態様においては、好ましい式Ｉの化合物は、式ＩＩに示す立体化学構造を有しうる。
2019059737.tif 000005
ＩＩ
【００２３】
一実施態様では、本発明による方法に使用されるＭＤＭ２−阻害剤は、式ＩＩａ
2019059737.tif 000006
（ＩＩａ）、
［式中、
Ｒ６は、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ’であり、
Ｒ’は、シクロヘキシルであるか、又は
１又は２の炭素原子がＮ、Ｓ又はＯによって置換されてよく、且つ前述のシクロヘキシル又は芳香族炭化水素が、低級アルキル、低級−アルケニル、低級−アルキニル、ジオキソ−低級−アルキレン（例えば、ベンゾジオキシル基を形成する）、ハロゲン、ヒドロキシ、ＣＮ、ＣＦ３、ＮＨ２、Ｎ（Ｈ、低級−アルキル）、Ｎ（低級−アルキル）２、アミノカルボニル、カルボキシ、ＮＯ２、低級−アルコキシ、チオ−低級−アルコキシ、低級−アルキルスルホニル、アミノスルホニル、低級−アルキルカルボニル、低級−アルキルカルボニルオキシ、低級−アルコキシカルボニル、低級−アルキル−カルボニル−ＮＨ、フルオロ−低級−アルキル、フルオロ−低級−アルコキシ、低級−アルコキシ−カルボニル−低級−アルコキシ、カルボキシ−低級−アルコキシ、カルバモイル−低級−アルコキシ、ヒドロキシ−低級−アルコキシ、ＮＨ２−低級−アルコキシ、Ｎ（Ｈ、低級−アルキル）−低級−アルコキシ、Ｎ（低級−アルキル）２−低級−アルコキシ、低級−アルキル−１−オキシラニル−低級−アルコキシ−低級−アルキル、２−オキソ−ピロリジン−１−イル，（１，１−ジオキソ）−２−イソチアゾリジン、３−低級−アルキル  スルフィニル、置換又は無置換複素環式環、置換又は無置換アリール環、置換又は無置換ヘテロアリール環、トリフルオロ−低級−アルキルスルホニルアミノ−アリール、低級−アルキル  スルホニルアミノカルボニル、低級−アルキル  スルホニルアミノカルボニル−アリール、ヒドロキシカルバモイル−フェニル、ベンジルオキシ−低級−アルコキシ、モノ−又はジ−低級アルキル置換アミノ−スルホニル及びハロゲン、ヒドロキシ、ＮＨ２、Ｎ（Ｈ、低級アルキル）又はＮ（低級アルキル）２で置換されてもよい低級−アルキルから独立に選択される基により一度又は二度置換可能である、５〜１０員の単環式又は二環式芳香族炭化水素であり；
ｎは、０又は１である］
の化合物である。
【００２４】
この実施態様においては、
Ｒ６が−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ’であり、
Ｒ’が、それぞれ無置換であるか、又はハロゲン、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシカルボニル、カルボキシ、カルボキシ  Ｃ１−６アルコキシ、オキソ及びＣＮから独立して選択される置換基により一度又は二度置換可能であ、フェニル、ピリジニル、ピラジニル又はピリミジニルであり；
ｎが０である、
式ＩＩａの化合物が好ましい。
【００２５】
別の実施態様では、本発明による方法に使用されるＭＤＭ２−阻害剤は、式ＩＩＩ
2019059737.tif 000007
（ＩＩＩ）、
［式中、
Ｘは、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、シアノ、ニトロ、エチニル、シクロプロピル、メチル、エチル、イソプロピル、ビニル及びメトキシからなる群より選択され、
Ｙは、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＯＨ、ニトロ、低級アルキル、シクロアルキル、低級アルコキシ、低級アルケニル、シクロアルケニル、低級アルキニルからなる群より独立して選択される一つ〜四つの基であり、
Ｚは低級アルコキシであり、
Ｒ１は、低級アルキル、置換低級アルキル、低級アルケニル、置換低級アルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、及び置換シクロアルケニルからなる群より選択され、
Ｒ２は
2019059737.tif 000008
、
[上式中、ＷはＦ、Ｃｌ又はＢｒであり、
ＶはＨ又はＦである]
から選択される置換フェニルであり：
Ｒ３は、水素、低級アルキル又は置換低級アルキルから選択され、
Ｒ４は：
2019059737.tif 000009
からなる群より選択され、
Ｒ５は、低級アルキル、置換低級アルキル、複素環、置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、天然及び非天然アミノ酸、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＨ、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＣＨ３、−（ＮＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＨ、−（ＮＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＣＨ３及び−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ６）２からなる群より選択され、ここで
ｎは３から６０、好ましくは３から４５であり、
Ｒ６は水素又はベンジルである、
化合物；又は
その薬学的に許容される塩又はエステルである。
【００２６】
この実施態様においては、
ＸがＨ、Ｆ又はＣｌから選択され、
ＹがＨ、Ｆ又はＣｌから選択され、
Ｒ１が低級アルキル又は置換低級アルキルであり、
Ｒ３が水素又は低級アルキルであり、
Ｒ５が、低級アルキル、置換低級アルキル、天然及び非天然アミノ酸、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＨ、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＣＨ３、−（ＮＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＨ、−（ＮＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＣＨ３、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ６）２からなる群より選択され、ここで
ｎは３から６０、好ましくは３から４５であり、
Ｒ６が水素である式ＩＩＩの化合物；
又はその薬学的に許容される塩が好ましい。
【００２７】
更に、この実施態様においては、
ＸがＨ、Ｆ又はＣｌから選択され；
ＹがＨ、Ｆ又はＣｌから選択され；
ＺがＣ１−６アルコキシであり；
Ｒ１がＣ１−６アルキルであり；
Ｒ２が
2019059737.tif 000010
［上式中、
ＷはＦ、Ｃｌ又はＢｒであり；
ＶはＨ又はＦである］
であり、
Ｒ３が水素又はＣ１−６アルキルであり；
Ｒ４が-Ｃ（Ｏ）−Ｒ５であり；ここで
Ｒ５は、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＨ；−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＣＨ３；及び−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ６）２（ｎは３から６０であり、Ｒ６は水素である）からなる群より選択される、
式ＩＩＩの化合物；又は
その薬学的に許容される塩が好ましい。
更に具体的には、ｎは３から５５、更に好ましくはｎは３から４５である。この実施態様においては、Ｒ５が−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＣＨ３であり、ｎが４０から６０である化合物が特に好ましい。
【００２８】
本明細書では、必要な場合には、種々の基は、低級アルキル、低級−アルケニル、低級−アルキニル、ジオキソ−低級−アルキレン（例えば、ベンゾジオキシル基を形成する）、ハロゲン、ヒドロキシ、ＣＮ、ＣＦ３、ＮＨ２、Ｎ（Ｈ、低級−アルキル）、Ｎ（低級−アルキル）２、アミノカルボニル、カルボキシ、ＮＯ２、低級−アルコキシ、チオ−低級−アルコキシ、低級−アルキルスルホニル、アミノスルホニル、低級−アルキルカルボニル、低級−アルキルカルボニルオキシ、低級−アルコキシカルボニル、低級−アルキル−カルボニル−ＮＨ、フルオロ−低級−アルキル、フルオロ−低級−アルコキシ、低級−アルコキシ−カルボニル−低級−アルコキシ、カルボキシ−低級−アルコキシ、カルバモイル−低級−アルコキシ、ヒドロキシ−低級−アルコキシ、ＮＨ２−低級−アルコキシ、Ｎ（Ｈ、低級−アルキル）−低級−アルコキシ、Ｎ（低級−アルキル）２−低級−アルコキシ、低級−アルキル−１−オキシラニル−低級−アルコキシ−低級−アルキル、２−オキソ−ピロリジン−１−イル，（１，１−ジオキソ）−２−イソチアゾリジン、３−低級−アルキル  スルフィニル、置換又は無置換複素環式環、置換又は無置換アリール環、置換又は無置換ヘテロアリール環、トリフルオロ−低級−アルキルスルホニルアミノ−アリール、低級−アルキル  スルホニルアミノカルボニル、低級−アルキル  スルホニルアミノカルボニル−アリール、ヒドロキシカルバモイル−フェニル、ベンジルオキシ−低級−アルコキシ、モノ−又はジ−低級アルキル置換アミノ−スルホニル、並びにハロゲン、ヒドロキシ、ＮＨ２、Ｎ（Ｈ、低級アルキル）又はＮ（低級アルキル）２で置換可能な低級アルキルからなる群より独立に選択される、１〜５の又は、好ましくは１〜３の、置換基で置換される。シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール及び複素環式管に好ましい置換基は、ハロゲン、低級アルコキシ、低級アルキル、ヒドロキシカルボニル、カルボキシ、カルボキシ  低級アルコキシ、オキソ及びＣＮである。アルキルに好ましい置換基は、アルコキシ及びＮ（低級アルキル）２である。
【００２９】
用語「アルキル」は、１から約７の炭素原子を有する基を含み、１から約２０の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖飽和炭化水素基を指す。特定の実施態様においては、アルキル置換基は低級アルキル置換基であってもよい。用語「低級アルキル」は、１から６の炭素原子を有するアルキル基を指し、特定の実施態様においては１から４の炭素原子を有するアルキル基を指す。アルキル基の例には、限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、及びｓ−ペンチルが含まれる。
【００３０】
本明細書で使用される「シクロアルキル」は、炭素原子のみからなり、いずれの環も飽和されている任意の安定な単環系又は多環系を指すことを意図しており、用語「シクロアルケニル」は、炭素原子のみからなり、その少なくとも一つの環が部分的に不飽和である任意の安定な単環系又は多環系を指すことを意図している。シクロアルキルの例には、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、アダマンチル、シクロオクチル、［２．２．２］ビシクロオクタン又は［３．３．０］ビシクロオクタンなどのビシクロオクタン、［４．３．０］ビシクロノナンなどのビシクロノナン、及び［４．４．０］ビシクロデカン（デカリン）などのビシクロデカンを含むビシクロアルキル、又はスピロ化合物が含まれる。シクロアルケニルの例には、限定されないが、シクロペンテニル又はシクロヘキセニルが含まれる。
【００３１】
本明細書で使用される用語「アルケニル」は、一つの二重結合を含み、２から６の、好ましくは２から４の炭素原子を有する、直鎖又は分岐鎖不飽和脂肪族炭化水素基を意味する。このような「アルケニル基」の例として、ビニルエチニル、アリル、イソプロペニル、１−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、２−エチル−１−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、４−メチル−３−ペンテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル及び５−ヘキセニルが挙げられる。
【００３２】
本明細書で使用される用語「アルキニル」は、一つの三重結合を含み、２から６の、好ましくは２から４の炭素原子を有する、直鎖又は分岐鎖不飽和脂肪族炭化水素基を意味する。このような「アルキニル基」の例として、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル及び５−ヘキシニルが挙げられる。
【００３３】
定義において使用される用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素、好ましくはフッ素及び塩素を意味する。
【００３４】
「アリール」は、一価の単環又は二環式芳香族炭素環式炭化水素基、好ましくは６から１０員の芳香環系を意味する。好ましいアリール基には、限定されないが、フェニル、ナフチル、トリル、及びキシリルが含まれる。アリール基が二環式である場合、好ましい基は１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イソインドール−５−イル基である。
【００３５】
「ヘテロアリール」は、２つ以下の環を含有する芳香族複素環系を意味する。好ましいヘテロアリール基には、限定されないが、チエニル、フリル、インドリル、ピロリル、ピリジニル、ピラジニル、オキサゾリル、チアキソリル（ｔｈｉａｘｏｌｙｌ）、キノリニル、ピリミジニル、イミダゾール、置換又は無置換のトリアゾリル、及び置換又は無置換のテトラゾリルが含まれる。
【００３６】
二環式のアリール又はヘテロアリールの場合、一つの環がアリールであり他方の環がヘテロアリールであり、且つ両方の環が置換又は無置換でありうる。
【００３７】
「ヘテロ環」又は「複素環」は、１から３の炭素原子が窒素、酸素又は硫黄原子から選択されるヘテロ原子により置き換えられている、置換又は無置換の５から８員の単環又は二環式の非芳香族炭化水素を意味する。例には、ピロリジン−２−イル；ピロリジン−３−イル；ピペリジニル；モルホリン−４−イルなどが含まれ、これらは順に置換することができる。「ヘテロ原子」は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される原子を意味する。
【００３８】
「アルコキシ、アルコキシル又は低級アルコキシ」は、酸素原子に結合した上記低級アルキル基のいずれかを指す。典型的な低級アルコキシ基には、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ又はプロポキシ、ブチルオキシなどが含まれる。アルコキシの意味に更に含まれるものとしては、複数のアルコキシ側鎖、例えばエトキシエトキシ、メトキシエトキシ、メトキシエトキシエトキシなど、及び置換アルコキシ側鎖、例えばジメチルアミノエトキシ、ジエチルアミノエトキシ、ジメトキシ−ホスホリルメトキシなどがある。
【００３９】
本明細書において使用される用語「ｍＰＥＧ」はメトキシポリエチレングリコールを意味し、これは市販されている（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ又はＩＤ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｋｏｒｅａ））。ｍＰＥＧの分子量の分布は、製造者及び／又はバッチによって変動しうる。本発明の一実施態様では、ｍＰＥＧは、約１５００Ｄａから約３０００Ｄａの平均分子量（ＭＷ）を有する。本発明の別の実施態様では、ｍＰＥＧは、約２０００Ｄａから約２２００Ｄａの平均ＭＷを有する。平均ＭＷは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって決定される。
【００４０】
薬学的に許容される塩及びエステル、担体、賦形剤などの「薬学的に許容される誘導体」は、特定の化合物が投与される対象にとって薬理学的に受容可能であり、実質的に非毒性であることを意味する。
【００４１】
「薬学的に許容される塩」は、本発明の化合物の生物学的有効性と特性を保持しており、且つ好適な非毒性有機酸若しくは無機酸、又は有機塩基若しくは無機塩基から形成される、一般的な酸付加塩或いは塩基付加塩を指す。酸付加塩の例には、無機酸、例えば塩化水素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸及び硝酸から誘導されるもの、並びに、有機酸、例えばｐ?トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、トリフルオロ酢酸などから誘導されるものが含まれる。塩基付加塩の例には、アンモニウム、カリウム、ナトリウム及び第４級アンモニウム水酸化物、例えばテトラメチルアンモニウム水酸化物から誘導されるものが含まれる。薬学的化合物（即ち、薬物）の塩への化学的修飾は、化合物の物理的及び化学的安定性、吸湿性、流動性及び溶解性の向上を得るための、薬剤師にとって周知の技法である。例えば、Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (6th Ed. 1995) at pp. 196 and 1456- 1457参照。
【００４２】
一実施態様では、本発明による方法に使用されるＭＤＭ２−阻害剤は、式
2019059737.tif 000011
の４−｛［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−４−（４−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−３−（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−シアノ−５−（２，２−ジメチル−プロピル）−ピロリジン−２−カルボニル］−アミノ｝−３−メトキシ−安息香酸である。
この化合物及びその作製方法は、例えば国際公開第２０１１／０９８３９８号に開示されている。
【００４３】
本発明による別の特定の化合物は、２−（（１−（４−（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（３−クロロ−２−フルオロフェニル）−４−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）−４−シアノ−５−ネオペンチルピロリジン−２−カルボキシアミド）−３−メトキシベンゾイルオキシ）エトキシ）カルボニルアミノ）酢酸である。
【００４４】
本発明による別の特定の化合物は、２−（（（４−（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（３−クロロ−２−フルオロフェニル）−４−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）−４−シアノ−５−ネオペンチルピロリジン−２−カルボキシアミド）−３−メトキシベンゾイルオキシ）メトキシ）−カルボニルアミノ）酢酸である。
【００４５】
本発明による更なる化合物は、３−オキソ−２，４，７，１０，１３，１６，１９−ヘプタオキサイコシル  ４−（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（３−クロロ−２−フルオロフェニル）−４−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）−４−シアノ−５−ネオペンチルピロリジン−２−カルボキシアミド）−３−メトキシベンゾアートである。
【００４６】
本発明による特定の化合物は、４−｛［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−（４−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−シアノ−５−（２，２−ジメチル−プロピル）−ピロリジン−２−カルボニル］−アミノ｝−３−メトキシ−安息香酸  １−ｍＰＥＧ−カルボニルオキシ−エチル  エステル（ｍＰＥＧ、平均ＭＷ、〜２０００）である。
【００４７】
本発明による特定の化合物は、４−｛［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−（４−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−シアノ−５−（２，２−ジメチル−プロピル）−ピロリジン−２−カルボニル］−アミノ｝−３−メトキシ−安息香酸  １−ｍＰＥＧ−カルボニルオキシ−エチル  エステル（ｍＰＥＧ、平均ＭＷ、〜２２００）である。
【００４８】
本発明による特定の化合物は、４−｛［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−（４−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−シアノ−５−（２，２−ジメチル−プロピル）−ピロリジン−２−カルボニル］−アミノ｝−３−メトキシ−安息香酸  １−ｍＰＥＧ−カルボニルオキシ−メチルエステル（ｍＰＥＧ、平均ＭＷ、〜２０００）である。
【００４９】
本発明による特定の化合物は、３−オキソ−２，４，７，１０，１３−ペンタオキサテトラデシル  ４−（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（３−クロロ−２−フルオロフェニル）−４−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）−４−シアノ−５−ネオペンチルピロリジン−２−カルボキシアミド）−３−メトキシベンゾアートである。
【００５０】
本発明による特定の化合物は、２７−オキソ−２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２８−デカオキサトリアコンタン−２９−イル  ４−（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（３−クロロ−２−フルオロフェニル）−４−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）−４−シアノ−５−ネオペンチルピロリジン−２−カルボキシアミド）−３−メトキシベンゾアートである。
【００５１】
本発明による特定の化合物は、４−｛［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−（４−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−シアノ−５−（２，２−ジメチル−プロピル）−ピロリジン−２−カルボニル］−アミノ｝−３−メトキシ−安息香酸  １−［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−２−（（Ｒ）−１，２−ジヒドロキシ−エチル）−４，５−ジヒドロキシ−テトラヒドロ−フラン−３−イルオキシカルボニルオキシ］−エチル  エステルである。
【００５２】
本発明による別の特定の化合物は、４−｛［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−（４−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−シアノ−５−（２，２−ジメチル−プロピル）−ピロリジン−２−カルボニル］−アミノ｝−３−メトキシ−安息香酸  １−（２−｛２−［２−（２−ジベンジルオキシホスホリルオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシカルボニルオキシ）−エチル  エステルである。
【００５３】
また、本発明による特定の化合物は、４−｛［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−（４−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−シアノ−５−（２，２−ジメチル−プロピル）−ピロリジン−２−カルボニル］−アミノ｝−３−メトキシ−安息香酸  １−（２−｛２−［２−（２−ホスホノオキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシカルボニルオキシ）−エチル  エステルである。
【００５４】
また、本発明による特定の化合物は、４−｛［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−（４−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−シアノ−５−（２，２−ジメチル−プロピル）−ピロリジン−２−カルボニル］−アミノ｝−３−メトキシ−安息香酸  １−ｍＰＥＧ−カルボニルオキシ−エチル  エステル（ｍＰＥＧ、平均ＭＷ、〜２０００）である。
2019059737.tif 000012
平均ＭＷ：〜２６９５
この化合物とその作製方法は、例えば国際公開第２０１３／１３５６４８号に開示されている。
【００５５】
また、本発明による特定の化合物は、
４−｛［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−（４−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−シアノ−５−（２，２−ジメチル−プロピル）−ピロリジン−２−カルボニル］−アミノ｝−３−メトキシ−安息香酸  １−ｍＰＥＧ−カルボニルオキシ−エチル  エステル（ｍＰＥＧ、平均ＭＷ、〜２２００）である。
2019059737.tif 000013
平均ＭＷ：〜２９００
この化合物とその作製方法は、例えば国際公開第２０１３／１３５６４８号に開示されている。
【００５６】
また、本発明による特定の化合物は、化合物Ａ（ＲＧ７１１２）とも呼ばれる、式（Ａ）の化合物である。
2019059737.tif 000014
（Ａ）
この化合物とその作製方法は、例えば国際公開第２００７／０６３０１３号に開示されている。
【００５７】
がん細胞株コレクションにおけるＭＤＭ２アンタゴニスト療法予測シグネチャーの確立
ＭＤＭ２アンタゴニスト療法予測シグネチャーを生成するために、遺伝子発現プロファイリングを用いたインビトロでのＭＤＭ２アンタゴニスト療法の応答（図１）を組み合わせる。多岐にわたるヒトのがんの腫瘍種類の広範なアレイである、集合的に腫瘍学の細胞株（ＣＥＬＬＯ）と呼ばれる２８１のヒトがん細胞株のバンクを、複数のハイスループットゲノム技術プラットフォームを用いて評価する。各細胞株由来の核酸の変異状態を、エキソームシーケンシングにより決定する。ベースラインでのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現量を、ＭＤＭ２アンタゴニスト療法に先立って、ＲＮＡシーケンシングにより取得する。本明細書で時にＲＧ７１１２と称するＭＤＭ２アンタゴニスト療法の化合物Ａの応答を、当業者に既知のアッセイ、例えばＲＮＡシーケンシング及びＧｅｎｅ  Ｃｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ２．０アレイを用いたマイクロアレイ測定により取得する。ＭＤＭ２療法の応答は、ハイスループットスクリーニングアッセイにより取得される。化合物Ａに対する応答に応じて、これら細胞株は、ＩＣ５０＜＝１と定義される感受性と、ＩＣ５０＞＝１０と定義される抵抗性に分類される。
2019059737.tif 000015
化合物Ａ（ＲＧ７１１２）
【００５８】
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【００５９】
２８１の細胞株のうち、２１０の細胞株は、低質のコール及び生殖系列の変異を除去する注意深い注釈付けの後、ＴＰ５３に変異を示す。変異ＴＰ５３を有する細胞株は、ＭＤＭ２アンタゴニスト療法に対する感受性が極めて低く（Ｐ＜２．２ｘ１０−１６）、これは過去文献によるデータと一貫している。しかしながら、化合物Ａの予測バイオマーカー候補としてＴＰ５３変異状態を使用することには二つの困難性が観察される。理論により限定されることを望むものではないが、最初の複数のＴＰ５３変異細胞株は、恐らくは、２２Ｒｖ１、ＤＵ１４５、ＫＭＳ−１２−ＢＭ、ＫＭＳ−２６、ＬＣＬＣ−１０３Ｈ、ＬＮ−１８、ＭＫＮ−４５、ＮＣＩ−Ｈ２１２２、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＰＣ−９、ＳＷ１４６３といった非機能性ＴＰ５３変異を有するために、化合物Ａに対する感受性応答を示す。
【００６０】
アッセイの他のいくつかの方法は、限定しないが、ａ）免疫組織化学（ＩＨＣ）分析、ｂ）ウェスタンブロット法、ｃ）免疫沈降、ｄ）酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）ｅ）ラジオイムノアッセイ、ｆ）蛍光励起セルソーター（ＦＡＣＳ）、ｇ）マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）及びエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−−ＭＳ）を含む、質量分析を含む。
【００６１】
ＭＤＭ２アンタゴニストに応答する可能性を評価するための一つの手法は、ＴＰ５３遺伝子が変異するかどうかを評価することである。しかしながら、これは、がんにおいて複数の変異がＴＰ５３に見られるという事実により複雑になっている。これら変異のすべてがｐ５３タンパク質の活性に干渉するわけではないことが、更にＴＰ５３変異テストの解釈を複雑にしている。加えて、野生型ＴＰ５３細胞株及び患者のＭＤＭ２アンタゴニストに対する応答には幅がある。したがって、容易に解釈できる診断ツールに基づいてＭＤＭ２アンタゴニストに対する応答性を予測可能にすることは、ＭＤＭ２アンタゴニストの臨床開発において、未だ満たされていない需要である。このために、ｐ５３経路の活性を反映する遺伝子発現シグネチャーの開発は、ＭＤＭ２アンタゴニスト療法に最も応答性の高い患者を選択する手段を提供する。
【００６２】
この目的のために、ベースラインｍＲＮＡ発現とＭＤＭ２アンタゴニスト療法への応答（ＩＣ５０）とのゲノム全体の関連付けを行い、２．３８ｘ１０−４７から９．５６ｘ１０−２３にわたるＰとの有意な関連を有する１３の遺伝子のリストが同定される。
【００６３】
機能注釈は、ゲノム全体の関連付けに基づく１３の重要な遺伝子が、−０．４７から−０．３１（一つの正の相関０．２８を含む）にわたる相関係数を有して、細胞周期の停止及びアポトーシスを含め、関連ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用又は下流のＰ５３経路における既知の制御因子であることを示す（表２参照）。その中でも、ＭＤＭ２は、インビトロでの感受性と相関するＭＤＭ２の過剰発現を有するナンバー４のトップ遺伝子であり、過去文献と一貫している。
したがって、一実施態様では、本発明は、がん患者の治療法に対する応答性を予測する方法を提供し、前記方法は、少なくとも一つの表２による遺伝子のレベルを検出すること、及びそのレベルを、ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用の阻害剤（ＭＤＭ２−阻害剤）である化合物に対する前記患者の応答を予測するためのバイオマーカーとして使用することを含む。この実施態様においては、本発明は、前記患者の、ＭＤＭ２−阻害剤を用いた治療に対する応答を予測するための方法にも関し、前記方法は、表２による１３の遺伝子のうちの、２、又は３、又は４、又は５、又は６、又は７、又は８、又は９、又は１０、又は１１、又は１２の合計レベルの検出、又は１３すべての検出を含む。更に、この実施態様においては、表２による前記遺伝子、又は遺伝子の組合せの検出を使用して、前記治療を継続すべきか否かを決定するために、前記ＭＤＭ２−阻害剤を用いた治療の間の前記患者の応答をモニタリングすることができる。更にこの実施態様において、前記方法は以下の工程を含む：
ａ）患者から試料を採取する工程；
ｂ）試料中の、表２による少なくとも一つの遺伝子のレベルを測定する工程；
ｃ）患者由来の前記レベルを、標準値、例えば同じがんを有する患者から取得された値と比較する工程；及び
ｄ）ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用の阻害剤として作用する化合物を投与する工程
を含む。
ａ）の試料は、本方法が、患者の治療に対する応答の予測方法として適用される場合は治療開始前に取得され、本方法が治療のモニタリングのために適用される場合は治療中に取得される。
本発明による「レベルを検出する（又は測定する）」という表現は、好ましくは、ｍＲＮＡ発現量を検出すること（又は測定すること）を意味する。
別の実施態様では、本発明は、本明細書に定義されるＭＤＭ２−阻害剤を用いた治療に対するがん患者の応答を決定するためのバイオマーカーとして使用するための、表２による少なくとも一つの遺伝子、又はその組合せを提供する。用語「がん」は、本明細書に定義されている通りであり、好ましくはＡＭＬである（４頁参照）。
【００６４】
ｍＲＮＡシグネチャーを更に構築するために、上方モデル選択手順により、１３の遺伝子間に、多変異ロジスティック回帰分類指標を構築する。ｍＲＮＡシグネチャーは、ＭＤＭ２、ＸＰＣ（色素性乾皮症、相補群Ｃ）、ＢＢＣ３（ＢＣＬ２結合成分３）を含む三つの遺伝子の上方制御と、腫瘍抑制遺伝子ＣＤＫＮ２Ａサイクリン依存性キナーゼ阻害剤２ａの下方制御からなる。
【００６５】
2019059737.tif 000027
【００６６】
最終シグネチャーは、１０分割交差検証から推定される、０．９３（９５％  ＣＩ  ０．９２〜０．９５、表３）の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）により、ＭＤＭ２アンタゴニスト抵抗性細胞株からＭＤＭ２アンタゴニスト感受性細胞株を区別することができる。したがって、ＭＤＭ２アンタゴニスト感受性細胞株は、ＭＤＭ２、ＸＰＣ、及びＢＢＣ３のベースラインの上方制御と、ＣＤＫＮ２Ａの下方制御とを示し；一方ＭＤＭ２アンタゴニスト抵抗性細胞株は、ＭＤＭ２、ＸＰＣ、ＢＢＣ３の下方制御と、ＣＤＫＮ２Ａの上方制御とを特徴とする。（図２参照）。
【００６７】
2019059737.tif 000028
【００６８】
標的遺伝子ＭＤＭ２に加えて、シグネチャーの他の三つの遺伝子はすべて、ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用又は顆粒のｐ５３経路の制御因子として生物学的にサポートされる。ＸＰＣ遺伝子は、損傷ＤＮＡの修復に関与する重要な役割を果たし、損傷認識、オープンな複合体形成、及び修復タンパク質複合体形成に貢献する。ＢＢＣ３のｍＲＮＡレベルは、ＤＮＡ−損傷剤への曝露及びＤＮＡ損傷誘導アポトーシスを媒介するｐ５３により誘導される。ＣＤＫＮ２Ａの二つの遺伝子産物であるｐ１６及びｐ１４ＡＲＦは共に主要な腫瘍抑制因子経路に結合しており、特に核小体中においてＭＤＭ２機能を隔離することによりそれを阻害するｐ１４ＡＲＦがそうである。ｍＲＮＡシグネチャーの基礎となる分子メカニズムを調べるために、ｍＲＮＡシグネチャースコアを、Ｐ５３の変異状態と、ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用及び下流のＰ５３経路に関与する重要な制御遺伝子と相関させる。
【００６９】
図２に示すように、低シグネチャースコアの細胞株は、恐らくはｐ５３変異しており；一方高シグネチャースコアを有する細胞株は恐らくはｐ５３野生型（Ｐ＜２．２×１０−１６）である。表４の各細胞株のｐ５３変異状態を参照されたい。更に、野生型ＴＰ５３を有するがシグネチャースコアの低い抵抗性細胞株の大部分は、ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用及び下流のＰ５３経路に関与する重要な制御遺伝子に変異を担持する。これは、シグネチャースコアが、ＭＤＭ２−Ｐ５３経路機能の代理的なｍＲＮＡレベル指標として働くことができることを示すものである。
【００７０】
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【００７１】
試験される腫瘍種類全体のｍＲＮＡシグネチャースコアの特異的予測力を調べるため、及びシグネチャースコアに基づく予測が腫瘍系統により交絡していないことを確認するため、ＣＥＬＬＯの入手可能な各腫瘍種類内のシグネチャースコアを調べた。
【００７２】
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【００７３】
様々な技術プラットフォーム下で測定されたシグネチャー頑健性にアクセスするために、シグネチャーｍＲＮＡ発現及びＲＮＡ−ｓｅｑ定質化とマイクロアレイ定量化との複合スコアを調べる。
【００７４】
ＭＤＭ２アンタゴニスト予測ｍＲＮＡ応答シグネチャーの性能を、ＮＯ２１２７９白血病治験（図１）由来の検体を用いる臨床セッティングで試験する。ＭＴＤにおいて治療された２８のＡＭＬ患者が登録されて、前治療及びＣ１Ｄ１０（サイクル１、１０日）サンプリングを完了した。患者は、年齢中央値が５９歳である、男性１８名と女性１０名から構成されている（表６）。ＮＯ２１２７９の臨床エンドポイントは次の４つのカテゴリー：完全寛解（ＣＲ）、形態学的に白血病のない状態（ＭＬＦＳ）、血液学的改善（ＨＩ）、及び進行性疾患（ＰＤ）に分けられた。ベースラインスクリーニング、単回投与（サイクル１、２日目、Ｃ１Ｄ２）後、及び投与の最終日（サイクル１、１０日目、Ｃ１Ｄ１０）において、血液白血病試料及び骨髄生検試料を収集し、ＭＡＣＳ（登録商標）分離により単離した１１。血液白血病試料中のＭＤＭ２拮抗作用の早期薬力学的効果を、ベースラインとＣ１Ｄ１０の間の．ＭＤＭ２  ＲＴ  ＰＣＲの変化を測定することにより評価した。ベースライン、Ｃ１Ｄ２及びＣ１Ｄ１０において取得された末梢血白血病細胞及び骨髄生検試料について、包括的な遺伝子発現プロファイルを生成した。
【００７５】
バイオマーカーパネル測定値手順が以前に報告されている１１。ＴＰ５３変異の分析は、ＰＣＲベース及びマイクロアレイベースのＡｍｐｌｉＣｈｉｐ  ＴＰ５３テスト（開発中、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、Ｃａｒｉｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｉｒｖｉｎｇ、ＴＸ、ＵＳＡ）により行った。このテストは、エクソン２〜１１及びそれらのスプライス部位における単一のヌクレオチド置換又は欠失を報告する１１、１４。ＭＤＭ２  ｍＲＮＡの濃度を、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓにおいて、血液からＭＡＣ単離された白血病細胞由来の合計５０ｎｇのＲＮＡを用いた定量的リアルタイムＰＣＲにより評価した。ＴａｑＭａｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）プローブは、二つの異なる蛍光性レポーターを同時に使用して、ＭＤＭ２  ｍＲＮＡ、参照ｍＲＮＡ、ベータ−グルクロニダーゼを検出するように設計された。遺伝子発現プロファイルは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ２．０マイクロアレイを用いて生成された。
【００７６】
腫瘍標本の評価に基づくと、２８名の患者のうち２３名が野生型ＴＰ５３を、５名の患者がＴＰ５３変異を有している（表６）。１日目には、試験した２８名の患者の、ＲＧ７１１２の２４時間の曲線下面積の平均値（ＡＵＣ０-２４ｈ）は、１９０，３１５ｎｇ＊ｈ／ｍＬ（ＩＱＲ：１１９，０３２-２４２，８５７ｎｇ＊ｈ／ｍＬ）である。２８名の患者の臨床応答は、３のＣＲ、４のＭＬＦＳ、６のＨＩ及び１５のＰＤを含む。Ｃ１Ｄ１０由来の試料中におけるＭＤＭ２  ｍＲＮＡ発現の中央値は、ベースラインの２．４６倍に増大し（ＩＱＲ：１．６２-４．５９）、これはＭＤＭ２転写のｐ５３活性化に起因する薬力学的バイオマーカー応答を実証している。薬物への曝露は、患者の臨床応答と有意な相関を有している（ｐ＝０．００２）。１５名のＰＤ患者のうちの８名が、不十分に曝露されて、１５０，０００ｎｇ＊ｈ／ｍＬ未満のＡＵＣ０-２４ｈと定義されるのに対し、他の三つのカテゴリーでは１名の患者だけが不十分に曝露されている。
【００７７】
2019059737.tif 000037
【００７８】
同定された４遺伝子シグネチャースコアを、２８名のＡＭＬ患者の各々について、ベースラインにおけるＭＤＭ２、ＢＢＣ３、ＸＰＣの和からＣＤＫＮ２Ａ発現量を差し引くことによって計算する。シグネチャースコアと患者のＭＤＭ２アンタゴニスト療法に対する臨床応答との間には有意な相関が存在する（ＰＤ＜Ｈｌ＜ＭＬＦＳ＜ＣＲ）（スピアマン相関係数０．５８、Ｐ＝６．６×１０−４）。シグネチャースコアは、ベースラインからＣ１Ｄ１０までのＭＤＭ２  ｍＲＮＡの変化により測定された、患者の薬力学的バイオマーカー応答とも有意に相関する（スピアマン相関係数０．４１、Ｐ＝０．０２）。シグネチャースコアと患者の臨床応答との相関は、１５０，０００ｎｇ＊ｈ／ｍＬより高いＡＵＣ０−２４ｈを有する患者と定義される、十分に高度に曝露した１５名の患者のサブセットの場合に更に増強される（スピアマン相関係数０．６４、Ｐ＝５．２ｘ１０−３）。
【００７９】
この４遺伝子のシグネチャーパネルは、以下の方式で、ＭＤＭ２阻害剤による治療に続いて応答カテゴリーにＡＭＬ患者を区別することができる：０．８２のＲＯＣ曲線のＡＵＣによりＰＤ／Ｈｌ患者からＣＲ／ＭＬＦＳ患者を、０．８３のＡＵＣによりＰＤ患者からＣＲ／ＭＬＦＳ／Ｈｌを区別する。対照的に、単一のバイオマーカーとしてのＭＤＭ２  ｍＲＮＡ発現は、０．５１のＡＵＣによりＰＤ／ＨＩ患者からＣＲ／ＭＬＦＳ患者を、０．６１のＡＵＣによりＰＤ患者からＣＲ／ＭＬＦＳ／Ｈｌ患者を区別することしかできなかった。シグネチャースコア１５というカットオフポイントを用いて、患者は、ＭＤＭ２アンタゴニスト療法に先立つベースラインにおいて、それぞれ１００％感受性及び７１％特異性で、応答すると思われる群と応答しないと思われる群に分類さる。したがって、シグネチャーパネルは、最も応答する可能性が高いと思われるＡＭＬ患者のサブセットを選択するため；及び応答する可能性が低いと思われるＡＭＬ患者を曝露することを回避するための、ＭＤＭ２アンタゴニスト療法に援用される予測バイオマーカーとして用いられる大きな可能性を有する。
【００８０】
したがって、一実施態様では、本発明は、ＭＤＭ２阻害剤の投与を含む治療法に応答すると思われるがん患者を同定する方法を提供し、この方法は、
ａ）患者から試料を採取すること；
ｂ）試料中のＭＤＭ２  ｍＲＮＡの発現量を測定すること；
ｃ）患者のＭＤＭ２  ｍＲＮＡ発現量を、同じがんを有する患者の標準値と比較すること；及び
ｄ）ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用の阻害剤として作用する化合物を投与すること
を含む。
「標準値」は、例えば、本明細書に定義される患者のシグネチャースコアのカットオフ値（カットオフポイント又は基準レベル）である。
【００８１】
別の実施態様では、本発明は、ＭＤＭ２阻害剤を含む治療法に応答すると思われるがん患者を同定するインビトロ法を提供し、この方法は、
ａ）治療に先立って患者から取得された試料中の、ＭＤＭ２、ＸＰＣ、ＢＢＣ３及びＣＤＫＮ２ＡのｍＲＮＡ発現量を測定すること；
ｂ）ａ）で取得された発現量を、患者のシグネチャースコアを計算するために数学的方程式に適用すること；
ｃ）ｂ）から得られた前記患者のシグネチャースコアを、基準レベルと比較すること；及び
ｄ）患者のシグネチャースコアが前記基準レベルを上回るとき、前記患者を、前記ＭＤＭ２阻害剤を含む治療法に対する応答性が高いと同定すること
を含む。
【００８２】
一実施態様では、基準レベルを上回る患者のシグネチャースコアは、ＭＤＭ２阻害剤を用いた治療に対する患者の応答性が高いことを示し、一方、前記レベルを下回るシグネチャースコアは、このような治療に対する前記患者の応答性が低いことを示す。
【００８３】
一実施態様では、ａ）で取得される試料は、血液白血病試料、又は骨髄生検試料である。
【００８４】
別の実施態様では、ｂ）での患者のシグネチャースコアは、ベースラインで（即ち、治療前に）測定された、ｌｏｇ２変換されたｍＲＮＡ発現量の和に、観察されたインビトロでの方向を乗じたものから計算され、これはシグネチャースコア＝ＧＭＤＭ２＋ＧＸＰＣ＋ＧＢＢＣ３−ＧＣＤＫＮ２Ａと定義される。この実施態様において、ベースラインでのｍＲＮＡ発現量は、好ましくはＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ２．０アレイを用いることにより、マイクロアレイ測定により測定される。また、この実施態様においては、ベースラインでのｍＲＮＡ発現量は、ＲＮＡシーケンシングによって測定されてもよい。
【００８５】
一実施態様では、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ２．０アレイ測定（「マイクロアレイ技術」又は「マイクロアレイ測定値」）を用いて計算された患者のシグネチャースコアの基準レベルは１４．０又は１４．５である。別の実施態様では、患者のシグネチャースコアの基準レベルは１５である。好ましい実施態様では、患者のシグネチャースコアの基準レベルは１５．４である（ヨーデン指標により選択）。
【００８６】
別の実施態様では、患者のシグネチャースコアは、ＲＴ  ＰＣＲ測定値によって得られるｍＲＮＡ発現量に基づいて計算される。ＲＴ  ＰＣＲを用いて計算される患者のシグネチャースコアは、マイクロアレイ技術に基づいて計算された値とは異なるかもしれない。しかしながら、本発明によるこの実施態様では、ＲＴ  ＰＣＲに基づく患者のシグネチャースコアは、当業者に周知のように、これら方法間に確立された相関関係によりマイクロアレイ技術を使用するときに得られる値に変換することができる。
別の実施態様では、ベースラインでのｍＲＮＡ発現量がＲＴ−ＰＣＲによって測定されるとき、ｂ）での患者のシグネチャースコアは、アルゴリズム１に基づいて、即ちベースラインで（即ち、治療前に）測定されてｌｏｇ２変換された相対的発現量（デルタ−ＣＰ）の和に、観察されたインビトロでの方向を乗じたものに基づいて計算され、これは、シグネチャースコア＝ＧＭＤＭ２＋ＧＸＰＣ＋ＧＢＢＣ３−ＧＣＤＫＮ２Ａ（式中、Ｇ＝デルタ−ＣＰ、したがってデルタ−ＣＰＭＤＭ２＝ＣＰハウスキーパー−ＣＰＭＤＭ２、デルタ−ＣＰＸＰＣ＝ＣＰハウスキーパー−ＣＰＸＰＣ、デルタ−ＣＰＢＢＣ３＝ＣＰハウスキーパー−ＣＰＢＢＣ３、デルタ−ＣＰＣＤＫＮ２Ａ＝ＣＰハウスキーパー−ＣＰＣＤＫＮ２Ａ）と定義される。「ハウスキーパー」遺伝子はＴＭＥＭである。
同じ患者試料の組で測定した場合、ＲＴ−ＰＣＲに基づくシグネチャースコアの測定値（上記アルゴリズム１の下での）は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ２．０アレイに基づくシグネチャースコアの測定値と、相関関数０．７９で相関している。この実施態様において、ＲＴ−ＰＣＲ測定値に基づく患者のシグネチャースコアの基準レベルは約２．０、又は２．１０又は２．２０である。またこの実施態様において、患者のシグネチャースコアの基準レベルは２．２６である（ヨーデン指標により選択）。
【００８７】
また別の実施態様では、ベースラインでのｍＲＮＡ発現量がＲＴ−ＰＣＲによって測定されるとき、ｂ）での患者のシグネチャースコアは、アルゴリズム２に基づいて、即ちベースラインで（即ち、治療前に）測定された相対的発現量（２デルタ−ＣＰ）の和に、観察されたインビトロでの方向を乗じたものに基づいて計算することもでき、これは、シグネチャースコア＝ＧＭＤＭ２＋ＧＸＰＣ＋ＧＢＢＣ３−ＧＣＤＫＮ２Ａ（式中、Ｇ＝２デルタ−ＣＰ、デルタ−ＣＰはアルゴリズム１で定義された通り）と定義される。「ハウスキーパー」遺伝子はＴＭＥＭである。
同じ患者試料の組で測定した場合、ＲＴ−ＰＣＲに基づくシグネチャースコアの測定値（上記アルゴリズム２の下での）は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ２．０アレイに基づくシグネチャースコアの測定値と、相関関数０．６３で相関している。この実施態様において、ＲＴ−ＰＣＲ測定値に基づく患者のシグネチャースコアの基準レベルは約４．１０、又は４．２０又は４．３０である。またこの実施態様において、患者のシグネチャースコアの基準レベルは４．３４である（ヨーデン指標により選択）。
【００８８】
一実施態様では、がんは血液学的腫瘍、好ましくはＡＭＬ、又はＭＤＳ、又はＭＰＮである。
【００８９】
別の実施態様では、がんは、例えば肺、前立腺、結腸、頭部、頸部、又は膵臓のがん又は肉腫又はメラノーマといった固形腫瘍である。
【００９０】
一実施態様では、ＭＤＭ２−阻害剤は、具体的に米国特許第８３５４４４４Ｂ２号、又は国際公開第２００７／０６３０１３号、国際公開第２０１０／０３１７１３号、国際公開第２０１１／０９８３９８号及び国際公開第２０１３／１３５６４８号に開示されている化合物；又は式Ｉ、ＩＩ、ＩＩａ又はＩＩＩによる化合物、又はそれらの、好ましくは式ＩＩａ又はＩＩＩによる化合物の組合せである。
【００９１】
別の実施態様では、ＭＤＭ２阻害剤は、本明細書に定義される化合物Ａ（ＲＧ７１１２）である。
【００９２】
また別の実施態様では、ＭＤＭ２阻害剤は、式
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の、化合物４−｛［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−４−（４−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−３−（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−シアノ−５−（２，２−ジメチル−プロピル）−ピロリジン−２−カルボニル］−アミノ｝−３−メトキシ−安息香酸である。
【００９３】
また別の実施態様では、ＭＤＭ２阻害剤は、式：
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（平均ＭＷ：２６９５）の化合物４−｛［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−（４−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−シアノ−５−（２，２−ジメチル−プロピル）−ピロリジン−２−カルボニル］−アミノ｝−３−メトキシ−安息香酸  １−ｍＰＥＧ−カルボニルオキシ−エチル  エステル（ｍＰＥＧ、平均ＭＷ、〜２０００）である。
【００９４】
また別の実施態様では、ＭＤＭ２阻害剤は、化合物４−｛［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−（４−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−シアノ−５−（２，２−ジメチル−プロピル）−ピロリジン−２−カルボニル］−アミノ｝−３−メトキシ−安息香酸  １−ｍＰＥＧ−カルボニルオキシ−エチル  エステル（ｍＰＥＧ、平均ＭＷ、〜２２００）：
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（平均ＭＷ：２９００）である。
【００９５】
また別の実施様態では、ＭＤＭ２阻害剤（アンタゴニスト）を用いた治療に対する患者の応答を予測するための、遺伝子発現（ｍＲＮＡ）シグネチャーの使用が提供される。この実施態様においては、「遺伝子発現シグネチャー」は、ベースラインで、即ちＭＤＭ２阻害剤（アンタゴニスト）を用いた治療に先立って測定したときの、ＭＤＭ２、ＸＰＣ、及びＢＢＣ３の発現増大と、ＣＤＫＮ２Ａの低発現とから構成される、４遺伝子ｍＲＮＡシグネチャーである。
【００９６】
シグネチャースコア測定値は、患者の薬力学的バイオマーカー応答（ＭＤＭ２発現の変化）とも相関する。実施例５に示されるデータは、本発明による４ｍＲＮＡシグネチャースコアが、ＭＤＭ２阻害剤を含む癌治療の有効性をモニタリングするための薬力学的バイオマーカーでもあることを示している。したがって、別の実施態様では、上記に定義するような、がんに罹患した患者における、ＭＤＭ２阻害剤を含む治療法の有効性をモニタリングするためのインビトロ法が提供され、この方法は、
ａ）治療に先立って患者から取得された試料中における、ＭＤＭ２、ＸＰＣ、ＢＢＣ３及びＣＤＫＮ２ＡのｍＲＮＡ発現量を測定すること；
ｂ）ａ）で取得された発現量を、治療前の患者のシグネチャースコアを計算するための数学的方程式に適用すること；
ｃ）工程ａ）及びｂ）を、前記ＭＤＭ２阻害剤を用いた治療の開始後に繰り返すこと；及び
ｄ）治療の開始後に取得されたシグネチャースコアを、治療に先立って取得された同スコアと比較すること
を含み、治療後のシグネチャースコアの方が高い場合に治療に対する患者の応答が示され、従って治療の継続が推奨される。
【００９７】
この実施態様において、ＭＤＭ２阻害剤は上記に定義した通りである。がんは固形腫瘍又はＡＭＬである。ａ）で取得される試料は、血液白血病試料、又は骨髄生検試料である。また、この実施態様においては、治療中のシグネチャースコアは、好ましくは治療開始後、即ちＭＤＭ２阻害剤の初回投与後１０日目に取得される。ＭＤＭ２阻害剤の初回投与後１０日目のシグネチャースコアの差異は、ベースラインで、即ち治療前に測定されたスコアの少なくとも１．２０倍である。好ましい実施態様では、ＭＤＭ２阻害剤の初回投与後１０日目のシグネチャースコアが治療間に測定されたスコアの約１．２３から約１．２６倍であることが、患者が治療に応答すること、及び治療を継続すべきことを示す。
【００９８】
式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩによる化合物、又はそれらの組合せ、又はその薬学的に許容される誘導体は、特に腫瘍性疾患（がん）を治療するために、ヒト又は動物体（対象）（患者）の予防的又は特に治療的処置のために使用することができる。このようながんの例には、限定されないが、上皮性腫瘍、扁平細胞腫瘍、基底細胞性腫瘍、移行細胞乳頭腫及び癌腫、腺癌（ａｄｅｎｏｍａ）及び腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、皮膚付属器腫瘍、粘膜表皮性腫瘍、嚢胞性腫瘍、粘液性及び漿液性腫瘍、腺管、小葉及び髄質性腫瘍、腺房細胞腫瘍、複合上皮性腫瘍、分化性腺腫瘍、傍神経節腫及びグロムス腫瘍、母斑及びメラノーマ、軟組織腫瘍及び肉腫、線維腫性腫瘍、粘液腫性腫瘍、脂肪腫性腫瘍、筋腫性腫瘍、複合混合性及び間質性腫瘍、線維上皮腫瘍、骨液様腫瘍、中皮腫瘍、胚細胞腫瘍、絨毛性腫瘍、中堅腫、血管腫瘍、リンパ管腫瘍、骨及び軟骨性腫瘍、巨細胞腫瘍、種々の骨腫瘍、歯原性腫瘍、神経膠腫、神経上皮性（ｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉｏｍａｔｏｕｓ）腫瘍、髄膜腫、神経鞘腫瘍、顆粒細胞腫瘍及び胞巣状軟部肉腫、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、他のリンパ網細腫瘍、形質細胞腫瘍、マスト細胞腫瘍、免疫増殖性疾患、白血病、種々の骨髄増殖性疾患、リンパ増殖性疾患及び骨髄異形成症候群が含まれる。
【００９９】
特に好ましくは、本発明による疾患は、腫瘍性疾患、がん、及び特にＡＭＬである。
【０１００】
罹患した身体の器官及び部分の観点から、がんの例には、限定されないが、乳房、子宮頸部、卵巣、結腸、直腸、（結腸及び直腸、即ち結腸直腸がんを含む）、肺（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、大型細胞肺がん及び中皮腫を含む）、骨、内分泌系、副腎、胸腺、肝臓、胃、腸、（胃がんを含む）、膵臓、骨髄、血液悪性腫瘍（例えばリンパ腫、白血病、骨髄腫又はリンパ性悪性腫瘍）、膀胱、尿管、腎臓、皮膚、甲状腺、脳、頭部、頸部、前立腺及び精巣が含まれる。好ましくは、がんは、乳がん、前立腺  がん、子宮頚がん、卵巣がん、胃がん、結腸直腸がん、膵臓がん、肝臓がん、脳のがん、神経内分泌がん、肺がん、腎臓がん、血液悪性腫瘍、メラノーマ及び肉腫からなる群より選択される。特に好ましくは、がんは、乳がん、子宮頚がん、卵巣がん、結腸直腸がん、メラノーマ及び肺がんからなる群より選択される。更には、特に好ましくは、がんは、肺がん、メラノーマ、卵巣がん及び結腸直腸がんからなる群より選択される。別の好ましい実施態様では、予測される抵抗性が後天性の抵抗性である場合、がんは肺がん又は卵巣がんである。また別の好ましい実施態様では、予測される抵抗性が先天性の抵抗性である場合、がんは、結腸直腸がん、肺がん又はメラノーマからなる群より選択される。
【０１０１】
治療の方法
本発明は、まずは感受性に関する患者由来の試料の活性レベルが一又は一組の標準レベル又は治療前開始レベルに対して確立され、次いでＭＤＭ２−阻害剤が投与される、治療方法にも関与する。好ましくは、前記ＭＤＭ２−阻害剤は、上記に定義されたように、一般式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩの化合物、又はその薬学的に許容される誘導体であり、更に好ましくは、式ＩＩａ又はＩＩＩの化合物、又はその薬学的に許容される誘導体である。前記化合物は、当業者には周知のように、薬学的組成物中において投与されうる。恒温動物、とくにヒトへの、鼻腔、頬側、直腸といった投与、又は特に経口投与のための、及び静脈内、筋肉内又は皮下投与といった非経口投与のための組成物が、特に好ましい。更には、特に静脈内投与のための組成物が好ましい。
【０１０２】
一般式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ、好ましくはＩＩａ又はＩＩＩの化合物、又はその薬学的に許容される誘導体を、単独で又は一又は複数の他の治療剤と組み合わせて投与することができる。可能な併用療法は、固定の組合せ、又は交互に又は互いに独立して与えられる、本発明の化合物と一又は複数の他の治療剤との投与、又は固定の組合せと一又は複数の治療剤との併用投与の形態をとることができる。
【０１０３】
それに代えて又は加えて、一般式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ、好ましくはＩＩａ又はＩＩＩの化合物、又はその薬学的に許容される誘導体を、特に腫瘍治療法のために、化学療法（細胞傷害性療法）、標的療法、内分泌療法、放射線療法、免疫療法、外科的処置、又はこれらの組合せと組合わせて投与することができる。上述のように、他の治療戦略という意味でのアジュバント療法と同様に、長期療法が等しく可能である。他の可能な治療は、腫瘍縮小後に患者の状態を維持するための治療法、又は例えば危険な状態の患者のための化学的予防療法である。
【０１０４】
キット及びデバイス
本発明は、定義された一般式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、好ましくはＩＩａ又はＩＩＩの化合物、又はその薬学的に許容される誘導体に対する、好ましくは対象（又は患者）のがんの応答を予測するための、一態様ではキットに、別の態様ではデバイスに関し、このキット又はデバイスはＭＤＭ２遺伝子を測定するために必要な試薬を含む。
【０１０５】
キット及びデバイスは、好ましくは、試料中のＭＤＭ２のレベルの比較対象となる一つ又は一組の標準値を含むコンパレーターモジュールを含みうる。好ましい実施態様では、コンパレーターモジュールは、キットの使用説明書に含まれる。別の好ましい実施態様では、コンパレーターモジュールは、表示装置、例えば、抵抗性レベルを示すために、試料測定値の読み出しに隣接して配置されるように設計された、カラーストリップ又は数値コード材料の形態である。一又は一組の標準値は、上述のように決定される。
【実施例】
【０１０６】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであって、限定するものではない。
【０１０７】
実施例１
ＣＥＬＬＯ細胞株のＲＮＡシーケンシング
Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＮＧＳ）技術によるＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）は、遺伝子発現を測定するための正確で感度の高い手法であり、更には、選択的スプライシング、対立遺伝子に特異的な発現、ノンコーディングＲＮＡ、及び変異の様々な形態（ＳＮＰ、インデル、遺伝子融合）を検出するためのパワーを有する。ＮＧＳ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑマシンは、５０又は１００ｂｐ長の読み取りに生のベースコールを生成し、これらは複数のデータ分析工程に供される。ＲＮＡ−ｓｅｑは、試料ごとに４０００〜５０００の読み取りを行うように実行される。この数字は、低発現遺伝子を検出する比較的高い感受性を提供すると共に、費用効率的な試料の多重化を可能にする。ＲＮＡは、ｐｏｌｙＡ  ＴｒｕＳｅｑ  Ｉｌｌｕｍｉｎａキットによる標準キットとＲＮＡライブラリーによって調製される。一つの細胞株につき１００ｎｇのｍＲＮＡが、各ＲＮＡ−ｓｅｑ反応のために使用される。複数の品質管理手順が、各試料のＲＮＡ−ｓｅｑデータに適用される。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑソフトウェアは、各レーンにローディングされるクラスター（ＤＮＡ断片）の総数、パーセントシーケンシングクオリティフィルター通過（オーバーローディング及びシーケンシング化学に起因するエラーを同定する）、各配列読み取りの各ベースのｐｈｒｅｄクオリティスコア、各シーケンスサイクルの全体の平均ｐｈｒｅｄスコア、及び全体のパーセントエラー（参照ゲノムに対するアラインメントに基づく）を報告する。各ＲＮＡ−ｓｅｑ試料について、ミトコンドリア及びリボソームＲＮＡを含む読み出しのパーセンテージが計算される。ＦＡＳＴＱＣパッケージが、更なるＱＣ測定基準（ベース分布、配列重複、過剰表示配列、及び濃縮ｋｍｅｒ）並びに図式的要約を提供するために使用される。最後に、３”バイアスの推定を含む更なるＲＮＡ−ｓｅｑ測定基準を提供するＰｉｃａｒｄツールキットが使用され（試料調製物中のｃＤＮＡ合成のためのポリ−Ａ捕獲又はプライミングの使用により引き起こされる）、リードのパーセンテージがエクソン、イントロン、及び遺伝子間領域へマッピングされる。
【０１０８】
実施例２
ＣＥＬＬＯ細胞株のＥｘｏｍシーケンシング
化合物Ａのインビトロアッセイ
２８１の細胞をＭＤＭ２アンタゴニストで処理し、ＩＣ５０（治療法への応答）を生成する。細胞株は起源の広範な腫瘍細胞種類にわたる。
【０１０９】
２８１の細胞株の中で、２１０の細胞株は、低質のコール及び生殖系列の変異を除去する注意深い注釈付けの後、ＴＰ５３に変異を示す。処理した７のＡＭＬ細胞株のうち、５がＴＰ５３に変異を示した。変異ＴＰ５３を有する細胞株は、ＭＤＭ２アンタゴニスト療法に対する感受性が極めて低く（Ｐ＜２．２ｘ１０−１６）、これは過去文献によるデータと一貫している。ベースラインｍＲＮＡ発現とＭＤＭ２アンタゴニスト療法への応答（ＩＣ５０）とのゲノム全体にわたる関連付けにより、２．３８ｘ１０−４７から９．５６ｘ１０−２３にわたるＰ値と大きな関連を有する１３の遺伝子のリストが同定される（補足として表２）。機能注釈は、ゲノム全体の関連に基づく１３の重要な遺伝子が、−０．４７から−０．３１（一つの正の相関０．２８を含む）にわたる相関係数を有しており、細胞周期の停止及びアポトーシスを含め、関連するＭＤＭ２−ｐ５３相互作用又は下流のＰ５３経路における既知の制御因子であることを示した（補足として表２）。その中でも、ＭＤＭ２は、インビトロでの感受性と相関するＭＤＭ２の過剰発現を伴う４番目に高い遺伝子であり、これは過去文献と一貫している。
【０１１０】
ＭＤＭ２、ＸＰＣ（色素性乾皮症、相補群Ｃ）、ＢＢＣ３（ＢＣＬ２結合成分３）を含む三つの遺伝子の上方制御と、腫瘍抑制遺伝子ＣＤＫＮ２Ａ（サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ）の下方制御を含む、多変異ロジスティック抗体分類指標が同定される（表２）。最終シグネチャーは、０．９３のＡＵＣ（９５％  ＣＩ  ０．９２〜０．９５）を有するＭＤＭ２アンタゴニスト抵抗性細胞株からＭＤＭ２アンタゴニスト感受性細胞株を区別することができる。したがって、ＭＤＭ２アンタゴニスト感受性細胞株は、ＭＤＭ２、ＸＰＣ、及びＢＢＣ３のベースラインの上方制御と、ＣＤＫＮ２Ａの下方制御とを示し；一方ＭＤＭ２アンタゴニスト抵抗性細胞株は、ＭＤＭ２、ＸＰＣ、ＢＢＣ３の下方制御と、ＣＤＫＮ２Ａの上方制御とを特徴とする（図２）。
【０１１１】
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【０１１２】
標的遺伝子ＭＤＭ２に加えて、シグネチャーの他の三つの遺伝子はすべて、ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用又は下流のｐ５３経路における制御因子として生物学的にサポートされる。ＸＰＣ遺伝子は、損傷ＤＮＡの修復に関与する重要な役割を果たし、損傷認識、オープンな複合体形成、及び修復タンパク質複合体形成に貢献する。アポトーシスのｐ５３上方制御モジュレーター（ＰＵＭＡ）としても知られるＢＢＣ３は、ＤＮＡ−損傷剤への曝露及びＤＮＡ損傷誘導アポトーシスを媒介するｐ５３により誘導された。ＣＤＫＮ２Ａの二つの遺伝子産物であるｐ１６及びｐ１４ＡＲＦは、共に主要な腫瘍抑制因子経路に結合しており、特にＭＤＭ２機能を核小体中において隔離することによりそれを阻害するｐ１４ＡＲＦがそうである。ｍＲＮＡシグネチャーの基礎となる分子メカニズムを調べるために、本発明者らは更に、ｍＲＮＡシグネチャースコアを、ｐ５３の変異状態と、ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用及び下流のｐ５３経路に関与する重要な制御遺伝子と相関させる（表４）。図２に示すように、低シグネチャースコアを有する細胞株は、恐らくはｐ５３変異していた；一方高シグネチャースコアを有する細胞株は恐らくはｐ５３野生型（Ｐ＜２．２×１０−１６）である。更に、本発明者らは、野生型ＴＰ５３を有するがシグネチャースコアの低い抵抗性細胞株の大部分が、ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用及び下流のｐ５３経路に関与する重要な制御遺伝子に変異を有することを同定した。これらの証拠は、シグネチャースコアが、ＭＤＭ２−Ｐ５３経路機能の代理的なｍＲＮＡレベル指標として働きうるという可能性を示した。
【０１１３】
試験される腫瘍種類全体のｍＲＮＡシグネチャースコアの特異的予測力を調べるため、及びシグネチャースコアに基づく予測が腫瘍系統により交絡していないことを確認するため、更にＣＥＬＬＯの入手可能な各腫瘍種類内のシグネチャースコアを調べた（表８）。シグネチャースコアの予測力は、ＡＭＬ細胞株に保存されることに注意されたい。
【０１１４】
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【０１１５】
種々のアッセイプラットフォームでのｍＲＮＡシグネチャーの頑健な証拠は、バイオマーカーを開発するうえでの臨床において重要である。この試験の場合、シグネチャーは、その感受性とマイクロアレイ技術におけるダイナミックレンジの拡大とを利用する、発現測定値のＲＮＡｓｅｑ定量化により開発される。表２に示すように、ＲＮＡｓｅｑにより測定された四つの遺伝子のｍＲＮＡ発現量は、マイクロアレイにより測定されたものとよく相関している。個体遺伝子の高い差別能力と全体のスコアはマイクロアレイ定量化を通して保存される。
【０１１６】
実施例３
インビトロアッセイ遺伝子発現分析法
ＭＤＭ２アンタゴニスト療法に先立つ、ベースラインでのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現量は、ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）及びＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ２．０アレイを用いたマイクロアレイ測定により得られる。ＲＮＡ−ｓｅｑデータの遺伝子発現分析をここにまとめる。まず、配列読み取りを、参照ヒトゲノム、及び参照ゲノム上の既知のエクソン位置から誘導されるスプライス接合断片の追加的なデータベースにマッピングする（Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓソフトウェア）。次いで、これらマッピングされたデータを組合わせ、遺伝子毎に読み取り（又は配列決定された塩基）の離散的計数を生成する。次いで、これら遺伝子発現の計数を、各試料のＲＮＡ計数の総量を均一にするように正規化し、遺伝子／転写長について補正する（ＲＰＫＭ）。すべての細胞株において、ＲＰＫＭ＝１を下回る発現値を有する遺伝子をすべて除去する（これは、細胞一つ当たりのＲＮＡ分子の一つのコピーより低い発現レベルにほぼ等しい）。次に、正規化した遺伝子計数を、負の二項モデルにより差別的に発現した（ＤＥ）遺伝子を見つける統計方法を用いて、応答細胞株と非応答細胞株とで差別的に発現した遺伝子を同定するために統計学的に試験する。実施される負の二項モデルはＤＥｓｅｑソフトウェアである。２０３５５遺伝子は、ＱＣ後に差別的発現分析に供される。統計学的有意性を決定するために、ボンフェローニ相関しきい値が使用された。偽発見率も推定して報告される。
【０１１７】
４遺伝子シグネチャーの開発
一変量のＤＥ分析に基づく１２の重要な遺伝子を、シグネチャー構築の候補と定める。遺伝子を、非応答細胞株に対する応答細胞株の倍率変化によりランク付けする。ポジティブ遺伝子を、１より大きい倍率変化を有するものと定義し、ネガティブ遺伝子を、１より小さい倍率変化を有するものと定義する。次いで、多変量ロジスティック回帰分類指標を、１０分割交差検証を用いた受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積を最大化するための上方モデル選択手順により構築する。モデル選択は、Ｒパッケージｂｅｓｔｇｌｍによる実装手順である。最終的な選択モデルは４つの遺伝子から構成される。したがって、各細胞株は、それらの回帰率により重み付けしたそれらの遺伝子発現値（ｌｏｇ変換されたＲＰＫＭ）の線形組合せにより予測され、化合物Ａのシグネチャー＝１．４３ＧＭＤＭ２＋１．２３ＧＸＰＣ＋０．４８ＧＢＢＣ３−０．７３ＧＣＤＫＮ２Ａとして定義される。
【０１１８】
マイクロアレイ遺伝子発現分析法
マイクロアレイ間の変動を低減するため、各マイクロアレイ中の試料の強度値を、分位点正規化法によりスケール調整する。次いで各強度値をｌｏｇ２変換する。
【０１１９】
化合物Ａの臨床治験における４遺伝子シグネチャーの評価
ＮＯ２１２７９フェーズ１臨床治験において、再発性／抵抗性白血病を有する患者を、化合物Ａの漸増投与により処置する。ＭＴＤ（１５００ｍｇ  ＢＩＤ×１０日）で処置した患者のサブセット由来の標本を、現行の遺伝子発現試験の一部として評価する。血液白血病試料は、ベースライン、サイクル１の２日目（Ｃ１Ｄ２）及びサイクル１の１０日目（Ｃ１Ｄ１０）において収集し、ＭＡＣ分離により単離する。
【０１２０】
治療に先立つベースラインでの４遺伝子のｍＲＮＡ発現値に基づいて、患者のリスクスコアを計算する。正確且つ先入観を排した検証を確実にするために、試験群に係数は適用しない。しかしながら、プラットフォームの違い及び患者と細胞株との大きな生物学的差異に起因して、患者レベル分類指標のインビトロ係数の組を直接適用することはできない。したがって、患者のシグネチャースコアは、単純に、マイクロアレイ分析によって測定したものに観察されたインビトロでの方向を乗じたシグネチャー遺伝子の発現量の和であり、化合物Ａシグネチャー＝ＧＭＤＭ２＋ＧＸＰＣ＋ＧＢＢＣ３−ＧＣＤＫＮ２Ａと定義される。これが遺伝子発現量の最適な組み合わせでないことに注意されたい。したがって、報告されたスコアの関連付け及び推測力は、スコア成績の控えめな見積である。
【０１２１】
実施例４
マイクロアレイ遺伝子発現分析法
マイクロアレイ間の変動を低減するため、各マイクロアレイ中の試料の強度値を、分位点正規化法により置換する。次いで各強度値をｌｏｇ２変換する。
【０１２２】
化合物Ａの臨床治験における４遺伝子シグネチャーの検証
ＮＯ２１２７９フェーズ１臨床治験において、再発性／難治性白血病を有する患者を、化合物Ａの漸増投与により処置する。ＭＴＤ（１５００ｍｇ  ＢＩＤ×１０日）で処置した患者のサブセット由来の標本を、現行の遺伝子発現試験の一部として評価する。白血病試料は、ベースライン、サイクル１の２日目（Ｃ１Ｄ２）及びサイクル１の１０日目（Ｃ１Ｄ１０）において収集し、ＭＡＣ分離により単離する。
【０１２３】
治療に先立つベースラインでの４遺伝子のｍＲＮＡ発現値に基づいて、患者のリスクスコアを計算する。正確且つ先入観を排した検証を確実にするために、試験群における係数の計算は行わない。しかしながら、プラットフォームの違い及び患者と細胞株との生物学的差異に起因して、患者レベル分類指標のインビトロ係数は適用しない。したがって、患者のシグネチャースコアは、単純に、マイクロアレイ分析によって測定したものに観察されたインビトロでの方向を乗じたシグネチャー遺伝子の発現量の和であり、化合物Ａのシグネチャー＝ＧＭＤＭ２＋ＧＸＰＣ＋ＧＢＢＣ３−ＧＣＤＫＮ２Ａと定義される。これが遺伝子発現量の最適な組み合わせではないこと、したがって報告されるスコアの関連付け及び予測力はスコア成績の控えめな予測であることに注意されたい。
【０１２４】
実施例５
インビボ試験
ＮＯ２１２７９のフェーズ１臨床治験において、再発性／難治性白血病を有する患者を、ＲＧ７１１２の漸増投与により処置する。ＭＴＤ（１５００ｍｇ  ＢＩＤ×１０日）で処置した患者のサブセット由来の標本を、現行の遺伝子発現試験の一部として評価する。白血病試料は、ベースライン、サイクル１の２日目（Ｃ１Ｄ２）及びサイクル１の１０日目（Ｃ１Ｄ１０）において収集し、ＭＡＣ分離により単離する。
【０１２５】
患者は、年齢中央値が５９歳である男性１８名と女性１０名から構成される。腫瘍標本アセスメントに基づくと、２８名の患者のうち２３名が野生型ＴＰ５３を、５名の患者がＴＰ５３変異を有する（一名の患者がイントロン７に変異Ａ〜Ｃを；二名の患者がエクソン５に変異ＣＧＣ〜ＣＡＣを；一名の患者がエクソン９フレームシフトに欠失Ｇ  ３２３＿３−３２４＿１を；一名がエクソン７に変異Ｓ２４０Ｇ−−Ｓ２４０、ＡＧＴ〜ＧＧＴを、それぞれ有する）。１日目には、試験した２８名の患者の、化合物Ａの２４時間の曲線下面積（ＡＵＣ０-２４ｈ）は１９０，３１５ｎｇ＊ｈ／ｍＬ（ＩＱＲ：１１９，０３２-２４２，８５７ｎｇ＊ｈ／ｍＬ）である。臨床応答を評価し、４つのカテゴリー、即ち：完全寛解（ＣＲ）、形態学的に白血病のない状態（ＭＬＦＳ）、血液学的改善（ＨＩ）、及び進行性疾患（ＰＤ）に分ける。３のＣＲ、４のＭＬＦＳ、６のＨＩ及び１５のＰＤを含む２８名の患者において臨床応答を評価する。ベースライン試料のアセスメントに加え、処置試料も評価する（サイクル１、１０日目）。Ｃ１Ｄ１０由来の生検中におけるＭＤＭ２  ｍＲＮＡ発現の中央値は、ベースラインの２．４６倍に増大しており（ＩＱＲ：１．６２-４．５９）、このことはＭＤＭ２転写のｐ５３活性化に起因する薬力学的バイオマーカー応答を実証している。
【０１２６】
ＭＴＤで投与された２８名の評価可能な患者のベースラインの血液細胞標本を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０マイクロアレイを用いて評価する。同定された４つの遺伝子シグネチャースコアを、２８名の患者の各々について、ベースラインにおけるＭＤＭ２、ＢＢＣ３、ＸＰＣの和からＣＤＫＮ２Ａ発現量を差し引くことによって計算する。シグネチャースコアと患者のＭＤＭ２アンタゴニスト療法に対する臨床応答との間には有意な相関が存在する（ＰＤ＜Ｈｌ＜ＭＬＦＳ＜ＣＲ）（スピアマン相関係数０．５８、Ｐ＝６．６×１０−４）。シグネチャースコアは、ベースラインからＣ１Ｄ１０までのＭＤＭ２  ｍＲＮＡの変化により測定した、患者の薬力学的バイオマーカー応答とも有意に相関する（スピアマン相関係数０．４１、Ｐ＝０．０２；図３）。シグネチャースコアと患者の臨床応答との相関は、更に、１５０，０００ｎｇ＊ｈ／ｍＬより高いＡＵＣ０−２４ｈを有する患者と定義される、十分に高度に曝露される１５名の患者のサブセットについて増強されている（スピアマン相関係数０．６４、Ｐ＝５．２ｘ１０−３）。このパネルは、０．８２のＲＯＣ曲線のＡＵＣによりＰＤ／Ｈｌ患者からＣＲ／ＭＬＦＳ患者を（図４、表１０）、０．８３のＡＵＣによりＰＤ患者からＣＲ／ＭＬＦＳ／Ｈｌを（図４）区別することができた。対照的に、単一のバイオマーカーとしてのＭＤＭ２  ｍＲＮＡ発現は、０．５１のＡＵＣによりＰＤ／ＨＩ患者からＣＲ／ＭＬＦＳ患者を、０．６１のＡＵＣによりＰＤ患者からＣＲ／ＭＬＦＳ／Ｈｌ患者を区別することしかできなかった。
【０１２７】
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【０１２８】
シグネチャースコア１５、又は１５．４（ヨーデン指標により選択）というカットオフポイントを用いて、患者は、ＭＤＭ２アンタゴニスト療法に先立つベースラインにおいて、それぞれ１００％感受性及び７１％特異性で、応答すると思われる群と応答しないと思われる群に分類される。したがって、シグネチャーパネルは、最も応答する可能性が高いと思われるＡＭＬ患者のサブセットを選択するため；及び応答する可能性が低いと思われるＡＭＬ患者を曝露することを回避するための、ＭＤＭ２アンタゴニスト療法のバイオマーカーとして援用される大きな可能性を有する。
【０１２９】
ｍＲＮＡシグネチャーの基礎となる分子メカニズムを理解するために、ｍＲＮＡシグネチャースコアをＴＰ５３の変異状態と相関させる。低シグネチャースコアを有する患者はＴＰ５３変異である可能性が高いと思われ；高シグネチャースコアを有する患者はＴＰ５３野生型又は良性変異であることが予測されるＴＰ５３変異である可能性が高いと思われる（Ｐ＝６．８６×１０−２）。五名のｐ５３変異患者のうち、四名が平均スコア１４．２±０．８を有する進行性疾患を示し（一名の患者がイントロン７に変異Ａ〜Ｃを；２名の患者がエクソン５に変異ＣＧＣ〜ＣＡＣを；一名の患者がエクソン９フレームシフトに欠失Ｇ  ３２３＿３−３２４＿１を有する）、残りの一名はエクソン７に変異Ｓ２４０Ｇ−  Ｓ２４０、ＡＧＴ〜ＧＧＴを有するＭＬＦＳを示し、ＩＡＲＣデータべスによるＤＮＡとの又はＤＮＡと相互作用するアミノ酸残基との直接的でない相互作用、及びスコア１５．８を予測する。この証拠は、シグネチャースコアが、ＭＤＭ２−Ｐ５３経路機能の代理的なｍＲＮＡレベル指標として働きうるという可能性を示す。
【０１３０】
ｍＲＮＡシグネチャーの組織特異性を調べるために、ベースライン骨髄細胞標本を、ＭＴＤで投与される１８名の患者の利用可能なサブセットから、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ２．０マイクロアレイを用いて測定する。血液−シグネチャースコアと骨髄−シグネチャースコアとは、スピアマン相関係数０．５０で有意に相関している（Ｐ＝０．０１６）。骨髄−シグネチャースコアは、ＭＤＭ２アンタゴニスト療法に対する患者の臨床応答及び薬力学的バイオマーカー応答と、それぞれスピアマン係数０．４６（Ｐ＝０．０５２）及び０．４２（Ｐ＝０．０６９）で有意に相関していた（ＭＤＭ２発現がサイクル１の１日目からサイクル１の１０日目までに変化する）。
【０１３１】
ｍＲＮＡシグネチャーの薬力学的特性を試験するために、血液細胞標本が、Ｃ１Ｄ１０に２８名の患者の大部分から測定され、Ｃ１Ｄ１０にシグネチャーが取得される。Ｃ１Ｄ１０の試料におけるＭＤＭ２、ＸＰＣ及びＢＢＣ３  ｍＲＮＡ発現の中央値は、ベースラインの２．３７倍（ＩＱＲ：１．７１〜５．００）、１．６９倍（ＩＱＲ：１．２７〜１．８８）、１．４５  倍（ＩＱＲ：１．１３〜１．９９）であり、このことは、シグネチャー中の正に相関した遺伝子について、ＭＤＭ２アンタゴニスト療法により刺激したそれぞれの遺伝子の上方制御を実証している。一方で、Ｃ１Ｄ１０の生検中のＣＤＫＮ２Ａ  ｍＲＮＡ発現の中央値は、ベースラインの０．２６倍（ＩＱＲ：０．０９〜０．３８）に低下しており、このことは、シグネチャー中の負に相関した遺伝子について、ＭＤＭ２アンタゴニスト療法により刺激された下方制御を示す。したがって、Ｃ１Ｄ１０の生検中の全体的なシグネチャースコアは、ベースラインの３．０５倍（ＩＱＲ：１．８８〜４．２３）であり、このことは、ＭＤＭ２アンタゴニスト療法により刺激された全体的スコアの上方制御を示す。要約すれば、シグネチャースコアは、ベースライン（相関係数０．５８、Ｐ＝９ｘ１０−４）で、及び治療レジメン中に測定されたとき、患者の臨床応答と一貫して相関している：Ｃ１Ｄ２（相関係数０．４０、Ｐ＝２．６９ｘ１０−２）、及びＣ１Ｄ１０（相関係数０．６５、Ｐ＝３．５ｘ１０−４）。シグネチャースコアの測定値は、ベースライン（相関係数０．４１、Ｐ＝１．９２ｘ１０−２）、Ｃ１Ｄ２（相関係数０．６４、Ｐ＝１．０７ｘ１０−３）、及びＣ１Ｄ１０（相関係数０．６４、Ｐ＝３．３ｘ１０−４）で測定されたとき、患者の薬力学的バイオマーカー応答（ＭＤＭ２発現の変化）とも一貫して相関している。Ｃ１Ｄ２のシグネチャースコアの中央値は、ＰＤ、ＨＩ、ＭＬＦＳ及びＣＲ患者それぞれについて、ベースラインの１．１１倍（ＩＱＲ：１．０５〜１．１６）、１．０８倍（ＩＱＲ：１．０４〜１．１０）、１．１７倍（ＩＱＲ：１．１４〜１．１９）、及び１．１５倍（ＩＱＲ：１．１３〜１．１５）である。Ｃ１Ｄ１０の中央値スコアは、ＰＤ、ＨＩ、ＭＬＦＳ及びＣＲ患者それぞれについて、ベースラインの１．１４倍（ＩＱＲ：１．０８〜１．２１）、１．２５倍（ＩＱＲ：１．２３〜１．３０）、１．２６倍（ＩＱＲ：１．２３〜１．３１）、及び１．２３倍（ＩＱＲ：１．２２〜１．２４）である。この証拠は、ｍＲＮＡシグネチャースコアが、ＭＤＭ２アンタゴニスト療法活量の予測バイオマーカー及び薬力学的バイオマーカーの両方であることを示している。このように、ベースラインのｍＲＮＡシグネチャースコアは、ＭＤＭ２阻害剤に対する患者の応答を予測し、ＭＤＭ２アンタゴニスト療法は、患者の臨床応答を示す治療サイクル中に様々な度合いで患者を刺激する（図３）。
【０１３２】
実施例６
フェーズＩ形腫瘍治験におけるＭＤＭ２アンタゴニスト療法予測シグネチャーのアセスメント
予測ｍＲＮＡシグネチャーを、更に二つの固形腫瘍治験において評価する（図１）。治験ＮＰ２１２８０において、前治療した３０名の患者及びＣ１Ｄ５の腫瘍生検試料を評価し；ＮＰ２２８９０において、前治療した２０名の患者及びＣ１Ｄ８の腫瘍生検試料を評価する（表１）。両臨床治験において、ｐ５３経路活性化のアセスメントを可能にしたバイオマーカーパッケージを評価し（ｐ５３  ＩＨＣ、ｐ２１  ＩＨＣ、ＭＤＭ２  ｍＲＮＡ、及びＫｉ６７）、ＭＤＭ２の阻害がＰ５３経路を活性化し、細胞増殖を低減する。以前に報告されているように、ＮＰ２２８９０において、Ｐ５３及びＰ２１の濃度、及びＭＤＭ２  ｍＲＮＡ発現はすべて、ベースラインからＣ１Ｄ８までに有意に増加しており、Ｋｉ−６７陽性腫瘍細胞はベースラインから減少している。バイオマーカーの応答におけるこのような変化は、ＭＩＣ−１の変化１２を除いて、薬物曝露と有意に相関していない。ＮＰ２１２８０では、Ｐ５３及びＰ２１の濃度、及びＭＤＭ２  ｍＲＮＡの発現はすべて、Ｃ１Ｄ１０でベースラインから増加しており（それぞれｐ＝２．８８×１０−３、２．３２×１０−３、１．０３×１０−５）；Ｋｉ−６７陽性腫瘍細胞はベースラインから減少している（ｐ＝２．６２×１０−２）。また、バイオマーカーの応答におけるこのような変化は、Ｋｉ−６７陽性腫瘍細胞の数を除いて、薬物曝露と有意に相関している（Ｐ５３の変化の場合ｐ＝４．７７ｘ１０−３、Ｐ２１の変化の場合ｐ＝５．３０×１０−２、及びＭＤＭ２の変化の場合ｐ＝２．５×１０−３）。
【０１３３】
患者のシグネチャースコアを、ベースラインとＣ１Ｄ５（ＮＯ２１２８０）及びＣ１Ｄ８（ＮＰ２２８９０）とにおいて同様に取得する。ｍＲＮＡシグネチャースコアは、化合物Ａの薬物動態学的及び薬力学的マーカーパネルとの相関の、二つの治験間での異質な大きさを示す。ＮＰ２１２８０では、ベースラインスコアは、患者のＭＤＭ２  ｍＲＮＡ発現の変化と、相関係数０．４１（ｐ＝２．８２ｘ１０−２）で有意に相関しているが、シグネチャースコアとＰ２１又はＫｉ−６７陽性腫瘍細胞数との有意な相関は観察されない。ＮＰ２２８９０では、シグネチャースコアとＭＤＭ２の変化及びＰ２１の変化との正相関の示唆が観察されるのみである（表９）。固形腫瘍治験標本の臨床結果の評価は実現していない。
【０１３４】
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【０１３５】
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【図１】
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【図２】
2019059737.tif 000050
【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年12月5日(2018.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを有する患者を治療するための、ＭＤＭ２阻害剤を含む、医薬であって、
ＭＤＭ２阻害剤を含む治療法に対するがん患者の応答性を予測するための方法であって、患者由来の試料においてＭＤＭ２、ＸＰＣ、ＢＢＣ３及びＣＤＫＮ２ＡのｍＲＮＡ発現レベルを測定すること、及びＭＤＭ２阻害剤に対する患者の応答を予測するためのバイオマーカーとして四遺伝子シグネチャースコアを計算するために、そのｍＲＮＡ発現レベルを使用することを含み、
ｉ）同じがんを有する患者由来の一つ又は一組の標準値と比較して；又は
ｉｉ）治療開始前に同じ患者から採取された一つ又は複数の試料と比較して治療開始後に採取された；又は
ｉｉｉ）正常な細胞又は組織由来の一つ又は一組の標準値と比較して；
患者由来の試料の高い四遺伝子シグネチャースコアは、ＭＤＭ２阻害剤による治療に対して感受性であることが予測される方法により、ＭＤＭ２阻害剤による治療に対して感受性であることが予測されたか又は応答性が示された患者に投与される医薬。
【請求項２】
方法において、応答が患者のがん治療法に対する応答であり、バイオマーカーが患者から採取された一つ又は複数の試料中においてインビトロで測定される、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
方法において、ＭＤＭ２阻害剤による治療に対して感受性であることが予測された患者はＭＤＭ２阻害剤が投与されることが推奨される、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項４】
がんを有する患者を治療するための、ＭＤＭ２阻害剤を含む、医薬であって、
がんに罹患した患者における、ＭＤＭ２阻害剤を含む治療法の有効性をモニタリングするためのインビトロ法であって、
ａ）治療に先立って患者から取得された試料中の、ＭＤＭ２、ＸＰＣ、ＢＢＣ３及びＣＤＫＮ２ＡのｍＲＮＡ発現レベルを測定すること；
ｂ）ａ）で取得された発現レベルを用いて、治療に先立つ患者のシグネチャースコアとして表される値を計算すること；
ｃ）工程ａ）及びｂ）を、前記ＭＤＭ２阻害剤を用いた治療の開始後に繰り返すこと；及び
ｄ）治療の開始後に取得されたシグネチャースコアを、治療に先立って取得された同スコアと比較すること
を含み、治療後の方がシグネチャースコアが高い場合に、治療に対する患者の応答性が示され、したがって治療の継続が推奨される方法によりＭＤＭ２阻害剤による治療に対して感受性であることが予測されたか又は応答性が示された患者に投与される医薬。
【請求項５】
ＭＤＭ２阻害剤が、式
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の４−｛［２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−４−（４−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−３−（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−シアノ−５−（２，２−ジメチル−プロピル）−ピロリジン−２−カルボニル］−アミノ｝−３−メトキシ−安息香酸である、請求項１から４のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項６】
ＭＤＭ２阻害剤が、式：
2019059737.tif 000055
の４−｛［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−（４−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−シアノ−５−（２，２−ジメチル−プロピル）−ピロリジン−２−カルボニル］−アミノ｝−３−メトキシ−安息香酸  １−ｍＰＥＧ−カルボニルオキシ−エチル  エステル（ｍＰＥＧ、平均ＭＷ、約２０００）である、請求項１から４のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項７】
ＭＤＭ２阻害剤が、
2019059737.tif 000056
（Ａ）
である、請求項１から４のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項８】
四遺伝子シグネチャーが、ＭＤＭ２、ＸＰＣ、ＢＢＣ３を含む三つの遺伝子の上方制御と、ＣＤＫＮ２Ａの下方制御とからなることを特徴とする、請求項１から７の何れか一項に記載の医薬。
【請求項９】
がんが、乳がん、前立腺がん、子宮頸がん、卵巣がん、胃がん、結腸直腸がん、膵臓がん、肝臓がん、脳腫瘍、神経内分泌がん、肺がん、腎臓がん、血液悪性腫瘍、メラノーマ及び肉腫からなる群より選択される、請求項１から７の何れか一項に記載の医薬。
【請求項１０】
がんが急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
ＭＤＭ２阻害剤が、化合物４−｛［２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−４−（４−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−３−（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−シアノ−５−（２，２−ジメチル−プロピル）−ピロリジン−２−カルボニル］−アミノ｝−３−メトキシ−安息香酸である、請求項１から１０の何れか一項に記載の医薬。
【請求項１２】
ＭＤＭ２阻害剤が、化合物４−｛［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−（４−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−シアノ−５−（２，２−ジメチル−プロピル）−ピロリジン−２−カルボニル］−アミノ｝−３−メトキシ−安息香酸  １−ｍＰＥＧ−カルボニルオキシ−エチル  エステル（ｍＰＥＧ、平均ＭＷ、約２０００）である、請求項１から１０の何れか一項に記載の医薬。
【外国語明細書】
2019059737000001.pdf