(57)【要約】      （修正有）【課題】殺虫活性を細菌、植物、植物細胞、組織および種子に付与する組成物および方法の提供。【解決手段】毒素ポリペプチドについてのコード配列を含む組成物が提供される。コード配列は、植物および細菌中での形質転換および発現のためのＤＮＡ構築物または発現カセット中で使用することができる。組成物としてはまた、形質転換された細菌、植物、植物細胞、組織、および種子が挙げられる。特に、単離毒素核酸分子が提供される。さらに、ポリヌクレオチドに対応するアミノ酸配列、およびそれらのアミノ酸配列に特異的に結合する抗体が包含される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
殺虫活性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる組換え核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列は、
ａ）配列番号１〜４に記載のヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号５〜２６のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号５〜２６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される、組換え核酸分子。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列が、植物中での発現のために設計された合成配列である、請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列が、植物細胞中での前記ヌクレオチド配列の発現を指向し得るプロモーターに作動可能に連結している、請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項４】
請求項１に記載の組換え核酸分子を含んでなる、ベクター。
【請求項５】
異種ポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含んでなる、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
請求項１に記載の組換え核酸を含有する、宿主細胞。
【請求項７】
細菌宿主細胞である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
植物細胞である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の宿主細胞を含んでなる、トランスジェニック植物。
【請求項１０】
植物が、メイズ、ソルガム、コムギ、キャベツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科の植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギおよびアブラナからなる群から選択される、請求項９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１１】
請求項１に記載の核酸分子を含んでなる、トランスジェニック種子。
【請求項１２】
殺虫活性を有する組換えポリペプチドであって、
ａ）配列番号５〜２６のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；および
ｂ）配列番号５〜２６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド
からなる群から選択される、組換えポリペプチド。
【請求項１３】
異種アミノ酸配列をさらに含んでなる、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１２に記載のポリペプチドを含んでなる、組成物。
【請求項１５】
粉末、粉剤、ペレット、粒剤、噴霧剤、乳剤、コロイド、および液剤からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
細菌細胞の培養物の乾燥、凍結乾燥、ホモジナイゼーション、抽出、ろ過、遠心分離、沈降、または濃縮により調製される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
約１重量％〜約９９重量％の前記ポリペプチドを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
鱗翅目、半翅目、鞘翅目、線虫、または双翅目の害虫集団を防除する方法であって、前記集団を殺虫有効量の請求項１２に記載のポリペプチドと接触させることを含んでなる、方法。
【請求項１９】
鱗翅目、半翅目、鞘翅目、線虫、または双翅目の害虫を殺滅する方法であって、前記害虫を殺虫有効量の請求項１２に記載のポリペプチドと接触させること、または前記害虫に殺虫有効量の請求項１２に記載のポリペプチドを摂食させることを含んでなる、方法。
【請求項２０】
殺虫活性を有するポリペプチドを産生する方法であって、請求項６に記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドをコードする核酸分子が発現される条件下で培養することを含んでなる、方法。
【請求項２１】
殺虫活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡ構築物をゲノム中に安定的に取り込んだ植物または植物細胞であって、前記ヌクレオチド配列は、
ａ）配列番号１〜４に記載のヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号５〜２６のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
ｃ）配列番号５〜２６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される、植物または植物細胞。
【請求項２２】
植物を害虫から保護する方法であって、植物またはその細胞中で殺虫ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させることを含み、前記ヌクレオチド配列は、
ａ）配列番号１〜４に記載のヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号５〜２６のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
ｃ）配列番号５〜２６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される、方法。
【請求項２３】
前記植物が、鱗翅目、半翅目、鞘翅目、線虫、または双翅目の害虫に対して殺虫活性を有する殺虫ポリペプチドを産生する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
植物の収穫高を増加させる方法であって、殺虫活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡ構築物をゲノム中に安定的に取り込んだ植物またはその種子を圃場中で生長させることを含み、前記ヌクレオチド配列は、
ａ）配列番号１〜４に記載のヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号５〜２６のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
ｃ）配列番号５〜２６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択され；
前記圃場は、前記ポリペプチドが殺虫活性を有する害虫が蔓延している、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１３年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６１／９１３，９０５号明細書、および２０１３年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６１／９１３，９１１号明細書の利益を主張する。
【０００２】
電子的に提出された配列表の参照
配列表の公式コピーは、２０１４年１１月１４日に作成され、９７キロバイトのサイズを有するファイル名「ＡＰＡ１３６０５４＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」を有するＡＳＣＩＩ形式の配列表として、本明細書と同時にＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。このＡＳＣＩＩ形式の文書中に含まれる配列表は本明細書の一部であり、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、分子生物学の分野に関する。殺虫タンパク質をコードする新規遺伝子が提供される。これらのタンパク質およびそれらをコードする核酸配列は、殺虫配合物の調製において、およびトランスジェニック害虫耐性植物の産生において有用である。
【背景技術】
【０００４】
バシルス・ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）は、昆虫のある目および種に対して特異的に毒性であるが、植物および非標的化生物には無害である結晶性封入体を産生する能力により特徴づけられるグラム陽性胞子形成土壌細菌である。この理由のため、バシルス・ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）株またはその殺昆虫タンパク質を含む組成物は、種々のヒトまたは動物疾患のために農業的昆虫害虫または媒介昆虫を防除するための環境的に許容可能な殺昆虫剤として使用することができる。
【０００５】
バシルス・ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からの結晶（Ｃｒｙ）タンパク質（デルタ−エンドトキシン）は、主に鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａｎ）、双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａｎ）、および鞘翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎ）の幼虫に対して強力な殺昆虫活性を有する。これらのタンパク質はまた、膜翅目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）、同翅亜目（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）、シラミ目（Ｐｈｔｈｉｒａｐｔｅｒａ）、食毛目（Ｍａｌｌｏｐｈａｇａ）、およびダニ目（Ａｃａｒｉ）害虫目、ならびに他の無脊椎動物目、例えば、線形動物門（Ｎｅｍａｔｈｅｌｍｉｎｔｈｅｓ）、扁形動物門（Ｐｌａｔｙｈｅｌｍｉｎｔｈｅｓ）、および肉質鞭毛虫門（Ｓａｒｃｏｍａｓｔｉｇｏｒｐｈｏｒａ）（Ｆｅｉｔｅｌｓｏｎ（１９９３）Ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｆａｍｉｌｙ  ｔｒｅｅ．Ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）に対して活性を示している。これらのタンパク質は最初、主にそれらの殺昆虫活性に基づきＣｒｙＩ〜ＣｒｙＶとして分類された。主要なクラスは、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）特異的（Ｉ）、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）および双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）特異的（ＩＩ）、鞘翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）特異的（ＩＩＩ）、双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）特異的（ＩＶ）、ならびに線虫特異的（Ｖ）および（ＶＩ）であった。タンパク質は亜科にさらに分類され；各科内のより高度に関連したタンパク質は、分類文字、例えば、Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃなどが割り当てられた。各分類内のさらにより密接に関連したタンパク質は、Ｃｒｙ１Ｃ１、Ｃｒｙ１Ｃ２などのような名称が与えられた。
【０００６】
命名法が最近、昆虫標的特異性よりもむしろアミノ酸配列の相同性に基づきＣｒｙ遺伝子について記載された（Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：８０７−８１３）。この分類において、各毒素は、第１ランク（アラビア数字）、第２ランク（大文字）、第３ランク（小文字）、および第４ランク（別のアラビア数字）を取り込むユニークな名称が割り当てられる。第１ランクにおいてローマ数字がアラビア数字に置き換えられている。４５％未満の配列同一性を有するタンパク質は異なる第１ランクを有し、第２および第３ランクの基準はそれぞれ７８％および９５％である。
【０００７】
結晶タンパク質は、昆虫の中腸中に摂取され、溶解されるまで殺昆虫活性を示さない。摂取されたプロ毒素は、昆虫の消化管中でプロテアーゼにより活性な毒性分子に加水分解される（Ｈｏｅｆｔｅ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅｌｅｙ（１９８９）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５３：２４２−２５５）。この毒素は、標的幼虫の中腸中の尖端の刷子縁受容体に結合し、尖端膜中に挿入してイオンチャネルまたは細孔を作り、幼虫の死滅をもたらす。
【０００８】
デルタ−エンドトキシンは、一般に、５つの保存された配列ドメイン、および３つの保存された構造ドメインを有する（例えば、ｄｅ  Ｍａａｇｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １７：１９３−１９９参照）。最初の保存された構造ドメインは、７つのアルファヘリックスからなり、膜挿入および細孔形成に関与する。ドメインＩＩは、グリークキー立体配置に配置された３つのベータシートからなり、ドメインＩＩＩは、「ゼリーロール」形成の２つの逆平行のベータシートからなる（ｄｅ  Ｍａａｇｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、前掲）。ドメインＩＩおよびＩＩＩは、受容体認識および結合に関与し、したがって、毒素特異性の決定因子とみなされる。
【０００９】
昆虫がもたらし得る破壊、および昆虫害虫の防除による収穫高の改善のため、新形態の殺虫毒素を発見することが継続的に必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
細菌、植物、植物細胞、組織および種子に対して殺虫活性を付与するための組成物および方法が提供される。組成物としては、殺虫および殺昆虫ポリペプチドの配列をコードする核酸分子、それらの核酸分子を含むベクター、およびベクターを含む宿主細胞が挙げられる。組成物としてはまた、殺虫ポリペプチド配列およびそのポリペプチドに対する抗体が挙げられる。ヌクレオチド配列は、生物、例として、微生物および植物における形質転換および発現のためにＤＮＡ構築物または発現カセット中で使用することができる。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、生物、例として、限定されるものではないが、微生物または植物における発現のために設計された合成配列であり得る。組成物としてはまた、本発明のヌクレオチド配列を含む細菌、植物、植物細胞、組織および種子を含む。
【００１１】
特に、殺虫タンパク質をコードする単離または組換え核酸分子が提供される。さらに、殺虫タンパク質に対応するアミノ酸配列が包含される。特に、本発明は、配列番号５〜２６に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または配列番号１〜４に記載のヌクレオチド配列、ならびに生物学的に活性なそれらの変異体および断片を含む単離または組換え核酸分子を提供する。本発明のヌクレオチド配列に相補的であり、もしくは本発明の配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列、またはその相補体も包含される。さらに、本発明のヌクレオチド配列、または本発明のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、ならびに生物学的に活性なそれらの変異体および断片を含むベクター、宿主細胞、植物、および種子が提供される。
【００１２】
本発明のポリペプチドを産生する方法、および鱗翅目、半翅目、鞘翅目、線虫、または双翅目の害虫の防除または殺滅のためにそれらのポリペプチドを使用する方法が提供される。試料中の本発明の核酸およびポリペプチドを検出するための方法およびキットも含まれる。
【００１３】
本発明の組成物および方法は、向上した害虫耐性または許容性を有する生物の産生に有用である。これらの生物およびそれらの生物を含む組成物は、農業目的に望ましい。本発明の組成物はまた、殺昆虫活性を有する変更もしくは改善されたタンパク質を生成するために、または製品もしくは生物中の殺虫タンパク質または核酸の存在を検出するために有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、生物、特に植物または植物細胞における害虫耐性または許容性を調節するための組成物および方法を対象とする。「耐性」は、本発明のポリペプチドの摂取または他の接触時に害虫（例えば、昆虫）が殺滅されることを意図する。「許容性」は、害虫の移動、摂食、繁殖、または他の機能の損害または低減を意図する。方法は、本発明の殺虫タンパク質をコードするヌクレオチド配列により生物を形質転換することを含む。特に、本発明のヌクレオチド配列は、殺虫活性を保有する植物および微生物の調製に有用である。したがって、形質転換された細菌、植物、植物細胞、植物組織および種子が提供される。組成物は、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）または他の種の殺虫核酸およびタンパク質である。配列は、他の相同（または部分相同）遺伝子の単離のためのプローブとして、目的生物への後続の形質転換のための発現ベクターの構築において、ならびに当技術分野において公知の方法、例えば、エンドトキシンのＣｒｙ１、Ｃｒｙ２、およびＣｒｙ９ファミリーのメンバーとのドメインスワッピングまたはＤＮＡシャッフリングによる変更された殺虫タンパク質の生成のために使用される。タンパク質は、鱗翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目および線虫の害虫集団の防除または殺滅において、および殺虫活性を有する組成物の産生に使用される。
【００１５】
「殺虫毒素」または「殺虫タンパク質」は、１つ以上の害虫、例として、限定されるものではないが、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）、半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）および鞘翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、もしくは線形動物門（Ｎｅｍａｔｏｄａ）のメンバーに対して毒性活性を有する毒素、またはそのようなタンパク質に対して相同性を有するタンパク質を意図する。殺虫タンパク質は、生物、例として、例えば、バシルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、クロストリジウム・ビフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）および乳化病菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）から単離されている。殺虫タンパク質は、本明細書に開示の全長ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列、および代替的な下流開始部位の使用に起因し、または殺虫活性を有するより短いタンパク質を産生するプロセシングに起因して、完全長よりも短い配列であるアミノ酸配列を含む。プロセシングは、タンパク質が発現される生物中で、またはタンパク質の摂取後に害虫中で起こり得る。
【００１６】
したがって、本明細書において、殺虫活性を付与する新規単離または組換えヌクレオチド配列が提供される。これらのヌクレオチド配列は、公知のデルタ−エンドトキシンまたはバイナリー毒素に対して相同性を有するポリペプチドをコードする。殺虫タンパク質のアミノ酸配列も提供される。この遺伝子の翻訳から生じるタンパク質により、細胞がそれを摂取する害虫を防除または殺滅することが可能となる。
【００１７】
単離核酸分子、ならびにその変異体および断片
本発明の一態様は、殺虫タンパク質およびポリペプチドまたは生物学的に活性なその部分をコードするヌクレオチド配列を含む単離または組換え核酸分子、ならびに配列相同性の領域を有するタンパク質をコードする核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用に十分な核酸分子に関する。本明細書において、本明細書の他箇所に定義されるストリンジェントな条件下で本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列も包含される。本明細書において使用される用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、組換えＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチド類似体を使用して生成されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００１８】
「単離」または「組換え」核酸配列（またはＤＮＡ）は、本明細書において、もはやその天然環境中に存在しない、例えば、インビトロまたは組換え細菌または植物宿主細胞中に存在する核酸配列（またはＤＮＡ）を指すために使用される。一部の実施形態において、単離または組換え核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて天然に核酸にフランキングする（すなわち、核酸の５’および３’末端に局在する配列）配列（好ましくはタンパク質をコードする配列）を含まない。本発明の目的のため、「単離」は、核酸分子を指すために使用される場合、単離染色体を除外する。例えば、種々の実施形態において、単離されたデルタ−エンドトキシンをコードする核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいて核酸分子に天然にフランキングする約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有し得る。種々の実施形態において、細胞材料を実質的に含まないデルタ−エンドトキシンタンパク質は、約３０％、２０％、１０％、または５％（乾燥重量基準）未満の非デルタ−エンドトキシンタンパク質（本明細書において「汚染タンパク質」とも称される）を有するタンパク質の調製物を含む。
【００１９】
本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１〜４に記載の配列、ならびにそれらの変異体、断片、および相補体を含む。「相補体」は、所与のヌクレオチド配列にハイブリダイズしてそれにより安定な二本鎖を形成し得るような、所与のヌクレオチド配列に対して十分に相補的であるヌクレオチド配列を意図する。これらのヌクレオチド配列によりコードされる殺虫タンパク質についての対応するアミノ酸配列は、配列番号５〜２６に記載される。
【００２０】
殺虫タンパク質をコードするこれらのヌクレオチド配列の断片である核酸分子も、本発明により包含される。「断片」は、殺虫タンパク質をコードするヌクレオチド配列の部分を意図する。ヌクレオチド配列の断片は、殺虫タンパク質の生物学的に活性な部分をコードし得、または以下に開示の方法を使用してハイブリダイゼーションプローブもしくはＰＣＲプライマーとして使用することができる断片であり得る。殺虫タンパク質をコードするヌクレオチド配列の断片である核酸分子は、少なくとも約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１３５０、１４００の連続ヌクレオチド、または意図される使用に応じて本明細書に開示の殺虫タンパク質をコードする全長ヌクレオチド配列中に存在するヌクレオチドの数までを含む。「連続」ヌクレオチドは、互いに直接隣接するヌクレオチド残基を意図する。本発明のヌクレオチド配列の断片は、殺虫タンパク質の生物学的活性を保持し、したがって殺虫活性を保持するタンパク質断片をコードする。したがって、本明細書に開示のポリペプチドの生物学的に活性な断片も包含される。「活性を保持する」は、断片が、殺虫タンパク質の殺虫活性の少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％またはそれより高い活性を有することを意図する。一実施形態において、殺虫活性は、殺鞘翅目活性である。別の実施形態において、殺虫活性は、殺鱗翅目活性である。別の実施形態において、殺虫活性は、殺線虫活性である。別の実施形態において、殺虫活性は、殺双翅目活性である。別の実施形態において、殺虫活性は、殺半翅目活性である。殺虫活性を計測する方法は、当技術分野において周知である。例えば、Ｃｚａｐｌａ  ａｎｄ  Ｌａｎｇ（１９９０）Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．８３：２４８０−２４８５；Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５２：１９９−２０６；Ｍａｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．ｏｆ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ  ７８：２９０−２９３；および米国特許第５，７４３，４７７号明細書を参照されたい（それらの全ては参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
【００２１】
本発明のタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする殺虫タンパク質をコードするヌクレオチド配列の断片は、少なくとも約１５、２５、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０の連続アミノ酸、または本発明の全長殺虫タンパク質中に存在するアミノ酸の総数までをコードする。一部の実施形態において、断片は、タンパク質分解開裂断片である。例えば、タンパク質分解開裂断片は、配列番号２、３、４、５、６、または７に対して少なくとも約３０アミノ酸、少なくとも約４０アミノ酸、少なくとも約５０、少なくとも約１００アミノ酸、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２７５、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、または約５５０アミノ酸のＮ末端またはＣ末端トランケーションを有し得る。一部の実施形態において、本明細書において包含される断片は、例えば、タンパク質分解による、またはコード配列中の終止コドンの挿入によるＣ末端結晶化ドメインの除去から生じる。一部の実施形態において、本明細書において包含される断片は、Ｎ末端シグナルペプチドの除去から生じる。Ｎ末端トランケーションは、Ｎ末端におけるメチオニン残基をさらに含み得る。
【００２２】
本発明の好ましい殺虫タンパク質は、配列番号１〜４のヌクレオチド配列に対して十分に同一であるヌクレオチド配列によりコードされ、または殺虫タンパク質は、配列番号５〜２６に記載のアミノ酸配列に対して十分に同一である。「十分に同一」は、標準的なパラメータを使用する本明細書に記載のアラインメントプログラムの１つを使用して参照配列と比較して少なくとも約６０％または６５％の配列同一性、約７０％または７５％の配列同一性、約８０％または８５％の配列同一性、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸またはヌクレオチド配列を意図する。当業者は、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置決めなどを考慮することにより、２つのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するためにこれらの値を適切に調整することができることを認識する。
【００２３】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の同一率を決定するため、配列は最適な比較目的のためにアラインされる。２つの配列間の同一率は、それらの配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一率＝同一の位置の数／位置の総数（例えば、重複位置）×１００）。一実施形態において、２つの配列は同一の長さである。別の実施形態において、同一率は、参照配列（すなわち、配列番号１〜２６のいずれかとして本明細書に開示の配列）の全体にわたり計算される。２つの配列間の同一率は、ギャップを許容し、または許容せずに、以下に記載のものと類似する技術を使用して決定することができる。同一率の計算において、典型的には正確な一致をカウントする。ギャップ、すなわち、残基がある配列中には存在するが、他の配列中には存在しないアラインメント中の位置は、非同一残基を有する位置とみなす。
【００２４】
２つの配列間の同一率の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７のとおり修正された、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド探索を、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長さ＝１２を用いて実施して本発明の殺虫様の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質探索を、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長さ＝３を用いて実施して本発明の殺虫タンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためにギャップ入りアラインメントを得るため、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０）を、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載のとおり利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して分子間の距離関係を検出する反復探索を実施することができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）前掲を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＸおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメータを使用することができる。アラインメントはまた、検査により手作業で実施することができる。
【００２５】
配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムである（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０）。ＣｌｕｓｔａｌＷは配列を比較し、アミノ酸またはＤＮＡ配列の全体をアラインし、したがって全アミノ酸配列の配列保存についてのデータを提供することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムは、いくつかの市販のＤＮＡ／アミノ酸分析ソフトウェアパッケージ、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ＳｕｉｔｅのＡＬＩＧＮＸモジュール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）において使用される。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてアミノ酸配列をアラインした後、アミノ酸同一率を評価することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントの分析に有用なソフトウェアプログラムの非限定的な例は、ＧＥＮＥＤＯＣ（商標）である。ＧＥＮＥＤＯＣ（商標）（Ｋａｒｌ  Ｎｉｃｈｏｌａｓ）は、複数のタンパク質間のアミノ酸（またはＤＮＡ）類似性および同一性の評価を可能とする。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｄ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡから入手可能）の一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。アミノ酸配列の比較のためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、ギャップ長さペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用することができる。
【００２６】
別記のない限り、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８（３）：４４３−４５３のアルゴリズムを使用するＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０を使用して以下のパラメータを使用して配列同一性または類似性を決定する：ＧＡＰウェイト５０および長さウェイト３、およびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリング・マトリックスを使用してヌクレオチド配列の同一％および類似％；ＧＡＰウェイト８および長さウェイト２、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングプログラムを使用してアミノ酸配列の同一％または類似％。均等なプログラムを使用することもできる。「均等なプログラム」は、ＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０により生成された対応するアラインメントと比較して同一のヌクレオチド残基一致および同一の配列同一率を有するアラインメントを対象の任意の２つの配列について生成する任意の配列比較プログラムを意図する。
【００２７】
本発明はまた変異体核酸分子を包含する。殺虫タンパク質をコードするヌクレオチド配列の「変異体」は、本明細書に開示の殺虫タンパク質をコードするが、遺伝子コードの縮重のために保存的に異なる配列、ならびに上記に考察したものと十分に同一であるものを含む。天然存在のアレル変異体は、周知の分子生物学技術、例えば、以下に概説されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技術を使用することにより同定することができる。変異体ヌクレオチド配列はまた、例えば、部位特異的突然変異誘発の使用により生成されたが、以下に考察される本発明に開示の殺虫タンパク質を依然としてコードする合成由来のヌクレオチド配列を含む。本発明により包含される変異体タンパク質は、生物学的に活性であり、すなわち、天然タンパク質の所望の生物学的活性、すなわち、殺虫活性を保有し続ける。「活性を保持する」は、変異体が、天然タンパク質の殺虫活性の少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％を有することを意図する。殺虫活性を計測する方法は当技術分野において周知である。例えば、Ｃｚａｐｌａ  ａｎｄ  Ｌａｎｇ（１９９０）Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．８３：２４８０−２４８５；Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５２：１９９−２０６；Ｍａｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．ｏｆ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ  ７８：２９０−２９３；および米国特許第５，７４３，４７７号明細書を参照されたい（それらの全ては参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
【００２８】
当業者は、本発明のヌクレオチド配列の突然変異により変化を導入することができ、それによりタンパク質の生物学的活性を変更することなく、コードされる殺虫タンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらすことができることをさらに認識する。したがって、変異体単離核酸分子は、１つ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を本明細書に開示の対応するヌクレオチド配列中に導入することにより作出することができ、その結果、１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失がコードされるタンパク質中に導入される。突然変異は、標準的な技術、例えば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発により導入することができる。このような変異体ヌクレオチド配列も、本発明により包含される。
【００２９】
例えば、保存的アミノ酸置換は、１つ以上の予測される非必須アミノ酸残基において作製することができる。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変更することなく殺虫タンパク質の野生型配列から変更することができる残基である一方、「必須」アミノ酸残基は生物学的活性に要求される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基により置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。
【００３０】
デルタ−エンドトキシンは、一般に、５つの保存された配列ドメイン、および３つの保存された構造ドメインを有する（例えば、ｄｅ  Ｍａａｇｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １７：１９３−１９９参照）。最初の保存された構造ドメインは、７つのアルファヘリックスからなり、膜挿入および細孔形成に関与する。ドメインＩＩは、グリークキー立体配置に配置された３つのベータシートからなり、ドメインＩＩＩは、「ゼリーロール」形成の２つの逆平行のベータシートからなる（ｄｅ  Ｍａａｇｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、前掲）。ドメインＩＩおよびＩＩＩは、受容体認識および結合に関与し、したがって毒素特異性の決定因子とみなされる。
【００３１】
アミノ酸置換は、機能を保持する非保存領域中で行うことができる。一般に、このような置換は、保存アミノ酸残基、または保存モチーフ内に残留するアミノ酸残基（このような残基は、タンパク質の活性に必須である）には行われない。保存され、タンパク質活性に必須であり得る残基の例としては、例えば、本発明の配列と類似または関連する毒素のアラインメントに含有される全てのタンパク質間で同一である残基（例えば、相同タンパク質のアラインメントにおいて同一である残基）が挙げられる。保存されているが、保存的アミノ酸置換を可能とし得、依然として活性を保持する残基の例としては、例えば、本発明の配列と類似または関連する毒素のアラインメントに含有される全てのタンパク質間で保存的置換のみを有する残基（例えば、アラインメント相同タンパク質中に含有される全てのタンパク質間の保存的置換のみを有する残基）が挙げられる。しかしながら、当業者は、機能的変異体が保存された残基において小さい保存または非保存の変更を有し得ることを理解する。
【００３２】
あるいは、変異体ヌクレオチド配列は、コード配列の全部または一部に沿ってランダムに突然変異を導入することにより、例えば、飽和突然変異誘発により作製することができ、得られた突然変異体を殺虫活性を付与する能力についてスクリーニングして活性を保持する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発後、コードされるタンパク質を組換え発現させることができ、標準的なアッセイ技術を使用してタンパク質の活性を決定することができる。
【００３３】
ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどの方法を使用して、対応する殺虫配列を同定することができ、このような配列は、本発明の配列に対して実質的な同一性を有する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）およびＩｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）を参照されたい。
【００３４】
ハイブリダイゼーション法において、殺虫ヌクレオチド配列の全部または一部を使用してｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。このようなｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーの構築法は、一般に当技術分野において公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、前掲に開示されている。いわゆるハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、または他のオリゴヌクレオチドであり得、検出可能な基、例えば、３２Ｐ、または任意の他の検出可能なマーカー、例えば、他の放射性同位体、蛍光化合物、酵素、もしくは酵素補因子により標識することができる。ハイブリダイゼーションのためのプローブは、本明細書に開示の公知の殺虫タンパク質コードヌクレオチド配列をベースとする合成オリゴヌクレオチドを標識することにより作製することができる。ヌクレオチド配列またはコードするアミノ酸配列中の保存ヌクレオチドまたはアミノ酸残基に基づき設計された縮重プライマーをさらに使用することができる。プローブは、典型的には、本発明の殺虫タンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその断片もしくは変異体の少なくとも約１２、少なくとも約２５、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００の連続ヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。ハイブリダイゼーションのためのプローブを調製する方法は、一般に当技術分野において公知であり、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、前掲に開示されている。
【００３５】
例えば、本明細書に開示の全殺虫配列、またはその１つ以上の部分を、対応する殺虫タンパク質様配列およびメッセンジャーＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得るプローブとして使用することができる。種々の条件下で特異的なハイブリダイゼーションを達成するため、このようなプローブとしては、ユニークであり、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長、または少なくとも約２０ヌクレオチド長である配列が挙げられる。このようなプローブを使用してＰＣＲにより選択生物から対応する殺虫配列を増幅させることができる。この技術は、所望の生物から追加のコード配列を単離するため、または生物中のコード配列の存在を決定するための診断アッセイとして使用することができる。ハイブリダイゼーション技術としては、プレーティングされたＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングが挙げられる（プラークまたはコロニーのいずれか；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。
【００３６】
したがって、本発明は、ハイブリダイゼーションのためのプローブ、および本発明のヌクレオチド配列の全部または一部にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列（例えば、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約４００、少なくとも約５００、１０００、１２００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、または本明細書に開示のヌクレオチド配列の全長まで）を包含する。このような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施することができる。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブがその標的配列に、他の配列よりも検出可能でより大きい程度で（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）ハイブリダイズする条件を意図する。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる環境中では異なる。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに１００％相補的な標的配列を同定することができる（相同プロービング（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｂｉｎｇ））。あるいは、ストリンジェンシー条件を調整してより低い程度の類似性が検出されるように配列中のいくらかのミスマッチを可能とする（非相同プロービング（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｂｉｎｇ））。一般に、プローブは、約１０００ヌクレオチド長未満、好ましくは５００ヌクレオチド長未満である。
【００３７】
典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３において約１．５Ｍ未満のＮａイオン、典型的には０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）であり、温度が短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドよりも大きい）では少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、脱安定化剤、例えば、ホルムアミドの添加により達成することができる。例示的な低いストリンジェンシー条件としては、３７℃における３０〜３５％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を用いてのハイブリダイゼーション、および５０〜５５℃における１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０ＭのＮａＣｌ／０．３Ｍのクエン酸三ナトリウム）中での洗浄が挙げられる。例示的な中程度のストリンジェンシー条件としては、３７℃における４０〜４５％のホルムアミド、１．０ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および５５〜６０℃における０．５×〜１×ＳＳＣ中での洗浄が挙げられる。例示的な高いストリンジェンシー条件としては、３７℃における５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および６０〜６５℃における０．１×ＳＳＣ中での洗浄が挙げられる。場合により、洗浄緩衝液は、約０．１％〜約１％のＳＤＳを含み得る。ハイブリダイゼーションの持続期間は、一般に、約２４時間未満、通常、約４〜約１２時間である。
【００３８】
特異性は、典型的にはハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、重要な因子は最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて、Ｔｍは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ  Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌの式から概算することができ；式中、Ｍは、一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの割合であり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合であり、Ｌは、塩基対でのハイブリッドの長さである。Ｔｍは、相補的標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度（規定のイオン強度およびｐＨ下で）である。Ｔｍは、１％ミスマッチする毎に約１℃だけ低減し；したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件を調整して所望の同一性の配列にハイブリダイズさせることができる。例えば、≧９０％の同一性を有する配列を求める場合、Ｔｍを１０℃減少させることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおいて特異的配列およびその相補体についての熱融点（ｔｈｅｒｍａｌ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。しかしながら、重度にストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔｍ）よりも１、２、３、または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；中程度にストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔｍ）よりも６、７、８、９、または１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；低いストリンジェンシーな条件は、熱融点（Ｔｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る。式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、ならびに所望のＴｍを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーの変動が本質的に記載されていることを理解する。所望の程度のミスマッチが４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴｍをもたらす場合、より高温を使用することができるようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイ
ブリダイゼーションに対する詳細なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【００３９】
単離タンパク質ならびにその変異体および断片
殺虫タンパク質も本発明に包含される。「殺虫タンパク質」は、配列番号５〜２６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を意図する。その断片、生物学的に活性な部分、および変異体も提供され、本発明の方法を実施するために使用することができる。「単離タンパク質」または「組換えタンパク質」は、もはや天然環境中に存在せず、例えば、インビトロまたは組換え細菌もしくは植物宿主細胞中に存在するタンパク質を指すために使用される。
【００４０】
「断片」または「生物学的に活性な部分」は、配列番号５〜２６に記載のアミノ酸配列と十分に同一であるアミノ酸配列を含み、殺虫活性を示すポリペプチド断片を含む。殺虫タンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、またはそれより大きいアミノ酸長であるポリペプチドであり得る。このような生物学的に活性な部分は、組換え技術により調製し、殺虫活性について評価することができる。殺昆虫活性を計測する方法は、当技術分野において周知である。例えば、Ｃｚａｐｌａ  ａｎｄ  Ｌａｎｇ（１９９０）Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．８３：２４８０−２４８５；Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５２：１９９−２０６；Ｍａｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．ｏｆ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ  ７８：２９０−２９３；および米国特許第５，７４３，４７７号明細書を参照されたい（それらの全ては参照により全体として本明細書に組み込まれる）。本明細書において使用される断片は、配列番号５〜２６の少なくとも８つの連続するアミノ酸を含む。しかしながら、本発明は、他の断片、例えば、タンパク質中の約１０、２０、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０またはそれより大きいアミノ酸長よりも大きい任意の断片を包含する。
【００４１】
「変異体」は、配列番号５〜２６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも約６０％、６５％、約７０％、７５％、約８０％、８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドを意図する。変異体としてはまた、ストリンジェントな条件下で、配列番号１〜４の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、またはその相補体によりコードされるポリペプチドが挙げられる。変異体としては、突然変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なるポリペプチドが挙げられる。本発明により包含される変異体タンパク質は、生物学的に活性であり、すなわち天然タンパク質の所望の生物学的活性を保有し続けており、すなわち殺虫活性を保持する。一部の実施形態において、変異体は、天然タンパク質に対して改善された活性を有する。殺虫活性を計測する方法は当技術分野において周知である。例えば、Ｃｚａｐｌａ  ａｎｄ  Ｌａｎｇ（１９９０）Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．８３：２４８０−２４８５；Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５２：１９９−２０６；Ｍａｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．ｏｆ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ  ７８：２９０−２９３；および米国特許第５，７４３，４７７号明細書を参照されたい（それらの全ては参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
【００４２】
細菌遺伝子、例えば、本発明のａｘｍｉ遺伝子は、オープンリーディングフレームの開始点の近くに複数のメチオニン開始コドンを保有することが極めて多い。これらの開始コドンの１つ以上における翻訳開始が機能タンパク質の生成をもたらすことが多い。これらの開始コドンとしては、ＡＴＧコドンを挙げることができる。しかしながら、細菌、例えば、バシルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）は、開始コドンとしてコドンＧＴＧも認識し、ＧＴＧコドンにおいて翻訳を開始するタンパク質は、最初のアミノ酸においてメチオニンを含有する。まれな場合において、細菌系中の翻訳は、ＴＴＧコドンにおいて開始し得るが、このイベントにおいてＴＴＧはメチオニンをコードする。さらに、これらのコドンのいずれが細菌中で天然に使用されるか事前に決定されないことが多い。したがって、代替的なメチオニンコドンの１つの使用も、殺虫タンパク質の生成をもたらし得ることが理解される。これらの殺虫タンパク質は本発明に包含され、本発明の方法において使用することができる。植物中で発現される場合、適切な翻訳のために代替開始コドンをＡＴＧに変更することが必要であることが理解される。
【００４３】
本発明の種々の実施形態において、殺虫タンパク質は、本明細書に開示の全長ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列、および代替的な下流開始部位の使用に起因して全長配列よりも短いアミノ酸配列を含む。したがって、本発明のヌクレオチド配列ならびに／または本発明のヌクレオチド配列を含むベクター、宿主細胞、および植物（ならびに本発明のヌクレオチド配列を作製および使用する方法）は、配列番号６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、２５および２６に対応するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【００４４】
本発明のポリペプチド、またはその変異体もしくは断片に対する抗体も包含される。抗体を産生する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；米国特許第４，１９６，２６５号明細書参照）。
【００４５】
したがって、本発明の一態様は、本発明のタンパク質またはペプチド分子およびそれらのホモログ、融合物または断片の１つ以上に特異的に結合する抗体、単鎖抗原結合分子、または他のタンパク質に関する。特に好ましい実施形態において、抗体は、配列番号５〜２６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片に特異的に結合する。別の実施形態において、抗体は、配列番号５〜２６に記載のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質またはその断片に特異的に結合する。
【００４６】
本発明の抗体は、本発明のタンパク質もしくはペプチド分子を定量的もしくは定性的に検出するため、またはタンパク質の翻訳後修飾を検出するために使用することができる。本明細書において使用される抗体またはペプチドは、非関連分子の存在により結合が競合阻害されない場合、本発明のタンパク質またはペプチド分子に「特異的に結合する」と記載される。
【００４７】
本発明の抗体は、本発明のタンパク質またはペプチド分子の検出に有用なキット内に含有させることができる。本発明は、試料を本発明の抗体と接触させ、試料が本発明のタンパク質またはペプチド分子を含有するか否かを決定することを含む、本発明のタンパク質またはペプチド分子（特に、配列番号５〜２６に記載のアミノ酸配列によりコードされる、本発明の抗体に特異的に結合し得るタンパク質（それらの変異体または断片を含む））を検出する方法をさらに含む。目的タンパク質またはペプチドの検出のために抗体を利用する方法は、当技術分野において公知である。
【００４８】
変更または改善された変異体
殺虫タンパク質のＤＮＡ配列は種々の方法により変更することができること、およびこれらの変更は、本発明の殺虫タンパク質によりコードされるものとは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列をもたらし得ることが認識される。このタンパク質は、種々の手法、例として、配列番号５〜２６の１つ以上のアミノ酸のアミノ酸置換、欠失、トランケーション、および挿入、例として、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５、約１５０、約１５５、またはそれより多い数までのアミノ酸置換、欠失または挿入において変更することができる。このような操作のための方法は一般に当技術分野において公知である。例えば、殺虫タンパク質のアミノ酸配列変異体は、ＤＮＡ中の突然変異により調製することができる。これはまた、突然変異誘発のいくつかの形態の１つにより、および／または指向進化で達成することができる。一部の態様において、アミノ酸配列中でコードされる変化は、タンパク質の機能に実質的に影響を及ぼさない。このような変異体は所望の殺虫活性を保有する。しかしながら、殺虫タンパク質が殺虫活性を付与する能力は、本発明の組成物にこのような技術を使用することにより改善することができることが理解される。例えば、ＤＮＡ複製の間に高い割合の塩基の誤取り込みを示す宿主細胞、例えば、ＸＬ−１Ｒｅｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中で殺虫タンパク質を発現させることができる。このような株中で増殖させた後、ＤＮＡを単離し（例えば、プラスミドＤＮＡを調製することにより、またはＰＣＲにより増幅させ、得られたＰＣＲ断片をベクター中にクローニングすることにより）、非突然変異誘発株中で殺虫タンパク質突然変異を培養し、例えば、殺虫活性について試験するためのアッセイを実施することにより、殺虫活性を有する突然変異した遺伝子を同定することができる。一般に、タンパク質は混合され、摂食アッセイにおいて使用される。例えば、Ｍａｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．ｏｆ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ  ７８：２９０−２９３を参照されたい。このようなアッセイは、植物を１つ以上の害虫と接触させ、かつ植物が生存する能力および／または植物が害虫の死滅を引き起こす能力を決定することを含み得る。毒性の増加をもたらす突然変異の例は、Ｓｃｈｎｅｐｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：７７５−８０６に見出される。
【００４９】
あるいは、実質的に活性に影響を及ぼすことなく、アミノまたはカルボキシ末端において多くのタンパク質のタンパク質配列に変更を行うことができる。これは、現代分子的方法、例えば、ＰＣＲ、例として、ＰＣＲ増幅に利用されたオリゴヌクレオチド中にアミノ酸コード配列を包含させることによりタンパク質コード配列を変更または伸長するＰＣＲ増幅により導入される挿入、欠失、または変更を含み得る。あるいは、付加されるタンパク質配列は、全タンパク質コード配列、例えば、タンパク質融合物を生成するために当技術分野において一般に使用されるものを含み得る。このような融合タンパク質は、（１）目的タンパク質の発現を増加させるため、（２）タンパク質精製、タンパク質検出、または当技術分野において公知の他の実験的使用を容易にするために結合ドメイン、酵素活性、またはエピトープを導入するため、（３）細胞内小器官、例えば、グラム陰性細菌の細胞膜周辺腔、または真核細胞の小胞体（後者はタンパク質のグリコシル化をもたらすことが多い）へのタンパク質の分泌または翻訳を標的化するために使用されることが多い。
【００５０】
本発明の変異体ヌクレオチドおよびアミノ酸配列はまた、突然変異誘発および組換え誘導手順、例えば、ＤＮＡシャッフリングに由来する配列を包含する。このような手順を用いると、１つ以上の異なる殺虫タンパク質コード領域を使用して所望の特性を保有する新たな殺虫タンパク質を作出することができる。このように、組換えポリヌクレオチドのライブラリーは、実質的な配列同一性を有し、インビトロまたはインビボで相同組換えすることができる配列領域を含む関連配列ポリヌクレオチドの集団から生成される。例えば、このアプローチを使用して、目的ドメインをコードする配列モチーフを、本発明の殺虫遺伝子と他の公知の殺虫遺伝子との間でシャッフルして、改善された目的特性、例えば、増加した殺昆虫活性を有するタンパク質をコードする新たな遺伝子を得ることができる。このようなＤＮＡシャッフリングのための方針は、当技術分野において公知である。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１；Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：４３６−４３８；Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：３３６−３４７；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４５０４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２８８−２９１；ならびに米国特許第５，６０５，７９３号明細書および同第５，８３７，４５８号明細書を参照されたい。
【００５１】
ドメインスワッピングまたはシャッフリングは、変更された殺虫タンパク質を生成するための別の機序である。ドメインは、殺虫タンパク質間でスワッピングすることができ、これにより改善された殺虫活性または標的スペクトルを有するハイブリッドまたはキメラ毒素をもたらす。組換えタンパク質を生成し、殺虫活性についてそれらを試験する方法は当技術分野において周知である（例えば、Ｎａｉｍｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：５３２８−５３３０；ｄｅ  Ｍａａｇｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：１５３７−１５４３；Ｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１７９５４−１７９５８；Ｓｃｈｎｅｐｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２０９２３−２０９３０；Ｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．９１９９９）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：２９１８−２９２５参照）。
【００５２】
ベクター
本発明の殺虫配列は、目的植物中での発現のための発現カセット中で提供することができる。「植物発現カセット」は、植物細胞中でのオープンリーディングフレームからのタンパク質の発現をもたらし得るＤＮＡ構築物を意図する。典型的には、これらはプロモーターおよびコード配列を含有する。このような構築物はまた、３’非翻訳領域を含有することも多い。このような構築物は、ある細胞内構造、例えば、葉緑体（または他のプラスチド）、小胞体、またはゴルジ装置へのペプチドの同時翻訳または翻訳後輸送を容易にするための「シグナル配列」または「リーダー配列」を含有し得る。
【００５３】
「シグナル配列」は、細胞膜を越える同時翻訳または翻訳後のペプチド輸送をもたらすことが公知の、またはその候補配列を意図する。真核生物において、これは典型的にはゴルジ装置中への分泌に関与し、一部はグリコシル化される。細菌の殺昆虫毒素は、標的害虫の腸中でタンパク質分解により活性化されるプロ毒素として合成されることが多い（Ｃｈａｎｇ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５０７−５１６）。本発明の一部の実施形態において、シグナル配列は、天然配列中に局在し、または本発明の配列に由来し得る。「リーダー配列」は、翻訳された場合、細胞内小器官へのペプチド鎖の同時翻訳輸送を引き起こすために十分なアミノ酸配列をもたらす任意の配列を意図する。したがって、これは、小胞体中への通過、液胞、プラスチド、例として、葉緑体、ミトコンドリア中などへの通過により、輸送および／またはグリコシル化を標的化するリーダー配列を含む。
【００５４】
「植物形質転換ベクター」は、植物細胞の効率的な形質転換に必要なＤＮＡ分子を意図する。このような分子は、１つ以上の植物発現カセットからなり得、２つ以上の「ベクター」ＤＮＡ分子に組織化することができる。例えば、バイナリーベクターは、植物細胞の形質転換のために全ての必要なシスおよびトランス作用機能をコードするために２つの非連続的なＤＮＡベクターを利用する植物形質転換ベクターである（Ｈｅｌｌｅｎｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５：４４６−４５１）。「ベクター」は、異なる宿主細胞間の移行のために設計された核酸構築物を指す。「発現ベクター」は、外来細胞中で異種ＤＮＡ配列または断片を取り込み、組み込み、および発現する能力を有するベクターを指す。カセットは、本発明の配列に作動可能に連結している５’および／または３’調節配列を含む。「作動可能に連結している」は、プロモーターと第２の配列との間の機能的連結を意図し、プロモーター配列は、第２の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始および媒介する。一般に、作動可能に連結している、は、連結している核酸配列が連続的であり、２つのタンパク質コード領域を接続する必要がある場合に連続的であり、同じリーディングフレーム中に存在することを意味する。カセットは、生物中に同時形質転換すべき少なくとも１つの追加の遺伝子をさらに含有し得る。あるいは、追加の遺伝子を複数の発現カセット上に提供することができる。
【００５５】
種々の実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、プロモーター、例えば、植物プロモーターに作動可能に連結している。「プロモーター」は、下流コード配列の転写を指向するように機能する核酸配列を指す。プロモーターは、他の転写および翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも称される）と一緒に、目的ＤＮＡ配列の発現に必要である。
【００５６】
このような発現カセットは、調節領域の転写調節下になるように殺虫配列を挿入するための複数の制限部位を備える。
【００５７】
発現カセットは、転写の５’−３’方向に、植物中で機能する、転写および翻訳開始領域（すなわち、プロモーター）、本発明のＤＮＡ配列、ならびに翻訳および転写終結領域（すなわち、終結領域）を含む。プロモーターは、植物宿主および／または本発明のＤＮＡ配列に対して、天然または相似、あるいは外来または異種であり得る。さらに、プロモーターは天然配列または代替的には合成配列であり得る。プロモーターが植物宿主に対して「天然」または「同種」である場合、プロモーターは、プロモーターが導入される天然植物中に見出されることを意図する。プロモーターが本発明のＤＮＡ配列に対して「外来」または「異種」である場合、プロモーターは、本発明の作動可能に連結しているＤＮＡ配列に対して天然でなく、または天然に存在するプロモーターではないことを意図する。
【００５８】
終結領域は、転写開始領域について天然であり得、作動可能に連結している目的ＤＮＡ配列について天然であり得、植物宿主について天然であり得、または別の起源に由来し得る（すなわち、プロモーター、目的ＤＮＡ配列、植物宿主、またはそれらの任意の組合せに対して外来または異種）。簡便な終結領域は、Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミド、例えば、オクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼ終結領域から入手可能である。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６４：６７１−６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１４１−１４９；Ｍｏｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１２６１−１２７２；Ｍｕｎｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１：１５１−１５８；Ｂａｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３；およびＪｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９も参照されたい。
【００５９】
適宜、遺伝子は、形質転換された宿主細胞中の発現の増加のために最適化することができる。すなわち、遺伝子は、発現改善のために宿主細胞に好ましいコドンを使用して合成することができ、または宿主に好ましいコドン使用頻度においてコドンを使用して合成することができる。一般に、遺伝子のＧＣ含量は増加する。例えば、宿主の好ましいコドン使用の考察については、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｏｗｒｉ（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１−１１を参照されたい。植物に好ましい遺伝子を合成する方法は、当技術分野において利用可能である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３８０，８３１号明細書、同第５，４３６，３９１号明細書、米国特許出願公開第２００９０１３７４０９号明細書、ならびにＭｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８を参照されたい。
【００６０】
一実施形態において、殺虫タンパク質は、発現のために葉緑体に標的化される。このように、殺虫タンパク質が葉緑体中に直接挿入されない場合、発現カセットは、殺虫タンパク質を葉緑体に指向する輸送ペプチドをコードする核酸をさらに含有する。このような輸送ペプチドは当技術分野において公知である。例えば、Ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６；Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０；Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８；Ｒｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１；およびＳｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４７８−４８１を参照されたい。
【００６１】
葉緑体に標的化すべき殺虫遺伝子は、植物核とこの細胞小器官との間のコドン使用の差異を埋めるために葉緑体中の発現のために最適化することができる。このように、目的核酸は、葉緑体に好ましいコドンを使用して合成することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３８０，８３１号明細書を参照されたい。
【００６２】
植物形質転換
本発明の方法は、ヌクレオチド構築物を植物中に導入することを含む。「導入」は、構築物が植物の細胞内部に近づけるように、植物にヌクレオチド構築物を提供することを意図する。本発明の方法は、植物にヌクレオチド構築物を導入する特定の方法を使用することを要求せず、ヌクレオチド構築物が植物の少なくとも１つの細胞の内部に近づけることのみを要求する。ヌクレオチド構築物を植物中に導入する方法は当技術分野において公知であり、それとしては、限定されるものではないが、安定的形質転換法、一過的形質転換法、およびウイルス媒介法が挙げられる。
【００６３】
「植物」は、全植物、植物器官（例えば、葉、幹、根など）、種子、植物細胞、珠芽、胚、およびその子孫を意図する。植物細胞は、分化または未分化であり得る（例えば、カルス、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉細胞、根細胞、師管細胞、花粉）。
【００６４】
「トランスジェニック植物」または「形質転換植物」または「安定的に形質転換された」植物または細胞または組織は、外来核酸配列またはＤＮＡ断片を植物細胞中に取り込み、または組み込んだ植物を指す。これらの核酸配列としては、外来性であり、すなわち、非形質転換植物細胞中に存在しないもの、ならびに内因性であり得、すなわち、非形質転換植物細胞中に存在するものが挙げられる。「異種」は、一般に、細胞に対して内因性でなく、またはそれらが存在する天然ゲノムの一部でなく、感染、形質移入、マイクロインジェクション、電気穿孔、マイクロプロジェクションなどにより細胞に添加された核酸配列を指す。
【００６５】
本発明のトランスジェニック植物は、本明細書に開示の新規毒素配列の１つ以上を発現する。種々の実施形態において、トランスジェニック植物は、１つ以上の追加の昆虫耐性のための遺伝子（例えば、Ｃｒｙ１、例えば、Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｅ、およびＣｒｙ１Ｆファミリーのメンバー；Ｃｒｙ２、例えば、Ｃｒｙ２Ａファミリーのメンバー；Ｃｒｙ９、例えば、Ｃｒｙ９Ａ、Ｃｒｙ９Ｂ、Ｃｒｙ９Ｃ、Ｃｒｙ９Ｄ、Ｃｒｙ９Ｅ、およびＣｒｙ９Ｆファミリーのメンバー；など）をさらに含む。トランスジェニック植物は、目的農業形質を付与する任意の遺伝子を含み得ることが当業者により理解される。
【００６６】
植物細胞の形質転換は、当技術分野において公知のいくつかの技術の１つにより達成することができる。本発明の殺虫遺伝子は、植物細胞中での発現を得、または向上させるために改変することができる。典型的には、このようなタンパク質を発現する構築物は、遺伝子の転写をドライブするためのプロモーター、ならびに転写終結およびポリアデニル化を可能とするための３’非翻訳領域を含有する。このような構築物の構成は当技術分野において周知である。一部の場合において、得られるペプチドが分泌され、またはそうでなければ植物細胞内に標的化されるように遺伝子を遺伝子操作することが有用であり得る。例えば、遺伝子を、小胞体へのペプチドの移行を容易にするためのシグナルペプチドを含有するように遺伝子操作することができる。イントロンのｍＲＮＡプロセシングが発現のために要求されるように、植物発現カセットがイントロンを含有するように遺伝子操作することも好ましいことがあり得る。
【００６７】
典型的には、この「植物発現カセット」は、「植物形質転換ベクター」中に挿入される。この植物形質転換ベクターは、植物形質転換を達成するために必要とされる１つ以上のＤＮＡベクターを含み得る。例えば、２つ以上の連続ＤＮＡセグメントを含む植物形質転換ベクターを利用することが一般的な慣行である。これらのベクターは、当技術分野において「バイナリーベクター」と称されることが多い。バイナリーベクターおよびヘルパープラスミドを有するベクターは、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換に使用されることが最も多く、効率的な形質転換を達成するために必要とされるＤＮＡセグメントのサイズおよび複雑性が極めて大きく、別個のＤＮＡ分子に機能を分離するために有利である。バイナリーベクターは、典型的には、Ｔ−ＤＮＡ移行に要求されるシス作用配列（例えば、左境界および右境界）、植物細胞中で発現し得るように遺伝子操作された選択マーカー、および「目的遺伝子」（トランスジェニック植物の生成が望まれる植物細胞中で発現し得るように遺伝子操作された遺伝子）を含有するプラスミドベクターを含有する。このプラスミドベクター上には、細菌複製に要求される配列も存在する。シス作用配列は、植物細胞中への効率的な移行およびそこでの発現を可能とするように配置される。例えば、選択マーカー遺伝子および殺虫遺伝子は、左境界と右境界との間に局在する。第２のプラスミドベクターは、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から植物細胞へのＴ−ＤＮＡの移行を媒介するトランス作用因子を含有することが多い。このプラスミドは、毒性機能（Ｖｉｒ遺伝子）を含有することが多く、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による植物細胞の感染、および当技術分野において理解されるとおり、境界配列における開裂によるＤＮＡの移行およびｖｉｒ媒介ＤＮＡ移行を可能とする（Ｈｅｌｌｅｎｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５：４４６−４５１）。いくつかのタイプのアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株（例えば、ＬＢＡ４４０４、ＧＶ３１０１、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５など）を植物形質転換に使用することができる。第２のプラスミドベクターは、他の方法、例えば、マイクロプロジェクション、マイクロインジェクション、電気穿孔、ポリエチレングリコールなどによる植物の形質転換に必要でない。
【００６８】
一般に、植物形質転換法は、異種ＤＮＡを標的植物細胞（例えば、未成熟または成熟胚、懸濁培養物、未分化カルス、プロトプラストなど）中に移行し、次いで最大閾値レベルの適切な選択（選択マーカー遺伝子に応じて）を適用して一群の非形質転換細胞塊から形質転換された植物細胞を回収することを含む。外植片は、典型的には同一培地の新たな供給物に移され、定型的に培養される。続いて、形質転換された細胞は、最大閾値レベルの選択剤が補給された再生培地上に置いた後、芽に分化する。次いで、根づいた芽または小植物を回収するために芽を選択発根培地に移す。次いで、トランスジェニック小植物は成熟植物に生長し、稔性種子を産生する（例えば、Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：２７１−２８２；Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：７４５−７５０）。外植片は、典型的には同一培地の新たな供給に移され、定型的に培養される。トランスジェニック植物を生成するための技術および方法の一般的な記載は、Ａｙｒｅｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ（１９９４）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １３：２１９−２３９およびＢｏｍｍｉｎｅｎｉ  ａｎｄ  Ｊａｕｈａｒ（１９９７）Ｍａｙｄｉｃａ  ４２：１０７−１２０に見出される。形質転換された材料は多くの細胞を含有するため、形質転換細胞および非形質転換細胞の両方が、主題の標的カルスまたは組織または細胞群のあらゆる断片中に存在する。非形質転換細胞を殺滅し、形質転換細胞を増殖させる能力は、形質転換された植物培養物をもたらす。非形質転換細胞を除去する能力は、形質転換植物細胞の迅速な回収およびトランスジェニック植物の良好な生成に対する制約であることが多い。
【００６９】
形質転換プロトコルおよびヌクレオチド配列を植物中に導入するためのプロトコルは、形質転換に標的化される植物または植物細胞のタイプ、すなわち単子葉または双子葉植物に応じて変動し得る。トランスジェニック植物の生成は、いくつかの方法の１つ、例として、限定されるものではないが、マイクロインジェクション、電気穿孔、遺伝子直接移行、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による植物細胞中への異種ＤＮＡの導入（アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換）、粒子に付着させた異種外来ＤＮＡを用いる植物細胞へのボンバードメント、弾道粒子加速（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）、エアロゾルビーム形質転換（米国特許出願公開第２００１００２６９４１号明細書；米国特許第４，９４５，０５０号明細書；国際公開第９１／００９１５号パンフレット；米国特許出願公開第２００２０１５０６６号明細書）、Ｌｅｃ１形質転換、およびＤＮＡを移行するための種々の他の非粒子直接媒介方法により実施することができる。
【００７０】
葉緑体の形質転換の方法は、当技術分野において公知である。例えば、Ｓｖａｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：８５２６−８５３０；Ｓｖａｂ  ａｎｄ  Ｍａｌｉｇａ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：９１３−９１７；Ｓｖａｂ  ａｎｄ  Ｍａｌｉｇａ（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：６０１−６０６を参照されたい。この方法は、選択マーカーを含有するＤＮＡのパーティクルガン送達および相同組換えを介するプラスチドゲノムへのＤＮＡの標的化に依存する。さらに、プラスチド形質転換は、核コードおよびプラスチド指向性ＲＮＡポリメラーゼの組織優先発現によるサイレントプラスチド媒介トランス遺伝子のトランス活性化により達成することができる。このような系は、ＭｃＢｒｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：７３０１−７３０５に報告されている。
【００７１】
植物細胞中に異種外来ＤＮＡを組み込んだ後、次いで、培地中で最大閾値レベルの適切な選択を適用して非形質転換細胞を殺滅し、定期的に新たな培地に移すことにより、この選択処理から生存する推定形質転換細胞を分離し、増殖させる。連続的に継代し、適切な選択によりチャレンジすることにより、プラスミドベクターにより形質転換された細胞を同定し、増殖させる。次いで、分子および生化学的方法を使用してトランスジェニック植物のゲノム中に組み込まれた目的異種遺伝子の存在を確認することができる。
【００７２】
形質転換された細胞は、慣用の手法に従って植物に生長させることができる。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５：８１−８４を参照されたい。次いで、これらの植物を生長させることができ、同一形質転換株または異なる株により受粉させ、所望の表現型特徴の構成的発現を有する得られたハイブリッドを同定する。所望の表現型特徴の発現が安定的に維持および遺伝されることを確保するために２世代以上を生長させることができ、次いで所望の表現型特徴の発現が達成されたことを確保するために種子を収穫することができる。このように、本発明は、ゲノム中に安定的に取り込まれた本発明のヌクレオチド構築物、例えば、本発明の発現カセットを有する形質転換された種子（「トランスジェニック種子」とも称される）を提供する。
【００７３】
植物形質転換の評価
植物細胞中に異種外来ＤＮＡを導入した後、植物ゲノム中の異種遺伝子の形質転換または組込みは、種々の方法、例えば、組み込まれた遺伝子に関連する核酸、タンパク質および代謝産物の分析などにより確認される。
【００７４】
ＰＣＲ分析は、土壌中に移植する前のより早い段階において、取り込まれた遺伝子の存在について、形質転換された細胞、組織または芽をスクリーニングするための迅速な方法である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。ＰＣＲは、目的遺伝子またはアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ベクターバックグラウンドなどに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施される。
【００７５】
植物形質転換は、ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析により確認することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、前掲）。一般に、全ＤＮＡを形質転換体から抽出し、適切な制限酵素により消化し、アガロースゲル中で分画し、ニトロセルロースまたはナイロン膜に転写する。次いで、膜または「ブロット」を、例えば、放射標識３２Ｐ標的ＤＮＡ断片によりプロービングして標準的な技術に従って植物ゲノム中に導入された遺伝子の組込みを確認する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、前掲）。
【００７６】
ノザンブロット分析においては、ＲＮＡを形質転換体の特定の組織から単離し、ホルムアルデヒドアガロースゲル中で分画し、当技術分野において定型的に使用される標準的な手順に従ってナイロンフィルターにブロッティングする（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、前掲）。次いで、当技術分野において公知の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、前掲）により、殺虫遺伝子由来の放射性プローブにフィルターをハイブリダイズさせることにより殺虫遺伝子によりコードされるＲＮＡの発現を試験する。
【００７７】
ウェスタンブロット、生化学アッセイなどをトランスジェニック植物に対して実施して殺虫タンパク質上に存在する１つ以上のエピトープに結合する抗体を使用する標準的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、前掲）により殺虫遺伝子によりコードされるタンパク質の存在を確認することができる。
【００７８】
植物における殺虫活性
本発明の別の態様において、殺虫活性を有する殺虫タンパク質を発現するトランスジェニック植物を生成することができる。例として、上記の方法を利用してトランスジェニック植物を生成することができるが、トランスジェニック植物細胞を生成する方法は本発明にとって重要でない。当技術分野において公知のまたは記載された方法、例えば、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換、微粒子銃形質転換、および非粒子媒介方法を、実験者の裁量で使用することができる。殺虫タンパク質を発現する植物は、当技術分野において記載される一般的な方法、例えば、カルスの形質転換、形質転換されたカルスの選択、およびそのようなトランスジェニックカルスからの稔性植物の再生により単離することができる。このようなプロセスにおいて、植物細胞中での発現が、形質転換細胞を同定および選択する能力を付与する限り、任意の遺伝子を選択マーカーとして使用することができる。
【００７９】
植物細胞について使用するための多数のマーカー、例えば、クロラムフェニコール、アミノグリコシドＧ４１８、ハイグロマイシンなどに対する耐性が開発されている。葉緑体代謝に関与する産物をコードする他の遺伝子を選択マーカーとして使用することもできる。例えば、植物除草剤、例えば、グリホサート、ブロモキシニル、またはイミダゾリノンに対する耐性を提供する遺伝子を特に使用することができる。このような遺伝子は報告されている（Ｓｔａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６３１０−６３１４（ブロモキシニル耐性ニトリラーゼ遺伝子）；およびＳａｔｈａｓｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：２１８８（ＡＨＡＳイミダゾリノン耐性遺伝子）。さらに、本明細書に開示の遺伝子は、細菌または植物細胞の形質転換を評価するためのマーカーとして有用である。植物、植物器官（例えば、葉、幹、根など）、種子、植物細胞、珠芽、胚またはその子孫中のトランス遺伝子の存在を検出する方法は、当技術分野において周知である。一実施形態において、トランス遺伝子の存在は殺虫活性を試験することにより検出される。
【００８０】
殺虫タンパク質を発現する稔性植物を殺虫活性について試験することができ、最適活性を示す植物をさらなる育種のために選択することができる。害虫活性についてアッセイするための方法が当技術分野において利用可能である。一般に、タンパク質は混合され、摂食アッセイにおいて使用される。例えば、Ｍａｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．ｏｆ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ７８：２９０−２９３を参照されたい。
【００８１】
本発明は、任意の植物種、例として、限定されるものではないが、単子葉および双子葉植物の形質転換に使用することができる。目的植物の例としては、限定されるものではないが、トウモロコシ（メイズ）、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科の植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、およびアブラナ、ブラシカ属種（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．）、アルファルファ、ライムギ、アワ、ベニバナ、ピーナッツ、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナッツ、パイナップル、柑橘類の木、ココア、チャノキ、バナナ、アボカド、イチジク、グァバ、マンゴー、オリーブ、パパイア、カシュー、マカダミヤ、アーモンド、オートムギ、野菜、観葉植物、および球果植物が挙げられる。
【００８２】
野菜としては、限定されるものではないが、トマト、レタス、グリーンビーンズ、ライマメ、エンドウおよびクルクミス属（Ｃｕｒｃｕｍｉｓ）のメンバー、例えば、キュウリ、カンタロープ、およびマスクメロンが挙げられる。観葉植物としては、限定されるものではないが、アザレア、アジサイ、ハイビスカス、バラ、チューリップ、ラッパズイセン、ツクバネアサガオ、カーネーション、ポインセチア、およびキクが挙げられる。好ましくは、本発明の植物は、作物である（例えば、メイズ、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科の植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、アブラナなど）。
【００８３】
殺虫防除における使用
害虫防除において、または殺虫剤として他の生物を遺伝子操作する際に、本発明のヌクレオチド配列またはその変異体を含む株を用いる一般的な方法は、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，０３９，５２３号明細書および欧州特許出願公開第０４８０７６２Ａ２号明細書を参照されたい。
【００８４】
本発明のヌクレオチド配列、もしくはその変異体を含有するバシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株、または本発明の殺虫遺伝子およびタンパク質を含有するように遺伝子的に変更された微生物を、農作物および製品を害虫から保護するために使用することができる。本発明の一態様において、毒素（殺虫剤）産生生物の完全細胞、すなわち非溶解細胞を、細胞が標的害虫の環境に施与される場合に細胞中で産生される毒素の活性を延長する試薬により処理する。
【００８５】
あるいは、殺虫剤は、殺虫遺伝子を細胞宿主中に導入することにより産生される。殺虫遺伝子の発現は、直接的にまたは間接的に殺虫剤の細胞内の産生および維持をもたらす。本発明の一態様において、次いで、これらの細胞を、細胞が標的害虫の環境に施与される場合に細胞中で産生される毒素の活性を延長する条件下で処理する。得られる産物は、毒素の毒性を保持する。次いで、これらの天然に封入された殺虫剤は、標的害虫が生息する環境、例えば、土壌、水、および植物の枝葉への適用のための慣用の技術に従って配合することができる。例えば、欧州特許出願公開第Ａ０１９２３１９号明細書およびそこに引用される参照文献を参照されたい。あるいは、得られる材料を殺虫剤として施与できるようにするために、本発明の遺伝子を発現する細胞を配合することができる。
【００８６】
本発明の活性成分は、通常、組成物の形態で施与され、他の化合物と同時にまたは連続的に、処理すべき作物領域または植物に施与することができる。これらの化合物は、肥料、雑草除去剤、抗凍結剤、界面活性剤、洗浄剤、殺虫石鹸、ドルマントオイル（ｄｏｒｍａｎｔ  ｏｉｌ）、ポリマー、および／または１回の配合物の施与後に標的領域の長期投与を可能とする持続放出もしくは生分解性担体配合物であり得る。これらはまた、所望であれば、さらに農学的に許容可能な担体、界面活性剤、または配合物の分野において慣用的に用いられる施与を促進する補助剤を一緒に含む、選択的除草剤、化学殺昆虫剤、殺ウイルス剤、殺微生物剤、殺アメーバ剤、殺虫剤、殺真菌剤、殺菌剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤またはそれらの調製物のいくつかの混合物であり得る。好適な担体および補助剤は、固体または液体であり得、配合技術において通常用いられる物質、例えば、天然もしくは再生鉱物、溶媒、分散剤、湿潤剤、粘着付与剤、結合剤または肥料に対応する。同様に、配合物は、標的害虫による殺虫性配合物の摂食または摂取を可能とするために、食用「餌」に調製することができ、または害虫「罠」にすることができる。
【００８７】
本発明の活性成分または本発明の細菌株により産生される殺虫性タンパク質の少なくとも１つを含有する本発明の農薬組成物を施与する方法は、葉への施与、種子コーティングおよび土壌施与を含む。施与回数および施与の割合は、対応する害虫による蔓延の強度に依存する。
【００８８】
組成物は、粉末、粉剤、ペレット、粒剤、噴霧剤、乳剤、コロイド、液剤またはそのような類似物などとして配合することができ、このような慣用の手段、例えば、ポリペプチドを含む細胞培養物の乾燥、凍結乾燥、ホモジネーション（ｈｏｍｏｇｅｎａｔｉｏｎ）、抽出、ろ過、遠心分離、沈降、または濃縮により調製することができる。少なくとも１つのこのような殺虫ポリペプチドを含有する全てのこのような組成物において、ポリペプチドは、約１重量％〜約９９重量％の濃度で存在し得る。
【００８９】
鱗翅目、半翅目、双翅目、または鞘翅目の害虫は、所与の領域中で本発明の方法により殺滅もしくは数を低減させることができ、または感受性害虫による蔓延を防ぐために環境領域に予防的に施与することができる。好ましくは、害虫は、殺虫有効量のポリペプチドを摂取し、またはそれと接触させる。「殺虫有効量」は、少なくとも１匹の害虫に死をもたらし、または害虫の成長、摂食、もしくは通常の生理学的発達を顕著に低減させ得る殺虫剤の量を意図する。この量は、例えば、防除すべき特定の標的害虫、特定の環境、場所、植物、作物、または処理すべき農業用地、環境条件、ならびに殺虫有効ポリペプチド組成物の施与の方法、割合、濃度、安定性および量などのような因子に応じて変動する。配合物は、気候条件、環境整備、および／または施与頻度および／または害虫蔓延の重度に対しても変動し得る。
【００９０】
記載の殺虫剤組成物は、細菌細胞、結晶および／もしくは胞子懸濁液、または単離タンパク質構成成分のいずれかを、所望の農学的に許容可能な担体とともに配合することにより作製することができる。組成物は、投与前に、適切な手段、例えば、凍結乾燥させ、フリーズドライし、乾燥させ、または水性担体、媒体もしくは適切な希釈剤、例えば、生理食塩水もしくは他の緩衝液中で配合することができる。配合された組成物は、粉剤または粒剤材料、または油（植物油または鉱物油）もしくは水中の懸濁液もしくは油／水乳剤の形態で、または水和剤として、または農業施与に好適な任意の他の担体材料との組合せであり得る。好適な農学的担体は固体または液体であり得、当技術分野において周知である。用語「農学的に許容可能な担体」は、殺虫剤配合技術に通常使用される全ての補助剤、不活性構成成分、分散剤、界面活性剤、粘着付与剤、結合剤などを網羅し；これらは殺虫剤配合の当業者には周知である。配合物を１つ以上の固体または液体補助剤と混合することができ、種々の手段により、例えば、慣用の配合技術を使用して好適な補助剤とともに殺虫組成物を例えば均一に混合、ブレンドおよび／または粉砕することにより調製することができる。好適な配合および施与法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４６８，５２３号明細書に記載されている。
【００９１】
「害虫」としては、限定されるものではないが、昆虫、真菌、細菌、線虫、ダニ、マダニなどが挙げられる。昆虫害虫としては、鞘翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）、膜翅目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、ハジラミ目（Ｍａｌｌｏｐｈａｇａ）、同翅亜目（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）、半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）、バッタ目（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ）、アザミウマ目（Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ）、ハサミムシ目（Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ）、等翅目（Ｉｓｏｐｔｅｒａ）、シラミ目（Ａｎｏｐｌｕｒａ）、隠翅目（Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ）、毛翅目（Ｔｒｉｃｈｏｐｔｅｒａ）など、特に、鞘翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、および双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）から選択される昆虫が挙げられる。
【００９２】
鞘翅目としては、オサムシ亜目（Ａｄｅｐｈａｇａ）およびカブトムシ亜目（Ｐｏｌｙｐｈａｇａ）が挙げられる。オサムシ亜目（Ａｄｅｐｈａｇａ）としては、オサムシ上科（Ｃａｒａｂｏｉｄｅａ）およびミズスマシ上科（Ｇｙｒｉｎｏｉｄｅａ）が挙げられる一方、カブトムシ亜目（Ｐｏｌｙｐｈａｇａ）としては、ガムシ上科（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｏｉｄｅａ）、ハネカクシ上科（Ｓｔａｐｈｙｌｉｎｏｉｄｅａ）、ホタル上科（Ｃａｎｔｈａｒｏｉｄｅａ）、カッコウムシ上科（Ｃｌｅｒｏｉｄｅａ）、コメツキムシ上科（Ｅｌａｔｅｒｏｉｄｅａ）、ナガフナガタムシ上科（Ｄａｓｃｉｌｌｏｉｄｅａ）、ドロムシ上科（Ｄｒｙｏｐｏｉｄｅａ）、マルトゲムシ上科（Ｂｙｒｒｈｏｉｄｅａ）、ヒラタムシ上科（Ｃｕｃｕｊｏｉｄｅａ）、ツチハンミョウ上科（Ｍｅｌｏｉｄｅａ）、ハナノミ上科（Ｍｏｒｄｅｌｌｏｉｄｅａ）、ゴミムシダマシ上科（Ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｏｉｄｅａ）、ナガシンクイムシ上科（Ｂｏｓｔｒｉｃｈｏｉｄｅａ）、コガネムシ上科（Ｓｃａｒａｂａｅｏｉｄｅａ）、カミキリムシ上科（Ｃｅｒａｍｂｙｃｏｉｄｅａ）、ハムシ上科（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｏｉｄｅａ）、およびゾウムシ上科（Ｃｕｒｃｕｌｉｏｎｏｉｄｅａ）が挙げられる。オサムシ上科（Ｃａｒａｂｏｉｄｅａ）としては、ハンミョウ科（Ｃｉｃｉｎｄｅｌｉｄａｅ）、オサムシ科（Ｃａｒａｂｉｄａｅ）、およびゲンゴロウ科（Ｄｙｔｉｓｃｉｄａｅ）が挙げられる。ミズスマシ上科（Ｇｙｒｉｎｏｉｄｅａ）としては、ミズスマシ科（Ｇｙｒｉｎｉｄａｅ）が挙げられる。ガムシ上科（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｏｉｄｅａ）としては、ガムシ科（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｄａｅ）が挙げられる。ハネカクシ上科（Ｓｔａｐｈｙｌｉｎｏｉｄｅａ）としては、シデムシ科（Ｓｉｌｐｈｉｄａｅ）およびハネカクシ科（Ｓｔａｐｈｙｌｉｎｉｄａｅ）が挙げられる。ホタル上科（Ｃａｎｔｈａｒｏｉｄｅａ）としては、ジョウカイボン科（Ｃａｎｔｈａｒｉｄａｅ）およびホタル科（Ｌａｍｐｙｒｉｄａｅ）が挙げられる。カッコウムシ上科（Ｃｌｅｒｏｉｄｅａ）としては、カッコウムシ科（Ｃｌｅｒｉｄａｅ）およびカツオブシムシ科
（Ｄｅｒｍｅｓｔｉｄａｅ）が挙げられる。コメツキムシ上科（Ｅｌａｔｅｒｏｉｄｅａ）としては、コメツキムシ科（Ｅｌａｔｅｒｉｄａｅ）およびタマムシ科（Ｂｕｐｒｅｓｔｉｄａｅ）が挙げられる。ヒラタムシ上科（Ｃｕｃｕｊｏｉｄｅａ）としては、テントウムシ科（Ｃｏｃｃｉｎｅｌｌｉｄａｅ）が挙げられる。ツチハンミョウ上科（Ｍｅｌｏｉｄｅａ）としては、ツチハンミョウ科（Ｍｅｌｏｉｄａｅ）が挙げられる。ゴミムシダマシ上科（Ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｏｉｄｅａ）としては、ゴミムシダマシ科（Ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｄａｅ）が挙げられる。コガネムシ上科（Ｓｃａｒａｂａｅｏｉｄｅａ）としては、クロツヤムシ科（Ｐａｓｓａｌｉｄａｅ）およびコガネムシ科（Ｓｃａｒａｂａｅｉｄａｅ）が挙げられる。カミキリムシ上科（Ｃｅｒａｍｂｙｃｏｉｄｅａ）としては、カミキリムシ科（Ｃｅｒａｍｂｙｃｉｄａｅ）が挙げられる。ハムシ上科（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｏｉｄｅａ）としては、ハムシ科（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｉｄａｅ）が挙げられる。ゾウムシ上科（Ｃｕｒｃｕｌｉｏｎｏｉｄｅａ）としては、ゾウムシ科（Ｃｕｒｃｕｌｉｏｎｉｄａｅ）およびキクイムシ科（Ｓｃｏｌｙｔｉｄａｅ）が挙げられる。
【００９３】
双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）としては、長角亜目（Ｎｅｍａｔｏｃｅｒａ）、短角亜目（Ｂｒａｃｈｙｃｅｒａ）、および環縫亜目（Ｃｙｃｌｏｒｒｈａｐｈａ）が挙げられる。長角亜目（Ｎｅｍａｔｏｃｅｒａ）としては、ガガンボ科（Ｔｉｐｕｌｉｄａｅ）、チョウバエ科（Ｐｓｙｃｈｏｄｉｄａｅ）、カ科（Ｃｕｌｉｃｉｄａｅ）、ヌカカ科（Ｃｅｒａｔｏｐｏｇｏｎｉｄａｅ）、ユスリカ科（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｉｄａｅ）、ブユ科（Ｓｉｍｕｌｉｉｄａｅ）、ケバエ科（Ｂｉｂｉｏｎｉｄａｅ）、およびタマバエ科（Ｃｅｃｉｄｏｍｙｉｉｄａｅ）が挙げられる。短角亜目（Ｂｒａｃｈｙｃｅｒａ）としては、ミズアブ科（Ｓｔｒａｔｉｏｍｙｉｄａｅ）、アブ科（Ｔａｂａｎｉｄａｅ）、ツルギアブ科（Ｔｈｅｒｅｖｉｄａｅ）、ムシヒキアブ科（Ａｓｉｌｉｄａｅ）、ムシヒキアブモドキ科（Ｍｙｄｉｄａｅ）、ツリアブ科（Ｂｏｍｂｙｌｉｉｄａｅ）、およびアシナガバエ科（Ｄｏｌｉｃｈｏｐｏｄｉｄａｅ）が挙げられる。環縫亜目（Ｃｙｃｌｏｒｒｈａｐｈａ）としては、無額嚢門（Ａｓｃｈｉｚａ）および無額嚢門（Ａｓｃｈｉｚａ）が挙げられる。無額嚢門（Ａｓｃｈｉｚａ）としては、ノミバエ科（Ｐｈｏｒｉｄａｅ）、ハナアブ科（Ｓｙｒｐｈｉｄａｅ）、およびメバエ科（Ｃｏｎｏｐｉｄａｅ）が挙げられる。無額嚢門（Ａｓｃｈｉｚａ）としては、無弁翅節（Ａｃａｌｙｐｔｒａｔａｅ）および弁翅節（Ｃａｌｙｐｔｒａｔａｅ）が挙げられる。無弁翅節（Ａｃａｌｙｐｔｒａｔａｅ）としては、マダラバエ科（Ｏｔｉｔｉｄａｅ）、ミバエ科（Ｔｅｐｈｒｉｔｉｄａｅ）、ハモグリバエ科（Ａｇｒｏｍｙｚｉｄａｅ）、およびショウジョウバエ科（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉｄａｅ）が挙げられる。弁翅節（Ｃａｌｙｐｔｒａｔａｅ）としては、シラミバエ科（Ｈｉｐｐｏｂｏｓｃｉｄａｅ）、ヒツジバエ科（Ｏｅｓｔｒｉｄａｅ）、ヤドリバエ科（Ｔａｃｈｉｎｉｄａｅ）、ハナバエ科（Ａｎｔｈｏｍｙｉｉｄａｅ）、イエバエ科（Ｍｕｓｃｉｄａｅ）、クロバエ科（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒｉｄａｅ）、およびニクバエ科（Ｓａｒｃｏｐｈａｇｉｄａｅ）が挙げられる。
【００９４】
鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）としては、アゲハチョウ科（Ｐａｐｉｌｉｏｎｉｄａｅ）、シロチョウ科（Ｐｉｅｒｉｄａｅ）、シジミチョウ科（Ｌｙｃａｅｎｉｄａｅ）、タテハチョウ科（Ｎｙｍｐｈａｌｉｄａｅ）、マダラチョウ科（Ｄａｎａｉｄａｅ）、ジャノメチョウ科（Ｓａｔｙｒｉｄａｅ）、セセリチョウ科（Ｈｅｓｐｅｒｉｉｄａｅ）、スズメガ科（Ｓｐｈｉｎｇｉｄａｅ）、ヤママユガ科（Ｓａｔｕｒｎｉｉｄａｅ）、シャクガ科（Ｇｅｏｍｅｔｒｉｄａｅ）、ヒトリガ科（Ａｒｃｔｉｉｄａｅ）、ヤガ科（Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ）、ドクガ科（Ｌｙｍａｎｔｒｉｉｄａｅ）、スカシバガ科（Ｓｅｓｉｉｄａｅ）、およびヒロズコガ科（Ｔｉｎｅｉｄａｅ）が挙げられる。
【００９５】
線虫としては、寄生性線虫、例えば、ネコブ、シスト、およびネグサレセンチュウ、例として、ヘテロデラ属種（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｓｐｐ．）、メロイドギネ属種（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｓｐｐ．）、およびグロボデラ属種（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｓｐｐ．）；特にシストセンチュウのメンバー、例として、限定されるものではないが、ダイズシストセンチュウ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ）；テンサイシストセンチュウ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｓｃｈａｃｈｔｉｉ）；ヘテロデラ・アベナエ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ａｖｅｎａｅ）（ムギシストセンチュウ）；ならびにグロボデラ・ロストキエンシス（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）およびグロボデラ・パイリダ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｐａｉｌｉｄａ）（ジャガイモシストセンチュウ）が挙げられる。ネグサレセンチュウとしては、ネグサレセンチュウ属種（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｓｐｐ．）が挙げられる。
【００９６】
半翅目害虫（半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）、同翅亜目（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）、または異翅亜目（Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａ）として命名される種を含む）としては、限定されるものではないが、リグス属種（Ｌｙｇｕｓ  ｓｐｐ．）、例えば、セイヨウサビイロカスミカメ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｔａｒｎｉｓｈｅｄ  ｐｌａｎｔ  ｂｕｇ）（Ｌｙｇｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓ）、サビイロカスミカメ（Ｌｙｇｕｓ  ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）、およびグリーンプラントバグ（ｇｒｅｅｎ  ｐｌａｎｔ  ｂｕｇ）（Ｌｙｇｕｓ  ｅｌｉｓｕｓ）；アブラムシ、例えば、モモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ）、ワタアブラムシ（Ａｐｈｉｓ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、サクランボアブラムシまたはブラックチェリーアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ  ｃｅｒａｓｉ）、ダイズアブラムシ（Ａｐｈｉｓ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ  Ｍａｔｓｕｍｕｒａ）；トビイロウンカ（Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ  ｌｕｇｅｎｓ）、およびネホテチクス属種（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｓｐｐ．）；ならびにカメムシ、例えば、アオカメムシ（Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ  ｈｉｌａｒｅ）、クサギカメムシ（Ｈａｌｙｏｍｏｒｐｈａ  ｈａｌｙｓ）、ミナミアオカメムシ（Ｎｅｚａｒａ  ｖｉｒｉｄｕｌａ）、コメカメムシ（Ｏｅｂａｌｕｓ  ｐｕｇｎａｘ）、アシアカカメムシ（Ｐｅｎｔａｔｏｍａ  ｒｕｆｉｐｅｓ）、ヨーロッパカメムシ（Ｒｈａｐｈｉｇａｓｔｅｒ  ｎｅｂｕｌｏｓａ）、およびカメムシ（Ｔｒｏｉｌｕｓ  ｌｕｒｉｄｕｓ）が挙げられる。
【００９７】
主要な作物についての本発明の昆虫害虫としては、以下が挙げられる：メイズ：ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）；タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ）；オオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）；ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）；サウスウエスタンコーンボーラー（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）；モロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）；サトウキビズイムシ（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）；ウエスタンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）；ノーザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｌｏｎｇｉｃｏｒｎｉｓ  ｂａｒｂｅｒｉ）；サザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗａｒｄｉ）；メラノツス属種（Ｍｅｌａｎｏｔｕｓ  ｓｐｐ．）、ハリガネムシ；ノーザンマスクドチェイファー（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ  ｂｏｒｅａｌｉｓ）（ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｍａｓｋｅｄ  ｃｈａｆｅｒ）（アオドウガネ）；サザンマスクドチェイファー（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ  ｉｍｍａｃｕｌａｔａ）（ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｍａｓｋｅｄ  ｃｈａｆｅｒ）（アオドウガネ）；マメコガネ（Ｐｏｐｉｌｌｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）；トウモロコシノミハムシ（Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ  ｐｕｌｉｃａｒｉａ）；メイズゾウムシ（Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ  ｍａｉｄｉｓ）；トウモロコシアブラムシ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ  ｍａｉｄｉｓ）；コーンルートアフィッド（Ａｎｕｒａｐｈｉｓ  ｍａｉｄｉｒａｄｉｃｉｓ）（ｃｏｒｎ  ｒｏｏｔ  ａｐｈｉｄ）；アメリカコバネナガカメムシ（Ｂｌｉｓｓｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ）；レッドレッグドグラスホッパー（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ）（ｒｅｄｌｅｇｇｅｄ  ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）；渡りバッタ（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ）；タネバエ（Ｈｙｌｅｍｙａ  ｐｌａｔｕｒａ）；コーンブロットリーフマイナー（Ａｇｒｏｍｙｚａ  ｐａｒｖｉｃｏｒｎｉｓ）（ｃｏｒｎ  ｂｌｏｔ  ｌｅａｆｍｉｎｅｒ）；クサキイロアザミウマ（Ａｎａｐｈｏｔｈｒｉｐｓ  ｏｂｓｃｒｕｒｕｓ）；盗賊アリ（Ｓｏｌｅ
ｎｏｐｓｉｓ  ｍｉｌｅｓｔａ）；ナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｕｒｔｉｃａｅ）；ソルガム：ソルガムボーラー（Ｃｈｉｌｏ  ｐａｒｔｅｌｌｕｓ）（ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｏｒｅｒ）；ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）；オオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）；モロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）；グラニュレートカットワーム（Ｆｅｌｔｉａ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）（ｇｒａｎｕｌａｔｅ  ｃｕｔｗｏｒｍ）；アオドウガネ（Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ  ｃｒｉｎｉｔａ）；エレオデス属（Ｅｌｅｏｄｅｓ）、
コノデルス属（Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ）、およびアエオルス属（Ａｅｏｌｕｓ）、ハリガネムシ；クビアカクビホソムシ（Ｏｕｌｅｍａ  ｍｅｌａｎｏｐｕｓ）；トウモロコシノミハムシ（Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ  ｐｕｌｉｃａｒｉａ）；メイズゾウムシ（Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ  ｍａｉｄｉｓ）；トウモロコシアブラムシ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ  ｍａｉｄｉｓ）；キイロサトウキビアブラムシ（Ｓｉｐｈａ  ｆｌａｖａ）；アメリカコバネナガカメムシ（Ｂｌｉｓｓｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ）；ソルガムヌカカ（Ｃｏｎｔａｒｉｎｉａ  ｓｏｒｇｈｉｃｏｌａ）；ニセナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）；ナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｕｒｔｉｃａｅ）；コムギ：アーミーワーム（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａｔａ）；ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）；モロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）；セイヨウネキリムシ（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ）；モロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）；クビアカクビホソムシ（Ｏｕｌｅｍａ  ｍｅｌａｎｏｐｕｓ）；オオタコゾウムシ（Ｈｙｐｅｒａ  ｐｕｎｃｔａｔａ）；サザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗａｒｄｉ）；ロシアンウィートアフィッド（Ｒｕｓｓｉａｎ  ｗｈｅａｔ  ａｐｈｉｄ）；ムギミドリアブラムシ（Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）；イングリッシュグレインアフィッド（Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ  ａｖｅｎａｅ）（Ｅｎ
ｇｌｉｓｈ  ｇｒａｉｎ  ａｐｈｉｄ）；レッドレッグドグラスホッパー（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ）；ディファレンシャルグラスホッパー（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ）（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）；渡りバッタ（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ）；ヘシアンバエ（Ｍａｙｅｔｉｏｌａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）；ムギアカタマバエ（Ｓｉｔｏｄｉｐｌｏｓｉｓ  ｍｏｓｅｌｌａｎａ）；ムギキモグリバエ（Ｍｅｒｏｍｙｚａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）（ｗｈｅａｔ  ｓｔｅｍ  ｍａｇｇｏｔ）；コムギスイセンハナアブ（Ｈｙｌｅｍｙａ  ｃｏａｒｃｔａｔａ）（ｗｈｅａｔ  ｂｕｌｂ  ｆｌｙ）；タバコアザミウマ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ  ｆｕｓｃａ）；コムギクキバチ（Ｃｅｐｈｕｓ  ｃｉｎｃｔｕｓ）；チューリップサビダニ（Ａｃｅｒｉａ  ｔｕｌｉｐａｅ）；ヒマワリ：サンフラワーバッドモス（Ｓｕｌｅｉｍａ  ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ）（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ  ｂｕｄ  ｍｏｔｈ）；サンフラワーモス（Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ  ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ）；サンフラワービートル（ｚｙｇｏｇｒａｍｍａ  ｅｘｃｌａｍａｔｉｏｎｉｓ）；キャロットビートル（Ｂｏｔｈｙｒｕｓ  ｇｉｂｂｏｓｕｓ）（ｃａｒｒｏｔ  ｂｅｅｔｌｅ）；サンフラワーシードミッジ（Ｎｅｏｌａｓｉｏｐｔｅｒａ  ｍｕｒｔｆｅｌｄｔｉａｎａ）（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ  ｓｅｅｄ  ｍｉｄｇｅ）；ワタ：ニセアメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）；オオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）；シロイチモジヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ）；ワタアカミムシガ（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ）；ワタミゾウムシ（Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）；ワタアブラムシ（Ａｐｈｉｓ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）；ワタノミハムシ（Ｐｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ  ｓｅｒｉａｔｕｓ）；オンシツコナジラミ（Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ  ａｂｕｔｉｌｏｎｅａ）；サビイロカスミカメ（Ｌｙｇｕｓ  ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）；レッドレッグドグラスホッパー（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ）；ディファレンシャルグラスホッパー（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ）；ネギアザミウマ（Ｔｈｒｉｐ
ｓ  ｔａｂａｃｉ）；タバコアザミウマ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｋｉｅｌｌａ  ｆｕｓｃａ）；ニセナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）；ナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｕｒｔｉｃａｅ）；イネ：サトウキビズイムシ（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）；ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）；オオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）；グレープコラスピス（Ｃｏｌａｓｐｉｓ  ｂｒｕｎｎｅａ）（ｇｒａｐｅ  ｃｏｌａｓｐｉｓ）；イネミズゾウムシ（Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ  ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ）；ココクゾウムシ（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）；クロスジツマグロヨコバイ（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｎｉｇｒｏｐｉｃｔｕｓ）；アメリカコバネナガカメムシ（Ｂｌｉｓｓｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ）；アオカメムシ（Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ  ｈｉｌａｒｅ）；ダイズ：ダイズシャクトリムシ（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ  ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）；ビロードマメケムシ（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）；グリーンクローバーワーム（Ｐｌａｔｈｙｐｅｎａ  ｓｃａｂｒａ）（ｇｒｅｅｎ  ｃｌｏｖｅｒｗｏｒｍ）；ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）；タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ）；シロイチモジヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ）；ニセアメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）；オオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）；インゲンテントウ（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ  ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ）；モモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ）；ジャガイモヒメヨコバイ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｆａｂａｅ）；アオカメムシ（Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ  ｈｉｌａｒｅ）；レッドレッグドグラスホッパー（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ）；ディファレンシャルグラスホッパー（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ）；タネバエ（Ｈｙｌｅｍｙａ  ｐｌａｔｕｒａ）；ダイズアザミウマ（Ｓｅｒｉｃｏｔｈｒｉｐｓ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）；ネギアザミウマ（Ｔｈｒｉｐｓ  ｔａｂａｃｉ）；イチゴハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉ）；ナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｕｒ
ｔｉｃａｅ）；オオムギ：ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）；タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ）；ムギミドリアブラムシ（Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）；アメリカコバネナガカメムシ（Ｂｌｉｓｓｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ）；アオカメムシ（Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ  ｈｉｌａｒｅ）；チャイロカメムシ（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｓｅｒｖｕｓ）；タネバエ（Ｄｅｌｉａ  ｐｌａｔｕｒａ）；ヘシアンバエ（Ｍａｙｅｔｉｏｌａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）；ホモノハダニ（Ｐｅｔｒｏｂｉａ  ｌａｔｅｎｓ）；アブラナ：ダイコンアブラムシ（Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）；ノミハムシ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ  ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）；ベルタアワヨトウ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ）；コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）；デリア属（Ｄｅｌｉａ）、ハナバエ。
【００９８】
線虫としては、寄生性線虫、例えば、ネコブ、シスト、およびネグサレセンチュウ、例として、ヘテロデラ属種（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｓｐｐ．）、メロイドギネ属種（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｓｐｐ．）、およびグロボデラ属種（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｓｐｐ．）；特にシストセンチュウのメンバー、例として、限定されるものではないが、ダイズシストセンチュウ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ）；テンサイシストセンチュウ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｓｃｈａｃｈｔｉｉ）；ヘテロデラ・アベナエ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ａｖｅｎａｅ）（ムギシストセンチュウ）；ならびにグロボデラ・ロストキエンシス（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）およびグロボデラ・パイリダ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｐａｉｌｉｄａ）（ジャガイモシストセンチュウ）が挙げられる。ネグサレセンチュウとしては、ネグサレセンチュウ属種（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｓｐｐ．）が挙げられる。
【００９９】
植物収穫高を増加させる方法
植物収穫高を増加させる方法が提供される。方法は、本明細書に開示の殺虫ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを発現する植物または植物細胞を提供し、前記ポリペプチドが殺虫活性を有する害虫が蔓延している（またはその害虫による蔓延の影響を受けやすい）圃場中で植物またはその種子を生育させることを含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、鱗翅目、鞘翅目、双翅目、半翅目、または線虫害虫に対して殺虫活性を有し、前記圃場は、鱗翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目、または線虫害虫が蔓延している。本明細書に定義される植物の「収穫高」は、その植物により産生されるバイオマスの質および／または量を指す。「バイオマス」は、任意の計測される植物産物を意図する。バイオマス産生の増加は、計測される植物産物の収穫高の任意の改善である。植物収穫高の増加は、いくつかの商業的用途を有する。例えば、植物の葉のバイオマスの増加は、ヒトまたは動物の消費のための葉野菜の収穫高を増加させ得る。さらに、葉バイオマスの増加を使用して植物由来の医薬または工業製品の産生を増加させることができる。収穫高の増加は、殺虫配列を発現しない植物と比較して、任意の統計学的に有意な増加、例として、限定されるものではないが、収穫高の少なくとも１％増加、少なくとも３％増加、少なくとも５％増加、少なくとも１０％増加、少なくとも２０％増加、少なくとも３０％増加、少なくとも５０％増加、少なくとも７０％増加、少なくとも１００％またはそれより大きい増加を含み得る。特定の方法において、植物収穫高は、本明細書に開示の殺虫タンパク質を発現する植物の改善された害虫耐性の結果として増加する。殺虫タンパク質の発現は、蔓延し、または摂食する害虫の能力の低減をもたらす。
【０１００】
植物はまた、１つ以上の化学組成物、例として、１つ以上の除草剤、殺昆虫剤、または殺真菌剤により処理することができる。例示的な化学組成物としては、以下が挙げられる：果物／野菜用除草剤：アトラジン、ブロマシル、ジウロン、グリホサート、リニュロン、メトリブジン、シマジン、トリフルラリン、フルアジホップ、グルホシネート、ハロスルフロンゴワン（Ｈａｌｏｓｕｌｆｕｒｏｎ  Ｇｏｗａｎ）、パラコート、プロピザミド、セトキシジム、ブタフェナシル、ハロスルフロン、インダジフラム；果物／野菜用殺虫剤：アルジカルブ、バシルス・ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｅｎｇｉｅｎｓｉｓ）、カルバリル、カルボフラン、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、アバメクチン、シフルトリン／ベータ−シフルトリン、エスフェンバレレート、ラムダ−シハロトリン、アセキノシル、ビフェナゼート、メトキシフェノジド、ノバルロン、クロマフェノジド、チアクロプリド、ジノテフラン、フルアクリピリム、スピロジクロフェン、ガンマ−シハロトリン、スピロメシフェン、スピノサド、リナキシピル、サイアジピル、トリフルムロン、スピロテトラマト、イミダクロプリド、フルベンジアミド、チオジカルブ、メタフルミゾン、スルホキサフロール、シフルメトフェン、シアノピラフェン（Ｃｙａｎｏｐｙｒａｆｅｎ）、クロチアニジン、チアメトキサム、スピノトラム（Ｓｐｉｎｏｔｏｒａｍ）、チオジカルブ、フロニカミド、メチオカルブ、エマメクチン安息香酸塩、インドキサカルブ、フェナミホス、ピリプロキシフェン、酸化フェンブタスズ；果物／野菜用殺真菌剤：アメトクトラジン、アゾキシストロビン、ベンチアバリカルブ、ボスカリド、カプタン、カルベンダジム、クロロタロニル、銅、シアゾファミド、シフルフェナミド、シモキサニル、シプロコナゾール、シプロジニル、ジフェノコナゾール、ジメトモルフ、ジチアノン、フェンアミドン、フェンヘキサミド、フルアジナム、フルジオキソニル、フルオピコリド、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルキサピロキサド、フォルペット、ホセチル、イプロジオン、イプロバリカルブ、イソピラザム、クレソキシム−メチル、マンコゼブ、マンジプロパミド、メタラキシル／メフェノキサム、メチラム、メトラフェノン、ミクロブタニル、ペンコナゾール、ペンチオピラド、ピコキシ
ストロビン、プロパモカルブ、プロピコナゾール、プロピネブ、プロキナジド、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、ピリメタニル、キノキシフェン、スピロキサミン、硫黄、テブコナゾール、チオファネート−メチル、トリフロキシストロビン；穀物用除草剤：２．４−Ｄ、アミドスルフロン、ブロモキシニル、カルフェントラゾン−Ｅ、クロロトルロン、クロルスルフロン、クロジナホップ−Ｐ、クロピラリド、ジカンバ、ジクロホップ−Ｍ、ジフルフェニカン、フェノキサプロップ、フロラスラム、フルカルバゾン−ＮＡ、フルフェナセット、フルピルスルフロン−Ｍ、フルロキシピル、フルルタモン、グリホサート、ヨードスルフロン、イオキシニル、イソプロツロン、ＭＣＰＡ、メソスルフロン、メトスルフロン、ペンジメタリン、ピノキサデン、プロポキシカルバゾン、プロスルホカルブ、ピロキシスラム、スルホスルフロン、チフェンスルフロン、トラルコキシジム、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリフルラリン、トリトスルフロン；穀物用殺真菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、クロロタロニル、シフルフェナミド、シプロコナゾール、シプロジニル、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フェンプロピジン、フェンプロピモルフ、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルキンコナゾール、フルキサピロキサド、イソピラザム、クレソキシム−メチル、メトコナゾール、メトラフェノン、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロクロラズ、プロピコナゾール、プロキナジド、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、キノキシフェン、スピロキサミン、テブコナゾール、チオファネート−メチル、トリフロキシストロビン；穀物用殺昆虫剤：ジメトエート、ラムダ−シハルトリン、デルタメトリン、アルファ−シペルメトリン、ベータ−シフルトリン、ビフェントリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン（Ｄｉｎｅｔｏｆｕｒａｎ）、クロルピリホス、ピリミカルブ、メチオカルブ、スルホキサフロール；メイズ用除草剤：アトラジン、アラクロール、ブロモキシニル、アセトクロル、ジカンバ、クロピラリド、（Ｓ−）ジメテナミド、グルホシネート、グリホサート、イソキサフルトール、（Ｓ−）メトラクロール、メソトリオン、ニコスルフロン、プリミスル
フロン、リムスルフロン、スルコトリオン、ホラムスルフロン、トプラメゾン、テンボトリオン、サフルフェナシル、チエンカルバゾン、フルフェナセット、ピロキサスルホン；メイズ用殺昆虫剤：カルボフラン、クロルピリホス、ビフェントリン、フィプロニル、イミダクロプリド、ラムダ−シハロトリン、テフルトリン、テルブホス、チアメトキサム、クロチアニジン、スピロメシフェン、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、デルタメトリン、チオジカルブ、ベータ−シフルトリン、シペルメトリン、ビフェントリン、ルフェヌロン、テブピリムホス、エチプロール、サイアジピル、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、アベルメクチン；メイズ用殺真菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、シプロコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フェニトロパン、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルキサピロキサド、イソピラザム、メトコナゾール、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロピコナゾール、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン；イネ用除草剤：ブタクロール、プロパニル、アジムスルフロン、ベンスルフロン、シハロホップ、ダイムロン、フェントラザミド、イマゾスルフロン、メフェナセット、オキサジクロメホン、ピラゾスルフロン、ピリブチカルブ、キンクロラック、チオベンカルブ、インダノファン、フルフェナセット、フェントラザミド、ハロスルフロン、オキサジクロメホン、ベンゾビシクロン、ピリフタリド、ペノキススラム、ビスピリバック、オキサジアルギル、エトキシスルフロン、プレチラクロール、メソトリオン、テフリルトリオン、オキサジアゾン、フェノキサプロップ、ピリミスルファン；イネ用殺昆虫剤：ダイアジノン、フェノブカルブ、ベンフラカルブ、ブプロフェジン、ジノテフラン、フィプロニル、イミダクロプリド、イソプロカルブ、チアクロプリド、クロマフェノジド、クロチアニジン、エチプロール、フルベンジアミド、リナキシピル、デルタメトリン、アセタミプリド、チアメトキサム、サイアジピル、スピノサド、スピノトラム、エマメクチン安息香酸塩、シペルメトリン、クロルピリホス、エトフェンプロックス、カルボフラン、ベンフラカルブ、スルホキサフロール；イネ用殺真菌剤：アゾキシストロビン、カルベンダジム、
カルプロパミド、ジクロシメット、ジフェノコナゾール、エディフェンホス、フェリムゾン、ゲンタマイシン、ヘキサコナゾール、ヒメキサゾール、イプロベンホス（ＩＢＰ）、イソプロチオラン、イソチアニル、カスガマイシン、マンコゼブ、メトミノストロビン、オリサストロビン、ペンシクロン、プロベナゾール、プロピコナゾール、プロピネブ、ピロキロン、テブコナゾール、チオファネート−メチル、チアジニル、トリシクラゾール、トリフロキシストロビン、バリダマイシン；ワタ用除草剤：ジウロン、フルオメツロン、ＭＳＭＡ、オキシフルオルフェン、プロメトリン、トリフルラリン、カルフェントラゾン、クレトジム、フルアジホップ−ブチル、グリホサート、ノルフルラゾン、ペンジメタリン、ピリチオバック−ナトリウム、トリフロキシスルフロン、テプラロキシジム、グルホシネート、フルミオキサジン、チジアズロン；ワタ用殺昆虫剤：アセフェート、アルジカルブ、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、アバメクチン、アセタミプリド、エマメクチン安息香酸塩、イミダクロプリド、インドキサカルブ、ラムダ−シハロトリン、スピノサド、チオジカルブ、ガンマ−シハロトリン、スピロメシフェン、ピリダリル、フロニカミド、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、ベータ−シフルトリン、スピロテトラマト、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、サイアジピル、スピノサド、スピノトラム、ガンマ−シハロトリン、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、チオジカルブ、アベルメクチン、フロニカミド、ピリダリル、スピロメシフェン、スルホキサフロール；ワタ用殺真菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、クロロタロニル、銅、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フェンアミドン、フルアジナム、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルキサピロキサド、イプロジオン、イソピラザム、イソチアニル、マンコゼブ、マネブ、メトミノストロビン、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロピネブ、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、キントゼン、テブコナゾール、テトラコナゾール、チオファネート−メチル、トリフ
ロキシストロビン；ダイズ用除草剤：アラクロール、ベンタゾン、トリフルラリン、クロリムロン−エチル、クロランスラム−メチル、フェノキサプロップ、ホメサフェン、フルアジホップ、グリホサート、イマザモックス、イマザキン、イマゼタピル、（Ｓ−）メトラクロール、メトリブジン、ペンジメタリン、テプラロキシジム、グルホシネート；ダイズ用殺昆虫剤：ラムダ−シハロトリン、メソミル、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、リナキシピル、サイアジピル、スピノサド、スピノトラム、エマメクチン安息香酸塩、フィプロニル、エチプロール、デルタメトリン、β−シフルトリン、ガンマおよびラムダ−シハロトリン、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、スピロテトラマト、スピノジクロフェン、トリフルムロン、フロニカミド、チオジカルブ、ベータ−シフルトリン；ダイズ用殺真菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、クロロタロニル、銅、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フルアジナム、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルトリアホール、フルキサピロキサド、イソピラザム、イプロジオン、イソチアニル、マンコゼブ、マネブ、メトコナゾール、メトミノストロビン、ミクロブタニル、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロピコナゾール、プロピネブ、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、テトラコナゾール、チオファネート−メチル、トリフロキシストロビン；サトウダイコン用除草剤：クロリダゾン、デスメジファム、エトフメセート、フェンメジファム、トリアラート、クロピラリド、フルアジホップ、レナシル、メタミトロン、キンメラック、シクロキシジム、トリフルスルフロン、テプラロキシジム、キザロホップ；サトウダイコン用殺昆虫剤：イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、デルタメトリン、β−シフルトリン、ガンマ／ラムダ−シハロトリン、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、テフルトリン、リナキシピル、シ
アキシピル（Ｃｙａｘｙｐｙｒ）、フィプロニル、カルボフラン；キャノーラ用除草剤：クロピラリド、ジクロホップ、フルアジホップ、グルホシネート、グリホサート、メタザクロール、トリフルラリン、エタメツルフロン、キンメラック、キザロホップ、クレトジム、テプラロキシジム；キャノーラ用殺真菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フルアジナム、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルシラゾール、フルキサピロキサド、イプロジオン、イソピラザム、メピコート−クロリド、メトコナゾール、メトミノストロビン、パクロブトラゾール、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロクロラズ、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、チオファネート−メチル、トリフロキシストロビン、ビンクロゾリン；キャノーラ用殺昆虫剤：カルボフラン、チアクロプリド、デルタメトリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、アセタミプリド、ジネトフラン、β−シフルトリン、ガンマおよびラムダ−シハロトリン、タウ−フルバレリエート（Ｆｌｕｖａｌｅｒｉａｔｅ）、エチプロール、スピノサド、スピノトラム、フルベンジアミド、リナキシピル、サイアジピル、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン。
【０１０１】
以下の実施例は、説明のために提供され、限定として提供されるものではない。
【実施例】
【０１０２】
実施例１．バシルス・ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からの新規殺虫遺伝子の発見
新規殺虫遺伝子を、細菌株ＡＴＸ４７３０７およびＡＴＸ６５００２から以下のステップを使用して同定した：
・株からの全ＤＮＡの調製。全ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡおよび染色体外ＤＮＡの両方を含有する。染色体外ＤＮＡは、以下の一部または全部の混合物を含有する；種々のサイズのプラスミド；ファージ染色体；未同定の他の染色体外分子。
・ＤＮＡの配列決定。次世代配列決定法を介して全ＤＮＡを配列決定する。
・相同性および／または他のコンピュータ分析を介する推定毒素遺伝子の同定。
・必要な場合、いくつかのＰＣＲまたはクローニング戦略の１つによる目的遺伝子の配列フィニッシング（例えば、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ）。
【０１０３】
【表１】
2019141078.tif 000002
【０１０４】
【表２】
2019141078.tif 000003
【０１０５】
【表３】
2019141078.tif 000004
【０１０６】
【表４】
2019141078.tif 000005
【０１０７】
実施例２．殺虫活性についてのアッセイ
本発明のヌクレオチド配列は、殺虫タンパク質を産生するその能力について試験することができる。害虫に対して殺虫剤として作用する殺虫タンパク質の能力は、多数の手法において評価されることが多い。当技術分野において周知な１つの手法は、摂食アッセイを実施することである。このような摂食アッセイにおいて、試験すべき化合物または対照試料のいずれかを含有する試料に害虫を曝す。これは試験すべき材料またはこのような材料の適切な希釈剤を、害虫が摂取する材料、例えば、人工食餌上に置くことにより実施されることが多い。試験すべき材料は、液体、固体、またはスラリーから構成され得る。試験すべき材料を表面上に置き、次いで乾燥させておくことができる。あるいは、試験すべき材料を溶融した人工食餌と混合し、次いでアッセイチャンバ中に分注することができる。アッセイチャンバは、例えば、カップ、皿、またはマイクロタイタープレートのウェルであり得る。
【０１０８】
吸汁害虫（例えば、アブラムシ）のためのアッセイは、仕切り、理想的には吸汁昆虫の吸汁口部分により突き通すことのできる部分により昆虫から試験材料を分離して試験材料の摂取が可能とすることを含み得る。試験材料は、摂食刺激剤、例えば、スクロースと混合して試験化合物の摂取を促進することが多い。
【０１０９】
他のタイプのアッセイとしては、害虫の口腔または腸中への試験材料のマイクロインジェクション、およびトランスジェニック植物の開発とそれに続くトランスジェニック植物を摂食する害虫の能力の試験を挙げることができる。植物試験は、通常消費される植物部分の単離、例えば、葉への小ケージの装着、または昆虫を収容するケージ中の完全植物の単離を含み得る。
【０１１０】
害虫をアッセイする他の方法およびアプローチは当技術分野において公知であり、例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｅｉｓｌｅｒ，ｅｄｓ．（１９９２）Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  ｂｉｏａｓｓａｙｓ  ｗｉｔｈ  ａｒｔｈｒｏｐｏｄｓ，ＣＲＣ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬに見出すことができる。あるいは、アッセイは、雑誌Ａｒｔｈｒｏｐｏｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ＴｅｓｔｓおよびＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙにおいて、またはＥｎｔｏｍｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ（ＥＳＡ）のメンバーとの議論により一般的に記載されている。
【０１１１】
一部の実施形態において、本明細書に開示の殺虫タンパク質の毒素領域をコードするＤＮＡ領域を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＭＡＬ−Ｃ４ｘの、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードするｍａｌＥ遺伝子の後にクローニングする。これらのインフレーム融合は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のＭＢＰ−Ａｘｍｉ融合タンパク質発現をもたらす。
【０１１２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の発現のため、ＢＬ２１＊ＤＥ３を個々のプラスミドにより形質転換した。単一コロニーを、カルベニシリンおよびグルコースが補給されたＬＢ中に接種し、３７℃において一晩増殖させる。翌日、新たな培地に、一晩培養物の１％を接種し、３７℃において対数期まで増殖させる。続いて、培養物を、２０℃において一晩かけて０．３ｍＭのＩＰＴＧにより誘導する。それぞれの細胞ペレットを、２０ｍＭのトリス−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ７．４＋２００ｍＭのＮａＣｌ＋１ｍＭのＤＴＴ＋プロテアーゼ阻害剤中で懸濁し、超音波処理する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を使用して融合タンパク質の発現を確認することができる。
【０１１３】
次いで、全無細胞抽出物を、ＭＢＰ−ａｘｍｉ融合タンパク質のアフィニティ精製のために高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）に装着したアミロースカラム上で流す。結合した融合タンパク質を樹脂から１０ｍＭのマルトース溶液により溶出させる。次いで、精製融合タンパク質をＸａ因子またはトリプシンのいずれかにより開裂させてＡｘｍｉタンパク質からアミノ末端ＭＢＰタグを除去する。タンパク質の開裂および可溶性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定することができる。
【０１１４】
実施例３．発現および精製
Ａｘｍｉ４７７（本明細書において配列番号８に記載される）、Ａｘｍｉ４８２（本明細書において配列番号１３に記載される）、Ａｘｍｉ４８６（本明細書において配列番号１６に記載される）、およびＡｘｍｉ５２５（本明細書において配列番号２６に記載される）のトランケート変異体を発現させ、生物活性についてアッセイした。３’末端においてＡｓｃＩリンカーを取り込むプライマーを用いてＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（登録商標）ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して遺伝子をそれらのそれぞれの株からＰＣＲ増幅させた。増幅したＰＣＲ産物をＡｓｃＩにより消化し、ｐＭａｌＣ４Ｘベクター中にライゲートした。クローンを配列決定により確認し、Ｂｌ２１コンピテント細胞中で形質転換した。それぞれの単一コロニーをＬＢ培地中に接種し、３７℃において対数期まで増殖させ、０．５ｍＭのＩＰＴＧにより２０℃において１８時間誘導した。精製タンパク質を、第Ｘａ因子により１：５０の比で室温において一晩消化した。精製タンパク質をバイオアッセイに選択昆虫害虫に対して標準的なプロトコルに従って供した。結果を表５〜８に示す。
【０１１５】
【表５】
2019141078.tif 000006
【０１１６】
【表６】
2019141078.tif 000007
【０１１７】
【表７】
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【０１１８】
【表８】
2019141078.tif 000009
【０１１９】
成長阻害スコア：
０  −  活性なし
１  −  均一な成長阻害なし
２  −  わずかな均一な成長阻害
３  −  強力な均一な成長阻害
４  −  重度の均一な成長阻害
【０１２０】
実施例４．植物発現のための遺伝子のベクター化
本発明のコード領域を、植物中での発現のために適切なプロモーターおよびターミネーター配列と接続する。このような配列は当技術分野において周知であり、それとしては、単子葉植物中での発現のためのイネアクチンプロモーターまたはメイズユビキチンプロモーター、双子葉植物中での発現のためのアラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＵＢＱ３プロモーターまたはＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、およびｎｏｓまたはＰｉｎＩＩターミネーターを挙げることができる。プロモーター−遺伝子−ターミネーター構築物を産生および確認するための技術も、当技術分野において周知である。
【０１２１】
本発明の一態様において、合成ＤＮＡ配列を設計および生成する。これらの合成配列は、親配列に対して変更されたヌクレオチド配列を有するが、親配列と本質的に同一であるタンパク質をコードする。
【０１２２】
本発明の別の態様において、得られるペプチドが植物小器官、例えば小胞体またはアポプラストに標的化されるように、改変バージョンの合成遺伝子が設計される。植物小器官への融合タンパク質の標的化をもたらすことが公知のペプチド配列は、当技術分野において公知である。例えば、シロバナルピナス（Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＩＤ  ＧＩ：１４２７６８３８；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２７：５９４−６０６）からの酸性ホスファターゼ遺伝子のＮ末端領域は、異種タンパク質の小胞体標的化をもたらすことが当技術分野において公知である。得られる融合タンパク質がまた、Ｃ末端においてペプチドＮ末端−リジン−アスパラギン酸−グルタミン酸−ロイシン（すなわち「ＫＤＥＬ」モチーフ（配列番号２７））を含む小胞体保持配列を含有する場合、融合タンパク質は小胞体に標的化される。融合タンパク質が、Ｃ末端において小胞体標的化配列を欠く場合、タンパク質は小胞体に標的化されるが、最終的にはアポプラスト中で封鎖される。
【０１２３】
したがって、この遺伝子は、本発明のアミノ酸配列のＮ末端に融合しているシロバナルピナス（Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＩＤ  ＧＩ：１４２７６８３８；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、前掲）からの酸性ホスファターゼ遺伝子のＮ末端３１アミノ酸、およびＣ末端におけるＫＤＥＬ配列（配列番号２７）を含有する融合タンパク質をコードする。したがって、得られるタンパク質は、植物細胞中での発現時に植物小胞体に標的化されることが予測される。
【０１２４】
上記の植物発現カセットは、適切な植物選択マーカーと組み合わせて形質転換細胞および組織の選択を支援し、植物形質転換ベクター中にライゲートする。これらとしては、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換からのバイナリーベクターまたはエアロゾルもしくは微粒子銃形質転換のための単純プラスミドベクターを挙げることができる。
【０１２５】
実施例５．本明細書に記載の殺虫タンパク質遺伝子によるメイズ細胞の形質転換
メイズの穂を受粉から８〜１２日後に最良に収集する。胚を穂から単離し、０．８〜１．５ｍｍサイズのそのような胚が形質転換における使用に好ましい。胚を、好適なインキュベーション培地、例えば、ＤＮ６２Ａ５Ｓ培地（３．９８ｇ／ＬのＮ６塩；１ｍＬ／Ｌ（１０００×原液）のＮ６ビタミン；８００ｍｇ／ＬのＬ−アスパラギン；１００ｍｇ／Ｌのミオ−イノシトール；１．４ｇ／ＬのＬ−プロリン；１００ｍｇ／Ｌのカザミノ酸；５０ｇ／Ｌのスクロース；１ｍＬ／Ｌ（１ｍｇ／ｍＬの原液）の２，４−Ｄ）上に胚盤側を上にしてプレーティングする。しかしながら、ＤＮ６２Ａ５Ｓ以外の培地および塩が好適であり、当技術分野において公知である。胚を暗所で２５℃において一晩インキュベートする。しかしながら、胚を一晩インキュベートすることは必ずしも必要でない。
【０１２６】
得られた外植片を、メッシュスクエア（１プレート当たり３０〜４０）に移し、約３０〜４５分間、浸透圧培地上に移し、次いでビーム処理プレートに移す（例えば、ＰＣＴ国際公開第０１３８５１４号パンフレットおよび米国特許第５，２４０，８４２号明細書参照）。
【０１２７】
植物細胞中で本発明の遺伝子に対して設計されたＤＮＡ構築物は、本質的にＰＣＴ国際公開第０１３８５１４号パンフレットに記載の条件を使用して、エアロゾルビーム加速器を使用して植物組織中に加速させる。ビーム処理後、胚を浸透圧培地上で約３０分間インキュベートし、インキュベーション培地上に２５℃において暗所で一晩置く。ビーム処理される外植片の過度の損傷を避けるため、それらを回復培地に移す前に少なくとも２４時間インキュベートする。次いで、胚を回復期間培地に２５℃において暗所で約５日間広げ、次いで選択培地に移す。外植片を、利用される特定の選択の性質および特徴に応じて８週間まで選択培地中でインキュベートする。選択期間後、得られたカルスを、成熟体細胞胚の形成が観察されるまで、胚成熟培地に移す。次いで、得られた成熟体細胞胚を微光下に置き、再生プロセスを当技術分野において公知の方法により開始させる。得られた芽を発根培地上で根づかせ、得られた植物を成苗ポットに移し、トランスジェニック植物として繁殖させる。
【０１２８】
材料
【０１２９】
【表９】
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【０１３０】
溶液のｐＨを、１ＮのＫＯＨ／１ＮのＫＣｌによりｐＨ５．８に調整し、Ｇｅｌｒｉｔｅ（Ｓｉｇｍａ）を３ｇ／Ｌまでの濃度において添加し、培地をオートクレーブ処理する。５０℃まで冷却した後、２ｍｌ／Ｌの５ｍｇ／ｍｌの硝酸銀（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｓ）の原液を添加する。
【０１３１】
実施例６．アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換による植物細胞への本発明の遺伝子の形質転換
穂を受粉の８〜１２日後に最良に収集する。胚を穂から単離し、０．８〜１．５ｍｍサイズのそれらの胚が、形質転換における使用に好ましい。胚を、好適なインキュベーション培地上に胚盤側を上にしてプレーティングし、暗所で２５℃において一晩インキュベートする。しかしながら、胚を一晩インキュベートすることは必ずしも必要でない。胚を、約５〜１０分間、Ｔｉプラスミド媒介移行のための適切なベクターを含有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株と接触させ、次いで約３日間（２５℃で暗所）共培養培地上にプレーティングする。共培養後、外植片を約５日間（２５℃で暗所）回復期間培地に移す。外植片を、利用される特定の選択の性質および特徴に応じて８週間まで選択培地中でインキュベートする。選択期間後、得られたカルスを、成熟体細胞胚の形成が観察されるまで、胚成熟培地に移す。次いで、得られた成熟体細胞胚を微光の下に置き、再生プロセスを当技術分野において公知のとおり開始させる。
【０１３２】
本明細書に記載の全ての刊行物および特許出願は本発明が関係する当業者の熟練度を示すものである。全ての刊行物および特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物または特許出願が個別かつ具体的に参照により組み込まれることが示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
前記の本発明を明確な理解のために幾分詳しく説明および実施例として記載したが、ある変化形態および改変形態を添付の特許請求の範囲内で実践することができることは明らかである。
【配列表】
2019141078000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月17日(2019.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
殺虫活性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる組換え核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列は、
ａ）配列番号３に記載のヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１５〜１９のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号１５〜１９のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される、組換え核酸分子。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列が、植物中での発現のために設計された合成配列である、請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列が、植物細胞中での前記ヌクレオチド配列の発現を指向し得るプロモーターに作動可能に連結している、請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項４】
請求項１に記載の組換え核酸分子を含んでなる、ベクター。
【請求項５】
異種ポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含んでなる、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
請求項１に記載の組換え核酸を含有する、宿主細胞。
【請求項７】
細菌宿主細胞である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
植物細胞である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の宿主細胞を含んでなる、トランスジェニック植物。
【請求項１０】
植物が、メイズ、ソルガム、コムギ、キャベツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科の植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギおよびアブラナからなる群から選択される、請求項９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１１】
請求項１に記載の核酸分子を含んでなる、トランスジェニック種子。
【請求項１２】
殺虫活性を有する組換えポリペプチドであって、
ａ）配列番号１５〜１９のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；および
ｂ）配列番号１５〜１９のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド
からなる群から選択される、組換えポリペプチド。
【請求項１３】
異種アミノ酸配列をさらに含んでなる、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１２に記載のポリペプチドを含んでなる、組成物。
【請求項１５】
粉末、粉剤、ペレット、粒剤、噴霧剤、乳剤、コロイド、および液剤からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
細菌細胞の培養物の乾燥、凍結乾燥、ホモジナイゼーション、抽出、ろ過、遠心分離、沈降、または濃縮により調製される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
約１重量％〜約９９重量％の前記ポリペプチドを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
鱗翅目、半翅目、鞘翅目、線虫、または双翅目の害虫集団を防除する方法であって、前記集団を殺虫有効量の請求項１２に記載のポリペプチドと接触させることを含んでなる、方法。
【請求項１９】
鱗翅目、半翅目、鞘翅目、線虫、または双翅目の害虫を殺滅する方法であって、前記害虫を殺虫有効量の請求項１２に記載のポリペプチドと接触させること、または前記害虫に殺虫有効量の請求項１２に記載のポリペプチドを摂食させることを含んでなる、方法。
【請求項２０】
殺虫活性を有するポリペプチドを産生する方法であって、請求項６に記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドをコードする核酸分子が発現される条件下で培養することを含んでなる、方法。
【請求項２１】
殺虫活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡ構築物をゲノム中に安定的に取り込んだ植物または植物細胞であって、前記ヌクレオチド配列は、
ａ）配列番号３に記載のヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１５〜１９のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
ｃ）配列番号１５〜１９のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される、植物または植物細胞。
【請求項２２】
植物を害虫から保護する方法であって、植物またはその細胞中で殺虫ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させることを含み、前記ヌクレオチド配列は、
ａ）配列番号３に記載のヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１５〜１９のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
ｃ）配列番号１５〜１９のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される、方法。
【請求項２３】
前記植物が、鱗翅目、半翅目、鞘翅目、線虫、または双翅目の害虫に対して殺虫活性を有する殺虫ポリペプチドを産生する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
植物の収穫高を増加させる方法であって、殺虫活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡ構築物をゲノム中に安定的に取り込んだ植物またはその種子を圃場中で生長させることを含み、前記ヌクレオチド配列は、
ａ）配列番号３に記載のヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１５〜１９のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
ｃ）配列番号１５〜１９のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択され；
前記圃場は、前記ポリペプチドが殺虫活性を有する害虫が蔓延している、方法。
【外国語明細書】
2019141078000001.pdf