(57)【要約】      （修正有）【課題】前立腺癌の検出、診断、モニタリング及び予見のための、新たなかつ効果的な方法の提供。【解決手段】癌又は前立腺癌の進展を診断、検出、モニター又は予見するための医薬組成物であって、ホスホジエステラーゼ４Ｄ７（ＰＤＥ４Ｄ７）発現産物又はＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に対する核酸親和性リガンド及び／又はペプチド親和性リガンドを含む医薬組成物の使用。また、ホルモン抵抗性前立腺癌対ホルモン感受性前立腺癌を診断、モニター又は予見するための方法とそれに対応するイムノアッセイの提供。【選択図】図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌又は前立腺癌の進展を診断、検出、モニター又は予見するための医薬組成物であって、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物又はＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に対する核酸親和性リガンド及び／又はペプチド親和性リガンドを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺癌に対するマーカーとして使用するためのホスホジエステラーゼ４Ｄ７（ＰＤＥ４Ｄ７）、及び、前立腺癌又はその進展を診断、検出、モニター又は予見するためのマーカーとしてのＰＤＥ４Ｄ７の使用に関する。本発明はまた、前立腺癌又はその進展を診断、検出、モニター又は予見するための組成物に関する。また本発明は、対応する方法及びイムノアッセイに関する。本発明はまた、ホルモン抵抗性前立腺癌対ホルモン感受性前立腺癌を診断、モニター又は予見するための方法とそれに対応するイムノアッセイの方法に関する。また本発明は、前立腺癌又はその進展を診断、検出、モニター又は予見するためのデータ取得方法とイムノアッセイに関する。また本発明は、前立腺癌治療を受けるべき個人を同定する方法、前立腺癌疾患を持つ個人又は個人の同齢集団を層別化するためのイムノアッセイ、前立腺癌を持つ個人を層別化するためのイムノアッセイに関する。また同様に、本発明は、ＰＤＥ４Ｄ７活性を直接刺激するか又は変更する化合物、ＰＤＥ４Ｄ７活性を間接的に刺激するか又は変更する化合物、ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質又はその生物活性同等物、ＰＤＥ４Ｄ７をコード化し発現する核酸、ＰＤＥ４Ｄ７ｍｉＲＮＡに特異的なｍｉＲＮＡインヒビター、脱メチル化剤及び／又はホスホジエステラーゼ変位因子を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、細胞群が制御を受けない成長、侵入及び時には転移を示す種類の疾患である。癌のこれらの３つの悪性の特性が、悪性の癌と良性腫瘍とを区別する。良性腫瘍は自己限定的であり、侵入も転移もしない。男性にとって先進国で３つの最も一般的に診断される癌が前立腺癌、肺癌及び大腸癌である。特に前立腺癌がヨーロッパ人男性における最も一般的な悪性腫瘍である。２００２年にヨーロッパでは、推定２２５０００人の男性が新たに前立腺癌と診断され、約８３０００人がこの疾患で死亡している。
【０００３】
特定のホスホジエステラーゼは癌発生に関連してきた。例えば、ホスホジエステラーゼＰＤＥ７は慢性リンパ性白血病に関係していると示されてきた（Ｚｈａｎｇ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ、ＰＮＡＳ、２００８、１０５（４９）：１９５３２−７）。なお多くの癌のタイプ又は癌の進展の形態に対して、利用可能な適切なマーカー分子は存在しない。
【０００４】
例えば前立腺癌はこれまでは前立腺特異的抗原（ＰＡＳ）の血清レベルから診断されてきた。しかし、ＰＳＡは前立腺癌特異的でなく他の状況で増加し、多くの場合偽陽性を導き得る（生検が実施されたＰＡＳレベルが増加した男性のうちの約７０％で癌は見られない）。さらに、ＰＳＡテスト結果で「正常」であっても後に前立腺癌を発生する予期できない数の偽陰性があり得る。
【０００５】
従って、前立腺癌の検出、モニタリング及び予見のための、新たなかつ効果的な他の診断方法を提供する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、この必要性に取り組み、前立腺癌の診断及び検出を可能とする手段並びに方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題は前立腺癌マーカーとして使用するためのホスホジエステラーゼ４Ｄ７（ＰＤＥ４Ｄ７）により解決される。
【０００８】
ホスホジエステラーゼ４Ｄ７は、前立腺癌細胞株及び患者由来の前立腺組織においてダウンレギュレートされることが本発明者により示された。ＰＤＥ４Ｄ７は従って、前立腺癌の予測に対するバイオマーカー、並びに、特定の癌の調査管理体制の層別化に加えて、前立腺癌進展の予見及びモニタリングに対する意志決定手段として考えられている。特に、本発明者により次のことが示された。即ち、ＰＤＥ４Ｄ７はホルモン抵抗性ヒト由来前立腺癌細胞株において、対応するヒト組織サンプルと同様にダウンレギュレートされるということである。前立腺癌マーカーとしてのＰＤＥ４Ｄ７に基づく診断方法及び使用は、従って、次の場合に有利に適用され得る。即ち（ｉ）生命を脅かす前立腺癌の形態を検出し診断する場合、（ｉｉ）生命を脅かす前立腺癌の形態を予見する場合、（ｉｉｉ）生命を脅かす前立腺癌の形態の癌進展をモニターする場合、（ｉｖ）生命を脅かす癌の形態と緩徐進行性の形態とを区別する場合においてである。
【０００９】
他の側面で、本発明は、前立腺癌又は前立腺癌の進展の診断、検出、モニタリング又は予見のための組成物に関し、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物又はタンパク質に対する核酸親和性リガンド及び／又はペプチド親和性リガンドを含む。
【００１０】
本発明の好ましい実施態様において、上記組成物は核酸親和性リガンド又はペプチド親和性リガンドを含み、これは造影剤として機能するように変更されている。
【００１１】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、上記組成物は、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物に特異的なオリゴヌクレオチドのセット、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物に特異的なプローブ、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物又はタンパク質に特異的なアプタマー、ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的な抗体及び／又はＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的な抗体変異体を含む。
【００１２】
さらなる側面において、本発明は前立腺癌又は前立腺癌の進展の診断、検出、モニタリング又は予見のためのマーカーとしてのＰＤＥ４Ｄ７の使用に関する。
【００１３】
他の側面において、本発明は、前立腺癌又は前立腺癌の進展の検出、診断、モニタリング又は予見をする方法に関し、ＰＤＥ４Ｄ７のレベルを決定するステップを含む。
【００１４】
他の側面で本発明は、ホルモン抵抗性前立腺癌又はホルモン抵抗性前立腺癌の進展の診断、モニタリング又は予見をする方法に関し、上記方法は、ホルモン感受性及びホルモン抵抗性前立腺癌を区別し、次のステップ：
（ａ）サンプル中のＰＤＥ４Ｄ７のレベルを決定するステップ；
（ｂ）サンプル中の参照遺伝子の発現レベルを決定するステップ；
（ｃ）ＰＤＥ４Ｄ７の測定された発現レベルを上記参照遺伝子の発現レベルに基準化するステップ；及び、
上記基準化された発現レベルと、ホルモン感受性前立腺癌を除外するために選択された既定のカットオフ値と比較するステップ；
を含み、上記カットオフ値よりも低い基準化された発現レベルがホルモン抵抗性前立腺癌を示し、上記カットオフ値が約１から７であり、好ましくは約５である。
【００１５】
他の側面において本発明は、データ取得方法に関し、次のステップ：
（ａ）ＰＤＥ４Ｄ７の発現について個人を試験するステップ；及び
（ｂ）ステップ（ａ）で決定された上記発現をコントロールレベルと比較するステップ；
を含む。
【００１６】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、上記診断、検出、モニタリング、予見又はデータ取得は、個人から得られたサンプルで実行されることになる。
【００１７】
他の側面において本発明は、前立腺癌又は前立腺癌の進展の診断、検出、モニタリング又は予見のためのイムノアッセイに関し、少なくとも次のステップ：
（ａ）ＰＤＥ４Ｄ７の発現についてサンプルを試験するステップ、
（ｂ）ＰＤＥ４Ｄ７の発現についてコントロールサンプルを試験するステップ、
（ｃ）ステップ（ａ）及びステップ（ｂ）のＰＤＥ４Ｄ７の発現の差を決定するステップ、及び
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた結果に基づいて前立腺癌又は前立腺癌の進展の存在又は段階を決定するステップ、
を含み、上記試験するステップは、ＰＤＥ４Ｄ７に特異的に結合する抗体の使用に基づく。
【００１８】
他の側面において本発明は、ホルモン感受性前立腺癌とホルモン抵抗性前立腺癌とを区別するためのイムノアッセイに関し、次のステップ：
（ａ）サンプル中のＰＤＥ４Ｄ７のレベルを決定するステップ；
（ｂ）サンプル中の参照遺伝子の発現レベルを決定するステップ；
（ｃ）ＰＤＥ４Ｄ７の測定された発現レベルを参照遺伝子の発現レベルに基準化するステップ；及び
（ｄ）基準化された発現レベルと、ホルモン感受性前立腺癌を除外するための既定のカットオフ値とを比較するステップ；
を含み、上記カットオフ値よりも低い基準化された発現レベルがホルモン抵抗性前立腺癌を示し、上記カットオフ値が約１から７、好ましくは約５である。
【００１９】
他の側面において本発明は、前立腺癌治療するべき個人を同定する方法に関し、次のステップ：
（ａ）個人から得られたサンプル中のＰＤＥ４Ｄ７の発現を試験するステップ；
（ｂ）上記サンプル中の参照遺伝子の発現を試験し及び／又はコントロールサンプル中のＰＤＥ４Ｄ７の発現を試験するステップ；
（ｃ）ステップ（ａ）の発現レベルをステップ（ｂ）のＰＤＥ４Ｄ７のコントロールサンプル中のレベルに関して分類するステップ；及び
（ｄ）上記個人のサンプルが低減したＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルを持つとして分類された場合に、上記個人を前立腺癌の治療を受けるべきとして同定するステップ；
を含む。
【００２０】
さらに他の側面において本発明は、前立腺癌疾患を持つ個人又は個人の同齢集団（コホート）を層別化するためのイムノアッセイに関し、次にステップ：
（ａ）ＰＤＥ４Ｄ７の発現について個人から得られたサンプルを試験するステップ；
（ｂ）参照遺伝子の発現について上記サンプルを試験する及び／又はＰＤＥ４Ｄ７の発現についてコントロールサンプルを試験するステップ；
（ｃ）ステップ（ａ）のＰＤＥ４Ｄ７の発現と、ステップ（ｂ）のＰＤＥ４Ｄ７の発現及び／又は上記参照遺伝子の発現との差を決定するステップ；及び
（ｄ）上記個人のサンプルが低減したＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルを持つ場合に、ステップ（ｃ）で得られた結果に基づき前立腺癌治療に対して個人又は個人の同齢集団を層別化するステップ；
を含む。
【００２１】
本発明のさらに好ましい実施態様において、上記発現の試験又は決定は、核酸若しくはタンパク質レベルの測定により又はＰＤＥ４Ｄ７の生物活性若しくは参照遺伝子の生物活性の決定により、遂行されるか又は追加的に遂行される。
本発明のさらに好ましい実施態様において、上記方法又はイムノアッセイはさらに、測定された核酸若しくはタンパク質レベル又は測定された生物活性を、コントロールレベルと比較するステップを含む。
【００２２】
本発明のさらに好ましい実施態様では、上記参照遺伝子がハウスキーピング遺伝子、特に好ましくはＧＡＰＤＨ若しくはＰＢＧＤ、又は異なるホスホジエステラーゼ、特に好ましくはＰＤＥ４Ｄ５である。
【００２３】
本発明のさらに好ましい実施態様では、上記方法又はイムノアッセイが、前立腺特異的抗原（ＰＡＳ）のレベルを決定するステップをさらに含む。
【００２４】
本発明のさらなる好ましい実施態様では、上記サンプルが、組織サンプル、尿サンプル、尿沈査サンプル、血液サンプル、唾液サンプル、精液サンプル、循環性腫瘍細胞を含むサンプル又は前立腺分泌エキソソームを含むサンプルである。
【００２５】
さらに他の側面において、本発明は、医薬組成物に関し：
（ａ）ＰＤＥ４Ｄ７の活性を直接的に刺激するか又は変更する化合物、好ましくはＰＤＥ４Ｄ７酵素活性のアロステリックアゴニスト；
（ｂ）ＰＤＥ４Ｄ７の活性を間接的に刺激するか又は変更する化合物；
（ｃ）ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質又はその生物活性同等物；
（ｄ）ＰＤＥ４Ｄ７をコード及び発現する核酸；
（ｅ）ＰＤＥ４Ｄ７ｍｉＲＮＡに特異的なｍｉＲＮＡインヒビター；
（ｆ）脱メチル化剤；及び
（ｇ）ホスホジエステラーゼ変位因子；
の群から選択される少なくとも１つの成分を含む。
【００２６】
ホスホジエステラーゼ４Ｄ７は、疾患関連細胞株においてダウンレギュレートされることから、ＰＤＥ４Ｄ７自体及びＰＤＥ４Ｄ７変更剤、ＰＤＥ４Ｄ７発現変更剤又はＰＤＥ４Ｄ７相互作用変更剤が、医薬物として有利に使用され得る。従って、観察されるダウンレギュレーションプロセスに対する相殺作用により、ＰＤＥ４Ｄ７及び／又はＰＤＥ４Ｄ７変更剤は医薬物として使用され得る。例えば、低いＰＤＥ４Ｄ７発現又はそのダウンレギュレーションに伴う効果の全て又は一部に相殺作用する医薬物として使用され得る。
【００２７】
さらなる側面において本発明は、前立腺癌の治療又は予防のための医薬組成物に関し：
（ａ）ＰＤＥ４Ｄ７の活性を直接的に刺激するか又は変更する化合物、好ましくはＰＤＥ４Ｄ７酵素活性のアロステリックアゴニスト；
（ｂ）ＰＤＥ４Ｄ７の活性を間接的に刺激するか又は変更する化合物；
（ｃ）ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質又はその生物活性同等物；
（ｄ）ＰＤＥ４Ｄ７をコード及び発現する核酸；
（ｅ）ＰＤＥ４Ｄ７ｍｉＲＮＡに特異的なｍｉＲＮＡインヒビター；
（ｆ）脱メチル化剤；及び
（ｇ）ホスホジエステラーゼ変位因子；
の群から選択される少なくとも１つの成分を含む。
【００２８】
ホスホジエステラーゼ４Ｄ７は、癌細胞株においてダウンレギュレートされることから、ＰＤＥ４Ｄ７自体及びＰＤＥ４Ｄ７変更剤、ＰＤＥ４Ｄ７発現変更剤又はＰＤＥ４Ｄ７相互作用変更剤が、癌、特に前立腺癌の治療のための医薬物として有利に使用され得る。従って、観察されるダウンレギュレーションプロセスに対する相殺作用により、ＰＤＥ４Ｄ７及び／又はＰＤＥ４Ｄ７変更剤は、癌性細胞、特に前立腺癌細胞における低いＰＤＥ４Ｄ７発現及び／又はＰＤＥ４Ｄ７のダウンレギュレーションに相殺作用する医薬物として使用され得る。
【００２９】
本発明の好ましい実施態様では、本明細書において説明したように前立腺癌治療は、上記医薬組成物の投与、又は、追加の癌治療、好ましくは放射線治療又は化学療法と組み合わせた上記医薬組成物の投与を含む。
【００３０】
他の側面において本発明は、癌、特に前立腺癌の治療又は予防の方法に関し：
（ａ）ＰＤＥ４Ｄ７の活性を直接的に刺激するか又は変更する化合物、好ましくはＰＤＥ４Ｄ７酵素活性のアロステリックアゴニスト；
（ｂ）ＰＤＥ４Ｄ７の活性を間接的に刺激するか又は変更する化合物；
（ｃ）ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質又はその生物活性同等物；
（ｄ）ＰＤＥ４Ｄ７をコード及び発現する核酸；
（ｅ）ＰＤＥ４Ｄ７ｍｉＲＮＡに特異的なｍｉＲＮＡインヒビター；
（ｆ）脱メチル化剤；及び／又は
（ｇ）ホスホジエステラーゼ変位因子；
の個人への投与を含む。
【００３１】
本発明の好ましい実施態様では、上記のホスホジエステラーゼ変位因子は、ペプチド、ペプチド模倣体、小分子、抗体又はアプタマーである。
【００３２】
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、上記前立腺癌はホルモン抵抗性前立腺癌である。
【００３３】
本発明のこれらの及び他の特徴、構成及び目的は、以下の詳細な説明から、添付図面及び実施例（これらは本発明の原理を説明するためである）を参照して明らかとなる。
【００３４】
説明は例示することを目的とするものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は発現レベルについて試験されたサンプルについてのまとめを示す。ＡＤは「アンドロゲン依存性」、ＡＳは「アンドロゲン感受性」及びＡＩは「アンドロゲン非依存性」を意味する。サンプル「ＰＣ３４６Ｐ異種移植片」から「３４６Ｆｌｕ２」は細胞株であり、サンプル「ＰＣ２９５」から「ＰＣ３７４」は異種移植片である。
【図２】図２は、いくつかの前立腺癌細胞株及び異種移植片での、ＧＡＰＤＨに基準化されたＰＤＥ４Ｄ７ｍＲＮＡのＬＮＣａＰと比較した相対的発現を示す。図は全ての研究されたサンプル（細胞株及び異種移植片を含む）のまとめを示す。
【図３】図３は、前立腺癌細胞株での、ＧＡＰＤＨに基準化されたＰＤＥ４Ｄ７ｍＲＮＡのＬＮＣａＰと比較した相対的発現を示す。
【図４】図４は、前立腺癌異種移植片での、ＧＡＰＤＨに基準化されたＰＤＥ４Ｄ７ｍＲＮＡのＬＮＣａＰと比較した相対的発現を示す。
【図５】図５は、前立腺癌細胞株及び異種移植片での、合計ＰＤＥ４Ｄ７ｍＲＮＡの割合として表されたＰＤＥ４Ｄ７含有量を示す。図は全ての研究されたサンプル（細胞株及び異種移植片を含む）のまとめを示す。
【図６】図６は、前立腺癌細胞株での、合計ＰＤＥ４Ｄ７ｍＲＮＡの割合として表されたＰＤＥ４Ｄ７含有量を示す。
【図７】図７は、前立腺癌異種移植片での、合計ＰＤＥ４Ｄ７ｍＲＮＡの割合として表されたＰＤＥ４Ｄ７含有量を示す。
【図８】図８は、ヒト患者組織サンプル中のヒトＰＤＥ４Ｄ７の相対的遺伝子発現を示す。情報は、表１に示された合計１６の異なるサンプル（リンパ節切除組織を含む）から導かれた。サンプルグループ「１＝ｎｏ」はホルモン応答性一次前立腺腫瘍として定義され、サンプルグループ「２＝ｙｅｓ」はホルモン抵抗性前立腺腫瘍として定義される。ヒト前立腺組織のヒトＰＤＥ４Ｄ７についての個々の相対的発現値が示される。結果はＧＡＰＤＨ及びＰＢＧＤの発現に基準化されている。相対的データ測定のメジアン値がそれぞれの患者グループについて示されている。
【図９】図９は、ヒト患者組織サンプル中のヒトＰＤＥ４Ｄ７の相対的遺伝子発現を示す。情報は、表１に示された合計１６の異なるサンプル（リンパ節切除組織を含む）から導かれた。サンプルグループ「１」はホルモン応答性一次前立腺腫瘍として定義され、サンプルグループ「２」はホルモン抵抗性前立腺腫瘍として定義される。結果はＧＡＰＤＨ及びＰＢＧＤの発現に基準化されている。図は、ヒトＰＤＥ４Ｄ７についての個々の相対的発現測定データのボックスプロットを示す。ここでボックスには全ての測定の７５％が含まれる。メジアン相対的発現値は、２つの色付きボックスの境界として示される。
【図１０】図１０は、ヒト患者組織サンプル中のヒトＰＤＥ４Ｄ７の相対的遺伝子発現を示す。情報は、表１に示された合計１２の異なるサンプル（リンパ節切除組織を除く）から導かれた。サンプルグループ「１＝ｎｏ」はホルモン応答性一次前立腺腫瘍として定義され、サンプルグループ「２＝ｙｅｓ」はホルモン抵抗性前立腺腫瘍として定義される。結果はＧＡＰＤＨ及びＰＢＧＤの発現に基準化されている。ヒト前立腺組織のヒトＰＤＥ４Ｄ７についての個々の相対的発現値が示される。相対的データ測定のメジアン値がそれぞれの患者グループについて示されている。
【図１１】図１１は、ヒト患者組織サンプル中のヒトＰＤＥ４Ｄ７の相対的遺伝子発現を示す。情報は、表１に示された合計１２の異なるサンプル（リンパ節切除組織を除く）から導かれた。サンプルグループ「１」はホルモン応答性一次前立腺腫瘍として定義され、サンプルグループ「２」はホルモン抵抗性前立腺腫瘍として定義される。結果はＧＡＰＤＨ及びＰＢＧＤの発現に基準化されている。図は、ヒトＰＤＥ４Ｄ７についての個々の相対的発現測定データのボックスプロットを示す。ここでボックスには全ての測定の７５％が含まれる。メジアン相対的発現値は、２つの色付きボックスの境界として示される。
【図１２】図１２は、ヒトＰＤＥ４Ｄ７インビボ発現の、ＰＣ３前立腺癌細胞の増殖に対する効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明者等は次のことを見出した。即ち、ＰＤＥ４Ｄ７はある特定の前立腺癌関連細胞タイプ及びヒト患者組織で強くダウンレギュレートされること、従って、ＰＤＥ４Ｄ７は前立腺癌に対するバイオマーカーとして使用され得るということである。ＰＤＥ４Ｄ７は、ＰＤＥ４Ｄ７変更剤又はＰＤＥ４Ｄ７発現変更剤と同様に、医薬物として、特に前立腺癌治療のための医薬物としてさらに使用され得る。
【００３７】
以下本発明は具体的な実施態様に関して説明されるが、この説明は限定的な意味で解釈されるものではない。
【００３８】
本発明の例示的実施態様を詳細に説明する前に、本発明を理解するための重要な定義を与える。
この明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、不定冠詞を有する単数形は、記載上明記されない限り対応する複数形をも含む。
【００３９】
本発明に関連して、用語「約」及び「略」とは、くだんの特徴の技術的効果を依然として確実にすると当業者であれば理解し得る範囲の精度を意味する。通常この用語は示される数字から±２０％、好ましくは±１５％、より好ましくは±１０％、さらにより好ましくは±５％の変動を示す。
【００４０】
用語「含む」は限定的意味ではないことが理解されるべきである。本発明の目的において、用語「からなる」は用語「含む」の好ましい実施形態であると考慮される。以下で群が少なくともある数の実施態様を含むと定義される場合、これはまた好ましくはこれらの実施態様のみからなる群を含むことを意味する。
【００４１】
さらに、明細書及び特許請求の範囲での用語「第一」、「第二」、「第三」又は「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」などは類似のエレメントを区別するために用いられるものであり、必ずしも数字の順又は時間の順を説明するためのものではない。そのように使用される用語は適当な条件下で交換可能であり、本明細書において記載される本発明の実施態様は本明細書で記載又は説明される順とは異なる順序でも作動可能である、ということが理解されるべきである。
【００４２】
用語「第一」、「第二」、「第三」又は「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」などが方法又は使用のステップに関する場合、これらのステップ間にはなんらの時間又は時間間隔の首尾一貫性が存在するものではなく、即ち、これらのステップは同時に実施されてもよい。又は、本明細書において定められたか又は定められるように、特に本願において明記されていない限り、これらのステップ間には、秒、分、時間、日、週、月又は年さえの時間間隔が存在してもよい。
【００４３】
本発明は本明細書において説明される具体的な方法、手順、タンパク質、バクテリア、ベクター、試薬などに限定されず、変更され得るということが理解されるべきである。本明細書において使用される技術用語は具体的な実施態様を説明するためだけのものであり、添付の特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。特に明記されない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的用語は当業者により通常理解される意味と同様の意味を持つ。
【００４４】
上記の通り、本発明はひとつの側面において、前立腺癌マーカーとして使用するためのホスホジエステラーゼ４Ｄ７（ＰＤＥ４Ｄ７）に関する。用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ７」又は「ＰＤＥ４Ｄ７」は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライスバリアント７、即ちヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ７遺伝子、好ましくはＧｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ：ＡＦ５３６９７６（ｖｅｒｓｉｏｎ  ＡＦ５３６９７６．１、ＧＩ：２２９０１８８３  ａｓ  ｏｆ  ３  Ｍａｒｃｈ  ２００９）に定められる配列、より好ましくは配列表の配列番号１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）で定められるヌクレオチド配列（これはＰＤＥ４Ｄ７転写物の上記Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒの配列に対応する）に関連し、さらに、配列表の配列番号２（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）で定められる対応するアミノ酸配列（これはＰＤＥ４Ｄ７転写物によりコードされるＰＤＥ４Ｄ７ポリペプチドの上記Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒの配列に対応する）に関連する。上記用語はまたＰＤＥ４Ｄ７と高度な相同性を示すヌクレオチド配列、例えば、配列表の配列番号１に定められる配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する核酸配列を含む。又は、配列表の配列番号２に定められる配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。又は、配列表の配列番号２に定められる配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。又は、配列表の配列番号１に定められる配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む。
【００４５】
本明細書において使用される場合、用語「ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ７遺伝子」、「ＰＤＥ４Ｄ７遺伝子」又は「ＰＤＥ４Ｄ７マーカー遺伝子」は、ホスホジエステラーゼ４Ｄをコードする遺伝子に関する。好ましくは、この用語はスプライスバリアント７として、例えばＧｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ：ＡＦ５３６９７６（ｖｅｒｓｉｏｎ  ＡＦ５３６９７６．１、ＧＩ：２２９０１８８３  ａｓ  ｏｆ  ３  Ｍａｒｃｈ  ２００９）又は配列表の配列番号１で定義される特定のエクソンの組合せとして、ホスホジエステラーゼ４Ｄを発現する遺伝子に関する。この用語はまた、バリアント７としてスプライスされるホスホジエステラーゼ４ＤをコードするｍＲＮＡ転写物から誘導されるＤＮＡ分子、好ましくはｃＤＮＡ分子に関する。
【００４６】
本明細書において使用される場合、用語「マーカー」又は「ＰＤＥ４Ｄ７マーカー」は、本明細書において上で定義された遺伝子、遺伝子的単位又は配列（ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列又はタンパク質配列）に関し、その発現レベルが、癌性細胞若しくは癌性組織中、或いは、癌性細胞若しくは癌性組織又はその一部若しくは断片を含むいかなるタイプのサンプル中で、コントロールレベル又は状態と比較して変更され、好ましくは低減される。この用語はまた、上記遺伝子的単位又は配列のいかなる発現産物、特にＰＤＥ４Ｄ７ｍＲＮＡ転写物、上記ＰＤＥ４Ｄ７転写物又はそのバリアント又は断片によりコードされるポリペプチドに関し、同様に本明細書において記載されたそれらの類似誘導体に関する。本明細書において使用される場合、用語「発現レベル」とは、ＰＤＥ４Ｄ７転写物の量に関し及び／又は既定の細胞数又は既定の組織部分から誘導されるＰＤＥ４Ｄ７タンパク質の量、好ましくは標準的な核酸（例えばＲＮＡ）又はタンパク質抽出手順で得られうるＰＤＥ４Ｄ７転写物及び／又はＰＤＥ４Ｄ７タンパク質の量に関する。適切な抽出方法は当業者に知られている。
【００４７】
本明細書において使用される場合、用語「コントロールレベル」（又は「コントロール状態」）とは、発現レベルに関するものであり、上記発現レベルは、疾患状態が癌性ではないことが知られている一人又は複数の対象から前もって集められ且つ保存されている１つ又は複数のサンプルを用いて試験サンプルと同時に及び／又は類似の若しくは匹敵する条件下で決定され得るものである。用語「疾患状態」又は「癌性疾患状態」は、非癌性細胞状態と終末期癌細胞状態（を含む）との間の細胞又は分子状態のいかなる状態又はタイプも意味する。好ましくはこの用語は、非癌性細胞状態（を除く）と終末期癌性細胞状態（を含む）との間の生物体中での異なる癌性増殖／発生の段階又は腫瘍発生のレベルを含む。このような発生の段階は、例えば段階０及びＩからＩＶ等、ＵＩＣＣにより定義される悪性腫瘍のＴＮＭ（腫瘍、節、転移）分類システムの全ての段階を含み得る。この用語はまた、ＴＮＭ段階０の前の段階も含む。例えば当業者に知られた癌バイオマーカーが変更された発現又は発現パターンを示す際の発生の段階を含む。
【００４８】
上記の発現レベルは好ましくは、本明細書において上で定義されたＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルであり得る。或いは又はこれに加えて、発現レベルはまた、好ましくはＰＤＥ４Ｄ７と関連した細胞中で発現されるいかなる他の適切な遺伝子又は遺伝子的成分の発現レベルであってもよい。例えば他のホスホジエステラーゼの発現レベル、ハウスキーピング遺伝子、例えばＧＡＰＤＨやＰＢＧＤなどの発現レベルであり得る。
【００４９】
用語「癌性」は、本発明に関連して、本明細書において上で定義された癌性疾患状態に関する。癌性のコントロールに関連して好ましいコントロールレベルは、悪性、ホルモン感受性腫瘍におけるＰＤＥ４Ｄ７の発現である。
【００５０】
用語「非癌性」は、本発明に関連して、良性でも悪性でも増殖が検出されない状態を意味する。かかる検出の適切な手段は当技術分野において知られている。非癌性コントロールに関連して好ましいコントロールレベルは正常状態、即ち健康又は非癌性組織でのＰＤＥ４Ｄ７の発現であり、又は良性前立腺腫瘍組織中のＰＤＥ４Ｄ７の発現である。本明細書において使用される場合、用語「良性前立腺腫瘍」は、癌の３つの全ての悪性特徴を欠く前立腺腫瘍であり、即ち無限に積極的には成長せず、周りに組織に侵入せず、かつ転移しないものである。通常良性前立腺腫瘍は、軽度な非進行性の前立腺新生物又は肥大症を意味し、癌の侵入性を有しない。さらに良性前立腺腫瘍は通常包み込まれており、従って、悪性化することが防止されている。良性腫瘍又は健康な状態は、当業者に知られたいかなる適切な、独立した分子、組織又は生理学的方法で決定され得る。
【００５１】
又は、コントロールレベルは統計的方法により、疾患状態が知られている対象からのサンプル中の本発明のＰＤＥ４Ｄ７マーカー遺伝子のすでに決定された１つ又は複数の発現レベルを分析して得られる結果に基づいて決定することができる。さらに、コントロールレベルは、すでに試験された対象又は細胞からの発現パターンのデータベースから導くこともできる。さらに、試験される生物サンプル中の本発明のマーカー遺伝子の発現レベルは、多数の参照サンプルから決定された多数のコントロールレベルと比較され得る。患者由来の生物サンプルと類似のタイプの組織から誘導される参照サンプルから決定されるコントロールレベルの使用が好ましい。特に好ましくは、疾患状態が本明細書において上で定義された非癌性である一人又は複数人の対象から得られた１つ又は複数のサンプルを用いることである。即ち良性でも悪性でも増殖が見られない健康状態を表す。本発明の他の実施態様では、コントロールレベルは、前立腺癌、例えばホルモン非依存性又はホルモン抵抗性前立腺癌であると診断された対象から得られる参照サンプルから決定され得る。
【００５２】
又は、参照サンプルは、細胞株、例えば不死化癌細胞株から誘導される、又は、組織異種移植片から誘導される材料を含むこともできる。好ましくは、前立腺癌細胞株から誘導される材料、又は、ヒト前立腺組織、特に良性の腫瘍由来ヒト前立腺組織を有する組織異種移植片から誘導される材料が、本発明による参照サンプルに含まれ得る。好ましい癌細胞株の例としては、ＰＣ３４６Ｐ、ＰＣ３４６Ｂ、ＬＮＣａＰ、ＶＣａＰ、ＤｕＣａＰ、ＰＣ３４６Ｃ、ＰＣ３、ＤＵ１４５、ＰＣ３４６ＣＤＤ、ＰＣ３４６Ｆｌｕｌ、ＰＣ３４６Ｆｌｕ２の細胞株が挙げられる。好ましい異種移植片の例としては、ＰＣ２９５、ＰＣ３１０、ＰＣ−ＥＷ、ＰＣ８２、ＰＣ１３３、ＰＣ１３５、ＰＣ３２４及びＰＣ３７４が挙げられる。好ましくは細胞株及び異種移植片のパネル全体が使用され得る。例えばヒトＰＣ３４６パネルである。さらに好ましくはＭａｒｑｕｅｓらの２００６、Ｅｕｒ．Ｕｒｏｌ、４９（２）：２４５−５７に記載されている細胞株及び異種移植片である。
【００５３】
さらに好ましい代わりの例として、参照サンプルが、臨床環境において得られる患者の組織、又は組織パネル若しくは組織収集物から得られ得る。サンプルは、例えば、外科的手術を受けている男性患者から得られてもよい。サンプルは、いかなる適切な組織タイプ、例えば前立腺組織又はリンパ節から得られてもよい。患者の組織収集物の好ましい例は、外科的前立腺手順（例えば前立腺切除）からのものである。
【００５４】
さらに、本発明のＰＤＥ４Ｄ７マーカーの発現レベルの標準値を、知られた疾患状態を持つ母集団で使用することが好ましい。標準値は、当該技術分野で知られるいかなる方法でも得られる。例えば、平均±２ＳＤ（標準偏差）又は平均±３ＳＤの範囲が、標準値として使用され得る。
【００５５】
さらに、コントロールレベルはまた、疾患状態が癌性であることが知られた一人若しくは複数人の対象からすでに収集されて保存された１つ又は複数のサンプルを用いることによって、試験サンプルと同時に、及び／又は、類似若しくは匹敵する条件で決定され得る。ここで対象はある種の癌タイプ、例えば前立腺癌、特にホルモン依存性、ホルモン感受性又はホルモン抵抗性の前立腺癌であると独立して診断された対象である。
【００５６】
本発明に関連して、癌性ではないと知られている生物サンプルから決定されるコントロールレベルは、「正常コントロールレベル」とされる。このコントロールレベルが癌性生物サンプル、例えば前立腺癌、特にホルモン依存性、ホルモン感受性又はホルモン抵抗性癌であると独立して診断された対象からのサンプルから決定される場合には、これは「癌性コントロールレベル」とされる。
【００５７】
用語「前立腺癌」とは、男性の生殖器系における前立腺の癌に関し、前立腺細胞が変異し制御されることなく複製し始めるものである。通常、前立腺癌は前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のレベルを上昇させる。本発明のひとつの実施態様では、用語「前立腺癌」はＰＳＡレベルが４．０を超える値を示す癌である。他の実施態様で、この用語は、２．０を超えるＰＳＡレベルを示す癌に関する。用語「ＰＳＡレベル」は、血液中の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のｎｇ／ｍｌでの濃度に関する。
【００５８】
用語「ホルモン依存性前立腺癌」とは、前立腺癌又は前立腺癌細胞株の成長及び／又は増殖が男性ホルモン刺激に依存するものを意味する。
【００５９】
用語「ホルモン感受性前立腺癌」とは、前立腺癌又は前立腺癌細胞株の成長及び増殖が男性ホルモン刺激に感受性を持つものを意味する。用語「感受性」とは、前立腺癌又は前立腺癌細胞株が、男性ホルモンの存在下で生化学的又は細胞的反応パターンを示すが、成長及び／又は増殖に男性ホルモンを必要としない状況を意味する。
【００６０】
用語「ホルモン抵抗性前立腺癌」とは、前立腺癌又は前立腺癌細胞株の成長及び増殖が男性ホルモン刺激に抵抗性であるものを意味する。この用語はまた、後期の前立腺癌進展段階に関するものであり、抗ホルモン、好ましくは、本明細書において上で定義された抗アンドロゲンの投与をもはや受け入れられないものを意味する。本明細書において使用される場合、用語「男性ホルモン」とはアンドロゲンを意味し、好ましくはテストステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオール又はアンドロステロンを意味する。
【００６１】
さらなる側面では、本発明は、前立腺癌又は前立腺癌の進展を診断、検出、モニター又は予見するためのマーカーとしてのＰＤＥ４Ｄ７の使用に関する。
【００６２】
本明細書において使用される場合、用語「前立腺癌の診断」とは、本発明のＰＤＥ４Ｄ７マーカーの発現レベルが、本明細書において上で定義されたコントロールレベルと比較して、好ましくは、本明細書において上で定義された正常コントロールレベルと比較された場合に、変更、好ましくは低減又はダウンレギュレートされる場合に、対象又は個人が前立腺癌に罹っていると考えられることを意味する。用語「診断」とはまた、上記比較の手順を通じて到達される結論を意味する。
【００６３】
本発明に関連して用語「変更された」又は「変更された発現レベル」とは、従って、発現レベルの変化を意味する。発現レベルが「変化する（される）」とみなされるのは、例えば分析されるサンプル中のＰＤＥ４Ｄ７遺伝子の発現が、コントロールレベルから例えば５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、又は５０％を超えて異なる場合であるか、又はコントロールレベルと比べて少なくとも０．１倍、少なくとも０．２倍、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍以上である場合である。コントロールレベルは、本明細書において上で定義された正常コントロールレベル又は癌性コントロールレベルのいずれかでよい。癌性コントロールレベルとの比較が実行されることになる場合、正常コントロールレベルとの追加の比較が好ましい。この追加の比較は変更の傾向を決定することを可能にする。即ち発現レベルの増加又は減少が観察される。
【００６４】
用語「変更する（される）」とは、試験サンプルをコントロールレベルと比較した場合の、好ましくはＰＤＥ４Ｄ７マーカーの発現レベルの減少若しくはダウンレギュレーション、又はＰＤＥ４Ｄ７マーカー発現の完全な抑制を意味する。コントロールレベルは、本明細書において上で定義された正常コントロールレベル又は癌性コントロールレベルのいずれかでよい。本発明の好ましい実施態様では、コントロールレベルはホルモン依存性前立腺腫瘍又は組織から誘導されるか若しくはそれらに関与する、より好ましくはホルモン感受性前立腺腫瘍又は組織から誘導されるか若しくはそれらに関与する癌性コントロールレベルである。本発明に関連して用語「減少された発現レベル」又は「ダウンレギュレートされた発現レベル」又は「発現レベルの減少」（これは同意語として使用され得る）とは、従って、分析される状況、例えば患者のサンプルから誘導可能な状況と参照点とのＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルの減少を意味し、参照点とは、正常コントロールレベル又は当業者に知られたいかなる適切な癌段階、好ましくはホルモン依存性、より好ましくはホルモン感受性腫瘍段階から誘導可能な癌性コントロールレベルのいずれかであり得る。発現レベルは、ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現がコントロールレベルから、例えば５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％又は５０％を超えて減少する場合、又はコントロールレベルと比較して、好ましくはホルモン依存性又はホルモン感受性腫瘍コントロールと比較して少なくとも０．１倍、少なくとも０．２倍、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍以上である場合に、「減少する」又は「ダウンレギュレート」されているとみなされる。
【００６５】
さらなる実施態様において、対象から得られるサンプルと、本明細書において上で定義された参照（癌性）との全体の遺伝子発現パターンの追加の類似性は、対象が癌に罹っていることを示す。本発明の他の実施態様において、診断は、追加の癌バイオマーカー発現レベルの解明と組み合わせることができる。例えばＰＳＡなどのバイオマーカーの発現が試験され得る。
【００６６】
癌、特に前立腺癌は、本発明のＰＤＥ４Ｄ７マーカーの発現レベルが変更される、好ましくは、本明細書において上で定義されるコントロールレベル、例えば、本明細書において上で定義される正常コントロールレベルに比べて減少又はダウンレギュレートされる場合には、診断されるべきものとして考えられ得る。
【００６７】
特に好ましい実施態様において、前立腺癌は、本明細書において上で定義されるように、ＰＤＥ４Ｄ７発現レベルが、試験サンプル中でコントロールレベルと比較して、好ましくはホルモン依存性腫瘍コントロール又はホルモン感受性前立腺腫瘍コントロールから誘導されるコントロール発現レベルと比べて、２０％から８０％の値だけ、好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％又は７０％の値だけ減少する場合に、診断されるべきものと考えられ得る。さらに好ましい実施態様において、ホルモン抵抗性前立腺癌は、本明細書において上で定義されるように、ＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルが、試験サンプル中で、コントロールレベルと比較して２０％から９０％の値だけ、好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％又は８０％の値だけ減少する場合に、診断されるべきものと考えられ得る。コントロールレベルは、正常コントロールレベル又は癌性コントロールレベル、好ましくはホルモン依存性又はホルモン感受性前立腺癌から誘導可能な癌性コントロールレベルのいずれかでよい。
【００６８】
本明細書において使用される場合、用語「前立腺癌の検出」とは、生物体での癌性疾患又は症状の存在が決定され得ること、又は癌性疾患又は症状が生物体で同定され得ることを意味する。癌性疾患又は症状を決定又は同定することが、本発明のＰＤＥ４Ｄ７マーカーの発現レベルと、本明細書において定義された正常コントロールレベルとを比較することで遂行され得る。癌、特に前立腺癌は、ＰＤＥ４Ｄ７マーカーの発現レベルと、本明細書において上で定義された癌性コントロールレベルとが同程度である場合に検出され得る。本発明の好ましい実施態様において、前立腺癌は、ＰＤＥ４Ｄ７マーカーの発現レベルと、確立された前立腺癌細胞又は細胞株、例えば、本明細書において上で示した前立腺癌細胞株の癌性コントロールレベルと同程度である場合に検出され得る。
【００６９】
本明細書において使用される場合、用語「前立腺癌のモニタリング」とは、診断された又は検出された癌性疾患又は症状に伴うものであり、例えば処置手順の間又はある期間であり、通常２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、５年、１０年又はいかなる他の期間の間実行されるものである。用語「伴う」とは、本明細書において上で定義された疾患状態、特に、これらの疾患状態の変化が、サンプル中の本発明のＰＤＥ４Ｄ７マーカーの発現レベルを、正常又は本明細書において上で定義される癌性コントロールレベル、好ましくはホルモン依存性腫瘍コントロール又はホルモン感受性前立腺腫瘍コントロールから誘導されるコントロール発現レベルとを、それぞれいかなるタイプの周期的期間、例えば毎週、２週毎、毎月、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２ヶ月毎、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０年毎の周期的期間で、例えば、２週間、３週間、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月間、１，５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０年間等、いかなる期間の間、比較することで検出され得ることを意味する。癌性コントロールレベルは、癌発生の異なる段階、例えばＴＮＭ分類システムの段階０及びＩからＩＶに応じてサンプルから導かれ得る。本発明の好ましい実施態様では、この用語は、診断された前立腺癌、より好ましくはホルモン依存性及びホルモン感受性前立腺癌に伴うものに関する。さらなる実施態様では、モニタリングはまた、ホルモン抵抗性前立腺癌に伴うもの、例えば治療手順の間に伴い使用され得る。モニタリングはまた、追加の遺伝子若しくは遺伝子的成分、例えばＧＡＰＤＨ若しくはＰＢＧＤなどのハウスキーピング遺伝子、又は、他のホスホジエステラーゼ、好ましくはＰＤＥ４Ｄ５の発現を検出することを含む。
【００７０】
本明細書において使用される場合、用語「前立腺癌の予見」とは、診断されるか又は検出される癌性疾患の進行又は予後を予期することを意味する。例えばある期間、治療の間又は治療後などに行うものである。この用語はまた、生存機会又は疾患からの回復の決定を意味し、同様に対象の予想される生存期間を予期することを意味する。予見はまた、特に、例えば６ヶ月、１年、２年、３年、５年、１０年又はいかなる他の期間での、将来への対象の生存可能性の確立を含む。
【００７１】
本明細書において使用される場合、用語「前立腺癌の進展」とは、前立腺癌発生の異なる段階への変化を意味し、健康状態から始まって末期癌への段階であって、例えばＴＮＭ分類の段階０及びＩからＩＶ、又はいかなる他の段階若しくはそのサブ段階の変化を意味する。通常かかる変化は、試験サンプル中のＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルが、同じ個人からの以前の試験サンプルの値と比べて、例えばホルモン依存性前立腺腫瘍若しくは腫瘍コントロール又はホルモン感受性前立腺腫瘍若しくは腫瘍コントロールから誘導されるサンプルと比較して変更される、好ましくは減少されることを伴うものである。前立腺癌の進展は、本明細書において上で定められているように、試験サンプル中のＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルが、同じ個人からの以前の試験サンプルの値と比較して、３％から５０％の値だけ減少する、好ましくは１０％、１５％、２０％又は２５％の値だけ減少する場合に、検出される又は診断されるとして考慮され得る。変更はいかなる期間にわたり検出され得る。好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月間、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０年間にわたり検出され得る。即ち、上記の値は、第一の時点でのＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルと、上記の時間経過後の第二の時点での値とを比較することで計算され得る。進展は、ひとつの特定の実施態様では、ホルモンの抵抗性前立腺癌への進展である。
【００７２】
本発明の特に好ましい実施態様では、用語「前立腺癌の進展」とは、ホルモン依存性前立腺癌又はホルモン感受性前立腺癌状態からホルモン抵抗性前立腺癌状態への変化を意味する。
【００７３】
ホルモン依存性前立腺癌又はホルモン感受性前立腺癌状態からホルモン抵抗性前立腺癌状態への進展は、本明細書において上で定められているように、試験サンプル中のＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルが、ホルモン感受性前立腺癌又はホルモン依存性前立腺癌を患っていると診断された同じ個人からの以前の試験サンプル中の値と比べて、３％から５０％の値だけ減少する、好ましくは１０％、１５％、２０％又は２５％の値だけ減少する場合に、検出される又は診断されるとして考慮され得る。この進展はまた、この比較が他の個人からの試験サンプル、組織収集物からの試験サンプル、データベースからの値などを元に実施される場合に、検出されるべきと考慮され得る。
【００７４】
変更は、いかなる期間にわたり検出され得る。好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月間、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０年間にわたり検出され得る。即ち、上記の値は、第一の時点でのＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルと、上記の時間経過後の第二の時点での値とを比較することで計算され得る。
【００７５】
さらなる実施態様において本発明は、前立腺癌、より好ましくはホルモン抵抗性前立腺癌発生の素因の診断及び検出に関する。本発明に関連して、「前立腺癌発生の素因」、特に「ホルモン抵抗性前立腺癌発生の素因」とは、前立腺癌、特にホルモン抵抗性前立腺癌発生のリスクの状態を意味する。好ましくは、ホルモン抵抗性前立腺癌発生の素因は、本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルが、本明細書において上で定められた癌性コントロールレベルより低い場合に存在し、例えば明らかにホルモン感受性前立腺癌を患っている対象の組織又はサンプルからの参照発現レベルよりも低い場合に存在する可能性がある。本明細書において使用される場合、用語「より低い」とは、ＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルが約４０％から８０％、好ましくは約５０％、癌性コントロールレベルより減少していることを意味する。
【００７６】
又は、本発明に関連して癌発生の素因は、本明細書において上で定義されたＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルが与えられる状況、及び、例えばＰＳＡなどのさらに他の癌マーカーが発現レベル又は発現パターンの変更を示さない場合に存在する可能性がある。さらに適切な癌マーカーは当業者に知られている。
【００７７】
従って、前立腺癌、特にホルモン抵抗性前立腺癌の素因は、上のひとつの状況が観察される場合に診断される又は検出されると考慮され得る。
【００７８】
試験生物学的サンプルの発現レベルとコントロールレベルとの差は、さらなるコントロール核酸の発現レベルに基準化され得る。例えばハウスキーピング遺伝子であり、その発現レベルは、細胞の癌性又は非癌性状態に応じて相違しないことが知られているものである。このような例証的なコントロール遺伝子の例としては、特に、β−アクチン、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）及びリボソームタンパク質Ｐ１が挙げられる。基準化はまた、他のホスホジエステラーゼ、好ましくはヒトホスホジエステラーゼであり、異なる腫瘍段階でも発現パターンが変化しないもの、を用いて実行されてもよい。好ましいホスホジエステラーゼは、ＰＤＥ４Ｄ５又はＰＤＥ４Ｄファミリのいかなる他のイソフォーム、例えばＰＤＥ４Ｄ１、ＰＤＥ４Ｄ２、ＰＤＥ４Ｄ３、ＰＤＥ４Ｄ４、ＰＤＥ４Ｄ６、ＰＤＥ４Ｄ８又はＰＤＥ４Ｄ９が挙げられる。
【００７９】
本発明に関連して、用語「診断する」及び「予見する」はまた、予期及び見込みの分析を含むことが意図される。マーカーとしてのＰＤＥ４Ｄ７は従って、疾患についての調査監視などの治療的介入又は診断基準を含む、治療方法に関する意思決定を行う際に臨床的に用いられ得る。本発明によれば、対象の状態を検査するための中間結果が与えられ得る。この中間結果は、追加の情報と組み合わせ、医者、看護師又は他の医療技術者が、対象がその疾患に罹っていることを診断する助けとなり得る。又は、本発明は対象由来の組織での癌性細胞を検出し、この対象がこの疾患に罹っていることを診断するために有用な情報を医者に提供するために利用され得る。
【００８０】
本発明により、診断、モニターされるべき対象又は個体、或いは、前立腺癌、前立腺癌の進展又は、前立腺癌の素因が検出されるか又は予見されるべき対象又は個体は動物であり、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。
【００８１】
特に好ましくは、ＰＤＥ４Ｄ７を、前立腺癌又は前立腺癌の進展の診断、検出、モニタリング又は予見のためのマーカーとして使用する際に、当業者に知られている分子イメージング装置、例えば磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）及び／又は磁気光子共鳴イメージング（ＭＰＩ）技術などを使用することである。例えばＰＤＥ４Ｄ７は、ヒト対象内の診断マーカーをオンラインで検出することのできるＭＲＩ又はＭＰＩなどの方法で、前立腺癌又は前立腺癌の進展の診断、検出、モニタリング又は予見のためのマーカーとして使用され得る。
【００８２】
さらなる側面において、本発明は、個人の前立腺癌又は前立腺癌の進展又は前立腺癌の素因の診断、検出、モニタリング又は予見のための組成物に関する。本発明による組成物は、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物又はタンパク質に対する核酸又はペプチド親和性リガンドを含んでもよい。
【００８３】
本明細書において使用される場合、用語「ＰＤＥ４Ｄ７発現産物に対する核酸親和性リガンド」とは、ＰＤＥ４Ｄ７転写物又はＰＤＥ４Ｄのスプライスバリアント７から導かれるＤＮＡ分子、より好ましくは配列表の配列番号１で示されるＤＮＡ配列又は配列表の配列番号１で示される配列の相補的ＤＮＡ配列又は対応するＲＮＡ配列へ特異的に結合することができる核酸分子を意味する。核酸親和性リガンドはまた、配列番号１で示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を持つＤＮＡ配列、又は、配列番号２で示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を持つアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列又はそれらの配列のいかなる断片にも特異的に結合することができるものである。
【００８４】
本明細書において使用される場合、用語「ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に対するペプチド親和性リガンド」とは、ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的に結合することができるペプチド分子を意味する。ペプチド分子は、好ましくは、配列表の配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質又はポリペプチドに特異的に結合することができるものである。ペプチド親和性リガンドはまた、配列番号１で示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を持つＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質又はポリペプチド、又は、配列番号２で示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を持つアミノ酸配列を含むタンパク質又はポリペプチド、又はそれらの配列のいかなる断片にも特異的に結合することができるものである。用語「ペプチド」とは、２個以上のアミノ酸を含むいかなるタイプのアミノ酸配列をも意味し、例えばポリペプチド構造、タンパク質構造又はそれらの機能的類似体を意味する。さらにペプチドはまたさらなる化学的部分又は機能と組み合わされてもよい。
【００８５】
本明細書において使用される場合、用語「発現産物」とは、ＰＤＥ４Ｄ７転写物又はＰＤＥ４Ｄ遺伝子の発現により生成されたｍＲＮＡ分子を意味する。より好ましくは、本明細書において上で定められた処理されたＰＤＥ４Ｄ転写物を意味し、例えば配列表の配列番号１の配列によるものである。
【００８６】
本発明の好ましい実施態様では、本発明の組成物は、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物に特異的なオリゴヌクレオチドのセット、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物に特異的なプローブ、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物又はＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的なアプタマー、ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的な抗体及びＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的な抗体変異体、を含む群から選択される、核酸及びペプチド親和性リガンドを含む。
【００８７】
本発明の組成物は、例えば、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物に特異的なオリゴヌクレオチドのセット及び／又はＰＤＥ４Ｄ７発現産物に特異的なプローブを含むことができる。本明細書において使用される場合、用語「ＰＤＥ４Ｄ７発現産物に特異的なオリゴヌクレオチド」は、ＰＤＥ４Ｄのスプライスバリアント７のセンス又はアンチセンス鎖に相補的であるヌクレオチド配列を意味する。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１に示されるＤＮＡ配列に又は配列番号１に示される配列の相補的ＤＮＡ配列に相補的である。オリゴヌクレオチド配列はまた、配列番号１に示されるＤＮＡ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を持つＤＮＡ配列、又は、配列番号２に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を持つアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に相補的でもある。
【００８８】
オリゴヌクレオチドは、当業者に知られた、配列番号１又はその相補鎖からのいかなる適切な長さ及び配列も有することができる。通常オリゴヌクレオチドは、長さ８から６０ヌクレオチド、好ましくは１０から３５ヌクレオチド、より好ましくは長さが１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２又は３３ヌクレオチドのものである。ＰＤＥ４Ｄ７発現産物に特異的なオリゴヌクレオチド配列は、当業者に知られたソフトウェアツールを用いて定めることができる。
【００８９】
本発明のさらなる実施態様で、オリゴヌクレオチド配列は、ＰＤＥ４Ｄ７遺伝子のエクソン１又はエクソン２に局在する配列、ＰＤＥ４Ｄ７遺伝子のエクソン１及びエクソン２の境界に局在する配列、又は、ＰＤＥ４Ｄ７遺伝子のエクソン２のみに局在する配列、好ましくは、ＰＤＥ４Ｄ７のひと続きの２７１ユニークヌクレオチド、即ちＰＤＥ４Ｄのエクソン１の３’末端での４２ヌクレオチドとエクソン２の５’末端での２２９ヌクレオチドに相補的であり得る。例えば、フォワードプライマーとして使用可能なオリゴヌクレオチドはＰＤＥ４Ｄ７遺伝子のエクソン１及びエクソン２の間の境界に局在され、リバースプライマーとして使用可能なオリゴヌクレオチドはＰＤＥ４Ｄ７遺伝子のエクソン２に局在され得る。
【００９０】
本発明の好ましい実施態様において、上記オリゴヌクレオチドのセットは、配列番号３及び４に記載された配列を持つ。さらに好ましくは、配列番号７及び／又は配列番号８に記載された配列を有するか又は含むオリゴヌクレオチドである。
【００９１】
本明細書において使用される場合、用語「ＰＤＥ４Ｄ７発現産物に特異的なプローブ」とは、ＰＤＥ４Ｄのスプライスバリアント７のセンス又はアンチセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を意味する。好ましくは、このプローブは配列番号１に示されるＤＮＡ配列又は配列番号１で示される配列の相補的ＤＮＡ配列に相補的である。このプローブ配列はまた、配列番号１の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＤＮＡ配列、又は、配列番号２の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に相補的であり得る。
【００９２】
このプローブは、配列番号１に記載の配列又はその相補物の配列から導かれ得るものとして、当業者に知られるいかなる適切な長さ及び配列も持ち得る。通常プローブは６から３００ヌクレオチドの長さを持ち得る。好ましくは１５から６０ヌクレオチドの長さであり、より好ましくは２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０ヌクレオチドの長さである。ＰＤＥ４Ｄ７発現産物に特異的なプローブ配列は、当業者に知られるソフトウェアツールを利用して定めることができる。
【００９３】
本発明のさらなる実施態様で、プローブ配列は、ＰＤＥ４Ｄ７遺伝子のエクソン１又はエクソン２に局在する配列、好ましくはＰＤＥ４Ｄ７のひと続きの２７１ユニークヌクレオチド、即ちＰＤＥ４Ｄのエクソン１の３’末端での４２ヌクレオチドとエクソン２の５’末端での２２９ヌクレオチドに相補的であり得る。このプローブは、例えばリアルタイムＰＣＲ等の定量的ＰＣＲ反応に対して使用されることになる場合、フォワード及びリバースプライマーの結合位置間の位置に局在されるように設計され得る。好ましくは、このプローブは、プライマーオリゴヌクレオチドの一つの近傍に局在されるように設計され得る。より好ましくは、このプローブはフォワードプライマーの近傍に局在され得る。
【００９４】
本発明の好ましい実施態様において、このプローブは配列番号５又は配列番号９に記載の配列を持つ。
【００９５】
本発明の組成物は、さらに又は代えて、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物又はタンパク質に特異的なアプタマーを含む。本明細書において使用される場合、用語「ＰＤＥ４Ｄ７発現産物に特異的なアプタマー」とは、短い核酸分子、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ又はＡＮＡ又は当業者には知られたいかなる他の適した核酸形であり、ＰＤＥ４Ｄスプライスバリアント７に特異的に結合することができるものであり、好ましくはＰＤＥ４Ｄのスプライスバリアント７から導かれるＤＮＡ分子を意味する。さらに好ましくは、核酸アプタマー分子は、配列番号１に記載のＤＮＡ配列又はその二重鎖の類似体に特異的に結合することができるものである。本発明による核酸アプタマーはまた、ＰＤＥ４Ｄ７転写物に対応するＲＮＡ、好ましくは、配列番号１に記載のＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ分子に結合し得るものである。
【００９６】
核酸アプタマーは、さらに、配列番号１に記載の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＤＮＡ配列と特異的に結合可能であり、又は、配列番号２に記載の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列と特異的に結合可能であり、又はこれらのＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ分子と特異的に結合可能である。
【００９７】
ＰＤＥ４Ｄのスプライスバリアント７に対する核酸アプタマーの特異性は、そのスプライスバリアントにのみ存在する配列に特異的に結合することで与えられてもよく、例えば、ＰＤＥ４Ｄのエクソン２、又は、エクソン１及びエクソン２の境界に存在する配列である。本発明の具体的な実施態様では、ＰＤＥ４Ｄのスプライスバリアント７に対する核酸アプタマーの特異性は、ＰＤＥ４Ｄ７のひと続きの２７１ユニークヌクレオチド内に局在する配列に特異的に結合することで与えられてもよい。即ちＰＤＥ４Ｄのエクソン１の３’末端の４２ヌクレオチド及びエクソン２の５’末端の２２９ヌクレオチドである。核酸アプタマーは、当業者に知られたいかなる適した方法によっても生成され得る。例えば、インビトロ選択又はＳＥＬＥＸ方法による。好ましくは、核酸アプタマーは、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ及びＳｚｏｓｔａｋの１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４６：８１８−８２２により与えられるガイダンスに基づいて生成及び／又は設計され得る。本発明による核酸アプタマーはさらに、追加の部分と組み合わされてもよい。例えば、ビオチン又はリボザイム要素などの酵素的機能などの相互作用部分と組み合わされてもよい。
【００９８】
本明細書において使用される場合、用語「ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的なアプタマー」とは、ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質と相互作用し且つ特異的に結合し得る短いペプチドを意味する。ペプチドアプタマーは好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質又はポリペプチドに特異的に結合し得るものである。ペプチドアプタマーはまた、配列番号１に記載の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質又はポリペプチド、又は、配列番号２に記載の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むタンパク質又はポリペプチドと特異的に結合し得るものである。通常ペプチドアプタマーは可変のポリペプチドループであり、例えば１０から２０のアミノ酸を含む。本発明に関連して、ペプチドアプタマーは好ましくは、１つ又は両方の末端にて足場構造に付加され得る。足場構造は、いかなる分子、好ましくはタンパク質であってもよく、優れた溶解性を有するものである。適切な足場分子は当業者に知られているものである。本発明に関連して使用されることになる好ましい足場分子は、バクテリアタンパク質チオレドキシンＡである。このアプタマーペプチドループは好ましくはこの足場分子の還元活性部位内に挿入され得る。又は、スタフィロコッカスタンパク質Ａ及びそのドメイン及びそれらのドメインの誘導体（タンパク質Ｚ又はリポカリンなど）が、本発明に関連して足場構造として使用され得る。
【００９９】
ペプチドアプタマーは、当業者に知られたいかなる適切な方法でも生成され得る。例えば、酵母ツーハイブリッド法により可能である。
【０１００】
本発明の他の好ましい実施態様において、上記組成物は、ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的な抗体を含むか又はさらに含んでよい。好ましくはモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。また好ましくは、抗体変異体又は断片であって、例えば、単鎖抗体、二重特異性抗体、低分子化抗体、モノクローナルＰＤＥ４Ｄ７特異的抗体に基づく単鎖Ｆｖ断片（ｓｃ（Ｆｖ））、Ｓｃ（Ｆｖ）２抗体、Ｆａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片、小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）、結合領域免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、ＶＨＨ含有抗体などが挙げられる。抗体は、一価、二価、三価又は多価であってもよい。抗体は、例えばマウス、ヒト若しくはキメラ、又は、ヒト化マウスの抗体等、いかなる起源のものであってもよい。本発明の特定の実施態様において、ＮＢ−３００−６５２（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）又はＧＴＸ１４６２９（ＧｅｎｅＴｅｘ，Ｉｎｃ．）のような市販の抗ＰＤＥ４Ｄ７抗体が、当該組成物に含まれてもよく、又は、診断上で使用されてもよい。
【０１０１】
抗体は、当業者に知られたいかなる適切な方法でも製造され得る。ポリクローナル抗体は、選択された抗原を用いて動物を免疫化することによって製造することができる。また、定められた特異性を持つモノクローナル抗体は、例えばＫｏｅｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎによって開発されたハイブリドーマ技術（Ｋｏｅｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７６、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、６：５１１−５１９）を用いて製造することができる。
【０１０２】
本明細書において上で定められたように、親和性リガンドは、種々のマーカーでラベルされてもよく、又は、種々のマーカーでラベルされた第二の親和性リガンドにより検出されて、検出、可視化及び／又は定量化を可能にし得る。これは、いかなる適切なラベルを用いても達成可能であり、このラベルは、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物又はＰＤＥ４Ｄ７タンパク質と相互作用可能な親和性リガンドと共役され、又は、いかなる第二の親和性リガンドと当業者に知られたいかなる適切な技術及び方法も使用して共役され得る。用語「第二の親和性リガンド」とは、本明細書において上で定められた親和性リガンド（即ち、２つの相互作用親和性リガンドを用いたシステムに関連して使用される場合では「第一の親和性リガンド」である）に結合可能な分子を意味する。結合相互作用は好ましくは特異的結合である。
【０１０３】
第一の及び／又は第二の親和性リガンドへ共役可能なラベルの例には、蛍光色素又は金属（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フルオレスカミン）、発色団色素（例えば、ロドプシン）、化学発光化合物（例えば、ルミナール、イミダゾール）及び生物発光タンパク質（例えば、ルシフェリン、ルシフェラーゼ）、ハプテン（例えば、ビオチン）が挙げられる。
【０１０４】
特に好ましい実施態様では、本明細書において上で定められたプローブ、特にＰＤＥ４Ｄ７発現産物に特異的なプローブとして使用されることになる親和性リガンドは、６−ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッド又はローダミンなどの蛍光ラベルでラベルされ、及び／又は、同時に、ＴＡＭＲＡ、Ｄａｂｃｙｌ、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、ＢＨＱ−１又はＢＨＱ−２などの消光ラベルでラベルされ得る。種々の他の有用な蛍光及び発色剤についてはＳｔｒｙｅｒの１９６８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１６２：５２６−５３３に記載されている。親和性リガンドは、また、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ）、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６２Ｃｕ、１２４Ｉ、７６Ｂｒ、８２Ｒｂ、６８Ｇａ又は１８Ｆ）又は粒子（例えば金）でラベルされ得る。
【０１０５】
異なるタイプのラベルは、例えば、アミン反応又はチオール反応などの種々の化学を用いて親和性リガンドと共役され得る。しかし、アミンやチオール以外の他の反応基もまた使用可能であり、例えばアルデヒド、カルボン酸及びグルタミンが挙げられる。
【０１０６】
本発明の好ましい実施態様では、本発明の核酸親和性リガンド又はペプチド親和性リガンドは造影剤として機能するように変更され得る。
【０１０７】
本明細書において使用される場合、用語「造影剤」とは、ＰＤＥ４Ｄ７マーカーと特異的に相互作用可能な分子化合物であり、人又は動物の体外に設けられる装置で検出され得るものを意味する。好ましくは、かかる造影剤は磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）又は磁気光子イメージング（ＭＰＩ）での使用に適するものである。用語「特異的に相互作用する」とは、人又は動物の体内に存在する細胞表面のＰＤＥ４Ｄ７マーカーと、その細胞で発現される他のタンパク質とよりも優位に相互作用し得る分子化合物の性質を意味する。造影剤組成物としても用いられ得る好ましい造影剤は、本明細書において上で定められた配列番号１のヌクレオチド配列、配列番号２のアミノ酸配列、又はそれらの誘導体若しくは類似変異体を持つ分子を特異的に検出することができる。好ましくは、造影剤は、本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７発現産物又はＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的なアプタマーであり、また、本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的な抗体である。
【０１０８】
ＰＤＥ４Ｄ７マーカーを特異的に認識することができるこれらの性質とは別に、造影剤は通常さらに、使用される特異的検出技術により検出され得るさらなる分子を含む。本明細書において使用される場合、用語「機能するよう変更される」とは、従って、当業者に知られたいかなる適切な変更であり、分子イメージング方法（特にＭＲＩ又はＭＰＩ）での造影剤の使用を可能にするために必要な変更を意味する。例えば、蛍光分光法を検出手段として用いる場合には、このような分子は検出可能なマーカー分子として蛍光体を含んでもよく、特定の波長で励起され得るものである。又は、放射活性ラベル、例えば、本明細書において上で定められた放射性同位体が適用され得る。ＭＲＩに適した本発明による好ましい造影剤については、上記抗体などの造影剤は、ＭＲＩで検出され得るマーカー分子を含んでもよい。そのような検出可能なラベルは、例えば、ＵＳＰＩＯＳ及び１９Ｆｌｕｏｒを含む。
【０１０９】
本発明の具体的な実施態様では、組成物はさらに付属成分を含んでもよく、例えば、ＰＣＲバッファ、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、二価カチオン又は一価カチオンなどのイオン、ハイブリダイゼーション溶液、第二の親和性リガンド（例えば、第二の抗体）、検出色素及びいかなる他の適切な化合物又は液体（当業者に知られた、本明細書において上で定められた親和性リガンド又は造影剤のいずれかに基づく検出を実施するために必要なもの）などが挙げられる。
【０１１０】
他の側面において、本発明は、本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７発現産物又はタンパク質に対する核酸又はペプチド親和性リガンドの、本明細書において上で定められた個人の前立腺癌又は前立腺癌の進展又は前立腺癌の素因を診断、検出、モニター又は予見するための組成物の調製における使用に関する。
【０１１１】
好ましい実施態様では本発明は、本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７発現産物に特異的なオリゴヌクレオチドのセット及び／又はＰＤＥ４Ｄ７発現産物に特異的なプローブの、本明細書において上で定められた個人の前立腺癌又は前立腺癌の進展又は前立腺癌の素因を診断、検出、モニター又は予見するための組成物の調製における使用に関する。他の好ましい実施態様において、本発明は、本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７発現産物又はタンパク質に特異的なアプタマーの、本明細書において上で定められた個人の前立腺癌又は前立腺癌の進展、又は前立腺癌の素因を診断、検出、モニター又は予見するための組成物の調製における使用に関する。
【０１１２】
さらなる好ましい実施態様において本発明は、本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的な抗体又はＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的な抗体変異体の、本明細書において上で定められた個人の前立腺癌又は前立腺癌の進展又は前立腺癌の素因を診断、検出、モニター又は予見するための組成物の調製における使用に関する。
【０１１３】
本発明の好ましい実施態様において、本明細書において上で定められた組成物は診断用組成物である。
【０１１４】
他の側面において本発明は、前立腺癌又は前立腺癌の進展又は前立腺癌の素因を検出、診断、モニター又は予見するための診断キットに関する。このキットは、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物に特異的なオリゴヌクレオチドのセット、及び／又は、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物に特異的なプローブ、及び／又は、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物又はタンパク質に特異的なアプタマー、及び／又は、ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的な抗体、及び、ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的な抗体変異体を含む。
【０１１５】
通常本発明の診断キットは、本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７の特異的検出を可能とする一つ又はそれ以上の試薬を含む。診断キットの試薬又は成分は、本発明によれば、一つ又はそれ以上の容器又は別々の物に含まれ得る。試薬の性質はキットが意図する検出方法によって決定される。ＰＤＥ４Ｄ７ｍＲＮＡの発現レベルでの（即ちＰＤＥ４Ｄ７発現産物を介した）検出が意図される場合、この含まれることになる試薬は、本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７発現産物に特異的なオリゴヌクレオチドのセット、及び／又は、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物に特異的なプローブであってもよく、これらは場合により、例えば本明細書において上で定められたラベルを用いて、当技術分野で知られた方法でラベルされてもよい。さらに又はこれに代えて、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物に特異的なアプタマーが含まれ得る。ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質レベルにて検出することが意図される場合、含まれることになる試薬は、本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的な抗体又は抗体変異体の抗原結合断片を含む抗体又は化合物であってもよい。さらに又はこれに代えて、ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的なアプタマーを含むこともできる。或いは、診断キットが、本明細書において上で定められた造影剤を含んでもよい。
【０１１６】
特異的タンパク質の存在はまた、ＰＤＥ４Ｄ７と特異的に相互作用する他の化合物（例えば特異的基質又はリガンド）を用いて検出され得る。
【０１１７】
好ましくは、本発明の診断キットは、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物又はＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に対する検出試薬を含む。この試薬は、例えば、バッファ溶液、ラベル又は洗浄液等を含む。さらに、キットは、ある量の既知の核酸分子又はタンパク質を含み、キットの較正のため又は内部制御として使用され得る。通常、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物の検出に対する診断キットは、付属成分を含んでもよく、例えば、ＰＣＲバッファ、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、二価カチオン又は一価カチオンなどのイオン、ハイブリダイゼーション溶液などである。ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質の検出に対する診断キットもまた、第二の親和性リガンドのような付属の成分を含んでもよく、例えば、第二の抗体、検出色素及びいかなる他の適切な化合物又は液体（当業者に知られた、タンパク質検出を実施するために必要なもの）などが挙げられる。かかる成分は当業者に知られており、実施される検出方法に応じて変わり得る。さらに、このキットは指示書を含んでもよく、及び／又は、得られる結果の関連性に関する情報を提供してもよい。
【０１１８】
他の側面において本発明は、個人の前立腺癌又は前立腺癌の進展を検出、診断、モニター又は予見するための方法に関し、少なくとも、サンプル中のＰＤＥ４Ｄ７のレベルを決定するステップを含む。用語「ＰＤＥ４Ｄ７のレベルを決定する」とは、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物（例えば、１つ又は複数のＰＤＥ４Ｄ７転写物）の存在又は量を決定すること、並びに／或いは、１つ又は複数のＰＤＥ４Ｄ７タンパク質の存在及び／又は量を決定することを意味する。用語「ＰＤＥ４Ｄ７のレベル」とは、従って、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物（例えば、１つ又は複数のＰＤＥ４Ｄ７転写物）の存在又は量、及び／又は、１つ又は複数のＰＤＥ４Ｄ７タンパク質の存在又は量の決定を意味する。ＰＤＥ４Ｄ７発現産物（例えば、１つ又は複数のＰＤＥ４Ｄ７転写物）或いは１つ又は複数のＰＤＥ４Ｄ７タンパク質の存在又は量を決定することは、当技術分野で知られたいかなる方法を用いても達成することができる。
【０１１９】
本発明の好ましい実施態様では、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物（例えば、１つ又は複数のＰＤＥ４Ｄ７転写物）、並びに／或いは、１つ又は複数のＰＤＥ４Ｄ７タンパク質の存在又は量の決定は、核酸又はタンパク質レベルの測定により、又は、ＰＤＥ４Ｄ７の生物活性の決定により達成される。従って、１つ又は複数のＰＤＥ４Ｄ７発現レベルは、ＰＤＥ４Ｄ７遺伝子によりコードされるｍＲＮＡの検出、ＰＤＥ４Ｄ７転写物によりコードされるＰＤＥ４Ｄ７タンパク質の検出、及び／又は、ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質の生物活性の検出を含む方法により決定され得る。
【０１２０】
例えば、ＰＤＥ４Ｄ７発現の核酸レベルの測定は、アガロース又はポリアクリルアミドゲルにおいてサンプルから得られる核酸分子（例えば、ＲＮＡ又はｃＤＮＡ）を分離し、続いて、本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７特異的オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせることで評価され得る。又は、発現レベルは、サンプルから得られた核酸をラベルし、続いて、配列決定ゲル上で分離することで決定され得る。核酸サンプルをゲル上に、患者及びコントロール又は標準の核酸が隣接したレーンにあるように置いてもよい。発現レベルの比較は視覚的又はデンシトメータにより達成され得る。ｍＲＮＡ又は発現産物の検出方法は当業者に知られている。通常はノーザンブロット分析がこの目的で使用され得る。
【０１２１】
又は、ＰＤＥ４Ｄ７発現の核酸レベルは、ＤＮＡアレイ又はマイクロアレイ方法で検出され得る。通常、試験されるべき対象からの核酸サンプルは処理されて、好ましくは蛍光ラベルでラベルされる。その後かかる核酸分子は、本発明のＰＤＥ４Ｄ７マーカー遺伝子又は知られたバイオマーカー又は癌マーカー遺伝子に対応する固定化キャプチャプローブとのハイブリダイズ処理方法で使用され得る。マイクロアレイ分析を実施するための適切な方法は当業者に知られている。
【０１２２】
標準の設定では、ＤＮＡアレイ又はマイクロアレイは、多くの遺伝子を検出する固定化高密度プローブを含む。このアレイ上のプローブはマーカー遺伝子の配列の一以上の部分に相補的であるか、又は、マーカー遺伝子の全コード領域に相補的である。本発明では、ポリヌクレオチドがＰＤＥ４Ｄ７発現と他の遺伝子の発現とを特異的に区別することができる限り、いかなるタイプのＰＤＥ４Ｄ７関連ポリヌクレオチドも、ＤＮＡアレイに対するプローブとして使用され得る。通常、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ生成物及びオリゴヌクレオチドがプローブとして有用である。好ましくは、ＰＤＥ４Ｄのスプライスバリアント７の特異的部分を含むプローブがプローブとして使用され得る。ＰＤＥ４Ｄ７発現の決定に加えてまた、他の遺伝子（例えば、さらなるバイオマーカー又は癌マーカー遺伝子）の発現の決定も遂行され得る。
【０１２３】
ＤＮＡアレイ又はマイクロアレイに基づく検出方法は通常、次のステップを含む：（１）サンプルからｍＲＮＡを単離し、場合によりｍＲＮＡをｃＤＮＡへ変換し、続いてこのＲＮＡ又はｃＤＮＡをラベルするステップ。ＲＮＡを単離する方法、それをｃＤＮＡへ変換する方法、さらに核酸をラベルする方法はマイクロアレイ技術の手順書に記載されている。（２）ステップ１からの核酸をマーカー遺伝子に対するプローブとハイブリダイズさせるステップ。サンプルからの核酸は色素（例えば、蛍光色素Ｃｙ３（赤）又はＣｙ５（青））でラベルされ得る。一般的に、コントロールサンプルが異なる色素でラベルされる。（３）サンプルからの核酸とプローブとのハイブリダイゼーションを検出し、少なくとも定性的に、より好ましくは定量的に、ＰＤＥ４Ｄ７及び／又は追加の試験されるマーカー遺伝子についてサンプル中のｍＲＮＡの量を決定するステップ。サンプルとコントロールとの発現レベルの差は、シグナル強度の違いに基づき推定され得る。これらは、適切な、しかし限定されるものではないソフトウェア（例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘから提供される）を用いて測定及び分析することができる。
【０１２４】
ＤＮＡアレイ上にスポットされる、使用されるマーカー遺伝子に対応するプローブの数には制限はない。また、マーカー遺伝子は２つ又はそれ以上のプローブで表わすことができ、このプローブは遺伝子の異なる部分とハイブリダイズする。プローブは、選択されたマーカー遺伝子につき設計される。このプローブは通常、５〜５０ヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチドである。より長いＤＮＡを、ＰＣＲによって又は化学的に合成することができる。そのようなオリゴヌクレオチドを合成する及び基板上に加える方法は、マイクロアレイの分野においてよく知られている。マーカー遺伝子以外の遺伝子もまた、ＤＮＡアレイにスポットされ得る。例えば、その発現レベルが大きく変化しない遺伝子に対するプローブをＤＮＡアレイにスポットしてアッセイ結果を基準化するか、又は、複数のアッセイ若しくは異なるアッセイのアッセイ結果を比較することができる。
【０１２５】
又は、ＰＤＥ４Ｄ７発現の核酸レベルは、定量的ＲＴ−ＰＣＲ方法、好ましくはＰＤＥ４Ｄ７ｍＲＮＡ転写物の逆転写に続くリアルタイムＰＣＲ方法で検出されてもよい。通常は、第一のステップとして、当業者に知られるいかなる適切な方法によっても転写物はｃＤＮＡ分子へ逆転写される。定量的又はリアルタイムＰＣＲ方法は、続いて、上で説明したように得られた第一のＤＮＡ鎖に基づいて実施され得る。
【０１２６】
好ましくは、このタイプの主要なＦＲＥＴに基づくプローブとしてのＴａｑｍａｎ又は分子ビーコンプローブが定量的ＰＣＲ検出のために使用され得る。どちらの場合でも、プローブ、好ましくは本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７プローブが、内部プローブとして役立ち、これは、関心ある標的領域に隣接する一組の対向プライマー、好ましくは本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７オリゴヌクレオチドのセットと組み合わせて使用される。標的セグメントが増幅されると、プローブは、選択的にその生成物にプライマー部位間の同定配列にて結合することができ、それにより標的の頻度の増加に相対してＦＲＥＴシグナルを増加させる。
【０１２７】
好ましくは、本発明による定量的ＰＣＲ方法に使用されることになるＴａｑｍａｎプローブは、ＦＲＥＴ対を持つ両末端がラベルされる約２２から３０塩基の上記のＰＤＥ４Ｄ７オリゴヌクレオチドを含んでもよい。通常、５’末端がフルオレセイン（例えばＦＡＭ）などのより短い波長の蛍光体を持ち、および３’末端は、一般的には、より長い波長の蛍光消光体（例えばＴＡＭＲＡ）又は非蛍光消光化合物（例えばＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）でラベルされる。好ましくは、定量的ＰＣＲのために使用されることになるプローブ、特に、本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７プローブは、レポータ色素に隣接する５’末端にてグアニン（Ｇ）を持たないものであり、これはプローブが分解した後のレポータ蛍光の消光を回避するためである。
【０１２８】
本発明による定量的ＰＣＲ方法に使用されることになる分子ビーコンプローブは好ましくは、ＰＣＲ生成物を検出し定量化するためにＦＲＥＴ相互作用を用いる。これは、５’末端が蛍光ラベルされ、３’末端が消光ラベルされている各プローブとの相互作用である。このプローブのヘアピン又は幹ループ構造は、好ましくは、２つの短い自己結合末端を持つ幹と、約２０から３０塩基の長い内部標的特異的領域を持つループを含むものである。
【０１２９】
本発明に関連して適用され得る別の検出メカニズムは、ループ構造のみを持ち短い相補的幹領域を持たずに作製されたプローブへも向けられる。本発明に関連して使用可能でもある、他のＦＲＥＴ系定量的ＰＣＲ方法は、２つのハイブリダイゼーションプローブの使用に基づくものであり、これは、標的上の隣接する部位に結合し、第一のプローブがその３’末端にて蛍光ドナーラベルを持ち、第二のプローブがその５’末端にて蛍光アクセプタラベルを持つものである。
【０１３０】
ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質又はそのいかなる断片、相同体又は誘導体のタンパク質レベルの測定は、当技術分野で知られているいかなる適切な検出技術を介しても実施され得る。好ましくは、ＰＤＥ４Ｄ７及びその誘導体のタンパク質レベルは、免疫学的に決定され得る。例えば、ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的な抗体、好ましくは本明細書において上で記載された抗体を用いて決定され得る。又は、本明細書において上で定められた抗体変異体又は断片が使用され得る。本発明はまた、本明細書において上で定義されるＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的なアプタマーなどのペプチド親和性リガンドの使用を構想する。
【０１３１】
ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質のタンパク質レベルの決定は、例えば、ポリアクリルアミドゲル上でサンプルからタンパク質を分離し、続いてウェスタンブロット分析で特異的に結合する抗体を用いてＰＤＥ４Ｄ７タンパク質の同定を行うことによって達成することができる。又は、タンパク質は２次元ゲル電気泳動システムで分離され得る。２次元ゲル電気泳動は当技術分野でよく知られており、通常、第一の次元に沿って等電点電気泳動を行い、続いて第二の次元に沿ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行うものである。２ＤＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの分析は、ゲル上のタンパク質スポットの強度を決定することによって実施され得るか、又は、免疫検出方法を用いて実施され得る。他の実施態様では、タンパク質サンプルは質量分析により分析される。
【０１３２】
本発明に関連して、ＰＤＥ４Ｄ７特異的抗体は、支持体上に設けられて固定化され得る。分析されることになるサンプル又は組織から得られるタンパク質は、後に、上記抗体と混合され得る。検出反応が次に、例えば、本明細書において上で定められた第二の親和性リガンド、好ましくは特異的抗体を用いて実施されてもよい。
【０１３３】
本発明に関連して使用可能な、特に本発明の診断目的で使用できる免疫学的試験は、例えば、競合的及び非競合的なアッセイシステムを含み、例えば、ウェスタンブロット、ＲＩＡ（ラジオリンク免疫アッセイ）などのラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈殿アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ（例えば、ラテックス凝集）、補体結合アッセイ、免疫放射線測定アッセイ、蛍光免疫アッセイ（例えば、ＦＩＡ（蛍光リンクイムノアッセイ））、化学ルミネッセンスイムノアッセイ、電気化学ルミネッセンスイムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）及びタンパク質Ａイムノアッセイなどの技術を用いたアッセイシステムが挙げられる。このようなアッセイはルーチン的な技術であり当業者によく知られている技術である。
【０１３４】
さらに、抗原への抗体の結合親和性及び抗原−抗体相互作用のオフレートは、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの一例はラジオイムノアッセイであり、ラベルされた抗原（例えば、３Ｈ又は１２５Ｉ）を適切な抗体と、ラベルされていない多量の抗原と共にインキュベートし、ラベルされた抗原へ結合する抗体を検出することを含む。関心のある抗体の特定の抗原に対する親和性及び結合のオフレートは、いかなる適切な分析方法によってもデータから決定され得る。例えば、スキャッチャードプロット分析が挙げられる。第二の抗体との競合はまた、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合には抗原は、ラベルされた化合物（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ）に共役する適切な抗体と、ラベルされていない多量の第二の抗体の存在下でインキュベートされ得る。
【０１３５】
さらに、ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的なアプタマー、好ましくは本明細書において上で定義されたアプタマーが、ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質の検出方法で使用され得る。かかるアプタマーは好ましくは、タンパク質−リガンド相互作用の検出を可能とするようにラベルされ得る。
【０１３６】
ＰＤＥ４Ｄ７の生物活性の決定は、ＰＤＥ４Ｄ７の対応する１つ又は複数の機能に特異的な分子又は酵素アッセイを適用して実施され得る。好ましくは、ホスホジエステラーゼによるｃＡＭＰの変換に基づく読み出しシステムが使用され得る。適切な技術は当業者に知られている。さらなる好ましい実施態様では、ＰＤＥ４Ｄ７の生物活性を決定するためのアッセイは、他のＰＤＥ４Ｄスプライスバリアント、他のＰＤＥ４イソ型及び／又は他のＰＤＥ、好ましくはｃＡＭＰの変換を行うことができる他のＰＤＥなどの活性の抑制との組み合わせで実施され得る。そのような活性の抑制は当業者に知られるいかなる適切な方法でも実施され得る。好ましくは、適切なアンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ分子又はｍｉＲＮＡ分子の使用を介して、より好ましくは特異的にハイブリダイズするアンチセンスヌクレオチド、特異的ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ分子の使用を介して実施され得る。
【０１３７】
さらに好ましい実施態様では、ＰＤＥ４Ｄ７の生物活性は、特異的なＰＤＥ４Ｄ７インヒビターを用いて試験され得る。かかるインヒビターの使用は、例えば、ｃＡＭＰ基質の変換に基づく読み出しシステムと組み合わせられ得る。通常、使用されることになるＰＤＥ４Ｄ７インヒビターはアンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子又はｍｉＲＮＡ分子を含む。
【０１３８】
ＰＤＥ４Ｄ７のレベルはまた、組織学的又は細胞生物学的手順を含む方法で検出され得る。通常、可視化技術、例えば、光学顕微鏡又は免疫蛍光顕微鏡、さらにフローサイトメトリー又はルミノメトリーなどが使用され得る。細胞のＰＤＥ４Ｄ７タンパク質の存在は、例えば、本明細書において上で定められたサンプルから試験されることになる細胞を除去することで検出又は決定され得る。組織切片又は生検サンプルも、これらの方法に使用され得る。その後、ＰＤＥ４Ｄ７に対する親和性リガンドが適用され得る。好ましくは、抗体又はアプタマーである。通常、かかる親和性リガンドはラベルされ、好ましくは、本明細書において上で定められた蛍光ラベルでラベルされる。かかる手順により、ＰＤＥ４Ｄ７を定量的に検出することを可能としさらに、その分布や発現の相対レベルを決定することができる。
【０１３９】
そのような手順は、可視化方法の使用を含む。適切な可視化方法は当業者に知られている。通常、使用されることになる方法は、蛍光測定、発光測定及び／又は酵素技術を含む。蛍光は通常、蛍光ラベルを特定の波長の光に曝露して、その後、放出された特定の波長の光を検出及び／又は定量化することによって、検出及び／又は定量化される。発光タグ付き親和性リガンドの存在は、化学反応の際に出てくる光によって検出及び／又は定量化することができる。酵素反応の検出は化学反応により生じるサンプル中の色のシフトによるものである。
【０１４０】
さらに好ましい実施態様では、ＰＤＥ４Ｄ７のレベルは、適切な分子イメージング技術により決定され得る。例えば、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）又は磁気光子イメージング（ＭＰＩ）を用いて、及び／又は、適切な造影剤、例えば、本明細書において上で定義された造影剤を用いて決定され得る。
【０１４１】
さらに好ましい実施態様では、本発明の前立腺癌又は前立腺癌の進展の検出、診断、モニタリング又は予見のための方法は、測定された核酸若しくはタンパク質レベル又は測定された生物活性をコントロールレベルと比較する追加のステップを含む。本明細書において使用される場合、用語「コントロールレベル」とは、本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７マーカー又は他の適切なマーカー（癌性コントロール又は非癌性コントロール）の発現を意味する。コントロールレベルの状態、性質、量及び条件は必要に応じて調整されてもよい。好ましくは、非癌性コントロールレベルが使用され得る。本明細書において使用される場合、用語「比較する」とは、データを査定、計算、評価又は処理するいかなる適した方法も意味する。
【０１４２】
さらに他の実施態様では、さらなる追加のステップとして、上記比較するステップの結果に基づいて、前立腺癌又は前立腺癌の進展の存在若しくは状態を決定することを含む。前立腺癌マーカーとしてのＰＤＥ４Ｄ７に関連して本明細書において上で提供された対応する定義に従った上記の方法で、前立腺癌は診断又は予見されてもよく、又は、前立腺癌の進展が診断又は予見されてもよい。
【０１４３】
他の実施態様において、本発明は、前立腺癌又は前立腺癌の進展の検出、診断、モニタリング又は予見のための方法に関し、この方法は少なくとも次のステップ：
（ａ）ＰＤＥ４Ｄ７発現産物又はＰＤＥ４Ｄ７タンパク質の発現について、少なくとも一人の前立腺癌の疑いのある個人から得られた少なくともひとつのサンプルを試験するステップ；
（ｂ）ＰＤＥ４Ｄ７発現産物又はＰＤＥ４Ｄ７タンパク質の発現について、少なくとも一人の癌を患っていない個人から得られた少なくともひとつのコントロールサンプルを試験するステップ；
（ｃ）ステップ（ａ）及び（ｂ）の発現における差を決定するステップ；及び
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた結果に基づき、前立腺癌又は前立腺癌の進展の存在若しくは段階につき判断するステップ；
を含む。
【０１４４】
ひとつの実施態様において、この診断の方法のステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び／又は（ｄ）は、人又は動物の体外で実施され得る。例えば、患者又は個人から得られたサンプル内で行われ得る。
【０１４５】
他の側面において本発明は、ホルモン抵抗性前立腺癌についての、又は、ホルモン抵抗性前立腺癌に向かう進展についての診断、モニタリング又は予見のための方法に関し、上記方法はホルモン感受性及びホルモン抵抗性前立腺癌を区別し、上記方法は次のステップ：
（ａ）サンプル中のＰＤＥ４Ｄ７のレベルを決定するステップ；
（ｂ）サンプル中の参照遺伝子の発現のレベルを決定するステップ；
（ｃ）測定されたＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルを上記参照遺伝子の発現レベルに基準化するステップ；及び、
（ｄ）上記基準化された発現レベルを、ホルモン感受性前立腺癌を除外するために選ばれた既定のカットオフ値と比較するステップ；
を含み、上記カットオフ値未満の基準化された発現レベルはホルモン抵抗性前立腺癌を示し、上記カットオフ値は、約１から７、好ましくは約５である。
【０１４６】
ＰＤＥ４Ｄ７のレベルは、本明細書において上で定められた核酸、タンパク質又は活性レベルで決定され得る。好ましくは、１つ又は複数のＰＤＥ４Ｄ７転写物及び／又はタンパク質の量の決定である。さらに、サンプル中の参照遺伝子のレベルが決定され得る。本明細書において使用される場合、用語「参照遺伝子」とは、いかなる適した遺伝子であり、例えば、選択される生物体における、いかなる安定して発現され持続的に検出され得る遺伝子、遺伝子産物、発現産物、タンパク質又はタンパク質変異体を意味する。この用語はまた、発現されたタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、同様に、それらの変異体等の遺伝子産物をも意味する。本発明は従ってまた、参照遺伝子から誘導された参照タンパク質をも含む。また参照遺伝子からの全ての種類の転写誘導物をも含み、同様にそれらの誘導物又はそれらのリンクされる二次的パラメータをも含む。それに代えてまたはそれに加えて、他の参照パラメータもまた、参照目的で使用され得る。例えば、代謝濃度、細胞サイズなどである。
【０１４７】
発現は、好ましくは同じサンプルで実施されてもよく、即ちＰＤＥ４Ｄ７のレベル及び参照遺伝子のレベルは同じサンプルで決定される。試験が同じサンプルで実施される場合、本明細書において記載される単一又は多重検出方法が実施され得る。好ましくは、多重検出に対して、配列番号７、８及び９の配列を持つオリゴヌクレオチド及びプローブが使用され得る。多重検出の実施のために、プライマー及び／又はプローブオリゴヌクレオチドの濃度は変更され得る。さらに、バッファ、イオンなどのさらなる成分の濃度及び存在も変更され得る。例えば、製造者の指示内容に比べて増加又は減少させられ得る。
【０１４８】
本発明の具体的な実施態様では、ひとつ以上の参照遺伝子又は安定発現遺伝子の発現が決定され得る。例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、３０以上の参照遺伝子の発現が決定され得る。かかる測定の結果は、別々に計算されるか、又は、平均発現インデックスを得るために組み合わされ得る。さらに、参照遺伝子発現のパターンが決定されてもよく、及び／又は、続くステップに対する根拠として使用されてもよい。かかるパターンは、特定の癌、特に前立腺癌の段階又は状態における遺伝子の知られた発現態様に基づくことができる。
【０１４９】
さらに、発現結果は、参照例又はデータベースからのすでに知られた結果と比較することができる。比較はさらに、結果の統計学的関連性を改善するために基準化手順を含んでもよい。
【０１５０】
本発明の他の実施態様で、サンプル中の参照遺伝子の発現のレベルを決定する代わりに、さらなる癌マーカー又は非定常的発現遺伝子の発現が決定されてもよい。例えば、ホルモン抵抗性前立腺癌で減少することが知られている、又はホルモン感受性前立腺癌で増加することが知られている遺伝子の発現が決定され得る。
【０１５１】
さらなる実施態様でまた、両方の発現決定が実施されてもよく、即ち参照遺伝子及びさらなる癌又はバイオマーカーの遺伝子の発現の決定が実施されてもよい。
【０１５２】
発現結果は、当業者に知られるいかなる適切な方法によっても基準化され得る。例えば、標準スコア、スチューデントｔテスト、スチューデント化残差テスト、標準化モーメントテスト又は係数分散テストのような基準化統計学的方法などが挙げられる。通常は、当業者に知られるそのようなテスト又は対応する式が使用され、発現データを標準化して、遺伝子発現レベルでの実際の変動と測定手順による変動とを区別することができる。
【０１５３】
ステップ（ａ）及び（ｂ）で得られる発現結果及び／又はステップ（ｃ）で得られる基準化結果に基づいて、ＰＤＥ４Ｄ７発現に対するカットオフ値との比較が実施され得る。カットオフ値であって、該値未満のＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルがホルモン抵抗性前立腺癌を指示し、その結果ホルモン感受性前立腺癌又は腫瘍型を除外するカットオフ値は、約０．７５から８、０．７５から７．５、０．７５から７、０．７５から６．５、０．７５から６、０．７５から６、０．７５から５．５、０．７５から５．５、１．０から８、１．２５から８、１．５から８、１．７５から８、２から８、２．２５から８、２．５から８、２．７５から８、３から８、３．２５から８、３．５から８、３．７５から８、４から８、４．２５から８、４．５から８、４．７５から８、又は、５から８である。より好ましいカットオフ値は、約５、例えば、４．９、４．８、４．７、４．６、４．５、４．４、４．３、４．２、４．１又は５．９、５．８、５．７、５．６、５．５、５．４、５．３、５．２、又は５．１である。特に好ましい実施態様において、カットオフ値は、参照遺伝子としてのハウスキーピング遺伝子と共に用いるものである。さらにより好ましくは、上記カットオフ値は、参照遺伝子としてのＧＡＰＤＨ及び／又はＰＢＧＤと共に用いるものである。
【０１５４】
本発明の好ましい実施態様では、カットオフ値は、例えば血清又は血漿などの血液サンプル中、尿サンプル中、又は、尿沈査サンプル中のＰＤＥ４Ｄ７についてのカットオフ値である。本発明の特に好ましい実施態様では、カットオフ値は、尿中での、本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７タンパク質又はポリペプチド又はいかなるその誘導体などについてのカットオフ値である。本発明の他の特に好ましい実施態様では、カットオフ値は、尿中に含まれる細胞、又は尿中に含まれる細胞から分泌されたエキソソーム中での、本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７タンパク質又はポリペプチド又はいかなるその誘導体などについてのカットオフ値である。本発明のさらにより好ましい実施態様では、カットオフ値は、尿沈査サンプル中での、及び、尿沈査サンプル中に含まれる細胞での、又は、尿沈査サンプル中に含まれる細胞から分泌されたエキソソーム中での、本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７タンパク質又はポリペプチド又はいかなるその誘導体などについてのカットオフ値である。
【０１５５】
測定され及び／又は基準化されたＰＤＥ４Ｄ７発現が上記カットオフ値を超える場合には、個人がホルモン抵抗性前立腺癌には罹っていないことを示すものと判断される。この値はさらに、個人がホルモン抵抗性前立腺癌以外の前立腺癌、特にホルモン依存性前立腺癌又はホルモン感受性前立腺癌に罹っていることを意味し得る。
【０１５６】
他の側面で本発明は、データ取得方法に関し、上記方法は少なくとも次のステップ：
（ａ）ＰＤＥ４Ｄ７の発現について個人を試験するステップ；及び
（ｂ）ステップ（ａ）で決定された発現をコントロールレベルと比較するステップ；
を含む。
【０１５７】
ＰＤＥ４Ｄ７の発現に対する試験は、本明細書において上で記載されたステップにより実施され得る。好ましくは、試験は、ＰＤＥ４Ｄ７の核酸又はタンパク質レベルの測定として、又は、ＰＤＥ４Ｄ７の生物活性の決定、より好ましくは、かかる測定に対して本明細書において上で記載された選択肢により実施され得る。試験は、個人で、即ちインビボで、又は個人の外部即ちエクスビボ又はインビトロで実施され得る。データ取得の方法に関連して使用される場合、用語「コントロールレベル」とは、本明細書において上で定められた癌性コントロールマーカー又は非癌性コントロールにおけるＰＤＥ４Ｄ７マーカー又は他の適切なマーカーの発現を意味する。このコントロールレベルの状態、性質、量及び条件は、必要に応じて調整され得る。好ましくは、非癌性コントロールレベルが使用され得る。より好ましくは、ホルモン感受性前立腺癌段階から得られるコントロールレベルが使用され得る。発現レベルをコントロールレベルと比較することは、データを査定、計算、評価又は処理するいかなる適切な方法に従って実施されてもよく、特に２つのデータセット間の違いを検出することを目的とする。差についての有意性の統計的評価がさらに行われてもよい。適切な統計手法は当業者に知られている。得られたデータ及び情報は、保存、蓄積、又は、当業者に知られた適切な情報学又はコンピュータ方法若しくはツールで処理されてもよく、及び／又は、適切な方法で、技術者がこのデータを、ひとつ以上の続く推論又は結論ステップのために用いることができるように提示することができる。
【０１５８】
他の側面において、本発明は、前立腺癌又は前立腺癌の進展について検出、診断、モニター又は予見するためのイムノアッセイに関し、上記イムノアッセイは少なくとも次のステップ：
（ａ）ＰＤＥ４Ｄ７の発現について個人から得られるサンプルを試験するステップ；
（ｂ）ＰＤＥ４Ｄ７の発現についてコントロールサンプルを試験するステップ；
（ｃ）ステップ（ａ）及びステップ（ｂ）の発現の差を決定するステップ；及び
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られる結果に基づいて、前立腺癌又は前立腺癌の進展の存在又は段階を決定するステップ；
を含む。
イムノアッセイは好ましくは、ＰＤＥ４Ｄ７に特異的に結合する抗体の使用に基づく。例えば、本明細書において記載される一つ以上のＰＤＥ４Ｄ７抗体が挙げられる。又は、イムノアッセイは、いかなる他の適した試薬を用いても、又はそれと組み合わせても実施され得る。例えば、上記アッセイは、本明細書において記載される核酸の検出又は酵素的試験方法と組み合わせることができる。
【０１５９】
さらなる側面で本発明は、ホルモン感受性及びホルモン抵抗性前立腺癌を区別するためのイムノアッセイに関し、上記イムノアッセイは次のステップ：
（ａ）サンプル中のＰＤＥ４Ｄ７のレベルを決定するステップ；
（ｂ）サンプル中の参照遺伝子の発現のレベルを決定するステップ；
（ｃ）測定されたＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルを参照遺伝子の発現に対して基準化するステップ；及び
（ｄ）基準化された発現レベルを、ホルモン感受性前立腺癌を除外するために選ばれた既定のカットオフ値と比較するステップ；
を含み、上記カットオフ値未満の基準化発現レベルはホルモン抵抗性前立腺癌であることを示し、上記カットオフ値は、約１から７である。好ましくは、カットオフ値は約５である。
【０１６０】
ＰＤＥ４Ｄ７のレベルは好ましくは、本明細書において上で記載されたタンパク質又は活性レベルで決定され得る。好ましくは、ＰＤＥ４Ｄ７特異的抗体を用いてＰＤＥ４Ｄ７タンパク質の量を決定することである。例えば、本明細書において記載されるひとつ以上のＰＤＥ４Ｄ７抗体が挙げられる。又は、イムノアッセイは、いかなる他の適切な試薬を用いても実施することができるか、又は、他の部分の決定と組み合わせることができる。例えば、上記アッセイは、本明細書において記載される核酸の存在若しくは量の検出又は酵素的試験方法と組み合わせることができる。
【０１６１】
さらに、サンプル中の、本明細書において上で定められた参照遺伝子のレベルが決定され得る。参照遺伝子の検出のために、遺伝子発現産物（即ちタンパク質）の量が決定され得る。好ましくは、当業者に知られるひとつ以上の適切な抗体を用いることによってである。又は、参照遺伝子の決定が、いかなる他の適した試薬を用いても実施され得る。又は、本明細書において記載される核酸の存在又は量の検出若しくは酵素的試験方法と組み合わされ得る。
【０１６２】
ステップ（ａ）及び（ｂ）で得られる発現結果及び／又はステップ（ｃ）で得られる基準化結果に基づいて、ＰＤＥ４Ｄ７発現に対するカットオフ値との比較が実施され得る。カットオフ値であって、イムノアッセイにおいて該値未満のＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルがホルモン抵抗性前立腺癌を指示し、その結果、ホルモン感受性前立腺癌又は腫瘍型を除外するカットオフ値は、約０．７５から８、０．７５から７．５、０．７５から７、０．７５から６．５、０．７５から６、０．７５から６、０．７５から５．５、０．７５から５．５、１．０から８、１．２５から８、１．５から８、１．７５から８、２から８、２．２５から８、２．５から８、２．７５から８、３から８、３．２５から８、３．５から８、３．７５から８、４から８、４．２５から８、４．５から８、４．７５から８、又は、５から８である。より好ましいカットオフ値は、約５、例えば、４．９、４．８、４．７、４．６、４．５、４．４、４．３、４．２、４．１又は５．９、５．８、５．７、５．６、５．５、５．４、５．３、５．２、又は５．１である。
【０１６３】
カットオフ値は、本明細書において以下に記載される、血液サンプル、例えば血清又は血漿サンプル、尿サンプル又は尿沈査サンプル中のＰＤＥ４Ｄ７についてのカットオフ値であってもよい。
【０１６４】
測定される及び／又は基準化されるＰＤＥ４Ｄ７発現が、示されるカットオフ値を超える場合、これは、個人がホルモン抵抗性前立腺癌に罹っていないことを示すものと考えられる。この値はさらに、個人がホルモン抵抗性前立腺癌以外の前立腺癌、特にホルモン依存性前立腺癌又はホルモン感受性前立腺癌に罹っていることを示し得る。
【０１６５】
さらなる側面で本発明は、前立腺癌治療を受けるべき個人を同定する方法に関し、上記方法は次のステップ：
（ａ）ＰＤＥ４Ｄ７の発現について個人から得られるサンプルを試験するステップ；
（ｂ）参照遺伝子の発現について上記サンプルを試験する、及び／又は、ＰＤＥ４Ｄ７の発現についてコントロールサンプルを試験するステップ；
（ｃ）ステップ（ａ）の発現のレベルを、ステップ（ｂ）のレベルに相対的に分類するステップ；及び
（ｄ）個人のサンプルがＰＤＥ４Ｄ７発現の減少したレベルを有するとして分類される場合に、上記個人を、前立腺癌治療を受けるべきであるとして同定するステップ；
を含む。
【０１６６】
ＰＤＥ４Ｄ７のレベルは、本明細書において上で記載された核酸、タンパク質又は活性レベルで決定され得る。好ましくは、１つ又は複数のＰＤＥ４Ｄ７転写物及び／又はタンパク質の量を決定することである。さらに、サンプル中の、本明細書において上で記載された参照遺伝子のレベルが決定され得る。参照遺伝子の発現に対する試験は、ＰＤＥ４Ｄ７の決定のために使用される同じサンプルで実施され得る。試験が同じサンプルで実施される場合、単一又は多重検出方法が実施され得る。好ましくは、多重検出のために、配列番号７、８及び９の配列を持つオリゴヌクレオチド及びプローブが使用され得る。多重検出の実施のために、プライマー及び／又はプローブオリゴヌクレオチドの濃度が変更され得る。さらに、バッファ、イオンなどのさらなる成分の存在及び濃度もまた変更され得る。例えば、製造者の指示と比べて増加又は減少させることができる。又は、参照遺伝子の発現に対する試験は異なるサンプルで行われてもよく、好ましくは、本明細書において上で定められたコントロールサンプルで行われてもよい。好ましくは、かかるコントロールサンプルは、試験サンプルと同じ個人からのコントロールサンプルであり、又は、異なる供給源又は個人から得られるコントロールサンプルであり得る。コントロールサンプルはまた、同じ組織から、好ましくは前立腺から得られるサンプルであるか、又は、異なる組織タイプから得られるものであってよい。好ましい他の組織タイプの例としては、間質前立腺組織、膀胱上皮組織及び尿道上皮組織などが挙げられる。
【０１６７】
さらに、参照遺伝子の発現のための試験サンプルの試験、及び、ＰＤＥ４Ｄ７の発現のためのコントロールサンプルの試験は組み合わされてもよい。
【０１６８】
さらなる実施態様において、コントロールサンプルはまた、参照遺伝子の発現に対して試験されてもよい。ひとつ以上のサンプルが参照遺伝子の発現に対して試験される場合、得られる発現結果は、当業者に知られるいかなる適切な統計手法によっても比較及び／又は平均化又は基準化され得る。
【０１６９】
本明細書において使用される場合、用語「ステップ（ｂ）のレベルに相対的にステップ（ａ）の発現のレベルを分類する」とは、ＰＤＥ４Ｄ７についての試験サンプル中の発現及びＰＤＥ４Ｄ７についてのコントロールサンプル中の発現とを、例えば、適切な基準化参照に対して基準化した後に比較することを意味する。比較した結果により、試験サンプルは、コントロールサンプルと同様の発現、コントロールサンプルと比べて増加した発現、又はコントロールサンプルと比べて減少した発現を与えるものとして示される。この用語はさらに、ＰＤＥ４Ｄ７についての試験サンプル中の発現及び参照遺伝子についての同じ試験サンプル中の発現が、例えば、基準化参照としてのさらなる遺伝子に対して基準化した後に比較されることを意味する。比較の結果により、試験サンプルは、参照遺伝子と同様の発現、参照遺伝子と比べて増加した発現、又は参照遺伝子と比べて減少した発現を与えるものとして示される。
【０１７０】
発現結果の分類によれば、個人は、ＰＤＥ４Ｄ７発現レベルが減少する場合に前立腺癌治療を受けるべきと考えられ得る。発現レベルは、試験サンプル中のＰＤＥ４Ｄ７遺伝子発現が、コントロールサンプル中のＰＤＥ４Ｄ７発現に比較して、例えば５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％又は５０％以上減少する場合に、又は、コントロールサンプル中のＰＤＥ４Ｄ７発現に比較して、少なくとも０．１倍、少なくとも０．２倍、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍以上である場合に「減少する」と考えられ、或いは、ＰＤＥ４Ｄ７遺伝子発現が、コントロールサンプル中の参照遺伝子の発現に比べて、例えば、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、又は５０％以上減少する場合に、又は、参照遺伝子の発現に比較して、少なくとも０．１倍、少なくとも０．２倍、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍以上減少する場合に「減少する」と考えられる。具体的な実施態様では、参照遺伝子の発現はまた、追加の遺伝子又はマーカー、例えば、ハウスキーピング遺伝子の発現に対して基準化されるか又は調節され得る。
【０１７１】
さらなる側面で本発明は、前立腺癌を持つ個人又は個人の同齢集団を層別化するためのイムノアッセイに関し、次のステップ：
（ａ）ＰＤＥ４Ｄ７の発現について、個人から得られたサンプルを試験するステップ；
（ｂ）参照遺伝子の発現について上記サンプルを試験する、及び／又は、ＰＤＥ４Ｄ７の発現について、コントロールサンプルを試験するステップ；
（ｃ）ステップ（ａ）でのＰＤＥ４Ｄ７の発現と、ステップ（ｂ）でのＰＤＥ４Ｄ７及び／又は参照遺伝子の発現との差を決定するステップ；及び
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた結果に基づいて、前立腺癌治療に対して個人又は個人の同齢集団を層別化するステップ；
を含み、ここで個人のサンプルのＰＤＥ４Ｄ７発現のレベルは減少している。
【０１７２】
ＰＤＥ４Ｄ７の発現の試験は、好ましくは、本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７タンパク質の量の決定又はＰＤＥ４Ｄ７活性レベルの決定により実施され得る。好ましくは、ＰＤＥ４Ｄ７特異的抗体、例えば、本明細書において記載されるひとつ以上のＰＤＥ４Ｄ７抗体を用いたＰＤＥ４Ｄ７タンパク質の量の決定である。又は、上記イムノアッセイは、いかなる他の適切な試薬を用いて実施されてもよく、又は、他の物の決定と組み合わされてもよい。例えば、アッセイは、本明細書において記載される核酸の存在若しくは量の検出又は酵素的試験方法と組み合わせることができる。さらに、サンプル中の、本明細書において上で記載された参照遺伝子のレベルが決定されてもよい。参照遺伝子の発現に対する試験は、ＰＤＥ４Ｄ７の決定に使用される同じサンプルを用いて実施され得る。試験が同じサンプルで実施される場合、単一検出又は並行若しくは多重検出の方法が実施され得る。好ましくは、並行又は多重検出のために、相違してラベルされる第一又は第二の抗体が使用され得る。
【０１７３】
又は、参照遺伝子の発現に対する試験は、異なるサンプルでも実施され得る。好ましくは、本明細書において上で記載のコントロールサンプルである。好ましくは、かかるコントロールサンプルは、試験サンプルと同じ個人からのコントロールサンプル、又は、異なる供給源或いは個人からのコントロールサンプルであり得る。コントロールサンプルはさらに、同じ組織、好ましくは前立腺組織又は異なる組織タイプからのものであってもよい。好ましい他の組織タイプの例は、間質前立腺組織、膀胱上皮組織及び尿道上皮組織が挙げられる。さらに、参照遺伝子の発現のための試験サンプルの試験及びＰＤＥ４Ｄ７の発現のためのコントロールサンプルの試験は組み合わせることができる。
【０１７４】
さらなる実施態様で、上記コントロールサンプルはまた、参照遺伝子の発現について試験され得る。一以上のサンプルが参照遺伝子の発現について試験される場合、得られる発現結果は、当業者に知られたいかなる適切な統計方法によっても比較及び／又は平均化又は基準化され得る。
【０１７５】
本明細書において使用される場合、用語「ステップ（ａ）でのＰＤＥ４Ｄ７の発現と、ステップ（ｂ）でのＰＤＥ３Ｄ７の発現及び／又は参照遺伝子の発現との差」とは、ＰＤＥ４Ｄ７についての試験サンプル中の発現とＰＤＥ４Ｄ７についてのコントロールサンプル中の発現が比較されることを意味し、例えば、適切な基準化参照に対して基準化された後で比較される。この比較の結果により、試験サンプルは、コントロールサンプルと同じ程度の発現、コントロールサンプルと比較して増加した発現、又はコントロールサンプルと比較して減少した発現を与えるものとして示される。この用語はまた、これに代えて又は加えて、ＰＤＥ４Ｄ７についての試験サンプル中の発現と参照遺伝子についての同じ試験サンプル中の発現が比較されることも意味し、例えば、基準化参照としてのさらなる遺伝子に対して基準化された後で比較される。その比較の結果により、試験サンプルは、参照遺伝子と同じ程度の発現、又は発現の差を与えるものとして示される。この差は、参照遺伝子と比較して増加した発現か、又は、参照遺伝子と比較して減少した発現のいずれかであり得る。
【０１７６】
本明細書において使用される場合、用語「前立腺癌治療に対して個人又は個人のコホート（同齢集団）を層別化する」とは、ある個人が類似の個人のグループに属するとして同定されることを意味し、その最適な治療形態が前立腺癌治療であり、好ましくは、上記の発現試験の結果によるホルモン抵抗性前立腺癌に対する治療であり、特に、異なるサンプルにおけるＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルと参照遺伝子又はＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルとの差によるものである。発現の差の決定により、個人は、ＰＤＥ４Ｄ７発現レベルが減少する場合には、その最適な治療形態が前立腺癌治療である類似の個人のグループに属するとして同定されてもよい。発現レベルは、試験サンプル中のＰＤＥ４Ｄ７遺伝子発現が、例えばコントロールサンプル中のＰＤＥ４Ｄ７発現と比較して、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、又は５０％以上減少する場合に、又は、コントロールサンプル中のＰＤＥ４Ｄ７発現と比較して、少なくとも０．１倍、少なくとも０．２倍、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍又は少なくとも１０倍以上減少する場合に、又は、ＰＤＥ４Ｄ７遺伝子の発現が、コントロールサンプル中の参照遺伝子の発現と比較して、例えば、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％又は５０％以上減少する場合に、又は、参照遺伝子の発現と比較して、少なくとも０．１倍、少なくとも０．２倍、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍以上減少する場合に、「減少する」と考えられる。特定の実施態様において、参照遺伝子の発現は、例えばハウスキーピング遺伝子等の追加の遺伝子又はマーカーの発現に基準化又は調整されてもよい。
【０１７７】
本明細書において上で記載されたように前立腺癌治療を受けるべきと考えられた個人、又は前立腺癌治療に対して層別化された個人は、当業者に知られたいかなる適切な治療的前立腺癌処置を受けてもよい。通常、ＤＰＥ４Ｄ７発現の減少により、前立腺癌治療を受けるべきと考えられた個人、又は該当する処置グループに層別化された個人は、ホルモン抵抗性前立腺癌に罹っていると考えられるか、又は、将来ホルモン抵抗性前立腺癌にかかる傾向があるものと考えられる。例えば、次の１から２４ヶ月という将来である。従って、同定された又は層別化された個人は、本発明による医薬組成物で処置され得る。例えば、本明細書において以下に記載される医薬組成物である。さらなる実施態様では、対応する同定された個人は、追加の癌治療と組み合わせて本発明による医薬組成物で処置され得る。用語「追加の癌治療」とは、当業者に知られたいかなるタイプの癌治療も意味する。好ましくは、ホルモン抵抗性前立腺癌に対して知られる癌治療の形態である。この用語はまた、例えば、いかなる適切な化学療法、放射線治療、外科手術、抗体治療などの形態も含む。
【０１７８】
又は、対応する同定されたか又は層別化された個人は、化学療法、放射線治療、外科手術、抗体治療などの一以上の癌治療のみで処置され得る。好ましくは、通常前立腺癌に対して、より好ましくはホルモン抵抗性前立腺癌に対して用いられる癌治療である。
【０１７９】
本発明のさらなる実施態様で、本明細書において上で記載される治療を受けるべきかを決定する分類方法又は層別化するためのイムノアッセイはまた、個人の処置をモニターするために使用され得る。例えば、ホルモン抵抗性前立腺癌に罹っているとして分類される個人についてである。上記モニタリングプロセスは、長期間にわたる発現決定として実施され得る。例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０週、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ヶ月、又は、１、２、３年又はそれ以上の期間、処置セッション中又はその後で実施され得る。決定ステップは、適切な間隔で実施され得る。例えば、毎週、２週間毎、３週間毎、毎月、２ヶ月毎、３ヶ月毎、６ヶ月毎、１２ヶ月毎などである。さらなる本発明の実施態様では、本明細書において上で記載されるいかなる治療計画も調節され得る。例えば、モニタリングプロセスの結果に応じて、いかなる適切な方法でも強化若しくは減衰又は変更され得る。
【０１８０】
ＰＤＥ４Ｄ７の発現に対する試験は、本明細書において上で記載のステップに従って実施され得る。好ましくは、試験は、ＰＤＥ４Ｄ７のタンパク質レベルの測定として実施されてもよく、より好ましくは、そのような測定に対する本明細書において上で記載された選択肢に従って実施されてもよい。コントロール又はコントロールサンプルとして、本明細書において上で記載されたコントロールを使用できる。特に好ましい実施態様では、試験ステップは、ＰＤＥ４Ｄ７に特異的に結合する抗体の使用に基づいてもよく、例えば、ＮＢ３００−６５２又はＧＴＸ１４６２９などの市販の抗ＰＤＥ４Ｄ７抗体の使用に基づいてもよい。上記イムノアッセイで癌が診断若しくは予見されてもよく、又は、癌の進展が診断若しくは予見されてもよい。或いは、癌マーカーとしてのＰＤＥ４Ｄ７に関連して本明細書において上で提供された対応する定義によるイムノアッセイで、個人が前立腺癌の治療を受けるべきと同定されてもよく、又は、個人若しくは個人の同齢集団が層別化されてもよい。従って、上記ＰＤＥ４Ｄ７の発現の試験又は決定が遂行され得る、或いは、核酸若しくはタンパク質レベルの測定により、又は、ＰＤＥ４Ｄ７の生物活性の決定によりさらに遂行され得る。類似の測定は、参照遺伝子に関して実施されてもよい。
【０１８１】
特に本発明の好ましい実施態様において、参照遺伝子はハウスキーピング遺伝子又は異なるホスホジエステラーゼである。ヒトにおいて、「ハウスキーピング遺伝子」の例には、とりわけβアクチン、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）及びリボソームタンパク質Ｐ１が挙げられる。これらの遺伝子のほか、いかなる他の適切な遺伝子もハウスキーピング遺伝子として使用され得る。ただし、この遺伝子が、安定した非変更レベルでの発現又は転写を示す限りであり、特に癌発生の異なる段階においてであり、より好ましくは前立腺癌発生の異なる段階においてであり、より好ましくはホルモン感受性前立腺癌からホルモン抵抗性前立腺癌への変化の段階の際に、である。特に好ましくは、ＧＡＰＤＨの遺伝子、転写物又は発現産物又はタンパク質である。さらに特に好ましくは、ＰＢＧＤの遺伝子、転写物又は発現産物又はタンパク質である。ハウスキーピング遺伝子の発現データは、同じ個人の一つ以上のサンプルから、又は、さらなる個人、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、１０００、５０００、１００００又はそれ以上の個人から得られてもよい。発現データはまた、当業者に利用可能なデータベースから又はデータ収集物から得られてもよい。
【０１８２】
本明細書において使用される場合、用語「異なるホスホジエステラーゼ」とは、ＰＤＥ４Ｄ７ではない他のホスホジエステラーゼを意味する。かかるホスホジエステラーゼで参照遺伝子として適するものは、選択された生物体において、安定して発現され且つ持続的に検出可能な遺伝子産物、発現産物、タンパク質又はタンパク質変異体を提供するべきである。特に好ましくは、ＰＤＥ４Ｄファミリのホスホジエステラーゼであり、例えば、ＰＤＥ４Ｄ１、ＰＤＥ４Ｄ２、ＰＤＥ４Ｄ３、ＰＤＥ４Ｄ４、ＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ６、ＰＤＥ４Ｄ８及びＰＤＥ４Ｄ９が挙げられる。より好ましくは、ＰＤＥ４Ｄ５ホスホジエステラーゼである。
【０１８３】
従って、ＧＡＰＤＨ、ＰＢＧＤ及び特にＰＤＥ４Ｄ５との基準化及び／又は比較が、上記のカットオフ値に基づく診断方法及びイムノアッセイ、個人の区別又は層別化のための同定方法又はイムノアッセイに対して好ましく使用され得る。対応する決定ステップは、別々の反応で実施されてもよく、又は、特に好ましくは、多重反応で実施されてよい。多重検出の遂行のために、プライマー及び／又はプローブオリゴヌクレオチドの濃度は変更され得る。さらに、バッファ、イオンなどのさらなる成分の濃度及び存在を変更してもよい。例えば、製造者の指示よりも増加又は減少させてもよい。本発明のさらなる実施態様では、本明細書において上で記載のＰＤＥ４Ｄ７の発現に基づく前立腺癌治療を受けるべきとされる個人を同定する方法は、さらに、ひとつ以上の類似の同定方法であって、ひとつ以上の異なるバイオマーカーの発現に基づく同定方法と組み合わせてもよい。好ましくは、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のレベルの決定である。従って、ＰＳＡのレベルが１０、２０、３０又は好ましくは５．０を超える場合、個人はホルモン抵抗性前立腺癌に罹っていると考えられるか、又は近い将来（即ち、次の１、２、３、４、５、６、１２ヶ月以内に）ホルモン抵抗性前立腺癌を発生させる恐れがあると考えられ得る。
【０１８４】
本発明の好ましい実施態様では、上記の診断、検出、モニタリング又は予見は、個人から得られるサンプルで実施されることになる。本明細書において使用される場合、用語「個人から得られるサンプル」とは、個人から、当業者に知られた適切な方法で得られるいかなる生物材料に関する。本発明に関連して使用されるサンプルは、好ましくは、医学的に許容される方法で、より好ましくは核酸（特にＲＮＡ）又はタンパク質が保存されるような方法で集められるべきある。
【０１８５】
生物サンプルには、身体組織及び液体（例えば、血液、汗、痰や唾液、精液および尿だけでなく、糞便又は糞便サンプルなど）が挙げられ得る。さらに、生物サンプルには、上皮細胞、好ましくは癌性上皮細胞又は癌性であると疑われる組織から得られる上皮細胞からの細胞抽出物又は上記細胞を含む細胞集団が含まれ得る。さらにより好ましくは、生物サンプルは、腺組織からの細胞集団を含有してもよく、例えば、サンプルは、男性個人の前立腺から得られてもよい。さらに、細胞は必要な場合、得られた身体組織及び液体から精製されてもよく、その後、生物サンプルとして使用され得る。
【０１８６】
サンプルは、特に最初の処理の後は、プールしてよい。しかし、非プールのサンプルも使用可能である。
【０１８７】
本発明の具体的な実施態様において、生物サンプルの内容はまた、濃縮ステップに供することができる。例えば、サンプルは、特定の細胞タイプ（例えば、前立腺細胞）の細胞膜又はオルガネラに特異的なリガンドに接触させられ得る。これらのリガンドは、例えば、磁気粒子で機能化されている。磁気粒子で濃縮された材料はその後、本明細書において上で記載されたか又は以下に記載される検出及び分析ステップに対して使用され得る。
【０１８８】
本発明の具体的な実施態様では、生検又は切断サンプルが得られ得る及び／又は使用され得る。そのようなサンプルは、細胞又は細胞可溶化物を含んでもよい。
【０１８９】
さらに、細胞（例えば、腫瘍細胞）は、流体又は液体サンプル（例えば、血液、尿、汗など）をろ過することで濃縮され得る。かかるろ過プロセスはまた、本明細書において上で記載されたリガンド特異的相互作用に基づく濃縮ステップと組み合わせることができる。
【０１９０】
本発明の特に好ましい実施態様では、サンプルには、組織サンプル、尿サンプル、尿沈査サンプル、血液サンプル、唾液サンプル、精液サンプル、循環腫瘍細胞を含むサンプル又は前立腺分泌エキソソームを含むサンプルが挙げられ得る。
【０１９１】
さらに他の側面で本発明は医薬組成物に関し、当該医薬組成物は、次の成分：
（ａ）ＰＤＥ４Ｄ７の活性を直接刺激するか又は変更する化合物、好ましくは、ＰＤＥ４Ｄ７酵素活性のアロステリックアゴニスト；
（ｂ）ＰＤＥ４Ｄ７の活性を間接的に刺激するか又は変更する化合物；
（ｃ）ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質又はその生物活性同等物；
（ｄ）ＰＤＥ４Ｄ７をコードし且つ発現する核酸；
（ｅ）ＰＤＥ４Ｄ７ｍｉＲＮＡに特異的なｍｉＲＮＡインヒビター；
（ｆ）脱メチル化剤；及び
（ｇ）ホスホジエステラーゼ変位因子、好ましくは、ペプチド、ペプチド様物、小分子、抗体又はアプタマー、
を含む群から選択される少なくとも１つの要素を含む医薬組成物である。
【０１９２】
本明細書において使用される場合、用語「ＰＤＥ４Ｄ７の活性を直接刺激するか又は変更する化合物」とは、ＰＤＥ４Ｄ７と直接相互作用することによって、ＰＤＥ４Ｄ７の活性を増加させてｃＡＭＰを分解することができる化合物に関する。かかる化合物は、ＰＤＥ４Ｄ７のいかなる直接相互作用体であってもよく、ＰＤＥ４Ｄ７の触媒作用に正の効果を与えるものである。かかる化合物は、好ましくは、ＰＤＥ４Ｄ７の触媒活性のアロステリックアゴニスト（例えば、ホモトロピックアロステリックモデュレータ）であってもよい。ＰＤＥ４Ｄ７の好ましいアロステリックアゴニストは、ｃＡＭＰ又はｃＡＭＰアナログである。本発明の範囲に含まれる他の直接刺激化合物には、イオン、好ましくは、生物学的に活性な一価及び二価のカチオン（例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋など）が挙げられる。
【０１９３】
本明細書において使用される場合、用語「ＰＤＥ４Ｄ７の活性を間接的に刺激するか又は変更する化合物」とは、ＰＤＥ４Ｄ７の直接相互作用剤と相互作用すること（「間接相互作用体」）によって、又は、ＰＤＥ４Ｄ７との相互作用を含まない間接的な作用経路を介して、ＰＤＥ４Ｄ７の活性を増加させてｃＡＭＰを分解することができる化合物に関する。かかる化合物は、ＰＤＥ４Ｄ７の相互作用体のいかなる直接相互作用体であってもよい。ＰＤＥ４Ｄ７の相互作用体の直接相互作用体による効果は、ＰＤＥ４Ｄ７の相互作用体自体がＰＤＥ４Ｄ７の活性に対して正の効果を有する場合には正となり、又は、ＰＤＥ４Ｄ７の相互作用体がＰＤＥ４Ｄ７の活性に対して負の効果を持つ場合には負となり得る。通常、正に作用する間接相互作用体は、直接相互作用体のアゴニスト効果を刺激してもよく、例えば、ｃＡＭＰ生成を増やすことによって、ＰＤＥ４Ｄ７により与えられないｃＡＭＰの分解プロセスを抑制することにより、ｃＡＭＰ又はその類似体などのアロステリックに作用する化合物の濃度の増加を促進してもよい。
【０１９４】
又は、かかる正に作用する間接的相互作用体は、直接結合タンパク質の結合様式の変更を促進し、ＰＤＥ４Ｄ７活性の増加を導く。通常、負に作用する間接的相互作用体は、ＰＤＥ４Ｄ７のインヒビターに対する抑制効果を持つことができる。かかる相互作用体の例は、ＰＤＥ４Ｄ７インヒビターを分解する酵素的活性、又は、ＰＤＥ４Ｄ７インヒビターに結合してクエンチすることもできるタンパク質である。又は、かかる相互作用体は、ＰＥ４Ｄ７の分解を導く活性を抑制することができる。例えば、プロテナーゼインヒビターである。さらなる例及びその実施は、当業者に知られているものである。
【０１９５】
又は、ＰＤＥ４Ｄ７活性の間接的刺激は、内因性ＰＤＥ４Ｄ７遺伝子の発現を活性化、保護又は維持する化合物により伝達され得る。かかる化合物の例には、ＰＤＥ４Ｄ７特異的転写因子、ＰＤＥ４Ｄ７特異的ｍＲＮＡ安定化活性又はＰＤＥ４Ｄ７スプライス因子が挙げられる。さらなる例及びその実施は、当業者に知られている。
【０１９６】
医薬組成物に含まれる「ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質」は、本明細書において上で記載のＰＤＥ４Ｄ７タンパク質であり得る。特に、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライスバリアント７によりコードされるタンパク質であってもよく、より好ましくは、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ：ＡＦ５３６９７６（ｖｅｒｓｉｏｎ  ＡＦ５３６９７６．１、ＧＩ：２２９０１８８３  ａｓ  ｏｆ  ３  Ｍａｒｃｈ  ２００９）において定められたアミノ酸配列を有してもよく、さらにより好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有してもよい。これに関して使用される場合、「ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質」にはまた、アミノ酸配列であり、配列番号２に記載の配列と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列、及び、配列番号１に記載の配列と、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列が含まれる。ＰＤＥ４Ｄ７の相同変異体、特に上記の変異体は、好ましくは、ＰＤＥ４Ｄ７の機能を持つ、即ちｃＡＭＰ分解機能である。本発明のさらなる実施態様では、ＰＤＥ４Ｄの相同変異体は、さらに又はこれに代えて、細胞内又は組織タイプ内でＰＤＥ４Ｄ７と類似又は同一の局在パターンを持つ。
【０１９７】
さらに好ましい実施態様では、ＰＤＥ４Ｄ７とＰＤＥ４Ｄ７の相同変異体の間の領域又は相同性は、このタンパク質のＣ末端領域に限局され得る。例えば、相同変異体は、ＰＤＥ４Ｄ７に存在するＮ末端領域を含むことができ、さらに、本明細書において上で示すＰＤＥ４Ｄ７に対する相同性の程度を有するタンパク質の残りの部分を含むことができる。相同変異体のＮ末端部分は、ＰＤＥ４Ｄ７からの、１から１２０、１から１１０、１から１００、１から９０、１から８０、１から７０、１から６０、１から５０、１から４０、１から３０、１から２０又は１から１０のアミノ酸を含むことができる。
【０１９８】
本明細書において使用される場合、用語「ＰＤＥ４Ｄ７の生物活性同等物」とは、ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質であって、ＰＤＥ４Ｄ７の全ての又は大部分の機能を実行することができるタンパク質を意味する。好ましくは、これは、ｃＡＭＰを分解することができるタンパク質に関連する。本発明のさらなる実施態様では、ＰＤＥ４Ｄ７の生物活性同等物は、さらに又はこれに代えて、細胞内又は組織タイプ内のＰＤＥ４Ｄ７と類似又は同一の局在パターンを持つことができる。ＰＤＥ４Ｄ７の生物活性同等物はまた、本明細書において上で規定されるＰＤＥ４Ｄ７変異体を含んでもよい。
【０１９９】
本発明によるＰＤＥ４Ｄ７又はＰＤＥ４Ｄ７の生物活性同等物は、当業者に知られたいかなる適切な方法によっても組み換え的に製造され得る。本発明は、従ってまた、ＰＤＥ４Ｄ７を製造する方法又はＰＤＥ４Ｄ７の生物活性同等物を製造する方法を含むものである。
【０２００】
従って本発明は、本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７又はＰＤＥ４Ｄ７の生物活性同等物をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、及び、組み換え技術によるＰＤＥ４Ｄ７又はＰＤＥ４Ｄ７の生物活性同等物の生成を熟考する。
【０２０１】
適切なベクターには、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス又はレトロウイルスベクターが挙げられ得る。レトロウイルスベクターは、複製可能又は複製欠損であってもよい。複製欠損の場合、ウイルス増幅は一般には、補完宿主細胞内でのみ生じる。ＰＤＥ４Ｄ７又はＰＤＥ４Ｄ７の生物活性同等物をコードするポリヌクレオチドは、宿主に伝播させるために選択的マーカーを含むベクター又はキャリアに結合され得る。対応するポリヌクレオチド挿入断片は、操作的に、適切なプロモーターへ結合され得る。例えば、ファージラムダＰＬプロモーター、Ｅ．Ｃｏｌｉのｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ及びｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター及びレトロウイルスＬＴＲのプロモーター又はＰＳＡプロモーターが挙げられる。他の適切なプロモーターは当業者に知られている。発現構築物はさらに、転写開始、停止の部位及び翻訳領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位を含むことができる。構築物による発現される転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳開始コドンを最初の位置に持ち、かつ翻訳されることになるポリペプチドの末端に適切に位置する終始コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）を含む。
【０２０２】
ポリペプチド又はタンパク質は、グリコシル化若しくは非グリコシル化されてもよく、又さもなければ、修飾され得る。さらに、ポリペプチド又はタンパク質はまた、一部の場合宿主介在プロセスの結果として、最初に修飾されるメチオニン残基を含んでいてよい。さらに、ポリペプチド、タンパク質又はペプチドは、アセチル化、ペグ（ＰＥＧ）化、ヘス（ＨＥＳ）化、ホルミル化、リン酸化、アミド化、知られる保護／ブロック基による誘導体化、特異的化学的切断、タンパク質切断、細胞性リガンド若しくは他のタンパク質に対する結合、又は、ハプ（ＨＡＰ）化（即ち、グリシンリッチのホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）を用いた融合）などで修飾され得る。かかる修飾は、当業者に知られる適切な技術で実施され得る。さらに、ポリペプチド、ペプチド又は変異体は、ひとつ以上の非古典的アミノ酸を含むことができる。
【０２０３】
さらに、本発明のＰＤＥ４Ｄ７又はＰＤＥ４Ｄ７の生物活性同等物は、当技術分野で知られる技術を用いて科学的に合成できる。例えばペプチド合成装置を使用することによって合成できる。
【０２０４】
本明細書において上で定められた医薬組成物に含まれる「ＰＤＥ４Ｄ７をコードし発現する核酸」とは、いかなる適切なキャリア成分も意味し、例えば、本明細書において上で記載されたように、発現可能なＰＤＥ４Ｄ７遺伝子を含む。好ましくは、かかるキャリア成分は、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ：ＡＦ５３６９７６（ｖｅｒｓｉｏｎ  ＡＦ５３６９７６．１、  ＧＩ：２２９０１８８３  ａｓ  ｏｆ  ３  Ｍａｒｃｈ  ２００９）で定められる配列を含んでもよく、より好ましくは、配列番号１に記載されるヌクレオチド配列を含んでもよい。かかるキャリア成分はまた、ＰＤＥ４Ｄ７に対する高度の相同性を持つヌクレオチド配列であって、例えば、配列番号１に記載の配列と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を持つ核酸配列、又は、配列番号２で記載される配列と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を持つアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むことができる。又は、上記キャリアは、ＰＤＥ４Ｄのゲノム配列を含んでもよく、好ましくは、配列番号６に相当するＥＮＳＥＭＢＬデータベースエントリー番号ＥＮＳＧ０００００１１３４４８（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ＥＮＳＧ０００００１１３４４８．８、Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｒｅｌｅａｓｅ５３−Ｍａｒｃｈ  ２００９）で定められる配列、又は、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ０３４２３４（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ＡＣ０３４２３４．４、ＧＩ：１８３９０１８２  ａｓ  ｏｆ  ２４  Ｍａｒｃｈ  ２００９）と組み合わせてＧｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ００８９３４（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ＡＣ００８９３４．５、ＧＩ：１７３８６２３５  ａｓ  ｏｆ  ２４  Ｍａｒｃｈ  ２００９）から得られる配列、又は、Ｗａｎｇらの２００３、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ、１５（９）：８８３−９１から得られる配列を含んでもよい。より好ましくは、上記キャリアは、配列番号６に記載されるＰＤＥ４Ｄのゲノム配列を含むことができる。
【０２０５】
さらに、本明細書において上で定めるＰＤＥ４Ｄ７の生物活性同等物は、本発明のキャリアに含まれ得る。
【０２０６】
ＰＤＥ４Ｄ７をコードするポリヌクレオチドは好ましくは、ヒト細胞に伝播させるための選択的マーカーを含むベクターに結合され得る。好ましい実施態様では、ポリヌクレオチド挿入断片はＰＳＡプロモーターに操作的に結合され得る。
【０２０７】
本発明の一実施態様において、本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７をコードし発現する核酸は、生きた治療物を介して提供され得る。本明細書において使用される場合、用語「生きた治療物」とは、本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７又はＰＤＥ４Ｄ７の生物活性同等物が、いかなる適切な生きたキャリアにおいても発現されることを意味する。従って、本発明は、対応するポリヌクレオチドであって、生細胞において発現するのに適するものである。本発明はまた、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター、適切な宿主及びその宿主細胞における組換え技術によるポリヌクレオチドの生成に関する。
【０２０８】
用語「生きたキャリア」とは、当業者に知られるいかなる適切な生きた宿主細胞又はウイルスに関する。適切な宿主の代表例には、限定されるものではないが、大腸菌又は乳酸菌等の細菌細胞、酵母細胞等の真菌細胞、原生動物、昆虫細胞又は動物細胞が挙げられる。好ましくは、この用語は、弱毒化細菌、弱毒化真菌細胞又は弱毒化原生動物に関する。適切なウイルスの代表例には、アデノウイルス、レトロウイルス又はレンチウイルスを含む群のウイルス、好ましくは、アデノウイルス、レトロウイルス又はレンチウイルスを含む群の弱毒化ウイルスが挙げられる。好ましい実施態様では、生菌の細菌細胞、特に生菌の大腸菌や乳酸菌細胞が使用され得る。より好ましくは、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９７３の細胞や、さらにより好ましくは、ラクトバチルスカゼイ又はラクトバチルスゼアエ３９３の細胞が使用され得る。
【０２０９】
本明細書において上で定められた医薬組成物に含まれる「ＰＤＥ４Ｄ７ｍｉＲＮＡに特異的なｍｉＲＮＡインヒビター」とは、ＰＤＥ４Ｄ７ｍｉＲＮＡ又はミクロＲＮＡ分子に相補的な核酸配列をコードする核酸分子を意味する。本明細書において使用される場合、用語「相補的」とは、ｍｉＲＮＡインヒビター核酸（センス分子）およびｍｉＲＮＡ（アンチセンス分子）間のいかなるミスマッチなしの完全な相補性を意味し、また同様に、ｍｉＲＮＡ分子と比較して核酸がいくつかの塩基のミスマッチを含む及び／又はさらなる若しくは欠失するヌクレオチドを含む状況なしの完全な相補性も意味する。他の実施態様では、２つの分子は、１つ又は複数の塩基のミスマッチを含むか、又は、（追加又は欠失により）ヌクレオチドの総数が異なる。さらなる実施態様では、「相補的」なｍｉＲＮＡインヒビター核酸分子は、少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、これが、ｍｉＲＮＡ分子に含まれる配列と完全な相補性を示すものである。
【０２１０】
通常、ｍｉＲＮＡインヒビター核酸分子は、天然起源のＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子、又は、合成核酸分子であって、その配列中にひとつ以上の修飾ヌクレオチドを含み、これらが同一タイプか又はひとつ以上の異なるタイプのものである分子である。
【０２１１】
例えば、かかるｍｉＲＮＡインヒビター核酸分子が、少なくとも一つのリボヌクレオチドバックボーンユニットと少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチドバックボーンとを含むということが本発明によって構想される。さらに、ｍｉＲＮＡインヒビター核酸分子は、ひとつ以上の上記ＲＮＡバックボーンの２’−Ｏ−メチル基又は２’−Ｏ−メトキシエチル基（これはまた２’−Ｏ−メチル化と参照される）への修飾を含み、これにより、培地でのヌクレアーゼ分解を防止し、重要なことにまた、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体ヌクレアーゼによるヌクレオチド鎖切断を防止し、ｍｉＲＮＡの不可逆的抑制をもたらす。他の可能な修飾は、２’−Ｏ−メチル化と機能的に同等なもので、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含むものであり、該核酸は、本明細書において上で記載されるように、ひとつ以上のＬＮＡヌクレオチドモノマーを含む核酸類似体を表す。
【０２１２】
本発明に関連して使用されることになるｍｉＲＮＡ発現の他のサイレンサーのクラスには、化学的に操作されたオリゴヌクレオチドで「アンタゴｍｉｒ（ａｎｔａｇｏｍｉｒｓ）」と言われるものを含み、これは、コレステロールへ共役した単鎖ＲＮＡ分子を表す。この分子は、１９から２５のヌクレオチドを含んでもよい。好ましくは、この分子は、２０、２１、２２、２３又は２４のヌクレオチドを含む。より好ましくは、この分子は、２３のヌクレオチド（さらなる詳細はＫｒｕｔｚｆｅｌｄｔら、２００５、Ｎａｔｕｒｅ、４３８：６８５−６８９を参照すること。）を含む。
【０２１３】
本発明の他の実施態様では、本明細書において上で定められたｍｉＲＮＡインヒビターは、組織又は細胞へ導入されることになる発現ベクターの形で提供され得る。又は、かかるベクターはまた、本明細書において上記の生きた治療物中に導入され得る。
【０２１４】
通常、ＲＮＡは、トランスフェクション又は一過性発現のベクター又はキャリアの形で与えられる導入遺伝子から生成され得る。例えば、競合的ｍｉＲＮＡインヒビターは、ひとつ以上の、好ましくは、複数の、関心あるミクロＲＮＡに対するタンデム結合部位を含む強力なプロモーターから発現される転写物として与えられ得る。Ｅｂｅｒｔらの、２００７、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、４：７２１−７２６に記載される「ミクロＲＮＡスポンジ」は、この技術の例示的な非限定的一例である。
【０２１５】
本明細書において上で定められた医薬組成物に含まれる「脱メチル化剤」は、クロマチン構造を脱メチル化することができる薬剤を意味し、好ましくはプロモーター領域、より好ましくはＰＤＥ４Ｄ７プロモーターである。本発明に関連して使用されることになる脱メチル化剤の例は、５−アザ−２’−デオキシシチジン及び５−アザシチジンである。これらは、ＤＮＡメチル化を含むクロマチン構造変化により不適切にサイレンスさせられた遺伝子を再活性化し、さらに、これらの変化を元に戻し、従って、主要な細胞経路を回復させることができるものである。これにより通常、遺伝子を再発現させ且つ形質転換された状態の一部の側面を元に戻すこととなる。５−アザ−２’−デオキシシチジン及び５−アザシチジンは、通常、ＤＮＡシトシンＣ５−メチルトランスフェラーゼを、ＤＮＡ中の５−アザ−２’−デオキシシチジン残基と酵素間で安定な複合体を形成することにより、その結果、メチルトランスフェラーゼ酵素へ結合される際に安定な遷移状態の中間体を真似ることにより、不活性化させることとなる。
【０２１６】
本発明による医薬組成物に含まれ得るさらなる薬剤は、それ自体又は５−アザ−２’−デオキシシチジン及び／又は５−アザシチジンと組み合わせられる、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）である。
【０２１７】
本明細書において上で定められた医薬組成物に含まれる「ホスホジエステラーゼ変位因子」とは、ホスホジエステラーゼ、特にＰＤＥ４Ｄ７の、相互作用相手又は相互作用体との相互作用を妨害又は中断させることができる化合物を意味する。かかるプロセスは、最終的には、ＰＤＥ、特にＰＤＥ４Ｄ７の、以前とは異なる相互作用相手との関連性を導く、結果として、ＰＤＥの再分布を導くこととなる。かかる新たな相互作用相手は、ＰＤＥ、特にＰＤＥ４Ｄ７を隔離し得るものであり、従って細胞挙動を変更するものである。例えば、レセプター結合又は他の下流の活性に対する影響を強める。かかる変位反応に関与し、及び／又は、ＰＤＥ、特にＰＤＥ４Ｄ７を隔離可能なタンパク質の相手の例には、ＡＫＡＰなどのアンカータンパク質、ＤＩＳＣ１、β−アレスチン又はＲＡＣＫ１などの足場タンパク質、ＸＡＰ２／ＡＩＰ／ＡＲＡ９などの制御タンパク質、ＰＫＡ−Ｒサブユニット又はＥＰＡＣなどのｃＡＭＰ結合タンパク質、又は、β１−アドレノセプタなどのレセプターが、ＥＲＫなどの酵素と同様に挙げられる。
【０２１８】
好ましいホスホジエステラーゼ変位因子はペプチド、ペプチド模倣体、小分子、抗体及びアプタマーである。ホスホジエステラーゼ変位因子に関連して「ペプチド」とは、ホスホジエステラーゼ、特にＰＤＥ４Ｄ７において存在するか該分子を表す一連のアミノ酸を意味する。又は、本明細書において上で定める相互作用又は隔離するペプチドを意味する。該ペプチドに含まれる一連のアミノ酸の長さは、５から１００のアミノ酸、好ましくは１０から５０のアミノ酸、より好ましくは２０から３０のアミノ酸であり得る。その長さは、ＰＤＥ又は相互作用体タンパク質又はその一部分と完全に同じ長さであってよく、又は、配列変動を有していてもよい。例えば、ペプチド配列は、修飾されたアミノ酸残基を全位置に対して２５％まで含むことができる。好ましくは、かかる修飾は、該分子の結合特性や構造特性を変化させないものである。ペプチドに存在するアミノ酸配列はまた、ＰＤＥ又は相互作用体タンパク質の空間領域を表してもよく、従って、分子の一次配列において隣接しないアミノ酸配列の並立を含むこととなる。
【０２１９】
ホスホジエステラーゼ変位因子に関連して「ペプチド模倣体」とは、ペプチドを真似るように設計された短いタンパク質様の鎖を意味する。かかるペプチド模倣体は、分子の特性を変えるために、既存のペプチド、例えば本明細書において上で記載したペプチドを修飾することから得られ得るものである。ペプチド模倣体は、分子の安定性又は結合能力を変化させる修飾により得られ得る。これらの修飾は、通常、天然では生じないペプチドへの変化を含む。例えば、本発明によるペプチド模倣体は、ペプチドバックボーンを変更していてもよく、又は、非天然のアミノ酸を含み得る。好ましくは、本発明によるペプチド模倣体は、本明細書において上で定められたホスホジエステラーゼ分子、特にＰＤＥ４Ｄ７、又は、相互作用タンパク質若しくは隔離タンパク質を表してもよい。
【０２２０】
本発明の一つの実施態様では、ペプチド模倣体は、ＰＤＥ、特にＰＤＥ４Ｄ７とその相互作用体との相互作用をブロックし得る。本発明の他の実施態様では、ペプチド模倣体は、ＰＤＥ、特にＰＤＥ４Ｄ７とその相互作用体との相互作用を強化し得る。
【０２２１】
ペプチド模倣体の調製方法及び技術、同様に、ペプチド模倣体の試験に対するアッセイは当業者に知られている。
【０２２２】
ホスホジエステラーゼ変位因子に関連して「小分子」とは、小さい有機化合物を意味し、好ましくは生物活性即ち生分子であるが、好ましくはポリマーではない化合物を意味する。かかる有機化合物は、いかなる適切な形態又は化学的性質を含んでもよい。この化合物は、二次代謝物などの天然化合物又は人工化合物であってもよく、新たに設計及び製造されたものであってもよい。本発明の一実施態様において、小分子は、ＰＤＥ、特にＰＤＥ４Ｄ７とその相互作用体との相互作用をブロックすることができる。本発明の他の実施態様では、小分子は、ＰＤＥ、特にＰＤＥ４Ｄ７とその相互作用体との相互作用を強化することができる。小分子の同定及び調製に対する方法及び技術、同様に、小分子の試験に対するアッセイは当業者に知られている。
【０２２３】
ホスホジエステラーゼ変位因子に関連して「抗体」又は「アプタマー」とは、本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７特異的抗体又は抗体変異体又は断片を意味し、又は、本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７特異的アプタマーを意味し、ＰＤＥ、特にＰＤＥ４Ｄ７とひとつ以上のその相互作用体との相互作用を妨害するか又は中断させることができるものを意味する。又は、この用語はまた、本明細書において上で記載されたひとつ以上のＰＤＥ４Ｄ７の相互作用体と結合する抗体又はアプタマーを意味してもよく、同様に、ＰＤＥ、特にＰＤＥ４Ｄ７とひとつ以上の相互作用体との相互作用を妨害するか又は中断させることができるものを意味してもよい。抗体又はアプタマーの製造又は試験に対する方法は、本明細書において上で記載され、及び／又は、当業者に知られている。
【０２２４】
本発明の一実施態様において、医薬組成物はさらに、追加の化合物を含むことができ、癌細胞に対して活性であり、例えば、当業者に知られる細胞毒性化合物又は他の化学療法又は放射線療法化合物が挙げられる。
【０２２５】
さらなる実施態様において、本発明は、本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７発現産物又はタンパク質に特異的なアプタマー、ＰＤＥ４Ｄ７の活性を直接刺激する又は調節する化合物、ＰＤＥ４Ｄ７酵素活性のアロステリックアゴニスト、ＰＤＥ４Ｄ７ｍｉＲＮＡに特異的なｍｉＲＮＡインヒビター、アンタゴｍｉｒ、ＰＤＥ４Ｄ７特異的脱メチル化剤、ＰＤＥ４Ｄ７特異的ホスホジエステラーゼ変位因子、ＰＤＥ４Ｄ７特異的ペプチド模倣体及びＰＤＥ４Ｄ７特異的小分子又は薬物の同定のためのスクリーニング手順及び方法も構想する。かかるスクリーニング手順は次のステップ：
（ａ）ＰＤＥ４Ｄ７を、分泌タンパク質若しくは細胞膜上のタンパク質、又は、細胞内成分としてのポリペプチドとして発現する細胞を製造するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）で製造したポリペプチドを、相互作用分子、例えばＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的なアプタマー、ＰＤＥ４Ｄ７の活性を直接刺激する又は調節する化合物、ＰＤＥ４Ｄ７酵素活性のアロステリックアゴニスト、ＰＤＥ４Ｄ７特異的ホスホジエステラーゼ変位因子、ＰＤＥ４Ｄ７特異的ペプチド模倣体又はＰＤＥ４Ｄ７特異的小分子若しくは薬物をおそらく含有する試験サンプルに接触させるステップ；及び、
（ｃ）ＰＤＥ４Ｄ７の結合及び／又はＰＤＥ４Ｄ７の活性の抑制若しくは調節を観察することで相互作用分子を同定するステップ；
を含み得る。
【０２２６】
又は、かかるスクリーニング手順は、次のステップ：
（ａ）直接または間接的に相互作用する分子、例えば、ＰＤＥ４Ｄ７転写物に特異的なアプタマー、ＰＤＥ４Ｄ７ｍｉＲＮＡに特異的なｍｉＲＮＡインヒビター、アンタゴｍｉｒ、ＰＤＥ４Ｄ７特異的脱メチル化剤、ＰＤＥ４Ｄ７特異的ホスホジエステラーゼ変位因子、ＰＤＥ４Ｄ７特異的ペプチド模倣体又はＰＤＥ４Ｄ７特異的小分子若しくは薬物をおそらく含有する試験サンプルと、ＰＤＥ４Ｄ７を転写物として発現するひとつ以上の細胞とを接触させるステップ；
（ｂ）上記配列の発現レベルを検出するステップ；及び
（ｃ）ＰＤＥ４Ｄ７の結合又はＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルの調節若しくは減少を観察することで相互作用分子を同定するステップ；
を含み得る。
【０２２７】
本発明はまた、本明細書において上で記載されたスクリーニング手順又は方法で得られた又は得られ得る、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物又はタンパク質に特異的なアプタマー、ＰＤＥ４Ｄ７の活性を直接刺激する又は調節する化合物、ＰＤＥ４Ｄ７酵素活性のアロステリックアゴニスト、ＰＤＥ４Ｄ７ｍｉＲＮＡに特異的なｍｉＲＮＡインヒビター、アンタゴｍｉｒ、ＰＤＥ４Ｄ７特異的脱メチル化剤、ＰＤＥ４Ｄ７特異的ホスホジエステラーゼ変位因子、ＰＤＥ４Ｄ７特異的ペプチド模倣体及びＰＤＥ４Ｄ７特異的小分子若しくは薬物を含むものである。
【０２２８】
さらなる側面において本発明は、癌の治療又は予防、特に前立腺癌の治療、好ましくは、ホルモン抵抗性前立腺癌の治療のための、本明細書において上で定められた医薬組成物に関する。
【０２２９】
さらに他の側面において、本発明は、癌、特に前立腺癌の治療又は予防、好ましくはホルモン抵抗性前立腺癌の治療のための医薬組成物の調製のための、（ａ）ＰＤＥ４Ｄ７の活性を直接刺激する又は調節する化合物、好ましくは、ＰＤＥ４Ｄ７酵素活性のアロステリックアゴニスト；（ｂ）ＰＤＥ４Ｄ７の活性を間接的に刺激する又は調節する化合物；（ｃ）ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質又はその生物活性同等物；（ｄ）ＰＤＥ４Ｄ７をコードし発現する核酸；（ｅ）ＰＤＥ４Ｄ７ｍｉＲＮＡに特異的なｍｉＲＮＡインヒビター；（ｆ）脱メチル化剤及び／又は（ｇ）ホスホジエステラーゼ変位因子、好ましくはペプチド、ペプチド模倣体、小分子、抗体又はアプタマーの使用に関する。
【０２３０】
他の側面において本発明は、癌、特に前立腺癌の治療又は予防、好ましくはホルモン抵抗性前立腺癌の治療のための方法に関し、
（ａ）ＰＤＥ４Ｄ７の活性を直接刺激する又は調節する化合物、好ましくはＰＤＥ４Ｄ７酵素活性のアロステリックアゴニスト；（ｂ）ＰＤＥ４Ｄ７の活性を間接的に刺激する又は調節する化合物；（ｃ）ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質又はその生物活性同等物；（ｄ）ＰＤＥ４Ｄ７をコードし発現する核酸；（ｅ）ＰＤＥ４Ｄ７ｍｉＲＮＡに特異的なｍｉＲＮＡインヒビター；（ｆ）脱メチル化剤及び／又は（ｇ）ホスホジエステラーゼ変位因子、好ましくはペプチド、ペプチド模倣体、小分子、抗体又はアプタマーを個人、特に癌を罹っているか又は癌にかかると予見される個人に投与するステップを含む。
【０２３１】
本発明による医薬組成物は、患者、対象又は個人に、当業者に知られる種々の送達系を利用して投与され得る。例えば、リポソームにおけるカプセル封入、ミクロ粒子、ミクロカプセル、化合物を発現可能な組み換え細胞、レセプター介在エンドサイトーシス、レトロウイルス又は他のベクターなどの一部分としての核酸の構築物を介して投与され得る。導入方法は、局所的、経腸的又は非経口的であり得る。また、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、吸入性、硬膜外及び経口経路を含んでもよい。組成物は、いかなる簡便な経路、例えば、注入又はボーラス注射により、上皮又は粘膜皮膚層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を介した吸収により、又は、吸入により投与されてもよく、さらに、他の生物活性剤とともに投与されてもよい。投与は、全身的又は局所的であってもよい。局所投与の好ましい方法は、直接注射である。
【０２３２】
他の実施態様において、関心のある部位へ直接注射針をガイドするために使用されるイメージング装置を利用して、医薬組成物を直接内臓、体腔などに送達することができる。医薬組成物はまた、外科的処置の際に疾患部位へ投与され得る。さらに他の実施態様では、医薬組成物は、制御された放出システムを用いて送達され得る。
【０２３３】
好ましくは、医薬組成物の剤形は、経口、局所的又は全身的投与に適したものである。好ましい実施態様では、医薬組成物は、局所的、経口的又は全身的に投与される。
【０２３４】
本発明の具体的な実施態様では、医薬組成物は、本明細書において上で記載された、個人を層別化するためのイムノアッセイ、又は、前立腺癌であると個人を同定する方法が実施された後、特に、ＰＤＥ４Ｄ７のレベルが減少したとして個人を分類した後で投与され得る。
【０２３５】
さらなる実施態様で、医薬組成物は、治療上有効な量の、本明細書において上で定められた本発明の医薬組成物の成分及び医薬的に許容される担体を含む。用語「医薬的に許容される」とは、動物、特にヒトにおいて使用するために、規制機関により承認されているか、又は、他の一般的に認識される薬局方により承認されることを意味する。用語「担体」とは、希釈剤、アジュバント、賦形剤又は溶剤を意味し、それらと共に治療薬は投与される。かかる担体は医薬的に許容される。即ち、投与される量及び濃度で被投与者に非毒性である。
【０２３６】
一般的に、成分は別々に供与されるか又は投与単位に一緒に混合されてもよい。例えば、活性物質の量を示すアンプルやサケットなどの密閉容器に入れた凍結乾燥させた乾燥粉末又は無水の濃縮物として供与又は混合される。
【０２３７】
本発明の医薬組成物は、中性の又は塩の形で処方され得る。
【０２３８】
好ましくは、医薬組成物は、直接投与され得るか、又は、当業者に知られるいかなる適切なアジュバントと組み合わせても投与され得る。本発明の組成物は、動物、好ましくは哺乳類に投与され得る。本明細書において使用される場合、「哺乳類」とは、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有するよう意図される。特に「哺乳類」にはヒトが含まれる。
【０２３９】
用語「投与される」とは、治療上有効な容量の上記組成物の投与を意味する。「治療上有効な量」とは、投与されて効果を生じる投与量を意味し、好ましくは、この効果は、ＰＤＥ４Ｄ７の誘導及び増加である。正確な投与量は治療の目的に依存し、既知の技術を用いて当業者により確認することが可能である。当技術分野で知られ且つ上記のように、全身的対局所的送達、年齢、体重、一般的な健康状態、性、食餌、投与の時間、薬物相互作用及び状態の重症度などに対する調節が必要とされ得る。また、当業者による定期的な実験により確認され得る。
【０２４０】
本発明による医薬組成物の活性成分又は化合物の濃度はさらに、意図される投与計画、意図される使用期間、組成物の全ての成分の正確な量及び比率、並びに、当業者に知られたその他の因子及びパラメータなどに合わせて調節され得る。
【０２４１】
本発明による活性物質又は化合物は、そのままで投与され得るか、又は、他の処置と組み合わせて投与され得る。好ましい実施態様では、本発明の医薬組成物は、抗ホルモン処置、例えば、抗アンドロゲン処置と組み合わせて投与され得る。
【０２４２】
本発明の医薬組成物はまた、当業者に知られたいかなる適切な保存剤を含むことができる。
【０２４３】
さらに、本発明による調製はまた、作用を補う又は強化するために抗酸化剤、フリーラジカル消去剤、抗紅斑性剤、抗炎症剤又は抗アレルギー性剤を有する化合物を含むことができる。
【０２４４】
本発明の他の好ましい実施態様では、本明細書において上で定められた医薬組成物の活性成分は、適切なキャリアタンパク質に融合させることができる。例えば、ＩｇＦｃレセプタータンパク質又はポリマー性Ｉｇレセプターに融合させることができる。好ましくは、本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７又はその生物活性同等物は、融合タンパク質として提供され得る。融合相手はＮ−又はＣ−末端で提供され得る。
【０２４５】
本発明による医薬組成物が、本明細書において上で定められた生細胞又は生きた治療物の形で投与されることになる場合に、形質転換され調製された細胞が、当業者に知られるいかなる適切な形でも患者に投与され得る。好ましくは、生きた治療物が、微生物を含む組成物の形で投与され得る。例えば、上記の乳酸菌が１０２から１０１２細胞、好ましくは１０３から１０８細胞の量で投与され得る。
【０２４６】
本発明のさらなる好ましい実施態様では、医薬組成物又は薬物中の２以上の成分の比率は、当業者の知識により適切に調節され得る。
【０２４７】
適切なアッセイが場合により、本発明の医薬組成物の成分に対する最適な比率及び／又は投与量の範囲を明らかにするために適用され得る。処方に適用されるべき、本明細書において上で定められた医薬組成物の成分間の正確な投与量とそれらの比率は、とりわけ、投与の経路及び疾患又は障害の正確なタイプに依存し、さらに、医者の判断及びそれぞれの患者の条件により決定されるべきである。有効な投与量又は成分比率は、インビトロ又は（動物）モデルの試験系から得られる用量反応曲線から推定されてもよい。
【０２４８】
典型的な投与量は、例えば、０．００１から１０００μｇの範囲であり得る。しかしこの例証的な範囲よりも下又は上の投与量も構想され、特に上記の因子を考慮して構想される。
【０２４９】
他の側面で本発明は、癌、特に前立腺癌の治療又は予防のための医療キットに関し、次の要素：（ａ）ＰＤＥ４Ｄ７の活性を直接刺激する又は調節する化合物、好ましくはＰＤＥ４Ｄ７酵素活性のアロステリックアゴニスト；（ｂ）ＰＤＥ４Ｄ７の活性を間接的に刺激する又は調節する化合物；（ｃ）ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質又はその生物活性同等物；（ｄ）ＰＤＥ４Ｄ７をコードし発現する核酸；（ｅ）ＰＤＥ４Ｄ７ｍｉＲＮＡに特異的なｍｉＲＮＡインヒビター；（ｆ）脱メチル化剤、及び（ｇ）ホスホジエステラーゼ変位因子；を含む群から選択される少なくとも１つの要素を含む。
【０２５０】
医療キットは、本明細書において上で定められた医薬組成物の投与に関して使用され得るものである。特に、本発明によるキットは、癌、特に前立腺癌の治療又は予防のために使用され得る。
【０２５１】
医療キットの成分は、本発明によると、ひとつ以上の容器又は別の物質に含まれ得る。これらは好ましくは、医薬組成物又は薬物として処方されてもよく、より好ましくは、本発明の医薬組成物に関して本明細書において上で記載されたものとして処方されてもよい。例えば、これらは適切な医薬担体などを含むことができる。特に好ましくは、本発明の医薬組成物に関して本明細書において上で記載された局所的投与のための処方である。本発明による医療キットは場合によりまた、文書を含み、この文書には医療キット及びその成分の使用又は適用方法が指示されている。好ましくは、本発明の医療キットに含まれる指示書には、推奨される処置選択、投与計画などが含まれ得る。医療キットはまた、指示リーフレットを含み、及び／又は、使用、投与量などについての追加の情報を提供することができる。
【０２５２】
本発明の医療キットは、当業者に知られたいかなる適切な投与計画によっても患者に投与され得る。医療キット又はキット成分は、好ましくは、週に一回、より好ましくは２回、３回、４回、５回又は６回与えられ得る。最も好ましくは、特に指示されない限り、毎日及び／又は一日２回或いはそれ以上与えられ得る。治療の進行の間に、投与は、はるかに長い時間間隔で与えられ得る。また必要な場合、はるかに短い時間間隔で与えられ、例えば、一日数回与えられ得る。好ましい場合には、治療への応答が、本明細書において記載の方法及び当業者に知られるさらなる方法を使用してモニターされてもよく、それにより投与量が、例えば、時間、量及び／又は成分などにおいて最適化され得る。進展は周期的評価によりモニターされ得る。本発明は、医療キットが併用療法のアプローチで適用されること、即ち、例えば、本明細書において上で記載された抗生物質、抗ウイルス剤又はＩｇＧ若しくはＩｇＡ免疫グロブリン、抗癌剤、及び、好ましくは抗ホルモン剤、より好ましくは抗アンドロゲンなどの他の医薬物又は薬物と同時投与で適用されるということも構想される。
【０２５３】
さらに具体的な側面において本発明は、本明細書において上で定められたＰＤＥ４Ｄ７の発現の決定のための成分を、本明細書において上で定められた前立腺癌、特にホルモン抵抗性前立腺癌の治療のための医療キットの成分と共に含むキットに関する。
【０２５４】
さらに、本発明の特に好ましい実施態様で、診断、検出、モニター又は予見されるべき癌、又は、その進展が診断、検出、モニター又は予見されるべき癌、又は、上記の医薬組成物で治療されるべき、若しくは、本発明による治療の方法により治療されるべき癌は、前立腺癌である。
【０２５５】
本発明の他の特に好ましい実施態様において、診断、検出、モニター又は予見されるべき癌、又は、その進展が診断、検出、モニター又は予見されるべき癌、又は、上記の医薬組成物で治療されるべき、若しくは、本発明による治療の方法により治療されるべき癌は、ホルモン抵抗性前立腺癌である。用語「ホルモン抵抗性前立腺癌」とは、前立腺癌又は前立腺癌細胞株の成長及び増殖が、男性性ホルモン刺激に抵抗性であることを意味する。この用語はまた、後期の前立腺癌発生段階に関し、ここではもはや、本明細書において上で定められた抗ホルモン、好ましくは抗アンドロゲンの投与を受け入れられない段階である。
【０２５６】
通常、前立腺癌の進展は、内分泌制御からパラ分泌制御まで、そして最終的には自己分泌制御への依存性におけるシフトを伴い、この複雑なプロセスは、細胞制御の分子レベルで生じる変化の結果であると信じられている。この段階で腫瘍の転移拡散の可能性があるために、ホルモン抵抗性前立腺癌は、本発明、特に上記の実施態様による診断及び治療に対する第一目標である。
【０２５７】
以下の実施例及び図は、例示の目的で提示される。従って、これらの実施例及び図は限定的であると解釈されるべきではないことが理解されたい。当業者は、本明細書に説明される原理のさらなる変更・変法について明確に想到することができる。
【実施例】
【０２５８】
実施例１−ヒト細胞株及びヒト組織異種移植片の定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイ
図１（なお詳細は、Ｍａｒｑｕｅｓら、２００６、Ｅｕｒ．Ｕｒｏｌ、４９（２）：２４５−５７も参照）に示される細胞株及びヒト組織異種移植片からＲＮＡを単離し、標準方法によりｃＤＮＡへ転写した。細胞株であるサンプル「ＰＣ３４６Ｐｘｅｎｏｇｒａｆｔ」から「３４６Ｆｌｕ２」の調製されたｃＤＮＡ、及び、異種移植片であるサンプル「ＰＣ２９５」から「ＰＣ３７４」の調製されたｃＤＮＡを、ＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルに対して試験した。
【０２５９】
ｑＲＴ−ＰＣＲ：材料及び方法
ＲＮＡサンプルを、ＤＮＡ汚染がないことを確認するためにＤＮａｓｅで処理した。ｃＤＮＡ合成の前に、ＲＮＡサンプルを、３７℃でＤＮａｓｅＩ（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）により３０分間処理した。１μｇのＲＮＡサンプルを、次に、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｖｉｌｏ  （Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理して、ｑＰＣＲ分析のための第一鎖ＤＮＡを製造業者の使用手順書に従って合成した。ＤＮＡサンプルを、その後、３７℃でＲｎａｓｅＨ１により３０分間処理した。
【０２６０】
得られたＤＮＡを最終濃度５０−６０ｎｇ／μｌとなるように希釈し、そのうち５μｌを９６−穴光学反応プレートのそれぞれの反応ウェルに添加した。
【０２６１】
定量的ＰＣＲ反応を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７３００装置を用いて、次の手順に従って１５μｌの反応容量で行った。
７．５μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ  ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ  ｗｉｔｈ  ＲＯＸ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）
２．２μｌのヌクレアーゼ不含有水
０．１μｌの１００ｐｍｏｌ／μｌプローブ
０．１μｌの１００ｐｍｏｌ／μｌフォワードプライマー
０．１μｌの１００ｐｍｏｌ／μｌリバースプライマー
それぞれの反応ウェルの合計容量はｃＤＮＡを含めて１５μｌであった。
【０２６２】
ＰＣＲ自体は、次のプログラムに沿って４０サイクル以上行った。
段階            繰り返し          温度（℃）          時間
１                １                ５０            ２秒
２                １                ９５            ２分
３                ４０              ９５            １５秒
６０            １分
ｑＲＴ−ＰＣＲプライマー及びプローブ（ＴＡＱＭＡＮ）
次のオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを、ＰＤＥ４Ｄ７に対するＲＴ−ＰＣＲに用いた。
長さ１０１の産物を生じるために、フォワードプライマー：５’−ＴＧＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣ−３’（配列番号３）、リバースプライマー：５’−ＧＣＴＧＡＡＴＡＴＴＧＣＧＡＣＡＴＧＡＡＡＧ−３’（配列番号４）を用いた。
【０２６３】
プローブとして、配列５’−ＣＣＡＧＴＡＡＴＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＴＴＴＣＣＧＣ−３’（配列番号５）を使用した。
【０２６４】
プローブセットは、ＰＤＥイソ型のユニークなＮ末端領域を標的とするように設計した。増幅産物は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ技術でのＴａｑｍａｎアッセイに対する最適範囲となるように設計した。全てのアッセイは、データ完全性を最大にするために４組で行った。ＧＡＰＤＨ参照プローブも含み、これに対して全ての連続したデータを参照させた。
【０２６５】
ｑＲＴ−ＰＣＲ：データ分析
異なるＲＴ−ＰＣＲ実験を基準化し比較するために、−ｄｄＣｔ方法を実施した。Ｃｔ値は、それぞれのプローブセットが比較できる効率で指数関数的に増幅されたところの手動でのカットオフ値観察によって得た。特に次のステップを実施した：
（１）参照及び関心のある遺伝子間（ＧＡＰＤＨは関心のある遺伝子から差し引く）のサイクル数の差（Ｃｔ）を計算し、実験サンプル（ＥＳ）ｄＣｔを与えるステップ。
（２）ひとつのサンプルを標準として選択し、（ＬＮＣａＰ）（Ｃ）に対して比較し、そのｄＣｔを計算するステップ。
（３）サイクル数の差における変化を、ｄＣｔ（ＥＳ）−ｄＣｔ（Ｃ）＝ｄｄＣｔにより誘導するステップ。
（４）最終的な比較可能な発現値を、それぞれのサイクル後の２倍のＤＮＡを考慮して２−ｄｄＣｔにより誘導し、それによりＬＮＣａＰに比較してｍＲＮＡの量を示すステップ。
【０２６６】
この演算は、ＬＮＣａＰ（これは値１を持つ）に比べた値を与えた。即ち、１を超えるいかなる値も、発現の増加として考慮し、１未満の値を発現が減少したとして考慮した。
【０２６７】
従って、全てのＰＣＲ反応の伸長効率は特定範囲内にあり、値１の結果を与えることが仮定された。
【０２６８】
異なるＲＴ−ＰＣＲ実験を基準化し比較するためのパーセンテージによるアプローチ
それぞれのプローブセットにつき、Ｃｔ（サイクル数）値を得た。これは、指数関数相での増幅曲線を横切るベースラインを見出すことで生成した。ベースラインは、それぞれの実験で得られた曲線により動的に生成した。次に、ＧＯＩのＣｔ（横切るか又はサイクル）値を、ＧＡＰＤＨ標準のＣｔ値から差し引いた。
【０２６９】
ＧＯＩＣｔ値は常に参照遺伝子よりも大きいとして、Ｃｔ（ＧＡＰＤＨ）−Ｃｔ（ＧＯＩ）＝ｄＣｔの式により、ｄＣｔ値は、負の値となり、即ち−ｄＣｔ値となった。
【０２７０】
それぞれのサイクルの倍加効果に基づいて、絶対値を、比較発現値＝２−ｄＣｔにより決定した。この計算から得られる値が非常に小さいものであることから、取り扱い上その値を１０００倍した。
【０２７１】
この方法で得られたＰＤＥ４Ｄ７についての発現レベルが図２から７に示されている。特に図２から４には、−ｄｄＣｔ方法により基準化された、異なるヒト前立腺癌細胞株及び異種移植片（図１）のＰＤＥ４Ｄ７ｃＤＮＡの相対的発現の相違が示されている。一方図５から７には、個人の細胞株又は異種移植片組織材料での総ＰＤＥ４Ｄ７発現に対して基準化された異なるヒト前立腺癌細胞株及び異種移植片（図１）のＰＤＥ４Ｄ７ｃＤＮＡの相対的発現の相違が示されている。
【０２７２】
図２から７に示されるように、ＰＤＥ４Ｄ７の発現（又は転写）レベルは、たいていのアンドロゲン依存又はアンドロゲン感受性対アンドロゲン非依存細胞株（図３及び６）又はヒト異種移植片（図４及び７）の間で有意に異なっている。図２及び５には、細胞株及び異種移植片の組み合わされた結果が示されている。
【０２７３】
図２から７に示される結果により、ヒト前立腺癌細胞株および組織中のＰＤＥ４Ｄ７の転写は、所与の細胞タイプにおけるアンドロゲンレセプター活性の状態に依存する。ＡＲ及びアンドロゲン／ホルモン刺激への細胞の感受性が存在する場合には、有意のＰＤＥ４Ｄ７転写を観察することができ、一方で活性ＡＲが不在である場合には、ＰＤＥ４Ｄ７転写は非常に小さく、即ち実質的に不在である。
【０２７４】
実施例２−ヒト組織サンプルを用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイ
ヒトＰＤＥ４Ｄ７の相対的遺伝子発現を、ホルモン感受性／応答性の患者からの前立腺癌組織対ホルモン耐性／去勢抵抗性の患者からの前立腺癌組織において評価した。
【０２７５】
材料及び方法
ＰＤＥ遺伝子発現実験のｑＰＣＲ測定において使用したサンプルの詳細は、表１にまとめられている：
【０２７６】
【表１】
2019059733.tif 000003
全てのサンプルは、男性患者（年齢５２から８２）から得た。「組織」の列は、段階分けのための、外科的手術中に採取された組織、前立腺組織又はリンパ節のいずれかを示す。「組織タイプ」の列は、組織切除の方法が記載されている。特に記載されていない限り、組織は、前立腺手術（前立腺切除）の際に切除されたものである。「ＴＵＲＦ」とは、Ｔｒａｎｓ  Ｕｒｅｔｈｒａｌ  Ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ（前立腺の経尿道的切除）を示す。ｃＤＮＡパネルには、４つのサンプルが含まれ、ホルモン感受性前立腺癌に罹っている患者からのサンプルであり、８つのサンプルはホルモン抵抗性前立腺癌に罹っている患者からのサンプルであり（「ホルモン耐性状態」の列における「ｙｅｓ」はホルモン抵抗性前立腺癌を示す）、かつ、４つのサンプルはリンパ節転移からのサンプルである。
【０２７７】
ヒトＰＤＥ４Ｄ７に使用されたプライマー及びプローブ配列：
センスプライマー配列：ＣＧＧＡＡＴＧＧＡＡＣＣＣＴＡＴＣＴＴＧＴＣ（配列番号７）
アンチセンスプライマー配列：ＴＴＧＧＴＣＧＴＴＧＡＡＴＧＴＴＣＴＣＴＧＡＴ（配列番号８）
プローブ配列：ＣＣＴＣＴＣＧＣＣＴＴＣＡＧＡＣＡＧＴＴＧＧＡＡＣＡＡＧＧＡＧＡＧＧ（ＦＡＭ−ラベル付き）（配列番号９）
ＰＤＥ４Ｄ７特異的プライマー（配列番号７及び８）は、ＦＡＭプローブ（配列番号９）と予め混合して、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実施し、さらに、製造者の指示書（ＰｒｉｍｅｒＤｅｓｉｇｎ、ＵＫ）により１：２０の希釈で使用した。ヒトｃＤＮＡサンプルは、標準のｑＰＣＲ専用、９６−穴ミクロタイタ（ＭＴ）プレートに配置した。
【０２７８】
１６の異なる患者からの１６組織サンプルは、９６−穴ＭＴプレートに配置した。１つのプレートあたり使用された１６ウェルにはそれぞれ、約２−３ｎｇのＲＮＡ逆転写されたｃＤＮＡが含まれていた。
【０２７９】
ＭＴプレートの使用されたウェルのそれぞれに、１５μＬのＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＧｅｎｅＡｍｐ  ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（２ｘ）、１３．５μＬのＲＮＡｓｅ／ＤＮＡｓｅ不含有水、及び、２μＬのＰｒｉｍｅｒＤｅｓｉｇｎ  ＰｅｒｆｅｃｔＰｒｏｂｅ  ｐｒｉｍｅｒｍｉｘ（ＰｒｉｍｅｒＤｅｓｉｇｎ、ＵＫ）を添加した。
【０２８０】
全てのサンプルは、次のＰＣＲ手順を用いて分析した：５０℃で２分、９５℃で１０分、９５℃で１５秒、蛍光を記録しながら５０℃で３０秒、７２℃で１５秒、及び、最後の３ステップを５０回繰り返した。
【０２８１】
相対的遺伝子発現値の計算のために、次の手順を使用した：４０若しくはそれ以上又は１６未満のＣＴ値は、低品質の点から除外した（ここで試験された遺伝子は平均Ｃｔ値が約３３であった）。
【０２８２】
ＣＴ値を基準化するために、次の方法を使用された：ＣＴ値を、較正曲線に基づき、相対的遺伝子コピー数に変換した。較正曲線は、ｃＤＮＡの異なる希釈につき独立して測定した。その後、ＰＤＥ４Ｄ７発現は、ハウスホールド遺伝子（グリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及びポルフォビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ））の平均コピー数でＰＤＥ４Ｄ７コピー数を割り算することとする。
【０２８３】
リンパ節切除組織サンプルを含む、ヒト前立腺組織（ホルモン応答性対ホルモン抵抗性）におけるヒトＰＤＥ４Ｄ７の相対的発現
ヒトＰＤＥ４Ｄ７イソ型の遺伝子発現レベルは、上で記載のようにヒト前立腺組織に対して決定した。相対的発現レベルは、２つの既定の前立腺組織において決定した：「ホルモン応答性」及び「ホルモン耐性」である。ヒトＰＤＥ４Ｄ７発現状態の初期調査のために、一次前立腺癌サンプルと共にリンパ節切除組織サンプルも含めた。
【０２８４】
リンパ節切除組織サンプルは、一次腫瘍からセンチネルリンパ節へ伝搬されるに従い侵入的に成長することで特徴付けされる。この意味で、これらのサンプルは、一次腫瘍細胞とは分子的見地から相違するものであり、制御されない増殖ではあるがなお一次臓器内で成長することで特徴付けされる。侵入性成長は、より侵襲性の成長の振る舞いを意味するが、これはまたホルモン耐性前立腺癌組織にも見られる。
【０２８５】
スチューデントｔテストを実施し、ヒトＰＤＥ４Ｄ７遺伝子発現が、ホルモン応答性ヒト前立腺組織と比較してホルモン抵抗性腫瘍組織において、平均して、わずかに減少しているかどうかを調べた。
【０２８６】
図８及び９から分かるように、ホルモン抵抗性腫瘍における発現は、一般に減少する。しかし、ホルモン感受性前立腺腫瘍のグループにおける発現からは容易には区別することはできない。試験された組織タイプ間での平均のＰＤＥ４Ｄ７発現の差は、従って有意ではないことを見出した（ｐ−値＝０．２２）。
【０２８７】
この結果は、グループ１の分析に含まれるサンプルの一部分のより侵襲性の振る舞いにより説明可能であると思われる。次のことが推測される。侵襲性の疾患がすでに、アンドロゲンに対する応答性を失っている腫瘍細胞中に存在し、ホルモン耐性又はホルモン抵抗性の振る舞いの特徴が本質的に侵襲性の腫瘍に含まれているように存在する、ということである。これらの細胞は従って、アンドロゲン欠乏条件で選択されると考えられる。このことは、なぜかかる組織タイプがヒトＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルを減少させる傾向がすでにあり、これにより標準Ｔテストで有意性が少ないｐ−値となるかを説明するものと思われる。従って、リンパ節切除組織サンプルの状態を正しく決定することの難しさ、即ち、これらの腫瘍にはすでにある程度のホルモン抵抗性腫瘍細胞集団が含まれていることを排除することができないという事実が、得られた結果を引き出したものであり得る。
【０２８８】
リンパ節切除組織サンプルを除いた、ヒト前立腺組織（ホルモン応答性対ホルモン抵抗性）におけるヒトＰＤＥ４Ｄ７の相対的発現
この問題を回避するために、相対的発現レベルを、２つの既定の組織において決定した：「ホルモン応答性」及び「ホルモン耐性」であり、ここで、ヒトＰＤＥ４Ｄ７発現の調査に対して、一次前立腺癌サンプルのみを含めた。即ち、リンパ節切除からの全てのサンプルを除外した。
【０２８９】
スチューデントＴテストを実施して、ヒトＰＤＥ４Ｄ７遺伝子発現が、ホルモン応答性ヒト前立腺組織に比較してホルモン抵抗性腫瘍組織中で平均して有意に減少するかどうかを見た。
【０２９０】
図１０及び１１から分かるように、ホルモン抵抗性前立腺腫瘍における発現は減少し、ホルモン感受性前立腺腫瘍グループにおける発現から容易に区別できる。２つの組織間（ホルモン抵抗性腫瘍組織対ホルモン感受性腫瘍組織）での平均のＰＤＥ４Ｄ７発現の差は有意であった（ｐ＝０．０３２）。
【０２９１】
図１０及び１１は、ホルモン抵抗性前立腺腫瘍におけるＰＤＥ４Ｄ７発現が一般的に、ホルモン感受性前立腺腫瘍に比較して減少することを示す。従って、ｃＡＭＰ−ＰＤＥ活性の減少したレベルは、増強された細胞増殖に対して有利であることを結論する。次のことは長い間推測されてきたことである。即ち、アンドロゲンレセプター遺伝子の変異又は遺伝子増幅に続いて、他の細胞シグナル経路の活性化が、ホルモン応答性からホルモン非依存性細胞成長への移行を支持することができる、ということである。ｃＡＭＰ−ＰＫＡ経路は、ホルモン関連成長の移行を意味するとされてきた経路の一つである。ホルモン感受性からホルモン耐性ヒト前立腺組織へのＰＤＥ４Ｄ７発現の変化はこの見解を支持する。
【０２９２】
実施例３−ＰＣ３増幅に対するＰＤＥ４Ｄ７発現の効果
アンドロゲン非依存性細胞株の増殖に対するヒトＰＤＥ４Ｄ７の異種性の発現の効果を試験するために、いくつかの遺伝子構築物をＰＣ３細胞に遺伝子導入し、コントロール処理した細胞株と比較して細胞成長を試験した。コントロールとして、無処理のＰＣ３細胞、ＰＤＥ４Ｄ７のドミナントネガティブな形態を用いて遺伝子導入されたＰＣ３細胞（ここでＰＤＥ４Ｄ７の触媒活性は、ＰＤＥ４Ｄ７のコード配列の遺伝子変異によりノックアウトされている）、同様に、ＰＤＥ４Ｄ１などのＰＤＥ４Ｄファミリの異なるイソ型を用いて遺伝子導入したＰＣ３細胞を使用した。
【０２９３】
ＰＣ３細胞は、Ｌ−グルタミン（最終濃度２ｍＭ）及びＰｅｎＳｔｒｅｐ  （１％）で補助されたＲＰＭＩ  １６４０中の５％ＣＯ２、３７Ｃ、５％Ｆｏｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍにて成長させた。ＰＣ３細胞は、９６穴ウェルプレート（ＭＴＰ）のウェル当たり５０００細胞の濃度で播種した。関心のある遺伝子（ＰＤＥ４Ｄ７、ドミナントネガティブＰＤＥ４Ｄ７及びＰＤＥ４Ｄ１）に対する遺伝子導入複合物は、Ｆｕｇｅｎｅ６Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬を製造者の指示書に従って用いて形成した。関心のある遺伝子それぞれにつき、約２５の独立した遺伝子導入を、試験の統計的精度を上げるために実施した（それぞれのバーは、約２５の独立した測定を表す）。
【０２９４】
４時間の最初のプレーティング時間の後、遺伝子導入複合体を成長培地に添加し、細胞を６０時間増殖させ、その後、ＰｒｏｍｅｇａＭＴＴ化合物を添加した。細胞増殖を調査するためのＭＴＴアッセイ手順は製造者の指示書に従った。
【０２９５】
吸光度の読み取りを、ＭｉｔｈｒａｓＬＢ９４０プレート読取システムを用いて行った。１秒の読み取りを各ウェルから取得した。
【０２９６】
上記の実験で実証されるように、アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞株ＰＣ３におけるヒトＰＤＥ４Ｄ７異種性発現は、インビボでの増殖に対し負の効果を示した。選択された条件での細胞増殖は、無処理の細胞、ＰＤＥ４Ｄ７の不活性の形態を用いて遺伝子導入された細胞に比較して、同様に、ＰＤＥ４Ｄ１発現に比較して、ヒトＰＤＥ４Ｄ７の発現によって合計約１５％抑止された。この効果は統計的に有意であった（無処理のＰＣ３に比較してｐ＜０．００１）。
【０２９７】
この実験により、ヒトＰＤＥ４Ｄ７の活性化は、アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞の細胞増殖に対して抑制効果があることが実証されている。細胞増殖に対する観測された効果は、統計的に高度に有意である。
【０２９８】
実験に使用された遺伝子導入の一過性の様式により（即ち、遺伝子導入の効率に多かれ少なかれ依存して、より少ないＰＣ３が遺伝子導入され、従ってＰＤＥ酵素を過剰発現する）、より高い一過性の遺伝子導入の効率がＰＣ３細胞において達成されると、より高いレベルの細胞増殖の抑制に達することができると予想される。
【０２９９】
本出願は、次のさらなる実施態様の事項を含む：
１．癌に対するマーカーとして使用するホスホジエステラーゼ４Ｄ７（ＰＤＥ４Ｄ７）。
２．癌又は癌の進展の診断、検出、モニタリング又は予見のための組成物であり、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物又はタンパク質に対する核酸親和性リガンド及び／又はペプチド親和性リガンドを含む、組成物。
３．事項２に記載の組成物であり、上記核酸親和性リガンド又はペプチド親和性リガンドが、造影剤として機能するように変更されている、組成物。
４．事項２に記載の組成物であり、上記親和性リガンドが、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物に特異的なオリゴヌクレオチドのセット、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物に特異的なプローブ、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物又はＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的なアプタマー、ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的な抗体及び／又はＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的な抗体変異体である、組成物。
５．ＰＤＥ４Ｄ７の、癌又は癌の進展の診断、検出、モニタリング又は予見のためのマーカーとしての使用。
６．癌又は癌の進展の診断、検出、モニタリング又は予見のための方法であり、少なくとも、サンプル中のＰＤＥ４Ｄ７のレベルを決定するステップを含む、方法。
７．事項６に記載の方法であり、上記決定するステップが、核酸又はタンパク質レベルの測定により、又は、ＰＤＥ４Ｄ７の生物活性の決定により遂行される、方法。
８．事項７に記載の方法であり、上記方法が、上記測定された核酸又はタンパク質レベル、又は、上記測定された生物活性をコントロールレベルと比較するステップをさらに含む、方法。
９．データ取得方法であり、少なくとも次のステップ：
（ａ）ＰＤＥ４Ｄ７の発現について個人を試験するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）で決定された上記発現を、コントロールレベルと比較するステップ；
を含む、方法。
１０．事項２に記載の使用、又は、事項６乃至９のいずれかひとつに記載の方法であり、上記診断、検出、モニタリング、予見又はデータ取得が、個人から得られたサンプルで実施されることになる、使用又は方法。
１１．癌又は癌の進展の診断、検出、モニタリング又は予見のためイムノアッセイであり、少なくとも次のステップ：
（ａ）ＰＤＥ４Ｄ７の発現につき個人から得られたサンプルを試験するステップ；
（ｂ）ＰＤＥ４Ｄ７の発現につきコントロールサンプルを試験するステップ；
（ｃ）ステップ（ａ）及び（ｂ）のＰＤＥ４Ｄ７の発現の差を決定するステップ；及び
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた結果に基づいて、癌又は癌の進展の存在又は段階を決定するステップ；
を含み、上記試験するステップは、ＰＤＥ４Ｄ７に特異的に結合する抗体の使用に基づく、イムノアッセイ。
１２．事項１０に記載の使用若しくは方法、又は、事項１１に記載のイムノアッセイであり、上記サンプルが組織サンプル、尿サンプル、尿沈査サンプル、血液サンプル、唾液サンプル、精液サンプル又は循環腫瘍細胞を含むサンプルである、使用若しくは方法、又は、イムノアッセイ。
１３．少なくとも一つの成分を含む医薬組成物であり、上記成分が：
（ａ）ＰＤＥ４Ｄ７の活性を直接刺激するか又は調節する化合物、好ましくはＰＤＥ４Ｄ７酵素活性のアロステリックアゴニスト；
（ｂ）ＰＤＥ４Ｄ７の活性を間接的に刺激するか又は調節する化合物；
（ｃ）ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質又はその生物活性同等物；
（ｄ）ＰＤＥ４Ｄ７をコードし、発現する核酸；
（ｅ）ＰＤＥ４Ｄ７ｍｉＲＮＡに特異的なｍｉＲＮＡインヒビター；
（ｆ）脱メチル化剤；及び
（ｇ）ホスホジエステラーゼ変位因子、好ましくはペプチド、ペプチド模倣体、小分子、抗体又はアプタマー；
を含む群から選択される、組成物。
１４．癌の治療又は予防のための医薬組成物であり：
（ａ）ＰＤＥ４Ｄ７の活性を直接刺激するか又は調節する化合物、好ましくはＰＤＥ４Ｄ７酵素活性のアロステリックアゴニスト；
（ｂ）ＰＤＥ４Ｄ７の活性を間接的に刺激するか又は調節する化合物；
（ｃ）ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質又はその生物活性同等物；
（ｄ）ＰＤＥ４Ｄ７をコードし、発現する核酸；
（ｅ）ＰＤＥ４Ｄ７ｍｉＲＮＡに特異的なｍｉＲＮＡインヒビター；
（ｆ）脱メチル化剤；及び
（ｇ）ホスホジエステラーゼ変位因子、好ましくはペプチド、ペプチド模倣体、小分子、抗体又はアプタマー；
を含む群から選択される少なくとも１つの成分を含む、医薬組成物。
１５．癌の治療又は予防のための医薬組成物の調製のための、
（ａ）ＰＤＥ４Ｄ７の活性を直接刺激するか又は調節する化合物、好ましくはＰＤＥ４Ｄ７酵素活性のアロステリックアゴニスト；
（ｂ）ＰＤＥ４Ｄ７の活性を間接的に刺激するか又は調節する化合物；
（ｃ）ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質又はその生物活性同等物；
（ｄ）ＰＤＥ４Ｄ７をコードし、発現する核酸；
（ｅ）ＰＤＥ４Ｄ７ｍｉＲＮＡに特異的なｍｉＲＮＡインヒビター；
（ｆ）脱メチル化剤；及び／又は
（ｇ）ホスホジエステラーゼ変位因子、好ましくはペプチド、ペプチド模倣体、小分子、抗体又はアプタマー；
の使用。
１６．事項１に記載のホスホジエステラーゼ、事項２乃至４のいずれかに記載の組成物、事項５、１０又は１２に記載の使用、事項６乃至１０又は１２のいずれかに記載の方法、事項１１又は１２に記載のイムノアッセイ、事項１３又は１４に記載の医薬組成物、又は事項１５に記載の使用であり、上記癌が前立腺癌である、ホスホジエステラーゼ、使用、組成物、方法、イムノアッセイ又は医薬組成物。
１７．事項１６に記載のホスホジエステラーゼ、使用、組成物、方法、イムノアッセイ又は医薬組成物であり、上記前立腺癌がホルモン抵抗性前立腺癌である、ホスホジエステラーゼ、使用、組成物、方法、イムノアッセイ又は医薬組成物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年11月29日(2018.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌又は前立腺癌の進展を診断、検出、モニター又は予見するための医薬組成物であって、ＰＤＥ４Ｄ７発現産物又はＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に対する核酸親和性リガンド及び／又はペプチド親和性リガンドを含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記核酸親和性リガンド及び／又はペプチド親和性リガンドが、造影剤として機能するように変更されている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記核酸親和性リガンド及び／又はペプチド親和性リガンドが、前記ＰＤＥ４Ｄ７発現産物に特異的なオリゴヌクレオチドのセット、前記ＰＤＥ４Ｄ７発現産物に特異的なプローブ、前記ＰＤＥ４Ｄ７発現産物又はＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的なアプタマー、前記ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的な抗体及び／又は前記ＰＤＥ４Ｄ７タンパク質に特異的な抗体変異体である、請求項１に記載の医薬組成物。