(57)【要約】      （修正有）【課題】幹細胞を網膜神経節細胞に分化させて成熟網膜神経節細胞を製造する方法の提供。【解決手段】（ａ）網膜前駆細胞をＩＧＦ１Ｒ（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）活性剤及びＷｎｔシグナル伝達経路活性剤を含む培地で培養して未成熟網膜神経節細胞に分化させる段階と、（ｂ）未成熟網膜神経節細胞を（ａ）段階の培地のＷｎｔシグナル伝達経路活性剤を含まない培地中で培養する段階と、を含む幹細胞を成熟網膜神経節細胞に分化させ、成熟網膜神経節細胞を製造する方法。【選択図】図１
2019208500.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）網膜前駆細胞（retinal progenitor cell）をＩＧＦ１Ｒ（insulin-like growth
factor-1 receptor）活性剤及びＷｎｔシグナル伝達経路活性剤を含む培地で培養して未成熟網膜神経節細胞（imMature retinal ganglion cell）に分化させる段階と、
（ｂ）未成熟網膜神経節細胞を（ａ）段階の培地のＷｎｔシグナル伝達経路活性剤を含まない培地中で培養する段階と、
を含む幹細胞を成熟網膜神経節細胞（Mature retinal ganglion cell）に分化させ、成熟網膜神経節細胞を製造する方法。
【請求項２】
前記（ａ）段階の培地が、ＩＧＦ１Ｒ活性剤、ＢＭＰ（bone morphogenetic protein）シグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦ（fibroblast growth factor）シグナル伝達経路活性剤及びＷｎｔシグナル伝達経路活性剤を含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（ｂ）段階が、前記（ａ）段階の培地からＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦシグナル伝達経路活性剤及びＷｎｔシグナル伝達経路活性剤を除去し、Ｓｈｈ（sonic hedgehog）シグナル伝達経路活性剤を添加した培地で未成熟網膜神経節細胞を培養するものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ｃ）前記（ｂ）段階の培地にＲＡ（retinoic acid）を添加した培地中で未成熟網膜
神経節細胞を培養する段階をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記（ｂ）段階が、
（ｉ）前記（ａ）段階の培地からＷｎｔシグナル伝達経路活性剤を除去した培地で未成熟網膜神経節細胞を培養する段階と、
（ｉｉ）前記（ｉ）段階の培地からＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤及びＦＧＦシグナル伝達経路活性剤を除去し、Ｓｈｈ(sonic hedgehog) シグナル伝達経路活性剤を添加した
培地で未成熟網膜神経節細胞を培養する段階と、
を含むものである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
（ｃ）前記（ｂ）段階の（ｉｉ）段階の培地にＲＡ（retinoic acid）を添加した培地
で未成熟網膜神経節細胞を培養する段階をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ｄ）前記（ｃ）段階の培地からＩＧＦ１Ｒ活性剤、Ｓｈｈシグナル伝達経路活性剤及びＲＡからなる群から選択された１以上を除去した培地で未成熟網膜神経節細胞又は成熟網膜神経節細胞を培養する段階をさらに含む、請求項４又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記（ａ）段階の網膜前駆細胞が、
（ａ’）幹細胞をＩＧＦ１Ｒ活性剤、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤を含む培地で培養し、浮遊凝集体の形態の眼球領域前駆体に分化させる段階と、
（ｂ’）前記（ａ’）段階の浮遊凝集体の形態の眼球領域前駆体を（ａ’）段階の培地にＦＧＦシグナル伝達経路活性剤を添加した培地で培養し、網膜前駆細胞に分化させる段階と、
を含む方法により得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記（ａ’）段階が１〜３０日間行われ、前記（ｂ’）段階が５〜１５日間行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記幹細胞が、骨髄幹細胞（bone marrow stem cell、BMS）、臍帯幹細胞（cord blood
stem cell）、羊水性幹細胞（amniotic fluid stem cell）、脂肪幹細胞（fat stem cell）、網膜幹細胞（retinal stem cells、RSCs）、網膜内ミューラーグリア細胞、胚性幹
細胞（embryonic stem cells、ESCs）、誘導多能性幹細胞（induced pluipotent stem cells、iPSCs）及び体細胞核移植幹細胞（somatic cell nuclear transfer cells、SCNTs）からなる群から選択されるものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記（ａ）段階が１〜１０日間行われ、前記（ｂ）段階が１〜１２０日間に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
未成熟網膜神経節細胞をＩＧＦ１Ｒ（insulin-like growth factor-1 receptor）活性
剤及びＳｈｈ（sonic hedgehog）シグナル伝達経路活性剤を含む培地で培養する段階を含む、未成熟網膜神経節細胞を成熟網膜神経節細胞に分化させ、成熟網膜神経節細胞を製造する方法であって、
前記培地はＷｎｔシグナル伝達経路活性化剤を含まない方法。
【請求項１３】
ＩＧＦ１Ｒ活性剤、Ｓｈｈシグナル伝達経路及びＲＡ（retinoic acid）を含む培地で
未成熟網膜神経節細胞を培養する段階をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＩＧＦ１Ｒ活性剤がＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２である、請求項１又は１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記培地内ＩＧＦ１Ｒ活性剤の濃度が０．０１〜１００ｎｇ／ｍｌである、請求項１又は１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｗｎｔシグナル伝達経路活性剤が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６ｂ；β-カテニン（β−ｃａｔｅｎｉｎ）レベルを増加させる物質；
リチウム、ＬｉＣｌ、２価の亜鉛（bivalent Zn）、ＢＩＯ（6-bromoindirubin-3’-oxime）、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＣＨＩＲ９９０２１、ＱＳ１１水和物、Ｔ
ＷＳ１１９、 ケンパウロン（kenpaullone）、アルステルパウロン（alsterpaullone）、インジルビン−３−オキシム（indirubin-3-oxime）、ＴＤＺＤ−８及びＲｏ  ３１−８
２２０メタンスルホン酸塩（Ro 31-8220 methanesulfonate salt）のようなＧＳＫ３（glycogen synthase kinase 3）阻害剤；Ａｘｉｎ阻害剤；ＡＰＣ（adenomatous polyposis coli）阻害剤；ノリン（norrin）及びＲ−スポンジン２（R-spondin2）からなる群から選択された１種以上のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記（ａ）段階のＷｎｔシグナル伝達経路活性剤中、ＬｉＣｌ、ＢＩＯ（6-bromoindirubin-3’-oxime）及びＳＢ４１５２８６を除いたＷｎｔシグナル伝達経路活性剤の培地内の濃度が０．０１〜５００ｎｇ／ｍｌであり、前記Ｗｎｔシグナル伝達経路活性剤中、前記ＬｉＣｌの培地内の濃度が０．１〜５０ｍＭであり、前記ＢＩＯの培地内の濃度が０．１〜５０μＭであり、ＳＢ４１５２８６の培地内の濃度が０．１〜５００μＭである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤が、ノギン（noggin）、コーディン（chordin）、
ツイステッド嚢胚形成因子（Twisted gastrulation、Tsg）、サーベラス（cerberus）、
ココ（Coco）、グレムリン（gremlin）、ＰＲＤＣ（Protein related to DAN and Cerberus）、ＤＡＮ（differential screening-selected gene aberrative in neuroblastoma）、ダンテ（dante）、ホリスタチン（follistatin）、ＵＳＡＧ−１（uterine sensitization-associated gene 1）、ドルソモルフィン（dorsomorphin）及びスクレロスチン（scl
erostin）からなる群から選択された１種以上のものである、請求項２又は８に記載の方
法。
【請求項１９】
前記培地内のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤の濃度が０．０１〜１００ｎｇ／ｍｌである、請求項２又は８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＦＧＦシグナル伝達経路活性剤が、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１７及びＦＧＦ１９からなる群から選択された１種以上のものである、請求項２又は８に記載の方法。
【請求項２１】
前記培地内のＦＧＦシグナル伝達経路活性剤の濃度が０．０１〜１００ｎｇ／ｍｌである、請求項２又は８に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｓｈｈシグナル伝達経路活性剤が、Ｓｈｈ、Ｓｍｏ（smoothened）受容体活性剤、Ｐｔｃ（Ｐａｔｃｈｅｄ）によるＳｍｏ抑制作用の阻害剤、Ｃｉ／Ｇｌｉファミリーレベルを増加させる物質、Ｃｉ／Ｇｌｉタンパク質の細胞内分解抑制剤及びＨｇ−Ａｇ又はプルモルファミン（Purmorphamine）のようなＳｈｈ受容体活性剤からなる群から選択され
た１種以上のものである、請求項３、５又は１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記培地内のＳｈｈシグナル伝達経路活性剤の濃度が０．１〜５０００ｎｇ／ｍｌである、請求項３、５又は１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記培地内のＲＡの濃度が０．５〜１０，０００ｎＭである、請求項４、６又は１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤が、Ｄｋｋ−１、Ｄｋｋ−２、Ｄｋｋ−３及びＤｋｋ−４からなる群から選択された１種以上のものである、請求項８に記載の方法。
【請求項２６】
前記培地内のＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤の濃度が０．０１〜１０，０００ｎｇ／ｍｌである、請求項８に記載の方法。
【請求項２７】
分化した細胞が目的とする成熟網膜神経節細胞に分化したかどうかを判定する段階をさらに含む、請求項１又は１２に記載の方法。
【請求項２８】
前記成熟網膜神経節細胞に分化したかどうかが、Ｂｒｎ３Ｂ、Ｂｒｎ３Ａ、Ｉｓｌｅｔ−１、ＮＦ２００、Ｔｕｊ１、Ｔｈｙ１．２、ＴｒｋＢ、ＮＭＤＡＲ１、Ｍａｐ２、Ｖｇｌｕｔ１、ＰＳＤ−９５、シナプトフィジン（Synaptophysin）及びシナプシン1（Synapsin1）からなる群から選択された１種以上の遺伝子のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベ
ルを測定することにより決定されるものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記（ｂ’）段階の浮遊凝集体の形態の眼球領域前駆体が、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、ポリ−Ｌ−リジン、マトリゲル（matrigel）、アガー（agar）、ポリオルニチン（polyornithine）、ゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチン（fibronectin）及びビトロネクチン（vitronectin）からなる群から選択された細胞外基質でコーティングされたプレ
ートに接着された状態で培養されたものである、請求項８に記載の方法。
【請求項３０】
前記（ａ’）段階の培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％のノックアウト血清代替剤及び１％のＢ２７サプリメントをさらに含むものであり、前記（ｂ’）段階の培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１％のＢ２７サプリメント及び１％のＮ２サプリメントをさらに含むものである、請求項８に記載の方法。
【請求項３１】
前記（ａ）と（ｂ）段階の培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１％のＢ２７サプリメント及び１％のＮ２サプリメントをさらに含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記未成熟網膜神経節細胞が、（ｉ）Ｂｒｎ３Ｂ、Ｂｒｎ３Ａ、Ｉｓｌｅｔ−１、ＮＦ２００及びＴｕｊ１からなる群から選択された１種以上の遺伝子、及び（ｉｉ）Ｍａｔｈ５遺伝子を発現するものである、請求項１又は１２に記載の方法。
【請求項３３】
前記方法により得られた成熟網膜神経節細胞が、全細胞の６０〜９５％、又はそれ以上を占めるものである、請求項１又は１２に記載の方法。
【請求項３４】
（ａ）網膜前駆細胞（retinal progenitor cell）をＩＧＦ１Ｒ（insulin-like growth
factor-1 receptor）活性剤及びＷｎｔシグナル伝達経路活性剤を含む培地で培養して未成熟網膜神経節細胞（imMature retinal ganglion cell）に分化させる段階と、
（ｂ）未成熟網膜神経節細胞を成熟網膜神経節細胞を得るために（ａ）段階の培地のＷｎｔシグナル伝達経路活性剤を含まない培地中で培養する段階と、
（ｃ）段階（ｂ）から得られた成熟網膜神経節細胞に成熟網膜神経節細胞の死滅抑制又は増殖促進の候補物質を処理する段階と、
（ｄ）候補物質の非処理群に比べて、前記候補物質が成熟網膜神経節細胞の死滅を抑制する、又は成熟網膜神経節細胞の増殖を促進する場合、それぞれ成熟網膜神経節細胞の死滅抑制剤又は増殖促進剤と判定する段階と、
を含む成熟網膜神経節細胞の死滅抑制剤又は増殖促進剤をスクリーニングする方法。
【請求項３５】
前記成熟網膜神経節細胞の死滅抑制剤又は増殖促進剤が、緑内障又は視神経病症の治療剤である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
（ａ）成熟網膜神経節細胞を得るために未成熟網膜神経節細胞をＩＧＦ１Ｒ（insulin-like growth factor-1 receptor）活性剤及びＳｈｈ（ソニックヘッジホッグ）シグナル
伝達経路活性化剤を含む培地中で未成熟網膜神経節細胞（imMature retinal ganglion cell）を培養する段階と、
（ｂ）段階（ａ）から得られた前記成熟網膜神経節細胞に成熟網膜神経節細胞の死滅抑制又は増殖促進の候補物質を処理する段階と、
（ｃ）候補物質の非処理群に比べて、前記候補物質が成熟網膜神経節細胞の死滅を抑制する、又は成熟網膜神経節細胞の増殖を促進する場合、それぞれ成熟網膜神経節細胞の死滅抑制剤又は増殖促進剤と判定する段階と、
を含む成熟網膜神経節細胞の死滅抑制剤又は増殖促進剤をスクリーニングする方法。
【請求項３７】
（ａ）ＩＧＦ１Ｒ（insulin-like growth factor-1 receptor）活性剤及びＷｎｔシグ
ナル伝達経路活性剤を含む培地で網膜前駆細胞を培養して未成熟網膜神経節細胞に分化させる段階と、
（ｂ）前記（ａ）段階の培地からＷｎｔシグナル伝達経路活性剤を除去した培地で未成熟網膜神経節細胞を培養する段階と、
を含む成熟網膜神経節細胞株を製造する方法。
【請求項３８】
前記（ｂ）段階の培地が、Ｓｈｈシグナル伝達経路活性剤又はＲＡ（retinoic acid）
、又は両方を含むものである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記培養された細胞を分離した後、
（ｉ）ＩＭＤＭ（Iscove’s Modified Dulbecco’s Media）、Ｌ−グルタミン、メルカプトエタノール及びインスリン／トランスフェリン／セレニウム−Ｘを含む培地、又は（
ｉｉ）ＩＭＤＭ（Iscove’s Modified Dulbecco’s Media）、Ｌ−グルタミン、メルカプトエタノール、ＦＧＦ２、ＩＧＦ−１及びＥＧＦを含む培地で前記細胞を培養する段階をさらに含む、請求項３７又は３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞を網膜神経節細胞に分化させ、網膜神経節細胞を製造する方法、前記方法で分化させた網膜神経節細胞、前記方法で分化させた網膜神経節細胞を用いて網膜神経節細胞の死滅抑制物質又は増殖促進物質をスクリーニングする方法、前記方法で分化させた網膜神経節細胞を含む、網膜神経節細胞の死滅抑制物質又は増殖促進物質をスクリーニングするためのキット、前記網膜神経節細胞を含む緑内障又は視神経病症の治療用薬学組成物、前記網膜神経節細胞を緑内障又は視神経病症が疑われる個体に投与する段階を含む、緑内障又は視神経病症の治療方法、及び成熟網膜神経節細胞株を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
失明は、医学的に光覚がないことをいい、現在、世界人口の０．２〜０．５％を占める数千万人の患者が苦しんでいる疾患であり、個人的、社会的及び経済的に大きな損失をもたらしている。全世界的に失明の主要原因の一つは、網膜の緑内障及び視神経病症である。緑内障は、最も重要で広く知られている進行性視神経の疾患で、不可逆的に失明につながる疾病である。４０歳以上の世界的な緑内障の有病率は約２〜３％を占めるほど非常に高く、世界的に、２０１０年には約６万人の緑内障患者がおり、２０２０年には８０００万人まで増加すると予想されている（非特許文献１）。社会的に活動する中高年層の緑内障の有病率は２〜３％を示し、人口の年齢とともに患者数が大幅に増加し、社会的、経済的負担となることが予想される。緑内障の治療において、現在、眼圧の低下が臨床で適用される唯一の治療法であるが、かなりの割合の緑内障患者が未だに失明に進行していることが知られている。また、眼圧低下は、緑内障の進行を一部抑制することができる保存的な方法に過ぎず、根本的な治療は不可能と知られている。
一方、視神経病症は、多様な原因による視神経の病症を総称し、視神経炎、虚血性視神経病症、中毒−栄養視神経病症、遺伝性視神経病症、視神経萎縮症などを含む。このうち、視神経の退行と損傷により引き起こされる疾患は、幹細胞療法によって助けられ得る。具体的には、緑内障は、網膜神経節細胞（retinal ganglion cell、RGC）の退行と損傷により発生する。光は、目を通過した後、光受容体細胞で電気信号に変換され、網膜神経節細胞はこれらの電気信号を受けて脳の中枢視神経に伝達する。
一方、幹細胞／再生医療は、緑内障及び視神経病症の最適な治療法になり得る。単一細胞型の退行と損失による疾病は、幹細胞治療の最適な候補である。特に、眼は外科的操作のために非常に容易であり、既に多様な手術方法が確立されており、幹細胞を病変部位に適用するのに困難がなく、また、目は治療薬剤の開発のモデルになることができる。
緑内障及び視神経病症において幹細胞治療の目的は、１）退行及び損傷した網膜神経節細胞（retinal ganglion cells、RGCs）を新たなＲＧＣｓに代替し、２）幹細胞治療の傍分泌効果（paracrine effects）として、抗炎症、抗アポトーシス化、神経保護、並びに
変性及び損傷したＲＧＣｓに対する血管保護の治療効果を誘導し、３）まだ直接治療剤が開発されていない緑内障の治療のために、幹細胞を利用して新薬を選別して開発することにある。このような治療法は、患者由来の多能性幹細胞を利用して個人化された幹細胞の治療につなげることができる。このような治療組成物の開発や治療薬物の開発モデルの開発のために絶対に必要なのは、高効率の網膜神経節細胞の生産である。特に、疾患により変性又は損傷を受けた網膜神経節細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで調製することができず、その
ため、正常又は異常な網膜神経節細胞を用いた緑内障及び視神経障害の新薬の開発が不可能であるという問題がある。したがって、幹細胞から網膜神経節細胞を大量に生産することができる場合、緑内障及び視神経病症のような網膜神経節細胞に関連する疾患のモデル構築が可能になり、これに対する薬剤を容易に開発することができる。特に、患者由来−誘導多能性幹細胞から分化させたＲＧＣｓ（iPSC-RGCs）の生産は、視神経の退行を予防
及び抑制することができる新薬の開発を可能にする。また、本発明者らは、先行特許である特許文献１及び特許文献２を通じて幹細胞から網膜細胞を分化させる方法を開示した。しかし、前記各文献に開示された方法によると、網膜前駆細胞の約６％のみが網膜神経節細胞に分化される。したがって、網膜神経節細胞への分化を最大化する分化方法の開発が依然として求められている。
本発明者らは、ヒト胚性幹細胞から分化した網膜神経節細胞を生産しようしたが、その成績はよくなかった。そこで、本発明者らは、幹細胞から網膜神経節細胞を生成することができる新たな方法を開発するために鋭意努力した結果、遺伝子の移植又は網膜組織との共培養なしに、化学的に規定された培養条件下で、５週間の短期間に高効率でヒト胚性幹細胞を網膜神経節細胞に分化させる方法を開発した。本発明の方法により開発された網膜神経節細胞の数は、ヒト胚性幹細胞の約２００倍であり、網膜神経節細胞は優れた神経生理学的な機能を有することを見出し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】大韓民国登録特許第１０−１２６８７４１号公報
【特許文献２】国際公開特許ＷＯ２０１１／０４３５９１号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Quigley HA and Broman AT、Br J Ophthalmol 2006;90:262-267
【非特許文献２】Barres, et al, Neuron. 1988;1:791-803.
【非特許文献３】Pfrieger Barres, Science. 1997;277:1684-7.
【非特許文献４】Ryan & Goss、Oncologist. 2008;13:16-24
【非特許文献５】Yamamoto & Oelgeschlager、Naturwissenschaften. 2004;91:519-34
【非特許文献６】Yanagita、Cytokine Growth Factor Rev.2005;16:309-17
【非特許文献７】Bottcher & Niehrs、Endocr Rev. 2005;26:63-77
【非特許文献８】eye field transcription factors ;Zuber、et al., Development. 2003;130:5155-67
【非特許文献９】Bertrand & Dahmane、Trends Cell Biol.2006;16:597-605
【非特許文献１０】Connors et al.,1982;McCormick & Prince、1987
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の一つの目的は、（ａ）ＩＧＦ１Ｒ（insulin-like growth factor-1 receptor
）活性剤及びＷｎｔシグナル伝達経路活性剤を含む培地中で網膜前駆細胞を培養して未熟な網膜神経節細胞に分化させる段階と、（ｂ） 未成熟網膜神経節細胞を、段階（a）の培地からＷｎｔシグナル伝達経路活性剤を除去し、それにＩＧＦ１Ｒ活性剤を添加することによって調製した培地中で培養する段階と、を含む幹細胞を成熟網膜神経節細胞に分化することにより、成熟網膜神経節細胞を製造する方法を提供することにある。
【０００６】
本発明の他の目的は、未成熟網膜神経節細胞をＩＧＦ１Ｒ活性剤及びＳｈｈ（sonic hedgehog）シグナル伝達経路活性剤を含む培地で培養する段階を含む、未成熟網膜神経節細胞を成熟網膜神経節細胞に分化させ、成熟網膜神経節細胞を製造する方法を提供することにある。
【０００７】
本発明のもう一つの目的は、（ａ）前述の方法で得られ、分離された成熟網膜神経節細胞を成熟網膜神経節細胞の死滅抑制又は増殖促進候補物質で処理する段階と、（ｂ）非候補治療群と比較して、前記候補物質が成熟網膜神経節細胞の死を阻害するか、又は成熟網膜神経節細胞の増殖を促進する場合、前記候補物質が成熟網膜神経節細胞の死滅阻害剤又
は増殖促進剤であると 判定する段階と、を含む成熟網膜神経節細胞の死滅抑制物質又は
増殖促進物質をスクリーニング方法を提供することにある。
【０００８】
本発明のもう一つの目的は、前述した本発明の方法により製造された未成熟網膜神経節細胞及び成熟網膜神経節細胞を提供することにある。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、前記成熟網膜神経節細胞を含む、成熟網膜神経節細胞の死滅抑制物質又は増殖促進物質をスクリーニングするためのキットを提供することにある。
【００１０】
本発明のもう一つの目的は、成熟網膜神経節細胞を含む、緑内障又は視神経病症の治療用薬学的組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明のもう一つの目的は、緑内障又は視神経病症の疑いのある個体に成熟網膜神経節細胞を投与する段階を含む、緑内障又は視神経病症の治療方法を提供することにある。 
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、（ａ）網膜前駆細胞をＩＧＦ１Ｒ活性剤及びＷｎｔシグナル伝達経路活性剤を含む培地中で培養して未成熟網膜神経節細胞に分化させる段階と、（ｂ）前記（ａ）段階の培地からＷｎｔシグナル伝達経路活性剤を除去し、ＩＧＦ１Ｒ活性剤を添加して製造した培地で未成熟網膜神経節細胞を培養する段階と、を含む成熟網膜神経節細胞株を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記目的を達成するために、本発明の一つの態様として、（ａ）網膜前駆細胞をＩＧＦ１Ｒ（insulin-like growth factor-1 receptor）活性剤及びＷｎｔシグナル伝達経路活
性剤を含む培地で培養して未成熟網膜神経節細胞に分化させる段階と、（ｂ）前記（ａ）段階の培地からＷｎｔシグナル伝達経路活性剤を除去し、ＩＧＦ１Ｒ活性剤を添加して製造した培地で未成熟網膜神経節細胞を培養する段階と、を含む幹細胞を成熟網膜神経節細胞に分化させ、成熟網膜神経節細胞を製造する方法を提供する。
【００１４】
網膜（retina）は、脊椎動物の中枢神経系内で最もよく研究された器官であり、詳細な形態、神経のシナプス連結、各網膜神経細胞の生理学的現象が数十年間調べられていた。しかし、これとは反対に、網膜神経細胞の構造的の発生及びそれらの多様な機能的メカニズムについてはまだ多くの部分が明らかになっていない。
【００１５】
用語、「網膜神経節細胞（retinal ganglion cells、RGCs）」とは、脊椎動物の網膜内に存在する出力（output）神経細胞であり、細胞の軸索（axon）は視神経を形成し、大脳に画像を送る。網膜神経節細胞は、神経系の構成単位であるニューロン、即ち、神経細胞であり、多数の樹状突起と１つの長い繊維性軸索を有する。樹状突起は、他の細胞とシナプスを形成し、神経細胞の電気活性を調節して細胞体内に流れてくる電気的刺激を送信する。軸索は、神経刺激に応答して神経伝達物質を放出する顆粒又は小胞を含む多くの分枝末端を有し、シナプスは、ニューロン間のインパルス伝達のポイントである。神経伝達物質と呼ばれる化学物質は、シナプス間隙を通過し、神経インパルスが維持される。発生過程の中、網膜神経節細胞は多能性網膜前駆細胞から産生される。例えば、マウスの場合、胎生期１１．５日（embryonic day(E)11.5）から開始し、出生時０まで（postnatal day(P)0）生成され、Ｅ１４．５にその生成がピークに至る。主要な増殖期はＥ１４．５〜Ｅ
１７．５の間であることが知られているが、これは動物に応じて変化するが、これに限定されない。
【００１６】
前記網膜神経節細胞は、網膜の多様な細胞から視覚情報を脳の視神経の中心に伝達するように機能する。目を通過した光は、光受容体細胞で電気信号に変換され、生成された電
気信号は、網膜の多様な神経細胞を経て網膜神経節細胞に伝達される。網膜神経節細胞は、この信号を受けて脳の視神経中枢に伝達する役割を果たす。
【００１７】
網膜神経節細胞の発生は、系統的な遺伝子調節ネットワークにより調節され、 主要な
転写因子により発生及び分化が 媒介される
【００１８】
前記網膜神経節細胞は、分化の程度に応じて、未成熟網膜神経節細胞及び成熟網膜神経節細胞に分けることができる。
【００１９】
前記「未成熟網膜神経節細胞」とは、細胞形態学的特徴及び網膜神経節細胞のタンパク質及び遺伝的マーカー特性を獲得する細胞をいう（非特許文献２）。 前記「成熟網膜神
経節細胞」とは、「未成熟網膜神経節細胞」の前記特性をすべて備えた以降のニューロンとして成熟された状態を示す細胞を意味する。即ち、形態学的特徴には、軸索成長、軸索枝化及び軸索リング；樹状突起枝化、樹状突起の階層化、樹状突起のリング；樹状突起の棘突起、シナプスボタン（synaptic bouton）などを有し、プレシナプス又はポストシナ
プスタンパク質形態のタンパク質及び遺伝的マーカー特徴、及び興奮性神経としての様々な受容体特性を示す。「成熟網膜神経節細胞」の電気生理学的な特徴は、自発性の興奮性ポストシナプスの電流（spontaneous excitatory postsynaptic currents、sEPSCs)）の
形成であり、これは、網膜神経節細胞間のシナプスの連結を形成することができる機能的な成熟を意味する（非特許文献３ ）。
【００２０】
前記「未成熟網膜神経節細胞」とは、網膜前駆細胞から網膜神経節細胞への分化の初期段階の細胞を意味する。そのような未成熟網膜神経節細胞は、網膜前駆細胞から網膜神経節細胞になる細胞、又は網膜神経節細胞になる細胞であるが、成熟網膜神経節細胞の形態学的特性及び生理学的特性を完全に有さない細胞である。本発明において、前記未成熟網膜神経節細胞及び早期網膜神経節細胞は混用される。
【００２１】
前記「成熟網膜神経節細胞」とは、網膜前駆細胞から網膜神経節細胞への分化の後期段階の網膜神経節細胞、又はすでに分化された網膜神経節細胞をいう。前記成熟網膜神経節細胞は、高周波活動電位を発生する生理学的特性及び長い軸索を有する形態学的特性を有するが、これらに限定されない。 
【００２２】
網膜神経節細胞が未成熟網膜神経節細胞であるか成熟網膜神経節細胞であるかは、それぞれの細胞に特異的なマーカーの発現レベル、並びに、その形態学的及び生理学的特性（例えば、電気化学的特性）を同定することによって決定することができる。
【００２３】
まず、網膜神経節細胞の発生及び分化において重要な役割を担う転写因子は以下のとおりである。網膜神経節細胞の生成に関与する転写因子として、ＡＴＯＨ７（Math5）、Ｂ
ｒｎ３ファミリー（Brn3A、Brn3B、Brn3C）及びＩｓｌ１（Islet-1）がある。
【００２４】
Ｍａｔｈ５とも命名されるＡＴＯＨ７は、網膜前駆細胞が網膜神経節細胞になる運命を決定する因子であり、網膜神経節細胞の形成に必須である。したがって、Ｍａｔｈ５は、好ましくは未成熟網膜神経節細胞で発現される。
【００２５】
また、遺伝子ネットワーク上、ＡＴＯＨ７の下流に位置するＰＯＵ４Ｆ２とＰＯＵ４Ｆ１（又はそれぞれＢｒｎ３ＢとＢｒｎ３Ａとも呼ばれる）及びＩｓｌ１（Islet-1）は、
ＲＧＣの発生には必要ではないことが知られており、ＲＧＣの分化及び生存のために必要であることが知られている。それらは、網膜神経節細胞の分化の初期段階で発現され、成熟網膜神経節細胞においても発現されることが知られている。
【００２６】
具体的には、Ｂｒｎ３ファミリーは、ＲＧＣ分化の調節、ＲＧＣの樹状突起の階層化、及び発生中のＲＧＣｓ軸索の突出に関与する。Ｂｒｎ３ファミリー中、Ｂｒｎ３ＢはＲＧＣ発生中の初期に発現され、ＲＧＣの初期マーカーの一つであり、ＲＧＣの軸索成長及び生存に重要な因子として作用する。
【００２７】
マウスにおいて、Ｂｒｎ３Ａの発現は、胎生期１２．５（Ｅ１２．５）から開始され、ラットにおいては、ＲＧＣ個体数の９２．２％で発現する。Ｂｒｎ３Ｂは、ＲＧＣ軸索の形成に作用するのに対し、Ｂｒｎ３Ａは樹状突起の形成に関与することが知られている。
【００２８】
Ｉｓｌ１は、網膜発生中に発現されるホメオドメインのＬＩＭタンパク質である。Ｉｓｌ１遺伝子は、ＲＧＣｓの生成直後に活性化され、発現は胎生期（embryonic day、E）１４．５前のＰＯＵ４Ｆ２の発現と同一である。また、 Ｉｓｌ１は、ＲＧＣの分化及び生
存に必要とされる因子であり、その発現はＡＴＯＨ７により影響を受ける。Ｉｓｌ１の発現は、完全に分割された細胞においてマウス胎生期（embryonic day、E）１１．５で開始され、Ｂｒｎ３Ｂ陽性ＲＧＣ細胞の一部でＢｒｎ３Ｂと共発現することが知られている。
【００２９】
前記の転写因子は、網膜神経節細胞の生成に重要な役割を果たし、そのため、未成熟網膜神経節細胞は、（１）Ｍａｔｈ５及び／又は、（２）Ｂｒｎ３Ｂ、Ｂｒｎ３Ａ及びＩｓｌｅｔ１からなる群から選択された１つ、具体的には、２つ、より具体的には、３つを発現することができる。また、これらマーカー遺伝子の発現は、網膜前駆細胞に比べて発現が増加していることができるが、これに限定されない。
【００３０】
また、前記未成熟網膜神経節細胞は、ＮＦ２００又は／及びＴｕｊ１が発現する細胞であってもよい。ＮＦ２００は、ニューロフィラメント２００ｋＤａと命名されるタンパク質であり、網膜神経節細胞の分化初期から発現する。また、Ｔｕｊ１も網膜神経節細胞の分化初期から発現することが知られている。したがって、これら２つの両遺伝子は、網膜神経節細胞、具体的には、未成熟網膜神経節細胞及び成熟網膜神経節細胞を区別するために使用されてもよいが、これらに限定されるものではない。また、成熟網膜神経節細胞に特異的なマーカー遺伝子には、Ｔｈｙ１．２、ＴｒｋＢ、ＮＭＤＡＲ１、Ｍａｐ２、Ｖｇｌｕｔ１、ＰＳＤ−９５、シナプトフィジン（Synaptophysin）及びシナプシン１（Synapsin1）がある。これら遺伝子は、成熟網膜神経節細胞で発現することが知られているマーカー遺伝子である。
【００３１】
したがって、成熟網膜神経節細胞は、Ｂｒｎ３Ｂ、Ｂｒｎ３Ａ、Ｉｓｌｅｔ−１、ＮＦ２００、Ｔｕｊ１、Ｔｈｙ１．２、ＴｒｋＢ、ＮＭＤＡＲ１、Ｍａｐ２、Ｖｇｌｕｔ１、ＰＳＤ−９５、シナプトフィジン（Synaptophysin）及びシナプシン１（Synapsin1）からなる群から選択された１つ、具体的には２つ、より具体的には３つ、より具体的には４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ及び１０個のマーカー遺伝子を発現してもよいが、これに限定されない。また、成熟網膜神経節細胞は、網膜前駆細胞又は未熟網膜神経節細胞と比較して、これら遺伝子の高発現を示すことができるが、これに限定されない。
【００３２】
本発明の方法は、未成熟網膜神経節細胞を介して網膜前駆細胞を成熟網膜神経節細胞に高収率で分化させる方法であって、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性剤を含む培地で網膜前駆細胞を培養して未成熟網膜神経節細胞に分化させ、 未成熟網膜神経節細胞を、Ｗｎｔシ
グナル伝達経路活性剤を含まない培地中で成熟網膜神経節細胞に分化させる。すなわち、本発明の技術的特徴は、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性剤を用いて特定の分化段階で幹細胞を処理することにより幹細胞の網膜神経節細胞への運命を決定し、様々な網膜細胞集団の６０％〜９５％又はそれ以上を、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性剤を除去することによって成熟網膜神経節細胞に分化させる。成熟網膜神経節細胞への高効率の分化を誘導するこの方法は、本発明によって初めて開発された。
【００３３】
本発明の方法について具体的に記述すると、下記のとおりである。
【００３４】
本発明の方法において、（ａ）段階は、網膜前駆細胞をＩＧＦ１Ｒ活性剤及びＷｎｔシグナル伝達経路活性剤を含む培地で培養し、未成熟網膜神経節細胞に分化させる段階である。（ａ）段階は１〜１０日間行われることができるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
本発明における用語、「網膜前駆細胞（retinal progenitor cell）」とは、網膜又は
網膜色素上皮細胞に存在する細胞に分化することができる多分化能前駆細胞をいう。前記網膜前駆細胞は、Ｒａｘ、Ｐａｘ６、Ｃｈｘ１０、Ｏｔｘ２、Ｓｏｘ２、Ｌｈｘ２、Ｓｉｘ３、Ｓｉｘ６及びＭｉｔｆからなる群から選択されたマーカーから構成される群から選択される１つ、２つ、又は３つ以上のマーカーが発現する特徴があり、特にＲａｘ及びＰａｘ６が１つ又は２つ発現するが、これに限定されない。
【００３６】
網膜発生と関連して、前述したように、網膜前駆細胞は、様々な種類の網膜内細胞（ロッド及びコーン光受容体細胞、網膜神経節細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、ミューラーグリア細胞など）と、Ｃｒｘ、リカバリン、ロドプシン、赤／緑オプシン、青オプシン、ペリフェリン２、ＰＤＥ６Ｂ、ＳＡＧ、Ｉｓｌｅｔ１／ＮＦ２００、Ｐｒｏｘ１、ＰＫＣ−ａ、Ｈｕ  Ｃ／Ｄ、ＧＦＡＰ、ＺＯ−１及びＲＰＥ６５のようなマーカーの陽性発現を特徴とする網膜色素上皮細胞に分化することができる。しかし、これらマーカーの発現レベル及び陽性率は、成熟網膜細胞又は網膜色素上皮細胞よりも網膜前駆細胞において弱くなるが、これに限定されない。
【００３７】
前記網膜前駆細胞を未成熟網膜神経節細胞に分化させるための培地は、ＩＧＦ１Ｒ活性剤及びＷｎｔシグナル伝達経路活性剤を全て含むことを特徴とする。また、前記網膜前駆細胞を未成熟網膜神経節細胞に分化させるための培地は、これに限定されないが、ＩＧＦ１Ｒ活性剤及びＷｎｔシグナル伝達経路活性剤以外にも、ＢＭＰ（bone morphogenetic protein）シグナル伝達経路阻害剤及びＦＧＦ（fibroblast growth factor）シグナル伝達経路活性剤を含むものであり得る。また、前記培地は、前述の物質以外に、１％のＢ２７サプリメント及び１％のＮ２サプリメント（N2 supplement）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培
地であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
本発明における用語、「ＩＧＦ１Ｒ活性剤」とは、チロシンキナーゼ受容体ファミリーの一種であるＩＧＦ−１受容体（insulin-like growth factor-1 receptor、ＩＧＦ１Ｒ
）を活性化する物質を指す。活性化されたＩＧＦ１Ｒはインスリン受容体基質（insulin receptor substrate、IRS）とで相互作用する。次に、ＩＧＦ１Ｒによって活性化される
ＩＲＳは、 ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ｍＴＯＲからなる一方の経路とＲａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫ
からなる他方の経路の活性剤として作用する（非特許文献４）。ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２はＩＧＦ１Ｒ活性剤の範囲内にある。インスリンに類似した分子構造を有するＩＧＦ−１は、細胞成長、細胞増殖、分化、及び細胞死滅などに関与するが、これに制限されない。
【００３９】
本発明において、前記ＩＧＦ１Ｒ活性剤は、ＩＧＦ１Ｒを活性化させる物質であれば制限なく使用することができ、その例としてＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２があり、具体的には、ＩＧＦ−１であるが、これに制限されるものではない。
【００４０】
前記網膜前駆細胞を未成熟網膜神経節細胞に分化させるために用いた培地は、具体的には０．０１〜１００ｎｇ／ｍｌであり、より具体的には０．１〜５０ｎｇ／ｍｌ、より具体的には１〜２０ｎｇ／ｍｌであり、最も具体的には１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＧＦ１Ｒ
活性剤を含むが、これに限定されない。
【００４１】
本発明における用語、「Ｗｎｔシグナル伝達経路活性剤」とは、細胞運命の決定、組織の再構築、極性、形態、接着及び増殖、及び未分化細胞の維持及び増殖を含む、胚形成中の様々なプロセスを調節することが知られているＷｎｔシグナル伝達経路を活性化する物質を意味する。任意の活性剤は、 Ｗｎｔ媒介シグナル又はβカテニン媒介シグナルを 伝達することができる限り、制限なくＷｎｔシグナル伝達経路内に含まれ得る。Ｗｎｔシグナル伝達経路は、Ｗｎｔシグナル伝達経路の第１トリガーであるＷｎｔがその受容体に結合することによって、又は細胞内Ｗｎｔシグナル伝達の下流標的であるβ-カテニンの安
定化によって媒介される一連のプロセスである。前記Ｗｎｔシグナル伝達経路活性剤は、特にこれに限定されないが、以下のとおりである。
【００４２】
１）Ｗｎｔタンパク質の直接添加：Ｗｎｔシグナル伝達経路の第１トリガーであるＷｎｔは分泌性糖タンパク質のファミリーであり、１９種類が知られている：Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１及びＷｎｔ１６ｂ。
【００４３】
２） β−カテニンのレベルの増加：ほとんどの細胞は、β−カテニンのレベルの増加
によりＷｎｔシグナル伝達経路に反応する。即ち、脱リン酸化されたβ−カテニンのレベル（又は安定化）の増加は、核内のβ−カテニンの転座を意味する。
【００４４】
３）Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄリン酸化またはＷｎｔの補助受容体であるＬＲＰ尾のリン酸化。 
【００４５】
４）グリコーゲンシンターゼキナーゼ（glycogen synthase kinase 3、GSK3）阻害剤：リチウム（Ｌｉ）、ＬｉＣｌ、２価の亜鉛、ＢＩＯ（6-bromoindirubin-3’-oxime）、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＱＳ１１水和物、ＴＷＳ１１９、ケンパウロン（Kenpaullone）、アルスターパウロン（alsterpaullone）、インジルビン−３−オキシム（Indirubin-3’-oxime）、ＴＤＺＤ−８及びＲｏ  ３１−８２２０メタンスルホン酸塩（Ro
31-8220 methanesulfonate salt）。
【００４６】
５）Ａｘｉｎ及びＡＰＣのようなＷｎｔシグナル伝達経路の陰性調節因子 の抑制、又
はＲＮＡｉ使用。
【００４７】
６）ノリン（Norrin）及びＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２のようなＷｎｔシグナル伝達経路を活性剤：ノリンはＦｒｉｚｚｌｅｄ  ４受容体と結合し、Ｒ−スポンジン２は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ８及びＬＲＰ６と相互作用する。
【００４８】
７）トランスフェクションを含む遺伝子導入：Ｗｎｔ過発現構成物又は β−カテニン
過発現構成物を使用してもよい。
【００４９】
本発明において、前記Ｗｎｔシグナル伝達経路活性剤は、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化させることができる物質であれば、制限なく使用することができる。具体的には、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６ｂ；β−カテニンを増加させる物質；リチウム、ＬｉＣｌ、２価の亜鉛、ＢＩＯ、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＣＨＩＲ９９０２１、ＱＳ１１水和物、ＴＷＳ１１９、ケンパウロン、アルスターパウロン、インジルビン−３−オキシム、ＴＤＺＤ−８又はＲｏ  ３１−８２２０メタ
ンスルホン酸塩のようなＧＳＫ３阻害剤；Ａｘｉｎ阻害剤、ＡＰＣ阻害剤、ノリン又はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２であり、より具体的には、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ１１、ノリン、ＬｉＣｌ、ＢＩＯ又はＳＢ４１５２８６であるが、特にこれに限定されるものではない。
【００５０】
未成熟網膜神経節細胞への網膜前駆細胞の分化誘導に用いられるＷｎｔシグナル伝達経路活性剤は、ＬｉＣｌ、ＢＩＯ及びＳＢ４１５２８６を除いた０．０１〜５００ｎｇ／ｍｌであり、具体的には０．１〜２００ｎｇ／ｍｌであり、より具体的には１〜１００ｎｇ／ｍｌである。前記Ｗｎｔシグナル伝達経路活性剤のうち、培地中のＬｉＣｌの含量は０．１〜５０ｍＭであり、具体的には０．５〜１０ｍＭであり、より具体的には１〜１０  ｍＭであり；ＢＩＯの含量は０．１〜５０μＭであり、具体的には０．１〜１０μＭであり、より具体的には０．５〜５μＭであり；ＳＢ４１５２８６の含量は０．１〜５００μＭであり、具体的には１〜１００μＭであり、より具体的には５〜５０μＭである。
【００５１】
本発明における用語、「ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤」とは、ＢＭＰシグナル伝達経路を阻害することができる物質群を意味する。ＢＭＰは、ＴＧＦ−β（transforming growth factor-β）スーパーファミリーに属するシグナル伝達経路のタンパク質であり、早
期胎児分化、胎生期の組織形成及び成体組織の恒常性に含まれている。細胞外に分泌されたＢＭＰは、タイプＩとタイプＩＩセリン／トレオニンキナーゼ受容体に結合してＢＭＰシグナル伝達経路を開始する。タイプＩＩ受容体は、タイプＩ受容体をリン酸化させ、リン酸化されたタイプＩ受容体は、細胞内の基質であるＳｍａｄタンパク質をリン酸化させ、細胞内シグナル伝達経路を媒介する。受容体により調節されるＳｍａｄタンパク質はＲ−Ｓｍａｄ（Receptor regulated Smad）といい、Ｓｍａｄ−１、２、３、５、及び８が
Ｒ−Ｓｍａｄに属する。それらは細胞内共通パートナーＳｍａｄ（Co-Smad）Ｓｍａｄ−
４に結合することができる。それらは核内に移動して蓄積し、そこで転写因子として作用し、標的遺伝子発現の調節に関与する （非特許文献５）。ＢＭＰシグナル伝達経路阻害
剤は、細胞表面受容体への細胞外ＢＭＰの結合を阻止する物質を指す。ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤の例としては、ノギン（Noggin）、コーディン（Chordin）、ツイスト嚢胚
形成因子（Twisted gastrulation、Tsg）、サーベラス（Cerberus）、ココ（Coco）、グ
レムリン（Gremlin）、ＰＲＤＣ（protein related to DAN and Cerberus）、ＤＡＮdifferential screening-selected gene aberrative in neuroblastoma）、ダンテ（dante）
、ホリスタチン（follistatin）、ＵＳＡＧ−１（uterine sensitization-associated gene 1）、ドルソモルフィン（dorsomorphin）又はスクレロスチン（Sclerostin）が含まれる。ＢＭＰシグナル伝達を阻害することにより、ノギンは、神経誘導及び背側神経外胚葉又は中胚葉の腹腔内での重要な役割を果たす。ノギンはＢＭＰｓグループである、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−７と結合し、これらＢＭＰがそれらの受容体に結合することを妨げる（非特許文献６）。
【００５２】
本発明において、いかなるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＢＭＰシグナル伝達経路を阻害させることができる限り、制限なく使用することができる。その例としては、ノギン、コーディン、ツイスト嚢胚形成因子、サーベラス、ココ、グレムリン、ＰＲＤＣ、ＤＡＮ、ダンテ（dante）、ホリスタチン（follistatin）、ＵＳＡＧ−１（uterine sensitization-associated gene 1）、ドルソモルフィン（dorsomorphin）又はスクレロスチン
であってもよいが、これらに限定されない。本発明の一実施例では、ノギンを使用した。
【００５３】
本発明において、前記網膜前駆細胞を未成熟網膜神経節細胞に分化させる培地に使用されるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤の濃度は０．０１〜１００ｎｇ／ｍｌであり、具体的には０．１〜５０ｎｇ／ｍｌであり、より具体的には０．５〜２０ｎｇ／ｍｌであり、最も具体的には１０ｎｇ／ｍｌであるが、特にこれに限定されるものではない。
【００５４】
本発明における用語、「ＦＧＦシグナル伝達経路活性剤」とは、ＦＧＦシグナル伝達経路を誘導又は促進することができる物質を意味する。ＦＧＦは、細胞増殖及び細胞分化をはじめ、血管形成、骨形態形成及び神経誘導を含む有糸分裂誘発に関与する因子である。今まで、２２種類のＦＧＦファミリーが知られていて、ＦＧＦ受容体ファミリー（ＦＧＦＲ）の４種類が存在する。 それらのｍＲＮＡは、選択的にスプライシングされた受容体
異形に結合してＦＧＦ受容体を活性化する。活性化されたＦＧＦＲは細胞質内のＲａｓ/
Ｒａｆ/ＭｅＫ経路を介してシグナルを媒介してＭＡＰキナーゼを活性化し、次にシグナ
ル伝達を誘導する（非特許文献７）。ＦＧＦファミリー中、ＦＧＦ２はｂａｓｉｃ  ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）とも呼ばれ、主にＦＧＦＲ  １ｂ、ＦＧＦＲ  １ｃ、ＦＧＦＲ  ２ｃ、ＦＧＦＲ  ３ｃ、ＦＧＦＲ４Δに結合し、特にＦＧＦＲ  １ｃ及びＦＧＦＲ  ３ｃを強く活性化させる。ＦＧＦＲ  １ｃ及びＦＧＦＲ  ３ｃの活性剤、ＦＧＦ１、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９などを代替物質として使用することができるが、これに限定されない。
【００５５】
本発明において、任意のＦＧＦシグナル伝達経路活性剤は、ＦＧＦシグナル伝達を刺激することができる限り、制限なく使用され得る。その例としてＦＧＦＲ  １ｃ又はＦＧＦＲ  ３ｃを活性剤として含んでもよく、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１７又はＦＧＦ１９などがあるが、これらに限定されない。本発明の一実施例では、ＦＧＦ２を使用した。
【００５６】
本発明において、前記網膜前駆細胞から未成熟網膜神経節細胞へと分化を誘導させる培地に使用されるＦＧＦシグナル伝達経路活性剤の濃度は０．０１〜１００ｎｇ／ｍｌであり、具体的には０．１〜５０ｎｇ／ｍｌであり、より具体的には１〜２０ｎｇ／ｍｌであり、最も具体的には５ｎｇ／ｍｌであるが、特にこれに限定されるものではない。
【００５７】
また、前記（ａ）段階の網膜前駆細胞は、幹細胞をＩＧＦ１Ｒ活性剤、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤を含む培地で培養し、浮遊凝集体の形態の眼球領域前駆体（eye field precursor）に分化させる（a'）段階；及び（a'）段階
の浮遊凝集体の形態の眼球領域前駆体を、（a'）段階の培地にＦＧＦシグナル伝達経路活性剤を添加して調製した培地中で培養して網膜前駆細胞に分化させる(ｂ')段階により得
ることができる。
【００５８】
幹細胞は、網膜前駆細胞に分化することができれば特に限定されず、骨髄幹細胞（bone
marrow stem cell、ＢＭＳ）、臍帯幹細胞（cord blood stem cell）、羊水性幹細胞（amniotic fluid stem cell）、脂肪幹細胞（fat stem cell）、網膜幹細胞（retinal stem
cell、RSC）、網膜内ミューラー膠細胞、胚性幹細胞（embryonic stem cell、ESC）、誘導多能性幹細胞（induced pluipotent stem cell、iPSC）及び体細胞核移植幹細胞（somatic cell nuclear transfer cell、SCNT）からなる群から選択されるものであり得る。
【００５９】
これら幹細胞は、ＩＧＦ１Ｒ活性剤、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤を含む培地で培養することにより、眼球領域前駆体に分化させることができる。ここで、ＩＧＦ１Ｒ活性剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤及びその濃度は、未成熟網膜神経節細胞への分化を誘導するために使用される前記培地におけるものと同じである。
【００６０】
本発明における用語、「Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤」とは、細胞外Ｗｎｔタンパク質と膜タンパク質Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体又は共受容体ＬＲＰとの間の相互作用を妨害するか、又は細胞内Ｗｎｔ媒介シグナル伝達を阻害する因子をいう。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤は、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達経路を抑制するものであれば、特に限定されない。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤の例は、共受容体ＬＲＰの抑制剤である、Ｄ
ｋｋ（Dickkopf）ファミリー（Dkk-1、Dkk-2、Dkk-3及びDkk-4）、Ｗｉｓｅ、Ｗｎｔ受容体阻害剤（sFRP:secreted Frizzled-related protein）ファミリー、ＦｒｉｚｚｌｅｄのＣＲＤ結合ドメイン（Frizzled-CRD domain）、ＷＩＦ−１（Wnt inhibitory factor-1）、ＩＷＰ−２、ＩＷＰ−３、ＩＷＰ−４、サーベラス、Ｗｎｔ抗体、ドミナントネガティブＷｎｔタンパク質、Ａｘｉｎの過発現、ＧＳＫ（グルコゲン合成酵素キナーゼ）の過発現、ドミナントネガティブＴＣＦ、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄドミナントネガティブ又はカゼインキナーゼ阻害剤（ＣＫＩ−７、Ｄ４４７６など）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の実施例では、Ｄｋｋ−１を使用した。
【００６１】
さらに、Ｗｎｔシグナル伝達は、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤に加えて、ＲＮＡｉのようなＷｎｔ経路に関与する各成分を抑制することによって阻害され得る。
【００６２】
該培地において、幹細胞を眼領域前駆細胞を介して網膜前駆細胞に分化させるために使用されるＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤の濃度は、０．０１〜１０，０００ｎｇ／ｍｌであり得るが、特にこれに限定されるものではない。 
【００６３】
本発明における用語、「眼球領域前駆体（eye field precursor）」とは、 胎児発生期分化過程で前脳神経板の眼球領域の前駆体に見出される特定のマーカー（眼球領域転写因子；非特許文献８）を発現する細胞を指す。前記眼球領域前駆体は、Ｓｉｘ３、Ｒａｘ、Ｐａｘ６、Ｏｔｘ２、Ｌｈｘ２及びＳｉｘ６からなる群から選択されたマーカーが１つ以上、２つ以上、又は３つ以上発現する特徴を有することができるが、これに限定されない。
【００６４】
前記眼球領域前駆体は、浮遊凝集体の形態を有する。ここで、前記浮遊凝集体は、胚芽幹細胞のコロニーをマウス繊維芽細胞（embryonic fibroblasts、ＭＥＦ）栄養細胞株及
び血清の供給なしに非接着性の培養器で少なくとも１日間培養したときに形成される培地内の浮遊細胞塊をいう。供給される培地の組成に応じて、前記眼球領域前駆体は眼球領域転写因子を発現することができる。
【００６５】
また、（ａ’）段階は１日〜３０日間行われ、そして（ｂ’）段階は５日〜１５日間行われることができるが、これに限定されない。
【００６６】
本発明において、（ｂ’）段階の眼球領域前駆体の浮遊凝集体は、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、ポリ−Ｌ−リジン、マトリゲル（matrigel）、アガー（agar）、ポリオルニチン（polyornithine）、ゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチン（fibronectin）及びビトロネクチン（vitronectin）からなる群から選択される細胞外基質でコーティングされ
たプレートに接着された状態で培養されるものであり得る。
【００６７】
前記プレートに接着する浮遊凝集体当たりの細胞群は、最適の効率を示す細胞数である。眼球領域前駆体の浮遊凝集体は２００〜４００個の細胞で構成されてもよいが、これに限定されない。
【００６８】
また、前記（ａ’）段階の培地は、ＩＧＦ１Ｒ活性剤、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤以外にも、１０％のノックアウト血清代替剤及び１％のＢ２７サプリメントをさらに含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地であり得る。
【００６９】
一方、前記（ｂ’）段階の培地は、前述のＩＧＦ１Ｒ活性剤、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤及びＦＧＦシグナル伝達経路活性剤以外にも、１％のＢ２７サプリメント及び１％のＮ２サプリメントをさらに含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地であり得る。
【００７０】
本発明の方法において、（ｂ）段階は、（ａ）段階で分化した未成熟網膜神経節細胞を培養する段階である。未成熟網膜神経節細胞は（ｂ）段階を通じて成熟網膜神経節細胞に分化することができる。
【００７１】
成熟網膜神経節細胞への高効率の分化のために、（ｂ）段階で使用される培地は（ａ）段階の培地に含まれていたＷｎｔシグナル伝達経路活性剤が含まれていないことを特徴とする。
【００７２】
より具体的には、（ｂ）段階は、（ａ）段階の培地からＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦシグナル伝達経路活性剤及びＷｎｔシグナル伝達経路活性剤を除去することにより製造された培地で、前記（ａ）段階の細胞を培養する段階であり、より具体的には、（ａ）段階の培地からＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦシグナル伝達経路活性剤及びＷｎｔシグナル伝達経路活性剤を除去し、Ｓｈｈ（sonic hedgehog）シグナル伝達経路活性剤をさらに添加して製造した培地で前記（ａ）段階の細胞を培養する段階であり得る。
【００７３】
また、（ｂ）段階は、（ｉ）（ａ）段階の培地からＷｎｔシグナル伝達経路活性剤を除去し、ＩＧＦ１Ｒ活性剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤及びＦＧＦシグナル伝達経路活性剤を含む培地で未成熟網膜神経節細胞を培養する段階と、（ｉｉ）（ｉ）段階の培地からＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤及びＦＧＦシグナル伝達経路活性剤を除去し、Ｓｈｈ(sonic hedgehog) シグナル伝達経路活性剤をさらに添加した培地で未成熟網膜神経節細胞
を培養する段階を含むものであり得る。
【００７４】
一方、本発明で使用される用語、「除去」とは、除去の対象となる物質を含まない培地を使用するという意味と解釈することができる。
【００７５】
また、前記培地は、前述の物質以外に、１％のＢ２７サプリメント及び１％のＮ２サプリメントを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地であることができるが、これに限定されない。
【００７６】
本発明における用語、「Ｓｈｈ（sonic hedgehog）シグナル伝達経路活性剤」とは、Ｓｈｈシグナル伝達経路を誘導又は活性化する物質をいう。Ｓｈｈは、胚発生期中、細胞の運命決定、極性、形態、増殖、分化などの多様な過程を調節するシグナル伝達経路物質として知られている（非特許文献９）。Ｓｈｈシグナル伝達経路は、２つの膜貫通タンパク質であるＰｔｃ（Patched）及びＳｍｏ（Smoothened）含む。Ｓｈｈがない場合、Ｐｔｃ
はＳｍｏと相互作用してＳｍｏを阻害する。一方、Ｓｈｈが存在する場合、ＳｈｈはＰｔｃと結合し、Ｓｍｏはもはや抑制されず、細胞質内のＣｉ/Ｇｌｉタンパク質は核内に流
入され、標的遺伝子の転写活性剤として作用する。Ｓｈｈシグナル伝達経路活性剤は、Ｓｈｈにより媒介されるシグナル伝達経路を増強することができるものであれば、特に限定されない。Ｓｈｈシグナル伝達経路活性剤としては、例えば、ヘッジホッグファミリーに属するタンパク質（例えば、Ｓｈｈ）、Ｓｍｏに対するＰｔｃの抑制作用の阻害剤、Ｓｍｏ受容体の活性剤、Ｓｈｈ受容体活性剤（例えば、Ｈｇ−Ａｇ、プルモルファミン（Purmorphamine）など）、Ｃｉ／Ｇｌｉファミリーレベルを増加させる物質、Ｃｉ／Ｇｌｉタ
ンパク質の細胞内分解抑制剤、及びトランスフェクションによるＳｈｈ過発現構成物又はＣｉ／Ｇｌｉ過発現構成物などを含むことができる。
【００７７】
本発明において、Ｓｈｈシグナル伝達経路を活性化させるものであれば、いかなるＳｈｈシグナル伝達経路活性剤も使用することができる。例えば、Ｓｈｈ、Ｓｍｏ受容体の活性剤、Ｓｍｏに対するＰｔｃの抑制作用の阻害剤、Ｃｉ／Ｇｌｉファミリーレベルを増加させる物質、Ｃｉ／Ｇｌｉ因子の細胞内分解阻害剤、及びＳｈｈ受容体活性剤であるＨｇ−Ａｇ又はプルモルファミンを含んでもよいが、これに限定されない。前記Ｓｈｈシグナ
ル伝達経路活性剤のより具体的な例としては、Ｓｈｈ又はプルモルファミンを挙げることができる。
【００７８】
本発明において、成熟網膜神経節細胞を未成熟網膜神経節細胞に分化させるために使用された培地内のＳｈｈシグナル伝達経路活性剤の濃度は０．１〜５０００ｎｇ／ｍｌであり、具体的には１〜２，５００ｎｇ／ｍｌであり、より具体的には１０〜１，０００ｎｇ／ｍｌであり、最も具体的には２５０ｎｇ／ｍｌであるが、特にこれに限定されない。
【００７９】
（ｂ）段階は１〜１２０日間行うことができる。
【００８０】
成熟網膜神経節細胞への高効率の分化のために、前記方法は、前記（ｂ）段階の培地にＲＡ（retinoic acid）を添加して製造した培地で、（ｂ）段階で培養された細胞を培養
する段階をさらに含むことができる。
【００８１】
本発明における用語、「ＲＡ（retinoic acid）」とは、親油性（lipophilic）分子で
あり、ビタミンＡの代謝産物をいう。ＲＡにはオールトランスレチノイン酸（all-trans retinoic acid）及び９−シスレチノイン酸（9-cis retinoic acid）の２種類がある。ＲＡは、核内に流入され、それぞれＲＡＲｓ（Retinoic acid Receptors、レチノイン酸受
容体)及びＲＸＲ(Retinoid X Receptor、レチノイドＸ受容体)と結合して標的遺伝子の転写を調節するが、これに制限されない。
【００８２】
本発明の方法に使用されるＲＡは、トランス型レチノイン酸及びシス型レチノイン酸であることができ、使用されるＲＡの濃度は０．５〜１０，０００ｎＭ、具体的には５〜５，０００ｎＭであり、より具体的には５０〜２，０００ｎＭ、さらに具体的には５００ｎＭであることができるが、特にこれに限定されない。
【００８３】
（ｃ）段階は１〜１２０日間行われることができるが、これに限定されない。
【００８４】
本発明の方法は、前記（ｃ）段階の培地からＩＧＦ１Ｒ活性剤、Ｓｈｈシグナル伝達経路活性剤及びＲＡからなる群から選択された1つ以上、２つ以上又は３つ以上を除去、よ
り具体的には、ＩＧＦ１Ｒ活性剤、Ｓｈｈシグナル伝達経路活性剤及びＲＡすべてを除去して製造した培地で未成熟網膜神経節細胞又は成熟網膜神経節細胞を培養する（ｄ）段階をさらに含むことができる。
【００８５】
本発明の実施例において、成熟が進められた未成熟網膜神経節細胞は、ＩＧＦ１Ｒ活性剤、Ｓｈｈシグナル伝達経路活性剤及びＲＡを全てがない培地で培養される場合にも、前記成分を全て含む培地で培養された場合と同等程度の成熟度を示した。
【００８６】
また、本発明の方法は、前述の段階を行った後、目的とする細胞、例えば、（ａ）段階を行った後に未成熟網膜神経節細胞の分化有無を判定する、又は（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）段階を行った後に成熟網膜神経節細胞の分化有無を判定する段階を含むことができる。
【００８７】
目的とする細胞、具体的に未成熟網膜神経節細胞及び成熟網膜神経節細胞の分化有無は、前記細胞に特異的なマーカー遺伝子発現の測定、及び/又は形態学的特徴及び/又は生理学的特性を確認して決定することができる。
【００８８】
前記マーカー遺伝子の発現の測定は、前記マーカー遺伝子のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルを測定することにより行うことができ、前記発現レベルの測定は、当業界において公知となった多様な方法を用いて行うことができる。
【００８９】
ｍＲＮＡレベルでマーカー遺伝子発現を分析する任意の技術は、当技術分野で公知のｍＲＮＡを解析する方法であれば特に限定されない。例えば、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、競争的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、ＲＮａｓｅ保護分析法、ノーザンブロッティング及びＤＮＡチップアッセイが挙げられる。
【００９０】
また、タンパクレベルでマーカー遺伝子発現を分析する任意の技術は、当技術分野で公知のタンパク質を解析する方法であれば特に限定されない。例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射線免疫分析、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、免疫組織染色法、免疫沈降分析法、補体固定分析法、フローサイトメトリー分析法（ＦＡＣＳ）及びタンパク質チップアッセイが挙げられる。
【００９１】
本発明の方法により分化された前記成熟網膜神経節細胞は、前分化性網膜前駆細胞に比べて、下記特徴中の１つ以上を示すことができる。
【００９２】
（１）Ｂｒｎ３Ｂの発現増加；（２）Ｂｒｎ３Ａの発現増加；（３）Ｉｓｌｅｔ１の発現増加；（４）ＮＦ２００の発現増加；（５）ＴｕＪ１の発現増加；（６）Ｔｈｙ１．２の発現増加；（７）ＴｒｋＢの発現増加；（８）ＮＭＤＡＲ１の発現増加；（９）Ｍａｐ２の発現増加；（１０）Ｖｇｌｕｔ１の発現増加；（１１）ＰＳＤ−９５の発現増加；（１２）シナプトフィジンの発現増加；及び（１３）シナプシン１の発現増加。
【００９３】
前記遺伝子の発現レベルの増加又は減少は、前記遺伝子がコードするタンパク質に対する抗体を使用する、又はＲＴ−ＰＣＲなどの当業者に周知の方法を用いて確認することができる。前記特性を多く有するほど分化した細胞は成熟網膜神経節細胞により近いと定義される。前記成熟網膜神経節細胞は、前記特性の中で、１つ以上、具体的には２つ以上、より具体的には３つ以上、より具体的には４つ以上、最も具体的には５つ以上を有する細胞であることが望ましい。本発明の方法で分化させた細胞の約４０％、６０％、８０％、９０％、９５％又は９８％以上が、目的とする特性を有する細胞であることが好ましく、割合が増加するほどより好ましいが、これに制限されない。
【００９４】
本発明のもう一つの態様は、未成熟網膜神経節細胞をＩＧＦ１Ｒ活性剤及びＳｈｈシグナル伝達経路活性剤を含む培地で培養する段階を含む、未成熟網膜神経節細胞を成熟網膜神経節細胞に分化させる方法を提供する。
【００９５】
前記未成熟網膜神経節細胞、ＩＧＦ１Ｒ活性剤、Ｓｈｈシグナル伝達経路活性剤及び成熟網膜神経節細胞については、前記で説明したとおりである。
【００９６】
未成熟網膜神経節細胞を成熟網膜神経節細胞に分化させる方法に適用されない培地は、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性剤を含まないことを特徴とする。
【００９７】
方法において、前記ＩＧＦ１Ｒ活性剤は、特にこれに限定されないが、具体的には０．０１〜１００ｎｇ／ｍｌであり、より具体的には０．１〜５０ｎｇ／ｍｌ、より具体的には１〜２０ｎｇ／ｍｌであり、最も具体的には１０ｎｇ／ｍｌの濃度で使用することができる。
【００９８】
方法において、前記Ｓｈｈシグナル伝達経路活性剤は、特にこれに限定されないが、０．１〜５０００ｎｇ／ｍｌであり、具体的には１〜２，５００ｎｇ／ｍｌであり、より具体的には１０〜１０００ｎｇ／ｍｌであり、最も具体的には２５０ｎｇ／ｍｌの濃度で使用することができる。
【００９９】
また、前記培地は、前述の物質以外に、１％のＢ２７サプリメント及び１％のＮ２サプリメントを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地であることができるが、これに限定されない。
【０１００】
前記方法は、前記ＩＧＦ１Ｒ活性剤及び前記Ｓｈｈシグナル伝達経路活性剤を含む培地にＲＡ（retinoic acid）を添加して製造した培地で未成熟網膜神経節細胞を培養する段
階をさらに含むことができる。ここで、「添加」とは、培地に物質を加える以外に、既存の培地組成に前記物質を含む培地で既存の培地を交換したという意味とも解釈することができる。
【０１０１】
ここで、ＲＡは、前記で説明したとおりであり、使用するＲＡの濃度は０．５〜１０，０００ｎＭ、具体的には５〜５，０００ｎＭであり、より具体的には５０〜２，０００ｎＭ、さらに具体的には５００ｎＭであることができるが、特にこれに限定されない。
【０１０２】
前記方法は、前述の培地からＩＧＦ１Ｒ活性剤、Ｓｈｈシグナル伝達経路活性剤及びＲＡからなる群から選択された１以上の成分、より具体的には、ＩＧＦ１Ｒ活性剤、Ｓｈｈシグナル伝達経路活性剤及びＲＡを全て除去して製造した培地で未成熟網膜神経節細胞又は成熟網膜神経節細胞を培養する段階をさらに含むことができる。
【０１０３】
本発明のもう一つの態様は、前述の方法により製造された未成熟網膜神経節細胞及び成熟網膜神経節細胞を提供する。
【０１０４】
前記方法、前記未成熟網膜神経節細胞及び前記成熟網膜神経節細胞については、先に説明したとおりである。
【０１０５】
本発明のもう一つの様態は、（ａ）前記成熟網膜神経節細胞に分化して得られた単離された成熟網膜神経節細胞を成熟網膜神経節細胞の死滅抑制剤候補又は増殖促進剤候補で処理する段階;及び（ｂ）非候補治療群と比較して、候補物質が成熟網膜神経節細胞の死滅
を阻害する、又は成熟網膜神経節細胞の増殖を促進する場合、前記候補物質が成熟網膜神経節細胞の死滅阻害剤又は増殖促進剤であることを決定する段階を含む、成熟網膜神経節細胞の死滅抑制剤又は増殖促進剤をスクリーニングする方法を提供する。
【０１０６】
前記成熟網膜神経節細胞に分化させる方法及び成熟網膜神経節細胞については、先に説明したとおりである。
【０１０７】
（ａ）段階は、本発明により成熟網膜神経節細胞に分化する前記方法により得られた、分離された成熟網膜神経節細胞に成熟網膜神経節細胞の死滅抑制又は増殖促進候補物質を処理する段階である。
【０１０８】
前記候補物質を処理した成熟網膜神経節細胞は、特にこれに限定されないが、健康な人又は患者から由来した幹細胞に、本発明の方法を適用して分化させた成熟網膜神経節細胞であることができる。
【０１０９】
本発明における用語、「成熟網膜神経節細胞の死滅抑制剤」とは、成熟網膜神経節細胞の死滅を抑制することができる物質を意味する。具体的には、前記死滅抑制剤は成熟網膜神経節細胞の死滅誘導条件に適用した場合、適用しない場合と比較して、成熟網膜神経節細胞の死滅程度を減少させる物質を含むことができる。前記死滅抑制剤の種類は、特に制限されず、化合物、タンパク質、ペプチド、及び核酸を含む。
【０１１０】
本発明における用語、「成熟網膜神経節細胞の増殖促進剤」とは、成熟網膜神経節細胞の増殖を誘導又は促進させることができる物質を意味する。具体的には、前記増殖促進物
質は、成熟網膜神経節細胞に適用した場合、適用しない場合と比較して、成熟網膜神経節細胞の増殖程度を増加させる物質を含むことができる。前記増殖促進物質の種類は、特に制限されず、化合物、タンパク質、ペプチド、又は核酸を含む。
【０１１１】
また、本発明の方法は、（ｂ） 候補物質の非処理群に比べて、前記候補物質が成熟網
膜神経節細胞の死滅を抑制する、又は成熟網膜神経節細胞の増殖を促進する場合、それぞれ成熟網膜神経節細胞の死滅抑制剤又は増殖促進剤であると判定する。 また、前記成熟
網膜神経節細胞の死滅抑制剤又は増殖促進剤は、緑内障又は視神経病症の治療剤であることができる。
【０１１２】
本発明における用語、「緑内障」とは、網膜神経節細胞の損失を伴う視神経の損傷を有する疾患をいう。
【０１１３】
本発明における用語、「視神経病症」とは、網膜を構成する神経節細胞及びその軸索が徐々に消失され誘導される視野障害が発生する疾患をいう。前記視神経病症は視神経炎、虚血性視神経病症、中毒−栄養視神経病症、遺伝性視神経病症及び視神経萎縮を含む。 
【０１１４】
前述のように、緑内障及び視神経病症は、網膜神経節細胞の損失を伴う疾患であるため、網膜神経節細胞の死滅を抑制する、増殖を促進することができる物質は、緑内障又は視神経病症の治療剤として使用することができる。
【０１１５】
本発明のもう一つの様態は、前述した本発明による方法で製造された成熟網膜神経節細胞を含む、成熟網膜神経節細胞の死滅抑制剤又は増殖促進剤をスクリーニングするためのキットを提供する。また、前記キットは、緑内障又は視神経病症の治療剤をスクリーニングするために使用することができる。
【０１１６】
前記成熟網膜神経節細胞、死滅抑制剤及び増殖促進剤は、先に説明したとおりである。
【０１１７】
前記キットは、当技術分野で公知の成熟網膜神経節細胞に加えて、網膜神経節細胞の死阻害剤又は増殖促進剤をスクリーニングすることができる様々なツールおよび/又は試薬
を含み得る。必要に応じて、各成分を混合するためのチューブ、ウェルプレート、及びそれらの使用を説明する取扱説明書をさらに含んでもよい。
【０１１８】
前記方法において使用することができる実験の過程、試薬及び反応条件は、当業界において公知となったものを利用することができ、これは当業者に自明である。 
【０１１９】
本発明のもう一つの様態は、前述の本発明の方法により生成された成熟網膜神経節細胞を含む、緑内障又は視神経病症の治療用薬学的組成物を提供する。
【０１２０】
前記成熟網膜神経節細胞、緑内障及び視神経病症については、先に説明したとおりである。
【０１２１】
本発明の前記薬学的組成物の使用は、幹細胞、例えば、ヒト胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞から成熟網膜神経節細胞への分化をインビトロで誘導し、成熟網膜神経節細胞を大量に増殖及び分化させた後、前記疾患を有する患者に投与する。前記薬学的組成物は当業界において一般的な剤形、例えば、注射剤の形態で製剤化することができる。前記組成物は外科手術的に網膜部位に直接移植するか、又は静脈内注射して網膜部位に移動させることができる。本発明の薬学的組成物は、移植する時の免疫拒絶反応が起こらないように、免疫抑制剤をさらに含むことができる。また、前記組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。本発明の治療用組成物の投与量は、患者の重症度、投与経路、
投与方法、投与回数、治療期間、患者の年齢及び性別、及び疾病の程度に応じて変わることができ、医学分野において周知の様々な要因に従って、当業者によって容易に決定され得る。
【０１２２】
本発明のもう一つの様態は、本発明の方法により製造した成熟網膜神経節細胞を緑内障又は視神経病症が疑われる個体に投与する段階を含む、緑内障又は視神経病症の治療方法を提供する。
【０１２３】
前記方法、成熟網膜神経節細胞、緑内障及び視神経病症については、先に説明したとおりである。
【０１２４】
本発明の成熟網膜神経節細胞は、任意の動物に投与することができ、前記動物はヒト及び霊長類だけでなく、牛、豚、羊、馬、犬、マウス、ラット及び猫などの家畜を含む。
【０１２５】
本発明における用語、「投与」とは、適切な方法により、分化した細胞の移植を含む、緑内障又は視神経病症が疑われる個体に本発明の組成物を導入することを意味する。本発明の組成物の投与経路は、目的組織に到達することができれば、多様な経路を通じて投与されることができ、網膜内注射が望ましい。
【０１２６】
本発明のもう一つの様態は、（ａ）網膜前駆細胞をＩＧＦ１Ｒ（insulin-like growth factor-1 receptor）活性剤及びＷｎｔシグナル伝達経路活性剤を含む培地で培養して未
成熟網膜神経節細胞に分化させる段階；及び（ｂ）前記（ａ）段階の培地からＷｎｔシグナル伝達経路活性剤を除去し、ＩＧＦ１Ｒ活性剤を添加して製造した培地で未成熟網膜神経節細胞を培養する段階を含む、成熟網膜神経節細胞株を製造する方法を提供する。
【０１２７】
前記培地は、Ｓｈｈシグナル伝達経路活性剤又はＲＡ（retinoic acid）、又は両方を
さらに含むものであり得る。
【０１２８】
また、前記方法は、前記ＩＧＦ１Ｒ活性剤及びＳｈｈシグナル伝達経路活性剤を含む培地で培養した細胞を分離した後、（ｉ）Ｌ−グルタミン、メルカプトエタノール及びインスリン／トランスフェリン／セレ二ウム−Ｘを含む培地、又は（ｉｉ）Ｌ−グルタミン、メルカプトエタノール、ＦＧＦ２、ＩＧＦ−１及びＥＧＦを含む培地で前記細胞を培養する段階をさらに含むことができる。前記培地は、具体的には、Ｌ−グルタミン、メルカプトエタノール、及びインスリン／トランスフェリン／セレ二ウム−Ｘを含むＩＭＤＭ培地、又はＬ−グルタミン、メルカプトエタノール、ＦＧＦ２、ＩＧＦ−１及びＥＧＦを含むＩＭＤＭ培地であり得る。本発明の一実施例では、ＩＭＤＭ、１５％のＦＢＳ、１ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのメルカプトエタノール及び１％のインスリン／トランスフェリン／セレン−Ｘを含む培地１、及びＩＭＤＭ、１５％のＦＢＳ、１ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのメルカプトエタノール、５  ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２、１０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１及び５ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＥＧＦを含む培地２を使用した。
【発明の効果】
【０１２９】
本発明の方法によると、幹細胞から網膜神経節細胞を高効率で分化させることができ、前記方法により得られた網膜神経節細胞を緑内障又は視神経病症のような疾患の治療剤選択試験及び細胞治療剤として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】細胞形態学的写真を示す。（Ａ）は、未分化状態のヒト胚性幹細胞の細胞コロニー（継代数３０）：継代数２９の細胞から５日間培養した後の細胞株である。前記細胞は、隣接するマウス胚線維芽細胞のフィーダ細胞から明確に分離され、平滑な表面及び均一な形態を有することを特徴とする、未分化状態のヒト胚性幹細胞の典型的な細胞コロニーを示す。（Ｂ）は、浮遊凝集体であり、図１（Ａ）の未分化状態のヒト胚性幹細胞コロニーから分離された後、超低接着表面プレートで４日間培養した浮遊凝集体である。前記浮遊凝集体は球形の形態を有し、1つの浮遊凝集体は約２９２±５３個の細胞からなる（Ｃ）〜（Ｆ）は、網膜神経節細胞に分化されている細胞の形態学顕微鏡写真である。（Ｃ）は、前記分化誘導後１４日目の細胞：ポリ−Ｄ−リジン／ラミニンが コーティングされたプレートに前記浮遊凝集体を移し植えて１０日間培養した後、即ち、未分化状態のヒト胚性幹細胞からの分化誘導１４日後の細胞の形態である。細胞は浮遊凝集体から分離され、分化し、貧弱な細胞質及び丸く大きな核を有する初期の分化段階の形態学的特徴を有することが観察された。（Ｄ）は、前記分化誘導後１７日目の細胞：未分化状態のヒト胚性幹細胞からの分化誘導１７日後の細胞形態である。活発な細胞増殖と同時に分化が起こっており、多数の丸い花の形態のロゼット（rosette）型の細胞群集を中心に、細胞増殖と分化が起きている。（Ｅ）は、前記分化誘導後２２日目の細胞：分化が進むにつれて、前記細胞は細胞質がより豊かになり、その核は図１（Ｄ）のものよりも小さい。短い又は長い神経軸索を有する神経細胞へ分化された細胞コロニーが観察される。（Ｆ）は、前記分化誘導後３９日目の細胞：ほとんどの細胞が神経細胞に分化している。神経細胞へ分化が進むにつれて、前記細胞は同様の細胞性であるが、図１（Ｅ）の分化誘導２２日目の細胞に比べて、成熟した神経細胞の形状を示した。神経細胞体は複数のクラスターを形成し、それらは長い神経細胞の軸索によって互いに連結されていた。＊顕微鏡視野：（Ａ）〜（Ｆ）（左：４０倍；右：１００倍）。
【図２】ヒト新生児包皮由来のＢＪ−１繊維芽細胞から再プログラムされた誘導多能性幹細胞の特性を示す。（Ａ）ヒト誘導性多能性幹細胞の位相差顕微鏡画像：継代数６の細胞から培養された６日目後の細胞株である。前記幹細胞はフィーダ細胞として隣接するマウス胚体細胞から明確に分離し、平滑な表面及び均一な形態を有することを特徴とする。周辺の栄養供給因子細胞であるマウス胚体細胞株とうまく分離されており、平らな表面を有する、均一な形状を示す。（Ｂ）と（Ｃ）は、誘導誘導多能性幹細胞のヒト胚性幹細胞の特性を示すアルカリホスファターゼ、Ｎａｎｏｇ、及びＳＳＥＡ−４染色の結果である。（Ｄ）は、繊維芽細胞から生成された誘導多能性幹細胞の多能性の評価のためのｔｅｒａｔｏｍａアッセイである。免疫抑制ＳＣＩＤマウスの背部位に繊維芽細胞から生成された誘導多能性幹細胞を移植した後、１０週目に多能性を示す外胚葉（左：神経組織）、中胚葉（中期：軟骨）、及び内胚葉（右：消化系）の３つの胚葉を有する奇形腫を発症した。＊スケールバー：（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）：２００μｍ。
【図３】本発明におけるヒト多能性幹細胞から網膜神経節細胞への分化を 示した模式図である。網膜神経節細胞の発生学的発達を参照して、化学的に規定された培地、インビトロでの細胞の接着、及び分化因子を各段階で考慮した。発生学的発達の段階及び期間は、マウスのものに基づいて計画した。
【図４】本発明におけるヒト多能性幹細胞から網膜神経節細胞への分化模式図を示したもので、分化誘導後１４日目から１７日目までの３日間Ｗｎｔ３ａを処置するプロトコール（プロトコールＡと呼ぶ）に従って実施した。このプロトコールは本発明のプロトコールのプロトタイプである。それぞれの分化段階における細胞型及び分化マーカーを示し、図１のプロトコールに従って分化した細胞の写真である。
【図５】本発明によるヒト多能性幹細胞から網膜神経節細胞への分化模式図を示したもので、分化誘導後１１日目から１４日目までＷｎｔ３ａを３日間処理したプロトコール（プロトコールＢと命名）である。
【図６】本発明におけるヒト多能性幹細胞から網膜神経節細胞への分化模式図を示したもので、分化誘導後１１日目から１７日目までＷｎｔ３ａを６日間処理したプロトコール（プロトコールＣと命名）である。
【図７】プロトコールＡに従い、ヒト胚性幹細胞株Ｈ９の分化誘導後１７日目の細胞マーカー発現を調べた結果を示す。（Ａ）網膜前駆細胞のマーカーであるＲａｘとＰａｘ６が同時に染色された細胞が観察された。網膜前駆細胞は、前記マーカーに同時に染色される特性を有する。（Ｂ）未成熟網膜神経節細胞のマーカーであるＭａｔｈ５が観察された。全細胞（ＤＡＰＩ染色される）に比べて、ほぼ１００％の細胞がＭａｔｈ５陽性を示す。（Ｃ）網膜神経節細胞の特異的なマーカーであるＢｒｎ３Ｂが、ほぼすべての細胞で観察された。Ｍａｔｈ５により網膜神経節細胞の運命が決定され、網膜神経節細胞に分化し始めていることが示されている。（Ｄ）すべての細胞は、網膜神経節細胞特異的マーカーの1つであるＢｒｎ３Ａ（緑色染色：核染色）及び神経細胞の細胞質に特異的なＴｕｊ１（赤色染色：β-チューブリンIIIとも呼ばれる）の両方に対して陽性である 。（Ｅ）細胞の約２０％は、網膜神経節細胞のサブタイプのマーカーであるＩｓｌｅｔ−１（赤色核染色）及び神経軸索特異的マーカーであるＮＦ２００（緑色）の両方に陽性である。＊スケールバー：Ａ：５０μｍ；  Ｂ：２００μｍ＆５０μｍ；  Ｃ〜Ｅ：１００μｍ＆５０μｍ。全細胞の核染色：ＤＡＰＩ（青色染色）。
【図８】プロトコールＡ（実験結果）に従ってヒト胚性幹細胞株Ｈ９の分化誘導後の３９日目のマーカー発現を調べるためのフローサイトメトリーの結果を示す。
【図９】プロトコールＡに従ってヒト胚性幹細胞株Ｈ９の分化誘導後３９日目の細胞マーカー発現を検討した結果である。（Ａ）図７で観察された網膜神経節細胞のマーカーである。（Ａ）Ｐａｘ６、（Ｂ）Ｂｒｎ３Ｂ、及び（Ｃ）Ｂｒｎ３Ａがまだ観察されている。（Ｄ）ほとんどすべての細胞は、Ｂｒｎ３Ａ（緑：核）及びＴｕｊ１（赤：細胞質染色、軸索及び樹状突起の両方が染色されている）の両方に対して陽性である。図７の１７日目の細胞に比べて神経細胞の軸索及び樹状突起がさらに多くなって太くなった形態を示す。軸索の棘突起、軸索リング及び細胞間の接続連結と樹状突起の枝化及び棘突起が観察される。軸索の棘突起とリング、細胞間のシナプス相互作用、樹状突起と棘突起が観察される。（Ｅ）細胞はＩｓｌｅｔ−１（赤：細胞核）及びＮＦ２００（緑：軸索）の両方に対して陽性である。図７の１７日目の細胞に比べて軸索の数が増えてきて、成熟した形態が観察された。（Ｆ）Ｂｒｎ３Ｂ（緑）及びＴｕｊ１（赤）：網膜神経節細胞に対して特異的染色であるＢｒｎ３ＢとＴｕｊ１の染色に陽性である。（Ｇ）Ｂｒｎ３Ｂ（緑）及びＴｈｙ１．２（赤）：網膜神経節細胞の特徴である、Ｂｒｎ３Ｂ核染色とＴｈｙ１．２の細胞質の染色を示す。（Ｈ）Ｂｒｎ３Ａ（緑）及びＴｈｙ１．２（赤）：網膜神経節細胞の特徴であるＢｒｎ３Ａ核染色とＴｈｙ１．２の細胞質の染色を示す。（Ｉ）Ｍａｐ２（緑）：樹状突起を含む細胞質の染色を示す。（Ｊ）分化誘導後３９日目における、ヒト胚性幹細胞由来−網膜神経節細胞の溶解物を抗体と反応させて得られた、ウェスタンブロット分析の結果として、網膜神経節細胞に特異的なタンパク質を示している。＊スケールバー：Ａ〜Ｃ：５０μｍ；  Ｄ：２００μｍ、５０μｍ及び２０μｍ；  Ｅ：１００μｍ、５０μｍ及び２０μｍ；  Ｆ：２００μｍ＆１００μｍ；  Ｇ：２０μｍ；  Ｈ：１００μｍ；  Ｉ：５０μｍ。全細胞の核染色：ＤＡＰＩ（青色）。
【図１０】プロトコールＡに従ってヒト胚性幹細胞株Ｈ９の分化誘導後５９日目の細胞マーカー発現を検討した結果である。（Ａ）細胞はＢｒｎ３Ａ（緑：細胞核）とＴｕｊ１（赤色：細胞質の染色により軸索と樹状突起が同時に染色される）の両方に対して陽性である。図８の３９日目の細胞に比べて、軸索及び樹状突起の数及び太さが増加した。（Ｂ）Ｔｕｊ１：軸索の棘突起とリング、細胞間のシナプス相互作用、樹状突起と棘突起が観察される。（Ｃ）ＮＦ２００：樹状突起の棘突起、軸索リングが観察される。（Ｄ）Ｓｙｎａｐｓｉｎ１：神経伝達物質放出に関与する代表的なタンパク質であるシナプシン１は、シナプス前小胞の樹状突起に沿って機能的に成熟した涙点（puncta）の形態で観察され、細胞間で神経電気刺激を伝達するシナプス相互作用が起こることを示している。（Ｅ）Ｍａｐ２／Ｖｇｌｕｔ１：（Ｄ）のＳｙｎａｐｓｉｎ１で表現されたシナプス前小胞の大半がグルタミン酸性小胞（glutamatergic vesicles、 (Vglut1：赤）であることを示す。Ｍａｐ２−陽性樹状突起（緑）に沿ってＶｇｌｕｔ１の存在が観察される。グルタミン酸性興奮性神経細胞が生成されたことを示す。（Ｆ）Ｍａｐ２／Ｖｇａｔ：図（Ｄ）のＳｙｎａｐｓｉｎ１で表現されたシナプス前部小胞のほとんどがギャバ性（GABAergic）小胞（Ｖｇａｔ：赤）であることを示す。Ｍａｐ２が染色された樹状突起（緑）に沿ってＶｇａｔが存在する。（Ｇ）ＰＳＤ−９５／Ｍａｐ２：シナプス−後部の小胞（postsynaptic vesicles）内のタンパク質の形成を示し、興奮性（excitatory）神経としての特性を示すＰＳＤ−９５が樹状突起（Ｍａｐ２）に沿って分布する。（Ｈ）Ｓｙｎａｐｓｉｎ１／ＰＳＤ−９５：超解像度顕微鏡（super resolution microscopy）による物理的なシナプス：シナプス−前部小胞であるＳｙｎａｐｓｉｎ１と興奮性シナプス−後部小胞であるＰＳＤ−９５が連接していることを示す。物理的なシナプスは、シナプス前部小胞とシナプス後部小胞の複合体が隣接していることにより確認することができる。「成熟網膜神経節細胞」の電気生理学的な特徴である自発的興奮シナプス−後部の電流 (sEPSCs)を可能にする神経伝達物質が形成されており、これは網膜神経節細胞の機能的な成熟を意味する。＊スケールバー：Ａ：１００μｍ；  Ｂ：１００μｍ＆２０μｍ；  Ｃ：２０μｍ；  Ｄ：５０μｍ＆２０μｍ；  Ｅ：２０μｍ；  Ｆ：２０μｍ；  Ｇ：５０μｍ及び１μｍ；  Ｈ：２μｍ＆０．５μｍ。細胞の核染色：ＤＡＰＩ（青色）。
【図１１】ヒト胚性幹細胞のＨ９細胞株にプロトコールＢによる方法を適用して分化させた３９日目の細胞のマーカー発現を確認した結果を示した図である。（Ａ）Ｍａｔｈ５、（Ｂ）Ｂｒｎ３Ｂ、（Ｃ）Ｂｒｎ３Ａ、（Ｄ）、（Ｅ）Ｉｓｌｅｔ−１（赤：細胞核）とＮＦ２００（緑：細胞の軸索）、（Ｆ）ＮＦ２００、（Ｇ）Ｂｒｎ３Ａ、Ｔｕｊ１、（Ｈ）Ｔｕｊ１、（Ｉ）Synapsin1／  Ｔｕｊ１、＊スケールバー：Ａ〜Ｉ：５０μｍ。図Ｈの核染色：ＤＡＰＩ（青色）。
【図１２】ヒト胚性幹細胞のＨ９細胞株にプロトコールＣによる方法を適用して分化させた３９日目の細胞のマーカー発現を確認した結果を示した図である。（Ａ）Ｍａｔｈ５、（Ｂ）Ｐａｘ６、（Ｃ）Ｂｒｎ３Ｂ、（Ｄ）Ｂｒｎ３Ａ、（Ｅ）Ｂｒｎ３Ａ、Ｔｕｊ１、（Ｆ）Ｉｓｌｅｔ−１（赤：細胞核）とＮＦ２００（緑：細胞の軸索）、（Ｇ）ＴｒｋＢ：成熟網膜神経節細胞のｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ受容体マーカーであるＴｒｋＢの発現を示す。（Ｈ）Synapsin1／  ＰＳＤ−９５、＊スケールバー：Ａ〜Ｈ：５０μｍ。
【図１３】ヒト胚性幹細胞のＨ７細胞株にプロトコールＡによる方法を適用して分化させた３９日目の細胞のマーカー発現を確認した結果を示した図である。（Ａ）Ｍａｔｈ５、（Ｂ）Ｂｒｎ３Ｂ、（Ｃ）Ｂｒｎ３Ａ、網膜神経節細胞の特徴的マーカーが、ほぼすべての細胞で観察される。（Ｄ）Ｂｒｎ３Ａ（緑：細胞核）とＴｕｊ１（赤：細胞染色に軸索と樹状突起が同時に染色される）、（Ｅ）、（Ｆ）Ｉｓｌｅｔ−１（赤：細胞核）とＮＦ２００（緑：細胞の軸索）、（Ｇ）Ｓｙｎａｐｓｉｎ１（緑）、Ｔｕｊ１（赤）：Ｔｕｊ１で染色された軸索に沿ってシナプス−前部小胞マーカーであるＳｙｎａｐｓｉｎ１が分布している。（Ｈ）Ｓｙｎａｐｓｉｎ１／ＰＳＤ−９５：シナプス−前部小胞マーカーであるＳｙｎａｐｓｉｎ１とシナプス−後部小胞のマーカーであるＰＳＤ−９５が近接している。Ｈ９細胞株と同様に、プロトコールＡによりＨ７細胞株が成熟した電気生理学的な機能を有する「成熟網膜神経節細胞」に分化したことを示す。＊スケールバー：Ａ：５０μｍ；  Ｂ、Ｃ：１００μｍ；  Ｄ：２００μｍ；  Ｅ：２００μｍ＆２０μｍ；  Ｆ：１００μｍ；  Ｇ：２０μｍ；  Ｈ：２０μｍ。図１３（Ｅ）の核染色：ＤＡＰＩ（青色）。
【図１４】ヒト誘導多能性幹細胞のプロトコールＡによる方法を適用して分化させた３９日目の細胞のマーカー発現を確認した結果を示した図である。（Ａ）Ｍａｔｈ５、（Ｂ）Ｐａｘ６、（Ｃ）Ｂｒｎ３Ｂ、（Ｄ）Ｂｒｎ３Ａ、（Ｅ）ＮＦ２００、（Ｆ）Ｂｒｎ３Ａ（赤：細胞核）とＮＦ２００（緑：細胞の軸索）、（Ｇ）Ｉｓｌｅｔ−１（赤：細胞核）とＮＦ２００（緑：細胞の軸索）：網膜神経節細胞のサブタイプの一種が観察される。（Ｈ）ＮＦ２００、Ｉｓｌｅｔ−１、（Ｉ）Ｂｒｎ３Ａ、Ｔｕｊ１、（Ｊ）Ｔｕｊ１：成熟神経細胞の軸索の分化、（Ｋ）Ｓｙｎａｐｓｉｎ１（緑）、Ｔｕｊ１（赤色）：Ｔｕｊ１で染色された軸索に沿ってシナプス−前部の小胞マーカーであるＳｙｎａｐｓｉｎ１が分布している。（Ｌ）Ｓｙｎａｐｓｉｎ１／ＰＳＤ−９５：シナプス−前部の小胞マーカーであるＳｙｎａｐｓｉｎ１とシナプス−後部小胞マーカーであるＰＳＤ−９５が近接している。Ｈ９細胞株と同様に、プロトコールＡによりヒト誘導多能性幹細胞株が成熟した電気生理学的な機能を有する「成熟網膜神経節細胞」に分化したことを示す。＊スケールバー：Ａ〜Ｃ、Ｅ〜Ｈ、Ｊ、Ｌ：５０μｍ；  Ｄ、Ｉ：１００μｍ；  Ｋ：２０μｍ。
【図１５】ヒト胚性幹細胞のＨ９細胞株にプロトコールＡによる方法を適用して分化させた３９日目の電気生理学的分析の結果を示した図である。（Ａ）ヒト胚性幹細胞由来−網膜神経節細胞で段階別の電流注入（ｐＡ）に反応して活動電位列車の形態の、強力で規則的なスパイキングを示す。これは生成された網膜神経節細胞が成熟した電気生理学的特性を獲得したことを示す。一般に、神経細胞が成熟するにつれて、活動電位は電流注入に応答して単一の短いスパイクから複数の持続するスパイクに変化する。（Ｂ）ヒト胚性幹細胞由来−網膜神経節細胞の電圧−開閉ナトリウム通路：−８０ｍＶ〜＋４０ｍＶの固定電圧で段階的脱分極反応に対する電流反応が 重ね合わされる。テトロドトキシン（TTX）を適用することにより、急速に活性化し、内向きナトリウム電流を不活性化した。（Ｃ）自発的興奮性シナプス後部の電流（sEPSCs）がヒト胚性幹細胞由来−網膜神経節細胞から分化誘導後３９日目に、他の網膜組織との共培養なしに検出された。これは、ヒト胚性幹細胞由来−網膜神経節細胞間の機能的な興奮性シナプスが形成されたことを示す。
【図１６】ヒト胚性幹細胞のＨ９細胞株をプロトコールＡによる方法を適用して分化させた５９日目の電気生理学的分析の結果を示した図である。（Ａ）カリウム電流：４−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ（４−ＡＰ）により外向きカリウム電流の急速−活性化分画が抑制された。（Ｂ）ヒト胚性幹細胞由来網膜神経節細胞における段階的電流注入（pA）に応答して、強力で規則的に活動電位の列が観察される。分化誘導後３９日目と比較して、スパイク数は増加した。（Ｃ）段階別の電流注入（ｐＡ）に対するスパイク数のグラフ：注入された電流の強さに比例してスパイク数が増加する。（Ｄ）樹状突起（dendrite:Map2−陽性）に分布したグルタミン酸性シナプス−前部小胞（Ｖｇｌｕｔ１）染色イメージ、（Ｅ）自発的興奮シナプス−後部の電流（ｓＥＰＳＣｓ）：ＡＭＰＡ受容体に対する阻害剤であるＣＮＱＸによりｓＥＰＳＣｓが消滅した。グルタミン酸性である興奮性シナプスが形成されたことを示す。
【図１７】プロトコールＢによる方法により分化したヒト胚性幹細胞Ｈ９細胞株の分化９６日目の電気生理学的分析の結果を示した図である。（Ａ）段階別の電流注入（ｐＡ）による列車の形態の活動電位スパイキングを示す。（Ｂ）自発的興奮シナプス−後部の電流（ｓＥＰＳＣｓ）を示す。ＡＭＰＡ受容体に対する阻害剤であるＣＮＱＸによりｓＥＰＳＣｓが消滅した。グルタミン酸性である興奮性シナプスが形成されたことを示す。
【図１８】プロトコールＣによる方法により分化されたヒト胚性幹細胞Ｈ９細胞株の分化６６日目の電気生理学的分析の結果を示した図である。（Ａ）段階別の電流注入（ｐＡ）による列車の形態の活動電位スパイキングを示す。（Ｂ）自発的興奮シナプス−後部の電流（ｓＥＰＳＣｓ）を示す。グルタミン酸性である興奮性シナプスが形成されたことを示す。
【図１９】プロトコールＢによる方法により３９日目まで分化したヒト胚性幹細胞を分化３９日目以降に分化培養液からＩＧＦ−１、Ｓｈｈ及び、ＲＡ（Retinoic acid）を除去した培養液を供給しながら成熟させた網膜神経節細胞の電気生理学的分析の結果を示した図である。（Ａ）分化９６日目のヒト胚性幹細胞由来−網膜神経節細胞において段階別の電流注入（ｐＡ）に反応して活動電位が列車の形態の強力で規則的な−スパイキング（regular-spiking）を示す。（Ｂ）分化９６日目のヒト胚性幹細胞由来−網膜神経節細胞で自発的興奮シナプス−後部の電流（ｓＥＰＳＣｓ）を示す。グルタミン酸性である興奮性シナプスが形成されたことを示す。
【図２０】プロトコールＡによる方法により分化したヒト誘導多能性幹細胞の分化３９日目の電気生理学的分析の結果を示した図である。（Ａ）ヒト誘導多能性幹細胞由来−網膜神経節細胞で段階別の電流注入（ｐＡ）に反応して活動電位が列車の形態の強力で規則的な−スパイキング（regular-spiking）を示す。これは、生成された網膜神経節細胞が成熟した電気生理学的特性を獲得したことを示す。（Ｂ）カリウム電流：４−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ（４−ＡＰ）により外向きカリウム電流の急速−活性化分画が抑制された。
【図２１】その他のＷｎｔシグナル伝達経路活性剤とＳｈｈ受容体活性剤によるヒト胚性幹細胞由来−網膜神経節細胞の分化を示した図である。前記分画法に使用したＷｎｔ３ａ以外のＷｎｔシグナル伝達経路活性剤であるＢＩＯ（6-bromoindirubin-3’-oxime）２μＭとノリン（Norrin）５０ｎｇ／ｍＬ、そしてＳｈｈ受容体活性剤であるＰｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ１μＭとレチノイン酸（ＲＡ）５００  ｎＭを使用してプロトコールＡ法の時間スケジュールを適用して分化させた。分化３９日目の免疫蛍光染色した結果、網膜神経節細胞のタンパクマーカーであるＩｓｌｅｔ−１（赤：細胞核）とＮＦ２００（緑：細胞の軸索）は、Ｗｎｔ３ａとＳｈｈを使用した分化の結果と同じ結果を示した。＊スケールバー：Ａ、Ｃ、Ｄ：１００μｍ；  Ｂ：５０μｍ
【図２２】網膜神経節細胞の作製のためのプロトコールＡ分化法に用いたＷｎｔ３ａ、Ｓｈｈ及びＲＡの影響を解析した結果を示す。それぞれの因子を分化スケジュールに従って処理し、分化誘導後３９日目に、網膜神経節細胞特異的マーカーを用いて免疫蛍光アッセイを行った。＊スケールバー：５０μｍ
【図２３】ヒト多能性幹細胞由来−網膜神経節細胞株の継代培養した細胞の形態を確認した結果である。細胞株の確立後の継代培養数１６（passage number 16）の細胞であり、即ち、継代培養数１５の細胞を３日間培養した細胞である。網膜神経節細胞株の継代培養した細胞は、試験管内で神経細胞の形態を示す。（Ａ）培養液１で継代培養した細胞の形態、（Ｂ）培養液２で継代培養した細胞の形態、培養液１及び培養液２で継代培養した細胞は全て神経細胞の特徴的な細胞質の延長（elongation）、長い神経突起（neuritis）と位相が明るい細胞体（phase bright soma）を有する明確な神経細胞の形態を示す。＊左図：位相差顕微鏡１００倍；右側図面：２００倍
【図２４】ヒト多能性幹細胞由来−網膜神経節細胞株の細胞マーカーの発現を確認した結果を示した図である。細胞は、細胞株樹立後継代培養数１７の細胞であり、継代１６日目の継代後３日目に免疫蛍光染色を行った。網膜神経節細胞の特徴的なマーカーは、ほぼすべての細胞で観察された。（Ａ）Ｍａｔｈ５、（Ｂ）Ｂｒｎ３Ｂ、（Ｃ）Ｂｒｎ３Ａ／Ｔｕｊ１、（Ｄ）Synapsin1／Ｔｕｊ１、（Ｅ）ＮＦ２００、（Ｆ）ＫＩ６７、（Ｇ）Ｔｈｙ１．２、（Ｈ）ＮＭＤＡＲ１、（Ｉ）ＴｒｋＢ、＊スケールバー：Ａ〜Ｉ：５０μｍ  核染色：ＤＡＰＩ（青）
【図２５】ヒト多能性幹細胞由来−網膜神経節細胞株における細胞内カルシウムの顕微鏡イメージであり、前記細胞は神経機能を有することを示す。継代培養数１５のヒト胚性幹細胞由来−網膜神経節細胞を３日間培養した。細胞に１ｕＭのｆｌｕｏｒ−４を処理し、１ｍＭのグルタミン酸（glutamate）で刺激を与えた後、時間微分イメージが得られた。その結果、多くの生細胞でカルシウムが検出された。黒（最低）から白色（最高）までの連続画像スペクトルは、カルシウム濃度を表す。ヒト胚性幹細胞由来−網膜神経細胞節細胞細胞において、グルタミン酸刺激に反応して細胞質カルシウムが相当量増加した（矢印の頭）。
【発明を実施するための形態】
【０１３１】
以下、本発明を下記例により詳しく説明する。ただし、下記例は本発明を例示するためのもので、本発明の範囲が下記例により制限されるものではない。
【０１３２】
実施例１：幹細胞の培養
＜１−１＞ヒト胚性幹細胞の培養
ヒト胚性幹細胞株（human embryonic stem cell:hESC）であるＨ９（ＷＡ０９、正常核型ＸＸ）とＨ７（ＷＡ０７、通常の核型、ＸＸ）をＷｉＣｅｌｌ研究機関（WiCell Research Institute、Madison、WI）から購入した。
【０１３３】
未分化状態のヒト胚性幹細胞株(H9 cells: passages 26 to 41; H7 cells: passages 23 to 32)を放射線が照射されたマウス胚繊維芽細胞株（mouse embryonic fibroblasts、MEF、Global Stem、Gaithersburg、MD）又はマイトマイシンが処理されたマウス胚繊維芽
細胞株（EmbryoMax Primary Mouse Embryo Fibroblasts、Millipore、Billerica、MA）のようなフィーダ細胞上で、以下の培養液で培養することにより増殖させた：胚性幹細胞の
培地［DMEM/F12(Invitrogen、Grand Island、NY）液、２０％（ｖ／ｖ）ノックアウト血
清代替剤（KnockOut serum replacement、Invitrogen、Carlsbad、CA）、１ｍＭのＬ−グルタミン（L-glutamine、Invitrogen）、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（nonessential amino acids、Invitrogen）、０．１ｍＭのメルカプトエタノール（mercaptoethanol、Sigma-Aldrich、St. Louis、MO）、４ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＦＧＦ２（human recombinant basic fibroblast growth factor、Invitrogen）］。
【０１３４】
前記培養液を毎日交換し、前記未分化状態の幹細胞（図１Ａ）を１：１５〜１：１８の割合で６日又は７日ごとに手技法やコラゲナーゼＶ（collagenase IV、Invitrogen）処理で継代培養（passage）した後、新たなマウス胚線維芽細胞株のフィーダ細胞に移した。
ヒト胚性幹細胞の継代培養時に、未分化ヒト胚性幹細胞の特異的抗原であるＯｃｔ４及びＳＳＥＡ−４（Chemicon、Temecula、CA）を免疫化学染色し、分化の程度を定期的にモニターした。分化された細胞は除去した。一方、ヒト胚性幹細胞の分化に望ましくない影響を与えることができる胚性幹細胞株におけるマイコプラズマ汚染の存在は、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Cambrex、Rockland、ME）を使用して、周期的にモニターした。
【０１３５】
＜１−２＞ヒト誘導多能性幹細胞（induced pluipotent stem cells、iPSCs）の生成及び培養
ヒト誘導多能性幹細胞は、ＢＪ１繊維芽細胞（neonatal foreskin fibroblast、ＡＴＣＣ）内にエピソーマルプラスミドベクター（Okita、Nat method 2011;8:409）を用いて、幹細胞の遺伝子（SOX2、KLF4、OCT4、L-MYC、LIN28、及びp53のための小さなヘアピンRNA）を形質導入して作製した。未分化状態のヒト誘導多能性幹細胞（継代数５〜９）を、放射線が照射されたマウス胚繊維芽細胞株（MEF、Global Stem、Gaithersburg、MD、USA）
又はマイトマイシンが処理されたマウスＳＮＬ細胞（SNL 76/7 cell line、ECACC、Porton Down、UK）のようなフィーダ細胞上で、以下の培養液で培養することにより増殖させた：胚性幹細胞の培養［DMEM/F12(Invitrogen、Grand Island、NY、USA）液、２０％（ｖ／ｖ）ノックアウト血清代替剤（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）を、１ｍＭのＬ−グル
タミン（Invitrogen）、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（Invitrogen）、０．１ｍＭのメルカプトエタノール（Sigma-Aldrich、St. Louis、MO）、４ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＦＧＦ２（Invitrogen）］。
【０１３６】
前記培養液を毎日交換し、前記未分化状態の幹細胞（図２Ａ）を１：１２〜１：１５の割合で６日又は７日ごとに手技法やコラゲナーゼＩＶ（Invitrogen）処理で継代培養した後、新たなマウス胚線維芽細胞株のフィーダ細胞に移した。ヒト誘導多能性幹細胞の継代培養時、未分化されたヒト誘導多能性幹細胞の特異的抗原であるアルカリホスファターゼ（Sigma-Aldrich）、ＮＡＮＯＧ（Abcam、Cambridge、MA）及びＳＳＥＡ−４（Chemicon
、Temecula、CA）を免疫化学染色し（図２Ｂ及び２Ｃ）、分化の程度を定期的にモニターした。分化した細胞は除去した。未分化ヒト誘導多能性幹細胞の多能性を評価するために奇形腫（teratoma）アッセイを行った。免疫が抑制されたマウスモデルであるｒｄ／ＳＣＩＤマウスの背側にヒト誘導多能性幹細胞を１ｘ１０７を移植してから１０週後、形成された腫瘍を除去してＨ＆Ｅ染色を行った（図２Ｄ）。
【０１３７】
ヒト誘導多能性幹細胞の分化に望ましくない影響を与えることができるヒト誘導多能性幹細胞におけるマイコプラズマ汚染の存在は、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ ｍｙｃｏｐｌａｓｍ
ａ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Cambrex、Rockland、ME）を使用して、周期的にモニタ
ーした。
【０１３８】
実施例２：ヒト胚性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞から眼球領域前駆体への分化
まず、実施例１の方法で培養されたヒト胚性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞をマウス
の胚繊維芽細胞から分離して、６−ウェル超低接着表面プレート（ultra-low attachment
plates、Corning Incorporated、Corning、NY、USA）にそれぞれ移した。
【０１３９】
前記６−ウェル超低接着表面プレートに移したヒト胚性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞に眼球前駆細胞への分化を誘導するための培養液［ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％のノックアウト血清代替剤、１ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、０．１ｍＭのメルカプトエタノール、１％のＢ２７サプリメント（Invitrogen）、１ｎｇ／ｍＬの組換えノギン（R&D Systems）、１ｎｇ／ｍＬの組換えＤｋｋ−１（recombinant Dickkopf-1、R&D Sytstems）及び５ｎｇ／ｍＬの組換えＩＧＦ−１（recombinant insulin-like growth factor-1、R&D Systems）を加えた。培養液は３日目に吸引して、新たな培養液に交換し、細胞は４〜５日間培養して培養液中の浮遊凝集体の形態の眼領域前駆体を生成させた（図１Ｂ、３）。
【０１４０】
実施例３：眼球領域前駆体から網膜前駆細胞への分化
前記実施例２で生成された眼球領域前駆体（浮遊凝集体）を、６ウェルポリ−Ｄ−リジン／ラミニンでコーティングされたプレート（BD Biosciences）にウェルあたり５３±８個の細胞（２９２±５３細胞／浮遊凝集体）の密度、１２ウェルのポリ−Ｄ−リジン／ラミニンでコーティングされたプレートには、ウェルあたり３０±５個の細胞の密度、８ウェルのポリ−Ｄ−リジン／ラミニンでコーティングされたプレートには、１２±４個の細胞の密度で植えた後、網膜前駆細胞への分化誘導培養液［ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Invitrogen）、１ｍＭのエル−グルタミン（Invitrogen）、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（Invitrogen）、０．１ｍＭのメルカプトエタノール（Sigma-Aldrich）、１％のＢ２７サプリメン
ト、１％のＮ２サプリメント（Invitrogen）、１０ｎｇ／ｍＬのＤｋｋ−１、１０ｎｇ／ｍＬのノギン、１０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１、５  ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２］を供給して、
供給しながら培養して網膜前駆細胞（図１Ｃ）に分化させるために１０日間培養した（
プロトコールＡ）（図３、４）。プロトコールＢ（図５）とＣ（図６）は、本培地を7日
間供給することにより実施した。
実施例４：網膜前駆細胞から未成熟網膜神経節細胞（imMature retinal ganglion cells：ＲＧＣｓ）への分化
前記実施例３で生成された網膜前駆細胞を未成熟網膜神経節細胞へ誘導分化するための培養液［ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Invitrogen）、１ｍＭのＬ−グルタミン（Invitrogen）、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（Invitrogen）、０．１ｍＭのメルカプトエタノール（Sigma-Aldrich）、１％のＢ２７サプリメント（Invitrogen）、１％のＮ２サプリメント（Invitrogen）、１０ｎｇ／ｍＬのノギン、１０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１、５ｎｇ／ｍＬのＦＧ
Ｆ２、５０ｎｇ／ｍｌの組換えＷｎｔ３ａ（recombinant Wnt3a、R&D Systems)］で３日
間培養して、未成熟網膜神経節細胞に分化させた（図１Ｄ、３〜５）。プロトコールＣは、 本培地を６日間供給することにより実施した（図６）。
【０１４１】
実施例５：未成熟網膜神経節細胞から成熟網膜神経節細胞への分化：段階１
前記実施例４で生成された未成熟網膜神経節細胞は分化培養液［ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Invitrogen）、１ｍＭのＬ−グルタミン（Invitrogen）、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（Invitrogen）、０．１ｍＭのメルカプトエタノール（Sigma-Aldrich）、１％のＢ２７サプ
リメント（Invitrogen）、１％のＮ２サプリメント（Invitrogen）、１０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１、２５０ｎｇ／ｍＬの組換えＳｈｈ（recombinant Sonic hedgehog amino terminal peptide、Shh、R&D Systems）］を５日間供給することより、成熟網膜神経節細胞に
分化させた（図１Ｅ、３〜６）。
【０１４２】
実施例６：未成熟網膜神経節細胞から成熟網膜神経節細胞への分化：段階２
前記実施例５で生成された網膜神経節細胞は分化培養液［ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Invitrogen）、１ｍＭのＬ−グルタミン（Invitrogen）、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（Invitrog
en）、０．１ｍＭのメルカプトエタノール（Sigma-Aldrich）、１％のＢ２７サプリメン
ト（Invitrogen）、１％のＮ２サプリメント（Invitrogen）、１０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１、２５０ｎｇ／ｍＬのＳｈｈ、５００ｎＭのオール−トランス−レチノ酸（all-trans retinoic acid 、RA、Sigma-Aldrich)］を１７日間供給することにより成熟させた。前記実施例２〜６のすべての培養液は、２〜３日ごとに新しい培養液に交換し、前記細胞は５％の二酸化炭素（ＣＯ２）、３７℃で培養した（図１Ｆ、３〜６）。本網膜神経節細胞の培養液は分化１２０日目までの培養に使用した。
【０１４３】
実施例７：細胞分化関連マーカーアッセイ
＜７−１＞免疫化学染色及び細胞分化に関連マーカータンパク質発現の確認
前記実施例３〜６で得られた細胞の分化は、下記のように免疫化学染色を使用して確認した。
【０１４４】
前記眼球領域前駆体（浮遊凝集体）を、８−ウェルポリ−Ｄ−リジン／ラミニンがコーティングされたスライド（BD Biosciences、Bedford、MA）で、前記網膜前駆細胞、未成
熟網膜神経節細胞及び成熟網膜神経節細胞への分化のために使用した同様の条件で培養した。各段階別で培養が完了した細胞を４％のパラホルムアルデヒド（paraformaldehyde、Sigma-Aldrich）で固定した後、３％のＢＳＡ（Jackson Immunoresearch Laboratory、Bar Harbor、ME、USA）と０．２５％のトリトン−Ｘ−１００（Triton X-100、Sigma-Aldrich）が含有されたＰＢＳで非特異的反応をブロックした。
【０１４５】
９０分間ブロックした後、各分化段階のスライドを表１のような各分化段階の細胞に特異的な抗体と共に４℃で一晩反応させた。前記抗体は、使用する前に、１％のＢＳＡと０．２５％のトリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ溶液に希釈した。スライドで培養された各段階の細胞をＰＢＳで５分間、３回洗浄した後、Ｃｙ３（1:800、Jackson Immunoresearch Laboratory）又はＡｌｅｘａ４８８（1:500、Invitrogen）が結合された種特異的二
次抗体（表１）と室温で２時間反応させた。一次抗体と二次抗体に対する適切な標準物質を利用し、非特異的染色や抗体間の相互反応有無を確認した。その後、前記細胞をＰＢＳでそれぞれ５分間、３回洗浄した後、ＤＡＰＩ（4’,6-diamidino-2 phenylindole）で対比染色し、ベクタシールド（Vectashield、Vector Laboratories）で計数し、続いて落射蛍光顕微鏡 (Nikon Eclipse, E800, Tokyo, Japan) 及び共焦点顕微鏡 (Zeiss LSM510, Carl Zeiss, Inc, Thornwood, NY, USA) 下で視覚化した。４００倍でランダムに選択した２０個の顕微鏡視野から５００個の細胞を計数し、各抗体に対する陽性反応について評価した。 抗体に対する陽性応答は、少なくとも３回の評価の後に決定された。
【０１４６】
＜７−２＞フローサイトメトリー分析及び細胞の分化に関連するマーカータンパク質発現の確認
細胞は、分化誘導後１７日目と３９日目に０．０５％のトリプシン（Invitrogen）で分離させた。細胞は、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ緩衝液（Biosciences）で固定し
、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（BD Biosciences）を使用して洗浄した。細胞は、一次抗体と４℃で３０分間反応させ、２次抗体と４℃で２０分間反応させた（表１）。前記反応試料は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Biosciences）とＦｌｏｗＪｏ  ｓｏｆｔｗａｒ
ｅ（Treestar）で分析した。
【０１４７】
＜７−３＞ウェスタンブロットによる網膜神経節細胞の特異的マーカーの確認
前記培養された細胞は、分化誘導後３９日目にプロテアーゼ阻害剤を含むタンパク質抽出緩衝液で溶解させた。総タンパク質濃度は、ブラッドフォードタンパク分析キットを使用して測定した。同量のタンパク質をポリアクリルアミドゲル（Any kD Mini-PROTEAN TGX precast polyacrylamide gels、Bio-Rad、Hercules、CA）にローディングした後、ポリビニリデンジフルオリドメンブレイン（polyvinylidene difluoride membrane、Milipore
、Billerica、MA）に移した。このメンブレインを１次抗体（表１、Ｂｒｎ３Ｂ  １：１
０００、Ｂｒｎ３Ａ  １：１０００、Ｔｕｊ１  １：１０００、ＮＦ２００  １：１０００、Ａｃｔｉｎ  １：２，０００）及び２次抗体（HRP-conjugated secondary antibody
、Goat anti-mouse or anti-rabbit IgG、diluted 1:2,000、Santa Cruz、CA）と反応さ
せた後、Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｓｃｅｎｃｅ分析キット（Amersham ECL、GE Healthcare Life technology、Piscataway、NJ）を使用し、反応タンパクを検出した。
【０１４８】
【表１】
2019208500.tif 000003
【０１４９】
分化に関連するマーカー発現の調査の結果、前記実施例４のプロトコールＡの方法により分化誘導後１７日目に得られたマーカーのフローサイトメトリー分析の結果（表２Ａ）は、網膜前駆細胞のマーカーであるＲａｘが９５．８±１．４％、Ｐａｘ６が９３．８±０．７％と示された（図７Ａ）。一方、網膜神経節細胞の特異的マーカーであるＭａｔｈ５、Ｂｒｎ３Ｂ及びＢｒｎ３Ａはそれぞれ９５．２±１．２％、９６．８±０．６％、及び９７．５±０．９％であった。マウスの場合、網膜神経節細胞の初期段階で発現される
Ｍａｔｈ５は、胎生期１１日目から生後１日目まで検出されることが報告されており、Ｂｒｎ３Ｂ及びＢｒｎ３Ａは胚発生の間に網膜神経節細胞の生成時から検出され、一生維持されることが知られている。また、これらマーカーは、大部分の網膜神経節細胞で同時に発現される。網膜神経節細胞のサブタイプのマーカーであるＩｓｌｅｔ−１は、１６．４±２．７％で検出された。分化誘導後１７日目の免疫蛍光染色の結果、陽性率はフローサイトメトリー分析の結果と同じであった。Ｍａｔｈ５とＢｒｎ３Ｂはほとんどの細胞核で強く染色された（図７Ｂ、Ｃ）。Ｂｒｎ３Ａ（核染色）−陽性細胞の細胞質は、神経細胞の特異的マーカーであるＴｕｊ１（９８．２±０．４％）で染色され（表２Ａ、図７Ｄ）、神経細胞の一種である網膜神経節細胞への分化が行われたことが確認された。網膜神経節細胞の軸索で発現されるＮＦ２００に陽性細胞の約１／５は、網膜神経節細胞のサブタイプのマーカーであるＩｓｌｅｔ−１で染色された（表２Ａ、図７Ｅ）。Ｉｓｌｅｔ−１陽性の網膜神経節細胞は、全体の網膜神経節細胞の３分の１程度を占めることが報告されている。細胞の軸索及び樹状突起で枝化、リングの形成、棘突起などの成熟はまだ観察されなかった。
【０１５０】
前記実施例６のプロトコールＡの方法により分化誘導後３９日目で得られた細胞マーカーのフローサイトメトリー分析の結果（表２Ｂ、図８）、Ｐａｘ６−陽性細胞が８２．３±３．５％と示された。Ｐａｘ６は網膜前駆細胞だけでなく、網膜神経節細胞に分化した後にも継続的に発現されることが知られている（図９Ａ）。Ｍａｔｈ５、Ｂｒｎ３Ｂ（図９Ｂ、Ｆ、Ｇ）及びＢｒｎ３Ａ（図９Ｃ、Ｄ、Ｈ）−陽性細胞はそれぞれ７７．３±２．７％、８４．７±０．８％、８９．９±２．３％と検出された。Ｍａｔｈ５は、細胞分化の進行により減少した。Ｉｓｌｅｔ−１―陽性細胞は、分化誘導後１７日目で１６．４±２．７％で、分化誘導後３９日目には３２．８±７．１％に増加し、全体網膜神経節細胞の約３分の１を占めるようになった（図９Ｅ）。一方、細胞増殖マーカーであるＫＩ６７−陽性細胞は、分化誘導後１７日目に８１．０±３．５％から１８．４±３．５％と格段に減少した。免疫蛍光染色の結果、軸索のリングと棘突起、及び樹状突起の枝化、リング、棘突起などが網膜神経節細胞で観察され、成熟が進行したことが確認された（図９Ｆ〜Ｉ）。この成熟は分化誘導後５９日目でさらに進行した（図１０）。
【０１５１】
ウェスタンブロット分析でも、免疫化学染色及びフローサイトメトリー分析で確認した網膜神経節細胞の特異的マーカーであるＢｒｎ３Ｂ、Ｂｒｎ３Ａ及び神経細胞特異的マーカーであるＮＦ２００、Ｔｕｊ１が強く発現していることが確認された（図９Ｊ）。
【０１５２】
【表２】
2019208500.tif 000004
【０１５３】
前記実施例５及び６のプロトコールＢ（図５）とプロトコールＣ（図６）により行った網膜神経節細胞への分化誘導後３９日目に、細胞のタンパク発現マーカーを確認した。細胞マーカーのフローサイトメトリー分析の結果（表３Ａ及びＢ）、細胞は網膜神経節細胞−特異的マーカーであるＭａｔｈ５、Ｂｒｎ３Ｂ及びＢｒｎ３Ａに陽性で、神経軸索及び樹状突起のマーカーであるＴｕｊ１とＮＦ２００はプロトタイププロトコールＡと類似していたが、プロトコールＢ及びＣでは、サブタイプマーカーであるＩｓｌｅｔ−１に陽性細胞はそれぞれ１２．４±２．５％及び７．８±１．６％に減少したことが観察された。一方、免疫蛍光染色法で細胞の形態を分析した結果、プロトコールＡに比べて、プロトコールＢは細胞の軸索及び樹状突起の陽性率と成熟度は類似するが、電気的機能を担当するシナプス−前部及び−後部のタンパク小胞の陽性率が低下していた（図１１）。プロトコールＣにおける細胞分化は、シナプス−前部及び−後部のタンパク小胞の生成は盛んであるが、相対的に軸索及び樹状突起の成熟が低下していた（図１２）。
【０１５４】
【表３】
2019208500.tif 000005
【０１５５】
ヒト胚性幹細胞株であるＨ９以外のＨ７及びヒト誘導多能性幹細胞は、実施例６のプロトコールＡによる網膜神経節細胞への分化を誘導した。分化誘導後３９日目に細胞マーカーの免疫蛍光染色及びフローサイトメトリーを行った。その結果、ヒト胚性幹細胞Ｈ７のＭａｔｈ５、Ｂｒｎ３Ｂ及びＢｒｎ３Ａは、それぞれ９５．０％、９０．２％、及び９４．４％で、Ｈ９細胞株と同じ陽性率が検出された（表４Ａ）。免疫蛍光染色の結果は、軸索及び樹状突起の成熟特徴及び電気的機能を有するシナプス前部及びシナプス後部小胞の能動的生成を示した（図１３）。
【０１５６】
ヒト誘導多能性幹胞では、Ｍａｔｈ５、Ｂｒｎ３Ｂ及びＢｒｎ３Ａは、それぞれ７３．０％、６１．４％、及び７７．０％で、Ｈ９細胞株より比較的減少した陽性率を示した（表４Ｂ）。免疫蛍光染色の結果は、 軸索及び樹状突起の成熟特徴及び電気的機能を有す
るシナプス前部及びシナプス後部小胞の能動的生成を示した（図１４）。 
【０１５７】
【表４】
2019208500.tif 000006
【０１５８】
実施例８：ヒト多能性幹細胞から分化した網膜神経節細胞の電気生理学的特性及び機能評価
全細胞電圧記録と電流クランプ（current-clamp）記録は、人工脳脊髄液を記録チャン
バーに１〜１．５ｍＬ/分の速度で注入することにより３２±１℃で行った。前記人工脳
脊髄液は、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１．２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２ ｍＭＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  グル
コース、１．２ｍＭ  ピルビン酸及び０．４ｍＭ  Ｎａ−ａｓｃｏｒｂａｔｅ組成で構成し、ｐＨ  ７．４で９５％Ｏ２、５％ＣＯ２飽和させた。パッチピペットは、３．５〜４．５ＭΩのチップ抵抗を有するものを用いた。全細胞の構成以降の連続抵抗（series resistance）は１０ＭΩ〜１５ＭΩであった。記録はＥＰＣ−１０  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ（HEKA、Lambrecht-Pfalz、Germany）を使用して行い、記録時のピペット溶液は、１４３ｍ
Ｍ  Ｋ−グルコン酸、７ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４ｍＭ  ＭｇＡＴＰ、０．３ｍＭ  ＮａＧＴＰ、４ｍＭ  Ｎａ−ａｓｃｏｒｂａｔｅ及び０．１ｍＭ  ＥＧＴＡで組成し、ｐＨはＫＯＨを使用して７．３に合わせた。自発性の興奮性シナプス−後部の電流（spontaneous excitatory postsynaptic currents(sEPSCs)）は、固定電圧−７０  ｍＶで記録した。自発的シナプス−後部の電流のパターンを特定するには、６−ｃｙａｎｏ−７−ｎｉｔｒｏｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ−２，３−ｄｉｏｎｅ（ＣＮＱＸ、５０μＭ）、Ｄ−（−）−２−ａｍｉｎｏ−５−ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＡＰ５、５０μＭ）と（＋）−Ｂｉｃｕｃｕｌｌｉｎｅ（５０μＭ）を実験チャンバー（Ｓｉｍｇａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のバス溶液に注入した。ＣＮＱＸはＡＭＰＡ受容体、ＡＰ５はＮＭＤＡ受容体、ＢｉｃｕｃｕｌｌｉｎｅはＧＡＢＡ受容体をそれぞれ遮断した。Ｎａ＋電流はテトロドトキシン（ＴＴＸ、１ｕＭ）で、Ｋ＋電流は４−アミノピリジン（４−ＡＰ、１ｍＭ）（Ｓｉｍｇａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）遮断した。
【０１５９】
＜８−１＞ヒト多能性幹細胞から分化した網膜神経節細胞の電気生理学的特性の評価
本研究の発明における分化したヒト多能性幹細胞−由来網膜神経節細胞の電気的特性を評価するために、まず、プロトコールＡにより分化した網膜神経節細胞を評価した。分化誘導後３９日目に行った活動電位の評価で段階的電流注入に反応して活動電位列車形態の強力かつ規則的なスパイキングが観察された（図１５Ａ）。全細胞パッチクランプ記録の結
果、電圧−開閉ナトリウム通路が存在することが確認され、テトロドトキシン（tetrodotoxin）により抑制した（図１５Ｂ）。したがって、ヒト多能性幹細胞−由来網膜神経節細胞は、電気的興奮性細胞に分化したことが確認された。また、分化誘導後５９日目の活動電位の評価では、段階的電流注入に反応して活動電位が分化誘導後３９日目より成熟していることが確認された（図１６Ｂ）。 発生学的発達の過程における神経細胞は、経時伴
い成熟した電気的な点火が可能な細胞に発達することが報告されている。これは、生体内で観察されるのと同じ現象である（非特許文献１０）。プロトコールＢ（図１７Ａ）及びプロトコールＣ（図１８Ａ）及びヒト誘導多能性幹細胞（図２０）により分化した網膜神経節細胞でも類似の結果を確認した。本発明のプロトコールにより分化した網膜神経節細胞は、経時に伴い電気的成熟度及び機能が増加することが確認された。
【０１６０】
＜８−２＞ヒト多能性幹細胞から分化した網膜神経節細胞の電気生理学的機能の評価
本発明によりヒト多能性幹細胞から分化した網膜神経節細胞は、機能的な興奮性シナプスを形成する。シナプス形成は、神経ネットワークの形成に非常に重要な段階である。ヒト多能性幹細胞由来−網膜神経節細胞間の物質的シナプスの形成は、超解像度顕微鏡を用いてシナプス−前部と−後部の小胞タンパク質の位置を確認した。シナプスは、シナプス−前部と−後部の区画に特異的なタンパク質が並置されたＭＡＰ２染色によって検出された樹状突起の近くに見出された直径数百ナノメートルの領域として定義した。シナプス−前部と−後部のタンパク小胞に対する抗体をシナプスを検出するために使用した：興奮性グルタミン酸性シナプス−後部のタンパク小胞のＰＳＤ−９５（glutamatergic postsynaptic density 95）とシナプス−前部のタンパク小胞のシナプシン１（synapsin1）に対する抗体を使用した。多能性幹細胞−由来網膜神経節細胞で生成されたＰＳＤ−９５は、樹状突起に沿って又はその１００ｎｍサイズ範囲で豊富であり、シナプス−前部の小胞であるシナプシン１と重ならず、並べられた状態で位置した（図１０Ｇ、Ｈ）。これは、別のヒト胚性幹細胞の細胞株であるＨ７（図１３Ｇ、Ｈ）、及びヒト誘導多能性幹細胞（図１４Ｋ、Ｌ）に由来した網膜神経節細胞の全てで確認され、この現象は、ヒトの多能性幹細胞由来−網膜神経節細胞間に物理的なシナプスを形成していることを立証する現象である。
【０１６１】
一方、細胞間で形成された物理的シナプスを電気生理学的に評価した。自発性の興奮性シナプス−後部の電流（ｓＥＰＳＣｓ）は他の網膜組織との共培養なしでヒト胚性幹細胞由来−網膜神経節細胞で分化誘導後３９日目に検出され（図１５Ｃ）、ヒト胚性幹細胞由来−網膜神経節細胞間の機能的な興奮性シナプスが形成されたことを示す。また、分化誘導後５９日目（図１６Ｅ）に評価したｓＥＰＳＣｓの頻度とスパイキングの深さがより増加したことが確認され、神経分化への成熟度が経時に従ってより進行させたことを暗示する。前記ｓＥＰＳＣｓはＣＮＱＸにより遮断されることが確認され、ＡＭＰＡ媒介興奮性グルタミン酸作動性神経細胞の一種類であることを提示する。類似の結果がプロトコールＢ（図１７Ｂ）とＣ（図１８Ｂ）により分化された網膜神経節細胞で観察された。
【０１６２】
実施例９：ヒト胚性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞から網膜の光受容体細胞への分化及び網膜神経節細胞への分化プロトコールの比較
本発明者らは、先行特許である特許文献１及び特許文献２を通じて幹細胞から網膜細胞を分化する方法を開示した。
【０１６３】
前記文献に開示された方法によると、網膜前駆細胞からの光受容体細胞の分化は最大約８０％に最大化された。しかし、その網膜神経節細胞への分化は部分的で、約６％しか進行しなかった。
【０１６４】
＜９−１＞ヒト胚性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞から網膜の光受容体細胞への分化
ヒト胚性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞から眼球領域前駆体及び網膜前駆細胞への分
化は、前記実施例１〜３と同様に行った。
【０１６５】
分化誘導後１３日目、前記実施例３で生成された網膜前駆細胞に光受容体前駆体の分化培養液［ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Invitrogen）、１ｍＭのエル−グルタミン（Invitrogen）、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（Invitrogen）、０．１ｍＭのメルカプトエタノール（Sigma-Aldrich）、１％のＢ２７サプリメント（Invitrogen）、１％のＮ２サプリメント（Invitrogen）、１０ｎｇ／ｍＬのノギン、１０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１、５ｎｇ／ｍＬのＦ
ＧＦ２及び５０ｎｇ／ｍｌの組換えＷｎｔ３ａ（recombinant Wnt3a、R&D Systems)］を
５日間供給しながら培養し、光受容体前駆体に分化させた。分化誘導後１８日目は、光受容体前駆体培養液に２５０ｎｇ／ｍＬの組換えＳｈｈ（recombinant Sonic hedgehog amino terminal peptide、Shh、R&D Systems)］を添加して５日間供給しながら培養して光受容体細胞に分化させた。分化２１日目、光受容体細胞の培養液にレチノイン酸（ＲＡ）５００ｎＭを添加して２９日目まで培養し、生成された光受容体細胞を成熟させた。２９日目以降の光受容体細胞の維持培養を継続する場合にもＷｎｔ３ａ、Ｓｈｈ及びＲＡが添加された培養液を継続的に供給した。前記培養法で生成された細胞を免疫蛍光法で分析時の光受容体細胞は８０％以上、網膜神経節細胞は、６％程度と確認された。
【０１６６】
＜９−２＞ヒト胚性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞から網膜神経節細胞への分化
ヒト胚性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞から網膜神経節細胞への分化は、眼球領域前駆体と同様の方法で行い、網膜前駆細胞への分化は、分化１４日目に５０ｎｇ／ｍｌの組換えＷｎｔ３ａを３日間だけ供給し、それ以後には除去した以外は光受容体細胞への分化と同一であった。また、ＳｈｈとＲＡは、Ｗｎｔ３ａを除去した後に供給した。すなわち、網膜神経節細胞への分化開始後、網膜神経節細胞を分化され成熟した時に、Ｗｎｔ３ａを除去し、各段階でＳｈｈとＲＡを添加した。
【０１６７】
前記培養法で生成された細胞を免疫蛍光法で分析した結果、光受容体細胞に関連するマーカーであるＣｒｘとＲｅｔ−Ｐ１は観察されなかった。
【０１６８】
実施例１０：未成熟網膜神経節細胞から成熟網膜神経節細胞への分化：段階２
実施例６で得られた成熟網膜神経節細胞は実施例６の分化培養方法を用いてで成熟させることができるが、また、分化誘導後３９日目以後から、前記分化培養液からＩＧＦ−１、Ｓｈｈ及び、レチノイン酸を除去した培養液を供給しながら、網膜神経節細胞を成熟させることもできる。電気生理学的分析は分化誘導後９６日目で行って成熟度を評価した（図１９）。また、網膜神経節細胞を分化誘導後３２日目から前記のように成熟させ、その結果、ＩＧＦ−１、Ｓｈｈ及びレチノイン酸を全て含む培養液を使用した場合と成熟度が類似の結果を示した。
【０１６９】
実施例１１：Ｗｎｔシグナル伝達経路活性剤とＳｈｈ受容体活性剤によるヒト胚性幹細胞由来−網膜神経節細胞の分化
ヒト胚性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞から眼球領域前駆体又は網膜前駆細胞への分化は、前記実施例１〜３と同様に行った。
【０１７０】
分化誘導後１４日目に前記実施例３で生成された網膜前駆細胞を分化培養液［ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Invitrogen）、１ｍＭのＬ−グルタミン（Invitrogen）、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（Invitrogen）、０．１ｍＭのメルカプトエタノール（Sigma-Aldrich）、１％
のＢ２７サプリメント（Invitrogen）、１％のＮ２サプリメント（Invitrogen）、１０ｎｇ／ｍＬのノギン、１０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１、５  ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２及び５０ｎｇ／ｍｌの組換えＷｎｔ３ａ（recombinant Wnt3a、R&D Systems)］で培養し、５０ｎｇ
／ｍｌの組換えＷｎｔ３ａの代わりにＷｎｔシグナル伝達経路活性剤であるＢＩＯ（6-bromoindirubin-3’-oxime）２μＭ又はノリン（Norrin）５０ｎｇ／ｍＬを添加した後、３
日間培養して未成熟網膜神経節細胞に分化させた。分化誘導後１７日目に、こうして生成された未成熟網膜神経節細胞を培養して、分化培養液［ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Invitrogen）、１ｍＭのエル−グルタミン（Invitrogen）、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（Invitrogen）、０．１ｍＭのメルカプトエタノール（Sigma-Aldrich）、１％のＢ２７サプリメント
（Invitrogen）、１％のＮ２サプリメント（Invitrogen）、１０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１、２５０ｎｇ／ｍＬの組換えＳｈｈ（R&D Systems）］に２５０ｎｇ／ｍＬのＳｈｈの代
わりにＳｈｈ受容体活性剤であるＰｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ  １μＭを添加した後、５日間成熟網膜神経節細胞に分化させた。分化誘導後２２日目に、前記成熟網膜神経節細胞は前記培養液にレチノイン酸（ＲＡ）５００ｎＭを添加して製造した培養液を用いて、３９日間成熟させた。 
【０１７１】
この方法により生成された細胞の免疫蛍光法は、網膜神経節細胞マーカーであるＩｓｌｅｔ１とＮＦ２００を使用して行い、Ｗｎｔ３ａ及びＳｈｈを使用した結果と同じ結果を取得した（図２１）。 
【０１７２】
実施例１２：ヒト多能性幹細胞−由来網膜神経節細胞の細胞株
網膜神経節細胞の産生におけるプロトコルＡ分化法に用いたＷｎｔ3ａ、Ｓｈｈ及びＲ
Ａのそれぞれの効果を調べるために、各因子をプロトコールＡの分化スケジュールに従って処理し、分化誘導後３９日目に網膜神経節細胞特異的マーカーを用いて免疫蛍光アッセイを実施した（図２２）。
【０１７３】
１μｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａアンタゴニストであるＤｋｋ１で分化誘導後１４〜１７日目にＷｎｔ３ａの代わりに処理し、ＳｈｈとＲＡを分化スケジュールに従って処理した後、免疫蛍光アッセイを行った。その結果、網膜神経節細胞はＷｎｔ３ａが添加されず、網膜前駆細胞の内在性Ｗｎｔ３ａがＤｋｋ１によって阻害された（すべてのマーカー陽性率：2％未満）ため、ほとんど生成されなかった。
【０１７４】
Ｓｈｈ及びＲＡをＷｎｔ３ａの処置なしにそれぞれの分化スケジュールに従って処置すると、少数の網膜神経節細胞が、網膜前駆細胞の内因性Ｗｎｔ３ａの影響によって産生された（すべてマーカー陽性率：約10％〜15％） （図２２（Ｂ））。
【０１７５】
ＳｈｈおよびＲＡの処置なしでＷｎｔ３ａのみ処置された場合、網膜神経節細胞の８０％又はそれ以上がＷｎｔ３ａの影響により産生された。しかし、網膜神経節細胞の軸索の口径成長及び纖維束攣縮はｓｈｈの欠如のために遅延した（NF200染色参照）。さらに、
網膜神経節細胞のシナプス形成及び樹状突起棘の発達は、ＲＡが存在しないために観察されなかった（TUJ1染色参照）（図２２（Ｃ））。
【０１７６】
ＲＡ処置なしでＷｎｔ３ａ及びＳｈｈを処置すると、網膜神経節細胞の８０％以上がＷｎｔ３ａの影響により産生され、Ｓｈｈの効果も観察された。 しかし、網膜神経節細胞
のシナプス形成及び樹状突起棘の発達は、ＲＡが存在しないために阻害された（TUJ1染色参照）（図２２（Ｄ））。
【０１７７】
Ｓｈｈの処置なしでＷｎｔ３ａ及びＲＡを処置すると、網膜神経節細胞の８０％以上がＷｎｔ３ａの影響により産生されるが、ｓｈｈの欠如のためにＮＦ２００陽性軸索の口径成長及び纖維束攣縮が遅延された（NF200染色参照） 。
【０１７８】
これらの結果は、Ｗｎｔ３ａの処置が網膜神経節細胞の分化において重要な役割を果たすことを示唆している。また、ＲＡ及びＳｈｈが予定に従って適切に処置された場合、網膜神経節細胞が十分に分化され得ることも確認された。
【０１７９】
実施例１３：ヒト多能性幹細胞由来の網膜神経節細胞の細胞株
幹細胞から各臓器の成熟細胞への分化は、長時間がかかり、専門家らの多くの時間と労力、試薬などが必要される。もし分化の最終、又は中間段階の細胞を細胞株にすることができれば、このような分化誘導時間を大幅に減らすことができる。即ち、分化して成熟した細胞を製作する場合、幹細胞株からではなく、製作された細胞株から分化を誘導し、短時間で成熟細胞を製作することができる。本研究者は、このような目的で分化のほぼ最終段階の成熟した細胞から細胞株の製作を試みて成功した。幹細胞の分化は、非対称細胞分裂（asymmetric division）で進められる。即ち、細胞分裂後に生成される２つの娘細胞
がそれぞれ異なる細胞の運命を有しており、一つの細胞は、元来の幹細胞のクローンであり、他の娘細胞は、幹細胞の性向を捨てて分化に進める細胞である。本研究者の発明は、分化成熟した細胞を２次培養すると、成熟した分化細胞は、環境の変化により死滅し、その中にいた幹細胞の性向を有する細胞が増殖して細胞株になるようにする。特に、元来の分化した細胞の性向と幹細胞の性向を同時に有する分化の中間段階の細胞株を作製したことは重要な発明である。
【０１８０】
細胞は、分化誘導後３２日目又は３９日目に０．０５％のトリプシン（Invitrogen）で解離させた。取得した細胞を、次の培養液中の一種類の培養液を添加し、それぞれ１．５〜１．６ｘ１０４／ｃｍ２ずつ培養フラスコ、皿又はプレートに植え付けた。下記両培養液（培養液１、培養液２）はいずれも細胞の増殖能力、継代培養回数及び周期、特性などは同じであった。細胞は５％の二酸化炭素（ＣＯ２）、３７℃で下記培養液を、それぞれ２〜３日ごとに交換して培養し、培養増殖した細胞は、１：６〜１：１０の割合で３〜４日ごとに０．０５％のトリプシン処理で継代培養した。
【０１８１】
培養液１：［ＩＭＤＭ（Invitrogen）、１５％のＦＢＳ、１ｍＭのエル−グルタミン（Invitrogen）、０．１ｍＭのメルカプトエタノール（Sigma-Aldrich）、1%Insulin/Transferrin/Selenium-X（Invitrogen）］。
【０１８２】
培養液２：［ＩＭＤＭ（Invitrogen）、１５％のＦＢＳ、１ｍＭのエル−グルタミン（Invitrogen）、０．１ｍＭのメルカプトエタノール（Sigma-Aldrich）、５ｎｇ／ｍＬの
ＦＧＦ２、１０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１、５ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＥＧＦ（human recombinant Epidermal growth factor Peprotech、Rocky Hill、NJ)］。
【０１８３】
細胞は、継代培養数２０（passage number 20:p20）まで培養を行い、培養液１及び培
養液２で継代培養した細胞はいずれも試験管内で神経細胞の形態を示した（図２３）。継代培養数１５〜１７（ｐ１５〜ｐ１７）におけるヒト多能性幹細胞由来−網膜神経節細胞株は細胞特性及び神経的機能を評価するために使用した。網膜神経節細胞に特異的なマーカーに対する抗体を使用して免疫蛍光染色を前記実施例７の方法により行い、神経的機能の評価は、神経細胞の機能をＬｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｃａ２＋ ｉｍａｇｉｎｇを通じて評価
した。
【０１８４】
カルシウムイメージ解析は、１８ｍｍ  ｃｏｖｅｒｓｌｉｐに培養された細胞をＴｙｒｏｄｅ’ｓ溶液（119 mM NaCl、2.5 mM KCl、2 mM CaCl2、2 mM MgCl2、25 mM HEPES、30
mM glucose、pH 7.4）で２〜３回洗浄後、１μＭ  Ｆｌｕｏ−４−ＡＭ（Life technologies、Carlsbad、CA、USA）染料を添加し、３７℃で培養した。１５分間培養した後、Ｔ
ｙｒｏｄｅ’ｓ溶液で１０分間洗浄した。時間差イメージは４０ｘ（１．０  ＮＡ）ｏｉｌ  ｌｅｎｓが装着されたＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−７１  ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Olympus、Tokyo、Japan）とＥＭＣＣＤ（iXon887、Andor Technologies、Belfast、Northern Ireland）で３０分間、０．５秒ごとに得た。１０番目のイメージフレ
ームから細胞を１ｍＭグルタミン酸で１０秒間刺激した。刺激した後、細胞はＴｙｒｏｄｅ’ｓ溶液で続けて貫流した。
【０１８５】
免疫蛍光染色の結果は、神経節細胞の特異的なマーカーである、Ｍａｔｈ５（９８．９％）、Ｂｒｎ３Ｂ（５２．４％）、及びＢｒｎ３Ａ（９９．７％）が全て発現していることを示し、機能マーカーであるＴｈｙ１．２（８６．１％）、ＴｒｋＢ（４４．０％）、ＮＭＤＡＲ−１（９７．０％）マーカーも発現していた。また、神経細胞の特異的なマーカーであるＴｕｊ１（１００％）、及び網膜神経節細胞の軸索マーカーであるＮＦ２００（９８．５％）も強く発現していた。一方、細胞増殖マーカーであるＫＩ６７（４９．２％）が評価され、細胞増殖能を有する細胞株として評価された（図２４）。
【０１８６】
網膜神経節細胞の細胞株の神経機能は細胞内カルシウムイメージにより検査した。継代培養した細胞に１ｕＭのｆｌｕｏｒ−４を処理し、１ｍＭグルタミン酸で刺激を与えた。その結果、多数の生きている細胞はグルタミン酸刺激に反応して細胞内カルシウムが相当量増加することが確認された。これは、網膜神経節細胞の細胞株が神経機能を有していることを示す（図２５）。
【０１８７】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されることがあることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更又は変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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