(57)【要約】      （修正有）【課題】骨欠損部位に経皮的に直接送達でき、優れた力学強度を有する人工骨を形成可能な材料、およびキットの提供。【解決手段】ホスホン酸基を有する基、及び、その金属塩からなる群より選択される少なくとも１種の特定置換基を有する変性セルロースナノファイバと、カルシウム塩と、水を含有する溶媒と、を含有するヒドロゲル。【選択図】図２１
2019208862.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホン酸基を有する基、及び、その金属塩からなる群より選択される少なくとも１種の特定置換基を有する変性セルロースナノファイバと、カルシウム塩と、水を含有する溶媒と、を含有するヒドロゲル。
【請求項２】
前記カルシウム塩が、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、及び、塩化カルシウムからなる群より選択される少なくとも１種である請求項１に記載のヒドロゲル。
【請求項３】
前記ホスホン酸基を有する基が、以下の式（１）で表される基である、請求項１又は２に記載のヒドロゲル。
【化１】
2019208862.tif 000014
式１中、Ｌ１Ａは単結合、又は、２価の連結基を表し、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基、又は、１価の有機基を表し、＊は結合位置を表す。
【請求項４】
前記ホスホン酸基を有する基が、以下の式（２）で表される基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【化２】
2019208862.tif 000015
式（２）中、Ｌ２１、及び、Ｌ２２はそれぞれ独立に、単結合、又は、２価の連結基を表し、Ｒ２は水素原子又は１価の有機基を表し、＊は結合位置を表す。
【請求項５】
前記変性セルロースナノファイバが、以下の式（Ｃ）で表される繰り返し単位を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【化３】
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式（Ｃ）中、Ｒ３１及びＲ３２は、それぞれ独立にアルデヒド基、及び、前記特定置換基からなる群より選択される少なくとも１種の基であり、
Ｒ３１、及び、Ｒ３２の少なくとも一方は、前記特定置換基を表す。
【請求項６】
前記ヒドロゲル中における、前記溶媒の体積基準の含有量に対する、前記変性セルロースナノファイバの質量基準の含有量の含有量比が、２．０〜８．０％である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【請求項７】
前記カルシウム塩が硫酸カルシウムを含有し、
前記ヒドロゲル中における、前記溶媒の体積基準の含有量に対する、前記硫酸カルシウムの質量基準の含有量の含有量比が、０．１〜１２％である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【請求項８】
前記カルシウム塩がリン酸カルシウムを含有し、
前記リン酸カルシウムが、α−リン酸三カルシウム、及び、β−リン酸三カルシウムからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【請求項９】
前記カルシウム塩がβ−リン酸三カルシウムを含有し、
前記ヒドロゲル中における、前記溶媒の体積基準の含有量に対する、前記β−リン酸三カルシウムの質量基準の含有量の含有量比が、５〜６０％である、請求項８に記載のヒドロゲル。
【請求項１０】
骨形成用である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
【請求項１１】
ホスホン酸基を有する基、又は、その金属塩からなる群より選択される少なくとも１種の特定置換基を有する変性セルロースナノファイバと、水と、を含有する第１剤と、カルシウム塩を含有する第２剤と、を含むキット。
【請求項１２】
前記第２剤が更に水を含有する、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
更に、経皮送達デバイスを含む、請求項１１又は１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒドロゲル、及び、キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨欠損の治療に、骨欠損部位に骨形成用材料を経皮的に（言い換えれば、大きく切開せずに）直接送達し、骨形成を促す治療方法が用いられている。このような治療方法に用いることができる骨形成用材料として、特許文献１には、「第８リン酸カルシウムと、ヒアルロン酸又はその塩とを含む骨再生用材料」が記載されている。
また、非特許文献１には、ビスホスホネートで変性したヒアルロン酸とリン酸カルシウムとを用いた骨形成用材料が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１５−５４０５４号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】M. R. Nejadnik, X. Yang, M. Bongio, H. S. Alghamdi, J. J.J.P. van den Beucken, M. C. Huysmans, J. A. Jansen, J. Hilborn, D. Ossipov, S.C.G. Leeuwenburgh, Self-healing hybrid nanocomposites consisting of bisphosphonated hyaluronan and calcium phosphate nanoparticles, Biomaterials, 35, 6918-6929 (2014).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、特許文献１及び非特許文献１に記載された骨形成用材料を用いて形成される人工骨は、力学強度が不十分であることを明らかとした。
そこで、本発明は、骨欠損部位に経皮的に直接送達でき、優れた力学強度を有する人工骨を形成可能な材料を提供することを課題とする。また、本発明は、キットを提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、以下の構成により上記課題を達成することができることを見出した。
【０００７】
［１］  ホスホン酸基を有する基、及び、その金属塩からなる群より選択される少なくとも１種の特定置換基を有する変性セルロースナノファイバと、カルシウム塩と、水を含有する溶媒と、を含有するヒドロゲル。
［２］  カルシウム塩が、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、及び、塩化カルシウムからなる群より選択される少なくとも１種である［１］に記載のヒドロゲル。
［３］  ホスホン酸基を有する基が、後述する式（１）で表される基である、［１］又は［２］に記載のヒドロゲル。
［４］  ホスホン酸基を有する基が、後述する式（２）で表される基である、［１〜３のいずれかに記載のヒドロゲル。
［５］  変性セルロースが、後述する式（Ｃ）で表される繰り返し単位を有する、［１］〜［４］のいずれかに記載のヒドロゲル。
［６］  ヒドロゲル中における、溶媒の体積基準の含有量に対する、変性セルロースナノファイバの質量基準の含有量の含有量比が、２．０〜８．０％である、［１］〜［５］のいずれかに記載のヒドロゲル。
［７］  カルシウム塩が硫酸カルシウムを含有し、ヒドロゲル中における、溶媒の体積基準の含有量に対する、硫酸カルシウムの質量基準の含有量の含有量比が、０．１〜１２％である、［１］〜［６］のいずれかに記載のヒドロゲル。
［８］  カルシウム塩がリン酸カルシウムを含有し、リン酸カルシウムが、α−リン酸三カルシウム、及び、β−リン酸三カルシウムからなる群より選択される少なくとも１種である、［１］〜［６］のいずれかに記載のヒドロゲル。
［９］  カルシウム塩がβ−リン酸三カルシウムを含有し、ヒドロゲル中における、溶媒の体積基準の含有量に対する、β−リン酸三カルシウムの質量基準の含有量の含有量比が、５〜６０％である、［８］に記載のヒドロゲル。
［１０］  骨形成用である、［１］〜［９］のいずれかに記載のヒドロゲル。
［１１］  ホスホン酸基を有する基、又は、その金属塩からなる群より選択される少なくとも１種の特定置換基を有する変性セルロースナノファイバと、水と、を含有する第１剤と、カルシウム塩を含有する第２剤と、を含むキット。
［１２］  第２剤が更に水を含有する、［１１］に記載のキット。
［１３］  更に、経皮送達デバイスを含む、［１１］又は［１２］に記載のキット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ヒドロゲル、及び、キットを提供できる。
なお、以下の説明では、特定置換基を有する変性セルロースナノファイバを「ｐＣＮＦ」（ＣＮＦはＣｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｎａｎｏｆｉｂｅｒの略である）ということがある。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ｐＣＮＦ、及び、アレンドロン酸の１Ｈ核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ  ＮＭＲ）である。
【図２】ｐＣＮＦ、及び、アルデヒド化セルロースの３１Ｐ核磁気共鳴スペクトル（３１Ｐ  ＮＭＲ）である。
【図３】ｐＣＮＦの走査型電子顕微鏡観察により取得した画像である。
【図４】ｐＣＮＦのエネルギー分散Ｘ線分光法（ＥＤＸ）の測定結果である。
【図５】ｐＣＮＦ溶液のせん断速度に対するせん断応力、及び、粘度である。
【図６】ｐＣＮＦとカルシウム塩とを含有するヒドロゲルの電子顕微鏡写真である。
【図７】ヒドロゲルの周波数変化に対する粘弾性特性の測定結果である。
【図８】ヒドロゲルのひずみ変化に対する粘弾性特性の測定結果である。
【図９】超音波照射を行う前後での、ヒドロゲルのせん断弾性率測定結果の比較結果である。
【図１０】ヒドロゲルのせん断弾性率への、分散液中のｐＣＮＦの濃度の影響である。
【図１１】ヒドロゲルのせん断弾性率への、アレンドロン酸当量の影響である。
【図１２】せん断弾性率に対するＣＮＦ表面の官能基の影響である。
【図１３】ヒドロゲルのチキソトロピー性の評価である。
【図１４】分散液中の硫酸カルシウム（ＣａＳＯ４）の濃度とせん断弾性率の関係を示すグラフである。
【図１５】分散液中のｐＣＮＦの濃度とせん断弾性率の関係を示すグラフである。
【図１６】分散液中のβ−ＴＣＰの濃度とせん断弾性率の関係を示すグラフである。
【図１７】分散液中のｐＣＮＦの濃度とせん断弾性率の関係を示すグラフである。
【図１８】疑似体液中に所定期間浸漬して、保持した、未処理のガラススライドの走査型電子顕微鏡写真である。
【図１９】疑似体液中に所定期間浸漬して、保持した、ｐＣＮＦフィルムの走査型電子顕微鏡写真である。
【図２０】疑似体液中に所定期間浸漬して、保持した、α−ＴＣＰプレートの走査型電子顕微鏡写真である。
【図２１】疑似体液中に所定期間浸漬して、保持した、ヒドロゲルの走査型電子顕微鏡写真である。
【図２２】疑似体液中に所定期間浸漬して、保持した、ヒドロゲルのＸ線回折測定結果である。
【図２３】ヒドロゲルの骨に対する接着強度の測定結果である。
【図２４】ヒドロゲルのせん断弾性率に対するｐＨの効果である。
【図２５】ｐＣＮＦの細胞生存率に与える影響の評価である。
【図２６】ｐＣＮＦの細胞生存率に与える影響の評価である。
【図２７】ポリスチレン培養皿上で培養した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図２８】硫酸カルシウムを含有するヒドロゲル上で培養した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図２９】β−リン酸三カルシウムを含有するヒドロゲル上で培養した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図３０】ｐＣＮＦ溶液の破骨細胞分化に与える影響の評価である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明について詳細に説明する。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
なお、本明細書において、「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
【００１１】
本明細書における基（原子群）の表記において、置換及び無置換を記していない表記は、本発明の効果を損ねない範囲で、置換基を有さないものと共に置換基を有するものをも包含するものである。例えば、「アルキル基」とは、置換基を有さないアルキル基（無置換アルキル基）のみならず、置換基を有するアルキル基（置換アルキル基）をも包含するものである。このことは、各化合物についても同義である。
また、本明細書において、「（メタ）アクリレート」はアクリレート及びメタクリレートの双方、又は、いずれかを表し、「（メタ）アクリル」はアクリル及びメタクリルの双方、又は、いずれかを表す。また、「（メタ）アクリロイル」はアクリロイル及びメタクリロイルの双方、又は、いずれかを表す。
【００１２】
［ヒドロゲル］
本発明の実施形態に係るヒドロゲルは、ホスホン酸基を有する基、及び、その金属塩からなる群より選択される少なくとも１種の置換基（本明細書において「特定置換基」という。）を有する変性セルロースナノファイバと、カルシウム塩と、水を含有する溶媒と、を含有するヒドロゲルである。
上記ヒドロゲルにより本発明の効果が得られる機序は必ずしも明らかではないが、本発明者らは以下のとおり推測している。
なお、本発明は、以下の機序により効果が得られるものに制限されない。言い換えれば、以下の機序以外の機序により効果が得られる場合であっても本発明の範囲に含まれるものとする。
【００１３】
従来、骨形成用材料（人工骨補填材料）としては、リン酸カルシウムが用いられることが多かった。リン酸カルシウムとしては、例えば、ハイドロキシアパタイト、及び、リン酸三カルシウム（例えば、β−ＴＣＰ）等が知られている。
しかし、これらの材料は、骨欠損部位に経皮的に直接送達できず（インジェクタブル）ではなく、骨欠損部位に導入しようとした場合には、大きく切開しなければならない等、侵襲性が高いという問題があった。
一方で、リン酸カルシウムの一種であるα−ＴＣＰは、インジェクタブルである一方、骨欠損部位に配置した後の分解速度が速すぎて、骨再生が完了する前に吸収されてしまう、すなわち、所望の骨形成が行われないという問題があった。
【００１４】
特許文献１及び非特許文献１に記載された材料は、上記問題の解決を企図して開発されたものであるものの、本発明者らの検討によれば、得られる人工骨の力学強度が不十分であることを知見している。得られる人工骨の力学強度が不十分であるとは、具体的には、十分なせん断弾性率を有する人工骨が形成できないことを意味する。
【００１５】
この点について、本発明者らは鋭意検討した結果、特定置換基を有する変性セルロースナノファイバと、カルシウム塩と、水を含有する溶媒と、を含有するヒドロゲルであれば、上記課題を解決することを知見し、本発明を完成させた。
【００１６】
本発明の実施形態に係るヒドロゲルは、特定置換基を有する変性セルロースナノファイバとカルシウム塩とを含有する。本発明の実施形態に係るヒドロゲルは、変性セルロースナノファイバを含有し、かつ、上記変性セルロースナノファイバにおける特定置換基とカルシウムとが結合することにより、変性セルロースナノファイバ同士がカルシウムを介して架橋され、結果として、優れた力学強度を有する人工骨が形成できるものと推測される。
【００１７】
更に、本発明の実施形態に係るヒドロゲルは、変性セルロースナノファイバを含有するため、優れた力学強度を有するのみならず、ナノポーラス構造を有しており、生体の骨と構造が類似している。
また、本発明の実施形態に係るヒドロゲルはチキソトロピー性を有し、剪断力下で粘度が低下するので、ダブルバレルシリンジを用いずともシングルシリンジでインジェクションすることができる。
また、本発明の実施形態に係るヒドロゲルは、疑似体液中でアパタイトを形成することができ、骨に対する優れた接着性も有する。
また、本発明の実施形態に係るヒドロゲルは、変性セルロースナノファイバが生分解性であるので、得られる人工骨も生分解性である。
また、本発明の実施形態に係るヒドロゲルは、優れた細胞接着性を有し、優れた生体適合性を有し、優れた生体親和性を有する。
【００１８】
また、後述する、ある種の特定置換基（典型的にはビスホスホネートに由来する置換基）を有する変性セルロースナノファイバを有するヒドロゲルは、ある種の特定化合物（典型的にはビスホスホネート）を放出することによって、破骨細胞の活性を抑制する機能も有する。
【００１９】
以下、本発明のヒドロゲルが含有する各成分について説明する。
なお、本明細書において、ヒドロゲルとは、水を含有する溶媒中で高分子鎖が物理的、及び／又は、化学的に架橋されることによって三次元網目構造を形成したものを意味する。上記架橋は可逆的であっても、不可逆的であってもよいが、可逆的であることが好ましい。
【００２０】
〔変性セルロースナノファイバ〕
本発明の実施形態に係るヒドロゲルは、特定置換基を有する変性セルロースナノファイバを含有する。
ヒドロゲル中における変性セルロースナノファイバの濃度としては特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有するヒドロゲルが得られる点で、ヒドロゲルの全質量に対して、０．５〜２０％が好ましく、２．０〜８．０％がより好ましい。
ヒドロゲルは、変性セルロースナノファイバの１種を単独で含有してもよく、２種以上を併せて含有してもよい。ヒドロゲルが２種以上の変性セルロースナノファイバを含有する場合は、変性セルロースナノファイバの濃度としては上記範囲内であることが好ましい。
【００２１】
なお、本明細書において、ヒドロゲル（又は、後述する変性セルロースナノファイバ分散液）中における変性セルロースナノファイバの「濃度」は、ヒドロゲル（又は分散液）中における、後述する溶媒の体積基準の含有量（単位：ｍＬ）に対する、ヒドロゲル（又は分散液）中における変性セルロースナノファイバの質量基準の含有量（単位：ｇ）の含有量比（百分率：ｗ／ｖ％）を意味する。
すなわち、変性セルロースナノファイバの質量基準の含有量（ｇ）／溶媒の体積基準の含有量（ｍＬ）×１００（％）で表される数値を意味する。
【００２２】
変性セルロースナノファイバは、セルロース原料から解繊、及び、変性を経て得られる微細繊維を意味する。
原料セルロースとしては、例えば、針葉樹系パルプ、広葉樹系パルプ、綿系パルプ等の植物、動物等から得られたセルロース、これらを用いた紙、古紙等を用いることができる。
【００２３】
本明細書において、セルロースナノファイバ及び変性セルロースナノファイバは数平均短軸径（平均繊維径）が３ｎｍ以上、５００ｎｍ未満のセルロース繊維を意味する。
変性セルロースナノファイバとしては、平均繊維径が３ｎｍ以上、５００ｎｍ未満であればよいが、より優れた本発明の効果を有するヒドロゲルが得られる点で、３〜１００ｎｍが好ましく、３〜５０ｎｍがより好ましい。
【００２４】
変性セルロースナノファイバの数平均繊維長としては特に制限されないが、一般に平均繊維径の１０倍以上であることが好ましい。
【００２５】
本明細書において、変性セルロースナノファイバの平均繊維径は、走査差型電子顕微鏡観察によって求められる。より具体的には、走査型電子顕微鏡観察で２０本の繊維の繊維径を測定し、その算術平均として求められる。
【００２６】
変性セルロースナノファイバは、ホスホン酸基を有する基、及び、その金属塩からなる群より選択される少なくとも１種の特定置換基を分子内に１つ以上有するセルロースナノファイバを意味する。
特定置換基のうち、ホスホン酸基を有する基としては特に制限されないが、例えば、以下の式で表される基が挙げられる。
【化１】
2019208862.tif 000003
【００２７】
上記式（Ａ１）中、ＬＡは（ｎ＋1）価の連結基であり、ＬＢは単結合、又は、２価の連結基であり、ｎは１以上の整数であり（１０以下が好ましく、４以下がより好ましく、３以下が更に好ましい）、＊はセルロース骨格との結合位置を表す。上記式（Ａ）中、複数あるＬＢは同一でも異なってもよい。
【００２８】
ＬＢの２価の連結基としては特に制限されないが、例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ２−（Ｒ２は水素原子又は１価の有機基を表す）、アルキレン基（炭素数１〜１０個が好ましい）、シクロアルキレン基（炭素数３〜１０個が好ましい）、アルケニレン基（炭素数２〜１０個が好ましい）、及び、これらの組み合わせ等が挙げられる。
【００２９】
ＬＡの（ｎ＋１）価の連結基としては、特に制限されないが、２価の連結基である場合、例えば、ＬＢとして例示したものが挙げられる。
３価以上の連結基としては、特に制限されないが、例えば、以下の式（１ａ）〜（１ｄ）で表される基が挙げられる。
【００３０】
【化２】
2019208862.tif 000004
【００３１】
式（１ａ）中、Ｌ３は３価の連結基を表す。Ｔ３は単結合又は２価の連結基を表し、３個のＴ３は互いに同一であってもよく異なっていてもよい。
Ｌ３としては、３価の炭化水素基（炭素数１〜１０が好ましい。なお、炭化水素基は、芳香族炭化水素基でもよく脂肪族炭化水素基でもよい。）、又は、３価の複素環基（５員環〜７員環の複素環基が好ましい）が挙げられ、炭化水素基にはヘテロ原子（例えば、−Ｏ−）が含まれていてもよい。Ｌ３の具体例としては、グリセリン残基、トリメチロールプロパン残基、フロログルシノール残基、及びシクロヘキサントリオール残基等が挙げられる。
【００３２】
式（１ｂ）中、Ｌ４は４価の基を表す。Ｔ４は単結合又は２価の連結基を表し、４個のＴ４は互いに同一であってもよく異なっていてもよい。
なお、Ｌ４の好適形態としては、４価の炭化水素基（炭素数１〜１０が好ましい。なお、炭化水素基は、芳香族炭化水素基でもよく脂肪族炭化水素基でもよい。）、４価の複素環基（５〜７員環の複素環基が好ましい）が挙げられ、炭化水素基にはヘテロ原子（例えば、−Ｏ−）が含まれていてもよい。Ｌ４の具体例としては、ペンタエリスリトール残基、及びジトリメチロールプロパン残基等が挙げられる。
【００３３】
式（１ｃ）中、Ｌ５は５価の基を表す。Ｔ５は単結合又は２価の連結基を表し、５個のＴ５は互いに同一であってもよく異なっていてもよい。
なお、Ｌ５の好適形態としては、５価の炭化水素基（炭素数２〜１０が好ましい。なお、炭化水素基は、芳香族炭化水素基でもよく脂肪族炭化水素基でもよい。）、又は、５価の複素環基（５〜７員環の複素環基が好ましい）が挙げられ、炭化水素基にはヘテロ原子（例えば、−Ｏ−）が含まれていてもよい。Ｌ５の具体例としては、アラビニトール残基、フロログルシドール残基、及びシクロヘキサンペンタオール残基等が挙げられる。
【００３４】
式（１ｄ）中、Ｌ６は６価の基を表す。Ｔ６は単結合又は２価の連結基を表し、６個のＴ６は互いに同一であってもよく異なっていてもよい。
なお、Ｌ６の好適形態としては、６価の炭化水素基（炭素数２〜１０が好ましい。なお、炭化水素基は、芳香族炭化水素基でもよく脂肪族炭化水素基でもよい。）、又は、６価の複素環基（６〜７員環の複素環基が好ましい）が挙げられ、炭化水素基にはヘテロ原子（例えば、−Ｏ−）が含まれていてもよい。Ｌ６の具体例としては、マンニトール残基、ソルビトール残基、ジペンタエリスリトール残基、ヘキサヒドロキシベンゼン、及び、ヘキサヒドロキシシクロヘキサン残基等が挙げられる。
【００３５】
一般式（１ａ）〜一般式（１ｄ）中、Ｔ３〜Ｔ６で表される２価の連結基の具体例及び好適形態は、すでに説明したＬＢの２価の連結基と同様であってよい。
【００３６】
なお、上記変性セルロースナノファイバが有するホスホン酸基を有する基は金属塩を形成していてもよい。金属塩を形成する金属としてとしては特に制限されないが、アルカリ金属又はアルカリ土類金属が挙げられ、なかでもより優れた本発明の効果を有するヒドロゲルが得られる点で、金属としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、又は、マグネシウムが好ましく、ナトリウムがより好ましい。
【００３７】
セルロースナノファイバに特定置換基を導入する方法としては特に制限されないが、例えば、酸化、エーテル化、エステル化、及び、シランカップリング等公知の方法が挙げられる。
【００３８】
（ホスホン酸基を有する基の好適形態）
ホスホン酸基を有する基としては、より優れた本発明の効果を有するヒドロゲルが得られる点で、以下の式（１）で表される基が好ましい。
【００３９】
【化３】
2019208862.tif 000005
【００４０】
式（１）中、Ｌ１Ａは単結合、又は、２価の連結基を表し、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基、又は、１価の有機基を表し、＊は結合位置を表す。
【００４１】
Ｌ１Ａの２価の連結基としては特に制限されず、例えば、ＬＢとしてすでに説明したものが挙げられ、より優れた本発明の効果を有するヒドロゲルが得られる点で、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−（Ｒは水素原子又は１価の有機基を表す）、アルキレン基（炭素数１〜１０個が好ましい）、又は、これらの組み合わせが好ましく、−ＮＲ−、炭素数１〜１０個のアルキレン基、又は、これらを組み合わせた基がより好ましい。
【００４２】
Ｒ１の１価の有機基としては特に制限されないが、ヘテロ原子を有していてもよいアルキル基（炭素数１〜１０個が好ましい）等が挙げられる。
【００４３】
更に優れた本発明のヒドロゲルが得られる点で、ホスホン酸基を有する基としては、以下の式（２）で表される基であることがより好ましい。
【００４４】
【化４】
2019208862.tif 000006
【００４５】
式（２）中、Ｌ２１、及び、Ｌ２２はそれぞれ独立に、単結合、又は、２価の連結基を表し、Ｒ２は水素原子、又は、１価の有機基を表し、＊は結合位置を表す。
【００４６】
Ｌ２１、及び、Ｌ２２の２価の連結基としては特に制限されず、Ｌ１Ａの２価の連結基として説明したものが挙げられ、なかでも、より優れた本発明の効果を有するヒドロゲルが得られる点で、ヘテロ原子を有していてもよい炭素数１〜１０個のアルキレン基が好ましく、炭素数１〜１０個のアルキレン基がより好ましい。
また、Ｒ２の１価の有機基としては特に制限されないが、例えば、式（１）のけるＲの１価の有機基として説明した形態が挙げられる。
なかでも、より優れた本発明の効果を有するヒドロゲルが得られる点で、Ｒ２としては、炭素数１〜１０個のアルキル基、又は、水素原子が好ましく、炭素数１〜５個のアルキル基、又は、水素原子がより好ましく、水素原子が更に好ましい。
【００４７】
式（２）で表されるホスホン酸基を有する基の具体例としては、以下の基が挙げられる。
【００４８】
【化５】
2019208862.tif 000007
【００４９】
上記式中、ｍは１〜１０の整数を表し、２〜５の整数がより好ましい。上記式中、＊は結合位置を表す。
上記のような特定置換基（ビスホスホン酸基、又は、その金属塩）を有する変性セルロースナノファイバを含有するヒドロゲルは、骨欠損部位に注入されると、経時的に上記特定置換基を解離させて放出する。後述する実施例で述べるとおり、このようなヒドロゲルは破骨細胞の活性を抑制する作用を有する。
【００５０】
＜特定変性セルロースナノファイバ＞
変性セルロースナノファイバを構成する変性セルロースナノファイバの構造としては、特定置換基を有していれば特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有するヒドロゲルが得られる点で、以下の式（Ｃ）で表される繰り返し単位を有していることが好ましい。以下、上記の繰り返し単位を有する変性セルロースを含むセルロースナノファイバを「特定変性セルロースナノファイバ」ともいう。
【００５１】
【化６】
2019208862.tif 000008
【００５２】
上記式（Ｃ）中、Ｒ３１、及び、Ｒ３２はそれぞれ独立にアルデヒド基、及び、特定置換基を表し、Ｒ３１、及び、Ｒ３２の少なくとも一方は、特定置換基である。上記特定置換基の形態はすでに説明したとおりである。
【００５３】
（特定変性セルロースナノファイバの製造方法）
特定変性セルロースナノファイバの製造方法としては特に制限されず、公知の方法が使用できる。
なかでも、より容易に特定変性セルロースナノファイバが得られる点で、以下の工程を有する特定変性セルロースナノファイバの製造方法が好ましい。
・セルロース骨格にアルデヒド基を導入する工程１
・アルデヒド基にホスホン酸基を有する基を有する化合物を反応させる工程２
【００５４】
工程１において、セルロース骨格にアルデヒド基を導入する方法としては特に制限されず、公知の方法が適用できる。典型的には未変性のセルロースに酸化剤を反応させることで、セルロースが有するヒドロキシ基をアルデヒド基に変換する方法が挙げられる。
【００５５】
なかでも、より容易に特定変性セルロースナノファイバが得られる点で、上記アルデヒド基は、セルロースナノファイバに酸化剤を作用させて、セルロース骨格中のグルコピラノース環における第２位と第３位の炭素原子間の結合の少なくとも一部を開裂させ、第２位と第３位のカルビノール基の両方、又は、片方をアルデヒド基に変換する方法が好ましい。
【００５６】
上記のような酸化剤としては、特に制限されないが、例えば、過ヨウ素酸、及び、過ヨウ素酸塩からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましい。過ヨウ素酸塩としては、例えば、過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム、過ヨウ素酸アンモニウム、過ヨウ素酸ルビジウム、及び、過ヨウ素酸セシウム等が挙げられ、過ヨウ素酸ナトリウムが好ましい。
【００５７】
過ヨウ素、又は、その塩をセルロースナノファイバに作用させた場合、通常、セルロースの繊維表面のセルロース分子鎖が持つグルコピラノース単位において、第２位と第３位の炭素間が開裂し、第２位と第３位のカルビノール基（＞Ｃ−ＯＨ）がともにアルデヒド基に変換されて、アルデヒド基を２つ有する構造の繰り返し単位が形成される。
【００５８】
工程２では、上記のようにして生成したアルデヒド基に、ホスホン酸基を有する基を有する化合物（以下、「特定化合物」ともいう。）を反応させ、特定変性セルロースナノファイバを得る。
特定化合物としては特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有するヒドロゲルが得られる点で、ホスホン酸基を２個以上有することが好ましい。ホスホン酸基の数の上限としては特に制限されないが１０個以下が好ましく、５個以下がより好ましく、３個以下が更に好ましい。
【００５９】
特定化合物とアルデヒド基とを反応させる方法としては特に制限されないが、特定化合物がアミノ基を有する場合、還元アミノ化反応（還元的アミノ化）を用いる方法が挙げられる。還元アミノ反応に用いる還元剤としては特に制限されないが、例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム、メチルアミンボラン、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、ピコリンボラン、及び、ピリジンボランからなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。
なかでも、取り扱いが容易で、かつ、反応性が高い点で、ピコリンボラン（２−ピコリンボラン）を用いることが好ましい。
【００６０】
特定化合物が有するアミノ基としては、より反応が進行しやすい観点から、１級又は２級のアミノ基が好ましい。
【００６１】
特定化合物としては特に制限されないが、例えば、エチドロン酸、クロドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、チルドロン酸、イバンドロン酸、リセドロン酸、ゾレドロン酸、ネリドロン酸、インカドロン酸、メドロン酸、及び、ｏｌｐａｄｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ等が挙げられる。
なかでも、窒素原子を含有する、パミドロン酸、アレンドロン酸、ネリドロン酸、イバンドロン酸、リセドロン酸、ゾレドロン酸、インカドロン酸、及び、ｏｌｐａｄｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ等が好ましく、なかでも、第１級又は第２級アミノ基を有するパミドロン酸、アレンドロン酸、ネリドロン酸、又は、インカドロン酸がより好ましく、第１級アミノ基を有するパミドロン酸、アロンドロン酸、又は、ネリドロン酸が更に好ましい。
【００６２】
【化７】
2019208862.tif 000009
【化８】
2019208862.tif 000010
【００６３】
すでに説明した工程１及び工程２を有する変性セルロースナノファイバの製造方法としては、公知の方法を用いることができる。上記の製造方法としては、例えば、Ｊｕｈｏ  Ａｎｔｔｉ  Ｓｉｒｖｉｏら  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  （２０１５），  ３３，  ５２４−５３２に記載された方法が挙げられ、上記内容は本明細書に組み込まれる。
【００６４】
変性セルロースナノファイバの製造方法としては、典型的には、酸化剤には過ヨウ素酸ナトリウムを用い、還元剤には２−ピコリンボランを用い、特定化合物としてアレンドロン酸を用いる場合が挙げられ、以下のスキームに基づき合成可能である。
【００６５】
【化９】
2019208862.tif 000011
【００６６】
上記の反応は、典型的には次の方法で実施可能である。なお、以下の数値範囲は典型例であって、変性セルロースナノファイバの製造方法としては以下に制限されない。
【００６７】
まず、未変性のセルロースナノファイバを、水を含有する分散溶媒に分散させ、セルロースナノファイバの分散液を得る。次に上記分散液に対して酸化剤を加えて、セルロース骨格にアルデヒド基を導入する。
【００６８】
酸化剤としては、典型的には過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）が使用でき、その使用量としては特に制限されないが、一般に、未変性のセルロースナノファイバ中における、グルコースに基づく繰り返し単位の量を１００モル％としたときに、５０〜２００モル％の過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）を添加するのが好ましい。
【００６９】
上記反応は、遮光しながら行うのが好ましい。
反応温度としては特に制限されないが、一般に、４０〜６０℃が好ましい。また、反応時間としては特に制限されないが、一般に、２〜６時間が好ましい。
また、反応は撹拌しながら行うことが好ましい。
【００７０】
上記反応により、セルロース骨格の少なくとも一部にアルデヒド基を有する、アルデヒド化セルロースを含有する溶液が得られる。
得られたアルデヒド化セルロースを含有する溶液から、アルデヒド化セルロースを精製してもよい。
精製の方法としては特に制限されないが、例えば、減圧濾過によって未反応物を含有する分散溶媒を除去し、得られた固形分を超純水で洗浄する操作を数回繰り返して、その後に凍結乾燥すると、アルデヒド化セルロースの乾燥粉末を得る方法が挙げられる。
【００７１】
次いで、アルデヒド化セルロースを炭酸水素ナトリウム水溶液に分散させ、特定化合物（例えばアレンドロン酸）を加える。
この場合、使用する特定化合物の量としては特に制限されないが、アルデヒド基量を１００モル％とした場合、特定化合物を５０〜１０００モル％、好ましくは１００〜４００モル％添加することが好ましい。
反応温度としては特に制限されないが、１０〜３０℃が好ましく、室温程度がより好ましい。反応時間としては特に制限されないが、１時間程度でよい。
反応は攪拌しながら行うことが好ましい。
【００７２】
次に、還元剤（例えば、エタノールに溶解した２−ピコリンボラン）を加える。還元剤の量としては特に制限されないが、アルデヒド基量を１００モル％としたとき、５０〜１０００モル％、好ましくは１００〜４００モル％添加することが好ましい。
反応温度としては特に制限されないが、１０〜３０℃が好ましく、室温程度がより好ましい。
反応時間としては特に制限されないが、一般に、１６〜２４時間が好ましい。
なお、反応は攪拌しながら行うことが好ましい。
【００７３】
上記のようにして得られた変性セルロースナノファイバは、更に超音波処理されてもよい。すなわち、変性セルロースナノファイバの製造方法は、得られた変性セルロースナノファイバを超音波処理する工程を更に有していてもよい。
変性セルロースナノファイバを超音波処理する方法としては特に制限されず、公知の方法が使用できる。例えば、公知の超音波ホモジナイザを使用する方法が挙げられる。
超音波ホモジナイザで処理する時間としては特に制限されないが、一般に１０〜３０分程度が好ましい。変性セルロースナノファイバを超音波処理する工程を有する製造方法によって製造された変性セルロースナノファイバを含有するヒドロゲルは、驚くべきことに、より優れた力学強度を有する。
【００７４】
（特定変性セルロースファイバの好適形態）
特定変性セルロースナノファイバとしては、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の繰り返し単位を有する変性セルロースナノファイバが好ましい。
【００７５】
【化１０】
2019208862.tif 000012
【００７６】
上記式中、Ｒ３１、及び、Ｒ３２はそれぞれ独立にアルデヒド基、又は、特定置換基を表し、Ｒ３１、及び、Ｒ３２のいずれか一方は特定置換基である。
【００７７】
上記式中、各繰り返し単位の含有量としては特に制限されないが、変性セルロースナノファイバの全繰り返し単位数を１００モル％としたとき、式（Ａ）で表される繰り返し単位の含有量としては特に制限されないが、一般に、３０〜９５モル％が好ましく、４０〜９０モル％がより好ましい。
式（Ｂ）で表される繰り返し単位の含有量としては特に制限されないが、一般に、４〜６５モル％が好ましく、５〜５５モル％がより好ましい。
式（Ｃ）で表される繰り返し単位の含有量としては特に制限されないが、一般に、１〜６５モル％が好ましく、５〜５５モル％がより好ましい。
【００７８】
〔カルシウム塩〕
本発明の実施形態に係るヒドロゲルは、カルシウム塩を含有する。
ヒドロゲル中におけるカルシウム塩の濃度としては特に制限されないが、一般に、０．０１〜９０％が好ましく、０．０５〜７０％がより好ましい。
ヒドロゲルは、カルシウム塩の１種を単独で含有してもよく、２種以上を併せて含有してもよい。組成物が２種以上のカルシウム塩を含有する場合には、その濃度の合計が上記範囲内であることが好ましい。
【００７９】
なお、本明細書において、ヒドロゲル中におけるカルシウム塩の「濃度」は、ヒドロゲル中における、後述する溶媒の体積基準の含有量（単位：ｍＬ）に対する、ヒドロゲル中におけるカルシウム塩の質量基準の含有量（単位：ｇ）の比の百分率（ｗ／ｖ％）を意味する。
すなわち、カルシウム塩の質量基準の含有量（ｇ）／溶媒の体積基準の含有量（ｍＬ）×１００（％）で表される数値を意味する。
【００８０】
カルシウム塩としては、特に制限されないが、一般に無機カルシウム塩が好ましい。
無機カルシウム塩としては、例えば、炭酸カルシウム、苦灰石（ドロマイト）、硫酸カルシウム、リン酸カルシウム、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、塩化カルシウム、及び、酢酸カルシウム等が挙げられる。
【００８１】
なかでも、より優れた本発明の効果を有するヒドロゲルが得られる点で、カルシウム塩としては、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、及び、塩化カルシウムからなる群より選択される少なくとも１種が好ましく、リン酸カルシウム、及び、硫酸カルシウムからなる群より選択される少なくとも１種がより好ましい。
【００８２】
本発明のヒドロゲルに使用可能なリン酸カルシウムとしては特に制限されないが、例えば、リン酸二水素カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸三カルシウム、リン酸八カルシウム、水酸アパタイト、フッ素アパタイト、塩素アパタイト、及び、炭酸アパタイト等が挙げられる。
また、リン酸三カルシウムとしては、α−リン酸三カルシウム（α−ＴＣＰ）、及び、β−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）等が挙げられる。
リン酸カルシウムとしては、リン酸三カルシウム、及び、水酸アパタイトからなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。
【００８３】
カルシウム塩としては、より優れた本発明の効果を有するヒドロゲルが得られる点で、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、及び、塩化カルシウムからなる群より選択される少なくとも１種が好ましく、α−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カルシウム、水酸アパタイト、硫酸カルシウム、及び、塩化カルシウムからなる群より選択される少なくとも１種がより好ましく、α−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カルシウム、水酸アパタイト、及び、硫酸カルシウムからなる群より選択される少なくとも１種が更に好ましい。
【００８４】
〔溶媒〕
本発明の実施形態に係るヒドロゲルは、水を含有する溶媒を含有する。
溶媒としては、水を含有していればよく、他の溶媒を含有していてもよい。他の溶媒としては特に制限されないが、水と混和する溶媒が好ましく、アルコール（例えばエタノール等）が挙げられる。
ヒドロゲルの固形分としては特に制限されないが、一般に、１質量％〜９９質量％が好ましい。
【００８５】
〔その他の成分〕
本発明の実施形態に係るヒドロゲルは、本発明の効果を奏する範囲内において、上記の以外の成分を含有していてもよい。上記以外の成分としては、例えば、
各種薬剤、及び、タンパク質等が挙げられる。
本発明の実施形態に係るヒドロゲルは、インジェクタブルであり、例えば、骨欠損部位に直接送達して使用されるため、骨欠損部位に直接上記薬剤及びタンパク質等を併せて送達できる。すなわち、本発明の実施形態に係るヒドロゲルは、上記薬剤、及び、タンパク質等の局所デリバリー担体、及び／又は、徐放性デリバリー担体として使用してもよい。
【００８６】
薬剤としては、例えばステロイド等の抗炎症薬、抗血栓薬、抗生物質、線維芽細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、及び、肝細胞増殖因子等の成長因子が挙げられる。
また、本発明のヒドロゲルとしては、上記以外の薬学的に許容される添加剤を添加することができ、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、及び、イプシロン−アミノカプロン酸等の緩衝化剤；塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び、濃グリセリン等の等張化剤；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、ステアリン酸ポリオキシル４０、及び、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の界面活性剤；等が挙げられる。
【００８７】
〔用途〕
本発明の実施形態に係るヒドロゲルは、医療用インジェクタブル人工骨として好適に使用される。例えば、骨粗しょう症治療や骨欠損部位への補填材に用いることができる。
【００８８】
［キット］
本発明の実施形態に係るキットは、ホスホン酸基を有する基、又は、その金属塩からなる群より選択される少なくとも１種の特定置換基を有する変性セルロースナノファイバと、水と、を含有する第１剤と、カルシウム塩を含有する第２剤と、を含むキットである。
【００８９】
上記キットは、特定置換基を有する変性セルロースナノファイバと水とを含有する第１剤と、カルシウム塩を含有する第２剤とを含むため、使用時に混合することで、すでに説明したヒドロゲルを調製することができる。
第１剤、及び、第２剤は、容器に収容されていてもよい。すなわち、上記キットは容器と、上記容器に収容された第１剤と、上記とは別の容器と、上記別の容器に収容された第２剤と、を含むキットであってもよい。
【００９０】
また、本発明の他の実施形態に係るキットは、第２剤に水を含有する。本実施形態に係るキットでは、カルシウム塩が水に分散した状態であるため、第１剤と第２剤とを混合してヒドロゲルを調製するのがより容易である。
【００９１】
また、本発明の他の実施形態に係るキットは、更に、経皮送達デバイスを含む。経皮送達デバイスは、上記第１剤と第２剤とを混合して得られたヒドロゲルを、骨欠損部位に経皮的に送達するために使用可能である。
【００９２】
経皮送達デバイスとしては、例えば、骨充填デバイス、シリンジ、ニードル、セメント銃、小径骨充填デバイス、指向性フローを可能にするように（例えば、サイドポート）改良されたチップ等が挙げられ得るが、上記に制限されない。
そのような経皮送達デバイスは、米国特許第６，２４１，７３４号、同第６，０４８，３４６号、同第６，６４１，５８７号、同第６，７１９，７６１号、及び、同第６，６４５，２１３号等に記載されており、上記基材は本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００９３】
以下に実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す実施例により限定的に解釈されるべきものではない。
【００９４】
＜特定変性セルロースナノファイバー（ｐＣＮＦ）の調製＞
非特許文献１を参考にして、表１に示した方法により特定置換基を有する変性セルロースを合成した。このうち、合成例２〜４、及び、合成例６〜１０についてはｐＣＮＦが得られた。
【００９５】
第一段階として、未変性セルロースを原料としてアルデヒド化セルロースを作製した。
まず、１ｇのろ紙粉末（ＡＤＶＡＮＴＥＣ、メッシュ：４０−１００、繊維長：１５０−４００μｍ）を撹拌子で撹拌しながら１００ｍＬの超純水に分散させて分散物を得た。得られた分散物に、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）をセルロース中のグルコース単位のモル数に対して０．５〜２当量の割合で、それぞれ添加した。ＮａＩＯ４添加後の分散物を、遮光しながら、オイルバス（５０℃）中で４時間撹拌することによって、グルコース単位中の３位と４位の間で開環させ、アルデヒド化セルロースを含有する反応物を調製した。
【００９６】
次に、上記反応物を減圧濾過することによって未反応のＮａＩＯ４等を含有する水溶液を除去し、得られた固形分を超純水で洗浄した。この操作を３回繰り返すことで洗浄を行い、最後に凍結乾燥することで、アルデヒド化セルロースの乾燥粉末を得た。生成されたアルデヒド基量（アルデヒド化セルロースの乾燥粉末質量に対するアルデヒド基量）を、中和滴定法によって定量した。結果を表１の「アルデヒド基量」の欄に示した（単位はｍｍｏｌ／ｇである）。
【００９７】
次に、得られたアルデヒド化セルロースに特定置換基を導入した。具体的には、特定化合物としてアレンドロン酸を用い、還元アミノ化反応を用いて、ｐＣＮＦを合成した。
具体的には、まず、上記アルデヒド化セルロースの乾燥粉末の１ｇを２００ｍＬの炭酸水素ナトリウム水溶液（０．２Ｍ、ｐＨ＝８）に分散させ分散液を得た。
次に、上記分散液に対して、アレンドロン酸（東京化成工業社製）を加えた。アレンドロン酸の添加量については表１に示したとおりである。なお、表１中の「アレンドロン酸」の欄に記載した数値は、アルデヒド基１モルに対して、添加したアレンドロン酸のモル量（表中には「当量」と記載した。）を表している。
【００９８】
次に、アレンドロン酸を加えた分散液を、室温で１時間、攪拌しながら反応させた。次に、反応後の分散液に、エタノールに溶解した２−ピコリンボラン（純正化学株式会社製）を添加した。２−ピコリンボランの添加量は表１に示したとおりである。
次に、２−ピコリンボランを添加した分散液を、室温で１６〜２４時間、攪拌しながら反応させ、反応生成物を含有する溶液を得た。得られた溶液から、４０００ｒｐｍ、３０分の遠心分離によって反応生成物を回収した。次に、回収した反応生成物を炭酸水素ナトリウム水溶液とエタノールとの等量混合溶媒によって洗浄した。この操作を３回行うことで、反応生成物中の未反応物を除去した。次に、反応生成物をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）でさらに１回洗浄した後に、超音波ホモジナイザ（１５０Ｗ、４０ｋＨｚ、６０％パワー、ＢＲＡＮＳＯＮ）によって１０〜３０分間ホモジナイズし、ｐＣＮＦを得た。
【００９９】
なお、アレンドロン酸の添加量がアルデヒド基に対して０．５当量、すなわち、５０モル％であって、かつ、アルデヒド基量が０．７８ｍｍｏｌ／ｇであった合成例１の場合は、ｐＣＮＦが得られなかった（なお表中、ｐＣＮＦの形成「Ａ」と記載されているのはｐＣＮＦが得られたこと、「Ｂ」と記載されているのは、ｐＣＮＦが得られなかったことを表す。）。これは、セルロースがナノ化されるための静電反発が十分ではなかったことによるものと考えられる。
【０１００】
各アルデヒド化セルロースのグルコース単位の開環割合、及び、アルデヒド基量は公知の滴定法により測定した。結果を表１に示した。
表１から分かるように、グルコース単位に対する過ヨウ素酸ナトリウムの仕込み量を０．５〜２当量まで変化させることで、開環するグルコース単位およびそれによって生成するアルデヒド基の量を制御することができる。
【０１０１】
【表１】
2019208862.tif 000013
【０１０２】
＜合成された特定変性セルロースナノファイバの同定＞
図１には、ｐＣＮＦ、及び、アレンドロン酸の１Ｈ核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ  ＮＭＲ）を示した。図１によると、ｐＣＮＦにおいて、２ｐｐｍ、及び、３ｐｐｍ付近にアレンドロン酸のメチレン基に由来するピークが観察された（図１中にａ及びｂにより示した。）。これによりアルデヒド化セルロースにアレンドロン酸が導入されたことが確認された（図１）。
【０１０３】
また、図２には、ｐＣＮＦ、及び、アルデヒド化セルロースの３１Ｐ核磁気共鳴スペクトル（３１Ｐ  ＮＭＲ）を示した。図２によると、ｐＣＮＦにおいて、１６ｐｐｍ付近にアレンドロン酸中のリンに由来するピークが観察されたことからアレンドロン酸の導入が確認された（図２）。
【０１０４】
＜電子顕微鏡観察＞
図３には、ｐＣＮＦの走査型電子顕微鏡観察により取得した画像を示した。図３によれば、ｐＣＮＦは繊維の直径（短径）が数ｎｍ〜１００ｎｍであり、アスペクト比（繊維長／繊維径）については、約１０〜５００であった。
【０１０５】
＜エネルギー分散Ｘ線分光法＞
図４には、ｐＣＮＦのエネルギー分散Ｘ線分光法（ＥＤＸ）の測定結果を示した。図４によれば、ｐＣＮＦはリンを含有し、アレンドロン酸が導入されていることを確認した。
【０１０６】
＜チキソトロピー性＞
図５には、粘弾性測定装置（Ｒｈｅｏｐｌｕｓ、アントンパール社）を用いて、濃度６％（ｐＣＮＦの含有量（ｇ）／分散溶媒の含有量（ｍＬ）×１００）のｐＣＮＦの分散液（分散溶媒はＰＢＳ、ｐＨ＝７）のせん断速度に対するせん断応力、及び、粘度の変化を測定した結果を示した。上記測定においては、直径１０ｍｍの円盤状の治具でｐＣＮＦを固定し、測定を行ったところ、せん断速度の増加に伴い、せん断応力が増加し、その後一定になった。また、粘度に関しては、低下した。
【０１０７】
これらの結果より、ｐＣＮＦはチキソトロピー性を有することが示された。
なお、チキソトロピー性とは、せん断に対して粘度が低下し、負荷を止めると再び粘度が回復する性質のことであり、シリンジ等を用いたインジェクタブル材料に非常に適した性質である。
【０１０８】
＜ヒドロゲルの調製＞
次に、作成したｐＣＮＦとカルシウム塩とを混合して、ヒドロゲルを作成した。
【０１０９】
カルシウム塩として塩化カルシウム溶液を用いる場合には、任意の濃度のｐＣＮＦの分散液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７）の周囲に１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液を加えることでヒドロゲルが得られる。
【０１１０】
カルシウム塩として硫酸カルシウムを用いる場合には、任意の濃度のｐＣＮＦの分散液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７）に任意の濃度の硫酸カルシウムを混合し、２４時間静置することでヒドロゲルが得られる。
【０１１１】
リン酸三カルシウム（α−ＴＣＰ、及び、β−ＴＣＰ）を用いる場合には、任意の濃度のｐＣＮＦの分散液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７）に任意の濃度のリン酸三カルシウムを混合し、２４時間静置することでヒドロゲルが得られる。
【０１１２】
＜電子顕微鏡観察＞
図６には、ｐＣＮＦとカルシウム塩とを含有するヒドロゲルの電子顕微鏡写真を示した。図６によれば、ヒドロゲルは多数のｐＣＮＦからなる数十ナノメートルのポアを有する構造であることが明らかとなった。
【０１１３】
＜粘弾特性＞
図７には、粘弾性測定装置を用いて、周波数に対するヒドロゲルのせん断弾性率の変化を測定した結果を示した。
また、図８には、粘弾性測定装置を用いて、ひずみに対するヒドロゲルのせん断弾性率の変化を測定した結果を示した。
なお、評価に用いたヒドロゲルは、濃度６％（ｐＣＮＦの含有量（ｇ）／分散液の含有量（ｍＬ）×１００）のｐＣＮＦの分散液（分散溶媒はＰＢＳ、ｐＨ＝７）１００μＬを粘弾性測定装置のステージにのせ、直径１０ｍｍの治具で挟み込んだ後、１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液を、周囲に２ｍＬ添加し、その場でゲル化反応を行って得たものである。
【０１１４】
測定中、ステージの温度は２５℃で保持し、測定時の周波数は１Ｈｚ（図８）、ひずみは１％（図７）で実験を行った。
ゲル化反応開始から１時間後に、周波数変化、及び、ひずみ変化に対するせん断弾性率の変化を測定したところ、周波数変化に対しては、せん断弾性率は一定であり（図７）、ひずみの変化が０．１％から１０％の範囲においては線形の粘弾特性を示すことが分かった（図８）。
【０１１５】
＜超音波処理の効果＞
ｐＣＮＦは、その製造工程において、ホスホン酸基の電荷反発によって、微細化されるものと推測される。
更に、ｐＣＮＦの製造工程中、ｐＣＮＦを含有する分散液に超音波照射、及び／又は、ミキサー等撹拌の機械刺激を加えることによって、ｐＣＮＦを更に微細化できるものと推測される。
図９には、超音波照射（６０％ｐｏｗｅｒ、３０分間）を行う前後での、濃度５％（ｐＣＮＦの含有量（ｇ）／分散溶媒の含有量（ｍＬ）×１００）のｐＣＮＦの分散液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７）を１００ｍＭカルシウム水溶液を用いてゲル化させたヒドロゲルのせん断弾性率測定結果の比較を示した。
図９によれば、超音波照射によって、せん断弾性率が約１．５倍になることが分かった。これは、ｐＣＮＦが更に微細化（ナノ化）することによってヒドロゲルゲル内により均一に分散したためと考えられる。
【０１１６】
＜ｐＣＮＦの含有量とアレンドロン酸（当量）の粘弾特性への影響＞
濃度０．８〜６．５％（ｐＣＮＦの含有量（ｇ）／溶媒の含有量（ｍＬ）×１００）のｐＣＮＦの分散液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７）１００μＬを粘弾性測定装置のステージにのせ、直径１０ｍｍの治具で挟み込んだ。
１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液を周囲に２ｍＬ添加し、その場でゲル化反応させ、ヒドロゲルを得た。
【０１１７】
測定中、ステージの温度は２５℃、測定時の周波数は１Ｈｚ、ひずみは１％で実験を行った。反応開始から１時間後に、分散液中におけるｐＣＮＦの濃度が図１０に記載したとおりになるように調製して得られたヒドロゲルのせん断弾性率を測定したところ、ｐＣＮＦの濃度の増加に伴ってせん断弾性率が増加していることが明らかとなった（図１０）。
更に、ｐＣＮＦを作製する際のアレンドロン酸の仕込み比を０〜１０まで変化させたところ、アレンドロン酸の仕込み比の増加に伴ったせん断弾性率の増加が見られたことから、導入したホスホン酸基によって架橋反応が引き起こされていることが示された。結果を図１１に示した。
【０１１８】
＜その他の変性セルロースナノファイバとの比較＞
ホスホン酸基のカルシウム架橋によって形成されるヒドロゲルの粘弾特性をその他の変性セルロースナノファイバで作製したゲルと比較した。結果を図１２に示した。
濃度２％のＯＨ−ＣＮＦ（ヒドロキシ基変性ＣＮＦ、ビンフィス、スギノマシン社）、濃度６．５％のｐＣＮＦの分散液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７、図１２中では「Ｂｉｓ−ｐＣＮＦ」と記載した。）、濃度５％のモノリン酸基で修飾したｐＣＮＦ（Ｍｏｎｏ−ｐＣＮＦ）の分散液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７）のそれぞれ１００μＬを粘弾性測定装置のステージにのせ、直径１０ｍｍの治具で挟み込んだ。
次に、１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液を周囲に２ｍＬ添加し、その場でゲル化反応させ、ヒドロゲルを得た。
測定中、ステージの温度は２５℃、測定時の周波数は１Ｈｚ、ひずみは１％で実験を行った。反応開始から１時間後に、各濃度の変性ＣＮＦで作製したヒドロゲルのせん断弾性率を測定したところ、ＯＨ−ＣＮＦと比較して、Ｍｏｎｏ−ｐＣＮＦ、及び、Ｂｉｓ−ｐＣＮＦを用いて作成したヒドロゲルは、より優れたせん断弾性率を有していることがわかった（図１２）。また、Ｍｏｎｏ−ｐＣＮＦとの比較では、Ｂｉｓ−ｐＣＮＦを用いて作成したヒドロゲルは、更に優れたせん断弾性率を有していることがわかった。これらの結果より、Ｍｏｎｏ−ｐＣＮＦ、及び、Ｂｉｓ−ｐＣＮＦを用いたヒドロゲルでは、ホスホン酸基が効果的にカルシウムイオンと配位しており、結果として、より優れた力学強度を有するヒドロゲルが得られることが明らかとなった。
【０１１９】
＜チキソトロピー性＞
濃度６．５％（ｐＣＮＦの含有量（ｇ）／溶媒の含有量（ｍＬ）×１００）のｐＣＮＦの分散液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７）１００μＬを粘弾性測定装置のステージにのせ、直径１０ｍｍの治具で挟み込んだ。次に、１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液を周囲に２ｍＬ添加し、その場でゲル化反応させてヒドロゲルを得た。
【０１２０】
測定中、ステージの温度は２５℃に保持し、測定時の周波数は１Ｈｚとした。
反応開始から１時間後に、ひずみを５分毎に１％、１００％と変化させたときの弾性率を図１３に示した。図１３によれば、ひずみを１％から１００％へと増加させると貯蔵弾性率（Ｇ′）が大きく低下し、再びひずみを１％に戻すと、貯蔵弾性率が回復することが分かった（図１３）。
この結果より、ヒドロゲルはチキソトロピー性を有していることが明らかとなった。
【０１２１】
＜ｐＣＮＦと硫酸カルシウムとを含有するヒドロゲルの粘弾特性＞
濃度５％（ｐＣＮＦの含有量（ｇ）／溶媒の含有量（ｍＬ）×１００）のｐＣＮＦの分散液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７）１００μＬと、硫酸カルシウム粉末とを混合し、ヒドロゲル中における硫酸カルシウム（ＣａＳＯ４）の濃度（硫酸カルシウムの含有量（ｇ）／溶媒の含有量（ｍＬ）×１００）がそれぞれ０．５％、１％、２％、４％、及び、１０％となるように混合液を作成した。上記混合液を、それぞれ粘弾性想定装置のステージにのせ、直径１０ｍｍの治具で挟み込んだ。
すなわち、ヒドロゲル中におけるｐＣＮＦを濃度５％とし、ヒドロゲル中における硫酸カルシウムの濃度を０．５〜１０％にそれぞれ調整したヒドロゲルを調製した。
【０１２２】
測定中、ステージの温度は２５℃に保持し、周波数は１Ｈｚ、ひずみは１％で実験を行った。反応開始から３０分後に、ヒドロゲルのせん断弾性率を測定した。結果を図１４に示した。
【０１２３】
図１４によれば、硫酸カルシウムの濃度の増加に伴って、ヒドロゲルのせん断弾性率は増加していることが明らかとなった。なかでも、硫酸カルシウムの濃度が、１〜１０％であると、ヒドロゲルはより優れたせん断弾性率を有し、２〜１０％であると、ヒドロゲルは更に優れたせん断弾性率を有し、３〜７％であると、ヒドロゲルは特に優れたせん断弾性率を有することがわかった。
特に４％硫酸カルシウムを用いたヒドロゲルが最も安定していた。
【０１２４】
次に、濃度１〜９％（ｐＣＮＦの含有量（ｇ）／溶媒の含有量（ｍＬ）×１００）のｐＣＮＦの分散液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７）１００μＬと硫酸カルシウム粉末（ヒドロゲル中の濃度が４％となるような量、すなわち、硫酸カルシウムの含有量（ｇ）／溶媒の含有量（ｍＬ）×１００が４％となるような量）を混合し、レオメーターのステージにのせ、直径１０ｍｍの治具で挟み込んだ。測定中、ステージの温度は２５度、測定時の周波数は１Ｈｚ、ひずみは１％で実験を行った。反応開始から３０分後に、ゲルのせん断弾性率を測定したところ、濃度の増加に伴ってせん断弾性率が増加していることが明らかとなった。結果を図１５に示した。
【０１２５】
なかでも、ｐＣＮＦの濃度が、２．０〜８．０％であると、ヒドロゲルはより優れたせん断弾性率を有し、３．０〜８．０％であると、更に優れたせん断弾性率を有し、４．０〜８．０％であると、特に優れたせん断弾性率を有することがわかった。
特にｐＣＮＦの濃度が５％のとき、ヒドロゲルは最も安定していた。
【０１２６】
＜β−リン酸三カルシウムで架橋したｐＣＮＦゲルの粘弾特性＞
濃度５％（ｐＣＮＦの含有量（ｇ）／溶媒の含有量（ｍＬ）×１００）のｐＣＮＦの分散液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７）１００μＬに、ヒドロゲル中における濃度がそれぞれ１０％、２０％、及び、５０％（β−リン酸三カルシウムの含有量（ｇ）／溶媒の含有量（ｍＬ）×１００）となるようβ−リン酸三カルシウム粉末を混合し、粘弾性測定装置のステージにのせ、直径１０ｍｍの治具で挟み込んだ。
測定中、ステージの温度は２５℃に保持し、測定時の周波数は１Ｈｚ、ひずみは１％で実験を行った。反応開始から３０分後に、ヒドロゲルのせん断弾性率を測定した。結果を図１６に示した。
【０１２７】
図１６によると、ヒドロゲル中におけるβ−ＴＣＰの濃度の増加に伴ってせん断弾性率が増加していることが明らかとなった。
なかでも、ヒドロゲル中におけるβ−ＴＣＰの濃度が、１０〜５０％であると、より優れたせん断弾性率を有するヒドロゲルが得られ、１５〜４５％であると、更に優れたせん断弾性率を有するヒドロゲルが得られることがわかった。特にヒドロゲル中におけるβ−ＴＣＰが２０％であると最も安定していた。
【０１２８】
次に、濃度１〜９％のｐＣＮＦ（ｐＣＮＦの含有量（ｇ）／溶媒の含有量（ｍＬ）×１００）の分散液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７）１００μＬとβ−リン酸三カルシウム粉末（ヒドロゲル中の濃度が２０％となるような量、すなわち、ヒドロゲル中におけるβ−リン酸三カルシウムの含有量（ｇ）／溶媒の含有量（ｍＬ）×１００が２０％となるような量）を混合し、レオメーターのステージにのせ、直径１０ｍｍの治具で挟み込んだ。測定中、ステージの温度は２５度、測定時の周波数は１Ｈｚ、ひずみは１％で実験を行った。反応開始から３０分後に、ゲルのせん断弾性率を測定した。結果を図１７に示した。
図１７によれば、ｐＣＮＦの濃度の増加に伴ってせん断弾性率が増加していることが明らかとなった。なかでも、ｐＣＮＦの濃度が、２．０〜８．０％であると、ヒドロゲルはより優れたせん断弾性率を有し、３．０〜８．０％であると、更に優れたせん断弾性率を有し、４．０〜８．０％であると、特に優れたせん断弾性率を有することがわかった。
特にｐＣＮＦの濃度が５％ｐＣＮＦであるヒドロゲルが最も安定していた。
【０１２９】
＜疑似体液中でのアパタイト形成＞
疑似体液とは、ヒトの血漿に近い無機イオン組成、含有量を有する水溶液を意味し、疑似体液中にヒドロゲルを浸漬することによって、ヒドロゲルが生体内でどのような表面構造の変化を生ずるかを比較的正確に再現することができる。
【０１３０】
超純水に塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸水素二カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウム、及び、トリスヒドロキシメチルアミノメタンを溶解することで、各種イオン濃度が次のようになるよう疑似体液を調製した。
【０１３１】
ナトリウムイオン：１４２ｍＭ、カリウムイオン：５ｍＭ、マグネシウムイオン：１．５ｍＭ、カルシウムイオン：２．５ｍＭ、塩化物イオン：１４８．８、炭酸水素イオン：４．２ｍＭ、リン酸イオン：１ｍＭ、硫酸イオン：０．５ｍＭ。
【０１３２】
未処理のガラススライド、及び、ガラススライドに濃度１％のｐＣＮＦをキャストして作製したｐＣＮＦフィルムを疑似体液に浸漬し、３７度で４週間静置した。
上記の２つの試料を走査型電子顕微鏡観察した結果を、図１８（ガラススライド）、図１９（ｐＣＮＦ）に示した。図１８、及び、図１９を見ると、ｐＣＮＦフィルム上にのみアパタイト形成が見られていた。ｐＣＮＦのホスホン酸基によってアパタイトの核形成が誘起され、アパタイトの結晶成長が起こったためであり、生体内においても体内のイオンによってアパタイトを形成し、高い骨伝導能を獲得すると期待される。
【０１３３】
同様に、固液比１．８で作製したα−リン酸三カルシウムプレート、及び、濃度５％のｐＣＮＦを混合したα−リン酸三カルシウムプレートコンポジット（ヒドロゲルに該当する）に関しても疑似体液に浸漬し、３７度で２週間静置した。
上記の２試料について、走査型電子顕微鏡観察した結果を図２０（α−ＴＣＰ）、及び、図２１（ヒドロゲル）に示した。
図２０、及び、図２１を見ると、ｐＣＮＦを混合したコンポジット（ヒドロゲル）のみにアパタイト形成が見られた。更に、Ｘ線回折測定（図２２）より、アパタイトに特徴的なピークが検出されたことから、コンポジット表面にアパタイトが形成されていることが確認された。
【０１３４】
＜ヒドロゲルの骨に対する接着性評価＞
ヒドロゲルの骨に対する接着性を評価するために、接着試験装置のステージと治具に象牙切片を接着剤を用いてそれぞれ固定し、ヒドロゲルを両側から挟み込むことで、接着性を評価した。
直径１０ｍｍの象牙切片（Ｗａｋｏ）を直径１０ｍｍの治具とステージにそれぞれ固定し、その間に、濃度５％のｐＣＮＦの分散液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７）１００μＬと、１００ｍｇのβ−リン酸三カルシウム粉末を混合したヒドロゲルを置いた。
１０Ｎで１分間圧着した後に、治具を引き上げることで接着強度を求めた。結果を図２３に示した。その結果、ヒドロゲル（図２３中、「β−ＴＣＰ＋ｐＣＮＦ」と記載した。）は、ｐＣＮＦ未添加のβ−ＴＣＰと比較して骨に対する接着強度が大幅に上昇した（図２３）。このことから、ヒドロゲルは、骨欠損部へ注入後にホストの骨組織に強く接着することが示された。
【０１３５】
＜ｐＨがｐＣＮＦゲルの安定性に与える影響＞
濃度５％のｐＣＮＦの分散液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７）１００μＬと硫酸カルシウム粉末を混合し（ヒドロゲル中の濃度４％）、直径１０ｍｍのシリコンモールドにいれ、３７度で２４時間静置することでゲル化させ、ヒドロゲルを得た。
その後、ｐＨを２〜９まで調製したＰＢＳにヒドロゲルを浸漬し、３７度で２４時間静置した。次に、ヒドロゲルを粘弾性測定装置のステージにのせ、直径１０ｍｍの治具で挟み込んだ。
測定中、ステージの温度は２５℃に保持し、測定時の周波数は１Ｈｚ、ひずみは１％で実験を行った。結果を図２４に示した。
【０１３６】
図２４に示した結果から、ｐＨが６以上であると、ヒドロゲルはより優れたせん断弾性率を有していることがわかった。
これは、ホスホン酸基がよりプロトン化しにくく、結果として、カルシウムとの結合がより強くなり、架橋構造が強固になったためであると考えられる。
実際、アレンドロン酸のｐＫ１は２．５、ｐＫ２は６．５であることからも上記の推定は支持される。
【０１３７】
一方で、生体の破骨細胞は、酸を産生することで局所的なｐＨを４．７〜６．８へ低下させることが知られており、そのようなｐＨ領域では、図２４に示したとおり、ヒドロゲルのせん断弾性率はより低下するため、ヒドロゲルがより分解されやすくなるものと推測される。つまり、ヒドロゲルは破骨細胞によって分解されると予想される。
【０１３８】
＜ｐＣＮＦが細胞機能に与える影響＞
ｐＣＮＦを細胞培養液中に分散させ、培養細胞に与えることで、細胞機能に与える影響をｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験で評価した。
ＲＡＷ２６４．７細胞、ＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１細胞（理研）は、ＭＥＭ−α培地（１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリンストレプトマイシン）を用いて３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養した。５×１０３個のＲＡＷ２６４．７細胞とＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間予備培養した。その後、ｐＣＮＦの濃度が図２５、及び、図２６に記載したとおりとなるよう、懸濁させた培地を添加し、培養を継続した。ｐＣＮＦを添加した日を０日目として、１日後に細胞数カウンティングキット（ＷＳＴ−８、ＤＯＪＩＮＤＯ）を用いて細胞数を定量した。すべての範囲で生存率は８０％以上であり、高い細胞生存率を示した。
【０１３９】
＜ｐＣＮＦゲルに対する細胞接着＞
濃度５％のｐＣＮＦの分散液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７）１００μＬと硫酸カルシウム粉末とを混合したもの（ヒドロゲル中の濃度４％）、及び、濃度５％のｐＣＮＦの分散液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７）１００μＬとβ−リン酸三カルシウム粉末を混合したものを、直径１０ｍｍのシリコンモールドにいれ、３７℃で２４時間静置することでゲル化させてヒドロゲルを得た。
次にヒドロゲルを４８ウェルプレートに移し、１時間ＵＶ（紫外線）照射して滅菌した。次に２×１０４個のＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１細胞をヒドロゲル上に播種し、２４時間培養した。その後、１０％ホルマリンで１５分間固定し、ローダミンラベル化ファロイジンを用いてアクチン染色およびＤＡＰＩ（４′，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）溶液を用いた核染色を行い、蛍光顕微鏡（ＢＺ−Ｘ、キーエンス）によって蛍光観察を行った。その結果、どちらのヒドロゲルにおいても良好な細胞接着が確認された。結果を図２７〜図２９に示した。
【０１４０】
図２７はポリスチレン培養皿上で上記細胞を培養したものを蛍光染色し、蛍光顕微鏡で観察した写真である。図２８は、濃度５％のｐＣＮＦの分散液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７）１００μＬと硫酸カルシウム粉末とを混合して得られた上記ヒドロゲル上で上記細胞を培養したものを蛍光染色し、蛍光顕微鏡で観察した写真であり、図２８は濃度５％のｐＣＮＦの分散液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７）１００μＬとβ−リン酸三カルシウム粉末とを混合して得られた上記ヒドロゲル上で上記細胞を培養したものを蛍光染色し、蛍光顕微鏡で観察した写真である。
【０１４１】
＜ｐＣＮＦによる破骨細胞分化の抑制評価＞
ｐＣＮＦを細胞培養液中に分散させ、破骨細胞の前駆細胞に与えることで、分化機能への影響をｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験で評価した。
ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＭＥＭ−α培地（１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリンストレプトマイシン）を用いて３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養した。１×１０３個のＲＡＷ２６４．７細胞を９６ウェルプレートに播種し２４時間予備培養した。
その後、５０ｎｇ／ｍＬのＲＡＮＫＬ（オリエンタル酵母）；５０ｎｇ／ｍＬのＲＡＮＫＬと各濃度のｐＣＮＦ（０．３２、１．２５、２．５ｍｇ／ｍＬ）；５０ｎｇ／ｍＬのＲＡＮＫＬと各濃度のアレンドロン酸（１、１０ｍＭ）；をそれぞれ培地に懸濁させ、ＲＡＷ２６４．７細胞に添加した。
２日後に培地交換を行い、４日間培養した。ＴＲＡＰ（Ｔａｒｔｒａｔｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）染色によって、破骨細胞を染色し、顕微鏡観察を行い、破骨細胞の面積を定量した。
【０１４２】
解析にはＩｍａｇｅＪを用いた。その結果、ｐＣＮＦの濃度に依存した破骨細胞分化の抑制が確認された（図３０）。この傾向は、破骨細胞分化を抑制することが知られているアレンドロン酸と同じであり、ｐＣＮＦが細胞に取り込まれ、修飾したビスホスホネートが作用することで分化を抑制したと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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