(57)【要約】      （修正有）【課題】線維芽細胞含を含む３次元足場（３ＤＦＣＳ）の表面に接着した収縮細胞またはその前駆細胞を含む収縮細胞構築物、および疾患を治療するためにそれらを使用するための方法の提供。【解決手段】収縮構築物を調製するための方法であって、（ａ）収縮構築物を生成するために、線維芽細胞含を含む３次元足場（３ＤＦＣＳ）の表面上に未成熟収縮細胞を播種することと、（ｂ）条線を形成する成熟収縮細胞への未成熟収縮細胞の分化を促進する条件下で収縮構築物を培養することと、を含む方法を提供する。さらなる態様では、本発明は、収縮細胞の機能不全によって特徴付けられる障害を治療するための方法であって、障害を治療するのに有効な量で、本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせの構築物と収縮細胞系障害を有する患者とを接触させることを含む方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
収縮構築物を調製するための方法であって、
（ａ）線維芽細胞含を含む３次元足場（３ＤＦＣＳ）の表面上に未成熟収縮細胞を播種して、収縮構築物を生成することと、
（ｂ）条線を形成する成熟収縮細胞への未成熟収縮細胞の分化を促進する条件下で前記収縮構築物を培養することと、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本願は、参照によりその全体が本明細書に援用される、２０１３年１０月９日出願の米国仮特許出願第６１／８８８８８２号の優先権を主張する。
【０００２】
政府の権利の記述
本発明は、ＶＡによって与えられた助成金番号１−１０１−ＢＸ００１４０６−０１Ａ１の下で政府支援によってなされたものである。
【背景技術】
【０００３】
米国の６５歳以上の患者の退院時診断の第１位である慢性心不全（ＣＨＦ）、ならびに関連する虚血性および非虚血性心疾患を有する患者のための新しい治療法が必要とされている。心不全の有病率は５００万人を超えており、患者の罹患率は年間５５万人である。心不全は、癌、事故、および脳卒中の併発よりも死に至る場合が多く、年間２３億ドル超の費用がかかる。患者がＮＹクラスＩＩＩまたはＩＶの心不全の症状を示すようになると、その死亡率は、心臓移植を行わない場合に２年間で５０％に近づく。ＣＨＦを治療するための最新のアプローチは、いくつかの異なる細胞型を使用して、心臓に幹細胞および／または前駆細胞を直接注入することである。しかし、このような注入法を用いた最近の臨床試験の結果は、概して期待はずれである。
【発明の概要】
【０００４】
一態様において、本発明は、収縮構築物を調製するための方法であって、
（ａ）線維芽細胞含を含む３次元足場（３ＤＦＣＳ）の表面上に未成熟収縮細胞を播種して、収縮構築物を生成することと、
（ｂ）条線を形成する成熟収縮細胞への未成熟収縮細胞の分化を促進する条件下で収縮構築物を培養することと、
を含む方法を提供する。
【０００５】
一実施形態では、未成熟収縮細胞は未成熟心筋細胞であり、成熟収縮細胞は成熟心筋細胞である。他の実施形態では、未成熟収縮細胞は未成熟平滑筋細胞または骨格筋細胞であり、成熟収縮細胞は成熟平滑筋細胞または骨格筋細胞である。別の実施形態では、収縮構築物は、それを必要としている対象に培養後に移植される。該構築物は、細胞収縮および／またはパッチレベルの収縮の開始前に移植されてもよく、別の実施形態では、収縮構築物は、パッチレベルの収縮の開始後に移植される。
【０００６】
別の態様では、本発明は、線維芽細胞含を含む３次元足場（３ＤＦＣＳ）の表面に接着した収縮細胞またはその前駆体を含む構築物であって、該構築物は３ＤＦＣＳの表面全体で自発的な同期収縮が可能であり、収縮細胞が１．３×１０５細胞／ｃｍ２〜２．９５×１０６細胞／ｃｍ２の密度で該構築物の表面上に播種され、３ＤＦＣＳ上の線維芽細胞と共に約１：１５〜約６：１の比で３ＤＦＣＳの表面上に存在する構築物を提供する。一実施形態では、収縮細胞は、前駆収縮細胞および成熟収縮細胞の組み合わせを含む。別の実施形態では、前駆収縮細胞および成熟収縮細胞は、約１：２〜約２：１の比で構築物表面上に存在する。他の実施形態では、収縮細胞は未成熟心筋細胞、成熟心筋細胞、またはそれらの組み合わせを含む。他の実施形態では、未成熟収縮細胞は、未成熟平滑筋細胞または未成熟骨格筋細胞であり、成熟収縮細胞は成熟平滑筋細胞または成熟骨格筋細胞である。別の実施形態では、収縮細胞は構築物上に条線を形成する。
【０００７】
さらなる態様では、本発明は、収縮細胞の機能不全によって特徴付けられる障害を治療するための方法であって、障害を治療するのに有効な量で本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせの構築物と収縮細胞系障害を有する患者とを接触させることを含む方法を提供する。一実施形態では、収縮細胞は、未成熟心筋細胞、成熟心筋細胞、またはそれらの組み合わせを含み、本方法は、障害を治療するのに有効な量の構築物とかかる障害に罹患している対象の心臓とを接触させることを含み、障害は、虚血誘発性心不全、慢性心不全（ＣＨＦ）、心不全を伴わない虚血、心筋症、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、心停止、うっ血性心不全、安定狭心症、不安定狭心症、心筋梗塞、冠動脈疾患、心臓弁膜症、虚血性心疾患、駆出率の低下、心筋灌流の低下、不適応な心臓リモデリング、不適応な左心室リモデリング、左心室機能の低下、左心不全、右心不全、後方不全、前方不全、収縮機能障害、拡張機能障害、全身血管抵抗の増加または減少、低拍出性心不全、高拍出性心不全、労作時呼吸困難、安静時呼吸困難、起座呼吸、頻呼吸、発作性夜間呼吸困難、めまい、精神錯乱、安静時の四肢の冷え、運動不耐性、易疲労感、末梢浮腫、夜間頻尿、腹水、肝腫大、肺水腫、チアノーゼ、心尖拍動の側方移動、奔馬調律、心雑音、傍胸骨拍動、および胸水を含み得るが、これらに限定されない。
【０００８】
一実施形態では、該構築物を対象の心外膜に接着させる。他の実施形態では、該構築物は、心外膜との接触時に収縮していないか、または心外膜との接触時に収縮している。さらなる実施形態では、治療は、左心室機能の改善、左心室拡張末期圧（ＥＤＰ）の低下、心筋灌流の改善、心筋細胞による心臓壁の再構築、ＣＨＦ対象における不適応な左心室リモデリングの逆進、左心室の受動的充満（Ｐａｓｓｉｖｅ ｆｉｌｌｉｎｇ）、能動的充満（ａｃｔｉｖｅ ｆｉｌｌｉｎｇ）などの拡張機能の改善、心室腔コンプライアンス、ならびにＥ’（ｍｍ／秒）の増加、Ｅ／Ｅ’の減少、ＬＶ ｄＰ／ｄｔ（ｍｍＨｇ／秒）の増加およびＴａｕ（ミリ秒）の減少を含むが、これらに限定されない心不全パラメータのうちの１つまたは複数を含む。別の実施形態では、構築物上の心筋細胞を患者の生来の心筋に電気的に結合させる。
【０００９】
さらなる実施形態では、収縮細胞は、未成熟骨格筋細胞、未成熟平滑筋細胞、成熟骨格筋細胞、成熟平滑筋細胞、またはそれらの組み合わせを含み、本方法は、障害を治療するのに有効な量で該構築物と障害を有する患者とを接触させることによって、骨格筋組織および／もしくは平滑筋組織の増強、修復、または回復から恩恵をうけることができる全ての障害を治療することを含む。
【００１０】
別の態様では、本発明は、薬物スクリーニングのための方法であって、本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせの構造物と目的の化合物とを接触させることと、該構築物の１つまたは複数の特徴に対する化合物の効果を決定することと、を含む方法を提供する。一実施形態では、方法は、該構築物と目的の化合物とを接触させる前に、該構築物の収縮を促進する条件下で該構築物を培養することを含む。別の実施形態では、収縮変位、収縮率、収縮同期性、および収縮速度のうちの１つまたは複数に対する化合物の効果が決定される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１−１】間隔を５００μｍ開けた１８か所の記録部位で、カスタム設計したマルチ電極アレイ（ＭＥＡ）を用いて、共培養後５日目の組織培養中の新生児心筋細胞（ＮＣＭ）−３次元線維芽細胞構築物（３ＤＦＣ）にて電気的活性化マッピングを行った（Ａ）。１０個の電極から記録を行い、各記録部位は、チャネル１〜１０として順番に番号を付けた（Ｂ）。パッチの電気的活性化は、７秒間隔で示され、各個別チャネルについてピークの横方向導通電圧を表示する一貫性のある心拍間の活性化を示した（Ｃ）。全チャネルが心拍間シーケンス（Ｄ）で、単一活性化（Ｅ）中に重なったことを振幅が示している。振幅を０．０３〜０．４２および−０．１３〜−０．７５ｍＶ（ＤおよびＥ）として記録した。
【図１−２】間隔を５００μｍ開けた１８か所の記録部位で、カスタム設計したマルチ電極アレイ（ＭＥＡ）を用いて、共培養後５日目の組織培養中の新生児心筋細胞（ＮＣＭ）−３次元線維芽細胞構築物（３ＤＦＣ）にて電気的活性化マッピングを行った（Ａ）。１０個の電極から記録を行い、各記録部位は、チャネル１〜１０として順番に番号を付けた（Ｂ）。パッチの電気的活性化は、７秒間隔で示され、各個別チャネルについてピークの横方向導通電圧を表示する一貫性のある心拍間の活性化を示した（Ｃ）。全チャネルが心拍間シーケンス（Ｄ）で、単一活性化（Ｅ）中に重なったことを振幅が示している。振幅を０．０３〜０．４２および−０．１３〜−０．７５ｍＶ（ＤおよびＥ）として記録した。
【図２】ａ）ブラックボックスで示される目的領域についての、播種したパッチを有する慢性心不全（ＣＨＦ）ラットにおけるペース活性化マップ。ｂ）位置「Ｐ」でのペーシング電極の導入中に心外膜表面から取った心電図は、キャプチャの成功を示す。ｃ）３２箇所での７２回の収縮を介してコンパイルされた活性化時間についての９個の異なる活性化マップのデータを提供する。作成した複数のマップは、測定結果に一貫性があることを示している。
【図３】人工多能性幹細胞由来の心筋細胞（赤色染色）を線維芽細胞の構築物上に播種し、共培養した。ビクリル繊維が、ネットのようなメッシュの織物として観察され得る。深紅色蛍光は埋め込まれた線維芽細胞である。これらの細胞は、局所的に播種され、パッチまたは埋め込まれた線維芽細胞に浸透しない。パッチは、播種後すぐに自発的で、同期的な収縮を開始した。遠心力を用いてランダムに細胞を播種した。
【図４】線維芽細胞パッチ上に播種した場合に、人工多能性幹細胞由来の心筋細胞は、力応答を起こした。データは、培養後５日目に、それぞれ２×１０６細胞（１．２×１０６細胞／ｃｍ２）で播種した線維芽細胞パッチからのものである。これは、ｉＰＳＣ由来の心筋細胞が整列し、一斉に収縮し、その結果生じた機能改善に潜在的に役立ち得ることを示す。
【図５】トリクローム染色は、パッチ移植後３週目のＬＶ断面を示す。対応するアスタリスクおよびボックスは、より高い倍率の領域を示す。矢印は、右の蛍光画像で示されるようなＲＦＰを表す筋細胞のバンドを示す。心外膜（ＥＰＩ）および心内膜（ＥＮＤ）は、方向のために標識されている。ＲＦＰ発現（赤色）の存在によって示されるように、正の赤色蛍光陽性細胞はヒトｉＰＳＣ−ｄＣＭの生存を示唆している。組織および構築物の核はＤＡＰＩ（青色）で標識されている。予想どおり、ヒトのｉＰＳＣ−ｄＣＭは、移植後３週目にも局在したままである。
【図６】標準的な組織培養における２日目（Ａ）対６日目（Ｂ）のヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞（ｈｉＰＳＣ−ＣＭ）のトリクローム染色。２日および６日の培養の両方で、全ての細胞が筋肉について陽性（赤／紫）染色している。培養６日後に、ｈｉＰＳＣ−ＣＭが拡大した。線維芽細胞パッチ上に播種した場合、２日目（ＣおよびＥ）には、ｈｉＰＳＣ−ＣＭのサイズは小さいままであるが、６日目（ＤおよびＦ）までにｈｉＰＳＣ−ＣＭは、条線が明確に存在する無傷の層へと発達したことにより、線維芽細胞のパッチは、インビトロでのｈｉＰＳＣ−ＣＭの成熟を可能にする構造的支持を提供することが示唆される。
【図７】梗塞を受けたが無治療の６週目の慢性心不全（ＣＨＦ）対照のトリクローム染色した左心室の断面（ＡおよびＢ）、冠動脈結紮後６週目（移植後３週間）のＣＨＦ＋ヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞パッチ（ｈｉＰＳＣ−ＣＭ）の断面（ＤおよびＥ）。心臓を切除し、右心室を除去し、心室の中点に沿って５μｍの横断切片に切断した。健康な心筋は赤紫色で、コラーゲン／瘢痕は青色で、赤血球は小さな赤い点として表されている。ボックス差し込み図は、より高い倍率の領域を表す。ｈｉＰＳＣ−ＣＭパッチの移植は、ＬＶ壁の厚さ（Ｄ）を増加させ、心筋（Ｄ）の保持および／または生成をもたらす。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
引用される全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に援用される。特記しない限り、本出願内で利用する技術は、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、遺伝子発現技術（酵素学における方法、１８５巻、Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ（編）、１９９１、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）、酵素学における方法の中の「タンパク質精製の手引き」（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ（編）、（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社）；ＰＣＲプロトコル：方法および応用の手引き（Ｉｎｎｉｓら、１９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）、動物細胞の培養：基本技術のマニュアル、第２版（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ社、ニューヨーク州ニューヨーク）、遺伝子導入および発現プロトコル、１０９〜１２８ページ、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ（編）、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ社、ニュージャージー州クリフトン）、ならびにＡｍｂｉｏｎ社の１９９８カタログ（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州オースティン）などのいくつかの公知の参考文献のいずれかの中で見つけることできる。
【００１３】
特に文脈が明確に指示しない限り、本明細書で使用する単数形「１つ（ａ」」、「１つ（ａｎ）」および「その」は、複数の言及を含む。本明細書で使用する「および」は、特に明記しない限り、「または」と交換的に使用される。
【００１４】
本明細書で使用する用語「約」は、記載されるパラメータ＋／−５％を意味する。
【００１５】
特に文脈が明確に指示しない限り、本発明の任意の態様の全ての実施形態は組み合わせて使用することができる。
【００１６】
第１の態様では、本発明は、線維芽細胞含を含む３次元足場（３ＤＦＣＳ）の表面に接着した収縮細胞を含む構築物を提供し、該構築物は３ＤＦＣＳの表面全体で自発的な同期収縮が可能であり、収縮細胞は、１．３×１０５細胞／ｃｍ２〜２．９５×１０６細胞／ｃｍ２の密度で該構築物の表面上に播種され、３ＤＦＣＳ上の線維芽細胞と共に約１：１５〜約６：１の比で３ＤＦＣＳの表面上に存在する。
【００１７】
本発明の構築物は、本明細書に記載の治療および薬物スクリーニングに使用できる。該構築物は、うっ血性心不全のげっ歯類モデルに移植した場合には機能的利点を提供し、移植した場合には電気的に安定であることが実施例で実証されている。
【００１８】
本明細書で使用する「３次元線維芽細胞構築物」は、構築物内の細胞により架橋された間隙を有する３次元構造に形成された、生体適合性で、非生物材料を含む３次元基板上で成長させた線維芽細胞を含む構築物である。３ＤＦＣは、適切な線維芽細胞に加えて、必要に応じて所与の目的のために細胞型を含んでよいことが理解される。例えば、３ＤＦＣは、内皮細胞を含むがこれらに限定されない他の間質細胞を含んでもよい。例えば、共に参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許出願第２００９／０２６９３１６号および米国特許第４，９６３，４８９号を参照されたい。
【００１９】
線維芽細胞および他の細胞は、起源が胎児であってもまたは成人であってもよく、皮膚、心筋、平滑筋、骨格筋、肝臓、膵臓、脳、脂肪組織（脂肪）などの便利な供給源に由来してよい。このような組織および／または臓器は、適切な生検によりまたは剖検時に取得できる。本発明の全ての態様のための代替実施形態では、線維芽細胞および他の細胞はヒト細胞である。本発明の全ての態様のための代替実施形態では、３ＤＦＣは、代謝活性のある生存組織を生成するために、生体吸収性メッシュ上でインビトロ培養された新生児皮膚線維芽細胞のマトリックス埋め込み型ヒト皮膚構築物である。これらの線維芽細胞は、メッシュ全体に増殖し、自己生産真皮マトリックスにそれ自体埋め込まれている、ヒト真皮コラーゲン、フィブロネクチン、およびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含む多種多様な増殖因子類ならびにサイトカイン類を分泌する。培養中に線維芽細胞は、血管新生増殖因子：ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）、およびアンジオポエチン−１を産生する（例えば、Ｊ．Ａｎａｔ．（２００６）２０９，ｐｐ５２７−５３２を参照されたい）。
【００２０】
織物の、結合させた、紡績の、印刷した、分解性、非分解性、同種異系、自己移植、異種移植、微細孔（均等な間隔、不均等な間隔、様々なサイズ）、細胞外マトリックスなどのうちの１つまたは複数を含み得る、合成、生物学的、分解性、非分解性、多孔性などの任意のおよび全ての足場を含むが、これらに限定されない任意の適切な３ＤＦＣＳを用いることができる。
【００２１】
３次元支持フレームワークは、（ａ）細胞を接着させることができ（または、細胞を接着させることができるように変更することができ）、かつｂ）細胞を２層以上の層内で成長させることができる任意の材料および／または形状のものであってよい。ナイロン（ポリアミド）、ダクロン（ポリエステル）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル化合物（例えば、ポリ塩化ビニル、ＰＶＣ）、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ；ＴＥＦＬＯＮ）、サーマノクス（ｔｈｅｒｍａｎｏｘ（ＴＰＸ））、ニトロセルロース、綿、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、腸線縫合糸、セルロース、ゼラチン、デキストランなどを含むが、これらに限定されないいくつかの異なる材料を用いて、フレームワークを形成してもよい。これらの材料のいずれかをメッシュに織り込んで、３次元フレームワークを形成してもよい。ナイロン、ポリスチレンなどの特定の材料は、細胞が接着しにくい基質である。これらの材料を３次元支持フレームワークとして使用する場合、フレームワークへの接着を高めるために、線維芽細胞および他の間質細胞の接種前にフレームワークを前処理することが望ましい。例えば、線維芽細胞および他の間質細胞を接種する前に、ナイロンスクリーンを０.１Ｍの酢酸で処理し、ポリリジン、牛胎児血清、および／またはコラーゲン中でインキュベートして、ナイロンをコーティングすることができる。ポリスチレンは、同様に、硫酸を用いて処理することができる。
【００２２】
３ＤＦＣをインビボで直接移植する場合には、ＰＧＡ、腸線縫合糸材料、コラーゲン、ポリ乳酸、またはヒアルロン酸などの生分解性材料を使用することが好ましい場合がある。例えば、これらの材料は、コラーゲンスポンジまたはコラーゲンゲルなどの３次元フレームワークに織り込まれてもよい。培養物を長期間維持するか、または凍結保存する場合には、ナイロン、ダクロン、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリビニル、テフロン、綿などの非分解性材料が好ましい場合がある。本発明に従って使用することができる便利なナイロンメッシュは、平均孔径が１４０μｍで、ナイロン繊維の平均繊維径が９０μｍであるナイロン濾過メッシュである（＃３−２１０／３６、Ｔｅｔｋｏ社、ニューヨーク州）。
【００２３】
平滑筋細胞、骨格筋細胞、および心筋細胞、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない任意の適切な収縮細胞を用いることができる。
【００２４】
収縮細胞は、幹細胞集団、前駆細胞集団、胚細胞またはウイルス、ｍＲＮＡ、エピソームベクターなどによる人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を介して再プログラムされた体細胞由来の胎生組織、新生児組織、成体組織を含むが、これらに限定されない任意の供給源に由来し得る。収縮細胞は、完全に成熟収縮細胞であるか、または特定の収縮細胞経路の未成熟細胞、またはそれらの組み合わせであってよい。これらの細胞は、齧歯類またはヒト細胞などの霊長類細胞などの任意の適切な生物に由来してよい。これらの細胞は、男性もしくは女性の対象に由来し得るか、または男性および女性の対象由来の細胞を組み合わせることができる。
【００２５】
１つの代替実施形態では、３ＤＦＣはパッチを含み、細胞はこのパッチの頂部上に播種される。この実施形態では、パッチの底部を、心臓などの目的の表面に接着させることができる。
【００２６】
一実施形態では、収縮細胞は、線維芽細胞と約１：１０〜約４：１の比で３ＤＦＣＳの表面上に存在する。別の実施形態では、収縮細胞は、線維芽細胞と約１：３〜約１．２：１の比で該構築物の表面上に存在する。様々なさらなる実施形態では、任意の実施形態または実施形態の組み合わせの収縮細胞は、線維芽細胞と比べて、約４：２０〜約１.２：１、約１：４〜約１.２：１、約６：２０〜約１.２：１、約７：２０〜約１.２：１、約２：５〜約１.２：１、約９：２０〜約１.２：１、約１：２〜約１.２：１、約１１：２０〜約１.２：１、約３：５〜約１.２：１、約１３：２０〜約１.２：１、約７：１０〜約１.２：１、約３：４〜約１.２：１、約４：５〜約１.２：１、約１７：２０〜約１.２：１、約９：１０〜約１.２：１、約１９：２０〜約１.２：１、および約１：１〜約１.２：１の比で構築物の表面上に存在する。
【００２７】
一実施形態では、収縮細胞は、２×１０５細胞／ｃｍ２〜２．９５×１０６細胞／ｃｍ２の密度で該構築物の表面上に播種される。別の実施形態では、収縮細胞は、２×１０６細胞／ｃｍ２〜２．５×１０６細胞／ｃｍ２の密度で該構築物の表面上に播種される。様々なさらなる実施形態では、収縮細胞は、２×１０５細胞／ｃｍ２〜２．９５×１０６細胞／ｃｍ２；５×１０５細胞／ｃｍ２〜２．９５×１０６細胞／ｃｍ２；１×１０６細胞／ｃｍ２〜２．９５×１０６細胞／ｃｍ２；１．５×１０６細胞／ｃｍ２〜２．９５×１０６細胞／ｃｍ２；１．３×１０５細胞／ｃｍ２〜２．５×１０６細胞／ｃｍ２；または１．３×１０５細胞／ｃｍ２〜２×１０６細胞／ｃｍ２の密度で該構築物の表面上に播種される。
【００２８】
さらなる実施形態では、収縮細胞は、未成熟収縮細胞と成熟収縮細胞の組み合わせを含む。このような一実施形態では、未成熟収縮細胞および成熟収縮細胞は、約１：２〜約２：１の比で構築物表面上に存在する。他の実施形態では、比率は約１：１〜約２：１、または約１：１〜約１：２である。
【００２９】
さらなる実施形態では、収縮細胞は、ＣＤ４０および／またはＨＬＡの発現を低減または排除するために操作される。この実施形態は、同種移植に特に適する宿主における移植細胞の良好な保持を可能にする減少免疫プロファイル（ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｐｒｏｆｉｌｅ）のために選択された細胞を提供する。
【００３０】
さらなる実施形態では、収縮細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する。非限定的な実施形態では、成熟収縮細胞は、本明細書に記載の本発明の方法を用いて該構築物上に生成されてよい。
【００３１】
一実施形態では、収縮細胞は未成熟心筋細胞を含む。
【００３２】
本明細書で使用する「未成熟心筋細胞」は観察可能なサルコメアを欠いている。様々な実施形態では、「成熟心筋細胞」と比較して、以下の特性のうちの１つまたは複数を有する：
・形態学的に小さい細胞サイズ；
・筋原繊維密度の減少；
・電気生理学的に抑えられ／減少した活動電位振幅；
・ＭＹＨ７（ベータミオシン重鎖）、ＭＹＨ６（アルファミオシン重鎖）、ＳＣＮ５Ａ、ＧＪＡ１（コネキシン４３）、ＨＣＮ４（過分極活性化Ｋ＋チャネル）、ＫＣＮＪ２（内向き整流性カリウムイオンチャネル）、ＳＥＲＣＡ２ａ（サルコ／小胞体（ｓａｒｃｏｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）ＡＴＰアーゼ）、アルファアクチニン、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）の遺伝子および／またはタンパク質の発現の減少。
【００３３】
別の実施形態では、収縮細胞は、成熟心筋細胞を含む。本明細書で使用する「成熟心筋細胞」は、観察可能なサルコメアを有する。様々な実施形態では、「未成熟心筋細胞」と比較して、成熟心筋細胞は、以下の特性のうちの１つまたは複数を有する：
・形態学的に小さい細胞サイズ；
・筋原繊維密度の減少；
・電気生理学的に抑えられ／減少した活動電位振幅；
・ＭＹＨ７（ベータミオシン重鎖）、ＭＹＨ６（アルファミオシン重鎖）、ＳＣＮ５Ａ、ＧＪＡ１（コネキシン４３）、ＨＣＮ４（過分極活性化Ｋ＋チャネル）、ＫＣＮＪ２（内向き整流性カリウムイオンチャネル）、ＳＥＲＣＡ２ａ（サルコ／小胞体ＡＴＰアーゼ）、アルファアクチニン、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）の遺伝子および／またはタンパク質の発現の減少。
【００３４】
本発明者らは、構築物上での（ｉＰＳＣ由来のものなどの）未成熟心筋細胞の成熟を示すことにより、該構築物が収縮細胞の生存および成熟を促進する独特かつ協力的な環境を提供し、したがって、細胞のインビボ投与に有効であることを実証した。
【００３５】
一実施形態では、未成熟心筋細胞および／または成熟心筋細胞は、１．３×１０５細胞／ｃｍ２〜２．７×１０６細胞／ｃｍ２の密度で該構築物の表面上に播種され、収縮細胞は、３ＤＦＣＳ上の線維芽細胞と共に約１：７〜約３：１の比で３ＤＦＣＳの表面上に存在する。別の実施形態では、未成熟心筋細胞および／または成熟心筋細胞は、１．２×１０６細胞／ｃｍ２〜２．３×１０６細胞／ｃｍ２の総密度で構築物の表面上に播種される。様々な実施形態では、該構築物は、治療的使用のための心筋細胞を２．９×１０５細胞／ｃｍ２、１．２×１０６細胞／ｃｍ２または２．３×１０６細胞／ｃｍ２の用量範囲で含む。
【００３６】
様々な実施形態では、心筋細胞は、３ＤＦＣＳ上の線維芽細胞と共に約１．５：１〜１：１．７；１：１〜３：１；１：１５〜３．５：１；１：１５〜１．７：１；１：６〜３．５：１；１．６〜１．５：１；または１：１．７〜１．５：１の比で３ＤＦＣＳの表面上に存在する。
【００３７】
心筋細胞集団は、１００％成熟心筋細胞または１００％未成熟心筋細胞、５０％成熟心筋細胞および５０％未成熟心筋細胞、またはそれらの任意の適切な変化率であってよい。
【００３８】
別の実施形態では、収縮細胞は平滑筋細胞を含む。このような一実施形態では、平滑筋細胞は、１．２×１０６細胞／ｃｍ２〜２．９５×１０６細胞／ｃｍ２の密度で該構築物の表面上に播種され、平滑筋細胞は、３ＤＦＣＳ上の線維芽細胞と共に約１：１５〜約３．５：１の比で３ＤＦＣＳの表面上に存在する。様々な実施形態では、平滑筋細胞は、３ＤＦＣＳ上の線維芽細胞と共に約１：１５〜約３．５：１；１：１５〜１．７：１；１：６〜３．５：１；２．５：１〜６：１；１．６〜１．５：１；または１：１．７〜１．５：１の比で３ＤＦＣＳの表面上に存在する。
【００３９】
様々なさらなる実施形態では、平滑筋細胞は、１．３×１０５細胞／ｃｍ２〜２．９４×１０６細胞／ｃｍ２；１．２×１０６細胞／ｃｍ２〜２．９４×１０６細胞／ｃｍ２；１．３×１０５細胞／ｃｍ２〜１．２×１０６細胞／ｃｍ２；または１．０×１０６細胞／ｃｍ２〜１．２×１０６細胞／ｃｍ２の密度で該構築物の表面上に播種される。別の実施形態では、平滑筋細胞は、１．０×１０６細胞／ｃｍ２〜１．２×１０６細胞／ｃｍ２の密度で該構築物の表面上に播種され、平滑筋細胞は、３ＤＦＣＳ上の線維芽細胞と共に約１：１．７〜約１．５：１の比で３ＤＦＣＳの表面上に存在する。
【００４０】
さらなる実施形態では、収縮細胞は骨格筋細胞を含む。このような一実施形態では、骨格筋細胞は、１．３×１０５細胞／ｃｍ２〜２．９５×１０６細胞／ｃｍ２の密度で該構築物の表面上に播種され、骨格筋細胞は、３ＤＦＣＳ上の線維芽細胞と共に約１：１５〜約３．５：１の比で３ＤＦＣＳの表面上に存在する。様々な実施形態では、骨格筋細胞は、３ＤＦＣＳ上の線維芽細胞と共に約１：１５〜約３．５：１；１：１５〜１．７：１；１：６〜３．５：１；１．６〜１．５：１；または１：１．７〜１．５：１の比で３ＤＦＣＳの表面上に存在する。様々なさらなる実施形態では、骨格筋細胞は、１．３×１０５細胞／ｃｍ２〜２．９４×１０６細胞／ｃｍ２；１．２×１０６細胞／ｃｍ２〜２．９４×１０６細胞／ｃｍ２；１．３×１０５細胞／ｃｍ２〜１．２×１０６細胞／ｃｍ２；または１．０×１０６細胞／ｃｍ２〜１．２×１０６細胞／ｃｍ２の密度で該構築物の表面上に播種される。別の実施形態では、骨格筋細胞は、１．０×１０５細胞／ｃｍ２〜１．２．０×１０６細胞／ｃｍ２の密度で該構築物の表面上に播種され、骨格筋細胞は、３ＤＦＣＳ上の線維芽細胞と共に約１：１．７〜約１．５：１の比で３ＤＦＣＳの表面上に存在する。
【００４１】
一実施形態では、任意の実施形態または実施形態の組み合わせの収縮細胞、特に構築物の心筋細胞および骨格筋の実施形態については、構築物上に条線を形成する。これらの実施形態では、収縮細胞は、顕微鏡で可視化できるサルコメアの繰り返しを形成する。
【００４２】
任意の実施形態の構築物は、任意の生物学的薬剤、遺伝子活性化、細胞の足場、筋肉の修復のための細胞外マトリックスなどを発現するように操作された収縮細胞を含んでよく、操作には前処理、プリロード、過剰発現、一般的な薬剤溶出特性が含まれ得、生物学的薬剤にはタンパク質、アミノ酸誘導体、ポリペプチドホルモン、ステロイド、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、サイトカイン、成長因子、細胞もしくは足場に関連する（内因性もしくは修飾された）受容体、酵素、酵素前駆体、ウイルス剤、抗菌剤など、または上記の任意の組み合わせが含まれ得る。
【００４３】
典型的なこのような化合物には、チモシンβ−４（ＴＢ４）、ａｋｔマウス胸腺腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ΑΚΤ１）、間質細胞由来因子−１アルファ（ＳＤＦ−１）、血管新生を促進する遺伝子、および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のうちの１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
本発明の構築物は、さらに、任意の生物学的薬剤、遺伝子活性化、細胞足場、細胞外マトリックス、または生来の脈管構造への外科的または生物学的結合が可能な確立された血管の組み込みを含んでよい。
【００４５】
別の態様では、本発明は、収縮細胞の機能不全によって特徴付けられる障害を治療するための方法であって、収縮細胞系障害を有する患者と、障害を治療するのに有効な量で本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせの構築物とを接触させることを含む方法を提供する。本発明者らは、構築物上の（ｉＰＳＣ由来のものなどの）未成熟心筋細胞の成熟を示すことにより、該構築物が収縮細胞の生存および成熟を促進する独特かつ協力的な環境を提供し、したがって、細胞のインビボ投与に有効であることを実証した。該構築物は、うっ血性心不全のげっ歯類モデルに移植した場合に機能的利益を提供し、移植した場合に電気的に安定であることが実施例で実証されている。本発明者らはまた、ヒトｉＰＳＣ由来の心筋細胞の心臓パッチが、左心室心臓組織への移植後にアンジオポエチン１（ＡＮＧ−１）、コネキシン４３（Ｃｘ４３）、および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のｍＲＮＡ発現レベルが増加することも実証した。
【００４６】
本発明の構築物は、（オープンキャビティ、低侵襲性、ロボット制御、カテーテルなどの）いずれかの外科的手段によって移植されてもよく、縫合糸、接着剤、細胞接着、分極（磁気）などの利用を介して所定の位置に移植する／埋め込むことができる。該構築物は、使用前に製造され、凍結保存されてもよい。
【００４７】
一実施形態では、収縮細胞は、未成熟心筋細胞、成熟心筋細胞、またはそれらの組み合わせを含み、本方法は、障害を治療するのに有効な量の構築物と、かかる障害に罹患している対象の心臓とを接触させることを含む。この実施形態では、障害には、虚血誘発性心不全、慢性心不全（ＣＨＦ）、心不全を伴わない虚血、心筋症、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、心停止、うっ血性心不全、安定狭心症、不安定狭心症、心筋梗塞、冠動脈疾患、心臓弁膜症、虚血性心疾患、駆出率の低下、心筋灌流の低下、不適応な心臓リモデリング、不適応な左心室リモデリング、左心室機能の低下、左心不全、右心不全、後方不全、前方不全、収縮機能障害、拡張機能障害、全身血管抵抗の増加または減少、低拍出心不全、高拍出心不全、労作時呼吸困難、安静時呼吸困難、起座呼吸、頻呼吸、発作性夜間呼吸困難、めまい、精神錯乱、安静時の四肢の冷え、運動不耐性、易疲労感、末梢浮腫、夜間頻尿、腹水、肝腫大、肺水腫、チアノーゼ、心尖拍動の側方移動、奔馬調律、心雑音、傍胸骨拍動、および胸水が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００４８】
したがって、本発明の方法は、３ＤＦＣ上に播種された細胞の生着／増殖を支援するために、独自のバイオリアクターとして心臓を用いる細胞ベースの治療のための送達システムとして３ＤＦＣを利用する。本発明の方法は、単離細胞注射とは対照的に大部分の心筋、すなわち、治療に必要とされる損傷した心筋量をカバーでき、したがって、細胞注射がヒトよりげっ歯類において良好に機能するように思われる理由に対する１つの批評に対処できる。また３ＤＦＣ上に播種した細胞は、単離細胞注射で見られるように循環中に取り除かれない。
【００４９】
本明細書中の任意の他の実施形態と組み合わせることができる代替実施形態では、対象は哺乳動物、最も好ましくはヒトである。本明細書中の任意の他の実施形態と組み合わせることができるさらなる代替実施形態では、対象はヒトである。別の代替実施形態では、未成熟心筋細胞、成熟心筋細胞、またはそれらの組み合わせが対象から取得される。
【００５０】
本明細書で使用する「ＣＨＦ」は、身体のニーズを満たすために十分な血液を供給する心臓の能力の（急速な発現とは対照的な）慢性の機能障害である。ＣＨＦは、心停止、心筋梗塞、および心筋症によって引き起こされる可能性はあるが、それらとは区別される。１つの代替実施形態では、対象はうっ血性心不全に罹患している。本明細書中の任意の他の実施形態と組み合わせることができる様々なさらなる代替実施形態では、対象の心不全は、左心不全、右心不全、後方不全（静脈背圧の増加）、前方不全（適切動脈灌流供給の不全）、収縮機能障害、拡張機能障害、全身血管抵抗、低拍出性心不全、高拍出性心不全を含む。本明細書中の任意の他の実施形態と組み合わせることができる様々なさらなる代替の実施形態では、対象のＣＨＦは、ニューヨーク心臓協会の機能分類に従って、クラスＩ〜ＩＶのいずれか、より好ましくは、クラスＩＩＩまたはＩＶであり得る。
クラスＩ：いかなる活動でも制約を経験しない；通常の活動からの症状はない。
クラスＩＩ：活動にわずかに軽い制約がある；患者は安静時または軽度の労作時に快適である。
クラスＩＩＩ：いかなる活動でも顕著な制約がある；患者は安静時にのみ快適である。
クラスＩＶ：いかなる身体活動も不快感をもたらし、安静時に症状が起こる。
【００５１】
本明細書中の任意の他の実施形態と組み合わせることができるさらなる代替実施形態では、対象は、ニューヨーク心臓協会の機能分類に従ってＣＨＦと診断されている。本明細書中の任意の他の実施形態と組み合わせることができるさらなる代替実施形態では、対象は、以下のもののうちの１つまたは複数によってさらに特徴づけられる：高血圧、肥満、喫煙、糖尿病、心臓弁膜症、および虚血性心疾患。
【００５２】
本明細書で使用する「治療する」または「治療」は、以下のうちの１つまたは複数を達成することを意味する：（ａ）障害の重症度の低下（例：ＣＨＦ対象についてクラスＩＩＩへ状態を改善するためのクラスＩＶ対象の治療）；（ｂ）障害に特徴的な症状の発症の制限または予防;（ｃ）障害に特徴的な症状の悪化の抑制;（ｄ）以前に障害の症状を示していた患者における症状の再発の制限または防止。ＣＨＦに特徴的な徴候には、駆出率の低下、心筋灌流の低下、不適応な心臓リモデリング（左心室リモデリングなど）、左心室機能の低下、労作時呼吸困難、安静時呼吸困難、起座呼吸、頻呼吸、発作性夜間呼吸困難、めまい、精神錯乱、安静時の四肢の冷え、運動不耐性、易疲労感、末梢浮腫、夜間頻尿、腹水、肝腫大、肺水腫、チアノーゼ、心尖拍動の側方移動、奔馬調律、心雑音、傍胸骨拍動、および胸水が含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
様々な実施形態では、治療は、左心室機能の改善、左心室拡張末期圧（ＥＤＰ）の低下、心筋灌流の改善、心筋細胞による心臓壁の再構築、ＣＨＦ対象における不適応な左心室リモデリングの逆進、左心室の受動的充満、能動的充満などの拡張機能の改善、心室腔コンプライアンス、ならびにＥ’（ｍｍ／秒）の増加、Ｅ／Ｅ’の減少、ＬＶ ｄＰ／ｄｔ（ｍｍＨｇ／秒）の増加およびＴａｕ（ミリ秒）の減少を含むが、これらに限定されない心不全パラメータのうちの１つまたは複数を含む。
【００５４】
一実施形態では、本明細書に記載の構築物は、虚血性心臓組織の治癒の促進に使用される。虚血組織の治癒を促進する構築物の能力は、部分的に虚血の重症度に依存する。当業者によって理解されるように、虚血の重症度は、部分的に組織が酸素を奪われている時間の長さに依存する。そのような活動の中で虚血組織のリモデリングの減少または予防がある。本明細書では「リモデリング」とは、以下のうちの１つまたは複数の存在を意味する：（１）虚血組織の進行性の菲薄化、（２）虚血組織に供給する血管の数もしくは血管の減少、および／または（３）虚血組織に供給する血管の１つもしくは複数の閉塞、ならびに虚血組織が筋肉組織を含む場合、（４）筋肉組織の収縮能の減少。治療を行わなければ、リモデリングは、典型的には、虚血組織の弱体化につながり、もはや対応する健常組織と同レベルで機能できなくなる。心臓血管の虚血は、一般に、冠動脈疾患の直接的な結果であり、一般的に冠状動脈におけるアテローム硬化性プラークの破裂によって引き起こされ、血栓の形成につながり、冠状動脈を閉塞または妨害する可能性があり、それによって下流の心筋から酸素が奪われる。虚血が長引くと、細胞死または壊死につながる場合があり、死んだ組織の領域は、一般に梗塞と呼ばれる。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法のための候補対象は、安定狭心症および可逆的心筋虚血を有する患者である。安定狭心症は、労作時またはストレス時に生じ、休息または舌下ニトログリセリンにより軽減される収縮性胸痛により特徴付けられる。安定狭心症の患者の冠動脈造影は、一般的に、少なくとも１つの冠状動脈の５０〜７０％に閉塞があることが明らかになっている。安定狭心症は、一般的に、臨床症状およびＥＣＧ変化の評価により診断される。安定狭心症の患者は、一過性ＳＴセグメント異常を有し得るが、安定狭心症に関連するこれらの変化の感度および特異性は低い。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法の候補は、不安定狭心症および可逆的心筋虚血を有する患者である。不安定狭心症は、舌下ニトログリセリンにより軽減される安静時の収縮性胸痛により特徴付けられる。狭心症胸痛は、一般的に、舌下ニトログリセリンにより軽減され、痛みは通常３０分以内に治まる。不安定狭心症の重症度には３つのクラスがある：クラスＩ、新規発症の、重症のまたは加速した狭心症として特徴づけられる；クラスＩＩ、重症度、持続時間、またはニトログリセリンの要求量の増加により特徴付けられる安静時の亜急性狭心症；クラスＩＩＩ、安静時の急性狭心症として特徴付けられる。不安定狭心症は、安定狭心症と急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の間の臨床状態を表わし、主として、血栓の閉塞を伴う非閉塞性プラークへの、粥状動脈硬化、環状動脈痙攣、または出血の重症度および程度の進行によるものと考えられている。不安定狭心症の患者の冠血管造影によると、通常少なくとも１つの冠状動脈の９０％以上に閉塞があることが明らかとなっており、酸素供給が基準の心筋の酸素要求量さえ満たせなくなる。安定アテロームプラークのゆっくりとした成長または不安定アテロームプラークの破裂は、血栓形成を伴い、不安定狭心症を引き起こし得る。これらは両方ともが重大な冠状動脈の狭窄を生じさせる。不安定狭心症は通常アテロームプラークの破裂、血小板活性化、および血栓形成に関係している。不安定狭心症は、通常、臨床症状、ＥＣＧ変化、および心臓マーカーの変化により診断される。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法の候補は、冠動脈バイパス（ＣＡＢＧ）術を経験している、左心室機能不全および可逆性心筋虚血を有するヒト患者であり、少なくとも１つの移植可能な冠血管、少なくとも１つの冠状血管を有し、バイパスまたは経皮冠動脈インターベンションを受けることができない。
【００５８】
いくつかの実施形態では、レーザドップラーイメージング（例えば、Ｎｅｗｔｏｎら、２００２，Ｊ Ｆｏｏｔ Ａｎｋｌｅ Ｓｕｒｇ，４１（４）：２３３−７を参照されたい）を用いて測定されるように、虚血組織への構築物の適用は虚血組織中に存在する血管の数を増加させる。いくつかの実施形態では、血管の数は１％、２％、５％増加し、他の実施形態では、血管の数は１０％、１５％、２０％増加し、さらには２５％、３０％、４０％、５０％も増加し、いくつかの実施形態では、血管の数はさらに増加するが、中間値も許容される。
【００５９】
いくつかの実施形態では、虚血心臓組織への構築物の適用は、駆出率を増加させる。健康な心臓では、駆出率は約６５〜９５パーセントである。虚血組織を含む心臓では、駆出率は、いくつかの実施形態では約２０〜４０パーセントである。したがって、いくつかの実施形態では、治療前の駆出率と比較して、構築物で治療すると駆出率が０．５〜１パーセント絶対改善する。他の実施形態では、構築物での治療により、駆出率が１パーセントを超えて絶対改善する。いくつかの実施形態では、治療前の駆出率と比較して１．５％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％またはそれ以上駆出率が絶対改善する。例えば、治療前の駆出率が４０％であった場合、これらの実施形態では治療後には４１％〜５９％またはそれ以上の駆出率が観察される。さらに他の実施形態では、治療前の駆出率と比較して、構築物による治療は１０％を超えて駆出率を改善する。
【００６０】
いくつかの実施形態では、虚血心臓組織への構築物の適用は、心拍出量（ＣＯ）（治療前の状態と比較して最大５５％またはそれ以上の増加）、左心室拡張終期容積係数（ＬＶＥＤＶＩ）、左心室収縮終期容積係数（ＬＶＥＳＶＩ）および収縮期壁肥厚（ＳＷＴ）のうちの１つまたは複数を増加させる。これらのパラメータは、例えば、放射性核種心室造影（ＲＮＶ）またはマルチゲート収集（ＭＵＧＡ）などの核スキャン、ならびにＸ線を含む当該技術の標準的な臨床診断法により測定される。
【００６１】
いくつかの実施形態では、虚血心臓組織への構築物の適用は、心筋損傷の診断に使用できるクレアチンキナーゼ（ＣＫ）、血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＳＧＯＴ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１４２６１３号参照）、トロポニンＩおよびトロポニンＴなどの心臓損傷の指標として臨床的に使用される１つまたは複数のタンパク質マーカーの血中濃度における実証可能な改善をもたらす（例えば、米国特許出願公開第２００５／００２１２３４号参照）。さらに他の実施形態では、アルブミンのＮ末端に影響を及ぼす変更が測定できる（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１４２６１３号、第２００５／００２１２３４号、および第２００５／０００４４８５号参照；これらの開示は参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【００６２】
さらに、該構築物は、心臓ポンプ、血管内ステント、血管内ステントグラフト、左心室アシスト装置（ＬＶＡＤ）、両心室心臓ペースメーカー、人工心臓、および増強体外式カウンターパルセーション（ＥＥＣＰ）を含む心疾患の治療に使用される治療装置と共に使用することができる。
【００６３】
本明細書中の任意の別の実施形態と組み合わせることができるさらなる代替実施形態では、治療により、対象に新たな心筋細胞および新たな血管が生成される。本明細書中の任意の別の実施形態と組み合わせることができるさらなる代替実施形態では、治療により、対象において左心室機能の改善、拡張終期圧力（ＥＤＰ）の低下（治療前の状態と比較して最大５０〜６０％またはそれ以上の減少）、心筋潅流、心筋細胞による心臓前壁の再構築、および／または不適応性左心室リモデリングの逆進が改善される。
【００６４】
左心室の収縮を支援するために同期して拍動する構築物が心臓上に配置される１つの非限定的な代替実施形態では、有益な治療は、駆出率の改善により実証可能である。さらなる非限定的な代替実施形態では、拍動しない構築物が心臓上に配置され、次いで、心臓の収縮を支援するために心臓上で自発的に拍動を始める。
【００６５】
該構築物は、接着を促進する任意の適切な方法で心臓と接触できる。該構築物を心外膜、心筋層および心内膜、最も好ましくは心外膜を含む心臓上の様々な位置に接着させてよい。接着手段には、構築物と心臓組織の間の直接接着、生物学的接着剤、縫合糸、合成接着剤、レーザ染料、またはヒドロゲルが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの市販の止血剤および封止剤には、ＳＵＲＧＩＣＡＬ（登録商標）（酸化セルロース）、ＡＣＴＩＦＯＡＭ（登録商標）（コラーゲン）、ＦＩＢＲＸ（登録商標）（光活性化フィブリン封止剤）、ＢＯＨＥＡＬ（登録商標）（フィブリン封止剤）、ＦＩＢＲＯＣＡＰＳ（登録商標）（乾燥粉末フィブリン封止剤）、多糖類ポリマーのｐ−ＧｌｃＮＡｃ（ＳＹＶＥＣ（登録商標）パッチ；Ｍａｒｉｎｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｐｏｌｙｍｅｒ ２７ＣＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｔｅｃｈ社）が含まれる。１時間半の間に、手術室で１２０ｍｌの患者の血液から自己由来のフィブリン封止剤を調製するための医療装置および器具も公知である（例えば、Ｖｉｖｏｓｔａｔ Ｓｙｓｔｅｍ）。
【００６６】
直接接着を使用する本発明の代替実施形態では、該構築物は心臓上に直接配置され、生来の細胞接着により生成物が接着する。さらなる代替実施形態では、該構築物を外科的接着剤、好ましくは、フィブリン接着剤などの生物学的接着剤を用いて心臓に接着させる。外科的接着剤としてのフィブリン接着剤の使用は公知である。フィブリン接着剤組成物は公知であり（例えば、米国特許第４，４１４，９７１号、同第４，６２７，８７９号および同第５，２９０，５５２号参照）、得られたフィブリンは自己由来であり得る（例えば、米国特許第５，６４３，１９２号参照）。接着剤組成物は、１つもしくは複数の薬剤または薬物（例えば、米国特許第４，３５９，０４９号および同第５，６０５，５４１号参照）を含むリポソームなどの追加の成分を含んでもよく、注入（例えば、米国特許第４，８７４，３６８号参照）により、またはスプレー（例えば、米国特許第５，３６８，５６３号および同第５，７５９，１７１号参照）により導入されてよい。フィブリン接着剤組成物を適用するためのキットも利用可能である（例えば、米国特許第５，３１８，５２４号参照）。
【００６７】
別の実施形態では、レーザ染料は心臓、構築物またはその両方に適用され、組織に接着させるのに適した波長のレーザを使用して活性化される。代替実施形態では、レーザ染料は、組織の機能または完全性を変化させない範囲の活性化周波数を有する。例えば、８００ｎｍの光は、組織と赤血球を通過する。レーザ染料としてインドシアングリーン（ＩＣＧ）を使用して、組織を通過するレーザ波長が使用されてもよい。５ｍｇ／ｍｌのＩＣＧの溶液が、３次元ストロマ組織（または標的部位）の表面上に塗布され、ＩＣＧが組織のコラーゲンに結合する。８００ｎｍ付近のピーク強度を備えた発光レーザからの５ミリ秒のパルスを使用してレーザ染料を活性化すると、コラーゲンが変性して、隣接組織のエラスチンが修飾された表面に融合する。
【００６８】
別の実施形態では、該構築物を、ヒドロゲルを使用して心臓に接着させる。いくつかの天然および合成のポリマー材料が適切なヒドロゲル組成物を形成するのに十分である。例えば、多糖類、例えば、アルギン酸塩は、２価カチオンと架橋されてもよく、ポリホスファゼンおよびポリアクリレートがイオン架橋されるか、または紫外線重合により架橋される（米国特許第５，７０９，８５４号）。あるいは、２−オクチルシアノアクリレート（「ＤＥＲＭＡＢＯＮＤ（商標）」、Ｅｔｈｉｃｏｎ社、ニュージャージー州サマービル）などの合成外科用接着剤を用いて、３次元ストロマ組織を接着させてもよい。
【００６９】
本発明の代替実施形態では、該構築物は、５−Ｏ、６−Ｏおよび７−Ｏプロレン縫合（Ｅｔｈｉｃｏｎカタログ番号８７１３Ｈ、８７１４Ｈおよび８７０１Ｈ）、ポリグレカプロン、ポリジオキサノン、ポリグラクチンまたは他の適切な非生物分解性もしくは生物分解性の縫合材料を含むが、これらに限定されない１つまたは複数の縫合糸を用いて心臓に固定される。縫合する場合、必ずしも必要というわけではないが、典型的には、両端針が使用される。
【００７０】
別の実施形態では、３ＤＦＣは、フレームワークが組織操作された最終生成物よりもわずかに大きいバイオリアクターシステム（例えば、米国特許第５，７６３，２６７号および同第５，８４３，７６６号）で成長する。最終生成物は、生物学的／合成接着剤の適用のための部位として使用される足場材料の縁、一端、フラップもしくはタブ、レーザ染料またはヒドロゲルを含む。代替実施形態では、足場の織物が縫合または微小縫合のための接着材料として使用されてよい。
【００７１】
本明細書で使用する「有効量」という語句は、本明細書で述べられるように、障害を治療するのに有効な構築物の量を意味する。当業者には明らかなように、本方法は、心筋細胞の機能不全によって特徴付けられる障害を治療するために、記載の構築物のうちの１つまたは複数の使用を含む。一実施形態では、本方法は、心臓の１つまたは複数の虚血領域、好ましくは、心臓の全ての虚血領域をカバーするのに役立つ量の１つまたは複数の構築物と心臓とを接触させることを含む。該構築物は、心筋細胞の機能不全によって特徴付けられる障害を有すると診断された個人における、組織治癒および／または弱ったもしくは損傷した心臓組織の血管再生の促進に有効な量で使用される。投与される構築物の量は、部分的に、障害の重症度、構築物が注射可能な組成物（参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第２００６０１５４３６５号参照）として使用されるかどうか、存在する様々な増殖因子および／もしくはＷｎｔタンパク質の濃度、構築物を含む生存細胞の数、ならびに／または治療される心臓組織（複数可）へのアクセス容易性に依存する。有効投与量の決定は十分に当業者の技能の範囲内にある。（参照によりその全体が本明細書に援用される）米国特許出願公開２００６０２９２１２５号に記載のイヌのモデルなどの適切な動物モデルを、心臓の特定の組織に対する用量効能試験に使用することができる。
【００７２】
本明細書に使用する「用量」とは、うっ血性心不全と診断された個人の心臓に適用される構築物の接着片の数を指す。構築物の典型的な接着片は約３５ｃｍ2である。当業者には理解されるように、心筋の機能不全によって特徴付けられる障害を有すると診断された個人における弱ったもしくは損傷した心臓組織の治癒を促進するのに十分な数の細胞を含む限り、接着片の絶対寸法は変更できる。したがって、本明細書に記載の方法に使用するのに適する接着片は、１５ｃｍ2〜５０ｃｍ2のサイズの範囲であり得る。
【００７３】
構築物の２つ以上の接着片を適用すると、本明細書に記載の方法により治療可能な心臓の面積を増加させることができる。例えば、構築物の２つの接着片を用いる実施形態では、治療可能な面積の大きさは約２倍になる。構築物の３つの接着片を用いる実施形態では、治療可能な面積の大きさは約３倍になる。構築物の４つの接着片を用いる実施形態では、治療可能な面積の大きさは約４倍になる。構築物の５つの接着片を用いる実施形態では、治療可能な面積は約５倍、すなわち３５ｃｍ2〜１７５ｃｍ2である。
【００７４】
いくつかの実施形態では、構築物の１つの接着片を、心筋細胞の機能不全によって特徴付けられる障害を有すると診断された個人の心臓の領域に接着させる。
【００７５】
他の実施形態では、構築物の２つの接着片を、心筋細胞の機能不全によって特徴付けられる障害を有すると診断された個人の心臓の領域に接着させる。
【００７６】
他の実施形態では、構築物の３つの接着片を、心筋細胞の機能不全によって特徴付けられる障害を有すると診断された個人の心臓の領域に接着させる。
【００７７】
他の実施形態では、構築物の４つ、５つ、またはそれ以上の接着片を、心筋細胞の機能不全によって特徴付けられる障害を有すると診断された個人の心臓の領域に接着させる。
【００７８】
構築物の２つ以上の接着片が投与される実施形態では、部分的に、心筋細胞の機能不全によって特徴付けられる障害の重症度、治療される面積の範囲、および／または治療される心臓組織（複数可）へのアクセス容易性に依存して、１つの接着片のもう一つの接着片に対する近接性を調整できる。例えば、いくつかの実施形態では、第１の小片の１つまたは複数の端が第２の小片の１つまたは複数の端と接触するように、３ＤＦＣの小片は互い直接隣接して配置できる。他の実施形態では、一方の小片の端がもう１方の小片の端に触れないように、小片を心臓組織に接着できる。これらの実施形態では、解剖状態および／または対象によって示される疾患状態に基づいて、小片は適切な距離で互いに離すことができる。一方の小片の別の小片に対する近接性の決定は当業者の通常の技能の範囲内にあり、必要とされる場合には、米国特許出願公開第２００６０２９２１２５号に記載のイヌのモデルなどの適切な動物モデルを使用して試験することができる。
【００７９】
構築物の複数の小片を含む実施形態では、小片の一部または全部が心臓の同じまたは異なる領域に接着できる。
【００８０】
構築物の複数の小片を含む実施形態では、小片を心臓に同時に接着させるか、または並行して接着させる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、構築物の小片は時間をかけて投与される。投与の回数および間隔は、部分的に、障害の重症度、３ＤＦＣが注射可能な組成物（参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第２００６０１５４３６５号参照）として使用されるかどうか、存在する様々な増殖因子および／もしくはＷｎｔタンパク質の濃度、３ＤＦＣを含む生存細胞の数、ならびに／または治療される心臓組織へのアクセス容易性に依存する。投与回数および連続適用の間の持続時間の決定は、十分に当業者の技能の範囲内にあり、必要な場合は、米国特許出願公開２００６０２９２１２５号に記載のイヌモデルなどの適切な動物モデル用いて試験することができる。
【００８２】
さらなる代替実施形態では、１つまたは複数の構築物を左心室と接触させる。さらなる代替実施形態では、１つまたは複数の構築物は心臓全体を覆う。
【００８３】
構築物の複数の小片を含む実施形態では、小片の一部または全部は、心臓を含む領域に接着できる。他の実施形態では、構築物の小片の１つまたは複数は、損傷した心筋層を含まない領域に接着できる。例えば、いくつかの実施形態では、第１の小片は虚血組織を含む領域に接着でき、第２の小片は虚血組織を含まない隣接領域に接着できる。これらの実施形態では、隣接領域は損傷組織または欠損組織を含むことができる。本明細書で使用する「損傷」または「欠損」組織とは、虚血組織を始動させる事象を含むがこれに限定されない内部および／または外部事象により引き起こされ得る組織の異常状態を指す。虚血組織、損傷組織または欠損組織を生じさせ得る他の事象には、疾患、外科手術、環境暴露、傷害、老化、および／またはそれらの組み合わせが含まれる。
【００８４】
培養された３次元組織の複数の小片を含む実施形態では、該構築物の小片を虚血組織に同時に接着させるか、または並行して接着できる。
【００８５】
構築物は、心外膜との接触時に（細胞レベル、パッチ（すなわち、構築物）レベル、もしくはその両方を）収縮できるか、または収縮できない。構築物の収縮は、２つの方法：１）細胞収縮および２）パッチレベルの収縮で説明される。細胞レベルの収縮では、播種された収縮細胞は同期的で、自発的な特徴で収縮するが、３ＤＦＣを動かすことはできず、可視化のために顕微鏡が必要とされる。パッチレベルの収縮は、細胞が組織化され、整列された後に生じ、総レベルでパッチ全体の動きまたは収縮が生じ、可視化のためにいかなる顕微鏡も必要としない。
【００８６】
一実施形態では、構築物上の心筋細胞を患者の生来の心筋に電気的に結合させる。この実施形態は、心室頻拍、および心室細動を含むがこれらに限定されない不整脈を誘発せずに、正常な洞調律でレシピエントを維持することを含むが、これに限定されない心臓内での電気的活動の改善に役立つ。
【００８７】
本方法はさらに、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、および間質細胞由来因子α（ＳＤＦ−Ｌα）を含むがこれらに限定されないサイトカイン類の対象への全身投与を含んでよい。
【００８８】
本明細書に記載の方法および組成物は、様々な医薬の投与および外科手術などの従来の治療と組み合わせて使用できる。例えば、いくつかの実施形態では、培養された３次元組織は、心筋細胞の機能不全によって特徴付けられる障害の治療に使用される１つまたは複数の医薬と共に投与される。本明細書に記載の方法で使用するのに適する医薬には、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、エナラプリル、リシノプリル、およびカプトプリル）、アンジオテンシンＩＩ（Ａ−ＩＩ）受容体遮断薬（例えば、ロサルタンおよびバルサルタン）、利尿薬（例えば、ブメタニド、フロセミド、およびスピロノラクトン）、ジゴキシン、β遮断薬、ならびにネシリチドが含まれる。
【００８９】
さらに、該構築物は、左心室アシスト装置（ＬＶＡＤ）とも称される心臓ポンプ、両心室心臓ペースメーカー、心臓ラップ手術、人工心臓および増強体外式カウンターパルセーション（ＥＥＣＰ）、ならびに心臓ラップ手術を含む、心筋細胞の機能不全によって特徴付けられる障害の治療に使用される他の選択肢と共に使用できる（例えば、米国特許第６，４２５，８５６号、同第６，０８５，７５４号、同第６，５７２，５３３号および同第６，７３０，０１６号を参照されたく、これらの内容は参照により本明細書に援用される）。
【００９０】
いくつかの実施形態では、該構築物は、心臓のラップ手術と組み合わせて使用される。これらの実施形態では、該構築物を送達および／または接着させるために可撓性のパウチまたはジャケットが使用され、該構築物は、損傷したまたは弱った心臓組織の上に配置される前にパウチ内に配置されるかまたは埋設され得る。他の実施形態では、パウチおよび３ＤＦＣは結合できる。例えば、パウチおよび構築物は、伸縮自在の縫糸アセンブリを使用して結合できる。他の実施形態では、該構築物はパウチにフレームワークを結合させるのに有用な糸を含むように構成できる。その内容が参照により本明細書に援用される米国特許第６，４１６，４５９号、同第５，７０２，３４３号、同第６，０７７，２１８号、同第６，１２６，５９０号、同第６，１５５，９７２号、同第６，２４１，６５４号、同第６，４２５，８５６号、同第６，２３０，７１４号、同第６，２４１，６５４号、同第６，１５５，９７２号、同第６，２９３，９０６号、同第６，４２５，８５６号、同第６，０８５，７５４号、同第６，５７２，５３３号および同第６，７３０，０１６号、および米国特許出願公開第２００３／０２２９２６５号、および同第２００３／０２２９２６１号は、該構築物の送達および／または接着に使用できるパウチおよびジャケット、例えば、心臓拘束装置の様々な実施形態について記載している。
【００９１】
いくつかの実施形態では、該構築物に加えて、他の装置がパウチ、例えば、除細動用電極、ジャケットが心臓上で所望の程度の張力で調節された場合を示す張力指示器に取り付けられ、本明細書に記載の方法および組成物に使用される。例えば、米国特許第６，１６９，９２２号および同第６，１７４，２７９号を参照されたく、これらの内容は参照により本明細書に援用される。
【００９２】
いくつかの方法を用いて、該構築物の接着前後に対象における心臓機能の変化を測定することができる。例えば、心エコー図を用いて、心臓がポンピングする能力を決定できる。心拍ごとに左心室から汲み出される血液の割合は、駆出率と呼ばれる。健康な心臓では、駆出率は約６０パーセントである。左心室が活発に収縮できなくなることにより引き起こされる慢性心不全、すなわち、収縮期心不全を有する個人では、駆出率は通常４０パーセント未満である。心不全の重症度および原因に依存して、駆出率は典型的には４０パーセント未満から１５パーセント以下の範囲である。ポンピング機能は正常であるが、心臓が堅い収縮期心不全と拡張期心不全を、心エコー図を用いて区別することもできる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、心エコー図を用いて、該構築物による治療前後の駆出率が比較される。特定の実施形態では、該構築物による治療は、駆出率を３〜５パーセント改善する。他の実施形態では、該構築物による治療は、駆出率を５〜１０パーセント改善する。さらに他の実施形態では、該構築物による治療は駆出率を１０パーセント超改善する。
【００９４】
放射性核種心室造影（ＲＮＶ）またはマルチゲート収集（ＭＵＧＡ）スキャン法などの核スキャンを用いて、拍動ごとに心臓がどれだけ多くの血液をポンピングするかを決定できる。これらの試験は個人の静脈に注入される少量の染料を使用して行われる。特殊なカメラを用いて、心臓を流れている放射性物質を検出する。他の試験にはＸ線および血液検査が含まれる。胸部Ｘ線を用いて、心臓のサイズおよび肺に流体が蓄積しているか否かを決定できる。血液検査を用いて、うっ血性心不全の特異的指標である脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）をチェックできる。ＢＮＰは、心臓が酷使された場合に、心臓により高レベルで分泌される。したがって、血液中のＢＮＰレベルの変化を用いて、治療計画の有効性を監視できる。
【００９５】
さらなる態様では、本発明は、ＣＨＦを治療するためのキットであって、上記に開示された適切な構築物と、該構築物を心臓または臓器に接着させる手段と、を備えたキットを提供する。接着手段には、上記の任意のかかる接着手段、例えば、外科用接着剤の組成物、ヒドロゲル、または予め装着された微小縫合用のプロレン針が含まれ得る。
【００９６】
別の実施形態では、収縮細胞には、未成熟骨格筋細胞、未成熟平滑筋細胞、成熟骨格筋細胞、成熟平滑筋細胞、またはそれらの組み合わせが含まれる。本方法を心筋細胞を用いて実証してきたが、これらは、薬物候補がインビボで機能するかを評価するために有効な薬剤スクリーニング系を提供するために使用することができる収縮細胞の完全な範囲の模範である。この態様では、本方法は、骨格筋組織および／もしくは平滑筋組織の増強、修復、または回復から恩恵を受けることができる全ての障害の治療を含み、障害を治療するのに有効な量で該構築物と障害を有する患者とを接触させることを含み得る。代表的なかかる障害には、神経筋疾患、変性疾患、炎症性疾患、自己免疫性筋疾患、および／または限定されないが外傷などの傷害の任意の形態が含まれるが、これらに限定されず、外傷には、血管障害（末梢動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、動脈瘤など）、呼吸器疾患（慢性閉塞性肺疾患、横隔膜ヘルニア、片側横隔膜ヘルニア（ボホダレク・ヘルニアまたは先天性横隔膜ヘルニアを含み得る）、横隔膜弛緩症など）、ヘルニア（鼠径部、腹部、半月状線、臍帯、ボホダレク、食道裂孔、モルガーニなど）が含まれ、傷害の任意の形態には、鈍力および／もしくは貫通外傷など、またはそのようなものの任意の組み合わせの結果生じ得るスポーツ傷害、熱傷、外傷後の傷、戦争の負傷、筋肉疲労などが含まれ得る。
【００９７】
別の態様では、本発明は、薬物スクリーニングのための方法であって、本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせの構築物と目的の化合物とを接触させ、該構築物の１つまたは複数の特性に対するその化合物の効果を決定することを含む方法を提供する。
【００９８】
この態様では、本発明の構築物は、薬物スクリーニングのために使用できる。本発明者らは、該構築物上での（ｉＰＳＣ由来のものなどの）未成熟心筋細胞の成熟を示した。したがって、本発明の構築物は、組織のような発達およびシグナル伝達を提供する。このことは、医薬品開発企業が可能な限り最も成熟した細胞に対する薬物試験を望むので重要である。現在のｉＰＳＣ（未成熟）心筋細胞は完全な成熟を示さない。発明者らのデータにより、ｉＰＳＣの心筋細胞の標準培養の場合とは対照的に、ｉＰＳＣ心筋細胞が本発明の構築物上で培養されると成熟（すなわち成熟心筋細胞へ成熟）することが示されている。一実施形態では、この態様の方法は、本発明の心筋細胞構築物を用いて使用される。本方法を心筋細胞を用いて実証してきたが、これらは、薬物候補がインビボで機能するかを評価するのに有効な薬剤スクリーニング系を提供するために使用できる収縮細胞の完全な範囲の例である。
【００９９】
この態様では、本方法は、目的の化合物と該構築物とを接触させる前に、構築物の収縮を促進するための条件下で構築物を培養することを含んでよい。この実施形態では、細胞および／またはパッチレベルの収縮（好ましくは、パッチレベルの収縮）が起こるまで、パッチを培養し、次いで、薬物を添加する。パッチの収縮（変位、収縮率／ピーク周波数、同期、割合、速度、活動電位、ビート／縮小パターンなど）を記録し、分析する。一実施形態では、収縮細胞は、長いＱＴなどの固有の遺伝的欠陥を有していてもよい。適切な培養技術は、本開示および実行されるアッセイの本来の目的に基づいて、当業者が決定できる。
【０１００】
さらなる態様では、本発明は、収縮構築物を調製するための方法であって、
（ａ）収縮構築物を生成するための線維芽細胞含を含む３次元足場（３ＤＦＣＳ）の表面上に未成熟収縮細胞を播種することと、
（ｂ）条線を形成する成熟収縮細胞への未成熟収縮細胞の分化を促進する条件下で、収縮構築物を培養することと、
を含む方法を提供する。
【０１０１】
本発明者らは、驚くべきことに、線維芽細胞含有構築物が、形態学的にまたは遺伝子もしくはタンパク質の発現を介して定義されるようなより成熟した細胞への未成熟収縮細胞の成熟を増強／促進し、したがって、例えば、本明細書に記載の治療用調製物の移植または薬物スクリーニングアッセイのために使用できる収縮構築物の調製を大幅に容易にすることを発見した。
【０１０２】
一実施形態では、本明細書で定義されるように、未成熟収縮細胞は未成熟心筋細胞であり、成熟収縮細胞は成熟心筋細胞である。別の実施形態では、未成熟収縮細胞は未成熟平滑筋細胞であり、成熟収縮細胞は成熟平滑筋細胞である。さらなる実施形態では、未成熟収縮細胞は未成熟骨格筋細胞であり、成熟収縮細胞は成熟骨格筋細胞である。
【０１０３】
一実施形態では、収縮細胞は、線維芽細胞と約１：１５〜約６：１、または約１：１０〜約４：１の比で３ＤＦＣＳの表面上に播種される。別の実施形態では、収縮細胞は、線維芽細胞と約１：３〜約１．２：１の比で該構築物の表面上に播種される。様々なさらなる実施形態では、任意の実施形態または実施形態の組み合わせの収縮細胞は、線維芽細胞と比較して、約４:２０〜約１.２：１、約１：４〜約１.２：１、約６：２０〜約１.２：１、約７：２０〜約１.２：１、約２：５〜約１.２：１、約９：２０〜約１.２：１、約１：２〜約１.２：１、約１１：２０〜約１.２：１、約３：５〜約１.２：１、約１３：２０〜１.２：１、約７：１０〜約１.２：１、約３：４〜約１.２：１、約４：５〜約１.２：１、約１７：２０〜約１.２：１、約９：１０〜約１.２：１、約１９：２０〜約１.２：１、約１：１〜約１.２：１の比で該構築物の表面上に播種される。
【０１０４】
一実施形態では、収縮細胞は、１．３×１０５細胞／ｃｍ２〜２．９５×１０６細胞／ｃｍ２または２×１０５細胞／ｃｍ２〜２．９５×１０６細胞／ｃｍ２の密度で該構築物の表面上に播種される。別の実施形態では、収縮細胞は、２×１０６細胞／ｃｍ２〜２．５×１０６細胞／ｃｍ２の密度で該構築物の表面上に播種される。様々なさらなる実施形態では、収縮細胞は、２×１０６細胞／ｃｍ２〜２．９５×１０６細胞／ｃｍ２；５×１０５細胞／ｃｍ２〜２．９５×１０６細胞／ｃｍ２；１×１０６細胞／ｃｍ２〜２．９５×１０６細胞／ｃｍ２；１．５×１０６細胞／ｃｍ２〜２．９５×１０６細胞／ｃｍ２；１．３×１０５細胞／ｃｍ２〜２．５×１０６細胞／ｃｍ２；または１．３×１０５細胞／ｃｍ２〜２×１０６細胞／ｃｍ２の密度で該構築物の表面上に播種される。
【０１０５】
さらなる実施形態では、収縮細胞は、未成熟収縮細胞と成熟収縮細胞の組み合わせを含む。このような一実施形態では、未成熟収縮細胞および成熟収縮細胞は、約１：２〜約２：１の比で構築物表面上に存在する。他の実施形態では、この比率は約１：１〜約２：１；または約１：１〜約１：２である。
【０１０６】
一実施形態では、収縮細胞は未成熟心筋細胞を含む。別の実施形態では、収縮細胞は成熟心筋細胞を含む。一実施形態では、未成熟心筋細胞および／または成熟心筋細胞は、１．３×１０５細胞／ｃｍ２〜２．７×１０６細胞／ｃｍ２の密度で該構築物の表面上に播種され、収縮細胞は、３ＤＦＣＳ上の線維芽細胞と共に約１：７〜約３：１の比で３ＤＦＣＳの表面上に播種される。別の実施形態では、未成熟心筋細胞および／または成熟心筋細胞は、２．９×１０５細胞／ｃｍ２〜２．３×１０６細胞／ｃｍ２の総密度で構築物の表面上に播種される。様々な実施形態では、該構築物は、治療で使用するための心筋細胞を２．９×１０５細胞／ｃｍ２、１．２×１０６細胞／ｃｍ２または２．３×１０６細胞／ｃｍ２の用量範囲で含む。心筋細胞集団は、１００％の成熟心筋細胞もしくは１００％の未成熟心筋細胞、５０％の成熟心筋細胞および５０％の未成熟心筋細胞、またはそれらの任意の適切な変化率であり得る。
【０１０７】
別の実施形態では、収縮細胞は平滑筋細胞を含む。このような一実施形態では、平滑筋細胞は、１．３×１０５細胞／ｃｍ２〜２．９５×１０６細胞／ｃｍ２の密度で該構築物の表面上に播種され、収縮細胞は、３ＤＦＣＳ上の線維芽細胞と共に約１：１５〜約３．５：１の比で３ＤＦＣＳの表面上に播種される。様々な実施形態では、平滑筋細胞は、３ＤＦＣＳ上の線維芽細胞と共に約１：１５〜３．５：１；１：１５〜１．７：１；１：６〜３．５：１；１．６〜１．５：１；または１：１．７〜１．５：１の比で３ＤＦＣＳの表面上に播種される。
【０１０８】
様々なさらなる実施形態では、平滑筋細胞は、１．３×１０５細胞／ｃｍ２〜２．９４×１０６細胞／ｃｍ２；１．２×１０６細胞／ｃｍ２〜２．９４×１０６細胞／ｃｍ２；１．３×１０５細胞／ｃｍ２〜１．２×１０６細胞／ｃｍ２；または１．０×１０６細胞／ｃｍ２〜１．２×１０６細胞／ｃｍ２の密度で該構築物の表面上に播種される。別の実施形態では、平滑筋細胞は、１．０×１０６細胞／ｃｍ２〜１．２×１０６細胞／ｃｍ２の密度で該構築物の表面上に播種され、平滑筋細胞は、３ＤＦＣＳ上の線維芽細胞と共に約１：１．７〜約１．５：１の比で３ＤＦＣＳの表面上に存在する。
【０１０９】
さらなる実施形態では、収縮細胞は骨格筋細胞を含む。このような一実施形態では、骨格筋細胞は、１．３×１０５細胞／ｃｍ２〜２．９５×１０６細胞／ｃｍ２の密度で該構築物の表面上に播種され、骨格筋細胞は、３ＤＦＣＳ上の線維芽細胞と共に約１：１５〜約３．５：１の比で３ＤＦＣＳの表面上に播種される。様々な実施形態では、骨格筋細胞は、３ＤＦＣＳ上の線維芽細胞と共に約１：１５〜３．５：１；１：１５〜１．７：１；１：６〜３．５：１；１．６〜１．５：１；または１：１．７〜１．５：１の比で３ＤＦＣＳの表面上に播種される。様々なさらなる実施形態では、骨格筋細胞は、１．３×１０５細胞／ｃｍ２〜２．９４×１０６細胞／ｃｍ２；１．２×１０６細胞／ｃｍ２〜２．９４×１０６細胞／ｃｍ２；１．３×１０５細胞／ｃｍ２〜１．２×１０６細胞／ｃｍ２；または１．０×１０６細胞／ｃｍ２〜１．２×１０６細胞／ｃｍ２の密度で該構築物の表面上に播種される。別の実施形態では、骨格筋細胞は、１．０×１０５細胞／ｃｍ２〜１．２×１０６細胞／ｃｍ２の密度で該構築物の表面上に播種され、骨格筋細胞は、３ＤＦＣＳ上の線維芽細胞と共に約１：１．７〜約１．５：１の比で３ＤＦＣＳの表面上に存在する。
【０１１０】
適切な培養条件は、未成熟心筋細胞が３ＤＦＣ上で培養される限り、当業者が決定することができる。ウシ胎児血清（５〜１５％、好ましくは１０％）ならびに（重炭酸ナトリウムおよび抗生物質を含むがこれらに限定されない）他の適切な因子を補充したＤＭＥＭ−ＬＧを含むが、これらに限定されない任意の有用な培地を使用してよい。
【０１１１】
培養した３ＤＦＣと３ＤＦＣ上に播種される収縮細胞との接触は、細胞を３ＤＦＣに接触させる力の適用を促進する任意の適切な条件下で行うことができる。一実施形態では、３ＤＦＣが培地に配置され、細胞が懸濁液に導入されると、細胞懸濁液の量は、３ＤＦＣが配置される培地の約２倍量になる。本明細書中の任意の他の実施形態と組み合わせることができる１つの代替実施形態では、接触は約３７℃で生じる。細胞密度および３ＤＦＣ上の線維芽細胞との比率は、本明細書に記載されているようなものである。
【０１１２】
一実施形態では、播種されるそれぞれの３ＤＦＣを、ウェルの底を覆い、水平に横たわるようにウェル内に配置する。前記細胞を３ＤＦＣに接触させる力に細胞懸濁液内の細胞を供することは、遠心力および電界によって発生する電気力、またはそのような力の組み合わせを含むが、これらに限定されない任意の適切な力の使用を含んでよい。代替実施形態では、遠心力が使用される。適用される遠心力は、３ＤＦＣ上に播種される細胞型などの様々な要因に依存する。本明細書中の任意の他の実施形態と組み合わせることができる１つの代替実施形態では、該構築物を、２〜１０分間、１２００ｒｐｍ〜１６００ｒｐｍで遠心分離する。代替の実施形態では、播種される全ての３ＤＦＣ構築物をウェル内に水平配置で（垂直ではなく）配置し、その結果、各ウェルを同一半径で回転させる。
【０１１３】
一実施形態では、培地は生体異物を含まない。例えば、該構築物は、３７℃、５％ＣＯ２で維持することができる。培地は、２４時間が好適であるが、１０〜４８時間ごとに変えることができる。播種および培養は、全ての組織培養試験済みの３５ｍｍ２、６５ｍｍ２、１００ｍｍ２などの「オープントップ」の培養皿または９６、２４、または６などの形式のウェルプレートの中で行うことができる。プレート／皿は、低密着性であっても、高密着性であってもよい。収縮細胞は、３ＤＦＣ上に播種し、共培養することができ、凍結保存したものと、（組織から）または組織培養調製物から新たに単離したものとの間で差異が生じる。凍結保存した細胞、組織または生存組織培養細胞から新たに単離した細胞は、任意の適切な技術によって３ＤＦＣ上に直接播種することができる。パッチは、該構築物の使用目的に最も適するように、任意の適切な期間培養できる。一実施形態では、該構築物は移植のために使用され、培養は１４〜２４０時間行われ、様々なさらなる実施形態では、培養は、移植前に１４〜１２０時間、１４〜３６時間、１４〜４８時間、１４〜２２時間、２４〜２４０時間、２４〜１２０時間、２４〜７２時間、２４〜４８時間、４８〜２４０時間、４８〜１２０時間、４８〜７２、１４〜２２時間、１８〜２２時間、４８時間未満、２４時間未満、２０時間未満、１６時間未満、または１４時間未満行われる。
【０１１４】
さらなる実施形態では、本方法は、それを必要とする対象への収縮構築物の移植をさらに含む。一実施形態では、該構築物は、移植時に細胞レベルまたはパッチレベルの収縮を示さない。この実施形態では、移植は、構築物上に細胞が接着した後であるが、細胞またはパッチレベルの収縮のいずれかの収縮開始前に行われ、その結果、心臓は細胞の配置および結合を促進し、不整脈を制限する。別の実施形態では、該構築物は、細胞レベルおよび／または構築物レベルの収縮が示された後に移植される。
【０１１５】
播種されたパッチは、典型的には、４８時間以内にパッチの表面を横切って細胞レベルの収縮を開始し、これらの収縮は、基礎となる３ＤＦＣが約７２時間後に（ビデオにより）視覚的に収縮するのを観察できる完全な「パッチ」の収縮に発展する。しかし、（凍結保存細胞などの）特定の細胞源は、細胞レベルの収縮が検出される前に、さらなる培養時間を必要とする場合もある。ビクリルメッシュが加水分解して崩壊し始めるので、構築物は、約１０日間培養することができる。
【０１１６】
移植すると、本発明の方法を本明細書に開示されたものと同様に実行できる。例えば、未成熟収縮細胞が未成熟心筋細胞であり、成熟収縮細胞が成熟心筋細胞である場合に、移植は、障害を治療するのに有効な量の収縮構築物と、かかる障害に罹患している対象の心臓とを接触させることを含む。この実施形態では、障害には、虚血誘発性心不全、慢性心不全（ＣＨＦ）、心不全を伴わない虚血、心筋症、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、心停止、うっ血性心不全、安定狭心症、不安定狭心症、心筋梗塞、冠動脈疾患、心臓弁膜症、虚血性心疾患、駆出率の低下、心筋灌流の低下、不適応な心臓リモデリング、不適応な左心室リモデリング、左心室機能の低下、左心不全、右心不全、後方不全、前方不全、収縮機能障害、拡張機能障害、全身血管抵抗の増加または減少、低拍出性心不全、高拍出性心不全、労作時呼吸困難、安静時呼吸困難、起座呼吸、頻呼吸、発作性夜間呼吸困難、めまい、精神錯乱、安静時の四肢の冷え、運動不耐性、易疲労感、末梢浮腫、夜間頻尿、腹水、肝腫大、肺水腫、チアノーゼ、心尖拍動の側方移動、奔馬調律、心雑音、傍胸骨拍動、および胸水が含まれ得るが、これらに限定されない。上記に開示されるような治療法の全ての他の実施形態を、本発明のこの態様に使用できる。
【０１１７】
別の実施形態では、本方法は、収縮構築物と目的の化合物とを接触させ、構築物の１つまたは複数の特性に対する化合物の効果を決定することをさらに含む。この薬剤スクリーニングの実施形態は上述されており、その中で開示される全ての実施形態は、本実施形態と共に使用できる。例えば、本方法は、目的の化合物と該構築物とを接触させる前に、構築物の収縮を促進する条件下で、該構築物を培養することを含んでよい。別の実施形態では、収縮変位、収縮率、収縮同期性、および収縮速度のうちの１つまたは複数に対する化合物の効果が決定される。
【０１１８】
実施例
パッチの製造
播種方法
簡単に説明すると、懸濁液中の細胞に遠心力を適用する。３次元線維芽細胞構築物（３ＤＦＣ）の表面上に細胞を押しやる／強いると、細胞をランダムだが均一に分布できる。ベースの構築物（３ＤＦＣ）が細胞の移植および配置のための支持体ならびに適切な要件を提供すると、収縮力が生じる。最終「生成物」は、線維芽細胞が埋め込まれ、収縮細胞集団、この調製ではｉＰＳＣ由来の（「未成熟」）心筋細胞が播種された分解性メッシュである。
【０１１９】
播種密度
誘導性ヒト多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の播種密度は、０.３×１０６細胞／ｃｍ２〜２．４×１０６細胞／ｃｍ２の範囲であり、１．２×１０６細胞／ｃｍ２が理想である。
【０１２０】
細胞間の比率
心臓パッチ用の出発材料は、ヒト皮膚線維芽細胞が埋め込まれた合成ビクリルメッシュを含む３ＤＦＣである。線維芽細胞は血管新生を示し、したがって、心臓への移植後、播種されたｉＰＳＣ由来の心筋細胞集団に栄養サポートを提供する。発明者らのデータは、細胞比（皮膚線維芽細胞に対するｉＰＳＣ由来の心筋細胞）が３：２０〜１．２：１の範囲であり、１．２：２が理想であることを示している。
【０１２１】
発明者らは、移植されたパッチの安定性および結合を調べるために、心臓を電気的マッピングする方法を開発した。（ＤＭＥＭ中１０％ＦＢＳ、３７℃、５％ＣＯ２で維持される）共培養後５日目の組織培養中のラット新生児心筋細胞（ＮＣＭ）−３ＤＦＣにて電気的活性化マッピングを行った。培地を２４時間ごとに変え、カスタム設計したマルチ電極アレイ（ＭＥＡ）を使用して、間隔を５００μｍ開けた１８か所の記録部位で記録した（図１Ａ）。１０個の電極から記録を行い、各記録部位は、チャネル１〜１０として順番に番号を付けた（図１Ｂ）。パッチの電気的活性化は、７秒間隔で示され、各個別チャネルについてピークの横方向導通電圧を表示する一貫性のある心拍間の活性化を示した（図１Ｃ）。全チャネルが心拍間シーケンス（図１Ｄ）で、単一活性化（図１Ｅ）中に重なったことを振幅が示している。振幅を０.０３〜０.４２および−０.１３〜−０.７５ｍＶとして記録した（図１ＤおよびＥ）。これらの結果は、ＮＣＭ−３ＤＦＣが電気的に安定であり（図１）、移植された場合に不整脈を誘発する可能性が低いことを実証する。
【０１２２】
発明者らが線維芽細胞パッチ上に播種したヒトｉＰＳＣの評価を行ったところ、Ｒ波振幅に関して改善の傾向が示される。発明者らは、パッチ作製後１８±４時間の時点で移植したヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞（ｈｉＰＳＣ−ＣＭ）を用いて完全な機能研究を行った。胸骨傍短軸および長軸における画像を用いて心エコー検査を行い、介入後３週目および６週目に専用のげっ歯類心エコー検査システム（Ｖｅｖｏ２１００）を用いて前方壁、側方壁、前外側壁、下壁および後壁を評価し、ＬＶ収縮期および拡張期の機能、すなわち、僧帽弁流入パターンを定義し、ＬＶ機能解析のためのＭモード、および心臓拡張期（前方ＬＶ壁）における心筋組織の動きの定量化用の組織ドップラーを用いて、機能を評価した。データを図１に示す。
【０１２３】
【表１】
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【０１２４】
このデータは、ＥＦが１３％、組織ドプラパラメータＥ’が２３％、Ｅ’／ａ’が３３％（ｐ＜０．０５）と増加し、ＥＤＰが４７％、Ｔａｕが１８％、Ｅ／ｅ’が２３％（ｐ＜０．０５）と減少することによって、ｈｉＰＳＣ−ＣＭ−３ＤＦＣが移植後３週目にＬＶ機能を改善することを示す。受動圧と容積の関係は、ｈｉＰＳＣ−ＣＭ−３ＤＦＣパッチ治療により、正常に向かう圧力軸に向かう左シフトを示す。これらのデータは、動作ＬＶＥＤＰの減少に関してＬＶの受動的充満および室内剛性の向上ならびに血行動態に示される改善を支持する。３ＤＦＣの単独移植では、機能的改善は観察されなかった。
【０１２５】
電気的な結合を行い、ピーク電圧振幅および伝導速度により評価した（図３）。３ＤＦＣに播種したヒトｉＰＳＣは、電圧に関して改善の傾向を示した（図２）。電圧を評価するために、ａ）ブラックボックスで示される目的領域について、播種したパッチ有する慢性心不全（ＣＨＦ）ラットモデルにおけるペーシング活性化マップを作成した（図２ａ）。ｂ）位置「Ｐ」におけるペーシング電極の導入中に心外膜表面から取った心電図は、キャプチャの成功を示す（図２ｂ）。３２箇所での７２回の収縮を介してコンパイルされた活性化時間についての９個の異なる活性化マップのデータを提供する（図２ｃ）。作成された複数のマップは、活性化時間（ミリ秒）および振幅（ｍＶ）の測定に一貫性を示した。これらの結果は、Ｒ波振幅および電圧の改善に関するこれらの結果は、パッチ上に播種された細胞が興奮性で、心臓組織と電気機械的に結合することを示すので重要である。
【０１２６】
ヒトｉＰＳＣ由来の心筋細胞を播種したパッチは、同期化形式で生成された力で自発的に拍動し、電気的にペーシングでき、かつ容易に移植できる。
【０１２７】
ヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞（赤色染色）を線維芽細胞の構築物上に播種し、共培養した（図３）。ビクリル繊維が、ネットのようなメッシュの織物として観察され得る。深紅色蛍光は埋め込まれた線維芽細胞である。これらの細胞は、局所的に播種され、パッチまたは埋め込まれた線維芽細胞に浸透しない。これらのパッチは、播種後すぐに自発的で、同期的な収縮を開始した。遠心力を用いてランダムに細胞を播種した。
【０１２８】
パッチの収縮は、２つの方法：１）細胞収縮および２）パッチレベルの収縮で説明される。細胞レベルの収縮では、播種した収縮細胞は同期的で、自発的な特徴で収縮しているが、３ＤＦＣを動かすことはできず、可視化のために顕微鏡が必要とされる。パッチレベルの収縮は、細胞が組織化され、整列された後に生じ、総レベルでパッチ全体の動きまたは収縮が生じ、可視化のためにいかなる顕微鏡も必要としない。播種されたパッチは、４８時間以内にパッチの表面を横切って細胞レベルの収縮を開始し、これらの収縮は、基礎となる３ＤＦＣが約７２時間後に視覚的に収縮するのを観察できる完全な「パッチ」の収縮に発展する。ビクリルメッシュが加水分解して崩壊し始めるので、パッチは約１０日間培養することができる。１０日間の培養後に、これらのパッチは構造的完全性を失う。
【０１２９】
図４に示すように、線維芽細胞パッチ上に播種した場合に、ヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞は、力応答を起こした。データは、培養後５日目に、それぞれ２×１０６細胞（１．２×１０６細胞／ｃｍ２）を播種した線維芽細胞パッチからのものである。熱制御および灌流機能を有する小型の無傷繊維試験装置（Ａｕｒｏｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社−モデル８０１Ｃ）を用いて力測定を行った。記載したようにパッチを作製し、１〜６日間培養した。次いで、パッチを約２ｍｍ×１７ｍｍの切片にトリミングし、力変換器に取り付けた。力の実験の間、トランスデューサウェルおよび灌流液の両方を３７℃で維持した。静止張力は力発生を獲得する前に達成された。力発生は、これは、ｉＰＳＣ由来の心筋細胞が整列し、一斉に収縮し、その結果生じた機能改善に潜在的に役立ち得ることを示す。
【０１３０】
病態生理学的に虚血誘発されたＣＨＦは、前部および前外側の薄型化に加えて、心拍出量を維持するための補償手段として、ＬＶの拡張によって示される。これらの領域には、組織の虚血の性質に起因して生存可能な心筋細胞が比較的存在せず、心筋の収縮性および性能が低下する。ＣＨＦに関連する細胞ベースの組織工学などの治療方針は、生存可能な心筋細胞で梗塞領域を再構築するために外因性、内因性、またはそれらの組み合わせによる細胞置換を含んでよい。図５に示すように、ｈｉＰＳＣ−ＣＭ−３ＤＦＣは、梗塞領域への心筋細胞の交換を容易にするのに役立つ。
【０１３１】
治療または様々なインビトロアッセイのための心筋細胞の成熟が重要であり得る。治療的には、心筋細胞の成熟は力発生の促進およびＬＶ機能のより良好な回復に役立ち得る一方で、より大きな組織、したがって、代表となる生理的なインビトロアッセイを提供する。ｈｉＰＳＣの成熟を、線維芽細胞の構築物（３ＤＦＣ）上での培養後に評価した（図６）。標準的な組織培養における２日目（Ａ）対６日目（Ｂ）のヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞（ｈｉＰＳＣ−ＣＭ）のトリクローム染色。２日および６日の両方の培養で、全ての細胞が筋肉について陽性に染色される。培養６日後、ｈｉＰＳＣ−ＣＭが拡大した。線維芽細胞パッチ上に播種した場合に、２日目（ＣおよびＥ）には、ｈｉＰＳＣ−ＣＭのサイズは小さいままであるが、６日目（ＤおよびＦ）までにｈｉＰＳＣ−ＣＭは、条線が明確に存在する無傷の層へと発達したことにより、線維芽細胞のパッチは、インビトロでのｈｉＰＳＣ−ＣＭの成熟を可能にする構造的支持を提供することが示唆される。
【０１３２】
さらに、内因性手段、細胞移植または２つの組み合わせによるｈｉＰＳＣ−ＣＭパッチの移植によって、前壁の厚さが増加し、生存心筋が増加することが示される（図７）。
【０１３３】
ヒトｉＰＳＣ由来の心筋細胞パッチで治療したＣＨＦのリアルタイムＰＣＲを介してｍＲＮＡの発現を評価した。このデータは、ｈｉＰＳＣ由来の心筋細胞の心臓パッチが、ＬＶ心臓組織におけるアンジオポエチン１（ＡＮＧ−１）、コネキシン４３（Ｃｘ４３）、および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のｍＲＮＡ発現レベルを増加させることを示す（表２）。３ＤＦＣ単独は、ＶＥＧＦおよびＡＮＧ−１の発現を顕著に増加させないが、ｈｉＰＳＣ−ＣＭ−３ＤＦＣの送達は、用量依存的な発現の増加をもたらす。ＶＥＧＦおよびＡＮＧ−１の発現は、組織再生の内因性の栄養サポートを提供することができる微小血管形成に関する機構的貢献者であり得る。さらに、Ｃｘ４３発現は、ＬＶの心筋細胞再増殖および機能の回復の確認となり得る。
【０１３４】
【表２】
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参考文献
1.  Thai, H. M., Juneman, E., Lancaster, J., Hagerty, T., Do, R., Castellano, L., Kellar, R., Williams, S., Sethi, G., Schmelz, M., Gaballa, M., & Goldman, S. (2009). Implantation of a three-dimensional fibroblast matrix improves left ventricular function and blood flow after acute myocardial infarction. Cell Transplant., 18(3), 283-295. PMC2739416:PM19558777. doi:10.3727/096368909788535004
2.   Lancaster, J., Juneman, E., Hagerty, T., Do, R., Hicks, M., Meltzer, K., Standley, P., Gaballa, M., Kellar, R., Goldman, S., & Thai, H. (2010). Viable fibroblast matrix patch induces angiogenesis and increases myocardial blood flow in heart failure after myocardial infarction. Tissue Eng.Part A., 16(10), 3065-3073. PM20486785. doi:10.1089/ten.TEA.2009.0589
3.  Lancaster, J. J., Arnce, S. A., Johnson, N. M., Juneman, E. B., Thai, H. M., Kellar, R. S., Vitorin, J. E., Burt, J. M., Bahl, J. J., & Goldman, S. (2010). In vivo evaluation of a biologically active cardiomyocyte seeded scaffold to treat chronic heart failure. [abstract]. Paper presented at the Heart Failure Society of America: 14th Annual Scientific Meeting, San Diego,CA. , 16(8) S45. doi:10.1016/j.cardfail.2010.06.155
4.  Lancaster, J. J., Arnce, S. A., Johnson, N. M., Juneman, E. B., Thai, H. M., Kellar, R. S., Vitorin, J. E., Burt, J. M., Gaballa, M. A., Bahl, J. J., & Goldman, S. Tissue engineered scaffold seeded with cardiomyocytes improves cardiac function in rats with chronic ischemic heart failure disease. (Journal of Heart and Lung Transplantation).
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年4月24日(2019.4.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
別の実施形態では、収縮細胞は、成熟心筋細胞を含む。本明細書で使用する「成熟心筋細胞」は、観察可能なサルコメアを有する。様々な実施形態では、「成熟心筋細胞」と比較して、未成熟心筋細胞は、以下の特性のうちの１つまたは複数を有する：
・形態学的に小さい細胞サイズ；
・筋原繊維密度の減少；
・電気生理学的に抑えられ／減少した活動電位振幅；
・ＭＹＨ７（ベータミオシン重鎖）、ＭＹＨ６（アルファミオシン重鎖）、ＳＣＮ５Ａ、ＧＪＡ１（コネキシン４３）、ＨＣＮ４（過分極活性化Ｋ＋チャネル）、ＫＣＮＪ２（内向き整流性カリウムイオンチャネル）、ＳＥＲＣＡ２ａ（サルコ／小胞体ＡＴＰアーゼ）、アルファアクチニン、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）の遺伝子および／またはタンパク質の発現の減少。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
収縮構築物を調製するための方法であって、
（ａ）線維芽細胞含を含む３次元足場（３ＤＦＣＳ）の表面上に未成熟細胞を播種して、収縮構築物を生成することと、
（ｂ）成熟細胞への前記未成熟細胞の分化を促進する条件下で前記構築物を培養することと、
を含み、前記未成熟細胞は多能性細胞、骨格前駆細胞、平滑筋前駆細胞、分化した骨格筋細胞、および分化した平滑筋細胞から選択され、前記成熟細胞は収縮することができる、方法。
【請求項２】
前記収縮構築物が約１４〜２４０時間培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記収縮構築物が４８時間未満培養される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記収縮構築物が約１４〜３６時間培養される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、前記構築物と目的の化合物とを接触させることと、前記構築物の１つまたは複数の特徴に対する前記化合物の効果を決定することと、をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、前記構築物と前記目的の化合物とを接触させる前に、または前記構築物と前記目的の化合物とを接触させている間に、前記構築物の収縮を促進する条件下で前記収縮構築物を培養することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
収縮変位、収縮率、収縮同期性、および収縮速度のうちの１つまたは複数に対する前記化合物の効果が決定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
線維芽細胞を含む３次元足場（３ＤＦＣＳ）の表面に接着した筋細胞もしくはその前駆細胞または多能性細胞を含む構築物であって、
前記筋細胞は、１．３×１０５細胞／ｃｍ２〜２．９５×１０６細胞／ｃｍ２の密度で前記構築物の表面上に播種され、前記３ＤＦＣＳ上の線維芽細胞と共に約１：１５〜約６：１の比で前記３ＤＦＣＳの表面上に存在する、
構築物。
【請求項９】
前記細胞が、ＣＤ４０および／またはＨＬＡの発現を低減または排除するように操作されている、請求項８に記載の構築物。
【請求項１０】
血管前駆細胞をさらに含む、請求項８または９に記載の構築物。
【請求項１１】
それを必要とする対象に移植するための、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項１２】
細胞収縮および／またはパッチレベルの収縮の開始前に移植される、請求項１１に記載の構築物。
【請求項１３】
パッチレベルの収縮の開始後に移植される、請求項１１に記載の構築物。
【請求項１４】
前記方法が、チモシンβ−４（ＴＢ４）、ａｋｔマウス胸腺腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ΑΚΤ１）、間質細胞由来因子−１アルファ（ＳＤＦ−１）、および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のうちの１つまたは複数と前記対象の心臓とを接触させることをさらに含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項１５】
薬物スクリーニングのための方法であって、目的の化合物と請求項８〜１４のいずれか一項に記載の構築物とを接触させることと、前記構築物の１つまたは複数の特徴に対する前記化合物の効果を決定することと、を含む方法。
【請求項１６】
前記方法が、前記構築物と前記目的の化合物とを接触させる前に、または前記構築物と前記目的の化合物とを接触させている間に、前記構築物の収縮を促進する条件下で前記構築物を培養することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
収縮変位、収縮率、収縮同期性、および収縮速度のうちの１つまたは複数に対する前記化合物の効果が決定される、請求項１６に記載の方法。