(57)【要約】      （修正有）【課題】肝臓毒性または腎不全などの重症な有害な副作用を誘発しない有効用量で免疫調節剤が投与されるワクチンに基づく免疫療法レジメンの提供。【解決手段】（ａ）単離免疫原性ＰＡＡポリペプチド、（ｂ）免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている単離核酸分子、（ｃ）免疫原性ＰＡＡポリペプチドまたは免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている単離核酸分子を含むワクチン組成物、（ｄ）ポリペプチド、核酸分子、および組成物の使用に関する方法、ならびに（ｅ）免疫抑制性細胞阻害剤および免疫エフェクター細胞賦活剤と組み合わせたワクチンの同時投与を含む、ワクチンに基づく免疫療法レジメンを提供する。【選択図】図１
2019054804.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている二重抗原構築体であって、２つの免疫原性ＰＡＡポリペプチドがそれぞれ、
（ａ）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列および免疫原性ＰＳＣＡポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、ならびに
（ｂ）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列および免疫原性ＰＳＡポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列
の２つのヌクレオチド配列によってコードされており、
（１）免疫原性ＰＳＡポリペプチドが配列番号１７のアミノ酸４〜２４０を含み、
（２）免疫原性ＰＳＣＡポリペプチドが配列番号２１のアミノ酸４〜１２３または配列番号２１のアミノ酸配列を含み、
（３）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドが、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸１５〜７５０を含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｖ）配列番号９のアミノ酸４〜７３９を含むポリペプチド、
（ｖｉ）配列番号３のアミノ酸４〜７３９を含むポリペプチド、
（ｖｉｉ）配列番号５のアミノ酸４〜７３９を含むポリペプチド、
（ｖｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸４〜７３９を含むポリペプチド、および
（ｉｘ）配列番号９のアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、二重抗原構築体。
【請求項２】
免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドが配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の二重抗原構築体。
【請求項３】
免疫原性ＰＳＣＡポリペプチドが配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の二重抗原構築体。
【請求項４】
免疫原性ＰＳＡポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列が配列番号１８に記載のヌクレオチド配列であり、免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列が配列番号１０に記載のヌクレオチド配列である、請求項３に記載の二重抗原構築体。
【請求項５】
（ａ）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、および
（ｂ）免疫原性ＰＳＣＡポリペプチドまたは免疫原性ＰＳＡポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列
の間に位置するＩＲＥＳ配列をさらに含む、請求項３に記載の二重抗原構築体。
【請求項６】
（ａ）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、および
（ｂ）免疫原性ＰＳＣＡポリペプチドまたは免疫原性ＰＳＡポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列
の間に位置する２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３に記載の二重抗原構築体。
【請求項７】
２ＡペプチドがＴ２ＡペプチドまたはＦ２Ａペプチドである、請求項６に記載の二重抗原構築体。
【請求項８】
（１）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、および
（２）免疫原性ＰＳＣＡポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列
を含む、請求項６に記載の二重抗原構築体。
【請求項９】
２ＡペプチドがＦ２Ａペプチドである、請求項８に記載の二重抗原構築体。
【請求項１０】
（１）配列番号２６、２７、２８もしくは２９のヌクレオチド配列、または
（２）配列番号２６、２７、２８もしくは２９のヌクレオチド配列の縮重変異体
を含む、請求項１に記載の二重抗原構築体。
【請求項１１】
（１）配列番号３０もしくは３１のヌクレオチド配列、または
（２）配列番号３０もしくは３１のヌクレオチド配列の縮重変異体
を含む、請求項１に記載の二重抗原構築体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の二重抗原構築体を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターを含む組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の二重抗原構築体を含む組成物。
【請求項１５】
添加剤をさらに含む、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ワクチン組成物である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
アジュバントをさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
哺乳動物における新生物性障害の処置に使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の二重抗原構築体、または請求項１２に記載のベクター。
【請求項１９】
哺乳動物における前立腺関連抗原（ＰＡＡ）に対する免疫応答の誘発に使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の二重抗原構築体、または請求項１２に記載のベクター。
【請求項２０】
ヒトにおける前立腺癌の処置に使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の二重抗原構築体、または請求項１２に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている、２０１２年５月４日に出願の米国仮出願第６１／６４２，８４４号の優先権を主張するものである。
【０００２】
配列表の参照
本出願は電子フォーマットの配列表と共に提出されている。配列表は、２０１３年４月４日に作成され、２５７ＫＢのサイズを有する、表題「ＰＣ７１８５４Ａ  ＳＥＱ  ＬＩＳＴＩＮＧ＿ＳＴ２５．ＴＸＴ」のファイルとして．ｔｘｔフォーマットで提供されている。．ｔｘｔファイル中に含有される配列表は明細書の一部であり、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている。
【０００３】
本発明は、一般に免疫療法に関し、より詳細には、新生物性障害を処置または予防するためのワクチンおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
がんは世界中で主な死亡原因である。がん管理の伝統的なレジメンは、循環がんおよび固形がんの選択的な群の管理に成功している。しかし、多くの腫瘍は伝統的な手法に対して耐性がある。近年、がんを処置するための免疫療法が調査されており、これは、腫瘍から遠位の部位でワクチン組成物を投与することによる、宿主由来の活性のある全身性腫瘍特異的免疫応答の発生を含む。単離した腫瘍関連抗原を含有するものを含めた、様々な種類のワクチンが提案されている。
【０００５】
前立腺がんは２番目に一般的に診断されているがんであり、世界中の先進国における男性のがん関連死の第四位の原因である。前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、および前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）などの様々な前立腺関連抗原（ＰＡＡ）は、その正常な対応物と比較して、前立腺がん細胞によって過剰発現されることが示されている。したがって、これらの抗原は、ワクチンに基づく免疫療法の使用を介した、抗原を発現するがんに対する特異的免疫応答を誘導させるための可能な標的を表す。（たとえばＭａｒｒａｒｉ，Ａ．、Ｍ．ｌｅｒｏら（２００７）．「Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．」Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ｌｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、５６（４）：４２９〜４５を参照。）
【０００６】
ＰＳＣＡはアミノ酸１２３個の膜タンパク質である。完全長ヒトＰＳＣＡのアミノ酸配列は配列番号２１のアミノ酸４〜１２３からなる。ＰＳＣＡは高い組織特異性を有しており、前立腺がん検体の８５％を超えるもので発現されており、より高いグリーソンスコアおよびアンドロゲン非依存性に伴って発現レベルは増加する。ＰＳＣＡは前立腺がん患者の骨転移の８０〜１００％で発現されている。
【０００７】
ＰＳＡは、前立腺の腺房および管を裏打ちする円柱上皮細胞によって排他的に産生される、カリクレイン様セリンプロテアーゼである。ＰＳＡ  ｍＲＮＡは、不活性なアミノ酸２６１個のプレプロＰＳＡ前駆体として翻訳される。プレプロＰＳＡは、前領域（シグナルポリペプチド）およびプロポリペプチドを構成する２４個のさらなる残基を有する。プロポリペプチドの放出はアミノ酸２３７個の成熟した細胞外形をもたらし、これは酵素活性がある。ヒト完全長ＰＳＡのアミノ酸配列を配列番号１５に提供する。ＰＳＡは臓器特異的であり、その結果、これは良性前立腺肥大（ＢＰＨ）組織、原発性前立腺がん組織、および転移性前立腺がん組織の上皮細胞によって産生される。
【０００８】
葉酸加水分解酵素１（ＦＯＬＨ１）としても知られるＰＳＭＡは、７５０個のアミノ酸から構成される。ヒト完全長ＰＳＭＡのアミノ酸配列を配列番号１に提供する。ＰＳＭＡには細胞質ドメイン（アミノ酸１〜１９）、膜貫通ドメイン（アミノ酸２０〜４３）、および細胞外ドメイン（アミノ酸４４〜７５０）が含まれる。ＰＳＭＡは、前立腺がん細胞の表面上および新生血管構造上で発現されるＩＩ型二量体膜貫通タンパク質である。また、これは正常な前立腺細胞、脳、唾液腺および胆樹上でも発現される。しかし、前立腺がん細胞中では、これは正常組織よりも１０００倍高いレベルで発現されることが見出された。これは、結腸、乳房、肝臓、膀胱、膵臓、肺、腎臓がんなどの様々な他の固形腫瘍ならびに黒色腫および肉腫の新生血管構造上で豊富に発現される。したがって、ＰＳＭＡは、前立腺がん細胞のみに特異的な標的ではなく、他のがんの汎癌腫標的としてもみなされている。ＰＳＭＡの発現は前立腺癌の普遍的な特長であると考えられ、その発現の増加は腫瘍の攻撃性と相関している。ＰＳＭＡの発現は高悪性度腫瘍、転移性病変およびアンドロゲン非依存性疾患において最も高い。
【０００９】
多数の腫瘍関連抗原が同定されており、これらの抗原の多くががんを処置または予防するためのタンパク質に基づくまたはＤＮＡに基づくワクチンとして調査されている一方で、ほとんどの臨床治験では、現在までに治療製品を生成することに失敗している。がんワクチンの開発の困難の１つは、がん抗原は通常は自己由来であり、したがって、免疫系は自己タンパク質を認識しないように自己調節されているために免疫原性に乏しいことにある。したがって、がんワクチンの免疫原性または治療効果を増強させる方法の必要性が存在する。
【００１０】
免疫原性を増強させるまたはがんワクチンの抗腫瘍有効性を増強させるために、数々の手法が調査されている。そのような手法の１つは、ＴＬＲ作用剤、ＴＮＦＲ作用剤、ＣＴＬＡ−４阻害剤、およびプロテインキナーゼ阻害剤などの様々な免疫調節剤の使用を含む。
【００１１】
トール様受容体（ＴＬＲ）は、造血細胞および非造血細胞上で発現される１型膜受容体である。少なくとも１１個のメンバーがＴＬＲファミリー中で同定されている。これらの受容体は、病原性生物によって発現される病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識するその能力によって特徴づけられている。ＴＬＲの始動は、増強されたサイトカインの産生、ケモカイン受容体の発現（ＣＣＲ２、ＣＣＲ５およびＣＣＲ７）、ならびに共刺激分子の発現を介して激しい炎症反応を誘発することが見出されている。したがって、自然免疫系中のこれらの受容体は、後に続く後天性免疫応答の極性に対して制御力を発揮する。ＴＬＲのうち、ＴＬＲ９が免疫応答におけるその機能について大規模に調査されている。ＴＬＲ９受容体の刺激は、炎症誘発性サイトカインの産生およびＴ細胞への共刺激分子の提示を増加させることによって、抗原提示細胞（ＡＰＣ）が強力かつＴＨ１に支配されるＴ細胞応答をプライミングすることを指示する。ＴＬＲ９のリガンドであるＣｐＧオリゴヌクレオチドは、強力な免疫刺激因子のクラスであることが見出された。ＣｐＧ治療はマウスにおける様々な腫瘍モデルに対して試験されており、腫瘍阻害または回帰を促進することが一貫して示されている。
【００１２】
細胞毒性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）は免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、ヘルパーＴ細胞の表面上で発現される。ＣＴＬＡ−４はＣＤ２８依存性Ｔ細胞活性化の負の調節因子であり、適応免疫応答の阻害性チェックポイントとして作用する。Ｔ細胞共刺激タンパク質ＣＤ２８と同様、ＣＴＬＡ−４は抗原提示細胞上のＣＤ８０およびＣＤ８６と結合する。ＣＴＬＡ−４はＴ細胞に阻害シグナルを伝達する一方で、ＣＤ２８は刺激シグナルを伝達する。ヒトＣＴＬＡ−４に対するヒト抗体は、ウイルスおよび細菌感染症の処置または予防およびがんの処置などのいくつかの病状における免疫刺激モジュレーターとして記載されている（ＷＯ０１／１４４２４号およびＷＯ００／３７５０４号）。様々な前臨床研究により、モノクローナル抗体によるＣＴＬＡ−４遮断は免疫原性腫瘍に対する宿主免疫応答を増強させ、確立された腫瘍を拒絶さえできることが示されている。２つの完全にヒトの抗ヒトＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であるイピリムマブ（ＭＤＸ−０１０）およびトレメリムマブ（ＣＰ−６７５２０６としても知られる）が、様々な種類の固形腫瘍の処置における臨床治験において調査されている。
【００１３】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーは、特異的な同族細胞表面受容体であるＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーと結合するサイトカインの群である。腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーはリガンド媒介性の三量体化によって作用し、いくつかの細胞内アダプターの動員を引き起こしてアポトーシス、ＮＦ−ｋＢ経路、ＪＮＫ経路、ならびに免疫および炎症反応などの複数のシグナル伝達経路を活性化させる。ＴＮＦスーパーファミリーの例には、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ４０リガンド、４−１ＢＢリガンド、ＣＤ２７、ＣＤ３０リガンド（ＣＤ１５３）、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＲＡＮＫリガンド、ＬＴ−アルファ、ＬＴ−ベータ、ＧＩＴＲリガンド、およびＬＩＧＨＴが含まれる。ＴＮＦＲスーパーファミリーには、たとえば、ＣＤ４０、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＣＤ７０（ＣＤ２７リガンド）、ＣＤ３０、ＴＮＦＲ２、ＲＡＮＫ、ＬＴ−ベータＲ、ＨＶＥＭ、ＧＩＴＲ、ＴＲＯＹ、およびＲＥＬＴが含まれる。ＣＤ４０は、Ｂリンパ球、樹状細胞、濾胞性樹状細胞、造血前駆細胞、上皮細胞、および癌腫の表面上に見つかる。ＣＤ４０は、糖タンパク質であり、活性化されたＴ細胞（主にＣＤ４＋であるが一部のＣＤ８＋および好塩基球／肥満細胞）上で発現される、リガンド（ＣＤ４０−Ｌ）と結合する。自然および適応免疫応答におけるＣＤ４０の役割が原因で、完全にヒトの作用剤であるＣＤ４０モノクローナル抗体ＣＰ８７０８９３などの様々なＣＤ４０作用性抗体を含めたＣＤ４０作用剤は、ワクチンアジュバントおよび治療における使用について探求されている。
【００１４】
プロテインキナーゼは、タンパク質中の特定の残基のリン酸化を触媒する酵素のファミリーである。プロテインキナーゼは、サイトカインのその受容体に対する作用を含めた細胞外シグナルを核へと伝達し、様々な生物学的事象を始動させることを司っているシグナル伝達経路における主要な要素である。正常細胞の生理学におけるプロテインキナーゼの数多くの役割には、細胞周期の制御ならびに細胞成長、分化、アポトーシス、細胞移動性、および有糸分裂誘発が含まれる。ｃ−Ｓｒｃ、ｃ−Ａｂｌ、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ、ホスホチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）ＡＫＴ、および表皮成長因子（ＥＧＦ）受容体などのキナーゼががん細胞中で一般的に活性化されており、腫瘍化に寄与することが知られている。必然的に、いくつかのキナーゼ阻害剤、特にチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）：サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤、細胞周期チェックポイント阻害剤、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ阻害剤、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）阻害剤、キナーゼ挿入ドメイン阻害剤、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路を標的とする阻害剤、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ（ＥＲＫ）経路を標的とする阻害剤、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）キナーゼ阻害剤、ｃ−ｋｉｔ阻害剤、およびセリン／スレオニンキナーゼ阻害剤が、抗がん治療のために現在開発されている。たとえば、ＭＫ０４５７、ＶＸ−６８０、ＺＤ６４７４、ＭＬＮ８０５４、ＡＺＤ２１７１、ＳＮＳ−０３２、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６）、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８  ＡＭＧ７０６、Ｚａｃｔｉｍａ（ＺＤ６４７４）、ＭＰ−４１２、ダサチニブ、ＣＥＰ−７０１（レスタウルチニブ）、ＸＬ６４７、ＸＬ９９９、Ｔｙｋｅｒｂ、（ラパチニブ）、ＭＬＮ５１８、（以前はＣＴ５３５１８として知られる）、ＰＫＣ４１２、ＳＴ１５７１、ＡＭＮ１０７、ＡＥＥ７８８、ＯＳＩ−９３０、ＯＳＩ−８１７、スニチニブリンゴ酸塩（Ｓｕｔｅｎｔ、ＳＵ１１２４８）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ＳＮＳ−０３２、ＳＮＳ−３１４、およびアキシチニブ（ＡＧ−０１３７３６）を含めたいくつかのキナーゼ阻害剤が、抗がん治療で使用するために臨床調査において調査されている。ゲフィチニブおよびエルロチニブは、経口利用が可能な２つのＥＧＦＲ−ＴＫＩである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
探求されている免疫調節剤は、典型的には、たとえば経口投与、静脈内注射もしくは輸液、または筋肉内注射によって患者に全身投与される。一部の免疫調節剤の有効な使用を制限する主要な要因の１つは、投与した薬剤への高い全身性曝露によって引き起こされる毒性である。たとえば、ＣＤ４０作用剤に関して、０．３ｍｇ／ｋｇが例示されている作用性ＣＤ４０抗体の最大耐量であり、それよりも高い用量は、静脈血栓閉塞症、グレード３頭痛、悪寒などの毒性効果をもたらすサイトカイン放出、および一過性肝臓毒性を含めた副作用を誘発し得ることが報告されている。（Ｖａｎｄｅｒｈｅｉｄｅら、Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２５（７）：８７６〜８８３３（Ｍａｒｃｈ  ２００７）。転移性腎細胞癌を有する患者において静脈内トレメリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４抗体）と経口スニチニブとの組合せを調査するための臨床治験では、腎不全の急速な発症が観察され、その結果、毎日６ｍｇ／ｋｇよりも高い用量のトレメリムマブ＋３７．５ｍｇのスニチニブのさらなる調査は推奨されなかった。Ｂｒｉａｎ  Ｉ．Ｒｉｎｉら：Ｐｈａｓｅ  １  Ｄｏｓｅ−Ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ  Ｔｒｉａｌ  ｏｆ  Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ  Ｐｌｕｓ  Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｒｅｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ．、Ｃａｎｃｅｒ、１１７（４）：７５８〜７６７（２０１１）を参照されたい］。したがって、肝臓毒性または腎不全などの重症な有害な副作用を誘発しない有効用量で免疫調節剤が投与されるワクチンに基づく免疫療法レジメンの必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
一部の態様では、本開示は、たとえば、ｉｎ  ｖｉｖｏ（たとえばヒトを含めた動物内）もしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫応答を誘発させるため、抗体を作製するため、または前立腺がんを含めたがんを処置するためのワクチン中の構成成分として使用するために有用な、単離した免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドおよび免疫原性ＰＳＡポリペプチドを提供する。一態様では、本開示は、配列番号１のヒトＰＳＭＡのアミノ酸１５〜７５０と少なくとも９０％の同一性を有しており、ヒトＰＳＭＡの保存的Ｔ細胞エピトープのうちの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９個のアミノ酸を対応する位置で含む、単離免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドを提供する。
【００１７】
他の態様では、本開示は、免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている核酸分子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本開示によって提供される免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドまたは前記ポリペプチドの機能的変異体をコードしているヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子またはその縮重変異体を提供する。
【００１８】
一部の他の態様では、本開示は、それぞれ２つ以上の免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている複数抗原核酸構築体を提供する。
【００１９】
また、本開示は、本発明の１つまたは複数の核酸分子を含有するベクターも提供する。ベクターは、核酸分子によってコードされている免疫原性ＰＡＡポリペプチドをクローニングもしくは発現させるため、またはワクチンなどの組成物中の核酸分子を宿主細胞もしくはヒトなどの宿主動物へと送達するために有用である。
【００２０】
一部のさらなる態様では、本開示は、１つもしくは複数の免疫原性ＰＡＡポリペプチド、免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている単離核酸分子、または免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている核酸分子を含有するベクターもしくはプラスミドを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、マウス、イヌ、サル、またはヒトなどの哺乳動物においてＰＡＡに対する免疫応答を誘発させるために有用な免疫原性組成物である。一部の実施形態では、組成物は、ヒトなどの哺乳動物を免疫化するため、異常な細胞増殖を阻害するため、がんの発生に対する保護を提供するため（予防剤として使用される）、またはがん、特に前立腺がんなどのＰＡＡの過剰発現に関連する障害を処置するため（治療剤として使用される）に有用なワクチン組成物である。
【００２１】
さらに他の態様では、本開示は、本明細書中に上述した免疫原性ＰＡＡポリペプチド、単離核酸分子、および免疫原性ＰＡＡポリペプチドまたは単離核酸分子を含む組成物を使用する方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、哺乳動物に、標的ＰＡＡに対して免疫原性である、有効量の本発明によって提供されるポリペプチド、そのような免疫原性ポリペプチドをコードしている有効量の単離核酸分子、またはそのような免疫原性ＰＡＡポリペプチドもしくはそのような免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている単離核酸分子を含む組成物を投与することを含む、哺乳動物、特にヒトにおいてＰＡＡに対する免疫応答を誘発させる方法を提供する。ポリペプチドまたは核酸ワクチンは１つまたは複数のアジュバントと共に使用し得る。
【００２２】
さらに他の態様では、本開示は、様々ながんを処置するためのＴＡＡ特異的免疫応答を誘導するための様々な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を送達するワクチンを、少なくとも１つの免疫抑制性細胞阻害剤および少なくとも１つの免疫エフェクター細胞賦活剤と組み合わせて同時投与することを含む、ワクチンに基づく免疫療法レジメン（すなわち「ＶＢＩＲ」）を提供する。具体的には、一部の態様では、本開示は、ワクチンを受ける哺乳動物に、有効量の少なくとも１つの免疫抑制性細胞阻害剤と少なくとも１つの免疫エフェクター細胞賦活剤とを投与することを含む、哺乳動物において新生物性障害を処置するためのワクチンの免疫原性または治療効果を増強させる方法を提供する。さらなる一態様では、本開示は、哺乳動物に、ワクチンと、少なくとも１つの免疫抑制性細胞阻害剤と、少なくとも１つの免疫エフェクター細胞賦活剤とを投与することを含む、哺乳動物において新生物性障害を処置する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＰＪＶ７５６３ベクターの模式図である。
【図２】５つのウイルス２Ａカセットのアミノ酸アラインメントを示す図である。スキップされたグリシン−プロリン結合はアスタリスクによって示されている。
【図３】好ましいＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの配列を示す図である。翻訳開始部位はアスタリスクによって示されている。最小ＩＲＥＳ要素には、ＥＭＣＶ  Ｌタンパク質の下線を引いた最初の５個のコドンは除外されている。
【図４】フローサイトメトリーによって測定した、二重抗原ワクチン構築体で形質移入したＨＥＫ２９３細胞の表面上でのヒトＰＳＭＡ改変抗原（アミノ酸１５〜７５０）および完全長ヒトＰＳＣＡの発現を示すドットプロットである。
【図５】ＰＳＭＡおよびＰＳＣＡ特異的モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングによって測定した、二重抗原ワクチン構築体で形質移入したＨＥＫ２９３細胞におけるヒトＰＳＭＡ改変抗原（アミノ酸１５〜７５０）および完全長ヒトＰＳＣＡの発現を示すウエスタンブロットの画像である。
【図６】ＰＳＡ特異的モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングによって測定した、二重抗原ワクチン構築体で形質移入したＨＥＫ２９３細胞におけるヒトＰＳＡサイトゾル抗原（アミノ酸２５〜２６１）の発現を示すウエスタンブロットの画像である。レーン５３００はＰＳＡよりも約２ｋＤ大きい薄いバンドを示し、これは２ＡペプチドのＣ末端融合と一貫している。
【図７Ａ】フローサイトメトリーによって測定した、三重抗原ワクチン構築体で形質移入したＨＥＫ２９３細胞の表面上でのヒトＰＳＭＡ改変抗原（アミノ酸１５〜７５０）および完全長ヒトＰＳＣＡの発現を示すドットプロットである。（単一抗原対照および単一プロモーター三重抗原構築体。）
【図７Ｂ】フローサイトメトリーによって測定した、三重抗原ワクチン構築体で形質移入したＨＥＫ２９３細胞の表面上でのヒトＰＳＭＡ改変抗原（アミノ酸１５〜７５０）および完全長ヒトＰＳＣＡの発現を示すドットプロットである。（二重プロモーター三重抗原構築体。）
【図８Ａ】ＰＳＡ特異的モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングによって測定した、三重抗原ワクチン構築体で形質移入したＨＥＫ２９３細胞におけるヒトＰＳＡの発現を示すウエスタンブロットの画像である。レーン５２５９および４５６中のバンドはレーン５２９７からのスピルオーバーである。スキャンしたゲルからは見ることができないが、レーン４５６、４５７、および４５８はＰＳＡよりも約２ｋＤ大きいバンドを示し、これは２ＡペプチドのＣ末端融合と一貫している。（単一プロモーター三重抗原構築体。）
【図８Ｂ】ＰＳＡ特異的モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングによって測定した、三重抗原ワクチン構築体で形質移入したＨＥＫ２９３細胞におけるヒトＰＳＡの発現を示すウエスタンブロットの画像である。レーン５２５９および４５６中のバンドはレーン５２９７からのスピルオーバーである。スキャンしたゲルからは見ることができないが、レーン４５６、４５７、および４５８はＰＳＡよりも約２ｋＤ大きいバンドを示し、これは２ＡペプチドのＣ末端融合と一貫している。（二重プロモーター三重抗原構築体）
【図９Ａ】ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって三重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図９Ｂ】ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって三重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図９Ｃ】ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって三重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図９Ｄ】ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって三重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図１０Ａ】ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって三重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図１０Ｂ】ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって三重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図１０Ｃ】ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって三重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図１０Ｄ】ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって三重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図１１】抗ＰＳＭＡ抗体価によって三重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図１２】抗ＰＳＣＡ抗体価によって三重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図１３】抗ＰＳＭＡ抗体細胞表面結合によって三重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図１４】抗ＰＳＣＡ抗体細胞表面結合によって三重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図１５Ａ】ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図１５Ｂ】ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図１５Ｃ】ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図１６Ａ】ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図１６Ｂ】ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図１６Ｃ】ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図１７】抗ＰＳＭＡ抗体価によって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図１８】抗ＰＳＣＡ抗体価によって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図１９】抗ＰＳＭＡ抗体細胞表面結合によって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図２０】抗ＰＳＣＡ抗体細胞表面結合によって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図２１Ａ】ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図２１Ｂ】ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図２１Ｃ】ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図２１Ｄ】ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図２２】抗ＰＳＭＡ抗体価によって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図２３】抗ＰＳＣＡ抗体価によって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図２４】抗ＰＳＭＡ抗体細胞表面結合によって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図２５】抗ＰＳＣＡ抗体細胞表面結合によって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図２６】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるヒトＰＳＭＡ改変抗原（アミノ酸１５〜７５０）対完全長ヒトＰＳＭＡ（アミノ酸１〜７５０）によって誘発されたＴ細胞免疫応答を評価するための代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図２７Ａ】ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる、パスツール（ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１）トランスジェニックマウスにおけるヒトＰＳＭＡ改変抗原（アミノ酸１５〜７５０）対完全長ヒトＰＳＭＡ抗原（アミノ酸１〜７５０）のＴ細胞免疫応答を評価するための代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図２７Ｂ】ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる、パスツール（ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１）トランスジェニックマウスにおけるヒトＰＳＭＡ改変抗原（アミノ酸１５〜７５０）対完全長ヒトＰＳＭＡ抗原（アミノ酸１〜７５０）のＴ細胞免疫応答を評価するための代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図２８】抗ＰＳＭＡ抗体価によってヒト改変および完全長ＰＳＭＡワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図２９】抗ＰＳＭＡ抗体細胞表面結合によってヒト改変および完全長ＰＳＭＡワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図３０】抗ＣＴＬＡ−４（ＣＰ−６７５、２０６）を１０ｍｇ／ｋｇで注射したインドアカゲザルにおいて競合的ＥＬＩＳＡによって測定した、血中抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体レベルを評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図３１Ａ】細胞内サイトカイン染色アッセイによる、ワクチンに誘導された免疫応答の品質に対する抗ネズミＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（クローン９Ｈ１０）の免疫調節活性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図３１Ｂ】細胞内サイトカイン染色アッセイによる、ワクチンに誘導された免疫応答の品質に対する抗ネズミＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（クローン９Ｈ１０）の免疫調節活性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図３２】単独療法として、または対照（対照）もしくはがんワクチン（ｒＨＥＲ２）と組み合わせて、スニチニブリンゴ酸塩（Ｓｕｔｅｎｔ）で処置した際の皮下腫瘍成長速度を評価および比較する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図３３Ａ】２０ｍｇ／ｋｇのスニチニブリンゴ酸塩（Ｓｕｔｅｎｔ）および対照（対照）またはがんワクチン（ｒＨＥＲ２）の抗腫瘍有効性を評価および比較する代表的な研究からのマウスの個々の腫瘍成長速度を示すグラフである。
【図３３Ｂ】２０ｍｇ／ｋｇのスニチニブリンゴ酸塩（Ｓｕｔｅｎｔ）および対照（対照）またはがんワクチン（ｒＨＥＲ２）の抗腫瘍有効性を評価および比較する代表的な研究からのマウスの個々の腫瘍成長速度を示すグラフである。
【図３３Ｃ】２０ｍｇ／ｋｇのスニチニブリンゴ酸塩（Ｓｕｔｅｎｔ）および対照（対照）またはがんワクチン（ｒＨＥＲ２）の抗腫瘍有効性を評価および比較する代表的な研究からのマウスの個々の腫瘍成長速度を示すグラフである。
【図３３Ｄ】２０ｍｇ／ｋｇのスニチニブリンゴ酸塩（Ｓｕｔｅｎｔ）および対照（対照）またはがんワクチン（ｒＨＥＲ２）の抗腫瘍有効性を評価および比較する代表的な研究からのマウスの個々の腫瘍成長速度を示すグラフである。
【図３４】スニチニブリンゴ酸塩（Ｓｕｔｅｎｔ）および対照（対照）またはがんワクチン（がん）で処置した、スニチニブリンゴ酸塩（Ｓｕｔｅｎｔ）および対照（対照）またはがんワクチン（ｒＨＥＲ２）の抗腫瘍有効性を評価する図３３に記載した研究からのマウスの群のカプラン−マイヤー生存曲線を示すグラフである。
【図３５Ａ】図３３で処置したマウスからの末梢血における、骨髄由来抑制細胞（Ｇｒ１＋ＣＤ１１ｂ＋）およびＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞を含有するＴｒｅｇにおける変化を示すグラフである。
【図３５Ｂ】図３３で処置したマウスからの末梢血における、骨髄由来抑制細胞（Ｇｒ１＋ＣＤ１１ｂ＋）およびＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞を含有するＴｒｅｇにおける変化を示すグラフである。
【図３６Ａ】マウスの腫瘍から単離した骨髄由来抑制細胞（Ｇｒ１＋ＣＤ１１ｂ＋）、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）、およびＰＤ−１＋ＣＤ８  Ｔ細胞の総数の変化を示すグラフである。
【図３６Ｂ】マウスの腫瘍から単離した骨髄由来抑制細胞（Ｇｒ１＋ＣＤ１１ｂ＋）、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）、およびＰＤ−１＋ＣＤ８  Ｔ細胞の総数の変化を示すグラフである。
【図３６Ｃ】マウスの腫瘍から単離した骨髄由来抑制細胞（Ｇｒ１＋ＣＤ１１ｂ＋）、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）、およびＰＤ−１＋ＣＤ８  Ｔ細胞の総数の変化を示すグラフである。
【図３７】皮下ＴＵＢＯ腫瘍を保有するＢＡＬＢ／ｎｅｕＴマウスにおける、対照（対照）またはがんワクチン（ワクチン）と組み合わせた、スニチニブリンゴ酸塩（Ｓｕｔｅｎｔ）および抗ネズミＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（クローン９Ｄ９）の抗腫瘍有効性を評価する代表的な研究からのマウスの群のカプラン−マイヤー生存曲線を示すグラフである。
【図３８】皮下ＴＵＢＯ腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｎｅｕＴマウスの血中スニチニブレベルの動力学を示すグラフである。
【図３９】スニチニブリンゴ酸塩（Ｓｕｔｅｎｔ）および対照またはがんワクチンを投薬した皮下ＴＵＢＯ腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｎｅｕＴマウスの抗腫瘍有効性を評価する代表的な研究からのマウスの群のカプラン−マイヤー生存曲線を示すグラフである。
【図４０】免疫調節剤を与えた場合の、ｒＨＥＲ２ワクチンによって誘導された抗原特異的Ｔ細胞応答の規模を評価する代表的な研究からのマウスの群からのＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ結果を示すグラフである。
【図４１Ａ】細胞内サイトカイン染色アッセイによる、ワクチンに誘導された免疫応答の品質に対するＣｐＧ７９０９（ＰＦ−０３５１２６７６）の免疫調節活性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図４１Ｂ】細胞内サイトカイン染色アッセイによる、ワクチンに誘導された免疫応答の品質に対するＣｐＧ７９０９（ＰＦ−０３５１２６７６）の免疫調節活性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図４２Ａ】細胞内サイトカイン染色アッセイによる、ワクチンに誘導された免疫応答の品質に対する作用性抗ネズミＣＤ４０モノクローナル抗体の免疫調節活性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図４２Ｂ】細胞内サイトカイン染色アッセイによる、ワクチンに誘導された免疫応答の品質に対する作用性抗ネズミＣＤ４０モノクローナル抗体の免疫調節活性を評価する代表的な研究の結果を示すグラフである。
【図４３】自発性乳癌を保有するＢＡＬＢ／ｎｅｕＴマウスにおける低用量スニチニブリンゴ酸塩（Ｓｕｔｅｎｔ）および対照またはがんワクチンの抗腫瘍有効性を評価する代表的な研究からのマウスの群のカプラン−マイヤー生存曲線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
Ａ．定義
用語「アジュバント」とは、ワクチン免疫原と共に与えた際に免疫応答を増強、加速、または延長させることができる物質をいう。
【００２５】
用語「作用剤」とは、別の分子または受容体の活性を促進する（誘導する、引き起こす、増強させる、または増加させる）物質をいう。用語、作用剤には、受容体と結合する物質（たとえば、抗体、別の種からの天然リガンドの相同体）およびそれと結合せずに受容体機能を促進させる物質（たとえば、関連タンパク質を活性化させることによる）が包含される。
【００２６】
用語「拮抗剤」または「阻害剤」とは、別の分子または受容体の生物活性を部分的または完全に遮断、阻害、または中和する物質をいう。
【００２７】
用語「同時投与」とは、処置期間中に同じ対象に２つ以上の薬剤を投与することをいう。２つ以上の薬剤は、単一の配合物中に包含され、したがって同時に投与され得る。あるいは、２つ以上の薬剤は別々の物理的配合物中にあり、別々に、順次または同時のどちらかで対象に投与し得る。用語「同時に投与した」または「同時の投与」とは、第１の薬剤の投与および第２の薬剤の投与の時間が互いに重なることを意味する一方で、用語「順次に投与した」または「順次の投与」とは、第１の薬剤の投与および第２の薬剤の投与の時間が互いに重ならないことを意味する。
【００２８】
用語「保存的Ｔ細胞エピトープ」とは、配列番号１に記載のヒトＰＳＭＡタンパク質の以下のアミノ酸配列のうちの１つをいう。
アミノ酸１６８〜１７６（ＧＭＰＥＧＤＬＶＹ）、
アミノ酸３４７〜３５６（ＨＳＴＮＧＶＴＲＩＹ）、
アミノ酸５５７〜５６６（ＥＴＹＥＬＶＥＫＦＹ）、
アミノ酸２０７〜２１５（ＫＶＦＲＧＮＫＶＫ）、
アミノ酸４３１〜４４０（ＳＴＥＷＡＥＥＮＳＲ）、
アミノ酸４〜１２（ＬＬＨＥＴＤＳＡＶ）、
アミノ酸２７〜３５（ＶＬＡＧＧＦＦＬＬ）、
アミノ酸１６８〜１７７（ＧＭＰＥＧＤＬＶＹＶ）、
アミノ酸４４１〜４５０（ＬＬＱＥＲＧＶＡＹＩ）、
アミノ酸４６９〜４７７（ＬＭＹＳＬＶＨＮＬ）、
アミノ酸７１１〜７１９（ＡＬＦＤＩＥＳＫＶ）、
アミノ酸６６３〜６７１（ＭＮＤＱＶＭＦＬ）、
アミノ酸１７８〜１８６（ＮＹＡＲＴＥＤＦＦ）、
アミノ酸２２７〜２３５（ＬＹＳＤＰＡＤＹＦ）、
アミノ酸６２４〜６３２（ＴＹＳＶＳＦＤＳＬ）、
アミノ酸３３４〜３４８（ＴＧＮＦＳＴＱＫＶＫＭＨＩＨＳ）、
アミノ酸４５９〜４７３（ＮＹＴＬＲＶＤＣＴＰＬＭＹＳＬ）、
アミノ酸６８７〜７０１（ＹＲＨＶＩＹＡＰＳＳＨＮＫＹＡ）、および
アミノ酸７３０〜７４４（ＲＱＩＹＶＡＡＦＴＶＱＡＡＡＥ）。
【００２９】
用語「サイトゾル性」とは、特定のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列が宿主細胞によって発現された後、発現されたポリペプチドが宿主細胞内に保持されることを意味する。
【００３０】
用語「縮重変異体」とは、塩基の置換を有するが同じポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列をいう。
【００３１】
用語「有効量」とは、哺乳動物において所望の効果を引き起こすために十分である、哺乳動物に投与する量をいう。
【００３２】
用語、所定のポリペプチドの「断片」とは、所定のポリペプチドよりも短く、かつ所定のポリペプチドの配列と１００％の同一性を共有するポリペプチドをいう。
【００３３】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における用語「同一」またはパーセント「同一性」とは、最大一致について比較およびアラインメントした際に、同じである、または指定されたパーセンテージの同一であるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する、２つ以上の配列または部分配列をいう。
【００３４】
用語「免疫エフェクター細胞賦活剤」または「ＩＥＣ賦活剤」とは、哺乳動物の免疫エフェクター細胞の１つまたは複数の種類の数、質、または機能を増加または増強させることができる物質をいう。免疫エフェクター細胞の例には、細胞溶解性ＣＤ８  Ｔ細胞、ＣＤ４０  Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＢ細胞が含まれる。
【００３５】
用語「免疫調節剤」とは、哺乳動物の自然、液性、または細胞性免疫系の任意の構成成分の働きを変更させる（たとえば、阻害する、減少させる、増加させる、増強させる、または刺激する）ことができる物質をいう。したがって、用語「免疫調節剤」には、本明細書中に定義する「免疫エフェクター細胞賦活剤」および本明細書中に定義する「免疫抑制性細胞阻害剤」、ならびに哺乳動物の免疫系の他の構成成分に影響を与える物質が包含される。
【００３６】
用語「免疫応答」とは、宿主脊椎動物の免疫系による、特定の物質（抗原または免疫原など）に対する任意の検出可能な応答をいい、それだけには限定されないが、自然免疫応答（たとえばＴｏｌｌ受容体シグナル伝達カスケードの活性化）、細胞媒介性免疫応答（たとえば、抗原特異的Ｔ細胞などのＴ細胞および免疫系の非特異的な細胞によって媒介される応答）、ならびに液性免疫応答（たとえば、血漿、リンパ、および／または組織液中への抗体の産生および分泌などの、Ｂ細胞によって媒介される応答）が含まれる。免疫応答の例には、トール様受容体活性化の変更（たとえば増加）、リンホカイン（たとえば、サイトカイン（たとえばＴｈ１、Ｔｈ２もしくはＴｈ１７型サイトカイン）またはケモカイン）の発現または分泌、マクロファージ活性化、樹状細胞活性化、Ｔ細胞（たとえばＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞）活性化、ＮＫ細胞活性化、Ｂ細胞活性化（たとえば抗体の産生および／または分泌）、免疫原（たとえば抗原（たとえば免疫原性ポリポリペプチド））とＭＨＣ分子との結合、細胞毒性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）応答の誘導、Ｂ細胞応答の誘導（たとえば抗体産生）、免疫系の細胞（たとえばＴ細胞およびＢ細胞）の拡大（たとえば細胞集団の成長）、ならびに抗原提示細胞による抗原のプロセッシングおよび提示の増加が含まれる。また、用語「免疫応答」には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの脊椎動物の免疫系の１つまたは複数の構成成分による特定の物質（抗原または免疫原など）に対する任意の検出可能な応答も包含される。
【００３７】
用語「免疫原性」とは、単独であるか担体と連結しているかにかかわらず、アジュバントの存在下または非存在下で、特定の抗原に対する免疫応答を引き起こす、誘発する、刺激する、もしくは誘導する、または特定の抗原に対する既存の免疫応答を改善する、増強させる、増加するもしくは延長する、物質の能力をいう。
【００３８】
用語「免疫原性ＰＳＡポリペプチド」とは、ヒトＰＳＡタンパク質に対してまたはヒトＰＳＡタンパク質を発現する細胞に対して免疫原性であるポリペプチドをいう。
【００３９】
用語「免疫原性ＰＳＣＡポリペプチド」とは、ヒトＰＳＣＡタンパク質に対してまたはヒトＰＳＣＡタンパク質を発現する細胞に対して免疫原性であるポリペプチドをいう。
【００４０】
用語「免疫原性ＰＳＭＡポリペプチド」とは、ヒトＰＳＭＡタンパク質に対してまたはヒトＰＳＭＡタンパク質を発現する細胞に対して免疫原性であるポリペプチドをいう。
【００４１】
用語「免疫原性ＰＡＡポリペプチド」とは、本明細書中で上記定義した「免疫原性ＰＳＡポリペプチド」、「免疫原性ＰＳＣＡポリペプチド」、または「免疫原性ＰＳＭＡポリペプチド」をいう。
【００４２】
用語「免疫原性ＰＳＡ核酸分子」とは、本明細書中に定義する免疫原性ＰＳＡポリペプチドをコードしている核酸分子をいう。
【００４３】
用語「免疫原性ＰＳＣＡ核酸分子」とは、本明細書中に定義する「免疫原性ＰＳＣＡポリペプチド」をコードしている核酸分子をいう。
【００４４】
用語「免疫原性ＰＳＭＡ核酸分子」とは、本明細書中に定義する「免疫原性ＰＳＭＡポリペプチド」をコードしている核酸分子をいう。
【００４５】
用語「免疫原性ＰＡＡ核酸分子」とは、本明細書中で上記定義した「免疫原性ＰＳＡポリペプチド」、「免疫原性ＰＳＣＡポリペプチド」、または「免疫原性ＰＳＭＡポリペプチド」をコードしている核酸分子をいう。
【００４６】
用語「免疫抑制性細胞阻害剤」または「ＩＳＣ阻害剤」とは、哺乳動物の免疫抑制細胞の数または機能を低下させるまたは抑制することができる物質をいう。免疫抑制細胞の例には、調節性Ｔ細胞（「Ｔ  ｒｅｇ」）、骨髄由来抑制細胞、および腫瘍関連マクロファージが含まれる。
【００４７】
治療剤または免疫調節剤などの物質を、ヒトを含めた哺乳動物に投与する文脈における用語「皮内投与」または「皮内投与した」とは、物質を哺乳動物の皮膚の真皮層内に送達することをいう。哺乳動物の皮膚は、３つの層、すなわち表皮層、真皮層、および皮下層から構成されている。表皮は、皮膚の比較的薄く強靭な外層である。表皮中の細胞のほとんどはケラチノサイトである。皮膚の次の層である真皮は、皮膚にその柔軟性および強度を与える、線維状かつ弾性のある組織（主にコラーゲン、エラスチン、およびフィブリリンから作製される）の厚い層である。真皮は、神経終末、汗腺および油（皮脂）腺、毛嚢、および血管を含有する。真皮は、皮膚の位置に応じて厚さが変動する。ヒトでは、これは眼瞼では約０．３ｍｍであり、背中では約３．０ｍｍである。皮下層は、脂肪ならびにより大きな血管および神経を収容する結合組織から作製される。この層の厚さは身体全体にわたって、および人毎に変動する。用語「皮内投与」とは、物質を真皮層の内部に送達することをいう。対照的に、「皮下投与」とは、物質を皮下層内に投与することをいい、「外用投与」とは、物質を皮膚の表面上に投与することをいう。
【００４８】
用語「局所投与」または「局所投与した」には、それぞれ本明細書中で上記定義したように「外用投与」、「皮内投与」、および「皮下投与」が包含される。また、この用語には、物質を腫瘍の内部に投与することを指す「腫瘍内投与」も包含される。局所投与は、投与した物質で全身体内分布が達成されるまでの一定期間の間、投与部位周辺で高い局所濃度を可能にすることを意図する一方で、「全身投与」は、投与した物質が血中に吸収されて、循環系を通じて全身にわたって器官または組織へと分配されることによって迅速に全身性曝露を果たすことを意図する。
【００４９】
用語「哺乳動物」とは、哺乳網（Ｍａｍｍａｌｉａ）の任意の動物種をいう。哺乳動物の例には、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類、ラット、マウス、モルモットなどの実験動物、ネコ、イヌ、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、およびブタなどの家畜、ならびにライオン、トラ、ゾウなどの捕獲野生動物等が含まれる。
【００５０】
用語「膜結合性」とは、特定のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列が宿主細胞によって発現された後、発現されたポリペプチドが細胞の膜と結合している、付着している、または他の様式で会合していることを意味する。
【００５１】
用語「新生物性障害」とは、細胞が異常に高いかつ制御されない速度で増殖する状態をいい、この速度は周囲の正常組織のそれを超えており、協調を欠いている。通常、これは「腫瘍」として知られる固形病変または塊をもたらす。この用語には良性および悪性の新生物性障害が包含される。本開示中で用語「がん」と互換性があるように使用される用語「悪性新生物性障害」とは、体内の他の位置へと拡散する腫瘍細胞の能力（「転移」として知られる）によって特徴づけられた新生物性障害をいう。用語「良性新生物性障害」とは、腫瘍細胞が転移する能力を欠く新生物性障害をいう。
【００５２】
用語「作動可能に連結した」とは、そのように記載した構成成分が、それらがその意図する様式で機能することを許容する関係性にある並置をいう。導入遺伝子と「作動可能に連結した」制御配列は、制御配列と適合性のある条件下で導入遺伝子の発現が達成されるような様式でライゲーションされている。
【００５３】
用語「相同分子種」とは、互いに類似しており、共通の祖先に由来する、異なる種中の遺伝子をいう。
【００５４】
用語「薬学的に許容できる添加剤」とは、活性成分と適合性があり、それを投与する対象において顕著な不都合な効果を引き起こさない、免疫原性またはワクチン組成物中の活性成分（たとえば、抗原、抗原コード核酸、免疫調節剤、またはアジュバント）以外の物質をいう。
【００５５】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は本明細書中で互換性があるように使用され、任意の長さのアミノ酸の多量体型をいい、これには、コードされているおよびコードされていないアミノ酸、化学修飾もしくは生化学修飾または誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾されたポリペプチド主鎖を有するポリペプチドが含まれることができる。
【００５６】
用語「予防すること」または「予防する」とは、（ａ）障害が起こらないようにすること、または（ｂ）障害の発症もしくは障害の症状の発症を遅延させることをいう。
【００５７】
用語「前立腺関連抗原」（またはＰＡＡ）とは、前立腺腫瘍細胞上で特異的に発現される、または腫瘍細胞によって同じ組織型の非腫瘍細胞よりも高い頻度もしくは密度で発現されるＴＡＡ（本明細書中に定義）をいう。ＰＡＡの例にはＰＳＡ、ＰＳＣＡ、およびＰＳＭＡが含まれる。
【００５８】
ポリペプチドの文脈における用語「分泌性」とは、ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列が宿主細胞によって発現された後、発現されたポリペプチドが宿主細胞の外に分泌されることを意味する。
【００５９】
プロテインキナーゼ阻害剤などの免疫調節剤の量を記載する際に使用した場合、用語「最適以下の用量」とは、免疫調節剤単独で患者に投与した場合に、処置している疾患について所望の治療効果を生じるために必要な最小量未満の免疫調節剤の用量をいう。
【００６０】
用語「処置すること」、「処置」、または「処置する」とは、障害を抑止する、障害の重症度を低下させる、または障害の症状の重症度もしくは発生頻度を低下させることをいう。
【００６１】
用語「腫瘍関連抗原」または「ＴＡＡ」とは、腫瘍細胞によって特異的に発現される、または腫瘍細胞によって同じ組織型の非腫瘍細胞よりも高い頻度もしくは密度で発現される抗原をいう。腫瘍関連抗原は、宿主によって通常は発現されない抗原であり得るか、宿主によって通常発現される分子の、突然変異した、切断された、ミスフォールディングされた、もしくは他の様式で異常な発現であり得るか、通常発現される分子と同一であるが異常に高いレベルで発現され得るか、または、異常なコンテキストもしくは環境中で発現され得る。腫瘍関連抗原は、たとえば、タンパク質もしくはタンパク質断片、複合糖質、ガングリオシド、ハプテン、核酸、またはこれらもしくは他の生体分子の任意の組合せであり得る。
【００６２】
用語「ワクチン」とは、特定の抗原に対する免疫応答を誘発するために哺乳動物に投与する免疫原性組成物をいう。
【００６３】
用語、所定のポリペプチドの「変異体」とは、その所定のポリペプチドのアミノ酸配列と１００％未満であるが８０％より高い同一性を共有しており、その所定のポリペプチドの免疫原性活性の少なくとも一部を示すポリペプチドをいう。
【００６４】
用語「ベクター」とは、外来核酸分子を輸送または移動させることができる核酸分子をいう。この用語には発現ベクターおよび転写ベクターがどちらも包含される。用語「発現ベクター」とは、標的細胞中で挿入物を発現させることができるベクターをいい、一般に、挿入物の発現を駆動するエンハンサー、プロモーター、およびターミネーター配列などの制御配列を含有する。用語「転写ベクター」とは、転写されるが翻訳されない能力を有するベクターをいう。転写ベクターは、その挿入物を増幅するために使用する。外来核酸分子は「挿入物」または「導入遺伝子」と呼ばれる。ベクターは、一般に、挿入物とベクターの主鎖として役割を果たすより大きな配列とからなる。ベクターの構造または起源に基づいて、ベクターの主要な種類には、プラスミドベクター、コスミドベクター、ラムダファージなどのファージベクター、アデノウイルス（Ａｄ）ベクターなどのウイルスベクター、および人工染色体が含まれる。
【００６５】
Ｂ．免疫原性前立腺関連抗原（ＰＡＡ）ポリペプチド
一部の態様では、本開示は、たとえば、ｉｎ  ｖｉｖｏ（たとえばヒトを含めた動物中）もしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫応答を誘発するため、エフェクターＴ細胞を活性化させるため、またはそれぞれＰＳＡおよびＰＳＭＡに特異的な抗体を産生させるため、またはがん、特に前立腺がんを処置するためのワクチン中の構成成分として使用するために有用な、単離免疫原性ＰＳＡポリペプチドおよびＰＳＭＡポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドは、本開示に鑑みて、当技術分野で知られている方法によって調製することができる。免疫応答を誘発するポリペプチドの能力は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで測定することができる。ポリペプチドまたはＤＮＡ構築体の免疫応答を誘発する能力を決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは当技術分野で知られている。そのようなｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの一例は、その開示が本出願中に組み込まれている米国特許第７，３８７，８８２号に記載のように、ポリペプチドを発現するポリペプチドまたは核酸の、Ｔ細胞応答を刺激する能力を測定することである。このアッセイ方法は、（１）培養中の抗原提示細胞を抗原と接触させることによって、抗原を抗原提示細胞に取り込ませてプロセッシングさせることができ、１つまたは複数のプロセッシングされた抗原を生成するステップと、（２）Ｔ細胞がプロセッシングされた抗原のうちの１つまたは複数に応答するために十分な条件下で、抗原提示細胞をＴ細胞と接触させるステップと、（３）Ｔ細胞がプロセッシングされた抗原のうちの１つまたは複数に応答するかどうかを決定するステップとを含む。使用するＴ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞であり得る。Ｔ細胞応答は、インターフェロン−ガンマおよびインターロイキン−２などのサイトカインのうちの１つまたは複数の放出、抗原提示細胞（腫瘍細胞）の溶解、ならびにＢ細胞による抗体の産生を測定することによって決定し得る。
【００６６】
Ｂ−１．免疫原性ＰＳＭＡポリペプチド
一態様では、本開示は、配列番号１のヒトＰＳＭＡのアミノ酸１５〜７５０と少なくとも９０％の同一性を有しており、ヒトＰＳＭＡの保存的Ｔ細胞エピトープのうちの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９個のアミノ酸を対応する位置で含む、単離免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドを提供する。
【００６７】
一部の実施形態では、免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドは、ヒトＰＳＭＡの保存的Ｔ細胞エピトープのうちの少なくとも１５、１６、１７、１８、または１９個を含む。
【００６８】
一部の実施形態では、本開示は、配列番号９のアミノ酸配列からなる免疫原性ＰＳＭＡポリペプチド、または配列番号９のアミノ酸配列と９３％〜９９％、９４％〜９８％、もしくは９４％〜９７％の同一性を有する免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドを提供する。
【００６９】
一部の特定の免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドの例には以下が含まれる。
１）配列番号１のアミノ酸１５〜７５０からなるポリペプチド、
２）配列番号３のアミノ酸４〜７３９を含むポリペプチド、
３）配列番号５のアミノ酸４〜７３９を含むポリペプチド、
４）配列番号７のアミノ酸４〜７３９を含むポリペプチド、
２）配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
３）配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
４）配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【００７０】
他の実施形態では、本開示は、以下からなる群から選択される免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドを提供する。
１）配列番号１１のアミノ酸配列からなるポリペプチド
２）配列番号１３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、および
３）配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【００７１】
一部の他の実施形態では、本開示は、以下のポリペプチドのうちの任意のものの変異体である単離免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドを提供する。
２）配列番号３のアミノ酸４〜７３９を含むポリペプチド、
３）配列番号５のアミノ酸４〜７３９を含むポリペプチド、および
４）配列番号７のアミノ酸４〜７３９を含むポリペプチド、
ただし、変異体のアミノ酸配列は配列番号１の配列と９３％〜９９％の同一性を有しており、かつ配列番号３、５、または７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を共有する。
【００７２】
所定のＰＡＡポリペプチドの変異体は、親免疫原性ＰＡＡポリペプチド中の１つまたは複数のアミノ酸の欠失、挿入、または置換によって得ることができる。そのような変異体の生成の一例はポリペプチドの個々のアミノ酸の保存的置換、すなわち、１つのアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸で置換することによる。
【００７３】
本発明の免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドは、配列番号１のヒトＰＳＭＡの保存的Ｔ細胞エピトープの一部または全体を保存しつつ、ヒトＰＳＭＡの残りの領域中の特定のアミノ酸を、ヒトＰＳＭＡの１つまたは複数の相同分子種中に見つかるアミノ酸で、対応する位置で置換することによって構築し得る。免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドを作製するために利用し得る様々なＰＳＭＡ相同分子種の配列は、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベースから入手可能である。これらの相同分子種をそのＮＣＢＩ  ＩＤ番号と共に表１８中に提供する。ヒトＰＳＭＡのアミノ酸を相同分子種のうちの１つまたは複数からのアミノ酸で置換することは、保存的置換もしくは非保存的置換または両方であってよく、達成が必要な多様性、ＭＨＣ結合、置換部位での相同分子種アミノ酸の存在、表面曝露、ならびに最適なプロセッシングおよび提示のためのタンパク質の３Ｄ構造の維持を含めた、当技術分野で知られているいくつかの要因に基づいて選択し得る。
【００７４】
Ｂ−２．免疫原性ＰＳＡポリペプチド
別の態様では、本開示は単離免疫原性ＰＳＡポリペプチドを提供する。一実施形態では、単離免疫原性ＰＳＡポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列または配列番号１５のアミノ酸４〜２６３からなるポリペプチド、またはその変異体である。別の実施形態では、単離免疫原性ＰＳＡポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸配列または配列番号１７のアミノ酸４〜２４０からなるポリペプチド、またはその変異体である。さらなる実施形態では、単離免疫原性ＰＳＡポリペプチドは、配列番号１９のアミノ酸配列または配列番号１９のアミノ酸４〜２８１からなるポリペプチド、またはその変異体である。
【００７５】
Ｃ．免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている核酸分子
一部の態様では、本開示は、免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている核酸分子を提供する。核酸分子は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）であることができる。したがって、核酸分子は、チミジン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）であることもできる本明細書中に開示したヌクレオチド配列を含むことができ、これはＤＮＡおよびＲＮＡの化学構造の相違を反映している。核酸分子は、修飾形、一本鎖もしくは二本鎖形、または直鎖もしくは環状形であることができる。核酸分子は、本開示に鑑みて、当技術分野で知られている方法を使用して調製することができる。
【００７６】
Ｃ−１．免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドをコードしている核酸分子
一態様では、本開示は、本開示によって提供される免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドまたはその機能的変異体を含めた免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子またはその縮重変異体を提供する。
【００７７】
一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は膜結合免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドをコードしている。一部の特定の実施形態では、単離核酸分子は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその縮重変異体を含む。
１）配列番号９のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列、
２）配列番号３のアミノ酸４〜７３９をコードしているヌクレオチド配列、
３）配列番号５のアミノ酸４〜７３９をコードしているヌクレオチド配列、および
４）配列番号７のアミノ酸４〜７３９をコードしているヌクレオチド配列。
【００７８】
一部の他の特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９の免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドの変異体をコードしており、変異体は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列と９３％〜９９％の同一性および（ｂ）配列番号３、５、または７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００７９】
さらに一部の他の特定の実施形態では、単離核酸分子は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその縮重変異体を含む。
１）配列番号４のヌクレオチド１０〜２２１７を含むヌクレオチド配列、
２）配列番号６のヌクレオチド１０〜２２１７を含むヌクレオチド配列、
３）配列番号８のヌクレオチド１０〜２２１７を含むヌクレオチド配列、および
４）配列番号１０のヌクレオチド１０〜２２１７を含むヌクレオチド配列。
【００８０】
Ｃ−２．免疫原性ＰＳＡポリペプチドをコードしている核酸分子
別の態様では、本開示は、本開示によって提供される免疫原性ＰＳＡポリペプチドを含めた免疫原性ＰＳＡポリペプチドをコードしている、単離核酸分子またはその縮重変異体を提供する。
【００８１】
一部の実施形態では、単離核酸分子は、サイトゾル免疫原性ＰＳＡポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１７の連続したアミノ酸残基４〜２４０からなるサイトゾル免疫原性ＰＳＡポリペプチドをコードしている。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むサイトゾル免疫原性ＰＳＡポリペプチドをコードしている。さらに別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１７のアミノ酸配列からなるサイトゾル免疫原性ＰＳＡポリペプチドをコードしている。さらに別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、本明細書中で上記提供した前記サイトゾル免疫原性ポリペプチドのうちの任意のものの機能的変異体をコードしている。
【００８２】
一部の他の実施形態では、単離核酸分子は、膜結合免疫原性ＰＳＡポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１９の連続したアミノ酸残基４〜２８１を含む膜結合免疫原性ＰＳＡポリペプチドをコードしている。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む膜結合免疫原性ＰＳＡポリペプチドをコードしている。さらに別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１９のアミノ酸配列からなる膜結合免疫原性ＰＳＡポリペプチドをコードしている。さらに他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、本明細書中で上記提供した前記膜結合免疫原性ＰＳＡポリペプチドのうちの任意のものの機能的変異体をコードしている。
【００８３】
本開示によって提供される特定の核酸分子の例には以下が含まれる。
１）配列番号１８のヌクレオチド配列からなる核酸分子、
２）配列番号１８のヌクレオチド配列を含む核酸分子、
３）配列番号２０のヌクレオチド配列からなる核酸分子、
４）配列番号２０のヌクレオチド配列を含む核酸分子、および
５）上記核酸分子１）〜４）のうちの任意のものの縮重変異体。
【００８４】
Ｃ−３．２つ以上の免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている核酸分子
別の態様では、本開示は、複数の免疫原性ＰＡＡポリペプチド、たとえば少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている核酸分子を提供する。そのような核酸分子は、本開示において「複数抗原構築体」、「複数抗原ワクチン」、「複数抗原プラスミド」などとも呼ばれる。したがって、一部の態様では、１つの核酸分子が２つのコードヌクレオチド配列を保有しており、それぞれのコードヌクレオチド配列が個々の免疫原性ＰＡＡポリペプチドを発現する。そのような核酸分子は、本開示において「二重抗原構築体」、「二重抗原ワクチン」、または「二重抗原プラスミド」などとも呼ばれる。一部の他の態様では、１つの核酸分子が３つのコードヌクレオチド配列を保有しており、それぞれのコードヌクレオチド配列が個々の免疫原性ＰＡＡポリペプチドを発現する。そのような核酸分子は、本開示において「三重抗原構築体」、「三重抗原ワクチン」、または「三重抗原プラスミド」とも呼ばれる。１つの複数抗原構築体によってコードされている個々のＰＡＡポリペプチドは、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、またはＰＳＣＡなどの同じ抗原に対して免疫原性であり得る。１つの複数抗原構築体によってコードされている個々のＰＡＡポリペプチドは、たとえば１つのＰＡＡポリペプチドはＰＳＭＡポリペプチドであり別のものはＰＳＡポリペプチドである、異なる抗原に対して免疫原性であり得る。具体的には、１つの複数抗原構築体は、以下の組合せのうちの任意のもので２つ以上の免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしていてよい。
１）少なくとも１つの免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドと少なくとも１つの免疫原性ＰＳＡポリペプチド、
２）少なくとも１つの免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドと少なくとも１つのＰＳＣＡポリペプチド、
３）少なくとも１つの免疫原性ＰＳＡポリペプチドと少なくとも１つのＰＳＣＡポリペプチド、および
４）少なくとも１つの免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドと少なくとも１つの免疫原性ＰＳＡポリペプチドと少なくとも１つのＰＳＣＡポリペプチド。
【００８５】
複数抗原構築体によってコードされている免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドは、サイトゾル性、分泌性、または膜結合性のいずれかであり得るが、好ましくは膜結合性である。同様に、複数抗原構築体によってコードされている免疫原性ＰＳＡポリペプチドは、サイトゾル性、分泌性、または膜結合性のいずれかであり得るが、好ましくはサイトゾル性である。
【００８６】
一部の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの膜結合免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドおよび少なくとも１つの膜結合ＰＳＡポリペプチドをコードしている複数抗原構築体を提供する。
【００８７】
一部の他の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの膜結合免疫原性ＰＳＭＡポリペプチド、少なくとも１つのサイトゾルＰＳＡポリペプチド、および少なくとも１つのＰＳＣＡポリペプチドをコードしている複数抗原構築体を提供し、少なくとも１つのサイトゾルＰＳＡポリペプチドは配列番号１７のアミノ酸４〜２４０を含み、少なくとも１つの免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドは以下からなる群から選択される。
１）配列番号１のアミノ酸１５〜７５０を含むポリペプチド、
２）配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
３）配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
４）配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
５）配列番号９のアミノ酸４〜７３９を含むポリペプチド、
６）配列番号３のアミノ酸４〜７３９を含むポリペプチド、
７）配列番号５のアミノ酸４〜７３９を含むポリペプチド、
８）配列番号７のアミノ酸４〜７３９を含むポリペプチド、および
９）配列番号９のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【００８８】
一部の特定の実施形態では、本開示は、免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドをコードしている少なくとも１つのヌクレオチド配列、免疫原性ＰＳＡポリペプチドをコードしている少なくとも１つのヌクレオチド配列、およびヒトＰＳＣＡポリペプチドをコードしている少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む複数抗原構築体を提供し、ヌクレオチド配列は配列番号１７または配列番号１７のアミノ酸４〜２４０の免疫原性ＰＳＡポリペプチドをコードしており、免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列は以下からなる群から選択される。
１）配列番号２のヌクレオチド配列、
２）配列番号４のヌクレオチド配列、
３）配列番号６のヌクレオチド配列、
４）配列番号８のヌクレオチド配列、
５）配列番号１０のヌクレオチド配列、
６）配列番号４のヌクレオチド１０〜２２１７を含むヌクレオチド配列、
７）配列番号６のヌクレオチド１０〜２２１７を含むヌクレオチド配列、
８）配列番号８のヌクレオチド１０〜２２１７を含むヌクレオチド配列、および
９）配列番号１０のヌクレオチド１０〜２２１７を含むヌクレオチド配列。
【００８９】
本開示によって提供される具体的な複数抗原構築体の例には、配列番号２３〜３６に記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子が含まれる。
【００９０】
本開示によって提供される複数抗原構築体は、本開示に鑑みて、当技術分野で知られている様々な技法を使用して調製することができる。たとえば、複数抗原構築体は、複数の独立プロモーターを単一のプラスミド内に取り込ませることによって構築することができる（Ｈｕａｎｇ，Ｙ．、Ｚ．Ｃｈｅｎら（２００８）．「Ｄｅｓｉｇｎ，ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｕａｌ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｇｅｎｉｃ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｎ  ＨＩＶ−１  ｓｕｂｔｙｐｅ  Ｃ／Ｂ’  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ．」Ｊ  Ａｃｑｕｉｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ  Ｓｙｎｄｒ、４７（４）：４０３〜４１１、Ｘｕ，Ｋ．、Ｚ．Ｙ．Ｌｉｎｇら（２０１１）．「Ｂｒｏａｄ  ｈｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ＨＡ  ａｎｄ  ＮＰ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ａｎ  Ｈ５Ｎ１  ｖｉｒｕｓ．」Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２４（１）：４５〜５６）。プラスミドは、それぞれがａ）エンハンサー要素を含むまたは含まない、ＲＮＡポリメラーゼ依存性の転写を開始させるための真核プロモーター、ｂ）標的抗原をコードしている遺伝子、およびｃ）転写終結配列からなる、複数の発現カセットを保有するように操作することができる。形質移入した細胞核にプラスミドが送達された後、それぞれのプロモーターから転写が開始され、それぞれが標的抗原のうちの１つをコードしている別々のｍＲＮＡの生成がもたらされる。ｍＲＮＡは独立して翻訳され、それにより所望の抗原が生成される。
【００９１】
また、本開示によって提供される複数抗原構築体は、ウイルス２Ａ様ポリペプチドの使用によって、単一のベクターを使用しても構築することができる（Ｓｚｙｍｃｚａｋ，Ａ．Ｌ．およびＤ．Ａ．Ｖｉｇｎａｌｉ（２００５）．「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ２Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｖｅｃｔｏｒｓ．」Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ、５（５）：６２７〜６３８、ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅ，Ｐ．、Ｇ．Ａ．Ｌｕｋｅら（２００６）．「Ｅ  ｕｎｕｍ  ｐｌｕｒｉｂｕｓ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｅｌｆ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ．」Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２４（２）：６８〜７５、Ｌｕｋｅ，Ｇ．Ａ．、Ｐ．ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅら（２００８）．「Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ’２Ａ−ｌｉｋｅ’  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅｓ．」Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ、８９（Ｐｔ  ４）：１０３６〜１０４２、Ｉｂｒａｈｉｍｉ，Ａ．、Ｇ．Ｖａｎｄｅ  Ｖｅｌｄｅら（２００９）．「Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ２Ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．」Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、２０（８）：８４５〜８６０、Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．、Ｓ．Ｒ．Ｌｅｅら（２０１１）．「Ｈｉｇｈ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ａ  ２Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ−１  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ，ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ａｎｄ  ｍｉｃｅ．」ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６（４）：ｅ１８５５６）。切断カセットまたはＣＨＹＳＥＬ（シス作用性ヒドロラーゼエレメント）とも呼ばれるこれらのポリペプチドは、長さが約２０個のアミノ酸であり、高度に保存的なカルボキシ末端のＤ−Ｖ／Ｉ−ＥＸＮＰＧＰモチーフを有する（図２）。このカセットは自然では稀であり、最も一般的には口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、ブタテッショウウイルス（ＰＴＶ）、およびゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルス（ＴＡＶ）などのウイルス中に見つかる（Ｌｕｋｅ，Ｇ．Ａ．、Ｐ．ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅら（２００８）．「Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ’２Ａ−ｌｉｋｅ’  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅｓ．」Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ、８９（Ｐｔ  ４）：１０３６〜１０４２）。２Ａに基づく複数抗原発現戦略を用いて、複数の標的抗原をコードしている遺伝子を、単一のオープンリーディングフレーム中で、２Ａカセットによって隔てて一緒に連結させることができる。オープンリーディングフレーム全体を、単一のプロモーターおよびターミネーターと共にベクター内にクローニングすることができる。構築体が宿主細胞に送達された後、複数の抗原をコードしているｍＲＮＡは単一のポリタンパク質として転写および翻訳される。２Ａカセットの翻訳中、リボソームはＣ末端のグリシンとプロリンとの間の結合をスキップする。このリボソームによるスキップは、上流タンパク質から下流タンパク質を開放する、同時翻訳の自己触媒的な「切断」のように作用する。２つのタンパク質抗原間での２Ａカセットの取り込みは、上流ポリペプチドのＣ末端上への約２０個のアミノ酸の付加および下流タンパク質のＮ末端への１つのアミノ酸（プロリン）の付加をもたらす。この方法の適応では、遍在的なプロテアーゼによりカセットが上流タンパク質から切断されるように、プロテアーゼ切断部位を２ＡカセットのＮ末端に取り込ませることができる（Ｆａｎｇ，Ｊ．、Ｓ．Ｙｉら（２００７）．「Ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．」Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、１５（６）：１１５３〜１１５９）。
【００９２】
本開示によって提供される複数抗原構築体を構築する別の戦略は、内部リボソーム進入部位、すなわちＩＲＥＳの使用を含む。内部リボソーム進入部位は、特定のＲＮＡ分子の５’非翻訳領域中に見つかるＲＮＡエレメント（図３）である（Ｂｏｎｎａｌ，Ｓ．、Ｃ．Ｂｏｕｔｏｎｎｅｔら（２００３）．「ＩＲＥＳｄｂ：ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｉｔｅ  ｄａｔａｂａｓｅ．」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３１（１）：４２７〜４２８）。これらは、真核リボソームをＲＮＡへと誘引して、下流のオープンリーディングフレームの翻訳を促進する。通常の細胞性７−メチルグアノシンｃａｐ依存性翻訳とは異なり、ＩＲＥＳ媒介性翻訳は、ＲＮＡ分子のはるか内部にあるＡＵＧコドンを開始させることができる。複数シストロン発現ベクター中で使用するために、効率の高いプロセッシングを利用することができる（Ｂｏｃｈｋｏｖ，Ｙ．Ａ．およびＡ．Ｃ．Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇ（２００６）．「Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ  ｉｎ  ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｕｐｏｎ  ＩＲＥＳ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｌｏｃａｔｉｏｎ．」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４１（３）：２８３〜２８４、２８６、２８８）。典型的には、２つの導入遺伝子は、ベクター内のプロモーターと転写ターミネーターとの間に、ＩＲＥＳによって隔てられた２つの別々のオープンリーディングフレームとして挿入する。構築体が宿主細胞に送達された後、両方の導入遺伝子をコードしている単一の長い転写物が転写される。第１のＯＲＦは伝統的なｃａｐ依存性様式で翻訳され、ＩＲＥＳの上流のストップコドンで終結する。第２のＯＲＦは、ＩＲＥＳを使用してｃａｐ非依存性様式で翻訳される。このようにして、２つの独立したタンパク質を、単一の発現カセットを有するベクターから転写された単一のｍＲＮＡから生成することができる。
【００９３】
複数抗原発現戦略はここではＤＮＡワクチン構築体のコンテキストにおいて記載されているが、原理はウイルスベクター遺伝子ワクチンのコンテキストにも同様に適用される。
【００９４】
Ｄ．免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている核酸分子を含有するベクター
本発明の別の態様は、本発明の１つまたは複数の核酸分子を含有するベクターに関する。ベクターは、核酸分子によってコードされている免疫原性ＰＡＡポリペプチドをクローニングもしくは発現させるため、またはワクチンなどの組成物中の核酸分子を宿主細胞もしくはヒトなどの宿主動物へと送達するために有用である。プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、およびウイルスベクターなどの様々なベクターを、本発明の核酸分子を含有および発現するように調製し得る。
【００９５】
一部の実施形態では、本開示は、本発明の核酸分子を含有する、プラスミドに基づくベクターを提供する。適切なプラスミドベクターの代表的な例には、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、およびｐＧＢ−２が含まれる。プラスミドベクターの他の代表的な例およびそのようなベクターを構築する方法は、米国特許第５，５８０，８５９号、第５，５８９，４６６号、第５，６８８，６８８号、第５，８１４，４８２号、および第５，５８０，８５９号に記載されている。
【００９６】
他の実施形態では、本発明は、レトロウイルス、アルファウイルス、アデノウイルスなどのウイルスから構築されるベクターを提供する。レトロウイルスベクターの代表的な例は、ＥＰ０，４１５，７３１号、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０７９３６号、ＷＯ９１／０２８５号、ＷＯ９３１１２３０号、ＷＯ９３１０２１８号、ＷＯ９４０３６２２号、ＷＯ９３２５６９８号、ＷＯ９３２５２３４号、ならびに米国特許第５，２１９，７４０号、第５，７１６，６１３号、第５，８５１，５２９号、第５，５９１，６２４号、第５，７１６，８２６号、第５，７１６，８３２号、および第５，８１７，４９１号により詳細に記載されている。アルファウイルスから作製することができるベクターの代表的な例は、米国特許第５，０９１，３０９号、第５，２１７，８７９号、第５，８４３，７２３号、および第５，７８９，２４５号に記載されている。一部の特定の実施形態では、本開示は、サルアデノウイルスなどの非ヒト霊長類アデノウイルスに由来するアデノウイルスベクターを提供する。そのようなアデノウイルスベクターの例およびその調製は、ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００５／０７１０９３号およびＷＯ２０１０／０８６１８９号に記載されており、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３、ＣｈＡｄ６８、ＣｈＡｄ８２、ＣｈＡｄ５５、ＣｈＡｄ７３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１４６、ＣｈＡｄ１４７、ＰａｎＡｄ１、Ｐａｎ  Ａｄ２、およびＰａｎ  Ａｄ３などの非複製ベクターならびにＡｄ４およびＡｄ７ベクターなどの複製能を有するベクターが含まれる。サルアデノウイルスからアデノウイルスベクターを構築する際、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、およびＥ４から選択されるウイルス遺伝子領域からの初期遺伝子のうちの１つまたは複数を、欠失させる、または欠失もしくは突然変異によって非機能的とすることのどちらかが好ましい。特定の実施形態では、ベクターはＣｈＡｄ３またはＣｈＡｄ６８から構築する。また、適切なベクターは、カナリアポックスウイルスまたはワクシニアウイルスなどのポックスウイルス（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、ＰＮＡＳ、８６：３１７〜３２１、１９８９、Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、５６９：８６〜１０３、１９８９、Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ、８：１７〜２１、１９９０、米国特許第４，６０３，１１２号、第４，７６９，３３０号、および第５，０１７，４８７号、ＷＯ８９／０１９７３号）、アデノ関連ベクター（たとえば米国特許第５，８７２，００５号を参照）、ＳＶ４０（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２７７：１０８〜１１４、１９７９）、ヘルペス（Ｋｉｔ、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．、２１５：２１９〜２３６、１９８９、米国特許第５，２８８，６４１号）、ならびにＨＩＶなどのレンチウイルス（Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５：５３２〜５３６、１９９１）などの他のウイルスからも作製��ることができる。
【００９７】
ベクターを構築する方法は当技術分野で周知である。発現ベクターには、典型的には、発現させる核酸配列と作動可能に連結されている１つまたは複数の制御要素が含まれる。用語「制御要素」とは、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーなどの総称であり、これらは集合的にレシピエント細胞中のコード配列の複製、転写、および翻訳をもたらす。選択されたコード配列が適切な宿主細胞中で複製、転写、および翻訳されることができる限り、これらの制御要素のすべてが必ずしも存在する必要はない。制御要素は、具体的な宿主細胞および他のベクター構成成分の供給源または構造などの、当業者に知られているいくつかの要因に基づいて選択される。免疫原性ＰＡＡポリペプチドの発現を増強させるためには、免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている配列の上流にコザック配列を提供することができる。脊椎動物では、既知のコザック配列は（ＧＣＣ）ＮＣＣＡＴＧＧであり、ただし、ＮはＡまたはＧであり、ＧＣＣは保存性がより低い。使用することができる例示的なコザック配列にはＡＣＣＡＵＧＧおよびＡＣＣＡＴＧＧが含まれる。
【００９８】
Ｅ．免疫原性ＰＡＡポリペプチドを含む組成物（ポリペプチド組成物）
別の態様では、本開示は、本開示によって提供される１つまたは複数の単離免疫原性ＰＡＡポリペプチドを含む組成物を提供する（「ポリペプチド組成物」）。一部の実施形態では、ポリペプチド組成物は、マウス、イヌ、非ヒト霊長類またはヒトなどの哺乳動物においてＰＡＡタンパク質に対する免疫応答を誘発するために有用な免疫原性組成物である。一部の他の実施形態では、ポリペプチド組成物は、ヒトなどの哺乳動物を免疫化するため、異常な細胞増殖を阻害するため、がんの発生に対する保護を提供するため（予防剤として使用される）、またはがん、特に前立腺がんなどのＰＡＡの過剰発現に関連する障害を処置するため（治療剤として使用される）に有用なワクチン組成物である。
【００９９】
本開示によって提供されるポリペプチド組成物は、免疫原性ＰＳＭＡポリペプチド、免疫原性ＰＳＡポリペプチド、または免疫原性ＰＳＣＡポリペプチドなどの、単一の種類の免疫原性ＰＡＡポリペプチドを含有していてよい。また、組成物は、２つ以上の異なる種類の免疫原性ＰＡＡポリペプチドの組合せを含有し得る。たとえば、ポリペプチド組成物は、以下の組合せのうちの任意のもので免疫原性ＰＡＡポリペプチドを含有していてよい。
１）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドと免疫原性ＰＳＡポリペプチド、
２）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドとＰＳＣＡポリペプチド、または
３）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドと免疫原性ＰＳＡポリペプチドとＰＳＣＡポリペプチド。
【０１００】
本開示によって提供される免疫原性組成物またはワクチン組成物は、薬学的に許容できる添加剤をさらに含み得る。免疫原性またはワクチン組成物のための薬学的に許容できる添加剤は当技術分野で知られている。適切な添加剤の例には、ナタネ油、ヒマワリ油、ピーナッツ油、綿実油、ホホバ油、スクアラン、スクアレン、生理食塩水、保存料および浸透圧制御剤などの生体適合性の油、担体ガス、ｐＨ制御剤、有機溶媒、疎水性剤、酵素阻害剤、吸水ポリマー、界面活性剤、吸収促進剤、ｐＨ調節剤、ならびに抗酸化剤が含まれる。
【０１０１】
組成物、特に免疫原性組成物またはワクチン組成物中の免疫原性ＰＡＡポリペプチドは、レシピエントに投与するための担体と連結させる、コンジュゲートさせる、または他の様式でそれ内に取り込ませ得る。用語「担体」とは、免疫原性ポリペプチドをレシピエント（たとえば患者）に送達するために免疫原性ポリペプチドと付着または他の様式で会合させることができる、物質または構造をいう。担体自体が免疫原性であり得る。担体の例には、免疫原性ポリペプチド、免疫ＣｐＧアイランド、リンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、コレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）、細菌または細菌ゴースト、リポソーム、キトソーム、ビロソーム、ミクロスフェア、樹状細胞などが含まれる。１つまたは複数の免疫原性ＰＡＡポリペプチド分子は単一の担体分子と連結していてよい。免疫原性ポリペプチドを担体と連結させる方法は当技術分野で知られている。
【０１０２】
本開示によって提供されるワクチン組成物または免疫原性組成物は、１つまたは複数の免疫調節剤またはアジュバントと併せて使用し得る。免疫調節剤またはアジュバントは、ワクチン組成物とは別々に配合し得るか、または、これらは同じワクチン組成物の配合物の一部であり得る。したがって、一実施形態では、ワクチン組成物は１つまたは複数の免疫調節剤またはアジュバントをさらに含む。免疫調節剤およびアジュバントの例を本明細書中以下に提供する。
【０１０３】
免疫原性およびワクチン組成物を含めたポリペプチド組成物は、液体形態（たとえば、溶液、懸濁液、または乳濁液）および固体形態（たとえば、カプセル、錠剤、または粉末）などの任意の適切な剤形で、当業者に知られている方法によって調製することができる。
【０１０４】
Ｆ．免疫原性ＰＡＡ核酸分子を含む組成物（核酸組成物）
また、本開示は、本開示によって提供される単離核酸分子またはベクターを含む組成物（本明細書中では「核酸組成物」）も提供する。核酸組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはヒトを含めた哺乳動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏでＰＡＡタンパク質に対する免疫応答を誘発させるために有用である。
【０１０５】
一部の特定の実施形態では、核酸組成物は、異常な細胞増殖を阻害するため、がんの発生に対する保護を提供するため（予防剤として使用される）、またはＰＡＡの過剰発現に関連するがんを処置するため（治療剤として使用される）、またはＰＳＭＡ、ＰＳＡ、およびＰＳＣＡなどの特定のヒトＰＡＡに対する免疫応答を誘発するためにヒトに投与するＤＮＡワクチン組成物である。組成物中の核酸分子は、「裸」核酸分子、すなわち、形質移入または発現を促進するエレメントを含まない単なる単離ＤＮＡ形態であり得る。あるいは、組成物中の核酸分子をベクター内に取り込ませることができる。
【０１０６】
本開示によって提供される核酸組成物は、それぞれが免疫原性ＰＳＭＡポリペプチド、免疫原性ＰＳＡポリペプチド、または免疫原性ＰＳＣＡポリペプチドなどの１種類の免疫原性ＰＡＡポリペプチドのみをコードしているように、個々の単離核酸分子を含んでいてよい。
【０１０７】
核酸組成物は、２種類以上の免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている、本開示によって提供される複数抗原構築体を含み得る。複数抗原構築体は、以下の組合せのうちの任意のもので２つ以上の免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしていてよい。
１）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドと免疫原性ＰＳＡポリペプチド、
２）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドと免疫原性ＰＳＣＡポリペプチド、
３）免疫原性ＰＳＡポリペプチドと免疫原性ＰＳＣＡポリペプチド、および
４）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドと免疫原性ＰＳＡポリペプチドと免疫原性ＰＳＣＡポリペプチド。
【０１０８】
ＤＮＡワクチン組成物を含めた核酸組成物は、薬学的に許容できる添加剤をさらに含み得る。ＤＮＡワクチン組成物を含めた核酸組成物のための適切な薬学的に許容できる添加剤の例は当業者に周知であり、糖などが含まれる。そのような添加剤は、水性または非水性溶液、懸濁液、および乳濁液であり得る。非水性添加剤の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが含まれる。水性添加剤の例には、生理食塩水および緩衝媒体を含めた、水、アルコール／水溶液、乳濁液または懸濁液が含まれる。また、適切な添加剤には、ポリヌクレオチド分子の細胞取り込みを支援する薬剤も含まれる。そのような薬剤の例は、（ｉ）ブピバカインなどの細胞透過性を改変させる化学薬品、（ｉｉ）ポリヌクレオチドのカプセル封入のためのリポソームもしくはウイルス粒子、または（ｉｉｉ）自身をポリヌクレオチドと会合させるカチオン性脂質またはシリカ、金、もしくはタングステン微粒子である。陰イオン性および中性リポソームは当技術分野で周知であり（リポソームを作製する方法の詳細な説明には、たとえばＬｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＲＰＣ  Ｎｅｗ  Ｅｄ、ＩＲＬ  ｐｒｅｓｓ（１９９０）を参照）、ポリヌクレオチドを含めた広い範囲の生成物の送達に有用である。また、カチオン性脂質も当技術分野で知られており、遺伝子送達のために一般的に使用されている。そのような脂質には、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピルＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）としても知られるＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３（トリメチルアンモニオ）プロパン）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシル−アンモニウムブロミド）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドログリシルスペルミン）およびＤＣＣｈｏｌ（３ベータ−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメタン）−カルバモイル）コレステロール）などのコレステロール誘導体が含まれる。これらのカチオン性脂質の説明は、ＥＰ１８７，７０２号、ＷＯ９０／１１０９２号、米国特許第５，２８３，１８５号、ＷＯ９１／１５５０１号、ＷＯ９５／２６３５６号、および米国特許第５，５２７，９２８号中に見つけることができる。本開示によって提供される核酸ワクチンと共に使用し得る特定の有用なカチオン性脂質配合物は、水性ビヒクル中で合わせた際に自己アセンブルしてリポソームを形成する、カチオン性脂質（ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ）と中性リン脂質（ＤＰｙＰＥ）の混合物であるＶＡＸＦＥＣＴＩＮである。
【０１０９】
遺伝子送達のためのカチオン性脂質は、一例としてＷＯ９０／１１０９２号に記載されている、ＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）などの中性脂肪と会合させて使用することが好ましい。さらに、ＤＮＡワクチンは、ＣＲＬ１００５などの非イオン性ブロックコポリマーと共に配合することもできる。
【０１１０】
Ｇ．免疫原性ＰＡＡポリペプチド、核酸分子、および組成物の使用
他の態様では、本開示は、本明細書中に上述した免疫原性ＰＡＡポリペプチド、単離核酸分子、および免疫原性ＰＡＡポリペプチドまたは単離核酸分子を含む組成物を使用する方法を提供する。
【０１１１】
一態様では、本開示は、哺乳動物に、（１）標的ＰＡＡに対して免疫原性である、本開示によって提供される免疫原性ＰＡＡポリペプチド、（２）そのような免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている単離核酸分子、（３）そのような免疫原性ＰＡＡポリペプチドを含む組成物、または（４）そのような免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている単離核酸分子を含む組成物を有効量で投与することを含む、哺乳動物、特にヒトにおいてＰＡＡに対する免疫応答を誘発させる方法を提供する。
【０１１２】
一部の実施形態では、本開示は、ヒトに、本開示によって提供される免疫原性ＰＳＭＡ組成物を有効量で投与することを含む、ヒトにおいてＰＳＭＡに対する免疫応答を誘発する方法を提供し、免疫原性ＰＳＭＡ組成物は、（１）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチド、（２）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドをコードしている単離核酸分子、（３）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドを含む組成物、または（４）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドをコードしている単離核酸分子を含む組成物から選択される。
【０１１３】
一部の他の実施形態では、本開示は、ヒトに、本開示によって提供される免疫原性ＰＳＡ組成物を有効量で投与することを含む、ヒトにおいてＰＳＡに対する免疫応答を誘発する方法を提供し、免疫原性ＰＳＡ組成物は、（１）免疫原性ＰＳＡポリペプチド、（２）免疫原性ＰＳＡポリペプチドをコードしている単離核酸分子、（３）免疫原性ＰＳＡポリペプチドを含む組成物、または（４）免疫原性ＰＳＡポリペプチドをコードしている単離核酸分子を含む組成物から選択される。
【０１１４】
別の態様では、本開示は、ヒトにおいて異常な細胞増殖を阻害する方法を提供し、異常な細胞増殖はＰＡＡの過剰発現と関連している。本方法は、ヒトに、過剰発現されたＰＡＡに対して免疫原性である、本開示によって提供される免疫原性ＰＡＡ組成物を有効量で投与することを含む。免疫原性ＰＡＡ組成物は、（１）免疫原性ＰＡＡポリペプチド、（２）１つもしくは複数の免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている単離核酸分子、（３）免疫原性ＰＡＡポリペプチドを含む組成物、または（４）１つもしくは複数の免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている単離核酸分子を含む組成物であり得る。一部の実施形態では、本方法は、ヒトにおいて前立腺中の異常な細胞増殖を阻害するためのものである。特定の実施形態では、本開示は、ヒトに、（１）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチド、（２）１つもしくは複数の免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドをコードしている単離核酸分子、（３）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドを含む組成物、または（４）１つもしくは複数の免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドをコードしている単離核酸分子を含む組成物を有効量で投与することを含む、ＰＳＭＡを過剰発現している前立腺中の異常な細胞増殖を阻害する方法を提供する。
【０１１５】
別の態様では、本開示は、ヒトにおいてがんを処置する方法を提供し、がんはＰＡＡの過剰発現と関連している。本方法は、ヒトに、過剰発現されたＰＡＡに対する免疫応答を誘発することができる免疫原性ＰＡＡ組成物を有効量で投与することを含む。免疫原性ＰＡＡ組成物は、（１）免疫原性ＰＡＡポリペプチド、（２）１つもしくは複数の免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている単離核酸分子、（３）免疫原性ＰＡＡポリペプチドを含む組成物、または（４）１つもしくは複数の免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている単離核酸分子を含む組成物であり得る。本方法で処置し得るがんの例には、乳がん、胃がん、卵巣がん、肺がん、膀胱がん、結腸直腸がん、腎臓がん、膵がんおよび前立腺がんが含まれる。
【０１１６】
一部の実施形態では、本開示は、ヒトに、本明細書中で上記提供した核酸組成物を有効量で投与することを含む、ヒトにおいて前立腺がんを処置する方法を提供する。組成物中の核酸は、免疫原性ＰＳＭＡポリペプチド、免疫原性ＰＳＡポリペプチド、または免疫原性ＰＳＣＡポリペプチドなどの、１つのみの特定の免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしていてよい。また、組成物中の核酸は、（１）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドと免疫原性ＰＳＡポリペプチド、（２）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドと免疫原性ＰＳＣＡポリペプチド、（３）免疫原性ＰＳＡポリペプチドと免疫原性ＰＳＣＡポリペプチド、（４）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドと免疫原性ＰＳＡポリペプチドと免疫原性ＰＳＣＡポリペプチドなどの、２つ以上の異なる免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしていてもよい。組成物中のそれぞれ個々の核酸分子は、ＰＳＭＡポリペプチド、ＰＳＡポリペプチド、またはＰＳＣＡポリペプチドなどの、１つのみの特定の免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしていてよい。あるいは、組成物中の個々の核酸分子は、（１）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドと免疫原性ＰＳＡポリペプチド、（２）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドと免疫原性ＰＳＣＡポリペプチド、（３）免疫原性ＰＳＣＡポリペプチドと免疫原性ＰＳＡポリペプチド、または（４）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドと免疫原性ＰＳＡポリペプチドと免疫原性ＰＳＣＡポリペプチドなどの、２つの異なる種類の免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている複数抗原構築体であり得る。一部の特定の実施形態では、核酸組成物は、少なくとも（４）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドと免疫原性ＰＳＡポリペプチドと免疫原性ＰＳＣＡポリペプチドをコードしている複数抗原構築体を含む。ヒトにおいて前立腺がんを処置するためのワクチン組成物中に含有される、またはワクチン組成物中の核酸によって発現される免疫原性ＰＳＣＡポリペプチドは、好ましくはヒト完全長ＰＳＣＡタンパク質である。
【０１１７】
ポリペプチドおよび核酸組成物は、当技術分野で知られているいくつかの方法によって、ヒトを含めた動物に投与することができる。適切な方法の例には、（１）筋肉内、皮内、表皮内、静脈内、動脈内、皮下、または腹腔内投与、（２）経口投与、および（３）外用適用（眼球、鼻腔内、および膣内適用など）が含まれる。使用し得る核酸ワクチン組成物の皮内または表皮内投与の１つの特定の方法は、ＰｏｗｄｅｒＭｅｄによって市販されている粒子媒介表皮送達（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）（ＰＭＥＤ（商標））ワクチン送達装置を使用した遺伝子銃送達である。ＰＭＥＤは、ワクチンを動物またはヒトに投与するための無針方法である。ＰＭＥＤシステムは、ＤＮＡを微視的な金粒子上に沈降させ、その後、これらをヘリウムガスによって表皮内に推進させることを含む。ＤＮＡがコーティングされた金粒子は表皮のＡＰＣおよびケラチノサイトへと送達され、これらの細胞の核内に入った後、ＤＮＡが金から溶離されて転写活性となり、コードされているタンパク質を生成する。その後、このタンパク質がＡＰＣによってリンパ球に提示されて、Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘導する。本開示によって提供される核酸ワクチンを筋肉内投与するための別の特定の方法は電気穿孔である。電気穿孔は、制御された電気パルスを使用して細胞膜中に一時的な孔を作製し、これが筋肉内に注射された核酸ワクチンの細胞取り込みを促進する。ＣｐＧを核酸ワクチンと組み合わせて使用する場合は、ＣｐＧおよび核酸ワクチンが１つの配合物中に同時配合され、配合物を電気穿孔によって筋肉内投与することが好ましい。
【０１１８】
本開示によって提供される所定の方法において投与する組成物中の免疫原性ＰＡＡポリペプチドまたは免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている核酸の有効量は、当業者によって容易に決定することができ、いくつかの要因に依存する。前立腺がんなどのがんを処置する方法では、免疫原性ＰＡＡポリペプチドまたは核酸の有効量を決定するために考慮し得る要因には、それだけには限定されないが、（１）対象の免疫状態および健康を含めた処置する対象、（２）処置するがんの重症度または段階、（３）使用するまたは発現させる特異的免疫原性ＰＡＡポリペプチド、（４）保護の度合または所望する処置、（５）投与の方法およびスケジュール、ならびに（６）使用する他の治療剤（アジュバントまたは免疫調節剤など）が含まれる。複数抗原ワクチン組成物を含めた核酸ワクチン組成物の事例では、配合および送達の方法は、有効な免疫応答を誘発するために必要な核酸の用量を決定するために主要な要因のうちに入る。たとえば、核酸の有効量は、核酸ワクチン組成物を水溶液として配合し、皮下注射針による注射または空気圧注射によって投与する場合は２μｇ／用量〜１０ｍｇ／用量の範囲であり得る一方で、核酸をコーティングされた金ビーズとして調製し、遺伝子銃技術を使用して送達する場合は１６ｎｇ／用量〜１６μｇ／用量しか必要でない場合がある。電気穿孔による核酸ワクチンの用量範囲は、一般に、０．５〜１０ｍｇ／用量の範囲である。核酸ワクチンをＣｐＧと共に電気穿孔によって同時配合物中で一緒に投与する事例では、核酸ワクチンの用量は０．５〜５ｍｇ／用量の範囲であってよく、ＣｐＧの用量は、典型的には０．０５ｍｇ〜５ｍｇ／用量の範囲、たとえば１人当たり０．０５、０．２、０．６、または１．２ｍｇ／用量である。
【０１１９】
本発明の核酸またはポリペプチドワクチン組成物は、頑強かつ持続性の免疫応答を誘導するためのプライミング−ブースト戦略において使用することができる。同じ免疫原性構築体の繰り返し注射に基づいたプライミングおよびブーストワクチン接種プロトコルは周知である。一般に、最初の投薬は保護的免疫を生じず、免疫系「プライミング」するのみであり得る。保護的免疫応答は２回目または３回目の投薬（「ブースト）後に発生する。ブーストは慣用技術に従って行われ、投与スケジュール、投与経路、アジュバントの選択肢、用量、および他のワクチンと共に投与した場合は潜在的な順序に関して、経験的にさらに最適化することができる。一実施形態では、本発明の核酸またはポリペプチドワクチンは、同じワクチンを動物に複数の用量で投与する、慣用の同種プライミング−ブースト戦略において使用する。別の実施形態では、核酸またはポリペプチドワクチン組成物は、同じ抗原を含有する異なる種類のワクチンを事前に決定された時間間隔で投与する、異種プライミング−ブーストワクチン接種において使用する。たとえば、核酸構築体は、初回投薬（「プライミング」）ではプラスミドの形態で、続く投薬（「ブースト」）ではベクターの一部として、またはその逆で投与し得る。
【０１２０】
前立腺がんの処置には、本発明のポリペプチドまたは核酸ワクチンは、前立腺酸性ホスファターゼに基づく抗原およびアンドロゲン受容体などの他の抗原に基づく前立腺がんワクチンと一緒に使用し得る。
【０１２１】
本発明のポリペプチドまたは核酸ワクチン組成物は、１つまたは複数のアジュバントと共に使用し得る。適切なアジュバントの例には、（１）水中油乳濁液配合物（ムラミルポリペプチドまたは細菌細胞壁構成成分などの他の特異的免疫賦活剤を含むまたは含まない）、たとえば、（ａ）微小流動化装置を使用してサブミクロン粒子へと配合した、５％のスクアレン、０．５％のＴｗｅｅｎ８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）、および０．５％のＳｐａｎ８５（トリオレイン酸ソルビタン）を含有するＭＦ５９（商標）（ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１４８３７号、Ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ、第１０章、Ｐｏｗｅｌｌ＆Ｎｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５）、（ｂ）サブミクロンの乳濁液へと微小流動化した、または渦撹拌してより大きな粒子径の乳濁液を作製したかのどちらかの、１０％のスクアレン、０．４％のＴｗｅｅｎ８０、５％のプルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、（ｃ）２％のスクアレン、０．２％のＴｗｅｅｎ８０、ならびにモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）などの１つまたは複数の細菌細胞壁構成成分を含有するＲＩＢＩ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、モンタナ州Ｈａｍｉｌｔｏｎ）、（２）ＱＳ２１、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、マサチューセッツ州Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ）、Ａｂｉｓｃｏ（登録商標）（スウェーデンＩｓｃｏｎｏｖａ）、またはＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ（登録商標）（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、オーストラリア）などのサポニンアジュバント、（３）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、（４）インターロイキン（たとえば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（ＰＣＴ公開ＷＯ９９／４４６３６号）など）、インターフェロン（たとえばガンマインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等のサイトカイン、（５）肺炎球菌糖類と共に使用した場合は任意選択でミョウバンの実質的非存在下の、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（たとえば、ＧＢ−２２２０２２１号、ＥＰ−Ａ−０６８９４５４号、ＷＯ００／５６３５８号）、（６）３ｄＭＰＬと、たとえばＱＳ２１および／または水中油乳濁液との組合せ（たとえば、ＥＰ−Ａ−０８３５３１８号、ＥＰ−Ａ−０７３５８９８号、ＥＰ−Ａ−０７６１２３１号）、（７）ＣｐＧモチーフを含む、すなわち少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含有し、シトシンがメチル化されていないオリゴヌクレオチド（たとえば、Ｋｒｉｅｇ、Ｖａｃｃｉｎｅ（２０００）１９：６１８〜６２２、Ｋｒｉｅｇ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ（２００１）３：１５〜２４、ＷＯ９８／４０１００号、ＷＯ９８／５５４９５号、ＷＯ９８／３７９１９号、およびＷＯ９８／５２５８１���）、（８）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（たとえばＷＯ９９／５２５４９号）、（９）オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（たとえばＷＯ０１／２１２０７号）、またはオクトキシノールなどの少なくとも１つの追加の非イオン性界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルもしくはエステル界面活性剤（たとえばＷＯ０１／２１１５２号）、（１０）サポニンおよび免疫賦活オリゴヌクレオチド（たとえばＣｐＧオリゴヌクレオチド）（たとえばＷＯ００／６２８００号）、（１１）アルミニウム塩（ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムなど）を含めた金属塩、（１２）サポニンおよび水中油乳濁液（たとえばＷＯ９９／１１２４１号）、（１３）サポニン（たとえばＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＭ２（任意選択で＋ステロール）（たとえばＷＯ９８／５７６５９号）。（１４）組成物の有効性を増強させる免疫賦活剤として作用する他の物質、たとえば、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−２５アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）を含めたムラミルポリペプチド、（１５）ポリＩ：ＣならびにＨｉｌｔｏｎｏｌおよびＡｍｐｌｉｇｅｎなどの類似化合物等のＴＬＲ３リガンドを含めた、天然または合成のトール様受容体（ＴＬＲ）のリガンド（たとえばＫａｎｚｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１３：１５５２〜１５５９（２００７））が含まれる。
【０１２２】
本発明のポリペプチドまたは核酸ワクチン組成物は、１つまたは複数の免疫調節剤と一緒に使用し得る。適切な免疫調節剤の例には、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤（アファチニブ、アキシチニブ、セジラニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、グランジニン、ラパチニブ、レスタウルチニブ、ネラチニブ、パゾパニブ、キザルチニブ、レゴラフェニブ、セマキサニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、チボザニブ、トセラニブ、ボスチニブおよびバンデタニブなど）、ＣＤ４０作用剤（ＣＤ４０作用性抗体など）、ＯＸ４０作用剤（ＯＸ４０作用性抗体など）、ＣＴＬＡ−４阻害剤（抗ＣＴＬＡ−４抗体イピリムマブおよびトレメリムマブなど）、ＴＬＲ作用剤、４−１ＢＢ作用剤、Ｔｉｍ−１拮抗剤、ＬＡＧＥ−３拮抗剤、ならびにＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１拮抗剤が含まれる。
【０１２３】
Ｈ．ワクチンに基づく免疫療法レジメン（ＶＢＩＲ）
さらなる一態様では、本開示は、哺乳動物、特にヒトにおいて新生物性障害を処置するためのワクチンの免疫原性または治療効果を増強させる方法を提供する。本方法は、新生物性障害の処置のためにワクチンを受ける哺乳動物に、（１）有効量の少なくとも１つの免疫抑制性細胞阻害剤（ＩＳＣ阻害剤）と、（２）有効量の少なくとも１つの免疫エフェクター細胞賦活剤（ＩＥＣ賦活剤）とを投与することを含む。本方法は、任意の形態または配合物中のワクチン、たとえば、サブユニットワクチン、タンパク質に基づくワクチン、ペプチドに基づくワクチン、またはＤＮＡに基づくワクチン、ＲＮＡに基づくワクチン、プラスミドに基づくワクチン、もしくはベクターに基づくワクチンなどの核酸に基づくワクチンと組み合わせて使用し得る。さらに、本方法は任意の特定の種類のワクチンまたは任意の特定の種類のがんに限定されない。むしろ、本方法は、良性、前悪性、および悪性の新生物性障害を含めた新生物性障害の処置が意図される任意のワクチンと組み合わせて使用し得る。たとえば、本方法は、以下の新生物性障害の任意のものの処置が意図されるワクチンと組み合わせて使用し得る：膀胱（進行性および転移性の膀胱がんが含まれる）、乳房、結腸（結腸直腸がんが含まれる）、腎臓、肝臓、肺（小細胞および非小細胞肺がんや肺腺癌が含まれる）、卵巣、前立腺、精巣、尿生殖路、リンパ系、直腸、喉頭、膵臓（外分泌膵癌が含まれる）、食道、胃、胆嚢、子宮頸部、甲状腺、および皮膚（扁平細胞癌が含まれる）のものを含めた癌腫、白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫、組織球性リンパ腫、およびバーケットリンパ腫を含めたリンパ系統の造血腫瘍、急性および慢性骨髄性白血病、脊髄形成異常症候群、骨髄性白血病、ならびに前骨髄急性白血病を含めた骨髄系統の造血腫瘍、星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、およびシュワン腫を含めた中枢および末梢神経系の腫瘍、線維肉腫、横紋筋肉腫、および骨肉腫を含めた間葉由来の腫瘍、黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞がん、および奇形癌を含めた他の腫瘍、黒色腫、切除不能の第ＩＩＩまたはＩＶ段階悪性黒色腫、扁平細胞癌、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、神経膠腫、胃腸がん、腎臓がん、卵巣がん、肝臓がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、神経芽細胞腫、膵がん、多形成膠芽細胞腫、子宮頸がん、胃がん、膀胱がん、肝細胞がん、乳がん、結腸がん、および頭頸部がん、胃がん、生殖細胞腫瘍、骨がん、骨腫瘍、成人悪性骨線維性組織球腫、小児悪性骨線維性組織球腫、肉腫、小児肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、新生物、形質細胞新生物、脊髄形成異常症候群、神経芽細胞腫、精巣生殖細胞腫瘍、眼内黒色腫、脊髄形成異常症候群、脊髄形成異常／骨髄増殖性疾患、滑膜肉腫、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病（Ｐｈ＋ＡＬＬ）、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、および肥満細胞症。
【０１２４】
一部の実施形態では、本開示は、ヒトにおいて前立腺がんを処置するためのワクチンの免疫原性または治療効果を増強させる方法を提供する。投与するワクチンは、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、またはＰＳＣＡなどの任意のヒトＰＡＡに対する免疫応答を誘発させ得る。一部の特定の実施形態では、投与するワクチンは、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、またはＰＳＣＡなどのヒトＰＡＡに対して免疫原性を誘発することができる抗原をコードしている核酸分子を含む。ワクチン中に含有され得る具体的な核酸分子の例には、本開示によって提供される以下のものが含まれる。
１）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチド、免疫原性ＰＳＡポリペプチド、または免疫原性ＰＳＣＡポリペプチドをコードしている核酸分子、
２）本開示によって提供される２つの免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている核酸分子、たとえば、ａ）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドと免疫原性ＰＳＡポリペプチド、ｂ）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドと免疫原性ＰＳＣＡポリペプチド、またはｃ）免疫原性ＰＳＡポリペプチドと免疫原性ＰＳＣＡポリペプチド、ならびに
３）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチド、免疫原性ＰＳＡポリペプチド、および免疫原性ＰＳＣＡポリペプチドである、３つの免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている核酸分子。
【０１２５】
別のさらなる態様では、本開示は、哺乳動物、特にヒトにおいて新生物性障害を処置する方法を提供する。本方法は、哺乳動物に、（１）有効量の新生物性障害に関連するＴＡＡに対する免疫応答を誘発することができるワクチンと、（２）有効量の少なくとも１つの免疫抑制性細胞阻害剤（ＩＳＣ阻害剤）と、（３）有効量の少なくとも１つの免疫エフェクター細胞賦活剤（ＩＥＣ賦活剤）とを投与することを含む。特定のＴＡＡに対する免疫応答を誘発することができる任意のワクチンを本方法で使用し得る。多くのＴＡＡが当技術分野で知られている。前立腺関連抗原に加えて、当技術分野で知られているＴＡＡの例は以下である：結腸直腸がんにはＣＥＡ、ＭＵＣ−１、Ｅｐ−ＣＡＭ、５Ｔ４、ｈＣＧ−ｂ、Ｋ−ｒａｓ、およびＴＥＲＴ、卵巣がんにはＣＥＡ、Ｍｕｃ−１、ｐ５３、メソテリン、サバイビン、およびＮＹ−ＥＳＯ−１、非小細胞肺がんにはＭｕｃ−１、５Ｔ４、ＷＴ−１、ＴＥＲＴ、ＣＥＡ、ＥＧＦ−ＲおよびＭＡＧＥ−Ａ３、腎細胞癌には５Ｔ４、ならびに膵がんにはＭｕｃ−１、メソテリン、Ｋ−Ｒａｓ、アネキシンＡ２、ＴＥＲＴ、およびＣＥＡ。新しいＴＡＡが同定され続けている。既知または新しいＴＡＡのうちの任意のものに対する免疫応答を誘発することができるワクチンを、本方法で使用することができる。さらに、投与するワクチンは、任意の形態または配合物中、たとえば、サブユニットワクチン、タンパク質に基づくワクチン、ペプチドに基づくワクチン、またはＤＮＡに基づくワクチン、ＲＮＡに基づくワクチン、プラスミドに基づくワクチン、もしくはベクターに基づくワクチンなどの核酸に基づくワクチンであってよい。
【０１２６】
一部の実施形態では、本開示は、ヒトにおいて前立腺がんを処置する方法を提供し、本方法は、ヒトに、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、またはＰＳＣＡなどの任意のヒトＰＡＡに対する免疫応答を誘発することができるワクチンを投与することを含む。一部の特定の実施形態では、投与するワクチンは、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、またはＰＳＣＡなどのヒトＰＡＡに対して免疫原性を誘発し得る抗原をコードしている核酸分子を含む。ワクチン中に含有され得る具体的な核酸分子の例には、本開示によって提供される以下のものが含まれる。
１）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチド、免疫原性ＰＳＡポリペプチド、または免疫原性ＰＳＣＡポリペプチドをコードしている核酸分子、
２）本開示によって提供される２つの免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている核酸分子、たとえば、ａ）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドと免疫原性ＰＳＡポリペプチド、ｂ）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドと免疫原性ＰＳＣＡポリペプチド、またはｃ）免疫原性ＰＳＡポリペプチドと免疫原性ＰＳＣＡポリペプチド、ならびに
３）免疫原性ＰＳＭＡポリペプチド、免疫原性ＰＳＡポリペプチド、および免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドである、３つの免疫原性ＰＡＡポリペプチドをコードしている核酸分子。
【０１２７】
本明細書中に上述した、哺乳動物において新生物性障害を処置する方法、および哺乳動物において新生物性障害を処置するためのワクチンの免疫原性または治療効果を増強させる方法は、「ワクチンに基づく免疫療法レジメン」（すなわち「ＶＢＩＲ」）とも呼ばれる。
【０１２８】
ワクチンに基づく免疫療法レジメンでは、ＩＥＣ賦活剤およびＩＳＣ阻害剤は、（１）静脈内、筋肉内、または経口投与などの全身投与、ならびに（２）皮内および皮下投与などの局所投与を含めた、任意の適切な方法および経路によって投与し得る。妥当または適切である場合は、一般に全身投与よりも局所投与が好ましい。任意のＩＥＣ賦活剤およびＩＳＣ阻害剤の局所投与は、医薬品の局所投与に適した、哺乳動物の身体の任意の位置で実施することができるが、これらの免疫調節剤は、ワクチン流入領域リンパ節に非常に近接して局所投与することがより好ましい。
【０１２９】
単一のクラスのＩＥＣ賦活剤からの２つ以上の特異的ＩＥＣ賦活剤（たとえば２つのＣＴＬＡ作用剤）をＩＳＣ阻害剤と組み合わせて投与し得る。さらに、２つ以上の異なるクラスのＩＥＣ賦活剤からの２つ以上の特異的ＩＥＣ賦活剤（たとえば１つのＣＴＬＡ−４拮抗剤および１つのＴＬＲ作用剤）を一緒に投与し得る。同様に、単一のクラスのＩＳＣ阻害剤からの２つ以上の特異的ＩＳＣ阻害剤（たとえば２つ以上のプロテインキナーゼ阻害剤）をＩＥＣ賦活剤と組み合わせて投与し得る。さらに、２つ以上の異なるクラスのＩＳＣ阻害剤からの２つ以上の特異的ＩＳＣ阻害剤（たとえば１つのプロテインキナーゼ阻害剤および１つのＣＯＸ−２阻害剤）を一緒に投与し得る。
【０１３０】
ワクチンに基づく免疫療法レジメンでは、ワクチンは、使用した任意またはすべての免疫調節剤（すなわちＩＳＣ阻害剤およびＩＥＣ賦活剤）と同時に、または順次に投与し得る。同様に、２つ以上の免疫調節剤を使用する場合は、これらを互いに関して同時にまたは順次に投与し得る。一部の実施形態では、ワクチンは、１つの免疫調節剤に関しては同時に（たとえば混合物中で）投与するが、１つまたは複数の追加の免疫調節剤に関しては順次に投与する。ワクチンに基づく免疫療法レジメンにおけるワクチンと免疫調節剤との同時投与には、抗原および免疫調節剤を同時に投与していない場合でも、ワクチンおよび少なくとも１つの免疫調節剤を、それぞれがワクチン流入領域リンパ節などの投与部位に同時に存在するように投与する事例が含まれることができる。また、ワクチンと免疫調節剤との同時投与には、ワクチンまたは免疫調節剤が投与部位から除去されているが、除去されたワクチンまたは免疫調節剤の少なくとも１つの細胞効果が、ワクチン流入領域リンパ節などの投与部位で、１つまたは複数の追加の免疫調節剤が少なくとも投与部位に投与されるまで持続する事例も含まれることができる。核酸ワクチンをＣｐＧと組み合わせて投与する事例では、ワクチンおよびＣｐＧを単一の配合物内に含有させ、任意の適切な方法によって一緒に投与し得る。一部の実施形態では、同時配合物（混合物）中の核酸ワクチンおよびＣｐＧは、電気穿孔と組み合わせた筋肉内注射によって投与する。
【０１３１】
任意のＩＳＣ阻害剤をワクチンに基づく免疫療法レジメンにおいて使用し得る。ＳＩＣ阻害剤のクラスの例には、プロテインキナーゼ阻害剤、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤、ホスホジエステラーゼ５型（ＰＤＥ５）阻害剤、およびＤＮＡ架橋結合剤が含まれる。ＣＯＸ−２阻害剤の例にはセレコキシブおよびロフェコキシブが含まれる。ＰＤＥ５阻害剤の例には、アバナフィル、ロデナフィル、ミロデナフィル、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ウデナフィル、およびザプリナストが含まれる。ＤＮＡ架橋結合剤の例はシクロホスファミドである。具体的なプロテインキナーゼ阻害剤の例を以下に詳述する。
【０１３２】
用語「プロテインキナーゼ阻害剤」とは、プロテインキナーゼの選択的または非選択的阻害剤として作用する任意の物質をいう。用語「プロテインキナーゼ」とは、アデノシン三リン酸の末端リン酸基の、タンパク質基質中のチロシン、セリンまたはスレオニン残基への転移を触媒する酵素をいう。プロテインキナーゼには受容体チロシンキナーゼおよび非受容体チロシンキナーゼが含まれる。受容体チロシンキナーゼの例には、ＥＧＦＲ（たとえば、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１／ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４）、ＩＮＳＲ（インスリン受容体）、ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＧＦ−ＩＩ１Ｒ、ＩＲＲ（インスリン受容体関連受容体）、ＰＤＧＦＲ（たとえば、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ）、ｃ−ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＶＥＧＦＲ−１／ＦＬＴ−１、ＶＥＧＦＲ−２／ＦＬＫ−１／ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ−３／ＦＬＴ−４、ＦＬＴ−３／ＦＬＫ−２、ＣＳＦ−１Ｒ、ＦＧＦＲ１〜４、ＣＣＫ４、ＴＲＫ  Ａ〜Ｃ、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＡ１〜８、ＥＰＨＢ１〜６、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ、ＴＥＫ、ＲＹＫ、ＤＤＲ１〜２、ＲＥＴ、ｃ−ＲＯＳ、ＬＴＫ（白血球チロシンキナーゼ）、ＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ）、ＲＯＲ１〜２、ＭＵＳＫ、ＡＡＴＹＫ１〜３、およびＲＴＫ１０６が含まれる。非受容体チロシンキナーゼの例には、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｓｒｃ、Ｆｒｋ、Ｂｔｋ、Ｃｓｋ、Ａｂｌ、Ｚａｐ７０、Ｆｅｓ／Ｆｐｓ、Ｆａｋ、Ｊａｋ、Ａｃｋ、およびＬＩＭＫが含まれる。本開示によって提供されるワクチンに基づく免疫療法レジメンでは、プロテインキナーゼ阻害剤は哺乳動物に最適以下の用量で投与する。用語「最適以下の用量」とは、チロシンキナーゼ阻害剤を標的新生物性障害のために単独療法（すなわち、いかなる他の治療剤も用いずにプロテインキナーゼ阻害剤を単独で投与する場合）で投与した場合の最小有効用量未満である用量をいう。
【０１３３】
ワクチンに基づく免疫療法レジメンにおける使用に適した具体的なプロテインキナーゼ阻害剤の例には、ラパチニブ、ＡＺＤ２１７１、ＥＴ１８ＯＣＨ３、インディルビン−３’−オキシム、ＮＳＣ−１５４０２０、ＰＤ１６９３１６、ケルセチン、ロスコビチン、トリシリビン、ＺＤ１８３９、５−ヨードツベルシジン、アダフォスチン、アロイシン、アルスターパウロン、アミノゲニステイン、ＡＰＩ−２、アピゲニン、アルクチゲニン、ＡＲＲＹ−３３４５４３、アキシチニブ（ＡＧ−０１３７３６）、ＡＹ−２２９８９、ＡＺＤ２１７１、ビスインドリルマレイミドＩＸ、ＣＣｌ−７７９、シェレリスリン、ＤＭＰＱ、ＤＲＢ、エデルホシン、ＥＮＭＤ−９８１６９３、エルブスタチン類似体、エルロチニブ、ファスジル、ゲフィチニブ（ＺＤ１８３９）、Ｈ−７、Ｈ−８、Ｈ−８９、ＨＡ−１００、ＨＡ−１００４、ＨＡ−１０７７、ＨＡ−１１００、ヒドロキシファスジル、ケンパウロン、ＫＮ−６２、ＫＹ１２４２０、ＬＦＭ−Ａ１３、ルテオリン、ＬＹ２９４００２、ＬＹ−２９４００２、マロトキシン、ＭＬ−９、ＭＬＮ６０８、ＮＳＣ−２２６０８０、ＮＳＣ−２３１６３４、ＮＳＣ−６６４７０４、ＮＳＣ−６８０４１０、ＮＵ６１０２、オロモウシン、オキシインドールＩ、ＰＤ１５３０３５、ＰＤ９８０５９、フロリジン、ピセタノール、ピクロポドフィリン、ＰＫＩ、ＰＰ１、ＰＰ２、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、ＰＴＫ７８７／ＺＫ−２２２５８４、プルバラノールＡ、Ｒａｐａｍｕｎｅ、ラパマイシン、Ｒｏ３１−８２２０、ロットレリン、ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２０３５８０、シロリムス、ＳＬ３２７、ＳＰ６００１２５、スタウロスポリン、ＳＴＩ−５７１、ＳＵ１４９８、ＳＵ４３１２、ＳＵ５４１６、ＳＵ５４１６（セマキサニブ）、ＳＵ６６５６、ＳＵ６６６８、ｓｙｋ阻害剤、ＴＢＢ、ＴＣＮ、チルホスチンＡＧ１０２４、チルホスチンＡＧ４９０、チルホスチンＡＧ８２５、チルホスチンＡＧ９５７、Ｕ０１２６、Ｗ−７、ワートマニン、Ｙ−２７６３２、Ｚａｃｔｉｍａ（ＺＤ６４７４）、ＺＭ２５２８６８、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））、スニチニブリンゴ酸塩（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）、ＳＵ１１２４８）、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）、ＯＳＩ−１７７４）、ラパチニブ（ＧＷ５７２０１６、ＧＷ２０１６）、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６）、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）、ＳＴＩ５７１）、ダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５）、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（Ｚａｃｔｉｍａ（登録商標）、ＺＤ６４７４）、およびニロチニブが含まれる。本発明における使用に適したさらなるプロテインキナーゼ阻害剤は、たとえば、米国特許第５，６１８，８２９号、第５，６３９，７５７号、第５，７２８，８６８号、第５，８０４，３９６号、第６，１００，２５４号、第６，１２７，３７４号、第６，２４５，７５９号、第６，３０６，８７４号、第６，３１３，１３８号、第６，３１６，４４４号、第６，３２９，３８０号、第６，３４４，４５９号、第６，４２０，３８２号、第６，４７９，５１２号、第６，４９８，１６５号、第６，５４４，９８８号、第６，５６２，８１８号、第６，５８６，４２３号、第６，５８６，４２４号、第６，７４０，６６５号、第６，７９４，３９３号、第６，８７５，７６７号、第６，９２７，２９３号、および第６，９５８，３４０号に記載されている。
【０１３４】
一部の実施形態では、プロテインキナーゼ阻害剤は、複数の具体的なキナーゼに作用する阻害剤である複数キナーゼ阻害剤である。複数キナーゼ阻害剤の例には、イマチニブ、ソラフェニブ、ラパチニブ、ＢＩＲＢ−７９６、およびＡＺＤ−１１５２、ＡＭＧ７０６、Ｚａｃｔｉｍａ（ＺＤ６４７４）、ＭＰ−４１２、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６）、ダサチニブ、ＣＥＰ−７０１（レスタウルチニブ）、ＸＬ６４７、ＸＬ９９９、Ｔｙｋｅｒｂ（ラパチニブ）、ＭＬＮ５１８（以前はＣＴ５３５１８として知られる）、ＰＫＣ４１２、ＳＴ１５７１、ＡＥＥ７８８、ＯＳＩ−９３０、ＯＳＩ−８１７、スニチニブリンゴ酸塩（Ｓｕｔｅｎｔ）、アキシチニブ（ＡＧ−０１３７３６）、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アキシチニブ、ボスチニブ、テムシロリムスならびにニロチニブ（ＡＭＮ１０７）が含まれる。一部の特定の実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤は、スニチニブ、ソラフェニブ、またはスニチニブもしくはソラフェニブの薬学的に許容できる塩もしくは誘導体（リンゴ酸塩やトシル酸塩など）である。
【０１３５】
Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．によって商品名ＳＵＴＥＮＴの下で販売されているスニチニブリンゴ酸塩は、ブタン二酸、ヒドロキシ−、（２Ｓ）−、Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−１，２−ジヒドロ−２−オキソ−３Ｈ−インドール−３−イルイジン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミドとの化合物（１：１）として化学的に記載される。この化合物、その合成、および特定の多型体は、米国特許第６，５７３，２９３号、米国特許公開第２００３−０２２９２２９号、第２００３−００６９２９８号および第２００５−００５９８２４号、ならびにＪ．Ｍ．Ｍａｎｌｅｙ、Ｍ．Ｊ．Ｋａｌｍａｎ、Ｂ．Ｇ．Ｃｏｎｗａｙ、Ｃ．Ｃ．Ｂａｌｌ、Ｊ．Ｌ  ＨａｖｅｎｓおよびＲ．Ｖａｉｄｙａｎａｔｈａｎ、「Ｅａｒｌｙ  Ａｍｉｄａｔｉｏｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ３−［（４−ａｍｉｄｏ）ｐｙｒｒｏｌ−２−ｙｌ］−２−ｉｎｄｏｌｉｎｏｎｅｓ」、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｗ．、６８、６４４７〜６４５０（２００３）に記載されている。スニチニブおよびそのＬ−リンゴ酸塩の配合物はＰＣＴ公開ＷＯ２００４／０２４１２７号に記載されている。スニチニブリンゴ酸塩は、切除不能な局所的に進行性または転移性の疾患に罹患している患者における、胃腸間質腫瘍、進行性腎細胞癌、および進行性の十分に分化した脾臓神経内分泌腫瘍を処置するために、米国において認可されている。ヒトにおける胃腸間質腫瘍（ＧＩＳＴ）および進行性腎細胞癌（ＲＣＣ）のためのスニチニブリンゴ酸塩の推奨用量は、４週間の処置、続いて２週間の休止のスケジュール（スケジュール４／２）の、１日１回の５０ｍｇの経口摂取である。脾臓神経内分泌腫瘍（ｐＮＥＴ）のためのスニチニブリンゴ酸塩の推奨用量は、１日１回の３７．５ｍｇの経口摂取である。
【０１３６】
ワクチンに基づく免疫療法レジメンでは、スニチニブリンゴ酸塩は単一用量または複数用量で経口投与し得る。典型的には、スニチニブリンゴ酸塩を２回、３回、４回またはそれより多くの連続した週１回の用量で送達し、スニチニブリンゴ酸塩を送達しない約１もしくは２週間またはそれより長い「休止」期間が続く。一実施形態では、用量を約４週間送達し、２週間休止する。別の実施形態では、スニチニブリンゴ酸塩を２週間送達し、１週間休止する。しかし、全処置期間の間に「休止」期間なしで送達してもよい。ワクチンに基づく免疫療法レジメンにおいてヒトに経口投与するスニチニブリンゴ酸塩の有効量は、典型的には１人当たり４０ｍｇ未満／用量である。たとえば、これは、１人当たり３７．５、３１．２５、２５、１８．７５、１２．５、６．２５ｍｇ／日で経口投与し得る。一部の実施形態では、スニチニブリンゴ酸塩は、１人当たり１〜２５ｍｇ／用量の範囲で経口投与する。一部の他の実施形態では、スニチニブリンゴ酸塩は、１人当たり６．２５、１２．５、または１８．７５ｍｇ／用量の範囲で経口投与する。他の投薬レジメンおよび変動が予測でき、医師の指導によって決定されるであろう。
【０１３７】
商品名ＮＥＸＡＶＡＲの下で販売されているソラフェニブトシル酸塩も、複数キナーゼ阻害剤である。その化学名は４−（４−｛３−［４−クロロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル］ウレイド｝フェノキシ）−Ｎ−メチルピリジン−２−カルボキサミドである。これは、原発性腎臓がん（進行性腎細胞癌）および進行性原発性肝臓がん（肝細胞癌）を処置するために米国において認可されている。推奨１日用量は、１日２回の４００ｍｇの経口摂取である。本開示によって提供されるワクチンに基づく免疫療法レジメンでは、経口投与するソラフェニブトシル酸塩の有効量は、典型的には１人当たり４００ｍｇ未満／日である。一部の実施形態では、経口投与するソラフェニブトシル酸塩の有効量は、１人当たり１０〜３００ｍｇ／日の範囲である。一部の他の実施形態では、経口投与するソラフェニブトシル酸塩の有効量は、１人当たり１０〜２００ｍｇ／日、たとえば、１人当たり１０、２０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、または２００ｍｇ／日である。
【０１３８】
商品名ＩＮＬＹＴＡの下で販売されているアキシチニブは、ＶＥＧＦ受容体１、２、および３の選択的阻害剤である。その化学名は（Ｎ−メチル−２−［３−（（Ｅ）−２−ピリジン−２−イル−ビニル）−１Ｈ−インダゾール−６−イルスルファニル］−ベンズアミドである。これは、１回の以前の全身療法が失敗した後の進行性腎細胞癌を処置するために認可されている。開始用量は１日２回の経口の５ｍｇである。用量調節は、個々の安全性および許容性に基づいて行うことができる。本開示によって提供されるワクチンに基づく免疫療法レジメンでは、経口投与するアキシチニブの有効量は、典型的には１日２回の５ｍｇ未満である。一部の他の実施形態では、経口投与するアキシチニブの有効量は、１日２回の１〜５ｍｇである。一部の他の実施形態では、経口投与するアキシチニブの有効量は、１日２回の１、２、３、４、または５ｍｇの間である。
【０１３９】
ワクチンに基づく免疫療法レジメンでは、任意のＩＥＣ賦活剤を使用し得る。これらは低分子または高分子（タンパク質、ポリペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および抗体など）であり得る。使用し得るＩＥＣ賦活剤の例には、ＴＮＦＲ作用剤、ＣＴＬＡ−４拮抗剤、ＴＬＲ作用剤、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）拮抗剤（ＢＭＳ−９３６５５８など）、抗ＰＤ−１抗体ＣＴ−０１１）、およびプログラム細胞死タンパク質１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）拮抗剤（ＢＭＳ−９３６５５９など）、リンパ球−活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）拮抗剤、ならびにＴ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有分子−３（ＴＩＭ−３）拮抗剤が含まれる。具体的なＴＮＦＲ作用剤、ＣＴＬＡ−４拮抗剤、およびＴＬＲ作用剤の例を本明細書中以下に詳細に提供する。
【０１４０】
ＴＮＦＲ作用剤。
ＴＮＦＲ作用剤の例には、ＯＸ４０、４−１ＢＢ（ＢＭＳ−６６３５１３など）、ＧＩＴＲ（ＴＲＸ５１８など）、およびＣＤ４０の作用剤が含まれる。具体的なＣＤ４０作用剤の例を本明細書以下に詳述する。
【０１４１】
ＣＤ４０作用剤は、細胞上のＣＤ４０受容体と結合し、１つまたは複数のＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌ関連活性を増加させることができる物質である。したがって、ＣＤ４０「作用剤」にはＣＤ４０「リガンド」が包含される。
【０１４２】
ＣＤ４０作用剤の例には、ＣＤ４０作用性抗体、ＣＤ４０作用性抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ならびに、そのオリゴマー（たとえば二価の三量体ＣＤ４０Ｌ）、含有融合タンパク質および変異体などのＣＤ４０Ｌの断片および誘導体が含まれる。
【０１４３】
本発明で使用するためのＣＤ４０リガンドには、細胞上の１つまたは複数のＣＤ４０受容体と結合してそれを活性化することができる任意のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードしている核酸が含まれる。適切なＣＤ４０リガンドは、たとえば、すべての特許および出願ならびにそれ中に開示されているＣＤ４０Ｌ配列がその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、米国特許第６，４８２，４１１号、第６，４１０，７１１号、米国特許第６，３９１，６３７号、および米国特許第５，９８１，７２４号に記載されている。ヒト治療における使用にはヒトＣＤ４０リガンドが好ましいが、任意の種からのＣＤ４０リガンドを本発明において使用し得る。獣医学の実施形態などの他の動物種での使用には、処置する動物に一致するＣＤ４０リガンドの種が好ましい。特定の実施形態では、ＣＤ４０リガンドは、天然に形成されるｇｐ３９ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質オリゴマー、ならびにオリゴマー化配列を含むｇｐ３９ペプチド、ポリペプチド、タンパク質（およびコード核酸）を含めた、ｇｐ３９ペプチドまたはタンパク質オリゴマーである。二量体、三量体および四量体などのオリゴマーが本発明の特定の態様において好ましい一方で、本発明の他の態様では、オリゴマー構造が１つまたは複数のＣＤ４０受容体と結合してそれを活性化させる能力を保持している限りは、より大きなオリゴマー構造の使用が企図される。
【０１４４】
特定の他の実施形態では、ＣＤ４０作用剤は抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合断片である。抗体は、ヒト、ヒト化、または部分的にヒトのキメラ抗ＣＤ４０抗体であることができる。具体的な抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の例には、Ｇ２８−５、ｍＡｂ８９、ＥＡ−５またはＳ２Ｃ６モノクローナル抗体、およびＣＰ８７０８９３が含まれる。特定の実施形態では、抗ＣＤ４０作用性抗体はＣＰ８７０８９３またはダセツズマブ（ＳＧＮ−４０）である。
【０１４５】
ＣＰ−８７０，８９３は、抗腫瘍治療として臨床的に調査されている、完全にヒトの作用性ＣＤ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。ＣＰ８７０，８９３の構造および調製はＷＯ２００３０４１０７０号に開示されている（抗体は内部識別「２１．４．１」によって識別されている）。ＣＰ−８７０，８９３の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４０および配列番号４１に記載する。臨床治験では、ＣＰ８７０，８９３は、一般に輸液１つあたり０．０５〜０．２５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、静脈輸液によって投与した。第Ｉ相臨床研究では、ＣＰ−８７０８９３の最大耐量（ＭＴＤ）は０．２ｍｇ／ｋｇであると推定され、用量規制毒性にはグレード３ＣＲＳおよびグレード３蕁麻疹が含まれていた。［Ｊｅｎｓ  Ｒｕｔｅｒら：Ｉｍｍｕｎｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｗｅｅｋｌｙ  ｄｏｓｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  ａｇｏｎｉｓｔ  ＣＤ４０  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ、１０：１０、９８３〜９９３、Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １５、２０１０］。本開示によって提供されるワクチンに基づく免疫療法レジメンでは、ＣＰ−８７０，８９３は皮内、皮下、または外用投与することができる。皮内投与することが好ましい。レジメンにおいて投与するＣＰ８７０８９３の有効量は、一般に０．２ｍｇ／ｋｇ未満、典型的には０．０１ｍｇ〜０．１５ｍｇ／ｋｇ、または０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【０１４６】
ダセツズマブ（ＳＧＮ−４０またはｈｕＳ２Ｃ６としても知られる、ＣＡＳ番号８８−４８６−５９−９）は、無痛性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫および多発性骨髄腫の臨床治験において調査されている別の抗ＣＤ４０作用性抗体である。臨床治験では、ダセツズマブを２ｍｇ／ｋｇ〜１６ｍｇ／ｋｇの範囲の週に１回の用量で静脈内投与した。本開示によって提供されるワクチンに基づく免疫療法レジメンでは、ダセツズマブは皮内、皮下、または外用投与することができる。皮内投与することが好ましい。ワクチンに基づく免疫療法レジメンにおいて投与するダセツズマブの有効量は、一般に１６ｍｇ／ｋｇ未満、典型的には０．２ｍｇ〜１４ｍｇ／ｋｇ、または０．５〜８ｍｇ／ｋｇ、または１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【０１４７】
ＣＴＬＡ−４阻害剤。
本開示によって提供されるワクチンに基づく免疫療法レジメンにおいて使用するための適切な抗ＣＴＬＡ−４拮抗剤には、それだけには限定されないが、抗ＣＴＬＡ−４抗体（ヒト抗ＣＴＬＡ−４抗体、マウス抗ＣＴＬＡ−４抗体、哺乳動物抗ＣＴＬＡ−４抗体、ヒト化抗ＣＴＬＡ−４抗体、モノクローナル抗ＣＴＬＡ−４抗体、ポリクローナル抗ＣＴＬＡ−４抗体、キメラ抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＣＴＬＡ−４ドメイン抗体など）、抗ＣＴＬＡ−４抗体の断片（単鎖抗ＣＴＬＡ−４断片、重鎖抗ＣＴＬＡ−４断片、および軽鎖抗ＣＴＬＡ−４断片など）、ならびに共刺激経路をアゴナイズするＣＴＬＡ−４の阻害剤が含まれる。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ−４阻害剤はイピリムマブまたはトレメリムマブである。
【０１４８】
ＹＥＲＶＯＹとして市販されているイピリムマブ（ＭＥＸ−０１０またはＭＤＸ−１０１としても知られる）は、ヒト抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体である。イピリムマブはそのＣＡＳ登録番号４７７２０２−００−９によって言及することもでき、すべての目的のためにその全体で本明細書中に参考として組み込まれているＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４号において抗体１０ＤＩとして開示されている。イピリムマブを含む医薬組成物の例はＰＣＴ公開ＷＯ２００７／６７９５９号中に提供されている。イピリムマブは、切除不能または転移性の黒色腫を処置するために米国において認可されている。単独療法としてのイピリムマブの推奨用量は、３週間毎に静脈内投与による３ｍｇ／ｋｇ、合計４回の投薬である。本発明によって提供される方法では、イピリムマブは局所投与する、特に皮内または皮下で投与する。局所投与するイピリムマブの有効量は、典型的には１人当たり５〜２００ｍｇ／用量の範囲である。一部の実施形態では、イピリムマブの有効量は、１人当たり１用量あたり１０〜１５０ｍｇ／用量の範囲である。一部の特定の実施形態では、イピリムマブの有効量は、１人当たり約１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ｍｇ／用量である。
【０１４９】
トレメリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６としても知られる）は完全にヒトのＩｇＧ２モノクローナル抗体であり、ＣＡＳ番号７４５０１３−５９−６を有する。トレメリムマブは、すべての目的のためにその全体で本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第６，６８２，７３６号において抗体１１．２．１として開示されている。トレメリムマブの重鎖および軽鎖のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４２および４３に記載する。トレメリムマブは、黒色腫および乳がんを含めた様々な腫瘍を処置するための臨床治験において調査されており、そこではトレメリムマブを、単一用量または複数用量のどちらかで、４または１２週間毎に、０．０１および１５ｍｇ／ｋｇの用量範囲で静脈内投与した。本発明によって提供されるレジメンでは、トレメリムマブは局所投与する、特に皮内または皮下で投与する。皮内または皮下投与するトレメリムマブの有効量は、典型的には１人当たり５〜２００ｍｇ／用量の範囲である。一部の実施形態では、トレメリムマブの有効量は、１人当たり１用量あたり１０〜１５０ｍｇ／用量の範囲である。一部の特定の実施形態では、トレメリムマブの有効量は、１人当たり約１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ｍｇ／用量である。
【０１５０】
トール様受容体（ＴＬＲ）作用剤。
用語「トール様受容体作用剤」または「ＴＬＲ作用剤」とは、トール様受容体（ＴＬＲ）の作用剤として作用する化合物をいう。これには、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、およびＴＬＲ１１またはその組合せの作用剤が含まれる。別段に指定しない限りは、ＴＬＲ作用性化合物への言及には、任意の異性体（たとえばジアステレオマーまたは鏡像異性体）、塩、溶媒和物、多型体などを含めた、任意の薬学的に許容できる形態の化合物が含まれることができる。特に、化合物に光学活性がある場合、化合物への言及には化合物の鏡像異性体および鏡像異性体のラセミ混合物のそれぞれが含まれることができる。また、化合物は、１つまたは複数の特定のＴＬＲの作用剤（たとえば、ＴＬＲ７作用剤、ＴＬＲ８作用剤、またはＴＬＲ７／８作用剤）として同定され得る。
【０１５１】
特定の化合物のＴＬＲアゴニズムは、当技術分野で知られている任意の適切な様式で評価し得る。用いる特定のアッセイにかかわらず、化合物を用いたアッセイの実施により特定のＴＬＲによって媒介される何らかの生物活性の少なくとも閾値の増加がもたらされる場合は、化合物を特定のＴＬＲの作用剤として同定することができる。逆に、指定されたＴＬＲによって媒介される生物活性を検出するように設計されたアッセイを実施するために使用した際に、化合物が生物活性の閾値の増加の誘発に失敗した場合は、化合物を、指定されたＴＬＲの作用剤として作用しないとして同定し得る。別段に指定しない限りは、生物活性の増加とは、適切な対照に観察されたものと同じ生物活性を超える増加をいう。アッセイは、適切な対照と併せて実施してもしなくてもよい。経験と共に、当業者は特定のアッセイで十分な熟知度を発達させる場合があり（たとえば、特定のアッセイ条件下で適切な対照において観察された値の範囲）、したがって特定のアッセイにおける化合物のＴＬＲアゴニズムを決定するために対照の実施が必ずしも必要でない場合がある。
【０１５２】
本発明の方法において有用な特定のＴＬＲ作用剤は、タンパク質、ペプチドなどの生体高分子とは対照的に、有機低分子である。低分子ＴＬＲ作用剤の例は、たとえば、米国特許第４，６８９，３３８号、第４，９２９，６２４号、第４，９８８，８１５号、第５，０３７，９８６号、第５，１７５，２９６号、第５，２３８，９４４号、第５，２６６，５７５号、第５，２６８，３７６号、第５，３４６，９０５号、第５，３５２，７８４号、第５，３６７，０７６号、第５，３８９，６４０号、第５，３９５，９３７号、第５，４４６，１５３号、第５，４８２，９３６号、第５，６９３，８１１号、第５，７４１，９０８号、第５，７５６，７４７号、第５，９３９，０９０号、第６，０３９，９６９号、第６，０８３，５０５号、第６，１１０，９２９号、第６，１９４，４２５号、第６，２４５，７７６号、第６，３３１，５３９号、第６，３７６，６６９号、第６，４５１，８１０号、第６，５２５，０６４号、第６，５４５，０１６号、第６，５４５，０１７号、第６，５５８，９５１号、および第６，５７３，２７３号中に開示されているものが含まれる。本発明によって提供される方法において有用な具体的な低分子ＴＬＲ作用剤の例には、４−アミノ−アルファ、アルファ，２−トリメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール、Ｎ−（２−｛２−［４−アミノ−２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］エトキシ−｝エチル）−Ｎ−メチルモルホリン−４−カルボキサミド、１−（２−アミノ−２−メチルプロピル）−２−（エトキシメチル−）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン、Ｎ−［４−（４−アミノ−２−エチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）ブチル］メタンスルホンアミド、Ｎ−［４−（４−アミノ−２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）ブチル］メタンスルホンアミド、およびイミキモドが含まれる。本開示によって提供される方法またはレジメンにおいて特に有用な一部のＴＬＲ作用剤は、総説論文であるＦｏｌｋｅｒｔ  Ｓｔｅｉｎｈａｇｅｎら：ＴＬＲ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ．、Ｖａｃｃｉｎｅ、２９（２０１１）：３３４１〜３３５５中に記述されている。
【０１５３】
一部の実施形態では、ＴＬＲ作用剤はＴＬＲ９作用剤、特にＣｐＧオリゴヌクレオチド（すなわちＣｐＧ．ＯＤＮ）である。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、リン酸結合によって連結されたシトシン、続いてグアニンを含有する短い核酸分子であり、シトシンのピリミジン環はメチル化されていない。ＣｐＧモチーフは、中心ＣｐＧに隣接する（その３’側および５’側に）少なくとも１つの塩基によって取り囲まれている、メチル化されていない中心ＣｐＧが含まれる塩基のパターンである。ＣｐＧオリゴヌクレオチドには、ＤおよびＫオリゴヌクレオチドがどちらも含まれる。ＣｐＧオリゴヌクレオチド全体がメチル化されていないことができる、または一部分がメチル化されていない場合がある。本開示によって提供される方法において有用なＣｐＧオリゴヌクレオチドの例には、米国特許第６１９４３８８号、第６２０７６４６号、第６２１４８０６号、第６２８３７１号、第６２３９１１６号、および第６３３９０６８号中に開示されているものが含まれる。
【０１５４】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドには、天然ＲＮＡおよびＤＮＡと比較して、リン酸ジエステルヌクレオシド間橋、ベータ−Ｄ−リボース（デオキシリボース単位および／または天然ヌクレオシド塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル）を含む様々な化学修飾および置換が包含されることができる。化学修飾の例は当業者に知られており、たとえば、Ｕｈｌｍａｎｎ  Ｅ．ら（１９９０）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、９０：５４３、「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ」、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ，ＵＳＡ、１９９３、Ｃｒｏｏｋｅ，ＳＴ．ら（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、３６：１０７〜１２９、およびＨｕｎｚｉｋｅｒ  Ｊ．ら、（１９９５）、Ｍｏｄ．Ｓｙｎｔｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、７：３３１〜４１７に記載されている。具体的には、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは修飾シトシンを含有することができる。修飾シトシンは、天然に存在するまたは天然に存在しないシトシンのピリミジン塩基類似体であり、これは、オリゴヌクレオチドの免疫賦活活性を損なわせずにこの塩基を置換することができる。修飾シトシンには、それだけには限定されないが、５位置換のシトシン（たとえば、５−メチル−シトシン、５−フルオロシトシン、５−クロロ−シトシン、５−ブロモ−シトシン、５−ヨード−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシメチル−シトシン、５−ジフルオロメチル−シトシン、および非置換または置換の５−アルキニル−シトシン）、６位置換のシトシン、Ｎ４位置換のシトシン（たとえばＮ４−エチル−シトシン）、５−アザ−シトシン、２−メルカプト−シトシン、イソシトシン、擬似イソシトシン、縮合環系を有するシトシン類似体（たとえばＮ，Ｎ’−プロピレンシトシンまたはフェノキサジン）、ならびにウラシルおよびその誘導体（たとえば、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−ブロモビニル−ウラシル、４−チオ−ウラシル、５−ヒドロキシ−ウラシル、５−プロピニル−ウラシル）が含まれる。一部の好ましいシトシンには、５−メチル−シトシン、５−フルオロ−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシメチル−シトシン、およびＮ４−エチル−シトシンが含まれる。
【０１５５】
また、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは修飾グアニンを含有することもできる。修飾グアニンは、天然に存在するまたは天然に存在しないグアニンのプリン塩基類似体であり、これは、オリゴヌクレオチドの免疫賦活活性を損なわせずにこの塩基を置換することができる。修飾グアニンには、それだけには限定されないが、７−デアザグアニン、７−デアザ−７位置換のグアニン、ヒポキサンチン、Ｎ２位置換のグアニン（たとえばＮ２−メチル−グアニン）、５−アミノ−３−メチル−３Ｈ，６Ｈ−チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２，７−ジオン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、プリン、インドール、アデニン、置換アデニン（たとえばＮ６−メチル−アデニン、８−オキソ−アデニン）、８位置換のグアニン（たとえば８−ヒドロキシグアニンおよび８−ブロモグアニン）、ならびに６−チオグアニンが含まれる。本開示の一部の実施形態では、グアニン塩基は、普遍塩基（たとえば、４−メチル−インドール、５−ニトロ−インドール、およびＫ−塩基）、芳香環系（たとえば、ベンズイミダゾールまたはジクロロ−ベンズイミダゾール、１−メチル−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−カルボン酸アミド）または水素原子によって置換されている。
【０１５６】
特定の態様では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドには修飾された主鎖が含まれる。核酸主鎖の修飾は、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与した際に核酸の活性の増強をもたらすことが実証されている。ステムループなどの二次構造は、核酸を分解に対して安定化させることができる。あるいは、核酸の安定化は、リン酸主鎖の修飾によって達成することができる。好ましい安定化された核酸は、少なくとも部分的にホスホロチオエート修飾された主鎖を有する。ホスホロチオエートは、ホスホロアミデートまたはＨ−ホスホネート化学のどちらかを用いた自動技法を使用して合成し得る。アリールおよびアルキルホスホネートは、たとえば米国特許第４，４６９，８６３号に記載のように作製することができ、アルキルホスホトリエステル（米国特許第５，０２３，２４３号および欧州特許第０９２，５７４号に記載のように荷電酸素部分がアルキル化されている）は、市販の試薬を使用した自動固相合成によって調製することができる。他のＤＮＡ主鎖の修飾および置換を作製する方法が記載されている（Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．およびＰｅｙｍａｎ，Ａ．（１９９０）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、９０：５４４、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、１：１６５）。ＣｐＧモチーフを有する２’−Ｏ−メチル核酸も免疫活性化を引き起こし、エトキシ修飾ＣｐＧ核酸もそうである。実際、ＣｐＧ効果を完全に無効にする主鎖修飾は見つかっていないが、Ｃを５−メチルＣで置き換えることによってこれは大幅に低下される。ホスホロチオエート連結を有する構築体は最大限の活性をもたらし、核酸を細胞内エクソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼによる分解から保護する。他の修飾されたオリゴヌクレオチドには、リン酸ジエステル修飾されたオリゴヌクレオチド、リン酸ジエステルとホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとの組合せ、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ｐ−エトキシ、およびその組合せが含まれる。これらの組合せのそれぞれおよび免疫細胞に対するその特定の効果は、ＣｐＧ核酸に関してＰＣＴ公開ＷＯ９６／０２５５５号およびＷＯ９８／１８８１０号ならびに米国特許第６，１９４，３８８号および第６，２３９，１１６号により詳細に記述されている。
【０１５７】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、１つまたは２つの接近可能な５’末端を有し得る。たとえば、２つのオリゴヌクレオチドを３’−３’連結によって付着させて１つまたは２つの接近可能な５’末端を有するオリゴヌクレオチドを作製することによって、２つのそのような５’末端を有する修飾されたオリゴヌクレオチドを作製することが可能である。３’−３’連結は、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート、または任意の他の修飾されたヌクレオシド間橋であり得る。そのような連結を達成する方法は当技術分野で知られている。たとえば、そのような連結は、Ｓｅｌｉｇｅｒ，Ｈ．ら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ３’−３’−  ａｎｄ  ５’−５’−ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ  ｌｉｎｋａｇｅｓ  ａｓ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（１９９１）、１０（１〜３）、４６９〜７７およびＪｉａｎｇら、Ｐｓｅｕｄｏ−ｃｙｃｌｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９）、７（１２）、２７２７〜２７３５に記載されている。
【０１５８】
さらに、３’末端ヌクレオシド間の連結がリン酸ジエステル、ホスホロチオエートまたは他の修飾橋ではない３’−３’連結のオリゴヌクレオチドは、トリまたはテトラエチレングリコールリン酸部分などの追加のスペーサーを使用して調製することができる（Ｄｕｒａｎｄ，Ｍ．ら、Ｔｒｉｐｌｅ−ｈｅｌｉｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｏｎｅ  （ｄＡ）１２  ａｎｄ  ｔｗｏ  （ｄＴ）１２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｒｉｄｇｅｄ  ｂｙ  ｔｗｏ  ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｃｈａｉｎｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９２）、３１（３８）、９１９７〜２０４、米国特許第５，６５８，７３８号および第５，６６８，２６５号）。あるいは、非ヌクレオチドリンカーを、エタンジオール、プロパンジオール、または脱塩基デオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）単位（Ｆｏｎｔａｎｅｌ，Ｍａｒｉｅ  Ｌａｕｒｅｎｃｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９４）、２２（１１）、２０２２〜７）から、標準のホスホルアミダイト化学を使用して誘導し得る。非ヌクレオチドリンカーは、１回もしくは複数回取り込ませるか、または互いに組み合わせて、連結させる２つのオリゴヌクレオチドの３’末端間に任意の望ましい距離を可能にする。
【０１５９】
ヌクレオシドの３’および／または５’末端に位置するリン酸ジエステルヌクレオシド間橋を修飾されたヌクレオシド間橋によって置き換えることができ、修飾されたヌクレオシド間橋は、たとえば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ＮＲ１Ｒ２−ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、ａ−ヒドロキシベンジルホスホネート、リン酸−（Ｃ１〜Ｃ２１）−Ｏ−アルキルエステル、リン酸−［（Ｃ６〜Ｃ２１）アリール−（Ｃ１〜Ｃ２１）−Ｏ−アルキル］エステル、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルホスホネートおよび／または（Ｃ６〜Ｃ１２）アリールホスホネート橋、（Ｃ７〜Ｃ１２）−ａ−ヒドロキシメチル−アリール（たとえばＰＣＴ公開ＷＯ９５／０１３６３号中に開示）から選択され、式中、（Ｃ６〜Ｃ１２）アリール、（Ｃ６〜Ｃ２０）アリールおよび（Ｃ６〜Ｃ１４）アリールは、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ニトロ、シアノによって置換されていてもよく、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、水素、（Ｃ１〜Ｃ１８）−アルキル、（Ｃ６〜Ｃ２０）−アリール、（Ｃ６〜Ｃ１４）−アリール、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル、好ましくは水素、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル、好ましくは（Ｃ１〜Ｃ４）−アルキルおよび／もしくはメトキシエチルであるか、または、Ｒ１およびＲ２は、それらを保有している窒素原子と一緒になって、５〜６員の複素環を形成し、これはＯ、ＳおよびＮからなる群から選択されるさらなるヘテロ原子をさらに含有することができる。
【０１６０】
ヌクレオシドの３’および／または５’末端に位置するリン酸ジエステル橋を脱リン酸橋（脱リン酸橋は、たとえば、Ｕｈｌｍａｎｎ  Ｅ．およびＰｅｙｍａｎ  Ａ．、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第２０巻、「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ」、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、１９９３、第１６章、ページ３５５ｆｆに記載されている）によって置き換え、脱リン酸橋は、たとえば、脱リン酸橋であるホルムアセタール、３’−チオホルムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オキシム、メチレンジメチル−ヒドラゾ、ジメチレンスルホンおよび／またはシリル基から選択される。
【０１６１】
本開示によって提供される方法またはレジメンにおいて使用するＣｐＧオリゴヌクレオチドは、キメラ主鎖を有していてもよい。キメラ主鎖とは、複数の種類の連結を含むものである。一実施形態では、キメラ主鎖は、式：５’  Ｙ１  Ｎ１ＺＮ２Ｙ２  ３’によって表すことができる。Ｙ１およびＹ２はヌクレオチドを１〜１０個有する核酸分子である。Ｙ１およびＹ２には、それぞれ少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間連結が含まれる。キメラオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも２個のヌクレオチドに主鎖修飾が含まれるため、これらの核酸は「安定化された免疫賦活核酸」の一種の一例である。
【０１６２】
キメラオリゴヌクレオチドに関して、Ｙ１およびＹ２は互いに独立しているとみなされる。これは、Ｙ１およびＹ２のそれぞれが、同じ分子中で互いとは異なる配列および異なる主鎖連結を有していても、有していなくてもよいことを意味する。一部の実施形態では、Ｙ１および／またはＹ２は３〜８個のヌクレオチドを有する。Ｎ１およびＮ２は、ヌクレオチドを０〜５個有する核酸分子であり、ただし、Ｎ１ＺＮ２は合計で少なくとも６個のヌクレオチドを有する。Ｎ１ＺＮ２のヌクレオチドはリン酸ジエステル主鎖を有しており、修飾された主鎖を有する核酸を含まない。Ｚは免疫賦活核酸モチーフ、好ましくは本明細書中に列挙するものから選択されたものである。
【０１６３】
式Ｙ１  Ｎ１ＺＮ２Ｙ２の中心ヌクレオチド（Ｎ１ＺＮ２）はリン酸ジエステルヌクレオチド間連結を有しており、Ｙ１およびＹ２は、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間連結を有するが、複数であってもよく、またはさらにはすべてが修飾されたヌクレオチド間連結であってもよい。好ましい実施形態では、Ｙ１および／またはＹ２は少なくとも２個もしくは２〜５個の修飾されたヌクレオチド間連結を有するか、または、Ｙ１は５個の修飾されたヌクレオチド間連結を有し、Ｙ２は２個の修飾されたヌクレオチド間連結を有する。一部の実施形態では、修飾されたヌクレオチド間連結は、ホスホロチオエート修飾された連結、ホスホロジチオエート連結またはｐ−エトキシ修飾された連結である。
【０１６４】
本開示によって提供される方法において有用な特定のＣｐＧオリゴヌクレオチドの例には以下が含まれる。
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ３’（ＣｐＧ  ７９０９）；
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ３’（ＣｐＧ  ２４５５５）；および
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＣＧＴＴＴＴ３’（ＣｐＧ  １０１０３）。
【０１６５】
合成２４量体の一本鎖であるＣｐＧ７９０９は、がんの処置について、単独療法として、および化学療法剤と組み合わせて、ならびにがんおよび感染性疾患に対するワクチンのアジュバントとしてのアジュバントについて大規模に調査されている。ＣｐＧ７９０９の単一の静脈内用量は、１．０５ｍｇ／ｋｇまで臨床効果なしかつ顕著な毒性なしで良好に耐用された一方で、単一用量の皮下のＣｐＧ７９０９は、筋痛および体質効果の用量規制毒性を伴って０．４５ｍｇ／ｋｇの最大耐量（ＭＴＤ）を有していたことが報告された。［Ｚｅｎｔ，Ｃｌｉｖｅ  Ｓら：Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ７９０９（ＰＦ−０３５１２６７６）ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ、５３（２）：２１１〜２１７（７）（２０１２）を参照されたい。本開示によって提供されるレジメンでは、ＣｐＧ７９０９は、筋肉内への注射または任意の他の適切な方法によって投与し得る。これは、ワクチン流入領域リンパ節に近接して、特に皮内または皮下投与によって局所投与することが好ましい。ＤＮＡワクチンなどの核酸ワクチンと共に使用するためには、ＣｐＧを好ましくは単一の配合物中でワクチンと共に同時配合し、電気穿孔と連結させた筋肉内注射によって投与し得る。筋肉内、皮内、または皮下投与によるＣｐＧ７９０９の有効量は、典型的には１０μｇ／用量〜１０ｍｇ／用量の範囲である。一部の実施形態では、ＣｐＧ７９０９の有効量は０．０５ｍｇ〜１４ｍｇ／用量の範囲である。一部の特定の実施形態では、ＣｐＧ７９０９の有効量は、約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０５  １ｍｇ／用量である。ＣｐＧ２４５５５およびＣｐＧ１０１０３を含めた他のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、同様の様式および用量レベルで投与し得る。
【０１６６】
一部の特定の実施形態では、本開示は、ヒトに、（１）有効量の少なくとも１つのＩＳＣ阻害剤と、（２）有効量の少なくとも１つのＩＥＣ賦活剤とを投与することを含む、ヒトにおいて新生物性障害を処置するためのワクチンの免疫原性または治療効果を増強させる方法を提供し、少なくとも１つのＩＳＣ阻害剤は、ソラフェニブトシル酸塩、スニチニブリンゴ酸塩、アキシチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アキシチニブ、ボスチニブ、テムシロリムス、またはニロチニブから選択されるプロテインキナーゼ阻害剤であり、少なくとも１つのＩＥＣ賦活剤は、ＣＴＬＡ−４阻害剤、ＴＬＲ作用剤、またはＣＤ４０作用剤から選択される。一部の好ましい実施形態では、レジメンは、ヒトに、（１）有効量の少なくとも１つのＩＳＣ阻害剤と、（２）有効量の少なくとも１つのＩＥＣ賦活剤とを投与することを含み、少なくとも１つのＩＳＣ阻害剤は、アキシチニブ、ソラフェニブトシル酸塩、またはスニチニブリンゴ酸塩から選択されるプロテインキナーゼ阻害剤であり、少なくとも１つのＩＥＣ賦活剤は、イピリムマブまたはトレメリムマブから選択されるＣＴＬＡ−４阻害剤である。一部のさらに好ましい実施形態では、レジメンは、ヒトに、（１）有効量の少なくとも１つのＩＳＣ阻害剤と、（２）有効量の少なくとも２つのＩＥＣ賦活剤とを投与することを含み、少なくとも１つのＩＳＣ阻害剤は、スニチニブまたはアキシチニブから選択されるプロテインキナーゼ阻害剤であり、少なくとも２つのＩＥＣ賦活剤は、トレメリムマブ、およびＣｐＧ７９０９、ＣｐＧ２４５５、またはＣｐＧ１０１０３から選択されるＴＬＲ作用剤である。
【０１６７】
一部の他の実施形態では、本開示は、ヒトに、（１）有効量のヒトＰＡＡに対する免疫応答を誘発することができるワクチンと、（２）有効量の少なくとも１つのＩＳＣ阻害剤と、（３）有効量の少なくとも１つのＩＥＣ賦活剤とを投与することを含む、ヒトにおいて前立腺がんを処置する方法を提供し、少なくとも１つのＩＳＣ阻害剤は、ソラフェニブトシル酸塩、スニチニブリンゴ酸塩、アキシチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アキシチニブ、ボスチニブ、テムシロリムス、またはニロチニブから選択されるプロテインキナーゼ阻害剤であり、少なくとも１つのＩＥＣ賦活剤は、ＣＴＬＡ−４阻害剤、ＴＬＲ作用剤、またはＣＤ４０作用剤から選択される。一部の好ましい実施形態では、本方法は、ヒトに、（１）有効量のヒトＰＡＡに対する免疫応答を誘発することができるワクチンと、（２）有効量の少なくとも１つのＩＳＣ阻害剤と、（３）有効量の少なくとも１つのＩＥＣ賦活剤とを投与することを含み、少なくとも１つのＩＳＣ阻害剤は、ソラフェニブトシル酸塩、スニチニブリンゴ酸塩、またはアキシチニブから選択されるプロテインキナーゼ阻害剤であり、少なくとも１つのＩＥＣ賦活剤は、イピリムマブまたはトレメリムマブから選択されるＣＴＬＡ−４阻害剤である。
【０１６８】
一部のさらなる具体的な実施形態では、本方法は、ヒトに、（１）有効量の少なくとも１つのＩＳＣ阻害剤と、（２）有効量の少なくとも２つのＩＥＣ賦活剤とを投与することを含み、少なくとも１つのＩＳＣ阻害剤は、スニチニブまたはアキシチニブから選択されるプロテインキナーゼ阻害剤であり、少なくとも２つのＩＥＣ賦活剤は、トレメリムマブ、およびＣｐＧ７９０９、ＣｐＧ２４５５、またはＣｐＧ１０１０３から選択されるＴＬＲ作用剤である。
【０１６９】
追加の治療剤。
本開示によって提供されるワクチンに基づく免疫療法レジメンは追加の治療剤をさらに含み得る。化学療法剤およびホルモン治療剤を含めた様々ながん治療剤を使用し得る。当業者は、本開示によって提供されるＶＢＩＲにおいて使用することができる他のがん治療剤の存在および開発を理解し、本明細書中に記載の治療形態に制限されないであろう。
【０１７０】
用語「化学療法剤」とは、がん細胞の死を引き起こす、またはがん細胞の成長、分裂、修復、および／もしくは機能に干渉することができる、化学物質または生体物質をいう。化学療法剤の例には、その開示が本明細書中に参考として組み込まれているＷＯ２００６／０８８６３９号、ＷＯ２００６／１２９１６３号、およびＵＳ２００６０１５３８０８号中に開示されているものが含まれる。特定の化学療法剤の例には、（１）クロラムブシル（ＬＥＵＫＥＲＡＮ）、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ）、イホスファミド（ＩＦＥＸ）、塩酸メクロレタミン（ＭＵＳＴＡＲＧＥＮ）、チオテパ（ＴＨＩＯＰＬＥＸ）、ストレプトゾトシン（ＺＡＮＯＳＡＲ）、カルムスチン（ＢＩＣＮＵ、ＧＬＩＡＤＥＬ  ＷＡＦＥＲ）、ロムスチン（ＣＥＥＮＵ）、およびダカルバジン（ＤＴＩＣ−ＤＯＭＥ）などのアルキル化剤、（２）細胞毒性抗生物質を含めたアルカロイドまたは植物ビンカアルカロイド、たとえば、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ）、エピルビシン（ＥＬＬＥＮＣＥ、ＰＨＡＲＭＯＲＵＢＩＣＩＮ）、ダウノルビシン（ＣＥＲＵＢＩＤＩＮＥ、ＤＡＵＮＯＸＯＭＥ）、ネモルビシン、イダルビシン（ＩＤＡＭＹＣＩＮ  ＰＦＳ、ＺＡＶＥＤＯＳ）、ミトキサントロン（ＤＨＡＤ、ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ）、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ、ＣＯＳＭＥＧＥＮ）、プリカマイシン（ＭＩＴＨＲＡＣＩＮ）、マイトマイシン（ＭＵＴＡＭＹＣＩＮ）、およびブレオマイシン（ＢＬＥＮＯＸＡＮＥ）、酒石酸ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ））、ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ）、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ）、およびビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ）、（３）カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ）、シタラビン（ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ）、フルダラビン（ＦＬＵＤＡＲＡ）、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ）、ヒドロキシ尿素（ＨＹＤＲＡ）、メトトレキサート（ＦＯＬＥＸ、ＭＥＸＡＴＥ、ＴＲＥＸＡＬＬ）、ネララビン（ＡＲＲＡＮＯＮ）、トリメトレキセート（ＮＥＵＴＲＥＸＩＮ）、およびペメトレキセド（ＡＬＩＭＴＡ）などの代謝拮抗剤、（４）ピリミジン拮抗剤、たとえば５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ）、ラルチトレキセド（トムデックス）、テガフール−ウラシル（ＵＦＴＯＲＡＬ）、およびゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ）、（５）ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ）などのタキサン、（６）白金薬物、たとえばシスプラチン（ＰＬＡＴＩＮＯＬ）およびカルボプラチン（ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ）、およびオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ）、（７）イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ）、トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ）、エトポシド（ＥＴＯＰＯＰＨＯＳ、ＶＥＰＥＳＳＩＤ、ＴＯＰＯＳＡＲ）、およびテニポシド（ＶＵＭＯＮ）などのトポイソメラーゼ阻害剤、（８）エトポシド（ＥＴＯＰＯＰＨＯＳ、ＶＥＰＥＳＳＩＤ、ＴＯＰＯＳＡＲ）などのエピポドフィロトキシン（ポドフィロトキシン誘導体）、（９）ロイコボリン（ＷＥＬＬＣＯＶＯＲＩＮ）などの葉酸誘導体、（１０）カルムスチン（ＢｉＣＮＵ）、ロムスチン（ＣｅｅＮＵ）などのニトロソ尿素、（１１）表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）��血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、肝細胞成長因子受容体（ＨＧＦＲ）、および血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）を含めた受容体チロシンキナーゼの阻害剤、たとえば、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ）、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ）、ゲネフィチニブ、ラパチニブ、ソラフェニブ、サリドマイド、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ）、アキシチニブ、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ、ＭＡＢＴＨＥＲＡ）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ）、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）、およびラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ）、ｌｙｍ−１（ＯＮＣＯＬＹＭ）、ＷＯ２００２／０５３５９６号に開示されているインスリン様成長因子−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）に対する抗体）、（１２）血管形成阻害剤、たとえば、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）、スラミン（ＧＥＲＭＡＮＩＮ）、アンジオスタチン、ＳＵ５４１６、サリドマイド、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤（バチマスタットおよびマリマスタットなど）、ＷＯ２００２０５５１０６号中に開示されているもの、ならびに（１３）ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ）などのプロテアソーム阻害剤が含まれる。
【０１７１】
用語「ホルモン治療剤」とは、ホルモンの産生を阻害もしくは排除する、またはがん細胞の成長および／もしくは生存に対するホルモンの効果を阻害もしくは相殺する、化学物質または生体物質をいう。ＶＢＩＲに適したそのような薬剤の例には、ＵＳ２００７０１１７８０９号中に開示されているものが含まれる。特定のホルモン治療剤の例には、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ）、トレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ）、アナストロゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ）、エキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ）、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＣＥ）、ゴセレリン（ＺＯＬＡＤＥＸ）、ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ）、アビラテロン、およびＭＤＶ３１００が含まれる。
【０１７２】
また、本開示によって提供されるＶＢＩＲは、（１）卵巣、精巣、副腎、および下垂体などの、ホルモンの産生に参加する器官または腺の一部または全体を除去する外科的方法、ならびに（２）患者の器官または腺を、標的ホルモンの産生を阻害または排除するために十分な量の放射線に供する放射線療法を含めた、他の治療と組み合わせても使用し得る。
【実施例】
【０１７３】
Ｉ．実施例
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を例示するために提供する。これらは、いかなる様式でも本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。上記記述およびこれらの実施例から、当業者は本発明の重要な特徴を確認することができ、その精神および範囲から逸脱せずに、様々な使用および条件に適応させるために本発明の様々な変更および改変を行うことができる。
【０１７４】
（実施例１）
ヒトＰＳＭＡタンパク質に由来するサイトゾル形、分泌形、および膜結合形の抗原
実施例１は、それぞれ「ヒトＰＳＭＡサイトゾル抗原」、「ヒトＰＳＭＡ分泌抗原」、および「ヒトＰＳＭＡ膜結合抗原」と呼ばれる３つの免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドの構築、ならびにこれらのポリペプチドの生物学的特性を例示する。
【０１７５】
１Ａ．免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドの設計
サイトゾル形、分泌形、および修飾形の免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドをコードしているＤＮＡ構築体をネイティブヒトＰＳＭＡタンパク質配列に基づいて構築し、抗腫瘍エフェクター免疫応答を誘導するその能力について試験した。ヒトＰＳＭＡ抗原形のそれぞれ構造および調製を以下に提供する。
【０１７６】
１Ａ１．ヒトＰＳＭＡサイトゾル抗原。サイトゾル形の免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドは、免疫原性ポリペプチドが発現された後にそれを細胞内に保持するように設計した。ヒトＰＳＭＡの細胞質ドメイン（アミノ酸１〜１９）および膜貫通ドメイン（アミノ酸２０〜４３）を除去し、配列番号１のヒトＰＳＭＡのアミノ酸４４〜７５０（細胞外ドメインすなわちＥＣＤ）からなるサイトゾルＰＳＭＡポリペプチドをもたらした。発現を増強させるために最適コザック配列「ＭＡＳ」をポリペプチドのＮ末端に付加し得る。
【０１７７】
１Ａ２．ヒトＰＳＭＡ分泌抗原。分泌形の免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドは、ポリペプチドが発現された後にそれを細胞外に分泌するように設計した。分泌ポリペプチドは、ＰＳＭＡ抗原が発現された後にその分泌を最大限にするために、配列番号１のヒトＰＳＭＡのアミノ酸４４〜７５０（ＥＣＤ）ならびにアミノ酸配列ＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤを有するＩｇカッパ分泌エレメントおよびＮ末端の２個のアミノ酸のリンカー（ＡＡ）から作製されている。
【０１７８】
１Ａ３．ヒトＰＳＭＡ膜結合抗原。免疫原性ＰＳＭＡ膜結合ポリペプチドは、細胞表面上のポリペプチドを安定化させるように設計した。ヒトＰＳＭＡタンパク質の最初の１４個のアミノ酸を除去し、生じる免疫原性ポリペプチドは、配列番号１のヒトＰＳＭＡタンパク質のアミノ酸１５〜７５０からなる。配列番号１のネイティブヒトＰＳＭＡタンパク質のアミノ酸１５〜７５０からなり、ネイティブヒトＰＳＭＡタンパク質と１００％の配列同一性を共有する免疫原性ポリペプチドは、本開示において「ヒトＰＳＭＡ改変」、「ｈＰＳＭＡ改変」、または「ｈＰＳＭＡｍｏｄ」抗原とも呼ばれる。
【０１７９】
１Ｂ．ＰＳＭＡ抗原を発現するＤＮＡプラスミドの調製
ＰＳＭＡサイトゾル抗原、ＰＳＭＡ分泌抗原、およびＰＳＭＡ改変抗原をコードしているＤＮＡ構築体を、動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏ試験に適したＰＪＶ７５６３ベクター内に個々にクローニングした（図１）。ＰＪＶ７５６３ベクター中のＤＮＡのどちらの鎖も配列決定して、設計の完全性を確認した。
【０１８０】
大スケールプラスミドＤＮＡ調製物（Ｑｉａｇｅｎ／ＣｓＣｌ）を配列が確認されたクローンから生成した。プラスミドＤＮＡの品質は、高い２６０／２８０比、高いスーパーコイル／ニックＤＮＡ比、低い内毒素レベル（＜１０Ｕ／ｍｇのＤＮＡ）および陰性の生物汚染によって確認された。
【０１８１】
１Ｃ．哺乳動物細胞におけるＰＳＭＡ構築体の発現
ＰＳＭＡサイトゾル抗原、分泌抗原、および改変抗原の発現はＦＡＣＳによって決定した。哺乳動物２９３細胞を、様々な免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドをコードしているＰＪＶ７５６３ＰＭＥＤベクターで形質移入した。３日後、２９３細胞を、マウス抗ＰＳＭＡ抗体、続いて蛍光コンジュゲート（ＦＩＴＣ）ラット抗マウス二次抗体で染色した。陰性対照に対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）として報告した以下のデータにより、ヒトＰＳＭＡ改変抗原が細胞表面上に発現されていることが確認された。
【０１８２】
【表１】
2019054804.tif 000003
【０１８３】
１Ｄ．金粒子上へのＰＳＭＡプラスミドの配合（ＮＤ１０／Ｘ１５用）
粒子媒介表皮送達（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）技術（ＰＭＥＤ）とは、ワクチンを動物または患者に投与する無針方法である。ＰＭＥＤシステムは、ＤＮＡを微視的な金粒子上に沈降させ、その後、これらをヘリウムガスによって表皮内に推進させることを含む。単回使用の装置であるＮＤ１０は、内部シリンダーからの加圧ヘリウムを使用して金粒子を送達し、連発式（ｒｅｐｅａｔｅｒ）送達装置であるＸ１５は、高圧ホースを介してＸ１５と接続された外部ヘリウムタンクを使用して金粒子を送達する。これらの装置をどちらも、ＰＳＭＡ  ＤＮＡプラスミドを送達する研究において使用した。金粒子は通常は直径１〜３μｍであり、粒子は１ｍｇの金粒子あたり２μｇのＰＳＭＡプラスミドを含有するように配合した。（Ｓｈａｒｐｅ，Ｍ．ら：Ｐ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  Ｈ５Ｎ１  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｂｙ  ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｖａｃｃｉｎｅ、２００７、２５（３４）：６３９２〜９８、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＬＫら：Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａ  ｐｏｗｄｅｒｅｄ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ  ｂｙ  ａ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  ｄｅｖｉｃｅ．Ｖａｃｃｉｎｅ、２００５、２３（４０）：４８６７〜７８）。
【０１８４】
１Ｅ．ｉｎ  ｖｉｖｏ研究に使用したトランスジェニックマウス
２つのヒトＨＬＡトランスジェニックマウスモデルを使用して様々なＨＬＡによる様々なＰＳＭＡ抗原の提示を評価し、１つのヒトＰＳＭＡトランスジェニックマウスモデルを使用してヒトＰＳＭＡに対する免疫寛容の破壊を評価した。第１のＨＬＡトランスジェニックマウスモデルでは、ＨＬＡ  Ａ２／ＤＲ１マウス（Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、フランス、パリ、「パスツールマウス」とも呼ばれる）を利用する。パスツールマウスはネズミβ−２−ミクログロブリンがノックアウトされており、機能的なＨ−２ｂ分子を発現しない。したがって、このモデルは、ヒトＨＬＡ  Ａ２およびＤＲ１のコンテキストにおける抗原の提示を表すと考えられる（Ｐａｊｏｔ，Ａ．、Ｍ．−Ｌ．Ｍｉｃｈｅｌ、Ｎ．Ｆａｘｉｌｌｅａｕ、Ｖ．Ｐａｎｃｒｅ、Ｃ．Ａｕｒｉａｕｌｔ、Ｄ．Ｍ．Ｏｊｃｉｕｓ、Ｆ．Ａ．Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒ、およびＹ．−Ｃ．Ｌｏｎｅ．Ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ：ＨＬＡ−Ａ２．１−／ＨＬＡ−ＤＲ１−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｈ−２  ｃｌａｓｓ  Ｉ−／ｃｌａｓｓ  ＩＩ−ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００４、３４：３０６０〜６９）。第２のＨＬＡトランスジェニックマウスモデルでは、Ｈ２ｂｋ座位でヒトβ−２−ミクログロブリンと共有結合されているヒトＨＬＡ  Ａ２４がノックインされているマウスを使用する。これらのマウスはネズミβ−２−ミクログロブリンを欠いており、機能的なＨ−２ｂ分子を発現しない。このモデルはヒトＨＬＡ  Ａ２４のコンテキストにおける抗原提示の評価を可能にする。
【０１８５】
１Ｆ．サイトゾル形、分泌形、および修飾形のヒトＰＳＭＡタンパク質の免疫原性
研究設計。８〜１０週齢のトランスジェニックマウスを、ＰＭＥＤ方法を使用して、様々なＰＳＭＡ  ＤＮＡ構築体を用いて、プライミング／ブースト／ブーストレジメンにおいて、それぞれのワクチン接種の間を２週間の間隔として免疫化した。あるいは、マウスを、５０μｌ（ＰＢＳ）中に１×１０９個のウイルス粒子のＰＳＭＡ抗原をコードしているアデノウイルスベクターを用いて、筋肉内注射によってプライミングした。アデノウイルスベクター（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶベクター）を、多重クローニング部位内にＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩ制限部位を含有するように改変した。その後、改変されたヒトＰＳＭＡをコードしているＤＮＡをＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩで制限消化し、このベクター内にライゲーションさせ、配列を確認した。その後、ｐＳｈｕｔｔｌｅヒトＰＳＭＡ改変ベクターをｐＡｄＥａｓｙ−１ベクターと組み換えさせ、ＡｄＥａｓｙシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従ってウイルスを増殖させた。２０日後、上述のＰＭＥＤを用いてこれらをブーストした。使用したレジメンのそれぞれにおいて、抗原特異的Ｔ細胞応答は、最後の免疫化の７日後にインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで測定した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイはサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に類似している。手短に述べると、ＩＦＮγ  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃５１−２５２５ｋｃ）に特異的な捕捉抗体をマイクロプレート中のポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜上に終夜、４℃でコーティングする。抗体との非特異的結合を防止するためにプレートを血清／タンパク質で遮断する。遮断後、エフェクター細胞（ＰＳＭＡで免疫化したマウスから単離した脾細胞など）および標的（ペプチドライブラリからのＰＳＭＡペプチド、ペプチドをパルシングした標的細胞もしくは関連抗原を発現する腫瘍細胞など）またはマイトジェン（脾細胞を非特異的に刺激してＩＦＮγを産生させるをウェルに加え、終夜、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内でインキュベーションした。エフェクター細胞によって分泌されたサイトカインをＰＶＤＦ膜の表面上のコーティング抗体によって捕捉した。細胞および培養培地を除去した後、検出のために１００μｌのビオチン標識したポリクローナル抗マウスＩＦＮγ抗体（０．５ｍｇ／ｍｌ−ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃５１−１８１８ｋｚ）をそれぞれのウェルに加えた。ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃５５７６３０）および沈殿基質である３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）を加えることによってスポットを可視化して、赤色のスポットが得られた。それぞれのスポットは単一のサイトカイン産生Ｔ細胞を表す。一般に、ここで開示した研究では、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは以下のように設定した：ＰＳＭＡで免疫化したマウスからの５×１０５個の脾細胞を、（１）１１個のアミノ酸が重複する１５個のアミノ酸のペプチドからなるＰＳＭＡペプチドライブラリ（表１６を参照）に由来するＰＳＭＡ特異的ペプチドの存在下で、（２）既知のＨＬＡ  Ａ２．１制限ＰＳＭＡ特異的ペプチドと共に、または（３）腫瘍細胞と共に��養した。内在性抗原提示の認識を測定するために、脾細胞を、ＰＳＭＡを自然に発現するヒトＨＬＡ  Ａ２前立腺がん細胞（すなわちＬＮＣａＰ、ＡＴＣＣから入手可能）と共に培養したか、またはヒトＰＳＭＡ改変抗原をコードしているアデノウイルスを形質導入し、したがってそれを発現するＨＬＡ  Ａ２腫瘍細胞と共に培養した。さらに、ヒトＰＳＭＡ  ＥＣＤタンパク質をＥＬＩＳｐｏｔアッセイに加えて、特異的にＣＤ４  ＩＦＮγを産生する細胞を測定した。適切な場合は対照のために、ＨＬＡ  Ａ２制限ＨＥＲ−２特異的ペプチドｐ１６８−１７５またはＰＳＭＡを発現する腫瘍細胞またはＢＳＡなどの無関係のタンパク質をＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおける陰性対照として使用した。データの結果を、１×１０６個の脾細胞のうちＩＦＮγを分泌するスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数について、正規化した様式で与える。試験したそれぞれのＰＳＭＡ抗原ペプチドについて少なくとも３回の研究を行った。
【０１８６】
結果。ＰＳＭＡペプチドライブラリに由来するペプチドと共に培養したパスツールマウスの脾細胞を用いたＥＬＩＳｐｏｔアッセイからのデータを表１に提示する。陽性応答はＳＦＣ＞１００を有するものと定義される。表１に示すように、上記実施例１Ａに記載した３つすべての抗原形であるヒトＰＳＭＡサイトゾル抗原、分泌抗原、および改変抗原を用いて作製した免疫原性ＰＭＳＡポリペプチドがＴ細胞応答を誘導することができる。ヒトＰＳＭＡ改変抗原形がＴ細胞応答の最良の幅および規模を誘導した。
【０１８７】
【表２】
2019054804.tif 000004
【０１８８】
パスツールマウス（ＨＬＡ  Ａ２．１制限ＰＳＭＡペプチドをパルシングした標的細胞およびＰＳＭＡ＋ＨＬＡ  Ａ２．１  ＬＮＣａＰ腫瘍細胞を認識した）における、様々なＰＳＭＡワクチン形態によって誘導されたＴ細胞応答に関するＥＬＩＳｐｏｔアッセイからのデータを表２に提示する。ここではＰＳＭＡを発現しないヒト前立腺がん細胞系であるＰＣ３を陰性対照として使用した。陽性応答はＳＦＣ＞５０を有するものと定義される。表２に示すように、試験した様々なＰＳＭＡ構築体が、既知のＨＬＡ  Ａ２制限ＰＳＭＡエピトープならびにＰＳＭＡタンパク質およびヒト前立腺がん細胞ＬＮＣａＰを認識するＴ細胞を誘導することができる。しかし、ＰＳＭＡ改変構築体が最良の幅および規模のＴ細胞応答を誘導することが示された。
【０１８９】
【表３】
2019054804.tif 000005
【０１９０】
１Ｇ．パスツールマウスまたは非ヒト霊長類にて測定した液性免疫応答
１Ｇ１．サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ。標準のサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイは自動Ｂｉｏｔｅｋシステムを使用して行った。２５μｌの、ＰＢＳ中に１．０μｇ／ｍｌのネイティブＰＳＭＡタンパク質を用いてプレートを終夜コーティングし、プレートを洗浄し、３５μｌ／ウェルの５％ＦＢＳ  １×ＰＢＳ−Ｔ  ０．０５％で遮断し、１時間、ＲＴ、６００ＲＰＭの振盪器上でインキュベーションした。遮断培地を傾瀉し、１：１００または１：５００で開始して５％ＦＢＳ  １×ＰＢＳ−Ｔ  ０．０５％中で半ログ希釈した、ワクチン接種したマウス血清の段階希釈を作製し、希釈した血清の２５μ試料を９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに加え、１時間、ＲＴ、６００ＲＰＭの振盪器上でインキュベーションした。Ｂｉｏｔｅｋ  ＥＬｘ４０５を使用して１×ＰＢＳ−Ｔ  ０．０５％中の７５ｕｌ／ウェルでプレートを３回洗浄し、２５μｌ／ウェルの１：３０，０００倍希釈抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ（ＡｂＣａｍカタログ＃ａｂ２００４３）二次抗体（１×ＰＢＳ−Ｔ  ０．０５％で希釈）を９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに加え、１時間、ＲＴ、６００ＲＰＭの振盪器上でインキュベーションした。Ｂｉｏｔｅｋ  Ｅｌｘ４０５を使用して１×ＰＢＳ−Ｔ  ０．０５％中の７５ｕｌ／ウェルでプレートを５回洗浄した。ＴＭＢ基質を１：１０で希釈し、２５μｌをそれぞれのウェルに加え、ＲＴで３０分間インキュベーションした。１２．５μｌ／ウェルの１ＭのＨ２ＳＯ４を加えることによって反応を停止させた。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓを４５０ｎｍの波長で使用してプレートを読み取った。データは力価として報告し、これらは、第１陽性（ｆｉｒｓｔ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）（平均および５％ＦＢＳ  ＰＢＳを超える両方の値＋標準偏差の３倍）および／または０．５もしくは１．０のＯＤでの計算力価として報告することができた。無関係のワクチン接種したマウスからの血清を陰性対照として使用した。
【０１９１】
【表４】
2019054804.tif 000006
【０１９２】
結果。表３に提示するデータは、ヒトＰＳＭＡサイトゾル抗原は抗ＰＳＭＡ応答を全く誘導しなかった一方で、ヒトＰＳＭＡ改変抗原はすべてのマウスにおいて良好な抗ＰＳＭＡ抗体応答を一貫して誘導したことを示している。
【０１９３】
表５に提示するデータは、ヒトＰＳＭＡ抗原によって誘導された抗体がＰＳＭＡライブラリ中の複数のペプチドエピトープに反応したことを示している。各群中の個々のマウスからの血清を等量でプールし、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて１：５００希釈で試験した。抗ジフテリア（ＣＲＭ）トキソイドをワクチン接種したマウスの陰性対照群を並行して試験した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルを、ＰＳＭＡペプチドライブラリに由来する単一のアミノ酸１５個のペプチド０．０３μｇでコーティングした。０．１０を超えるＯＤ値が陽性とみなされる。
【０１９４】
１Ｇ２．ＦＡＣＳ細胞結合アッセイ。様々な前立腺がん細胞系をこのアッセイに使用した。ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣ）を、ＰＳＭＡを発現するヒト前立腺がん細胞として使用し、ＰＣ３（ＡＴＣＣ）を、ＰＳＭＡを発現しない陰性ヒト前立腺がん細胞として使用した。一部のアッセイでは、ヒトネイティブ完全長ＰＳＭＡを安定して発現するように操作したＴＲＡＭＰ−Ｃ２細胞系およびＰＳＭＡを発現しない親ＴＲＡＭＰ−Ｃ２細胞系（陰性対照）を細胞結合アッセイに使用した。細胞結合アッセイは以下のように行った：ＬＮＣａＰおよびＰＣ３細胞（またはＴＲＡＭＰ−Ｃ２ＰＳＭＡおよびＴＲＡＭＰ  Ｃ２）を、９６ウェルプレート中に２×１０５個の細胞／ウェル（５０μＬ）で別々のウェルに播種した。１ｆに記載した、ＰＳＭＡをワクチン接種したマウスからの血清をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、１％のＦＢＳ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、および１ｍＭのＥＤＴＡ）で１：５０に希釈した。５０μＬの希釈されたＪ５９１−Ａ抗体（マウス抗ヒトＰＳＭＡ抗体、ＡＴＣＣのクローンＪ５９１−Ａ）を希釈した試験血清またはＦＡＣＳ緩衝液（未染色試料）に加えて、染色プレート中の１ウェルあたり適切な細胞数を達成した。すべてをピペット操作によって混合し、その後、氷上で２０分間保管した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、それぞれの洗浄は、１２００ＲＰＭ、５℃で５分間の遠心分離によるものであった。１：２００希釈のＰＥ標識したヤギ抗マウスＩｇ（Ｓｉｇｍａ、カタログＰ９６７０−５）および０．２５μｌのＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ａｑｕａ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃Ｌ３４９５７）を含有する５０μＬの二次染色溶液をそれぞれの細胞含有ウェルに加え、氷上で２０分間保管した。既に記載したように細胞を２回洗浄した。洗浄した細胞ペレットを１２５ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、その後、７５ｕＬの４％パラホルムアルデヒド溶液をそれぞれのウェルに加えて細胞を固定した。少なくとも１５分間の間、試料を氷上で保管し、光から保護した。試料をＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩで流した。１０，０００個の生細胞事象がそれぞれの試料で記録された。それぞれの細胞種の対照試料は、１）未染色細胞、２）二次抗体のみを用いた細胞、３）Ｊ５９１＋二次抗体を用いた細胞、および４）ナイーブ血清＋二次抗体を用いた細胞であった。データは陰性対照に対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）として報告した。
【０１９５】
ＦＡＣＳ細胞結合アッセイの結果。表４は、ヒトＰＳＭＡ分泌抗原および改変抗原のどちらに誘導された抗体も、ヒトＰＳＭＡ陽性前立腺がん細胞（ＬＮＣａＰ）と結合し、ＰＳＭＡ陰性前立腺がん細胞（ＰＣ３）と結合しない能力を有することを示している。ＰＳＭＡ改変抗原はすべてのマウスにおいて良好な抗ＰＳＭＡ抗体応答を一貫して誘導した。
【０１９６】
【表５】
2019054804.tif 000007
【０１９７】
【表６】
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【０１９８】
１Ｇ３．抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ
研究設計。インドアカゲザルを、アデノウイルス（１ｅ１１Ｖ．Ｐ．、筋肉内に注射）によって送達したヒトＰＳＭＡ改変抗原をコードしている核酸を用いて免疫化し、続いて、それぞれ８および６週間の間隔で２回のＰＭＥＤ免疫化（８回の操作／免疫化、下腹部の右および左側でそれぞれ４回ずつの操作）を行った。動物は、２回目のＰＭＥＤ免疫化の時点でそれぞれの鼠径部流入領域リンパ節に近接して３ｍｇのＣｐＧ（ＰＦ−０３５１２６７６）の皮内注射も受けた。抗体依存性細胞媒介性細胞傷害は、任意の免疫化の前（免疫前血漿）および最後のＰＭＥＤ免疫化の８日後（免疫血漿）の血液から採取した血漿から決定した。
【０１９９】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害アッセイ。抗体依存性細胞媒介性細胞傷害は、標準のクロム５１放出アッセイを使用して決定した。ヒト前立腺がん細胞系ＬＮＣａＰおよびＰＣ３を標的細胞として使用した。新鮮に単離したヒトＰＢＭＣ細胞をエフェクター細胞として使用した。エフェクター対標的細胞は３０：１に設定した。手短に述べると、１つの標識反応について、２００ｕｌ中に１．５×１０６個の標的細胞を２００μＣｉの５１Ｃｒと共にインキュベーションした（３７℃、５％ＣＯ２で１時間）。細胞を３回洗浄し、細胞濃度を２×１０５個の細胞／ｍｌに調節した。対照モノクローナル抗体（ｍＡｂ）または試験血漿（１：５０）を２×濃度で作製し、１７５ｕｌのそれぞれの（アッセイの大きさに依存する）ｍＡｂ／血漿希釈液を１７５ｕｌの標的細胞に加えた。混合物を３０分間、４℃、エッペンドルフチューブ中でインキュベーションした。未結合の抗体を開放するために細胞を１回洗浄した。この時点で、１００ｕｌの新鮮に単離したエフェクター細胞を１００ｕｌのモノクローナル抗体または試験血漿と結合した標的細胞と共に９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに加え、３７℃および５％ＣＯ２で４時間インキュベーションした。試料は２つ組で試験した。最大放出のためには１００μｌの２Ｎ  ＨＣｌを標的ウェルに加え、自発性放出のためには１００μｌの培地を標的ウェルに加えた。特異的溶解は以下のように計算した：パーセント放出＝（ＥＲ−ＳＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）×１００［式中、ＥＲ（エフェクター＋標的細胞の放出）は実験的放出であり、ＳＲ（培地とインキュベーションした標的細胞単独）は自発性放出であり、ＭＲ（２Ｎ  ＨＣｌとインキュベーションした標的細胞単独）は最大放出であった］。パーセント特異的溶解は、無関係の標的（ＰＣ３）放出を抗原特異的標的（ＬＮＣａＰ）放出から減算することによって計算した。
【０２００】
【表７】
2019054804.tif 000009
【０２０１】
結果。抗体依存性細胞毒性アッセイからのデータを表６に提示する。ｈＰＳＭＡで免疫化した動物に由来する免疫血漿でコーティングしたヒト前立腺ＰＳＭＡ＋がん細胞系であるＬＮＣａＰはエフェクター細胞によって溶解された一方で、同じ免疫血清でコーティングしたヒト前立腺ＰＳＭＡ−がん細胞系であるＰＣ３はエフェクター細胞によって溶解されなかった。同様に、免疫前血漿でコーティングしたＬＮＣａＰはエフェクター細胞によって溶解されなかった。ＬＮＣａＰ細胞はＨＥＲ−２を発現することが知られているため、ＨＥＲ−２に対するモノクローナル抗体であるＨｅｒｃｅｐｔｉｎを陽性対照として使用した（Ｌｉ，Ｃｏｚｚｉら、２００４）。ＬＮＣａＰ細胞はＣＤ２０を発現しないため、Ｂ細胞抗原（ＣＤ２０）に対するモノクローナルであるＲｉｔｕｘａｎを陰性対照抗体として使用した。どちらのモノクローナル抗体もＡＤＣＣ活性を有すると報告されている（Ｄａｌｌ’Ｏｚｚｏ、Ｔａｒｔａｓら、２００４、Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｏ’Ｄｏｎｏｖａｎら、２０１１）。
【０２０２】
（実施例２）
ＰＳＭＡシャッフル抗原の構築
本実施例は、実施例１に記載のヒトＰＳＭＡ改変抗原（配列番号９）の変異体である様々な免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドの構築および特定の生物学的特性を例示する。
【０２０３】
２Ａ．ＰＳＭＡシャッフル抗原の設計
実施例１に記載のヒトＰＳＭＡ改変抗原（配列番号９）の変異体である様々な免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドを設計した。これらの変異体は、ヒトＰＳＭＡの相同分子種から選択された突然変異をヒトＰＳＭＡ改変抗原配列内に導入することによって作製した。これらの変異体は、本開示中で「ＰＳＭＡシャッフル抗原」または「シャッフルＰＳＭＡ改変抗原」と互換性があるように呼ばれる。これらの変異体の作製に使用する原理および手順を以下に提供する。
【０２０４】
シャッフル変異体の点突然変異を選択するためにコンピュータアルゴリズムを書いた。まず、ＮＣＢＩのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用したＰＳＭＡと１２個の相同分子種（別表２ａ）との複数配列アラインメントを構築した。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴからの出力には、相同分子種間でのそれぞれのＰＳＭＡ位置におけるそれぞれの残基の性向が含まれる。その後、これらの性向をｐｅｒｌスクリプトで使用して、以下のように点突然変異を選択した。
１）すべての位置のうち、ネイティブヒトＰＳＭＡ中の同一性に一致しない、最も一般的に観察された残基を選択する。
２）この突然変異位置が同定されたクラスＩまたはＩＩヒトＰＳＭＡエピトープと重複しないことを確認して、点突然変異が本明細書中上記定義された保存的Ｔ細胞エピトープ（表１９）内にはないことを確実にする。
３）突然変異のヒト残基に対する類似度をＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスによって計算して、残基置換のＢＬＯＳＵＭ６２類似度スコアが０〜１の範囲（包括的）内であることを確認する。
【０２０５】
ヒトＰＳＭＡに対して特定のパーセント配列同一性（１００未満）に達するまで、この反復手順に従う。
【０２０６】
このアルゴリズムへの入力として役割を果たすために、ＮＣＢＩのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用してＰＳＭＡ相同分子種を構築し、位置特異的な確率マトリックスを構築した。さらに、同定されたＰＳＭＡのエピトープ領域をファイル中に列挙し、これもシャッフルアルゴリズムに提供した。膜結合機能性の問題を回避するために、非シャッフル領域はタンパク質のサイトゾルおよび膜貫通領域にも拡張した。相同分子種ＰＳＭＡタンパク質配列、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムはＮＣＢＩのサイトからダウンロードした。
【０２０７】
その後、これらの入力データを使用してシャッフルスクリプトを実行し、元のヒトＰＳＭＡと９４％の配列同一性を有するヒトＰＳＭＡの変異体を生成した。さらに、ＨＬＡ−Ａ２結合を改善させるための３つの突然変異を、Ｅｐｉｔｏｐｔｉｍｉｚｅｒアルゴリズムにおけるその性能に基づいて導入した（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、Ｅｎｇｅｌｈｏｒｎら、２００７）。これらの突然変異は、Ｍ６６４Ｌ（エピトープ：６６３〜６７１）、Ｉ６７６Ｖ（エピトープ：６６８〜６７６）、およびＮ７６Ｌ（エピトープ：７５〜８３）である。生じた抗原は、「シャッフルＰＳＭＡ改変抗原１」、「シャッフルＰＳＭＡ改変１」、または「ＰＳＭＡシャッフル抗原１」と呼ばれる。
【０２０８】
コンセンサスランク＜１％および神経回路網によるＩＣ５０（シングルベスト方法）＜５００を有するエピトープに基づく結果により、ＨＬＡ  Ａ２．１、ＨＬＡ  Ａ３、ＨＬＡ  Ａ１１、ＨＬＡ  Ａ２４、およびＨＬＡ  Ｂ７からの予測されたエピトープは、このシャッフル抗原中で高度に保存的であったことが示された。実施例１に記載のヒトＰＳＭＡ改変抗原の２つの追加の変異体は、すべての非保存的置換を除去するために、より高い配列同一性およびより制限的なＢＬＯＳＵＭスコアカットオフである１を用いて設計した。これら２つの変異体は、それぞれ「シャッフルＰＳＭＡ改変抗原２」および「シャッフルＰＳＭＡ改変抗原３」とも呼ばれる。ヒトＰＳＭＡ改変構築体（たとえばヒトＰＳＭＡのアミノ酸１５〜７５０）に対するシャッフルＰＳＭＡ改変抗原１〜３のパーセント同一性は、それぞれ約９３．６％、９４．９％、および９６．４％である。
【０２０９】
シャッフルＰＳＭＡ改変抗原１は配列番号３のアミノ酸配列を有しており、ヒトＰＳＭＡ改変抗原と比較して以下の突然変異を有する。
Ｎ４７Ｓ、Ｔ５３Ｓ、Ｋ５５Ｑ、Ｍ５８Ｖ、Ｌ６５Ｍ、Ｎ７６Ｌ、Ｓ９８Ａ、Ｑ９９Ｅ、Ｋ１２２Ｅ、Ｎ１３２Ｄ、Ｖ１５４Ｉ、Ｉ１５７Ｖ、Ｆ１６１Ｙ、Ｄ１９１Ｅ、Ｍ１９２Ｌ、Ｖ２０１Ｌ、Ｖ２２５Ｉ、Ｉ２５８Ｖ、Ｇ２８２Ｅ、Ｉ２８３Ｌ、Ｒ３２０Ｋ、Ｌ３６２Ｉ、Ｓ３８０Ａ、Ｅ４０８Ｋ、Ｌ４１７Ｉ、Ｈ４７５Ｙ、Ｋ４８２Ｑ、Ｍ５０９Ｖ、Ｓ５１３Ｎ、Ｅ５４２Ｋ、Ｍ５８３Ｌ、Ｎ５８９Ｄ、Ｒ５９８Ｑ、Ｓ６１３Ｎ、Ｉ６１４Ｌ、Ｓ６１５Ａ、Ｑ６２０Ｅ、Ｍ６２２Ｌ、Ｓ６４７Ｎ、Ｅ６４８Ｑ、Ｓ６５６Ｎ、Ｉ６５９Ｌ、Ｖ６６０Ｌ、Ｌ６６１Ｖ、Ｍ６６４Ｌ、Ｉ６７６Ｖ
【０２１０】
シャッフルＰＳＭＡ改変抗原２は配列番号５のアミノ酸配列を有しており、ヒトＰＳＭＡ改変抗原と比較して以下の突然変異を有する。
突然変異：
Ｎ４７Ｓ、Ｋ５５Ｑ、Ｍ５８Ｖ、Ｑ９１Ｅ、Ｓ９８Ａ、Ａ１１１Ｓ、Ｋ１２２Ｅ、Ｎ１３２Ｄ、Ｖ１５４Ｉ、Ｉ１５７Ｖ、Ｆ１６１Ｙ、Ｖ２０１Ｌ、Ｖ２２５Ｉ、Ｉ２５８Ｖ、Ｓ３１２Ａ、Ｒ３２０Ｋ、Ｋ３２４Ｑ、Ｒ３６３Ｋ、Ｓ３８０Ａ、Ｅ４０８Ｋ、Ｈ４７５Ｙ、Ｋ４８２Ｑ、Ｙ４９４Ｆ、Ｅ４９５Ｄ、Ｋ４９９Ｅ、Ｍ５０９Ｌ、Ｎ５４０Ｄ、Ｅ５４２Ｋ、Ｎ５４４Ｓ、Ｍ５８３Ｉ、Ｉ５９１Ｖ、Ｒ５９８Ｑ、Ｒ６０５Ｋ、Ｓ６１３Ｎ、Ｓ６４７Ｎ、Ｅ６４８Ｑ、Ｓ６５６Ｎ、Ｖ６６０Ｌ
【０２１１】
シャッフルＰＳＭＡ改変抗原３は配列番号７のアミノ酸配列を有しており、ヒトＰＳＭＡ改変抗原と比較して以下の突然変異を有する。
突然変異：
Ｔ３３９Ａ、Ｖ３４２Ｌ、Ｍ３４４Ｌ、Ｔ３４９Ｎ、Ｎ３５０Ｔ、Ｅ３５１Ｋ、Ｓ４０１Ｔ、Ｅ４０８Ｋ、Ｍ４７０Ｌ、Ｙ４７１Ｈ、Ｈ４７５Ｙ、Ｆ５０６Ｌ、Ｍ５０９Ｌ、Ａ５３１Ｓ、Ｎ５４０Ｄ、Ｅ５４２Ｋ、Ｎ５４４Ｓ、Ｇ５４８Ｓ、Ｖ５５５Ｉ、Ｅ５６３Ｖ、Ｖ６０３Ａ、Ｒ６０５Ｋ、Ｋ６０６Ｎ、Ｙ６０７Ｈ、Ｄ６０９Ｅ、Ｋ６１０Ｎ、Ｉ６１１Ｌ
【０２１２】
２Ｂ．パスツールマウスにおいてワクチン接種後に測定した免疫応答
研究設計。８〜１０週齢のパスツールマウスを、ＰＭＥＤ方法を使用して、シャッフルＰＳＭＡ改変抗原を発現する様々なプラスミドＤＮＡを用いて、プライミング／ブースト／ブーストレジメンにおいて、それぞれのワクチン接種の間を２週間の間隔で、実施例１Ｆに記載のように免疫化した。抗原特異的ＴおよびＢ細胞応答は、最後の免疫化の７日後にそれぞれインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。
【０２１３】
【表８】
2019054804.tif 000010
【０２１４】
結果。表７に提示するＥＬＩＳｐｏｔデータは、全体的に、シャッフルＰＳＭＡ改変抗原は、ヒトＰＳＭＡ改変抗原に非常に類似した幅および規模のＴ細胞応答を誘導できることを実証している。ＳＦＣ＞１００が陽性とみなされる。記号「＊」は、正確に数えるには数が多すぎたことを表す。
【０２１５】
【表９】
2019054804.tif 000011
【０２１６】
表８に示すように、すべてのシャッフルＰＳＭＡ抗原は、既知のＨＬＡ  Ａ２制限ＰＳＭＡエピトープ、およびＰＳＭＡを発現するようにＰＳＭＡ導入遺伝子を保有するアデノウイルスを形質導入したヒトＨＬＡ  Ａ２腫瘍細胞を認識するＴ細胞を誘導することができる。ＰＳＭＡを発現しなかった腫瘍細胞は陰性対照として役割を果たし、認識されなかった。ＳＦＣ＞５０が陽性とみなされる。
【０２１７】
【表１０】
2019054804.tif 000012
【０２１８】
表９に示すＥＬＩＳｐｏｔデータは、ＣＤ８を枯渇させた脾細胞を用いて得た。したがって、データはＣＤ４  Ｔ細胞に特異的なＴ細胞応答を表す。データは、シャッフルＰＳＭＡ改変抗原２によって誘発されるＣＤ４応答は、ヒトＰＳＭＡ改変抗原によって誘導されるものに非常に類似していることを示している。ＳＦＣ＞５０が陽性とみなされる。
【０２１９】
【表１１】
2019054804.tif 000013
【０２２０】
表１０中のデータは、すべてのシャッフルＰＳＭＡ改変抗原が抗ヒトＰＳＭＡ抗体応答を誘導できることを実証している。シャッフルＰＳＭＡ改変抗原２およびヒトＰＳＭＡ改変抗原は、すべてのマウスにおいて一貫した抗体応答を誘導した。
【０２２１】
【表１２】
2019054804.tif 000014
【０２２２】
表１１中のＥＬＩＳｐｏｔデータは、全体的に、ＨＬＡ  Ａ２４マウスにおいてシャッフルＰＳＭＡ改変抗原２によって誘導されたＴ細胞応答は、ヒトＰＳＭＡ改変抗原に幅および規模が非常に類似していることを実証している。ＳＦＣ＞１００が陽性とみなされる。
【０２２３】
２Ｃ．シャッフルＰＳＭＡ改変抗原によるヒトＰＳＭＡに対する免疫寛容の破壊
研究設計。ヒトＰＳＭＡトランスジェニックマウスモデルでは、前立腺中でＰＳＭＡの発現を特異的に駆動する最小限のラットプロバシンプロモーターを使用して作製したマウスを使用する（Ｚｈａｎｇ、Ｔｈｏｍａｓら、２０００）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４１（１２）：４６９８〜４７１０。これらのマウスはＣ５７ＢＬ／６のバックグラウンドで作製した。ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫組織化学染色データにより、これらのＰＳＭＡトランスジェニックマウスにおける前立腺の腹側および背外側側根中でのＰＳＭＡの発現が確認された。これらのマウスにおけるヒトＰＳＭＡタンパク質の内在性発現が免疫寛容を生じると予想される。
【０２２４】
結果。表１２に示すように、ＰＳＭＡトランスジェニックマウスの２０％のみが、ヒトＰＳＭＡ改変抗原を使用してヒトＰＳＭＡに対するＴ細胞応答を開始させることができた。しかし、ＰＳＭＡトランスジェニックマウスの６７％が、シャッフルＰＳＭＡ改変抗原２を使用してＰＳＭＡ特異的Ｔ細胞応答を開始させることができた。このデータは、シャッフルＰＳＭＡ改変抗原２中に非自己アミノ酸配列を含めることが、自己ヒトＰＳＭＡ抗原に対する耐用の破壊を改善させたことを示唆している。ＳＦＣ＞５０が陽性とみなされる。
【０２２５】
【表１３】
2019054804.tif 000015
【０２２６】
（実施例３）
様々な免疫原性ＰＳＡポリペプチドの設計
実施例３は、サイトゾル形、分泌形、および膜結合形の免疫原性ＰＳＡポリペプチドの構築および特定の生物学的特性を例示する。
【０２２７】
３Ａ．様々なＰＳＡ抗原形の構築
３つの異なる免疫原性ＰＳＭＡポリペプチド形（たとえば、サイトゾル形、膜結合形、および分泌形）について実施例１に記載したものと同様に、３つの形における免疫原性ＰＳＡポリペプチドも、ヒトＰＳＡ配列に基づいて設計した。ネイティブヒトＰＳＡのアミノ酸２５〜２６１からなるサイトゾル形の免疫原性ＰＳＡポリペプチドは、分泌シグナルおよびプロドメイン（アミノ酸１〜２４）を欠失させることによって構築する。このサイトゾル免疫原性ＰＳＡポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１７に提供する。ＰＳＡポリペプチドの分泌形はネイティブ完全長ヒトＰＳＡ（アミノ酸１〜２６１）である。膜結合形の免疫原性ＰＳＡポリペプチドは、免疫原性ＰＳＡポリペプチドのサイトゾル形（ネイティブヒトＰＳＡのアミノ酸２５〜２６１）をヒトＰＳＭＡの膜貫通ドメイン（ヒトＰＳＭＡのアミノ酸１５〜５４）と連結させることによって構築する。
【０２２８】
３Ｂ．パスツールおよびＨＬＡ  Ａ２４マウスにおける免疫応答
研究設計。８〜１０週齢のＨＬＡ  Ａ２パスツールマウスまたはＨＬＡ  Ａ２４マウスを、様々なＰＳＡ抗原を発現するＤＮＡを用いて、実施例３Ａに提供したＰＭＥＤを使用して、プライミング／ブースト／ブーストレジメンにおいて、それぞれのワクチン接種の間を２週間の間隔で、実施例１に記載のように免疫化した。抗原特異的ＴおよびＢ細胞応答は、最後の免疫化の７日後にインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。
【０２２９】
【表１４】
2019054804.tif 000016
【０２３０】
結果。表１３は、ＰＳＡペプチドライブラリに由来するペプチドと共に培養した、ＨＬＡ  Ａ２パスツールマウスまたはＨＬＡ  Ａ２４マウスから単離した脾細胞に由来するＥＬＩＳｐｏｔデータを示す。Ｔ細胞応答はＨＬＡ  Ａ２およびＨＬＡ  Ａ２４マウスのどちらでも検出することができる。ＳＦＣ＞１００が陽性とみなされる。
【０２３１】
【表１５】
2019054804.tif 000017
【０２３２】
表１４中に示すＥＬＩＳｐｏｔデータは、サイトゾル形および膜結合形のどちらの免疫原性ＰＳＡポリペプチドも、サイトゾルＰＳＡ抗原を発現するようにアデノウイルスを形質導入したヒト腫瘍細胞（ＳＫｍｅｌ５−Ａｄ−ＰＳＡ）を認識するが、ｅＧＦＰを発現するようにアデノウイルスを形質導入した細胞（ＳＫｍｅｌ５−Ａｄ−ｅＧＦＰ）を認識しないＴ細胞を誘導できることを示している。また、これら２つの抗原はＰＳＡタンパク質に対する応答も誘発した。ＰＳＡ分泌抗原は、ＳＫｍｅｌ５−Ａｄ−ＰＳＡまたはＰＳＡタンパク質のどちらに対するＴ細胞も誘導することに失敗した。ＳＦＣ＞５０が陽性とみなされる。
【０２３３】
【表１６】
2019054804.tif 000018
【０２３４】
表１５中のデータは、分泌形および膜結合形のどちらの免疫原性ＰＳＡポリペプチドも抗ＰＳＡ抗体応答を誘導できることを実証している。
【０２３５】
【表１７−１】
2019054804.tif 000019
【０２３６】
【表１７−２】
2019054804.tif 000020
【０２３７】
【表１７−３】
2019054804.tif 000021
【０２３８】
【表１８】
2019054804.tif 000022
【０２３９】
【表１９】
2019054804.tif 000023
【０２４０】
【表２０】
2019054804.tif 000024
【０２４１】
（実施例４）
複数抗原ワクチン構築体の構築
本実施例では、単一構成成分のＤＮＡワクチン構築体から複数の抗原を発現させるためのいくつかの戦略を説明する。これらの複数抗原ＤＮＡワクチン構築体を同じ一般的なプラスミド主鎖をｐＰＪＶ７５６３として共有する。複数抗原発現戦略はここではＤＮＡワクチンのコンテキストにおいて記載されているが、原理はウイルスベクター遺伝子ワクチン（アデノウイルスベクターなど）のコンテキストにも同様に適用される。別段に指定しない限りは、複数抗原構築体中に含まれる遺伝子は、本明細書中上記で記載したヒトＰＳＭＡ改変抗原（ＰＳＭＡと記載）、完全長ヒトＰＳＣＡ（ＰＳＣＡと記載）、およびヒトＰＳＡサイトゾル抗原（ＰＳＡと記載）をコードしている。
【０２４２】
（実施例４Ａ）
二重抗原構築体
４Ａ１．複数のプロモーターを利用した二重抗原構築体の構築
一般戦略。多価核酸ワクチン構築体を作製するための１つの戦略は、複数の独立プロモーターを単一のプラスミド内に取り込ませることである（Ｈｕａｎｇ，Ｙ．、Ｚ．Ｃｈｅｎら（２００８）．「Ｄｅｓｉｇｎ，ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｕａｌ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｇｅｎｉｃ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｎ  ＨＩＶ−１  ｓｕｂｔｙｐｅ  Ｃ／Ｂ’  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ．」Ｊ  Ａｃｑｕｉｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ  Ｓｙｎｄｒ、４７（４）：４０３〜４１１、Ｘｕ，Ｋ．、Ｚ．Ｙ．Ｌｉｎｇら（２０１１）．「Ｂｒｏａｄ  ｈｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ＨＡ  ａｎｄ  ＮＰ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ａｎ  Ｈ５Ｎ１  ｖｉｒｕｓ．」Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２４（１）：４５〜５６）。プラスミドは、それぞれがａ）エンハンサー要素を含むまたは含まない、ＲＮＡポリメラーゼ依存性の転写を開始させるための真核プロモーター、ｂ）標的抗原をコードしている遺伝子、およびｃ）転写終結配列からなる、複数の発現カセットを保有するように操作することができる。形質移入した細胞核にプラスミドが送達された後、それぞれのプロモーターから転写が開始され、それぞれが標的抗原のうちの１つをコードしている別々のｍＲＮＡの生成がもたらされる。ｍＲＮＡは独立して翻訳され、それにより所望の抗原が生成される。
【０２４３】
プラスミド４６０（ＰＳＭＡ／ＰＳＣＡ二重プロモーター）。部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、および制限断片挿入の技法を使用してプラスミド４６０を構築した。まず、部位特異的突然変異誘発を使用し、ＭＤ５およびＭＤ６プライマーを用いて、製造者のプロトコル（Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅキット、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ）に従って、Ｋｐｎ  Ｉ制限部位をプラスミド５２５９中のＣＭＶプロモーターの上流に導入した。次に、Ｋｐｎ  Ｉ制限部位を保有するプライマー（ＭＤ７およびＭＤ８）を使用して、最小限のＣＭＶプロモーター、ヒトＰＳＭＡ、およびウサギＢグロブリン転写ターミネーターからなる発現カセットをプラスミド５１６６からＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ単位複製配列をＫｐｎ  Ｉで消化し、仔ウシ腸管アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理したプラスミド５２５９の新しく導入されたＫｐｎ  Ｉ部位内に挿入した。
【０２４４】
４Ａ２．２Ａペプチドを利用した二重抗原構築体の構築
一般戦略。また、複数のタンパク質抗原は、ウイルス２Ａ様ペプチドの使用によって、単一のベクターからも発現させることができる（Ｓｚｙｍｃｚａｋ，Ａ．Ｌ．およびＤ．Ａ．Ｖｉｇｎａｌｉ（２００５）．「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ２Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｖｅｃｔｏｒｓ．」Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ、５（５）：６２７〜６３８、ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅ，Ｐ．、Ｇ．Ａ．Ｌｕｋｅら（２００６）．「Ｅ  ｕｎｕｍ  ｐｌｕｒｉｂｕｓ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｅｌｆ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ．」Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２４（２）：６８〜７５、Ｌｕｋｅ，Ｇ．Ａ．、Ｐ．ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅら（２００８）．「Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ’２Ａ−ｌｉｋｅ’  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅｓ．」Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ、８９（Ｐｔ  ４）：１０３６〜１０４２、Ｉｂｒａｈｉｍｉ，Ａ．、Ｇ．Ｖａｎｄｅ  Ｖｅｌｄｅら（２００９）．「Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ２Ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．」Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、２０（８）：８４５〜８６０、Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．、Ｓ．Ｒ．Ｌｅｅら（２０１１）．「Ｈｉｇｈ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ａ  ２Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ−１  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ，ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ａｎｄ  ｍｉｃｅ．」ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６（４）：ｅ１８５５６）。切断カセットまたはＣＨＹＳＥＬ（シス作用性ヒドロラーゼエレメント）とも呼ばれるこれらのペプチドは、長さがアミノ酸約２０個であり、高度に保存的なカルボキシ末端のＤ−Ｖ／Ｉ−ＥＸＮＰＧＰモチーフを有する（図２）。このカセットは自然では稀であり、最も一般的には口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、ブタテッショウウイルス（ＰＴＶ）、およびゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルス（ＴＡＶ）などのウイルス中に見つかる（Ｌｕｋｅ，Ｇ．Ａ．、Ｐ．ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅら（２００８）．「Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ’２Ａ−ｌｉｋｅ’  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅｓ．」Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ、８９（Ｐｔ  ４）：１０３６〜１０４２）。２Ａに基づく複数抗原発現戦略を用いて、複数の標的抗原をコードしている遺伝子を、単一のオープンリーディングフレーム中で、２Ａカセットによって隔てて一緒に連結させることができる。オープンリーディングフレーム全体を、単一のプロモーターおよびターミネーターと共にベクター内にクローニングすることができる。遺伝子ワクチンが細胞に送達された後、複数の抗原をコードしているｍＲＮＡは単一のポリタンパク質として転写および翻訳される。２Ａカセットの翻訳中、リボソームはＣ末端のグリシンとプロリンとの間の結合をスキップする。このリボソームによるスキップは、下流タンパク質から上流タンパク質を開放する、同時翻訳の自己触媒的な「切断」のように作用する。２つのタンパク質抗原間での２Ａカセットの取り込みは、上流ポリペプチドのＣ末端上への約２０個のアミノ酸の付加および下流タンパク質のＮ末端への１つのアミノ酸（プロリン）の付加をもたらす。この方法の適応では、遍在的なプロテアーゼによりカセットが上流タンパク質から切断されるように、プロテアーゼ切断部位を２ＡカセットのＮ末端に取り込ませることができる（Ｆａｎｇ，Ｊ．、Ｓ．Ｙｉら（２００７）．「Ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．」Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、１５（６）：１１５３〜１１５９）。
【０２４５】
プラスミド４５１（ＰＳＭＡ−Ｔ２Ａ−ＰＳＣＡ）。重複ＰＣＲおよび制限断片交換の技法を使用してプラスミド４５１を構築した。まず、ヒトＰＳＭＡのアミノ酸１５〜７５０をコードしている遺伝子を、プラスミド５１６６を鋳型として使用し、プライマー１１９および１１７を用いたＰＣＲによって増幅した。完全長ヒトＰＳＣＡをコードしている遺伝子を、プラスミド５２５９を鋳型として使用し、プライマー１１８および１２０を用いたＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲにより、ＰＳＭＡの３’末端およびＰＳＣＡの５’末端に重複するＴＡＶ  ２Ａ（Ｔ２Ａ）配列の付加がもたらされた。単位複製配列を一緒に混合し、プライマー１１９および１２０を用いたＰＣＲによって増幅した。ＰＳＭＡ−Ｔ２Ａ−ＰＳＣＡ単位複製配列をＮｈｅ  ＩおよびＢｇｌ  ＩＩで消化し、同様に消化したプラスミド５１６６内に挿入した。高い切断効率を促進するために、グリシン−セリンリンカーをＰＳＭＡとＴ２Ａカセットとの間に含めた。
【０２４６】
プラスミド４５４（ＰＳＣＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ）。ＰＣＲおよび制限断片交換の技法を使用してプラスミド４５４を作製した。まず、完全長ヒトＰＳＣＡをコードしている遺伝子を、プラスミド５２５９を鋳型として使用し、プライマー４２および１３２を用いたＰＣＲによって増幅した。単位複製配列をＢａｍＨ  Ｉで消化し、同様に消化した、ＣＩＰで処理したプラスミド５３００内に挿入した。高い切断効率を促進するために、グリシン−セリンリンカーをＰＳＣＡとＦＭＤＶ  ２Ａ（Ｆ２Ａ）カセットとの間に含めた
【０２４７】
プラスミド５３００（ＰＳＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ）。重複ＰＣＲおよび制限断片交換の技法を使用してプラスミド５３００を構築した。まず、ＰＳＡのアミノ酸２５〜２６１をコードしている遺伝子を、プラスミド５２９７から、プライマーＭＤ１およびＭＤ２を用いたＰＣＲによって増幅した。ヒトＰＳＭＡのアミノ酸１５〜７５０をコードしている遺伝子を、プラスミド５１６６から、プライマーＭＤ３およびＭＤ４を用いたＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲにより、ＰＳＡの３’末端およびＰＳＭＡの５’末端に重複するＦ２Ａ配列の付加がもたらされた。単位複製配列を一緒に混合し、ＰＣＲによって伸長させた。ＰＳＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ単位複製配列をＮｈｅ  ＩおよびＢｇｌ  ＩＩで消化し、同様に消化したプラスミドｐＰＪＶ７５６３内に挿入した。
【０２４８】
４Ａ３．内部リボソーム進入部位を利用した二重抗原構築体
一般戦略：複数のタンパク質抗原を単一のプラスミドまたはベクターから発現させるための第３の戦略は、内部リボソーム進入部位、すなわちＩＲＥＳの使用を含む。内部リボソーム進入部位は、特定のＲＮＡ分子の５’非翻訳領域中に見つかるＲＮＡエレメント（図３）である（Ｂｏｎｎａｌ，Ｓ．、Ｃ．Ｂｏｕｔｏｎｎｅｔら（２００３）．「ＩＲＥＳｄｂ：ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｉｔｅ  ｄａｔａｂａｓｅ．」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３１（１）：４２７〜４２８）。これらは、真核リボソームをＲＮＡへと誘引して、下流のオープンリーディングフレームの翻訳を促進する。通常の細胞性７−メチルグアノシンｃａｐ依存性翻訳とは異なり、ＩＲＥＳ媒介性翻訳は、ＲＮＡ分子のはるか内部にあるＡＵＧコドンを開始させることができる。複数シストロン発現ベクター中で使用するために、効率の高いプロセッシングを利用することができる（Ｂｏｃｈｋｏｖ，Ｙ．Ａ．およびＡ．Ｃ．Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇ（２００６）．「Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ  ｉｎ  ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｕｐｏｎ  ＩＲＥＳ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｌｏｃａｔｉｏｎ．」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４１（３）：２８３〜２８４、２８６、２８８）。典型的には、２つの導入遺伝子は、ベクター内のプロモーターと転写ターミネーターとの間に、ＩＲＥＳによって隔てられた２つの別々のオープンリーディングフレームとして挿入する。遺伝子ワクチンが細胞に送達された後、両方の導入遺伝子をコードしている単一の長い転写物が転写される。第１のＯＲＦは伝統的なｃａｐ依存性様式で翻訳され、ＩＲＥＳの上流のストップコドンで終結する。第２のＯＲＦは、ＩＲＥＳを使用してｃａｐ非依存性様式で翻訳される。このようにして、２つの独立したタンパク質を、単一の発現カセットを有するベクターから転写された単一のｍＲＮＡから生成することができる。
【０２４９】
プラスミド４４９（ＰＳＭＡ−ｍＩＲＥＳ−ＰＳＣＡ）。重複ＰＣＲおよび制限断片交換の技法を使用してプラスミド４４９を構築した。まず、完全長ヒトＰＳＣＡをコードしている遺伝子を、プラスミド５２５９から、プライマー１２４および１２３を用いたＰＣＲによって増幅した。最小限のＥＭＣＶ  ＩＲＥＳを、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＩＲＥＳから、プライマー１０１および１２５を用いたＰＣＲによって増幅した。重複する単位複製配列を一緒に混合し、プライマー１０１および１２３を用いたＰＣＲによって増幅した。ＩＲＥＳ−ＰＳＣＡ単位複製配列をＢｇｌ  ＩＩおよびＢａｍＨ  Ｉで消化し、Ｂｇｌ  ＩＩで消化し、ＣＩＰで処理したプラスミド５１６６内に挿入した。ＩＲＥＳ内の自発性突然変異を固定するために、Ａｖｒ  ＩＩからＫｐｎ  Ｉの配列を含有するＩＲＥＳをｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＩＲＥＳからの等価の断片で置き換えた。
【０２５０】
プラスミド６０３（ＰＳＣＡ−ｐＩＲＥＳ−ＰＳＭＡ）。ＰＣＲおよびシームレスクローニングの技法を使用してプラスミド６０３を構築した。好ましいＥＭＣＶ  ＩＲＥＳにその３’末端で付着した完全長ヒトＰＳＣＡをコードしている遺伝子を、プラスミド４５５から、プライマーＳＤ５４６およびＳＤ５４７を用いたＰＣＲによって増幅した。ヒトＰＳＭＡのアミノ酸１５〜７５０をコードしている遺伝子を、プラスミド５１６６から、プライマーＳＤ５４８およびＳＤ５５０を使用したＰＣＲによって増幅した。２つの重複ＰＣＲ単位複製配列を、Ｎｈｅ  ＩおよびＢｇｌ  ＩＩで消化したｐＰＪＶ７５６３内に、製造者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）に従ったシームレスクローニングによって挿入した。
【０２５１】
プラスミド４５５（ＰＳＣＡ−ｍＩＲＥＳ−ＰＳＡ）。重複ＰＣＲおよび制限断片交換の技法を使用してプラスミド４５５を構築した。まず、ヒトＰＳＡのアミノ酸２５〜２６１をコードしている遺伝子を、プラスミド５２９７から、プライマー１１５および１１４を用いたＰＣＲによって増幅した。最小限のＥＭＣＶ  ＩＲＥＳを、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＩＲＥＳから、プライマー１０１および１１６を用いたＰＣＲによって増幅した。重複する単位複製配列を一緒に混合し、プライマー１０１および１１４を用いたＰＣＲによって増幅した。ＩＲＥＳ−ＰＳＡ単位複製配列をＢｇｌ  ＩＩおよびＢａｍＨ  Ｉで消化し、Ｂｇｌ  ＩＩで消化し、ＣＩＰで処理したプラスミド５２５９内に挿入した。このクローン内の自発性突然変異を固定するために、Ｂｇｌ  ＩＩからＢｓｔＥ  ＩＩの配列を新鮮な重複ＰＣＲ反応からの等価の断片で置き換えた。
【０２５２】
（実施例４Ｂ）
三重抗原ＤＮＡ構築体
一般戦略。ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、および／またはＰＳＡの発現を指示する二重抗原発現ベクターの能力を、形質移入したＨＥＫ２９３細胞において特徴づけた（図４〜６）。ＰＳＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ、ＰＳＭＡ−ｍＩＲＥＳ−ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ−Ｔ２Ａ−ＰＳＣＡ、ＰＳＡ−Ｔ２Ａ−ＰＳＣＡ、ＰＳＣＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ−ｐＩＲＥＳ−ＰＳＭＡ、およびＰＳＭＡ−ｍＩＲＥＳ−ＰＳＡを含めたいくつかの二重抗原発現カセットを、様々な組合せで三重抗原発現ベクター内に取り込ませるために選択した。すべての事例において、ベクターは親ｐＰＪＶ７５６３プラスミド主鎖に基づくものであった。４つのベクター（プラスミド４５６、４５７、４５８、および４５９）では、３つすべての抗原の発現を駆動するために、ウサギＢグロブリン転写ターミネーターを有する単一の完全ＣＭＶプロモーターを利用した。２つの他のベクター（プラスミド８４６および８５０）では、３つの抗原の発現を駆動するために、ＩＲＥＳまたは２Ａのどちらかと組み合わせた二重プロモーター戦略を組み入れた。プラスミド／ベクターの増幅中の第１および第２のカセットの間の組換えの可能性を最小限にするために、複数の２Ａカセットを有するベクターは、異なるカセットを保有するように操作した。抗原発現はフローサイトメトリー（図７）およびウエスタンブロッティング（図８）によって実証された。
【０２５３】
プラスミド４５６（ＰＳＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ−ｍＩＲＥＳ−ＰＳＣＡ）。プラスミド４５６を制限断片交換によって構築した。プラスミド５３００をＮｈｅ  ＩおよびＨｐａ  Ｉで消化し、約１．８ｋｂの挿入物を、同様に消化したプラスミド４４９内にライゲーションした。
【０２５４】
プラスミド４５７（ＰＳＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ−Ｔ２Ａ−ＰＳＣＡ）。プラスミド４５７を制限断片交換によって構築した。プラスミド５３００をＮｈｅ  ＩおよびＨｐａ  Ｉで消化し、約１．８ｋｂの挿入物を、同様に消化したプラスミド４５１内にライゲーションした。
【０２５５】
プラスミド４５８（ＰＳＡ−Ｔ２Ａ−ＰＳＣＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ）。ＰＣＲおよび制限断片交換の技法を使用してプラスミド４５８を構築した。ヒトＰＳＡのアミノ酸２５〜２６１をコードしている遺伝子を、プラスミド５２９７から、プライマー１１９および１３９を用いたＰＣＲによって増幅し、３’末端にＴ２Ａ配列およびＮｈｅ  Ｉ制限部位の付加がもたらされた。単位複製配列をＮｈｅ  Ｉで消化し、同様に消化したプラスミド４５４内に挿入した。
【０２５６】
プラスミド４５９（ＰＳＣＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ−ｍＩＲＥＳ−ＰＳＡ）。プラスミド４５９を制限断片交換によって構築した。プラスミド４５４をＮｈｅ  ＩおよびＢｇｌ  ＩＩで消化し、ＰＳＣＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ含有挿入物を、同様に消化したプラスミド４５５内にライゲーションした。
【０２５７】
プラスミド８４６（ＣＢＡ−ＰＳＡ、ＣＭＶ−ＰＳＣＡ−ｐＩＲＥＳ−ＰＳＭＡ）。ＰＣＲおよびシームレスクローニングの技法を使用してプラスミド８４６を構築した。まず、１）ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）遺伝子からのプロモーターおよび５’非翻訳領域、２）ハイブリッドニワトリベータアクチン／ウサギベータグロビンのイントロン、３）ヒトＰＳＡのアミノ酸２５〜２６１をコードしている遺伝子、ならびに４）ウシ成長ホルモンターミネーターからなる発現カセットを合成した。このＰＳＡ発現カセットを、プラスミド７９６から、プライマー３ＳａｌＩＣＢＡおよび５ＳａｌＩＢＧＨを用いたＰＣＲによって増幅した。単位複製配列を、ＧｅｎｅＡｒｔシームレスクローニングおよびアセンブリキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を使用して、プラスミド６０３のＳａｌＩ部位内にクローニングした。このプラスミドが細胞内に送達された後、ＰＳＡの発現はＣＢＡプロモーターから駆動される一方で、ＰＳＣＡおよびＰＳＭＡの発現はＣＭＶプロモーターから駆動される。
【０２５８】
プラスミド８５０（ＣＢＡ−ＰＳＡ、ＣＭＶ−ＰＳＣＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ）。ＰＣＲおよびシームレスクローニングの技法を使用してプラスミド８５０を構築した。まず、ＣＢＡプロモーターに駆動されるＰＳＡ発現カセットを、プラスミド７９６から、プライマー３ＳａｌＩＣＢＡおよび５ＳａｌＩＢＧＨを用いたＰＣＲによって増幅した。単位複製配列を、ＧｅｎｅＡｒｔシームレスクローニングを使用して、プラスミド４５４のＳａｌＩ部位内にクローニングした。このプラスミドが細胞内に送達された後、ＰＳＡの発現はＣＢＡプロモーターから駆動される一方で、ＰＳＣＡおよびＰＳＭＡの発現はＣＭＶプロモーターから駆動される。
【０２５９】
【表２１】
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【０２６０】
【表２２】
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【０２６１】
（実施例４Ｃ）
三重抗原アデノウイルス構築体
一般戦略。ＤＮＡプラスミドと同様、ウイルスワクチンベクターも、複数の前立腺がん抗原を送達するために操作することができる。ＤＮＡワクチンについて上述した３つの複数抗原発現戦略、すなわち、二重プロモーター、２Ａペプチド、および内部リボソーム進入部位を様々な組合せで組み入れて、三重抗原アデノウイルスベクターを作製した。手短に述べると、複数抗原発現カセットを、２コピーのテトラサイクリンオペレーター配列（ＴｅｔＯ２）を保有するように改変したｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶプラスミド内にクローニングした。組換えアデノウイルス血清型５ベクターを、ＡｄＥａｓｙベクター系を使用して、製造者のプロトコル（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ）に従って作製した。ウイルスをＨＥＫ２９３細胞中で増幅し、標準のプロトコルに従った二重塩化セシウムバンド形成によって精製した。ｉｎ  ｖｉｖｏ研究の前に、ウイルスストックをウイルス粒子の濃度、感染力の力価、無菌性、内毒素、遺伝子および導入遺伝子の完全性、導入遺伝子の正体、ならびに発現について徹底的に特徴づけた。
【０２６２】
アデノウイルス−７３３（ＰＳＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ−Ｔ２Ａ−ＰＳＣＡ）。Ａｄ−７３３はプラスミド４５７のウイルス均等物である。３つの抗原の発現は、大スケール産生中に導入遺伝子の発現を抑圧するためのテトラサイクリンオペレーターを用いて、Ｔｅｔリプレッサーを発現するＨＥＫ２９３系中で、単一のＣＭＶプロモーターから駆動される。複数抗原発現戦略には２つの異なる２Ａ配列が含まれる。
【０２６３】
アデノウイルス−７３４（ＰＳＡ−Ｔ２Ａ−ＰＳＣＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ）。Ａｄ−７３４はプラスミド４５８のウイルス均等物である。３つの抗原の発現は、大スケール産生中に導入遺伝子の発現を抑圧するためのテトラサイクリンオペレーターを用いて、Ｔｅｔリプレッサーを発現するＨＥＫ２９３系中で、単一のＣＭＶプロモーターから駆動される。複数抗原発現戦略には２つの異なる２Ａ配列が含まれる。
【０２６４】
アデノウイルス−７３５（ＰＳＣＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ−ｍＩＲＥＳ−ＰＳＡ）。Ａｄ−７３５はプラスミド４５９のウイルス均等物である。３つの抗原の発現は、大スケール産生中に導入遺伝子の発現を抑圧するためのテトラサイクリンオペレーターを用いて、Ｔｅｔリプレッサーを発現するＨＥＫ２９３系中で、単一のＣＭＶプロモーターから駆動される。複数抗原発現戦略には１つの２Ａ配列および１つのＩＲＥＳが含まれる。
【０２６５】
アデノウイルス−７９６（ＣＢＡ−ＰＳＡ、ＣＭＶ−ＰＳＣＡ−ｐＩＲＥＳ−ＰＳＭＡ）。Ａｄ−７９６はプラスミド８４６のウイルス均等物である。ＰＳＡの発現はニワトリベータアクチンプロモーターから駆動される一方で、ＰＳＣＡおよびＰＳＭＡの発現はＣＭＶ−ＴｅｔＯ２プロモーターから駆動される。複数抗原発現戦略には２つのプロモーターおよび１つのＩＲＥＳが含まれる。
【０２６６】
アデノウイルス−８０９（ＣＢＡ−ＰＳＡ、ＣＭＶ−ＰＳＣＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ）。Ａｄ−８０９はプラスミド８５０のウイルス均等物である。ＰＳＡの発現はニワトリベータアクチンプロモーターから駆動される一方で、ＰＳＣＡおよびＰＳＭＡの発現はＣＭＶ−ＴｅｔＯ２プロモーターから駆動される。複数抗原発現戦略には２つのプロモーターおよび１つの２Ａ配列が含まれる。
【０２６７】
（実施例５）
三重抗原ＤＮＡワクチンの免疫原性
実施例５は、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＡを発現する三重抗原核酸ワクチン構築体の、３つすべてのコードされている前立腺抗原に対して抗原特異的ＴおよびＢ細胞応答を誘発する能力を例示している。
【０２６８】
細胞性免疫応答の研究。実施例５に記載したＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＡを含有する三重抗原構築体の免疫原性を、以下に記載の手順に従ってＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて研究した。
【０２６９】
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを０日目にプライミングし、ヒトＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＡ抗原をコードしているＤＮＡワクチン構築体を用いて、ＰＭＥＤ投与によって、１４、２８および４９日目にブーストした。標的タンパク質を同時発現した３つのＤＮＡワクチンおよび１つの同時配合手法を含めた、合計４つの異なる三重抗原ワクチン接種戦略を評価した。同時発現には、２Ａペプチドまたは内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって連結された、３つすべての前立腺抗原をコードしている単一のＤＮＡプラスミドを以下のように使用した：ＰＳＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ−Ｔ２Ａ−ＰＳＣＡ（プラスミドＩＤ＃４５７）、ＰＳＡ−Ｔ２Ａ−ＰＳＣＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ（プラスミドＩＤ＃４５８）、およびＰＳＣＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ−ＩＲＥＳ−ＰＳＡ（プラスミドＩＤ＃４５９）。同時配合手法には、それぞれ個々にＰＳＭＡ、ＰＳＣＡまたはＰＳＡをコードしている３つの異なるＤＮＡプラスミドをＰＭＥＤ送達のために単一の金粒子上に同時配合した。同時配合を例外として、同時発現を制御するＤＮＡエレメント（２ＡおよびＩＲＥＳ）は、長さ、導入遺伝子の発現効率、および標的導入遺伝子に付着している外来遺伝物質の存在が異なる。対照として、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡまたはＰＳＡのいずれかの単一の前立腺抗原を発現するＤＮＡをワクチン接種した。同時発現させた三重または単一抗原ＤＮＡワクチンでは１回のＰＭＥＤ投与あたり２μｇの用量のＤＮＡワクチンプラスミドを与えた一方で、１回のＰＭＥＤ投与あたりそれぞれ１μｇの同時配合した三重抗原ＤＮＡワクチン（合計３μｇ）を投与した。三重および単一抗原ワクチンに対する細胞性免疫応答は、最後のＰＭＥＤワクチン接種の７日後である５６日目にそれぞれの動物から脾臓を採取することによって測定した。脾細胞を単離し、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに供して、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＡに特異的なＴ細胞応答を測定した。手短に述べると、個々の動物からの２×１０５個の脾細胞／ウェルを、単一のヒト前立腺抗原もしくはＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＡを一緒に安定して発現する５×１０４個／ウェルのＴＲＡＭＰ−Ｃ２（トランスジェニック腺癌マウス前立腺）細胞と共に、または１０μｇ／ｍｌの個々もしくはヒトＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＡに特異的なペプチドのプール（ペプチドおよびペプチドプールの組成には表２２を参照）と共に、または対照としての培地単独で播種した。各条件を３つ組で行った。プレートを２０時間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションし、洗浄し、インキュベーション後に製造者の指示に従って展開した。ＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数をＣｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．（ＣＴＬ）リーダーによって計数した。結果を図９および１０に提示し、これは、１×１０６個の脾細胞に対して正規化した、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡまたはＰＳＡに特異的なＳＦＣの平均数±１群あたり５匹のマウスの標準偏差を示す。
【０２７０】
【表２３】
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【０２７１】
抗体応答研究。三重および単一抗原ワクチンに対する抗体応答は、最後のＰＭＥＤワクチン接種の７日後である５６日目にそれぞれの動物から血清を採取することによって測定した。血清を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に供して、抗ＰＳＭＡおよび抗ＰＳＣＡ抗体価を決定した。手短に述べると、ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌのヒトＰＳＭＡまたはＰＳＣＡでコーティングし、終夜、４℃でインキュベーションした。その後、プレートを遮断し、ＲＴで１時間、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共にインキュベーションした。それぞれの血清試料を、１：１００希釈で開始して２つ組で段階希釈し、１時間、ＲＴでインキュベーションした。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたヤギ抗マウスポリクローナルＩｇＧ抗体をＲＴで１時間インキュベーションした。洗浄後、ＴＭＢペルオキシダーゼＥＩＡ基質をＲＴで３０分間インキュベーションした。１Ｎの硫酸を加えることによって比色反応を停止させ、その後、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。滴定曲線をそれぞれの血清試料についてプロットした（試料の希釈率対吸光度）。その後、血清力価（続いて力価の逆数への変換）を、検出下限（ＬＬＯＤ、バックグラウンド＋３標準偏差）を超える光学密度（ＯＤ）値を有する、試験したうち最も希釈された血清試料、または１．０のＯＤ値が達成されるように計算した血清希釈率として採用した。結果を図１１および１２に提示し、これは、平均力価±１群あたり５匹のマウスの標準偏差を示す。
【０２７２】
また、血清を、適切な細胞系の細胞表面上で発現されるヒトＰＳＭＡまたはＰＳＣＡのどちらかに対する抗体結合を測定し、したがって、複数抗原ワクチンによって産生された抗体が、それぞれネイティブＰＳＭＡおよびＰＳＣＡのコンホメーションを認識することができるかどうかを決定するための蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）アッセイにも供した。ＬＮＣａＰ（ヒト前立腺腺癌）細胞を利用して、ネイティブＰＳＭＡに対する抗体結合を測定した。ＰＣ３（ヒト前立腺がん）細胞は、ヒトＰＳＭＡを発現しないため、ＦＡＣＳアッセイにおける対照として役割を果たした。ヒトＰＳＣＡを発現するアデノウイルス（Ａｄ−ＰＳＣＡ）を形質導入したＭＩＡ−ＰａＣａ−２（ヒト膵癌）細胞を利用して、ネイティブＰＳＣＡに対する抗体結合を測定した。形質導入していないＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞は対照として役割を果たした。手短に述べると、抗ＰＳＭＡ抗体結合を測定するために、２×１０５個のＬＮＣａＰまたはＰＣ３細胞を、１：１００希釈のマウス血清または１５μｇ／ｍｌの対照マウス−抗ヒトＰＳＭＡモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（クローンＪ５９１−Ａ）と共に２０分間、４℃でインキュベーションした。抗ＰＳＣＡ抗体結合を測定するために、２×１０５個のＡｄ−ＰＳＣＡを形質導入したおよび形質導入していないＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞を、１：３０希釈のマウス血清または４μｇ／ｍｌの対照マウス抗ヒトＰＳＣＡ  ｍＡｂ（クローン７Ｆ５）と共に２０分間、４℃でインキュベーションした。続いて、細胞を洗浄し、二次フィコエリスリン（ＰＥ）とコンジュゲートしたヤギ−抗マウスＩｇＧ抗体およびｌｉｖｅ／ｄｅａｄ色素と共にさらに２０分間、４℃でインキュベーションした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、１．５％のパラホルムアルデヒド中に再懸濁させ、１０，０００個の生細胞がＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ上で獲得された。結果を図１３および１４に提示し、これは、１群あたり５匹のマウスの二次抗マウス抗体単独に対するマウス血清の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の平均倍数変化±標準偏差を示す。ＰＳＡは本研究において調査した複数抗原ワクチンによって細胞質タンパク質として発現されたため、抗体価は測定しなかった。
【０２７３】
結果：
図９Ａ〜９Ｄは、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって三重抗原ワクチンの細胞性免疫応答を評価する代表的な研究の結果を示す。手短に述べると、１群あたり５匹のマウスを０日目にプライミングし、１４、２８および４９日目にＰＭＥＤでブーストした。最後のＰＭＥＤワクチン接種の７日後である５６日目に、内在性前立腺抗原の認識を、（Ａ）ＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＭＡ、（Ｂ）ＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＣＡ、（Ｃ）ＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＡ、および（Ｄ）ＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＭＡ−ＰＳＡ−ＰＳＣＡ細胞に対するＴ細胞応答をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検査することによって評価した。ＴＲＡＭＰ  Ｃ２細胞はアッセイのバックグラウンド対照として役割を果たした。内在性ＰＳＭＡに対するＩＦＮ−γ  Ｔ細胞応答では、単一のＰＳＭＡ  ＰＭＥＤワクチン接種の後にＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＭＡに対する有意な応答が観察され、これは、他の研究で見られた応答と一貫していた。ＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＭＡに対する同様のＰＳＭＡに特異的なＩＦＮ−γ  Ｔ細胞応答が、三重抗原ワクチン接種の後に検出された。対照的に、応答の完全な消失が同時配合したＰＳＭＡとＰＳＣＡとＰＳＡのワクチン接種の後に観察された（＊は二方向ＡＮＯＶＡによってｐ＜０．０５であることを示す）。内在性ＰＳＣＡに対するＩＦＮ−γ  Ｔ細胞応答では、単一のＰＳＣＡワクチンを４つの異なる三重抗原ワクチンと比較した場合に、ＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＣＡ細胞に対する応答に有意差は観察されなかった。内在性ＰＳＡに対するＩＦＮ−γ  Ｔ細胞応答では、ＰＳＣＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ−ＩＲＥＳ−ＰＳＡ（＊＊＊は二方向ＡＮＯＶＡによってｐ＜０．００１であることを示す）または同時配合したワクチン（＊は二方向ＡＮＯＶＡによってｐ＜０．０５であることを示す）のどちらかに対する単一のＰＳＡワクチンの免疫原性を比較した場合に、ＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＡに対する応答規模の有意な減少が検出された。ＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＭＡ−ＰＳＣＡ−ＰＳＡに対する応答を検査した際に、ＰＳＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ−Ｔ２Ａ−ＰＳＣＡワクチンの後に最高規模のＩＦＮ−γ  Ｔ細胞応答が観察された。まとめると、これらのデータは、内在性ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＡの認識、ならびに同時発現ＤＮＡワクチン接種戦略を使用した、特にＰＳＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ−Ｔ２Ａ−ＰＳＣＡワクチン構築体を用いた場合の３つすべての前立腺抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞応答の生成を実証している。しかし、同時配合ＤＮＡワクチン接種戦略は、ＰＳＭＡおよびＰＳＡに対する抗原特異的ＩＦＮ−γ  Ｔ細胞応答の損失をもたらした。
【０２７４】
図１０Ａ〜１０Ｄは、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって三重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示す。手短に述べると、１群あたり５匹のマウスを０日目にプライミングし、１４、２８および４９日目にＰＭＥＤでブーストした。５６日目に、（Ａ）ＰＳＭＡペプチド、（Ｂ）ＰＳＭＡペプチドプール、（Ｃ）ＰＳＣＡペプチド、および（Ｄ）ＰＳＡペプチド（表２２を参照）に対するＴ細胞応答をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価した。培地単独はアッセイのバックグラウンド対照として役割を果たした。個々およびＰＳＭＡペプチドプールの両方に対するＩＦＮ−γ  Ｔ細胞応答では、ＰＳＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ−Ｔ２Ａ−ＰＳＣＡ三重抗原ワクチンを投与した後に、単一のＰＳＭＡワクチンと比較して最高規模の応答が観察された。同様に、ＰＳＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ−Ｔ２Ａ−ＰＳＣＡワクチンを投与した後に、ＰＳＣＡおよびＰＳＡに特異的なペプチドに対して最高規模のＩＦＮ−γ  Ｔ細胞応答が検出された。同時配合したＰＳＭＡとＰＳＣＡとＰＳＡのワクチンは、ＰＳＭＡ特異的ペプチドに対して低いＴ細胞応答から応答なしをもたらし、ＰＳＣＡおよびＰＳＡに特異的なペプチドに対して低規模の応答をもたらした。また、これらのデータは、同じワクチン構築体から同時発現させた場合にＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＡに対するＴ細胞応答の生成も実証している。ＰＳＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ−Ｔ２Ａ−ＰＳＣＡのワクチン接種の後に３つすべての前立腺抗原に対して一貫した頑強なＩＦＮ−γ  Ｔ細胞応答が存在しており、ＰＳＡ−Ｔ２Ａ−ＰＳＣＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ、ＰＳＭＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ−ＩＲＥＳ−ＰＳＡ、および同時配合したＰＳＭＡとＰＳＣＡとＰＳＡのワクチン接種の後に前立腺抗原に対するＩＦＮ−γ  Ｔ細胞応答の規模の有意な減少が存在していた。
【０２７５】
図１１は、抗ＰＳＭＡ抗体価によって三重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示す。手短に述べると、１群あたり５匹のマウスを０日目にプライミングし、１４、２８および４９日目にＰＭＥＤでブーストした。５６日目に、血清抗ＰＳＭＡ抗体価をＥＬＩＳＡによって評価した。ＰＳＭＡをワクチン接種したすべての動物が有意な抗ＰＳＭＡ抗体価を生成した。力価間に有意差はなかったが、ＰＳＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ−Ｔ２Ａ−ＰＳＣＡを用いたワクチン接種は、ＰＳＭＡをワクチン接種した他の群よりもわずかに低い力価をもたらした。これらのデータは、同時発現および同時配合ワクチン戦略の両方を使用した、三重抗原ワクチン接種の後の抗ＰＳＭＡ特異的抗体の産生を実証している。
【０２７６】
図１２は、抗ＰＳＣＡ抗体価によって三重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示す。手短に述べると、１群あたり５匹のマウスを０日目にプライミングし、１４、２８および４９日目にＰＭＥＤでブーストした。５６日目に、血清抗ＰＳＣＡ抗体価をＥＬＩＳＡによって評価した。抗体価を、ＰＳＣＡ単独および同時配合したＰＳＭＡとＰＳＣＡとＰＳＡをワクチン接種したマウスにおいて検出した。これらの結果は、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＡの同時配合が、同時発現ＤＮＡワクチン接種戦略と比較して検出可能な抗ＰＳＣＡ抗体価を誘発することを示している。
【０２７７】
図１３は、抗ＰＳＭＡ抗体細胞表面結合によって三重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示す。手短に述べると、１群あたり５匹のマウスを０日目にプライミングし、１４、２８および４９日目にＰＭＥＤでブーストした。５６日目に、細胞表面ネイティブＰＳＭＡの認識を、ＬＮＣａＰおよびＰＣ３細胞との血清抗体結合によって評価した。ＰＣ３細胞はアッセイのバックグラウンド対照として役割を果たした。ＰＳＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ−Ｔ２Ａ−ＰＳＣＡのワクチン接種は、ＰＳＡ−Ｔ２Ａ−ＰＳＣＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡおよびＰＳＭＡ単独をワクチン接種したマウスよりも有意に低いＬＮＣａＰ細胞に対する結合能力を有する抗ＰＳＭＡ抗体をもたらした（＊は一方向ＡＮＯＶＡによってｐ値＜０．０５であることを示す）。すべての他のＰＳＭＡをワクチン接種した群は抗ＰＳＭＡ抗体結合に有意差を示さなかった。Ｊ５９１−Ａ  ｍＡｂにおける、二次抗体単独に対する倍数変化は４５．３であった（データ示さず）。全体的に、これらのデータは、同時発現および同時配合ＤＮＡワクチン接種戦略の両方を使用した、三重抗原ワクチン接種の後の、ネイティブＰＳＭＡを認識する抗ＰＳＭＡ特異的抗体の産生を実証している。
【０２７８】
図１４は、抗ＰＳＣＡ抗体細胞表面結合によって三重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示す。手短に述べると、１群あたり５匹のマウスを０日目にプライミングし、１４、２８および４９日目にＰＭＥＤでブーストした。５６日目に、細胞表面ネイティブＰＳＣＡの認識を、Ａｄ−ＰＳＣＡを形質導入したおよび形質導入していないＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞との血清抗体結合によって評価した。形質導入していない親細胞はアッセイのバックグラウンド対照として役割を果たした。単一のＰＳＭＡおよび単一のＰＳＡサイトワクチンを例外として、ＰＳＣＡを用いたすべてのワクチンレジメンは、親細胞と比較して、Ａｄ−ＰＳＣＡを形質導入したＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞との有意な抗ＰＳＣＡ抗体結合をもたらした。ＰＳＣＡをワクチン接種した群間で、Ａｄ−ＰＳＣＡを形質導入したＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞との抗ＰＳＣＡ抗体結合に有意差はなかった（一方向ＡＮＯＶＡ、ｐ値＞０．０５）。７Ｆ５  ｍＡｂにおける、二次抗体単独に対する倍数変化は１８．７であった（データ示さず）。全体的に、これらのデータは、同時発現および同時配合ＤＮＡワクチン接種戦略の両方を使用した、三重抗原ワクチン接種の後の、ネイティブＰＳＣＡを認識する抗ＰＳＣＡ特異的抗体の産生を実証している。
【０２７９】
（実施例６）
二重抗原ワクチンの免疫原性
以下の実施例は、２つの前立腺抗原を発現する二重抗原ワクチンの、２つのコードされている前立腺抗原に対する抗原特異的ＴおよびＢ細胞応答を誘発する能力を例示するために提供する。
【０２８０】
６Ａ．Ｃ５７ＢＬ／６におけるＰＳＭＡおよびＰＳＣＡを含有する二重抗原ワクチンの免疫原性：
研究手順。
細胞性免疫応答研究。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを０日目にプライミングし、ヒトＰＳＭＡおよびＰＳＣＡを発現するＤＮＡを用いて、ＰＭＥＤ表皮注射によって、１４、２８、４２および７０日目にブーストした。抗原を同時発現した４つのＤＮＡワクチンおよび１つの同時配合手法を含めた、合計５つの異なる二重抗原ＤＮＡワクチン接種戦略を評価した。同時発現には、二重プロモーター、２ＡペプチドまたはＩＲＥＳによって連結された、２つの前立腺抗原であるＰＳＭＡおよびＰＳＣＡをコードしている単一のＤＮＡワクチンプラスミドを投与した。これらには、ＰＳＭＡ−ＰＳＣＡ二重プロモーター（プラスミドＩＤ＃４６０）、ＰＳＭＡ−Ｔ２Ａ−ＰＳＣＡ（プラスミドＩＤ＃４５１）、ＰＳＣＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ（プラスミドＩＤ＃４５４）およびＰＳＣＡ−ＩＲＥＳ−ＰＳＭＡ（プラスミドＩＤ＃６０３）が含まれていた。同時配合には、ＰＳＭＡおよびＰＳＣＡをそれぞれ個々にコードしている２つの異なるＤＮＡプラスミドを、ＰＭＥＤ送達のために単一の金粒子上に同時配合した。同時配合を例外として、同時発現を制御するＤＮＡエレメント（二重プロモーター、２ＡおよびＩＲＥＳ）は、長さ、導入遺伝子の発現効率、および標的導入遺伝子に付着している外来遺伝物質の存在が異なる。対照として、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＰＳＭＡまたはＰＳＣＡの単一の前立腺抗原を発現するＤＮＡをワクチン接種した。同時発現させた二重または単一抗原ＤＮＡワクチンでは１回のＰＭＥＤ投与あたり２μｇの合計用量のＤＮＡワクチンを与えた一方で、同時配合ではそれぞれ２μｇのＤＮＡワクチンプラスミド（１回の投与あたり合計４μｇのＤＮＡ）を与えた。二重および単一抗原ワクチンの細胞性免疫応答は、最後のＰＭＥＤワクチン接種の７日後である７７日目にそれぞれの動物から脾臓を採取することによって測定した。脾細胞を単離し、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに供して、ＰＳＭＡおよびＰＳＣＡに特異的なＴ細胞応答を測定した。手短に述べると、個々の動物からの２×１０５個の脾細胞／ウェルを、単一の内在性ヒト前立腺抗原もしくはＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＡを一緒に発現する５×１０４個／ウェルのＴＲＡＭＰ−Ｃ２細胞と共に、または１０μｇ／ｍｌの個々もしくはヒトＰＳＭＡおよびＰＳＣＡに特異的なペプチドのプール（ペプチドおよびペプチドプールの組成には表２２を参照）と共に、または対照としての培地単独で播種した。各条件を３つ組で行った。プレートを２０時間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションし、洗浄し、インキュベーション後に製造者の指示に従って展開した。ＩＦＮ−γ  ＳＦＣの数をＣＴＬリーダーによって計数した。結果を図１５および１６に提示し、これは、１×１０６個の脾細胞に対して正規化した、ＰＳＭＡまたはＰＳＣＡに特異的なＳＦＣの平均数±１群あたり５匹のマウスの標準偏差を示す。
【０２８１】
抗体応答研究。二重および単一抗原ワクチンに対する抗体応答は、最後のＰＭＥＤワクチン接種の７日後である７７日目にそれぞれの動物から血清を採取することによって測定した。血清中の抗ＰＳＭＡおよび抗ＰＳＣＡ抗体価は、実施例５に記載のようにＥＬＩＳＡを使用して決定した。結果を図１７および１８に提示し、これは、平均力価±１群あたり５匹のマウスの標準偏差を示す。
【０２８２】
また、血清を、適切な細胞系の細胞表面上で発現されるヒトＰＳＭＡまたはＰＳＣＡのどちらかに対する抗体結合を測定し、したがって、複数抗原ワクチンによって産生された抗体が、それぞれネイティブＰＳＭＡおよびＰＳＣＡのコンホメーションを認識することができるかどうかを決定するためのＦＡＣＳアッセイにも供した。ＰＳＡは本研究において調査した複数抗原ワクチンによって細胞質タンパク質として発現されたため、細胞表面ネイティブＰＳＡに対する抗体結合は測定しなかった。ＦＡＣＳアッセイは、実施例５に記載の手順に従って実施した。図１９および２０に提示する結果は、１群あたり５匹のマウスの二次抗マウス抗体単独に対するマウス血清のＭＦＩの平均倍数変化±標準偏差を示す。ＰＳＡは本研究において調査した複数抗原ワクチンによって細胞質タンパク質として発現されたため、細胞表面ネイティブＰＳＡに対する抗体価および結合は測定しなかった。
【０２８３】
結果。
図１５Ａ〜１５Ｃは、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示す。手短に述べると、１群あたり５匹のマウスを０日目にプライミングし、１４、２８、４２および７０日目にＰＭＥＤでブーストした。７７日目に、内在性ＰＳＭＡおよびＰＳＣＡの認識を、（Ａ）ＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＭＡ、（Ｂ）ＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＣＡ、および（Ｃ）ＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＭＡ−ＰＳＡ−ＰＳＣＡ細胞に対するＴ細胞応答をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検査することによって評価した。ＴＲＡＭＰ  Ｃ２細胞はアッセイのバックグラウンド対照として役割を果たした。内在性ＰＳＭＡに対するＩＦＮ−γ  Ｔ細胞応答では、応答ＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＭＡの規模は、ＰＳＭＡ単独を用いたワクチン接種と比較して、ＰＳＭＡ−ＰＳＣＡ二重プロモーター、ＰＳＭＡ−Ｔ２Ａ−ＰＳＣＡ、ＰＳＣＡ−ＩＲＥＳ−ＰＳＭＡおよび同時配合したＰＳＭＡとＰＳＣＡを用いたワクチン接種後に有意に減少していた（＊＊および＊＊＊は、二方向ＡＮＯＶＡによってそれぞれｐ値＜０．０１および＜０．００１であることを示す）。しかし、ＰＳＣＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡワクチン構築体は、単一のＰＳＭＡワクチンとしてのＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＭＡ細胞と同様の規模のＩＦＮ−γ  Ｔ細胞応答を誘発した。内在性ＰＳＣＡに対するＩＦＮ−γ  Ｔ細胞応答では、ＰＳＣＡワクチン単独と比較して、ＰＳＭＡ−ＰＳＣＡ二重プロモーター、ＰＳＣＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ−ＩＲＥＳ−ＰＳＭＡおよび同時配合したＰＳＭＡとＰＳＣＡを含めた二重抗原ワクチンのうちのいくつかを用いたワクチン接種の後に、有意に増加した応答が観察された（＊、＊＊および＊＊＊は、二方向ＡＮＯＶＡによってそれぞれｐ値＜０．０５、０．０１および０．００１であることを示す）。ＰＳＣＡ−Ｔ２Ａ−ＰＳＭＡワクチン構築体は、単一のＰＳＣＡワクチンとしてのＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＣＡ細胞と同様の規模のＩＦＮ−γ  Ｔ細胞応答を誘発した。ＩＦＮ−γ  Ｔ細胞応答をＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＭＡ−ＰＳＡ−ＰＳＣＡと比較すると、異なる二重抗原ワクチンをワクチン接種した群間に有意差はなかった。まとめると、これらのデータは、同時発現および同時配合ＤＮＡワクチン接種戦略の両方を使用した、二重抗原ワクチン接種の後のＰＳＭＡおよびＰＳＣＡに特異的なＴ細胞応答の生成を実証している。
【０２８４】
図１６Ａ〜１６Ｃは、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示す。手短に述べると、１群あたり５匹のマウスを０日目にプライミングし、１４、２８、４２および７０日目にＰＭＥＤでブーストした。７７日目に、（Ａ）ＰＳＭＡペプチド、（Ｂ）ＰＳＭＡペプチドプール、および（Ｃ）ＰＳＣＡペプチド（表２２を参照）に対するＴ細胞応答をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価した。培地単独はアッセイのバックグラウンド対照として役割を果たした。個々およびＰＳＭＡペプチドプールの両方に対するＩＦＮ−γ  Ｔ細胞応答では、ＰＳＭＡ−Ｔ２Ａ−ＰＳＣＡおよびＰＳＣＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ二重抗原ワクチン接種の後に、単一のＰＳＭＡワクチンと比較して最高規模の応答が観察された。ＰＳＭＡ−ＰＳＣＡ二重プロモーター、ＰＳＣＡ−ＩＲＥＳ−ＰＳＭＡおよび同時配合したＰＳＭＡとＰＳＣＡを用いたワクチン接種の後に、個々のＰＳＭＡペプチドに対するＩＦＮ−γ  Ｔ細胞応答の有意な低下が観察された。ＰＳＣＡ特異的ペプチドに対するＩＦＮ−γ  Ｔ細胞応答は、異なる二重抗原ワクチンをワクチン接種した群間で類似していた。また、これらのデータは、同じＤＮＡワクチン構築体上で同時発現させた場合、または同時配合物として送達した場合に、ＰＳＭＡおよびＰＳＣＡの両方に対するＴ細胞応答の生成も実証している。
【０２８５】
図１７は、抗ＰＳＭＡ抗体価によって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示す。手短に述べると、１群あたり５匹のマウスを０日目にプライミングし、１４、２８、４２および７０日目にＰＭＥＤでブーストした。７７日目に、血清抗ＰＳＭＡ抗体価をＥＬＩＳＡによって評価した。ＰＳＭＡをワクチン接種したすべての動物が有意な抗ＰＳＭＡ抗体価を生成した。二重ワクチン構築体であるＰＳＣＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡおよび単一のＰＳＭＡワクチンをワクチン接種したマウスは、ＰＳＭＡをワクチン接種したマウスのすべての他の群よりも有意に高い抗体価を生じた（一方向ＡＮＯＶＡ、ｐ値＜０．０５）。ＰＳＭＡ−ＰＳＣＡ二重プロモーターおよび同時配合したＰＳＭＡとＰＳＣＡを用いたワクチン接種は、ＰＳＭＡ−Ｔ２Ａ−ＰＳＣＡワクチンを受けたマウスよりも高い抗体価をもたらした。まとめると、これらのデータは、同時発現および同時配合ワクチン接種戦略の両方を使用した、ＰＳＭＡおよびＰＳＣＡを用いた二重抗原ＤＮＡワクチン接種の後の抗ＰＳＭＡ特異的抗体の産生を実証している。
【０２８６】
図１８は、抗ＰＳＣＡ抗体価によって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示す。手短に述べると、１群あたり５匹のマウスを０日目にプライミングし、１４、２８、４２および７０日目にＰＭＥＤでブーストした。７７日目に、血清抗ＰＳＣＡ抗体価をＥＬＩＳＡによって評価した。同時配合したＰＳＭＡとＰＳＣＡおよび単一のＰＳＣＡワクチンをワクチン接種したマウスは、ＰＳＣＡをワクチン接種したマウスのすべての他の群よりも有意に高い抗体価を生じた（一方向ＡＮＯＶＡ）。ＰＳＭＡ−ＰＳＣＡ二重プロモーターを用いたワクチン接種は、ＰＳＭＡ−Ｔ２Ａ−ＰＳＣＡ、ＰＳＣＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡおよびＰＳＣＡ−ＩＲＥＳ−ＰＳＭＡを用いたワクチン接種よりも高い抗体価をもたらした。これらの結果は、ＰＳＭＡおよびＰＳＣＡの同時発現または同時配合が抗ＰＳＣＡ抗体を誘発することを示している。
【０２８７】
図１９は、抗ＰＳＭＡ抗体細胞表面結合によって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示す。手短に述べると、１群あたり５匹のマウスを０日目にプライミングし、１４、２８、４２および７０日目にＰＭＥＤでブーストした。７７日目に、細胞表面ネイティブＰＳＭＡの認識を、ＬＮＣａＰおよびＰＣ３細胞との血清抗体結合によって評価した。ＰＣ３細胞はアッセイのバックグラウンド対照として役割を果たした。単一のＰＳＣＡワクチンを例外として、ＰＳＭＡを用いたすべてのワクチンレジメンは、対照ＰＣ３細胞と比較してＬＮＣａＰ細胞との有意な抗ＰＳＭＡ抗体結合をもたらした。ＰＳＭＡをワクチン接種した群間で、ＬＮＣａＰ細胞との抗ＰＳＭＡ抗体結合に有意差はなかった（一方向ＡＮＯＶＡ、ｐ値＞０．０５）。Ｊ５９１−Ａ  ｍＡｂにおける、二次抗体単独に対する倍数変化は４５．３であった（データ示さず）。これらのデータは、同時発現および同時配合ワクチン接種戦略の両方を使用した、二重抗原ＤＮＡワクチン接種の後の、ネイティブＰＳＭＡを認識する抗ＰＳＭＡ特異的抗体の産生を実証している。
【０２８８】
図２０は、抗ＰＳＣＡ抗体細胞表面結合によって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示す。手短に述べると、１群あたり５匹のマウスを０日目にプライミングし、１４、２８、４２および７０日目にＰＭＥＤでブーストした。７７日目に、細胞表面ネイティブＰＳＣＡの認識を、Ａｄ−ＰＳＣＡを形質導入したおよび形質導入していないＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞との血清抗体結合によって評価した。形質導入していない親細胞はアッセイのバックグラウンド対照として役割を果たした。単一のＰＳＭＡワクチンを例外として、ＰＳＣＡを用いたすべてのワクチンレジメンは、対照細胞と比較して、Ａｄ−ＰＳＣＡを形質導入したＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞との有意な抗ＰＳＣＡ抗体結合をもたらした。ＰＳＣＡをワクチン接種した群間で、Ａｄ−ＰＳＣＡを形質導入したＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞との抗ＰＳＣＡ抗体結合に有意差はなかった（一方向ＡＮＯＶＡ、ｐ値＞０．０５）。７Ｆ５  ｍＡｂにおける、二次抗体単独に対する倍数変化は１８．７であった（データ示さず）。全体的に、これらのデータは、同時発現および同時配合ワクチン接種戦略の両方を使用した、二重抗原ＤＮＡワクチン接種の後の、ネイティブＰＳＣＡを認識する抗ＰＳＣＡ特異的抗体の産生を実証している。
【０２８９】
６Ｂ．Ｃ５７ＢＬ／６における、ＰＳＭＡとＰＳＡまたはＰＳＣＡとＰＳＡのどちらかを含有する二重抗原ワクチンの免疫原性
研究手順。
細胞性免疫応答研究。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを０日目にプライミングし、ヒトＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＡを発現するＤＮＡを用いて、ＰＭＥＤ表皮注射によって、１４および２８日目にブーストした。２つの同時発現手法および２つの同時配合戦略を含めた、合計４つの異なる二重抗原ワクチン戦略を評価した。同時発現には、２Ａペプチドによって連結された、２つの前立腺抗原であるＰＳＭＡおよびＰＳＡをコードしている単一のＤＮＡプラスミド（プラスミドＩＤ＃５３００）、またはＩＲＥＳによって連結されたＰＳＣＡおよびＰＳＡ（プラスミドＩＤ＃４５５）を投与した。同時配合には、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡまたはＰＳＡを個々にコードしているプラスミドを、ＰＭＥＤ送達のために単一の金粒子上に同時配合した。具体的には、これらには、同時配合したＰＳＭＡとＰＳＡおよび同時配合したＰＳＣＡとＰＳＡが含まれていた。対照として、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡまたはＰＳＡの単一の前立腺抗原を発現するＤＮＡをワクチン接種した。同時発現させた二重または単一抗原ワクチンでは１回のＰＭＥＤ投与あたり２μｇの用量のＤＮＡを与えた一方で、同時配合ではそれぞれ２μｇのＤＮＡワクチンプラスミド（１回の投与あたり合計４μｇのＤＮＡ）を与えた。二重および単一抗原ワクチンの細胞性免疫応答は、３５日目にそれぞれの動物から脾臓を採取することによって測定した。脾細胞を単離し、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに供して、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＡに特異的なＴ細胞応答を測定した。手短に述べると、個々の動物からの２×１０５個の脾細胞／ウェルを、単一の内在性ヒト前立腺抗原もしくはＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＡを一緒に発現する５×１０４個／ウェルのＴＲＡＭＰ−Ｃ２細胞と共に、または１０μｇ／ｍｌの個々もしくはヒトＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＡに特異的なペプチドのプール（ペプチドおよびペプチドプールの組成には表２２を参照）と共に、または対照としての培地単独で播種した。各条件を３つ組で行った。プレートを２０時間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションし、洗浄し、インキュベーション後に製造者の指示に従って展開した。ＩＦＮ−γ  ＳＦＣの数をＣＴＬリーダーによって計数した。結果を図２１および２２に提示し、これは、１×１０６個の脾細胞に対して正規化した、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＡに特異的なＳＦＣの平均数±１群あたり５匹のマウスの標準偏差を示す。
【０２９０】
抗体応答研究。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを０日目にプライミングし、ヒトＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＡを発現するＤＮＡを用いて、ＰＭＥＤによって、１４、２８および４９日目にブーストした。二重および単一抗原ワクチンに対する抗体応答は、最後のＰＭＥＤワクチン接種の７日後である５６日目にそれぞれの動物から血清を採取することによって測定した。血清中の抗ＰＳＭＡおよび抗ＰＳＣＡ抗体価は、実施例５に記載のようにＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定した。結果を図２３および２４に提示し、これは、平均力価±１群あたり５匹のマウスの標準偏差を示す。
【０２９１】
また、血清を、適切な細胞系の細胞表面上で発現されるヒトＰＳＭＡまたはＰＳＣＡのどちらかに対する抗体結合を測定し、したがって、複数抗原ワクチンによって産生された抗体が、それぞれネイティブＰＳＭＡおよびＰＳＣＡのコンホメーションを認識することができるかどうかを決定するためのＦＡＣＳアッセイにも供した。ＰＳＡは本研究において調査した複数抗原ワクチンによって細胞質タンパク質として発現されたため、細胞表面ネイティブＰＳＡに対する抗体結合は測定しなかった。ＦＡＣＳアッセイは、実施例５に記載の手順に従って実施した。結果を図２５および２６に提示し、これは、１群あたり５匹のマウスの二次抗マウス抗体単独に対するマウス血清のＭＦＩの平均倍数変化±標準偏差を示す。ＰＳＡは本研究において調査した複数抗原ワクチンによって細胞質タンパク質として発現されたため、細胞表面ネイティブＰＳＡに対する抗体価および結合は測定しなかった。
【０２９２】
結果。
図２１Ａ〜２１Ｄは、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示す。手短に述べると、１群あたり５匹のマウスを０日目にプライミングし、１４および２８日目にＰＭＥＤでブーストした。３５日目に、内在性ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＡの認識を、（Ａ）ＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＭＡ、（Ｂ）ＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＣＡ、（Ｃ）ＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＡ、および（Ｄ）ＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＭＡ−ＰＳＡ−ＰＳＣＡ細胞に対するＴ細胞応答をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検査することによって評価した。ＴＲＡＭＰ  Ｃ２細胞はアッセイのバックグラウンド対照として役割を果たした。細胞上の内在的に発現されたＰＳＭＡに対するＩＦＮ−γ  Ｔ細胞応答では、ＰＳＭＡを含有する二重抗原（ＰＳＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡおよび同時配合したＰＳＭＡとＰＳＡ）とＰＳＭＡ単独とを用いたワクチン接種の後の、ＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＭＡに対する応答間に有意差は観察されなかった。同様に、内在性ＰＳＣＡに対するＩＦＮ−γ  Ｔ細胞応答では、単一のＰＳＣＡワクチンと比較して、二重ＰＳＣＡ−ＩＲＥＳ−ＰＳＡおよび同時配合したＰＳＣＡとＰＳＡのワクチン間でＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＣＡに対する応答規模の相違は観察されなかった。内在性ＰＳＡに対するＩＦＮ−γ  Ｔ細胞応答では、ＰＳＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ（＊＊＊は二方向ＡＮＯＶＡによってｐ＜０．００１であることを示す）および同時配合したＰＳＭＡとＰＳＡ（＊＊は二方向ＡＮＯＶＡによってｐ＜０．０１であることを示す）のどちらかに対する単一のＰＳＡワクチンの免疫原性を比較した場合に、ＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＡに対する応答規模の有意な増加が検出された。二重ＰＳＣＡおよびＰＳＡワクチンを受けた動物と単一のＰＳＡワクチンとを受けた動物を比較した際に、ＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＡに対する応答規模の相違は観察されなかった。ＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＭＡ−ＰＳＡ−ＰＳＣＡに対するＩＦＮ−γ  Ｔ細胞応答を検査した際に、異なる二重抗原ワクチンをワクチン接種した群間の応答に有意差はなかった。まとめると、これらのデータは、同時発現および同時配合ワクチン戦略の両方を使用した、ＰＳＭＡおよびＰＳＡに特異的なＴ細胞応答の生成、ならびに二重抗原ＤＮＡワクチン接種の後のＰＳＣＡおよびＰＳＡに特異的なＴ細胞応答を実証している。
【０２９３】
図２２は、抗ＰＳＭＡ抗体価によって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示す。手短に述べると、１群あたり５匹のマウスを０日目にプライミングし、１４、２８および４９日目にＰＭＥＤでブーストした。５６日目に、血清抗ＰＳＭＡ抗体価をＥＬＩＳＡによって評価した。ＰＳＭＡをワクチン接種したすべての動物が有意な抗ＰＳＭＡ抗体価を生成した。ＰＳＡ−Ｆ２Ａ−ＰＳＭＡ、同時配合したＰＳＭＡとＰＳＡ、およびＰＳＭＡ単独をワクチン接種したマウス間で抗体価に有意差はなかった（一方向ＡＮＯＶＡ、ｐ値＞０．０５）。まとめると、これらのデータは、同時発現および同時配合ワクチン戦略の両方を使用した、ＰＳＭＡおよびＰＳＡを用いた二重抗原ＤＮＡワクチン接種の後の抗ＰＳＭＡ特異的抗体の産生を実証している。
【０２９４】
図２３は、抗ＰＳＣＡ抗体価によって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示す。手短に述べると、１群あたり５匹のマウスを０日目にプライミングし、１４、２８および４９日目にＰＭＥＤでブーストした。５６日目に、血清抗ＰＳＣＡ抗体価をＥＬＩＳＡによって評価した。ＰＳＣＡをワクチン接種したすべての動物が有意な抗ＰＳＣＡ抗体価を生じた。ＰＳＣＡ−ＩＲＥＳ−ＰＳＡ、同時配合したＰＳＣＡとＰＳＡ、およびＰＳＣＡ単独をワクチン接種したマウス間で抗体価に有意差はなかったが（一方向ＡＮＯＶＡ、ｐ値＞０．０５）、ＰＳＣＡ−ＩＲＥＳ−ＰＳＡのワクチン接種の後に生成された抗体価はＰＳＣＡをワクチン接種した他の群よりも低い傾向があった。これらの結果は、ＰＳＣＡおよびＰＳＡの同時発現または同時配合が抗ＰＳＣＡ抗体を誘発することを示している。
【０２９５】
図２４は、抗ＰＳＭＡ抗体細胞表面結合によって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示す。手短に述べると、１群あたり５匹のマウスを０日目にプライミングし、１４、２８および４９日目にＰＭＥＤでブーストした。５６日目に、細胞表面ネイティブＰＳＭＡの認識を、ＬＮＣａＰおよびＰＣ３細胞との血清抗体結合によって評価した。ＰＣ３細胞はアッセイのバックグラウンド対照として役割を果たした。ＰＳＭＡをワクチン接種した群間で、ＬＮＣａＰ細胞との抗ＰＳＭＡ抗体結合に有意差はなかった（一方向ＡＮＯＶＡ、ｐ値＞０．０５）。Ｊ５９１−Ａ  ｍＡｂにおける、二次抗体単独に対する倍数変化は４５．３であった（データ示さず）。全体的に、これらのデータは、同時発現および同時配合ワクチン戦略の両方を使用した、二重抗原ワクチン接種の後の、ネイティブＰＳＭＡを認識する抗ＰＳＭＡ特異的抗体の産生を実証している。
【０２９６】
図２５は、抗ＰＳＣＡ抗体細胞表面結合によって二重抗原ワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示す。手短に述べると、１群あたり５匹のマウスを０日目にプライミングし、１４、２８および４９日目にＰＭＥＤでブーストした。５６日目に、細胞表面ネイティブＰＳＣＡの認識を、Ａｄ−ＰＳＣＡを形質導入したおよび形質導入していないＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞との血清抗体結合によって評価した。形質導入していない親細胞はアッセイのバックグラウンド対照として役割を果たした。ＰＳＣＡをワクチン接種したすべてのマウス群は、Ａｄ−ＰＳＣＡを形質導入したＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞と非常に低い抗ＰＳＣＡ抗体結合を実証した。ＰＳＣＡ−ＩＲＥＳ−ＰＳＡのワクチン接種は、ＰＳＣＡ単独をワクチン接種したマウスと比較して、有意に減少したＡｄ−ＰＳＣＡを形質導入したＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞との結合をもたらした（＊は一方向ＡＮＯＶＡによってｐ＜０．０５であることを示す）。まとめると、これらのデータは、ＰＳＣＡおよびＰＳＡの同時発現または同時配合は、非常に低い、抗ＰＳＣＡ特異的抗体によるネイティブＰＳＣＡの認識をもたらすことを実証している。
【０２９７】
（実施例７）
ヒトＰＳＭＡ改変抗原の免疫原性
研究設計。配列番号１のネイティブヒトＰＳＭＡタンパク質の１５〜７５０個のアミノ酸（ａａ）からなる免疫原性ＰＳＭＡポリペプチド（「ヒトＰＳＭＡ改変抗原」または「ｈＰＳＭＡ改変」）をコードしている構築体を使用したＤＮＡワクチン接種によって誘導された免疫応答を、ネイティブヒト完全長ＰＳＭＡタンパク質（ｈＰＳＭＡ完全長）によって誘導されたものと比較した。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたは雌パスツール（ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１）トランスジェニックマウスの群を０日目にプライミングし、ＰＭＥＤ投与によって、ｈＰＳＭＡ完全長またはｈＰＳＭＡ改変タンパク質のどちらかをコードしているＤＮＡワクチンの２μｇ用量を用いて、１４および２８日目にブーストした。３５日目にマウスを採血し、屠殺し（３回目のワクチン接種の７日後）、ｈＰＳＭＡ完全長タンパク質に対するＴ細胞免疫応答を、脾細胞中で、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、個々の動物からの５×１０５個の脾細胞／ウェルの単細胞懸濁液を、１０μｇの精製ｈＰＳＭＡタンパク質、５×１０４個のＴＲＡＭＰ−Ｃ２細胞単独、またはｈＰＳＭＡもしくはＰＳＭＡ−ＰＳＡ−ＰＳＣＡ融合タンパク質を発現するＴＲＡＭＰ−Ｃ２細胞と共に播種した。パスツール（ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１）トランスジェニックマウスでは、個々の動物からの５×１０５個の脾細胞／ウェルの単細胞懸濁液を、ヒトＰＳＭＡタンパク質配列に由来する既知のＨＬＡ−Ａ２制限ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープをパルシングしたヒトＨＬＡ−Ａ２を発現する５×１０４個のＫ５６２細胞と共に播種した（表２３）。また、パスツールマウスにおける応答は、１０μｇ／ｍｌの精製ＰＳＭＡタンパク質、または対照タンパク質（Ａｄ−ｅＧＦＰ）もしくは完全長ヒトＰＳＭＡタンパク質（Ａｄ−ｈＰＳＭＡ）を発現するアデノウイルスベクターを形質導入した５×１０４個のＳＫ−Ｍｅｌ５細胞を使用して決定した。各条件を３つ組で行った。プレートを２０時間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションし、洗浄し、インキュベーション後に製造者の指示に従って展開した。ＩＦＮ−γ  ＳＦＣの数をＣＴＬリーダーによって計数した。結果を図１９および２０に提示し、これは、ＰＳＭＡに特異的なＳＦＣの平均数／百万個の脾細胞±１群あたりの標準偏差を示す。
【０２９８】
ＥＬＩＳＡアッセイ。改変および完全長ＰＳＭＡワクチンによって誘導された抗体応答を、３５日目に採取したそれぞれの動物からの血清において測定した。血清をＥＬＩＳＡに供して抗ＰＳＭＡ抗体価を決定し、血清中の抗ＰＳＭＡ抗体価は、実施例５に記載のようにＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定した。結果を図２６に提示し、これは、１群あたりのマウスの数の平均力価±標準偏差を示す。
【０２９９】
ＦＡＣＳアッセイ。また、血清を、適切な細胞系の細胞表面上で発現されるヒトＰＳＭＡのいずれかに対する抗体結合を測定し、したがって、改変および完全長ＰＳＭＡワクチンによって産生された抗体が、ネイティブＰＳＭＡのコンホメーションを認識することができるかどうかを決定するためのＦＡＣＳアッセイにも供した。ＦＡＣＳアッセイは、実施例５に記載の手順に従って実施した。結果を図２９に提示し、これは、１群あたりのマウスの数の二次抗マウス抗体単独に対するマウス血清のＭＦＩの平均倍数変化±標準偏差を示す。
【０３００】
【表２４】
2019054804.tif 000028
【０３０１】
結果。図２６は、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定した、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるヒトＰＳＭＡ改変（アミノ酸１５〜７５０）対完全長ヒトＰＳＭＡ（アミノ酸１〜７５０）によって誘発されたＴ細胞免疫応答を評価するための代表的な研究の結果を示す。１群あたり５匹のマウスを０日目にプライミングし、１４および２８日目にｈＰＳＭＡ改変またはｈＰＳＭＡ完全長タンパク質を発現するＤＮＡワクチンを用いてＰＭＥＤでブーストした。３５日目に、ｈＰＳＭＡ完全長タンパク質に対して誘発された応答を、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、ＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＭＡまたは精製ヒトＰＳＭＡ  ＥＣＤタンパク質（図２６中で精製ｈＰＳＭＡタンパク質と呼ぶ）に対するＴ細胞応答を決定することによって比較した。ＴＲＡＭＰ  Ｃ２細胞はアッセイのバックグラウンド対照として役割を果たした。ＴＲＡＭＰ  Ｃ２−ＰＳＭＡまたは精製ｈＰＳＭＡタンパク質に対して誘発されたＩＦＮ−γ  Ｔ細胞応答の規模は、群間で有意な差がなかった（二方向ＡＮＯＶＡ、ｐ値＞０．０５）。これらの結果は、ｈＰＳＭＡ改変およびｈＰＳＭＡ完全長タンパク質を発現するＤＮＡワクチンがＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて等価なＴ細胞免疫応答を誘発することを示す。
【０３０２】
図２７Ａおよび２７Ｂは、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる、パスツール（ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１）トランスジェニックマウスにおけるヒトＰＳＭＡ改変抗原（アミノ酸１５〜７５０）対完全長ヒトＰＳＭＡ抗原（アミノ酸１〜７５０）のＴ細胞免疫応答を評価するための代表的な研究の結果を示す。１群あたり１０匹のマウスを０日目にプライミングし、１４および２８日目にｈＰＳＭＡ改変またはｈＰＳＭＡ完全長タンパク質をコードしているＤＮＡワクチンを用いてＰＭＥＤでブーストした。３５日目に、ｈＰＳＭＡ完全長タンパク質に対して誘発されたＴ細胞応答を、（Ａ）既知のＣＤ８＋エピトープを表すＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドに由来するＰＳＭＡ、および（Ｂ）Ａｄ−ｈＰＳＭＡを形質導入したＳＫ−Ｍｅｌ５細胞または精製ｈＰＳＭＡ完全長タンパク質を使用したＩＦＮ−  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定した。ｈＨＥＲ２  １０６ペプチドおよびＳＫ−Ｍｅｌ５  Ａｄ−ｅＧＦＰは、アッセイにおいて陰性対照として役割を果たした。ｈＰＳＭＡ改変ワクチンはＨＬＡ−Ａ２制限ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対して最高規模のＩＦＮ−γ  Ｔ細胞免疫応答を誘発したが、群間の差は有意ではなかった（二方向ＡＮＯＶＡ、ｐ値＞０．０５）。同様に、ｈＰＳＭＡ改変ワクチンはＡｄ−ｈＰＳＭＡを形質導入したＳＫ−Ｍｅｌ５細胞に対して最高規模の免疫応答を誘発し、精製ｈＰＳＭＡタンパク質に対するＩＦＮ−γ  ＳＦＣの頻度が有意により高かった（二方向ＡＮＯＶＡ、ｐ値＞０．０５）。これらの結果は、パスツール（ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１）トランスジェニックマウスにおいて、ｈＰＳＭＡ改変タンパク質を発現するＤＮＡワクチンは、ｈＰＳＭＡタンパク質に対するＴ細胞応答を誘導することにおいてｈＰＳＭＡ完全長タンパク質よりも強力であることを実証している。
【０３０３】
図２８は、抗ＰＳＭＡ抗体価によってヒト改変および完全長ＰＳＭＡワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示す。手短に述べると、マウスを０日目にプライミングし、１４および２８日目にＰＭＥＤでブーストした。９匹のパスツールマウスに改変ＰＳＭＡをワクチン接種し、１０匹のパスツールマウスに完全長ＰＳＭＡをワクチン接種し、１群あたり５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに改変または完全長ＰＳＭＡのどちらかをワクチン接種した。３５日目に、血清抗ＰＳＭＡ抗体価をＥＬＩＳＡによって評価した。予想どおり、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、パスツールマウスよりも有意に高い抗ＰＳＭＡ抗体価を生じた（一方向ＡＮＯＶＡ）。マウスの同じ株間の抗体価を比較すると、改変および完全長ＰＳＭＡをワクチン接種したマウス間で抗体価に有意差はなかった（一方向ＡＮＯＶＡ、ｐ値＞０．０５）。全体的に、これらの結果は、ヒトＰＳＭＡの完全長型を用いたワクチン接種は、ヒト改変ＰＳＭＡワクチンと比較して等価な抗ＰＳＭＡ抗体価を生じることを実証している。
【０３０４】
図２９は、抗ＰＳＭＡ抗体細胞表面結合によってヒト改変および完全長ＰＳＭＡワクチンの免疫原性を評価する代表的な研究の結果を示す。手短に述べると、１群あたり５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスを０日目にプライミングし、１４および２８日目にＰＭＥＤでブーストした。３５日目に、細胞表面ネイティブＰＳＭＡの認識を、ＬＮＣａＰおよびＰＣ３細胞との血清抗体結合によって評価した。ＰＣ３細胞はアッセイのバックグラウンド対照として役割を果たした。改変または完全長ＰＳＭＡをワクチン接種したマウス間でＬＮＣａＰ細胞との抗ＰＳＭＡ抗体結合に有意差はなかった（一方向ＡＮＯＶＡ、ｐ値＞０．０５）。Ｊ５９１−Ａ  ｍＡｂにおける、二次抗体単独に対する倍数変化は１４．３であった（データ示さず）。全体的に、これらのデータは、改変または完全長ＰＳＭＡのワクチン接種のどちらかの後に、ネイティブＰＳＭＡを認識する抗ＰＳＭＡ特異的抗体を産生させることが実現可能であることを実証している。
【０３０５】
（実施例８）
ワクチンに誘導された免疫応答に対する抗ＣＴＬＡ−４抗体の効果
本発明によって提供されるヒトＰＳＭＡ核酸分子によって誘導された免疫応答に対する抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（ＣＰ−６７５、２０６）の局所投与の効果をサル研究において調査し、ここでは、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＰＳＭＡ特異的Ｔ細胞応答を測定することによって免疫応答を評価した。
【０３０６】
動物の処置および試料の採取。各試験群に５〜６匹（＃１〜５または６）の３群の雄インドアカゲザルを、アデノウイルス（１ｅ１１Ｖ．Ｐ．、筋肉内に注射）によって送達したヒトＰＳＭＡ改変抗原（配列番号９）をコードしている核酸（配列番号１０）によって免疫化し、その後、それぞれ６および９週間の間隔で２回のＰＭＥＤによるＤＮＡ免疫化（８回の操作／免疫化、下腹部の右および左側でそれぞれ４回ずつの操作）を行った。第２および３群の動物は、ＰＭＥＤ免疫化に続いてそれぞれの鼠径部流入領域リンパ節に近接して３ｍｇのＣｐＧ（ＰＦ−０３５１２６７６）の両側皮内注射をさらに受けた。第２群は、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（ＣＰ−６７５、２０６）静脈内注射も受け、第３群は、２回目のＰＭＥＤ免疫化の時点で左および右の鼠径部ワクチン流入領域リンパ節のそれぞれに近接して５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（ＣＰ−６７５、２０６）の皮内注射を受けた。
【０３０７】
最後のＰＭＥＤ免疫化の１６日後に末梢血試料をそれぞれの動物から採取した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を試料から単離し、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに供してＰＳＭＡ特異的Ｔ細胞応答を測定した。手短に述べると、個々の動物からの４ｅ５個のＰＢＭＣ／ウェルを、それぞれ２ｕｇ／ｍｌのＰＳＭＡ特異的ペプチドのプール、１０ｕｇ／ｍｌのｈＰＳＭＡ  ＥＣＤタンパク質、１０ｕｇ／ｍｌのアカゲザルＰＳＭＡ  ＥＣＤタンパク質、またはそれぞれ２ｕｇ／ｍｌの非特異的な対照ペプチド（ヒトＨＥＲ２ペプチドプール）と共に、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴプレート中に播種した。ＰＳＭＡ特異的ペプチドプールのそれぞれの組成を表２４Ａ中に提供する。プレートを１６時間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションし、洗浄し、インキュベーション後に製造者の指示に従って展開した。ＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数をＣＴＬリーダーによって計数した。各条件を２つ組で行った。結果を表２４Ｂに提示し、これは、１ｅ６個のＰＢＭＣに対して正規化した、ＳＦＣの平均数を非特異的な対照ペプチドから減算した、３つ組からのＰＳＭＡ特異的ＳＦＣの平均数を示す。＾は、スポット数が数えるには多すぎたため計数が正確ではないことを示す。
【０３０８】
ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ手順。ＩＦＮγに特異的な捕捉抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃５１−２５２５ｋｃ）をマイクロプレート中のポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜上に終夜、４℃でコーティングする。抗体との非特異的結合を防止するためにプレートを血清／タンパク質で遮断する。遮断後、エフェクター細胞（免疫化したマウスから単離した脾細胞またはアカゲザルから単離したＰＢＭＣなど）および標的（ペプチドライブラリからのＰＳＭＡペプチド、抗原特異的ペプチドをパルシングした標的細胞または関連抗原を発現する腫瘍細胞など）をウェルに加え、終夜、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内でインキュベーションした。エフェクター細胞によって分泌されたサイトカインをＰＶＤＦ膜の表面上のコーティング抗体によって捕捉した。細胞および培養培地を除去した後、検出のために１００μｌのビオチン標識したポリクローナル抗ヒトＩＦＮγ抗体をそれぞれのウェルに加えた。ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼおよび沈殿基質である３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）を加えることによってスポットを可視化して、製造者（Ｍａｂｔｅｃｈ）のプロトコルに従って赤色のスポットが得られた。それぞれのスポットは単一のサイトカイン産生Ｔ細胞を表す。
【０３０９】
結果。表２４Ｂは、抗体なし（第１群）、または静脈内注射によって全身的に与えた（第２群）、もしくはワクチン流入領域リンパ節に近接した皮内注射によって局所的に与えた（第３群）抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（ＣＰ−６７５、２０６）を用いて、ワクチンによって誘導されたＴ細胞応答を評価および比較する、代表的なＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。表１Ｂに示すように、ＰＳＭＡワクチンは、ＣｐＧ（ＰＦ−０３５１２６７６）および抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（ＣＰ−６７５、２０６）の非存在下で、複数のＰＳＭＡ特異的ペプチドおよびタンパク質に対して測定可能なＩＦＮγ  Ｔ細胞応答を誘導した。応答はＣｐＧ（ＰＦ−０３５１２６７６）の添加および抗ＣＴＬＡ−４抗体の全身性送達（ＣＰ−６７５、２０６、第２群）によって中程度に増強された。しかし、抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（ＣＰ−６７５、２０６）をワクチン流入領域リンパ節に近接した皮内注射によって局所的に送達した場合に（第３群）、複数のＰＳＭＡペプチドおよびＰＳＭＡタンパク質に対する応答のより強力かつ有意な増強が観察された。
【０３１０】
【表２５−１】
2019054804.tif 000029
【０３１１】
【表２５−２】
2019054804.tif 000030
【０３１２】
【表２６】
2019054804.tif 000031
【０３１３】
（実施例９）
サルに投与した後のＣＴＬＡ−４抗体の全身性曝露
抗ＣＴＬＡ−４抗体トレメリムマブ（ＣＰ６７５２０６）の血中レベルを、インドアカゲザルにおいて、抗体を皮内または静脈内注射によって投与した後に調査した。
【０３１４】
動物の処置および試料の採取。１つの処置群あたり３匹の動物に、伏在静脈内への単一の静脈内注射または鼠径部流入領域リンパ節に近接した大腿上部への複数の０．２ｍｌの皮内両側注射のどちらかを用いて、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体トレメリムマブを注射した。注射の０、１、２、４、８、１２、２４、および４８時間後に、抗凝固剤としてヘパリンリチウムを含有する２．０ｍｌのバキュテナーチューブ内に血液試料を採取した。血漿は、バキュテナーチューブ中の上清から、１５００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離の後に採取された。血漿中のトレメリムマブのレベルを、以下に提供する手順に従って定量的ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。
【０３１５】
トレメリムマブの定量的ＥＬＩＳＡアッセイ手順。３８４ウェルの高結合アッセイプレート（ＶＷＲ−Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅカタログ＃８２０５１−２６４）を、１００ｍＭの炭酸−炭酸水素塩コーティング緩衝液中に１．０μｇ／ｍｌの、２５μｌ／ウェルのＣＤ−１５２（ＣＴＬＡ−４、Ａｎｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓカタログ＃５０１−０２０）でコーティングし、終夜、４℃でインキュベーションした。プレートを１×ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０１ＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で×６洗浄し、４０μＬ／ウェルの５％ＦＢＳ／１×ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを使用して遮断し、６００ｒｐｍ、ＲＴで１時間、振盪しながらインキュベーションした。標準は、トレメリムマブの以下の希釈液を作製することによって調製した：２００、６７、２２、７．４、２．５、０．８２、０．２７、０．０９および０．０３ｎｇ／ｍＬ。試料を１：１００、１：１，０００および１：１０，０００に希釈した。希釈剤は、１×ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０１ＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）中に１％のナイーブカニクイマカクザル血清および５％ＦＢＳからなる。２５μＬ／ウェルの各標準、試料、および希釈剤対照を２つ組でプレート内に移し、６００ｒｐｍ、ＲＴで１時間、振盪しながらインキュベーションした。１×ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで×６洗浄した後、１×ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて１：５，０００の希釈率の、２５μＬ／ウェルの二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ  ＨＲＰ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ＃９０４２−０５）を加え、その後、６００ｒｐｍ、室温で１時間、振盪しながらインキュベーションした。１×ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで×６洗浄した後、２５μＬ／ウェルのＴＭＢペルオキシダーゼＥＩＡ基質（溶液Ａ＋Ｂ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄカタログ＃１７２−１０６７）を加え、プレートをＲＴで４分間インキュベーションした。１２．５μＬ／ウェルの１Ｎの硫酸を加えることによって比色反応を停止させ、その後、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。検量線を使用して各試料中のトレメリムマブの量を定量し、０．２７〜６７ｎｇ／ｍＬを定量的範囲として使用した。
【０３１６】
結果。代表的な研究からの血漿抗ＣＴＬＡ−４レベルを図３０に提示する。示したように、抗ＣＴＬＡ−４抗体トレメリムマブの皮内注射は、静脈内注射（ＡＵＣ０〜２４＝７．２×１０６ｎｇ・時間／ｍｌ）よりも、血液中の抗体の緩徐な放出動力学および低い全身性曝露（ＡＵＣ０〜２４＝４．９×１０６ｎｇ・時間／ｍｌ）プロフィールを示す。
【０３１７】
（実施例１０）
マウスにおけるワクチンに誘導された免疫応答に対する抗ＣＴＬＡ−４抗体の効果
研究手順。１群あたり６匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ｒＨｅｒ−２を発現するＤＮＡを用いて、４週間の間隔を空けたＰＭＥＤによってプライミングおよびブーストした。凡例に示すように、１５０μｇのマウスＣＴＬＡ−４に特異的なモノクローナル抗体（クローン９Ｈ１０、Ｂｉｏｘｃｅｌｌもしくは＃ＢＥ０１３１）またはアイソタイプ対照モノクローナル抗体（Ｂｉｏｘｃｅｌｌ＃ＢＥ００９１）をＰＭＥＤ操作の日に投与し、ＰＭＥＤ後の日には１００μｇを局所皮内注射または全身性腹腔内注射によって投与した。多機能的（複数サイトカイン陽性）Ｔ細胞免疫応答は、最後のＰＭＥＤ免疫化の７日後に個々のマウスから単離した脾細胞からＩＣＳアッセイによって測定した。１０μｇ／ｍｌのワクチン特異的エピトープペプチド（ｒＨｅｒ−２特異的抗原特異的ＣＤ８（ｐ６６）、ＣＤ４（ｐ１６９）エピトープまたは無関係のペプチドＨＢＶ（コア抗原ｐ８７））で５時間刺激した後、脾細胞を最初にＣＤ４、ＣＤ３およびＣＤ８について染色し、続いて、透過処理ならびにＩＦＮα、ＴＮＦαおよびＩＬ−２の発現についての染色を行い、これをフローサイトメトリーによって分析した。それぞれの動物の全脾臓あたりの抗原特異的な単一、二重または三重サイトカイン陽性Ｔ細胞の総数は、無関係のペプチドＨＢＶに対する応答をワクチン特異的応答から減算し、脾臓あたりの単離された脾細胞の総数によって正規化することによって計算する。
【０３１８】
結果。図３１Ａおよび３１Ｂは、細胞内サイトカイン染色アッセイによる、ワクチンに誘導された免疫応答の品質に対する抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（クローン９Ｈ１０）の免疫調節活性を評価する代表的な研究の結果を示す。最後のＰＭＥＤの７日後、抗ＣＴＬＡ−４の局所的な皮内送達による抗原特異的な単一および二重サイトカイン陽性ＣＤ８  Ｔ細胞応答、ならびに全身性送達による二重および三重サイトカイン陽性ＣＤ８  Ｔ細胞応答の有意な増加が観察された。さらに、皮内送達による抗原特異的単一サイトカイン陽性ＣＤ４  Ｔ細胞および抗ＣＴＬＡ−４の全身性送達による二重サイトカイン陽性細胞の有意な増加が観察された（＊はスチューデントＴ検定によってＰ＜０．０５であることを示す）。
【０３１９】
（実施例１１）
抗がんワクチンと組み合わせたスニチニブの相乗効果
研究手順。抗がんＤＮＡワクチンと組み合わせたスニチニブリンゴ酸塩の抗腫瘍有効性をＢＡＬＢ／ｎｅｕＴトランスジェニック雌マウスにおいて調査した。ラットＨｅｒ−２（ｒＨｅｒ−２）腫瘍関連抗原を発現するヘテロ接合性ＢＡＬＢ／ｎｅｕＴトランスジェニック雌マウスに、ＢＡＬＢ／ｎｅｕＴマウスの自発性乳房腫瘍に由来するｒＨｅｒ−２を発現するＴＵＢＯ細胞１ｅ６個を皮下移植した。腫瘍細胞移植の７日後、マウスに、ビヒクルまたは凡例に示した用量のスニチニブリンゴ酸塩のいずれかを１日１回経口で投薬した。スニチニブリンゴ酸塩治療を開始した３日後に、（ａ）腫瘍もしくはマウス中で発現されない抗原を発現する対照ワクチンまたは（ｂ）腫瘍およびマウス中で発現される配列番号５４のラットＨｅｒ−２抗原（ｒＨＥＲ２）を発現するＤＮＡがんワクチン構築体のどちらかから構成されるレジメンを用いてマウスを免疫化した。腫瘍成長速度は、皮下ＴＵＢＯ腫瘍の長径（ａ）および短径（ｂ）を週に２回測定し、体積をａ×ｂ２×０．５ｍｍ３として計算することによって分析した。各処置群あたり１０匹のマウスからの腫瘍体積の平均および標準誤差を腫瘍移植後の日数に対してプロットする。
【０３２０】
結果。図３２は、単独療法として、またはＤＮＡがんワクチンと組み合わせて、スニチニブリンゴ酸塩で処置した際の皮下腫瘍成長速度を評価および比較する代表的な研究の結果を示す。ＤＮＡがんワクチン（ｒＨＥＲ２：１ｅ９Ｖ．Ｐ．のｒＨｅｒ−２を発現するアデノウイルスの筋肉内注射、次いで、ＰＭＥＤによる、ｒＨｅｒ−２を発現するＤＮＡの２回の隔週の操作）を受けたマウスからの腫瘍は迅速に成長し続けた一方で、２０ｍｇ／ｋｇまたは４０ｍｇ／ｋｇの用量のどちらかのスニチニブリンゴ酸塩を対照ワクチン（対照：１ｅ９Ｖ．Ｐ．のｅＧＦＰを発現するアデノウイルスの筋肉内注射、次いで、ＰＭＥＤによる、ＨＢＶコア抗原を発現するＤＮＡの２回の隔週の操作）と共に受けたマウスからの腫瘍は腫瘍成長速度を有意に減少させ、２０ｍｇ／ｋｇは、４０ｍｇ／ｋｇの用量と比較して最適以下の有効性を示した。しかし、がんワクチンを２０ｍｇ／ｋｇの最適以下の用量のスニチニブリンゴ酸塩と共に同時投与した場合は、腫瘍は、対照ワクチンと同時投与した同じ用量のスニチニブリンゴ酸塩で処置したマウスよりもはるかに遅い成長速度、およびより高い用量のスニチニブリンゴ酸塩で処置したマウスと同様の成長速度で成長した。がんワクチンは、最適以下の用量のスニチニブリンゴ酸塩を受けたマウスに追加の治療上の利点をもたらす。
【０３２１】
図３３Ａ〜３３Ｄは、対照（対照）またはＤＮＡがんワクチン（ｒＨＥＲ２）を用いた２０ｍｇ／ｋｇのスニチニブリンゴ酸塩の抗腫瘍有効性を評価および比較する代表的な研究からのマウスの個々の腫瘍成長速度を示す。手短に述べると、腫瘍細胞移植の７日後、１つの処置群あたり１０匹のマウスに、ビヒクルまたは２０ｍｇ／ｋｇのスニチニブリンゴ酸塩（Ｓｕｔｅｎｔ）のどちらかを３４日間、１日１回経口投薬した。Ｓｕｔｅｎｔ投薬を開始した３日後、アデノウイルスによるプライミング、次いでＰＭＥＤの一連の免疫化を開始し、これはＳｕｔｅｎｔ治療を中断した後も継続した。具体的には、マウスを、１ｅ９Ｖ．Ｐ．のｅＧＦＰを発現するアデノウイルスの筋肉内注射、続いて、ＨＢＶコアおよび表面抗原を発現するＤＮＡのＰＭＥＤによる２回の隔週、２回の９日間および４回の週に１回の操作から構成される対照ワクチン、またはその代わりにｒＨｅｒ−２を発現するアデノウイルスおよびＤＮＡから構成されるがんワクチンのどちらかで免疫化した。ビヒクルを対照ワクチンと共に受けた動物の腫瘍は７日目付近に測定可能になり、成長し続けて腫瘍移植の５０日後には２０００ｍｍ３に達した。Ｓｕｔｅｎｔを対照ワクチンと共に受けた動物の腫瘍成長は、Ｓｕｔｅｎｔ治療を中断するまで有意に損なわれた。腫瘍は、Ｓｕｔｅｎｔを中断した直後に迅速な成長速度を示し、その大多数が腫瘍移植の５０日後に２０００ｍｍ３に達した。がんワクチン接種のみを受けた動物の腫瘍成長速度は、がんワクチンまたはＳｕｔｅｎｔを受けなかった動物よりもわずかに遅かった。がんワクチンとＳｕｔｅｎｔとの組合せは、Ｓｕｔｅｎｔ治療中に腫瘍成長を抑制しただけでなく（図３３）、Ｓｕｔｅｎｔ処置を中断した後にも動物の６０％において腫瘍の進行を有意に損なわせた。
【０３２２】
図３４は、Ｓｕｔｅｎｔと対照（対照）またはがんワクチン（ｒＨＥＲ２）との抗腫瘍有効性を評価する、図２Ｂに記載した研究からのマウスの群のカプラン−マイヤー生存曲線を示す。ＩＡＵＣＵＣ指針に従って、腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達した際にマウスを屠殺した。Ｓｕｔｅｎｔ（２０ｍｇ／ｋｇ）およびがんワクチンで処置したマウスのみが、ビヒクルと対照ワクチン、Ｓｕｔｅｎｔなしのがんワクチン、またはがんワクチンなしのＳｕｔｅｎｔのどちらかで処置したマウスと比較して有意に延長された生存を示した（＊は対数順位検定によってＰ＜０．０１）。図３５Ａ〜３５Ｄは、図２Ｂで処置したマウスからの末梢血中の骨髄由来抑制細胞（Ｇｒ１＋ＣＤ１１ｂ＋）およびＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞を含有するＴｒｅｇのパーセンテージを示す。手短に述べると、２７日目（Ｓｕｔｅｎｔまたはビヒクル処置を開始した２０日後）の各群からの５匹のマウスの顎下採血から、ＰＢＭＣを染色し、Ｇｒ１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ２５の発現についてフローサイトメトリーによって分析した。各処置群の平均および標準誤差を示す。Ｓｕｔｅｎｔもがんワクチンも受けなかったマウス（ビヒクル＋対照）と比較して、Ｓｕｔｅｎｔと対照またはがんワクチンのどちらかとによって処置したマウスにおいて％骨髄由来抑制細胞の統計的に有意な低下が観察された。しかし、Ｓｕｔｅｎｔとがんワクチンとの組合せ（Ｓｕｔｅｎｔ＋ｒＨＥＲ２）で処置したマウスでは、Ｓｕｔｅｎｔなしのがんワクチン（ビヒクル＋ｒＨＥＲ２）またはがんワクチンなしのＳｕｔｅｎｔ（Ｓｕｔｅｎｔ＋対照）で処置したマウスよりも有意に少ない骨髄由来抑制細胞が観察された。ＣＤ４集団におけるＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を含有するＴｒｅｇの統計的に有意な低下が、Ｓｕｔｅｎｔとがんワクチンによって観察された。これらのマウスは、ＳｕｔｅｎｔなしのがんワクチンまたはがんワクチンなしのＳｕｔｅｎｔで処置したマウスよりも、その血液中のＣＤ４集団中にＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を含有するＴｒｅｇの％が有意に低かった。＊はスチューデントＴ検定によってＰ＜０．０５であることを示す。
【０３２３】
図３６Ａ〜３６Ｃは、マウスの腫瘍から単離した骨髄由来抑制細胞（Ｇｒ１＋ＣＤ１１ｂ＋）、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）およびＰＤ−１＋ＣＤ８  Ｔ細胞の総数を示す。手短に述べると、マウスに、単一の１日１回の経口量のビヒクルまたは２０ｍｇ／ｋｇのＳｕｔｅｎｔのどちらかを、ＴＵＢＯ細胞を移植した３日後に２８日間与えた。同じマウスを、１ｅ９Ｖ．Ｐ．のｅＧＦＰを発現するアデノウイルスの筋肉内注射、続いて、ＰＭＥＤによって送達するＨＢＶコア抗原を発現するＤＮＡの２回の隔週の投与から構成される対照ワクチン、またはｒＨｅｒ−２を発現するアデノウイルスおよびＤＮＡから構成されるがんワクチンのどちらかで免疫化した。５０μｇのＣｐＧ（ＰＦ−０３５１２６７６）の皮内注射を、ＰＭＥＤ投与を用いて、右側鼠径部流入領域リンパ節に近接して与えた。２回目のＰＭＥＤおよびＣｐＧ投与の７日後、１つの処置群あたり６匹のマウスから個々の腫瘍を単離した。単離した皮下腫瘍から調製した単細胞懸濁液を、Ｇｒ１、Ｃｄ１１ｂ、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、およびＰＤ−１に特異的な抗体によって染色し、フローサイトメトリーによって分析した。図中に示すように各処置群からの１μｇの腫瘍あたりの特異的細胞の総数の平均および標準誤差をプロットする。（＊はスチューデントＴ検定によってＰ＜０．０５であることを示す）。マウスにがんワクチンを与えた場合に腫瘍中に見つかる免疫抑制性ＴｒｅｇまたはＭＤＳＣの頻度（ＡおよびＢ）は、対照ワクチンを受けたマウス（ＡおよびＢ）と比較して有意差はなかったが、がんワクチンのみを受けたマウスと比較して、マウスをＳｕｔｅｎｔで処置した際に有意な低下が観察された（ＡおよびＢ）。また、がんワクチンのみを受けたマウス（Ｃ）と比較して、Ｓｕｔｅｎｔで処置したマウスにおいてＰＤ−１＋ＣＤ８  Ｔ細胞の低下も観察された（Ｃ）。まとめると、これらのデータは、ワクチンと組み合わせた、Ｔｒｅｇ、ＭＤＳＣまたはＣＤ８＋ＰＤ−１＋Ｔ細胞を低下させる薬剤が、腫瘍を保有する動物における腫瘍量の低下に有益であろうことを実証している。
【０３２４】
（実施例１２）
スニチニブおよび抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせたワクチンの抗がん有効性
スニチニブおよび抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（クローン９Ｄ９）と組み合わせたがんワクチンの抗腫瘍有効性を、皮下ＴＵＢＯ腫瘍を保有するＢＡＬＢ／ｎｅｕＴマウスにおいて調査した。
【０３２５】
研究手順。手短に述べると、各群あたり１０匹のマウスに、ビヒクルまたは２０ｍｇ／ｋｇのスニチニブリンゴ酸塩のどちらかを、腫瘍移植後の１０日目から開始して６４日目まで、１日１回経口投薬した。抗原なし（対照ワクチン）または配列番号５４のラットＨｅｒ−２抗原（がんワクチン）のどちらかをコードしている、アデノウイルスベクターとしてのＤＮＡ構築体を用いたワクチン接種を１３日目に開始し、続いて、ＤＮＡによるそれぞれの抗原（ＨＢＶ抗原またはｒＨｅｒ−２）の２回の週に１回の免疫化、２回の隔週の免疫化、および７回の週に１回の免疫化を行った。抗ネズミＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体で処置したマウスの群（黒丸および白三角）に、２０、２７、４１、５５、６２、６９、７６、８３、９０、および９７日目のＰＭＥＤ注射の直後に、２５０μｇの抗体を腹腔内注射した。
【０３２６】
結果。図３７は、がんワクチンと組み合わせたスニチニブおよび抗ネズミＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（クローン９Ｄ９）の抗腫瘍有効性を評価する、代表的な研究からのマウスの群のカプラン−マイヤー生存曲線を示す。Ｓｕｔｅｎｔと対照ワクチン（白丸）、抗ネズミＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（白三角）またはがんワクチン（黒三角）とで処置したマウスにおいて増加した生存時間が観察された。抗ネズミＣＴＬＡ−４と組み合わせたＳｕｔｅｎｔおよびがんワクチンで処置したマウスにおいて生存のさらなる増加が観察された（黒丸）。Ｐ値は対数順位検定によって計算した。
【０３２７】
（実施例１３）
スニチニブの全身性曝露および低用量スニチニブと組み合わせた抗がんワクチンの抗がん有効性
スニチニブ全身性曝露の研究。
血中スニチニブの動力学を、皮下ＴＵＢＯ腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｎｅｕＴマウスにおいて調査した。手短に述べると、腫瘍移植の６日後、各処置群あたり２０匹のマウスに、２０ｍｇ／ｋｇのＳｕｔｅｎｔを経口で１日１回（ＳＩＤ）、または１０ｍｇ／ｋｇを１日２回（ＢＩＤ）、６時間間隔で与えた。Ｓｕｔｅｎｔ投薬後の示したいくつかの時点（０、２、４、６、８、１０、１２、および２４時間）で、２〜３匹のマウスからの顎下血液をヘパリンリチウムチューブ内に採取した。×１０００ｇで１５分間遠心分離した後に血漿上清がチューブから回収され、血漿試料からのスニチニブレベルをＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定した。各時点での各群の平均および標準誤差をプロットする。
【０３２８】
結果を図３８に提示する。各時点での各群の平均および標準誤差をプロットする。水平の点線は、単独療法において腫瘍成長を有効に阻害するために必要な最小スニチニブ血中レベルである５０ｎｇ／ｍｌを印している（Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．ら：「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＳＵ１１２４８，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ／ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ」．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０３、９：３２７〜３３７）。示したように、２０ｍｇ／ｋｇのＳＩＤまたは１０ｍｇ／ｋｇのＢＩＤのどちらかを受けたマウスにおける血中スニチニブレベルは、腫瘍成長を一過的に有効に阻害する５０ｎｇ／ｍｌの標的有効用量を、２４時間以内しか維持しない。２０ｍｇ／ｋｇのＳＩＤ群における血中レベルは、２時間で５０ｎｇ／ｍｌを超えてピークとなり、６時間で５０ｎｇ／ｍｌまで下がり、Ｓｕｔｅｎｔ投薬の１２時間後までには血液から除去された。１０ｍｇ／ｋｇのＢＩＤを受けた群におけるレベルは、２時間で５０ｎｇ／ｍｌを超えてピークとなったが、４時間までに５０ｎｇ／ｍｌ未満まで迅速に下がり、これは２回目の投薬の２時間後に再びピークとなった。このレベルは４時間までに５０ｎｇ／ｍｌまで迅速に下がり、２回目の投薬の１８時間後までには血液から除去された。１日２回の投薬レジメンにもかかわらず、１０ｍｇ／ｋｇを受けた動物は、２０ｍｇ／ｋｇの単一の１日１回の投薬レジメンよりも短い標的濃度での曝露時間を示したままであった。
【０３２９】
抗腫瘍有効性の研究。
抗がんワクチンと組み合わせた低用量スニチニブの長期投与の抗腫瘍有効性を、皮下ＴＵＢＯ腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｎｅｕＴマウスにおいて調査した。手短に述べると、マウスに、スニチニブリンゴ酸塩（Ｓｕｔｅｎｔ）を２０ｍｇ／ｋｇのＳＩＤで３１日間または１０ｍｇ／ｋｇのＢＩＤで１０４日間与え、対照ワクチンまたはがんワクチンを与えた。抗原を送達しない対照ワクチンおよび配列番号５４のラットｈｅｒ−２抗原（ｒＨｅｒ−２）を送達するがんワクチンをアデノウイルスによって９日目に与え、続いて、ＨＢＶ抗原またはｒＨｅｒ−２をそれぞれ送達するＰＭＥＤによって、ＤＮＡの５回の隔週の投与を行った。
【０３３０】
結果を図３９に提示する。がんワクチンは、２０ｍ／ｋｇのＳｕｔｅｎｔを与えたマウスの生存を改善させた一方で、１０ｍｇ／ｋｇのＳｕｔｅｎｔを与えたマウスの生存がさらに有意に改善されていた（＊は対数順位検定によってＰ＝０．０５）。
【０３３１】
（実施例１４）
がんワクチンによって誘導された免疫応答に対するＣｐＧまたはＣＤ４０作用剤の効果
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫原性研究
がんによって誘導された抗原特異的免疫応答の規模および品質に対する免疫調節剤の局所投与の効果をＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて調査し、免疫応答は、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイまたは細胞内サイトカイン染色アッセイを使用してｒＨＥＲ２特異的Ｔ細胞応答を測定することによって評価した。手短に述べると、示したように１群あたり４〜６匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ｒＨＥＲ２抗原配列（配列番号５４）をコードしているＤＮＡプラスミド発現構築体を用いて、ＰＭＥＤ送達系によって免疫化した。ＰＭＥＤ操作に続いて、免疫調節剤ＣｐＧ７９０９（ＰＦ−０３５１２６７６）および抗ＣＤ４０モノクローナル作用性抗体を、ワクチン流入領域鼠径リンパ節に近接した皮内注射によって局所投与した。抗原特異的Ｔ細胞応答は、以下に記載の手順に従って、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴまたは細胞内サイトカイン染色アッセイによって測定した。
【０３３２】
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイ
ｒＨｅｒ−２特異的多機能的（複数サイトカイン陽性）Ｔ細胞免疫応答は、個々の動物から単離した脾細胞またはＰＢＭＣからＩＣＳアッセイによって測定した。典型的には、１ｅ６個の脾細胞を、１μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡおよび１０μｇ／ｍｌのペプチド刺激剤（ｒＨｅｒ−２特異的ＣＤ８  ｐ６６、ｒＨｅｒ−２特異的ＣＤ４  ｐ１６９または無関係のＨＢＶ  ｐ８７）と共に５時間、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内でインキュベーションした。刺激後、脾細胞を洗浄し、Ｆｃγ遮断剤（抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２）で１０分間、４℃で遮断し、次いで、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ａｑｕａ染色、抗マウスＣＤ３ｅＰＥ−Ｃｙ７、抗マウスＣＤ８ａパシフィックブルー、および抗マウスＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０  ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５で２０分間染色した。細胞を洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドを用いて終夜、４℃で固定し、ＢＤ  ｆｉｘ／ｐｅｒｍ溶液を用いて３０分間、ＲＴで透過処理し、抗マウスＩＦＮγ  ＡＰＣ、抗マウスＴＮＦα  Ａｌｅｘａ４８８および抗マウスＩＬ−２  ＰＥと共に３０分間、ＲＴでインキュベーションした。細胞を洗浄し、２０，０００個のＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞をフローサイトメトリーによる分析のために獲得した。それぞれの動物の全脾臓あたりの抗原特異的な単一、二重または三重サイトカイン陽性Ｔ細胞の総数は、無関係のペプチドＨＢＶに対するｒＨｅｒ−２特異的応答をワクチン特異的応答から減算し、脾臓から単離された脾細胞の総数に対して正規化することによって計算する。
【０３３３】
ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果
図４０は、免疫調節剤を示したように与えた場合の、ｒＨＥＲ２ワクチンによって誘導された抗原特異的Ｔ細胞応答の規模を評価する代表的な研究からのマウスの群からのＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ結果を示す。手短に述べると、１処置群あたりのそれぞれのマウス（ｎ＝４匹）を、ｒＨＥＲ２抗原配列（配列番号５４）をコードしているＤＮＡプラスミド発現構築体を用いて、ＰＭＥＤによって免疫化し、直後に、示したように１００ｕｇの対照ラットＩｇＧモノクローナル抗体（Ｂｉｏｘｃｅｌｌ＃ＢＥ００８９：対照ｍＡｂ）または５０μｇのＣｐＧ７９０９または１００ｕｇの抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（Ｂｉｏｘｃｅｌｌ＃ＢＥ００１６−２：ａ−ＣＤ４０  ｍＡｂ）のどちらかを与えた。抗原特異的免疫応答は、ＰＭＥＤ操作の７日後に、対照または１０μｇ／ｍｌの濃度のｒＨｅｒ−２特異的ｐ６６ペプチドと混合した５ｅ５個の脾細胞からのＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定した。１ｅ５個のＣＤ８  Ｔ細胞を含有する脾細胞からのＩＦＮγ分泌細胞の総数を個々の動物からのＥＬＩＳＰＯＴ結果から計算し、脾細胞中のＣＤ８  Ｔ細胞の％ならびに各群の平均および標準誤差をプロットした。示したように、ＣｐＧ７９０９および抗ＣＤ４０モノクローナル抗体ではどちらも、対照抗体を受けたマウスと比較して、ｒＨｅｒ−２  ＤＮＡによって誘導された抗原特異的免疫応答の規模が有意に増強されていた。
【０３３４】
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイの結果。図４１Ａおよび４１Ｂは、細胞内サイトカイン染色アッセイによる、ワクチンに誘導された免疫応答の品質に対するＣｐＧ７９０９の免疫調節活性を評価する代表的な研究の結果を示す。手短に述べると、それぞれの動物を、ＰＭＥＤによって送達した、ｒＨＥＲ２抗原配列（配列番号５４）をコードしているＤＮＡプラスミド発現構築体を用いて、４週間間隔で２回免疫化した。ＰＭＥＤによる両方のＤＮＡ免疫化の直後に、各群中のマウス（ｎ＝５匹）に、右側ワクチン流入領域鼠径部リンパ節に近接したＰＢＳ（ＰＭＥＤ群）または５０μｇのＣｐＧ７９０９（ＰＭＥＤ＋ＣｐＧ群）のどちらかの皮内注射を与えた。ＰＭＥＤによる最後の免疫化の７日後、それぞれ個々のマウスから単離した脾細胞に対してＩＣＳアッセイを行って、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよび／またはＩＬ−２を分泌する抗原特異的な多機能的なＣＤ８またはＣＤ４  Ｔ細胞を検出した。ＰＢＳと比較してＣｐＧ７９０９の局所送達で処置したマウスから、ｒＨｅｒ−２特異的複数サイトカイン陽性のＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞応答の有意な増加が検出された。ＰＢＳと比較してＣｐＧ７９０９投与の局所送達を受けた動物では、単一サイトカイン陽性ＣＤ８集団の増加が観察された（＊はスチューデントＴ検定によってＰ＜０．０５であることを示す）。
【０３３５】
図４２Ａおよび４２Ｂは、細胞内サイトカイン染色アッセイによる、ワクチンに誘導された免疫応答の品質に対する作用性抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の免疫調節活性を評価する代表的な研究の結果を示す。手短に述べると、それぞれの動物を、ＰＭＥＤによって送達した、ｒＨＥＲ２抗原配列（配列番号５４）をコードしているＤＮＡプラスミド発現構築体によって、４週間間隔で２回免疫化した。最初の免疫化をＰＭＥＤによって投与した１日後に、各群中のマウス（ｎ＝６匹）に、右側ワクチン流入領域鼠径部リンパ節に近接したアイソタイプＩｇＧ対照（ＩｇＧを用いたＰＭＥＤ）または抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（ａＣＤ４０を用いたＰＭＥＤ）のどちらかの１００μｇの皮内注射を与えた。最後のＰＭＥＤの７日後、それぞれ個々のマウスから単離した脾細胞に対してＩＣＳアッセイを行って、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよび／またはＩＬ−２を分泌するｒＨｅｒ−２特異的な多機能的なＣＤ８またはＣＤ４  Ｔ細胞を検出した。アイソタイプＩｇＧ対照と比較して抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の局所送達で処置したマウスから、ｒＨｅｒ−２特異的三重サイトカイン陽性のＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞応答の有意な増加が検出された。また、局所的に与えた抗ＣＤ４０モノクローナル抗体によって、ｒＨｅｒ−２特異的な単一および二重サイトカイン陽性ＣＤ４  Ｔ細胞も有意に増加していた（＊はスチューデントＴ検定によってＰ＜０．０５であることを示す）。
【０３３６】
（実施例１５）
低用量スニチニブと組み合わせたがんワクチンの抗がん有効性
低用量スニチニブと組み合わせた抗がんワクチンの抗腫瘍有効性を、自発性乳腺パッド腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｎｅｕＴマウスにおいて調査した。
【０３３７】
動物の処置。手短に述べると、１３〜１４週齢の雌マウスに、５ｍｇ／ｋｇのスニチニブリンゴ酸塩（Ｓｕｔｅｎｔ）を１１２日間、１日２回、経口で与えた。３日目にプライミングとして抗原を送達しない対照ワクチンおよび配列番号５４のラットＨｅｒ−２抗原（ｒＨｅｒ−２）を送達するがんワクチンをアデノウイルス注射によって与え、次いで、ＰＭＥＤによる、それぞれＨＢＶ抗原（対照ワクチン）またはｒＨｅｒ−２（がんワクチン）を送達するＤＮＡの７回の隔週の投与を行った。生存エンドポイントは、１０個すべての乳腺パッドが腫瘍陽性となった際、または乳房腫瘍のうちのいずれかの体積が２０００ｍｍ３に達した際に決定した。結果を図４３に提示する。
【０３３８】
結果。Ｓｕｔｅｎｔの以前に公開されている薬物動態学プロフィール（Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．、Ｌａｉｒｄ，Ｄ．ら：「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＳＵ１１２４８，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ／ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ」．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０３、９：３２７〜３３７）および以前のデータ（図３８）と比較して、１日２回、５ｍｇ／ｋｇで投薬したマウスにおけるＳｕｔｅｎｔのＣＭａｘは、マウスおよびヒトにおいて効率的な抗腫瘍有効性を達成するために必要な最小血中レベルよりも有意に低いと予想される。データは、低用量Ｓｕｔｅｎｔの単独療法で処置したマウスの生存における素早い一時的な改善を示している。しかし、癌ワクチンを与えた場合に、生存のより持続的かつ有意な改善が観察された（対数順位検定によってＰ＜０．０００１）。
【０３３９】
（実施例１６）
ＣｐＧの局所投与によるワクチンに誘導された免疫応答の増強
本発明によって提供されるヒトＰＳＭＡ核酸によって誘導された免疫応答に対するＣｐＧ（ＰＦ−０３５１２６７６）の局所投与の免疫増強をサル研究において調査し、ここでは、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＰＳＭＡ特異的Ｔ細胞応答を測定することによって免疫応答を評価した。
【０３４０】
動物の処置および試料の採取。各試験群あたり６匹（＃１〜６）の、６群のチャイニーズカニクイマカクザルを、電気穿孔によって送達した、ヒトＰＳＭＡ改変抗原（配列番号１のアミノ酸１５〜７５０）をコードしているプラスミドＤＮＡによって免疫化した。手短に述べると、すべての動物は０日目に５ｍｇのプラスミドＤＮＡの両側筋肉内注射、続いて電気穿孔（ＤＮＡ  ＥＰ）を受けた。続いて、電気穿孔の直後、第２群は、ＤＮＡ注射部位に近接して１ｍｇのミョウバンと混合した２ｍｇのＣｐＧの両側筋肉内注射を受けた。第３および４群は、それぞれ０日目または３日目のどちらかに、ＤＮＡ注射部位に近接して、ミョウバンなしで送達した２ｍｇのＣｐＧの両側筋肉内注射を受けた。第５群は、３日目にワクチン流入領域鼠径部リンパ節に近接して送達したＣｐＧの２ｍｇの両側皮内注射を受けた。第６群は、０日目に筋肉内に同時電気穿孔した、ＤＮＡ溶液と混合した２００μｇのＣｐＧの両側注射を受けた。
【０３４１】
ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ手順。ＤＮＡ免疫化の１５日後に末梢血試料をそれぞれの動物から採取した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を血液試料から単離し、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに供してＰＳＭＡ特異的Ｔ細胞応答を測定した。手短に述べると、個々の動物からの４ｅ５個のＰＢＭＣ／ウェルを、それぞれ２ｕｇ／ｍｌのＰＳＭＡ特異的ペプチドのプールまたは非特異的な対照ペプチド（ヒトＨＥＲ２ペプチドプール）と共に、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴプレート中に播種した。ＰＳＭＡ特異的ペプチドプールのそれぞれの組成を表１Ａ中に提供する。プレートを１６時間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションし、洗浄し、インキュベーション後に製造者の指示に従って展開した。ＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数をＣＴＬリーダーによって計数した。各条件を２つ組で行った。代表的な実験の結果を表１Ｂに提示する。報告したＰＳＭＡ特異的応答は、非特異的な対照ペプチド（ヒトＨＥＲ２ペプチドプール）に対するＳＦＣの平均数をＰＳＭＡペプチドプールに対するＳＦＣの平均数から減算し、１ｅ６個のＰＢＭＣで観察されたＳＦＣに対して正規化することによって計算する。＾は、スポット数が数えるには多すぎたため計数が正確ではないことを示す。ＮＤは未検を示す。
【０３４２】
結果。表２８は、ＣｐＧなし（第１群）、または筋肉内（第２、３、４、および５群）もしくは皮内注射（第６群）によって局所的に与えたＣｐＧ（ＰＦ−０３５１２６７６）を用いた、ワクチンによって誘導されたＩＦＮγ  Ｔ細胞応答を評価および比較する代表的なＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。表１Ｂの結果を図１にプロットする。表１Ｂおよび図１に示すように、複数のＰＳＭＡ特異的ペプチドプールに対するＰＳＭＡ特異的ＩＦＮγ  Ｔ細胞応答が、６匹すべての動物においてＣｐＧ（ＰＦ−０３５１２６７６）の非存在下で検出された（第１群）。測定されたＰＳＭＡペプチドに対する全応答は、ＤＮＡ電気穿孔の３日後にＣｐＧ（ＰＦ−０３５１２６７６）を筋肉内（第４群では３／６匹）または皮内（第５群では２／６匹）注射のどちらかによって追加で受けた数匹の動物において、わずかにより高かった。しかし、ＣｐＧを同じ日の電気穿孔の直後に送達した場合は（第２および３群）、ミョウバンと混合したか混合しなかったかにかかわらず、高い応答を生じることに失敗した動物が数匹存在していた（第２群では４／６匹および第３群では３／６匹）。しかし、１０倍低い用量のＣｐＧをＤＮＡ溶液と共に筋肉内に同時電気穿孔した場合に４／６匹の動物でより高い総応答が検出され（第６群）、ペプチドプールＨ１およびＲ１に対する応答がＣｐＧを受けなかった動物（第１群）よりも統計的に高かった（Ｐ＜０．０５）。データは、低用量のＣｐＧが、筋肉内に同時穿孔した場合に、ＤＮＡワクチンによって誘導されたＩＦＮγ  Ｔ細胞応答を有効に増強できることを示している。
【０３４３】
【表２７】
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【０３４４】
（実施例１７）
抗ＣＴＬＡ−４抗体の局所投与によるワクチンに誘導された免疫応答の増強
アカゲザルＰＳＭＡ核酸によって誘導された免疫応答に対する抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（ＣＰ−６７５、２０６）の低用量皮下投与の効果をサル研究において調査し、ここでは、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＰＳＭＡ特異的Ｔ細胞応答を測定することによって免疫応答を評価した。本研究で使用したアカゲザルＰＳＭＡ核酸は配列番号５６に記載の配列を有しており、配列番号５５の免疫原性ＰＳＭＡポリペプチドをコードしている。
【０３４５】
動物の処置および試料の採取。各試験群あたり７匹（＃１〜７）の、５群の雄インドアカゲザルを、両側筋肉内注射によって送達した、アカゲザルＰＳＭＡ改変ポリペプチドをコードしているアデノウイルス（２×５ｅ１０Ｖ．Ｐ．）で免疫化した。アデノウイルス注射の直後、第１群はビヒクルを受け、第２〜４群は、ワクチン流入領域リンパ節に近接した、それぞれ２×２５ｍｇ、２×１６．７ｍｇおよび２×８．４ｍｇの用量の抗ＣＴＬＡ−４抗体（ＣＰ−６７５、２０６）の両側皮下注射を受けた。
【０３４６】
免疫化の９日後、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をそれぞれの動物から単離し、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに供してアカゲザルＰＳＭＡ特異的Ｔ細胞応答を測定した。手短に述べると、個々の動物からの４ｅ５個のＰＢＭＣ／ウェルを、それぞれ２ｕｇ／ｍｌのアカゲザルＰＳＭＡ特異的ペプチドのプール（表２４Ａ中で定義したＰ１、Ｐ２、Ｐ３もしくはＲ１＋Ｒ２）または非特異的な対照ペプチド（ヒトＨＥＲ２ペプチドプール）と共に、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴプレート中に播種した。プレートを１６時間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションし、洗浄し、インキュベーション後に製造者の指示に従って展開した。ＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数をＣＴＬリーダーによって計数した。各条件を２つ組で行った。アカゲザルＰＳＭＡ特異的ペプチドプールのバックグラウンド調節したＳＦＣからの２つ組の平均を、１ｅ６個のＰＢＭＣにおける応答に対して正規化した。それぞれ個々の動物からのペプチドプールに対する個々および合計の応答を表２９に提示する。
【０３４７】
ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ手順。ＩＦＮγに特異的な捕捉抗体ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃５１−２５２５ｋｃ）をマイクロプレート中のポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜上に終夜、４℃でコーティングする。抗体との非特異的結合を防止するためにプレートを血清／タンパク質で遮断する。遮断後、エフェクター細胞（免疫化したマウスから単離した脾細胞またはアカゲザルから単離したＰＢＭＣなど）および標的（ペプチドライブラリからのＰＳＭＡペプチド、抗原特異的ペプチドをパルシングした標的細胞または関連抗原を発現する腫瘍細胞など）をウェルに加え、終夜、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内でインキュベーションした。エフェクター細胞によって分泌されたサイトカインをＰＶＤＦ膜の表面上のコーティング抗体によって捕捉した。細胞および培養培地を除去した後、検出のために１００μｌのビオチン標識したポリクローナル抗ヒトＩＦＮγ抗体をそれぞれのウェルに加えた。ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼおよび沈殿基質である３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）を加えることによってスポットを可視化して、製造者（Ｍａｂｔｅｃｈ）のプロトコルに従って赤色のスポットが得られた。それぞれのスポットは単一のサイトカイン産生Ｔ細胞を表す。
【０３４８】
結果。表２９は、抗体なし（第１群）、またはワクチン流入領域リンパ節に近接した皮下注射によって局所的に与えた（第２〜４群）抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（ＣＰ−６７５、２０６）を用いて、ワクチンによって誘導されたＴ細胞応答を比較する代表的なＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。ワクチンは免疫応答を生じ（第１群）、これは、５０ｍｇの用量の抗ＣＴＬＡ−４抗体（ＣＰ−６７５、２０６）の局所投与によって有意に増強された（第２群、低く見積もられた値を使用したスチューデントＴ検定によってＰ＝０．００１）。また、応答は、それぞれ３３．４ｍｇ（第３群：低く見積もられた値を使用したスチューデントＴ検定によってＰ＝０．００４）および１６．７ｍｇ（第４群：スチューデントＴ検定によってＰ＝０．０５）の低用量の抗ＣＴＬＡ−４抗体によっても有意に増強された。データは、皮下注射によって送達した低用量の抗ＣＴＬＡ−４がワクチンに誘導された免疫応答を有意に増強できることを示唆している。
【０３４９】
【表２８】
2019054804.tif 000033
【０３５０】
（実施例１８）
低用量スニチニブによる骨髄由来抑制細胞の免疫調節
以下の実施例は、非腫瘍マウスモデルのｉｎ  ｖｉｖｏにおける骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）に対する低用量スニチニブの免疫調節効果を例示するために提供する。
【０３５１】
研究手順。
ＭＤＳＣが濃縮された脾細胞を作製するために、ＴＵＢＯ細胞（１×１０６個）を５匹のＢＡＬＢ／ｎｅｕＴマウスの脇腹に移植し、腫瘍体積が１０００〜１５００ｍｍ３に達するまで約２０〜３０日間放置した。その後、マウスを屠殺し、脾臓を取り出し、ＭＤＳＣが濃縮された脾細胞を回収した。５μＭのＣＦＳＥを用いて脾細胞を１０分間標識し、ＰＢＳで洗浄し、計数した。続いて標識した細胞をＰＢＳ溶液中に５×１０７個の脾細胞／ｍｌで再懸濁させ、ｉ．ｖ．尾静脈注射によってナイーブＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウス内に養子移植させた。養子移入の３日前に、レシピエントマウスにおいて、ビヒクルまたは５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇのスニチニブリンゴ酸塩（Ｓｕｔｅｎｔ）を用いた１日２回の投薬を開始した。養子移入の後、レシピエントマウスはビヒクルまたはスニチニブの１日２回の投薬をさらに２日間受け続け、その後の時点でマウスを屠殺し、脾臓を取り出し、脾細胞を回収し、表現型分析のために処理した。
【０３５２】
脾細胞を計数し、ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＰＢＳ、０．２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン、および０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム）中に５×１０６個の細胞／ｍｌで再懸濁させた。脾細胞のフローサイトメトリー染色には、Ｆｃ受容体を遮断して非特異的結合を最小限にするために、最初に２．５×１０６個の細胞をＣＤ１６／ＣＤ３２に対する抗体と共に、１０分間、４℃でインキュベーションした。その後、ネズミ細胞表面マーカーに対する適切な蛍光体コンジュゲート抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて、脾細胞を２０分間、４℃で染色した。Ｔ細胞では（抗ＣＤ３（パシフィックブルー）、クローン１７Ａ２）、ＭＤＳＣでは（抗ＧＲ−１（ＡＰＣ）、クローンＲＢ６−８Ｃ５および抗ＣＤ１１ｂ（ＰｅｒＣｐ  Ｃｙ５．５）、クローンＭ１／７０）。ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色も含めた。抗体のインキュベーション後、染色された脾細胞を２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、遠心分離によってペレット化し、０．２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた後に、ＢＤ  ＣＡＮＴＯ  ＩＩフローサイトメーターでデータを獲得した。養子移植されたＭＤＳＣの生存に対するスニチニブまたはビヒクルの効果を監視するために、ライブのｓｉｎｇｌｅｔ  ｇａｔｅにおいてＣＦＳＥ＋、ＣＤ３−、ＧＲ１＋、ＣＤ１１ｂ＋のパーセンテージを計算した。その後、全脾細胞数のうち、実際の細胞数が何パーセントを表すかを計算することによって、脾臓あたりの養子移植されたＭＤＳＣの数を決定した。データはＦｌｏＪｏおよびＧｒａｐｈ  ｐａｄソフトウェアによって分析した。
【０３５３】
結果。表３１に提示するデータは、養子移入の２日後に、ビヒクルまたは５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇのスニチニブのいずれかを１日２回で投薬したマウスからの、脾臓あたり回収された養子移植されたＣＳＦＥ＋、ＣＤ３−、ＧＲ１＋、ＣＤ１１ｂ＋細胞の平均数（ｎ＝７匹／群）を表す。データは、１日２回で投薬したスニチニブは、５ｍｇ／ｋｇと低い投薬でさえもｉｎ  ｖｉｖｏでＭＤＳＣに対して免疫調節効果を有しており、ビヒクルで処置した対照群と比較した場合に回収された数の統計的に有意な低下をもたらすことを実証している。
【０３５４】
【表２９】
2019054804.tif 000034
【０３５５】
（実施例１９）
三重抗原アデノウイルスおよびＤＮＡ構築体の免疫原性
以下の実施例は、本発明によって提供される３つの抗原ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＡを発現する三重抗原ワクチン構築体（アデノウイルスベクターまたはＤＮＡプラスミドのどちらかの形態）の、非ヒト霊長類において３つすべてのコードされている抗原に対する特異的Ｔ細胞応答を誘発する能力を例示するために提供する。
【０３５６】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ研究手順。プライミングの９日前に、本発明によって提供されるそれぞれ３つの抗原を発現する５つのアデノウイルスベクター（ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＡ。Ａｄ−７３３、Ａｄ−７３４、Ａｄ−７３５、Ａｄ−７９６およびＡｄ−８０９）のＴ細胞免疫原性を、それぞれ単一抗原（ＰＳＭＡ、ＰＳＡまたはＰＳＣＡ）のみを発現する３つのアデノウイルスベクターの混合と比較した。単一抗原を発現する単一のアデノウイルス（第１〜３群）に対する応答を評価して、特異性を実証した。手短に述べると、インドアカゲザル（第１および３群にはｎ＝６匹、第２群にはｎ＝７匹、第４〜９群にはｎ＝８匹）に合計１ｅ１１Ｖ．Ｐ．を筋肉内注射し、次いで同じ日に１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ−４を皮内注射した。注射の９日後、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をそれぞれの動物から単離し、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに供して、ＰＳＭＡ、ＰＳＡおよびＰＳＣＡに特異的なＴ細胞応答を測定した。
【０３５７】
アデノウイルスおよび抗ＣＴＬＡ−４注射の１３週間後にＴ細胞応答が収縮された際に、サルに、電気穿孔によって送達したＤＮＡ（第１群：ＰＳＭＡ、プラスミド５１６６、第２群：ＰＳＡ、プラスミド５２９７、第３群：ＰＳＣＡ、プラスミド５２５９、第４群：ＰＳＭＡ、ＰＳＡおよびＰＳＣＡの混合、プラスミド５１６６、５２５９および５２９７、第４群：プラスミド４５７、第６群：プラスミド４５８、第７群：プラスミド４５９、第８群：プラスミド７９６、第９群：プラスミド８０９）のブーストワクチン接種を与えた。要約すると、プライミングに使用したアデノウイルス中にコードされているものと同じ発現カセットを送達する、合計５ｍｇの本発明によって提供されるプラスミドＤＮＡを、それぞれの動物に与えた。ブーストワクチン接種の９日後、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をそれぞれの動物から単離し、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに供した。
【０３５８】
ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。手短に述べると、個々の動物からの４ｅ５個のＰＢＭＣ／ウェルを、それぞれ２ｕｇ／ｍｌの、ＰＳＭＡ特異的ペプチドプールＰ１、Ｐ２、Ｐ３もしくはＨ１およびＨ２（表２４Ａ）、ＰＳＡ特異的プール１もしくは２（表２５）、ＰＳＣＡ特異的プール（表２６）、または非特異的な対照ペプチド（ヒトＨＥＲ２ペプチドプール）と共に、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴプレート中に播種した。プレートを１６時間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションし、洗浄し、インキュベーション後に製造者の指示に従って展開した。ＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数をＣＴＬリーダーによって計数した。各条件を２つ組で行った。抗原特異的ペプチドプールのバックグラウンド調節したＳＦＣからの２つ組の平均を、１ｅ６個のＰＢＭＣにおける応答に対して正規化した。表中の抗原特異的応答は、対応する抗原特異的ペプチドまたはペプチドプールに対する応答の合計を表す。
【０３５９】
結果：表２７は、それぞれが単一抗原を発現する３つのアデノウイルスの混合物と比較した、それぞれが３つすべての抗原を発現する５つの異なるアデノウイルスのＴ細胞免疫原性を、インドアカゲザルにおいてＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴによって評価する研究を表す。Ａｄ−ＰＳＭＡのみ（第１群）の注射を受けた動物の大多数は、ＰＳＭＡに対する特異的応答を誘導したが、ＰＳＡまたはＰＳＣＡに対しては誘導しなかった（スチューデントＴ検定、Ｐ＜０．０３。ＰＳＣＡに対する応答を優先的に誘導した１匹の動物（＃４）は統計分析から除去した）。Ａｄ−ＰＳＡの注射のみを受けた動物（第２群）は、ＰＳＡに対する特異的応答を誘導したが、ＰＳＭＡまたはＰＳＣＡに対しては誘導しなかった（スチューデントＴ検定、Ｐ＜０．０２）。Ａｄ−ＰＳＣＡの注射のみを受けた動物（第３群）は、ＰＳＣＡに対する特異的応答を誘導したが、ＰＳＭＡまたはＰＳＡに対しては誘導しなかった（スチューデントＴ検定、Ｐ＜０．０３）。５つすべての三重抗原を発現するアデノウイルスベクター（第５〜９群）は、３つすべての抗原に対するＩＦＮγ  Ｔ細胞応答を誘導し、その規模は動物ごとに変動していた。三重抗原を発現するアデノウイルスによって誘導されたＰＳＣＡに対する応答の規模は、個々のベクターの混合と同等であった（第４群）。しかし、Ａｄ−８０９によって誘導されたＰＳＭＡに対する応答の規模（第９群）およびＡｄ−７９６によって誘導されたＰＳＡに対する応答の規模（第８群）は、混合よりもそれぞれ有意に優れていた（スチューデントＴ検定、それぞれＰ＝０．０４およびＰ＝０．０２）。これらの結果は、非ヒト霊長類において、三重抗原を発現するアデノウイルスを用いたワクチン接種は、個々のアデノウイルスの混合を用いたワクチン接種に等価またはそれより優れたＴ細胞免疫応答を誘発できることを示している。
【０３６０】
表２８は、抗ＣＴＬＡ−４と組み合わせたアデノウイルスプライミング、続いて対応するプラスミドＤＮＡの電気穿孔ブーストによって送達した、本発明中に提供される５つの異なる三重抗原発現カセットの免疫原性を評価する研究を表すＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ結果を示す。免疫応答は、抗ＣＴＬＡ−４を用いたアデノウイルスプライミングおよびＤＮＡ電気穿孔ブースト免疫化によって同様に送達した単一抗原を発現する３つの構築体の混合と比較する。
【０３６１】
Ａｄ−ＰＳＭＡと抗ＣＴＬＡ−４、次いでプラスミド−ＰＳＭＡ（第１群）の免疫化のみを受けた動物はすべて、ＰＳＭＡに対する特異的応答を誘導したが、ＰＳＡまたはＰＳＣＡに対しては誘導しなかった。同様に、Ａｄ−ＰＳＡと抗ＣＴＬＡ−４、次いでプラスミド−ＰＳＡの免疫化のみを受けた動物（第２群）はすべて、ＰＳＡに対する特異的応答を誘導したが、ＰＳＭＡまたはＰＳＣＡに対しては誘導せず、最後に、Ａｄ−ＰＳＣＡと抗ＣＴＬＡ−４、次いでプラスミド−ＰＳＣＡ（第３群）の免疫化のみを受けた動物はすべて、ＰＳＣＡに対する特異的応答を誘導したが、ＰＳＭＡまたはＰＳＡに対しては誘導しなかった（スチューデントＴ検定、Ｐ＜０．０１）。
【０３６２】
三重抗原を発現するベクター（第５〜９群）または混合（第４群）のいずれかで免疫化したすべての動物は、３つすべての抗原に対するＩＦＮγ  Ｔ細胞応答を誘導した。検出されたＰＳＣＡまたはＰＳＡ特異的ＩＦＮγ  Ｔ細胞の頻度は、これらの群すべて（第４〜９群）でそれぞれ同様であった。しかし、三重抗原発現ベクターのワクチン接種を受けた第７および９の構築体群は、３つの単一抗原を発現する構築体の混合（第４群）よりも有意に高い頻度のＰＳＭＡに対する応答を生じた。これらの結果は、非ヒト霊長類において、１つのカセット中で三重抗原を発現するアデノウイルスおよびＤＮＡワクチンは、単一抗原を発現するアデノウイルスおよびＤＮＡの混合に対するものに等価またはそれより優れたＩＦＮγ  Ｔ細胞応答を誘発できることを示している。
【０３６３】
【表３０−１】
2019054804.tif 000035
【０３６４】
【表３０−２】
2019054804.tif 000036
【０３６５】
【表３１−１】
2019054804.tif 000037
【０３６６】
【表３１−２】
2019054804.tif 000038
【０３６７】
【表３２】
2019054804.tif 000039
【０３６８】
【表３３】
2019054804.tif 000040
【０３６９】
（実施例２０）
スニチニブによるＳＴＡＴ３リン酸化の低下
以下の実施例は、脾臓における免疫抑制の主要な媒介物質であるＳＴＡＴ３（転写活性化因子のシグナル伝達物質３）のリン酸化を直接阻害するスニチニブの能力を例示するために提供する。
【０３７０】
研究手順。脾臓中のＳＴＡＴ３のリン酸化状態に対するＳｕｔｅｎｔの急性効果を皮下腫瘍マウスモデルにおいて調査して、化合物の直接免疫調節効果を評価した。手短に述べると、１０〜１２週齢の雌ＢＡＬＢ／ｎｅｕＴマウスに、１ｅ６個のＴＵＢＯ細胞を右脇腹に皮下で移植した。腫瘍移植の４１日後、２０ｍｇ／ｋｇのＳｕｔｅｎｔを経口胃管栄養法によって与えた。Ｓｕｔｅｎｔ投薬の０、１、３、７および２４時間後に、１つの時点あたり３匹の動物をＩＡＵＣＵＣ指針の下で屠殺し、脾臓を液体窒素中ですぐにスナップ凍結してリン酸化状態を保存した。健康なマウス対照として使用するために、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾臓をスナップ凍結した。
【０３７１】
ＳＴＡＴ３アッセイ手順。ｐｏｌｙｔｒｏｎ組織ホモジナイザーを使用して、スナップ凍結した脾臓を１００ｍｇの組織／５００μＬの溶解緩衝液（７０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのβ−リン酸グリセロール、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１００ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１００ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍｇ／ｍＬのロイペプチン）でホモジナイズした。生じた消化物を１０，０００ｇで１５分間遠心分離した。上清を単離し、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を使用してタンパク質の濃度を決定した。４０μｇのタンパク質を、全ＳＴＡＴ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号８５−８６１０１−１１）またはホスホＳＴＡＴ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号８５−８６１０２−１１）ＥＬＩＳＡキットのどちらかのそれぞれのウェルに加えた。どちらのタンパク質の相対レベルも、キット中に提供される標準および独自に購入した標準（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号９３３３−Ｓ）と比較した。
【０３７２】
結果。表２９は、脾臓中のＳＴＡＴ３のリン酸化状態に対するＳｕｔｅｎｔの効果を評価する代表的なＳＴＡＴアッセイの結果を示す。健康または腫瘍を保有するマウスのどちらからの脾臓抽出物も、ＥＬＩＳＡによって同様のレベルのＳＴＡＴ３タンパク質を示した（全ＳＴＡＴ３）。しかし、腫瘍を保有するマウスからの抽出物は、健康なＢＡＬＢ／ｃよりも有意に高いレベルのリン酸化されたＳＴＡＴ３を有していた（スチューデントＴ検定、Ｐ＜０．００１）。Ｓｕｔｅｎｔ処置のたった１時間後にリン酸化レベルは健康な動物と同様のレベルまで迅速に減少し、７時間まで、未処置のマウスよりも低いレベルで維持された。２４時間で、ＳＴＡＴ３のリン酸化レベルはＳｕｔｅｎｔ処置前のレベルまで完全に回復した。リン酸化の動力学は血液中の循環Ｓｕｔｅｎｔのレベルを反映している。Ｓｕｔｅｎｔの薬物動態学プロフィールを反映する、脾臓におけるＳＴＡＴ３リン酸化の迅速な応答は、腫瘍を保有する動物におけるＳｕｔｅｎｔの直接免疫調節機能を示差している。
【０３７３】
【表３４】
2019054804.tif 000041
【０３７４】
生の配列表
配列番号１．完全長ヒトＰＳＭＡのアミノ酸配列
ＭＷＮＬＬＨＥＴＤＳＡＶＡＴＡＲＲＰＲＷＬＣＡＧＡＬＶＬＡＧＧＦＦＬＬＧＦＬＦＧＷＦＩＫＳＳＮＥＡＴＮＩＴＰＫＨＮＭＫＡＦＬＤＥＬＫＡＥＮＩＫＫＦＬＹＮＦＴＱＩＰＨＬＡＧＴＥＱＮＦＱＬＡＫＱＩＱＳＱＷＫＥＦＧＬＤＳＶＥＬＡＨＹＤＶＬＬＳＹＰＮＫＴＨＰＮＹＩＳＩＩＮＥＤＧＮＥＩＦＮＴＳＬＦＥＰＰＰＰＧＹＥＮＶＳＤＩＶＰＰＦＳＡＦＳＰＱＧＭＰＥＧＤＬＶＹＶＮＹＡＲＴＥＤＦＦＫＬＥＲＤＭＫＩＮＣＳＧＫＩＶＩＡＲＹＧＫＶＦＲＧＮＫＶＫＮＡＱＬＡＧＡＫＧＶＩＬＹＳＤＰＡＤＹＦＡＰＧＶＫＳＹＰＤＧＷＮＬＰＧＧＧＶＱＲＧＮＩＬＮＬＮＧＡＧＤＰＬＴＰＧＹＰＡＮＥＹＡＹＲＲＧＩＡＥＡＶＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩＧＹＹＤＡＱＫＬＬＥＫＭＧＧＳＡＰＰＤＳＳＷＲＧＳＬＫＶＰＹＮＶＧＰＧＦＴＧＮＦＳＴＱＫＶＫＭＨＩＨＳＴＮＥＶＴＲＩＹＮＶＩＧＴＬＲＧＡＶＥＰＤＲＹＶＩＬＧＧＨＲＤＳＷＶＦＧＧＩＤＰＱＳＧＡＡＶＶＨＥＩＶＲＳＦＧＴＬＫＫＥＧＷＲＰＲＲＴＩＬＦＡＳＷＤＡＥＥＦＧＬＬＧＳＴＥＷＡＥＥＮＳＲＬＬＱＥＲＧＶＡＹＩＮＡＤＳＳＩＥＧＮＹＴＬＲＶＤＣＴＰＬＭＹＳＬＶＨＮＬＴＫＥＬＫＳＰＤＥＧＦＥＧＫＳＬＹＥＳＷＴＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫＬＧＳＧＮＤＦＥＶＦＦＱＲＬＧＩＡＳＧＲＡＲＹＴＫＮＷＥＴＮＫＦＳＧＹＰＬＹＨＳＶＹＥＴＹＥＬＶＥＫＦＹＤＰＭＦＫＹＨＬＴＶＡＱＶＲＧＧＭＶＦＥＬＡＮＳＩＶＬＰＦＤＣＲＤＹＡＶＶＬＲＫＹＡＤＫＩＹＳＩＳＭＫＨＰＱＥＭＫＴＹＳＶＳＦＤＳＬＦＳＡＶＫＮＦＴＥＩＡＳＫＦＳＥＲＬＱＤＦＤＫＳＮＰＩＶＬＲＭＭＮＤＱＬＭＦＬＥＲＡＦＩＤＰＬＧＬＰＤＲＰＦＹＲＨＶＩＹＡＰＳＳＨＮＫＹＡＧＥＳＦＰＧＩＹＤＡＬＦＤＩＥＳＫＶＤＰＳＫＡＷＧＥＶＫＲＱＩＹＶＡＡＦＴＶＱＡＡＡＥＴＬＳＥＶＡ
配列番号２．配列番号１の完全長ヒトＰＳＭＡをコードしているヌクレオチド配列
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配列番号３．ＰＳＭＡシャッフル抗原１のアミノ酸配列
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配列番号４．配列番号３のＰＳＭＡシャッフル抗原１のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列
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配列番号５．ＰＳＭＡシャッフル抗原２のアミノ酸配列
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配列番号６．配列番号５のＰＳＭＡシャッフル抗原２のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列
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配列番号７．ＰＳＭＡシャッフル抗原３のアミノ酸配列
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配列番号８．配列番号７のＰＳＭＡシャッフル抗原３のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列
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配列番号９．膜結合ＰＳＭＡ抗原のアミノ酸配列
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配列番号１０．配列番号９の膜結合ＰＳＭＡ抗原のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列
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配列番号１１．サイトゾルＰＳＭＡ抗原のアミノ酸配列
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配列番号１２．配列番号１１のサイトゾルＰＳＭＡ抗原のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列
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配列番号１３．分泌ＰＳＭＡ抗原のアミノ酸配列
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配列番号１４．配列番号１３の分泌ＰＳＭＡ抗原のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列
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配列番号１５．完全長ヒトＰＳＡのアミノ酸配列
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配列番号１６．配列番号１５の完全長ヒトＰＳＡのアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列
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配列番号１７．サイトゾルＰＳＡ抗原のアミノ酸配列
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配列番号１８．配列番号１７のサイトゾルＰＳＡ抗原のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列
ａｔｇｇｃｔａｇｃａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｃａａａａｇｃｇｔｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｇｃａｃａｇｃｔｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃａｇｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔｇａｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃｇａｔｔｃｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃｃａｃｇａｃｃｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃａｃｇｇａｔｇｃｔｇｔｇａａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔａａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｇｇａａｇｔｇｇａｔｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃ
配列番号１９．膜結合ＰＳＡ抗原のアミノ酸配列
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配列番号２０．配列番号１９の膜結合ＰＳＡ抗原のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列
ａｔｇｇｃｔａｇｃｇｃｇｃｇｃｃｇｃｃｃｇｃｇｃｔｇｇｃｔｇｔｇｃｇｃｔｇｇｇｇｃｇｃｔｇｇｔｇｃｔｇｇｃｇｇｇｔｇｇｃｔｔｃｔｔｔｃｔｃｃｔｃｇｇｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｇｇｇｔｇｇｔｔｔａｔａａａａｔｃｃｔｃｃａａｔｇａａｇｃｔａｃｔａａｃａｔｔａｃｔｃｃａｇｇａａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｃａａａａｇｃｇｔｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｇｃａｃａｇｃｔｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃａｇｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔｇａｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃｇａｔｔｃｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃｃａｃｇａｃｃｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃａｃｇｇａｔｇｃｔｇｔｇａａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔａａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｇｇａａｇｔｇｇａｔｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃｔｇａ
配列番号２１．完全長ヒトＰＳＣＡのアミノ酸配列
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配列番号２２．配列番号２１の完全長ヒトＰＳＣＡのアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列
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配列番号２３．プラスミド５１６６のヌクレオチド配列
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配列番号２４．プラスミド５２５９のヌクレオチド配列
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配列番号２５．プラスミド５２９７のヌクレオチド配列
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配列番号２６．プラスミド４６０のヌクレオチド配列
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配列番号２７．プラスミド４５１のヌクレオチド配列
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配列番号２８．プラスミド４５４のヌクレオチド配列
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配列番号２９．プラスミド５３００のヌクレオチド配列
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配列番号３０．プラスミド４４９のヌクレオチド配列
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配列番号３１．プラスミド６０３のヌクレオチド配列
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配列番号３２．プラスミド４５５のヌクレオチド配列
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配列番号３３．プラスミド４５６のヌクレオチド配列
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配列番号３４．プラスミド４５７のヌクレオチド配列
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配列番号３５．プラスミド４５８のヌクレオチド配列
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配列番号３６．プラスミド４５９のヌクレオチド配列
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配列番号３７．ＰＳＨＵＴＴＬＥ  ＩＲＥＳのヌクレオチド配列
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配列番号３８．Ｈｅｒ−２抗原のアミノ酸配列：
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（シグナル配列に下線を引いた）
配列番号３９．配列番号３８のＨｅｒ−２抗原アミノ酸配列をコードしている核酸配列
ＡＴＧＧＣＴＡＧＣＧＡＧＣＴＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＴＧＴＡＧＡＴＧＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴＴＣＴＡＣＡＣＡＧＧＴＣＴＧＣＡＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＡＣＴＧＣＣＣＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＣＡＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＧＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＣＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡＡＣＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＴＧＡＴＣＧＣＣＣＡＣＡＡＣＣＡＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＧＣＴＧＡＧＡＡＴＣＧＴＧＣＧＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＴＣＧＡＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＧＧＣＧＡＣＣＣＴＣＴＧＧＡＴＡＧＣＧＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧＣＧＧＡＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＧＧＡＧＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＡＴＣＡＧＧＣＧＧＡＧＣＣＣＴＣＡＧＣＴＧＴＧＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＴＧＣＴＧＴＧＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＴＴＣＣＧＧＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＣＣＴＣＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＡＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＧＧＧＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＣＣＡＴＧＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＴＣＡＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＴＧＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＧＧＡＣＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＧＣＧＣＣＴＧＣＧＣＣＡＧＡＴＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＣＴＧＣＣＴＡＣＣＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＣＧＡＡＣＡＧＴＧＣＧＣＣＧＣＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＧＡＴＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＴＧＣＡＣＴＴＣＡＡＣＣＡＣＡＧＣＧＧＣＡＴＣＴＧＣＧＡＧＣＴＧＣＡＣＴＧＣＣＣＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＴＡＣＡＡＣＡＣＣＧＡＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＡＧＣＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＣＣＧＡＧＧＧＣＣＧＧＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＣＣＡＧＣＴＧＴＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＡＣＧＴＧＧＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＴＧＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＧＧＡＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＧＡＴＧＣＧＡＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＴＴＧＣＧＣＣＡＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＣＧＧＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＡＣＡＣＣＴＧＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＣＧＣＣＡＡＣＧＴＧＣＡＧＧＡＣＴＴＣＧＴＧＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＴＴＴＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＧＣＣＴＴＣＣＴＧＣＣＣＧＡＧＡＧＣＴＴＣＧＡＣＧＧＣＧＡＴＣＣＴＧＣＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＣＣＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＴＣＧＡＧＡＣＡＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＡＧＣＧＣＣＴＧＧＣＣＣＧＡＣＡＧＣＴＴＣＣＣＣＡＡＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＴＣＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＴＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＧＧＣＧＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＧＡＡＴＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＧＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＧＡＴＣＴＧＧＣＣＴＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＣＡＣＣＧＧＡＡＣＧＣＣＣＧＧＣＴＧＴＧＣＴＴＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＴＴＣＡＧＡＡＡＣＣＣＣＣＡＣＣＡＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＡＡＣＣＧＧＣＣＣＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＴＴＣＧＴＧＴＧＣＴＡＣＴＣＣＣＴＧＴＧＣＧＣＣＣＡＣＧＧＣＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＣＴＡＣＣＣＡＧＴＧＣＧＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣＴＴＣＣＴＧＣＧＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＴＧＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＧＣＣＧＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＧＡＣＴＧＣＣＣＣＧＧＧＡＡＴＡＣＧＴＧＡＡＣＧＣＣＡＧＡＣＡＣＴＧＣＣＴＧＣＣＴＴＧＣＣＡＣＣＣＣＧＡＧＴＧＣＣＡＧＣＣＣＣＡＧＡＡＴＧＧＣＡＧＣＧＴＧＡＣＣＴＧＣＴＴＣＧＧＡＣＣＣＧＡＧＧＣＣＧＡＴＣＡＧＴＧＴＧＴＧＧＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＣＣＣＣＣＡＴＴＣＴＧＣＧＴＧＧＣＣＡＧＡＴＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＡＡＧＣＣＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＡＣＡＴＧＣＣＣＡＴＣＴＧＧＡＡＧＴＴＣＣＣＣＧＡＣＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧＣＣＴＧＣＣＡＧＣＣＴＴＧＣＣＣＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＣＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＧＣＣＣＴＧＣＣＧＡＧＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＡＧＣＧＣＣＧＴＧＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＧＴＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＧＡＴＣＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＴＡＣＡＣＣＡＴＧＣＧＧＣＧＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＣＣＴＣＴＡＧＣＣＣＣＡＴＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＣＧＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＡＣＡＴＧＧＧＣＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＣＧＣＣＧＡＧＧＡＡＴＡＣＣＴＧＧＴＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＣＣＣＧＡＣＣＣＴＡＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＧＧＣＴＣＴＡＣＣＧＣＣＣＡＣＡＧＡＣＧＧＣＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧＡＡＡＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＧＡＡＴＧＧＡＡＣＣＴＡＧＣＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＴＣＣＣＡＧＡＡＧＣＣＣＴＡＧＡＧＣＣＣＣＴＡＧＣＧＡＧＧＧＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＴＴＣＧＡＴＧＧＣＧＡＴＣＴＧＧＣＣＧＴＧＧＧＣＧＴＧＡＣＣＡＡＧＧＧＡＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＴＣＣＣＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＧＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＡＧＧＴＧＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＣＣＴＣＡＧＣＣＣＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＣＧＴＧＣＡＧＣＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＡＣＣＣＧＡＧＧＧＡＣＣＴＣＣＡＡＧＣＣＣＴＧＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＣＧＧＣＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＡＡＣＧＧＣＧＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＣＧＴＧＴＴＣＡＣＣＴＴＣＧＧＡＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＧＣＡＣＡＧＣＣＡＧＣＣＣＴＣＣＡＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＣＴＣＣＣＣＣＧＣＣＴＴＣＧＡＣＡＡＣＣＴＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣＧＡＧＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＡＴＴＴＣＧＡＧＧＧＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＧＣＣＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＡＣＧＴＧＣＣＣＧＴＧＴＧＡ
配列番号４０．抗ＣＤ４０抗体ＣＰ８７０，８９３の重鎖のアミノ酸配列：
ＭＤＷＴＷＲＩＬＦＬＶＡＡＡＴＧＡＨＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＤＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＮＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＱＰＬＧＹＣＴＮＧＶＣＳＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。
配列番号４１．抗ＣＤ４０抗体ＣＰ８７０，８９３の軽鎖の酸配列：
ＭＲＬＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＦＰＧＳＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＹＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＴＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＮＩＦＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。
配列番号４２．抗ＣＴＬＡ−４抗体トレメリムマブの重鎖の酸配列
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＲＧＡＴＬＹＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号４３．抗ＣＴＬＡ−４抗体トレメリムマブの軽鎖の酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＮＳＹＬＤＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＳＴＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号４４．ＣｐＧ７９０９のヌクレオチド配列
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ３’
配列番号４５．ＣｐＧ２４５５５のヌクレオチド配列
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ３’
配列番号４６．ＣｐＧ１０１０３のヌクレオチド配列
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＣＧＴＴＴＴ３’
配列番号４７．ｅＧＦＰのアミノ酸配列
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫ
配列番号４８．ＨＢＶコア抗原のアミノ酸配列
ＭＤＩＤＰＹＫＥＦＧＡＴＶＥＬＬＳＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲＥＡＬＥＳＰＥＨＣＳＰＨＨＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴＬＡＴＷＶＧＮＮＬＥＤＰＡＳＲＤＬＶＶＮＹＶＮＴＮＭＧＬＫＩＲＱＬＬＷＦＨＩＳＣＬＴＦＧＲＥＴＶＬＥＹＬＶＳＦＧＶＷＩＲＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲＲＧＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＱＳＲＥＳＱＣ
配列番号４９．ＨＢＶ表面抗原のアミノ酸配列
ＭＥＮＩＴＳＧＦＬＧＰＬＬＶＬＱＡＧＦＦＬＬＴＲＩＬＴＩＰＱＳＬＤＳＷＷＴＳＬＮＦＬＧＧＳＰＶＣＬＧＱＮＳＱＳＰＴＳＮＨＳＰＴＳＣＰＰＩＣＰＧＹＲＷＭＣＬＲＲＦＩＩＦＬＦＩＬＬＬＣＬＩＦＬＬＶＬＬＤＹＱＧＭＬＰＶＣＰＬＩＰＧＳＴＴＴＳＴＧＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣＴＣＩＰＩＰＳＳＷＡＦＡＫＹＬＷＥＷＡＳＶＲＦＳＷＬＳＬＬＶＰＦＶＱＷＦＶＧＬＳＰＴＶＷＬＳＡＩＷＭＭＷＹＷＧＰＳＬＹＳＩＶＳＰＦＩＰＬＬＰＩＦＦＣＬＷＶＹＩ
配列番号５０．アカゲザルＰＳＭＡ  ＥＣＤタンパク質のアミノ酸配列：
ＭＡＳＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤＡＡＨＨＨＨＨＨＫＳＳＳＥＡＴＮＩＴＰＫＨＮＭＫＡＦＬＤＥＬＫＡＥＮＩＫＫＦＬＨＮＦＴＱＩＰＨＬＡＧＴＥＱＮＦＱＬＡＫＱＩＱＳＱＷＫＥＦＧＬＤＳＶＥＬＴＨＹＤＶＬＬＳＹＰＮＫＴＨＰＮＹＩＳＩＩＮＥＤＧＮＥＩＦＮＴＳＬＦＥＰＰＰＡＧＹＥＮＶＳＤＩＶＰＰＦＳＡＦＳＰＱＧＭＰＥＧＤＬＶＹＶＮＹＡＲＴＥＤＦＦＫＬＥＲＤＭＫＩＮＣＳＧＫＩＶＩＡＲＹＧＫＶＦＲＧＮＫＶＫＮＡＱＬＡＧＡＴＧＶＩＬＹＳＤＰＡＤＹＦＡＰＧＶＫＳＹＰＤＧＷＮＬＰＧＧＧＶＱＲＧＮＩＬＮＬＮＧＡＧＤＰＬＴＰＧＹＰＡＮＥＹＡＹＲＲＧＩＡＥＡＶＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩＧＹＹＤＡＱＫＬＬＥＫＭＧＧＳＡＳＰＤＳＳＷＲＧＳＬＫＶＰＹＮＶＧＰＧＦＴＧＮＦＳＴＱＫＶＫＭＨＩＨＳＴＳＥＶＴＲＩＹＮＶＩＧＴＬＲＧＡＶＥＰＤＲＹＶＩＬＧＧＨＲＤＳＷＶＦＧＧＩＤＰＱＳＧＡＡＶＶＨＥＩＶＲＳＦＧＴＬＫＫＥＧＷＲＰＲＲＴＩＬＦＡＳＷＤＡＥＥＦＧＬＬＧＳＴＥＷＡＥＥＮＳＲＬＬＱＥＲＧＶＡＹＩＮＡＤＳＳＩＥＧＮＹＴＬＲＶＤＣＴＰＬＭＹＳＬＶＹＮＬＴＫＥＬＥＳＰＤＥＧＦＥＧＫＳＬＹＥＳＷＴＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫＬＧＳＧＮＤＦＥＶＦＦＱＲＬＧＩＡＳＧＲＡＲＹＴＫＮＷＥＴＮＫＦＳＳＹＰＬＹＨＳＶＹＥＴＹＥＬＶＥＫＦＹＤＰＭＦＫＹＨＬＴＶＡＱＶＲＧＧＭＶＦＥＬＡＮＳＶＶＬＰＦＤＣＲＤＹＡＶＶＬＲＫＹＡＤＫＩＹＮＩＳＭＫＨＰＱＥＭＫＴＹＳＶＳＦＤＳＬＦＳＡＶＫＮＦＴＥＩＡＳＫＦＳＥＲＬＲＤＦＤＫＳＮＰＩＬＬＲＭＭＮＤＱＬＭＦＬＥＲＡＦＩＤＰＬＧＬＰＤＲＰＦＹＲＨＶＩＹＡＰＳＳＨＮＫＹＡＧＥＳＦＰＧＩＹＤＡＬＦＤＩＥＳＫＶＤＰＳＱＡＷＧＥＶＫＲＱＩＳＩＡＴＦＴＶＱＡＡＡＥＴＬＳＥＶＡ
配列番号５１．ラットＨｅｒ−２  ｐ６６ペプチド（Ｈ−２ｄ  Ｔ細胞エピトープ）のアミノ酸配列
ＴＹＶＰＡＮＡＳＬ
配列番号５２．ラットＨｅｒ−２  ｐ１６９ペプチド（Ｈ−２ｄ  Ｔ細胞エピトープ）のアミノ酸配列
ＤＭＶＬＷＫＤＶＦＲＫＮＮＱＬ
配列番号５３．ＨＢＶコア抗原ｐ８７ペプチドのアミノ酸配列
ＳＹＶＮＴＮＭＧＬ
配列番号５４．ラットＨｅｒ−２抗原（ｒＨｅｒ−２）のアミノ酸配列：
ＭＡＳＥＬＡＡＷＣＲＷＧＦＬＬＡＬＬＰＰＧＩＡＧＴＱＶＣＴＧＴＤＭＫＬＲＬＰＡＳＰＥＴＨＬＤＭＬＲＨＬＹＱＧＣＱＶＶＱＧＮＬＥＬＴＹＶＰＡＮＡＳＬＳＦＬＱＤＩＱＥＶＱＧＹＭＬＩＡＨＮＱＶＫＲＶＰＬＱＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬＦＥＤＫＹＡＬＡＶＬＤＮＲＤＰＱＤＮＶＡＡＳＴＰＧＲＴＰＥＧＬＲＥＬＱＬＲＳＬＴＥＩＬＫＧＧＶＬＩＲＧＮＰＱＬＣＹＱＤＭＶＬＷＫＤＶＦＲＫＮＮＱＬＡＰＶＤＩＤＴＮＲＳＲＡＣＰＰＣＡＰＡＣＫＤＮＨＣＷＧＥＳＰＥＤＣＱＩＬＴＧＴＩＣＴＳＧＣＡＲＣＫＧＲＬＰＴＤＣＣＨＥＱＣＡＡＧＣＴＧＰＫＨＳＤＣＬＡＣＬＨＦＮＨＳＧＩＣＥＬＨＣＰＡＬＶＴＹＮＴＤＴＦＥＳＭＨＮＰＥＧＲＹＴＦＧＡＳＣＶＴＴＣＰＹＮＹＬＳＴＥＶＧＳＣＴＬＶＣＰＰＮＮＱＥＶＴＡＥＤＧＴＱＲＣＥＫＣＳＫＰＣＡＲＶＣＹＧＬＧＭＥＨＬＲＧＡＲＡＩＴＳＤＮＶＱＥＦＤＧＣＫＫＩＦＧＳＬＡＦＬＰＥＳＦＤＧＤＰＳＳＧＩＡＰＬＲＰＥＱＬＱＶＦＥＴＬＥＥＩＴＧＹＬＹＩＳＡＷＰＤＳＬＲＤＬＳＶＦＱＮＬＲＩＩＲＧＲＩＬＨＤＧＡＹＳＬＴＬＱＧＬＧＩＨＳＬＧＬＲＳＬＲＥＬＧＳＧＬＡＬＩＨＲＮＡＨＬＣＦＶＨＴＶＰＷＤＱＬＦＲＮＰＨＱＡＬＬＨＳＧＮＲＰＥＥＤＣＧＬＥＧＬＶＣＮＳＬＣＡＨＧＨＣＷＧＰＧＰＴＱＣＶＮＣＳＨＦＬＲＧＱＥＣＶＥＥＣＲＶＷＫＧＬＰＲＥＹＶＳＤＫＲＣＬＰＣＨＰＥＣＱＰＱＮＳＳＥＴＣＦＧＳＥＡＤＱＣＡＡＣＡＨＹＫＤＳＳＳＣＶＡＲＣＰＳＧＶＫＰＤＬＳＹＭＰＩＷＫＹＰＤＥＥＧＩＣＱＰＣＰＩＮＣＴＨＳＣＶＤＬＤＥＲＧＣＰＡＥＱＲＡＳＰＶＴＦＩＩＡＴＶＶＧＶＬＬＦＬＩＬＶＶＶＶＧＩＬＩＫＲＲＲＱＫＩＲＫＹＴＭＲＲＮＥＤＬＧＰＳＳＰＭＤＳＴＦＹＲＳＬＬＥＤＤＤＭＧＤＬＶＤＡＥＥＹＬＶＰＱＱＧＦＦＳＰＤＰＴＰＧＴＧＳＴＡＨＲＲＨＲＳＳＳＴＲＳＧＧＧＥＬＴＬＧＬＥＰＳＥＥＧＰＰＲＳＰＬＡＰＳＥＧＡＧＳＤＶＦＤＧＤＬＡＭＧＶＴＫＧＬＱＳＬＳＰＨＤＬＳＰＬＱＲＹＳＥＤＰＴＬＰＬＰＰＥＴＤＧＹＶＡＰＬＡＣＳＰＱＰＥＦＶＮＱＳＥＶＱＰＱＰＰＬＴＰＥＧＰＬＰＰＶＲＰＡＧＡＴＬＥＲＰＫＴＬＳＰＧＫＮＧＶＶＫＤＶＦＡＦＧＧＡＶＥＮＰＥＦＬＶＰＲＥＧＴＡＳＰＰＨＰＳＰＡＦＳＰＡＦＤＮＬＦＦＷＤＱＮＳＳＥＱＧＰＰＰＳＮＦＥＧＴＰＴＡＥＮＰＥＦＬＧＬＤＶＰＶ
配列番号５５．アカゲザルＰＳＭＡ抗原のアミノ酸配列：
ＭＡＳＡＲＲＰＲＷＬＣＡＧＡＬＶＬＡＧＧＦＦＬＬＧＦＬＦＧＷＦＩＫＳＳＳＥＡＴＮＩＴＰＫＨＮＭＫＡＦＬＤＥＬＫＡＥＮＩＫＫＦＬＨＮＦＴＱＩＰＨＬＡＧＴＥＱＮＦＱＬＡＫＱＩＱＳＱＷＫＥＦＧＬＤＳＶＥＬＴＨＹＤＶＬＬＳＹＰＮＫＴＨＰＮＹＩＳＩＩＮＥＤＧＮＥＩＦＮＴＳＬＦＥＰＰＰＡＧＹＥＮＶＳＤＩＶＰＰＦＳＡＦＳＰＱＧＭＰＥＧＤＬＶＹＶＮＹＡＲＴＥＤＦＦＫＬＥＲＤＭＫＩＮＣＳＧＫＩＶＩＡＲＹＧＫＶＦＲＧＮＫＶＫＮＡＱＬＡＧＡＴＧＶＩＬＹＳＤＰＡＤＹＦＡＰＧＶＫＳＹＰＤＧＷＮＬＰＧＧＧＶＱＲＧＮＩＬＮＬＮＧＡＧＤＰＬＴＰＧＹＰＡＮＥＹＡＹＲＲＧＩＡＥＡＶＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩＧＹＹＤＡＱＫＬＬＥＫＭＧＧＳＡＳＰＤＳＳＷＲＧＳＬＫＶＰＹＮＶＧＰＧＦＴＧＮＦＳＴＱＫＶＫＭＨＩＨＳＴＳＥＶＴＲＩＹＮＶＩＧＴＬＲＧＡＶＥＰＤＲＹＶＩＬＧＧＨＲＤＳＷＶＦＧＧＩＤＰＱＳＧＡＡＶＶＨＥＩＶＲＳＦＧＴＬＫＫＥＧＷＲＰＲＲＴＩＬＦＡＳＷＤＡＥＥＦＧＬＬＧＳＴＥＷＡＥＥＮＳＲＬＬＱＥＲＧＶＡＹＩＮＡＤＳＳＩＥＧＮＹＴＬＲＶＤＣＴＰＬＭＹＳＬＶＹＮＬＴＫＥＬＥＳＰＤＥＧＦＥＧＫＳＬＹＥＳＷＴＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫＬＧＳＧＮＤＦＥＶＦＦＱＲＬＧＩＡＳＧＲＡＲＹＴＫＮＷＥＴＮＫＦＳＳＹＰＬＹＨＳＶＹＥＴＹＥＬＶＥＫＦＹＤＰＭＦＫＹＨＬＴＶＡＱＶＲＧＧＭＶＦＥＬＡＮＳＶＶＬＰＦＤＣＲＤＹＡＶＶＬＲＫＹＡＤＫＩＹＮＩＳＭＫＨＰＱＥＭＫＴＹＳＶＳＦＤＳＬＦＳＡＶＫＮＦＴＥＩＡＳＫＦＳＥＲＬＲＤＦＤＫＳＮＰＩＬＬＲＭＭＮＤＱＬＭＦＬＥＲＡＦＩＤＰＬＧＬＰＤＲＰＦＹＲＨＶＩＹＡＰＳＳＨＮＫＹＡＧＥＳＦＰＧＩＹＤＡＬＦＤＩＥＳＫＶＤＰＳＱＡＷＧＥＶＫＲＱＩＳＩＡＴＦＴＶＱＡＡＡＥＴＬＳＥＶＡ
配列番号５６  配列番号５５」のアカゲザルＰＳＭＡ抗原をコードしているヌクレオチド配列
ＡＴＧＧＣＴＡＧＣＧＣＴＡＧＡＡＧＧＣＣＣＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＴＧＧＣＧＧＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＧＧＣＴＧＧＴＴＣＡＴＣＡＡＧＴＣＣＴＣＣＡＧＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＣＣＣＡＡＧＣＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＧＧＣＣＴＴＴＣＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＡＡＧＡＡＧＴＴＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＴＴＣＡＣＣＣＡＧＡＴＣＣＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＣＣＣＡＧＴＧＧＡＡＡＧＡＧＴＴＣＧＧＣＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＴＧＧＡＡＣＴＧＡＣＣＣＡＣＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＣＣＣＡＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＣＣＣＡＡＣＴＡＣＡＴＣＴＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＧＡＡＡＴＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＡＧＣＣＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＧＧＣＴＡＣＧＡＧＡＡＣＧＴＧＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＴＧＣＣＣＣＣＡＴＴＣＴＣＣＧＣＡＴＴＣＡＧＴＣＣＡＣＡＡＧＧＣＡＴＧＣＣＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣＧＴＧＡＡＣＴＡＣＧＣＣＡＧＧＡＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＧＧＧＡＣＡＴＧＡＡＧＡＴＣＡＡＣＴＧＣＴＣＣＧＧＣＡＡＧＡＴＣＧＴＧＡＴＣＧＣＣＡＧＡＴＡＣＧＧＣＡＡＧＧＴＧＴＴＣＡＧＧＧＧＣＡＡＣＡＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＣＧＣＴＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＴＧＡＣＣＣＣＧＣＣＧＡＣＴＡＣＴＴＣＧＣＣＣＣＡＧＧＣＧＴＧＡＡＧＴＣＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＧＧＣＴＧＧＡＡＣＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＴＧＣＡＧＡＧＧＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＡＡＣＧＧＣＧＣＴＧＧＣＧＡＣＣＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＡＧＧＡＴＡＣＣＣＣＧＣＣＡＡＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣＴＡＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＴＣＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＴＧＧＧＣＣＴＧＣＣＣＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＴＧＣＡＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＡＧＡＡＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＴＧＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＣＧＡＣＴＣＣＴＣＴＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＧＴＧＣＣＣＴＡＣＡＡＣＧＴＧＧＧＣＣＣＡＧＧＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＡＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＣＡＣＡＴＣＣＡＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＧＡＡＧＴＧＡＣＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＡＡＣＧＴＧＡＴＣＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＧＡＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＡＴＡＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＣＡＴＣＧＡＣＣＣＡＣＡＧＴＣＴＧＧＣＧＣＣＧＣＴＧＴＧＧＴＧＣＡＣＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＧＧＴＣＣＴＴＣＧＧＡＡＣＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＧＧＡＴＧＧＣＧＣＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＣＡＡＴＣＣＴＧＴＴＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＡＣＧＣＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＧＡＧＴＧＧＧＣＣＧＡＧＧＡＡＡＡＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＧＣＧＴＣＧＣＣＴＡＣＡＴＣＡＡＣＧＣＣＧＡＣＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＣＣＣＴＧＡＧＧＧＴＧＧＡＣＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣＴＧＡＴＧＴＡＣＴＣＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＡＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＡＴＣＣＣＣＣＧＡＣＧＡＧＧＧＣＴＴＣＧＡＧＧＧＣＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＡＣＧＡＧＴＣＣＴＧＧＡＣＣＡＡＧＡＡＧＴＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＧＡＧＴＴＣＴＣＣＧＧＣＡＴＧＣＣＣＡＧＧＡＴＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＡＣＧＡＣＴＴＣＧＡＧＧＴＧＴＴＣＴＴＣＣＡＧＡＧＧＣＴＧＧＧＡＡＴＣＧＣＣＴＣＣＧＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＴＡＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣＴＧＧＧＡＧＡＣＡＡＡＣＡＡＧＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＣＣＣＣＴＧＴＡＣＣＡＣＴＣＣＧＴＧＴＡＣＧＡＡＡＣＣＴＡＣＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＡＧＴＴＣＴＡＣＧＡＣＣＣＣＡＴＧＴＴＣＡＡＧＴＡＣＣＡＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＣＣＧＣＧＧＡＧＧＣＡＴＧＧＴＧＴＴＣＧＡＧＣＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＣＴＧＣＣＣＴＴＣＧＡＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＴＡＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＡＡＡＴＣＴＡＣＡＡＣＡＴＣＴＣＣＡＴＧＡＡＧＣＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＡＡＴＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＴＴＣＧＡＣＴＣＣＣＴＧＴＴＣＴＣＣＧＣＣＧＴＧＡＡＧＡＡＴＴＴＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＧＣＣＴＣＣＡＡＧＴＴＣＴＣＣＧＡＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＧＡＣＴＴＣＧＡＣＡＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧＡＡＣＧＡＣＣＡＧＣＴＧＡＴＧＴＴＣＣＴＧＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＧＡＣＣＣＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＣＡＧＡＣＡＧＧＣＣＣＴＴＣＴＡＣＡＧＧＣＡＣＧＴＧＡＴＣＴＡＣＧＣＣＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＡＣＡＡＣＡＡＡＴＡＣＧＣＣＧＧＣＧＡＧＴＣＣＴＴＣＣＣＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＧＡＴＧＣＣＣＴＧＴＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＧＴＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＴＧＧＧＧＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＧＧＣＡＧＡＴＣＡＧＴＡＴＣＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＡＧＴＧＣＡＧＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＴＣＣＧＡＧＧＴＧＧＣＣ
【図１】
2019054804.tif 000042
【図２】
2019054804.tif 000043
【図３】
2019054804.tif 000044
【図４】
2019054804.tif 000045
【図５】
2019054804.tif 000046
【図６】
2019054804.tif 000047
【図７−１】
2019054804.tif 000048
【図７−２】
2019054804.tif 000049
【図８】
2019054804.tif 000050
【図９−１】
2019054804.tif 000051
【図９−２】
2019054804.tif 000052
【図９−３】
2019054804.tif 000053
【図９−４】
2019054804.tif 000054
【図１０−１】
2019054804.tif 000055
【図１０−２】
2019054804.tif 000056
【図１０−３】
2019054804.tif 000057
【図１０−４】
2019054804.tif 000058
【図１１】
2019054804.tif 000059
【図１２】
2019054804.tif 000060
【図１３】
2019054804.tif 000061
【図１４】
2019054804.tif 000062
【図１５−１】
2019054804.tif 000063
【図１５−２】
2019054804.tif 000064
【図１５−３】
2019054804.tif 000065
【図１６−１】
2019054804.tif 000066
【図１６−２】
2019054804.tif 000067
【図１６−３】
2019054804.tif 000068
【図１７】
2019054804.tif 000069
【図１８】
2019054804.tif 000070
【図１９】
2019054804.tif 000071
【図２０】
2019054804.tif 000072
【図２１−１】
2019054804.tif 000073
【図２１−２】
2019054804.tif 000074
【図２１−３】
2019054804.tif 000075
【図２１−４】
2019054804.tif 000076
【図２２】
2019054804.tif 000077
【図２３】
2019054804.tif 000078
【図２４】
2019054804.tif 000079
【図２５】
2019054804.tif 000080
【図２６】
2019054804.tif 000081
【図２７】
2019054804.tif 000082
【図２８】
2019054804.tif 000083
【図２９】
2019054804.tif 000084
【図３０】
2019054804.tif 000085
【図３１】
2019054804.tif 000086
【図３２】
2019054804.tif 000087
【図３３−１】
2019054804.tif 000088
【図３３−２】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【配列表】
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