(57)【要約】【課題】バイオレメディエーションにおいて実用的な使用が可能なレベルの、優れたシアン分解能力を有する微生物を見出し、これによるシアン汚染環境の浄化手段を提供すること、及び、優れたシアン分解能力を有する微生物の候補を選別する手段を見出すことにより、シアン汚染環境に適用可能なバイオレメディエーション技術の豊富化手段を提供すること。【解決手段】配列番号１に示されるアミノ酸配列から０−２０％の相違が許容されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の遺伝子を保有する１種又は２種以上の微生物を検出して、当該検出微生物をシアン分解能を有する微生物の候補とする、シアン分解能を有する微生物の選択方法、及び、上記遺伝子を保有する優れたシアン分解能力を有する微生物、当該微生物を含有するシアン分解剤、及び、当該シアン分解剤を用いるシアン汚染物の浄化方法、を見出すことにより、上記の課題を解決し得ることを見出した。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列から０−２０％の相違が許容されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の遺伝子を保有する１種又は２種以上の微生物を検出して、当該検出微生物をシアン分解能を有する微生物の候補とする、シアン分解能を有する微生物の選択方法。
【請求項２】
微生物は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属細菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌、又は、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌であることを特徴とする、請求項２に記載の微生物の選択方法。
【請求項３】
配列番号１に示されるアミノ酸配列から０−２０％の相違が許容されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の遺伝子を保有する微生物。
【請求項４】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むニトリラーゼをコードする遺伝子を保有することを特徴とする、請求項３に記載の微生物。
【請求項５】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むニトリラーゼをコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号２に示される塩基配列であることを特徴とする、請求項３又は４に記載の微生物。
【請求項６】
微生物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌であることを特徴とする、請求項３−５のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項７】
シアン分解能力が、１．０×１０-11 ｇＣＮ／ＣＦＵ／ｈｒ以上であることを特徴とする、請求項３−６のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項８】
独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センターにおいて、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４５０（識別表示：１７０２１４＿Ｂａ．Ｔ）として寄託された、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌。
【請求項９】
請求項３−８のいずれか１項に記載の微生物を含有するシアン分解剤。
【請求項１０】
さらに微生物活性化成分を含有することを特徴とする、請求項９に記載のシアン分解剤。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載のシアン分解剤を、シアン汚染物に作用させて当該汚染物を浄化する、浄化方法。
【請求項１２】
シアン汚染物は、土壌及び／又は地下水であることを特徴とする、請求項１１に記載の浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境汚染物の浄化能を有する微生物における、その選択方法、当該微生物、及び当該微生物の環境浄化用途に関する発明であり、より具体的には、優れたシアン分解能を有する微生物の候補を選択する方法、シアン分解能を有する微生物、当該微生物を含有するシアン分解剤、当該シアン分解剤を用いるシアン汚染物の浄化方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
シアン化合物は、電気メッキや金属鉱業に用いられているが、設備の廃棄や機器の取扱い不良等によって環境中に流出することで、土壌や地下水の汚染を引き起こす場合があり、土壌汚染対策法においては、第２種特定有害物質に指定されている。
【０００３】
シアンが人体に及ぼす影響として、細胞内呼吸の阻害が挙げられる。シアンは、経口、経皮、経気道により体内に取り込まれると、シアン化物イオンとなり、細胞のミトコンドリア内の呼吸鎖を担うシトクロム等の鉄イオンと強く結合することで、細胞内呼吸の阻害を引き起こす。
【０００４】
一般にシアン化合物は水溶性であることから、一度地下水中に放出されると、その流れによって短期間に広範囲に汚染が拡散することが懸念される。
【０００５】
このようなシアン化合物による環境汚染に対処するため、バイオレメディエーションの活用も模索されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５１８９９３８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１には、シアン化合物を浄化するためのバイオレメディエーションにおいて、アセトアルデヒドを供給して、微生物によるシアン分解能を向上させるための技術が開示されている。
【０００８】
しかしながら、現状では、０．０３ｍＬ／Ｌのシアン化合物を分解するのに１０日以上を要す等、肝心の高いシアン分解能を有するシアン分解微生物自体が見出されておらず、バイオレメディエーションによるシアン分解技術が実用可能なレベルに達しているとはいえない。
【０００９】
本発明の課題は、バイオレメディエーションにおいて実用的な使用が可能なレベルの、優れたシアン分解能力を有する微生物を見出し、これによるシアン汚染環境の浄化手段を提供することにある。また、優れたシアン分解能力を有する微生物の候補を選別する手段を見出すことにより、シアン汚染環境に適用可能なバイオレメディエーション技術の豊富化手段を提供することも課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、シアン化合物を分解可能な微生物の存在を、シアン汚染環境において検討したところ、極めて優れたシアン分解能を有する微生物を見出した。そして、このシアン分解微生物は、特定のニトリラーゼ遺伝子を保有しており、このニトリラーゼ遺伝子を組み込んだ大腸菌から抽出されるニトリラーゼが優れたシアン分解能を有することが確認された。すなわち、このニトリラーゼ遺伝子は、微生物が優れたシアン分解能力を有するための本質的な遺伝子の一つであり、この特定遺伝子の保有の程度を検出することによって、優れたシアン分解能を有する微生物の候補を選択することが可能であることが明らかになった。優れたシアン分解能を有する微生物を、環境中において地道なスクリーニング操作の繰り返しにより選択することは極めて手間のかかる作業であり、初期の遺伝子スクリーニングによって候補を絞り込むことができれば、目的とするシアン分解菌の分離の効率が飛躍的に高まり、シアン汚染環境のバイオレメディエーション技術による浄化の実用化を加速することが可能となる。
【００１１】
本発明は、以下の内容である。なお、本発明において、シアン化合物（ｃｙａｎｉｄｅ）をシアンとも記載する。
【００１２】
第１に、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列から０−２０％の相違が許容されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の遺伝子を保有する１種又は２種以上の微生物を検出して、当該検出微生物をシアン分解能を有する微生物の候補とする、シアン分解能を有する微生物の選択方法（以下、本発明の選択方法ともいう）である。
【００１３】
第２に、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列から０−２０％の相違が許容されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の遺伝子を保有する微生物（以下、本発明のシアン分解微生物ともいう）である。
【００１４】
第３に、本発明は、上記本発明のシアン分解微生物を含有するシアン分解剤（以下、本発明のシアン分解剤ともいう）である。
【００１５】
第４に、本発明は、上記本発明のシアン分解剤を、シアン汚染物に作用させて当該汚染物を浄化する、浄化方法（以下、本発明の浄化方法ともいう）である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、優れたシアン分解能を有する微生物の候補を選択する方法、シアン分解能を有する微生物、当該微生物を含有するシアン分解剤、及び、当該シアン分解剤を用いる汚染物の浄化方法、が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明のシアン分解微生物の非常に優れたシアン分解能を示す図である。
【図２】既存のシアン分解微生物の標準的なシアン分解能を示す図である。
【図３】本発明のシアン分解微生物の保有するニトリラーゼのアミノ酸配列と近縁のニトリラーゼのアミノ酸配列との相同性を検討した結果を示した図である。
【図４】本発明のシアン分解微生物の保有するニトリラーゼ遺伝子を組み込んだ大腸菌の可溶性のニトリラーゼ画分の電気泳動図である。
【図５】本発明のシアン分解微生物の保有するニトリラーゼ遺伝子を組み込んだ大腸菌のシアン分解能を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
［選択方法］
上述のように、本発明の選択方法は、配列番号１に示されるアミノ酸配列から０−２０％の相違が許容されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の遺伝子（以下、検出対象遺伝子ともいう）を保有する微生物を検出して、当該検出微生物を「シアン分解能を有する微生物」の候補とする、シアン分解能を有する微生物の選択方法である。
【００１９】
配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ニトリル基を分解するニトリラーゼの中でも、優れたシアン分解活性を示すニトリラーゼのアミノ酸配列である。検出対象となる「当該アミノ酸配列をコードする遺伝子」の塩基配列は、当該アミノ酸配列がコードされている限り特に限定されず、少なくともＤＮＡのトリプレットコドンにおいて可能性のある塩基配列を全て含むものである。その塩基配列の一例を、配列番号２として示す。また、アミノ酸配列の相違のパーセンテージは、配列番号１のアミノ酸数（２６１）に対して相違するアミノ酸数のパーセンテージであり、小数点以下は切り捨てる。「相違するアミノ酸数」は、対応アミノ酸残基が欠失している場合は当該欠失アミノ酸数を当て嵌め、アミノ酸残基が変更されている場合は当該変更アミノ酸数を当て嵌め、アミノ酸配列が挿入されている場合には、当該挿入アミノ酸残基数を当て嵌めて、カウントを行なうことで、当該アミノ酸配列の相違のパーセンテージを算出することができる。この許容されるアミノ酸配列の相違の範囲が広ければ、シアン分解能を有する候補となる微生物の検索範囲は広くなるがノイズも多くなる。逆にこの相違の範囲を狭めれば、ノイズは少なくなるが優れたシアン分解能を有する微生物を選択から漏らしてしまう可能性も高くなる。この本発明の選択方法の指標である遺伝子の保有が、優れたシアン分解能の唯一の要素とは言い切れず、他の要因と組み合わさっている場合も想定されるからである。
【００２０】
配列番号１のアミノ酸配列をデータベース上のタンパク質のアミノ酸配列と比較したところ、９０％程度以上の相同性を有するタンパク質が存在する他は６６％以下の相同性であり、明らかに特性が異なることが予想された。そこで、本発明でのアミノ酸配列の相違の許容範囲を「０−２０％」とした。また、さらなる絞込みのために好適な当該許容範囲を「０−１５％」、さらに好適な許容範囲を「０−１２％」とした。
【００２１】
本発明の選択方法を行う対象となる微生物は限定されないが、典型的には細菌類である。ただし、その他の微生物、例えば、放線菌類、藍藻類、古細菌類、カビ、酵母、藻類等が除外される訳ではない。細菌類は、限定されないが、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属細菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌、又は、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌等が好適な対象となる。また、対象微生物は、１種とは限らず、２種以上であってもよい。例えば、細菌類の共生体（コンソーシア）単位に対して、本発明の選択方法を行うことも可能である。
【００２２】
本発明の選択方法は、例えば、下記のように行うことができる。
【００２３】
（１）対象微生物の特定
例えば、シアン化合物汚染が認められる地下水や土壌から、微生物を遺伝子分析が可能な、夾雑物が除かれた態様で分離して、被験対象物とする。上記のように、微生物は、遺伝子分析機器の性能上、有効な遺伝子分析が可能な限り、微生物の種類は１種であっても、２種以上であってもよい。共生体（コンソーシア）として遺伝子分析を行う場合には、複数微生物における遺伝子解析が可能な機器を用いて行う必要がある。
【００２４】
（２）検出対象遺伝子の特定・検出
次に、得られた被験対象物中の微生物における、検出対象遺伝子の存否と類似度の特定と検出を行う。「存否」の特定は、検出対象遺伝子、すなわち、配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子が、設定された塩基配列の類似許容度の範囲で、被験対象物中の微生物において存在するか否かの特定である。「類似度」の特定は、当該「存否」の特定において「存在する」との結果が出た場合に、当該検出対象遺伝子が、配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列からの相違の度合い（パーセンテージ）である。当該度合いが小さいほど、被験微生物のシアン分解性能は高いことが推定される。
【００２５】
この検出対象遺伝子の特定・検出工程は、現在又は将来において提供される遺伝子解析方法によって行うことができる。
【００２６】
一例を挙げれば、ＤＮＡ塩基配列決定法の原理的な手法であるジデオキシ法（サンガー法）、マクサム・ギルバート法、特にジデオキシ法を原理的手法として用い、さらに必要に応じて、ＰＣＲ法等を選択的に用いる種々の機器分析により検出対象遺伝子の特定・検出を行うことができる。また、Ｒｏｃｈｅ−４５４  ＧＳ  ＦＬＸ（ロシュ社）、Ｈｉｓｅｑ２０００、Ｈｉｓｅｑ２５００（共にイルミナ社）、１分子リアルタイムシークエンサー（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社等）やナノポアシーケンサー（オックスフォード・ナノポア・テクノロジーズ社）などの先端ＤＮＡシーケンサーのよる特定・検出を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
遺伝子解析により、検出対象遺伝子が認められた１種又は２種以上の微生物を、優れたシアン分解能を有する微生物の候補として選択することができる。
【００２８】
例えば、このようにして優れたシアン分解能を有する微生物の候補として選択された微生物を、さらに、シアン含有培地等におけるシアンの時間当たりの消費量を求めること等により、実際のシアン分解能力を検討することにより、シアン分解菌を最終的に同定することができる。本発明の選択方法により、大変な時間と根気の必要であった同定過程を、事前の遺伝子解析による絞り込みにより飛躍的に簡便化することが可能である。
【００２９】
［シアン分解微生物］
上述のように、本発明のシアン分解微生物は、配列番号１に示されるアミノ酸配列から０−２０％、好ましくは０−１５％、さらに好ましくは０−１２％の相違が許容されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の遺伝子を保有する微生物である。
【００３０】
「配列番号１に示されるアミノ酸配列から０−２０％、好ましくは０−１５％、さらに好ましくは０−１２％の相違が許容されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の遺伝子」は、上記の検出対象遺伝子と同一である。上記と同様に、その典型例として配列番号２に示す塩基配列の遺伝子が挙げられる。
【００３１】
本発明のシアン分解微生物は、シアン分解能力を保有する限り特に限定されないが、後述する本発明の浄化方法の代表的な態様であるバイオレメディエーション等外部環境において用いる際の安全性が保たれていることが好ましい。
【００３２】
このようなシアン分解能力を保有し、かつ、好適には安全性が確保されている本発明のシアン分解微生物の種類は、典型的には細菌類である。ただし、その他の微生物、例えば、放線菌類、藍藻類、古細菌類、カビ、酵母、藻類等が除外される訳ではない。前記細菌類は、限定されないが、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属細菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌、又は、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌等が好適である。また、本発明のシアン分解微生物は、１種とは限らず、例えば、細菌類の共生体（コンソーシア）単位であってもよい。
【００３３】
本発明のシアン分解微生物のシアン分解能力は、１．０×１０-11 ｇＣＮ／ＣＦＵ／ｈｒ以上であることが好ましく、さらに好ましくは２．０×１０-11 ｇＣＮ／ＣＦＵ／ｈｒ以上である。
【００３４】
この「ｇＣＮ／ＣＦＵ／ｈｒ」は、シアン分解微生物のシアン分解能力の指標となる単位であり、１細胞の微生物における時間当たりにシアンが分解されるグラム数である。被験微生物の性質に応じた温度、培地、通気条件等を設定し、インビトロで計測することができる。微生物のシアン分解能力を、汚染土壌や汚染地下水において発揮させることが前提であれば、この計測環境における計測温度は０−４０℃、好ましくは１０−３０℃程度である。また、培地は標準培地を選択することが計測環境の客観性が担保され好ましい。通気条件は、被験微生物の性質に応じて、好気条件下又は嫌気条件を選択することができる。後述する実施例においては、２５℃、液体培地（若干量の酵母エキスを添加）、及び、被験のＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌の生育に適した好気条件下で計測を行っている。この事実により、少なくとも２５℃を含む常温において、汚染土壌や汚染地下水におけるシアンの浄化用途における有用性を確認することができた。
【００３５】
本発明のシアン分解微生物は、天然に存在するものであっても、人工的に構築されたものであってもよい。天然に存在する本発明のシアン分解微生物は、例えば、シアン汚染環境の土壌や地下水をサンプルとして、当該サンプルからシアン分解活性を指標とするスクリーニングを行うことにより単離することができるが、好適には、前述の本発明の選択方法で、候補微生物を絞り込んだ後に、このシアン分解活性を指標とするスクリーニングを行うことが好ましい。人工的に構築される本発明のシアン分解微生物は、配列番号１のニトリラーゼのアミノ酸配列から０−２０％、好ましくは０−１５％、さらに好ましくは０−１２％の相違が許容されるアミノ酸配列をコードする遺伝子、最も好ましくは、配列番号２の塩基配列に代表される、配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子、を人工的に組み込んだ微生物が挙げられる。典型的には、後述する実施例に記載の本発明のシアン分解菌が保有する当該組み込み対象遺伝子を、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅方法により増幅させて、ＰＣＲクローニングベクター等を用いてクローニングを行い、さらに、当該クローニング遺伝子を組み込んだ遺伝子発現用ベクターで、宿主を形質転換すること等により、所望する人工的な本発明のシアン分解菌の候補とすることができる。そして、この候補に対してシアン分解活性を指標とするスクリーニングを行い、具体的なシアン分解活性を検証することにより、本発明のシアン分解菌として確立することができる。
【００３６】
本発明のシアン分解菌の最も好適な態様の一つとして、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むニトリラーゼをコードする遺伝子を含有する、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌が挙げられる。そして上述したように、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子として、配列番号２の塩基配列の遺伝子が例示される。
【００３７】
そして、この最も好適な態様のシアン分解能を有するＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌の一例を、独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センターにおいて、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４５０（識別表示：１７０２１４＿Ｂａ．Ｔ）として寄託した。
【００３８】
［シアン分解剤］
本発明のシアン分解剤は、その必須要素である本発明のシアン分解微生物そのものとすることが可能である。この場合には、本発明のシアン分解微生物が再活性化可能な方法で保存された保存物の形態であることが好適である。具体的には、凍結保存品、凍結乾燥品、Ｌ−乾燥品等とすることができる。本発明のシアン分解微生物に対して、それぞれ常法を用いることでこれらの保存物を作製することができる。その際、必要に応じて添加剤を用いることができる。例えば、凍結保存品は、グリセロール、ジメチルスルホキシド等を用いて作製することが可能であり、凍結乾燥品は、スキムミルク、グルタミン酸ナトリウム等を用いて作製することが可能である。
【００３９】
上述したように、本発明の分解剤には、一剤型の他、二剤以上の多剤型の形態も認められる。一剤型の本発明の分解剤は、上記した本発明のシアン分解菌をそのまま剤とする形態である。複数の剤の組で構成される多剤型の場合は、少なくとも一剤が本発明のシアン分解菌の剤（第一剤）であり、他の剤としては、接種環境における微生物の生育を促進する成分（微生物活性化成分）を含む剤（第二剤）や、本発明のシアン分解微生物が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌等の好気性菌である場合には、酸素を供給する剤（第三剤）が例示される。
【００４０】
当該第二剤に含まれる「微生物活性化成分」は、本発明のシアン分解微生物の生育促進効果が認められる限り限定されないが、環境負荷が少ない成分とすることが好適である。具体的には、酵母エキス、コーヒー粕、オリゴ糖シロップ、シクロデキストリン、デキストリン、水飴、還元糖、糖蜜（廃糖蜜）、クエン酸に代表される有機酸等から選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。好気性菌に対して好適な、上記第三剤としては、酸素（空気）の他に、希釈した過酸化水素やＯＲＣ（Ｏｘｙｇｅｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ、Ｒｅｇｅｎｅｓｉｓ）等がある。
【００４１】
上記第一剤、第二剤、さらに第三剤は、別々に標的箇所に添加して、当該箇所において事後的に両剤を接触させて、第一剤中の本発明のシアン分解微生物を第二剤中の微生物活性化成分、さらに必要に応じて第三剤からの酸素によって活性化（増殖を促進させる）形態で用いてもよいし、第一剤と第二剤を混合して予め活性化した本発明のシアン分解微生物を標的箇所に添加し、必要に応じて第三剤を添加する形態で用いてもよい。
【００４２】
また、上記第一剤の本発明のシアン分解微生物と第二剤の微生物活性化成分が固定化担体に固定化された固形剤も、本発明の分解剤の好適な態様の１つとして考えられる。固定化することにより、徐放性を付与することができる。
【００４３】
［浄化方法］
上記のように、本発明の浄化方法は、本発明のシアン分解剤を、シアン汚染物に作用させて当該汚染物を浄化する、浄化方法である。
【００４４】
分解又は浄化の対象となるシアン汚染物は、通常は汚染された土壌、地下水等が該当するが、必要に応じて他の対象物、例えば、廃棄物や排水処理後の汚泥等も汚染物として例示される。また、汚染物は原環境から分離されている状態であっても、非分離の状態、すなわち汚染された土地（地下部分を含む）そのものであってもよい。
【００４５】
原環境から分離の状態とは、いわゆる「汚染土壌の掘削による汚染物質の除去」を行う場合であり、事前調査により把握した範囲の汚染土壌を掘削し、掘削した汚染土壌以外の清浄な土壌の他、浄化処理を行った当該掘削土壌にて埋め戻す作業であり、「施設型浄化」とも言われる。浄化された掘削土壌は、別の場所に載置する場合もある。いずれにしても、本発明の浄化方法を掘削土壌に適用する場合には、ランドファーミング、バイオパイル、スラリーバイオ等の手法を用いることが可能である。ランドファーミングは、掘削した汚染土壌を敷き広げ、本発明の分解剤を添加することにより汚染土壌中の微生物の活性を高めて有害物質を分解する方法である。バイオパイルは、掘削した汚染土壌を畝型に成型して、本発明の分解剤を供給しつつ微生物の活性を高め有害物質を分解する方法である。スラリーバイオは、掘削した汚染土壌に水を加えてスラリー状に調整して、これをスラリーリアクターという反応槽に移し、そこに本発明の分解剤を供給して混合することにより微生物を活性化する方法である。
【００４６】
非分離の状態とは、汚染土壌を掘削せずに、原位置において浄化する「原位置浄化（原位置バイオレメディエーション）」を意味するものである。原位置浄化法にて、本発明の浄化方法を行う場合には、本発明の分解剤は、浄化領域の上流（地下水の上流を意味する）に設けた１個又は２個以上の井戸から供給することが好適である。このようにすることにより、地下水により分解剤中の本発明のシアン分解菌が、シアン化合物を分解しつつ徐々に下流に移行し、結果として汚染全領域におけるシアンの浄化を行うことができる。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明の実施例について説明する。
【００４８】
［実施例１］本発明のシアン分解微生物の単離と同定
（１）単離
シアン汚染地下水のサンプルを寒天培地に塗布し、生成された単一コロニーを採取した。次に、採取したコロニーを、シアン（シアン化カリウム）を含有させた液体培地へ植菌し、培養を行った。シアンの分解が確認された培養液を選んで、寒天培地に塗布し、同様にコロニー生成と液体培地での培養の操作を繰り返すことで、微生物の単離培養を行った。シアンはＶＩＳＯＣＯＬＯＲ  ＥＣＯ  Ｃｙａｎｉｄｅ  Ｔｅｓｔ  Ｋｉｔ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社）による発色を吸光光度計で測定し定量した。
【００４９】
（２）初期同定
このように単離されたシアン分解菌の各々について、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析を行うことで、同定を行った。
【００５０】
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は、原核生物の菌叢解析に頻繁に用いられる遺伝子領域である。この遺伝子は全ての種に存在し、生物間で高度に保存されている９つの領域と、比較的保存性の低い９つの特異的な領域（Ｖ１−９）が、交互に繰り返す構造である約１５００ｂｐの塩基長の遺伝子である。保存性の低い特異的な領域は系統発生学的に分類された塩基配列であることが知られている。そのため、生物間で高度に保存されている配列からユニバーサルプライマーを設計し、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子全長の塩基配列を決定、解析することにより、生物種毎に系統分類を行うことが可能である。一般的に、全ゲノムの相同性が７０％以上の場合、それらは同種の生物であるとされるが、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子においては、９７％以上の相同性があれば類縁関係が認められ、９９％以上の相同性があれば同種である可能性が高いとされている。
【００５１】
地下水より得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を増幅すべくＰＣＲを行った。使用した１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のユニバーサルプライマー配列は表１に示した通りである。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
ＰＣＲの温度サイクルは、ｉ）変性９６℃・５分、ii）変性９６℃・３０秒、iii）アニーリング５０℃・３０秒、iv）伸長７２℃・２分  （ ii）−iv）を３０サイクル）、ｖ）伸長７２℃・７分、vi）終了４℃、にて行った。
【００５４】
得られたＰＣＲ産物について、電気泳動を行い、期待通りに１５００ｂｐ付近のバンドが得られたことをエチジウムブロマイド染色により確認し（図示せず）、この１５００ｂｐ付近のバンドからの分離物を、ＤＮＡ精製キット（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ：ＧＥＮ社製）を用いて精製を行った。次いで、Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ２０（タカラバイオ社製）にてライゲーションを行い、これを用いてＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α  Ｃｏｍｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）の形質転換を行った。アンピシリン含有培地を用いての選択により得られた、培養プレート上の白色を示す形質転換体のコロニー菌体の各々をｄＨ2Ｏに懸濁して、これらに対してコロニーＰＣＲを行った。プライマーは、ｐＭＤ２０のマルチクローニングサイトの配列に結合するＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４及びＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒｖ（共にタカラバイオ社製）を用いた（表２）。
【００５５】
【表２】
2019054735.tif 000004
【００５６】
コロニーＰＣＲの温度サイクルは、ｉ）変性９５℃・１５分、ii）変性９５℃・３０秒、iii）アニーリング５０℃・３０秒、iv）伸長７２℃・２分  （ ii）−iv）を３０サイクル）、ｖ）伸長７２℃・７分、vi）終了４℃、にて行った。
【００５７】
得られたＰＣＲ産物について、電気泳動を行い、期待通りに１５００ｂｐ付近のバンドが得られたことをエチジウムブロマイド染色により確認した（図示せず）。このようにして電気泳動により１５００ｂｐ付近のバンドが認められ、形質転換が成功したことが確認されたサンプルが由来するコロニーの懸濁液各々から、プラスミド抽出を常法により行い、ユーロフィンジェノミクス株式会社に依頼してシーケンス解析を行い、この解析から得られた配列をＢＬＡＳＴで検索し、２種類の菌株を同定した（表３）。表３中の相同性は、表中に示した既知の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列との相同性のパーセンテージである。
【００５８】
【表３】
2019054735.tif 000005
【００５９】
検討の結果、バチルス属細菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＰＤＳＬｚｇ−１の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と高い相同性を有するバチルス属細菌（菌株２）が最も高いシアン分解能を示したので、当該バチルス属細菌についての検討することとした。
【００６０】
上記のバチルス属の単離菌を液体培地（ＬＢ培地（トリプトン １％（ｗ／ｖ）、酵母エキス ０．５％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム １％（ｗ／ｖ））で３７℃にて静置培養し、遠心分離により沈殿した菌体を一白金耳で２０ｍｌの生理食塩水に溶解させた。この菌体溶液に、シアン化カリウム（ＫＣＮ）を１９３ｍｇ／ｌ（ＣＮ換算で７７．２ｍｇ／ｌ）、酵母エキスを０．１％（ｗ／ｖ）となるように添加したサンプル群と、生理食塩水２０ｍｌに、シアン化カリウムを１９３ｍｇ／ｌ、酵母エキスを０．１％（ｗ／ｖ）となるように添加した比較群を、３７℃において静置培養（通気）を行い、両者のシアン濃度の減少度合を比較した。シアン濃度は、上記の通り、ＶＩＳＯＣＯＬＯＲ  ＥＣＯ  Ｃｙａｎｉｄｅ  Ｔｅｓｔ  Ｋｉｔ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社）による発色を吸光光度計で測定し定量した。
【００６１】
その結果、上記のバチルス属の単離菌は、１９３ｍｇ／ｌ（ＣＮ換算で７７．２ｍｇ／ｌ）のシアン化カリウムのほぼ全量分（少なくとも９０％以上）を、２時間程度の内に減少させたことが確認された（図１）。生菌数は、約２×１０６ＣＦＵ／ｍｌであった。シアン分解能は、２．２×１０-11 ｇＣＮ／ＣＦＵ／ｈｒ程度であることがわかった。
【００６２】
この結果は、本発明のシアン分解微生物が極めて優れたシアン分解能を有することを示すものである。
【００６３】
このバチルス属の単離菌を、本発明のシアン分解微生物の一例として、独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センターにおいて、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４５０（識別表示：１７０２１４＿Ｂａ．Ｔ）として寄託した。
【００６４】
同様の方法で、本発明のシアン分解菌と共に単離された、ペドバクター属細菌（菌株１）のシアン分解能を調べた。具体的には、当該ペドバクター属の単離菌を液体培地（ＬＢ培地（トリプトン １％（ｗ／ｖ）、酵母エキス ０．５％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム １％（ｗ／ｖ））で３７℃にて静置培養し、遠心分離により沈殿した菌体を一白金耳で２０ｍｌの生理食塩水に溶解させた。この菌体溶液に、シアン化カリウムを１９．４ｍｇ／ｌ（ＣＮ換算で７.７６ｍｇ／ｌ）、酵母エキスを０．１％（ｗ／ｖ）となるように添加したサンプル群と、生理食塩水２０ｍｌに、シアン化カリウムを１９．４ｍｇ／ｌ、酵母エキスを０．１％（ｗ／ｖ）となるように添加した比較群を、３７℃において静置培養（通気）を行い、両者のシアン濃度の減少度合を比較した。シアン濃度は、上記の通り、ＶＩＳＯＣＯＬＯＲ  ＥＣＯ  Ｃｙａｎｉｄｅ  Ｔｅｓｔ  Ｋｉｔ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社）による発色を吸光光度計で測定し定量した。
【００６５】
その結果、上記のペドバクター属の単離菌は、１９．４ｍｇ／ｌ（ＣＮ換算で７．７６ｍｇ／ｌ）のシアン化カリウムのほぼ半量分を、７日間程度の内に減少させたことが確認された（図２）。生菌数は、約３×１０９ＣＦＵ／ｍｌであった。シアン分解能は、高々７．９×１０-18 ｇＣＮ／ＣＦＵ／ｈｒ程度であることが確認された。
【００６６】
（３）シアン分解酵素（ニトリラーゼ）の同定
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＰＤＳＬｚｇ−１のゲノム配列情報を調べたところ、ニトリラーゼ遺伝子を保有することが分かり、このニトリラーゼがシアン分解を担っている可能性があると予想した。当該ニトリラーゼ遺伝子配列を基にプライマーを設計し、バチルス属の単離菌から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＴＡＫＡＲＡ Ｅｘ  Ｔａｑを用いたＰＣＲを行った。用いたプライマーは表４に示した通りである。
【００６７】
【表４】
2019054735.tif 000006
【００６８】
このＰＣＲの温度サイクルは、ｉ）変性９６℃・５分、ii）変性９６℃・３０秒、iii）アニーリング５５℃・３０秒、iv）伸長７２℃・２分  （ ii）−iv）を３０サイクル）、ｖ）伸長７２℃・７分、vi）終了４℃、にて行った。
【００６９】
得られたＰＣＲ増幅産物を電気泳動し、目的とするニトリラーゼ配列のバンドを単離して、常法により精製した。精製したサンプルを、Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ２０（タカラバイオ社製）へライゲーションを行い、これを用いてＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α  Ｃｏｍｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）の形質転換を行った。アンピシリン含有培地を用いての選択により得られた、培養プレート上の白色を示す形質転換体のコロニー菌体の各々をｄＨ2Ｏに懸濁して、常法によるプラスミド抽出を行った。さらに目的のニトリラーゼ遺伝子が正しくクローニングされていることを確認するために、常法による制限酵素切断を行った。抽出したプラスミドのインサートの両端を切断するために、制限酵素として、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩを使用した。
【００７０】
制限酵素処理を行ったサンプルを、１．５％アガロースゲル電気泳動し、目的の位置にバンドが得られたことが確認されたサンプルを、ユーロフィンジェノミクス株式会社に依頼してＤＮＡシーケンスを解析した（配列番号２）。このＤＮＡシーケンスから翻訳して得られたニトリラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）をＢＬＡＳＴで検索し、既知のニトリラーゼとのアミノ酸配列との相同性を検討した。その結果を表５（表５−１、２、３）に示す。表５は、ＢＬＡＳＴの独自のアルゴリズムで計算された各スコアから、配列番号１のアミノ酸配列のニトリラーゼと既知のニトリラーゼのアミノ酸配列（Accesion No.で示した）の相同性の上位１００位を示したものである。ＢＬＡＳＴにおいては、アミノ酸配列の全長（Total）と部分的で最適な領域のスコア（ＭＡＸ）が計算されて、順位付けされる。表５において、配列番号１のアミノ酸配列のニトリラーゼと「酵素の表示：Description」に示した既知のニトリラーゼのアミノ酸配列が比較されてスコアが算出される。スコアとは、２つのアミノ酸配列を並べて同じ位置に同じ残基があれば正の値、違えば負の値を与えて合計した点数であり、大きな値の方が相同性は高いといえる。表５では、最大スコア（Max score：Score of single best aligned sequence）と総合スコア（Total score：Sum of scores of all aligned sequences）は全て同値となっている。また、期待値（E-Value）は、現在のデータベースにおいて、全く偶然に同じスコアになる配列の数の期待値であり、小さいほど偶然には起こり得ないことを意味している。従って、スコア値が大きく、期待値が小さい場合には、その配列間の相同性（配列の同一性：Ident）は高いといえる。
【００７１】
【表５−１】
2019054735.tif 000007
【００７２】
【表５−２】
2019054735.tif 000008
【００７３】
【表５−３】
2019054735.tif 000009
【００７４】
その結果、本発明のシアン分解微生物の保有する「配列番号１のアミノ酸配列のニトリラーゼ」と、１００％相同のニトリラーゼは存在せず、当該ニトリラーゼは新規であることが明らかになった。
【００７５】
また、ニトリラーゼのアミノ酸配列が「９９−８９％以上の相同性の群」（グループ１）と、「６６％以下の相同性の群」（グループ２）の群に明確に分かれることが示された。この結果からすると、本発明の選択方法における指標である「配列番号１に示されるアミノ酸配列から概ね０−２０％の相違、少なく見積もっても０−１５％、さらに少なく見積もっても０−１２％の相違」が、配列番号１のアミノ酸配列のニトリラーゼと同族のニトリラーゼの存在を推測するのに妥当な範囲であることが分かる。上述のように、本発明のシアン分解微生物は、非常に優れたニトリラーゼ分解活性を示すことから、本発明の選択方法を用いることにより、優れたシアン分解能を有する微生物の候補を選択することが可能であることが示された。
【００７６】
参考のために、図３に上記アライメントの結果、最も配列番号１のニトリラーゼのアミノ酸配列と近縁のアミノ酸配列（ＷＰ  ０４７２０２０９６．１：配列番号９）とのアライメントの結果を示す。
【００７７】
上段の「Query」が配列番号１のニトリラーゼのアミノ酸配列であり、下段の「Sbjct」が、比較対象のアミノ酸配列であり、中断のアミノ酸配列のうち、一文字のアミノ酸記号で示されている部分が共通部分で、「  」又は「＋」で示されている部分が両アミノ酸の異なる箇所である。２６１アミノ酸中、２５８アミノ酸が相同（９９％の相同）であることが示されている。
【００７８】
［実施例２］ニトリラーゼのシアン分解活性等
配列番号２の塩基配列のニトリラーゼ遺伝子を大腸菌発現ベクターｐＥＴ２３ｂのＮｄｅＩ，  ＸｈｏＩサイトに組み込み、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。この組換え大腸菌を、ＬＢ培地中１８℃で４０時間培養した。遠心分離により沈殿した菌体１ｇを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）２０ｍｌで溶かし、超音波破砕機を用いて菌体を氷上で破砕した。この破砕溶液を１５０００ｒｐｍ  で３０分間遠心分離した。得られた上清を可溶性画分として新しいファルコンに移し、沈殿は５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にて再懸濁した。
【００７９】
次に、ニトリラーゼが発現したか否かを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて確認をした。各サンプル７．５μｌに対して  ２×Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  を７．５μｌ加え、サーマルサイクラーを用いて９５℃で５分間熱処理をした。得られたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて泳動した（図４）。
【００８０】
図４に示すように、目的分子量の３０ｋＤａの位置に可溶性画分が確認され、これが配列番号２の塩基配列を基に発現された配列番号１の塩基配列のニトリラーゼであると結論付けられる。
【００８１】
さらに、上記の組換え大腸菌の破砕液から遠心分離により得られた可溶性画分に、シアン化カリウムを２２．５ｍｇ／ｌ（ＣＮ換算で９ｍｇ／ｌ）となるように添加したサンプル（Ｎｉｔｒｉｌａｓｅ）と、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）にシアン化カリウムを２０ｍｇ／ｌ（ＣＮ換算で８ｍｇ／ｌ）となるように添加したサンプル（Ｂｌａｎｋ）を比較した（図５）。
【００８２】
「Ｂｌａｎｋ」と比較して、「Ｎｉｔｒｉｌａｓｅ」は、３時間で約１５ｍｇ／ｌ（ＣＮ換算で約６ｍｇ／ｌ）のシアン濃度が減少した。従って、上記の組換え大腸菌の破砕液中のニトリラーゼ（配列番号１のアミノ酸配列のニトリラーゼ）が、シアン分解活性を有することが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
上記実施例において、配列番号１のアミノ酸配列のニトリラーゼをコードする遺伝子を保有するバチルス属細菌と、当該ニトリラーゼをコードする遺伝子を組み込んだ組換え大腸菌の培養物が、非常に優れたシアン分解能を発揮することが示された。
【００８４】
この事実により、上記のニトリラーゼをコードする遺伝子が組み込まれた微生物が優れたシアン分解能を発揮することが期待される。当該ニトリラーゼ遺伝子（配列番号２）を保有するバチルス属細菌は、その典型例である。
【００８５】
また、当該ニトリラーゼ遺伝子は、微生物における優れたシアン分解活性を伴う指標としても用いられることが示され、本発明の選択方法の有用性が認められる。
さらに優れたシアン分解能を有する本発明のシアン分解微生物を含有する、本発明のシアン分解剤が提供されることで、これを、シアンに汚染された地下水や土壌等のシアン汚染物に作用させて当該汚染物を浄化する浄化方法が、主に、バイオレメディエーション技術として提供され、数多く存在するシアン分解環境の浄化に大いに貢献することが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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