(57)【要約】      （修正有）【課題】野生型ソルガム植物と比較して、除草剤、例えば、ＡＨＡＳ酵素を標的とする除草剤、特に、イミダゾリノンおよびスルホニルウレアに対する改善された耐性を示すソルガム植物の提供。【解決手段】ソルガムＡＨＡＳタンパク質ラージサブユニットの位置９３にアラニンからトレオニンへの置換を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをゲノム中に含むソルガム植物。ソルガム植物は、そのゲノム中に、ソルガムＡＨＡＳの突然変異ラージサブユニットまたは本発明のソルガムＡＨＡＳポリペプチドをコードする、１、２、３コピー以上のポリヌクレオチドを含んでもよい。この文脈において、ソルガム植物は、ＡＨＡＳ酵素活性を阻害することができる任意の除草剤に対して寛容性であってもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ソルガムＡＨＡＳタンパク質のラージサブユニットの位置９３にアラニンからトレオニ
ンへの置換を有するポリペプチドをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチドをゲ
ノム中に含むソルガム植物であって、野生型ソルガム植物と比較して１つまたは複数の除
草剤に対する耐性が増大した上記植物。
【請求項２】
前記除草剤が、イミダゾリノンおよびスルホニルウレアからなる群から選択される、請
求項１に記載のソルガム植物。
【請求項３】
前記イミダゾリノン除草剤が、イマゼタピル、イマザピル、およびイマザピックからな
る群から選択される、請求項２に記載のソルガム植物。
【請求項４】
少なくとも１つのポリヌクレオチドが、配列番号１を含む、請求項１に記載のソルガム
植物。
【請求項５】
コードされる前記ポリペプチドが配列番号２を含む、請求項１に記載のソルガム植物。
【請求項６】
ＮＣＩＭＢ４１８７０に記載のＡＨＡＳ遺伝子中に突然変異を含む、請求項１に記載の
ソルガム植物。
【請求項７】
前記ソルガム植物が、ＮＣＩＭＢ４１８７０について記載された耐性と同様なイミダゾ
リノン群の１つまたは複数の除草剤に対する増大した耐性形質を含む、請求項１に記載の
ソルガム植物。
【請求項８】
１つまたは複数の除草剤に対する耐性が増大した前記ソルガム植物が、別のソルガム植
物への遺伝子移入により耐性形質を導入するのに有用である、請求項６または７に記載の
ソルガム植物。
【請求項９】
前記植物がトランスジェニックである、請求項１に記載のソルガム植物。
【請求項１０】
前記植物が非トランスジェニックである、請求項１に記載のソルガム植物。
【請求項１１】
前記ソルガム植物が、ＮＣＩＭＢ４１８７０などの植物、ＮＣＩＭＢ４１８７０植物の
子孫、ＮＣＩＭＢ４１８７０突然変異植物およびＮＣＩＭＢ４１８７０突然変異体の子孫
からなる群から選択される、ＮＣＩＭＢ４１８７０の耐性形質を含む除草剤耐性ソルガム
植物。
【請求項１２】
前記除草剤がイミダゾリノン群に属する、請求項１１に記載のソルガム植物。
【請求項１３】
前記植物がトランスジェニックである、請求項１１に記載のソルガム植物。
【請求項１４】
前記植物が非トランスジェニックである、請求項１１に記載のソルガム植物。
【請求項１５】
ソルガムＡＨＡＳタンパク質のラージサブユニットの位置９３にアラニンからトレオニ
ンへの置換を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをゲノ
ム中に含むソルガム種子。
【請求項１６】
前記種子が野生型ソルガム植物と比較してイミダゾリノン群中の１つまたは複数の除草
剤に対する耐性が増大した植物を生成する、請求項１５に記載の種子。
【請求項１７】
前記種子が寄託された種子ＮＣＩＭＢ４１８７０に示されるＡＨＡＳ遺伝子中に突然変
異を含む、請求項１５に記載の種子。
【請求項１８】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の植物の種子。
【請求項１９】
請求項１１から１４のいずれか１項に記載の植物の種子。
【請求項２０】
ａ）ソルガム植物に由来する核酸試料を準備するステップと、
ｂ）ソルガム植物に由来する前記核酸試料中に存在するＡＨＡＳ遺伝子に対応する領域
を増幅する工程と、
ｃ）イミダゾリノン群に由来する除草剤に対する耐性を付与する突然変異である、増幅
された核酸試料中の少なくとも１個の前記突然変異の存在に基づいて除草剤耐性植物を同
定するステップと
を含む、除草剤耐性植物を同定するための方法。
【請求項２１】
前記核酸試料がＭＣＩＭＢ４１８７０に存在する突然変異などの少なくとも１個の突然
変異を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１個の突然変異がコードされたポリペプチド中にＡｌａ９３Ｔｈｒ置換
を含み、前記ポリペプチドがアセトヒドロキシ酸合成酵素活性を有する、請求項２０に記
載の方法。
【請求項２３】
前記核酸試料が配列番号１を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが配列番号２を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記植物が単子葉植物である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記植物が双子葉植物である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記植物がトランスジェニック植物である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記植物が非トランスジェニック植物である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記除草剤がイミダゾリノンおよびスルホニルウレアの群から選択される、請求項２０
に記載の方法。
【請求項３０】
イミダゾリノン群またはスルホニルウレア群中の、有効量の除草剤を雑草および作物植
物に施用するステップを含む、作物植物のごく近くにある雑草を防除する方法。
【請求項３１】
前記イミダゾリノン除草剤が、イマゼタピル、イマザピック、およびイマザピルからな
る群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記作物植物が、
ａ）ソルガムＡＨＡＳタンパク質の位置９３にアラニンからトレオニンへの置換を有す
るポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをそのゲノム中に含むソ
ルガム植物であって、野生型ソルガム植物と比較してイミダゾリノンまたはスルホニルウ
レアの群中の１つまたは複数の除草剤に対する耐性が増大した前記植物、
ｂ）ＮＣＩＭＢ４１８７０中などのＡＨＡＳ遺伝子中に突然変異を含むソルガム植物、
ｃ）ＮＣＩＭＢ４１８７０により示される耐性などの、イミダゾリノンまたはスルホニ
ルウレアの群中の１つまたは複数の除草剤に対する増大した耐性形質を含むソルガム植物
、
ｄ）ソルガム植物ａ）〜ｃ）の植物、子孫、誘導体または突然変異体
からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号２に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有し、除草剤
耐性ＡＨＡＳ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｄ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも８５％の同一性を有し、
ＡＨＡＳのラージサブユニットを含み、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示すポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列、
ｅ）ヌクレオチド配列ａ）〜（ｄ）の１つと完全に相補的なヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項３４】
前記ポリヌクレオチドがＡＨＡＳのラージサブユニット中にＡｌａ９３Ｔｈｒ置換を含
むポリペプチドをコードする、請求項３３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３５】
発現カセットに作動可能に連結された請求項３３に記載のヌクレオチド配列を含む、発
現カセット。
【請求項３６】
前記ポリヌクレオチドの発現を誘導する少なくとも１個のプロモーターをさらに含む、
請求項３５に記載の発現カセット。
【請求項３７】
前記プロモーターが植物、細菌、真菌、動物細胞および原生動物中での発現のためのプ
ロモーターを含む群から選択される、請求項３６に記載の発現カセット。
【請求項３８】
請求項３５に記載の発現カセットで形質転換された細胞。
【請求項３９】
前記細胞が細菌、真菌、酵母、植物細胞、および動物細胞からなる群から選択される、
請求項３８に記載の細胞。
【請求項４０】
ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号２に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有し、除草剤
耐性ＡＨＡＳ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｄ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも８５％の同一性を有し、
ＡＨＡＳのラージサブユニットを含み、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示すポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列、
ｅ）ヌクレオチド配列ａ）〜（ｄ）の１つと完全に相補的なヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを有し、選択可能な
遺伝子、前記ヌクレオチド配列の発現を誘導することができるヌクレオチド配列に作動可
能に連結された少なくとも１個のプロモーターをさらに含む、形質転換ベクター。
【請求項４１】
細菌、真菌、酵母、植物細胞および動物細胞を含む群から選択される細胞を形質転換す
るための、請求項４０に記載のベクターの使用。
【請求項４２】
ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号２に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有し、除草剤
耐性ＡＨＡＳ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｄ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも８５％の同一性を有し、
ＡＨＡＳのラージサブユニットを含み、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示すポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列、
ｅ）ヌクレオチド配列ａ）〜（ｄ）の１つと完全に相補的なヌクレオチド配列
を含む群から選択されるポリヌクレオチドに作動可能に連結された、植物のゲノム中に組
込まれた少なくとも１個のプロモーターを含み、ベクターが選択可能な遺伝子、前記ヌク
レオチド配列の発現を誘導することができるヌクレオチド配列に作動可能に連結された少
なくとも１個のプロモーターをさらに含む、形質転換された植物。
【請求項４３】
前記プロモーターが組織特異的プロモーターおよび葉緑体特異的プロモーターからなる
群から選択される、請求項４２に記載の植物。
【請求項４４】
前記植物が単子葉植物である、請求項４２に記載の植物。
【請求項４５】
前記植物が双子葉植物である、請求項４２に記載の植物。
【請求項４６】
前記植物がソルガム、トウモロコシ、コメ、およびコムギからなる群から選択される、
請求項４４に記載の植物。
【請求項４７】
前記植物がダイズおよびアブラナからなる群から選択される、請求項４５に記載の植物
。
【請求項４８】
前記植物が非形質転換植物と比較して増大した除草剤耐性を含む、請求項４２に記載の
植物。
【請求項４９】
前記除草剤がイミダゾリノンおよびスルホニルウレアからなる群から選択される、請求
項４２に記載の植物。
【請求項５０】
ｉ）ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号２に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有し、除草
剤耐性ＡＨＡＳ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｄ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも８５％の同一性を有し
、ＡＨＡＳのラージサブユニットを含み、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示すポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列、および
ｅ）ヌクレオチド配列ａ）〜ｄ）の１つと完全に相補的なヌクレオチド配列
の群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む発現カセットまた
はベクターであって、前記発現カセットが前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結された
少なくとも１個のプロモーターをさらに含み、前記プロモーターが前記ポリヌクレオチド
の発現を誘導する、上記発現カセットまたはベクターを用いて植物細胞を形質転換するス
テップと、
ｉｉ）前記植物細胞を再生して、除草剤耐性植物を取得するステップと
を含む、除草剤耐性植物または除草剤耐性が増大した植物を取得するための方法。
【請求項５１】
前記プロモーターが植物組織特異的プロモーターを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記プロモーターが葉緑体特異的プロモーターを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記除草剤がイミダゾリノンおよびスルホニルウレアからなる群から選択される、請求
項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記イミダゾリノン除草剤がイマゼタピル、イマザピック、およびイマザピルを含む群
から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記植物が単子葉植物である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記植物が双子葉植物である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
前記植物がソルガム、トウモロコシ、コメおよびコムギからなる群から選択される、請
求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記植物がダイズおよびアブラナからなる群から選択される、請求項５６に記載の方法
。
【請求項５９】
前記植物が非形質転換植物と比較して増大した除草剤耐性を含む、請求項５０に記載の
方法。
【請求項６０】
前記植物がＡＨＡＳのラージサブユニットを含み、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示す、請
求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ソルガム（ソルガム種）は、約２０種の草を含む植物の属である。それは東アフリカの
熱帯および亜熱帯地域を原産とし、ヒトおよび動物による消費のための穀物用に、大陸の
どこででも育てられており、飼料として、およびアルコール飲料の製造のためにも用いら
れている。それはグルテンを含まないため、ソルガムはセリアック病に罹患する個体にと
って好適である。
【０００２】
ソルガムは、多くの穀類よりも干ばつおよび過剰の土壌水分含量に対して寛容性である
。それは様々な土壌および気象条件下で適切に生長することができる。同様に、それは灌
漑に対して好ましく応答し、その生活環の間に必要とするのは最小で２５０ｍｍであり、
最適な灌漑範囲は４００〜５５０ｍｍである。
【０００３】
迅速で均一な発芽およびそれにより良好な作物の移植を達成するためには、土壌は植付
けの時点で適切な水分含量を有さなければならない。水の最大の要求は発芽後３０日で開
始し、穀物が満たされるまで続き、最も重要な段階は円錐花序形成および開花のものであ
り、それはこの時点での水の欠乏は収量の低下をもたらすからである。
【０００４】
さらに、ソルガムは、干ばつ期には休眠したままになる能力を有し、好ましい期間の下
で生長を再開するが、これらのストレス状況は性能に影響し得る。
【０００５】
ソルガムは、正常な発達のために高い温度を必要とし、結果として、他の作物よりも低
温に対する感受性が高い。発芽には少なくとも１８℃の土壌温度が必要である；植物の実
際の活発な生長は、１５℃の温度に達するまで達成されず、最適温度は約３２℃である。
【０００６】
アセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ）は、分枝アミノ酸であるバリン、ロイシンお
よびイソロイシンの合成を触媒する第１の酵素である。ＡＨＡＳは、スルホニルウレア、
イミダゾリノン、トリアゾロピリミジンおよびピリミジルオキシ安息香酸などのいくつか
の除草剤の標的である。前者２つの除草剤ファミリーは、その低い毒性および雑草に対す
る高い有効性のため現代の農業において広く用いられている。
【０００７】
イミダゾリノンファミリーの除草剤は、イマゼタピル、イマザキン、およびイマザピル
を含む。
【０００８】
市場に存在するいくつかのスルホニルウレアは、メツルフロン−メチル、クロロスルフ
ロン、ニコスルフロン、シノスルフロン、イミダスルフロン、ハロスルフロン、リムスル
フロン、トリスルフロン−メチル、およびトリベヌロン−メチルである。
【０００９】
しかしながら、イミダゾリノンおよび／またはスルホニルウレアファミリーの除草剤に
耐性である植物；例えば、Ｚｅａ  ｍａｙｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎ
ａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔ
ａｂａｃｕｍ、およびＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａなどの種がある（Ｓｅｂａｓｔｉａｎら
（１９８９）Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．，２９：１４０３〜１４０８頁；Ｓｗａｎｓｏｎら、１
９８９  Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７８：５２５〜５３０頁；Ｎｅｗｈｏｕｓ
ｅら（１９９１）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，８３：６５〜７０頁；Ｓａｔｈ
ａｓｉｖａｎら（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９７：１０４４〜１０５０
頁；Ｍｏｕｒａｎｄら（１９９３）Ｊ．Ｈｅｒｅｄｉｔｙ  ８４：９１〜９６頁；米国特
許第５，５４５，８２２号）。イミダゾリノン型の除草剤に対する耐性を付与するＡＨＡ
Ｓのラージサブユニットにおける点突然変異がヒマワリにおいて記載されている（ＷＯ２
００７／０１１８９２０）。
【００１０】
イミダゾリノンまたはスルホニルウレア型の除草剤に対して耐性である植物も検出され
ている。これらの植物は、自然に耐性を獲得し、作物育種のために用いられており、除草
剤耐性品種をもたらしている。耐性植物の分析から、アミノ酸ＡｌａのＶａｌによる置換
をもたらすヒマワリのＡＨＡＳタンパク質において点突然変異が決定された（Ｗｈｉｔｅ
ら（２００３）Ｗｅｅｄ  Ｓｃｉ．，５１：８４５〜８５３頁）。
【００１１】
さらに、米国特許第４，７６１，３７３号；第５，３３１，１０７号；第５，３０４，
７３２号；第６，２１１，４３８号；第６，２１１，４３９号；および第６，２２２，１
００号は、イミダゾリノン除草剤に対して耐性である植物を開示している。これらの植物
は全て、一般に、植物における除草剤耐性を惹起するための変化したＡＨＡＳ遺伝子の使
用を記載し、ある特定のイミダゾリノン耐性トウモロコシ系を特に開示している。米国特
許第５，７３１，１８０号および米国特許第５，７６７，３６１号は、イミダゾリノン特
異的耐性をもたらす野生型単子葉植物ＡＨＡＳアミノ酸配列における単一のアミノ酸置換
を有する単離された遺伝子を考察している。
【００１２】
特許文献ＷＯ２００６／００７３７３およびＷＯ２００６／０６０６３４は、コムギ植
物においてイミダゾリノン型の除草剤に対して耐性を付与する突然変異を開示している。
【００１３】
刊行物「タバコアセトヒドロキシ酸合成酵素における除草剤耐性を付与するアミノ酸」
は、除草剤耐性を付与するＡＨＡＳにおける様々な点突然変異を記載している（ＧＭ  Ｃ
ｒｏｐｓ  １：２、６２〜６７頁；２０１０年２月１６日）。
【００１４】
特許文献ＵＳ２０１００１１５６６３は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子を変
化させることにより達成される除草剤耐性ソルガム植物に関する。また、除草剤ジニトロ
アニリンに対して耐性であるソルガム植物（ＵＳ２０１００２０５６８６）および除草剤
アセト乳酸合成酵素に対して耐性であるソルガム植物（ＷＯ２００８／０７３８００）も
開示されている。
【発明の概要】
【００１５】
本発明のソルガム植物は、野生型ソルガム植物と比較して、除草剤、例えば、ＡＨＡＳ
酵素を標的とする除草剤、特に、イミダゾリノンおよびスルホニルウレアに対する改善さ
れた耐性を示す。特に、本発明のソルガム植物（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）は、
そのゲノム中に、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。前記ポリヌクレオチドは、
ソルガムＡＨＡＳのラージサブユニットの位置９３または等価な位置にアラニンからトレ
オニンへの置換を有するＡＨＡＳのラージサブユニットをコードし、前記植物は野生型ソ
ルガム植物と比較して、イミダゾリノン群から選択される除草剤などの１つまたは複数の
除草剤に対する耐性が増大している。ソルガム植物は、そのゲノム中に、ソルガムＡＨＡ
Ｓの突然変異ラージサブユニットまたは本発明のソルガムＡＨＡＳポリペプチドをコード
する、１、２、３コピー以上のポリヌクレオチドを含んでもよい。この文脈において、ソ
ルガム植物は、ＡＨＡＳ酵素活性を阻害することができる任意の除草剤に対して寛容性で
あってもよい、すなわち、ソルガム植物は、限定されるものではないが、イマゼタピル、
イマザピル、およびイマザピックなどのイミダゾリノン型の除草剤または限定されるもの
ではないが、クロロスルフロン、メツルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリム
ロンエチル、チオフェンスルフロンメチル、トリベヌロンメチル、ベンスルフロンメチル
、ニコスルフロン、エタメツルフロンメチル、リムスルフロン、トリフルスルフロンメチ
ル、トリアスルフロン、プリミスルフロンメチル、シノスルフロン、アミドスルフロン、
フルザスルフロン、イマゾスルフロン、ピラゾスルフロンエチル、およびハロスルフロン
などのスルホニルウレア群の除草剤に対して寛容性であってもよい。
【００１６】
好ましい実施形態においては、イミダゾリノンまたはスルホニルウレアの群に属する除
草剤に対して耐性である本発明のソルガム植物は、ＶＴ１１−１１３３１−ＢＫと命名さ
れたソルガム系であり、その種子はブダペスト条約の下で２０１１年１０月１２日に受託
番号ＮＣＩＭＢ４１８７０の下でＮＣＩＭＢコレクションに寄託されたものである。突然
変異ＶＴ１１−１１３３１−ＢＫ植物、その部分およびその種子は、そのゲノム中に、配
列番号２に記載の配列を有するＡＨＡＳラージサブユニットのポリペプチドをコードする
配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む突然変異ＡＨＡＳ
遺伝子を含む。ＡＨＡＳのラージサブユニットに対応する配列番号２のアミノ酸配列は、
ソルガムＡＨＡＳのラージサブユニットの野生型アミノ酸配列（配列番号３）と１個のア
ミノ酸が異なり、前記相違はソルガムＡＨＡＳのラージサブユニットの位置９３、または
等価な位置にアラニンからトレオニンへの置換を含む。
【００１７】
本発明の除草剤寛容性ソルガム植物遺伝資源は、他のソルガム品種への遺伝子移入によ
る寛容性形質の導入にとって有用である。本発明のソルガム植物は、ＡＨＡＳラージサブ
ユニットをコードし、ソルガムＡＨＡＳの前記ラージサブユニットの位置９３または等価
な位置にアラニンからトレオニンへの置換を有するポリヌクレオチドを含む植物の子孫お
よび種子を含み、前記植物は野生型ソルガム植物と比較して、１つまたは複数のイミダゾ
リノンおよび／またはスルホニルウレア除草剤に対する耐性の増大を示す。
【００１８】
好ましい実施形態においては、除草剤耐性ソルガム植物は、ＮＣＩＭＢ４１８７０の耐
性形質を含み、ＮＣＩＭＢ４１８７０に記載の植物、ＮＣＩＭＢ４１８７０植物の子孫、
ＮＣＩＭＢ４１８７０植物の突然変異体、およびＮＣＩＭＢ４１８７０突然変異体の子孫
であってもよい。前記植物は、トランスジェニックまたは非トランスジェニックであって
もよく、農業使用、または観葉植物などの他の使用にとって好適な任意の植物種に属して
もよい。
【００１９】
ソルガムＡＨＡＳタンパク質ラージサブユニットの位置９３にアラニンからトレオニン
への置換を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをそのゲ
ノム中に含むソルガム種子がさらに提供される。この種子は、野生型ソルガム植物と比較
して、イミダゾリノン群の１つまたは複数の除草剤に対する耐性が増大した植物を発芽、
生成する。好ましい実施形態においては、前記種子は、ＮＣＩＭＢ４１８７０として寄託
された種子である。
【００２０】
イミダゾリノンまたはスルホニルウレアの群中の除草剤に対して耐性である植物を同定
するための方法であって、
ａ）ソルガム植物に由来する核酸試料を供給するステップと、
ｂ）前記核酸試料中に存在するソルガム植物からＡＨＡＳ遺伝子に対応する領域を増幅
するステップと、
ｃ）イミダゾリノン除草剤に対する耐性を付与する前記増幅された核酸試料中の少なく
とも１つの突然変異の存在に基づいて、イミダゾリノン群の除草剤に対して耐性であるソ
ルガム植物を同定するステップと
を含む、上記方法がさらに提供される。好ましい実施形態においては、ＮＣＩＭＢ４１８
７０中の突然変異などのＡＨＡＳ中に少なくとも１つの突然変異を含む植物が選択され、
ＡＨＡＳ遺伝子中の前記少なくとも１つの突然変異は野生型ソルガムＡＨＡＳアミノ酸配
列と比較して、Ａｌａ９３Ｔｈｒ置換を含むＡＨＡＳのポリペプチドまたはラージサブユ
ニットをコードする。前記植物は単子葉植物または双子葉植物であってもよい。好ましく
は、前記植物は、ソルガム、コメ、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、オートムギ、オオム
ギ、ライムギ、アマ、ワタ、サトウキビ、ヒマワリなどの農業の対象となる植物である。
同定の方法は、特異的点突然変異ＳＮＰマーカーを用いてもよい。
【００２１】
本発明は、農業用植物、例えば、ソルガム植物の近くにある雑草を防除するための方法
であって、前記ソルガム植物がイミダゾリノンおよび／またはスルホニルウレアの群中の
由来する除草剤などの除草剤に対して耐性である、前記方法を提供する。好ましい実施形
態においては、除草剤はイミダゾリノンである。イミダゾリノン除草剤は、イマゼタピル
、イマザピック、またはイマザピルであってもよい。前記植物は、ＮＣＩＭＢ４１８７０
などの耐性形質を示してもよく、その誘導体、突然変異体、または子孫植物であってもよ
い。
【００２２】
本発明は、限定されるものではないが、以下のヌクレオチド配列：
配列番号１に記載の配列、
配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
配列番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチ
ドであって、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示す前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列、
−配列番号１に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも８５％の同一性を有するヌク
レオチド配列であって、ＡＨＡＳのラージサブユニットを含むポリペプチドをコードし、
除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示す前記ヌクレオチド配列、
またはその相補配列
のうちの１つまたは複数を含むポリペプチドを提供する。好ましくは、前記ポリヌクレオ
チドは、Ａｌａ９３Ｔｈｒ置換を含むＡＨＡＳのラージユニットのポリペプチドをコード
する。
【００２３】
本発明はまた、以下のヌクレオチド配列：配列番号１、配列番号２に記載のポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列、配列番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも９５％
の配列同一性を有するポリペプチドであって、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示す前記ポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列；配列番号１に記載のヌクレオチド配列に対する少
なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列であって、ＡＨＡＳのラージサブユニ
ットを含むポリペプチドをコードし、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示す前記ヌクレオチド配
列、またはその相補配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む発現カセット
も提供する。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、Ａｌａ９３Ｔｈｒ置換を含むＡＨＡ
Ｓのラージユニットのポリペプチドをコードし；前記配列は発現を行うためのヌクレオチ
ド配列、例えば、１つまたは複数のプロモーター、エンハンサーまたは他の公知の調節配
列に作動可能に連結される。プロモーターは、植物、植物組織、葉緑体、動物、細菌、真
菌または酵母細胞中での発現のためのプロモーターであってもよい。
【００２４】
本発明は、以下のヌクレオチド配列：ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、ｂ）
配列番号２に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ｃ）配列番号２のアミ
ノ酸配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドであって、除草剤
耐性ＡＨＡＳ活性を示す前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ｄ）配列番号
１に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配
列であって、ＡＨＡＳのラージサブユニットを含むポリペプチドをコードし、除草剤耐性
ＡＨＡＳ活性を示す前記ヌクレオチド配列のうちの１つを有する少なくとも１つのポリヌ
クレオチドを含み、前記ヌクレオチド配列の発現を誘導する作動可能に連結された配列お
よび選択マーカーをさらに含む形質転換ベクターを提供する。ベクターを、それぞれ特定
の場合のために適合化される、細菌、真菌、酵母、植物細胞または動物細胞を形質転換す
るために用いることができる。
【００２５】
本発明は、そのゲノム中に組込まれた、ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列；ｂ
）配列番号２に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ｃ）配列番号２のア
ミノ酸配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドであって、除草
剤耐性ＡＨＡＳ活性を示す前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ｄ）配列番
号１に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド
配列であって、ＡＨＡＳのラージサブユニットを含むポリペプチドをコードし、除草剤耐
性ＡＨＡＳ活性を示す前記ヌクレオチド配列；ｅ）ａ）から（ｄ）のヌクレオチド配列の
１つと完全に相補的なヌクレオチド配列から選択されるポリヌクレオチドに作動可能に連
結された少なくとも１つのプロモーターを含み、ベクターが選択可能な遺伝子と、前記ヌ
クレオチド配列の発現を誘導するヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも１
つのプロモーターとをさらに含む、形質転換された植物を提供する。プロモーターは、植
物、例えば、植物組織または葉緑体においてポリペプチド発現を誘導するプロモーターで
ある。形質転換植物は、単子葉植物、例えば、ソルガム、トウモロコシ、コメ、もしくは
コムギ；または双子葉植物、例えば、ヒマワリ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、タバコもしく
はアブラナであってもよい。形質転換植物は、等量の前記除草剤が両方に対して施用され
た場合に同じ野生型植物と比較して除草剤（イミダゾリノンおよびスルホニルウレア）に
対して耐性である。
【００２６】
本発明はまた、除草剤耐性植物または除草剤に対する耐性が増大した植物を取得するた
めの方法であって、ｉ）植物細胞を、ポリヌクレオチドを含む発現カセットで形質転換す
るステップ、ｉｉ）植物細胞を再生させて、除草剤耐性植物を取得するステップを含み、
前記ポリヌクレオチドが、以下のヌクレオチド配列：ａ）配列番号１に記載のヌクレオチ
ド配列、ｂ）配列番号２に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ｃ）配列
番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドであ
って、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示す前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｄ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも８５％の同一性を有するヌ
クレオチド配列であって、ＡＨＡＳのラージサブユニットを含むポリペプチドをコードし
、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示す前記ヌクレオチド配列およびｅ）ａ）から（ｄ）のヌク
レオチド配列の１つと完全に相補的なヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを有する
、前記方法も提供する。ＤＮＡ発現カセットは、植物、例えば、植物組織または葉緑体に
おける前記ポリペプチドの発現を誘導するための少なくとも１つのプロモーターを含む。
形質転換植物は、単子葉植物、例えば、ソルガム、トウモロコシ、コメ、もしくはコムギ
；または双子葉植物、例えば、ヒマワリ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、タバコ、ダイズもし
くはアブラナであってもよい。形質転換植物は、等量の前記除草剤が両方に対して施用さ
れた場合に野生型植物と比較して除草剤（イミダゾリノンおよびスルホニルウレア）に対
して耐性である。前記植物は、除草剤に対して耐性であるＡＨＡＳのラージサブユニット
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】イミダゾリノン耐性突然変異ソルガム系（ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ）および元の自家受粉ソルガム系８０２３７または野生型系の用量応答曲線を示す図である。アッセイされた除草剤は、０（対照）、１Ｘ、２Ｘ、３Ｘおよび４Ｘの施用率のイマゼタピル、イマザピルおよびイマザピックであった。除草効果を、未処理の対照と比較した空中組織の乾燥物量（Dry matter ＤＭ）のパーセンテージとして測定した；それぞれの値は３回のアッセイの平均である。
【図１Ｂ】イミダゾリノン耐性突然変異ソルガム系（ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ）および元の自家受粉ソルガム系８０２３７または野生型系の用量応答曲線を示す図である。アッセイされた除草剤は、０（対照）、１Ｘ、２Ｘ、３Ｘおよび４Ｘの施用率のイマゼタピル、イマザピルおよびイマザピックであった。除草効果を、未処理の対照と比較した空中組織の乾燥物量（Dry matter ＤＭ）のパーセンテージとして測定した；それぞれの値は３回のアッセイの平均である。
【図１Ｃ】イミダゾリノン耐性突然変異ソルガム系（ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ）および元の自家受粉ソルガム系８０２３７または野生型系の用量応答曲線を示す図である。アッセイされた除草剤は、０（対照）、１Ｘ、２Ｘ、３Ｘおよび４Ｘの施用率のイマゼタピル、イマザピルおよびイマザピックであった。除草効果を、未処理の対照と比較した空中組織の乾燥物量（Dry matter ＤＭ）のパーセンテージとして測定した；それぞれの値は３回のアッセイの平均である。
【図２Ａ】突然変異ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ  ＡＨＡＳヌクレオチド配列と、元のエンドガミックソルガム系８０２３７または野生型系のものとのアラインメントを示す図である。ヌクレオチドのＧからＡの置換は、両配列を識別する位置＋２７７に示される。重複するアンプリコン配列を増幅するのに用いられる異なるプライマーに下線を付ける。
【図２Ｂ】突然変異ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ  ＡＨＡＳヌクレオチド配列と、元のエンドガミックソルガム系８０２３７または野生型系のものとのアラインメントを示す図である。ヌクレオチドのＧからＡの置換は、両配列を識別する位置＋２７７に示される。重複するアンプリコン配列を増幅するのに用いられる異なるプライマーに下線を付ける。
【図３】ソルガムＡＨＡＳ遺伝子のコドン９３のＳＮＰ  Ｇ／Ａに関する遺伝子型決定アッセイを示す図である。特異的ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳマーカーを、ＡＤＶ−ＩＭＩ−ＲｘＦ２  ９０５２３に由来する１７７個のＦ２子孫植物の遺伝子型において分析した。３つのクラスターが明確に定義され、対立遺伝子突然変異体（Ａ／Ａ）のホモ接合植物に対応するドット（黒い丸）、ヘテロ接合植物（Ａ／Ｇ）に対応する三角（黒い三角形）および野生型対立遺伝子（Ｇ／Ｇ）のホモ接合植物の菱形（黒い菱形）として同定された。
【図４】ソルガムＡＨＡＳ遺伝子（受託番号ＧＭ６６３３６３．１）のヌクレオチド配列と、Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅヌクレオチド配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ．ｎｅｔ／ｓｅａｒｃｈ．ｐｈｐ）に寄託されたソルガムゲノム配列（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）とをマッチングさせることにより得られた結果を示す図である。このマッチングは、ＡＨＡＳ  ＧＭ６６３３６３．１配列が、ソルガムゲノムの染色体４に位置するＡＨＡＳ配列に対する高度に有意な相同性（値ｅ＝０）を示すことを示しており、これは対象の遺伝子がこの連結基に存在することを示す。
【図５】Ｓ．ｂｉｃｏｌｏｒ染色体４の連結マップを示す図である。隣接するマーカー間の距離はセンチモルガン（ｃＭ）で与えられる。ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳおよび１７７個のＦ２植物の遺伝子型の染色体４中の７つのＳＳＲを参照するイマゼタピルに対する耐性の染色体位置が示される。このマップは、ＬＯＤ＝３のデフォルトパラメータおよび５０ｃＭの最大Ｋｏｓａｍｂｉ距離を用いる、ＪｏｉｎＭａｐソフトウェアを用いて構築されたものである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
除草剤寛容性植物を得るために、エンドガミックソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏ
ｌｏｒ）系８０２３７植物を、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）の水性溶液で処理した
。処理した種子を植え、開放授粉のために放置した。２７３個のＭ１植物を選択し、それ
ぞれの植物の２個の種子を苗床に植えることによって、合計５４６個のＭ２植物を得た。
それぞれの対の１個の植物に由来する花粉を採取し、その対の他の植物を授粉させるため
に用いた。２７３個の授粉したＭ２植物のそれぞれから得られたＭ３種子を収穫した。合
計２７３個の畝間にＭ３子孫を植えた。それぞれのＭ３畝間からの５０個の植物に、１０
０ｍｌ  Ｌ  ａ．ｉ．／ｈａのイマゼタピルを噴霧した。畝間からの６８個の植物は、除
草剤による処理後に正常な生長および症状の非存在を示し、除草剤に対して耐性であると
考えられ、ＶＴ０９−９７５４と同定された。畝間からの耐性植物の系譜を同定し、それ
らを８０２３７ＥＭＳ２−１９２と命名した（以後、ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒと呼ぶ）。元の
ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体から選択された除草剤寛容性Ｍ７突然変異体植物および種
子（ＶＴ１１−１１３３１−ＢＫと命名）を取得し、ブダペスト条約の条項の下で、２０
１１年１０月１２日に受託番号ＮＣＩＭＢ４１８７０としてＮＣＩＭＢコレクションに寄
託した。
【００２９】
本発明は、ＥＭＳで突然変異させたソルガム植物に限定されない。他の突然変異方法、
例えば、放射線照射および化学的変異原などの方法により得られたソルガム植物も本発明
の範囲内にある。除草剤耐性突然変異植物を、除草剤と共に培養された細胞に対する選択
圧および除草剤耐性植物を生成するための耐性細胞の選択のプロセスを用いて取得するこ
ともできる。突然変異および育種方法の詳細を、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃｕｌ
ｔｉｖａｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」Ｆｅｈｒ、１９９３、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（引用することにより本明細書の一部をなすものとす
る）に見出すことができる。
【００３０】
続いて、イミダゾリノン耐性植物突然変異体ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ（元の突然変異）に対
する除草剤噴霧の効果を、エンドガミックソルガム系８０２３７（Ａｄｖａｎｔａ所有エ
リート系）の応答と比較した。その目的のために、植物を、畑上で、イミダゾリノンファ
ミリーに属する３つの除草剤：イマゼタピル、イマザピル、およびイマザピックで処理し
た。４つの異なる施用率をアッセイした：それぞれの除草剤について１Ｘ、２Ｘ、３Ｘ、
および４Ｘ。それぞれの除草剤に関する推奨される畑施用率（１Ｘ）を、表１に示す。
【００３１】
【表１】
2019141045.tif 000002
【００３２】
噴霧の１０日後、全ての植物を、空中組織における乾燥物量（ＤＭ）についてアッセイ
した。その結果を図１に示す。
【００３３】
本発明のＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体の応答を、エンドガミック系８０２３７のもの
と比較した。表２は、未処理対照と比較した乾燥物量のパーセンテージ（ＤＭ％対照）と
して表した、異なる施用率のイマゼタピル、イマザピル、およびイマザピックの効果を示
す。開示された値は、３回の実験の平均である。
【００３４】
【表２】
2019141045.tif 000003
【００３５】
これらの結果は、本発明のＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体が４Ｘの施用率でも３つの試
験したイミダゾリノン群の除草剤に対して耐性であることを示す。逆に、元のエンドガミ
ック系８０２３７は、推奨される施用率（１Ｘ）が適用される場合でも、全ての除草剤に
対して明確に感受性である。
【００３６】
見られるように、本発明の除草剤耐性ソルガム植物は、イマゼタピル、イマザピック、
またはイマザピルなどのイミダゾリノン群の除草剤に対して耐性である。
【００３７】
イミダゾリノン耐性ソルガム植物に、公知のイミダゾリノン除草剤群のいずれかの使用
の推奨量の４倍である量を噴霧することができる。耐性植物は、例えば、ＮＣＩＭＢ４１
８７０種子に由来する植物において観察されるような耐性形質を有してもよく、またはそ
れは、それから誘導された植物、子孫、もしくはそのゲノム中に、ソルガムＡＨＡＳタン
パク質の位置９３または等価な位置にアラニンからトレオニンへの置換を有するポリペプ
チドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、野生型ソルガム植物と比較
してイミダゾリノン群に由来する１つまたは複数の除草剤に対する耐性が増大した他の植
物であってもよい。
【００３８】
さらに、当業者であれば、そのようなアミノ酸位置が、アミノ酸が付加されるか、また
は例えば、アミノ酸配列のＮ末端から除去されるかどうかに応じて変化してもよいことを
認識するであろう。「等価な位置」とは、例示されたアミノ酸位置と同じ保存領域内にあ
る位置を意味することが意図される。
【００３９】
本発明において、除草剤に対する用語「寛容性」および除草剤に対する「耐性」は、同
じ意味およびイミダゾリノンまたはスルホニルウレアなどの除草剤に関連して用いられる
場合、等価な範囲を有する。
【００４０】
本発明は、有効量の除草剤に対して耐性を示す植物、植物細胞、植物組織を提供する。
「有効量」とは、野生型植物、植物細胞または組織の生長を阻害することができるが、耐
性植物、植物細胞または植物組織に対する重篤な効果をもたらさない除草剤の量を意味す
る。除草剤の有効量は、雑草を排除するための推奨量である。野生型植物、細胞または組
織は、例えば、イミダゾリノンまたはスルホニルウレアの群に属する除草剤の除草剤耐性
形質を示さないものである。用語「植物」は、任意の段階の植物、または植物部分を包含
し、前記植物部分は知識を有する植物学者には周知の種子、葉、花、茎、組織または器官
であってもよい。
【００４１】
突然変異を検出するために、前記ＡＨＡＳポリペプチドまたはラージサブユニットが除
草剤耐性である、アセトヒドロキシ酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする本
発明の突然変異ソルガムＡＨＡＳ遺伝子を配列決定した。
【００４２】
突然変異植物に由来するＡＨＡＳ遺伝子ＤＮＡ配列と、野生型ソルガム植物に由来する
ＡＨＡＳ遺伝子ＤＮＡ配列との比較により、ヌクレオチド位置＋２７７のＧヌクレオチド
がＡに変化する点突然変異が同定されたが、これは本発明のＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異
体から元のソルガム８０２３７系（野生型）を識別するものである。突然変異体および野
生型系に由来するＡＨＡＳアミノ酸配列を推定した場合、ヌクレオチド置換（配列番号１
のＡＣＧによるＧＣＧ）がコドン９３で突然変異ポリペプチドをコードし、アセトヒドロ
キシ酸合成酵素活性を示し、突然変異ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ系のソルガムＡＨＡＳタンパク
質のラージサブユニットに対応するポリペプチド（配列番号２）中のアラニンからトレオ
ニン（Ａｌａ９３Ｔｈｒ）への置換をもたらすことが観察された。
【００４３】
前記ポリペプチドの位置９３または異なる種に属する別のＡＨＡＳ酵素の等価な位置に
アラニンからトレオニン（Ａｌａ９３Ｔｈｒ）への置換を有するポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを含む植物、植物部分、種子、その子孫、トランスジェニック植物な
ども本発明の範囲内にある。
【００４４】
少なくとも８５％、９５％、または９８％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまた
はポリペプチドも本発明の範囲内にある。配列同一性パーセントは、２つのアミノ酸配列
または２つのヌクレオチド配列のアラインメントにより決定される。２つの配列間のアラ
インメントのパーセンテージを、例えば、以下の式：
（同一の位置の量／重複する位置の総量）ｘ１００
を用いて算出することができる。
【００４５】
２つの配列間のアラインメントのパーセンテージは、様々な数学アルゴリズム、例えば
、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３頁のＮＢＬＡ
ＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに含まれるアルゴリズムを用いて決定される。ＢＬＡ
ＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを用いる場合、
対応するプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメー
タを用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを
参照されたい。配列の比較のために用いられる数学アルゴリズムの別の好ましい非限定例
は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１〜１７頁のアル
ゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパ
ッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組込まれている。ア
ミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを用いる場合、ＰＡＭ１２０ウェイト
残基テーブル（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナル
ティ、および４のギャップペナルティを用いることができる。また、アラインメントを手
動による検査により実施することもできる。
【００４６】
本発明は、除草剤耐性を付与するポリヌクレオチドおよびタンパク質を含む。除草剤耐
性ポリヌクレオチドを参照する場合、それは除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質をコードする
ポリヌクレオチドを意味すると理解される。除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質は、天然であ
っても、または突然変異体であってもよく、それらはイミダゾリノンまたはスルホニルウ
レアの群に属する除草剤に対する耐性を付与する。
【００４７】
イミダゾリノン、例えば、イマゼタピルに対する耐性の継承を、イマゼタピル感受性系
とＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体とを交配することにより生成された分離Ｆ２ソルガム集
団において評価した。かくして得られたＦ２植物に、発芽後の段階Ｖ６で３Ｘ、２０日間
の施用率でイマゼタピル（Ｐｉｖｏｔ（登録商標）、ＢＡＳＦ）を噴霧し、表現型症状を
、処理の１０日後に評価した。その結果を表３に提供する。
【００４８】
【表３】
2019141045.tif 000004
【００４９】
結果は、Ｆ２植物集団を、３つの表現型カテゴリー：損傷のない植物、萎黄病植物およ
び枯死した植物に個体をグループ化するのを可能にする表現型スコアリングによる視覚的
症状に基づいて分類することができることを示す。
【００５０】
配列決定により、本発明の除草剤寛容性ソルガム突然変異体が、アセトヒドロキシ酸合
成酵素活性を有するポリペプチドまたはＡＨＡＳタンパク質のラージサブユニット中に点
突然変異を有することが示された。配列番号１に記載のヌクレオチド配列は、ヌクレオチ
ドＧが、ヌクレオチド位置＋２７７（コドン９３に対応する）でＡに変化していることを
示し、これは本発明の誘導されたＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体から元のソルガムエンド
ガミック系８０２３７（除草剤に対して感受性である）を識別するものである。この分子
マーカーを、ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳと命名した。
【００５１】
除草剤耐性である可能性のある植物、植物部分または種子を検出するためのＳＮＰ−Ｓ
ｂＡＨＡＳマーカーの有用性を決定するために、除草剤耐性ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異
体（ＶＴ０９−９７５４−４８−６−ＢＫ選択）と、除草剤感受性エンドガミック系９０
５２３とを交配させることにより生成されたＦ２集団（本明細書ではＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ
ｘ９０５２３  Ｆ２集団と命名する）に由来する１７７個の植物を試験した。図３は、一
例として、Ｆ２集団からのいくつかの植物の対立遺伝子識別を示す。２つの試験した対照
を、予想されるクラスターにグループ化した（それぞれ、ホモ接合耐性およびホモ接合感
受性の、ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体および野生型９０５２３）。これらのデータによ
り、分子マーカーＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳが、アセトヒドロキシ酸合成酵素活性を有するポ
リペプチドまたはソルガムＡＨＡＳタンパク質のラージサブユニットをコードするポリヌ
クレオチドのヌクレオチド位置＋２７７の３つの対立遺伝子組合せを識別するのに有用で
あることが確認される。
【００５２】
当業者であれば、ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳマーカーおよびその使用の開示を考慮して、例
えば、イミダゾリノンおよび／またはスルホニルウレアの群に属する除草剤、例えば、イ
マゼタピル、イマザピックなどに対する除草剤耐性植物を同定することができる。同定方
法は、本明細書に記載の方法に加えて、任意の他の公知の方法であってもよく、例えば、
ＡＳＡ（Ｓｏｌｅｉｍａｎｉら（２００３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐ  ２
１：２８１〜２８８頁）、ＰＡＭＳＡ（Ｇａｕｄｅｔら（２００７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ
Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐ  ２５：１〜９頁）、ＳＳＣＰ（ＧｅｒｍａｎｏおよびＫｌｅｉｎ（
１９９９）Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  ９９：３７〜４９頁）またはＴａｑＭａ
ｎ（登録商標）（Ｊｏｎｅｓら（２００８）Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ  ６４：１２〜１５頁）を参照されたい。
【００５３】
耐性表現型と突然変異対立遺伝子数との相関を、ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳマーカーを用い
て分析した。この目的のために、Ｆ２子孫（ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒｘ９０５２３）に由来す
る個々の植物の萎黄病および枯死表現型を、イマゼタピルを噴霧した後に試験した。同時
に、ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳマーカーの遺伝子型を試験した。その結果を表４に示す。分子
マーカーＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳと、イマゼタピルに対する耐性との相関（表現型の評定と
して測定）を、カイ二乗独立検定を用いて決定した。この試験により、表現型および遺伝
子型共分離に従う、ＡＨＡＳ遺伝子中の誘導された突然変異（特異的ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡ
Ｓマーカーを用いて遺伝子型決定された）と、イマゼタピルに対する耐性との高度に有意
な相関を示す確率ｐ＝１．９４８ｅ−４６が得られた。
【００５４】
【表４】
2019141045.tif 000005
【００５５】
さらに、除草剤耐性および特異的ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳマーカーの遺伝子マッピングを
実行した。ＧｅｎＢａｎｋ（受託番号ＧＭ６６３３６３．１、配列番号４）に開示された
ソルガムＡＨＡＳ配列に基づいて、ＢＬＡＳＴ分析を実行して、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃ
ｏｌｏｒのＤＮＡ配列と、Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐ
ｈｙｔｏｚｏｍｅ．ｎｅｔ／ｓｅａｒｃｈ．ｐｈｐ）とを一致させた。図４に示される結
果は、イミダゾリノン群に属する除草剤に対する耐性と関連するＡＨＡＳ配列がＳｏｒｇ
ｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒゲノムの染色体４中に位置することを示している。この情報に基
づくフィンガープリンティング（遺伝子型決定）手順を、様々なＳＳＲ型ＤＮＡ分子マー
カーを用いて本発明の突然変異ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ系およびエンドガミック９０２５３系
について実行した。染色体４に位置する７個の多型ＳＳＲを、遺伝子型決定のために選択
した（Ｍａｃｅ、ＥＳら、Ａ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｐ  ｏｆ  ｓ
ｏｒｇｈｕｍ  ｔｈａｔ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎ
ｔ  ｍａｐｓ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｒｒ
ａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＤＡｒＴ）  ｍａｒｋｅｒｓ、ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、２００９、９：１３頁；Ｓｒｉｎｉｖａｓ、Ｇら、Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ
ａｎｄ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆ
ｒｏｍ  ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ  ｄｒｏｕｇｈｔ  ｓｔｒｅｓｓ  ＥＳＴｓ  ｉｎ  Ｓｏ
ｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ（Ｌ．）、Ｍｏｅｎｃｈ．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅ
ｔ．２００９、１１８：７０３〜７１７頁；Ｒａｍｕ、Ｐら、Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ｍａ
ｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｍａｒｋｅｒｓ  ａｖａ
ｉｌａｂｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｕｂｌｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎ
ｔ  ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ、Ｍｏｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ２０１０、２６：
４０９〜４１８頁；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｂｋ．ａｒｓ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ｐｓｇ
ｄ／ｓｏｒｇｈｕｍ／２００９ＳｏｒｇｈｕｍＳＥＡＭｓ＿ＬＢＫＡＲＳ．ｘｌｓ）。
【００５６】
この手順の結果を用いれば、ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳマーカーと耐性表現型の両方を遺伝
子マッピングすることが可能であったが、これはイミダゾリノンに対する耐性および特異
的ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳマーカーが、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒの染色体４中の以
前に同定されたＳＳＲにフランキングして染色体４中に位置することを示している（図５
）。
【００５７】
本発明のポリヌクレオチド（配列番号１）を、トランスジェニック植物を得るために植
物中に導入することができる。ポリヌクレオチドを植物、特に、農業目的の植物、例えば
、トウモロコシ、ダイズ、ソルガム、コムギ、サトウキビ、アマ、ヒマワリまたは他の植
物；野菜、樹木、または観葉植物に導入するための様々な方法がある。トランスジェニッ
ク植物を得るためにポリヌクレオチドを導入する方法は当業界で周知であり、組換え方法
を用いることもできる。
【００５８】
例えば、ベクターを用いる植物の形質転換のための様々な方法がある（Ａｎ、Ｇ．ら（
１９８６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｙｓｉｏｌ．，８１：３０１〜３０５頁；Ｆｒｙ、Ｊ．ら（１
９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，６：３２１〜３２５頁；Ｂｌｏｃｋ、Ｍ．（
１９８８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ．，７６：７６７〜７７４頁；Ｈｉｎｃｈ
ｅｅら（１９９０）Ｓｔａｄｌｅｒ．Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｍｐ．，２０３２１２．２０３〜
２１２頁；Ｂａｒｃｅｌｏら（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，５：５８３〜５９２頁；Ｂ
ｅｃｋｅｒら（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，５：２９９〜３０７頁；Ｂｏｒｋｏｗｓｋ
ａら（１９９４）Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ．，１６：２２５〜２３０頁；
Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：２３９
〜２４６頁；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：３０
９〜３１４頁；Ｄｈｉｒら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９９：８１〜８
８頁；Ｃａｓａｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：
１１２１２〜１１２１６頁；Ｄｏｎｇ、Ｊ．Ａ．およびＭｃｈｕｇｈｅｎ、Ａ．（１９９
３）Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．，９１：１３９〜１４８頁；Ｇｏｌｏｖｋｉｎら（１９９３）
Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．，９０：４１〜５２頁；Ｇｕｏ  Ｃｈｉｎ  Ｓｃｉ．，Ｂｕｌｌ．
，３８：２０７２〜２０７８頁；Ａｓａｎｏら（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅ
ｐ．，１３；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ、Ｐ．（１９９４）Ａｇｒｏ．Ｆｏｏｄ．Ｉｎｄ．Ｈｉ  
Ｔｅｃｈ．，５：１７〜２７頁；Ｅａｐｅｎら（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅ
ｐ．，１３：５８２〜５８６頁；Ｈａｒｔｍａｎら（１９９４）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ  １２：９１９９２３頁；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ、Ｐ．（１９９３）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ
Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．−Ｐｌａｎｔ；２９Ｐ：１１９〜１２４頁；Ｄａｖｉｅ
ｓら（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，１２：１８０〜１８３頁；Ｒｉｔａ
ｌａら（１９９４）Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３１７〜３２５頁；ならびに
Ｗａｎ、Ｙ．Ｃ．およびＬｅｍａｕｘ、Ｐ．Ｇ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．，１０４：３７４８頁）。
【００５９】
植物を形質転換するためのいくつかの方法および遺伝子操作技術が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ、  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍ
ａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ
、Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙ
ｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．に記載されている。
【００６０】
ベクターを、米国特許第４，９４５，０５０号およびＣａｓａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、９０：１１２１２頁、１９９３に記載されたものなどの弾道粒子
加速技術を用いて導入することもできる。
【００６１】
例えば、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された植物は、除草剤耐性ＡＨＡＳタン
パク質を発現し、イミダゾリノンおよび／またはスルホニルウレアなどの除草剤に対する
耐性形質を示す。「除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質」とは、除草剤が野生型ＡＨＡＳタン
パク質のＡＨＡＳ活性を阻害する濃度でＡＨＡＳ活性を阻害する除草剤の存在下にある場
合、野生型ＡＨＡＳ活性のものよりも高いＡＨＡＳ活性を示すタンパク質を意味する。
【００６２】
本発明のポリヌクレオチド配列を、対象、例えば、農業対象の植物において耐性ＡＨＡ
Ｓタンパク質を発現させるための発現カセット中に含有させることができる。このカセッ
トは、例えば、少なくとも１つのプロモーターに作動可能に連結された調節配列を含む。
プロモーターは当業界で周知であり、例えば、構成的、誘導的、組織特異的、葉緑体特異
的プロモーターであってもよく、それらは全て植物中で機能的である。カセットは、当業
界で公知の転写終結配列をさらに含む。カセットは、除草剤耐性ＡＨＡＳポリヌクレオチ
ドの発現効率を改善するための様々な調節配列、例えば、イントロン、ウイルス配列など
のエンハンサーを含んでもよく；または前記ポリヌクレオチドに結合した、もしくは結合
していない、本発明のポリヌクレオチドとは異なる対象の他のポリヌクレオチド配列；ま
たはリーダー配列を含んでもよい。
【００６３】
プロモーターとしては、限定されるものではないが、構成的、誘導的、組織または器官
特異的プロモーター、例えば、３５Ｓプロモーター、創傷もしくは化学誘導性プロモータ
ー、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターなどが挙げられる（
Ｃｈａｏら、１９９９、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２０：９７９頁；米国特許第
５，１８７，２６７号、米国特許第５，０５７，４２２号）。
【００６４】
また、植物において有用であり得る好適な転写ターミネーターも当業者には公知であり
、例えば、Ｏｄｅｌｌら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０頁；Ｓａｎｆａｃｏ
ｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，５：１４１頁、１９９０；Ｍｕｎｒｏｅら、１９９０  Ｇ
ｅｎｅ  ９１：１５１頁；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、１９８７、Ｇｅｎｅ  ５６：１２５頁
；Ｊｏｓｈｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１５：９６２７頁、１９８７を
参照されたい。
【００６５】
「作動可能に連結された」とは、プロモーターと第２の配列との機能的連結を指すこと
が意図される。プロモーター配列は、第２の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始、媒
介する。用語「作動可能に連結された」とは、連結される核酸配列が連続的であり、２つ
のタンパク質コード領域を結合させるのに必要である場合、連続的であり、同じ読み枠中
にあることを意味する。カセットは、複数の発現カセットであってもよい。
【００６６】
本発明のポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドの融合物の形態で、または別々に、他
のポリヌクレオチドに結合させることができる。他のポリヌクレオチドは、例えば、当業
者には周知である除草剤耐性、昆虫耐性または他の植物部分をコードしてもよい。
【００６７】
植物中での発現を改善するために、本発明のポリヌクレオチドを、例えば、植物にとっ
て好ましいコドンを含有させること、イントロンまたは有害な配列などの配列を欠失させ
ることにより改変することができる。また、突然変異され、例えば、欠失もしくは挿入を
示す本発明の耐性ＡＨＡＳポリペプチドまたは本明細書に記載のものとは異なる他の突然
変異をコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲内にある。「突然変異ポリヌクレオチ
ド」とは、そのヌクレオチド配列中に永続的な変化を有するポリヌクレオチドを意味する
。
【００６８】
本発明のポリヌクレオチドを、置換、欠失、トランケーション、および挿入により変化
させることができる。そのような操作のための方法は当業界で一般に公知である。突然変
異誘発およびヌクレオチド配列変化のための方法は当業界で周知である（Ｋｕｎｋｅｌ（
１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８２：４８８〜４９２頁
；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：３６
７〜３８２頁；ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびそこで引用された参考文献）。対象の
タンパク質の生物活性に影響しないアミノ酸置換を、引用することにより本明細書の一部
をなすものとする、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆ
ｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．）に見出すことができる。
【００６９】
本発明のＡＨＡＳポリヌクレオチドを含むＤＮＡを、ベクターの一部として様々な植物
に導入することができる。好適なベクターの選択は、形質転換のために用いられることが
意図される方法および形質転換される植物に依存する。当業者であれば、様々なベクター
、例えば、Ｔｉおよび／またはＲｉをよく知っている。Ｔ−ＤＮＡも、ＴｉまたはＲｉベ
クターを組込むためのフランキング領域として用いられる（ＷＯ８４／０２９１３、Ｈｅ
ｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：２０９頁；Ｈｏｒ
ｓｃｈら、１９８４、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：４９６頁；Ｆｒａｌｅｙら、１９８３、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ  ８０：４８０３頁）。
【００７０】
ベクターは、発現カセットおよび他のヌクレオチド配列、例えば、抗生物質または除草
剤に対する耐性を付与するマーカーなどの選択マーカーおよび植物中での対象のポリヌク
レオチド、例えば、配列番号２のＡＨＡＳラージサブユニットポリペプチドの発現を誘導
するための配列を含んでもよい。
【００７１】
本発明の耐性ＡＨＡＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、
イミダゾリノンおよびスルホニルウレアの型の除草剤に対して耐性であるトランスジェニ
ック植物を取得するのに有用であってもよい。形質転換植物は、双子葉植物または単子葉
植物などの任意の型の植物であってもよく、特に、限定されるものではないが、ソルガム
（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、トウモロコシ
（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ種（例えば、Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｒａｐａ、
Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、コメ（Ｏｒ
ｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、キビ（Ｐｅｎｎ
ｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ）、（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、（Ｓｅｔ
ａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ）、（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ）、ヒマワリ（Ｈ
ｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ、
Ｔ．Ｔｕｒｇｉｄｕｍ  ｓｓｐ．ｄｕｒｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、タ
バコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏ
ｇａｅａ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  
ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍ
ａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ  ｓｐｐ．）、ココナッ
ツ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒ
ｉｕｓ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）、柑橘類の木（Ｃｉｔｒｕｓ
ｓｐｐ．）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓ
ｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ  ｓｐｐ．）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒ
ｉｃａｎａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉ
ｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、
サトウダイコン（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂ
ｅｒｏｓｕｍ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐ．）、野菜、観葉植物、およ
び樹木などの農業対象の植物が挙げられる。好ましくは、本発明の植物は、ソルガムであ
る。
【００７２】
本発明は、以下の実施例により良好に例示されるが、その範囲を限定すると解釈される
べきではない。逆に、本発明の他の実施形態、改変物および等価物が、本明細書を読んだ
後に可能となり、当業者であれば、本発明の精神および／または添付の特許請求の範囲か
ら逸脱することなく提言することができることが明確に理解されるべきである。
【実施例１】
【００７３】
［エンドガミックソルガム系８０２３７の突然変異誘発およびイミダゾリノン耐性突然変
異体８０２３７ＥＭＳ２−１９２の選択］
エンドガミック系８０２３７に由来する３２０００個の予め発芽させたソルガム種子を
、０．０５％ｖ／ｖのエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）の水性溶液中に１６時間浸した
。処理された種子を２００７年１２月２１日にＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｉｏ
ｎ  ｏｆ  Ａｄｖａｎｔａ  Ｓｅｅｄｓ  ｉｎ  Ｖｅｎａｄｏ  Ｔｕｅｒｔｏ、Ｐｒｏｖ
ｉｎｃｅ  ｏｆ  Ｓａｎｔａ  Ｆｅ、Ａｒｇｅｎｔｉｎａのプロット１番（３３°４１’
４７’’Ｓ；６１°５８’４５’’Ｗ）に植え、それらを開放授粉のために放置した。
【００７４】
合計２７３個のＭ１植物を選択し、それぞれの植物からの２個の種子を２００８年５月
２３日にＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｖａｎｔａ  Ｓｅｅｄ
ｓ  ｉｎ  Ｏｒａｎ、Ｐｒｏｖｉｎｃｅ  ｏｆ  Ｓａｌｔａ、Ａｒｇｅｎｔｉｎａ（２２
°４９’３７’’Ｓ；６４°２０’１４’’Ｗ）の苗床に植え、合計５４６個のＭ２植物
を得た。それぞれの対の一方の植物から花粉を採取し、その対の他方の植物を授粉させる
のに用いた。２７３個の授粉したＭ２植物のそれぞれから得られたＭ３種子を収穫した。
合計２７３個の畝間のＭ３子孫を２００８年１２月１６日にＶｅｎａｄｏ  Ｔｕｅｒｔｏ
に植え、それぞれのＭ３畝間に由来する５０個の植物に２００８年１２月２３日に１００
ｍｌ  Ｌ  ａ．ｉ．／ｈａのイマゼタピルを噴霧した。畝間に由来する６８個の植物は除
草剤による処理後に正常な生長および症状の非存在を示し、除草剤に耐性であると考えら
れ、ＶＴ０９−９７５４と同定された。畝間に由来する耐性植物の系譜を同定し、それら
を８０２３７ＥＭＳ２−１９２と命名した（以後、ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒと呼ぶ）。
【００７５】
世代の歴史を表５に示す。
【００７６】
【表５】
2019141045.tif 000006
【実施例２】
【００７７】
［元のソルガムエンドガミック系８０２３７と比較した、耐性ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変
異体におけるイミダゾリノンによる処理に対する応答率の分析］
ソルガム系８０２３７（Ａｄｖａｎｔａ所有のエリート系）および本発明のイミダゾリ
ノン耐性ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体（元の突然変異）に、畑上で、イミダゾリノン群
中の３つの除草剤：イマゼタピル、イマザピル、およびイマザピックを噴霧した。４つの
異なる施用率をそれぞれの除草剤についてアッセイした：１Ｘ、２Ｘ、３Ｘおよび４Ｘ（
１Ｘが推奨される施用率である）（上記の表１を参照されたい）。
【００７８】
畑実験をＶｅｎａｄｏ  Ｔｕｅｒｔｏにおいて実行し、植付けを２０１０年１２月１日
に行った。除草剤を発芽の２０日後に噴霧した（Ｖ６段階）。全ての処理を、その対応す
る未処理対照と比較した。実験設計は、３つの複製物に分割したプロットからなっていた
（主プロット：除草剤による処理；副プロット：系）。
【００７９】
噴霧の１０日後、全ての植物を、空中組織における乾燥物量（ＤＭ）についてアッセイ
した。除草剤応答を、対応する未処理対照の空中組織におけるＤＭパーセンテージとして
評価した。
【００８０】
かくして、それぞれの施用率ｊに関する除草剤ｉに対して感受性である系を、
ＤＭｉｊ％対照＝（ＤＭｉｊ＊１００）／ＤＭ対照
として表した。ＤＭｉｊ％対照は、それぞれの系に由来するそれぞれの処理に関する３回
の実験の平均値である。
【実施例３】
【００８１】
［アセトヒドロキシ酸合成酵素活性を有し、イミダゾリノン耐性である本発明の突然変異
ポリペプチドをコードするソルガムＡＨＡＳ遺伝子の配列決定］
ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体（ＶＴ１１−１１３３１−ＢＫ選択）および野生型エン
ドガミック系８０２３７に由来する葉組織に関して配列決定試験を行った。ゲノムＤＮＡ
を単離し、１００ｎｇ／μｌの最終濃度で水中に再懸濁した。ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変
異体およびソルガム系８０２３７に由来するアセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ）遺
伝子の配列決定のために、受託番号ＧＭ６６３３６３．１の下でＧｅｎＢａｎｋに開示さ
れたソルガムＡＨＡＳ配列に基づいて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅のた
めの特異的プライマーを設計した。完全なＡＨＡＳコード配列を表す５つの重複するＤＮ
Ａセグメント（アンプリコン）を生成するためにプライマーを設計した。設計されたプラ
イマーの配列は以下の通りである。
【００８２】
【表６】
2019141045.tif 000007
【００８３】
ＰＣＲ混合物は２５μｌの最終容量および以下の成分：１Ｘ反応バッファー（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、２．５ｍＭ  
ＭｇＣｌ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２μＭの各プライマー、０．５μｌ  Ｐｌａ
ｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１００ｎｇのゲノム
ＤＮＡを有していた。ＰＣＲ反応を、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００
サーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）中で実施し、増幅条件は以下の通りであ
った：９４℃で１分間の初期変性、次いで、９４℃で４５秒間、５７℃で４５秒間、およ
び７２℃で７０秒間の３５サイクルのステップ、ならびに７２℃で１０分間の最終伸長ス
テップ。
【００８４】
両方ともＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ産物ならびに元のソルガム系８０２３７に関するＳｂＡＨ
ＡＳ−Ｆ１およびＳｂＡＨＡＳ−Ｒ１ＯＬＤ１−Ｒ２プライマーを用いた場合、増幅産物
は得られなかった。
【００８５】
この問題を克服するために、２つの新しいプライマーを設計して、第６のアンプリコン
を生成した：
【００８６】
【表７】
2019141045.tif 000008
【００８７】
上記のものと同じＰＣＲ条件を用いて、第６のアンプリコンを得た。
【００８８】
ＰＣＲによる増幅の結果生じる２μｌの各ＤＮＡ産物をアガロースゲル電気泳動により
検査して、分子量マーカーＬｏｗ  ＤＮＡ  Ｍａｓｓ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）を参照して断片サイズおよびＤＮＡ濃度見積もり値を分析した。残りのＰＣＲ産物
を、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶゲル（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−
Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。精製されたＤＮＡを、Ｂｉｇ
Ｄｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎ
ｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者の説明書に従っ
て用いて配列決定した。
【００８９】
各アンプリコンに関して得られたアセトヒドロキシ酸合成酵素の配列決定ファイルを、
ＣＡＰ３  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｐｂ
ｉｌ．ｕｎｉｖ−ｌｙｏｎ１．ｆｒ／ｃａｐ３．ｐｈｐ）を用いて整理した。アセトヒド
ロキシ酸合成酵素遺伝子の得られるＤＮＡ配列を、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗバージョン２．１
プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇ）を用いて整列させた。
【実施例４】
【００９０】
［イマゼタピル感受性系と、耐性ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体とを交配させることによ
り生成された分離Ｆ２ソルガム集団におけるイマゼタピル耐性の継承］
ソルガム系９０５２３（Ａｄｖａｎｔａ所有エリート系、イミダゾリノンに感受性）と
、イミダゾリノン耐性ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体（ＶＴ０９−９７５４−４８−６−
ＢＫ選択）との間で標的化交配を実行した。得られるＦ１植物を自家授粉させ、Ｆ２種子
を収穫した。Ｆ２種子を、２０１０年１０月にＶｅｎａｄｏ  Ｔｕｅｒｔｏの畑に植えた
。Ｆ２植物（１７７個の植物）に、３ｘの施用率で（商業的使用のために製造業者により
推奨される施用率は１Ｘであり、これは１００ｍｌ  ａ．ｉ．／ｈａと等しい）、イマゼ
タピル（Ｐｉｖｏｔ（登録商標）、ＢＡＳＦ）を噴霧した。噴霧の前に、ＡＤＶ−ＩＭＩ
−Ｒ突然変異体（ＶＴ０９−９７５４−４８−６−ＢＫ選択）と野生型系９０５２３の両
方に由来する１７７個のＦ２植物のそれぞれから葉組織を採取して、ゲノムＤＮＡを単離
し、遺伝子型決定分析における使用のために最終濃度１００ｎｇ／μｌで水に再懸濁した
。
【００９１】
除草剤を、発芽の２０日後に噴霧した（段階Ｖ６）。植物を噴霧の１０日後に評価し、
以下の表現型スコアリングに従って視覚的に評価された症状により除草効果を３つのカテ
ゴリーに分類した：
−１＝損傷なし
−２＝萎黄病
−３＝枯死。
【実施例５】
【００９２】
［ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳに特異的なＤＮＡマーカーの開発］
ヌクレオチド位置＋２７７（コドン９３）のヌクレオチドＧをＡにより置きかえるＡＨ
ＡＳ遺伝子中の単一の点突然変異は、誘導されたＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体から元の
エンドガミックソルガム系８０２３７（除草剤感受性）を識別する。下記群の二重標識さ
れたプライマーおよびプローブを用いて、分子マーカー（本明細書ではＳＮＰ−ＳｂＡＨ
ＡＳと命名される）を設計した：
【００９３】
【表８】
2019141045.tif 000009
【００９４】
ＡＢ  ７５００サーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔ
ｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳ）を用いるリアルタイムＰＣＲ対立遺伝子識別アッセイによ
り、遺伝子型決定を行った。ＰＣＲ反応混合物を、１２．５μｌの２Ｘ  Ｐｅｒｆｅｃｔ
ａ（登録商標）ｑＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳ）、０．０８μＭのプライマー（フォワードおよ
びリバース）、０．４μＭのプローブ（１および２）、１０μｌのゲノムＤＮＡならびに
最終容量を作るためのＤＮａｓｅ非含有水を含む２５μｌの最終容量で調製した。増幅条
件は、９５℃で１０ｍｉｎの１回の初期変性サイクル、次いで、９２℃で１５秒間の変性
および６０℃で１ｍｉｎのハイブリダイゼーション／伸長の５０サイクルであった。対立
遺伝子識別アッセイの結果を、ＡＢ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔ
ｅｍ（ＳＤＳ）７５００  １．４ソフトウェアプログラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳ）を用いて増幅後に分析した。
【実施例６】
【００９５】
［除草剤耐性とＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体中のＡＨＡＳ突然変異との相関］
ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒｘ９０５２３交配により得られた個々のＦ２子孫植物を、イマゼタ
ピルを用いる噴霧（実施例４に記載の方法を用いる）後に表現型分類（損傷なし、萎黄病
および枯死）した後、ＡＨＡＳ中の誘導された突然変異に特異的である分子マーカーＳＮ
Ｐ−ＳｂＡＨＡＳを用いて（実施例５に記載の方法を用いる）遺伝子型分類した。
【実施例７】
【００９６】
［除草剤耐性および特異的ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳマーカーの遺伝子マッピング］
除草剤耐性および特異的ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳマーカーを遺伝子マッピングした。Ｇｅ
ｎｂａｎｋ（受託番号ＧＭ６６３３６３．１）に開示されたソルガムＡＨＡＳ配列に基づ
いて、ＢＬＡＳＴ分析を実行して、それをＰｈｙｔｏｚｏｍｅデータベース（ｈｔｔｐ：
／／ｗｗｗ．ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ．ｎｅｔ／ｓｅａｒｃｈ．ｐｈｐ）に寄託されたＳｏｒ
ｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒのゲノムＤＮＡ配列と一致させた。
【００９７】
突然変異ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ系およびエンドガミック系９０２５３の遺伝子型決定（フ
ィンガープリンティング）を、ＳＳＲ型分子マーカー群を用いて実行した。Ｓｏｒｇｈｕ
ｍ  ｂｉｃｏｌｏｒゲノムの染色体４に位置する７個の多型ＳＳＲを、遺伝子型決定のた
めに選択した（Ｍａｃｅ、ＥＳら、Ａ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｐ  
ｏｆ  ｓｏｒｇｈｕｍ  ｔｈａｔ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐ
ｏｎｅｎｔ  ｍａｐｓ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ａｒｒａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＤＡｒＴ）  ｍａｒｋｅｒｓ、ＢＭＣ  Ｐｌａｎ
ｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００９、９：１３頁；Ｓｒｉｎｉｖａｓ、Ｇら、Ｅｘｐｌｏｒａ
ｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｍａｒｋｅ
ｒｓ  ｆｒｏｍ  ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ  ｄｒｏｕｇｈｔ  ｓｔｒｅｓｓ  ＥＳＴｓ  ｉ
ｎ  Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ（Ｌ．）、Ｍｏｅｎｃｈ．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．
Ｇｅｎｅｔ．２００９、１１８：７０３〜７１７頁；Ｒａｍｕ、Ｐら、Ｉｎ  ｓｉｌｉｃ
ｏ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｍａｒｋｅｒｓ
ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｕｂｌｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉ
ｃｉｅｎｔ  ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ、Ｍｏｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ２０１０
、２６：４０９〜４１８頁；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｂｋ．ａｒｓ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ
／ｐｓｇｄ／ｓｏｒｇｈｕｍ／２００９ＳｏｒｇｈｕｍＳＥＡＭｓ＿ＬＢＫＡＲＳ．ｘｌ
ｓ）。
【００９８】
７つの選択された多型ＳＳＲは以下の通りであった。
【００９９】
【表９】
2019141045.tif 000010
【０１００】
試験したＳＳＲのそれぞれに由来する得られるＰＣＲ断片を、自動化配列決定装置ＡＢ
Ｉ３１３０ｘ１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるキャピラリー電気泳
動により分解した。これらの７個のＳＳＲの遺伝子型決定を、ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒｘ９０
５２３交配から得られるＦ２子孫の１７７個の個体において行った。さらに、これらの同
じ１７７個のＦ２子孫植物を、ＡＨＡＳ遺伝子中の導入された突然変異に特異的なＳＮＰ
−ＳｂＡＨＡＳマーカーの存在に関して分析した。結果を、Ｆ２子孫植物に関するイマゼ
タピルの施用時の表現型評定に従って分類し、コンピュータプログラムＪｏｉｎＭａｐ（
Ｖａｎ  Ｏｏｉｊｅｎ、ＪＷおよびＶｏｏｒｉｐｓ、ＲＥ、ＪｏｉｎＭａｐ  ３．０  Ｓ
ｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｌ
ｉｎｋａｇｅ  ｍａｐｓ、Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
、２００１、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて分析し
た。
【０１０１】
【表１０】
2019141045.tif 000011
【図１Ａ】
2019141045.tif 000012
【図１Ｂ】
2019141045.tif 000013
【図１Ｃ】
2019141045.tif 000014
【図２Ａ】
2019141045.tif 000015
【図２Ｂ】
2019141045.tif 000016
【図３】
2019141045.tif 000017
【図４】
2019141045.tif 000018
【図５】
2019141045.tif 000019
【配列表】
2019141045000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月2日(2019.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ソルガムＡＨＡＳタンパク質のラージサブユニットの位置９３にアラニンからトレオニ
ンへの置換を有するポリペプチドをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチドをゲ
ノム中に含むソルガム植物であって、野生型ソルガム植物と比較して１つまたは複数の除
草剤に対する耐性が増大した上記植物。