(57)【要約】      （修正有）【課題】ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現系の調節エレメント、及び目的のタンパク質（ＰＯＩ）を産生する方法の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は１若しくは２の点変異を有するその機能的バリアント、及びＰＯＩをコードする核酸配列を含む発現カセットを導入した組換え酵母宿主細胞においてＰＯＩを産生する方法、及び宿主細胞からのＰＯＩの分泌を増大するための特定の核酸の使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は１若しくは２の点変異を有するその機能的バリアント、及び
ｂ）配列番号１１、１２、１３及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチド
からなる群から選択されるリーダーをコードし、
好ましくは、リーダーペプチドをコードする、配列番号１８、１９及び２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号１８、１９、若しくは２０のいずれかのコドン最適化バリアントである、単離された核酸。
【請求項２】
配列番号１２のアミノ酸配列を有するリーダーペプチドであるリーダーをコードし、好ましくは、配列番号１９のヌクレオチド配列からなるか、又は配列番号１９のコドン最適化バリアントからなる、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は１若しくは２の点変異を有するその機能的バリアント、及び
ｂ）配列番号２、３、４及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するシグナルペプチド
からなる群から選択されるリーダーをコードし、
好ましくは、シグナルペプチドをコードする、配列番号１５、１６及び１７からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号１５、１６若しくは１７のいずれかのコドン最適化バリアントである、単離された核酸。
【請求項４】
配列番号３のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドであるリーダーをコードし、好ましくは、配列番号１６のヌクレオチド配列からなるか、又は配列番号１６のコドン最適化バリアントからなる、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
ＤＮＡである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸によってコードされ、好ましくは、配列番号１、２、３、４、５、１０、１１、１２、１３及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、単離されたリーダー。
【請求項７】
配列番号３又は配列番号１２のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項６のリーダー。
【請求項８】
ＰＯＩをコードする核酸配列に作動可能に連結したリーダーをコードする核酸を含む発現カセットであって、前記リーダーが、
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は１若しくは２の点変異を有するその機能的バリアント、
ｂ）配列番号１１、１２、１３及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、好ましくは、リーダーペプチドをコードする、配列番号１８、１９及び２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号１８、１９、若しくは２０のいずれかのコドン最適化バリアント、
ｃ）配列番号１のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は１若しくは２の点変異を有するその機能的バリアント、並びに
ｄ）配列番号２、３、４及び５からなる群から選択される、アミノ酸配列を有するシグナルペプチド、好ましくは、シグナルペプチドをコードする、配列番号１５、１６及び１７からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号１５、１６、若しくは１７のいずれかのコドン最適化バリアント、
からなる群から選択されることによって特徴付けられる、発現カセット。
【請求項９】
前記ＰＯＩが、ネイティブのＮ末端アミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の発現カセット。
【請求項１０】
前記ＰＯＩが、抗体又はその断片、酵素及びペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質結合体、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン及びワクチン様タンパク質又は粒子、プロセス酵素、成長因子、ホルモン及びサイトカインを含む治療用タンパク質から選択されるか、又は前記ＰＯＩが、好ましくは抗体又はその断片、成長因子、ホルモン及びサイトカインからなる群から選択される、宿主細胞代謝産物の産生を媒介する、請求項８又は９に記載の発現カセット。
【請求項１１】
前記ＰＯＩが、成長因子、ホルモン、サイトカイン、抗体及び抗体断片からなる群から選択され、抗体及び抗体断片が、好ましくは、完全長抗体、ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、Ｆａｂ及びＦｃ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項１０に記載の発現カセット。
【請求項１２】
前記リーダーをコードする前記核酸に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の発現カセット。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれか１項に記載の発現カセットを含む、組換え酵母宿主細胞又はベクター。
【請求項１４】
前記酵母が、ピキア属、カンジダ属、トルロプシス属、アークスラ属、ハンゼヌラ属、オガテア属、ヤロウイア属、クリベロミセス属、サッカロミセス属及びコマガタエラ属からなる群の属から選択される、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載の宿主細胞を準備すること、
前記宿主細胞を培養して、前記ＰＯＩを発現させること、及び
前記ＰＯＩを精製して、精製ＰＯＩの調製物を得ること
を含む、酵母宿主細胞においてＰＯＩを産生する方法。
【請求項１６】
前記ＰＯＩが、ネイティブのＮ末端アミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＯＩが、Ｎ末端アミノ酸残基として追加のアラニンを含まないアミノ酸配列を含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰＯＩが、抗体又はその断片、酵素及びペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質結合体、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン及びワクチン様タンパク質又は粒子、プロセス酵素、成長因子、ホルモン及びサイトカインを含む治療用タンパク質から選択されるか、又は前記ＰＯＩが、宿主細胞代謝産物の産生を媒介する、請求項１５〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＯＩが、成長因子、ホルモン、サイトカイン、抗体及び抗体断片からなる群から選択され、抗体及び抗体断片が、好ましくは、完全長抗体、ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、Ｆａｂ及びＦｃ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
宿主細胞からのＰＯＩの分泌のための、及び／又は宿主細胞からのＰＯＩの分泌を増大するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸、又は請求項６若しくは７に記載のリーダーの使用。
【請求項２１】
分泌ＰＯＩの少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、又は１００％が、ネイティブのＮ末端アミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本発明は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現系の調節エレメント及び目的のタンパク質（ＰＯＩ）を産生する方法におけるその使用に関する。
【背景】
【０００２】
タンパク質の首尾よい分泌は、原核生物及び真核生物宿主の両方によって達成されている。最も目立った例は、細菌、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、酵母菌、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス若しくはハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、糸状菌、例えばアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）若しくはトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、又は、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞である。いくつかのタンパク質の分泌は、高い割合で容易に達成されるが、多くの他のタンパク質は、比較的低レベルでしか分泌されない。
【０００３】
宿主生物における遺伝子の異種発現は、その宿主細胞の安定的な形質転換を可能にするベクターを必要とする。このベクター又は発現カセットは、コード配列の５’末端に隣接する機能的プロモーターと共に遺伝子を提供しなければならない。従って、転写は、このプロモーター配列によって調節され、そして開始される。
【０００４】
分泌経路は、典型的には、膜貫通ポリペプチド及び分泌を目的とするポリペプチドの小胞体（ＥＲ）の腔内への移行によって開始する。この目的のために、これらのタンパク質は、アミノ末端前駆配列を有する。この配列は、「リーダー」とも呼ばれ、シグナルペプチド及び任意の分泌リーダープロペプチドを含むか、又はこれらからなる。シグナルペプチドは、典型的には、１３〜３６の比較的疎水性のアミノ酸からなる。シグナルペプチドは、短い、陽に帯電したアミノ末端領域（ｎ領域）；中央の疎水性領域（ｈ領域）；及びシグナルペプチダーゼによって切断される部位を含むより極性のカルボキシ末端領域（ｃ領域）、という共通構造を有する。小体の管腔側において、シグナルペプチドが、シグナルペプチダーゼによって切断される。ＥＲに常在するシャペロン及びフォールダーゼによる初期のポリペプチドの連続的な折り畳みの後、このタンパク質は、さらに、ＥＲから出るように仕向けられる。このプロセスは、例えば、Ｓ．セレビシエ接合因子アルファ（ＭＦα）の前駆体に存在する、Ｎ末端プロ配列の存在によって支えられていてもよい。次いで、タンパク質は、ゴルジネットワークに、そして最後に、上清への分泌のために、細胞膜に輸送される。リーダープロペプチドは、（恐らく）ゴルジ常在プロテアーゼ、例えばＳ．セレビシエのＫｅｘ２プロテアーゼによってタンパク質から切断される。
【０００５】
酵母の殆どは大量の内在性タンパク質を分泌せず、その細胞外プロテオームは、これまで広範囲に性質決定されていなかったので、酵母における使用のために利用可能な分泌配列の数は、限られている。従って、Ｓ．セレビシエ由来の接合因子アルファリーダーペプチド（ＭＦα）に対する標的タンパク質の融合が、多くの酵母の種（ピキア属、クリベロミセス属、ザイゴサッカロミセス属を含む）において分泌発現を駆動するために使用された。残念なことに、Ｋｅｘ２プロテアーゼによるＭＦαのタンパク質分解プロセシングは、多くの場合、産物における異種Ｎ末端アミノ酸残基を生じる。
【０００６】
ＥＰ３２４２７４Ｂ１は、切断型Ｓ．セレビシエアルファ因子リーダー配列を用いた酵母における異種タンパク質の改善された発現及び分泌を記載し、ＥＰ３０１６６９Ｂ１は、異種タンパク質の分泌のためのクリベロミセス属アルファ因子リーダー配列を記載する。
【０００７】
或いは、Ｓ．セレビシエホスファターゼ（ＰＨＯ５、ＤＫ３６１４）、Ｓ．セレビシエスクロースインベルターゼ（ＳＵＣ、ＷＯ８４／０１１５３）及び酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３、ＥＰ７９２３６７Ｂ１）のシグナルペプチドは、酵母における分泌発現のために使用された。ＥＰ０４３８２００（Ａ１）は、Ｐ．パストリスにおける発現のためのＳ．セレビシエＳＵＣ２のシグナルペプチド配列を記載する。
【０００８】
ＵＳ５２６８２７３は、多くの場合ＭＦαよりも弱い、Ｐ．パストリス酸ホスファターゼ（ＰＨＯ１）シグナル配列を記載する。
【０００９】
ＵＳ７７４１０７５は、組換えタンパク質発現のためのＰ．パストリスＰＩＲ１分泌シグナルペプチド、並びに組換え体表面呈示のためのピキア・パストリスＰＩＲ１及びＰＩＲ２アンカードメインペプチドを記載する。
【００１０】
Ｋｈａｓａら、２０１１（Ｙｅａｓｔ．２８（３）：２１３〜２６）は、ピキア・パストリスＰＩＲ遺伝子の単離、並びに細胞表面呈示及び組換えタンパク質分泌、特にＰ．パストリスにおける、ＰｐＰｉｒ１ｐタンパク質のプレ−プロシグナルを利用した組換えタンパク質分泌のためのその利用を、ＭＦαと比較することなく、記載する。
【００１１】
ＷＯ２０１１０７３３６７Ａ１及びＫｏｔｔｍｅｉｅｒら、２０１１（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．９１：１，１３３〜１４１）は、ピキア・パストリスにおいて組換えタンパク質の効率的な分泌を媒介するヒドロホビンシグナル配列、特に、Ｐ．パストリスにおけるｅＧＦＰの分泌のためのトリコデルマ・リーゼイヒドロホビンのプレ−配列又はプロ−配列の使用を、記載する。
【００１２】
Ｐ．パストリスゲノム配列決定の過程において、５４の異なる配列が、予測シグナルペプチドとして挙げられ、これは、タンパク質の分泌を提供するための切断部位を含む（Ｄｅ  Ｓｃｈｕｔｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．１５４４  ２００９）。
【００１３】
ＵＳ２０１１／００２１３７８Ａ１は、シグナル配列を含むことが同定されている５４のＰ．パストリス遺伝子のセットを記載する。この中で、ＵＳ２０１１／００２１３７８Ａ１において挙げられた配列番号８の残基１〜２１は、やはり、タンパク質の分泌を提供するための切断部位を含む。
【００１４】
ＥＰ２２５８８５５Ａ１は、Ｐ．パストリス由来の発現系の調節配列を記載する。ここで、Ｐ．パストリスＥｐｘ１タンパク質のシグナル及びリーダー配列は、５７のアミノ酸前駆配列として使用され、目的のタンパク質ＰＯＩの発現及び分泌を促進する。シグナルペプチダーゼについての切断部位は、シグナル配列に続くこと、すなわち、２０位と２１位との間であることが予測され、切断部位の配列におけるハイフンとして表される：ＶＳＡ−ＡＰ（配列番号６）。
【００１５】
組換え真核生物宿主細胞においてＰＯＩを発現するために好適な代替の調節エレメント、並びに、真核生物細胞において分泌タンパク質を産生するための、単純且つ効率的な、そして好ましくは均一なＮ末端のＰＯＩをもたらす方法を提供することが望ましい。
【発明の要旨】
【００１６】
この目的は、特許請求される主題によって解決される。
【００１７】
本発明は、
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は１若しくは２の点変異を有するその機能的バリアント、
ｂ）配列番号１１、１２、１３及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、
ｃ）配列番号１のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は１若しくは２の点変異を有するその機能的バリアントであって、好ましくは配列番号２以外であるもの、並びにｄ）配列番号２、３、４及び５からなる群から選択される、好ましくは配列番号２以外のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド
からなる群から選択されるリーダーをコードする、単離された核酸を提供する。
【００１８】
本発明は、さらに、
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は１若しくは２の点変異を有するその機能的バリアント、
ｂ）配列番号１１、１２、１３及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、
ｃ）配列番号１のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は１若しくは２の点変異を有するその機能的バリアントであって、好ましくは配列番号２以外であるもの、並びにｄ）配列番号２、３、４及び５からなる群から選択される好ましくは配列番号２以外のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド
からなる群から選択されるリーダーを提供する。
【００１９】
従って、この特定のリーダーペプチドは、３６のアミノ酸（ａａ）のリーダー配列によって特徴付けられ、ここで、Ｎ末端の２０のａａ配列は、特定のシグナルペプチドである。
【００２０】
従って、この特定のシグナルペプチドは、２０のａａシグナル配列、具体的には、Ｃ末端が伸長された配列、例えば付加されたアミノ酸、例えばアラニンによるＣ末端伸長を含む２１のａａ配列を除く、２０のａａシグナル配列によって特徴付けられる。
【００２１】
配列番号１：ＭＫＸＳＴＮＬＩＬＡＩＡＡＡＳＸＶＶＳＡ、ここで、
３位のＸは、Ｆ又はＬのどちらかであり、
１６位のＸは、Ａ又はＴのどちらかである。
【００２２】
例えば、２０アミノ酸（ａａ）のシグナルペプチドであるＥｐｘＬ−Ａは、配列番号１のアミノ酸配列を有し、ここで、３位のＸは、Ｌであり、そして１６位のＸは、Ａである（配列番号２）。
【００２３】
特定の例に従って、２０アミノ酸（ａａ）シグナルペプチドであるＥｐｘＬ−Ａは、配列番号１のアミノ酸配列を有し、ここで、３位のＸは、Ｆであり、そして１６位のＸは、Ａである（配列番号３）。
【００２４】
具体的には、本発明は、配列番号２、３、４及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するシグナルペプチドをコードする、シグナルペプチド又は核酸を提供する。
【００２５】
配列番号２：ＭＫＬＳＴＮＬＩＬＡＩＡＡＡＳＡＶＶＳＡ
配列番号３：ＭＫＦＳＴＮＬＩＬＡＩＡＡＡＳＡＶＶＳＡ
配列番号４：ＭＫＦＳＴＮＬＩＬＡＩＡＡＡＳＴＶＶＳＡ
配列番号５：ＭＫＬＳＴＮＬＩＬＡＩＡＡＡＳＴＶＶＳＡ
３位及び１６位におけるアミノ酸置換は、太字及び下線によって表される。
【００２６】
本発明に従うシグナルペプチドをコードする核酸分子は、ここでは、「シグナル配列」とも呼ばれる。
【００２７】
本発明に従う、上で具体的に規定されたリーダーは、配列番号１０のアミノ酸配列を有する。
【００２８】
配列番号１０：
ＭＫＸＳＴＮＬＩＬＡＩＡＡＡＳＸＶＶＳＡＡＰＶＡＰＡＥＥＡＡＮＨＬＨＫＲ、ここで、
３位のＸは、Ｆ又はＬのどちらかであり、
１６位のＸは、Ａ又はＴのどちらかである。
【００２９】
具体的には、本発明は、リーダー、又は配列番号１１、１２、１３及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーをコードする核酸を提供する。
【００３０】
配列番号１１：ＭＫＬＳＴＮＬＩＬＡＩＡＡＡＳＡＶＶＳＡＡＰＶＡＰＡＥＥＡＡＮＨＬＨＫＲ
配列番号１２：ＭＫＦＳＴＮＬＩＬＡＩＡＡＡＳＡＶＶＳＡＡＰＶＡＰＡＥＥＡＡＮＨＬＨＫＲ
配列番号１３：ＭＫＦＳＴＮＬＩＬＡＩＡＡＡＳＴＶＶＳＡＡＰＶＡＰＡＥＥＡＡＮＨＬＨＫＲ
配列番号１４：ＭＫＬＳＴＮＬＩＬＡＩＡＡＡＳＴＶＶＳＡＡＰＶＡＰＡＥＥＡＡＮＨＬＨＫＲ
３位及び１６位におけるアミノ酸置換は、太字及び下線によって表される。
【００３１】
例えば、３６アミノ酸（ａａ）切断型リーダーであるＥｐｘＬ−ＫＲは、配列番号１０のアミノ酸配列を有し、ここで、３位のＸはＬであり、そして１６位のＸは、Ａである。
【００３２】
特定の例に従い、３６アミノ酸（ａａ）リーダーペプチドであるＥｐｘＬ−ＫＲは、配列番号１０のアミノ酸配列を有し、ここで、３位のＸは、Ｆであり、そして１６位のＸは、Ａである（配列番号１２）。
【００３３】
配列番号１０、１１、１２、１３若しくは１４のアミノ酸配列を有する本発明のリーダー、又は１若しくは２の点変異を有するその機能的バリアントは、ここでは「切断型リーダー」と呼ばれる。
【００３４】
具体的には、切断型リーダーをコードする核酸は、配列番号２、３、４及び５からなる群から選択される、好ましくは配列番号２を除くシグナルペプチドをコードする核酸を含むか、又はこれらからなる。具体的には、切断型リーダーをコードする核酸は、配列番号１１、１２、１３、及び１４からなる群から選択されるリーダーペプチドをコードする核酸を含むか、又はこれらからなる。
【００３５】
具体的には、切断型リーダーは、配列番号２、３、４及び５からなる群から選択される、好ましくは配列番号２を除くシグナルペプチドを含むか、若しくはこれらからなるか、又は、配列番号１１、１２、１３、及び１４からなる群から選択されるリーダーペプチドからなる。
【００３６】
具体的に好ましい核酸は、配列番号３のアミノ酸配列のシグナルペプチド又は配列番号１２のリーダーペプチドをコードする；好ましくは、シグナルペプチド又はリーダーペプチドをコードする核酸配列は、それぞれ、配列番号１６又は配列番号１９である。具体的に好ましいリーダーは、配列番号３のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は配列番号１２のアミノ酸配列を有するリーダーペプチドである。
【００３７】
従って、本発明の特定の態様は、リーダー又はこのようなリーダーをコードする核酸を指し、これは、
ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、好ましくは、ここで、コード核酸は、配列番号１６のヌクレオチド配列、又は配列番号１６のコドン最適化バリアントからなる；又は
ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を有するか、含むか、又はこれからなるリーダーペプチド、好ましくはここで、コード核酸は、配列番号１９のヌクレオチド配列、又は配列番号１９のコドン最適化バリアントからなる、
である。
【００３８】
具体的には、本発明に従う核酸は、
ａ）シグナルペプチドをコードする、配列番号１５、１６及び１７からなる群から選択される、好ましくは、配列番号１５以外であるヌクレオチド配列、又は
ｂ）リーダーペプチドをコードする、配列番号１８、１９及び２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は
ｃ）配列番号１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０のコドン最適化バリアントであるヌクレオチド配列
を有する。
【００３９】
本発明の特定の核酸は、配列番号３のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドである、リーダーをコードする。好ましくは、ここで、この核酸は、配列番号１６のヌクレオチド配列、又は配列番号１６のコドン最適化バリアントからなる。
【００４０】
本発明の特定の核酸は、リーダーペプチド又は配列番号１２のアミノ酸配列を有する切断型リーダーであるリーダーをコードする。ここで、好ましくは、この核酸は、配列番号１９のヌクレオチド配列、又は配列番号１９のコドン最適化バリアントからなる。
【００４１】
配列番号１５：Ｐ．パストリス、ＣＢＳ７４３５株（ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  Ｆｕｎｇａｌ
Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ
Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、ユトレヒト、オランダ）から得られたヌクレオチド配列：
ＡＴＧＡＡＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＡＡＴＴＴＧＡＴＴＣＴＡＧＣＴＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＣＧＣＣＧＴＴＧＴＣＴＣＡＧＣＴ
配列番号１６：Ｐ．パストリスＣＢＳ７４３５株から実施例９に記載されるプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって得られる、実施例９において使用されるヌクレオチド配列。
【００４２】
ＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＴＡＣＣＡＡＴＴＴＧＡＴＴＣＴＡＧＣＴＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＣＧＣＣＧＴＴＧＴＣＴＣＡＧＣＴ
配列番号１７：Ｐ．パストリス、ＤＳＭＺ７０３８２株（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）から得られたヌクレオチド配列
ＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＴＡＣＣＡＡＴＴＴＧＡＴＣＴＴＡＧＣＴＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＣＡＣＴＧＴＴＧＴＣＴＣＡＧＣＴ
上の配列において変わっているヌクレオチドは、下線で示されている。
【００４３】
配列番号１８：Ｐ．パストリス、ＣＢＳ７４３５株（ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  Ｆｕｎｇａｌ
Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ
Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、ユトレヒト、オランダ）から得られるヌクレオチド配列
ＡＴＧＡＡＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＡＡＴＴＴＧＡＴＴＣＴＡＧＣＴＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＣＧＣＣＧＴＴＧＴＣＴＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＡＧＴＴＧＣＴＣＣＡＧＣＣＧＡＡＧＡＧＧＣＡＧＣＡＡＡＣＣＡＣＴＴＧＣＡＣＡＡＧＣＧＴ
配列番号１９：Ｐ．パストリスＣＢＳ７４３５株から実施例１及び５に記載されるプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって得られる、実施例５において使用されるヌクレオチド配列
ＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＴＡＣＣＡＡＴＴＴＧＡＴＴＣＴＡＧＣＴＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＣＧＣＣＧＴＴＧＴＣＴＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＡＧＴＴＧＣＴＣＣＡＧＣＣＧＡＡＧＡＧＧＣＡＧＣＡＡＡＣＣＡＣＴＴＧＣＡＣＡＡＧＣＧＴ
配列番号２０：Ｐ．パストリス、ＤＳＭＺ７０３８２株（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）から得られるヌクレオチド配列
ＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＴＡＣＣＡＡＴＴＴＧＡＴＣＴＴＡＧＣＴＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＣＡＣＴＧＴＴＧＴＣＴＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＡＧＴＴＧＣＴＣＣＡＧＣＣＧＡＡＧＡＧＧＣＡＧＣＡＡＡＣＣＡＣＴＴＧＣＡＣＡＡＧＣＧＴ
具体的には、本発明に従う核酸は、ＤＮＡである。
【００４４】
具体的には、本発明に従うリーダーは、ポリペプチドである。
【００４５】
特定の側面に従い、本発明は、単離されたリーダー、切断型リーダー、シグナルペプチド又はリーダーペプチドを提供し、好ましくは、このリーダーは、配列番号１、２、３、４、５、１０、１１、１２、１３及び１４からなる群から選択される、好ましくは配列番号２を除くアミノ酸配列を有する。
【００４６】
具体的に好ましいリーダーは、配列番号３又は配列番号１２のアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００４７】
別の側面に従い、本発明は、ＰＯＩをコードする核酸配列に作動可能に連結したリーダーをコードする核酸を含む発現カセットをさらに提供し、このリーダーは、
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は１若しくは２の点変異を有するその機能的バリアント、
ｂ）配列番号１１、１２、１３及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、
ｃ）配列番号１のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は１若しくは２の点変異を有するその機能的バリアント、並びに
ｄ）配列番号２、３、４及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するシグナルペプチド
からなる群から選択されることを特徴とし、好ましくは、ここで、配列番号２のアミノ酸配列からなるシグナルペプチドの、１以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又はこれらからなるポリペプチド、例えばナノボディとの融合は、除外される。
【００４８】
なお、特定の例に従い、本発明は、成長因子、ホルモン、サイトカイン、抗体及び抗体断片（特に、ここで抗体又は抗体断片は、ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、Ｆａｂ、Ｆｃ融合タンパク質、及び、完全長抗体、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ又はＩｇからなる群、好ましくは、完全長抗体、ｓｃＦｖ又はＦａｂからなる群から選択される）からなる群から選択されるＰＯＩと、配列番号１１、１２、１３及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチドとの融合、又は配列番号２、３、４及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するシグナルペプチドとの融合を提供し、具体的には、配列番号２のアミノ酸配列からなるシグナルペプチドと、このような抗体又は抗体断片のいずれか、具体的には、完全長抗体、ｓｃＦｖ又はＦａｂのいずれかとの融合が挙げられる。
【００４９】
発現カセットにおいて使用されるシグナル又はリーダーペプチドをコードする具体的に好ましいヌクレオチド配列は、配列番号３又は配列番号１２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から成り、好ましくは、配列番号１６又は配列番号１９からなるか、又は配列番号１６又は配列番号１９のコドン最適化バリアントからなる。このようなシグナル又はリーダーペプチドは、好ましくは、任意の抗体又は抗体断片を含めた任意のＰＯＩに融合し、具体的には、配列番号３又は配列番号１２のアミノ酸配列からなるシグナルペプチド又はリーダーペプチドと１以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又はこれらからなるポリペプチド、例えばナノボディとの融合物を含む。
【００５０】
別の側面に従い、本発明は、
ａ）シグナルペプチドをコードする、配列番号１５、１６及び１７からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は
ｂ）リーダーペプチドをコードする、配列番号１８、１９及び２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は
ｃ）配列番号１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０のコドン最適化バリアントであるヌクレオチド配列、
を含む発現カセットをさらに提供し、好ましくは、ここで、配列番号１５のヌクレオチド配列が１以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばナノボディをコードするヌクレオチド配列に融合した融合構築物は、除外される。
【００５１】
なお、特定の例に従って、本発明は、配列番号１５のヌクレオチド配列が、ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、Ｆａｂ、Ｆｃ融合タンパク質及び完全長抗体、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ又はＩｇＥからなる群から選択される、好ましくは、完全長抗体、ｓｃＦｖ又はＦａｂからなる群から選択される抗体又は抗体断片をコードするヌクレオチド配列と融合した融合構築物を、提供する。
【００５２】
具体的に好ましいヌクレオチド配列は、配列番号３のシグナルペプチドをコードする配列番号１６である。
【００５３】
別の具体的に好ましいヌクレオチド配列は、配列番号１２のリーダーペプチドをコードする配列番号１９である。
【００５４】
従って、特定の例に従い、本発明は、配列番号１６又は１９のヌクレオチド配列が任意の目的のタンパク質（例えば、具体的には、ここではＰＯＩと記載され、任意の抗体又は抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない）をコードするヌクレオチド配列と融合した融合構築物を提供し、具体的には、ＰＯＩが１以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばナノボディを含むか又はこれらからなるポリペプチドである融合構築物を含む。
【００５５】
本発明に従う発現カセットにより、ＰＯＩ、具体的には、正しいネイティブのＮ末端アミノ酸残基を有する（特に、Ｎ末端に追加のアラニンを有さない）分泌された成熟ＰＯＩの発現を提供することが、初めて可能になった。
【００５６】
具体的には、ＰＯＩは、抗体又はその断片、酵素及びペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質結合体、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン及びワクチン様タンパク質又は粒子、プロセス酵素、成長因子、ホルモン並びにサイトカインが挙げられる治療用タンパク質から選択されるか、又はここで、このＰＯＩは、好ましくは抗体又はその断片、成長因子、ホルモン及びサイトカインからなる群から選択される、宿主細胞代謝物の産生を媒介する。
【００５７】
特定の例に従い、抗体又はその断片は、ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、Ｆａｂ、Ｆｃ融合タンパク質及び完全長抗体、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ又はＩｇＥからなる群から選択され、好ましくは、完全長抗体、ｓｃＦｖ又はＦａｂからなる群から選択される。
【００５８】
具体的には、本発明に従う発現カセットは、本発明に従う核酸とＰＯＩをコードする核酸との融合物であり、それ自体で天然に存在しない核酸である。本発明は、本発明に従うリーダーとＰＯＩとの融合タンパク質であり、それ自体で天然に存在しない融合タンパク質を、さらに提供する。
【００５９】
従って、リーダーは、ＰＯＩの産生の改善、例えば、分泌量の増大のために、及び、質の改善、例えば正しいＮ末端のために操作されており、先行技術のリーダーとは異なるリーダーを使用する。
【００６０】
本発明に従う発現カセットは、具体的に、シグナルペプチド又はＡＰＶＡＰＡＥＥＡＡＮＨＬＨＫＲ（配列番号７）からなるプロ配列によって伸長されたシグナルペプチドのどちらかからなるリーダー配列をコードする。このプロ配列は、Ｐ．パストリスＥｐｘ１タンパク質のネイティブの完全長リーダーの一部、すなわち、以下の配列番号８：ＭＫＦＳＴＮＬＩＬＡＩＡＡＡＳＴＶＶＳＡＡＰＶＡＰＡＥＥＡＡＮＨＬＨＫＲＡＹＹＴＤＴＴＫＴＨＴＦＴＥＶＶＴＶＹＲＴ
の５７のアミノ酸配列のアミノ酸２１〜３６と同一の１６のアミノ酸配列である。
【００６１】
両方のリーダー、シグナルペプチド及び本発明の切断型リーダーは、驚くべきことに、先行技術のリーダー（例えば、ここではＥｐｘＬ−ＡＡとも呼ばれ（２１アミノ酸）：ＵＳ２０１１／００２１３７８Ａ１に従う配列番号２１：ＭＫＬＳＴＮＬＩＬＡＩＡＡＡＳＡＶＶＳＡＡ）を凌ぐ、予期せぬ改善された特性を有することが判明した。
【００６２】
さらに、ＥＰ２２５８８５５Ａ１に記載される、配列番号８の５７アミノ酸配列であるＰ．パストリスＥｐｘ１タンパク質の完全長リーダー、又は３位におけるロイシンによるそのバリアントと比較して、改善された特性が示され得る。
【００６３】
このことは、より驚くべきことであった。何故なら、プロ配列又は切断型リーダーを有さない、本発明に従う２０アミノ酸のシグナルペプチドは、それぞれ、完全長リーダーの３５％及び６３％の長さしか有さないからである。
【００６４】
本発明のリーダーは、アルファ接合因子（αＭＦ）リーダーとの融合と比較して、ＰＯＩと融合する場合に、具体的には、ＰＯＩが、ホルモン、サイトカイン、抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、Ｆａｂ、Ｆｃ融合タンパク質、及び完全長抗体、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ又はＩｇＥからなる群から、好ましくは、完全長抗体、ｓｃＦｖ又はＦａｂからなる群から選択される）である場合、特定の利点、例えばＰＯＩの分泌の増大及び／又は質の改善、例えば正しいＮ末端を有する。
【００６５】
本発明に従う発現カセットは、ＥＰ２２５８８５５Ａ１に記載されるＰ．パストリスＥｐｘ１タンパク質のネイティブのリーダー（配列番号８）をコードする核酸を、明白に除外する。
【００６６】
本発明に従う発現カセットはさらに、Ｐ．パストリスＥｐｘ１タンパク質の完全長リーダーのアミノ酸１〜２１を有するリーダーをコードする核酸、すなわちＵＳ２０１１／００２１３７８Ａ１に記載される配列番号１１を、明白に除外する。
【００６７】
本発明の特定の側面に従い、発現カセットは、任意に、発現構築物、例えばベクター内に、組み込まれる。
【００６８】
さらなる本発明の特定の側面に従い、発現カセット又は発現構築物は、リーダーをコードする核酸に作動可能に連結したプロモーターを含む。
【００６９】
本発明の特定の態様に従い、本発明は、本発明に従う発現カセットを含む組換え酵母宿主細胞、具体的には、酵母宿主細胞株、より具体的には、生産細胞株を提供する。本発明の特定の側面に従い、本発明に従う発現カセットは、ベクター、又はベクターの一部である。
【００７０】
好ましくは、酵母は、ピキア属、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、アークスラ属（Ａｒｘｕｌａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、オガテア属（Ｏｇａｔｅａ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、コマガタエラ属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）、好ましくは、メチロトローフ酵母、及び特に好ましいＰ．パストリス、コマガタエラ・パストリス、Ｋ．ファフィ（Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ）又はＫ．シュードパストリス（Ｋ．ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ）からなる群の属から選択される。
【００７１】
別の特定の態様に従い、本発明は、酵母宿主細胞においてＰＯＩを産生する方法を提供し、この方法は、
本発明の宿主細胞を準備すること、
上記宿主細胞を培養し、上記ＰＯＩを発現させること、及び
上記ＰＯＩを精製し、精製ＰＯＩの調製を得ること
を含む。
【００７２】
本発明に従い、発現カセットは、好ましくは、酵母宿主細胞において組換え遺伝子の分泌を促進するために使用され、それによって、分泌産物の収量を増大する。
【００７３】
従って、本発明に従う発現カセットは、この発現カセットによって形質転換された宿主細胞におけるＰＯＩの効率的な発現及び分泌を提供する。この点において、本発明に従う発現カセットは、酵母発現カセットと理解される。
【００７４】
具体的に、このＰＯＩは、組換えタンパク質である。この語は、ここで常に、ポリペプチド及びタンパク質の両方、例えば組換え宿主細胞によって産生されるものを含むと理解される。ＰＯＩは、異種タンパク質、例えば酵母とは異種の、例えば、より高度な真核生物、例えばヒトに由来するタンパク質、若しくはＰ．パストリス以外の酵母種に由来するタンパク質、又は人工のポリペプチド若しくはタンパク質など、であってもよい。或いは、ＰＯＩは、酵母、例えばＰ．パストリスに由来する同種のタンパク質であってもよい。
しかし、これは、本発明に従うベクターによって形質転換されていないネイティブの酵母によっては発現されない又は所望の量で発現されないが、本発明に従う組換え酵母宿主細胞によって、所望の量で発現される（例えば、有為な量のＰＯＩ又は代謝産物を産生するように過剰発現される）。
【００７５】
具体的には、ＰＯＩは、ネイティブのＮ末端アミノ酸配列を有するアミノ酸配列を有する。このＰＯＩは、好ましくは、Ｎ末端アミノ酸残基として追加のアラニンを含まないアミノ酸配列を含む。具体的には、このＰＯＩは、リーダー配列に由来する追加のＮ末端アミノ酸残基を有さない。このことは、組換えタンパク質産生の質及び産生の容易さにおいて、特に重要である。
【００７６】
具体的には、上記ＰＯＩは、分泌ポリペプチド又はタンパク質であり、これは、可溶性の細胞外分子又は膜結合分子を含む。
【００７７】
具体的には、上記ＰＯＩは、治療用タンパク質から選択され、これは、抗体又はその断片、酵素及びペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質結合体、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン及びワクチン様タンパク質又は粒子、プロセス酵素、成長因子、ホルモン並びにサイトカインを含む。又は、上記ＰＯＩは、宿主細胞代謝産物の産生を媒介する。ＰＯＩはまた、宿主細胞代謝産物の産生を媒介する発現産物であってもよい。
【００７８】
具体的には、ＰＯＩは、成長因子、ホルモン、サイトカイン、抗体及び抗体断片、好ましくは、完全長抗体、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ又はＩｇＥなど、ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、Ｆａｂ及びＦｃ融合タンパク質からなる群、好ましくは、完全長抗体、ｓｃＦｖ又はＦａｂからなる群から選択される。
【００７９】
具体的には、ＰＯＩは、アラニン以外のＮ末端アミノ酸残基を含む。従って、先行技術（ＥＰ２２５８８５５Ａ１）において予測されたＶＳＡ−ＡＰ（配列番号６）のシグナルペプチダーゼ切断部位は存在しない。
【００８０】
具体的には、ＰＯＩは、分泌タンパク質、例えばタンパク質の活性な形態又は前駆形態であり得る成熟タンパク質であってもよい。
【００８１】
本発明に従う方法は、好ましくは、培養細胞における宿主細胞の培養を提供し、そして上記ＰＯＩ又は代謝産物が、例えば、分泌ＰＯＩとして得られ、これは、膜結合の若しくは可溶性若しくは細胞外のタンパク質又は代謝産物を含み、これらは、任意に、細胞培養上清から精製される。
【００８２】
さらなる側面に従い、本発明は、宿主細胞からのＰＯＩの分泌のために、及び／又は宿主細胞からのＰＯＩの分泌の増大のために、好ましくは、分泌ＰＯＩの少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、又は１００％がネイティブのＮ末端アミノ酸配列を含む、本発明の核酸又はリーダーの使用を提供し、特に、本発明のシグナルペプチド又は切断型リーダーをコードする核酸を、提供する。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１：プロモーター配列ｐＧ１：配列番号９。
【図２−１】図２．１：Ｐ．パストリス分泌ｐＴＲＰの還元した上清の、それぞれＥｐｘＬ−ＲＴ又はＭＦαによる銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図２−２】図２．２：Ｐ．パストリス分泌ｅＧＦＰの還元した上清の、ＥｐｘＬ−ＲＴ又はＭＦαによる銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図２−３】図２．３：Ｐ．パストリス分泌ＨＳＡの還元した上清の、それぞれＥｐｘＬ−ＲＴ又はＭＦαによる抗ＨＳＡウェスタンブロット。
【図３】図３：Ｐ．パストリス分泌ＨＳＡの上清の、Ｎ末端配列決定のための、ＥｐｘＬ−ＲＴによるクーマシー染色ウェスタンブロット。
【図４−１】図４．１：Ｐ．パストリス分泌ｐＴＲＰの還元した上清の、それぞれＥｐｘＬ−ＲＴ、ＥｐｘＬ−ＫＲ又はＭＦαによる銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図４−２】図４．２：Ｐ．パストリス分泌ｅＧＦＰの還元した上清の、それぞれＥｐｘＬ−ＫＲ又はＭＦαによる銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図４−３】図４．３：それぞれＥｐｘＬ−ＫＲによる、Ｐ．パストリス分泌ＨｙＨＥＬ重鎖又はＨｙＨＥＬ軽鎖の上清。ＨＣ：抗ＩｇＧガンマ鎖抗体を用いるウェスタンブロット；ＬＣ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色。
【図５−１】図５．１：Ｐ．パストリス分泌ｅＧＦＰの還元した上清の、それぞれ、ＥｐｘＬ−ＫＲ、ＥｐｘＬ−ＡＡ又はＥｐｘＬ−Ａによる銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図５−２】図５．２：Ｐ．パストリス分泌ＬＣの還元した上清の、それぞれ、ＥｐｘＬ−ＫＲ、ＥｐｘＬ−ＡＡ又はＥｐｘＬ−Ａによる銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図５−３】図５．３：ｐＧ１の制御下のＰ．パストリス分泌ＨｙＨＥＬ  Ｆａｂの還元しない上清の、それぞれ、ＥｐｘＬ−Ａ又はＭＦαによるウェスタンブロット。
【図６】図６：それぞれ、ｐＧ１の制御下のＰ．パストリス分泌ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ヒトソマトトロピン、インターフェロンアルファ２ａ、３つの異なる抗体断片Ｆａｂ１、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、及び２つの異なる単一鎖Ｆｖ抗体断片ｓｃＦｖ１及びｓｃＦｖ２の上清の、ＥｐｘＬ−Ａによるウェスタンブロット。
【発明の詳細な説明】
【００８４】
明細書を通して使用される特定の用語は、以下の意味を有する。
【００８５】
ここで使用される用語「細胞株」は、延長された時間にわたって増殖する能力を獲得している特定の細胞の種類の確立されたクローンを指す。用語「宿主細胞株」は、内因性の若しくは組換えの遺伝子又はこのようなポリペプチドによって媒介されるポリペプチド若しくは細胞代謝産物を産生するための代謝経路の産物を発現するために使用される細胞株を指す。「産生宿主細胞株」又は「産生細胞株」は、産生プロセスの産物、例えばＰＯＩを得るための、バイオリアクターにおける培養のための即時使用用の細胞株であることが、一般に理解されている。用語「酵母宿主」又は「酵母細胞株」又は「酵母宿主細胞」又は「宿主細胞」又は「宿主」は、ＰＯＩ又は宿主細胞代謝産物を産生するために培養され得る、任意の酵母細胞を意味する。
【００８６】
用語「発現」又は「発現系」又は「発現カセット」は、発現産物、例えばＰＯＩの所望のコード配列及び制御配列、例えば作動可能な連結下にあるプロモーターを含むことによって、これらの配列によって形質転換されたか又はトランスフェクトされた宿主が、コードされたタンパク質又は宿主細胞代謝産物を産生することができる、核酸分子を指す。形質転換に作用するため、この発現系は、ベクターに含まれていてもよい；しかし、関連するＤＮＡはまた、宿主染色体に組み込まれていてもよい。発現は、分泌又は非分泌の、ポリペプチド又は代謝産物を含む発現産物を指してもよい。具体的には、この用語は、例えば、ベクターによって運ばれて宿主細胞に導入された外来性のＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現について、好適な条件下の宿主細胞及び適合性のベクターを指す。
【００８７】
ここで使用される「発現構築物」又は「ベクター」は、好適な宿主生物において、クローニングした組換えヌクレオチド配列すなわち組換え遺伝子の転写及びそのｍＲＮＡの翻訳のために必要とされるＤＮＡ配列として定義される。発現ベクターは、発現カセットを含み、そしてさらに、一緒に作動可能に連結した、宿主細胞又はゲノム組み込み部位における自律複製のための起点、１以上の選択可能マーカー（例えば、アミノ酸合成遺伝子又は抗生物質、例えばゼオシン、カナマイシン、Ｇ４１８若しくはヒグロマイシンに対する抵抗性を付与する遺伝子）、いくつかの制限酵素切断部位、好適なプロモーター配列及び転写ターミネーターを通常含む。ここで使用される用語「プラスミド」及び「ベクター」は、自律複製するヌクレオチド配列、並びにゲノムに組み込まれるヌクレオチド配列を含む。
【００８８】
具体的には、この用語は、これによって、ＤＮＡ又はＲＮＡの配列（例えば外来性遺伝子）が宿主細胞に導入されて、宿主を形質転換させ、そして導入した配列の発現（例えば転写及び翻訳）を促進し得る、ビヒクルを指す。プラスミドは、本発明の好ましいベクターである。
【００８９】
ベクターは、典型的には、外来性のＤＮＡが挿入されている、感染因子であるＤＮＡを含む。ＤＮＡの１つのセグメントをＤＮＡの別のセグメント内に挿入する一般的方法は、制限部位と呼ばれる特定の部位（ヌクレオチドの特定の群）でＤＮＡを切断する、制限酵素と呼ばれる酵素の使用を含む。「カセット」は、所定の制限部位にてベクター内に挿入され得るＤＮＡコード配列又は発現産物をコードするＤＮＡのセグメントを指す。カセット制限部位は、正確なリーディングフレーム内でのカセットの挿入を保証するように設計される。一般に、外来性のＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１以上の制限部位にて挿入され、次いで、ベクターによって感染性ベクターＤＮＡと共に宿主細胞内に運ばれる。挿入されたか又は付加されたＤＮＡを有するＤＮＡのセグメント又は配列、例えば発現ベクターはまた、「ＤＮＡ構築物」とも呼ばれる。一般的な種類のベクターは、「プラスミド」であり、これは、一般に、二本鎖ＤＮＡの自己完結型分子であり、追加の（外来性の）ＤＮＡを容易に受け入れ、好適な宿主細胞内に容易に導入され得る。プラスミドベクターは、多くの場合、コードＤＮＡ及びプロモーターＤＮＡを含み、そして、外来性のＤＮＡを挿入するために好適な、１以上の制限部位を有する。コードＤＮＡは、特定のポリペプチド又はタンパク質、例えばＰＯＩについての特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、コードＤＮＡの発現を開始するか、調節するか、又はそれ以外で媒介するか若しくは制御するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡ及びコードＤＮＡは、同じ遺伝子由来であっても、又は異なる遺伝子由来であってもよく、同じ又は異なる生物由来であってもよい。組換えクローニングベクターは、多くの場合、クローニング又は発現のための１以上の複製系、宿主における選別のための１以上のマーカー、例えば抗生物質抵抗性、及び１以上の発現カセットを含む。
【００９０】
例えば配列番号１のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドなどの本発明に従う調節配列に関して、又は配列番号１０のアミノ酸配列を有するリーダーに関して、ここで使用される用語「機能的バリアント」は、アミノ酸配列において１又は２の点変異を有し、非改変配列と比較して実質的に同じシグナル又はリーダーの活性を有する、これらのバリアントを指す。本発明の核酸の機能的バリアントは、任意の本発明のシグナルペプチド又はリーダーをコードするコドン最適化配列（ここではまた「コドン最適化バリアント」とも呼ばれる）を、さらに含む。核酸のこのようなコドン最適化は、異種の系において発現される組換えＤＮＡにおける、発現のために使用される生物におけるコドン使用頻度のパターンに適合させるための、コドンの体系的改変として理解される。本発明は、具体的には、発現されたタンパク質の収量を増大するものである。
【００９１】
ここで使用される用語「シグナルペプチド」、「リーダー」又は「切断型リーダー」は、常に、それぞれ配列番号１及び配列番号１０の特定のアミノ酸、並びにまた、１又は２の点変異を有するその機能的バリアントを指すものと理解される。
【００９２】
ここで使用される用語「実質的に同じシグナル又はリーダーの活性」は、組換え宿主細胞による上清へのＰＯＩの実質的に同じ分泌によって示される活性を指す；例えば、上清におけるＰＯＩレベルが、それぞれ配列番号１又は配列番号１０のリーダーによって提供される上清におけるＰＯＩレベルの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％である。
【００９３】
点変異は、１以上の単一（非連続の）アミノ酸の異なるアミノ酸への置換又は交換によって非操作アミノ酸配列と異なっているアミノ酸配列の発現をもたらすポリヌクレオチドの操作として理解される。好ましい機能的バリアントは、それぞれ配列番号１及び配列番号１０の３位及び１６位において、１以上の点変異を有する。
【００９４】
さらに好ましい点変異は、同じ極性及び／又は電荷のアミノ酸の交換を指す。この点において、アミノ酸は、６４のトリプレットコドンによってコードされる２０の天然に存在するアミノ酸を指す。これらの２０のアミノ酸は、中性の電荷、正の電荷、及び負の電荷を有するものに分類されてもよい：
「中性」のアミノ酸は、そのそれぞれの３文字及び１文字のコード並びに極性と共に、以下に示される：
アラニン：（Ａｌａ、Ａ）非極性、中性；
アスパラギン：（Ａｓｎ、Ｎ）極性、中性；
システイン：（Ｃｙｓ、Ｃ）非極性、中性；
グルタミン：（Ｇｌｎ、Ｑ）極性、中性；
グリシン：（Ｇｌｙ、Ｇ）非極性、中性；
イソロイシン：（Ｉｌｅ、Ｉ）非極性、中性；
ロイシン：（Ｌｅｕ、Ｌ）非極性、中性；
メチオニン：（Ｍｅｔ、Ｍ）非極性、中性；
フェニルアラニン：（Ｐｈｅ、Ｆ）非極性、中性；
プロリン：（Ｐｒｏ、Ｐ）非極性、中性；
セリン：（Ｓｅｒ、Ｓ）極性、中性；
トレオニン：（Ｔｈｒ、Ｔ）極性、中性；
トリプトファン：（Ｔｒｐ、Ｗ）非極性、中性；
チロシン：（Ｔｙｒ、Ｙ）極性、中性；
バリン：（Ｖａｌ、Ｖ）非極性、中性；及び
ヒスチジン：（Ｈｉｓ、Ｈ）極性、正（１０％）中性（９０％）。
【００９５】
「正」に荷電したアミノ酸は：
アルギニン：（Ａｒｇ、Ｒ）極性、正；及び
リシン：（Ｌｙｓ、Ｋ）極性、正である。
【００９６】
「負」に荷電したアミノ酸は：
アスパラギン酸：（Ａｓｐ、Ｄ）極性、負；及び
グルタミン酸：（Ｇｌｕ、Ｅ）極性、負である。
【００９７】
核酸、ＰＯＩ又は他の化合物に関してここで使用される用語「単離された」又は「単離」は、天然に関連する環境から十分に分離されていて、「実質的に純粋な」形態で存在する化合物を指すものとする。「単離された」は、他の化合物若しくは材料との人工すなわち合成の混合物、又は基本的な活性に干渉しない不純物の存在の除外を必ずしも意味するとは限らず、これらは、例えば、不完全な精製に起因して存在していてもよい。特に、本発明の単離された核酸分子はまた、化学的に合成されたものを含むことをも意味する。本発明の核酸に関して、用語「単離された核酸」は、時々使用される。この用語は、ＤＮＡに適用される場合、それが由来する生物の天然に存在するゲノムにおいてそれがすぐ連続している配列から分離されているＤＮＡ分子を指す。例えば、「単離された核酸」は、ベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクター内に挿入されたか、又は原核生物若しくは真核生物の細胞又は宿主生物のゲノムＤＮＡ内に組み込まれたＤＮＡ分子を含んでもよい。具体的には、本発明に従う用語「単離された核酸」は、ＥＰＸ１タンパク質をコードする核酸が、本発明に従うリーダーをコードする核酸に連結されることを除外する。ＲＮＡに適用される場合、用語「単離された核酸」は、主に、上で定義された単離されたＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子を指す。或いは、この用語は、その天然の状態（すなわち、細胞内又は組織内）において関連している他の核酸から十分に分離されているＲＮＡ分子を指してもよい。「単離された核酸」（ＤＮＡ又はＲＮＡのどちらか）は、生物学的又は合成的な手段によって、直接的に産生され、その産生の間に存在した他の成分から分離される分子を、さらに表す。
【００９８】
ここで使用される用語「リーダー」は、以下のように理解される。本発明の発現カセットにおけるポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、ＰＯＩの分泌を指向する、分泌又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域に関連し得る。分泌経路へと運命付けられたタンパク質は、初期のタンパク質鎖の粗面小胞体を横切る運び出しが一旦開始されたら成熟タンパク質から切断される、Ｎ末端リーダー配列を有する。リーダーは、発現されたタンパク質の、細胞膜に向かって、又は細胞膜の外側への輸送を誘導し、それによって、発現されたタンパク質が分離され、そして精製されることを容易にする。一般に、ペリプラズム空間、細胞膜又は細胞外に輸送される膜タンパク質又は分泌タンパク質は、このようなＮ末端配列を含む。通常、リーダーは、タンパク質が輸送された後、特定化細胞性ペプチダーゼによってタンパク質から切断される。
【００９９】
真核生物細胞によって分泌されたタンパク質は、一般に、このタンパク質のＮ末端に融合したリーダー配列を有し、これは、完全な、すなわち「完全長の」タンパク質から切断されて、このタンパク質の分泌又は「成熟」形態を産生する。
【０１００】
本発明に従うリーダーの特定の例は、シグナルペプチドからなるリーダー、又はシグナルペプチド及びプロ配列からなるリーダー、例えばここで記載される切断型リーダーである。配列番号１のシグナルペプチドからなるリーダー、又は配列番号１０の切断型リーダーは、ここでまた、本発明に従う調節配列とも呼ばれる。
【０１０１】
ここで使用される用語は、特に、ＰＯＩ発現の改変を可能にするための制御配列を指す。リーダー（リーダーペプチドとも呼ばれる）は、ＰＯＩアミノ酸配列のＮ末端に連結される。リーダーをコードする核酸は、ＰＯＩをコードする核酸配列の５’末端よりも上流であり、これに作動可能に連結している。選択した宿主細胞において機能する、本発明に従う任意のリーダー配列が、使用されてもよい。
【０１０２】
用語「ネイティブのＮ末端アミノ酸残基」又は「ネイティブのＮ末端アミノ酸配列」は、Ｎ末端配列の１以上のアミノ酸、例えば挙げられたＰＯＩのＮ末端アミノ酸残基を指すものと理解される。このアミノ酸残基は、発現される挙げられたＰＯＩの配列と比較した場合に、正しいものであると考えられる。従って、ネイティブのＮ末端アミノ酸残基は、正しい完全なアミノ酸配列を得るために、例えばＰＯＩに対し外来性である追加の（余分な）Ｎ末端アミノ酸残基を有さない機能的化合物を得るために必須であるＰＯＩのネイティブのＮ末端又はＮ末端領域を提供する。典型的には、任意の野生型タンパク質は、ネイティブのＮ末端アミノ酸残基を有すると理解される。また、組換えタンパク質もまた、タンパク質の所望の特性を呈示する、前に定義されたネイティブのＮ末端アミノ酸残基を有してもよい。
【０１０３】
具体的には、本発明のシグナルペプチド又は切断型リーダーがＰＯＩのネイティブのＮ末端アミノ酸残基に直接結合する場合、遊離したタンパク質は、少なくとも一定の程度、天然のＮ末端アミノ酸残基を含み、そして典型的には、可変長のＮ末端伸長を含まない。
ＰＯＩの好ましい組成物は、少なくとも一定の程度、好ましくは、ＰＯＩ分子の大部分、又はＰＯＩ分子の少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、若しくは１００％（ｗ／ｗ）、Ｎ末端に追加のアミノ酸残基を有することなく、例えばシグナルペプチド若しくはプロ配列、又はその断片に由来するように、正しいＮ末端を含むネイティブのＮ末端アミノ酸残基によって特徴付けられる。
【０１０４】
ここで使用される用語「プロ配列」は、ＰＯＩのＮ末端に作動可能に連結した前駆体アミノ酸配列を指すものとする。プロ配列はまた、プロ配列のＮ末端に作動可能に連結したシグナル配列を有してもよい。典型的には、プロ配列は、ＰＯＩから切断され、ＰＯＩの成熟形態を残す。
【０１０５】
本発明に従うプロ配列の特定の例は、切断型リーダーの一部であり、以下のアミノ酸配列を有し：
配列番号７：ＡＰＶＡＰＡＥＥＡＡＮＨＬＨＫＲ
すなわち、切断型プロ配列：配列番号１０の切断型リーダー配列のアミノ酸２１〜３６である。
【０１０６】
ここで使用される用語「作動可能に連結する」は、１以上のヌクレオチド配列の機能がこの核酸分子上に存在する少なくとも１の他のヌクレオチド配列によって影響を受ける方法での、単一核酸分子、例えばベクターの上の、ヌクレオチド配列の結合を指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に作用可能である場合、組換え遺伝子のこのコード配列と作動可能に連結する。さらなる例として、シグナルペプチドをコードする核酸は、タンパク質を、分泌形態、例えば成熟タンパク質の前駆形態又は成熟タンパク質で発現可能である場合、ＰＯＩをコードする核酸配列に作動可能に連結する。具体的には、互いに作動可能に連結したこのような核酸は、直接に、すなわち、シグナルペプチドをコードする核酸とＰＯＩをコードする核酸配列との間にさらなる要素又は核酸配列を有することなく、連結されてもよい。
【０１０７】
ここで使用される「プロモーター」は、コード配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。プロモーター活性は、その転写効率によって評価されてもよい。これは、例えば、プロモーターからのｍＲＮＡ転写の量のノーザンブロッティングによる測定により直接決定されてもよいか、又は、プロモーターから発現された遺伝子産物の量の測定によって、間接的に決定されてもよい。
【０１０８】
ここで使用される用語「目的のタンパク質（ＰＯＩ）」は、宿主細胞において組換え技術によって産生されたポリペプチド又はタンパク質を指し、組換えＰＯＩ又は組換え宿主細胞によって産生されたＰＯＩとも呼ばれる。より具体的には、組換えＰＯＩは、宿主細胞において天然に存在しない、すなわち、異種タンパク質であってもよく、又はさもなければ、宿主細胞に対してネイティブである、すなわち、宿主細胞と同種のタンパク質であってもよいが、例えば、ＰＯＩをコードする核酸配列を有する自己複製ベクターによる形質転換によって、又はＰＯＩをコードする核酸配列の１以上のコピーの組換え技術による宿主細胞のゲノムへの組み込みの際に、又は例えばプロモーター又はシグナル配列のＰＯＩをコードする遺伝子の発現を制御する１以上の調節配列の組換え改変によって、産生される。特定の場合において、異種又は同種のどちらかのＰＯＩである組換えＰＯＩは、組換え宿主細胞によって過剰発現され、高収量の産物を得ている。いくつかの場合、ここで使用される用語ＰＯＩはまた、組換え的に発現されたタンパク質によって媒介された宿主細胞による任意の代謝産物を指す。
【０１０９】
ここで使用される用語「分泌」は、ポリペプチド又はタンパク質、具体的にはＰＯＩの、宿主植物細胞の細胞膜及び細胞壁の両方を横切った移行を指す。分泌ＰＯＩは、細胞壁の中につなぎ止められている膜結合タンパク質として細胞膜の一部であってもよく、又は、細胞上清に可溶性タンパク質として放出されてもよい。
【０１１０】
ＰＯＩに関してここで使用される用語「分泌」は、具体的には、膜結合ＰＯＩ又は細胞外ＰＯＩのどちらかのＰＯＩの成熟形態（活性タンパク質の前駆形態又は活性タンパク質を含む）での発現を含むことが、理解される。
【０１１１】
ここで使用される用語「組換え」は、「遺伝子操作によって調製されるか、又は遺伝子操作の結果」を意味する。従って、「組換え微生物」は、少なくとも１の「組換え核酸」を含む。組換え微生物は、具体的には発現ベクター又はクローニングベクターを含むか、又は、組換え核酸配列を含むように遺伝子操作されている。「組換えタンパク質」は、宿主においてそれぞれの組換え核酸を発現することによって産生される。
【０１１２】
本発明の核酸分子又はペプチド／ポリペプチド／タンパク質は、好ましくは、組換え体であり、リーダーとＰＯＩとの融合のために提供される。ここで使用される「組換え」は、例えば、化学的合成又は遺伝子操作技術による核酸の単離されたセグメントの操作による、そうでなければ分離されている２つの配列のセグメントの人工的な組合せを指す。「組換え」はまた、異種核酸の導入により改変されている、細胞又は発現カセット、又はそのように改変されている細胞に由来する細胞に対する言及をも含むが、天然に存在する事象（例えば、自発的変異、天然の形質転換／形質導入／転移）、例えば熟考したヒトの介入によらずに起こるものによる細胞又はベクターの変化を含まない。
【０１１３】
ここで使用される用語「シグナル配列」は、タンパク質の輸送を指示する、通常は短い（３〜６０アミノ酸長）ペプチド鎖であるシグナルペプチドをコードする核酸を指すものとする。シグナルペプチドはまた、標的化シグナル、運搬ペプチド又は局在化シグナルとも呼ばれる。シグナルペプチドは、具体的には発現されたタンパク質の、分泌経路に沿った輸送を誘導する。一般に、ペリプラズム空間、細胞膜又は細胞外に輸送される膜タンパク質又は分泌タンパク質は、このようなＮ末端シグナル配列を含む。通常、シグナルペプチドは、初期のタンパク質鎖の小胞体への移行が一旦達成されると、シグナルペプチダーゼによって、成熟タンパク質から切断される。
【０１１４】
本発明に従って使用されるシグナルペプチドの特定の例は、配列番号１のシグナルペプチド、又は１若しくは２の点変異を有するその機能的バリアントである。本発明に従って使用されるシグナルペプチドは、典型的には、配列番号６の切断部位の存在がなくとも、アミノ酸Ａｌａ２０の後の切断を提供する、本来の特徴を有する。
【０１１５】
シグナルペプチドは、典型的には、ＰＯＩをコードする核酸配列が続き、任意にシグナル配列の下流及びＰＯＩコード配列の上流にプロ配列を有する、核酸配列によってコードされる。
【０１１６】
ここで使用される用語「実質的に純粋」又は「精製された」は、化合物、例えば核酸分子又はＰＯＩの少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％を含む調製物を指す。純度は、化合物に適した方法（例えば、クロマトグラフィー方法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）によって、測定される。
【０１１７】
本発明に従う特定のシグナルペプチドをコードする新規な単離された核酸を、同定し、そして性質決定して、シグナルペプチドが、続くアミノ酸残基から独立したＣ末端における切断を提供する本来の特性を組み込むことが見出されたことは、驚くべきことであった。これは、ここでは、Ｃ末端における「本来の分泌部位」とも呼ばれた。従って、一旦リーダーが切断されると、シグナルペプチド配列に続くアミノ酸配列は、正確な、ネイティブのＮ末端アミノ酸配列を有する。
【０１１８】
予期せぬことに、本発明に従うシグナルペプチドをコードする核酸を用いる場合、ネイティブのＰ．パストリスＥｐｘ１リーダーのシグナル配列とプロ配列との間、すなわち、２０位と２１位との間に位置することが当該分野で公知である、シグナルペプチダーゼについての切断部位：ＶＳＡ−ＡＰ（配列番号６）のハイフンで示される切断部位は、省略できる。従って、改善された発現系は、ＰＯＩの正しいネイティブのＮ末端アミノ酸残基を提供され得た。これは、具体的には、Ｎ末端アミノ酸残基として追加のアラニンを含まず、少なくとも一定の程度、例えば、ＰＯＩ分子の殆どがネイティブのＮ末端配列を１００％まで含んだ（ＬＣ−ＭＳによって決定された場合）。
【０１１９】
従って、２０アミノ酸のシグナルペプチドをコールする即時使用用の単離された核酸が、初めて使用可能であった。先行技術の（例えば、ＵＳ２０１１００２１３７８Ａ１の）シグナル配列は、常に、Ｃ末端において、少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含んだ。これは、アラニンであり、発現されるタンパク質の誤ったＮ末端を生じ得る。
【０１２０】
同様に、本発明に従う切断型リーダーは、続くアミノ酸残基から独立したＣ末端における切断を提供する本来の特性を組み込むことが見出された。これは、ここでは、Ｃ末端における「本来の切断部位」とも呼ばれる。従って、切断型リーダーのＣ末端に続くか、又は切断型リーダーのプロ配列のＣ末端に続くアミノ酸配列は、このリーダーが一旦切断された後は、正しい、ネイティブのＮ末端アミノ酸配列を有する。
【０１２１】
本発明の単離された核酸及び発現ベクターは、従って、ネイティブのＮ末端アミノ酸残基を有するＰＯＩの発現及び分泌を提供する。より驚くべきことに、２１アミノ酸配列（すなわち、例えばＵＳ２０１１００２１３７８Ａ１において示唆されたように、Ｃ末端における追加のアラニンによって伸長された２０アミノ酸シグナルペプチド）によって実行された実験と比較した際に、２０アミノ酸シグナルペプチドによる分泌収量はずっと多かった。
【０１２２】
従って、本発明の別の態様は、本発明に従う核酸又はリーダーペプチドの、ＰＯＩの分泌のための、及び／又は宿主細胞由来のＰＯＩの分泌を増大するための使用である。ここで、好ましくは、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、又は１００％のＰＯＩが、本発明に従うリーダーが一旦切断された後、ネイティブのＮ末端アミノ酸配列を含む。好ましくは、分泌の増大は、公知のシグナルペプチドである配列番号２１と比較して、１．１５倍、１．５倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍以上である。最も好ましくは、ＰＯＩは、以下でさらに定義される抗体若しくは断片又はその誘導体である。
【０１２３】
さらに、先行技術のネイティブの完全長リーダーの僅か６３％の長さを有する（従って、配列番号８の完全長リーダー配列の有為な部分よりも短い）切断型リーダー配列が使用され得ることが、予期せず見出された。完全長リーダー配列によって実施された実験と比較して、切断型リーダーにより、増大さえした分泌収量が見出されたことは、驚くべきことであった。
【０１２４】
本発明に従って、単離された核酸又は発現カセット又はベクターは、天然によって使用されるか、又は組換え発現系において典型的に使用される他の従来の調節エレメント又は配列と共に使用され得、例えば、高収量での組換えタンパク質産生のための構築物を提供する。調節配列の例としては、プロモーター、オペレーター及びエンハンサー、リボソーム結合部位、並びに転写及び翻訳の開始及び停止を制御する配列が、挙げられる。
【０１２５】
関連の配列の機能を証明するため、発現カセット又はベクターを、ＰＯＩの発現を駆動するように構築してもよく、発現された及び／又は分泌された収量を、従来の調節エレメントを有する構築物と比較する。実験手順の詳細な記載は、以下の実施例において見出され得る。
【０１２６】
同定された配列は、Ｐ．パストリスから特定のヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによって増幅され、ＰＯＩのＮ末端又はＰＯＩ配列の上流に機能的に連結した酵母発現ベクター内にクローニングし、そして酵母宿主細胞株、例えばＰ．パストリス内に、種々の異なるＰＯＩの、分泌形態での高レベル生産のために、形質転換された。ＰＯＩの収量に対する調節配列、例えば本発明に従うシグナル配列及び切断型リーダーの効果を推定するために、本発明に従って得られた酵母宿主細胞株は、従来の調節エレメントを含む株と比較して、振とうフラスコ実験及びフェドバッチ又はケモスタット発酵において培養されてもよい。
【０１２７】
本発明の調節配列、特にシグナルペプチド又は切断型リーダーをコードする配列及び発現ベクターにより、本発明に従う方法は、好ましくは、酵母宿主細胞及び特に、Ｐ．パストリス宿主細胞において、分泌の増強による産生の増大を提供するだけでなく、より高い質のＰＯＩも、提供する。ＰＯＩの分泌における増大は、先行技術のエレメントと比較してタンパク質分泌を増大する調節配列、特にシグナル配列又は切断型リーダーの存在下での、分泌収量の比較に基づいて決定される。
【０１２８】
ＰＯＩは、任意の真核生物の、原核生物の又は合成のポリペプチドであり得る。これは、膜結合タンパク質又は細胞外発現タンパク質のどちらかとして、成熟タンパク質として分泌され得る。本発明はまた、天然に存在するタンパク質の、機能的に同等なバリアント、誘導体及び生物学的活性断片の組換え産生をも提供する。機能的に同等なバリアントは、好ましくは、実質的に同じ機能的特徴又は活性を有する。
【０１２９】
ここでいうＰＯＩは、真核生物宿主細胞に同種の産物であってもよく、又は治療的、予防的、診断的、分析的又は産業的使用のための、異種の産物であってもよい。
【０１３０】
ＰＯＩは、好ましくは、酵母細胞において産生された異種の組換えポリペプチド又はタンパク質である。
【０１３１】
具体的には、ＰＯＩは、真核生物タンパク質、好ましくは、哺乳動物タンパク質である。
【０１３２】
本発明に従って産生されるＰＯＩは、マルチマータンパク質、好ましくは、ダイマー又はテトラマーであってもよい。
【０１３３】
本発明の１つの側面に従い、ＰＯＩは、組換え又は異種のタンパク質であり、好ましくは、抗体若しくはその断片、酵素及びペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質結合体、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン及びワクチン様タンパク質若しくは粒子、プロセス酵素、成長因子、ホルモン及びサイトカイン、又はＰＯＩの代謝産物を含む、治療用タンパク質から選択される。
【０１３４】
特定のＰＯＩは、抗原結合分子、例えば抗体又はその断片である。特定のＰＯＩの中でもとりわけ、抗体、例えばモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、免疫グロブリン（Ｉｇ）又は免疫グロブリンクラスＧ（ＩｇＧ）、重鎖抗体（ＨｃＡｂ’ｓ）又はその断片、例えば断片−抗原結合（Ｆａｂ）、Ｆｄ、単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、又は操作されたそのバリアント、例えばＦｖダイマー（ダイアボディ）、Ｆｖトリマー（トライアボディ）、Ｆｖテトラマー、又はミニボディ、及び単一ドメイン抗体様ＶＨ若しくはＶＨＨ若しくはＶ−ＮＡＲである。
【０１３５】
さらなる特定のＰＯＩは、アプロチニン、組織因子経路インヒビター又は他のプロテアーゼインヒビター、及びインスリン又はインスリン前駆体、インスリンアナログ、成長ホルモン、インターロイキン、組織プラスミノゲンアクチベーター、形質転換成長因子ａ又はｂ、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、ＧＲＰＰ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩｌ因子、第ＸＩＩＩ因子、血小板由来成長因子１、血清アルブミン、酵素類、例えばリパーゼ若しくはプロテアーゼ、又は機能的ホモログ、機能的に同等なバリアント、誘導体、並びにネイティブのタンパク質と類似の機能を有する生物学的に活性な断片である。ＰＯＩは、ネイティブのタンパク質と構造的に類似であってもよく、ネイティブのタンパク質のＣ及びＮ末端のどちらか若しくは両方又は側鎖に対する１以上のアミノ酸の付加、ネイティブのアミノ酸配列における１又はいくつかの異なる部位における１以上のアミノ酸の置換、ネイティブのタンパク質のどちらか若しくは両方の末端、又はアミノ酸配列の１若しくはいくつかの部位における１以上のアミノ酸の欠失、或いは、ネイティブのアミノ酸配列１以上の部位における１以上のアミノ酸の挿入によってネイティブのタンパク質に由来してもよい。このような改変は、上述のタンパク質のいくつかについて、周知である。
【０１３６】
ＰＯＩはまた、生化学反応又はいくつかの反応のカスケードの産物を得る目的で、例えば、宿主細胞の代謝産物を得るために、宿主細胞において生化学反応を提供する基質、酵素、インヒビター又は補因子から選択され得る。産物の例は、本発明に従う組換えタンパク質又はＰＯＩの発現の後に増大した収量で得られ得る、ビタミン、例えばリボフラビン、有機酸及びアルコールであり得る。
【０１３７】
具体的には、本発明に従う組換え産物を発現する宿主細胞は、ＰＯＩの組換え発現に好適な任意の酵母細胞であり得る。
【０１３８】
好ましい宿主細胞は、ピキア属、カンジダ属、トルロプシス属、アークスラ属、ハンゼヌラ属、オガテア属、ヤロウイア属、クリベロミセス属、サッカロミセス属又はコマガタエラ属から選択され、好ましくはメチロトローフ酵母であり、そして具体的に好ましくは、Ｐ．パストリス、コマガタエラ・パストリス、Ｋ．ファフィ、又はＫ．シュードパストリスから選択される。
【０１３９】
本発明に従う好ましい宿主細胞の例としては、ピキア属、例えばＰ．パストリス若しくはＰ．メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、又はコマガタエラ属、例えばＫ．パストリス、Ｋ．シュードパストリス若しくはＫ．ファフィが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４０】
新しい文献は、ピキア・パストリスを、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・ファフィ及びコマガタエラ・シュードパストリスに分類し、再命名している。ここでは、ピキア・パストリスは、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・ファフィ及びコマガタエラ・シュードパストリスの全てに、同時に使用される。
【０１４１】
Ｐ．パストリス株の例としては、ＣＢＳ  ７０４（＝ＮＲＲＬ  Ｙ−１６０３＝ＤＳＭＺ  ７０３８２）、ＣＢＳ  ２６１２（＝ＮＲＲＬ  Ｙ−７５５６）、ＣＢＳ  ７４３５（＝ＮＲＲＬ  Ｙ−１１４３０）、ＣＢＳ  ９１７３−９１８９（ＣＢＳ株：ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌ−ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ユトレヒト、オランダ）、及びＤＳＭＺ  ７０８７７（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）が挙げられるが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ由来の株、例えばＸ−３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１及びＳＭＤ１１６８もまた、挙げられる。上述の株の全ては、形質転換体を産生しそして異種遺伝子を発現させるために、首尾よく使用されている。
【０１４２】
本発明に従って、本発明に従うシグナル配列又は切断型リーダーに作動可能に連結したプロモーター配列を含むベクターによって形質転換された酵母宿主細胞を準備することが、好ましい。
【０１４３】
本発明の好ましい様式に従い、本発明に従う発現カセットは、プロモーター、例えばＰ．パストリスｐＧＡＰ（グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、ｐＡＯＸ（アルコールオキシダーゼ）プロモーター若しくは配列番号９（図１、ｐＧ１プロモーター）、又はこれらの機能的バリアントを含む。有意な配列活性は、このようなプロモーター配列の一部分によってのみ得られてもよい。具体的には、少なくとも１５０の連続する塩基すなわちｂｐからなるプロモーター配列の好ましい部分は、より好ましくは、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ若しくは少なくとも９００ｂｐからなる。好ましくは、プロモーター領域の３’末端は、プロモーター配列の好ましい部分に含まれる。
【０１４４】
好ましい発現系において、プロモーターは、誘導性又は構成的なプロモーターである。
このプロモーターは、内因性プロモーターであってもよく、又は宿主細胞に対して異種であってもよい。誘導性プロモーターの好ましい例は、ｐＧ１プロモーターであり、これは、グルコース限定条件によって誘導性であり、配列番号９のヌクレオチド配列を有する。
【０１４５】
本発明に従う特定の宿主細胞は、異種の又は組換えのプロモーター配列を含み、これは、産生宿主とは異なる株に由来していてもよく、例えば、別の酵母株、例えばＳ．セレビシエ株などに由来していてもよい。別の特定の態様において、本発明に従う宿主細胞は、宿主細胞と同じ属、種又は株に起源を有するプロモーターを含む、本発明に従う組換え発現構築物を含む。
【０１４６】
プロモーターは、宿主細胞において転写活性を示し、宿主と同種であるか又は異種であるかのどちらかのタンパク質をコードする遺伝子に由来していてもよい、任意のＤＮＡ配列であってもよい。プロモーターは、好ましくは、宿主細胞に同種のタンパク質をコードする遺伝子に由来する。
【０１４７】
例えば、本発明に従うプロモーターは、酵母、例えばＳ．セレビシエ株に由来していてもよい。なお、具体的に好ましい態様は、Ｐ．パストリス産生宿主細胞株において組換えＰＯＩを産生する方法における使用のために、Ｐ．パストリスに起源を有するプロモーターを利用する。ヌクレオチド配列と同種の起源は、同じ属又は種の宿主細胞内へのその組み込みを容易にし、従って、恐らくは産業製造プロセスにおいて収量が増大した、ＰＯＩの安定的産生を可能にする。また、他の好適な酵母若しくは他の真菌又は他の生物、例えば脊椎動物若しくは植物由来のプロモーターの機能的に活性なバリアントもまた、使用され得る。
【０１４８】
酵母宿主細胞による使用のためのさらなる好適なプロモーター配列は、細胞内で高い濃度で存在することが知られる代謝酵素（例えば、解糖酵素、例えばトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）、ラクターゼ（ＬＡＣ）及びガラクトシダーゼ（ＧＡＬ））をコードする遺伝子から得られるプロモーターが挙げられてもよいが、これらに限定されない。
【０１４９】
好適なプロモーターの好ましい例は、酵母細胞において遺伝子転写のためのプロモーターとして機能するＤＮＡ配列を含む酵母プロモーターである。好ましい例は、Ｓ．セレビシエＭａｌ、ＴＰＩ、ＣＵＰ、ＡＤＨ若しくはＰＧＫプロモーター、又はＰ．パストリスグルコース−６−リン酸イソメラーゼプロモーター（ＰＰＧＩ）、３−ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＰＧＫ）若しくはグリセロールアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼプロモーターＰＧＡＰ、アルコールオキシダーゼプロモーター（ＰＡＯＸ）、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼプロモーター（ＰＦＬＤ）、イソクエン酸リアーゼプロモーター（ＰＩＣＬ）、翻訳伸長因子プロモーター（ＰＴＥＦ）、及びＰ．パストリスエノラーゼ１のプロモーター（ＰＥＮＯ１）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＰＴＰＩ）、アルファ−ケトイソカプロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＴＨＩ）、リボソームサブユニットタンパク質（ＰＲＰＳ２、ＰＲＰＳ７、ＰＲＰＳ３１、ＰＲＰＬ１）、熱ショックタンパク質ファミリーメンバー（ＰＳＳＡ１、ＰＨＳＰ９０、ＰＫＡＲ２）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＧＮＤ１）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＰＭ１）、トランスケトラーゼ（ＰＴＫＬ１）、ホスファチジルイノシトールシンターゼ（ＰＰＩＳ１）、第一鉄−Ｏ２−オキシドレダクターゼ（ＰＦＥＴ３）、高親和性鉄パーミアーゼ（ＰＦＴＲ１）、抑制可能アルカリホスファターゼ（ＰＰＨＯ８）、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ（ＰＮＭＴ１）、フェロモン反応転写因子（ＰＭＣＭ１）、ユビキチン（ＰＵＢＩ４）、一本鎖ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（ＰＲＡＤ２）及びミトコンドリア内膜の主要ＡＤＰ／ＡＴＰキャリアのプロモーター（ＰＰＥＴ９）である。
【０１５０】
ＰＯＩが、宿主細胞に対して同種のタンパク質、すなわち、宿主細胞において天然に存在するタンパク質である場合、宿主細胞におけるＰＯＩの発現は、ネイティブのプロモーター配列の、宿主細胞に対して異種のプロモーター配列又は宿主細胞に対して同種であるがこのＰＯＩのネイティブのプロモーター配列とは異なるプロモーター配列との交換によって、調節されてもよい。
【０１５１】
新規なプロモーターを導入するこの目的は、例えば、部位特異的組換えを可能にする標的遺伝子、プロモーター配列及び宿主細胞に好適な選択可能マーカーの、同種配列を含む組換えＤＮＡ分子による宿主細胞の形質転換によって、達成されてもよい。部位特異的組換えは、プロモーター配列を、ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結するために行わなければならない。これは、ネイティブのプロモーター配列の代わりに異種プロモーター配列からのＰＯＩの発現をもたらす。
【０１５２】
本発明の具体的に好ましい態様において、プロモーター配列は、ＰＯＩのネイティブのプロモーター配列に対して増大したプロモーター活性を有する。
【０１５３】
本発明に従い、本発明に従うシグナル配列又は切断型リーダーを含む、本発明に従うワイルドカードベクター又は発現カセットを提供することも可能である。このようなワイルドカードベクター又は発現カセットは、ＰＯＩをコードする目的の遺伝子を容易に組み込む。ワイルドカード細胞株は、従って、その発現能力について特徴付けられた、事前形成された宿主細胞株である。このことは、ＰＯＩ産生のために、産生細胞株を生み出すための革新的「ワイルドカード」プラットフォーム戦略を、例えば、部位特異的カセット組み込み又は部位特異的リコンビナーゼ媒介型カセット交換を用いて、追及する。このような新規な宿主細胞は、目的の遺伝子（ＧＯＩ）の、例えば、所定のゲノム発現部位内への、再生可能な非常に効率的な産生細胞株を得るためのクローニングを容易にする。
【０１５４】
好ましい態様に従い、本発明に従う発現ベクターは、宿主細胞のゲノム内への、１細胞あたり１コピー又は複数コピーでの組み込みのために好適なプラスミドである。ＰＯＩをコードする組換えヌクレオチド配列もまた、１細胞あたり１コピー又は複数コピーで、自己複製プラスミドにおいて提供されてもよい。好ましいプラスミドは、真核生物発現ベクター、好ましくは、酵母発現ベクターである。
【０１５５】
発現ベクターは、クローニングベクター、改変クローニングベクター、及び、具体的には、設計されたプラスミドが挙げられてもよいが、これらに限定されない。本発明において使用される好ましい発現ベクターは、宿主細胞における組換え遺伝子の発現に好適な任意の発現ベクターであってもよく、宿主生物に依存して選択される。組換え発現ベクターは、宿主生物のゲノム内に複製可能であるか又は組み込み可能である任意のベクターであってもよく、宿主ベクター、例えば酵母ベクターとも呼ばれ、本発明に従うＤＮＡ構築物を運ぶ。好ましい酵母発現ベクターは、ハンゼヌラ属、オガテア属、ピキア属、カンジダ属及びトルロプシス属によって表されるメチロトローフ酵母からなる群から選択される酵母における発現に好適である。
【０１５６】
本発明において、ベクターとして、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣＺａｌｆａ、ｐＧＡＰＺアルファ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＧＡＰＨｉｓ若しくはｐＰＵＺＺＬＥに由来するプラスミドを使用することが、好ましい。
【０１５７】
本発明の好ましい態様に従って、組換え構築物は、関連の遺伝子をベクター内にライゲーションすることによって、得られる。これらの遺伝子は、このようなベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより、宿主細胞ゲノム内に安定的に組み込まれ得る。遺伝子によってコードされるポリペプチドは、形質転換体を培養することによって、組換え宿主細胞株を用いて産生され得、従って、適切な培地中に得られ、培養物から発現されたＰＯＩを単離し、そして発現産物に適切な方法によって精製し、特に、夾雑するタンパク質からＰＯＩを分離する。
【０１５８】
ＰＯＩをコードするＤＮＡ配列はまた、好適なターミネーター配列、例えばＡＯＸ１（アルコールオキシダーゼ）ターミネーター、ＣＹＣ１（シトクロムｃ）ターミネーター、ＴＥＦ（転写伸長因子）ターミネーターにも、作動可能に接続されてよい。
【０１５９】
発現ベクターは、１以上の表現型選択可能マーカー、例えば、抗生物質抵抗性を付与するか又は栄養要求性を満たすタンパク質をコードする遺伝子を、含んでいてもよい。酵母ベクターは、酵母プラスミドからの複製の起源、自己複製配列（ＡＲＳ）又は代わりに宿主ゲノム内への組み込みのために使用される配列、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写停止のための配列、及び選択可能マーカーを、一般的に含む。
【０１６０】
ＤＮＡ配列、例えばリーダー配列及び／又はＰＯＩ、プロモーター及びターミネーターをコードする配列をそれぞれライゲーションするため、及び、これらを組み込み又は宿主複製のために必要な情報を含む好適なベクター内に挿入するために使用される手順は、当業者に周知であり、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ第２版」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）によって記載される。
【０１６１】
本発明に従うベクターは、最初に、ベクターの所望のエレメントの完全なＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を調製し、そしてこの構築物を好適な発現ベクター内に挿入することによって構築されても、又は、個々のエレメント、例えばシグナル、リーダー又はＰＯＩについての遺伝情報を含むＤＮＡ断片を順次挿入し、その後ライゲーションすることによって構築されてもよいことが、理解される。或いは、発現カセットの個々のエレメントもまた、ＰＣＲによって融合され得る。
【０１６２】
マルチクローニング部位を有するベクターであるマルチクローニングベクターもまた、本発明に従って使用され得、ここで、所望の遺伝子は、マルチクローニング部位に組み込まれて、発現ベクターを提供し得る。発現ベクターにおいて、プロモーターは、リーダー配列及びＰＯＩの遺伝子の上流に置かれ、遺伝子の発現を調節する。マルチクローニングベクターの場合、リーダー配列及びＰＯＩの遺伝子がマルチクローニング部位に導入されるので、プロモーターは、マルチクローニング部位の上流に置かれる。リーダー配列の遺伝子は、ＰＣＲ反応又は合成的調製のどちらかの間、ＰＯＩの遺伝子に融合されていてもよく、又はリーダー配列の遺伝子は、ベクター又は発現カセットにおいて提供され得、標準的クローニング手順によってＰＯＩの遺伝子が導入され得る。
【０１６３】
本発明に従って提供される発現ベクター又はカセット及びＤＮＡ構築物は、確立された標準的方法、例えばホスホルアミダイト法によって、合成的に調製されてもよい。ＤＮＡ構築物はまた、ゲノム起源であってもｃＤＮＡ起源であってもよく、例えば、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを調製し、本発明のポリペプチドの全て又は一部をコードするＤＮＡ配列について、標準的技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８９）に従い合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることによって、得られる。最後に、ＤＮＡ構築物は、標準的技術に従って、合成起源、ゲノム起源又はｃＤＮＡ起源アニーリング断片によって調製された、合成起源とゲノム起源との混合であっても、合成起源とｃＤＮＡと起源との混合であっても、又はゲノム起源とｃＤＮＡ起源との混合であってもよく、適切な場合、この断片は完全なＤＮＡ構築物の種々の部分に対応する。
【０１６４】
リーダー及び／又はＰＯＩをコードするＤＮＡ配列が、アルゴリズム及び技術水準に従って、宿主生物のコドン使用頻度選択について最適化されてもよい（市販の供給者、例えばＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎｅＣｕｓｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ又はＤＮＡ２．０によって提供される）ことは当業者にとって明らかである。
【０１６５】
別の好ましい態様において、酵母発現ベクター又はカセットは、例えば、同種組換えによって、酵母ゲノムに安定的に組み込まれ得る。
【０１６６】
好ましい側面において、本発明は、発現ベクター又はカセットが、形質転換した宿主細胞によって成熟ＰＯＩの分泌を引き起こすために有効であるリーダー配列を含む方法に関する。
【０１６７】
本発明に従うシグナル配列又は切断型リーダーは、当業者に公知の従来のクローニング技術による組換え発現を意図して、ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列に融合され得る。好ましい態様において、ＰＯＩのヌクレオチド配列は、分泌リーダーのヌクレオチド配列に融合し、従って、シグナル配列又は切断型リーダーは、タンパク質を分泌経路に標的化して、ここで、リーダーが切断されて、タンパク質が培地中に放出される。
【０１６８】
細胞を本発明に従う発現ベクター又はカセットによって形質転換することによって得られた、本発明に従う形質転換宿主細胞は、好ましくは、まず、大きな細胞数まで効率的に増殖させる条件で、ＰＯＩを発現する負荷を負うことなく培養されてもよい。ＰＯＩ発現についての細胞株が調製されると、発現産物を産生するための培養技術が選択される。
【０１６９】
差次的発酵戦略は、増殖期と産生期との間を分ける。増殖及び／又は産生は、バッチ様式、フェドバッチ様式又は連続的様式で、好適に起こり得る。任意の好適なバイオリアクターが使用され得、バッチ、フェドバッチ、連続式、撹拌タンクリアクター、又はエアリフトリアクターが挙げられる。
【０１７０】
試験的規模又は産業規模において発酵プロセスを提供することが、有益である。産業処理規模は、好ましくは、少なくとも１０Ｌ、具体的には少なくとも５０Ｌ、好ましくは、少なくとも１ｍ3、好ましくは、少なくとも１０ｍ3、最も好ましくは、少なくとも１００ｍ3の容積を使用する。
【０１７１】
産業規模での産生条件が好ましく、これは、例えば、約０．０２〜０．４ｈ-1の希釈速度で約５０〜１０００Ｌ又はそれ以上の発酵槽容量での、数日間の典型的な処理時間、又は連続的な方法を使用する、１００Ｌ〜１０ｍ3又はそれ以上の反応容量におけるフェドバッチ培養を指す。
【０１７２】
好適な培養技術は、バッチ相で開始し、その後、高速の特定の増殖速度にて短く急激なフェドバッチ相が続き、さらにその後、低い特定の増殖速度でフェドバッチ相が続く、バイオリアクターでの培養を含んでもよい。別の好適な培養技術は、バッチ相及びその後の低希釈速度での連続式培養相を含んでもよい。本発明の好ましい態様は、バイオマスを提供するためのバッチ培養及びその後の高収量ＰＯＩ産生のためのフェドバッチ培養を含む。
【０１７３】
本発明に従う宿主細胞株を、増殖条件下でバイオリアクター内にて培養し、少なくとも１ｇ／Ｌの細胞乾燥重量、より好ましくは、少なくとも１０ｇ／Ｌ細胞乾燥重量、好ましくは、少なくとも２０ｇ／Ｌ細胞乾燥重量の細胞密度を得ることが、好ましい。このような収量のバイオマス産生を、試験的規模又は産業規模で提供することが、有益である。
【０１７４】
ここで開示される方法は、ＰＯＩの発現を可能にする条件下で上記の組換え宿主細胞を培養することを、さらに含んでもよいことが、理解される。膜結合型又は可溶性の、組換え的に産生されたＰＯＩ又は宿主細胞代謝産物は、次いで、細胞培養培地から単離されて、当業者に周知の技術によって、さらに精製され得る。
【０１７５】
宿主細胞によるＰＯＩ発現及び分泌のためのいくつかの異なるアプローチが、好ましい。タンパク質は、所望のタンパク質をコードするＤＮＡを有する本発明に従う発現ベクター又はカセットによって真核生物を形質転換することによって、発現され、プロセシングされて分泌され、形質転換生物の培養を調製し、培養を増殖し、そしてタンパク質を培養培地から回収（例えば、細胞培養の画分にこのタンパク質を濃縮して富化する）するか、又はこのタンパク質を精製して、実質的に純粋な調製物を得る。また、（例えば、Ｈｅｉｓｓら、２０１２；Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２５３−０１２−４２６０−４によって記載されるように）１以上の主要な夾雑する宿主細胞タンパク質を取り除いた宿主細胞が、ＰＯＩの精製を容易にするために、適用され得る。
【０１７６】
組換えポリペプチド又はタンパク質産物を得るための単離及び精製の方法として、方法、例えば可溶性の相違を用いる方法、例えば塩析及び溶媒沈殿、分子量の相違を用いる方法、例えば限外濾過及びゲル電気泳動、電荷の相違を用いる方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、特定の親和性を用いる方法、例えば親和性クロマトグラフィー、疎水性の相違を用いる方法、例えば逆相高速液体クロマトグラフィー、及び等電点の相違を用いる方法、例えば等電点電気泳動が、使用されてもよい。
【０１７７】
高度に精製された産物は、夾雑するタンパク質を本質的に含まず、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又はなお少なくとも９８％、１００％までの純度を有する。精製産物は、細胞培養上清の精製、又はそれとも細胞屑からの精製によって、得られてもよい。
【０１７８】
単離されたそして精製されたＰＯＩは、従来方法、例えばウェスタンブロッティング又はその活性のアッセイによって同定され得る。精製化合物の構造は、アミノ酸分析、アミノ末端分析、一次構造分析などによって定義され得る。化合物が大容量且つ高純度レベルで入手可能であることが好ましく、従って、製薬組成物における活性成分として使用されるための必要条件を満たす。
【０１７９】
本発明に従う好ましい宿主細胞株は、約２０世代、好ましくは、少なくとも３０世代、より好ましくは、少なくとも４０世代、最も好ましくは、少なくとも５０世代の培養の後であっても、本発明に従う調節配列及びＰＯＩ遺伝子の組み込みを維持し、発現レベルも高く、例えば少なくともμｇ／Ｌレベルで保つ。この組換え宿主細胞は、驚くほど安定的であり、このことは、産業規模のタンパク質産生のために使用する際、大きな利点である。
【０１８０】
本発明は、以下の実施例においてさらに詳細に記載される。この実施例は、特許請求される本発明の範囲を、決して限定することを意図しない。
【０１８１】
［実施例］
例１：Ｐ．パストリスＥｐｘ１ネイティブのリーダー（配列番号８）を分泌のために用いる、組換えタンパク質の発現のためのＰ．パストリス宿主細胞株の構築
１ａ）：Ｐ．パストリスＥｐｘ１ネイティブのリーダー（シグナル配列及びプロ配列；配列番号８、ＥｐｘＬ−ＲＴ、「前駆配列」）を含む発現ベクターの構築
Ｐ．パストリスにおいてネイティブに分泌されたタンパク質Ｅｐｘ１の同定及び推定分泌リーダー配列ＥｐｘＬ−ＲＴ（Ｅｐｘ１シグナル配列及びプロ配列、実験的に決定した成熟Ｅｐｘ１タンパク質のＮ末端までからなる）の同定は、ＥＰ２２５８８５５に記載されている。成熟Ｅｐｘ１の実験的に証明されたＮ末端に先行する最後のアミノ酸は、Ａｒｇ−Ｔｈｒ（ＲＴ）であったので、推定分泌リーダー配列は、ＥｐｘＬ−ＲＴと呼ばれた。
【０１８２】
ＰＯＩの分泌のためにＰ．パストリスＥｐｘ１タンパク質の分泌リーダー配列を用いる発現ベクターを産生するために、それぞれの配列（配列番号８）を、ｐＰＭ２＿ｐＧＡＰ発現ベクターのＰＧＡＰプロモーター（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター）のリーディングフレーム内にクローニングした。ｐＰＭ２＿ｐＧＡＰ発現ベクターは、ＷＯ２００８／１２８７０１Ａ２に記載されるｐＰｕｚｚｌｅ＿ｚｅｏＲ＿ＡＯＸＴＴベクター骨格の誘導体であり、ｐＵＣ１９細菌複製起源、Ｐ．パストリスグリセロールアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、Ｓ．セレビシエＣＹＣ１転写ターミネーター及びゼオシン抗生物質抵抗性カセットからなる。
【０１８３】
オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰ．パストリスゲノムＤＮＡからのＰＣＲによって、Ｅｐｘ１分泌リーダー配列を増幅した（表１）。
【表１】
2019141063.tif 000002
【０１８４】
その後、ＰＣＲ産物（１８９ｂｐ）を制限酵素ＳｂｆＩ及びＮｓｉＩによって消化し；そしてＳｂｆＩによって直鎖化し仔ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理したｐＰＭ２＿ｐＧＡＰベクター内にライゲーションした。ＮｓｉＩ及びＳｂｆＩは重なる末端を作るので、生じた構築物ｐＰＭ２＿ｐＧＡＰｘＬＲＴは、ＥｐｘＬ−ＲＴ配列の開始コドン直前に１つのＳｂｆＩ部位を有する。ＳｂｆＩ及びＡｓｃＩによる得られたプラスミドの消化により、正しい組み込みを確認した。
【０１８５】
１ｂ）ｐＰＭ２＿ｐＧＡＰｘＬＲＴベクターを用いた組換えブタトリプシノゲンを分泌するＰ．パストリス株の構築
組換えブタトリプシノゲン（ｒｐＴＲＰ）の発現のために、コドン最適化人工遺伝子を合成した（Ｇｅｎｅａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。オープンリーディングフレーム側方の制限酵素Ｐｆｌ２３ＩＩ及びＳｆｉＩのための部位を、運ばれたプラスミドをテンプレートとして用いるＰＣＲ増幅の間に付加した。プライマーを、表２．１に示す。ＰＣＲ産物を、Ｐｆｌ２３ＩＩ及びＳｆｉＩで消化し、そしてＰｆｌ２３ＩＩ、ＳｆｉＩ及びＣＩＰ処理プラスミドｐＰＭ２＿ｐＧＡＰｘＬＲＴ（例１ａ）内にクローニングした。ライゲーションしたプラスミドを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、そしてゼオシン被膜したＬＢアガー上でプレート培養した。制限エンドヌクレアーゼ分析を実施し、プラスミドｐＰＭ２＿ｐＧＡＰｘＬＲＴ＿ｒｐＴＲＰの正しいアイデンティティを確認した。
【表２−１】
2019141063.tif 000003
【０１８６】
１ｃ）組換えヒト血清アルブミン又は高感度緑色蛍光タンパク質ｐＰＭ２＿ｐＧＡＰｘＬＲＴベクターを過剰発現するＰ．パストリス株の構築
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又は高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコードする遺伝子を、Ｓｔａｄｌｍａｙｒら（２０１０、Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５０：５１９−５２９）に記載されるベクターから、表２．２に示されるプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を、ＡｃｃＩ及びＳｆｉＩで消化し、そしてＡｃｃＩ及びＳｆｉＩ処理プラスミドｐＰＭ２＿ｐＧＡＰｘＬＲＴ（例１ａ）内にクローニングした。ライゲーションしたプラスミドを、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、そしてゼオシン被膜したＬＢアガー上でプレート培養した。配列確認後、ベクターｐＰＭ２＿ｐＧＡＰｘＬＲＴ−ＨＳＡ及びｐＰＭ２＿ｐＧＡＰｘＬＲＴ−ｅＧＦＰを、プロモーター領域において直鎖化し、そしてＰ．パストリスに形質転換した。ＨＳＡについては、Ｓｔａｄｌｍａｙｒら、２０１０に記載されるネイティブのＨＳＡリーダーを用いる構築物を参照として用い、他方、ｅＧＦＰを、対照としてＳ．セレビシエＭＦαリーダーの後にクローニングした。
【表２−２】
2019141063.tif 000004
【０１８７】
例２：組換え分泌タンパク質の発現及び産物分析のためのＰ．パストリス宿主細胞株の培養
全てのプラスミドを、Ｐ．パストリスへの電気的形質転換の前に、それぞれのプロモーター領域又はＡＯＸ−ＴＴ組み込み領域において直鎖化した。陽性の形質転換体を、酵母抽出物（１０ｇ／Ｌ）、ペプトン（２０ｇ／Ｌ）、グルコース（２０ｇ／Ｌ）及びゼオシンを含むＹＰＤアガープレート上で選別した。
【０１８８】
２ａ）小規模培養における、組換え分泌タンパク質を発現する形質転換Ｐ．パストリス株の培養
１０ｇ／Ｌグリセロールを含む５ｍＬのＹＰ培地（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン）を、例１ｂ、５、７、又は９からのＰ．パストリス株のシングルコロニーによって植菌し、２８℃で一晩増殖させた。これらの培養物のアリコート（０．１の最終ＯＤ600に相当する）を、２０ｇ／Ｌグルコースで補った１０ｍＬの発現培養培地（培地組成は、各組換えタンパク質について下で示す）に移し、２８℃にて４８時間にわたり、１００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ内で１７０ｒｐｍでインキュベートした。或いは、２ｍＬの発現培養培地を、２４ディープウェルプレート内での培養のために使用した。グルコース（１０ｇ／Ｌ）を、１２時間毎に繰り返し加え、その後、細胞を、２５００×ｇにて１０分間室温での遠心分離により回収し、分析のために調製した。ｐＧ１駆動発現のために、グルコース制限増殖条件を、グルコースフィードビーズを用いることによって達成した（Ｋｕｈｎｅｒ、ＣＨ）。これは、グルコース補充の代わりに、（グルコース）＝１．６３＊ｔ0.74［ｍｇ／Ｄｉｓｃ］の等式に従って長時間にわたりグルコースを放出する。
１０ｍＬの主培養のために２フィードビーズを使用した。バイオマスを、１ｍＬの細胞浮遊液の遠心分離後、細胞重量を測定することによって決定した。他方、上清における組換え分泌タンパク質の決定を、以下の例２ｂ〜２ｅで記載する。
【０１８９】
発現培養培地は、以下の通りである：
ブタトリプシノゲンについて：１リットルあたり：１０ｇ酵母抽出物、１０ｇのエンドウ豆ペプトン、１０．２ｇ  （ＮＨ４）2ＰＯ4、１．２４ｇ  ＫＣｌ、０．１ｇ  ＣａＣｌ2、ＨＣｌにてｐＨ５．０に調整。
【０１９０】
ＨＳＡについて：１リットルあたり：２２ｇクエン酸、３．１５ｇ  （ＮＨ4）2ＨＰＯ4、０．０２７ｇ  ＣａＣｌ2＊２Ｈ2Ｏ、０．９ｇ  ＫＣｌ、０．５ｇ  ＭｇＳＯ4＊７Ｈ2Ｏ、２ｍｌ  ５００×ビオチン及び１．４７ｍＬ微量塩ストック溶液［１リットルあたり：６ｇ  ＣｕＳＯ4＊５Ｈ2Ｏ、０．０８ｇ  ＮａＩ、３ｇ  ＭｎＳＯ4＊Ｈ2Ｏ、０．２ｇ  Ｎａ2ＭｏＯ4＊２Ｈ2Ｏ、０．０２ｇ  Ｈ3ＢＯ3、０．５ｇ  ＣｏＣｌ2、２０ｇ  ＺｎＣｌ2、５ｇ  ＦｅＳＯ4＊７Ｈ2Ｏ及び５ｍＬ  Ｈ2ＳＯ4］；５Ｍ  ＫＯＨでｐＨを６にした；濾過によって滅菌した。
【０１９１】
ｅＧＦＰ及び抗体断片について（例えばＦａｂ）：１リットルあたり：１０ｇ酵母抽出物、１０ｇペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０、１３．４ｇ酵母窒素塩基及び硫酸アンモニウム、０．４ｍｇビオチン
２ｂ）トリプシンの定量
Ｐ．パストリス培養上清を、小プレパック型サイズ排除クロマトグラフィーカラム（Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  ＰＤ−１０  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎｓ  １７−０８５１−０１；ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて脱塩した。２．５ｍＬの上清をカラムに適用し、３．５ｍＬの溶出緩衝液（１ｍＭ  ＨＣｌ）で溶出した。溶出後、７０μＬの２Ｍ  ＣａＣｌ2溶液を、加えた。
【０１９２】
不活性型トリプシノゲンを活性型トリプシンに変換するため、３００μＬの脱塩上清（＋ＣａＣｌ2）を、６９０μＬの活性化緩衝液（５０ｍＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ  ｐＨ８．６；４０ｍＭ  ＣａＣｌ2及び０．１５ｇ／Ｌエンテロキナーゼ、Ｓｉｇｍａ；Ｅ０６３２）と混合し、２時間、３７℃にてインキュベートした。
【０１９３】
１６５μＬの活性化混合物を、１０００μＬのＴＡＭＥ−溶液（希釈緩衝液（５０ｍＭ
ＴＲＩＳ／ＨＣｌ  ｐＨ８．１；４０ｍＭ  ＣａＣｌ2）に溶解した４４６ｍｇ／ＬのＮα−ｐ−Ｔｏｓｙｌ−Ｌ−アルギニン−メチル−エステル−塩酸塩（ＴＡＭＥ；Ｓｉｇｍａ；Ｔ４６２６）を含む）と混合し、２４７ｎｍにおける吸収動態学を、３０℃にて、５分間にわたって分光光度計で測定した。必要な場合、活性型トリプシン溶液を、希釈緩衝液で希釈し、本方法の直線範囲（ΔＡ２４７／分＜０．３）に合わせた。１ｇ／Ｌのトリプシン濃度は、ΔＡ２４７／分＝０．１０１に相当する。
【０１９４】
２ｃ）ＥＬＩＳＡによるＨＳＡの定量
Ｐ．パストリス上清におけるＨＳＡの定量のために、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｅｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ８０−１２９、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＴＸ、ＵＳＡ）を使用した。ＨＳＡ標準を、４００ｎｇ／ｍＬの開始濃度で使用した。上清サンプルを、適宜希釈した。
【０１９５】
２ｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析
タンパク質ゲル分析のために、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ系を、１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ又は４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル及びＭＯＰＳ泳動緩衝液（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて使用した。電気泳動後、タンパク質を、銀染色によって可視化したか、又はウェスタンブロット分析のためにニトロセスロース膜へ移行させた。従って、タンパク質を、湿（タンク）移行（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のためのＸＣｅｌｌ  ＩＩ（商標）Ｂｌｏｔ  Ｍｏｄｕｌｅを製造業者の指示に従って用いて、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。ブロッキングの後、ウェスタンブロットを、以下の抗体でプローブ探索した：ＨＳＡについて：抗ヒト血清アルブミン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体、Ｂｅｔｈｙｌ  Ａ８０−１２９Ｐ（１：５００００）；ＩｇＧについて軽鎖：抗ヒトカッパ軽鎖（結合及び遊離）−アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合体化抗体、Ｓｉｇｍａ  Ａ３８１３（１：５０００）；ＩｇＧ重鎖について：ヤギにおいて産生させた抗ヒト−ＩｇＧ（γ−鎖特異的）−抗体、Ｓｉｇｍａ  Ｉ３３８２（１：５０００）及び抗ヤギＡＰ結合体（１：２００００）。
【０１９６】
検出を、ＡＰ−結合体についてＮＢＴ／ＢＣＩＰ系に基づく比色定量ＡＰ検出キット（ＢｉｏＲａｄ）によって、そしてＨＲＰ−結合体について化学蛍光Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって、実施した。
【０１９７】
２ｅ）ＥＬＩＳＡによるＦａｂの定量
インタクトなＦａｂの定量を、被膜抗体（１：１０００）としての抗ヒトＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ７４９７）及び検出抗体としてヤギ抗ヒトカッパ軽鎖（結合及び遊離）−アルカリホスファターゼ結合体化抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａ３８１３）（１：１０００）を用いたＥＬＩＳＡによって行った。ヒトＦａｂ／カッパ、ＩｇＧ断片（ＢｅｔｈｙｌＰ８０−１１５）を、５０ｎｇ／ｍＬの開始濃度を有する標準として使用した。上清サンプルを、適宜希釈した。検出を、ｐＮＰＰ基質（Ｓｉｇｍａ  Ｓ０９４２）によって行った。
被膜、希釈、及び洗浄の緩衝液は、ＰＢＳ（２ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4．２Ｈ2Ｏ、２．７ｍＭ  ｇ  ＫＣｌ、８ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に基づき、適宜、ＢＳＡ（１％（ｗ／ｖ））及び／又はＴｗｅｅｎ２０（０．１％（ｖ／ｖ））によって仕上げられた。
【０１９８】
例３：分泌のためにＰ．パストリスＥｐｘ１前駆配列（ＥｐｘＬ−ＲＴ、配列番号８）を用いるＰ．パストリス宿主細胞株による、組換えタンパク質の発現
３ａ）分泌のためにＥｐｘＬ−ＲＴを用いる、組換えブタトリプシノゲンを過剰発現するＰ．パストリスの分析
分泌のためにＥｐｘＬ−ＲＴ配列を用いるｐＴＲＰを発現するＰ．パストリスを、例２ａに記載されるように培養し、例２ｂに記載されるようにトリプシン活性アッセイを用いて、そして例２ｄに記載されるＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。分泌のためにＭＦαを用いるｐＴＲＰを発現するＰ．パストリスを、参照として使用した。
【０１９９】
予期せぬことに、ＥｐｘＬ−ＲＴ分泌リーダーを用いるｐＴＲＰ発現は、約３０ｋＤａのタンパク質スメアをもたらした（図２．１、左側）。他方、ＭＦαは、正しいサイズの分泌ｐＴＲＰをもたらした（２５ｋＤａ；図２．１、右側）。ＥｐｘＬ−ＲＴを有する分泌されたｐＴＲＰの一部もまた、より少ない程度ではあるが、正しいサイズのｐＴＲＰをもたらした。ＥｐｘＬ−ＲＴによって分泌されたｐＴＲＰの量は、ＭＦαを用いて分泌された量の５０％未満だった（表３、例２ｂに記載されるように、トリプシン活性アッセイによって測定した）。スメアのバンドは、恐らく、ＥｐｘＬ−ＲＴ配列の不適切なプロセシング（切断）によって出現したＥｐｘＬ−ＲＴ−ｐＴＲＰ融合タンパク質を表す。
【表３】
2019141063.tif 000005
【０２００】
３ｂ）分泌のためにＥｐｘＬ−ＲＴを用いる組換えｅＧＦＰを過剰発現するＰ．パストリスの分析
分泌のためにＥｐｘＬ−ＲＴ配列を用いるｅＧＦＰを発現するＰ．パストリスを、例２ａに記載するように培養し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットを用いて分析した（例２ｄ）。明らかに、ネイティブのＥｐｘＬ−ＲＴは、ＭＦα（図２．２、右側）とは対照的に、ｅＧＦＰを完全には分泌できなかった（図２．２、左側）。細胞内で、ＥｐｘＬ−ＲＴ配列の一部に未だ結合しているｅＧＦＰが観察され、そのようにしてタンパク質発現の欠陥を排除した（示さず）。
【０２０１】
３ｃ）分泌のためにＥｐｘＬ−ＲＴを用いる組換えヒト血清アルブミンを過剰発現するＰ．パストリスの分析
分泌のためにＥｐｘＬ−ＲＴ配列を用いるＨＳＡを発現するＰ．パストリスを、例２ａに記載されるように培養し、そしてＨＳＡ  ＥＬＩＳＡ（例２ｃ）及びウェスタンブロット（例２ｄ）を用いて分析した。分泌のためにネイティブのＨＳＡリーダーを用いるＨＳＡを発現するＰ．パストリスを、参照として使用した（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ．２００６．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ．３４（１）：５５−９）。
【０２０２】
各構築物の１２の別個のクローンを、合成スクリーニング培地中の４８時間の振とうフラスコ培養の後に、その分泌挙動について分析した。上清を、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びその後のＨＳＡの検出のために抗ＨＳＡ抗体を用いるウェスタンブロッティングによって、定量的に試験した。ＥｐｘＬ−ＲＴによって分泌されたＨＳＡについて、顕著な二重バンドパターンが見えた（図２．３、左側）。ネイティブのリーダーによって分泌されたＨＳＡ（図２．３、右側）、及び精製したＨＳＡ（示さず）と比較し、下側バンドは、正しく処理されたＨＳＡであった。上側バンドは予期しなかったが、僅かにより大きな分子量により、不適切にプロセシングされたＥｐｘＬ−ＲＴに起因するＥｐｘＬ−ＲＴ−ＨＳＡ融合タンパク質を表しているのであろう。バンド強度（ＩｍａｇｅＪによって分析される）に基づくと、全部の分泌されたＨＳＡの４０〜６０％は、不適切に大きな分子量形態で表れた。
【０２０３】
まとめ：分泌のためにＥｐｘＬ−ＲＴ配列を用いる場合、分泌された組換えタンパク質について、スメア又は二重バンドパターンが見えるが、これは長いリーダーＥｐｘＬ−ＲＴの不適切なプロセシング又はプロセシングの欠如の指標である。この特徴は、ＥＰ２２５８８５５Ａ１の完全長Ｅｐｘ１リーダー配列に相当するＥｐｘＬ−ＲＴが、組換えタンパク質分泌のために好適ではなく、有用ではないことを表す。
【０２０４】
例４：ＨＳＡを発現する培養物のより高分子量のバンドのＮ末端の同定
次いで、上の例３ｃ）で記載したようにＥｐｘＬ−ＲＴを用いて発現させたＨＳＡのＮ末端を、Ｎ末端配列決定によってさらに分析した。
【０２０５】
従って、５００μＬのそれぞれの上清を、タンパク質を濃縮するための遠心分離フィルター（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  １０ｋＤａ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＦＣ５０１０）上にロードし、５分間遠心分離して、１５μＬのサンプルを、逆回転によって回収した。
【０２０６】
その後、サンプルを、４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥゲルによって分離し、そしてホウ酸塩緩衝液（１リットルあたり：３．０９ｇホウ酸塩［５０ｍＭ］、１００ｍＬ  ＭｅＯＨ、１Ｍ  ＮａＯＨにてｐＨ９にした）によるウェスタンブロットを、ＰＶＤＦ（フッ化ビニリデン）膜を用いて、２時間にわたって２５Ｖにて実施した。ブロッティングの前に、ゲルを、ホウ酸塩緩衝液中で１０分間にわたってインキュベートし、ここで、膜は、３０秒間にわたってメタノール中に漬けられ、その後、３分間ホウ酸塩緩衝液に漬けられる。
【０２０７】
ブロッティングの後、膜を、３分間にわたってクーマシー（０．１％［ｗ／ｖ］Ｒ２５０、ＭｅＯＨ［４０％  ｖ／ｖ］、酢酸［１０％  ｖ／ｖ］）によって染色し、その後、脱染色した（ＭｅＯＨ［４０％  ｖ／ｖ］、酢酸［１０％  ｖ／ｖ］）。膜を、ｄｄＨ2Ｏですすぎ、そして上側及び下側のバンド（図３）を切り出して、Ｎ末端ＥＤＭＡＮ配列決定をした。下側のバンドについて、ＤがＮ末端アミノ酸として、結局は、ＨＳＡの第１のアミノ酸（ＨＳＡのＮ末端、配列番号３０：ＤＡＨＫＳＥＶ）で決定され、それに対し、上側バンドについては、ＡＹＹＴ（配列番号３１）が、分泌タンパク質のＮ末端として決定された。これらのアミノ酸は、ＥｐｘＬ−ＲＴ配列（配列番号８）の一部であり、望まない２１のアミノ酸が、ＨＳＡに突出して残っている。ＡＹＹＴ（配列番号２３）に先行するＥｐｘＬ−ＲＴの配列は、ＫＲであり、これは、二塩基性のＬｙｓ−Ａｒｇペプチダーゼ切断モチーフの一部であり得る。プロテアーゼ、例えばＫｅｘ２による二塩基性Ｌｙｓ−Ａｒｇモチーフのプロセシングは、モチーフ自体だけではなく、三次元構造及び周囲のアミノ酸環境にも依存する（Ｂａｄｅｒら、２００８、ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：１１６．）。他の酵母（例えばサッカロミセス・セレビシエ、カンジダ亜種）のＥｐｘ１ホモログの配列を用いた、ＥｐｘＬ−ＲＴのＢＬＡＳＴ分析及び配列アラインメントは、リーダー配列におけるＫＲモチーフが、保存されないことを明らかにした。従って、プロテアーゼ、例えばＫｅｘ２によるＫＲモチーフのプロセシングは、配列分析に基づいては演繹的に推定できない。
【０２０８】
例５：分泌のためにＰ．パストリスＥｐｘＬ−ＫＲ配列（切断型リーダー、３位のＸがＦであり、そして１６位のＸがＡである配列番号１０（配列番号１２））を用いる組換えタンパク質の発現のためのＰ．パストリス宿主細胞株の構築
ＥｐｘＬ−ＲＴにおけるＫＲ配列が本当にプロテアーゼ切断部位であるかどうかを試験するために、分泌のためにＥｐｘＬ−ＫＲ配列を用いる組換えタンパク質の発現のためのベクターを、構築した。
【０２０９】
５ａ）分泌のためにＥｐｘＬ−ＫＲ配列を用いるＨＳＡを過剰発現するＰ．パストリス株の構築
ＨＳＡを、表４．１のプライマーを用いて増幅し、そしてＢｇｌＩ及びＳｂｆｉＩで消化したベクターｐＰＭ２＿ｐＧＡＰｘＬＲＴ内にライゲーションした。配列確認後、ベクターｐＰＭ２＿ｐＧＡＰｘＬＫＲ−ＨＳＡをプロモーター領域にて直鎖化し、Ｐ．パストリス内に形質転換した。
【表４−１】
2019141063.tif 000006
【０２１０】
５ｂ）分泌のためにＥｐｘＬ−ＫＲ配列を用いるブタトリプシノゲン又はｅＧＦＰを過剰発現するＰ．パストリス株の構築
ｐＴＲＰを、表４．２のプライマーを用いて増幅し、そしてＰｖｕＩＩ及びＳｂｆｉＩで消化したベクターｐＰＭ２＿ｐＧＡＰｘＬＲＴ内にライゲーションした。発現ベクターｐＰＭ２＿ｐＧＡＰｘＬＫＲ−ｅＧＦＰを、同じように作製した。配列確認後、ベクターｐＰＭ２＿ｐＧＡＰｘＬＫＲ−ｐＴＲＰ及びｐＰＭ２＿ｐＧＡＰｘＬＫＲ−ｅＧＦＰを、プロモーター領域で直鎖化し、Ｐ．パストリス内に形質転換した。
【表４−２】
2019141063.tif 000007
【０２１１】
５ｃ）分泌のためにＥｐｘＬ−ＫＲ配列を用いる、抗体軽鎖又は重鎖を過剰発現するＰ．パストリス株の構築
抗体ＨｙＨＥＬの軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）を、表４．３のプライマーを用いて増幅し、ＢｇｌＩＩ及びＳｂｆｉＩで消化したベクターｐＰＭ２＿ｐＧＡＰｘＬＲＴ内にライゲーションした。配列確認後、ベクターｐＰＭ２＿ｐＧＡＰｘＬＫＲ−ＬＣ及びｐＰＭ２＿ｐＧＡＰｘＬＫＲ−ＨＣをプロモーター領域において直鎖化し、そしてＰ．パストリス内に形質転換した。
【表４−３】
2019141063.tif 000008
【０２１２】
例６：分泌のためにＥｐｘＬ−ＫＲ（切断型リーダー、３位のＸがＦ、及び１６位のＸがＡである配列番号１０（配列番号１２））を用いるＰ．パストリス宿主細胞株による組換えタンパク質の発現
６ａ）分泌のためにＥｐｘＬ−ＫＲを用いる組換えブタトリプシノゲンを過剰発現するＰ．パストリスの分析
分泌のためにＥｐｘＬ−ＫＲ配列を用いるｐＴＲＰを発現するＰ．パストリス（例５ｂ）を、例２ａで記載したように培養し、例３ａのように分析した。
【０２１３】
驚いたことに、我々は、短くしたＥｐｘ分泌リーダーＥｐｘＬ−ＫＲ（図４．１、中間部）を用いることによって、プロセシングは本当に増強されたことを観察した。分泌のためにＥｐｘＬ−ＲＴを用いた際に観察されたタンパク質スメアとは対照的に（図４．１、左側）、ＥｐｘＬ−ＫＲを用いたｐＴＲＰの分泌は、正しいサイズのバンドを生じた（図４．１、中間部）。ＥｐｘＬ−ＫＲを用いて分泌されたｐＴＲＰの正しいＮ末端を、質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって確認した。
【０２１４】
従って、約１０μｇの各サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そして所望のタンパク質バンドを切り出し、そしてゲル内で消化した。タンパク質を、ゲル中でカルバミドメチル化した。このタンパク質を、配列決定等級のトリプシン（Ｒｏｃｈｅ）、又はＧｌｕ−Ｃ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＬｙｓＣ（Ｒｏｃｈｅ）及びキモトリプシン（Ｒｏｃｈｅ）のどちらかで消化するか、又は消化せずに分析した。全てのタンパク分解反応を、３７℃にて一晩実施した。その後、サンプルを、直接、ＬＣ−ＭＳシステム（オンラインナノ供給源を備えたＬＣ：Ｄｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  ＬＣ、ＭＳ：Ｂｒｕｋｅｒ、ａｍａＺｏｎ  ＥＴＤ）に注入した。ペプチドを、Ｃ−１８カラム（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ  ＧｍｂＨ、Ｃ−１８  ＨＰＬＣ  カラム  ＲｅｐｒｏＳｉｌ−Ｐｕｒ  ２００＊０．１ｍｍ、３μｍパッキング、２００Ａ孔径、流速：０．４μＬ／分）上で分離し、９５％溶媒Ａ及び５％溶媒Ｂ（溶媒Ａ：水中０．１％  ＦＡ、ＡＣＣＮ中０．１％ＦＡ）から３２％  Ｂまでの線形勾配を４０分間適用した後に、大きなペプチドの溶出を容易にする３２％  Ｂから７５％  Ｂまでの１５分間の線形勾配を適用し、そしてデータ依存型獲得によるＭＳによって分析した。データを、標準Ｂｒｕｋｅｒソフトウェア（データ分析）及びＧＰＭと組み合わせたフリーウェアプログラムＸ！−ｔａｎｄｅｍを用いて処理した。
【０２１５】
ＥｐｘＬ−ＫＲによって分泌されるｐＴＲＰの正しいＮ末端とは対照的に、分泌のためにＭＦαを用いる場合に分泌されたｐＴＲＰのＮ末端に、アミノ酸ＥＡＥＡが残されたことを決定した。さらに、ＥｐｘＬ−ＫＲを用いて分泌されたｐＴＲＰの量は、一般的に使用されるＭＦα−分泌リーダーと比較して、２０％を超えて高かった（表５）。
【表５】
2019141063.tif 000009
【０２１６】
６ｂ）分泌のためにＥｐｘＬ−ＫＲを用いる、組換えヒト血清アルブミンを過剰発現するＰ．パストリスの分析
分泌のためにＥｐｘＬ−ＫＲ配列を用いる、ＨＳＡを発現するＰ．パストリス（例５ａ）を、例２ａに記載されるように培養し、ウェスタンブロットを用いて分析した（例２ｄ）。
【０２１７】
分泌のためにＥｐｘＬ−ＲＴを用いた場合に観察された二重バンドパターン（図２．３、左側）とは対照的に、ＥｐｘＬ−ＫＲを用いるＨＳＡの分泌は、正しいサイズの一本のバンドをもたらした（示さず）。従って、ＥｐｘＬ−ＫＲは、正しくプロセシングされたＨＳＡを分泌できた。
【０２１８】
６ｃ）分泌のためにＥｐｘＬ−ＫＲを用いる、ｅＧＦＰを過剰発現するＰ．パストリスの分析
分泌のためにＥｐｘＬ−ＫＲ配列を用いる、ｅＧＦＰを発現するＰ．パストリス（例５ｂ）を、例２ａに記載されるように培養し、例３ｂのように分析した。
【０２１９】
ＥｐｘＬ−ＫＲリーダーのみが正しいサイズのｅＧＦＰをもたらす（図４．２、左側）のに対し、ＭＦαリーダーの残渣は、より大きな分子量のｅＧＦＰをもたらした（図４．２、右側）。ＬＣ−ＭＳ分析（例６ａに記載される）は、ＥｐｘＬ−ＫＲによって分泌されるｅＧＦＰの正しいＮ末端を確認した。このことは、分泌産物について、正しいＮ末端を有する分子の含量が、少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９８％、なおより好ましくは少なくとも９９％又は約１００％（ｗ／ｗ）であるために適格である。対照的に、ＭＦαの使用は、Ｓｔｅ１３アミノペプチダーゼによるリーダーペプチドの不適切なプロセシングに起因して、Ｎ末端に付加したアミノ酸配列としてアミノ酸ＥＡＥＡを残した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるバンドのサイズに従い、ＭＦαによって分泌されたｅＧＦＰの多くが、Ｎ末端にＥＡＥＡが突出する不適切なアミノ酸を有する。他方、ＥｐｘＬ−ＫＲによって分泌されたｅＧＦＰについて、不適切なサイズのバンドは観察されない。ｐＴＲＰについて（図６ａ）、ＥｐｘＬ−ＫＲを用いたｅＧＦＰの分泌レベルは、ＭＦαを用いたのと比較して２０％を超えて高かった（表６）。
【表６】
2019141063.tif 000010
【０２２０】
６ｄ）分泌のためにＥｐｘＬ−ＫＲを用いる、抗体軽鎖又は抗体重鎖を過剰発現するＰ．パストリスの分析
分泌のためにＥｐｘＬ−ＫＲ配列を用いる、ＨｙＨＥＬ  ＬＣ又はＨｙＨＥＬ  ＨＣのどちらかを発現するＰ．パストリス（例５ｃ）を、例２ａに記載されるように培養し、例２ｄのように分析した。
【０２２１】
両抗体鎖は、ＥｐｘＬ−ＫＲ配列を用いて分泌され得（図４．３）、ＥｐｘＬ−ＫＲが、Ｐ．パストリスにおける抗体産生のための貴重な分泌リーダーであることを確認した。
ＥｐｘＬ−ＫＲによって分泌されたＨｙＨＥＬ  ＬＣの正しいＮ末端を、例６ａに記載されるように、ＬＣ−ＭＳ分析によって確認した。
【０２２２】
例７：分泌のためにＥｐｘＬ−ＡＡ配列（配列番号２１）を用いる組換えタンパク質の発現のための、Ｐ．パストリス宿主細胞株の構築
ＷＯ２０１０／１３５６７８及びＵＳ２０１１００２１３７８は、ＭＫＬＳＴＮＬＩＬＡＩＡＡＡＳＡＶＶＳＡＡ（配列番号２１）のアミノ酸配列、すなわち、配列番号８のアミノ酸１〜２１を記載し、これは、完全長Ｅｐｘ１リーダーの最初の２１アミノ酸に相当する。しかし、この配列が実際に組換えタンパク質の分泌のために好適であることを示す実験データは、ＷＯ２０１０／１３５６７８及びＵＳ２０１１００２１３７８において提供されていない。以後ＥｐｘＬ−ＡＡと呼ぶこの断片が、正しくプロセシングされた組換えタンパク質の分泌を可能にするために十分であるかどうかを試験するために、我々は、分泌のためにＥｐｘＬ−ＡＡ配列を用いる組換えタンパク質の発現のためのベクターを構築した。
【０２２３】
抗体軽鎖ＬＣ、ｐＴＲＰ、及びｅＧＦＰを、表７のプライマーを用いて増幅し、そしてＢｇｌＩ及びＳｆｉＩで消化したベクターｐＰＭ２＿ｐＧＡＰｘＬＲＴ内にライゲーションした。配列確認後、ベクターｐＰＭ２＿ｐＧＡＰｘＬＡＡ−ＬＣ、ｐＰＭ２＿ｐＧＡＰｘＬＡＡ−ｐＴＲＰ及びｐＰＭ２＿ｐＧＡＰｘＬＡＡ−ｅＧＦＰを、プロモーター領域において直鎖化し、それぞれＰ．パストリスに形質転換した。
【表７】
2019141063.tif 000011
【０２２４】
例８：分泌のためにＥｐｘＬ−ＡＡ（配列番号２１）を用いるＰ．パストリス宿主細胞株による組換えタンパク質の発現
８ａ）分泌のためにＥｐｘＬ−ＡＡを用いる、ｅＧＦＰを過剰発現するＰ．パストリスの分析
分泌のためにＥｐｘＬ−ＡＡ配列を用いる、ｅＧＦＰを発現するＰ．パストリス（例７）を、例２ａに記載されるように培養し、例３ｂのように分析した。
【０２２５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、ＥｐｘＬ−ＡＡによるバンドのサイズは、ＥｐｘＬ−ＫＲによるものよりも僅かに大きく（図５．１）、これは、少なくとも１つのＡｌａ残基がｅＧＦＰのＮ末端に残されていて、それにより、組換え分泌タンパク質の非ネイティブのＮ末端を呈示することを示している。
【０２２６】
８ｂ）分泌のためにＥｐｘＬ−ＡＡを用いる、組換えブタトリプシノゲンを過剰発現するＰ．パストリスの分析
分泌のためにＥｐｘＬ−ＡＡ配列を用いる、ｐＴＲＰを発現するＰ．パストリス（例７）を、例２ａに記載されるように培養し、例３ａのように分析した。
【０２２７】
ｐＴＲＰは、ＥｐｘＬ−ＡＡ配列を用いて分泌されたが、しかし、分泌レベルは、ＥｐｘＬ−ＫＲ配列によるよりも低かった（表８）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、ＥｐｘＬ−ＡＡによるバンドのサイズは、ＥｐｘＬ−ＫＲによるよりも僅かに大きく（図５．１）、このことは、少なくとも１つのＡｌａ残基が、ｐＴＲＰのＮ末端に残されていることを示す。
【０２２８】
実際に、ＥｐｘＬ−ＡＡによって分泌されたｐＴＲＰのＮ末端配列決定は、組換え分泌タンパク質のＮ末端が、ＥｐｘＬ−ＡＡ配列から残された付加アミノ酸、Ａｌａを含み、それにより、組換え分泌タンパク質の非ネイティブのＮ末端を呈示することを明らかにした。
【表８】
2019141063.tif 000012
【０２２９】
８ｃ）分泌のためにＥｐｘＬ−ＡＡを用いる、ＬＣを過剰発現するＰ．パストリスの分析
分泌のためにＥｐｘＬ−ＡＡ配列を用いる、ＨｙＨＥＬ  ＬＣを発現するＰ．パストリス（例７）を、例２ａに記載されるように培養し、例２ｄのように分析した。ＬＣについて、ＥｐｘＬ−ＡＡによる分泌レベルは、ＥｐｘＬ−ＫＲ又はＭＦアルファと比較して低かった（図５．２）。ｐＴＲＰについて、ＥｐｘＬ−ＡＡによって分泌されたＬＣのＮ末端配列決定は、組換え分泌タンパク質のＮ末端が、ＥｐｘＬ−ＡＡ配列が残した付加アミノ酸、Ａｌａを含んだことを示した。
【０２３０】
これはやはり、シグナル配列に由来する望まぬ残基であり、分泌された組換えタンパク質の産生に対し、ＥｐｘＬ−ＡＡを好適でないものとする。
【０２３１】
例９：分泌のためにＥｐｘＬ−Ａ配列（シグナルペプチド配列、３位のＸがＦであり、そして１６位のＸがＡである配列番号１、配列番号３）を用いる組換えタンパク質の発現のための、Ｐ．パストリス宿主細胞株の構築
従って、我々は、ネイティブのＥｐｘ１リーダー（ＥｐｘＬ−Ａと呼ぶ）の最初の２０アミノ酸のみからなるシグナル配列によって、組換えタンパク質を分泌するＰ．パストリス株を構築した。Ａｌａは、予測されたシグナルペプチダーゼ切断部位（のＣ末端）の前の最後のアミノ酸を表し、ここで、ＳＰ切断部位のＮ末端側において、組換えタンパク質が直ちに開始する。このＮ末端アミノ酸の性質がＳＰの切断に影響を与えないことを確認するために、我々は、３つの異なる組換えタンパク質：ｅＧＦＰ（疎水性アミノ酸Ｖａｌで開始する）、並びに抗体ＬＣ及びＨＣ（負に荷電したアミノ酸Ａｓｐで開始する）の分泌を試験した。
【０２３２】
抗体軽鎖ＬＣ、Ｆａｂ−ＨＣ、及びｅＧＦＰを、表９のプライマーを用いて増幅し、そしてＢｇｌＩ及びＳｆｉＩで消化したベクターｐＰＭ２＿ｐＧＡＰｘＬＲＴ内にライゲーションした。配列確認後、ベクターをプロモーター領域において直鎖化し、そしてＰ．パストリスに形質転換した。
【０２３３】
ＬＣ及びＦａｂ−ＨＣについて、ｐＧＡＰプロモーターもまた、ＡｐａＩ及びＳｂｆＩを用いて誘導性ｐＧ１プロモーター（配列番号９）と交換し、次いで、両鎖についての発現カセットを、適合する制限酵素ＭｒｅＩ及びＡｇｅＩを用いることによって、１つのベクター上に合わせた。配列確認後、このベクターをＡＯＸ−ＴＴ領域において直鎖化し、そしてＰ．パストリスに形質転換した。
【表９】
2019141063.tif 000013
【０２３４】
例１０：分泌のためにＥｐｘＬ−Ａ（シグナルペプチド配列、３位のＸがＦであり、そして１６位のＸがＡである配列番号１（配列番号３））を用いる、Ｐ．パストリス宿主細胞株による組換えタンパク質の発現
１０ａ）分泌のためにＥｐｘＬ−Ａを用いる、ｅＧＦＰを過剰発現するＰ．パストリスの分析
分泌のためにＥｐｘＬ−Ａ配列を用いてｅＧＦＰを発現するＰ．パストリス（例９）を、例２ａに記載されるように培養し、例３ｂのように分析した。
【０２３５】
図５．１に見られるように、ＥｐｘＬ−Ａを用いるｅＧＦＰの分泌レベルは、ＥｐｘＬ−ＫＲと同等であり、ＥｐｘＬ−ＡＡよりも高かった。
【０２３６】
Ｋｏｔｔｍａｉｅｒら（２０１１  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９１：１３３−１４１）に記載されるヒドロホビンシグナル及びリーダー配列、並びにＭＦαプレプロリーダーとは対照的に、ＥｐｘＬ−Ａ配列及びＥｐｘＬ−ＫＲ配列は、ｅＧＦＰの液胞標的化をもたらさない（共焦点レーザー走査顕微鏡観察によって証明された。データ示さず）。両株は、分泌経路に存在するタンパク質を表す、細胞内ｅＧＦＰ分布を示す（染色は、主に小胞体である）；従って、ＥｐｘＬ−Ａシグナルペプチド及びＥｐｘＬ−ＫＲ切断型リーダーは、「分泌表現型」を示すので、組換えタンパク質分泌に十分に適すると考えられる。
【０２３７】
１０ｂ）分泌のためにＥｐｘＬ−Ａを用いる、ＬＣを過剰発現するＰ．パストリスの分析
分泌のためにＥｐｘＬ−Ａ配列を用いてＨｙＨＥＬ  ＬＣを発現するＰ．パストリス（例９）を、例２ａに記載されるように培養し、例６ｄのように分析した。
【０２３８】
抗体軽鎖の分泌のためのＥｐｘＬ−Ａの使用は、正しいサイズのタンパク質（図５．２）をもたらし、ここで、分泌は、ＥｐｘＬ−ＫＲによるものと同じくらい効率的で、ＥｐｘＬ−ＡＡによるものよりも８倍高かった（表１０）。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、図５．２に示されるゲル上のバンド強度を定量することにより、分泌レベルを比較した。
【表１０】
2019141063.tif 000014
【０２３９】
ＥｐｘＬ−Ａによって分泌されるＬＣのＮ末端が、正しいＮ末端ＤＩＶＬＴＱＳＰ（Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ、配列番号５４）であることを、ＬＣ−ＭＳによって確認した。
【０２４０】
従って、Ｅｐｘ１、ＥｐｘＬ−Ａのシグナルペプチドは、より長い配列ＥｐｘＬ−ＡＡとは対照的に、正しいＮ末端を有する組換えタンパク質を分泌するのに十分であり且つ好適である。
【０２４１】
構成的ｐＧＡＰプロモーターの制御下での発現に加え、ＥｐｘＬ−ＡによるＬＣの分泌を、誘導性ｐＧ１プロモーター（配列番号９）の制御下で試験した。株構築を、例９に記載した。スクリーニング培養物におけるグルコース制限条件を、例２ａに記載されるように、グルコースフィードビーズを用いて作成した。このような誘導条件下で、軽鎖の分泌を観察した。
【０２４２】
１０ｃ）分泌のためにＥｐｘＬ−Ａを用いる、抗体Ｆａｂ断片を過剰発現するＰ．パストリスの分析
両鎖の分泌のためにＥｐｘＬ−Ａ配列を用いてＨｙＨＥＬ抗体のＦａｂ断片（軽鎖（ｖL及びｃL）並びに重鎖断片（ｖH及びｃH1）からなる）を発現するＰ．パストリス（例９に記載する株）を、例２ａに記載されるように培養し、例２ｄ及び２ｅのように分析した。
【０２４３】
驚いたことに、ＨｙＨＥＬ  ＦａｂのＬＣ及びＨＣの両方の分泌のためにＥｐｘＬ−Ａ配列を用いることにより、分泌されたインタクトなＦａｂのレベルが、ＭＦαプレプロリーダーによるものよりも最大１０倍高かった（例２ｅに記載されるようにＥＬＩＳＡによって決定した）。バイオマスあたりのＦａｂ収量は、分泌のためにＭＦαを用いた場合の０．０３〜０．１３ｍｇ  Ｆａｂ／ＯＤと比較して、ＥｐｘＬ−Ａを用いた場合に０．１５〜０．３５ｍｇ  Ｆａｂ／ＯＤであった。さらに、ＥｐｘＬ−Ａにより、ｐＧ１の制御下でＨｙＨＥＬ  Ｆａｂを分泌するＰ．パストリスの上清は、高レベルの遊離ＬＣ又は組換えタンパク質のより高分子量の凝集体を含まない（図５．３）。
【０２４４】
例１１：分泌のためにＥｐｘＬ−Ａ（シグナルペプチド配列、３位のＸがＦであり、そして１６位のＸがＡである配列番号１（配列番号３）を用いる、Ｐ．パストリス宿主細胞株による組換えタンパク質の発現
ＥｐｘＬ−Ａ（配列番号３）を用いることによるＰ．パストリスからの８種のタンパク質の分泌を、試験した：ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ソマトトロピン、インターフェロンアルファ２ａ（ＩＦＮ−α２ａ）、２つの異なるｈｉｓ−タグ化ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ１及びｓｃＦｖ２）並びに３つの異なるＦａｂ（Ｆａｂ１、Ｆａｂ２及びＦａｂ３）。
【０２４５】
遺伝子を、Ｐ．パストリスについてコドン最適化し、そしてＧｅｎｅＡｒｔ（Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成した。得られたベクターを、ＳｂｆＩ及びＳｆｉＩによって消化し、そして遺伝子を、ベクターｐＰＭ２ａＺ３０＿ｐＧ１内にライゲーションした。Ｆａｂの場合、両鎖についての発現カセットを、適合性の制限酵素、ＭｒｅＩ及びＡｇｅＩを使用することによって、１つのベクター上に合わせた。配列確認後、ベクターを、ＡＯＸターミネーター領域において直鎖化し、Ｐ．パストリスに形質転換した。
【０２４６】
分泌のためにＥｐｘＬ−Ａ配列（配列番号３）を用いる、組換えタンパク質（ヒト成長ホルモン、ソマトトロピン、インターフェロンアルファ２ａ、２つのｈｉｓ−タグ化ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ１及びｓｃＦｖ２）並びに３つのＦａｂ（Ｆａｂ１、Ｆａｂ２及びＦａｂ３）（Ｆａｂは、軽鎖（ｖL及びｃL）並びに重鎖断片（ｖH及びｃH1）からなる））を発現するＰ．パストリス株を、１リットルあたり：１０ｇ酵母抽出物、１０ｇペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０、１３．４ｇ酵母窒素塩基及び硫酸アンモニウム並びに０．４ｍｇビオチンを含む培地中で培養した。小規模スクリーニングを、２フィードビーズにより、２４ウェルプレートにおいて実施した（Ｋｕｈｎｅｒ、径６ｍｍ）。
【０２４７】
上清を、例２ｄのように分析した。ＰＯＩを、特定の抗体の使用によってウェスタンブロットにおいて検出した：ソマトトロピン及びヒト成長ホルモンについて：ＧＨ１ポリクローナル抗体；Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ  １７８６７−１ＡＰ（１：５０００）及び抗ウサギＩｇＧ（分子全体）−アルカリホスファターゼ抗体、Ｓｉｇｍａ  Ａ３６８７（１：１２０００）。インターフェロン−アルファ２ａについて：インターフェロンアルファ２ａ抗体；抗体−オンラインＡＢＩＮ５７３７９５（１：１，５００）及び抗ウサギＩｇＧ（分子全体）−アルカリホスファターゼ抗体、Ｓｉｇｍａ  Ａ３６８７（１：１２０００）。Ｈｉｓ−タグ化ｓｃＦｖについて：ペンタ−Ｈｉｓ  ＨＲＰ結合体；ＱＩＡＧＥＮ  １０１４９９２８（１：１，５００）。
【０２４８】
ＥｐｘＬ−Ａ配列（配列番号３）を使用した場合、全ての試験したタンパク質は、培養培地中に首尾よく分泌された（図６）。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年4月25日(2019.4.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は１若しくは２の点変異を有するその機能的バリアント、及び
ｂ）配列番号１１、１２、１３及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチド
からなる群から選択されるリーダーをコードし、
好ましくは、リーダーペプチドをコードする、配列番号１８、１９及び２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号１８、１９、若しくは２０のいずれかのコドン最適化バリアントである、単離された核酸。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４８】
ＥｐｘＬ−Ａ配列（配列番号３）を使用した場合、全ての試験したタンパク質は、培養培地中に首尾よく分泌された（図６）。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は１若しくは２の点変異を有するその機能的バリアント、及び
ｂ）配列番号１１、１２、１３及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチド
からなる群から選択されるリーダーをコードし、
好ましくは、リーダーペプチドをコードする、配列番号１８、１９及び２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号１８、１９、若しくは２０のいずれかのコドン最適化バリアントである、単離された核酸。
［２］
配列番号１２のアミノ酸配列を有するリーダーペプチドであるリーダーをコードし、好ましくは、配列番号１９のヌクレオチド配列からなるか、又は配列番号１９のコドン最適化バリアントからなる、［１］に記載の核酸。
［３］
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は１若しくは２の点変異を有するその機能的バリアント、及び
ｂ）配列番号２、３、４及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するシグナルペプチド
からなる群から選択されるリーダーをコードし、
好ましくは、シグナルペプチドをコードする、配列番号１５、１６及び１７からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号１５、１６若しくは１７のいずれかのコドン最適化バリアントである、単離された核酸。
［４］
配列番号３のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドであるリーダーをコードし、好ましくは、配列番号１６のヌクレオチド配列からなるか、又は配列番号１６のコドン最適化バリアントからなる、［３］に記載の核酸。
［５］
ＤＮＡである、［１］〜［４］のいずれか１に記載の核酸。
［６］
［１］〜［５］のいずれか１に記載の核酸によってコードされ、好ましくは、配列番号１、２、３、４、５、１０、１１、１２、１３及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、単離されたリーダー。
［７］
配列番号３又は配列番号１２のアミノ酸配列からなるペプチドである、［６］のリーダー。
［８］
ＰＯＩをコードする核酸配列に作動可能に連結したリーダーをコードする核酸を含む発現カセットであって、前記リーダーが、
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、又は１若しくは２の点変異を有するその機能的バリアント、
ｂ）配列番号１１、１２、１３及び１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリーダーペプチド、好ましくは、リーダーペプチドをコードする、配列番号１８、１９及び２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号１８、１９、若しくは２０のいずれかのコドン最適化バリアント、
ｃ）配列番号１のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド、又は１若しくは２の点変異を有するその機能的バリアント、並びに
ｄ）配列番号２、３、４及び５からなる群から選択される、アミノ酸配列を有するシグナルペプチド、好ましくは、シグナルペプチドをコードする、配列番号１５、１６及び１７からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号１５、１６、若しくは１７のいずれかのコドン最適化バリアント、
からなる群から選択されることによって特徴付けられる、発現カセット。
［９］
前記ＰＯＩが、ネイティブのＮ末端アミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、［８］に記載の発現カセット。
［１０］
前記ＰＯＩが、抗体又はその断片、酵素及びペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質結合体、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン及びワクチン様タンパク質又は粒子、プロセス酵素、成長因子、ホルモン及びサイトカインを含む治療用タンパク質から選択されるか、又は前記ＰＯＩが、好ましくは抗体又はその断片、成長因子、ホルモン及びサイトカインからなる群から選択される、宿主細胞代謝産物の産生を媒介する、［８］又は［９］に記載の発現カセット。
［１１］
前記ＰＯＩが、成長因子、ホルモン、サイトカイン、抗体及び抗体断片からなる群から選択され、抗体及び抗体断片が、好ましくは、完全長抗体、ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、Ｆａｂ及びＦｃ融合タンパク質からなる群から選択される、［１０］に記載の発現カセット。
［１２］
前記リーダーをコードする前記核酸に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、［８］〜［１１］のいずれか１に記載の発現カセット。
［１３］
［８］〜［１２］のいずれか１に記載の発現カセットを含む、組換え酵母宿主細胞又はベクター。
［１４］
前記酵母が、ピキア属、カンジダ属、トルロプシス属、アークスラ属、ハンゼヌラ属、オガテア属、ヤロウイア属、クリベロミセス属、サッカロミセス属及びコマガタエラ属からなる群の属から選択される、［１３］に記載の宿主細胞。
［１５］
［１３］又は［１４］に記載の宿主細胞を準備すること、
前記宿主細胞を培養して、前記ＰＯＩを発現させること、及び
前記ＰＯＩを精製して、精製ＰＯＩの調製物を得ること
を含む、酵母宿主細胞においてＰＯＩを産生する方法。
［１６］
前記ＰＯＩが、ネイティブのＮ末端アミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、［１５］に記載の方法。
［１７］
前記ＰＯＩが、Ｎ末端アミノ酸残基として追加のアラニンを含まないアミノ酸配列を含む、［１５］又は［１６］に記載の方法。
［１８］
前記ＰＯＩが、抗体又はその断片、酵素及びペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質結合体、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン及びワクチン様タンパク質又は粒子、プロセス酵素、成長因子、ホルモン及びサイトカインを含む治療用タンパク質から選択されるか、又は前記ＰＯＩが、宿主細胞代謝産物の産生を媒介する、［１５］〜［１６］のいずれか１に記載の方法。
［１９］
前記ＰＯＩが、成長因子、ホルモン、サイトカイン、抗体及び抗体断片からなる群から選択され、抗体及び抗体断片が、好ましくは、完全長抗体、ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、Ｆａｂ及びＦｃ融合タンパク質からなる群から選択される、［１８］に記載の方法。
［２０］
宿主細胞からのＰＯＩの分泌のための、及び／又は宿主細胞からのＰＯＩの分泌を増大するための、［１］〜［５］のいずれか１に記載の核酸、又は［６］若しくは［７］に記載のリーダーの使用。
［２１］
分泌ＰＯＩの少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、又は１００％が、ネイティブのＮ末端アミノ酸配列を含む、［２０］に記載の使用。
【外国語明細書】
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