(57)【要約】      （修正有）【課題】合成コンセンサス口蹄疫ウイルス（FMDV）免疫原性タンパク質およびそのようなタンパク質をコードする核酸分子、FMDVに対するワクチンの提供。【解決手段】ウイルスタンパク質2Aのコード配列に連結されるプロテアーゼ切断部位のコード配列にウイルスタンパク質VP１のそのＣ末端で連結されるコード配列に連結されるプロテアーゼ切断部位のコード配列にウイルスタンパク質VP３のそのＣ末端で連結されるコード配列にプロテアーゼ切断部位のそのＣ末端で連結されるコード配列にウイルスタンパク質VP２のそのＣ末端で連結されるコード配列にプロテアーゼ切断部位のそのＣ末端で連結されるコード配列にウイルスタンパク質VP４のそのＣ末端で連結されるコード配列に連結されるリーダー配列などを含む核酸分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子であって、
ａ）ウイルスタンパク質2Aのコード配列に連結されるプロテアーゼ切断部位のコード配列にウイルスタンパク質VP１のそのＣ末端で連結されるコード配列に連結されるプロテアーゼ切断部位のコード配列にウイルスタンパク質VP３のそのＣ末端で連結されるコード配列にプロテアーゼ切断部位のそのＣ末端で連結されるコード配列にウイルスタンパク質VP２のそのＣ末端で連結されるコード配列にプロテアーゼ切断部位のそのＣ末端で連結されるコード配列にウイルスタンパク質VP４のそのＣ末端で連結されるコード配列に連結されるリーダー配列と、
ｂ）ウイルスタンパク質2Aのコード配列に連結されるプロテアーゼ切断部位のコード配列にウイルスタンパク質VP１のそのＣ末端で連結されるコード配列に連結されるプロテアーゼ切断部位のコード配列にウイルスタンパク質VP３のそのＣ末端で連結されるコード配列にプロテアーゼ切断部位のそのＣ末端で連結されるコード配列にウイルスタンパク質VP２のそのＣ末端で連結されるコード配列に連結されるリーダー配列と、
ｃ）ウイルスタンパク質VP１のコード配列に連結されるプロテアーゼ切断部位のコード配列にウイルスタンパク質VP３のそのＣ末端で連結されるコード配列にプロテアーゼ切断部位のそのＣ末端で連結されるコード配列にウイルスタンパク質VP２のそのＣ末端で連結されるコード配列にプロテアーゼ切断部位のそのＣ末端で連結されるコード配列にウイルスタンパク質VP４のそのＣ末端で連結されるコード配列に連結されるリーダー配列と、
ｄ）ウイルスタンパク質VP１のコード配列に連結されるプロテアーゼ切断部位のコード配列にウイルスタンパク質VP３のそのＣ末端で連結されるコード配列にプロテアーゼ切断部位のそのＣ末端で連結されるコード配列にウイルスタンパク質VP２のそのＣ末端で連結されるコード配列に連結されるリーダー配列と、をコードする配列を含む、核酸分子。
【請求項２】
前記リーダー配列がIgE配列である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記切断部位が、フューリンによって認識されるrgrkrrs（配列番号27）である、請求項１または２のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項４】
前記ウイルスタンパク質が、Ａ、Asia１、Ｃ、Ｏ、SAT１、SAT２、およびSAT３からなる群より選択されるFMDVサブタイプ由来である、請求項１〜３のいずれかに記載のプラスミド。
【請求項５】
ｂｅ核酸配列をコードする前記ウイルスタンパク質が、FMDVサブタイプＡ、Asia１、Ｃ、Ｏ、SAT１、SAT２、およびSAT３からなる群の１〜７つのFMDVサブタイプ由来である、請求項４に記載の１、２、３、４、５、６、または７つのプラスミドを含む、ワクチン。
【請求項６】
ｂｅ核酸配列をコードする前記ウイルスタンパク質が、Ａ、Asia１、Ｃ、およびＯからなる群の各FMDVサブタイプ由来である、４つのプラスミドを含む請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
ｂｅ核酸配列をコードする前記ウイルスタンパク質が、FMDVサブタイプＡ、Asia１、Ｃ、Ｏ、SAT１、SAT２、およびSAT３の各々由来である、７つのプラスミドを含む請求項５に記載のワクチン。
【請求項８】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、および配列番号11からなる群より選択される核酸配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸分子からなる群より選択されるプラスミドであって、前記プラスミドが配列番号１の核酸配列を含むか、前記プラスミドが配列番号３の核酸配列を含むか、前記プラスミドが配列番号５の核酸配列を含むか、前記プラスミドが配列番号７の核酸配列を含むか、前記プラスミドが配列番号９の核酸配列を含むか、または前記プラスミドが配列番号11の核酸配列を含む、プラスミド。
【請求項１０】
請求項９に記載のプラスミドを１つ以上含む、ワクチン。
【請求項１１】
個体におけるFMDVに対する免疫反応を起こす方法であって、請求項５、６、７、または10に記載のワクチンを前記個体に投与することを含む、方法。
【請求項１２】
個体におけるFMDVへの感染を予防する方法であって、請求項５、６、７、または12に記載のワクチンを前記個体に投与することを含む、方法。
【請求項１３】
FMDVに感染している個体を治療する方法であって、請求項５、６、７、または12に記載のワクチンを前記個体に投与する、方法。
【請求項１４】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、および配列番号11におけるFMDV VP１、VP２、VP３、またはVP４タンパク質コード配列と、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、および配列番号11における配列によってコードされるFMDV VP１、VP２、VP３、またはVP４タンパク質の少なくとも70％をコードするそれらのフラグメントと、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、および配列番号11における配列によってコードされるFMDV VP１、VP２、VP３、またはVP４タンパク質をコードするコード配列に90％相同である核酸配列と、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、および配列番号11におけるFMDV VP１、VP２、VP３、またはVP４タンパク質をコードするコード配列に90％相同である核酸配列によってコードされるFMDV VP１、VP２、VP３、またはVP４タンパク質の少なくとも70％をコードするフラグメントとからなる群より選択される配列を１つ以上含む、核酸分子。
【請求項１５】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、および配列番号11におけるFMDV VP１、VP２、VP３、またはVP４タンパク質コード配列からなる群より選択される配列を１つ以上含む、請求項14に記載の核酸分子。
【請求項１６】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、および配列番号11にあるFMDV VP１、VP２、VP３、またはVP４タンパク質コード配列のフラグメントからなる群より選択される配列を１つ以上含み、前記フラグメントが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、および配列番号11によってコードされるFMDV VP１、VP２、VP３、またはVP４タンパク質の少なくとも８０％をコードする、請求項14に記載の核酸分子。
【請求項１７】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、および配列番号11にあるFMDV VP１、VP２、VP３、またはVP４タンパク質コード配列のフラグメントからなる群より選択される配列を１つ以上含み、前記フラグメントが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、および配列番号11によってコードされるFMDV VP１、VP２、VP３、またはVP４タンパク質の少なくとも90％をコードする、請求項14に記載の核酸分子。
【請求項１８】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、および配列番号11にあるFMDV VP１、VP２、VP３、またはVP４タンパク質コード配列のフラグメントからなる群より選択される配列を１つ以上含み、前記フラグメントが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、および配列番号11によってコードされるFMDV VP１、VP２、VP３、またはVP４タンパク質の少なくとも95％をコードする、請求項14に記載の核酸分子。
【請求項１９】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、および配列番号１１における配列によってコードされるFMDV VP１、VP２、VP３、またはVP４タンパク質をコードするコード配列に95％相同である核酸配列からなる群より選択される配列を１つ以上含む、請求項14に記載の核酸分子。
【請求項２０】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、および配列番号11における配列によってコードされるFMDV VP１、VP２、VP３、またはVP４タンパク質をコードするコード配列に98％相同である核酸配列からなる群より選択される配列を１つ以上含む、請求項14に記載の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、合成コンセンサス口蹄疫ウイルス（FMDV）免疫原性タンパク質およびそのようなタンパク質をコードする核酸分子、FMDVに対するワクチン、FMDVに対する免疫反応を誘導する方法、FMDVに感染した個体とFMDVに対するワクチンを接種された個体を区別する方法、ならびに個体をFMDVに対して予防的および／または治療的に免疫化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
口蹄疫（FMD）は、ウシ、ブタ、ヤギおよびシカをはじめとする家畜および野生の偶蹄目動物の伝染性の高い疾患であり、宿主内で急速に複製して接触した感受性動物に伝播する。該疾患は、発熱、跛行、ならびに舌、足、鼻、および乳首の水疱性病変を特徴とし、罹患率は高いが、成体動物の死亡率は低い。FMDV感染は、ウシ、水牛、ヒツジ、ヤギ、およびブタを深刻な水泡病に至らせ、それは持続感染に進展し得る（ブタを除く）。FMDVは、数ある中でもとりわけ、アンテロープ、ゾウ、ハリネズミ等を含む多くの他の哺乳類種に感染する可能性がある。しかしながら、ｉ）アフリカ水牛が持続的に感染しており、ｉｉ）病気がめったに観察されないといった理由から、元々のFMDV自然宿主はアフリカ水牛かもしれない。
【０００３】
FMDの原因物質は、口蹄疫ウイルス（FMDV）というピコルナウイルス科（Picornaviridae family）アフトウイルス属（Aphthovirus genus）の第４群（＋）ssRNAウイルスである。FMDVは、７つの主な血清型：Ｏ、Ａ、Ｃ、SAT-1、SAT-2、SAT-3、およびAsia-1に発生する。これらの血清型は、地域的に制限され、世界的に最も一般的なのはＯ血清型である。FMDVの一本鎖プラスセンスRNAゲノムは、４つの構造タンパク質VP１〜VP４それぞれを60コピー有する正二十面体カプシドによって取り囲まれたほぼ8500塩基である。ウイルスタンパク質は、Ａ、Asia 1、Ｏ、Ｃ、SAT１、SAT２、およびSAT３を含むそのいくつかのサブタイプ内で抗原多様性が高い。
【０００４】
FMDは、経済的に破壊的であり、偶蹄目家畜の感染は、重大な損失を引き起こす可能性がある。近年の集団発生は、何十億ドルの損失をもたらしている。1997年の台湾、2001年の英国およびオランダをはじめ、過去に疾患が発生しなかった複数の国々で近年発生しており、また南米の複数の国々で発生したことは、経済的に破壊的なウイルスであることを認識させた。さらに、経済テロリストがFMDVを使用して、年間1000億米ドルの畜産業など、巨大畜産業を有する国家を標的とした攻撃をする可能性があり、世界全体の問題となっている。
【０００５】
FMDVを制御する以前の手段としては、感染動物または接触動物の殺処分、および除染が挙げられる。FMDV発生により家畜を殺処分した国では、最後の発生後３ヶ月間、FMDVの非存在状態を経た場合のみ、畜産業を再開することができる。動物にワクチン接種を行い、殺処分を行わなかった国では、FMDの非存在状態を取り戻すのに丸々一年待たなければならないため、各国では通常、FMDV発生を処理するための動物へのワクチン接種を、最後の手段として用いる。しかしながら、各国はFMDVの発生前に動物にワクチン接種して、FMDの非存在状態を保持できるように期待している。
【０００６】
過去にFMDVワクチンは、化学的に不活化された全ウイルス抗原をアジュバントとともに含んでいたが、これには、ワクチン生成に高価な高度密閉製造設備が必要であるといった欠点がある。過去25〜30年間にわたり、研究者らは、単回接種後に防御をもたらすワクチンの開発を試みてきた。これらの努力には、ウイルス粒子から精製されたVP１、生物工学的に作られたVP１、VP１ペプチド、化学合成されたVP１ペプチド、VP１エピトープを発現する生ベクターの使用、VP１エピトープをコードするDNAの接種、およびFMDV感染培養物から生成された全カプシドタンパク質VP１〜VP４の使用または複製欠損ヒトアデノウイルス５型（Ad５）ベクターを介したVP１〜VP４カプシドの送達が含まれる。これらのアプローチは全て、FMDVウイルスのサブタイプ全てにまたがるエピトープをわずかな数しか接種動物に供与しない。
【０００７】
したがって当該技術分野では、FDMVの様々なサブタイプにわたる複数のFMDVエピトープに対する防御をもたらすのに好適なワクチン、およびFMDVに感染した哺乳動物を診断する方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
ウイルスタンパク質をコードする配列を含む核酸分子であって、ウイルスタンパク質VP４が、そのＣ末端で、プロテアーゼ切断部位に対して連結され、そのＣ末端で、ウイルスタンパク質VP２に対して連結され、そのＣ末端で、プロテアーゼ切断部位に対して連結され、そのＣ末端で、ウイルスタンパク質VP３に対して連結され、そのＣ末端で、プロテアーゼ切断部位に対して連結され、そのＣ末端で、ウイルスタンパク質VP１をコードする配列に対して連結され、そのＣ末端で、プロテアーゼ切断部位に対して連結され、そのC末端で、ウイルスタンパク質2Aに対して連結されている、核酸分子が開示される。核酸分子は、ウイルスタンパク質VP４のコード配列の５’末端でリーダー配列をコードする核酸配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ウイルスタンパク質VP４のコード配列は省略される。いくつかの実施形態において、ウイルスタンパク質2Aのコード配列は省略される。いくつかの実施形態において、Ｎ末端リーダー配列をコードするコード配列は省略される。いくつかの実施形態において、Ｎ末端リーダー配列をコードするコード配列は、IgGまたはIgEリーダー配列などのIgリーダー配列である。いくつかの実施形態において、切断部位はフューリンによって認識される。
【０００９】
ウイルスタンパク質が、Ａ、Asia１、Ｃ、Ｏ、SAT１、SAT２、およびSAT３からなる群より選択されるFMDVサブタイプ由来であるプラスミドをはじめとする、核酸分子を含むプラスミドが提供される。核酸配列をコードするウイルスタンパク質が、Ａ、Asia１、Ｃ、およびＯからなる群の各FMDVサブタイプ由来である、４つのプラスミドを含むワクチンが提供される。いくつかの実施形態において、ウイルスタンパク質がＡ、Asia１、Ｃ、Ｏ、SAT１、SAT２、およびSAT３からなる群の各FMDVサブタイプからの核酸配列をコードする、７つのプラスミドを含むワクチンも提供される。いくつかの実施形態において、ウイルスタンパク質が、Ａ、Asia１、Ｃ、Ｏ、SAT１、SAT２、およびSAT３からなる群より選択されるFMDVサブタイプからの核酸配列をコードする、７つ未満、すなわち、１、２、３、４、５、または６つのプラスミドを含むワクチンが提供される。
【００１０】
本明細書内で開示される、ウイルスタンパク質をコードする配列を含む核酸分子は、ウイルスタンパク質VP４をコードする配列が、そのＣ末端で、プロテアーゼ切断部位をコードする配列に対して連結され、そのＣ末端で、ウイルスタンパク質ＶＰ２をコードする配列に対して連結され、そのＣ末端で、プロテアーゼ切断部位をコードする配列に対して連結され、そのＣ末端で、ウイルスタンパク質VP３をコードする配列に対して連結され、そのＣ末端で、プロテアーゼ切断部位をコードする配列に対して連結され、そのＣ末端で、ウイルスタンパク質VP１をコードする配列に対して連結され、そのＣ末端で、プロテアーゼ切断部位をコードする配列に対して連結され、そのC末端で、ウイルスタンパク質２Aをコードする配列に対して連結されており、該核酸分子は、ロングバージョンまたは「ロング」と称される。本明細書内で開示される、ウイルスタンパク質をコードする配列を含む核酸分子は、ウイルスタンパク質VP２をコードする配列が、そのＣ末端で、プロテアーゼ切断部位をコードする配列に対して連結され、そのＣ末端で、ウイルスタンパク質VP３をコードする配列に対して連結され、そのＣ末端で、プロテアーゼ切断部位をコードする配列に対して連結され、そのＣ末端で、ウイルスタンパク質VP１をコードする配列に対して連結され、そのC末端で、ウイルスタンパク質２Aをコードする配列に対して連結されており、該核酸分子は、ショートバージョンまたは「ショート」と称される。ロングおよびショート双方のバージョンにおいて、ウイルスタンパク質VP１をコードするコード配列の３’末端に連結されるプロテアーゼ切断部位のコード配列、および連結されるウイルスタンパク質２Ａのコード配列は省略される場合がある。ロングおよびショート双方のバージョンにおいて、Ｎ末端リーダー配列のコード配列は、ロングバージョンの場合はウイルスタンパク質VP４のコード配列のＮ末端、およびロング配列の場合はウイルスタンパク質VP２のコード配列に連結される。Ｎ末端リーダーは、IgGまたはIgEシグナル配列などの好ましいIgリーダーである。いくつかの実施形態において、切断部位はフューリンによって認識される。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ウイルスタンパク質がＡ、Asia１、Ｃ、Ｏ、SAT１、SAT２、およびSAT３からなる群より選択されるFMDVサブタイプであるプラスミドをはじめとする、核酸分子を含むプラスミドが提供される。いくつかの実施形態において、核酸配列をコードするウイルスタンパク質が、Ａ、Asia１、Ｃ、およびＯからなる群の各FMDVサブタイプ由来である、４つのプラスミドを含むワクチンが、提供される。いくつかの実施形態において、ウイルスタンパク質がＡ、Asia１、Ｃ、Ｏ、SAT１、SAT２、およびSAT３からなる群の各FMDVサブタイプからの核酸配列をコードする、７つのプラスミドを含むワクチンも提供される。
【００１２】
開示されるワクチンのうちの１つを個体に投与することによって、個体においてFMDVに対する免疫反応を起こす方法が提供される。
【００１３】
開示されるワクチンのうちの１つを個体に投与することによって、個体においてFMDV感染を予防する方法が提供される。
【００１４】
本明細書で提供されるのは、Ａ、Asia 1、Ｃ、Ｏ、SAT１、SAT２、SAT３、SAT４を含むFMDの複数のサブタイプに対してワクチン接種を受けた対象において交差反応性免疫反応を誘発する口蹄疫ウイルスの少なくともVP１〜VP３、および好ましくは、VP１〜VP４のコンセンサスアミノ酸配列をコードする配列を含む単離された核酸である。本核酸は、（ａ）配列番号２に示されるVP−４−VP２−VP３−VP１（ロング）をコードする配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含むFMDV−A24cruzeiroに由来する構築物、（ｂ）配列番号４に示されるVP２−VP３−VP１（ショート）をコードする配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含むFMDV−A24cruzeiroに由来する構築物、（ｃ）配列番号６に示されるVP-4−VP２−VP３−VP１（ロング）をコードする配列番号５に示されるヌクレオチド配列を含むFMDV−As1−Shamir89に由来する構築物、（ｄ）配列番号８に示されるVP2−VP3−VP1（ショート）をコードする配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含むFMDV−As1−Shamir89に由来する構築物、（ｅ）配列番号10に示されるVP-4−VP２−VP３−VP１（ロング）をコードする配列番号９に示されるヌクレオチド配列を含むFMDV−SAT2に由来する構築物、（ｆ）配列番号12に示されるVP２−VP３−VP１（ショート）をコードする配列番号11に示されるヌクレオチド配列を含むFMDV−STA2に由来する構築物、からなる群より選択される配列を含み得る。
【００１５】
本明細書で提供されるのは、ａ）配列番号13に示される配列を有するpVAXなどのプラスミドに挿入される配列番号１（FMDV−A24cruzeiro−ロング）に示されるような、FMDV−A24cruzeiro由来の修飾ヌクレオチド配列、ｂ）配列番号14に示される配列を有するpVAXなどのプラスミドに挿入される配列番号３（FMDV−A24cruzeiro−ショート）に示されるような、FMDV−A24cruzeiro由来の修飾ヌクレオチド配列、ｃ）配列番号15に示される配列を有するpVAXなどのプラスミドに挿入される配列番号５（FMDV−As1−Shamir89−ロング）に示されるような、FMDV−As1−Shamir89由来の修飾ヌクレオチド配列、およびｄ）配列番号16に示される配列を有するpVAXなどのプラスミドに挿入される配列番号７（FMDV−As1−Shamir89−ロング）に示されるような、FMDV−As1−Shamir89由来の修飾ヌクレオチド配列、からなる群より選択されるものなどの核酸分子である。
【００１６】
組成物中の核酸分子は、以下の核酸配列、および／またはそれらのフラグメント、および／または該配列に相同性の配列、および／またはそのような相同性の配列フラグメントを含み得る：ａ）配列番号17に示されるようなVP４をコードするFMDV−As1−Shamir89に由来する核酸配列、ｂ）配列番号18に示されるようなVP４をコードするFMDV−A24cruzeiroに由来する核酸配列、ｃ）配列番号19に示されるようなVP２をコードするFMDV−As1−Shamir89に由来する核酸配列、ｄ）配列番号20に示されるようなVP２をコードするFMDV−A24cruzeiroに由来する核酸配列、ｅ）配列番号21に示されるような2AをコードするFMDV−As1−Shamir89に由来する核酸配列、ｆ）配列番号21に示されるような2AをコードするFMDV−A24cruzeiroに由来する核酸配列、ｇ）配列番号23に示されるようなVP３をコードするFMDV−As1−Shamir89に由来する核酸配列、ｈ）配列番号24に示されるようなVP３をコードするFMDV−A24cruzeiroに由来する核酸配列、ｉ）配列番号25に示されるようなVP１をコードするFMDV−As1−Shamir89に由来する核酸配列、ｊ）配列番号26に示されるようなVP２をコードするFMDV−A24cruzeiroに由来する核酸配列。
【００１７】
プロテアーゼフューリンによって認識される切断部位のアミノ酸配列は、配列番号27に示される配列である。
【００１８】
いくつかの実施形態において、構築物は、C3プロテアーゼコンセンサスタンパク質（配列番号29）をコードするC3コンセンサスコード配列（配列番号28）を含み得る。
【００１９】
同じく本明細書で提供されるのは、哺乳動物において複数の口蹄疫ウイルス（FMDV）サブタイプに対する免疫反応を起こすことが可能なワクチンであり、該ワクチンは、１つ以上のFMDVサブタイプからのカプシドタンパク質VP１〜VP４を含むコンセンサスFMDV抗原をコードするコード配列に機能的に連結したプロモータを含むDNAプラスミドと、薬学的に許容される賦形剤とを含み、該DNAプラスミドは、哺乳動物の細胞中のコンセンサスFMDV抗原を、哺乳動物における広範囲の交差反応性免疫反応を誘発するのに効果的な量で発現することが可能である。本ワクチンは、FMDVサブタイプＡ、Asia １、Ｃ、Ｏ、SAT１、SAT２、SAT３またはそれらの組み合わせに対する免疫反応を起こし得る。
【００２０】
同じく本明細書で提供されるのは、哺乳動物において複数の口蹄疫ウイルス（FMDV）サブタイプに対する免疫反応を起こすことが可能なワクチンであり、該ワクチンは、サブタイプＡ、Asia １、Ｃ、Ｏ、SAT１、SAT２、SAT３またはそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上のFMDVサブタイプからのカプシドタンパク質VP１〜VP４を含むコンセンサスFMDV抗原をコードするコード配列に機能的に連結したプロモータを含むDNAプラスミド１つ以上と、薬学的に許容されるその賦形剤とを含み、該DNAプラスミドは、哺乳動物の細胞中のコンセンサスFMDV抗原を、哺乳動物において免疫反応を誘発するのに効果的な量で発現することが可能である。本ワクチンを哺乳動物、例えばブタ、反芻動物、ヒトまたは霊長類に投与してもよい。本ワクチンは、哺乳動物における免疫反応、例えば、体液反応、細胞反応、または体液反応と細胞反応の双方を誘発し得る。
【００２１】
同じく本明細書で提供されるのは、哺乳動物において複数のFDMVサブタイプに対する免疫反応を起こすことが可能なワクチンであり、該ワクチンは、口蹄疫ウイルス（FMDV）サブタイプＡ、Asia １、Ｃ、Ｏ、SAT１、SAT２、またはSAT３のカプシドタンパク質VP１〜VP４をコードするコンセンサスアミノ酸配列を１つ以上含む抗原と、薬学的に許容されるその賦形剤とを含む。薬学的に許容される賦形剤は、IL-2およびIL-15からなる群より選択されるアジュバントであってもよい。ワクチンの薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤であってもよい。トランスフェクション促進剤は、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度のポリアニオン、ポリカチオンまたは脂質、例えば、ポリ−Ｌ−グルタマートであってもよい。本ワクチンを哺乳動物、例えばブタ、反芻動物、ヒトまたは霊長類に投与してもよい。本ワクチンは、哺乳動物における免疫反応、例えば、体液反応、細胞反応、または体液反応と細胞反応の双方を誘発し得る。
【００２２】
同じく本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるDNAプラスミドワクチンを哺乳動物の組織に送達すること、およびDNAプラスミドを細胞に侵入させるのに効果的な定電流のエネルギーパルスで組織の細胞を電気穿孔すること、を含む、哺乳動物において複数のFMDVウイルスサブタイプに対する免疫反応を誘発する方法である。本明細書に記載されるDNAプラスミドワクチンの送達は、DNAプラスミドワクチンを皮膚間、皮下、または筋肉の組織に注射することを含み得る方法によって達成され得る。電流およびエネルギーパルスを、既存の電流と等しい定電流でプリセットすることにより、該方法のDNAプラスミドを送達してもよい。該方法の電気穿孔ステップは、電気穿孔された細胞中のインピーダンスを測定すること、エネルギーパルスのエネルギーレベルを測定されたインピーダンスに対して調整して、電気穿孔された細胞中で定電流を保持することをさらに含んでいてもよく、ここで測定および調整ステップは、エネルギーパルスの寿命内で行われる。電気穿孔ステップは、エネルギーパルスを分散パターンで送達するパルスシーケンスパターンにより、エネルギーパルスを複数の電極に送達することをさらに含んでいてもよい。
【００２３】
同じく提供されるのは、FMDVに感染した哺乳動物を診断する方法であり、該方法は、哺乳動物から液体試料を単離すること、哺乳動物の液体試料から抗体を単離すること、および単離された抗体を本明細書に記載されるワクチン接種された対照哺乳動物と比較することを含み、該対照哺乳動物は、FMDV VP１−VP４タンパク質への抗体のみを有し、該FMDVに感染した哺乳動物は、FMDV VP１−V4タンパク質およびFMDV非構造性タンパク質への抗体を有する。非構造タンパク質は、FMDV 2C、3A、および3Dポリメラーゼであってもよい。
【００２４】
哺乳動物において１つ以上のFMDVウイルスサブタイプに対する免疫反応を誘発する方法が提供される。本明細書に記載されるワクチンを使用することを含む方法は、いくつかの実施形態において、FMDV免疫原性配列を有するタンパク質をコードする核酸分子を哺乳動物の組織に投与するステップと、DNAプラスミドを細胞に侵入させるのに効果的な定電流のエネルギーパルスで組織の細胞を電気穿孔するステップとを含み得る。
【００２５】
FMDVに感染した哺乳動物を、本明細書に開示された工程によりワクチン接種された哺乳動物において診断する方法も提供される。該方法は、ワクチン接種された哺乳動物から液体試料を単離すること、および当該ワクチン中に含まれないFMDVタンパク質および／または当該ワクチン中に含まれないFMDVタンパク質に対する抗体の存在を検出すること、を含む。そのようなFMDVタンパク質および／またはそのようなFMDVタンパク質に対する抗体の存在は、ワクチン接種された哺乳動物がFMDVに感染していることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】血清型Asia １のためのFMDV−As1−Shamir-89 DNAワクチン構築物の略図であり、As1 Shamir89挿入がBamH1およびXho-1部位へのクローンであることを示している。プラスミドマップは、プラスミドpVAXに基づく。FMDV−As1−Shamir挿入の実施例は、ロング形式であってもよく、それはpFMDV−As1 Shamir-89-Lとして図１に示され、またはショート形式であってもよく、それはpFMDV−As1 Shamir-89-Sとして図１に示される。
【図２】As1−Shamir89-S（左−配列番号７）およびAs1-Shamir89-L（右−配列番号５）のクローン化を示している一対の染色されたゲルと、FMDV-As1-Shamir89-Lロング形式（配列番号６はFMDV-As1-Shamir89-Lロング形式配列である）のアミノ酸配列とを示す。該配列は、陰影のついたＮ末端にIgEリーダー配列、小文字で書かれたタンパク質分解切断部位、およびIgEリーダーと第１のタンパク質分解切断部位との間に太字のVP４配列を含んでいた。VP１配列は、第３と第４のタンパク質分解切断部位との間に太字で示され、2a配列は、最後（第４）のタンパク質分解切断部位と終止との間である。
【図３】FMDV-A24cruzeiro DNAワクチン構築物の略図であり、A24cruzeiro挿入がBamH1およびXho-1部位へのクローンであることを示している。プラスミドマップは、プラスミドpVAXに基づく。FMDV-A24cruzeiro挿入の実施例は、ロング形式であってもよく、それはpFMDV-A24cruzeiro-Lとして図３に示され、またはショート形式であってもよく、それはpFMDV-A24cruzeiro-Sとして図３に示される。
【図４】A24cruzeiro-S（左−配列番号３）およびA24cruzeiro-L（右−配列番号１）のクローン化を示している一対の染色されたゲルと、FMDV-A24cruzeiro-Lロング形式（配列番号２はFMDV-A24cruzeiro-Lロング形式配列である）のアミノ酸配列とを示す。該配列は、陰影のついたＮ末端にIgEリーダー配列、小文字で書かれたタンパク質分解切断部位を含んでおり、VP４配列は、IgEリーダーと第１のタンパク質分解切断部位との間に示される。VP１配列は、第３と第４のタンパク質分解切断部位との間に示され、2a配列は、最後（第４）のタンパク質分解切断部位と終止との間である。
【図５】FMDV-Sat2 DNAワクチン構築物の略図であり、Sat２挿入がBamH1およびXho-1部位へのクローンであることを示している。プラスミドマップは、プラスミドpVAXに基づく。FMDV-Sat挿入の実施例は、ロング形式であってもよく、それはpFMDV-As1-Sat2-Lとして図５に示され、またはショート形式であってもよく、それはpFMDV-Sat2-Sとして図５に示される。
【図６】Sat2-S（左−配列番号11）およびSat2-L（右−配列番号９）のクローン化を示している一対の染色されたゲルと、FMDV-Sat2-Lロング形式（配列番号10はFMDV-Sat2-Lロング形式配列である）のアミノ酸配列とを示す。該配列は、陰影のついたＮ末端にIgEリーダー配列、小文字で書かれたタンパク質分解切断部位を含んでおり、VP４配列は、IgEリーダーと第１のタンパク質分解切断部位との間に示される。VP１配列は、第３と第４のタンパク質分解切断部位との間に示され、2a配列は、最後（第４）のタンパク質分解切断部位と終止との間である。
【図７】タンパク質発現の実験結果を示す。
【図８】１）pVAX、２）FMDV-A24cruzeiro-L、３）FMDV-A24cruzeiro-S、４）FMDV-Shamir89-L、５）FMDV-Shamir89-S、FMDV-Sat2-L、FMDV-Sat2-S、の投与に続く免疫反応を未処置と比較して評価するために、電気穿孔を使用した免疫化実験の実験プロトコルを示す。
【図９】FMDV-A24cruzeiro-LおよびFMDV-A24cruzeiro-Sワクチンによって誘発される細胞免疫反応のデータを示す。
【図１０】FMDV-As1-Sharma89-LおよびFMDV-As1-Sharma89-Sワクチンによって誘発される細胞免疫反応のデータを示す。
【図１１】FMDV-Sat2-LおよびFMDV-Sat2-Sワクチンによって誘発される細胞免疫反応のデータを示す。
【図１２】ELISA分析のためのDNAトランスフェクションおよび細胞可溶化物調製のための実験プロトコルを示す。
【図１３】FMDV-A24cruzeiro-LおよびFMDV-A24cruzeiro-Sワクチンによって、ならびにFMDV-As1-Sharma89-LおよびFMDV-As1-Sharma89-Sワクチンによって誘発される、マウス内の抗体誘導のデータを示す。
【図１４】FMDV-A24cruzeiro-Lトランスフェクト細胞およびFMDV-As1-Sharma89-Lトランスフェクト細胞から調製されるタンパク質可溶化物を使用した抗体結合のELISA分析のデータを示す。
【図１５】sharir配列とcruzeiro配列のアミノ酸配列比較を示す。Shamir VP４配列（配列番号17）は、cruzeiro VP４配列（配列番号18）と比較して示され、Shamir VP２配列（配列番号19）は、cruzeiro VP２配列（配列番号20）と比較して示され、Shamir 2A配列（配列番号21）は、cruzeiro 2A（配列番号22）と比較して示される。
【図１６】sharir配列とcruzeiro配列のアミノ酸配列比較を示す。Shamir VP３配列（配列番号23）は、cruzeiro VP３配列（配列番号24）と比較して示され、Shamir VP１配列（配列番号25）は、cruzeiro VP１配列（配列番号26）と比較して示される。
【図１７】ジェネリックFMDV DNAワクチン構築物の略図を示し、挿入がBamH1およびXho-1部位へのクローンであることを示している。ジェネリックFMDVワクチンのプラスミドマップは、プラスミドpVAXに基づく。FMDV挿入の実施例は、ロング形式であってもよく、それはロング形式挿入として図17に示され、またはショート形式であってもよく、それはショート形式挿入として図７に示される。各形式に示されるIgEリーダーは、任意的であることが示される、または、異なるリーダーで置換される場合がある。２Ａ配列は、任意的と示され、フューリン切断部位（rgrkrrs−配列番号27）は、置換可能であると示される。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
コンセンサスアミノ酸配列は、多重FMDVタンパク質と様々な血清型由来の個々のFMDVタンパク質とを含む融合タンパク質用に生成されている。該タンパク質をコードする核酸分子も生成されている。
【００２８】
本発明の一様態において、Ａ、Asia １、Ｏ、Ｃ、SAT１、SAT２、およびSAT３を含むFMDVの１つ以上のサブタイプにわたる口蹄疫から哺乳動物を守るために、生成されワクチン中で使用することができる、FMDVタンパク質VP１、VP２、VP３、VP４、および／または2A、および／または3Cと、これらのタンパク質をコードする核酸配列とを含む、融合タンパク質が存在する。好ましくは、VP１遺伝子は、FMDVの選択されるサブタイプのためのコンセンサスであり、例えば、本明細書で記載されるのは、VP１がSat２コンセンサスVP１である、FMDV-Sat２である。
【００２９】
科学的理論に束縛されるものではないが、FMDVの１つ以上のサブタイプのためのVP１、VP２、VP３、および／またはVP４のコンセンサスアミノ酸配列を対象とするワクチンが、FMDVの各サブタイプ内の大部分の種に対して効果的な免疫反応（体液、細胞のいずれか、またはその両方）を誘発するのに効果的となるエピトープの大きなレパートリーを提示するであろう。科学的理論に束縛されるものではないが、VP１は、VP１のコンセンサスアミノ酸配列を対象とするワクチンにとって、優れた免疫原性ターゲットである。VP１は、主要な免疫原である。
【００３０】
いくつかの実施形態の構築物は、ロング形式およびショート形式を含む。いくつかの実施形態の構築物は、ウイルスタンパク質VP１、VP２、VP３、およびVP４を以下の特定の順番で提供する：VP４−VP２−VP３−VP１。任意的なテール、2Aも提供される。本構築物は、任意的なIgEリーダー配列を有する。出現されるとき、タンパク質分解切断部位「CS」は、VP４、VP２、VP３、VP１、および存在するときは2A、の各々の間に提供される。該部位を処理することができるプロテアーゼは、いくつかの実施形態においてはフューリン、またはいくつかの実施形態においてはFMDVプロテアーゼであってもよい。他のプロテアーゼ部位も使用してよい。該部位は、ワクチンが発現される細胞内でよく見られるプロテアーゼによって認識されなければならない。
【００３１】
本発明の一様態において、Ａ、Asia 1、Ｏ、Ｃ、SAT１、SAT２、およびSAT３を含むFMDVの１つ以上のサブタイプにわたる口蹄疫から哺乳動物を守るために、生成されワクチン中で使用することができる、コンセンサスFMDVタンパク質VP１、VP２、VP３、VP４、および／または2A、および／または3Cと、これらのタンパク質をコードする核酸配列とを含む、融合タンパク質が存在する。
【００３２】
本発明の別の態様において、Ａ、Asia 1、Ｏ、Ｃ、SAT１、SAT２、およびSAT３をはじめとするFMDVの１つ以上のサブタイプにわたる口蹄疫から哺乳動物を守るために、生成されワクチン中で使用することができる、２つの異なるサブタイプに由来する、コンセンサスFMDVタンパク質VP１とこのタンパク質をコードする核酸配列とを含む、融合タンパク質が存在する。
【００３３】
本発明の別の態様において、コンセンサスFMDVタンパク質VP１と、それをコードする核酸配列とが存在し、それらを生成させてワクチン中で使用し、Ａ、Asia 1、Ｏ、Ｃ、SAT１、SAT２、およびSAT３をはじめとするFMDVの１つ以上のサブタイプにまたがる口蹄疫に対する哺乳動物の防御を提供することができる。
【００３４】
１．定義
本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定を意図するものではない。本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、文脈によりそうでないことが明確に示されない限り、複数形の指示対象を含む。
【００３５】
本明細書における数値的範囲の引用では、同程度の正確さを含む、それらの間に介入する各数字が、明白に企図される。例えば、６〜９の範囲では、６および９に加えて、数値７および８が企図され、範囲6.0〜7.0では、数値6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、および7.0が、明白に企図される。
【００３６】
ａ．アジュバント
本明細書で用いられる「アジュバント」は、本明細書に記載されたDNAプラスミドワクチンに添加されて、DNAプラスミドおよび以下記載されるコード核酸配列によりコードされる口蹄疫ウイルス（FMDV）抗原の抗原性を向上させる任意の分子を意味してもよい。
【００３７】
ｂ．抗体
「抗体」は、Fab、F(ab’)2、Fdおよび一本鎖抗体、ジアボディ、二特異性抗体、二機能性抗体およびそれらの誘導体をはじめとする分類IgG、IgM、IgA、IgDもしくはIgE、またはフラグメントの抗体、あるいはそのフラグメントまたは誘導体を意味してもよい。抗体は、所望のエピトープまたはそれに由来する配列に十分な結合特異性を示す哺乳動物の血清試料、ポリクローナル抗体、アフィニティ精製抗体、またはそれらの混合物から単離された抗体であってもよい。
【００３８】
ｃ．コード配列
本明細書で用いられる「コード配列」または「コード核酸」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（RNAまたはDNA分子）を意味してもよい。コード配列は、核酸を投与される個体または哺乳動物の細胞中での発現を指示することが可能なプロモータおよびポリアデニル化シグナルを含む調節要素に機能的に連結された開始および終結シグナルをさらに含んでいてもよい。
【００３９】
ｄ．相補配列
本明細書で用いられる「相補配列」または「相補的な」は、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の間のワトソン・クリック型（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはフーグスティーン型塩基対を意味し得る核酸を意味してもよい。
【００４０】
ｅ．コンセンサスまたはコンセンサス配列
本明細書で用いられる「コンセンサス」または「コンセンサス配列」は、特定のインフルエンザ抗原の複数のサブタイプのアライメントの分析に基づいて構築され、特定のインフルエンザ抗原の複数のサブタイプまたは血清型に対して広範囲の免疫性を誘導するために用い得る、合成核酸配列または対応するポリペプチド配列を意味してもよい。コンセンサスFMDV抗原は、VP１、VP２、VP３、VP4、およびＣ２プロテアーゼヌクレオチドならびにアミノ酸配列を含んでいてもよい。同じく合成抗原、例えば融合タンパク質をコンセンサス配列（またはコンセンサス抗原）に操作してもよい。
【００４１】
ｆ．定電流
本明細書で用いられる「定電流」は、組織、または該組織を画定する細胞が、同じ組織に送達された電気パルスの持続時間にわたり、受容または受けた電流を定義する。電気パルスは、本明細書に記載された電気穿孔装置から送達される。本明細書で提供される電気穿孔装置は、好ましくは瞬時フィードバックを有する、フィードバック要素を有するため、この電流は、電気パルスの寿命内では該組織中で一定アンペアを維持する。フィードバック要素は、パルスの持続時間を通して組織（または細胞）の抵抗を測定し、電気穿孔装置の電気エネルギー出力を変化させる（例えば、電圧を上昇させる）ことができ、それにより同じ組織内の電流は、電気パルスを通して（μ秒の単位）、そしてパルスとパルスの間は一定を維持する。いくつかの実施形態において、フィードバック要素は、制御装置を含む。
【００４２】
ｇ．電流フィードバックまたはフィードバック
本明細書で用いられる「電流フィードバック」または「フィードバック」は、互換的に用いられてもよく、電極間で組織内電流を測定すること、および該電流をそれに応じて一定レベルに保持するためにEP装置により送達されるエネルギー出力を変化させること、を含む、提供された電気穿孔装置の能動性応答を意味してもよい。この一定レベルは、パルスシーケンスまたは電気的処理の開始前にユーザーによりプリセットされる。装置内の電気回路では、電極間の組織内電流を連続してモニタリングして、モニタリングされた電流（または組織内電流）をプリセット電流と比較することができ、そしてエネルギー出力調整を連続して行ってモニタリングされた電流をプリセットレベルに保持することができるため、フィードバックは電気穿孔装置の電気穿孔構成要素、例えば制御装置により遂行されてもよい。フィードバックループは、アナログ閉回路フィードバックであるため、瞬時であってもよい。
【００４３】
ｈ．分散された電流
本明細書で用いられる「分散された電流」は、本明細書に記載された電気穿孔装置の様々な針電極アレイから送達される電流のパターンを意味してもよく、そのパターンにより、電気穿孔されている組織の任意の領域での電気穿孔関連の熱性ストレスの発生が最小になるか、または好ましくは排除される。
【００４４】
ｉ．電気穿孔
本明細書で互換的に用いられる「電気穿孔」、「電気可透過化」、または「電気的運動促進」（「EP」）は、膜貫通電場パルスの使用により生体膜中で顕微鏡的経路（細孔）を誘導することを指してもよく、それらの存在により、生体分子、例えばプラスミド、オリゴヌクレオチド、siRNA、薬物、イオン、および水が細胞膜の一方の側から他方の側に通過する。
【００４５】
ｊ．フィードバック機構
本明細書で用いられる「フィードバック機構」は、所望の組織のインピーダンス（エネルギーパルスの送達前、送達時および／または送達後）を受けて既存の値、好ましくは電流と比較し、送達されたエネルギーパルスを調整してプリセット値を実行する、ソフトウエアまたはハードウエア（またはファームウエア）により実施される工程を指してもよい。フィードバック機構は、アナログ閉回路により実施してもよい。
【００４６】
ｋ．フラグメント
本明細書で用いられる「フラグメント」は、少なくとも１つのFMDVサブタイプ、例えばＡ、Asia 1、Ｃ、Ｏ、SAT１、SAT２、またはSAT３のための非フラグメントの免疫反応と実質的に類似した、哺乳動物において免疫反応を誘発することが可能なポリペプチドをコードする部分または核酸を意味してもよい。該フラグメントは、配列番号１、３、５、７、９、または11の核酸配列によってコードされるFMDVタンパク質の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも95％を含んでもよい。該DNAフラグメントは、30以上のヌクレオチド長、45以上、60以上、75以上、90以上、120以上、150以上、180以上、210以上、240以上、270以上、300以上、360以上、420以上、480以上、540以上、600以上、660以上、720以上、780以上、840以上、900以上、960以上、1020以上、1080以上、1140以上、1200以上、1260以上、1320以上、1380以上、1440以上、1500以上、1560以上、1620以上、1680以上、1740以上、1800以上、1860以上、1820以上、1880以上、1940以上、2000以上、2600以上、2700以上、2800以上、2900以上、2910以上、2920以上、2930以上、2931以上、2932以上、2933以上、2934以上、2935以上、2936以上、2937以上、または2938以上のヌクレオチド長であってもよい。
【００４７】
DNAフラグメントは、免疫グロブリンリーダーのためのコード配列、例えばIgEまたはIgG配列を含んでいてもよい。
【００４８】
DNAフラグメントは、10未満のヌクレオチド、20未満、30未満、40未満、50未満、60未満、75未満、90未満、120未満、150未満、180未満、210未満、240未満、270未満、300未満、360未満、420未満、480未満、540未満、600未満、660未満、720未満、780未満、840未満、900未満、960未満、1020未満、1080未満、1140未満、1200未満、1260未満、1320未満、1380未満、1440未満、1500未満、1560未満、1620未満、1680未満、または1740未満のヌクレオチド、1800未満、1860未満、1820未満、1880未満、1940未満、2000未満、2600未満、2700未満、2800未満、2900未満、2910未満、2920未満、2930未満、2931未満、2932未満、2933未満、2934未満、2935未満、2936未満、2937未満、または2938未満であってもよい。
【００４９】
「フラグメント」は、少なくとも１つのFMDVサブタイプ、例えばＡ、Asia １、Ｃ、Ｏ、SAT１、SAT２、またはSAT３のための非フラグメントの免疫反応と実質的に類似した哺乳動物において免疫反応を誘発することが可能なポリペプチドフラグメントを意味してもよい。該フラグメントは、配列番号２、４、６、８、10、12をはじめとする本発明の様々なコードポリペプチド配列のうちの少なくとも１つから選択されたポリペプチドフラグメントであってもよい。ポリペプチドフラグメントを分析して、Los Alamos National LaboratoryのFMDV Sequence Databaseなどの公的に入手可能なデータベースによって提供される少なくとも１つの抗原エピトープと接触させてもよい。タンパク質のフラグメントは配列番号２、４、６、８、10または12に示されるポリタンパク質に示されるFMDVタンパク質の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも95％を含んでもよい。ポリペプチドは、免疫グロブリンリーダーのためのアミノ酸配列、例えばIgEまたはIgGを含んでいてもよい。ポリペプチドフラグメントは、30以上のアミノ酸長、45以上、60以上、75以上、90以上、120以上、150以上、180以上、210以上、240以上、270以上、300以上、360以上、420以上、480以上、540以上、600以上、660以上、または710以上のアミノ酸長であってもよい。ポリペプチドフラグメントは、10未満のアミノ酸、20未満、30未満、40未満、50未満、60未満、75未満、90未満、120未満、150未満、180未満、210未満、240未満、270未満、300未満、360未満、420未満、480未満、540未満、600未満、660未満、700未満、701未満、702未満、703未満、704未満、705未満、706未満、707未満、708未満、709未満、または710未満のアミノ酸長であってもよい。
【００５０】
ｌ．相同性
マルチプル配列アラインメントの相同性を、ClustalW（http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html）を使用して生成してもよい。
【００５１】
ｍ．同一性のある
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、本明細書で用いられる「同一性のある」または「同一性」は、特定領域で同一となる特定パーセンテージの残基をその配列が有することを意味してもよい。パーセンテージは、２つの配列を最適にアライニングすること、特定領域で２つの配列を比較すること、同一残基が両方の配列内に生じる位置の数を決定して適合位置の数を得ること、適合位置の数を特定領域の位置の総数で割ること、およびその結果に100を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ること、により計算してもよい。２つの配列が異なる長さであるか、またはアライメントが１つ以上のねじれ型末端を生成していて、比較される特定領域が単一配列のみを含む場合、単一配列の残基は、計算の分子ではなく分母中に含まれる。DNAとRNAを比較する場合、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は同等であると見なしてもよい。同一性は、手動で実施してもよく、またはBLASTもしくはBLAST2.0などのコンピューター配列アルゴリズムを用いることにより実施してもよい。
【００５２】
ｎ．インピーダンス
本明細書で用いられる「インピーダンス」は、フィードバック機構を考察する際に用いてもよく、オームの法則により電流値に変換することができ、そのためプリセット電流と比較することができる。
【００５３】
ｏ．免疫反応
本明細書で用いられる「免疫反応」は、提供されたDNAプラスミドワクチンを介したFMDVコンセンサス抗原の導入に応答した、宿主の免疫系、例えば哺乳動物の免疫系の活性化を意味してもよい。免疫反応は、細胞反応もしくは体液反応、または双方の形態であり得る。
【００５４】
ｐ．核酸
本明細書で用いられる「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、互いに共有結合的に連結された少なくとも２つのヌクレオチドを意味してもよい。一本鎖の表示は、相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸はまた、記述された一本鎖の相補鎖を包含する。核酸の多くの変異体を、所定の核酸と同じ目的で用いてもよい。したがって、核酸はまた、実質的に同一の核酸およびその相補配列も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ターゲット配列にハイブリダイズしうるプローブを提供する。つまり核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
【００５５】
核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であってもよく、または二本鎖配列と一本鎖配列の両方の部分を含んでいてもよい。核酸は、DNA、ゲノムDNAとcDNAの両方、RNAまたはハイブリッドであってもよく、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンをはじめとする塩基の組み合わせを含んでいてもよい。核酸は、化学合成法または組換え法により得られてもよい。
【００５６】
核酸は、一般にホスホジエステル連結を含むが、少なくとも１つの異なる連結、例えば、ホスホラミダート、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、またはＯ−メチルホスホロアミダイト連結と、ペプチド核酸バックボーンおよび連結を有し得る核酸類似体を含んでいてもよい。他の類似の核酸としては、参照により組み込まれた米国特許第5,235,033号および同第5,034,506号に記載されたものなど、正のバックボーン；非イオン性バックボーン；および非リボースバックボーンを有するものが挙げられる。非天然由来または修飾ヌクレオチドを１つ以上含む核酸も、核酸の一定義に含まれる。修飾ヌクレオチド類似体は、例えば、核酸分子の５’末端および／または３’末端に位置してもよい。ヌクレオチド類似体の代表的な例は、糖修飾またはバックボーン修飾リボヌクレオチドから選択してもよい。しかしながら、５−位で修飾されたウリジンまたはシチジン、例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン；８−位で修飾されたアデノシンおよびグアノシン、例えば８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば７−デアザアデノシン；Ｏ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６−メチルアデノシンなど、ヌクレオ塩基修飾リボヌクレオチド、すなわち、天然由来ヌクレオ塩基の代わりに非天然由来ヌクレオ塩基を含むリボヌクレオチドも適していることに、留意しなければならない。２’−OH基が、Ｈ、OR、Ｒ、ハロ、SH、SR、NH2、NHR、NR2またはCN（ここで、Ｒは、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Cl、BrまたはＩである）から選択される基により置換されていてもよい。修飾ヌクレオチドは、例えば、参照により本明細書に組み込まれた、Krutzfeldt et al., Nature (Oct.30,2005），Soutschek et al., Nature 432:173-178(2004）、および米国特許出願公開第20050107325号に記載された通り、ヒドロキシプロリノール結合を解して、コレステロールと共役したヌクレオチドを包含してもよい。修飾ヌクレオチドおよび核酸は、参照により本明細書に組み込まれた米国特許第20020115080号に記載された通り、ロックされた核酸（LNA）を包含してもよい。追加の修飾ヌクレオチドおよび核酸は、参照により本明細書に組み込まれた米国特許出願公開第20050182005号に記載される。リボース−リン酸バックボーンの修飾を、様々な理由で、例えば、生理学的環境でそのような分子の安定性および半減期を向上させるため、細胞膜を通した拡散を促進するため、またはバイオチップのプローブとして、実行してもよい。天然由来核酸と類似体との混合物を生成してもよく、あるいは異なる核酸類似体の混合物ならびに天然由来核酸と類似体との混合物を、生成してもよい。
【００５７】
ｑ．機能的に連結された
本明細書で用いられる「機能的に連結された」は、遺伝子の発現が空間的につながったプロモータの制御下にあることを意味してもよい。プロモータは、その制御下で遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置してもよい。プロモータと遺伝子の間の距離は、プロモータが由来する遺伝子内では、そのプロモータとプロモータが制御する遺伝子との間の距離と、ほぼ同一であってもよい。当業者に公知の通り、この距離の変動は、プロモータ機能を喪失せずに適合させることができる。
【００５８】
ｒ．プロモータ
本明細書で用いられる「プロモータ」は、細胞内の核酸の発現を供与、活性化または促進させることが可能な合成または天然由来の分子を意味してもよい。プロモータは、発現をさらに促進するために、ならびに／またはその空間的発現および／もしくは時間的発現を変化させるために、１つ以上の特異的転写調節配列を含んでいてもよい。プロモータは、遠位のエンハンサまたはレプレッサ要素を含んでいてもよく、それは転写開始部位から何千もの塩基対に位置することができる。プロモータは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物をはじめとする供給源に由来してもよい。プロモータは、遺伝子成分の発現を構成的に調節してもよく、あるいは発現が起こる細胞、組織もしくは臓器に関して、または発現が起こる発達段階に関して、または生理学的ストレス、病原、金属イオンもしくは導入剤などの外部刺激に応答して、変動的に調節してもよい。プロモータの代表的な例としては、バクレリオファージT7プロモータ、バクテリオファージT3プロモータ、SP6プロモータ、lacオペレータ−プロモータ、tacプロモータ、SV40後期プロモータ、SV40初期プロモータ、RSV-LTRプロモータ、CMV IEプロモータ、SV40初期プロモータまたはSV40後期プロモータ、およびCMV IEプロモータが挙げられる。
【００５９】
ｓ．ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
本明細書に使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、核酸の複合混合物中のように、第一の核酸配列（例えば、プローブ）が、第二の核酸配列（例えば、ターゲット）にハイブリダイズする条件を意味し得る。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる環境では異なっている。ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度pHで特定の配列の熱融点（Ｔm）よりも約５〜10℃低くなるように選択してもよい。Ｔmは、ターゲットに相補的なプローブの50％が平衡状態でターゲット配列にハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度pH、および核酸濃度下で）であってもよい（ターゲット配列が過剰に存在するため、Ｔmでは、平衡状態でプローブの50％が占領される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約1.0Ｍナトリウムイオン未満、例えば、pH7.0〜8.3で0.01〜1.0Mナトリウムイオン（または他の塩）濃度となり、温度が短いプローブ（例えば、約10〜50ヌクレオチド）では少なくとも約30℃となり、長いプローブ（例えば、約50ヌクレオチドを超える）では少なくとも約60℃となる条件であってもよい。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加により実現してもよい。選択的または特異的ハイブリダイゼーションでは、正のシグナルは、バックグランドハイブリダイゼーションの少なくとも２〜10倍であってもよい。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、以下のものが挙げられる：50％ホルムアミド、５×SSC、および１％SDS、42℃でインキュベート、または５×SSC、１％SDS、65℃でインキュベート、0.2×SSCで洗浄、ならびに65℃の0.1％SDS。
【００６０】
ｔ．実質的に相補性
本明細書に使用される「実質的に相補性」とは、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100またはそれ以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域で、第一の配列が第二の配列の相補配列に少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％または99％同一であること、あるいは２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味し得る。
【００６１】
ｕ．実質的に同一の
本明細書に使用される「実質的に同一の」とは、第一の配列が第二の配列の相補配列に実質的に相補性である場合に、第一の配列と第二の配列とが、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100またはそれ以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域で、あるいは核酸に関して、少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％または99％同一であることを意味し得る。
【００６２】
ｖ．サブタイプまたは血清型
本明細書で互換的に、そしてFMDVウイルスに関連して使用される「サブタイプ」または「血清型」は、１つのサブタイプが、異なるサブタイプとは別の免疫系によって認識されるような、FMDVウイルス抗原の遺伝子変異体を意味する。
【００６３】
ｗ．変異体
核酸に関して本明細書に使用される「変異体」とは、（ｉ）参照されるヌクレオチド配列の部分もしくはフラグメント；（ii）参照されるヌクレオチド配列もしくはその部分の相補配列；（iii）参照される核酸もしくはその相補配列と実質的に同一である核酸；または（iv）ストリンジェントな条件下で、参照される核酸、その相補配列、もしくはそれと実質的に同一の配列にハイブリダイズする核酸、を意味し得る。
【００６４】
アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によりアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持している、ペプチドまたはポリペプチドに関する「変異体」。変異体は、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味してもよい。アミノ酸の保存的置換、すなわち、１つのアミノ酸を、類似の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）を有する別のアミノ酸と置き換えることは、典型的に小規模な変更を伴うとして、当該技術分野で認識されている。これらの小規模な変更は、当該技術分野において理解されるように、部分的に、アミノ酸の疎水性親水性インデックスを考慮することによって、特定することができる。Kyte et al.,J.Mol .Biol. 157:105-132 (1982）。アミノ酸の疎水性親水性インデックスは、その疎水性および荷電の考慮に基づく。類似の疎水性親水性インデックスを有するアミノ酸が、置換することができ、タンパク質の機能を依然として保持できることは、当該技術分野で公知である。一態様において、±２の疎水性親水性インデックスを有するアミノ酸が、置換されている。アミノ酸の親水性を利用して、生物学的機能を保持したタンパク質を生じる置換を明らかにすることもできる。ペプチドとの関連でアミノ酸の親水性を考慮することで、そのペプチドの最大の局所的平均親水性、つまり抗原性および免疫原性と良好に相関することが報告されている有用な指標を計算することができる。参照により本明細書に完全に組み込まれた米国特許第4,554,101号。当該技術分野で理解される通り、類似の親水性値を有するアミノ酸の置換により、生物活性、例えば免疫原性を保持したペプチドを得ることができる。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて実施してもよい。アミノ酸の疎水性インデックスおよび親水性値の両方とも、そのアミノ酸の特定の側鎖により影響を受ける。その観察と一致して、疎水性、親水性、荷電、寸法、および他の性質により明らにされた通り、生物学的機能に適合性のあるアミノ酸置換が、アミノ酸、特にそれらアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存することは理解されている。
【００６５】
ｘ．ベクター
本明細書で用いられる「ベクター」は、複製起点を含む核酸配列を意味してもよい。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であってもよい。ベクターは、DNAまたはRNAベクターであってもよい。ベクターは、自己複製する染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに統合されるベクターのいずれかであってもよい。
【００６６】
２．FMDVタンパク質およびコード配列
サブタイプＡ、Ｃ、Ｏ、Asia、SAT１、SAT２、およびSAT３の各々のゲノムは、GenBank内で以下の受託番号で見つかる。
Ａ：JF749843
Ｃ：NC_002554
Ｏ：JF749851
Asia：DQ533483
SAT-1：JF749860
SAT-2：JF749862
SAT-3：NC_011452。
サブタイプＡ、Ｃ、Ｏ、Asia、SAT１、SAT２、およびSAT３の各々のためのVP１、VP２、VP３、およびVP４の各々のコード配列の位置を特定するために、これらを使用することができる。同様に、先に記したように、国際公開第2011/054011号は、異なるデザインを使用しているが、FMDVサブタイプＡ、Ｃ、Ｏ、Asia、SAT１、SAT２、およびSAT３からのVP１、VP２、VP３、VP４を有するFMDVワクチンを開示する。当業者は、国際公開第2011/054011号およびGenBank内の情報を使用して、サブタイプＡ、Ｃ、Ｏ、Asia、SAT１、SAT２およびSAT３からのFMDVタンパク質VP１、VP２、VP３、VP４の各々のコード配列を識別することができる。
【００６７】
サブタイプＡ、Ｃ、Ｏ、Asia、SAT１、SAT２、またはSAT３からのFMDVタンパク質VP１、VP２、VP３、またはVP４に95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、または99％以上相同である相同性タンパク質を、いくつかの構築物内に使用してもよい。
【００６８】
完全長配列の95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、または99％以上を有する、サブタイプＡ、Ｃ、Ｏ、Asia、SAT１、SAT２、またはSAT３からのFMDVタンパク質VP１、VP２、VP３、またはVP４のフラグメントを、いくつかの構築物内に使用してもよい。
【００６９】
サブタイプＡ、Ｃ、Ｏ、Asia、SAT１、SAT２、またはSAT３からのFMDVタンパク質VP１、VP２、VP３、またはVP4に95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、または99％以上相同性であり、完全長配列の95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、または99％以上を有する、タンパク質のフラグメントを、いくつかの構築物内に使用してもよい。
【００７０】
これらのFMDVタンパク質、相同性タンパク質、FMDVタンパク質のフラグメント、および相同性タンパク質のフラグメントのコード配列を、構築物内に使用してもよい。
【００７１】
本来のタンパク質分解切断部位が、アミノ酸配列：RGRKRRSなどのコンセンサス抗原配列の各々の間に存在し得る。
【００７２】
本明細書で提供されるのは、１つ以上の口蹄疫ウイルス（FMDV）サブタイプに対して哺乳動物において免疫反応を誘発することが可能な抗原である。抗原は、カプシドタンパク質VP１、VP２、VP３、VP４、そのコンセンサス、その変異体、そのフラグメントまたはそれらの組み合わせを含むFMDV抗原であってもよい。FMDV抗原は、FMDVサブタイプＡ、Asia １、Ｃ、Ｏ、SAT１、SAT２、またはSAT３由来であってもよい。FMDV抗原は、免疫反応を誘導し得る特定のFMDV免疫原に対して効果的となり得る抗原エピトープを少なくとも１つ含んでいてもよい。FMDV抗原のエンプティウイルスカプシドタンパク質VP１〜VP４は、インタクトFMDVウイルス中に存在する免疫原性部位およびエピトープの全レパートリーを提供する。コンセンサスFMDV抗原配列は、１つのFMDVサブタイプの複数のFMDVウイルスのFMDV抗原配列から得てもよい。コンセンサスFMDV抗原は、VP１、VP２、VP３、およびVP４ FMDVサブタイプコンセンサスタンパク質配列を含んでいてもよく、それらがコンセンサスVP１〜VP４タンパク質であってもよい。コンセンサスVP１〜VP４タンパク質は、少なくとも１つのFMDVタンパク質3C切断部位を含んでいてもよい。タンパク質3C切断部位は、コンセンサスVP１〜４タンパク質のコンセンサスVP１、VP２、VP３、およびVP４配列の各々の間に存在してもよい。タンパク質３ＣによるコンセンサスVP１〜VP４タンパク質の切断は、コンセンサスVP１〜VP４タンパク質を切断して、コンセンサスVP１−、コンセンサスVP２−、コンセンサスVP３−、およびコンセンサスVP４−タンパク質を生成し得る。あるいは、本来のタンパク質分解切断部位が、アミノ酸配列：RGRKRRSなどのコンセンサス抗原配列の各々の間に存在し得る。
【００７３】
いくつかの実施形態において、タンパク質は80％相同である。いくつかの実施形態において、タンパク質は90％相同である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、95％相同である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、96％相同である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、97％相同である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、98％相同である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、99％相同である。
【００７４】
本明細書で提供されるのは、１つ以上の口蹄疫ウイルス（FMDV）サブタイプに対して哺乳動物において免疫反応を誘発することが可能な抗原のコード配列である。抗原は、カプシドタンパク質VP１、VP２、VP３、VP４、そのコンセンサス、その変異体、そのフラグメントまたはそれらの組み合わせを含むFMDV抗原であってもよい。FMDV抗原は、FMDVサブタイプＡ、Asia １、Ｃ、Ｏ、SAT１、SAT２、またはSAT３由来であってもよい。FMDV抗原は、免疫反応を誘導し得る特定のFMDV免疫原に対して効果的となり得る抗原エピトープを少なくとも１つ含んでいてもよい。FMDV抗原のエンプティウイルスカプシドタンパク質VP１〜４は、インタクトFMDVウイルス中に存在する免疫原性部位およびエピトープの全レパートリーを提供する。コンセンサスFMDV抗原配列は、１つのFMDVサブタイプの複数のFMDVウイルスのFMDV抗原配列から得てもよい。コンセンサスFMDV抗原は、VP１、VP２、VP３、およびVP４ FMDVサブタイプコンセンサスタンパク質配列を含んでいてもよく、それらがコンセンサスVP１〜４タンパク質であってもよい。コンセンサスVP１〜４タンパク質は、少なくとも１つのFMDVタンパク質3C切断部位を含んでいてもよい。タンパク質3C切断部位は、コンセンサスVP１〜４タンパク質のコンセンサスVP１、VP２、VP３、およびVP４配列の各々の間に存在してもよい。タンパク質3CによるコンセンサスVP１〜４タンパク質の切断は、コンセンサスVP１〜４タンパク質を切断して、コンセンサスVP１−、コンセンサスVP２−、コンセンサスVP３−、およびコンセンサスVP４−タンパク質を生成し得る。あるいは、本来のタンパク質分解切断部位が、アミノ酸配列：RGRKRRSなどのコンセンサス抗原配列の各々の間に存在し得る。プロテアーゼ3Cのコンセンサスを含む融合タンパク質のコード配列が提供される。
【００７５】
加えて、コード配列は、本明細書に記載されるタンパク質のフラグメントであり得るタンパク質をコードし得る。いくつかの実施形態において、コード配列は、コンセンサスタンパク質の20％であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、コンセンサスタンパク質の30％であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、コンセンサスタンパク質の40％であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、コンセンサスタンパク質の50％であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、コンセンサスタンパク質の60％であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、コンセンサスタンパク質の70％であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、コンセンサスタンパク質の85％であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、コンセンサスタンパク質の90％であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、コンセンサスタンパク質の95％であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、コンセンサスタンパク質の96％であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、コンセンサスタンパク質の97％であるタンパク質をコードする。
Ｉ
【００７６】
加えて、コード配列は、本明細書に提供されるタンパク質に相同であるタンパク質をコードし得る。いくつかの実施形態において、コード配列は、80％相同であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、90％相同であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、95％相同であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、96％相同であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、97％相同であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、98％相同であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、99％相同であるタンパク質をコードする。
【００７７】
加えて、コード配列は、本明細書に記載されるタンパク質に相同性のタンパク質のフラグメントであるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の20％であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の30％であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の40％であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の50％であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の60％であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の70％であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の80％であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の90％であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の95％であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の96％であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の97％であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の98％であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の99％であるタンパク質をコードする。
【００７８】
３．プラスミド
本明細書で提供されるのは、哺乳動物において免疫反応を誘発するのに効果的な量で、哺乳動物の細胞において１つ以上のFMDV抗原を発現することが可能なベクターである。該ベクターは、FMDV抗原をコードする異種核酸を含んでいてもよい。該ベクターは、プラスミドであってもよい。該プラスミドは、FMDV抗原をコードする核酸で細胞をトランスフェクトするのに有用であってもよく、形質転換される宿主細胞は、培養され、FMDV抗原の発現が起こる条件下に保持される。
【００７９】
プラスミドは、本明細書内に提供されるタンパク質より選択されるFMDV抗原、そのフラグメント、その相同性配列、および相同性のフラグメントをコードする核酸を含んでいてもよい。プラスミドは、コード配列の上流に存在し得る開始コドンまたはリーダー配列と、コード配列の下流に存在し得る終結コドンとをさらに含んでいてもよい。開始コドンおよび終止コドンは、コード配列の枠内に存在してもよい。
【００８０】
プラスミドは、コード配列に機能的に連結したプロモータを含んでいてもよい。コード配列に機能的に連結したプロモータは、シミアンウイルス40（SV40）からのプロモータ、マウス乳癌ウイルス（MMTV）プロモータ、ヒト免疫欠損ウイルス（HIV）プロモータ、例えば、ウシ免疫欠損ウイルス（BIV）ロングターミナルリピート（LTR）プロモータ、モロニーウイルスプロモータ、トリ白血病ウイルス（ALV）プロモータ、サイトメガロウイルス（CMV）プロモータ、例えば、CMV前初期プロモータ、エプスタインバーウイルス（EBV）プロモータ、またはラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモータであってもよい。プロモータは、ヒト遺伝子、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインからのプロモータであってもよい。プロモータは、天然または合成の組織特異性プロモータ、例えば筋肉または皮膚特異性プロモータであってもよい。そのようなプロモータの例は、その内容が全体として参照により本明細書に組み込まれた、米国特許出願公開第20040175727号に記載されている。
【００８１】
プラスミドは、ポリアデニル化シグナルを含んでいてもよく、それがコード配列の下流に存在してもよい。ポリアデニル化シグナルは、SV40ポリアデニル化シグナル、LTRポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（bGH）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（hGH）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルであってもよい。SV40ポリアデニル化シグナルは、pCEP4プラスミド（カリフォルニア州サンディエゴ、Invitrogen）からのポリアデニル化シグナルであってもよい。
【００８２】
プラスミドは、コード配列の上流のエンハンサを含んでいてもよい。エンハンサは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはウイルスエンハンサ、例えば、CMV、FMDV、RSVまたはEBVのものであってもよい。ポリヌクレオチドの機能増強は、参照により本明細書に完全に組み込まれた、米国特許第5,593,972号、同第5,962,428号および国際公開第94/016737号に記載されている。
【００８３】
プラスミドは、プラスミドを染色体外で保持して細胞内のプラスミドの複数のコピーを生成するために、哺乳動物の複製起点を含んでいてもよい。プラスミドは、Invitrogen（カリフォルニア州、サンディエゴ）のpVAX1、pCEP4またはpREP4であってもよく、これらはエプスタインバーウイルスの複製起点および核抗原EBNA-１コード領域を含み得、統合を行わずに高コピー数のエピソーム複製を生成し得る。プラスミドのバックボーンは、pAV0242であってもよい。プラスミドは、複製欠損アデノウイルス５型（Ad5）プラスミドであってもよい。
【００８４】
プラスミドは、調節配列を含んでいてもよく、それがプラスミドを投与された細胞中での遺伝子発現に十分に適していてもよい。コード配列は、コドンを含んでいてもよく、それが宿主細胞中でコード配列のより効率的な転写を可能にしてもよい。
【００８５】
コード配列は、Igリーダー配列を含んでいてもよい。リーダー配列は、コード配列の５’であってもよい。この配列によりコードされたコンセンサスタンパク質は、Ｎ−末端Igリーダーに続いてコンセンサスタンパク質を含んでいてもよい。Ｎ−末端Igリーダーは、IgEまたはIgGであってもよい。
【００８６】
プラスミドは、pSE420（カリフォルニア州サンディエゴ、Invitrogen）であってもよく、それを大腸菌（Escherichia coli）（E.Coli）中でのタンパク質産生のために使用してもよい。プラスミドは、pYES2（カリフォルニア州サンディエゴ、Invitrogen）であってもよく、それを酵母のサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株でのタンパク質産生に使用してもよい。プラスミドは、MAXBAC（商標）完全バキュロウイルス発現系（カリフォルニア州サンディエゴ、Invitrogen）のものであってもよく、それを昆虫細胞中でのタンパク質産生に使用してもよい。プラスミドは、pcDNA IまたはpcDNA3（カリフォルニア州サンディエゴ、Invitrogen）であってもよく、それを哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞中でのタンパク質産生に使用してもよい。
【００８７】
プラスミドは、１つ以上のサブタイプ、例えば、Asia、Ａ、Ｏ、Ｃ、SAT１、SAT２、およびSAT３からの、VP１、VP２、VP３、VP４、および3Cの１つ以上をコードするコード配列を１つ以上含んでいてもよい。
【００８８】
いくつかの実施形態において、プラスミドは、サブタイプAsia、Ａ、Ｏ、Ｃ、SAT１、SAT２、またはSAT３からの複数の異なるコンセンサスFMDV抗原VP１、VP２、VP３、VP４、および3Cのコード配列を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態において、プラスミドは、サブタイプAsia、Ａ、Ｏ、Ｃ、SAT１、SAT２、またはSAT３からの複数の異なるコンセンサスFMDV抗原VP１、VP２、VP３、およびVP４のコード配列を含む。
【００９０】
いくつかの実施形態において、プラスミドは、サブタイプAsia、Ａ、Ｏ、およびＣのうちの２つからの２つの異なるコンセンサスFMDV抗原VP１、例えば、サブタイプAsiaからのVP１とサブタイプＯからのVP１、またはサブタイプＡからのVP１とサブタイプＣからのVP１、のコード配列を含む。
【００９１】
いくつかの実施形態において、プラスミドは、コンセンサスFMDV抗原VP１、例えば、VP１サブタイプAsia、VP１サブタイプＡ、VP１サブタイプＯまたはVP１サブタイプＣ、のコード配列を含む。
【００９２】
コード配列は、機能的に連結されたプロモータにより全て調節された異なるDNAプラスミド、例えば、１つ以上のプロモータにより調節された、複数のコンセンサスFMDV抗原を含むコード配列を有するDNAプラスミド、によりコードさせることができる。
【００９３】
ベクターは、本明細書内に記載される変異型プラスミドなど、変化を伴う、pVAX1またはpVax1変異体であり得る。変異型pVax1プラスミドは、バックボーンベクタープラスミドpVAX1（カリフォルニア州カールスバッド、Invitrogen）の2998塩基対変異体である。CMVプロモータは、塩基137〜724に位置する。T7プロモータ／プライミング部位は、塩基664〜683にある。多重クローニング部位は、塩基696〜811にある。ウシGHポリアデニル化シグナルは、塩基829〜1053にある。カナマイシン耐性遺伝子は、塩基1226〜2020にある。pUC起点は、塩基2320〜2993にある。
【００９４】
Invitrogenから入手可能なpVAX1の配列に基づいて、次の突然変異体が、本明細書に記載されるプラスミド１〜６の骨格として使用されたpVAX1の配列に見いだされた：
【表１】
2019141069.tif 000002
【００９５】
塩基対２、３、および４が、バックボーン、CMVプロモータの上流において、ACTからCTGに変更される。
【００９６】
ベクターのバックボーンは、pAV0242であり得る。ベクターは、複製能欠損アデノウイルス５型（Ad5）ベクターであり得る。
【００９７】
プラスミドは、調節配列を含んでいてもよく、それがプラスミドを投与された細胞中での遺伝子発現に十分に適していてもよい。コード配列は、宿主細胞中でコード配列のより効率的な転写を可能にし得るコドンを含んでいてもよい。
【００９８】
コード配列は、Igリーダー配列を含んでいてもよい。リーダー配列は、コード配列の５’であってもよい。この配列によってコードされるコンセンサス抗原は、Ｎ−末端Igリーダーに続いてコンセンサス抗原タンパク質を含んでいてもよい。Ｎ−末端Igリーダーは、IgEまたはIgGであってもよい。
【００９９】
プラスミドは、pSE420（カリフォルニア州サンディエゴ、Invitrogen）であってもよく、それを大腸菌（Escherichia coli）（E.coli）中でのタンパク質産生のために使用してもよい。プラスミドは、pYES2（カリフォルニア州サンディエゴ、Invitrogen）であってもよく、それを酵母のサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株でのタンパク質産生に使用してもよい。プラスミドは、MAXBAC（商標）完全バキュロウイルス発現系（カリフォルニア州サンディエゴ、Invitrogen）のものであってもよく、それを昆虫細胞中でのタンパク質産生に使用してもよい。プラスミドは、pcDNA IまたはpcDNA3（カリフォルニア州サンディエゴ、Invitrogen）であってもよく、それを哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞中でのタンパク質産生に使用してもよい。
【０１００】
４．ワクチン
科学的理論に束縛されるものではないが、FMDVに対して広範に免疫反応（体液、細胞、またはその両方）を誘発するために使用され得るワクチンは、先に示されたコード配列、すなわち、Ａ、Asia １、Ｃ、Ｏ、SAT１、SAT２、SAT３またはそれらの組み合わせなどのFMDVサブタイプからなる群より選択されるサブタイプからのタンパク質VP１、VP２、VP３、VP４および2Aの１つ以上をコードする核酸配列、を１つ以上含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、本ワクチンは、FMDV C3プロテアーゼをコードする核酸を含んでいてもよく、それはコンセンサスC3プロテアーゼ核酸であってもよい。
【０１０１】
これは以下を含む：
Ａ、Asia 1、Ｃ、Ｏ、SAT１、SAT２、SAT３、SAT４を含む、FMDの複数のサブタイプに対してワクチン接種を受けた対象において交差反応性免疫反応を誘発する口蹄疫ウイルスの少なくともVP１〜VP３、および好ましくは、VP１〜４のコンセンサスアミノ酸配列をコードする配列を含む単離された核酸。核酸は、（ａ）配列番号１；配列番号２をコードするヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号３；配列番号４をコードするヌクレオチド配列、（ｃ）配列番号５；配列番号６をコードするヌクレオチド配列、ｄ）配列番号７；配列番号８をコードするヌクレオチド配列、ｅ）配列番号９；配列番号10をコードするヌクレオチド配列、およびｆ）配列番号11；配列番号12をコードするヌクレオチド配列、からなる群より選択される配列を含み得る。
【０１０２】
本明細書で提供されるのは、哺乳動物において１つ以上のFMDVサブタイプに対する免疫反応を起こすことが可能なワクチンである。ワクチンは、先に考察されたプラスミドを含んでいてもよい。ワクチンは、それぞれがＡ、Asia １、Ｃ、Ｏ、SAT１、SAT２、SAT３またはそれらの組み合わせなどのFMDVサブタイプ１つ以上を対象とするプラスミドを、複数含んでいてもよい。ワクチンは、それ自体がＡ、Asia １、Ｃ、Ｏ、SAT１、SAT２、SAT３またはそれらの組み合わせなどのFMDVサブタイプ１つ以上を対象とする、FMDV抗原を含んでいてもよい。ワクチンは、世界の特定の地域、例えばアジア、ヨーロッパおよびサブアフリカからのFMDVサブタイプを対象とするプラスミドを含んでいてもよい。あるいは、または加えて、ワクチンは、Ａ、Asia １、Ｃ、Ｏ、SAT１、SAT２、SAT３またはそれらの組み合わせなどのFMDVサブタイプ１つ以上のタンパク質を含んでいてもよい。ワクチンは、それ自体がＡ、Asia １、Ｃ、Ｏ、SAT１、SAT２、SAT３またはそれらの組み合わせなどのFMDVサブタイプ１つ以上を対象とする、FMDV抗原を含んでいてもよい。ワクチンは、世界の特定の地域、例えばアジア、ヨーロッパおよびサブアフリカからのFMDVサブタイプを対象とするプラスミドおよび／またはタンパク質を含んでいてもよい。ワクチンは、治療的または予防的免疫反応を誘導するように提供してもよい。
【０１０３】
本明細書で提供されるのは、DNAを約１ナノグラム〜約10 mg含む本発明による医薬組成物である。いくつかの実施形態において、本発明に従った医薬組成物は、１）少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、９５もしくは100ナノグラム、または少なくとも１、５、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995もしくは1000マイクログラム、または少なくとも1.5、２、2.5、３、3.5、４、4.5、５、5.5、６、6.5、７、7.5、８、8.5、９、9.5もしくは10mg以上；および２）15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95もしくは100ナノグラム以下、または１、５、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995、もしくは1000マイクログラム以下、または1.5、２、2.5、３、3.5、４、4.5、５、5.5、６、6.5、７、7.5、８、8.5、９、9.5、もしくは10 mg以下の間で含む。いくつかの実施形態において、本発明による医薬組成物は、DNAを約５ナノグラム〜約10 mg含む。いくつかの実施形態において、本発明による医薬組成物は、DNAを約25ナノグラム〜約５mg含む。いくつかの実施形態において、該医薬組成物は、DNAを約50ナノグラム〜約１mg含む。いくつかの実施形態において、該医薬組成物は、DNAを約0.1〜約500マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、該医薬組成物は、DNAを約１〜約350マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、該医薬組成物は、DNAを約５〜約250マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、該医薬組成物は、DNAを約10〜約200マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、該医薬組成物は、DNAを約15〜約150マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、該医薬組成物は、DNAを約20〜約100マイクログラム含��。いくつかの実施形態において、該医薬組成物は、DNAを約25〜約75マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、該医薬組成物は、DNAを約30〜約50マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、該医薬組成物は、DNAを約35〜約40マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、本薬学的組成物は、DNAを約100〜約200マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、該医薬組成物は、DNAを約10マイクログラム〜約100マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、該医薬組成物は、DNAを約20マイクログラム〜約80マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、該医薬組成物は、DNAを約25マイクログラム〜約60マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、該医薬組成物は、DNAを約30ナノグラム〜約50マイクログラム含む。いくつかの実施形態において、該医薬組成物は、DNAを約35ナノグラム〜約45マイクログラム含む。いくつかの好ましい実施形態において、該医薬組成物は、DNAを約0.1〜約500マイクログラム含む。いくつかの好ましい実施形態において、該医薬組成物は、DNAを約１〜約350マイクログラム含む。いくつかの好ましい実施形態において、該医薬組成物は、DNAを約25〜約250マイクログラム含む。いくつかの好ましい実施形態において、該医薬組成物は、DNAを約100〜約200マイクログラム含む。
【０１０４】
本発明による医薬組成物は、用いられる投与様式に従って配合される。医薬組成物が注射可能な医薬組成物である場合、それは滅菌されており、パイロジェンフリーおよび微粒子フリーである。好ましくは、等張性配合剤が用いられる。一般に、等張性のための添加剤として、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを挙げることができる。いくつかの例において、等張性溶液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水が、好ましい。安定化剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。いくつかの実施形態において、血管収縮剤が、配合剤に添加される。
【０１０５】
好ましくは、該医薬組成物は、ワクチンであり、より好ましくはDNAワクチンである。
【０１０６】
ワクチンは、DNAワクチンであってもよい。DNAワクチンは、１つ以上のコンセンサス前立腺抗原の核酸コード配列を含む、複数の同一または異なるプラスミドを含んでいてもよい。DNAワクチンは、コンセンサス前立腺抗原を１つ以上コードする核酸配列を１つ以上含んでいてもよい。DNAワクチンが、１つを超えるコンセンサス前立腺抗原のコード配列を含む場合、そのような配列は全て、単一プラスミド上に存在してもよく、またはそのような配列のそれぞれが、異なるプラスミド上に存在してもよい。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、１つ以上のコンセンサス前立腺抗原と組み合わせた１つ以上のコンセンサス前立腺抗原をコードする核酸配列を含んでいてもよい。
【０１０８】
ＤＮＡワクチンは、参照により本明細書に完全に組み込まれた、米国特許第5,593,972号、同第5,739,118号、同第5,817,637号、同第5,830,876号、同第5,962,428号、同第5,981,505号、同第5,580,859号、同第5,703,055号、および同第5,676,594号に開示されている。DNAワクチンは、染色体に統合されるのを阻害する要素または試薬をさらに含むことができる。ワクチンは、前立腺抗原のRNAであってもよい。RNAワクチンを、細胞に導入することができる。
【０１０９】
ワクチンは、先に記載された遺伝子構築物または抗原を含む組換えワクチンであってもよい。ワクチンは、１つ以上のタンパク質サブユニットの形態の１つ以上のコンセンサス前立腺抗原、または１つ以上のコンセンサス抗原を含む１つ以上の弱毒ウイルス粒子を含むこともできる。弱毒ワクチンは、弱毒生ワクチン、死菌ワクチン、ならびに組換えベクターを用いて１つ以上のコンセンサス前立腺抗原をコードする外来遺伝子を送達するワクチン、サブユニットワクチンおよびタンパク質ワクチンであってもよい。弱毒生ワクチン、前立腺抗原を送達するために組換えベクターを使用する弱毒生ワクチン、サブユニットワクチン、および糖タンパク質ワクチンの例は、米国特許第4,510,245号、同第4,797,368号、同第4,722,848号、同第4,790,987号、同第4,920,209号、同第5,017,487号、同第5,077,044号、同第5,110,587号、同第5,112,749号、同第5,174,993号、同第5,223,424号、同第5,225,336号、同第5,240,703号、同第5,242,829号、同第5,294,441号、同第5,294,548号、同第5,310,668号、同第5,387,744号、同第5,389,368号、同第5,424,065号、同第5,451,499号、同第5,453,364号、同第5,462,734号、同第5,470,734号、同第5,474,935号、同第5,482,713号、同第5,591,439号、同第5,643,579号、同第5,650,309号、同第5,698,202号、同第5,955,088号、同第6,034,298号、同第6,042,836号、同第6,156,319号、および同第6,589,529号に記載され、これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。ワクチンは、他のワクチン成分、例えば、FMDVタンパク質またはタンパク質をコードする発現ベクターと組み合わせたプラスミドを含んでいてもよい。
【０１１０】
提供されるワクチンを使用して、治療的または予防的免疫反応をはじめとする免疫反応を誘導してもよい。コンセンサス前立腺抗原を対象とする抗体および／またはキラーＴ細胞を、生成してもよい。そのような抗体および細胞を、単離してもよい。
【０１１１】
ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでいてもよい。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤としての機能的分子であってもよい。薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤であり得、これには、免疫刺激複合体（ISCOMS）などの界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むLPS類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレン等の小胞体、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルス性タンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、あるいは他の既知のトランスフェクション促進剤が挙げられる。
【０１１２】
トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマート（LGS）をはじめとするポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマートであり、より好ましくはポリ−Ｌ−グルタマートは、６mg/ml未満の濃度でワクチン中に存在する。トランスフェクション促進剤は、界面活性剤、例えば免疫刺激複合体（ISCOMS）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質ＡをはじめとするLPS類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレンおよびスクアレンなどの小胞を含んでいてもよく、ヒアルロン酸を用いて、遺伝子構築物と一体化させて投与してもよい。いくつかの実施形態において、DNAプラスミドワクチンは、トランスフェクション促進剤、例えば脂質、レシチンリポソームまたはDNAリポソーム混合物（例えば、国際公開第09324640号を参照）として当該技術分野で公知の他のリポソームをはじめとするリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知のトランスフェクション促進剤を含んでいてもよい。好ましくは、トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマート（LGS）をはじめとするポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。ワクチン中のトランスフェクション剤の濃度は、４mg/ml未満、２mg/ml未満、１mg/ml未満、0.750mg/ml未満、0.500mg/ml未満、0.250mg/ml未満、0.100mg/ml未満、0.050mg/ml未満、または0.010mg/ml未満である。
【０１１３】
薬学的に許容される賦形剤は、アジュバントであってもよい。アジュバントは、代替的なプラスミド中で発現されるか、またはワクチン中で先のプラスミドと組み合わせたタンパク質として送達される他の遺伝子であってもよい。アジュバントは、α−インターフェロン（IFN−α）、β−インターフェロン（IFN−β）、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（PDGF）、TNFα、TNFβ、GM-CSF、上皮成長因子（EGF）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（CTACK）、上皮胸腺発現ケモカイン（TECK）、粘膜関連上皮ケモカイン（MEC）、IL-12、IL-15、MHC、CD80、シグナル配列が欠失したIL-15を含み、かつ任意でIgE由来のシグナルペプチドを含むCD86からなる群から選択することができる。アジュバントは、IL-12、IL-15、CTACK、TECK、血小板由来成長因子（PDGF）、TNFα、TNFβ、GM-CSF、上皮成長因子（EGF）、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【０１１４】
有用なアジュバントであり得る他の遺伝子としては、MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、RANTES、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18の突然変異体形態、CD40、CD40L、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、IL-7、神経成長因子、血管内皮成長因子、Fas、TNF受容体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、Caspase ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、不活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、インターフェロン応答遺伝子、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、O×40、O×40 LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2、およびそれらの機能性フラグメントをコードする遺伝子が挙げられる。
【０１１５】
ワクチンは、参照により完全に組み込まれた、1994年４月１日出願の米国特許出願第021,579号に記載されるように遺伝子ワクチン促進剤をさらに含んでいてもよい。
【０１１６】
ワクチンは、用いられる投与様式に従って配合してもよい。注射可能なワクチン医薬組成物は、滅菌されており、パイロジェンフリーおよび微粒子フリーであってもよい。等張性配合剤または溶液が、用いられてもよい。等張性のための添加剤として、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを挙げることができる。ワクチンは、血管収縮剤を含んでいてもよい。等張性溶液は、リン酸緩衝生理食塩水を含んでいてもよい。ワクチンは、ゼラチンおよびアルブミンをはじめとする安定化剤をさらに含んでいてもよい。ワクチン配合剤へのLGSまたはポリカチオンまたはポリアニオンなど、安定化により、配合剤を室温または周囲温度で長時間安定にさせてもよい。
【０１１７】
５．ワクチンを送達する方法
本明細書で提供されるのは、免疫反応を誘導し得るFMDVの免疫原に対して特に効果的となるエピトープを含むFMDV抗原の遺伝子構築物およびタンパク質を提供するためのワクチンを送達する方法である。ワクチンを送達する方法またはワクチン接種の方法は、治療的および予防的免疫反応を誘導するために提供され得る。ワクチン接種工程により、哺乳動物において複数のFMDVサブタイプに対する免疫反応を起こし得る。ワクチンは、哺乳動物の免疫系の活性を調整し、免疫反応を促進するために、個体に送達され得る。ワクチンの送達は、細胞中で発現されて細胞の表面に送達され、それに対し免疫系が認識して細胞反応、体液反応、または細胞反応と体液反応を誘導する核酸分子としてのFMDV抗原のトランスフェクションであり得る。ワクチン送達は、先に記載されたワクチンを哺乳動物に投与することによって、複数のFMDVウイルスに対する免疫反応を哺乳動物において誘導または誘発するために使用され得る。
【０１１８】
ワクチンおよびプラスミドを哺乳動物の細胞内に送達する際に、トランスフェクトされた細胞は、ワクチンから注入されたプラスミド各々のコンセンサスカプシドを発現および分泌する。これらの分泌されたカプシドタンパク質は、免疫系により外来物質として認識され、それらに対して抗体が生成される。これらの抗体は、免疫系により保持され、続いてのFMDV感染を急速に浄化させる。
【０１１９】
ワクチンを哺乳動物に投与して、哺乳動物において免疫反応を誘発してもよい。哺乳動物は、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類、ウシ、畜牛、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、水牛、バイソン、ウシ属、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、およびニワトリであってもよい。
【０１２０】
ａ．併用処置
ワクチンを、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（PDGF）、TNFα、TNFβ、GM-CSF、上皮成長因子（EGF）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（CTACK）、上皮胸腺発現ケモカイン（TECK）、粘膜関連上皮ケモカイン（MEC）、IL-12、IL-15、MHC、CD80、シグナル配列が欠失したIL-15を含み、かつ任意でIgEからのシグナルペプチドを含むCD86、IL-12、IL-15、CTACK、TECK、血小板由来成長因子（PDGF）、TNFα、TNFβ、GM-CSF、上皮成長因子（EGF）、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、RANTES、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18の突然変異形態、CD40、CD40L、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、IL-7、神経成長因子、血管上皮成長因子、Fas、TNF受容体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、カスパーゼICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、不活性化NIK、SAP K、SAP-1、JNK、インターフェロン応答遺伝子、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、O×40、O×40 LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2およびそれらの機能的フラグメントまたはそれらの組み合わせをコードする他のタンパク質または遺伝子と併用して投与してもよい。ワクチンを、CTACKタンパク質、TECKタンパク質、MECタンパク質またはそれらの機能的フラグメントと併用して投与してもよい。
【０１２１】
ワクチンを、経口、非経口、舌下、経皮、経直腸、経粘膜、局所、吸入、口腔投与、胸腔内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻内、髄腔内、および関節内、またはそれらの組み合わせをはじめとする異なる経路で投与してもよい。獣医学的使用では、通常の獣医学的実践に従い、該組成物を適切に許容される配合剤として投与してもよい。獣医は、特定の動物に最も適した投与レジメンおよび投与経路を、容易に決定することができる。ワクチンを、伝統的なシリンジ、針なし注射装置、「微粒子衝撃遺伝子銃」、または他の物理的方法、例えば電気穿孔法（「EP」）、「水力学的方法」、または超音波により投与してもよい。
【０１２２】
ワクチンのプラスミドは、インビボ電気穿孔を用いる、または用いないDNA注入（DNAワクチン接種とも呼ばれる）、リポソーム介在ベクター、ナノ粒子促進ベクター、組換えベクター、例えば組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルス随伴ウイルスおよび組換えワクシニアをはじめとする複数の周知テクノロジーにより哺乳動物に送達してもよい。FMDV抗原を、インビボ電気穿孔と共にDNA注入を介して送達してもよい。
【０１２３】
ｂ．電気穿孔
ワクチンのプラスミドの電気穿孔を介したワクチンの投与は、ユーザーによるプリセット電流入力と類似の定電流を生成するエネルギーパルスを、哺乳動物の所望の組織に送達するように構成され得る電気穿孔装置を用いて遂行してもよい。電気穿孔装置は、電気穿孔構成要素および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを含んでいてもよい。電気穿孔構成要素は、制御装置、電流波形発生器、インピーダンステスタ、波形ロガー、入力要素、ステータス報告要素、コミュニケーションポート、メモリー構成要素、電源、および電源スイッチをはじめとする電気穿孔装置の１つ以上の様々な要素を含み、それらを組み込んでいてもよい。電気穿孔は、VGXP Cellectra（商標）システムを用いて遂行して、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを促進してもよい。
【０１２４】
電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の一要素として機能してもよく、他の要素は、電気穿孔構成要素と連通する別個の要素（または構成要素）である。電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の１つを超える要素として機能してもよく、それが電気穿孔構成要素とは別個の電気穿孔装置の他の要素とも連通していてもよい。１つの電気機械的または機械的装置の一部として存在する電気穿孔装置の要素は、その要素が１つの装置として、または互いに連通する別個の要素として機能し得るように限定しなくてもよい。電気穿孔構成要素は、所望の組織内で定電流を生成するエネルギーパルスを送達することが可能であり得、フィードバック機構を含む。電極アセンブリは、空間的配置内に複数の電極を有する電極アレイを含んでいてもよく、ここで電極アセンブリは、電気穿孔構成要素からエネルギーパルスを受け、電極を介して所望の組織にそれを送達する。複数の電極の少なくとも１つは、エネルギーパルスの送達時にはニュートラルであり、所望の組織中のインピーダンスを測定して、そのインピーダンスを電気穿孔構成要素に伝える。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受けてもよく、電気穿孔構成要素により送達されたエネルギーパルスを調整して定電流を保持することができる。
【０１２５】
複数の電極が、分散パターンでエネルギーパルスを送達してもよい。複数の電極は、プログラムされたシーケンス下で電極制御を介して、分散パターンでエネルギーパルスを送達してもよく、プログラムされたシーケンスは、ユーザーにより電気穿孔構成要素に入力される。プログラムされたシーケンスは、順序どおり送達された複数のパルスを含んでいてもよく、ここで複数のパルスの各パルスが、インピーダンスを測定する１つのニュートラル電極を含む少なくとも２つの活性電極により送達され、複数のパルスの次のパルスが、インピーダンスを測定する１つのニュートラル電極を含む少なくとも２つの活性電極の異なる１つにより送達される。
【０１２６】
フィードバック機構は、ハードウエアまたはソフトウエアのいずれかにより実施してもよい。フィードバック機構は、アナログ閉回路により実施してもよい。フィードバックは、50μs、20μs、10μsまたは1μsごとに起こるが、好ましくは実時間フィードバックまたは瞬時（すなわち、応答時間を決定するための入手可能な技術により決定される実質的に瞬時）である。ニュートラル電極で所望の組織中のインピーダンスを測定してもよく、そのインピーダンスをフィードバック機構に伝え、フィードバック機構がインピーダンスに応答してエネルギーパルスを調整し、プリセット電流と類似の値の定電流を保持する。フィードバック機構は、エネルギーパルスの送達時に定電流を連続および瞬時的に保持してもよい。
【０１２７】
本発明のDNAワクチンの送達を促進し得る電気穿孔装置および電気穿孔法の例としては、その内容の全てが全体として参照により本明細書に組み込まれる、Draghia-Akli他による米国特許第7,245,963号、Smith他により提出された米国出願特許公開第2005/0052630号に記載のものが挙げられる。DNAワクチンの送達を促進するのに使用され得る他の電気穿孔装置および電気穿孔法としては、その全てが全体として参照により本明細書に組み込まれる、2006年10月17日出願の米国仮特許出願第60/852,149号および2007年10月10日出願の同第60/978,982号に対して35USC 119(e)の下に利益を主張する、2007年10月17日出願の同時係属中および共有の米国特許出願第11/874072号に提供されるものが挙げられる。
【０１２８】
Draghia-Akli他による米国特許第7,245,963号には、体内または植物内の選択された組織の細胞中への生体分子の導入を促進するためのモジュラー電極システムおよびその使用が記載されている。モジュラー電極は、複数の針電極；皮下注射針；プログラム可能な定電流パルス制御装置から複数の針電極への導電的連結を提供する電気コネクター；および電源を含んでいてもよい。オペレータが、支持構造上に搭載された複数の針電極を把握して、体内または植物内の選択された組織にそれらをしっかりと挿入することができる。その後、皮下注射針を介して、生体分子を選択された組織へ送達する。プログラム可能な定電流パルス制御装置を起動して、定電流の電気パルスを複数の針電極に印加する。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間での細胞への生体分子導入を促進する。米国特許第7,245,963号の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２９】
Ｓｍｉｔｈ他により提出された米国特許出願公開第2005/0052630号には、体内または植物内の選択された組織の細胞中への生体分子導入を効果的に促進するために用いられ得る電気穿孔装置が記載されている。該電気穿孔装置は、操作がソフトウエアまたはファームウエアに特定される電気運動装置（「EKD装置」）を含む。EKD装置は、ユーザーの制御およびパルスパラメータ入力に基づきアレイの電極間で一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生成し、電流波形データの保存および取得を可能にする。電気穿孔装置は、針電極のアレイを有する交換可能な電極ディスク、注射針用の中央注入チャネル、および取り外し可能なガイドディスクも含む。米国特許出願公開第2005/0052630号の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３０】
米国特許第7,245,963号および米国特許出願公開第2005/0052630号に記載された電極アレイおよび方法は、筋肉などの組織だけでなく、他の組織または臓器にも深く穿通させるように構成されていてもよい。電極アレイの形態によって、注射針（選択された生体分子を送達する）が、ターゲット臓器にも完全に挿入され、電極によってあらかじめ表示された領域のターゲット組織に垂直に注射により投与される。米国特許第7,245,963号および米国特許出願公開第2005/005263号に記載された電極は、好ましくは20mm長および21ゲージである。
【０１３１】
加えて、電気穿孔装置およびその使用を組み込んだいくつかの実施形態で企図される通り、以下の特許：1993年12月28日発行の米国特許第5,273,525号、2000年８月29日発行の米国特許第6,110,161号、2001年７月17日発行の同第6,261,281号、2005年10月25日発行の同第6,958,060号、および2005年９月６日発行の米国特許第6,939,862号に記載された電気穿孔装置が存在する。さらに、様々な装置のいずれかを用いたDNAの送達に関係する2004年２月24日発行の米国特許第6,697,669号、およびDNA注入の方法が注目された2008年２月５日発行の米国特許第7,328,064号に提供された主題を取り扱う特許が、本明細書内に企図されている。先の特許は、全体として参照により組み込まれる。
【０１３２】
ｃ．ワクチンを調製する方法
本明細書で提供されるのは、ワクチンを調製する方法である。いくつかの実施形態において、該方法は、DNAプラスミドを含むワクチンを調製する方法である。DNAプラスミドを、哺乳動物発現プラスミドへの最終的なサブクローニングステップの後、当該技術分野で公知の方法を用いて、大規模発酵タンクで細胞培養物に接種するのに用いることができる。プラスミドを、適合性宿主細胞に変換して培養し、FMDV抗原の発現が起こる条件下に保持する。FMDV抗原を、細胞を溶解することにより培養物から回収するか、または培地から回収して、単離してもよい。単離されたVP１〜４コンセンサスタンパク質を、ワクチン中で抗体の天然供給源として用いてもよい。単離された本質的に純粋なFMDV抗原を生成するのに用いられ得る自動合成装置を用いて、FMDV抗原を組換え技術により生成してもよい。これらの技術は、FMDVの特定のサブタイプのFMDV抗原の変異体を導入するのに有用となり得る。
【０１３３】
本発明のEP装置と共に用いられるDNAプラスミドは、公知の装置および技術の組み合わせを利用して配合または製造することができるが、好ましくは、それらは、2007年５月23日に出願された許諾対象である同時係属中の米国仮特許出願第60/939,792号に記載された最適化プラスミド製造技術を用いて製造される。いくつかの実施例において、これらの研究で使用されるDNAプラスミドは、10 mg/mL以上の濃度で製剤化することができる。その製造技術は、米国特許出願第60/939792号に記載されたものに加えて、2007年７月３日発行の許諾対象特許である米国特許第7,238,522号に記載されたものをはじめとする、当業者に一般的に公知の様々な装置およびプロトコルも含む、または組み込んでいる。先に参照された出願および特許、米国特許出願第60/939,792号および米国特許第7,238,522号は、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
実施例
実施例１
【０１３４】
図１〜17に示されるように、いくつかの実施形態の構築物が、作製され、テストされている。これらの図は、ワクチンが作製され、それらの使用によってデータが生成されたことを示す。
【０１３５】
図17は、ジェネリックFMDV DNAワクチン構築物の略図を示し、挿入がBamH1およびXho-1部位へのクローンであることを示している。ジェネリックFMDVワクチンのプラスミドマップは、プラスミドpVAXに基づく。FMDV挿入の実施例は、ロング形式であってもよく、それはロング形式挿入として図17に示され、またはショート形式であってもよく、それはショート形式挿入として図７に示される。各形式に示されるIgEリーダーは、任意的であることが示される、または、異なるリーダーで置換される場合がある。2A配列は、任意的と示され、フューリン切断部位（rgrkrrs−配列番号27）は、置換可能であると示される。
【０１３６】
図１は、図17に示されるジェネリックFMDV DNAワクチンのFMDV-As1-Shamir-89バージョンである。図３は、図17に示されるジェネリックFMDV DNAワクチンのFMDV-A24cruzeiro DNAバージョンである。図５は、図17に示されるジェネリックFMDV DNAワクチンのFMDV-SAT2 DNAバージョンである。図１は、血清型 Asia 1のためのFMDV-As1-Shamir-89 DNAワクチン構築物の略図であり、As1 Shamir89挿入がBamH1およびXho-1部位へのクローンであることを示している。図３に示されるFMDV-A24cruzeiro DNAワクチン構築物は、クローンBamH1およびXho-1部位である。図５に示されるFMDV-SAT DNAワクチン構築物は、クローンBamH1およびXho-1部位である。図１、３および５の各々において、プラスミドマップは、プラスミドpVAXに基づく。FMDV-As1-Shamir挿入の実施例は、ロング形式であってもよく、それはpFMDV-As1 Shamir-89-Lとして図１に示され、またはショート形式であってもよく、それはpFMDV-As1 Shamir-89-Sとして図１に示される。挿入の実施例は、ロング形式であってもよく、それはpFMDV-A24cruzeiro-Lとして図３に示され、またはショート形式であってもよく、それはpFMDV-A24cruzeiro-Sとして図３に示される。FMDV-SAT2挿入の実施例は、ロング形式であってもよく、それはpFMDV-As1 Sat2ロング形式として図５に示され、またはショート形式であってもよく、それはpFMDV-Sat2として図５に示される。
【０１３７】
図２は、As1-Shamir89-S（左−配列番号７）およびAs1-Shamir89-L（右−配列番号５）のクローン化を示している一対の染色されたゲルを示し、図４は、A24cruzeiro-S（左−配列番号３）およびA24cruzeiro-L（右−配列番号１）のクローン化を示している一対の染色されたゲルを示す。図６は、Sat2-S（左−配列番号11）およびSat2-L（右−配列番号９）のクローン化を示している一対の染色されたゲルを示す。これらのデータは、挿入がそれぞれのプラスミドに適切に組み込まれたことを示す。図２は、FMDV-As1-Shamir89-Lロング形式のアミノ酸配列を示す。図４は、FMDV-A24cruzeiro-Lロング形式のアミノ酸配列を示す。図６は、FMDV-Sat2ロング形式のアミノ酸配列を示す。各ロング形式において、配列は、陰影のついたＮ末端にIgEリーダー配列、小文字で書かれたタンパク質分解切断部位、およびIgEリーダーと第１のタンパク質分解切断部位との間に太字のVP４配列を含んでいた。第１のタンパク質分解切断部位と第２のタンパク質分解切断部位の間は、VP２のコード配列である。第２のタンパク質分解切断部位と第３のタンパク質分解切断部位の間は、VP３のコード配列である。第３のタンパク質分解切断部位と第４のタンパク質分解切断部位の間は、VP１のコード配列である。最後（第４）のタンパク質分解切断部位と終止との間の2A配列。
【０１３８】
図７は、タンパク質発現の実験結果を示す。SDSゲル上のタンパク質のウェスタンブロットは、FMDV-A24cruzeiro-Sショート形式、FMDV-A24cruzeiro-Lロング形式、pVAX、FMDV-As1-Shamir89-Sショート形式およびFMDV-As1-Shamir89-Lロング形式から産生された試料からのタンパク質発現を比較した。該ブロットは、抗A24抗血清で精査された。
【０１３９】
図８は、１）pVAX、２）FMDV-A24cruzeiro-L、３）FMDV-A24cruzeiro-S、４）FMDV-Shamir89-L、５）FMDV-Shamir89-S、FMDV-Sat2-L、FMDV-Sat2-S、の投与に続く免疫反応を未処置と比較して評価するために、電気穿孔を使用した免疫化実験の実験プロトコルを示す。
【０１４０】
図９は、FMDV-A24cruzeiro-LおよびFMDV-A24cruzeiro-Sワクチンによって誘発される細胞免疫反応のデータを示す。図10は、FMDV-As1-Sharma89-LおよびFMDV-As1-Sharma89-Sワクチンによって誘発される細胞免疫反応のデータを示す。図11は、FMDV-Sat2-LおよびFMDV-Sat2-Sワクチンによって誘発される細胞免疫反応のデータを示す。図12は、ELISA分析のためのDNAトランスフェクションおよび細胞可溶化物調製のための実験プロトコルを示す。図13は、FMDV-A24cruzeiro-LおよびFMDV-A24cruzeiro-Sワクチンによって、ならびにFMDV-As1-Sharma89-LおよびFMDV-As1-Sharma89-Sワクチンによって誘発される、マウス内の抗体誘導のデータを示す。図14は、FMDV-A24cruzeiro-Lトランスフェクト細胞およびFMDV-As1-Sharma89-Lトランスフェクト細胞から調製されるタンパク質可溶化物を使用した抗体結合のELISA分析のデータを示す。FMDVワクチンは、マウス内で免疫原性であった。全ての免疫化された動物内で抗体陽転が観察された。ワクチンのロング形式は、ショート形式よりも効能があった。体液性応答は、Creuzeiroワクチンと比較して、Shamirワクチンに対して最も効能があるように見えるが、双方のワクチンが、効能があった。細胞応答は、Creuzeiroワクチンと比較して、Shamirワクチンとより交差反応性があった。妥当な水準の免疫反応性を示すウシ血清陽性血清との比較は、ワクチンによって誘導された。
【０１４１】
図15は、sharir配列とcruzeiro配列のアミノ酸配列比較を示す。Shamir VP４配列（配列番号17）は、cruzeiro VP４配列（配列番号18）と比較して示され、Shamir VP２配列（配列番号19）は、cruzeiro VP２配列（配列番号20）と比較して示され、Shamir 2A配列（配列番号21）は、cruzeiro 2A（配列番号22）と比較して示される。
【０１４２】
図16は、sharir配列とcruzeiro配列のアミノ酸配列比較を示す。Shamir VP３配列（配列番号23）は、cruzeiro VP３配列（配列番号24）と比較して示され、Shamir VP１配列（配列番号25）は、cruzeiro VP１配列（配列番号26）と比較して示される。
実施例２
【０１４３】
１４の構築物が、FMDVワクチンを調製するためにデザインされた。７つの口蹄疫ウイルスサブタイプＡ、Asia １、Ｃ、Ｏ、SAT１、SAT２、SAT３、SAT４からの配列が使用される。２つの構築物デザイン、ロング形式およびショート形式、が使用され得る。したがって、サブタイプＡ、Asia １、Ｃ、Ｏ、SAT１、SAT２、SAT３、SAT４の各々の構築物のロングおよびショート形式が存在するため、14の構築物を産出する。ワクチンは、わずか４つ、典型的には７つの構築物を使用して、生成され得る。
【０１４４】
ジェネリックロング形式は、図17に示される。免疫原コード配列は、VP４、VP２、VP３、VP１の順番で配置される。プロテアーゼ切断部位のコード配列は、４つのウイルスタンパク質のそれぞれを分離する。コード配列は、提供されるいかなる任意のIgEリーダー配列のためにも提供され得る。同様にFMDVペプチド2Aテールは、プロテアーゼ切断部位を含む末端に提供される。
【０１４５】
ジェネリックショート形式は、図17に示される。免疫原コード配列は、VP２、VP３、VP１の順番で配置される。プロテアーゼ切断部位のコード配列は、４つのウイルスタンパク質のそれぞれを分離する。コード配列は、提供されるいかなる任意のIgEリーダー配列のためにも提供され得る。同様に16アミノ酸2Aテールは、プロテアーゼ切断部位を含む末端に提供される。
【０１４６】
構築物が、プラスミド発現ベクターに挿入され、14のプラスミドをもたらす。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、Ａ−ロング形式、Asia １−ロング、Ｃ−ロング形式、Ｏ−ロング形式、SAT１−ロング形式、SAT２−ロング形式、SAT３−ロング形式、およびSAT４−ロング形式を含む。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、Ａ−ショート形式、Asia １−ショート、Ｃ−ショート形式、Ｏ−ショート形式、SAT１−ショート形式、SAT２−ショート形式、SAT３−ショート形式、およびSAT４−ショート形式を含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、Ａ−ロング形式、Asia １−ロング、Ｃ−ロング形式、およびＯ−ロング形式を含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、Ａ−ショート形式、Asia 1−ショート、Ｃ−ショート形式、およびＯ−ショート形式を含む。
【０１５１】
Ｎ末端は、IgEもしくはIgGなどのリーダー配列であり得、またはリーダーがない。
【０１５２】
個々のウイルスタンパク質は、発現が所望される細胞内によく存在するプロテアーゼによって互いに分離される。
【０１５３】
国際公開第2011/054011号は、FMDVワクチンを開示している。その開示に含まれるのは、様々な実施形態に含まれ得る２８の配列のためのアミノ酸配列およびコード配列である。14のウイルス配列とは、FMDV サブタイプＡ、Asia 1、Ｏ、Ｃ、SAT１、SAT２、およびSAT３の各々のVP１、VP２、VP３、およびVP４である。そこに開示される配列は、ワクチンに含まれ得る構築物を生成するために使用され得る。
【０１５４】
構築物は、ロング形式およびショート形式を含む。図１は、各々の部分的ジェネリック形式を示す。図17に示されるように、本発明において、構築物は、ウイルスタンパク質VP１、VP２、VP３、およびVP４を、特定の順番：VP４−VP２−VP３−VP１で提供する。任意的なテール、2Aも提供される。本構築物は、任意的なIgEリーダー配列を有する。出現されるとき、タンパク質分解切断部位「CS」は、VP４、VP２、VP３、VP１、および存在するときは2A、の各々の間に提供される。該部位を処理することができるプロテアーゼは、いくつかの実施形態において、フューリンであってもよい。他のプロテアーゼ部位も使用してよい。該部位は、ワクチンが発現される細胞内でよく見られるプロテアーゼによって認識されなければならない。
【０１５５】
本発明の一様態において、Ａ、Asia 1、Ｏ、Ｃ、SAT１、SAT２、およびSAT３をはじめとするFMDVの１つ以上のサブタイプにわたる口蹄疫から哺乳動物を守るために、生成されワクチン中で使用することができる、コンセンサスFMDVタンパク質VP１、VP２、VP３、VP４および／または3Cと、これらのタンパク質をコードする核酸配列とを含む融合タンパク質が存在する。
【０１５６】
本発明の別の態様において、Ａ、Asia 1、Ｏ、Ｃ、SAT１、SAT２、およびSAT3をはじめとするFMDVの１つ以上のサブタイプにわたる口蹄疫から哺乳動物を守るために、生成されワクチン中で使用することができる、２つの異なるサブタイプに由来する、コンセンサスFMDVタンパク質VP１とこのタンパク質をコードする核酸配列とを含む、融合タンパク質が存在する。
【０１５７】
本発明の別の態様において、Ａ、Asia 1、Ｏ、Ｃ、SAT１、SAT２、およびSAT３をはじめとするFMDVの１つ以上のサブタイプにわたる口蹄疫から哺乳動物を守るために、生成されワクチン中で使用することができる、コンセンサスFMDVタンパク質VP１と、それをコードする核酸配列とが存在する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【外国語明細書】
2019141069000001.pdf