(57)【要約】【課題】固定化酵素を再使用して間隔を空けて油脂の加水分解反応を行っても、反応休止期間中の酵素の加水分解活性の低下を抑え、脂肪酸類を生産性良く製造できる方法の提供。【解決手段】次の工程（Ａ）及び（Ｂ）：（Ａ）含水率が１０質量％以上である油水混合物を固定化酵素と接触させて油脂を加水分解し、脂肪酸類を得る工程、（Ｂ）油脂の加水分解反応に使用した固定化酵素を油脂と接触させて、当該固定化酵素の水分活性を０．７５以下に低下させる工程を含む、脂肪酸類の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程（Ａ）及び（Ｂ）：
（Ａ）含水率が１０質量％以上である油水混合物を固定化酵素と接触させて油脂を加水分解し、脂肪酸類を得る工程、
（Ｂ）油脂の加水分解反応に使用した固定化酵素を油脂と接触させて、当該固定化酵素の水分活性を０．７５以下に低下させる工程
を含む、脂肪酸類の製造方法。
【請求項２】
工程（Ｂ）で用いる油脂の使用量が反応系内の初期水分量に対して１０００質量％以上である請求項１記載の脂肪酸類の製造方法。
【請求項３】
工程（Ｂ）の前に、油脂の加水分解反応に使用した固定化酵素に対して不活性ガスブローを行う工程を更に含む請求項１又は２記載の脂肪酸類の製造方法。
【請求項４】
工程（Ｂ）において、油脂の加水分解反応終了から１２０時間以内に固定化酵素に対して油脂を接触させる請求項１〜３のいずれか１項記載の脂肪酸類の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素分解法による脂肪酸類の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸類は、食品の中間原料やその他各種の工業製品の添加剤、中間原料として広く利用されている。かかる脂肪酸類は、一般に、菜種油、大豆油等の植物油や牛脂等の動物油を加水分解することにより製造される。
油脂を加水分解する方法としては、高温高圧分解法と酵素分解法がある（例えば、特許文献１、２）。酵素分解法は、リパーゼ等の油脂加水分解酵素を触媒として用い、油脂に水を加えて比較的低温の条件で反応を行うもので、トランス不飽和脂肪酸を生成しないという利点を有する。
【０００３】
工業的に油脂を酵素分解法で加水分解する場合、酵素を効率的に使用するため、無機又は有機の固定化担体に酵素を固定化した固定化酵素が用いられ、これは繰り返し加水分解反応に使用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０００−１６０１８８号公報
【特許文献２】特開２００７−９９９５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、固定化酵素を再使用しながら間欠的に、特に長い時間間隔で油脂の加水分解反応を行うと、酵素の加水分解活性が反応休止期間中に低下してしまい脂肪酸類の生産性が悪くなることが判明した。
従って、本発明は、固定化酵素を再使用して間隔を空けて油脂の加水分解反応を行っても、反応休止期間中の酵素の加水分解活性の低下を抑え、脂肪酸類を生産性良く製造できる方法を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、反応休止期間中に酵素の加水分解活性が低下してしまう原因について種々検討したところ、加水分解反応後、固定化酵素に水が付着して残っていることに原因があることを見出した。すなわち、油脂の加水分解反応においては加水分解の方へ平衡反応を進行させるために反応系内へ水が多く供給されるので加水分解反応後に固定化酵素に水が多く付着した状態となる。そしてこの状態が長く、また付着した水が多い程、酵素の加水分解活性が低下していたのである。
そこで更に検討したところ、加水分解反応に使用した固定化酵素と油脂を接触させる処理を行い、固定化酵素に付着して残っている水を消費させて固定化酵素の水分活性を所定値以下に低下させれば、反応休止期間中の酵素の加水分解活性の低下が抑えられることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の工程（Ａ）及び（Ｂ）：
（Ａ）含水率が１０質量％以上である油水混合物を固定化酵素と接触させて油脂を加水分解し、脂肪酸類を得る工程、
（Ｂ）油脂の加水分解反応に使用した固定化酵素を油脂と接触させて、当該固定化酵素の水分活性を０．７５以下に低下させる工程
を含む、脂肪酸類の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、反応休止期間中の酵素の加水分解活性の低下を抑えられるため、固定化酵素を再使用して間隔を空けて油脂の加水分解反応を行っても脂肪酸類を生産性良く得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の脂肪酸類の製造方法は、（Ａ）含水率が１０質量％以上である油水混合物を固定化酵素と接触させて油脂を加水分解し、脂肪酸類を得る工程、及び（Ｂ）油脂の加水分解反応に使用した固定化酵素を油脂と接触させて、当該固定化酵素の水分活性を０．７５以下に低下させる工程を有する。
本明細書において「脂肪酸類」は、脂肪酸の他、油脂を含んでいてもよい。
「油脂」は、「油」と同義であり、油脂（油）を構成する物質にはトリグリセリド（ＴＡＧ）のみならずモノグリセリド（ＭＡＧ）やジグリセリド（ＤＡＧ）も含まれる。すなわち、油脂（油）は、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドのいずれか１種以上を含むものである。
【００１０】
〔工程（Ａ）〕
本工程は、含水率が１０質量％以上である油水混合物を固定化酵素と接触させて油脂を加水分解し、脂肪酸類を得る工程である。本明細書において「油水混合物」は、加水分解の対象となる油脂と水の混合物であるが、分相していても、乳化状態となっていてもよい。
加水分解の対象となる油脂は、植物性油脂、動物性油脂のいずれでもよい。例えば、大豆油、菜種油、サフラワー油、米油、コーン油、ヒマワリ油、綿実油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、ハトムギ油、小麦胚芽油、シソ油、アマニ油、エゴマ油、チアシード油、サチャインチ油、クルミ油、キウイ種子油、サルビア種子油、ブドウ種子油、マカデミアナッツ油、ヘーゼルナッツ油、カボチャ種子油、椿油、茶実油、ボラージ油、パーム油、パームオレイン、パームステアリン、やし油、パーム核油、カカオ脂、サル脂、シア脂、藻油等の植物性油脂；魚油、ラード、牛脂、バター脂等の動物性油脂；あるいはそれらのエステル交換油、水素添加油又は分別油等の油脂類を挙げることができる。これらの油脂は、それぞれ単独で用いてもよく、２種以上混合して用いてもよい。
【００１１】
加水分解の対象となる油脂を構成する脂肪酸は特に限定されず、飽和脂肪酸又は不飽和脂肪酸のいずれであってもよいが、油脂を構成する脂肪酸のうち６０〜１００質量％が不飽和脂肪酸であることが好ましく、より好ましくは７０〜９９質量％、更に７５〜９７質量％、更に８０〜９５質量％が不飽和脂肪酸であるのが外観、油脂の工業的生産性の点で好ましい。不飽和脂肪酸の炭素数は１４〜２４、更に１６〜２２であるのが生理効果の点から好ましい。なお、本明細書における脂肪酸量は遊離脂肪酸換算量である。
【００１２】
また、加水分解の対象となる油脂を構成する脂肪酸のうち、飽和脂肪酸の含有量は、低温での結晶析出抑制の点で、３０質量％以下であることが好ましく、２０質量％以下、更に１５質量％以下、更に１０質量％以下であるのがより好ましい。また、油脂の工業的生産性の点で、０．５質量％以上であることが好ましい。飽和脂肪酸としては、炭素数１４〜２４、更に１６〜２２のものが好ましい。
【００１３】
油脂は、それぞれの原料となる植物、又は動物から搾油後、油分以外の固形分をろ過や遠心分離等により除去するのが好ましい。次いで、水、場合によっては更に酸を添加混合した後、遠心分離等によってガム分を分離することにより脱ガムすることが好ましい。また、油脂は、アルカリを添加混合した後、水洗し脱水することにより脱酸を行うことが好ましい。更に、油脂は、活性白土等の吸着剤と接触させた後、吸着剤をろ過等により分離することにより脱色を行うことが好ましい。更に、脱臭は、不快な臭いや呈味物質を除去し、風味・色相・保存安定性の良好な精製油を得る工程であり、高温・減圧条件下で水蒸気を吹き込みながら有臭成分を除去する水蒸気脱臭を行うことが好ましい。これらの処理は、以上の順序で行うことが好ましいが、順序を変更しても良い。また、この他に、油脂は、ろう分の除去のために、低温で固形分を分離するウインタリングを行っても良い。
【００１４】
水は、蒸留水、イオン交換水、脱気水、水道水、井戸水等いずれのものでもよい。グリセリン等その他の水溶性成分が混合されていても良い。必要に応じて、酵素の安定性が維持できるようにｐＨ３〜９の緩衝液を用いてもよい。
【００１５】
油水混合物の含水率は１０質量％以上であるが、工業的な生産性の点から、１０〜８５質量％、更に１５〜７５質量％、更に２０〜６５質量％が好ましい。なお、本発明において、油水混合物中の水は、反応系内へ添加する水の他に、反応系内へ添加する油脂に含まれる水を含める。
油水混合物の含水率をコントロールする方法としては、（１）あらかじめ、反応成分の水分量をカールフィッシャー法等により測定しておき、合計の水分量をコントロールする方法、（２）反応成分を完全に脱水して、後で所定量の水を加える方法等がある。
【００１６】
固定化酵素は、油脂加水分解酵素を担体に固定化した固定化油脂加水分解酵素である。
油脂加水分解酵素としては、リパーゼが好ましい。リパーゼは、特に制限されず、動物由来、植物由来、又は微生物由来のリパーゼを用いることができる。例えば、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ジオトリケム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等の起源のリパーゼが挙げられる。
なかでも、加水分解効率の点から、位置・鎖長選択性のない、所謂非選択性リパーゼを用いるのが好ましく、更にキャンディダ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）によって生産される非選択性リパーゼを用いるのが好ましい。
【００１７】
固定化担体としては、セライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モレキュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシウム、セラミックス等の無機担体、セラミックスパウダー、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、キトサン、イオン交換樹脂、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子等が挙げられる。なかでも、保水力が高い点からイオン交換樹脂が好ましい。また、イオン交換樹脂の中でも、大きな表面積を有することにより酵素の吸着量を高くできるという点から、多孔質であることが好ましい。
【００１８】
固定化担体として用いる樹脂の粒子径は５０〜２０００μｍが好ましく、更に１００〜１０００μｍが好ましい。細孔径は１０〜１５０ｎｍが好ましく、更に１０〜１００ｎｍが好ましい。材質としては、フェノールホルムアルデヒド系、ポリスチレン系、アクリルアミド系、ジビニルベンゼン系等が挙げられ、更にフェノールホルムアルデヒド系樹脂（例えば、Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ社製Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ａ−５６８）が酵素吸着性向上の点から好ましい。
このとき、用いる油脂加水分解酵素量は、担体質量に対して０．１〜３００質量％、更に０．５〜２００質量％、更に１〜１５０質量％が工業的生産性の点から好ましい。固定化の際、酵素を溶液状態にするが、緩衝剤を用いてｐＨ３〜７に調整して用いることが好ましい。固定化時の温度は０〜６０℃、更に３〜４０℃が好ましい。
【００１９】
固定化酵素の活性を高めるために、油脂加水分解酵素の固定化前に予め脂溶性脂肪酸又はその誘導体を担体に吸着させる処理を施しても良い。処理を施す方法としては、例えば、クロロホルム、ヘキサン、エタノール等の有機溶剤に脂溶性脂肪酸又はその誘導体を一旦分散、溶解させた後、水に分散させた担体に加える方法が挙げられる。
使用する脂溶性脂肪酸としては、炭素数８〜１８の飽和又は不飽和の、直鎖又は分岐鎖の、水酸基が置換していても良い脂肪酸が挙げられる。具体的には、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、α-リノレン酸、リシノール酸等が挙げられる。またその誘導体としては、これらの脂肪酸と一価又は多価アルコールとのエステル、リン脂質、及びこれらのエステルにエチレンオキサイドを付加した誘導体が挙げられる。具体的には、上記脂肪酸のメチルエステル、エチルエステル、モノグリセリド、ジグリセリド、それらのエチレンオキサイド付加体、ポリグリセリンエステル、ソルビタンエステル、ショ糖エステル等が挙げられる。これらの脂溶性脂肪酸又はその誘導体は２種以上を併用しても良い。
【００２０】
油脂加水分解酵素の加水分解活性は、後述する方法により測定した力価が２０Ｕ／ｇ（乾燥質量）以上、更に１００〜１００００Ｕ／ｇ（乾燥質量）、更に５００〜５０００Ｕ／ｇ（乾燥質量）の範囲であることが好ましい。
【００２１】
固定化酵素の使用量（乾燥質量）は、酵素の活性を考慮して適宜決定することができるが、油脂に対して、１〜２０質量％、更に２〜１５質量％使用するのが工業的生産性の点から好ましい。
【００２２】
含水率が１０質量％以上である油水混合物と固定化酵素とを接触させる手段としては、浸漬、攪拌、該固定化酵素を充填したカラムにポンプ等で通液すること等が挙げられる。攪拌する場合には、反応槽径によって異なるが、固定化酵素が沈降せず、破砕を抑制し、効率的に加水分解反応を進行させる点から、１０〜１０００ｒ／ｍｉｎが好ましく、更には２０〜７００ｒ／ｍｉｎ、更には３０〜５００ｒ／ｍｉｎが好ましい。
【００２３】
本発明において、油脂の加水分解は、回分式、連続式、又は半連続式の加水分解反応装置で行うことができる。油脂と水の加水分解反応装置内への供給は、並流式、向流式どちらでもよい。加水分解反応装置に供給される油脂及び水は、必要により予め脱気又は脱酸素した油脂及び水を用いてもよい。
【００２４】
加水分解の反応温度は、酵素の特性によって決定することができるが、反応速度を向上する点、酵素の失活を抑制する点から、０〜８０℃、更に１０〜７０℃、更に２０〜６０℃が好ましい。
【００２５】
加水分解反応は、得られる加水分解油中の遊離脂肪酸濃度によって管理し、所定の脂肪酸濃度に到達した時点で終了することができる。本発明において、油脂の加水分解反応は、遊離脂肪酸濃度・収率を高くできる点から、遊離脂肪酸濃度が８５質量％以上、更に８６〜９８質量％、更に９１〜９７質量％の範囲で行うのが好ましい。
遊離脂肪酸濃度は、油相の酸価及び脂肪酸組成から以下の式で示される。
遊離脂肪酸濃度（質量％）＝ｘ×ｙ／５６.１１／１０
（ｘ＝油相の酸価[ｍｇＫＯＨ/ｇ]、ｙ＝脂肪酸組成から求めた平均分子量）
なお、油相の酸価は、日本油化学会編「基準油脂分析試験法２００３年版」中の「酸価（２．３．１−１９９６）」により測定できる。
【００２６】
加水分解の反応時間は、固定化酵素の使用量や酵素活性を考慮して適宜決定することができるが、工業的生産性の点から、１〜２４時間、更に２〜１２時間、更に２．５〜６時間、更に３〜４．５時間が好ましい。
【００２７】
加水分解反応は、空気との接触が出来るだけ回避されるように、窒素等の不活性ガス存在下で行うことが好ましい。
【００２８】
加水分解反応後、反応液から油相として脂肪酸類を得るには、固定化酵素と水相を静置分離や遠心分離等で油相と分離すればよい。
油相は脂肪酸類としてこのまま使用しても良く、クロマトグラフィー、分子蒸留、液液分配、結晶分別、脱酸法等の分別手段により遊離脂肪酸画分を分取してもよい。
加水分解反応に使用した固定化酵素は、分離、回収後、再び含水率が１０質量％以上である油水混合物に作用させて油脂の加水分解に再利用する。
【００２９】
〔工程（Ｂ）〕
本工程は、油脂の加水分解反応に使用した固定化酵素を油脂と接触させて、当該固定化酵素の水分活性を０．７５以下に低下させる工程である。
油脂の加水分解反応後、濾過や不活性ガスブローによって油水を分離し、回収した固定化酵素の水分量は、通常、１５質量％以上であり、また、水分活性は、通常、０．９以上である。
このように油脂の加水分解反応後の固定化酵素は水が多く付着した状態にあるところ、当該固定化酵素を油脂と接触させることにより、油脂の加水分解に当該固定化酵素に付着して残っている水を消費させて固定化酵素の水分活性を０．７５以下に低下させることができる。そのため、反応休止期間中の酵素の加水分解活性の低下が抑えられる。
【００３０】
油脂と接触させた後の固定化酵素の水分活性は０．７５以下であるが、酵素の加水分解活性の低下抑制の点から、０．１〜０．７５、更に０．２〜０．６５、更に０．３〜０．６が好ましい。固定化酵素の水分活性は、後述の〔分析方法〕（iii）に記載した方法に従って求めた値をいう。
【００３１】
本工程において、油脂は、特に限定されず、前述の植物性油脂、動物性油脂等のいずれでもよい。
油脂の加水分解反応に使用した固定化酵素に接触させる油脂の使用量は当該固定化酵素の水分活性を０．７５以下に低下させることができればよい。水分活性低減効率の点、工業的生産性の点から、油脂の使用量は、反応系内の初期水分量に対して１０００質量％以上、更に１２５０〜５０００質量％、更に１５００〜４０００質量％、更に１７５０〜３０００質量％であるのが好ましい。ここで、反応系内の初期水分は、工程（Ｂ）前、油脂の加水分解反応に使用した固定化酵素に付着して残っている水の他に、反応系内へ添加する油脂に含まれる水を含める。また、油脂の加水分解を固定化酵素を充填した酵素塔（反応塔）と油脂及び水を酵素塔へ供給する基質供給塔を備えた加水分解反応装置にて行う場合は、加水分解反応後、基質供給塔内や基質供給塔と酵素塔の間の供給路にも水が残っているため、反応系内の初期水分は、工程（Ｂ）前に当該加水分解反応装置内に残っている水も含む。あらかじめ、工程（Ｂ）前に、油脂の加水分解反応に使用した固定化酵素の残存水分量等の反応系内の残存水分量を見積もり、それに応じた油脂を供給して当該固定化酵素に接触させることで、当該固定化酵素の水分活性を０．７５以下に低下させることができる。
【００３２】
油脂の加水分解反応に使用した固定化酵素と油脂とを接触させる手段としては、前述と同じ手段、例えば、浸漬、攪拌、該固定化酵素を充填したカラムにポンプ等で通液すること等が挙げられる。
当該固定化酵素と油脂との接触温度は、反応系内の残存水分が消費されて固定化酵素の水分活性が低下し、また、酵素の失活が起こらず、酵素特性に合わせればよく、前述の油脂の加水分解反応温度の範囲が好ましい。
当該固定化酵素と油脂との接触は、得られる部分分解油中の遊離脂肪酸濃度が平衡状態に到達した時点で終了することができる。例えば、遊離脂肪酸濃度が７０質量％以下、更に５〜６０質量％、更に１０〜５０質量％、更に１５〜４０質量％の範囲で終了する。得られる部分分解油は、以降の加水分解反応原料として利用することができる。
【００３３】
加水分解反応後、固定化酵素に水が多く付着した状態が長く続く程、酵素の加水分解活性が低下し易いことから、油脂の加水分解反応に使用した固定化酵素と油脂との接触は、加水分解反応終了から好ましくは１２０時間以内に行うことが好ましい。
【００３４】
本発明では、油脂の加水分解反応に使用した固定化酵素と油脂とを接触させる前に、あらかじめ固定化酵素に対して窒素等の不活性ガスを供給する不活性ガスブローを行い、できるだけ固定化酵素における水の付着量を減らすのが好ましい。
【００３５】
工程（Ｂ）を行った後の固定化酵素は、以降の加水分解反応に再使用できる。
本発明では、加水分解反応終了から、間隔を空けて、例えば２４時間以上後、更に７２時間以上後、更に１２０時間以上後に、固定化酵素を再使用して油脂の加水分解反応を開始する場合に、本発明の効果がより有効に発揮される。
固定化酵素を再使用して油脂の加水分解反応を開始する際の固定化酵素の残存活性率は、脂肪酸類の生産性の点から高いのが好ましく、８０％以上がより好ましく、更に８５〜９９％、更に９０〜９８％が好ましい。固定化酵素の残存活性率は、後述の〔分析方法〕（vi）に記載した方法に従って求めた値をいう。
固定化酵素を再使用する回数は、酵素活性によって相違するものの、酵素を効率的に使用する点から、１回以上、更に２回以上、更に５回以上、更に１０回以上であるのが好ましい。
【実施例】
【００３６】
〔分析方法〕
（ｉ）酸価（ＡＶ）の測定
日本油化学会編「基準油脂分析試験法２００３年版」中の「酸価（２．３．１−１９９６）」に従って測定した。
【００３７】
（ii）遊離脂肪酸濃度の算出
以下の式（１）で、油脂を加水分解して得られる脂肪酸の遊離脂肪酸濃度を求めた。アマニ油の脂肪酸平均分子量は２８０とした。
遊離脂肪酸濃度［質量％］＝加水分解油の酸価（ＡＶ）／アマニ油の脂肪酸平均分子量／５６．１１／１０・・・・（１）
【００３８】
（iii）水分活性の測定
固定化酵素の水分活性は水分活性精密測定装置ＬａｂＭａｓｔｅｒ−ａｗを用いて測定した。
【００３９】
（iv）固定化酵素の乾燥質量比率の測定
油分及び水分の付着した固定化酵素ａ質量部に対し１０質量倍のヘキサン及びアセトンで交互に各３回ずつ洗浄後、７０℃で１５時間放置することにより脱溶剤し、固定化酵素のみの質量を秤量した（ｂ質量部）。以下の式（２）で、固定化酵素の乾燥質量比率を求めた。
固定化酵素の乾燥質量比率＝ｂ／ａ×１００［質量％］・・・・（２）
（ａ：油分及び水分の付着した固定化酵素質量、ｂ：固定化酵素質量）
【００４０】
（ｖ）加水分解活性（発現活性）の測定
１００ｍＬの三つ口フラスコに固定化酵素５ｇ及び菜種油５０ｇを加え、三日月羽根（幅５０ｍｍ×高さ２０ｍｍ）で４３０ｒ／ｍｉｎで撹拌しながら、ウォーターバスにて４０℃に加温した。これに蒸留水３０ｇを加え反応を開始した。継時でサンプリングを行い、遠心分離（３０００ｒ／ｍｉｎ、１分）により油水分離した後、油相の酸価の測定を行った。酸価が１７５ｍｇＫＯＨ／ｇに到達する時間を求め、以下の式（３）から加水分解活性を求めた。
加水分解活性[Ｕ／ｇ（乾燥質量）]
=(酸価１７５到達時間[ｈｒ]/５２３．１２)＾(−１／１．０９１９)
×菜種油[ｇ]/（固定化酵素[ｇ]×乾燥質量比[-]）・・・・（３）
【００４１】
（vi）残存活性率の算出
以下の式（４）で、固定化酵素の残存活性率を求めた。
残存活性率［％］＝保存後の加水分解活性［Ｕ／ｇ（乾燥質量）］／工程（Ｂ）後の加水分解活性［Ｕ／ｇ（乾燥質量）］×１００・・・・（４）
【００４２】
〔固定化酵素の調製〕
アニオン交換樹脂Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ａ−５６８（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ社製、粒径分布１５０〜８５０μｍの粒子が９６質量％）を粉砕して分級し、粒度１５０〜４２５μｍの粒子が９７質量％である樹脂１質量部をＮ／１０のＮａＯＨ溶液１０質量部中で１時間攪拌した。ろ過した後１０質量部のイオン交換水で洗浄し、５００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１０質量部でｐＨの平衡化を行った。ろ過後、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１０質量部で２時間ずつ２回ｐＨの平衡化を行った。この後ろ過を行い、担体を回収した後エタノール４質量部でエタノール置換を３０分行った。ろ過した後、菜種脂肪酸を０．５８質量部含むエタノール４．２２質量部を加え３０分間、大豆脂肪酸を担体に吸着させた。ろ過によって担体を回収した後、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）５質量部で３０分ずつ４回洗浄し、ろ過して担体を回収した。
次いで、市販のＣａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ属由来のリパーゼＡＹ「アマノ」４００ＳＤ−Ｋ（天野エンザイム製）０．０２９質量部を５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１８質量部に溶解した酵素液と２時間接触させ、固定化を行った。ろ過し、固定化酵素を回収して５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）５質量部で洗浄を行うことにより、固定化していない酵素やタンパクを除去した。以上の操作はいずれも２０℃で行った。その後菜種油を４質量部加え４０℃で２時間攪拌した。ろ過後、菜種油を４質量部加え４０℃で減圧しながら撹拌し、真空度が７５０Ｐａ-ａｂｓに到達したところで常圧に戻し、その後ろ過して油脂と分離し、固定化酵素とした。
固定化酵素の加水分解活性は３６２１Ｕ／ｇ（乾燥質量）であった。
【００４３】
〔工程（Ａ）〕
固定化酵素を乾燥重量で８７.８ｇ計量し、５Ｌ容の四つ口フラスコに仕込んだ。そこへアマニ油を２０００ｇと蒸留水を１２００ｇ添加した。当該油水混合物の含水率は３７．５質量％であった。窒素気流下で攪拌しながら４０℃で加水分解反応を行った。遊離脂肪酸濃度が９３質量％に到達したところで遠心分離により油水分離し、油相として脂肪酸類を得、また、ろ過して固定化酵素を回収した。
回収した固定化酵素の水分量は１６．５質量％、水分活性０．９４、加水分解活性は３５８５Ｕ／ｇ（乾燥質量）であった。
【００４４】
〔比較例１〕
工程（Ａ）で回収した固定化酵素を５０℃、１３６時間保存した後、加水分解活性を測定した。加水分解活性は２５４９Ｕ／ｇ（乾燥質量）、残存活性率は７１．１％となった。
【００４５】
〔実施例１〕
〔工程（Ｂ）〕
５００ｍＬ容の四つ口フラスコに、工程（Ａ）で回収した固定化酵素を乾燥重量で２０ｇ計量し、アマニ油２７９ｇを添加した。アマニ油の使用量は、反応系内の初期水分量の２８９２質量％であった。４０℃で撹拌し、固定化酵素とアマニ油を遊離脂肪酸濃度が平衡になるまで接触させた後、ろ過し、固定化酵素を回収した。
回収した固定化酵素は水分活性０．４６、加水分解活性は３６４１Ｕ／ｇ（乾燥質量）であった。
【００４６】
工程（Ｂ）で回収した固定化酵素を５０℃、１３６時間保存した後、加水分解活性を測定した。加水分解活性は３３８３Ｕ／ｇ（乾燥質量）、残存活性率は９２．９％となった。
【００４７】
〔実施例２〕
〔工程（Ｂ）〕
５００ｍＬ容の四つ口フラスコに、工程（Ａ）で回収した固定化酵素を乾燥重量で２０ｇ計量し、アマニ油１７２ｇを添加した。アマニ油の使用量は、反応系内の初期水分量の１７８６質量％であった。４０℃で撹拌し、固定化酵素とアマニ油を遊離脂肪酸濃度が平衡になるまで接触させた後、ろ過し、固定化酵素を回収した。回収した固定化酵素は水分活性０．６２、加水分解活性は３５５０Ｕ／ｇ（乾燥質量）であった。
【００４８】
工程（Ｂ）で回収した固定化酵素を５０℃、１３６時間保存した後、加水分解活性を測定した。加水分解活性は３０９６Ｕ／ｇ（乾燥質量）、残存活性率は８７．２％となった。
【００４９】
〔実施例３〕
〔工程（Ｂ）〕
５００ｍＬ容の四つ口フラスコに、工程（Ａ）で回収した固定化酵素を乾燥重量で２０ｇ計量し、アマニ油１１８ｇを添加した。アマニ油の使用量は、反応系内の初期水分量の１２２５質量％であった。４０℃で撹拌し、固定化酵素とアマニ油を遊離脂肪酸濃度が平衡になるまで接触させた後、ろ過し、固定化酵素を回収した。回収した固定化酵素は水分活性０．７１、加水分解活性は３５６４Ｕ／ｇ（乾燥質量）であった。
【００５０】
工程（Ｂ）で回収した固定化酵素を５０℃、１３６時間保存した後、加水分解活性を測定した。加水分解活性は２９８４Ｕ／ｇ（乾燥質量）、残存活性率は８３．７％となった。
【００５１】
実施例及び比較例の結果を表１に示す。
【００５２】
【表１】
2019054738.tif 000002
【００５３】
表１より明らかなように、反応休止期間中に酵素の加水分解活性が低下するところ（比較例１）、実施例１〜３のように使用後の固定化酵素と油脂とを接触させて固定化酵素の水分活性を所定値以下に低下させることにより、酵素の加水分解活性の低下を抑えられた。これにより、固定化酵素を再使用する油脂の加水分解反応において、次の反応まで間隔が空いても脂肪酸類を生産性よく得られる。