(57)【要約】【課題】三次元組織体の表面のみならず、内部における細胞の収縮を高精度で、かつ容易に測定することができる粒子含有三次元組織体の提供。【解決手段】細胞接着性を有する基板に接着しており、かつ厚み方向の片側表面近傍及びその逆側表面近傍の少なくともいずれかと、厚み方向の中央近傍とに、少なくとも粒子を含有する粒子含有三次元組織体である。平均厚みが、３０μｍ以上である態様、平面視したときに、粒子の射影が互いに重ならない程度に、粒子の密度が十分疎である態様、前記細胞が、収縮能を有する態様などが好ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞接着性を有する基板に接着しており、かつ
厚み方向の片側表面近傍及びその逆側表面近傍の少なくともいずれかと、厚み方向の中央近傍とに、少なくとも粒子を含有することを特徴とする粒子含有三次元組織体。
【請求項２】
平均厚みが、３０μｍ以上である請求項１に記載の粒子含有三次元組織体。
【請求項３】
平面視したときに、粒子の射影が互いに重ならない程度に、粒子の密度が十分疎である請求項１から２のいずれかに記載の粒子含有三次元組織体。
【請求項４】
収縮能を有する請求項１から３のいずれかに記載の粒子含有三次元組織体。
【請求項５】
前記粒子が、表面に細胞接着性を有する成分を有する請求項１から４のいずれかに記載の粒子含有三次元組織体。
【請求項６】
前記粒子が、光学的計測手段を用いて検出可能である請求項１から５のいずれかに記載の粒子含有三次元組織体。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の粒子含有三次元組織体を、光干渉断層撮影装置を用いて測定し、前記粒子の変位量を算出する粒子変位量算出工程と、
前記粒子変位量算出工程により得られた粒子の変位量から前記細胞の収縮量を算出する細胞収縮量算出工程と、を含むことを特徴とする粒子含有三次元組織体の収縮計測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子含有三次元組織体、及び粒子含有三次元組織体の収縮計測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体外で細胞を扱う場合、細胞を平面的に扱うことが主流であった。
【０００３】
近年、三次元組織構築技術が発展し、生体外にて三次元組織体を人工的に作製することが可能となってきた。それら三次元組織体に関する研究の発展により、人工的に作製された三次元組織体の再生医療分野や創薬分野への応用が期待されている。
三次元組織体を再生医療や創薬分野で利用するためには、三次元組織体の品質を担保するために、品質を評価する技術が重要である。特に、作製した三次元組織体である心筋細胞や心筋細胞シートにおける評価としては、心筋細胞の拍動状態を、画像処理技術による評価、画像処理技術と染色技術とを組み合わせた評価電気刺激に対する拍動の応答による評価が行われている。
【０００４】
また、薬剤投与に対する心筋の拍動状態変化等を観察することにより、薬剤の生体への影響等を評価することを目指した様々な技術開発が行われている。これらの技術の中でも、三次元心筋組織体の収縮量評価技術が特に注目されている。細胞の収縮力を求める代表的な手法としては、（１）細胞の接着基板に粒子を含有させ、基板内の粒子の動きから収縮力を算出する方法、及び（２）細胞の膜表面に粒子を含有させ、表面の粒子の動きから収縮力を算出する方法が既に知られている。
【０００５】
しかし、（１）細胞の接着基板に粒子を含有させ、基板内の粒子の動きから収縮力を算出する方法では、測定サンプルは単層（二次元）を想定したものであった。そのため、本手法で多層（三次元）の測定を試みると、基板部の動きのみを捉えることとなり、三次元組織体本来の動きを捉えることができないという問題があった。また、（２）細胞の膜表面に粒子を含有させ、表面の粒子の動きから収縮力を算出する方法では、前記（１）と同様に、単層（二次元）を想定したものであったため、三次元組織の表層の動きのみしか捉えることができないという問題があった。
【０００６】
そこで、透明基板上に心筋細胞集団を配置し、心筋拍動細胞に与えた強制拍動刺激に対する心筋細胞の応答から心筋細胞の品質を評価する心毒性評価装置が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、三次元組織体の表面のみならず、内部における細胞の収縮を高精度で、かつ容易に測定することができる粒子含有三次元組織体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するための手段としての本発明の粒子含有三次元組織体は、細胞接着性を有する基板に接着しており、かつ厚み方向の片側表面近傍及びその逆側表面近傍の少なくともいずれかと、厚み方向の中央近傍とに、少なくとも粒子を含有する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、三次元組織体の表面のみならず、内部における細胞の収縮を高精度で、かつ容易に測定することができる粒子含有三次元組織体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の粒子含有三次元組織体の一例を示す模式図である。
【図２】図２は、組織体を測定する従来の方法の一例を示す模式図である。
【図３】図３は、組織体を測定する従来の方法の他の一例を示す模式図である。
【図４】図４は、粒子含有三次元組織体を、平面視したときの粒子含有三次元組織体の粒子を射影した一例を示す模式図である。
【図５】図５は、粒子含有三次元組織体の収縮計測方法の一例を示すブロック図である。
【図６Ａ】図６Ａは、本発明の粒子含有三次元組織体の収縮計測方法の一例を示す模式図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、時刻ｔ０における粒子含有三次元組織体中の粒子の位置を示す模式図である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、時刻ｔ１における粒子含有三次元組織体中の粒子の位置を示す模式図である。
【図６Ｄ】図６Ｄは、時刻ｔ０からｔ１への粒子の移動量を示す模式図である。
【図７】図７は、フーリエドメイン方式の粒子含有三次元組織体の収縮計測装置の一例を示す模式図である。
【図８】図８は、本発明の粒子含有三次元組織体の収縮計測方法により得られる相互相関関数の一例を表すグラフである。
【図９】図９は、一の断面と交差する方向における他の断面に係る断層画像の一例を示す模式図である。
【図１０】図１０は、実施例１における粒子含有三次元マウス心筋組織体の様子の一例を示す模式図である。
【図１１】図１１は、比較例１における三次元マウス心筋組織体の様子の一例を示す模式図である。
【図１２】図１２は、実施例２におけるｉＰＳ由来心筋細胞の様子の一例を示す模式図である。
【図１３】図１３は、実施例２におけるｉＰＳ由来心筋細胞の様子の他の一例を示す模式図である。
【図１４】図１４は、実施例３における粒子含有三次元組織体の様子の一例を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（粒子含有三次元組織体）
本発明の粒子含有三次元組織体は、細胞接着性を有する基板に接着しており、かつ厚み方向の片側表面近傍及びその逆側表面近傍の少なくともいずれかと、厚み方向の中央近傍とに、少なくとも粒子を含有し、更に必要に応じてその他の成分を含む。
本発明の粒子含有三次元組織体は、従来の心毒性評価装置では、二次元的な細胞の動きを捉えているに過ぎなく、三次元組織体本来の動きを捉えることができないという問題があるという知見に基づくものである。また、従来の技術では、三次元組織体を構成する細胞集団は屈折率が一様であるため、光を用いて観察する場合、組織体内部の動きを観察することが困難であるという問題があるという知見に基づくものである。
本発明の粒子含有三次元組織体は、三次元組織体の内部に粒子を含有させることにより、三次元組織体と光学特性の異なる粒子を三次元組織体内へ含有させることにより、入射光の屈折率を変化させることが可能になり、三次元組織体の深さ方向の収縮（変位、動き）を観察しやすくすることができる。また、三次元組織体の三次元的な動きを捉えることができるため、基板又は表面の接着の影響を受けずに組織体本来の収縮（変位、動き）を捉えることが可能になり、例えば、薬剤浸透や深さ方向に対する刺激への細胞応答などを観察することができる。
厚み方向とは、基板の底面に対して垂直な方向を意味する。
【００１２】
細胞集合体は、各部位における細胞が、同一の収縮（変位、動き）をしているわけではなく、細胞集合体の表層、内部、及び下層では異なる方向、かつ異なる収縮量で収縮（変位、動き）している。また、細胞集合体の同一の層中においても、異なる方向、かつ異なる収縮量で収縮している。細胞集合体の収縮を各部位ごとに正確に評価することにより、細胞集合体の機能、及び状態をより正確に把握することができるため、各部位における細胞の収縮を捉えることは重要である。
【００１３】
粒子含有三次元組織体とは、粒子を含有する三次元形状を有する組織体を意味する。
組織体とは、細胞同士がコネクソンやカドヘリン、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）等のタンパク質を介して結合した構造の単位であり、全体としてひとつのまとまった役割をもつ集合体を意味する。
【００１４】
図１は、本発明の粒子含有三次元組織体の一例を示す模式図である。図１に示すように、粒子含有三次元組織体２０は、細胞接着性を有する基板２１上に、細胞により形成される組織体２２が接着している。また、粒子含有三次元組織体２０は、必要に応じて、培地を含有してもよい。
組織体は、粒子２３を含有する。本実施例は、粒子含有三次元組織体２０は、厚み方向の片側表面近傍（例えば、Ｔ１）と、その逆側表面近傍（例えば、Ｔ３）と、厚み方向の中央近傍（例えば、Ｔ２）とに、粒子２３を含有する一例を示している。さらに本実施例では、溶媒（培地）２４をＴ３に載せた構成である。
本実施例では、Ｔ１〜Ｔ３のそれぞれに粒子２３を有する構成のため、後述する計測方法にて、片側表面近傍Ｔ１に含有する粒子２３の動きと、厚み方向の中央近傍Ｔ２に含有する粒子２３の動きを比較することにより、前者（Ｔ１）が後者（Ｔ２）よりも変位が小さいことを確認することが可能である。これは、組織体のＴ１がＴ２よりも固定壁（基板）の影響を受け、本来の組織体変位が示されていないと推測される。
また、逆側表面近傍Ｔ３に含有する粒子２３の動きと、厚み方向の中央近傍Ｔ２に含有する粒子２３の動きを比較することにより、前者（Ｔ３）が後者（Ｔ２）よりも変位が小さいことを確認することが可能である。これは、組織体のＴ３が、近接する溶媒（培地）２４の粘性の影響を受ける結果、本来の組織体変位が示されていないと推測される。
本実施例では、Ｔ１やＴ３といった表面近傍の粒子だけでなく、厚み方向の中央近傍Ｔ２にも粒子２３を含有するため、表面の影響を受けていない組織体変位をも確認することができる。つまり、後述の計測方法にて、正確な拍動力を知ることができる。
厚み方向の片側表面近傍とは、厚み方向における表面に近い範囲を意味する。
逆側表面近傍とは、片側表面近傍とは反対側の表面に近い範囲を意味する。
厚み方向の中央近傍とは、厚み方向における中央に近い範囲を意味する。
【００１５】
図２は、組織体を測定する従来の方法の一例を示す模式図である。図３は、組織体を測定する従来の方法の他の一例を示す模式図である。
図２に示すように、組織体を測定する従来の方法では、基板３１上に、粒子３３を含むコーティング層３４を有し、コーティング層３４上に、組織体３２を有する三次元細胞体３０を使用する。コーティング層３４に含まれる粒子３３の動きを観察することにより、組織体３２の拍動（動き）を測定している。しかし、この方法では、コーティング層３４に接着している組織体の拍動（動き）しか測定することができず、組織体の表面、及び内部の三次元的な動きを測定することはできない。
また、図３に示すように、組織体を測定する他の従来の方法では、基板４１上の組織体４２表面に粒子４３を有する粒子含有三次元組織体４０を使用する。組織体４２表面の粒子の動きを観察することにより、組織体４２の拍動（動き）を測定している。しかし、この方法では、組織体４２の表面の拍動（動き）しか測定することができず、組織体内部、及び底部の拍動（動き）を測定することはできない。
一方、上記した粒子含有三次元組織体２０の構成を用いて、後述する計測方法で計測することにより、組織体内部の動きをも測定することが可能である。
【００１６】
粒子含有三次元組織体の平均厚みとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３０μｍ以上が好ましく、５０μｍ以上がより好ましく、１００μｍ以上が特に好ましい。平均厚みが、３０μｍ以上であると、薬剤の浸透等、深さ方向の刺激に対する応答を検出することができる。厚みは、非侵襲的な観察手法として光干渉断層撮影（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）を用いる方法や、侵襲的な観察手法として作製組織体の切片を作製して光学顕微鏡にて厚みを測定することができる。平均厚みは、粒子含有三次元組織体の任意の５箇所の厚みの平均値から求めることができる。
【００１７】
粒子含有三次元組織体としては、平面視したときに、粒子の射影が互いに重ならない程度に、粒子の密度が十分疎であることが好ましい。平面視したときに、粒子の射影が互いに重ならない程度に、粒子の密度が十分疎であることにより、粒子は光の入射光に対して重ならず、後述する計測方法によって、より組織体の動きを容易に検出することができる。
【００１８】
図４は、粒子含有三次元組織体を、平面視したときの粒子含有三次元組織体の粒子を射影した一例を示す模式図である。図４に示すように、平面視したときの粒子含有三次元組織体の粒子５３は、粒子の密度が十分疎であることから各々単一の粒子として視認することができ、また粒子５３同士の距離は十分離れているため、組織体の挙動によって粒子５３が移動した場合でも、各々が重なることはなく、十分単一粒子として視認し続けられ、後述の計測方法によって、粒子５３の挙動が捉らえられ、延いては正確な拍動力を知ることができる。
【００１９】
＜粒子＞
粒子は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、細胞へ悪影響を与えず、かつ細胞の収縮（動き）を阻害しないことが好ましい。
【００２０】
粒子の体積平均粒径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１μｍ以上５０μｍ以下が好ましく、２μｍ以上２０μｍ以下がより好ましく、５μｍ以上１５μｍ以下がさらに好ましく、７μｍ以上１０μｍ以下が特に好ましい。
【００２１】
粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、組織体と光学特性の異なる粒子が好ましい。
組織体と光学特性の異なる粒子としては、例えば、ポリスチレン粒子、ガラス粒子、金粒子、銀粒子、アルミナ粒子などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、ポリスチレン粒子が好ましい。
また、粒径や光学特性について異なる粒子を、厚み方向で見て各層（例えば、厚み方向の片側表面近傍（上層）と厚み方向の中央近傍（中層））にそれぞれ配置してもよい。
【００２２】
粒子としては、表面に細胞接着性を有する成分を有することが好ましい。
細胞接着性を有する成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、フィブリノーゲン、ラミニン、ビトロネクチンなどが挙げられる。
【００２３】
粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、光学的計測手段を用いて検出可能であることが好ましい。
光学的計測手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、モアレ干渉法を用いた手段、スペックル干渉法を用いた手段、ホログラフィ法を用いた手段、デジタル画像相関法を用いた手段などが挙げられる。これらの中でも、スペックル干渉法を用いた手段が好ましい。
スペックル干渉法を用いた手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、位相差顕微鏡、光干渉断層撮影（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ＯＣＴ）装置などが挙げられる。これらの中でも、光干渉断層撮影装置が好ましい。
【００２４】
粒子の含有量としては、粒子含有三次元組織体全量に対して、１質量％以上５０質量％以下が好ましく、１質量％以上３０質量％以下がより好ましく、５質量％以上２０質量％以下が特に好ましい。含有量が、１質量％以上であると、組織体の拍動（動き）を正確に測定することができ、５０質量％以下であると、粒子が組織体の接着、及び伸展を阻害しない。
また、粒子含有三次元組織体の、厚み方向の片側表面近傍、その逆側表面近傍、及び厚み方向の中央近傍の各単位における粒子の含有量としては、１質量％以上５０質量％以下が好ましく、１質量％以上３０質量％以下がより好ましく、５質量％以上２０質量％以下が特に好ましい。含有量が、１質量％以上であると、組織体の拍動（動き）を正確に測定することができ、５０質量％以下であると、粒子が組織体の接着、及び伸展を阻害しない。
【００２５】
＜組織体を構成する細胞＞
組織体を構成する細胞としては、組織を形成する多細胞生物の細胞であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、動物細胞、植物細胞などが挙げられる。
【００２６】
組織体を構成する細胞としては、収縮能を有する細胞が好ましく、拍動能を有する心筋細胞がより好ましく、外因的な刺激に対する収縮力の測定を行う際は心筋細胞である必要はなく、三次元組織体を形成可能な細胞を用いることもできる。
【００２７】
拍動能を有する心筋細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｉＰＳ由来心筋細胞、マウス心筋細胞、ラット心筋細胞などが挙げられる。
三次元組織体を形成可能な細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｉＰＳ細胞、ｉＰＳ細胞由来各種分化細胞、各種線維芽細胞などが挙げられる。
【００２８】
組織体を構成する細胞の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０１×１０４個／ｃｍ２〜１００×１０４個／ｃｍ２が好ましい。
【００２９】
＜細胞接着性を有する基板（培養容器）＞
細胞接着性を有する基板（培養容器）は、細胞接着性を有すれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞接着性を有する容器、基板のコーティング層として接着性タンパク質により細胞接着性を付与できる容器などが挙げられる。
細胞接着性を有する容器としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、表面処理済みプラスチックディッシュなどが挙げられる。
接着性タンパク質により細胞接着性を付与できる容器としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガラスボトムディッシュなどが挙げられる。
接着性タンパク質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、フィブリノーゲン、ラミニン、ビトロネクチンなどが挙げられる。
培養容器の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平面形状のみならず、穴が開いた形状、メッシュ状、凹凸のある形状、ハニカム形状などが挙げられる。これらの中でも、平面形状が好ましい。
培養容器の材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガラス、各種ポリマーからなるプラスチック、濾紙、金属、ハイドロゲルなどが挙げられる。
培養容器としては、非孔質基材、多孔質基材、ファイバー、織布や不織布等の布や、例えば、ハイドロゲル表面、医療用材料表面、人工臓器表面、細胞膜のようなリン脂質膜等の上にも形成することができる。
【００３０】
培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＤＭＩ、ＧｌｕｔａＭａｘ培地、無血清培地などが挙げられる。
【００３１】
［粒子含有三次元組織体の作製方法］
粒子を含むエッペンチューブに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）へ懸濁させた細胞を加え、粒子含有細胞懸濁液を得る。その後、コーティング処理した基材に、粒子含有細胞懸濁液を付与して、粒子含有三次元組織体を得ることができる。
また、コーティング層を有する基板に液滴形成装置（例えば、自社開発装置）を用いて、細胞を吐出する。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に粒子を含有する粒子含有液を、液滴形成装置（例えば、自社開発装置）を用いて細胞上に吐出する。次に、所定の時間経過後に、本工程を繰り返し行うことにより、粒子含有三次元組織体内部の任意箇所へポリスチレン粒子を配置した粒子含有三次元組織体を得ることができる。
所定の時間としては、２時間〜４８時間が好ましく、３時間〜４時間がより好ましい。所定の時間が、２時間〜４８時間であると、細胞同士がある程度隙間なく詰まるため、粒子の沈降を防ぐことができる。
【００３２】
粒子含有三次元組織体としては、細胞及び粒子をインクジェット法を用いて吐出して三次元組織体を作製することが好ましい。インクジェット法を用いることにより、三次元組織体の収縮量（移動量）を算出するための光学的計測手段の測定面に対して角度を付けて、三次元組織体中に粒子を精密に配置する（重ならないように配置する）ことができる。
【００３３】
（粒子含有三次元組織体の収縮計測方法、及び粒子含有三次元組織体の収縮計測装置）
本発明の粒子含有三次元組織体の収縮計測方法は、本発明の粒子含有三次元組織体を、光干渉断層撮影装置を用いて測定し、前記粒子の変位量を算出する粒子変位量算出工程と、前記粒子変位量算出工程により得られた粒子の変位量から前記細胞の収縮量を算出する細胞収縮量算出工程と、を含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
粒子含有三次元組織体の収縮計測装置は、本発明の粒子含有三次元組織体を、光干渉断層撮影装置を用いて測定し、前記粒子の変位量を算出する粒子変位量算出手段と、前記粒子変位量算出手段により得られた粒子の変位量から前記細胞の収縮量を算出する細胞収縮量算出手段と、を有し、更に必要に応じてその他の手段を有する。
粒子含有三次元組織体の収縮計測方法は、粒子含有三次元組織体の収縮計測装置により好適に実施することができる。
【００３４】
図５は、粒子含有三次元組織体の収縮計測方法の一例を示すブロック図である。図５に示すように、粒子含有三次元組織体の収縮計測方法は、まず、単離した心筋細胞（単離心筋細胞）に、粒子を添加して、心筋細胞懸濁液を得る。得られた心筋細胞懸濁液を細胞接着性を有する基板に播種し、粒子含有三次元組織体を得る。次に、拍動が開始するまで培養する。次に、光干渉断層撮影装置を用いて、拍動（粒子）を観察し、粒子移動量を解析する。光干渉断層装置により取得された画像を用いて、三次元心筋組織体内へ含有された各粒子の単位時間当たりの移動量を画像解析（例えば、ソフトウェア名：ＩｍａｇｅＪ）にて導出する。次に、細胞の物性値（ばね定数：１００ｍＮ／ｍ）を用いて、フックの法則を基にした下記計算式より算出された粒子含有三次元組織体の収縮力を求めることができる。なお、画像解析は、ＩｍａｇｅＪを用いることができる。
Ｆ＝Ｇ×Ｌ  ・・・  式
なお、式中、Ｆは、収縮力を表し、Ｇは、ばね定数を表し、Ｌは、粒子移動量を表す。
【００３５】
組織体の培養としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜、培養温度、培養時間などを選択することができる。
培養温度としては、４℃〜６０℃が好ましく、２０℃〜４０℃がより好ましく、３０℃〜３７℃が特に好ましい。
培養時間としては、１時間〜２４０時間が好ましく、７２時間〜１２０時間がより好ましく、９６時間〜１２０時間が特に好ましい。培養時間が、１時間〜２４０時間であると、細胞間の結合状態が安定化する。
【００３６】
＜粒子変位量算出工程、及び粒子変位量算出手段＞
粒子変位量算出工程は、後方散乱光情報取得処理を含み、更に必要に応じてその他の処理を含む。
粒子変位量算出手段は、後方散乱光情報取得部を有し、更に必要に応じてその他の部材を有する。
粒子変位量算出工程は、粒子変位量算出手段により好適に実施することができる。
【００３７】
＜＜後方散乱光情報取得処理、及び後方散乱光情報取得部＞＞
後方散乱光情報取得処理は、粒子含有三次元組織体に対して、少なくとも２つの異なる時刻において、光を照射して粒子含有三次元組織体からの後方散乱光の情報を取得する処理である。
後方散乱光情報取得部は、粒子含有三次元組織体に対して、少なくとも２つの異なる時刻において、光を照射して粒子含有三次元組織体からの後方散乱光の情報を取得する部材である。
後方散乱光情報取得部とは、後方散乱光の情報を取得するための部材を意味する。
なお、光の情報とは、例えば、光の強度を意味し、分光検出器においては、周波数毎の光の強度情報である。
【００３８】
少なくとも２つの異なる時刻としては、例えば、時系列で時刻Δｔ〜ｎΔｔのｎ時の時点における時刻などが挙げられる。少なくとも２つの異なる時刻としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、多いほうが、粒子含有三次元組織体の変位量をより詳細に評価することができるため好ましい。時刻Δｔ〜ｎΔｔにおいて、複数の後方散乱光の情報を取得することにより、粒子含有三次元組織体の収縮量をより詳細に算出することができる。
【００３９】
また、粒子含有三次元組織体に光を照射する領域としては、特に制限されず、目的に応じて適宜選択でき、例えば、特定の一部分のみの粒子含有三次元組織体の状態を評価したい場合は、当該一部領域のみに光を照射すればよく、粒子含有三次元組織体全体の状態を評価したい場合は、粒子含有三次元組織体全体に光を照射すればよい。
【００４０】
図６Ａは、本発明の粒子含有三次元組織体の収縮計測方法の一例を示す模式図である。図６Ｂは、時刻ｔ０における粒子含有三次元組織体中の粒子の位置を示す模式図である。図６Ｃは、時刻ｔ１における粒子含有三次元組織体中の粒子の位置を示す模式図である。図６Ｄは、時刻ｔ０からｔ１への粒子の移動量を示す模式図である。
図６Ａに示すように、粒子含有三次元組織体９０は、基材（培養容器）９１に、必要に応じてコーティング層としてコラーゲンゲル９４を有し、コラーゲンゲル９４上に粒子９３を含有する組織体９２を有する。組織体９２は、必要に応じて適宜、培地９５に浸漬していてもよい。粒子含有三次元組織体９０を粒子含有三次元組織体の収縮計測装置１００を用いて測定することにより時刻Δｔ〜ｎΔｔにおける粒子の位置を算出することができる。図６Ｂに示すように、時刻ｔ０における粒子含有三次元組織体中の粒子９３の位置に対して、図６Ｃに示すように、時刻ｔ１における粒子含有三次元組織体中の粒子９３’の位置は組織体９２の変位に伴い、変位（移動）する。
図６Ｄに示すように、図６Ｂに示す時刻ｔ０における粒子含有三次元組織体中の粒子９３の位置（Ｘ０）と、図６Ｃに示す時刻ｔ１における粒子含有三次元組織体中の粒子９３’の位置（Ｘ１）とから、下記式（１）に示すように粒子移動量を算出することができる。また、下記式（２）に示すように移動速度を算出することができる。
粒子移動量＝Ｘ１−Ｘ０  ・・・  式（１）
移動速度＝（Ｘ１−Ｘ０）×（ｔ１−ｔ０）  ・・・  式（２）
【００４１】
後方散乱光情報取得処理、及び後方散乱光情報取得部において、粒子含有三次元組織体に対して光を照射する際、照射する光を測定光と参照光とに分割し、測定光を粒子含有三次元組織体に照射して粒子含有三次元組織体からの後方散乱光の情報を得ると共に、後方散乱光と参照光との干渉光の情報を取得することが好ましい。
光としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、光干渉断層撮影を行う際には様々な波長を有するインコヒーレント光などが挙げられる。
分割とは、照射する光を測定光と参照光とに分けることを意味する。
光としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、９００ｎｍ、９３０ｎｍ、１，３００ｎｍ、又は１，３２５ｎｍの中心波長で動作するスーパールミネッセンスダイオード、中心波長１，０６０ｎｍ、１，３１０ｎｍ、又は１，５５０ｎｍで動作する波長掃引型のレーザーなどが挙げられる。
照射とは、所定の位置に一定時間留まって光が射出されている状態を意味する。
後方散乱光とは、光ファイバー中で前進する光に対して後方に反射して戻る光を意味する。
測定光とは、粒子含有三次元組織体を測定するための光を意味する。
参照光とは、光束を２つに分割し、一方の波面（光路）に対して、他方の波面（光路）がどれだけ違っているかを調べるための基準となる波面を意味する。
干渉光とは、後方散乱光と参照光との重畳光を意味する。
【００４２】
後方散乱光の取得としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、光干渉断層撮影（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ＯＣＴ）装置を用いることができる。
光干渉断層撮影（ＯＣＴ）装置は、非侵襲、及び非接触にて測定できることから、眼科における生体組織の高解像度な断層画像を取得する方法として広く使用されている。
光干渉断層撮影においては、一次元の深さ方向の測定データをＡスキャンデータ、二次元画像をＢスキャン像、及び三次元画像をＣスキャン像と呼ぶ。
【００４３】
光干渉断層撮影（ＯＣＴ）装置においては、例えば、タイムドメイン方式、フーリエドメイン方式などが挙げられる。これらの中でも、フーリエドメイン方式が好ましい。
タイムドメイン方式としては、例えば、タイムドメインＯＣＴなどが挙げられる。
フーリエドメイン方式としては、例えば、スペクトルドメインＯＣＴ、光周波数掃引ＯＣＴなどが挙げられる。
タイムドメインＯＣＴとしては、ミラーを動かして参照光の光路長を機械的に変化させながら参照光を得、参照光と後方散乱光を重畳して干渉光の情報を得て断層画像取得を行う。
スペクトルドメインＯＣＴとしては、分光・検出器を用いてスペクトル情報を検出して断層画像取得を行う。
光周波数掃引ＯＣＴとしては、波長走査光源を用いてスペクトル干渉信号を検出して断層画像取得を行う。
干渉信号とは、周波数と時間との要素を持つ三次元的な情報を意味する。
断層画像とは、任意の断面層だけを明瞭に撮影した画像を意味する。
【００４４】
フーリエドメイン方式のＯＣＴとしては、取得するスペクトル干渉信号をフーリエ変換して深さ情報（透過光又は反射光の強度信号）を得るため、タイムドメイン方式のようにＯＣＴ撮影時にはミラーを動かして参照光の光路長変化する（これを通常Ａスキャンという）操作を必要としない。これにより、タイムドメイン方式のＯＣＴに比べて格段に速い速度で断層画像を取得することができる。そのため、近年は、主に、フーリエドメイン方式のＯＣＴが採用されるようになっている。
【００４５】
図７は、フーリエドメイン方式の粒子含有三次元組織体の収縮計測装置の一例を示す模式図である。図７に示すように、フーリエドメイン方式のＯＣＴの原理に従った粒子含有三次元組織体の収縮計測装置１００は、光線束１０２を生成する光源１０１と、マイケルソン干渉計装置と、レンズによって絞られた測定光１０６を、粒子含有三次元組織体内を空間的に走査するためのビーム偏向装置１５０と、測定光１０６を、調査する三次元形状を有する粒子含有三次元組織体１４０に向け照射し、測定光１０６を集光するレンズ１６０と、を有する。
測定光１０６は、粒子含有三次元組織体に照射されると、多重散乱光１１１、多重前方散乱光１１３、後方散乱光１１２に分かれる。
マイケルソン干渉計装置は、光線束１０２のビームを、参照光１０４と、測定光１０６と、に分離することができる。さらに、マイケルソン干渉計装置は、ミラー１３０により逆方向に偏向された参照光１０４と、レンズ１６０を通して反射波面１２８を形成する粒子含有三次元組織体から反射する後方散乱光１１２と、を重ね合わせて干渉光（重畳光）１０８を形成する装置（ビームスプリッタ）１２０を有する。
粒子含有三次元組織体の収縮計測装置１００は、さらに回折格子とアレイディテクタからなる分光器１７０を有し、参照光１０４と粒子含有三次元組織体１４０で反射して戻ってきた後方散乱光１１２を合波して形成された干渉波面１１８を形成する干渉光１０８を干渉信号として検出し、得られた分光スペクトルをフーリエ変換することにより粒子含有三次元組織体１４０の深さ情報を得ることができる。
【００４６】
光干渉断層撮影（ＯＣＴ）における奥行き分解能としては、光の時間遅延の測定分解能によって決まる。
低コヒーレンス干渉における奥行き分解能としては、光の電界の自己相関関数の幅によって与えられる。自己相関関数は、光源の波長スペクトル幅の逆数に比例する。ガウス型のスペクトルの場合、奥行き分解能は、下記式（３）によって求めることができる（空気中）。
【００４７】
【数１】
2019054781.tif 000003
式（３）中、Δｚは自己相関関数の半値全幅を表し、Δλは波長パワースペクトルの半値全幅を表し、λｃは光源の中心波長を表す。
【００４８】
横方向の分解能としては、使用するレンズの開口数（ＮＡ）と、光源の中心波長（λ）で決まり、レンズで集光した際のスポットサイズＷ０は、下記式（４）によって求めることができる（空気中）。
【００４９】
【数２】
2019054781.tif 000004
粒子含有三次元組織体１４０に、照射された測定光１０６は、粒子含有三次元組織体１４０内で、多重散乱光１１１や、多重前方散乱光１１３、多重後方散乱光、単一前方散乱光、後方散乱光１１２などにより、波面が乱れた状態で反射される。反射された後方散乱光１１２と、参照光１０４とを合波して得られた干渉信号はスペックル画像となって検出される。このスペックル画像は、粒子含有三次元組織体などが変位することにより、前記スペックル画像も粒子含有三次元組織体の収縮（変位）に応じて収縮（変位、移動）する。
【００５０】
光源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、波長９３０ｎｍのスーパールミネッセンスダイオードなどが挙げられる。
【００５１】
少なくとも異なる２つの時刻としては、粒子含有三次元組織体に対して試薬を投与する前後の時刻であることが好ましい。粒子含有三次元組織体に対して試薬を投与する前後の時刻で、断層画像を取得することにより、三次元形状を有する粒子含有三次元組織体の動きの評価結果に基づいて、薬剤が三次元形状を有する粒子含有三次元組織体に与える影響を評価することができる。
試薬を投与する前後の時刻とは、試薬を投与する前の時刻、及び試薬を投与した後の時刻を意味する。
試薬を投与した後の時刻としては、投与直後であってもよく、刺激による反応が落ち着いた時刻であってもよい。
【００５２】
試薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬効の評価を行う試薬、毒性の評価を行う試薬などが挙げられる。
【００５３】
薬効の評価を行う試薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、オキサゾロン、ベンゾキノン、２，４−ジニトロコロベンジン、４−フェニレンジアミン、グルタルアルデヒド、ベンゾイルペルオキシド、４−メチルアミノフェノール硫酸塩、ホルムアルデヒド、シンナムアルデヒド、エチレンジアミン、アクリル酸２−ヒドロキシエチル、イソオイゲノール、硫酸ニッケル（ＩＩ）、ベンジリデンアセトン、２−ノニン酸メチル、サリチル酸ベンジル、ジエチレントリアミン、チオグリセロール、２−メルカプトベンゾチアゾール、フェニルアセトアルデヒド、ヘキシルシンナムアルデヒド、ジヒドロオイゲノール、ベンゾイソチアゾリオーネ、シトラール、レゾルシノール、安息香酸フェニル、オイゲノール、アビエチン酸、アミノ安息香酸エチル、ベンジルシンナメート、シンナミルアルコール、ヒドロキシシトロネラール、イミダゾリジニル尿素、ブチルグリシジルエーテル、エチレングリコールジメタクリラート、グリオキサール、４−ニトロベンジルブロミドなどが挙げられる。
毒性の評価を行う試薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化亜鉛、１−ブタノール、安息香酸、エチルバニリン、４−ヒドロキシ安息香酸、スルファニル酸、酒石酸、サリチル酸メチル、サリチル酸、ラウリル硫酸ナトリウム、乳酸、ベンジルアルコール、デキストラン、ジエチルフタレート、グリセロール、プロピルパラベン、Ｔｗｅｅｎ８０、ジメチルイソフタレート、フェノール、クロロベンゼン、スルファニルアミド、オクタン酸などが挙げられる。
【００５４】
＜細胞収縮量算出工程、及び細胞収縮量算出手段＞
細胞収縮量算出工程は、粒子変位量算出工程により得られた粒子の変位量から細胞の収縮量を算出する工程である。
細胞収縮量算出手段は、粒子変位量算出手段により得られた粒子の変位量から細胞の収縮量を算出する手段である。
細胞収縮量算出工程は、細胞収縮量算出手段により好適に実施することができる。
【００５５】
細胞収縮量算出工程は、少なくとも２つの異なる時刻における後方散乱光の情報に基づき、粒子含有三次元組織体の収縮量を算出する工程である。
細胞収縮量算出手段は、少なくとも２つの異なる時刻における後方散乱光の情報に基づき、粒子含有三次元組織体の収縮量を算出する手段である。
細胞収縮量算出工程は、細胞収縮量算出手段を用いて好適に実施することができる。
【００５６】
細胞収縮量算出工程、及び細胞収縮量算出手段は、干渉光に基づく干渉信号から断層画像を得て、少なくとも２つの異なる時刻における、複数の断層画像を比較して粒子含有三次元組織体の収縮量を算出することが好ましい。
複数の断層画像を比較とは、複数の断層画像を用いて、断層画像どうしを比べることを意味する。
収縮量を算出するとは、粒子含有三次元組織体の収縮を見定めることを意味する。
細胞収縮量算出手段とは、細胞の収縮量を算出するための手段を意味する。
【００５７】
細胞収縮量算出工程、及び細胞収縮量算出手段において、断層画像が、複数の画素により表された三次元形状を有する粒子含有三次元組織体のスペックルパターンの撮像（以下、「スペックル画像」とも称することがある）であり、複数の断層画像の比較が、複数のスペックル画像どうしの相互相関関数（以下、「相関パターン」とも称することがある）を算出することにより行われることが好ましい。
複数の画素とは、元の画像から相関を計算する領域を切り出した部分の画素を意味する。
また、細胞収縮量算出工程、及び細胞収縮量算出手段において、複数のスペックル画像どうしの相互相関関数の算出が、前記スペックル画像における特定画素毎に行われることが好ましい。
相互相関関数の算出とは、信号を一定時間ずらしたときに、元の信号とどの程度関係があるかを計算して結果の値を出すことを意味する。
特定画素毎に行われるとは、特定の画素において行うことを意味する。
【００５８】
スペックル画像を連続するフレーム間で相関演算して、スペックル画像のパターンの経時的変化から、粒子含有三次元組織体の変位（移動）を求めることができる。なお、求められた変位を積算することにより総変位を求めることができる。また、求められた変位をフレームレートで割ることにより粒子含有三次元組織体の収縮（変位、移動）の収縮（移動）速度及び加速度を求めることができる。時刻ｔ＝ｎΔｔに測定したスペックルパターンの撮像結果（以下、「画像パターン」とも称することがある）をｆ（ｎ）（＝ｆ（ｎ）ｉｊ）と表記する。ただし、添え字ｉ，ｊは、それぞれ、検出したスペックル画像の画素の位置を表す。例えば、ｆ（３）２３は、時刻ｔ＝３Δｔにおいて、ｉ方向に２つ目、その直交方向であるｊ方向に３つ目の画素の画素値を意味する。なお、特に断らない限り、画像パターンをｆ（ｎ）と表記する。特定の画素ｉ，ｊの画素値を意味する場合、画像パターンをｆ（ｎ）ｉｊと表記する。
画像パターンｆ（ｎ）を受信すると、その画像パターンｆ（ｎ）とその前に受信した画像パターンｆ（ｎ−１）とを用いて、下記式（５）から相互相関関数を求める。
ｆ（ｎ）★ｆ（ｎ−１）≡Ｆ−１［ＬＣＦ［ｆ（ｎ）］Ｆ［ｆ（ｎ−１）］＊］  ・・・式（５）
ただし、記号“★”は相互相関演算子、関数ＬＣは低周波数除去パターン、関数Ｆ［ｆ］は関数ｆの離散フーリエ変換、関数Ｆ−１［ｆ］は関数ｆの逆離散フーリエ変換、記号Ｆ＊はＦの複素共役である。式（５）によれば、離散フーリエ変換を用いることで相互相関関数の高速演算が可能になる。
【００５９】
低周波数除去パターンとしては、１２８×３２画素のうちの中心画素及びその周囲の３×３画素の画素値をゼロ、その他の画素値を１とするパターンである。式（５）において、低周波数除去パターンＬＣとの積を取ることにより、画像パターンの背景除去処理が施される。なお、低周波数除去パターンＬＣは、予め実験等により、背景分布（バックグラウンド）を良好に除去できるように定めることとする。これにより、粒子含有三次元組織体の収縮（変位）を高精度で求めることができる。
【００６０】
図８は、本発明の粒子含有三次元組織体の収縮計測方法により得られる相互相関関数の一例を表すグラフである。低周波除去を行わない相関パターンでは、緩やかな山状の分布の中にスペックルパターンに由来する鋭いピークの先端が僅かに現れるにすぎないが、これに対して、図８に示すように、相関パターンでは、緩やかな山状の分布は現れず、振幅の小さいノイズの中にスペックルパターンに由来する鋭いピークのほぼ全体が現れている。このように、画像パターンの背景除去処理を施すことにより、相関パターンにおいて背景分布（バックグラウンド）が除去されてスペックルパターンに由来するピークがはっきりと現れ、その結果、ピークの位置を高精度で求めることができる。
【００６１】
相互相関関数を解析して前記複数の画素のピッチ単位の第１変位と、前記ピッチ単位以下の第２変位と、を求めることにより、前記異なる時刻間の粒子含有三次元組織体の変位を求めることができる。変位は、スペックルパターンに由来する最大の画素値を有する画素の位置（ピーク位置）からピクセルピッチ単位により求めることができる。さらに、ピクセルピッチ以下の変位は、次のサブピクセル処理により求めることができる。これらＯＣＴ画像の画素ピッチを加味することにより、三次元形状を有する粒子含有三次元組織体の変位を求めることができる。
【００６２】
サブピクセル処理では、折れ線近似（一次と零次の二項式近似）、放物線近似（二次と零次の二項式近似）、折れ線と放物線の和による近似（二次から零次の三項式近似）等を適用して相互相関関数ｆ（ｎ）★ｆ（ｎ−１）を補間することにより、ピクセルピッチ以下の変位を求める。ここで、相互相関関数ｆ（ｎ）★ｆ（ｎ−１）のうちの最大の画素値Ｐ（０）を有する画素ｉ０とし、画素ｉ０からｍ隣の画素ｉ＝ｉ０＋ｍの画素値をＰ（ｍ（＝ｉ−ｉ０））とする。折れ線近似では、Ｐ（０）近傍で画素値を一次と零次の二項式を用いてＰ（ｉ−ｉ０）＝ａ｜ｉ−ｉ０｜＋Ｐ０と近似する。それにより、ピクセルピッチ以下の変位ｘは、下記式（６ａ）、又は下記式（６ｂ）により求めることができる。
ｘ＝｛Ｐ（−１）−Ｐ（１）｝／｛２Ｐ（−１）−２Ｐ（０）｝  ・・・  式（６ａ）
ただし、式（６ａ）において、Ｐ（−１）≧Ｐ（１）である。
ｘ＝−｛Ｐ（１）−Ｐ（−１）｝／｛２Ｐ（１）−２Ｐ（０）｝  ・・・  式（６ｂ）
ただし、前記式（６ｂ）において、Ｐ（−１）＜Ｐ（１）である。
【００６３】
放物線近似では、Ｐ（０）近傍で画素値を二次と零次の二項式を用いて、Ｐ（ｉ−ｉ０）＝ｂ（ｉ−ｉ０）２＋Ｐ０と近似する。それにより、変位ｘは、下記式（７）により求めることができる。
ｘ＝−｛Ｐ（１）−Ｐ（−１）｝／｛２Ｐ（−１）−４Ｐ（０）＋２Ｐ（１）｝  ・・・  式（７）
【００６４】
折れ線と放物線の和による近似では、Ｐ（０）近傍で画素値を２次多項式を用いてＰ（ｉ−ｉ０）＝ｂ（ｉ−ｉ０）２＋ａ｜ｉ−ｉ０｜＋Ｐ０と近似する。それにより、変位ｘは、下記式（８ａ）、又は下記式（８ｂ）により求めることができる。
ｘ＝｛Ｐ（−１）−Ｐ（１）｝／｛Ｐ（−１）−Ｐ（０）−Ｐ（１）＋Ｐ（２）｝  ・・・  式（８ａ）
ただし、式（８ａ）において、Ｐ（−１）≧Ｐ（１）である。
ｘ＝｛Ｐ（１）−Ｐ（−１）｝／｛Ｐ（−２）−Ｐ（−１）−Ｐ（０）＋Ｐ（１）｝  ・・・  式（８ｂ）
ただし、前記式（８ｂ）において、Ｐ（−１）＜Ｐ（１）である。
【００６５】
求めた変位を積算することにより、三次元形状を有する粒子含有三次元組織体の総変位を求めることができる。なお、本実施形態では、サブピクセル処理において折れ線と放物線との和による近似を採用して相互相関関数を補間することとしたが、三次多項式等、より高次の近似を採用して補間することとしてもよい。
【００６６】
本発明の粒子含有三次元組織体の収縮計測方法では、細胞収縮量算出工程において、各時刻ｎΔｔのスペックル画像を、複数画素で構成される複数の区画画像に区画化し、各区画画像に対して、変位値ｘを算出することが好ましい。この場合、各区画画像に対して、相互相関関数、変位量、及び速さを算出して、これらのパラメータの二次元マッピング画像を得て、三次元形状を有する粒子含有三次元組織体の動きを評価することになる。
【００６７】
細胞収縮量としては、光干渉断層装置により取得された画像を用いて、三次元心筋組織体内へ含有された各粒子の単位時間当たりの移動量を画像解析（ソフトウェア名：ＩｍａｇｅＪ製）にて導出し、細胞の物性値（ばね定数：１００ｍＮ／ｍ）を用いて、フックの法則を基にした下記計算式より算出された粒子含有三次元組織体の収縮力を求めることができる。なお、画像解析は、ＩｍａｇｅＪを用いることができる。
Ｆ＝Ｇ×Ｌ  ・・・  式
なお、式中、Ｆは、収縮力を表し、Ｇは、ばね定数を表し、Ｌは、粒子移動量を表す。
【００６８】
細胞収縮量算出工程、及び細胞収縮量算出手段において、複数の断層画像の比較が、粒子含有三次元組織体における、一の断面に係る断層画像について行われるだけでなく、一の断面と交差する方向における他の断面に係る断層画像についても行われることが好ましい。
図９は、一の断面と交差する方向における他の断面に係る断層画像の一例を示す模式図である。図９に示すように、粒子含有三次元組織体３００において、一の断面と交差する方向における他の断面の断層画像３０１においても収縮評価を行うことにより、粒子含有三次元組織体の収縮をより詳細に測定することができる。
一の断面と交差する方向における他の断面とは、一の断面と一部が交差し、かつ一の断面とは平面方向に対して異なる断面であることを意味する。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例により限定されるものではない。
【００７０】
（粒子含有三次元組織体の平均厚み）
粒子含有三次元組織体の厚みは、光干渉断層撮影（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ＯＣＴ）装置を用いて５点を測定した。５点の平均値を算出し、平均厚みとした。
【００７１】
（実施例１）
マウス胎児の心臓から大部分の非心筋細胞を取り除いた細胞群を凍結保存した心筋細胞を使用する心筋細胞培養キット（商品名：Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｋｉｔ（Ｍｏｕｓｅ、Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  Ｃｅｌｌ）、コスモ・バイオ株式会社製）を用いた。まず、三次元心筋組織体の拍動をより正確に捉えるために、コラーゲンゲル（商品名：ＴｙｐｅＩ−Ａ  ／Ｃｅｌｌ  ｍａｔｒｉｘ、倉敷紡績株式会社製）を手順書に従い、平均厚みが５００μｍになるように作製し、２４ウェル培養プレート（商品名：ＭＩＣＲＯ  ＰＬＡＴＥ  ２４Ｗｅｌｌ、ＡＧＣテクノグラス株式会社製）の底にコーティング処理を行った。その後、直径７．７μｍのポリスチレン粒子（商品名：Ｄｕｋｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ２００８Ａ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｋ．Ｋ．社製）を含む１．５ｍＬエッペンチューブ（商品名：ＨＹＰＥＲ  ＭＩＣＲＯ  ＴＵＢＥ、ＷＡＴＳＯＮ社製）に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）へ懸濁させた単離済みのマウス心筋細胞を１ｍＬ加え、粒子含有マウス心筋細胞懸濁液を得た。得られた粒子含有マウス心筋細胞懸濁液における心筋細胞密度は１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、粒子濃度は２×１０６ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬであった。その後、それら粒子含有マウス心筋細胞（粒子含有三次元組織体）をコーティング処理済み２４ウェル培養プレートに２×１０６個／ｍＬとなるように細胞を播種して、平均厚みが１００μｍである粒子含有マウス心筋組織体を得た。その後、拍動を開始するまで３７℃、ＣＯ２インキュベータにて７２時間培養を行った。
【００７２】
粒子含有三次元マウス心筋組織体の拍動の様子を、ガラスヒーター（装置名：細胞培養コンパクトチャンバー、ＢＬＡＳＴ社製）を用いて培養プレート部が３７℃となるように温度制御を行いながら、光干渉断層装置（装置名：Ｇａｎｙｍｅｄｅ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ社製）を用いて観察を行った。観察は、心筋組織の拍動最大値を捉えるため、撮影間隔６ｍｓｅｃ（＝１６７ＦＰＳ，  Ｆｒａｍｅ  Ｐｅｒ  Ｓｅｃｏｎｄ）にて撮影を行った。結果を図１０に示す。
図１０に示すように、コーティング層６４を有する基板６１に接着した粒子含有三次元マウス心筋組織体（粒子含有三次元組織体）６０における組織体６２は、厚み方向の片側表面近傍Ｔ１と、その逆側表面近傍Ｔ３と、厚み方向の中央近傍Ｔ２とに、粒子６３を含有していた。
【００７３】
その後、実施例１で得た粒子含有マウス心筋組織体を光干渉断層装置により取得された画像を用いて、三次元心筋組織体内へ含有された各粒子の単位時間当たりの収縮量を画像解析（ソフトウェア名：ＩｍａｇｅＪ）にて導出した結果、最大で５μｍであった。その後、細胞の物性値（ばね定数：１００ｍＮ／ｍ）を用いて、フックの法則を基にした下記計算式より算出された粒子含有マウス心筋組織体の収縮力最大値を５００ｐＮであった。
Ｆ＝Ｇ×Ｌ  ・・・  式
なお、式中、Ｆは、収縮力を表し、Ｇは、ばね定数を表し、Ｌは、粒子移動量を表す。
【００７４】
（比較例１）
実施例１において、ポリスチレン粒子を使用しなかった以外は、実施例１と同様にして、平均厚みが１００μｍである三次元マウス心筋組織体を得た。
実施例１と同様にして、三次元マウス心筋組織体の観察を行った。結果を図１１に示す。
図１１に示すように、コーティング層７４を有する基板７１に接着した粒子含有三次元マウス心筋組織体７０における組織体７２は、粒子を含有していない。
【００７５】
図１０及び図１１の結果から、同一種のマウス心筋細胞を用いて作製した粒子含有三次元組織体であるが、図１０に示すように、粒子を含有させることにより、組織体の拍動の様子がより鮮明に観察することが確認できた。一方、図１１に示すように、比較例１の粒子含有三次元組織体は、粒子を含有しないため、組織体の拍動の様子を観察することができなかった。
【００７６】
（実施例２）
ｉＰＳ由来心筋細胞（商品名：ｉＣｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ、ＣＤＩ社製）を用いた。まず、三次元心筋組織体を基板へ接着させるため、ガラスボトムディッシュ（商品名：ガラスベースディッシュ、ＡＧＣテクノグラス株式会社製）の表面にフィブロネクチン（商品名：Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ、ＳＩＧＭＡ社製）を用いたコーティング処理を行った。その後、コーティング処理済みディッシュへｉＰＳ由来心筋細胞を１．５×１０６ｃｅｌｌ／ｃｍ２となるように播種した。３７℃で２４時間培養後、位相差顕微鏡（装置名：ＣＫＸ４１、オリンパス株式会社製）を用いて、ｉＰＳ由来心筋細胞の接着を確認した。次に、直径１０μｍのポリスチレン粒子（ＰＳ粒子）を含むＰＢＳ溶液（商品名：Ｄｕｋｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ２００８Ａ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｋ．Ｋ．社製）をｉＰＳ由来心筋細胞の上に１×１０４ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｃｍ２となるように滴下した。その後、３７℃、ＣＯ２インキュベータへ３時間培養を行った。その後、心筋組織上へ粒子が存在している集合体の上へ、再度ｉＰＳ由来心筋細胞を１．５×１０６ｃｅｌｌ／ｃｍ２となるように播種した。その後、粒子を３×１０４ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｃｍ２となるように滴下し、３７℃、ＣＯ２インキュベータへ３時間培養を行った。本工程を複数回繰り返して行うことにより、ポリスチレン粒子（ＰＳ粒子）が規則的に配置された、平均厚みが２００μｍである粒子含有ｉＰＳ由来心筋組織体（粒子含有三次元組織体）を作製した。その後、拍動を開始するまで３７℃、ＣＯ２インキュベータにて７２時間培養を行った。
【００７７】
実施例１と同様にして、三次元マウス心筋組織体の観察を行った。その結果、実施例１と同様に、粒子を含有させることにより、組織体の拍動の様子がより鮮明に観察することが確認できた。結果を図１２、及び図１３に示す。
図１２に示すように、コーティング層８４を有する基板８１に接着した粒子含有三次元マウス心筋組織体８０における組織体８２は、厚み方向の片側表面近傍Ｔ１と、その逆側表面近傍Ｔ３と、厚み方向の中央近傍Ｔ２とに、粒子８３を含有していた。
【００７８】
また、実施例１と同様にして、ｉＰＳ由来心筋細胞の収縮力最大値を測定したところ、０．５ｍＮであった。
【００７９】
（実施例３）
ｉＰＳ由来心筋細胞（商品名：ｉＣｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ、ＣＤＩ社製）を用いた。基板への細胞接着性を高めるために、基板（ガラスボトムディッシュ、商品名：ガラスベースディッシュ、ＡＧＣテクノグラス株式会社製）の表面全体へフィブロネクチン溶液（０．２ｍｇ／ｍＬ、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ、ＳＩＧＭＡ社製）を塗布してコーティング層を作製した。その後、３７℃インキュベータ内にて１２時間のインキュベートを行った後、コーティング層を有する基板に液滴形成装置（自社開発装置）を用いて、およそ１０層分（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の心筋細胞を吐出した。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に直径７μｍのポリスチレン（ＰＳ）粒子（商品名：Ｄｕｋｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ２００８Ａ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｋ．Ｋ．社製）を１×１０５ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ濃度に調整した粒子含有液を調製し、液滴形成装置（自社開発装置）を用いて心筋細胞への吐出を行った。その後、本工程を繰り返し行うことにより、粒子含有三次元組織体内部の任意箇所へポリスチレン粒子を配置した平均厚みが１００μｍである粒子含有三次元組織体を得た。その後、拍動を開始するまで３７℃、ＣＯ２インキュベータにて７２時間培養を行った。
【００８０】
実施例１と同様にして、心筋組織体の観察を行った。その結果、実施例１と同様に、粒子を含有させることにより、組織体の拍動の様子がより鮮明に観察することが確認できた。また、任意の位置に粒子を配置した粒子含有三次元組織体を作製できた。結果を図１４に示す。
図１４に示すように、コーティング層８９を有する基板８６に接着した粒子含有三次元組織体８５における組織体８８は、厚み方向の片側表面近傍Ｔ１と、その逆側表面近傍Ｔ３と、厚み方向の中央近傍Ｔ２とに、粒子８７を含有していた。
【００８１】
また、実施例１と同様にして、ｉＰＳ由来心筋細胞の収縮力最大値を測定したところ、０．１ｍＮであった。
【００８２】
本発明の態様としては、例えば、以下のとおりである。
＜１＞  細胞接着性を有する基板に接着しており、かつ
厚み方向の片側表面近傍及びその逆側表面近傍の少なくともいずれかと、厚み方向の中央近傍とに、少なくとも粒子を含有することを特徴とする粒子含有三次元組織体である。
＜２＞  平均厚みが、３０μｍ以上である前記＜１＞に記載の粒子含有三次元組織体である。
＜３＞  平面視したときに、粒子の射影が互いに重ならない程度に、粒子の密度が十分疎である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の粒子含有三次元組織体である。
＜４＞  収縮能を有する前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の粒子含有三次元組織体である。
＜５＞  前記収縮能を有する粒子含有三次元組織体が、拍動能を有する心筋細胞により形成される前記＜４＞のに記載の粒子含有三次元組織体である。
＜６＞  拍動能を有する心筋細胞が、ｉＰＳ由来心筋細胞、マウス心筋細胞、及びラット心筋細胞から選択される少なくとも１種である前記＜５＞のに記載の粒子含有三次元組織体である。
＜７＞  前記粒子が、表面に細胞接着性を有する成分を有する前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の粒子含有三次元組織体である。
＜８＞  前記粒子が、光学的計測手段を用いて検出可能である前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の粒子含有三次元組織体である。
＜９＞  前記粒子が、ポリスチレン粒子、ガラス粒子、金粒子、銀粒子、及びアルミナ粒子から選択される少なくとも１種である前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の粒子含有三次元組織体である。
＜１０＞  前記粒子が、ポリスチレン粒子である前記＜９＞に記載の粒子含有三次元組織体である。
＜１１＞  前記粒子の体積平均粒径が、１μｍ以上５０μｍ以下である前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の粒子含有三次元組織体である。
＜１２＞  前記＜１＞から＜１１＞のいずれかに記載の粒子含有三次元組織体を、光干渉断層撮影装置を用いて測定し、前記粒子の変位量を算出する粒子変位量算出工程と、
前記粒子変位量算出工程により得られた粒子の変位量から前記細胞の収縮量を算出する細胞収縮量算出工程と、を含むことを特徴とする粒子含有三次元組織体の収縮計測方法である。
【００８３】
前記＜１＞から＜１１＞のいずれかに記載の粒子含有三次元組織体、及び前記＜１２＞に記載の粒子含有三次元組織体の収縮計測方法は、従来における前記諸問題を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００８４】
【特許文献１】国際公開第２０１４／０９８１８２号パンフレット
【符号の説明】
【００８５】
２０、３０、４０、６０、８０、８５      粒子含有三次元組織体
２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、８６      基板
２３、３３、４３、５３、６３、８３、８７      粒子
１００      粒子含有三次元組織体の収縮計測装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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