(57)【要約】【課題】本開示は、特に、タンパク質、タンパク質前駆体、またはタンパク質もしくはタンパク質前駆体の部分的もしくは全体的加工型をコードし得る修飾核酸分子を含む製剤された組成物を提供する。本発明は、細胞の官能基および／または活性を改変できるポリペプチドをコードするのに有用な核酸をさらに提供する。【解決手段】製剤された組成物は、修飾核酸分子および送達剤をさらに含み得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞または組織において目的のポリペプチドを産生する方法であって、前記哺乳動物細胞または組織を目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡを含む製剤に接触させることを含み、製剤はナノ粒子、ポリ（酪酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リピドイド、リポプレックス、リポソーム、ポリマー、（単糖を含む）炭水化物、カチオン性脂質、フィブリンゲル、フィブリンヒドロゲル、フィブリン糊、フィブリンシーラント、フィブリノゲン、トロンビン、速やかに排出される脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰｓ）およびそれらの組合せからなる群より選択される、方法。
【請求項２】
修飾ｍＲＮＡが精製されたＩＶＴ転写物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
修飾ｍＲＮＡを含む製剤がナノ粒子であり、前記ナノ粒子は少なくとも１つの脂質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
脂質がＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧおよびペグ化脂質からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
脂質がカチオン性脂質である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
カチオン性脂質がＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡおよびＤＯＤＭＡからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
脂質の修飾ｍＲＮＡに対する重量比が１０：１から３０：１である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
修飾ｍＲＮＡを含むナノ粒子製剤の平均寸法が６０〜２２５ｎｍである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
修飾ｍＲＮＡを含むナノ粒子製剤のＰＤＩが０．０３〜０．１５である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
脂質のゼータ電位がｐＨ７．４で−１０〜＋１０である、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
修飾ｍＲＮＡを含むナノ粒子製剤が融合性脂質、コレステロールおよびＰＥＧ脂質をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
修飾ｍＲＮＡを含むナノ粒子製剤がモル比５０：１０：３８．５：１．５〜３．０（カチオン性脂質：融合性脂質：コレステロール：ＰＥＧ脂質）を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＰＥＧ脂質がＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧおよびＰＥＧ−ＤＭＧから選択され、融合性脂質がＤＳＰＣである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
接触させることが、シリンジポンプ、内部浸透圧ポンプおよび外部浸透圧ポンプからなる群より選択される装置の使用による、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
修飾ｍＲＮＡを含む製剤がポリ（酪酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェアである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
修飾ｍＲＮＡを含むＰＬＧＡマイクロスフェア製剤のマイクロスフェアの寸法が４〜２０μｍである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
修飾ｍＲＮＡを含むＰＬＧＡマイクロスフェア製剤が、４８時間で修飾ｍＲＮＡの５０％未満を放出する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
修飾ｍＲＮＡを含むＰＬＧＡマイクロスフェア製剤が血清中で安定である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
安定性が９０％血清中の非製剤の修飾ｍＲＮＡに対し決定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
負荷重量パーセントが少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％または少なくとも０．４％である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
ＰＬＧＡマイクロスフェア中修飾ｍＲＮＡの封入効率が少なくとも５０％である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
ＰＬＧＡマイクロスフェア中修飾ｍＲＮＡの封入効率が少なくとも７０％である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
ＰＬＧＡマイクロスフェア中修飾ｍＲＮＡの封入効率が少なくとも９０％である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
ＰＬＧＡマイクロスフェア中修飾ｍＲＮＡの封入効率が少なくとも９７％である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記哺乳動物細胞または組織を接触させることが、静脈内、筋肉内、硝子体内、くも膜下腔内、腫瘍内、肺および皮下からなる群より選択される投与経路により生じる、請求項１１に記載の方法。
【請求項２６】
目的のポリペプチドが、接触後７２時間まで、接触前よりも高いレベルで血清中に検出可能である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
目的のポリペプチドが、男性対象の血清中よりも高レベルで女性対象の血清中に検出可能である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
製剤が第２修飾ｍＲＮＡをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
製剤が第３修飾ｍＲＮＡをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
修飾ｍＲＮＡを含む製剤が、速やかに排出される脂質ナノ粒子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
速やかに排出される脂質ナノ粒子が、ｒｅＬＮＰ脂質、融合性脂質、コレステロールおよびＰＥＧ脂質をモル比５０：１０：３８．５：１．５（ｒｅＬＮＰ脂質：融合性脂質：コレステロール：ＰＥＧ脂質）で含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
融合性脂質がＤＳＰＣであり、ＰＥＧ脂質がＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ｒｅＬＮＰ脂質が、内部エステルを有するＤＬｉｎ−ＤＭＡ、末端エステルを有するＤＬｉｎ−ＤＭＡ、内部エステルを有するＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、および末端エステルを有するＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
全脂質の修飾ｍＲＮＡに対する重量比が１０：１から３０：１である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
接触させることが、分割投与スケジュールを用いる注入により生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
注入が、皮内スペース、表皮、皮下組織および筋肉からなる群より選択される組織に対し行われる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
修飾ｍＲＮＡを含む製剤がフィブリンシーラントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
修飾ｍＲＮＡを含む製剤がリピドイドを含み、脂質がＣ１２−２００および９８Ｎ１２−５からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
修飾ｍＲＮＡを含む製剤がポリマーであり、前記ポリマーは、ヒドロゲルまたは外科用シーラントの層でコーティングされ、被覆され、囲包され、封入され、またはそれを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
ポリマーがＰＬＧＡ、エチレン酢酸ビニル、ポロクサマーおよびＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）からなる群より選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ポリマー、ヒドロゲルまたは外科用シーラントの追加の層をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
修飾ｍＲＮＡが、キャップ０、キャップ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシンおよび２−アジド−グアノシンからなる群より選択される少なくとも１つの５’末端キャップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４３】
５’末端キャップがキャップ１である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
修飾ｍＲＮＡが少なくとも２つの修飾を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも２つの修飾が、５−メチルシチジン、シュードウリジンおよび１−メチル−シュードウリジンからなる群より独立して選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
目的のポリペプチドを哺乳動物細胞または組織において産生する方法であって、前記哺乳動物細胞または組織を目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡを含む緩衝製剤と接触させることを含む、方法。
【請求項４７】
緩衝製剤が、食塩水、リン酸緩衝食塩水および乳酸リンゲル液からなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
緩衝製剤が、１〜１０ｍＭのカルシウム濃度を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
修飾ｍＲＮＡが精製されたＩＶＴ転写物を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記哺乳動物細胞または組織を接触させることが、静脈内、筋肉内、硝子体内、くも膜下腔内、腫瘍内、肺および皮下からなる群より選択される投与経路により生じる、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記目的のポリペプチドが、接触部位から全身的部位の前記細胞または組織において産生される、請求項２５から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
投与経路が筋肉内または皮下のいずれかである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
脂質ナノ粒子製剤がシーラント内でさらに製剤される、請求項３に記載の方法。
【請求項５４】
前記シーラントがフィブリンシーラントである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
霊長類において薬理効果を生じる方法であって、前記霊長類を製剤された目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡを含む組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項５６】
修飾ｍＲＮＡが精製されたＩＶＴ転写物を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
製剤が、ナノ粒子、ポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リピドイド、リポプレックス、リポソーム、ポリマー、（単糖を含む）炭水化物、カチオン性脂質、フィブリンゲル、フィブリンヒドロゲル、フィブリン糊、フィブリンシーラント、フィブリノゲン、トロンビン、速やかに排出される脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ）およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
薬理効果が、薬理効果を生ずることが知られている治療剤に関連する前記薬理効果よりも高い、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
薬理効果が、目的のポリペプチドをコードする製剤されていない修飾ｍＲＮＡを含む組成物が生じる薬理効果よりも高い、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
薬理効果が、目的のポリペプチドをコードする製剤の非修飾ｍＲＮＡを含む組成物が生じる薬理効果よりも高い、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
薬理効果が、疾患、障害、病状または感染の治療上有効な結果をもたらす、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
薬理効果が、細胞数の変化、血清化学の改変、酵素活性の改変、ヘモグロビンの増加およびヘマトクリットの増加からなる群より選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
治療上有効な結果が、治療、１つ以上の症状の改善、診断、予防および発症の遅延からなる群より選択される、請求項６２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、細胞に導入された外来性非修飾核酸分子、特にウイルス核酸は、サイトカインとインターフェロン（ＩＦＮ）の生成と最終的には細胞死をもたらす自然免疫反応を誘発する。治療剤、診断、試薬にとって、また、生物学的アッセイにとって、自然免疫反応の代わりに核酸の細胞内翻訳およびコードされたタンパク質の生成をもたらすように、核酸、例えばリボ核酸（ＲＮＡ）を細胞に送達できることは大きな関心事である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、自然免疫反応を生成することなしに標的細胞への核酸のインビボ送達を有効に促進できる送達剤を含む製剤された組成物を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、特に、タンパク質、タンパク質前駆体、またはタンパク質もしくはタンパク質前駆体の部分的もしくは全体的加工型をコードし得る修飾核酸分子を含む製剤された組成物を提供する。製剤された組成物は、修飾核酸分子および送達剤をさらに含み得る。本発明は、細胞の官能基および／または活性を修飾できるポリペプチドをコードするのに有用な核酸をさらに提供する。
【０００５】
一態様では、哺乳動物細胞または組織における目的のポリペプチドを生成する方法が記述される。方法は、哺乳動物細胞または組織を目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡを含む製剤と接触させることを含む。製剤は、限定ではなく、ナノ粒子、ポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リピドイド、リポプレックス、リポソーム、ポリマー、（単糖を含む）炭水化物、カチオン性脂質、フィブリンゲル、フィブリンヒドロゲル、フィブリン糊、フィブリンシーラント、フィブリノゲン、トロンビン、速やかに排出される脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ）およびそれらの組合せであり得る。修飾ｍＲＮＡは、精製されたＩＶＴ転写物を含み得る。
【０００６】
１つの実施形態では、修飾ｍＲＮＡを含む製剤は、少なくとも１つの脂質を含み得るナノ粒子である。脂質は、限定ではなく、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧおよびペグ化脂質から選択され得る。別の態様では、脂質は、限定ではなく、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｄ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡおよびＤＯＤＭＡなどのカチオン性脂質であり得る。
【０００７】
製剤中の脂質の修飾ｍＲＮＡに対する比は、１０：１から３０：１０であり得る。ナノ粒子製剤の平均サイズは、６０から２２５ｎｍの修飾ｍＲＮＡを含み得る。修飾ｍＲＮＡを含むナノ粒子製剤のＰＤＩは、０．０３から０．１５である。脂質のゼータ電位はｐＨ７．４で−１０から＋１０であり得る。
【０００８】
修飾ｍＲＮＡの製剤は、融合性脂質、コレステロールおよびＰＥＧ脂質を含み得る。製剤は、５０：１０：３８．５：１．５〜３．０（カチオン性脂質：融合性脂質：コレステロール：ＰＥＧ脂質）のモル比を有し得る。ＰＥＧ脂質は、限定ではなくＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧから選択され得る。融合性脂質は、ＤＳＰＣであり得る。
【０００９】
哺乳動物細胞または組織は、限定ではなく、シリンジポンプ、内部浸透圧ポンプおよび外部浸透圧ポンプなどのデバイスを使用して接触され得る。
修飾ｍＲＮＡの製剤は、サイズが４から２０μｍのＰＬＧＡマイクロスフェアであり得る。修飾ｍＲＮＡは、４８時間内に製剤から５０％未満放出され得る。ＰＬＧＡマイクロスフェア製剤は、血清中で安定であり得る。安定性は、製剤されていない修飾ｍＲＮＡに対し９０％で決定され得る。
【００１０】
ＰＬＧＡマイクロスフェア中修飾ｍＲＮＡの充填重量パーセントは、少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％または少なくとも０．５％であり得る。ＰＬＧＡマイクロスフェア中修飾ｍＲＮＡの封入効率は、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％または少なくとも９７％であり得る。
【００１１】
本発明の脂質ナノ粒子は、限定ではなく、フィブリンシーラントなどのシーラント中で製剤され得る。
哺乳動物細胞または組織は、限定ではなく、静脈内、筋肉内、硝子体内、くも膜下腔内、腫瘍内、肺および皮下などの投与経路により接触され得る。哺乳動物細胞または組織は、分割投与スケジュールを使用して接触され得る。哺乳動物細胞または組織は、注入により接触され得る。注入は、皮内スペース、表皮、皮下組織および筋肉からなる群より選択される組織に対し行われ得る。目的のポリペプチドは、接触場所から全身に位置する細胞または組織において産生され得る。
【００１２】
目的のポリペプチドは、接触後最高７２時間まで血清中に検出され得る。目的のポリペプチドのレベルは投与前のレベルよりも高くなり得る。目的のポリペプチドのレベルは、男性対象の血清中よりも女性対象の血清中のほうが高い場合がある。
【００１３】
修飾ｍＲＮＡの製剤は、２以上の修飾ｍＲＮＡを含み得る。製剤は、２または３つの修飾ｍＲＮＡを有し得る。
修飾ｍＲＮＡを含む製剤は、脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ）、融合性脂質、コレステロールおよびＰＥＧ脂質をモル比５０：１０：３８．５：１．５（ｒｅＬＮＰ脂質：融合性脂質：コレステロール：ＰＥＧ脂質）で含み得る速やかに排出されるｒｅＬＮＰ脂質を含み得る。融合性脂質は、ＤＳＰＣであり得、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧであり得る。ｒｅＬＮＰ脂質内部もしくは末端エステルを含むＤＬｉｎ−ＤＭＡ内部もしくは末端エステルを含むＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡであり得る。全脂質の修飾ｍＲＮＡに対する重量比は、１０：１から３０：１であり得る。
【００１４】
修飾ｍＲＮＡを含む製剤は、フィブリンシーラントを含み得る。
修飾ｍＲＮＡを含む製剤は、脂質がＣ１２−２００と９８Ｎ１２−５からなる群より選択されるリピドイドを含み得る。
【００１５】
修飾ｍＲＮＡを含む製剤はポリマーを含み得る。ポリマーは、ヒドロゲルまたは外科用シーラントの層でコーティングされ得、囲包され得、取り囲まれ得、封入され得、またはそれを含み得る。ポリマーは、ＰＬＧＡ、エチレン酢酸ビニル、ポロクサマーおよびＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）からなる群より選択され得る。
【００１６】
目的のポリペプチドは、哺乳動物細胞または組織において、哺乳動物細胞または組織を目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡを含む緩衝製剤と接触させて産生され得る。緩衝製剤は、限定ではなく、生理食塩水（ｓｌａｉｎｅ）、リン酸緩衝食塩水および乳酸リンゲル液から選択され得る。緩衝製剤は、１から１０ｍＭのカルシウム濃度を含み得る。緩衝製剤中の修飾ｍＲＮＡは、精製されたＩＶＴ転写物を含み得る。
【００１７】
霊長類において、該霊長類を製剤された目的のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡを含む組成物と接触させることで薬理効果が生じ得る。修飾ｍＲＮＡは、精製されたＩＶＴ転写物を含み得、かつ／またはナノ粒子、ポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リピドイド、リポプレックス、リポソーム、ポリマー、（単糖を含む）炭水化物、カチオン性脂質、フィブリンゲル、フィブリンヒドロゲル、フィブリン糊、フィブリンシーラント、フィブリノゲン、トロンビン、速やかに排出される脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ）およびそれらの組合せ中で製剤され得る。薬理効果は、薬理効果を生じることが知られている治療剤および／または組成物に関する該薬理効果よりも高くなり得る。組成物は、製剤されたまたはされていない修飾ｍＲＮＡを含み得る。薬理効果は、疾患、障害、病状または感染症の治療上有効な結果をもたらし得る。そのような治療上有効な結果には、限定ではなく、治療、１つ以上の症状の改善、診断、予防および発症の遅延が含まれ得る。薬理効果には、限定ではなく、細胞数の変化、血清化学の改変、酵素活性の改変、ヘモグロビンの増加およびヘマトクリットの増加が含まれ得る。
【００１８】
１つの実施形態では、本開示は、修飾核酸分子と送達剤を含む製剤された組成物を提供する。修飾核酸分子は、ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒的ＤＮＡ、三重らせん体形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクターおよびそれらの組合せからなる群より選択され得る。修飾核酸分子がｍＲＮＡである場合、ｍＲＮＡはｃＤＮＡに由来する。
【００１９】
１つの実施形態では、修飾核酸分子は、少なくとも１つの修飾と１つの翻訳可能領域を含み得る。いくつかの例では、修飾核酸は、少なくとも２つの修飾と１つの翻訳可能領域を含み得る。修飾は、核酸分子の主鎖および／またはヌクレオシドに位置し得る。修飾は、ヌクレオシド結合と主鎖結合の両方に位置し得る。
【００２０】
１つの実施形態では、修飾は修飾核酸分子の主鎖結合に位置し得る。主鎖結合は、１つ以上の酸素原子の置換で修飾され得る。主鎖結合の修飾は、少なくとも１つのホスホジエステル結合のホスホロチオエート結合での置換を含み得る。
【００２１】
１つの実施形態では、修飾は修飾核酸分子のヌクレオシドに位置し得る。ヌクレオシドの修飾は、前記ヌクレオシドの糖に位置し得る。ヌクレオシドの修飾はヌクレオシドの２’位で生じ得る。
【００２２】
ヌクレオシド修飾は、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチル−ウリジン、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、５−アザ−シチジン、シュードイソシチジン、３−メチル−シチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−シュードイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−シュードイソシチジン、２−アミノプリン、２、６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−メトキシ−アデニン、イノシン、１−メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシンおよびＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシンからなる群より選択される化合物を含み得る。別の実施形態では、修飾は、５−メチルシトシン、シュードウリジンおよび１−メチルシュードウリジンからなる群より独立して選択される。
【００２３】
１つの実施形態では、修飾は修飾核酸分子の核酸塩基に位置し得る。核酸塩基の修飾は、シトシン、グアニン、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選択され得る。核酸塩基の修飾は、デアザ−アデノシンとデアザ−グアノシンからなる群より選択され得、リンカーが前記デアザ−アデノシンまたはデアザ−グアノシンのＣ−７またはＣ−８位で結合され得る。修飾核酸塩基は、シトシンとウラシルからなる群より選択され得、リンカーが修飾核酸塩基にＮ−３またはＣ−５位で結合され得る。核酸塩基に結合されるリンカーは、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、テトラエチレングリコール、二価アルキル、アルケニル、アルキニル部分、エステル、アミドおよびエーテル部分からなる群より選択され得る。
【００２４】
１つの実施形態では、核酸分子の２つの修飾が修飾核酸分子のヌクレオシドに位置し得る。修飾ヌクレオシドは、５−メチルシトシンとシュードウリジンより選択され得る。
１つの実施形態では、修飾核酸分子の２つの修飾がヌクレオチドまたはヌクレオシドに位置し得る。１つの実施形態では、本開示は、限定ではなく、配列番号６、配列番号７、配列番号９および配列番号１０などの核酸分子と送達剤を含む製剤を提供する。核酸分子は、長さ約１６０ヌクレオチドのポリＡテールを含み得る。さらに、核酸分子は、限定ではなく、キャップ０、キャップ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシンおよび２−アジド−グアノシンなどの少なくとも１つの５’末端キャップを含み得る。
【００２５】
１つの実施形態では、本開示は、配列番号６の核酸、キャップ１である５’末端キャップ、長さ約１６０ヌクレオチドのポリＡテールおよび送達剤を提供する。
１つの実施形態では、本開示は、配列番号７の核酸、キャップ１である５’末端キャップ、長さ約１６０ヌクレオチドのポリＡテールおよび送達剤を提供する。
【００２６】
１つの実施形態では、本開示は、配列番号９の核酸、キャップ１である５’末端キャップ、長さ約１６０ヌクレオチドのポリＡテールおよび送達剤を提供する。
１つの実施形態では、本開示は、配列番号１０の核酸、キャップ１である５’末端キャップ、長さ約１６０ヌクレオチドのポリＡテールおよび送達剤を提供する。
【００２７】
１つの実施形態では、送達剤は、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、速やかに排出される脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ）、ポリマー、リポプレックス、ペプチド、タンパク質、ヒドロゲル、シーラント、化学修飾、コンジュゲーション、細胞およびエンハンサーからなる群より選択される、送達を向上させる少なくとも１つの方法を含む。送達剤として使用され得るリピドイド、脂質ナノ粒子および速やかに排出される脂質ナノ粒子は、Ｃ１２−２００、ＭＤ１、９８Ｎ１２−５、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ペグ化脂質およびそれらの類似体からなる群より選択され得る脂質を含み得る。速やかに排出される脂質ナノ粒子は、脂質鎖の末端にエステル結合を有し得るか、またはエステル結合は脂質鎖の飽和炭素の右側または左側に位置する内部結合であり得る。送達剤として使用され得る速やかに排出される脂質ナノ粒子は、限定ではなく、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡとＤＬｉｎ−ＤＭＡであり得る。
【００２８】
１つの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ＰＥＧおよび少なくとも１つの、限定ではないがコレステロール、カチオン性脂質および融合性脂質などの成分を含み得る。
１つの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ、コレステロール、カチオン性脂質および融合性脂質のうち少なくとも１つを含み得る。
【００２９】
１つの実施形態では、融合性脂質は、ジステロイルホファチジルコリン（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌ  ｃｈｏｌｉｎｅ）（ＤＳＰＣ）である。別の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧである。さらに別の実施形態では、カチオン性脂質は、限定ではなく、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、Ｃ１２−２００、９８Ｎ１２−５およびＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡであり得る。
【００３０】
１つの実施形態では、脂質ナノ粒子組成物は、５０ｍｏｌ％カチオン性脂質、１０ｍｏｌ％ＤＳＰＣ、１．５〜３．０ｍｏｌ％ＰＥＧおよび３７〜３８．５ｍｏｌ％コレステロールを含み得る。
【００３１】
１つの実施形態では、修飾核酸はＰＬＧＡとともに製剤されて徐放製剤を形成し得る。別の実施形態では、修飾核酸はＰＬＧＡおよび他の活性および／または不活成分と共に製剤されて徐放製剤を形成し得る。１つの実施形態では、修飾核酸分子は、限定ではなく、配列番号９と配列番号１０を含み得る。
【００３２】
１つの実施形態では、徐放製剤は、徐放マイクロスフェアを含み得る。徐放マイクロスフェアは、直径が約１０から約５０μｍであり得る。別の実施形態では、徐放マイクロスフェアは、少なくとも１つの修飾核酸分子の約０．００１から約１．０重量パーセントを含み得る。
【００３３】
１つの実施形態では、本発明の修飾核酸は、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に少なくとも１つの終止コドンを含み得る。終止コドンは、ＴＧＡ、ＴＡＡおよびＴＡＧから選択され得る。１つの実施形態では、本発明の修飾核酸は、終止コドンＴＧＡおよび１つの追加の終止コドンを含む。さらなる実施形態では、追加の終止コドンはＴＡＡであり得る。別の実施形態では、本発明の修飾核酸は、３つの終止コドンを含む。
【００３４】
１つの実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドをコードし得る修飾核酸を含む放出制御製剤を提供する。修飾核酸は、送達剤中に封入されているか、実質的に封入されていてよい。送達剤は、ポリマー、ヒドロゲルおよび／または外科用シーラントの層でコーティングされ得、囲包され得、取り囲まれ得、封入され得、またはそれを含み得る。さらなる実施形態では、放出制御製剤は、ポリマー、ヒドロゲルおよび／または外科用シーラントの第２層を含み得る。
【００３５】
１つの実施形態では、放出制御製剤の送達剤は、限定ではなく、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、速やかに排出される脂質ナノ粒子、リポプレックスおよび自己会合脂質ナノ粒子を含み得る。
【００３６】
放出制御製剤において使用され得るポリマーは、限定ではなく、ＰＬＧＡ、エチレン酢酸ビニル、ポロクサマーおよびＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）を含み得る。放出制御製剤において使用され得る外科用シーラントは、限定ではなく、フィブリノゲンポリマー、ＴＩＳＳＥＥＬＬ（登録商標）、ＰＥＧ系シーラントおよびＣＯＳＥＡＬ（登録商標）を含み得る。
【００３７】
１つの実施形態では、放出制御製剤の送達剤は、脂質ナノ粒子または速やかに排出される脂質ナノ粒子送達剤を含む。一態様では、脂質ナノ粒子または速やかに排出される脂質ナノ粒子は、ポリマー、ヒドロゲルおよび／または外科用シーラントの層でコーティングされ得、実質的にコーティングされ得、囲包され得、実質的に囲包され得、取り囲まれ得、実質的に取り囲まれ得、封入され得、実質的に封入され得、またはそれを含み得る。別の態様では、送達剤は、ＰＬＧＡの層でコーティングされ得、実質的にコーティングされ得、囲包され得、実質的に囲包され得、取り囲まれ得、実質的に取り囲まれ得、封入され得、実質的に封入され得、またはそれを含み得る、脂質ナノ粒子であり得る。
【００３８】
上記および他の目的、特徴および利点は、添付の図面（全図面を通じて同じ参照文字は同一部分を指す）に示されるような、以下の本発明の特定の実施形態の記述から明らかになろう。図面は必ずしも一定尺度ではなく、代わりに本発明の様々な実施形態の原理を示す強調がなされている。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明において有用な従来技術の脂質構造を示す図である。９８Ｎ１２−５（ＴＥＴＡ５−ＬＡＰ）、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ（２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン）、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡおよびＣ１２−２００の構造が示されている。
【図２】本明細書で教示されるＩＶＴ反応において有用な代表的プラスミドの図である。プラスミドは、発明者らが設計したインサート６４８１８を含んでいる。
【図３】ＰＬＧＡマイクロスフェア内に封入された修飾ｍＲＮＡのゲルプロファイルの図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
細胞への核酸送達は、不正確な発現レベル、子孫および近隣細胞への核酸の有害な伝搬および突然変異を引き起こす大きなリスクをもたらし得る、標的細胞ゲノムへの核酸の組込を含む、多くの望まれない問題を有する。本開示の修飾核酸分子は、それらが導入される細胞集団の自然免疫活性を低下させることができるので、その細胞集団におけるタンパク質産生効率が高まる。さらに、本開示の核酸およびタンパク質の１つ以上の追加の有利な活性および／または特徴が本明細書に記載される。
【００４１】
さらに、本明細書では、疾患、障害および／または病状を有するか有すると思われる対象を治療する方法が提供され、方法は、そのような治療を必要とする対象に、本明細書に記載の組成物を、該疾患、障害および／または病状を治療するのに十分な量投与することを含む。
【００４２】
本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、特に断らない限り、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。本発明が特徴とする方法の実施または試験において、本明細書に記載のものと同様かまたは同等の方法および材料が使用され得るが、適切な方法と材料を以下に記載する。
【００４３】
修飾核酸分子
本開示は、本明細書に記載されるような１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド（「修飾核酸分子」、「修飾ｍＲＮＡ」または「修飾ｍＲＮＡ分子」と称される）を含む、ｍＲＮＡなどのＲＮＡを含む核酸を提供する。本発明の核酸分子の修飾は、限定ではないが修飾ｍＲＮＡが導入される細胞の自然免疫反応の大幅な低下またはその実質的誘導の欠如を含む有用な特徴を有し得る。修飾核酸分子は、非修飾核酸分子と比べて、タンパク質産生の効率増、核酸の細胞内保持および被接触細胞の生存性を示し得、ならびに低い免疫原性を有し得る。
【００４４】
１つの翻訳可能領域と、１、２もしくは３以上の２つのヌクレオシド修飾を含む修飾核酸分子が提供される。本開示で使用される例示的核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはそれらのハイブリッドを含む。好ましい実施形態では、修飾核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。本明細書に記載されるように、本開示の修飾核酸分子は、修飾ｍＲＮＡが導入される細胞の自然免疫反応を実質的に誘導しないかもしれない。別の実施形態では、修飾されていない核酸と比べて、修飾核酸分子は、修飾核酸分子が導入される細胞において分解の低減を示すかもしれない。
【００４５】
「核酸」という用語は、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれるかまたは組み込まれ得るあらゆる化合物および／または物質を含む。本開示にしたがい使用される例となる核酸には、限定ではないが、１つ以上のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むＲＮＡ、それらのハイブリッド、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒的ＤＮＡ、三重らせん体形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクターなどが含まれる。
【００４６】
ある特定の実施形態では、細胞に導入された修飾核酸分子を細胞内で分解することが望ましい。例えば、タンパク質産生の精密なタイミングが望ましい場合は、修飾核酸分子の分解が望まれよう。したがって、本開示は、細胞内で定方向の作用を受けることができる、分解ドメインを含む修飾核酸分子を提供する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、修飾核酸分子は、糖、核酸塩基（例えば核酸塩基の５’位で）またはリン酸基の主鎖（例えばリン酸をチオリン酸などの別の部分で置換）上で化学修飾され得る。いくつかの実施形態では、修飾は、結果として、自然免疫反応に貢献し得る、主溝結合パートナーの相互作用を撹乱し得る。いくつかの実施形態では、製剤された組成物は、対象に投与されると、送達剤を含まない修飾核酸分子の投与に対し、修飾核酸分子の生物学的利用能、治療濃度域または分布量が向上する結果となり得る。いくつかの実施形態では、本発明の修飾核酸分子の修飾ヌクレオシドとヌクレオチドは、その全容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２１３８５３０号に記載のＯ保護化合物を用いて合成され得る。
【００４８】
ある特定の実施形態では、修飾核酸分子はｍＲＮＡを含み得る。特定の実施形態では、修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）は、ｃＤＮＡに由来し得る。ある特定の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、少なくとも２つのヌクレオシド修飾を含み得る。１つの実施形態では、ヌクレオシド修飾は、５−メチルシトシンとシュードウリジンから選択され得る。別の実施形態では、ヌクレオシド修飾のうち少なくとも１つは５−メチルシトシンおよび／またはシュードウリジンではない。ある特定の実施形態では、送達剤は、ｍｍＲＮＡの局所および全身送達のための製剤を含み得る。修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡの製剤は、限定ではないがリピドイド、リポソームおよび脂質ナノ粒子、速やかに排出される脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、ペプチドおよびタンパク質、少なくとも１つの化学修飾およびコンジュゲーション、エンハンサー、および／または細胞から選択され得る。
【００４９】
１つの実施形態では、本発明の修飾核酸分子は、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に少なくとも２つの終止コドンを含み得る。終止コドンは、ＴＧＡ、ＴＡＡおよびＴＡＧから選択され得る。１つの実施形態では、本発明の核酸は、終止コドンＴＧＡおよび１つの追加の終止コドンを含む。さらなる実施形態では、追加の終止コドンはＴＡＡであり得る。別の実施形態では、修飾核酸分子は、３つの終止コドンを含み得る。
【００５０】
核酸の他の成分は、修飾核酸分子においては任意であるが、これらの成分はいくつかの実施形態では有利であり得る。
非翻訳領域（ＵＴＲ）
遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）は転写されるが翻訳されない。５’ＵＴＲは転写開始部位から始まり開始コドンへと続くが、開始コドンは含まない。それに対して３’ＵＴＲは、終止コドンの直後から始まって転写終結シグナルまで続く。核酸分子の安定性と翻訳という点で、ＵＴＲが果たす調節的役割に関する根拠が強くなっている。ＵＴＲの調節的特徴は、分子の安定性を増大させるために本発明の修飾ｍＲＮＡ分子に組み込まれ得る。特定の特徴は、望まれない器官の部位に誤って向けられた場合に転写の発現低下の制御を確保するために組み込んでもよい。
【００５１】
５’ＵＴＲと翻訳開始
天然の５’ＵＴＲは、翻訳開始において役割を果たす特徴をもつ。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般に知られているコザック配列に似た特徴を有する。コザック配列は、ＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号１）の配列を有し、ここでＲは、別のＧが続いている開始コドン（ＡＵＧ）上流のプリン（アデニンまたはグアニン）の３つの基である。５’ＵＴＲは、伸長因子の結合に関与する二次構造を形成することでも知られている。
【００５２】
特定の標的器官の大量に発現した遺伝子に典型的に見出される特徴を操作することで、本発明の修飾ｍＲＮＡ分子の安定性とタンパク質産生を増大することができる。例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポプロテインＡ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、αフェトプロテイン、エリスロポエチンまたは第ＶＩＩＩ因子などの肝臓に発現するｍＲＮＡの５’ＵＴＲの導入は、肝細胞株または肝臓においてｍｍＲＮＡなどの修飾核酸分子の発現を増大させるのに使用され得る。同様に、他の組織特異的ｍＲＮＡの５’ＵＴＲを使用してその組織における発現を向上させることが、筋肉（ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ハーキュリン（Ｈｅｒｃｕｌｉｎ））、内皮細胞（Ｔｉｅ−１、ＣＤ３６）、骨髄系細胞（Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ−１、ｉ−ＮＯＳ）、白血球（ＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織（ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）および肺上皮細胞（ＳＰ−Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）において可能である。
【００５３】
他の非ＵＴＲ配列を、本発明の修飾核酸分子の５’ＵＴＲ（または３’ＵＴＲ）に組み込んでもよい。例えば、イントロンまたはイントロンの一部の配列を本発明の修飾ｍＲＮＡの隣接領域に組み込んでもよい。イントロン配列の組込みは、ｍＲＮＡレベルならびにタンパク質産生を増加させ得る。
【００５４】
３’ＵＴＲとＡＵリッチ領域
３’ＵＴＲは、そこに埋め込まれたアデノシン（Ａ）とウリジン（Ｕ）の配列を有することが知られている。これらのＡＵに富む特徴は、代謝率の高い遺伝子に特によく見られる。配列特徴と機能特性に基づき、ＡＵリッチ領域（ＡＲＥ）は３つのクラスに分類できる（Ｃｈｅｎｅｔａｌ，  １９９５）：クラスＩのＡＲＥはＵリッチ領域内にＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散した複製を含む。Ｃ−ＭｙｃとＭｙｏＤは、クラスＩのＡＲＥを含む。クラスＩＩのＡＲＥは、２つ以上の重複するＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）（配列番号２）九量体を有する。このタイプのＡＲＥを含む分子は、ＧＭ−ＣＳＦとＴＮＦ−ａを含む。クラスＩＩＩのＡＲＥはあまり記述されていない。これらのＵリッチ領域はＡＵＵＵＡモチーフを含んでいない。ｃ−Ｊｕｎとミオゲニンはこのクラスのよく研究された２例である。ＡＲＥに結合するほとんどのタンパク質がメッセンジャーを不安定化させることがわかっているが、ＥＬＡＶファミリーのメンバーは、もっとも特記すべきはＨｕＲであるが、ｍＲＮＡの安定性を増加させることが記載されている。ＨｕＲは、全て３つのクラスのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を核酸分子の３’ＵＴＲ内に設計すると、ＨｕＲ結合がもたらされ、インビボでのメッセージが安定しよう。
【００５５】
３’ＵＴＲ  ＡＵリッチ領域（ＡＲＥ）の導入、除去または修飾は、本発明の修飾ｍＲＮＡの安定性を調節するのに使用され得る。特定の修飾ｍＲＮＡを設計する際、ＡＲＥの１つ以上の複製が導入され得、本発明の修飾ｍＲＮＡの安定性が低下し、それによって翻訳が削減され、得られるタンパク質の産生が減少する。
【００５６】
同様に、ＡＲＥは、細胞内の安定性を増加させるために特定され、除去または変異され得るので、得られるタンパク質の翻訳と産生が増加する。トランスフェクションの実験が、本発明の修飾ｍＲＮＡを用いて適切な細胞株において実施でき、タンパク質産生がトランスフェクション後の様々な時点でアッセイできる。例えば、細胞は、異なるＡＲＥ操作分子を用いて、関連のタンパク質に対しＥＬＩＳＡキットを使用し、トランスフェクション後６時間、１２時間、２４時間、４８時間および７日で産生されるタンパク質をアッセイすることで、トランスフェクションされ得る。
【００５７】
マイクロＲＮＡ結合部位の組込み
マイクロＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ）は、１９〜２５ヌクレオチド長の非翻訳ＲＮＡであり、核酸分子の３’ＵＴＲに結合し、核酸分子の安定性を低下させるかまたは翻訳を阻害することのいずれかにより遺伝子発現を低下させる。本発明の修飾ｍＲＮＡは、１つ以上のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列またはマイクロＲＮＡシードを含み得る。そのような配列は、その全容が参照として本明細書に組み込まれる米国特許公報第２００５／０２６１２１８号および米国特許公報第２００５／００５９００５号に教示されているような、あらゆる既知のマイクロＲＮＡに対応し得る。
【００５８】
マイクロＲＮＡ配列は、「シード領域」すなわち成熟マイクロＲＮＡの２〜８位の領域の配列を含み、この配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列に対し完璧なワトソン−クリック相補性を有する。マイクロＲＮＡシードは、成熟マイクロＲＮＡの２〜８または２〜７位を含み得る。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡシードは、７ヌクレオチド（例えば成熟マイクロＲＮＡの２〜８のヌクレオチド）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ標的内のシード相補部位はマイクロＲＮＡの１位の反対のアデニン（Ａ）に隣接している。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡシードは、６ヌクレオチド（例えば成熟マイクロＲＮＡの２〜７のヌクレオチド）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ標的内のシード相補部位はマイクロＲＮＡの１位の反対のアデニン（Ａ）に隣接している。たとえば、いずれもその全容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｒｉｍｓｏｎ  Ａ，  Ｆａｒｈ  ＫＫ，  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＷＫ，  Ｇａｒｒｅｔｔ−Ｅｎｇｅｌｅ  Ｐ，  Ｌｉｍ  ＬＰ，  Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰおよびＭｏｌ  Ｃｅｌｌ．  ２００７  Ｊｕｌ  ６；２７（１）：９１−１０５を参照されたい。マイクロＲＮＡシードの塩基は標的配列と完全な相補性を有する。目的のマイクロＲＮＡが入手可能であれば、マイクロＲＮＡ標的配列を本発明の修飾ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに設計することで、分子を分解または翻訳低下の標的にできる。このプロセスは、核酸分子送達後のオフターゲット効果の危険性を低減させよう。マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ標的領域およびそれらの発現パターンと生物学における役割の特定が報告されている（Ｂｏｎａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２０１０  １１：９４３−９４９；  Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６；  Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ａｎｄ  Ｒａｏ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２０１２  ２６：４０４−４１３  （２０１１  Ｄｅｃ  ２０．  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）；  Ｂａｒｔｅｌ  Ｃｅｌｌ  ２００９  １３６：２１５−２３３；  Ｌａｎｄｇｒａｆ  ｅｔ  ａｌ，
Ｃｅｌｌ，  ２００７  １２９：１４０１−１４１４；  全てその全容を参照により本明細書に組み込む）。
【００５９】
例えば、修飾核酸分子が修飾ｍＲＮＡであって、肝臓への送達は意図しなかったにも関わらず肝臓に送達されてしまった場合、肝臓に多いマイクロＲＮＡのｍｉＲ−１２２は、ｍｉＲ−１２２の１つ以上の標的部位が修飾ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに設計されれば、目的の遺伝子の発現を阻害できる。異なるマイクロＲＮＡへの１つ以上の結合部位の導入は、修飾核酸分子および／または修飾ｍＲＮＡの寿命、安定性およびタンパク質翻訳をさらに減少させるように設計できる。
【００６０】
ここでは、「マイクロＲＮＡ部位」という用語は、マイクロＲＮＡ標的部位もしくはマイクロＲＮＡ認識部位、またはマイクロＲＮＡが結合または会合する任意のヌクレオチド配列を指す。「結合」は、伝統的なワトソン−クリックのハイブリダイゼーション規則にしたがい得、またはマイクロＲＮＡと標的配列のマイクロＲＮＡ部位での、またはそれに隣接しての任意の安定な結合を反映し得ることを理解すべきである。
【００６１】
反対に、本発明の修飾ｍＲＮＡの目的のためには、特定の組織におけるタンパク質発現を増加させるために、マイクロＲＮＡ結合部位はそれらが自然に生じる配列の外側に設計され得る（すなわち配列から除去される）。例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位を除去して肝臓におけるタンパク質発現を増加させてよい。複数の組織における発現の調節は、１またはいくつかのマイクロＲＮＡ結合部位の導入または除去を通じて達成できる。
【００６２】
マイクロＲＮＡがｍＲＮＡを調節することでタンパク質発現が調節されることがわかっている組織の例には、限定ではなく、肝臓（ｍｉＲ−１２２）、筋肉（ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１２６）、骨髄系細胞（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７）、脂肪組織（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ−１ｄ、ｍｉＲ−１４９）、腎臓（ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４）および肺上皮細胞（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１２６）が含まれる。マイクロＲＮＡは、血管新生（ｍｉＲ−１３２）などの複雑な生物学的過程も調節できる（Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６；その全容が参照により本明細書に組み込まれる）。本発明の修飾ｍＲＮＡにおいては、そのような過程に関与するマイクロＲＮＡの結合部位は除去または導入され得、修飾ｍＲＮＡの発現を生物学的に適切な細胞タイプまたは適切な生物学的過程のコンテクストに合わせる。
【００６３】
最後に、異なる細胞タイプにおけるマイクロＲＮＡの発現パターンの理解を通じ、修飾ｍＲＮＡを、特定の細胞タイプにおいて、または特定の生物学的条件下のみで、より標的化して発現するように設計できる。組織に特異的なマイクロＲＮＡ結合部位の導入を通じて、修飾ｍＲＮＡは、組織におけるタンパク質の発現または生物学的条件のコンテクストにおいて最適になるよう設計され得る。
【００６４】
トランスフェクションの実験は、適切な細胞株において、操作された修飾ｍＲＮＡを用いて実施でき、トランスフェクション後の様々な時点でタンパク質産生がアッセイできる。例えば、細胞は、異なるマイクロＲＮＡ結合部位操作修飾ｍＲＮＡを用いて、関連のタンパク質に対しＥＬＩＳＡキットを使用し、トランスフェクション後６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間および７日で産生されるタンパク質をアッセイすることで、トランスフェクションされ得る。インビボの実験は、製剤された修飾ｍＲＮＡの組織特異的発現の変化を検査するために、マイクロＲＮＡ結合部位操作分子を用いて実施することもできる。
【００６５】
５’キャッピング
ｍＲＮＡの５’キャップ構造は核酸搬出に関与し、ｍＲＮＡの安定性を増加させ、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合するが、これはＣＢＰとポリ（Ａ）結合タンパク質の結合を通じて細胞内のｍＲＮＡ安定性と翻訳能力を担い、成熟環状ｍＲＮＡ種を形成する。キャップは、ｍＲＮＡのスライシングの間、５’近位イントロンの除去をさらに補助する。
【００６６】
内因性ｍＲＮＡ分子は、５’末端にキャップされ得、ｍＲＮＡ分子の末端グアノシンキャップ残基と５’末端転写センスヌクレオチドの間に５’−ｐｐｐ−５’−三リン酸結合が生じる。この５’−グアニル酸キャップは次にメチル化されてＮ７−メチル−グアニル酸残基を生成し得る。ｍＲＮＡの５’末端の末端および／または末端前（ａｎｔｅｔｅｒｍｉｎａｌ）の転写ヌクレオチドのリボース糖も所望により２’−Ｏ−メチル化されていてよい。グアニル酸キャップ構造の加水分解と切断による５’キャップ除去は、ｍＲＮＡ分子などの核酸分子を分解の標的にし得る。
【００６７】
本発明の修飾ｍＲＮＡに対する修飾は、キャップ除去を回避する加水分解抵抗性のキャップ構造を生成し得るので、ｍＲＮＡの半減期が延長される。キャップ構造の加水分解には５’−ｐｐｐ−５’ホスホロジエステル結合の切断が必要なので、キャッピング反応の間修飾ヌクレオチドが使用され得る。例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（マサチューセッツ州イプスウィッチ）のワクチニアキャッピング酵素をα−チオ−グアノシンヌクレオチドとともに製造者の指示に従い使用して、５’−ｐｐｐ−５’キャップ内にホスホロチオエート結合を形成してよい。α−メチル−ホスホネートおよびセレノ−リン酸ヌクレオチドなどの追加の修飾グアノシンヌクレオチドを使用してもよい。
【００６８】
追加の修飾には、限定ではなく、糖環の２’−ヒドロキシル基のｍＲＮＡの５’末端および／または５’末端前のヌクレオチドのリボース糖の２’−Ｏ−メチル化（上述のとおり）が含まれる。複数の異なる５’キャップ構造が、ｍＲＮＡ分子などの核酸分子の５’キャップを生成するのに使用され得る。
【００６９】
キャップ類似体は、本明細書では合成キャップ類似体、化学キャップ、化学キャップ類似体または構造的もしくは機能的キャップ類似体とも呼ばれ、キャップ機能を保持しながら、その化学構造は天然の（すなわち内因性、野生型または生理学的）５’−キャップとは異なる。キャップ類似体は、化学的（すなわち非酵素的）または酵素的に合成され、および／または核酸分子に結合され得る。
【００７０】
例えば、アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）キャップは、５’−５’−三リン酸基で連結された２つのグアニンを含み、一方のグアニンは３’−Ｏ−メチル基のほかにもＮ７メチル基を含む（すなわち、Ｎ７，３’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−三リン酸−５’−グアノシン（ｍ７Ｇ−３’ｍｐｐｐ−Ｇ；同じく３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇとも呼ばれる）。他方の非修飾グアニンの３’−Ｏ原子は、キャッピングされた核酸分子（例えばｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ）の５’末端ヌクレオチドに連結される。Ｎ７−および３’−Ｏ−メチル化グアニンは、キャッピングされた核酸分子（例えばｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ）の末端部分を与える。
【００７１】
別の例となるキャップはｍＣＡＰであり、ＡＲＣＡに似ているが、２’−Ｏ−メチル基をグアノシン上に有する（すなわち、Ｎ７，２’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−三リン酸−５’−グアノシン、ｍ７Ｇｍ−ｐｐｐ−Ｇ）。
【００７２】
キャップ類似体はインビトロ転写反応において核酸分子の同時キャッピングを可能にするが、転写物の最高２０％がキャッピングされていないままであり得る。このことと、内因性の細胞転写機構により産生された核酸の内因性５’キャップ構造とのキャップ類似体の構造的差異は、翻訳能力の低下と細胞安定性の低下につながり得る。
【００７３】
本発明の修飾ｍＲＮＡは、より真正な５’キャップ構造を生成するために、転写後にも酵素を用いてキャッピングされ得る。ここでは「より真正」という語句は、構造的または機能的に内因性または野生型の特徴をよく反映または模倣した特徴を指す。つまり、「より真正」な特徴は、従来技術の合成の特徴または類似体などと比べて内因性、野生型、天然または生理学的な細胞機能および／または構造の良好な代表であるか、または１つ以上の点において対応する内因性、野生型、天然または生理学的な特徴よりも性能がよい。本発明のより真正な５’キャップ構造の非限定的な例は、とりわけ、当技術分野で既知の合成の５’キャップ構造（または野生型、天然または生理学的５’キャップ構造）と比べてキャップ結合タンパク質の結合の増加、半減期の延長、５’エンドヌクレアーゼに対する感受性低下および／または５’キャップ除去の低減を有するものである。例えば、組換えワクチニアウイルスキャッピング酵素および組換え２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素は、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチドの間に正準の５’−５’−三リン酸結合を生成でき、ここでキャップグアニンはＮ７メチル化を含み、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルを含んでいる。このような構造をキャップ１構造と称する。このキャップは、例えば当技術分野で既知の他の５’キャップ類似体と比べて、高度な翻訳能力と細胞安定性および細胞の炎症促進性サイトカインの活性化の低下をもたらす。キャップ構造は、限定ではなく、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ１）、および７ｍＧ（５’）−ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）を含む。
【００７４】
修飾ｍＲＮＡは転写後キャッピングされ得、また、このプロセスはより高効率なので、ほぼ１００％の修飾ｍＲＮＡがキャッピングされ得る。このことは、キャップ類似体がインビトロの転写反応の間にｍＲＮＡに連結される場合のおよそ８０％と対照的である。
【００７５】
本発明によれば、５’末端キャップは内因性キャップまたはキャップ類似体を含み得る。本発明によれば、５’末端キャップは、グアニン類似体を含み得る。有用なグアニン類似体には、限定ではなく、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシンおよび２−アジド−グアノシンが含まれる。
【００７６】
ウイルス配列
限定ではないがオオムギ黄萎ウイルス（ＢＹＤＶ−ＰＡＶ）の翻訳促進配列などの追加のウイルス配列が設計され本発明の修飾ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに挿入され得、ｍＲＮＡの翻訳をインビトロとインビボで刺激し得る。トランスフェクション実験は、適切な細胞株において実施され得、タンパク質産生はＥＬＩＳＡでトランスフェクション後１２時間、２４時間、４８時間、７２時間および７日目にアッセイされ得る。
【００７７】
ＩＲＥＳ配列
さらに、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る修飾ｍＲＮＡが提供される。最初に特徴的ピコルナウイルスＲＮＡとして同定されたＩＲＥＳは、５’キャップ構造の非存在下でタンパク質合成開始における重要な役割を果たす。ＩＲＥＳは、唯一のリボソーム結合部位として作用し得るか、またはｍＲＮＡの複数のリボソーム結合部位の１つとして働き得る。２以上の機能リボソーム結合部位を含む修飾ｍＲＮＡは、リボソームにより独立して翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチドをコードし得る（「複数シストロン核酸分子」）。修飾ｍＲＮＡにＩＲＥＳが与えられると、さらに所望により第２翻訳可能領域が与えられる。本発明にしたがい使用され得るＩＲＥＳ配列の例には、限定ではなく、ピコナウイルス（例えばＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）またはコオロギ麻痺ウイルス（ｃｒｉｃｋｅｔ
ｐａｒａｌｙｓｉｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ）（ＣｒＰＶ）由来のものが含まれる。
【００７８】
ポリＡテール
ＲＮＡプロセスの間、安定性を増加させるために、アデニンヌクレオチドの長鎖（ポリＡテール）が修飾ｍＲＮＡ分子などの修飾核酸分子に付加され得る。転写直後、転写物の３’末端が切断され３’ヒドロキシルを離し得る。次いでポリＡポリメラーゼがアデニンヌクレオチドの鎖をＲＮＡに付加する。このプロセスはポリアデニル化と呼ばれ、例えば、およそ１００から２５０残基長であり得るポリＡテールを付加する。
【００７９】
特定のポリＡテールの長さが本発明の修飾ｍＲＮＡに特定の利点を与えることが発見されている。
一般に、本発明のポリＡテールの長さは、３０ヌクレオチドよりも長い。別の実施形態では、ポリＡテールは、３５ヌクレオチドよりも長い（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００および３，０００ヌクレオチドであるか、これらよりも長い）。いくつかの実施形態では、修飾ｍＲＮＡは、約３０から約３，０００のヌクレオチド（例えば、３０から５０、３０から１００、３０から２５０、３０から５００、３０から７５０、３０から１，０００、３０から１，５００、３０から２，０００、３０から２，５００、５０から１００、５０から２５０、５０から５００、５０から７５０、５０から１，０００、５０から１，５００、５０から２，０００、５０から２，５００、５０から３，０００、１００から５００、１００から７５０、１００から１，０００、１００から１，５００、１００から２，０００、１００から２，５００、１００から３，０００、５００から７５０、５００から１，０００、５００から１，５００、５００から２，０００、５００から２，５００、５００から３，０００、１，０００から１，５００、１，０００から２，０００、１，０００から２，５００、１，０００から３，０００、１，５００から２，０００、１，５００から２，５００、１，５００から３，０００、２，０００から３，０００、２，０００から２，５００および２，５００から３，０００）を含む。
【００８０】
１つの実施形態では、ポリＡテールは、修飾ｍＲＮＡ全体の長さに対し設計される。この設計は、コード領域の長さ、特定の特徴または領域の長さ（隣接領域など）または修飾ｍＲＮＡから発現される最終生成物の長さに基づき得る。
【００８１】
このコンテクストでは、ポリＡテールの長さは、修飾ｍＲＮＡ、その領域または特徴よりも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％長くてよい。ポリＡテールは、それが属する修飾ｍＲＮＡの断片として設計してもよい。このコンテクストでは、ポリＡテールは、分子の全長または分子の全長からポリＡテールを引いたものの１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％以上であり得る。さらに、ポリＡ結合タンパク質のための修飾ｍＲＮＡの操作結合部位とコンジュゲーションは、発現を増加させ得る。
【００８２】
さらに、複数の別個の修飾ｍＲＮＡが、ポリＡテールの３’末端の修飾ヌクレオチドを利用して、３’末端を介してＰＡＢＰ（ポリＡ結合タンパク質）に結合し得る。トランスフェクション実験を、適切な細胞株において実施することができ、タンパク質産生はＥＬＩＳＡでトランスフェクション後１２時間、２４時間、４８時間、７２時間および７日目にアッセイされ得る。
【００８３】
１つの実施形態では、本発明の修飾ｍＲＮＡは、ポリＡ−Ｇカルテットを含むように設計されている。Ｇカルテットは、４つのグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイであり、ＤＮＡとＲＮＡの両方でＧリッチ配列により形成され得る。この実施形態では、ＧカルテットはポリＡテールの末端で組み込まれている。得られたｍｍＲＮＡ分子は、様々な時点で、安定性、タンパク質産生および半減期を含む他のパラメータについてアッセイされる。ポリＡ−Ｇカルテットは、１２０ヌクレオチドのポリＡテールのみを使用したものの少なくとも７５％に相当するタンパク質産生をもたらすことが見出されている。
【００８４】
修飾
本発明の修飾核酸と修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）は、１、２、またはそれより多くの異なる修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾核酸とｍｍＲＮＡは、１、２、またはそれより多くの異なるヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞に導入された修飾核酸またはｍｍＲＮＡ（例えば１つ以上のｍｍＲＮＡ分子を有する）は、非修飾核酸またはｍｍＲＮＡと比べると、細胞内での分解の低減を示す。
【００８５】
修飾核酸とｍｍＲＮＡは、あらゆる有用な修飾、例えば、糖、核酸塩基など上の修飾（例えば、核酸塩基の１つ以上の修飾、例えば、ピリミジン核酸塩基の１個の原子を所望により置換アミノ、所望により置換チオール、所望により置換アルキル（例えば、メチルまたはエチル）、またはハロ（例えば、クロロまたはフルオロ）で置き換えまたは置換、またはヌクレオシド間結合（例えば、ホスホジエステル主鎖への１つ以上の修飾）を含み得る。ある特定の実施形態では、修飾は、糖とヌクレオシド間結合の両方に存在する（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはそれらのハイブリッドに存在するような１または修飾）。さらなる修飾が本明細書に記載される。
【００８６】
本明細書に記載されるように、本発明の修飾核酸とｍｍＲＮＡは、ｍＲＮＡが導入される細胞の自然免疫反応を実質的に誘導しない。ある特定の実施形態では、細胞に導入された修飾核酸分子または修飾核酸分子を細胞内で分解することが望ましい場合がある。例えば、タンパク質産生の精密なタイミングが望ましい場合は、修飾核酸分子または修飾ｍＲＮＡの分解が好ましい場合がある。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は細胞内で定方向の作用を受けることができる、分解ドメインを含む修飾核酸分子を提供する。別の態様では、本開示は、主溝相互作用たとえば結合パートナーの核酸との結合を破壊し得るヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む核酸を提供する（たとえば、修飾ヌクレオチドの主溝相互作用パートナーへの結合親和性が、非修飾ヌクレオチドと比べて低下している）。
【００８７】
修飾核酸とｍｍＲＮＡは、所望により、他の剤（例えば、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒的ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重らせん体形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクターなど）を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド（例えば、ｍｍＲＮＡ分子）を含み得る。これらの修飾核酸とｍｍＲＮＡを以下に詳述する。
【００８８】
修飾核酸
本発明の修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、目的のポリペプチドをコードする連結ヌクレオシドの第１領域、第１領域の５’末端に位置する第１隣接領域、および第１領域の３’末端に位置する第２隣接領域を含み得る。
【００８９】
いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、式（Ｉａ）または式（Ｉａ−１）：
【００９０】
【化１】
2019059793.tif 000002
【００９１】
を有するｎ個の連結ヌクレオシドまたはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｕは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕまたはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、ここでｎｕは０から２の整数であり、各ＲＵは、独立して、Ｈ、ハロまたは所望により置換されているアルキルであり；
【００９２】
【化２】
2019059793.tif 000003
【００９３】
は、単結合かまたは存在せず；
Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ１”、Ｒ２”、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４とＲ５はそれぞれ、存在する場合は、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、所望により置換されているアルキニルオキシ、所望により置換されているアミノアルコキシ、所望により置換されているアルコキシアルコキシ、所望により置換されているヒドロキシアルコキシ、所望により置換されているアミノ、アジド、所望により置換されているアリール、所望により置換されているアミノアルキル、所望により置換されているアミノアルケニル、所望により置換されているアミノアルキニルまたは不存在であり；ここでＲ３とＲ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、Ｒ２”またはＲ５のうち１つ以上との組合せ（例えばＲ１’とＲ３の組合せ、Ｒ１”とＲ３の組合せ、Ｒ２’とＲ３の組合せ、Ｒ２”とＲ３の組合せ、またはＲ５とＲ３の組合せ）は、一緒に、所望により置換されているアルキレンまたは所望により置換されているヘテロアルキレンを形成し得、それらが結合している炭素とともに、所望により置換されているヘテロシクリル（例えば、二環、三環または四環ヘテロシクリル）を提供し；ここで、Ｒ５とＲ１’、Ｒ１”、Ｒ２’またはＲ２”のうち１つ以上との組合せ（例えばＲ１’とＲ５の組合せ、Ｒ１”とＲ５の組合せ、Ｒ２’とＲ５の組合せ、またはＲ２”とＲ５の組合せ）は、一緒に、所望により置換されているアルキレンまたは所望により置換されているヘテロアルキレンを形成し得、それらが結合している炭素とともに、所望により置換されているヘテロシクリル（例えば、二環、三環または四環ヘテロシクリル）を提供し；ここでＲ４とＲ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、Ｒ２”、Ｒ３またはＲ５のうち１つ以上との組合せは、一緒に、所望により置換されているアルキレンまたは所望により置換されているヘテロアルキレンを形成し得、それらが結合している炭素とともに、所望により置換されているヘテロシクリル（例えば、二環、三環または四環ヘテロシクリル）を提供し；
ｍ’とｍ’’はそれぞれ、独立して、０から３の整数（例えば、０から２、０から１、１から３または１から２）であり；
Ｙ１、Ｙ２およびＹ３はそれぞれ、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−ＮＲＮ１−、所望により置換されているアルキレンまたは所望により置換されているヘテロアルキレンであり、ここでＲＮ１はＨ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているアリールまたは不存在であり；
各Ｙ４は独立して、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、ボラニル（ｂｏｒａｎｙｌ）、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、所望により置換されているアルキニルオキシ、所望により置換されているチオアルコキシ、所望により置換されているアルコキシアルコキシまたは所望により置換されているアミノであり；
各Ｙ５は独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、所望により置換されているアルキレン（例えば、メチレン）または所望により置換されているヘテロアルキレンであり；
ｎは１から１００，０００の整数であり；
Ｂは、核酸塩基（例えばプリン、ピリミジンまたはその誘導体）であり、ここでＢとＲ１’の組合せ、ＢとＲ２’の組合せ、ＢとＲ１”の組合せ、またはＢとＲ２”の組合せは、それらが結合している炭素とともに、所望により二環基（例えば二環ヘテロシクリル）を形成し得、またはここでＢ、Ｒ１”とＲ３の組合せ、またはＢ、Ｒ２”とＲ３の組合せは、所望により、本明細書の式（ＩＩｏ）〜（ＩＩｐ）などにある三環基または四環基（例えば三環または四環ヘテロシクリル）を形成し得る）。いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは修飾リボースを含む。
【００９４】
いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、式（Ｉａ−２）〜（Ｉａ−５）を有するｎ個の連結ヌクレオシドまたはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含む。
【００９５】
【化３】
2019059793.tif 000004
【００９６】
いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、式（Ｉｂ）または式（Ｉｂ−１）：
【００９７】
【化４】
2019059793.tif 000005
【００９８】
を有するｎ個の連結ヌクレオシドまたはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含み、ここで
Ｕは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕまたはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、ここでｎｕは０から２の整数であり、各ＲＵは、独立して、Ｈ、ハロまたは所望により置換されているアルキルであり；
【００９９】
【化５】
2019059793.tif 000006
【０１００】
は、単結合かまたは存在せず；
Ｒ１、Ｒ３’、Ｒ３”およびＲ４はそれぞれ、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、所望により置換されているアルキニルオキシ、所望により置換されているアミノアルコキシ、所望により置換されているアルコキシアルコキシ、所望により置換されているヒドロキシアルコキシ、所望により置換されているアミノ、アジド、所望により置換されているアリール、所望により置換されているアミノアルキル、所望により置換されているアミノアルケニル、所望により置換されているアミノアルキニルまたは不存在であり；ここでＲ１とＲ３’の組合せまたはＲ１とＲ３”の組合せは、一緒に、所望により置換されているアルキレンまたは所望により置換されているヘテロアルキレンを形成し得（例えばロックド核酸を産生する）；
各Ｒ５は、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、所望により置換されているアルキニルオキシ、所望により置換されているアミノアルコキシ、所望により置換されているアルコキシアルコキシまたは不存在であり；
Ｙ１、Ｙ２およびＹ３はそれぞれ、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−ＮＲＮ１−、所望により置換されているアルキレンまたは所望により置換されているヘテロアルキレンであり、ここでＲＮ１はＨ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、または所望により置換されているアリールであり；
各Ｙ４は独立して、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、ボラニル、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、所望により置換されているアルキニルオキシ、所望により置換されているアルコキシアルコキシまたは所望により置換されているアミノであり；
ｎは１から１００，０００の整数であり；
Ｂは核酸塩基である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、式（Ｉｃ）：
【０１０２】
【化６】
2019059793.tif 000007
【０１０３】
を有するｎ個の連結ヌクレオシドまたはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｕは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕまたはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、ここでｎｕは０から２の整数であり、各ＲＵは、独立して、Ｈ、ハロまたは所望により置換されているアルキルであり；
【０１０４】
【化７】
2019059793.tif 000008
【０１０５】
は、単結合かまたは存在せず；
Ｂ１、Ｂ２およびＢ３はそれぞれ、独立して、核酸塩基（例えばプリン、ピリミジン、または本明細書に記載されるようなその誘導体）、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、所望により置換されているアルキニルオキシ、所望により置換されているアミノアルコキシ、所望により置換されているアルコキシアルコキシ、所望により置換されているヒドロキシアルコキシ、所望により置換されているアミノ、アジド、所望により置換されているアリール、所望により置換されているアミノアルキル、所望により置換されているアミノアルケニルまたは所望により置換されているアミノアルキニルであり、ここでＢ１、Ｂ２とＢ３のうち１つだけが核酸塩基であり；
Ｒｂ１、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒ３およびＲ５はそれぞれ、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、所望により置換されているアルキニルオキシ、所望により置換されているアミノアルコキシ、所望により置換されているアルコキシアルコキシ、所望により置換されているヒドロキシアルコキシ、所望により置換されているアミノ、アジド、所望により置換されているアリール、所望により置換されているアミノアルキル、所望により置換されているアミノアルケニルまたは所望により置換されているアミノアルキニルであり；
Ｙ１、Ｙ２およびＹ３はそれぞれ、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−ＮＲＮ１−、所望により置換されているアルキレンまたは所望により置換されているヘテロアルキレンであり、ここでＲＮ１はＨ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、または所望により置換されているアリールであり；
各Ｙ４は独立して、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、ボラニル、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、所望により置換されているアルキニルオキシ、所望により置換されているアルコキシアルコキシまたは所望により置換されているアミノであり；
各Ｙ５は独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、所望により置換されているアルキレン（例えば、メチレン）または所望により置換されているヘテロアルキレンであり；
ｎは１から１００，０００の整数であり；
ここでＵを含む環は１つ以上の二重結合を含み得る。
【０１０６】
特定の実施形態では、Ｕを含む環は、Ｕ−ＣＢ３Ｒｂ３の間またはＣＢ３Ｒｂ３−ＣＢ２Ｒｂ２の間に二重結合をもたない。
いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、式（Ｉｄ）：
【０１０７】
【化８】
2019059793.tif 000009
【０１０８】
を有するｎ個の連結ヌクレオシドまたはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｕは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕまたはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、ここでｎｕは０から２の整数であり、各ＲＵは、独立して、Ｈ、ハロまたは所望により置換されているアルキルであり；
各Ｒ３は、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、所望により置換されているアルキニルオキシ、所望により置換されているアミノアルコキシ、所望により置換されているアルコキシアルコキシ、所望により置換されているヒドロキシアルコキシ、所望により置換されているアミノ、アジド、所望により置換されているアリール、所望により置換されているアミノアルキル、所望により置換されているアミノアルケニルまたは所望により置換されているアミノアルキニルであり；
Ｙ１、Ｙ２およびＹ３はそれぞれ、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−ＮＲＮ１−、所望により置換されているアルキレンまたは所望により置換されているヘテロアルキレンであり、ここでＲＮ１はＨ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、または所望により置換されているアリールであり；
各Ｙ４は独立して、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、ボラニル、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、所望により置換されているアルキニルオキシ、所望により置換されているアルコキシアルコキシまたは所望により置換されているアミノであり；
各Ｙ５は独立して、Ｏ、Ｓ、所望により置換されているアルキレン（例えば、メチレン）または所望により置換されているヘテロアルキレンであり；
ｎは１から１００，０００の整数であり；
Ｂは、核酸塩基（例えばプリン、ピリミジン、またはその誘導体）である。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、修飾核酸分子または修飾ｍＲＮＡは、式（Ｉｅ）：
【０１１０】
【化９】
2019059793.tif 000010
【０１１１】
を有するｎ個の連結ヌクレオシドまたはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｕ’とＵ”はそれぞれ、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕ、またはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、ここでｎｕは０から２の整数であり、各ＲＵは、独立して、Ｈ、ハロまたは所望により置換されているアルキルであり；
各Ｒ６は、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、所望により置換されているアルキニルオキシ、所望により置換されているアミノアルコキシ、所望により置換されているアルコキシアルコキシ、所望により置換されているヒドロキシアルコキシ、所望により置換されているアミノ、アジド、所望により置換されているアリール、所望により置換されているアミノアルキル、所望により置換されているアミノアルケニルまたは所望により置換されているアミノアルキニルであり；
各Ｙ５’は独立して、Ｏ、Ｓ、所望により置換されているアルキレン（例えば、メチレンまたはエチレン）であるか、または所望により置換されているヘテロアルキレンであり；
ｎは１から１００，０００の整数であり；
Ｂは、核酸塩基（例えばプリン、ピリミジン、またはその誘導体）である。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、式（Ｉｆ）または（Ｉｆ−１）：
【０１１３】
【化１０】
2019059793.tif 000011
【０１１４】
を有するｎ個の連結ヌクレオシドまたはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｕ’とＵ”はそれぞれ、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕまたはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、ここでｎｕは０から２の整数であり、各ＲＵは、独立して、Ｈ、ハロまたは所望により置換されているアルキルであり（例えば、Ｕ’はＯでありＵ”はＮである）；
【０１１５】
【化１１】
2019059793.tif 000012
【０１１６】
は、単結合かまたは存在せず；
Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ１”、Ｒ２”、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、所望により置換されているアルキニルオキシ、所望により置換されているアミノアルコキシ、所望により置換されているアルコキシアルコキシ、所望により置換されているヒドロキシアルコキシ、所望により置換されているアミノ、アジド、所望により置換されているアリール、所望により置換されているアミノアルキル、所望により置換されているアミノアルケニル、所望により置換されているアミノアルキニルまたは不存在であり；ここでＲ１’とＲ３の組合せ、Ｒ１”とＲ３の組合せ、Ｒ２’とＲ３の組合せまたはＲ２”とＲ３の組合せは、一緒に、所望により置換されているアルキレンまたは所望により置換されているヘテロアルキレンを形成し得（例えばロックド核酸を産生する）；ｍ’とｍ”はそれぞれ、独立して、０から３の整数（例えば、０から２、０から１、１から３または１から２）であり；
Ｙ１、Ｙ２およびＹ３はそれぞれ、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−ＮＲＮ１−、所望により置換されているアルキレンまたは所望により置換されているヘテロアルキレンであり、ここでＲＮ１はＨ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているアリールまたは不存在であり；
各Ｙ４は独立して、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、ボラニル、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、所望により置換されているアルキニルオキシ、所望により置換されているアルコキシアルコキシまたは所望により置換されているアミノであり；
各Ｙ５は独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、所望により置換されているアルキレン（例えば、メチレン）または所望により置換されているヘテロアルキレンであり；
ｎは１から１００，０００の整数であり；
Ｂは、核酸塩基（例えばプリン、ピリミジン、またはその誘導体）である。
【０１１７】
修飾核酸またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態（例えば、（Ｉａ）〜（Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））では、Ｕを含む環は１つか２つの二重結合を有する。
【０１１８】
修飾核酸またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）〜Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））では、存在する場合は、Ｒ１、Ｒ１’およびＲ１”はそれぞれＨである。さらなる実施形態では、存在する場合は、Ｒ２、Ｒ２’およびＲ２”はそれぞれ、独立して、Ｈ、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシ、所望により置換されているアルコキシ（例えば、メトキシまたはエトキシ）または所望により置換されているアルコキシアルコキシである。特定の実施形態では、アルコキシアルコキシは、−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’であり、ここでｓ１は１から１０の整数（例えば、１から６または１から４）であり、ｓ２とｓ３はそれぞれ、独立して、０から１０の整数（例えば、０から４、０から６、１から４、１から６または１から１０）であり、Ｒ’はＨまたはＣ１〜２０アルキルである）。いくつかの実施形態では、ｓ２は０であり、ｓ１は１または２であり、ｓ３は０または１であり、Ｒ’はＣ１〜６アルキルである。
【０１１９】
修飾核酸またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）〜Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））では、存在する場合は、Ｒ２、Ｒ２’およびＲ２”はそれぞれＨである。さらなる実施形態では、存在する場合は、Ｒ１、Ｒ１’およびＲ１”はそれぞれ、独立して、Ｈ、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシ、所望により置換されているアルコキシ（例えば、メトキシまたはエトキシ）または所望により置換されているアルコキシアルコキシである。特定の実施形態では、アルコキシアルコキシは、−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’であり、ここでｓ１は１から１０の整数（例えば、１から６または１から４）であり、ｓ２とｓ３はそれぞれ、独立して、０から１０の整数（例えば、０から４、０から６、１から４、１から６または１から１０）であり、Ｒ’はＨまたはＣ１〜２０アルキルである）。いくつかの実施形態では、ｓ２は０であり、ｓ１は１または２であり、ｓ３は０または１であり、Ｒ’はＣ１〜６アルキルである。
【０１２０】
修飾核酸またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）〜Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））では、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ、独立して、Ｈ、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルコキシ（例えば、メトキシまたはエトキシ）または所望により置換されているアルコキシアルコキシである。特定の実施形態では、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はＨであり、Ｒ５はＨであり、またはＲ３、Ｒ４およびＲ５は全てＨである。特定の実施形態では、Ｒ３はＣ１〜６アルキルであり、Ｒ４はＣ１〜６アルキルであり、Ｒ５はＣ１〜６アルキルであり、またはＲ３、Ｒ４およびＲ５は全てＣ１〜６アルキルである。特定の実施形態では、Ｒ３とＲ４はいずれもＨであり、Ｒ５はＣ１〜６アルキルである。
【０１２１】
修飾核酸またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）〜Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））では、Ｒ３とＲ５は、一緒に、所望により置換されているアルキレンまたは所望により置換されているヘテロアルキレンを形成し、それらが結合している炭素とともに、所望により置換されているヘテロシクリル（例えば、トランス−３’，４’類似体などの二環、三環または四環ヘテロシクリル）を与え、ここでＲ３とＲ５は、一緒に、ヘテロアルキレン（例えば、−（ＣＨ２）ｂ１Ｏ（ＣＨ２）ｂ２Ｏ（ＣＨ２）ｂ３−、ここでｂ１、ｂ２およびｂ３はそれぞれ、独立して、０から３の整数である）を形成する。
【０１２２】
修飾核酸またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）〜Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））では、Ｒ３とＲ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、Ｒ２”またはＲ５のうちの１つ以上が、一緒に、所望により置換されているアルキレンまたは所望により置換されているヘテロアルキレンを形成し、それらが結合している炭素とともに、所望により置換されているヘテロシクリル（例えば、二環、三環または四環ヘテロシクリルを与え、Ｒ３とＲ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、Ｒ２”またはＲ５のうちの１つ以上が、一緒に、ヘテロアルキレン（例えば、−（ＣＨ２）ｂ１Ｏ（ＣＨ２）ｂ２Ｏ（ＣＨ２）ｂ３−、ここでｂ１、ｂ２およびｂ３はそれぞれ、独立して、０から３の整数である）を形成する。
【０１２３】
修飾核酸またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）〜Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））では、Ｒ５とＲ１’、Ｒ１”、Ｒ２’またはＲ２”のうちの１つ以上が、一緒に、所望により置換されているアルキレンまたは所望により置換されているヘテロアルキレンを形成し、それらが結合している炭素とともに、所望により置換されているヘテロシクリル（例えば、二環、三環または四環ヘテロシクリルを与え、Ｒ５とＲ１’、Ｒ１”、Ｒ２’またはＲ２”のうちの１つ以上が、一緒に、ヘテロアルキレン（例えば、−（ＣＨ２）ｂ１Ｏ（ＣＨ２）ｂ２Ｏ（ＣＨ２）ｂ３−、ここでｂ１、ｂ２およびｂ３はそれぞれ、独立して、０から３の整数である）を形成する。
【０１２４】
修飾核酸またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）〜Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））では、各Ｙ２は、独立して、Ｏ、Ｓまたは−ＮＲＮ１−であり、ここでＲＮ１はＨ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニルまたは所望により置換されているアリールである。特定の実施形態では、Ｙ２はＮＲＮ１−であり、ここでＲＮ１はＨまたは所望により置換されているアルキルである（例えばメチル、エチル、イソプロピルまたはｎ−プロピルなどのＣ１〜６アルキル）。
【０１２５】
修飾核酸またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）〜Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））では、各Ｙ３は、独立して、ＯまたはＳである。
【０１２６】
修飾核酸またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）〜Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））では、Ｒ１はＨであり；各Ｒ２は、独立して、Ｈ、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシ、所望により置換されているアルコキシ（例えば、メトキシまたはエトキシ）または所望により置換されているアルコキシアルコキシ（例えば、−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’、ここでｓ１は１から１０の整数（例えば、１から６、または１から４）であり、ｓ２とｓ３はそれぞれ、独立して、０から１０の整数（例えば、０から４、０から６、１から４、１から６、または１から１０）であり、Ｒ’はＨまたはＣ１〜２０アルキルであり、たとえばここでｓ２は０であり、ｓ１は１または２であり、ｓ３は０または１であり、Ｒ’はＣ１〜６アルキルである）；各Ｙ２は、独立して、Ｏまたは−ＮＲＮ１−であり、ここでＲＮ１はＨ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニルまたは所望により置換されているアリール（例えば、ここでＲＮ１はＨまたは所望により置換されているアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピルまたはｎ−プロピルなどのＣ１−６アルキル）である）であり；各Ｙ３は、独立して、ＯまたはＳ（例えば、Ｓ）である。さらなる実施形態では、Ｒ３は、Ｈ、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルコキシ（例えば、メトキシまたはエトキシ）または所望により置換されているアルコキシアルコキシである。さらなる実施形態では、各Ｙ１は、独立して、Ｏまたは−ＮＲＮ１−であり、ここでＲＮ１は、Ｈ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニルまたは所望により置換されているアリール（例えば，ここでＲＮ１はＨまたは所望により置換されているアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピルまたはｎ−プロピルなどのＣ１〜６アルキル）である）であり；各Ｙ４は、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているチオアルコキシ、所望により置換されているアルコキシアルコキシまたは所望により置換されているアミノである。
【０１２７】
修飾核酸またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）〜（Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））では、各Ｒ１は、独立して、Ｈ、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシ、所望により置換されているアルコキシ（例えば、メトキシまたはエトキシ）または所望により置換されているアルコキシアルコキシ（例えば、−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’、ここでｓ１は１から１０の整数（例えば、１から６、または１から４）であり、ｓ２とｓ３はそれぞれ、独立して、０から１０の整数（例えば、０から４、０から６、１から４、１から６、または１から１０）であり、Ｒ’はＨまたはＣ１〜２０アルキルであり、たとえばここでｓ２は０であり、ｓ１は１または２であり、ｓ３は０または１であり、Ｒ’はＣ１〜６アルキルである）；Ｒ２はＨであり；各Ｙ２は、独立して、Ｏまたは−ＮＲＮ１−であり、ここでＲＮ１はＨ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニルまたは所望により置換されているアリール（例えば、ここでＲＮ１はＨまたは所望により置換されているアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピルまたはｎ−プロピルなどのＣ１〜６アルキル）である）であり；各Ｙ３は、独立して、ＯまたはＳ（例えば、Ｓ）である。さらなる実施形態では、Ｒ３は、Ｈ、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルコキシ（例えば、メトキシまたはエトキシ）または所望により置換されているアルコキシアルコキシである。さらなる実施形態では、各Ｙ１は、独立して、Ｏまたは−ＮＲＮ１−であり、ここでＲＮ１は、Ｈ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニルまたは所望により置換されているアリール（例えば，ここでＲＮ１はＨまたは所望により置換されているアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピルまたはｎ−プロピルなどのＣ１〜６アルキル）である）であり；各Ｙ４は、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているチオアルコキシ、所望により置換されているアルコキシアルコキシまたは所望により置換されているアミノである。
【０１２８】
修飾核酸またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）〜（Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））では、Ｕを含む環は、β−Ｄ（例えばβ−Ｄ−リボ）立体配置である。
【０１２９】
修飾核酸またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）〜（Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））では、Ｕを含む環は、α−Ｌ（例えばα−Ｌ−リボ）立体配置である。
【０１３０】
修飾核酸またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）〜（Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））では、１つ以上のＢはシュードウリジン（ψ）または５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）ではない。いくつかの実施形態では、約１０％から約１００％のＢ核酸塩基がψまたはｍ５Ｃではない（例えば、Ｂのｎ数の１０％から２０％、１０％から３５％、１０％から５０％、１０％から６０％、１０％から７５％、１０％から９０％、１０％から９５％、１０％から９８％、１０％から９９％、２０％から３５％、２０％から５０％、２０％から６０％、２０％から７５％、２０％から９０％、２０％から９５％、２０％から９８％、２０％から９９％、２０％から１００％、５０％から６０％、５０％から７５％、５０％から９０％、５０％から９５％、５０％から９８％、５０％から９９％、５０％から１００％、７５％から９０％、７５％から９５％、７５％から９８％、７５％から９９％および７５％から１００％がψまたはｍ５Ｃではない）。いくつかの実施形態では、Ｂはψまたはｍ５Ｃではない。
【０１３１】
修飾核酸またはｍｍＲＮＡのいくつかの実施形態（例えば、式（Ｉａ）〜（Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ−１）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））では、Ｂがシトシン、グアニン、ウラシルおよびアデンから選択された非修飾核酸塩基である場合、Ｙ１、Ｙ２またはＹ３の少なくとも１つはＯではない。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは修飾リボースを含む。いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、式（ＩＩａ）〜（ＩＩｃ）：
【０１３３】
【化１２】
2019059793.tif 000013
【０１３４】
を有するｎ個の連結ヌクレオシドまたはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含む。特定の実施形態では、ＵはＯまたはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、ここでｎｕは０から２の整数であり、各ＲＵは、独立して、Ｈ、ハロまたは所望により置換されているアルキル（例えば、Ｕは−ＣＨ２−または−ＣＨ−である）である。別の本発明では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、所望により置換されているアルキニルオキシ、所望により置換されているアミノアルコキシ、所望により置換されているアルコキシアルコキシ、所望により置換されているヒドロキシアルコキシ、所望により置換されているアミノ、アジド、所望により置換されているアリール、所望により置換されているアミノアルキル、所望により置換されているアミノアルケニル、所望により置換されているアミノアルキニルまたは存在せず（例えば、Ｒ１とＲ２はそれぞれ、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、所望により置換されているアルキルまたは所望により置換されているアルコキシであり；Ｒ３とＲ４はそれぞれ、独立して、Ｈまたは所望により置換されているアルキルであり；Ｒ５はＨまたはヒドロキシである）、
【０１３５】
【化１３】
2019059793.tif 000014
【０１３６】
は単結合または二重結合である。
特定の実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、式（ＩＩｂ−１）〜（ＩＩｂ−２）：
【０１３７】
【化１４】
2019059793.tif 000015
【０１３８】
を有するｎ個の連結ヌクレオシドまたはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含む。いくつかの実施形態では、ＵはＯまたはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、ここでｎｕは０から２の整数であり、各ＲＵは、独立して、Ｈ、ハロまたは所望により置換されているアルキル（例えば、Ｕは−ＣＨ２−または−ＣＨ−である）である。他の実施形態では、Ｒ１とＲ２はそれぞれ、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、所望により置換されているアルキニルオキシ、所望により置換されているアミノアルコキシ、所望により置換されているアルコキシアルコキシ、所望により置換されているヒドロキシアルコキシ、所望により置換されているアミノ、アジド、所望により置換されているアリール、所望により置換されているアミノアルキル、所望により置換されているアミノアルケニル、所望により置換されているアミノアルキニルまたは存在しない（例えば、Ｒ１とＲ２はそれぞれ、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、所望により置換されているアルキルまたは所望により置換されているアルコキシ、例えば、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、アルキルまたはアルコキシである）。特定の実施形態では、Ｒ２はヒドロキシまたは所望により置換されているアルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシまたは本明細書に記載されるいずれか）である。
【０１３９】
特定の実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、式（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−４）：
【０１４０】
【化１５】
2019059793.tif 000016
【０１４１】
を有するｎ個の連結ヌクレオシドまたはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含む。いくつかの実施形態では、ＵはＯまたはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、ここでｎｕは０から２の整数であり、各ＲＵは、独立して、Ｈ、ハロまたは所望により置換されているアルキル（例えば、Ｕは−ＣＨ２−または−ＣＨ−である）である。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、所望により置換されているアルキニルオキシ、所望により置換されているアミノアルコキシ、所望により置換されているアルコキシアルコキシ、所望により置換されているヒドロキシアルコキシ、所望により置換されているアミノ、アジド、所望により置換されているアリール、所望により置換されているアミノアルキル、所望により置換されているアミノアルケニル、所望により置換されているアミノアルキニルまたは存在しない（例えば、Ｒ１とＲ２はそれぞれ、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、所望により置換されているアルキルまたは所望により置換されているアルコキシ、例えば、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、アルキルまたはアルコキシであり；各Ｒ３は、独立して、Ｈまたは所望により置換されているアルキルである））。特定の実施形態では、Ｒ２は、所望により置換されているアルコキシ（例えば、メトキシまたはエトキシまたは本明細書に記載されるいずれか）である。特定の実施形態では、Ｒ１は、所望により置換されているアルキルであり、Ｒ２はヒドロキシである。他の実施形態では、Ｒ１はヒドロキシであり、Ｒ２は所望により置換されているアルキルである。さらなる実施形態では、Ｒ３は所望により置換されているアルキルである。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、非環状修飾リボースを含む。いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、式（ＩＩｄ）〜（ＩＩｆ）：
【０１４３】
【化１６】
2019059793.tif 000017
【０１４４】
を有するｎ個の連結ヌクレオシドまたはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含む。
いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、非環式修飾ヘキシトールを含む。いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、式（ＩＩｇ）〜（ＩＩｊ）：
【０１４５】
【化１７】
2019059793.tif 000018
【０１４６】
を有するｎ個の連結ヌクレオシドまたはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含む。
いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、収縮または拡大リボース環を有する糖部分を含む。いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、式（ＩＩｋ）〜（ＩＩｍ）：
【０１４７】
【化１８】
2019059793.tif 000019
【０１４８】
を有するｎ個の連結ヌクレオシドまたはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含み、ここでＲ１’、Ｒ１”、Ｒ２’およびＲ２”はそれぞれ、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、所望により置換されているアルキニルオキシ、所望により置換されているアミノアルコキシ、所望により置換されているアルコキシアルコキシまたは不存在であり；ここでＲ２’とＲ３の組合せまたはＲ２”とＲ３の組合せは、一緒に、所望により置換されているアルキレンまたは所望により置換されているヘテロアルキレンを形成し得る。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、ロックされた修飾リボースを含む。いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、式（ＩＩｎ）：
【０１５０】
【化１９】
2019059793.tif 000020
【０１５１】
を有するｎ個の連結ヌクレオシドまたはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含み、ここでＲ３’はＯ、Ｓまたは−ＮＲＮ１−であり、ここでＲＮ１はＨ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニルまたは所望により置換されているアリールであり、Ｒ３”は所望により置換されているアルキレン（例えば、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）または所望により置換されているヘテロアルキレン（例えば、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−または−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２−である）（例えば、Ｒ３’はＯでありＲ３”は所望により置換されているアルキレン（例えば、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）である）である。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、式（ＩＩｎ−１）〜（ＩＩ−ｎ２）：
【０１５３】
【化２０】
2019059793.tif 000021
【０１５４】
を有するｎ個の連結ヌクレオシドまたはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含み、ここでＲ３’はＯ、Ｓまたは−ＮＲＮ１−であり、ここでＲＮ１はＨ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニルまたは所望により置換されているアリールであり、Ｒ３”は所望により置換されているアルキレン（例えば、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）または所望により置換されているヘテロアルキレン（例えば、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−または−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２−）（例えば、Ｒ３’はＯであり、Ｒ３”は所望により置換されているアルキレン（例えば、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）である）である。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、四環系ヘテロシクリルを形成するロックされた修飾リボースを含む。いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、式（ＩＩｏ）：
【０１５６】
【化２１】
2019059793.tif 000022
【０１５７】
を有するｎ個の連結ヌクレオシドまたはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含み、ここでＲ１２ａ、Ｒ１２ｃ、Ｔ１’、Ｔ１”、Ｔ２’、Ｔ２”、Ｖ１およびＶ３は、本明細書に記載されるとおりである。
【０１５８】
修飾核酸またはｍｍＲＮＡの式はいずれも、本明細書に記載される１つ以上の核酸塩基を含み得る（例えば式（ｂ１）〜（ｂ４３））。
１つの実施形態では、本発明は、少なくとも１つのヌクレオチド（例えばｍｍＲＮＡ分子）を含む修飾核酸またはｍｍＲＮＡを調製する方法を提供し、ここで修飾核酸は、ここで定義される式（Ｉａ）：
【０１５９】
【化２２】
2019059793.tif 000023
【０１６０】
を有するｎ個のヌクレオシドを含み、該方法は、ここで定義される式（ＩＩＩａ）：
【０１６１】
【化２３】
2019059793.tif 000024
【０１６２】
の化合物をＲＮＡポリメラーゼとｃＤＮＡ鋳型と反応させることを含む。
さらなる実施形態では、本発明は、少なくとも１つのヌクレオチド（例えばｍｍＲＮＡ分子）を含む修飾核酸またはｍｍＲＮＡを増幅する方法を提供し、該方法は、ここで定義される式（ＩＩＩａ）の化合物を、プライマー、ｃＤＮＡ鋳型およびＲＮＡポリメラーゼと反応させることを含む。
【０１６３】
１つの実施形態では、本発明は、少なくとも１つのヌクレオチド（例えばｍｍＲＮＡ分子）を含む修飾核酸またはｍｍＲＮＡを調製する方法を提供し、ここで修飾核酸は、ここで定義される式（Ｉａ−１）：
【０１６４】
【化２４】
2019059793.tif 000025
【０１６５】
を有するｎ個のヌクレオシドを含み、該方法は、ここで定義される（ＩＩＩａ−１）：
【０１６６】
【化２５】
2019059793.tif 000026
【０１６７】
の化合物をＲＮＡポリメラーゼとｃＤＮＡ鋳型と反応させることを含む。
さらなる実施形態では、本発明は、少なくとも１つのヌクレオチド（例えばｍｍＲＮＡ分子）を含む修飾核酸またはｍｍＲＮＡを増幅する方法を提供し、該方法は、ここで定義される式（ＩＩＩａ−１）の化合物を、プライマー、ｃＤＮＡ鋳型およびＲＮＡポリメラーゼと反応させることを含む。
【０１６８】
１つの実施形態では、本発明は、少なくとも１つのヌクレオチド（例えばｍｍＲＮＡ分子）を含む修飾ｍＲＮＡを調製する方法を提供し、ここでポリヌクレオチドは、ここで定義される式（Ｉａ−２）：
【０１６９】
【化２６】
2019059793.tif 000027
【０１７０】
を有するｎ個のヌクレオシドを含み、該方法は、ここで定義される式（ＩＩＩａ−２）：
【０１７１】
【化２７】
2019059793.tif 000028
【０１７２】
の化合物をＲＮＡポリメラーゼとｃＤＮＡ鋳型と反応させることを含む。
さらなる実施形態では、本発明は、少なくとも１つのヌクレオチド（例えばｍｍＲＮＡ分子）を含む修飾核酸またはｍＲＮＡを増幅する方法を提供し、該方法は、
ここで定義される式（ＩＩＩａ−２）の化合物を、プライマー、ｃＤＮＡ鋳型およびＲＮＡポリメラーゼと反応させることを含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、反応は１回から約７，０００回反復され得る。本明細書のどの実施形態でも、Ｂは式（ｂ１）〜（ｂ４３）の核酸塩基であり得る。
修飾核酸およびｍｍＲＮＡは、所望により、本明細書に記載される５’および／または３’隣接領域を含み得る。
【０１７４】
修飾ＲＮＡ（例えばｍｍＲＮＡ）分子
本発明は、例えば、修飾リボヌクレオシド、修飾リボヌクレオチドなどの修飾ＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）分子の構成要素も含む。例えば、これらのｍｍＲＮＡは、本発明の修飾核酸またはｍｍＲＮＡの調製に有用であり得る。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、構成要素分子は式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩａ−１）：
【０１７６】
【化２８】
2019059793.tif 000029
【０１７７】
またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有し、ここで置換基は本明細書に記載されるとおり（例えば式（Ｉａ）と（Ｉａ−１）の置換基）であり、ここでＢがシトシン、グアニン、ウラシルおよびアデニンから選択された非修飾核酸塩基である場合、Ｙ１、Ｙ２またはＹ３の少なくとも１つはＯではない。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得る構成要素分子は、式（ＩＶａ）〜（ＩＶｂ）：
【０１７９】
【化２９】
2019059793.tif 000030
【０１８０】
またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有し、Ｂは本明細書に記載されるとおりである（例えば（ｂ１）〜（ｂ４３）のいずれか１つ）。特定の実施形態では、式（ＩＶａ）または（ＩＶｂ）は、修飾ウラシルと組み合わされる（例えば、式（ｂ１）〜（ｂ９）、（ｂ２１）〜（ｂ２３）および（ｂ２８）〜（ｂ３１）のいずれか１つ、たとえば式（ｂ１）、（ｂ８）、（ｂ２８）、（ｂ２９）または（ｂ３０））。特定の実施形態では、式（ＩＶａ）または（ＩＶｂ）は、修飾シトシンと組み合わされる（例えば、式（ｂ１０）〜（ｂ１４）、（ｂ２４）、（ｂ２５）および（ｂ３２）〜（ｂ３６）のいずれか１つ、たとえば式（ｂ１０）または（ｂ３２））。特定の実施形態では、式（ＩＶａ）または（ＩＶｂ）は、修飾グアニンと組み合わされる（例えば、式（ｂ１５）〜（ｂ１７）および（ｂ３７）〜（ｂ４０）のいずれか１つ）。特定の実施形態では、式（ＩＶａ）または（ＩＶｂ）は、修飾アデニンと組み合わされる（例えば、式（ｂ１８）〜（ｂ２０）および（ｂ４１）〜（ｂ４３）のいずれか１つ）。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得る構成要素分子は、式（ＩＶｃ）〜（ＩＶｋ）：
【０１８２】
【化３０】
2019059793.tif 000031
【０１８３】
またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有し、Ｂは本明細書に記載されるとおりである（例えば（ｂ１）〜（ｂ４３）のいずれか１つ）。特定の実施形態では、式（ＩＶｃ）〜（ＩＶｋ）のうち１つは、修飾ウラシルと組み合わされる（例えば、式（ｂ１）〜（ｂ９）、（ｂ２１）〜（ｂ２３）および（ｂ２８）〜（ｂ３１）のいずれか１つ、たとえば式（ｂ１）、（ｂ８）、（ｂ２８）、（ｂ２９）または（ｂ３０））。特定の実施形態では、式（ＩＶｃ）〜（ＩＶｋ）のうち１つは、修飾シトシンと組み合わされる（例えば、式（ｂ１０）〜（ｂ１４）、（ｂ２４）、（ｂ２５）および（ｂ３２）〜（ｂ３６）のいずれか１つ、たとえば式（ｂ１０）または（ｂ３２））。特定の実施形態では、式（ＩＶｃ）〜（ＩＶｋ）のうち１つは、修飾グアニンと組み合わされる（例えば、式（ｂ１５）〜（ｂ１７）および（ｂ３７）〜（ｂ４０）のいずれか１つ）。特定の実施形態では、式（ＩＶｃ）〜（ＩＶｋ）のうち１つは、修飾アデニンと組み合わされる（例えば、式（ｂ１８）〜（ｂ２０）および（ｂ４１）〜（ｂ４３）のいずれか１つ）。
【０１８４】
他の実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得る構成要素分子は、式（Ｖａ）または（Ｖｂ）：
【０１８５】
【化３１】
2019059793.tif 000032
【０１８６】
またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有し、Ｂは本明細書に記載されるとおりである（例えば（ｂ１）〜（ｂ４３）のいずれか１つ）。
他の実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得る構成要素分子は、式（ＩＸａ）または（ＩＸｄ）：
【０１８７】
【化３２】
2019059793.tif 000033
【０１８８】
またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有し、Ｂは本明細書に記載されるとおりである（例えば（ｂ１）〜（ｂ４３）のいずれか１つ）。特定の実施形態では、式（ＩＸａ）〜（ＩＸｄ）のうち１つは、修飾ウラシルと組み合わされる（例えば、式（ｂ１）〜（ｂ９）、（ｂ２１）〜（ｂ２３）および（ｂ２８）〜（ｂ３１）のいずれか１つ、たとえば式（ｂ１）、（ｂ８）、（ｂ２８）、（ｂ２９）または（ｂ３０））。特定の実施形態では、式（ＩＸａ）〜（ＩＸｄ）のうち１つは、修飾シトシンと組み合わされる（例えば、式（ｂ１０）〜（ｂ１４）、（ｂ２４）、（ｂ２５）および（ｂ３２）〜（ｂ３６）のいずれか１つ、たとえば式（ｂ１０）または（ｂ３２））。特定の実施形態では、式（ＩＸａ）〜（ＩＸｄ）のうち１つは、修飾グアニンと組み合わされる（例えば、式（ｂ１５）〜（ｂ１７）および（ｂ３７）〜（ｂ４０）のいずれか１つ）。特定の実施形態では、式（ＩＸａ）〜（ＩＸｄ）のうち１つは、修飾アデニンと組み合わされる（例えば、式（ｂ１８）〜（ｂ２０）および（ｂ４１）〜（ｂ４３）のいずれか１つ）。
【０１８９】
他の実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得る構成要素分子は、式（ＩＸｅ）〜（ＩＸｇ）：
【０１９０】
【化３３】
2019059793.tif 000034
【０１９１】
またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有し、Ｂは本明細書に記載されるとおりである（例えば（ｂ１）〜（ｂ４３）のいずれか１つ）。特定の実施形態では、式（ＩＸｅ）〜（ＩＸｇ）のうち１つは、修飾ウラシルと組み合わされる（例えば、式（ｂ１）〜（ｂ９）、（ｂ２１）〜（ｂ２３）および（ｂ２８）〜（ｂ３１）のいずれか１つ、たとえば式（ｂ１）、（ｂ８）、（ｂ２８）、（ｂ２９）または（ｂ３０））。特定の実施形態では、式（ＩＸｅ）〜（ＩＸｇ）のうち１つは、修飾シトシンと組み合わされる（例えば、式（ｂ１０）〜（ｂ１４）、（ｂ２４）、（ｂ２５）および（ｂ３２）〜（ｂ３６）のいずれか１つ、たとえば式（ｂ１０）または（ｂ３２））。特定の実施形態では、式（ＩＸｅ）〜（ＩＸｇ）のうち１つは、修飾グアニンと組み合わされる（例えば、式（ｂ１５）〜（ｂ１７）および（ｂ３７）〜（ｂ４０）のいずれか１つ）。特定の実施形態では、式（ＩＸｅ）〜（ＩＸｇ）のうち１つは、修飾アデニンと組み合わされる（例えば、式（ｂ１８）〜（ｂ２０）および（ｂ４１）〜（ｂ４３）のいずれか１つ）。
【０１９２】
他の実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得る構成要素分子は、式（ＩＸｈ）〜（ＩＸｋ）：
【０１９３】
【化３４】
2019059793.tif 000035
【０１９４】
またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有し、Ｂは本明細書に記載されるとおりである（例えば（ｂ１）〜（ｂ４３）のいずれか１つ）。特定の実施形態では、式（ＩＸｈ）〜（ＩＸｋ）のうち１つは、修飾ウラシルと組み合わされる（例えば、式（ｂ１）〜（ｂ９）、（ｂ２１）〜（ｂ２３）および（ｂ２８）〜（ｂ３１）のいずれか１つ、たとえば式（ｂ１）、（ｂ８）、（ｂ２８）、（ｂ２９）または（ｂ３０））。特定の実施形態では、式（ＩＸｈ）〜（ＩＸｋ）のうち１つは、修飾シトシンと組み合わされる（例えば、式（ｂ１０）〜（ｂ１４）、（ｂ２４）、（ｂ２５）および（ｂ３２）〜（ｂ３６）のいずれか１つ、たとえば式（ｂ１０）または（ｂ３２））。特定の実施形態では、式（ＩＸｈ）〜（ＩＸｋ）のうち１つは、修飾グアニンと組み合わされる（例えば、式（ｂ１５）〜（ｂ１７）および（ｂ３７）〜（ｂ４０）のいずれか１つ）。特定の実施形態では、式（ＩＸｈ）〜（ＩＸｋ）のうち１つは、修飾アデニンと組み合わされる（例えば、式（ｂ１８）〜（ｂ２０）および（ｂ４１）〜（ｂ４３）のいずれか１つ）。
【０１９５】
他の実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得る構成要素分子は、式（ＩＸｌ）〜（ＩＸｒ）：
【０１９６】
【化３５】
2019059793.tif 000036
【０１９７】
またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を有し、ここでｒ１とｒ２はそれぞれ、独立して、０から５の整数（例えば、０から３、１から３または１から５）であり、Ｂは本明細書に記載されるとおりである（例えば、（ｂ１）〜（ｂ４３）のいずれか１つ）。特定の実施形態では、式（ＩＸｌ）〜（ＩＸｒ）のうち１つは、修飾ウラシルと組み合わされる（例えば、式（ｂ１）〜（ｂ９）、（ｂ２１）〜（ｂ２３）および（ｂ２８）〜（ｂ３１）のいずれか１つ、たとえば式（ｂ１）、（ｂ８）、（ｂ２８）、（ｂ２９）または（ｂ３０））。特定の実施形態では、式（ＩＸｌ）〜（ＩＸｒ）のうち１つは、修飾シトシンと組み合わされる（例えば、式（ｂ１０）〜（ｂ１４）、（ｂ２４）、（ｂ２５）および（ｂ３２）〜（ｂ３６）のいずれか１つ、たとえば式（ｂ１０）または（ｂ３２））。特定の実施形態では、式（ＩＸｌ）〜（ＩＸｒ）のうち１つは、修飾グアニンと組み合わされる（例えば、式（ｂ１５）〜（ｂ１７）および（ｂ３７）〜（ｂ４０）のいずれか１つ）。特定の実施形態では、式（ＩＸｌ）〜（ＩＸｒ）のうち１つは、修飾アデニンと組み合わされる（例えば、式（ｂ１８）〜（ｂ２０）および（ｂ４１）〜（ｂ４３）のいずれか１つ）。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得る構成要素分子は、
【０１９９】
【化３６】
2019059793.tif 000037
【０２００】
2019059793.tif 000038
【０２０１】
からなる群またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体より選択され得、ここで各ｒは、独立して、０から５の整数（例えば、０から３、１から３または１から５）である。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得る構成要素分子は、
【０２０３】
【化３７】
2019059793.tif 000039
【０２０４】
からなる群またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体より選択され得、ここで各ｒは、独立して、０から５の整数（例えば、０から３、１から３または１から５）であり、ｓ１は本明細書に記載されるとおりである。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍｍＲＮＡ）に組み込まれ得る構成要素分子は、修飾ウリジン（例えば、
【０２０６】
【化３８】
2019059793.tif 000040
【０２０７】
2019059793.tif 000041
【０２０８】
2019059793.tif 000042
【０２０９】
2019059793.tif 000043
【０２１０】
2019059793.tif 000044
【０２１１】
2019059793.tif 000045
【０２１２】
2019059793.tif 000046
【０２１３】
2019059793.tif 000047
【０２１４】
2019059793.tif 000048
【０２１５】
2019059793.tif 000049
【０２１６】
2019059793.tif 000050
【０２１７】
2019059793.tif 000051
【０２１８】
2019059793.tif 000052
【０２１９】
2019059793.tif 000053
【０２２０】
からなる群より選択される）またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体であり、ここでＹ１、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ６およびｒは本明細書に記載されるとおりである（例えば、各ｒは、独立して、０から５の整数であり、たとえば０から３、１から３、または１から５である））。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得る構成要素分子は、修飾シチジン（例えば、
【０２２２】
【化３９】
2019059793.tif 000054
【０２２３】
2019059793.tif 000055
【０２２４】
2019059793.tif 000056
【０２２５】
2019059793.tif 000057
【０２２６】
2019059793.tif 000058
【０２２７】
からなる群より選択される）またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体であり、ここでＹ１、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ６およびｒは本明細書に記載されるとおりである（例えば、各ｒは、独立して、０から５の整数であり、たとえば０から３、１から３、または１から５である））。たとえば、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得る構成要素分子は、
【０２２８】
【化４０】
2019059793.tif 000059
【０２２９】
またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体であり得、ここで各ｒは、独立して、０から５の整数（例えば、０から３、１から３または１から５）である。
いくつかの実施形態では、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得る構成要素分子は、修飾アデノシン（例えば、
【０２３０】
【化４１】
2019059793.tif 000060
【０２３１】
2019059793.tif 000061
【０２３２】
2019059793.tif 000062
【０２３３】
2019059793.tif 000063
【０２３４】
2019059793.tif 000064
【０２３５】
2019059793.tif 000065
【０２３６】
からなる群より選択される）またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体であり、ここでＹ１、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ６およびｒは本明細書に記載されるとおりである（例えば、各ｒは、独立して、０から５の整数であり、たとえば０から３、１から３，または１から５である））。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得る構成要素分子は、修飾グアノシン（例えば、
【０２３８】
【化４２】
2019059793.tif 000066
【０２３９】
2019059793.tif 000067
【０２４０】
2019059793.tif 000068
【０２４１】
2019059793.tif 000069
【０２４２】
からなる群より選択される）またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体であり、ここでＹ１、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ６およびｒは本明細書に記載されるとおりである（例えば、各ｒは、独立して、０から５の整数であり、たとえば０から３、１から３，または１から５である））。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、化学修飾は、環のＣ−５のＣ基（例えば、シトシンまたはウラシルなどのピリミジンヌクレオシド）をＮで置換することを含み得る（例えば、Ｃ−５の＞ＣＨ基を＞ＮＲＮ１基で置換し、ここでＲＮ１はＨまたは所望により置換されているアルキルである）。例えば、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得るｍｍＲＮＡ分子は、
【０２４４】
【化４３】
2019059793.tif 000070
【０２４５】
またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体であり得、ここで各ｒは、独立して、０から５の整数（例えば、０から３、１から３または１から５）である。
別の実施形態では、化学修飾は、シトシンのＣ−５の水素をハロ（例えば、Ｂｒ、Ｃｌ、ＦまたはＩ）または所望により置換されているアルキル（例えば、メチル）で置換することを含み得る。例えば、修飾核酸またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得るｍｍＲＮＡ分子は、
【０２４６】
【化４４】
2019059793.tif 000071
【０２４７】
またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体であり得、ここで各ｒは、独立して、０から５の整数（例えば、０から３、１から３または１から５）である。
さらなる実施形態では、化学修飾は、Ｃ−４位のＮＨ２とＣ−５位の炭素原子で形成される縮合環を含み得る。例えば、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡに組み込まれ得る構成要素分子は、
【０２４８】
【化４５】
2019059793.tif 000072
【０２４９】
またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体であり得、ここで各ｒは、独立して、０から５の整数（例えば、０から３、１から３または１から５）である。
糖の修飾
修飾核酸またはｍｍＲＮＡ（例えば、本明細書に記載されるＲＮＡまたはｍＲＮＡ）に組み込まれ得る修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチド（例えば、構成要素分子）は、リボ核酸の糖上の修飾であり得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、ある数の異なる置換基で修飾または置換され得る。２’位の例となる置換基は、限定ではなく、Ｈ、ハロ、所望により置換されているＣ１〜６アルキル；所望により置換されているＣ１〜６アルコキシ；所望により置換されているＣ６〜１０アリールオキシ；所望により置換されているＣ３〜８シクロアルキル；所望により置換されているＣ３〜８シクロアルコキシ；所望により置換されているＣ６〜１０アリールオキシ；所望により置換されているＣ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ、所望により置換されているＣ１〜１２（ヘテロシクリル）オキシ；糖（例えば、リボース、ペントースまたは本明細書に記載されるいずれか）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（ここでＲはＨまたは所望により置換されているアルキルであり、ｎは０から２０の整数（例えば、０から４、０から８、０から１０、０から１６、１から４、１から８、１から１０、１から１６、１から２０、２から４、２から８、２から１０、２から１６、２から２０、４から８、４から１０、４から１６および４から２０）である）；２’−ヒドロキシルがＣ１〜６アルキレンまたはＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋により同じリボース糖の４’−炭素に結合している「ロックされた（架橋型）」核酸（ＬＮＡ）（例示的架橋はメチレン、プロピレン、エーテルまたはアミノ架橋；ここで定義されるアミノアルキル；ここで定義されるアミノアルコキシ；ここで定義されるアミノ；およびここで定義されるアミノ酸を含んだ）を含む。
【０２５０】
一般に、ＲＮＡは、酸素を有する５員環である糖基リボースを含む。例示的非限定的な修飾ヌクレオチドは、リボース内の酸素の（例えばＳ、Ｓｅまたはメチレンまたはエチレンなどのアルキレンでの）置換；二重結合の付加（例えばリボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換）；リボース環収縮（例えばシクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成する）；リボース環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニルおよびホスホロアミデート主鎖も有するホルホリノなどの、追加の炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環を形成する）；多環型（例えば、トリシクロ；および「非ロック」型、たとえばグリコール核酸（ＧＮＡ）（例えば、Ｒ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡ、ここでリボースはホスホジエステル結合に結合したグリコール単位で置換されている）、トレオース核酸（ＴＮＡ、ここでリボースはα−Ｌ−スレオフラノシル−（３’→２’）で置換されている）およびペプチド核酸（ＰＮＡ、ここで２−アミノ−エチル−グリシン結合がリボースとホスホジエステル主鎖と置き換わっている）を含む。糖基は、リボース内の対応する炭素の立体構造とは反対の立体化学構造を有する１つ以上の炭素も含み得る。したがって、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、例えば、糖としてアラビノースを含むヌクレオチドを含み得る。
【０２５１】
核酸塩基の修飾
本開示は、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドを提供する。ここでは「ヌクレオシド」は、糖分子（例えばペントースまたはリボース）またはその誘導体と有機塩基（例えばプリンまたはピリミジン）またはその誘導体の組合せを含む化合物として定義される。ここでは「ヌクレオチド」はリン酸基を含むヌクレオシドとして定義される。修飾ヌクレオチド（例えば修飾ｍＲＮＡ）は、本明細書に記載されるあらゆる便利な方法で合成され得る（例えば，化学的、酵素的または組替え的に１つ以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含む）。
【０２５２】
修飾ヌクレオチドの塩基の対合は、標準的なアデノシン−チミン、アデノシン−ウラシルまたはグアノシン−シトシン塩基対のみならず、非標準または修飾塩基を含むヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチド間に形成されるものも包含し、ここで水素結合ドナーと水素結合アクセプターの配置は、非標準塩基と標準塩基間または２つの相補的非標準塩基構造間での水素結合を許容する。そのような非標準塩基の対合の一例は、修飾ヌクレオチドイノシンとアデニン、シトシンまたはウラシル間の塩基の対合である。
【０２５３】
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含み得る。ＲＮＡ中に見られる核酸塩基の例には、限定ではなく、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルが含まれる。ＤＮＡ中に見られる核酸塩基の例には、限定ではなく、アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンが含まれる。これらの核酸塩基は、強化された特性、例えば、主溝結合パートナーの結合を破壊することによるヌクレアーゼへの耐性を有する修飾核酸またはｍｍＲＮＡ分子を提供するために、修飾されるかまたは全体的に置換され得る。以下の表１は、各正準ヌクレオチドの化学的面を特定している。円は、各化学領域を構成する原子を特定している。
【０２５４】
【表１】
2019059793.tif 000073
【０２５５】
いくつかの実施形態では、Ｂは修飾ウラシルである。例示的修飾ウラシルは、式（ｂ１）〜（ｂ５）：
【０２５６】
【化４６】
2019059793.tif 000074
【０２５７】
を有するものまたはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含み、ここで
【０２５８】
【化４７】
2019059793.tif 000075
【０２５９】
は単結合または二重結合であり；
Ｔ１’、Ｔ１”、Ｔ２’およびＴ２”はそれぞれ、独立して、Ｈ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルコキシまたは所望により置換されているチオアルコキシであり、またはＴ１’とＴ１”の組合せまたはＴ２’とＴ２”の組合せは一緒に（例えばＴ２のように）Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）またはＳｅ（セレノ）を形成し；
Ｖ１とＶ２はそれぞれ、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＶｂ）ｎｖ、またはＣ（ＲＶｂ）ｎｖであり、ここでｎｖは０から２の整数であり、各ＲＶｂは、独立して、Ｈ、ハロ、所望により置換されているアミノ酸、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているハロアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、所望により置換されているアルキニルオキシ、所望により置換されているヒドロキシアルキル、所望により置換されているヒドロキシアルケニル、所望により置換されているヒドロキシアルキニル、所望により置換されているアミノアルキル（例えば、本明細書に記載されるいずれかの、例えば、トリフルオロアセチルなどのＮ−保護基で置換されている）、所望により置換されているアミノアルケニル、所望により置換されているアミノアルキニル、所望により置換されているアシルアミノアルキル（例えば、本明細書に記載されるいずれかの、例えば、トリフルオロアセチルなどのＮ−保護基で置換されている）、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルキル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルケニル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルキニルまたは所望により置換されているアルコキシカルボニルアルコキシ（例えば、所望により、アルキルについて（１）〜（２１）から選択されるものなどの、本明細書に記載されるいずれかの置換基で置換されている）であり；
Ｒ１０は、Ｈ、ハロ、所望により置換されているアミノ酸、ヒドロキシ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているアミノアルキル、所望により置換されているヒドロキシアルキル、所望により置換されているヒドロキシアルケニル、所望により置換されているヒドロキシアルキニル、所望により置換されているアミノアルケニル、所望により置換されているアミノアルキニル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルキル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルケニル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルキニル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルコキシ、所望により置換されているカルボキシアルコキシ、所望により置換されているカルボキシアルキルまたは所望により置換されているカルバモイルアルキルであり；
Ｒ１１はＨまたは所望により置換されているアルキルであり；
Ｒ１２ａは、Ｈ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているヒドロキシアルキル、所望により置換されているヒドロキシアルケニル、所望により置換されているヒドロキシアルキニル、所望により置換されているアミノアルキル、所望により置換されているアミノアルケニル、または所望により置換されているアミノアルキニル、所望により置換されているカルボキシアルキル（例えば、所望によりヒドロキシで置換されている）、所望により置換されているカルボキシアルコキシ、所望により置換されているカルボキシアミノアルキル、または所望により置換されているカルバモイルアルキルであり；
Ｒ１２ｃは、Ｈ、ハロ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているチオアルコキシ、所望により置換されているアミノ、所望により置換されているヒドロキシアルキル、所望により置換されているヒドロキシアルケニル、所望により置換されているヒドロキシアルキニル、所望により置換されているアミノアルキル、所望により置換されているアミノアルケニルまたは所望により置換されているアミノアルキニルである。
【０２６０】
他の例示的修飾ウラシルは、式（ｂ６）〜（ｂ９）：
【０２６１】
【化４８】
2019059793.tif 000076
【０２６２】
を有するものまたはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含み、式中、
【０２６３】
【化４９】
2019059793.tif 000077
【０２６４】
は単結合または二重結合であり；
Ｔ１’、Ｔ１”、Ｔ２’およびＴ２”はそれぞれ、独立して、Ｈ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルコキシまたは所望により置換されているチオアルコキシであるか、またはＴ１’とＴ１”の組合せは一緒に（例えばＴ１のように）またはＴ２’とＴ２”の組合せは一緒に（例えばＴ２のように）Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）、またはＳｅ（セレノ）を形成するか、またはＴ１とＴ２はそれぞれ、独立して、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）またはＳｅ（セレノ）であり；
Ｗ１とＷ２はそれぞれ、独立して、Ｎ（ＲＷａ）ｎｗまたはＣ（ＲＷａ）ｎｗであり、ここでｎｗは０から２の整数であり、各ＲＷａは、独立して、Ｈ、所望により置換されているアルキルまたは所望により置換されているアルコキシであり；
各Ｖ３は、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＶａ）ｎｖまたはＣ（ＲＶａ）ｎｖであり、ここでｎｖは０から２の整数であり、各ＲＶａは、独立して、Ｈ、ハロ、所望により置換されているアミノ酸、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているヒドロキシアルキル、所望により置換されているヒドロキシアルケニル、所望により置換されているヒドロキシアルキニル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているヘテロシクリル、所望により置換されているアルケテロシクリル（ａｌｋｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌ）、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、または所望により置換されているアルキニルオキシ、所望により置換されているアミノアルキル（例えば、本明細書に記載されるいずれかの、例えば、トリフルオロアセチルまたはスルホアルキルなどのＮ−保護基で置換されている）、所望により置換されているアミノアルケニル、所望により置換されているアミノアルキニル、所望により置換されているアシルアミノアルキル（例えば、本明細書に記載されるいずれかの、例えば、トリフルオロアセチルなどのＮ−保護基で置換されている）、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルキル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルケニル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルキニル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアシル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルコキシ、所望により置換されているカルボキシアルキル（例えば、所望によりヒドロキシおよび／またはＯ−保護基で置換されている）、所望により置換されているカルボキシアルコキシ、所望により置換されているカルボキシアミノアルキル、または所望により置換されているカルバモイルアルキル（例えば、所望により、アルキルについて（１）〜（２１）から選択されるものなどの本明細書に記載されるいずれかの置換基で置換されている）であり、ここでＲＶａとＲ１２ｃは、所望により、それらが結合している炭素原子と一緒に、所望により置換されているシクロアルキル、所望により置換されているアリールまたは所望により置換されているヘテロシクリル（例えば５または６員環）を形成し得；
Ｒ１２ａは、Ｈ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているヒドロキシアルキル、所望により置換されているヒドロキシアルケニル、所望により置換されているヒドロキシアルキニル、所望により置換されているアミノアルキル、所望により置換されているアミノアルケニル、所望により置換されているアミノアルキニル、所望により置換されているカルボキシアルキル（例えば、所望によりヒドロキシおよび／またはＯ−保護基で置換されている）、所望により置換されているカルボキシアルコキシ、所望により置換されているカルボキシアミノアルキル、所望により置換されているカルバモイルアルキルまたは不存在であり；
Ｒ１２ｂは、Ｈ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているヒドロキシアルキル、所望により置換されているヒドロキシアルケニル、所望により置換されているヒドロキシアルキニル、所望により置換されているアミノアルキル、所望により置換されているアミノアルケニル、所望により置換されているアミノアルキニル、所望により置換されているアルカリール、所望により置換されているヘテロシクリル、所望により置換されているアルケテロシクリル（ａｌｋｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌ）、所望により置換されているアミノ酸、所望により置換されているアルコキシカルボニルアシル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルコキシ、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルキル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルケニル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルキニル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルコキシ、所望により置換されているカルボキシアルキル（例えば、所望によりヒドロキシおよび／またはＯ−保護基で置換されている）、所望により置換されているカルボキシアルコキシ、所望により置換されているカルボキシアミノアルキルまたは所望により置換されているカルバモイルアルキルであり、
ここでＲ１２ｂとＴ１’の組合せまたはＲ１２ｂとＲ１２ｃの組合せは、一緒に、所望により置換されているヘテロシクリルを形成し得；
Ｒ１２ｃは、Ｈ、ハロ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているチオアルコキシ、所望により置換されているアミノ、所望により置換されているアミノアルキル、所望により置換されているアミノアルケニルまたは所望により置換されているアミノアルキニルである。
【０２６５】
さらなる例示的修飾ウラシルは、式（ｂ２８）〜（ｂ３１）：
【０２６６】
【化５０】
2019059793.tif 000078
【０２６７】
を有するものまたはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｔ１とＴ２はそれぞれ、独立して、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）、またはＳｅ（セレノ）であり；
ＲＶｂ’とＲＶｂ”はそれぞれ、独立して、Ｈ、ハロ、所望により置換されているアミノ酸、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているハロアルキル、所望により置換されているヒドロキシアルキル、所望により置換されているヒドロキシアルケニル、所望により置換されているヒドロキシアルキニル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、所望により置換されているアルキニルオキシ、所望により置換されているアミノアルキル（例えば、本明細書に記載されるいずれかの、例えば、トリフルオロアセチルまたはスルホアルキルなどのＮ−保護基で置換されている）、所望により置換されているアミノアルケニル、所望により置換されているアミノアルキニル、所望により置換されているアシルアミノアルキル（例えば，本明細書に記載されるいずれかの、例えば、トリフルオロアセチルなどのＮ−保護基で置換されている）、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルキル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルケニル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルキニル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアシル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルコキシ、所望により置換されているカルボキシアルキル（例えば、所望によりヒドロキシおよび／またはＯ−保護基で置換されている）、所望により置換されているカルボキシアルコキシ、所望により置換されているカルボキシアミノアルキル、または所望により置換されているカルバモイルアルキル（例えば、所望により、アルキルについて（１）〜（２１）から選択されるものなどの本明細書に記載されるいずれかの置換基で置換されている）（例えば、ＲＶｂ’は、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニルまたは所望により置換されているアミノアルキルであり、例えば、本明細書に記載されるいずれかの、例えば、トリフルオロアセチルまたはスルホアルキルなどのＮ−保護基で置換されている）であり；
Ｒ１２ａは、Ｈ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているカルボキシアミノアルキル、所望により置換されているアミノアルキル（例えば、本明細書に記載されるいずれかの、例えば、トリフルオロアセチルまたはスルホアルキルなどのＮ−保護基で置換されている）、所望により置換されているアミノアルケニルまたは所望により置換されているアミノアルキニルであり；
Ｒ１２ｂは、Ｈ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているヒドロキシアルキル、所望により置換されているヒドロキシアルケニル、所望により置換されているヒドロキシアルキニル、所望により置換されているアミノアルキル、所望により置換されているアミノアルケニル、所望により置換されているアミノアルキニル（例えば，本明細書に記載されるいずれかの、例えば、トリフルオロアセチルまたはスルホアルキルなどのＮ−保護基で置換されている）、
所望により置換されているアルコキシカルボニルアシル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルコキシ、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルキル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルケニル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルキニル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルコキシ、所望により置換されているカルボキシアルコキシ、所望により置換されているカルボキシアルキルまたは所望により置換されているカルバモイルアルキルである。
【０２６８】
特定の実施形態では、Ｔ１はＯ（オキソ）であり、Ｔ２はＳ（チオ）またはＳｅ（セレノ）である。他の実施形態では、Ｔ１はＳ（チオ）であり、Ｔ２はＯ（オキソ）またはＳｅ（セレノ）である。いくつかの実施形態では、ＲＶｂ’は、Ｈ、所望により置換されているアルキルまたは所望により置換されているアルコキシである。
【０２６９】
他の実施形態では、Ｒ１２ａとＲ１２ｂはそれぞれ、独立して、Ｈ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニルまたは所望により置換されているヒドロキシアルキルである。特定の実施形態では、Ｒ１２ａはＨである。他の実施形態では、Ｒ１２ａとＲ１２ｂはいずれもＨである。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、Ｒ１２ｂのＲＶｂ’は、それぞれ、独立して、所望により置換されているアミノアルキル（例えば、本明細書に記載されるいずれかの、例えば、トリフルオロアセチルまたはスルホアルキルなどのＮ−保護基で置換されている）、所望により置換されているアミノアルケニル、所望により置換されているアミノアルキニルまたは所望により置換されているアシルアミノアルキル（例えば、本明細書に記載されるいずれかの、例えば、トリフルオロアセチルなどのＮ−保護基で置換されている）である。いくつかの実施形態では、所望により置換されているアミノアルキルのアミノおよび／またはアルキルは、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているスルホアルキル、所望により置換されているカルボキシ（例えば、Ｏ−保護基で置換されている）、所望により置換されているヒドロキシ（例えば、Ｏ−保護基で置換されている）、所望により置換されているカルボキシアルキル（例えば、Ｏ−保護基で置換されている）、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルキル（例えば、Ｏ−保護基で置換されている）またはＮ−保護基のうち１つ以上で置換されている。いくつかの実施形態では、所望により置換されているアミノアルキルは、所望により置換されているスルホアルキルまたは所望により置換されているアルケニルで置換されている。特定の実施形態では、Ｒ１２ａとＲＶｂ”はいずれもＨである。特定の実施形態では、Ｔ１はＯ（オキソ）であり、Ｔ２はＳ（チオ）またはＳｅ（セレノ）である。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、ＲＶｂ’は、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルキルまたは所望により置換されているカルバモイルアルキルである。
特定の実施形態では、Ｒ１２ａ、Ｒ１２ｂ、Ｒ１２ｃまたはＲＶａの所望による置換基は、ポリエチレングリコール基（例えば、−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’であり、ここでｓ１は１から１０の整数（例えば、１から６または１から４）であり、ｓ２とｓ３はそれぞれ、独立して、０から１０の整数（例えば、０から４、０から６、１から４、１から６または１から１０）であり、Ｒ’はＨまたはＣ１−２０アルキルである）；またはアミノ−ポリエチレングリコール基（例えば、−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１であり、ここでｓ１は１から１０の整数（例えば、１から６または１から４）であり、ｓ２とｓ３はそれぞれ、独立して、０から１０の整数（例えば、０から４、０から６、１から４、１から６または１から１０）であり、各ＲＮ１は、独立して、水素または所望により置換されているＣ１〜６アルキルである）である。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、Ｂは修飾シトシンである。例となる修飾シトシンは、化合物（ｂ１０）〜（ｂ１４）：
【０２７３】
【化５１】
2019059793.tif 000079
【０２７４】
またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含み、ここで
Ｔ３’とＴ３”はそれぞれ、独立して、Ｈ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルコキシまたは所望により置換されているチオアルコキシであり、またはＴ３とＴ３”の組合せは、一緒に（例えばＴ３のように）、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）またはＳｅ（セレノ）を形成し；
各Ｖ４は、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＶｃ）ｎｖまたはＣ（ＲＶｃ）ｎｖであり、ここでｎｖは０から２の整数であり、各ＲＶｃは、独立して、Ｈ、ハロ、所望により置換されているアミノ酸、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、所望により置換されているヘテロシクリル、所望により置換されているアルケテロシクリル（ａｌｋｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌ）または所望により置換されているアルキニルオキシ（例えば、所望により、アルキルについて（１）〜（２１）から選択されるものなどの、本明細書に記載されるいずれかの置換基で置換されている）であり、ここでＲ１３ｂとＲＶｃは、一緒に、所望により置換されているヘテロシクリルを形成し得；
各Ｖ５は、独立して、Ｎ（ＲＶｄ）ｎｖまたはＣ（ＲＶｄ）ｎｖであり、ここでｎｖは０から２の整数であり、各ＲＶｄは、独立して、Ｈ、ハロ、所望により置換されているアミノ酸、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、所望により置換されているヘテロシクリル、所望により置換されているアルケテロシクリル（ａｌｋｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌ）または所望により置換されているアルキニルオキシ（例えば、所望により、アルキルについて（１）〜（２１）から選択されるものなどの、本明細書に記載されるいずれかの置換基で置換されている）であり（例えば、Ｖ５は−ＣＨまたはＮである）；
Ｒ１３ａとＲ１３ｂはそれぞれ、独立して、Ｈ、所望により置換されているアシル、所望により置換されているアシルオキシアルキル、所望により置換されているアルキルまたは所望により置換されているアルコキシであり、ここでＲ１３ｂとＲ１４の組合せは、一緒に、所望により置換されているヘテロシクリルを形成し得；
各Ｒ１４は、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、所望により置換されているアシル、所望により置換されているアミノ酸、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているハロアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているヒドロキシアルキル（例えば、Ｏ−保護基で置換されている）、所望により置換されているヒドロキシアルケニル、所望により置換されているヒドロキシアルキニル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、所望により置換されているアルキニルオキシ、所望により置換されているアミノアルコキシ、所望により置換されているアルコキシアルコキシ、所望により置換されているアシルオキシアルキル、所望により置換されているアミノ（例えば、−ＮＨＲ、ここでＲはＨ、アルキル、アリールまたはホスホリルである）、アジド、所望により置換されているアリール、所望により置換されているヘテロシクリル、所望により置換されているアルケテロシクリル（ａｌｋｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌ）、所望により置換されているアミノアルキル、所望により置換されているアミノアルケニルまたは所望により置換されているアミノアルキルであり；
Ｒ１５とＲ１６はそれぞれ、独立して、Ｈ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニルまたは所望により置換されているアルキニルである。
【０２７５】
さらなる例示的修飾シトシンは、式（ｂ３２）〜（ｂ３５）：
【０２７６】
【化５２】
2019059793.tif 000080
【０２７７】
を有するものまたはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｔ１とＴ３はそれぞれ、独立して、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）またはＳｅ（セレノ）であり；
Ｒ１３ａとＲ１３ｂはそれぞれ、独立して、Ｈ、所望により置換されているアシル、所望により置換されているアシルオキシアルキル、所望により置換されているアルキルまたは所望により置換されているアルコキシであり、ここでＲ１３ｂとＲ１４の組合せは、一緒に、所望により置換されているヘテロシクリルを形成し得；
各Ｒ１４は、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、所望により置換されているアシル、所望により置換されているアミノ酸、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているハロアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているヒドロキシアルキル（例えば、Ｏ−保護基で置換されている）、所望により置換されているヒドロキシアルケニル、所望により置換されているヒドロキシアルキニル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、所望により置換されているアルキニルオキシ、所望により置換されているアミノアルコキシ、所望により置換されているアルコキシアルコキシ、所望により置換されているアシルオキシアルキル、所望により置換されているアミノ（例えば、−ＮＨＲ、ここでＲはＨ、アルキル、アリールまたはホスホリルである）、アジド、所望により置換されているアリール、所望により置換されているヘテロシクリル、所望により置換されているアルケテロシクリル（ａｌｋｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌ）、所望により置換されているアミノアルキル（例えば、ヒドロキシアルキル、アルキル、アルケニルまたはアルキニル）、所望により置換されているアミノアルケニルまたは所望により置換されているアミノアルキニルであり；
Ｒ１５とＲ１６はそれぞれ、独立して、Ｈ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニルまたは所望により置換されているアルキニル（例えば、Ｒ１５はＨであり、Ｒ１６はＨまたは所望により置換されているアルキルである）である。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、Ｒ１５はＨであり、Ｒ１６はＨまたは所望により置換されているアルキルである。特定の実施形態では、Ｒ１４はＨ、アシルまたはヒドロキシアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１４はハロである。いくつかの実施形態では、Ｒ１４とＲ１５はいずれもＨである。いくつかの実施形態では、Ｒ１５とＲ１６はいずれもＨである。いくつかの実施形態では、Ｒ１４とＲ１５とＲ１６はそれぞれ、Ｈである。さらなる実施形態では、Ｒ１３ａとＲ１３ｂはそれぞれ、独立して、Ｈまたは所望により置換されているアルキルである。
【０２７９】
修飾シトシンのさらなる非限定的な例は、式（ｂ３６）：
【０２８０】
【化５３】
2019059793.tif 000081
【０２８１】
の化合物またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含み、式中、
各Ｒ１３ｂは、独立して、Ｈ、所望により置換されているアシル、所望により置換されているアシルオキシアルキル、所望により置換されているアルキルまたは所望により置換されているアルコキシであり、ここでＲ１３ｂとＲ１４ｂの組合せは、一緒に、所望により置換されているヘテロシクリルを形成し得；
各Ｒ１４ａとＲ１４ｂは、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、所望により置換されているアシル、所望により置換されているアミノ酸、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているハロアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているヒドロキシアルキル（例えば、Ｏ−保護基で置換されている）、所望により置換されているヒドロキシアルケニル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、所望により置換されているアルキニルオキシ、所望により置換されているアミノアルコキシ、所望により置換されているアルコキシアルコキシ、所望により置換されているアシルオキシアルキル、所望により置換されているアミノ（例えば、−ＮＨＲ、ここでＲはＨ、アルキル、アリール、ホスホリル、所望により置換されているアミノアルキルまたは所望により置換されているカルボキシアミノアルキルである）、アジド、所望により置換されているアリール、所望により置換されているヘテロシクリル、所望により置換されているアルケテロシクリル（ａｌｋｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌ）、所望により置換されているアミノアルキル、所望により置換されているアミノアルケニルまたは所望により置換されているアミノアルキニルであり；
Ｒ１５はそれぞれ、独立して、Ｈ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニルまたは所望により置換されているアルキニルである。
【０２８２】
特定の実施形態では、Ｒ１４ｂは、所望により置換されているアミノ酸（例えば、所望により置換されているリジン）である。いくつかの実施形態では、Ｒ１４ａはＨである。
いくつかの実施形態では、Ｂは修飾グアニンである。例となる修飾グアニンは、式（ｂ１５）〜（ｂ１７）：
【０２８３】
【化５４】
2019059793.tif 000082
【０２８４】
の化合物またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｔ４’、Ｔ４”、Ｔ５’、Ｔ５”、Ｔ６’およびＴ６”はそれぞれ、独立して、Ｈ、所望により置換されているアルキルまたは所望により置換されているアルコキシであり、ここでＴ４’とＴ４”の組合せ（例えばＴ４のように）またはＴ５’とＴ５”の組合せ（例えば、Ｔ５のように）またはＴ６’とＴ６”の組合せは一緒に（例えば、Ｔ６のように）、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）またはＳｅ（セレノ）を形成し；
Ｖ５とＶ６はそれぞれ、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＶｄ）ｎｖまたはＣ（ＲＶｄ）ｎｖであり、ここでｎｖは０から２の整数であり、各ＲＶｄは、独立して、Ｈ、ハロ、チオール、所望により置換されているアミノ酸、シアノ、アミジン、所望により置換されているアミノアルキル、所望により置換されているアミノアルケニル、所望により置換されているアミノアルキニル、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシ、所望により置換されているアルキニルオキシ（例えば、所望により、アルキルについて（１）〜（２１）から選択されるものなどの、本明細書に記載されるいずれかの置換基で置換されている）、所望により置換されているチオアルコキシまたは所望により置換されているアミノであり；
Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９ａ、Ｒ１９ｂ、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３およびＲ２４はそれぞれ、独立して、Ｈ、ハロ、チオール、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているチオアルコキシ、所望により置換されているアミノまたは所望により置換されているアミノ酸である。
【０２８５】
例となる修飾グアノシンは、式（ｂ３７）〜（ｂ４０）：
【０２８６】
【化５５】
2019059793.tif 000083
【０２８７】
の化合物またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｔ４’はそれぞれ、独立して、Ｈ、所望により置換されているアルキルまたは所望により置換されているアルコキシであり、各Ｔ４は、独立して、Ｏ（オキソ）、Ｓ（チオ）またはＳｅ（セレノ）であり；
Ｒ１８、Ｒ１９ａ、Ｒ１９ｂおよびＲ２１はそれぞれ、独立して、Ｈ、ハロ、チオール、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているチオアルコキシ、所望により置換されているアミノまたは所望により置換されているアミノ酸である。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、Ｒ１８はＨまたは所望により置換されているアルキルである。さらなる実施形態では、Ｔ４はオキソである。いくつかの実施形態では、Ｒ１９ａとＲ１９ｂはそれぞれ、独立して、Ｈまたは所望により置換されているアルキルである。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、Ｂは修飾アデニンである。例となる修飾アデニンは、式（ｂ１８）〜（ｂ２０）：
【０２９０】
【化５６】
2019059793.tif 000084
【０２９１】
の化合物またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含み、式中、
各Ｖ７は、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＶｅ）ｎｖまたはＣ（ＲＶｅ）ｎｖであり、ここでｎｖは０から２の整数であり、各ＲＶｅは、独立して、Ｈ、ハロ、所望により置換されているアミノ酸、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルケニルオキシまたは所望により置換されているアルキニルオキシ（例えば、所望により、アルキルについて（１）〜（２１）から選択されるものなどの、本明細書に記載されるいずれかの置換基で置換されている）であり；
各Ｒ２５は、独立して、Ｈ、ハロ、チオール、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているチオアルコキシまたは所望により置換されているアミノであり；
Ｒ２６ａとＲ２６ｂはそれぞれ、独立して、Ｈ、所望により置換されているアシル、所望により置換されているアミノ酸、所望により置換されているカルバモイルアルキル、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているヒドロキシアルキル、所望により置換されているヒドロキシアルケニル、所望により置換されているヒドロキシアルキニル、所望により置換されているアルコキシまたはポリエチレングリコール基（例えば、−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’、ここでｓ１は１から１０の整数（例えば、１から６または１から４）であり、ｓ２とｓ３はそれぞれ、独立して、０から１０の整数（例えば、０から４、０から６、１から４、１から６または１から１０）であり、Ｒ’はＨまたはＣ１〜２０アルキルである）；またはアミノ−ポリエチレングリコール基（例えば、−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１、ここでｓ１は１から１０の整数（例えば、１から６または１から４）であり、ｓ２とｓ３はそれぞれ、、独立して、０から１０の整数（例えば、０から４、０から６、１から４、１から６または１から１０）であり、各ＲＮ１は、独立して、水素または所望により置換されているＣ１〜６アルキルである）であり；
各Ｒ２７は、独立して、Ｈ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているチオアルコキシまたは所望により置換されているアミノであり；
各Ｒ２８は、独立して、Ｈ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、または所望により置換されているアルキニルであり；
各Ｒ２９は、独立して、Ｈ、所望により置換されているアシル、所望により置換されているアミノ酸、所望により置換されているカルバモイルアルキル、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているヒドロキシアルキル、所望により置換されているヒドロキシアルケニル、所望により置換されているアルコキシまたは所望により置換されているアミノである。
【０２９２】
例となる修飾アデニンは、式（ｂ４１）〜（ｂ４３）：
【０２９３】
【化５７】
2019059793.tif 000085
【０２９４】
の化合物またはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体を含み、式中、
各Ｒ２５は、独立して、Ｈ、ハロ、チオール、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているチオアルコキシまたは所望により置換されているアミノであり；
Ｒ２６ａとＲ２６ｂはそれぞれ、独立して、Ｈ、所望により置換されているアシル、所望により置換されているアミノ酸、所望により置換されているカルバモイルアルキル、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているヒドロキシアルキル、所望により置換されているヒドロキシアルケニル、所望により置換されているヒドロキシアルキニル、所望により置換されているアルコキシまたはポリエチレングリコール基（例えば、−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’、ここでｓ１は１から１０の整数（例えば、１から６または１から４）であり、ｓ２とｓ３はそれぞれ、独立して、０から１０の整数（例えば、０から４、０から６、１から４、１から６または１から１０）であり、Ｒ’はＨまたはＣ１〜２０アルキルである）；またはアミノ−ポリエチレングリコール基（例えば、−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１、ここでｓ１は１から１０の整数（例えば、１から６または１から４）であり、ｓ２とｓ３はそれぞれ、独立して、０から１０の整数（例えば、０から４、０から６、１から４、１から６または１から１０）であり、各ＲＮ１は、独立して、水素または所望により置換されているＣ１〜６アルキルである）であり；
各Ｒ２７は、独立して、Ｈ、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているチオアルコキシまたは所望により置換されているアミノである。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、Ｒ２６ａはＨであり、Ｒ２６ｂは所望により置換されているアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ２６ａとＲ２６ｂはそれぞれ、独立して、所望により置換されているアルキルである。特定の実施形態では、Ｒ２７は所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルコキシまたは所望により置換されているチオアルコキシである。他の実施形態では、Ｒ２５は所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルコキシまたは所望により置換されているチオアルコキシである。
【０２９６】
特定の実施形態では、Ｒ２６ａ、Ｒ２６ｂまたはＲ２９の所望による置換基は、ポリエチレングリコール基（例えば、−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’、ここでｓ１は１から１０の整数（例えば、１から６または１から４）であり、ｓ２とｓ３はそれぞれ、独立して、０から１０の整数（例えば、０から４、０から６、１から４、１から６，または１から１０）であり、Ｒ’はＨまたはＣ１−２０アルキルである）；またはアミノ−ポリエチレングリコール基（例えば、−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１、ここでｓ１は１から１０の整数（例えば、１から６または１から４）であり、ｓ２とｓ３はそれぞれ、独立して、０から１０の整数（例えば、０から４、０から６、１から４、１から６または１から１０）であり、各ＲＮ１は、独立して、水素または所望により置換されているＣ１〜６アルキルである）である。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、Ｂは式（ｂ２１）：
【０２９８】
【化５８】
2019059793.tif 000086
【０２９９】
を有し得、式中Ｘ１２は、独立して、Ｏ、Ｓ、所望により置換されているアルキレン（例えば、メチレン）または所望により置換されているヘテロアルキレンであり、ｘａは０から３の整数であり、Ｒ１２ａとＴ２は本明細書に記載されるとおりである。
【０３００】
いくつかの実施形態では、Ｂは式（ｂ２２）：
【０３０１】
【化５９】
2019059793.tif 000087
【０３０２】
を有し得、式中Ｒ１０’は、独立して、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているアリール、所望により置換されているヘテロシクリル、所望により置換されているアミノアルキル、所望により置換されているアミノアルケニル、所望により置換されているアミノアルキニル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルキル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルケニル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルキニル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルコキシ、所望により置換されているカルボキシアルコキシ、所望により置換されているカルボキシアルキルまたは所望により置換されているカルバモイルアルキルであり、Ｒ１１、Ｒ１２ａ、Ｔ１およびＴ２は本明細書に記載されるとおりである。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、Ｂは式（ｂ２３）：
【０３０４】
【化６０】
2019059793.tif 000088
【０３０５】
を有し得、式中Ｒ１０は所望により置換されているヘテロシクリル（例えば、所望により置換されているフリル、所望により置換されているチエニル、または所望により置換されているピロリル）、所望により置換されているアリール（例えば、所望により置換されているフェニルまたは所望により置換されているナフチル）、または本明細書に記載されるいずれかの置換基（例えばＲ１０について）であり；ここでＲ１１（例えば、Ｈまたは本明細書に記載されるいずれかの置換基）、Ｒ１２ａ（例えば、Ｈまたは本明細書に記載されるいずれかの置換基）、Ｔ１（例えば、オキソまたは本明細書に記載されるいずれかの置換基）およびＴ２（例えば、オキソまたは本明細書に記載されるいずれかの置換基）は本明細書に記載されるとおりである。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、Ｂは式（ｂ２４）：
【０３０７】
【化６１】
2019059793.tif 000089
【０３０８】
を有し得、式中Ｒ１４’は、独立して、所望により置換されているアルキル、所望により置換されているアルケニル、所望により置換されているアルキニル、所望により置換されているアリール、所望により置換されているヘテロシクリル、所望により置換されているアルカリール、所望により置換されているアルケテロシクリル（ａｌｋｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌ）、所望により置換されているアミノアルキル、所望により置換されているアミノアルケニル、所望により置換されているアミノアルキニル、所望により置換されているアルコキシ、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルキル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルケニル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルキニル、所望により置換されているアルコキシカルボニルアルコキシ、所望により置換されているカルボキシアルコキシ、所望により置換されているカルボキシアルキルまたは所望により置換されているカルバモイルアルキルであり、Ｒ１３ａ、Ｒ１３ｂ、Ｒ１５およびＴ３は本明細書に記載されるとおりである。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、Ｂは式（ｂ２５）：
【０３１０】
【化６２】
2019059793.tif 000090
【０３１１】
を有し得、式中Ｒ１４’は、所望により置換されているヘテロシクリル（例えば、所望により置換されているフリル、所望により置換されているチエニル、または所望により置換されているピロリル）、所望により置換されているアリール（例えば、所望により置換されているフェニルまたは所望により置換されているナフチル）または本明細書に記載されるいずれかの置換基（例えば、Ｒ１４またはＲ１４’について）であり；ここでＲ１３ａ（例えば、Ｈまたは本明細書に記載されるいずれかの置換基）、Ｒ１３ｂ（例えば、Ｈまたは本明細書に記載されるいずれかの置換基）、Ｒ１５（例えば、Ｈまたは本明細書に記載されるいずれかの置換基）およびＴ３（例えば、オキソまたは本明細書に記載されるいずれかの置換基）は本明細書に記載されるとおりである。
【０３１２】
いくつかの実施形態では、Ｂは、シトシン、グアニン、アデニンおよびウラシルからなる群より選択される核酸塩基である。いくつかの実施形態では、Ｂは、
【０３１３】
【化６３】
2019059793.tif 000091
【０３１４】
であり得る。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する例となる核酸塩基およびヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば、５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン）、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレノ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン（τｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−シュードウリジン、５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基デオキシチミンを有する）、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−シュードウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、３−メチル−シュードウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロシュードウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、Ｎ１−メチル−シュードウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオ−ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α−チオ−ウリジン、２��−Ｏ−メチル−ウリジン（Ｕｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’−Ｏ−メチル−シュードウリジン（ψｍ）、２−チオ−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２’‐Ｆ‐アラ‐ウリジン、２’‐Ｆ‐ウリジン、２’‐ＯＨ‐アラ‐ウリジン、５‐（２‐カルボメトキシビニル）ウリジンおよび５‐［３‐（１‐Ｅ‐プロペニルアミノ）ウリジンを含む。
【０３１５】
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は修飾シトシンである。修飾シトシンを有する例となる核酸塩基およびヌクレオシドは、５−アザ−シチジン、６−アザ−シチジン、シュードイソシチジン、３−メチル−シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃ４Ｃ）、５−ホルミル−シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチル−シチジン（ｍ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−シュードイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−シュードイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、α−チオ−シチジン、２’−Ｏ−メチル−シチジン（Ｃｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチル−シチジン（ｍ４２Ｃｍ）、１−チオ−シチジン、２’‐Ｆ‐アラ‐シチジン、２’‐Ｆ‐シチジンおよび２’‐ＯＨ‐アラ‐シチジンを含む。
【０３１６】
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は修飾アデニンである。修飾アデニンを有する例となる核酸塩基およびヌクレオシドは、２−アミノ−プリン、２、６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ハロ−プリン（例えば、２−アミノ−６−クロロ−プリン）、６−ハロ−プリン（例えば、６−クロロ−プリン）、２−アミノ−６−メチル−プリン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシニルカルバモイル−アデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデノシン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチル−アデノシン（ａｃ６Ａ）、７−メチル−アデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−メトキシ−アデニン、α−チオ−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−アデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチル−アデノシン（ｍ６２Ａｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸）（Ａｒ（ｐ））、２−アミノ−Ｎ６−メチル−プリン、１−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、２’‐Ｆ‐アラ‐アデノシン、２’‐Ｆ‐アデノシン、２’‐ＯＨ‐アラ‐アデノシンおよびＮ６‐（１９‐アミノ‐ペンタオキサノナデシル）−アデノシンを含む。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は修飾グアニンである。修飾グアニンを有する例となる核酸塩基およびヌクレオシドは、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４−デメチル−ワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙＷ）、ペルオキシワイブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ）、未修飾ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ＊）、７−デアザ−グアノシン、ケウオシン（Ｑ）、エポキシケウオシン（ｏＱ）、ガラクトシル−ケウオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル−ケウオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチル−イノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−グアノシン（ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、α−チオ−グアノシン、２’−Ｏ−メチル−グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２２Ｇｍ）、１−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’−Ｏ−メチル−イノシン（Ｉｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−イノシン（ｍ１Ｉｍ）、２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸）（Ｇｒ（ｐ））、１−チオ−グアノシン、Ｏ６−メチル−グアノシン、２’‐Ｆ‐アラ‐グアノシンおよび２’‐Ｆ‐グアノシンを含む。
【０３１８】
ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジン類似体から独立して選択され得る。例えば、核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシルまたはヒポキサンチンからそれぞれ独立して選択され得る。別の実施形態では、核酸塩基は、例えば、ピアゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルおよび他のアデニンとグアニンのアルキル誘導体、２−プロピルおよび他のアデニンとグアニンのアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ（例えば、８−ブロモ）、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、デアザグアニン、７−デアザグアニン、３−デアザグアニン、デアザアデニン、７−デアザアデニン、３−デアザアデニン、ピアゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、イミダゾ［１，５−ａ］１，３，５トリアジノン、９−デアザプリン、イミダゾ［４，５−ｄ］ピラジン、チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン、ピラジン−２−オン、１，２，４−トリアジン、ピリダジンおよび１，３，５トリアジンを含む、塩基の天然および合成の誘導体も含み得る。ヌクレオチドを省略表記のＡ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵで表す場合、各文字は、それを示す塩基および／またはその誘導体を指し、例えば、Ａは、アデニンまたはアデニン類似体例えば、７−デアザアデニンを含む。
【０３１９】
ヌクレオシド間結合の修飾
修飾核酸またはｍｍＲＮＡ分子に組み込まれ得る修飾ヌクレオシドとヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合（例えば、リン酸主鎖）上に修飾され得る。主鎖のリン酸基は、酸素原子の１つ以上を異なる置換基で置換することで修飾され得る。さらに、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、非置換リン酸部分の、本明細書に記載される修飾リン酸による大幅な置換を含み得る。修飾リン酸基の例には、限定ではなく、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルが含まれる。ホスホロジチオエートは、非結合酸素がいずれも硫黄で置換されている。リン酸リンカーは、結合する酸素を窒素で置換することにより（架橋ホスホロアミデート）、硫黄で置換することにより（架橋ホスホロチオエート）、および炭素で置換することにより（架橋メチレン−ホスホネート）修飾されることもできる。
【０３２０】
非天然ホスホロチオエート主鎖結合を通じてα−チオ置換リン酸部分がＲＮＡとＤＮＡポリマーに安定性を供与するために与えられる。ホスホロチオエートＤＮＡおよびＲＮＡは、ヌクレアーゼ耐性が増加し、次いで細胞内環境での半減期が延長される。ホスホロチオエートが結合した修飾核酸またはｍｍＲＮＡ分子は、細胞の自然免疫分子の弱い結合／活性化を通じて、自然免疫反応を低下させることも期待される。
【０３２１】
特定の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、α−チオ−ヌクレオシド（例えば、５’−Ｏ−（１−チオリン酸）−アデノシン、５’−Ｏ−（１−チオリン酸）−シチジン（α−チオ−シチジン）、５’−Ｏ−（１−チオリン酸）−グアノシン、５’−Ｏ−（１−チオリン酸）−ウリジンまたは５’−Ｏ−（１−チオリン酸）−シュードウリジン）を含む。
【０３２２】
修飾糖、核酸塩基およびヌクレオシド間結合の組合せ
本発明の修飾核酸とｍｍＲＮＡは、糖、核酸塩基および／またはヌクレオシド間結合への修飾の組合せを含み得る。これらの組合せは、本明細書に記載されるいずれかの１つ以上の修飾を含み得る。例えば、本明細書に記載される式（Ｉａ）、（Ｉａ−１）〜（Ｉａ−３）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ）のいずれかのヌクレオチドを、本明細書に記載される核酸塩基（例えば、式（ｂ１）〜（ｂ４３）のものまたはその他本明細書に記載されるいずれか）のいずれかと組み合わせることができる。
【０３２３】
修飾核酸とｍｍＲＮＡ分子の合成
本発明により使用する修飾核酸とｍｍＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるような任意の便利な技法にしたがい調製され得る。本明細書に開示の修飾核酸およびｍｍＲＮＡ分子の合成に使用される修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、容易に入手可能な出発材料から、以下の一般的な方法と手順を用いて、調製できる。典型的なまたは好ましい作業条件（例えば、反応温度と時間、反応物のモル比、溶媒、圧力など）が整えば、当業者であればさらなる作業条件の最適化と開発が可能であろう。最適反応条件は、使用される反応物や溶媒により異なり得るが、そのような条件は当業者による日常的な最適化手順により決定され得る。
【０３２４】
本明細書に記載される工程は、当技術分野で既知の任意適切な方法にしたがいモニタリングされ得る。例えば、生成物の形成は、分光学的手段、例えば核磁気共鳴分光法（例えば、１Ｈまたは１３Ｃ）赤外線分光法、分光測定法（例えば、ＵＶ−可視）、または質量分析、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または薄層クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーにより、モニタリングされ得る。
【０３２５】
本発明の修飾核酸とｍｍＲＮＡ分子の調製は、様々な化学基の保護と脱保護を含み得る。保護と脱保護の必要性と、適切な保護基の選択は、当業者には容易に決定され得る。保護基の化学については、例えば、その全容が参照として本明細書に組み込まれる、ＧｒｅｅｎｅらのＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｄ．  Ｅｄ．，  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９１において見出され得る。
【０３２６】
本明細書に記載される工程の反応は、有機化学の当業者により容易に選択され得る適切な溶媒中で行われ得る。適切な溶媒は、反応が行われる温度、すなわち溶媒の凍結温度から溶媒の沸騰温度の範囲であり得る温度で、出発材料（反応物）、中間体または生成物と実質的に非反応性であり得る。所与の反応が、１種類の溶媒または２種類以上の溶媒の混合物中で行われ得る。特定の反応ステップにより、特定の反応ステップに適した溶媒が選択され得る。
【０３２７】
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドのラセミ混合物の分割が、当技術分野で既知の数々の方法のいずれかにより行われ得る。方法の例としては、光学活性な塩形成有機酸である「キラル分離酸」を用いての分別結晶が含まれる。分別結晶に適した分離剤は、例えば、酒石酸、ジアセチル酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、マンデル酸、リンゴ酸、乳酸または様々な光学活性カンファースルホン酸のＤおよびＬ型などの光学活性酸である。ラセミ混合物の分割は、光学活性分離剤（例えば、ジニトロベンゾイルフェニルグリシン）を充填したカラムで溶出して行われ得る。適切な溶離溶媒組成物は、当業者により決定され得る。
【０３２８】
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチド（例えば、構成要素分子）は、それらの全容が参照として本明細書に組み込まれる、Ｏｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ７４：２５８５−２５８８  （２００９）；  Ｐｕｒｍａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２（１）：  ７２−７８，  （１９９４）；  Ｆｕｋｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １（４）：  ５６３−５６８  （１９６２）；およびＸｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  ４８（９）：  １７２９−１７４０  （１９９２）に記載の合成法にしたがい調製され得る。
【０３２９】
本発明の修飾核酸とｍｍＲＮＡは、分子の全長にわたり均等に修飾されていなくてもよい。例えば、１つ以上または全種のヌクレオチド（例えば、プリンまたはピリミジン、または、Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれかの１つ以上または全て）は、本発明のポリヌクレオチドまたはその所与の配列領域で均等に修飾されていてもされていなくてもよい。いくつかの実施形態では，本発明のポリヌクレオチド（またはその所与の配列領域）の全ヌクレオチドＸは修飾されており、ここでＸは、Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれかのヌクレオチドか、またはＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋ＣまたはＡ＋Ｇ＋Ｃの組合せのいずれかであってよい。
【０３３０】
異なる糖修飾、ヌクレオチド修飾および／またはヌクレオシド間結合（例えば、主鎖構造）が修飾核酸またはｍｍＲＮＡの様々な位置に存在し得る。当業者であれば、ヌクレオチド類似体または他の修飾（複数可）が、修飾核酸またはｍｍＲＮＡの機能が実質的に低下しないように、修飾核酸またはｍｍＲＮＡのどの位置（複数可）に位置してもよいことを理解されよう。修飾は、５’または３’末端修飾でもよい。修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、約１％から約１００％、またはその間のあらゆるパーセンテージ（例えば、１％から２０％、１％から２５％、１％から５０％、１％から６０％、１％から７０％、１％から８０％、１％から９０％、１％から９５％、１０％から２０％、１０％から２５％、１０％から５０％、１０％から６０％、１０％から７０％、１０％から８０％、１０％から９０％、１０％から９５％、１０％から１００％、２０％から２５％、２０％から５０％、２０％から６０％、２０％から７０％、２０％から８０％、２０％から９０％、２０％から９５％、２０％から１００％、５０％から６０％、５０％から７０％、５０％から８０％、５０％から９０％、５０％から９５％、５０％から１００％、７０％から８０％、７０％から９０％、７０％から９５％、７０％から１００％、８０％から９０％、８０％から９５％、８０％から１００％、９０％から９５％、９０％から１００％および９５％から１００％）の修飾ヌクレオチドを含み得る。
【０３３１】
いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、修飾ピリミジン（例えば、修飾ウラシル／ウリジンまたは修飾シトシン／シチジン）を含む。いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡ分子内のウラシルまたはウリジンは、約１％から約１００％の修飾ウラシルまたは修飾ウリジン（例えば、１％から２０％、１％から２５％、１％から５０％、１％から６０％、１％から７０％、１％から８０％、１％から９０％、１％から９５％、１０％から２０％、１０％から２５％、１０％から５０％、１０％から６０％、１０％から７０％、１０％から８０％、１０％から９０％、１０％から９５％、１０％から１００％、２０％から２５％、２０％から５０％、２０％から６０％、２０％から７０％、２０％から８０％、２０％から９０％、２０％から９５％、２０％から１００％、５０％から６０％、５０％から７０％、５０％から８０％、５０％から９０％、５０％から９５％、５０％から１００％、７０％から８０％、７０％から９０％、７０％から９５％、７０％から１００％、８０％から９０％、８０％から９５％、８０％から１００％、９０％から９５％、９０％から１００％、および９５％から１００％の修飾ウラシルまたは修飾ウリジン）で置換され得る。修飾ウラシルまたはウリジンは、単一の独自構造をもつ化合物または異なる構造（例えば，本明細書に記載されるような、２、３、４つ以上の独自構造）を有する複数の化合物で置換され得る。いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡ分子中のシトシンまたはシチジンは、約１％から約１００％の修飾シトシンまたは修飾シチジン（例えば、１％から２０％、１％から２５％、１％から５０％、１％から６０％、１％から７０％、１％から８０％、１％から９０％、１％から９５％、１０％から２０％、１０％から２５％、１０％から５０％、１０％から６０％、１０％から７０％、１０％から８０％、１０％から９０％、１０％から９５％、１０％から１００％、２０％から２５％、２０％から５０％、２０％から６０％、２０％から７０％、２０％から８０％、２０％から９０％、２０％から９５％、２０％から１００％、５０％から６０％、５０％から７０％、５０％から８０％、５０％から９０％、５０％から９５％、５０％から１００％、７０％から８０％、７０％から９０％、７０％から９５％、７０％から１００％、８０％から９０％、８０％から９５％、８０％から１００％、９０％から９５％、９０％から１００％および９５％から１００％の修飾シトシンまたは修飾シチジン）で置換され得る。修飾シトシンまたはシチジンは、単一の独自構造をもつ化合物または異なる構造（例えば，本明細書に記載されるような、２、３、４つ以上の独自構造）を有する複数の化合物で置換され得る。
【０３３２】
いくつかの実施形態では、本開示は、式（Ｉａ−１）：
【０３３３】
【化６４】
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【０３３４】
を有するｎ個の連結ヌクレオシドを含む修飾核酸またはｍｍＲＮＡを合成する方法を提供し、該方法は、
ａ）式（ＩＶ−１）：
【０３３５】
【化６５】
2019059793.tif 000093
【０３３６】
のヌクレオチドを
式（Ｖ−１）：
【０３３７】
【化６６】
2019059793.tif 000094
【０３３８】
のホスホロアミダイト化合物と反応させて、
（式中Ｙ９はＨ、ヒドロキシ、ホスホリル、ピロリン酸、硫酸、アミノ、チオール、所望により置換されているアミノ酸またはペプチド（例えば、２から１２アミノ酸を含む）であり；各Ｐ１、Ｐ２とＰ３は、独立して、適切な保護基であり；
【０３３９】
【化６７】
2019059793.tif 000095
【０３４０】
は固体支持体を意味する）
式（ＶＩ−１）：
【０３４１】
【化６８】
2019059793.tif 000096
【０３４２】
の修飾核酸またはｍｍＲＮＡを得るステップと、
ｂ）式（Ｖ）の修飾核酸またはｍｍＲＮＡを酸化または硫化して式（ＶＩＩ−１）：
【０３４３】
【化６９】
2019059793.tif 000097
【０３４４】
の修飾核酸またはｍｍＲＮＡを得るステップと、
ｃ）保護基を除去して式（Ｉａ）の修飾核酸またはｍｍＲＮＡを得るステップを含む。
いくつかの実施形態では、ステップａ）とｂ）は、１回から約１０，０００回反復される。いくつかの実施形態では、方法は、アデノシン、シトシン、グアノシン、およびウラシルからなる群より選択されるヌクレオチド（例えば、構成要素分子）をさらに含む。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、ピリミジンまたはその誘導体であり得る。いくつかの実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは翻訳可能である。
【０３４５】
修飾核酸およびｍｍＲＮＡの他の成分は任意であり、いくつかの実施形態では有益である。例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および／または３’ＵＴＲが与えられ、ここで片方または両方が独立して、１つ以上の異なるヌクレオシド修飾を含み得る。そのような実施形態では、ヌクレオシド修飾は、翻訳可能領域にも存在し得る。また、コザック配列を含む修飾核酸およびｍｍＲＮＡも提供される。
【０３４６】
修飾核酸またはｍｍＲＮＡ、例えば、ＲＮＡまたはｍＲＮＡに組み込まれる修飾ヌクレオチドの例示的合成を、以下スキーム１から１１に示す。スキーム１は、修飾ヌクレオシドを含むヌクレオシドのリン酸化の一般的方法を示す。
【０３４７】
スキーム１
【０３４８】
【化７０】
2019059793.tif 000098
【０３４９】
様々な保護基を使用して反応が制御され得る。例えば、スキーム２は、ヒドロキシル基の２’および３’位ではなく糖の５’位のリン酸化を促進する複数の保護および脱保護ステップの使用を示す。
【０３５０】
スキーム２
【０３５１】
【化７１】
2019059793.tif 000099
【０３５２】
修飾ヌクレオチドは、あらゆる便利な方法で合成され得る。スキーム３、４および７は、修飾プリン核酸塩基を有する修飾ヌクレオチドを合成する例となる方法を示し、スキーム５と６は、修飾シュードウリジンまたはシュードイソシチジンを有する修飾ヌクレオチドを合成する例となる方法を示す。
【０３５３】
スキーム３
【０３５４】
【化７２】
2019059793.tif 000100
【０３５５】
スキーム４
【０３５６】
【化７３】
2019059793.tif 000101
【０３５７】
スキーム５
【０３５８】
【化７４】
2019059793.tif 000102
【０３５９】
スキーム６
【０３６０】
【化７５】
2019059793.tif 000103
【０３６１】
スキーム７
【０３６２】
【化７６】
2019059793.tif 000104
【０３６３】
スキーム８と９は、修飾ヌクレオチドの例示的合成を示す。スキーム１０は、ヌクレオチドを産生する非限定的な生体触媒的方法を示す。
スキーム８
【０３６４】
【化７７】
2019059793.tif 000105
【０３６５】
スキーム９
【０３６６】
【化７８】
2019059793.tif 000106
【０３６７】
スキーム１０
【０３６８】
【化７９】
2019059793.tif 000107
【０３６９】
スキーム１１は、修飾ウラシルの例示的合成を示し、ここでＮ１位が他で示したＲ１２ｂで修飾されており、リボースの５’位がリン酸化されている。Ｔ１、Ｔ２、Ｒ１２ａ、Ｒ１２ｂおよびｒは本明細書に示されているとおりである。この合成、ならびにその最適化バージョンは、他のピリミジン核酸塩基およびプリン核酸塩基の修飾（例えば、式（ｂ１）〜（ｂ４３）を参照）および／または１つ以上のリン酸基の導入（例えば、糖の５’位）にも使用できる。このアルキル化反応は、１つ以上の所望により置換されているアルキル基を、本明細書に記載のあらゆる核酸塩基のあらゆる反応基（例えばアミノ基）に含めるのにも使用できる（例えば、シトシン、ウラシル、アデニンおよびグアニンのワトソン−クリック塩基対面のアミノ基）。
【０３７０】
スキーム１１
【０３７１】
【化８０】
2019059793.tif 000108
【０３７２】
ｍｍＲＮＡにおけるヌクレオチドの組合せ
修飾ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドの組合せのさらなる例を以下表２に示す。これらの修飾ヌクレオチドの組合せは、本発明の修飾核酸またはｍｍＲＮＡを形成するのに使用され得る。特に断らない限り、修飾ヌクレオチドは、本発明の修飾核酸またはｍｍＲＮＡの天然ヌクレオチドを完全に置き換えてよい。非限定的な例として、天然ヌクレオチドのウリジンは、本明細書に記載される修飾ヌクレオシドで置換されてよい。別の非限定的な例では、天然ヌクレオチドウリジンは、本明細書に開示される修飾ヌクレオシドの少なくとも１つで部分的に（例えば、約０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９．９％）置換されていてよい。
【０３７３】
【表２】
2019059793.tif 000109
【０３７４】
2019059793.tif 000110
【０３７５】
修飾ヌクレオチドの組合せのさらなる例を以下表３に示す。これらの修飾ヌクレオチドの組合せは、本発明の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを形成するのに使用され得る。
【０３７６】
【表３】
2019059793.tif 000111
【０３７７】
2019059793.tif 000112
【０３７８】
いくつかの実施形態では、少なくとも２５％のシトシンが式（ｂ１０）〜（ｂ１４）の化合物で置換されている（例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％）。
【０３７９】
いくつかの実施形態では、少なくとも２５％のウラシルが式（ｂ１）〜（ｂ９）の化合物で置換されている（例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％）。
【０３８０】
いくつかの実施形態では、少なくとも２５％のシトシンが式（ｂ１０）〜（ｂ１４）の化合物で置換され、少なくとも２５％のウラシルが式（ｂ１）〜（ｂ９）の化合物で置換されている（例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％）。
【０３８１】
修飾核酸分子の合成
本開示により使用される修飾核酸分子は、限定ではなく，  化学合成および酵素的合成などのインビトロの転写、または長い前駆物質の酵素的および化学的切断などを含む、任意入手可能な技法により調製され得る。ＲＮＡを合成する方法は、当技術分野で既知である（例えば、それらの全容が参照として本明細書に組み込まれるＧａｉｔ，  Ｍ．Ｊ．  （ｅｄ．）  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｏｘｆｏｒｄ  ［Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ］，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ：  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８４；  ａｎｄ  Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，  Ｐ．  （ｅｄ．）  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：
ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖ．  ２８８  （Ｃｌｉｆｔｏｎ，  Ｎ．Ｊ．）  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎ．Ｊ．：  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００５を参照）。
【０３８２】
本明細書に開示される修飾核酸分子は、容易に入手可能な出発材料から、以下の一般的な方法と手順を用いて調製できる。典型的なまたは好ましい作業条件（例えば、反応温度と時間、反応物のモル比、溶媒、圧力など）が整えば、特に断らない限り他の作業条件も使用され得ることが理解される。最適反応条件は、使用される反応物や溶媒により異なり得るが、そのような条件は当業者による日常的な最適化手順により決定され得る。
【０３８３】
本明細書に記載される工程は、当技術分野で既知の任意適切な方法にしたがいモニタリングされ得る。例えば、生成物の形成は、分光学的手段、例えば核磁気共鳴分光法（例えば、１Ｈまたは１３Ｃ）赤外線分光法、分光測定法（例えば、ＵＶ−可視）、質量分析、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または薄層クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーにより、モニタリングされ得る。
【０３８４】
修飾核酸分子の調製は、様々な化学基の保護と脱保護を含み得る。保護と脱保護の必要性と、適切な保護基の選択は、当業者には容易に決定され得る。保護基の化学については、例えば、その全容が参照として本明細書に組み込まれる、ＧｒｅｅｎｅらのＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｄ．  Ｅｄ．，  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９１において見出され得る。
【０３８５】
本明細書に記載される工程の反応は、有機化学の当業者により容易に選択され得る適切な溶媒中で行われ得る。適切な溶媒は、反応が行われる温度、すなわち溶媒の凍結温度から溶媒の沸騰温度の範囲であり得る温度で、出発材料（反応物）、中間体または生成物と実質的に非反応性であり得る。所与の反応が、１種類の溶媒または２種類以上の溶媒の混合物中で行われ得る。特定の反応ステップに応じて、特定の反応ステップに適した溶媒が選択され得る。
【０３８６】
修飾核酸分子のラセミ混合物の分割は、当技術分野で既知の数々の方法のいずれでも実施され得る。方法の例としては、限定ではなく、光学活性な塩形成有機酸である「キラル分離酸」を用いての分別結晶が含まれる。分別結晶に適した分離剤は、例えば、酒石酸、ジアセチル酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、マンデル酸、リンゴ酸、乳酸または様々な光学活性カンファースルホン酸のＤおよびＬ型などの光学活性酸である。ラセミ混合物の分割は、光学活性分離剤（例えば、ジニトロベンゾイルフェニルグリシン）を充填したカラムで溶出して行われ得る。適切な溶離溶媒組成物は、当業者により決定され得る。
【０３８７】
修飾核酸分子は、分子の全長にわたり均等に修飾されていなくてもよい。異なる核酸修飾および／または主鎖構造が核酸の様々な位置に存在し得る。当業者であれば、ヌクレオチド類似体または他の修飾（複数可）が、核酸の機能が実質的に低下しないように、核酸のどの位置（複数可）に位置してもよいことを理解されよう。修飾は、５’または３’末端修飾でもよい。核酸は、最低１％かつ最大１００％の修飾ヌクレオチド、または少なくとも５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも１０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも２５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも５０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾ヌクレオチドまたは少なくとも９０％の修飾ヌクレオチドなどのその間のあらゆるパーセンテージを含み得る。例えば、核酸は、ウラシルまたはシトシンなどの修飾ピリミジンを含み得る。いくつかの実施形態では、核酸中少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％のウラシルが修飾ウラシルで置換され得る。修飾ウラシルは、単一の独自構造を有する化合物で置換され得、または異なる構造（例えば、２、３、４つ以上の独自構造）を有する複数の化合物で置換され得る。いくつかの実施形態では、核酸中少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％のシトシンが修飾シトシンで置換され得る。修飾シトシンは、単一の独自構造を有する化合物で置換され得、または異なる構造（例えば、２、３、４つ以上の独自構造）を有する複数の化合物で置換され得る。
【０３８８】
一般に、本明細書では「ｍｍＲＮＡ」と呼ばれる本開示の修飾ｍＲＮＡの最短の長さは、ジペプチドをコードするのに十分であり得るｍＲＮＡ配列の長さであり得る。別の実施形態では、ｍＲＮＡ配列の長さは、トリペプチドをコードするのに十分であり得る。別の実施形態では、ｍＲＮＡ配列の長さは、テトラペプチドをコードするのに十分であり得る。別の実施形態では、ｍＲＮＡ配列の長さは、ペンタペプチドをコードするのに十分であり得る。別の実施形態では、ｍＲＮＡ配列の長さは、ヘキサペプチドをコードするのに十分であり得る。別の実施形態では、ｍＲＮＡ配列の長さは、ヘプタペプチドをコードするのに十分であり得る。別の実施形態では、ｍＲＮＡ配列の長さは、オクタペプチドをコードするのに十分であり得る。別の実施形態では、ｍＲＮＡ配列の長さは、ノナペプチドをコードするのに十分であり得る。別の実施形態では、ｍＲＮＡ配列の長さは、デカペプチドをコードするのに十分であり得る。
【０３８９】
修飾核酸分子配列がコードできるジペプチドの例は、限定ではなく、カルノシンとアンセリンを含む。
さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは３０ヌクレオチドを超える長さであり得る。別の実施形態では、ｍＲＮＡは３５ヌクレオチドを超える長さであり得る（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００および５，０００ヌクレオチドであるか、これらよりも長い）。
【０３９０】
修飾核酸分子の例示的特性
主溝相互作用パートナー
本明細書に記載される修飾核酸分子、例えば、修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）は、ヌクレオチドまたは核酸の主溝面との相互作用、例えば結合を介してＲＮＡリガンドを検出し応答する認識受容体との相互作用を攪乱し得る。したがって、本明細書に記載される修飾ヌクレオチドまたは修飾核酸分子を含むＲＮＡリガンドは、主溝結合パートナーとの相互作用を低下させ、したがって、自然免疫反応または炎症促進性サイトカインの発現と分泌、またはその両方を低下させる。
【０３９１】
主溝相互作用、例えば結合パートナーの例は、限定ではなく、以下のヌクレアーゼとヘリカーゼを含む。膜内で、ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）３，７および８は単鎖および二本鎖ＲＮＡに応答できる。細胞質内で、ＤＥＸ（Ｄ／Ｈ）ヘリカーゼのスーパーファミリー２のメンバーとＡＴＰアーゼは、ＲＮＡを検知し、抗ウイルス応答を開始できる。これらのヘリカーゼは、ＲＩＧ−Ｉ（レチノイン酸誘導遺伝子Ｉ）とＭＤＡ５（黒色腫分化関連性遺伝子５）を含む。他の例は、ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２（ＬＧＰ２）、タンパク質を含むＨＩＮ−２００ドメインまたはヘリカーゼ−ドメイン含有タンパク質を含む。
【０３９２】
修飾核酸分子を用いての自然細胞免疫反応の予防または低減
本明細書に記載される修飾核酸分子、例えば、ｍｍＲＮＡは、細胞内の自然免疫反応を低下させる。「自然免疫反応」という用語は、限定ではないが一般にはウイルスまたは細菌由来の単鎖核酸を含む外因性核酸に対する細胞反応を含み、サイトカイン、特にインターフェロンの発現と放出、および細胞死の誘導を含む。タンパク質合成も自然細胞免疫反応中に低下し得る。細胞内の自然免疫反応を排除することは有利であるが、本開示は、そのような反応全てを除去することなく、インターフェロンシグナル伝達を含む免疫反応を大幅に低下させる修飾ｍＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、免疫反応は、対応する非修飾核酸分子に誘導される免疫反応と比べ、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％または９９．９％以上低下し得る。そのような低下は、インターフェロン１型の発現または活性レベル、またはＴｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８）などのインターフェロンが調節する遺伝子の発現により測定され得る。自然免疫反応の低下は、細胞集団に対する修飾ＲＮＡの１回または複数の投与後の細胞死の低下によっても測定され得、たとえば、細胞死は、対応する非修飾核酸分子で観察されるよりも１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％または９５％以上少ない細胞死頻度である。さらに、細胞死は、修飾核酸分子が接触した細胞の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、０．１％よりも少ないか、０．０１％以下に、影響し得る。
【０３９３】
本開示は、標的細胞集団への、たとえばインビトロ、エックスビボまたはインビボでの修飾核酸分子の頻回導入（例えば、トランスフェクション）を提供する。細胞集団との接触ステップは、１回または複数回（たとえば２、３、４、５回または６回以上）繰り返してよい。いくつかの実施形態では、細胞集団を修飾核酸分子に接触させるステップは、その細胞集団において所定のタンパク質翻訳効率が得られるよう十分な回数繰り返してよい。核酸修飾により標的細胞集団の毒性が低下しているので、そのような頻回のトランスフェクションは様々な細胞種において達成可能である。
【０３９４】
本明細書で教示される修飾の組合せを含む本発明の修飾核酸は、それらを治療様式としてより適切にする優れた特性を有し得る。
当分野の「全か無か」のモデルは、修飾ｍＲＮＡの治療的利用に関連づけられる生物学的現象を記述するのにまったく不十分であることが確認されている。発明者らは、タンパク質産生を向上するためには、修飾または修飾の組合せの性質、修飾パーセントを考慮し、２以上のサイトカインまたは測定基準を調査して特定の修飾ｍＲＮＡの有効性とリスクのプロファイルを決定し得る、と定めている。
【０３９５】
本発明の一態様では、修飾ｍＲＮＡの有効性を非修飾と比較して決定する方法は、本発明の外因性核酸の投与により発現が引き起こされる、１つ以上のサイトカインの測定と分析を含む。これらの値は、非修飾核酸の投与、またはサイトカイン反応、ポリＩＣ、Ｒ−８４８または当技術分野で既知の他の基準などの標準的測定基準と比較される。
【０３９６】
本明細書で開発される標準的測定基準の一例は、細胞、組織または生物内で産生される翻訳ポリペプチド（タンパク質）のレベルまたは量と、細胞、組織または生物内で修飾核酸の投与または接触の結果として発現が引き起こされるサイトカインの１つ以上（またはパネル）のレベルまたは量の比率の測定である。そのような比率は、ここでは、タンパク質：サイトカイン比率または「ＰＣ」比率と呼ばれる。ＰＣ比率が高いほど、修飾核酸は有効である（タンパク質をコードするポリヌクレオチドを測定）。サイトカインに対する本発明の好ましいＰＣ比率は、１より大きい、１０より大きい、１００より大きい、１０００より大きい、１０，０００より大きい、またはそれよりも大きくてよい。異なるまたは非修飾構築物の修飾核酸よりも高いＰＣ比率を有する修飾核酸が好ましい。
【０３９７】
ＰＣ比率は、ポリヌクレオチド中に存在する修飾パーセントによりさらに認定される。例えば、１００％の修飾核酸に基準化すると、サイトカインの機能（またはリスク）としてのタンパク質産生またはサイトカインプロファイルが決定され得る。
【０３９８】
１つの実施形態では、本発明は、化学作用、サイトカインまたは修飾パーセントで、修飾核酸（ポリヌクレオチド）のＰＣ比率を比較することによりあらゆる特定の修飾ポリヌクレオチドの相対的な有効性を決定する方法を提供する。
【０３９９】
免疫反応の活性化：ワクチン
本発明の１つの実施形態では、ｍＲＮＡ分子は生物の免疫反応を引き出すかまたは誘発するために使用され得る。送達されるｍＲＮＡ分子は、免疫原性ペプチドまたはポリペプチドをコードし得、２以上のそのようなペプチドまたはポリペプチドをコードし得る。
【０４００】
さらに、特定の修飾ヌクレオシドまたはそれらの組合せは、本発明の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡに導入されると、自然免疫反応を活性化する。そのような活性化分子は、ポリペプチドおよび／または他のワクチンと組み合わせるとアジュバントとして有用である。特定の実施形態では、活性化分子は、ワクチンとして有用なポリペプチド配列をコードする翻訳可能領域を含み、したがって自己アジュバントとなる能力を提供する。
【０４０１】
１つの実施形態では、本発明の修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡは、免疫原をコードし得る。免疫原をコードする修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡの送達は、免疫反応を活性化し得る。非限定的な例として、免疫原をコードする修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡは、細胞に送達されて複数の自然反応経路をトリガーし得る（その全容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２００６３７７号を参照）。別の非限定的な例として、免疫原をコードする本発明の修飾核酸分子とｍｍＲＮＡは、脊椎動物に、その脊椎動物の免疫原となるのに十分な量で、送達され得る（それらの全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２００６３７２号と同第２０１２００６３６９号を参照）。
【０４０２】
本発明の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、ワクチンのポリペプチド配列をコードし得、さらに阻害剤を含み得る。阻害剤は抗原提示を損ない得、および／または当技術分野で既知の様々な経路を阻害し得る。非限定的な例として、本発明の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、抗原提示を損ない得る阻害剤との組合せでワクチンに使用してよい（それらの全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２０８９２２５号と同第２０１２０８９３３８号を参照）。
【０４０３】
１つの実施形態では、本発明の修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡは、自己複製ＲＮＡであり得る。自己複製ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ送達と囲包された遺伝子産物の発現の効率を高め得る。１つの実施形態では、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１つの本明細書に記載されるおよび／または当技術分野で既知の修飾を含み得る。１つの実施形態では，自己複製ＲＮＡは、自己複製ＲＮＡが感染性ウイルス粒子の産生を誘発しないように設計され得る。非限定的な例として、自己複製ＲＮＡは、それらの全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる米国出願公開第２０１１０３００２０５号と国際公開第２０１１００５７９９号に記載される方法で設計され得る。
【０４０４】
１つの実施形態では、本発明の自己複製修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、免疫反応を生じ得るタンパク質をコードし得る。非限定的な例として、修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１つの抗原をコードし得る自己複製ｍＲＮＡであり得る（それらの全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる米国出願公開第２０１１０３００２０５号と国際公開第２０１１００５７９９を参照）。
【０４０５】
１つの実施形態では、本発明の自己複製修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、本明細書に記載されるまたは当技術分野で既知の方法を用いて製剤され得る。非限定的な例として、自己複製ＲＮＡは、Ｇｅａｌｌら（その全容が参照により本明細書に組み込まれるＮｏｎｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ＲＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ，  ＰＮＡＳ  ２０１２；  ＰＭＩＤ：  ２２９０８２９）に記載される方法により送達用に製剤され得る。
【０４０６】
１つの実施形態では、本発明の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、両親媒性および／または免疫原性両親媒性ペプチドをコードし得る。
１つの実施形態では、本発明の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡの製剤は、両親媒性および／または免疫原性両親媒性ペプチドをさらに含み得る。非限定的な例として、両親媒性および／または免疫原性両親媒性ペプチドを含む修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、それらの全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる米国出願公開第２０１１０２５０２３７号ならびに国際公開第２０１０００９２７７号および同第２０１０００９０６５号に記載されるように製剤され得る。
【０４０７】
１つの実施形態では、本発明の修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡは、免疫賦活性であり得る。非限定的な例として、修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡは、プラス鎖またはマイナス鎖ＲＮＡウイルスゲノムの全部または一部をコードし得る（それらの全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２０９２５６９号および米国出願公開第２０１２０１７７７０１号を参照）。別の非限定的な例では、本発明の免疫賦活性修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、本明細書に記載されるおよび／または当技術分野で既知の賦形剤とともに投与用に製剤され得る（それらの全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２０６８２９５号および米国出願公開第２０１２０２１３８１２号を参照）。
【０４０８】
１つの実施形態では、本明細書に記載される方法で製剤されたワクチンの応答は、治療効果を誘発する様々な化合物を加えて増強され得る。非限定的な例として、ワクチン製剤は、ＭＨＣＩＩ結合ペプチドまたはＭＨＣＩＩ結合ペプチドに類似の配列を有するペプチドを含み得る（それらの全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２０２７３６５号、同第２０１１０３１２９８号および米国出願公開第２０１２００７０４９３号、同第ＵＳ２０１１０１１０９６５号を参照）。別の例として、ワクチン製剤は、対象におけるニコチン残基に対する抗体反応を生成し得る修飾ニコチン化合物を含み得る（それらの全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２０６１７１７号および米国出願公開第２０１２０１１４６７７号を参照）。
【０４０９】
ポリペプチド変異体
修飾核酸分子は、基準ポリペプチド配列と特定の同一性のあるポリペプチド、例えば変異体ポリペプチドをコードする。「同一性」という用語は、当技術分野で知られるように、２以上のペプチドの配列間で配列を比較して決定される関係を指す。当分野では、「同一性」は、２以上のアミノ酸残基の鎖間の一致数により決定されるペプチド同士の配列関連性の度合いも指す。同一性は、特定の数学モデルまたはコンピュータープログラム（すなわち「アルゴリズム」）に指定される、（存在する場合は）ギャップアラインメントを有する２以上の配列の小さい方の間の同一整合のパーセントを測る。関連ペプチドの同一性は、既知の方法で容易に計算できる。そのような方法は、限定ではなく、その全容がすべて参照により本明細書に組み込まれるＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．，  ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８；  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｗ．，  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９３；  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  １，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，
Ｈ．  Ｇ．，  ｅｄｓ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  １９９４；  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７；  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｄｓ．，  Ｍ．  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．  ４８，  １０７３  （１９８８）に記載されるものを含む。
【０４１０】
いくつかの実施形態では、ポリペプチド変異体は、基準ポリペプチドと同じか類似の活性を有し得る。あるいは、変異体は、基準ポリペプチドと比べて改変された活性（例えば増加または減少）を有し得る。一般に、本開示の特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、本明細書に記載される当業者には既知の配列アラインメントプログラムおよびパラメータにより決定される場合、その特定の基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する。
【０４１１】
当業者ならば認識しようが、タンパク質断片、機能タンパク質ドメインおよび相同タンパク質も、本開示の範囲であるとみなされる。例えば、本明細書では、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１００を超えるアミノ酸長さの、基準タンパク質の任意のタンパク質断片（基準ポリペプチド配列よりも少なくとも１アミノ酸残基だけ短いが他は同一であるポリペプチド配列を意味する）が提供される。別の例では、本明細書に記載されるいずれかの配列と約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約１００％同一である、約２０、約３０、約４０、約５０または約１００個のアミノ酸伸長を含む任意のタンパク質が、本開示にしたがい利用され得る。特定の実施形態では、本開示にしたがい利用されるタンパク質配列は、本明細書に提供または参照されるいずれかの配列に示されるような、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１以上の突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）を含む。
【０４１２】
ポリペプチド−核酸複合体
適切なタンパク質翻訳は、ｍＲＮＡに関連するある数のポリペプチドと核酸の物理的集合を含む。本開示は、１つ以上のヌクレオシド修飾（例えば、少なくとも２つの異なるヌクレオシド修飾）とｍＲＮＡに結合した１つ以上のポリペプチドを有する翻訳可能ｍＲＮＡを含むタンパク質−核酸複合体を提供する。一般に、タンパク質は、この複合体が導入される細胞の自然免疫反応を回避または低下させるのに有効な量で提供される。
【０４１３】
翻訳不可能修飾核酸分子
本明細書に記載されるように、実質的に翻訳不可能な配列を有するｍＲＮＡが提供される。そのようなｍＲＮＡは、対象に投与される場合ワクチンとして有効であり得る。ワクチンを投与される対象が哺乳動物であり得、より好ましくはヒトであり、最も好ましくは患者であることがさらに提供される。
【０４１４】
１つ以上の非コード領域を含む修飾核酸分子も提供される。そのような修飾核酸分子は一般には翻訳されないが、１つ以上の翻訳機構成分、たとえばリボソームタンパク質または転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）などに結合し捕捉する能力があるので、細胞内でのタンパク質発現を有効に低下させる。修飾核酸分子は、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏ−ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはＰｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）を含み得る。
【０４１５】
医薬組成物
製剤、投与、送達および投薬
本発明は、修飾核酸およびｍｍＲＮＡ組成物ならびに１つ以上の薬剤的に許容可能な賦形剤と組み合わせた複合体を提供する。医薬組成物は、１つ以上の追加の活性物質、例えば治療的および／または予防的活性物質を所望により含んでよい。製剤および／または薬剤の製造における一般的考察は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２１ｓｔ  ｅｄ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  ２００５（その全容が参照により本明細書に組み込まれる）に見出され得る。
【０４１６】
いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者または対象に投与される。本開示の目的では、「活性成分」という語句は、一般に、本明細書に記載されるような、送達される修飾核酸およびｍｍＲＮＡを指す。
【０４１７】
ここで提供される医薬組成物の説明は主としてヒトへの投与に適した医薬組成物に関するが、当業者であれば、そのような組成物は一般に、他の任意の動物、例えば非ヒト動物、例えば非ヒト哺乳動物への投与に適していることを理解されよう。様々な動物への投与に適した組成物を得るための、ヒトへの投与に適した医薬組成物の修飾は、よく理解されており、通常の技術を有する獣医薬理学者であれば、せいぜい通常の実験をするだけでそのような修飾を設計および／または実施できる。医薬組成物の投与が企図される対象には、限定ではなく、ヒトおよび／または他の霊長類；家畜、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウスおよび／またはラットなどの商業関連の哺乳動物を含む哺乳動物；および／または家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウおよび／またはシチメンチョウなどの商業関連のトリを含む鳥類が含まれる。
【０４１８】
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、あらゆる既知のまたは今後薬理学分野で開発される方法で調製され得る。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１つ以上の他の副成分と結合させるステップ、次いで必要および／または所望される場合は、製品の分割、成形および／または所望の単回または反復投与単位に包装するステップを含む。
【０４１９】
本発明による医薬組成物は、単回単位用量としておよび／または複数の単回単位用量として調製され、包装され、および／または原体で販売され得る。ここでは「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量である。活性成分の量は、一般に、対象に投与され得る活性成分の用量に等しいおよび／またはそのような用量の好都合な画分、例えばそのような用量の半分または３分の１である。
【０４２０】
本発明による医薬組成物中の活性成分、薬剤的に許容可能な賦形剤および／または任意の追加成分の相対量は、治療対象が何であるか、そのサイズ、および／または状態により、またさらに組成物の投与経路により異なる。例として、組成物は、０．１％から１００％、例えば、０．５から５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
【０４２１】
製剤
本発明の修飾核酸およびｍｍＲＮＡは、１つ以上の賦形剤を用いて製剤され得、（１）安定性が増加する；（２）細胞トランスフェクションが増加する；（３）（例えば、修飾核酸またはｍｍＲＮＡのデポ剤からの）徐放性または遅効型放出を可能にする；（４）体内分布を変える（例えば、修飾核酸またはｍｍＲＮＡを特定の組織または細胞種に向ける）；（５）コードされたタンパク質のインビボでの翻訳を増加させる；および／または（６）コードされたタンパク質のインビボでの放出特性を変える。溶媒、分散媒、希釈物または他の液体ビヒクル、分散または懸濁補助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存料のいずれかまたは全てなどの従来からの賦形剤に加えて、本発明の賦形剤は、限定ではなく、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、修飾核酸またはｍｍＲＮＡトランスフェクションされた細胞（例えば対象への移植のため）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体およびそれらの組合せを含み得る。したがって、本発明の製剤は、１つ以上の賦形剤を、それぞれ、ともに修飾核酸またはｍｍＲＮＡの安定性を増加させ、修飾核酸またはｍｍＲＮＡによる細胞のトランスフェクションを増加させ、修飾核酸またはｍｍＲＮＡにコードされるタンパク質の発現を増加させ、および／または修飾核酸またはｍｍＲＮＡにコードされるタンパク質の放出特性を変える量で、含み得る。さらに、本発明の修飾核酸およびｍｍＲＮＡは、自己会合核酸ナノ粒子を用いて製剤してもよい。
【０４２２】
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、あらゆる既知のまたは今後薬理学分野で開発される方法で調製され得る。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１つ以上の他の副成分と結合させるステップを含む。
【０４２３】
本開示による医薬組成物は、単回単位用量としておよび／または複数の単回単位用量として調製され、包装され、および／または原体で販売され得る。ここでは「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量を指す。活性成分の量は、一般に、対象に投与され得る活性成分の用量に等しいおよび／またはそのような用量の好都合な画分、例えば、限定ではないが、そのような用量の半分または３分の１であり得る。
【０４２４】
本開示による医薬組成物中の活性成分、薬剤的に許容可能な賦形剤および／または任意の追加成分の相対量は、治療されている対象が何であるか、そのサイズ、および／またはの状態により、またさらに組成物の投与経路により異なり得る。例えば、組成物は、０．１％から９９％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
【０４２５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ｍＲＮＡ製剤は、少なくとも１つの修飾ｍＲＮＡを含み得る。製剤は、１、２、３、４または５つの修飾ｍＲＮＡを含み得る。１つの実施形態では、製剤は、タンパク質をコードする少なくとも３つの修飾ｍＲＮＡを含む。１つの実施形態では、製剤は、タンパク質をコードする少なくとも５つの修飾ｍＲＮＡを含む。
【０４２６】
医薬製剤は、ここでは、限定ではなく、あらゆる全ての溶媒、分散媒、希釈物または他の液体ビヒクル、分散または懸濁補助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存料などを含む、所望される特定の剤形に適した、薬剤的に許容可能な賦形剤を追加で含み得る。医薬組成物を製剤する様々な賦形剤および組成物の調製技法は当技術分野で既知である（その全容が参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａ．  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  ＭＤ，  ２００６を参照）。一般的な賦形媒体の使用が、いずれかの一般的な賦形媒体も、何等かの望ましくない生物学的効果を生じたり、それ以外にも医薬組成物のいずれかの他の成分（複数可）と有害な相互作用をするなど、物質またはその誘導体と不適合でないかぎり、本開示の範囲内に企図されている。
【０４２７】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の粒子サイズは増加および／または減少させてよい。粒子サイズの変化は、限定ではないが炎症などの生物学的反応を阻止するのを補助でき得るか、または哺乳動物に送達された修飾ｍＲＮＡの生物学的効果を増加させ得る。
【０４２８】
医薬組成物の製造に使用される薬剤的に許容可能な賦形剤は、限定ではなく、不活希釈物、界面活性剤および／または乳液、保存料、緩衝剤、滑沢剤および／または油を含む。そのような賦形剤は、本発明の医薬製剤に所望により含まれ得る。
【０４２９】
リピドイド
リピドイドの合成は広く記載されており、これらの化合物を含む製剤は特に修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡの送達に適している（その全容がすべて参照により本明細書に組み込まれるＭａｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  ２０１０    ２１：１４４８−１４５４；  Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．  ２０１０  ２６７：９−２１；  Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００８  ２６：５６１−５６９；  Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２０１０  １０７：１８６４−１８６９；  Ｓｉｅｇｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２０１１  １０８：１２９９６−３００１を参照）。
【０４３０】
これらのリピドイドは、げっ歯類と非ヒト霊長類において２本鎖低分子干渉ＲＮＡ分子を効果的に送達するのに使用されているが（その全容がすべて参照により本明細書に組み込まれるＡｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００８  ２６：５６１−５６９；  Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００８  １０５：１１９１５−１１９２０；  Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２００９  １７：８７２−８７９；  Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ
Ａ．  ２０１０  １０７：１８６４−１８６９；  Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１１  ２９：１００５−１０１０を参照）、本開示は、それらの製剤と、１本鎖修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡの送達における使用を記述する。複合体、ミセル、リポソームまたは粒子はこれらのリピドイドを含んで調製され得るので、局所および／または全身投与経路によるリピドイド製剤注入後のコードされたタンパク質の産生により判断すると、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡが効果的に送達される結果になる。修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡのリピドイド複合体は、限定ではなく、静脈内、筋肉内または皮下経路を含む様々な方法により投与され得る。
【０４３１】
核酸のインビボでの送達は、限定ではなく、製剤の組成、粒子のペグ化の性質、ロードの程度、オリゴヌクレオチドと脂質の比率および生物物理学的パラメータ、たとえば限定ではなく粒子サイズを含む多くのパラメータに影響され得る（その全容が参照により本明細書に組み込まれるＡｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２００９  １７：８７２−８７９を参照）。一例として、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質のアンカー鎖の長さのわずかな変化が、インビボでの有効性に大きな影響を及ぼし得る。限定ではなく、ペンタ［３−（１−ラウリルアミノプロピオニル）］−トリエチレンテトラミンヒドロクロリド（９８Ｎ１２−５として知られるＴＥＴＡ−５ＬＡＰ；その全容が参照により本明細書に組み込まれるＭｕｒｕｇａｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４０１：６１  （２０１０）を参照）、Ｃ１２−２００（誘導体と変異体を含む）およびＭＤ１を含む異なるリピドイドとの製剤のインビボ活性が試験され得る。
【０４３２】
本明細書で「９８Ｎ１２−５」と呼ばれるリピドイドは、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，
Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２００９  １７：８７２−８７９に開示されており、その全容が参照により本明細書に組み込まれる（図１参照）。
【０４３３】
本明細書で「Ｃ１２−２００」と呼ばれるリピドイドは、Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２０１０  １０７：１８６４−１８６９  およびＬｉｕ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．  ２０１０  ６６９−６７０に開示されており（図１参照）、いずれもその全容が参照により本明細書に組み込まれる。リピドイド製剤は、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡに加えて３つか４つまたはそれより多くの成分を含む粒子を含み得る。一例として、特定のリピドイドを含む製剤は、限定ではなく９８Ｎ１２−５を含み、４２％リピドイド、４８％コレステロールおよび１０％ＰＥＧ（Ｃ１４アルキル鎖長）をさらに含み得る。別の例として、特定のリピドイドを含む製剤は、限定ではなくＣ１２−２００を含み、５０％リピドイド、１０％ジステロイルホスファチジルコリン、３８．５％コレステロールおよび１．５％ＰＥＧ−ＤＭＧを含み得る。
【０４３４】
１つの実施形態では、全身性静脈内投与用にリピドイドとともに製剤された修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、肝臓を標的にし得る。例えば、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを用いた、４２％９８Ｎ１２−５、４８％コレステロールおよび１０％ＰＥＧ−脂質の脂質モル濃度の組成を含み、約７．５対１の全脂質対修飾核酸またはｍｍＲＮＡの最終重量比を有し、ＰＥＧ脂質上のアルキル鎖長がＣ１４であり、平均粒子径がおよそ５０〜６０ｎｍである最終最適化された静脈内製剤は、製剤の分布が肝臓に９０％以上となる結果をもたらし得る（その全容が参照により本明細書に組み込まれるＡｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，
Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２００９  １７：８７２−８７９を参照）。別の例では、Ｃ１２−２００（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる米国特許仮出願第６１／１７５，７７０号および国際公開公報第２０１０１２９７０９号を参照）リピドイドを用いた静脈内製剤は、Ｃ１２−２００／ジステロイルホスファチジルコリン／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧのモル比５０／１０／３８．５／１．５を有し得、約７対１の全脂質対修飾核酸またはｍｍＲＮＡの重量比を有し得、平均粒子径が８０ｎｍであり、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを肝細胞に送達するのに有効であり得る（その全容が参照により本明細書に組み込まれるＬｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２０１０  １０７：１８６４−１８６９を参照）。別の実施形態では、ＭＤ１リピドイド含有製剤は、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを肝細胞にインビボで有効送達するのに使用され得る。筋肉内または皮下経路の最適化リピドイド製剤の特徴は、標的の細胞種および製剤が細胞外マトリックスを通って血流に拡散する能力により大きく異なり得る。内皮窓のサイズにより、肝細胞への有効送達には１５０ｎｍ未満の粒子径が望ましい場合があるが（その全容が参照により本明細書に組み込まれるＡｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２００９  １７：８７２−８７９を参照）、限定ではなく、内皮細胞、骨髄系細胞および筋肉細胞を含む他の細胞種に製剤を送達する場合のリピドイド製剤修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡの使用は、同様にサイズが限定されない可能性がある。ｓｉＲＮＡを骨髄系細胞および内皮などの他の非肝細胞にインビボで送達する場合のリピドイド製剤の使用が報告されている（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれるＡｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００８  ２６：５６１−５６９；  Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１１  ２９：１００５−１０１０；  Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｄｖ．  Ｆｕｎｃｔ．  Ｍａｔｅｒ．  ２００９  １９：３１１２−３１１８；  ８ｔｈ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｕｄａｈ  Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，
Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ８−９，  ２０１０を参照）。単球などの骨髄系細胞への有効送達、リピドイド製剤は同様の成分モル比を有し得る。リピドイドと、限定ではなくジステロイルホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ−ＤＭＧを含む他の成分の異なる比率が、限定ではなく肝細胞、骨髄系細胞、筋肉細胞などを含む異なる細胞種に送達される修飾核酸またはｍｍＲＮＡの製剤を最適化するのに使用され得る。例えば、成分モル比は、限定ではなく、５０％のＣ１２−２００、１０％のジステロイルホスファチジルコリン、３８．５％のコレステロール、および％１．５のＰＥＧ−ＤＭＧを含み得る（その全容が参照により本明細書に組み込まれるＬｅｕｓｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１１  ２９：１００５−１０１０を参照）。皮下または筋肉内送達による、細胞（限定ではなく、脂肪細胞および筋肉細胞など）への核酸の局所送達へのリピドイド製剤の使用は、全身送達に所望される全ての製剤成分を要しないことがあり、リピドイドと修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡだけを含み得る。
【０４３５】
異なるリピドイドの組合せは、リピドイドが修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡにより細胞のトランスフェクションを増加させることができ得；および／またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させることができ得るので、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡが指令するタンパク質産生の効率を向上させるのに使用され得る（その全容が参照により本明細書に組み込まれるＷｈｉｔｅｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２０１１，
１９：１６８８−１６９４を参照）。
【０４３６】
リポソーム、リポプレックスおよび脂質ナノ粒子
本発明の修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡは、１つ以上のリポソーム、リポプレックスまたは脂質ナノ粒子を用いて製剤され得る。１つの実施形態では、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡの医薬組成物は、リポソームを含む。リポソームは、人工的に調製される小胞で、主として脂質二重層で構成され得、栄養剤と医薬製剤の投与用の送達ビヒクルとして使用され得る。リポソームは異なる寸法であり得、例えば、限定ではなく、多ラメラ小胞（ＭＬＶ）は直径が数百ナノメートルであり得、狭い水性コンパートメントで分離された一連の同心二重層を含み得、小単細胞小胞（ＳＵＶ）は直径５０ｎｍ未満であり得、大単ラメラ小胞（ＬＵＶ）は直径５０〜５００ｎｍであり得る。リポソームの設計は、リポソームの不健康な組織への結合を向上させるか、または限定ではなく飲食作用などのイベントを活性化するため、限定ではなく、オプソニンまたはリガンドを含み得る。リポソームは、医薬製剤の送達を向上させるために低いかまたは高いｐＨを含み得る。
【０４３７】
リポソームの形成は、限定ではなく、封入される医薬製剤およびリポソーム成分、脂質小胞が分散される媒体の性質、封入される物質の有効濃度とその潜在的毒性、小胞の適用および／または送達中に関与するあらゆる追加の工程、最適化サイズ、多分散性および意図される適用での小胞の有効期間、ならびにバッチ間の再現性および安全かつ高効率のリポソーム製品の大規模生産の可能性などの物理化学的特徴により得る。
【０４３８】
１つの実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、限定ではなく、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）リポソーム、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ワシントン州ボセル）のＤｉＬａ２リポソーム、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）およびＭＣ３（その全容が参照により本明細書に組み込まれる米国出願公開第２０１００３２４１２０号）から形成されるようなリポソーム、および限定ではなくＪａｎｓｓｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ（ペンシルバニア州ホーシャム）のドキシル（登録商標）などの低分子薬物を送達し得るリポソームを含み得る。１つの実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、限定ではなく、以前記述され、オリゴヌクレオチドのインビトロとインビボでの送達に適していることが示されている安定化プラスミド−脂質粒子（ＳＰＬＰ）または安定化核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）の合成から形成されるものなどのリポソームを含み得る（その全容がすべて参照により本明細書に組み込まれるＷｈｅｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．  １９９９  ６：２７１−２８１；
Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．  １９９９  ６：１４３８−１４４７；  Ｊｅｆｆｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．  ２００５  ２２：３６２−３７２；  Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
２００５  ２：１００２−１００７；  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ．  ２００６  ４４１：１１１−１１４；  Ｈｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．    ２００５  １０７：２７６−２８７；  Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２０１０  ２８：１７２−１７６；  Ｊｕｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２００９  １１９：６６１−６７３；  ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００８  １９：１２５−１３２を参照）。Ｗｈｅｅｌｅｒらの元々の方法は、界面活性剤透析法であったが、後にＪｅｆｆｓらが改良を加え、自発小胞形成法と呼ばれている。リポソーム製剤は、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡに加えて３〜４つの脂質成分で構成される。一例として、リポソームは、Ｊｅｆｆｓらに記述されるように、限定ではなく、５５％のコレステロール、２０％のジステロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１０％のＰＥＧ−Ｓ−ＤＳＧおよび１５％の１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）を含み得る。別の例としては、特定のリポソーム製剤は、Ｈｅｙｅｓらに記述されるように、限定ではなく、４８％のコレステロール、２０％のＤＳＰＣ、２％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡおよび３０％のカチオン性脂質を含み得、ここでカチオン性脂質は１，２−ジステアルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（１，２−ｄｉｓｔｅａｒｌｏｘｙ−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ）（ＤＳＤＭＡ）、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡまたは１，２−ジリノレニルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）を含み得る。
【０４３９】
１つの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの免疫原をコードし得るｍｍＲＮＡを送達するために形成され得るリポソームを含み得る。ｍｍＲＮＡはリポソームに封入され得、および／または水性コアに含まれてからリポソームに封入され得る（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２０３１０４６号、同第２０１２０３１０４３号、同第２０１２０３０９０１号および同第２０１２００６３７８号を参照）。別の実施形態では、免疫原をコードし得るｍｍＲＮＡは、カチオン性の水中油の乳剤中で製剤され得、ここで乳剤粒子は油のコアとｍｍＲＮＡと相互作用できるカチオン性脂質を含み、分子を乳剤粒子に固定する（その全容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２００６３８０号を参照）。さらに別の実施形態では、脂質製剤は、少なくともトランスフェクションを増強し得る脂質であるカチオン性脂質と、脂質部分に連結した親水性頭部基を含む少なくとも１種類の脂質を含み得る（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１０７６８０７号および米国出願公開第２０１１０２００５８２号を参照）。別の実施形態では、免疫原をコードする修飾ｍＲＮＡは、官能性脂質二重層間に架橋結合を有し得る脂質小胞内で製剤され得る（その全容が参照により本明細書に組み込まれる米国出願公開第２０１２０１７７７２４号を参照）。
【０４４０】
１つの実施形態では、修飾ｍＲＮＡは、官能性脂質二重層間に架橋結合を有し得る脂質小胞内で製剤され得る。
１つの実施形態では、修飾ｍＲＮＡは脂質−ポリカチオン複合体内で製剤され得る。脂質−ポリカチオン複合体の形成は、当技術分野で既知の方法で達成され得、および／またはその全容が参照により本明細書に組み込まれる米国出願公開第２０１２０１７８７０２号に記載されるように達成され得る。非限定的な例として、ポリカチオンは、限定ではなく、ポリリジン、ポリオルニチンおよび／またはポリアルギニンなどのカチオン性ペプチドまたはポリペプチド、およびその全容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２０１３３２６号に記載されるカチオン性ペプチドを含み得る。別の実施形態では、修飾ｍＲＮＡは、限定ではなく、コレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などの中性脂質をさらに含み得る脂質−ポリカチオン複合体内で製剤され得る。
【０４４１】
リポソーム製剤は、限定ではなく、カチオン性脂質成分の選択、カチオン性脂質の飽和度、ペグ化の性質、全成分比およびサイズなどの生物物理学的パラメータに影響され得る。Ｓｅｍｐｌｅら（Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２０１０  ２８：１７２−１７６；その全容が参照により本明細書に組み込まれる）による１つの例では、リポソーム製剤は５７．１％のカチオン性脂質、７．１％のジパルミトイルホスファチジルコリン、３４．３％のコレステロールおよび１．４％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡで構成された。別の例として、カチオン性脂質の組成が変化すると、ｓｉＲＮＡを細胞を提示している様々な抗原により有効に送達できた（Ｂａｓｈａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２０１１  １９：２１８６−２２００；その全容が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０４４２】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤中のＰＥＧの比率は、増加もしくは減少し得、および／またはＰＥＧ脂質の炭素鎖の長さは、Ｃ１４からＣ１８まで修飾されてＬＮＰ製剤の薬物動態および／または生体分布を変更し得る。非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、カチオン性脂質、ＤＳＰＣおよびコレステロールと比べて１〜５％の脂質モル比のＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含み得る。別の実施形態では、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧは、限定ではなく、ＰＥＧ−ＤＳＧ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）またはＰＥＧ−ＤＰＧ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）などのＰＥＧ脂質で置換され得る。カチオン性脂質は、限定ではなくＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、Ｃ１２−２００およびＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡなどの当技術分野で既知の任意の脂質から選択され得る。
【０４４３】
１つの実施形態では、カチオン性脂質は、限定ではなく国際公開第２０１２０４０１８４号、同第２０１１１５３１２０号、同第２０１１１４９７３３号、同第２０１１０９０９６５号、同第２０１１０４３９１３号、同第２０１１０２２４６０号、同第２０１２０６１２５９号、同第２０１２０５４３６５号、同第２０１２０４４６３８号、同第２０１００８０７２４号、同第２０１０２１８６５号および同第２００８１０３２７６号、米国特許第７，８９３，３０２号、同第７，４０４，９６９号および同第８，２８３，３３３号、ならびに米国出願公開第２０１０００３６１１５号および同第２０１２０２０２８７１号（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる）に記載されるカチオン性脂質から選択され得る。別の実施形態では、カチオン性脂質は、限定ではなく国際公開第２０１２０４０１８４号、同第２０１１１５３１２０号、同第２０１１１４９７３３号、同第２０１１０９０９６５号、同第２０１１０４３９１３号、同第２０１１０２２４６０号、同第２０１２０６１２５９号、同第２０１２０５４３６５号および同第２０１２０４４６３８号（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる）に記載される式Ａから選択され得る。さらに別の実施形態では、カチオン性脂質は、限定ではなく国際公開第２００８１０３２７６号の式ＣＬＩ〜ＣＬＸＸＩＸ、米国特許第７，８９３，３０２号の式ＣＬＩ〜ＣＬＸＸＩＸ、米国特許第７，４０４，９６９号の式ＣＬＩ〜ＣＬＸＸＸＸＩＩおよび米国出願公開第２０１０００３６１１５号の式Ｉ〜ＶＩ（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる）から選択され得る。非限定的な例として、カチオン性脂質は、（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−２０，２３−ジエン−１０−アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７，２０−ジエン−９−アミン、（１Ｚ，１９Ｚ）−Ｎ５Ｎ−ジメチルペンタコサ−ｌ６、１９−ジエン−８−アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルドコサ−１３，１６−ジエン−５−アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘンイコサ−１２，１５−ジエン−４−アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−６−アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−７−アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８，２１−ジエン−１０−アミン、（１５Ζ，１８Ζ）−Ν，Ν−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−５−アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−４−アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタコサ−１９，２２−ジエン−９−アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８，２１−ジエン−８−アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７，２０−ジエン−７−アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６，１９−ジエン−６−アミン、（２２Ｚ，２５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコンタ−２２，２５−ジエン−１０−アミン、（２１Ｚ，２４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリアコンタ−２１，２４−ジエン−９−アミン、（���８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８−エン−１０−アミン、（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７−エン−９−アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタコサ−１９，２２−ジエン−７−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサン−１０−アミン、（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ−エチル−Ｎ−メチルノナコサ−２０，２３−ジエン−ｌ０−アミン、１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−ｌ−ノニルイコサ−１１，１４−ジエン−ｌ−ｙｌ］ピロリジン、（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−２０−エン−ｌ０−アミン、（１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエプタコサ−１５−エン−ｌ０−アミン、（１４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１４−エン−ｌ０−アミン、（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１７−エン−ｌ０−アミン、（２４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリトリアコンタ−２４−エン−ｌ０−アミン、（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−２０−エン−ｌ０−アミン、（２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコンタ−２２−エン−ｌ０−アミン、（１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６−エン−８−アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘンイコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−ｌ３，１６−ジエン−ｌ−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｌ−［（ｌＳ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］エプタデカン−８−アミン、１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヘキシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナデカン−１０−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ノナデカン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２１−［（ｌＳ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘンイコサン−ｌ０−アミン，Ν，Ν−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−｛［（ｌＲ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン−１０−アミン，Ν，Ν−
ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン−８−アミン、Ν，Ν−ジメチル−［（ｌＲ，２Ｓ）−２−ウンデシルシクロプロピル］テトラデカン−５−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−｛７−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプチル｝ドデカン−１−アミン、１−［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヘプチルシクロプロピル］−Ν，Ν−ジメチルオクタデカン−９−アミン、１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−デシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタデカン−６−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｌ−［（ｌＳ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ペンタデカン−８−アミン、Ｒ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、Ｓ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝ピロリジン、（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−［（５Ｚ）−オクタ−５−エン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝アゼチジン、（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−（ヘプチルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−（ノニルオキシ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン；（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−６，９，１２−トリエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（ペンチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−３−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ν，Ν−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−ｌ３，１６−ジエン−ｌ−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ）−ドコサ−１３−エン−１−イルオキシ］−３−���ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、１−［（１３Ｚ）−ドコサ−１３−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−［（９Ｚ）−ヘキサデカ−９−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｒ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｈ（１−メトイルオクチル）オキシ］−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、（２Ｒ）−１−［（３，７−ジメチルオクチル）オキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（オクチルオキシ）−３−（｛８−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−｛［８−（２−オクリルシクロプロピル）オクチル］オキシ｝−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミンおよび（１ｌＥ，２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−ｌ１，２０，２−トリエン−１０−アミンまたはその薬剤的に許容可能な塩もしくは立体異性体から選択され得る。
【０４４４】
１つの実施形態では、カチオン性脂質は、当技術分野で既知の方法で、および／または国際公開第２０１２０４０１８４号、同第２０１１１５３１２０号、同第２０１１１４９７３３号、同第２０１１０９０９６５号、同第２０１１０４３９１３号、同第２０１１０２２４６０号、同第２０１２０６１２５９号、同第２０１２０５４３６５号、同第２０１２０４４６３８号、同第２０１００８０７２４号および同第２０１０２１８６５号（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる）に記載されるように合成され得る。
【０４４５】
１つの実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを３％の脂質モル比で含有し得る。別の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを１．５％の脂質モル比で含有し得る。
【０４４６】
１つの実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００）を含有し得る。１つの実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００、当技術分野で既知のカチオン性脂質および少なくとも１つの他の成分を含有し得る。別の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００、当技術分野で既知のカチオン性脂質、ＤＳＰＣおよびコレステロールを含有し得る。非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＳＰＣおよびコレステロールを含有し得る。別の非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＳＰＣおよびコレステロールをモル比２：４０：１０：４８で含有し得る（例えば、その全容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｅａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ
ＲＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ，  ＰＮＡＳ  ２０１２；  ＰＭＩＤ：  ２２９０８２９４を参照）。
【０４４７】
１つの実施形態では、ＬＮＰ製剤は、その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１１２７２５５号または同第２００８１０３２７６号に記載される用法により製剤され得る。非限定的な例として、本明細書に記載される修飾ＲＮＡは、その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１１２７２５５号および／または同第２００８１０３２７６号に記載されるように、ＬＮＰ製剤中に封入され得る。別の非限定的な例として、本明細書に記載される修飾ＲＮＡは、その全容が参照により本明細書に組み込まれる米国出願公開第２０１２０２０７８４５号に記載されるような非経口経路で送達されるナノ粒子内で製剤され得る。
【０４４８】
１つの実施形態では、本明細書に記載されるＬＮＰ製剤は、ポリカチオン組成物を含み得る。非限定的な例として、ポリカチオン組成物は、その全容が参照により本明細書に組み込まれる米国出願公開第２００５０２２２０６４号の式１〜６０から選択され得る。別の実施形態では、ポリカチオン組成物を含むＬＮＰ製剤は、本明細書に記載される修飾ＲＮＡのインビボおよび／またはインビトロの送達に使用され得る。
【０４４９】
１つの実施形態では、本明細書に記載されるＬＮＰ製剤は、透過促進分子を追加で含み得る。非限定的透過促進分子は、米国出願公開第２００５０２２２０６４号（その全容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０４５０】
１つの実施形態では、医薬組成物は、限定ではなくＤｉＬａ２リポソーム（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ワシントン州ボセル）、ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ワシントン州ボセル）、中性ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）ベースのリポソーム（例えば、卵巣癌のｓｉＲＮＡ送達（Ｌａｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００６  ５（１２）１７０８−１７１３）；その全容が参照により本明細書に組み込まれる）およびヒアルロナンでコーティングされたリポソーム（Ｑｕｉｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、イスラエル）などのリポソーム内で製剤され得る。
【０４５１】
ナノ粒子製剤は、炭水化物担体と修飾核酸分子（例えばｍｍＲＮＡ）を含む炭水化物ナノ粒子であり得る。非限定的な例として、炭水化物担体は、限定ではなく無水物−修飾フィトグリコーゲンまたはグリコーゲンタイプの材料、フィトグリコーゲン（ｐｈｔｏｇｌｙｃｏｇｅｎ）オクテニルサクシネート、フィトグリコーゲンβデキストリン、無水物−修飾フィトグリコーゲンβデキストリンを含み得る。（例えば、その全容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２１０９１２１号を参照）。
【０４５２】
脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質を速やかに排出される脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ）として知られる生分解性カチオン性脂質で置換することで、改良され得る。限定ではないがＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、およびＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡなどのイオン化できるカチオン性脂質は、時間が経つと血漿および組織内に蓄積することが示されており、潜在的な毒性源であり得る。速やかに排出される脂質の速やかな代謝は、脂質ナノ粒子の忍容性および治療インデックスをラットにおける１ｍｇ／ｋｇ用量から１０ｍｇ／ｋｇ用量へと、一桁改良し得る。酵素分解されたエステル結合を含むことで、ｒｅＬＮＰ製剤の活性は維持されたままで、カチオン成分の分解および代謝プロファイルが向上し得る。エステル結合は、脂質鎖内部に位置しても、脂質鎖も末端で末端に位置してもよい。内部エステル結合は、脂質鎖のどの炭素も置換し得る。
【０４５３】
１つの実施形態では、内部エステル結合は、飽和炭素のどちら側に配置されてもよい。ｒｅＬＮＰの非限定的な例は、
【０４５４】
【化８１】
2019059793.tif 000113
【０４５５】
を含む。
１つの実施形態では、免疫反応は、ナノ種、ポリマーおよび免疫原を含み得る脂質ナノ粒子の送達により誘発され得る。（米国出願公開第２０１２０１８９７００号および国際公開第２０１２０９９８０５号；その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる）。ポリマーは、ナノ種を封入し得るか、または部分的にナノ種を封入し得る。免疫原は、組換えタンパク質、本明細書に記載される修飾ＲＮＡであり得る。１つの実施形態では、脂質ナノ粒子は、限定ではないが病原体に対するワクチンでの使用のため製剤される。
【０４５６】
脂質ナノ粒子は、操作されて、脂質ナノ粒子が粘膜バリアを貫通できるように、粒子の表面特性を改変され得る。粘液は、限定ではないが口腔（例えば頬内および食道の膜および扁桃組織）、眼、消化器（例えば胃、小腸、大腸、結腸、直腸）、鼻腔、呼吸器（例えば鼻腔、咽頭、気管および気管支の膜）、生殖器（例えば膣、子宮頸部および尿道の膜）などの粘膜組織上に位置する。高薬物封入効率と多くの薬物を徐放性送達する能力に好ましい１０〜２００ｎｍよりも大きいナノ粒子は、粘膜バリアを通って速やかに拡散するには大きすぎると考えられている。粘液は絶えず分泌され、流れ、排出または消化され、回収されるので、捕捉された粒子のほとんどは数秒または数時間内に粘膜組織から除去され得る。低分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で密にコーティングされている大きい高分子ナノ粒子（直径２００ｎｍ〜５００ｎｍ）の粘液中の拡散率は、水中に拡散した同じ粒子の４〜６倍低いだけであった（Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ  ２００７  １０４（５）：１４８２−４８７；  Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．  ２００９  ６１（２）：  １５８−１７１；その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる）。ナノ粒子の輸送は、透過速度および／または限定ではなく蛍光退色後回復測定（ＦＲＡＰ）および高解像度の多粒子追跡（ＭＰＴ）を含む蛍光顕微鏡技法を用いて判定され得る。非限定的な例として、粘膜バリアを貫通できる組成物は、米国特許第８，２４１，６７０号（その全容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように作製され得る。
【０４５７】
粘液を透過するように操作された脂質ナノ粒子は、高分子材料（すなわち高分子コア）および／またはポリマー−ビタミンコンジュゲートおよび／またはトリブロックコポリマーを含み得る。高分子材料は、限定ではなく、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリウレア、ポリカーボネート、ポリ（スチレン）、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリルおよびポリアクリレートを含み得る。高分子材料は、生分解性および／または生体適合性であり得る。高分子材料は、さらに照射され得る。非限定的な例として、高分子材料は、ガンマ照射され得る（例えば、その全容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２８２１６５号を参照）。特定のポリマーの非限定的な例は、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＥＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＰＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリアルキルシアノアクラレート、ポリウレタン、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリエチレンおよびポリプロピレンなどのポリアルキレン、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などのポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリ（エチレンテレフタレート）などのポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリ（ビニルアセテート）などのポリビニルエステル、ポリ（ビニルクロリド）（ＰＶＣ）などのポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリウレタン、誘導体化セルロース、例えばアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリル酸のポリマー、例えばポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、ポリ（アクリル酸オクタデシル）およびコポリマーならびにそれらの混合物、ポリジオキサノンとそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロクサマー、ポリ（オルト）エステル、ポリ（ブチル酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、およびトリメチレンカルボネート、ポリビニルピロリドンを含む。脂質ナノ粒子は、限定ではなくブロックコポリマーおよび（ポリ（エチレングリコール））−（ポリ（酸化プロピレン））−（ポリ（エチレングリコール））トリブロックコポリマー（例えば、その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる米国出願公開第２０１２０１２１７１８号および米国出願公開第２０１００００３３３７号および米国特許第８，２６３，６６５号を参照）などのコポリマーでコーティングされるかまたは結合されていてよい。コポリマーは、安全と認められる（ＧＲＡＳ）ポリマーであり得、脂質ナノ粒子の形成は、新規の化学成分が生成しないように行われ得る。例えば、脂質ナノ粒子は、新規の化学成分を生じることなく、尚もヒト粘液を速やかに透過することができる、ＰＬＧＡナノ粒子をコーティングするポロクサマーを含み得る（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ２０１１  ５０：２５９７−２６００；その全容が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０４５８】
ポリマー−ビタミンコンジュゲートのビタミンは、ビタミンＥであり得る。コンジュゲートのビタミン部分は、限定ではなくビタミンＡ、ビタミンＥ、他のビタミン類、コレステロール、疎水性部分または他の界面活性剤の疎水性成分（例えば、ステロール鎖、脂肪酸、炭化水素鎖およびアルキレンオキシド鎖）などの他の適切な成分で置換され得る。
【０４５９】
粘液を透過するように操作された脂質ナノ粒子は、限定ではなくｍｍＲＮＡ、陰イオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えばカチオン界面活性剤、例えばジメチルジオクタデシル−アンモニウムブロミド）、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコールおよびポロクサマー）、粘液溶解薬（例えば、Ｎ−アセチルシステイン、ヨモギ、ブロメライン、パパイン、クサギ、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、チモシンβ４ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、エルドステイン）およびｒｈＤＮａｓｅを含む様々なＤＮａｓｅなどの表面改変剤を含み得る。表面改変剤は、粒子表面に埋め込まれるかまたは巻き込まれているか、または脂質ナノ粒子の表面に（例えばコーティング、吸収、共有結合または他のプロセスにより）配置され得る。（例えば、その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる米国出願公開第２０１００２１５５８０号および米国出願公開第２００８０１６６４１４号を参照）。
【０４６０】
粘液を透過する脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの本明細書に記載されるｍｍＲＮＡを含み得る。ｍｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子に封入され得、および／または粒子表面に配置され得る。ｍｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子に共有結合され得る。粘液を透過する脂質ナノ粒子の製剤は、複数のナノ粒子を含み得る。さらに、製剤は、粘液と相互作用して周辺粘液の構造的および／または粘性の性質を改変し粘膜付着を低下させ得、粘膜組織への粘液を透過する脂質ナノ粒子の送達を増加させ得る粒子を含有し得る。
【０４６１】
１つの実施形態では、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、限定ではなくＡＴＵＰＬＥＸ（商標）系、ＤＡＣＣ系、ＤＢＴＣ系および他のＳｉｌｅｎｃｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（英国ロンドン）のｓｉＲＮＡ−リポプレックス技術、ＳＴＥＭＧＥＮＴ（登録商標）のＳＴＥＭＦＥＣＴ（商標）（マサチューセッツ州ケンブリッジ）およびポリエチレンアミン（ＰＥＩ）またはプロタミンベースの核酸の標的化および非標的化送達の酸などのリポプレックスとして製剤される（Ａｌｅｋｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．
２００８  ６８：９７８８−９７９８；  Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔ
Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１２  ５０：７６−７８；  Ｓａｎｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００６  １３：１２２２−１２３４；  Ｓａｎｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００６  １３：１３６０−１３７０；  Ｇｕｔｂｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２０１０  ２３：３３４−３４４；  Ｋａｕｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ２０１０  ８０：２８６−２９３Ｗｅｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２００９  ３２：４９８−５０７；  Ｗｅｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２００８  ３１：１８０−１８８；  Ｐａｓｃｏｌｏ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ４：１２８５−１２９４；  Ｆｏｔｉｎ−Ｍｌｅｃｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ３４：１−１５；  Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００５，  ２３：７０９−７１７；  Ｐｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００７  ６；１０４：４０９５−４１００；  ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００８  １９：１２５−１３２；全てその全容が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０４６２】
１つの実施形態では、そのような製剤は、構築され得るかまたはインビボで受動的または能動的に限定ではなく肝細胞、免疫細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、抗原提示細胞および白血球を含む異なる細胞種に向けられるように改変された組成物でもあり得る（Ａｋｉｎｃ
ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２０１０  １８：１３５７−１３６４；  Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００５  ２３：７０９−７１７；  Ｊｕｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２００９  １１９：６６１−６７３；  Ｋａｕｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ
２０１０  ８０：２８６−２９３；  Ｓａｎｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００６  １３：１２２２−１２３４；  Ｓａｎｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００６  １３：１３６０−１３７０；  Ｇｕｔｂｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２０１０  ２３：３３４−３４４；
Ｂａｓｈａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２０１１  １９：２１８６−２２００；  Ｆｅｎｓｋｅ  ａｎｄ  Ｃｕｌｌｉｓ，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ
Ｄｅｌｉｖ．  ２００８  ５：２５−４４；  Ｐｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００８  ３１９：６２７−６３０；  Ｐｅｅｒ  ａｎｄ  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０１１  １８：１１２７−１１３３；全てその全容が参照により本明細書に組み込まれる）。製剤の肝臓細胞受動的標的化の１つの例は、アポリポプロテインＥに結合し、これらの製剤がインビボで肝細胞に結合し吸収されるのを促進することが示されている、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡおよびＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡベースの脂質ナノ粒子製剤を含む（Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２０１０  １８：１３５７−１３６４；その全容が参照により本明細書に組み込まれる）。製剤は、限定ではなく葉酸、トランスフェリン、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）および抗体標的化アプローチに例示されるように、それらの表面の異なるリガンドの発現を通じて選択的に標的化することもできる（Ｋｏｌｈａｔｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１１  ８：１９７−２０６；  Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ  ａｎｄ  Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，  Ｆｒｏｎｔ
Ｂｉｏｓｃｉ．  ２０１１  １６：１３８８−１４１２；  Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ．  ２０１０  ２７：２８６−２９８；  Ｐａｔｉｌ  ｅｔ
ａｌ．，  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．  ２００８  ２５：１−６１；  Ｂｅｎｏｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  ２０１１  １２：２７０８−２７１４；  Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  ２００８  ５：３０９−３１９；  Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２０１０  １８：１３５７−１３６４；  Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１２  ８２０：１０５−１１６；  Ｂｅｎ−Ａｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１２  ７５７：４９７−５０７；  Ｐｅｅｒ  ２０１０  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．  ２０：６３−６８；  Ｐｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００７  １０４：４０９５−４１００；  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１１  ７２１：３３９−３５３；  Ｓｕｂｒａｍａｎｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２０１０  １８：２０２８−２０３７；  Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００５  ２３：７０９−７１７；  Ｐｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００８  ３１９：６２７−６３０；  Ｐｅｅｒ  ａｎｄ  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０１１  １８：１１２７−１１３３；全てその全容が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０４６３】
１つの実施形態では、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、固体脂質ナノ粒子として製剤される。固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）は、平均径が１０〜１０００ｎｍの球体であり得る。ＳＬＮは、親油性分子を溶解できる固体脂質コアマトリックスを有し、界面活性剤および／または乳液で安定化し得る。さらなる実施形態では、脂質ナノ粒子は、自己会合脂質−ポリマーナノ粒子であり得る（その全容が参照により本明細書に組み込まれるＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，  ２００８，  ２  （８），  ｐｐ  １６９６−１７０２を参照）。
【０４６４】
リポソーム、リポプレックスまたは脂質ナノ粒子は、これらの製剤は修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡにより細胞トランスフェクションを増加させることができ得、および／またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させることができ得るので、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡが指令するタンパク質産生の効力を向上させるために使用され得る。そのような１つの例は、脂質封入を用いてポリプレックスプラスミドＤＮＡの有効な全身性送達を可能にすることに関する（Ｈｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２００７
１５：７１３−７２０；  その全容が参照により本明細書に組み込まれる）。リポソーム、リポプレックスまたは脂質ナノ粒子は、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡの安定性を増加させるのにも使用され得る。
【０４６５】
１つの実施形態では、本発明の修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡは、放出制御および／または標的化送達用に製剤され得る。ここでは、「放出制御」は、特定の放出パターンにしたがい治療結果をもたらす医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。１つの実施形態では、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、本明細書に記載されるおよび／または当技術分野で既知の送達剤に封入されて放出制御および／または標的化送達され得る。本明細書では「封入する」という用語は、被包する、包囲するまたは包むことを意味する。本発明の化合物の製剤に関しては、封入は、実質的、完全または部分的であり得る。「実質的に封入された」という用語は、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９％より多くの、または９９．９９９％より多くの本発明の医薬組成物または化合物が送達剤に被包され、囲包され、または包まれ得ることを意味する。「部分的封入」は、１０、１０、２０、３０、４０、５０未満またはより少量の本発明の医薬組成物または化合物が送達剤に被包され、囲包され、または包まれ得ることを意味する。有利にも、封入は、蛍光および／または電子顕微鏡像を用いて本発明の医薬組成物または化合物の漏れまたは活性を測定して決定され得る。例えば、少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９または９９．９９％より多くの本発明の医薬組成物または化合物が送達剤中に封入される。
【０４６６】
１つの実施形態では、放出制御製剤は、限定ではなくトリブロックコポリマーを含み得る。非限定的な例として、製剤は、２つの異なるタイプのトリブロックコポリマーを含み得る（国際公開第２０１２１３１１０４号および同第２０１２１３１１０６号；その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる）。
【０４６７】
別の実施形態では、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子または速やかに排出される脂質ナノ粒子中に封入され得、脂質ナノ粒子または速やかに排出される脂質ナノ粒子は次に本明細書に記載されるおよび／または当技術分野で既知のポリマー、ヒドロゲルおよび／または外科用シーラント中に封入され得る。非限定的な例として、ポリマー、ヒドロゲルまたは外科用シーラントは、ＰＬＧＡ、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡｃ）、ポロクサマー、ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．、フロリダ州アラチュア）、ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）、外科用シーラント、たとえばフィブリノゲンポリマー（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．、ジョージア州コーネリア）、ＴＩＳＳＥＬＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ、イリノイ州ディアフィールド）、ＰＥＧベースのシーラントおよびＣＯＳＥＡＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ、イリノイ州ディアフィールド）であり得る。
【０４６８】
別の実施形態では、脂質ナノ粒子は、対象に注入されるとゲルを形成し得る、当技術分野で既知の任意のポリマーに封入され得る。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、生分解性であり得るポリマーマトリックス中に封入され得る。
【０４６９】
１つの実施形態では、放出制御および／または標的化送達用の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡ製剤は、少なくとも１つの放出制御コーティングも含み得る。放出制御コーティングは、限定ではなく、ＯＰＡＤＲＹ（登録商標）、ポリビニルピロリドン／ビニルアセテートコポリマー、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ＥＵＤＲＡＧＩＴ  ＲＬ（登録商標）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ  ＲＳ（登録商標）およびエチルセルロース水性分散系（ＡＱＵＡＣＯＡＴ（登録商標）およびＳＵＲＥＬＥＡＳＥ（登録商標））などのセルロース誘導体を含む。
【０４７０】
１つの実施形態では、放出制御および／または標的化送達製剤は、少なくとも１つの、ポリカチオン側鎖を含み得る分解性ポリエステルを含み得る。分解性ポリエステルは、限定ではなく、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、およびそれらの組合せを含む。別の実施形態では、分解性ポリエステルは、ペグ化ポリマーを形成するＰＥＧコンジュゲーションを含み得る。
【０４７１】
１つの実施形態では、本発明の修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡは、治療用ナノ粒子中に封入され得る。治療用ナノ粒子は、本明細書に記載される当技術分野で既知の、限定ではなく国際公開第２０１０００５７４０号、同第２０１００３０７６３号、同第２０１０００５７２１号、同第２０１０００５７２３号、同第２０１２０５４９２３号、米国出願公開第２０１１０２６２４９１号、同第２０１００１０４６４５号、同第２０１０００８７３３７号、同第２０１０００６８２８５号、同第２０１１０２７４７５９号、同第２０１０００６８２８６および同第２０１２０２８８５４１号、および米国特許第８，２０６，７４７号、同第８，２９３，２７６号、同第８，３１８，２０８号および同第８，３１８，２１１号（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる）などの方法で製剤され得る。別の実施形態では、治療用ポリマーナノ粒子は、米国出願公開第２０１２０１４０７９０号（その全容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法により同定され得る。
【０４７２】
１つの実施形態では、治療用ナノ粒子は徐放用に製剤され得る。ここでは「徐放」は、特定の時間にわたりある放出速度にしたがう医薬組成物または化合物を指す。時間は、限定ではなく、時間、日、週、月および年を含み得る。非限定的な例として、徐放ナノ粒子は、限定ではなく、本発明の修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡなどのポリマーおよび治療剤を含み得る（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる国際公開第２０１００７５０７２号および米国出願公開第２０１００２１６８０４号および同第２０１１０２１７３７７号および同第２０１２０２０１８５９号を参照）。
【０４７３】
１つの実施形態では、治療用ナノ粒子は、標的に特異的であるように製剤され得る。非限定的な例として、治療用ナノ粒子は、コルチコステロイドを含み得る（その全容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１１０８４５１８号を参照）。１つの実施形態では、本発明の治療用ナノ粒子は、癌に特異的であるように製剤され得る。非限定的な例として、治療用ナノ粒子は、国際公開第２００８１２１９４９号、同第２０１０００５７２６号、同第２０１０００５７２５号、同第２０１１０８４５２１号および米国出願公開第２０１０００６９４２６号、同第２０１２０００４２９３号および同第２０１００１０４６５５号（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる）に記載されるナノ粒子内に製剤され得る。
【０４７４】
１つの実施形態では、本発明のナノ粒子は、高分子マトリックスを含み得る。非限定的な例として、ナノ粒子は、限定ではなくポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、ポリヒドロキシ酸、フマル酸ポリプロピル（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅｓ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリウレア、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）またはそれらの組合せなどの２以上のポリマーを含み得る。
【０４７５】
１つの実施形態では、治療用ナノ粒子はジブロックコポリマーを含む。１つの実施形態では、ジブロックコポリマーは、ＰＥＧを、限定ではなく、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、ポリヒドロキシ酸、フマル酸ポリプロピル（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅｓ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリウレア、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）またはそれらの組合せなどのポリマーと組合せて含み得る。
【０４７６】
非限定的な例として、治療用ナノ粒子は、ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマーを含む（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる米国出願公開第２０１２０００４２９３号および米国特許第８，２３６，３３０号を参照）。別の非限定的な例として、治療用ナノ粒子は、ＰＥＧとＰＬＡまたはＰＥＧとＰＬＧＡのジブロックコポリマーを含むステルスナノ粒子である（その全容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，２４６，９６８号を参照）。
【０４７７】
１つの実施形態では、治療用ナノ粒子は、マルチブロックコポリマー（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる、例えば米国特許第８，２６３，６６５号および同第８，２８７，９１０号を参照）を含み得る。
【０４７８】
１つの実施形態では、本明細書に記載されるブロックコポリマーは、非高分子ミセルとブロックコポリマーを含むポリイオン複合体中に含まれ得る（その全容が参照により本明細書に組み込まれる、例えば米国出願公開第２０１２００７６８３６号を参照）。
【０４７９】
１つの実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１つのアクリルポリマーを含み得る。アクリルポリマーは、限定ではなく、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリレートおよびそれらの組合せを含む。
【０４８０】
１つの実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１つの本明細書に記載されるおよび／または当技術分野で既知のカチオン性ポリマーを含み得る。
１つの実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１つの、限定ではなくポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリ（β−アミノエステル）（例えばその全容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，２８７，８４９号を参照）およびそれらの組合せなどのアミン含有ポリマーを含み得る。
【０４８１】
１つの実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１つの、ポリカチオン側鎖を含み得る分解性ポリエステルを含み得る。分解性ポリエステルは、限定ではなく、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）およびそれらの組合せを含む。別の実施形態では、分解性ポリエステルは、ペグ化ポリマーを形成するＰＥＧコンジュゲーションを含み得る。
【０４８２】
別の実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１つの標的リガンドのコンジュゲーションを含み得る。標的リガンドは、限定ではないがモノクローナル抗体などの当技術分野で既知のいかなるリガンドでもよい。（Ｋｉｒｐｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００６  ６６：６７３２−６７４０；その全容が参照により本明細書に組み込まれる。）
１つの実施形態では、癌を標的とするのに使用され得る治療用ナノ粒子は、水溶液中で製剤され得る（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１０８４５１３号および米国出願公開第２０１１０２９４７１７号を参照）。
【０４８３】
１つの実施形態では、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、合成ナノキャリアに封入され、結合されおよび／または会合し得る。合成ナノキャリアは、限定ではなく国際公開第２０１０００５７４０号、同第２０１００３０７６３号、同第２０１２１３５０１号、同第２０１２１４９２５２号、同第２０１２１４９２５５号、同第２０１２１４９２５９号、同第２０１２１４９２６５号、同第２０１２１４９２６８号、同第２０１２１４９２８２号、同第２０１２１４９３０１号、同第２０１２１４９３９３号、同第２０１２１４９４０５号、同第２０１２１４９４１１号および同第２０１２１４９４５４、および米国出願公開第２０１１０２６２４９１号、同第２０１００１０４６４５号、同第２０１０００８７３３７および同第２０１２０２４４２２２号（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる）に記載されるものを含む。合成ナノキャリアは、当技術分野で既知のおよび／または本明細書に記載される方法を用いて製剤され得る。非限定的な例として、合成ナノキャリアは、国際公開第２０１０００５７４０号、同第２０１００３０７６３号および同第２０１２１３５０１号、および米国出願公開第２０１１０２６２４９１号、同第２０１００１０４６４５号、同第２０１０００８７３３７号および同第２０１２０２４４２２２号（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる）に記載される方法を用いて製剤され得る。別の実施形態では、合成ナノキャリア製剤は、国際公開第２０１１０７２２１８号および米国特許第８，２１１，４７３号（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる）に記載される方法により凍結乾燥され得る。
【０４８４】
１つの実施形態では、合成ナノキャリアは、本明細書に記載される修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡを放出するための反応基を有し得る（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２０９５２５５２号および米国出願公開第２０１２０１７１２２９号を参照）。
【０４８５】
１つの実施形態では、合成ナノキャリアは、免疫賦活剤を含んで合成ナノキャリアの送達から免疫反応を増強し得る。非限定的な例として、合成ナノキャリアは、免疫系のＴｈ１ベースの反応を増強し得るＴｈ１免疫賦活剤を含み得る（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる国際公開第２０１０１２３５６９号および米国出願公開第２０１１０２２３２０１号を参照）。
【０４８６】
１つの実施形態では、合成ナノキャリアは、標的化放出用に製剤され得る。１つの実施形態では、合成ナノキャリアは、修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡを特定のｐＨで、および／または所望の間隔をおいて放出するように製剤される。非限定的な例として、合成ナノ粒子は、修飾ｍＲＮＡ分子および／またはｍｍＲＮＡを２４時間後および／またはｐＨ４．５で放出するように製剤され得る（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる国際公開第２０１０１３８１９３号および同第２０１０１３８１９４号および米国出願公開第２０１１００２０３８８号および同第２０１１００２７２１７号を参照）。
【０４８７】
１つの実施形態では、合成ナノキャリアは、本明細書に記載される修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡの徐放制御および／または徐放用に製剤され得る。非限定的な例として、徐放性の合成ナノキャリアは、当技術分野で既知の、本明細書に記載される方法により、および／または国際公開第２０１０１３８１９２号および米国出願公開第２０１００３０３８５０号（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる）に記載されるように製剤され得る。
【０４８８】
１つの実施形態では、合成ナノキャリアはワクチンとして使用されるように製剤され得る。１つの実施形態では、合成ナノキャリアは、少なくとも１つの抗原をコードする、少なくとも１つの修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡを封入し得る。非限定的な例として、合成ナノキャリアは、少なくとも１つの抗原とワクチン剤形用の賦形剤を含み得る（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１１５０２６４号および米国出願公開第２０１１０２９３７２３号を参照）。別の非限定的な例として、ワクチン剤形は、同じまたは異なる抗原と賦形剤とともに少なくとも２つの合成ナノキャリアを含み得る（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１１５０２４９号および米国出願公開第２０１１０２９３７０１号を参照）。ワクチン剤形は、本明細書に記載される、当技術分野で既知の方法および／または国際公開第２０１１１５０２５８号および米国出願公開第２０１２００２７８０６号（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる）に記載の方法により選択され得る。
【０４８９】
１つの実施形態では、合成ナノキャリアは、少なくとも１つのアジュバントをコードする、少なくとも１つの修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡを含み得る。別の実施形態では、合成ナノキャリアは、少なくとも１つの修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡおよびアジュバントを含み得る。非限定的な例として、アジュバントを含む合成ナノキャリアは、国際公開第２０１１１５０２４０号および米国出願公開第２０１１０２９３７００号（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる）に記載の方法により製剤され得る。
【０４９０】
１つの実施形態では、合成ナノキャリアは、ウイルス由来のペプチド、断片または領域をコードする少なくとも１つの修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡを封入し得る。非限定的な例として、合成ナノキャリアは、限定ではなく国際公開第２０１２０２４６２１号、同第２０１２０２６２９号、同第２０１２０２４６３２号および米国出願公開第２０１２００６４１１０号、同第２０１２００５８１５３号および同第２０１２００５８１５４号（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる）に記載のナノキャリアを含み得る。
【０４９１】
１つの実施形態では、ナノ粒子は、経口投与用に最適化され得る。ナノ粒子は、少なくとも１つの、限定ではなくキトサンまたはその誘導体などのカチオン性バイオポリマーを含み得る。非限定的な例として、ナノ粒子は、米国出願公開第２０１２０２８２３４３号（その全容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法により製剤され得る。
【０４９２】
ポリマー、生分解性ナノ粒子およびコアシェルナノ粒子
本発明の修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡは、天然および／または合成ポリマーを用いて製剤され得る。送達に使用され得るポリマーの非限定的な例は、限定ではなくＭＩＲＵＳ（登録商標）Ｂｉｏ（ウィスコンシン州マディソン）およびＲｏｃｈｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ（ウィスコンシン州マディソン）のＤＹＮＡＭＩＣ  ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥ（登録商標）（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州パサデナ）製剤、ＰＨＡＳＥＲＸ（商標）ポリマー製剤、たとえば限定ではなくＳＭＡＲＴＴ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（商標）（ワシントン州シアトル）、ＤＭＲＩ／ＤＯＰＥ、ポロクサマー、ＶＡＸＦＥＣＴＩＮ（登録商標）Ｖｉｃａｌ（カリフォルニア州サンディエゴ）のアジュバント、キトサン、Ｃａｌａｎｄｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（カリフォルニア州パサデナ）のシクロデキストリン、デンドリマーとポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）のポリマー、ＲＯＮＤＥＬ（商標）（ＲＮＡｉ／オリゴヌクレオチドナノ粒子送達）ポリマー（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州パサデナ）および限定ではなく、ＰＨＡＳＥＲＸ（商標）（ワシントン州シアトル）などのｐＨ反応性ｃｏ−ブロックポリマーを含む。
【０４９３】
キトサン製剤の非限定的な例は、正電荷をもつキトサンのコアと、負電荷をもつ基質の外部分を含む（米国出願公開第２０１２０２５８１７６号；その全容が参照により本明細書に組み込まれる）。キトサンは、限定ではなくＮ−トリメチルキトサン、モノ−Ｎ−カルボキシメチルキトサン（ＭＣＣ）、Ｎ−パルミトイルキトサン（ＮＰＣＳ）、ＥＤＴＡ−キトサン、低分子量キトサン、キトサン誘導体、またはそれらの組合せを含む。
【０４９４】
１つの実施形態では、本発明で使用されるポリマーは、限定ではなく細菌などの不必要な物質のポリマー表面への結合を減ずるおよび／または阻害する処理を受けている。ポリマーは、既知の方法および／または当分野で記載される方法および／または国際公開第２０１２１５０４６７号（その全容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法により処理され得る。
【０４９５】
ＰＬＧＡ製剤の非限定的な例は、限定ではなく、ＰＬＧＡを６６％Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）に溶解させて形成され、残りが水系溶媒とリュープロリドである、ＰＬＧＡ注射デポ剤（例えばＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））を含む。注入されると、ＰＬＧＡとリュープロリドペプチドは皮下スペースに沈降する。
【０４９６】
これらのポリマーアプローチの多くは、オリゴヌクレオチドを細胞質にインビボ送達するのに有効であることが示されている（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．  ２００８  １９：１２５−１３２に概説；その全容が参照により本明細書に組み込まれる）。この場合は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）での核酸のロバストなインビボ送達を得ている２つのポリマーアプローチは、ダイナミックポリコンジュゲートと、シクロデキストリンベースのナノ粒子である。これらの送達アプローチの第１は、ダイナミックポリコンジュゲートを用い、マウスのインビボでｓｉＲＮＡを有効送達して肝細胞中の内因性標的ｍＲＮＡの発現を停止させることが示されている（Ｒｏｚｅｍａ  ｅｔ
ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００７  １０４：１２９８２−１２８８７；その全容が参照により本明細書に組み込まれる）。この特定のアプローチは、マルチコンポーネント・ポリマーシステムであり、その主要な特徴は、核酸、この場合はｓｉＲＮＡが、ジスルフィド結合により共有結合する膜活性ポリマーを含み、ＰＥＧ（電荷マスキングのため）基とＮ−アセチルガラクトサミン基（肝細胞の標的化のため）の両方が、ｐＨ感受性結合により連結されている（Ｒｏｚｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００７  １０４：１２９８２−１２８８７；その全容が参照により本明細書に組み込まれる）。肝細胞に結合してエンドソーム内に入ると、ポリマー複合体は低ｐＨ環境で分解してポリマーがその正電荷を露出し、エンドソーム脱出とポリマーからのｓｉＲＮＡの細胞質内放出がもたらされる。Ｎ−アセチルガラクトサミン基をマンノース基で置換することで、アシアログリコプロテイン受容体を発現する肝細胞から洞様内皮とクッパー細胞に標的を変えられることが示されている。別のポリマーアプローチは、トランスフェリンを標的とするシクロデキストリンを含有するポリカチオンナノ粒子の使用を含む。これらのナノ粒子は、トランスフェリン受容体を発現するユーイング肉腫腫瘍細胞においてＥＷＳ−ＦＬＩ１遺伝子産物の発現を標的化して停止させることが示されており（Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５  ６５：  ８９８４−８９８２；その全容が参照により本明細書に組み込まれる）、これらのナノ粒子内で製剤されたｓｉＲＮＡは非ヒト霊長類において良好に忍容された（Ｈｅｉｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００７  １０４：５７１５−２１；その全容が参照により本明細書に組み込まれる）。これらの送達戦略はいずれも標的化送達とエンドソーム脱出機構の両方を用いた論理的アプローチを組み込んでいる。
【０４９７】
ポリマー製剤は、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡの徐放または放出遅延（例えば筋肉内または皮下注射後）を可能にする。修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡの改変された放出プロファイルは、たとえば、コードされたタンパク質の長期間にわたる翻訳をもたらし得る。ポリマー製剤は、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡの安定性を高めるためにも使用され得る。生分解性ポリマーは、以前はｍｍＲＮＡ以外の核酸を分解から保護するのに使用されており、インビボでのペイロードの徐放をもたらすことが示されている（Ｒｏｚｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００７  １０４：１２９８２−１２８８７；  Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  ２０１０  ７：１４３３−１４４６；  Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  ２０１０  Ｏｃｔ
１；  Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ．  ２０１２  Ｊａｎ  １３；  Ｍａｎｇａｎｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２０１２  ３３：２３０１−２３０９；  Ｂｅｎｏｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  ２０１１  １２：２７０８−２７１４；  Ｓｉｎｇｈａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ．  ２０１１  ２：１３３−１４７；  ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００８  １９：１２５−１３２；  Ｓｃｈａｆｆｅｒｔ  ａｎｄ  Ｗａｇｎｅｒ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００８  １６：１１３１−１１３８；  Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  ２０１１  ８：１４５５−１４６８；  Ｄａｖｉｓ，  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．  ２００９  ６：６５９−６６８；  Ｄａｖｉｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０  ４６４：１０６７−１０７０；その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる）。
【０４９８】
１つの実施形態では、医薬組成物は、徐放製剤であり得る。さらなる実施形態では、徐放製剤は、皮下送達用であり得る。徐放製剤は、限定ではなくＰＬＧＡマイクロスフェア、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡｃ）、ポロクサマー、ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．、フロリダ州アラチュア）、ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）、外科用シーラント、たとえばフィブリノゲンポリマー（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．、ジョージア州コーネリア）、ＴＩＳＳＥＬＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ、イリノイ州ディアフィールド）、ＰＥＧベースのシーラントおよびＣＯＳＥＡＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，
Ｉｎｃ、イリノイ州ディアフィールド）を含み得る。
【０４９９】
非限定的な例として、修飾ｍＲＮＡは、ＰＬＧＡマイクロスフェアを可変放出速度（例えば日および週）で、封入工程中修飾ｍＲＮＡの完全性を維持しながら修飾ｍＲＮＡをＰＬＧＡマイクロスフェア内に封入して調製することで、ＰＬＧＡマイクロスフェア内に製剤され得る。ＥＶＡｃは、非生分解性の生体適合性ポリマーであり、前臨床の徐放性埋め込み用途（例えば、持続放出製品の緑内障用ピロカルピン眼内インサートのオクサート（Ｏｃｕｓｅｒｔ）または徐放性プロゲステロン子宮内デバイスのプロゲスタサート（ｐｒｏｇｅｓｔａｓｅｒｔ）；経皮的送達システムのテストデルム（Ｔｅｓｔｏｄｅｒｍ）、デュラゲシク（Ｄｕｒａｇｅｓｉｃ）およびセレギリン；カテーテル）に広範に使用されている。ポロクサマーＦ−４０７ＮＦは親水性の非イオン性界面活性剤であり、５℃未満の温度で低粘度を有するポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンのトリブロックコポリマーであり、１５℃より高い温度で固体ゲルを形成する。ＰＥＧベースの外科用シーラントは、１分で調製され得、３分でシールし３０日以内に再吸収される送達デバイス中に混合された２つの合成ＰＥＧ成分を含む。ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）と天然のポリマーは、投与部位でのインサイツのゲル化が可能である。それらは、タンパク質およびペプチド薬候補とイオン性相互作用により相互作用して安定化効果をもたらすことが示されている。
【０５００】
ポリマー製剤は、限定ではないが葉酸、トランスフェリンおよびＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）に例示されるように、異なるリガンドの発現により選択的に標的化されることもできる（Ｂｅｎｏｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  ２０１１  １２：２７０８−２７１４；  Ｒｏｚｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００７  １０４：１２９８２−１２８８７；  Ｄａｖｉｓ，  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．  ２００９  ６：６５９−６６８；
Ｄａｖｉｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０  ４６４：１０６７−１０７０；その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる）。
【０５０１】
本発明の修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡは、高分子化合物と一緒にまたはその中で製剤され得る。ポリマーは、限定ではなくポリエチレン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ｌ−リジン）（ＰＬＬ）、ＰＬＬにグラフトされたＰＥＧ、カチオン性リポポリマー、生分解性カチオン性リポポリマー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、架橋分枝ポリ（アルキレンイミン）、ポリアミン誘導体、修飾ポロクサマー、生分解性ポリマー、弾性生分解性ポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルブロックランダムコポリマー、マルチブロックコポリマー、線状生分解性コポリマー、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸）（ＰＡＧＡ）、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマー、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、ポリヒドロキシ酸、フマル酸ポリプロピル（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅｓ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリウレア、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、アクリルポリマー、アミン含有ポリマー、デキストランポリマー、デキストランポリマー誘導体またはそれらの組合せなどの少なくとも１つのポリマーを含み得る。
【０５０２】
非限定的な例として、本発明の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、米国特許第６，１７７，２７４号（その全容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ＰＬＬでグラフトされたＰＥＧの高分子化合物を用いて製剤され得る。製剤は、細胞のインビトロトランスフェクションまたは修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡのインビボ送達に使用され得る。別の例では、修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡは、カチオン性ポリマーを含む懸濁液または媒体中、乾燥医薬組成物中、または米国出願公開第２００９００４２８２９号および同第２００９００４２８２５号（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる）に記載されるような乾燥させることが可能な水溶液中に懸濁され得る。
【０５０３】
別の非限定的な例として、本発明の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマー（その全容が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる米国出願公開第２０１２０００４２９３号および米国特許第８，２３６，３３０号を参照）またはＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡブロックコポリマー（その全容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，００４，５７３号を参照）とともに製剤され得る。非限定的な例として、本発明の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、ＰＥＧとＰＬＡまたはＰＥＧとＰＬＧＡのジブロックコポリマーとともに製剤され得る（その全容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，２４６，９６８号を参照）。
【０５０４】
ポリアミン誘導体が、核酸分子および／またはｍｍＲＮＡの送達、または疾患の治療および／または予防、または埋め込みまたは注射デバイスに含まれるように使用され得る（その全容が参照により本明細書に組み込まれる米国出願公開第２０１００２６０８１７号）。非限定的な例として、医薬組成物は、修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡおよび米国出願公開第２０１００２６０８１７号（その全容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるポリアミン誘導体を含み得る。非限定的な例として、本発明の修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、限定ではなく炭水化物ジアジドモノマーとオリゴアミンを含むジルキン結合物（ｄｉｌｋｙｎｅｕｎｉｔｅ）を組み合わせて調製される１，３−双極子付加重合体を含むポリマーなどのポリアミドポリマーを用いて送達され得る（米国特許第８，２３６，２８０号；その全容が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０５０５】
本発明の修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡは、少なくとも１つのアクリルポリマーとともに製剤され得る。アクリルポリマーは、限定ではなくアクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリレートおよびそれらの組合せを含む。
【０５０６】
一実施形態では、本発明の修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡは、国際公開第２０１１１１５８６２号、国際公開第２０１２０８２５７４号、国際公開第２０１２０６８１８７、および米国特許出願公開第２０１２０２８３４２７号（参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている少なくとも１つのポリマーおよび／またはその誘導体と共に製剤化してよい。別の一実施形態では、本発明の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、国際公開第２０１１１１５８６２号（参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている式Ｚのポリマーと共に製剤化してよい。さらに別の一実施形態では、本発明の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、国際公開第２０１２０８２５７４号または国際公開第２０１２０６８１８７号（参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている式Ｚ、Ｚ’、またはＺ”のポリマーと共に製剤化してよい。本発明の修飾核酸および／または修飾ｍＲＮＡと共に製剤化されるポリマーは、国際公開第２０１２０８２５７４号または国際公開第２０１２０６８１８７号（参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている方法で合成してよい。
【０５０７】
本発明の修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡの製剤には、少なくとも１つのアミン含有ポリマーが含まれてよく、アミン含有ポリマーの例として、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５０８】
例えば、本発明の修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡは、ポリ（アルキレンイミン）、生分解性カチオン性リポポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ポリマー、生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、生分解性ポリエステルランダムコポリマー、直鎖状生分解性コポリマー、ＰＡＧＡ、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマー、またはこれらの組み合わせを含む医薬組成物の形で製剤化してよい。直鎖状生分解性コポリマーは、当技術分野で公知の方法および／または米国特許第６，６９６，０３８号、米国特許出願公開第２００３００７３６１９号および第２００４０１４２４７４号（参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載の方法で製造してよい。ポリ（アルキレンイミン）は、当技術分野で公知の方法および／または米国特許出願公開第２０１００００４３１５号（参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載の方法で製造してよい。生分解性ポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、または生分解性ポリエステルランダムコポリマーは、当技術分野で公知の方法および／または米国特許第６，５１７，８６９号および第６，２６７，９８７号（参照により、これらの文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載の方法で製造してよい。直鎖状生分解性コポリマーは、当技術分野で公知の方法および／または米国特許第６，６５２，８８６号に記載の方法で製造してよい。ＰＡＧＡポリマーは、当技術分野で公知の方法および／または米国特許第６，２１７，９１２号（参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載の方法で製造してよい。ＰＡＧＡポリマーは、ポリマーと共重合してコポリマーまたはブロックコポリマーを形成してよく、その例としてポリ−Ｌ−リシン、ポリアルギン、ポリオルニチン、ヒストン、アビジン、プロタミン、ポリ乳酸、およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）が挙げられるが、これらに限定されない。生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマーは、当技術分野で公知の方法および／または米国特許第８，０５７，８２１号または米国特許出願公開第２０１２００９１４５号（参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載の方法で製造してよい。例えば、マルチブロックコポリマーは、分枝状ポリエチレンイミンと比べて特徴的なパターンを有する直鎖状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）ブロックを用いて合成してよい。さらに、組成物または医薬組成物は、当技術分野で公知の方法、本明細書に記載の方法、または米国特許出願公開第２０１００００４３１５号もしくは米国特許第６，２６７，９８７号および第６，２１７，９１２号（参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載の方法で製造してよい。
【０５０９】
本発明の修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡは、少なくとも１つの分解性ポリエステルと共に製剤化してよく、この分解性ポリエステルはポリカチオン性側鎖を含有してよい。分解性ポリエステルの例として、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。別の一実施形態では、分解性ポリエステルがＰＥＧコンジュゲートを含んでペグ化ポリマーを形成してよい。
【０５１０】
本発明の修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡは、少なくとも１つの架橋性ポリエステルと共に製剤化してよい。架橋性ポリエステルには、当技術分野で公知の架橋性ポリエステル、および米国特許出願公開第２０１２０２６９７６１号（参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載の架橋性ポリエステルが含まれる。
【０５１１】
一実施形態では、本明細書に記載のポリマーは、脂質終端ＰＥＧとコンジュゲートしてよい。非限定的な一例として、ＰＬＧＡは、脂質終端ＰＥＧとコンジュゲートしてＰＬＧＡ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧを形成してよい。別の非限定的な一例として、本発明で使用するＰＥＧコンジュゲートは、国際公開第２００８１０３２７６号（参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。ポリマーは、リガンドコンジュゲートを用いてコンジュゲートしてよく、リガンドコンジュゲートの例として、米国特許第８，２７３，３６３号（参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載のコンジュゲートが挙げられるが、これに限定されない。
【０５１２】
一実施形態では、本明細書に記載の修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡは、別の化合物と共にコンジュゲートしてよい。コンジュゲートの非限定的な例は、米国特許第７，９６４，５７８号および第７，８３３，９９２号（参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。別の一実施形態では、本発明の修飾ＲＮＡは、米国特許第７，９６４，５７８号および第７，８３３，９９２号（参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載の式１−１２２のコンジュゲートと共にコンジュゲートしてよい。本明細書に記載の修飾ＲＮＡは、金（ただし金に限定されない）等の金属と共にコンジュゲートしてよい（例えばＧｉｌｊｏｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２００９  １３１（６）：  ２０７２−２０７３を参照。参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）。別の一実施形態では、本明細書に記載の修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡは、金ナノ粒子中にコンジュゲートおよび／または封入してよい（国際公開第２０１２１６２６９号および米国特許出願公開第２０１２０３０２９４０号；参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）。
【０５１３】
米国特許出願公開第２０１００００４３１３号（参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載の通り、遺伝子送達組成物に、ヌクレオチド配列およびポロキサマーが含まれてよい。例えば、米国特許出願公開第２０１００００４３１３号に記載のポロキサマーを伴う遺伝子送達組成物に、本発明の修飾核酸およびｍｍＲＮＡを使用してよい。
【０５１４】
一実施形態では、本発明のポリマー製剤はカチオン性担体を含んでよく、コレステロール基およびポリエチレングリコール基と共有結合し得るカチオン性リポポリマーと接触させることにより、本発明のポリマー製剤を安定化させてよい。ポリマー製剤とカチオン性リポポリマーの接触は、米国特許出願公開第２００９００４２８２９号（参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載の方法で行うことができる。カチオン性担体の例として、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド−ポリアミン、ジデオキシ−ジアミノ−ｂ−シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ−［Ｎ-（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモ
イル］コレステロールヒドロクロリド（ＤＣ−コレステロールＨＣｌ）ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５１５】
本発明の修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡは、１つ以上のポリマーで出来たポリプレックス中に製剤化されてよい（米国特許出願公開第２０１２０２３７５６５号および第２０１２０２７０９２７号；参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、ポリプレックスは２つ以上のカチオン性ポリマーを含む。カチオン性ポリマーは、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）（例えば直鎖状ＰＥＩ）を含んでよい。
【０５１６】
ポリマー、脂質、および／または他の生分解性薬剤（例えばリン酸カルシウムが挙げられるが、これに限定されない）の組み合わせを用いて、本発明の修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡをナノ粒子として製剤化してもよい。構成成分をコアシェル、ハイブリッド、および／または多層の構造に組み合わせてよく、これによりナノ粒子の微調整を可能にし、修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡの送達を亢進することができる（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，
Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ．  ２００６  ５：７９１−７９６；  Ｆｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２００８  ２９：１５２６−１５３２；  ＤｅＫｏｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．  ２０１１  ６３：７４８−７６１；  Ｅｎｄｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２０１１  ３２：７７２１−７７３１；  Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．  ２０１１  Ｊｕｎ  ６；８（３）：７７４−８７（参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる））。非限定的な例として、ナノ粒子は複数のポリマーを含んでよく、このポリマーの例として親水性−疎水性ポリマー（例えばＰＥＧ−ＰＬＧＡ）、疎水性ポリマー（例えばＰＥＧ）、および／または親水性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない（国際公開第２０１２０２２５１２９号；参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）。
【０５１７】
脂質および／またはポリマーと組み合わされた生分解性リン酸カルシウムナノ粒子は、インビボで修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡを送達することが示されている。一実施形態では、脂質をコーティングしたリン酸カルシウムナノ粒子（この粒子はアニスアミド等の標的リガンドを含有してもよい）を用いて、本発明の修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡを送達してよい。例えば、マウス転移性肺モデルにおいて効果的にｓｉＲＮＡを送達する目的で、脂質をコーティングしたリン酸カルシウムナノ粒子が使われた（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，
Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．  ２０１０  １４２：  ４１６−４２１；  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．  ２０１２  １５８：１０８−１１４；  Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２０１２  ２０：６０９−６１５。参照により、これらの文献の全体が本明細書に組み込まれる）。この送達システムは、ｓｉＲＮＡの送達を改善する目的で、標的化されるナノ粒子と、エンドソーム回避を亢進する成分であるリン酸カルシウムの両方を組み合わせたものである。
【０５１８】
一実施形態では、ＰＥＧ−ポリアニオンブロックコポリマーを伴うリン酸カルシウムを用いて、修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡを送達してよい（Ｋａｚｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．  ２００４  ９７：３４５−３５６；  Ｋａｚｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ．  ２００６  １１１：３６８−３７０；参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）。
【０５１９】
一実施形態では、ＰＥＧ電荷変換ポリマー（Ｐｉｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２０１１  ３２：３１０６−３１１４）を用いてナノ粒子を形成し、本発明の修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡに送達してよい。ＰＥＧ電荷変換ポリマーは、酸性ｐＨで切断されてポリカチオンとなることにより、ＰＥＧ−ポリアニオンブロックコポリマーを改良でき、これによりエンドソーム回避を亢進できる。
【０５２０】
コアシェル型ナノ粒子の使用は、カチオン性架橋ナノゲルコアおよび種々のシェルを高速合成する方法に一層重点を置いている（Ｓｉｅｇｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２０１１  １０８：１２９９６−１３００１）。ナノ粒子のコア成分とシェル成分の両方の化学組成を変更することにより、ポリマーナノ粒子の複合体形成、送達、および内部移行を精密に制御できる。例えば、コアシェル型ナノ粒子は、コレステロールをナノ粒子に共有結合させた後、ｓｉＲＮＡを効率的にマウス肝細胞に送達することができる。
【０５２１】
一実施形態では、ＰＬＧＡ中間層とＰＥＧ含有中性脂質外層を含む中空脂質コアを用いて、本発明の修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡを送達してよい。非限定的な一例として、ルシフェラーゼ発現腫瘍を有するマウスにおいて、脂質−ポリマー−脂質ハイブリッドナノ粒子は、従来のリポプレックスと比べて有意にルシフェラーゼ発現を抑制すると判定された（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ．  ２０１１  ５０：７０２７−７０３１；参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）。
【０５２２】
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に開示される修飾核酸分子で形成されたコアと、ポリマーシェルとを含んでよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載のポリマーおよび当技術分野で公知のポリマーのいずれで形成されてもよい。さらなる一実施形態では、ポリマーシェルを用いて、コア内の修飾核酸を保護することができる。
【０５２３】
本発明の修飾核酸分子で使用するコアシェル型ナノ粒子は、米国特許第８，３１３，７７７号（参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載されており、同第８，３１３，７７７号に記載の方法で形成することができる。
【０５２４】
一実施形態では、コアシェル型ナノ粒子は、本明細書に開示される修飾核酸分子で形成されたコアと、ポリマーシェルとを含んでよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載のポリマーおよび当技術分野で公知のポリマーのいずれで形成されてもよい。さらなる一実施形態では、ポリマーシェルを用いて、コア内の修飾核酸分子を保護することができる。
ペプチドおよびタンパク質
本発明の修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡによる細胞のトランスフェクションを増加させる目的で、修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡをペプチドおよび／またはタンパク質と共に製剤化することができる。一実施形態では、例えば細胞透過性ペプチド（ただしこれに限定されない）等のペプチドと、細胞内送達を可能にするタンパク質およびペプチドを使用して、医薬製剤を送達してよい。本発明の医薬製剤で使用してよい細胞透過性ペプチドの非限定的な一例として、ポリカチオンと結合して細胞内空間への送達を促進する細胞透過性ペプチド（例えば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、トランスポータン、またはｈＣＴ由来の細胞透過性ペプチド）が挙げられる（例えばＣａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，
Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ３（３）：３１０−８  （２００１）；  Ｌａｎｇｅｌ，  Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ＦＬ，  ２００２）；  Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｄｅｓ．  １１（２８）：３５９７−６１１  （２００３）；  Ｄｅｓｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ６２（１６）：１８３９−４９  （２００５）を参照。これらの文献はすべて、参照により本明細書に組み込まれる）。細胞内空間への組成物の送達を亢進する細胞透過性剤（例えばリポソーム）を含むように、組成物を製剤化することもできる。細胞内送達を可能にする目的で、本発明の修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡを、例えばＡｉｌｅｒｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）およびＰｅｒｍｅｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）が提供するペプチドおよび／またはタンパク質と結合させて複合体を形成してよい（Ｃｒｏｎｉｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ２０１０  ５：７４７−７５２；  ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ２００９  １０６：６１１１−６１１６；  Ｓａｗｙｅｒ，  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．  ２００９  ７３：３−６；  Ｖｅｒｄｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｉｌｉｎｓｋｉ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２０１２；５０３：３−３３；これらの文献はすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０５２５】
一実施形態では、細胞透過性ポリペプチドは第１ドメインと第２ドメインを含んでよい。第１ドメインは、超荷電ポリペプチド（ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）を含んでよい。第２ドメインは、タンパク質結合パートナーを含んでよい。本明細書で使用する「タンパク質結合パートナー」という語は、抗体およびその機能性断片、足場タンパク質、またはペプチドを含むが、これらに限定されない。細胞透過性ポリペプチドは、タンパク質結合パートナーのための細胞内結合パートナーをさらに含んでよい。細胞透過性ポリペプチドは、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡの導入先の細胞から分泌されることも可能である。
【０５２６】
ペプチドまたはタンパク質を含む製剤を使用することにより、修飾核酸分子もしくはｍｍＲＮＡによる細胞トランスフェクションを増加させ、修飾核酸分子もしくはｍｍＲＮＡの生体内分布を（例えば特定の組織もしくは細胞型を標的化することにより）変化させ、かつ／またはコード化タンパク質の翻訳を増加させることができる（例えば国際公開第２０１２１１０６３６号を参照。参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）。
細胞
本発明の修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡをエキソビボで細胞にトランスフェクトし、続いてこの細胞を対象に移植することができる。非限定的な例として、医薬組成物には、修飾ＲＮＡを肝細胞および骨髄細胞に送達するための赤血球、修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡをウイルス様粒子（ＶＬＰ）にして送達するためのビロソーム、修飾ＲＮＡを送達するために電気穿孔処理された細胞、例えばＭＡＸＣＹＴＥ（登録商標）（メリーランド州ゲーサーズバーグ）やＥＲＹＴＥＣＨ（登録商標）（フランス、リヨン）（これらに限定されない）から提供される細胞が含まれてよい。ｍｍＲＮＡ以外のペイロードを送達するための赤血球、ウイルス粒子、および電気穿孔処理された細胞の使用例が、文献に記載されている（Ｇｏｄｆｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２０１２  １２：１２７−１３３；  Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２０１２  １２：３８５−３８９；  Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２０１１  １０８：１０９８０−１０９８５；  Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．  ２０１０
２７：４００−４２０；  Ｈｕｃｋｒｉｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ２００７；１７：３９−４７；  Ｃｕｓｉ，  Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ．  ２００６  ２：１−７；  ｄｅ  Ｊｏｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００６  １３：４００−４１１；これらの全文献の全体が参照により本明細書に組み込まれる）。国際公開第２０１１０８５２３１号および米国特許出願公開第２０１１０１７１２４８号（参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載の方法で合成された合成ＶＬＰの状態にして、修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡを送達してよい。
【０５２７】
本発明の修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡの細胞系製剤を使用することにより、（例えば細胞担体における）細胞トランスフェクションを保証し、修飾核酸分子もしくはｍｍＲＮＡの生体内分布を（例えば細胞担体を特定の組織もしくは細胞型に標的化することにより）変化させ、かつ／またはコード化タンパク質の翻訳を増加させることができる。
細胞への導入
ウイルス介在性および非ウイルス介在性の手法をはじめ、種々の方法が当技術分野において公知であり、核酸を細胞に導入するのに適している。代表的な非ウイルス介在性手法の例として、電気穿孔法、リン酸カルシウム介在性移入、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソーム介在性移入、マイクロインジェクション、微小噴出物介在性移入（ナノ粒子）、カチオン性ポリマー介在性移入（ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等）、または細胞融合が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５２８】
ソノポレーションすなわち細胞ソノポレーションの手法とは、細胞原形質膜の透過性を改変するために音響（例えば超音波周波数）を使用することである。ソノポレーション方法は当技術分野で公知であり、例えば米国特許出願公開第２０１００１９６９８３号では細菌との関連で教示され、例えば米国特許出願公開第２０１００００９４２４号では他の細胞型との関連で教示されている（参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）。
【０５２９】
電気穿孔手法も当技術分野で周知である。一実施形態では、実施例８に記載のように、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを電気穿孔法で送達してよい。  
ヒアルロニダーゼ
本発明の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを筋肉内または皮下に局所注射する場合、ヒアルロナンの加水分解を触媒するヒアルロニダーゼを含めてよい。ヒアルロナンの加水分解を触媒することにより、間質バリアの一成分であるヒドロゲナーゼがヒアルロナンの粘性を下げるので、組織の透過性が上昇する（Ｆｒｏｓｔ，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  （２００７）  ４：４２７−４４０；参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）。トランスフェクトされた細胞が産生するコード化タンパク質を急速に分散させ全身に分布させることは、有用である。あるいは、筋肉内または皮下に投与された本発明の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡに曝される細胞数を増加させる目的で、ヒアルロニダーゼを使用してもよい。
ナノ粒子模倣体
本発明の修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡを、ナノ粒子模倣体内に封入し、かつ／またはナノ粒子模倣体に吸収させてよい。ナノ粒子模倣体は、送達機能する生体または粒子、例えば病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生体、プリオン、および細胞（ただしこれらに限定されない）を模倣することができる。非限定的な例として、本発明の修飾ｍＲＮＡを、ウイルスの送達機能を模倣できる非ウイルス性（ｎｏｎ−ｖｉｒｏｎ）粒子内に封入してよい（国際公開第２０１２００６３７６号を参照。参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）。
ナノチューブ
本発明の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを、少なくとも１つのナノチューブに付着等により結合させてよい。ナノチューブの例として、ロゼットナノチューブ、リンカーを伴うツインベースを有するロゼットナノチューブ、カーボンナノチューブ、および／または単一壁カーボンナノチューブが挙げられるが、これらに限定されない。修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡをナノチューブに結合するには、立体性、イオン性、共有結合性等の力（これらに限定されない）、および／または他の力を用いてよい。
【０５３０】
一実施形態では、ナノチューブは、１つ以上の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを細胞内に放出することができる。体内のナノチューブ間の相互作用を管理するように、かつ／または本明細書に開示される修飾核酸分子もしくはｍｍＲＮＡに付着もしくは結合させるように、少なくとも１つのナノチューブのサイズおよび／または表面構造を変更してよい。一実施形態では、ナノチューブの寸法および／または特性を調整する目的で、上記少なくとも１つのナノチューブの構成要素、または当該構成要素に結合する官能基を変更してよい。非限定的な例として、正常血管の壁にある穴は通過できないが、腫瘍組織の血管にある比較的大きな穴は通過できる程度に小さいナノチューブとなるように、ナノチューブの長さを変更してよい。
【０５３１】
一実施形態では、ポリマー（例えばポリエチレングリコールが挙げられるがこれに限定されない）を含む送達亢進化合物を、少なくとも１つのナノチューブにコーティングしてもよい。別の一実施形態では、少なくとも１つのナノチューブおよび／または修飾ｍＲＮＡを、薬剤的に許容可能な賦形剤および／または送達ビヒクルと混合してよい。
【０５３２】
一実施形態では、修飾ｍＲＮＡを、付着および／または他の方法により少なくとも１つのロゼットナノチューブに結合させる。ロゼットナノチューブは、当技術分野で公知の方法および／または国際公開第２０１２０９４３０４号（参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載の工程により形成してよい。少なくとも１つの修飾ｍＲＮＡを、国際公開第２０１２０９４３０４号（参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載の工程により、付着および／または他の方法で少なくとも１つのロゼットナノチューブに結合させてよい。この工程では、少なくとも１つの修飾ｍＲＮＡを付着または他の方法によりロゼットナノチューブに結合させることができる条件下で、ロゼットナノチューブまたはロゼットナノチューブを形成するモジュールを、少なくとも１つの修飾ｍＲＮＡと水性媒体中で混合する。
【０５３３】
一実施形態では、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを、付着および／または他の方法により少なくとも１つのカーボンナノチューブに結合させてよい。非限定的な一例として、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを連結剤に結合し、この連結剤をカーボンナノチューブに結合してよい（例えば米国特許第８，２４６，９９５号を参照。参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）。カーボンナノチューブは単一壁ナノチューブであってよい（例えば米国特許第８，２４６，９９５号を参照。参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）。
コンジュゲート
本発明の修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡには、コンジュゲートが含まれ、例えば、担体もしくはターゲティンググループと共有結合している修飾核酸分子もしくはｍｍＲＮＡ、あるいは、一緒になって融合タンパク質を産生する２つのコード化領域を含む修飾核酸分子もしくはｍｍＲＮＡ（例えば、標的化グループと治療用タンパク質もしくはペプチドを有する）が含まれる。
【０５３４】
本発明のコンジュゲートには、天然の物質、例えばタンパク質（例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、グロブリン）；炭水化物（例えばデキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、ヒアルロン酸）；または脂質が含まれる。リガンドは、組換え分子または合成ポリマー等の合成分子であってもよく、例えば合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えばアプタマー）であってもよい。ポリアミノ酸の例として、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｉｎｅ）が挙げられる。ポリアミンの例として、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第４級塩、αヘリカルペプチドが挙げられる。
【０５３５】
特にＲＮＡに対するポリヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示している代表的な米国特許として、米国特許第４，８２８，９７９号、第４，９４８，８８２号、第５，２１８，１０５号、第５，５２５，４６５号、第５，５４１，３１３号、第５，５４５，７３０号、第５，５５２，５３８号、第５，５７８，７１７号、第５，５８０，７３１号、第５，５９１，５８４号、第５，１０９，１２４号、第５，１１８，８０２号、第５，１３８，０４５号、第５，４１４，０７７号、第５，４８６，６０３号、第５，５１２，４３９号、第５，５７８，７１８号、第５，６０８，０４６号、第４，５８７，０４４号、第４，６０５，７３５号、第４，６６７，０２５号、第４，７６２，７７９号、第４，７８９，７３７号、第４，８２４，９４１号、第４，８３５，２６３号、第４，８７６，３３５号、第４，９０４，５８２号、第４，９５８，０１３号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，２４５，０２２号、第５，２５４，４６９号、第５，２５８，５０６号、第５，２６２，５３６号、第５，２７２，２５０号、第５，２９２，８７３号、第５，３１７，０９８号、第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号、第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号、第５，５１０，４７５号、第５，５１２，６６７号、第５，５１４，７８５号、第５，５６５，５５２号、第５，５６７，８１０号、第５，５７４，１４２号、第５，５８５，４８１号、第５，５８７，３７１号、第５，５９５，７２６号、第５，５９７，６９６号、第５，５９９，９２３号、第５，５９９，９２８号、第５，６８８，９４１号、第６，２９４，６６４号、第６，３２０，０１７号、第６，５７６，７５２号、第６，７８３，９３１号、第６，９００，２９７号、第７，０３７，６４６号（参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５３６】
一実施形態では、本発明のコンジュゲートは、本発明の修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡの担体として機能してよい。このコンジュゲートはカチオン性ポリマーを含んでよく、カチオン性ポリマーの例として、ポリアミン、ポリリジン、ポリアルキレンイミン、ポリエチレンイミン（ポリ（エチレングリコール）とグラフト可能）が挙げられる。非限定的な一例として、コンジュゲートはポリマーコンジュゲートと類似していてよく、このポリマーコンジュゲートの合成方法は米国特許第６，５８６，５２４号（参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０５３７】
コンジュゲートは、ターゲティンググループを含んでいてもよい。例えば、細胞もしくは組織のターゲティング薬剤（例えばレクチン、糖タンパク質、脂質）、またはタンパク質（例えば、腎細胞等の特定の細胞型と結合する抗体）を含んでいてもよい。ターゲティンググループは、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、フランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣体、またはアプタマーであり得る。
【０５３８】
ターゲティンググループは、タンパク質（例えば糖タンパク質）、ペプチド（例えば共リガンド（ｃｏ−ｌｉｇａｎｄ）に対する特異的親和性を有する分子）、抗体（例えば癌細胞、内皮細胞、骨細胞等の特定の細胞型に結合する抗体）であり得る。ターゲティンググループには、ホルモンおよびホルモン受容体も含まれ得る。ターゲティンググループには、非ペプチド性の種、例えば脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、またはアプタマーも含まれ得る。リガンドは、例えばリポ多糖、またはｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子であり得る。
【０５３９】
ターゲティンググループは、特定の受容体をターゲティングできる任意のリガンドであってよい。例えば、葉酸、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース−６Ｐ、アプタマー、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ、およびＨＤＬリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ターゲティンググループはアプタマーである。アプタマーは非修飾であってよく、あるいは本明細書に開示される修飾の任意の組み合わせを有していてもよい。
【０５４０】
一実施形態では、本発明の医薬組成物には、化学修飾、例えば、ロックド核酸に類似した修飾（ただしこれに限定されない）が含まれていてよい。
サンタリスから提供されているロックド核酸（ＬＮＡ）等のＬＮＡの調製を教示している代表的な米国特許の例として、米国特許第６，２６８，４９０号、第６，６７０，４６１号、第６，７９４，４９９号、第６，９９８，４８４号、第７，０５３，２０７号、第７，０８４，１２５号、および第７，３９９，８４５号（参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５４１】
ＰＮＡ化合物の調製を教示している代表的な米国特許の例として、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、および第５，７１９，２６２号（参照により、これらの各文献は本明細書に組み込まれる）が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、例えばＮｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９１，  ２５４，  １４９７−１５００に記載されている。
【０５４２】
本発明のいくつかの実施形態は、ホスホロチオエート主鎖を有する修飾核酸またはｍｍＲＮＡ、および他の修飾主鎖を有するオリゴヌクレオシド、特に、上記で参照している米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖と呼ばれる］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、および−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［ここで、天然ホスホジエステル主鎖は−Ｏ-Ｐ（Ｏ
）２−Ｏ−ＣＨ２−で表される］、ならびに上記で参照している米国特許第５，６０２，２４０号のアミド主鎖を有するオリゴヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、上記で参照している米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ主鎖構造を有する。
【０５４３】
２’位置の修飾も送達に役立ち得る。好ましくは、２’位置の修飾は、ポリペプチドコード配列内（すなわち翻訳可能領域内）に位置しない。２’位置の修飾は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、および／またはテール領域に位置してよい。２’位置の修飾には、２’位置のＨ（すなわち２’−デオキシ）；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つ以上が含まれてよい（ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル、またはＣ２〜Ｃ１０のアルケニルおよびアルキニルに置換されても置換されなくてもよい）。代表的な適切な修飾の例として、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が挙げられる（式中、ｎとｍは１〜約１０である）。他の実施形態では、修飾核酸またはｍｍＲＮＡは、２’位置に以下のうちの１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、薬物動態特性を改良するための基、薬力学特性を改良するための基、類似の特性を有する他の置換基。いくつかの実施形態では、修飾には２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、別名２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥ（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ，  １９９５，  ７８：４８６−５０４）すなわちアルコキシ−アルコキシ基が含まれる。別の代表的な修飾として、下記実施例に記載の２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（下記実施例に記載の通り別名２’−ＤＭＡＯＥ、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野で２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル、２’−ＤＭＡＥＯＥとも呼ばれる）、すなわち、同様に下記実施例に記載の通り２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２が挙げられる。他の修飾として、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上または２’−５’連結ｄｓＲＮＡ内の糖の３’位置、および５’末端ヌクレオチドの５’位置に、類似の修飾を行ってもよい。本発明のポリヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分等の糖模倣体を有してもよい。そのような修飾糖構造の調製を教示している代表的な米国特許の例として、米国特許第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１���，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、および第５，７００，９２０号が挙げられるが、これらに限定されない（参照により、これらの各文献が本明細書に組み込まれる）。
【０５４４】
さらに他の実施形態では、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、細胞透過性ペプチドに共有結合的にコンジュゲートされる。細胞透過性ペプチドはシグナル配列を含んでいてもよい。安定性を高め、細胞トランスフェクションを増加させ、かつ／または生体内分布を（例えば特定の組織もしくは細胞型に標的化することにより）変化させるように、本発明のコンジュゲートを設計することができる。
自己組織化ナノ粒子
核酸の自己組織化ナノ粒子
自己組織化ナノ粒子のサイズは明確に定義されており、核酸の鎖は容易に再プログラムできるので、自己組織化ナノ粒子のサイズを精密に制御できる。例えば、癌標的化ナノ送達担体の最適粒子サイズは２０〜１００ｎｍであり、その理由は、２０ｎｍを超える直径は腎クリアランスを回避し、透過性および保持の亢進効果により特定の腫瘍への送達を亢進するからである。自己組織化核酸ナノ粒子を使用することにより、サイズおよび形状が均一な単一集団は、癌標的化リガンドの空間定位および密度が精密に制御され、送達が亢進される。非限定的な一例として、短いＤＮＡ断片および治療用ｓｉＲＮＡの再プログラム可能な自己組織化を用いて、オリゴヌクレオチドナノ粒子が調製された。これらのナノ粒子は分子的に同一であり、粒子サイズおよび標的リガンドの位置と密度が制御可能である。ＤＮＡ断片およびｓｉＲＮＡは自己組織化して１ステップの反応物となり、ＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ四面体ナノ粒子を生成してインビボの標的化送達に使用される（Ｌｅｅ  ｅｔ
ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１２  ７：３８９−３９３；参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）。
【０５４５】
一実施形態では、本明細書に開示される修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡを、自己組織化ナノ粒子として製剤化してよい。非限定的な一例では、核酸を使用してナノ粒子を製造でき、このナノ粒子を、本発明の修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡの送達システムで使用してよい（例えば国際公開第２０１２１２５９８７号を参照。参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）。
【０５４６】
一実施形態では、核酸自己組織化ナノ粒子は、本明細書に開示される修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡで形成されたコアと、ポリマーシェルとを含んでよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載のポリマーおよび当技術分野で公知のポリマーのいずれで形成されてもよい。さらなる一実施形態では、ポリマーシェルを用いて、コア内の修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡを保護することができる。
ポリマー系自己組織化ナノ粒子
ポリマーを用いて、ナノ粒子へと自己組織するシートを形成してよい。このようなナノ粒子を使用して、本発明の修飾核酸およびｍｍＲＮＡを送達してよい。一実施形態では、このような自己組織化ナノ粒子は、ＲＮＡヘアピンの長いポリマーで形成されたマイクロスポンジであってよい。このポリマーは、結晶性の「プリーツ」シートを形成してからマイクロスポンジへと自己組織化する。このようなマイクロスポンジは、密に充填されたスポンジ様のマイクロ粒子であり、効率的な担体として機能でき、細胞にカーゴ（積荷）を送達する能力を有し得る。マイクロスポンジの直径は１μｍ〜３００ｍｎであってよい。マイクロスポンジは、当技術分野で公知の他の薬剤と複合体を形成して、より大きなマイクロスポンジを形成してよい。非限定的な一例として、マイクロスポンジは、ポリカチオン性ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｅ）（ＰＥＩ）等の薬剤と複合体を形成して外層を形成し、細胞取り込みを促進することができる。この複合体は、高温（１５０℃）時に安定状態を維持できる直径２５０ｎｍの粒子を形成できる（Ｇｒａｂｏｗ  ａｎｄ  Ｊａｅｇａｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１２，  １１：２６９−２６９；参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）。加えて、このようなマイクロスポンジは、リボヌクレアーゼよる分解に対して並外れた程度の保護を示すことができ得る。
【０５４７】
別の一実施形態では、マイクロスポンジ等（ただしこれに限定されない）のポリマー系自己組織化ナノ粒子は、完全にプログラム可能なナノ粒子であってよい。ナノ粒子の幾何学形状、サイズ、および化学量論を精密に制御することにより、修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡ等（ただしこれらに限定されない）のカーゴ（積荷）を送達するための最適なナノ粒子を作成できる。  
【０５４８】
一実施形態では、ポリマー系ナノ粒子は、本明細書に開示される修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡで形成されたコアと、ポリマーシェルとを含んでよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載のポリマーおよび当技術分野で公知のポリマーのいずれで形成されてもよい。さらなる一実施形態では、ポリマーシェルを用いて、コア内の修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡを保護することができる。
無機ナノ粒子
本発明の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを、無機ナノ粒子中に製剤化してよい（米国特許第８，２５７，７４５号；参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）。無機ナノ粒子には、水膨張性の粘土物質が含まれていてよい（ただしこれに限定されない）。非限定的な一例として、無機ナノ粒子には、単純ケイ酸塩で作られた合成スメクタイト粘土が含まれていてよい（例えば、米国特許第５，５８５，１０８号および第８，２５７，７４５号を参照。参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）。
【０５４９】
一実施形態では、無機ナノ粒子は、本明細書に開示される修飾核酸で形成されたコアと、ポリマーシェルとを含んでよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載のポリマーおよび当技術分野で公知のポリマーのいずれで形成されてもよい。さらなる一実施形態では、ポリマーシェルを用いて、コア内の修飾核酸を保護することができる。
半導体性および金属製のナノ粒子
本発明の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを、半導体性または金属製の材料を含む水分散性ナノ粒子中に製剤化してよく（米国特許出願公開第２０１２０２２８５６５号；参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）、あるいは磁性ナノ粒子中に製剤化してよい（米国特許出願公開第２０１２０２６５００１号および第２０１２０２８３５０３号；参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）。水分散性ナノ粒子は、疎水性ナノ粒子、親水性ナノ粒子のどちらであってもよい。
【０５５０】
一実施形態では、半導体性および／または金属性ナノ粒子は、本明細書に開示される修飾核酸で形成されたコアと、ポリマーシェルとを含んでよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載のポリマーおよび当技術分野で公知のポリマーのいずれで形成されてもよい。さらなる一実施形態では、ポリマーシェルを用いて、コア内の修飾核酸を保護することができる。
ゲルおよびヒドロゲル
一実施形態では、本明細書に開示される修飾ｍＲＮＡを封入して、当技術分野で公知の、対象に注入されたときにゲルを形成できるヒドロゲルを形成してよい。ヒドロゲルとは、親水性ポリマー鎖が網状組織となったものであり、水を分散媒とするコロイド状ゲルの形で見られることもある。ヒドロゲルは、吸水性の高い（９９％超の水を含有できる）天然ポリマーまたは合成ポリマーである。ヒドロゲルは含水量が高いので、天然組織によく似た一定程度の柔軟性も有する。本明細書に記載のヒドロゲルを使用して、生体適合性、生分解性、および／または多孔性の脂質ナノ粒子を封入してよい。
【０５５１】
非限定的な一例として、ヒドロゲルは、アプタマーで官能化されたヒドロゲルであってよい。アプタマーで官能化されたヒドロゲルをプログラムすることにより、核酸ハイブリダイゼーションを用いて１つ以上の修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡを放出することができる。（Ｂａｔｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃｉｅｔｙ．  ２０１２  １３４：１２４１０−１２４１３；参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）。
【０５５２】
非限定的な別の一例として、ヒドロゲルは、逆オパールの形状にされてよい。オパールヒドロゲルは比較的高い膨張比を示し、膨張速度も一桁速い。オパールヒドロゲルの生産方法およびオパールヒドロゲルの説明は、国際公開第２０１２１４８６８４号（参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０５５３】
非限定的なさらに別の一例では、ヒドロゲルは、抗菌性ヒドロゲルであってよい。抗菌性ヒドロゲルは、薬剤的に許容可能な塩または有機物質を含んでよく、例えば、医薬品グレードおよび／または医療グレードの銀塩およびアロエベラゲルもしくは抽出物を含んでよい（ただしこれらに限定されない）（国際公開第２０１２１５１４３８号を参照。参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）。
【０５５４】
一実施形態では、修飾ｍＲＮＡを脂質ナノ粒子中に封入してから、この脂質ナノ粒子を封入してヒドロゲルにしてよい。
一実施形態では、本明細書に開示される修飾ｍＲＮＡを封入して、当技術分野で公知の任意のゲルにしてよい。非限定的な一例として、このゲルは、フルオロウラシル注入可能ゲルであってよく、あるいは、当技術分野で公知の化合物および／または薬剤を含有するフルオロウラシル注入可能ゲルであってよい。別の一例では、修飾ｍＲＮＡを、エピネフリン含有フルオロウラシルゲル内に封入してよい（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｔｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  １９９９  ４４（４）：２６７−２７４を参照。参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）。
【０５５５】
一実施形態では、本明細書に開示される修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡを封入してフィブリンゲル、フィブリンヒドロゲル、またはフィブリン接着剤にしてよい。別の一実施形態では、修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子または速やかに排出される脂質ナノ粒子中に製剤化してから、フィブリンゲル、フィブリンヒドロゲル、またはフィブリン接着剤へと封入してよい。さらに別の一実施形態では、修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡをリポプレックスとして製剤化してから、フィブリンゲル、ヒドロゲル、またはフィブリン接着剤へと封入してよい。フィブリンゲル、フィブリンヒドロゲル、およびフィブリン接着剤は、フィブリノゲン溶液と、カルシウムに富むトロンビン溶液という２つの成分を含む（例えば、Ｓｐｉｃｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｋｏｓ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１０．  １４８：  ４９−５５；  Ｋｉｄｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１２．  １５７：８０−８５を参照。参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）。フィブリンゲル、フィブリンヒドロゲル、および／またはフィブリン接着剤の成分の濃度を変更することにより、ゲル、ヒドロゲル、および／または接着剤の特性、網状組織メッシュサイズ、および／または分解特性を変化させることができる。例えば、フィブリンゲル、フィブリンヒドロゲル、および／またはフィブリン接着剤の徐放特性を変えることができる（ただしこれに限定されない）（例えば、ｐｉｃｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｋｏｓ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１０．  １４８：  ４９−５５；  Ｋｉｄｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１２．  １５７：８０−８５；  Ｃａｔｅｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２００８．  １４：１１９−１２８を参照。参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）。本発明に開示される修飾ｍＲＮＡの送達に使用する場合、この特徴は有利であり得る（例えば、Ｋｉｄｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１２．  １５７：８０−８５；  Ｃａｔｅｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２００８．  １４：１１９−１２８を参照。参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）。
陽イオンと陰イオン
本明細書に開示される修飾核酸分子の製剤は、陽イオンまたは陰イオンを含んでよい。一実施形態では、製剤は、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ＋、およびこれらの組み合わせ等（ただしこれらに限定されない）の金属陽イオンを含む。非限定的な一例として、製剤は、ポリマーを含み、金属陽イオンと複合体を形成した修飾ｍＲＮＡを含む（例えば、米国特許第６，２６５，３８９号および第６，５５５，５２５号を参照。参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）。
成形されたナノ粒子およびマイクロ粒子
本明細書に開示される修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡを、ナノ粒子および／またはマイクロ粒子中に製剤化してよい。このようなナノ粒子および／またはマイクロ粒子は、任意のサイズ、形状、および化学構造に成形してよい。一例として、ＬＩＱＵＩＤＡ
ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（登録商標）（ノースカロライナ州モリスビル）が提供するＰＲＩＮＴ（登録商標）技術を用いてナノ粒子および／またはマイクロ粒子を作製してよい（例えば、国際公開第２００７０２４３２３号を参照。参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）。
【０５５６】
一実施形態では、成形されたナノ粒子は、本明細書に開示される修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡで形成されたコアと、ポリマーシェルとを含んでよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載のポリマーおよび当技術分野で公知のポリマーのいずれで形成されてもよい。さらなる一実施形態では、ポリマーシェルを用いて、コア内の修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡを保護することができる。
ナノジャケットおよびナノリポソーム
本明細書に開示される修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡを、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｎａｎｏ（ペンシルベニア州ステートカレッジ）が提供するナノジャケットおよびナノリポソーム中に製剤化してよい。ナノジャケットは、体内で天然に存在する化合物（カルシウム、リン酸を含む）で作られ、少量のケイ酸塩を含むこともある。ナノジャケットのサイズは５〜５０ｎｍの範囲に及び、修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡ等（ただしこれらに限定されない）の親水性および疎水性化合物の送達に使用できる。
【０５５７】
ナノリポソームは、体内の天然の脂質等（ただしこれに限定されない）の脂質で作られる。ナノリポソームのサイズは６０〜８０ｎｍの範囲に及び、修飾核酸分子および／またはｍｍＲＮＡ等（ただしこれらに限定されない）の親水性および疎水性化合物の送達に使用できる。一態様では、本明細書に開示される修飾核酸を、セラミドナノリポソーム等（ただしこれに限定されない）のナノリポソーム中に製剤化する。
賦形剤
医薬製剤は、薬剤的に許容可能な賦形剤を追加的に含んでよい。本明細書で使用する「賦形剤」には、所望される特定の剤形に適したすべての溶剤、分散媒、希釈剤、その他の液体ビヒクル、分散補助剤もしくは懸濁補助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、保存剤、固体結合剤、滑沢剤等が含まれるが、これらに限定されない。医薬組成物を製剤化するための種々の賦形剤、および医薬組成物の種々の調製手法が、当技術分野において公知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａ．  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  ＭＤ，  ２００６を参照。参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）。望ましくない生物学的効果が生じる等により、医薬組成物の他の成分と有害な方法で相互作用するなどして、従来の賦形剤媒体が物質またはその誘導体と不適合である場合を除き、従来の賦形剤媒体の使用は、本開示の範囲内で企図され得る。
【０５５８】
いくつかの実施形態では、薬剤的に許容可能な賦形剤の純度は少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であってよい。いくつかの実施形態では、賦形剤は、ヒトでの使用および動物での使用に承認されたものであってよい。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国食品医薬品局に承認されたものであってよい。いくつかの実施形態では、賦形剤は、医薬品グレードであってよい。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、ヨーロッパ薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、および／または国際薬局方の基準を満足したものであってよい。
【０５５９】
医薬製剤の製造において使われる薬剤的に許容可能な賦形剤の例として、不活性希釈剤、分散剤および／または造粒剤、表面活性剤、および／または乳化剤、崩壊剤、結合剤、保存剤、緩衝剤、滑沢剤、および／または油が挙げられるが、これらに限定されない。このような賦形剤を、医薬製剤中に随意に含めてよい。加えて、医薬組成物にカカオバター、坐剤ワックス、着色剤、コーティング剤、甘味剤、風味剤、および／または香料等の賦形剤を含めてもよい。
【０５６０】
代表的な賦形剤として、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウムラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉末砂糖等、および／またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５６１】
代表的な造粒剤および／または分散剤の例として、ジャガイモデンプン、コーンスターチ、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、柑橘パルプ、カンテン、ベントナイト、セルロースおよび木材製品、海綿、陽イオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニル−ピロリドン）（クロスポビドン）、カルボキシメチルスターチナトリウム（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、アルファ化デンプン（スターチ１５００）、微結晶性デンプン、水不溶性デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム、四級アンモニウム化合物等、および／またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５６２】
代表的な表面活性剤および／または乳化剤の例として、天然乳化剤（例えばアカシア、カンテン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガント、コンドラクス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ロウ、レシチン）、コロイド粘土（例えばベントナイト［ケイ酸アルミニウム］、ＶＥＥＧＵＭ（登録商標）［ケイ酸アルミニウムマグネシウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子アルコール（例えばステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、モノステアリン酸トリアセチン、ジステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸グリセリル、モノステアリン酸プロピレングリコール、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えばカルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、カルボキシビニルポリマー）、カラゲナン、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０］、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミテート［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、ソルビタンモノステアレート［ＳＰＡＮ（登録商標）６０］、ソルビタントリステアレート［ＳＰＡＮ（登録商標）６５］、グリセリルモノオレエート、ソルビタンモノオレエート［ＳＰＡＮ（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えばポリオキシエチレンモノステアレート［ＭＹＲＪ（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシ化ヒマシ油、ポリオキシメチレンステアレート、ＳＯＬＵＴＯＬ（登録商標））、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えばＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル（例えばポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ジエチレングリコールモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ＰＬＵＯＲＩＮＣ（登録商標）Ｆ６８、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドクサートナトリウム等、および／またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５６３】
代表的な結合剤の例として、デンプン（例えばコーンスターチ、デンプンのり）；ゼラチン；糖類（例えばスクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）；天然ガムおよび合成ガム（例えばアカシア、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュモス抽出物、パンワール（ｐａｎｗａｒ）ガム、ガッチ（ｇｈａｔｔｉ）ガム、イサポール皮（ｉｓａｐｏｌ  ｈｕｓｋ）の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、カラマツアラビノガラクタン（ａｒａｂｏｇａｌａｃｔａｎ））；アルギン酸塩；ポリエチレンオキシド；ポリエチレングリコール；無機カルシウム塩；ケイ酸；ポリメタクリル酸；ロウ類；水；アルコール等；およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５６４】
代表的な保存剤の例として、抗酸化剤、キレート化剤、抗菌性保存剤、抗真菌性保存剤、アルコール保存剤、酸性保存剤、および／または他の保存剤が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な抗酸化剤の例として、αトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および／または亜硫酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。代表的なキレート化剤の例として、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、および／またはエデト酸三ナトリウムが挙げられる。代表的な抗菌性保存剤の例として、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、イミド尿素ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、および／またはチメロサールが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な抗真菌性保存剤の例として、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム  、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、および／またはソルビン酸が挙げられるが、これらに限定されない。代表的なアルコール保存剤の例として、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシベンゾエート、および／またはフェニルエチルアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な酸性保存剤の例として、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、βカロチン、クエン酸、酢酸、デヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、および／またはフィチン酸が挙げられるが、これらに限定されない。その他の保存剤の例として、トコフェロール、酢酸トコフェロール、メシル酸デテロキシム（ｄｅｔｅｒｏｘｉｍｅ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ＧＬＹＤＡＮＴ  ＰＬＵＳ（登録商標）、ＰＨＥＮＯＮＩＰ（登録商標）、メチルパラベン、ＧＥＲＭＡＬＬ（登録商標）１１５、ＧＥＲＭＡＢＥＮ（登録商標）ＩＩ、ＮＥＯＬＯＮＥ（商標）、ＫＡＴＨＯＮ（商標）、および／またはＥＵＸＹＬ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５６５】
代表的な緩衝剤の例として、クエン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、リン酸緩衝溶液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、Ｄ−グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロピオン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、二塩基性リン酸カルシウム、リン酸、三塩基性リン酸カルシウム、水酸化リン酸カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、二塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、二塩基酸リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱物質を含まない水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコール等、および／またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５６６】
代表的な滑沢剤の例として、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸グリセリル（ｇｌｙｃｅｒｙｌ  ｂｅｈａｎａｔｅ）、水素化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム等、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５６７】
代表的な油の例として、アーモンド油、杏仁油、アボカド油、ババス油、ベルガモット油、ブラックカラント種油、ルリヂサ油、ケード油、カモミール油、キャノーラ油、キャラウェー油、カルナバ油、ヒマシ油、シナモン油、ココアバター、ココナツ油、タラ肝油、コーヒーの油、トウモロコシ油、綿実油、エミュー油、ユーカリ油、月見草油、魚油、アマニ油、ゲラニオール油、ゴード（ｇｏｕｒｄ）油、グレープシード油、ヘーゼルナッツ油、ヒソップ油、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ油、ククイナッツ油、ラバンディン油、ラベンダー油、レモン油、リツェアクベバ油、マカデミアナッツ油、マロウ（ｍａｌｌｏｗ）油、マンゴー種子油、メドウフォームシード油、ミンク油、ナツメグ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラッフィー油、パーム油、パーム核油、桃仁油、ピーナッツ油、ケシの実油、カボチャ種子油、菜種油、米ぬか油、ローズマリー油、ベニバナ油、ビャクダン油、サザンカ（ｓａｓｑｕａｎａ）油、セイボリー油、シーバックソーン油、ゴマ油、シアバター、シリコーン油、大豆油、ヒマワリ油、ティーツリー油、アザミ油、ツバキ油、ベチバー油、クルミ油、および小麦胚種油が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な油の例として、ステアリン酸ブチル、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン３６０、ミリスチン酸イソプロピル、鉱物油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、および／またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５６８】
製剤者の判断に従って、ココアバター、坐剤用ワックス、着色剤、コーティング剤、甘味剤、風味剤、および／または香料等の賦形剤が組成物中に存在してよい。
送達
本開示は、治療、製薬、診断、または画像化の目的で、薬剤送達の科学研究において想定される進歩を考慮に入れた任意の経路を用いて修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを送達することを包含している。送達は、「裸」または製剤化した状態で実施してよい。
「裸」の状態での送達
本発明の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、裸の状態で細胞に送達してよい。本明細書で使用する「裸の状態」という語句は、トランスフェクションを促進する薬剤がない状態で、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを送達することを指す。例えば、細胞に送達される修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、修飾をまったく含まなくてもよい。裸の状態の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、当技術分野で公知の投与経路または本明細書に記載の投与経路を用いて細胞に送達してよい。
製剤化された状態での送達
本発明の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、本明細書に記載の方法を用いて製剤化してよい。製剤は、修飾核酸分子または修飾および／もしくは非修飾のｍｍＲＮＡを含有してよい。製剤には、細胞透過剤、薬剤的に許容可能な担体、送達剤、生分解性または生体適合性のポリマー、溶媒、および徐放性送達デポ剤（ただしこれらに限定されない）をさらに含んでよい。製剤化された状態の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、当技術分野で公知の投与経路または本明細書に記載の投与経路を用いて細胞に送達してよい。
【０５６９】
また、当技術分野におけるいくつかの方法のいずれかを用いて、器官または組織に直接送達するように組成物を製剤化してもよい。これらの方法の例として、直接浸漬もしくは直接浴、カテーテル、ゲル、粉末、軟膏、クリーム、ローション、および／または液滴による送達、組成物を被覆または含浸させた布または生分解性材料等の基質の使用等が挙げられるが、これらに限定されない。
投与
本発明の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、治療上有効な結果をもたらす任意の経路で送達してよい。具体的な経路として、腸内、経胃腸、硬膜外、経口、経皮、硬膜外（硬膜上）、脳内（大脳に送達）、脳室内（脳室に送達）、皮膚上（皮膚に塗布）、皮内（皮膚自体に送達）、皮下（皮膚の下）、経鼻投与（鼻を通じて送達）、静脈内（静脈に送達）、動脈内（動脈に送達）、筋肉内（筋肉に送達）、心臓内（心臓に送達）、骨髄内注入（骨髄に送達）、髄腔内（脊柱管に送達）、腹腔内（腹膜に注入または注射）、膀胱腔内注入、硝子体内（眼を通じて送達）、陰茎海綿体注射（陰茎の底部に送達）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（表皮を通じて拡散させ全身に分配）、経粘膜（粘膜を通じて拡散）、ガス注入（吸飲）、舌下、唇下、浣腸、点眼（結膜に送達）、点耳が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、組成物が血液脳関門、血管関門、その他の上皮性関門を通過できる方法で組成物を投与してよい。本発明の修飾核酸またはｍｍＲＮＡの非限定的な投与経路例を以下に示す。
非経口投与および注射剤投与
非経口投与用の液体剤形として、薬剤的に許容可能なエマルション、マイクロエマルション、液剤、懸濁液、シロップ剤、および／またはエリキシル剤が挙げられるが、これらに限定されない。液体剤形は、活性成分に加えて、当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含んでもよい。この不活性希釈剤の例として、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタン脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物が挙げられる。経口組成物の場合、不活性希釈剤の他に、湿潤剤、乳化および懸濁剤、甘味剤、風味剤、および／または香料等のアジュバントを含んでいてもよい。非経口投与用の特定の実施形態では、組成物を、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）、アルコール、油、改質油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはこれらの組み合わせ等の可溶化剤と混合する。
【０５７０】
例えば水性または油性の滅菌注射懸濁液等の注射用調製物を、公知の技術に従って、適切な分散剤、湿潤剤、および／または懸濁剤を用いて製剤化してよい。滅菌注射用調製物は、毒性がなく非経口用として許容可能な希釈剤および／または溶媒中の、滅菌した注射用液剤、懸濁液、および／またはエマルションであってよい（例えば、１，３−ブタンジオール溶液）。許容可能なビヒクルおよび溶媒の中でも、特に、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張性塩化ナトリウム溶液を使用してよい。従来、溶媒または懸濁媒体として、滅菌不揮発性油が使われている。この目的で、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激性不揮発油を使用してよい。オレイン酸等の脂肪酸を注射剤の調製に使用してよい。
【０５７１】
例えば、細菌保持フィルターに通してろ過することにより、および／または使用前に滅菌水もしくは他の滅菌注射媒体に溶解もしくは分散させることのできる滅菌性固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことにより、注射製剤を滅菌することができる。
【０５７２】
活性成分の効果を長期化させる目的で、皮下注射または筋肉注射された活性成分の吸収を遅らせることが望まれることが多い。このことは、難水溶性の結晶性材料または非晶質材料の懸濁液を用いることによって達成できる。この場合、薬剤の吸収速度は薬剤の溶解速度に依存し、薬剤の溶解速度は、結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、油ビヒクル中に薬剤を溶解または懸濁させることにより、非経口投与剤形の吸収を遅らせることもできる。ポリラクチド−ポリグリコリド等の生分解性ポリマー中で薬剤のマイクロ封入マトリクスを形成することにより、注射用デポ剤形が製造される。薬剤とポリマーの比率、および使用する特定ポリマーの性質に応じて、薬剤の放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例として、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。注射用デポ製剤は、生体組織と適合するリポソームまたはマイクロエマルション中に薬剤を封入することにより調製される。
直腸内および膣内投与
直腸内投与または膣内投与用の組成物は、典型的には坐剤である。この坐剤は、周囲温度では固体であるが体温時は液体となり、よって腸腔または膣腔で融解して活性成分を放出する適切な非刺激性賦形剤（例えばココアバター、ポリエチレングリコール、坐剤用ワックス）と、組成物とを混合することにより調製できる。
経口投与
経口投与用の液体剤形として、薬剤的に許容可能なエマルション、マイクロエマルション、液剤、懸濁液、シロップ剤、および／またはエリキシル剤が挙げられるが、これらに限定されない。液体剤形は、活性成分に加えて、当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含んでもよい。この不活性希釈剤の例として、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタン脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物が挙げられる。経口組成物の場合、不活性希釈剤の他に、湿潤剤、乳化および懸濁剤、甘味剤、風味剤、および／または香料等のアジュバントを含んでいてもよい。非経口投与用のある特定の実施形態では、組成物を、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）、アルコール、油、改質油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはこれらの組み合わせ等の可溶化剤と混合する。
【０５７３】
経口投与用の固体剤形として、カプセル、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒が挙げられる。このような固体剤形では、活性成分と、不活性かつ薬剤的に許容可能な少なくとも１つの賦形剤とを混合する。このような賦形剤の例として、クエン酸ナトリウムもしくは二リン酸カルシウムおよび／または充填材もしくは増量剤（例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ケイ酸）、結合剤（例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、アカシア）、保湿剤（例えばグリセロール）、崩壊剤（例えばカンテン、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のケイ酸塩、炭酸ナトリウム）、溶解遅延剤（例えばパラフィン）、吸収促進剤（例えば四級アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えばセチルアルコール、グリセロールモノステアレート）、吸収剤（例えばカオリン、ベントナイト粘土）、滑沢剤（例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、およびこれらの混合物が挙げられる。カプセル、錠剤、丸剤の場合、剤形に緩衝剤を含めてよい。
局所または経皮投与
本明細書に記載の通り、本発明の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを含有する組成物は、局所投与用に製剤化してよい。皮膚は容易にアクセスできるので、理想的な送達標的部位であり得る。遺伝子発現が皮膚に制限され、非特異的毒性を回避できる可能性があるだけでなく、皮膚内の特定の層および細胞型にも遺伝子発現が制限される。
【０５７４】
送達する組成物の皮膚発現の部位は、核酸の送達経路によって異なる。修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを皮膚に送達する際に一般に考慮される経路は、次の３つである。（ｉ）局所適用（例えば局所／局部治療用）；（ｉｉ）皮内注射（例えば局所／局部治療用）；（ｉｉｉ）全身送達（例えば、皮膚領域と真皮外領域の両方に影響する皮膚疾患の治療用）。修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、当技術分野で公知のいくつか異なるアプローチで皮膚に送達することができる。大部分の局所送達アプローチはＤＮＡ送達に有効であることが示されており、このような局所送達アプローチの例として、非カチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体、カチオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体、粒子介在性（遺伝子銃）、穿刺介在性の遺伝子トランスフェクション、およびウイルス送達アプローチの局所適用が挙げられるが、これらに限定されない。核酸の送達後、数種類の皮膚細胞型（基底角化細胞、皮脂腺細胞、皮膚線維芽細胞、真皮マクロファージが含まれるが、これらに限定されない）で遺伝子産物が検出されている。
【０５７５】
一実施形態では、本発明は、本発明の方法を簡便かつ／または効果的に実行するための種々の包帯（例えば創傷包帯）または絆創膏（例えばガーゼ付き絆創膏）を提供する。典型的には、包帯または絆創膏は、使用者が対象に対して複数の処置を実施できるように、十分な量の医薬組成物および／または本明細書に記載の修飾核酸分子もしくはｍｍＲＮＡを含んでよい。
【０５７６】
一実施形態では、本発明は、複数回の注射で送達される修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡ組成物を提供する。
一実施形態では、局所および／または経皮投与の前に、組織の少なくとも１つの領域（例えば皮膚）に、透過性を高めることのできる装置および／または溶液を供してよい。一実施形態では、皮膚の透過性を高めるため、組織を剥離装置（ａｂｒａｓｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ）に供してよい（米国特許出願公開第２００８０２７５４６８号を参照。参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）。別の一実施形態では、組織を超音波強化装置に供してよい。超音波強化装置の例として、米国特許出願公開第２００４０２３６２６８号、ならびに米国特許第６，４９１，６５７号および第６，２３４，９９０号（参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載の装置が挙げられるが、これらに限定されない。組織の透過性を増強する方法は、米国特許出願公開第２００４０１７１９８０号および第２００４０２３６２６８号、ならびに米国特許第６，１９０，３１５号（参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０５７７】
一実施形態では、本明細書に記載の修飾ｍＲＮＡの製剤を送達する前に、装置を用いて組織の透過性を強化してよい。皮膚の透過性を測定するには、当技術分野で公知の方法および／または米国特許第６，１９０，３１５号（参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載の方法を使用してよい。非限定的な一例として、米国特許第６，１９０，３１５号（参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載の薬剤送達方法を用いて修飾ｍＲＮＡ製剤を送達してよい。
【０５７８】
別の非限定的一例では、透過性を強化できる装置に組織を供する前、最中、および／また後に、局所麻酔薬の共融混合物（ＥＭＬＡ）クリームで組織を処置してよい。Ｋａｔｚら（Ａｎｅｓｔｈ  Ａｎａｌｇ  （２００４）；  ９８：３７１−７６；参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）が示したところによれば、ＥＭＬＡクリームと低エネルギーを併用すると、低エネルギー超音波を用いた前処置から５分後という早い時期に表在性皮膚痛覚脱失の発生が見られた。
【０５７９】
一実施形態では、組織に透過性強化処置を実施する前、最中、および／または後に、組織に亢進剤（ｅｎｈａｎｃｅｒ）を適用してよい。亢進剤の例として、輸送亢進剤、物理的亢進剤、空洞化亢進剤が挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第６，１９０，３１５号（参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）に、亢進剤の非限定的な例が記載されている。
【０５８０】
一実施形態では、本明細書に記載の修飾ｍＲＮＡの製剤であって、免疫応答を起こす物質をさらに含有し得る製剤を送達する前に、装置を用いて組織の透過性を強化してよい。別の非限定的一例では、免疫応答を起こす物質を含有する製剤を、米国特許出願公開第２００４０１７１９８０号および第２００４０２３６２６８号（参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載の方法で送達してよい。
【０５８１】
組成物の局所および／または経皮投与用の剤形には、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤、および／またはパッチが含まれ得る。一般に、無菌条件下において、活性成分と、薬剤的に許容可能な賦形剤、および／または保存剤（必要な場合）、および／または緩衝剤（必要な場合）とを混合する。
【０５８２】
加えて、本発明は経皮パッチの使用を企図している。経皮パッチは、身体への化合物の送達を制御できるという追加の利点を有する場合が多い。このような剤形は、例えば化合物を適切な媒体に溶解および／または分配することにより調製できる。これに代替または追加して、速度制御膜を設け、かつ／または化合物をポリマーマトリクスおよび／もしくはゲル中に分配することにより、速度を制御してもよい。
【０５８３】
局所投与に適した製剤の例として、液体および／または半液体の調製物（例えばリニメント剤、ローション）、水中油および／または油中水エマルション（例えば、クリーム、軟膏、ペースト）、および／または溶液、および／または懸濁液が挙げられるが、これらに限定されない。局所投与可能な製剤は、例えば、約０．１％〜約１０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含んでよいが、活性成分の濃度は、溶媒中の活性成分の溶解限度と同じ高さの濃度であってもよい。局所投与用製剤は、本明細書に記載の追加成分の１つ以上をさらに含んでいてもよい。
デポ剤の投与
本明細書に記載の通り、いくつかの実施形態では、持続放出するように組成物をデポ剤の形で製剤化する。一般に、ある特定の器官または組織（「標的組織」）を投与の標的とする。
【０５８４】
本発明のいくつかの態様では、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを、標的組織の内部または至近位置に空間的に保持する。本明細書において、組成物を哺乳類対象の標的組織に提供する方法が提供される。この方法は、化合物、特に化合物の核酸成分が実質的に標的組織内に保持されるような条件下で、化合物と標的組織（１つ以上の標的細胞を含む組織）を接触させることにより行う。すなわち、組成物の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９％、または９９．９９％超が標的組織中に保持される。有利には、１つ以上の標的細胞に進入した組成物中に存在する核酸の量を測定することにより、保持率が決定される。例えば、投与後の一定期間、対象に投与した核酸の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９％、または９９．９９％超が細胞内に存在する。例えば、リボ核酸とトランスフェクション試薬を含有する水性組成物を用いて哺乳類対象に筋肉内注射し、筋細胞内に存在するリボ核酸の量を測定することにより組成物の保持率を決定する。
【０５８５】
本発明のいくつかの態様は、哺乳類対象の標的組織に組成物を提供する方法を指向しており、この方法は、組成物が標的組織（１つ以上の標的細胞を含む組織）内に実質的に保持される条件下で、組成物を標的組織に接触させることにより行う。この組成物は、関心のポリペプチドが少なくとも１つの標的細胞内で産生されるように、有効量の核酸分子またはｍｍＲＮＡを含有する。一般に組成物は、細胞透過剤および薬剤的に許容可能な担体を含有するが、「裸」の核酸（例えば、細胞透過剤等の薬剤を伴わない核酸）も企図されている。
【０５８６】
いくつかの状況では、組織内で細胞が産生するタンパク質の量が増加することが好ましい。好ましくは、このタンパク質産生量の増加は、標的組織内の細胞に空間的に制限される。したがって、哺乳類対象の組織内で関心のタンパク質産生を増加させる方法が提供される。修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを含有する組成物が提供され、この場合、所定体積の標的組織内に含まれる相当な割合の細胞内で関心のポリペプチドが産生されるように、組成物の単位量が決定されていることを特徴とする。
【０５８７】
いくつかの実施形態では、組成物は複数の異なる修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを含み、この修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡの１つ以上が関心のポリペプチドをコードする。組成物の細胞内送達を補助する目的で、随意に組成物に細胞透過剤を含有させてもよい。（一般的には、所定体積の標的組織に隣接する組織、または遠位に位置する組織では、関心のポリペプチドの有意な産生を誘発せずに）所定体積の標的組織内に含まれる相当な割合の細胞内で関心のポリペプチドを産生させるように、組成物の必要用量を決定する。この決定に続いて、決定した用量を哺乳類対象の組織に直接導入する。
【０５８８】
一実施形態では、本発明は、複数回の注射または分割用量の注射で送達される修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを提供する。
一実施形態では、小さな使い捨て型の薬剤リザーバー、パッチポンプ、または浸透圧ポンプを用いて、本発明を標的組織の近くに保持してよい。パッチポンプの非限定的な例として、ＢＤ（登録商標）（ニュージャージー州フランクリンレイクス）、Ｉｎｓｕｌｅｔ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（マサチューセッツ州ベッドフォード）、ＳｔｅａｄｙＭｅｄ
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（カリフォルニア州サンフランシスコ）、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ（ミネソタ州ミネアポリス）（例えばＭｉｎｉＭｅｄ）、ＵｎｉＬｉｆｅ（ペンシルベニア州ヨーク）、Ｖａｌｅｒｉｔａｓ（ニュージャージー州ブリッジウォーター）、ＳｐｒｉｎｇＬｅａｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（マサチューセッツ州ボストン）が製造および／または販売しているパッチポンプが挙げられる。浸透圧ポンプの非限定的な例として、ＤＵＲＥＣＴ（登録商標）（カリフォルニア州クパチーノ）が製造している浸透圧ポンプ（例えばＤＵＲＯＳ（登録商標）、ＡＬＺＥＴ（登録商標））が挙げられる。
肺内投与
頬側口腔を介する肺内投与に適した医薬組成物を調製し、包装し、かつ／または販売してよい。このような製剤は、活性成分を含む乾燥粉末を含んでよく、この乾燥粉末は、直径が約０．５ｎｍ〜約７ｎｍまたは約１ｎｍ〜約６ｎｍの範囲にある。このような組成物は、投与用に適切に乾燥粉末の形態にされる。投与するには、粉末を分配するために噴射剤流が向けられる乾燥粉末容器を備える装置を使用し、かつ／または、自己噴射する溶媒／粉末分配容器（例えば、密閉容器内の低沸点噴射剤に溶解および／または懸濁した活性成分を含む装置）を使用する。このような粉末は、粒子の少なくとも９８重量％が０．５ｎｍ超の直径を有し、粒子の少なくとも９５％の数が７ｍｎ未満の直径を有する粒子を含む。あるいは、粒子の少なくとも９５重量％が１ｎｍ超の直径を有し、粒子の少なくとも９０％の数が６ｍｎ未満の直径を有する粒子を含む。乾燥粉末組成物は、固体の微粉末希釈剤（例えば糖）を含んでよく、簡便には、単位用量形態で提供される。
【０５８９】
低沸点噴射剤は、一般に、大気圧時の沸点が６５°Ｆ未満の液体噴射剤を含む。一般に、噴射剤は組成物の５０％〜９９．９％（ｗ／ｗ）を構成してよく、活性成分は組成物の０．１％〜２０％（ｗ／ｗ）を構成してよい。噴射剤は、追加的な成分、例えば液体非イオン性および／または固体陰イオン性表面活性剤、および／または固体の希釈剤をさらに含んでいてもよい（これらの追加的成分の粒子サイズは、活性成分を含む粒子と同じ桁のサイズであってよい）。
【０５９０】
非限定的な一例として、本明細書に記載の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを、米国特許第８，２５７，６８５号（参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載の方法で肺内投与用に製剤化してよい。
【０５９１】
肺内送達用に製剤化された医薬組成物は、活性成分を溶液および／または懸濁液の液滴の形で提供してよい。このような製剤は、活性成分を含む水性および／または希アルコール性の溶液および／または懸濁液として、かつ随意に滅菌状態にして、調製し、包装し、かつ／または販売してよく、簡便に、任意の噴霧装置および／または微粒化装置を用いて投与してよい。このような製剤は、１つ以上の追加的成分をさらに含んでよい。この追加的成分の例として、風味剤（例えばサッカリンナトリウム）、揮発油、緩衝剤、表面活性剤、および／または保存剤（例えばヒドロキシ安息香酸メチル）が挙げられるが、これらに限定されない。この投与経路で提供する液滴の平均直径は、約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲にあってよい。
鼻腔内、経鼻、および口腔投与
肺内投与に有用な本明細書に記載の製剤は、医薬組成物の鼻腔内送達に有用である。鼻腔内投与に適した別の製剤は、活性成分を含む粗粉末であり、この粗粉末の平均粒径は約０．２μｍ〜５００μｍである。このような製剤は、嗅ぎ薬を摂取する方法で投与する。すなわち、粉末容器を鼻に近づけ、鼻腔を通じて急速に吸入することにより投与される。
【０５９２】
経鼻投与に適した製剤は、例えば、わずか０．１％（ｗ／ｗ）から１００％（ｗ／ｗ）もの活性成分を含んでよく、本明細書に記載の追加的成分を１つ以上含んでよい。医薬組成物を口腔投与に適した製剤の形で調製し、包装し、かつ／または販売してよい。このような製剤は、例えば、従来の方法で製造された錠剤および／またはトローチ剤の形であってよく、例えば０．１％〜２０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含んでよく、残りの成分は、口で溶解可能および／または分解可能な組成物を含み、さらに随意に、本明細書に記載の追加的成分の１つ以上を含んでいてもよい。あるいは、口腔投与に適した製剤は、活性成分を含む粉末、ならびに／またはエアロゾル化および／もしくは微粒化した溶液および／もしくは懸濁液を含んでよい。このような粉末化、エアロゾル化、および／またはエアロゾル化した製剤は、散布時点で約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍ範囲の平均の粒径および／または液滴直径を有してよく、本明細書に記載の追加的成分の１つ以上をさらに含んでよい。眼内投与
医薬組成物を眼内投与に適した製剤の形で調製し、包装し、かつ／または販売してよい。このような製剤は、例えば点眼薬の形態であってよく、例えば、水性または油性の液体賦形剤中、活性成分が０．１／１．０％（ｗ／ｗ）溶液および／または懸濁液である点眼薬であってよい。このような点眼薬は、緩衝剤、塩類、および／または本明細書に記載の他の追加的成分の１つ以上をさらに含んでよい。他の有用な眼内投与製剤の例として、微結晶形態および／またはリポソーム調製物の形で活性成分を含む製剤が挙げられる。点耳薬および／または点眼薬は、本発明の範囲内にあることが企図されている。眼および／または周囲組織に送達する医薬組成物を格納するための多層薄膜装置を作製してよい。
ペイロード投与：検出可能剤および治療剤
本明細書に記載の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、生体標的に物質（「ペイロード」）を送達することが望まれる多数の異なるシナリオで使用できる。例えば、標的を検出するための検出可能物質の送達や、治療薬の送達に使用できる。検出方法の例として、インビトロ、インビボ両方の画像化、例えば、免疫組織化学検査、生物発光画像法（ＢＬＩ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、陽電子放射型断層撮影法（ＰＥＴ）、電子顕微鏡法、Ｘ線コンピュータ断層撮影、ラマンイメージング、光干渉断層法、吸収画像法、赤外線画像法、蛍光反射画像法、蛍光顕微鏡法、蛍光分子断層画像法、磁気共鳴画像法、Ｘ線画像法、超音波画像法、光音響画像法、実験室アッセイ、または、標識／染色／画像化が必要とされる任意の状況が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５９３】
修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡは、リンカーとペイロードの両方を任意の有用な向きで含むように設計することができる。例えば、２端を有するリンカーを用いて、一方の端をペイロードに結合し、他方の端を核酸塩基（例えば、デアザアデノシンもしくはデアザグアノシンのＣ−７もしくはＣ−８位置、またはシトシンもしくはウラシルのＮ−３もしくはＣ−５位置）に結合する。本発明のポリヌクレオチドは、１を超える数のペイロード（例えば標識と転写阻害剤）の他、切断可能リンカーを含むこともできる。
【０５９４】
一実施形態では、修飾ヌクレオチドは修飾７−デアザ−アデノシン三リン酸塩であり、切断可能リンカーの一方の端は７−デアザ−アデニンのＣ７位置に結合し、リンカーの他方の端は阻害剤（例えば、シチジン上の核酸塩基のＣ５位置）に結合し、標識（例えばＣｙ５）はリンカーの中心に結合する（例えば、米国特許第７，９９４，３０４号（参照によりこの文献は本明細書に組み込まれる）の図５にあるＡ＊ｐＣｐ  Ｃ５  Ｐａｒｇ  Ｃａｐｌｅｓｓの化合物１および第９欄と第１０欄を参照）。上記の修飾７−デアザ−アデノシン三リン酸塩がコード領域に取り込まれた時点で、得られるポリヌクレオチドは、標識と阻害剤（例えばポリメラーゼ阻害剤）に結合した切断可能リンカーを有している。（例えば、切断可能ジスルフィド部分を有するリンカーを還元するための還元条件により）リンカーが切断すると、標識と阻害剤が放出される。さらなるリンカーおよびペイロード（例えば治療剤、検出可能標識、細胞透過ペイロード）は、本明細書に記載されている。
【０５９５】
以下のスキーム１２に代表的な修飾ヌクレオチドを示す。ここでは、核酸塩基であるアデニンが、７−デアザアデニンのＣ−７炭素位置でリンカーと結合している。加えて、スキーム１２は、リンカーおよび、ｍＲＮＡの３’末端に取り込まれたペイロード（例えば検出可能剤）を有する修飾ヌクレオチドを示している。ジスルフィドの切断と、プロパルギルエステルに対するチオール基の１，２−付加反応により、検出可能剤が放出される。残りの構造（例えばスキーム１２でｐＡｐＣ５Ｐａｒｇと表示）は阻害剤である。修飾ヌクレオチドの構造の理論的根拠は、係留された阻害剤が、第２の塩基を取り込むポリメラーゼの能力を立体的に妨げることである。したがって重要なことは、係留が、この機能に影響するのに十分に長く、かつ阻害剤が、２番目以降のヌクレオチドがポリヌクレオチド鎖へと成長するのを阻害または禁止する化学立体定位にあることである。
スキーム１２
【０５９６】
【化８２】
2019059793.tif 000114
【０５９７】
【化８３】
2019059793.tif 000115
【０５９８】
例えば、本明細書に記載の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを用いて、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）のリプログラミングを行うことができ、この場合、クラスター内の総細胞と比較して、トランスフェクトされた細胞を直接的に追跡できる。別の例では、リンカーを介して薬剤を修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡに結合でき、蛍光標識可能な薬剤を用いて、インビボ（例えば細胞内）で薬剤を追跡することができる。他の例として、細胞への可逆的な薬剤送達に修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを使用することが挙げられるが、これに限定されない。
【０５９９】
本明細書に記載の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを用いて、特定の小器官に対するペイロード（例えば、検出可能剤または治療剤）の細胞内標的化を行うことができる。代表的な細胞内標的の例として、先進のｍＲＮＡ処理のための核局在化、阻害剤を含有するｍＲＮＡに連結した核局在配列（ＮＬＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６００】
加えて、本明細書に記載の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを用いて、（例えば生きた動物の）細胞または組織に治療剤を送達することができる。例えば、癌細胞を死滅させるため、本明細書に記載の修飾核酸またはｍｍＲＮＡを用いて、高極性の化学療法剤を送達することができる。リンカーを通じて治療剤に結合した修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡが膜透過を促進できるので、治療剤が細胞内に移動して、細胞内標的に到達することができる。
【０６０１】
一例では、リボース環の２’位置および／または修飾核酸分子もしくはｍｍＲＮＡの３’位置および／または５’位置でリンカーが結合する（例えば国際公開第２０１２０３０６８３号を参照。参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）。リンカーは、本明細書に開示される任意のリンカー、当技術分野で公知の任意のリンカー、および／または国際公開第２０１２０３０６８３号（参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている任意のリンカーであってよい。
【０６０２】
別の一例では、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを、切断可能リンカー通じてウイルス阻害性ペプチド（ＶＩＰ）に結合することができる。この切断可能リンカーにより、ＶＩＰと色素を細胞内に放出することができる。別の一例では、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを、いくつかの細菌毒素（例えばコレラ毒素、ジフテリア毒素、百日咳毒素）の作用に関与するＡＤＰ−リボシレートにリンカーを介して結合させることができる。これらの毒素タンパク質は、ヒト細胞内の標的タンパク質を修飾するＡＤＰリボシル基転移酵素である。例えばコレラ毒素ＡＤＰリボシレートＧタンパク質は、小腸の内面から大量の体液分泌を起こすことによりヒト細胞を修飾し、結果として生命に関わる下痢を起こす。
【０６０３】
いくつかの実施形態では、ペイロードは、細胞毒、放射性イオン、化学療法剤、その他の治療剤等の治療剤であってよい。細胞毒または細胞毒性薬には、細胞に有害であり得る任意の薬剤が含まれる。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１-デヒドロ
テストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、マイタンシノイド、例えばマイタンシノール（米国特許第５，２０８，０２０号を参照。この文献の全体が本明細書に組み込まれる）、ラシェルマイシン（ＣＣ−１０６５、米国特許第５，４７５，０９２号、第５，５８５，４９９号、および第５，８４６，５４５号を参照。参照により、これらの全文献が本明細書に組み込まれる）、およびこれらの類似体または同族体が挙げられるが、これらに限定されない。放射性イオンの例として、ヨウ素（例えばヨウ素１２５、ヨウ素１３１）、ストロンチウム８９、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、ホスフェート、コバルト、イットリウム９０、サマリウム１５３、プラセオジムが挙げられるが、これらに限定されない。その他の治療剤の例として、代謝拮抗剤（例えばメトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオテパクロラムブシル、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン系薬剤（例えばダウノルビシン（以前のダウノマイシン）、ドキソルビシン）、抗生剤（例えばダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ））、および有糸分裂阻害剤（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、マイタンシノイド）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６０４】
いくつかの実施形態では、ペイロードは検出可能剤であってよい。検出可能剤とは、例えば、種々の有機低分子、無機化合物、ナノ粒子、酵素もしくは酵素基質、蛍光物質、発光物質（例えばルミノール）、生物発光物質（例えばルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン）、化学発光物質、放射性物質（例えば１８Ｆ、６７Ｇａ、８１ｍＫｒ、８２Ｒｂ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１３３Ｘｅ、２０１Ｔｌ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ、９９ｍＴｃ（例えば過テクネチウム酸として（テクネチウム酸（ＶＩＩ）、ＴｃＯ４））、造影剤（例えば金（例えば金ナノ粒子）、ガドリニウム（例えばキレートＧｄ）、酸化鉄（例えば超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、単結晶酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＯＮ）、極小超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ））、マンガンキレート剤（例えばＭｎ−ＤＰＤＰ）、硫酸バリウム、ヨウ化造影剤（イオヘキソール）、マイクロバブル、パーフルオロカーボン）である。上記の光学的に検出可能な標識の例として、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体（例えばアクリジンおよびアクリジンイソチオシアネート）；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート；Ｎ−（４−アニリノ−ｌ−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアントイエロー；クマリンおよび誘導体（例えばクマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１））；シアニン色素；シアノシン；４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５”−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸塩；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］−ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアン酸（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体（例えば、エオシンおよびエオシンイソチオシアネート）；エリスロシンおよび誘導体（例えばエリスロシンＢおよびエリスロシンイソチオシアネート）；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体（例えば５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、Ｘ−ローダミン−５−（および−６）−イソチオシアネート（ＱＦＩＴＣまたはＸＲＩＴＣ）、フルオレサミン）；２−［２−［３−［［１，３−ジヒドロ−１，１−ジメチル−３−（３−スルホプロピル）−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２−イリデン］エチリデン］−２−［４−（エトキシカルボニル）−１−ピペラジニル］−１−シクロペンテン−１−イル］エテニル］−１，１−ジメチル−３−（３−スルホルプロピル）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウムヒドロキシド、内塩、ｎ，ｎ−ジエチルエタンアミン（１：１）を有する化合物（ＩＲ１４４）；５−クロロ−２−［２−［３−［（５−クロロ−３−エチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾール−イリデン）エチリデン］−２−（ジフェニルアミノ）−１−シクロペンテン−１−イル］エテニル］−３−エチルベンゾチアゾリウムペルクロレート（ＩＲ１４０）；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラロザニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体（例えばピレン、ピレンブチレート、スクシンイミジル１−ピレン）；酪酸量子ドット；リアクティブレッド（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（商標）ブリリアント・レッド３Ｂ−Ａ）；ローダミンおよび誘導体（例えば６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢ、塩化スルホニルローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テキサスレッド）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ））；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；シアニン−３（Ｃｙ３）；シアニン−５（Ｃｙ５）；シアニン−５．５（Ｃｙ５．５）、シアニン−７（Ｃｙ７）；ＩＲＤ７００；ＩＲＤ８００；Ａｌｅｘａ６４７；Ｌａ  Ｊｏｌｔａ  Ｂｌｕｅ；フタロシアニン；ならびにナフタロシアニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６０５】
いくつかの実施形態では、検出可能剤は、活性化時に検出可能となる検出不能前駆体であってよい（例えば蛍光発生テトラジン−フルオロフォア構築物（例えばテトラジン−ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、テトラジン−オレゴングリーン４８８、テトラジン−ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−Ｘ）または酵素で活性化可能な蛍光発生薬剤（例えばＰＲＯＳＥＮＳＥ（登録商標）（ヴィスエンメディカル）））。酵素標識される組成物を使用できるインビトロのアッセイの例として、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、およびウエスタンブロット解析法が挙げられるが、これらに限定されない。
併用
核酸分子またはｍｍＲＮＡは、１つ以上の他の治療薬、予防薬、診断薬、または造影剤と組み合わせて使用してよい。「〜と組み合わせて」という表現は、上記薬剤を同時に投与しなければならず、かつ／または、一緒に送達するように製剤化されなければならないことを意図していないが、このような送達方法は本開示の範囲内にある。１つ以上の他の所望される治療剤または医療手技と同時またはその前後に、組成物を投与してよい。一般に、各薬剤は、当該薬剤に対して決定される用量および／またはタイムスケジュールに基づいて投与される。いくつかの実施形態では、本開示は、医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物、または画像化用組成物を、その生物学的利用能を改善でき、その代謝作用を低下および／または改変でき、その排出を阻害でき、かつ／またはその体内分布を改変できる薬剤と組み合わせて送達することを包含している。非限定的な一例として、核酸分子またはｍｍＲＮＡを、癌治療または過剰増殖細胞の制御のための医薬品と組み合わせて使用してよい。米国特許第７，９６４，５７１号（参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている固体原発腫瘍または転移腫瘍の併用療法では、インターロイキン−１２をコードするＤＮＡプラスミドを含む医薬組成物をリポポリマーと共に使用し、さらに少なくとも１つの抗癌剤または化学療法剤を投与する。さらに、抗増殖性分子をコードする本発明の核酸分子またはｍｍＲＮＡは、リポポリマーを有する医薬組成物中に存在してよく（例えば、抗増殖性分子をコードするＤＮＡプラスミドおよびリポポリマーを含む医薬組成物をクレームしている米国特許出願公開第２０１１０２１８２３１号を参照。参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）、この組成物を、少なくとも１つの化学療法剤または抗癌剤と共に投与してよい。
細胞透過性ペイロード
いくつかの実施形態では、例えばＲＮＡ、ｍＲＮＡ等の核酸に取り込まれる修飾ヌクレオチドおよび修飾核酸分子は、細胞透過性部分であり得るペイロードや、組成物の細胞内送達を亢進する薬剤を含むこともできる。例えば、組成物に含めてよいものの例として、細胞内空間への送達を促進する細胞透過性ペプチド配列、例えばＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、トランスポータン、またはｈＣＴ由来の細胞透過性ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。例えばＣａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ３（３）：３１０−８；  Ｌａｎｇｅｌ，  Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ＦＬ  ２００２）；  Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．
１１（２８）：３５９７−６１１；  Ｄｅｓｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ６２（１６）：１８３９−４９を参照（参照により、これらの全文献は本明細書に組み込まれる）。細胞内空間への組成物の送達を亢進する細胞透過性剤（例えばリポソーム）を含むように、組成物を製剤化することもできる。
生物標的
例えばＲＮＡ、ｍＲＮＡ等の核酸に取り込まれる本明細書に記載の修飾ヌクレオチドおよび修飾核酸分子を用いて、特定のリガンドが存在するか特定のリガンドを生成可能な任意の生物標的にペイロードを送達することができる。リガンドは、共有結合または非共有結合により生物標的と結合できる。
【０６０６】
生物標的の例として、例えば抗体、核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ等）、タンパク質、酵素等のバイオポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の例として、酵素、受容体、イオンチャンネルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、標的は、組織型または細胞型に特異的なマーカーであってよく、例えば、選択された組織型または細胞型の上に特異的に発現するタンパク質であってよい。いくつかの実施形態では、標的は受容体であってよい。受容体の例として、原形質膜受容体および核内受容体が挙げられるが、これらに限定されない。さらに具体的な例として、Ｇタンパク質共役受容体、細胞孔タンパク質、輸送タンパク質、表面発現抗体、ＨＬＡタンパク質、ＭＨＣタンパク質、増殖因子受容体が挙げられるが、これらに限定されない。
投薬
本発明は、本発明の修飾ｍＲＮＡおよびそのコード化タンパク質または複合体を、これを必要とする対象に投与することを含んでなる方法を提供する。核酸、タンパク質、もしくは複合体、またはその医薬組成物、画像化用組成物、診断用組成物、もしくは予防用組成物は、疾患、障害、および／または状態（例えば作業記憶欠損に関連する疾患、障害、および／または状態）を予防、治療、診断、または画像化する上で効果的な、任意の量および投与経路を用いて対象に投与してよい。正確な必要量は、対象の種、年齢、全般的状態、疾患の重症度、個々の組成物、その投与様式、その活性様式等に応じて、対象ごとに異なる。本発明の組成物は、投与を簡易化し用量を均一にする目的で、通常は単位投与剤形で製剤化される。しかし、本発明の組成物の１日の総使用量は、健全な医療判断の範囲内で主治医が決定することが理解されるであろう。ある特定の患者に対する具体的な治療有効投与量、予防有効投与量、または適切な画像化投与量のレベルは、様々な要因によって決まる。こうした様々な要因の例として、治療対象の障害、および障害の重症度；使用する特定の化合物の活性；使用する特定の組成物；患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別、および食事；使用する特定の化合物の投与時間、投与経路、および排出速度；治療期間；使用する特定の化合物と併用または同時使用する薬物；ならびに、医療分野でよく知られている同類の要因が挙げられる。
【０６０７】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、所望される治療効果、診断効果、予防効果、または画像化効果を得る目的で、１日に対象の体重１ｋｇあたり約０．０００１〜約１００ｍｇ、約０．００１〜約０．０５ｍｇ、約０．００５〜約０．０５ｍｇ、約０．００１〜約０．００５ｍｇ、約０．０５〜約０．５ｍｇ、約０．０１〜約５０ｍｇ、約０．１〜約４０ｍｇ、約０．５〜約３０ｍｇ、約０．０１〜約１０ｍｇ、約０．１〜約１０ｍｇ、または約１〜約２５ｍｇを送達するのに十分なレベルの投与量で、１日１回以上投与してよい。所望される投与量を、１日３回、１日２回、１日１回、２日に１回、３日に１回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回送達してよい。ある特定の実施形態では、所望される投与量を、多回投与（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、またはそれ以上の回数の投与）を用いて送達してよい。
【０６０８】
本発明によれば、ｍｍＲＮＡを分割用量投与計画で投与した場合に、哺乳類対象において比較的高いレベルのタンパク質が産生されることが発見されている。本明細書で使用する「分割用量」という語は、単回単位用量または総１日用量を２回以上の用量に分割することを指す（例えば、単回単位用量を２回以上の投与に分割する）。本明細書で使用する「単回単位用量」という語は、１用量／１回／単一経路／単一接点（すなわち単一の投与事象）において投与される治療剤の用量を指す。本明細書で使用する「総１日用量」という語は、２４時間の期間に投与または処方される量を指す。総１日用量を単回単位用量として投与してよい。一実施形態では、本発明のｍｍＲＮＡを分割用量で対象に投与する。ｍｍＲＮＡは、緩衝剤のみで製剤化してもよく、本明細書に記載の製剤形態で製剤化してもよい。
剤形
本明細書に記載の医薬組成物は、本明細書に記載の剤形に製剤化してよい。例えば、局所投与、鼻腔内投与、気管支内投与、注射投与（例えば静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、心臓内、腹腔内、皮下投与）用として製剤化してよい。
液体剤形
非経口投与用の液体剤形として、薬剤的に許容可能なエマルション、マイクロエマルション、液剤、懸濁液、シロップ剤、および／またはエリキシル剤が挙げられるが、これらに限定されない。液体剤形は、活性成分に加えて、当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含んでもよい。こうした不活性希釈剤の例として、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタン脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。非経口投与用のある特定の実施形態では、組成物を、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）、アルコール、油、改質油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはこれらの組み合わせ等の可溶化剤と混合してよい。
注射剤
例えば水性または油性の滅菌注射懸濁液等の注射用調製物を、公知の技術に従って製剤化してよく、この注射用調製物には、適切な分散剤、湿潤剤、および／または懸濁剤が含まれていてよい。滅菌注射用調製物は、毒性がなく非経口用として許容可能な希釈剤および／または溶媒中の、滅菌した注射用液剤、懸濁液、および／またはエマルションであってよい（例えば、１，３−ブタンジオール溶液）。許容可能なビヒクルおよび溶媒の中でも、特に、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張性塩化ナトリウム溶液（ただしこれらに限定されない）を使用してよい。従来、溶媒または懸濁媒体として、滅菌不揮発性油が使われている。この目的で、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激性不揮発油を使用してよい。オレイン酸等の脂肪酸を注射剤の調製に使用してよい。
【０６０９】
例えば、細菌保持フィルターに通してろ過することにより、および／または使用前に滅菌水もしくは他の滅菌注射媒体に溶解もしくは分散させることのできる滅菌性固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことにより、注射製剤を滅菌することができる。
【０６１０】
活性成分の効果を長期化させる目的で、皮下注射または筋肉注射された活性成分の吸収を遅らせることが望まれる場合がある。このことは、難水溶性の結晶性材料または非晶質材料の懸濁液を用いることによって達成できる。この場合、修飾ｍＲＮＡの吸収速度は薬剤の溶解速度に依存し、薬剤の溶解速度は、結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、油ビヒクル中に修飾ｍＲＮＡを溶解または懸濁させることにより、非経口投与される修飾ｍＲＮＡの吸収を遅らせることもできる。ポリラクチド−ポリグリコリド等の生分解性ポリマー中で修飾ｍＲＮＡのマイクロ封入マトリクスを形成することにより、注射用デポ剤形が製造される。修飾ｍＲＮＡとポリマーの比率、および使用する特定ポリマーの性質に応じて、修飾ｍＲＮＡの放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例として、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられるが、これらに限定されない。注射用デポ製剤は、生体組織と適合するリポソームまたはマイクロエマルション中に修飾ｍＲＮＡを封入することにより調製してよい。
肺投与剤
肺内投与に有用な本明細書に記載の製剤は、医薬組成物の鼻腔内送達にも使用してよい。鼻腔内投与に適した別の製剤は、活性成分を含む粗粉末であってよく、この粗粉末の平均粒径は約０．２μｍ〜５００μｍである。このような製剤は、嗅ぎ薬を摂取する方法で投与してよい。すなわち、粉末容器を鼻に近づけ、鼻腔を通じて急速に吸入することにより投与してよい。
【０６１１】
経鼻投与に適した製剤は、例えば、わずか０．１％（ｗ／ｗ）から１００％（ｗ／ｗ）もの活性成分を含んでよく、本明細書に記載の追加的成分を１つ以上含んでよい。医薬組成物を口腔投与に適した製剤の形で調製し、包装し、かつ／または販売してよい。このような製剤は、例えば、従来の方法で製造された錠剤および／またはトローチ剤の形であってよく、例えば０．１％〜２０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含有してよく、残りの成分は、口で溶解可能および／または分解可能な組成物を含んでよく、さらに随意に、本明細書に記載の追加的成分の１つ以上を含んでいてもよい。あるいは、口腔投与に適した製剤は、活性成分を含む粉末、ならびに／またはエアロゾル化および／もしくは微粒化した溶液および／もしくは懸濁液を含んでよい。このような粉末化、エアロゾル化、および／またはエアロゾル化した製剤は、散布時点で約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍ範囲の平均の粒径および／または液滴直径を有してよく、本明細書に記載の追加的成分の１つ以上をさらに含んでよい。
【０６１２】
医薬品の製剤化および／または製造の一般的な考慮事項は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２１ｓｔ  ｅｄ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  ２００５（参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。コーティングまたはシェル
錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤という固体剤形は、コーティングおよびシェル（例えば腸溶コーティング、その他、医薬製剤分野で周知のコーティング）を用いて調製してよい。このような剤形は、随意に乳白剤を含んでもよく、活性成分だけを放出する組成にすることができ、優先的には、腸管の特定部位で、かつ随意に徐放的に、活性成分だけを放出する組成にすることができる。使用可能な包埋組成物の例として、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。ラクトース、乳糖や高分子ポリエチレングリコール等の賦形剤を使用して、類似タイプの固体組成物を軟ゼラチンカプセルおよび硬ゼラチンカプセルの充填材として用いてよい。
医薬組成物の特性
本明細書に記載の医薬組成物は、下記の１つ以上の特性で特徴付けることができる。
生物学的利用能
修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡは、本明細書に記載の送達剤を用いて組成物に製剤化した場合、本明細書に記載の送達剤がない組成物と比べて、生物学的利用能の上昇を示し得る。本明細書で使用する「生物学的利用能」という用語は、哺乳動物に投与された所定用量の修飾核酸分子の全身利用度を指す。生物学的利用能の評価は、曲線下面積（ＡＵＣ）を測定するか、哺乳動物に化合物を投与した後に形態が変化していない化合物の最大血清濃度または最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）を測定することにより行うことができる。ＡＵＣとは、横軸（Ｘ軸）に時間を示し縦軸（Ｙ軸）に化合物の血清濃度または血漿濃度を示したグラフの、曲線下の面積を測定するものである。一般に、特定の化合物のＡＵＣは、当業者に対して公知の方法を用いて計算でき、これらの方法はＧ．  Ｓ．  Ｂａｎｋｅｒ，  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ｖ．  ７２，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｉｎｃ．，  １９９６（参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０６１３】
Ｃｍａｘ値とは、哺乳動物に化合物を投与した後、哺乳動物の血清中または血漿中で達成する化合物の最大濃度である。当業者に公知の方法を用いて、特定の化合物のＣｍａｘを測定することができる。本明細書で使用する「生物学的利用能の上昇」または「薬物動態の改善」という語句は、本明細書に記載の送達剤と同時投与された第１の修飾核酸分子の全身アベイラビリティをＡＵＣ、Ｃｍａｘ、またはＣｍｉｎで測定した値が、このような同時投与を行わない場合よりも高いことを意味する。いくつかの実施形態では、修飾核酸分子の生物学的利用能は、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％の上昇を示し得る。
治療濃度域
本発明の修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡは、本明細書に記載の送達剤と共に組成物に製剤化された場合、本明細書に記載の送達剤がない修飾核酸分子組成物を投与後の治療濃度域と比べて、修飾核酸分子組成物の投与後の治療濃度域の拡大を示し得る。本明細書で使用する「治療濃度域」という用語は、高い確率で治療効果を誘発する作用部位における、血漿濃度範囲または治療的活性物質のレベルの範囲を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の送達剤と同時投与した場合の修飾核酸分子の治療濃度域は、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％上昇し得る。
分布容積
本発明の修飾核酸分子は、本明細書に記載の送達剤と共に組成物に製剤化された場合、本明細書に記載の送達剤がない修飾核酸分子組成物と比べて、分布容積（Ｖｄｉｓｔ）の改善（例えば減少または標的化）を示し得る。分布容積（Ｖｄｉｓｔ）とは、体内の薬物量を、血中または血漿中の薬物濃度と関連付けたものである。本明細書で使用する「分布容積」という用語は、体内の薬物濃度が血中濃度または血漿中濃度と同一であると仮定した場合に、体内薬物総量を含有するのに必要な液量を指す。すなわち、Ｖｄｉｓｔは、体内薬物量を薬物の血中または血漿中濃度で割った値に等しい。例えば、用量１０ｍｇで血漿中濃度が１０ｍｇ／Ｌの場合、分布容積は１リットルとなる。分布容積は、血管外組織にどの程度薬物が存在するかを表す。分布容積が大量である場合、化合物が血漿タンパク結合よりも組織成分と結合する傾向があることを表す。臨床環境では、Ｖｄｉｓｔを使用することにより、定常状態の濃度を達成するための負荷投与量を決定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の送達剤と同時投与した場合の修飾核酸分子の分布容積は、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％低下し得る。
生物学的効果
一実施形態では、動物におけるタンパク質発現を分析することにより、当該動物に送達した修飾ｍＲＮＡの生物学的効果を分類してよい。本発明の修飾ｍＲＮＡを投与した哺乳動物から生体試料を回収し、この試料を分析することにより、タンパク質発現を測定することができる。一実施形態では、哺乳動物に投与した修飾ｍＲＮＡでコードされる発現タンパク質が少なくとも５０ｐｇ／ｍｌであることが好適であり得る。例えば、哺乳動物に送達された修飾ｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現が５０〜２００ｐｇ／ｍｌである場合、当該哺乳動物における治療有効量のタンパク質とみなすことができる。
マススペクトロメトリーによる修飾核酸の検出
マススペクトロメトリー（ＭＳ）（質量分析法）とは、イオンに変換した後の分子に関する構造情報および分子質量／濃度情報を提供できる分析手法である。分子が最初にイオン化されて正または負の電荷を得た後、質量分析器内を通過して、各々の質量電荷（ｍ／ｚ）比に応じて様々な分析器領域に到達する。
【０６１４】
マススペクトロメトリーを実施するには質量分析計を用いる。この質量分析計は、分画された試料をイオン化し、その後の分析用に荷電分子を生成するためのイオン源を備える。例えば、試料をイオン化する方法として、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、光イオン化、電子衝撃イオン化、高速原子衝撃（ＦＡＢ）／液体二次イオン化（ＬＳＩＭＳ）、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電界イオン化、電界脱離、サーモスプレー／プラズマスプレーイオン化、およびパーティクルビームイオン化が挙げられる。当業者であれば、測定対象の分析物、試料の種類、検出器の種類、正モードか負モードかの選択等に基づいてイオン化方法の選択を決定できることを理解するであろう。
【０６１５】
試料をイオン化した後、それにより生成された正または負の電荷を持つイオンを分析することにより、質量電荷比（すなわちｍ／ｚ）を決定できる。質量電荷比を測定するのに適した分析計の例として、四重極型分析計、イオントラップ型分析計、および飛行時間型分析計が挙げられる。いくつかのモードを用いてイオンを検出できる。例えば、選択されたイオンを検出でき（すなわち、選択的イオンモニタリングモード（ＳＩＭ）を使用）、あるいは、スキャニングモードを用いて、例えば多重反応モニタリング（ＭＲＭ）または選択反応モニタリング（ＳＲＭ）を用いてイオンを検出することもできる。
【０６１６】
タンパク質を検証する方法として、ペプチド標準の安定同位体標識希釈を連結した液体クロマトグラフィー多重反応モニタリング（ＬＣ−ＭＳ／ＭＲＭ）が効果的な方法であることが実証されている（例えばＫｅｓｈｉｓｈｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００９  ８：  ２３３９−２３４９；  Ｋｕｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００９  ５５：１１０８−１１１７；  Ｌｏｐｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２０１０  ５６：２８１−２９０を参照。参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）。バイオマーカー発見試験で頻繁に使われる非標的化マススペクトロメトリーと異なり、標的化ＭＳ法は、計測器の全分析能力を複合混合物中の選択された数十〜数百個のペプチドに集中させる、ペプチド配列をベースにしたＭＳモードである。検出および断片化の対象を関心のタンパク質に由来するペプチドに限定することにより、発見モードＭＳ法と比べて、感度と再現性が劇的に改善される。マススペクトロメトリーに基づくこの多重反応モニタリング（ＭＲＭ）法を用いたタンパク質定量化は、臨床試料の迅速、かつ標的化された多重のタンパク質発現プロファイリングを通じて、バイオマーカーの発見および定量化に劇的な影響を及ぼすことができる。
【０６１７】
一実施形態では、本発明の少なくとも１つの修飾ｍＲＮＡでコードされた少なくとも１つのタンパク質を含有し得る生体試料を、ＭＲＭ−ＭＳの方法を用いて分析してよい。生体試料の定量化のさらなる例として、内部標準としての同位体標識ペプチドまたはタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６１８】
本発明によれば、対象から取得した生体試料に対して酵素消化を行ってよい。本明細書で使用する「消化」という用語は、より短いペプチドに分断することを意味する。本明細書で使用する「試料を処理してタンパク質を消化する」という語句は、試料中のタンパク質を分解するように試料を操作することを意味する。このような酵素の例として、トリプシン、エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ、キモトリプシンが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、本発明の少なくとも１つの修飾ｍＲＮＡでコードされた少なくとも１つのタンパク質を含有し得る生体試料を、酵素を用いて消化してよい。
【０６１９】
一実施形態では、本発明の修飾ｍＲＮＡでコードされたタンパク質を含有し得る生体試料のタンパク質を、エレクトロスプレーイオン化法を用いて分析してよい。エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）マススペクトロメトリー（ＥＳＩＭＳ）では、電気エネルギーを援用してイオンを溶液から気相に移行させてから、マススペクトロメトリーにより分析する。試料の分析には、当技術分野で公知の方法（例えばＨｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．  ２００３  ２４（１）：３−１２；参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）を用いてよい。溶液に含まれるイオン種を気相に移行させるには、帯電液滴の細かい霧を散布し、溶媒を蒸発させてイオンを耐電液滴から排出させて、高電荷液滴のミストを生成する方法で行ってよい。少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの質量分析計（例えば四重極型質量分析計が挙げられるが、これに限定されない）を使用して、高電荷液滴のミストを分析してよい。さらに、マススペクトロメトリー法に精製ステップが含まれていてもよい。非限定的な一例として、単一のｍ／ｚ比を選択するように第１の四極子を設定して、別のｍ／ｚ比を有する他の分子イオンを除去できるようにしてよい。これにより、ＭＳ分析前の複雑で時間を要する試料精製手順を排除することができる。
【０６２０】
一実施形態では、本発明の修飾ｍＲＮＡでコードされたタンパク質を含有し得る生体試料のタンパク質を、直列ＥＳＩＭＳシステム（例えばＭＳ／ＭＳ）で分析してよい。非限定的な例として、プロダクトスキャン（もしくはドータースキャン）、プレカーサースキャン（ペアレントスキャン）、ニュートラルロス、または多重反応モニタリングを用いて液滴を分析してよい。
【０６２１】
一実施形態では、本発明の修飾ｍＲＮＡでコードされたタンパク質を含有し得る生体試料を、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）マススペクトロメトリー（ＭＡＬＤＩＭＳ）を用いて分析してよい。ＭＡＬＤＩにより、高分子、低分子の両方（例えばタンパク質）を非破壊的に蒸発させイオン化することができる。ＭＡＬＤＩ分析では、最初に、分析物を大型モル過剰マトリクス化合物と共結晶化する。また、このマトリクス化合物の例として紫外線吸収弱有機酸が挙げられるが、これに限定されない。ＭＡＬＤＩで使用されるマトリクスの非限定的な例は、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸、および２，５−ジヒドロキシ安息香酸である。分析物−マトリクス混合物をレーザー照射すると、マトリクスと分析物が蒸発し得る。レーザー誘起脱離により、無傷の分析物のイオンが高収率で得られ、化合物の高精度な測定が可能になる。試料の分析には、当技術分野で公知の方法（例えばＬｅｗｉｓ，  Ｗｅｉ  ａｎｄ  Ｓｉｕｚｄａｋ，  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０００：５８８０−５８９４；参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）を用いてよい。ＭＡＬＤＩ分析で使われる質量分析計の非限定的な例として、線形飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計、ＴＯＦリフレクトロン型質量分析計、フーリエ変換型質量分析計が挙げられる。
【０６２２】
一実施形態では、乾燥液滴法（ｄｒｉｅｄ−ｄｒｏｐｌｅｔ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて分析物−マトリクス混合物を形成してよい。生体試料をマトリクスと混合して、マトリクス対試料の比率が約５０００：１の飽和マトリクス溶液を生成する。次に、飽和マトリクス溶液の分注量（約０．５〜２．０μＬ）を静置して乾燥させ、分析物−マトリクス混合物を形成する。
【０６２３】
一実施形態では、薄膜層法（ｔｈｉｎ−ｌａｙｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて分析物−マトリクス混合物を形成してよい。同種のマトリクス膜を最初に形成してから、試料に貼り付ける。マトリクスにより試料が吸収されて、分析物−マトリクス混合物を形成することができる。
【０６２４】
一実施形態では、厚膜層法（ｔｈｉｃｋ−ｌａｙｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて分析物−マトリクス混合物を形成してよい。ニトロセルロースマトリクス添加剤を用いて、同種のマトリクス膜を形成する。均一なニトロセルロースマトリクス層が得られると、試料に貼り付け、試料をマトリクスに吸収させて分析物−マトリクス混合物を形成する。
【０６２５】
一実施形態では、サンドイッチ法（ｓａｎｄｗｉｃｈ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて分析物−マトリクス混合物を形成してよい。薄膜層法でマトリクス結晶の薄層を作製した後、水性トリフルオロ酢酸の液滴、試料、およびマトリクスを添加する。次に、試料をマトリクスに吸収させて分析物−マトリクス混合物を形成する。
修飾核酸分子の使用
治療剤
本明細書に記載の修飾核酸分子、および本明細書に記載の修飾核酸分子から翻訳されたタンパク質は、治療剤として使用することができる。例えば、本明細書に記載の修飾核酸分子を対象に投与することができる。この場合、修飾核酸分子がインビボで翻訳されて、対象内に治療用ペプチドが産生される。したがって、本明細書において、ヒトその他の哺乳動物の疾患または状態を治療または防止するための組成物、方法、キット、および試薬が提供される。本開示の活性治療剤の例として、修飾核酸分子、修飾核酸分子を含有する、または当該修飾核酸分子から翻訳されたポリペプチドを含有する細胞、修飾核酸分子から翻訳されたポリペプチド、および修飾核酸分子を含有する、または当該修飾核酸分子から翻訳されたポリペプチドを含有する細胞と接触する細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６２６】
ある特定の実施形態では、併用療法剤を提供する。この併用療法剤は、翻訳可能領域を含む１つ以上の修飾核酸分子と、抗体依存性の細胞毒性を誘発するタンパク質を含有してよい。本明細書で使用する「翻訳可能領域」は、対象の免疫を強化し得る単一または複数のタンパク質をコードする。例えば、本明細書において、トラスツズマブおよび顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）をコードする１つ以上の核酸を含有する治療剤を提供する。特に、このような併用療法剤は、トラスツズマブに対する誘導抵抗性が発生しているＨｅｒ２陽性乳癌患者において有用であり得る（例えば、Ａｌｂｒｅｃｈｔ，  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  ２（６）：７９５−８  （２０１０）を参照。参照により、この文献の全体が本明細書に組み入れられる）。
【０６２７】
本明細書に記載の修飾核酸分子を用いて細胞集団において組換えポリペプチドの翻訳を誘発する方法も、提供される。このような翻訳は、インビボ、エキソビボ、培養下、インビトロのいずれでも可能である。少なくとも１つのヌクレオシド修飾と、組換えポリペプチドをコードする翻訳可能領域とを有する核酸を含有する有効量の組成物に、細胞集団を接触させてよい。核酸が細胞集団の１つ以上の細胞に局在化できる条件下で細胞集団を接触させてよく、この核酸から細胞内で組換えポリペプチドが翻訳され得る。
【０６２８】
標的組織、標的細胞型、投与手段、核酸の物理特性（例えばサイズ、修飾ヌクレオシドの範囲）、その他の決定要因に少なくとも部分的に基づいて、有効量の組成物を提供してよい。概して、有効量の組成物により、細胞内で効率的にタンパク質が産生され、好ましくは、対応する非修飾核酸分子を含有する組成物よりも高効率にタンパク質が産生される。効率が上昇したことは、細胞トランスフェクションの増加（すなわち、核酸でトランスフェクトされた細胞の割合の増加）、核酸からのタンパク質翻訳の増加、核酸分解の減少（例えば、修飾核酸分子からのタンパク質翻訳持続時間の増加で実証される）、または宿主細胞の自然免疫反応の減少で実証できる。
【０６２９】
本開示のいくつかの態様は、組換えポリペプチドの翻訳を、それを必要とする哺乳類対象においてインビボで誘発する方法を指向している。この場合、少なくとも１つのヌクレオシド修飾と、組換えタンパク質をコードする翻訳可能領域とを有する核酸を含有する有効量の組成物を、本明細書に記載の送達方法を用いて対象に投与してよい。核酸が対象の細胞に局在化される量その他の条件下で核酸を投与してよく、この核酸から細胞内で組換えポリペプチドが翻訳され得る。核酸が局在化される細胞、または細胞が存在する組織を、１ラウンド以上の核酸投与により標的化してよい。
【０６３０】
本開示の別のいくつかの態様は、修飾核酸分子を含有する細胞を哺乳類対象に移植することに関する。哺乳類対象への細胞投与は当業者には公知であり、例として、局所的植え込み（例えば局所投与または皮下投与）、器官送達または全身注射（例えば静脈内注射または吸入）、薬剤的に許容可能な担体内での細胞の製剤化が挙げられるが、これらに限定されない。修飾核酸分子を含有する組成物を、筋肉内投与、経動脈投与、腹腔内投与、静脈内投与、鼻腔内投与、皮下投与、内視鏡的投与、経皮投与、または髄腔内投与用に製剤化する。いくつかの実施形態では、組成物を徐放用として製剤化してよい。
【０６３１】
治療剤の投与対象としてよい対象は、疾患、障害、もしくは有害な状態を患っているか、または疾患、障害、もしくは有害な状態を発症する危険性がある対象である。臨床診断、バイオマーカーレベル、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）、および当技術で公知の他の方法を含み得る根拠に基づいて、対象を特定し、診断し、分類する方法が提供される。
【０６３２】
ある特定の実施形態では、投与された修飾核酸分子が１つ以上の組換えポリペプチドの産生を指示する。この場合、産生を指示された組換えポリペプチドは、組換えポリペプチドが翻訳され得る細胞内に実質的に欠乏し得る機能活性を提供する。例えば、欠乏している機能活性は、酵素的、構造的、または遺伝子調節的な性質のものであり得る。
【０６３３】
他の実施形態では、投与された修飾核酸分子が１つ以上の組換えポリペプチドの産生を指示し、この場合、産生を指示された組換えポリペプチドは、組換えポリペプチドが翻訳され得る細胞内に実質的に欠乏し得るポリペプチド（または複数のポリペプチド）に置き換わる。このような欠乏の原因は、コーディング遺伝子またはその調節経路の遺伝子変異であり得る。あるいは、組換えポリペプチドは、細胞内もしくは細胞表面に存在する内在性タンパク質、または細胞から分泌される内在性タンパク質の活性に拮抗するように機能する。通常、例えば内在性タンパク質の変異の結果、活性が改変されるか局在化するなどの理由で、内在性タンパク質の活性は対象に有害になり得る。加えて、組換えポリペプチドは、細胞内もしくは細胞表面に存在する生物的部分、または細胞から分泌される生物的部分の活性に、直接的または間接的に拮抗するように機能する。拮抗作用を受ける生物的部分の例として、脂質（例えばコレステロール）、リポタンパク質（例えば低密度リポタンパク質）、核酸、炭水化物、低分子毒素が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６３４】
本明細書に記載の組換えタンパク質は、細胞内（潜在的には、核等の特定の区画内）で局在化するように操作してよく、あるいは、細胞から分泌されるように、または細胞の原形質膜に転位置されるように操作される。
【０６３５】
本明細書に記載の通り、本開示の修飾核酸分子の有用な特徴の１つは、外来性核酸に対する細胞の自然免疫反応を減少させる能力を有することである。本明細書において、単一細胞または細胞集団における免疫反応の用量調節、低減、または排除を実施する方法が提供される。いくつかの実施形態では、第１用量の第１外来性核酸（翻訳可能領域と、少なくとも１つのヌクレオシド修飾とを含む）を含有する第１組成物に細胞を接触させ、第１外来性核酸に対する細胞の自然免疫反応のレベルを測定してよい。続いて、第２用量の第１外来性核酸を含む第２組成物に、細胞を接触させてよい。この第２用量は、第１用量より少ない量の第１外来性核酸を含有する。あるいは、第１用量の第２外来性核酸に細胞を接触させてもよい。第２外来性核酸は、第１外来性核酸と同一または異なる１つ以上の修飾ヌクレオシドを含有してよい。あるいは、第２外来性核酸は、修飾ヌクレオシドを含有していなくてもよい。第１組成物および／または第２組成物に細胞を接触させるステップを１回以上繰り返してよい。加えて、細胞内のタンパク質産生（例えばタンパク質翻訳）の効率を随意に測定してもよく、目標とするタンパク質産生効率を達成するまで、細胞への第１組成物および／または第２組成物の再トランスフェクションを繰り返し実施してよい。
疾患および状態の治療法
タンパク質活性の欠損または異常を特徴とする疾患症状を、欠損しているタンパク質活性を供給するか、または異常なタンパク質活性を克服することにより治療または予防する方法を、本明細書において提供する。ウイルスＤＮＡベクターと比較して、修飾ｍＲＮＡは導入後のタンパク質産生が急速に開始するので、本開示の化合物は、急性疾患（例えば敗血症、脳卒中、心筋梗塞）の治療で特に有利である。さらに、本開示の修飾ｍＲＮＡは転写速度を変更でき、よって遺伝子発現に変化を起こすことができるので、この修飾ｍＲＮＡを使用すれば、タンパク質の正確な用量調節が達成可能となる。
【０６３６】
機能障害性または異常性のタンパク質活性を特徴とする疾患の例として、癌および増殖性疾患、遺伝性疾患（例えば嚢胞性線維症）、自己免疫疾患、糖尿病、神経変性疾患、心血管疾患、代謝疾患が挙げられるが、これらに限定されない。本開示は、本明細書に記載の修飾核酸分子を含有する核酸もしくは細胞に基づく治療剤を導入することにより、対象のこのような状態もしくは疾患を治療する方法を提供する。この場合、本明細書に記載の修飾核酸分子は、対象の細胞に存在する異常なタンパク質活性を拮抗等の方法により克服するタンパク質をコードする。機能障害性タンパク質の具体例として、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子のミスセンス変異体（ＣＦＴＲタンパク質の機能障害性タンパク質変異体を産生して、嚢胞性線維症を引き起こす変異体）が挙げられるが、これに限定されない。
【０６３７】
タンパク質活性が欠損している（または、適切なタンパク質機能が発生しないほど実質的に減少している）ことを特徴とし得る、多くの疾患が存在する。このようなタンパク質は不存在であるか、本質的に機能不全であり得る。
【０６３８】
したがって、有効量のＣＴＦＲポリペプチドが細胞内に存在する条件下で、哺乳類対象の細胞を、機能的ＣＦＴＲポリペプチドをコードする翻訳可能領域を有する修飾核酸分子と接触させることにより、対象の嚢胞性線維症を治療する方法を提供する。好ましい標的細胞は、肺等の上皮細胞であり、投与方法は標的組織を考慮して決定される。すなわち、肺送達の場合は、吸入投与用にＲＮＡ分子を製剤化する。
【０６３９】
別の一実施形態では、本開示は、対象の細胞集団に、Ｓｏｒｔｉｌｉｎ（ゲノム研究により近年特徴付けされたタンパク質）をコードする修飾ｍＲＮＡ分子を導入することにより、対象の高脂血症を治療し、これにより対象の高脂血症を寛解させる方法を提供する。ＳＯＲＴ１遺伝子は、Ｓｏｒｔｉｌｉｎと呼ばれるトランスゴルジ網（ＴＧＮ）膜貫通タンパク質をコードする。遺伝学研究により、５人に１人がＳＯＲＴ１遺伝子の１ｐ１３遺伝子座に一塩基多型ｒｓ１２７４０３７４を有し、低レベルの低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）を有する傾向があることが示されている。約３０％の人々に存在するマイナー対立遺伝子の各コピーがＬＤＬコレステロールを８ｍｇ／ｄＬ変化させるのに対し、母集団の約５％に存在するマイナー遺伝子の２つのコピーは、ＬＤＬコレステロールを１６ｍｇ／ｄＬ低下させる。マイナー対立遺伝子の保有者は、心筋梗塞のリスクが４０％低下していることも示されている。マウスにおけるインビボの機能研究では、マウスの肝組織でＳＯＲＴ１を過剰発現させた結果、ＬＤＬコレステロールレベルが８０％もの有意な割合で低下し、ＳＯＲＴ１を発現停止すると、ＬＤＬコレステロールが約２００％増加したと記されている（Ｍｕｓｕｎｕｒｕ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｒｏｍ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ｖａｒｉａｎｔ  ｔｏ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｖｉａ  ＳＯＲＴ１  ａｔ  ｔｈｅ  １ｐ１３  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｌｏｃｕｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０；  ４６６：  ７１４−７２１；参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）。
細胞性核酸の送達方法
本開示の方法は、細胞集団へのインビボ、エキソビボ、または培養下での核酸の送達を亢進する。例えば、複数の宿主細胞（例えば酵母細胞や哺乳類細胞等の真核細胞）を含有する細胞培養液を、少なくとも１つのヌクレオシド修飾を有し、かつ随意に翻訳可能領域を有する修飾核酸分子を含有する組成物と接触させてよい。また組成物は、一般に、トランスフェクション試薬等、宿主細胞への修飾核酸分子の取り込み効率を高め得る化合物を含有してもよい。修飾核酸分子は、対応する非修飾の核酸分子と比べて、細胞集団における高い保持率を示し得る。修飾核酸分子は、非修飾核酸分子よりも高い保持率を有し得る。いくつかの実施形態では、修飾核酸分子の保持率は、非修飾核酸分子より少なくとも約５０％、７５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、または２００％超高い。そのような保持率の優位性は、修飾核酸分子による１ラウンドのトランスフェクションで達成でき、あるいは、後続の反復ラウンドのトランスフェクションで得ることができる。
【０６４０】
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の核酸と共に、標的細胞集団に修飾核酸分子を送達してよい。このような送達は同時であってもよく、あるいは、修飾核酸分子を送達した後、１つ以上の追加の核酸を送達してもよい。追加の１つ以上の核酸は、修飾核酸分子、非修飾核酸分子のどちらであってもよい。最初に修飾核酸分子が存在することによって、細胞集団の自然免疫反応が実質的に誘発されなくてもよく、さらに、後に非修飾核酸分子が存在することによって、自然免疫反応が活性化されなくてもよいことが理解される。この点で、標的細胞集団内に存在することが所望されるタンパク質が非修飾核酸分子から翻訳される場合、強化された核酸自体が翻訳領域を含む必要はない。
標的部分
いくつかの実施形態では、修飾核酸分子を提供することにより、細胞表面にタンパク質結合パートナーまたは受容体が発現する。このパートナーまたは受容体は、細胞の標的を特定の組織空間に向けるか、特定の部分と相互作用するようにインビボまたはインビトロで機能することができる。適切なタンパク質結合パートナーの例として、抗体およびその機能性断片、足場タンパク質、またはペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、脂質、炭水化物、または他の生物的部分の合成および細胞外局在化を指示する目的で、修飾核酸分子を使用してよい。
遺伝子発現の永久停止
哺乳類対象においてエピジェネティック（後成的）に遺伝子発現を停止する、核酸を含む方法。この場合、遺伝子をサイレンシングする目的で、配列特異的なヒストンＨ３メチル化を指示することのできる単一または複数のポリペプチドを翻訳可能領域がコードして、ヘテロクロマチンの形成を開始し、特定遺伝子周辺の遺伝子転写を減少させる。例えば、ヤヌスキナーゼ２遺伝子における機能獲得型変異は、骨髄増殖性疾患ファミリーの原因である。
細胞表面でのリガンドまたは受容体の発現
いくつかの態様および本明細書に記載の態様の実施形態では、修飾ＲＮＡを使用して、細胞表面にリガンドまたはリガンド受容体を発現することができる（例えばホーミング部分）。細胞表面にリガンドまたはリガンド受容体部分が結合すると、細胞は、組織または薬剤との間で所望の生物相互作用をインビボで有することが可能になる。リガンドは、抗体、抗体断片、アプタマー、ペプチド、ビタミン、炭水化物、タンパク質もしくはポリペプチド、受容体（例えば細胞表面受容体）、接着分子、糖タンパク質、糖残基、治療薬、薬剤、グリコサミノグリカン、またはこれらの組み合わせであり得る。例えば、リガンドは、癌細胞に特異的な抗原を認識することにより、細胞が腫瘍細胞と優先的に相互作用できるようにして、改変細胞の腫瘍特異的な局在化を可能にする抗体であり得る。好ましいリガンドは治療対象組織の外面にある標的分子と相互作用できるので、リガンドにより、細胞組成物は治療対象組織に蓄積できるようになる。他の組織に対しては限られた交差反応性を有するリガンドが、一般的に好ましい。
【０６４１】
いくつかの例では、リガンドは、細胞が特定組織を標的化すること、あるいは細胞が特定リガンドと相互作用することを可能にするホーミング部分として機能できる。このようなホーミング部分の例として、特定の結合ペアの任意のメンバー、抗体、モノクローナル抗体、またはこれらの誘導体もしくは類似体が挙げられ（ただしこれらに限定されない）、その具体例として、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単一ドメイン抗体、ラクダ化抗体（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）および抗体断片、ヒト化抗体および抗体断片、ならびに上記の多価バージョン；単一特異性抗体、二重特異性抗体を含む（ただしこれらに限定されない）多価の結合試薬、例えばジスルフィド安定化Ｆｖ断片、ｓｃＦｖタンデム（（ＳＣＦＶ）２断片）、典型的には共有結合その他の方法で安定化している（すなわちロイシンジッパーまたはヘリックスで安定化している）ｓｃＦｖ断片である二重特異性抗体、三重特異性抗体、または四重特異性抗体；その他のホーミング部分（例えばアプタマー、受容体、融合タンパク質）が挙げられる。
【０６４２】
いくつかの実施形態では、ホーミング部分は、細胞標的化特異性の調整を可能にする表面結合抗体であってよい。所望される標的部位の関心のエピトープに対して特異性の高い抗体を産生させることができるので、表面結合抗体は特に有用である。一実施形態では、所望の標的に対してそれぞれ異なる特異性を有し得る複数の抗体が細胞表面に発現する。このような方法により、ホーミング相互作用の結合活性と特異性を高めることができる。
【０６４３】
当業者であれば、所望される局在化または細胞機能に基づいて任意のホーミング部分を選択できる。例えば、タモキシフェン等のエストロゲン受容体リガンドは、細胞表面のエストロゲン受容体が減少しているエストロゲン依存性乳癌細胞に細胞を標的化することができる。リガンド／受容体相互作用のその他の非限定的な例として、ＣＣＲＩ（例えば、関節リウマチにおける炎症性関節組織もしくは脳、および／または多発性硬化症の治療）、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８（例えば、リンパ節組織への標的化）、ＣＣＲ６、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０（例えば、腸組織への標的化）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ１０（例えば、皮膚への標的化）、ＣＸＣＲ４（例えば、全般的な血管外移動亢進）、ＨＣＥＬＬ（例えば、炎症、炎症性疾患、骨髄の治療）、Ａｌｐｈａ４ｂｅｔａ７（例えば、腸粘膜の標的化）、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１（例えば、内皮への標的化）が挙げられる。概して、標的化（例えば癌転移）に関与する任意の受容体を、本明細書に記載の方法および組成物に利用することができる。細胞死介在物質
一実施形態では、修飾核酸分子組成物を用いて、細胞死受容体、細胞死受容体のリガンド、またはこれらの組み合わせの発現を増加させることにより、細胞（例えば癌細胞）にアポトーシスを誘発することができる。この方法は、所望される任意の細胞に細胞死を誘発する目的で使用でき、細胞が自然のアポトーシスシグナルを回避する癌の治療において特に有用である。
【０６４４】
アポトーシスは、多くの独立シグナル経路により誘発でき、これらの独立シグナル経路は最終エフェクター機構に集結する。このエフェクター機能は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体／リガンドスーパーファミリーに属するいくつかの「死の受容体」とそのリガンド間の多くの相互作用からなる。最もよく特徴付けられている細胞死受容体は、ＣＤ９５（「Ｆａｓ」）、ＴＮＦＲＩ（ｐ５５）、細胞死受容体３（ＤＲ３またはＡｐｏ３／ＴＲＡＭＯ）、ＤＲ４、およびＤＲ５（ａｐｏ２−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）である。アポトーシスの最終エフェクター機構とは、カスパーゼと命名された一連のプロテイナーゼの活性化であり得る。このカスパーゼが活性化する結果、生命に必要な一連の細胞タンパク質が切断されて、細胞死が生じる。細胞死受容体／リガンドにより誘発されるアポトーシスの分子機構は、当技術分野で周知である。例えば、Ｆａｓ／ＦａｓＬが介在するアポトーシスは、３つのＦａｓＬ分子が結合することにより誘発される。この３つのＦａｓＬ分子は、Ｃ末端デスドメイン（ＤＤ）を介してＦａｓ受容体の三量体形成を誘発し、このＦａｓ受容体は、アダプタータンパク質ＦＡＤＤ（デスドメインを有するＦａｓ結合タンパク質）とカスパーゼ８を動員する。この三分子複合体Ｆａｓ／ＦＡＩＤＤ／カスパーゼ８がオリゴマーを形成する結果、酵素前駆体カスパーゼ８がタンパク質分解により活性カスパーゼ８へと切断し、この活性カスパーゼ８が、カスパーゼ３を含む他の下流カスパーゼをタンパク質分解で活性化することにより、アポトーシス処理を開始する。デスリガンドは一般に、三量体またはそれ以上の高次構造に形成された場合にアポトーシス性である。単量体としてのデスリガンドは、細胞死受容体との結合で三量体と競合することにより、抗アポトーシス剤として機能できる。
【０６４５】
一実施形態では、修飾核酸分子組成物は細胞死受容体（例えばＦａｓ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＭＯ、ＴＮＦＲ、ＴＬＲ等）をコードする。修飾ＲＮＡのトランスフェクションにより細胞死受容体を発現するようにされた細胞は、その受容体を活性化するリガンドが誘発する細胞死を受けやすくなる。同様に、（例えば細胞表面に）デスリガンドを発現するようにされた細胞は、トランフェクトされた細胞が標的細胞と接触したとき、受容体を用いて細胞死を誘発する。別の一実施形態では、修飾ＲＮＡ組成物は、細胞死受容体リガンド（例えばＦａｓＬ、ＴＮＦ等）をコードする。別の一実施形態では、修飾ＲＮＡ組成物はカスパーゼ（例えばカスパーゼ３、カスパーゼ８、カスパーゼ９等）をコードする。癌細胞が非増殖型または制御された増殖型へと適切に分化できないことを頻繁に示す場合、別の一実施形態では、合成の修飾ＲＮＡ組成物は、細胞死受容体とその適切な活性化リガンドの両方をコードする。別の一実施形態では、合成の修飾ＲＮＡ組成物は分化因子をコードする。この分化因子は、癌幹細胞等の癌細胞内で発現したとき、癌細胞が非病原性表現型または非自己再生表現型に分化するよう誘発し（例えば、細胞増殖速度の低下、細胞分裂の減少等）、または、癌細胞が休眠細胞期（例えばＧ０休止期）に入るよう誘発する。
【０６４６】
当業者であれば、アポトーシス誘発手法を使用する場合は、修飾核酸分子を適切に（例えば腫瘍細胞に）標的化して、細胞死が不要に広範に拡大するのを防止する必要があることを理解するであろう。したがって、修飾核酸分子が癌細胞だけに発現するようにするため、癌抗原を認識する送達メカニズム（例えば、リガンドまたは抗体の結合、リポソーム標的化等）を使用してよい。
キットおよび装置
キット
本発明は、本発明の方法を簡便および／または効果的に実施するための種々のキットを提供する。典型的には、キットは、使用者が対象の複数の治療を実施し、かつ／または複数の実験を実施するに足る、十分な量および／または数の構成要素を含む。
【０６４７】
一態様では、本発明は、翻訳可能領域を含む第１の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを含む、タンパク質産生用キットを提供する。このキットは、包装と説明書、および／または製剤組成物を形成するための送達剤をさらに含んでよい。送達剤は、生理食塩水、緩衝液、リピドイド（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）、または本明細書に開示される任意の送達剤を含んでよい。
【０６４８】
一実施形態では、緩衝液は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸、および／またはＥＤＴＡを含み得る。別の一実施形態では、緩衝液は、生理食塩水、２ｍＭカルシウムを含む生理食塩水、５％スクロース、２ｍＭカルシウムを含む５％スクロース、５％マンニトール、２ｍＭカルシウムを含む５％マンニトール、乳酸リンゲル液、塩化ナトリウム、２ｍＭカルシウムを含む塩化ナトリウム、およびマンノースを含み得る（これらに限定されない）（例えば米国特許出願公開第２０１２０２５８０４６号を参照。参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）。さらなる一実施形態では、緩衝液は沈殿または凍結乾燥されていてよい。一定し再現可能な高濃度の生理食塩水または単純な緩衝液配合を実現できるように、各成分の量を変えてよい。また、一定期間中および／または種々の条件下で緩衝液中の修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡの安定性が増すように、成分を変えてもよい。
【０６４９】
一態様では、本発明は、翻訳可能領域を含む第１の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡ（その量は、標的細胞に導入された時点で、翻訳可能領域がコードする所望のタンパク質量を産生できる有効量である）と；阻害性核酸を含む第２の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡ（その量は、細胞の自然免疫反応を実質的に阻害できる有効量である）と；包装および説明書と、を含むタンパク質産生用キットを提供する。
【０６５０】
一態様では、本発明は、翻訳可能領域を含む修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡと、包装および説明書とを含む、タンパク質産生用キットであって、この核酸は細胞ヌクレアーゼによる分解の減少を示す、タンパク質産生用キットを提供する。
【０６５１】
一態様では、本発明は、翻訳可能領域を含む修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを含む、タンパク質産生用キットであって、この核酸は細胞ヌクレアーゼによる分解の減少を示し、哺乳類細胞は第１核酸の翻訳可能領域による翻訳に適している、タンパク質産生用キットを提供する。
装置
本発明は、関心のポリペプチドをコードする修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを組み込むことのできる装置を提供する。この装置は、上記核酸を必要とする対象（例えばヒト患者）に直ちに送達できる製剤の形で核酸を合成するための、安定した製剤にされた試薬を格納する。上記関心のポリペプチドの非限定的な例として、創傷治癒のための増殖因子および／または血管形成促進因子、感染制御を促進するためのペプチド抗生物質、および、新たに特定されたウイルスに対する免疫反応を急速に刺激するための抗原が挙げられる。
【０６５２】
いくつかの実施形態では、この装置は、すべて完備した自立型であり、さらに、合成方法および／または生成された修飾核酸分子もしくはｍｍＲＮＡの分析方法の説明書を無線リモートアクセスで取得する能力を随意に有していてもよい。この装置は、少なくとも１つの修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡ、好ましくは無制限の数の様々な修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡをモバイル合成することができる。ある特定の実施形態では、この装置は、１名または少数の個人により運搬することができる。他の実施形態では、この装置は、卓上または机上に収まるように拡大／縮小される。他の実施形態では、この装置は、スーツケース、バックパック、または類似サイズの物体に収まるように拡大／縮小される。
【０６５３】
別の一実施形態では、この装置は、ポイント・オブ・ケア装置またはハンドヘルド型装置であってよい。さらなる実施形態では、この装置は、車両（例えば自動車、トラック、救急車）または軍用車両（例えばタンク、人員運搬車）に収まるように拡大／縮小される。関心のポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡを生成するために必要な情報は、装置内に存在するコンピュータ可読媒体内に存在する。
【０６５４】
一実施形態では、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡの形で投与されたタンパク質のレベルを評価する目的で、装置を使用してよい。この装置は、血液検査、尿検査、その他の生物流体試験を含んでよい。
【０６５５】
いくつかの実施形態では、この装置は、核酸およびポリペプチド配列のデータベースと通信する（例えば無線で通信する）能力を有する。この装置は、１つ以上の試料容器を挿入するための少なくとも１つの試料ブロックを格納する。このような試料容器は、液体または他の形態の任意の数の材料（例えば鋳型ＤＮＡ、ヌクレオチド、酵素、緩衝剤、その他の試薬）を収容することができる。また、この試料容器は、試料ブロックと接触することにより加熱および冷却することができる。この試料ブロックは通常、少なくとも１つの試料ブロック用の１つ以上の電子制御ユニットを用いて、装置のベースと連通している。好ましくは、この試料ブロックは加熱モジュールを格納し、この加熱分子（ｈｅａｔｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）は、約−２０Ｃ〜約＋１００Ｃの温度範囲で試料容器とその内容物を加熱および／または冷却することができる。装置のベースは、電圧源（例えば電池または外部電圧源）と連通している。この装置は、ＲＮＡ合成用材料を保存し分配する手段も格納する。
【０６５６】
この試料ブロックは、合成された核酸を分離するためのモジュールを随意に格納してもよい。あるいは、この装置は、試料ブロックと機能的に連結した分離モジュールを格納してもよい。好ましくは、この装置は、合成された核酸を分析する手段を格納する。上記の分析には、配列同一性（例えば、ハイブリダイゼーションにより実証）、所望されない配列の不存在、合成されたｍＲＮＡの完全性測定（例えば、微小流体粘度測定と分光測定法の併用による分析）、修飾ＲＮＡの濃度および／または効力（例えば、分光測定法による分析）が含まれる。
【０６５７】
ある特定の実施形態では、この装置は、対象から取得した生体材料中に存在する病原体を検出する手段（例えば微生物同定用ＩＢＩＳ  ＰＬＥＸ−ＩＤシステム（Ａｂｂｏｔｔ、イリノイ州アボットパーク））と組み合わされる。
【０６５８】
本発明に記載の皮内投与医薬組成物の送達に適切な装置として、例えば米国特許第４，８８６，４９９号、第５，１９０，５２１号、第５，３２８，４８３号、第５，５２７，２８８号、第４，２７０，５３７号、第５，０１５，２３５号、第５，１４１，４９６号、および第５，４１７，６６２号（参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている短針（ショートニードル）装置が挙げられる。皮内投与組成物の投与は、針の有効な皮膚貫通長さを制限する装置（例えば、ＰＣＴ国際公開第９９／３４８５０号（参照により、この文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載の装置およびその機能的均等物）により行ってよい。液体噴射式注射器を介して、かつ／または角質層を貫通して真皮に届く噴流を生成する針を介して液体組成物を真皮に送達する噴射式注射器が、好適である。噴射式注射器については、例えば、米国特許第５，４８０，３８１号、第５，５９９，３０２号、第５，３３４，１４４号、第５，９９３，４１２号、第５，６４９，９１２号、第５，５６９，１８９号、第５，７０４，９１１号、第５，３８３，８５１号、第５，８９３，３９７号、第５，４６６，２２０号、第５，３３９，１６３号、第５，３１２，３３５号、第５，５０３，６２７号、第５，０６４，４１３号、第５，５２０，６３９号、第４，５９６，５５６号、第４，７９０，８２４号、第４，９４１，８８０号、第４，９４０，４６０号、ならびにＰＣＴ国際公開第９７／３７７０５号および第９７／１３５３７号（参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。圧縮ガスを用いて粉末形態ワクチンの皮膚外層から真皮への送達を加速するバリスティック粉末／粒子送達装置が、好適である。上記に追加または代替して、古典的な皮内投与マントゥー法において従来の注射器を使用してもよい。
【０６５９】
いくつかの実施形態では、この装置はポンプであってよく、あるいは、血液脳関門を通過して本発明の化合物または組成物を投与するためのカテーテルを含んでいてもよい。このような装置の例として、加圧嗅覚送達装置、イオン導入装置、多層微小流体装置等が挙げられるが、これらに限定されない。このような装置は、携帯式、固定式のどちらでもよい。このような装置は、植え込み型であるか、外部から身体に係留されるか、またはこれらの組み合わせであってよい。
【０６６０】
投与装置を使用して、本明細書で教示される単回投与、多回投与、または分割投与計画に従って、本発明の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを送達してよい。このような装置について、以下に記載する。
【０６６１】
本明細書に開示されている方法および組成物と併用される、細胞、器官、および組織に多回投与するための当技術分野で公知の方法および装置は、本発明の実施形態として企図されている。その例として、複数の針を備える方法および装置、例えばルーメンやカテーテルを使用するハイブリッド装置、熱、電流、または放射線で駆動される機構を利用した装置が挙げられる。
【０６６２】
本発明によれば、これらの多回投与装置を利用して、本明細書で企図される単一用量、多回用量、または分割用量を送達してよい。
治療剤を固形組織に送達する方法は、Ｂａｈｒａｍｉらにより説明されており、例えば米国特許出願公開第２０１１０２３０８３９号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｂａｈｒａｍｉによれば、規則的に並んだ針が装置に組み込まれ、各針の長さに沿って、上記固形組織の任意の場所に、実質的に均等量の流体が送達される。
【０６６３】
生物組織を通過して生体材料を送達する装置は、Ｋｏｄｇｕｌｅらにより説明されており、例えば米国特許出願公開第２０１１０１７２６１０号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｋｏｄｇｕｌｅによれば、一種以上の金属で製造され、外径が約２００ミクロン〜約３５０ミクロン、長さが少なくとも１００ミクロンの複数の中空マイクロ針が装置に組み込まれて、この装置からペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸分子、脂質、その他の薬剤的活性成分、またはこれらの組み合わせを送達する。
【０６６４】
治療剤を組織に送達するための送達プローブは、Ｇｕｎｄａｙらにより説明されており、例えば米国特許出願公開第２０１１０２７０１８４号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｇｕｎｄａｙによれば、複数の針が装置に組み込まれ、この装置が付属カプセルを作動位置と非作動位置の間で移動させて、カプセルから針を通じて薬剤を排出させる。
【０６６５】
頻回注射医療器具は、Ａｓｓａｆにより説明されており、例えば米国特許出願公開第２０１１０２１８４９７号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ａｓｓａｆによれば、複数の針が装置に組み込まれ、この装置は、１本以上の針に接続したチャンバーを有し、各注射の後にチャンバーに医療流体を連続的に補充する手段を有する。
【０６６６】
一実施形態では、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡを、少なくとも３本の針を介して、同時または６０分以内に、３つの異なる部位（隣接部位でもよい）に皮下投与または筋肉内投与する（例えば、同時または６０分以内に、４、５、６、７、８、９、または１０の部位に投与する）。米国特許出願公開第２０１１０２３０８３９号および第２０１１０２１８４９７号（参照により、これらの各文献の全体が本明細書に組み込まれる）に記載の装置を使用すると、分割用量を隣接組織に同時に投与することができる。
【０６６７】
物質を患者の体内に注射するための少なくとも部分的に植え込み型のシステム、特に陰茎勃起刺激システムは、Ｆｏｒｓｅｌｌにより説明されており、例えば米国特許出願公開第２０１１０１９６１９８号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｆｏｒｓｅｌｌによれば、複数の針が装置に組み込まれ、患者の左右の海綿体に隣接した位置に、この装置が１つ以上のハウジングと共に植え込まれる。針を通じて薬剤を供給するためのリザーバーとポンプも植え込まれる。
【０６６８】
治療有効量の鉄を経皮送達する方法は、Ｂｅｒｅｎｓｏｎにより説明されており、例えば米国特許出願公開第２０１００１３０９１０号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｂｅｒｅｎｓｏｎによれば、複数の針を用いて角質層中に複数のマイクロチャンネルを作成でき、これにより、イオン注入パッチの鉄イオンの経皮送達を亢進することができる。
【０６６９】
生物組織を通過して生体材料を送達する方法は、Ｋｏｄｇｕｌｅらにより説明されており、例えば米国特許出願公開第２０１１０１９６３０８号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｋｏｄｇｕｌｅによれば、治療活性成分を含有する複数の生分解性マイクロ針が装置に組み込まれ、この装置から、タンパク質、炭水化物、核酸分子、脂質、その他の薬剤的活性成分、またはこれらの組み合わせが送達される。
【０６７０】
ボツリヌス毒素組成物を含む経皮パッチは、Ｄｏｎｏｖａｎにより説明されており、例えば米国特許出願公開第２００８０２２００２０号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｄｏｎｏｖａｎによれば、複数の針がパッチに組み込まれ、血管を破らずに皮膚角質層に突き出た針を通じて、装置から角質層下にボツリヌス毒素が送達される。
【０６７１】
約０．２〜１５ｍＬの液体製剤を保持できる小型の使い捨てリザーバーまたはパッチポンプを皮膚に配置して、小口径針（ｓｍａｌｌ  ｂｏｒｅ  ｎｅｅｄｅｄ）（例えば２６〜３４ゲージ）を用いて連続的に製剤を皮下送達できる。非限定的な例として、このパッチポンプは、３０〜３４ゲージ針を有するばね付き５０ｍｍ×７６ｍｍ×２０ｍｍ（ＢＤ（商標）Ｍｉｃｒｏｉｎｆｕｓｅｒ、ニュージャージー州フランクリンレイクス）、インスリン等の薬剤送達用の２ｍＬリザーバーを有する４１ｍｍ×６２ｍｍ×１７ｍｍ（ＯＭＮＩＰＯＤ（登録商標）、Ｉｎｓｕｌｅｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ベッドフォード）、または０．５〜１０ｍＬリザーバーを有する４３〜６０ｍｍ径、１０ｍｍ厚さ（ＰＡＴＣＨＰＵＭＰ（登録商標）、ＳｔｅａｄｙＭｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、カリフォルニア州サンフランシスコ）であってよい。さらに、パッチポンプは電池式および／または充電式であってよい。
【０６７２】
極低温治療位置に活性薬剤を投与するための凍結探針は、Ｔｏｕｂｉａにより説明されており、例えば米国特許出願公開第２００８０１４００６１号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｔｏｕｂｉａによれば、活性薬剤をチャンバーへと受け取るプローブに複数の針が組み込まれ、このプローブから組織に薬剤が送達される。
【０６７３】
炎症を治療もしくは防止し、または健常な関節を促進する方法が、Ｓｔｏｃｋらにより説明されており、例えば米国特許出願公開第２００９０１５５１８６号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｓｔｏｃｋによれば、複数の針が装置に組み込まれ、この装置から、シグナル伝達調節因子化合物を含有する組成物が投与される。
【０６７４】
多部位注射システムが、Ｋｉｍｍｅｌｌらにより説明されており、例えば米国特許出願公開第２０１００２５６５９４号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｋｉｍｍｅｌｌによれば、複数の針が装置に組み込まれ、この装置から針を通じて角質層に薬剤が送達される。
【０６７５】
インターフェロンを皮内区画に送達する方法が、Ｄｅｋｋｅｒらにより説明されており、例えば米国特許出願公開第２００５０１８１０３３号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｄｅｋｋｅｒによれば、露出高さ０〜１ｍｍの出口を有する複数の針が装置に組み込まれ、この装置は、０．３ｍｍ〜２ｍｍの深さに物質を送達することにより薬物動態と生物学的利用能を改善する。
【０６７６】
遺伝子、酵素、および生物剤を組織細胞に送達する方法が、Ｄｅｓａｉにより説明されており、例えば米国特許出願公開第２００３００７３９０８号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｄｅｓａｉによれば、複数の針が装置に組み込まれ、この装置が体内に挿入されて、これらの針を通じて薬剤流体が送達される。
【０６７７】
線維芽細胞で不整脈を治療する方法が、Ｌｅｅらにより説明されており、例えば米国特許出願公開第２００４０００５２９５号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｌｅｅによれば、複数の針が装置に組み込まれ、この装置から組織の局所領域に線維芽細胞が送達される。
【０６７８】
磁気的に制御されたポンプを用いて脳腫瘍を治療する方法が、Ｓｈａｃｈａｒらにより説明されており、例えば米国特許第７，７９９，０１２号（方法）および第７，７９９，０１６号（装置）（参照により、これらの文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｓｈａｃｈａｒによれば、複数の針がポンプに組み込まれ、このポンプから針を通じて制御部位に薬剤が押し出される。
【０６７９】
哺乳類の雌における膀胱の機能障害を治療する方法が、Ｖｅｒｓｉらにより説明されており、例えば米国特許第８，０２９，４９６号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｖｅｒｓｉによれば、規則的に並んだマイクロ針が装置に組み込まれ、この装置から針を通じて治療剤が膀胱三角に直接送達される。
【０６８０】
マイクロ針経皮輸送装置が、Ａｎｇｅｌらにより説明されており、例えば米国特許第７，３６４，５６８号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ａｎｇｅｌによれば、複数の針が装置に組み込まれ、様々な方向から体表に挿入された針を通じて、物質が体表内に運搬される。このマイクロ針経皮輸送装置は、中実、中空のどちらのマイクロ針システムでもよい。非限定的な一例として、中実のマイクロ針システムは、最大容量が０．５ｍｇで、薬剤を塗布した１５０〜７００μｍ高さの中実のマイクロ針を１ｃｍ２あたり３００〜１５００本有し得る。このマイクロ針は角質層を貫通して、短時間（例えば２０秒〜１５分）皮膚に残る。別の例では、中空のマイクロ針システムは最大３ｍＬの容量を有し、約９５０μｍ高さのマイクロ針１ｃｍ２あたり１５〜２０本を用いて液体製剤を送達する。このマイクロ針は皮膚を貫通して、液体製剤を装置から皮膚内に流入させる。この中空マイクロ針システムは、製剤の容積と粘度に応じて１〜３０分間装着してよい。
【０６８１】
皮下注入装置が、Ｄａｌｔｏｎらにより説明されており、例えば米国特許第７，１５０，７２６号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｄａｌｔｏｎによれば、複数の針が装置に組み込まれ、この装置から針を通じて皮下組織に流体が送達される。
【０６８２】
ワクチンおよび遺伝子治療剤をマイクロカニューレで皮内送達する装置および方法が、Ｍｉｋｓｚｔａらにより説明されており、例えば米国特許第７，４７３，２４７号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｍｉｔｓｚｔａによれば、少なくとも１本の中空マイクロ針が装置に組み込まれ、この装置から、対象の皮膚の０．０２５ｍｍ〜２ｍｍの深さにワクチンが送達される。
【０６８３】
インスリンを送達する方法が、Ｐｅｔｔｉｓらにより説明されており、例えば米国特許第７，７２２，５９５号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｐｅｔｔｉｓによれば、装置に組み込まれた２本の針の両方が、本質的に同時に皮膚に挿入される。このとき、第１の針は２．５ｍｍ未満の深さからインスリンを皮内区画に送達し、第２の針は２．５ｍｍ超５．０ｍｍ未満の深さからインスリンを皮下区画に送達する。
【０６８４】
吸引下の皮膚注射送達が、Ｋｏｃｈａｍｂａらにより説明されており、例えば米国特許第６，８９６，６６６号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｋｏｃｈａｍｂａによれば、互いに比較的近接している複数の針が装置に組み込まれ、この装置から皮膚層の下に流体を注射する。
【０６８５】
皮膚を通過して物質を回収または送達する装置が、Ｄｏｗｎらにより説明されており、例えば米国特許第６，６０７，５１３号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｄｏｗｎによれば、長さ約１００ミクロン〜約２０００ミクロン、約３０〜５０ゲージの複数の皮膚貫通部材が装置に組み込まれる。
【０６８６】
皮膚に物質を送達する装置が、Ｐａｌｍｅｒらにより説明されており、例えば米国特許第６，５３７，２４２号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｐａｌｍｅｒによれば、規則的に並んだマイクロ針が装置に組み込まれ、この装置は、伸張アセンブリを用いて針と皮膚の接触を亢進し、より均一な物質送達を提供する。
【０６８７】
局在性薬物送達用の潅流装置が、Ｚａｍｏｙｓｋｉにより説明されており、例えば米国特許第６，４６８，２４７号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｚａｍｏｙｓｋｉによれば、複数の皮下針が装置に組み込まれ、皮下注射器が退縮すると同時に、皮下注射器の内容物が組織に注射される。
【０６８８】
マイクロ針とヒト皮膚間の相互作用を改善することにより、薬剤および生体分子が組織を通過して輸送されるのを亢進する方法が、Ｐｒａｕｓｎｉｔｚらにより説明されており、例えば米国特許第６，７４３，２１１号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｐｒａｕｓｎｉｔｚによれば、マイクロ針の取り付け先表面の剛性を高め変形性を下げることのできる装置に、複数のマイクロ針を組み込む。
【０６８９】
薬剤を器官内投与するための装置、Ｔｉｎｇらにより説明されており、例えば米国特許第６，０７７，２５１号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｔｉｎｇによれば、投与を亢進するためのサイド開口部を有する複数の針が装置に組み込まれ、これらの針が針チャンバーから伸張、退縮することにより、薬剤がリザーバーから針に排出され、標的器官に注射される。
【０６９０】
複数針のホルダーと皮下マルチチャンネル注入ポート、Ｂｒｏｗｎにより説明されており、例えば米国特許第４，６９５，２７３号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｂｒｏｗｎによれば、針ホルダーに設けられた複数の針が、注入ポートの隔壁を貫通して挿入され、注入ポート内の隔離チャンバーに通じる。
【０６９１】
デュアル皮下注射器が、Ｈｏｒｎにより説明されており、例えば米国特許第３，５５２，３９４号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｈｏｒｎによれば、スタイルと長さが異なってよい２本の針が６８ｍｍ未満の間隔を空けて装置に組み込まれ、深さの異なる注射を可能にする。
【０６９２】
複数の針と複数の流体コンパートメントを持つ注射器が、Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇにより説明されており、例えば米国特許第３，５７２，３３６号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇによれば、複数の流体コンパートメントを持つ注射器に複数の針が組み込まれ、１つの注射剤へと混合できない複数の不適合性薬剤を同時に投与することができる。
【０６９３】
流体を皮内注射するための手術器具が、Ｅｌｉｓｃｕらにより説明されており、例えば米国特許第２，５８８，６２３号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｅｌｉｓｃｕによれば、複数の針が手術器具に組み込まれ、この器具から流体が皮内に注射されて比較的広く分散する。
【０６９４】
物質を複数の乳管に同時送達するための器具が、Ｈｕｎｇにより説明されており、例えば欧州特許第１８１８０１７号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｈｕｎｇによれば、複数のルーメンが装置に組み込まれ、この装置が管ネットワークの開口部を通って挿入され、流体を管ネットワークに送達する。
【０６９５】
心臓その他の器官の組織に薬剤を導入するためのカテーテルが、Ｔｋｅｂｕｃｈａｖａにより説明されており、例えば国際公開第２００６１３８１０９号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｔｋｅｂｕｃｈａｖａによれば、組み込まれた２本の湾曲針が平らな軌道を描いて器官壁部に入る。
【０６９６】
薬剤を送達するための装置が、Ｍｃｋａｙらにより説明されており、例えば国際公開第２００６１１８８０４号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｍｃｋａｙによれば、各針に複数の開口部が設けられた複数の針が装置に組み込まれ、組織への局所的送達（脊椎円板の内部円板空間等）を促進する。
【０６９７】
免疫調節物質を哺乳動物皮膚の皮内空間に直接送達する方法が、Ｐｅｔｔｉｓにより説明されており、例えば国際公開第２００４０２００１４号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｐｅｔｔｉｓによれば、複数の針が装置に組み込まれ、針を通じて０．３ｍｍ〜２ｍｍの深さに物質が送達される。
【０６９８】
全身吸収および薬物動態の改善のため、皮膚内の少なくとも２つの区画に物質を投与する方法および装置が、Ｐｅｔｔｉｓらにより説明されており、例えば国際公開第２００３０９４９９５号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｐｅｔｔｉｓによれば、約３００μｍ〜約５ｍｍ長さの複数の針が装置に組み込まれ、この装置から皮内および皮下組織の複数の区画に同時に送達される。
【０６９９】
針とローラーを備えた薬剤送達装置が、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎらにより説明されており、例えば国際公開第２０１２００６２５９号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｚｉｍｍｅｒｍａｎによれば、ローラー内に配置された複数の中空針が装置に組み込まれ、ローラーの回転と当時にリザーバーの内容物が針を通って送達される。
【０７００】
ステント等の薬剤送達装置は当技術分野で公知であり、例えば米国特許出願公開第２００６００２０３２９号、第２００４０１７２１２７号、および第２０１００１６１０３２号（参照により、これらの文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。本明細書に記載の修飾核酸分子およびｍｍＲＮＡの製剤は、ステントを用いて送達してよい。加えて、本明細書で使用するステントは、複数の修飾核酸分子および／または製剤を、同時または様々な送達速度で送達することが可能であり得る。ステント製造者の非限定的な例として、ＣＯＲＤＩＳ（登録商標）（フロリダ州マイアミ）（ＣＹＰＨＥＲ（登録商標））、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（マサチューセッツ州ネイティック）（ＴＡＸＵＳ（登録商標））、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ（ミネソタ州ミネアポリス）（ＥＮＤＥＡＶＯＵＲ（登録商標））、およびＡｂｂｏｔｔ（イリノイ州アボットパーク）（ＸＩＥＮＣＥ  Ｖ（登録商標））が挙げられる。
カテーテルおよび／またはルーメンを利用した方法および装置
カテーテルおよびルーメンを用いた方法および装置を使用して、本発明のｍｍＲＮＡを単回投与、多回投与、または分割投与スケジュールで投与してよい。このような方法および装置について、以下に記載する。
【０７０１】
損傷した心筋層へのカテーテルを用いた骨格筋芽細胞の送達が、Ｊａｃｏｂｙらにより説明されており、例えば米国特許出願公開第２００６０２６３３３８号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｊａｃｏｂｙによれば、複数の針が装置に組み込まれ、装置の少なくとも一部分が血管に挿入されて、針を通じて対象の心臓の局所領域に細胞組成物が送達される。
【０７０２】
神経毒を用いて喘息を治療するための器具が、Ｄｅｅｍらにより説明されており、例えば米国特許出願公開第２００６０２２５７４２号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｄｅｅｍによれば、複数の針が装置に組み込まれ、この装置から針を通じて神経毒が気管支組織に送達される。
【０７０３】
多重成分治療剤を投与する方法が、Ｎａｙａｋにより説明されており、例えば米国特許第７，６９９，８０３号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｎａｙａｋによれば、複数の注射カニューレを装置に組み込んでよく、この装置に、治療剤が送達される組織の送達深さを制御するための深さスロットを含めてよい。
【０７０４】
チャンネルを除去して少なくとも１つの治療剤を所望の組織領域に送達するための外科装置が、ＭｃＩｎｔｙｒｅらにより説明されており、例えば米国特許第８，０１２，０９６号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。ＭｃＩｎｔｙｒｅによれば、複数の針が装置に組み込まれ、チャンネルを囲む組織領域に治療剤が分配される。この装置は、特に経心筋的血行再建術によく適している。
【０７０５】
哺乳類の雌における膀胱の機能障害を治療する方法が、Ｖｅｒｓｉらにより説明されており、例えば米国特許第８，０２９，４９６号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｖｅｒｓｉによれば、規則的に並んだマイクロ針が装置に組み込まれ、この装置から針を通じて治療剤が膀胱三角に直接送達される。
【０７０６】
可撓性の生体関門に流体を送達する装置および方法が、Ｙｅｓｈｕｒｕｎらにより説明されており、例えば米国特許第７，９９８，１１９号（装置）および第８，００７，４６６号（方法）（参照により、これらの文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｙｅｓｈｕｒｕｎによれば、装置に設けられたマイクロ針が可撓性生体関門を貫通して伸長し、中空マイクロ針の穴を通じて流体が注射される。
【０７０７】
心外膜面を有する心臓の組織領域に物質を心外膜注射し体幹内に配置する方法が、Ｂｏｎｎｅｒらにより説明されており、例えば米国特許第７，６２８，７８０号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｂｏｎｎｅｒによれば、装置には細長いシャフトと末端の注射ヘッドが設けられ、これにより、針を組織内へと動かし、針を通じて組織に薬剤を注射する。
【０７０８】
穿刺を塞ぐ装置が、Ｎｉｅｌｓｅｎらにより説明されており、例えば米国特許第７，９７２，３５８号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｎｉｅｌｓｅｎによれば、複数の針が装置に組み込まれ、この装置から穿刺路周辺組織に閉鎖剤が送達される。
【０７０９】
筋形成および血管形成の方法が、Ｃｈｉｕらにより説明されており、例えば米国特許第６，５５１，３３８号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｃｈｉｕによれば、少なくとも１．２５ｍｍの最大直径と、６〜２０ｍｍの穿刺深さを提供できる有効長さを有する５〜１５本の針を装置に組み込み、この装置を心筋近くに挿入する。この装置から、これらの針の少なくとも一部分にある導管を通じて、外来性の血管新生因子または筋原性因子を心筋に供給する。
【０７１０】
前立腺組織の治療方法が、Ｂｏｌｍｓｊらにより説明されており、例えば米国特許第６，５２４，２７０号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｂｏｌｍｓｊによれば、装置は、尿道に挿入されるカテーテルを含み、少なくとも１つの中空先端部を有し、この先端部は周辺の前立腺組織内に伸長可能である。この先端部を通じて、収斂薬と鎮痛剤が前立腺組織に投与される。
【０７１１】
骨内部位に流体を注入する方法が、Ｆｉｎｄｌａｙらにより説明されており、例えば米国特許第６，７６１，７２６号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｆｉｎｄｌａｙによれば、複数の針が装置に組み込まれ、この装置は、軟質材層で覆われた硬い殻の物質を貫通でき、この硬い殻の物質より下の所定距離の位置に流体を送達する。
【０７１２】
薬剤を血管壁に注射する装置が、Ｖｉｇｉｌらにより説明されており、例えば米国特許第５，７１３，８６３号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｖｉｇｉｌによれば、装置内の各屈曲性チューブに複数の注射器が取り付けられ、この注射器から薬物流体がマルチルーメンカテーテルを通じて屈曲性チューブに導入され、注射器から血管壁に注入される。
【０７１３】
身体通路周辺の組織に治療剤および／または診断剤を送達するカテーテルが、Ｆａｘｏｎらにより説明されており、例えば米国特許第５，４６４，３９５号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｆａｘｏｎによれば、少なくとも１本のニードルカニューレがカテーテルに組み込まれ、カテーテルから外に突き出る針を通じて、所望の薬剤が組織に送達される。
【０７１４】
治療剤を送達するためのバルーンカテーテルが、Ｏｒｒらにより説明されており、例えば国際公開第２０１００２４８７１号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｏｒｒによれば、複数の針が装置に組み込まれ、この装置から組織内の様々な深さに治療剤が送達される。別の一態様では、薬剤溶出バルーンを用いて本明細書に記載の薬剤を送達してよい。薬剤溶出バルーンは標的病変適用において使用してよい。その例として、ステント内再狭窄、蛇行血管内病変、分岐部病変、大腿／膝窩病変、および膝より下の病変の治療が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７１５】
管腔付近に配置された組織に治療剤（例えば、修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡ）を送達する装置が、Ｐｅｒｒｙらにより説明されており、例えば米国特許出願公開第２０１００１２５２３９号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｐｅｒｒｙによれば、カテーテルに設けられるバルーンは、当技術分野で公知の治療剤またはＰｅｒｒｙに記載の治療剤が塗布されていてよい。バルーンが膨張すると、治療剤が周辺組織に接触する。さらに、バルーンに施されたコーティングの温度を変えて組織に治療剤を放出する目的で、この装置は熱源を有していてもよい。
電流を利用した方法および装置
電流を利用した方法および装置を使用して、本発明のｍｍＲＮＡを、本明細書で教示される単回投与、多回投与、または分割投与計画に従って投与してよい。このような方法および装置について、以下に記載する。
【０７１６】
電気コラーゲン導入治療装置が、Ｍａｒｑｕｅｚにより説明されており、例えば米国特許出願公開第２００９０１３７９４５号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｍａｒｑｕｅｚによれば、複数の針が装置に組み込まれ、これらの針が皮膚を繰り返し突き刺し、先に皮膚に塗布された物質の一部分を皮膚内に導入する。
【０７１７】
動電システムが、Ｅｔｈｅｒｅｄｇｅらにより説明されており、例えば米国特許出願公開第２００７０１８５４３２号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｅｔｈｅｒｅｄｇｅによれば、いくつかのマイクロ針が装置に組み込まれ、この装置は、電流により針を通じて薬剤を標的治療部位に送り込む。
【０７１８】
イオン導入装置が、Ｍａｔｓｕｍｕｒａらにより説明されており、例えば米国特許第７，４３７，１８９号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｍａｔｓｕｍｕｒａによれば、複数の針が装置に組み込まれ、この装置は、イオン化可能な薬剤を比較的高速または高効率に生体に送達することができる。
【０７１９】
無針注射および電気穿孔法による生物活性薬剤の皮内送達が、Ｈｏｆｆｍａｎｎらにより説明されており、例えば米国特許第７，１７１，２６４号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｈｏｆｆｍａｎｎによれば、１つ以上の無針注射器が電気穿孔装置に組み込まれ、無針注射と電気穿孔法の組み合わせで十分に皮膚内、筋肉内、または粘膜内の細胞に薬剤を導入することができる。
【０７２０】
電気透過処理が介在する細胞内送達の方法が、Ｌｕｎｄｋｖｉｓｔらにより説明されており、例えば米国特許第６，６２５，４８６号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｌｕｎｄｋｖｉｓｔによれば、一対の針電極をカテーテルに組み込む。このカテーテルを体管腔内に配置した後、針電極を伸長させ、体管腔周辺の組織内に貫入させる。次に、この装置は、上記針電極の少なくとも一方を通じて薬剤を導入し、上記一対の針電極により電場をかける。これにより、薬剤が細胞膜を通過して治療部位の細胞に到達できる。
【０７２１】
経皮免疫化のための送達システムが、Ｌｅｖｉｎらにより説明されており、例えば国際公開第２００６００３６５９号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｌｅｖｉｎによれば、複数の電極が装置に組み込まれ、この装置が電極間に電気エネルギーをかける。これにより、皮膚内にマイクロチャンネルが生成され、経皮送達が促進される。
【０７２２】
ＲＦエネルギーを皮膚内に送達する方法が、Ｓｃｈｏｍａｃｋｅｒにより説明されており、例えば国際公開第２０１１１６３２６４号（参照により、この文献の内容全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。Ｓｃｈｏｍａｃｋｅｒによれば、複数の針が装置に組み込まれ、この装置は、真空を施すことにより皮膚を引き込んでプレートと接触させる。これにより、プレートに設けられた穴を通って針が皮膚内に挿入され、ＲＦエネルギーが送達される。
定義
本明細書の様々な箇所で、本発明の化合物の置換基が、群で、または範囲で開示されている。本開示は、そのような群および範囲の構成要素の個々の別の組み合わせの１つ１つを含むことが具体的に意図されている。たとえば、「Ｃ１−６アルキル」という用語は、メチル、エチル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキルおよびＣ６アルキルが個々に開示されることが具体的に意図される。
約：本明細書で使用する「約」という用語は、列挙された値の±１０％を意味する。
組み合わせて投与される：本明細書で使用する「組み合わせて投与される」または「併用投与」という用語は、２つ以上の剤（たとえば、本明細書に記述される抗微生物ポリペプチド等の抗微生物ポリペプチド（たとえば、抗細菌ポリペプチド）をコードする修飾核酸またはｍｍＲＮＡ、および抗微生物剤（たとえば、抗微生物ポリペプチドまたは本明細書に記述される小分子抗微生物化合物等））を、対象に同時に投与するか、または、患者に各剤の効果が重複しうるような間隔以内で投与することを意味する。いくつかの実施態様において、それらはお互いに約６０、３０、１５、１０、５または１分以内に投与される。いくつかの実施形態において、剤の投与は、組み合わせ効果（例えば相乗効果）が得るのに十分に近い間隔を互いに置く。
動物：本明細書で使用する「動物」という用語は、動物界の任意の構成員を指す。いくつかの実施態様において、「動物」とは、任意の発達段階にあるヒトを指す。いくつかの実施態様において、「動物」とは、任意の発達段階にある非ヒト動物を指す。ある特定の実施態様において、非ヒト動物は、哺乳類（たとえば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類またはブタ等）である。いくつかの実施態様において、動物とは、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類および昆虫を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、動物は、遺伝子操作された動物であるトランスジェニック動物、またはクローンである。
対象抗原または所望の抗原：本明細書で使用する「対象の抗原」または「所望の抗原」という用語には、抗体および断片、突然変異体、変異体および本明細書に記述されるそれらの改変物に免疫特異的に結合される、本明細書に提示されるタンパク質および他の生体分子を含む。対象抗原の例としては、インスリン、インスリン様成長因子、ｈＧＨ、ｔＰＡ、サイトカイン類（たとえば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８等のインターロイキン類（ＩＬ）、インターフェロン（ＩＦＮ）α、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮωまたはＩＦＮτ、ＴＮＦαおよびＴＮＦβ、ＴＮＦγ、ＴＲＡＩＬ等の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１およびＶＥＧＦ等）が挙げられるが、これらに限定されない。
およそ：本明細書で使用する対象の１つ以上の値へ適用させた「およそ」または「約」という用語は、規定された参照値に類似である値を指す。ある特定の実施態様において、「およそ」または「約」という用語は、他で定義または他で文脈上明らかでない限りは、規定された参照値いずれかの方向（大きいか、小さいか）で、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％または１％未満以内にある値の範囲を指す（そのような数値が可能値の１００％を超える場合を除く）。
関連する：本明細書で使用する「関連する」「結合される」「結び付けられる」「付着される」および「繋がれる」という用語は、２つ以上の部分に対して用いられる場合、その部分が物理的に他方と、直接的に関連もしくは結合し、または、結合剤として機能する１つ以上の追加の部分を介して関連もしくは結合し、十分に安定な構造を形成し、その構造が用いられる条件下（たとえば、生理学的条件下）で、物理的にそれら部分が関連したままでいることを意味する。「関連」は、必ずしも直接的な共有化学結合を厳密に介する必要性はない。また、「関連した」実体が物理的に関連したままの状態であるように、十分に安定な結合性に基づいたイオン結合または水素結合またはハイブリダイゼーションを意味しても良い。
二機能性：本明細書で使用する「二機能性」という用語は、少なくとも２つの機能を有する、または維持している任意の物質、分子または部分を指す。その機能は、同じ結果をもたらすものでも、異なる結果をもたらすものであってもよい。機能を生み出す構造は、同じであっても異なっていても良い。たとえば、本発明の二機能性に修飾されたＲＮＡは、細胞毒性のペプチドをコードし（第一の機能）、一方で、コードＲＮＡを含有するそれらヌクレオチドは、それ自体で細胞毒性である（第二の機能）。この例において、二機能性に修飾されたＲＮＡの癌細胞への送達は、癌を改善もしくは治療しうるペプチドまたはタンパク質を生み出すだけでなく、ヌクレオチドの細胞毒性ペイロードを運搬し、修飾ＲＮＡの翻訳が無くとも、その細胞の分解は必ず発生する。
生体適合性：本明細書で使用する「生体適合性」という用語は、損傷、毒性または免疫システムによる拒絶をほとんどもたらさずに、または全くもたらさずに、生細胞、組織、器官またはシステムと適合可能であることを意味する。
生分解性：本明細書で使用する「生分解性」という用語は、生物の作用により、無害な産物に分解されることができることを意味する。
生物活性のある：本明細書で使用する「生物活性のある」という文言は、生物学的システムおよび／または生命体の中で、活性を有する任意の物質の特性を指す。たとえば、生命体に投与された際に、その生命体に生物学的な影響を与える物質は、生物活性があるとみなされる。特定の実施態様において、修飾核酸または、本発明のｍｍＲＮＡは、修飾核酸またはｍｍＲＮＡの部分の一部分に生物活性があれば、または生物学的に関連があるとみなされている活性をミミックすれば、生物活性があるとみなされうる。
化学的用語：以下に、「アシル」〜「チオール」までの様々な化学用語の定義を提示する。
【０７２３】
本明細書で使用する「アシル」という用語は、本明細書に定義されるカルボニル基を介して、元の分子群に付着する、本明細書に定義される水素またはアルキル基（たとえば、ハロアルキル基）を表し、ホルミル（すなわち、カルボキシアルデヒド基）、アセチル、プロピニル、ブタノイル等に例示される。例となる非置換アシル基は、１〜７炭素、１〜１１炭素または１〜２１炭素を含む。いくつかの実施形態において、アルキル基はさらに、本明細書に記述されるように、１、２、３または４の置換基で置換される。
【０７２４】
本明細書で使用する「アシルアミノ」という用語は、本明細書に定義されるアミノ基を介して元の分子群に付着される（すなわち、−Ｎ（ＲＮ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｒであり、ここで、ＲはＨまたは任意選択的に置換されたＣ１−６、Ｃ１−１０またはＣ１−２０アルキル基であり、ＲＮ１は本明細書に定義される）、本明細書に定義されるアシル基を表す。例となる非置換アシルアミノ基は、１〜４１炭素（たとえば、１〜７、１〜１３、１〜２１、２〜７、２〜１３、２〜２１または２〜４１炭素）を含む。いくつかの実施形態において、アルキル基はさらに、本明細書に記述されるように１、２、３または４の置換基で置換され、および／または、アミノ基は、−ＮＨ２または−ＮＨＲＮ１であり、ここで、ＲＮ１は、独立して、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＲＮ２２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、アルキルまたはアリールであり、各ＲＮ２はＨ、アルキルまたはアリールであってもよい。
【０７２５】
本明細書で使用する「アシルオキシ」という用語は、酸素原子を介して元の分子群に付着される（すなわち、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒであり、ＲはＨまたは任意選択的に置換されたＣ１−６、Ｃ１−１０またはＣ１−２０アルキル基である）、本明細書に定義されるアシル基を表す。例となる非置換アシルオキシ基は、１〜２１炭素（たとえば、１〜７または１〜１１炭素）を含む。いくつかの実施形態において、アルキル基はさらに、本明細書に記述されるように、１、２、３または４の置換基で置換され、および／またはアミノ基は、−ＮＨ２または−ＮＨＲＮ１であり、ここで、ＲＮ１は、独立して、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＲＮ２２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、アルキルまたはアリールであり、各ＲＮ２はＨ、アルキルまたはアリールであってもよい。
【０７２６】
本明細書で使用する「アルカリル」という用語は、本明細書に定義されるアルキレン基を介して元の分子群に付着される、本明細書に定義されるアリール基を表す。例となる非置換アルカリル基は、７〜３０炭素（たとえば、７〜１６または７〜２０炭素であり、たとえば、Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、Ｃ１−１０アルク−Ｃ６−１０アリール、またはＣ１−２０アルク−Ｃ６−１０アリール）である。いくつかの実施形態において、アルキレンおよびアリールはそれぞれ、本明細書に定義されるように、１、２、３または４の置換基で、各基がさらに置換されても良い。接頭辞「アルク−（ａｌｋ−）」が先行する他の基も同様に定義され、「アルク」は、他で言及されない限り、Ｃ１−６アルキレンを指し、付着される化学構造は、本明細書に定義される。
【０７２７】
「アルクシクロアルキル」という用語は、本明細書に定義されるアルキレン基（たとえば、１〜４炭素、１〜６炭素、１〜１０炭素または１〜２０炭素のアルキレン基）を介して元の分子群に付着される、本明細書に定義されるシクロアルキル基を表す。いくつかの実施形態において、アルキレンおよびシクロアルキルはそれぞれ、本明細書に定義されるように、１、２、３または４の置換基で、各基がさらに置換されても良い。
【０７２８】
本明細書で使用する「アルケニル」という用語は、他で特定されない限り、１つ以上の炭素−炭素二重結合を含有する２〜２０炭素（たとえば、２〜６炭素または２〜１０炭素）の一価直鎖基または一価分枝鎖基を表し、エチニル、１−プロペニル、２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル等に例示される。アルケニル類は、シス異性体およびトランス異性体の両方を含む。アルケニル基は、本明細書に定義されるアミノ、アリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリル（たとえば、ヘテロアリール）から独立して選択される置換基、または、本明細書に記述される例となるアルキル置換基の任意のものの１、２、３または４つと任意選択的に置換されてもよい。
【０７２９】
「アルケニルオキシ」という用語は、他で特定されない限り、式−ＯＲ（Ｒは、Ｃ２−２０アルケニル基（たとえば、Ｃ２−６またはＣ２−１０アルケニル）である）の化学置換基を表す。例となるアルケニルオキシ基は、エテニルオキシ、プロペニルオキシ等を含む。いくつかの実施形態において、アルケニル基は、本明細書に定義されるように、１、２、３または４の置換基（たとえば、ヒドロキシ基等）でさらに置換されてもよい。
【０７３０】
「アルクヘテロアリール」という用語は、本明細書に定義されるアルキレン基を介して元の分子群に付着される、本明細書に定義されるヘテロアリール基を指す。例となる非置換アルクヘテロアリール基は、２〜３２炭素（たとえば、２〜２２炭素、２〜１８炭素、２〜１７炭素、２〜１６炭素、３〜１５炭素、２〜１４炭素、２〜１３炭素または２〜１２炭素であり、たとえば、Ｃ１−６アルク−Ｃ１−１２ヘテロアリール、Ｃ１−１０アルク−Ｃ１−１２ヘテロアリール、またはＣ１−２０アルク−Ｃ１−１２ヘテロアリール）である。いくつかの実施形態において、アルキレンおよびヘテロアリールはそれぞれ、本明細書に各基に対して定義されるように、１、２、３または４の置換基で、さらに置換されても良い。アルクヘテロアリール基は、アルクヘテロシクリル基のサブセットである。
【０７３１】
「アルクヘテロシクリル」という用語は、本明細書に定義されるアルキレン基を介して元の分子群に付着される、本明細書に定義されるヘテロシクリル基を表す。例となる非置換アルクヘテロシクリル基は、２〜３２炭素（たとえば、２〜２２炭素、２〜１８炭素、２〜１７炭素、２〜１６炭素、３〜１５炭素、２〜１４炭素、２〜１３炭素または２〜１２炭素であり、たとえば、Ｃ１−６アルク−Ｃ１−１２ヘテロシクリル、Ｃ１−１０アルク−Ｃ１−１２ヘテロシクリル、またはＣ１−２０アルク−Ｃ１−１２ヘテロシクリル）である。いくつかの実施形態において、アルキレンおよびヘテロシクリルはそれぞれ、本明細書に各基に対して定義されるように、１、２、３または４の置換基で、さらに置換されてもよい。
【０７３２】
「アルコキシ」という用語は、式−ＯＲの化学置換基を表し、他で特定されない限り、Ｒは、Ｃ１−２０アルキル基（たとえば、Ｃ１−６またはＣ１−１０アルキル）である。例となるアルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ（たとえば、ｎ−プロポキシおよびイソプロポキシ等）、ｔ−ブトキシ等が挙げられる。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に定義されるように、１、２、３または４の置換基（たとえば、ヒドロキシまたはアルコキシ）でさらに置換されてもよい。
【０７３３】
「アルコキシアルコキシ」という用語は、アルコキシ基で置換されたアルコキシ基を表す。例となる非置換アルコキシアルコキシ基は、２〜４０炭素（たとえば、２〜１２炭素または２〜２０炭素であり、たとえば、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−１０アルコキシ−Ｃ１−１０アルコキシ、またはＣ１−２０アルコキシ−Ｃ１−２０アルコキシ）を含む。いくつかの実施形態において、各アルコキシ基は、本明細書に定義されるように、１、２、３または４の置換基でさらに置換されてもよい。
【０７３４】
「アルコキシルキル」という用語は、アルコキシ基で置換されたアルキル基を表す。例となる非置換アルコキシアルキル基は、２〜４０炭素（たとえば、２〜１２炭素または２〜２０炭素であり、たとえば、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−１０アルコキシ−Ｃ１−１０アルキル、またはＣ１−２０アルコキシ−Ｃ１−２０アルキル）を含む。いくつかの実施形態において、アルキルおよびアルコキシはそれぞれ、本明細書に各基に対して定義されるように、１、２、３または４の置換基で、さらに置換されてもよい。
【０７３５】
本明細書で使用する「アルコキシカルボニル」という用語は、カルボニル原子（たとえば、−Ｃ（Ｏ）−ＯＲであり、ここで、Ｒは、Ｈまたは任意選択的に置換されたＣ１−６、Ｃ１−１０またはＣ１−２０アルキル基である）を介して元の分子群に付着される、本明細書に定義されるアルコキシを表す。例となる非置換アルコキシカルボニルは、１〜２１炭素（たとえば、１〜１１炭素または１〜７炭素）を含む。いくつかの実施形態において、アルコキシ基は、本明細書に定義されるように、１、２、３または４の置換基でさらに置換される。
【０７３６】
本明細書で使用する「アルコキシカルボニルアルコキシ」という用語は、本明細書に定義されるアルコキシカルボニル基（たとえば、−Ｏ−アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＯＲであり、ここで、Ｒは、任意選択的に置換されたＣ１−６、Ｃ１−１０またはＣ１−２０アルキル基である）で置換される、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す。例となる非置換アルコキシカルボニルアルコキシは、３〜４１炭素（たとえば、３〜１０炭素、３〜１３炭素、３〜１７炭素、３〜２１炭素、３〜３１炭素であり、たとえば、Ｃ１−６アルコキシカルボニル−Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−１０アルコキシカルボニル−Ｃ１−１０アルコキシまたは、Ｃ１−２０アルコキシカルボニル−Ｃ１−２０アルコキシ等）を含む。いくつかの実施形態において、各アルコキシ基は、独立して、本明細書に記述されるように、１、２、３または４の置換基（たとえば、ヒドロキシ基）でさらに置換される。
【０７３７】
本明細書で使用する「アルコキシカルボニルアルキル」という用語は、本明細書に定義されるアルコキシカルボニル基（たとえば、−アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＯＲであり、ここで、Ｒは、任意選択的に、置換されたＣ１−２０、Ｃ１−１０またはＣ１−６アルキル基である）で置換される、本明細書に定義されるアルキル基を表す。例となる非置換アルコキシカルボニルアルキルは、３〜４１炭素（たとえば、３〜１０炭素、３〜１３炭素、３〜１７炭素、３〜２１炭素、３〜３１炭素であり、たとえば、Ｃ１−６アルコキシカルボニル−Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−１０アルコキシカルボニル−Ｃ１−１０アルキルまたは、Ｃ１−２０アルコキシカルボニル−Ｃ１−２０アルキル等）を含む。いくつかの実施形態において、各アルキル基およびアルコキシ基は、独立して、本明細書に記述されるように、１、２、３または４の置換基（たとえば、ヒドロキシ基）でさらに置換される。
【０７３８】
本明細書で使用する「アルキル」という用語は、他で特定されない限り、１〜２０炭素（たとえば、１〜１０炭素または１〜６炭素）の直鎖飽和基および分枝飽和基の両方を含む。アルキル基は、メチル、エチル、ｎ−プロピルおよびｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチル等により例示され、任意選択的に、１、２、３、または２炭素以上のアルキル基の場合には、４の置換基で、置換されてもよく、当該置換基は、独立して、（１）Ｃ１−６アルコキシ；（２）Ｃ１−６アルキルスルフィニル；（３）本明細書に定義されるアミノ（たとえば、非置換アミノ（すなわち、−ＮＨ２）または置換アミノ（すなわち、−Ｎ（ＲＮ１）２）であり、ここで、ＲＮ１は、アミノで定義されている）；（４）Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−６アルコキシ；（５）アジド；（６）ハロ；（７）（Ｃ２−９ヘテロシクリル）オキシ；（８）ヒドロキシ；（９）ニトロ；（１０）オキソ（たとえば、カルボキシアルデヒドまたはアシル）；（１１）Ｃ１−７スピロシクリル；（１２）チオアルコキシ；（１３）チオール；（１４）−ＣＯ２ＲＡ´であり、ＲＡ´は、（ａ）Ｃ１−２０アルキル（たとえば、Ｃ１−６アルキル）、（ｂ）Ｃ２−２０アルケニル（たとえば、Ｃ２−６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、（ｆ）アミノ−Ｃ１−２０アルキル、（ｇ）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコールであり、ｓ１は、１〜１０の整数（たとえば、１〜６または１〜４）で、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０の整数（たとえば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６または１〜１０）であり、および、Ｒ´は、ＨまたはＣ１−２０アルキル、（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコールであり、ｓ１は、１〜１０の整数（たとえば、１〜６または１〜４）であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０の整数（たとえば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６または１〜１０）であり、および、各ＲＮ１は、独立して、水素または任意選択的に置換されたＣ１−６アルキル、からなる群から選択される；（１５）−Ｃ（Ｏ）ＮＲＢ’ＲＣ’であり、ＲＢ´およびＲＣ´のそれぞれは、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリールおよび（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から選択される；（１６）−ＳＯ２ＲＤ´であり、ＲＤ´は、（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、（ｃ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）ヒドロキシ、からなる群から選択される；（１７）−ＳＯ２ＮＲＥ´ＲＦ´であり、ＲＥ´およびＲＦ´のそれぞれは、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリールおよび（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、からなる群から選択される；（１８）−Ｃ（Ｏ）ＲＧ´であり、ここで、ＲＧ´は、（ａ）Ｃ１−２０アルキル（たとえば、Ｃ１−６アルキル）、（ｂ）Ｃ２−２０アルケニル（たとえば、Ｃ２−６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６−���０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、（ｆ）アミノ−Ｃ１−２０アルキル、（ｇ）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコールであり、ｓ１は、１〜１０の整数（たとえば、１〜６または１〜４）で、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０の整数（たとえば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６または１〜１０）であり、および、Ｒ´は、ＨまたはＣ１−２０アルキル、（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコールであり、ｓ１は、１〜１０の整数（たとえば、１〜６または１〜４）であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０の整数（たとえば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６または１〜１０）であり、および、各ＲＮ１は、独立して、水素または任意選択的に置換Ｃ１−６アルキル、からなる群から選択される；（１９）−ＮＲＨ’Ｃ（Ｏ）ＲＩ’であり、ここで、ＲＨ´は、（ａ１）水素および（ｂ１）Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、ＲＩ´は、（ａ２）Ｃ１−２０アルキル（たとえば、Ｃ１−６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２−２０アルケニル（たとえば、Ｃ２−６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６−１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、（ｆ２）アミノ−Ｃ１−２０アルキル、（ｇ２）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール（ここで、ｓ１は、１〜１０の整数（たとえば、１〜６または１〜４）で、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０の整数（たとえば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６または１〜１０）であり、および、Ｒ´は、ＨまたはＣ１−２０アルキル）、（ｈ２）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコールであり、ｓ１は、１〜１０の整数（たとえば、１〜６または１〜４）であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０の整数（たとえば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６または１〜１０）であり、および、各ＲＮ１は、独立して、水素または任意選択的に置換されたＣ１−６アルキル、からなる群から選択される；（２０）ＮＲＪ´Ｃ（Ｏ）ＯＲＫ´であり、ここで、ＲＪ´は、（ａ１）水素および（ｂ１）Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、ＲＫ´は、（ａ２）Ｃ１−２０アルキル（たとえば、Ｃ１−６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２−２０アルケニル（たとえば、Ｃ２−６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６−１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、（ｆ２）アミノ−Ｃ１−２０アルキル、（ｇ２）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール（ここで、ｓ１は、１〜１０の整数（たとえば、１〜６または１〜４）で、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０の整数（たとえば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６または１〜１０）であり、および、Ｒ´は、ＨまたはＣ１−２０アルキル）、（ｈ２）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコールであり、ｓ１は、１���１０の整数（たとえば、１〜６または１〜４）であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０の整数（たとえば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６または１〜１０）であり、および、各ＲＮ１は、独立して、水素または任意選択的に置換Ｃ１−６アルキル、からなる群から選択される；および、（２１）アミジン、からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、これらの基のそれぞれは、本明細書に記述されるようにさらに置換されてもよい。たとえば、Ｃ１−アルカリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換され、各アリーロイル置換基を放出してもよい。
【０７３９】
本明細書で使用する「アルキレン」および接頭辞「アルク−」という用語は、２つの水素原子を除去することにより、直鎖飽和炭化水素または分枝鎖飽和炭化水素から得られる飽和二価炭化水素基を表し、メチレン、エチレン、イソプロピレン等に代表される。「Ｃｘ−ｙアルキレン」および接頭辞「Ｃｘ−ｙアルク−」という用語は、ｘ〜ｙの炭素を有するアルキレン基を表す。ｘ値の例としては、１、２、３、４、５および６であり、ｙ値の例としては、２、３、４、５、６、７、８、９，１０、１２、１４、１６、１８または２０（たとえば、Ｃ１−６、Ｃ１−１０、Ｃ２−２０、Ｃ２−６、Ｃ２−１０、またはＣ２−２０アルキレン）である。いくつかの実施形態において、アルキレンは、本明細書でアルキル基に対して定義されるように、１、２、３または４の置換基でさらに置換されてもよい。
【０７４０】
本明細書で使用する「アルキルスルフィニル」という用語は、−Ｓ（Ｏ）−基を介して元の分子群に付着されるアルキル基を表す。例となる非置換アルキルスルフィニル基は、１〜６炭素、１〜１０炭素、または１〜２０炭素である。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に定義されるように、１、２、３または４の置換基でさらに置換されてもよい。
【０７４１】
本明細書で使用する「アルキルスルフィニルアルキル」という用語は、アルキルスルフィニル基により置換される、本明細書に定義されるアルキル基を表す。例となる非置換アルキルスルフィニルアルキル基は、２〜１２炭素、２〜２０炭素または、２〜４０炭素である。いくつかの実施形態において、各アルキル基は、本明細書に定義されるように、１、２、３または４の置換基でさらに置換されてもよい。
【０７４２】
本明細書で使用する「アルキニル」という用語は、炭素−炭素三重結合を含有する、２〜２０炭素原子（たとえば、２〜４炭素、２〜６炭素または２〜１０炭素）の一価直鎖基または一価分枝鎖基を表し、エチニル、１−プロピニル等に代表される。アルキニル基は、独立して、本明細書に定義されるアリール、シクロアルキルもしくはヘテロシクリル（たとえばヘテロアリール）、または本明細書に記述される任意の例となるアルキル置換基から選択される１、２、３または４の置換基で任意選択的に置換されても良い。
【０７４３】
「アルキニルオキシ」という用語は、式−ＯＲの化学置換基を表し、他で特定されない限り、Ｒは、Ｃ２−２０アルキニル基（たとえば、Ｃ２−６またはＣ２−１０アルキニル）である。例となるアルキニルオキシ基は、エチニルオキシ、プロピニルオキシ等を含む。いくつかの実施形態において、アルキニル基は、本明細書に定義されるように、１、２、３または４の置換基（たとえば、ヒドロキシ基）でさらに置換されてもよい。
【０７４４】
本明細書で使用する「アミジン」という用語は、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２基を表す。
本明細書で使用する「アミノ」という用語は、−Ｎ（ＲＮ１）２を表し、ここで、各ＲＮ１は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｎ（ＲＮ２）２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、Ｎ−保護基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、アルカリル、シクロアルキル、アルクシクロアルキル、カルボキシアルキル、スルホアルキル、ヘテロシクリル（たとえば、ヘテロアリール）、またはアルクヘテロシクリル（たとえば、アルクヘテロアリール）であり、ここで、これら列挙されたＲＮ１基のそれぞれは、本明細書に定義されるように、各基を任意選択的に置換してもよく；または、２つのＲＮ１を結合させ、ヘテロシクリルまたはＮ−保護基を形成しても良く、および、各ＲＮ２は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールである。本発明のアミノ基は、非置換アミノ（すなわち、−ＮＨ２）または置換アミノ（すなわち、−Ｎ（ＲＮ１）２）であっても良い。好ましい態様としては、アミノは、−ＮＨ２または、−ＮＨＲＮ１であり、ＲＮ１は、独立して、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＲＮ２２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、アルキル、カルボキシアルキル、スルホアルキルまたはアリールであり、各ＲＮ２は、Ｈ、Ｃ１−２０アルキル（たとえば、Ｃ１−６アルキル）またはＣ６−１０アリールであっても良い。
【０７４５】
本明細書で使用する「アミノ酸」という用語は、側鎖、アミノ基および酸性基（たとえば、−ＣＯ２Ｈのカルボキシ基または−ＳＯ３Ｈのスルホ基）を有する分子を指し、ここで当該アミノ酸は側鎖、アミノ基、または酸性基（たとえば、側鎖）により元の分子群に付着される。いくつかの実施形態において、アミノ酸は、カルボニル基により元の分子群に付着され、ここで、側鎖またはアミノ基は、カルボニル基に付着される。側鎖の例としては、任意選択的に置換されたアルキル、アリール、ヘテロシクリル、アルカリル、アルクヘテロシクリル、アミノアルキル、カルバモイルアルキルおよびカルボキシアルキルが挙げられる。例となるアミノ酸としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシノルバリン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、ピロリシン、セレノシステイン、セリン、タウリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンが挙げられる。アミノ酸基は、１、２、３、または、２以上の炭素のアミノ酸基である場合には４つの置換基（（１）Ｃ１−６アルコキシ；（２）Ｃ１−６アルキルスルフィニル；（３）本明細書に定義されるアミノ（たとえば非置換アミノ（すなわち、−ＮＨ２）または置換アミノ（すなわち、−Ｎ（ＲＮ１）２）で、ＲＮ１はアミノに対し定義されたもの）；（４）Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−６アルコキシ；（５）アジド；（６）ハロ；（７）（Ｃ２−９ヘテロシクリル）オキシ；（８）ヒドロキシ；（９）ニトロ；（１０）オキソ（たとえば、カルボキシアルデヒドまたはアシル）；（１１）Ｃ１−７スピロシクリル；（１２）チオアルコキシ；（１３）チオール；（１４）−ＣＯ２ＲＡ´（ＲＡ´は、（ａ）Ｃ１−２０アルキル（たとえばＣ１−６アルキル）、（ｂ）Ｃ２−２０アルケニル（たとえば、Ｃ２−６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、（ｆ）アミノ−Ｃ１−２０アルキル、（ｇ）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール（ここで、ｓ１は、１〜１０の整数（たとえば、１〜６または１〜４）で、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０の整数（たとえば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６または１〜１０）であり、および、Ｒ´は、ＨまたはＣ１−２０アルキル）、および、（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコールであり、ｓ１は、１〜１０の整数（たとえば、１〜６または１〜４）であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０の整数（たとえば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６または１〜１０）であり、および、各ＲＮ１は、独立して、水素または任意選択的に置換されたＣ１−６アルキル）からなる群から選択される）；（１５）−Ｃ（Ｏ）ＮＲＢ´ＲＣ´（各ＲＢ´およびＲＣ´は、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリールおよび（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から独立して選択される）；（１６）−Ｓ���２ＲＤ´（ＲＤ´は、（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、（ｃ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）ヒドロキシ、からなる群から選択される）；（１７）−ＳＯ２ＮＲＥ´ＲＦ´（ＲＥ´およびＲＦ´のそれぞれは、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリールおよび（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリールからなる群から独立して選択される）；（１８）−Ｃ（Ｏ）ＲＧ´（ＲＧ´は、（ａ）Ｃ１−２０アルキル（たとえばＣ１−６アルキル）、（ｂ）Ｃ２−２０アルケニル（たとえば、Ｃ２−６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、（ｆ）アミノ−Ｃ１−２０アルキル、（ｇ）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール（ここで、ｓ１は、１〜１０の整数（たとえば、１〜６または１〜４）で、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０の整数（たとえば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６または１〜１０）であり、および、Ｒ´は、ＨまたはＣ１−２０アルキル）、および、（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコールであり、ｓ１は、１〜１０の整数（たとえば、１〜６または１〜４）であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０の整数（たとえば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６または１〜１０）であり、および、各ＲＮ１は、独立して、水素または任意選択的に置換されたＣ１−６アルキル）からなる群から選択される）；（１９）−ＮＲＨ’Ｃ（Ｏ）ＲＩ’であり、ここで、ＲＨ´は、（ａ１）水素および（ｂ１）Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、ＲＩ´は、（ａ２）Ｃ１−２０アルキル（たとえば、Ｃ１−６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２−２０アルケニル（たとえば、Ｃ２−６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６−１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、（ｆ２）アミノ−Ｃ１−２０アルキル、（ｇ２）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール（ここで、ｓ１は、１〜１０の整数（たとえば、１〜６または１〜４）で、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０の整数（たとえば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６または１〜１０）であり、および、Ｒ´は、ＨまたはＣ１−２０アルキル）、（ｈ２）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコールであり、ｓ１は、１〜１０の整数（たとえば、１〜６または１〜４）であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０の整数（たとえば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６または１〜１０）であり、および、各ＲＮ１は、独立して、水素または任意選択的に置換Ｃ１−６アルキル、からなる群から選択される、からなる群から選択される；（２０）ＮＲＪ´Ｃ（Ｏ）ＯＲＫ´であり、ここで、ＲＪ´は、（ａ１）水素および（ｂ１）Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、ＲＫ´は、（ａ２）Ｃ１−２０アルキル（たとえば、Ｃ１−６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２−２０アルケニル（たとえば、Ｃ２−６アルケニル）、��ｃ２）Ｃ６−１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、（ｆ２）アミノ−Ｃ１−２０アルキル、（ｇ２）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール（ここで、ｓ１は、１〜１０の整数（たとえば、１〜６または１〜４）で、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０の整数（たとえば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６または１〜１０）であり、および、Ｒ´は、ＨまたはＣ１−２０アルキル）、（ｈ２）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ−ポリエチレングリコールであり、ｓ１は、１〜１０の整数（たとえば、１〜６または１〜４）であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０の整数（たとえば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６または１〜１０）であり、および、各ＲＮ１は、独立して、水素または任意選択的に置換されたＣ１−６アルキル、からなる群から選択される；（２１）アミジン、からなる群から独立して選択される置換基）で、任意選択的に置換されてもよい。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記述されるようにさらに置換されてもよい。
【０７４６】
本明細書で使用する「アミノアルコキシ」という用語は、本明細書に定義されるアミノ基で置換される、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す。アルキルおよびアミノはそれぞれ、各基（たとえば、ＣＯ２ＲＡ´（ＲＡ´は、（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール（たとえば、カルボキシ）からなる群から選択される））に対して本明細書に記述されるように、１、２、３または４の置換基で、さらに置換されてもよい。
【０７４７】
本明細書で使用する「アミノアルキル」という用語は、本明細書に定義されるアミノ基で置換される、本明細書に定義されるアルキル基を表す。アルキルおよびアミノはそれぞれ、各基（たとえば、ＣＯ２ＲＡ´（ＲＡ´は、（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール（たとえば、カルボキシ）からなる群から選択される））に対して本明細書に記述されるように、１、２、３または４の置換基で、さらに置換されてもよい。
【０７４８】
本明細書で使用する「アリール」という用語は、１または２つの芳香族環を有する単環、二環または多環の炭素環系を表し、フェニル、ナフチル、１，２−ジヒドロナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、アントラセニル（ａｎｔｈｒａｃｅｎｙｌ）、フェナントレニル、フルオレニル、インダニル、インデニル等に例示され、（１）Ｃ１−７アシル（たとえば、カルボキシアルデヒド）；（２）Ｃ１−２０アルキル（たとえば、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルスルフィニル−Ｃ１−６アルキル、アミノ−Ｃ１−６アルキル、アジド−Ｃ１−６アルキル、（カルボキシアルデヒド）−Ｃ１−６アルキル、ハロ−Ｃ１−６アルキル（たとえば、ペルフルオロアルキル）、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、ニトロ−Ｃ１−６アルキル、またはＣ１−６チオアルコキシ−Ｃ１−６アルキル）；（３）Ｃ１−２０アルコキシ（たとえば、ペルフルオロアルコキシ等のＣ１−６アルコキシ）；（４）Ｃ１−６アルキルスルフィニル；（５）Ｃ６−１０アリール；（６）アミノ；（７）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール；（８）アジド；（９）Ｃ３−８シクロアルキル；（１０）Ｃ１−６アルク−Ｃ３−８シクロアルキル；（１１）ハロ；（１２）Ｃ１−１２ヘテロシクリル（たとえば、Ｃ１−１２ヘテロアリール）；（１３）（Ｃ１−１２ヘテロシクリル）オキシ；（１４）ヒドロキシ；（１５）ニトロ；（１６）Ｃ１−２０チオアルコキシ（たとえば、Ｃ１−６チオアルコキシ）；（１７）−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ´（ｑは、０〜４の整数であり、ＲＡ´は、（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、からなる群から選択される）；（１８）−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢ´ＲＣ´（ｑは、０〜４の整数であり、ＲＢ´およびＲＣ´は、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、からなる群から独立して選択される）；（１９）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ´（ｑは、０〜４の整数であり、ＲＤ´は、（ａ）アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、（ｃ）アルク−Ｃ６−１０アリール、からなる群から選択される）；（２０）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥ´ＲＦ´（ｑは、０〜４の整数であり、ＲＥ´およびＲＦ´は、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、からなる群から独立して選択される）；（２１）チオール；（２２）Ｃ６−１０アリールオキシ；（２３）Ｃ３−８シクロアルコキシ；（２４）Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−６アルコキシ；（２５）Ｃ１−６アルク−Ｃ１−１２ヘテロシクリル（たとえば、Ｃ１−６アルク−Ｃ１−１２ヘテロアリール）；（２６）Ｃ２−２０アルケニル；および（２７）Ｃ２−２０アルキニル、からなる群から独立して選択される１、２、３、４または５の置換基で任意選択的に置換されてもよい。いくつかの実施形態において、これらの基のそれぞれは、本明細書に記述されるようにさらに置換されてもよい。たとえば、Ｃ１−アルカリルまたはＣ１−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれアリーロイルおよび（ヘテロシクリル）オイル置換基を放出してもよい。
【０７４９】
本明細書で使用する「アリールアルコキシ」という用語は、酸素原子を介して元の分子群に付着される、本明細書に定義されるアルカリル基を表す。非置換アルコキシルキル基の例としては、７〜３０炭素（たとえば、７〜１６炭素または７〜２０炭素で、たとえば、Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−１０アルコキシ、またはＣ６−１０アリール−Ｃ１−２０アルコキシ等）が挙げられる。いくつかの実施形態において、アリールアルコキシ基は、本明細書に定義されるように、１、２、３または４の置換基で置換されてもよい。
【０７５０】
「アリールオキシ」という用語は式−ＯＲ´の化学置換基を表し、ここで、Ｒ´は、他で特定されない限り、６〜１８炭素のアリール基である。いくつかの実施形態において、アリール基は、本明細書に定義されるように、１、２、３または４の置換基で置換されてもよい。
【０７５１】
本明細書で使用する「アリーロイル」という用語は、カルボニル基を介して元の分子群に付着される、本明細書に定義されるアリール基を表す。例となる非置換アリーロイル基は、７〜１１炭素である。いくつかの実施形態において、アリール基は、本明細書に定義されるように、１、２、３または４の置換基で置換されても良い。
【０７５２】
「アジド」という用語は、−Ｎ３基を表し、また、−Ｎ＝Ｎ＝Ｎとしても表される。
本明細書で使用する「二環」という用語は、２つの環を有する構造を指し、当該環は、芳香族でも、非芳香族でも良い。二環構造としては、本明細書に定義されるスピロシクリル基、および１つ以上の架橋を共有する２つの環（そのような架橋は、１つの原子または鎖（２、３またはそれ以上の原子を含む）を含むことができる）が挙げられる。例となる二環基としては、二環炭素環基（第一と第二の環は、本明細書に定義される炭素環基である）；二環アリール基（第一と第二の環は、本明細書に定義されるアリール基）；二環ヘテロシクリル基（第一の環はヘテロシクリル基であり、第二の環は炭素環（たとえばアリール）またはヘテロシクリル（たとえばヘテロアリール）基である）；二環ヘテロアリール基（第一の環はヘテロアリール基であり、第二の環は炭素環（たとえばアリール）またはヘテロシクリル（たとえばヘテロアリール）基である）が挙げられる。いくつかの実施形態において、二環基は、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基およびアリール基に対して本明細書に定義されるように、１、２、３または４の置換基で置換されていても良い。
【０７５３】
本明細書で使用する「炭素環の」および「炭素環」という用語は、任意選択的に置換されたＣ３−１２単環、二環、または三環を指し、当該環は芳香族または非芳香族であっても良く、炭素原子により環が形成されている。炭素環構造としては、シクロアルキル基、シクロアルケニル基およびアリール基が挙げられる。
【０７５４】
本明細書で使用する「カルバモイル」という用語は、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＲＮ１）２を表し、各ＲＮ１の意味は、本明細書に提示される「アミノ」の定義にある。
本明細書で使用する「カルバモイルアルキル」という用語は、本明細書に定義されるカルバモイル基で置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。アルキル基はさらに、本明細書に記述されるように、１、２、３または４の置換基で置換されていてもよい。
【０７５５】
本明細書で使用する「カルバミル」という用語は、−ＮＲＮ１Ｃ（＝Ｏ）ＯＲまたは−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＮ１）２という構造を有するカルバミン酸基を指し、各ＲＮ１の意味は、本明細書に提示される「アミノ」の定義にあり、Ｒは、本明細書に定義されるアルキル、シクロアルキル、アルクシクロアルキル、アリール、アルカリル、ヘテロシクリル（たとえば、ヘテロアリール）またはアルクヘテロシクリル（たとえば、アルクヘテロアリール）である。
【０７５６】
本明細書で使用する「カルボニル」という用語は、Ｃ（Ｏ）基を表し、また、Ｃ＝Ｏとしても表される。
「カルボキシアルデヒド」という用語は、−ＣＨＯという構造を有するアシル基を表す。
【０７５７】
本明細書で使用する「カルボキシ」という用語は、−ＣＯ２Ｈを意味する。
本明細書で使用する「カルボキシアルコキシ」という用語は、本明細書に定義されるカルボキシ基により置換された、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す。アルコキシ基は、本明細書にアルキル基に対して記述されるように、１、２、３または４の置換基でさらに置換されていても良い。
【０７５８】
本明細書で使用する「カルボキシアルキル」という用語は、本明細書に定義されるカルボキシ基で置換された、本明細書に定義されるように、アルキル基を表す。アルキル基は、本明細書に記述される、１、２、３または４の置換基でさらに置換されていても良い。
【０７５９】
本明細書で使用する「シアノ」という用語は、−ＣＮ基を表す。
「シクロアルコキシ」という用語は、式−ＯＲの化学置換基を表し、Ｒは、他で特定されない限り、本明細書に定義されるＣ３−８シクロアルキル基である。シクロアルキル基は、本明細書に記述されるように、１、２、３または４の置換基でさらに置換されていても良い。例となる非置換シクロアルコキシ基は、３〜８炭素である。
【０７６０】
本明細書で使用する「シクロアルキル」という用語は、他で特定されない限り、３〜８炭素の一価の飽和または不飽和の非芳香族環炭化水素基を表し、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、ビシクロ［２．２．１．］ヘプチル等に例示される。当該シクロアルキル基が１つの炭素−炭素二重結合を含む場合、当該シクロアルキル基は、「シクロアルケニル」基と呼称されてもよい。例となるシクロアルケニル基としては、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等が挙げられる。本発明のシクロアルキル基は、（１）Ｃ１−７アシル（たとえば、カルボキシアルデヒド）；（２）Ｃ１−２０アルキル（たとえば、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルスルフィニル−Ｃ１−６アルキル、アミノ−Ｃ１−６アルキル、アジド−Ｃ１−６アルキル、（カルボキシアルデヒド）−Ｃ１−６アルキル、ハロ−Ｃ１−６アルキル（たとえば、ペルフルオロアルキル）、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、ニトロ−Ｃ１−６アルキル、またはＣ１−６チオアルコキシ−Ｃ１−６アルキル）；（３）Ｃ１−２０アルコキシ（たとえば、ペルフルオロアルコキシ等のＣ１−６アルコキシ）；（４）Ｃ１−６アルキルスルフィニル；（５）Ｃ６−１０アリール；（６）アミノ；（７）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール；（８）アジド；（９）Ｃ３−８シクロアルキル；（１０）Ｃ１−６アルク−Ｃ３−８シクロアルキル；（１１）ハロ；（１２）Ｃ１−１２ヘテロシクリル（たとえば、Ｃ１−１２ヘテロアリール）；（１３）（Ｃ１−１２ヘテロシクリル）オキシ；（１４）ヒドロキシ；（１５）ニトロ；（１６）Ｃ１−２０チオアルコキシ（たとえば、Ｃ１−６チオアルコキシ）；（１７）−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ´（ｑは、０〜４の整数であり、ＲＡ´は、（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、からなる群から選択される）；（１８）−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢ´ＲＣ´（ｑは、０〜４の整数であり、ＲＢ´およびＲＣ´は、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ６−１０アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、からなる群から独立して選択される）；（１９）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ´（ｑは、０〜４の整数であり、ＲＤ´は、（ａ）Ｃ６−１０アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、（ｃ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、からなる群から選択される）；（２０）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥ´ＲＦ´（ｑは、０〜４の整数であり、ＲＥ´およびＲＦ´は、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ６−１０アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、からなる群から独立して選択される）；（２１）チオール；（２２）Ｃ６−１０アリールオキシ；（２３）Ｃ３−８シクロアルコキシ；（２４）Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−６アルコキシ；（２５）Ｃ１−６アルク−Ｃ１−１２ヘテロシクリル（たとえば、Ｃ１−６アルク−Ｃ１−１２ヘテロアリール）；（２６）オキソ；（２７）Ｃ２−２０アルケニル；および（２８）Ｃ２−２０アルキニル、で任意選択的に置換されてもよい。いくつかの実施形態において、これらの基のそれぞれは、本明細書に記述されるようにさらに置換されてもよい。たとえば、Ｃ１−アルカリルまたはＣ１−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換され、それぞれアリーロイルおよび（ヘテロシクリル）オイル置換基を放出しても良い。
【０７６１】
「ジアステレオマー」という用語は、互いに鏡像ではなく、および重ね合わせることができない立体異性体を意味する。
本明細書で使用する剤の「有効量」という用語は、有益なまたは所望された結果（たとえば、臨床結果）をもたらすのに十分な量であり、「有効量」は、それが適用される状況に依存する。たとえば、癌の治療剤の投与という状況では、剤の有効量は、その剤の投与が無い場合の反応性と比較して、本明細書に定義されるような癌の治療を得るのに十分な量である。
【０７６２】
本明細書で使用する「光学異性体」という用語は、本発明化合物のそれぞれ光学的に活性な形態を意味し、少なくとも８０％（すなわち、１つの光学異性体が少なくとも９０％で、他の光学異性体が最大で１０％である）、好ましくは少なくとも９０％、およびより好ましくは少なくとも９８％の鏡像体過剰率または光学純度（当分野の標準法で測定）を有する。
【０７６３】
本明細書で使用する「ハロ」という用語は、臭素、塩素、ヨウ素またはフッ素から選択されるハロゲンを表す。
本明細書で使用する「ハロアルコキシ」という用語は、ハロゲン基（すなわち、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）で置換された、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す。ハロアルコキシは、１つ、２つ、３つ、またはアルキル基が２以上の炭素の場合には、４つのハロゲンで置換されても良い。ハロアルコキシ基としては、ペルフルオロアルコキシ類（たとえば、−ＯＣＦ３）、−ＯＣＨＦ２、−ＯＣＨ２Ｆ、−ＯＣＣｌ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ）ＣＨ３、および−ＯＣＨＩＣＨ３が挙げられる。いくつかの実施形態において、ハロアルコキシ基は、本明細書でアルキル基に対して記述されるように、１、２、３または４の置換基で、さらに置換されていても良い。
【０７６４】
本明細書で使用する「ハロアルキル」という用語は、ハロゲン基（すなわち、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）で置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。ハロアルキル基は、１つ、２つ、３つ、またはアルキル基が２以上の炭素である場合、４つのハロゲンで置換されても良い。ハロアルキル基としては、ペルフルオロアルキル類（たとえば、−ＣＦ３）、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＣｌ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ）ＣＨ３および、−ＣＨＩＣＨ３が挙げられる。いくつかの実施形態において、ハロアルキル基は、本明細書でアルキル基に対して記述されるように、１、２、３または４の置換基で、さらに置換されていても良い。
【０７６５】
本明細書で使用する「ヘテロアルキレン」という用語は、構成炭素原子のうちの１つまたは２つがそれぞれ、窒素、酸素または硫黄で置き換えられている、本明細書に定義されるアルキレン基を指す。いくつかの実施形態において、ヘテロアルキレン基は、本明細書でアルキレン基に対して定義されるように、１、２、３または４の置換基で、さらに置換されていても良い。
【０７６６】
本明細書で使用する「ヘテロアリール」という用語は、本明細書に定義されるヘテロシクリルのサブセットを表し、それらは芳香族である（すなわち、４ｎ＋２パイ電子を単環または多環系内に含有する）。例となる非置換ヘテロアリールとしては、１〜１２炭素（たとえば、１〜１１、１〜１０、１〜９、２〜１２、２〜１１、２〜１０、２〜９）のものが挙げられる。いくつかの実施形態において、ヘテロアリールは、ヘテロシクリル基に対して定義されるように、１、２、３または４の置換基で置換されている。
【０７６７】
本明細書で使用する「ヘテロシクリル」という用語は、他で特定されない限り、５−、６−、または７−員環を表し、窒素、酸素、および硫黄からなる群から独立して選択される１、２、３または４のヘテロ原子を含有する。５員環は、０〜２の二重結合を有し、６員環および７員環は、０〜３の二重結合を有する。例となる非置換ヘテロシクリル基としては、１〜１２（たとえば、１〜１１、１〜１０、１〜９、２〜１２、２〜１１、２〜１０、２〜９）炭素のものが挙げられる。「ヘテロシクリル」という用語はまた、架橋された多環構造を有する複素環化合物を表し、１つ以上の炭素および／またはヘテロ原子が、単環の２つの非隣接員を架橋する（たとえば、キヌクリジニル基）。「ヘテロシクリル」という用語は、二環、三環および四環基を含み、上述の任意の複素環が、１、２、または３の炭素環に縮合されている（たとえば、アリール環、シクロヘキサン環、シクロヘキセン環、シクロペンタン環または他の単環複素環（たとえば、インドリル、キノリル、イソキノリル、テトラヒドロキノリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル等））。縮合複素環の例示としては、トロパン類および１，２，３，５，８，８ａ−ヘキサヒドロインドリジンが挙げられる。複素環としては、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピリジル、ピペリジニル、ホモピペリジニル、ピラジニル、ピペラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、イソキサゾリル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チアゾリル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、イソチアゾリジニル、インドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、キノキサリニル、ジヒドロキノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、フタラジニル、ベンジミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾキサゾリル、ベンゾチアジアゾリル、フリル、チエニル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル（たとえば、１，２，３−オキサジアゾリル）、プリニル、チアジアゾリル（たとえば、１，２，３−チアジアゾリル）、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロインドリル、ジヒドロキノリル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、ジヒドロイソキノリル、ピラニル、ジヒドロピラニル、ジチアゾリル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾチエニル等（それらのジヒドロ体およびテトラヒドロ体を含み、１つ以上の二重結合が還元され、水素で置き換えられている）が挙げられる。さらに他の例となる複素環としては、２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−オキサゾリル；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−イミダゾリル；２，３，４，５−テトラヒドロ−５−オキソ−１Ｈ−ピラゾリル（たとえば、２，３，４，５−テトラヒドロ−２−フェニル−５−オキソ−１Ｈ−ピラゾリル）；２，３，４，５−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−１Ｈ−イミダゾリル（たとえば、２，３，４，５−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−５−メチル−５−フェニル−１Ｈ−イミダゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−チオキソ−１，３，４−オキサジアゾリル（たとえば、２，３−ジヒドロ−２−チオキソ−５−フェニル−１，３，４−オキサジアゾリル）；４，５−ジヒドロ−５−オキソ−１Ｈ−トリアゾリル（たとえば、４，５−ジヒドロ−３−メチル−４−アミノ  ５−オキソ−１Ｈ−トリアゾリル）；１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソピリジニル（たとえば、１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３，３−ジエチルピリジニル）；２，６−ジオキソ−ピペリジニル（たとえば、２，６−ジオキソ−３−エチル−３−フェニルピペリジニル）；１，６−ジヒドロ−６−オキソピリジミニル；１，６−ジヒドロ−４−オキソピリミジニル（たとえば、２−（メチルチオ）−１，６−ジヒドロ−４−オキソ−５−メチルピリミジン−１−イル）；１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソピリミジニル（たとえば、１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３−エチルピリミジニル）；１，６−ジヒドロ−６−オキソ−ピリダジニル（たとえば、１，６−ジヒドロ−６−オキソ−３−エチルピリダジニル）；１，６−ジヒドロ−６−オキソ−１，２，４−トリアジニル（たとえば、１，６−ジヒドロ−５−イソプロピル−６−オキソ−１，２，４−トリアジニル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−インドリル（たとえば、３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−インドリルおよび２，３−ジヒドロ−２−オキソ−３，３’−スピロプロパン−１Ｈ−インドール−１−イル）；１，３−ジヒドロ−１−オキソ−２Ｈ−イソ−インドリル；１，３−ジヒドロ−１，３−ジオキソ−２Ｈ−イソ−インドリル；１Ｈ−ベンゾピラゾリル（たとえば、１−（エトキシカルボニル）−１Ｈ−ベンゾピラゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−ベンゾイミダゾリル（たとえば、３−エチル−２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−ベンゾイミダゾリル）；２，３−ジヒド
ロ−２−オキソ−ベンゾキサゾリル（たとえば、５−クロロ−２，３−ジヒドロ−２−オキソ−ベンゾキサゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−ベンゾキサゾリル；２−オキソ−２Ｈ−ベンゾピラニル；１，４−ベンゾジオキサニル；１，３−ベンゾジオキサニル；２，３−ジヒドロ−３−オキソ，４Ｈ−１，３−ベンゾチアジニル；３，４−ジヒドロ−４−オキソ−３Ｈ−キナゾリニル（たとえば、２−メチル−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−３Ｈ−キナゾリニル）；１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３Ｈ−キナゾリル（たとえば、１−エチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３Ｈ−キナゾリル）；１，２，３，６−テトラヒドロ−２，６−ジオキソ−７Ｈ−プリニル（たとえば、１，２，３，６−テトラヒドロ−１，３−ジメチル−２，６−ジオキソ−７Ｈ  −プリニル）；１，２，３，６−テトラヒドロ−２，６−ジオキソ−１Ｈ−プリニル（たとえば、１，２，３，６−テトラヒドロ−３，７−ジメチル−２，６−ジオキソ−１Ｈ−プリニル）；２−オキソベンズ［ｃ，ｄ］インドリル；１，１−ジオキソ−２Ｈ−ナフト［１，８−ｃ，ｄ］イソチアゾリル；および、１，８−ナフチレンジカルボキサミドが挙げられる。さらなる複素環としては、３，３ａ，４，５，６，６ａ−ヘキサヒドロ−ピロロ［３，４−ｂ］ピロール−（２Ｈ）−イルおよび、２，５−ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−イル、ホモピペラジニル（または、ジアゼパニル）、テトラヒドロピラニル、ジチアゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、オキセパニル、チエパニル、アゾカニル、オキセカニル、およびチオカニルが挙げられる。複素環基としてはまた、式：
【０７６８】
【化８４】
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【０７６９】
（ここで、Ｅ´は、−Ｎ−および−ＣＨ−からなる群から選択され、Ｆ´は、−Ｎ＝ＣＨ−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ２−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＯＣＨ２−、−Ｏ−、および−Ｓ−からなる群から選択され、Ｇ´は、−ＣＨ−および−Ｎ−からなる群から選択される）の基も挙げられる。本明細書に言及されるの任意の複素環基は、（１）Ｃ１−７アシル（たとえば、カルボキシアルデヒド）；（２）Ｃ１−２０アルキル（たとえば、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ−Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルスルフィニル−Ｃ１−６アルキル、アミノ−Ｃ１−６アルキル、アジド−Ｃ１−６アルキル、（カルボキシアルデヒド）−Ｃ１−６アルキル、ハロ−Ｃ１−６アルキル（たとえば、ペルフルオロアルキル）、ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル、ニトロ−Ｃ１−６アルキル、またはＣ１−６チオアルコキシ−Ｃ１−６アルキル）；（３）Ｃ１−２０アルコキシ（たとえば、ペルフルオロアルコキシ等のＣ１−６アルコキシ）；（４）Ｃ１−６アルキルスルフィニル；（５）Ｃ６−１０アリール；（６）アミノ；（７）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール；（８）アジド；（９）Ｃ３−８シクロアルキル；（１０）Ｃ１−６アルク−Ｃ３−８シクロアルキル；（１１）ハロ；（１２）Ｃ１−１２ヘテロシクリル（たとえば、Ｃ２−１２ヘテロアリール）；（１３）（Ｃ１−１２ヘテロシクリル）オキシ；（１４）ヒドロキシ；（１５）ニトロ；（１６）Ｃ１−２０チオアルコキシ（たとえば、Ｃ１−６チオアルコキシ）；（１７）−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ´（ｑは、０〜４の整数であり、ＲＡ´は、（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、からなる群から選択される）；（１８）−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢ´ＲＣ´（ｑは、０〜４の整数であり、ＲＢ´およびＲＣ´は、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、からなる群から独立して選択される）；（１９）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ´（ｑは、０〜４の整数であり、ＲＤ´は、（ａ）Ｃ１−６アルキル、（ｂ）Ｃ６−１０アリール、（ｃ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、からなる群から選択される）；（２０）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥ´ＲＦ´（ｑは、０〜４の整数であり、ＲＥ´およびＲＦ´はそれぞれ、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）Ｃ６−１０アリール、および（ｄ）Ｃ１−６アルク−Ｃ６−１０アリール、からなる群から独立して選択される）；（２１）チオール；（２２）Ｃ６−１０アリールオキシ；（２３）Ｃ３−８シクロアルコキシ；（２４）アリールアルコキシ；（２５）Ｃ１−６アルク−Ｃ１−１２ヘテロシクリル（たとえば、Ｃ１−６アルク−Ｃ１−１２ヘテロアリール）；（２６）オキソ；（２７）（Ｃ１−１２ヘテロシクリル）イミノ；（２８）Ｃ２−２０アルケニル；および（２９）Ｃ２−２０アルキニルからなる群から独立して選択される１、２、３、４または５の置換基で、任意選択的に置換されてもよい。いくつかの実施形態において、これらの基のそれぞれは、本明細書に記述されるようにさらに置換されても良い。たとえば、Ｃ１−アルカリルまたはＣ１−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換され、それぞれおアリーロイルおよび（ヘテロシクリル）オイル置換基を放出しても良い。
【０７７０】
本明細書で使用する「（ヘテロシクリル」イミノ」という用語は、イミノ基を介して元の分子群に付着された、本明細書に定義されるヘテロシクリル基を表す。いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル基は、本明細書に定義されるように、１、２、３または４の置換基で置換されても良い。
【０７７１】
本明細書で使用する「（ヘテロシクリル）オキシ」という用語は、酸素原子を介して元の分子群に付着された、本明細書に定義されるヘテロシクリル基を表す。いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル基は、本明細書に定義されるように、１、２、３または４の置換基で置換されても良い。
【０７７２】
本明細書で使用する「（ヘテロシクリル）オイル」という用語は、カルボニル基を介して元の分子群に付着された、本明細書に定義されるヘテロシクリル基を表す。いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル基は、本明細書に定義されるように、１、２、３または４の置換基で置換されても良い。
【０７７３】
本明細書で使用する「炭化水素」という用語は、炭素原子と水素原子のみからなる基を表す。
本明細書で使用する「ヒドロキシ」という用語は、−ＯＨ基を表す。
【０７７４】
本明細書で使用する「ヒドロキシアルケニル」という用語は、１〜３のヒドロキシ基で置換された、本明細書に定義されるアルケニル基を表すが、ただし、アルキル基の１つの炭素原子にヒドロキシ基は１つのみ付着し、ジヒドロキシプロペニル、ヒドロキシイソペンテニル等に例示される。
【０７７５】
本明細書で使用する「ヒドロキシアルキル」という用語は、１〜３のヒドロキシ基で置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表すが、ただし、アルキル基の１つの炭素原子にヒドロキシ基は１つのみ付着し、ヒドロキシメチル、ジヒドロキシプロピル等に例示される。
【０７７６】
本明細書で使用する「異性体」という用語は、本発明の任意の化合物の、任意の互変異性体、立体異性体、光学異性体またはジアステレオマーを意味する。本発明の化合物は、１つ以上のキラル中心および／または二重結合を有し、ゆえに、立体異性体（たとえば、二重結合異性体（すなわち、幾何Ｅ／Ｚ異性体）またはジアステレオマー（たとえば、光学異性体（すなわち、（＋）または（−））またはシス／トランス異性体）等）として存在しうることが認識される。本発明に従い、本明細書に描写される化学構造および、ゆえに本発明の化合物は、すべての対応する立体異性体を包含し、すなわち、立体異性的に純粋な形態（たとえば、幾何異性体的に純粋、光学異性体的に純粋、またはジアステレオマー的に純粋）、および光学異性体および立体異性体の混合物（たとえば、ラセミ体）の両方を包含する。本発明の化合物の光学異性体および立体異性体の混合物は、たとえばキラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高速液体クロマトグラフィー、キラル塩複合体としての化合物の結晶化、またはキラル溶媒中での化合物の結晶化等の公知の方法により、通常、光学異性体成分または立体異性体成分へと分解することができる。光学異性体および立体異性体はまた、公知の不斉合成方法により、立体異性的または光学異性体的に純粋な中間体、試薬および触媒から得ることができる。
【０７７７】
本明細書で使用する「Ｎ−保護アミノ」という用語は、本明細書に定義される、１つまたは２つのＮ−保護基が付着した、本明細書に定義されるアミノ基を指す。
本明細書で使用する「Ｎ−保護基」という用語は、合成手順の間、アミノ基を望ましくない反応から保護することを意図した基を表す。広く用いられているＮ−保護基は、Ｇｒｅｅｎｅ，  “Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９９）（参照により本明細書に援用される）に開示されている。Ｎ−保護基としては、アシル基、アリーロイル基またはカルバミル基（たとえば、ホルミル）、アセチル、プロピニル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、２−クロロアセチル、２−ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、ｏ−ニトロフェノキシアセチル、α−クロロブチリル、ベンゾイル、４−クロロベンゾイル、４−ブロモベンゾイル、４−ニトロベンゾイル、およびキラル補助基（たとえば、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン等の保護もしくは非保護Ｄ、ＬまたはＤ、Ｌ−アミノ酸等）；スルホニル含有基（たとえば、ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル等）；カルバマート形成基（たとえば、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、２，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，４，５−トリメトキシベンジルオキシカルボニル、１−（ｐ−ビフェニルイル）−１−メチルエトキシカルボニル、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、フェノキシカルボニル、４−ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル−９−メトキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニル等）、アルカリル基（たとえば、ベンジル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチル等）およびシリル基（たとえば、トリメチルシリル等）が挙げられる。好ましいＮ−保護基は、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、アラニル、フェニルスルホニル、ベンジル、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）およびベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）である。
【０７７８】
本明細書で使用する「ニトロ」という用語は、−ＮＯ２基を表す。
本明細書で使用する「オキソ」という用語は、＝Ｏを表す。
本明細書で使用する「ペルフルオロアルキル」という用語は、本明細書に定義されるアルキル基であって、アルキル基に結合された各水素ラジカルが、フッ化物ラジカルで置き換えられているアルキル基を表す。ペルフルオロアルキル基は、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル等に例示される。
【０７７９】
本明細書で使用する「ペルフルオロアルコキシ」という用語は、本明細書に定義されるアルコキシ基であって、アルコキシ基に結合された各水素ラジカルがフッ化物ラジカルで置き換えられているアルコキシ基を表す。ペルフルオロアルコキシ基は、トリフルオロメトキシ、ペンタフルオロエトキシ等で例示される。
【０７８０】
本明細書で使用する「スピロシクリル」という用語は、両末端が元の基の同じ炭素原子に結合し、スピロ環基を形成するＣ２−７アルキレンジラジカルを表し、および、両端が同じ原子に結合しているＣ１−６ヘテロアルキレンジラジカルもまた表す。スピロ環基を形成するヘテロアルキレンラジカルは、窒素、酸素および硫黄からなる群から独立して選択される１、２、３または４のヘテロ原子を含有することができる。いくつかの実施形態において、スピロ環基は、１〜７の炭素（ジラジカルが付着している炭素原子を除く）を含む。本発明のスピロ環基は、シクロアルキルおよび／またはヘテロシクリル基に対する任意選択的な置換基として本明細書に提示される１、２、３または４の置換基で、任意選択的に置換されても良い。
【０７８１】
本明細書で使用する「立体異性体」という用語は、全ての可能性のある異なる異性体、ならびに化合物が有し得る立体配座型（たとえば、本明細書に記述される任意の化学式の化合物）を指し、特に、全ての可能性のある立体化学的異性体型および立体配座的異性体型、すべてのジアステレオマー、光学異性体および／または基本の分子構造の配座異性体を指す。本発明の一部の化合物は、異なる互変異性型で存在しても良く、後者のものはすべて本発明の範囲内に含まれる。
【０７８２】
本明細書で使用する「スルホアルキル」という用語は、−ＳＯ３Ｈのスルホ基で置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に記述されるように、１、２、３または４の置換基でさらに置換されても良い。
【０７８３】
本明細書で使用する「スルホニル」という用語は、−Ｓ（Ｏ）２−基を表す。
本明細書で使用する「チオアルカリル」という用語は、化学式−ＳＲの化学置換基を表し、Ｒは、アルカリル基である。いくつかの実施形態において、アルカリル基は、本明細書に記述されるように、１、２、３または４の置換基でさらに置換されても良い。
【０７８４】
本明細書で使用する「チオアルクヘテロシクリル」という用語は、化学式−ＳＲの化学置換基を表し、Ｒは、アルクヘテロシクリル基である。いくつかの実施形態において、アルクヘテロシクリル基は、本明細書に記述されるように、１、２、３または４の置換基でさらに置換されても良い。
【０７８５】
本明細書で使用する「チオアルコキシ」という用語は、化学式−ＳＲの化学置換基を表し、Ｒは、本明細書に定義されるアルキル基である。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に記述されるように、１、２、３または４の置換基でさらに置換されても良い。
【０７８６】
「チオール」という用語は、−ＳＨ基を表す。
化合物：本明細書で使用する「化合物」という用語は、すべての立体異性体、幾何異性体、互変異性体および描写される構造の同位体を含むことが意図される。
【０７８７】
本明細書に記述される化合物は、非対称（たとえば、１以上の立体中心を有する）であっても良い。他で示唆されない限り、すべての立体異性体（たとえば光学異性体およびジアステレオマー等）が意図される。非対称で置換された炭素を含有する本開示の化合物は、光学的に活性な状態またはラセミ体で単離することができる。光学的に活性な開始材料から光学的に活性な型を調製する方法は、当分野で公知であり、たとえば、ラセミ混合物の分解または立体選択的合成などによるものがある。オレフィン、Ｃ＝Ｎ二重結合等の多くの幾何異性体もまた、本開示の化合物中に含まれ、そのような安定な異性体はすべて、本開示で予期されるものである。本開示化合物のシスおよびトランス幾何異性体が記述され、異性体の混合物として単離または、分離異性型として単離されても良い。
【０７８８】
本開示の化合物には、互変異性型もまた含まれる。互変異性型は、一重結合と隣接する二重結合とを交換する（プロトンの移動が伴う）ことにより得ることができる。互変異性型は、同じ実験式および総荷電を有する異性体プロトン化状態である、プロトトロピー互変異性体（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｉｃ  ｔａｕｔｏｍｅｒ）を含む。プロトトロピー互変異性体としては、ケトン−エノール対、アミド−イミド酸対、ラクタム−ラクチム対、アミド−イミド酸対、エナミン−イミン対、およびプロトンが複素環の２つ以上の位置を占める場合（たとえば、１Ｈ−および３Ｈ−イミダゾール、１Ｈ−、２Ｈ−および４Ｈ−１，２，４−トリアゾール、１Ｈ−および２Ｈ−イソインドール、ならびに、１Ｈ−および２Ｈ−ピラゾール等）の環状形態を含む。互変異性型は、平衡状態にあってもよく、または適切な置換により、１つの形態に立体的に固定されていても良い。
【０７８９】
本開示の化合物にはまた、中間体または最終化合物に発生する原子の同位体のすべてが含まれる。「同位体」とは、同じ原子番号を有するが、核の中性子数が異なるために、異なる質量数を有する原子を指す。たとえば、水素の同位体として、トリチウムと重水素が挙げられる。
【０７９０】
本開示の化合物および塩は、常法により溶媒または水分子との組み合わせで調製され、溶媒和物および水和物を形成することができる。
保存された：本明細書で使用する「保存された」という用語は、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のヌクレオチドまたはアミノ酸のそれぞれで、比較される２以上の配列の同じ位置で変化せずに存在するものである。相対的に保存されたヌクレオチドまたはアミノ酸とは、配列の他の場所に現れるヌクレオチドまたはアミノ酸よりも、多くの関連配列中で保存されているものである。
【０７９１】
いくつかの実施形態において、もし２以上の配列が互いに１００％同一である場合、それらは「完全に保存された」と言われる。いくつかの実施形態において、２以上の配列が互いに少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、それらは「高度に保存された」と言われる。いくつかの実施形態において、２以上の配列が、互いに約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一である場合、「高度に保存された」と言われる。いくつかの実施形態において、２つ以上の配列が、互いに少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「保存された」と言われる。いくつかの実施形態において、２以上の配列が、互いに約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一である場合、「保存された」と言われる。配列の保存は、オリゴヌクレオチドもしくはポリペプチドの全体の長さに対して適用しても良く、またはそれらの部分、領域もしくは特性に対して適用しても良い。
放出制御：本明細書で使用する「放出制御」とは、特定の放出パターンに従い、治療結果をもたらす医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。
環状の、または環化：本明細書で使用する「環状の」という用語は、連続的なループの存在を指す。環状分子は、ただ連結し、サブユニットの切れ目のない鎖を形成するものであり、必ずしも円形である必要は無い。たとえば本発明の操作されたＲＮＡまたはｍＲＮＡ等の環状分子は、単一ユニットもしくは多量体であっても良く、または１つ以上の成分の複合体または高次構造を含有しても良い。
細胞増殖抑制：本明細書で使用する「細胞増殖抑制」とは、細胞（たとえば、哺乳類細胞（たとえば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生虫、プリオンまたはそれらの組み合わせの増殖、分裂または繁殖を阻害、減少、抑制することを指す。
細胞毒性：本明細書で使用する「細胞毒性」とは、細胞（たとえば、哺乳類細胞（たとえば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生虫、プリオンまたはそれらの組み合わせに対する、殺傷効果もしくは有害作用、毒性効果もしくは死に至る作用を指す。
送達：本明細書で使用する「送達」とは、化合物、物質、実体、部分、カーゴ（積荷）、またはペイロードを送達させる作用または方法を指す。
送達剤：本明細書で使用する「送達剤」とは、修飾核酸またはｍｍＲＮＡの標的細胞へのインビボ送達を、少なくとも部分的に促進する任意の物質を指す。
不安定化：本明細書で使用する「不安定な」「不安定にする」または「不安定化領域」という用語は、開始時、野生型または同じ領域もしくは分子の天然型よりも安定性に欠ける領域または分子を意味する。
検出可能標識：本明細書で使用する「検出可能標識」とは、当分野公知の方法（Ｘ線撮影、蛍光、化学発光、酵素活性、吸光等を含む）により容易に検出可能な、他の実体に付着される、組み込まれる、もしくは結合される、１以上のマーカー、シグナルまたは部分を指す。検出可能標識としては、放射性同位体、フルオロフォア、クロモフォア、酵素、色素、金属イオン、リガンド（たとえば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびハプテン等）、量子ドット等が挙げられる。検出可能標識は、本明細書に記述されるペプチドまたはタンパク質の任意の部位に位置しても良い。それらは、アミノ酸、ペプチドもしくはタンパク質内、または、Ｎ末端もしくはＣ末端に位置しても良い。
消化：本明細書で使用する「消化」という用語は、小さな小片または成分にバラバラに壊すことを意味する。ポリペプチドまたはタンパク質に関する場合、消化により、ペプチドがもたらされる。
遠位：本明細書で使用する「遠位」という用語は、対象の点または領域から離れた位置、または中心から離れた位置を意味する。
用量分割因子（ＤＳＦ）：総１日用量または単回単位用量のＰＵＤで割られた、用量分割処置のＰＵＤの比率。値は、投与レジメン群の比較から得られる。
封入：本明細書で使用する「封入」とは、囲包する、囲む、包み込むことを意味する。
操作された：本明細書において、本発明の実施態様が、開始時点、野生型もしくは天然型分子から変化した特性または性質（構造的または化学的のいずれでも）を有する様に設計される場合、それらは「操作されている」。
エキソソーム：本明細書で使用する「エキソソーム」は、哺乳類細胞から分泌される小胞である。
発現：本明細書において、核酸配列の「発現」とは、以下の事象の１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型産生（たとえば、転写による）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセッシング（たとえば、スプライシング、エディティング、５´キャップの形成および／または３´末端のプロセッシング等）；（３）ポリペプチドまたはタンパク質へのＲＮＡの翻訳；および（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
特性：本明細書で使用する「特性」とは、特徴、性質または独特の要素を指す。
製剤：本明細書で使用する「製剤」には、少なくとも修飾核酸またはｍｍＲＮＡおよび送達剤が含まれる。
断片：本明細書で使用する「断片」とは、部分を指す。たとえば、タンパク質の断片には、培養細胞から単離された全長タンパク質の消化により得られたポリペプチドが含有されても良い。機能的：本明細書で使用する「機能的」な生体分子は、それが特徴付けられる特性および／または活性を示す形態にある生体分子である。
相同性：本明細書で使用する「相同性」という用語は、高分子の間（たとえば、核酸分子（たとえば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）の間、および／または、ポリペプチド分子の間）の全体的な関連性を指す。いくつかの実施形態において、複数の高分子配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一または類似である場合、それらは互いに「相同性である」とみなされる。「相同性である」という用語は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列）の間の比較を指す。本発明に基づくと、ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが、少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つの連続配列に対し、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはさらに９９％である場合、２つのポリヌクレオチド配列は、相同性であるとみなされる。いくつかの実施形態において、相同なポリヌクレオチド配列は、少なくとも４〜５の独自の特定アミノ酸の連続配列をコードする能力により特徴付けられる。６０ヌクレオチド未満の長さのポリヌクレオチド配列に対しては、相同性は、少なくとも４〜５の独自の特定アミノ酸の連続配列をコードする能力により決定づけられる。本発明に基づくと、２つのタンパク質が少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つの連続配列に対して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％同一である場合、その２つのタンパク質配列は、相同であるとみなされる。
同一性：本明細書で使用する「同一性」という用語は、高分子の間（たとえば、オリゴヌクレオチド分子（たとえば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）の間、および／または、ポリペプチド分子の間）の全体的な関連性を指す。２つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの算出は、たとえば、最適比較の目的で２つの配列を並べることにより行うことができる（最適並列のために、たとえば、ギャップを第一および第二の核酸配列のうちの１つまたは両方に導入することができ、非同一の配列は、比較対象に対し無視することができる）。ある実施態様において、比較目的のために並べられた配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％である。次いで、対応するヌクレオチドの位置でヌクレオチドが比較される。第一の配列の位置が、第二の配列の対応する位置と同じヌクレオチドで占められている場合、その分子はその位置で同一である。２つの配列の間の同一性パーセントは、配列により共有されている同一の位置数の関数であり、２つの配列の最適配列のために導入する必要のあった各ギャップの長さ、およびギャップの数を考慮している。配列の比較および２つの配列の間の同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを用いて得ることができる。たとえば、２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、たとえばＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．，  ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｗ．，  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９３；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  Ｉ，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．  Ｇ．，  ｅｄｓ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  １９９４；および、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｄｓ．，  Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１（これらはそれぞれ参照により本明細書に援用される）に記述されている方法を用いて決定することができる。たとえば、２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０残基重量表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ（ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ）および４のギャップペナルティを用いたＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＭｅｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ，  １９８９，  ４：１１−１７）を用いて決定することができる。あるいは、２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセ��トを、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ  ｍａｔｒｉｘを用いたＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用いて決定することができる。配列間の同一性パーセントを決定するために普遍的に用いられている方法としては、Ｃａｒｉｌｌｏ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｄ．，  ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，  ４８：１０７３  （１９８８）（参照により本明細書に援用される）に開示されている方法が挙げられるが、これに限定されない。同一性決定の技術は、公的に利用可能なコンピュータープログラムにおいて体系化されている。２つの配列の間の相同性を決定するためのコンピューターソフトウェアの例としては、ＧＣＧ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｐａｃｋａｇｅ，  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １２（１），  ３８７  （１９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよび、ＦＡＳＴＡ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５，  ４０３  （１９９０）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７９２】
遺伝子の発現阻害：本明細書で使用する「遺伝子の発現阻害」という文言は、遺伝子の発現産物の量の減少をもたらすことを意味する。発現産物は、遺伝子から転写されたＲＮＡ（たとえば、ｍＲＮＡ）または遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドであっても良い。典型的には、ｍＲＮＡレベルの減少により、それらから翻訳されるポリペプチドレベルの減少ももたらされる。発現レベルは、ｍＲＮＡまたはタンパク質を測定する標準的な技術を用いて決定されてもよい。
インビトロ：本明細書で使用する「インビトロ」という用語は、生物体（動物、植物、微生物）内ではなく、たとえば、試験管中または反応槽中、細胞培養中、ペトリ皿の中等、人工的な環境で発生する事象を指す。
インビボ：本明細書で使用する「インビボ」という用語は、生物体（たとえば、動物、植物もしくは微生物またはそれらの細胞もしくは組織）内で発生する事象を指す。
単離された：本明細書で使用する「単離された」という用語は、関連構成要素（天然または実験上の設定のいずれでも）の少なくとも一部から分離された物質または実体を指す。単離された物質は、それらが関連していた物質に対して、純度レベルが変化していてもよい。単離された物質および／または実体は、それらが当初関連していた他の構成要素の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％かそれ以上から分離されても良い。いくつかの実施形態において、単離された剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超の純度である。本明細書において、実質的に他の成分が無い場合、その物質は、「純粋」である。実質的に単離された：「実質的に単離された」とは、成分が、それが形成された、または検出された環境から実質的に分離されていることを意味する。部分的分離には、たとえば、本開示の化合物が富化された組成物を含むことができる。実質的な分離には、本開示の化合物、またはその塩を少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９７重量％、少なくとも約９９重量％含有する組成物を含むことができる。化合物およびその塩を単離する方法は当分野の日常的な作業である。
リンカー：本明細書において、リンカーは、たとえば１０〜１，０００原子の原子群を指し、原子または群（たとえば、限定されないが、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニルおよびイミン等）から構成されることができる。リンカーは、第一の末端で核酸塩基もしくは糖鎖部分上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドに付着することができ、第二の末端で検出可能な剤または治療剤等のペイロードに付着することができる。リンカーは、核酸配列への組み込みに干渉しないような長さのものであってもよい。リンカーは、たとえばｍｍＲＮＡ多量体の形成（たとえば、２以上の修飾核酸分子またはｍｍＲＮＡ分子の結合を介する）、またはｍｍＲＮＡの形成、ならびに本明細書に記述されるペイロードの投与等の任意の有用な目的のために用いられても良い。リンカーに組み込むことができる化学基の例としては、限定されないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリールまたはヘテロシクリル（それらは各々、本明細書に記述されるように任意選択的に置換されることができる）が挙げられる。リンカーの例としては、限定されないが、不飽和アルカン類、ポリエチレングリコール類（たとえば、エチレンまたはプロピレングリコール単量体（たとえば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール等））、およびデキストランポリマー類ならびにそれらの誘導体が挙げられる。他の例としては、限定されないが、リンカー内の開裂可能な部分（たとえば、ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）またはアゾ結合（−Ｎ＝Ｎ−）（それらは、還元剤または光分解により開裂することができる））が挙げられる。選択的開裂可能な結合の非限定的な例示としては、たとえばトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）または他の還元剤および／もしくは光分解の使用により開裂することができるアミド結合、ならびに、たとえば酸性加水分解または塩基性加水分解により開裂することができるエステル結合が挙げられる。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位：本明細書において、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位は、少なくともｍｉＲＮＡの「シード」領域に結合する核酸転写物のヌクレオチド位置または領域を表す。
修飾された：本明細書で使用する「修飾された」とは、変化した本発明の分子構造または状態を指す。分子は、化学的、構造的および機能的を含む、様々な状態で修飾されうる。一実施態様において、本発明のｍＲＮＡ分子は、非天然ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの導入により修飾されている。
粘液：本明細書で使用する「粘液」とは、粘性で、ムチン糖タンパク質を含有する天然物質を指す。
天然の：本明細書で使用する「天然の」とは、人工的な補助無しに、自然に存在していることを意味する。
非ヒト脊椎動物：本明細書で使用する「非ヒト脊椎動物」には、ホモサピエンスを除くすべての脊椎動物が含まれる（野生種および家畜化された種も含まれる）。非ヒト脊椎動物の例としては、限定されないが、たとえば、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、リャマ、ラバ、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ、水牛およびヤク等の哺乳類が挙げられる。
オフ−ターゲット：本明細書で使用する「オフ−ターゲット」とは、任意の１つ以上の標的、遺伝子、または細胞転写物に対する任意の意図されない効果を指す。
オープンリーディングフレーム：本明細書で使用する「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」とは、所与のリーディングフレーム中に、終止コドンを含まない配列を指す。
操作可能に結合された：本明細書で使用する「操作可能に結合された」という文言は、２以上の分子、構築物、転写物、実体、部分等の間の機能的な結合を指す。
パラトープ：本明細書で使用する「パラトープ」とは、抗体の抗原結合部位を指す。
患者：本明細書で使用する「患者」とは、治療を求める可能性のある対象、もしくは治療を必要とする可能性のある対象、治療を必要とする対象、治療を受けている対象、治療を受けるであろう対象、または特定の疾患または状態に対して訓練された専門家によるケアを受けている対象を指す。
ペプチド：本明細書で使用する「ペプチド」は、５０の長さ以下のアミノ酸（たとえば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０の長さのアミノ酸）である。
薬剤的に許容可能な：「薬剤的に許容可能な」という文言は、本明細書において、妥当な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、合理的な利益／リスク比に見合った、ヒトおよび動物の組織に接触する使用に適した化合物、物質、組成物および／または剤型を指すために用いられる。
薬剤的に許容可能な賦形剤：本明細書で使用する「薬剤的に許容可能な賦形剤」とは、本明細書に記述される化合物以外の任意の構成要素（たとえば、活性化合物を懸濁または溶解することができる媒体）を指し、患者に実質的に非毒性および非炎症性である特性を有する。賦形剤としては、たとえば、抗接着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング剤、圧縮補助剤、崩壊剤、色素（染料）、皮膚軟化剤、乳化剤、増量剤（希釈剤）、塗膜形成剤またはコーティング剤、香味料、香料、流動促進剤（流量増強剤）、潤滑剤、保存料、印刷用インク、吸着剤、懸濁剤または溶解剤、甘味料および水和水を含めても良い。例となる賦形剤としては、限定されないが、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微晶質セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、α化澱粉、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、セラック、二酸化シリコン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、澱粉（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、滑石、二酸化チタニウム、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣおよびキシリトールが挙げられる。
薬剤的に許容可能な塩：本発明には、本明細書に開示される化合物の薬剤的に許容可能な塩もまた含まれる。本明細書で使用する「薬剤的に許容可能な塩」とは、本開示化合物の誘導体を指し、既存の酸または塩基部分が塩の形態に転換されることにより（たとえば、遊離塩基と適切な有機酸を反応させることにより）、元の化合物が修飾されている。薬剤的に許容可能な塩としては、限定されないが、アミン等の塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩、カルボン酸等の酸性残基のアルカリ塩または有機塩等が例示される。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトネート、ヘキサノエート、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカノエート、吉草酸塩等が挙げられる。代表的なアルカリ塩またはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等、ならびに、非毒性のアンモニウム、４級アンモニウムおよびアミンカチオン（限定されないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン等が挙げられる）が挙げられる。本開示の薬剤的に許容可能な塩としては、たとえば、非毒性の無機酸または有機酸から形成された、元の化合物の従来的な非毒性塩が挙げられる。本開示の薬剤的に許容可能な塩は、従来的な化学法により、塩基性部分または酸性部分を含有する元の化合物から合成することができる。一般的に、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸型または遊離塩基型と、水もしくは有機溶媒またはその２つの混合物（通常、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリル等の非水性溶媒が好ましい）に溶解した適切な塩基または酸の化学量論量とを反応させることにより調製することができる。適切な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １７ｔｈ  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．，
１９８５，  ｐ．  １４１８，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｕｓｅ，  Ｐ．Ｈ．  Ｓｔａｈｌ
ａｎｄ  Ｃ．Ｇ．  Ｗｅｒｍｕｔｈ  （ｅｄｓ．），  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，  ２００８、および、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ６６，  １−１９  （１９７７）に記載されている（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
薬剤的に許容可能な溶媒和物：本明細書で使用する「薬剤的に許容可能な溶媒和物」という用語は、適切な溶媒分子が結晶格子中に組み込まれている本発明の化合物を意味する。適切な溶媒は、投与される用量で生理学的に耐容できるものである。たとえば、溶媒和物は、結晶化、再結晶化、または、有機溶媒、水もしくはそれらの混合物を含む溶液からの沈殿により調製されてもよい。適切な溶媒の例としては、エタノール、水（たとえば、モノ−、ジ−、およびトリ−水和物）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ´−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ´−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２−（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２−ピロリドン、安息香酸ベンジル等が挙げられる。水が溶媒の場合、溶媒和物は、「水和物」と呼称される。
薬物動態：本明細書で使用する「薬物動態」とは、生物体へと投与された物質の運命の決定に関連する、分子または化合物の任意の１つ以上の特性を指す。薬物動態は、吸収、分布、代謝および排出の比率および程度を含む、数種の領域に分けられる。これは通常、ＡＤＭＥと呼ばれており、（Ａ）吸収は、血液循環に入る物質のプロセスである；（Ｄ）分布は、身体の組織および体液を巡る物質の分散または伝達である；（Ｍ）代謝（または、生体内変化）は、親となる化合物の、娘の化合物への不可逆的な変化である；（Ｅ）排出（または除去）は、身体からの物質の除去、を指す。稀なケースとして、一部の薬物は、身体組織中に不可逆的に蓄積する。
薬理作用：本明細書で使用する「薬理作用」は、外因的な物質に生命体またはシステムが接触または曝された後に発生する、生命体またはシステムの中の、計測可能な生物学的な現象である。薬理作用は、たとえば、治療、１つ以上の症状の改善、診断、予防、および疾患、障害、疾病もしくは感染の発生の遅延等の、治療上有効な結果をもたらすものであっても良い。そのような生物学的な現象の測定は、定量的、定性的、または他の生物学的現象と相対的なものであってもよい。定量的測定は、統計的に有意なものであっても良い。定量的な測定は、程度または種類によるものであっても良く、少なくとも、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の差であっても良い。それらは存在または非存在、より良いまたはより悪い、多いまたは少ない、として観察可能なものであっても良い。薬理作用に言及する場合の外因的な物質とは、生命体またはシステムに対して、全体的または部分的のいずれでも、異物である物質である。たとえば、野生型の生体分子に対する修飾は、構造的なものであれ化学的なものであれ、外因的な物質を生み出すであろう。同様に、天然には生命体またはシステム中に見出されない化合物、分子または物質中への野生型分子への組み込み（もしくは野生型分子との組み合わせ）もまた、外因的な物質を生み出すであろう。本発明の修飾ｍＲＮＡは、外因的な物質を含有する。薬理作用の例としては、限定されないが、好中球、網状赤血球、顆粒球、赤血球（赤色血液細胞）、巨核球、血小板、単球、結合組織マクロファージ、表皮ランゲルハンス細胞、破骨細胞、樹状細胞、ミクログリア細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞もしくは網状赤血球の増加または減少等の、細胞数の変化が挙げられる。薬理作用には、血液化学所見、ｐＨ、ヘモグロビン、ヘマトクリット、酵素（たとえば、限定されないが肝臓酵素のＡＳＴおよびＡＬＴ）のレベルの変化、脂質プロファイルの変化、電解質、代謝マーカー、ホルモンまたは、当業者に公知の他のマーカーもしくはプロファイルにおける変化も含まれる。
物理化学：本明細書で使用する「物理化学」は、物理的な、および／または化学的な特性に関連すること、またはそのような特性を意味する。
予防：本明細書で使用する「予防」という用語は、感染、疾病、障害および／または疾患の発生の部分的または完全な遅延；特定の感染、疾病、および／または疾患の１つ以上の兆候、特性または臨床症状の発生の部分的または完全な遅延；特定の感染、疾病、障害および／もしくは疾患の１つ以上の兆候、特性または症状の発生の部分的または完全な遅延；ならびに／または、感染、疾病、障害および／もしくは疾患に関連した症状発生リスクの減少を指す。
プロドラッグ：本開示には、本明細書に記述される化合物のプロドラッグもまた含まれる。本明細書で使用する「プロドラッグ」とは、化学的または物理的変化により治療剤として振る舞う物質、分子または実体の基礎となる形態にある任意の物質、分子または実体を指す。プロドラッグは、何らかの方法で共有結合または隔離されていても良く、および哺乳類対象への投与の前に、投与により、または投与の後に、活性薬剤部分を放出、または活性薬剤部分へと変化するものであってもよい。プロドラッグは、化合物中に存在する官能基を修飾することにより調製されても良く、その修飾物は、日常的な操作またはインビボのいずれかで、元の化合物へと開裂される。プロドラッグには、ヒドロキシル基、アミノ基、スルフヒドリル基またはカルボキシル基が、哺乳類対象に投与された際に、それぞれ遊離ヒドロキシル基、遊離アミノ基、遊離スルフヒドリル基または遊離カルボキシル基を形成するように開裂する任意の基に結合している化合物が含まれる。プロドラッグの調製および使用については、Ｔ．  Ｈｉｇｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｖ．  Ｓｔｅｌｌａ，  “Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，”  Ｖｏｌ．  １４  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａ．Ｃ．Ｓ．  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ、および、Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，  ｅｄ．  Ｅｄｗａｒｄ  Ｂ．  Ｒｏｃｈｅ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７（それら両方とも、参照により、その全体で本明細書に援用される）において考察がなされている。
増殖：本明細書で使用する「増殖」という用語は、速やかに成長、拡大もしくは増加する、または、成長、拡大もしくは増加をもたらすことを意味する。「増殖性」とは、増殖することが出来る能力を有することを意味する。「抗増殖性」とは、増殖特性とは逆または、増殖特性とは適合しない特性を有することを意味する。
対象のタンパク質：本明細書で使用する「対象のタンパク質」または「所望のタンパク質」という用語には、本明細書に提示されるもの、ならびに、それらの断片、変異体、突然変異体および変化物が含まれる。
隣接：本明細書で使用する「隣接」という用語は、対象の点または領域に対して、または対象の中心に対してより近い場所に位置づくことを意味する。
シュードウリジン：本明細書において、シュードウリジンは、ウリジンヌクレオシドのＣ−グリコシド異性体を指す。「シュードウリジンアナログ」は、シュードウリジンの任意の修飾体、変異体、異性体または誘導体である。たとえば、シュードウリジンアナログには、限定されないが、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、１−タウリノメチル−シュードウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−シュードウリジン、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１Ψ）、１−メチル−４−チオ−シュードウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、３−メチル−シュードウリジン（ｍ３Ψ）、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、Ｎ１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３Ψ）、および２´−Ｏ−メチル−シュードウリジン（Ψｍ）が含まれる。
精製された：本明細書で使用する「精製する」、「精製された」、「精製」は、不用な構成要素、汚染物質、混合物または欠陥物から実質的に純粋にする、またはそれらを清浄化することを意味する。
試料：本明細書で使用する「試料」または「生物学的試料」という用語は、その組織、細胞または構成成分（たとえば、限定されないが、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血、尿、膣液、および精液を含む体液等）のサブセットを指す。試料はさらに、生命体全体、またはその組織、細胞もしくは構成成分、またはその分画もしくは部分（限定されないが、たとえば、血漿、血清、髄液、ならびに、リンパ液、皮膚、呼吸器、腸管および尿生殖器の外部断片、涙、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、器官等を含む）から調製された、ホモジネート、溶解物または抽出物を含んでも良い。さらに、試料は、たとえば栄養成分を含む培養液（ｂｒｏｔｈ）またはゲル（たとえばタンパク質または核酸等の細胞成分を含有しても良い）等の培地を指す。
シグナル配列：本明細書で使用する「シグナル配列」という文言は、タンパク質の運搬または局在性を指示することができる配列を指す。
単回単位用量：本明細書で使用する「単回単位用量」という語は、１用量／１回／単一経路／単一接点（すなわち単一の投与事象）において投与される治療剤の用量を指す。
類似性：本明細書で使用する「類似性」という用語は、高分子の間（たとえば、ポリヌクレオチド分子（たとえば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）の間、および／または、ポリペプチド分子の間）の全体的な関連性を指す。高分子の、他の高分子に対する類似性パーセントの算出は、同一性パーセントの算出と同じような方法で行うことができる（当分野で理解される、保存的置換を考慮する類似性パーセントの算出は除く）。
分割用量：本明細書で使用する「分割用量」という語は、単回単位用量または総１日用量を２回以上の用量に分割することを指す
安定：本明細書で使用する「安定」とは、有用な程度の純度までの、反応混合物からの単離の間、存在し続けるのに十分に頑健である化合物、および、好ましくは有効な治療剤へと製剤化することができる化合物を指す。
安定化した：本明細書で使用する「安定化する」、「安定化した」、「安定化領域」という用語は、安定にする、または安定になることを意味する。
対象：本明細書で使用する「対象」または「患者」という用語は、たとえば実験目的で、診断目的で、予防目的で、および／または治療目的で、本発明に従う組成物が投与されうる任意の生物体を指す。典型的な対象としては、動物（たとえば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類およびヒト等）および／または植物が挙げられる。
実質的に：本明細書で使用する「実質的に」という用語は、対象の特徴または特性を、全てもしくはほぼ全ての程度または範囲で示す定性的な状態を指す。生物学分野の当業者であれば、生物学的現象および化学的現象は、あったとしても、めったに完了までいかない、および／または、完了もしくは達成にまでは進展しない、または、完全な結果を回避することを理解するであろう。それゆえ、「実質的に」という用語は、本明細書において、多くの生物学的現象および化学的現象において、本来的に、完全性が欠落している可能性を捉えるために用いられる。
実質的に同等：本明細書においては、投与の間の時間差に関しており、この用語は、＋／−  ２％を意味する。
実質的に等しい：本明細書において、複数回投与に関連しており、この用語は２秒以内を意味する。
罹患している：疾病、障害および／または疾患に「罹患」している個々人は、疾病、障害および／または疾患の１つ以上の兆候を示しているか、またはそれにより診断される。
罹患しやすい：疾病、障害および／または疾患に対して「罹患しやすい」個々人は、疾病、障害および／または疾患の兆候を示していない、および／または、それで診断されていないが、疾患またはその兆候を発現する傾向を有している。いくつかの実施形態において、疾病、障害および／または疾患（たとえば、癌）に罹患しやすい個々人は、以下の１つ以上で特徴づけられてもよい：（１）疾病、障害および／または疾患の発現に関連した遺伝的変異；（２）疾病、障害および／または疾患の発現に関連した遺伝的ポリモルフィズム；（３）疾病、障害および／または疾患の発現に関連した、タンパク質および／もしくは核酸の発現ならびに／または活性の増加ならびに／または減少；（４）疾病、障害および／または疾患の発現に関連したライフスタイルおよび／または習慣；（５）疾病、障害および／または疾患の家族歴；（６）疾病、障害および／または疾患の発現に関連した微生物への露出および／または感染。いくつかの実施形態において、疾病、障害および／または疾患に罹患しやすい個々人は、疾病、障害および／または疾患を発症する。いくつかの実施形態において、疾病、障害および／または疾患に罹患しやすい個々人は、疾病、障害および／または疾患を発症しない。
徐放：本明細書で使用する「徐放」という用語は、特定の期間にわたる放出率に従う医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。
合成：本明細書で使用する「合成」という用語は、ヒトの手により生産、調整および／または製造されたことを意味する。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたは他の分子の合成は、化学的または酵素的であっても良い。
標的細胞：本明細書で使用する「標的細胞」とは、対象の１つ以上の任意の細胞を指す。細胞は、インビトロ、インビボ、インサイツまたは生命体の組織または器官中で見いだされても良い。生命体は、動物であっても良く、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒト、最も好ましくは患者であってもよい。
治療剤：「治療剤」という用語は、対象に投与された際に、治療的効果、診断的効果および／もしくは予防的効果を有する任意の剤、ならびに／または、望ましい生物学的作用および／もしくは薬理学的作用を引き起こす任意の剤を指す。
治療有効量：本明細書で使用する「治療有効量」という用語は、疾病、障害および／または疾患に罹患した、または罹患しやすい対象に投与された際に、疾病、障害および／もしくは疾患の症状を、治療ならびに／または改善する、ならびに／または、疾病、障害および／もしくは疾患の発現を診断する、予防する、ならびに／または遅延させるために十分である、送達される剤（たとえば、核酸、薬剤、治療剤、診断剤、予防剤等）の量を意味する。
治療上有効な結果：本明細書で使用する「治療上有効な結果」は、疾病、障害および／または疾患に罹患している、または罹患しやすい対象において、疾病、障害および／もしく疾患の症状を、治療ならびに／または改善する、ならびに／または、疾病、障害および／もしくは疾患の発現を診断する、予防する、ならびに／または遅延させるために十分である結果を意味する。
総１日用量：本明細書で使用する「総１日用量」という語は、２４時間の期間に投与または処方される量を指す。総１日用量を単回単位用量として投与してよい。
転写因子：本明細書で使用する「転写因子」という用語は、たとえば転写の活性化または抑制によって、ＤＮＡのＲＮＡへの転写を制御するＤＮＡ結合タンパク質を指す。一部の転写因子は、単独で転写制御に作用する一方で、他は、他のタンパク質と協調して作用する。一部の転写因子は、ある条件下で、転写活性化または転写抑制の両方を行うことができる。通常、転写因子は、標的遺伝子の制御領域中の特定のコンセンサス配列に高度に類似した配列、または特定の標的配列に結合する。転写因子は、単独で、または他の分子と複合体化して、標的遺伝子の転写を制御してもよい。
治療：本明細書で使用する「治療」という用語は、完全にまたは部分的に、特定の感染、疾病、障害および／または疾患の１つ以上の症状または特性の発生を減少させること、それらの重篤度を減少させること、それらの進行を阻害すること、ならびに／または、それらの発現を緩和、改善、好転、軽減および／もしくは遅延させること、を指す。たとえば、癌の「治療」は、腫瘍の存続、増殖および／または核酸を阻害することを指し得る。治療は、疾病、障害および／または疾患と関連した病理の発現リスクを減少させる目的で、疾病、障害および／または疾患の兆候を示していない対象に投与されてもよく、および／または、疾病、障害および／もしくは疾患の早期兆候のみを示している対象に投与されてもよい。
非修飾：本明細書で使用する「非修飾」とは、形はどうあれ、変化する前の任意の物質、化合物または分子を指す。常にではないが、非修飾とは、野生型または天然型の生体分子を指す。分子は、一連の修飾を受けるかもしれず、それによって、各修飾分子は、次なる修飾のための「非修飾」開始分子として供される可能性もある。
均等および範囲
当業者であれば、日常的な実験を超えることなく、本明細書に記述される本発明に従う特定の実施態様に対する多くの均等物を認識または確認するであろう。本発明の範囲は、上記の記述に限定される意図は無く、添付のクレームに明記される。
【０７９３】
クレームにおいて、たとえば、「１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」等の冠詞が、逆のことが示唆されない限り、または文脈から明らかでない限り、１つ以上を意味し得る。群の１つ以上のメンバーの間に「または」を含むクレームまたは明細書は、逆のことが示されない限り、または文脈から明らかでない限り、群のメンバーの１つ、１つ以上、またはすべてが、所与の産物もしくはプロセス中に存在、または用いられ、または関連する場合、条件を満たしたとみなされる。本発明は、正確に群の１つのメンバーが所与の産物またはプロセスに存在、用いられ、または関連する実施態様を含む。本発明は、群のメンバーの２つ以上またはすべてが、所与の産物またはプロセスに存在、用いられ、または関連する実施態様を含む。
【０７９４】
「含有する」という用語は、開かれた表現であることが意図されており、追加の要素または工程が含有されてもよいこともまた、注意されたい。
範囲が与えられる場合、端点が含まれる。さらに、他で示されるか、または文脈および当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、任意の特定の値または、本発明の異なる実施態様で述べられた範囲内の副次的な値を、文脈上、他で明確に規定されない限り、範囲の低限の単位の１０分の１まで取ることが可能である。
【０７９５】
さらに、先行技術の範囲内にある本発明の任意の特定の実施態様は、任意のクレームの１つ以上から明確に除外され得る。たとえ本明細書において除外を明確に説明していなくとも、そのような実施態様は当業者に対し公知であると判断され、それらは除外されうる。本発明の組成物の任意の特定の実施態様（たとえば、任意の核酸またはそれによりコードされるタンパク質；任意の製造方法；任意の使用方法等）は、先行技術の存在と関連しようがしまいが、何らかの理由により、任意のクレームの１つ以上から除外することができる。
【０７９６】
すべての引用の出展元（たとえば、参考文献、公表文献、データベース、データベースの登録物）および本明細書に引用された技術は、たとえ明白に引用中に述べられていなくとも、参照により本出願に援用される。引用の出展元と本出願の記述が矛盾する場合、本出願の記述が優先される。
【０７９７】
項目および表の見出しは、限定を意図していない。
【実施例】
【０７９８】
以下の実施例において、本発明をさらに説明するが、それらはクレームに記述される本発明の範囲を限定しない。
実施例１．修飾ｍＲＮＡの産生
本発明に従う修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）は、標準的な実験法および材料を用いて作製されてもよい。対象遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、強力なＫｏｚａｋ翻訳開始シグナルを含有しうる５´非翻訳領域（ＵＴＲ）に隣接していてもよく、および／または、ポリＡテールの鋳型付加のためのｏｌｉｇｏ（ｄＴ）配列を含み得るα−グロビン３´ＵＴＲに隣接していてもよい。修飾ｍＲＮＡは、細胞性自然免疫反応を減少させるために修飾されていても良い。細胞性応答を減少させるための修飾には、シュードウリジン（Ψ）および５−メチル−シチジン（５ｍｅＣまたはｍ５Ｃ）を含んでも良い（Ｋａｒｉｋｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２３：１６５−７５  （２００５）、Ｋａｒｉｋｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １６：１８３３−４０  （２００８）、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＢＲ  ｅｔ  ａｌ．  ＮＡＲ  （２０１０）（それらは各々、参照により本明細書にその全体で援用される）を参照のこと）。
【０７９９】
ＯＲＦは、様々な上流または下流の付加（たとえば、限定されないが、β−グロビン、タグ等）を含有しても良く、および、たとえば限定されないがＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ
Ｐａｒｋ，ＣＡ）等の最適化サービスに発注しても良く、および、ＸｂａＩ認識を有するマルチプルクローニングサイトを含有しても良い。プラスミドＤＮＡを受け取ると、再構成され、化学的にコンピテントな大腸菌へと形質転換されうる。
【０８００】
本発明に対し、ＮＥＢ  ＤＨ５−α  コンピテント大腸菌を使用する。形質転換は、１００ｎｇのプラスミドを使用し、ＮＥＢの説明書に従って実施する。プロトコールは以下である：
１．氷上で１０分間、ＮＥＢ  ５−α  コンピテント大腸菌のチューブを溶かす。
２．１ｐｇ〜１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを含有する１〜５μｌを、細胞混合物に添加する。注意深くチューブを４〜５回弾き、細胞とＤＮＡを混合する。ボルテックスを行ってはいけない。
３．混合物を氷上に３０分間静置する。混合してはいけない。
４．正確に３０秒間、４２℃でヒートショックを与える。混合してはいけない。
５．氷上に５分間、静置する。混合してはいけない。
６．９５０μｌの室温のＳＯＣをピペットで取り、混合物に入れる。
７．６０分間、３７℃で静置する。強く揺する（２５０ｒｐｍ）か、回転させる。
８．選択プレートを３７℃まで温める。
９．チューブを弾き、転倒混和することで完全に細胞を混合する。
【０８０１】
各希釈の５０〜１００μｌを選択プレート上に撒き、３７℃で一晩、インキュベートする。あるいは、２４〜３６時間、３０℃でインキュベートするか、または４８時間、２５℃でインキュベートする。
【０８０２】
次いで、シングルコロニーを用いて、適切な抗生物質を用いたＬＢ増殖培地５ｍｌに接種し、次いで、５時間、増殖させる（２５０ＲＰＭ、３７℃）。次いで、これを用いて、２００ｍｌの培養培地に接種し、同一条件下で一晩、増殖させる。
【０８０３】
プラスミドを単離するために（８５０μｇまで）、メーカーの説明書に従いＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰＵＲＥＬＩＮＫ（登録商標）ＨｉＰｕｒｅ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州カールスバッド）を用いて、マキシプレップ（ｍａｘｉ  ｐｒｅｐ）を行う。
【０８０４】
インビトロ転写（ＩＶＴ）のｃＤＮＡ生成のために、プラスミド（図２に示される実施例）を、たとえばＸｂａＩ等の制限酵素を用いて、最初に直線化する。典型的なＸｂａＩを用いる制限酵素消化は、以下を含有する：プラスミド１．０μｇ；１０×緩衝液  １．０μｌ；ＸｂａＩ  １．５μｌ；ｄＨ２Ｏで１０μｌにする；１時間、３７℃でインキュベート。実験規模（＜５μｇ）で実施する場合、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰＵＲＥＬＩＮＫ（登録商標）  ＰＣＲ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州カールスバッド）を、メーカーの説明書に依って用いて、反応物をクリーンアップする。より大きな規模での精製は、より大きな負荷容量を有する、たとえばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎの標準ＰＵＲＥＬＩＮＫ（登録商標）  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州カールスバッド）等の製品で行う必要がある可能性がある。クリーンアップの後、直線化したベクターは、ＮａｎｏＤｒｏｐを用いて定量し、アガロースゲル電気泳動を用いて直線化を分析して確認する。
【０８０５】
修飾ｍＲＮＡを作製するための本明細書記述の方法は、長い分子を含む、全てのサイズの分子の作製に用いても良い。記述される方法を用いた修飾ｍＲＮＡは、グルコシダーゼ，α；酸（ＧＡＡ）（３．２ｋｂ）、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）（４．７ｋｂ）、ＶＩＩ因子（７．３ｋｂ）、リソソーム酸リパーゼ（４５．４ｋＤａ）、グルコセレブロシダーゼ（５９．７ｋＤａ）およびイズロン酸２−スルファターゼ（７６ｋＤａ）を含む、異なるサイズの分子に対し作製される。
【０８０６】
非限定的な例示として、Ｇ−ＣＳＦが対象ポリペプチドを代表しても良い。実施例１〜５に概要が説明されるステップに用いられる配列を、表４に示す。開始コドン（ＡＴＧ）は、表４の各配列中に下線が引かれていることに注意されたい。
【０８０７】
【表４】
2019059793.tif 000117
【０８０８】
2019059793.tif 000118
【０８０９】
実施例２：ｃＤＮＡ産生のためのＰＣＲ
ｃＤＮＡ調製のためのＰＣＲ手順は、Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（マサチューセッツ州ウォーバーン）の２×ＫＡＰＡ  ＨＩＦＩ（登録商標）ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘを用いて行う。このシステムには、２×ＫＡＰＡ  ＲｅａｄｙＭｉｘは１２．５μｌ；フォワードプライマー（１０ｕＭ）は０．７５μｌ；リバースプライマー（１０ｕＭ）は０．７５μｌ；鋳型ｃＤＮＡは１００ｎｇ、含まれ、ｄＨ２０で２５．０μｌに希釈される。反応条件は、９５℃で５分、および９８℃で２０秒、次いで５８℃で１５秒、次いで７２℃で４５秒を２５サイクル、そして７２℃で５分、そして４℃で終了である。
【０８１０】
本発明のリバースプライマーには、ｍＲＮＡ中のｐｏｌｙ−Ａ１２０に対するｐｏｌｙ−Ｔ１２０が組み込まれている。より長い、またはより短いｐｏｌｙ（Ｔ）系を有する他のリバースプライマーを用いて、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールの長さを調製することもできる。
【０８１１】
反応物は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰＵＲＥＬＩＮＫ（登録商標）ＰＣＲ  Ｍｉｃｒｏ
Ｋｉｔ（カリフォルニア州カールスバッド）（５μｇまで）を、メーカーの説明書に従い用いて、クリーンアップする。より多量の反応物には、より大きな容量の製品を用いてクリーンアップする必要がある。クリーンアップの後、ｃＤＮＡを、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）を用いて定量し、アガロースゲル電気泳動で分析して、ｃＤＮＡが予測サイズであることを確認する。次いで、インビトロの転写反応へと進む前に、ｃＤＮＡの配列解析を行う。
実施例３．インビトロ転写
インビトロ転写反応により、修飾ヌクレオチドまたは修飾ＲＮＡを含有するｍＲＮＡが生成される。入力ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスを、天然ＮＴＰおよび非天然ＮＴＰを用いて組織内で作製する。
【０８１２】
典型的なインビトロ転写反応は以下を含む：
１．鋳型ｃＤＮＡ    １．０  μｇ
２．１０×転写緩衝液  （４００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１９０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭスペルミジン）  ２．０μｌ
３．カスタムＮＴＰ（各々２５ｍＭ）  ７．２μｌ
４．ＲＮａｓｅ阻害剤  ２０Ｕ
５．Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  ３０００Ｕ
６．ｄＨ２０  最大２０．０μｌ。そして、
７．３７℃で３〜５時間インキュベーション。
【０８１３】
粗ＩＶＴミックスを、翌日のクリーンアップのために、４℃で一晩保存しても良い。次いで、１ＵのＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅを用いて、元のテンプレートを消化する。３７℃、１５分間のインキュベーションの後、ｍＲＮＡを、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（登録商標）Ｋｉｔ（テキサス州オースティン）を用いてメーカーの説明書に従い精製する。このキットは、５００μｇまでのＲＮＡを精製することができる。クリーンアップの後、ＲＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐを用いて定量し、アガロースゲル電気泳動により分析して、ＲＮＡが適正なサイズであり、ＲＮＡの分解が発生していないことを確認する。実施例４．ｍＲＮＡの酵素的キャッピング
ｍＲＮＡのキャッピングは、以下のように実施する：混合物には以下を含む：ＩＶＴ  ＲＮＡ６０〜１８０μｇおよびｄＨ２Ｏで７２μｌまで。混合物を、６５℃で５分間インキュベートし、ＲＮＡを変性させ、次いで、直ちに氷へと移す。
【０８１４】
次いで、プロトコールは以下である。１０×キャッピング緩衝液（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、６０ｍＭ  ＫＣｌ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）（１０．０μｌ）；２０ｍＭ  ＧＴＰ（５．０μｌ）；２０ｍＭ  Ｓ−アデノシルメチオニン（２．５μｌ）；ＲＮａｓｅ阻害剤（１００Ｕ）；２′−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（４００Ｕ）；ワクシニアキャッピング酵素（グアニリルトランスフェラーゼ）（４０Ｕ）を混合し、ｄＨ２０（２８μｌまで）；および、３７℃で３０分間、６０μｇのＲＮＡをインキュベーション、または２時間まで１８０μｇのＲＮＡをインキュベーション。
【０８１５】
次いで、ｍＲＮＡをＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（登録商標）Ｋｉｔ（テキサス州オースティン）を用いてメーカーの説明書に従い精製する。クリーンアップの後、ＲＮＡを、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて定量し、アガロースゲル電気泳動により分析して、ＲＮＡが適正なサイズであり、ＲＮＡの分解が発生していないことを確認する。ＲＮＡ産物はまた、逆転写ＰＣＲを実行し、配列解析のためのｃＤＮＡを生成することにより、配列解析されてもよい。
実施例５．ポリＡテール反応
ｃＤＮＡにはｐｏｌｙ−Ｔが無いので、最終産物精製の前にポリＡテール反応を必ず実施しなければならない。これは、キャップ化ＩＶＴ  ＲＮＡ（１００μｌ）；ＲＮａｓｅ阻害剤（２０Ｕ）；１０×Ｔａｉｌｉｎｇ緩衝液（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、２．５Ｍ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２）（１２．０μｌ）；２０ｍＭ
ＡＴＰ（６．０μｌ）；ポリＡポリメラーゼ（２０Ｕ）を混合し、ｄＨ２０で１２３．５μｌまで、３７℃で３０分間インキュベートすることにより行う。もしポリＡテールがすでに転写物にある場合、ｔａｉｌ反応は飛ばして、直接、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（登録商標）キット（テキサス州オースティン）（５００μｇまで）での精製へと進んでも良い。ポリＡポリメラーゼは、酵母で発現された組換え酵素が好ましい。
【０８１６】
本明細書に記述および実施された試験に対して、ポリＡテールは、ＩＶＴ鋳型にコードされ、１６０ヌクレオチドの長さを含有する。しかしながら、ポリＡテール反応の処理能力または完全性は、常に正確に１６０ヌクレオチドをもたらすものではないことを理解されたい。それゆえ、およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテール（たとえば、約１５０〜１６５、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４または１６５等）もまた本発明の範囲内にある。
実施例６．天然５´キャップおよび５´キャップ類似体
修飾ＲＮＡの５´キャッピングは、５´−グアノシンキャップを生成するための以下の化学的ＲＮＡキャップ類似体をメーカーのプロトコールに従い用いて、インビトロ転写反応の間に同時に完了させても良い：３´−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ＡＲＣＡキャップ］；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）。修飾ＲＮＡの５´−キャッピングは、「キャップ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）を生成するためのワクシニアウイルスキャッピング酵素を用いて、転写の後で完了させても良い。キャップ１構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素および、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ−２′−Ｏ−メチルを生成するための２´−Ｏメチルトランスフェラーゼの両方を用いて生成しても良い。キャップ２構造は、２´−Ｏ−メチルトランスフェラーゼを用いた５´−終わりから３番目のヌクレオチドの２´−Ｏ−メチル化により、キャップ１構造から生成されてもよい。キャップ３構造は、２´−Ｏメチルトランスフェラーゼを用いた５´−終わりから４番目のヌクレオチドの２´−Ｏ−メチル化により、キャップ２構造から生成されても良い。酵素は、組換え物質由来のものが好ましい。
【０８１７】
哺乳類細胞へのトランスフェクションの場合は、修飾ｍＲＮＡは、１２〜１８時間または１８時間超（たとえば、２４、３６、４８、６０、７２時間か７２時間以上）の間の安定性を有する。
実施例７．キャッピング
Ａ．タンパク質発現アッセイ
ＡＲＣＡ（３´Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ）キャップ類似体またはキャップ１構造を含有するヒトＧ−ＣＳＦ（配列番号５に示されるｃＤＮＡ；およそ１６０ヌクレオチドの長さのポリＡテール（配列は示さず）を有する、各シトシンで５−メチルシトシンに完全に修飾、および各ウリジン部位でのシュードウリジン置換で完全に修飾されたｍＲＮＡ配列を配列番号６に示す）をコードする合成ｍＲＮＡは、等濃度で、ヒト初代角化細胞へとトランスフェクションすることができる。トランスフェクション後、６、１２、２４、３６時間で、培養培地中に分泌されるＧ−ＣＳＦの量を、ＥＬＩＳＡで分析することができる。培地中に高レベルのＧ−ＣＳＦを分泌する合成ｍＲＮＡは、高度に翻訳的に有能なキャップ構造を有する合成ｍＲＮＡに対応する。
【０８１８】
Ｂ．純度分析合成
ＡＲＣＡキャップ類似体またはキャップ１構造粗合成産物を含有する、ヒトＧ−ＣＳＦ（配列番号５に示されるｃＤＮＡ；およそ１６０ヌクレオチドの長さのポリＡテール（配列は示さず）を有する、各シトシンで５−メチルシトシンに完全に修飾、および各ウリジン部位でのシュードウリジン置換で完全に修飾されたｍＲＮＡ配列を配列番号６に示す）をコードする合成ｍＲＮＡは、変性アガロース−尿素ゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析を用いて、純度を比較することができる。電気泳動で、単一の、確固としたバンドを有する合成ｍＲＮＡは、複数のバンドまたは縞状のバンドを有する合成ｍＲＮＡと比較して、高純度の産物に対応する。単一のＨＰＬＣピークを有する合成ｍＲＮＡもまた、高純度の産物に対応する。高効率でのキャッピング反応により、より純粋なｍＲＮＡ群がもたらされる。
【０８１９】
Ｃ．サイトカイン分析
ＡＲＣＡキャップ類似体またはキャップ１構造を含有する、ヒトＧ−ＣＳＦ（配列番号５に示されるｃＤＮＡ；およそ１６０ヌクレオチドの長さのポリＡテール（配列は示さず）を有する、各シトシンで５−メチルシトシンに完全に修飾、および各ウリジン部位でのシュードウリジン置換で完全に修飾されたｍＲＮＡ配列を配列番号６に示す）をコードする合成ｍＲＮＡは、複数の濃度で、ヒト初代角化細胞へとトランスフェクションすることができる。トランスフェクション後、６、１２、２４、３６時間で、たとえばＴＮＦαおよびＩＦＮβ等の培養培地中へと分泌された炎症性サイトカインの量を、ＥＬＩＳＡにより分析することができる。培地中へ高レベルの炎症性サイトカインを分泌する合成ｍＲＮＡは、免疫活性化キャップ構造を含有する合成ｍＲＮＡに対応する。
【０８２０】
Ｄ．キャッピング反応効率
ＡＲＣＡキャップ類似体またはキャップ１構造を含有する、ヒトＧ−ＣＳＦ（配列番号５に示されるｃＤＮＡ；およそ１６０ヌクレオチドの長さのポリＡテール（配列は示さず）を有する、各シトシンで５−メチルシトシンに完全に修飾、および各ウリジン部位でのシュードウリジン置換で完全に修飾されたｍＲＮＡ配列を配列番号６に示す）をコードする合成ｍＲＮＡは、キャップ化ｍＲＮＡヌクレアーゼ処置の後、ＬＣ−ＭＳによりキャッピング反応効率を分析することができる。キャップ化ｍＲＮＡのヌクレアーゼ処理により、ＬＣ−ＭＳで検出可能な、遊離ヌクレオチド、そしてキャップ化５´−５−三リン酸キャップ構造の混合物が得られる。ＬＣ−ＭＳスペクトル上で、キャップ化産物の量は、反応物由来の総ｍＲＮＡのパーセントとして表され、キャッピング反応効率に対応する。高いキャッピング反応効率を伴うキャップ構造は、ＬＣ−ＭＳによるキャップ化産物をより多量に有する。
実施例８．修飾ＲＮＡまたはＲＴ  ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動
個々の修飾ＲＮＡ（２０μｌ体積中で、２００〜４００ｎｇ）または逆転写ＰＣＲ産物（２００〜４００ｎｇ）を、非変性１．２％アガロースＥ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）上のウェル内にロードし、メーカーのプロトコールに従い、１２〜１５分間、泳動する。
実施例９．リピドイド（Ｌｉｐｉｄｏｉｄｓ）を用いた修飾ｍＲＮＡの製剤化
修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）は、細胞に添加する前に、規定の比率でリピドイドとｍｍＲＮＡを混合することにより、インビトロ実験に対して製剤化される。インビボの製剤は、身体中の循環を促進するための、追加成分の添加を必要し得る。これらのリピドイドのインビボでの作用に適した粒子形成の能力を検証するために、ｓｉＲＮＡリピドイドに用いられる標準処方プロセスを、開始点として用いた。当初のｍｍＲＮＡ−リピドイドの製剤は、４２％リピドイド、４８％コレステロールおよび１０％ＰＥＧから構成される粒子からなり得、可能性のある比率の最適化をさらに行っても良い。粒子の形成の後、ｍｍＲＮＡを添加し、複合体と結合させる。封入効率は、標準的な色素排除アッセイを用いて測定する。
実施例１０〜１４の材料と方法
Ａ．脂質合成
６つの脂質（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００およびＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）が、修飾ＲＮＡとの製剤化のために、当分野で概説される方法により合成された。ＤＬｉｎ−ＤＭＡおよび前駆体は、Ｈｅｙｅｓ  ｅｔ．  ａｌ，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２００５，  １０７，  ２７６−２８７に記述されるように合成した。ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡおよびＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡおよび前駆体は、Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ．  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２０１０，  ２８，  １７２−１７６．に記述されるように合成され、９８Ｎ１２−５および前駆体は、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ．  ａｌ，
Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２００８，  ２６，  ５６１−５６９に記述されるように合成した。
【０８２１】
Ｃ１２−２００および前駆体を、Ｌｏｖｅ  ｅｔ．  ａｌ，  ＰＮＡＳ，  ２０１０，
１０７，  １８６４−１８６９に概説される方法に従い合成した。２−エポキシドデカン（５．１０ｇ、２７．７ｍｍｏｌ、８．２ｅｑ）を、Ａｍｉｎｅ２００（０．７２３ｇ、３．３６  ｍｍｏｌ、１ｅｑ）および攪拌棒を含有するバイアルに添加した。バイアルを密封し、８０℃まで加熱した。反応物を、８０℃で４日間、攪拌した。次いで、混合物を、純粋ジクロロメタン（ＤＣＭ）〜ＤＣＭ：ＭｅＯＨ  ９８：２の勾配を用いたシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。標的化合物を、ＲＰ−ＨＰＬＣでさらに精製し、所望の化合物を得た。
【０８２２】
ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡおよび前駆体を、ＷＯ２０１００５４４０１（参照によりその全体で本明細書に援用される）に記述される手順に従い合成した。ＤＭＦ１０ｍＬに溶解したジリノレイルメタノール（１．５ｇ、２．８ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ酪酸（１．５ｇ、２．８ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、ＤＩＰＥＡ（０．７３ｍＬ、４．２ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）およびＴＢＴＵ（１．３５ｇ、４．２ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）の混合物を、室温で１０時間攪拌した。次いで、反応混合物をエーテルで希釈し、水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮した。粗生成物を、ＤＣＭ〜ＤＣＭ：ＭｅＯＨ  ９８：２の勾配を用いたシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。次いで、標的化合物を、追加のＲＰ−ＨＰＬＣ精製に供し、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｃ４カラムを用いて行われ、標的化合物を得た。
【０８２３】
Ｂ．修飾ＲＮＡナノ粒子の製剤化
合成脂質、１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、アラバマ州アラバスター）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ、タウフカーシェン）、およびα−［３’−（１，２−ジミリストイル−３−プロパノキシ）−カルボキサミド−プロピル］−ω−メトキシ−ポリオキシエチレン（ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ）（ＮＯＦ、ベルギー、Ｂｏｕｗｅｌｖｅｎ）の溶液を、エタノール中で、５０ｍＭの濃度で調製し、−２０℃で保存した。脂質を、モル比が５０：１０：３８．５：１．５（脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ）となるように組み合わせて、エタノールで最終脂質濃度２５ｍＭまで希釈した。水に溶解した１〜２ｍｇ／ｍＬ濃度の修飾ｍＲＮＡの溶液を、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３）で希釈し、修飾ｍＲＮＡ原溶液を形成した。脂質および修飾ｍＲＮＡの製剤は、合成脂質溶液と修飾ｍＲＮＡ溶液を、総脂質対修飾ｍＲＮＡ重量の比率が、１０：１、１５：１、２０：１および３０：１になるように組み合わせて調製した。脂質エタノール溶液を、水性修飾ｍＲＮＡ溶液に速やかに注入し、３３％エタノールを含有する懸濁液を得た。溶液を、手動（ＭＩ）またはシリンジポンプの補助（ＳＰ）（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｐｕｍｐ  ３３  Ｄｕａｌ  Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｐｕｍｐ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  マサチューセッツ州ホリストン）のいずれかで注入した。
【０８２４】
エタノールを除去し、緩衝液交換を行うために、製剤を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に対し、初期産物の２００倍の体積で、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．
イリノイ州ロックフォード）を用いて、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）は１０ｋＤで、２度、透析した。最初の透析は、室温で３時間行い、次いで、製剤を４℃で一晩透析した。得られたナノ粒子懸濁液を、０．２μｍの滅菌フィルター（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，ドイツ、ニュームブレヒト）を介してろ過してガラスバイアルに入れ、圧着閉鎖で密封した。
【０８２５】
Ｃ．製剤の特徴付け
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ  （Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，  Ｍａｌｖｅｒｎ，  イギリス、ウスターシャー）を用いて、修飾ｍＲＮＡナノ粒子の粒子サイズ、多分散性インデックス（ＰＤＩ）およびゼータ電位を測定した（粒子サイズ測定には１×ＰＢＳに溶解、ゼータ電位測定には１５ｍＭＰＢＳに溶解）。
【０８２６】
紫外線−可視光分光法を用いて、修飾ｍＲＮＡナノ粒子製剤の濃度を測定した。１×ＰＢＳに溶解した希釈製剤の１００μｌを、メタノールとクロロホルムの４：１（ｖ／ｖ）混合物  ９００μＬに加えた。混合した後、溶液の吸光スペクトルを、ＤＵ  ８００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｉｎｃ．，カリフォルニア州ブレア）で、２３０ｎｍと３３０ｎｍの間で記録した。ナノ粒子製剤中の修飾ＲＮＡ濃度は、製剤中に用いられた修飾ＲＮＡの減衰係数および、２６０ｎｍの波長での吸光度と３３０ｎｍの波長でのベースライン値の間の差異に基づき算出された。
【０８２７】
ＱＵＡＮＴ−ＩＴ（登録商標）ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  カリフォルニア州カールスバッド）を用いて、ナノ粒子による修飾ＲＮＡの封入を評価した。試料を、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中でおよそ５μｇ／ｍＬの濃度まで希釈した。希釈試料５０μＬを、ポリスチレンの９６ウェルプレートに移し、次いで、５０μＬのＴＥ緩衝液か、５０μＬの２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液のいずれかを加えた。３７℃の温度で１５分間、プレートをインキュベートした。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）の試薬を、ＴＥ緩衝液で１：１００に希釈し、この溶液１００μＬを各ウェルに加えた。蛍光強度を、蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ；  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて、励起波長約４８０ｎｍ、発光波長約５２０ｎｍで測定した。試薬ブランクの蛍光値を、各試料の値から差し引き、遊離修飾ＲＮＡの割合を、生の試料（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加がないもの）の蛍光強度を破壊試料（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加により破壊されたもの）の蛍光値で割ることにより測定した。
【０８２８】
Ｄ．インビトロインキュベーション
ヒト胚腎上皮細胞（ＨＥＫ２９３）および肝細胞癌上皮細胞（ＨｅｐＧ２）（ＬＧＣ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ＧｍｂＨ，  ドイツ、ヴェーゼル）を９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ  ＧｍｂＨ，  ドイツ、フリッケンハウゼン）上に播種し、ＨＥＫ２９３細胞のプレートは、１型コラーゲンで前もってコートした。ＨＥＫ２９３細胞を、３０，０００細胞／ウェルの密度で、１００μｌの細胞培養培地で播種し、ＨｅｐＧ２細胞を、３５，０００細胞／ウェルの密度で、１００μｌの細胞培養培地で播種した。ＨＥＫ２９３細胞に対しては、細胞培養培地は、ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、および１×非必須アミノ酸（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，  ドイツ、ベルリン）および１．２ｍｇ／ｍｌ炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  ドイツ、ミュンヘン）の添加）で、ＨｅｐＧ２に対しては、細胞培養培地は、ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ドイツ、ダルムシュタット）、１０％ＦＣＳ（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムおよび１×非必須アミノ酸（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，  ドイツ、ベルリン）の添加）であった。ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ配列は、配列番号７に示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示さない；５´キャップ、キャップ１）を含有する製剤を、細胞播種の後に、直接、四重で加え、インキュベートした。インビトロ転写（ＩＶＴ）で用いられた、Ｔ７プロモーター、５´非翻訳領域（ＵＴＲ）および３´ＵＴＲを有するｍＣｈｅｒｒｙ  ｃＤＮＡを、配列番号８に示す。ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡは、各シトシンで５ｍｅＣで修飾され、各ウリジン部位で、シュードウリジン置換で修飾された。
【０８２９】
培養培地上清を、９６ウェルのＰｒｏ−Ｂｉｎｄ  Ｕ底プレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＧｍｂＨ，  ドイツ、ハイデルベルク）へと移すことで細胞を回収した。細胞を、２分の１量のトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，  ドイツ、ベルリン）でトリプシン処理し、各上清でプールし、１体積のＰＢＳ／２％ＦＣＳ（両方ともＢｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，  ドイツ、ベルリン）／０．５％ホルムアルデヒド（Ｍｅｒｃｋ，  ドイツ、ダルムシュタット）を加えることにより固定した。次いで、試料を、ＬＳＲＩＩサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＧｍｂＨ，  ドイツ、ハイデルベルク）にて、５３２ｎｍ励起レーザーおよび６１０／２０フィルター（ＰＥ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄに対する）で、フローサイトメーター測定に供した。すべてのイベントの平均蛍光強度（ＭＦＩ）および４つの独立したウェルの標準偏差を、分析された試料に対し示す。
実施例１０．ナノ粒子製剤の精製
ＨＥＫ２９３およびＨｅｐＧ２中の、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡおよび９８Ｎ１２−５のナノ粒子製剤を、修飾ＲＮＡに対する脂質の比率および／または精製に平均蛍光強度（ＭＦＩ）が依存していたかを測定するために検証した。３つのＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ製剤および、２つの９８Ｎ１２−５製剤を、表５に記述される仕様でシリンジポンプを用いて製造した。精製試料は、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ−２５  ＤＮＡグレード（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  スウェーデン）で精製した。精製前後（ａＰ）の各製剤を、２４ウェルプレート中の修飾ＲＮＡ２５０ｎｇ／ウェルの濃度で検証した。各製剤およびバックグラウンド試料に対するフローサイトメーターで分析した際の、ＦＬ４チャンネルに対するマーカーが陽性である細胞の割合（％ＦＬ４−陽性）、ならびに、各製剤およびバックグランド試料のＦＬ４チャンネルに対するマーカーのＭＦＩを表６に示す。精製された製剤は、精製前に検証した製剤よりも、やや高いＭＦＩであった。
【０８３０】
【表５】
2019059793.tif 000119
【０８３１】
【表６】
2019059793.tif 000120
【０８３２】
実施例１１．濃度応答曲線
９８Ｎ１２−５（ＮＰＡ−００５）および、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（ＮＰＡ−００３）のナノ粒子製剤を、様々な濃度で検証して、ＦＬ４またはｍＣｈｅｒｒｙ（ｍＲＮＡ配列は、配列番号７に示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されている）のＭＦＩを用量の範囲にわたり測定した。検証された製剤の概要を表７に示す。９８Ｎ１２−５のナノ粒子製剤の最適濃度を決定するために、修飾ＲＮＡの製剤の様々な濃度（１００ｎｇ、１０ｎｇ、１．０ｎｇ、０．１ｎｇおよび０．０１ｎｇ／ウェル）を、ＨＥＫ２９３の２４ウェルプレートで検証し、得られた各用量のＦＬ４  ＭＦＩの結果を表８に示す。同様に、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡのナノ粒子製剤の最適濃度を決定するために、修飾ＲＮＡの製剤の様々な濃度（２５０ｎｇ、１００ｎｇ、１０ｎｇ、１．０ｎｇ、０．１ｎｇおよび０．０１ｎｇ／ウェル）を、ＨＥＫ２９３の２４ウェルプレートで検証し、得られた各用量のＦＬ４  ＭＦＩの結果を表９に示す。ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡのナノ粒子製剤はまた、修飾ＲＮＡの製剤の様々な濃度（２５０ｎｇ、１００ｎｇおよび３０ｎｇ／ウェル）を、ＨＥＫ２９３の２４ウェルプレートで検証され、得られた各用量のＦＬ４  ＭＦＩの結果を表１０に示す。９８Ｎ１２−５に対する１ｎｇ／ウェルの用量、およびＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡに対する１０ｎｇ／ウェルの用量は、バックグラウンドのＦＬ４  ＭＦＩに似ていることが見出された。
【０８３３】
どのくらい近くまでその濃度がバックグラウンドに似ているかを測定するために、ｍＣｈｅｒｒｙ発現の検出のための最適化フィルターセットを備えたフローサイトメーターを使用したところ、バックグラウンドレベルと比較して感度が増加した結果を得るこことができた。２５ｎｇ／ウェルの用量、０．２５ｎｇ／ウェルの用量、０．０２５ｎｇ／ウェルの用量、および０．００２５ｎｇ／ウェルの用量を、９８Ｎ１２−５（ＮＰＡ−００５）およびＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（ＮＰＡ−００３）に対して分析し、ｍＣｈｅｒｒｙのＭＦＩを決定した。表１１に示されるように、０．０２５ｎｇ／ウェルの濃度およびそれより低い濃度は、ｍＣｈｅｒｒｙのバックグラウンドＭＦＩレベルに類似している（約３８６．１２５）。
【０８３４】
【表７】
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【０８３５】
【表８】
2019059793.tif 000122
【０８３６】
【表９】
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【０８３７】
【表１０】
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【０８３８】
【表１１】
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【０８３９】
実施例１２．手動注入およびシリンジポンプ処方
ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡおよび９８Ｎ１２−５の２つの製剤は、手動注入（ＭＩ）およびシリンジポンプ注入（ＳＰ）により調製され、バックグラウンド試料と共に分析し、異なる製剤のｍＣｈｅｒｒｙ（ｍＲＮＡ配列は、配列番号７に示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されている）のＭＦＩと比較した。表１２に、同じ脂質および脂質／ＲＮＡ比率の手動注入製剤と比較して、シリンジポンプ製剤がより高いＭＦＩを有していたことを示す。
【０８４０】
【表１２】
2019059793.tif 000126
【０８４１】
実施例１３．ＬＮＰ製剤
ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００およびＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡの製剤を、６０ｎｇ／ウェルまたは６２．５ｎｇ／ウェルの濃度（ＨＥＫ２９３細胞のプレート）、および６２．５ｎｇ／ウェルの濃度（ＨｅｐＧ２細胞のプレート）で、２４時間、インキュベートして、各製剤に対するｍＣｈｅｒｒｙ（ｍＲＮＡ配列は、配列番号７に示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されている）のＭＦＩを測定した。検証された製剤の概要を以下の表１３に示す。６０ｎｇ／ウェルに対する表１４、および、６２．５ｎｇ／ウェルに対する表１５、１６、１７および１８に示されるように、ＮＰＡ−００３およびＮＰＡ−０１８の製剤が、もっとも高いｍＣｈｅｒｒｙのＭＦＩを有し、ＮＰＡ−００８、ＮＰＡ−０１０およびＮＰＡ−０１３の製剤が、バックグラウンド試料のｍＣｈｅｒｒｙのＭＦＩの値ともっとも類似している。
【０８４２】
【表１３】
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【０８４３】
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【０８４４】
【表１４】
2019059793.tif 000129
【０８４５】
【表１５】
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【０８４６】
【表１６】
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【０８４７】
【表１７】
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【０８４８】
【表１８】
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【０８４９】
実施例１４．  インビボ製剤試験
げっ歯類（ｎ＝５）に、少なくとも１つの修飾ｍＲＮＡおよび脂質を含有する製剤の単回用量を、静脈内、皮下、筋肉内に投与する。げっ歯類に投与される修飾ｍＲＮＡは、Ｇ−ＣＳＦ（ｍＲＮＡ配列は、配列番号６に示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）（ｍＲＮＡ配列は、配列番号９に示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）、ＩＸ因子（ｍＲＮＡ配列は、配列番号１０に示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）またはｍＣｈｅｒｒｙ（ｍＲＮＡ配列は、配列番号７に示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）から選択される。インビトロ転写（ＩＶＴ）で用いられた、Ｔ７プロモーター、５´非翻訳領域（ＵＴＲ）および３´ＵＴＲを有するエリスロポエチンｃＤＮＡは、配列番号１１および配列番号１２に示す。
【０８５０】
各製剤はまた、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、  ｒｅＬＮＰ、ＡＴＵＰＬＥＸ（登録商標）、ＤＡＣＣ、およびＤＢＴＣのうちの１つから選択される脂質も含有する。げっ歯類は、修飾されたｍＲＮＡの製剤の１００μｇ、１０μｇまたは１μｇを注入され、試料は、特定の時間間隔で採取される。
【０８５１】
ヒトＧ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡを含有する製剤を投与されたげっ歯類からの血清は、特定のＧ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡにより測定され、ヒトＩＸ因子修飾ＲＮＡを投与されたマウスからの血清は、特定のＩＸ因子  ＥＬＩＳＡまたは発色アッセイにより分析される。ｍＣｈｅｒｒｙ修飾ｍＲＮＡを投与されたマウス由来の肝臓および脾臓は、免疫組織化学法（ＩＨＣ）または蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）により分析される。対照として、製剤を何も注入されていないマウス群およびそれらの血清および組織が、採取され、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳおよび／またはＩＨＣにより分析される。
Ａ．経時的変化
げっ歯類は、投与された製剤に対するタンパク質発現の経時的変化を試験するために、少なくとも１つの修飾ｍＲＮＡを含有する製剤を投与される。げっ歯類は、タンパク質発現および全血球数を測定するために、修飾ｍＲＮＡ製剤の投与の前後に、特定の時間間隔で採血される。また、試料を、修飾ｍＲＮＡ製剤が皮下および筋肉内に投与されたげっ歯類の投与部位から採取し、その組織内のタンパク質発現を測定する。
Ｂ．用量応答性
げっ歯類は、各製剤の用量応答性を測定するため、少なくとも１つの修飾ｍＲＮＡを含有する製剤が投与される。げっ歯類は、タンパク質発現および全血球数を測定するために、修飾ｍＲＮＡ製剤の投与の前後に、特定の時間間隔で採血される。また、げっ歯類を殺処分し、内部組織に対する修飾ｍＲＮＡ製剤の作用を分析する。また、試料を、修飾ｍＲＮＡ製剤が皮下および筋肉内に投与されたげっ歯類の投与部位から採取し、その組織内のタンパク質発現を測定する。
Ｃ．毒性
げっ歯類は、各製剤の毒性を試験するため、少なくとも１つの修飾ｍＲＮＡを含有する製剤が投与される。げっ歯類は、タンパク質発現および全血球数を測定するために、修飾ｍＲＮＡ製剤の投与の前後に、特定の時間間隔で採血される。また、げっ歯類を殺処分し、内部組織に対する修飾ｍＲＮＡ製剤の作用を分析する。また、試料を、修飾ｍＲＮＡ製剤が皮下および筋肉内に投与されたげっ歯類の投与部位から採取し、その組織内のタンパク質発現を測定する。
実施例１５．ＰＬＧＡマイクロスフェア製剤
ＰＬＧＡマイクロスフェアの製剤化に用いられたパラメータの最適化により、マイクロスフェア内に封入される修飾ｍＲＮＡの完全性を維持したまま、高い封入効率および放出率の調節が可能になりうる。たとえば、限定されないが、粒子サイズ、回収率および封入効率等のパラメータを、最適な製剤を得るために、最適化しても良い。
Ａ．ＰＬＧＡマイクロスフェアの合成
ポリラクチックグリコール酸（ＰＬＧＡ）マイクロスフェアが、当分野で公知の水／油／水の二重乳化法を用いて、ＰＬＧＡ（Ｌａｃｔｅｌ、Ｃａｔ＃  Ｂ６０１０−２、固有粘度０．５５−０．７５、５０：５０  ＬＡ：ＧＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃  ３４８４０６−２５Ｇ、ＭＷ  １３−２３ｋ）ジクロロメタンおよび水を用いて、合成された。簡潔に言うと、０．１ｍｌの水（Ｗ１）を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解した２ｍｌのＰＬＧＡ（濃度範囲は、ＰＬＧＡ５０〜２００ｍｇ／ｍｌ）（Ｏ１）に、添加した。Ｗ１／Ｏ１のエマルションを、スピード４（約１５，０００ｒｐｍ）で３０秒間、ホモジナイズした（ＩＫＡ  Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ、Ｔ１８）。次いで、Ｗ１／Ｏ１エマルションに、１００〜２００ｍｌの０．３〜１％ＰＶＡ（Ｗ２）を加え、様々なスピードで、１分間、ホモジナイズした。製剤を、３時間、攪拌したままにして、次いで、遠心（２０〜２５分間、４，０００ｒｐｍ、４℃）により洗浄した。上清を棄て、ＰＬＧＡペレットを、５〜１０ｍｌの水に再懸濁し、これを２回繰り返した。各製剤に対する平均粒子サイズ（２０〜３０の粒子を象徴する）を、洗浄後、顕微鏡により測定した。表１９に、ＰＬＧＡ濃度の増加により、より大きなサイズのマイクロスフェアがもたらされたことを示す。２００ｍｇ／ｍＬのＰＬＧＡ濃度からは、平均粒子サイズは１４．８μｍ、１００ｍｇ／ｍＬでは８．７μｍ、そして５０ｍｇ／ｍＬのＰＬＧＡでは、平均粒子サイズは４．０μｍであった。
【０８５２】
【表１９】
2019059793.tif 000134
【０８５３】
表２０に、ホモジナイゼーションスピードを、５（約２０，０００ｒｐｍ）からスピード４（約１５，０００ｒｐｍ）にまで減少することにより、粒子サイズが１４．８μｍから２９．７μｍに増加したことを示す。
【０８５４】
【表２０】
2019059793.tif 000135
【０８５５】
表２１に、Ｗ２体積を増加することにより（すなわち、Ｗ２：Ｏ１の比率を、５０：１から１００：１に増加すること）、平均粒子サイズがやや減少したことを示す。ＰＶＡ濃度を、０．３から１ｗｔ％に変えても、ＰＬＧＡマイクロスフェアのサイズにほとんど影響はなかった。
【０８５６】
【表２１】
2019059793.tif 000136
【０８５７】
Ｂ．修飾ｍＲＮＡの封入
修飾Ｇ−ＣＳＦｍＲＮＡ（配列番号６。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されている）を、２ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶解した（Ｗ３）。ＰＬＧＡマイクロスフェア製剤の３つのバッチを、以下のパラメータで上述のように作製した：２ｍｇ／ｍｌで、０．１ｍｌのＷ３、２００ｍｇ／ｍｌで１．６ｍｌのＯ１、１％で１６０ｍｌのＷ２。そしてそれらを、第一のエマルション（Ｗ３／Ｏ１）に対してはスピード４でホモジナイズし、第二のエマルション（Ｗ３／Ｏ１／Ｗ２）に対してはスピード５でホモジナイズした。遠心による洗浄の後、製剤を液体窒素中で凍結させ、次いで、３日間、凍結乾燥させた。製剤の封入効率を検証するために、凍結乾燥材料を、ＤＣＭ中で６時間、脱製剤化（ｄｅｆｏｒｍｕｌａｔｅ）させ、次いで、一晩、水中で抽出した。次いで、試料中の修飾ＲＮＡ濃度を、ＯＤ２６０により測定した。封入効率は、修飾ＲＮＡの実際の量を測り、修飾ＲＮＡの開始量で割ることにより算出した。検証した３つのバッチにおいて、封入効率は、５９．２、４９．８および６１．３であった。
【０８５８】
Ｃ．ＰＬＧＡマイクロスフェアに封入した修飾ｍＲＮＡの完全性
修飾ＩＸ因子ｍＲＮＡ（配列番号１０。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されている）を、様々な濃度で水に溶解し（Ｗ４）、製剤中に含まれる重量パーセントを変え（ｍｇ  修飾ＲＮＡ／ｍｇ  ＊１００）そして、封入効率を測定した。表２２に示すパラメータを用いて、ＰＬＧＡマイクロスフェア製剤の４つの異なるバッチを作製した（ホモジナイズスピードは、第一のエマルション（Ｗ４／Ｏ１）に対してはスピード４、第二のエマルション（Ｗ４／Ｏ１／Ｗ２）に対してはスピード５）。
【０８５９】
【表２２】
2019059793.tif 000137
【０８６０】
凍結乾燥の後、ＰＬＧＡマイクロスフェアを２ｍｌのエッペンドルフチューブ中で検量し、修飾ＲＮＡ約１０μｇに対応させた。凍結乾燥により、ＰＬＧＡマイクロスフェアの全体的な構造は破壊されないことが判明した。ＰＬＧＡマイクロスフェアの含有重量パーセント（ｗｔ％）を増加させるために、修飾ＲＮＡの量を増加させて試料に加えた。１．０ｍｌのＤＣＭを各チューブに加えることによりＰＬＧＡマイクロスフェアを脱製剤化させ、次いで、試料を６時間振とうさせた。修飾ＲＮＡ抽出のために、０．５ｍｌの水を各試料に加え、その試料を一晩振とうさせ、ＯＤ２６０で試料中の修飾ＲＮＡの濃度を測定した。抽出プロセスによる回復を測定するため、未製剤化ＩＸ因子修飾ＲＮＡ（配列番号１０。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されている）（脱製剤化対照）を、ＤＣＭ中に入れ、脱製剤化プロセスに供した。表２３に、試料の含有量および封入効率を示す。すべての試料封入効率は、脱製剤化対照に対して正規化された。
【０８６１】
【表２３】
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【０８６２】
Ｄ．ＰＬＧＡマイクロスフェア中に封入された修飾ｍＲＮＡの放出試験
ＩＸ因子修飾ＲＮＡ（配列番号１０）で製剤化されたＰＬＧＡマイクロスフェアを、上述のように脱製剤化させ、抽出された修飾ＲＮＡの完全性を、自動化電気泳動（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｅｘｐｅｒｉｏｎ）で測定した。抽出修飾ｍＲＮＡは、非製剤化修飾ｍＲＮＡおよび脱製剤化対照に対して比較し、封入修飾ｍＲＮＡの完全性を検証した。図３に示すように、ｍｏｄＲＮＡの大部分は、脱製剤化対照（Ｄｅｆｏｒｍ対照）および非製剤化対照（Ｕｎｆｏｒｍ対照）に対して、バッチ番号Ａ、Ｂ、ＣおよびＤで損なわれていなかった。
【０８６３】
Ｅ．ＰＬＧＡマイクロスフェア中に封入された修飾ｍＲＮＡのタンパク質発現
ＩＸ因子修飾ＲＮＡ（配列番号１０。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されている）で製剤化されたＰＬＧＡマイクロスフェアを、上述のように脱製剤化させ、抽出された修飾ＲＮＡのタンパク質発現を、インビトロトランスフェクションアッセイにより測定した。ＨＥＫ２９３細胞を、三重で、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により複合体化させたＩＸ因子修飾ＲＮＡ（２５０ｎｇ）で逆向きトランスフェクションさせた。
【０８６４】
ＩＸ因子修飾ＲＮＡを、ヌクレアーゼを含有しない水で２５ｎｇ／μｌの濃度まで希釈し、ＲＮＡｉＭＡＸは、血清フリーのＥＭＥＭで１３．３倍に希釈した。希釈した修飾ＲＮＡおよび希釈したＲＮＡｉＭＡＸを等量、共に混合し、室温で２０〜３０分間、静置させた。次いで、ＩＸ因子修飾ＲＮＡ２５０ｎｇを含有するトランスフェクションミックス２０μｌを、３０，０００個の細胞を含有する細胞懸濁液８０μｌに添加した。次いで、細胞を加湿した３７℃／５％ＣＯ２の細胞培養インキュベーター中で１６時間、インキュベートして、細胞培養上清を回収した。細胞上清中のＩＸ因子タンパク質発現を、ＩＸ因子に特異的なＥＬＩＳＡキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ，  Ｃａｔ  ＃  ＨＦＩＸＫＴ−ＴＯＴ）で分析し、表２４にタンパク質発現を示す。検証したすべてのＰＬＧＡマイクロスフェアバッチにおいて、ＩＸ因子修飾ＲＮＡは活性状態のままであり、ＰＬＧＡマイクロスフェア中での製剤化およびその後の脱製剤化の後もＩＸ因子タンパク質を発現した。
【０８６５】
【表２４】
2019059793.tif 000139
【０８６６】
Ｆ．ＰＬＧＡマイクロスフェア中に封入された修飾ｍＲＮＡの放出試験
ＩＸ因子修飾ＲＮＡ（配列番号１０。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されている）で製剤化されたＰＬＧＡマイクロスフェアを、２４ｍｇ／ｍｌのマイクロスフェア濃度まで水で再懸濁させた。再懸濁の後、１５０μｌのＰＬＧＡマイクロスフェア懸濁液を、エッペンドルフチューブへと分注した。試験を行う間、３７℃で試料をインキュベートし、振とうさせ続けた。０．２、１、２、８、１４および２１日目で、三重で試料を得た。ＰＬＧＡマイクロスフェアから放出された修飾ＲＮＡの量を測定するために、試料を遠心し、上清を除去し、上清中の修飾ＲＮＡ濃度をＯＤ２６０で測定した。表２５に、各試料中の修飾ＲＮＡ総量に基づき算出された放出割合を示す。３１日後、ＩＸ因子修飾ＲＮＡの９６％が、ＰＬＧＡマイクロスフェアから放出された。
【０８６７】
【表２５】
2019059793.tif 000140
【０８６８】
Ｇ．ＰＬＧＡマイクロスフェアの粒子サイズ再現性
ＩＸ因子修飾ＲＮＡ（配列番号１０。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されている）ＰＬＧＡマイクロスフェアの３つのバッチを、バッチＤに対して上述のものと同一の条件を用いて作製した（４ｍｇ／ｍｌで０．４ｍｌのＷ４、２００ｍｇ／ｍｌで２．０ｍｌのＯ１、１％で２００ｍｌのＷ２、および、Ｗ４／Ｏ１／Ｗ２エマルションに対しては、スピード５でホモジナイズ）（表２２に示す）。ＰＬＧＡマイクロスフェア懸濁液の均質性を改善するために、遠心の前にろ過を取り入れた。遠心の前に３時間、攪拌した後、すべての製剤化材料を、１００μｍのナイロンメッシュろ過器（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ，  Ｃａｔ  ＃  ２２−３６３−５４９）に通して、大きな塊を除去した。洗浄および水での再懸濁の後、ＰＬＧＡマイクロスフェア試料１００〜２００μｌを用いて、レーザー回析（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ２０００）により製剤の粒子サイズを計測した。試料の粒子サイズを表２６に示す。
【０８６９】
【表２６】
2019059793.tif 000141
【０８７０】
ろ過を用いた３つのＰＬＧＡマイクロスフェアのバッチの結果を、同一条件下、ろ過無しで作製されたＰＬＧＡマイクロスフェアのバッチと比較した。洗浄前のろ過ステップを含めることにより、平均粒子サイズが減少し、３つのＰＬＧＡマイクロスフェアのバッチ間の粒子サイズの分布が一定であることが示された。
【０８７１】
Ｈ．ＩＸ因子ＰＬＧＡマイクロスフェアの血清安定性
緩衝液（ＴＥ）もしくは９０％血清（Ｓｅ）に溶解した、ＩＸ因子ｍＲＮＡ  ＲＮＡ（配列番号１０。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されている）または、緩衝液、９０％血清もしくは１％血清に溶解したＰＬＧＡ中のＩＸ因子ｍＲＮＡを、緩衝液、９０％血清または１％血清中で、ｍＲＮＡ濃度５０ｎｇ／μｌ（総量は７０μｌ）で、インキュベートした。０、３０、６０または１２０分で試料を取り除いた。ＲＮａｓｅは、２０分間、５５℃で、２５ｕｌの４ｘプロテナーゼＫ緩衝液（０．４ｍｌ  １Ｍトリス−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、０．１ｍｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、０．１２ｍｌ  ５Ｍ  ＮａＣｌ、および０．４ｍｌ  １０％ＳＤＳ）、および８μｌのプロテナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加することにより、プロテナーゼＫ消化で不活化させた。ＩＸ因子ｍＲＮＡは、バイオアナライザーによる分析の前に、沈殿（１時間、２５０μｌの９５％エタノールを添加し、１３ｋ  ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去し、沈殿物に２００μｌの７０％エタノールを添加し、５分間、１３ｋ  ｒｐｍで再遠心し、上清を除去し、７０ｕμｌの水で沈殿物を再懸濁）または、ＰＬＧＡマイクロスフェアから抽出した（１３ｋ  ｒｐｍで５分遠心し、上清を除去し、１ｍｌの水で沈殿物を洗浄し、１３ｋ  ｒｐｍで５分遠心し、上清を除去し、沈殿物に２８０μｌのジクロロメタンを添加し、１５分間振とうし、７０ｕｌの水を添加し、次いで、２時間振とうし、水層を除去）。ＰＬＧＡマイクロスフェアにより、２時間にわたり、９０％血清および１％血清中での分解からＩＸ因子修飾ｍＲＮＡが守られた。９０％血清中では、ＩＸ因子修飾ｍＲＮＡは最初の時点で完全に分解される。
実施例１６．脂質ナノ粒子のインビボ試験
Ｇ−ＣＳＦ（インビトロ転写実験に用いられた、Ｔ７プロモーター、５´非翻訳領域（ＵＴＲ）および３´ＵＴＲを有するｃＤＮＡを配列番号５に示す。ｍＲＮＡ配列は、配列番号６に示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されている）および、ＩＸ因子（インビトロ転写実験に用いられた、Ｔ７プロモーター、５´非翻訳領域（ＵＴＲ）および３´ＵＴＲを有するｃＤＮＡを配列番号１３に示す。ｍＲＮＡ配列は配列番号１０に示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されている）の修飾ｍＲＮＡを、シリンジポンプ法を用いて、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化した。ＬＮＰは、最終脂質モル比  ５０：１０：３８．５：１．５（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ：  ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ）で、修飾ｍＲＮＡに対する総脂質の重量比  ２０：１で製剤化された。表２７に、製剤の粒子サイズ、ゼータ電位および封入による特徴付けを示す。
【０８７２】
【表２７】
2019059793.tif 000142
【０８７３】
ＬＮＰ製剤を、修飾ｍＲＮＡの用量は１００μｇ、１０μｇまたは１μｇで、マウス（ｎ＝５）に静脈内投与した。投与８時間後で、マウスを殺処分した。心臓穿刺で血清をマウス（Ｇ−ＣＳＦまたはＩＸ因子修飾ｍＲＮＡ製剤を投与されている）から採取した。タンパク質発現をＥＬＩＳＡにより測定した。
【０８７４】
Ｇ−ＣＳＦ投与群またはＩＸ因子投与群において、有意な体重減少（＜５％）はなかった。Ｇ−ＣＳＦ投与群またはＩＸ因子投与群のタンパク質発現は、標準曲線からＥＬＩＳＡにより測定された。血清試料を希釈し（Ｇ−ＣＳＦに対しては約２０〜２，５００倍、ＩＸ因子に対しては約１０〜２５０倍）、試料が標準曲線の線形範囲内に確実に入るようにした。表２８に示されるように、ＥＬＩＳＡにより測定されたＧ−ＣＳＦタンパク質発現は、１、１０および１００ｕｇ投与群に対して、それぞれおよそ１７、１２００および４７００ｎｇ／ｍｌであった。表２９に示されるように、ＥＬＩＳＡにより測定されたＩＸ因子タンパク質発現は、１、１０および１００ｕｇ投与群に対して、それぞれおよそ３６，３８０および３０００〜１１０００ｎｇ／ｍｌであった。
【０８７５】
【表２８】
2019059793.tif 000143
【０８７６】
【表２９】
2019059793.tif 000144
【０８７７】
表３０に示されるように、上述のＬＮＰ製剤は、同じ用量の修飾ｍＲＮＡの静脈内（ＩＶ）リポプレックス製剤の投与、および、生理食塩水に溶解した同じ用量の修飾ｍＲＮＡの筋肉内（ＩＭ）または皮下（ＳＣ）投与と比較して、約１０，０００〜１００，０００倍、タンパク質産生を増加させた。表３０において用いられている「〜」という記号は、「約」を意味する。
【０８７８】
【表３０】
2019059793.tif 000145
【０８７９】
実施例１７〜２２の材料と方法
Ｇ−ＣＳＦ（ｍＲＮＡ配列は配列番号６に示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されている）およびＥＰＯ（ｍＲＮＡ配列は配列番号９に示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されている）の修飾ｍＲＮＡを、シリンジポンプ法を用いて、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化した。ＬＮＰは、最終脂質モル比  ５０：１０：３８．５：１．５（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ：  ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ）で、修飾ｍＲＮＡに対する総脂質の重量比２０：１で製剤化された。表３１に、製剤の粒子サイズ、ゼータ電位および封入による特徴付けを示す。
【０８８０】
【表３１】
2019059793.tif 000146
【０８８１】
実施例１７．修飾ｍＲＮＡを用いた、脂質ナノ粒子のインビボ試験
表３１（上述）に示すＬＮＰ製剤を、ラット（ｎ＝５）に静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）または皮下（ＳＣ）に、０．０５ｍｇ／ｋｇの修飾ｍＲＮＡ単回用量で投与した。ラットの対照群（ｎ＝４）には何も処置しなかった。Ｇ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡ製剤またはＥＰＯ修飾ｍＲＮＡ製剤を投与された２時間、８時間、２４時間、４８時間および９６時間以降に、ラットから採血し、ＥＬＩＳＡを用いてタンパク質発現を測定した。ＥＰＯ修飾ｍＲＮＡを静脈内投与されたラットは、７日目でも採血された。
【０８８２】
表３２に示すように、修飾ＥＰＯｍＲＮＡを静脈内投与されたラットにおけるＥＰＯタンパク質発現は、５日目に検出できなくなった。修飾Ｇ−ＣＳＦｍＲＮＡを静脈内投与されたラットにおけるＧ−ＣＳＦは、７日目まで検出可能であった。ＥＰＯ修飾ｍＲＮＡの皮下投与および筋肉内投与は、少なくとも２４時間まで検出可能であり、Ｇ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡは、少なくとも８時間まで検出可能であった。表３２において、「ＯＳＣ」は、標準曲線の外側の値を指し、「ＮＴ」は検証していないことを意味する。
【０８８３】
【表３２】
2019059793.tif 000147
【０８８４】
実施例１８．インビボ試験の経時的変化
表３１（上述）に示されるＬＮＰ製剤を、マウス（ｎ＝５）に静脈内（ＩＶ）に、０．５、０．０５または０．００５ｍｇ／ｋｇの修飾ｍＲＮＡ単回用量で投与した。Ｇ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡ製剤またはＥＰＯ修飾ｍＲＮＡ製剤を投与された８時間、２４時間、７２時間および６日後に、マウスから採血し、ＥＬＩＳＡを用いてタンパク質発現を測定した。
【０８８５】
表３３に示されるように、修飾ｍＲＮＡを静脈内で投与されたマウスにおけるＥＰＯタンパク質発現およびＧ−ＣＳＦタンパク質発現は、修飾ｍＲＮＡを０．００５ｍｇ／ｋｇおよび０．０５ｍｇ／ｋｇで投与されたマウスでは７２時間で検出されなくなり、ＥＰＯ修飾ｍＲＮＡを投与されたマウスでは、６日で検出されなくなった。表３３において、「＞」は、「より大きい」を意味し、「ＮＤ」は検出されなかったことを意味する。
【０８８６】
【表３３】
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【０８８７】
実施例１９．げっ歯類におけるＬＮＰ製剤のインビボ試験
Ａ．マウスにおけるＬＮＰ製剤
表３１（上述）に示されるＬＮＰ製剤を、マウス（ｎ＝４）に静脈内（ＩＶ）に、０．０５ｍｇ／ｋｇまたは０．００５ｍｇ／ｋｇの修飾ｍＲＮＡ単回用量で投与した。また、未処置の対照マウスの３群（ｎ＝４）も用意した。Ｇ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡ製剤またはＥＰＯ修飾ｍＲＮＡ製剤を投与された２時間、８時間、２４時間、４８時間、および７２時間後に、マウスから採血し、タンパク質発現を測定した。Ｇ−ＣＳＦおよびＥＰＯのタンパク質発現は、ＥＬＩＳＡを用いて測定された。
【０８８８】
表３４に示されるように、マウスにおけるＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦのタンパク質発現は、０．００５ｍｇ／ｋｇの修飾ＲＮＡ投与を受けたマウスに対しては、少なくとも４８時間で検出できなくなり、０．０５ｍｇ／ｋｇの修飾ＲＮＡ投与を受けたマウスに対しては少なくとも７２時間で検出できなくなった。表３４において、「ＯＳＣ」は、標準曲線の外側にある値を指し、および「ＮＴ」は、検証されなかったことを意味する。
【０８８９】
【表３４】
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【０８９０】
Ｂ．ラットにおけるＬＮＰ製剤
表３１（上述）に示されるＬＮＰ製剤を、ラット（ｎ＝４）に静脈内（ＩＶ）に、０．０５ｍｇ／ｋｇの修飾ｍＲＮＡ単回用量で投与する。また、未処置の対照ラット群（ｎ＝４）も用意する。Ｇ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡ製剤またはＥＰＯ修飾ｍＲＮＡ製剤を投与された２時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、７日および１４日後に、ラットから採血し、タンパク質発現を測定する。Ｇ−ＣＳＦおよびＥＰＯのタンパク質発現を、ＥＬＩＳＡを用いて測定する。
実施例２０．ＬＮＰの早期の経時的変化試験
表３１（上述）に示されるＬＮＰ製剤を、哺乳類に静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）または皮下（ＳＣ）に、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇまたは０．００５ｍｇ／ｋｇの修飾ｍＲＮＡ単回用量で投与する。哺乳類対照群は未処置とする。哺乳類は、修飾ｍＲＮＡ  ＬＮＰ製剤を投与された５分、１０分、２０分、３０分、４５分、１時間、１．５時間および／または２時間後に哺乳類から採血し、タンパク質発現を、ＥＬＩＳＡを用いて測定する。また、顆粒球レベルおよび赤血球数等の全血球数を測定するために哺乳類から採血する。
実施例２１．非ヒト霊長類のインビボ試験
表３１（上述）に示されるＬＮＰ製剤を、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）（カニクイザル）（ｎ＝２）に、静脈内ボーラス投与として、およそ３０秒間にわたり、皮下注射針（必要であれば、シリンジ／ａｂｂｏｃａｔｈまたは翼状針に付着されても良い）を用いて投与した。０．０５ｍｇ／ｋｇのＥＰＯもしくはＧ−ＣＳＦ、または０．００５ｍｇ／ｋｇのＥＰＯを、修飾ｍＲＮＡ単回用量として、０．５ｍＬ／ｋｇの投与体積で、ＮＨＰに投与した。修飾ｍＲＮＡ  ＬＮＰ製剤の投与の５〜６日前に、ＮＨＰから採血し、血清中のタンパク質発現およびベースラインの全血球数を測定した。修飾ｍＲＮＡ製剤の投与後、８、２４、４８および７２時間でＮＨＰから採血し、タンパク質発現を測定した。投与の２４時間および７２時間後で、ＮＨＰの全血球数も測定した。Ｇ−ＣＳＦおよびＥＰＯのタンパク質発現を、ＥＬＩＳＡにより測定した。すべての実験の経過中に、尿もＮＨＰから採取し、臨床的安全性を評価した。Ｇ−ＣＳＦおよびＥＰＯの修飾ｍＲＮＡ製剤の投与後に、ＮＨＰから試料を採取し、ＥＬＩＳＡを用いてタンパク質発現を測定した。非ヒト霊長類の臨床化学的所見、血液学的所見、尿検査およびサイトカインもまた分析された。
【０８９１】
表３５に示すように、０．０５ｍｇ／ｋｇを投与されたＮＨＰのＥＰＯタンパク質発現は、７２時間で検出できなくなり、ＥＰＯ製剤を０．００５ｍｇ／ｋｇ投与されたＮＨＰは、４８時間で検出できなくなる。表３５において、「＜」は、「より大きい値」を意味する。Ｇ−ＣＳＦタンパク質発現は、修飾ｍＲＮＡ製剤の投与後、２４時間までに見られなくなった。予備的に、修飾ｍＲＮＡ製剤の投与後、ＮＨＰにおいて確認された顆粒球と網状赤血球のレベルにおいて、増加があった。
【０８９２】
【表３５】
2019059793.tif 000150
【０８９３】
実施例２２．Ｇ−ＣＳＦおよびＥＰＯに対する非ヒト霊長類のインビボ試験
表３１（上述）に示されるＬＮＰ製剤を、静脈内投与（ＩＶ）として、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）（カニクイザル）（ｎ＝２）に投与した。０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇもしくは０．００５ｍｇ／ｋｇのＥＰＯ、またはＧ−ＣＳＦを、修飾ｍＲＮＡ単回ＩＶ投与として、０．５ｍＬ／ｋｇの投与体積で、ＮＨＰに投与した。修飾ｍＲＮＡ  ＬＮＰ製剤の投与前にＮＨＰから採血し、血清中のタンパク質発現と、全血球数のベースラインを測定した。Ｇ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡ製剤の投与後、８、２４、４８および７２時間で、ＮＨＰから採血し、タンパク質発現を測定した。ＥＰＯ修飾ｍＲＮＡ製剤の投与後、８、２４、４８、７２時間および７日で、ＮＨＰから採血し、タンパク質発現を測定した。
【０８９４】
Ｇ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡ製剤またはＥＰＯ修飾ｍＲＮＡ製剤を投与された後にＮＨＰから採取された試料を、ＥＬＩＳＡにより分析して、タンパク質発現を測定した。好中球数および網状赤血球数もまた、投与前、修飾Ｇ−ＣＳＦ製剤または修飾ＥＰＯ製剤の投与後２４時間、３日、７日、１４日および１８日で測定された。
【０８９５】
表３６に示されるように、Ｇ−ＣＳＦタンパク質発現は、７２時間を超えて検出されなかった。表３６において、「＜３９」は、３９ｐｇ／ｍｌの検出下限値を下回る値を指す。
【０８９６】
【表３６】
2019059793.tif 000151
【０８９７】
表３７に示されるように、ＥＰＯタンパク質発現は、７日を超えて検出されなかった。表３７において、「＜７．８」は、７．８ｐｇ／ｍｌの検出下限値を下回る値を指す。
【０８９８】
【表３７】
2019059793.tif 000152
【０８９９】
表３８に示されるように、すべてのＧ−ＣＳＦ群において、投与前のレベルと比較して、好中球の増加があった。
【０９００】
【表３８】
2019059793.tif 000153
【０９０１】
表３９に示されるように、投与後３日〜１４／１８日に、投与後２４時間の網状赤血球レベルと比較して、すべてのＥＰＯ群において網状赤血球の増加があった。
【０９０２】
【表３９】
2019059793.tif 000154
【０９０３】
表４０〜４２に示されるように、ＥＰＯ修飾ＲＮＡの投与により、ヘモグロビン（ＨＧＢ）、ヘマトクリット（ＨＣＴ）および赤血球（ＲＢＣ）数を含む他の赤血球パラメータが作用を受けた。
【０９０４】
【表４０】
2019059793.tif 000155
【０９０５】
【表４１】
2019059793.tif 000156
【０９０６】
【表４２】
2019059793.tif 000157
【０９０７】
表４３および４４に示されるように、修飾ＲＮＡの投与により、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）を含む血清化学的パラメータが作用を受けた。
【０９０８】
【表４３】
2019059793.tif 000158
【０９０９】
【表４４】
2019059793.tif 000159
【０９１０】
表４５に示されるように、修飾ＲＮＡの投与により、修飾ｍＲＮＡ投与後のサイトカイン、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）の増加がもたらされた。
【０９１１】
【表４５】
2019059793.tif 000160
【０９１２】
実施例２３．非ヒト霊長類における、筋肉内投与および／または皮下投与の試験
修飾ＥＰＯ  ｍＲＮＡ（配列番号９。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されている）または修飾Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（配列番号６。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されている）を含有する製剤（生理食塩水に溶解）を、非ヒト霊長類（カニクイザル）（ＮＨＰ）に、筋肉内（ＩＭ）または皮下（ＳＣ）投与した。０．０５ｍｇ／ｋｇまたは０．００５ｍｇ／ｋｇの修飾ｍＲＮＡ単回用量を、投与体積０．５ｍＬ／ｋｇとした。投与の５〜６日前に非ヒト霊長類から採血し、血清タンパク質濃度およびベースラインの全血球数を測定する。修飾ｍＲＮＡ製剤の投与後、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、７日および１４日で、ＮＨＰから採血し、タンパク質発現を測定する。Ｇ−ＣＳＦおよびＥＰＯのタンパク質発現は、ＥＬＩＳＡにより測定される。投与後２４時間、７２時間、７日および１４日で、ＮＨＰの全血球数も測定される。ＮＨＰから全実験の過程にわたり尿を採取し、臨床的安全性を評価するために分析する。投与部位に近い組織もまた採取し、タンパク質発現を測定するために分析する。
実施例２４．修飾ｍＲＮＡの輸送
修飾ｍＲＮＡの局在および／または輸送を測定するために、以下のように試験を行っても良い。
【０９１３】
ｓｉＲＮＡおよび修飾ｍＲＮＡのＬＮＰ製剤を、当分野に公知の方法および／または本明細書に記述の方法に従い、製剤化する。ＬＮＰ製剤は、たとえばＧ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＶＩＩ因子および／または本明細書に記述される任意のタンパク質等のタンパク質をコードしうる修飾ｍＲＮＡを少なくとも１つ含んでも良い。製剤は、筋肉内注射または皮下注射を用いて、哺乳類の筋肉内に局所的に投与されても良い。修飾ｍＲＮＡの用量およびＬＮＰのサイズを変えて、哺乳類体内の輸送に対するその作用を測定、および／または、たとえば、限定されないが炎症等の生物学的反応に対する影響を分析しても良い。哺乳類は、血清中に存在する、投与された修飾ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の発現、および／または哺乳類の全血球数を測定するために、異なる時点で採血されても良い。
【０９１４】
たとえば、肝臓で発現し、血清中に分泌されるＶＩＩ因子をコードする修飾ｍＲＮＡは、筋肉内および／または皮下に投与されても良い。修飾ｍＲＮＡ投与の前、または同時に、ｓｉＲＮＡを投与し、内因性ＶＩＩ因子をノックアウトする。投与される修飾ｍＲＮＡの筋肉内注射および／または皮下注射により生じるＶＩＩ因子は、血液中で測定される。また、ＶＩＩ因子のレベルは、注射部位の近くの組織で測定される。ＶＩＩ因子が、血液中で発現される場合、修飾ｍＲＮＡの輸送がある。ＶＩＩ因子が組織内で発現され、血液中で発現されない場合、ＶＩＩ因子は局所発現のみである。
実施例２５．複合的な修飾ｍＲＮＡの製剤
修飾ｍＲＮＡのＬＮＰ製剤は、当分野に公知の方法および／または本明細書に記述される方法に従い、製剤化される。ＬＮＰ製剤は、たとえばＧ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、トロンボポエチンおよび／または当分野に公知もしくは本明細書に記述の任意のタンパク質等のタンパク質をコードしうる修飾ｍＲＮＡを少なくとも１つ含んでも良い。修飾ｍＲＮＡの少なくとも１つは、１、２、３、４または５つの修飾ｍＲＮＡ分子を含んでも良い。修飾ｍＲＮＡを少なくとも１つ含有する製剤を、単回投与レジメンまたは複数回投与レジメンで、静脈内、筋肉内または皮下に投与されてもよい。たとえば、限定されないが、血液および／または血清等の生物学的試料を、少なくとも１つの修飾ｍＲＮＡ製剤の投与前後の異なる時点で採取および分析してもよい。前記タンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡの少なくとも１つを含有する製剤を哺乳類に投与した後の、５０〜２００ｐｇ／ｍｌの生物学的試料中のタンパク質の発現は、生物学的に有効であるとみなされる。
実施例２６．ポリエチレングリコール比率の試験
Ａ．ＰＥＧ  ＬＮＰの製剤化および特徴付け
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を、シリンジポンプ法を用いて製剤化した。修飾Ｇ−ＣＳＦ（配列番号６。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されている）に対する総脂質の重量比２０：１で、ＬＮＰが製剤された。製剤のモル比の範囲を表４６に示す。
【０９１５】
【表４６】
2019059793.tif 000161
【０９１６】
２つのＰＥＧ脂質のタイプ、すなわち１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＮＯＦ  Ｃａｔ  ＃  ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＧＭ−０２０）および、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＳＧ、ＮＯＦ  Ｃａｔ  ＃  ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＧＳ−０２０）を、１．５ｍｏｌ％または３．０ｍｏｌ％で検証した。ＬＮＰの製剤化および修飾Ｇ−ＣＳＦｍＲＮＡの封入の後、ＬＮＰ製剤を、粒子サイズ、ゼータ電位および封入割合で特徴付け、その結果を表４７に示す。
【０９１７】
【表４７】
2019059793.tif 000162
【０９１８】
Ｂ．ＰＥＧ  ＬＮＰのインビボスクリーニング
表４０に記述されるＰＥＧ  ＬＮＰ製剤をマウス（ｎ＝５）に０．５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。製剤の投与後、２時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間および８日でマウスから血清を採取した。血清をＥＬＩＳＡにより分析し、Ｇ−ＣＳＦのタンパク質発現を測定し、その発現レベルを表４８に示す。ＰＥＧ−ＤＭＧを用いたＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＳＡでのＬＮＰ製剤よりもタンパク質発現が大幅に高いレベルにあった。
【０９１９】
【表４８】
2019059793.tif 000163
【０９２０】
実施例２７．カチオン性脂質製剤試験
Ａ．カチオン性脂質ナノ粒子の製剤化および特徴付け
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を、シリンジポンプ法を用いて製剤化した。修飾ｍＲＮＡに対する総脂質の重量比２０：１でＬＮＰを製剤化した。カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧの最終脂質モル比の範囲の概要を、表４９に示す。
【０９２１】
【表４９】
2019059793.tif 000164
【０９２２】
エタノールに溶解した２５ｍＭの脂質溶液および、５０ｍＭクエン酸（ｐＨ３）に溶解した修飾ＲＮＡを混合して、自然発生の小胞構造を形成させた。エタノールを除去する前に、小胞を、エタノール中で安定化させ、透析による緩衝液交換を行った。次いで、ＬＮＰを粒子サイズ、ゼータ電位および封入割合で特徴付けした。表５０に、カチオン性脂質としてＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡまたはＣ１２−２００を用いた、ＥＰＯ修飾ｍＲＮＡ（配列番号９。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されている）または、Ｇ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡ（配列番号６。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されている）を封入したＬＮＰの特徴付けを記述する。
【０９２３】
【表５０】
2019059793.tif 000165
【０９２４】
Ｂ．カチオン性ＬＮＰ製剤のインビボスクリーニング
表４２に記述されるカチオン性脂質製剤の処方を、０．５ｍｇ／ｋｇの用量で、マウス（ｎ＝５）に静脈内投与した。製剤の投与後、２時間、２４時間、７２時間および／または７日でマウスから血清を採取した。血清をＥＬＩＳＡにより分析し、ＥＰＯまたはＧ−ＣＳＦのタンパク質発現を測定し、その発現レベルを表５１に示す。
【０９２５】
【表５１】
2019059793.tif 000166
【０９２６】
カチオン性脂質Ｃ１２−２００（ＮＰＡ−０７５−１およびＮＰＡ−０７６−１）を有するＬＮＰ製剤を投与されたマウスにおいて毒性が見られ、毛皮の矮小化、行動の委縮、および１０％を超える体重の消失といった症状を示したため、２４時間で殺処分された。Ｃ１２−２００は、より毒性があると予測されるが、短期間での高い発現レベルを有した。カチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＤＭＡ（ＮＰＡ−０７３−１およびＮＰＡ−０７４−１）は、検証した３つのカチオン性脂質のうち最も低い発現を示した。ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（ＮＰＡ−０７１−１および、ＮＰＡ−０７２−１）は、３日目まで良い発現を示し、ＥＰＯ製剤に対し７日目までバックグラウンド試料を超えていた。
実施例２８．タンパク質発現のスクリーニング方法
Ａ．エレクトロスプレーイオン化
対象に投与された修飾ＲＮＡによりコードされるタンパク質を含有し得る生物学的試料を調製し、１、２、３または４質量分析器を用いて、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）のメーカーのプロトコールに従い、分析する。生物学的試料はまた、タンデムのＥＳＩ質量分析法システムを用いて分析されてもよい。
【０９２７】
タンパク質断片のパターン、または全タンパク質は、規定のタンパク質に対する既知の対照と比較され、比較により同定される。
Ｂ．マトリックス支援レーザー脱離イオン化
対象に投与された修飾ＲＮＡによりコードされるタンパク質を含有し得る生物学的試料を調製し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）に対するメーカーのプロトコールに従って、分析する。
【０９２８】
タンパク質断片のパターン、または全タンパク質を、規定のタンパク質に対する既知の対照と比較し、比較により同定する。
Ｃ．液体クロマトグラフィー−質量分析−質量分析
修飾ＲＮＡによりコードされるタンパク質を含有し得る生物学的試料を、トリプシン酵素で処理して、その中に含有されるタンパク質を消化しても良い。得られたペプチドを、液体クロマトグラフィー−質量分析−質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により分析する。ペプチドを、質量分析器で断片化し、コンピューターアルゴリズムを介して、タンパク質配列データベースと合致しうる特徴的なパターンを得る。消化された試料を希釈して、規定のタンパク質に対する開始材料（１ｎｇ以下）を得ても良い。単純な緩衝液バックグラウンド（たとえば、水または揮発性塩）を含有する生物学的試料は、溶液内消化を行いやすい；より複雑なバックグラウンド（たとえば、洗剤、非揮発性塩、グリセロール）は、試料分析を促進するための追加のクリーンアップステップを必要とする。
【０９２９】
タンパク質断片のパターン、または全タンパク質を、規定のタンパク質に対する既知の対照と比較し、比較により同定する。
実施例２９．ＬＮＰ  インビボ試験
ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡ（配列番号１４。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されている）を脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として、シリンジポンプ法を用いて製剤化した。最終脂質モル比  ５０：１０：３８．５：１．５（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ）で、修飾ｍＲＮＡに対する総脂質の重量比  ２０：１で、ＬＮＰを製剤化した。ｍＣｈｅｒｒｙ製剤の粒子サイズ、ゼータ電位および封入による特徴付けを、表５２に示す。
【０９３０】
【表５２】
2019059793.tif 000167
【０９３１】
１００μｇの修飾ｍＲＮＡ用量で、マウス（ｎ＝５）にＬＮＰ製剤を静脈内投与した。投与の２４時間後、マウスを殺処分した。ｍＣｈｅｒｒｙ修飾ｍＲＮＡ製剤を投与されたマウスからの肝臓と脾臓を免疫組織化学法（ＩＨＣ）、ウェスタンブロットまたは蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）で分析した。
【０９３２】
肝臓の組織像は、切片全体で単一のｍＣｈｅｒｒｙ発現を示した一方で、未処置の動物は、ｍＣｈｅｒｒｙを発現しなかった。また、ウェスタンブロットを用いて、処置動物におけるｍＣｈｅｒｒｙ発現を確認したが、未処置の動物においては、ｍＣｈｅｒｒｙは検出されなかった。対照マーカーとして用いたチューブリンを処置および未処置マウスの両方で検出したことから、肝臓細胞の正常なタンパク質発現は影響を受けなかったことが示唆される。
【０９３３】
また、ｍＣｈｅｒｒｙマウスおよび未処置マウスの脾臓で、ＦＡＣＳおよびＩＨＣを実施した。すべての白血球群は、ＦＡＣＳ分析により、ｍＣｈｅｒｒｙ発現が陰性であった。また、ＩＨＣにより、ｍＣｈｅｒｒｙ処置マウスと未処置マウスとの間の脾臓に差は認められなかった。
実施例３０．シリンジポンプ  インビボ試験
ｍＣｈｅｒｒｙ修飾ｍＲＮＡを、シリンジポンプ法を用いて脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化する。最終脂質モル比  ５０：１０：３８．５：１．５（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ）で、修飾ｍＲＮＡに対する総脂質の重量比  ２０：１で、ＬＮＰを製剤化する。ｍＣｈｅｒｒｙ製剤を粒子サイズ、ゼータ電位および封入で特徴付けする。
【０９３４】
１０μｇまたは１００μｇの修飾ｍＲＮＡ用量で、マウス（ｎ＝５）にＬＮＰ製剤を静脈内投与する。投与の２４時間後、マウスを殺処分する。ｍＣｈｅｒｒｙ修飾ｍＲＮＡ製剤を投与されたマウスからの肝臓と脾臓を免疫組織化学法（ＩＨＣ）、ウェスタンブロットおよび／または蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）で分析する。
実施例３１．インビトロおよびインビボ発現
Ａ．リピドイド製剤を用いたヒト細胞におけるインビトロ発現
インビトロトランスフェクションの検証のために用いられるリピドイドに対するｍｍＲＮＡの比率を、異なるリピドイド：ｍｍＲＮＡの比率で経験的に検証する。ｓｉＲＮＡおよびリピドイドを用いた従前の研究では、２．５：１、５：１、１０：１および１５：１のリピドイド：ｓｉＲＮＡ  ｗｔ：ｗｔ比率である。ｓｉＲＮＡと比較してｍｍＲＮＡは長いことを考慮すると、ｍｍＲＮＡに対するリピドイドのｗｔ：ｗｔは低い方が効果的である可能性がある。さらにまた、比較のために、ｍｍＲＮＡをＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）またはＴＲＡＮＳＩＴ−ｍＲＮＡ（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ、ウィスコンシン州マディソン）カチオン性脂質送達ビヒクルを用いて、製剤化する。リピドイド−製剤化ルシフェラーゼ（配列番号１５に示されるＩＶＴ  ｃＤＮＡ配列；ｍＲＮＡ配列は、配列番号１６に示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１、各シトシンで５−メチルシトシンに完全に修飾され、各ウリジン部位でシュードウリジンに置換されている）、緑の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（配列番号１７に示されるＩＶＴ  ｃＤＮＡ野生型配列；ｍＲＮＡ配列は、配列番号１８に示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない、５´キャップ、キャップ１）、Ｇ−ＣＳＦ（ｍＲＮＡ配列は、配列番号６に示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）、およびＥＰＯ  ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ配列は、配列番号９に示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）の、所望のタンパク質産物を発現する能力は、ルシフェラーゼ発現に対する発光、ＧＦＰ発現に対するフローサイトメトリー、ならびにＧ−ＣＳＦおよびエリスロポエチン（ＥＰＯ）分泌に対するＥＬＩＳＡにより確認することができる。
【０９３５】
Ｂ．静脈内注射後のインビボ発現
限定されないが、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００およびＭＤ１を含む、様々な異なるリピドイドを用いて、製剤の静脈内全身投与を行う。
【０９３６】
ｍｍＲＮＡを含有するリピドイド製剤は、動物に静脈内注入される。タンパク質がコードされた修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の発現は、血液、および／または、たとえば限定されないが、動物から採取された肝臓および脾臓等の他の器官試料において、分析される。単回用量静脈内試験の実施により、強さ、用量応答性、および所望産物の発現の寿命もまた、分析することができる。
【０９３７】
一実施態様において、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＭＤ１および他のリピドイドのリピドイドベースの製剤を用いて、ルシフェラーゼ、緑の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質、分泌型アルカリホスファターゼ（ｓＡＰ）、ヒトＧ−ＣＳＦ、ヒトＩＸ因子、またはヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍｍＲＮＡを、動物体内へ運搬する。上述のように脂質でｍｍＲＮＡを製剤化した後、生理食塩水製剤、またはルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｓＡＰ、ヒトＧ−ＣＳＦ、ヒトＩＸ因子、およびヒトＥＰＯから選択される異なるｍｍＲＮＡのうちの１つを含有するリピドイド製剤のいずれかを投与される群に、動物を分ける。動物への注入の前に、ｍｍＲＮＡ含有リピドイド製剤を、ＰＢＳで希釈する。次いで、１０ｍｇ／ｋｇから、１ｎｇ／ｋｇという低い用量の範囲（好ましい範囲は、１０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｎｇ／ｋｇであり、ｍｍＲＮＡの用量は動物の体重に依存する（たとえば、２０ｇのマウスは、最大で０．２ｍｌの製剤を投与される（用量は、体重ｋｇあたりｍｍＲＮＡは無しとしている）））にある製剤化ｍｍＲＮＡの単回用量を動物に投与する。ｍｍＲＮＡ−リピドイド製剤の投与後、血清、組織および／または組織溶解物を得て、ｍｍＲＮＡにコードされる産物のレベルを、単回で、および／または時間間隔の範囲で、測定する。リピドイド製剤化ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｓＡＰ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＸ因子およびＥＰＯ  ｍｍＲＮＡの、所望のタンパク質産物を発現する能力は、ルシフェラーゼ発現に対しては発光、ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ発現に対してはフローサイトメトリー、ｓＡＰに対しては酵素活性、または、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＸ因子および／もしくはＥＰＯの分泌に対しては、ＥＬＩＳＡにより確認する。
【０９３８】
また、複数回用量レジメンに対するさらなる試験を実施して、ｍｍＲＮＡの最大発現を測定、ｍｍＲＮＡによる発現の飽和性の評価（並行して、または順に対照および活性ｍｍＲＮＡ製剤を投与する）、および、繰り返しの薬剤投与の実行可能性を測定する（週または月で分けた投与でｍｍＲＮＡを与え、次いで、発現レベルが、たとえば免疫原性等の因子により影響をうけるかどうかを測定する）。また、たとえばＧ−ＣＳＦおよびＥＰＯ等のタンパク質の生理学的な機能分析は、検証された動物由来の試料を分析し、それぞれ顆粒球数および赤血球数の増加を検出することにより、測定する。たとえばＩＸ因子等の、動物体内における発現タンパク質産物の活性は、ＩＸ因子の酵素活性（たとえば、活性化部分トロンボプラスチン時間等）および凝固時間への効果の分析を介して、評価することができる。
【０９３９】
Ｃ．筋肉内注射および／または皮下注射後のインビトロ発現
筋肉内注射の経路または皮下注射の経路を介した、ｍＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドを送達するためのリピドイド製剤の使用について、従前には報告が無いため、評価を行う必要がある。ｍｍＲＮＡの筋肉内注射および／または皮下注射について、ｍｍＲＮＡ含有リピドイド製剤が、所望のタンパク質の局所および全身の両方の発現を行うことができるかどうかを決定するために評価を行う。
【０９４０】
ルシフェラーゼ、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質、分泌型アルカリホスファターゼ（ｓＡＰ）、ヒトＧ−ＣＳＦ、ヒトＩＸ因子またはヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍｍＲＮＡから選択されるｍｍＲＮＡを含有する９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００およびＭＤ１のリピドイド製剤を、動物に筋肉内注射および／または皮下注射する。タンパク質がコードされたｍｍＲＮＡの発現を、筋肉組織内または皮下組織内の両方で、ならびに、血中および他の器官（たとえば肝臓および脾臓等）で全身的に分析する。単回用量試験により、強さ、用量応答性、および所望産物の発現の寿命を分析することができる。
【０９４１】
生理食塩水製剤または修飾ｍＲＮＡを含有する製剤のいずれかの投与をうける群に動物を分ける。注射の前に、ｍｍＲＮＡ含有リピドイド製剤をＰＢＳで希釈する。５０ｍｇ／ｋｇから、１ｎｇ／ｋｇという低い範囲（好ましい範囲は１０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｎｇ／ｋｇ）にある製剤化ｍｍＲＮＡの単回筋肉内用量を、動物に投与する。マウスに対する筋肉内投与の最大用量は、マウスの後肢への筋肉内注射に対して、およそ１ｍｇのｍｍＲＮＡ〜０．０２ｎｇのｍｍＲＮＡである。皮下投与に対しては、４００ｍｇ／ｋｇ〜１ｎｇ／ｋｇ（好ましい範囲は、８０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｎｇ／ｋｇ）の範囲にある製剤化ｍｍＲＮＡの単回皮下用量を、動物に投与する。マウスに対する皮下投与の最大用量は、およそ８ｍｇのｍｍＲＮＡ〜０．０２ｎｇのｍｍＲＮＡである。
【０９４２】
２０グラムのマウスに対しては、単回の筋肉内注射の体積は最大で０．０２５ｍｌであり、単回の皮下注射は最大で０．２ｍｌである。投与されるｍｍＲＮＡの最適用量は、動物の体重から算出される。ｍｍＲＮＡ−リピドイドの投与後の様々な時点で、血清、組織および組織溶解物を得て、ｍｍＲＮＡにコードされる産物のレベルを測定する。リピドイド製剤化ルシフェラーゼ、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質、分泌型アルカリホスファターゼ（ｓＡＰ）、ヒトＧ−ＣＳＦ、ヒトＩＸ因子またはヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍｍＲＮＡの所望タンパク質産物を発現する能力は、ルシフェラーゼ発現に対しては発光、ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ発現に対してはフローサイトメトリー、ｓＡＰに対しては酵素活性、ならびに、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＸ因子およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）分泌に対してはＥＬＩＳＡにより確認する。
【０９４３】
また、複数回用量レジメンに対するさらなる試験を実施して、ｍｍＲＮＡを用いた最大発現を測定、ｍｍＲＮＡによる発現の飽和性の評価（並行して、または順に、対照および活性ｍｍＲＮＡ製剤を投与することにより得られる）、および、繰り返しの薬剤投与の実行可能性を測定する（週または月で分けた投与でｍｍＲＮＡを与え、次いで、発現レベルが、たとえば免疫原性等の因子により影響をうけるかどうかを測定する）。また、一回で複数回の筋肉内注射または皮下注射の部位を用いる試験を利用して、ｍｍＲＮＡ薬剤への露出を増加させ、タンパク質産生の改善を行う。たとえば、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｓＡＰ、ヒトＧ−ＣＳＦ、ヒトＩＸ因子およびヒトＥＰＯ等のタンパク質の生理学的な機能分析を、検証された動物由来の試料を分析し、顆粒球数および／または赤血球数の変化を検出することにより、測定する。たとえばＩＸ因子等の、動物体内における発現タンパク質産物の活性を、ＩＸ因子の酵素活性（たとえば、活性化部分トロンボプラスチン時間等）および凝固時間への効果の分析を介して、評価することができる。
実施例３２．リポプレックスを用いたインビボ送達
Ａ．ヒトＥＰＯ修飾ＲＮＡリポプレックス
修飾ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ配列は、配列番号９に示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）（ＥＰＯ；完全に５−メチルシトシン修飾；Ｎ１−メチルシュードウリジン）を１００μｇ含有する製剤を、５０〜７０μＬ中、３０％体積のＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）（Ｌｉｐｏｐｌｅｘ−ｈ−Ｅｐｏ−４６；Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ２またはＧｅｎ２）でリポプレックス化し、４匹のＣ５７／ＢＬ６マウスに筋肉内へ送達した。他の群は、３０％体積のＲＮＡｉＭＡＸ（登録商標）でリポプレックス化された、修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ１００μｇを含有する対照として、リポプレックス化修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｌｉｐｏｐｌｅｘ−ｌｕｃ）（配列番号１５にＩＶＴ  ｃＤＮＡ配列を示す。ｍＲＮＡの配列は配列番号１６に示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１。各シトシンで５−メチルシトシンで完全に修飾され、各ウリジン部位でシュードウリジン置換されている）の投与を受けたマウス、または陰性対照として６５μｇｌの投与体積で製剤緩衝液の注射を受けたマウスからなる。筋肉内注射の１３時間後、血清を各マウスから採取し、ヒトＥＰＯ  ＥＬＩＳＡにより、マウス血清中のヒトＥＰＯタンパク質の量を測定し、表５３にその結果を示す。
【０９４４】
【表５３】
2019059793.tif 000168
【０９４５】
Ｂ．ヒトＧ−ＣＳＦ修飾ＲＮＡリポプレックス
修飾ヒトＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（配列番号６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１。）（Ｇ−ＣＳＦは、５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾され（Ｇ−ＣＳＦ）、または、Ｇ−ＣＳＦは、５−メチルシトシンおよびＮ１−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されている（Ｇ−ＣＳＦ−Ｎ１））の２つのバージョンのうちの１つの１００μｇを含有する製剤を、３０％体積のＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）でリポプレックス化し、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、１５０ｕＬで筋肉内送達（Ｉ．Ｍ）、１５０μＬで皮下送達（Ｓ．Ｃ）、および２２５ｕＬで静脈内送達（Ｉ．Ｖ）した。
【０９４６】
３つの対照群には、１００μｇの修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１５にＩＶＴ
ｃＤＮＡ配列を示す。配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１。各シトシンで５−メチルシトシンで完全に修飾され、各ウリジン部位でシュードウリジン置換されている）を筋肉内（Ｌｕｃ−ｕｎｓｐ  Ｉ．Ｍ．）、または、１５０μｇの修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡを静脈内（Ｌｕｃ−ｕｎｓｐ  Ｉ．Ｖ．）、または、１５０μＬの製剤緩衝液を筋肉内（Ｂｕｆｆｅｒ  Ｉ．Ｍ．）、のいずれかで投与した。製剤の投与６時間後、血清を各マウスから採取し、ヒトＧ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡによりマウス血清中のヒトＧ−ＣＳＦタンパク質の量を測定し、その結果を表５４に示す。
【０９４７】
これらの結果より、５−メチルシトシン／シュードウリジン、および、５−メチルシトシン／Ｎ１−メチルシュードウリジンでの修飾ヒトＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡの両方が、リポプレックス化製剤で、Ｉ．Ｖ．経路で投与またはＩ．Ｍ．経路で投与された場合に、血清中のヒトＧ−ＣＳＦタンパク質の特異的発現をもたらすことができることが示される。
【０９４８】
【表５４】
2019059793.tif 000169
【０９４９】
Ｃ．ヒトＧ−ＣＳＦ修飾ＲＮＡリポプレックスの比較
５−メチルシトシン（５ｍｃ）およびシュードウリジン（Ψ）修飾を有する、ＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）の３０％体積でリポプレックス化された修飾ヒトＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｅｎ１−Ｌｉｐｏｐｌｅｘ）、生理食塩水に溶解した、５ｍｃおよびΨ修飾を有する修飾ヒトＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｅｎ１−Ｓａｌｉｎｅ）、Ｎ１−５−メチルシトシン（Ｎ１−５ｍｃ）およびΨ修飾を有する、ＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）の３０％体積でリポプレックス化された修飾ヒトＧ−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｅｎ２−Ｌｉｐｏｐｌｅｘ）、Ｎ１−５ｍｃおよびΨ修飾を有する、生理食塩水に溶解した、修飾ヒトＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｅｎ２−Ｓａｌｉｎｅ）、５ｍｃおよびΨ修飾を有する、ＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）の３０％体積でリポプレックス化された修飾ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ−Ｌｉｐｏｐｌｅｘ）、または、生理食塩水に溶解した、５ｍｃおよびΨ修飾を有する修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｌｕｃ−Ｓａｌｉｎｅ）のいずれか１００μｇを含有する製剤を、筋肉内注射（Ｉ．Ｍ．）または皮下注射（Ｓ．Ｃ．）で投与し、そして、各投与法の対照群は、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに製剤緩衝液（Ｆ．Ｂｕｆｆｅｒ）８０μＬの用量を与えた。注射の１３時間後、血清および注射部位からの組織を各マウスから採取し、Ｇ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡにより分析して、ヒトＧ−ＣＳＦタンパク質レベルを比較した。筋肉内投与および皮下投与のマウス血清におけるヒトＧ−ＣＳＦタンパク質の結果を、表５５に示す。
【０９５０】
これらの結果より、５−メチルシトシン／シュードウリジン、および、５−メチルシトシン／Ｎ１−メチルシュードウリジン修飾ヒトＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡが、生理食塩水製剤またはリポプレックス化製剤のいずれでも、Ｉ．Ｍ．投与経路またはＳ．Ｃ．投与経路を介して送達される場合、血清中のヒトＧ−ＣＳＦタンパク質の特異的発現をもたらすことができることが示される。表５５に、５−メチルシトシン／Ｎ１−メチルシュードウリジン修飾ヒトＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡが、多くの場合、５−メチルシトシン／シュードウリジン修飾ヒトＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡと比較して、ヒトＧ−ＣＳＦタンパク質産生を増加させることを示す。
【０９５１】
【表５５】
2019059793.tif 000170
【０９５２】
Ｄ．ｍＣｈｅｒｒｙ修飾ＲＮＡリポプレックスの比較
筋肉内投与と皮下投与
ＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）の３０％体積でリポプレックス化された修飾ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡ（配列番号７にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）、または、生理食塩水に溶解した修飾ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡのいずれか１００μｇを含有する製剤を、マウスに筋肉内投与または皮下投与する。製剤緩衝液をまた、筋肉内または皮下のいずれかで、対照群のマウスに投与する。マウスの注射部位を、切片作成のために注射の１７時間後に採取して、タンパク質産生の原因となる細胞型（複数含む）の測定を行っても良い。
【０９５３】
硝子体内投与
ＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）でリポプレックス化された修飾ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡ、製剤緩衝液に溶解した修飾ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡ、ＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）でリポプレックス化された修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ、製剤緩衝液に溶解した修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡのいずれか１０μｇを含有する製剤を、５μｌ／目の用量体積で、ラットに硝子体内投与（ＩＶＴ）で投与することができる。製剤緩衝液はまた、ＩＶＴにより、５μｌ／目の用量体積で、ラットの対照群に投与される。切片作成および溶解のために注射後１８時間で処置ラットから目を採取して、ｍｍＲＮＡがインビボで目に効率的に送達されたかどうか、およびタンパク質産生をもたらしたかどうかを測定、またならびに、インビボでタンパク質産生の原因となる細胞型（複数含む）を測定することができる。
【０９５４】
鼻腔内投与
ＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）の３０％体積でリポプレックス化された修飾ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡ、生理食塩水に溶解した修飾ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡ、ＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）の３０％体積でリポプレックス化された修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ、または生理食塩水に溶解した修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡのいずれか１００μｇを含有する製剤を、鼻腔内投与する。製剤緩衝液がまた、対照群に鼻腔内投与される。切片作成（ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡ投与群に対して）またはホモジナイゼーション（ルシフェラーゼｍＲＮＡ投与群に対して）のために、注射後およそ１３時間で肺を採取してもよい。これらの試料を用いて、ｍｍＲＮＡがインビボで肺に効率的に送達されたかどうか、およびタンパク質産生をもたらしたかどうかを測定、またならびに、インビボでタンパク質産生の原因となる細胞型（複数含む）を測定する。
実施例３３．様々な脂質比を用いたインビボ送達
修飾ｍＲＮＡを、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに送達させ、様々な脂質比および得られるタンパク質発現を評価した。ＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）の１０％、３０％または５０％でリポプレックス化された、修飾ヒトＥＰＯ  ｍＲＮＡ（配列番号９にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１。５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されている）１００μｇの製剤、ＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）の１０％、３０％、または５０％でリポプレックス化された、修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１５にＩＶＴ  ｃＤＮＡ配列を示す。配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１。各シトシンで５−メチルシトシンで完全に修飾され、各ウリジン部位でシュードウリジン置換されている）１００μｇの製剤、または製剤緩衝液を、単回７０μｌの用量で、マウスに筋肉内投与した。血清を注射後１３時間で採取して、ヒトＥＰＯ  ＥＬＩＳＡを行い、各マウスのヒトＥＰＯタンパク質レベルを測定した。表５６に示されるヒトＥＰＯ  ＥＬＩＳＡの結果から、異なる割合のＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）のそれぞれに対し、筋肉内で発現された修飾ヒトＥＰＯが、血清中に分泌されていることが示される。
【０９５５】
【表５６】
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【０９５６】
実施例３４．哺乳類における、筋肉内および皮下インビボ送達
製剤緩衝液中で製剤化された修飾ヒトＥＰＯ  ｍＲＮＡ（配列番号９にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１。５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されている）を、Ｃ５７／ＢＬ６マウスまたはＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットのいずれかに送達させ、ヒトＥＰＯ産生の用量依存性を評価した。表５７の投与チャートに記載されるように、ラットに、修飾ヒトＥＰＯ  ｍＲＮＡ（ｈ−ＥＰＯ）５０μｌ、修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｌｕｃ）（配列番号１５にＩＶＴ  ｃＤＮＡ配列を示す。配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１。各シトシンで５−メチルシトシンで完全に修飾され、各ウリジン部位でシュードウリジン置換されている）を５０μｌ、または製剤緩衝液（Ｆ．Ｂｕｆｆｅｒ）５０μｌを筋肉内注射した。
【０９５７】
表５８の投与チャートに記述されているように、マウスに、修飾ヒトＥＰＯ  ｍＲＮＡ（ｈ−ＥＰＯ）、修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｌｕｃ）または製剤緩衝液（Ｆ．Ｂｕｆｆｅｒ）の５０μｌを筋肉内注射、または皮下注射した。注射の１３時間後、血液を採取し、血清を分析し、各マウスまたはラットのヒトＥＰＯの量を測定した。ラット試験に対する平均および幾何平均（ｐｇ／ｍｌ）を表５７に示す。
【０９５８】
【表５７】
2019059793.tif 000172
【０９５９】
【表５８】
2019059793.tif 000173
【０９６０】
実施例３５．筋肉内  インビボ送達後の、活性持続期間
製剤緩衝液中で製剤化された修飾ヒトＥＰＯ  ｍＲＮＡ（配列番号９にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１。５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されている）を、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに送達させ、用量応答性の持続期間を測定した。表５９の投与チャートに記述されているように、修飾ヒトＥＰＯ  ｍＲＮＡ（ｈ−ＥＰＯ）、修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１５にＩＶＴ  ｃＤＮＡ配列を示す。配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１。各シトシンで５−メチルシトシンで完全に修飾され、各ウリジン部位でシュードウリジン置換されている）（Ｌｕｃ）または製剤緩衝液（Ｆ．Ｂｕｆｆｅｒ）の５０μｌを、ラットに筋肉内注射した。筋肉内注射の２、６、１２、２４、４８および７２時間後にラットから採血し、所与の時間での血清中のヒトＥＰＯ濃度を測定した。また、本試験に対する平均および幾何平均（ｐｇ／ｍｌ）を、表５９に示す。
【０９６１】
【表５９】
2019059793.tif 000174
【０９６２】
実施例３６．投与経路
異なる投与経路を用いた分割投与を調査するための試験を行った。一度に複数の皮下注射部位または筋肉内注射部位を用いた試験を設計し、ｍｍＲＮＡ薬剤曝露を増加させ、タンパク質産生を改善する方法を調査した。発現タンパク質産生の検出に加えて、検証された動物由来の試料を分析することで、タンパク質の生理学的機能評価もまた測定された。
【０９６３】
驚くことに、単回単位投与または複数回投与スキームによるものよりも、ｍｍＲＮＡの分割投与により、より多くのタンパク質が産生され、表現型応答も強められることが判明した。
【０９６４】
緩衝液に単独で溶解、または３０％  ｌｉｐｏｐｌｅｘ（ＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標））で製剤化され、投与された、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍｍＲＮＡ（配列番号９にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）または、ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）の使用を分割用量実験の設計に含めた。投与媒体（製剤緩衝液）は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２  ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  Ｎａ＋リン酸塩（１．４ｍＭ  リン酸一ナトリウム、；０．６ｍＭ  リン酸二ナトリウム）、および０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）から構成された。ｐＨは、水酸化ナトリウムで調製され、最終溶液は滅菌ろ過された。ｍｍＲＮＡは、各シトシンで５ｍｅＣで修飾され、各ウリジン部位でシュードウリジン置換で修飾された。
【０９６５】
表６０の投与チャートに概要されるように、１群につき４匹のマウスが、筋肉内投与（Ｉ．Ｍ．）、静脈内投与（Ｉ．Ｖ．）または皮下投与（Ｓ．Ｃ．）された。すべてのマウスから注射の１３時間後に血清を採取し、筋肉内注射群および皮下注射群からは、注射部位の組織を採取し、静脈内投与群からは、脾臓、肝臓および腎臓を採取した。筋肉内注射群からの結果および皮下注射群からの結果を、表６１に示す。
【０９６６】
【表６０】
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【０９６７】
【表６１】
2019059793.tif 000176
【０９６８】
実施例３７．速やかに排出される脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ）の試験
Ａ．修飾ＲＮＡ  ｒｅＬＮＰの処方
合成脂質、１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、アラバマ州アラバスター）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ、タウフカーシェン）、および、α−［３’−（１，２−ジミリストイル−３−プロパノキシ）−カルボキサミド−プロピル］−ω−メトキシ−ポリオキシエチレン（ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ）（ＮＯＦ、ベルギー、Ｂｏｕｗｅｌｖｅｎ）の溶液を調製し、−２０℃で保存する。合成脂質は、内部エステルを有するＤＬｉｎ−ＤＭＡ、末端エステルを有するＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ−内部エステル、および末端エステルを有するＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡから選択される。ｒｅＬＮＰは、５０：１０：３８．５：１．５（ｒｅＬＮＰ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ）のモル比となるように組み合わされる。ｒｅＬＮＰおよび修飾ｍＲＮＡの製剤は、修飾ｍＲＮＡに対する総脂質の重量比が１０：１、１５：１、２０：１および３０：１で、修飾ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液とを混合することにより調製される。
【０９６９】
Ｂ．製剤の特徴付け
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，  Ｍａｌｖｅｒｎ，  イギリス、ウスターシャー）を用いて、修飾ｍＲＮＡナノ粒子の粒子サイズ、多分散性インデックス（ＰＤＩ）およびゼータ電位を測定する（粒子サイズ測定には１×  ＰＢＳに溶解、ゼータ電位測定には１５ｍＭ  ＰＢＳに溶解）。
【０９７０】
紫外線−可視光分光法を用いて、修飾ｍＲＮＡナノ粒子製剤の濃度を測定する。混合の後、溶液の吸収スペクトルを、ＤＵ８００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｉｎｃ．，カリフォルニア州ブレア）で、２３０ｎｍと３３０ｎｍの間で記録する。ナノ粒子製剤中の修飾ＲＮＡ濃度は、製剤に用いた修飾ＲＮＡの減衰係数ならびに、２６０ｎｍの波長での吸収および３３０ｎｍの波長でのベースライン値の間の差異に基づき算出される。
【０９７１】
ＱＵＡＮＴ−ＩＴ（登録商標）ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  カリフォルニア州カールスバッド）を用いて、ナノ粒子による修飾ＲＮＡの封入を評価する。試料を、希釈し、ポリスチレン９６ウェルプレートに移し、次いで、ＴＥ緩衝液または２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液のいずれかを加える。プレートをインキュベートし、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）試薬をＴＥ緩衝液で希釈し、この溶液を各ウェルに加える。蛍光強度を、蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ；  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて測定する。試薬ブランクの蛍光値を、各試料から差し引き、遊離修飾ＲＮＡの割合を、生の試料の蛍光強度を、撹乱された試料の蛍光値で割ることにより測定する。
【０９７２】
Ｃ．インビトロインキュベーション
ヒト胚腎上皮細胞（ＨＥＫ２９３）および肝細胞癌上皮細胞（ＨｅｐＧ２）（ＬＧＣ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ＧｍｂＨ，  ドイツ、ヴェーゼル）を９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ  ＧｍｂＨ，  ドイツ、フリッケンハウゼン）上に播種し、ＨＥＫ２９３細胞のプレートは、Ｉ型コラーゲンで前もってコートする。ＨＥＫ２９３細胞を、３０，０００細胞／ウェル・１００μｌ細胞培養培地の密度で播種し、ＨｅｐＧ２細胞を、３５，０００細胞／ウェル・１００μｌ細胞培養培地の密度で播種する。ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ配列は、配列番号７に示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示さない；５´キャップ、キャップ１）を含有する製剤を、細胞播種の後に、直接加え、インキュベートする。インビトロ転写（ＩＶＴ）で用いられた、Ｔ７プロモーター、５´非翻訳領域（ＵＴＲ）および３´ＵＴＲを有するｍＣｈｅｒｒｙ  ｃＤＮＡを、配列番号８に示す。
【０９７３】
培養培地上清を、９６ウェルのＰｒｏ−Ｂｉｎｄ  Ｕ底プレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＧｍｂＨ，  ドイツ、ハイデルベルク）へと移すことで細胞を回収する。細胞を、２分の１量のトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，  ドイツ、ベルリン）でトリプシン処理し、各上清でプールし、１体積のＰＢＳ／２％ＦＣＳ（両方ともＢｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，  ドイツ、ベルリン）／０．５％ホルムアルデヒド（Ｍｅｒｃｋ，  ドイツ、ダルムシュタット）を加えることにより固定する。次いで、試料を、ＬＳＲＩＩサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＧｍｂＨ，  ドイツ、ハイデルベルク）にて、ＰＥ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄに対するフィルターおよび励起レーザーを使用したフローサイトメーター測定に供する。すべてのイベントの平均蛍光強度（ＭＦＩ）および４つの独立したウェルの標準偏差を、分析された試料に対して示す。
【０９７４】
Ｄ．インビボ製剤試験
マウスに、修飾ｍＲＮＡおよびｒｅＬＮＰを含有する製剤の単回用量を静脈内投与する。マウスに投与された修飾ｍＲＮＡは、Ｇ−ＣＳＦ（配列番号９にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）、ＩＸ因子（配列番号１０にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）またはｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号７にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）から選択される。
【０９７５】
マウスに、製剤化修飾ｍＲＮＡの１００μｇ、１０μｇ、または１μｇを注射し、製剤投与の８時間後に殺処分する。ヒトＧ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡを含有する製剤を投与されたマウス由来の血清は、特定のＧ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡにより測定され、ヒトＩＸ因子修飾ＲＮＡを投与されたマウス由来の血清は、特定のＩＸ因子ＥＬＩＳＡまたは発色アッセイにより分析される。ｍＣｈｅｒｒｙ修飾ｍＲＮＡを投与されたマウス由来の肝臓および脾臓は、免疫組織化学法（ＩＨＣ）または蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）により分析される。対照として、製剤を何も注射されていないマウス群、そして、それらの血清および組織を採取して、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳおよび／またはＩＨＣで分析する。
実施例３８．インビトロのＶＥＧＦ−Ａのトランスフェクション
ヒト血管内皮増殖因子アイソフォームＡ（ＶＥＧＦ−Ａ）修飾ｍＲＮＡ（配列番号１９にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）を、逆向きトランスフェクションを介して、２４マルチウェルプレート中のヒト角化細胞にトランスフェクションした。インビトロ転写（ＩＶＴ）に用いられたＴ７プロモーター、５´非翻訳領域（ＵＴＲ）および３´ＵＴＲを有するＶＥＧＦ−ＡのｃＤＮＡは、配列番号２０に示す。ヒト角化細胞は、５０〜７０％コンフルエンスに達するまで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）から入手されるＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｓ７を入れたＥＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地中で増殖させた。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）から入手されるＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）と複合体化されたＶＥＧＦ−Ａをコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の０、４６．８７５、９３．７５、１８７．５、３７５、７５０、および１５００ｎｇを、細胞にトランスフェクションさせた。ＲＮＡ：ＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）複合体は、第一に、室温で１０分間、５×体積希釈でサプリメントフリーのＥＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地でＲＮＡをインキュベートすることによって形成された。第二のバイアル中で、ＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）試薬を、室温で１０分間、１０Ｘ体積希釈でサプリメントフリーのＥＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地とインキュベートした。次いで、ＲＮＡバイアルを、ＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）バイアルと混合し、細胞を滴下させて加える前に、室温で２０〜３０分間、インキュベートさせた。
【０９７６】
ヒト角化細胞にトランスフェクションされたＶＥＧＦ−Ａ（配列番号１９にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）をコードする完全最適化ｍＲＮＡは、翻訳の間に、たとえば天然ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）、各ウリジン部位でシュードウリジンおよび各シトシン部位で５−メチルシトシン（シュードＵ／５ｍｃ）、および各ウリジン部位でＮ１−メチル−シュードウリジンおよび各シトシン部位で５−メチルシトシン（Ｎ１−メチル−シュードＵ／５ｍＣ）等の修飾を含んでいた。細胞は、ＶＥＧＦ−ＡをコードするｍｍＲＮＡでトランスフェクションされ、培養培地中の分泌されたＶＥＧＦ−Ａ濃度（ｐｇ／ｍｌ）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）から入手したＥＬＩＳＡキットを用いて、メーカーの推奨する説明書に従い、トランスフェクション後６、１２、２４、および４８時間後に各濃度を計測した。表６２に示されるこれらのデータより、ＶＥＧＦ−Ａをコードする修飾ｍＲＮＡは、ヒト角化細胞において翻訳されることができ、ＶＥＧＦ−Ａは、細胞の外へ移送され、細胞外環境へと放出されることが示される。
【０９７７】
【表６２】
2019059793.tif 000177
【０９７８】
実施例３９．ＩＸ因子のインビボ試験
製剤緩衝液中で製剤化されたヒトＩＸ因子ｍｍＲＮＡ（Ｇｅｎ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾）を、筋肉内注射を介してマウスに送達させた。結果より、ＩＸ因子タンパク質は、投与後１３時間で計測した際に、血清中で増加していたことが示される。
【０９７９】
本試験において、マウス（ＩＸ因子に対してはＮ＝５、ルシフェラーゼまたは緩衝液対照に対してはＮ＝３）に、ＩＸ因子ｍｍＲＮＡ（配列番号１０にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）、ルシフェラーゼ（ＩＶＴに対するｃＤＮＡ配列は配列番号１５に示す。配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１。各シトシンで５メチルシトシンに完全に修飾され、各ウリジン部位でシュードウリジン置換）または製剤緩衝液（Ｆ．Ｂｕｆｆｅｒ）を、２×１００ｕｇ／マウスで、５０μｌを筋肉内注射した。筋肉内注射の１３時間後にマウスから採血し、血清中のヒトポリペプチド濃度（ｐｇ／ｍｌ）を測定した。結果より、ルシフェラーゼ投与または緩衝液対照投与のいずれかではＩＸ因子は１００ｐｇ／ｍＬ未満であったことと比較して、ＩＸ因子ｍｍＲＮＡの投与により１３時間で１６００ｐｇ／ｍＬのレベルに達したことが明らかとなった。
実施例４０．複数部位への投与：筋肉内および皮下
Ｇｅｎ１またはＧｅｎ２（５−メチルシトシン（５ｍｃ）およびシュードウリジン（Ψ）修飾、Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｅｎ１；またはＮ１−５−メチルシトシン（Ｎ１−５ｍｃ）およびΨ修飾、Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｅｎ２）のいずれかとして修飾され、製剤緩衝液中で製剤化されたヒトＧ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡ（配列番号６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）を、筋肉内注射（ＩＭ）または皮下注射（ＳＣ）を介してマウスに送達させた。３日間（２４時間隔）、毎日、４回の投与または２×５０ｕｇ（２つの部位）に注射を行った。４回目の投与が、採血およびＣＢＣ分析の６時間前に行われた。ルシフェラーゼ（ＩＶＴに対するｃＤＮＡ配列は配列番号１５に示す。配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１。各シトシンで５メチルシトシンに完全に修飾され、各ウリジン部位でシュードウリジン置換）または製剤緩衝液（Ｆ．Ｂｕｆｆｅｒ）を対照とした。最初のｍＲＮＡ注射の７２時間後（最後のｍＲＮＡ投与の６時間後）にマウスから採血し、好中球数におけるｍＲＮＡにコードされたヒトＧ−ＣＳＦの作用を測定した。投与レジメン、得られた好中球数（千／ｕＬ）を表６３に示す。表６３において、アスタリスク（＊）は、統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【０９８０】
筋肉内注射については、データから、Ｇｅｎ１  Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡは３日目で対照を４倍超える好中球数の増加が示され、Ｇｅｎ２  Ｇ−ＣＳＦ  ｍｍＲＮＡは２倍の増加が示されている。皮下注射については、データから、Ｇｅｎ２  Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡは３日目で対照を２倍超える好中球数の増加が示されている。
【０９８１】
血中好中球数の特異的な増加により明らかであるように、これらのデータから、５−メチルシチジン／シュードウリジンおよび５−メチルシチジン／Ｎ１−メチルシュードウリジン修飾ｍＲＮＡの両方が、生物学的に活性であることが示される。
【０９８２】
【表６３】
2019059793.tif 000178
【０９８３】
実施例４１．静脈内投与
５−メチルシトシン（５ｍｃ）およびシュードウリジン（Ψ）修飾（Ｇｅｎ１）で修飾されたヒトＧ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡ（配列番号６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）；または何も修飾されていないもの、および１０％リポプレックス（ＲＮＡｉＭａｘ）で製剤化されたものを、１００μｌの体積中、５０μｇ  ＲＮＡの用量でマウスに静脈内（ＩＶ）注射で、０、２、および４日目で送達させた。１、５、８日目で好中球を測定した。対照は、非特異的哺乳類ＲＮＡまたは製剤緩衝液単独（Ｆ．Ｂｕｆｆｅｒ）とした。１、５および８日目でマウスから採血し、好中球数増加に対するｍＲＮＡにコードされたヒトＧ−ＣＳＦの作用を測定した。投与レジメン、得られた好中球数（千／ｕＬ；Ｋ／ｕＬ）を表６４に示す。
【０９８４】
静脈内投与に対しては、データから、Ｇ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡにより５日目で、対照を４〜５倍こえるの好中球数の増加が明らかになったが、非修飾Ｇ−ＣＳＦｍＲＮＡまたは非特異対照では増加は見られなかった。血球数は最後の注射の４日後にベースラインに戻った。白血球群において他の変化は認められなかった。
【０９８５】
表６４において、アスタリスク（＊）は、緩衝液と比較した統計的有意差（Ｐ＜０．００１）を示す。
これらのデータより、リポプレックスで製剤化した５−メチルシチジン／シュードウリジン修飾ｍＲＮＡは、血中好中球数の特異的増加により明らかなように、Ｉ．Ｖ．投与経路を介して送達された場合、生物学的に活性であることが示される。他の細胞サブセットには有意な変化はなかった。同様に、非修飾Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡの投与は、好中球数に何も薬理学的な作用は示さなかった。
【０９８６】
【表６４】
2019059793.tif 000179
【０９８７】
実施例４２．生理食塩水製剤：筋肉内投与
Ａ．タンパク質発現
ヒトＧ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡ（配列番号６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）およびヒトＥＰＯ  ｍｍＲＮＡ（配列番号９にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）；Ｇ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡ（５−メチルシトシン（５ｍｃ）およびシュードウリジン（Ψ）で修飾）およびＥＰＯ修飾ｍＲＮＡ（Ｎ１−５−メチルシトシン（Ｎ１−５ｍｃ）およびΨで修飾）を、製剤緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化カルシウム、２ｍＭリン酸塩、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ６．５））中で製剤化し、１００μｇの用量で、筋肉内（ＩＭ）投与を介してマウスに送達させた。
【０９８８】
対照は、ルシフェラーゼ（ＩＶＴに対するｃＤＮＡ配列は配列番号１５に示す。配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１。各シトシンで５メチルシトシンに完全に修飾され、各ウリジン部位でシュードウリジン置換）または製剤緩衝液（Ｆ．Ｂｕｆｆｅｒ）とした。投与の１３時間後にマウスから採血し、血清中のヒトポリペプチドの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を測定した（Ｇ−ＣＳＦ群はマウス血清中のヒトＧ−ＣＳＦを測定し、ＥＰＯ群はマウス血清中のヒトＥＰＯを測定した）。データを表６５に示す。
【０９８９】
【表６５】
2019059793.tif 000180
【０９９０】
Ｂ．用量応答性
ヒトＥＰＯ修飾ｍＲＮＡ（配列番号９にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾）を、製剤緩衝液中で製剤化し、筋肉内（ＩＭ）注射を介してマウスに送達させた。
【０９９１】
対照は、ルシフェラーゼ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１。５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾）または製剤緩衝液（Ｆ．Ｂｕｆｆｅｒ）とした。注射の１３時間後にマウスから採血し、血清中のヒトポリペプチドの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を測定した。用量および発現は、表６６に示す。
【０９９２】
【表６６】
2019059793.tif 000181
【０９９３】
実施例４３．複数用量／複数回投与
一度で複数の筋肉内注射部位を用いる試験を設定し、行った。
単回複数用量実験の設計には、製剤緩衝液に溶解したヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍｍＲＮＡ（配列番号９にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）、またはＧ−ＣＳＦ（配列番号６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）を用いた投与を含めた。投与媒体（Ｆ．Ｂｕｆｆｅｒ）を対照として用いた。ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦ  ｍｍＲＮＡは、各シトシンで５−メチルシトシンで修飾され、各ウリジン部位でシュードウリジン置換されていた。
【０９９４】
動物（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット、ｎ＝５）に、単回単位投与に対しては、１００μｇのＩＭ（筋肉内）注射を行った（１か所の大腿部へ投与）。複数回投与に対しては、ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦ  ｍｍＲＮＡの両方に対して、１００μｇの６回投与が行われた（２か所の大腿部に投与）。対照投与には、単回用量で緩衝液を用いた。ヒトＥＰＯ血中レベルは、注射後１３時間で評価した。
【０９９５】
ヒトＥＰＯタンパク質を、Ｉ．Ｍ．の１３時間後、ラット血清中で測定した。ラットの５群は処置および評価された。結果を表６７に示す。
【０９９６】
【表６７】
2019059793.tif 000182
【０９９７】
実施例４４．シグナル配列交換試験
ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（配列番号６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）をコードするｍｍＲＮＡの変異体をいくつか、修飾ヌクレオチドシュードウリジンおよび５−メチルシトシン（シュードＵ／５ｍＣ）を用いて合成した。これらの変異体には、野生型Ｎ末端分泌シグナルペプチド配列（ＭＡＧＰＡＴＱＳＰＭＫＬＭＡＬＱＬＬＬＷＨＳＡＬＷＴＶＱＥＡ；配列番号２１）、分泌シグナルペプチド無し、または他のｍＲＮＡ由来の分泌シグナルペプチド配列のいずれかをコードするＧ−ＣＳＦ構築物が含まれた。これらには、野生型ＧＣＳＦシグナルペプチド配列が、ヒトα−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）（ＭＭＰＳＳＶＳＷＧＩＬＬＬＡＧＬＣＣＬＶＰＶＳＬＡ；配列番号２２）、ヒトＩＸ因子（ＦＩＸ）（ＭＱＲＶＮＭＩＭＡＥＳＰＳＬＩＴＩＣＬＬＧＹＬＬＳＡＥＣＴＶＦＬＤＨＥＮＡＮＫＩＬＮＲＰＫＲ；配列番号２３）、ヒトプロラクチン（Ｐｒｏｌａｃ）（ＭＫＧＳＬＬＬＬＬＶＳＮＬＬＬＣＱＳＶＡＰ；配列番号２４）、またはヒトアルブミン（Ａｌｂ）（ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲ；配列番号２５）のいずれかのシグナルペプチド配列と置換されている配列が含まれた。
【０９９８】
各Ｇ−ＣＳＦ変異体をコードする修飾ｍＲＮＡ２５０ｎｇを、２４ウェルプレート中（各ウェルには３００，０００細胞が含まれる）のＨＥＫ２９３Ａ（表中の２９３Ａ）、マウス筋芽細胞（表中のＭＭ）（Ｃ２Ｃ１２，ＣＲＬ−１７７２，ＡＴＣＣ）およびラット筋芽細胞（表中のＲＭ）（Ｌ６株、ＣＲＬ−１４５８、ＡＴＣＣ）細胞株へ、１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてトランスフェクションした。２４時間後に上清を回収し、分泌Ｇ−ＣＳＦタンパク質を、ヒトＧ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたＥＬＩＳＡにより分析した。表６８に示されるデータより、アルブミンシグナルペプチドをコードするＧ−ＣＳＦ  ｍｍＲＮＡでトランスフェクションされた細胞は、その野生型対応型よりも少なくとも１２倍超のＧ−ＣＳＦタンパク質を分泌することが明らかとなった。
【０９９９】
【表６８】
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【１０００】
実施例４５．サイトカイン試験：ＰＢＭＣ
ＰＢＭＣ単離および培養：ナトリウムヘパリンチューブに入った２人のドナー由来のヒト血液５０ｍＬを、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ（ロットはＫＰ３０９２８およびＫＰ３０９３１）から入手した。各ドナーに対し、血液をプールし、ＤＰＢＳ（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５９３３１Ｃ、ロットは０７１Ｍ８４０８）で７０ｍＬまで希釈し、２本の５０ｍＬコニカルチューブで均等に分割した。Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １７−５４４２−０３、ロットは１００７４４００）の１０ｍＬを血液層の下に静かに注入した。チューブを、ゆっくりとした加速およびブレーキで、３０分間、２０００ｒｐｍで遠心した。チューブを取り出し、軟膜ＰＢＭＣ層を静かに、新しい５０ｍＬのコニカルチューブへ写し、ＤＰＢＳで洗浄した。チューブを、１０分間、１４５０ｒｐｍで遠心した。
【１００１】
上清を吸引し、ＰＢＭＣペレットを、５０ｍＬのＤＰＢＳで再懸濁および洗浄した。チューブを１０分間、１２５０ｒｐｍで遠心した。この洗浄ステップを繰り返し、ＰＢＭＣペレットを、１９ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ  Ｉ（Ｇｉｂｃｏ  １１０５８、ロットは１０７２０８８）で再懸濁し、計数した。細胞懸濁液を、３．０×１０６細胞／ｍＬ生細胞の濃度まで調整した。
【１００２】
次いで、これらの細胞を５つの９６ウェル組織培養処理丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ３７９９）に、ドナーごとに、５０μＬ／ウェルで播種した。３０分以内に、トランスフェクション混合物を各ウェルに５０μＬ／ウェルの量で添加した。トランスフェクションの４時間後、培地に、１０μＬのウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ  １００８２、ロットは１０１２３６８）を補給した。
【１００３】
トランスフェクションの準備：ヒトＧ−ＣＳＦ（配列番号６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）（（１）天然ＮＴＰ、（２）５−メチルシチジンおよびシュードウリジンで１００％置換、または（３）５−メチルシチジンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで１００％置換のいずれかを含有）をコードするｍｍＲＮＡ；ルシフェラーゼ（ＩＶＴ  ｃＤＮＡ配列は配列番号１５に示す。配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１。各シトシンで５−メチルシトシンで完全に置換、および各ウリジン部位でシュードウリジンで置換）（（１）天然ＮＴＰ、または（２）５−メチルシチジンおよびシュードウリジンで１００％置換のいずれかを含む）をコードするｍｍＲＮＡ、および、ＴＬＲアゴニストＲ８４８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｔｌｒｌ−ｒ８４８）を、２５００μＬ  Ｏｐｔｉｍｅｍ  Ｉの最終量で３８．４ｎｇ／μＬまで希釈した。
【１００４】
それらとは別に、４３２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １１６６８−０２７、ロット１０７０９６２）を、１３．１ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ  Ｉで希釈した。９６ウェルプレートで、１３５μＬの各ｍｍＲＮＡの９つのアリコート、陽性対照（Ｒ−８４８）または陰性対照（Ｏｐｔｉｍｅｍ  Ｉ）を、１３５μＬの希釈Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００に加えた。トランスフェクションされる材料を含有しているプレートを、２０分間、インキュベートした。次いで、５０μＬ／ウェルの各ヒトＰＢＭＣプレートにトランスフェクション混合物を移した。次いで、プレートを、３７℃でインキュベートした。２、４、８、２０および４４時間で、各プレートをインキュベーターから取り出し、上清を凍らせた。
【１００５】
最後のプレートを取り出した後、上清を、ヒトＧ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＫＨＣ２０３２）およびヒトＩＦＮ−α  ＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ４１１０５−２）を用いて分析した。各条件は、２重に行われた。
【１００６】
結果：修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）および非修飾ｍＲＮＡの、コードされたタンパク質を産生する能力が、経時的に（Ｇ−ＣＳＦ産生を）分析され、同時に、ｍＲＮＡが自然免疫認識を引き起こす能力が、インターフェロンα産生により測定された。インビトロでのＰＢＭＣ培養物の使用は、オリゴヌクレオチドの潜在的な免疫刺激活性を測定する方法として受け入れられている（Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ２００９  １９：８９−１０２）。
【１００７】
結果は、４パラメータのロジスティック曲線への当てはめを用いて、各ＥＬＩＳＡプレートの標準曲線に対して補間された。特定のＥＬＩＳＡにより経時的に測定された、２つの別のＰＢＭＣドナー由来のＩＦＮαおよびＧ−ＣＳＦ産生の平均を表６９および表７０に示す。
【１００８】
Ｇ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡにおいて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００未処置条件由来のバックグラウンドシグナルを、各時点で差し引いた。データから、天然ＮＴＰ、５−メチルシチジンおよびシュードウリジン１００％置換、または５−メチルシチジンおよびＮ１−メチルシュードウリジン１００％置換を含有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡで、ヒト末梢血単核球によるヒトＧ−ＣＳＦタンパク質の明確な産生が示された。Ｇ−ＣＳＦ産生は、非修飾ｍＲＮＡと比較して、修飾ｍＲＮＡの使用により有意に増加し、５−メチルシチジンおよびＮ１−メチルシュードウリジン含有Ｇ−ＣＳＦ  ｍｍＲＮＡが、最も高いレベルのＧ−ＣＳＦ産生を示した。自然免疫認識に関しては、非修飾ｍＲＮＡが相当量のＩＦＮα産生をもたらした一方で、修飾ｍＲＮＡはＩＦＮαの産生を大きく阻害した。５−メチルシチジンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡは、サイトカインを有意には増加させなかった一方で、５−メチルシチジンおよびシュードウリジンで完全に置換されたＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡは、ＩＦＮα、ＴＮＦαおよびＩＰ１０を誘導した。他の多くのサイトカインは、いずれの修飾でも影響を受けなかった。
【１００９】
【表６９】
2019059793.tif 000184
【１０１０】
【表７０】
2019059793.tif 000185
【１０１１】
実施例４６．修飾ｍＲＮＡの化学的修飾範囲
たとえば、限定されないが、５−メチルシトシンおよびシュードウリジンの化学的修飾等の修飾ヌクレオチドは、哺乳類細胞における自然免疫応答を減少させ、ＲＮＡの発現を増加させることが示されている。驚くことに、そして従前には知られていなかったことに、化学的修飾が１００％未満である場合、化学的修飾による作用を、漸増させることができる。以前は、化学的修飾の有益な効果を発揮するためには完全な修飾が必要十分条件であり、１００％未満のｍＲＮＡの修飾はほとんど作用しないと信じられていた。しかしながら、化学的修飾の効果は、完全な修飾ではなくても誘導することができ、その効果は、標的、濃度および修飾に依存するものであることが今回、示された。
【１０１２】
Ａ．ＰＢＭＣにトランスフェクションされた修飾ＲＮＡ
５−メチルシトシン（５ｍＣ）およびシュードウリジン（シュードＵ）で修飾されたＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡまたは非修飾Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡの９６０ｎｇを、３人の健常な血液ドナー（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３）由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）へＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  ０．８ｕＬでトランスフェクションした。Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（配列番号６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）は、５ｍＣおよびシュードＵで完全に修飾され（１００％修飾）、または５ｍＣおよびシュードＵで修飾されず（０％修飾）、または５ｍＣおよびシュードＵで部分的に修飾された（ｍＲＮＡは５０％修飾、２５％修飾、１０％修飾、５％修飾、１％修飾または０．１％修飾を含有）。ルシフェラーゼ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１。５ｍｅＣおよびシュードＵで完全修飾）の対照試料もまた、Ｇ−ＣＳＦ発現に対して分析された。ＴＮＦαおよびＩＦＮαに対しては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、ＬＰＳ、Ｒ−８４８、ルシフェラーゼ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１。５ｍｅＣおよびシュードＵで完全修飾）およびＰ（Ｉ）Ｐ（Ｃ）の対照試料がまた分析された。上清を回収し、トランスフェクションの２２時間後にＥＬＩＳＡを実施し、タンパク質発現を測定した。Ｇ−ＣＳＦ発現を表７１に示し、ＩＦＮαおよびＴＮＦα発現は、表７２に示す。ＩＦＮαおよびＴＮＦαの発現は、Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡトランスフェクションによる二次的な作用である可能性がある。ｍＲＮＡが完全には修飾されていない場合には、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮαおよびＴＮＦαの化学的修飾量は漸増し得、その変化の傾向は、各標的で同じではないことが表から示される。
【１０１３】
【表７１】
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【１０１４】
【表７２】
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【１０１５】
Ｂ．ＨＥＫ２９３にトランスフェクションされた修飾ＲＮＡ
ヒト胚腎上皮細胞（ＨＥＫ２９３）を、１００μｌの細胞培養培地中、３０，０００細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレートに播種した。ＲＮＡｉＭＡＸ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）で製剤化された修飾Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（配列番号６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）の２５０ｎｇを、ウェルに添加した。Ｇ−ＣＳＦは、５ｍＣおよびシュードＵで完全に修飾され（１００％修飾）、または５ｍＣおよびシュードＵで修飾されず（０％修飾）、または５ｍＣおよびシュードＵで部分的に修飾されている（７５％修飾、５０％修飾または２５％修飾を含有するｍＲＮＡ）。対照試料（ＡＫ５／２、ｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号７にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５ｍＣおよびシュードＵで完全に修飾）および未処置）もまた分析した。５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡの半減期は、およそ８〜１０時間である。１６時間後に上清を回収し、分泌型Ｇ−ＣＳＦタンパク質をＥＬＩＳＡで分析した。表７３に、ｍＲＮＡが完全には修飾していない場合、Ｇ−ＣＳＦの化学的修飾の量が漸増できることを示す。
【１０１６】
【表７３】
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【１０１７】
実施例４７：修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）のインビボ送達
修飾ＲＮＡを、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに筋肉内、皮下、または静脈内で送達させ、ルシフェラーゼを用いた修飾ＲＮＡの生体分布を評価した。すべての送達法に用いられた製剤緩衝液には、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化カルシウム、２ｍＭ  Ｎａ＋リン酸塩（１．４ｍＭリン酸一ナトリウムおよび０．６ｍＭのリン酸二ナトリウムを含む）そして０．５ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含有し、水酸化ナトリウムを用いて、ろ過および滅菌される前に、最終ｐＨ６．５に調節された。１×濃度を、送達緩衝液として用いた。マウスに送達されるリポプレックス化溶液を作製するために、第一のバイアルで、５０μｇのＲＮＡを、室温で１０分間、送達緩衝液中で平衡化させ、第二のバイアルで、１０μｌのＲＮＡｉＭＡＸ（登録商標）を、室温で１０分間、送達緩衝液中で平衡化させた。平衡化の後、バイアルを組み合わせ、送達緩衝液を、最終体積１００μｌになるように加え、次いで、室温で２０分間、インキュベートした。ルシフェリンを、１５０ｍｇ／ｋｇで、各マウスに腹腔内投与（ＩＰ）し、１５分〜３０分の間、ルシフェリン露出曲線のプラトー層の間に画像撮影を行った。ルシフェリンを作製するために、１ｇのＤ−ルシフェリンカリウム塩またはナトリウム塩を、６６．６ｍｌの滅菌リン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ）（Ｍｇ２＋またはＣａ２＋を含有しない）に溶解させ、１５ｍｇ／ｍｌの溶液を作製した。可能な限り遮光しながら、溶液を静かに混合し、窒素でパージする前に０．２μｍのシリンジフィルターを通し、分注し、そして−８０℃で凍結させた。投与の日、もしルシフェリンが溶解していなければ、水浴を用いて溶かし、ゆっくりと混合し、氷上に置いた。
【１０１８】
投与後２、８、２４時間で各マウスの全身像を撮影した。投与後２４時間で各マウスから組織画像と血清を採取した。静脈内投与を受けたマウスは、肝臓、脾臓、腎臓、肺、心臓、腎周囲脂肪組織および胸腺の画像を撮影した。筋肉内投与または皮下投与を受けたマウスは、肝臓、脾臓、腎臓、肺、腎周囲脂肪組織および注射部位の筋肉の画像を撮影した。各投与経路および投与レジメンに対し、光子／秒で、全身画像から生物発光を測定した。
【１０１９】
Ａ．筋肉内投与
マウスに、５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｎａｋｅｄ−Ｌｕｃ）、５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全修飾されたリポプレックス化修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（リポプレックス−ｌｕｃ）（ＩＶＴ  ｃＤＮＡ配列は配列番号１５に示す。配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；各シトシンで５−メチルシトシンで完全に置換、および各ウリジン部位でシュードウリジンで置換）、リポプレックス化修飾顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）ｍＲＮＡ（配列番号６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾）（リポプレックス−サイトカイン）、または製剤緩衝液のいずれかを、各製剤に対し、５０μｇの修飾ＲＮＡ（５０μｌの注射体積）の単回用量で、右後肢に、５μｇの修飾ＲＮＡ（５０μｌの注射体積）の単回用量で、左後肢に、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）投与した。投与後２、８および２４時間での各群のルシフェラーゼ発現シグナルの平均生物発光を、表７４に示す。５μｇおよび５０μｇの修飾ＲＮＡ製剤（リポプレックス含有および非含有）の注射部位で、生物発光は陽性シグナルを示した。
【１０２０】
【表７４】
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【１０２１】
Ｂ．皮下投与
修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｎａｋｅｄ−Ｌｕｃ）、リポプレックス化修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（リポプレックス−ｌｕｃ）、リポプレックス化修飾Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（リポプレックス−Ｇ−ＣＳＦ）または製剤緩衝液のいずれかを、５０μｇの修飾ｍＲＮＡの単回用量（各製剤に対し１００μｌの注射体積）で、皮下（Ｓ．Ｃ．）投与した。投与２時間、８時間、および２４時間後での、各群のルシフェラーゼ発現シグナルに対する生物発光平均を、表７５に示す。５０μｇの修飾ｍＲＮＡ製剤（リポプレックス含有および非含有）の注射部位で、生物発光は陽性シグナルを示した。
【１０２２】
【表７５】
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【１０２３】
Ｃ．静脈内投与
修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｎａｋｅｄ−Ｌｕｃ）、リポプレックス化修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（リポプレックス−ｌｕｃ）、リポプレックス化修飾Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（リポプレックス−Ｇ−ＣＳＦ）または製剤緩衝液のいずれかを、５０μｇの修飾ｍＲＮＡの単回用量（各製剤に対し１００μｌの注射体積）で、静脈内（Ｉ．Ｖ．）投与した。投与２時間後での、各群の脾臓におけるルシフェラーゼ発現シグナルに対する生物発光平均を、表７６に示す。５０μｇの修飾ｍＲＮＡ製剤（リポプレックス含有）の脾臓において、生物発光は陽性シグナルを示した。
【１０２４】
【表７６】
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【１０２５】
実施例４８．分割用量試験
一度に複数の皮下注射または筋肉内注射を用いた試験を設計し、ｍｍＲＮＡ薬剤曝露を増加させ、タンパク質産生を改善する方法を調査した。発現タンパク質産生の検出に加えて、検証された動物由来の試料を分析することで、タンパク質の生理学的機能評価もまた測定された。
【１０２６】
驚くことに、単回単位投与または複数回投与スキームによるものよりも、ｍｍＲＮＡの分割投与により、より多くのタンパク質が産生され、表現型応答も強められることが判明した。
【１０２７】
緩衝液に単独で溶解され、投与された、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）修飾ｍＲＮＡ（配列番号９にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）の使用を、単回単位用量、複数回用量および分割用量実験の設計に含めた。投与媒体（製剤緩衝液）は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  Ｎａ＋リン酸塩（１．４ｍＭ  リン酸一ナトリウム、；０．６ｍＭ  リン酸二ナトリウム）、および０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）から構成された。ｐＨは、水酸化ナトリウムで調製され、最終溶液は滅菌ろ過された。ｍｍＲＮＡは、各シトシンで５ｍｅＣ修飾され、各ウリジン部位でシュードウリジン置換された。
【１０２８】
単回単位用量（１００μｇ）に対し、動物（ｎ＝５）にＩＭ（筋肉内）注射を行った。複数回投与に対しては、１００μｇの３回投与、１００ｕｇの６回投与の２つのスケジュールを用いた。分割投与スキームに対しては、３３．３μｇのｍｍＲＮＡの３回投与、１６．５μｇのｍｍＲＮＡの６回投与の２つのスケジュールを用いた。対照投与には、緩衝液のみ６回投与を用いた。対照ｍｍＲＮＡには、ルシフェラーゼｍｍＲＮＡ（ＩＶＴ  ｃＤＮＡ配列は配列番号１５に示す。配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１。各シトシンで５ｍｅＣで完全に置換、および各ウリジン部位でシュードウリジンで置換）を、１００μｇで６回投与を用いた。血液および筋肉組織を、投与１３時間後に評価した。
【１０２９】
ヒトＥＰＯタンパク質を、ＥＰＯｍｍＲＮＡ（緩衝液に溶解）を単回、複数回または分割投与した１３時間後のマウス血清中で測定された。マウスの７群（１群につきｎ＝５のマウス）を処置し、評価した。結果を表７７に示す。
【１０３０】
【表７７】
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【１０３１】
分割係数は、単位薬剤あたりの単回用量産物で割った、単位薬剤あたりの産物として定義される（ＰＵＤ）。たとえば、処置群２に対しては、０．２８の値または単位薬剤（ｍｍＲＮＡ）あたりの産物（ＥＰＯ）が、単位薬剤あたりの単回用量産物（０．１４）で割られる。その結果、２となる。同様に、処置群４に対しては、１．１の値または単位薬剤（ｍｍＲＮＡ）あたりの産物（ＥＰＯ）は、単位薬剤あたりの単回用量産物（０．１４）で割られる。その結果、７．９となる。結果として、投与分割係数（ＤＳＦ）を、分割用量レジメンの有効性の指標として用いてもよい。総１日用量の任意の単回投与に対しては、ＤＳＦは、１と等しくなるはずである。それゆえ、分割用量レジメンにおいて、この値より大きいＤＳＦはいずれも、有効性が増加したことを示す。
【１０３２】
用量応答性の傾向、注射部位の影響、および注射のタイミングの影響を測定するために、試験を実施する。これらの試験において、１μｇ、５μｇ、１０μｇ，２５μｇ、５０μｇおよびその間の値の様々な用量を用いて、用量応答性の結果を決定する。１００μｇの総用量に対する分割投与には、１．６μｇ、４．２μｇ、８．３μｇ、１６．６μｇの３回投与または６回投与が含まれ、または、選択された総用量の投与と等しい値と総用量が含まれる。
【１０３３】
注射部位は、後肢または注射に適した十分な広さの領域がある任意の体表面から選択される。また、真皮（真皮内）、表皮（表皮内）、皮下組織（ＳＣ）または筋肉（ＩＭ）を標的とするために、注射の深度の選択も含まれる。注射角度は、標的とした送達部位に基づき変化し、真皮内部位を標的とする注射では皮膚表面の平面から１０〜１５度、皮下注射に対しては皮膚表面の平面から２０〜４５度の間、しっかりと筋肉内へ注射する場合には、６０〜９０度の間の角度である。
実施例４９．エキソソームの定量化
本発明のｍｍＲＮＡの量および局在性を、単離エキソソームにおける量（当初、経時的または残留基準）を測定することにより、決定することができる。本試験において、通常、ｍｍＲＮＡはコドン最適化されており、内因性ｍＲＮＡ由来の配列が明らかであるため、ＧｉｂｂｉｎｇｓらのＰＣＴ／ＩＢ２００９／００５８７８（参照によりその全体で本明細書に援用される）の方法を用いて、天然または野生型の内因性ｍＲＮＡのレベルと比較して、ｍｍＲＮＡのレベルを定量する。
【１０３４】
これらの試験において、本法は、最初にエキソソームまたは小胞（好ましくは本発明の修飾ｍｍＲＮＡで従前に治療されたことがある患者の体液由来のもの）を単離し、次いで、前記エキソソーム内の修飾ｍｍＲＮＡのレベルを、ｍＲＮＡマイクロアレイ、ｑＲＴ−ＰＣＲまたは当分野のＲＮＡ測定のための他の方法（適切な抗体または免疫組織化学法によるものを含む）の１つを用いて、測定する。
実施例５０．修飾ｍＲＮＡトランスフェクション
Ａ．逆向きトランスフェクション
コラーゲンコートされた２４ウェルの組織培養プレート中での実験実施のために、角化細胞を、１×１０５の細胞密度で播種する。コラーゲンコートされた９６ウェルの組織培養プレート中での実験実施のために、角化細胞を、０．５×１０５の細胞密度で播種する。トランスフェクションされる各修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）のために、修飾ｍＲＮＡ：ＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）を、上述のように調製し、時間内（たとえば、細胞が組織培養プレートに付着する前、細胞播種から６時間）に、マルチウェルのプレート中の細胞と混合する。
【１０３５】
Ｂ．前向きトランスフェクション
コラーゲンコートされた２４ウェルの組織培養プレート中では、角化細胞を、０．７×１０５の細胞密度で播種する。コラーゲンコートされた９６ウェルの組織培養プレート中での実験実施のためには、角化細胞を、０．３×１０５の細胞密度で播種する。角化細胞は、２４時間以上で、７０％を超えるコンフルエンスの状態にまで増殖する。トランスフェクションされる各修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）のために、修飾ｍＲＮＡ：ＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）を、上述のように調製し、細胞播種し組織培養プレートに付着してから２４時間後、マルチウェルのプレートの細胞にトランスフェクションする。
【１０３６】
Ｃ．修飾ｍＲＮＡ翻訳スクリーニング：Ｇ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡ
角化細胞を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）から入手されるＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｓ７を補充したＥＰＩＬＩＦＥ培地中で、７０％を超えるコンフルエンスで増殖させる。角化細胞の１セットを、ＲＮＡＩＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手）で複合体化された化学的修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の３００ｎｇで逆向きトランスフェクションさせた。角化細胞の他のセットは、ＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手）で複合体化された修飾ｍＲＮＡの３００ｎｇで前向きトランスフェクションさせる。修飾ｍＲＮＡ：ＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）複合体は、最初にＲＮＡを、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ無しのＥＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地と、５×の体積希釈で、室温で１０分間、インキュベートすることにより形成される。
【１０３７】
第二のバイアル中で、ＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）試薬を、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ無しのＥＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地と、１０×体積希釈で、室温で１０分間、インキュベートした。次いで、ＲＮＡバイアルを、ＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）バイアルと混合させ、室温で２０〜３０分間インキュベートし、細胞を滴下させて添加した。培養培地中の分泌型ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の濃度は、各化学的修飾ｍＲＮＡに対し、三重で、トランスフェクションの１８時間後に測定する。
【１０３８】
トランスフェクションされたヒト角化細胞からのヒトＧ−ＣＳＦの分泌を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎまたはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）から入手されるＥＬＩＳＡキットを用いて、メーカーの推奨説明書に従い、定量する。
【１０３９】
Ｄ．修飾ｍＲＮＡ用量および期間：Ｇ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡ
角化細胞を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）から入手されるＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｓ７を補充したＥＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地中で、７０％を超えるコンフルエンスで増殖させる。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）から入手されるＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）で複合体化された、修飾ｍＲＮＡの０ｎｇ、４６．８７５ｎｇ、９３．７５ｎｇ、１８７．５ｎｇ、３７５ｎｇ、７５０ｎｇまたは、１５００ｎｇのいずれかで、角化細胞を逆向きトランスフェクションする。修飾ｍＲＮＡ：ＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）複合体は上述のように形成される。培養培地中の分泌型ヒトＧ−ＣＳＦ濃度は、各修飾ｍＲＮＡの各濃度に対し、３重で、トランスフェクションの０、６、１２、２４および４８時間後で測定される。トランスフェクションされたヒト角化細胞からのヒトＧ−ＣＳＦの分泌は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎまたはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手されるＥＬＩＳＡキットを用いて、メーカーの推奨説明書に従い、定量する。
実施例５１．ＥＬＩＳＡアッセイを用いた、修飾ｍＲＮＡに対する細胞性自然免疫応答の検出
インビトロトランスフェクションされたヒト角化細胞から分泌されたヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、ヒトインターフェロンβ（ＩＦＮβ）およびヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）に対する酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を、細胞性自然免疫応答の検出のために検証する。角化細胞を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）から入手されるヒト角化細胞増殖サプリメントを補充されたＥＰＩＬＩＦＥ（登録商標）中（ヒドロコルチゾンは非存在）で、７０％を超えるコンフルエンスで増殖させる。分泌型ＴＮＦα角化細胞を、０ｎｇ、９３．７５ｎｇ、ｌ８７．５ｎｇ、３７５ｎｇ、７５０ｎｇ、１５００ｎｇまたは３０００ｎｇの化学的修飾ｍＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手されるＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）で、複合体化されている）で、上述のように３重で、逆向きトランスフェクションする。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手されるＥＬＩＳＡキットを用いて、メーカーのプロトコールに従い、化学的修飾ｍＲＮＡのそれぞれに対し、トランスフェクションの２４時間後の培養培地中の分泌型ＴＮＦαを測定する。
【１０４０】
同じ培養培地中の分泌型ＩＦＮβは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手されるＥＬＩＳＡキットを用いて、メーカーのプロトコールに従い、化学的修飾ｍＲＮＡのそれぞれに対してトランスフェクションの２４時間後に測定する。同じ培養培地中の分泌型ヒトＧ−ＣＳＦの濃度は、化学的修飾ｍＲＮＡのそれぞれに対し、トランスフェクションの２４時間後に測定する。トランスフェクションされたヒト角化細胞から分泌されたヒトＧ−ＣＳＦは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎまたはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）から入手されるＥＬＩＳＡキットを用いて、メーカーの推奨説明書に従い、定量する。代表的なＩ型サイトカインであるＴＮＦαおよびＩＦＮβを測定することにより、修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）が、天然のポリヌクレオチドおよび他の化学的修飾ポリヌクレオチドまたは基準化合物と比較して、細胞性自然免疫応答の減少を誘導することができることが、データから示唆される。
実施例５２．ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）修飾ｍＲＮＡにより誘導される細胞増殖の分析
ヒト角化細胞を、２４ウェルのコラーゲンコートされたＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）（Ｃｏｍｉｎｇ，  マサチューセッツ州ローウェル）共培養組織培養プレート中で、７０％を超えるコンフルエンスで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手されるＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｓ７を補充されたＥＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地で増殖させる。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手されるＲＮＡＩＭＡＸで複合体化された、指定の化学的修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）の７５０ｎｇで、上述のように、３重で、逆向きトランスフェクションを行う。修飾ｍＲＮＡ：ＲＮＡＩＭＡＸ：複合体は、上述のように形成される。角化細胞培地は、トランスフェクション後、６〜８時間で交換する。トランスフェクションの４２時間後、０．４μｍ孔の半透過性ポリエステル膜を備えた、２４ウェルＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）プレートインサートを、ヒトＧＣＳＦ修飾ｍＲＮＡをトランスフェクションした角化細胞を含有する培養プレート内に静置する。
【１０４１】
ヒト骨髄芽球である、Ｋａｓｕｍｉ−１細胞またはＫＧ−１（０．２×１０５細胞）を、挿入ウェル内に播種し、ＣｙＱｕａｎｔ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  カリフォルニア州カールスバッド）を用いて、９６ウェルプレートの１００〜１２０μｌ体積中の細胞の増殖を、共培養開始から４２時間後に定量する。修飾ｍＲＮＡがコードしているヒトＧ−ＣＳＦにより誘導された骨髄芽球の細胞増殖は、トランスフェクションされていない角化細胞／骨髄芽球の共培養対照のウェルに対して正規化された細胞増殖のパーセントとして表される。角化細胞および骨髄芽球インサート共培養ウェルの両方における分泌型ヒトＧ−ＣＳＦ濃度は、各修飾ｍＲＮＡに対し、２重で、共培養開始の４２時間後に測定される。ヒトＧ−ＣＳＦの分泌は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手されるＥＬＩＳＡキットを用いて、メーカーの推奨説明書に従い、定量される。
【１０４２】
ヒト角化細胞フィーダー細胞およびトランスフェクションされていないヒト骨髄芽球中の、トランスフェクションされたヒトＧ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡが、ＲＴ−ＰＣＲにより検出される。試料細胞由来の総ＲＮＡが抽出され、ＲＮＥＡＳＹ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ，  カリフォルニア州バレンシア）を用いて、メーカーの説明書に従い溶解される。抽出された総ＲＮＡは、メーカーのプロトコールに従いＰＲＯＴＯＳＣＲＩＰＴ（登録商標）Ｍ−ＭｕＬＶ  Ｔａｑ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，  マサチューセッツ州イプスウィッチ）を用いた、ヒトＧ−ＣＳＦ特異的プライマーでの修飾ｍＲＮＡ−Ｇ−ＣＳＦの特異的増幅のために、ＲＴ−ＰＣＲに供される。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、１．２％アガロースゲル電気泳動により可視化される。実施例５３．緩衝液製剤の試験
緩衝液に溶解した、Ｇ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡ（配列番号６。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１。Ｎ１−シュードウリジンおよび５−メチルシトシンで完全に修飾）または、ＩＸ因子修飾ｍＲＮＡ（配列番号１０。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１。Ｎ１−シュードウリジンおよび５−メチルシトシンで完全に修飾）を、修飾ｍＲＮＡ用量２００ｕｇ／ラット、５０ｕｌの注射体積で、ラット（ｎ＝５）に筋肉内投与する（表７８に記述される）。修飾ｍＲＮＡは、水中で１〜２日間、凍結乾燥される。次いで、以下に列挙される緩衝液中で再構成され、６ｍｇ／ｍｌの標的濃度にする。ＯＤ２６０で濃度を測定する。投与の前に、試料を適切な緩衝液で４ｍｇ／ｍｌまで希釈する。
【１０４３】
修飾ｍＲＮＡの沈殿のために、３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）および純エタノールを、それぞれ総量の１０分の１、修飾ｍＲＮＡの総量の４倍で、添加する。材料を、最低１時間、−８０℃に静置する。次いで、材料を、３０分間、４０００ｒｐｍ、４℃で遠心する。上清を除去し、ペレットを遠心し、７５％エタノールで３回、洗浄する。最後に、ペレットを緩衝液で再構成し、６ｍｇ／ｍｌの標的濃度にする。ＯＤ２６０で濃度を測定する。投与の前に、試料を、適切な緩衝液で４ｍｇ／ｍｌまで希釈する。すべての試料は、以下に記述されない限り、凍結乾燥により調製される。
【１０４４】
【表７８】
2019059793.tif 000193
【１０４５】
血清試料を、様々な時間間隔でラットから採取し、Ｇ−ＣＳＦまたはＩＸ因子ＥＬＩＳＡを用いて、Ｇ−ＣＳＦタンパク質発現またはＩＸ因子タンパク質発現に対し分析する。実施例５４．複数回用量試験
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝８、メス４、オス４）に、２８日にわたり、８回（週に２回）、静脈内注射する。ラットに、脂質ナノ粒子で製剤化されたルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡのヒトＧ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡを０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇもしくは０．０００５  ｍｇ／ｋｇ、生理食塩水に溶解したヒトＧ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡを０．５ｍｇ／ｋｇ、ヒトＧ−ＣＳＦタンパク質  Ｎｅｕｐｏｇｅｎを０．２ｍｇ／ｋｇ、または、脂質ナノ粒子で製剤化された翻訳不可能なヒトＧ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡを注射する。血清を、前もって決定された時間間隔の間で採取し、Ｇ−ＣＳＦタンパク質発現（週の最初の投与の８、２４および７２時間後）、全血球数および白血球数（週の最初の投与の２４および７２時間後）ならびに、臨床化学的所見（週の最初の投与の２４および７２時間後）を評価する。２９日目（最後の投与の４日後）で、ラットを殺処分し、全血球数、白血球数、臨床化学所見、タンパク質発現を測定し、組織病理学および解剖により、主要器官への作用を評価する。さらに、抗体アッセイを、２９日目でラットに実施する。
実施例５５．ルシフェラーゼＬＮＰ  インビボ試験
ルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡ（配列番号１６。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１。Ｎ１−シュードウリジンおよび５−メチルシトシンで完全に修飾）を、シリンジポンプ法を用いて、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化した。ＬＮＰは、修飾ｍＲＮＡに対する総脂質の重量比２０：１、最終脂質モル比５０：１０：３８．５：１．５（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧ）で製剤化された。表７９に示されるように、ルシフェラーゼＬＮＰ製剤を、粒子サイズ、ゼータ電位および封入で特徴付けた。
【１０４６】
【表７９】
2019059793.tif 000194
【１０４７】
表８０に概要があるように、ルシフェラーゼＬＮＰ製剤を、Ｂａｌｂ−Ｃマウス（ｎ＝３）に、筋肉内、静脈内および皮下投与し、ＰＢＳ中で製剤化されたルシフェラーゼ修飾ＲＮＡをマウスに静脈内投与した。
【１０４８】
【表８０】
2019059793.tif 000195
【１０４９】
ルシフェラーゼＬＮＰを静脈内および筋肉内に投与されたマウスを、２、８、２４、４８、１２０および１９２時間で画像撮影し、ルシフェラーゼＬＮＰ製剤を皮下投与されたマウスは、２、８、２４、４８および１２０時間で画像撮影し、表８１に示されるように、ルシフェラーゼ発現を測定した。表８１において、「ＮＴ」は検証しなかったことを意味する。画像撮影の２０分前に、マウスに、Ｄ−ルシフェリン溶液を１５０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射した。次いで、動物を麻酔し、画像を、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて得た。生物発光は、マウス全体の総流量（光子／秒）として測定された。
【１０５０】
【表８１】
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【１０５１】
ＬＮＰ製剤を静脈内投与された１匹のマウスを、８時間で殺処分し、肝臓および脾臓のルシフェラーゼ発現を測定した。また、ＬＮＰ製剤を筋肉内投与された１匹のマウスを、８時間で殺処分し、注射部位周辺の筋肉ならびに肝臓および脾臓のルシフェラーゼ発現を測定した。表８２に示されるように、発現は、静脈内投与および筋肉内投与後の肝臓および脾臓の両方、ならびに筋肉内注射部位周辺の筋肉で認められた。
【１０５２】
【表８２】
2019059793.tif 000197
【１０５３】
実施例５６．インビトロＰＢＭＣ試験：修飾％
５−メチルシトシン（５ｍＣ）およびシュードウリジン（シュードＵ）で修飾されたＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ、または非修飾Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡを４８０ｎｇ、０．４μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて、３人の健常な血液ドナー（Ｄ１、Ｄ２およびＤ３）由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）へトランスフェクションした。Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（配列番号６；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）は、５ｍＣおよびシュードＵで完全に修飾され（１００％修飾）、または５ｍＣおよびシュードＵで修飾されず（０％修飾）、または５ｍＣおよびシュードＵで部分的に修飾された（ｍＲＮＡは７５％修飾、５０％修飾、または２５％修飾を含有）。ルシフェラーゼ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１。５ｍｅＣおよびシュードＵで完全修飾）の対照試料もまた、Ｇ−ＣＳＦ発現に対して分析された。ＴＮＦαおよびＩＦＮαに対しては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、ＬＰＳ、Ｒ−８４８、ルシフェラーゼ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１。５ｍｅＣおよびシュードＵで完全修飾）およびＰ（Ｉ）Ｐ（Ｃ）の対照試料がまた分析された。上清を回収し、トランスフェクションの２２時間後にＥＬＩＳＡを実施し、タンパク質発現を測定した。Ｇ−ＣＳＦ発現を表８３に示し、ＩＦＮαおよびＴＮＦαの発現を、表８４に示す。ＩＦＮαおよびＴＮＦαの発現は、Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡトランスフェクションによる二次的な作用である可能性がある。表８３および８４より、ｍＲＮＡが完全には修飾されていない場合、Ｇ−ＣＳＦ、インターフェロンα（ＩＦＮα）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の化学的修飾の量が徐々に変化し、その変化傾向は、各標的で同じではないことが示される。
【１０５４】
上述のように、インビトロアッセイシステムとしてＰＢＭＣを用いると、翻訳（この場合は、Ｇ−ＣＳＦタンパク質産生）とサイトカイン産生（この場合はＩＦＮαタンパク質産生に例示される）の間の相関を確立することが可能である。タンパク質発現の上昇と、自然免疫活性化経路の低誘導は相関し、化学物質の修飾割合は、この比率（表８５）に基づいて都合よく判定することができる。表８３および８４から算出され、表８５に示されるように、５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾すると、何も修飾しない場合（天然Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ）よりも、タンパク質／サイトカイン産生の比率がかなり上昇することが示されている（ＩＦＮαに対しては１００倍、ＴＮＦαに対しては２７倍）。部分的な修飾では、修飾が次第に低下すると直線的な関係性が現れ、タンパク質／サイトカイン比率の低下をもたらすことが示されている。
【１０５５】
【表８３】
2019059793.tif 000198
【１０５６】
【表８４】
2019059793.tif 000199
【１０５７】
【表８５】
2019059793.tif 000200
【１０５８】
実施例５７．ＰＢＭＣにトランスフェクションされた修飾ＲＮＡ
５−メチルシトシン（５ｍＣ）およびシュードウリジン（シュードＵ）で修飾されたＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ、または非修飾Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡの５００ｎｇを、０．４μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００で、３人の健常な血液ドナー（Ｄ１、Ｄ２およびＤ３）由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）へとトランスフェクションした。Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（配列番号６。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）は、５ｍＣおよびシュードＵで完全に修飾され（１００％修飾）、または５ｍＣおよびシュードＵで修飾されず（０％修飾）、または５ｍＣおよびシュードＵで部分的に修飾された（ｍＲＮＡは５０％修飾、２５％修飾、１０％修飾、５％修飾、１％修飾または０．１％修飾を含有）。ｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号７にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１。５ｍｅＣおよびシュードＵで完全修飾）、および５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたＧ−ＣＳＦ（対照Ｇ−ＣＳＦ）の対照試料もまた、Ｇ−ＣＳＦ発現に対して分析された。腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）およびインターフェロンα（ＩＦＮα）に対しては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、ＬＰＳ、Ｒ−８４８、ルシフェラーゼ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１。５ｍｅＣおよびシュードＵで完全修飾）およびＰ（Ｉ）Ｐ（Ｃ）の対照試料がまた分析された。上清をトランスフェクションの６時間および１８時間後に回収し、ＥＬＩＳＡを実施して、タンパク質発現を測定した。ドナー１のＧ−ＣＳＦ、ＩＦＮα、およびＴＮＦαの発現は、表８６に示し、ドナー２は表８７、ドナー３は表８８に示す。
【１０５９】
５−メチルシトシンおよびシュードウリジンでの１００％完全修飾は、３つのヒトＰＢＭＣドナーすべてで、最も高いタンパク質翻訳（Ｇ−ＣＳＦ）および最も低い量のサイトカイン産生をもたらした。修飾量の減少により、よりサイトカインの産生（ＩＦＮαおよびＴＮＦα）が増えたことから、サイトカインを減少させ、そしてタンパク質産生を改善するため（Ｇ−ＣＳＦ産生により明らかであるように）には、完全修飾が重要であることがさらに強調されることとなった。
【１０６０】
【表８６】
2019059793.tif 000201
【１０６１】
【表８７】
2019059793.tif 000202
【１０６２】
【表８８】
2019059793.tif 000203
【１０６３】
実施例５８．ＢＪ線維芽細胞における、自然免疫応答試験
Ａ．単一トランスフェクション
ヒト初代包皮線維芽細胞（ＢＪ線維芽細胞）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）（カタログ＃  ＣＲＬ−２５２２）より得て、１０％ウシ胎児血清を補充したＥａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＡＴＣＣ、カタログ＃  ３０−２００３）中で、３７℃、５％ＣＯ２下で増殖させた。ＢＪ線維芽細胞を、０．５ｍｌの培養培地中、３００，０００細胞／ウェルの密度で、２４ウェルプレート上に播種した。５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された、修飾Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（配列番号６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）（Ｇｅｎ１）、または、キャップ０、キャップ１もしくはキャップの無い、５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾された、修飾Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇｅｎ２）の２５０ｎｇを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃  １１６６８−０１９）を用いて、メーカーのプロトコールに従い、トランスフェクションした。ｐｏｌｙＩ：Ｃ（ＰＩＣ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｐｏ）、天然ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）および天然Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡの対照試料もまた、トランスフェクションした。１８時間後に細胞を回収し、総ＲＮＡを単離し、メーカーのプロトコールに従い、ＲＮｅａｓｙマイクロキット（カタログ  ＃７４００４）を用いて、ＤＮＡＳＥ（登録商標）で処理した。総ＲＮＡの１００ｎｇを、メーカーのプロトコールに従い、Ｈｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（カタログ  ＃４３６８８１４）を用いた、ｃＤＮＡ合成に用いた。次いで、ｃＤＮＡを、メーカーのプロトコールに従い、Ｂｉｏｒａｄ  ＣＦＸ３８４機器のＳｙｂｒＧｒｅｅｎを用いて、定量リアルタイムＰＣＲにより、自然免疫応答遺伝子の発現に対して分析した。表８９に、ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）と比較した、自然免疫応答転写物の発現レベルを示し、ＨＰＲＴに対し相対的な誘導の倍数として表す。表において、標準的測定基準のパネルには、以下が含まれる：ＲＩＧ−Ｉは、レチノイン酸誘導遺伝子１（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  １）、ＩＬ６は、インターロイキン−６、ＯＡＳ−１は、オリゴアデニレート合成酵素１（ｏｌｉｇｏａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  １）、ＩＦＮｂは、インターフェロン−β、ＡＩＭ２は、ａｂｓｅｎｔ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ−２、ＩＦＩＴ−１は、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｐｅａｔｓ  １、ＰＫＲは、タンパク質キナーゼＲ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｒ）、ＴＮＦａは、腫瘍壊死因子α、およびＩＦＮａは、インターフェロンαである。
【１０６４】
【表８９】
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【１０６５】
Ｂ．反復トランスフェクション
ヒト初代包皮線維芽細胞（ＢＪ線維芽細胞）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）（カタログ＃  ＣＲＬ−２５２２）より得て、１０％ウシ胎児血清を補充したＥａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＡＴＣＣ、カタログ＃  ３０−２００３）中で、３７℃、５％ＣＯ２下で増殖させた。ＢＪ線維芽細胞を、０．５ｍｌの培養培地中、３００，０００細胞／ウェルの密度で、２４ウェルプレート上に播種した。修飾していない修飾Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（配列番号６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）、５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された、修飾Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇｅｎ１）、または、５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾された、修飾Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇｅｎ２）の２５０ｎｇを、メーカーのプロトコールに従い、５日間、毎日、トランスフェクションした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌ２０００）およびｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡ（配列番号７にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１。５−メチルシチジンおよびシュードウリジンで完全に修飾）の対照試料もまた、５日間、毎日、トランスフェクションした。表９０に結果を示す。
【１０６６】
非修飾ｍＲＮＡは、一日後、インターフェロンβ（ＩＦＮ−ｂｅｔａ）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）のサイトカイン応答を示した。少なくともシュードウリジンで修飾されたｍＲＮＡは、２〜３日後、サイトカイン応答を示したが、５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで修飾されたｍＲＮＡは、３〜５日後、応答の減少を示した。
【１０６７】
【表９０】
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【１０６８】
実施例５９．自然免疫応答のインビボ検出試験
メスＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝５）に、５´キャップ、キャップ１を有するＧ−ＣＳＦ
ｍＲＮＡ（ＧＣＳＦ  ｍＲＮＡ  ｕｎｍｏｄ）（配列番号６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない）、５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（ＧＣＳＦ  ｍＲＮＡ
５ｍｃ／ｐＵ）、５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾され、５´キャップを有するＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（ＧＣＳＦ  ｍＲＮＡ  ５ｍｃ／Ｎ１ｐＵ）、または５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾され、５´キャップの無いＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（ＧＣＳＦ  ｍＲＮＡ  ５ｍｃ／Ｎ１  ｐＵ  ｎｏ  ｃａｐ）、またはＲ８４８もしくは５％スクロースのいずれかの対照で、筋肉内注射を行った（表９１に記述される）。投与の８時間後で血液を採取し、ＥＬＩＳＡを用いてＧ−ＣＳＦおよびインターフェロンα（ＩＦＮα）のタンパク質レベルを測定し、その結果を表８１に示す。
【１０６９】
表９１に示されるように、非修飾、５ｍｃ／ｐＵ、および５ｍｃ／Ｎ１ｐＵ修飾Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡは、マウス血清においてヒトＧ−ＣＳＦ発現をもたらした。キャップの無い５ｍｃ／Ｎ１ｐＵ修飾Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡは、血清中のヒトＧ−ＣＳＦ発現をもたらさず、このことから、タンパク質翻訳における５´キャップ構造の重要性が強調される。
【１０７０】
予想されたように、Ｒ８４８、５％スクロースのみ、および非処置群では、ヒトＧ−ＣＳＦタンパク質は発現されなかった。重要なことは、血清中のマウスＩＦＮαにより測定されたように、サイトカイン産生において有意差が見られたことである。予想されたように、非修飾Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡは、インビボで堅固なサイトカイン応答を示した（Ｒ８４８陽性対照よりも強い）。５ｍｃ／ｐＵ修飾Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡは、低いが、インビボで検出可能なサイトカイン応答を示した一方で、５ｍｃ／Ｎ１ｐＵ修飾ｍＲＮＡでは、血清中のＩＦＮαは検出されなかった（媒体または非処置動物でも同様である）。
【１０７１】
また、５ｍｃ／Ｎ１ｐＵ修飾ｍＲＮＡの応答は、キャップの有無にかかわらず、同じであった。これらのインビボでの結果より、１）非修飾ｍＲＮＡは、はっきりとした自然免疫応答が誘導される、２）５ｍｃ／ｐＵ修飾の１００％組込により、減少はするが、消失はしない、３）５ｍｃ／Ｎ１ｐＵ修飾の組み込みにより、サイトカイン応答は検出されなくなる、という結論が強固なものとなった。
【１０７２】
最後に、これらの注射が５％スクロース中に溶解したものであったことを考慮すると（スクロース自身は何の作用もない）、これらの結果は、これらの修飾体の免疫賦活化の可能性を正確に反映しているもののはずである。
【１０７３】
データから、Ｎ１ｐＵ修飾分子がより多くのタンパク質を産生する一方で、ＩＦＮα発現にはほとんど作用しない、または作用しないことが明らかである。また、キャッピングがこの化学修飾体のタンパク質産生に対して必要であることが明らかである。非修飾ｍＲＮＡのタンパク質：サイトカイン比率（ＰＣ＝９）と比較して、ＰＣ比が７４８であることから、この化学的修飾は、ＩＦＮαに関連した生物学的意義または作用に関して、非常に優れたものであることが示唆される。
【１０７４】
【表９１】
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【１０７５】
実施例６０．修飾ＲＮＡのインビボ送達
修飾ｍＲＮＡのタンパク質産生を、修飾Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡもしくは修飾ＩＸ因子ｍＲＮＡの、メスＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝６）への送達により評価した。５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（配列番号６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）（Ｇ−ＣＳＦ  Ｇｅｎ１）、５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（Ｇ−ＣＳＦ  Ｇｅｎ２）、または、５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたＩＸ因子ｍＲＮＡ（配列番号１０にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない）（ＩＸ因子  Ｇｅｎ１）、を４００μｇ（１００μｌ）、凍結乾燥形態から５％スクロース中で再構成させ、ラットに注射した。注射の８時間後に血液を採取し、血清中のＧ−ＣＳＦタンパク質レベルをＥＬＩＳＡにより測定した。表９２に８時間後の血清Ｇ−ＣＳＦタンパク質レベルを示す。
【１０７６】
これらの結果より、Ｇ−ＣＳＦ  Ｇｅｎ１および、Ｇ−ＣＳＦ  Ｇｅｎ２修飾ｍＲＮＡの両方が、単回筋肉内注射の後、ラットでヒトＧ−ＣＳＦタンパク質を産生することができること、および、ヒトＧ−ＣＳＦタンパク質産生は、Ｇｅｎ１化学物質よりも、Ｇｅｎ２化学物質を用いたときのほうが改善されることが示される。
【１０７７】
【表９２】
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【１０７８】
実施例６１．修飾ＲＮＡの安定性
修飾ＲＮＡの完全性を維持するための保存条件をより良く把握するために、安定性実験を実施した。非修飾Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（配列番号６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）、５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（配列番号６にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）、および５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾され、０．７５％体積のＲＮＡＩＭＡＸ（登録商標）でリポプレックス化されたＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡを、５０℃、４０℃、３７℃、２５℃、４℃、または−２０℃で保存した。０時間、２時間、６時間、２４時間、４８時間、５日間および１４日間、ｍＲＮＡを保存した後、そのｍＲＮＡを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＥＸＰＥＲＩＯＮ（登録商標）システムを用いた電気泳動により分析した。また、修飾、非修飾、およびリポプレックス化されたＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡを、ＲＮＡＳＴＡＢＬＥ（登録商標）（Ｂｉｏｍａｔｒｉｃａ，  Ｉｎｃ．  カリフォルニア州サンディエゴ）中で４０℃、または、水中で−８０℃もしくは４０℃で、３５日間、保存し、電気泳動により分析した。
【１０７９】
安定化剤の無いｍＲＮＡ試料はすべて、４℃または−２０℃での２週間保存の後、安定であった。修飾Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（リポプレックス化有りまたは無し）は、非修飾Ｇ−ＣＳＦよりも、２５℃で保存された場合（４８時間と比べて、５日で安定ではなくなった）、３７℃で保存された場合（６時間と比べて、２４時間で安定ではなくなった）、および、５０℃で保存された場合（２時間と比べて、６時間で安定ではなくなった）において、より安定であった。非修飾Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ、修飾Ｇ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（リポプレックス化有りまたは無し）は、１２回の凍結／融解のサイクルに耐容であった。
【１０８０】
安定化剤中で、４０℃で保存されたｍＲＮＡは、水中で−８０℃で保存されたｍＲＮＡ試料と、３５日後に同様の安定性を示した一方で、水中で４０℃で保存されたｍＲＮＡは、１８日後、非常に分解が進んでいた。
【１０８１】
４℃、２５℃、３７℃で保存されたｍＲＮＡ試料を、１×ＴＥ緩衝液または製剤緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化カルシウム、２ｍＭリン酸塩、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ６．５））中で保存した。４℃で保存されたｍＲＮＡは、ＴＥ緩衝液および製剤緩衝液の両方で、少なくとも６０日は安定であった。製剤緩衝液中、２５℃で保存されたｍＲＮＡは、１４日で安定ではなくなり、ＴＥ緩衝液では少なくとも６日で安定ではなくなった。製剤緩衝液中、３７℃でのｍＲＮＡの保存は、ＴＥ緩衝液（たった４日までしか安定ではなかった）と比較すれば、６日まで安定であった。
実施例６２．製剤化ｍＲＮＡの発現に対する化学的修飾の影響
５−メチルシトシンおよび２´フルオロウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６。およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）を、生理食塩水またはＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ中で製剤化し、げっ歯類に、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇおよび／または０．０００５ｍｇ／ｋｇの用量で、静脈内、筋肉内または皮下に投与する。５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）を、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ中で製剤化し、げっ歯類に、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇおよび／または０．０００５ｍｇ／ｋｇの用量で、筋肉内または皮下に投与する。ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ製剤は、投与の前に分析し、平均サイズとゼータ電位を測定する。投与の２時間後、８時間後、２４時間後、７２時間後、９６時間後、１４４時間後および１６８時間後にげっ歯類を撮像し、生物発光を、光子／秒で、各製剤および投与経路に対して、測定する。
実施例６３．ＰＬＧＡ製剤化ｍＲＮＡの発現
Ａ．ルシフェラーゼＰＬＧＡマイクロスフェアの合成および特徴付け
５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６。およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）、２−チオウリジンで置換されたウリジンの２５％で修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡ、および５−メチルシトシンで置換されたシトシンの２５％で修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡ、Ｎ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡ、またはシュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡを、１×ＴＥ緩衝液中で再構成し、次いで、ＰＬＧＡマイクロスフェア中で製剤化した。ＰＬＧＡマイクロスフェアは、ＰＬＧＡエステルキャップ（Ｌａｃｔｅｌ、Ｃａｔ＃  Ｂ６０１０−２、固有粘度０．５５−０．７５、  ５０：５０  ＬＡ：ＧＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃  ３４８４０６−２５Ｇ、ＭＷ  １３−２３ｋ）ジクロロメタンおよび水を用いた、当分野で公知の方法である、水／油／水の二重乳状化法を用いて合成された。簡潔に述べると、ＴＥ緩衝液に４ｍｇ／ｍｌで溶解したｍＲＮＡ０．４ｍｌ（Ｗ１）を、２００ｍｇ／ｍｌのＰＬＧＡの濃度でジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解したＰＬＧＡ（Ｏ１）を２ｍｌ添加した。Ｗ１／Ｏ１エマルションを、３０秒、スピード５（約１９，０００ｒｐｍ）でホモジナイズ（ＩＫＡ
Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ、Ｔ１８）した。次いで、Ｗ１／Ｏ１エマルションに、２５０ｍｌの１％ＰＶＡ（Ｗ２）を加え、１分、スピード５（約１９，０００ｒｐｍ）でホモジナイズした。製剤を３時間、攪拌し続け、次いで、１００μｍのナイロンメッシュストレイナー（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ，  Ｃａｔ  ＃  ２２−３６３−５４９）に通して大きな凝集物を除去し、最後に、遠心により洗浄した（１０分、９，２５０ｒｐｍ、４℃）。上清を棄て、ＰＬＧＡペレットを、５〜１０ｍｌの水に再懸濁し、これを２回繰り返した。洗浄後、水で再懸濁し、１００〜２００μｌのＰＬＧＡマイクロスフェア試料を用いて、レーザー回析（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ２０００）により製剤の粒子サイズを計測した。洗浄された製剤を、液体窒素中で凍結させ、次いで、２〜３日間、凍結乾燥させた。
【１０８２】
凍結乾燥後、約１０ｍｇのＰＬＧＡ  ＭＳを、２ｍｌのエッペンドルフチューブ内に量り取り、１ｍｌのＤＣＭを加えて、試料を２〜６時間振とうさせることによって、脱製剤化した。ｍＲＮＡは、０．５ｍｌの水を加え、試料を一晩振とうさせることにより、脱製剤化されたＰＬＧＡマイクロスフェアから抽出した。ＴＥ緩衝液に溶解した製剤化されていないルシフェラーゼｍＲＮＡ（未製剤化対照）を、ＤＣＭ中に注ぎ、脱製剤化プロセスを経させて、トランスフェクションアッセイにおける対照として用いた。封入効率、積載重量パーセント、および粒子サイズを表９３に示す。封入効率は、製剤に添加されたｍＲＮＡの当初量で割った、ＰＬＧＡマイクロスフェアの脱製剤化由来のｍＲＮＡのｍｇとして算出された。製剤中の積載重量パーセントは、製剤に添加されたＰＬＧＡの当初量で割った、ＰＬＧＡマイクロスフェアの脱製剤化由来のｍＲＮＡのｍｇとして算出された。
【１０８３】
【表９３】
2019059793.tif 000208
【１０８４】
Ｂ．ＰＬＧＡマイクロスフェア中で封入された修飾ｍＲＮＡのタンパク質発現
トランスフェクションの前日、２０，０００のＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ｎｏ．  ＣＣＬ−２；ヴァージニア州マナサス）を、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ニューヨーク州グランドアイランド）での処置により回収して、１ウェルあたり、総量で１００μｌのＥＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳおよび１×Ｇｌｕｔａｍａｘを補充）の９６ウェルの細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ヴァージニア州マナサス）に播種した。細胞を、一晩、５％ＣＯ２雰囲気下、３７ｏＣで増殖させた。翌日、８３ｎｇの脱製剤化ルシフェラーゼｍＲＮＡ  ＰＬＧＡマイクロスフェア試料、脱製剤化ルシフェラーゼｍＲＮＡ対照（Ｄｅｆｏｒｍ対照）または、非製剤化ルシフェラーゼｍＲＮＡ対照（Ｕｎｆｏｍｕｌ対照）を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ニューヨーク州グランドアイランド）の最終量１０ｕｌで希釈した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  （ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ニューヨーク州グランドアイランド）をトランスフェクション試薬として用いて、０．２μｌを、最終量１０ｕｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で希釈した。室温での５分間のインキュベーションの後、両溶液を混合し、さらに室温で１５分、インキュベートした。次いで、２０μｌの混合溶液を、ＨｅＬａ細胞を含有する細胞培養培地１００μｌに添加した。次いで、前述のようにプレートをインキュベートした。
【１０８５】
１８〜２２時間のインキュベーションの後、ルシフェラーゼを発現している細胞を、メーカーの説明書に従い、１００μｌのＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ウィスコンシン州マディソン）で溶解した。溶解物のアリコートを、乳白色のポリスチレン９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ヴァージニア州マナサス）へと移し、１００ｕｌの完全ルシフェラーゼアッセイ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，ウィスコンシン州マディソン）と混合した。試薬無しのプレートのバックグラウンドシグナルは、１ウェルにつき、約２００相対光単位であった。プレートリーダーは、ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１（ＢｉｏＴｅｋ，  ヴァーモント州ウィノースキー）であった。
【１０８６】
細胞を回収し、各試料に対する生体発光（相対光単位、ＲＬＵ）を表９４に示す。これらの試料のトランスフェクションにより、様々なルシフェラーゼｍＲＮＡ化学物質が、ＰＬＧＡマイクロスフェア製剤の後でもルシフェラーゼタンパク質を発現できることが確認された。
【１０８７】
【表９４】
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【１０８８】
実施例６４．  ＩＸ因子のインビトロ試験
Ａ．無血清培地
ヒトＩＸ因子ｍＲＮＡ（配列番号１０にｍＲＮＡ配列を示す。およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾）を、無血清培地にトランスフェクションした。細胞培養上清を回収し、ペプチドの２次元ＨＰＬＣ分離を行う前に、トリプシン消化に供した。マトリックス支援レーザー脱離イオン法を用いて、ペプチドを検出した。８つのペプチドが検出され、その検出されたペプチドのうち７つが、ＩＸ因子に特有のものである。これらの結果より、無血清培地にトランスフェクションされたｍＲＮＡが、完全長のＩＸ因子タンパク質を発現できたことが示唆される。
【１０８９】
Ｂ．ヒト胚腎（ＨＥＫ）２９３Ａ細胞
２５０ｎｇのコドン最適化ヒトＩＸ因子ｍＲＮＡ（配列番号１０にｍＲＮＡ配列を示す。５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）を、１０％ＦＢＳの存在下、ＤＭＥＭ中で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて、ＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクションした（１５０，０００細胞／ウェル）。トランスフェクション複合体を、トランスフェクションの３時間後、除去した。トランスフェクション後、３、６、９、１２、２４、４８および７２時間で、細胞を回収した。総ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡ合成に用いた。ｃＤＮＡを、コドン最適化ＩＸ因子特異的プライマーセットを用いた定量リアルタイムＰＣＲによる分析に供した。ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ）レベルを、正規化に用いた。データは、３時間の時点でのｍＲＮＡレベルを１００％として考慮して、検出できたｍＲＮＡのパーセントとしてプロットした。５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたＩＸ因子修飾ｍＲＮＡのヒト胚腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞中の半減期は、約８〜１０時間である。
実施例６５．生理食塩水製剤：皮下投与
ヒトＧ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡ（配列番号６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾）、およびヒトＥＰＯ修飾ｍＲＮＡ（配列番号９にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾）を、生理食塩水中で製剤化し、筋肉内（ＩＭ）注射、１００ｕｇの用量で、マウスに送達させた。
【１０９０】
対照には、ルシフェラーゼ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾）または製剤緩衝液（Ｆ．Ｂｕｆｆｅｒ）を含ませた。注射後１３時間でマウスから採血し、血清中のヒトポリペプチドの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を測定した。（Ｇ−ＣＳＦ群は、マウス血清中のヒトＧ−ＣＳＦを測定し、ＥＰＯ群は、マウス血清中のヒトＥＰＯを測定した。）データを表９５に示す。
【１０９１】
ｍＲＮＡは、製剤化無しでは血清中で速やかに分解されることから、システム中でより長く継続するｍＲＮＡの最も良い送達方法は、ｍＲＮＡを製剤化することである。表９５に示されるように、ｍＲＮＡは、緩衝液製剤化のみで、皮下に送達することができる。
【１０９２】
【表９５】
2019059793.tif 000210
【１０９３】
実施例６６．製剤ナノ粒子の安定性
ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、Ｔｅｔａ−５−Ｌａｐ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡの製剤（脂質：ｍＲＮＡ比は２０：１）を、安定性に対する、粒子サイズ、多分散性指標および封入効率を、室温で評価した。ほとんどのナノ粒子は、室温で少なくとも１か月、安定である（表９６および９７に示す）。
【１０９４】
【表９６】
2019059793.tif 000211
【１０９５】
【表９７】
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【１０９６】
実施例６７．硝子体内送達
生理食塩水中で製剤化された、ｍＣｈｅｒｒｙ修飾ｍＲＮＡ（配列番号７にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾）、およびルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾）を、ラットの硝子体内に送達させた（表９８に記述される）。試料は、生理食塩水のみを硝子体内に送達させた対照と比較された。
【１０９７】
【表９８】
2019059793.tif 000213
【１０９８】
動物が麻酔されている間に、１日目に、各動物の左目または右目に、製剤を投与する。投与の前の日に、ゲンタマイシン眼軟膏または溶液を、両目に二度、適用する。また、ゲンタマイシン眼軟膏または溶液を、注射のすぐ後、および注射の翌日にも適用する。投与の前に、散瞳点眼薬（１％トロピカミドおよび／または２．５％フェニレフリン）を各目に適用する。
【１０９９】
投与の１８時間後、ｍＣｈｅｒｒｙおよび送達緩衝液の投与を受けた眼を摘出し、各目を別々に、１０ｍＬの４％パラホルムアルデヒドを含有するチューブ内に、室温で一晩、組織固定のために静置した。翌日、眼を、１０ｍＬの３０％スクロースを含有するチューブへ別々に移し、処理及び切片作製されるまで、２１℃で保存する。異なる切片から作製されたスライドを、Ｆ−顕微鏡下で評価した。陽性発現は、ｍＣｈｅｒｒｙ修飾ｍＲＮＡを投与された眼から作製されたスライドに認められ、対照には何も発現していなかった。実施例６８．インビボサイトカイン発現試験
マウスに、２００μｇのＧ−ＣＳＦ修飾ｍＲＮＡ（配列番号６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない）（５´キャップで修飾されていない、キャップ１（非修飾）、５−メチルシトシンおよびシュードウリジンおよび５´キャップ、キャップ１で完全に修飾された（Ｇｅｎ１）、または５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジン、および５´キャップ、キャップ１で完全に修飾された（Ｇｅｎ２  キャップ）、または、キャップ無し（Ｇｅｎ２  非キャップ））を筋肉内注射した。Ｒ−８４８、５％スクロースおよび非処置マウスの対照もまた分析された。８時間後に血清をマウスから採取し、インターフェロンα（ＩＦＮα）発現を分析した。結果を表９９に示す。
【１１００】
【表９９】
2019059793.tif 000214
【１１０１】
実施例６９．ＶＥＧＦ修飾ｍＲＮＡのインビトロ発現
ＨＥＫ２９３細胞を、修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）ＶＥＧＦ−Ａ（配列番号１９にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾）（表１００に示される濃度で、Ｌｉｐｏｆｅａｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）より入手）で複合体化されている）でトランスフェクションした。タンパク質発現をＥＬＩＳＡにより検出し、タンパク質（ｐｇ／ｍｌ）を表１００に示す。
【１１０２】
【表１００】
2019059793.tif 000215
【１１０３】
実施例７０．ＨｅＬａ細胞におけるＧＦＰのインビトロスクリーニング
トランスフェクションの前日、２０，０００個のＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ｎｏ．  ＣＣＬ−２；ヴァージニア州マナサス）を、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ニューヨーク州グランドアイランド）での処理により回収し、１ウェルあたり総量１００μｌのＥＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳおよび１×Ｇｌｕｔａｍａｘを補充）の９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ヴァージニア州マナサス）に播種した。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で、一晩増殖させた。翌日、表１０１に記述される化学的修飾を受けた緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（配列番号１８にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）修飾ｍＲＮＡの３７．５ｎｇまたは７５ｎｇを、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ニューヨーク州グランドアイランド）で最終体積１０μｌに希釈した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ニューヨーク州グランドアイランド）をトランスフェクション試薬として用いて、０．２ｕｌをＯＰＴＩ−ＭＥＭで最終体積１０μｌに希釈した。室温で５分間のインキュベーションの後、両溶液を混合して、室温でさらに１５分インキュベートした。次いで、ＨｅＬａ細胞を含有する１００μｌの細胞培養培地に２０μｌの混合溶液を添加し、室温でインキュベートした。
【１１０４】
１８〜２２時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼを発現している細胞を、メーカーの説明書に従い、１００μｌのＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  （Ｐｒｏｍｅｇａ，  ウィスコンシン州マディソン）で溶解させた。溶解物のアリコートを、乳白色のポリスチレン９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ヴァージニア州マナサス）へと移し、１００ｕｌの完全ルシフェラーゼアッセイ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，ウィスコンシン州マディソン）と混合した。メジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を、各化学物質に対し測定し、表１０１に結果を示す。
【１１０５】
これらの結果より、Ｎ１−メチルシュードウリジンおよび５−メチルシトシンで完全に修飾されたＧＦＰは、他の化学物質と比較して、ＨｅＬａ細胞においてより多くのタンパク質を産生することが示される。さらに、より多量のＧＦＰを細胞に投与すると、ＭＦＩの値も最も高くなった。
【１１０６】
【表１０１】
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【１１０７】
実施例７１．毒性試験
Ａ．試験設計
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝８、メス４、オス４）に、修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾）を、表１０２の投与チャートに概略があるように、注射により投与した。対照群には、製剤緩衝液（Ｆ．Ｂｕｆｆｅｒ）を投与した。７日後、ラットを殺処分した。
【１１０８】
【表１０２】
2019059793.tif 000217
【１１０９】
Ｂ．体重増加および食物摂取
ｍＲＮＡの投与の前、および投与の７日後にラットの体重を計測した。表１０３に、性別で分けて検証した群当たりの平均体重増加と体重増加率を示す。すべての動物は体重が増加し続け、振る舞いも正常であった。分析した各群は、試験の経過中、およそ同じ量の食物を摂取した。
【１１１０】
【表１０３】
2019059793.tif 000218
【１１１１】
Ｃ．電解質
７日後、ラットを殺処分し、電解質を測定するために試料を採取した。各群のカルシウム、重炭酸、カリウム、リン、塩素およびナトリウムのレベルを分析した。結果を表１０４に示す。７日後、ラットの電解質に変化は認められなかった。
【１１１２】
【表１０４】
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【１１１３】
Ｄ．血液学的所見
７日後、ラットを殺処分し、血液学的レベルを測定するために試料を採取した。赤血球（ＲＢＣ）、ヘマトクリット（ＨＧＴ）、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、ヘモグロビン（ＨＧＢ）、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）および平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）を、各群に対し測定した。結果を表１０５に示す。投与の７日後において、血球数または血液凝固因子に変化は無かった。
【１１１４】
【表１０５】
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【１１１５】
Ｅ．白血球
７日後、ラットを殺処分し、白血球数を測定するために試料を採取した。好中球（分葉核好中球の割合）、単球、好塩基球、リンパ球、好酸球および白血球（ＷＢＣ）を各群に対し測定した。結果を表１０６に示す。表１０６において、「ＮＴ」は、検証しなかった子をと意味する。投与の７日後、白血球数の増加は無く、このことから、炎症は無かったことが示唆される。
【１１１６】
【表１０６】
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【１１１７】
Ｆ．血清化学分析
７日後、ラットを殺処分し、血清化学分析を行うために試料を採取した。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびクレアチニンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）を各群に対して測定した。結果を表１０７に示す。
【１１１８】
【表１０７】
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【１１１９】
Ｇ．肝臓タンパク質
７日後、ラットを殺処分し、肝臓タンパク質レベルを測定するために試料を採取した。アルブミン、グロブリンおよび総タンパク質のレベルを各群に対し測定した。結果を表１０８に示す。修飾ｍＲＮＡを投与された７日後の肝酵素または肝臓タンパク質に変化は認められなかった。
【１１２０】
【表１０８】
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【１１２１】
Ｈ．結論
修飾ｍＲＮＡを投与された７日後のラットの分析より、高用量のｍＲＮＡの投与による副作用は発生していない。この分析からは、有効量の３０倍もの高用量でも、安全であると思われる。組織病理学的所見からは、注射部位に最小限の炎症が認められたが、注射部位には注射に伴う変化のみが認められ、用量に関連した問題は示唆されない。さらに、筋酵素に変化は無く、筋肉への損傷は無かったことが示唆される。
実施例７２．修飾ＲＮＡの保管条件
Ａ．有機物質
有機的環境に対するｍＲＮＡの耐容性を評価するために、ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾）を、室温で、エタノール、メタノールまたはジクロロメタンの溶液中、１ｍｇ／ｍｌの濃度で保存した。１時間、６時間、および１日で試料を採取した。試料を水で２００ｎｇ／μｌまで希釈し、ドラフト内で、室温で一晩インキュベートして有機溶媒を蒸発させた。対照試料は、水に溶解したｍＲＮＡで平行して行われた（水対照、有機物質）。バイオアナライザーによる試料の測定では、３つの溶液のそれぞれにおいて、１日間、室温でｍＲＮＡは安定であった。
【１１２２】
Ｂ．水性溶媒
ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾）を、３つの異なる緩衝液および水に添加し、ｍＲＮＡ安定性に対する水性溶媒の影響を評価した。ｍＲＮＡは、クエン酸緩衝液（ｐＨ３、１００ｍＭクエン酸）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液（ｐＨ７．４、６．７ｍリン酸塩および１５４ｍＭ塩化ナトリウム）、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８、１０ｍＭ  トリス−塩酸および１ｍＭエチレンジアミン四酢酸）または水（ｐＨ５．５、注射用水（ＷＦＩ））に、１ｍｇ／ｍｌの濃度で、添加した。１時間、６時間および１日で試料を採取し、水で２００ｎｇ／ｕｌの濃度まで希釈した。対照試料は、水に溶解したｍＲＮＡで平行して行われた（水対照、水性物質）。ＰＢＳ緩衝液、ＴＥ緩衝液、および水でのｍＲＮＡのインキュベーションでは、１日後のｍＲＮＡの完全性には影響はなかった。クエン酸でインキュベートされた試料は、バイオアナライザーにより検出されなかった。
【１１２３】
クエン酸緩衝液をさらに評価する試験を行うため、１０ｍＭのクエン酸および１ｍｇ／ｍｌのルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾）を有する、ｐＨ２、３および４の各クエン酸緩衝液を評価した。ｐＨが２では、沈殿が視覚的に検出できたが、ｐＨが４を下回るとバイオアナライザーによる検出はできなかった。リン酸緩衝液と比較すると、低いｐＨで試料中にｍＲＮＡは検出されなかったが、ｐＨ２のリン酸緩衝液試料中において沈殿が視認できた。
【１１２４】
Ｃ．ｐＨ
ｍＲＮＡの安定性に対するｐＨの影響を調べるために、ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾）を、ｐＨ５．８、６．５または７．２の水性緩衝液中で、室温で保存した。ｍＲＮＡをｐＨ試料に加えてから１時間後、１日後および１週間後で試料を採取した。採取後、試料を、１ｍｇ／ｍｌの濃度でインキュベートし、次いで、凍結およびバイオアナライザーによる分析の前に水で２００ｎｇ／ｕｌまで希釈した。評価した５．８〜７．２のｐＨ範囲における室温での保管では、ｍＲＮＡは１週間後でも安定であった。
【１１２５】
Ｄ．凍結／融解および凍結乾燥
ｍＲＮＡ安定性に対する、凍結／融解サイクルの影響を評価するために、製剤緩衝液に溶解したルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾）を、複数回の凍結／融解サイクルに供した。ｍＲＮＡは、少なくとも１８サイクルの間、安定であることが判明した。
【１１２６】
さらに、ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾）を、３ラウンドの凍結乾燥に供し、ｍＲＮＡの安定性を検証した。ｍＲＮＡを水に添加し、３ラウンドの各凍結乾燥の後で試料を採取した。乾燥したｍＲＮＡを、水で希釈し、１ｍｇ／ｍｌの濃度にした。バイオアナライザーによる分析まで、試料は２００ｎｇ／μｌで凍結保存した。対照試料は、ｍＲＮＡおよび水に製剤で平行して行い、同じ凍結および融解のサイクルを行った。ｍＲＮＡは、２００ｎｇ／ｕｌで、バイオアナライザーによる分析を行った際には、３サイクルの凍結乾燥の後でも安定であることが判明した。
【１１２７】
Ｅ．遠心
ｍＲＮＡの完全性に対する遠心の影響を評価するために、１ｍｇ／ｍｌで水に溶解したルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジン）に、４℃で１０分間、１０ｋＲＰＭ（１３．３ｋ  ｘｇ）を１０サイクル行った。対照試料として、ｍＲＮＡおよび水の試料を、遠心の間、４℃で保存した。２００ｎｇ／ｕｌで、バイオアナライザーによる分析を行った際には、１０サイクルの遠心の後でもｍＲＮＡは安定であることが判明した。
【１１２８】
Ｆ．保管後のインビトロトランスフェクション
トランスフェクションの前日、２０，０００のＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ｎｏ．  ＣＣＬ−２；ヴァージニア州マナサス）を、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ニューヨーク州グランドアイランド）での処理により回収して、１ウェルあたり、総量で１００μｌのＥＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳおよび１×Ｇｌｕｔａｍａｘを補充）の９６ウェルの細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ヴァージニア州マナサス）に播種した。細胞を、一晩、５％ＣＯ２雰囲気下、３７ｏＣで増殖させた。翌日、凍結乾燥、遠心させた製剤由来のルシフェラーゼｍＲＮＡの２５０ｎｇ、ならびに、水性溶媒および有機溶媒試料を最終量１０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ニューヨーク州グランドアイランド）に希釈した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  （ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ニューヨーク州グランドアイランド）をトランスフェクション試薬として用いて、０．２μｌを、１０μｌの最終量のＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で希釈した。室温での５分間のインキュベーションの後、両溶液を混合し、さらに室温で１５分、インキュベートした。次いで、２０μｌの混合溶液を、ＨｅＬａ細胞を含有する細胞培養培地１００ｕｌに添加した。次いで、前述のようにプレートをインキュベートした。
【１１２９】
１８〜２２時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼを発現している細胞を、メーカーの説明書に従い、１００μｌのＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  （Ｐｒｏｍｅｇａ，  ウィスコンシン州マディソン）で溶解させた。溶解物のアリコートを、乳白色のポリスチレン９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ヴァージニア州マナサス）へと移し、１００ｕｌの完全ルシフェラーゼアッセイ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，ウィスコンシン州マディソン）と混合した。試薬無しのプレートのバックグラウンドシグナルは、１ウェルあたり、約２００の相対光単位であった。プレートリーダーは、ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１  （ＢｉｏＴｅｋ，  ヴァーモント州ウィノースキー）であった。
【１１３０】
擬似トランスフェクションの対照（試薬のみをトランスフェクション）、水に溶解したルシフェラーゼｍＲＮＡ対照、および未処置のものも評価した。細胞を回収し、各シグナルに対する平均生体発光（相対光単位、ＲＬＵ）を表１０９に示す。これらの試料のトランスフェクションにより、凍結乾燥、遠心、有機溶媒および水性溶媒（クエン酸緩衝液を除く）は、ルシフェラーゼｍＲＮＡの活性に影響を与えないことが確認された。クエン酸緩衝液は、トランスフェクション後の活性減少を示した。
【１１３１】
【表１０９】
2019059793.tif 000224
【１１３２】
実施例７３．均質化
異なるルシフェラーゼｍＲＮＡ溶液（表１１０に記述。「Ｘ」は、その成分を含有する溶液を指す）（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾）を評価して、異なる溶液の産生率、ｍＲＮＡの完全性をバイオアナライザーにより検証し、ｍＲＮＡのタンパク質発現をインビトロトランスフェクションにより検証した。ｍＲＮＡ溶液は、水、１×ＴＥ緩衝液中で、表１１０に示されるように、４ｍｇ／ｍｌで調製され、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、または乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）（Ｌａｃｔｅｌ、Ｃａｔ＃  Ｂ６０１０−２、固有粘度  ０．５５−０．７５、５０：５０  ＬＡ：ＧＡ）の２００ｍｇ／ｍｌを含有するＤＣＭのいずれかに添加し、０．８ｍｇ／ｍｌの最終ｍＲＮＡ濃度を得た。均質化を必要とする溶液は、３０秒間、スピード５（およそ１９，０００ｒｐｍ）（ＩＫＡ  Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ，  Ｔ１８）で均質化した。水、ジクロロメタンおよび乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）に溶解したｍＲＮＡは、回復不能（ＮＲ）であった。ＮＲ試料を除くすべての試料は、バイオアナライザー（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｅｘｐｅｒｉｏｎ）による測定で、ｍＲＮＡの完全性が維持された。
【１１３３】
トランスフェクションの前日、２０，０００のＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ｎｏ．  ＣＣＬ−２；ヴァージニア州マナサス）を、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ニューヨーク州グランドアイランド）での処理により回収して、１ウェルあたり、総量で１００μｌのＥＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳおよび１×Ｇｌｕｔａｍａｘを補充）の９６ウェルの細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ヴァージニア州マナサス）に播種した。細胞を、一晩、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で増殖させた。翌日、回復可能試料由来のルシフェラーゼｍＲＮＡの２５０ｎｇを、最終量１０ｕｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ニューヨーク州グランドアイランド）に希釈した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  （ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
ニューヨーク州グランドアイランド）をトランスフェクション試薬として用いて、０．２μｌを、最終量１０ｕｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で希釈した。室温での５分間のインキュベーションの後、両溶液を混合し、さらに室温で１５分、インキュベートした。次いで、２０μｌの混合溶液を、ＨｅＬａ細胞を含有する細胞培養培地１００μｌに添加した。次いで、前述のようにプレートをインキュベートした。対照ルシフェラーゼｍＲＮＡ（生理食塩水中で製剤化したルシフェラーゼｍＲＮＡ）（対照）および未処置細胞（未処置）もまた、評価した。細胞を回収し、各シグナルに対する生体発光平均（光子／秒）（生体発光、（ｐ／ｓ））も表１１０に示す。分析した際、回復可能試料はすべて、ルシフェラーゼｍＲＮＡの活性を示した。
【１１３４】
１８〜２２時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼを発現している細胞を、メーカーの説明書に従い、１００μｌのＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  ウィスコンシン州マディソン）で溶解させた。溶解物のアリコートを、乳白色のポリスチレン９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ヴァージニア州マナサス）へと移し、１００ｕｌの完全ルシフェラーゼアッセイ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，ウィスコンシン州マディソン）と混合した。試薬無しのプレートのバックグラウンドシグナルは、１ウェルあたり、約２００の相対光単位であった。プレートリーダーは、ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１  （ＢｉｏＴｅｋ，  ヴァーモント州ウィノースキー）であった。
【１１３５】
細胞を回収し、各シグナルに対する平均生体発光（相対光単位、ＲＬＵ）（生体発光、（ＲＬＵ））を表１１０に示す。回復可能試料はすべて、分析した際、ルシフェラーゼｍＲＮＡの活性を示した。
【１１３６】
【表１１０】
2019059793.tif 000225
【１１３７】
実施例７４．ＴＥ緩衝液および水の評価
ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾）を水またはＴＥ緩衝液中で、表１１１に概略があるように再構成し、次いで、ＰＬＧＡマイクロスフェア中で製剤化した。ＰＬＧＡマイクロスフェアは、当分野で公知の水／油／水の二重乳化法を用いて、ＰＬＧＡ（Ｌａｃｔｅｌ、Ｃａｔ＃  Ｂ６０１０−２、固有粘度０．５５−０．７５、５０：５０  ＬＡ：ＧＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃  ３４８４０６−２５Ｇ、ＭＷ  １３−２３ｋ）ジクロロメタンおよび水を用いて、合成された。簡潔に言うと、水またはＴＥ緩衝液に２〜６ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解したｍＲＮＡの０．２〜０．６ｍｌ（Ｗ１）を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）に１００ｍｇ／ｍｌのＰＬＧＡ濃度で溶解したＰＬＧＡの２ｍｌ（Ｏ１）に加えた。Ｗ１／Ｏ１のエマルションを、スピード５（約１９，０００ｒｐｍ）で３０秒間、均質化した（ＩＫＡ  Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ、Ｔ１８）。次いで、Ｗ１／Ｏ１エマルションを、２５０ｍｌの１％ＰＶＡ（Ｗ２）に加え、スピード５（約１９，０００ｒｐｍ）で、１分間、均質化した。製剤を、３時間、攪拌したままにして、次いで、１００μｍのナイロンメッシュストレイナー（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ，  Ｃａｔ  ＃  ２２−３６３−５４９）を通して大きな凝集塊を除去し、最後に遠心（１０分、９２５０ｒｐｍ、４℃）により洗浄した。上清を棄て、ＰＬＧＡペレットを、５〜１０ｍｌの水に再懸濁し、これを２回繰り返した。洗浄された製剤を液体窒素中で凍結させ、次いで、２〜３日間凍結乾燥させた。凍結乾燥後、約１０ｍｇのＰＬＧＡ  ＭＳを、２ｍｌのエッペンドルフチューブ内で計量し、１ｍｌのＤＣＭを添加することにより脱製剤化させ、２〜６時間、試料を振とうさせた。０．５ｍｌの水を添加し、一晩試料を振とうすることにより、脱製剤化したＰＬＧＡマイクロスフェアからｍＲＮＡを抽出した。水またはＴＥ緩衝液に溶解した非製剤化ルシフェラーゼｍＲＮＡ（脱製剤化対照）を、ＤＣＭに加え、脱製剤化プロセスを経て、トランスフェクションアッセイにおける対照として用いた。
【１１３８】
トランスフェクションの前日、２０，０００のＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ｎｏ．  ＣＣＬ−２；ヴァージニア州マナサス）を、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ニューヨーク州グランドアイランド）での処置により回収して、１ウェルあたり、総量で１００ｕｌのＥＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳおよび１×Ｇｌｕｔａｍａｘを補充）の９６ウェルの細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ヴァージニア州マナサス）に播種した。細胞を、一晩、５％ＣＯ２雰囲気下、３７ｏＣで増殖させた。翌日、脱製剤化ルシフェラーゼｍＲＮＡ試料１００ｎｇを、最終量１０ｕｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ニューヨーク州グランドアイランド）で希釈した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  （ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ニューヨーク州グランドアイランド）をトランスフェクション試薬として用いて、０．２μｌを、１０ｕｌの最終量のＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で希釈した。室温での５分間のインキュベーションの後、両溶液を混合し、さらに室温で１５分、インキュベートした。次いで、２０μｌの混合溶液を、ＨｅＬａ細胞を含有する細胞培養培地１００μｌに添加した。次いで、前述のようにプレートをインキュベートした。
【１１３９】
１８〜２２時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼを発現している細胞を、メーカーの説明書に従い、１００ｕｌのＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  ウィスコンシン州マディソン）で溶解させた。溶解物のアリコートを、乳白色のポリスチレン９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ヴァージニア州マナサス）へと移し、１００μｌの完全ルシフェラーゼアッセイ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，ウィスコンシン州マディソン）と混合した。試薬無しのプレートのバックグラウンドシグナルは、１ウェルあたり、約２００の相対光単位であった。プレートリーダーは、ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１  （ＢｉｏＴｅｋ，  ヴァーモント州ウィノースキー）であった。各製剤由来のルシフェラーゼｍＲＮＡの活性を測定するために、各製剤に対する相対光単位（ＲＬＵ）を、適切なｍＲＮＡ脱製剤化対照（水またはＴＥ緩衝液に溶解したｍＲＮＡ）のＲＬＵで割った。表１１１に、ルシフェラーゼｍＲＮＡの活性を示す。ＰＬＧＡマイクロスフェア製剤中のルシフェラーゼ製剤（Ｆｏｒｍ．）の活性は、水と比較して、ＴＥ緩衝液中で製剤化することによりかなり改善された。
【１１４０】
【表１１１】
2019059793.tif 000226
【１１４１】
実施例７５．ｍＲＮＡに対する化学的修飾
トランスフェクションの前日、２０，０００のＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ｎｏ．  ＣＣＬ−２；ヴァージニア州マナサス）を、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ニューヨーク州グランドアイランド）での処理により回収して、１ウェルあたり、総量で１００μｌのＥＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳおよび１×Ｇｌｕｔａｍａｘを補充）の９６ウェルの細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ヴァージニア州マナサス）に播種した。細胞を、一晩、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で増殖させた。翌日、表１１２に記述される化学的修飾を受けたルシフェラーゼ修飾ＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）の８３ｎｇを、最終量１０ｕｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ニューヨーク州グランドアイランド）で希釈した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  （ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ニューヨーク州グランドアイランド）をトランスフェクション試薬として用いて、０．２μｌを、最終量１０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で希釈した。室温での５分間のインキュベーションの後、両溶液を混合し、さらに室温で１５分、インキュベートした。次いで、２０μｌの混合溶液を、ＨｅＬａ細胞を含有する細胞培養培地１００μｌに添加し、室温でインキュベートした。
【１１４２】
１８〜２２時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼを発現している細胞を、メーカーの説明書に従い、１００ｕｌのＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  ウィスコンシン州マディソン）で溶解させた。溶解物のアリコートを、乳白色のポリスチレン９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ヴァージニア州マナサス）へと移し、１００ｕｌの完全ルシフェラーゼアッセイ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，ウィスコンシン州マディソン）と混合した。溶解物量は、１ウェルあたり２ｍｉｏ相対光単位（ＲＬＵ）を超えない量まで調整または希釈され、最も強いシグナルを生み出す試料を検出し、検証された各化学物質に対するＲＬＵを表１１２に示す。プレートリーダーは、ＢｉｏＴｅｋ
Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１  （ＢｉｏＴｅｋ，  ヴァーモント州ウィノースキー）であった。試薬無しのプレートのバックグラウンドシグナルは、１ウェルあたり、約２００の相対光単位であった。
【１１４３】
【表１１２】
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【１１４４】
実施例７６．修飾ｍＲＮＡの筋肉内投与および皮下投与
５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼ修飾ＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）（５ｍｃ／ｐＵ）、５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡ（５ｍＣ／Ｎ１ｍｐＵ）、シュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡ（ｐＵ）、Ｎ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡ（Ｎ１ｍｐＵ）または、５−メチルシトシンで置換されたシトシンが２５％、および２−チオウリジンで置換されたウリジンが２５％で修飾されたルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡ（５ｍＣ／ｓ２Ｕ）を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で製剤化し、２．５ｍｇ／ｋｇの用量で、Ｂａｌｂ−Ｃマウスに筋肉内投与または皮下投与した。筋肉内送達に対しては、２時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間および１４４時間でマウスを撮像し、皮下送達に対しては、２時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、および１２０時間で撮像した。撮像の２０分前に、Ｄ−ルシフェリン溶液を１５０ｍｇ／ｋｇでマウスに腹腔内注射した。次いで、動物を麻酔し、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で画像撮影を行った。生体発光は、マウス全体の総流量（光子／秒）として測定された。筋肉内投与に対する平均総流量（光子／秒）を表１１３に示し、皮下投与に対する平均総流量（光子／秒）を表１１４に示す。バックグラウンドシグナルは、３．７９Ｅ＋０５（ｐ／ｓ）であった。筋肉内投与のピーク発現は、全ての化学物質に対して２４〜４８時間の間で見られ、発現は１４４時間でもまだ検出された。皮下送達に対しては、ピーク発現は２〜８時間の間に見られ、発現は７２時間でも検出された。
【１１４５】
【表１１３】
2019059793.tif 000228
【１１４６】
【表１１４】
2019059793.tif 000229
【１１４７】
実施例７７．浸透圧ポンプ試験
移植の前に、浸透圧ポンプ（ＡＬＺＥＴ（登録商標）Ｏｓｍｏｔｉｃ  Ｐｕｍｐ  ２００１Ｄ，  ＤＵＲＥＣＴ  Ｃｏｒｐ．  Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，  ＣＡ）に０．２ｍｌの１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）をロードし（ＰＢＳをロードしたポンプ）、または、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に１ｍｇ／ｍｌで溶解したルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）を０．２ｍｌ、ロードして（ルシフェラーゼをロードしたポンプ）、一晩、３７℃で、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でインキュベートする。
【１１４８】
Ｂａｌｂ−Ｃマウス（ｎ＝３）に、ＰＢＳをロードしたポンプまたはルシフェラーゼをロードしたポンプのいずれかを皮下移植し、２時間、８時間および２４時間で撮像する。対照として、ＰＢＳをロードしたポンプを皮下に移植し、そのマウスに１×ＰＢＳに溶解したルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡを皮下注射（ＰＢＳをロードしたポンプ；ＳＣルシフェラーゼ）、または、浸透圧ポンプを移植せず、そのマウスに１×ＰＢＳに溶解したルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡを皮下注射（ＳＣルシフェラーゼ）する。ルシフェラーゼ製剤の概要を表１１５に示す。
【１１４９】
【表１１５】
2019059793.tif 000230
【１１５０】
実施例７８．外部浸透圧ポンプ試験
外部浸透圧ポンプ（ＡＬＺＥＴ（登録商標）Ｏｓｍｏｔｉｃ  Ｐｕｍｐ  ２００１Ｄ，
ＤＵＲＥＣＴ  Ｃｏｒｐ．  Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，  ＣＡ）に、０．２ｍｌの１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）をロードし（ＰＢＳをロードしたポンプ）、または、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に１ｍｇ／ｍｌで溶解したルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）を０．２ｍｌ、ロードし（ルシフェラーゼをロードしたポンプ）、一晩、３７℃で、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でインキュベートする。
【１１５１】
外部のＰＢＳをロードしたポンプまたはルシフェラーゼをロードしたポンプに連結したカテーテルを用いて、Ｂａｌｂ−Ｃマウス（ｎ＝３）に製剤を投与する。２時間、８時間、および２４時間でマウスを撮像する。対照として、外部のＰＢＳをロードしたポンプを用いて、マウスに１×ＰＢＳに溶解したルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡの皮下投与（ＰＢＳをロードしたポンプ；ＳＣルシフェラーゼ）を、または、外部ポンプを用いずに、マウスに１×ＰＢＳに溶解したルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡの皮下投与のみ（ＳＣルシフェラーゼ）を行う。撮像の２０分前に、Ｄ−ルシフェリンを１５０ｍｇ／ｋｇでマウスに腹腔内投与する。次いで、動物を麻酔し、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で画像撮影を行う。生体発光を、マウス全体の総流量（光子／秒）として測定する。ルシフェラーゼ製剤の概要および平均総流量（光子／秒）を表１１６に示す。
【１１５２】
【表１１６】
2019059793.tif 000231
【１１５３】
実施例７９．フィブリンシーラント試験
たとえばＴｉｓｓｅｅｌ（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐ．，  Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）等のフィブリンシーラントは、二連型シリンジ中のフィブリノーゲンおよびトロンビンから構成される。混合すると、フィブリノーゲンはフィブリンに転換され、約１０〜３０秒でフィブリン塊を形成する。この塊は、身体の自然凝固メカニズムを模すことができる。さらに、フィブリンヒドロゲルは３次元構造であり、徐放性の放出送達に用いることが出来る可能性がある。現在、フィブリンシーラントは、たとえば縫合、結紮、焼灼等の従来的な外科的手技に代わるための、止血およびシーリングへの適用が承認されている。
【１１５４】
トロンビンおよびフィブリノーゲン成分を、二連型シリンジ内に別々負荷した。Ｂａｌｂ−Ｃマウス（ｎ＝３）に、５０μｌのフィブリノーゲン、５０μｌのトロンビンを皮下注射し、また、同じ部位に修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）を注射し（Ｔｉｓｓｅｅｌ＋ルシフェラーゼ）、または、５０μｌのフィブリノーゲンおよび５０μｌのトロンビンを注射し（Ｔｉｓｓｅｅｌ）、または、修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡを注射（ルシフェラーゼ）した。フィブリノーゲンおよびトロンビンの注射は、二連型のシリンジを用いて同時に行った。ルシフェラーゼの皮下注射は、フィブリノーゲン／トロンビン注射の１５分後に行い、フィブリンヒドロゲルを重合させた（Ｔｉｓｓｅｅｌ＋ルシフェラーゼ群）。未処置マウスの対照群もまた評価を行った。５時間および２４時間でマウスを撮像した。撮像の２０分前に、Ｄ−ルシフェリン溶液を１５０ｍｇ／ｋｇでマウスに腹腔内注射した。次いで、動物を麻酔し、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で画像撮影を行った。生体発光を、マウス全体の総流量（光子／秒）として測定した。ルシフェラーゼ製剤の概要および平均総流量（光子／秒）を表１１７に、平均総流量（光子／秒）を表１１８に示す。フィブリンシーラントは、画像撮影およびルシフェラーゼ注射に干渉しないことが判明し、Ｔｉｓｓｅｅｌはルシフェラーゼ発現を示した。
【１１５５】
【表１１７】
2019059793.tif 000232
【１１５６】
【表１１８】
2019059793.tif 000233
【１１５７】
実施例８０．フィブリン含有ｍＲＮＡシーラント試験
Ａ．修飾ｍＲＮＡおよび塩化カルシウム
再構成の前に、５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾された、または、Ｎ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）を、塩化カルシウムに加える。次いで、塩化カルシウムを用いてトロンビンを再構成する。フィブリノーゲンは、メーカーの説明書に従い、線維素溶解阻害剤で再構成する。再構成されたトロンビン（修飾ｍＲＮＡを含有）およびフィブリノーゲンを、二連型シリンジに負荷する。５０μｌのフィブリノーゲンおよび５０μｌのトロンビン（修飾ｍＲＮＡ含有）をマウスに皮下注射するか、または、５０μｌのＰＢＳ（等量の修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡを含有）をマウスに注射する。未処置マウスの対照群もまた、評価する。前もって決定されていた間隔でマウスを撮像し、平均総流量（光子／秒）を測定する。
【１１５８】
Ｂ．脂質ナノ粒子製剤化修飾ｍＲＮＡおよび塩化カルシウム
再構成の前に、５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾された、または、Ｎ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）を、脂質ナノ粒子中で製剤化し、塩化カルシウムに加える。次いで、塩化カルシウムを用いてトロンビンを再構成する。フィブリノーゲンは、メーカーの説明書に従い、線維素溶解阻害剤で再構成する。再構成されたトロンビン（修飾ｍＲＮＡを含有）およびフィブリノーゲンを、二連型シリンジに負荷する。５０μｌのフィブリノーゲンおよび５０μｌのトロンビン（修飾ｍＲＮＡ含有）をマウスに皮下注射するか、または、５０μｌのＰＢＳ（等量の修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡを含有）をマウスに注射する。未処置マウスの対照群もまた、評価する。前もって決定されていた間隔でマウスを撮像し、平均総流量（光子／秒）を測定する。
【１１５９】
Ｃ．修飾ｍＲＮＡおよびフィブリノーゲン
再構成の前に、５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾された、または、Ｎ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）を、線維素溶解阻害剤に加える。次いで、線維素溶解阻害剤溶液を用いてフィブリノーゲンを再構成する。トロンビンは、メーカーの説明書に従い、塩化カルシウム溶液で再構成する。再構成されたフィブリノーゲン（修飾ｍＲＮＡを含有）およびトロンビンを、二連型シリンジに負荷する。５０μｌのトロンビンおよび５０μｌのフィブリノーゲン（修飾ｍＲＮＡ含有）をマウスに皮下注射するか、または、５０μｌのＰＢＳ（等量の修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡを含有）をマウスに注射した。未処置マウスの対照群もまた、評価する。前もって決定されていた間隔でマウスを撮像し、平均総流量（光子／秒）を測定する。
【１１６０】
Ｄ．脂質ナノ粒子製剤化修飾ｍＲＮＡおよびフィブリノーゲン
再構成の前に、５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾された、または、Ｎ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）を、脂質ナノ粒子中で製剤化し、線維素溶解阻害剤に加える。次いで、線維素溶解阻害剤溶液を用いてフィブリノーゲンを再構成する。トロンビンは、メーカーの説明書に従い、塩化カルシウム溶液で再構成する。再構成されたフィブリノーゲン（修飾ｍＲＮＡを含有）およびトロンビンを、二連型シリンジに負荷する。５０μｌのトロンビンおよび５０μｌのフィブリノーゲン（修飾ｍＲＮＡ含有）をマウスに皮下注射するか、または、５０μｌのＰＢＳ（等量の修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡを含有）をマウスに注射した。未処置マウスの対照群もまた、評価する。前もって決定されていた間隔でマウスを撮像し、平均総流量（光子／秒）を測定する。
【１１６１】
Ｅ．修飾ｍＲＮＡおよびトロンビン
再構成の前に、５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾された、または、Ｎ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）を、再構成されたトロンビン（メーカーの説明書に従い、塩化カルシウムでトロンビンが再構成された）に加える。次いで、線維素溶解阻害剤溶液を用いて、メーカーの説明書に従い、フィブリノーゲンを再構成する。再構成されたフィブリノーゲンおよびトロンビン（修飾ｍＲＮＡを含有）を、二連型シリンジに負荷する。５０μｌのトロンビン（修飾ｍＲＮＡ含有）および５０μｌのフィブリノーゲンをマウスに皮下注射するか、または、５０μｌのＰＢＳ（等量の修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡを含有）をマウスに注射した。未処置マウスの対照群もまた、評価する。前もって決定されていた間隔でマウスを撮像し、平均総流量（光子／秒）を測定する。
【１１６２】
Ｆ．脂質ナノ粒子製剤化修飾ｍＲＮＡおよびトロンビン
再構成の前に、５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾された、または、Ｎ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）を、脂質ナノ粒子中で製剤化し、再構成されたトロンビン（メーカーの説明書に従い、塩化カルシウムで再構成された）に加える。次いで、線維素溶解阻害剤溶液を、メーカーの説明書に従い用いて、フィブリノーゲンを再構成する。再構成されたフィブリノーゲンおよびトロンビン（修飾ｍＲＮＡを含有）を、二連型シリンジに負荷する。５０μｌのトロンビン（修飾ｍＲＮＡ含有）および５０μｌのフィブリノーゲンをマウスに皮下注射するか、または、５０μｌのＰＢＳ（等量の修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡを含有）をマウスに注射した。未処置マウスの対照群もまた、評価する。前もって決定されていた間隔でマウスを撮像し、平均総流量（光子／秒）を測定する。
実施例８１．５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジン修飾ｍＲＮＡのカチオン性脂質製剤
５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）を、表１１９に記述されるカチオン性脂質で製剤化した。その製剤を、０．０５ｍｇ／ｋｇで、Ｂａｌｂ−Ｃマウスに、静脈内（Ｉ．Ｖ．）、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）、または皮下（Ｓ．Ｃ．）投与した。
【１１６３】
【表１１９】
2019059793.tif 000234
【１１６４】
撮像の２０分前に、Ｄ−ルシフェリン溶液を１５０ｍｇ／ｋｇでマウスに腹腔内注射した。次いで、動物を麻酔し、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で画像撮影を行った。生体発光は、マウス全体の総流量（光子／秒）として測定した。投与の２時間、８時間、および２４時間後でマウスを撮像し、平均総流量（光子／秒）を、各投与経路およびカチオン性脂質製剤に対して測定した。バックグラウンドの流量は約４．１７Ｅ＋０５  ｐ／ｓであった。画像撮影の結果を表１２０に示す。表１２０において、「ＮＴ」は検証しなかったことを意味する。
【１１６５】
【表１２０】
2019059793.tif 000235
【１１６６】
実施例８２．脂質ナノ粒子静脈内試験
ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された）を、表１２１に記述されるように、５０％のＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡまたは、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ならびに、３８．５％のコレステロール、１０％のＤＳＰＣ、および１．５％のＰＥＧを含有する脂質ナノ粒子中で製剤化した。その製剤を、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇまたは０．０００５ｍｇ／ｋｇの用量で、Ｂａｌｂ−Ｃマウスに静脈内（Ｉ．Ｖ．）投与した。撮像の２０分前に、Ｄ−ルシフェリン溶液を１５０ｍｇ／ｋｇでマウスに腹腔内注射した。次いで、動物を麻酔し、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で画像撮影を行った。生体発光を、マウス全体の総流量（光子／秒）として測定した。
【１１６７】
【表１２１】
2019059793.tif 000236
【１１６８】
ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡに対しては、投与の２時間、８時間、２４時間、７２時間、９６時間、および１６８時間後にマウスを撮像し、各投与経路およびカチオン性脂質製剤に対して平均総流量（光子／秒）を測定した。バックグラウンド流量は約３．６６Ｅ＋０５ｐ／ｓであった。画像撮影の結果を表１２２に示す。器官を８時間目に撮像し、平均総流量（光子／秒）を、肝臓、脾臓、肺および腎臓に対して測定した。各器官に対する対照もまた分析された。その結果を表１２３に示す。すべての投与レベルに対するピークシグナルは、投与の８時間後であった。また、様々な器官（肝臓、脾臓、肺および腎臓）への配分は、ＬＮＰ用量の増加または減少により制御できる可能性がある。
【１１６９】
【表１２２】
2019059793.tif 000237
【１１７０】
【表１２３】
2019059793.tif 000238
【１１７１】
ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡに対しては、投与の２時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、および１４４時間後にマウスを撮像し、各投与経路およびカチオン性脂質製剤に対して平均総流量（光子／秒）を測定した。バックグラウンド流量は約４．５１Ｅ＋０５ｐ／ｓであった。画像撮影の結果を表１２４に示す。器官を８時間目に撮像し、平均総流量（光子／秒）を、肝臓、脾臓、肺および腎臓に対して測定された。各器官に対する対照もまた分析された。その結果を表１２５に示す。すべての投与レベルに対するピークシグナルは、投与の８時間後であった。また、様々な器官（肝臓、脾臓、肺および腎臓）への配分は、ＬＮＰ用量の増加または減少により制御できる可能性がある。
【１１７２】
【表１２４】
2019059793.tif 000239
【１１７３】
【表１２５】
2019059793.tif 000240
【１１７４】
実施例８３．脂質ナノ粒子皮下試験
ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された）を、表１２６に記述されるように、５０％のＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ならびに、３８．５％のコレステロール、１０％のＤＳＰＣ、および１．５％のＰＥＧを含有する脂質ナノ粒子中で製剤化した。その製剤を、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、または０．００５ｍｇ／ｋｇの用量で、Ｂａｌｂ−Ｃマウスに皮下（Ｓ．Ｃ．）投与した。
【１１７５】
【表１２６】
2019059793.tif 000241
【１１７６】
撮像の２０分前に、Ｄ−ルシフェリン溶液を１５０ｍｇ／ｋｇでマウスに腹腔内注射した。次いで、動物を麻酔し、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で画像撮影を行った。生体発光は、マウス全体の総流量（光子／秒）として測定した。投与の２時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、および１４４時間後にマウスを撮像し、各投与経路およびカチオン性脂質製剤に対して平均総流量（光子／秒）を測定した。検出の低限値は約３Ｅ＋０５ｐ／ｓであった。画像撮影の結果を表１２７に示す。器官を８時目に撮像し、平均総流量（光子／秒）を、肝臓、脾臓、肺および腎臓に対して測定した。各器官に対する対照もまた分析された。その結果を表１２８に示す。すべての投与レベルに対するピークシグナルは、投与の８時間後であった。また、様々な器官（肝臓、脾臓、肺および腎臓）への配分は、ＬＮＰ用量の増加または減少により制御できる可能性がある。高用量では、ＬＮＰ製剤は皮下注射部位の外側へと移動する（高レベルのルシフェラーゼ発現が肝臓、脾臓、肺および腎臓で検出される）。
【１１７７】
【表１２７】
2019059793.tif 000242
【１１７８】
【表１２８】
2019059793.tif 000243
【１１７９】
実施例８４．カチオン性脂質ナノ粒子皮下試験
ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された）を、５０％のＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、３８．５％のコレステロール、１０％のＤＳＰＣ、および１．５％のＰＥＧを含有する脂質ナノ粒子中で製剤化する。その製剤を、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、または０．００５ｍｇ／ｋｇの用量で、Ｂａｌｂ−Ｃマウスに皮下（Ｓ．Ｃ．）投与する。
【１１８０】
投与の２時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、および１４４時間後にマウスを撮像し、各投与経路およびカチオン性脂質製剤に対して平均総流量（光子／秒）を測定した。器官を８時間目に撮像し、平均総流量（光子／秒）を、肝臓、脾臓、肺および腎臓に対して測定する。各器官に対する対照もまた分析される。
実施例８５．リポプレックス試験
５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）（５ｍｃ／ｐＵ）、５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡ（５ｍＣ／Ｎ１ｍｐＵ）、または、５−メチルシトシンで置換されたシトシンが２５％、および２−チオウリジンで置換されたウリジンが２５％で修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡ（５ｍＣ／ｓ２Ｕ）を、リポプレックス化した。その製剤を、０．１０ｍｇ／ｋｇの用量で、Ｂａｌｂ−Ｃマウスに静脈内（Ｉ．Ｖ．）、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）または皮下（Ｉ．Ｃ．）投与した。
【１１８１】
撮像の２０分前に、Ｄ−ルシフェリン溶液を１５０ｍｇ／ｋｇでマウスに腹腔内注射した。次いで、動物を麻酔し、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で画像撮影を行った。生体発光は、マウス全体の総流量（光子／秒）として測定した。投与の８時間、２４時間、および４８時間後でマウスを撮像し、平均総流量（光子／秒）を、各投与経路および化学的修飾に対して測定した。バックグラウンドシグナルは約３．９１Ｅ＋０５ｐ／ｓであった。画像撮影の結果を表１２９に示す。器官を６時間で撮像し、平均総流量（光子／秒）を、肝臓、脾臓、肺および腎臓に対して測定された。各器官に対する対照もまた分析された。結果を表１３０に示す。
【１１８２】
【表１２９】
2019059793.tif 000244
【１１８３】
【表１３０】
2019059793.tif 000245
【１１８４】
実施例８６．修飾ｍＲＮＡのカチオン性脂質製剤
２５％のシトシンが５−メチルシトシンで置換され、２５％のウリジンが２−チオウリジンで置換され、修飾された、ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）（５ｍＣ／ｓ２Ｕ）を、表１３１に記述されるカチオン性脂質中で製剤化した。その製剤を、０．０５ｍｇ／ｋｇの用量で、Ｂａｌｂ−Ｃマウスに静脈内（Ｉ．Ｖ．）、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）または皮下（Ｉ．Ｃ．）投与した。
【１１８５】
【表１３１】
2019059793.tif 000246
【１１８６】
撮像の２０分前に、Ｄ−ルシフェリン溶液を１５０ｍｇ／ｋｇでマウスに腹腔内注射した。次いで、動物を麻酔し、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で画像撮影を行った。生体発光を、マウス全体の総流量（光子／秒）として測定した。投与の２時間、８時間および２４時間後でマウスを撮像し、平均総流量（光子／秒）を、各投与経路およびカチオン性脂質製剤に対して測定した。バックグラウンド流量は約３．３１Ｅ＋０５  ｐ／ｓであった。画像撮影の結果を表１３２に示す。表１３２において、「ＮＴ」は、検証しなかったことを意味する。未処置マウスは、２時間で３．１４Ｅ＋０５、８時間で３．３３Ｅ＋０５、および２４時間で３．４６Ｅ＋０５の平均流量を示した。３つすべての検証投与経路に対するピーク発現は、８時間で見られた。ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡおよびＤＯＤＭＡが評価した全ての投与経路に対して示した発現よりも、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡは、より高い発現を示している。
【１１８７】
【表１３２】
2019059793.tif 000247
【１１８８】
実施例８７．５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジン修飾ｍＲＮＡの製剤化
５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で製剤化した。その製剤を、２．５ｍｇ／ｋｇの用量で、Ｂａｌｂ−Ｃマウスに筋肉内（Ｉ．Ｍ．）または皮下（Ｉ．Ｃ．）投与した。
【１１８９】
撮像の２０分前に、Ｄ−ルシフェリン溶液を１５０ｍｇ／ｋｇでマウスに腹腔内注射した。次いで、動物を麻酔し、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で画像撮影を行った。生体発光を、マウス全体の総流量（光子／秒）として測定した。投与の５分、３０分、６０分および１２０分後でマウスを撮像し、平均総流量（光子／秒）を、各投与経路およびカチオン性脂質製剤に対して測定した。バックグラウンド流量は約３．７８Ｅ＋０５  ｐ／ｓであった。画像撮影の結果を表１３３に示す。ルシフェラーゼの発現は、両方の送達経路で、３０分ですでに認められていた。皮下投与のピーク発現は３０〜６０分の間である。筋肉内発現は、１２０分でまだ増加していた。
【１１９０】
【表１３３】
2019059793.tif 000248
【１１９１】
実施例８８．  化学的修飾ｍＲＮＡの筋肉内投与および皮下投与
Ｎ４−アセチルシチジンで完全に修飾されたルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）、５−メトキシウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡ、Ｎ４−アセチルシチジンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡ、または、５−メチルシトシンおよび５−メトキシウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で製剤化し、２．５ｍｇ／ｋｇの用量で、Ｂａｌｂ−Ｃマウスに筋肉内または皮下投与した。撮像の２０分前に、Ｄ−ルシフェリン溶液を１５０ｍｇ／ｋｇでマウスに腹腔内注射した。次いで、動物を麻酔し、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で画像撮影を行った。生体発光を、マウス全体の総流量（光子／秒）として測定した。２時間、８時間および２４時間でマウスを撮像した。筋肉内投与に対する平均総流量（光子／秒）を表１３４に示し、皮下投与に対する平均総流量（光子／秒）を表１３５に示す。バックグラウンドシグナルは約３．８４Ｅ＋０５（ｐ／ｓ）であった。筋肉内投与に対するピーク発現は、全ての化学物質に対して２４〜４８時間の間で見られ、１２０時間でもまだ発現が検出された。皮下送達に対しては、ピーク発現は２〜８時間で見られ、発現は７２時間でも検出された。
【１１９２】
【表１３４】
2019059793.tif 000249
【１１９３】
【表１３５】
2019059793.tif 000250
【１１９４】
実施例８９．インビボ試験
少なくとも１つの化学的修飾を含有するルシフェラーゼ修飾ｍＲＮＡを、シリンジポンプ法を用いて脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化し、その粒子サイズ、ゼータ電位、および封入の特性を明らかにする。
【１１９５】
表１３６に示すように、ルシフェラーゼＬＮＰ製剤を、Ｂａｌｂ−Ｃマウスに筋肉内（Ｉ．Ｍ．）、静脈内（Ｉ．Ｖ．）または皮下（Ｉ．Ｃ．）に投与する。ＰＢＳ中で製剤化される対照ルシフェラーゼ修飾ＲＮＡは、マウスに静脈内投与される。
【１１９６】
【表１３６】
2019059793.tif 000251
【１１９７】
２、８、２４、４８、１２０および１９２時間でマウスを撮像し、生体発光を測定する（マウス全体の総流量（光子／秒）として測定）。８時間または１９２時間で、肝臓、脾臓、腎臓ならびに、皮下投与および筋肉内投与の注射部位を撮像し、生体発光を測定する。
実施例９０．化学的修飾ｍＲＮＡのカチオン性脂質製剤試験
５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）（５ｍＣ／ｐＵ）、またはシュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡ（ｐＵ）、またはＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｎ１ｍｐＵ）を、表１３７に記述されるカチオン性脂質中で製剤化した。その製剤を、０．０５ｍｇ／ｋｇの用量で、Ｂａｌｂ−Ｃマウスに静脈内（Ｉ．Ｖ．）、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）または皮下（Ｉ．Ｃ．）投与した。
【１１９８】
【表１３７】
2019059793.tif 000252
【１１９９】
撮像の２０分前に、Ｄ−ルシフェリン溶液を１５０ｍｇ／ｋｇでマウスに腹腔内注射した。次いで、動物を麻酔し、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で画像撮影を行った。生体発光を、マウス全体の総流量（光子／秒）として測定した。投与の２時間、８時間および２４時間後でマウスを撮像し、平均総流量（光子／秒）を、各投与経路およびカチオン性脂質製剤に対して測定した。バックグラウンド流量は約４．１１Ｅ＋０５  ｐ／ｓであった。画像撮影の結果を表１３８に示す。３つすべての検証経路に対するピーク発現は８時間で見られた。
【１２００】
【表１３８】
2019059793.tif 000253
【１２０１】
実施例９１．化学的修飾ｍＲＮＡの試験
Ｎ４−アセチルシチジンで完全に修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）（Ｎ４−ａｃｅｔｙｌ）、５−メトキシウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡ（５ｍｅｔｈ）、Ｎ４−アセチルシチジンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｎ４−ａｃｅｒｙｌ／Ｎ１ｍｐＵ）、または、５−メチルシトシンおよび５−メトキシウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡ（５ｍＣ／５−ｍｅｔｈ）を、表１３９に記述されるようにＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ中で製剤化した。その製剤を、０．０５ｍｇ／ｋｇの用量で、Ｂａｌｂ−Ｃマウスに静脈内（Ｉ．Ｖ．）、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）または皮下（Ｉ．Ｃ．）投与した。
【１２０２】
【表１３９】
2019059793.tif 000254
【１２０３】
撮像の２０分前に、Ｄ−ルシフェリン溶液を１５０ｍｇ／ｋｇでマウスに腹腔内注射した。次いで、動物を麻酔し、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で画像撮影を行った。生体発光を、マウス全体の総流量（光子／秒）として測定した。投与の２時間、６時間および２４時間後でマウスを撮像し、平均総流量（光子／秒）を、各投与経路およびカチオン性脂質製剤に対して測定した。バックグラウンド流量は約２．７０＋０５ｐ／ｓであった。画像撮影の結果を表１４０に示す。
【１２０４】
【表１４０】
2019059793.tif 000255
【１２０５】
実施例９２．ＰＬＧＡマイクロスフェア
Ａ．ＰＬＧＡマイクロスフェアの合成
ポリラクチックグリコール酸（ＰＬＧＡ）マイクロスフェアを、当分野で公知の水／油／水の二重乳化法を用いて、ＰＬＧＡ−エステルキャップ（Ｌａｃｔｅｌ、Ｃａｔ＃  Ｂ６０１０−２、固有粘度０．５５−０．７５、５０：５０  ＬＡ：ＧＡ）、またはＰＬＧＡ−酸キャップ（Ｌａｃｔｅｌ、Ｃａｔ＃Ｂ６０１３−２、固有粘度０．５５−０．７５、５０：５０  ＬＡ：ＧＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃
３４８４０６−２５Ｇ、ＭＷ  １３−２３ｋ）ジクロロメタンおよび水を用いて、合成した。簡潔に言うと、水に４ｍｇ／ｍｌで溶解したｍＲＮＡ（Ｗ１）の０．４ｍｌを、ジクロロメタン（ＤＣＭ）に５０〜２００ｍｇ／ｍｌのＰＬＧＡの濃度範囲で溶解したＰＬＧＡ（Ｏ１）の２ｍｌに添加した。Ｗ１／Ｏ１のエマルションを、スピード４（約１５，０００ｒｐｍ）で３０秒間、均質化した（ＩＫＡ  Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ、Ｔ１８）。次いで、Ｗ１／Ｏ１エマルションに、２５０ｍｌの１％ＰＶＡ（Ｗ２）を加え、スピード５（約１９，０００ｒｐｍ）で、１分間、均質化した。製剤を、３時間、攪拌させ、次いで、１００μｍのナイロンメッシュストレイナー（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ，  Ｃａｔ  ＃  ２２−３６３−５４９）を通して、大きな凝集塊を除去し、最後に、遠心（１０分間、９，２５０ｒｐｍ、４℃）により洗浄した。上清を棄て、ＰＬＧＡペレットを、５〜１０ｍｌの水に再懸濁し、これを２回繰り返した。洗浄された製剤を、液体窒素中で凍結させ、次いで、２〜３日間、凍結乾燥させた。
【１２０６】
Ｂ．均質化スピードまたはＰＬＧＡ濃度の減少
ＰＬＧＡルシフェラーゼマイクロスフェア（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾）を、上述の条件を用いて、エステルキャップされたＰＬＧＡで作製した。水での洗浄および再懸濁の後、１００〜２００μｌのＰＬＧＡマイクロスフェア試料を用いて、レーザー回析（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ２０００）により製剤の粒子サイズを計測した。２００ｍｇ／ｍｌのＰＬＧＡ濃度で、第一のエマルションを第二のエマルションに添加する間の均質化スピードを下げることにより作製されたマイクロスフェアの粒子サイズを、表１４１に示し、第一のエマルションを第二のエマルションに添加する間の均質化のスピードは５で、ジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解したＰＬＧＡの濃度を下げることにより作製されたマイクロスフェアの粒子サイズを表１４２に示す。
【１２０７】
【表１４１】
2019059793.tif 000256
【１２０８】
【表１４２】
2019059793.tif 000257
【１２０９】
酸またはエステルキャップ化された、固有粘度０．５５〜０．７５を有するＰＬＧＡを用いて、表１４３に示されるマイクロスフェアを作製した。マイクロスフェアの粒子サイズおよび放出速度もまた測定し、表１４３にその結果を示す。
【１２１０】
【表１４３】
2019059793.tif 000258
【１２１１】
Ｃ．ＰＬＧＡマイクロスフェア中に封入された修飾ｍＲＮＡの放出試験
ルシフェラーゼ修飾ＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾）で製剤化されたＰＬＧＡマイクロスフェアを脱製剤化し、抽出された修飾ＲＮＡの完全性を、自動化電気泳動（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｅｘｐｅｒｉｏｎ）により測定した。凍結乾燥の後、約１０ｍｇのＰＬＧＡ  ＭＳを２ｍｌのエッペンドルフチューブ内に量り入れ、１ｍｌのＤＣＭを添加し、２〜６時間、試料を振とうさせることにより脱製剤化した。０．５ｍｌの水を添加し、一晩、試料を振とうさせることにより脱製剤化ＰＬＧＡマイクロスフェアからｍＲＮＡを抽出した。水に溶解した非製剤化ルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｄｅｆｏｒｍ対照）を、ＤＣＭに注ぎ、脱製剤化プロセスを経て、対照として用いた。抽出された修飾ｍＲＮＡを、非製剤化修飾ｍＲＮＡおよび脱製剤化対照に対して比較し、封入修飾ｍＲＮＡの完全性を検証した。脱製剤化対照（Ｄｅｆｏｒｍ対照）および非製剤化対照（Ｕｎｆｏｒｍ対照）と比較して、修飾ＲＮＡの大部分は、バッチＩＤ  Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅに対して損なわれていなかった。
【１２１２】
Ｄ．ＰＬＧＡマイクロスフェア中で封入された修飾ｍＲＮＡの放出試験
ルシフェラーゼ修飾ＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１６０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾）で製剤化されたＰＬＧＡマイクロスフェアを、２重、または３重で、８０ｍｇ／ｍｌのＰＬＧＡマイクロスフェア濃度まで、ＴＥ緩衝液中で再懸濁した。再懸濁の後、試料を、試験を行う間、３７℃でインキュベートおよび振とうさせ続けた。各時点（０．０４、０．２５、１．２、４および７日）で、チューブを遠心し、上清を除去し、ペレットを０．２５ｍｌの新しいＴＥ緩衝液中に再懸濁した。ＰＬＧＡマイクロスフェアから放出された修飾ＲＮＡの量を測定するために、上清中の修飾ＲＮＡ濃度をＯＤ２６０で測定した。表１４４に示す放出％は、各試料中の修飾ＲＮＡの総量に基づき算出された。ｍＲＮＡ製剤の放出率は、粒子サイズ、ＰＬＧＡ濃度、およびエステル末端キャップ対する酸末端キャップの変化で調整することができる。
【１２１３】
【表１４４】
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【１２１４】
Ｅ．ルシフェラーゼＰＬＧＡマイクロスフェア  インビボ試験
５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１６にｍＲＮＡ配列を示す；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１）、またはＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡを含有するＰＬＧＡマイクロスフェアを、表１４５に記述されるように製剤化し、マウスに皮下注射する。撮像の２０分前に、Ｄ−ルシフェリン溶液を１５０ｍｇ／ｋｇでマウスに腹腔内注射する。次いで、動物を麻酔し、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で画像撮影を行う。生体発光を、マウス全体の総流量（光子／秒）として測定する。
【１２１５】
【表１４５】
2019059793.tif 000260
【１２１６】
実施例９３．緩衝液製剤
修飾ｍＲＮＡを水ベースの緩衝液中で製剤化してもよい。生物系に類似している緩衝液は、伝統的に等張のものである。そのような緩衝剤および緩衝溶液は、以下のガイドラインに従い調製されてもよい。例となる成分を表１４６に示す。
【１２１７】
いくつかの実施形態において、カルシウムイオンを、製剤のための緩衝溶液に加えてもよい。
【１２１８】
【表１４６】
2019059793.tif 000261
【１２１９】
実施例９４．複数の修飾ｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子
ＥＰＯｍＲＮＡ（配列番号９；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、Ｇ−ＣＳＦｍＲＮＡ（配列番号６；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）、およびＩＸ因子ｍＲＮＡ（配列番号１０；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示していない；５´キャップ、キャップ１；５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾）を、表１４７に記述されるようにＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ中で製剤化する。その製剤を、０．０５ｍｇ／ｋｇの用量で、Ｂａｌｂ−Ｃマウスに静脈内（Ｉ．Ｖ．）、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）または皮下（Ｉ．Ｃ．）に投与する。対照ＬＮＰ製剤（１つのｍＲＮＡのみを含有）もまた、等量を投与する。
【１２２０】
【表１４７】
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【１２２１】
製剤の投与後、８時間、２４時間、７２時間および／または７日でマウスから血清を採取する。血清をＥＬＩＳＡで分析し、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、およびＩＸ因子のタンパク質発現を測定する。
実施例９５．５−メチルシトシンおよびＮ１−メチルシュードウリジン修飾ｍＲＮＡのカチオン性脂質製剤試験
ＥＰＯｍＲＮＡ（配列番号９；およそ１４０ヌクレオチドのポリＡテールは配列中に示臣ꚁ臣ꪁ臣鮼볯슕궂菣莃菣膀苣ꎃ菣鞃볯鮼볯銈菣膃菣랂菣랂菣誁苣뎁볯醼裢ꆃ菣ꮃ苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃臣貮藥ꮁ뿤뺣볯膀臣龁臣膀볯銈볯뎼볯趽볯꺼볯袼藩鞈闧랏볯鮼臣袂臣醼볯邼菣꾂菣ꪂ菣覃臣鶃菣ꆼ菣벃菣꾁藩鞈룤ꮁꓧ鞁臣蒁臣蒁볯閼듂苣ꎃ菣鞃胣궂菣莃菣醼볯閼裢ꆃ菣ꮃ苣袃苣뎃臣袂臣꺼볯銈菣膃菣랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣ꞁ껥ꢅ臣꺿ꏩ覼苣膀ꇨ醼볯颼臣風뿨閁苣讂苣蚁臣膀볯겼뷯躽裢궼볯鎼裢꒼볯ꆼ臣袂臣꒼볯覽뷯銈볯ꎼ볯銈볯궼볯궸臣붣觥隌臣讂胣鶁臣붣觥銂胣邼볯邼볯趽뷯込뷯螽臣ꢔ蟩ꞁ胣ꊼ뷯貽뷯銈볯麃苣릂臣馝蓨薆볯ꦼ볯뚼볯覼胣训苨薆볯ꦼ볯궼볯覼臣龁臣꺚룤袼볯躼볯躼볯ꮁ諦躸臣讂胣ં䐼噉邀볯銼볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀ꇨ醼볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㔰㜹㌹琮晩㸢〲㤱㔰㜹㌹琮晩ꃂ〰㈰㌶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ㰊䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 붣觥꺁諦躸뻥膀볯芙雩膀볯钼駦鎖胣鞼볯芙雩誁苣뎁볯뺁臣꾁볯ꖗ臣麃苣릂臣覂ꇨ薸苣ꆎ迥馁苣芀ꇨ薸苣ꖼ볯ꦼ볯ꆼ臣蚈黦鞁胣ꖼ볯꾼臣袂臣Ꞽ裢ꎼ볯ꚼ臣뾂菣醃苣ꪳ駧뺏苣겸껥馁苣芀戼㹲龮雦设볯隼볯랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣誁苣뎁볯醼裢ꆃ菣ꮃ苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃臣螌郥Ꞁ볯ꆼ볯㲲牢ਾ†뿨뒹胣钃菣龃苣뎃菣꾂菣ꪂ苣覃苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃臣ꢳ鯧貁鯩뺁苣膀苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃臣龁臣꺼볯銈菣膃菣랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣뢁臣꺿ꏩ銂郥覜臣讂뷯늼볯ꆼ苣뾪臣讂臣膂臣肸胩꺁꟦ꂀ듦Ꞁꧨ鎨臣궨꣨閁苣ꚁ臣讂胣ં䐼噉邀볯銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁ꧨ鎨臣膀뿤뺣臣꺼볯趽胣ꎼ볯趽胣銼뷤膀볯趽臣袂臣ꪃ菣뢅룤階룤ꞁ뷤붣臣貂臣뒠郥꺁軩랕胣芄뫦Ꞁꋥꂊ胣낒꟦ꂀ臣颭鳥誁苣뎁雧뒰胦뺁臣꾁ꛨ뒰胦뢛뫤鲽铧꺁ꓥ隌臣놽鿩銂ꃧ뚩臣讂苣蚁꣨袨臣貂臣芀껥骮胦节臣龁ꫨ뮟臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 鎁臣꺛髧꺁臣膂臣膀苣ꮃ苣ꪃ賥膀苣꾂菣ꊂ菣ꮂ菣隌胣ꊂ菣궂菣銈苣꾂菣ꊂ菣궂菣隌胣ꊂ菣벃菣隌胣ꊂ菣궂菣銈苣ꪃ菣ꮃ賥膀苣龃菣몟苣뒼臣ꊂ菣궂菣隌菩蚈胣ꮂ菣鲃苣랂菣뢅鿥銂鳦馁苣ꊂ菣궂菣隌菩蚈胣誁苣뎁苣龃菣뢅鯩랍菩蚈苣ꮐ鳦馁苣ꊂ菣궂菣隌菩蚈苣ꮐ苣꺿ꏩ貁ꫨ뮟臣貂苣芀苣ꮃ苣ꮃ賥꺁꣧ꚺ臣膀胩뢸胣ꎼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰醼⼼畳㹢裢ꎼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰隼⼼畳㹢臣芁苣芀賥ꚭ髧꺿ꏩ꺁뻤銂胣ꢡ볯钼볯誁苣뎁ꇨ醼볯邼臣鞈賦馁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣ꢡ볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰〹㤵㤷⸳楴≦㈾㄰〹㤵㤷⸳楴쉦゠〰㘲㰴愯㰾䐯噉ਾਊ䐼噉邀볯銼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀ꇨ醼볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㔰㜹㌹琮晩㸢〲㤱㔰㜹㌹琮晩ꃂ〰㈰㔶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ㰊䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰〹㤵㤷⸳楴≦㈾㄰〹㤵㤷⸳楴쉦゠〰㘲㰶愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰〹㤵㤷⸳楴≦㈾㄰〹㤵㤷⸳楴쉦゠〰㘲㰷愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢껥붖뻤馼볯躼ꓥ뚄臣貃苣것苣랂菣誁苣뎁鷩ꦤ蓧꺁菣꾂菣ꪂ苣覃臣蒵臣벾臣㲿甯㰾牢ਾ†ꓥ뚄臣貃苣것苣랂菣誁苣뎁鷩ꦤ蓧꺁菣꾂菣ꪂ苣覃苣膀꿥ꆱ臣鶃菣骃菣膃菣銂苣벃菣鞁臣蒁苣趽볯꺼볯뢁臣蒵臣벾苣芀臣貂苣꺁뻤ꢁ臣ꚁ胣ꢡ볯閼볯誁苣뎁볯閼볯銂ꓧ馁胣芁苣꺨臣芸단貃苣것苣랂菣覸菣뎃藩袼볯뒼볯覼苣膀鳦몙飦꺁菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣뾪鿦馁苣芀臣貂苣꺁臩麊苣膀ꇨ醼볯銼臣몤臣芀곦蒁臣膀뻥覂苣龁뷯늼볯ꆼ臣ꒁ臣ꚁ胣뾂菣醃苣ꪳ铧龔胣떂苣袃苣ꒂ菣颪냥膀臣袂臣込臣龁臣뮲駧릊黦銂铧뾁蟥馁菨鮊苣鲤꣨馁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣ꢡ볯閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰〹㤵㤷⸳楴≦㈾㄰〹㤵㤷⸳楴쉦゠〰㘲㰸愯㰾䐯噉ਾਊ䐼噉邀볯銼볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀ꇨ醼볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㔰㜹㌹琮晩㸢〲㤱㔰㜹㌹琮晩ꃂ〰㈰㤶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢껥붖뻤馼볯躼ꃦ뢅ꇥ몟臣袂臣궂냦隌觧袼돧覼臣꺁뿤뺣臣蒵臣벾臣㲿甯㰾牢ਾ†ꓥ뚄臣貃苣것苣랂菣誁苣뎁鷩ꦤ蓧꺁菣꾂菣ꪂ苣覃苣膀꿥ꆱ臣鶃菣骃菣膃菣銂苣벃菣鞁臣蒁苣趽볯꺼볯뢁臣蒵臣벾苣芀ꃦ뢅ꇥ몟臣袂臣궂냦隌觧袼돧覼臣ꆸ雦뢁臣꺿ꏩ銂鳦馁苣芸단꺁菣꾂菣ꪂ苣覃臣袂臣꺼볯낼苣膀뷯늼볯ꆼ臣ꢁ뗧뾁뻨뺁苣讂菨鮊胣뾂菣醃苣ꪳ苣ꎔ铧馁苣붃諥膀苣ꒂ菣ꮂ苣뎃苣颪냥馁苣붃諥膀臣袂臣込臣龁臣뮲駧릊黦銂铧뾁蟥馁菨鮊臣뺯臣ꚁꓦ벨臣讂胣鎁苣覂臣貃苣것苣랂菣꺁뻤銂ꇨ醼볯鎼臣袂臣ꢡ볯閼볯ꮁꓧ馁胣ં䐼噉邀볯銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀ꇨ醼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㔰㜹㌹琮晩㸢〲㤱㔰㜹㌹琮晩ꃂ〰㈰〷⼼㹡⼼䥄㹖ਊ㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣ꢡ볯閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰〹㤵㤷⸳楴≦㈾㄰〹㤵㤷⸳楴쉦゠〰㜲㰱愯㰾䐯噉ਾਊ䐼噉邀볯銼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†ꇨꮁ臣蒁臣膀胣떼볯낼胣꾁苣ꪃ苣뎃룤ꪃ菣뢅苣ꢡ臣膀胣Ꞽ볯낼胣꾁苣ꊂ菣랂菣覸菣뎃藩銂ꇨ鞁胣貀볯뒼볯趀臣ꊂ菣躃苣뎃룤ꪃ菣뢅苣ꢡ臣膀胣ꎼ볯낼胣꾁苣袃苣뎃룤ꪃ菣뢅苣ꢡ臣膀胣뒼볯趀臣袃菣ꪃ菣뢅苣ꢡ臣膀胣ꊼ뷯趀臣馃菣뢂菣銂ꇨ馁胣ં䐼噉邀볯銼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†铧蒁苣貂臣蒁苣螖꣨꾁胣뚈駩ꞁ臣ꪁ臣風뿨꺁臣膂臣螖꣨ꞁ臣誂胣鶁臣ꚁ胣袂苣莺臣ꎧ蟩ꮁ臣讂鳦몙飦꺁鳧꺁꿧늛臣袂臣뺲ꗧ讁苣뢀蓨馁苣鎁臣ꪁ臣膀럦颻臣꾂菣벃菣꺁꿧늛蛥ꞁꓥ뒛臣芁苣蚁苣鎁臣貁郧ꎧ臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 겜駧躘臣風뿨閁苣讂臣辁臣讁臣龮雦讅꟦ꮁ雩鞁臣膀臣讂꣧ꚺꧨ내臣膀臣袂臣芁苣랅뷤Ꞁ臣風뿨閁苣ꚁ臣讂臣膀鳦몙飦꾁胣뮻蓦꺁臣꺁苣蚁臣뎩듧论ꃩ节臣辁臣龮雦讅꟦膀臣龁臣릉껥꺁껥붖藦颧臣邙껥閁苣讂蓦뎛臣ꪁ臣膀藥財諦鎡苣莀藦鞁臣膀鳦节뫥辁胣꾏菨Ꞁ臣芁苣ꎧ蟩銂迦몤臣膀鳦몙飦꺁蓦뎛臣貂苣蒯鯥銂鳦릊臣薌郥馁苣膀럦颻臣꾂菣벃菣ꮁ鳦몙飦꾁뫦ꂋ臣讂臣뾁臣閁苣讂胣ં䐼噉邀볯銼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ꣨誏臣貂苣馁臣ꚁ臣겅ꇨ螖賧膀觧놨蟥颡胣릉꣨誁苣뎁믤꺁迥莀雦꺌臣膀臣꺁藥鎽臣芏藧ꮁ苣誂迦ꢔ臣貂苣芀鿧뺛臣龔臣讂ꃥ袐胣겜飦내鯦袼껥ꦾ苣ꮐ苣覼臣ꪄ藥閁苣讂胣閁苣ꮁ胣薠鯧꺁ꇨ財胣邝雦膀雦閳臣袂臣龮雦设臣膀뻤몤ꫨ躘臣뾁苣꺛髧ꢁ臣ꚁ臣誂胣邙껥꺁蓦뎛臣ꆄ臣芀戼㹲袼믤風볯㲉牢ਾ†ꗥ뺁臣蒁껥붖뷥讅臣鞁臣膀룤風껥붖뷥讅臣覂諦ꆏ臣趁苣肊ꇨ蒚胦뎃臣ꒁ臣ꚁ胣風볨馁苣芀戼㹲뮼ꃩ꺛볯붼戼㹲 몓매開觧내菨뺁臣꾁뗧钹臣誁臣ꚁ鯧蒚臣鶃菣骃菣膃菣銂铧龔臣讂雦閳臣芁臣ꚁ胣趉꣨몓매開觧내菨뺁臣꾁뗧钹苣꺛髧꺁菣ꪃ菣鞃菣覃苣뎂菣覃臣讂뿤뺣뷯늼볯ꆼ苣ꮐ苣붣觥ꮁ軦ꚧ臣鮁苣鎁臣銂郥뾁胣붣觥꾁菣躃닧邭胣鶃菣袼藩뢅裢낂菣뎂菣ꮃ藩놅蟩袐뷤覼볯낼볯Ꞽ볯覼菣ꒂ苣궃苣閃苣ꊂ胣ꪃ菣覃苣覃胣ꪃ菣鞃菣莃苣릂胣ꪃ菣붂菣ꂃ胣鶃菣麃菣膀볯颍돧銂郥肂볯궂냦隌觧膀苣膃苣뎃胦芄돨膀菣ꎂ菣ꪃ菣늂菣膀菣ꎂ菣ꪃ菣銃菣궃苣ꮃ胣閃苣隃菣뎃돧膀菣ꎂ菣ꪃ菣랂菣ꦃ菣袃胣閃苣隃菣躃苣뎃胣袃菣뎃菣뎃胣龀苣讁臣銎蟥閁苣讂蓨ꪳ菣躃닧邭볯銽뷯겼볯낼뷯覼臣袂臣鶁苣覂臣蒵郥鮁臣覂臣讂뻧袂苣뢁諦閁苣讂胣릖돦芀戼㹲뮼ꃩ꺛볯붼戼㹲 꺿ꏩ趽볯꺼볯貁닧붣臣貂臣ꦼ볯뒼믨馆觧銂郥肂胣薠鯧醼臣風볨꺁雦閳胣㲂牢ਾ볯薠鯧鎼볯㲽牢ਾ†뿤뺣뷯늼볯ꆼ苣ꮐ苣붣觥貁菣躃닧邭臣芁苣膀觥風菣躃닧邭臣醰臣辁臣节볯ꒁ臣芄돨銂郥肂胣薠鯧醼臣風볨꺁雦閳胣㲂牢ਾ볯薠鯧钼볯㲽牢ਾ†蓨ꪳ臣꒼볯覽뷯銈볯궼볯膀볯겼뷯躽裢ꮼ裢꒼볯ꆼ胣馼볯꺼볯銼裢閼胣ꎼ볯銼裢銼볯邼胣꒼볯覽뷯銈볯ꎼ볯銈볯궼볯膀볯겼뷯躽裢ꮼ볯銼裢꒼볯ꆼ胣꒼볯꒼볯ꆼ胣낼볯Ꞽ볯膀볯ꖼ볯膀볯ꖼ볯銈볯궼볯誁苣뎁菣낂賥芄돨讁苣ꪁ苣꒾苣誂臩麊臣貂苣膀ꃩ꺛볯ꮁ꣨覼臣릖돦芀戼㹲뮼ꃩ꺛볯붼戼㹲 芄돨貁苣膃苣뎃胦芄돨ꞁ臣讂胣薠鯧鎼臣風볨꺁雦閳胣㲂牢ਾ볯薠鯧隼볯㲽牢ਾ†苣膃苣뎃胦芄돨貁볯겼뷯躽裢꒼볯ꆼ胣꒼볯覽뷯銈볯銈볯궼볯膀볯겼뷯躽裢궼볯鎼裢꒼볯ꆼ胣꒼볯覽뷯銈볯ꎼ볯銈볯궼볯誁苣뎁볯꾼볯궼볯讁苣ꪁ苣꒾苣誂臩麊臣貂苣膀ꃩ꺛볯ꮁ꣨覼臣릖돦芀戼㹲뮼ꃩ꺛볯붼戼㹲 芄돨꺁뿤뺣뷯늼볯ꆼ臣뺯臣讂蟩辇꿦貁볯邼볯醼臣覂볯邼볯醼臣芁苣膀ꃩ꺛볯ꮁ꣨覼臣릖돦芀戼㹲뮼ꃩ꺛볯붼戼㹲 꺿ꏩ趽볯꺼볯銂郥肂菣躃닧邭ꏨꒉ臣뎹鷥뢯돦貁볯邼胣銼볯閼뷯趽臣芁苣膀ꃩ꺛볯ꮁ꣨覼臣릖돦芀戼㹲뮼ꃩ꺛볯붼戼㹲 꺿ꏩ趽볯꺼볯銂郥肂菣躃닧邭ꏨꒉ臣낼볯ꦼ臣邼볯邼볯鲀볯躼볯閼臣芁苣膀ꃩ꺛볯ꮁ꣨覼臣릖돦芀戼㹲뮼ꃩ꺛볯邼볯㲽牢ਾ†蓨ꪳ臣벂菣뾂鯩趽臣邽볯鞼볯钼臣銈볯邼胣讼볯邼臣芁苣膀ꃩ꺛볯ꮁ꣨覼臣릖돦芀戼㹲뮼ꃩ꺛볯醼볯㲽牢ਾ†뿤뺣뷯늼볯ꆼ苣ꮐ苣誃菣銲귥붣觥貁黨袐胦芄돨膀苣것苣蚃菣벃菣誁苣뎁볯ꖼ볯芄돨銂臣覂臣ꮐ苣膀ꃩ꺛볯ꮁ꣨覼臣릖돦芀戼㹲뮼ꃩ꺛볯銼볯㲽牢ਾ†뿤뺣뷯늼볯ꆼ苣ꮐ苣誃菣銲귥붣觥貁菣ꮃ꿦閼볯骼볯邼볯鎼볯躼볯骼볯躼볯鲀볯躼볯袼苣膃苣뎃胦芄돨骼黨袐胦芄돨骼苣것苣蚃菣벃菣骼볯ꖼ볯芄돨覼苣覜臣讂胣薠鯧醼볯ꮁ꣨覼臣릖돦芀戼㹲뮼ꃩ꺛볯鎼볯㲽牢ਾ†볯ꖼ볯芄돨貁볯ꖼ볯銈뷯銈볯꾼볯Ꞽ臣袂臣낼볯Ꞽ裢꒼볯Ꞽ臣覂臩麊臣貂胣趞郥Ꞁ蓨ꪳ臣꒼볯낼볯ꞁ臣讂胣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