(57)【要約】【課題】腎臓を腎障害から保護するための方法を提供する。【解決手段】方法は、有効量の芳香族カチオン性ペプチドを、その投与が必要な被検体に投与することを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性肝障害の治療又は予防を必要とする対象における急性肝障害を治療又は予防するための薬剤の製造における、芳香族カチオン性ペプチドの使用。
【請求項２】
前記ペプチドが、Ｐｈｅ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2及びＤ−Ａｒｇ−２’６’Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記急性肝障害が、虚血、薬剤誘発性肝毒性、ウイルス感染、肥満又は胆管閉塞症の一つ以上によって生じる、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
急性肝不全の治療又は予防を必要とする対象における急性肝不全を治療又は予防するための薬剤の製造における、芳香族カチオン性ペプチドの使用。
【請求項５】
前記ペプチドが、Ｐｈｅ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2及びＤ−Ａｒｇ−２’６’Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2からなる群から選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記急性肝不全が、ウイルス性肝炎、薬剤誘発性肝毒性、頻繁なアルコール依存症又は自己免疫性肝炎の一つ以上によって生じる、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
前記薬剤が、急性肝不全を予防するために、肝毒性を誘発することが知られているか疑われる作用剤の投与よりも前又はこれと同時に対象に投与される、請求項４に記載の使用。
【請求項８】
前記薬剤が、急性肝不全を治療するために、肝毒性を誘発することが知られているか疑われる作用剤の投与の後に対象に投与される、請求項４に記載の使用。
【請求項９】
前記薬剤が、肝酵素レベル上昇、血清ビリルビン増加、血清アンモニア増加、血清ブドウ糖増加、血清乳酸増加及び血清クレアチニン増加からなる群から選択される急性肝不全の兆候又は症候の一つ以上を軽減する、請求項４に記載の使用。
【請求項１０】
前記薬剤が、経口、局所的、全身的、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下又は経皮的に投与される、請求項１又は４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２００８年２月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／０３１，５８５号の優先権の利益を主張するものであり、その内容全体を本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓の重篤な病状のひとつに、急性腎不全（ＡＲＦ）または急性腎不全（ａｃｕｔｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｊｕｒｙ）（ＡＫＩ）とも呼ばれる急性腎障害（ＡＲＩ）がある。ＡＲＩでは、糸球体濾過量や尿排出量の低下あるいはその両方が特徴である。ＡＲＩには、検査を受けなければ腎線維症および慢性腎不全につながりかねない炎症反応を伴う。ＡＲＩは通常、長い時間すなわち何日もかけて発生し、可逆性となる可能性をはらんでいる。ＡＲＩは入院患者によく見られる合併症であり、その出現率が過去１５年で大幅に上昇している。いくつかの放射線造影剤による毒性作用が原因で、独特なタイプのＡＲＩである造影剤腎症が引き起こされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、腎臓の保護が必要な被検体において、急性腎障害から腎臓を保護するための方法を提供するものである。この方法は、有効量の芳香族カチオン性ペプチドを被検体に投与することを含む。芳香族カチオン性ペプチドは、（ａ）少なくとも１個の正味の正電荷と、（ｂ）最低３個のアミノ酸と、（ｃ）最大約１２個のアミノ酸と、（ｄ）３ｐmがｒ＋１以下の最大数である、正味の正電荷の最小数（ｐm）とアミノ酸残基の総数（ｒ）との関係と、（ｅ）ａが１であればｐtも１であってもよい場合を除き、３ａがｐt＋１以下の最大数である、芳香族基の最小数（ａ）と正味の正電荷の総数（ｐt）との関係と、を有する。
【０００４】
一実施形態では、造影剤腎症の出現を予防または寛解するために、放射線造影剤よりも前またはこれと同時に、被検体にペプチドを投与する。一実施形態では、ペプチドが、Ｐｈｅ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2（ＳＳ−２０）またはＤ−Ａｒｇ−２’６’Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（ＳＳ−３１）からなる群から選択される。
【０００５】
一実施形態では、急性腎障害は、被検体が腎毒性薬剤に曝露されることと関連している。一実施形態では、腎毒性薬剤への曝露よりも前またはこれと同時に、ペプチドを被検体に投与する。
【０００６】
一実施形態では、腎毒性薬剤が、アセトリゾ酸、ジアトリゾ酸、ヨーダミド、イオグリク酸、イオタラム酸、イオキシタラム酸、メトリゾ酸、メトリザミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソールなどの放射線造影剤染料である。
【０００７】
一実施形態では、腎毒性薬剤が、薬剤または化学物質である。例示的な実施形態では、薬剤または化学物質が、シスプラチン、ゲンタマイシン、セファロリジン、シクロスポリン、アムホテリシン、四塩化炭素、トリクロロエチレン、ジクロロアセチレンからなる群から選択される化合物のうちの１種以上である。
【０００８】
もうひとつの態様では、本発明は、急性腎障害または慢性腎障害の治療が必要な被検体において、これを治療する方法を提供するものである。この方法は、有効量の芳香族カチオン性ペプチドを被検体に投与することを含む。芳香族カチオン性ペプチドは、（ａ）少なくとも１個の正味の正電荷と、（ｂ）最低３個のアミノ酸と、（ｃ）最大約１２個のアミノ酸と、（ｄ）３ｐmがｒ＋１以下の最大数である、正味の正電荷の最小数（ｐm）とアミノ酸残基の総数（ｒ）との関係と、（ｅ）ａが１であればｐtも１であってもよい場合を除き、３ａがｐt＋１以下の最大数である、芳香族基の最小数（ａ）と正味の正電荷の総数（ｐt）との関係と、を有する。一実施形態では、被検体に対する腎毒性薬剤への曝露後にペプチドを投与する。
【０００９】
一実施形態では、ペプチドが、Ｐｈｅ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2（ＳＳ−２０）およびＤ−Ａｒｇ−２’６’Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（ＳＳ−３１）ペプチドからなる群から選択される。
【００１０】
一実施形態では、ペプチドが式Ｉ
【化１】
2019059785.tif 000003
によって定義され、
式中、Ｒ1およびＲ2は各々独立に、
（ｉ）水素、
（ｉｉ）直鎖または分岐鎖のＣ1〜Ｃ6アルキル、
【化２】
2019059785.tif 000004
から選択され、
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12は各々独立に、
（ｉ）水素、
（ｉｉ）直鎖または分岐鎖のＣ1〜Ｃ6アルキル、
（ｉｉｉ）Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、
（ｉｖ）アミノ、
（ｖ）Ｃ1〜Ｃ4アルキルアミノ、
（ｖｉ）Ｃ1〜Ｃ4ジアルキルアミノ、
（ｖｉｉ）ニトロ、
（ｖｉｉｉ）ヒドロキシル、
（ｉｘ）ハロゲンから選択され、ここで「ハロゲン」は、クロロ、フルオロ、ブロモ、ヨードを包含し、
ｎは、１〜５の整数である。
【００１１】
特定の実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12がすべて水素であり、ｎが４である。もうひとつの実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ11がすべて水素であり、Ｒ8およびＲ12がメチルであり、Ｒ10がヒドロキシルであり、ｎが４である。
【００１２】
一実施形態では、ペプチドが式ＩＩ
【化３】
2019059785.tif 000005
によって定義され、
式中、Ｒ1およびＲ2は各々独立に、
（ｉ）水素、
（ｉｉ）直鎖または分岐鎖のＣ1〜Ｃ6アルキル、
【化４】
2019059785.tif 000006
から選択され、
Ｒ3およびＲ4は各々独立に、
（ｉ）水素、
（ｉｉ）直鎖または分岐鎖のＣ1〜Ｃ6アルキル、
（ｉｉｉ）Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、
（ｉｖ）アミノ、
（ｖ）Ｃ1〜Ｃ4アルキルアミノ、
（ｖｉ）Ｃ1〜Ｃ4ジアルキルアミノ、
（ｖｉｉ）ニトロ、
（ｖｉｉｉ）ヒドロキシル、
（ｉｘ）ハロゲンから選択され、ここで「ハロゲン」は、クロロ、フルオロ、ブロモ、ヨードを包含し、
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は各々独立に、
（ｉ）水素、
（ｉｉ）直鎖または分岐鎖のＣ1〜Ｃ6アルキル、
（ｉｉｉ）Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、
（ｉｖ）アミノ、
（ｖ）Ｃ1〜Ｃ4アルキルアミノ、
（ｖｉ）Ｃ1〜Ｃ4ジアルキルアミノ、
（ｖｉｉ）ニトロ、
（ｖｉｉｉ）ヒドロキシル、
（ｉｘ）ハロゲンから選択され、ここで「ハロゲン」は、クロロ、フルオロ、ブロモ、ヨードを包含し、
ｎは１〜５の整数である。
【００１３】
特定の実施形態では、Ｒ1およびＲ2が水素であり、Ｒ3およびＲ4がメチルであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9がすべて水素であり、ｎが４である。
【００１４】
一態様では、開示は、腎臓の保護が必要な被検体において、慢性腎障害から腎臓を保護するための方法を提供するものである。この方法は、Ｐｈｅ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（ＳＳ−２０）およびＤ−Ａｒｇ−２’６’Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（ＳＳ−３１）からなる群から選択される有効量のペプチドを被検体に投与することを含む。一実施形態では、慢性腎障害が、慢性腎障害（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｊｕｒｙ）を引き起こし得る薬剤または化学物質などの腎毒性薬剤の投与または腎毒性薬剤への曝露と関連している。特定の実施形態では、薬剤または化学物質が四塩化炭素である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、虚血、薬剤（アセトアミノフェン、アルコール）、ウイルス、肥満（非アルコール性脂肪性肝炎）、閉塞（胆管閉塞症、腫瘍）によって生じる急性肝障害の予防および／または治療に有用である。いくつかの実施形態では、本発明の芳香族カチオン性ペプチドを被検体に投与して、急性肝不全（ＡＬＦ）を予防または治療する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１ａ〜ｄは、ＴＵＮＥＬを用いてアポトーシス細胞を染色した腎臓切片の顕微鏡写真を示す。
【図２】図２ａ〜ｄは、Ｈ＆Ｅで染色した腎臓切片の顕微鏡写真を示し、図２ｅ〜ｈは、ＰＡＳで染色した腎臓切片の顕微鏡写真を示す。
【図３】ＳＳ−２０またはＳＳ−３１での処理によって、４５分間の虚血と２４時間の再灌流によって生じる病理組織学的スコアが有意に改善されたことを示すグラフである。
【図４ａ】ＳＳ−２０またはＳＳ−３１での処理によって、再灌流後にＡＴＰ生成速度が有意に高まったことを示すグラフである。図４ａは、１５分間の虚血後の腎組織におけるＡＴＰ含有量を示す。
【図４ｂ】ＳＳ−２０またはＳＳ−３１での処理によって、再灌流後にＡＴＰ生成速度が有意に高まったことを示すグラフである。図４ｂは、４５分間の虚血に続く１時間の再灌流後の腎組織におけるＡＴＰ含有量を示す。
【図５】ＳＳ−２０またはＳＳ−３１での前処理によって、４５分間の虚血後の腎ミトコンドリア呼吸が有意に改善されたことを示すグラフである。
【図６ａ−ｃ】１４日間の一側尿管結紮（ＵＵＯ）モデルでＳＳ−１が髄質線維症を低減することを示すデータである。図６ａ〜図６ｃは、対側の未閉塞腎（ＣＫ）、閉塞腎（ＯＫ）またはＳＳ−３１処理腎での尿細管、糸球体または間質での炎症または線維症を示す。
【図６ｄ】ＣＫ、ＯＫ、ＳＳ−３１処理腎での間質性を示すグラフである。
【図７】１４日間のＵＵＯモデルでＳＳ−３１が線維芽細胞の発現を減らすことを示すグラフである。
【図８】１４日間のＵＵＯモデルでＳＳ−３１が尿細管アポトーシスを減少させることを示すグラフである。
【図９】１４日間のＵＵＯモデルでＳＳ−３１がマクロファージ発現を減少させることを示すグラフである。
【図１０】１４日間のＵＵＯモデルでＳＳ−３１が尿細管増殖を増加させることを示すグラフである。
【図１１ａ】１４日間のＵＵＯモデルでＳＳ−３１が酸化障害を減少させることを示すデータである。図１１ａは、ＨＯ−１発現を分析するためのＲＴ−ＰＣＲの結果の写真である。
【図１１ｂ】１４日間のＵＵＯモデルでＳＳ−３１が酸化障害を減少させることを示すデータである。図１１ｂは、腎閉塞の尿細管および間質区画の両方についての８−ＯＨ  ｄＧ染色の結果の顕微鏡写真である。
【図１１ｃ】１４日間のＵＵＯモデルでＳＳ−３１が酸化障害を減少させることを示すデータである。図１１ｃは、腎閉塞の尿細管および間質区画の両方についての８−ＯＨ  ｄＧ染色の結果の顕微鏡写真である。
【図１２】ＳＳ−３１が放射線造影剤染料によって生じる腎機能障害を低減させたことを示すグラフである。
【図１３】ＳＳ−３１が放射線造影剤染料傷害から腎尿細管を保護したことを示す一連の顕微鏡写真である。ＰＡＳ染色によって、形態的に正常な対照ラットの腎臓では近位尿細管の刷子縁が無傷であることが明らかになった（図１３ａ）。染料処理によって、近位尿細管細胞の特徴的な腎刷子縁が損なわれ、上皮細胞が平板化し、さらに若干の空砲形成が生じた（図１３ｂ）。これらの作用は、ＳＳ−３１での処理によって減弱した。これらの試料でのＰＡＳ染色によって、無傷の刷子縁と正常な糸球体が明らかになった（図１３ｃ）。
【図１４】ＳＳ−３１が放射線造影剤染料傷害によって誘発される腎尿細管アポトーシスを防止したことを示す一連の顕微鏡写真である。ＴＵＮＥＬ染色を利用して、アポトーシス腎尿細管を可視化した。対照の腎臓ではアポトーシス細胞／ｈｐｆがほとんど認められなかった（図１４ａ）。ビヒクル処理した染料注入腎臓には、毎視野（ｈｐｆ）に多数のアポトーシス細胞があった（図１４ｂ）。この作用は、ＳＳ−３１処理した染料注入腎臓で大幅に減弱された（図１４ｃ）。
【図１５】実施例３の実験２に示す研究のプロトコールと投薬スケジュールを示す流れ図である。
【図１６】染料処理によって、近位尿細管細胞の特徴的な腎刷子縁が損なわれ、若干の空砲形成が生じた（図１６ａ）ことを示す一連のＰＡＳ染色顕微鏡写真である。これらの作用はＳＳ−３１での処理によって減弱し、これらの試料でのＰＡＳ染色によって、無傷の刷子縁と正常な糸球体が明らかになった（図１６ｂ）。図１６ｃは、形態的に正常な対照ラットの腎臓では近位尿細管の刷子縁が無傷であることを示した。
【図１７ａ】放射線造影剤染料投与後の対照およびＳＳ−３１処理ラットにおける血清シスタチンＣの変化を示すグラフである。
【図１７ｂ】放射線造影剤染料投与後の対照およびＳＳ−３１処理ラットにおけるＧＦＲの変化を示すグラフである。
【図１８】放射線造影剤染料投与前後の対照およびＳＳ−３１処理ラットにおけるクレアチニンクリアランスを示すグラフである。
【図１９】実施例４の実験３に示す研究のプロトコールと投薬スケジュールを示す流れ図である。
【図２０】実施例５の実験１に示す研究のプロトコールと投薬スケジュールを示す流れ図である。
【図２１ａ】放射線造影剤染料投与前後のＣＩＮのグリセリンモデルにおける対照およびＳＳ−３１処理ラットのＧＦＲを示すグラフである。
【図２１ｂ】放射線造影剤染料投与前後のＣＩＮのグリセリンモデルにおける対照およびＳＳ−３１処理ラットの尿中アルブミンを示すグラフである。
【図２２ａ】グリセリン、ジアトリゾ酸、対照（ＰＢＳ）で処理したラットから得た腎臓切片をＰＡＳ染色した場合の一連の顕微鏡写真を示す。
【図２２ｂ】グリセリン、ジアトリゾ酸、ＳＳ−３１で処理したラットから得た腎臓切片をＰＡＳ染色した場合の一連の顕微鏡写真を示す。
【図２３】実施例５の実験２に示す研究のプロトコールと投薬スケジュールを示す流れ図である。
【図２４】放射線造影剤染料投与前後のＣＩＮのグリセリンモデルにおける対照およびＳＳ−３１処理ラットのＧＦＲを示すグラフである。
【図２５】放射線造影剤染料投与前後のＣＩＮのグリセリンモデルにおける対照およびＳＳ−３１処理ラットの尿タンパクを示すグラフである。
【図２６ａ】グリセリン、ジアトリゾ酸、対照（ＰＢＳ）で処理したラットから得た腎臓切片をＰＡＳ染色した場合の一連の顕微鏡写真を示す。
【図２６ｂ】グリセリン、ジアトリゾ酸、ＳＳ−３１で処理したラットから得た腎臓切片をＰＡＳ染色した場合の一連の顕微鏡写真を示す。
【図２７】実施例５の実験３に示す研究のプロトコールと投薬スケジュールを示す流れ図である。
【図２８】放射線造影剤染料投与前後のＣＩＮのグリセリンモデルにおける対照およびＳＳ−３１処理ラットのＧＦＲを示すグラフである。
【図２９】放射線造影剤染料投与前後のＣＩＮのグリセリンモデルにおける対照およびＳＳ−３１処理ラットの尿タンパクを示すグラフである。
【図３０ａ】グリセリン、ジアトリゾ酸、対照（ＰＢＳ）で処理したラットから得た腎臓切片をＰＡＳ染色した場合の一連の顕微鏡写真を示す。
【図３０ｂ】グリセリン、ジアトリゾ酸、ＳＳ−３１で処理したラットから得た腎臓切片をＰＡＳ染色した場合の一連の顕微鏡写真を示す。
【図３１】ＣＣｌ4対照群（図３１ａ）、ＳＳ−３１処理群（図３１ｂ）、未処理の対照群（図３１ｃ）のＨ＆Ｅ染色を示す一連の顕微鏡写真である。
【図３２ａ−ｂ】腎毒性薬剤であるシスプラチンを投与したラットにおいて、全体重（図３２ａ）、腎臓の重量（図３２ｂ）に対して本発明の芳香族カチオン性ペプチドがおよぼす作用を示す一連のグラフである。
【図３２ｃ−ｅ】腎毒性薬剤であるシスプラチンを投与したラットにおいて、血清クレアチニン（図３２ｃ）、ＢＵＮ（図３２ｄ）、クレアチニンクリアランス（図３２ｅ）に対して本発明の芳香族カチオン性ペプチドがおよぼす作用を示す一連のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、特定の芳香族カチオン性ペプチドによって、被検体における急性腎障害または急性肝不全などの急性の臓器不全を予防および／または治療することが可能であるという、本発明者らによる驚くべき発見に基づくものである。いくつかの態様では、芳香族カチオン性ペプチドによって、慢性腎障害などの慢性の臓器傷害を予防および／または治療することが可能である。なお、本発明を十分に理解できるよう、本発明の特定の態様、モード、実施形態、変形例、特徴について、下記ではさまざまな詳細度で説明している旨は理解できよう。
【００１８】
本発明を実施するにあたり、分子生物学、タンパク質生化学、細胞生物学、免疫学、微生物学、組換えＤＮＡに関する従来の多くの技術を使用している。これらの技術は周知であり、それぞれたとえば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｓ．  Ｉ〜ＩＩＩ，  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｅｄ．  （１９９７）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｖｏｌｓ．  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，  Ｇｌｏｖｅｒ，  Ｅｄ．  （１９８５）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｇａｉｔ，  Ｅｄ．  （１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｅｄｓ．  （１９８５）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｅｄｓ．  （１９８４）、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｅｄ．  （１９８６）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８６）、Ｐｅｒｂａｌ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８４）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｃａｌｏｓ，  Ｅｄｓ．  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ＮＹ，  １９８７）、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  Ｖｏｌｓ．  １５４  ａｎｄ  １５５，  Ｗｕ  ＆  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，  ａｎｄ  Ｗｕ，  Ｅｄｓ．に説明されている。本明細書に引用する参考文献はいずれも、あらゆる目的で、個々の刊行物、特許明細書または特許出願明細書全体をあらゆる目的で個々にそれぞれ援用した場合と同程度、その内容全体を本明細書に援用するものである。
【００１９】
本明細書で使用するいくつかの用語の定義を、以下にあげておく。別途定義しないかぎり、本明細書で使用する科学技術用語はいずれも、概して本発明が属する分野の当業者が一般に理解している意味と同じ意味を有する。
【００２０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、その指示対象の複数形を含む（文脈から、そうでないことが明白な場合を除く）。たとえば、「細胞」とは、２以上の細胞の組み合わせも含む。
【００２１】
本明細書で使用する場合、元素Ａが元素Ｂと「関連している」といった言い回しは、両方の元素が存在することを意味するが、あるひとつの元素が必ずしもその原因として他の元素に結合しているという意味には解釈されるべきではない。
【００２２】
本明細書で使用する場合、被検体に対する作用剤、薬剤またはペプチドの「投与」には、化合物を被検体に導入または送達してその意図した機能を発揮させるあらゆる経路を含む。投与は、経口、鼻腔内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下）、直腸または局所的な経路をはじめとする、任意の好適な経路で実施可能なものである。投与には、自己投与と他者による投与を含む。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「アミノ酸」という用語は、天然に生じるアミノ酸と合成アミノ酸ならびに、天然に生じるアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を含む。天然に生じるアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるものならびに、後に修飾されたアミノ酸、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、Ｏ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然に生じるアミノ酸と同じ基本化学構造すなわち、水素と結合したα−炭素、カルボキシル基、アミノ基、Ｒ基を有する化合物（ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなど）を示す。このような類似体では、Ｒ基が修飾されている（ノルロイシンなど）かペプチド骨格が修飾されているが、天然に生じるアミノ酸と同じ基本化学構造が維持されている。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の基本的な化学構造の異なる構造を有するが、天然に生じるアミノ酸と同様に機能する化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を示す。本明細書では、アミノ酸を一般に知られている３文字の記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ推奨の１文字の記号のいずれかで示すことがある。
【００２４】
「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはペプチドは、作用剤の誘導元である細胞源または組織源からの細胞物質または他の汚染ポリペプチドを実質的に含まないか、化学的に合成した場合は化学前駆体または他の化学物質からのそれを実質的に含まない。たとえば、単離された芳香族カチオン性ペプチドは、作用剤の診断用途または治療用途に干渉し得る物質を含まない。このような干渉物質としては、酵素、ホルモンならびに、他のタンパク質性および非タンパク質性溶質があげられる。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「病状」という用語は、治療および／または予防が望ましい１種以上の物理的および／または心理的症候として明示される症状または疾患を含むがこれに限定されるものではなく、過去に同定および新たに同定された疾患や他の機能障害も含む。たとえば、病状は、急性腎障害または急性肝不全あるいは、任意の関連した症候または合併症であり得る。一実施形態では、病状が、放射線造影剤染料の投与に関連した急性腎障害である。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」という用語は、本明細書ではペプチド結合または修飾されたペプチド結合すなわちペプチドアイソスターによって互いに結合された２個以上のアミノ酸を含むポリマーを意味して同義に用いられる。ポリペプチドは、一般にペプチド、糖ペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる短鎖と、通常はタンパク質と呼ばれる長鎖の両方を示す。ポリペプチドは、２０遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含有するものであってもよい。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングなどの自然な過程または従来技術において周知の化学修飾法のいずれかによって修飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾については、基本的なテキストや、さらに詳細な研究論文ならびに、膨大な研究文献に十分説明されている。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「保護する」または「保護」という単語は、本発明のペプチドで治療した被検体が、急性腎障害または急性肝不全などの特定の疾患または機能障害を発症する尤度および／または危険性を低下させることを示す。一般に、疾患または機能障害を発症する尤度は、本発明のペプチドで治療していない同じ被検体が、急性腎障害または急性肝不全などの組織損傷を発症する尤度および／または危険性と比較して、尤度が少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２５％、一層好ましくは少なくとも約５０％、なお一層好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％低下した場合に、減少したとみなされる。特定の実施形態では、ペプチドを造影剤よりも前またはこれと同時に投与すると、ペプチドが造影剤によって引き起こされる急性腎障害（すなわち、造影剤腎症）から被検体を保護する。
【００２８】
「被検体」という用語は、本明細書で使用する場合、脊椎動物種の構成員を示す。ここに開示の主題についての方法は、温血脊椎動物で特に有用である。本明細書で提供するのは、人間などの哺乳動物ならびに、絶滅が危惧されているがゆえに重要であったり、人間にとって経済的に重要（人間の食糧として農場で飼育されている動物）および／または社会的に重要（ペットとして、あるいは動物園で飼われている動物）であったりする哺乳動物の治療である。特定の実施形態では、被検体が人間である。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「治療する」または「治療」または「緩和」という表現は、治療と予防的または予防対策の両方を示し、この場合、目的は標的の病的状態または機能障害を予防するか遅らせる（低減する）ことにある。本発明の方法による芳香族カチオン性ペプチドを治療量で投与後、被検体において特定の疾患または症状の１種以上の兆候および症候の観察可能および／または測定可能な低減あるいは欠如が認められた場合に、被検体のその疾患または症状がうまく「治療された」ことになる。たとえば、急性腎障害の場合、治療または予防は、代謝性アシドーシス、高カリウム血症、乏尿または無尿の低減、体液バランスの回復、他の臓器系への影響の改善を含むことがある。腎臓の機能については、血清クレアチニンレベル、血清クレアチニンクリアランスまたは血液尿素窒素レベルを測定して評価することもできる。また、上述したような病状のさまざまな治療モードまたは予防モードが、「実質的な」ものを意味することを意図したものであり、これには完全な治療または予防はもとより完全とまではいかない治療や予防も含み、この場合、生物学的または医学的に関連する何らかの結果が達成されることは理解できよう。
【００３０】
ペプチド
本発明において有用な芳香族カチオン性ペプチドは水溶性で、極めて極性が高い。これらの特性にもかかわらず、ペプチドは細胞膜を容易に貫通することができる。
【００３１】
本発明において有用な芳香族カチオン性ペプチドは、ペプチド結合によって共有結合的に結合された最低３個のアミノ酸を含み、好ましくは最低４個のアミノ酸を含む。
【００３２】
本発明の芳香族カチオン性ペプチドに存在する最大数のアミノ酸は、ペプチド結合によって共有結合的に結合された約１２個のアミノ酸である。好ましくは、アミノ酸の最大数が約１２、一層好ましくは約９、最も好ましくは約６である。最適なのは、ペプチドに存在するアミノ酸の数が４の場合である。
【００３３】
本発明において有用な芳香族カチオン性ペプチドのアミノ酸は、どのようなアミノ酸であってもよい。本明細書で使用する場合、「アミノ酸」という用語は、少なくとも１個のアミノ基と、少なくとも１個のカルボキシル基とを含む有機分子を示すものとして用いられる。好ましくは、少なくとも１個のアミノ基が、カルボキシル基に対してα位にある。
【００３４】
アミノ酸は、天然に生じるものであってもよい。天然に生じるアミノ酸は、たとえば、哺乳類タンパク質に普通に見られる２０種類の最も一般的な左旋性（Ｌ）アミノ酸、すなわち、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｕ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅｕ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン、（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、バリン（Ｖａｌ）を含む。
【００３５】
他の天然に生じるアミノ酸としては、たとえば、タンパク質合成とは関係のない代謝過程で合成されるアミノ酸があげられる。たとえば、アミノ酸であるオルニチンやシトルリンは、尿素の生成時に哺乳類での代謝で合成される。
【００３６】
本発明において有用なペプチドには、１種以上の非天然型のアミノ酸を含むことが可能である。非天然型のアミノ酸は、Ｌ−、右旋性（Ｄ）またはこれらの混合物であり得る。ペプチドは、天然に生じるアミノ酸を含まないものであってもよい。
【００３７】
非天然型のアミノ酸は、一般に生きた生物体の普通の代謝過程では合成されず、タンパク質中に天然に生じないアミノ酸である。また、本発明において有用な非天然型のアミノ酸は、好ましくは、一般的なプロテアーゼによっても認識されないものである。
【００３８】
非天然型のアミノ酸は、ペプチドのどのような位置にも存在し得る。たとえば、非天然型のアミノ酸は、Ｎ末端、Ｃ末端あるいは、Ｎ末端とＣ末端との間の任意の位置にあればよい。
【００３９】
非天然のアミノ酸は、たとえば、アルキル基、アリール基またはアルキルアリール基を含むものであってもよい。アルキルアミノ酸のいくつかの例として、α−アミノ酪酸、β−アミノ酪酸、γ−アミノ酪酸、δ−アミノ吉草酸、ε−アミノカプロン酸があげられる。アリールアミノ酸のいくつかの例として、オルト−、メタ−、パラ−アミノ安息香酸があげられる。アルキルアリールアミノ酸のいくつかの例として、オルト−、メタ−、パラ−アミノフェニル酢酸ならびに、γ−フェニル−β−アミノ酪酸があげられる。
【００４０】
また、非天然型のアミノ酸は、天然に生じるアミノ酸の誘導体を含む。天然に生じるアミノ酸の誘導体は、たとえば、天然に生じるアミノ酸に対する１種以上の化学基の付加を含むものであってもよい。
【００４１】
たとえば、１種以上の化学基を、フェニルアラニンまたはチロシン残基の芳香環の２’、３’、４’、５’または６’位のうちの１以上あるいは、トリプトファン残基のベンゾ環の４’、５’、６’または７’位に付加することが可能である。この基は、芳香環に付加可能などのような化学基であってもよい。このような基のいくつかの例として、分岐鎖または非分岐のＣ1〜Ｃ4アルキル（メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルまたはｔ−ブチルなど）、Ｃ1〜Ｃ4アルキルオキシ（すなわち、アルコキシ）、アミノ、Ｃ1〜Ｃ4アルキルアミノおよびＣ1〜Ｃ4ジアルキルアミノ（たとえば、メチルアミノ、ジメチルアミノ）、ニトロ、ヒドロキシル、ハロ（すなわち、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード）があげられる。天然に生じるアミノ酸の非天然型誘導体のいくつかの具体例として、ノルバリン（Ｎｖａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）があげられる。
【００４２】
本発明の方法において有用なペプチドでのアミノ酸の修飾のもうひとつの例に、ペプチドのアスパラギン酸またはグルタミン酸残基のカルボキシル基の誘導体化がある。誘導体化の一例が、アンモニアあるいは、第一級アミンまたは第二級アミン（メチルアミン、エチルアミン、ジメチルアミンまたはジエチルアミンなど）でのアミド化である。誘導体化のもうひとつの例として、たとえば、メチルまたはエチルアルコールでのエステル化があげられる。
【００４３】
もうひとつの当該修飾として、リシン、アルギニンまたはヒスチジン残基のアミノ基の誘導体化があげられる。たとえば、このようなアミノ基は、アシル化可能なものである。いくつかの好適なアシル基として、たとえば、アセチルまたはプロピオニル基など、上述したＣ1〜Ｃ4アルキル基のうちのいずれかを含むベンゾイル基またはアルカノイル基があげられる。
【００４４】
非天然型のアミノ酸は、一般的なプロテアーゼに対して好ましくは耐性であり、一層好ましくは非感受性である。プロテアーゼに対して耐性または非感受性の非天然型アミノ酸の例として、上述した天然に生じるＬ−アミノ酸のうちのいずれかの右旋性（Ｄ−）形態ならびに、Ｌ−および／またはＤ−非天然型のアミノ酸があげられる。Ｄ−アミノ酸は通常、タンパク質には発生しないが、細胞が持つ通常のリボソームタンパク質合成機構以外の手段で合成される特定のペプチド抗生物質に見いだされる。本明細書で使用する場合、Ｄ−アミノ酸を非天然型アミノ酸であるとみなす。
【００４５】
プロテアーゼ感受性を最小限に抑えるために、本発明の方法において有用なペプチドは、アミノ酸が天然型であるか非天然型であるかを問わず、一般的なプロテアーゼに認識される５未満、好ましくは４未満、一層好ましくは３未満、最も好ましくは２未満の連続したＬ−アミノ酸を含む必要がある。最適なのは、ペプチドがＤ−アミノ酸だけを含み、Ｌ−アミノ酸を含まない場合である。
【００４６】
ペプチドがアミノ酸のプロテアーゼ感受性配列を含む場合、これらのアミノ酸のうちの少なくとも１個が好ましくは非天然に生じるＤ−アミノ酸で、プロテアーゼ耐性を持たせている。プロテアーゼ感受性配列の一例として、エンドペプチダーゼおよびトリプシンなど、一般的なプロテアーゼによって容易に切断される２個以上の連続した塩基性アミノ酸があげられる。塩基性アミノ酸の例として、アルギニン、リシンおよびヒスチジンがあげられる。
【００４７】
好適な実施形態では、芳香族カチオン性ペプチドが、ペプチドにおけるアミノ酸残基の総数に比して生理学的ｐＨで正味の正電荷の最小数を有する。生理学的ｐＨで正味の正電荷の最小数を、以下では（ｐm）とする。ペプチドにおけるアミノ酸残基の総数を以下では（ｒ）とする。
【００４８】
後述する正味の正電荷の最小数は、いずれも生理学的ｐＨでのものである。「生理学的ｐＨ」という表現は、本明細書で使用する場合、哺乳類の体の組織および臓器の細胞における正常なｐＨを示す。たとえば、人間の生理学的ｐＨは通常７．４前後であるが、哺乳動物の正常な生理学的ｐＨは約７．０〜約７．８の間のｐＨであり得る。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「正味の電荷」とは、ペプチド中に存在するアミノ酸が持つ正電荷数と負電荷数のバランスを示す。本明細書では、正味の電荷が生理学的ｐＨで測定したものであることは理解できよう。生理学的ｐＨで正に荷電した天然に生じるアミノ酸としては、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジンがあげられる。生理学的ｐＨで負に荷電した天然に生じるアミノ酸としては、Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸があげられる。
【００５０】
一般に、ペプチドは正に荷電したＮ末端アミノ基と負に荷電したＣ末端カルボキシル基とを有する。これらの電荷は、生理学的ｐＨで互いに打ち消し合う。
【００５１】
本発明の一実施形態では、芳香族カチオン性ペプチドは、３ｐmがｒ＋１以下の最大数である、生理学的ｐＨでの正味の正電荷の最小数（ｐm）とアミノ酸残基の総数（ｒ）との関係を有する。この実施形態では、正味の正電荷の最小数（ｐm）とアミノ酸残基の総数（ｒ）との関係が以下のようになる。
【００５２】
【表１】
2019059785.tif 000007
【００５３】
もうひとつの実施形態では、芳香族カチオン性ペプチドが、２ｐmがｒ＋１以下の最大数である、正味の正電荷の最小数（ｐm）とアミノ酸残基の総数（ｒ）との関係を有する。この実施形態では、正味の正電荷の最小数（ｐm）とアミノ酸残基の総数（ｒ）との関係が以下のようになる。
【００５４】
【表２】
2019059785.tif 000008
【００５５】
一実施形態では、正味の正電荷の最小数（ｐm）とアミノ酸残基の総数（ｒ）とが等しい。もうひとつの実施形態では、ペプチドが、３個または４個のアミノ酸残基と、最低１個の正味の正電荷、好ましくは、最低２個の正味の正電荷、一層好ましくは最低３個の正味の正電荷を有する。
【００５６】
好適な実施形態では、芳香族カチオン性ペプチドが、正味の正電荷の総数（ｐt）に比して芳香族基の最小数を有する。芳香族基の最小数を以下では（ａ）とする。
【００５７】
芳香族基を有する天然に生じるアミノ酸としては、アミノ酸ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニンがあげられる。たとえば、ヘキサペプチドＬｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐには、正味の正電荷が２個（リシンおよびアルギニン残基によるもの）と３個（チロシン、フェニルアラニンおよびトリプトファン残基によるもの）の芳香族基がある。
【００５８】
本発明の一実施形態では、本発明の方法において有用な芳香族カチオン性ペプチドは、ｐtが１であればａも１であってもよい場合を除き、３ａがｐt＋１以下の最大数である、生理学的ｐＨ（ｐt）での芳香族基の最小数（ａ）と正味の正電荷の総数との関係を有する。この実施形態では、芳香族基の最小数（ａ）と正味の正電荷の総数（ｐt）との関係が以下のようになる。
【００５９】
【表３】
2019059785.tif 000009
【００６０】
もうひとつの実施形態では、芳香族カチオン性ペプチドが、２ａがｐt＋１以下の最大数である、芳香族基の最小数（ａ）と正味の正電荷の総数（ｐt）との関係を有する。この実施形態では、芳香族アミノ酸残基の最小数（ａ）と正味の正電荷の総数（ｐt）との関係が以下のようになる。
【００６１】
【表４】
2019059785.tif 000010
【００６２】
もうひとつの実施形態では、芳香族基の数（ａ）と正味の正電荷の総数（ｐt）とが等しい。
【００６３】
カルボキシル基、特にＣ末端アミノ酸の末端カルボキシル基を、たとえばアンモニアでアミド化し、Ｃ末端アミドを形成してもよい。あるいは、Ｃ末端アミノ酸の末端カルボキシル基を、適当な第一級または第二級アミンでアミド化してもよい。第一級または第二級アミンは、たとえば、アルキル、特に分岐鎖または非分岐のＣ1〜Ｃ4アルキルあるいはアリールアミンであってもよい。したがって、ペプチドのＣ末端のアミノ酸を、アミド、Ｎ−メチルアミド、Ｎ−エチルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルアミド、Ｎ−フェニルアミドまたはＮ−フェニル−Ｎ−エチルアミド基に変換してもよい。
【００６４】
本発明の芳香族カチオン性ペプチドのＣ末端には生じない、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸残基の遊離カルボン酸基を、これがペプチド内で生じる場所でアミド化してもよい。これらの内部位置でのアミド化は、上述したアンモニアあるいは、第一級または第二級アミンのいずれかで実施することができる。
【００６５】
一実施形態では、本発明の方法において有用な芳香族カチオン性ペプチドが、２個の正味の正電荷と、少なくとも１個の芳香族アミノ酸とを有するトリペプチドである。特定の実施形態では、本発明の方法において有用な芳香族カチオン性ペプチドが、２個の正味の正電荷と、２個の芳香族アミノ酸とを有するトリペプチドである。
【００６６】
本発明の方法において有用な芳香族カチオン性ペプチドは、以下のペプチド例を含むが、これに限定されるものではない。
Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ2、
Ｄ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＮＨ2、
Ｔｒｐ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2、
Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ、
Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−ＮＨ2、
Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ、
Ｄ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ、
Ｌｙｓ−Ｄ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−ＮＨ2、
Ｐｈｅ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ、
Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ2、
Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2、
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ、
Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｈｉｓ−ＮＨ2、
Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ、
Ａｓｐ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ2、
Ｄ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ2、
Ａｌａ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、
Ｔｙｒ−Ｄ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ、
Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2、
Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ、
Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ、
Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＮＨ2、
Ａｒｇ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ、
Ｄ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2、
Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ、
Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−ＮＨ2、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ、
Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｄ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−ＮＨ2。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本発明の方法において有用なペプチドは、チロシン残基またはチロシン誘導体を有するペプチドである。チロシンの好ましい誘導体としては、２’−メチルチロシン（Ｍｍｔ）、２’，６’−ジメチルチロシン（２’６’Ｄｍｔ）、３’，５’−ジメチルチロシン（３’５’Ｄｍｔ）、Ｎ，２’，６’−トリメチルチロシン（Ｔｍｔ）、２’−ヒドロキシ−６’−メチルチロシン（Ｈｍｔ）があげられる。
【００６８】
一実施形態では、ペプチドが、式Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2（本明細書ではＳＳ−０１と呼ぶ）で表される。ＳＳ−０１は、アミノ酸であるチロシン、アルギニン、リシンによる３個の正味の正電荷と、アミノ酸であるフェニルアラニンおよびチロシンによる２個の芳香族基を有する。ＳＳ−０１のチロシンは、式２’，６’−Ｄｍｔ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2で表される化合物（本明細書ではＳＳ−０２と呼ぶ）を生成するための２’，６’−ジメチルチロシンにおける誘導体などチロシンの修飾された誘導体であってもよい。
【００６９】
好適な実施形態では、Ｎ末端のアミノ酸残基がアルギニンである。このようなペプチドの一例に、Ｄ−Ａｒｇ−２’６’Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（本明細書ではＳＳ−３１と呼ぶ）がある。
【００７０】
もうひとつの実施形態では、Ｎ末端のアミノ酸は、フェニルアラニンまたはその誘導体である。フェニルアラニンの好ましい誘導体としては、２’−メチルフェニルアラニン（Ｍｍｐ）、２’，６’−ジメチルフェニルアラニン（Ｄｍｐ）、Ｎ，２’，６’−トリメチルフェニルアラニン（Ｔｍｐ）、２’−ヒドロキシ−６’−メチルフェニルアラニン（Ｈｍｐ）があげられる。このようなペプチドの一例に、Ｐｈｅ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2（本明細書ではＳＳ−２０と呼ぶ）がある。一実施形態では、ＤｍｔがＮ末端にこないようにＳＳ−０２のアミノ酸配列を変更する。このような芳香族カチオン性ペプチドの一例が、式Ｄ−Ａｒｇ−２’６’Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（ＳＳ−３１）で表される。
【００７１】
さらに別の実施形態では、芳香族カチオン性ペプチドが、式Ｐｈｅ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−ＮＨ2（本明細書ではＳＳ−３０と呼ぶ）で表される。あるいは、Ｎ末端フェニルアラニンが、２’，６’−ジメチルフェニルアラニン（２’６’Ｄｍｐ）などフェニルアラニンの誘導体であってもよい。アミノ酸位置１に２’，６’−ジメチルフェニルアラニンを含むＳＳ−０１は、式２’，６’−Ｄｍｐ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−ＮＨ2で表される。
【００７２】
ＳＳ−２０、ＳＳ−３１ならびにこれらの誘導体はさらに、機能的類似体を含み得る。類似体がＳＳ−２０またはＳＳ−３１と同じ機能を持つ場合に、ペプチドはＳＳ−２０またはＳＳ−３１の機能的類似体とみなされる。類似体は、たとえば、１個以上のアミノ酸が別のアミノ酸で置換された、ＳＳ−０１またはＳＳ−３１の置換変異体であってもよい。
【００７３】
ＳＳ−２０またはＳＳ−３１の好適な置換変異体として、保存されたアミノ酸置換があげられる。アミノ酸については、その物理化学的特徴に応じて以下のように分類できる。  （ａ）非極性アミノ酸：Ａｌａ（Ａ）Ｓｅｒ（Ｓ）Ｔｈｒ（Ｔ）Ｐｒｏ（Ｐ）Ｇｌｙ（Ｇ）Ｃｙｓ（Ｃ）、
（ｂ）酸性アミノ酸：Ａｓｎ（Ｎ）Ａｓｐ（Ｄ）Ｇｌｕ（Ｅ）Ｇｌｎ（Ｑ）、
（ｃ）塩基性アミノ酸：Ｈｉｓ（Ｈ）Ａｒｇ（Ｒ）Ｌｙｓ（Ｋ）、
（ｄ）疎水性アミノ酸：Ｍｅｔ（Ｍ）Ｌｅｕ（Ｌ）Ｉｌｅ（Ｉ）Ｖａｌ（Ｖ）、
（ｅ）芳香族アミノ酸：Ｐｈｅ（Ｆ）Ｔｙｒ（Ｙ）Ｔｒｐ（Ｗ）Ｈｉｓ（Ｈ）。
【００７４】
ペプチドにおける同一群の別のアミノ酸によるアミノ酸の置換は、保存された置換と呼ばれ、元のペプチドの物理化学的特徴を保持できる。対照的に、ペプチドにおける異なる群の別のアミノ酸によるアミノ酸の置換は、通常は元のペプチドの特徴を変えてしまうことが多い。本発明を実施するにあたって有用な類似体の例として、表５に示す芳香族カチオン性ペプチドがあげられるが、これに限定されるものではない。
【００７５】
【表５】
2019059785.tif 000011
【００７６】
特定の状況下で、オピオイド受容体アゴニスト活性も有するペプチドを用いると都合がよいこともある。本発明を実施するにあたって有用な類似体の例として、表６に示す芳香族カチオン性ペプチドがあげられるが、これに限定されるものではない。
【００７７】
【表６】
2019059785.tif 000012
【００７８】
【表７】
2019059785.tif 000013
【００７９】
【表８】
2019059785.tif 000014
【００８０】
Ｄａｂ  ＝  ジアミノ酪酸
Ｄａｐ  ＝  ジアミノプロピオン酸
Ｄｍｔ  ＝  ジメチルチロシン
Ｍｍｔ  ＝  ２’−メチルチロシン
Ｔｍｔ  ＝  Ｎ，２’，６’−トリメチルチロシン
Ｈｍｔ  ＝  ２’−ヒドロキシ，６’−メチルチロシン
ｄｎｓＤａｐ  ＝  β−ダンシル−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸
ａｔｎＤａｐ  ＝  β−アントラニロイル−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸
Ｂｉｏ  ＝  ビオチン
【００８１】
表５および６に示すペプチドのアミノ酸は、Ｌ−配置またはＤ−配置のいずれであってもよい。
【００８２】
ペプチドの合成
本発明の方法において有用なペプチドは、従来技術において周知の方法によって化学的に合成されたものであってもよい。タンパク質を合成するための好適な方法としては、たとえば、ＳｔｕａｒｔおよびＹｏｕｎｇによって“Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （１９８４）ならびに“Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２８９，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９７）に記載されているものなどがあげられる。
【００８３】
被検体における腎障害を保護および治療するための方法
概要  本明細書に記載の芳香族カチオン性ペプチドは、被検体の腎臓を腎障害から保護する上で有用である。急性腎障害（ＡＲＩ）は、患者の血液から老廃物を排泄するための腎機能の低下を示す。ＡＲＩには一般に、尿がほとんど生成されないか、まったく生成されないほど低レベルまで糸球体濾過量（ＧＦＲ）が低下することを含むという特徴がある。このため、通常であれば腎臓が排除する物質が体内に残ったままになる。
【００８４】
ＡＲＩの原因は多岐にわたるが、次の３つのカテゴリに分類できる。（１）ショック／心停止時あるいは出血後に見られるような全身血圧の低下などによって、腎臓に適切な量の血液が供給されない腎前性ＡＲＩ、（２）薬剤性毒性などによって腎臓内で不全症が生じる腎性ＡＲＩ、（３）腎結石または膀胱／前立腺癌がゆえの尿管閉塞に見られるような、腎臓からの尿の流れの障害によって引き起こされる腎後性ＡＲＩ。ＡＲＩが、これらのカテゴリのうちのいずれか１つまたは組み合わせと関連していることもある。
【００８５】
場合によっては、急性腎障害を早期に診断して治療すれば、急性腎障害から慢性腎不全への進行を予防できることがある。ＡＲＩには、放置すれば腎線維症や慢性腎不全へとつながりかねない炎症反応を伴う。慢性腎不全（ＣＲＦ）とは、進行性の腎機能喪失と不可逆的な腎臓の障害を示す。
【００８６】
腎機能を評価するための方法は従来技術において周知であり、全身血圧および糸球体毛細血管圧、タンパク尿（アルブミン尿など）、顕微鏡的および肉眼的血尿、血清クレアチニンレベル（人間の腎機能を推測するためのひとつの式では、クレアチニンレベル２．０ｍｇ／ｄｌを正常な腎臓機能の５０パーセント、４．０ｍｇ／ｄｌを２５パーセントとするなど）、糸球体濾過量（ＧＦＲ）（クレアチニンクリアランス速度など）の低下、尿細管障害の度合いの測定を含むがこれに限定されるものではない。たとえば、このような評価は、血清クレアチニンレベル、クレアチニンクリアランス速度、２４時間尿タンパク分泌、糸球体濾過量（ＧＦＲ）、尿アルブミンクレアチニン速度、アルブミン排泄速度、腎生検試料などの生物学的および／または生理学的パラメータを用いて少なくとも１つの腎臓機能を見極めることを含むものであってもよい。
【００８７】
腎構造の変質を評価するための方法も周知である。例示的な方法を実施例で説明する。このような方法として、腎臓の画像化（ＭＲＩ、超音波など）または腎生検試料の組織学的見極めがあげられる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、たとえば、尿細管間質性または糸球体損傷の程度および／または腎線維症（コラーゲンおよびフィブロネクチンの堆積など）の度合いで判断される腎構造の変質を低減する。
【００８８】
腎機能および疾患状態に関する詳細な説明については、Ｔｈｅ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  ｅｄｓ．  Ｓｅｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ３ｒｄ  ｅｄ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  ２０００を参照のこと。通常、２４時間という時間あたり０．１５ｇ未満のタンパク質が尿に排泄される。ほぼすべてのタイプの腎臓疾患で、尿に対して軽度（１日あたり最大５００ｍｇ）から中程度（１日あたり最大４ｇ）のタンパク質漏洩が生じる。正常な尿中アルブミン濃度は１．０ｍｇ／ｄｌ未満である。通常、尿中アルブミンが３０〜３００ｍｇ／ｄｌの場合はミクロアルブミン尿とみなされ、３００ｍｇ／ｄｌ以上だとマクロアルブミン尿とみなされる。血清クレアチニンの正常値は、男性で０．６〜１．５ｍｇ／ｄｌ、女性で０．６〜１．１ｍｇ／ｄｌである。
【００８９】
虚血によって生じるＡＲＩを予防または治療する方法  腎臓が腎臓に対する適切な量の血液供給を受けることのできない症状の一例に、虚血がある。虚血はＡＲＩの主な原因のひとつである。一方または両方の腎臓での虚血は、大動脈手術や腎移植時、あるいは心血管麻酔時に認められる一般的な問題である。また、腎動脈上腹部大動脈瘤および傍腎動脈腹部大動脈瘤の手術や腎移植など大動脈および／または腎動脈のクランプを伴う外科的手法が特に、かなりの術後合併症ならびに早期の同種移植片拒絶につながる腎性貧血を生じやすい。このような形態の手術を受けている高リスク患者では、腎機能障害の出現率が５０％と高いことが報告されている。
【００９０】
虚血は、重篤な下痢症または火傷、ショック、さらには移植前におけるドナー腎臓の保存と関連のある虚血の結果として、体から血液が失われたり、体液が失われたりすることで生じる場合がある。これらの状況では、尿細管上皮細胞での虚血傷害、尿細管腔への上皮細胞の脱落、糸球体濾過の喪失につながる尿細管流の閉塞、急性腎障害を引き起こすのに十分な時間にわたり、危険なほど低レベルまで腎臓への血流が減少することがある。
【００９１】
また、麻酔後や手術後、あるいはα−アドレナリン作動薬の摂取後に、これに関連する全身血管収縮または腎血管収縮によって、被検体がＡＲＩの被害を受けやすくなることもある。さらに、アナフィラキシーによって生じる全身血管拡張ならびに、降圧薬、敗血症または薬剤の過剰投与でも、体が本来持っている防御すなわち、腎臓などの非必須臓器の血管収縮が中断されるため、ＡＲＩを生じることがある。
【００９２】
したがって、一実施形態では、ＡＲＩの危険性のある被検体が、腎臓に対する血液供給または血圧が中断または低下している被検体であってもよい。これらの被検体には、このような血液供給の中断または低減よりも前またはこれと同時に本発明の芳香族カチオン性ペプチドを投与してもよい。同様に、虚血を治療するための治療用作用剤よりも後で芳香族カチオン性ペプチドを投与してもよい。
【００９３】
薬剤性毒性によって生じるＡＲＩを予防または治療する方法  ＡＲＩのもうひとつの原因として、薬剤性毒性があげられる。たとえば、腎毒素によって、直接的な毒性が尿細管上皮細胞に引き起こされる可能性がある。腎毒素としては、シスプラチン、ゲンタマイシン、セファロリジン、シクロスポリン、アムホテリシンなどの治療薬、放射線造影剤染料（詳細については後述）、農薬（パラコートなど）、環境汚染物質（トリクロロエチレンおよびジクロロアセチレンなど）があげられるが、これに限定されるものではない。他の例として、ピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮ）；ゲンタマイシンなどのアミノ配糖体；セファロリジンなどのセファロスポリン；タクロリムスまたはシロリムスなどのカルシニューリン阻害剤があげられる。また、非ステロイド系抗炎症薬、抗レトロウイルス薬、抗サイトカイン薬、免疫抑制薬、腫瘍学的な薬剤またはＡＣＥ阻害剤によって薬剤性腎毒性が引き起こされることもある。薬剤性腎毒性はさらに、鎮痛薬乱用、シプロフロキサシン、クロピドグレル、コカイン、ｃｏｘ−２阻害剤、利尿薬、ホスカメット、金、イホスファミド、イムノグロビン、漢方薬、インターフェロン、リチウム、マンニトール、メサラミン、マイトマイシン、ニトロソウレア、ペニシラミン、ペニシリン、ペンタミジン、キニーネ、リファンピン、ストレプトゾシン、スルホンアミド、チクロピジン、トリアムテレン、バルプロ酸、ドキソルビシン、グリセロール、シドホビル、トブラマイシン、硫酸ネオマイシン、コリスチメタート、バンコマイシン、アミカシン、セフォタキシム、シスプラチン、アシクロビル、リチウム、インターロイキン−２、シクロスポリンまたはインジナビルによって生じることもある。
【００９４】
尿細管上皮細胞への直接的な毒性に加えて、腎毒素によっては腎灌流も減少させて、酸素利用率が限られていることが知られている領域の損傷を引き起こすことがある（髄質内部領域）。このような腎毒素として、アムホテリシンおよび放射線造影剤染料があげられる。腎不全は、虚血、体液量減少、閉塞または感染と組み合わさると、これらの薬剤を臨床関連の用量で用いた場合にすら生じる可能性がある。その一例に、腎機能が損なわれた患者での放射線造影剤染料の使用がある。造影剤染料腎症（ＣＩＮ）の出現率は正常な患者で３〜８％であるが、真性糖尿病の患者では２５％まで上昇する。ＡＲＩのほとんどの症例が、素因的併存症のある患者で発生する（ＭｃＣｏｍｂｓ，  Ｐ．Ｒ．  ＆  Ｒｏｂｅｒｔｓ，  Ｂ．  Ｓｕｒｇ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｂｓｔｅｔ，  １４８：１７５〜１７８  （１９７９））。
【００９５】
したがって、一実施形態では、ＡＲＩの危険性のある被検体は、腎毒性作用のある１種以上の治療薬を投与されていることがある。これらの被検体には、本発明の芳香族カチオン性ペプチドを、当該治療用作用剤よりも前またはこれと同時に投与してもよい。同様に、芳香族カチオン性ペプチドを治療用作用剤よりも後で投与して腎毒性を治療してもよい。
【００９６】
放射線造影剤によって生じるＡＲＩを予防または治療する方法  一実施形態では、造影剤腎症（ＣＩＮ）の危険性のある被検体に対して、被検体をこの症状から保護するために本発明の芳香族カチオン性ペプチドを投与する。ＣＩＮは急性腎不全の重要な原因のひとつである。ＣＩＮは、血管内Ｘ線造影物質への曝露後４８時間以内に発生する急性腎不全と定義される。ＣＩＮは、Ｘ線による手技に伴う一般的な合併症である。
【００９７】
冠動脈、心臓または神経血管造影法の際などに、被検体が放射線造影剤染料に曝露されると、ＣＩＮが生じる。造影剤染料を用いると、体内の閉塞組織を医師が可視的に確認できるため、このような染料は多くの診断や介入治療に必須である。ＣＩＮの危険性が最も高い被検体は、高齢者と糖尿病や慢性の腎臓疾患がある被検体、あるいは心不全が進行した被検体である。血清クレアチニン試験を用いて、ＣＩＮの発症を観察したり、治療を観察したり、さらにはＣＩＮの発症から被検体を保護する上での本発明のペプチドの効果を観察したりすることが可能である。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ＣＩＮから保護するために、造影剤の投与よりも前またはこれと同時に、本発明の芳香族カチオン性ペプチドを被検体に投与する。たとえば、被検体は、造影剤の使用よりも約１〜２時間、約１〜６時間、約１〜１２時間、約１〜２４時間または約１〜４８時間前に、ペプチドの投与を受けてもよい。同様に、造影剤とほぼ同時にペプチドを被検体に投与してもよい。さらに、被検体に対するペプチドの投与を、造影剤の投与後に継続してもよい。いくつかの実施形態では、ＣＩＮに対する保護または予防効果を発揮するために、造影剤の投与後、約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、２４、４８時間間隔で被検体がペプチドの投与を受け続けてもよい。
【００９９】
いくつかの実施形態では、ＣＩＮを治療するための造影剤の投与後に、本発明の芳香族カチオン性ペプチドを被検体に投与する。たとえば、被検体は、造影剤を使用した約１〜２時間、約１〜６時間、約１〜１２時間、約１〜２４時間、約１〜４８時間または約１〜７２時間後に、ペプチドの投与を受けてもよい。たとえば、本発明のペプチドの投与を受ける前に、被検体が、血清クレアチニンレベルの上昇および／または尿量減少などのＣＩＮの１種以上の兆候または症候を呈することがある。本発明のペプチドを投与すると、ペプチドを投与されていない対照被検体と比較して、被検体における腎臓の機能を示す上記の指標のうち１つ以上が改善される。
【０１００】
造影剤のタイプ．ＣＩＮの出現率は、使用する造影剤の化学構造、特にモル浸透圧濃度およびイオン（または非イオン）構造に影響される（Ｚｉｒｏｇｉａｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  ｃａｒｄｉａｃ  ｃａｔｈｅｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．”  Ｈｅｌｌｅｎｉｃ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ，  ４５：０７〜１１３  （２００４）を参照のこと）。本明細書で使用する場合、「造影剤」とは、ＣＴまたはＭＲＩスキャンなどの画像における体内構造の可視性を改善する目的で用いられる化合物を示す。また、「造影剤」という用語を、本明細書では「画像化剤」とも呼ぶ。画像化剤としては、染料、蛍光染料、金粒子、酸化鉄粒子ならびに、常磁性分子を含む他の造影剤、ｘ線減衰化合物（ＣＴおよびｘ線用）、超音波用造影剤、γ線放出アイソトープ（シンチグラフィ）、ポジトロン放出アイソトープ（ＰＥＴ）など、従来技術において周知のものがあげられる。造影剤は、たとえば、非経口注射（静脈内、動脈内、髄腔内、腹腔内、皮下、筋肉内など）、経口（錠剤または飲料として）、直腸または吸入によって被検体に投与可能である。
【０１０１】
たとえば、Ｘ線造影剤が硫酸バリウムを含むものであってもよいし、有機（非イオン性）化合物またはイオン性化合物にヨウ素を含むものであってもよい。ヨウ素造影剤の例として、表７に示すものがあげられる。
【０１０２】
【表９】
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【０１０３】
ＭＲＩ造影剤は、常磁性造影剤（ガドリニウム化合物など）、超常磁性造影剤（酸化鉄ナノ粒子など）、反磁性作用剤（硫酸バリウムなど）、これらの組み合わせを含むものであってもよい。ＭＲＩに好ましい金属イオンとして、原子数２１〜２９、３９〜４７または５７〜８３のもの、一層好ましくは、原子数２１〜２９、４２、４４または５７〜８３の金属イオンの常磁性形態があげられる。特に好ましい常磁性金属イオンは、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩおよびＩＩＩ）、Ｃｒ（ＩＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｄｙ（ＩＩＩ）、Ｔｂ（ＩＩＩおよびＩＶ）、Ｈｏ（ＩＩＩ）、Ｅｒ（ＩＩＩ）、Ｐｒ（ＩＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩおよびＩＩＩ）からなる群から選択される。Ｇｄ（ＩＩＩ）が特に有用である。本明細書で使用する場合、「Ｇｄ」という用語は、金属ガドリニウムのイオン形態を含むことを意図している点に注意されたい。このようなイオン形態は、ＧＤ（ＩＩＩ）、ＧＤ３＋などと記述可能であり、企図するイオン形態に差異はない。ＣＴ造影剤は、ヨウ素（イオン性または非イオン性製剤）、バリウム、硫酸バリウム、Ｇａｓｔｒｏｇｒａｆｉｎ（ジアトリゾ酸メグルミンおよびジアトリゾ酸ナトリウム溶液）、これらの組み合わせを含むものであってもよい。もうひとつの実施形態では、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ造影剤が金属キレートを含むものであってもよい。
【０１０４】
上述したように、造影剤としては、１種以上のヨウ素部分を有する分子があげられるが、これに限定されるものではない。ヨウ素は、有機化合物またはイオン性化合物のいずれかで結合していてもよい。最も初期の造影剤は、水溶液中でヨウ素から解離するナトリウム原子を含むイオンであった。有機化合物は、解離して成分の分子に戻ることがないため、副作用が少なめである。
【０１０５】
ヨウ素系造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）は、水溶性、水不溶性、油性の造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）に分けられる。水不溶性造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）としては、気管支造影で用いられるプロピリオドン（Ｄｉｏｎｏｓｉｌ（登録商標））の水性懸濁液があげられる。油性造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）としては、ケシ油中のヨウ素４０％の安定した化合物であるＬｉｐｉｏｄｏｌならびに、それぞれヨウ素含有率４８％および３７％のケシ油のヨウ素系脂肪酸のエチルエステルであるＬｉｐｉｏｄｏｌ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）流体およびＥｔｈｉｏｄｏｌ（登録商標）があげられる。これらの油はリンパ管造影に用いられ、子宮卵管造影にも用いられることがある。ヨードフェニルウンデシル酸（イオフェンジラート）は、油による脊髄造影用の造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉｕｍ）（商品名：Ｐａｎｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）、Ｍｙｏｄｉｌ（登録商標））である。
【０１０６】
水溶性造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）は、ヨウ素系造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）の最高に大きな群をなす。これらの造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）は、高浸透圧、低浸透圧、等浸透圧造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）に分類できる。モル浸透圧濃度は、これらの造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）の有害事象のいくつかと関連している。モノマーイオン性造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）は、経口胆嚢造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）および尿路／血管造影剤という２つの主な群をなす。これらの造影剤（ｍｅｄｉａ）の例として、アセトリゾ酸（Ｄｉａｇｉｎｏｌ（登録商標）、Ｕｒｏｋｏｎ（登録商標））；ジアトリゾ酸（Ａｎｇｉｏｇｒａｆｉｎ（登録商標）、Ｈｙｐａｑｕｅ（登録商標）、Ｒｅｎｏｇｒａｆｉｎ（登録商標）、Ｕｒｏｇｒａｆｉｎ（登録商標）、Ｕｒｏｖｉｓｏｎ（登録商標））；ヨーダミド（Ｕｒｏｍｉｒｏ（登録商標））；イオグリク酸（Ｒａｙｖｉｓｔ（登録商標））；イオタラム酸（Ｃｏｎｒａｙ（登録商標））；イオキシタラム酸（Ｔｅｌｅｂｒｉｘ（登録商標））；メトリゾ酸（Ｉｓｏｐａｑｕｅ（登録商標）、Ｔｒｉｏｓｉｌ（登録商標））があげられる。
【０１０７】
尿路／血管造影剤はいずれも、三ヨウ素系安息香酸の誘導体の塩であり、３位と５位の側鎖だけが異なる。塩のカチオンは、主にナトリウムまたはメグルミンのいずれかであるか、その両方の混合物である。ナトリウム塩は通常、メグルミンよりも血管内皮および血液脳関門ならびに神経組織に対する毒性が高い。ナトリウムとメグルミンの混合物は、それぞれの塩単独の場合よりも心毒性が低い。製造業者によっては、ナトリウムを部分的にカルシウムやマグネシウムで代置して毒性を抑えていることもある。
【０１０８】
血管内用のイオン性モノマー造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）は、モル浸透圧濃度が通常の臨床用途で血漿の７〜８倍になる、いわゆる高浸透圧性造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）（ＨＯＣＭ）である。この高モル浸透圧濃度は、痛み、内皮障害、血栓症および血栓性静脈炎、血液脳関門の乱れ、心血管造影時の徐脈、肺循環時の血圧上昇などのいくつかの自覚的および他覚的有害作用の原因である。低浸透圧性造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）（ＬＯＣＭ）を導入すれば、これらの副作用が実質的に抑えられる。モル浸透圧濃度は、容積単位溶液あたりの分子数に左右される。イオン性モノマー作用剤は、解離して２つの分子になる塩であり、一方のアニオンが３つのヨウ素原子がゆえの放射線不透過特性を有し、もう一方のカチオンには放射線不透過特性がない。これらの作用剤は、３：２または比１．５作用剤（分子２個あたりヨウ素原子３個）とも呼ばれる。Ｘ線吸収率を損なうことなくモル浸透圧濃度が低めの造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）を得るための手法には、次の３通りがある。１）非イオン性モノマー、２）イオン性ダイマーまたは３）非イオン性ダイマーの生成。非イオン性造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）は、解離することがなく、その水溶性は通常、いくつかの親水性ヒドロキシル基によって達成される。三ヨウ素系非イオン性モノマーは、モル浸透圧濃度がイオン性モノマー（３：１または比３作用剤である）の約半分である。いくつかの作用剤が、非イオン性モノマー系造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）のすぐに使える都合のよい形の溶液で入手可能であり、メトリザミド（Ａｍｉｐａｑｕｅ（登録商標））；イオヘキソール（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ（登録商標））；イオパミドール（Ｉｏｐａｍｉｒｏ（登録商標）、Ｉｓｏｖｕｅ（登録商標）、Ｎｉｏｐａｍ（登録商標）、Ｓｏｌｕｔｒａｓｔ（登録商標））；イオペントール（Ｉｍａｇｏｐａｑｕｅ（登録商標））；イオプロミド（Ｕｌｔｒａｖｉｓｔ（登録商標））；イオベルソール（Ｏｐｔｉｒａｙ（登録商標））を含む。
【０１０９】
これらの造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）は、３つの側鎖すべてに結合した親水性ヒドロキシル基を有し、その毒性を抑える一助となる特徴も有する。モル浸透圧濃度だけでなく、毒性は、化学構造すなわち化学毒性と呼ばれることもある固有の毒性にも左右される。造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉｕｍ）の毒性機序は完全には理解されていないが、化学毒性は媒質のタンパク質結合能と関連していると考えられている。これは、造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉｕｍ）と周囲の生物学的分子（酵素など）との間の非特異的な弱い相互作用によって引き起こされるものである。この相互作用は、イオン性作用剤にのみ存在する電気力と、造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）の場合は主にベンゼン環である分子の疎水性部分間の相互作用によって助長される。第２世代の非イオン性モノマーの多くの親水性側鎖基が、内側の疎水性ベンゼン環を相互作用から保護し、これによって化学毒性を抑えている。分子の相対的な疎水性／親水性は、その分配係数と呼ばれるが、親水性が高いとタンパク質の結合度が低くなるため、分配係数は小さいほど有利である。
【０１１０】
２個の三ヨウ素系ベンゼン環を有するダイマー系造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）は、主に次の３つの群をなす。イオン性静脈内胆嚢造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）、一酸性イオン性造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）、非イオン性造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）。後ろ２つの群はともに、いわゆる低浸透圧性造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）に属する。一酸性イオン性ダイマーは、ナトリウムメグルミンイオキサグル酸（Ｈｅｘａｂｒｉｘ（登録商標））の１つしかない。ダイマーアニオンにはカルボキシル基が１個あり、他のものは非イオン化側鎖基で置換されている。これによって、粒子２個あたりヨウ素原子６個となる。この造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉｕｍ）は、６：２（＝３：１）または比３作用剤（非イオン性モノマーと類似）である。ある程度はそのイオン特性、またある程度はヒドロキシル基が少ないことが原因で、モル浸透圧濃度が同等であれば非イオン性モノマーよりもイオキサグル酸のほうが毒性が高い（ただし、モル浸透圧濃度が低いため、イオン性モノマーよりは毒性が低い）。
【０１１１】
非イオン性ダイマーでは、１分子あたり６個のヨウ素原子が得られる（比６作用剤）。非イオン性ダイマー造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）の例として、イオトロラン（Ｉｓｏｖｉｓｔ（登録商標））およびイオジキサノール（Ｖｉｓｉｐａｑｕｅ（登録商標））があげられる。イオトロランは血漿に対してほぼ等浸透圧（０．３２ｏｓｍ／ｋｇ  Ｈ2Ｏ）であるのに対し、イオジキサノールは血漿に対して実際に低浸透圧である。血漿に対する等浸透圧濃度（０．２９ｏｓｍ／ｋｇ  Ｈ2Ｏ）は、適量の生理食塩水を加えればどのようなヨウ素濃度でも達成される。これらの作用剤は、等浸透圧濃度であることや、非イオン特性、極めて多数のヒドロキシル基を有する（低分配係数）事実などがあいまって、極めて低毒性である。
【０１１２】
尿路造影および血管造影用のさまざまな水溶性造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）（イオン性および非イオン性モノマー、非イオン性ダイマー）はいずれも、細胞外造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）であり、糸球体濾過によって代謝されずに排泄される。最初の６時間以内に注射した用量の８５〜９０％前後、最初の２４時間以内で９５〜１００％が尿中に認められる。通常、２％未満が便に見られることがある。
【０１１３】
非イオン性造影剤（分子中に６個のヨウ素アニオンを含有）は、イオン性造影剤（分子中に３個のヨウ素アニオンを含有）よりも腎毒性が低いと考えられていた。しかしながら、４４３名の患者を無作為に非イオン性（イオパミドール）とイオン性（ジアトリゾ酸）造影剤とに割り振った最近の研究で、ＣＩＮの出現率に統計的な差異は認められなかった（８．２と１０．２％）（Ｚｉｒｏｇｉａｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  ｃａｒｄｉａｃ  ｃａｔｈｅｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．」  Ｈｅｌｌｅｎｉｃ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ４５：１０７〜１１３  （２００４））。さらに、最近の実証結果でも、腎疾患が進行した患者でのＭＲＩ研究時のガドリニウム含有造影剤への曝露と腎性線維化性皮膚症の出現率との関連が指摘されている（Ａｇａｈｔｅｈｒａｎｉ  ａｎｄ  Ｍｏｕｓｓａ，  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，  ４：４９〜５９  （２００７））。よって、造影剤のタイプとは関係なく、腎不全の機序は同じであるように見え、本発明の芳香族カチオン性ペプチドは、これらの作用剤によって生じるＡＲＩの予防または治療に有用である。
【０１１４】
ＡＲＩにおける芳香族カチオン性ペプチドの別の用途  別の実施形態では、それを必要とする被検体が、尿流に障害のある被検体であってもよい。尿の流れに対する閉塞は、尿路のどこにでも起こり得るものであり、多くの異なる原因があり得る。このような原因として、腎結石または膀胱／前立腺癌があげられる。尿流閉塞と関連した一般的な臨床機能障害のひとつに、一側尿管結紮（ＵＵＯ）がある。これは、尿細管細胞アポトーシス、マクロファージ浸潤、間質性線維症とも関連している。間質性線維症は、低酸素環境につながり、外科的矯正にもかかわらず腎機能の進行性低下の一因となる。よって、ＵＵＯのある被検体またはその危険性のある被検体に、本発明の芳香族カチオン性ペプチドを投与して、被検体をＡＲＩから保護またはこれを治療することができる。
【０１１５】
本発明のさらに別の態様では、腎臓の保護を必要とする哺乳動物において、腎線維症から腎臓を保護するための方法が得られる。この方法は、上述したような有効量の芳香族カチオン性ペプチドを哺乳動物に投与することを含む。上述したペプチドは、上述したように、当業者間で周知の任意の方法で、これを必要とする哺乳動物に投与可能である。
【０１１６】
「線維症」という用語は、線維組織あるいは、子宮筋腫または線維性変性の異常な処理を示す。線維症は、さまざまな傷害または疾患が原因で生じ得るものであり、さまざまな臓器の移植に関する慢性の移植片拒絶が原因で生じることも多い。線維症は一般に、細胞外マトリクス成分の異常な生成、蓄積または堆積を伴い、これには、コラーゲンやフィブロネクチンなどの過生成と堆積増加も含まれる。本明細書で使用する場合、「腎線維症」という用語は、腎臓の線維症を示す。たとえば、腎線維症は、腎臓機能の悪化や障害につながる細胞外マトリクス成分、特にコラーゲンの過生成または異常な堆積と関連している。
【０１１７】
本発明のもうひとつ態様では、急性腎障害の治療を必要とする哺乳動物においてこれを治療するための方法が得られる。この方法は、上述したような有効量の芳香族カチオン性ペプチドを哺乳動物に投与することを含む。上述したペプチドは、上述したように、当業者間で周知の任意の方法で、これを必要とする哺乳動物に投与可能である。
【０１１８】
本発明の方法は、少なくともある程度は薬剤または化学物質の腎毒性に起因し得る腎機能不全、腎不全または末期腎不全の患者において特に有用なことがある。他の指標として、９７（男性）および８８（女性）ｍｌ／分未満のクレアチニンクリアランスレベル、血液尿素２０〜２５ｍｇ／ｄｌ以上があげられる。さらに、ミクロアルブミン尿、マクロアルブミン尿および／またはタンパク尿レベルが、２４時間の時間あたり１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｇまたはそれより多くを上回るおよび／または血清クレアチニンレベルが約１．０、１．５、２．０、２．５、３、３．５、４．０、４．５、５、５．５、６、７、８、９、１０ｍｇ／ｄｌまたはそれより高い患者で、治療が役立つ場合がある。
【０１１９】
本発明の方法を用いて、対照被検体に比して腎機能が２５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％またはそれよりもさらに正常未満の患者における腎疾患の進行を遅らせるまたは逆転させることが可能である。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、対照被検体に比して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれよりも多く腎機能の喪失を遅らせる。他の実施形態では、本発明の方法は、対照被検体に比して患者の血清クレアチニンレベル、タンパク尿および／または尿中アルブミン排泄を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれよりも多く改善するものである。腎機能を評価するための非限定的な例示としての方法は、本明細書ならびに、国際公開第ＷＯ  ０１／６６１４０号パンフレットに記載されている。
【０１２０】
もうひとつの実施形態では、移植前に急性腎障害から被検体の腎臓を保護するのに本発明において有用なペプチドを用いることができる。たとえば、摘出した腎臓を、上述したペプチドを含有する溶液に入れる。標準緩衝溶液中のペプチドの濃度については、当業者が容易に判断可能である。このような濃度は、たとえば、約０．０１ｎＭ〜約１０μＭ、約０．１ｎＭ〜約１０μＭ、約１μＭ〜約５μＭまたは約１ｎＭ〜約１００ｎＭであればよい。
【０１２１】
ＡＲＩを治療する方法  本発明のもうひとつの態様では、本発明は、急性腎障害の治療を必要とする被検体においてこれを治療するための方法を提供するものである。この方法は、上述したような有効量の芳香族カチオン性ペプチドを被検体に投与することを含む。上述したペプチドは、上述したように、当業者間で周知の任意の方法で、これを必要とする被検体に投与可能である。
【０１２２】
急性腎障害からの保護またはその治療が必要な被検体には、酸化障害に関連する疾患、症状に羅患またはその治療を受けている被検体も含まれる。一般に、酸化障害は、反応性酸素種（ＲＯＳ）および／または反応性窒素種（ＲＮＳ）などの遊離ラジカルによって引き起こされる。ＲＯＳおよびＲＮＳの例として、ヒドロキシルラジカル（ＨＯ・）、スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ2・-）、一酸化窒素（ＮＯ・）、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）、ペルオキシ亜硝酸アニオン（ＯＮＯＯ-）があげられる。
【０１２３】
虚血性または毒性の侵襲が、急性尿細管壊死（ＡＴＮ）と呼ばれる急性かつ可逆性のことも多い腎機能喪失の二次的疾患につながることがある。これは、ＡＲＩのもうひとつの一般的な原因である。ＡＴＮの過程は三相性である。ＡＴＮの開始期には、虚血および関連の血行力学的変化がきっかけとなる糸球体濾過量（ＧＦＲ）の急唆な降下が認められ、その後、致死下または致死的な尿細管上皮傷害が認められるのが特徴である。ＡＴＮの確立期または持続期は、ＧＦＲが低下し続けるのが特徴である。致死下の尿細管傷害としては、刷子縁の喪失、空砲形成、近位尿細管の平板化、尿細管の拡張があげられる。近位尿細管に細胞壊死が見られることもある。腎間質が浮腫性になる場合もあれば、他方では髄質に白血球性浸潤が観察される場合もある。遠位尿細管腔が円柱で閉塞される場合もあり、近位よりは遠位の尿細管上皮細胞のほうがアポトーシスに関与しやすい。このような構造的および機能的攪乱は、修復および再生応答によって腎構造が復旧してＧＦＲが正常化する回復または利尿期に解決されやすい。
【０１２４】
虚血および腎毒性物質によって生じるＡＲＩの一般的な機序は、ミトコンドリア機能異常およびＡＴＰ欠損を伴い、これが腎近位尿細管細胞（ＲＰＴＣ）傷害と壊死につながる。ＲＰＴＣは、特定の輸送機序での水、イオン、巨大分子の効率的な輸送を可能にする形態と機能の両方の点で、極めて特殊化されている。ＲＰＴＣは、極めて高密度のミトコンドリアを含有し、酸素を用いて酸化的リン酸化とＡＴＰの合成を維持しているが、これは腎尿細管輸送プロセスで大量に必要なものである。虚血が生じると、細胞内ＡＴＰが失われてこれらの輸送プロセスがかなり乱される。血流が元に戻れば細胞死を制限する助けになるが、ミトコンドリア機能の回復が虚血の期間を左右する。虚血が長引くと、再灌流にもかかわらず酸化的リン酸化の速度が低下し続けるという事例がある。進行性虚血は、錯体Ｉ、錯体Ｖ、アデニンヌクレオチド輸送体をはじめとするミトコンドリア電子輸送鎖のいくつかの成分の阻害ならびに、ＡＴＰ生成の低下につながる。また、虚血によって、心臓ミトコンドリアのカルジオリピンとチトクロムＣ（いずれもチトクロムＣオキシダーゼ活性を阻害する）の含有量が減少する。よって、ミトコンドリアは虚血時に、再灌流に伴う酸素と基質の回復時にＡＴＰを生成する能力を制限しかねない損傷を受けやすい。
【０１２５】
さらに、損傷を受けたミトコンドリアは、再灌流時に大量のＲＯＳを生成し、虚血後の鉄過負荷がゆえに余分なヒドロキシルラジカルがある。ミトコンドリアは通常、ミトコンドリア酸化防止系の多層ネットワークによって酸化障害から保護されるが、ＲＯＳ生成がミトコンドリアの酸化防止能を超えると酸化障害を受ける可能性がある。ＲＯＳは、ミトコンドリアにおける核酸、タンパク質、脂質への損傷のきっかけとなり得る。タンパク質の酸化とニトロ化によって、ミトコンドリア電子輸送鎖における多くの酵素の機能が変化するのに対し、アデニンヌクレオチド輸送体の酸化は、ＡＴＰ合成のマトリクスへのＡＤＰの流入を損なう。ＲＯＳは、膜浸透性を高め、Ｆ0Ｆ1ＡＴＰａｓｅ活性を落とし、ＡＴＰ生成量を減らすことで、腎ミトコンドリアを損傷することが分かっている。
【０１２６】
したがって、ミトコンドリア機能異常は、壊死またはアポトーシスにつながることがある。壊死は、細胞内容物、特にタンパク質分解酵素の放出につながる細胞膜の細胞膨潤と破壊が特徴であり、これは隣接細胞の破壊を生じることがある。一方、アポトーシスは、周囲の細胞に影響せずに生物体が老化した異常な細胞を排除するプログラム細胞死と定義され、生物体が生存するためには好ましいとされている。そこでは、死にかかっている細胞が貪食によって排除されるからである。アポトーシスでの死か壊死かの判断ステップは、細胞内ＡＴＰ含有量に左右されているように見える。アポトーシスは、特にＡｐａｆ−１とシトクロムｃとの間のアポトソーム錯体の形成時に、エネルギを要するステップを伴う。よって、かなりの細胞ＡＴＰ枯渇がある場合には、壊死による死しか起こり得ない。
【０１２７】
腎毒性物質による急性腎毒性におけるミトコンドリアＲＯＳの役割に関する証拠が蓄積されている（Ｂａｌｉｇａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｖ，  ３１：９７１〜９９７  （１９９９））。シスプラチン誘発性ミトコンドリア酸化ストレス、ＡＴＰおよびグルタチオン減少、カルジオリピン過酸化およびアポトーシスならびに、シスプラチン腎毒性を、ヒドロキシルラジカルスカベンジャーで寛解可能である（Ｓａｎｔｏｓ，  Ｎ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，  ６１：１４５〜１５５  （２００８））。放射線造影剤染料は、ｉｎ  ｖｉｖｏ（Ｂｅｅｒｉ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｈｙｐｏｘｉａ  ａｌｏｎｇ  ｔｈｅ  ｔｈｉｃｋ  ａｓｃｅｎｄｉｎｇ  ｌｉｍｂ  ｏｆ  ｒａｔ  ｋｉｄｎｅｙｓ．  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ，  ４７：１８０６〜１８１０  （１９９５））ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ｈｉｚｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，  １３：９１１〜９１８  （１９９８）；  Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，  ２３５：８４３〜８４９  （２００５））にて腎尿細管細胞アポトーシスの速度を高める。しかしながら、放射線造影剤染料媒質の腎毒性は、単に酸化ストレスだけでは説明できず、ミトコンドリアエネルギと完全性も重要な役割を果たしているように見える（Ｚａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｕｂｕｌａｒ  ｉｎｊｕｒｙ：  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｘｉｄａｎｔ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ．  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ，  ６４：１２８〜１３９  （２００３）；Ｈｕｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，  ２５２：Ｆ２４６〜２５５  （１９８７））。酸化障害も腎後性閉塞性ＡＲＩに関係しており、内在性ミトコンドリア介在性アポトーシス経路が伸展誘発性尿細管細胞アポトーシスに関与しているという証拠がある（Ｚｈａｎｇ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，  ９：７１〜８０  （２００１））。
【０１２８】
上皮細胞が損傷を受けると、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαをはじめとする炎症性メディエータが放出され、これが白血球の浸潤ならびに、炎症誘発性サイトカイン、炎症性細胞遊走因子およびＲＯＳの放出によって開始される強い炎症反応につながる。白血球の浸潤は、腎性貧血−再灌流、尿管閉塞および腎毒素で観察され、炎症プロセスがＡＲＩの一因となっている。浸潤しているリンパ球やマクロファージが活性化され、ＴＧＦβ、ＩＬ−１３およびＰＤＧＦなどの前線維化サイトカインおよび成長因子の分泌を開始する。これがさらにマクロファージと線維芽細胞を活性化させる。ＴＧＦβは、Ｅ−カドヘリンを下方制御し、α−ＳＭＡ発現を上方制御して、コラーゲン生成を増すことで、上皮間葉転換（ＥＭＴ）で中心的な役割を担っている。線維症は、時間の経過とともにコラーゲンが増加するような形で、筋線維芽細胞による新たなコラーゲンの合成速度が、その分解速度を上回ったときに生じる。ＭＣＰ−１などの炎症性細胞遊走因子も、マクロファージおよび筋線維芽細胞を傷害部位に補充することで、線維症において役割を果たしている。コラーゲン代謝回転およびＥＣＭ再構築が、さまざまなマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）によって調整される。
【０１２９】
被検体を組織傷害または臓器不全から保護またはこれを治療する方法
本発明の芳香族カチオン性ペプチドがＡＲＩの予防または治療に有用であるという発見は、腎臓以外の他の系での組織傷害や臓器不全にも適用可能である。たとえば、本発明の芳香族カチオン性ペプチドが、ミトコンドリア機能異常、細胞死、炎症、線維症を最小限に抑えると想定される。いくつかの実施形態では、本発明は、膵炎、虚血、多発外傷、出血性ショック、免疫介在性臓器傷害といった非感染性病態などの組織傷害のある被検体を治療する方法を提供するものである。
【０１３０】
組織傷害は、大動脈瘤修復、多発外傷、末梢血管疾患、腎血管疾患、心筋梗塞、脳卒中、敗血症、多臓器不全などと関連している場合がある。一態様では、本発明は、傷害および／または虚血の生じた、心臓、脳、脈管構造、腸、肝臓、腎臓、眼などからの組織のある被検体を治療する方法に関する。この方法は、治療有効量の芳香族カチオン性ペプチドを被検体に投与して治療効果または予防効果を得ることを含む。本発明のもうひとつの実施形態は、本発明のペプチドを投与して、腎臓、肺、心臓、肝臓、脳、膵臓などからなる群から選択される１以上の臓器の機能を改善するものである。特定の実施形態では、肺機能の改善が、浮腫レベルの低下、組織学的外傷スコアの改善、炎症レベルの低下からなる群から選択される。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、虚血、薬剤（アセトアミノフェン、アルコール）、ウイルス、肥満（非アルコール性脂肪性肝炎）、閉塞（胆管閉塞症、腫瘍）によって生じる急性肝障害の予防および／または治療にペプチドが有用である。いくつかの実施形態では、本発明の芳香族カチオン性ペプチドを被検体に投与して、急性肝不全（ＡＬＦ）を予防または治療する。ＡＬＦは、肝臓が正常に機能しなくなるような肝臓細胞の重篤かつ広範囲にわたる損傷が原因で生じる臨床症状である。ＡＬＦは、肝性脳症や重篤な肝機能障害につながる肝臓細胞の大量壊死からも生じる。これは、ウイルス性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ）、薬剤毒性、頻繁なアルコール依存症、自己免疫性肝炎などのさまざまな種類の疾患によって発生する。ＡＬＦは、死亡率の高い極めて重篤な臨床症状である。米国では、薬剤関連肝毒性がＡＬＦの主な原因である。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、ＡＬＦに対する保護性を持たせるために、アセトアミノフェンなどの誘発性肝毒性が知られているか疑われる薬剤または作用剤の投与よりも前またはこれと同時に、本発明の芳香族カチオン性ペプチドを被検体に投与する。たとえば、被検体は、薬剤または作用剤を使用する約１〜２時間、約１〜６時間、約１〜１２時間、約１〜２４時間または約１〜４８時間前にペプチドの投与を受けてもよい。同様に、薬剤または作用剤とほぼ同時にペプチドを被検体に投与して、その薬剤または作用剤によって生じるＡＬＦに対する予防効果を得るようにしてもよい。さらに、薬剤または作用剤の投与後に、被検体に対するペプチドの投与を継続してもよい。いくつかの実施形態では、保護または予防効果を発揮するために、薬剤または作用剤の投与後、約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、２４、４８時間間隔で被検体がペプチドの投与を受け続けてもよい。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、肝酵素（トランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼ）レベル上昇、血清ビリルビン増加、血清アンモニア増加、血清ブドウ糖増加、血清乳酸増加または血清クレアチニン増加を含むがこれに限定されるものではない、ＡＬＦの１以上の兆候または症候を示す被検体に本発明の芳香族カチオン性ペプチドを投与する。本発明のペプチドを投与すると、ペプチドを投与していない対照被検体と比較して、被検体でこれらの肝臓機能指標のうち１以上が改善される。被検体には、ＡＬＦの最初の兆候または症候が認められてから約１〜２時間、約１〜６時間、約１〜１２時間、約１〜２４時間、約１〜４８時間または約１〜７２時間後にペプチドを投与することができる。
【０１３４】
投与モード
本発明の方法において有用なペプチドを、それ必要とする被検体において、急性腎障害または急性肝不全からの被検体を保護するのに効果的な量で被検体に投与する。また、本発明の方法において有用なペプチドを、それを必要とする被検体において、急性腎障害または急性肝不全を治療するのに効果的な量で被検体に投与する。
【０１３５】
本明細書で使用する場合、組成物の「有効量」または「薬学的有効量」または「治療有効量」という用語は、ＡＲＩまたはＡＬＦに関連する症候の予防または低減につながる量など、所望の治療効果および／または予防効果を達成するのに十分な量である。被検体に投与される本発明による組成物の量は、疾患のタイプおよび重篤度ならびに、全身の健康、年齢、性別、体重、薬物耐性などの個体の特徴に左右される。また、疾患の度合い、重篤度およびタイプにも左右される。当業者であれば、これらの要因および他の要因に応じて、適切な薬用量を判断できるであろう。本発明の組成物は、１種以上の別の治療用化合物との組み合わせでも投与可能である。本発明の方法では、芳香族カチオン性ペプチドを、この疾患または症状によって引き起こされるＡＲＩの１以上の兆候のある被検体に投与してもよい。有効量の芳香族カチオン性ペプチドを投与すると、代謝性アシドーシス（血液の酸性化）、高カリウム血症（カリウムレベル上昇）、乏尿または無尿（尿生成の悪化または停止）、体液バランスの変化、他の臓器系への影響など、被検体におけるＡＲＩの少なくとも１つの兆候または症候が改善される。たとえば、「治療有効量」の芳香族カチオン性ペプチドとは、急性腎不全の生理学的作用が、最低でも寛解されるレベルを意図している。一般に、生物学的作用の有効性は、ペプチドを投与していない被検体または被検体クラスとの比較で測定される。
【０１３６】
有効量については、医師や技師にとってはなじみの方法で、予備治験および治験時に判断する。有効量の本発明の方法において有用なペプチドを、好ましくは製剤組成物中で、それを必要とする被検体に、製剤化合物を投与するための多数の周知の方法のうち任意のものを用いて投与する。
【０１３７】
好ましい実施形態では、ペプチドを全身投与してもよいし、局所投与してもよい。一実施形態では、ペプチドを静脈内投与する。たとえば、本発明の方法において有用な芳香族カチオン性ペプチドを、高速静脈内ボーラス注入によって投与してもよい。しかしながら、好ましくは、このペプチドを定速静脈点滴で投与する。
【０１３８】
このペプチドを、経口、局所的、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、皮下または経皮的に投与してもよい。
【０１３９】
本発明の方法において有用なペプチドを、従来技術において周知のような徐放によって被検体に投与してもよい。徐放投与は、特定の時間にわたって特定の薬剤レベルを達成する薬剤送達方法のひとつである。このレベルは一般に、血清または血漿濃度で測定される。放出制御して化合物を送達するための方法に関する説明は、国際公開第ＷＯ０２／０８３１０６号パンフレットに見いだすことが可能である。
【０１４０】
従来技術において周知の医薬製剤であれば、どれでも本発明の方法において有用な芳香族カチオン性ペプチドの投与に適している。経口投与の場合、液体または固体製剤を使用することができる。製剤のいくつかの例として、錠剤、ゼラチンカプセル、ピル、トローチ、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウェハ、チューインガムなどがあげられる。当該技術分野の実務者が理解しているように、ペプチドを好適な製剤キャリア（ビヒクル）または賦形剤と混合することも可能である。キャリアおよび賦形剤の例として、スターチ、乳、糖、特定タイプのクレー、ゼラチン、乳酸、ステアリン酸またはその塩（ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウムを含む）、タルク、植物油脂、ガム、グリコールがあげられる。
【０１４１】
全身、経口、腹腔内、局所、鼻腔内、皮下または経皮投与の場合、本発明の方法において有用な芳香族カチオン性ペプチドの製剤に、ペプチドの送達に利用可能であることが従来技術において周知のものなどの従来の希釈剤、キャリアまたは賦形剤などを使用してもよい。たとえば、製剤は、安定剤、界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤、任意に塩および／または緩衝剤のうちの１種以上を含むことができる。ペプチドは、水溶液形態または凍結乾燥形態で送達可能なものである。
【０１４２】
安定剤は、たとえば、グリシンなどのアミノ酸あるいは、スクロース、テトラロース、ラクトースまたはデキストランなどのオリゴ糖であってもよい。あるいは、安定剤は、マンニトールなどの糖アルコールあるいは、これらの組み合わせであってもよい。好ましくは、安定剤または安定剤同士の組み合わせが、ペプチドの重量に対して約０．１重量％〜約１０重量％をなす。
【０１４３】
界面活性剤は、好ましくはポリソルベートなどの非イオン性界面活性剤である。好適な界面活性剤のいくつかの例として、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０ならびに、約０．００１％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８などのポリエチレングリコールまたはポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールがあげられる。
【０１４４】
塩または緩衝剤は、たとえば、塩化ナトリウムあるいはリン酸ナトリウム／リン酸カリウムなど、どのような塩または緩衝剤であってもよい。好ましくは、緩衝剤は、製剤組成物のｐＨを約５．５〜約７．５の範囲に維持する。塩および／または緩衝剤も、モル浸透圧濃度を人間または動物への投与に適したレベルに維持するのに有用である。塩または緩衝剤は、約１５０ｍＭから約３００ｍＭのほぼ等張の濃度で存在するものであってもよい。
【０１４５】
本発明の方法において有用なペプチドの製剤はさらに、１種以上の従来の添加剤を含むものであってもよい。このような添加剤のいくつかの例として、たとえばグリセロールなどの可溶化剤、たとえば塩化ベンザルコニウム（「ｑｕａｔ」として知られる第４級アンモニウム化合物の混合物）、ベンジルアルコール、クロレトンまたはクロロブタノールなどの酸化防止剤、たとえばモルヒネ誘導体などの麻酔薬、あるいは上述したような等張作用剤などがあげられる。酸化または他の損傷に対してさらに注意する形として、不透過性のストッパで密封したバイアル中にて窒素ガス下で製剤組成物を保管してもよい。
【実施例】
【０１４６】
実施例１．虚血−再灌流（Ｉ／Ｒ）によって生じる腎前性ＡＲＩに対する保護
虚血−再灌流によって生じるＡＲＩから被検体を保護するにあたって本発明の芳香族カチオン性ペプチドが持つ効果を、Ｉ／Ｒで引き起こしたＡＲＩの動物モデルで調査した。
【０１４７】
Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（２５０〜３００ｇ）を以下の４群に振り分けた。（１）Ｉ／Ｒなしの偽手術群、（２）Ｉ／Ｒ＋生理食塩水ビヒクル処理、（３）Ｉ／Ｒ＋ＳＳ−２０処理、（４）Ｉ／Ｒ＋ＳＳ−３１処理。各実験群をラット８匹ずつで構成した。虚血の３０分前と再灌流直前に、ＳＳ−２０およびＳＳ−３１（３ｍｇ／ｋｇ、生理食塩水に溶解）をラットに投与した。対照ラットには、同一スケジュールで生理食塩水を単独で用いた。
【０１４８】
ケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）とキシラジン（４ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の混合物でラットを麻酔した。マイクロクランプを用いて３０分間または４５分間、左腎血管椎弓根を一時的に閉塞させた。虚血時間の終了時、クランプを外して再灌流させた。その時点で、対側の右腎を摘出した。２４時間の再灌流後、動物を屠殺し、心臓穿刺によって血液試料を採取した。血液尿素窒素（ＢＵＮ）および血清クレアチニン（Ｂｉｏａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＩＵＲ−５００およびＤＩＣＴ−５００）によって腎機能を判定した。
【０１４９】
腎形態学的検査：腎臓を１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン蝋に包埋した。３ミクロンの切片をヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）と過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）で染色し、光学顕微鏡法で分析した。以下の基準で病変を点数化した。［１］個々の細胞の有糸分裂と壊死、［２］隣接する近位曲尿細管の細胞がすべて壊死し、周囲の尿細管では生存している、［３］壊死が近位曲尿細管の遠位側の３つ目に限局され、壊死バンドが内側の皮質にまで至っている、［４］壊死が近位曲尿細管の３箇所すべてに影響している。
【０１５０】
アポトーシスのＴＵＮＥＬアッセイ：腎組織切片を脱パラフィン化し、キシレン等級化アルコールシリーズおよび脱イオンＨ2Ｏで再水和させた後、２０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫにて２０分間、ＲＴでインキュベートした。Ｉｎ  ｓｉｔｕ細胞死検出ＰＯＤキット（Ｒｏｃｈｅ，  ＩＮ，  ＵＳＡ）を製造業者の指示どおりに用いた。簡単に説明すると、腎臓切片の内在性ペルオキシダーゼ活性を、０．３％Ｈ2Ｏ2メタノール溶液での１０分間のインキュベーションによって遮断した。続いてこの切片を、加湿チャンバにて暗い中で３０分間、３７℃でＴＵＮＥＬ反応混合物を用いてインキュベートした。洗浄後、５０〜１００μｌのＣｏｎｖｅｒｔｅｒ−ＰＯＤを用いて加湿チャンバにて３０分間、ＲＴでスライドをインキュベートした。このスライドをＤＡＢ溶液中でインキュベート（１〜３分間）し、ヘマトキシリンで対比染色し、等級化シリーズのアルコールで脱水し、顕微鏡用にＰｅｒｍｏｕｎｔでマウントした。
【０１５１】
免疫組織化学的検査：パラフィンブロックから腎臓切片を切り出し、スライドに載せた。キシレンでパラフィンを除去した後、等級化したアルコールシリーズおよび脱イオンＨ2Ｏを用いてスライドを再水和させた。クエン酸緩衝液（１０ｍＭクエン酸、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ６．０）中にてＡｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌを加熱した。内在性ペルオキシダーゼを過酸化水素０．３％のメタノール溶液中でブロックした。続いて、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）に対する一次抗体（ラット抗−ＨＯ−１／ＨＭＯＸ１／ＨＳＰ３２モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  ＭＮ，  ＵＳＡ）を１：２００希釈したもの））と、二次抗体（ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ラットＩｇＧ、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣ（ＶＥＣＴＯＲ  Ｌａｂ  Ｉｎｃ．  ＭＩ，  ＵＳＡ））とを用いて免疫組織化学的検査を実施した。基質試薬である３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ，  Ｓｉｇｍａ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）を用いて、赤色を発色させた。対比染色にはヘマトキシリンを用いた。
【０１５２】
ウェスタンブロット：腎臓組織を氷上にて２ｍｌのＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）中でホモジナイズし、５００×ｇで３０分間遠心処理して、細胞デブリを取り除いた。上清のアリコートを−８０℃で保管した。各試料のタンパク質三十（３０）μｇを添加液に懸濁させ、５分間沸騰させた後、各試料の１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を実施した。分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移した。膜を５％脱脂粉乳および１％ウシ血清アルブミン中にて１時間ブロックした後、ニトロセルロースブロットを、１：２０００希釈抗ＨＯ−１／ＨＭＯＸ１／ＨＳＰ３２または１：１０００希釈抗ＡＭＰＫα−１、モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  ＭＮ，  ＵＳＡ）を用いてインキュベートした後、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体を用いてインキュベートした。Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ検出システム（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）とＸ線フィルムを用いてブロットのタンパク質バンドを検出した。相対密度測定によって、定量化する。
【０１５３】
ＡＴＰ含有量アッセイ：１０ｍｌの５％トリクロロ酢酸に１０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＥＤＴＡを加えたものに腎臓組織をすみやかに入れ、小さな細片に切断した。組織を氷上でホモジナイズし、さらに１０分間インキュベートし、２０００×ｇで１０分間遠心処理し、１０Ｎ  ＫＯＨでｐＨ７．６に中和した。２０００×ｇで１０分間の遠心処理後、得られた上清のアリコートを−８０℃で保管した。生物発光（ＡＴＰバイオルミネッセントキット、Ｓｉｇｍａ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）によってＡＴＰを測定した。
【０１５４】
結果  本発明の芳香族カチオン性ペプチドが、虚血−再灌流によって引き起こしたＡＲＩのモデルに対しておよぼす作用を調査した。上述した手法で腎ミトコンドリアを単離し、酸素消費量を測定した。結果は以下のとおりである。
【０１５５】
【表１０】
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【０１５６】
上記の表から、ＳＳ−２０またはＳＳ−３１のいずれかで処理すると、４５分間の虚血と２４時間の再灌流後にラットにおけるＢＵＮおよび血清クレアチニン値が改善されることが分かる。ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手したキット（ＤＩＵＲ−５００およびＤＩＣＴ−５００）を使用して、ＢＵＮと血清クレアチニンをアッセイした。＊は偽群でｐ＜０．０５であることを示す。＃はＩＲ＝生理食塩水群でｐ＜０．０５であることを示す。
【０１５７】
図１は、ＳＳ−２０またはＳＳ−３１のいずれかで処理すると、３０分間の虚血と２４時間の再灌流後に尿細管細胞アポトーシスが防止されたことを示している。ＴＵＮＥＬを用いて、腎臓切片のアポトーシス細胞を染色した。Ｉ／Ｒ未実施の動物の髄質領域では、ＴＵＮＥＬ陽性細胞が極めてわずかしか観察されなかった（図１ａ）。３０分間の虚血と２４時間の再灌流後に、動物の髄質で多数のＴＵＮＥＬ陽性上皮細胞が観察された（図１ｂ）。３０分間の虚血開始の３０分前と再灌流の直前にＳＳ−２０（３ｍｇ／ｋｇ）またはＳＳ−３１（３ｍｇ／ｋｇ）で処理すると、髄質のＴＵＮＥＬ陽性細胞が有意に抑えられた（図１ｃおよび図１ｄ）。
【０１５８】
図２は、ＳＳ−２０またはＳＳ−３１のいずれかで処理すると、４５分間の虚血と２４時間の再灌流後に尿細管細胞傷害が防止されたことを示している。腎臓切片をＨ＆Ｅ（図２ａ〜図２ｄ）およびＰＡＳ（図２ｅ〜図２ｈ）で染色した。虚血−再灌流によって、髄質内部の近位尿細管では、刷子縁の喪失、空砲形成、壊死が生じ、遠位尿細管は円柱で閉塞された（図２ｂ）。ＳＳ−２０またはＳＳ−３１のいずれかで前処理すると、刷子縁が保護され、近位尿細管での壊死が防止された（図２ｃおよび図２ｄ）。
【０１５９】
図３は、ＳＳ−２０またはＳＳ−３１での処理によって、４５分間の虚血と２４時間の再灌流によって生じる病理組織学的スコアが有意に改善されたことを示している。データは平均±ＳＤとして示してある。一元配置ＡＮＯＶＡおよびＳｃｈｅｆｆｅ試験を用いて、複数の対を比較した。
【０１６０】
図４は、ＳＳ−２０またはＳＳ−３１での処理によって、再灌流後にＡＴＰ生成速度が有意に高まったことを示している。１５分間の虚血終了時（図４ａ）と、４５分間の虚血に続く１時間の再灌流後（図４ｂ）に、腎組織のＡＴＰ含有量を求めた。ＡＴＰは１５分間の虚血後ですでに大幅に低下しており、これはＳＳ−２０またはＳＳ−３１のいずれかで前処理しても変わらなかった。ビヒクル対照群での１時間の再灌流後もＡＴＰ含有量は依然として極めて低かったが、ＳＳ−２０またはＳＳ−３１で処理した動物では有意に高かった。
【０１６１】
図５は、ＳＳ−２０またはＳＳ−３１での前処理によって、４５分間の虚血後に腎ミトコンドリア呼吸が有意に改善された結果を示している。ＡＤＰを加えるとステート３呼吸が開始された。４５分間の虚血後にラットから単離したミトコンドリアで酸素消費量が有意に減少した。ＳＳ−２０またはＳＳ−３１での前処理によって、虚血ミトコンドリアが非虚血対照と何ら違わないほど酸素消費が有意に改善された。
【０１６２】
まとめると、これらの結果から、虚血−再灌流によって生じるＡＲＩの出現率を抑える上で、ペプチドＳＳ−３１およびＳＳ−２０が効果的であることが分かる。それ自体、本発明の芳香族カチオン性ペプチドは、虚血によって生じるＡＲＩから被検体を保護する方法において有用である。
【０１６３】
実施例２．尿管閉塞によって生じる腎後性ＡＲＩに対する保護
尿管閉塞によって生じるＡＲＩから被検体を保護するにあたって本発明の芳香族カチオン性ペプチドが持つ効果を、尿管閉塞の動物モデルで調査した。この実施例は、このような実験の結果について説明するものである。
【０１６４】
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに対して、滅菌条件下で正中腹部切開部から４−０絹縫合糸を用いて一側尿管結紮術（ＵＵＯ）を実施した。尿管下部の端、尿管膀胱移行部のすぐ上で左尿管を結紮して、尿管を閉塞させた。
【０１６５】
ＵＵＯの１日前にＳＳ−３１（１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝８）を腹腔内投与し、１４日間継続した。別群の動物には生理食塩水を与え、ビヒクル対照（ｎ＝１６）とした。
【０１６６】
腎組織診断：認定病理専門医（ＳＶＳ、腎病理の専門家）によってパラフィン包埋標本のトリクローム切片を調べ、線維症を０〜＋＋＋までのスコアで点数化した。
【０１６７】
免疫組織化学解析：上述したようにＥＤ−１（Ｓｅｒｏｔｅｃ）に対するモノクローナル抗体を用いてマクロファージの免疫組織化学染色を実施した。２名の独立した異なる研究者によって盲検式に１０毎視野（×４００）でマクロファージを計数した。実施例１で説明したようにしてＴＵＮＥＬアッセイを実施した。実施例１で説明したようにして、免疫組織化学的検査を用いて線維芽細胞の存在を調べた。使用した抗体は、ＤＡＫＯ  ＃  Ｓ１００−Ａ４（１：１００希釈）であった。Ｓ１００−Ａ４抗原は、ＦＳＰ−１（線維芽細胞特異的タンパク質）としても知られている。オーブンにてプロテイナーゼＫを用いて２０分間細胞をインキュベートすることで、抗原を回収した。残りの免疫ペルオキシダーゼプロトコールについては、常法に従って実施した。Ｓ１００−Ａ４の染色が紡錘形の間質細胞に見られたが、丸い細胞にも見られ、病理学者がこれを炎症性細胞と同定した。紡錘形の細胞だけを計数対象とした。一次抗体なしでインキュベートした試料には染色が認められなかった。抗原回収用のプロテイナーゼＫを用いて８−ＯＨ  ｄＧ染色を実施した。使用した抗体は、日本老化制御研究所から入手したものであり、１：２００〜１：５００の希釈物として利用した。
【０１６８】
ポリメラーゼ連鎖反応解析：腎臓から単離したヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）のＰＣＲを以下のようにして実施した。ラットの腎臓を収集し、使用するまで−８０℃で保管しておいた。Ｔｒｉｚｏｌ  （登録商標）−クロロホルム抽出法を用いて全ＲＮＡを抽出した。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  ｍＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、製造業者の指示に従ってｍＲＮＡを精製した。２６０ｎｍでの吸光度を測定して、ｍＲＮＡの濃度と純度を求めた。Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＰＣＲについては、自動サーマルサイクラーＴｈｅｒｍｏＨｙｂｒｉｄ，  ＰＸ２にて、最初の活性化ステップを９５℃で１５分間実施し、続いて９４℃で４５秒の変性、６０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で６０秒の伸長を３５サイクル実施した。ＰＣＲ生成物を２％アガロースゲル電気泳動で分離した。ゲル上のバンドを臭化エチジウム染色によって可視化し、Ｉｍａｇｅ  Ｊ濃度測定解析ソフトウェアを用いて分析した。ＨＯ−１のプライマーは、ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＡＴＴ  ＧＣＧ  ＣＡＧ  ＡＡ（配列番号１）とＡＴＧ  ＧＣＡ  ＴＡＡ  ＡＴＴ  ＣＣＣ  ＡＣＴ  ＧＣ（配列番号２）［４２７  ｂｐ］であった。ＧＡＰＤＨを対照として利用した。
【０１６９】
結果  すぐ上で述べた手法に基づいて、尿管閉塞によって生じるＡＲＩから被検体を保護するにあたって本発明の芳香族カチオン性ペプチドが持つ効果を、尿管閉塞の動物モデルで調査した。ＵＵＯ（１４日間）によって、間質性線維症、尿細管アポトーシス、マクロファージ浸潤および尿細管増殖の増加をはじめとする、腎臓における特徴的ないくつかの変化が生じる。ＵＵＯの１日前と、１４日間にわたって毎日、動物をＳＳ−３１で事前処理した。対照動物には、ＵＵＯの期間中をとおして生理食塩水だけを与えた。
【０１７０】
対側の非閉塞腎臓（図６ａ、ＣＫ）には、尿細管、糸球体または間質の炎症または線維症があるとしても極めてわずかしか認められなかった（データ図示せず）。対照ビヒクル処理群の閉塞腎（図６ｂ、ＯＫ）では、限局的な腎盂周囲１＋染色の領域と一緒に中程度（１〜２＋）の髄質トリクローム染色が認められた。皮質には、髄質ほどは線維症が見られなかった。ＯＫにも中程度の炎症が認められ、おおよそ点数化すると皮質で１＋、髄質で２＋であった。ＳＳ−３１処理腎臓（図６ｃ）では、トリクローム染色が有意に少なく、皮質で０−微量、髄質でｔｒ−１＋であった）。間質体積を測定すると、対照ＯＫの髄質間質体積が６９．２±２．１％であったのに対し、ＣＫでは０．５±０．１％であった（図６ｄ）。１ｍｇ／ｋｇのＳＳ−３１で処置したところ、間質体積の増加が５４．９±２．３％まで調節された。ＳＳ−３１の用量が多ければ多いほど効果的であった。よって、ＳＳ−３１は１４日間のＵＵＯモデルで髄質線維症を低減することになる。
【０１７１】
線維芽細胞特異的タンパク質（ＦＳＰ−１）用の免疫ペルオキシダーゼによって、線維芽細胞を可視化した。ＯＫ群でＦＳＰ−１の発現増加が認められ（１６．９±２．３細胞／ＨＰＦ）、対照ＣＫ群にはごく少数の間質線維芽細胞しか存在しなかった（１．１±０．３ＦＳＰ＋細胞／ＨＰＦ）（図７）。ＳＳ−３１（１ｍｇ／ｋｇ）は、ＯＫにおける線維芽細胞浸潤の量を対照の４３．４％まで有意に減少させた。さらに、ＳＳ−３１（３ｍｇ／ｋｇ）で処理すると、ＯＫにおける線維芽細胞浸潤の量を未処理ＯＫの２８．０％まで減少させた。このように、ＳＳ−３１は１４日間のＵＵＯモデルで線維芽細胞の発現を減少させる。
【０１７２】
未処理のＯＫでは、２週間のＵＵＯで、ＣＫに比してアポトーシスの尿細管細胞が有意に増加した。アポトーシス細胞については、ＴＵＮＥＬアッセイを用いて可視化した。１ｍｇ／ｋｇのＳＳ−３１によって、尿細管アポトーシスがＨＰＦあたりアポトーシス細胞１５．１±３．１からＨＰＦあたり細胞５．１±０．５個（ｐ＜０．０５）まで有意に減少した。３ｍｇ／ｋｇのＳＳ−３１では、腎尿細管アポトーシスがさらに有意に減少した（アポトーシス細胞３．０±０．３個／ＨＰＦ）（図８）。このように、ＳＳ−３１は１４日間のＵＵＯモデルで尿細管アポトーシスを減少させる。
【０１７３】
２週間のＵＵＯの後にＣＫに比してＯＫへのマクロファージ浸潤の有意な増加があった（細胞３３．８±６．３個／ＨＰＦｖｓ．細胞０．０４±０．０３個／ＨＰＦ）。ＥＤ−１用の免疫ペルオキシダーゼによってマクロファージを可視化した。１ｍｇ／ｋｇと３ｍｇ／ｋｇのＳＳ−３１はどちらもＯＫへのマクロファージ浸潤を有意に減少させた（図９）。このように、ＳＳ−３１は１４日間のＵＵＯモデルでマクロファージの発現を減少させる。
【０１７４】
閉塞腎は、ＰＣＮＡに対する免疫ペルオキシダーゼで可視化した場合の腎尿細管細胞増殖の増加と関連していた。ＳＳ−３１は、ＯＫにおいて腎尿細管増殖の有意な増加を引き起こした。尿細管増殖は、１ｍｇ／ｋｇの用量で２倍に増加し、３ｍｇ／ｋｇで３ｍｇ／ｋｇの用量で３．５倍に増加した（図１０）。このように、ＳＳ−３１は１４日間のＵＵＯモデルで尿細管増殖を増加させる。
【０１７５】
閉塞腎（ＯＫ）では、８−ＯＨ  ｄＧおよびヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）の発現増加で評価した場合の酸化障害の増加が認められた。ＲＴ−ＰＣＲをＨＯ−１発現に使用し、ＵＵＯがＨＯ−１発現の増加に関連していた（ＨＯ−１／ＧＡＤＰＨ  １．０９ｖｓ．未閉塞の対照での０．０７）（図１１ａ）。ＳＳ−３１での処理によって、閉塞腎におけるＨＯ−１の発現が減少した。閉塞腎の尿細管と間質区画の両方で８−ＯＨ  ｄＧ染色が検出された（図１１ｂ）。８−ＯＨ  ｄＧ陽性細胞／ＨＰＦの数字が、ＣＫに比してＯＫで有意に増加したが（細胞５．０±１．４個／ＨＰＦｖｓ．細胞１．４±０．１個／ＨＰＦ）、これはＳＳ−３１で処理することで有意に低減された（図１１ｃ）。このように、ＳＳ−３１は１４日間のＵＵＯモデルで酸化障害を減少させる。
【０１７６】
まとめると、これらの結果から、尿管閉塞によって引き起こしたＡＰＩの動物モデルでは、間質性線維症、尿細管アポトーシス、マクロファージ浸潤および尿細管増殖を抑える上で、ペプチドＳＳ−３１が効果的であることが分かる。それ自体、本発明の芳香族カチオン性ペプチドは、尿管閉塞によって生じる急性腎障害から被検体を保護する方法において有用である。
【０１７７】
実施例３．Ｉｎｄｏ／Ｌ−ＮＡＭＥ動物モデルにおけるＣＩＮの治療と予防
ＣＩＮから被検体を保護するにあたって本発明の芳香族カチオン性ペプチドが持つ効果を、放射線造影剤染料を投与して引き起こしたＡＲＩの動物モデルで調査した。この実施例は、このような実験の結果について説明するものである。
【０１７８】
実験１
動物モデル：この実施例では、Ａｇｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９４：１０６９−１０７５  （１９９４）によって説明されているような放射線造影剤染料誘発性腎不全のモデル。人間の場合と同様、放射線造影剤染料は通常、腎機能が正常な動物に投与しても無毒である。しかしながら、腎機能が損なわれた動物では放射線造影剤染料がＡＲＩを誘発する可能性がある。このモデルでは、損なわれた腎機能が、インドメタシン（１０ｍｇ／ｋｇ）およびＬ−ＮＡＭＥ（１０ｍｇ／ｋｇ）の投与によって誘発したものであった。動物を以下の３群に分けた。
１．群（１）  対照（ｎ＝８）
２．群（２）  インドメタシン／Ｌ−ＮＡＭＥ（１５分間間隔で与えた）に続いて、イオタラム酸（ＡｎｇｉｏＣｏｎｒａｙ  ６ｍｌ／ｋｇ）（ｎ＝７）
３．群（３）  ＳＳ−３１（３ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）をインドメタシン／Ｌ−ＮＡＭＥ／イオタラム酸投与の１５分前に与え、薬剤曝露直後に第２の用量のＳＳ−３１（３ｍｇ／ｋｇ）を再度与えた（ｎ＝９）
【０１７９】
実験プロトコール：水道水と標準的なラット用固形飼料の自由給餌下、ラットを代謝ケージ（Ｎａｌｇｅ  Ｃｏ．，  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，  ＮＹ）で飼育した。基線の２４時間の採尿後、ラットをケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）とキシラジン（４ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の混合物で麻酔した。左大腿静脈および動脈をカニューレ処置し、基線の血液試料を抜き取って（１ｍｌ）クレアチニンレベルを測定した。次に、この動物を上述したようなさまざまな薬剤で治療した。次に、イオタラム酸メグルミン６０％（造影剤染料；ＡｎｇｉｏＣｏｎｒａｙ  ６ｍｌ／ｋｇ）を動脈カニューレ経由で注入した。さらに、左大腿動脈を結紮し、カニューレを除去した。ラットを代謝ケージに戻し、さらに２４時間採尿した。この時間が経過したら、尾静脈から血液試料を抜き取った（１ｍｌ）。その後、動物を麻酔し、腎臓を摘出し、安楽死させた。
【０１８０】
腎機能：基線と染料投与の２４時間後にＧＦＲを求めて、腎機能を評価した。ＧＦＲについては、染料投与の前後に２４時間間隔で推定したクレアチニンクリアランスによって求めた。血漿（Ｐｃｒ）、尿クレアチニン（Ｕｃｒ）レベル（Ｂｉｏａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＤＩＣＴ−５００）、尿量を測定して、クレアチニンクリアランスを分析した。
【０１８１】
腎組織診断：腎臓を１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン蝋に包埋した。３ミクロンの切片をヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）と過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）で染色し、認定病理専門医が光学顕微鏡法で分析した。
【０１８２】
結果：すぐ上で述べた手法に基づいて、ＣＩＮから被検体を保護するにあたって本発明の芳香族カチオン性ペプチドが持つ効果を、放射線造影剤染料を投与して引き起こしたＡＲＩの動物モデルで調査した。結果は以下のとおりである。
【０１８３】
対照ラットでは、最初の２４時間（２３５．０±３０．５μｌ／分／ｇ）と次の２４時間（２２３．７±４４．０μｌ／分／ｇ）との間でＧＦＲに有意差は認められなかった（図１２）。インドメタシンおよびＬ−ＮＡＭＥで事前処理した動物に造影剤染料を投与すると、ＧＦＲが２４時間で２３０．８±２１．０μｌ／分／ｇから８７．６±１０．６μｌ／分／ｇまで下降した。染料投与の前後にＳＳ−３１で処理すると、腎機能の低下が抑えられ、ＧＦＲは２４７．９±２０．４μｌ／分／ｇから１５７．９±２６．６μｌ／分／ｇまで下降しただけであった。染料注入後にＳＳ−３１がＧＦＲに対しておよぼす作用は有意であった（ビヒクル処理群と比較して、Ｐ＜０．０５）。９匹のＳＳ−３１処理ラットのうちの６匹が、染料の作用からほぼ完全に保護された。このように、ＳＳ−３１が放射線造影剤染料によって生じる腎機能障害を低減させた。
【０１８４】
ＰＡＳ染色によって、形態的に正常な対照ラットの腎臓では近位尿細管の刷子縁が無傷であることが明らかになった（図１３ａ）。染料処理によって、近位尿細管細胞の特徴的な腎刷子縁が損なわれ、若干の空砲形成が生じた（図１３ｂ）。これらの作用はＳＳ−３１での処理によって減弱し、これらの試料でのＰＡＳ染色によって、無傷の刷子縁と正常な糸球体が明らかになった（図１３ｃ）。このように、ＳＳ−３１が放射線造影剤染料傷害から腎尿細管を保護した。
【０１８５】
ＴＵＮＥＬ染色を利用して、アポトーシス腎尿細管を可視化した。対照の腎臓ではアポトーシス細胞／ｈｐｆがほとんど認められなかった（図１４ａ）。ビヒクル処理した染料注入腎臓には、多数のアポトーシス細胞／ｈｐｆがあった（図１４ｂ）。この作用は、ＳＳ−３１処理した染料注入腎臓で大幅に減弱された（図１４ｃ）。このように、ＳＳ−３１が放射線造影剤染料傷害によって誘発される腎尿細管アポトーシスを予防した。
【０１８６】
まとめると、これらの結果から、放射線造影剤染料傷害から腎尿細管を保護している腎機能障害を抑える上で、ペプチドＳＳ−３１が効果的であることが分かる。それ自体、本発明の芳香族カチオン性ペプチドは、造影剤によって生じる急性腎障害から被検体を保護する方法において有用である。
【０１８７】
実験２
動物モデル：この実験では、上述したものと同じインドメタシンおよびＬ−ＮＡＭＥモデルを使用した。このモデルでは、インドメタシン（８ｍｇ／ｋｇ）とＬ−ＮＡＭＥ（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与して、損なわれた腎機能を誘発した。動物を、図１５に示す投薬スケジュールおよび研究プロトコールで２群に分けた。
【０１８８】
腎機能：基線と染料投与の２６時間後に、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈａｙｗａｒｄ，  ＣＡ）から入手したＤＩＣＴ−キットを用いて血清および尿クレアチニンを求め、腎機能を評価した。同じく基線と染料投与の２６時間後に、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）によって尿タンパク濃度も求めた。試料をスチューデントのｔ検定で分析し、ｐ＜０．０５で差異を有意であるとみなした。
【０１８９】
腎組織診断：腎臓を１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン蝋に包埋した。３ミクロンの切片をヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）と過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）で染色し、認定病理専門医が光学顕微鏡法で分析した。
【０１９０】
結果：すぐ上で述べた手法に基づいて、ＣＩＮから被検体を保護するにあたって本発明の芳香族カチオン性ペプチドが持つ効果を、放射線造影剤染料を投与して引き起こしたＡＲＩの動物モデルで調査した。結果は以下のとおりである。
【０１９１】
【表１１】
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【０１９２】
インドメタシンおよびＬ−ＮＡＭＥで事前処理したラットの場合、造影剤染料を投与することで、２６時間の時点で基線レベルである０．６１±０．０２（ｍｇ／ｄＬ）から０．８５±０．０７（ｍｇ／ｄＬ）への血清クレアチニン増加と、４．３２±１．６５（ｍｇ／ｍｌ）から２１．７２±４．６３（ｍｇ／ｍｌ）への尿タンパク濃度の増加が誘発された。これは、造影剤染料投与の２６時間後にＳｃｒが４０％増加、タンパク質濃度が４倍に増加したことを示していた。対照的に、染料投与の前後にＳＳ−３１で処理すると、腎機能の低下が抑えられ、血清クレアチニンの増加は基線レベルである０．６７±０．０９（ｍｇ／ｄＬ）から０．７３±０．０４（ｍｇ／ｄＬ）にとどまり、尿タンパク濃度は４．２８±１．１５（ｍｇ／ｍｌ）から１１．７６±２．７１（ｍｇ／ｍｌ）まで増加した。これは、造影剤染料投与の２６時間後にＳｃｒがわずか９％増加、タンパク質濃度の増加は１．７倍であることを示していた。ＳＳ−３１処理ラット７匹のうち５匹が、造影剤染料誘発性腎症から保護された（すなわち染料の２６時間後にＳｃｒ増加２５％未満）。
【０１９３】
ＰＡＳ染色を用いたことで、染料処理によって近位尿細管細胞の特徴的な腎刷子縁が損なわれ、若干の空砲形成が生じた（図１６ａ）ことが明らかになった。これらの作用はＳＳ−３１での処理によって減弱し、これらの試料でのＰＡＳ染色によって、無傷の刷子縁と正常な糸球体が明らかになった（図１６ｂ）。図１６ｃは、形態的に正常な対照ラットの腎臓では近位尿細管の刷子縁が無傷であることを示している。このように、ＳＳ−３１が放射線造影剤染料傷害によって誘発される腎尿細管アポトーシスを予防した。
【０１９４】
まとめると、これらの結果から、放射線造影剤染料傷害から腎尿細管を保護している腎機能障害を抑える上で、ペプチドＳＳ−３１が効果的であることが分かる。それ自体、本発明の芳香族カチオン性ペプチドは、造影剤によって生じる急性腎障害から被検体を保護する方法において有用である。
【０１９５】
実施例４．糖尿病の動物モデルにおけるＣＩＮの治療および予防
実験１
動物モデル：糖尿病によって損なわれた腎機能は、造影剤誘発性腎症の主な病因のひとつである（ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈ，  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，  ２００８，  ５１，  １４１９〜１４２８）。この実験では、合計５７匹のＳＤラットに高脂肪食を６週間にわたって与えた後、低用量のストレプトゾトシン（３０ｍｇ／ｋｇ）を注射した。さらに９週間後、血糖、血清クレアチニン、シスタチンＣを測定した。以下の選択基準すなわち、Ｓｃｒ＞２５０μＭ、シスタチンＣ＞７５０ｎｇ／ｍｌ、血糖＞＝１６．７ｕＭに基づいて、２０匹のラットを選択して造影剤誘発性腎症の研究を実施した。
【０１９６】
動物を２群に分けた。第１群のラットにはイオヘキソールおよびＳＳ−３１を供給投与した。第２群のラットには、イオヘキソールおよび対照ビヒクルを投与した。１日目、各群のラットから血清試料を採取し、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて尿中の全タンパク質を測定した。２日目と３日目に、３ｍｇ／ｋｇのＳＳ−３１（第１群）またはビヒクル（第２群）を染料注射（６ｍＬ／ｋｇ  ｉ．ｖ．尾静脈）の３０分前にｓ．ｃ．投与した。染料投与の２時間後と２４時間後に、ＳＳ−３１（第１群）またはＰＢＳ（第２群）投与を繰り返した。４日目と５日目に血清および尿試料を採取した。５日目にラットを安楽死させて腎臓および重要臓器を回収した。試料をスチューデントのｔ検定で分析し、ｐ＜０．０５で差異を有意であるとみなした。
【０１９７】
腎機能：基線、染料投与の４８時間後および７２時間後に、Ｊｉａｎｃｈｅｎｇ  Ｃｒキット（Ｎａｎｊｉｎｇ，  Ｐ．Ｒ．Ｃ）を用いて血清および尿クレアチニンを求め、腎機能を評価した。Ｓｃｒ、Ｕｃｒおよび尿量に基づいて、クレアチニンクリアランスを計算した。尿タンパク濃度をＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイキット（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）で求めた。シスタチンＣをＷｅｓｔａｎｇ  Ｒａｔ  Ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃキット（Ｓｈａｎｇｈａｉ，  Ｐ．Ｒ．Ｃ．）で測定した。
【０１９８】
結果：すぐ上で述べた手法に基づいて、糖尿病動物モデルでＣＩＮを減弱させるにあたって本発明の芳香族カチオン性ペプチドが持つ効果を調査した。結果を表１０および図１７ａならびに図１７ｂにまとめておく。
【０１９９】
【表１２】
2019059785.tif 000018
【０２００】
ビヒクル処理群で糖尿病ラットに造影剤染料を投与すると、血清シスタチンＣ（ＡＫＩバイオマーカー）レベルが６５５．９±４９．１（基線）から９３８．４±５７．９（染料後４８時間）および染料投与後７２時間の１５７６．７±１４９．９（ｎｇ／ｍｌ）まで上昇した。一方、ＳＳ−３１処理群では、シスタチンＣは同じ時間で７０８．６±５１．３から１００８．１±４６．４および１３０３．６±１４７．１（ｎｇ／ｍｌ）まで上昇しただけであった（図１７ａ）。７２時間の時点で、シスタチンＣの増加を減弱させるＳＳ−３１の作用が統計的に有意（Ｐ＜０．０５）であった。
【０２０１】
ビヒクル処理群で糖尿病ラットに造影剤染料を投与すると、染料注射の４８時間後に、クレアチニンクリアランスが２０％を超えて減少した（図１７ｂ）。対照的に、ＳＳ−３１処理群では、同じ時間で染料注射前後のクレアチニンクリアランスに有意な変化は認められなかった。染料投与によって誘発されるクレアチニンクリアランスを減弱させるＳＳ−３１の作用が統計的に有意（Ｐ＜０．０５）であった。このように、ＳＳ−３１は糖尿病動物モデルで放射線造影剤染料によって生じる腎機能障害を低減させた。それ自体、本発明の芳香族カチオン性ペプチドは、造影剤によって生じる急性腎障害から被検体を保護する方法において有用である。
【０２０２】
実験２
この実験では、３０匹のＳＤラットに高脂肪食を６週間にわたって与えた後、低用量のストレプトゾトシン（３０ｍｇ／ｋｇ）を注射した。さらに９週間後、このラットを造影剤誘発性腎症研究に用いた。以下の用量、投薬スケジュール、研究プロトコールを用いて、動物を２群に分けた。０日目、動物の体重を測定し、ブドウ糖と血清試料を採取した。１日目、Ｓｃｒをアッセイし、スポット採尿を実施した。２日目と３日目に、３ｍｇ／ｋｇのＳＳ−３１（第１群）またはビヒクル（第２群）を染料注射（６ｍＬ／ｋｇ  ｉ．ｖ．尾静脈）の３０分前にｓ．ｃ．投与した。染料投与の２時間後、１日後、２日後、３日後、４日後、５日後に、ＳＳ−３１（第１群）またはＰＢＳ（第２群）投与を繰り返した。８日目には、血清および尿試料を採取し、ラットを安楽死させて腎臓および重要臓器を回収した。
【０２０３】
腎機能：基線、造影剤染料（イオヘキソール）投与の２４時間後、３日後、６日後に、Ｊｉａｎｃｈｅｎｇ  Ｃｒキット（Ｎａｎｊｉｎｇ，  Ｐ．Ｒ．Ｃ）を用いて血清および尿クレアチニンを求め、腎機能を評価した。Ｓｃｒ、Ｕｃｒおよび尿量に基づいて、クレアチニンクリアランスを計算した。試料をスチューデントのｔ検定で分析し、ｐ＜０．０５で差異を有意であるとみなした。
【０２０４】
結果：すぐ上で述べた手法に基づいて、糖尿病動物モデルでＣＩＮを減弱させるにあたって本発明の芳香族カチオン性ペプチドが持つ効果を調査した。結果を表１１および図１８にあげておく。
【０２０５】
【表１３】
2019059785.tif 000019
【０２０６】
ビヒクル処理群で糖尿病ラットに造影剤染料を投与すると、染料注射の２４時間後に、クレアチニンクリアランスが１７２±１６．１から１２５．２±７．３（μｌ／分／１００ｇ）まで、２７％を超えて減少した（図１８）。対照的に、ＳＳ−３１処理群では、同じ時間で染料注射前後のクレアチニンクリアランスに１５９．２±２５．１から１５９．９±９（μｌ／分／１００ｇ）と有意な変化は認められなかった。染料投与によって誘発されるクレアチニンクリアランスを減弱させるＳＳ−３１の作用が統計的に有意（Ｐ＜０．０５）であった。このように、ＳＳ−３１は糖尿病動物モデルで放射線造影剤染料によって生じる腎機能障害を低減させた。それ自体、本発明の芳香族カチオン性ペプチドは、造影剤によって生じる急性腎障害から被検体を保護する方法において有用である。
【０２０７】
実験３
この実験では、２０匹のＳＤラットに高脂肪食を６週間にわたって与えた後、低用量のストレプトゾトシン（３５ｍｇ／ｋｇ）を注射した。さらに１５週間後、このラットで造影剤誘発性腎症研究を実施した。図１９に示す用量、投薬スケジュール、研究プロトコールを用いて、ＨＦＤ／ＳＴＺ動物を２群に分けた。また、本発明者らは、通常の固形飼料を与えた同じバッチから得た９匹のラットに対して同じプロトコールを実施した正常な対照群を含めた。
【０２０８】
腎機能：基線、造影剤染料（イオヘキソール）投与の２４時間後、３日後、６日後に、Ｊｉａｎｃｈｅｎｇ  Ｃｒキット（Ｎａｎｊｉｎｇ，  Ｐ．Ｒ．Ｃ）を用いて血清および尿クレアチニンを求め、腎機能を評価した。Ｓｃｒ、Ｕｃｒおよび尿量に基づいて、クレアチニンクリアランスを計算した。試料をスチューデントのｔ検定で分析し、ｐ＜０．０５で差異を有意であるとみなした。
【０２０９】
結果：すぐ上で述べた手法に基づいて、糖尿病動物モデルでＣＩＮを減弱させるにあたって本発明の芳香族カチオン性ペプチドが持つ効果を調査した。結果を表１２にあげておく。
【０２１０】
【表１４】
2019059785.tif 000020
【０２１１】
上記の表から、対照動物（Ａ群）では、どの動物でも造影剤染料侵襲２４時間後の時点でＳｃｒが増加しなかったことが分かる。ビヒクル処理群のＨＦＤ／ＳＴＺラットでは、１０匹のうち５匹の動物で造影剤染料投与の２４時間後にＳｃｒが２０％を超えて上昇した。対照的に、ＳＳ−３１で処理すると、同じ時間でＳｃｒが２０％を超えて増加したのは９匹のラットのうち２匹しかいなかった。このように、ＳＳ−３１は糖尿病動物モデルで放射線造影剤染料によって生じる腎機能障害を低減させた。それ自体、本発明の芳香族カチオン性ペプチドは、造影剤によって生じる急性腎障害から被検体を保護する方法において有用である。
【０２１２】
実施例５．グリセロール誘発性横紋筋融解動物モデルにおけるＣＩＮの治療および予防
ＣＩＮから被検体を保護および／または治療するにあたって本発明の芳香族カチオン性ペプチドが持つ効果を、放射線造影剤染料投与によって引き起こしたＡＲＩのグリセロール誘発性横紋筋融解動物モデルで調査した。この実施例は、このような実験の結果について説明するものである。
【０２１３】
実験１
動物モデル：過去の研究で、グリセロール誘発性横紋筋融解によって腎臓が損傷を受けた動物で造影剤染料を投与すると、ＣＩＮが生じ得ることが分かっていた（Ｐａｒｖｅｚ，  Ｚ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，  １９８９，  ２４，  ６９８〜７０２；  Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｃｔａ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃａ，  ２０００，  ４１，  ５０３〜５０７）。このモデルでは、体重３００〜４００ｇのＳＤラットを２４時間脱水状態にした後、２５％グリセロール溶液（ｖ／ｖ）を１０ｍｌ／ｋｇの用量でｉ．ｍ．注射した。二十四時間（２４時間）後、ラットをグループ分けし、図２０に詳細に示すような造影剤誘発性腎症研究プロトコールを実施した。Ｃ群の動物とＢ群の動物における腎機能を比較することで、ＳＳ−３１がＡＲＩに対しておよぼす作用を調べることが可能である。試料をスチューデントのｔ検定で分析し、ｐ＜０．０５で差異を有意であるとみなした。
【０２１４】
腎機能：基線、脱水の２４時間後および造影剤染料投与の４８時間後に、Ｊｉａｎｃｈｅｎｇ  Ｃｒキット（Ｎａｎｊｉｎｇ，  Ｐ．Ｒ．Ｃ）を用いて血清および尿クレアチニンを求め、腎機能を評価した。Ｓｃｒ、Ｕｃｒおよび尿量に基づいて、クレアチニンクリアランスを計算した。尿ミクロアルブミン濃度を競合的ＥＬＩＳＡアッセイで求めた。
【０２１５】
結果：すぐ上で述べた手法に基づいて、グリセロール誘発性横紋筋融解動物モデルでＣＩＮを減弱させるにあたって芳香族カチオン性ペプチドが持つ効果を調査した。結果を図２１および図２２にあげておく。
【０２１６】
グリセロール誘発性横紋筋融解ラットで造影剤染料を投与すると、ビヒクル処理群では、染料注射の４８時間後に、クレアチニンクリアランスが１３％減少した（図２１）。対照的に、ＳＳ−３１処理群では、同じ時間で染料注射前後のクレアチニンクリアランスに有意な変化は認められなかった（図２１ａ）。
【０２１７】
アルブミン尿は、糸球体膜の浸透性が高まったことを示す指標のひとつであり、造影剤染料によって誘発可能である。２４時間の脱水（Ｔ０）後、尿ミクロアルブミンレベルはＧｌｙ／染料／ＰＢＳ群で３８５．１±５９．８（μｇ／２４時間）、Ｇｌｙ／染料／ＳＳ−３１群（この時点ではペプチド処理なし）で７５７．７±４６２．９（μｇ／２４時間）であった（図２１ｂ）。グリセロールをｉ．ｍ．投与すると、注射２４時間後（Ｔ１）に、どちらの群でもグリセロール誘発性横紋筋融解が原因で尿ミクロアルブミンレベルが実質的に増加した。しかしながら、Ｔ２の時点では、ＳＳ−３１処理群の全アルブミン尿がビヒクル処理群に比して有意に減少したことから、ＳＳ−３１には、このグリセロール誘発性横紋筋融解モデルで造影剤染料によって生じる糸球体基底膜の浸透性に対する保護作用があるのではないかと思われる。
【０２１８】
ＰＡＳ染色を用いたことで、染料処理が、近位尿細管細胞の特徴的な腎刷子縁の喪失、糸球体の膨潤、腎尿細管細胞での顕著なタンパク質円柱堆積をもたらしたことが明らかになった（図２２ａ）。これらの作用はＳＳ−３１での処理によって減弱した。これらの試料でのＰＡＳ染色によって、尿細管細胞の無傷の刷子縁、正常な糸球体、最小タンパク質円柱が明らかになったためである（図２２ｂ）。このように、ＳＳ−３１は腎尿細管を放射線造影剤染料傷害から保護した。
【０２１９】
実験２
体重３００〜４００グラムのＳＤラットを２４時間脱水状態にした後、２５％グリセロール溶液（ｖ／ｖ）を１０ｍｌ／ｋｇの用量でｉ．ｍ．注射した。二十四時間後、ラットをグループ分けし、造影剤誘発性腎症研究プロトコールを実施した。体重３００〜３５０ｇの１６匹のＳＤラットを、図２３に示す用量、投薬スケジュールおよび研究プロトコールで無作為に３つの群に分けた。Ａ群の動物とＢ群の動物における腎機能を比較することで、ＳＳ−３１がＡＲＩに対しておよぼす作用を調べることが可能である。試料をスチューデントのｔ検定で分析し、ｐ＜０．０５で差異を有意であるとみなした。
【０２２０】
腎機能：基線、脱水の２４時間後および造影剤染料投与の４８時間後に、Ｊｉａｎｃｈｅｎｇ  Ｃｒキット（Ｎａｎｊｉｎｇ，  Ｐ．Ｒ．Ｃ）を用いて血清および尿クレアチニンを求め、腎機能を評価した。Ｓｃｒ、Ｕｃｒおよび尿量に基づいて、クレアチニンクリアランスを計算した。尿タンパク濃度をＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイキット（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）で求めた。
【０２２１】
結果：すぐ上で述べた手法に基づいて、グリセロール誘発性横紋筋融解動物モデルでＣＩＮを減弱させるにあたって本発明の芳香族カチオン性ペプチドが持つ効果を調査した。結果を図２４、図２５、図２６にあげておく。
【０２２２】
グリセロール誘発性横紋筋融解ラットで造影剤染料を投与すると、ビヒクル処理群では、染料注射の４８時間後に、クレアチニンクリアランスが２５％減少した（図２４）。対照的に、ＳＳ−３１処理群では同じ時間でクレアチニンクリアランスの低減が１３％であった。このように、ＳＳ−３１はグリセロール誘発性横紋筋融解動物モデルで放射線造影剤染料によって生じる腎機能障害を低減させた。
【０２２３】
タンパク尿は腎障害の兆候のひとつであり、尿中に過剰なタンパク質が存在するのは、吸収が不十分であるか濾過不足のいずれかを示す。グリセロールおよび造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｅｄｉａ）が糸球体膜の浸透性を増加させ、過剰な量の尿タンパクの漏れを引き起こす場合があることが、過去に報告されている（Ｔｈｏｍｓｅｎ  Ｈ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃａ，  １９８９，  ３０，  ２１７〜２２２）。ビヒクル処理群では、異なる時点での２４時間尿タンパクレベルは以下のとおりであった。Ｔｂ（基線）＝１５．８±１．６ｍｇ；Ｔ０（グリセリンの２４時間後）＝５２．９±９．１ｍｇ；Ｔ１（グリセリンの４８時間後および染料の２４時間後）＝５４．１±５．８ｍｇ、Ｔ２（グリセリンの７２時間後および染料の４８時間後）＝２９．７±３．６ｍｇ；Ｔ３（グリセリンの９６時間後および染料の７２時間後）＝３０．２±５．１ｍｇ（図２５）。
【０２２４】
ＳＳ−３１処理群では、Ｔｂ（１５．５±１．５ｍｇ）およびＴ０（５０．２±８．６ｍｇ）での２４時間尿タンパクレベルは、これらの時点でペプチド投与がない場合、ビヒクル対照群に匹敵するものであった。しかしながら、Ｔ１（グリセリンの４８時間後および染料の２４時間後）の時点では、ＳＳ−３１処理群の２４時間尿タンパクが３９．５±３．５ｍｇまで低下した（図２５）。同じ時点のビヒクル処理群と比較して、差異が統計的に有意であった（ｐ＜＝０．０５）。このことから、ＳＳ−３１ペプチドがこのＣＩＮ動物モデルで糸球体基底膜の浸透性障害の回復を加速するということが示された。このように、本発明の芳香族カチオン性ペプチドは、放射線造影剤染料によって生じるＡＲＩを治療するための方法において有用である。
【０２２５】
ＰＡＳ染色を用いたことで、染料処理が、近位尿細管細胞の特徴的な腎刷子縁の喪失、糸球体の膨潤、腎尿細管細胞での顕著なタンパク質円柱堆積をもたらしたことが明らかになった（図２６ａ）。これらの作用はＳＳ−３１での処理によって減弱した。これらの試料でのＰＡＳ染色によって、尿細管細胞の無傷の刷子縁、正常な糸球体、最小タンパク質円柱が明らかになったためである（図２６ｂ）。このように、ＳＳ−３１は腎尿細管を放射線造影剤染料傷害から保護した。
【０２２６】
実験３
体重３００〜４００グラムのＳＤラットを２４時間脱水状態にした後、２５％グリセロール溶液（ｖ／ｖ）を１０ｍｌ／ｋｇの用量でｉ．ｍ．注射した。二十四時間（２４時間）後、ラットをグループ分けし、造影剤誘発性腎症研究プロトコールを実施した。体重３５０〜４００ｇの１８匹のＳＤラットを、図２７に示す用量、投薬スケジュールおよび研究プロトコールで無作為に３つの群に分けた。Ａ群の動物とＢ群の動物における腎機能を比較することで、ＳＳ−３１がＡＲＩに対しておよぼす作用を調べることが可能である。
【０２２７】
腎機能：基線、脱水の２４時間後および造影剤染料投与の４８時間後に、Ｊｉａｎｃｈｅｎｇ  Ｃｒキット（Ｎａｎｊｉｎｇ，  Ｐ．Ｒ．Ｃ）を用いて血清および尿クレアチニンを求め、腎機能を評価した。Ｓｃｒ、Ｕｃｒおよび尿量に基づいて、クレアチニンクリアランスを計算した。尿タンパク濃度をＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイキット（Ｓｉｇｍａ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．）で求めた。試料をスチューデントのｔ検定で分析し、ｐ＜０．０５で差異を有意であるとみなした。
【０２２８】
結果：すぐ上で述べた手法に基づいて、グリセロール誘発性横紋筋融解動物モデルでＣＩＮを減弱させるにあたって本発明の芳香族カチオン性ペプチドが持つ効果を調査した。結果を図２８および図２９にあげておく。
【０２２９】
グリセロール誘発性横紋筋融解ラットで造影剤染料を投与すると、ビヒクル処理群では、染料注射の４８時間後に、クレアチニンクリアランスが２４％減少した（図２８）。対照的に、ＳＳ−３１処理群では、同じ時間でクレアチニンクリアランスに有意な変化は認められなかった（図２８）。このように、ＳＳ−３１は、グリセロール誘発性横紋筋融解動物モデルにおいて放射線造影剤染料によって引き起こした腎機能障害を低減した。
【０２３０】
上述したように、タンパク尿は腎障害の兆候のひとつであり、尿中に過剰なタンパク質が存在するのは、吸収が不十分であるか濾過不足のいずれかを示す。ビヒクル処理群の異なる時点のタンパク質レベルをＳＳ−３１処理群と比較すると、ペプチド処理群のほうがビヒクル群よりも早く回復した（図２９）。このことから、ＳＳ−３１ペプチドがこのＣＩＮ動物モデルで糸球体基底膜の浸透性障害の回復を加速するということが示された。このように、本発明の芳香族カチオン性ペプチドは、放射線造影剤染料によって生じるＡＲＩ治療のための方法において有用である。
【０２３１】
ＰＡＳ染色を用いたことで、染料処理が、近位尿細管細胞の特徴的な腎刷子縁の喪失、糸球体の膨潤、腎尿細管細胞での顕著なタンパク質円柱堆積をもたらしたことが明らかになった（図３０ａ）。これらの作用はＳＳ−３１での処理によって減弱した。これらの試料でのＰＡＳ染色によって、尿細管細胞の無傷の刷子縁、正常な糸球体、最小タンパク質円柱が明らかになったためである（図３０ｂ）。このように、ＳＳ−３１は腎尿細管を放射線造影剤染料傷害から保護した。
【０２３２】
まとめると、上記の実施例で得られた結果は、いくつかの動物モデルで造影剤によって引き起こされた急性腎不全（ａｃｕｔｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｊｕｒｙ）から被検体を保護する上での本発明の芳香族カチオン性ペプチドの有用性を明確に示していた。また、実験７および８で実証された、損傷を受けた腎臓の回復を加速した。
【０２３３】
実施例６：ＣＣｌ4慢性腎臓傷害モデルにおける腎毒性の治療および予防
動物モデル：反応性ラジカルの生成が四塩化炭素誘発性腎毒性と関係があり、これは脂質の過酸化、機能不全タンパク質の蓄積と関与しており、腎臓の傷害につながる（Ｏｚｔｕｒｋ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｕｒｏｌｏｇｙ，  ２００３，  ６２，  ３５３〜３５６）。この実施例は、四塩化炭素（ＣＣｌ4）誘発性慢性腎毒性の予防用に芳香族カチオン性ペプチドを投与することによる作用について説明するものである。
【０２３４】
研究設計と実験プロトコール：このモデルでは、体重２５０ｇのＳＤラットに０．３５ｇ／Ｌのフェノバルビタール溶液（管腔水）を２週間与えた後、３群に分けて以下のようにして処理した。
【０２３５】
【表１５】
2019059785.tif 000021
【０２３６】
５週目の終わりに、肝臓病理組織学的切開および線維症検査のために各群から４匹のラットを屠殺した。７週目の終わりには、各群に残っているすべてのラットを屠殺し、病理組織学的切開および検査のために腎臓と肝臓の組織を収集した。
【０２３７】
腎組織診断：腎臓を１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン蝋に包埋した。３ミクロンの切片をヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、病理学者が光学顕微鏡法で分析した。
【０２３８】
結果：上述した手法に基づいて、ＣＣｌ4誘発性慢性腎毒性に対して保護するにあたって本発明の芳香族カチオン性ペプチドが持つ効果を調査した。結果を以下の表１４にあげておく。
【０２３９】
【表１６】
2019059785.tif 000022
【０２４０】
ＳＳ−３１は腎尿細管をＣＣｌ4腎毒性から保護した。Ｈ＆Ｅ染色を用いたことで、ＣＣｌ4処理が尿細管上皮細胞の変性および壊死が生じる（図３１ａ）ことが明らかになった。対照的に、ＳＳ−３１処理動物（図３１ｂ）の腎組織診断には、観察可能な病理組織学的変化は何ら認められず、未処理の対照動物（図３１ｃ）とほぼ同じであった。
【０２４１】
このように、上記の実施例で得られた結果は、ＣＣｌ4腎毒性によって生じる慢性腎障害（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｊｕｒｙ）から被検体を保護する上での本発明の芳香族カチオン性ペプチドの有用性を示していた。
【０２４２】
実施例７．シスプラチンによって生じるＡＲＩの予防
シスプラチン誘発性ＡＲＩから被検体を保護するにあたって本発明の芳香族カチオン性ペプチドが持つ効果を、シスプラチンによって引き起こしたＡＲＩの動物モデルで調査した。
【０２４３】
１日目にＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（３５０−４００ｇ）に一用量のシスプラチン（７ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。第１群のラット（ｎ＝８）には、シスプラチン投与の直前に一用量のＳＳ−３１（３ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与し、さらに３日間にわたって１日１回繰り返した。第２群のラット（ｎ＝８）第２群のラット（ｎ＝８）には、シスプラチン投与日とその後３日間にわたって同容量の生理食塩水を投与した。
【０２４４】
実験プロトコール：シスプラチン投与前は、ラットに水道水と標準的なラット用固形飼料を自由給餌した。シスプラチン投与前に尾静脈から対照血液試料を得た。シスプラチン注射の前に、生理食塩水またはＳＳ−３１（生理食塩水に溶解）をラットに皮下投与した。シスプラチン（生理食塩水に溶解）を７ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。次に、すべてのラットに生理食塩水またはＳＳ−３１（３ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを３日間にわたって１日１回投与した。最後の２４時間は、ラットを代謝ケージに入れて採尿した。この時間が経過したら、尾静脈から血液試料を抜き取った。その後、動物を麻酔し、腎臓を摘出し、安楽死させた。
【０２４５】
腎機能：血液尿素窒素（ＢＵＮ）、血清クレアチニン、尿クレアチニン、尿タンパクで腎機能を評価した（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＡＬＸ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）。尿クレアチニン、尿流量、血清クレアチニンから求めたクレアチニンクリアランスから、ＧＦＲを推定した。
【０２４６】
腎組織診断：腎臓を１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン蝋に包埋した。３ミクロンの切片を過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）で染色し、光学顕微鏡法で分析した。
【０２４７】
結果：すぐ上で述べた手法に基づいて、シスプラチン腎毒性から被検体を保護するにあたって本発明の芳香族カチオン性ペプチドが持つ効果を、シスプラチン投与によって引き起こしたＡＲＩの動物モデルで調査した。スチューデントのｔ検定を用いて群同士を比較した。
【０２４８】
生理食塩水で処理したラットでは、シスプラチン投与前の体重（３７８．４±８．２ｇ）と比較して、シスプラチン投与の３日後に体重が有意に低減した（３３３±１２．６ｇ）（ｐ＜０．０００１）（図３２ａ）。ＳＳ−３１処理群の体重は、シスプラチン処理前に生理食塩水群と同様であり（３７６．９±５．２ｇ；ｐ＝０．６７３）、この体重はシスプラチン処理の３日後も変化しなかった（３８４±２８ｇ；ｐ＝０．４６）。ＳＳ−３１処理群では、生理食塩水に比してシスプラチン処理が体重に対しておよぼす作用に有意な差異があった（ｐ＝０．００４）。腎臓の重量も生理食塩水処理群（１．４±０．２ｇ）と比較してＳＳ−３１処理群（１．６±０．２ｇ）のほうが重かった（ｐ＝０．０３６）（図３２ｂ）。
【０２４９】
生理食塩水で処理したラットでは、シスプラチン処理の３日後に血清クレアチニンが０．４±０．０９ｍｇ／ｄｌから２．５±２．８ｍｇ／ｄｌ）まで増加した（ｐ＝０．０６５）（図３２ｃ）。対照的に、ＳＳ−３１処理群では、血清クレアチニンが０．４±０．０９ｍｇ／ｄｌから０．８±０．７３ｍｇ／ｄｌまで増加しただけであった。ラット間のばらつきが大きすぎて、統計的な有意性には至らなかった。しかしながら、ＳＳ−３１を投与された８匹のラットのうちの５匹で、血清クレアチニンに変化が見られなかった（＜０．４ｍｇ／ｄｌ）のに対し、生理食塩水ラット８匹のうち血清クレアチニンが１．０ｍｇ／ｄｌ未満なのはわずか１匹だった。シスプラチン処理の３日後に、生理食塩水群（０．５±０．６ｍｌ／分）と比較して、ＳＳ−３１処理ラットではクレアチニンクリアランスが有意に高かった（２．２±１．３ｍｌ／分）（ｐ＝０．０２４）（図３２ｅ）。
【０２５０】
生理食塩水で処理したラットでは、シスプラチン処理の３日後にＢＵＮが１７．３±１．５ｍｇ／ｄｌから１１４．４±１０５ｍｇ／ｄｌ）まで増加した（ｐ＝０．０３５）（図３２ｄ）。対照的に、ＳＳ−３１処理群では、ＢＵＮが１５．５±１．７ｍｇ／ｄｌから２９．３±２５ｍｇ／ｄｌまで増加しただけであった（ｐ＝０．１６７）。ＢＵＮはシスプラチン処理の３日後にＳＳ−３１処理群で有意に低くなった（ｐ＝０．０４２）。
【０２５１】
まとめると、ＳＳ−３１はシスプラチンによって生じる損傷から腎臓を保護した。それ自体、本発明の芳香族カチオン性ペプチドは、腎毒性薬剤によって生じる急性腎障害から被検体を保護する方法において有用である。
【０２５２】
実施例８．芳香族カチオン性ペプチドによるＡＬＦの保護および治療
ＡＬＦの予防および／または治療に対する作用を示すために、ＡＬＦの動物モデルで本発明の芳香族カチオン性ペプチドを試験する。好適な動物モデルは、外科的手法、毒性肝傷害またはこれらの組み合わせを用いて、実験動物でＡＬＦを誘発する（Ｂｅｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，  「Ａｃｕｔｅ  Ｌｉｖｅｒ  Ｆａｉｌｕｒｅ：  Ａ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒａｉｓａｌ  ｏｆ  Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ．」  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｂｒａｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  ２０：４０９〜４２３  （２００５）を参照のこと）。
【０２５３】
本発明の芳香族カチオン性ペプチドがＡＬＦの予防に対しておよぼす作用を試験するために、薬剤または外科的侵襲よりも前またはこれと同時にペプチドを投与する。ペプチドを投与された被検体とペプチドを投与されなかった被検体とで、侵襲後の肝機能を比較する。血清肝酵素（トランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼ）のレベル、血清ビリルビン、血清アンモニア、血清ブドウ糖、血清乳酸または血清クレアチニンなどの１種以上の指標を用いて肝機能を評価する。ＡＬＦを予防する上での本発明の芳香族カチオン性ペプチドの有効性は、対照被検体と比較した場合のＡＬＦの発生または重篤度（上記のマーカーで示した）の低減によって示される。
【０２５４】
本発明の芳香族カチオン性ペプチドがＡＬＦの治療に対しておよぼす作用を試験するために、動物モデルでＡＬＦを誘発するのに用いた薬剤または外科的侵襲の後でペプチドを投与する。治療過程で（数時間から数日間の範囲）、ペプチドを投与された被検体とペプチドを投与されなかった被検体とで肝機能を比較する。血清肝酵素（トランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼ）のレベル、血清ビリルビン、血清アンモニア、血清ブドウ糖、血清乳酸または血清クレアチニンなどの１種以上の指標を用いて肝機能を評価する。ＡＬＦを治療する上での本発明の芳香族カチオン性ペプチドの有効性は、対照被検体と比較した場合のＡＬＦの１以上の兆候または症候（上記のマーカーで示した）の低減によって示される。
【０２５５】
等価物
本発明は、本出願に記載の特定の実施形態に関して限定されるものではない。これらの実施形態は、本発明の個々の態様についての単なる例であることを意図したものである。当業者であれば分かるように、本発明の主旨および範囲を逸脱することなく、多くの改変および変更をほどこすことができる。本発明の範囲内の機能的に等価な方法および組成物についても、本明細書にて列挙したものに加えて、当業者であれば上記の説明から分かるであろう。このような改変および変更は、添付の特許請求の範囲に記載の範囲に包含されることを意図している。本発明は、添付の特許請求の範囲ならびに、このような特許請求の範囲が権利を与えられる等価物の完全な範囲に記載の用語によってのみ限定される。本発明は、特定の方法、試薬、化合物、組成物または生物学的系に限定されるものではなく、もちろん、これらも可変であることは理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定することを意図したものではない旨も理解されたい。
【０２５６】
また、開示内容の特徴または態様をマーカッシュ群に関して記述している場合、当該開示が個々の構成要素またはマーカッシュ群の構成要素のサブグループに関しても説明していることは、当業者であれば自明であろう。
【０２５７】
当業者であれば理解できるように、あらゆる目的で、特に記述された説明を提供することに関し、本明細書に開示のあらゆる範囲は、考えられるあらゆる部分範囲およびその部分範囲の組み合わせも包含する。列挙された範囲は、同じ範囲を少なくとも半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに細分化して十分に説明かつ実現できるものとして、容易に認識可能である。非限定的な例として、本明細書に記載の各範囲を、下３分の１、真ん中の３分の１、上３分の１などに容易に細分化できる。また、当業者であれば理解できるように、「最大」「少なくとも」「を超える」「未満」などの言い回しはいずれも、言及された数字を含み、上述したような部分範囲に後から細分化可能な範囲を示す。最後に、当業者であれば理解できるように、範囲には個々のメンバも含む。このため、たとえば、１〜３個の細胞を含む群は、１、２または３個の細胞を含む群を示す。同様に、１〜５個の細胞を含む群は、１、２、３、４または５個の細胞を含む群を示すといった具合である。
【０２５８】
他の実施形態は以下の特許請求の範囲内に記載される。
本発明の好ましい態様は、下記の通りである。
〔１〕腎臓の保護が必要な被検体において腎臓を急性腎障害から保護するための方法であって、Ｐｈｅ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2（ＳＳ−２０）およびＤ−Ａｒｇ−２’６’Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（ＳＳ−３１）からなる群から選択される有効量のペプチドを被検体に投与することを含む、方法。
〔２〕前記急性腎障害が、腎毒性薬剤への被検体の曝露と関連している、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記腎毒性薬剤に曝露される前またはこれと同時に前記被検体に前記ペプチドを投与する、前記〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記腎毒性薬剤が放射線造影剤染料である、前記〔２〕に記載の方法。
〔５〕前記放射線造影剤染料が、アセトリゾ酸、ジアトリゾ酸、ヨーダミド、イオグリク酸、イオタラム酸、イオキシタラム酸、メトリゾ酸、メトリザミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、およびイオベルソールからなる群から選択される、前記〔４〕に記載の方法。
〔６〕前記腎毒性薬剤が薬剤または化学物質である、前記〔２〕に記載の方法。
〔７〕前記薬剤または化学物質が、シスプラチン、ゲンタマイシン、セファロリジン、シクロスポリン、アムホテリシン、四塩化炭素、トリクロロエチレン、およびジクロロアセチレンからなる群から選択される化合物のうちの１種以上である、前記〔６〕に記載の方法。
〔８〕腎障害の治療が必要な被検体において腎障害を治療するための方法であって、Ｐｈｅ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2（ＳＳ−２０）およびＤ−Ａｒｇ−２’６’Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（ＳＳ−３１）からなる群から選択される有効量のペプチドを被検体に投与することを含む、方法。
〔９〕前記腎障害が、腎毒性薬剤への前記被検体の曝露と関連している、前記〔８〕に記載の方法。
〔１０〕前記被検体に対する腎毒性薬剤への曝露後に前記ペプチドを投与する、前記〔９〕に記載の方法。
〔１１〕前記腎毒性薬剤が放射線造影剤染料である、前記〔９〕に記載の方法。
〔１２〕前記放射線造影剤染料が、アセトリゾ酸、ジアトリゾ酸、ヨーダミド、イオグリク酸、イオタラム酸、イオキシタラム酸、メトリゾ酸、メトリザミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、およびイオベルソールからなる群から選択される、前記〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕前記腎毒性薬剤が、急性腎不全（ａｃｕｔｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｊｕｒｙ）を引き起こし得る薬剤または化学物質である、前記〔９〕に記載の方法。
〔１４〕前記薬剤または化学物質が、シスプラチン、ゲンタマイシン、セファロリジン、シクロスポリン、アムホテリシン、四塩化炭素、トリクロロエチレン、およびジクロロアセチレンからなる群から選択される化合物のうちの１種以上である、前記〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕腎臓の保護が必要な被検体において慢性腎障害から腎臓を保護するための方法であって、Ｐｈｅ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2（ＳＳ−２０）およびＤ−Ａｒｇ−２’６’Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（ＳＳ−３１）からなる群から選択される有効量のペプチドを被検体に投与することを含む、方法。
〔１６〕前記慢性腎障害が、腎毒性薬剤の投与またはこれに対する曝露と関連している、前記〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕前記腎毒性薬剤が、慢性腎障害（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｊｕｒｙ）を引き起こし得る薬剤または化学物質である、前記〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕前記薬剤または化学物質が四塩化炭素である、前記〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕前記腎毒性薬剤への曝露の前またはこれと同時に前記ペプチドを投与する、前記〔１６〕に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６ａ−ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図２２ａ】
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【図２２ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６ａ】
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【図２６ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０ａ】
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【図３０ｂ】
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【図３１】
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【図３２ａ−ｂ】
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【図３２ｃ−ｅ】
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【配列表】
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