(57)【要約】【課題】良好な免疫原性を有するＭＤＰ１の製造方法を提供する。【解決手段】製造方法は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＭＤＰ１）を製造する方法であって、前記ＭＤＰ１は、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、前記ＭＤＰ１をコードする遺伝子と、前記遺伝子の上流に作動可能に連結された誘導性プロモーターと、を含むベクターを非病原性の迅速発育型抗酸菌に形質転換し、培養する培養工程と、誘導物質を添加して、前記迅速発育型抗酸菌のＭＤＰ１の発現を誘導する誘導工程と、を含む方法である。（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個以上数個以下のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列；（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＭＤＰ１）を製造する方法であって、
前記ＭＤＰ１は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、
前記ＭＤＰ１をコードする遺伝子と、前記遺伝子の上流に作動可能に連結された誘導性プロモーターと、を含むベクターを非病原性の迅速発育型抗酸菌に形質転換し、培養する培養工程と、
誘導物質を添加して、前記迅速発育型抗酸菌のＭＤＰ１の発現を誘導する誘導工程と、
を含む製造方法。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個以上数個以下のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列
【請求項２】
前記迅速発育型抗酸菌が有するＭＤＰ１遺伝子が欠失又は失活している請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記迅速発育型抗酸菌を破砕し、酸を用いて抽出した前記ＭＤＰ１に変性剤を添加する変性工程と、
前記変性剤を実質的に含まない緩衝液を用いた液体クロマトグラフィーにより、前記ＭＤＰ１を精製する精製工程と、を更に含む請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記迅速発育型抗酸菌を破砕し、酸を用いて抽出した前記ＭＤＰ１に変性剤を添加する変性工程と、
前記変性剤を含む緩衝液を用いた液体クロマトグラフィーにより、前記ＭＤＰ１を精製する第１の精製工程と、
前記変性剤を実質的に含まない緩衝液を用いた液体クロマトグラフィーにより、前記ＭＤＰ１を精製する第２の精製工程と、を更に含む請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項５】
前記ＭＤＰ１はＣ末端側にタグペプチドを備える請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記液体クロマトグラフィーは、前記タグペプチドを用いたアフィニティークロマトグラフィーである請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記迅速発育型抗酸菌は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓである請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
配列番号２に示される塩基配列からなる核酸を含むベクターを含む非病原性の迅速発育型抗酸菌。
【請求項９】
前記迅速発育型抗酸菌が有するＭＤＰ１遺伝子が欠失又は失活している請求項８に記載の非病原性の迅速発育型抗酸菌。
【請求項１０】
前記迅速発育型抗酸菌がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓである請求項８又は９に記載の非病原性の迅速発育型抗酸菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫原性を有するＭＤＰ１の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界中で年間に１０４０万人が新規に結核を発病し、１７０万人が結核で死亡している（２０１６年、世界保健機関による統計）。日本では、乳児期に接種したＢＣＧに対する免疫が低下する１０代半ばから老年に至る世代の結核発症が問題となっている。世界で唯一の結核ワクチンであるＢＣＧは、小児の結核性髄膜炎や粟粒結核には十分に有効であるが、成人の肺結核に対する効果は限定的である。しかも、成人結核に対するＢＣＧの再接種の有効性は明確でない。
【０００３】
このため、ＢＣＧによる免疫効果を増強するために、ヒト結核菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＭＤＰ１）を使用することが提案されている。ＭＤＰ１は、結核菌感染者診断のための抗原として有望であり、また、アジュバントとしてＤＮＡとの共存でマウスに投与することで抗体価の上昇、感染防御効果を増強することが知られている（例えば、非特許文献１参照）。また、ＭＤＰ１は、菌体内でＤＮＡと結合するタンパク質であり、抽出が困難である。そのため、比較的効率の良い抽出方法として、例えば、塩酸を用いる方法が用いられている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
一方、発明者らは、ＭＤＰ１が細菌では珍しく、長大な天然変性領域を有し、翻訳後修飾の生じるタンパク質であることを明らかにしている（例えば、非特許文献２〜５参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−２１９６９９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Matsumoto S et al., “DNA Augments Antigenicity of Mycobacterial DNA-Binding Protein 1 and Confers Protection against Mycobacterium tuberculosis Infection in Mice”, J Immunol., Vol. 175, Issue 1, p441-449, 2005.
【非特許文献２】Anand C et al., “A Sir2 family protein Rv1151c deacetylates HU to alter its DNA binding mode in Mycobacterium tuberculosis.”, Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 493, p1204-1209, 2017.
【非特許文献３】Green K D et al., “Acetylation by Eis and Deacetylation by Rv1151c of Mycobacterium tuberculosis HupB: Biochemical and Structural Insight.”, Biochemistry, Vol. 57, p781-790, 2018.
【非特許文献４】Pethe K et al., “Mycobacterial heparin-binding hemagglutinin and laminin-binding protein share antigenic methyllysines that confer resistance to proteolysis.”, PNAS, Vol. 99, No. 16, p10759-10764, 2002.
【非特許文献５】Ghosh S et al., “Lysine acetylation of the Mycobacterium tuberculosis HU protein modulates its DNA binding and genome organization.”, Molecular Microbiology, Vol. 100, No. 4, p577-588, 2016.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献１及び特許文献１に記載の方法では、ＭＤＰ１の発現系として、大腸菌を宿主とした過剰発現系を用いていた。しかしながら、大腸菌から得られたＭＤＰ１は、翻訳後修飾が生じず、免疫原性が低いことが課題であった。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、良好な免疫原性を有するＭＤＰ１の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＭＤＰ１遺伝子と前記遺伝子の上流に作動可能に連結された誘導性プロモーターとを含むベクターを非病原性の迅速発育型抗酸菌に形質転換してＭＤＰ１を発現させる誘導型過剰発現系を用いることで、免疫原性（細胞性応答及び抗体応答）が良好なＭＤＰ１を効率よく製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る製造方法は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＭＤＰ１）を製造する方法であって、前記ＭＤＰ１は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、前記ＭＤＰ１をコードする遺伝子と、前記遺伝子の上流に作動可能に連結された誘導性プロモーターと、を含むベクターを非病原性の迅速発育型抗酸菌に形質転換し、培養する培養工程と、誘導物質を添加して、前記迅速発育型抗酸菌のＭＤＰ１の発現を誘導する誘導工程と、を含む方法である。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個以上数個以下のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列
【００１１】
前記迅速発育型抗酸菌が有するＭＤＰ１遺伝子が欠失又は失活していてもよい。
上記第１態様に係る製造方法は、前記迅速発育型抗酸菌を破砕し、酸を用いて抽出した前記ＭＤＰ１に変性剤を添加する変性工程と、前記変性剤を実質的に含まない緩衝液を用いた液体クロマトグラフィーにより、前記ＭＤＰ１を精製する精製工程と、を更に含んでもよい。
上記第１態様に係る製造方法は、前記迅速発育型抗酸菌を破砕し、酸を用いて抽出した前記ＭＤＰ１に変性剤を添加する変性工程と、前記変性剤を含む緩衝液を用いた液体クロマトグラフィーにより、前記ＭＤＰ１を精製する第１の精製工程と、前記変性剤を実質的に含まない緩衝液を用いた液体クロマトグラフィーにより、前記ＭＤＰ１を精製する第２の精製工程と、を更に含んでもよい。
前記ＭＤＰ１はＣ末端側にタグペプチドを備えてもよい。
前記液体クロマトグラフィーは、前記タグペプチドを用いたアフィニティークロマトグラフィーであってもよい。
前記迅速発育型抗酸菌は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓであってもよい。
【００１２】
本発明の第２態様に係る非病原性の迅速発育型抗酸菌は、配列番号２に示される塩基配列からなる核酸を含むベクターを含む。
前記迅速発育型抗酸菌が有するＭＤＰ１遺伝子が欠失又は失活していてもよい。
前記迅速発育型抗酸菌がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓであってもよい。
【発明の効果】
【００１３】
上記態様の製造方法によれば、免疫原性が良好なＭＤＰ１を効率よく製造できる。上記態様の迅速発育型抗酸菌によれば、免疫原性が良好なＭＤＰ１を得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１における大腸菌−抗酸菌シャトルベクターｐＳＯ２４６を示す模式図である。
【図２】実施例１におけるプラスミドｐＳＯ２６４−ｈｕｐＢ（Ｒｖ２９８６ｃ）−Ｈｉｓ６を示す模式図である。
【図３】実施例１におけるプラスミドｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯを示す模式図である。
【図４】実施例１におけるプラスミドｐＳＯ２６４−ＡＣＥ−ｈｕｐＢ（Ｒｖ２９８６ｃ）−Ｈｉｓ６を示す模式図である。
【図５Ａ】実施例１におけるｈｕｐＢ−Ｈｉｓ６誘導発現型Ｍ．ｓｅｍｇｍａｔｉｓ株でのＭＤＰ１の発現をＣＢＢ染色により確認した画像である。
【図５Ｂ】実施例１におけるｈｕｐＢ−Ｈｉｓ６誘導発現型Ｍ．ｓｅｍｇｍａｔｉｓ株でのＭＤＰ１の発現を抗ＭＤＰ１抗体を用いたウェスタンブロット解析により確認した画像である。
【図５Ｃ】実施例１におけるｈｕｐＢ−Ｈｉｓ６誘導発現型Ｍ．ｓｅｍｇｍａｔｉｓ株でのＭＤＰ１の発現を抗ヒスチジン抗体を用いたウェスタンブロット解析により確認した画像である。
【図６】実施例１におけるヒスチジンタグを用いたアフィニティークロマトグラフィー（１回目）で流出されたフラクションのＣＢＢ染色の結果を示す画像である。
【図７】実施例１におけるヒスチジンタグを用いたアフィニティークロマトグラフィー（２回目）で流出されたフラクションのＣＢＢ染色の結果を示す画像である。
【図８Ａ】実施例１におけるｈｕｐＢ−Ｈｉｓ６誘導発現型Ｍ．ｓｅｍｇｍａｔｉｓ株から得られたＭＤＰ１（アセトアミド誘導から２４時間後、４８時間後及び７２時間後）、並びに、大腸菌発現系を用いて得られたＭＤＰ１について、抗ヒスチジン抗体を用いたウェスタンブロット解析の結果を示す画像である。
【図８Ｂ】実施例１におけるｈｕｐＢ−Ｈｉｓ６誘導発現型Ｍ．ｓｅｍｇｍａｔｉｓ株から得られたＭＤＰ１（アセトアミド誘導から２４時間後、４８時間後及び７２時間後）、並びに、大腸菌発現系を用いて得られたＭＤＰ１について、抗ＭＤＰ１−メチル化抗体を用いたウェスタンブロット解析の結果を示す画像である。
【図９Ａ】試験例１におけるＭＤＰ１−Ｍ及びＭＤＰ１−Ｅ存在下で培養したＢＣＧ接種歴のあるヒト由来の末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌｓ；ＰＢＭＣ）のインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ｇａｍｍａ；ＩＦＮ−γ）産生量を示すグラフである。
【図９Ｂ】試験例１におけるＭＤＰ１−Ｍ及びＭＤＰ１−Ｅ存在下で培養したＢＣＧ接種歴のあるヒト由来のＰＢＭＣのＣＣＬ２（Ｃ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ２）産生量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
≪免疫原性を有するＭＤＰ１の製造方法≫
本実施形態の製造方法は、免疫原性を有するＭＤＰ１を製造する方法である。
前記ＭＤＰ１は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個以上数個以下のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列
【００１６】
また、本実施形態の製造方法は、培養工程と、誘導工程と、をこの順に含む方法である。
培養工程では、前記ＭＤＰ１をコードする遺伝子と、前記遺伝子の上流に作動可能に連結された誘導性プロモーターと、を含むベクターを非病原性の迅速発育型抗酸菌に形質転換し、培養する。
誘導工程では、誘導物質を添加して、前記迅速発育型抗酸菌のＭＤＰ１の発現を誘導する。
【００１７】
本実施形態の製造方法では、後述する実施例に示すように、非病原性の迅速発育型抗酸菌を宿主として用いてＭＤＰ１を発現させるため、得られるＭＤＰ１は翻訳後修飾が有し、免疫原性が良好なものとなる。非病原性の迅速発育型抗酸菌を宿主として用いることで、翻訳後修飾が生じたＭＤＰ１が得られることは、発明者らが今回初めて見出した。
また、ＭＤＰ１は抗酸菌の増殖を抑制することが知られている。これに対し、本実施形態の製造方法では、ＭＤＰ１の発現を誘導性プロモーター制御下で調節しているため、宿主菌体を十分に増殖させた後にＭＤＰ１の発現を誘導することができ、大量のＭＤＰ１を製造することができる。
【００１８】
本実施形態の製造方法により得られるＭＤＰ１は、以下の（ａ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
【００１９】
配列番号１に示されるアミノ酸配列は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ株）のＭＤＰ１のアミノ酸配列である。
また、配列番号１７に示されるアミノ酸配列は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）のＭＤＰ１のアミノ酸配列である。配列番号１に示されるアミノ酸配列（以下、「ＭｔｂＭＤＰ１」と称する場合がある）及び配列番号１７に示されるアミノ酸配列（以下、「Ｍ．ｓｍｅｇＭＤＰ１」と称する場合がある）を、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いて、アライメント解析した結果を以下の表１に示す。なお、表１において、「＊」はアミノ酸配列の完全一致を示し、「：」は強い類似性のあるアミノ酸配列であることを示し、「．」は弱い類似性のあるアミノ酸配列であることを示し、空欄は類似性のないアミノ酸配列であることを示している。また、類似性の強い、弱いの基準は、ＰＡＭ２５０  ＭＡＴＲＩＸにおいて、アミノ酸間のスコアが０．５より大きいか、０．５以下であるかで判断される。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
表１から、ＭｔｂＭＤＰ１において、Ｍ．ｓｍｅｇＭＤＰ１と類似性がない部分は、Ｎ末端から１２番目のグルタミン残基（Ｑ）、Ｎ末端から１０７番目のグリシン残基（Ｇ）、Ｎ末端から１５８番目のバリン残基（Ｖ）、Ｎ末端から１５９番目のリシン残基（Ｋ）、Ｎ末端から１６７番目のリシン残基（Ｋ）、Ｎ末端から１６８番目のバリン残基（Ｖ）、Ｎ末端から１６９番目のトレオニン残基（Ｔ）、Ｎ末端から１７０番目のリシン残基（Ｋ）、Ｎ末端から１７１番目のアラニン残基（Ａ）、Ｎ末端から１７２番目のバリン残基（Ｖ）、Ｎ末端から１７３番目のリシン残基（Ｋ）及びＮ末端から１９７番目のアルギニン残基（Ｒ）である。上記類似性がない部分は、ＭｔｂＭＤＰ１等の病原性を有する抗酸菌のＭＤＰ１独自のアミノ配列である可能性がある。
【００２２】
また、本実施形態の製造方法により得られるＭＤＰ１は、上記（ａ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドとして、下記（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含んでもよい。
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個以上数個以下のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列
【００２３】
中でも、本実施形態の製造方法により得られるＭＤＰ１は、上記（ａ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドとして、下記（ｂ１）又は（ｃ１）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことが好ましい。
（ｂ１）配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１２位のグルタミン残基（Ｑ）、アミノ酸番号１０７位のグリシン残基（Ｇ）、アミノ酸番号１５８位のバリン残基（Ｖ）、アミノ酸番号１５９位のリシン残基（Ｋ）、アミノ酸番号１６７位のリシン残基（Ｋ）、アミノ酸番号１６８位のバリン残基（Ｖ）、アミノ酸番号１６９位のトレオニン残基（Ｔ）、アミノ酸番号１７０位のリシン残基（Ｋ）、アミノ酸番号１７１位のアラニン残基（Ａ）、アミノ酸番号１７２位のバリン残基（Ｖ）、アミノ酸番号１７３位のリシン残基（Ｋ）及びアミノ酸番号１９７位のアルギニン残基（Ｒ）以外の部位において、１個以上数個以下のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列；
（ｃ１）配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１２位のグルタミン残基（Ｑ）、アミノ酸番号１０７位のグリシン残基（Ｇ）、アミノ酸番号１５８位のバリン残基（Ｖ）、アミノ酸番号１５９位のリシン残基（Ｋ）、アミノ酸番号１６７位のリシン残基（Ｋ）、アミノ酸番号１６８位のバリン残基（Ｖ）、アミノ酸番号１６９位のトレオニン残基（Ｔ）、アミノ酸番号１７０位のリシン残基（Ｋ）、アミノ酸番号１７１位のアラニン残基（Ａ）、アミノ酸番号１７２位のバリン残基（Ｖ）、アミノ酸番号１７３位のリシン残基（Ｋ）及びアミノ酸番号１９７位のアルギニン残基（Ｒ）以外の部位と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列
【００２４】
上記（ｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド及び上記（ｂ１）のアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、上記（ａ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等であるために、欠失、置換又は付加されてもよいアミノ酸の数としては、１個以上１０個以下が好ましく、１個以上８個以下がより好ましく、１個以上５個以下がさらに好ましく、１個以上３個以下が特に好ましい。
【００２５】
なお、本明細書中において、「置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本実施形態の製造方法で得られるポリペプチドの属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン及びヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びプロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン及びスレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン及びメチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン及びグルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン）等で分類することができる。
【００２６】
また、上記（ｃ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド及び上記（ｃ１）のアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、上記（ａ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等であるためには８０％以上の同一性を有する。係る同一性としては、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９７％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
【００２７】
ここで、基準アミノ酸配列に対する、対象アミノ酸配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準アミノ酸配列及び対象アミノ酸配列をアラインメントする。ここで、各アミノ酸配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準アミノ酸配列及び対象アミノ酸配列において、一致したアミノ酸の数を算出し、下記式（Ｉ）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
「配列同一性（％）」  ＝  ［一致したアミノ酸の数］／［対象アミノ酸配列のアミノ酸の総数］×１００  （Ｉ）
【００２８】
さらに、上記（ｂ）、上記（ｂ１）、上記（ｃ）又は上記（ｃ１）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むＭＤＰ１は、免疫原性を有する。
一般に、「免疫原性」とは、抗原が抗体産生や細胞性応答を誘導する性質を意味する。
【００２９】
また、本実施形態の製造方法により得られるＭＤＰ１は、タグペプチドを備えてもよい。また、タグペプチドは、ＭＤＰ１の立体構造から、ＭＤＰ１のＣ末端側に備えることが好ましい。本実施形態の製造方法により得られるＭＤＰ１は、タグペプチドを備えることで、後述する精製工程において、該タグペプチドを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、ＭＤＰ１を精製することができる。
また、タグペプチドとしては、ＭＤＰ１が立体構造を維持できる程度の大きさであるものであればよい。このようなタグペプチドとしては、例えば、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）（６個程度連続したヒスチジン残基からなるタグペプチド）、ＨＱタグ（ヒスチジン残基とグルタミン残基とが交互に連続した６個程度のアミノ酸残基からなるタグペプチド）、ＨＮタグ（ヒスチジン残基とアスパラギン酸残基とが交互に連続した１２個程度のアミノ酸残基からなるタグペプチド）、ＨＡＴタグ（ニワトリの乳酸脱水素酵素由来のタグペプチド）、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ（参考文献１：米国特許第４７０３００４号明細書）、ＨＡタグ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニン由来のタグペプチド）、ｃ−ｍｙｃタグ（ヒトｃ−ｍｙｃタンパク質由来のタグペプチド）等が挙げられる。
【００３０】
次いで、本実施形態の製造方法の各工程について、以下に詳細を説明する。
【００３１】
＜培養工程＞
培養工程では、前記ＭＤＰ１をコードする遺伝子と、前記遺伝子の上流に作動可能に連結された誘導性プロモーターと、を含むベクターを非病原性の迅速発育型抗酸菌に形質転換し、培養する。
ベクターの非病原性の迅速発育型抗酸菌への導入方法としては、公知の方法を用いることができ、具体的には、例えば、エレクトロポレーション法、ヒートショック法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、パーティクル・ガン法、ウイルスを用いた方法や、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標） ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）等の市販のトランスフェクション試薬を用いた方法等が挙げられる。
ベクター導入後の培養条件としては、抗酸菌を培養する際に一般的に用いられる条件であればよく、培養温度は、例えば２５℃以上４０℃以下とすることができる。また、培養時間は特に限定はなく、植菌数から所望の菌体数となるまでに必要な期間とすることができる。
【００３２】
［ベクター］
培養工程で用いられるベクターは、上記ＭＤＰ１をコードする遺伝子と、前記遺伝子の上流に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含む。
なお、本明細書において、「作動可能に連結されている」とは、上記誘導性プロモーターが上記ＭＤＰ１をコードする遺伝子の発現を調節可能であることを意味する。
【００３３】
培養工程で用いられるベクターは、発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては、核酸菌に導入しＭＤＰ１を発現させることができるベクターであればよく、例えば、ｐＳＯ２４６（参考文献２：Matsumoto S et al., “A stable Escherichia cd-mycobacteria shuttle vector ‘pS0246’in Mycobacterium bovis BCG.”, FEMS Microbiology Letters, Vol. 135, p237-243, 1996.）、ｐＹＴ９３７（参考文献３：Goto Y et al., “Development of a new host vector system in mycobacteria.”, FEMS Microbiology Letters, Vol. 83, No. 3, p277-282, 1991.）、ｐＮＮ（参考文献４：Ohara N et al., “Characterization of the transcriptional initiation regions of genes for the major secreted protein antigens 85C and MPB51 of Mycobacterium bovis BCG.”, Microbial Pathogenesis, Vol. 23, p303-310, 1997.）等が挙げられる。
【００３４】
（ＭＤＰ１をコードする遺伝子）
上記ＭＤＰ１をコードする遺伝子としては、例えば、以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの塩基酸配列からなる遺伝子を含む遺伝子等が挙げられる。
（ｄ）配列番号３に示される塩基配列；
（ｅ）配列番号３に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列；
（ｆ）配列番号３に示される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列；
（ｇ）配列番号３に示される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストトリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列
【００３５】
なお、配列番号３に示される塩基配列は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ株）のＭＤＰ１の塩基配列である。
【００３６】
また、上記（ｅ）の塩基配列からなる遺伝子を含む遺伝子がコードするポリペプチドにおいて、上記（ｄ）の塩基配列からなる遺伝子を含む遺伝子がコードするポリペプチドと機能的に同等であるために、欠失、置換又は付加されてもよい塩基の数としては、１個以上３０個以下が好ましく、１個以上２４個以下がより好ましく、１個以上１５個以下がさらに好ましく、１個以上９個以下が特に好ましい。
【００３７】
また、上記（ｆ）の塩基配列からなる遺伝子を含む遺伝子がコードするポリペプチドにおいて、上記（ｄ）の塩基配列からなる遺伝子を含む遺伝子がコードするポリペプチドと機能的に同等であるために、８０％以上の同一性を有する。係る同一性としては、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９７％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
【００３８】
ここで、基準塩基配列に対する、対照塩基配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準塩基配列及び対象塩基配列をアラインメントする。ここで、各塩基配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準塩基配列及び対象塩基配列において、一致した塩基の塩基数を算出し、下記式（ＩＩ）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
「配列同一性（％）」  ＝  ［一致した塩基数］／［対象塩基配列の総塩基数］×１００  （ＩＩ）
【００３９】
なお、本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法が挙げられる。例えば、ハイブリダイゼーションバッファー中で、５５℃以上７０℃以下で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件が挙げられる。前記ハイブリダイゼーションバッファーとしては、例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ 塩化ナトリウム、０．３Ｍ クエン酸溶液、ｐＨ７．０）、０．１重量％ Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び、５０％フォルムアミドからなる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液が好ましく、０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液がより好ましい。
【００４０】
また、上記ＭＤＰ１をコードする遺伝子としては、例えば、以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの塩基酸配列からなる遺伝子のみからなってもよく、以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの塩基酸配列からなる遺伝子に加えて、例えば、タグペプチドをコードする遺伝子等を含んでもよい。
【００４１】
（誘導性プロモーター）
誘導性プロモーターとしては、誘導物質存在時に、該プロモーターの下流に存在する遺伝子（本実施形態の製造方法では、ＭＤＰ１をコードする遺伝子）の発現を誘導することができるプロモーターを用いることができる。上述のように、ＭＤＰ１は抗酸菌の増殖を抑制することが知られている。これに対し、培養工程で用いられるベクターは、ＭＤＰ１の発現を誘導性プロモーター制御下で調節しているため、宿主菌体を十分に増殖させた後にＭＤＰ１の発現を誘導することができ、大量のＭＤＰ１を製造することができる。
このような誘導性プロモーターとして具体的には、例えば、サリチル酸誘導性プロモーター（参考文献５：国際公開第９５／１９４３３号）、テトラサイクリン誘導性プロモーター（参考文献６：Gatz c et al., “Stringent repression and homogeneous de-repression by tetracycline of modified CaMV 35S promoter in intact transgenic tobacco plants.”, Plant J., Vol. 2, Issue 3, p397-404, 1992.）、アセトアミド誘導性プロモーター、エタノール誘導性プロモーター、亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーター、ガラクトース誘導性プロモーター等が挙げられる。中でも、誘導性プロモーターとしては、アセトアミド誘導性プロモーターが好ましい。
【００４２】
（その他の構成）
ベクターは、上記ＭＤＰ１をコードする遺伝子及び上記誘導性プロモーターに加えて、さらに、例えば、エンハンサー、応答配列、ポリアデニル化シグナル配列、薬剤耐性配列、マーカー配列等を含んでもよい。
【００４３】
中でも、培養工程に用いられるベクターとしては、配列番号２に示される塩基配列からなる核酸を含むベクターが好ましい。配列番号２に示される塩基配列は、アセトアミダーゼレギュレーター遺伝子（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ６３０９５）及びアセトアミダーゼ遺伝子のプロモーター領域（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５７１７５）を含む塩基配列（全長２８９０ｂｐ）と、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ株）のＭＤＰ１の塩基配列と、ヒスチジンタグの塩基配列とがこの順に連結された塩基配列である。
【００４４】
［迅速発育型抗酸菌］
培養工程で用いられる抗酸菌（ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌）は、安全性及び製造効率の観点から、非病原性であって、且つ、迅速発育型の抗酸菌である。一般に、「迅速発育型抗酸菌」とは、孤立コロニーができるように十分に希釈した新鮮菌液を卵培地に接種した場合に、接種から１週間未満に肉眼的にコロニーを認め得るものを意味する。一方、「遅発育型抗酸菌」とは、上記条件で培養した場合に、肉眼的にコロニーを認め得るまで、接種から１週間以上要するものを意味する（参考文献７：吉田眞一ら編、『戸田新細菌学』、第３３版、南山堂、２００７年５月７日、第６３０頁）。
結核菌は、上記２分類のうち、遅発育型抗酸菌に分類される。一方、本実施形態の製造方法で宿主として用いられる抗酸菌は、迅速発育型抗酸菌である。いずれの抗酸菌も、ＭＤＰ１遺伝子を有し、ＭＤＰ１を発現するが、その機能は菌種によって異なることが知られている。その中で、結核菌ＭＤＰ１を迅速発育型抗酸菌で発現させることで、翻訳後修飾が生じ、良好な免疫原性を有するＭＤＰ１が得られることは、今回発明者らが初めて見出したことである。
【００４５】
培養工程で用いられる非病原性の迅速発育型抗酸菌として具体的には、例えば、Ｍ．  ｃｈｉｔａｅ（ＡＦ０５７４６１）、Ｍ．  ｆａｌｌａｘ（ＡＦ０５７４６２）、Ｍ．  ｐｈｌｅｉ（ＡＦ０５７４８０）、Ｍ．  ａｕｒｕｍ（ＡＦ０５７４５６）、Ｍ．  ｖａｃｃａｅ（ＡＦ０５７４９２）、Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（ＡＦ０５７４８５）等が挙げられる。中でも、非病原性の迅速発育型抗酸菌としては、Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓが好ましい。
【００４６】
また、遅発育型抗酸菌では、ＭＤＰ１遺伝子が生存に必須であり、ＭＤＰ１遺伝子を欠失又は失活すると死滅するのに対し、迅速発育型抗酸菌ではＭＤＰ１遺伝子を欠失又は失活しても生存可能である。このことから、培養工程で用いられる迅速発育型抗酸菌は、ＭＤＰ１遺伝子を欠失又は失活していてもよい。これにより、迅速発育型抗酸菌内で発現されるＭＤＰ１が導入したベクターに由来するもの（すなわち、結核菌ＭＤＰ１及びそれと同等の機能を有するタンパク質）のみとなるため、続く工程において、ＭＤＰ１の精製をより簡便に行うことができる。
【００４７】
＜誘導工程＞
誘導工程では、誘導物質を添加して、上記迅速発育型抗酸菌のＭＤＰ１の発現を誘導する。
誘導物質としては、ベクターに含まれる誘導性プロモーターの種類に応じて適宜選択すればよく、具体的には、以下に示すものが挙げられる。
サリチル酸誘導性プロモーターの場合、例えば、サリチル酸及びその誘導体等；
テトラサイクリン誘導性プロモーターの場合、例えば、テトラサイクリン、ドキシサイクリン等のテトラサイクリン系抗生物質；
アセトアミド誘導性プロモーターの場合、例えば、アセトアミド及びその誘導体等；
エタノール誘導性プロモーターの場合、例えば、エタノール等；
亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーターの場合、例えば、亜鉛及びその塩等；
ガラクトース誘導性プロモーターの場合、例えば、ガラクトース及びその誘導体等
【００４８】
誘導物質の添加量は、ベクターに含まれる誘導性プロモーターの種類に応じて適宜調節することができる。
また、誘導物質添加後の迅速発育型抗酸菌の培養時間としては、ＭＤＰ１が発現し、十分な量蓄積するまでの期間とすることができ、例えば３日間以上７日間以下とすることができる。
【００４９】
ＭＤＰ１の発現は、例えば、後述する実施例に示すように、培養後の一部の菌体を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色法により、又は、さらに抗ＭＤＰ１抗体を用いたウェスタンブロット解析により、確認することができる。
【００５０】
また、誘導工程においてＭＤＰ１の発現が確認された菌体から、例えば、以下に示す変性工程及び精製工程等を経て、ＭＤＰ１を取り出すことができる。
【００５１】
＜変性工程＞
変性工程では、まず、誘導工程後の迅速発育型抗酸菌を公知の方法により破砕して破砕液を調製する。菌体の破砕方法としては、例えば、界面活性剤を使用する方法、超音波処理法、ホモジナイザーを使用する方法、ビーズを使用する破砕方法等が挙げられ、これらに限定されない。これらの方法を１種単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。
【００５２】
次いで、破砕液から酸を用いてＭＤＰ１を抽出する。ここで用いられる酸としては、例えば、塩酸、硫酸、酢酸等が挙げられ、中でも、塩酸が好ましい。
ＭＤＰ１の抽出方法として具体的には、例えば、塩酸を用いる場合には、破砕液から遠心分離等により菌体をペレットとして回収し、該ペレットを例えば０．０１Ｎ以上０．５Ｎ以下程度の塩酸を懸濁した後、例えば８時間以上２４時間以下程度攪拌することで、ＭＤＰ１を可溶化し、溶液中に抽出することができる。
【００５３】
次いで、得られたＭＤＰ１を含む抽出液に変性剤を添加し、ＭＤＰ１を変性させる。これにより、続く精製工程において、ＭＤＰ１の固定相への吸着性を向上させ、さらに、ＭＤＰ１以外のタンパク質等の夾雑物の除去が容易になる。
使用する変性剤としては、例えば、尿素、グアニジン塩酸塩、Ｎ−ラウリルサルコシル等が挙げられる。
変性剤の添加量としては、変性剤の種類に応じて適宜調節することができる。
例えば、変性剤として尿素を用いる場合には、ＭＤＰ１を含む抽出液中の尿素の含有量が例えば１ｍｏｌ／Ｌ以上１０ｍｏｌ／Ｌ以下程度となるように、該抽出液に尿素を添加する。
【００５４】
＜精製工程＞
精製工程では、変性剤を実質的に含まない緩衝液を用いた液体クロマトグラフィーにより、ＭＤＰ１を精製する。
ここでいう「変性剤を実質的に含まない」とは、変性剤を含まない、又は、ＭＤＰ１のリフォルディングを妨げない程度の極少量しか変性剤を含まない状態を意味する。精製工程において、変性剤を実質的に含まない緩衝液を用いることで、ＭＤＰ１が固定相に吸着されたままの状態で、その立体構造を再構築（リフォルディング）することができる。
また、液体クロマトグラフィーとしては、例えば、ＭＤＰ１に対する特異的結合物質を備える固定相を用いたアフィニティークロマトグラフィーが好ましい。ＭＤＰ１に対する特異的結合物質としては、例えば、抗ＭＤＰ１抗体、タグペプチドに対する特異的結合物質等が挙げられる。なお、タグペプチドに対する特異的結合物質は、タグペプチドの種類に応じて適宜選択することができる。
例えば、タグペプチドが、ヒスチジンタグ、ＨＱタグ、ＨＮタグ、ＨＡＴタグである場合には、タグペプチドに対する特異的結合物質を備える固定相として、金属イオンが固定化された担体を用いることができる。金属イオンとしては、２価の金属イオンが好ましく、例えば、ニッケルイオン、亜鉛イオン、銅イオン、カルシウムイオン、コバルトイオン、鉄イオン（ＩＩ）等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、金属イオンとしては、上記タグペプチドとの親和性及び溶出のしやすさから、ニッケルイオンが好ましい。
また、例えば、タグペプチドが、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ、ＨＡタグ又はｃ−ｍｙｃタグである場合には、タグペプチドに対する特異的結合物質を備える固定相として、抗ＦＬＡＧ抗体、抗ＨＡ抗体又は抗ｃ−ｍｙｃ抗体がそれぞれ固定化された担体を用いることができる。
【００５５】
液体クロマトグラフィーにおいて、移動相として用いられる緩衝液としては、ｐＨ６以上８以下程度の中性のものが好ましく、例えば、以下に示す酸類、塩基類、塩類等が用いて調製することができる。これらを１種類単独で、又は、２種以上組み合わせて用いてもよい。
酸類としては、例えば、リン酸、酢酸、クエン酸、酒石酸、ホウ酸、塩酸等が挙げられる。
塩基類としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ；Ｔｒｉｓ）等が挙げられる。
塩類としては、例えば、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００５６】
具体的な精製方法としては、例えば、まず、ＭＤＰ１を含む移動相を、ＭＤＰ１に対する特異的結合物質を備える固定相にアプライし、固定相にＭＤＰ１を、前記特異的結合物質を介して吸着させる。なお、ＭＤＰ１を含む移動相を固定相にアプライする前に、変性工程後の変性ＭＤＰ１を含む溶液を、変性剤を含む緩衝液を外液として透析してもよい。
次いで、変性剤を実質的に含まない緩衝液を送液することで、変性剤を除去し、ＭＤＰ１を固定相に吸着させた状態でリフォルディングする。次いで、キレート剤を含み、且つ、変性剤を実質的に含まない緩衝液を用いて、立体構造が再構築されたＭＤＰ１を溶出させる。ＭＤＰ１の溶出に用いられるキレート剤としては、例えば、イミダゾール、エチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ；ＥＤＴＡ）等が挙げられる。また、緩衝液中のキレート剤の濃度は、例えば２００ｍＭ以上とすることができる。また、液体クロマトグラフィーにおいて、上記以外は、公知の方法を用いることができる。
また、ＭＤＰ１が得られたことは、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色法により、又は、さらに抗ＭＤＰ１抗体を用いたウェスタンブロット解析により、確認することができる。
さらに、ＭＤＰ１が翻訳後修飾されていることは、例えば、抗メチル化ＭＤＰ１抗体を用いたウェスタンブロット解析等により、確認することができる。
【００５７】
また、本実施形態の製造方法において、精製工程を第１の精製工程及び第２の精製工程に分けて行ってもよい。
第１の精製工程では、変性剤を含む緩衝液を用いた液体クロマトグラフィーにより、ＭＤＰ１を精製する。第１の精製工程を行うことで、夾雑物をより効果的に除去することができ、精製度のより高いＭＤＰ１が得られる。なお、第１の精製工程で用いられる変性剤及び緩衝液中の変性剤の濃度としては、上記変性工程において例示されたものと同様のものが挙げられる。また、第１の精製工程で用いられる変性剤の種類及び緩衝液中の変性剤の濃度は、上記変性工程において用いられる変性剤と同一であってもよく、異なっていてもよい。
第２の精製工程では、変性剤を実質的に含まない緩衝液を用いた液体クロマトグラフィーにより、ＭＤＰ１を精製する。第２の精製工程を行うことで、立体構造が再構築されたＭＤＰ１を得ることができる。
中でも、ワクチンに使用可能な程度の高精製度のＭＤＰ１を得られることから、精製工程を第１の精製工程及び第２の精製工程に分けて行うことが好ましい。
【００５８】
具体的な精製方法としては、例えば、まず、ＭＤＰ１を含む移動相を、ＭＤＰ１に対する特異的結合物質を備える固定相にアプライし、固定相にＭＤＰ１を、前記特異的結合物質を介して吸着させる。次いで、変性剤を含む緩衝液を送液することで、ＭＤＰ１以外のタンパク質等の夾雑物を固定相から除去する。次いで、変性剤及びキレート剤を含む緩衝液を用いて、変性状態のＭＤＰ１を溶出させる（第１の精製工程）。このとき、ＭＤＰ１が得られたことは、上記と同様に、ＣＢＢ染色法又は抗ＭＤＰ１抗体を用いたウェスタンブロット解析で確認することができる。
【００５９】
次いで、再度、ＭＤＰ１を含む移動相を、ＭＤＰ１に対する特異的結合物質を備える固定相にアプライし、固定相にＭＤＰ１を、前記特異的結合物質を介して吸着させる。次いで、変性剤を実質的に含まない緩衝液を送液することで、変性剤を除去し、ＭＤＰ１を固定相に吸着させた状態でリフォルディングする。次いで、キレート剤を含み、且つ、変性剤を実質的に含まない緩衝液を用いて、立体構造が再構築されたＭＤＰ１を溶出させる（第２の精製工程）。
ＭＤＰ１が得られたことは、上記と同様に、ＣＢＢ染色法又は抗ＭＤＰ１抗体を用いたウェスタンブロット解析で確認することができる。
さらに、ＭＤＰ１が翻訳後修飾されていることは、例えば、抗メチル化ＭＤＰ１抗体を用いたウェスタンブロット解析等により、確認することができる。
【００６０】
＜使用用途＞
本実施形態の製造方法で得られたＭＤＰ１は、例えば、結核感染者に対する血清診断抗原、インターフェロン−γ遊離試験（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  γ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ａｓｓａｙ；ＩＧＲＡ）等に用いるＴ細胞応答を利用した診断抗原、成人期以降の低下した結核免疫を増強するワクチン抗原として有用である。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６２】
［実施例１］
１．プラスミドの構築
（１）ＭＤＰ１遺伝子の増幅及び精製
まず、結核菌Ｈ３７Ｒｖ株（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ）のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＭＤＰ１遺伝子（「ｈｕｐＢ」又は「Ｒｖ２９８６ｃ」とも呼ばれる）（塩基配列：配列番号３）のＮ末端に制限酵素サイトＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｄｅＩを、Ｃ 末端にヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−６）及び制限酵素サイトＫｐｎＩを付加して、ＰＣＲ法により増幅した。（なお、得られた増幅産物を、以下、「ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｄｅＩ−ｈｕｐＢ−Ｈｉｓ６−ＫｐｎＩ」と称する場合がある）。使用したプライマーの塩基配列を以下の表２に示す。また、増幅試薬は、Ｔａｋａｒａ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｋｉｔを使用した。
【表２】
2019208430.tif 000003
【００６３】
次いで、ＰＣＲ生成物について、アガロースゲル電気泳動を行い、ＦａｓｔＧｅｎｅ（登録商標）  ゲル／ＰＣＲ抽出キット（日本ジェネティクス社製）を用いて、増幅産物のバンドを含むゲルから増幅産物を抽出及び精製した。次いで、増幅産物を制限酵素ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断して、切断産物を得た（なお、得られた切断産物を、以下、「ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｄｅＩ−ｈｕｐＢ−Ｈｉｓ６−ＫｐｎＩ（６８７ｂｐ）／ＨｉｎｄＩＩＩ，ＫｐｎＩ」と称する場合がある）。
【００６４】
（２）大腸菌−抗酸菌シャトルベクターｐＳＯ２４６へのＭＤＰ１遺伝子の挿入
次いで、大腸菌−抗酸菌シャトルベクターｐＳＯ２４６（図１参照）を制限酵素ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、切断産物を得た（なお、得られた切断産物を、以下、「ｐＳＯ２４６／ＨｉｎｄＩＩＩ，ＫｐｎＩ」と称する場合がある）。次いで、この切断産物「ｐＳＯ２４６／ＨｉｎｄＩＩＩ，ＫｐｎＩ」と、（１）で得られた切断産物「ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｄｅＩ−ｈｕｐＢ−Ｈｉｓ６−ＫｐｎＩ（６８７ｂｐ）／ＨｉｎｄＩＩＩ，ＫｐｎＩ」とについて、アガロースゲル電気泳動を行い、ＦａｓｔＧｅｎｅ（登録商標）  ゲル／ＰＣＲ抽出キット（日本ジェネティクス社製）を用いて、切断産物のバンドを含むゲルから切断産物をそれぞれ抽出及び精製した。次いで、精製後の「ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｄｅＩ−ｈｕｐＢ−Ｈｉｓ６−ＫｐｎＩ（６８７ｂｐ）／ＨｉｎｄＩＩＩ，ＫｐｎＩ」を、精製後の「ｐＳＯ２４６／ＨｉｎｄＩＩＩ，ＫｐｎＩ」にライゲーションして、ライゲーション産物「ｐＳＯ２６４−ｈｕｐＢ（Ｒｖ２９８６ｃ）−Ｈｉｓ６」を得た（図２参照）。なお、ライゲーションは、ＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いて、メーカーのプロトコールに従って実施した。
【００６５】
（３）大腸菌の形質転換及びライゲーション産物の増幅
次いで、上記「１．」の（２）で得られたライゲーション産物「ｐＳＯ２６４−ｈｕｐＢ（Ｒｖ２９８６ｃ）−Ｈｉｓ６」をコンピテントセル（Ｅ.  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α）に形質転換し、１０μｇ／ｍＬのカナマイシン含有ＬＢ  ａｇａｒに接種して、３７℃で一晩培養した。次いで、出現したコロニーを１０μｇ／ｍＬのカナマイシン含有ＬＢ  ｂｒｏｔｈ  ２ｍＬ以上５ｍＬ以下程度に接種して、３７℃で培養して増菌し、菌体からプラスミドを公知の方法を用いて抽出した。次いで、抽出されたプラスミドに挿入された「ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｄｅＩ−ｈｕｐＢ−Ｈｉｓ６−ＫｐｎＩ」を、以下の表３に示すプライマーを用いて増幅し、その塩基配列をＤＮＡシーケンス解析で確認した。なお、抽出されたプラスミドに挿入された「ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｄｅＩ−ｈｕｐＢ−Ｈｉｓ６−ＫｐｎＩ」の増幅は、ユーロフィンジェノミクス社に外部委託した。
【００６６】
【表３】
2019208430.tif 000004
【００６７】
次いで、上記「１．」の（３）で増幅されたライゲーション産物「ｐＳＯ２６４−ｈｕｐＢ（Ｒｖ２９８６ｃ）−Ｈｉｓ６」をＢａｍＨＩ及びＮｄｅＩで切断して、切断産物を得た（なお、得られた切断産物を、以下、「ｐＳＯ２６４−ｈｕｐＢ（Ｒｖ２９８６ｃ）−Ｈｉｓ６／ＢａｍＨＩ，ＮｄｅＩ」と称する場合がある）。
【００６８】
（４）ｐＳＯ２６４−ｈｕｐＢ（Ｒｖ２９８６ｃ）−Ｈｉｓ６プラスミドへのアセトアミダーゼレギュレーター遺伝子及びアセトアミダーゼ遺伝子のプロモーター領域の挿入
次いで、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（図３参照）を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＮｄｅＩで切断して、アセトアミダーゼレギュレーター遺伝子（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ６３０９５）及びアセトアミダーゼ遺伝子のプロモーター領域（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５７１７５）を含む塩基配列（全長２８９０ｂｐ）（以下、この塩基配列からなる核酸部位を「Ａｃｅ  ｕｎｉｔ」と称する場合がある）を切り出した。なお、図３に示す「ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ」は、発明者らが作製したプラスミドであり、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｅｍｇｍａｔｉｓ（Ｍ．ｓｅｍｇｍａｔｉｓ）のゲノムＤＮＡからＰＣＲ法により増幅した上記Ａｃｅ  ｕｎｉｔが挿入されたものである。
次いで、この切断産物「Ａｃｅ  ｕｎｉｔ」と、（３）で得られた切断産物「ｐＳＯ２６４−ｈｕｐＢ（Ｒｖ２９８６ｃ）−Ｈｉｓ６／ＢａｍＨＩ，ＮｄｅＩ」とについて、アガロースゲル電気泳動を行い、ＦａｓｔＧｅｎｅ（登録商標）  ゲル／ＰＣＲ抽出キット（日本ジェネティクス社製）を用いて、切断産物のバンドを含むゲルから切断産物をそれぞれ抽出及び精製した。次いで、精製後の「Ａｃｅ  ｕｎｉｔ」を、精製後の「ｐＳＯ２６４−ｈｕｐＢ（Ｒｖ２９８６ｃ）−Ｈｉｓ６／ＢａｍＨＩ，ＮｄｅＩ」にライゲーションして、「Ａｃｅ  ｕｎｉｔ」と「ｈｕｐＢ（Ｒｖ２９８６ｃ）−Ｈｉｓ６」とを連結したｈｕｐＢ−Ｈｉｓ６誘導発現プラスミド「ｐＳＯ２６４−ＡＣＥ−ｈｕｐＢ（Ｒｖ２９８６ｃ）−Ｈｉｓ６」を構築した（図４参照）。なお、ライゲーションは、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  ｖｅｒ．２（東洋紡社製）を用いて、メーカーのプロトコールに従って実施した。
【００６９】
なお、ｈｕｐＢ−Ｈｉｓ６誘導発現プラスミド「ｐＳＯ２６４−ＡＣＥ−ｈｕｐＢ（Ｒｖ２９８６ｃ）−Ｈｉｓ６」は以下の表４に示す５セットのプライマーを用いて、ＰＣＲ法により増幅した。次いで、増幅産物について、それぞれアガロースゲル電気泳動を行い、その塩基数から想定通りのプラスミドが構築されていることを確認した。また、得られたｈｕｐＢ−Ｈｉｓ６誘導発現プラスミド「ｐＳＯ２６４−ＡＣＥ−ｈｕｐＢ（Ｒｖ２９８６ｃ）−Ｈｉｓ６」を配列番号１６に示す。
【００７０】
【表４】
2019208430.tif 000005
【００７１】
２．迅速発育型抗酸菌Ｍ．ｓｅｍｇｍａｔｉｓの形質転換及びＭＤＰ１の発現誘導
（１）迅速発育型抗酸菌Ｍ．ｓｅｍｇｍａｔｉｓの形質転換
ｍｄｐ１遺伝子（ＭＳＭＥＧ＿２３８９）を欠失させたＭ．ｓｅｍｇｍａｔｉｓ  ｍｃ２＿１５５株（以下、「Ｍ．ｓｅｍｇｍａｔｉｓ  Δｍｄｐ１」と称する場合がある）に、上記「１．」で得られたｈｕｐＢ−Ｈｉｓ６誘導発現プラスミド「ｐＳＯ２６４−ＡＣＥ−ｈｕｐＢ（Ｒｖ２９８６ｃ）−Ｈｉｓ６」をエレクトロポレーション法により導入し、形質転換した。次いで、形質転換後の菌液を１０μｇ／ｍＬのカナマイシン及び５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシン含有７Ｈ１１培地に接種した。次いで、２日後から３日後までに出現したコロニーをｈｕｐＢ−Ｈｉｓ６誘導発現型Ｍ．ｓｅｍｇｍａｔｉｓ株（以下、「Ｍ．ｓｅｍｇｍａｔｉｓ  ｍｃ２１５５Δｍｄｐ１：：ＡＣＥ−ｈｕｐＢ（Ｒｖ２９８６ｃ）−Ｈｉｓ６」と称する場合がある）として用いた。
【００７２】
（２）菌の培養及びＭＤＰ１の発現誘導
次いで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０を添加したＭｕｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  ＩＩ  ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）５００ｍＬを１Ｌの坂口フラスコに入れ、カナマイシン（最終濃度：１０μｇ／ｍＬ）及びハイグロマイシン（最終濃度：５０μｇ／ｍＬ）を添加して、菌株培養用の培地を調製した。次いで、（１）で得られたｈｕｐＢ−Ｈｉｓ６誘導発現型Ｍ．ｓｅｍｇｍａｔｉｓ株を、上記調製した培地に接種し、大型恒温振とう培養機バイオシェーカー（登録商標）  Ｇ・ＢＲ−３００（ＴＡＩＴＥＣ社製）を用いて、３７℃、１１５ｒｐｍ／分の条件下で振盪培養した。培養液の６００ｎｍ吸光度が１．０付近に達した時点で、アセトアミド（シグマアルドリッチ社製）を最終濃度２％となるよう添加し、さらに２４時間、４８時間又は７２時間培養した。次いで、菌体を遠心分離（１５，０００×ｇ、５分間、４℃）により回収した。次いで、少量の菌体を水とともにビーズビーターで破砕し、ＳＤＳ（最終濃度：１％）を加えて、９５℃で２０分間加熱した。次いで、加熱後の菌体溶液の上清を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色、並びに、抗ＭＤＰ１抗体及び抗ヒスチジン抗体を用いたウェスタンブロット解析により、ＭＤＰ１の発現を確認した。代表的な結果として、アセトアミド誘導後４８時間培養した菌体のＣＢＢ染色の結果を図５Ａ（１レーンあたりのタンパク質量：１０μｇ）に、抗ＭＤＰ１抗体を用いたウェスタンブロット解析の結果を図５Ｂ（１レーンあたりのタンパク質量：２μｇ）に、抗ヒスチジン抗体を用いたウェスタンブロット解析の結果を図５Ｃ（１レーンあたりのタンパク質量：５００ｎｇ）に示す。図５Ａ〜図５Ｃにおいて、（−）はアセトアミドを添加せずに培養した菌体、（＋）はアセトアミド添加して培養した菌体である。また、矢印はＭＤＰ１のバンドを示す。
【００７３】
図５Ａ〜図５Ｃから、アセトアミドを添加して培養した菌体において、ｈｕｐＢ−Ｈｉｓ６が発現していることが確かめられた。
【００７４】
３．ＭＤＰ１の抽出
次いで、「２．」で培養した菌体を粒径０．３ｍｍ以上０．５ｍｍ以下程度の石英砂（キシダ化学製）とともに乳鉢で破砕した。次いで、０．２５Ｎの塩酸に懸濁し、４℃で一晩攪拌した。次いで、懸濁液を遠心分離（１５，０００×ｇ、２０分間）し、上清を得た。次いで、得られた上清に同容量の８Ｍの尿素を加えた後、さらに１０Ｍの水酸化ナトリウム溶液を加えて、ｐＨを８．０に調整した。次いで、ｐＨ調整後の溶液を透析チューブ（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｕｂｉｎｇ  ３，５００ＭＷＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）に入れ、６Ｍの尿素含有Ｈｉｓ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、６Ｍ  尿素）（以下、「Ｈｉｓ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ａ１）」と称する場合がある）を外液として一晩透析した。次いで、透析後の溶液を０．２μｍのフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）で濾過後、ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｌｏｒ  １０ｓを用いて精製して、ＭＤＰ１含有溶液を得た。
【００７５】
４．ＭＤＰ１の精製
ＭＤＰ１の精製は２段階で実施した。１段階目は６Ｍの尿素含有ＢｕｆｆｅｒでＭＤＰ１含有フラクションを流出し、２段階目は尿素不含Ｂｕｆｆｅｒを用いてカラム上でＭＤＰ１をリフォルディングした後、ＭＤＰ１含有フラクションを得た。具体的には、以下に示す手順で行った。なお、カラム操作はコールドルーム（４℃以上９℃以下程度）で実施した。また、精製に用いた装置及び緩衝液の組成は以下に示すとおりである。
【００７６】
（測定装置）
装置名：ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ／１０Ｓ（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）
フラクションコレクター：Ｆｒａｃ−９００（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）
カラム：ＨｉｓＴｒａｐ（登録商標）  ＦＦ  ５ｍＬ（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）
【００７７】
（緩衝液の組成）
６Ｍの尿素含有Ｈｉｓ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ａ１）：５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、６Ｍ  尿素
６Ｍの尿素含有Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｂ１）：５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、６Ｍ  尿素
尿素不含Ｈｉｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｂ１  ｗ／ｏ）及び（Ａ２  ｗ／ｏ）：５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０
尿素不含Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｂ２  ｗ／ｏ）：５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０
なお、上記（Ｂ１  ｗ／ｏ）及び上記（Ａ２  ｗ／ｏ）は、同じ組成の緩衝液であるが、液体クロマトグラフィーにおいてグラジエントは緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂ間で設定する必要があるため、上記のとおり、異なる名称を付した。
【００７８】
（１）１段階目の精製
まず、カラムをセットした液体クロマトグラフに、上記「３．」で抽出及び精製したＭＤＰ１含有溶液をアプライし、６Ｍの尿素含有Ｈｉｓ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ａ１）を流速２ｍＬ／分の条件下で流して、ＭＤＰ１をカラム内に吸着させた。次いで、緩衝液の混合比が６Ｍの尿素含有Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｂ１）を１０％、及び、６Ｍの尿素含有Ｈｉｓ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ａ１）を９０％となるように設定し、流速２ｍＬ／分の条件下で３０カラム容量分（１５０ｍＬ）の緩衝液を流して、カラム内を洗浄した。次いで、６Ｍの尿素含有Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｂ１）が１００％となるまでグラジエントをかけて、流速２ｍＬ／分の条件下で８カラム容量分（４０ｍＬ）緩衝液を流して、ＭＤＰ１を流出させた。次いで、流出フラクションを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色によりＭＤＰ１が含まれるフラクションを確認した。ＣＢＢ染色の結果を図６に示す。図６から、ＭＤＰ１が含まれるフラクションを透析チューブ（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｕｂｉｎｇ  ３，５００ＭＷＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）に入れ、６Ｍのウレア含有Ｈｉｓ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ａ１）を外液として一晩透析した。
【００７９】
（２）２段階目の精製
次いで、カラムをセットした液体クロマトグラフに、透析後のＭＤＰ１含有溶液をアプライし、６Ｍの尿素含有Ｈｉｓ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ａ１）を流速１ｍＬ／分の条件下で流して、ＭＤＰ１をカラム内に吸着させた。次いで、尿素不含Ｈｉｓ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂ１  ｗ／ｏ）を１００％となるまでグラジエントをかけて、流速１ｍＬ／分の条件下で３０カラム容量分（１５０ｍＬ）流して、カラム内の緩衝液の組成を置き換えて、カラム上でＭＤＰ１のリフォルディングを行った。次いで、緩衝液の混合比が尿素不含Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｂ２  ｗ／ｏ）を１０％、及び、尿素不含Ｈｉｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（Ａ２  ｗ／ｏ）を９０％となるように設定し、流速１ｍＬ／分の条件下で３０カラム容量分（１５０ｍＬ）の緩衝液を流して、カラム内を洗浄した。次いで、尿素不含Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｂ２  ｗ／ｏ）が１００％となるまでグラジエントをかけて、流速１ｍＬ／分の条件下で８カラム容量分（４０ｍＬ）緩衝液を流して、ＭＤＰ１を流出させた。次いで、緩衝液の混合比が尿素不含Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｂ２  ｗ／ｏ）が１００％となるように設定し、流速１ｍＬ／分の条件下で５カラム容量分（２５ｍＬ）の緩衝液を流して、カラムに残存するＭＤＰ１を流出させた。次いで、流出フラクションを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色によりＭＤＰ１が含まれるフラクションを確認した。ＣＢＢ染色の結果を図７に示す。図７から、ＭＤＰ１が含まれるフラクションを透析チューブ（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｕｂｉｎｇ  ３，５００ＭＷＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）に入れ、生理食塩水を外液として一晩透析して、精製後のＭＤＰ１含有溶液とした。
【００８０】
５．抗ＭＤＰ１−メチル化抗体を用いたウェスタンブロット解析によるＭＤＰ１の翻訳後修飾の確認
上記「４．」で得られたＭＤＰ１含有溶液（アセトアミド誘導後２４時間、４８時間又は７２時間培養）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗ヒスチジン抗体及び抗ＭＤＰ１−メチル化抗体を用いたウェスタンブロット解析を行った。なお、以下、ｈｕｐＢ−Ｈｉｓ６誘導発現型Ｍ．ｓｅｍｇｍａｔｉｓ株をアセトアミド誘導後２４時間、４８時間又は７２時間培養して得られたＭＤＰ１を総じて「ＭＤＰ１−Ｍ」と称する場合がある。
また、対照として、大腸菌にプラスミドｐＥＴ２１ｂ−ｍｄｐ１を導入して発現させたＭＤＰ１（以下、「ＭＤＰ−Ｅ」と称する場合がある）も準備し、同様にウェスタンブロット解析を行った。抗ヒスチジン抗体を用いたウェスタンブロット解析の結果を図８Ａに、抗ＭＤＰ１−メチル化抗体を用いたウェスタンブロット解析の結果を図８Ｂに示す。
【００８１】
図８Ａ及び図８Ｂから、抗酸菌発現系で製造されたＭＤＰ１（ＭＤＰ１−Ｍ）はメチル化されていることが確かめられた。一方、大腸菌発現系で製造されたＭＤＰ１（ＭＤＰ１−Ｅ）は、メチル化が見られなかった。
【００８２】
［試験例１］ＭＤＰ１のサイトカイン産生誘導能の確認試験
１．ヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ｇａｍｍａ；ＩＦＮ−γ）産生量の測定
次いで、実施例１で得られたＭＤＰ１−Ｍのヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ｇａｍｍａ；ＩＦＮ−γ）産生誘導能を調べた。具体的には、以下に示す手順で試験を行った。
まず、実施例１で得られたＭＤＰ１−Ｍ（ｈｕｐＢ−Ｈｉｓ６誘導発現型Ｍ．ｓｅｍｇｍａｔｉｓ株をアセトアミド誘導後４８時間培養して得られたＭＤＰ１）及び実施例１において対照として用いたＭＤＰ１−Ｅをそれぞれ最終濃度０．１μＭ又は０．５μＭとなるように添加した培地を調製した。また、対照として、ＭＤＰ１不含培地、及び、ツベルクリン反応検査に用いられる精製ツベルクリン（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ；ＰＰＤ）を最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加した培地を準備した。
次いで、ＢＣＧ接種歴のあるヒト由来の末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌｓ；ＰＢＭＣ）を４×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種し、上記調製した各培地を用いて培養した。培養３日目及び５日目に各培養上清を回収して、ヒトＩＦＮ−ｇａｍｍａ測定ＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を用いて、ヒトＩＦＮ−γの産生量を測定した。結果を図９Ａに示す。なお、図９Ａにおいて、「ｎｏｎｅ」は、ＭＤＰ１不含培地で培養したＰＢＭＣを示す。
【００８３】
２．ヒトＣＣＬ２（Ｃ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ２）産生量の測定
次いで、実施例１で得られたＭＤＰ１−ＭのヒトＣＣＬ２（Ｃ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ２）（ＭＣＰ１（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）とも呼ばれる）産生誘導能を調べた。具体的には、以下に示す手順で試験を行った。
まず、実施例１で得られたＭＤＰ１−Ｍ（ｈｕｐＢ−Ｈｉｓ６誘導発現型Ｍ．ｓｅｍｇｍａｔｉｓ株をアセトアミド誘導後４８時間培養して得られたＭＤＰ１）及び実施例１において対照として用いたＭＤＰ１−Ｅをそれぞれ最終濃度０．００５μＭ、０．０５μＭ又は０．５μＭとなるように添加した培地を調製した。また、対照として、ＭＤＰ１不含培地、及び、ＰＰＤを最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加した培地を準備した。
次いで、ＢＣＧ接種歴のあるヒト由来のＰＢＭＣを２×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種し、上記調製した各培地を用いて培養した。培養３日目に各培養上清を回収して、ヒトＭＣＰ１／ＣＣＬ２測定ＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を用いて、ヒトＣＣＬ２産生量を測定した。結果を図９Ｂに示す。なお、図９Ｂにおいて、「ｎｏｎｅ」は、ＭＤＰ１不含培地で培養したＰＢＭＣを示す。
【００８４】
図９Ａ及び図９Ｂから、ＢＣＧ接種歴のあるヒト由来のＰＢＭＣに対して、抗酸菌発現系で製造されたＭＤＰ１（ＭＤＰ１−Ｍ）は大腸菌発現系で製造されたＭＤＰ１（ＭＤＰ１−Ｅ）よりも高いサイトカイン産生誘導能を示した。
【００８５】
以上のことから、抗酸菌発現系で製造されたＭＤＰ１（ＭＤＰ１−Ｍ）は、翻訳後修飾が生じており、細胞性応答が良好であることが確かめられた。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本実施形態の製造方法によれば、免疫原性が良好なＭＤＰ１を効率よく製造できる。本実施形態の製造方法により得られたＭＤＰ１は、例えば、結核感染者に対する血清診断抗原、成人期以降の低下した結核免疫を増強するワクチン抗原として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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