(57)【要約】【課題】炎症応答を減少させるための、リポテイコ酸が減少した組み換えラクトバチルスを提供すること。【解決手段】炎症性障害を処置または予防するための方法および組成物が提供される。本発明の組成物は、細胞表面のリポテイコ酸の提示を減少させるように遺伝子改変された組換え体細菌を含む。本発明の方法は、細胞表面のリポテイコ酸の提示を減少させるように改変された組換え体細菌を被験体に投与することを含む。組換え体細菌の投与は、所望の治療的応答を促進する。組換え体細菌は、単一の用量または一連の用量で投与することができる。本発明の方法は、例えば炎症性腸疾患、大腸炎またはクローン病を処置または予防することを含む、様々な炎症性障害を処置または予防することにおいて有益である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
図面に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、炎症を減少させるための方法および組成物に関する。
【０００２】
ＥＦＳウェブを通してテキストファイルとして提出される配列リストへの参照
情報変換用米国標準コード（ＡＳＣＩＩ）に従って、配列リストの公式コピーは、２０１１年６月１６日の作成日および１５．７ＫＢのサイズの、４０６７３４ｓｅｑｌｉｓｔ．ｔｘｔのファイル名で、ＥＦＳウェブを通してテキストファイルとして明細書と同時に提出される。ＥＦＳウェブを通して出願される配列リストは、明細書の一部であり、本明細書で参照により完全に本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
腸管の免疫ホメオスタシスの維持は、細菌ミクロフローラ、腸上皮および宿主の自然免疫細胞の平衡のとれた相互作用を含む。これらの免疫学的相互作用の調節解除は、免疫機能不全を生じ、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）およびクローン病を含むヒト炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に一般的である明白な炎症をもたらすことができる。ＩＢＤの細胞性および分子機構は完全には理解されていないが、炎症性サイトカイン（例えばＩＬ−１２）によって誘導される慢性の腸管炎症が中心的な役割を演ずることをデータは示す。これらのサイトカインは、疾患進行に強く関与する病原性ＣＤ４＋Ｔ細胞の分化を開始する。したがって、研究は、これらの細胞の調節が実験的大腸炎を軽減することを示す。さらに、ＩＬ−１２のように、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットを利用する活性化樹状細胞（ＤＣ）から分泌されるＩＬ−２３も、ＩＢＤを含む様々な自己免疫性疾患の発達と関係づけられている。ＩＬ−２３の炎症性の性質は、Ｔｈ１７の誘導に帰されている。さらに、このサイトカインは、ＤＣでのＴＮＦαおよびＩＬ−６などの炎症性サイトカインの産生も活性化する。全体として、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットシグナル伝達を妨害することは炎症をかなり低減すること、およびＩＬ−１２とＩＬ−２３の両方がＩＢＤを引き起こす炎症性カスケードに関与することを研究は示す。これらのサイトカインの両方と対照的に、ＩＬ−１０は炎症性シグナルに対する調節効果を及ぼし、それによって、炎症性サイトカインによって導き出される免疫応答を調整する。
【０００４】
プロバイオティック微生物は宿主の免疫細胞と相互作用することができ、特異的なプロバイオティックＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の種はＤＣを刺激して炎症性サイトカイン（すなわちＩＬ−１２）および調節性ＩＬ−１０を産生させることができる。乳酸桿菌は、ヒト胃腸管の正常な居住者であり、小腸の天然微生物叢の主要な構成要素である。これらの細菌は有益な片利共生者とみなされ、一部の種および株はヒトによる消費の長い歴史のために安全と一般に認識されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＩＢＤなどの炎症性胃腸障害の処置を向上させるために、当技術分野でさらなる方法および組成物が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
被験体における炎症を低減するための方法および組成物が提供される。本組成物は、細胞表面のリポテイコ酸の提示（ｄｉｓｐｌａｙ）を減少させるように遺伝子改変された組換え体細菌を含む。方法は、細胞表面のリポテイコ酸の提示を減少させるように改変された組換え体細菌を被験体に投与することを含む。組換え体細菌の投与は、所望の治療的応答を促進する。組換え体細菌は、単一の用量または一連の用量で投与することができる。方法は、例えば炎症性腸疾患、大腸炎またはクローン病を処置または予防することを含む、様々な炎症性障害を処置または予防することにおいて有益である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１（ＡおよびＢ）は、ＬＴＡ生合成に関与する経路および遺伝子を示す。Ｃ〜Ｄは、オーバーラップ伸張によるスプライシング（ＳＯＥｉｎｇ）ＰＣＲ（Horton,  RM（１９９５年）Mol  Biotechnol.４月；３巻（２号）：９３〜９頁）を用いて増幅および連結された標的ＯＲＦの内部領域に隣接する２つの非連続断片を示す。生じた断片をｐＯＲＩ２８にクローニングし、温度感受性ヘルパープラスミドｐＴＲＫ６６９を含むＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＫ１３９２に形質転換した。標的領域に隣接するプライマーによるＰＣＲを用いて、欠失突然変異についてＥＲＭ感受性細胞をスクリーニングし、欠失を含む領域を配列決定することによって確認した。
【図２】図２（Ａ）は、ＮＣＫ５６（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＦＭとも呼ばれる）またはＮＣＫ２０２５で処理されたＤＣの表現型を示す。骨髄由来ＤＣは、ＮＣＫ５６またはＮＣＫ２０２５と２４時間共培養された。細胞を対応する抗体で染色し、固定し、その後ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒによって分析した。パネルＢは、単独で、またはＮＣＫ５６もしくはＮＣＫ２０２５のいずれかと１：１で、１および６時間培養されたＤＣを示す。ＲＮＡを抽出し、逆転写し、ＴＬＲ１およびＴＬＲ２のためのプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。示すデータは、単独で１時間のＤＣ、またはこれらの細胞とＮＣＫ５６もしくはＮＣＫ２０２５との共培養を表す。パネルＣは、サイトカイン分析を示す。ＮＣＫ５６またはＮＣＫ２０２５で処理されたＤＣおよび未処理のＤＣの上清に放出されたサイトカインを、ＥＬＩＳＡによってアッセイした。パネルＤは、Ｔ細胞増殖を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群（５匹／群）を、４日間連続でＮＣＫ５６またはＮＣＫ２０２５で経口処理した。［３Ｈ］チミジン組込みを用いてＴ細胞増殖をアッセイするために、腸間膜ＬＮ−Ｔ細胞を得、ＮＣＫ５６またはＮＣＫ２０２５で処理されたＤＣおよび未処理のＤＣと４日間共培養した。一部の実験では、抑制されたＴ細胞増殖を回復させるために、ＮＣＫ２０２５と共培養したＤＣに由来する上清に抗ＩＬ−１０抗体を加えた。サイトカインをアッセイするために、マウスの各群に由来する腸間膜ＬＮ−Ｔ細胞を、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株で処理されたか未処理のＤＣと共培養した。
【図３Ａ】図３は、ＤＳＳによって誘発された大腸炎のＮＣＫ２０２５による改善を示す。パネルＡは、ＮＣＫ５６もしくはＮＣＫ２０２５（５×１０８ｃｆｕ／１００μｌ／マウス）またはＰＢＳを４日間連続で経口接種されたＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１０）を示す。マウスのこれらの群を飲料水に溶解させた３％ＤＳＳに５日間、その後プレーン水に７日間曝露させ、Ｈ＆Ｅ染色、体重減、下痢および潜血陽性を含む大腸炎の進行について経時的に評価した。パネルＢ〜Ｅは、結腸のＨ＆Ｎ染色を示す。Ｂは、未処理のマウスを示し、Ｃは、ＤＳＳ処理されたマウスを示し、Ｄは、ＮＣＫ５６−ＤＳＳ処理されたマウスを示し、Ｅは、ＮＣＫ２０２５−ＤＳＳ処理されたマウスを示す。Ｆは、大腸炎スコアを表す。ＦＯＢは糞便の潜血陽性を、ＤＡＩは疾患活動性指数を表す。データは、少なくとも３つの独立した実験の代表である。パネルＧは、結腸のサイトカイン分析を示す。ＮＣＫ５６またはＮＣＫ２０２５またはＤＳＳで処理されたマウス（５匹／群）の結腸を冷ＰＢＳで洗浄し、細断し、３７℃で１８時間培養した。サイトカインは、ＥＬＩＳＡによってアッセイした。
【図３Ｂ】図３は、ＤＳＳによって誘発された大腸炎のＮＣＫ２０２５による改善を示す。パネルＡは、ＮＣＫ５６もしくはＮＣＫ２０２５（５×１０８ｃｆｕ／１００μｌ／マウス）またはＰＢＳを４日間連続で経口接種されたＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１０）を示す。マウスのこれらの群を飲料水に溶解させた３％ＤＳＳに５日間、その後プレーン水に７日間曝露させ、Ｈ＆Ｅ染色、体重減、下痢および潜血陽性を含む大腸炎の進行について経時的に評価した。パネルＢ〜Ｅは、結腸のＨ＆Ｎ染色を示す。Ｂは、未処理のマウスを示し、Ｃは、ＤＳＳ処理されたマウスを示し、Ｄは、ＮＣＫ５６−ＤＳＳ処理されたマウスを示し、Ｅは、ＮＣＫ２０２５−ＤＳＳ処理されたマウスを示す。Ｆは、大腸炎スコアを表す。ＦＯＢは糞便の潜血陽性を、ＤＡＩは疾患活動性指数を表す。データは、少なくとも３つの独立した実験の代表である。パネルＧは、結腸のサイトカイン分析を示す。ＮＣＫ５６またはＮＣＫ２０２５またはＤＳＳで処理されたマウス（５匹／群）の結腸を冷ＰＢＳで洗浄し、細断し、３７℃で１８時間培養した。サイトカインは、ＥＬＩＳＡによってアッセイした。
【図４Ａ】図４は、ＮＣＫ２０２５によって確立された大腸炎の緩和を示す。パネルＡ〜Ｄは、大腸炎を開始するために滅菌水に溶解した３％ＤＳＳの５日周期を最初に受けた３群のＣ５７ＢＬ／６マウス（１０匹／群）を示し、群の２つはその後４日間連続でＮＣＫ５６またはＮＣＫ２０２５で経口処理された。マウスを屠殺して結腸を調査したプロトコルの１３日目まで、疾患の進行を監視した。パネルＢ〜Ｄは、結腸Ｈ＆Ｎ染色を示す。パネルＢは、ＤＳＳ処理されたマウスを示し、パネルＣは、ＤＳＳ−ＮＣＫ５６処理されたマウスを示し、パネルＤは、ＤＳＳ−ＮＣＫ０２５処理されたマウスを示す。パネルＥは、大腸炎スコアを表す。ＦＯＢは糞便の潜血陽性を、ＤＡＩは疾患活動性指数を表す。データは、少なくとも３つの独立した実験の代表である。パネルＦは、結腸のサイトカイン分析を示す。マウスの各群の結腸を洗浄し、細断して、３７℃で１８時間培養した。サイトカインは、ＥＬＩＳＡによってアッセイした。
【図４Ｂ】図４は、ＮＣＫ２０２５によって確立された大腸炎の緩和を示す。パネルＡ〜Ｄは、大腸炎を開始するために滅菌水に溶解した３％ＤＳＳの５日周期を最初に受けた３群のＣ５７ＢＬ／６マウス（１０匹／群）を示し、群の２つはその後４日間連続でＮＣＫ５６またはＮＣＫ２０２５で経口処理された。マウスを屠殺して結腸を調査したプロトコルの１３日目まで、疾患の進行を監視した。パネルＢ〜Ｄは、結腸Ｈ＆Ｎ染色を示す。パネルＢは、ＤＳＳ処理されたマウスを示し、パネルＣは、ＤＳＳ−ＮＣＫ５６処理されたマウスを示し、パネルＤは、ＤＳＳ−ＮＣＫ０２５処理されたマウスを示す。パネルＥは、大腸炎スコアを表す。ＦＯＢは糞便の潜血陽性を、ＤＡＩは疾患活動性指数を表す。データは、少なくとも３つの独立した実験の代表である。パネルＦは、結腸のサイトカイン分析を示す。マウスの各群の結腸を洗浄し、細断して、３７℃で１８時間培養した。サイトカインは、ＥＬＩＳＡによってアッセイした。
【図５】図５は、ＮＣＫ２０２５によるＴｒｅｇ細胞の誘導を示す。パネルＡ〜Ｂは、ＮＣＫ５６もしくはＮＣＫ２０２５（５×１０８ｃｆｕ／１００μｌ／マウス）またはＰＢＳを４日間連続で経口接種されたＣ５７ＢＬ／６マウス（５匹／群）を示す。５日目にマウスを屠殺し、切り離した結腸を洗浄した。結腸の単一細胞懸濁液をマウスの各群から調製して、Ｐｅｒｃｏｌ勾配によって濃縮した。リンパ球を対応する抗体またはアイソタイプが一致する抗体で染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒによって分析した。実験は、少なくとも７回繰り返した。
【図６】図６は、ＩＬ−１０−／−マウスでの大腸炎の誘導を示す。Ａ〜Ｂ：Ｃ５７ＢＬ／６ＩＬ−１０−／−マウス群（１０匹／群）を従来通りに１週間収容した。マウスにＮＣＫ５６またはＮＣＫ２０２５を４日間連続で接種し、次に、大腸炎の開始を速め、誘導するために、低用量のピロキシカムを１週間与え、続いて高用量のピロキシカムを１週間与えた。体重減少を測定し、２週後にマウスを屠殺し、結腸断面のスイスロールおよび組織切片をＨ＆Ｅ染色のために調製した。Ｃは、ピロキシカム単独で処理したマウスを示し、Ｄは、ＮＣＫ５６−ピロキシカムで処理したマウスを示し、Ｅは、ＮＣＫ２０２５−ピロキシカムで処理したマウスを示す。スコアは、０から４のスケールで盲目的に判定した。
【図７Ａ】図７は、ＮＣＫ５６もしくはＮＣＫ２０２５による処理後または未処理のマウスにおけるＤＳＳで誘導した大腸炎での遺伝子の調節を示す。パネルＡ〜Ｂは、大腸炎のＤＳＳ誘導の前の４日間、ＮＣＫ５６、ＮＣＫ２０２５を与えられたか未処理のままのマウス（５匹／群）を示す。近位または遠位の結腸領域を切り離し、ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡマイクロアレイ分析は、マウスの結腸で免疫調節／刺激、シグナル伝達、増殖、アポトーシス、血管形成および接着にかかわる経路での、差次的遺伝子発現パターンを明らかにする。値は、対照マウスと比較して実験条件に曝露させた遺伝子の発現の増加の倍率（＞１．０）または発現の減少の倍率（＜１．０）を表す。
【図７Ｂ】図７は、ＮＣＫ５６もしくはＮＣＫ２０２５による処理後または未処理のマウスにおけるＤＳＳで誘導した大腸炎での遺伝子の調節を示す。パネルＡ〜Ｂは、大腸炎のＤＳＳ誘導の前の４日間、ＮＣＫ５６、ＮＣＫ２０２５を与えられたか未処理のままのマウス（５匹／群）を示す。近位または遠位の結腸領域を切り離し、ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡマイクロアレイ分析は、マウスの結腸で免疫調節／刺激、シグナル伝達、増殖、アポトーシス、血管形成および接着にかかわる経路での、差次的遺伝子発現パターンを明らかにする。値は、対照マウスと比較して実験条件に曝露させた遺伝子の発現の増加の倍率（＞１．０）または発現の減少の倍率（＜１．０）を表す。
【図７Ｃ】図７は、ＮＣＫ５６もしくはＮＣＫ２０２５による処理後または未処理のマウスにおけるＤＳＳで誘導した大腸炎での遺伝子の調節を示す。パネルＡ〜Ｂは、大腸炎のＤＳＳ誘導の前の４日間、ＮＣＫ５６、ＮＣＫ２０２５を与えられたか未処理のままのマウス（５匹／群）を示す。近位または遠位の結腸領域を切り離し、ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡマイクロアレイ分析は、マウスの結腸で免疫調節／刺激、シグナル伝達、増殖、アポトーシス、血管形成および接着にかかわる経路での、差次的遺伝子発現パターンを明らかにする。値は、対照マウスと比較して実験条件に曝露させた遺伝子の発現の増加の倍率（＞１．０）または発現の減少の倍率（＜１．０）を表す。
【図８Ａ】図８は、配列番号１〜１６の配列を提供する。
【図８Ｂ】図８は、配列番号１〜１６の配列を提供する。
【図８Ｃ】図８は、配列番号１〜１６の配列を提供する。
【図８Ｄ】図８は、配列番号１〜１６の配列を提供する。
【図８Ｅ】図８は、配列番号１〜１６の配列を提供する。
【図８Ｆ】図８は、配列番号１〜１６の配列を提供する。
【図８Ｇ】図８は、配列番号１〜１６の配列を提供する。
【図８Ｈ】図８は、配列番号１〜１６の配列を提供する。
【図８Ｉ】図８は、配列番号１〜１６の配列を提供する。
【図８Ｊ】図８は、配列番号１〜１６の配列を提供する。
【図８Ｋ】図８は、配列番号１〜１６の配列を提供する。
【図８Ｌ】図８は、配列番号１〜１６の配列を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明はこれから添付図を参照して以下により完全に記載され、そこにおいて、全てではないがいくつかの本発明の実施形態が示される。実際、これらの発明は多くの異なる形で具現化することができ、本明細書に示される実施形態に限定されるものと解釈されるべきでない。むしろ、これらの実施形態は、この開示が、適用可能な法的要件を満たすように提供される。類似の数は、全体に類似のエレメントを指す。
【０００９】
ここに示す本発明の多くの改変形態および他の実施形態は、上記記載および関連図に提示される教示の助けをかりて、これらの発明が関係する当業技術者に思いつくであろう。したがって、本発明は開示される具体的な実施形態に限定されず、改変形態および他の実施形態が添付の請求項の範囲内に含まれるものとされていることを理解すべきである。本明細書で特定の用語が使用されるが、それらは一般的および記述的な意味だけで用いられ、限定目的で用いられるものではない。
【００１０】
概要
炎症性障害を処置または予防するための方法および組成物を含む、被験体で炎症を減少させるための方法および組成物が提供される。そのような方法および組成物は、細菌細胞の表面でＬＴＡの提示を減少させるように改変された組換え体細菌を用いて、胃腸管で炎症を低減するために使用することができる。胃腸管の顕在的炎症は、潰瘍性（uncreative）大腸炎およびクローン病を含むヒトＩＢＤを代表する。細胞表面でＬＴＡの提示を減少させることによって、本発明の組換え体細菌は、対応する野生型細菌細胞よりかなり多くの正味の炎症性応答を低減する。したがって、それを必要とする被験体で抗炎症サイトカインの生成を刺激し、炎症誘発性サイトカインの生成を制限することによって炎症性応答を低減する、様々な組換え体細菌およびそれらの使用方法が提供される。
【００１１】
ＬＴＡ提示の減少した組換え体細菌細胞
細胞表面上のＬＴＡの提示を減少させる方法および組成物が提供される。ここで用いられるように、細胞表面上のＬＴＡの提示の減少は、適当な対照と比較したときの、細胞表面で提示されるＬＴＡのレベルのいかなる統計的に有意な減少も含む。そのような減少には、例えば、細胞表面で提示されるＬＴＡの量の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の減少を含めることができる。細胞表面のＬＴＡの量のアッセイ方法には、例えば、ブタノールおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー（Morath  S、Geyer  AおよびHartung  T（２００１年）J  Exp  Med１９３巻（３号）：３９３〜３９７頁）または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）（Tadlerら（２００５年）J  Clin  Lab  Anal.１９８９年；３巻（１号）：２１頁）が含まれる。
【００１２】
本明細書で用いる用語「表面」、「細胞表面」または「細菌表面」は、原形質膜を含む、その外側の細菌細胞の領域を指す。グラム陽性細菌は、その中にタイコ酸が散在する原形質膜の外側のペプチドグリカンの層を含む。グラム陰性細菌は、ペプチドグリカン層を覆う外膜をさらに含む。したがって、本発明による表面上のＬＴＡの提示は、グラム陽性細菌の原形質膜もしくはペプチドグリカン層、またはグラム陰性細菌の原形質膜、ペプチドグリカン層もしくは外膜の中、またはその上であってよい。
【００１３】
細胞表面上のＬＴＡの提示を減少させるように遺伝子改変されている組換え体細菌細胞が提供される。本明細書で用いるように、用語「組換え体細菌」または「組換え体細菌細胞」は、対象の遺伝子に関して少なくとも１つの遺伝子変更が実行された細菌もしくは複数の細菌細胞、またはそのように変更された細胞の系統を引いてその遺伝子変更を含む細胞を指す。したがって、本明細書で用いるように、用語「遺伝子改変された」または「遺伝子改変」は、対象の遺伝子または核酸配列に関して実行された欠失、付加または置換などの遺伝子変更を指す。一部の実施形態では、遺伝子変更は、人の手による組換え技術に起因する変更である。
【００１４】
一部の実施形態では、遺伝子変更は、細菌細胞のゲノムへの異種ポリヌクレオチドの導入を含む。本明細書で用いるように、配列に関して「異種」とは、外来の種を起源とするか、同じ種を起源とする場合には故意のヒト介入によって組成および／またはゲノム遺伝子座がその天然形から実質的に改変される配列である。例えば、異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーターは、ポリヌクレオチドが由来する種と異なる種に由来するか、または同種／類似種に由来する場合には、一方または両方はそれらの原形および／またはゲノム遺伝子座から実質的に改変されるか、または、プロモーターは作動可能に連結するポリヌクレオチドの天然のプロモーターでない。
【００１５】
対象のいかなる細菌も、本明細書に記載される方法および組成物で用いることができる。具体的な実施形態では、細菌はプロバイオティック細菌を含む。本明細書で用いられる用語「プロバイオティック」は、「適当量で投与されるときに宿主に健康上の有益性を付与する生きている微生物（ＦＡＯ２００１：isapp.net/docs/ProbioticDefinition.pdfのウェブサイトを参照）または被験体の腸管の健康および均衡に寄与する少なくとも１つの生物体」を指す。具体的な実施形態では、それは「フレンドリー」、「有益」または「善玉」細菌とも呼ばれ、それは、被験体によって摂取されると健康な腸管の維持を助け、病気および／または疾患の１つまたはそれより多くの症状の部分的または完全な緩和に役立つ。本明細書で用いるように、「プロバイオティック特性」は、腸の機能および安定性の強化；感染性および非感染性の疾患に対する保護の改善；免疫系調整；乳糖不耐性の緩和；消化および栄養素吸収の改善；血中コレステロールの低減；アレルギーリスクの低減；および尿路感染リスクの低減を含む。一部の実施形態では、プロバイオティック特性は、プロバイオティック細菌を受けとる被験体での抗炎症サイトカイン生成の増加、プロバイオティック細菌を受けとる被験体での炎症誘発性サイトカイン生成の減少、またはプロバイオティック細菌を受けとる被験体での抗炎症サイトカイン生成と炎症誘発性サイトカイン生成との比の増加を含む。
【００１６】
一部の実施形態では、本明細書に記載される細菌は、１つまたはそれより多くのプロバイオティック特性を強化するように改変されている。例えば、一部の実施形態では、胃腸上皮への接着を増加させるように改変され、細胞表面上のＬＴＡの提示を減少させるようにさらに改変されている細菌が提供される。他の実施形態では、酸または胆汁への耐性を増加させるように改変され、細胞表面上のＬＴＡの提示を減少させるようにさらに改変されている細菌が提供される。
【００１７】
他の実施形態では、細菌は乳酸菌である。本明細書で用いるように、「乳酸菌」は、以下から選択される属からの細菌を意味する：Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｌｌｏｉｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｄｏｌｏｓｉｇｒａｎｕｌｕｍ属、Ｌａｃｔｏｓｐｈａｅｒａ属、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ属およびＷｅｉｓｓｅｌｌａ属（Holzapfelら（２００１年）Am.  J.  Clin.  Nutr.７３巻：３６５Ｓ〜３７３Ｓ頁；Sneath編（１９８６年）Bergey’s  Manual  of  Systematic  Bacteriology  ２巻、Lippincott、Williams  and  Wilkins、Hagerstown、MD）。
【００１８】
さらに他の実施形態では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属が用いられる。「Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属」は、それらに限定されないが、Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｎｉ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓおよびWoodら（HolzapfelおよびWood編（１９９５年）The  Genera  of  Lactic  Acid  Bacteria、２巻、Springer、New  York）によって概説される多数の他の種を含むＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属からの任意の細菌を意味する。具体的な実施形態では、細菌はＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＦＭである。
【００１９】
ＬＴＡの提示が減少した細菌の生成、そのような細菌の種培養の調製および基質、特にミルクなどの食物基質を発酵させる方法は、それらに限定されないが、Maeyra-MaekinenおよびBigret（１９９３年）Lactic  Acid  Bacteria.  SalminenおよびvonWright編  Marcel  Dekker,  Inc.  New  York.  ６５〜９６頁；Sandine（１９９６年）Dairy  Starter  Cultures  CoganおよびAccolas編  VCH  Publishers、New  York.  １９１〜２０６頁；Gilliland（１９８５年）Bacterial  Starter  Cultures  for  Food.  CRC  Press、Boca  Raton、Floridaに記載されるものを含む公知の技術に従って実行することができる。
【００２０】
本明細書に記載される細菌細胞は、Sambrookら（１９８９年）Molecular  Cloning,  A  Laboratory  Manual（２版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、New  York）に一般に記載されるような適する培地で培養することができる。
【００２１】
一部の実施形態では、本明細書に記載される菌株は、本明細書に記載されるような細胞表面のＬＴＡの提示の減少をもたらす少なくとも１つの遺伝子変更を含む細菌の、生物学的に純粋な培養である。さらなる実施形態では、細菌は１つまたはいくつかのヌクレオチドの付加、欠失および／または置換を含む。これらの株には、それらに限定されないが以下のものが含まれてよい：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉまたはＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ。「生物学的に純粋な」は、他の細菌細胞が９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％含まれないことを意味する。他の実施形態では、本明細書に記載される菌株は他の菌株と一緒に見出されて、混合培養を形成する。
【００２２】
「対照」または「対照細胞」または「対照細菌」は、組換え体細菌細胞の表現型の変化を測定するための参照点を提供する。対照細菌は、例えば：（ａ）野生型細菌、すなわち、対象細菌をもたらした遺伝子変更のための出発材料と同じ遺伝子型のもの；または（ｂ）出発材料と同じ遺伝子型であるが、ヌル構築物で（すなわち、マーカー遺伝子を含む構築物などの、対象の形質に及ぼす既知の影響がない構築物で）形質転換されている細菌、を含むことができる。
【００２３】
ＬＴＡ関連のポリペプチドおよびポリヌクレオチド
細胞表面上のＬＴＡ提示の減少した組換え体細菌を、少なくとも１つのＬＴＡ関連のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの活性レベルが調整される（すなわち増加または減少する）ように変更した。本明細書で用いるように、用語「ＬＴＡ」は、リポテイコ酸、膜内に糖脂質が固定され、ポリ（グリセロリン酸）（Ｇｒｏ−Ｐ）鎖が壁内に伸長している両性高分子を指す。一部の実施形態では、用語「ＬＴＡ」または「リポテイコ酸」には、壁テイコ酸（ＷＴＡ）、細胞壁のペプチドグリカン層と共有結合しているテイコ酸が含まれる。ＬＴＡの生合成は、細胞の内側の膜に固定される糖脂質を形成する、グリコシルトランスフェラーゼを通した炭水化物ユニットの移動から始まる。糖脂質は膜タンパク質を通して細胞から輸送され、細胞の外側の細胞膜に固定される。最後に、ホスホグリセロールトランスフェラーゼは固定された糖脂質にグリセロリン酸（Ｇｒｏ−Ｐ）単位を輸送して、細長いＬＴＡ（図１）を形成する。したがって、本発明のＬＴＡ関連のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、細胞表面上のＬＴＡの生成、組成、輸送、アセンブリーおよび提示に関与するポリヌクレオチドおよびポリペプチドを包含すると理解される。一部の実施形態では、細菌を投与される被験体で炎症性応答を調整するために、細菌表面のＬＴＡの提示が低減される。
【００２４】
これらのＬＴＡ関連の配列の断片および変異体を、本明細書に記載される方法を実施するために用いることもできる。本明細書で用いるように、用語「遺伝子」および「組換え体遺伝子」は、オープンリーディングフレームを含む核酸分子、特にＬＴＡの生成、アセンブリーまたは提示に関与するタンパク質をコードするものを指す。一実施形態では、ＬＴＡ関連のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、配列番号１および２、またはその活性断片もしくは変異体を含む。さらなる実施形態では、ＬＴＡ関連のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、配列番号３〜１６、またはその活性断片もしくは変異体を含む。
【００２５】
ＬＴＡ関連のポリヌクレオチドは、ＬＴＡ関連のタンパク質をコードするコード配列だけでなく、プロモーターなどの調節配列の両方を含む。ＬＴＡ関連のポリヌクレオチドは、リボゾーム結合部位などの、ＬＴＡ関連のｍＲＮＡの正しい翻訳のために必須の部位をさらに含むことができる。
【００２６】
ＬＴＡ、細胞壁、細胞膜、細胞表面と関連するかまたは分泌される、単離ポリペプチドおよびタンパク質、ならびにその変異体および断片が包含される。本発明の目的上、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は互換的に用いられる。
【００２７】
本明細書で用いる用語「発現」は、本発明の核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写を指す。発現は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すこともできる。
【００２８】
ＬＴＡの提示を減少させること
標的のＬＴＡ関連のポリヌクレオチドの発現レベル（濃度および／または活性）を調整する方法および組成物が提供される。本明細書で用いるように、「標的配列」は、発現レベルを調整することを望む任意の配列を含む。標的配列には、ポリペプチドをコードする配列とそれをコードしない配列の両方が含まれる。機能的ＬＴＡ関連のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、細菌の表面上のＬＴＡの生成、アセンブリー、輸送または提示を担うタンパク質、配列またはＲＮＡをコードすると理解される。したがって、発現が低減されたＬＴＡ関連のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、その野生型対応物と比較したとき、表面上のＬＴＡの提示が減少した細菌をもたらすであろう。一部の実施形態では、表面上のＬＴＡの提示が減少した細菌は、大腸炎などのＩＢＤを起こしている被験体の炎症性応答を低減または予防することができる。
【００２９】
ポリヌクレオチドまたはそれによってコードされるポリペプチドの発現レベルを「低減する」または「低減すること」は、標的配列のポリヌクレオチドまたはポリペプチドレベルが、適当な対照中の同じ標的配列のポリヌクレオチドレベルまたはポリペプチドレベルより統計学的に低いことを意味するものとする。特定の実施形態では、現在開示されている対象物により標的配列のポリヌクレオチドレベルおよび／またはポリペプチドレベルを低減することは、適当な対照中の同じ標的配列のポリヌクレオチドレベル、またはそれによってコードされるポリペプチドのレベルの少なくとも９５％の減少、少なくとも９０％の減少、少なくとも８０％の減少、少なくとも７０％の減少、少なくとも６０％の減少、少なくとも５０％の減少、少なくとも４０％の減少、少なくとも３０％の減少、少なくとも２０％の減少、少なくとも１０％の減少、または少なくとも５％の減少をもたらす。他の実施形態では、標的配列のポリヌクレオチドレベルおよび／またはポリペプチドレベルを低減することは、適当な対照と比較したとき、ポリヌクレオチドレベル、またはそれによってコードされるポリペプチドのレベルの約３％〜１５％、１０％〜２５％、２０％〜３５％、３０％〜４５％、４０％〜５５％、５０％〜６５％、６０％〜７５％、７０％〜９０％、７０％〜８０％、７０％〜８５％、８０％〜９５％、９０％〜１００％の減少をもたらす。ＲＮＡ転写産物のレベル、コードされたポリペプチドのレベルまたはポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの活性のアッセイ方法は、本明細書の他の場所で議論される。
【００３０】
一部の実施形態では、対象のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルを増加させることによって、細胞表面上のＬＴＡの提示を減少させることができる。ポリヌクレオチドまたはそれによってコードされるポリペプチドの発現レベルを「増加させる」または「増加させること」は、標的配列のポリヌクレオチドまたはポリペプチドレベルが、適当な対照中の同じ標的配列のポリヌクレオチドレベルまたはポリペプチドレベルより統計学的に高いことを意味するものとする。特定の実施形態では、現在開示されている対象物により標的配列のポリヌクレオチドレベルおよび／またはポリペプチドレベルを増加させることは、適当な対照中の同じ標的配列のポリヌクレオチドレベル、またはそれによってコードされるポリペプチドのレベルの少なくとも９５％の増加、少なくとも９０％の増加、少なくとも８０％の増加、少なくとも７０％の増加、少なくとも６０％の増加、少なくとも５０％の増加、少なくとも４０％の増加、少なくとも３０％の増加、少なくとも２０％の増加、少なくとも１０％の増加、または少なくとも５％の増加をもたらす。他の実施形態では、標的配列のポリヌクレオチドレベルおよび／またはポリペプチドレベルを増加させることは、適当な対照と比較したとき、ポリヌクレオチドレベル、またはそれによってコードされるポリペプチドのレベルの約３％〜１５％、１０％〜２５％、２０％〜３５％、３０％〜４５％、４０％〜５５％、５０％〜６５％、６０％〜７５％、７０％〜９０％、７０％〜８０％、７０％〜８５％、８０％〜９５％、９０％〜１００％の増加をもたらす。ＲＮＡ転写産物のレベル、コードされたポリペプチドのレベルまたはポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの活性のアッセイ方法は、本明細書の他の場所で議論される。
【００３１】
表面上のＬＴＡの提示が減少している組換え体生物体は、様々な技術を用いて構築することができる。本発明では、ＬＴＡアセンブリー経路の１つの酵素の少なくとも１つ、例えばホスホグリセロールトランスフェラーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を、本明細書に記載されるように減少させることができる。
【００３２】
一実施形態では、ホスホグリセロールトランスフェラーゼを含むＬＴＡ関連のポリペプチドのレベルが低減される。特定の実施形態では、配列番号２に示すホスホグリセロールトランスフェラーゼまたはその活性断片もしくは変異体の発現が低減される。ホスホグリセロールトランスフェラーゼは、糖脂質へのＧｒｏ−Ｐ単位の移動に関与し、それによってＬＴＡ鎖を伸長させるポリペプチドである。様々なホスホグリセロールトランスフェラーゼポリペプチドおよびこれらのポリペプチドをコードする遺伝子が公知である。本明細書で用いるように、ホスホグリセロールトランスフェラーゼは、ＬＴＡ合成酵素（ＬｔａＳ）、グリセリンホスホトランスフェラーゼ、グリセロホスホトランスフェラーゼ、およびＬＴＡのポリグリセロールホスフェート骨格の形成のためにＧｒｏ−Ｐ単位の移動を触媒する任意の他のポリペプチドを包含する。ホスホグリセロールトランスフェラーゼは、アルカリ性ホスファターゼスーパーファミリー（ＭｄｏＢ［ＣＯＧ１３６８］ホスホグリセロールトランスフェラーゼ）のメンバーである。例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＮＺ＿ＡＣＧＸ０１００００６８．１およびＮＣ＿０１０６０９．１を参照。これらの参照の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３３】
別の実施形態では、ＬＴＡ関連のポリペプチドは、グリコシルトランスフェラーゼを含むことができる。この実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼのレベルは、本明細書の他の場所に記載されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルを低減する方法のいずれかを用いて低減される。一実施形態では、配列番号４または６に示すグリコシルトランスフェラーゼまたはその活性断片もしくは変異体の発現が低減される。グリコシルトランスフェラーゼは、糖脂質およびＬＴＡの脂質アンカーの合成に関与するポリペプチドである。グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドおよびこれらのポリペプチドをコードする遺伝子が公知である。本明細書で用いるように、用語グリコシルトランスフェラーゼは、糖脂質またはＬＴＡの脂質アンカー、例えばＹｇｐＰ、Ｕｇｔ、ＢｇｓＡ、ＩａｇＡ、ＬａｆＡまたはＬａｆＢなどの合成を触媒する任意のポリペプチドを指す。グリコシルトランスフェラーゼは、グリコシルトランスフェラーゼ＿ＧＴＢ＿タイプのスーパーファミリー［ｃｌ１００１３］のメンバーである。様々なグリコシルトランスフェラーゼが公知である。例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＮＣ＿０１０６０９．１およびＥＦ１３８８３５．１を参照。これらの参照の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３４】
テイコ酸におけるＤ−Ａｌａ置換の特質およびレベルは、細胞表面上のＬＴＡの提示を減少させることができる。Ｄ−アラニル−ＬＴＡの合成は、ｄｌｔオペロン、ＤｌｔＡ、ＤｌｔＢ、ＤｌｔＣまたはＤｌｔＤによってコードされる４つのタンパク質を必要とする。したがって、一部の実施形態では、ＬＴＡ関連のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、配列番号９〜１６を含む、Ｄｌｔオペロンに示されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含むことができる。したがって別の実施形態では、ＤｌｔＡ、ＤｌｔＢ、ＤｌｔＣまたはＤｌｔＤのレベルは、本明細書の他の場所に記載されるＬＴＡ関連のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルを低減する方法のいずれかを用いて低減される。ｄｌｔオペロンの様々なメンバーが公知である。例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＦ０９２０１（ＤｌｔＡ）；ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＢ１７６５８．１（ＤｌｔＢ）；ＮＣＢＩ受託番号ＣＡＲ８６６７４．１（ＤｌｔＣ）；およびＮＣＢＩ受託番号ＣＡＱ６５９８１．１（ＤｌｔＤ）を参照。これらの参照の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。ＬＴＡの構造は、公知の技術を用いてＮＭＲおよびＭＳで測定することができる。例えば、Morath  S、Geyer  AおよびHartung  T（２００１年）J  Exp  Med１９３巻（３号）：３９３〜３９７頁を参照。
【００３５】
ＬＴＡ関連のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現の減少は、当技術分野で周知の様々な技術によって達成することができる。例えば、遺伝子発現は突然変異によって減少させることができる。突然変異は、その突然変異が、細胞表面上のＬＴＡの提示が減少するように機能的ＬＴＡ関連のタンパク質の発現の減少につながるか、ＬＴＡ関連のポリヌクレオチドの発現の減少をもたらす限り、挿入、欠失、置換またはその組合せであってよい。ＬＴＡの提示の減少した細菌は、被験体の炎症性応答を低減し、それによって大腸炎などの炎症性腸疾患を処置または予防するために用いることができる。
【００３６】
染色体上の特定の部位に突然変異を導入するために、組換えＤＮＡ技術を用いることができる。そのような突然変異は、突然変異させられた遺伝子が、細胞表面上のＬＴＡの提示が減少するように機能的ＬＴＡ関連のタンパク質の発現の減少につながるか、ＬＴＡ関連の遺伝子の発現の減少をもたらす限り、挿入、欠失、１つのヌクレオチドの別のヌクレオチドによる置換またはその組合せであってよい。そのような突然変異は、いくつかの塩基対の欠失によって作ることができる。一実施形態では、そのような突然変異の結果、他の塩基対は正しいリーディングフレーム内にもはやないので、１つの単一の塩基対の欠失は、ＬＴＡ関連のタンパク質を機能しないようにし、それによって細菌表面上のＬＴＡの提示を減少させることができた。他の実施形態では、多数の塩基対、例えば１００塩基対が除去される。さらに他の実施形態では、ＬＴＡ関連遺伝子の全長を欠失させる。ＬＴＡ関連遺伝子の発現を低減するために、オープンリーディングフレームに終止コドンを導入する突然変異、またはオープンリーディングフレームでフレームシフトを引き起こす突然変異を用いることができた。
【００３７】
ＬＴＡの提示を減少させるためにＬＴＡ関連遺伝子の発現を減少させる他の技術は、当技術分野で周知である。例えば、技術には、部位特異的突然変異誘発、制限酵素消化とその後の再ライゲーション、ＰＣＲに基づく突然変異誘発技術、対立遺伝子の交換、対立遺伝子の置換、ＲＮＡ干渉または翻訳後修飾による遺伝子配列の改変を含めることができる。プラスミドにＬＴＡ関連の遺伝子をクローニングすること、制限酵素による遺伝子の消化、その後のエンドヌクレアーゼ処理、再ライゲーション、および相同組換えなどの標準組換えＤＮＡ技術は全て当技術分野で公知であり、Maniatis／Sambrook（Sambrook,  J.らMolecular  cloning:  a  laboratory  manual.  ISBN０−８７９６９−３０９−６）に記載されている。Ｃｌｏｎｔｅｃｈから販売されているＴＲＡＮＳＦＯＲＭＥＲキットを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発によって部位特異的突然変異を生成することができる。ＰＣＲ技術は、（DieffenbachおよびDreksler；PCR  primers,  a  laboratory  manual.  ISBN  ０−８７９６９−４４７−３およびISBN  ０−８７９６９−４４７−５）に広範囲に記載されている。
【００３８】
コード領域での突然変異、およびプロモーターなどの調節配列を含む正しい転写および翻訳のために必須のそれらの配列での突然変異も、本発明の範囲内に入るとみなされる。
【００３９】
特定の実施形態では、組換え体細菌は、表面上のＬＴＡの提示が減少するように、部位特異的突然変異誘発によって改変される。他の実施形態では、ＬＴＡの提示が減少した細菌は、細菌集団から単離される。本明細書で用いる単離という用語は、その天然の環境から分離される細菌を指すと理解されよう。これは、例えば、混合細菌集団または環境試料からの精製によるものであってよい。単離細菌は、その細菌の天然の環境の他の細菌種および構成要素を実質的に含まない。天然の環境の他の細菌種および構成要素を実質的に含まない細菌には、天然の環境の混入細菌種または構成要素の約３０％未満、２０％、１０％、５％または１％を有する細菌調製物が含まれる。
【００４０】
アッセイ
開示されるポリペプチドおよび／または核酸分子の発現を検出するアッセイには、ＬＴＡの検出および／または定量を含めることができる。ＬＴＡの検出のための方法は、本明細書の他の場所に記載されている。細菌細胞表面上のＬＴＡの提示の減少は、細菌にさらされる宿主細胞の抗炎症応答の増加または炎症誘発性応答の減少をもたらすことができる。本発明のＬＴＡ関連のポリペプチドの発現を評価するために、例えば抗炎症応答または炎症誘発性応答を測定するアッセイを用いることもできる。炎症性応答を測定する方法も、本明細書の他の場所に記載されている。
【００４１】
断片および変異体
文脈に従い、「断片」はポリペプチドもしくはタンパク質のアミノ酸配列の一部、またはポリペプチドもしくはタンパク質のアミノ酸配列の一部をコードするポリヌクレオチドを指す。断片は元のタンパク質の活性を保持することができ、したがって、そのような「活性」断片には、例えば、ホスホグリセロールトランスフェラーゼ活性を保持する配列番号２の断片などの、ＬＴＡ関連のタンパク質の断片が含まれる。活性ホスホグリセロールトランスフェラーゼをコードする配列番号１の断片などの、ＬＴＡ関連のヌクレオチド配列の断片は、生物学的に活性であるタンパク質断片をコードすることができる。さらに、ＬＴＡ関連のタンパク質の断片には、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および１６の断片が含まれる。生物学的に活性なヌクレオチド断片は、ＬＴＡ関連のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの一部を単離し、ＬＴＡ関連のタンパク質のコードされた部分を発現させ、ＬＴＡ関連のタンパク質のコードされた部分の活性を評価することによって調製することができる。他の実施形態では、ＬＴＡ関連のタンパク質のヌクレオチド配列の断片は、生物学的に活性なポリペプチドをコードする必要がないが、発現されたときに標的のＬＴＡ関連のポリペプチドの発現を抑制する（すなわちセンス、アンチセンス、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ抑制）ポリヌクレオチドを含むことができた。ＬＴＡ関連のポリヌクレオチドの断片には、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３および１５の断片が含まれる。ＬＴＡ関連の核酸分子の断片は、少なくとも約１５、２０、５０、７５、１００、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００ヌクレオチド、または本明細書で開示される完全長ＬＴＡ関連のヌクレオチド配列に存在するヌクレオチドの総数まで含む。
【００４２】
アミノ酸配列の断片には、ＬＴＡ関連のタンパク質、または部分長のタンパク質のアミノ酸配列に十分に同一であるかそれに由来するアミノ酸配列を含み、ＬＴＡ関連のタンパク質の少なくとも１つの活性を示す（すなわち、細胞表面で提示されるＬＴＡのレベルを調整する）が、本明細書で開示される完全長ＬＴＡ関連のタンパク質より少ないアミノ酸を含むペプチドが含まれる。ＬＴＡ関連のタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば長さが１０、２５、５０、１００、１５０、２００個の連続したアミノ酸であるか、または本発明の完全長ＬＴＡ関連のタンパク質（すなわち、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６）に存在するアミノ酸の総数までであるポリペプチドであってよい。そのような生物学的に活性な部分は組換え技術によって調製することができ、ホスホグリセロールトランスフェラーゼ活性などの天然のＬＴＡ関連のタンパク質の機能的活性の１つまたはそれより多くについて評価することができる。ここで用いられるように、断片は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６の少なくとも５つの連続したアミノ酸を含む。しかし、本発明は、６、７、８または９個を超えるアミノ酸のタンパク質中の任意の断片などの他の断片を包含する。
【００４３】
一部の実施形態では、本明細書の他の場所で提供されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異体の発現を低減するように改変されている組換え体細菌が提供される。「変異体」は、十分に同一の配列を意味する。したがって、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４もしくは１６中のＬＴＡ関連のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と十分に同一である核酸分子、または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３もしくは１５のヌクレオチド配列もしくはその相補配列を含む核酸分子の発現を低減するように改変された細菌を包含する。変異体ポリヌクレオチドには、１つまたはいくつかの付加、欠失または置換を含む配列がさらに含まれる。変異体には、本発明のヌクレオチド配列によってコードされる変異体ポリペプチドも含まれる。さらに、本発明のポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に示されるアミノ酸配列と十分に同一であるアミノ酸配列を有する。「十分に同一の」は、１つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が、第２のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して十分であるか最小限の数の同等または同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドを含み、このように、共通の構造ドメインを提供すること、および／またはＬＴＡ関連の生体活性などの共通の機能的活性を示すことを意味する。保存的な変異体には、遺伝子コードの変性のために異なるヌクレオチド配列が含まれる。
【００４４】
一般に、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４もしくは１６のアミノ酸配列のいずれかと、または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３もしくは１５のヌクレオチド配列のいずれかと、それぞれ少なくとも約４５％、５５％または６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％または７５％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％、８５％または９０％、最も好ましくは少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、本明細書で十分に同一であると定義される。本発明によって包含される変異体タンパク質は生物学的に活性であり、すなわち、それらは配列番号２のホスホグリセロールトランスフェラーゼ活性などの、天然のタンパク質の所望のＬＴＡ関連の生体活性を保持する。例えば、Varcamontiら（２００３年）Appl.  Environ.  Microbiol.６９巻：１２８７〜１２８９頁を参照。タンパク質の生物学的に活性な変異体は、そのタンパク質とわずか１〜１５アミノ酸残基、わずか１〜１０、例えば６〜１０、わずか５、わずか４、３、２アミノ酸残基、または１アミノ酸残基が異なることさえもある。
【００４５】
ＬＴＡ関連のポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、切断および挿入を含む様々な方法で変更することができる。突然変異誘発およびポリヌクレオチド変更のための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Kunkel（１９８５年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８２巻：４８８〜４９２頁；Kunkelら（１９８７年）Methods  in  Enzymol.１５４巻：３６７〜３８２頁；米国特許第４，８７３，１９２号；WalkerおよびGaastra編（１９８３年）Techniques  in  Molecular  Biology（MacMillan  Publishing  Company、New  York）およびその中の引用文献を参照。対象のタンパク質の生体活性に影響しないアミノ酸置換に関する指針は、参照により本明細書に組み込まれるDayhoffら（１９７８年）Atlas  of  Protein  Sequence  and  Structure（Natl.  Biomed.  Res.  Found.、Washington、D.C.）のモデルに見出すことができる。１つのアミノ酸を類似した特性を有する別のものと交換することなどの、保存的な置換を生成することができる。当業技術者は、本明細書で開示されるＬＴＡ関連のポリペプチドの活性は、本明細書の他の場所に記載されるものなどの、慣用されるスクリーニングアッセイによって評価することができることを理解する。
【００４６】
本明細書で用いるように、「天然配列」のポリペプチドは、自然に由来する対応するポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列のポリペプチドは、自然から単離することができるか、組換えおよび／または合成手段によって生成することができる。用語「天然配列」は、具体的にはポリペプチドの天然に存在する切断された、可溶性のまたは分泌された形、天然に存在する変異形、および天然に存在する対立遺伝子変異体を包含する。
【００４７】
本明細書で用いるように、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列との関連で「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウインドウでの最大対応のために整列させたときに同じである、２つの配列中の残基を指す。配列同一性の百分率がタンパク質に関して用いられるとき、同一でない残基位置はしばしば保存的アミノ酸置換で異なり、そこでは、類似した化学特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基のためにアミノ酸残基が置換され、したがってその分子の機能的特性を変化させないと認識される。配列が保存的な置換で異なる場合、置換の保存的な性質について補正するために、配列同一性パーセントを上方向に調整することができる。そのような保存的な置換で異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この調整のための手段は、当業者に周知である。一般的に、これは、保存的な置換を、完全ではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングすることを含み、それによって配列同一性百分率を増加させる。したがって、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存的な置換が０のスコアを与えられる場合、保存的な置換は０から１の間のスコアが与えられる。保存的な置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実施される通りに計算される。
【００４８】
本明細書で用いるように、「配列同一性の百分率」は、比較ウインドウで２つの最適に整列させた配列を比較することによって判定される値を意味し、そこで、比較ウインドウでのポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適整列の参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。両方の配列で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が起こる位置の数を判定してマッチしている位置の数を与え、マッチしている位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛け算して配列同一性の百分率を与えることによって、百分率は計算される。
【００４９】
特に明記しない限り、本明細書で提供される配列同一性／類似性の値は、以下のパラメーター：５０のギャップウェイトおよび３の長さウェイト、およびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを用いるヌクレオチド配列のための同一性％および類似性％；８のギャップウェイトおよび２の長さウェイト、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いるアミノ酸配列のための同一性％および類似性％；を用いるＧＡＰバージョン１０、またはその任意の同等のプログラムを用いて得られる値を指す。「同等プログラム」は、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰバージョン１０によって生成される対応する整列と比較したときに、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のマッチおよび同一の配列同一性パーセントを有する整列を生成する、任意の配列比較プログラムを意味する。
【００５０】
処置および予防の方法
本明細書の他の場所に記載される組換え体細菌の投与を含む、被験体で炎症を減少させる方法が提供される。一部の実施形態では、ＬＴＡの提示が減少した組換え体細菌の投与は、被験体で大腸炎などのＩＢＤの症状を改善することができる。他の実施形態では、ＬＴＡの提示が減少した組換え体細菌の投与は、被験体で大腸炎などのＩＢＤの開始を予防することができる。一部の実施形態では、例えば配列番号１またはその活性断片もしくは変異体の発現の減少を含む、例えばホスホグリセロールトランスフェラーゼを含むＬＴＡ関連のタンパク質の発現が減少した組換え体細菌は、細胞表面上のＬＴＡの提示が減少し、確立された大腸炎の症状を改善することおよび大腸炎の開始を予防することができる。下記の実施例１を参照されたい。一部の実施形態では、被験体において胃腸管で炎症を局所的に処置および／または予防する方法、胃腸管の炎症性障害を処置および／または予防する方法、ならびに腸で疼痛を局所的に処置する方法が提供される。
【００５１】
本明細書で「処置」は、胃腸障害を有する被験体の健康状態または症状を治癒させるか、治すか、緩和するか、軽減するか、変更するか、直すか、改善するか、向上させるかまたは影響を及ぼすことと定義される。処置される被験体は、例えば炎症性腸疾患を起こしているか、炎症性腸疾患を起こす危険があることを含む、胃腸障害を起こしているか起こす危険があってよい。
【００５２】
組換え体細菌の投与は、予防的目的または治療的目的のいずれのためであってよい。「予防する」ことは、組換え体細菌が予防的に提供されること、すなわち細菌がいかなる症状にも先立って提供されることを意味する。組換え体細菌の予防的投与は、任意の以降の症状を予防するか弱める役目を果たす。治療的に提供される場合、細菌は症状の開始時（または直後に）提供される。物質の治療的投与は、任意の実際の症状を弱くする役目を果たす。
【００５３】
「被験体」は、動物を意味する。具体的な実施形態では、被験体は哺乳動物、例えば霊長類またはヒトである。他の実施形態では、被験体には、ネコもしくはイヌなどの家畜、または反芻動物、ウマ、ブタ、家禽もしくはヒツジなどの農業動物が含まれる。具体的な実施形態では、本発明の医薬製剤による処置を受ける被験体は、ヒトである。一部の実施形態では、処置を受けるヒトは、新生児、小児、幼児、思春期直前の子供、若者または成人であってよい。本発明の被験体は、胃腸障害の症状を起こしていてもよく、または胃腸障害の危険があってもよい（例えば抗生物質処置を受けた被験体）。
【００５４】
胃腸障害
本発明の方法および組成物は、炎症性胃腸障害の処置に関する。本明細書で用いるように、用語「炎症性胃腸障害」または「胃腸障害」または「胃腸管の炎症性障害」は、免疫系または免疫系の細胞によって媒介される、胃腸管または腸の疾患を指す。炎症性胃腸障害には、例えば炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎、リンパ性大腸炎、顕微鏡的大腸炎、コラーゲン蓄積大腸炎、自己免疫性腸疾患、アレルギー性胃腸疾患および好酸性胃腸疾患、ならびに下痢、鼓脹、膨満、腹部けいれん、腹部疼痛または便秘が含まれる。特定の実施形態では、本発明の方法は、肥満、またはＩＢＤ、下痢、鼓脹、膨満、腹部けいれん、腹部疼痛または便秘を含む肥満の症状の処置または予防に関する。例えば、参照により本明細書に組み込まれるKadooka  Yら（２０１０年）Eur  J  Clin  Nutr.６４巻（６号）：６３６〜４３頁を参照。
【００５５】
一部の実施形態では、炎症の減少には、腸管の完全性の刺激；腸管の透過性の低減；ムチンの合成、分泌および／または質の向上；腸管上皮の成熟および分化の向上；栄養吸収の向上；抗微生物活性を運搬する可溶性因子の生成の増加；感染抵抗性の刺激、向上または支援；ウイルスまたは細菌性感染に対する細胞性または体液性応答の支援；細胞傷害性の増加（抗ウイルス性と抗腫瘍の両方）；全身および／または粘膜ワクチン接種応答の支援；細胞性および／または体液性免疫の増加または支援；自然免疫（好中球、食細胞、マクロファージおよびナチュラルキラー細胞活性を含む）の増加または支援；適応的ＴおよびＢ細胞免疫の増加または支援；ヘルパーＴ細胞１（Ｔｈ１）サイトカインパターンの刺激（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−アルファ；ヒト白血球抗原−Ｄｒ（ＨＬＡ−Ｄｒ）の発現の増加）；炎症の抑制または全身および粘膜炎症媒介物質（サイトカインおよび／またはケモカインを含む）の生成；全体のおよび／またはアレルゲン特異的なＩｇＥを低減することによる感作の低減；アレルギー性サイトカインの産生の低減；Ｔｈ２支援免疫グロブリンプロファイルの低減；ならびにその組合せを含めることができる。
【００５６】
本明細書で用いるように、用語「抗炎症性サイトカイン」は、そのサイトカインの受容体を有する細胞で抗炎症応答を導き出す、天然に存在するか組み換え型のタンパク質、その類似体またはその断片を指す。本発明の抗炎症性サイトカインは、炎症誘発性サイトカイン応答を制御する免疫調節性分子であってよい。本発明の抗炎症性サイトカインには、インターロイキン（ＩＬ）−１受容体アンタゴニスト、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１およびＩＬ−１３、ＩＬ−１６、ＩＦＮ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、Ｇ−ＣＳＦが含まれる。
【００５７】
本明細書で用いるように、用語「炎症誘発性サイトカイン」は、炎症を有利にする免疫調節性サイトカインを指す。本発明の炎症誘発性サイトカインには、ＩＬ１−アルファ、ＩＬ１−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−アルファ、ＬＴ、ＬＩＦ、オンコスタチンまたはＩＦＮ−アルファ，ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマが含まれる。
【００５８】
一部の実施形態では、組換え体細菌の投与は、抗炎症性サイトカイン生成の増加をもたらす。本明細書で用いるように、抗炎症性サイトカイン生成の「増加」または「増加させる」ことは、適当な対照と比較したときの、抗炎症性サイトカインレベルの統計的に有意な任意の増加を含む。そのような増加には、例えば、抗炎症性サイトカインレベルの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％またはそれ以上の増加を含めることができる。そのような増加には、例えば、抗炎症性サイトカインレベルの少なくとも約３％〜１５％、１０％〜２５％、２０％〜３５％、３０％〜４５％、４０％〜５５％、５０％〜６５％、６０％〜７５％、７０％〜８５％、８０％〜９５％、９０％〜１０５％、１００％〜１１５％、１０５％〜１２０％、１１５％〜１３０％、１２５％〜１５０％、１４０％〜１６０％、１５５％〜５００％またはそれ以上の増加を含めることもできる。抗炎症性サイトカインレベルのレベルのアッセイ方法は公知である。例えば、Leng  S.ら、（２００８年）J  Gerontol  A  Biol  Sci  Med  Sci６３巻（８号）：８７９〜８８４頁を参照。抗炎症性サイトカインの生成のアッセイ方法には、多重ビーズアッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴおよびフローサイトメトリーが含まれる。例えば、Maeckerら（２００５年）BMC  Immunology  ６巻：１３頁を参照。
【００５９】
方法および組成物には、炎症性応答を減少させるか予防することができる、炎症誘発性サイトカイン生成を減少させるものも含まれる。本明細書で用いるように、炎症誘発性サイトカイン生成のレベルの減少は、適当な対照と比較したときの、被験体での炎症誘発性サイトカイン生成のレベルの統計的に有意ないかなる減少も含む。そのような減少には、例えば、炎症誘発性サイトカインのレベルの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の減少を含めることができる。サイトカインレベルのアッセイ方法は公知であり、例としては、Leng  S.ら、（２００８年）J  Gerontol  A  Biol  Sci  Med  Sci  ６３巻（８号）：８７９〜８８４頁が含まれる。炎症誘発性サイトカインの生成のアッセイ方法には、多重ビーズアッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴおよびフローサイトメトリーが含まれる。例えば、Maeckerら（２００５年）BMC  Immunology  ６巻：１３頁を参照。
【００６０】
炎症性サイトカイン生成は、抗炎症性サイトカイン生成と炎症誘発性サイトカイン生成の比をアッセイすることによって測定することもできる。具体的な態様では、抗炎症性サイトカイン生成と炎症誘発性サイトカイン生成の比は、適当な対照と比較して約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、３００、６００、９００、１０００倍またはそれ以上増加する。他の態様では、抗炎症性サイトカイン生成と炎症誘発性サイトカイン生成の比は、適当な対照と比較して約１から５倍、約５から１０倍、約１０から２０倍、約２０から３０倍、約３０から４０倍、約４０倍から６０倍、約６０倍から８０倍、約８０倍から約１００倍、約１００から２００倍、約２００倍から３００倍、約３００から４００倍、約４００から約５００倍、約５００から約５００倍、約５００倍から約７００倍、約７００倍から８００倍、約８００倍から約１０００倍またはそれ以上増加する。抗炎症性サイトカイン生成と炎症誘発性サイトカイン生成の比の判定方法は、例えばLeng  S.ら、（２００８年）J  Gerontol  A  Biol  Sci  Med  Sci  ６３巻（８号）：８７９〜８８４頁に見出すことができる。サイトカインの生成のアッセイ方法には、多重ビーズアッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴおよびフローサイトメトリーが含まれる。例えば、Maeckerら（２００５年）BMC  Immunology  ６巻：１３頁を参照。
【００６１】
炎症性障害
一部の実施形態では、本明細書の他の場所に記載される組成物および方法を用いて炎症を減少させることによって、免疫性および炎症性の障害を処置または予防することができる。例えば、本明細書に記載される方法および組成物によって処置または予防することができるであろう障害には、それらに限定されないが以下のものが含まれる：関節炎（慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎）、乾癬、アトピー皮膚炎を含む皮膚炎；慢性自己免疫性じんま疹、多発筋炎／皮膚筋炎、中毒性表皮壊死症、全身の強皮症および硬化、呼吸窮迫症候群、成人呼吸不全症候群（ＡＲＤＳ）、髄膜炎、アレルギー性鼻炎、脳炎、ブドウ膜炎、大腸炎、糸球体腎炎、アレルギー性状態、湿疹、喘息、Ｔ細胞の浸潤および慢性炎症性応答を含む状態、アテローム硬化症、自己免疫性心筋炎、白血球接着欠乏、全身性ループスエリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス（腎炎、非腎臓、円板状、脱毛症を含む）、若年性糖尿病、多発硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、サイトカインおよびＴリンパ球によって媒介される急性および後発性過敏性と関連する免疫応答、結核、サルコイドーシス、肉芽腫症、例えばヴェーゲナー肉芽腫症、無顆粒球症、血管炎（ＡＮＣＡを含む）、無形成性貧血、クームス陽性貧血、ダイヤモンド−ブラックファン貧血、免疫性溶血性貧血、例えば自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、悪性貧血、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少、汎血球減少、白血球減少、白血球漏出を含む疾患、ＣＮＳ炎症性障害、多臓器損傷症候群、重症筋無力症、抗原抗体複合体媒介性の疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、ランバート−イートン筋無力症症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スチーブンス−ジョンソン症候群、固形臓器移植拒絶（高パネル反応性抗体価、組織でのＩｇＡ沈着、その他のための前処置を含む）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、水疱性類天疱瘡、天疱瘡（全て落葉状、尋常性を含む）、自己免疫性多腺性内分泌障害、ライター病、スティッフマン症候群、巨細胞性動脈炎、免疫複合体性腎炎、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発性ニューロパシーまたはＩｇＭ媒介性神経病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性血小板減少、自己免疫性精巣炎および卵巣炎を含む精巣および卵巣の自己免疫性疾患、原発性甲状腺機能低下症；自己免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、亜急性甲状腺炎、特発性の甲状腺機能低下症、アジソン病、甲状腺機能亢進症、自己免疫性多腺症候群（または多腺内分泌症候群）、インスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）とも呼ばれるＩ型糖尿病およびシーハン症候群を含む自己免疫性内分泌疾患；自己免疫性肝炎、リンパ系間質性肺臓炎（ＨＩＶ）、閉塞性細気管支炎（非移植性）対ＮＳＩＰ、ギラン−バレー症候群、大血管血管炎（リウマチ性多筋痛および巨細胞（高安の）動脈炎を含む）、中間血管血管炎（川崎病および結節性多発動脈炎を含む）、強直性脊椎炎、ベルジェ病（ＩｇＡ腎症）、急速進行性糸球体腎炎、原発性胆汁性肝硬変症、セリアック病（グルテン性腸症）、寒冷グロブリン血、ＡＬＳまたは冠状動脈疾患。
【００６２】
具体的な実施形態では、被験体で炎症を減少させることによって、心臓の障害を処置または予防する。本明細書で用いるように、心臓の障害には、それらに限定されないが以下のものが含まれる：心不全、例えば、それらに限定されないが、心臓肥大、左心不全および右心不全；虚血性心疾患、例えば、それらに限定されないが、狭心症、心筋梗塞、慢性虚血性心疾患および突然心臓死；高血圧性心疾患、例えば、それらに限定されないが、全身（左側）の高血圧性心疾患および肺（右側）の高血圧性心疾患；心臓弁膜症、例えば、それらに限定されないが、カルシウム沈着によって引き起こされる弁変性、例えば石灰化大動脈弁狭窄症、先天的二尖性の大動脈弁のカルシウム沈着および僧帽弁の輪状カルシウム沈着、ならびに僧帽弁の粘液腫様変性（僧帽弁脱出）、リウマチ熱およびリウマチ性心疾患、感染性心内膜炎および非感染性増殖、例えば全身性ループスエリテマトーデスの非細菌性血栓性心内膜炎および心内膜炎（リブマン−サックス心内膜炎）、カルチノイド心疾患および人工弁の合併症；心筋疾患、例えば、それらに限定されないが、拡張型心筋症、肥大型心筋症、収縮性心筋症および心筋炎；心膜疾患、例えば、それらに限定されないが、心膜流出および心膜血腫および心外膜炎、例えば急性心外膜炎および治癒した心外膜炎、およびリウマチ様心疾患；新生物心疾患、例えば、それらに限定されないが、原発性心臓腫瘍、例えば粘液腫、脂肪腫、乳頭状弾性線維腫、横紋筋腫および肉腫、ならびに非心臓性新生物の心臓への影響；先天心疾患、例えば、それらに限定されないが、左右シャント−後期のチアノーゼ、例えば心房中隔欠損症、心室中隔欠損症、動脈管開存および房室中隔欠損症、右左シャント−早期のチアノーゼ、例えばファローの四徴症、大動脈の転位、総動脈幹、三尖弁閉鎖および全体の肺静脈結合異常、閉塞性先天奇形、例えば大動脈の縮窄、肺動脈狭窄症および閉鎖症、ならびに大動脈狭窄症および閉鎖症、ならびに心臓移植に関わる障害。
【００６３】
医薬組成物
一部の実施形態では、ＬＴＡの提示が減少した細菌株は、栄養補助剤および／または食品添加物などの機能性食品組成物の形で被験体に投与される。具体的な実施形態では、医薬組成物は、ホスホグリセロールトランスフェラーゼ（配列番号１および２に示すポリヌクレオチドおよびポリペプチドなど）をコードするポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を減少させるように改変されている組換え体細菌を含む。他の実施形態では、抽出物が医薬組成物の形で被験体に投与される。本明細書の他の場所に記載されるように、投与は単一用量または多回用量投与を含むことができる。
【００６４】
医薬組成物は、液体製剤または固体製剤であってよい。医薬組成物が固体製剤である場合は、それは錠剤、吸引錠剤、噛み錠剤、チューインガム、カプセル、小袋、粉末、顆粒剤、被覆粒子、被覆錠剤、腸溶被覆錠剤、腸溶被覆カプセル、融解ストリップまたはフィルムとして製剤化することができる。医薬組成物が液体製剤である場合は、それは経口溶液、懸濁液、乳剤またはシロップとして製剤化することができる。前記組成物は、それらに限定されないが、乳酸発酵食品、発酵乳製品、耐性デンプン、食物繊維、炭水化物、タンパク質およびグリコシル化タンパク質からなる群から独立して選択される担体材料をさらに含むことができる。
【００６５】
本明細書で用いるように、用語「医薬組成物」は、要求される効果、すなわち胃腸管の炎症性障害の治療または予防が達成される限り、食品組成物、栄養補助食品、機能性食品、医療食品または栄養製品として製剤化することができよう。前記食品組成物は、飲料、ヨーグルト、ジュース、アイスクリーム、パン、ビスケット、クラッカー、シリアル、ヘルスバー、スプレッドおよび栄養製品からなる群から選択することができる。食品組成物は、乳酸発酵食品、発酵乳製品、耐性デンプン、食物繊維、炭水化物、タンパク質およびグリコシル化タンパク質からなる群から選択される担体材料をさらに含むことができる。
【００６６】
本発明により用いられるか本発明により生成される、本発明による医薬組成物は、不活性のビヒクルまたは薬剤として許容されるアジュバント、担体、保存料などの周知である他の物質を含むこともできる。
【００６７】
本開示は、組換え体細菌のお互いとの組合せ、および／または胃腸管の炎症性障害の処置で有益な１つまたはそれより多くの他の剤との組合せも含む。例えば、本発明の細菌は、胃腸管の炎症性障害の処置のための従来の抗炎症剤、例えばプレドニゾン、メサラミン、アザチオプリン、ＴＮＦ阻害剤、メトトレキセートまたは６−メルカプトプリンの有効な用量と併用投与することができる。用語「併用投与」は、活性剤の同時投与と逐次的投与の両方を指す。当然ながら併用療法は本明細書で提供される剤に限定されず、炎症性障害の処置のための任意の組成物が含まれる。
【００６８】
治療的有効量
「治療的有効用量」、「治療的有効量」または「有効量」は、被験体に投与されるときに炎症性応答を減少させるか、炎症性応答の増加を予防する、ＬＴＡの提示が減少した組換え体細菌の量を意味する。「陽性治療応答」は、例えば、炎症性胃腸障害の症状の少なくとも１つの状態を向上させることを指す。
【００６９】
治療薬の有効量は、意図する目標に基づいて決定される。用語「単位用量」は、被験体で使用するのに適する物理的に別個の単位を指し、各単位は、その投与、すなわち適当な経路および処置療法に関連して所望の応答を生成するように計算される、治療組成物の所定量を含む。処置回数と単位用量の両方によって投与される量は、処置される被験体、被験体の状態および所望の保護によって決まる。治療組成物の正確な量も、医者の判断によって決まり、各個体に固有である。一般に、組換え体細菌の投薬量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的な医学的状態および過去の病歴などの因子によって異なる。具体的な実施形態では、約１０４から約１０１２ＣＦＵ、１０５から１０１１ＣＦＵ、１０６から１０１０ＣＦＵ、１０８から１０１０ＣＦＵまたは１０８から１０１２ＣＦＵの範囲で細菌を投与することが望ましいかもしれない。
【００７０】
本発明の一部の実施形態では、本方法は細菌の多回用量の投与を含む。本方法は、本明細書に記載される細菌を含む組成物の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０またはそれ以上の回数の治療的有効用量の投与を含むことができる。一部の実施形態では、用量は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１４日、２１日、３０日または３０日を超える期間中に投与される。組成物の多回用量の投与の頻度および継続期間は、炎症性応答を低減または予防し、それによって胃腸障害を処置または予防するようなものである。さらに、本発明の組換え体細菌の治療的有効量による被験体の処置には、単回処置を含めることができるか、一連の処置を含めることができる。処置のために用いられる細菌の有効投薬量は、特定の処置の過程で増減することができることも理解される。投薬量の変化は、当技術分野で公知であり、本明細書に記載される炎症を検出するための診断アッセイの結果から得ること、および明らかになることができる。
【００７１】
寄託
出願人は、２０１１年１月１０日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０  ＵＳＡに、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１１５８７でＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＫ２０２５を寄託した。２０１１年１月１０日にＡＴＣＣに寄託された細菌培養は、本出願の出願日の前からＮｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、１００  Ｓｃｈａｕｂ  Ｈａｌｌ、Ｃａｍｐｕｓ  Ｂｏｘ  ７６２４、Ｒａｌｅｉｇｈ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ、２７６９５によって維持されていた寄託物からとられた。この寄託物へのアクセスは、出願の係属中、請求により、特許商標庁長官および長官によってその権利があると決定される者が利用できる。出願中のいかなる請求項の許可の後、出願人は米国特許法施行規則第１．８０８章に従って寄託物を一般に利用できるようにする。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＫ２０２５のこの寄託物は、公的な受託所であるＡＴＣＣ受託機関において、３０年間か、最近の請求から５年間か、または特許施行期間のいずれかのうちで最も長い期間にわたって維持され、その期間中に生存能力が無くなった場合には交換される。さらに、出願人は、寄託後のサンプルの生存能力の表示を提供することを含む、米国特許法施行規則第１．８０１〜１．８０９章の要件の全てを有するか満たす。出願人は、生物学的材料の移動または商業でのその輸送に関する法律によって課されるいかなる規制も回避する権限を有しない。
【００７２】
上で提供される記載を考慮して、以下の実施形態が提供される：
番号をつけた実施形態：
１．細菌の表面上のリポテイコ酸（ＬＴＡ）の提示を減少させるように遺伝子改変されている、組換え体または単離された細菌。
２．ホスホグリセロールトランスフェラーゼの発現を減少させるように遺伝子改変されている、実施形態１の組換え体または単離された細菌。
３．配列番号１に示す核酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの発現を減少させるように遺伝子改変されている、実施形態１または２の組換え体または単離された細菌。
４．配列番号１に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの発現を減少させるように遺伝子改変されている、実施形態１または２の組換え体または単離された細菌。
５．プロバイオティック細菌である、前記実施形態のいずれか一つの組換え体または単離された細菌。
６．前記プロバイオティック細菌が乳酸細菌である、実施形態５の組換え体または単離された細菌。
７．前記乳酸細菌がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓである、実施形態６の組換え体または単離された細菌。
８．前記ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓがＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓである、実施形態７の組換え体細菌。
９．前記遺伝子改変がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＦＭで実施された、実施形態８の組換え体または単離された細菌。
１０．前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓが、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１５８７の下で寄託されているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＫ２０２５である、実施形態８の組換え体または単離された細菌。
１１．細菌を、前記細菌の表面上のリポテイコ酸（ＬＴＡ）の提示を減少させるように遺伝子改変することを含む、組換え体または単離された細菌の作製方法。
１２．前記組換え体または単離された細菌が、ホスホグリセロールトランスフェラーゼの発現を減少させるように改変されている、実施形態１１の方法。
１３．前記組換え体または単離された細菌が、配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの発現を減少させるように遺伝子改変されている、実施形態１１または１２の方法。
１４．前記組換え体細菌がプロバイオティック細菌である、実施形態１１〜１３のいずれか一つの方法。
１５．前記プロバイオティック細菌が乳酸細菌である、実施形態１４の方法。
１６．前記乳酸細菌がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓである、実施形態１５の方法。
１７．前記ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓがＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓである、実施形態１６の方法。
１８．前記遺伝子改変がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＦＭで実施された、実施形態１７の方法。
１９．前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓが、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１５８７の下で寄託されているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＫ２０２５である、実施形態１７の方法。
２０．前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓが、配列番号１に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの発現を減少させるように改変されている、実施形態１７〜１９のいずれか一つの方法。
２１．被験体において炎症を減少させる方法であって、実施形態１〜１０のいずれか一つの組換え体または単離された細菌の治療的有効量を前記被験体に投与することを含む方法。
２２．被験体の胃腸管の炎症性障害を処置または予防する方法であって、実施形態１〜１０のいずれか一つの組換え体または単離された細菌の治療的有効量を被験体に投与することを含む方法。
２３．前記被験体が動物である、実施形態２１または２２のいずれか一つの方法。
２４．前記被験体が哺乳動物である、実施形態２３の方法。
２５．前記被験体がヒトである、実施形態２４の方法。
２６．前記被験体が家畜である、実施形態２３の方法。
２７．前記被験体が農業動物である、実施形態２３の方法。
２８．前記被験体が胃腸障害を有する、実施形態２１〜２７のいずれか一つの方法。
２９．前記胃腸障害が、炎症性腸疾患、クローン病、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、肥満、下痢、鼓脹、膨満、腹部けいれん、腹部疼痛、便秘およびその任意の組合せからなる群から選択される、実施形態２８の方法。
３０．前記細菌が前記被験体における１つまたはそれより多くの抗炎症性サイトカインの生成を増加させる、実施形態２１〜２９のいずれか一つの方法。
３１．前記抗炎症性サイトカインがＩＬ−１０である、実施形態３０の方法。
３２．前記細菌が前記被験体における１つまたはそれより多くの炎症誘発性サイトカインの生成を減少させる、実施形態２１〜３１のいずれか一つの方法。
３３．前記炎症誘発性サイトカインが、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびその任意の組合せからなる群から選択される、実施形態３２の方法。
３４．前記細菌の前記治療的有効量が約１０８から１０１２ＣＦＵ／日である、実施形態２１〜３３のいずれか一つの方法。
３５．実施形態１〜１０のいずれか一つの組換え体または単離された細菌を含む医薬組成物。
３６．医薬として使用するための、実施形態１〜１０のいずれか一つの組換え体または単離された細菌。
３７．実施形態２３〜２７のいずれか一つの被験体などの被験体の胃腸管の炎症性障害の処置または予防で使用するための、実施形態１〜１０のいずれか一つの組換え体または単離された細菌。
３８．前記細菌が前記被験体における抗炎症性サイトカイン生成の増加を引き起こす、実施形態３６または３７の使用のための組換え体または単離された細菌。
３９．前記抗炎症性サイトカインがＩＬ−１０である、使用のための実施形態３８の組換え体または単離された細菌。
４０．前記細菌が前記被験体における１つまたはそれより多くの炎症誘発性サイトカインの生成を減少させる、実施形態３６〜３９のいずれか一つの使用のための組換え体または単離された細菌。
４１．前記炎症誘発性サイトカインが、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびその任意の組合せからなる群から選択される、実施形態４０の使用のための組換え体または単離された細菌。
４２．前記細菌が治療的有効量で被験体に投与されるために製剤化され、前記細菌の治療的有効量が約１０８から１０１２ＣＦＵ／日である、実施形態３６〜４１のいずれか一つの使用のための組換え体または単離された細菌。
４３．前記胃腸障害が、炎症性腸疾患、クローン病、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、肥満、下痢、鼓脹、膨満、腹部けいれん、腹部疼痛、便秘およびその任意の組合せからなる群から選択される、実施形態３６〜４２のいずれか一つの使用のための組換え体または単離された細菌。
４４．医薬の製造における、実施形態１〜１０のいずれか一つの細菌の使用。
４５．被験体、例えば実施形態２３〜２７のいずれか一つの被験体の胃腸管の障害の処置または予防のための医薬の製造における、４４の細菌の使用。
４６．炎症性障害の処置のための医薬の製造における、実施形態４４または４５の細菌の使用。
４７．前記障害が、炎症性腸疾患、クローン病、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、肥満、下痢、鼓脹、膨満、腹部けいれん、腹部疼痛、便秘およびその任意の組合せからなる群から選択される、実施形態４６の細菌の使用。
４８．医薬としての、実施形態１〜１０のいずれか一つの細菌の使用。
４９．前記医薬が、被験体、例えば実施形態２３〜２７のいずれか一つの被験体の胃腸管の障害の処置または予防のためである、実施形態４８の細菌の使用。
５０．前記障害が炎症性障害である、実施形態４８または４９の細菌の使用。
５１．前記胃腸障害が、炎症性腸疾患、クローン病、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、肥満、下痢、鼓脹、膨満、腹部けいれん、腹部疼痛、便秘およびその任意の組合せからなる群から選択される、実施形態５０の細菌の使用。
【００７３】
番号のついていない実施形態
第一の態様により、細菌の表面上のリポテイコ酸（ＬＴＡ）の提示を減少させるように遺伝子改変されている、組換え体または単離された細菌が提供される。
【００７４】
一実施形態では、組換え体または単離された細菌は、ホスホグリセロールトランスフェラーゼの発現を減少させるように遺伝子改変されている。具体的な実施形態では、組換え体または単離された細菌は、非改変対照と比較したとき、ホスホグリセロールトランスフェラーゼの発現を約３％〜１５％、１０％〜２５％、２０％〜３５％、３０％〜４５％、４０％〜５５％、５０％〜６５％、６０％〜７５％、７０％〜９０％、７０％〜８０％、７０％〜８５％、８０％〜９５％、９０％〜１００％だけ減少させるように遺伝子改変されている。
【００７５】
さらなる実施形態では、組換え体または単離された細菌は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１５のいずれかに示す核酸配列またはその断片もしくは変異体と、少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの発現を減少させるように遺伝子改変されている。
【００７６】
さらなる実施形態では、組換え体または単離された細菌は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１５のヌクレオチド配列またはその断片もしくは変異体を含むポリヌクレオチドの発現を減少させるように遺伝子改変されている。
【００７７】
第二の態様により、細菌を、細菌の表面上のリポテイコ酸の提示を減少させるように遺伝子改変することを含む、組換え体または単離された細菌の作製方法が提供される。具体的な実施形態では、細菌は部位特異的突然変異誘発によって改変される。
【００７８】
さらなる実施形態では、前記組換え体または単離された細菌は、ホスホグリセロールトランスフェラーゼの発現を減少させるように改変されている。
【００７９】
ホスホグリセロールトランスフェラーゼの発現の減少は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは翻訳後のレベルでの破壊の結果であってよいことが理解され、発現のそのような減少を達成するのに適する方法は当技術分野で公知であり、本明細書でさらに詳細に議論される。
【００８０】
別の実施形態では、前記組換え体または単離された細菌は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１５のいずれかに示す核酸配列またはその断片もしくは変異体と、少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの発現を減少させるように遺伝子改変されている。
【００８１】
さらなる実施形態では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１５に示すヌクレオチド配列またはその断片もしくは変異体を含むポリヌクレオチドの発現を減少させるように改変されている。
【００８２】
さらなる実施形態では、組換え体または単離された細菌は、プロバイオティック細菌である。具体的には、乳酸細菌。より具体的には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、特にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ。さらにより具体的には、遺伝子改変はＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＦＭで実施される。
【００８３】
具体的な実施形態では、組換え体または単離された細菌は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１５８７の下で寄託されているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ
ＮＣＫ２０２５である。
【００８４】
第三の態様では、本明細書の他の場所に記載される組換え体または単離された細菌の治療的有効量を被験体に投与することを含む、被験体で炎症を減少させる方法が提供される。
【００８５】
一実施形態では、炎症の減少は、冠状動脈疾患または心不全などの心臓の疾患を処置または予防する。
【００８６】
第四の態様では、本明細書の他の場所に記載される組換え体または単離された細菌の治療的有効量を被験体に投与することを含む、胃腸管の炎症性障害を処置または予防する方法が提供される。
【００８７】
一実施形態では、被験体は動物、より具体的には哺乳動物である。
【００８８】
別の実施形態では、被験体はヒトである。
【００８９】
さらなる実施形態では、被験体は家畜である。
【００９０】
さらなる実施形態では、被験体は農業動物である。
【００９１】
さらなる実施形態では、被験体は胃腸障害を有する。
【００９２】
具体的な実施形態では、胃腸障害は、炎症性腸疾患、クローン病、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、肥満、下痢、鼓脹、膨満、腹部けいれん、腹部疼痛、便秘およびその任意の組合せからなる群から選択される。
【００９３】
細菌は、被験体で１つまたはそれより多くの抗炎症性サイトカインの生成を増加させることができることが理解されよう。
【００９４】
具体的な実施形態では、抗炎症性サイトカインはＩＬ−１０である。
【００９５】
別の実施形態では、細菌は、被験体で１つまたはそれより多くの炎症誘発性サイトカインの生成を減少させる。
【００９６】
さらなる実施形態では、炎症誘発性サイトカインは、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、ＴＮＦαまたはその任意の組合せからなる群から選択される。
【００９７】
さらなる実施形態では、細菌は治療的有効量で投与され、そこで、細菌の治療的有効量は約１０８から１０１２ＣＦＵ／日である。
【００９８】
第五の態様により、本明細書に記載される組換え体または単離された細菌を含む医薬組成物が提供される。
【００９９】
第六の態様により、医薬として使用するための、本明細書に記載される組換え体または単離された細菌が提供される。
【０１００】
第七の態様により、被験体の胃腸管の障害の処置または予防で使用するための、本明細書に記載される組換え体または単離された細菌が提供される。
【０１０１】
具体的には、障害は炎症性障害である。
【０１０２】
より具体的には、胃腸障害は、炎症性腸疾患、クローン病、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、肥満、下痢、鼓脹、膨満、腹部けいれん、腹部疼痛、便秘およびその任意の組合せからなる群から選択される。
【０１０３】
別の実施形態では、本明細書に記載される方法によって用いるための組換え体または単離された細菌は、被験体において抗炎症性サイトカイン生成を増加させる。
【０１０４】
一実施形態では、抗炎症性サイトカインはＩＬ−１０である。
【０１０５】
別の実施形態では、本明細書に記載される方法によって用いるための組換え体または単離された細菌は、被験体において１つまたはそれより多くの炎症誘発性サイトカインの生成を減少させる。
【０１０６】
さらなる実施形態では、炎症誘発性サイトカインは、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、ＴＮＦαまたはその任意の組合せからなる群から選択される。
【０１０７】
細菌は治療的有効量で提供され、そこで、細菌の治療的有効量は約１０８から１０１２ＣＦＵ／日であることが理解されよう。
【０１０８】
第八の態様により、医薬の製造における、本明細書の他の場所に記載される細菌の使用が提供される。
【０１０９】
具体的な実施形態では、医薬は、被験体の胃腸管の障害を処置または予防するためのものである。
【０１１０】
さらなる実施形態では、障害は炎症性障害である。
【０１１１】
さらなる実施形態では、胃腸障害は、炎症性腸疾患、クローン病、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、肥満、下痢、鼓脹、膨満、腹部けいれん、腹部疼痛、便秘およびその任意の組合せからなる群から選択される。
【０１１２】
第九の態様により、医薬としての、本明細書に記載される細菌の使用が提供される。
【０１１３】
具体的な実施形態では、医薬は、被験体の胃腸管の障害を処置または予防するためのものである。
【０１１４】
さらなる実施形態では、障害は炎症性障害である。
【０１１５】
さらなる実施形態では、障害は、炎症性腸疾患、クローン病、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、肥満、下痢、鼓脹、膨満、腹部けいれん、腹部疼痛、便秘およびその任意の組合せからなる群から選択される。
【０１１６】
本明細書に記載される任意の態様に関して、被験体は、任意の適する被験体、例えば上の第四の態様に関して記載される被験体であってよいことが明らかとなる。
【０１１７】
さらなる態様が上に記載される。特別に記載されていないか明らかに不適合でない限り、１つの特定の態様に関して記載される任意の特徴が全ての他の態様に等しく適用できることは、当分野の技術者に容易に明らかになる。
【０１１８】
以下の実施例は例示として提供され、限定するためではない。
【実施例】
【０１１９】
（実施例１）
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓでＬＴＡの提示を減少させること。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＦＭ（ＮＣＫ５６）で；遺伝子ＬＢＡ０４４４〜ＬＢＡ０４４７が同定され、ＬＴＡ生合成でのそれらの推定上の役割についてアノテートされた（図１Ｂ）。遺伝子ＬＢＡ０４４４およびＬＢＡ０４４８は、推定上のｒｈｏ非依存性ターミネーターが隣接しており（Kingsford  C、Ayanbule  KおよびSalzberg  S（２００７年）Genome  Biology  ８巻（２号）：Ｒ２２頁）、これらの２つの遺伝子が同時転写されてオペロンとして機能することを示す。ＬＢＡ０４４４〜ＬＢＡ０４４７遺伝子はＬＴＡ生合成で推定上の役割を有するが、ＬＢＡ０４４８はこのカスケードで役割を果たさないようである仮定的タンパク質である。
【０１２０】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の種は、次にＴ細胞免疫応答を誘導するＤＣで様々なシグナルを効果的に活性化することができる（Mohamadzadeh  Mら、（２００５年）Proc  Natl  Acad  Sci  USA１０２巻（８号）：２８８０〜２８８５頁；Konstantinov  SRら、（２００８年）Proc  Natl  Acad  Sci  USA１０５巻（４９号）：１９４７４〜１９４７９頁）。ＤＣ機能の改変に関与する分子機構をさらに調査するために、我々はＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＫ５６でホスホグリセロールトランスフェラーゼ遺伝子（ＬＢＡ０４４７）を特異的に欠失させた。このゲノム領域のＰＣＲ分析は、欠失突然変異体ＮＣＫ２０２５が２ｋｂｐを失ったことを示した（図１Ｃ〜Ｄ）。この領域の配列決定は、ＬＢＡ０４４７の消去を確認した。親ＮＣＫ５６および突然変異体ＮＣＫ２０２５の細胞壁抽出物のクロマトグラフ分析は、ホスホグリセロールトランスフェラーゼ遺伝子が欠失している突然変異体におけるＬＴＡの不在を実証した。
【０１２１】
ＮＣＫ２０２５処理ＤＣ。ＤＣとＮＣＫ５６またはＬＴＡ陰性突然変異体（ＮＣＫ２０２５）との共培養は、ＮＣＫ２０２５がＤＣ表面でＭＨＣＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６を下方制御することを示した（図２Ａ）。さらに、ＮＣＫ５６によるＤＣの処理はＴＬＲ１および２の転写を誘導したが、これらの２つのパターン認識受容体（ＰＲＲ）はＮＣＫ２０２５処理ＤＣでは活性化されなかった（図２Ｂ）。両方の株は、ＤＣでＩＬ−１０生成を誘導した；しかし、このサイトカインの生成は、ＮＣＫ２０２５と共培養したＤＣで有意に増加した（図２Ｃ）。同時に、ＩＬ−１２およびＴＮＦαは、ＮＣＫ２０２５処理ＤＣで有意に低減された（図２Ｃ）。腸間膜ＬＮ由来のＴ細胞をＮＣＫ５６またはＮＣＫ２０２５で処理した骨髄由来ＤＣと共培養することによって、Ｔ細胞増殖を判定した。Ｔ細胞増殖は、ＮＣＫ５６と比較して、Ｔ細胞と共培養されたＮＣＫ２０２５処理ＤＣで有意に抑止された（図２Ｄ）。興味深いことに、ＮＣＫ２０２５処理ＤＣの上清に抗ＩＬ−１０抗体を加えることはＴ細胞の増殖を部分的に回復させ、ＩＬ−１０がＤＣ：Ｔ細胞共培養でＴ細胞の増殖を調節する重要な因子であり得ることを示している。ＤＣ：Ｔ細胞共培養から収穫された上清の分析は、ＩＬ−１０はＴ細胞で高度に誘導されたが、ＩＦＮγ、ＩＬ−２およびＴＮＦαは、ＮＣＫ２０２５で処理されたマウスのＴ細胞から最小限に放出されたことを示した（図２Ｅ）。
【０１２２】
ＤＳＳによって誘導された大腸炎のＮＣＫ２０２５による改善。ＮＣＫ２０２５の免疫調節特性をｉｎ  ｖｉｖｏで判定するために、３％ＤＳＳへの曝露の前（予防的）か後（治療的）の４日間連続でＮＣＫ５６またはＮＣＫ２０２５で処理したマウスで、ＤＳＳによって誘導された大腸炎を分析した。データは、ＤＳＳがベースライン（図３Ｂ）と比較して未処理のＣ５７ＢＬ／６マウス（図３Ａ、Ｃ）で臨床的および組織学的大腸炎を誘導したことを示す。臨床的には、マウスは９日目後に体重が減り始め、１３日目までにおよそ１０％の全体重減少があり、１０日目から１１日目頃に重度の出血性下痢を起こした（図３Ａ）。対照的に、ＮＣＫ２０２５によるマウスの経口接種は、体重減少を有意に予防し、下痢および潜血陽性を低減させた（図３Ａ）。全体として、「疾患活動性指数」（ＤＡＩ）は２日目から有意に低減された。さらに、ＮＣＫ２０２５によるマウスの前処理は、組織学的大腸炎スコアを９０％（２１．５±１．４から２．３±０．５まで）まで低減した（図３Ｂ〜Ｆ）。したがって、図３Ｅは、粘膜に限られた限定的な炎症を有する、無傷の非潰瘍上皮を表す。ＮＣＫ２０２５による大腸炎の予防におけるＬＴＡ欠失の役割に特に対処するために、第３群のマウスをＮＣＫ５６で処理した。野生型Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＫ５６は大腸炎の開始を予防せず（図３Ａおよび３Ｄ）、マウスは無処理マウスと類似した臨床的および組織学的大腸炎を起こした。結腸組織によって発現されるサイトカインを解明するために、結腸をマウスの各群から抽出して一晩培養した。結腸サイトカインの分析は、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＴＮＦαおよびＩＦＮγのレベルがＮＣＫ５６およびＤＳＳで処理されたマウスに由来する結腸でより高かったことを示す（図３Ｇ）。対照的に、ＩＬ−１０生成は、ＮＣＫ２０２５処理マウスに由来する結腸培養で有意に上昇した。ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＦＮγおよびＴＮＦαは、ＮＣＫ２０２５処理マウスの結腸で有意に低減された（図３Ｇ）。
【０１２３】
さらに、ＤＳＳによって誘導された大腸炎でＮＣＫ２０２５に対してＮＣＫ５６を接種されたマウスの遠位および近位領域での遺伝子の調査は、免疫刺激性（すなわち、ＣＤ４０、ＣＣＬ１１）、シグナル伝達（すなわち、Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ４）および増殖／アポトーシス／血管形成／プロテイナーゼ（すなわち、ＴＩＭＰ１、ＦＡＳＬ、ＩＣＡＭ１）遺伝子の上方制御を明らかにし、ＮＣＫ２０２５ではなくＮＣＫ５６で処理されたマウスでの活性炎症性応答を示唆している（図７Ａおよび７Ｂ）。興味深いことには、様々な調節、シグナル伝達および抗炎症性の遺伝子［すなわち、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ＰＬＡ２Ｇ７）、血清反応因子（ＳＲＦ）、ＴＧＦβ、（ｐ２１活性化キナーゼＰＡＫ１、ＲＡＦ１、マトリックスメタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ１）、Ｔｙｋ２］が、ＮＣＫ５６またはＤＳＳ単独ではなくＮＣＫ２０２５で処理されたマウスの結腸遠位（近位でない）領域で高く調節された（図７Ａ）。このことは、ＤＳＳによって誘導された大腸炎がより重度である遠位結腸でそれらの調節機能を発揮するために、そのような遺伝子がかなり活性化されることを意味する。
【０１２４】
ＤＳＳによって誘導された大腸炎に及ぼすＮＣＫ２０２５の治療的効果。確立された大腸炎を有するマウスでＮＣＫ２０２５曝露の効果に取り組むために、マウスを３％ＤＳＳに先ず曝露させた後に、ＮＣＫ５６またはＮＣＫ２０２５で処理した。疾患の症状が起こると、マウスはＮＣＫ５６またはＮＣＫ２０２５を４日連続で受けた（図４Ａ）。データは、ＮＣＫ５６とＮＣＫ２０２５の両方が、確立された大腸炎を有意に異なる程度に弱毒化したことを示す。ＮＣＫ２０２５によるマウスの処理は、体重の安定化ならびに下痢および血液損失の急速な解消をもたらしたが、ＮＣＫ５６処理マウスは、より遅い速度であるものの体重が減り続け、下痢および血液損失を解消するのが有意により遅かった（図４Ａ）。組織学的分析は進行中の活動的な大腸炎および潰瘍を明らかにし、１３日目のＤＳＳ処理マウスでは１６．８±２．２の大腸炎スコアであった（図４Ｂ、Ｅ）。ＮＣＫ２０２５で処理されたマウスは有意に向上した大腸炎スコア（８．４±２．２、ｐ＝０．０１）を有し、稀な潰瘍、再生した陰窩構造体および主に粘膜に限定された炎症を含む、加速された治癒を実証した（図４Ｄ、Ｅ）。再び、ＮＣＫ５６処理は組織学的大腸炎スコアを穏やかに向上させ（１４．７±２．０、ｐ＝ＮＳ）、上皮の原状回復があったが、粘膜および粘膜下組織の中では陰窩再生が限定的で進行中の活動的炎症があった（図４Ｃ、Ｅ）。興味深いことに、ＮＣＫ２０２５処理マウスのサイトカイン分析は、これらのマウスの結腸でＩＬ−１０の上方制御ならびにＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＬ−６およびＩＦＮγの最小限の放出を示す（図４Ｆ）。対照的に、ＮＣＫ５６またはＤＳＳ単独で処理されたマウスの結腸ではＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＦＮγおよびＩＬ−６が高度に誘導され、ＩＬ−１０はこれらの群のマウスで最小限に放出された（図４Ｆ）。
【０１２５】
ＮＣＫ２０２５による結腸ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の誘導。自身へのおよび片利共生の微生物叢への脱制御された免疫応答を抑制することにおける、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の役割が最近強調されている（Fontenot  JD、Gavin  MAおよびRudensky  AY（２００３年）Nat  Immunol  ４巻（４号）：３３０〜３３６頁）。したがって、ＮＣＫ５６と比較して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでそれが結腸ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞を増強するかどうか判定するために、ＤＣおよび処理マウスの結腸微小環境でＩＬ−１０を誘導するＮＣＫ２０２５を調査した。実際に、ＮＣＫ５６と比較して、ＮＣＫ２０２５で処理されたマウスの結腸でＴｒｅｇ細胞が有意に誘導されたことを図５ＡおよびＢは示し、これらの細胞のサプレッサー効果が粘膜でＤＳＳによって誘導される誇張された炎症に影響を与えることができることを示唆している。
【０１２６】
ＩＬ−１０の調節効果。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験からのデータ、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏサイトカイン分析は、大腸炎を改善するＮＣＫ２０２５の効果が粘膜でのＩＬ−１０の誘導に依存することを示唆する（Kuhn  R、Lohler  J、Rennick  D、Rajewsky  KおよびMuller  W（１９９３年）Cell  ７５巻（２号）：２６３〜２７４頁）。これらの観察を確認するために、「予防的」および治療的な試験をＩＬ−１０−／−マウスで上記のように実施した。ＩＬ−１０−／−マウスは片利共生細菌への曝露の結果自然発生のＴｈ１媒介性の大腸炎を起こし、ヒトクローン病に類似する深部の経壁潰瘍病変を伴う（Berg  DJら、（１９９６年）J  Clin  Invest  ９８巻（４号）：１０１０〜１０２０頁）。大腸炎の開始の前に、マウスをＮＣＫ５６またはＮＣＫ２０２５（または対照群として無処理）により４日間連続で接種した。大腸炎の開始は、前記のようにピロキシカム処理によって誘導した。臨床的には、体重減少を２８日間監視し、組織学的大腸炎の程度を評価するために屠殺の後結腸を単離した。ＮＣＫ５６またはＮＣＫ２０２５のいずれによっても、誘導された大腸炎の最初の２週間に見られる、予想された体重減少からの保護はなかった（図６Ａ）。総合すると、３群の全ては類似した組織学的大腸炎および大腸炎スコアを生じ（図６Ｂ〜Ｅ）、ＮＣＫ２０２５の免疫調節特性のために内在性ＩＬ−１０が必要とされることを示唆した。
【０１２７】
考察
腸管の免疫寛容を制御する免疫機構の崩壊は、慢性ＩＢＤにつながる（Macdonald  TTおよびMonteleone  G（２００５年）Science  ３０７巻（５７１７号）：１９２０〜１９２５頁；MacDonald  TTおよびGordon  JN（２００５年）Gastroenterol  Clin  North  Am  ３４巻（３号）：４０１〜４１２頁、ｖｉｉ〜ｖｉｉｉ）。ＣＤを有する患者の粘膜固有層でのＩＦＮγ＋Ｔ細胞の数の増加は、無制御の腸炎症および組織破壊（Powrie  F（１９９５年）Immunity  ３巻（２号）：１７１〜１７４頁）につながる、ＩＢＤの発病におけるＴｈ１分極化の関与を強く示唆する（Fuss  IJら、（１９９６年）J  Immunol  １５７巻（３号）：１２６１〜１２７０頁；２５〜２７；Neurath  MF、Duchmann  RおよびMeyer  zum  Buschenfelde  KH（１９９６年）Dtsch  Med  Wochenschr  １２１巻（２２号）：７３５〜７４１頁（in  ger）；Neurath  MFら、（１９９６年）J  Exp  Med１８３巻（６号）：２６０５〜２６１６頁）。ＣＤ８＋（Cheroutre  H（２００６年）Gastroenterology１３１巻（２号）：６６７〜６７０頁；Vezys  VおよびLefrancois  L（２００２年）J  Immunol１６９巻（１２号）：６６７７〜６６８頁）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（Elson  COら、（２００５年）Immunol  Rev  ２０６巻：２６０〜２７６頁；Wirtz  SおよびNeurath  MF（２０００年）Int  J  Colorectal  Dis  １５巻（３号）：１４４〜１６０頁）の両方は、高度活性化ＤＣから放出される炎症性サイトカイン（すなわちＩＬ−１２）によって末梢で活性化されるときに、腸管の炎症を誘発する。したがって、効果的な免疫療法は、調節シグナルによって一般に持続する免疫寛容崩壊の基礎をなす免疫シグナル伝達機構に関する深い知識を必要とする（Wirtz  Sら、（１９９９年）J  Immunol  １６２巻（４号）：１８８４〜１８８８頁）。
【０１２８】
近年では、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓゲノムの配列決定および注釈が、最終的に治療的適用につながる、粘膜の細胞性および分子事象に影響を及ぼすことができるこの細菌の細胞表面構成要素の遺伝子操作を可能にした（Konstantinov  SRら、（２００８年）Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １０５巻（４９号）：１９４７４〜１９４７９頁；Altermann  Eら、（２００５年）Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １０２巻（１１号）：３９０６〜３９１２頁）。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの細胞壁および細胞表面タンパク質は、細胞形状の維持およびＤＣを含む免疫細胞の活性化のために重要である構成要素を含む（Konstantinov  SRら、（２００８年）Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １０５巻（４９号）：１９４７４〜１９４７９頁）。細菌と自然免疫細胞（innate  cell）（すなわちＤＣ）との間の複雑なクロストークおよび大腸炎とのその関連性を研究するために、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓでＬＴＡのグリセロール鎖を合成するホスホグリセロールトランスフェラーゼをコードする遺伝子を欠失させた。データは、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓのＬＴＡ陰性変異株であるＮＣＫ２０２５が、マウスＤＣで調節シグナル（すなわちＩＬ−１０）およびより少ない副刺激分子（ＣＤ４０、ＣＤ８６）を誘導し、事実上これらの細胞を調節ＤＣに変換したことを示す（Belkaid  YおよびOldenhove  G（２００８年）Immunity  ２９巻（３号）：３６２〜３７１頁）。そのような調節ＤＣとＣＤ４＋Ｔ細胞との以降の相互作用は、Ｔ細胞活性化をかなり変化させた。さらに、ＮＣＫ２０２５処理は、ＤＳＳで誘導された大腸炎を改善し、この細菌株による動物の前処置が、結腸組織学、体重減少、低減された下痢および潜血陽性によって実証されるようなＤＳＳチャレンジに抵抗する調節免疫を誘導したことを示している。
【０１２９】
粘膜の中で明白な炎症性応答を調節する機構の１つは、ＩＬ−１０である（Kraus  TAら、（２００５年）J  Clin  Invest  １１５巻（８号）：２２３４〜２２４３頁；Kraus  TAおよびMayer  L（２００５年）Curr  Opin  Gastroenterol  ２１巻（６号）：６９２〜６９６頁）。このサイトカインが、ＤＣだけでなくＮＣＫ２０２５処理マウスの結腸組織によっても高度に分泌されることを我々のデータは明らかに示し、この現象はＤＳＳ大腸炎の治療のための予防的戦略でも治療的戦略でも見られる。ＩＬ−１０が、抗炎症性効果を発揮するその能力を通して自然免疫応答および適応免疫応答の両方を調整することが以前に示されている（Moore  KW、de  Waal  Malefyt  R、Coffman  RLおよびO’Garra  A（２００１年）Annu  Rev  Immunol  １９巻：６８３〜７６５頁；Trinchieri  G（２００７年）J  Exp  Med  ２０４巻（２号）：２３９〜２４３頁）。ＤＣにおけるＭＨＣＩＩ、副刺激分子およびＩＬ−１２の生成を下方制御することによって、このサイトカインはＴ細胞を機能的に抑制し、その全てはＴ細胞の分化および活性化に強く関与している（Moore  KW、de  Waal  Malefyt  R、Coffman  RLおよびO’Garra  A（２００１年）Annu  Rev  Immunol１９巻：６８３〜７６５頁；de  Waal  Malefyt  R、Abrams  J、Bennett  B、Figdor  CGおよびde  Vries  JE（１９９１年）J  Exp  Med  １７４巻（５号）：１２０９〜１２２０頁）。さらに、ＩＬ−１０は、リンパ球でＪａｋ１、Ｔｙｋ２およびＳｔａｔ３経路を含む多数のシグナル伝達カスケードを開始するその活性化ＩＬ−１０受容体を通して（Finbloom  DSおよびWinestock  KD（１９９５年）J  Immunol  １５５巻（３号）：１０７９〜１０９０頁）、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、Ｂ細胞およびＴｈ１分極化も調節する（Moore  KW,  de  Waal  Malefyt  R,  Coffman  RLおよび  O’Garra  A（２００１年）Annu  Rev  Immunol  １９巻：６８３〜７６５頁）。これらの観察は、粘膜寛容の調節および維持が、病原性ＣＤ４＋Ｔ免疫応答を著しく改変するＩＬ−１０によってきわどく支配されることを実証し、ここで提示される知見と一貫する。さらに、重度の大腸炎を起こすＩＬ−１０欠損マウスを用いて、無害な抗原に応じてのＩＬ−１０の重要な役割が最近実証された（Kuhn  R、Lohler  J、Rennick  D、Rajewsky  KおよびMuller  W（１９９３年）Cell  ７５巻（２号）：２６３〜２７４頁）。上で見られるように、ＮＣＫ２０２５の免疫調節効果は、ＩＬ−１０−／−で確立された大腸炎を完全に元に戻すのに十分でなかった；しかし、予防的／治療的な方法で与えられたときにそれは大腸炎の誘導を実際に抑止し、炎症の開始の調節におけるＩＬ−１０の重要な役割を鮮明にした。
【０１３０】
重要なことに、ＩＬ−１０分泌Ｔｒｅｇ細胞が、効率的なＴ細胞免疫の誘導を次に調節して付随的な組織傷害を制御する（Matarese  G、De  Rosa  VおよびLa  Cava  A（２００８年）Trends  Immunol  ２９巻（１号）：１２〜１７頁）ＤＣの炎症特性を制御するという考えを、益々多くの証拠が裏づける（Lund  JM、Hsing  L、Pham  TTおよびRudensky  AY（２００８年）Science  ３２０巻（５８８０号）：１２２０〜１２２４頁）。この点に関しては、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＬＴＡ陰性変異株処置が、マウスの結腸でＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞数を増加させたことを我々は示す。ＦｏｘＰ３遺伝子での突然変異がＴｈ１およびＴｈ２サイトカインシグナルの無制御の増殖およびかなりの上昇をもたらすヒトと齧歯動物の両モデルで以前に実証されているように、これらの観察は炎症性障害におけるＴｒｅｇ細胞の重要な役割を強く裏づける（Fontenot  JD、Gavin  MAおよびRudensky  AY（２００３年）Nat  Immunol  ４巻（４号）：３３０〜３３６頁）。ＩＬ−１０を調節することができる追加の機構ならびに自然免疫細胞およびＴ細胞に対するその以降の効果は、未定のままである。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓでのＬＴＡ合成に関与する遺伝子全体の完全な欠失は、腸管の微小環境にかなりの影響を及ぼして、調節シグナル（すなわちＩＬ−１０、Ｔｒｅｇ細胞）を誘導し、誘導された炎症性免疫応答の間に細胞共存を回復することができる誘導細菌をもたらす。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓは、ＤＣ機能を著しく変更するＳ層タンパク質の特異な提示を表す（Konstantinov  SRら、（２００８年）Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １０５巻（４９号）：１９４７４〜１９４７９頁、Mohamadzadeh  M、Duong  T、Sandwick  SJ、Hoover  TおよびKlaenhammer  TR（２００９年）Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １０６巻（１１号）：４３３１〜４３３６頁）。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓのＳ層は３つのＳ層Ａ、ＢおよびＸ遺伝子からなり（Goh  YJら、（２００９年）Appl  Environ  Microbiol  ７５巻（１０号）：３０９３〜３１０５頁、Goh  YJおよびKlaenhammer  TR（２００９年）Front  Biosci１４巻：１３６２〜１３８６頁）、そこで、「自己集合」Ｓ層タンパク質ＡまたはＢはこの細菌の表面を覆う主要なタンパク質である。腸に永久に定着しない外来細菌での遺伝子改変は、プロバイオティック微生物を投与することによって免疫応答が調節されている（すなわち活動的ＩＢＤ）か、平静が保たれている（すなわち腸管感染）場合に、より多くの治療選択肢を提供することができる。これは、経口免疫応答の調節を最適化することができる治療用ビヒクルの開発を促進する。したがって、自己免疫性疾患に対してそのようなプロバイオティック介入を確立することは、より良い臨床転帰を達成するために、様々な免疫学的観点から慎重に編成されなければならない。
【０１３１】
第１に、炎症は通常の免疫の一部であるので、炎症の支配的な調節は恒常的であるべきでない（Nathan  C（２００２年）Nature  ４２０巻（６９１７号）：８４６〜８５２頁）。腸に定着する細菌は、腸管の調節／副刺激免疫の均衡を維持するために必要とされる免疫応答を害し得る。例えば、感染の間、炎症過程は、感染からの回復を促進する病原体の認識、ならびに自然免疫応答および適応免疫応答の活性化を可能にする。したがって、微生物排除を達成し、様々な免疫カスケードおよび病原体の存在による不必要な組織傷害をさらに予防するために、連続する事象を編成する炎症は、適切に段階づけされ、調節されなければならない。そのような炎症過程は、炎症性応答の拡大、抑制または調節を引き起こすことができる特異的なチェックポイントおよびフィードバックループを通して制御することができる。そのような正および負のフィードバックループは、炎症性応答を媒介し、その制御で調節的な役割を最終的に演ずる様々な分子に依存する。重要なことに、細菌のクリアランスの方へシグナルを動員する能動免疫は、炎症性シグナルによって部分的に誘導される調節シグナル（すなわちＩＬ−１０）によって制御される最適な細胞性同時刺激を必要とする。
【０１３２】
第２には、一過性調節免疫を達成するために、細菌種を含む手段は慎重に選択され、用いられなければならない。この点に関しては、炎症を弱めるための、広く用いられているプロバイオティック微生物Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＦＭのＬＴＡ欠失誘導体の遺伝子構築は、我々の手法で助けになった。この細菌は新しい遺伝子またはＤＮＡ配列を抱えず、腸に永久に定着しないので、それは、経口的に接種されたときに調節免疫応答を誘導するための理想的なビヒクルの役割をすることができる。このことは、炎症を低減させる目標が達成されると、腸で「正常な」免疫を再確立するためにプロバイオティックサプリメントのいずれも停止することができることを意味する。最後に、これらの研究は、感染などの疾患で効果的な免疫活性化に必要な副刺激シグナルを無視することなく、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓでのＬＴＡの欠失がどのように自然免疫細胞で調節機構を開始するかを証明する。
【０１３３】
全体として、標的の予防的または治療的な戦略は、細胞性相互作用が深く理解され、自己免疫、炎症または抗炎症性応答で頂点に達する重要な分子が同定されるときに有効になる。
【０１３４】
方法
試薬。ピロキシカムおよびスリンダクは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得られた。デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）は、ＭＰ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）から得られた。ＮＳ−３９８は、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）から得られた。ＣＤ４、ＣＤ２５、ＦｏｘＰ３、ＣＤ３、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ−１０およびマウスＧＭ−ＣＳＦのためのモノクローナル抗体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入された。
【０１３５】
細菌株。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓのＮＣＫ５６およびＮＣＫ２０２５を１％で接種し、ｄｅ  Ｍａｎ、ＲｏｇｏｓａおよびＳｈａｒｐｅブロス（ＭＲＳ、Ｄｉｆｃｏ）において３７℃で１５時間増殖させた。その後、各培養の１ｍｌを５０ｍｌの新鮮なＭＲＳに移し、３７℃で１８時間インキュベートした。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数は、６００ｎｍで光学濃度を測定することによって判定した（Greene  JDおよびKlaenhammer  TR（１９９４年）Appl  Environ  Microbiol  ６０巻（１２号）：４４８７〜４４９４頁）。細胞を遠心分離によって収穫し、滅菌ＰＢＳで２回洗浄し、２０％グリセロールを含むＰＢＳに５×１０８ＣＦＵ／ｍｌで再懸濁し、その後ｉｎ  ｖｉｔｒｏで未熟なＤＣ（１：１）を刺激するために用いるまで、−８０で保存した。マウスの経口接種のために、４８時間増殖させた細菌を滅菌ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳに５×１０９／ｍｌで再懸濁し、マウスの経口接種のために用いた（５×１０８ｃｆｕ／１００μｌ  ＰＢＳ／マウス）。
【０１３６】
マウス。６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６、およびＩＬ−１０−／−（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）マウスが、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）およびＧｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹから購入された。マウスは、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物管理施設で、特定病原体除去、無ヘリコバクター条件の下で、マイクロアイソレーターケージで維持した。ＩＬ−１０−／−マウスの結腸で、炎症のいかなる自然発生の徴候も観察されなかった。実験は、Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ（ＮＩＨ−７２−２３）のＮＩＨガイドラインに従って公認機関で実施され、動物プロトコルは地域の倫理委員会の承認を得た。
【０１３７】
ホスホグリセロールトランスフェラーゼを標的にする。標準の組込みおよび切除方法、手段および株を用いて、ホスホグリセロールトランスフェラーゼ（ＬＢＡ０４４７）の欠失により、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＫ５６の突然変異株を構築した（Pfeiler  EAおよびKlaenhammer  TR（２００９年）Appl  Environ  Microbiol  ７５巻（１８号）：６０１３〜６０１６頁、Russell  WMおよびKlaenhammer  TR（２００１年）Appl  Environ  Microbiol  ６７巻（９号）：４３６１〜４３６４頁）。ＬＢＡ０４４７に隣接する２つの標的断片、Ｄｅｌ１＿ＳｐｈＩおよびＤｅｌ２＿ＢｇｌＩＩを含む、ｐＯＲＩ２８欠失ベクターを構築した。二重交差組込みおよび切除事象の後、ゲノムでＬＢＡ０４４７の１，９８４ｂｐの欠失を有するＮＣＫ２０２５が回収された。ＮＣＫ２０２５のＬＢＡ０４４７領域でのＰＣＲアンプリコンおよびＤＮＡ配列決定は、約２ｋｂｐの欠損を確認し、欠失を囲む遺伝子で追加の突然変異を明らかにしなかった。
【０１３８】
ＬＴＡ生化学分析。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓのＮＣＫ５６（５×１０８／ｃｆｕ／１０ｍｌ）およびＮＣＫ２０２５（５×１０８／ｃｆｕ／１０ｍｌ）を、ＥＲＭなしのｄｅＭａｎ、ＲｏｇｏｓａおよびＳｈａｒｐｅブロス（ＭＲＳ、Ｄｉｆｃｏ、Ｌａｗｒｅｎｃｅ、ＫＳ）の冷凍保存株（−８０℃）から３７℃で増殖させた。その後、ＮＣＫ５６およびＮＣＫ２０２５でのＬＴＡの発現を、以前に記載されているように分析した（Morath  S、Geyer  AおよびHartung  T（２００１年）J  Exp  Med  １９３巻（３号）：３９３〜３９７頁）。簡潔には、株ＮＣＫ５６とＮＣＫ２０２５の両方の冷凍抽出物をｐＨ４．７のクエン酸緩衝液（０．０５Ｍ）で溶解し、その後１５分間のシンジケート化が続いた。室温で２０分間撹拌しながら、細菌溶解物（３０ｍｌ）をｎ−ブタノールの等量と混合した。４０分の遠心分離（１７，２００×ｇ）の後、２回目の抽出のために新鮮なクエン酸緩衝液を添加する前に水相を収集した。この再抽出を２回実行し、３つの水相をプールして凍結乾燥した。クロマトグラフィー出発緩衝液（３５ｍｌ、０．１Ｍ酢酸アンモニウム中の１５％ｎ−プロパノール、ｐＨ４．７）への試料の再懸濁の後、全ての試料を遠心分離（２６，９００×ｇで１時間）にかけて、濾過した（０．２μｍ）。両方の細菌株からの凍結乾燥材料を０．７％トリフルオロ酢酸で溶解し、各株からの０．４５ｍｇの抽出物をＨＰＬＣによって分析した。吸光度を２６０ｎｍで連続的に監視して、クロマトグラフを得た。
【０１３９】
細胞培養。マウス大腿骨を切り取り、周囲の組織から機械的に精製し、冷たいＰＢＳを用いて骨髄を洗い流した。赤血球を溶解するために、細胞をトリス緩衝塩化アンモニウムで処理した。その後、ＣＤ１９、ＣＤ３、ＭＨＣＩＩおよびＧｒ−１に対する特異抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＩＡ＋細胞およびＧｒ−１−顆粒球を明確に取り出した。残りの細胞はＩ−Ａ−であり、６穴プレートで、マウスＧＭ−ＣＳＦだけ（２５ｎｇ／ｍｌ）を含む１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えたＲＰＭＩ１６４０完全培地で６日間培養した。一日おきに、培養にＧＭ−ＣＳＦを含む新鮮な培地を供給した。６日目に細胞を収穫して、異なる実験のために用いた。Ｔ細胞の活性化および増殖を試験するために、ＮＣＫ５６またはＮＣＫ２０２５を４日連続でＣ５７ＢＬ／６マウスに投与した（５×１０８ＣＦＵ／１００μｌ／マウス）。１週後に、マウスを屠殺して、各群のマウスの腸間膜ＬＮを単離した。腸間膜Ｔ細胞は、負磁気ビーズ除去によって濃縮した。Ｔ細胞の活性化および増殖をアッセイするために、ＮＣＫ５６またはＮＣＫ２０２５で処理されたＤＣおよび未処理のＤＣ（９６穴プレートに１０４／ウェル）を、無血清培地で５日間、単離腸間膜ＬＮ  ＣＤ４＋Ｔ細胞（１０５／ウェル）と段階的な用量で培養した。その後、９６穴プレートの各ウェルの２５μｌを収穫して、サイトカイン分析のために冷凍した。次に最後の１６時間、細胞をウェルにつき０．５μＣｉ［３Ｈ］チミジンでパルスした（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ）（Pulendran  Bら、（２００４年）Eur  J  Immunol  ３４巻（１号）：６６〜７３頁）。一部の実験では、抗ＩＬ−１０抗体（最終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）をＤＣ：Ｔ細胞共培養でそれぞれ用いた。
【０１４０】
ＤＳＳ誘導大腸炎。ワクチン接種／予防試験のために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群（マウス１０匹／群）に、ＮＣＫ５６またはＮＣＫ２０２５（５×１０８ｃｆｕ／１００μｌ  ＰＢＳ／マウス）を４日間連続で経口接種した。これらの群のマウスおよび対照マウスは、６日周期の飲料水中の３％ＤＳＳを１回受け、続いて通常の飲料水を１日受け、その後８日目に屠殺された。非接種群でＤＳＳの第１周期の後に急性の大腸炎が観察された。体重減少、下痢および糞便の潜血陽性（ＦＯＢ）を含む疾患の進行が、試験の全期間中に監視された。その後、マウスを屠殺し、結腸断面スイスロールを１０％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。組織切片（４μｍ）をヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、以前に記載されているように盲目的にスコアリングした（Cooper  HSら、（１９９３年）Lab  Invest  ６９巻（２号）：２３８〜２４９頁、Murthy  SNら、（１９９３年）Dig  Dis  Sci  ３８巻（９号）：１７２２〜１７３４頁）。０から２８のスケールに基づく格付けは、炎症性浸潤の程度、びらん、潰瘍または壊死の存在、ならびに病変の深さおよび表面伸展を考慮する。処理試験のために、３群のＣ５７ＢＬ／６マウス（１０匹／群）は大腸炎を開始するために５日周期の３％ＤＳＳを最初に受け、群の２匹はその後４日間連続でＮＣＫ５６またはＮＣＫ２０２５による経口栄養（５×１０８ｃｆｕ／１００μｌ  ＰＢＳ／マウス）を通して処理された。上のようにマウスが屠殺されて結腸が調査されたプロトコルの１３日目まで、疾患の進行が監視された。
【０１４１】
結腸組織培養。結腸組織培養を、前述のとおりに実施した（Sellon  RKら、（１９９８年）Infect  Immun  ６６巻（１１号）：５２２４〜５２３１頁）。簡潔には、３％ＤＳＳ適用の前か後にＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株で処理された各マウス群の結腸組織を、冷ＰＢＳで完全に洗った。組織を１ｃｍ片に切断し、２８０ｒｐｍで３０分間、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む完全ＲＰＭＩ１６４０中で振盪させた。５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン／アムホテリシンＢを追加したＲＰＭＩ１６４０培地で、結腸組織を３７℃で１８時間培養した。上清を次に収集し、サイトカイン分析のために用いるまで−８０℃で保存した。
【０１４２】
ＩＬ−１０−／−大腸炎。Ｃ５７ＢＬ／６  ＩＬ−１０−／−の群（１０／群）を、病原体除去ハウジングから従来のハウジングに移し、１週間順応させた。次にマウスにＮＣＫ５６またはＮＣＫ２０２５（５×１０８ｃｆｕ／１００μｌ  ＰＢＳ／マウス）を４日間連続で接種し、次に、大腸炎の開始を速め、同調させるために、以前に記載されているように（Berg  DJら、（２００２年）Gastroenterology  １２３巻（５号）：１５２７〜１５４２頁）、低用量のピロキシカムを１週間与え、続いて高用量のピロキシカムを１週間与えた。標準飼料を２週間与えた後（２８日目）、マウスを屠殺し、結腸断面スイスロールを１０％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。以前に記載されるとおり（Berg  DJら、（２００２年）Gastroenterology  １２３巻（５号）：１５２７〜１５４２頁）、組織切片（４μｍ）をＨ＆Ｅで染色し、０から４のスケールで盲目的にスコアリングした。
【０１４３】
フローサイトメトリー。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ処理および未処理のＤＣ（５×１０５）を表面マーカーモノクローナル抗体と一緒に４℃で３０分間インキュベートし、０．１％ＦＣＳを加えた大量のＰＢＳで洗浄し、０．１％パラホルムアルデヒドで固定し、標準のＣＥＬＬＱＵＥＳＴ獲得分析ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いることによってＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ４レーザーサイトメトリーで分析した。１条件につき少なくとも１０４個のゲート付事象が得られた。一部の実施形態では、結腸リンパ球を導くために、マウスの群（マウス５匹／群）に、ＮＣＫ５６またはＮＣＫ２０２５（５×１０８ｃｆｕ／１００μｌの無菌ＰＢＳ／マウス）を４日間連続で接種した。以前に記載されるとおり（Haddad  Wら、（２００３年）J  Exp  Med  １９８巻（３号）：３６９〜３７７頁）、マウスを屠殺し、結腸を洗い、単一の細胞を粘膜固有層から単離した。リンパ球をＰｅｒｃｏｌを用いて濃縮し、抗ＣＤ４  ＦＩＴＣ、ＣＤ２５  ＡＰＣ抗体および７ＡＡＤで染色した。その後、染色された細胞を固定し、透過性化させ、抗ＦｏｘＰ３  ＰＥまたはアイソタイプ抗体で染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒによって分析した。
【０１４４】
リアルタイムＰＣＲ。ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、ＭＤ）を用いて、骨髄ＤＣから全ＲＮＡを単離した。５μｇのＲＮＡからｃＤＮＡを合成するために高容量ｃＤＮＡ逆転写キットを用い、ＴＬＲ１およびＴＬＲ２遺伝子の発現は、Ｐｏｗｅｒ  Ｓｙｂｅｒグリーン２×ＰＣＲマスターミックスを備えたＡＢＩ７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いてリアルタイム半定量ＰＣＲで判定した。ゲノムＤＮＡの増幅を排除するために、ＴＬＲ１（フォワード−ＴＴＡＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＧＴＧＡＡＴＧＣＡＧＴＴＧ；リバース−ＧＡＧＣＡＴＴＧＣＣＡＣＡＴＧＧＧＴＡＴＡＧ）およびＴＬＲ２（フォワード−ＣＡＡＡＧＣＧＴＣＡＡＡＴＣＴＣＡＧＡＧＧＡＴ；リバース−ＡＣＡＣＣＣＣＡＧＡＡＧＣＡＴＣＡＣＡＴＧ）のためのプライマーを、イントロン接合部にわたる領域のために選択した。結果は、内因性の対照（フォワード−ＧＴＣＧＴＧＧＡＴＣＴＧＡＣＧＴＧＣＣ；リバース−ＴＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣ）としてＧａｐｄｈを用いるｄｄＣＴ法を用いる対照試料と比較した、増加倍数を反映する。
【０１４５】
低比重ｃＤＮＡマイクロアレイ：ＤＳＳ単独、ＮＣＫ５６−ＤＳＳまたはＮＣＫ２０２５−ＤＳＳで処理された各群のマウス（５×／群）の結腸遠位および近位領域をＰＢＳで洗い流し、ＲＮＡ安定化のためにＲＮＡＬａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ、ＭＤ）に直ちに浸漬した。ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、ＭＤ）でＲＮＡを抽出し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｎａｎｏｃｈｉｐ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて質を評価した。用いた全ての試料は、７を超えるＲＮＡインテグリティ番号（ＲＩＮ）を有していた。マイクロアレイのための逆転写およびハイブリダイゼーションは、製造業者（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＤｕａｌＣｈｉｐ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって記載されているとおりに実行した。簡潔には、最初にオリゴ（ｄＴ）１２〜１８プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒に７０℃で１０分間試料をインキュベートし、続いてＲＴミックス（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ、ｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ビオチン標識ＡＴＰおよびＣＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を加え、４２℃で９０分間、次に７０℃で１５分間インキュベートすることによって、６ｕｇのＲＮＡを逆転写した。ＲＮアーゼＨを加え、試料を３７℃で２０分間、続いて９５℃で３分間インキュベートして反応を終了させた。生じたｃＤＮＡをハイブリダイゼーションチャンバーに加え、エッペンドルフサーモミキサーで１４００ｒｐｍで混合しながら６０℃で一晩インキュベートした。製造業者（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって記載されているとおりに、スライドを洗浄し、Ｓｉｌｖｅｒｑｕａｎｔ検出系を用いてビオチン組込みを検出することによってＲＮＡレベルを判定した。分析は、Ｓｉｌｖｅｒｑｕａｎｔ分析ソフトウェア（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、試料と同じ結腸領域からの対照との比較によって実施された。
【０１４６】
本明細書で指摘した全ての刊行物および特許出願は、本発明が関連する分野の技術者のレベルを示すものである。全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的におよび個々に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４７】
上記の発明は理解の明快性のために例示および例として多少詳細に記載されたが、添付の請求項の範囲内で特定の変更および改変を実施することができることは明らかになる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図８Ｋ】
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【図８Ｌ】
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【配列表】
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