(57)【要約】【課題】神経伸長に影響を及ぼす原因物質を模索するとともに、当該原因物質による皮膚刺激のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価方法、および当該原因物質による神経伸長の抑制を目的とした有効成分の評価方法を提供する。【解決手段】汚染物質を用いてコントロールの神経細胞の長さよりも神経細胞の長さが伸長している細胞を作製する、神経細胞の作製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
汚染物質を用いてコントロールの神経細胞の長さよりも神経細胞の長さが伸長している細胞を作製する、神経細胞の作製方法。
【請求項２】
培養された表皮細胞に汚染物質を添加した後、培養上清を神経細胞に添加することを有する、請求項１に記載の作製方法。
【請求項３】
前記汚染物質が、芳香族炭化水素受容体アゴニストである、請求項１または２に記載の作製方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の作製方法により得られた神経細胞。
【請求項５】
汚染物質に表皮細胞を接触させて得られる試料を準備し、前記試料と、前記汚染物質に接触させていないコントロールと、を比較した場合の変化を測定する、汚染物質による皮膚刺激のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価方法。
【請求項６】
前記汚染物質が、芳香族炭化水素受容体アゴニストである、請求項５に記載の評価方法。
【請求項７】
前記変化が、神経細胞の神経伸長変化である、請求項５または６に記載の評価方法。
【請求項８】
前記変化が、神経成長因子の分泌量の変化である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項９】
前記試料が、培養した表皮細胞に汚染物質を添加した後、培養上清を神経細胞に添加することで得られる、請求項５〜８のいずれか１項に記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
掻痒性皮膚疾患は、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、接触性皮膚炎、尋常性乾癬、乾皮症、痒疹など痒みを伴う疾患である。通常、健常な皮膚では、末梢知覚神経は表皮と真皮の境界である基底層までしか到達していないが、上記疾患を有する皮膚では、末梢知覚神経が表皮内にまで多数伸長しており、これが痒みを引き起こすことが知られている。末梢知覚神経の伸長には、主にケラチノサイトが産生する神経成長因子（ＮＧＦ；ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）と、軸索伸長反発因子であるセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）とが関与していることが知られている（非特許文献１）。具体的には、ＮＧＦが相対的に増加すると末梢知覚神経が伸長し、Ｓｅｍａ３Ａが相対的に増加すると末梢知覚神経の伸長が抑制されることが報告されている。さらに近年では、末梢知覚神経の伸長が、痒みのみならず、皮膚が外部から受ける刺激に対して過敏になる敏感肌にも関与することが報告されている（特許文献１）。よって、末梢知覚神経の伸長を抑制することで、掻痒性皮膚疾患や敏感肌の予防、治療および／または改善が期待できるため、知覚神経伸長を抑制する様々な有効成分の検討が行われている。
【０００３】
また、知覚神経伸長を抑制する有効成分の検討においては、神経細胞を伸長させて評価するのが一般的である。例えば、ラット副腎髄質褐色細胞腫に由来する継代細胞であるＰＣ１２細胞は、神経成長因子（ＮＧＦ；ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）の刺激により神経様細胞に分化をするので、知覚神経伸長を抑制する有効成分の評価に用いられている（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１７−２２１１８９号公報
【特許文献２】特開２０１０−１２６４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】難治性痒みの発現メカニズム  乾燥、透析、アトピー性皮膚炎に伴う痒みについて、高森  健二、日皮会誌：１１８（１０），１９３１−１９３９，２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、神経伸長に影響を及ぼす原因物質を模索するとともに、当該原因物質による伸長した神経細胞の作製方法、および皮膚刺激のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、汚染物質を用いてコントロールの神経細胞の長さよりも神経細胞の長さが伸長している細胞を作製する、神経細胞の作製方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、汚染物質を刺激物質として、伸長した神経細胞を作製することができる。また、汚染物質で刺激された伸長した神経細胞を用いて、汚染物質による皮膚刺激に対する有効成分のスクリーニングを行うことが可能となる。よって、汚染物質で刺激された伸長した神経細胞を用いることで、効果的に鎮痒作用あるいは敏感肌を抑える有効成分を開発することが可能となる。さらに、例えば、神経伸長を指標として、汚染物質による皮膚への刺激を評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例３における、汚染物質の添加によるＮ１Ｅ−１１５細胞の神経伸長の画像である。
【図２】実施例４における、汚染物質の添加によるヒトｉＰＳ細胞由来の神経細胞の神経伸長の画像である。
【図３】実施例５における、汚染物質の添加によるヒトｉＰＳ細胞由来の神経細胞の神経伸長に対するＬＰＡによる抑制効果の画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の構成を更に詳細に説明する。
【００１１】
本発明の一実施形態は、汚染物質を用いてコントロールの神経細胞の長さよりも神経細胞の長さが伸長している細胞を作製する、神経細胞の作製方法である。このような方法によれば、伸長した神経細胞を作製することができ、後述するような有効成分の探索に用いることができる。
【００１２】
大気汚染の原因とされる汚染物質による人体への影響としては、汚染物質を直接吸入する恐れがあることから、呼吸器系に対する影響が広く論じられてきた。さらに、皮膚も生体における最外層の臓器であり常に外界に曝されていることから、呼吸器系と同様にして、汚染物質に直接接触する可能性を潜在的に有している。
【００１３】
日本では大気汚染防止法により、それらの多くが規制の対象となっており、排出基準等が定められるなど、対策が講じられている。しかしながら、ＰＭ（粒子状物質）に関しては、近隣諸国から越境輸送されてくることが、日本周辺で昨今非常に深刻な問題となりつつある。なお、大気汚染防止法では法規制の対象である粒子状物質として「自動車排ガスの中の粒子状物質」を指定しており、同法関連法規では粒子状物質が「自動車排ガスの中の粒子状物質」に限定して用いられている。
【００１４】
一方、皮膚においては、掻痒性皮膚疾患や敏感肌は非常に多くの患者が悩まされている疾患であり、これらの疾患の原因は限定されておらず、乾燥や紫外線、体質や加齢によるものなどがある。本発明者らは、大気汚染物質の付着による炎症の可能性に着目した。
【００１５】
大気汚染物質中に存在する芳香族炭化水素受容体のアゴニストを表皮細胞に適用すると該アゴニストが芳香族炭化水素受容体（ＡｈＲ；Ａｒｙｌ  Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合する。この結合によって表皮バリア機能破壊や炎症応答、あるいは色素沈着が引き起こされることが知られており、これらのメカニズムとして細胞接着分子（ＩＣＡＭ−１；ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）、インターロイキン１−α（ＩＬ−１α；Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６；Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ；ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ；ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ；Ｐｒｏ−ｏｐｉｏｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ）、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ；Ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）の関与が報告されている（Ｋｒｕｔｍａｎｎ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｃｉ．  ２０１４  Ｄｅｃ；７６（３）：１６３−８）。
【００１６】
かような技術的背景の中で、本発明者らは、皮膚に対する汚染物質の接触が神経細胞に対して影響を及ぼす可能性について鋭意研究した。その結果、表皮細胞へ汚染物質を接触させることで神経成長因子（ＮＧＦ）が分泌されることを見出した。さらに汚染物質の表皮細胞の刺激によって、神経細胞の伸長をもたらすことを確認し、伸長した神経細胞の作製方法を完成させた。
【００１７】
汚染物質としては、一般的な大気汚染物質であればいずれも用いることができる。大気汚染物質は、種々の型の化学物質および／または生体異物及び粒子から成り、主要な物質としては、自動車、火力発電所、焼却炉、暖炉などの排煙、火山噴火による噴出物、土壌粒子などに由来する粒子状物質（ＰＭ；ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  ｍａｔｔｅｒ）；粉塵、燃焼などに由来する一酸化炭素、硫黄酸化物（二酸化硫黄など）、窒素酸化物（二酸化窒素など）などの排出ガス；炭化水素と窒素酸化物などが光化学反応を起こして生じるオゾン（Ｏ３）や多環芳香族炭化水素（ＰＡＨｓ；ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ  ａｒｏｍａｔｉｃ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ）などの光化学オキシダント；燃焼や石油製品からの揮発などが由来の揮発性有機化合物（ＶＯＣ；Ｖｏｌａｔｉｌｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ；ホルムアルデヒドなどのアルデヒド類；ダイオキシン類；石綿などが挙げられる。
【００１８】
なお、大気汚染防止法では法規制の対象である粒子状物質として「自動車排ガスの中の粒子状物質」を指定しており、同法関連法規では粒子状物質が「自動車排ガスの中の粒子状物質」に限定して用いられている。したがって、大気汚染物質としては、自動車排ガスの中の粒子状物質であることが好ましく、ディーゼル排ガスの粒子状物質であることがより好ましい。
【００１９】
大気汚染物質としては、評価試験の再現性の観点から一定のモデル物質を用いることが好ましい。汚染物質のモデル化合物としては、芳香族炭化水素受容体（ＡｈＲ；Ａｒｙｌ  Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）のアゴニストを用いることができる。炭化水素受容体アゴニストとしては、多環芳香族炭化水素（Ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ  ａｒｏｍａｔｉｃ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ；ＰＡＨｓ）が挙げられる。ここで多環芳香族炭化水素には窒素置換多環芳香族炭化水素も含まれる。多環芳香族炭化水素（Ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ  ａｒｏｍａｔｉｃ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ；ＰＡＨｓ）としては、例えばアメリカ国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から入手可能な標準物質のうち、ＮＩＳＴ  ＳＲＭ（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌ）１９７５（Ｄｉｅｓｅｌ  Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｅｘｔｒａｃｔ）、ＮＩＳＴ  ＳＲＭ１６５０ｂ（Ｄｉｅｓｅｌ  Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｍａｔｔｅｒ）、ＮＩＳＴ  ＳＲＭ２９７５（Ｄｉｅｓｅｌ  Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｍａｔｔｅｒ）などが挙げられ、特にＮＩＳＴ  ＳＲＭ１９７５が好ましい。これらの標準物質の詳細についてはアメリカ国立標準技術研究所のウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｉｓｔ．ｇｏｖ／）より入手可能である。例えば、ＮＩＳＴ  ＳＲＭ１９７５は、ディーゼル排ガスの粒子状物質の混合物であり、多環芳香族炭化水素の混合物である。ここで、多環芳香族炭化水素には、フェナントレン、フルオランテン、ベンズ（ａ）アントラセン、クリセン、トリフェニレン、ベンゾ（ｂ）フルオランテン、ベンゾピレン、ニトロピレン、ニトロアントラセン、ニトロクリセンなどが挙げられる。
【００２０】
コントロールとは、通常の神経細胞を指し、汚染物質での刺激を受けていない神経細胞を指す。
【００２１】
神経細胞の作製方法の具体的手順としては、これに限定されるものではないが、汚染物質を表皮細胞に接触させることを有することが好ましい。通常皮膚の最外層は角層および表皮細胞であることから、汚染物質の接触方法としては、まず、表皮細胞と接触させるのが望ましい。
【００２２】
さらに、汚染物質を表皮細胞に接触させた後、神経細胞を接触させることが好ましく、培養された表皮細胞に汚染物質を添加した後、培養上清を神経細胞に添加することを有することがより好ましい。
【００２３】
表皮細胞の培養に用いる培地は、細胞に合わせて適宜選択すればよい。培地の種類は特に限定されないが、例えば、任意の細胞培養基本培地や分化培地、初代培養専用培地等を用いることができる。具体的には、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、α−ＭＥＭ、グラスゴーＭＥＭ（ＧＭＥＭ）、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ハムＦ−１２、ＭＣＤＢ培地、ウィリアムス培地Ｅ、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｔｈａｗ  ｍｅｄｉｕｍ、ＭＳＣ専用培地およびこれらの混合培地等が挙げられるが、これらには限定されず、細胞が増殖や分化に必要な成分が含まれる培地であれば利用可能である。さらに、血清、各種成長因子、分化誘導因子、抗生物質、ホルモン、アミノ酸、糖、塩類等を添加した培地を使用してもよい。培養温度も特に制限されないが、通常は２５〜４０℃程度で行う。
【００２４】
表皮細胞の培養時間は、特に制限されるものではないが、好ましくは４〜４８時間である。
【００２５】
細胞培養は、シングルもしくはマルチウェルプレートなどの培養用のプレート、シャーレ、ディッシュ、フラスコ、バッグ等の各種容器に細胞を撒くことができる。また、細胞培養容器は、大量培養装置や潅流培養装置などの培養装置における細胞培養容器の形態であってもよい。
【００２６】
また、汚染物質の添加量は特に限定されないが、１〜１０ｍｇ／ｍｌ培地であることが好ましく、２〜８ｍｇ／ｍｌ培地であることがより好ましい。汚染物質添加後の培養時間は、特に制限されるものではないが、細胞の増殖速度などを考慮して適宜決定することが可能である。ここで、培養の時間は、好ましくは４〜４８時間である。
【００２７】
表皮細胞は、単層培養に限定されず、培養再構成皮膚を用いてもよい。
【００２８】
表皮細胞としては、正常ヒト表皮細胞（ＮＨＥＫｓ；  Ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ）、ヒト表皮角化細胞株（ＨａＣａＴ）、三次元培養表皮モデル（ＲＨＥＥｓ；Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）等を使用することができる。表皮細胞としては、好ましくは正常ヒト表皮細胞（ＮＨＥＫｓ）である。市販品としては、クラボウ社製、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｐｒｏｍｏ  ｃｅｌｌ社製、Ｌｏｎｚａ社製、ＭａｔＴｅｋ社製、ＥＰＩＳＫＩＮ社製等から入手することができる。
【００２９】
汚染物質と表皮細胞とを接触した後に接触させる神経細胞（コントロールの神経細胞）としては、ラット副腎髄質褐色細胞腫に由来するＰＣ１２細胞、実際皮膚に存在する神経由来の細胞としてマウス神経芽細胞腫Ｎ１Ｅ−１１５細胞、ヒト脳由来神経細胞（ＨＮ神経細胞；Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｒｏｎｓ神経細胞）、またはヒトｉＰＳ由来神経細胞等が挙げられる。特に限定されるものではないが、細胞種および細胞供給の安定性といった観点からヒトｉＰＳ由来神経細胞を用いることが好ましい。神経細胞は、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社等から入手することができる。
【００３０】
本発明の他の態様は、上記作製方法により得られた神経細胞である。
【００３１】
従来、神経伸長に影響を及ぼす因子として汚染物質の存在は確認されていなかったが、本発明者らは、汚染物質が掻痒性皮膚疾患や敏感肌の原因となる神経細胞の神経伸長を引き起こすことを見出した。これにより、汚染物質によって伸長した神経細胞を用いて、汚染物質とともに有効成分を添加することで、汚染物質による皮膚への刺激および汚染物質による刺激に対する改善作用を有する有効成分の評価が可能となる。
【００３２】
このような評価は、神経突起伸長を抑制するための薬剤の開発や評価に用いることができる。さらに、このような評価は、掻痒性皮膚疾患を治療するための薬剤の開発や評価に用いることができる。
【００３３】
したがって、本発明の他の態様は、汚染物質による神経突起伸長を抑制する有効成分を評価する方法である。
【００３４】
具体的手順としては特に限定されるものではないが、汚染物質および有効成分を表皮細胞に接触させた後、神経細胞を接触させる方法；汚染物質を表皮細胞に接触させた後、有効成分を添加し、さらに神経細胞を接触させる方法；汚染物質を表皮細胞に接触させた後、神経細胞を接触させ、その後有効成分を添加する方法；などいずれの方法であってもよいが、汚染物質および有効成分を表皮細胞に接触させた後、神経細胞を接触させる方法であることが好ましい。表皮細胞から放出される因子による神経伸長の制御を評価する方が、直接的に汚染物質および有効成分を神経細胞へ添加するよりも現実的な条件であると言える。
【００３５】
この際の評価基準としては、例えば、汚染物質のみを添加した場合の神経突起の長さよりも、有効成分をさらに添加した場合の神経突起の長さが短くなっていれば、有効成分として有用であると判断できる。汚染物質のみを添加した場合の神経突起の長さに対して、有効成分をさらに添加した場合の神経突起の長さが好ましくは９５％以下、より好ましくは９０％以下であれば、有効成分として判断できる。
【００３６】
本発明の他の実施形態は、汚染物質に表皮細胞を接触させて得られる試料を準備し、試料と、汚染物質に接触させていないコントロールと、を比較した場合の変化を測定する、汚染物質による皮膚刺激のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価方法である。
【００３７】
汚染物質に表皮細胞を接触させる方法としては、培養された表皮細胞に汚染物質を添加することが好ましい。具体的方法は、上述したとおりである。
【００３８】
汚染物質に、表皮細胞および神経細胞を接触させる順序については特に限定されないが、汚染物質に表皮細胞を接触させた後、神経細胞を接触させることが好ましく、培養された表皮細胞に汚染物質を添加してさらに培養後、培養上清を神経細胞に添加することがより好ましい。
【００３９】
本形態において、汚染物質は、芳香族炭化水素受容体アゴニストであることが好ましい。芳香族炭化水素受容体アゴニストについては上述したとおりである。
【００４０】
コントロールと比較した場合の変化としては、神経細胞の神経伸長（長さ）変化であることが好ましい。神経細胞の長さの測定方法は、下記実施例に記載の方法で測定する。そして、大気汚染物質を接触させた場合にコントロールと比較して神経細胞が伸長した場合に、当該大気汚染物質は皮膚刺激性があると判断される。具体的には、大気汚染物質による神経伸長は、コントロールの神経の長さに対して、１０５％以上となることが好ましく、１１０％以上となることがより好ましい。
【００４１】
また、他の実施形態としては、コントロールと比較した場合の変化が、神経成長因子の分泌量の変化である。神経成長因子の分泌量は、下記実施例に記載の方法で測定する。そして、大気汚染物質を接触した場合にコントロールと比較して神経成長因子の分泌量が増加した場合に、当該大気汚染物質は皮膚刺激性があると判断される。具体的には、大気汚染物質による神経成長因子の分泌量は、コントロールの神経成長因子の分泌量に対して、１０５％以上となることが好ましく、１０８％以上となることがより好ましい。神経成長因子の分泌量は、例えば、培養された表皮細胞に汚染物質を添加してさらに培養後、培養上清中の神経成長因子の分泌量を測定すればよい。神経成長因子の分泌量は、免疫学的測定法（イムノアッセイ）により検出することができる。
【００４２】
さらに、他の実施形態としては、コントロールと比較した場合の変化が、セマフォリン３Ａの発現量の変化である。セマフォリン３Ａの発現量は、下記実施例に記載の方法で測定する。そして、大気汚染物質を接触した場合にコントロールと比較してセマフォリン３Ａの発現量が増加した場合に、当該大気汚染物質は皮膚刺激性があると判断される。具体的には、大気汚染物質によるセマフォリン３Ａの発現量は、コントロールのセマフォリン３Ａの発現量に対して、９５％以下となることが好ましく、９０％以下となることがより好ましい。
【００４３】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲がこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
汚染物質モデルとして、アメリカ国立標準技術研究所より購入したＮＩＳＴ  ＳＲＭ１９７５を、表皮細胞として、正常ヒト表皮細胞（ＮＨＥＫｓ）を用いた。
【００４５】
また、汚染物質による刺激の改善作用を有する有効成分としては、表皮細胞の分化を制御することで皮膚のバリア改善作用を有することが知られているリゾフォスファチジン酸（製品名：ＬＰＡ、日光ケミカルズ社製）を評価物質として評価を行った。
実施例１．汚染物質による、表皮細胞からの神経成長因子（ＮＧＦ）の分泌作用
１、実験方法
表皮細胞を２．０×１０４  ｃｅｌｌｓの播種密度で９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種した。培地として倉敷紡績株式会社製ＨｕＭｅｄｉａＫＧ２を用いた。２４時間培養後、汚染物質モデルＮＩＳＴ  ＳＲＭ１９７５（アメリカ国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ）、標準参照物質、Ｄｉｅｓｅｌ  Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｅｘｔｒａｃｔ）を表１の各濃度で添加し、２４時間培養を行った。その後、培養上清中のＮＧＦ分泌量をαＬＩＳＡ法（パーキンエルマー社製）にて測定した。ＮＩＳＴ  ＳＲＭ１９７５添加後の細胞は、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）にて洗浄後ＢＣＡ法でタンパク量を測定し、単位タンパク当たりのＮＧＦ分泌量として表した。なお、統計処理はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔ検定を用いて解析を行った。
※αＬＩＳＡ法：ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ；イライザ、エライザ法）試料溶液中に含まれる目的の抗原あるいは抗体を、特異抗体あるいは抗原で捕捉すると共に、酵素反応を利用して検出・定量する方法。
【００４６】
ＢＣＡ法：タンパク質の定量方法。アルカリ条件下でタンパク質によって２価の銅イオン（Ｃｕ２＋）が１価の銅イオン（Ｃｕ＋）に還元される原理と、１価の銅イオンが２分子のビシンコニン酸（ＢＣＡ；Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ）と配位結合して紫色に呈色する原理を組合せた方法。
２、結果
結果を表１に示した。表１中、Ｍｅａｎは平均値を、Ｓ．Ｄ．は標準偏差を、ｔ−ｔｅｓｔはｔ検定におけるコントロールに対する有意差を、それぞれ示す。
【００４７】
ＮＩＳＴ  ＳＲＭ１９７５未添加コントロールと比較して、ＮＩＳＴ  ＳＲＭ１９７５を添加した細胞では、添加濃度依存的にＮＧＦ分泌量の増加が認められた。
【００４８】
【表１】
2019208437.tif 000002
【００４９】
実施例２．汚染物質による、表皮細胞における神経伸長反発因子（Ｓｅｍａ３Ａ）の発現抑制作用
１、実験方法
表皮細胞を２．０×１０４  ｃｅｌｌｓの播種密度で９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種した。培地として倉敷紡績株式会社製ＨｕＭｅｄｉａＫＧ２を用いた。２４時間培養後、ＮＩＳＴ  ＳＲＭ１９７５を表２に記載の濃度で添加し、２４時間培養を行った。その後、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴ（登録商標） Ｋｉｔのプロトコルに準拠しｃＤＮＡを作成し、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙを用いて、当該キットのプロトコルに準拠し、Ｓｅｍａ３Ａの発現量をＲｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ法（アプライドバイオシステムズ社製）にて測定した。なお、プライマーとしては、Ａｓｓａｙ  ＩＤ：  Ｈｓ００１７３８１０を使用した。Ｓｅｍａ３Ａの発現量はＮＩＳＴ  ＳＲＭ１９７５未添加コントロールの発現量を１とした相対比で表した。なお、統計処理はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔ検定を用いて解析を行った。表１中、Ｍｅａｎは平均値を、Ｓ．Ｄ．は標準偏差を、ｔ−ｔｅｓｔはｔ検定におけるコントロールに対する有意差を、それぞれ示す。
※Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ法：定量ＰＣＲのひとつで、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を経時的に測定することで、増幅幅に基づいて鋳型となるＤＮＡの定量を行う方法。
２、結果
結果を表２に示した。ＮＩＳＴ  ＳＲＭ１９７５未添加コントロールと比較して、ＮＩＳＴ  ＳＲＭ１９７５を添加した細胞では、添加濃度依存的にＳｅｍａ３Ａ発現量の低下が認められた。
【００５０】
【表２】
2019208437.tif 000003
【００５１】
実施例３．汚染物質によるマウス神経芽細胞腫Ｎ１Ｅ−１１５細胞の神経伸長作用
１、実験方法
表皮細胞を２．０×１０４  ｃｅｌｌｓの播種密度で９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種した。培地として倉敷紡績株式会社製ＨｕＭｅｄｉａＫＧ２を用いた。その後、ＮＩＳＴ  ＳＲＭ１９７５を５ｍｇ／ｍｌ培地の濃度で添加し、２４時間培養を行った。培養後、ＰＢＳで細胞を洗浄してＳＲＭ１９７５を除去し、新鮮な倉敷紡績株式会社製ＨｕＭｅｄｉａＫＢ２培地を添加し、上記雰囲気下で２４時間培養した。ＮＩＳＴ  ＳＲＭ１９７５の刺激により表皮細胞から分泌された因子を含む培養上清を回収した。別途、９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）中、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製神経細胞（Ｎ１Ｅ−１１５）を０．５×１０４  ｃｅｌｌｓの播種密度で播種し、２４時間培養後、表皮細胞の培養上清を添加し、２４時間培養した。神経細胞（Ｎ１Ｅ−１１５）はブリリアントグリーンで染色し、位相差顕微鏡（倍率１００倍）で観察した。
２、結果
結果を図１に示した。ＮＩＳＴ  ＳＲＭ１９７５未添加の表皮細胞培養上清添加では、神経細胞（Ｎ１Ｅ−１１５）の神経伸長は認められなかった。一方、ＮＩＳＴ  ＳＲＭ１９７５を添加した表皮細胞の培養上清では神経細胞（Ｎ１Ｅ−１１５）の神経伸長が認められたことから、汚染物質の皮膚曝露による神経細胞の伸長が確認された。
実施例４．汚染物質によるヒトｉＰＳ由来神経細胞の神経伸長作用
１、実験方法
表皮細胞をＴ２５フラスコに１．５×１０６ｃｅｌｌｓの播種密度で播種した。培地として倉敷紡績株式会社製ＨｕＭｅｄｉａＫＧ２を用いた。２４時間培養後、上記培地で希釈したＮ１ＳＴ  ＳＲＭ１９７５を表３に示す最終濃度となるように添加し、２４時間培養を行った。培養後、ＰＢＳで細胞を洗浄してＳＲＭ１９７５を除去し、新鮮な倉敷紡績株式会社製ＨｕＭｅｄｉａＫＢ２培地を添加し、２４時間培養した。ＮＩＳＴ  ＳＲＭ１９７５の刺激により表皮細胞から分泌された因子を含む培養上清を回収した。
【００５２】
別途、９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにヒトｉＰＳ由来神経細胞（ｈｉＰＳ）を２．２×１０４ｃｅｌｌｓの播種密度で播種した。培地として表皮細胞の培養上清およびｈｉＰＳ分化培地の混合培地を用いた。２４時間培養後、表皮細胞の培養上清を添加し、上記雰囲気で４８時間培養した。神経細胞（ヒトｉＰＳ由来神経細胞）は細胞骨格を抗β−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体、細胞核をＨｏｅｃｈｓｔでそれぞれ染色し、蛍光顕微鏡（倍率１００倍）で観察した（図２）。視野中に観察される神経細胞の突起の長さを測定し、平均値を算出した。表３中、神経細胞の突起の長さを、未添加コントロールの神経細胞の長さの平均値を１００％とした相対値で表した。
２、結果
結果を表３および図２に示した。ＮＩＳＴ  ＳＲＭ１９７５未添加の表皮細胞培養上清添加では、神経細胞（ヒトｉＰＳ細胞）の神経伸長は認められなかった。一方、ＮＩＳＴ  ＳＲＭ１９７５を添加した表皮細胞の培養上清では神経細胞（ヒトｉＰＳ細胞）の神経伸長が認められたことから、汚染物質の皮膚曝露による神経細胞の伸長が確認された。なお、５０ｎｇ／ｍＬのＮＧＦを培養上清の代わりに神経細胞に添加した例（表３における比較対象）の結果も併せて記載する。
【００５３】
【表３】
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【００５４】
実施例５．汚染物質によるヒトｉＰＳ細胞の神経伸長作用に対する、ＬＰＡの抑制作用
１、実験方法
表皮細胞をＴ２５フラスコに１．５×１０６ｃｅｌｌｓの播種密度で播種した。培地として倉敷紡績株式会社製ＨｕＭｅｄｉａＫＧ２を用いた。２４時間培養後、ＮＩＳＴ  ＳＲＭ１９７５および日光ケミカルズ株式会社製「ＬＰＡ」（ＬＰＡ含量２５質量％）を添加し、２４時間培養を行った。培養後、ＰＢＳで汚染物質を洗浄後、新鮮な倉敷紡績株式会社製ＨｕＭｅｄｉａＫＢ２培地を添加し、２４時間培養した。ＮＩＳＴ  ＳＲＭ１９７５の刺激により表皮細胞から分泌された因子を含む培養上清を回収した。
【００５５】
別途、９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに、ヒトｉＰＳ由来神経細胞（ｈｉＰＳ）を２．２×１０４  ｃｅｌｌｓの播種密度で播種した。培地として表皮細胞の培養上清およびｈｉＰＳ分化培地の混合培地を用いた。２４時間培養後、表皮細胞の培養上清を添加し、上記雰囲気下で４８時間培養した。神経細胞（ヒトｉＰＳ細胞）は細胞骨格を抗β−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体、細胞核をＨｏｅｃｈｓｔでそれぞれ染色し、蛍光顕微鏡（倍率１００倍）で観察した（図３）。視野中に観察される神経細胞の突起の長さを測定し、平均値を算出した。表４中、神経細胞の突起の長さを、未添加コントロールの神経細胞の長さの平均値を１００％とした相対値で表した（Ｍｅａｎ（１））。また、ＳＲＭ１９７５および１０μｇ／ｍＬ  ＬＰＡ添加については、ＳＲＭ１９７５添加後の神経細胞の長さの平均値を１００％とした相対値でも表した（Ｍｅａｎ（２））。
２、結果
ＳＲＭ１９７５およびＬＰＡを添加して培養した表皮細胞の培養上清を用いた場合には、神経細胞の突起の長さがコントロールと同等レベルであった。すなわち、本願の評価計を用いて、大気汚染物質により神経伸長が誘導される条件において神経伸長抑制作用を有する有効成分の評価を行うことができる。
【００５６】
【表４】
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【００５７】
以上のことから、本発明によれば、汚染物質で刺激を受けた伸長した神経細胞の作製方法が提供される。また、汚染物質による刺激に対する有効成分のスクリーニングを行うことで、効果的に鎮痒作用あるいは敏感肌を抑える有効成分を開発することが可能となることから、これらを有効成分とした化粧品あるいは医薬品を提供することが可能になる。さらに、本発明の評価法を用いることで、汚染物質による神経伸長を指標として、汚染物質による皮膚への刺激を評価することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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