(57)【要約】      （修正有）【課題】本発明は、フラビウイルスを中和する抗体およびその使用方法を提供する。【解決手段】これらの抗体は、ウエストナイルウイルスEタンパク質を認識しかつデングウイルスを含むフラビウイルス科のメンバーと交差反応する、mAb11から誘導されている。本発明の抗体は、Fcγ受容体に結合しない改変Fc領域を有することにより、ウイルス感染の抗体依存性増強を防止する。本発明の抗体は、フラビウイルス感染およびその症状を処置するために使用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
a.アミノ酸配列
2019054796.tif 000031
をそれぞれ含む3つのCDRを持つ、重鎖と、
b.アミノ酸配列
2019054796.tif 000032
をそれぞれ含む3つのCDRを持つ、軽鎖と、
c. Fcγ受容体に結合しないように改変されたFc領域と
を含み、かつフラビウイルスに結合する、単離されたヒト化モノクローナル抗体。
【請求項２】
SEQ ID NO: 1を有するVHアミノ酸配列と、SEQ ID NO: 3を有するVLアミノ酸配列と、Fcγ受容体に結合しないように改変されたFc領域とを含み、かつフラビウイルスに結合する、単離されたヒト化モノクローナル抗体。
【請求項３】
SEQ ID NO: 2を有するVHヌクレオチド配列と、SEQ ID NO: 4を有するVLヌクレオチド配列と、Fcγ受容体に結合しないように改変されたFc領域とを含み、かつフラビウイルスに結合する、単離されたヒト化モノクローナル抗体。
【請求項４】
フラビウイルス感染の抗体依存性増強に寄与しない、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項５】
フラビウイルスを中和する、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項６】
Fc領域がアミノ酸位置234および235に変異を含有する、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項７】
変異がL234AおよびL235Aである、請求項6記載の抗体。
【請求項８】
Fc領域がSEQ ID NO: 7またはSEQ ID NO: 13のアミノ酸配列を含む、請求項6記載の抗体。
【請求項９】
改変されたFc領域が新生児型Fc受容体に結合する、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１０】
フラビウイルスが、ウエストナイルウイルス、デングウイルス（血清型1〜4）、セントルイス脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、およびマレー渓谷脳炎ウイルスである、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１１】
植物において産生される、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１２】
治療用作用物質に連結されている、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１３】
前記治療用作用物質が、毒素、放射性標識、siRNA、小分子、またはサイトカインである、請求項12記載の抗体。
【請求項１４】
前記サイトカインがTGF-βである、請求項13記載の抗体。
【請求項１５】
前記請求項のいずれか一項記載の抗体を産生する、細胞。
【請求項１６】
対象に請求項1〜14のいずれか一項記載の抗体を投与する工程を含む、フラビウイルス感染の抗体依存性増強を防止する方法。
【請求項１７】
前記抗体がフラビウイルスによる初回感染後に投与される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
請求項1〜13のいずれか一項記載の抗体とワクチンとを対象に投与する工程を含む、ワクチン効率を増加させる方法。
【請求項１９】
前記抗体と前記ワクチンが逐次的にまたは同時に投与される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記ワクチンがウイルスワクチンである、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
フラビウイルス感染の症状を処置または軽減する方法であって、その必要がある対象に請求項1〜14のいずれか一項記載の抗体を含む組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項２２】
フラビウイルス感染の1つまたは複数の症状の発症を遅延させる方法であって、その必要がある対象に請求項1〜14のいずれか一項記載の抗体を含む組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項２３】
抗ウイルス剤を投与する工程をさらに含む、請求項21または22記載の方法。
【請求項２４】
抗ウイルス剤が、抗体、治療用作用物質に連結された抗体、または小分子である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体と抗ウイルス剤が逐次的にまたは同時に投与される、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
前記1つまたは複数の症状が、体重減少、麻痺、発熱、頭痛、悪心、嘔吐、発疹、および身体痛を含む、請求項21〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
前記フラビウイルスが、ウエストナイルウイルス、デングウイルス（血清型1〜4）、セントルイス脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、またはマレー渓谷脳炎ウイルスである、請求項1〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
SEQ ID NO: 2、4および8の核酸配列を含む、核酸配列。
【請求項２９】
SEQ ID NO: 1、3および7または13を含むポリペプチドをコードする、核酸配列。
【請求項３０】
SEQ ID NO: 1、3および7または13を含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項３１】
請求項28および29記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項３２】
請求項31記載のベクターを含む、細胞。
【請求項３３】
植物細胞である、請求項15または32記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は2013年3月15日に出願された米国特許出願第61/792,336号の恩典および同出願への優先権を主張し、同出願の内容は参照により本明細書にその全文が組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して、フラビウイルス中和抗体ならびにその使用方法に関する。
【０００３】
政府の利益
本発明は、米国国立衛生研究所によって交付されたAI0703431の下、政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ウエストナイルウイルスやデングウイルスなどのフラビウイルスは地球規模の健康に著しい脅威を与える。ウエストナイルウイルスは複数の種に致命的な髄膜炎または脳炎をもたらしうる熱病の原因になる。鳥と蚊はどちらもウエストナイルウイルスを運ぶことができ、そのことが世界的に驚くべきペースでのこのウイルスの伝播を可能にしてきた。同様に、デングウイルスの4つの血清型も蚊咬傷を介した伝染が可能であり、毎年、500,000例の入院と20,000例の死亡とを含む何千万例というデング熱のヒト症例の原因になり、マラリアに匹敵する経済的負担を伴う。
【０００５】
フラビウイルス感染を防止し処置するためにワクチンと抗体治療が現在開発されている。しかし、フラビウイルスに対するワクチン接種戦略は他のウイルスほど簡単ではないかもしれないことを示す証拠が、デングウイルス感染から得られている。あるデングウイルス血清型による初回感染は相同な血清型に対する防御免疫を誘導する。しかし、異なる血清型による感染に対する交差防御は起こらない。むしろ既存の免疫は、感染の抗体依存性増強（ADE）による感染と疾病のリスクの増加に関連する。ADEでは、先行フラビウイルス感染によって生じた抗体または母親から子どもに受動移入された抗体が、感染率と病原性が増加する原因になる。したがって、フラビウイルスに対する抗体に基づく治療またはワクチンという従来の方法は、フラビウイルス感染および疾病の発生を指数関数的に増加させうる。
【０００６】
したがって、感染の抗体依存性増強のリスクを増加させずにフラビウイルス感染とそれに関係する疾患および障害を防止するための治療および方法が、差し迫って必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、フラビウイルスに結合してフラビウイルスを中和しかつフラビウイルス感染の抗体依存性増強に寄与しないモノクローナル抗体の発見に基づいている。本モノクローナル抗体は完全ヒト抗体である。本抗体はウエストナイルウイルスエンベロープタンパク質E（WNE）を認識し、フラビウイルス科の他のメンバーとの幅広い交差反応性を有する。重要なことに、本抗体は、Fcγ受容体への結合を防止する変異をFc領域に含有する。本抗体を本明細書ではhuFV抗体という。
【０００８】
本発明は、CDR1がアミノ酸配列
2019054796.tif 000002
を、CDR2がアミノ酸配列
2019054796.tif 000003
を、かつCDR3がアミノ酸配列
2019054796.tif 000004
をそれぞれ含む、3つのCDRを持つ重鎖と、CDR1がアミノ酸配列
2019054796.tif 000005
を、CDR2がアミノ酸配列
2019054796.tif 000006
を、かつCDR3がアミノ酸配列
2019054796.tif 000007
をそれぞれ含む、3つのCDRを持つ軽鎖とを有する、単離されたヒト化モノクローナル抗体を提供する。本抗体は、Fcγ受容体に結合しないように改変されたFc領域を有し、フラビウイルスに結合する。例示的なFc領域を本明細書において開示する。
【０００９】
一局面において、本発明は、SEQ ID NO: 1を有するVHアミノ酸配列と、SEQ ID NO: 3を有するVLアミノ酸配列とを有する、単離されたヒト化モノクローナル抗体を提供する。もう一つの局面において、本発明は、SEQ ID NO: 2を有するVHヌクレオチド配列と、SEQ ID NO: 4を有するVLヌクレオチド配列とを含む、単離されたヒト化モノクローナル抗体を提供する。本抗体はさらに、Fcγ受容体に結合しないように改変されたFc領域を含み、フラビウイルスに結合する。
【００１０】
本発明は、フラビウイルスを中和する単離されたヒト化モノクローナル抗体を提供する。
【００１１】
本発明は、Fcγ受容体に結合しないように改変されたFc領域を持つ抗体を提供する。本改変Fc領域はアミノ酸位置234および235に変異を含有する。一局面では、変異がL234AおよびL235Aである。一態様において、改変Fc領域は、CH2領域の4位および5位のアミノ酸が変異しているCH2領域を含む。例えば4位および5位のロイシンアミノ酸が異なるアミノ酸、好ましくはアラニンに変異している。別の態様において、改変Fc領域は、108位および109位のアミノ酸が変異しているFc領域を含む。例えば、Fc領域の108位および109位のロイシンが異なるアミノ酸、好ましくはアラニンに変異している。もう一つの態様では、改変Fc領域が、SEQ ID NO: 7のアミノ酸配列を含む。本改変Fc領域は新生児型Fc受容体（FcRn）に結合する。
【００１２】
一局面において、本抗体はフラビウイルス感染の抗体依存性増強に寄与しない。
【００１３】
一局面において、本抗体は治療用作用物質に連結される。治療用作用物質は、毒素、放射性標識、siRNA、小分子、またはサイトカインである。例えばサイトカインはTGF-βである。
【００１４】
本発明はさらに、huFV抗体を産生する細胞を提供する。細胞は哺乳動物細胞（すなわちマウス、ウサギ、ヤギ、またはヒツジ）または植物細胞（すなわちタバコ植物）であることができる。 
【００１５】
本発明は、対象にhuFV抗体を投与することによってフラビウイルス感染の抗体依存性増強を防止するための方法を提供する。一局面では、抗体が、フラビウイルスによる初回感染後に投与される。
【００１６】
加えて、本発明は、huFV抗体とワクチンとを対象に投与することによってワクチン効率を増加させる方法を提供する。一局面では、huFV抗体とワクチンとが逐次的にまたは同時に投与される。一局面では、ワクチンがウイルスワクチンである。
【００１７】
本発明はさらに、フラビウイルス感染の症状を処置または軽減するための方法であって、その必要がある対象に、huFV抗体を含有する組成物を投与することによる方法を提供する。もう一つの局面において、本発明は、フラビウイルス感染の1つまたは複数の症状の発症または進行を遅延させるための方法を特徴とする。フラビウイルス感染の症状としては、体重減少、麻痺、発熱、頭痛、悪心、嘔吐、発疹、および身体痛が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。一局面では、抗ウイルス剤が対象に投与される。一局面では、huFV抗体と抗ウイルス剤とが逐次的にまたは同時に投与される。抗ウイルス剤は、抗体、治療用作用物質に連結された抗体、または小分子である。
【００１８】
フラビウイルスは、ウエストナイルウイルス、デングウイルス（血清型1〜4）、セントルイス脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、マレー渓谷脳炎ウイルスである。
【００１９】
本発明はさらに、SEQ ID NO: 2、4および8の核酸配列を含有する核酸配列を提供する。
【００２０】
本発明はさらに、SEQ ID NO: 1および3のポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。本発明はさらに、SEQ ID NO: 1、3および7のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを提供する。
【００２１】
本発明はさらに、SEQ ID NO: 2、4および8を含有する核酸配列またはSEQ ID NO: 1、3および7のポリペプチドをコードする核酸配列を含有するベクターを提供する。
【００２２】
加えて、本発明は、SEQ ID NO: 2、4および8を含有する核酸配列またはSEQ ID NO: 1、3および7のポリペプチドをコードする核酸配列を含有するベクターを含有する細胞を提供する。
【００２３】
[本発明1001]
a.アミノ酸配列
2019054796.tif 000008
をそれぞれ含む3つのCDRを持つ、重鎖と、
b.アミノ酸配列
2019054796.tif 000009
をそれぞれ含む3つのCDRを持つ、軽鎖と、
c. Fcγ受容体に結合しないように改変されたFc領域と
を含み、かつフラビウイルスに結合する、単離されたヒト化モノクローナル抗体。
[本発明1002]
SEQ ID NO: 1を有するVHアミノ酸配列と、SEQ ID NO: 3を有するVLアミノ酸配列と、Fcγ受容体に結合しないように改変されたFc領域とを含み、かつフラビウイルスに結合する、単離されたヒト化モノクローナル抗体。
[本発明1003]
SEQ ID NO: 2を有するVHヌクレオチド配列と、SEQ ID NO: 4を有するVLヌクレオチド配列と、Fcγ受容体に結合しないように改変されたFc領域とを含み、かつフラビウイルスに結合する、単離されたヒト化モノクローナル抗体。
[本発明1004]
フラビウイルス感染の抗体依存性増強に寄与しない、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1005]
フラビウイルスを中和する、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1006]
Fc領域がアミノ酸位置234および235に変異を含有する、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1007]
変異がL234AおよびL235Aである、本発明1006の抗体。
[本発明1008]
Fc領域がSEQ ID NO: 7またはSEQ ID NO: 13のアミノ酸配列を含む、本発明1006の抗体。
[本発明1009]
改変されたFc領域が新生児型Fc受容体に結合する、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1010]
フラビウイルスが、ウエストナイルウイルス、デングウイルス（血清型1〜4）、セントルイス脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、およびマレー渓谷脳炎ウイルスである、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1011]
植物において産生される、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1012]
治療用作用物質に連結されている、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1013]
前記治療用作用物質が、毒素、放射性標識、siRNA、小分子、またはサイトカインである、本発明1012の抗体。
[本発明1014]
前記サイトカインがTGF-βである、本発明1013の抗体。
[本発明1015]
前記本発明のいずれかの抗体を産生する、細胞。
[本発明1016]
対象に本発明1001〜1014のいずれかの抗体を投与する工程を含む、フラビウイルス感染の抗体依存性増強を防止する方法。
[本発明1017]
前記抗体がフラビウイルスによる初回感染後に投与される、本発明1016の方法。
[本発明1018]
本発明1001〜1013のいずれかの抗体とワクチンとを対象に投与する工程を含む、ワクチン効率を増加させる方法。
[本発明1019]
前記抗体と前記ワクチンが逐次的にまたは同時に投与される、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記ワクチンがウイルスワクチンである、本発明1018の方法。
[本発明1021]
フラビウイルス感染の症状を処置または軽減する方法であって、その必要がある対象に本発明1001〜1014のいずれかの抗体を含む組成物を投与する工程を含む、方法。
[本発明1022]
フラビウイルス感染の1つまたは複数の症状の発症を遅延させる方法であって、その必要がある対象に本発明1001〜1014のいずれかの抗体を含む組成物を投与する工程を含む、方法。
[本発明1023]
抗ウイルス剤を投与する工程をさらに含む、本発明1021または1022の方法。
[本発明1024]
抗ウイルス剤が、抗体、治療用作用物質に連結された抗体、または小分子である、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記抗体と抗ウイルス剤が逐次的にまたは同時に投与される、本発明1023の方法。
[本発明1026]
前記1つまたは複数の症状が、体重減少、麻痺、発熱、頭痛、悪心、嘔吐、発疹、および身体痛を含む、本発明1021〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
前記フラビウイルスが、ウエストナイルウイルス、デングウイルス（血清型1〜4）、セントルイス脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、またはマレー渓谷脳炎ウイルスである、本発明1001〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
SEQ ID NO: 2、4および8の核酸配列を含む、核酸配列。
[本発明1029]
SEQ ID NO: 1、3および7または13を含むポリペプチドをコードする、核酸配列。
[本発明1030]
SEQ ID NO: 1、3および7または13を含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
[本発明1031]
本発明1028および1029の核酸を含む、ベクター。
[本発明1032]
本発明1031のベクターを含む、細胞。
[本発明1033]
植物細胞である、本発明1015または1032の細胞。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明らかになり、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲に包含される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】野生型mAb-11を含有する発現ベクターの略図である。
【図２】遺伝子操作されたmAb-11-LALAを含有する発現ベクターの略図である。
【図３】致死性デング2型ウイルス感染に対するmAb11（LALA）防御を示す、一連の3つのグラフである。（A）カプラン-マイヤー生存曲線により、野生型（wt）Fc領域または変異型（mut）Fc領域を持つmAb11が投与されたマウスの生存を比較している。（B）野生型（wt）Fc領域または変異型（mut）Fc領域を持つmAb11が投与されたマウスにおいて、元の体重に対するパーセントをモニタリングした。（C）野生型（wt）Fc領域または変異型（mut）Fc領域を持つmAb11が投与されたマウスの外観、運動性および全般的態度に基づいて、臨床スコアを決定した。
【図４】哺乳動物細胞または植物細胞に由来するLALA変異を持つ哺乳類mAb11（mutAb）を投与し、次に致死性デング2型ウイルス感染でチャレンジしたマウスの生存率を比較する、一連の3つのグラフである。（A）植物由来の変異型mAb11抗体と比較した哺乳動物由来の変異型mAb11抗体。（B）対照抗体と比較した哺乳動物由来の変異型mAb11抗体。（C）対照抗体と比較した植物由来の変異型mAb11抗体。
【図５】哺乳動物細胞または植物細胞に由来するLALA変異を持つ哺乳類mAb11（mutAb）を投与し、次に致死性デング2型ウイルス感染でチャレンジしたマウスの体重パーセントを比較する、一連の3つのグラフである。（A）植物由来の変異型mAb11抗体と比較した哺乳動物由来の変異型mAb11抗体。（B）対照抗体と比較した哺乳動物由来の変異型mAb11抗体。（C）対照抗体と比較した植物由来の変異型mAb11抗体。
【図６】哺乳動物細胞または植物細胞に由来するLALA変異を持つ哺乳類mAb11（mutAb）を投与し、次に致死性デング2型ウイルス感染でチャレンジしたマウスの臨床スコアを比較する、一連の3つのグラフである。（A）植物由来の変異型mAb11抗体と比較した哺乳動物由来の変異型mAb11抗体。（B）対照抗体と比較した哺乳動物由来の変異型mAb11抗体。（C）対照抗体と比較した植物由来の変異型mAb11抗体。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
詳細な説明
本発明は、ウイルス感染の抗体依存性増強に寄与することなく、フラビウイルス科のメンバーによる感染を中和する抗体を提供する。ウエストナイルウイルスに結合してウエストナイルウイルスを中和する抗体は国際公開WO2005/123774に記載されており、その内容は参照により本明細書にその全文が組み入れられる。本発明の抗体は、抗体のFc領域がFc-ガンマ受容体に結合しないように、ウエストナイルウイルスに対する抗体mAb11を改変することによって作製された。したがって本改変抗体は、感染の抗体依存性増強に寄与しない。本明細書において開示する抗体および方法は、この抗体と、フラビウイルスによる感染ならびに関連する疾患および障害を処置または防止するための方法とに関係する。本発明の抗体mAB11-LALAは、本明細書において説明し、実施例において実証するとおり、フラビウイルス感染を防止し処置する能力が、野生型mAb11と比較して増加していた。
【００２６】
mAb11はファージディスプレイスクリーニングを使って同定されたものであり、ウエストナイルウイルスエンベロープタンパク質Eには、DIおよびDIIドメイン内で、具体的には融合ループペプチドに結合する（Gould et al., Journal of Virology, 2005, 79(23):14606-14613;Sultana et al., Journal of Immunology, 2009, 183:650-660（これらの内容は参照により本明細書にその全文が組み入れられる））。Fc領域中のアミノ酸位置234および235に変異を持つ遺伝子操作されたmAb11抗体を、本明細書では「mAb11-LALA」という。
【００２７】
本発明の抗体はフラビウイルス科のメンバーに対して幅広い交差反応性を有する。例えば本抗体は、数種類の異なるフラビウイルス、例えば限定するわけではないがウエストナイルウイルス、デングウイルス（血清型1、2、3および4）、セントルイス脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、およびマレー渓谷脳炎ウイルスなどの交差反応性および中和を示す。
【００２８】
ウイルス感染、具体的にはフラビウイルス属のメンバーによる感染を処置および防止するために、中和抗体が既に開発され、現在も開発されている。初期の研究では、そのような抗体はフラビウイルス科メンバー（すなわちウエストナイルウイルスまたは4つのデングウイルス血清型のうちの1つ）による感染に対して中和および防御の増加を示すことが実証された。しかし、実験対象を中和抗体で処置してからフラビウイルス（すなわちデングウイルス）の投与によってチャレンジする後続のウイルスチャレンジ研究では、ウイルス血症の減少は見られなかった。いくつかの例では、上述の抗体による処置が、対照と比較して感染の増強をもたらした。これは、抗体依存性増強（ADE）と呼ばれる機序によって媒介されると考えられる。これらの結果は、フラビウイルス感染の抗体依存性増強を防止する治療薬および方法を開発することの重要性を示している。
【００２９】
感染の抗体依存性増強は、宿主細胞上のFcγ受容体（FcγR）に抗体のFc領域が結合することによって達成されうる。それゆえに、これらの抗体に結合した感染性ウイルス粒子は、Fc領域-Fc受容体結合によって、より効率よく宿主細胞に導かれる。これは、ウイルスの感染率および複製率を増加させ、それによってウイルスの感染性および病原性を増強する。
【００３０】
標準的な抗ウイルス抗体とは対照的に、本発明の抗体は、Fcγ受容体（FcγR）への結合が低減しているか、またはFcγRに結合しない。Fcγ受容体には、例えばFcγRI、FcγRIIIa、FcγRIIIb、およびFcγRIIIcなどがある。一態様では、本発明の抗体がFc領域中に1つまたは複数の変異を含有する。変異は、FcγRへの抗体の結合を低減または抑止する変異であればなんでもよい。変異は、Fc領域におけるアミノ酸の置換、付加、または欠失であることができる。本発明の抗体は変異したFc領域を有するが、それでも本抗体は強力なフラビウイルス中和を与える。
【００３１】
抗体のFc領域は2つのドメインCH2とCH3を含んでいる。これらのドメインが、または当技術分野において公知のこれらドメイン内の特別なアミノ酸が、FcγRとの相互作用を媒介する。本発明の抗体は、CH2ドメインもしくはCH3ドメインまたはその両方に、FcγRへの抗体の結合を低減または抑止する任意の変異（すなわち、1つまたは2つ以上のアミノ酸の置換、付加、または欠失）を含有する。例えば本発明の抗体は、野生型Fc領域の位置233、234、235、236、237、250、314、または428における少なくとも1つのアミノ酸の変異または置換を含有する。アミノ酸置換は、好ましくは、アラニンへの置換である。
【００３２】
一態様では、本発明の抗体のFc領域が、抗体の重鎖の位置234もしくは235またはその両方における置換を含む。一般に、野生型Fc領域の位置234および235のアミノ酸はロイシン（「L」）である。一態様では、本発明の抗体が、位置234、235、またはその両方に、ロイシンではないアミノ酸を含む。もう一つの態様では、本発明の抗体が、位置234、235、またはその両方にアラニン（「A」）を含む。Fc領域の位置234および235に変異を含み、その位置でロイシンがアラニンに変異している抗体を、本明細書では「LALA」変種という。
【００３３】
好ましい一態様では、本発明の抗体が完全長抗体、すなわちインタクトな抗体であり、この場合、抗体は抗原結合領域（すなわちFab領域またはFabフラグメント）と（本明細書に記載するような、改変型または変異型）Fc領域とを含有する。ADEを回避するために設計された当技術分野において以前に開発された抗体は、FcγRへの結合を防止するためにFc領域を欠くものが多い。本発明の抗体は、Fc領域を保持していることにより、優れた性質が得られる。そのような性質の一つは、循環IgGレベルのホメオスタシスに決定的な役割を果たす内皮細胞上に発現する新生児型受容体（FcRn）に結合する能力である。FcRnへの循環抗体の結合は飲作用によるインターナリゼーションを誘発し、その場合、抗体は細胞表面にリサイクルされて、血液の塩基性pHで放出される。この機序により、本発明の抗体は分解から保護され、他の非改変抗体またはFc領域を欠く抗体フラグメントと比較して、半減期が増加する。血清における本発明の抗体の持続性の増加は、循環レベルの向上、投与頻度の低下、および用量の低減を可能にすることにより、効力を増加させる。本発明の抗体のもう一つの性質として、補体因子に結合する能力を挙げることができる。抗体のFc領域へのC1qなどの補体因子の結合は、補体依存性細胞傷害（CDC）を活性化するためのシグナリングカスケードの引き金を引く。
【００３４】
Fc領域上のFcγ受容体の結合部位が新生児型Fc受容体（FcRn）の結合部位とは異なることは、当技術分野では公知である。それゆえに、本発明の抗体は、Fcγ受容体への結合は低減しているか、またはFcγ受容体には結合することができないが、FcRn受容体への結合については依然として適格であるように改変されたFc領域を有する。本発明の抗体は、非改変抗体と比較してFcγRおよび/もしくはFcRnに対するその結合アフィニティーならびに/またはその血清中半減期を変化させるために、重鎖のCH2ドメインまたはCH3ドメインの特定領域にランダムアミノ酸変異を導入することによって、改変することができる。そのような改変の例として、アミノ酸残基234、235、236、237、250、314、および428からなる群より選択される重鎖領域からの少なくとも1つのアミノ酸の置換が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。したがって本発明の抗体は、非改変抗体より長い半減期を有し、そのことが、フラビウイルス感染および続発疾患の防止および処置において増加した効力を付与する。
【００３５】
一局面において、本発明の抗体は、Fcγ受容体への結合は低減しているか、またはFcγ受容体には結合することができないが、C1qなどの補体因子への結合については依然として適格であるように改変されたFc領域を有する。
【００３６】
当業者は、本発明の改変抗体を容易に調製することができるであろう。抗体のFc領域に変異または置換を導入するための組換えDNA技法は、当技術分野において公知である。Fc受容体（FcγrまたはFcRn）に結合する能力または結合しない能力に関するFc領域の特徴付けは、当業者であれば、例えば免疫沈降、イムノアッセイ、アフィニティークロマトグラフィー、またはアレイ技法などによって、容易に行うことができる。
【００３７】
本明細書に記載するヒト化抗体は、ハイブリドーマなどの哺乳類発現系において産生することができる。本明細書に記載するヒト化抗体は、非哺乳類発現系によって、例えばトランスジェニック植物などによって、産生することもできる。例えば本明細書に記載する抗体は、形質転換タバコ植物（ベンサミアナタバコ（N. benthamiana）およびタバコ（N. tabaccum））において産生される。
【００３８】
本発明のmAb11のさまざまな核酸配列およびアミノ酸配列を以下に掲載する。
【００３９】
重鎖可変（VH）アミノ酸配列:
2019054796.tif 000010
【００４０】
重鎖可変（VH）核酸配列:
2019054796.tif 000011
【００４１】
軽鎖可変（VH）アミノ酸配列:
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【００４２】
軽鎖可変（VH）核酸配列:
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【００４３】
Fc領域は3つの重鎖定常ドメインCH1、CH2またはCH3ドメインを含んでいる。ヒンジ領域はCH1領域とCH2領域を接合している。野生型Fc領域と、本発明に関する改変Fc領域について、例示的なFc領域配列を以下に掲載する。
【００４４】
野生型mAb-11のFc領域のアミノ酸配列を以下のとおり掲載する。
2019054796.tif 000014
【００４５】
野生型mAb-11のFc領域の核酸配列を以下のとおり掲載する。
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【００４６】
mAb-11-LALAの改変Fc領域のアミノ酸配列を以下に掲載する。例えば位置108および109のアミノ酸が変異している。以下の掲載する配列では、位置108および109のロイシンアミノ酸がアラニンに変異している（下線部）。
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【００４７】
mAb-11-LALAの改変Fc領域の核酸配列を以下に掲載する。例えば、掲載した核酸配列がコードする位置108および109のアミノ酸は、ロイシンからアラニンに変異している（下線部）。
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【００４８】
CH1領域のアミノ酸配列を以下に掲載する。
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【００４９】
CH1領域の核酸配列を以下に掲載する。
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【００５０】
本明細書に記載するmAb11抗体は、Fcγ受容体への結合を低減または阻害する変異を、特にCH2領域に含みうる。この変異は、好ましくは、FcRn受容体への結合に影響を及ぼさない。mAb11抗体は、好ましくは、2つの隣接するリジンが後述のアラニンに変異するように、CH2領域に2つの変異を含有する。例えばこれらの変異はCH2領域のアミノ酸位置4および5に位置する。変異は、好ましくは、アラニンへの変異である。
【００５１】
野生型mAb11抗体のCH2領域のアミノ酸配列を以下に掲載する。
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【００５２】
野生型mAb11抗体のCH2領域の核酸配列を以下に掲載する。
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【００５３】
変異型mAb11抗体のCH2領域のアミノ酸配列を以下に掲載する（LALA変異に下線を付す）。
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【００５４】
変異型mAb11抗体のCH2領域の核酸配列を以下に掲載する（LALA変異に下線を付す）。
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【００５５】
mAb11抗体のCH3領域のアミノ酸配列を以下に掲載する。
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【００５６】
mAb11抗体のCH3領域の核酸配列を以下に掲載する。
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【００５７】
ヒンジ領域のアミノ酸配列を以下に掲載する。
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【００５８】
ヒンジ領域の核酸配列を以下に掲載する。
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【００５９】
野生型mAb-11の重鎖（可変領域と定常領域の両方を含む）のアミノ酸配列を以下に掲載する。
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【００６０】
変異型mAb-11の重鎖（可変領域と定常領域の両方を含む）のアミノ酸配列を以下に掲載する（LALA変異に下線を付す）。
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【００６１】
抗体
本明細書において使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ig）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に特異的に結合する（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を指す。「に特異的に結合する」または「と免疫反応する」とは、抗体が、所望の抗原の1つまたは複数の抗原決定基と反応し、他のポリペプチドとは反応しないことを意味する。抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびキメラ抗体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００６２】
一般に、ヒトから得られる抗体分子はIgG、IgM、IgA、IgEおよびIgDクラスのいずれかに関係し、これらのクラスは分子中に存在する重鎖の性質によって互いに相違する。一定のクラスには、IgG1、IgG2などといったサブクラスもある。さらにまた、ヒトでは、軽鎖がκ鎖またはλ鎖でありうる。「抗原結合部位」または「結合部分」という用語は、免疫グロブリン分子のうち、抗原結合に参加する部分を指す。抗原結合部位は、重（「H」）鎖および軽（「L」）鎖のN末端可変（「V」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のV領域内の3つの高度に多様なストレッチ（「超可変領域」と呼ばれる）が、より保存された隣接ストレッチ（「フレームワーク領域」または「FR」として知られている）の間に挿入されている。したがって「FR」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域間に、超可変領域に隣接して、天然に見いだされるアミノ酸配列を指す。抗体分子では、軽鎖の3つの超可変領域と重鎖の3つの超可変領域とが、三次元空間において互いに相対して配置されることで、抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合される抗原の三次元表面に対して相補的であり、重鎖と軽鎖のそれぞれの3つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」と呼ばれる。
【００６３】
本明細書において使用する用語「エピトープ」は、免疫グロブリン、scFv、またはT細胞受容体に特異的に結合する能力を有する任意のタンパク質決定基を包含する。エピトープ決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖などといった分子の化学的に活性な表面基群からなり、通常は特異的な三次元構造特徴と特異的な電荷特徴とを有している。例えば抗体は、ポリペプチドのN末端ペプチドまたはC末端ペプチドに対して生じさせることができる。
【００６４】
本明細書において使用する用語「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」は、免疫グロブリン分子とその免疫グロブリンが特異性を示す抗原との間で起こるタイプの非共有結合的相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強さ、すなわちアフィニティーは、相互作用の解離定数（Kd）で表現することができ、小さいKdほど強いアフィニティーを表す。選択したポリペプチドの免疫学的結合特性は、当技術分野において周知の方法を使って定量することができる。そのような方法の一つでは抗原結合部位/抗原複合体の形成速度と解離速度が測定され、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用のアフィニティー、および両方向への速度に等しく影響を及ぼす幾何学的パラメータに依存する。したがって「オン速度定数」（Kon）と「オフ速度定数」（Koff）は、濃度の計算と実際の会合速度および解離速度とによって決定することができる（Nature 361:186-87（1993）参照）。Koff/Konの比は、アフィニティーに関係しない全てのパラメータの相殺を可能にし、解離定数Kdに等しい（一般論についてはDavies et al.（1990）Annual Rev Biochem 59:439-473を参照されたい）。放射性リガンド結合アッセイなどのアッセイまたは当業者に公知の類似するアッセイで測定した場合に、平衡結合定数（Kd）が≦1μM、好ましくは≦100nM、より好ましくは≦10nM、最も好ましくは≦100pM〜約1pMであれば、本発明の抗体はフラビウイルスエピトープに特異的に結合するという。
【００６５】
本発明のフラビウイルスタンパク質（すなわちエンベロープタンパク質またはウエストナイルエンベロープタンパク質E）またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログは、これらのタンパク質構成要素に免疫特異的に結合する抗体の生成において、免疫原として利用することができる。
【００６６】
あるヒトモノクローナル抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体と同じ特異性を有するかどうかは、後者がフラビウイルスに結合するのを前者が妨げるかどうかを確かめることによって、甚だしい実験を行わずに決定することが可能であることは、当業者にはわかるであろう。被験ヒトモノクローナル抗体が、本発明のヒトモノクローナル抗体による結合の減少によって示されるように、本発明のヒトモノクローナル抗体と競合するのであれば、それら2つのモノクローナル抗体は同じエピトープまたは密接に関係するエピトープに結合する可能性が高い。
【００６７】
ヒトモノクローナル抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体の特異性を有するかどうかを決定するためのもう一つの方法は、本発明のヒトモノクローナル抗体を、それが通常反応するフラビウイルスエンベロープタンパク質、例えばウエストナイルウイルスタンパク質Eなどと共にプレインキュベートした後、被験ヒトモノクローナル抗体を加えて、被験ヒトモノクローナル抗体が、フラビウイルスエンベロープタンパク質、例えばウエストナイルウイルスEに結合するその能力を阻害されるかどうかを決定することである。被験ヒトモノクローナル抗体が阻害されるなら、それが本発明のモノクローナル抗体と同じエピトープ特異性または機能的に等価なエピトープ特異性を有することは、ほぼ確実である。本発明のヒトモノクローナル抗体のスクリーニングは、WNEを利用し、試験モノクローナル抗体がフラビウイルス科のメンバーを中和できるかどうかを決定することによって行うこともできる。
【００６８】
本発明のタンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログ、もしくはオルソログに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の産生には、当技術分野において公知のさまざまな手法を使用することができる（例えば、参照により本明細書に組み入れられるAntibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照されたい）。
【００６９】
抗体は、主として免疫血清のIgG画分を与えるプロテインAまたはプロテインGを使ったアフィニティークロマトグラフィーなどの周知の技法によって精製することができる。次に、あるいは前記に代えて、得ようとしている免疫グロブリンのターゲットである特異的抗原、またはそのエピトープをカラム上に固定化することで、イムノアフィニティークロマトグラフィーによって免疫特異的抗体を精製することができる。免疫グロブリンの精製は、例えばD. Wilkinson（The Scientist［発行所:The Scientist, Inc.、ペンシルベニア州フィラデルフィア］Vol. 14, No. 8（April 17, 2000）, pp. 25-28）によって論述されている。
【００７０】
本明細書において使用する「モノクローナル抗体」または「MAb」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、ユニークな軽鎖遺伝子産物およびユニークな重鎖遺伝子産物からなる一分子種の抗体分子だけを含有する抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（CDR）は、その集団の全ての分子において同一である。mAbは、それに対するユニークな結合アフィニティーを特徴とする抗原の特定エピトープと免疫反応する能力を有する抗原結合部位を含有する。
【００７１】
モノクローナル抗体はハイブリドーマ法、例えばKohler and Milstein, Nature, 256:495（1975）に記載されているものなどを使って調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター、または他の適当な宿主動物を典型的には免疫化剤で免疫化することで、その免疫化剤に特異的に結合するであろう抗体を産生するまたは産生する能力を有するリンパ球を引き出す。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
【００７２】
免疫化剤は、典型的には、タンパク質抗原、そのフラグメントまたはその融合タンパク質を含むであろう。一般に、ヒト由来の細胞が望ましい場合には末梢血リンパ球が使用され、非ヒト哺乳動物供給源が望ましい場合には脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用される。次にリンパ球を、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使って不死化細胞株と融合することで、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles an Practice, Academic Press,（1986）pp. 59-103）。不死化細胞株は通常は形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯類、ウシおよびヒト由来の骨髄腫細胞である。通常は、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、融合していない不死化細胞の成長または生存を阻害する物質を好ましくは1種または複数種含有する適切な培養培地中で培養することができる。例えば親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRTまたはHPRT）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、HGPRT欠損細胞の成長を防止する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含むであろう（「HAT培地」）。
【００７３】
好ましい不死化細胞株は、効率よく融合し、選択した抗体産生細胞による抗体の安定的高レベル発現を支持し、HAT培地などの培地に対して感受性を示すものである。より好ましい不死化細胞株は、例えばSalk Institute Cell Distribution Center（カリフォルニア州サンディエゴ）およびAmerican Type Culture Collection（バージニア州マナッサス）から入手することができるマウス骨髄腫株である。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫細胞株およびマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も記述されている（Kozbor, J. Immunol, 133:3001（1984）;Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York,（1987）pp. 51-63を参照されたい）。
【００７４】
次に、ハイブリドーマ細胞の培養を行った培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降によって、またはラジオイムノアッセイ（RIA）や酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）などのインビトロ結合アッセイによって決定する。そのような技法およびアッセイは当技術分野において公知である。モノクローナル抗体の結合アフィニティーは、例えばMunson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220（1980）のスキャッチャード解析によって決定することができる。さらにまた、モノクローナル抗体の治療的応用では、ターゲット抗原に対して高度な特異性と高い結合アフィニティーを有する抗体を同定することが重要である。
【００７５】
所望のハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press,（1986）pp. 59-103参照）。この目的のための適切な培養培地には例えばダルベッコ変法イーグル培地やRPMI-1640培地がある。あるいは、ハイブリドーマ細胞を哺乳動物において腹水としてインビボで増殖させることもできる。
【００７６】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、培養培地または腹水から、例えばプロテインA-Sepharose、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどといった従来の免疫グロブリン精製手法によって単離または精製することができる。
【００７７】
モノクローナル抗体は組換えDNA法、例えば米国特許第4,816,567号に記載されている方法などによって、製作することもできる。本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の手法を使って（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力を有するオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、容易に単離し、配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAの好ましい供給源として役立つ。単離されたら、DNAを発現ベクターに入れ、次にそれをサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、または本来であれば免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトすることで、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を達成することができる。DNAは、例えばヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列で相同なマウス配列を置換することによって（米国特許第4,816,567号;Morrison, Nature 368, 812-13（1994）参照）、または免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列の全部または一部を共有結合で接合することによって、改変することもできる。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインを置換するか、またはキメラ二価抗体を創製するために本発明の抗体の一方の抗原結合部位の可変ドメインを置換することができる。
【００７８】
完全ヒト抗体は、軽鎖と重鎖の両方の全配列が、CDRを含めて、ヒト遺伝子から生じる抗体分子である。そのような抗体を、本明細書では「ヒト化抗体」、「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」と呼ぶ。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ技法;ヒトB細胞ハイブリドーマ技法（Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4:72参照）;およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技法（Cole, et al, 1985 In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96参照）を使って調製することができる。ヒトモノクローナル抗体を利用することができ、ヒトモノクローナル抗体はヒトハイブリドーマを使用することによって（Cote, et al, 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80:2026-2030）、またはインビトロでヒトB細胞をエプスタインバーウイルスで形質転換することによって（Cole, et al., 1985 In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96参照）、産生することができる。
【００７９】
加えて、既存の哺乳類系に代わる安価な産生系として、ヒト化抗体をトランスジェニック植物中で産生することもできる。例えばトランスジェニック植物はタバコ植物、すなわちベンサミアナタバコ（Nicotiania benthamiana）およびタバコ（Nicotiana tabaccum）であることができる。抗体は植物の葉から精製される。植物の安定形質転換はアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはパーティクルボンバードメントの使用によって達成することができる。例えば、少なくとも重鎖配列および軽鎖配列を含有する核酸発現ベクターを、形質転換により、細菌培養、すなわちA. ツメファシエンス（A. tumefaciens）BLA4404株中で発現させる。植物の浸潤は注入によって達成することができる。可溶性葉抽出物は、葉組織を乳鉢で摩砕し、遠心分離することによって調製することができる。抗体の単離と精製は、当業者に公知の方法の多くによって容易に行うことができる。植物における抗体産生のための他の方法は、例えばFischer et al, Vaccine, 2003, 21:820-5、およびKo et al, Current Topics in Microbiology and Immunology, Vol. 332, 2009, pp. 55-78に記載されている。したがって本発明はさらに、本発明の抗体をコードするベクターを含む、または本発明の抗体を産生する、任意の細胞または植物を提供する。
【００８０】
加えて、ファージディスプレイを含む他の技法を使ってヒト抗体を産生することもできる（Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227:381（1991）;Marks et al, J. Mol. Biol, 222:581（1991）参照）。同様に、トランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活化されているマウスにヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって、ヒト抗体を製作することができる。チャレンジを行うと、遺伝子再編成、アセンブリ、および抗体レパートリーを含むあらゆる点でヒトに見られるものによく似たヒト抗体産生が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号、同第5,545,806号、同第5,569,825号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、同第5,661,016号、およびMarks et al, Bio/Technology 10, 779-783（1992）、Lonberg et al, Nature 368 856-859（1994）、Morrison, Nature 368, 812-13（1994）、Fishwild et al, Nature Biotechnology 14, 845-51（1996）、Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826（1996）、およびLonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93（1995）に記載されている。
【００８１】
ヒト抗体はさらに、抗原によるチャレンジに応答してその動物の内在性抗体ではなく完全ヒト抗体を産生するように改変されたトランスジェニック非ヒト動物を使って産生することもできる（PCT公開WO94/02602参照）。非ヒト宿主中で免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖をコードする内在性遺伝子は無力化されており、ヒト免疫グロブリン重鎖およびヒト免疫グロブリン軽鎖をコードする活性な遺伝子座が宿主のゲノムに挿入される。ヒト遺伝子は、例えば必要なヒトDNAセグメントを含有する酵母人工染色体を使って組み込まれる。次に、全ての改変ではなくその一部を含有する中間トランスジェニック動物を異種交配することにより、所望の改変を全て与える動物を子孫として得る。そのような非ヒト動物の好ましい態様はマウスであり、PCT公開WO 96/33735およびWO 96/34096に開示されているように、Xenomouse（商標）と称されている。この動物は、完全ヒト免疫グロブリンを分泌するB細胞を産生する。抗体は、関心対象の免疫原による免疫化後に、例えばポリクローナル抗体の調製物として動物から直接取得するか、あるいはその動物に由来する不死化B細胞、例えばモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから取得することができる。加えて、ヒト可変領域を含む免疫グロブリンをコードする遺伝子を回収し、発現させることによって抗体を直接取得するか、またはヒト可変領域を含む免疫グロブリンをコードする遺伝子をさらに改変して、例えば一本鎖Fv（scFv）分子などといった抗体のアナログを取得することもできる。
【００８２】
内在性免疫グロブリン重鎖の発現を欠くマウスに代表される非ヒト宿主を作出する方法の一例は、米国特許第5,939,598号に開示されている。これは、胚性幹細胞において少なくとも1つの内在性重鎖遺伝子座から、当該遺伝子座の再配列を防止し、再配列した免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写産物の形成を防止するために、Jセグメント遺伝子を欠失させ（この欠失は、選択可能マーカーをコードする遺伝子を含有するターゲティングベクターによって達成される）、体細胞と生殖細胞が前記選択可能マーカーをコードする遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを、前記胚性幹細胞から作出することを含む方法によって得ることができる。
【００８３】
ヒト抗体などの関心対象の抗体を産生するための一方法は、米国特許第5,916,771号に開示されている。この方法は、重鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを一つの培養哺乳動物宿主細胞に導入し、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターをもう一つの哺乳動物宿主細胞に導入し、それら2つの細胞を融合してハイブリッド細胞を形成させることを含む。このハイブリッド細胞は前記重鎖と前記軽鎖を含有する抗体を発現する。
【００８４】
この手法のさらなる改良として、免疫原上の臨床的に問題となるエピトープを同定するための方法および前記問題となるエピトープに高いアフィニティーで免疫特異的に結合する抗体を選択するための関連する方法が、PCT公開WO 99/53049に開示されている。
【００８５】
抗体は、上述の一本鎖抗体をコードするDNAセグメントを含有するベクターによって発現させることができる。
【００８６】
これらは、ベクター、リポソーム、裸のDNA、アジュバントに補助されたDNA、遺伝子銃、カテーテルなどを含みうる。ベクターとしては、ターゲティング部分（例えば細胞表面受容体に対するリガンド）と核酸結合部分（例えばポリリジン）とを有する化学コンジュゲート（例えばWO 93/64701に記載されているもの）、ウイルスベクター（例えばDNAまたはRNAウイルスベクター）、ターゲット部分（例えばターゲット細胞に特異的な抗体）と核酸結合部分（例えばプロタミン）とを含有する融合タンパク質である融合タンパク質（例えばPCT/US 95/02140（WO 95/22618）に記載されているもの）、プラスミド、ファージなどが挙げられる。ベクターは、染色体ベクター、非染色体ベクターまたは合成ベクターであることができる。
【００８７】
好ましいベクターとして、ウイルスベクター、融合タンパク質および化学コンジュゲートが挙げられる。レトロウイルスベクターとしてモロニーマウス白血病ウイルスが挙げられる。DNAウイルスベクターは好ましい。これらのベクターには、オルトポックスベクターまたはトリポックスベクターなどのポックスベクター、単純ヘルペスIウイルス（HSV）ベクターなどのヘルペスウイルスベクター（Geller, A. I. et al, J. Neurochem, 64:487（1995）;Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed.（Oxford Univ. Press, Oxford England）（1995）;Geller, A. I. et al, Proc Natl. Acad. Sci.:U.S.A. 90:7603（1993）;Geller, A. I., et al, Proc Natl. Acad. Sci USA 87:1149（1990）参照）、アデノウイルスベクター（LeGal LaSalle et al, Science, 259:988（1993）;Davidson, et al, Nat. Genet 3:219（1993）;Yang, et al, J. Virol. 69:2004（1995）参照）およびアデノ随伴ウイルスベクター（Kaplitt, M. G.. et al, Nat. Genet. 8:148（1994）参照）などがある。
【００８８】
ポックスウイルスベクターは細胞の細胞質中に遺伝子を導入する。トリポックスウイルスベクターは、核酸の短期間発現だけをもたらす。神経細胞中に核酸を導入するには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルス（HSV）ベクターが好ましい。アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（約4ヶ月）より短期間の発現（約2ヶ月）をもたらし、アデノ随伴ウイルスの発現はHSVベクターより短い。選択される特定ベクターはターゲット細胞および処置される状態に依存するであろう。導入は、例えば感染、トランスフェクション、形質導入または形質転換などの標準的技法によって行うことができる。遺伝子導入の様式の例として、例えば裸のDNA、CaPO4沈殿、DEAEデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクション、およびウイルスベクターなどが挙げられる。
【００８９】
ベクターを使って、本質的に任意の所望のターゲット細胞にターゲティングすることができる。例えば、定位的注入を使って、ベクター（例えばアデノウイルス、HSV）を所望の場所に向かわせることができる。加えて、SynchroMed Infusion Systemなどのミニポンプ注入システムを使った脳室内（icv）注入によって粒子を送達することもできる。対流と呼ばれるバルクフローに基づく方法も、脳の広い領域に大きな分子を送達するのに効果的であることが判明しており、ターゲット細胞へのベクターの送達に役立ちうる（Bobo et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :2076-2080（1994）;Morrison et al, Am. J. Physiol. 266:292-305（1994）参照）。使用することができる他の方法には、カテーテル、静脈内、非経口、腹腔内および皮下注射、経口投与経路または他の公知の投与経路がある。
【００９０】
これらのベクターは、さまざまな方法で使用することができる多量の抗体を発現させるために使用することができる。例えば、抗体は試料中のフラビウイルスの存在を検出するために使用することができる。抗体は、フラビウイルスエンベロープタンパク質に結合させてその活性の妨害を試みるためにも使用することができる。
【００９１】
好ましい一態様では、本発明の抗体は、Fc受容体に結合する野生型Fc領域と類似するFc領域を含有する完全長抗体である。
【００９２】
ヘテロコンジュゲート抗体も本発明の範囲内である。ヘテロコンジュゲート抗体は、共有結合で接合された2つの抗体から構成される。そのような抗体は、例えば免疫系細胞を望ましくない細胞にターゲティングするため（米国特許第4,676,980号参照）、およびHIV感染を処置するため（WO 91/00360;WO 92/200373;EP 03089参照）に、提唱されている。これらの抗体は、架橋剤を必要とする方法など、合成タンパク質化学における公知の方法を使って、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使って、またはチオエーテル結合を形成させることによって、イムノトキシンを構築することができる。この目的のための適切な試薬の例として、イミノチオレートおよびメチル-4-メルカプトブチルイミデート、ならびに例えば米国特許第4,676,980号に開示されているものが挙げられる。
【００９３】
例えばウイルス感染の中和または防止における抗体の有効性を強化するために、エフェクター機能に関して本発明の抗体を改変することが望ましい場合がある。例えばシステイン残基をFc領域に導入することによって、この領域内での鎖間ジスルフィド結合形成を可能にすることができる。こうして生成するホモ二量体型抗体は、改善したインターナリゼーション能力ならびに/または増加した補体媒介性細胞殺滅性および抗体依存性細胞性細胞傷害性（ADCC）を有しうる（Caron et al, J. Exp Med., 176:1191-1195（1992）およびShopes, J. Immunol, 148:2918-2922（1992）参照）。あるいは、二重Fc領域を有し、それにより、強化された補体溶解性およびADCC能を有しうる抗体を、工学的に作製することもできる（Stevenson et al, Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230（1989）参照）。好ましい一態様において、本発明の抗体は、Fc領域がFc受容体に結合しないように、Fc領域が改変されている。前記Fc受容体は、好ましくは、Fcγ受容体である。Fc領域がFcγ受容体には結合しないが、新生児型Fc受容体には結合するように、Fc領域が改変されている抗体は、特に好ましい。
【００９４】
本発明は、毒素（例えば細菌、真菌、植物、または動物由来の酵素的に活性な毒素、またはそのフラグメント）などの細胞傷害性作用物質にコンジュゲートされた抗体、または放射性同位体にコンジュゲートされた抗体（すなわち放射性コンジュゲート）を含む、イムノコンジュゲートにも関係する。
【００９５】
使用することができる酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントとしては、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、エンドトキシンA鎖（緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファ-サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質（dianthin protein）、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（PAPI、PAPII、およびPAP-S）、ニガウリ（momordica charantia）インヒビター、クルシン、クロチン、サボンソウ（sapaonaria officinalis）インヒビター、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、およびトリコテシン（tricothecenes）が挙げられる。放射性コンジュゲート抗体の産生にはさまざまな放射性核種を利用することができる。例として212Bi、131I、131In、90Y、および186Reが挙げられる。
【００９６】
抗体と細胞傷害性作用物質のコンジュゲートは、さまざまな二官能性タンパク質カップリング剤、例えばN-スクシンイミジル-3-（2-ピリジルジチオール）プロピオネート（SPDP）、イミノチオラン（IT）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジポイミデートHCLなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒド（glutareldehyde）など）、ビス-アジド化合物（ビス（p-アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-（p-ジアゾニウムベンゾイル）-エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン2,6-ジイソシアネート（tolyene 2,6-diisocyanate）など）、およびビス-活性フッ素化合物（1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼンなど）を使って製作される。例えば、リシンイムノトキシンは、Vitetta et al, Science 238:1098（1987）に記載されているように調製することができる。炭素14標識1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸（MX-DTPA）は、放射性ヌクレオチドを抗体にコンジュゲートするための例示的なキレート剤である（WO94/11026参照）。
【００９７】
得られた抗体または本発明の他の分子に考えうる多種多様な部分をカップリングできることは、当業者にはわかるであろう（例えば「Conjugate Vaccines」Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr（eds）, Carger Press, New York,（1989）参照（この文献の内容は全て参照により本明細書に組み入れられる））。
【００９８】
カップリングは、抗体と他の部分とがそれぞれの活性を保つ限り、2つの分子を結合する任意の化学反応によって達成することができる。この結合は、例えば共有結合、アフィニティー結合、インターカレーション、配位結合および錯化など、多くの化学的機序を含みうる。しかし好ましい結合は共有結合である。共有結合は、既存の側鎖の直接縮合によって、または外部橋かけ分子の組込みによって、達成することができる。本発明の抗体などのタンパク質分子の他の分子へのカップリングには、多くの二価または多価連結剤が有用である。例えば、代表的カップリング剤として、チオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼンおよびヘキサメチレンジアミンなどの有機化合物を挙げることができる。このリストは、当技術分野において公知のカップリング剤のさまざまなクラスを網羅するものではなく、より一般的なカップリング剤の例示である（Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549（1984）;Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216（1982）;およびVitetta et al, Science 238:1098（1987）参照）。好ましいリンカーは文献に記載されている（例えばMBS（M-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用を記述しているRamakrishnan, S. et al, Cancer Res. 44:201-208（1984）参照。オリゴペプチドリンカーを使って抗体にカップリングされたハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体の使用を記述している米国特許第5,030,719号も参照されたい）。特に好ましいリンカーとして、（i）EDC（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノ-プロピル）カルボジイミド塩酸塩;（ii）SMPT（4-スクシンイミジルオキシカルボニル-アルファ-メチル-アルファ-（2-ピリジル-ジチオ）-トルエン（Pierce Chem. Co., カタログ番号21558G）;（iii）SPDP（スクシンイミジル-6[3-（2-ピリジルジチオ）プロピオンアミド]ヘキサノエート（Pierce Chem. Co.,カタログ番号21651G）;（iv）スルホ-LC-SPDP（スルホスクシンイミジル6[3-（2-ピリジルジチオ）-プロピオンアミド]ヘキサノエート（Pierce Chem. Co., カタログ番号2165-G）;および（v）EDCにコンジュゲートされたスルホ-NHS（N-ヒドロキシスルホ-スクシンイミド:Pierce Chem. Co.,カタログ番号24510）が挙げられる。
【００９９】
上記のリンカーは、異なる特質を有する構成要素を含有するので、異なる物理化学的性質を有するコンジュゲートをもたらす。例えばアルキルカルボキシレートのスルホ-NHSエステルは、芳香族カルボキシレートのスルホ-NHSエステルより安定である。NHS-エステル含有リンカーはスルホ-NHSエステルより溶解度が低い。さらに、リンカーSMPTは、立体障害の大きいジスルフィド結合を含有し、増加した安定性を有するコンジュゲートを形成することができる。ジスルフィド結合はインビトロで切断されるので、ジスルフィド結合は一般に他の結合より安定性が低く、利用できるコンジュゲートは少なくなる。スルホ-NHSは、特に、カルボジイミドカップリング剤の安定性を強化することができる。カルボジイミドカップリング剤（例えばEDC）をスルホ-NHSと一緒に使用すると、カルボジイミドカップリング反応だけの場合よりも加水分解に対する耐性が高いエステルが形成される。
【０１００】
本明細書において開示する抗体は、イムノリポソームとして製剤化することができる。抗体を含有するリポソームは、当技術分野において公知の方法によって、例えばEpstein et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688（1985）;Hwang et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030（1980）;および米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号に記載されている方法などによって調製される。循環時間が向上したリポソームが米国特許第5,013,556号に開示されている。
【０１０１】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）を含む脂質組成物を使った逆相蒸発法によって生成させることができる。所定の孔径のフィルターを通してリポソームを押し出すことで、所望の直径を持つリポソームが得られる。本発明の抗体のFab'フラグメントは、Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288（1982）に記載されているように、ジスルフィド交換反応により、リポソームにコンジュゲートすることができる。
【０１０２】
フラビウイルスに対する抗体の使用
所望の特異性を有する抗体をスクリーニングするための方法として、例えば限定するわけではないが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）および当技術分野内で公知の他の免疫学的に媒介される技法が挙げられる。
【０１０３】
WNEなどのフラビウイルスエンベロープタンパク質に対する抗体（またはそのフラグメント）は、（例えば適当な生理学的試料内のフラビウイルスタンパク質のレベルの測定や、診断方法や、タンパク質のイメージングなどにおいて使用するための）WNEなどのフラビウイルスエンベロープタンパク質の位置特定および/または定量に関係する、当技術分野内で公知の方法において使用することができる。所与の態様では、WNEなどのフラビウイルスエンベロープタンパク質に特異的な抗体、または抗体由来の抗原結合ドメインを含有するその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログが、薬理活性化合物（本明細書では以下「治療薬」という）として利用される。
【０１０４】
WNEなどのフラビウイルスエンベロープタンパク質に特異的な本発明の抗体は、イムノアフィニティー、クロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準的技法によってフラビウイルスポリペプチドを単離するために使用することができる。フラビウイルスタンパク質に対する抗体（またはそのフラグメント）は、例えば所与の処置レジメンの効力を決定するための臨床試験手順の一部として組織中のタンパク質レベルをモニタリングするために、診断的に使用することができる。検出は、抗体を検出可能な物質にカップリング（すなわち物理的に連結）することによって容易にすることができる。検出可能な物質の例として、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、および放射性材料が挙げられる。適切な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが挙げられ、適切な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ、発光材料の例としてルミノールが挙げられ、生物発光材料の例としてルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、適切な放射性物質の例としては、125I、131I、35Sまたは3Hが挙げられる。
【０１０５】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体を含めて、治療用作用物質として使用することができる。そのような作用物質は一般に、対象におけるフラビウイルス関連疾患またはフラビウイルス関連病態（例えばデング熱）を処置または防止するために使用されるであろう。抗体調製物、好ましくはそのターゲット抗原に対して高い特異性と高いアフィニティーを有するものを、対象に投与すると、それは一般に、その抗体調製物とターゲットとの結合によって、効果を生じるであろう。抗体の投与は、細胞へのウイルスのインターナリゼーションを抑止または阻害または妨害しうる。この場合、抗体はターゲットに結合し、Fc受容体発現細胞への結合を防止し、それによってウイルスと細胞膜との融合をブロックし、感染の抗体依存性増強におけるウイルスのインターナリゼーションを阻害する。
【０１０６】
本発明の抗体の治療有効量は、一般に、治療目的を達成するのに必要な量に関係する。上述のように、これは、抗体とそのターゲット抗原との間の結合相互作用であり、その結合相互作用は、一定の例では、ターゲットの機能を妨害するものでありうる。投与する必要がある量は、さらに、抗体のその特異的抗原に対する結合アフィニティーにも依存するであろうし、また投与された抗体が、その投与を受けた対象の自由体積から枯渇する速度にも依存するであろう。本発明の抗体または抗体フラグメントの治療有効用量の一般的範囲は、非限定的な例として、約0.1mg/kg体重〜約50mg/kg体重でありうる。一般的な投薬頻度は、例えば1日2回〜1週間に1回の範囲にありうる。
【０１０７】
フラビウイルスタンパク質に特異的に結合する本発明の抗体またはそのフラグメント、および本明細書において開示するスクリーニングアッセイによって同定される他の分子は、フラビウイルス関連障害を処置するために、薬学的組成物の形態で投与することができる。そのような組成物の調製に関わる原理および考慮すべき事項ならびに構成要素の選択における指針は、例えばRemington: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed.（Alfonso R. Gennaro, et al., editors）Mack Pub. Co., Easton, Pa., 1995;Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994;およびPeptide And Protein Drug Delivery（Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4）, 1991, M. Dekker, New Yorkに掲載されている。
【０１０８】
本発明の態様では、抗体フラグメント、特にFc領域を欠く抗体フラグメントは、好ましくない。ターゲットタンパク質配列に結合する能力を保ったペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチドは化学合成し、かつ/または組換えDNA技術によって産生することができる（例えばMarasco et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7889-7893（1993）参照）。製剤は、処置される特定の適応症のために必要に応じて、2種以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものを含有することもできる。前記に代えて、または前記に加えて、組成物は、その機能を強化する作用物質、例えば細胞傷害性作用物質、サイトカイン、化学療法剤、または成長阻害剤などを含むこともできる。それらの分子は、意図した目的に有効な量で組み合わされて適切に存在する。
【０１０９】
活性成分は、例えばコアセルベーション技法または界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ-（メチルメタクリレート）マイクロカプセル、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）、またはマクロエマルションに封入することもできる。
【０１１０】
インビボ投与に使用される製剤は滅菌状態になければならない。これは滅菌濾過膜を通したろ過によって容易に達成される。
【０１１１】
徐放性調製物を調製することができる。徐放性調製物の適切な例としては、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックスであって、マトリックスが例えばフィルムまたはマイクロカプセルなどの造形品の形態にあるものが挙げられる。徐放性マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（2-ヒドロキシエチル-メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号）、L-グルタミン酸とγ-エチル-L-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT（商標）（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア）、およびポリ-D-（-）-3-ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン-酢酸ビニルおよび乳酸-グリコール酸などのポリマーは100日にわたる分子の放出を可能にするが、一定のヒドロゲルはそれより短い期間でタンパク質を放出する。
【０１１２】
本発明の抗体は、試料中のフラビウイルス（またはそのタンパク質もしくはタンパク質フラグメント）の存在を検出するための作用物質として使用することができる。好ましくは、抗体は検出可能な標識を含有する。抗体はポリクローナル抗体であるか、より好ましくはモノクローナル抗体であることができる。インタクトな抗体は好ましい。プローブまたは抗体に関して「標識（された）」という用語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリング（すなわち物理的に連結）することによるプローブまたは抗体の直接的標識と、直接的に標識されたもう一つの試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識とを包含するものとする。間接的標識の例として、蛍光標識された二次抗体を使った一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンで検出することができるようにする、ビオチンによるDNAプローブの末端標識が挙げられる。「生物学的試料」という用語は、対象から単離された組織、細胞および生体液、ならびに対象内に存在する組織、細胞および液体を包含するものとする。したがって、血液および血液の画分または構成要素、例えば血清、血漿、またはリンパ液は、「生物学的試料」という用語の用法に包含される。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロでもインビボでも、生物学的試料中の分析物mRNA、タンパク質、またはゲノムDNAを検出するために使用することができる。例えば、分析物mRNAを検出するためのインビトロ技法として、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチューハイブリダイゼーションが挙げられる。分析物タンパク質を検出するためのインビトロ技法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、ウェスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光が挙げられる。分析物ゲノムDNAを検出するためのインビトロ技法としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。イムノアッセイを実行するための手順は、例えば「ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology」Vol. 42, J. R. Crowther（Ed.）Humana Press, Totowa, NJ, 1995;「Immunoassay」E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996;および「Practice and Theory of Enzyme Immunoassays」P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985に記載されている。さらにまた、分析物タンパク質を検出するためのインビボ技法として、標識抗分析物タンパク質抗体を対象に導入することが挙げられる。例えば、対象におけるその存在および位置を標準的なイメージング技法によって検出することができる放射性マーカーで、抗体を標識することができる。
【０１１３】
薬学的組成物
本発明の抗体または作用物質（本明細書では「活性化合物」ともいう）ならびにその誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログは、投与に適した薬学的組成物に組み入れることができる。そのような組成物は、典型的には、抗体または作用物質と、薬学的に許容される担体とを含む。本明細書において使用する用語「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与と適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを包含するものとする。適切な担体は、この分野における標準的参考書であるRemington's Pharmaceutical Sciencesの最新版に記載されており、この文献は参照により本明細書に組み入れられる。そのような担体または希釈剤の好ましい例として、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および5％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。リポソームおよび固定油などの非水性媒体も使用することができる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒質および作用物質の使用は、当技術分野において周知である。従来の媒質または作用物質は、それらが活性化合物と不適合でない限り、本組成物における使用が考えられる。補助活性化合物も組成物に組み入れることができる。
【０１１４】
本発明の薬学的組成物は意図した投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例として、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（すなわち外用）、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の構成要素を含むことができる:注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤;ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤;アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤;エチレンジアミン四酢酸（EDTA）などのキレート剤;酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤、および張性を調節するための塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの作用物質。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調節することができる。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回量バイアルに封入することができる。
【０１１５】
注射剤としての使用に適した薬学的組成物としては、滅菌水性溶液（水溶性である場合）または分散液および滅菌注射可能溶液または分散液をその場で調製するための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与の場合は、適切な担体として、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL（商標）（BASF、ニュージャージー州パーシパニー）またはリン酸緩衝食塩水（PBS）が挙げられる。いずれの場合も、組成物は滅菌状態でなければならず、容易な注射針通過性が存在する程度の流動性を示すべきである。組成物は、製造条件下および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌や真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であることができる。適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散系の場合は必要な粒度を維持することによって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどといった、さまざまな抗細菌剤および抗真菌剤によって達成することができる。多くの場合、例えば糖類、ポリアルコール、例えばマンニトール（manitol）、ソルビトール、塩化ナトリウムなどといった等張剤を組成物に含めることが好ましいであろう。注射可能な組成物の長時間にわたる吸収は、組成物に、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって、引き起こすことができる。
【０１１６】
滅菌注射可能溶液は、適当な溶媒に必要な量の活性化合物を、必要に応じて上に列挙した成分の1つまたは組み合わせと共に、組み入れた後、ろ過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散系は、基礎分散媒と上に列挙したものから必要な他の成分とを含有する滅菌媒体に活性化合物を組み入れることによって調製される。滅菌注射可能溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製の方法は、活性成分と所望する任意の追加成分との粉末を、前もって滅菌ろ過されたその溶液から与える、真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１１７】
経口組成物は一般に不活性希釈剤または食用に適した担体を含む。それらはゼラチンカプセルに封入するか、錠剤に圧縮することができる。経口治療薬投与のためには、活性化合物を賦形剤と共に組み入れて、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用することができる。経口組成物は、洗口液として使用するための液体担体を使って調製することもでき、その場合は、液体担体中の化合物が経口的に適用され、うがいの上、吐き出されるか、または嚥下される。薬学的に適合する結合剤および/またはアジュバント材料を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、次に挙げる成分または類似の性質を持つ化合物のいずれかを含有することができる:微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤;デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Primogel、またはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤;ステアリン酸マグネシウムまたはSterotesなどの潤滑剤;コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤;スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤;またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジフレーバーなどの香味剤。
【０１１８】
吸入による投与の場合、組成物は、適切な噴射剤、例えば二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器もしくはディスペンサーまたはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０１１９】
全身性投与は、経粘膜手段または経皮手段によって行うこともできる。経粘膜投与または経皮投与の場合、透過させるべき障壁に適した浸透剤を製剤中に使用する。そのような浸透剤は当技術分野において一般に公知であり、例えば経粘膜投与用には、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体などが挙げられる。経粘膜投与は鼻噴霧剤または坐剤の使用によって達成することができる。経皮投与の場合、活性化合物は、当技術分野において一般に知られているように、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化される。
【０１２０】
（例えばカカオ脂および他のグリセリドなどといった従来の坐剤基剤を使って）坐剤の形態または直腸送達用の滞留浣腸剤の形態で、化合物を調製することもできる。
【０１２１】
一態様では、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む放出制御製剤など、身体からの迅速な排除から化合物を保護するであろう担体を使って、活性化合物が調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製するための方法は、当業者には明白であるだろう。材料は、Alza CorporationやNova Pharmaceuticals, Inc.から商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞にターゲティングされるリポソームを含む）も、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば米国特許第4,522,811号に記載されているように、当業者に公知の方法にしたがって調製することができる。
【０１２２】
投与を容易にし、投薬量を均一にするために、経口組成物または非経口組成物を投薬単位形態で製剤化することは、とりわけ有利である。本明細書にいう投薬単位形態とは、処置される対象への単位投薬量として適した物理的に不連続な単位であって、各単位が、必要な薬学的担体と一緒になって所望の治療効果をもたらすように計算された前もって決定された量の活性化合物を含有しているものを指す。本発明の投薬単位形態の仕様は、活性化合物のユニークな特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体を処置するためにそのような活性化合物を配合する技術分野に内在する制約によって定まり、それらに直接依存する。
【０１２３】
薬学的組成物は、容器、パック、またはディスペンサーに、投与に関する説明書と共に含めることができる。
【０１２４】
スクリーニング方法
本発明は、調整因子、すなわちフラビウイルスと細胞膜との融合を調整するかまたは他の形で妨害する候補化合物もしくは試験化合物または候補作用物質もしくは試験作用物質（例えばペプチド、ペプチドミメティック、小分子または他の薬物）を同定するための方法（本明細書では「スクリーニングアッセイ」ともいう）を提供する。フラビウイルス感染を処置するのに有用な化合物を同定する方法も提供する。本発明は、本明細書に記載するスクリーニングアッセイを使って同定された化合物も包含する。
【０１２５】
例えば本発明は、フラビウイルスと細胞膜との間の相互作用を調整する候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能な（spatially addressable）パラレル固相または液相ライブラリー、デコンボルーションを必要とする合成ライブラリー法、「一ビーズ一化合物」ライブラリー法、およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法などといった、当技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における数多くのアプローチのいずれかを使って得ることができる。生物学的ライブラリーによるアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の4つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、または小分子化合物ライブラリーに適用可能である（Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12:145参照）。
【０１２６】
本明細書にいう「小分子」とは、約5kD未満、最も好ましくは約4kD未満の分子量を有する組成物を指すものとする。小分子は例えば核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティック、糖質、脂質または他の有機分子もしくは無機分子であることができる。化学的および/または生物学的混合物、例えば真菌、細菌、または藻類抽出物のライブラリーは、当技術分野において公知であり、本発明のアッセイのいずれかでスクリーニングすることができる。
【０１２７】
分子ライブラリーを合成するための方法の例は、当技術分野では、例えば次に挙げる文献に見いだすことができる:DeWitt, et al, 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909;Erb, et al, 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:11422;Zuckermann, et al, 1994. J. Med. Chem. 37:2678;Cho, et al, 1993. Science 261:1303;Carrell, et al, 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059;Carell, et al, 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061;およびGallop, et al, 1994. J. Med. Chem. 37:1233。
【０１２８】
化合物のライブラリーは、溶解状態で（例えばHoughten, 1992. Biotechniques 13:412-421）、またはビーズ上（Lam, 1991. Nature 354:82-84参照）、チップ上（Fodor, 1993. Nature 364:555-556参照）、細菌（米国特許第5,223,409号参照）、胞子（米国特許第5,233,409号参照）、プラスミド（Cull, et al, 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869参照）またはファージ上（Scott and Smith, 1990. Science 249:386-390;Devlin, 1990. Science 249:404-406;Cwirla, et al, 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:6378-6382;Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222:301-310;および米国特許第5,233,409号参照）に、存在することができる。
【０１２９】
一態様では、候補化合物を抗体-抗原複合体に導入し、その候補化合物が抗体-抗原複合体を破壊するかどうかを決定する。この場合、この複合体の破壊は、その候補化合物がフラビウイルスと細胞膜との間の相互作用を調整することを示す。例えば抗体はモノクローナル抗体mAb11、mAb11-LALA、またはその任意の変種であることができ、抗原はフラビウイルスのエンベロープタンパク質（すなわち、ウエストナイルタンパク質E）上に位置しうる。
【０１３０】
もう一つの態様では、少なくとも1つのフラビウイルスエンベロープタンパク質を用意し、それを少なくとも1つの中和モノクローナル抗体にばく露する。抗体-抗原複合体の形成を検出し、1種または複数種の候補化合物をその複合体に導入する。もし前記1種または複数種の候補化合物の導入後に抗体-抗原複合体が破壊されたら、その候補化合物はフラビウイルス関連疾患またはフラビウイルス関連障害、例えばデング熱を処置するのに有用である。例えば、前記少なくとも1つのフラビウイルスタンパク質は、フラビウイルス分子として提供することができる。
【０１３１】
抗体-抗原複合体を妨害または破壊する試験化合物の能力の決定は、例えば、複合体中の標識化合物を検出することによって抗原またはその生物学的に活性な部分への試験化合物の結合を決定することができるように、試験化合物を放射性同位体または酵素標識とカップリングすることによって、達成することができる。例えば、125I、35S、14C、または3Hで直接的にまたは間接的に試験化合物を標識し、電磁波放射の直接計数によって、またはシンチレーション計数によって、放射性同位体を検出することができる。あるいは、試験化合物を例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼなどで酵素標識し、適当な基質の生成物への転化を決定することによって、その酵素標識を検出することもできる。
【０１３２】
一態様では、アッセイが、抗体-抗原複合体を試験化合物と接触させる工程、および抗原と相互作用するかまたは他の形で既存の抗体-抗原複合体を破壊する試験化合物の能力を決定する工程を含む。この態様では、抗原と相互作用しかつ/または抗体-抗原複合体を破壊する試験化合物の能力を決定する工程が、抗原またはその生物学的に活性な部分に、抗体と比較して優先的に結合する試験化合物の能力を決定する工程を含む。
【０１３３】
もう一つの態様では、アッセイが、抗体-抗原複合体を試験化合物と接触させる工程、および抗体-抗原複合体を調整する試験化合物の能力を決定する工程を含む。抗体-抗原複合体を調整する試験化合物の能力の決定は、例えば試験化合物の存在下で抗体に結合しまたは抗体と相互作用する抗原の能力を決定することによって達成することができる。
【０１３４】
本明細書に開示するどのスクリーニング方法においても、抗体は、Fc領域によるFc-ガンマ受容体への結合が低減しているかFc領域がFc-ガンマ受容体に結合しないように、Fc領域が改変されているモノクローナル抗体Ab-11などのフラビウイルス中和抗体、またはその任意の変種でありうることは、当業者にはわかるであろう。加えて、抗原はフラビウイルスエンベロープタンパク質、またはその一部分であることができる。
【０１３５】
本明細書に開示するスクリーニング方法は、細胞ベースのアッセイとして行うか、無細胞アッセイとして行うことができる。本発明の無細胞アッセイでは、可溶型と膜結合型のタンパク質およびそのフラグメントをどちらも使用することができる。膜結合型のタンパク質を含む無細胞アッセイの場合は、膜結合型のタンパク質が溶解状態に維持されるように、可溶化剤を利用することが望ましいだろう。そのような可溶化剤の例として、ノニオン洗浄剤、例えばn-オクチルグルコシド、n-ドデシルグルコシド、n-ドデシルマルトシド、オクタノイル-N-メチルグルカミド、デカノイル-N-メチルグルカミド、Triton（登録商標）X-100、Triton（登録商標）X-114、Thesit（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）n、N-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート、3-(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホネート（CHAPS）または3-(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホネート（CHAPSO）が挙げられる。
【０１３６】
複数の態様において、候補化合物の導入後に、抗体と抗原の一方または両方の複合体形成型を複合体未形成型から分離することが容易になるように、またアッセイの自動化に適応するために、抗体または抗原のどちらか一方を固定化することが望ましいだろう。候補化合物の存在下および非存在下での抗体-抗原複合体の観察は、反応物の入れるのに適した任意の器で達成することができる。そのような器の例として、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠心管が挙げられる。一態様では、タンパク質の一方または両方をマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を用意することができる。例えば、GST-抗体融合タンパク質またはGST-抗原融合タンパク質をグルタチオンSepharoseビーズ（Sigma Chemical、ミズーリ州セントルイス）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させ、次にそれを試験化合物と混和し、その混合物を複合体形成を促す条件下で（例えば塩類およびpHに関して生理的条件で）インキュベートする。インキュベーション後に、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して未結合の構成要素（ビーズの場合は固定化されたマトリックス）をいずれも除去し、複合体を直接的または間接的に決定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離させて、標準的技法を使って抗体-抗原複合体のレベルを決定することもできる。
【０１３７】
本発明のスクリーニングアッセイでは、タンパク質をマトリックス上に固定化するための他の技法も使用することができる。例えば、ビオチンとストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用して、抗体または抗原のいずれかを固定化することができる。ビオチン化された抗体分子または抗原分子を、ビオチン-NHS（N-ヒドロキシ-スクシンイミド）から、当技術分野内で周知の技法（例えばビオチン化キット、Pierce Chemicals、イリノイ州ロックフォード）を使って調製し、ストレプトアビジン被覆96ウェルプレート（Pierce Chemical）のウェルに固定化することができる。あるいは、関心対象の抗体または抗原と反応するが、関心対象の抗体-抗原複合体の形成を妨害しない他の抗体を、プレートのウェルに誘導体化し、未結合の抗体または抗原を抗体コンジュゲーションによってウェルに捕捉することもできる。そのような複合体を検出するための方法として、GST固定化複合体に関して上述した方法に加えて、抗体または抗原と反応する前記他の抗体を使った複合体の免疫検出が挙げられる。
【０１３８】
本発明はさらに、前述のスクリーニングアッセイのいずれかによって同定される新規作用物質、および本明細書に記載する処置のためのそれらの使用に関する。
【０１３９】
診断アッセイ
本発明の抗体は、例えば従来型のイムノアッセイなど、適当なアッセイによって検出することができる。例えば、フラビウイルスエンベロープタンパク質（例えばウエストナイルウイルスタンパク質E）またはそのフラグメントを固相に固定するアッセイを行うことができる。試料中の抗体が固相上の固定化されたポリペプチドに結合することを可能にするのに十分な時間にわたって、インキュベーションを維持する。この第1インキュベーションの後、固相を試料から分離する。未結合の材料と妨害物質、例えば試料中に同様に存在しうる非特異的タンパク質とを除去するために、固相を洗浄する。次に、固定化ポリペプチドに結合した関心対象の抗体を含有する固相を、第2の標識抗体またはビオチンもしくはアビジンなどのカップリング剤に結合した抗体と共にインキュベートする。この第2抗体は、もう一つの抗フラビウイルス抗体またはもう一つの抗体であることができる。抗体用の標識は当技術分野において周知であり、放射性核種、酵素（例えばマレイン酸デヒドロゲナーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ）、蛍光物質（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコシアニン、フルオレスカミン（fluorescarmine））、ビオチンなどが挙げられる。標識抗体を固相と共にインキュベートし、固相に結合した標識を測定する。これらのイムノアッセイおよび他のイムノアッセイは、当業者であれば容易に行うことができる。
【０１４０】
生物学的試料中のフラビウイルスの存在または非存在を検出するための例示的な方法では、試験対象から生物学的試料を取得し、生物学的試料中でフラビウイルスの存在が検出されるように、生物学的試料を本発明の標識モノクローナル抗体と接触させる。
【０１４１】
プローブまたは抗体に関して本明細書において使用する用語「標識（された）」とは、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリング（すなわち物理的に連結）することによるプローブまたは抗体の直接的標識と、直接的に標識されたもう一つの試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識とを包含するものとする。間接的標識の例として、蛍光標識された二次抗体を使った一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンで検出することができるようにする、ビオチンによるDNAプローブの末端標識が挙げられる。「生物学的試料」という用語は、対象から単離された組織、細胞および生体液、ならびに対象内に存在する組織、細胞および液体を包含するものとする。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロでもインビボでも、生物学的試料中のフラビウイルスを検出するために使用することができる。例えば、フラビウイルスを検出するためのインビトロ技法として、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、ウェスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光が挙げられる。さらにまた、フラビウイルスを検出するためのインビボ技法として、標識抗フラビウイルス抗体を対象に導入することが挙げられる。例えば、対象におけるその存在および位置を標準的なイメージング技法によって検出することができる放射性マーカーで、抗体を標識することができる。
【０１４２】
一態様では、生物学的試料が試験対象からのタンパク質分子を含有する。好ましい生物学的試料の一つは、対象から通常の手段によって単離された末梢血白血球試料である。
【０１４３】
本発明は、生物学的試料中のフラビウイルスの存在を検出するためのキットも包含する。例えば、本キットは、生物学的試料中のフラビウイルスを検出する能力を有する標識化合物または標識作用物質（例えば抗フラビウイルスモノクローナル抗体）、試料中のフラビウイルスの量を決定するための手段、および試料中のフラビウイルスの量を標準と比較するための手段を含むことができる。前記化合物または作用物質は適切な容器に入れることができる。本キットはさらに、試料中のフラビウイルスを検出するためのキットの使用に関する説明書を含むことができる。
【０１４４】
受動免疫化
受動免疫化は、ウイルス疾患の予防および処置にとって有効で安全な戦略であることが判明している（Keller et al., Clin. Microbiol. Rev. 13:602-14（2000）;Casadevall, Nat. Biotechnol. 20:114（2002）;Shibata et al, Nat. Med. 5:204-10（1999）;およびIgarashi et al., Nat. Med. 5:211-16（1999）参照;これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる）。中和ヒトモノクローナル抗体を使った受動免疫化は、フラビウイルス感染ならびに関連疾患および関連障害の緊急予防および緊急処置のための応急処置戦略になりうる。また同時に、これに代わる、もっと時間の掛かるワクチンおよび新薬の開発も進行中である。
【０１４５】
従来の免疫原と比較して、サブユニットワクチンには潜在的に著しい利点がある。サブユニットワクチンでは、従来の不活化全病原体ワクチンまたは弱毒化全病原体ワクチンの産生、流通、および送達にはつきまとう安全上の問題が回避される。さらにまた、サブユニットワクチンは、確認された防御エピトープだけを含むように合理的に設計することにより、抑制性Tエピトープ（Steward et al, J. Virol. 69:7668（1995）参照）または無益な非防御応答を誘導することによって免疫系を破壊する免疫優性Bエピトープ（例えば「デコイ」エピトープ）（Garrity et al, J. Immunol. 159:279（1997）参照）を避けることができる。
【０１４６】
さらにまた、多くの異なるウイルス、チャレンジ経路、および動物モデルに関して、インビトロでの抗体中和活性とインビボでの防御との間によい相関関係が存在することも、当業者にはわかるであろう（Burton, Natl. Rev. Immunol. 2:706-13（2002）;Parren et al, Adv. Immunol. 77:195-262（2001）参照）。本明細書に提示するデータは、mAb-11ヒトモノクローナル抗体および他のmAb変種をさらに開発し、インビボ動物研究で試験することで、フラビウイルス感染ならびに関連疾患および関連障害を予防および処置するための強力なADE阻害剤としてのその臨床的有用性を決定できることを実証している。
【０１４７】
ワクチン接種における抗原-Igキメラ
免疫系に抗原決定基を効率よく提示するための足場として初めて抗体が使用されてから10年以上が経つ（Zanetti, Nature 355:476-77（1992）;Zaghouani et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:631-35（1995））。ペプチドは、IgG分子の不可分の一部として含まれ（例えば本明細書に記載の11Aまたは256IgG1モノクローナル抗体）、ペプチドエピトープの抗原性および免疫原性は遊離のペプチドと比較して著しく強化される。そのような強化は、おそらく、抗原-IgGキメラの長い半減期、より良い提示、およびそれぞれの自然の構造を模倣する束縛されたコンフォメーションによるのであろう。
【０１４８】
さらにまた、抗原-Igキメラを使用することのもう一つの利点は、抗原-Igキメラの可変領域またはFc領域のいずれかを、プロフェッショナル抗原提示細胞（APC）へのターゲティングに使用することができるという点である。現在までに、重鎖可変遺伝子（VH）の相補性決定領域（CDR）がB細胞またはT細胞によって認識されるさまざまな抗原ペプチドで置き換えられた組換えIgが生成されている。そのような抗原-Igキメラは、体液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方を誘導するために使用されている（Bona et al, Immunol. Today 19:126-33（1998）参照）。
【０１４９】
特異的エピトープがCDR3ループ中に移植されたキメラは、HIV-1 gp120 V3-ループまたはヒトCD4受容体の第1細胞外ドメイン（D1）に対する体液性応答を誘導するために使用されている（Lanza et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11683-87（1993）;Zaghouani et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:631-35（1995）参照）。免疫血清は、HIV-1MNによるCD4 SupT1細胞の感染を防止すること（抗gp120 V3C）またはシンシチウム形成を阻害すること（抗CD4-D1）ができた。CDR2およびCDR3を同時にペプチドエピトープで置き換えることができ、挿入することができるペプチドの長さは19アミノ酸長までである。
【０１５０】
あるいは、あるグループは「トロイボディ（troybody）」戦略を開発した。この戦略では、ペプチド抗原がIg定常（C）領域のループ中に提示され、キメラの可変領域は、B細胞表面上のIgD、またはB細胞、樹状細胞（DC）およびマクロファージを含むプロフェッショナルAPC上のMHCクラスII分子へのターゲティングに使用することができる（Lunde et al, Biochem. Soc. Trans. 30:500-6（2002）参照）。
【０１５１】
抗原-Igキメラは、抗原をIgG分子のFc部分と直接融合することによって製作することもできる。You et al., Cancer Res. 61:3704-11（2001）は、この方法を使ってB型肝炎ウイルスコア抗原に対する非常に高レベルの抗体を含む、特異的免疫応答の全てのアームを得ることができた。
【０１５２】
DNAワクチン接種
DNAワクチンは安定であり、抗原に天然のプロセシングを受ける機会を与え、より長時間持続する応答を誘導することができる。DNAワクチンは、非常に魅力的な免疫化戦略であるものの、免疫応答を誘導するその潜在能力は著しく制限されることが多い。注入されたDNAが樹状細胞（DC）などのプロフェッショナルAPCによってあまり取り込まれないことが、そのような制限の主な原因であるだろう。抗原-Igキメラワクチンと組み合わせることで、APC抗原提示の強化に基づく前途有望な新しいDNAワクチン戦略が報告されており（Casares, et al, Viral Immunol. 10:129-36（1997）;Gerloni et al, Nat. Biotech. 15:876-81（1997）;Gerloni et al, DNA Cell Biol. 16:611-25（1997）;You et al, Cancer Res. 61:3704-11（2001）参照）、これは、DCの表面にFc受容体（FcγR）が存在することを利用している。
【０１５３】
抗原（Ag）-IgキメラをコードするDNAワクチンを生成させることができる。免疫化すると、そのDNA分子を取り込んだ細胞によってAg-Ig融合タンパク質が発現され分泌されることになる。分泌されたAg-Ig融合タンパク質は、B細胞応答を誘導しつつ、DC表面上のFcγRとFcフラグメントとの相互作用によって捕捉され、インターナライズされることができ、それが、効率の良い抗原提示を促進し、抗原特異的免疫応答を著しく強化することになる。同じ原理を応用すると、機能的抗MHC II特異的scFv領域遺伝子を保持する抗原-IgキメラをコードするDNAも、免疫原を3タイプ全てのAPCにターゲティングすることができる。免疫応答は、必要であれば、インビトロで生成させた同じタンパク質抗原の使用により、さらに増強することもできる（すなわち「プライムおよびブースト」）。この戦略を使用して、フラビウイルスの感染に対する特異的細胞性免疫応答および体液性免疫応答が、DNAワクチンの筋肉内（i.m.）注射によって達成された（Casares et al, Viral. Immunol. 10:129-36（1997）参照）。
【０１５４】
ワクチン組成物
一般に1種または複数種のモノクローナル抗体またはscFvの混合物およびそれらの組み合わせを含む治療用または予防用組成物が、ここに提供される。予防用ワクチンはフラビウイルス感染を防止するために使用することができ、治療用ワクチンはフラビウイルス感染後に個体を処置するために使用することができる。予防的使用には、ワクチン接種対象におけるフラビウイルスに対する抗体価を増加させることが含まれる。このようにして、フラビウイルスと接触するリスクが高い対象（すなわちウイルスを保因している蚊が生育している亜熱帯地域にいる対象）に、フラビウイルスに対する受動免疫を提供することができる。
【０１５５】
これらのワクチン組成物は補助的免疫調整作用物質と一緒に投与することができる。例えばサイトカイン、リンホカイン、およびケモカイン、限定するわけではないが、IL-2、改変IL-2（Cys125→Ser125）、GM-CSF、IL-12、γ-インターフェロン、IP-10、MIP1β、およびRANTESなど。
【０１５６】
免疫化の方法
本発明のワクチンは、他の抗ウイルスワクチンより優れた免疫防御特性および免疫治療特性を有する。
【０１５７】
本発明は、対象の免疫化の方法、例えば免疫応答を誘導する方法を提供する。対象は、病原性エンベロープウイルスの膜融合タンパク質を含有する組成物を対象に投与することによって免疫化される。融合タンパク質は、生物学的に適合するマトリックスでコーティングされるか、生物学的に適合するマトリックスに包埋される。
【０１５８】
融合タンパク質はグリコシル化される（例えば糖質部分を含有する）。糖質部分は単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、またはそれらの誘導体（例えばスルホ置換体またはホスホ置換体）の形態をとりうる。糖質は線状または分枝状である。糖質部分はポリペプチドにN結合またはO結合している。N結合型グリコシル化はアスパラギン側鎖のアミド窒素に起こり、O結合型グリコシル化はセリン側鎖およびスレオニン側鎖のヒドロキシ酸素に起こる。
【０１５９】
糖質部分はワクチン接種される対象にとって内在性である。あるいは糖質部分はワクチン接種される対象にとって外因性である。糖質部分は、ワクチン接種される対象のポリペプチド上に典型的には発現しない糖質部分である。例えば糖質部分は植物特異的糖質である。植物特異的糖質部分としては、例えばコア結合α1,3フコースまたはコア結合β1,2キシロースを有するN結合型グリカンが挙げられる。あるいは、糖質部分は、ワクチン接種される対象のポリペプチドまたは脂質上に発現する糖質部分である。例えば多くの宿主細胞が、ヒト様糖付加物を伴うヒトタンパク質を産生するように遺伝子工学的に操作されている。
【０１６０】
例えば融合タンパク質は三量体型ヘマグルチニンタンパク質である。任意で、ヘマグルチニンタンパク質は、植物細胞などの非哺乳動物細胞において産生される。
【０１６１】
対象は、ウイルス感染を発生するリスクまたはウイルス感染に罹患するリスクがある。フラビウイルス科のメンバーとして、例えばウエストナイルウイルス、デングウイルス（血清型1〜4）、セントルイス脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、またはマレー渓谷脳炎ウイルスが挙げられる。例えば、対象は他のフラビウイルス感染が報告された地域または国に旅行してきた対象である。
【０１６２】
本明細書に記載する方法は、ウイルス感染の重症度の低減またはウイルス感染の1つまたは複数の症状の軽減をもたらす。感染は、典型的には、標準的方法を使って医師によって診断またはモニタリングされる。免疫化を必要とする対象は、当技術分野において公知の方法によって同定される。例えば、CDCのGeneral Recommendation on Immunization（51(RR02) pp1-36）に概説されているように、対象を免疫化する。がんは、例えば身体検査、生検、血液検査、またはx線によって診断される。
【０１６３】
対象は例えば任意の哺乳動物、例えばヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、魚またはトリである。
【０１６４】
処置は感染の診断に先だって施行される。あるいは、処置は診断後に施行される。処置の効能は、その特定障害または感染を診断または処置するための任意の公知の方法に関連して決定される。障害の1つまたは複数の症状の軽減は、その化合物が臨床的利益を与えることを示す。
【０１６５】
処置の方法
本発明は、フラビウイルス関連疾患またはフラビウイルス関連障害のリスクがある（または前記疾患もしくは障害にかかりやすい）対象を処置する予防的方法および治療的方法をどちらも提供する。そのような疾患または障害として、例えば発熱、髄膜炎、脳炎、黄熱、デング熱が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０１６６】
予防方法
一局面において、本発明は、本発明のモノクローナル抗体または本発明の方法に従って同定された作用物質を対象に投与することによって対象におけるフラビウイルス関連疾患またはフラビウイルス関連障害を防止するための方法を提供する。例えばモノクローナル抗体mAb-11、mAb11-LALA、およびその任意の変種であって、Fc領域が改変されることにより、Fc-ガンマ受容体への結合が低減または抑止されているものを、治療有効量で投与することができる。任意で、2種または3種以上の抗フラビウイルス抗体が同時投与される。
【０１６７】
フラビウイルス関連疾患またはフラビウイルス関連障害のリスクがある対象として、感染節足動物（すなわち蚊またマダニ）からのフラビウイルスにばく露した患者が挙げられる。例えば対象は、他のフラビウイルス感染が報告され確認された世界の地域または国に旅行してきた対象である。予防剤の投与は、疾患または障害を防止するために、あるいはその進行を遅延させるために、フラビウイルス関連疾患またはフラビウイルス関連障害に特有の症状の発現前に行うことができる。
【０１６８】
適当な作用物質は、本明細書に記載のスクリーニングアッセイに基づいて決定することができる。上記に代えて、または上記に加えて、投与すべき作用物質は、本発明の方法に従って同定されたフラビウイルスを中和するモノクローナル抗体である。いくつかの態様では、本発明の抗体を、フラビウイルスを中和することが知られている他の抗体または抗体フラグメントと共に投与することができる。抗体の投与は逐次的、同時、または交互であることができる。
【０１６９】
治療方法
本発明のもう一つの局面は、患者におけるフラビウイルス関連疾患またはフラビウイルス関連障害を処置する方法に関する。一態様において、本方法は、フラビウイルスを中和する作用物質（例えば本明細書に記載するスクリーニングアッセイによって同定される作用物質および/または本発明の方法に従って同定されるモノクローナル抗体）または前記作用物質の組み合わせを、疾患または障害を患っている患者に投与する工程を伴う。
【０１７０】
併用方法
本発明は、2つまたは3つ以上の抗体、例えばmAb11-LALAまたはmAb11の変種であって、変種のFc領域がFcガンマ受容体に結合しないかFcガンマ受容体への結合が低減しているものを、当技術分野において公知の他のフラビウイルス中和抗体、例えばmAb11と共に投与することによる、患者におけるウエストナイル熱、髄膜炎、デング熱、黄熱または脳炎などのフラビウイルス関連疾患またはフラビウイルス関連障害の処置を提供する。もう一つの態様では、本発明は、本発明の抗体、例えば本明細書に記載するmAb11-LALAまたはmAb11変種を、当技術分野において公知の任意の抗ウイルス剤と共に投与することによって、患者におけるフラビウイルス関連疾患またはフラビウイルス関連障害を処置するための方法を提供する。抗ウイルス剤は、ペプチド、核酸、小分子、阻害剤、またはRNAiであることができる。
【０１７１】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、以下の実施例は添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１７２】
実施例1:マウスにおける致死性デング2型ウイルス感染の予防
ここでは、マウスにおけるmAb11抗体（野生型と改変Fc領域を持つ変異型との両方）の投与の予防効果を調べる研究を説明する。この研究では40匹のマウスを評価し、その40匹を各8匹の5群に分割した。第1群では、マウスにアイソタイプ対照IgG対照抗体を投与した。第2群には250μg/マウス（約12.5mg/kg）の野生型mAb11を投与した。第3群には50μg/マウス（約2.5mg/kg）の野生型mAb11（wt mAb）を投与した。第4群には250μg/マウス（約12.5mg/kg）の、Fc領域にLALA変異を持つmAb11（mut mAb）を投与した。第5群には50μg/マウス（約2.5mg/kg）の、Fc領域にLALA変異を持つmAb11（mut mAb）を投与した。
【０１７３】
抗体処置（対照、野生型mAb11または変異型mAb11）の施行後のある期間後に、例えば4時間または24時間後に、マウスに致死量のデング2型ウイルスを注射した。次に、体重減少、罹病、ならびに外観（外被および眼の外観）、運動性、および態度を含む臨床スコア（下記の表に例示するとおり）などのさまざまな因子について、マウスを10日間にわたって毎日観察した。
【０１７４】
（表１）臨床スコア
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5以上のスコアがつくか、かつ/または体重減少が20％に達した場合は、マウスを安楽死させた。
【０１７５】
研究結果を定量化して図3に提示する。具体的に述べると、図3Aは、異なるマウス群の生存率を示すカプラン-マイヤー曲線を表している。これらの結果は、対照抗体および両投薬量の野生型mAb11が、マウスを疾患関連死/安楽死から保護するのに有効でなかったことを示している。これに対し、本発明の変異型mAb11を投与されたマウスはどちらの投薬量でも全て、致死用量の感染に耐えて生き残った。これらの結果は、変異型mAb11がフラビウイルス感染に関して、特に野生型抗体と比較して、予防効力を有することを実証している。
【０１７６】
感染前からの体重減少％を比較すると（図3B）、変異型mAb11を投与された動物は、対照抗体または野生型mAb11を投与された動物が試験の間に失った体重よりも、体重減少が少なかった。臨床スコア解析では、対照の外観および態度に関する他の定性的間接結果を組み合わせて、観察された動物の健康状態をスコア化する。図3Cに示すとおり、対照または野生型mAb11を投与された動物の健康状態は、急速に低下したが（臨床スコア数は4以上に上昇した）、変異型mAb11を投与された動物は感染10日後でも、健康で、用心深く、よく動く状態を保っていた。
【０１７７】
総合すると、これらの結果は全て、変異型mAb11がフラビウイルス感染関連死を効果的に防止し、疾患の症状の進行を遅延させ、デングウイルスに感染したマウスに総合的な予防効果を持っていたことを示している。
【０１７８】
実施例2:哺乳動物細胞由来の抗体と植物細胞由来の抗体との比較
本明細書において説明するように、本発明の抗体は、トランスジェニック植物において産生することができる。他の研究により、ヒトにおける処置のための投与に適したヒト化抗体が、植物中でうまく産生されることが示されている。さらにまた、植物における治療用抗体産生は哺乳動物細胞における抗体産生に代わる安価で効率のよい手段であり、そのうえ、動物病原性夾雑物も含まない。本発明のmAb11抗体（Fc領域にLALA変異を含有するもの;mutAb）の効力を調べるために、哺乳動物発現系から産生された抗体と植物（タバコ植物）から産生された抗体とをインビボで比較した。
【０１７９】
この研究にはA129マウスを使用した。A129マウスは、中枢神経系におけるウイルス複製を制限するのに必要なIFNα/β受容体を欠く。A129マウスは、フラビウイルス感染に関してヒト疾患を再現するのに、この分野において最も厳密なモデルである。1PFU（プラーク形成単位）のデングウイルスに感染させたA129マウスは、麻痺を起こす（Prestwood et al, J. Virol, 2012,
【０１８０】
この研究では45匹のマウスを評価し、その45匹を各9匹の5群に分割した。第1群では、マウスに対照IgG抗体を投与した。使用した対照抗体はZ-MAB（Zero-結合モノクローナル抗体;AB Biosciences）である。第2群には、哺乳動物発現系において産生された250μg/マウス（約12.5mg/kg）の、Fc領域にLALA変異を持つmAb11（mut mAb）（mutAb哺乳動物）を投与した。第3群には、哺乳動物発現系において産生された50μg/マウス（約2.5mg/kg）の変異型mAb11を投与した。第4群には、植物発現系において産生された250μg/マウス（約12.5mg/kg）の変異体mAb（mutAb植物）を投与した。第5群には、植物発現系において産生された50μg/マウス（約2.5mg/kg）の変異体mAb11を投与した。
【０１８１】
マウスには上述した抗体の投薬量で投与した後、致死用量のデングウイルスでチャレンジした。次に、体重減少、罹病、ならびに外観（外被および眼の外観）、運動性、および態度を含む臨床スコア（表1に記載のとおり）などのさまざまな因子について、マウスを20日間にわたって毎日観察した。
【０１８２】
これらの研究の結果を図4、5および6に要約する。図5は、マウスの総生存率を表す。哺乳動物系から産生された変異型mAb11はどちらの用量でも、対照と比較してウイルス感染からの保護効果を示した（図4A）。実施例1および図3に示した結果と同様に、mutAb抗体を投与されたマウスは全て、研究10日目を越えて生き残った。図Bに示すように、植物からのmutAbはどちらの用量でも保護効果を示した。哺乳動物および植物からの2種のmutAb同士の比較を図3に示す。この図は、植物からのmutAbが、疾患進行および疾患死からマウスを保護するのに、より一層効果的というわけではないにしても、ちょうど同程度には有効であることを示している。
【０１８３】
図5は、研究中の動物の体重減少％を表している。mutAb哺乳動物抗体とmutAb植物抗体は共に、どちらも、対照抗体と比較してマウスを体重減少から保護した（図5Bおよび5C）。哺乳動物由来のmutAbと植物由来のmutAbとの比較は、抗体産生方法の結果としての体重減少に有意な相違を示さなかった（図5A）。
【０１８４】
図6は、研究の間の動物の臨床スコアを表している。mutAb哺乳動物抗体およびmutAb植物抗体の投与は、対照抗体と比較して症状の進行または重症度からマウスを保護した（図6Bおよび6C）。哺乳動物由来のmutAbと植物由来のmutAbとの比較により、これら2種の抗体の性能は類似していることが示され、高い方の投薬量で植物由来mutAb（250μg）を投与されたマウスは、臨床スコアによる測定では、わずかにより良い総合的健康状態を示した（図6A）。
【０１８５】
総合すると、これらの結果は、本発明の変異型抗体の産生は、疾患の防御および重症度の低減に関して、標準的な哺乳動物発現系によって産生された抗体とちょうど同じ程度に有効であったことを示している。測定されたパラメータの一部については、植物由来抗体が、とりわけ高用量のmutAb植物由来抗体において、哺乳動物由来の抗体と比較して、わずかに増加した治療効果を有することを示した。したがって、植物由来の本発明の抗体は、フラビウイルス感染の防御および処置に有用であるだろう。
【０１８６】
他の態様
本発明をその詳細な説明と共に記載したが、上記の説明は、本発明を例示しようとするものであって、添付の特許請求の範囲によって画定される本発明の範囲を限定する意図はない。他の局面、利点、および変更態様も、添付の特許請求の範囲の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年11月26日(2018.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列GYSTH（SEQ ID NO: 21）、WDNPSSGDTTYAENFRG（SEQ ID NO: 22）、およびGGDDYSFDH（SEQ ID NO: 23）をそれぞれ含む3つのCDRを有する、ヒト化または完全ヒト免疫グロブリン重鎖ポリペプチドをコードする核酸配列であって、重鎖ポリペプチドが、Fc領域がFcγ受容体に結合しないように、Fc領域中に1つまたは複数の変異を有する、前記核酸配列。
【請求項２】
アミノ酸配列RGDSLRSYYAS（SEQ ID NO: 24）、GENNRPS（SEQ ID NO: 25）、およびNSRDSSDHLLL（SEQ ID NO: 26）をそれぞれ含む3つのCDRを有するヒト化または完全ヒト免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項３】
請求項1記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項４】
請求項2記載の核酸をさらに含む、請求項3記載のベクター。
【請求項５】
請求項2記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項６】
請求項4記載のベクターを含む、細胞。
【請求項７】
細胞が植物細胞である、請求項6記載の細胞。
【請求項８】
請求項3記載のベクターによって産生される抗体。
【請求項９】
Fc領域中の1つまたは複数の変異が、アミノ酸位置233、234、235、236、237、250、314、または428にある、請求項1記載の核酸。