(57)【要約】【課題】ヒアルロニダーゼを含む新規な組換えエキソソーム及びその用途を提供する。【解決手段】本発明は、ヒアルロニダーゼを含む組換えエキソソーム及びその用途に関するものであって、さらに詳細には、膜表面にヒアルロニダーゼを提示する組換えエキソソーム及びその抗癌剤としての用途に関するものである。【選択図】図８Ｅ
2019208422.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜に組換えヒアルロニダーゼが提示された組換えエキソソーム。
【請求項２】
前記ヒアルロニダーゼは、ＧＰＩ−アンカリングされた形態の膜結合ヒアルロニダーゼである請求項１に記載の組換えエキソソーム。
【請求項３】
前記ＧＰＩ−アンカリングされた形態の膜結合ヒアルロニダーゼは、全長ＰＨ２０である請求項２に記載の組換えエキソソーム。
【請求項４】
前記ＰＨ２０は、配列番号１〜３０に記載されるアミノ酸配列のうち何れか１つを含む請求項３に記載の組換えエキソソーム。
【請求項５】
請求項１ないし請求項４のうち何れか一項に記載の組換えエキソソームを有効成分として含む癌治療用組成物。
【請求項６】
膜に組換えヒアルロニダーゼが提示され、内部に坑癌化合物が封入された組換えエキソソームを有効成分として含む癌治療用薬学的組成物。
【請求項７】
膜に組換えヒアルロニダーゼが提示された組換えエキソソーム及び坑癌化合物を有効成分として含む癌治療用薬学的組成物。
【請求項８】
前記坑癌化合物は、免疫原性細胞死誘導剤、免疫チェックポイント阻害剤、有糸分裂阻害剤、代謝拮抗剤、ホルモン剤、アルキル化剤、Ｆｌｔ３リガンド、及びトポイソメラーゼ阻害剤で構成される群から選択される１つまたは２つ以上の組合わせである請求項６または７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記免疫原性細胞死誘導剤は、アントラサイクリン系抗癌剤、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、タキサン系抗癌剤、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、シクロホスファミド、強心性配糖体、ＧＡＤＤ３４／ＰＰ１阻害剤、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）またはオキサリプラチンである請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記アントラサイクリン系抗癌剤は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピクサントロン、サバルビシン、またはバルビシンである請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記強心性配糖体は、非免疫原性細胞死誘導剤と組合わせられて使われる請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記ＧＡＤＤ３４／ＰＰ１阻害剤は、マイトマイシンと組合わせられて使われる請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記タキサン系抗癌剤は、パクリタキセルまたはドセタキセルである請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用阻害剤またはＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／Ｂ７−２相互作用阻害剤である請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用阻害剤は、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブまたはアベルマブである請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／Ｂ７−２相互作用阻害剤は、イピリムマブである請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載の組換えエキソソームを癌にかかった個体に投与する段階を含む前記個体の癌治療方法。
【請求項１８】
坑癌化合物を前記個体にさらに投与する請求項１７に記載の癌治療方法。
【請求項１９】
前記坑癌化合物は、前記組換えエキソソームと同時に投与されるか、間隔を置いて順次に投与される請求項１８に記載の癌治療方法。
【請求項２０】
追加的に、前記個体に光力学治療法または放射線治療法を施行する請求項１７に記載の癌治療方法。
【請求項２１】
追加的に、前記個体に光力学治療法または放射線治療法を施行する請求項１８に記載の癌治療方法。
【請求項２２】
治療的に有効な量の膜に組換えヒアルロニダーゼが提示され、内部に坑癌化合物が封入された組換えエキソソームを癌にかかった個体に投与する段階を含む前記個体の癌治療方法。
【請求項２３】
追加的に、前記個体に光力学治療法または放射線治療法を施行する請求項２２に記載の癌治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な組換えエキソソーム及びその用途に係り、より具体的には、表面にヒアルロニダーゼを提示する新規な組換えエキソソーム及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌治療のためのナノ薬物に関するこれまでの研究成果にもかかわらず、薬物伝達に使われるほとんどのナノ粒子は、腫瘍組織を深く侵透できず、固形腫瘍の血管周辺のみに限定されるために、その治療効能が制限された（Ｍａｎｚｏｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１２，７２：５５６６−５５７５，２０１２；Ｊａｉｎ  ａｎｄ  Ｓｔｙｌｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．７：６５３−６６４，２０１０；Ｍｉｎｃｈｉｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｔａｎｎｏｃｋ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ６：５８３−５９２，２００６）。腫瘍内ナノ粒子蓄積の程度は、癲癇液圧力の上昇と稠密に複雑な細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）のために、深刻に制限される。
【０００３】
ＥＣＭは、主にヒアルロン酸（ＨＡ）とグリコサミノグリカン（ｇｌｕｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ）ゲル内に包埋された稠密コラーゲンネットワークで構成され（Ｔｏｏｌｅ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，４（７）：５２８−５３９，２００４；Ｅｖａｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５９（１３）：１３５１−１３６５，２００７）、腫瘍微小環境で癲癇内圧力の形態で強力な物理的及び流体力学的障壁を作り出す（Ｓｈｅｐａｒｄ，Ｆｒｏｎｔ  Ｏｎｃｏｌ．，５：１９２，２０１５；Ｈｅｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ４（１０）：８０６−８１３，２００４；Ｗａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．，４０（１）：２１−４１，２０１２）。
【０００４】
腫瘍微小環境内でのＥＣＭ破壊に対する治療戦略（Ｗｈａｔｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．１（４）：２９１−２９６，２０１１；Ｔｏｎｇ  ａｎｄ  Ｋｏｈａｎｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，５６：４１−５７，２０１６）は、ＰＥＧ−ＰＨ２０（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ｒＨｕＰＨ２０酵素、組換えヒトヒアルロニダーゼ酵素）を含む多様な臨床試験を進行させながら、臨床的に迅速に発展しつつある（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，９（１１）：３０５２−３０６４，２０１１；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，１６（５）：３２６８−３２７７，２０１６；Ｈｉｎｇｏｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２０１６，２２（１２）：２８４８−２８５４，２０１６）。また、腫瘍で酵素伝達効率とナノ粒子の拡散とを向上させるために、高分子ナノ粒子でＥＣＭ分解酵素の多価提示（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）戦略が開発されている（Ｖｉｌｌｅｇａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ．７（４３）：２４０７５−２４０８１；Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２（２）：２６５−２７４，２００７；Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０８（６）：２４２６−２４３１．２０１１；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ  ６（７）：１０１２−１０２２，２０１６）。しかし、このようなナノ剤形の可能な問題点は、酵素固定化のための追加工程によって、酵素特性が非可逆的に変化されるということである。また、膜結合グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）ドメインが欠けている切断されたＰＨ２０の形態を有する化学的に変形された合成ナノ粒子の治療効能に対する恐れが依然として残っている（Ｒｏｓｅｎｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＡＰＳ  Ｊ．１７（５）：１１４４−１１５６，２０１５；Ａｒｍｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４７（３）：８１０−８１４，１９９７）。天然ＰＨ２０ヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）のＧＰＩアンカリング（ａｎｃｈｏｒａｇｅ）は、細胞表面でタンパク質の移動性を増加させて、卵保護膜（ｅｇｇ  ｖｅｓｔｍｅｎｔ）への成功的な浸透のための最大速度及び卵子−精子の膜融合を可能にする（Ｈｕｎｎｉｃｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５４（６）：１３４３−１３４９，１９９６；Ｓａｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｎｄｒｏｌ．，１８（２）：１５１−１５８，１９９７）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、前記問題点を含んだ多様な問題点を解決するためのものであって、より効率的なＰＨ２０に基づいたナノ薬物及びそれを利用した坑癌免疫治療剤及び膵腸細胞でのインスリン分泌促進を通じる糖尿病治療剤を提供することを目的とする。しかし、このような課題は、例示的なものであって、これにより、本発明の範囲が限定されるものではない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一観点によれば、膜に組換えヒアルロニダーゼが提示された組換えエキソソーム（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｘｏｓｏｍｅ）が提供される。
【０００７】
本発明の他の一観点によれば、前記組換えエキソソームを有効成分として含む癌治療用組成物が提供される。
【０００８】
本発明の他の一観点によれば、膜に組換えヒアルロニダーゼが提示され、内部に坑癌化合物が封入された組換えエキソソームを有効成分として含む癌治療用組成物が提供される。
【０００９】
本発明の他の一観点によれば、膜に組換えヒアルロニダーゼが提示された組換えエキソソーム及び坑癌化合物を有効成分として含む癌治療用組成物が提供される。
【００１０】
本発明の他の一観点によれば、治療的に有効な量の前記組換えエキソソームを癌にかかった個体に投与する段階を含む前記個体の癌治療方法が提供される。
【００１１】
本発明の他の一観点によれば、治療的に有効な量の膜に組換えヒアルロニダーゼが提示され、内部に坑癌化合物が封入された組換えエキソソームを癌にかかった個体に投与する段階を含む前記個体の癌治療方法が提供される。
【発明の効果】
【００１２】
前記のようになされた本発明の一実施例による組換えエキソソームは、腫瘍組織周辺に布陣して、兔疫細胞及び坑癌化合物の近接を妨害する細胞外基質を分解させることによって、遺伝子の伝達のような複雑な機転に依らずとも、癌細胞を選択的に除去することができて、癌の治療に有用に使われる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株から本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（以下、‘Ｅｘｏ−ＰＨ２０’と略称する）の製造及び特性を示したものであって、図１Ａは、Ｅｘｏ−ＰＨ２０でのＰＨ２０及びエキソソームマーカーとしてのＡｌｉｘ及びＴｓｇ１０１の発現を検出するための抗体を利用したウェスタンブロットの分析結果を示す。
【図１Ｂ】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株から本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（以下、‘Ｅｘｏ−ＰＨ２０’と略称する）の製造及び特性を示したものであって、図１Ｂは、本発明のＥｘｏ−ＰＨ２０のＰＨ２０発現を定量するために、標準として順次に希釈された組換えＰＨ２０（ｒＨｕＰＨ２０）を使用したウェスタンブロットの分析結果を示す。
【図１Ｃ】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株から本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（以下、‘Ｅｘｏ−ＰＨ２０’と略称する）の製造及び特性を示したものであって、図１Ｃは、本発明の一実施例によるＥｘｏ−ＰＨ２０のサイズ分布を動的光散乱分析（ＤＬＳ）で分析した結果を示すグラフ、及び前記Ｅｘｏ−ＰＨ２０を透過電子顕微鏡で撮影した写真（グラフ内の右側、スケールバー：上側１００ｎｍ及び下側２０ｎｍ）である。
【図１Ｄ】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株から本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（以下、‘Ｅｘｏ−ＰＨ２０’と略称する）の製造及び特性を示したものであって、図１Ｄは、対照群エキソソーム（以下、‘Ｅｘｏ−Ｃｏｎ’と略称する）のサイズ分布を動的光散乱分析（ＤＬＳ）で分析した結果を示すグラフ、及び前記Ｅｘｏ−ＰＨ２０を透過電子顕微鏡で撮影した写真（グラフ内の右側、スケールバー：上側１００ｎｍ及び下側２０ｎｍ）である。
【図１Ｅ】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株から本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（以下、‘Ｅｘｏ−ＰＨ２０’と略称する）の製造及び特性を示したものであって、図１Ｅは、同一質量に換算されたヒト組換えＰＨ２０と本発明のＥｘｏ−ＰＨ２０との酵素活性を比較したグラフである。
【図１Ｆ】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株から本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（以下、‘Ｅｘｏ−ＰＨ２０’と略称する）の製造及び特性を示したものであって、図１Ｆは、Ｅｘｏ−ＰＨ２０に発現されているＰＨ２０ヒアルロニダーゼがエキソソームの脂質ラフト（ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔ）に存在することを示すためのウェスタンブロットの分析結果である。
【図２Ａ】本発明の一実施例によって製造されたＰＨ２０表面提示及びドキソルビシン内部封入エキソソーム（以下、‘Ｅｘｏ−ＰＨ２０Ｄｏｘ’）の製造及び特性を示したものであって、図２Ａは、多様な量のドキソルビシン（試料当たり繰り返し回数ｎ＝３）と反応させた１００μｇのエキソソームのドキソルビシン積載量を定量した結果を示すグラフである。
【図２Ｂ】本発明の一実施例によって製造されたＰＨ２０表面提示及びドキソルビシン内部封入エキソソーム（以下、‘Ｅｘｏ−ＰＨ２０Ｄｏｘ’）の製造及び特性を示したものであって、図２Ｂは、Ｅｘｏ−ＰＨ２０Ｄｏｘを透過電子顕微鏡で撮影した結果を示す写真であって、左側のスケールバーは、１００ｎｍを示し、右側のスケールバーは、２０ｎｍを示す。
【図２Ｃ】本発明の一実施例によって製造されたＰＨ２０表面提示及びドキソルビシン内部封入エキソソーム（以下、‘Ｅｘｏ−ＰＨ２０Ｄｏｘ’）の製造及び特性を示したものであって、図２Ｃは、Ｅｘｏ−ＰＨ２０Ｄｏｘのサイズ分布を動的光散乱分析（ＤＬＳ）で分析した結果を示すグラフである。
【図２Ｄ】本発明の一実施例によって製造されたＰＨ２０表面提示及びドキソルビシン内部封入エキソソーム（以下、‘Ｅｘｏ−ＰＨ２０Ｄｏｘ’）の製造及び特性を示したものであって、図２Ｄは、生理学的環境（ｐＨ７．４、−●−）及び癌微小環境と類似した酸性条件
【００１４】
【数１】
2019208422.tif 000003
【００１５】
での経時的なドキソルビシンの放出程度（％）を示すグラフである。
【図２Ｅ】本発明の一実施例によって製造されたＰＨ２０表面提示及びドキソルビシン内部封入エキソソーム（以下、‘Ｅｘｏ−ＰＨ２０Ｄｏｘ’）の製造及び特性を示したものであって、図２Ｅは、同一質量に換算されたヒト組換えＰＨ２０と本発明のＥｘｏ−ＰＨ２０、Ｅｘｏ−ＰＨ２０Ｄｏｘとの酵素活性を比較したグラフである。
【図３Ａ】本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０）の試験管内条件での酵素活性を分析した結果を示すものであって、図３Ａの左側は、同一質量に換算されたヒト組換えＰＨ２０とＥｘｏ−ＰＨ２０とを３０分間処理した後、腫瘍ＨＡの枯渇程度を対照群ＰＣ３  ＨＡ領域に比べて、実験群ＰＣ３  ＨＡ領域の相対的長さを測定した結果を示すグラフであり、右側は、ＰＨ２０  ５３ｎｇに換算されたヒト組換えＰＨ２０とＥｘｏ−ＰＨ２０とを処理した時、位相差顕微鏡で撮影した結果であって、ＰＣ３細胞の拡大された代表イメージ（スケールバー：１００μｍ）である。
【図３Ｂ】本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０）の試験管内条件での酵素活性を分析した結果を示すものであって、図３Ｂは、同一質量のＰＨ２０（０、５．３、２６．５、５３ｎｇ）に換算されたヒト組換えＰＨ２０とＥｘｏ−ＰＨ２０とを３０分間処理した時、位相差顕微鏡で撮影した結果であって、ＰＣ３細胞（上段）及び拡大されたイメージ（下段、スケールバー：上側５０μｍ及び下側１００μｍ）でＰＨ２０に敏感なＨＡの代表イメージである。
【図３Ｃ】本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０）の試験管内条件での酵素活性を分析した結果を示すものであって、図３Ｃは、Ｅｘｏ−ＰＨ２０で１時間処理した腫瘍ＨＡ枯渇をリアルタイムで検出した結果を示す位相差顕微鏡撮影イメージであって、ＨＡ高発現ＰＣ３癌細胞周囲のＨＡ（黄色の矢印）は、固定された赤血球を排除することで検出された。
【図４Ａ】本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０）の腫瘍内投与後、生体内条件での坑癌活性を分析した結果を示すものであって、図４Ａは、Ｅｘｏ−ＰＨ２０（スケールバー：２００μｍ）を投与したＰＣ３腫瘍保有動物から摘出された腫瘍組織に対する免疫組織化学の結果を撮影した写真であって、Ｅｘｏ−ＰＨ２０（５ｍｇ／ｋｇ）の腫瘍内投与後、ＰＣ３異種移植片を６、１２、２４、４８及び９６時間経過後、回収して腫瘍薄片に対して抗ＰＨ２０抗体（上段）及び抗ＨＡＢＰ抗体（下段）を使用して染色した結果である。
【図４Ｂ】本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０）の腫瘍内投与後、生体内条件での坑癌活性を分析した結果を示すものであって、図４Ｂは、対照群として同一量のＥｘｏ−Ｃｏｎを腫瘍内投与した後、ＰＣ３異種移植片を６、１２、２４、４８及び９６時間経過後、回収して腫瘍薄片に対して抗ＨＡＢＰ抗体を使用してＨＡに対して染色した結果である。
【図４Ｃ】本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０）の腫瘍内投与後、生体内条件での坑癌活性を分析した結果を示すものであって、図４Ｃは、ＰＣ３細胞保有癌モデルに対してＰＨ２０  ５３０ｎｇの同一質量に換算されたヒト組換えＰＨ２０と本発明のＥｘｏ−ＰＨ２０及び対照群としてＥｘｏ−Ｃｏｎ及びＰＢＳとをそれぞれ腫瘍内投与後、経時的な腫瘍の体積を測定した結果を示すグラフである。
【図４Ｄ】本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０）の腫瘍内投与後、生体内条件での坑癌活性を分析した結果を示すものであって、図４Ｄは、ＰＣ３細胞保有癌モデルに対してＰＢＳ、Ｅｘｏ−Ｃｏｎ及びＰＨ２０  ５３０ｎｇの同一質量に換算されたヒト組換えＰＨ２０と本発明のＥｘｏ−ＰＨ２０とをそれぞれ腫瘍内投与後、経時的なマウスの重量を測定した結果を示すグラフである。
【図４Ｅ】本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０）の腫瘍内投与後、生体内条件での坑癌活性を分析した結果を示すものであって、図４Ｅは、腫瘍切除術を通じてＰＣ３保有マウスモデルでＰＨ２０  ５３０ｎｇ及び２６５ｎｇの同一質量に換算されたヒト組換えＰＨ２０と本発明のＥｘｏ−ＰＨ２０及び対照群としてＥｘｏ−Ｃｏｎ及びＰＢＳとをそれぞれ腫瘍内投与後、実験終点から摘出された腫瘍の重量を示すグラフであって、各値は、平均±ＳＤ（ＡＮＯＶＡ分析によって、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、グループ当たりマウス数ｎ＝５）を示す。
【図４Ｆ】本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０）の腫瘍内投与後、生体内条件での坑癌活性を分析した結果を示すものであって、図４Ｆは、ＰＢＳ、Ｅｘｏ−Ｃｏｎ及びＰＨ２０  ５３０ｎｇ及び２６５ｎｇの同一質量に換算されたヒト組換えＰＨ２０、Ｅｘｏ−ＰＨ２０を投与した動物で腫瘍移植２８日経過後、摘出されたＰＣ３癌を羅列したイメージである。
【図４Ｇ】本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０）の腫瘍内投与後、生体内条件での坑癌活性を分析した結果を示すものであって、図４Ｇは、ＰＢＳ、Ｅｘｏ−Ｃｏｎ及びＰＨ２０  ５３０ｎｇの同一質量に換算されたヒト組換えＰＨ２０、Ｅｘｏ−ＰＨ２０を投与した動物で腫瘍移植２８日経過後、摘出されたＰＣ３腫瘍薄片を抗ＨＡＢＰ抗体を用いて染色した免疫組織化学の写真である。
【図５Ａ】本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０）の静脈注射後、生体内条件での坑癌活性を分析した結果を示すものであって、図５Ａは、ＰＣ３腫瘍細胞を保有したＢＡＬＢ／ｃヌードマウスでｃｙ５．５蛍光染料で標識したＥｘｏ−Ｃｏｎ、Ｅｘｏ−ＰＨ２０（１０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与後、時間（０、１、３、６、１２、２４時間）によってエキソソームの体内分布を確認したラットの全身蛍光イメージである。
【図５Ｂ】本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０）の静脈注射後、生体内条件での坑癌活性を分析した結果を示すものであって、図５Ｂは、ＰＣ３腫瘍細胞を保有したＢＡＬＢ／ｃヌードマウスでｃｙ５．５蛍光染料で標識したＥｘｏ−Ｃｏｎ、Ｅｘｏ−ＰＨ２０（１０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与後、２４時間が経た時点で摘出したラットの癌及び臓器（腎臓、脾臓、肝、心臓、肺）にエキソソームの蓄積された程度を確認した蛍光イメージである。
【図５Ｃ】本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０）の静脈注射後、生体内条件での坑癌活性を分析した結果を示すものであって、図５Ｃは、ＰＣ３腫瘍細胞を保有したＢＡＬＢ／ｃヌードマウスで１０ｍｇ／ｋｇのＥｘｏ−Ｃｏｎ、Ｅｘｏ−ＰＨ２０静脈内投与による腫瘍成長を記録したグラフであって、各値は、ＡＮＯＶＡによる平均±ＳＤ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、グループ当たりマウス数ｎ＝５）で示す。
【図５Ｄ】本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０）の静脈注射後、生体内条件での坑癌活性を分析した結果を示すものであって、図５Ｄは、腫瘍切除術を通じてＰＣ３保有マウスモデルで実験終点から摘出された腫瘍の重量を示すグラフであって、各値は、平均±ＳＤ（ＡＮＯＶＡ分析によって、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、グループ当たりｎ＝５匹のマウス）を示す。
【図５Ｅ】本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０）の静脈注射後、生体内条件での坑癌活性を分析した結果を示すものであって、図５Ｅは、実験終点から摘出されたＰＣ３腫瘍薄片を抗ＨＡＢＰ抗体を用いて染色した免疫組織化学の写真である。
【図５Ｆ】本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０）の静脈注射後、生体内条件での坑癌活性を分析した結果を示すものであって、図５Ｆは、Ｅｘｏ−ＰＨ２０がＰＣ３腫瘍の微小血管領域に及ぼす影響を示したものであって、左側は、ＰＢＳ（−●−）、Ｅｘｏ−Ｃｏｎ（−○−、１０ｍｇ／ｋｇ）及び
【００１６】
【数２】
2019208422.tif 000004
【００１７】
静脈投与後、時間経過（ｔ＝０、１、３、６及び２４時間）による相対血流（血管化率、％）を高解像度超音波映像で２０ｍｍ２当たり血管分布を用いて計算した結果を示すグラフであり、右側は、２４時間経過後、血流の状態を確認するために撮影した超音波映像である。
【図５Ｇ】本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０）の静脈注射後、生体内条件での坑癌活性を分析した結果を示すものであって、図５Ｇは、３つのグループで時間の経過（ｔ＝０、１、３、６及び２４時間）によって撮影した超音波映像である。
【図６】本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０）の全身投与後、ナノ粒子の癌組織への浸透の増加有無を分析した結果であって、Ｅｘｏ−ＰＨ２０がＰＣ３異種移植モデルでリポソームの腫瘍内分布を向上させることを示す腫瘍組織薄片に対する蛍光イメージであって、スケールバーは、１００μｍであり、ＰＣ３腫瘍保有マウスのしっぽ静脈注射を通じて１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅｘｏ−ＰＨ２０を投与した後、３時間後にｃｙ５．５−標識されたリポソーム（４ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射し、リポソーム注入７時間経過後、腫瘍組織を摘出し、ＯＣＴ媒質に包埋して冷凍薄片化した後、蛍光顕微鏡下で分析し、Ｈｏｅｃｈｓｔは、核（青色）の染色に使用し、血管は、抗ＣＤ３１抗体（緑色）で染色した。
【図７Ａ】免疫能力モデル動物での本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０）の４Ｔ１異種移植モデル免疫能力マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に全身投与後、坑癌活性を分析した結果を示すものであって、図７Ａは、１０ｍｇ／ｋｇのＥｘｏ−ＰＨ２０の全身投与後、経時的な腫瘍成長を記録したグラフであって、各値は、平均±ＳＤ（ＡＮＯＶＡ分析によって、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、グループ当たりｎ＝５匹のマウス）を示す。
【図７Ｂ】免疫能力モデル動物での本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０）の４Ｔ１異種移植モデル免疫能力マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に全身投与後、坑癌活性を分析した結果を示すものであって、図７Ｂは、前記図７Ａの実験終了後、摘出された腫瘍組織の重量を測定した結果を示すグラフであって、各値は、平均±ＳＤ（ＡＮＯＶＡ分析によって、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、グループ当たりマウス数ｎ＝５）を示す。
【図７Ｃ】免疫能力モデル動物での本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０）の４Ｔ１異種移植モデル免疫能力マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に全身投与後、坑癌活性を分析した結果を示すものであって、図７Ｃは、４Ｔ１腫瘍の凍結薄片から浸潤されたＣＤ８＋Ｔ細胞を示す免疫蛍光染色イメージであって、スケールバーは、１００μｍを示し、腫瘍移植２５日後、切除された腫瘍標本を抗マウスＣＤ８抗体で染色し、マウスＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ−４８８  ２次抗体（緑色）で染色し、Ｈｏｅｃｈｓｔは、核（青色）の染色に使われる。
【図７Ｄ】免疫能力モデル動物での本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示組換えエキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０）の４Ｔ１異種移植モデル免疫能力マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に全身投与後、坑癌活性を分析した結果を示すものであって、図７Ｄは、４Ｔ１腫瘍の凍結薄片から浸潤されたＣＤ８＋Ｔ細胞の数を表記したグラフであって、図７Ｃに示したイメージを含んだ１０枚のイメージでＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞を計数し、各値は、平均±ＳＤ（ＡＮＯＶＡ分析によって、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）を示す。
【図８Ａ】本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示及びドキソルビシン内部封入エキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０Ｄｏｘ）の坑癌活性を分析した結果を示すものであって、図８Ａは、陰性対照群としてＰＢＳ（−●−）、遊離ドキソルビシン（Ｆｒｅｅ  Ｄｏｘ、１ｍｇ／ｋｇ、−○−）、ＰＨ２０表面提示エキソソーム
【００１８】
【数３】
2019208422.tif 000005
【００１９】
、ドキソルビシン封入対照エキソソーム（Ｅｘｏ−ＣｏｎＤｏｘ、１０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ  ｄｏｘ  ｄｏｓｅに相応する、−△−）及びＰＨ２０表面提示及びドキソルビシン内部封入エキソソーム
【００２０】
【数４】
2019208422.tif 000006
【００２１】
を静脈投与したＰＣ３保有異種移植腫瘍モデル動物の経時的な腫瘍成長を示すグラフである。
【図８Ｂ】本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示及びドキソルビシン内部封入エキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０Ｄｏｘ）の坑癌活性を分析した結果を示すものであって、図８Ｂは、前記図８Ａの実験終了後、腫瘍組織を摘出して腫瘍組織の重量を測定した結果を示すグラフであって、図８Ａ及び図８Ｂで、データは、平均±ＳＤ（ＡＮＯＶＡ分析によって（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、各グループ当たりマウス数ｎ＝５）。
【図８Ｃ】本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示及びドキソルビシン内部封入エキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０Ｄｏｘ）の坑癌活性を分析した結果を示すものであって、図８Ｃは、図８Ｂから摘出された各実験群の腫瘍組織を撮影した写真である。
【図８Ｄ】本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示及びドキソルビシン内部封入エキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０Ｄｏｘ）の坑癌活性を分析した結果を示すものであって、図８Ｄは、ＰＣ３腫瘍保有マウスに３ｍｇ／ｋｇドキソルビシンを封入したエキソソームを静脈投与後、２４時間が経た時点に摘出した腫瘍組織で薬物分布に対するＰＣ３腫瘍組織断面を共焦点蛍光顕微鏡で撮影した写真であって（スケールバー：５０μｍ）、Ｈｏｅｃｈｓｔは、核（青色）の染色に使われ、血管は、抗ＣＤ３１抗体（緑色）で染色する。
【図８Ｅ】本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示及びドキソルビシン内部封入エキソソーム（Ｅｘｏ−ＰＨ２０Ｄｏｘ）の坑癌活性を分析した結果を示すものであって、図８Ｅは、本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示及びドキソルビシン内部封入エキソソームの併用処理の効果を図式的に示した概要図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
用語の定義
本明細書で使われる用語「エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）」は、多くの、おそらく血液、尿、及び細胞培養の培養培地を含むあらゆる生物学的液体に存在するかも知れない、ナノサイズの細胞由来の小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）である。エキソソームのサイズは、３０ｎｍ〜１００ｎｍと知られており、多小胞体（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｂｏｄｙ）が細胞膜と融合する時、細胞から分泌されるか、細胞膜を通じて直接分泌される。エキソソームは、凝固、細胞間信号伝逹、及び代謝廃棄物の管理のような多様な過程で重要な役割を果たしていると知られている。
【００２３】
本明細書で使われる用語「組換えエキソソーム」は、人為的に生産されたエキソソームを意味し、エキソソームを生産することができる宿主細胞（ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）に遺伝子工学（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）によって外来タンパク質を暗号化する遺伝子を形質導入して、形質転換宿主細胞を製造した後、前記形質転換宿主細胞を培養した後、それから収得されたエキソソームである。前記組換えエキソソームには、形質導入された外来タンパク質が内部またはエキソソーム膜に含まれている。
【００２４】
本明細書で使われる用語「ヒアルロニダーゼ」は、ヒアルロン酸（ＨＡ）の分解を触媒する酵素を意味する。カールマイヤー（Ｋａｒｌ  Ｍｅｙｅｒ）は、１９７１年、この酵素を酵素反応産物に基づいて３種のグループに分類した。前記３種の主要類型は、２種の真核細胞エンドグリコシダーゼ加水分解酵素と原核細胞リアーゼ（ｌｙａｓｅ）類型のグリコシダーゼである。ヒトには、ＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２、ＨＹＡＬ３、ＨＹＡＬ４、ＨＹＡＬ５の５種の機能性ヒアルロニダーゼと１種の擬似遺伝子（ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅ）であるＨＹＡＬ６とがあるが、そのうち、ＨＹＡＬ５は、精子付着分子１（ＳＰＡＭ１）またはＰＨ２０と知られており、精子表面タンパク質であるＰＨ２０は、グルコシル加水分解酵素５６族に属し、睾丸から発現される。ＰＨ２０は、ヒアルロン酸でＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸残基との間の（１→４）結合をランダムに加水分解する。ＳＰＡＭ−１／ＰＨ２０は、精子−卵子付着に関与する。受精時に、精子は、まず透明帯（ｚｏｎａ  ｐｅｌｌｕｃｉｄａ）に到逹する前に卵子を取り囲む卵丘細胞層を貫通しなければならないが、卵丘細胞は、排卵前に形成されるヒアルロン酸を含有するマトリックスに包まれている。ＰＨ２０は、ヒアルロン酸を消化させて、精子が卵丘細胞の層を貫通することを支援する。
【００２５】
本明細書で使われる「免疫原性細胞死（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）」は、アントラサイクリン（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ）系抗癌剤、タキサン系抗癌剤、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）及びボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）のような細胞増殖抑制剤や放射線療法及び光力学治療法によって引き起こされる一種の細胞死を意味する。前記免疫原性細胞死は、一般的な細胞死とは異なって、癌細胞の免疫学的細胞死は、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）の活性化とそれによる特異的なＴ細胞反応の活性化とを通じて効果的な坑癌免疫反応を誘発することができる。免疫原性細胞死を誘発する物質を免疫原性細胞死誘導剤（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎｄｕｃｅｒ）または免疫原性細胞死誘導抗癌剤（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔ）と称する。前記免疫原性細胞死及び免疫原性細胞死誘導剤に対しては、Ｋｒｏｅｍｅｒら（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１：５１−７２，２０１３）によく整理されている。前記文献は、全体として本明細書に参照として組み込まれる。
【００２６】
本明細書で使われる「非免疫原性細胞死誘導抗癌剤（ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔ）」は、免疫原性細胞死ではない一般的な細胞死を誘導する物質を意味する。
【００２７】
本明細書で使われる用語「アントラサイクリン系抗癌剤（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎ−ｔｙｐｅ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔ）」は、ストレプトミセス属細菌であるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ  ｖａｒ．ｃａｅｓｉｕｓ由来の癌化学療法に使われる細胞周期非特異的な抗癌剤系列を称する。アントラサイクリン系抗癌剤は、白血病、リンパ腫、乳房癌、胃癌、子宮癌、卵巣癌、膀胱癌、及び肺癌を含んだ多様な癌の治療に使われるが、従来に開発されている化学療法抗癌剤のうち、最も効果的な抗癌剤中の１つである。最初に発見されたアントラサイクリン系抗癌剤としては、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）があり、引き続き開発されているドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、その後に開発されているエピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ピクサントロン（ｐｉｘａｎｔｒｏｎｅ）、サバルビシン（ｓａｂａｒｕｂｉｃｉｎ）、バルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）などが存在する。アントラサイクリン系抗癌剤の作用機転としては、ＤＮＡ／ＲＮＡ鎖の塩基上の間に挿入されることによって、ＤＮＡ及びＲＮＡ合成を抑制して、迅速に成長する癌細胞の複製を妨害すること、トポイソメラーゼＩＩ酵素活性を抑制して、スーパーコイル化ＤＮＡの緊張緩和を抑制して、転写と複製とを妨害すること、鉄媒介遊離酸素ラジカルの形成を通じるＤＮＡ、タンパク質及び細胞膜の損傷誘導及びＤＮＡ損傷反応、エピゲノム及び転写体を脱調節するクロマチンからヒストン放逐誘導などが挙論されている。最近の研究によれば、ドキソルビシンがＣＤ４＋細胞を活性化させることによって、Ｔｈ１免疫反応を増加させると報告され（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．９（１３−１４）：１５３０−１５３９，２００９）、樹状細胞とドキソルビシンの併用投与時に、骨肉腫の免疫学的細胞死（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）を誘発することによって、坑癌活性を示すと報告されている（Ｋａｗａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１：２１６９−２１７５，２０１６）。
【００２８】
本明細書で使われる用語「タキサン系抗癌剤（ｔａｘａｎｏｉｄ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔまたはｔａｘｎｅ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ）」は、イチイ属（Ｔａｘｕｓ  ｓｐ．）の植物から抽出されたジテルペノイドタキサン誘導体（ｄｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ  ｔａｘａｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）であって、細胞内のマイクロチューブルの組立てを増進させ、解体を阻害する機転を有した有糸分裂阻害剤である。現在常用化された薬物としては、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）及びドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）などが存在し、そのうち、パクリタキセルは、Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａの周皮から抽出したタキサン系抗癌剤であって、１９９２年難治性卵巣癌治療剤として米国ＦＤＡの承認を受け、ドセタキセルは、Ｔａｘｕｓ  ｂａｃａａｔａから由来したタキサン系抗癌剤であって、パクリタキセルと効能が類似し、乳房癌、非細胞肺癌、リンパ腫、膀胱癌などの治療に使われており、パクリタキセルに比べて、親水性が高い特性を有している。最近、タキサン系抗癌剤も、癌細胞を細胞毒性Ｔリンパ球に対して感作させることによって、これら癌細胞の免疫原性細胞死を促進させる機転を有すると明らかになっている。
【００２９】
本明細書で使われる用語「免疫チェックポイント阻害剤（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」は、Ｔリンパ球のような特定類型の免疫系細胞及び一部の癌細胞によって生産された特定タンパク質を遮断する類型の薬物を意味するが、これらタンパク質は、免疫反応を抑制し、Ｔリンパ球が癌細胞の殺傷を防止する。したがって、このようなタンパク質が遮断されれば、免疫系の「制動装置」が解けられ、Ｔリンパ球が癌細胞をさらによく殺すことができる。前記「免疫チェックポイント」と現在までよく知られたものは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１及びＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／Ｂ７−２などが存在する。ＰＤ−１阻害剤としては、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ（商標名：Ｋｅｙｔｒｕｄａ）、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ（商標名：Ｏｐｄｉｖｏ）などが存在し、ＰＤ−１のリガンドであるＰＤ−Ｌ１の阻害剤としては、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ（商標名：Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、及びＡｖｅｌｕｍａｂ（商標名：Ｂａｖｅｎｃｉｏ）などが存在する。一方、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／Ｂ７−２の相互作用を阻害するＣＴＬＡ−４阻害剤としては、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ（商標名：Ｙｅｒｖｏｙ）などがＦＤＡの承認を受けた。最近、数年間、特に、転移性黒色腫（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ）またはホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）の患者から印象的な成功を収め、他の類型の癌患者を対象とした臨床試験で多くの可能性を示している。
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明の一観点によれば、膜に組換えヒアルロニダーゼが提示された及び組換えエキソソームが提供される。
【００３１】
前記組換えエキソソームにおいて、前記ヒアルロニダーゼは、ＧＰＩ−アンカリングされた形態の膜結合ヒアルロニダーゼであり、前記ＧＰＩ−アンカリングされた形態の膜結合ヒアルロニダーゼは、全長ＰＨ２０であり、前記ＰＨ２０は、配列番号１〜３０に記載されるアミノ酸配列のうち何れか１つを含みうる。前記配列番号１〜３０に記載されるアミノ酸配列は、表１に記載されたように、ヒトＰＨ２０の３６−４９０  ａ．ａに相応し、相同性が少なくとも８５％以上の他種由来のＰＨ２０またはそれと予測になるタンパク質である。
【００３２】
本発明の他の一観点によれば、前記組換えエキソソームを有効成分として含む癌治療用組成物が提供される。
【００３３】
本発明の他の一観点によれば、膜に組換えヒアルロニダーゼが提示され、内部に坑癌化合物が封入された組換えエキソソームを有効成分として含む癌治療用薬学的組成物が提供される。
【００３４】
本発明の他の一観点によれば、膜に組換えヒアルロニダーゼが提示された組換えエキソソーム及び坑癌化合物を有効成分として含む癌治療用薬学的組成物が提供される。
【００３５】
前記癌治療用薬学的組成物において、前記坑癌化合物は、免疫原性細胞死誘導剤、免疫チェックポイント阻害剤、有糸分裂阻害剤、代謝拮抗剤（ａｎｔｉｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ）、ホルモン剤、アルキル化剤（ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、Ｆｌｔ３リガンドまたはトポイソメラーゼ阻害剤（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）であり得る。
【００３６】
前記癌治療用薬学的組成物において、前記免疫原性細胞死誘導剤は、アントラサイクリン系抗癌剤、タキサン系抗癌剤、抗ＥＧＦＲ抗体、ＢＫチャネル作用剤、ボルテゾミブ、強心性配糖体（ｃａｒｄｉａｃ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）、シクロホスファミド系抗癌剤、ＧＡＤＤ３４／ＰＰ１阻害剤、ＬＶ−ｔＳＭＡＣ、麻しん（Ｍｅａｓｌｅｓ）ウイルス、またはオキサリプラチンであり、強心性配糖体は、非免疫原性細胞死誘導剤と組合わせられて使われ、前記ＧＡＤＤ３４／ＰＰ１阻害剤は、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）と組合わせられて使われ、前記アントラサイクリン系抗癌剤は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピクサントロン、サバルビシン、またはバルビシンであり、前記タキサン系抗癌剤は、パクリタキセルまたはドセタキセルであり、前記免疫原性細胞死誘導剤は、前記免疫チェックポイント阻害剤と組合わせられて使われる。
【００３７】
前記癌治療用薬学的組成物において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１／ＰＤＬ１相互作用阻害剤またはＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／Ｂ７−２相互作用阻害剤であり、前記ＰＤ−１／ＰＤＬ１相互作用阻害剤は、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）またはアベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）であり、前記ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／Ｂ７−２相互作用阻害剤は、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）であり得る。
【００３８】
前記癌治療用薬学的組成物において、前記アルキル化剤は、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ、ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ、ＣＣＮＵ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ、ＤＴＩＣ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）またはオキサリプラチンであり得る。
【００３９】
前記坑癌治療用薬学的組成物において、前記トポイソメラーゼ阻害剤は、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）またはイリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ、ＣＰＴ  ＩＩ）であり、前記代謝拮抗剤は、デオキシコホルマイシン（ｄｅｏｘｙｃｏｆｏｒｍｙｃｉｎ）、６−メルカプトプリン（６−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、６−チオグアニン（６−ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、アザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ）、２−クロロデオキシアデノシン（２−ｃｈｌｏｒｏｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、シトシンアラビノシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）、アザシチジン（ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、フルダラビンホスフェート（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）またはペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）であり得る。
【００４０】
前記癌治療用薬学的組成物において、前記有糸分裂阻害剤は、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、パクリタキセル、ドセタキセル、エストラムスチンホスフェート（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはＮＡＢ−パクリタキセルであり得る。
【００４１】
前記癌治療用薬学的組成物において、前記ホルモン剤は、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、アロマターゼ（ａｒｏｍａｔａｓｅ）阻害剤、リュープロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）またはオクトレオチド（ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ）であり得る。
【００４２】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体を含みうる。薬学的に許容可能な担体を含む前記組成物は、経口または非経口のさまざまな剤型であり得るが、非経口のための剤型であることが望ましい。製剤化する場合には、通常の充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固型製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固型製剤は、１つ以上の化合物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤の以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使われる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使われる単純希釈剤である水、流動パラフィンの以外に、さまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれうる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使われる。座剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、トウイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使われる。
【００４３】
前記薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び座剤からなる群から選択される何れか１つの剤型を有しうる。
本発明の薬学的組成物は、経口または非経口投与されうるが、非経口投与される場合、静脈内注射、鼻腔内吸入、筋肉内投与、腹腔内投与、経皮吸収など多様な経路を通じて投与することが可能である。
【００４４】
前記本発明の組成物は、薬学的に有効な量で投与される。
【００４５】
本発明において、用語「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／危険の比率で疾患の治療に十分な量を意味し、有効容量レベルは、個体の種類及び重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時使われる薬物を含んだ要素及びその他の医学分野によく知られた要素によって決定されうる。本発明の薬学的組成物は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇの容量で投与され、さらに望ましくは、１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される。一方、前記投与量は、患者の年齢、性別及び状態によって適切に調節される。
【００４６】
本発明の薬学的組成物は、個別治療剤として投与するか、他の有効物質と併用して投与され、従来の治療剤と順次または同時に投与される。そして、単一または多重投与される。前記要素をいずれも考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果が得られる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定されうる。
【００４７】
本発明の他の一観点によれば、治療的に有効な量の前記組換えエキソソームを癌にかかった個体に投与する段階を含む前記個体の癌治療方法が提供される。
【００４８】
前記癌治療方法において、１つ以上の坑癌化合物を前記個体にさらに投与することができる。この場合、前記坑癌化合物は、前記組換えエキソソームと同時に投与されるか、間隔を置いて順次に投与される。
【００４９】
前記癌治療方法において、選択的に、前記坑癌化合物の投与の代わりに、または前記坑癌化合物の投与と並行して、前記個体に光力学治療法または放射線治療法を施行することができる。
【００５０】
本発明の他の一観点によれば、治療的に有効な量の膜に組換えヒアルロニダーゼが提示され、内部に坑癌化合物が封入された組換えエキソソームを癌にかかった個体に投与する段階を含む前記個体の癌治療方法が提供される。
【００５１】
前記癌治療方法において、前記個体に対して追加的に光力学治療法または放射線治療法を施行することができる。
【００５２】
前記坑癌化合物は、前述した通りである。
【００５３】
【表１】
2019208422.tif 000007
【００５４】
切断された組換えヒアルロニダーゼを有する合成ナノ剤形の限界を勘案する時、本発明者らは、本質的に自然由来のナノ粒子である天然ＧＰＩ−アンカリングされたＰＨ２０を保有するエキソソームを開発した。エキソソームは、小さなＲＮＡｓ、脂質及びタンパク質を含むほとんどの細胞類型によって放出されるナノサイズの細胞外小胞であって、現在利用可能な合成薬物伝達手段に比べて、さまざまな利点を有しうる。このような長所は、自然障壁を克服することができる能力、固有な細胞ターゲティング特性及び向上した透過性及び保持（ＥＰＲ）効果及び生体適合性を含む。生物学的情報を伝達する本来の機能に基づいて、治療剤としてのエキソソームの採用が注目を浴びている。ＧＰＩ固定されたタンパク質は、それらの生体内形成過程でエキソソーム表面の脂質ラフトに豊かに存在するということと知られており、結果としてエキソソームに、このようなタンパク質を表示することは、比較的簡単である。したがって、自然由来のエキソソームは、如何なる化学変形なしも、酵素ナノ粒子それ自体として作用すると期待される。
【００５５】
本発明者らは、自体的に腫瘍病巣に侵透して薬物伝達を行う新たなエキソソーム−基盤プラットフォームを設計した。組換えＰＨ２０を利用した以前の研究と比較して、本発明者らは、まず癌治療でエキソソーム表面にＧＰＩ−アンカリングされたヒアルロニダーゼの高い活性を立証した。したがって、本発明は、膜関連タンパク質を提示するためのエキソソームの必要性に対する強力な証拠と根拠とを提供した。本来のＧＰＩ固定タンパク質を有した酵素−基盤の薬物伝達システムは、医療及び研究分野いずれもに適用可能である。
【００５６】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。しかし、本発明は、以下で開示される実施例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態として具現可能なものであって、以下の実施例は、本発明の開示を完全にし、当業者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものである。
【００５７】
実験方法
本発明に使われた一般的な実験方法は、下記の通りである：
細胞培養：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０％ウシ胎児血清及び１％抗生剤が添加されたダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）で成長させた。ヒトＰＣ３前立腺癌細胞及びラットの４Ｔ１乳房癌細胞を１０％ウシ胎児血清及び１％抗生剤を含有するＲＰＭＩ培地で保持させた。あらゆる細胞株は、３７℃で５％  ＣＯ２で保持された。
【００５８】
免疫ブロッティング（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）：総タンパク質の量は、ＢＣＡ分析キットによって決定され、同量（１０μｇ）のエキソソームタンパク質をウェスタンブロットの分析に使われた。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に移した。膜を１ＸＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、０．０５％  ｔｗｅｅｎ２０）で１時間５％脱脂粉乳で遮断した。前記ブロットを一晩中４℃で１次抗体（抗ＰＨ２０抗体、１：５００、Ａｂｃａｍ、ａｂ１９６５９６；抗Ａｌｉｘ抗体、１：１０００、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ｓｃ９９０１０；または抗Ｔｓｇ１０１抗体、１：５００、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ｓｃ２２７７４）と反応させた。引き続き、膜をＨＲＰ−接合抗マウスまたは抗ウサギ二次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と反応させ、結果を化学発光（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって視覚化した。エキソソームに対するＰＨ２０の定量分析のために、組換えＰＨ２０を対照群として入れ、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してバンド体積を分析した。
【００５９】
動的光散乱分析（ＤＬＳ）：２５゜〜１７３゜の固定角でＺｅｔａｓｉｚｅｒ  ｎａｎｏ  Ｚｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して製造されたエキソソームのサイズ分布を分析した。データは、装備が提供するソフトウェアを使用して分析した。
【００６０】
透過電子顕微鏡撮影（ＴＥＭ）：エキソソームのサイズと形状とを確認するために、Ｆｏｒｍｖａｒ−ｃａｒｂｏｎでコーティングされた格子に４％ホルムアルデヒドで固定された１０μｇのエキソソームを積載した。洗浄後、サンプルを１ｗ／ｖ％の酢酸ウラニルで１分間染色した。格子を乾燥させ、透過電子顕微鏡（Ｔｅｃｎａｉ  ＴＥＭ）で分析した。
【００６１】
脂質ラフトドメイン分離：脂質ラフト及び非ラフト分画物を製造社（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｃ．）のプロトコルを少し修正して、エキソソームから分離した。簡単に言って、エキソソームを冷たいＰＢＳで洗浄し、４℃で２０分間プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む弱いＲＩＰＡ緩衝液（Ａ−緩衝液、１％  ＮＰ−４０含有）で常温培養した。１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上澄み液（ＲＩＰＡ−可溶性分画）を収集し、ペレットを室温で５分間可溶化緩衝液（Ｂ−緩衝液）と混合した。溶解されたパレットを１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液（ＲＩＰＡ不溶性分画）を収集した。ＲＩＰＡ可溶性分画は、細胞質または非ラフト膜タンパク質を意味し、ＲＩＰＡ不溶性分画は、脂質ラフトの膜タンパク質を意味する。
【００６２】
酵素活性の分析：Ｅｘｏ−ＰＨ２０の酵素活性を組換えヒトＰＨ２０の酵素活性と比較するために、製造社（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）のプロトコルを利用した。具体的に、希釈された酵素試料を３７℃で安定化させた後、サンプルを即時ヒアルロン酸と混合し、３７℃で４５分間反応させた。反応物を酸性アルブミン溶液を含有するキュベットに移した後、室温で１０分間反応させた。その後、試料での６００ｎｍでの透過率（ＵＶ／ｖｉｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ）を測定した。提供されたプロトコルによって酵素活性を計算した。
【００６３】
粒子排除分析（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）：試験管内でＰＣ３細胞株のＨＡ発現を視覚化するために、細胞を４ウェルチャンバまたは３５ｍｍ共焦点皿で２４時間培養した後、３７℃で１時間Ｅｘｏ−ＰＨ２０を含有する無血清培養培地で処理した。引き続き、培地をＰＢＳ中の１ｘ１０９細胞／ｍＬの固定されたマウス赤血球の懸濁液に代替した。細胞は、カメラスキャナー及び映像プログラム（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）と結合された位相差顕微鏡で映像化した。長さ（細胞当たり平均５点）は、細胞と固定された赤血球との間のそれぞれの距離によって決定された。値は、処理されていないＰＣ３  ＨＡ領域（対照群、１００％で表示）に対する相対長さの平均±ＳＤで計算した。
【００６４】
リアルタイム実験で、ＰＣ３細胞を固定されたマウス赤血球と共に培養し、Ｅｘｏ−ＰＨ２０を含有する無血清培地に取り替えた。イメージは、リアルタイム細胞映像化顕微鏡（Ｂｉｏｓｔａｔｉｏｎ−ＩＭ、Ｎｉｋｏｎ）によって１時間５分ごとに収得した。
【００６５】
マウスモデルで抗腫瘍効果の評価：雄性ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウス（６週齢）と雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（７週齢）とを利用し、韓国科学技術研究院（ＫＩＳＴ）の施設で保持した。本研究プロトコルは、ＫＩＳＴ機関動物管理及び使用委員会（ＩＡＣＵＣ）の承認を受けた。
【００６６】
ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスの左側後足にヒトＰＣ３前立腺癌細胞１ｘ１０７個を接種した。ラット４Ｔ１乳房癌細胞２ｘ１０６個を雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの乳房脂肪パッドに定位的に（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ）接種した。腫瘍体積（ｍｍ３）は、（幅）２ｘ（長さ）ｘ０．５に計算された。平均サイズが７５ｍｍ３である腫瘍が安定化された後に、各被験体に試験薬物を３日ごとに５回腫瘍内または静脈内に注入し、腫瘍サイズを３日ごとに測定した。実験が終われば、腫瘍を切開し、重量を測定した。
【００６７】
生体内でエキソソームの酵素活性を分析するために、ＰＢＳ、Ｅｘｏ−Ｃｏｎ（５ｍｇ／ｋｇ）及びＥｘｏ−ＰＨ２０（５ｍｇ／ｋｇ）をＰＣ３保有マウスの腫瘍内注入を通じて投与した。６、１２、２４、４８及び９６時間後、マウスを犠牲させ、腫瘍組織を摘出して分析した。
【００６８】
エキソソームのマウス体内分布：エキソソームのマウス体内分布を確認するために、エキソソームをｃｙ５．５蛍光染料で標識した。雄性ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスに左側後足にヒトＰＣ３前立腺癌細胞１ｘ１０７個を接種した。平均サイズが１５０ｍｍ３である腫瘍でマウスに、それぞれＰＢＳ、１０ｍｇ／ｋｇのｃｙ５．５−Ｅｘｏ−Ｃｏｎ及び１０ｍｇ／ｋｇのｃｙ５．５−Ｅｘｏ−ＰＨ２０を静脈注射した。静脈注射後、各０、１、３、６、１２、２４時間になる時点にラットの全身蛍光イメージを得て、２４時間になる時点でマウスを犠牲させ、腫瘍及び臓器（腎臓、脾臓、肝、心臓、肺）を摘出して、ｃｙ５．５−エキソソームの蓄積程度を蛍光イメージを通じて得た。
【００６９】
リポソーム−ｃｙ５．５の分布：雄性ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスに左側後足にヒトＰＣ３前立腺癌細胞１ｘ１０７個を接種した。平均サイズが１５０ｍｍ３である腫瘍でマウスに、それぞれＰＢＳ、１０ｍｇ／ｋｇのＥｘｏ−Ｃｏｎ及び１０ｍｇ／ｋｇのＥｘｏ−ＰＨ２０を静脈注射した。３時間後、４ｍｇ／ｋｇのリポソーム−ｃｙ５．５を静脈注射した。７時間後、マウスを犠牲させ、腫瘍組織を摘出して、リポソーム−ｃｙ５．５の分布程度を分析した。
【００７０】
免疫組織化学染色：腫瘍組織を切除し、一晩中１０％中性ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン封入処理した。パラフィン封入された組織を薄片化し、抗原引き出し後、薄片を抗ＰＨ２０抗体（１：２００、Ａｂｃａｍ、ａｂ１９６５９６）または抗ＨＡＢＰ抗体（１：２００、Ａｂｃａｍ、ａｂ１８１８３７）と４℃で一晩中反応させた。翌日、薄片を室温で２時間２次抗体（１：２００、ＧＢＩ  Ｌａｂｓ、Ｄ４３−１８）と共に恒温反応させ、３０秒間対照染色させた。イメージは、光学顕微鏡（ＢＸ  ５１、Ｏｌｙｍｐｕｓ，ＵＳＡ）を使用して収得した。
【００７１】
免疫蛍光染色：切除された腫瘍組織をＯＣＴ化合物に挿入して凍結させた。組織薄片化後（１０μｍ）、３％  ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間遮断した後、抗ＣＤ８抗体（１：２００、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｂｄ５５０１８１）または抗ＣＤ３１抗体（１：２００、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｂｄ５５３３７０）４℃で一晩中ＰＢＳで１０分間隙で３回洗浄し、室温で１時間Ａｌｅｘａ−４８８−接合２次抗体（１：４００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と培養した。核は、Ｄａｐｉ−Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇで染色した。腫瘍組織でのドキソルビシンによる蛍光分布を分析するために、凍結された腫瘍薄片を４℃で一晩中抗ＣＤ３１抗体（１：２００、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｂｄ５５３３７０）と共に恒温培養した。洗浄後、Ａｌｅｘａ−４８８−接合２次抗体（１：４００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に室温で１時間培養した。核は、Ｄａｐｉ−Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇで染色した。組織薄片の蛍光信号は、Ｌｅｉｃａ蛍光顕微鏡を使用して、各実験群ごとに別途に収得した。
【００７２】
腫瘍でＤｏｘ蛍光分布の造影：雄性ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスの左側後足にヒトＰＣ３前立腺癌細胞１ｘ１０７個を接種した。平均サイズが１５０ｍｍ３である腫瘍で静脈注射を通じて、それぞれＰＢＳ、Ｅｘｏ−ＣｏｎＤｏｘ及びＥｘｏ−ＰＨ２０Ｄｏｘをマウスに投与した。２４時間後、マウスを犠牲させ、腫瘍組織を摘出して分析した。
【００７３】
腫瘍血流：腫瘍血流の変化を感知するために、ヒトＰＣ３前立腺癌を保有したマウスを使用した。この初期測定（ｔ＝０）以後、実験動物にＰＢＳ、Ｅｘｏ−Ｃｏｎ（１０ｍｇ／ｋｇ）及びＥｘｏ−ＰＨ２０（１０ｍｇ／ｋｇ）を静脈注射した。イメージは、適切な時点（ｔ＝１、３、６及び２４時間）から収得し、Ｖｅｖｏ  ７７０高分解能超音波造影装置（Ｖｅｖｏ  ７７０、Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、腫瘍血流の変化を測定した。
【００７４】
実施例１：エキソソームの製造
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１５０ｍｍ皿当たり６ｘ１０６個の濃度で播種した。グルタマックス（最終濃度１％、Ｇｉｂｃｏ）が補充された新たな無血清ＤＭＥＭ培地に培地を交換した後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をリポフェクタミン３０００（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を使用して、ＧＰＩアンカー付着部位を含む全長ＰＨ２０（３６−４９０  ａ．ａ、配列番号１）を暗号化する遺伝子が含まれたプラスミド（ｐＣＭＶ６−ＨｕＰＨ２０）１８μｇで形質感染させた。残骸物及び微小小嚢（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）を除去するために、上澄み液を収穫し、異なるＲＣＦで遠心分離した。簡略に、上澄み液をまず３００ｇで１０分間遠心分離し、引き続き、２，０００ｇで１０分間、最後に、１０，０００ｇで３０分間遠心分離した。最後に、０．２２μｍフィルターを通じる濾過後、エキソソーム含有上澄み液を４５Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で１５０，０００ｇで３時間超遠心分離した。エキソソームをタンパク質分解酵素抑制剤（Ｒｏｃｈｅ）が含まれたＰＢＳに再懸濁し、４℃で保管した。ＰＨ２０遺伝子に形質感染されていない細胞からエキソソームを収得して、対照群として使用した。
【００７５】
精製されたＥｘｏ−ＰＨ２０は、エキソソームマーカータンパク質（Ａｌｉｘ及びＴｓｇ１０１）を含有しており、膜表面にＰＨ２０も含んでいる（図１Ａ及び図１Ｂ）。Ｅｘｏ−ＰＨ２０及び対照群エキソソーム（Ｅｘｏ−ｃｏｎ）の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）イメージと動的光散乱（ＤＬＳ）の分析結果、これらエキソソームいずれも１００ｎｍの平均サイズを有する完全な円状を有することを示して、形態上、これら２つのエキソソームが差がないことが分かった（図１Ｃ及び図１Ｄ）。
【００７６】
定量的ウェスタンブロッティングのための標準として順次に希釈された濃度の組換えヒトＰＨ２０（ｒＨｕＰＨ２０）を使用して、エキソソーム内のＰＨ２０タンパク質濃度は、１検定曲線を用いて計算し、エキソソームｍｇ当たり５．３μｇで確認された（図１Ｂ）。ＰＨ２０ヒアルロニダーゼ活性は、濁度分析によって定量化され、エキソソーム１ｍｇ当たり１，９５４  Ｕ（エキソソームＰＨ２０ｍｇ当たり＞３６０，０００  Ｕ）であると確認された。これは、対照群（ｒＨｕＰＨ２０  １１０，０００Ｕ／ｍｇ）に比べて、３倍増加したものである（図１Ｅ及び表２）。また、前述した脂質ラフトドメイン分離結果、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼがエキソソーム上の脂質ラフトに存在するということが確認された（図１Ｆ）。前記結果を通じて、エキソソームの脂質ラフトドメインに存在するＧＰＩ固定ＰＨ２０は、切断された形態よりも高い酵素活性を有するということが明かになった。エキソソーム膜の脂質ラフト上に存在するＧＰＩアンカリングされたタンパク質の側面移動がタンパク質の活性を増加させるということを勘案する時、マイクロドメイン−強化された（ｍｉｃｒｏｄｏｍａｉｎ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ）エキソソームは、膜結合されたタンパク質を提示するための適切なプラットフォームになりうる。
【００７７】
【表２】
2019208422.tif 000008
【００７８】
実施例２：ドキソルビシン積載エキソソームの製造
本発明者らは、固形腫瘍治療に広範囲に使われるドキソルビシン（Ｄｏｘ）のような化学療法薬物が同時にＰＨ２０と共に伝達されれば、抗腫瘍効能が強化されるという仮説を立てた。ドキソルビシンは、１０．２±０．３％の最終積載量で簡単なインキュベーション方法を通じてエキソソームにカプセル化された。
【００７９】
エキソソームにドキソルビシン（Ｄｏｘ）を封入するために、前記実施例１から製造された総１００μｇのエキソソームをドキソルビシン塩酸塩（５０、１００、２００、３００及び４００μｇ）と４℃で一晩中混合した。未積載薬物は、ａｉｒ−ｆｕｇｅで除去し、薬物が積載されたエキソソームは、ＰＢＳ緩衝液で希釈した。薬物の積載量は、Ｄｏｘ（４８０ｎｍで励起及び５９０ｎｍで放射）の蛍光強度を測定して決定した。エキソソームに薬物を入れた後、柔らかに混合し、３７℃でＰＢＳ（ｐＨ７．４）または酢酸塩溶液（ｐＨ６．４）に浸した。既定の時点（３０分、１、２、３、６及び２４時間）に、蛍光分析のために、緩衝液を回収し、新たな緩衝液に代替した。放出されたＤｏｘの量は、４８０ｎｍでの励起及び５９０ｎｍでの放射で蛍光分析によって決定された。その結果、混合ドキソルビシン濃度とエキソソーム１００μｇ当たり積載された薬物量（μｇ）は、混合されたドキソルビシン濃度に依存的に増加することを確認することができた（図２Ａ）。
【００８０】
ドキソルビシンを封入したＥｘｏ−ＰＨ２０（Ｅｘｏ−ＰＨ２０Ｄｏｘ）のＴＥＭ及びＤＬＳ分析は、Ｅｘｏ−ＰＨ２０と比較して、サイズと形状面で大きな差がないことを示し、薬物積載が、エキソソームの物理的特性を変化させないことを確認した（図２Ｂ及び図２Ｃ）。本発明者らは、また、生理条件（ｐＨ７．４）よりは腫瘍微小環境のような酸性ｐＨ（ｐＨ６．４）下でＥｘｏ−ＰＨ２０Ｄｏｘからのドキソルビシンの放出を調査したが、酸性条件でドキソルビシンの放出が加速化されることを確認した（図２Ｄ）。Ｅｘｏ−ＰＨ２０ＤｏｘのＰＨ２０ヒアルロニダーゼ活性は、Ｅｘｏ−ＰＨ２０のＰＨ２０ヒアルロニダーゼ活性と類似していることを示し、これは、薬物積載がＰＨ２０ヒアルロニダーゼ活性を変化させないことを確認した（図２Ｅ）。
【００８１】
実験例１：ＰＨ２０表面提示エキソソームの坑癌活性
１−１：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析
本発明者らは、前記ＰＨ２０表面提示エキソソームがヒト組換えＰＨ２０に比べて、高い酵素活性を有するかを確認するために、ヒアルロン酸（ＨＡ）−依存性細胞外基質を生成することができるヒト前立腺癌細胞ＰＣ３の細胞外基質に対するＰＨ２０同一質量に換算されたヒト組換えＰＨ２０とＥｘｏ−ＰＨ２０との分解能を比較した。具体的に、試験管内でＨＡ細胞外基質を視覚化するために、固定された赤血球を用いて、前述したように、粒子排除分析を行った。ＰＣ３のＨＡ−ｈｉｇｈ細胞外基質は、ヒト組換えＰＨ２０とＥｘｏ−ＰＨ２０処理後、濃度依存的に枯渇したが、ヒト組換えＰＨ２０に比べて、Ｅｘｏ−ＰＨ２０が相対的にさらに多く細胞外基質を枯渇させ、対照エキソソーム（Ｅｘｏ−Ｃｏｎ）では、そのような効果が表われなかった（図３Ａ及び図３Ｂ）。ＰＣ３細胞を利用した時間経過実験は、ＨＡがＥｘｏ−ＰＨ２０処理後、６０分以内にほぼ減少することを示した（図３Ｃ）。
【００８２】
１−２：腫瘍内投与ｉｎ  ｖｉｖｏ分析
ＨＡを枯渇させるＥｘｏ−ＰＨ２０の坑癌活性も、ＰＣ３（ＨＡ−ｈｉｇｈ）−保有異種正位移植マウスモデルで評価した。Ｅｘｏ−ＰＨ２０（ＰＨ２０タンパク質：２６．５μｇ／ｋｇ、エキソソーム：５ｍｇ／ｋｇ）の単一腫瘍内投与時に、投与後、６時間以内に腫瘍ＥＣＭでＨＡが効果的に除去された（図４Ａ及び図４Ｂ）。Ｅｘｏ−ＰＨ２０−媒介ＨＡ枯渇は、ＨＡの漸進的再構築と共に４８時間以上保持された。
【００８３】
一方、Ｅｘｏ−ＰＨ２０−媒介ＥＣＭリモデリングが生体内腫瘍成長の阻害と関連するので、本発明者らは、ＰＣ３異種移植マウスモデルを使用して、Ｅｘｏ−ＰＨ２０の抗腫瘍活性を評価した。ＰＢＳ、Ｅｘｏ−Ｃｏｎ及びＰＨ２０同一質量５３０ｎｇに換算された組換えヒトＰＨ２０とＥｘｏ−ＰＨ２０とを３日ごとにマウスに腫瘍内注射して、総５回注射でＨＡ再合成及び循環を相殺させた。同一質量に換算されたヒト組換えＰＨ２０に比べて、Ｅｘｏ−ＰＨ２０処理によって腫瘍成長が鈍化された一方、対照群エキソソーム（Ｅｘｏ−Ｃｏｎ）の処理時には、実質的な抑制が観察されず、エキソソーム及びヒト組換えＰＨ２０処理は、ラットの重量には影響を及ぼさなかった（図４Ｃ及び図４Ｄ）。摘出された腫瘍の平均重量は、対照群よりもＥｘｏ−ＰＨ２０−処理群で有意に低く表われ、摘出された腫瘍のサイズも、対照群よりもＥｘｏ−ＰＨ２０−処理群で相対的に小さく、これは、観察された腫瘍成長の阻害と一致した（図４Ｅ及び図４Ｆ）。ＨＡＢＰ染色結果は、Ｅｘｏ−ＰＨ２０で処理したマウスから摘出された腫瘍でＰＣ３異種移植片のＨＡレベルが枯渇したことを示した（図４Ｇ）。これは、細胞外基質分解能の結果（図３Ａ）と類似に、同一質量に換算された組換えヒトＰＨ２０に比べて、Ｅｘｏ−ＰＨ２０の腫瘍成長抑制効果に優れることを示し、ＨＡ高発現腫瘍保有ラットでＨＡが枯渇すれば、腫瘍のＥＣＭに影響を与えて、腫瘍の成長や拡張を減少させることを示した。
【００８４】
１−３：静脈投与ｉｎ  ｖｉｖｏ分析
引き続き、本発明者らは、静脈内投与されたＥｘｏ−ＰＨ２０の抗腫瘍効能を調査するのに先立って、ＰＣ３腫瘍保有マウスで静脈内投与されたＥｘｏ−ＰＨ２０のラットの体内分布程度を調査した。経時的にｃｙ５．５−蛍光染料で標識されたエキソソームは、ほとんど肝に蓄積されるにもかかわらず、ＥＰＲ効果によって癌に移動することを確認し、静脈内投与２４時間後に摘出した臓器及び癌でエキソソームが蓄積されていることを確認することができた（図５Ａ及び図５Ｂ）。
【００８５】
このような結果に基づいて、本発明者らは、ＰＣ３腫瘍保有マウスで静脈内投与されたＥｘｏ−ＰＨ２０の抗腫瘍効能を調査した。結果は、Ｅｘｏ−ＰＨ２０が処理されたグループのマウスが対照グループ（図５Ｃ及び図５Ｄ）と比較して、顕著に減少した腫瘍成長（約８３％抑制）を示した。ＨＡＢＰ染色結果は、Ｅｘｏ−ＰＨ２０で処理したマウスから摘出された腫瘍でＰＣ３異種移植片のＨＡレベルが枯渇したことを示した（図５Ｅ）。本発明者らは、また、腫瘍でＨＡの減少が高解像度超音波映像を利用した生体内実験で腫瘍血管再灌流の変化と関連があるかを調査した。図５Ｆに示されたように、Ｅｘｏ−ＰＨ２０処理によって、ＰＣ３腫瘍保有マウス（図５Ｇ）に対するエキソソーム投与３時間後、相対的血管形成で３倍増加した。
【００８６】
１−４：ナノ粒子浸透分析
このような結果によって、本発明者らは、Ｅｘｏ−ＰＨ２０−媒介腫瘍ＥＣＭ再構築がＨＡ−枯渇した腫瘍組織でナノ粒子浸透を向上させるか否かをさらに調査した。ＨＡが枯渇した後のナノ粒子の浸透を評価するために、Ｅｘｏ−ＰＨ２０前処理の不在または存在下で蛍光体−接合ＰＥＧ−リポソームをＰＣ３腫瘍保有マウスに静脈内注射した。リポソーム蓄積は、処理されていない腫瘍組織では最小であったが、Ｅｘｏ−ＰＨ２０処理後に劇的に増加した（図６）。このような結果は、Ｅｘｏ−ＰＨ２０が血液灌流を増加させるだけではなく、ＨＡ枯渇による腫瘍微小環境の癲癇耐圧を減少させて、腫瘍でのナノ粒子の拡散を増加させることを立証することである。
【００８７】
１−５：免疫能力モデル動物を利用した分析
引き続き、本発明者らは、免疫能力マウスで全身投与されたＥｘｏ−ＰＨ２０の効能を調査した。対照群と比較して、腫瘍成長は、４Ｔ１細胞に移植されたＢＡＬＢ／ｃ免疫能力マウスでＥｘｏ−ＰＨ２０によって有意に減少した（図７Ａ及び図７Ｂ）。引き続き、本発明者らは、腫瘍組織の免疫蛍光染色を行って、局所腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を分析した。４Ｔ１腫瘍保有免疫能力マウスモデルで、対照群と比較して、Ｅｘｏ−ＰＨ２０投与時に、腫瘍で幅広いＴ細胞浸潤が観察された（図７Ｃ及び図７Ｄ）。総合的に見る時、このような結果は、Ｅｘｏ−ＰＨ２０が腫瘍微小環境でＨＡを成功的に分解し、腫瘍組織でナノ粒子及び兔疫細胞の浸透を向上させるということを示す。
【００８８】
実験例２：ＰＨ２０表面提示ドキソルビシン封入エキソソームの坑癌活性
前記実施例２から製造されたＥｘｏ−ＰＨ２０Ｄｏｘの治療可能性は、ＰＣ３異種移植片を使用して生体内で分析した。試験の結果、Ｅｘｏ−ＰＨ２０Ｄｏｘの処理は、上昇的に腫瘍成長を抑制したが、これは、組合わせ治療が抗腫瘍効能を著しく向上させるということを意味する（図８Ａないし図８Ｃ）。特に、Ｅｘｏ−ＰＨ２０の強化された浸透は、腫瘍組織で効果的な薬物放出を確実に保証した。Ｅｘｏ−ＰＨ２０Ｄｏｘを投与した腫瘍保有マウスの腫瘍組織薄片で対照群と比較して有意に高く、均一に分布されたＤｏｘ蛍光信号が血管から観察された（図８Ｄ）。総合すれば、Ｅｘｏ−ＰＨ２０は、化学療法の効能を向上させ、この効果は、ＰＨ２０によるＨＡの枯渇、後続腫瘍のＥＣＭ再構築及び増加した血管灌流を通じるドキソルビシンの腫瘍浸透の結果である（図８Ｅ）。
【００８９】
本発明の一実施例によるＰＨ２０表面提示エキソソームは、癌を取り囲んだ微小環境の構成要素であるＥＣＭのヒアルロン酸ネットワークを分解させ、兔疫細胞及び坑癌化合物の癌組織への接近性を向上させることによって、腫瘍治療可能性を画期的に向上させた。
本発明は、実施例を参考にして説明されたが、これは例示的なものに過ぎず、当業者ならば、これより多様な変形及び均等な他実施例が可能であるという点を理解できるであろう。したがって、本発明の真の技術的保護範囲は、特許請求の範囲の技術的思想によって決定されるべきである。
【図１Ａ】
2019208422.tif 000009
【図１Ｂ】
2019208422.tif 000010
【図１Ｃ】
2019208422.tif 000011
【図１Ｄ】
2019208422.tif 000012
【図１Ｅ】
2019208422.tif 000013
【図１Ｆ】
2019208422.tif 000014
【図２Ａ】
2019208422.tif 000015
【図２Ｂ】
2019208422.tif 000016
【図２Ｃ】
2019208422.tif 000017
【図２Ｄ】
2019208422.tif 000018
【図２Ｅ】
2019208422.tif 000019
【図３Ａ】
2019208422.tif 000020
【図３Ｂ】
2019208422.tif 000021
【図３Ｃ】
2019208422.tif 000022
【図４Ａ】
2019208422.tif 000023
【図４Ｂ】
2019208422.tif 000024
【図４Ｃ】
2019208422.tif 000025
【図４Ｄ】
2019208422.tif 000026
【図４Ｅ】
2019208422.tif 000027
【図４Ｆ】
2019208422.tif 000028
【図４Ｇ】
2019208422.tif 000029
【図５Ａ】
2019208422.tif 000030
【図５Ｂ】
2019208422.tif 000031
【図５Ｃ】
2019208422.tif 000032
【図５Ｄ】
2019208422.tif 000033
【図５Ｅ】
2019208422.tif 000034
【図５Ｆ】
2019208422.tif 000035
【図５Ｇ】
2019208422.tif 000036
【図６】
2019208422.tif 000037
【図７Ａ】
2019208422.tif 000038
【図７Ｂ】
2019208422.tif 000039
【図７Ｃ】
2019208422.tif 000040
【図７Ｄ】
2019208422.tif 000041
【図８Ａ】
2019208422.tif 000042
【図８Ｂ】
2019208422.tif 000043
【図８Ｃ】
2019208422.tif 000044
【図８Ｄ】
2019208422.tif 000045
【図８Ｅ】
2019208422.tif 000046
【配列表】
2019208422000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月15日(2019.10.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜に組換えヒアルロニダーゼが提示された組換えエキソソーム及び免疫チェックポイント阻害剤を有効成分として含む癌治療用薬学的組成物。
【請求項２】
前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用阻害剤またはＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／Ｂ７−２相互作用阻害剤である請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用阻害剤は、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブまたはアベルマブである請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／Ｂ７−２相互作用阻害剤は、イピリムマブである請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
膜に組換えヒアルロニダーゼが提示された組換えエキソソーム及び免疫チェックポイント阻害剤を癌にかかった人間以外の哺乳動物個体に投与する段階を含む前記個体の癌治療方法。
【請求項６】
前記免疫チェックポイント阻害剤は、前記組換えエキソソームと同時に投与されるか、間隔を置いて順次に投与される請求項５に記載の癌治療方法。
【請求項７】
追加的に、前記個体に光力学治療法または放射線治療法を施行する請求項５に記載の癌治療方法。