(57)【要約】【課題】優れた生活習慣病の改善又は予防作用、肝臓及び腎臓の線維化の改善又は予防作用、肝機能改善作用、並びにニキビの改善又は予防作用を有する食品組成物を提供する。【解決手段】ヒドロキシイソフラボン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする生活習慣病の改善又は予防用食品組成物、肝臓及び／又は腎臓の線維化の改善又は予防用食品組成物、肝機能改善用食品組成物、並びにニキビの改善又は予防用食品組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）〜（５）で表されるヒドロキシイソフラボン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする生活習慣病の改善又は予防用食品組成物。
【化１】
2019208502.tif 000013
【化２】
2019208502.tif 000014
【化３】
2019208502.tif 000015
【化４】
2019208502.tif 000016
【化５】
2019208502.tif 000017
【請求項２】
前記生活習慣病が、糖尿病、インスリン抵抗性、脂質異常症、肥満、及び脂肪肝からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の食品組成物。
【請求項３】
式（１）〜（５）で表されるヒドロキシイソフラボン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする肝臓及び／又は腎臓の線維化の改善又は予防用食品組成物。
【請求項４】
式（１）〜（５）で表されるヒドロキシイソフラボン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする肝機能改善用食品組成物。
【請求項５】
式（１）〜（５）で表されるヒドロキシイソフラボン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とするニキビの改善又は予防用食品組成物。
【請求項６】
イソフラボン含有組成物の発酵物を有効成分とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生活習慣病の改善又は予防用食品組成物、肝臓及び腎臓の線維化の改善又は予防用食品組成物、肝機能改善用食品組成物、並びにニキビの改善又は予防用食品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の欧米化により、脂肪摂取量が上昇し、脂質異常症、高血圧、糖尿病、肥満などの生活習慣病が増加している。一般的に、生活習慣病の発生や予後に関する要因として、生活習慣、遺伝、環境が挙げられる。そして、生活習慣としては、食生活、運動習慣、休養、喫煙、飲酒などが挙げられる。
【０００３】
特許文献１では、高濃度にイソフラボンを含む原料を発酵させることで、ヒドロキシイソフラボンを効率的に製造することができること、得られたヒドロキシイソフラボンは優れた抗グリケーション作用を奏することが報告されている。特許文献１で製造されたヒドロキシイソフラボンは、8位がヒドロキシル化されたダイゼイン、ゲニステイン、グリシテインなどのイソフラボンである。
【０００４】
また、特許文献２では、このようなヒドロキシイソフラボンを含む発酵イソフラボンが、未発酵のイソフラボンと比べて顕著に優れた脱毛防止作用を示す上に、環境ホルモン作用を示さないことが報告されている。特許文献２では脱毛防止作用が主に調査されており、それ以外の効果については具体的には示されていない。
【０００５】
また、非特許文献１には、大豆イソフラボンが糖尿病などの各種疾患に対する効果について記載されており、大豆イソフラボンに含まれるゲニステインがβ細胞増殖に対する作用、インスリン分泌に対する作用などの糖尿病に対する効果を有することが記載されている。しかしながら、一般的に、血清インスリン濃度の上昇は、「膵臓への負担増加」を意味する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５３１８３３９号公報
【特許文献２】特開２０１８−５２９２８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】BIOMEDICAL REPORTS 1: 697-701, 2013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、優れた生活習慣病の改善又は予防作用、肝臓及び腎臓の線維化の改善又は予防作用、肝機能改善作用、並びにニキビの改善又は予防作用を有する食品組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒドロキシイソフラボンを含む発酵イソフラボンを、マウスに経口摂取させることで、高脂肪食による体重、血糖値、血清コレステロール値及び血清トリグリセリド値の上昇を抑制すること、更に糖尿病モデルマウスにおいて血糖値及びHbA1c値の上昇を抑制することを見出し、これは生活習慣病に対して著効を有することを示すものである。さらに、発酵イソフラボンにより肝臓及び腎臓の線維化が改善されることを見出した。また、マウスの肝機能に関わる血液検査結果から、発酵イソフラボンにより肝機能が改善されることを見出した。その上、発酵イソフラボンは、皮脂線細胞において炎症性サイトカインのTNFAの発現を抑制することが示されたので、これはニキビ(ざ瘡)に対して著効を有することを示すものである。
【００１０】
本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次の生活習慣病の改善又は予防用食品組成物、肝臓及び／又は腎臓の線維化の改善又は予防用食品組成物、肝機能改善用食品組成物、並びにニキビの改善又は予防用食品組成物を提供するものである。
【００１１】
項１．下記式（１）〜（５）で表されるヒドロキシイソフラボン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする生活習慣病の改善又は予防用食品組成物。
【００１２】
【化１】
2019208502.tif 000002
【００１３】
【化２】
2019208502.tif 000003
【００１４】
【化３】
2019208502.tif 000004
【００１５】
【化４】
2019208502.tif 000005
【００１６】
【化５】
2019208502.tif 000006
【００１７】
項２．前記生活習慣病が、糖尿病、インスリン抵抗性、脂質異常症、肥満、及び
脂肪肝からなる群から選択される少なくとも１種である、項１に記載の食品組成物。
項３．式（１）〜（５）で表されるヒドロキシイソフラボン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする肝臓及び／又は腎臓の線維化の改善又は予防用食品組成物。
項４．式（１）〜（５）で表されるヒドロキシイソフラボン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする肝機能改善用食品組成物。
項５．式（１）〜（５）で表されるヒドロキシイソフラボン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とするニキビの改善又は予防用食品組成物。
項６．イソフラボン含有組成物の発酵物を有効成分とする、項１〜５のいずれか一項に記載の食品組成物。
【発明の効果】
【００１８】
ヒドロキシイソフラボン及びこれを含む発酵イソフラボンは、顕著に優れた生活習慣病の改善又は予防作用、肝臓及び腎臓の線維化の改善又は予防作用、肝機能改善作用、並びにニキビの改善又は予防作用を有するので、生活習慣病の改善又は予防用食品組成物、肝臓及び／又は腎臓の線維化の改善又は予防用食品組成物、肝機能改善用食品組成物、並びにニキビの改善又は予防用食品組成物の有効成分として有用である。
【００１９】
その上、ヒドロキシイソフラボン及びこれを含む発酵イソフラボンは、炎症作用及び環境ホルモン様作用を示さないため安全性において優れている。また、ヒドロキシイソフラボン及びこれを含む発酵イソフラボンは、天然由来成分であるので安全性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】HFD試験におけるddYマウスの(A)体重推移、(B)血糖値推移、(C)血清トリグリセリド値推移、(D)血清コレステロール値推移を示すグラフである。n=5-7、データは平均値±標準誤差値である。
【図２】HFD試験におけるddYマウスの剖検の結果を示す写真である。
【図３】HFD試験におけるddYマウスの肝臓の病理解析の結果を示す写真である。
【図４】HFD試験におけるddYマウスの(A, B, C)脂肪組織の病理解析の結果を示す写真、(D)脂肪細胞直径(μm)を示すグラフである。直径測定は、1匹当たり異なる5枚の切片を用いて、1枚の切片から60〜100の細胞直径を計測し、求めた。*:P<0.05 vs HFD. データは平均±標準誤差値を示す。
【図５】HFD試験におけるddYマウスの肝臓の病理解析の結果(HE染色、アザン染色、PAS染色)を示す写真である。倍率は対物レンズの倍率を示す。
【図６】HFD試験におけるddYマウスの腎臓の病理解析の結果(アザン染色、PAS染色)を示す写真である。倍率は対物レンズの倍率を示す。
【図７】C57/BL6Nマウスの(A) HFD試験の体重推移、(B) OGTT試験の結果を示すグラフである。n=5、データは平均値±標準誤差値である。
【図８】KK-Ayマウスの(A)体重推移、(B)血糖値推移、(C) HbA1c値推移を示すグラフである。n=5、データは平均値±標準誤差値である。
【図９】低容量ストレプトゾトシン(STZ)誘導糖尿病モデルマウスの(A)血糖値推移、(B)体重推移を示すグラフである。CRL-: STZ投与をしていないでCRF-1を給餌した群、CRL+: STZを投与しCRF-1を給餌した群、Unifine: STZを投与し2%Unifineを混餌したCRF-1を給餌した群。n=5、データは平均値±標準誤差値である。
【図１０】3T3-L1脂肪細胞をUnifineの存在下又は非存在下で分化条件に供し、経時的に顕微鏡観察した結果を示す写真である。n=6
【図１１】SZ-95皮脂腺細胞のUnifine存在下又は非存在下における炎症性サイトカインTNFAのmRNA発現量を示すグラフである。n=6、データは平均値±標準誤差値である。
【図１２】Glycolysis rateアッセイの結果を示すグラフである。CRL:コントロール、Iso:未発酵イソフラボン、Uni: Unifine。n=4、データは平均値±標準誤差値である。**:P<0.01 vs CRL
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２２】
なお、本明細書において「含む(comprise)」とは、「本質的にからなる(essentially consist of)」という意味と、「のみからなる(consist of)」という意味をも包含する。
【００２３】
本発明の生活習慣病の改善又は予防用食品組成物、肝臓及び／又は腎臓の線維化の改善又は予防用食品組成物、肝機能改善用食品組成物、並びにニキビの改善又は予防用食品組成物は、下記式（１）〜（５）で表されるヒドロキシイソフラボン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とすることを特徴とする。
【００２４】
【化６】
2019208502.tif 000007
【００２５】
【化７】
2019208502.tif 000008
【００２６】
【化８】
2019208502.tif 000009
【００２７】
【化９】
2019208502.tif 000010
【００２８】
【化１０】
2019208502.tif 000011
【００２９】
式（１）〜（５）で表されるヒドロキシイソフラボン及びそれらの塩
式（１）で表されるヒドロキシイソフラボンは、ダイゼインの誘導体であって、8位(A環の8位)炭素にヒドロキシル基を備える化合物である。
【００３０】
式（２）で表されるヒドロキシイソフラボンは、ゲニステインの誘導体であって、8位(A環の8位)炭素にヒドロキシル基を備える化合物である。
【００３１】
式（３）で表されるヒドロキシイソフラボンは、グリシテインの誘導体であって、8位(A環の8位)炭素にヒドロキシル基を備える化合物である。
【００３２】
式（４）で表されるヒドロキシイソフラボンは、ダイゼインの誘導体であって、6位(A環の6位)炭素にヒドロキシル基を備える化合物である。
【００３３】
式（５）で表されるヒドロキシイソフラボンは、ダイゼインの誘導体であって、3'位(B環の3位)炭素にヒドロキシル基を備える化合物である。
【００３４】
上記のようなヒドロキシイソフラボンは、イソフラボン配糖体(以下では配糖体と称することもある)からイソフラボンアグリコン(以下ではアグリコンと称することもある)を生成し、更に、このアグリコンをヒドロキシル化して得ることができる。ここで、ダイジン、グリシチン、ゲニスチンなどはA環7位に糖が結合した配糖体であり、この配糖体から糖を解離させることでダイゼイン、ゲニステイン、グリシテインなどのアグリコンが生成する。本明細書におけるイソフラボン類とは、イソフラボン配糖体、イソフラボンアグリコン及びヒドロキシイソフラボンを意味する。
【００３５】
式（１）〜（５）で表されるヒドロキシイソフラボンの塩としては、例えば、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム等の無機塩；メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン等の有機塩基との塩；リジン、オルニチン、アルギニン等の塩基性アミノ酸との塩及びアンモニウム塩が挙げられる。当該塩は、酸付加塩であってもよく、かかる塩としては、具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、酒石酸、フマル酸、コハク酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸等の有機酸；アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸との酸付加塩が挙げられる。また、式（１）〜（５）で表されるヒドロキシイソフラボンには、その水和物、溶媒和物、結晶多形なども含まれる。
【００３６】
本明細書において「式（１）〜（５）で表されるヒドロキシイソフラボン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種」(以下では、これを本発明のヒドロキシイソフラボンと称することもある)とは、式（１）〜（５）で表されるヒドロキシイソフラボン及び式（１）〜（５）で表されるヒドロキシイソフラボンの塩の10種類の化合物から選択される少なくとも１種の化合物のことを意味する。
【００３７】
本発明における式（１）〜（５）で表されるヒドロキシイソフラボン及びそれらの塩としては、単離又は精製された状態でない物(粗精製物)、及び単離又は精製された物のいずれも使用することができる。
【００３８】
本発明における式（１）〜（５）で表されるヒドロキシイソフラボン及びそれらの塩は、自家調製品又は市販品を問わず使用することができる。自家調製する方法をとしては、発酵により生合成する方法、及び化学的に合成する方法が挙げられる。本発明の式（１）〜（５）で表されるヒドロキシイソフラボン及びそれらの塩は、中でも、イソフラボン含有組成物を発酵させて製造することが好ましい。本発明では、式（１）〜（５）で表されるヒドロキシイソフラボン及びそれらの塩を含む、イソフラボン含有組成物の発酵物それ自体を使用することもできる。そのようなイソフラボン含有組成物の発酵物は、東洋発酵株式会社より「UNIFINE (登録商標)」として販売されている。
【００３９】
本発明におけるイソフラボン含有組成物は、イソフラボン類を含有する組成物のことであり、通常、イソフラボン配糖体及びイソフラボンアグリコン、特にイソフラボン配糖体を多く含有する。イソフラボン含有組成物に含まれるイソフラボン類の量は、特に制限されず、好ましくは10〜100質量%、より好ましくは25〜99質量%、更に好ましくは35〜90質量%、特に好ましくは40〜80質量%である。このようにイソフラボン含有組成物中のイソフラボン類の含有量が高い場合は、発酵によりヒドロキシイソフラボンを高濃度で得ることができる。
【００４０】
上記イソフラボン含有組成物としては、イソフラボン類が濃縮されて含有された植物抽出物が挙げられる。植物抽出物を得るための植物としては、豆科植物、バラ科植物、アヤメ科植物、桑科植物、ヒユ科植物などが挙げられ、これらの中では他の植物に比べてイソフラボン類の含有量が多いことから豆科植物が好ましい。
【００４１】
イソフラボン含有組成物の発酵は、公知の方法、例えば、特許文献１(特許第５３１８３３９号公報)に記載の方法に従い実施することができる。
【００４２】
本発明におけるイソフラボン含有組成物の発酵物としては、発酵により得られた状態のままの物、及び発酵後に抽出処理、濃縮処理、濾過処理、乾燥処理、滅菌処理、pH調整、脱臭処理、脱色処理等の処理を行った物のいずれも使用することができる。
【００４３】
本発明のヒドロキシイソフラボン及びこれを含む発酵イソフラボンは、特許文献２(特開２０１８−５２９２８号公報)に示されているように、炎症作用及び環境ホルモン様作用(性ホルモン作用、特にエストロゲン作用)を示さないため安全性において優れている。さらに、本発明のヒドロキシイソフラボン及びこれを含む発酵イソフラボンは、天然由来成分であるので安全性が高い。
【００４４】
食品組成物としては哺乳動物(ヒトを含む)が摂取できるあらゆる飲食品が含まれ、例えば、乳製品；発酵食品(ヨーグルト、チーズ等)；飲料類(コーヒー、ジュース、ココア、茶飲料、スポーツドリンク、栄養ドリンクのような清涼飲料、乳飲料、乳酸菌飲料、乳酸菌入り飲料、ヨーグルト飲料、炭酸飲料、日本酒、洋酒、果実酒のような酒等)；スプレッド類(カスタードクリーム等)；ペースト類(フルーツペースト等)；洋菓子類(チョコレート、ドーナツ、パイ、シュークリーム、ガム、グミ、ゼリー、キャンデー、クッキー、ケーキ、プリン、ビスケット等)；氷菓類(アイスクリーム、アイスキャンデー、シャーベット等)；食品類(カレー、牛丼、雑炊、味噌汁、スープ、ミートソース、パスタ、漬物、ジャム、ハム、ソーセージ、ベーコン等)；調味料類(ドレッシング、ふりかけ、旨味調味料、スープの素、味噌、醤油、ソース、ケチャップ、オイスターソース等)などが挙げられる。
【００４５】
食品組成物の製法も特に限定されず、適宜公知の方法に従うことができる。
【００４６】
食品組成物としては、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント、保健用食品、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品なども挙げられる。サプリメントとして使用する際の投与単位形態については特に限定されず適宜選択できるが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤、散剤等が挙げられる。
【００４７】
また、食品組成物としては、生活習慣病の改善又は予防作用、肝臓及び腎臓の線維化の改善又は予防作用、肝機能改善作用、及びニキビの改善又は予防作用を付与する添加剤についての意味も包含するものである。
【００４８】
食品組成物には、必要に応じて、賦形剤、ビタミン類、ミネラル類、フラボノイド類、キノン類、ポリフェノール類、アミノ酸、核酸、必須脂肪酸、清涼剤、結合剤、甘味料、崩壊剤、滑沢剤、着色料、香料、安定化剤、防腐剤、徐放調整剤、界面活性剤、光沢剤、溶解剤、湿潤剤等を配合することができる。
【００４９】
食品組成物に含まれる本発明のヒドロキシルイソフラボンの割合は、例えば、0.01〜99質量%、0.1〜80質量%、1〜70質量%などが挙げられる。
【００５０】
食品組成物の摂取量は、摂取者の体重、年齢、性別、症状などの種々の条件に応じて適宜設定することができる。
【００５１】
後述する実施例で示すように、本発明者らは、マウスに本発明のヒドロキシイソフラボンを経口摂取させることで、高脂肪食による体重、血糖値、血清コレステロール値及び血清トリグリセリド値の上昇を抑制し、更に糖尿病モデルマウスにおいて血糖値及びHbA1c値の上昇を抑制することを見出したことから、生活習慣病に対する改善又は予防作用が期待できる。さらに、本発明のヒドロキシイソフラボンの摂取により肝臓及び腎臓の線維化の改善が観察された。また、マウスの糖負荷試験では、本発明のヒドロキシイソフラボンの摂取により血糖値の低下が観察されたことから、インスリン抵抗性に対する効果が期待できる。さらに、マウスの肝機能及び脂質代謝に関わる血液検査結果から、本発明のヒドロキシイソフラボンによる肝機能及び脂質代謝の改善が観察された。その上、本発明のヒドロキシイソフラボンは、皮脂線細胞において炎症性サイトカインのTNFA (TNF-α)の発現を抑制することを見出したことから、ニキビ(ざ瘡)に対する改善又は予防作用が期待できる。
【００５２】
そのため、本発明のヒドロキシイソフラボンは、顕著に優れた生活習慣病の改善又は予防作用、肝臓及び腎臓の線維化の改善又は予防作用、肝機能改善作用、並びにニキビの改善又は予防作用を有するので、生活習慣病の改善又は予防用食品組成物、肝臓及び／又は腎臓の線維化の改善又は予防用食品組成物、肝機能改善用食品組成物、並びにニキビの改善又は予防用食品組成物の有効成分として好適に使用することができる。
【００５３】
ここで、生活習慣病としては、特に制限されず、例えば、糖尿病(特に2型糖尿病)、インスリン抵抗性、脂質異常症、肥満、脂肪肝などが挙げられる。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。
【００５５】
以下の実験で使用するUnifine (東洋発酵株式会社)は、イソフラボンを含む大豆エキスを麹菌で発酵した発酵素材であり、本発明の8-OH体イソフラボンを7.7%含有する物である。
【００５６】
＜実験方法＞
１．高脂肪食(HFD)試験
Unifineは、日本クレア株式会社(Tokyo, Japan)に依頼し、HFD-32に2%の濃度で混餌した。血糖値は、ニプロフリースタイルフリーダムライト(Nipro, Osaka, Japan)を用いて測定した。血清はヘマトクリット管を用いて血液を採取し、12,000rpm にて分離後、コレステロールワコー・トリグリセリドワコー(FUJIFILM Wako Pure Chemical, Osaka, Japan)を用いて、経時的に測定した。糖負荷試験(OGTT: oral glucose tolerancetest)は、同様に6週間のHFD負荷を行った後、300 mg/mlグルコースを100μl経口投与することにより行い、継時的に上述の血糖値測定を行った。
【００５７】
２．KK-Ayマウス試験
8週齢雄KK-Ayマウスは、日本クレア株式会社(Tokyo, Japan)より搬入した。1週間の馴化の後、普通食(CRF-1：オリエンタル酵母株式会社)を対照群として、CRF-1に2%のUnifineを混餌した試料を連日8週間摂取させ、体重及び平常時血糖値を測定した。HbA1c値は、8週間経過後、麻酔下で心採血を行い、抗凝固剤として10%EDTAを500μlの血液に対して10μl添加し、冷蔵保存した。これらのサンプルは、株式会社オリエンタルバイオサービスに依頼し、HbA1c値を測定した。
【００５８】
３．低容量ストレプトゾトシン(STZ)誘導糖尿病モデルマウス試験
個体1匹あたり、100 mg/kgの濃度で15週齢BL6マウスにストレプトゾトシンを腹腔内注射した。平常時血糖値が300 mg/dl以上になることで、糖尿病の病態が形成されたと判断した。普通食(CRF-1)を対照群として、CRF-1に2%のUnifineを混餌した試料を連日摂取させ、体重及び平常時血糖値を測定した。
【００５９】
４．3T3-L1脂肪細胞分化試験
マウス脂肪細胞前駆細胞は、10%牛胎児血清(FCS)及びペニシリン・ストレプトマイシン・アムホテリシンB (抗生物質溶液)を含むDMEMにて培養を行った。脂肪細胞への分化は、10μg/mlインスリン、2.5μMデキサメタゾン、10μg/ml 3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)を終濃度として加えた培地に、40μg/mlのUnifineを含むように添加し、隔日に培地を交換して、経過観察を行った。
【００６０】
５．SZ-95皮脂腺細胞分化試験
SZ-95:ヒト皮脂腺細胞株は、デッサウ医療センター(ドイツ)から輸入し、Sebomed basal medium (Biochrom, Berlin, Germany)に、10%FCS、抗生物質溶液、ヒト組換え型EGF (Peprotech)(終濃度：5 ng/ml)を添加して培養した。10μg/ml大腸菌LPS (ナカライテスク株式会社, Kyoto, Japan)の刺激の有無の30分前に、40μg/mlのUnifineを含むように添加し、LPS添加の24時間後に、細胞をセパゾール(RNA抽出液)で可溶化した。
【００６１】
６．定量的PCR (qPCR)
常法によりtotal RNAを調製し、1 gを逆転写反応した。次に、Piko real system (Thermo fisher Scientific)を用いて、定量的PCR解析を行った。用いたプライマーペアは以下のとおりである。
hTNFA
5'-ATGAGCACTGAAAGCATGATCC-3' (配列番号１)
5'-GAGGGCTGATTAGAGAGAGGTC-3' (配列番号２)
hGAPDH
5'-ACCCACTCCTCCACCTTTG-3' (配列番号３)
5'-CTCTTGTGCTCTTGCTGGG-3' (配列番号４)
【００６２】
７．フラックスアナライザー試験
C2C12細胞は、10%牛胎仔血清(fetal bovine serum: FBS)及び抗生物質を含むhigh glucose DMEM(ナカライテスク株式会社)により継代しながら培養を行った。
【００６３】
専用の24穴プレートに30,000細胞の濃度でC2C12細胞を播種し、培養を行った。20μg/mlのUnifine (発酵イソフラボン)又は未発酵イソフラボンの存在下で、C2C12細胞を48時間前処理した。その後、細胞は、10 mMグルコース、1 mMピルビン酸、及び2 mMグルタミンが添加されたシーホース培地を用いてインキュベートした。Rotenone (Rot：Complex I阻害薬)、Antimycin A (AA：Complex III阻害薬)、2-deoxyglucose (2-DG：解糖系阻害薬)をそれぞれ終濃度1μM (Rot)、1μM (AA)、10 mM (2-DG)となるように調製し、Glycolysis rate assay kit用にプログラムしてフラックスアナライザー(Agilent Technologies)により解析を行った。
【００６４】
８．統計処理
有意差の検定はstudent's unpaird t-testを用いて、多検体比較はDunnet-test又はTukey-testを用いた。p<0.05の場合は有意であると判定した。
【００６５】
＜結果＞
１．HFD試験
HFD試験の結果を図１〜４及び表１に示す。
【００６６】
HFD群は、普通食を給餌したNormal Diet:ND群に比べ、明確に体重増加、並びに平常時血糖値、平常時血清トリグリセリド値、及び血清コレステロール値のいずれのパラメーターも時間経過とともに増加したのに対して、HFDに混餌した2% Unifine (以下、HFD+Unifine群)は、顕著に体重増加を防止し、各パラメーターにおいて良好な成績を示した(図１)。
【００６７】
また、それぞれの餌で6週間飼育した後、剖検した。その結果、体重に比例するように、HFD群ではND群に比べて明らかに内臓脂肪が形成されていたのに対して、HFD+Unifine群では腸間膜脂肪組織及び精巣上体脂肪組織のいずれも縮小していた(図２)。
【００６８】
6週間のHFD試験を行った後、肝臓の一部は、病理解析に供した。ND群は正常な組織像を示したのに対して(図３Ａ、Ｄ、Ｇ)、HFD群は肝組織内に白抜けした領域(脂肪)を多領域に観察した(図３Ｂ、Ｅ、Ｈ)。これに対し、HFD＋Unifine群は、ND群と同様、ほぼ正常な組織像を認めた(図３Ｃ、Ｆ、Ｉ)。
【００６９】
6週間のHFD試験を行った後、脂肪組織の一部は、病理解析に供した。ND群は正常な組織像を示したのに対して(図４Ａ)、HFD群は肥大化した脂肪細胞を多領域に観察した(図４Ｂ)。これに対し、HFD＋Unifine群は、ND群ほどは改善していなかったが、脂肪細胞の直径測定試験により、有意に小型化した(図４Ｃ、Ｄ)。
【００７０】
また、病理解析に供した肝臓の一部について、HE染色、アザン染色及びPSA染色を行った(図５)。HFD群において、アザン染色により、全体的に青色に染まっており、コラーゲンなどの膠原繊維質が増加していると考えられる。これに対して、HFD+Unifine群は青色に染色されていなかった。PAS染色は、グリコーゲンが染色されており、HFD群において、濃く染色された部分がまだらになり、薄く染色される縞状の像が認められ、HFD+Unifine群ではそれは認められなかった。
【００７１】
腎臓の一部についても、病理解析に供し、アザン染色及びPAS染色を行った(図６)。HFD群において、アザン染色により、腎皮質側の腎糸球体が濃青色に染色されていたが、これはHFD+Unifine群においては観察されなかった。また、PAS染色から、HFD群のみ薄く染色された。
【００７２】
剖検時に心採血を行い、肝機能マーカーと脂質代謝マーカーについて、血液検査を行った。その結果、各肝機能検査値及び脂質代謝検査値は、HFDによって大きく悪化し、そこへUnifineが加わったことで大きく改善した(表１)。
【００７３】
【表１】
2019208502.tif 000012
【００７４】
２．OGTT試験
上記HFD試験の結果から、発酵イソフラボンが抗糖尿病作用を有することが強く示唆されたので、次にOGTT試験を行った。結果を図７に示す。
【００７５】
その結果、異なる2つのマウス種(ddYとC57/BL6N)で、同様にHFDは体重増加を示したのに対し、HFD+Unifine群は有意に体重増加を予防した(図７Ａ)。この条件下で、Unifineは耐糖能を示し、糖負荷後30分の血糖値の最高血中濃度、及びその後の速やかな血糖値の低下を示した(図７Ｂ)。
【００７６】
３．KK-Ayマウス試験
次に、2型糖尿病モデルであるKK-Ayマウスを用いて、Unifineの効果を調べた。Unifineは、通常食：CRF-1に2%の濃度で混餌し、8週間飼育した。結果を図８に示す。
【００７７】
KK-Ayマウスは、CRF-1により体重増加を認めたのに対し、Unifineを混餌したCRF-1で飼育すると、その増加は穏やかになった(図８Ａ)。また、経時的に平常時血糖値を測定したところ、およそ1週間経過後ほどから顕著にCRF-1で飼育したマウスは高血糖を示したのに対し、Unifineを混餌したCRF-1で飼育するとほぼ200 mg/dl以下で推移した(図８Ｂ)。また、およそ1ヶ月前の血糖状態を反映するHbA1c値は、Unifineにより顕著に抑制された(図８Ｃ)。
【００７８】
４．低容量ストレプトゾトシン誘導糖尿病モデルマウス試験
低容量ストレプトゾトシン誘導糖尿病モデルマウスを用いて、Unifineの効果を調べた。Unifineは、通常食：CRF-1に2%の濃度で混餌し飼育した。結果を図９に示す。
【００７９】
経時的に平常時血糖値を測定したところ、STZ投与しCRF-1で飼育したマウスは高血糖を示したのに対し、STZ投与しUnifineを混餌したCRF-1で飼育すると血糖値は低下していた(図９Ａ)。また、全ての群で64日間(およそ9週間)体重減少が認められないので、２型糖尿病と判断された(図９Ｂ)。
【００８０】
５．培養細胞へのUnifineの効果
脂肪細胞分化試験及び皮脂腺細胞分化試験を行った。その結果を図１０及び１１に示す。
【００８１】
脂肪細胞分化系では、Unifineは脂肪細胞分化を抑制した(図１０)。そこで、皮脂腺細胞の炎症モデルを用いて調べたところ、LPSによって炎症性サイトカインであるTNFAの発現が著しく亢進し、これに対してUnifineは顕著に抑制作用を示した(図１１)。
【００８２】
６．Glycolysis rateアッセイ
Glycolysis rateアッセイを行った。その結果を図１２に示す。
【００８３】
Basal Glycolysisは、未発酵イソフラボンでは影響がなく、発酵イソフラボンにおいてのみ、ECARの上昇が認められ、glycoPER値は有意に亢進していた。また、Compensatory GlycolysisのglycoPER値も発酵イソフラボンにおいてのみ有意に亢進していた。
【図１】
2019208502.tif 000018
【図２】
2019208502.tif 000019
【図３】
2019208502.tif 000020
【図４】
2019208502.tif 000021
【図５】
2019208502.tif 000022
【図６】
2019208502.tif 000023
【図７】
2019208502.tif 000024
【図８】
2019208502.tif 000025
【図９】
2019208502.tif 000026
【図１０】
2019208502.tif 000027
【図１１】
2019208502.tif 000028
【図１２】
2019208502.tif 000029
【配列表】
2019208502000001.app