(57)【要約】      （修正有）【課題】コラーゲン産生促進用組成物の提供。【解決手段】バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとコラーゲンペプチドを含有するコラーゲン産生促進用組成物。コラーゲンペプチドがトリペプチドを５質量％以上含有する前記組成物。【効果】前記組成物は生体コラーゲン産生の機能を促進する作用を有している。またバラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスの有する抗菌性や抗ウイルス作用をあわせ持つため、感染症の防御や、感染予後体力回復のための飲食品としても使用可能である。【選択図】図１
2019141028.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとコラーゲンペプチドを含有するコラーゲン産生促進用組成物。
【請求項２】
コラーゲンペプチドがトリペプチドを５質量％以上含有するものである請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
コラーゲンペプチドが、トリペプチドを１０〜２０質量％含有するものである請求項１記載の組成物。
【請求項４】
バラ科バラ属の植物が、ガリカローズ、ドッグローズ、アポテカリーズローズ、スイー
トブライヤー、ダマスクバラ、セイヨウバラ及びハマナシから選ばれる１種以上である請
求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスが水、親水性有機溶媒又はこれら
の混合液により抽出処理して得られたエキスである請求項１〜４のいずれかに記載の組成
物。
【請求項６】
コラーゲンペプチドが、コラーゲン又はゼラチンをコラゲナーゼにより酵素分解した酵
素分解物である請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキス１質量部に対し、コラーゲンペプ
チドを４０〜１２８０質量部の比率で含有する請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体のコラーゲン産生を促進するための新規な組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは線維芽細胞から細胞外に分泌されるタンパク質である。コラーゲンは、生体における種々の結合組織に、力学的な強度を与えるのに役立っており、腱の主成分はコラーゲン繊維がきちんとすきまなく配列したもので、非常に強い力に耐える。また、皮膚においては、真皮の乾燥重量のうち約７０％をコラーゲンが占めているといわれ、皮膚の弾力性や柔軟性を維持するのに重要な役割を果たしている。また、コラーゲンがそれに接する細胞に対して、増殖、分化シグナルを与えるための情報伝達の働きも担っていることがわかってきている。コラーゲンには種々のタイプが存在することが知られており、３０種以上のタイプが報告されている。なかでもコラーゲンの線維性を構成する基本のタイプがＩ型コラーゲンであり、生体の主要構成成分である。脊椎動物では８５％〜９０％と最も大量に存在するコラーゲンであり、骨に大量に含まれ、骨に弾力性を持たせる働きをしている。また皮膚の真皮にも非常に多く、Ｉ型コラーゲンの太い線維にて皮膚の強さを生み出す働きがある。
近年、皮膚の弾力性や、シワの改善を目的としてコラーゲンやコラーゲンの加水分解物を経口摂取することが行われており、「美容ドリンク」や「美肌飲料」などの名称でコラーゲンやコラーゲンの加水分解物を含む飲料が市販されている。これらの飲料は、１回当たりコラーゲン換算で９００〜１００００ｍｇを摂取することが効果的であるといわれている。
経口摂取したコラーゲンやコラーゲンペプチドがどのような作用機序で皮膚の弾力性やシワの改善に働くのか、詳細な機構は明らかになっていないが、一部のペプチドが、コラーゲンを経口摂取すると血液中に出現することが知られている。そしてそのペプチドが線維芽細胞のＩ型コラーゲンの産生を促進することも知られている。
【０００３】
特許文献１には、コラーゲンをコラゲナーゼで酵素分解した際に得られるＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐの構造を有するトリペプチド（コラーゲントリペプチド）が生体コラーゲン合成促進作用を有し、これを含むコラーゲン加水分解物をコラーゲン合成促進剤として利用する技術が記載されている。
特許文献２には、前記のコラーゲントリペプチドとフラボノイドの一種であるシリマリンとリンゴ抽出物が、コラーゲンと線維芽細胞からなるコラーゲンゲルを収縮させ、シワ改善に用いることができることが記載されている。
特許文献３には、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ、またはＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇの構造を有するコラーゲン由来のペプチドがシリビンと相乗的にＩ型コラーゲンの産生を促進することが記載されている。
特許文献４では、コラーゲンを経口摂取した直後に血液中に出現する複数のトリペプチド又はジペプチドを合成して、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ、Ａｌａ−Ｈｙｐのジペプチドまたはトリペプチドが培養マウス線維芽細胞に対してコラーゲン合成を促進することを確認して、その結果に基づき、皮膚コラーゲン産生促進剤として利用することを提案している。
特許文献５にはＧｌｙ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｈｙｐのいずれかの配列を有するジペプチドを有効成分とするコラーゲン産生促進剤が記載されている。
このように、これまでの研究開発から、コラーゲンタンパク質の加水分解物やコラーゲンペプチド、アミノ酸など多くの物質がコラーゲン産生促進作用を有することが明らかとなっており、引き続き有用な物質の探索が行われている。
【０００４】
一方、バラ科バラ属の植物の花弁又はつぼみのエキスに様々な作用が見いだされている。そして、これを化粧品や健康食品に配合できることも知られている。特許文献６には、ドッグローズ、アポテカリーズローズ、スイートブライヤー、ダマスクバラ、セイヨウバラ及びハマナシから選ばれる少なくとも１種のバラ科バラ属の植物のつぼみ又は花弁を水、親水性有機溶媒又はこれらの混合液により抽出処理して得られた抽出物を有効成分とする抗菌作用組成物や飲食品が記載されている。
特許文献７には、特許文献６と同様の抽出物であって、ドッグローズ、アポテカリーズローズ、スイートブライヤー、ダマスクバラ、セイヨウバラ及びハマナシから選ばれる少なくとも１種のバラ科植物のつぼみ又は花弁を水、親水性有機溶媒又はこれらの混合液により抽出処理して得られた抽出物が記載されている。そして、この抽出物に抗インフルエンザウィルス作用を見いだし、これを有効成分とする抗インフルエンザウィルス剤及びこれを配合した飲食品の発明が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３８０２７２１号公報
【特許文献２】特許第５５７２４０６号公報
【特許文献３】特許第４０３３８７７号公報
【特許文献４】特許第４９９５１５５号公報
【特許文献５】特開２０１６−１６９１９９号公報
【特許文献６】特許第４６３３２２６号公報
【特許文献７】特開２００２−１４５７９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、特許文献１から５に開示されたコラーゲンペプチドのコラーゲン産生促進機能の増強に注目している。種々の物質やエキスの作用を検討したところ、バラ科バラ属の植物の花弁及び／またはつぼみのエキスとコラーゲンペプチドを組み合わせた組成物に強いコラーゲン産生促進作用を見いだし、本発明をなした。
バラ科バラ属の植物の花弁及び／またはつぼみのエキスにコラーゲンペプチドの作用を増強するという知見は、従来技術には見いだせない新規な発見である。この結果に基づき本発明をなした。
すなわち、本発明は、コラーゲン産生促進作用を有する、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとコラーゲンペプチドを含有する新規な組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとコラーゲンペプチドを含有するコラーゲン産生促進用組成物。
（２）コラーゲンペプチドがトリペプチドを５質量％以上含有するものである（１）に記載の組成物。
（３）コラーゲンペプチドが、トリペプチドを１０〜２０質量％含有するものである（１）に記載の組成物。
（４）バラ科バラ属の植物が、ガリカローズ、ドッグローズ、アポテカリーズローズ、スイートブライヤー、ダマスクバラ、セイヨウバラ及びハマナシから選ばれる１種以上である（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスが水、親水性有機溶媒又はこれらの混合液により抽出処理して得られたエキスである（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（６）コラーゲンペプチドが、コラーゲン又はゼラチンをコラゲナーゼにより酵素分解した酵素分解物である（１）〜（５）のいずれかに記載の組成物。
（７）バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキス１質量部に対し、コラーゲンペプチドを４０〜１２８０質量部の比率で含有する（１）〜（６）のいずれかに記載の組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の組成物は、生体コラーゲン産生の機能を促進する作用を有している。またバラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスの有する抗菌性や抗ウイルス作用をあわせ持つため、感染症の防御や、感染予後体力回復のための飲食品としても使用可能である。また本発明の組成物は、原料とする成分の食経験が長く、安全性が確認されているため、飲食品として経口で摂取することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】コラーゲン産生促進試験の結果を示すグラフである。
【図２】低分子コラーゲンによるコラーゲン産生促進試験結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとコラーゲンペプチドを含有するコラーゲン産生促進用組成物に関する。
本発明の組成物について説明する。
バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみは、どのような品種から採取したものでもかまわないが、園芸種として大量に栽培されているものが産業上好ましい。このようなものとして特にガリカローズ（Ｒｏｓａ  ｇａｌｌｉｃａ）、ドッグローズ（Ｒｏｓａ  ｃａｎｉｎａ）、アポテカリーズローズ（Ｒｏｓａ  ｇａｌｌｉｃａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、スイートブライヤー（Ｒｏｓａ  ｒｕｂｉｇｉｎｏｓａ）、ダマスクバラ（Ｒｏｓａ  ｄａｍａｓｃｅｎａ  ｔｒｉｇｉｎｔｉｐｅｔａｌａ）、セイヨウバラ（Ｒｏｓａ  ｃｅｎｔｉｆｏｌｉａ）及びハマナシ（Ｒｏｓａ  ｒｕｇｏｓａｒｕｂｒａ）が好ましい。
【００１１】
例えば、バラ科バラ属の植物の花弁又はつぼみを生のまま又は乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用い粉砕して溶媒抽出に供することにより得ることができる。抽出に用いる溶媒としては、水又は親水性有機溶媒及びこれらの混合液を室温乃至溶媒の沸点以下の温度で用いることが好ましい。具体的には、メタノール、エタノール等の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール等の炭素数２〜４の多価アルコール、及びこれら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。なお、水と親水性有機溶媒との混合系溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１〜４０質量部、多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１０〜９０質量部添加することが好ましい。
【００１２】
この場合、抽出処理は、室温乃至還流加熱下で、任意の装置を用いて行うことができる。例えば、抽出溶媒を満たした処理槽にバラ科植物のつぼみ（又は花弁）を投入し、必要に応じて時々攪拌しながら、３０分〜２時間静置して可溶性成分を溶出した後、濾過して固形物を除去し、得られた抽出液から抽出溶媒を溜去し、乾燥することにより赤褐色のバラエキスが得られる。抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常５０〜９０℃で３０分〜２時間程度である。また、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いた場合には、通常４０〜８０℃で３０分〜２時間程度である。なお、溶媒で抽出することにより得られる抽出液は、抽出溶媒が安全性の高いものであればそのまま配合して本発明の有効成分として用いることができる。特許文献６には具体的な製造方法が開示されており、これにしたがって本発明に適したエキスを得ることができる。
【００１３】
このようにして得られるバラ科植物のエキスは、原料に由来する好ましい風味を有しており、そのまま本発明に利用可能であるが、必要に応じて、脱色等を目的とする精製を施し、配合用途に応じて、アルコールその他の有機溶剤の溶液又は水溶液の形として利用することができる。
【００１４】
本発明に用いるバラ科バラ属の植物のエキスは、必要によりデキストリンやシクロデキストリンを添加して、噴霧乾燥などの乾燥手段で粉末化することもできる。
本発明に用いるバラ科バラ属の植物のエキスは、市販されているものを使用することができる。本発明に適した、バラのつぼみのエキスの噴霧乾燥品である丸善製薬株式会社製の「ローズバッツエキスパウダーＭＦ」を例示できる。
本発明に用いるバラ科バラ属の植物エキスは、ポリフェノールを５質量％以上含有し、好ましくは１０〜８０質量％、特に好ましくは１０〜２０質量％含有するものである。
【００１５】
コラーゲンペプチドは、トリペプチドを含有し、通常一般のコラーゲンと称するものとは区別されるものである。さらに詳しくは、アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ，Ｙはアミノ酸）であるペプチドを含有するものが好ましく、特に好ましくはアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐを含有するものが好ましい。またコラーゲンペプチド中のトリペプチド含量は５質量％以上が好ましく、さらに好ましくは１０質量％以上であり、特に好ましくは１０〜２０質量％である。
本発明に用いるコラーゲンペプチドは、豚、ウシなどの動物由来、魚由来いずれも使用可能である。
【００１６】
本発明に用いるコラーゲンペプチドは、主にコラーゲン又はゼラチンを酵素加水分解して製造することができる。コラーゲン又はゼラチン加水分解物は、既に市販されているが、これらの酵素的に加水分解されたコラーゲンの多くは、分子量の分布範囲が２０００〜８００００である。これらの加水分解物は水に対する分散性の向上を目的とするものである。これに対して本発明で用いるコラーゲン加水分解物は、コラーゲン又はゼラチンをコラゲナーゼによって加水分解して得られるもので、特定の有効成分として上記のアミノ酸配列であるＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐのペプチドを主とする分子量約４００以下のペプチドを含むことが特徴である。このようなコラーンゲペプチドとしては、市販されているものを使用することができる。市販されているもので、本発明に使用可能なものとしては、ゼライス株式会社が販売する「ＨＡＣＰ−０１」を例示することができる。また特許文献１に開示された方法に従って、本発明に適したコラーゲンペプチドを調製することができる。
【００１７】
本発明にあっては、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとコラーゲンペプチドの相乗作用によってコラーゲン産生を促進する。このような相乗効果を得るためには、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとコラーゲンペプチドが、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキス１質量部に対し４０〜１２８０質量部含有する組成物とする。
【００１８】
この組成物を飲食品に添加する場合、 添加量は、０．０１質量％以上、好ましくは０．５〜９５質量％、特に好ましくは５〜９０質量％である。医薬品又は化粧品とする場合、症状及び対象とする年齢や、体重、投与する剤形によって異なるため一義的に配合量を決定できない。
【００１９】
食品としては、通常の食品の他、栄養補助食品、機能性食品、健康食品、特定保健用食品等として、例えば、錠剤、カプセル、パウダー等のような形態が好ましい。その他、ジュースのような飲料、ゼリーに配合することもできる。  
【００２０】
医薬品用途において、投与に関しては、有効成分を経口投与、非経口摂取の場合、直腸内投与、注射等の投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。形態としては、例えば、粉末、散剤、顆粒、錠剤、カプセル、等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤、外用剤等が挙げられる。これらの製剤は常套手段により調製することが可能である。上記の医薬品用担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチレンデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤等の添加剤を適宜添加することも可能である。
【００２１】
本発明の組成物を化粧品とする場合、本発明の効果を損なわない範囲で、通常化粧料に常用される各種の成分を適宜配合することができる。このような配合可能なその他の成分としては、本発明の目的を妨げない限り特に限定されず、例えば、油分、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、色材、アルコール類、紫外線防止剤、アミノ酸類、ビタミン類、美白剤、有機酸、無機塩類、酵素、酸化防止剤、安定剤、防腐剤、殺菌剤、皮膚賦活剤、血行促進剤、抗脂漏剤、抗炎症剤等の薬剤、金属イオン封鎖剤、ｐＨ調整剤、収斂剤、清涼剤、香料、色素、水が挙げられる。
【００２２】
本発明の組成物を含む化粧料の形態は特に限定されず、例えば、化粧水、乳液、クリーム、美容液、ファンデーション等の形態でスキンケア化粧料やメーキャップ化粧料、マッサージ化粧料、パック化粧料に用いることができる。また、本発明の組成物は、薬事法の言う化粧品、医薬部外品、医薬品等に含まれる製品とすることができる。乳液、クリーム、ローションのようなスキンケア製品、軟膏等に用いられる。特に限定されるものではないが、その剤型は水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水−油２層系、水−油−粉末３層系等、幅広い剤型を取り得る。
【実施例】
【００２３】
以下に本発明の組成物を用いたコラーゲン産生促進試験例を示し、 本発明を具体的に説明する。
（１）試験試料（サンプル）
バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとして、丸善製薬株式会社が販売しているローズバッツエキスパウダーＭＦを用いた。またコラーゲンペプチドとして、コラーゲントリペプチドが１０〜２０質量％含まれているゼライス株式会社製のコラーゲンペプチドＨＡＣＰ−０１を用いた。
【００２４】
（２）試験方法
１）使用細胞
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ：ロンザジャパン株式会社)
２）試験試料（サンプル）
コラーゲンペプチド（ＨＡＣＰ−０１：ゼライス株式会社：コラーゲントリペプチド１０〜２０質量％含有品）、バラつぼみエキス（ローズバッツエキスパウダーＭＦ：丸善製薬株式会社：ポリフェノール１０〜２０質量％含有品）を試験試料（サンプル）とした。
【００２５】
３）細胞培養
細胞は３７℃、５％二酸化炭素、９５％空気の条件下で培養を行った。培地は非働化したウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１０％、ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）１％を添加したダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース含有、ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。以降、この培地を基礎培地と表記する。通常培養には１０ｃｍまたは１５ｃｍディッシュを用い、継代時の細胞剥離には０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。
【００２６】
（３）サンプル調製
各サンプルは培地で溶解した。ＵＶＡ照射前は基礎培地を用い、ＵＶＡ照射後はＦＢＳ不含基礎培地を用いた。
サンプルの最終濃度
バラつぼみエキス（ローズバッツエキスパウダーＭＦ）  ６．２５、１２．５、２５、５０（μｇ／ｍＬ）
コラーゲンペプチド（ＨＡＣＰ−０１）  ２０００、４０００、８０００（μｇ／ｍＬ）
併用  各濃度の組合せ
下記の表１に示す添加濃度で試験を実施した。
【００２７】
【表１】
2019141028.tif 000003
【００２８】
（４）細胞の形態観察
形態観察には倒立型システム顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ  ＩＸ７０）を用いて行った。
【００２９】
（５）コラーゲン産生量の確認試験
２４ｗｅｌｌプレートに細胞を１×１０５  ｃｅｌｌｓ／５００μＬ／ｗｅｌｌで播種した。１日前培養した後、サンプル入り基礎培地５００μＬと交換して１日培養した。その後、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、カルシウム・マグネシウム含有、フェノールレッド不含）５００μＬに置換し、蓋を取ったディッシュをＵＶＡ照射ランプの下に一列に置いて１２Ｊ／ｃｍ２照射した（約１３２分）。照射後、ＨＢＳＳを取り除き、サンプル入りのＦＢＳ不含基礎培地５００μＬと交換して２日間培養した。培地を回収し、−８０℃中に保存した。培地回収後、ディッシュを５００μＬのリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液２００μＬで懸濁し、細胞を回収した。
回収した培地は４℃、１０，０００×ｇで１０分間遠心し、その上清中のＩ型コラーゲン量をＣｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉ，  Ｈｕｍａｎ，  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（株式会社エーセル）を用いて測定した。細胞懸濁液は４℃、１０，０００×ｇで１０分間遠心し、その上清中のタンパク量をＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いて測定した。培地中のＩ型コラーゲン量は細胞タンパク量で補正した。
【００３０】
（６）試験結果
コラーゲンペプチドとバラつぼみエキスによるＩ型コラーゲン産生効果を図１に示す。
なお、コラーゲンペプチドとバラつぼみエキスによるコラーゲン産生能の相乗効果については以下の基準で判定した。
相乗効果：理論値＜実測値
理論値＝（Ａ／Ｄ−１）×１００＋（Ｂ／Ｄ−１）×１００
実測値＝（Ｃ／Ｄ−１）×１００
Ａ：バラつぼみエキス単独添加によるＩ型コラーゲン産生量
Ｂ：コラーゲンペプチド単独添加によるＩ型コラーゲン産生量
Ｃ：バラつぼみエキスとコラーゲンペプチドの併用によるＩ型コラーゲン産生量
Ｄ：コントロール群（無添加サンプル）のＩ型コラーゲン産生量
さらに、コラーゲンペプチドとバラつぼみエキスの併用効果の検定には、得られた測定結果について二元配置分散分析法（繰り返しあり）を用いた。以上の測定結果と併用効果の判定表を、下記の表２に示す。
【００３１】
【表２】
2019141028.tif 000004
【００３２】
図１から、コラーゲンペプチドとバラつぼみエキスの併用により、Ｉ型コラーゲンの産生量が顕著に上昇したことが確認できた。
【００３３】
表２に示すように、すべてのコラーゲンペプチドとバラつぼみエキス併用群は、有意にコラーゲン産生を促進したと評価できる。また、二元配置分散分析において有意に差が認められたものに関しては判定を◎とした。また、このときのコラーゲンペプチドとバラつぼみエキスの配合比率は、表１からバラつぼみエキス１質量部に対してコラーゲンペプチドを４０〜１２８０質量部の範囲において、コラーゲン産生を促進することがわかった。
なお、細胞観察の結果、各試験群においてコラーゲンペプチド及びバラつぼみエキスの添加は、細胞の生育や形態には影響しないことをＷＳＴ−８アッセイ（ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８、株式会社同仁化学研究所）と顕鏡観察により確認している。
以上の試験結果の解析から、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとコラーゲンペプチドを含有する組成物は、細胞の生育に影響を及ぼさずにコラーゲン産生を促進することがわかった。またバラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとコラーゲンペプチドの配合比は、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキス１質量部に対してコラーゲンペプチドを４０〜１２８０質量部を含むように調製することが効果的であるものと考えられた。
【００３４】
＜比較試験例＞
本発明の効果を正しく理解するために、比較試験例としてコラーゲントリペプチド含有量が５質量％未満の低分子コラーゲンを用いた試験を同様にして実施した。
【００３５】
（１）試験試料（サンプル）
バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとして、丸善製薬株式会社が販売
しているローズバッツエキスパウダーＭＦを用いた。
またコラーゲントリペプチドの含有量が５質量％未満の低分子コラーゲン（平均分子量５０００）を用いた。
【００３６】
（２）試験方法
１）使用細胞
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ：ロンザジャパン株式会社)
２）試験試料（サンプル）
低分子コラーゲン（ゼライス株式会社）、バラつぼみエキス（ローズバッツエキスパウダーＭＦ：丸善製薬株式会社：ポリフェノール１０〜２０質量％含有品）を試験試料（サンプル）とした。
【００３７】
３）細胞培養
細胞は３７℃、５％二酸化炭素、９５％空気の条件下で培養を行った。培地は非働化したウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１０％、ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）１％を添加したダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース含有、ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。通常培養には１０ｃｍまたは１５ｃｍディッシュを用い、継代時の細胞剥離には０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。
【００３８】
（３）サンプル調製
各サンプルは培地で溶解した。ＵＶＡ照射前は基礎培地を用い、ＵＶＡ照射後はＦＢＳ不含基礎培地を用いた。
サンプルの最終濃度
バラつぼみエキス（ローズバッツエキスパウダーＭＦ）  ６．２５、１２．５、２５（μｇ／ｍＬ）
低分子コラーゲン  ２０００、８０００（μｇ／ｍＬ）
併用  各濃度の組合せ
下記の表３に示す添加濃度で試験を実施した。
【００３９】
【表３】
2019141028.tif 000005
【００４０】
（４）細胞の形態観察
形態観察には倒立型システム顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ  ＩＸ７０）を用いて行った。
【００４１】
（５）コラーゲン産生量の確認試験
２４ｗｅｌｌプレートに細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／５００μＬ／ｗｅｌｌで播種した。１日前培養した後、サンプル入り基礎培地５００μＬと交換して１日培養した。その後、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、カルシウム・マグネシウム含有、フェノールレッド不含）５００μＬに置換し、蓋を取ったディッシュをＵＶＡ照射ランプの下に一列に置いて１２Ｊ／ｃｍ２照射した（約１３２分）。照射後、ＨＢＳＳを取り除き、サンプル入りのＦＢＳ不含基礎培地５００μＬと交換して２日間培養した。培地を回収し、−８０℃中に保存した。培地回収後、ディッシュを５００μＬのリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液２００μＬで懸濁し、細胞を回収した。
回収した培地は４℃、１０，０００×ｇで１０分間遠心し、その上清中のＩ型コラーゲン量をＣｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉ，Ｈｕｍａｎ，ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（株式会社エーセル）を用いて測定した。細胞懸濁液は４℃、１０，０００×ｇで１０分間遠心し、その上清中のタンパク量をＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いて測定した。培地中のＩ型コラーゲン量は細胞タンパク量で補正した。
【００４２】
（６）試験結果
バラつぼみエキスと低分子コラーゲンによるＩ型コラーゲン産生効果を、表４及び図２に示す。
【００４３】
【表４】
2019141028.tif 000006
【００４４】
またバラつぼみエキスと低分子コラーゲンによるコラーゲン産生能の相乗効果については以下の基準で判定した。
相乗効果：相加効果の理論値＜実測値
相加効果の理論値＝（Ａ／Ｄ−１）×１００＋（Ｂ／Ｄ−１）×１００
実測値＝（Ｃ／Ｄ−１）×１００
Ａ：バラつぼみエキス単独添加によるＩ型コラーゲン産生量
Ｂ：低分子コラーゲン単独添加によるＩ型コラーゲン産生量
Ｃ：バラつぼみエキスと低分子コラーゲンの併用によるＩ型コラーゲン産生量
Ｄ：コントロール群（無添加サンプル）のＩ型コラーゲン産生量
判定結果を表５に示す。
【００４５】
【表５】
2019141028.tif 000007
【００４６】
図２、及び表４、５から、コラーゲンペプチドとバラつぼみエキスの併用によって、Ｉ型コラーゲンの産生量が相乗的に増加しないことが確認できた。
【００４７】
表５において示すように、バラつぼみエキス６．２５μｇ／ｍｌ、低分子コラーゲン８０００μｇ／ｍｌの組み合わせでは、相加効果の理論値＜実測値の結果となった。しかし、実測値２８６．６７％に対して相加効果理論値は２７６．６４％と、その効果はごくわずかであり、その他の組み合わせはいずれも実測値のほうが理論値より小さいことから、低分子コラーゲンとバラつぼみエキス併用による相乗効果群は、統計学的な有意差は認められなかった。
【００４８】
飲料に配合した処方
コラーゲンペプチド（ゼライス株式会社）６ｇ、バラつぼみエキス（丸善製薬株式会社
）０．０１ｇ、ビタミンＣ３００ｍｇ を用い、常法によりドリンク剤を製造した。
【００４９】
参考製造例１
バラ科バラ属の植物のつぼみのエキスの製造例
バラのつぼみ（Ｒｏｓａ  ｇａｌｌｉｃａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）３００ｇに５０重
量％エタノールを２０００ｍＬ加え、還流冷却器を付けて、８０℃にて１時間抽出した後
、濾紙で濾過して抽出液１を得た。また、抽出残渣に５０重量％エタノール１５００ｍＬ
を加え、同様に還流冷却器を付けて、８０℃にて１時間抽出した後、濾紙で濾過して抽出
液２を得た。得られた抽出液１、２を合せて減圧下で濃縮、乾燥させて粉末エキス１００
ｇを得た（収率３３．３％）。
【００５０】
参考製造例２
バラ科バラ属の植物のつぼみのエキスの製造例
バラのつぼみ（Ｒｏｓａ  ｃｅｎｔｉｆｏｌｉａ）３００ｇに水２０００ｍＬを加え、
９０℃にて１時間抽出を行った後、濾紙にて濾過し、抽出液を得た。得られた抽出液を減
圧下で濃縮、乾燥させて、製造例２の粉末エキス１００ｇを得た（収率３３．３％）。
【００５１】
参考製造例３
コラーゲンペプチドの製造例
コラーゲンタンパクとして、ウシ真皮より調製したゼラチン３０ｇを蒸留水３００ｍｌ
に加温溶解し、０．４５μｍのフィルターで滅菌ろ過した。
このゼラチン３０ｇを蒸留水３００ｍｌに加温溶解した。コラゲナーゼタイプＩ（Ｗｏ
ｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．）３００ｍｇを加え、アンモ
ニア水にてｐＨを７．５に調整した後３７℃で１時間放置した。反応終了後、反応液を１
００℃で３分間加熱しコラゲナーゼを失活させ、次いで０．４５μｍのフィルターで滅菌
ろ過した。このろ液をＣＤＰ−０とした。このろ液ＣＤＰ−０を蒸留水で平衡化したＳｅ
ｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）によりゲルろ過し、２
つの画分（ＣＤＰ−１，ＣＤＰ−２）に分け、それぞれを凍結乾燥した。それぞれのピー
クをＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＨＲ１０／３０（ＧＥヘルスケア・ジャパン株
式会社）に供し、０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７
．２）を溶出液に用いて分子量を求めたところ、ＣＤＰ−１が約１２０００〜５００に分
布し、ＣＤＰ−２が約３５０だった。ＣＤＰ−２の約５０％がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐで
あった。
【図１】
2019141028.tif 000008
【図２】
2019141028.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月13日(2018.12.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとトリペプチドを１０〜２０質量％含有するコラーゲンペプチドを含有するコラーゲン産生促進用組成物であって、有効成分としてバラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキス１質量部に対し、トリペプチドを１０〜２０質量％含有するコラーゲンペプチドを４０〜１２８０質量部の比率で含有するコラーゲン産生促進組成物。
【請求項２】
バラ科バラ属の植物が、ガリカローズ、ドッグローズ、アポテカリーズローズ、スイートブライヤー、ダマスクバラ、セイヨウバラ及びハマナシから選ばれる１種以上である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスが水、親水性有機溶媒又はこれらの混合液により抽出処理して得られたエキスである請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
コラーゲンペプチドが、コラーゲン又はゼラチンをコラゲナーゼにより酵素分解した酵素分解物である請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月10日(2019.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとトリペプチドを１０〜２０質量％含有するコラーゲンペプチドを含有するコラーゲン産生促進用組成物であって、有効成分としてバラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキス１質量部に対し、トリペプチドを１０〜２０質量％含有するコラーゲンペプチドを４０〜６４０質量部の比率で含有するコラーゲン産生促進組成物。
【請求項２】
バラ科バラ属の植物が、ガリカローズ、ドッグローズ、アポテカリーズローズ、スイートブライヤー、ダマスクバラ、セイヨウバラ及びハマナシから選ばれる１種以上である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスが水、親水性有機溶媒又はこれらの混合液により抽出処理して得られたエキスである請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
コラーゲンペプチドが、コラーゲン又はゼラチンをコラゲナーゼにより酵素分解した酵素分解物である請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。 
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとトリペプチドを１０〜２０質量％含有するコラーゲンペプチドを含有するコラーゲン産生促進用組成物であって、有効成分としてバラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキス１質量部に対し、トリペプチドを１０〜２０質量％含有するコラーゲンペプチドを４０〜６４０質量部の比率で含有するコラーゲン産生促進組成物。
（２）バラ科バラ属の植物が、ガリカローズ、ドッグローズ、アポテカリーズローズ、スイートブライヤー、ダマスクバラ、セイヨウバラ及びハマナシから選ばれる１種以上である（１）に記載の組成物。
（３）バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスが水、親水性有機溶媒又はこれらの混合液により抽出処理して得られたエキスである（１）または（２）に記載の組成物。
（４）コラーゲンペプチドが、コラーゲン又はゼラチンをコラゲナーゼにより酵素分解した酵素分解物である（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。 
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明にあっては、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとコラーゲンペプチドの相乗作用によってコラーゲン産生を促進する。このような相乗効果を得るためには、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとコラーゲンペプチドが、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキス１質量部に対し４０〜６４０質量部含有する組成物とする。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
【表２】
2019141028.tif 000010
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
表２に示すように、すべてのコラーゲンペプチドとバラつぼみエキス併用群は、有意にコラーゲン産生を促進したと評価できる。また、二元配置分散分析において有意に差が認められたものに関しては判定を◎とした。また、このときのコラーゲンペプチドとバラつぼみエキスの配合比率は、表１からバラつぼみエキス１質量部に対してコラーゲンペプチドを４０〜６４０質量部の範囲において、コラーゲン産生を促進することがわかった。    なお、細胞観察の結果、各試験群においてコラーゲンペプチド及びバラつぼみエキスの添加は、細胞の生育や形態には影響しないことをＷＳＴ−８アッセイ（ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８、株式会社同仁化学研究所）と顕鏡観察により確認している。
以上の試験結果の解析から、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとコラーゲンペプチドを含有する組成物は、細胞の生育に影響を及ぼさずにコラーゲン産生を促進することがわかった。またバラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとコラーゲンペプチドの配合比は、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキス１質量部に対してコラーゲンペプチドを４０〜６４０質量部を含むように調製することが効果的であるものと考えられた。