(57)【要約】      （修正有）【課題】サイズのばらつきが小さい液滴からなるエマルジョンを生成できる生成装置を提供する。【解決手段】繊維を編んで構成される膜を用いた膜乳化によりエマルジョンを生成する。膜乳化によりエマルジョンを生成する生成手段と、前記生成されたエマルジョンを保持する保持手段と、エマルジョン中に含まれる核酸を増幅するための熱処理を行う処理手段と、熱処理を行った後のエマルジョンを撮影する撮影手段と、を有することを特徴とするシステム。【選択図】図１
2019208497.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜乳化によりエマルジョンを生成する生成装置であって、繊維を編んで構成される膜を有することを特徴とする生成装置。
【請求項２】
前記繊維の材質がナイロン又はポリエステルの少なくともいずれか一方であることを特徴とする請求項１に記載の生成装置。
【請求項３】
前記膜を複数有し、前記複数の膜はエマルジョンが生成される方向に間隔をもって連結されていることを特徴とする請求項１又は請求項２のいずれか１項に記載の生成装置。
【請求項４】
前記複数の膜における前記間隔をなす領域の体積は、１つの膜により生成されるエマルジョンの体積よりも大きいことを特徴とする請求項３に記載の生成装置。
【請求項５】
前記膜は、前記繊維を編むことにより前記繊維間に生じる孔であって、前記膜の厚み方向に貫通する孔を複数有し、孔と孔との間隔が、前記孔を構成する繊維間の距離である孔径の２倍以上であることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の生成装置。
【請求項６】
前記孔径は、５μｍ以上２０μｍ未満であることを特徴とする請求項５に記載の生成装置。
【請求項７】
前記膜を平面とみなす場合に、前記平面の面積に対する、前記繊維を編むことにより前記繊維間に生じる孔が占める面積の割合である開孔率が、１２％以下であることを特徴とする請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の生成装置。
【請求項８】
前記膜により生成されるエマルジョンを保持する保持部をさらに有することを特徴とする請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載の生成装置。
【請求項９】
前記保持部では、前記膜により生成されたエマルジョンに含まれる分析対象物の濃度を測定するための処理が行われることを特徴とする請求項８に記載の生成装置。
【請求項１０】
繊維を編んで構成される膜を有し、膜乳化によりエマルジョンを生成する生成手段と、前記生成されたエマルジョンを保持する保持手段と、
前記エマルジョン中に含まれる核酸を増幅するための熱処理を行う処理手段と、
前記熱処理を行った後のエマルジョンを撮影する撮影手段と、
を有することを特徴とするシステム。
【請求項１１】
分析対象物が含まれる水相と油相とを、繊維を編んで構成される膜を介して混合することにより、油中水型エマルジョンを生成する工程と、
前記生成された油中水型エマルジョンを構成する水相に含まれる前記分析対象物の分析を行う工程と、
を有することを特徴とする分析方法。
【請求項１２】
前記膜を２枚以上３枚以下有することを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の生成装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書の開示は、生成装置、システム、分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料の分析や医薬品、化粧品等の分野において、エマルジョンに関する技術が活用されている。エマルジョンを利用した試料の分析として、油中水型エマルジョンを反応場として核酸試料を分析するデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ：ｄｉｇｉｔａｌ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が提案されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２０１２−５０３７７３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
エマルジョンを利用する技術において、サイズのばらつきが小さい液滴からなるエマルジョンを生成できることが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の実施形態に係るエマルジョンの生成装置は、膜乳化によりエマルジョンを生成する生成装置であって、繊維を編んで構成される膜を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の実施形態に係るエマルジョンの生成装置によれば、サイズのばらつきが小さい液滴からなるエマルジョンを生成することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明の実施形態に係る生成装置により生成されたエマルジョンの一例を示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係る生成装置により生成されたエマルジョンを用いたｄＰＣＲの結果の一例を示す図である。
【図３】本発明の実施例を示す表である。
【図４】本発明の実施例を示す表である。
【図５】本発明の実施形態に係る生成装置の構成の一例を示す図である。
【図６】本発明の実施形態に係る生成装置により生成されたエマルジョンの一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、図面を参照して本発明の実施形態を説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、当業者の通常の知識に基づいて、以下の実施の形態に対して適宜変更、改良等が加えられたものも本発明の範囲に含まれる。
【０００９】
エマルジョン及びエマルジョンを生成する乳化技術は、試料の分析や、医薬品、化粧品の製造に利用されている。試料の分析の一例として、核酸の濃度を推定するｄＰＣＲ（デジタルＰＣＲ：ｄｉｇｉｔａｌ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）が知られている。ｄＰＣＲでは、分析の対象とする核酸を含む試料を、核酸を増幅するための増幅試薬、核酸を検出するための蛍光試薬などと混合して希釈し、物理的に独立した多数の反応場に分割する。このとき、核酸を含む試料を十分に希釈しておくことで、それぞれの反応場に含まれる核酸の数が１個または０個のいずれかとなるようにしておく。エマルジョンに含まれるそれぞれの液滴はｄＰＣＲにおいて反応場として用いられることがある。そして、多数の反応場のそれぞれにおいて独立にＰＣＲが行われ、核酸が増幅される。増幅後に蛍光試薬により核酸を検出し、当該蛍光試薬のシグナルが検出された反応場の数（陽性反応場数）と、増幅後にシグナルが検出されなかった反応場の数（陰性反応場数）とに基づいて、試料中の核酸の濃度を推定することができる。
【００１０】
ｄＰＣＲにおいてエマルジョンの含まれるそれぞれの液滴を反応場として用いる方法として、油中水型エマルジョン（Ｗ／Ｏエマルジョン）中の液滴を反応場として用いる方法がある。油中水型エマルジョンの形成方法としては、撹拌装置や超音波破砕装置などにより機械的エネルギーを付与することでエマルジョンを形成する機械的乳化法がある。また、マイクロチャネル乳化法やマイクロ流路分岐乳化法などのマイクロ流路デバイスを用いた方法、乳化膜を用いる膜乳化法などがエマルジョンを形成する方法として挙げられる。
【００１１】
マイクロ流路デバイスなどを用いた方法では、スループットが悪く、またマイクロ流路を生成するためには高い精度管理が必要であるために、高価であるという課題がある。
【００１２】
機械的乳化法や膜乳化法は、マイクロ流路デバイスを用いた方法に比べて液滴のサイズのばらつき（分散）が大きくなる傾向にあるものの、スループット良くエマルジョンを形成できる。また、膜乳化法は、エマルジョンを形成する装置の装置構成を単純にできるとともに、液滴のサイズのばらつきが比較的低いエマルジョンを形成できる。すなわち膜乳化法では、機械的乳化法に比べ、大掛かりな装置を用いずに簡便にエマルジョンを生成できる。しかしながら、膜乳化法において乳化膜として用いられるシラス多孔質ガラスなどの多孔質材料が高価であったり、加工が難しかったりするという課題が存在する。
【００１３】
第１の実施形態は、安価に、均一なサイズの液滴からなるエマルジョンを生成する方法を提供することを目的とする。発明者らは検討の結果、以下に詳述する生成装置により、安価にサイズのばらつきの小さいエマルジョンを生成できることを見出した。また、発明者らは検討の結果、生成装置においてエマルジョンの材料を複数回、膜を通過させることにより、目的のサイズよりも大きい巨大な液滴の発生を抑制することができることを見出した。
【００１４】
図５は第１の実施形態に係る生成装置１００の一例を示す図である。生成装置１００は投入部１１０と乳化膜部１２０と保持部１３０とを含む。なお生成装置１００は乳化膜部１２０が含まれていればよく、投入部１１０及び保持部１３０は別の装置として生成装置１００に接続されていてもよい。
【００１５】
［膜の種類］
生成装置１００は乳化膜部１２０を含む。乳化膜部１２０は、エマルジョンの材料を通過させるための孔を複数有する乳化膜を含む。以下では、乳化膜を単に膜と称することがある。
【００１６】
液滴は当該材料が乳化膜の孔を通過する際に生成されるので、それぞれの孔における環境が略同一であることが好ましい。環境とは、例えば孔の形状や孔の径や孔と孔との間隔である。サイズのばらつきの小さい液滴を生成するための乳化膜として、例えば繊維を編んだ膜が挙げられる。好ましくは、繊維を網目状に編んだ膜である。繊維を網目状に編んだ膜は、濾過用フィルタとして市販されているものでもよく、例えば、メルクミリポア製のナイロンネットフィルターシリーズ、ＮＢＣメッシュテック製のマイクロメッシュシリーズ、Ｓｅｆａｒ製のナイロンメッシュシリーズなどが挙げられる。
【００１７】
［膜の材質］
乳化膜部１２０を構成する乳化膜の材質は、それぞれの孔における環境が略同一となるように加工することが可能な材質であればよい。好ましくは、網目状に編んだ膜を形成する繊維に成形できる材質である。例えば、ナイロンなどが挙げられる。ナイロンの種類としては、ナイロン４、ナイロン６、ナイロン１１、ナイロン１２、ナイロン４６、ナイロン６６、ナイロン６１０、ナイロンＭＸＤ６（メタキシリレンジアミンとアジピン酸の重縮合体）及びこれらの共重合体などが挙げられる。また、ポリエステルなども挙げられる。ポリエステルの種類としては、ポリエチレンテレフタレート、ポリトリメチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレートなどが挙げられる。
【００１８】
［膜の表面処理］
乳化膜部１２０を構成する乳化膜は、表面処理が施されていてもよい。例えば表面処理として、フッ素コート等の撥水加工が施されていてもよい。
【００１９】
［膜の孔径］
乳化膜部１２０を構成する乳化膜は、液滴を生成するための複数の孔を有する。乳化膜の孔の径は、生成したい液滴のサイズに応じて選択される。孔径は目開きという言葉でも表される。例えば、生成したい液滴のサイズが約４０μｍから約６０μｍの場合、孔径は５μｍ以上２０μｍ未満が好ましい。乳化膜部１２０の複数の孔のそれぞれの孔径は、略同一であることが好ましい。膜の形状は液滴を生成できる形状であればよく、例えば正方形、長方形、円形、楕円形である。
【００２０】
［膜の孔と孔の間隔］
乳化膜部１２０は液滴を生成するための複数の孔を有する。１つの膜における孔と孔との間隔は、巨大な液滴を抑制するために、十分に離れていることが好ましい。例えば、孔径１０μｍの膜を用いて約６０μｍの液滴を生成させる場合、孔と孔の間隔は孔径の２倍以上あいていることが好ましい。これは、孔と孔の間隔が近い場合、生成される液滴同士が膜上で融合し、巨大な液滴が生成されてしまう可能性が高くなるためである。
【００２１】
［開孔率］
開孔率とは、膜における孔の占める割合を示す。例えば、一辺がＡの正方形の孔がｄの間隔で配置してある場合の開孔率は（Ａ／（Ａ＋ｄ））２×１００％という式で表される。ｄ＝２Ａの時、開孔率は１１．１％となる。開孔率は十分に小さいことが好ましい。例えば、孔径１０μｍの膜を用いて約６０μｍの液滴を生成させる場合、開孔率は１２％以下であることが好ましい。これは、開孔率が大きい場合、生成される液滴同士が膜上で融合し、巨大な液滴が生成されてしまう可能性が高くなるためである。
【００２２】
繊維を編むことにより膜を形成する場合、その繊維間に孔が生じるように形成する。前記孔は、前記膜の厚み方向に該膜を貫通する。そして、その孔と孔との間隔が、前記孔を構成する繊維間の距離である孔径の２倍（開孔率１１．１％に相当）以上であることが望ましい。前記膜を平面とみなした場合、前記平面の面積に対する、前記繊維を編むことにより前記繊維間に生じる孔が占める面積の割合である開孔率が、１２％以下であることが望ましい。
【００２３】
［膜と膜の間隔］
乳化膜部１２０は、複数の乳化膜を含んでいてもよく、図５に示す例では第１の乳化膜１２１と第２の乳化膜１２２と第３の乳化膜１２３とを含む。乳化膜部１２０が有する乳化膜の数は使用者の目的に応じて任意に設定されてよい。
【００２４】
発明者らは、エマルジョンの材料を一度、乳化膜に通過させただけでは、目的のサイズの数十μｍオーダーの液滴以外に、数百〜数千μｍオーダーの巨大な液滴が生成されてしまうというおそれがあることを見出した。そして発明者らは、エマルジョンの材料を、乳化膜に複数回、通過させることにより、巨大な液滴を大幅に抑えることができることを見出した。すなわち乳化膜部１２０は、複数の乳化膜を有することにより、エマルジョンの材料を複数回、乳化膜を通過させることができ、目的のサイズよりも大きい巨大な液滴の発生を抑制することができる。以下では、複数の乳化膜を有する乳化膜部１２０の説明において、それぞれの乳化膜は略同一の構成であるものとする。
【００２５】
生成するエマルジョン中に巨大な液滴が生成される場合、膜を直列に複数、連結することにより、その巨大な液滴の生成を抑えることができる。膜を複数連結させる場合、膜と膜の間隔は、１の膜を通過し生成されるエマルジョンの体積以上の体積を有することが好ましい。例えば、膜を２個連結した場合、１つ目の膜を通過し生成されたエマルジョンの生成速度より、２つ目の膜を通過し生成されるエマルジョンの生成速度が遅い場合、１回目と２回目の膜の間に、液滴が蓄積していくことになる。この場合、１回目の膜を通過し生成される液滴の体積が、膜間の体積以上になると、液滴同士が融合し大液滴が生成されてしまうおそれがある。そのため、膜と膜の間隔は、エマルジョンの体積以上の体積を有することが好ましい。
【００２６】
［膜を通過させる回数］
膜を通過させる回数は、１回、乃至は２回、乃至は３回が好ましい。巨大な液滴を抑制させるためには、膜を通過させる回数は、２回以上が好ましく、より好ましくは、２回、乃至は３回である。これは、膜を通過させる回数が多くなると、目的とする数十μｍオーダーよりサイズの小さい液滴が増加するためである。すなわち、膜を２枚以上３枚以下有することが好ましい。
【００２７】
［膜を通過させる速度］
膜を通過させる速度は、特には限定されない。大液滴の生成を抑えたい場合には、速度は遅い方が好ましく、例えば、約１０ｍＬ／ｈｒ以下の速度が好ましく、より好ましくは、約３ｍＬ／ｈｒ未満の速度が好ましい。
【００２８】
続いて、本発明の実施形態に係る乳化膜部１２０を用いてｄＰＣＲを行う場合について説明する。
【００２９】
［油性組成物（Ｏ）］
ｄＰＣＲに用いる油性組成物（Ｏ）は、脂肪族炭化水素（Ａ）と、界面活性剤（Ｂ）と、を含有する。本実施形態において、脂肪族炭化水素（Ａ）の２５℃における動粘度は１０ｍｍ２／ｓ未満であり、界面活性剤（Ｂ）は、側鎖にアルキル基を有するポリエーテル変性ポリシロキサンである。また、別の実施形態において、脂肪族炭化水素（Ａ）は炭素原子数が７以上３０以下であり、界面活性剤（Ｂ）は、側鎖にアルキル基を有するポリエーテル変性ポリシロキサンである。
【００３０】
脂肪族炭化水素（Ａ）は油性組成物（Ｏ）の主成分であり、脂肪族炭化水素（Ａ）として２５℃における動粘度が１０ｍｍ２／ｓ未満の脂肪族炭化水素を用いることで、油性組成物（Ｏ）の動粘度を低くすることができる。あるいは、脂肪族炭化水素（Ａ）として炭素原子数が７以上３０以下の脂肪族炭化水素を用いることで、油性組成物（Ｏ）の動粘度を低くすることができる。これにより、油性組成物（Ｏ）を用いて形成される油中水型エマルジョンの流動性を向上させることができる。また、油性組成物（Ｏ）の動粘度を１０ｍｍ２／ｓ未満とすることにより、膜乳化等によって油中水型エマルジョンを形成する際にも、液滴のサイズを均一にしやすくすることができる。
【００３１】
一般に、２５℃における動粘度が１０ｍｍ２／ｓ未満といった低い動粘度の脂肪族炭化水素を主成分とした、低動粘度の油性組成物（Ｏ）を用いて形成される油中水型エマルジョンは、エマルジョンの安定性が低い傾向にある。このような場合でも、側鎖にアルキル基を有するポリエーテル変性ポリシロキサンを界面活性剤（Ｂ）として用いることで、安定性の高い油中水型エマルジョンを形成可能な油性組成物を実現できる。
【００３２】
以下、油性組成物（Ｏ）の各成分について、詳細に説明する。
【００３３】
＜脂肪族炭化水素（Ａ）＞
本実施形態に係る脂肪族炭化水素（Ａ）は、２５℃における動粘度が１０ｍｍ２／ｓ未満の脂肪族炭化水素である。脂肪族炭化水素（Ａ）の２５℃における動粘度は、６．５ｍｍ２／ｓ未満であることが好ましい。これにより、油性組成物（Ｏ）を用いて膜乳化法等によって油中水型エマルジョンを形成したときに、液滴のサイズのばらつきが低いエマルジョンを形成することができる。脂肪族炭化水素（Ａ）の２５℃における動粘度の下限は特に限定はされないが、０．５ｍｍ２／ｓ以上であることが好ましく、１ｍｍ２／ｓ以上であることがより好ましい。これにより、油性組成物（Ｏ）を用いて膜乳化法等によって油中水型エマルジョンを形成したときに、安定性の高いエマルジョンを形成することができる。
【００３４】
脂肪族炭化水素（Ａ）は、２５℃において液体である、液状炭化水素である。脂肪族炭化水素（Ａ）の沸点は、１００℃以上であることが好ましく、１８０℃以上であることがより好ましい。脂肪族炭化水素（Ａ）の沸点が１００℃以上であることにより、油性組成物（Ｏ）を用いて形成した油中水型エマルジョンをＰＣＲのために加熱しても、油性組成物（Ｏ）の蒸発を抑制することができる。
【００３５】
脂肪族炭化水素（Ａ）の含有量は、油性組成物（Ｏ）の全体を１００質量％としたときに、７０質量％以上９９．９質量％以下であることが好ましく、８０質量％以上９９質量％以下であることがより好ましい。
【００３６】
脂肪族炭化水素（Ａ）の比重は、０．９ｇ／ｃｍ３未満であることが好ましく、０．８５ｇ／ｃｍ３未満であることがより好ましい。脂肪族炭化水素（Ａ）の比重の下限は特に限定はされないが、０．３ｇ／ｃｍ３以上であることが好ましく、０．５ｇ／ｃｍ３以上であることがより好ましい。脂肪族炭化水素（Ａ）の比重が０．９ｇ／ｃｍ３未満であることにより、油性組成物（Ｏ）の比重を１ｇ／ｃｍ３未満にすることができ、油性組成物（Ｏ）を用いて油中水型エマルジョンを形成したときに液滴を重力方向下側に集めやすくなる。その結果、油中水型エマルジョンを用いた反応や分析を行う際に、均一に反応を進行させやすくなり、液滴の観察も容易になるため、好ましい。
【００３７】
脂肪族炭化水素（Ａ）は、パラフィン系炭化水素であることが好ましく、イソパラフィン系炭化水素やシクロパラフィン系炭化水素であることがより好ましい。また、脂肪族炭化水素（Ａ）は、炭素原子数が７以上３０以下であることが好ましく、１０以上２５以下であることがより好ましく、１０以上２０以下であることが特に好ましい。脂肪族炭化水素（Ａ）の炭素原子数が３０以下であることで、脂肪族炭化水素（Ａ）の分子量を小さくすることができ、２５℃における動粘度を低くすることができる。なお、脂肪族炭化水素（Ａ）は、複数種類の脂肪族炭化水素によって構成されていてもよい。
【００３８】
脂肪族炭化水素（Ａ）として好適な、２５℃における動粘度が１０ｍｍ２／ｓ未満のイソパラフィン系炭化水素の市販品としては、アイソパーＥ（２５℃における動粘度０．８３ｍｍ２／ｓ）、アイソパーＧ（２５℃における動粘度１．４９ｍｍ２／ｓ）、アイソパーＨ（２５℃における動粘度１．８０ｍｍ２／ｓ）、アイソパーＬ（２５℃における動粘度１．６１ｍｍ２／ｓ）、アイソパーＭ（２５℃における動粘度３．７７ｍｍ２／ｓ）（以上、エクソンモービル製、「アイソパー」はエクソンモービルの登録商標）等が挙げられる。
【００３９】
また、脂肪族炭化水素（Ａ）として好適な、２５℃における動粘度が１０ｍｍ２／ｓ未満のシクロパラフィン系炭化水素の市販品としては、エクソールＤ３０（２５℃における動粘度１．０４ｍｍ２／ｓ）、エクソールＤ４０（２５℃における動粘度１．３０ｍｍ２／ｓ）、エクソールＤ６０（２５℃における動粘度１．７３ｍｍ２／ｓ）、エクソールＤ８０（２５℃における動粘度２．０９ｍｍ２／ｓ）、エクソールＤ９５（２５℃における動粘度２．４９ｍｍ２／ｓ）、エクソールＤ１１０（２５℃における動粘度３．４３ｍｍ２／ｓ）、エクソールＤ１３０（２５℃における動粘度６．１２ｍｍ２／ｓ）（以上、エクソンモービル製、「エクソール」はエクソンモービルの登録商標）等が挙げられる。
【００４０】
＜界面活性剤（Ｂ）＞
界面活性剤（Ｂ）は、側鎖にアルキル基を有するポリエーテル変性ポリシロキサンである。エマルジョンの安定性を向上させる方法として、界面活性剤を添加することは知られているが、エマルジョンを構成するオイルなどの種類によって好適な界面活性剤は異なる。本発明者らが鋭意検討した結果、上述の脂肪族炭化水素（Ａ）を主成分とする油性組成物（Ｏ）においては、側鎖にアルキル基を有するポリエーテル変性ポリシロキサンを界面活性剤として用いることが好適であることを見いだした。すなわち、油性組成物（Ｏ）が界面活性剤（Ｂ）を含有することで、油性組成物（Ｏ）を用いて油中水型エマルジョンを形成したときに、エマルジョンの安定性を向上させることができる。これは、界面活性剤（Ｂ）が側鎖にアルキル基を有するために脂肪族炭化水素（Ａ）との親和性が高いこと、高分子のポリシロキサン骨格を有するためにエマルジョンを安定化させやすいこと、等に起因するものと発明者らは推測している。
【００４１】
界面活性剤（Ｂ）は、炭素原子数６以上３０以下のアルキル基を１個以上１００個以下で側鎖に有するポリエーテル変性ポリシロキサンであることが好ましい。また、界面活性剤（Ｂ）は、側鎖にポリエチレングリコール構造および／またはポリプロピレングリコール構造を有することが好ましい。また、界面活性剤（Ｂ）は、分岐構造を有する、ポリエーテル変性ポリシロキサンであってもよい。
【００４２】
界面活性剤（Ｂ）は、下記式（１）〜（８）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも１つであることが好ましい。これらの化合物を用いることで、エマルジョンの安定性が特に優れ、９０〜１００℃程度に加熱しても安定な油中水型エマルジョンを形成することができる。界面活性剤（Ｂ）は、下記式（１）または（２）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも１つであることがより好ましい。
【００４３】
【化１】
2019208497.tif 000003
式（１）中、ａは１以上２００以下の整数、ｂは１以上１００以下の整数、ｃは１以上１００以下の整数、ｄは１以上４０以下の整数、ｅは１以上２００以下の整数である。
【００４４】
【化２】
2019208497.tif 000004
式（２）中、ａは１以上２００以下の整数、ｂは１以上１００以下の整数、ｃは１以上４０以下の整数である。
【００４５】
【化３】
2019208497.tif 000005
式（３）中、ａは１以上２００以下の整数、ｂは１以上１００以下の整数、ｃは１以上４０以下の整数である。
【００４６】
【化４】
2019208497.tif 000006
式（４）中、ａは１以上２００以下の整数、ｂは１以上１００以下の整数、ｃは１以上４０以下の整数である。
【００４７】
【化５】
2019208497.tif 000007
式（５）中、ａは１以上２００以下の整数、ｂは１以上１００以下の整数、ｃは１以上４０以下の整数である。
【００４８】
【化６】
2019208497.tif 000008
式（６）中、ａは１以上２００以下の整数、ｂは１以上１００以下の整数、ｃは１以上４０以下の整数である。
【００４９】
【化７】
2019208497.tif 000009
式（７）中、ａは１以上２００以下の整数、ｂは１以上１００以下の整数、ｃは１以上４０以下の整数である。
【００５０】
【化８】
2019208497.tif 000010
式（８）中、ａは１以上２００以下の整数、ｂは１以上１００以下の整数、ｃは１以上４０以下の整数である。
【００５１】
界面活性剤（Ｂ）は、具体的には、式（１）で表されるラウリルＰＥＧ−９ポリジメチルシロキシエチルジメチコン（ＩＮＣＩ名）、式（２）で表されるセチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ジメチコン（ＩＮＣＩ名）、式（３）で表されるセチルＰＥＧ／ＰＰＧ−７／３ジメチコン（ＩＮＣＩ名）、式（４）で表されるセチルＰＥＧ−８ジメチコン（ＩＮＣＩ名）、式（５）で表されるラウリルＰＥＧ−８ジメチコン（ＩＮＣＩ名）、式（６）で表されるラウリルＰＥＧ−１０メチルエーテルジメチコン（ＩＮＣＩ名）、式（７）で表されるラウリルＰＥＧ−１０トリス（トリメチルシロキシ）シリルエチルジメチコン（ＩＮＣＩ名）、式（８）で表されるセチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１５／１５ブチルエーテルジメチコン（ＩＮＣＩ名）等を挙げることができる。
【００５２】
ラウリルＰＥＧ−９ポリジメチルシロキシエチルジメチコン（ＩＮＣＩ名）の市販品としては、ＫＦ−６０３８（信越化学工業製）を使用することができる。セチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ジメチコン（ＩＮＣＩ名）の市販品としては、ＫＦ−６０４８（信越化学工業製）、ＡＢＩＬ  ＥＭ９０、ＡＢＩＬ  ＥＭ１８０（以上、Ｅｖｏｎｉｋ製、「ＡＢＩＬ」はＥｖｏｎｉｋの登録商標）等を使用することができる。セチルＰＥＧ／ＰＰＧ−７／３ジメチコン（ＩＮＣＩ名）の市販品としては、ＳｅｒａＳｏｌ  ＳＣ  ８２（ＫＣＣ  Ｂｅａｕｔｙ製）を使用することができる。セチルＰＥＧ−８ジメチコン（ＩＮＣＩ名）の市販品としては、Ｓｉｌｕｂｅ  ＦＦ  １０８−１６（Ｓｉｌｔｅｃｈ製）を使用することができる。ラウリルＰＥＧ−８ジメチコン（ＩＮＣＩ名）の市販品としては、Ｓｉｌｕｂｅ  Ｊ２０８−４１２（Ｓｉｌｔｅｃｈ製）を使用することができる。ラウリルＰＥＧ−１０メチルエーテルジメチコン（ＩＮＣＩ名）の市販品としては、Ｓｉｌｏｋ  ２２０５（Ｓｉｌｏｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ製）を使用することができる。ラウリルＰＥＧ−１０トリス（トリメチルシロキシ）シリルエチルジメチコン（ＩＮＣＩ名）の市販品としては、ＥＳ−５３００  ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮ  ＡＩＤ（東レ・ダウコーニング製）を使用することができる。セチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１５／１５ブチルエーテルジメチコン（ＩＮＣＩ名）の市販品としては、Ｂｅｌｓｉｌ  ＤＭＣ  ３０７１  ＶＰ（Ｗａｃｋｅｒ製、「Ｂｅｌｓｉｌ」はＷａｃｋｅｒの登録商標）を使用することができる。
【００５３】
界面活性剤（Ｂ）の含有量は、油性組成物（Ｏ）の全体を１００質量％としたときに、０．０１質量％以上１０質量％以下であることが好ましく、０．１質量％以上８質量％以下であることがより好ましい。また、０．１質量％以上４質量％以下であることがさらに好ましく、１質量％以上４質量％以下であることが特に好ましい。
【００５４】
＜その他のオイル＞
油性組成物（Ｏ）は、上述の脂肪族炭化水素（Ａ）以外のオイルをさらに含有していてもよい。具体的には、２５℃における動粘度が１０ｍｍ２／ｓ未満のシリコーンオイルを含有していてもよい。
【００５５】
このようなシリコーンオイルの市販品としては、ＫＦ−９６Ｌ−１ｃｓ、ＫＦ−９６Ｌ−１．５ｃｓ、ＫＦ−９６Ｌ−２ｃｓ（以上、信越化学工業製）、ＤＯＷ  ＣＯＲＮＩＮＧ  ＴＯＲＡＹ  ＳＨ  ２００  ＦＬＵＩＤ  １  ＣＳ、ＤＯＷ  ＣＯＲＮＩＮＧ  ＴＯＲＡＹ  ＳＨ  ２００  ＦＬＵＩＤ  １．５  ＣＳ、ＤＯＷ  ＣＯＲＮＩＮＧ  ＴＯＲＡＹ  ＳＨ  ２００  ＦＬＵＩＤ  ２  ＣＳ（以上、東レ・ダウコーニング製）等を用いることができる。
【００５６】
［水性組成物（Ｗ）］
本実施形態に係る油性組成物（Ｏ）は、水を含み、油性組成物（Ｏ）と相溶しない水性組成物（Ｗ）と組み合わせることで、安定な油中水型エマルジョンを形成することができる。油中水型エマルジョンでは、連続相である油性組成物（Ｏ）中に、分散相である水性組成物（Ｗ）の液滴が分散している。本実施形態に係る油性組成物（Ｏ）を用いて形成される油中水型エマルジョンは高い安定性を有するため、油中水型エマルジョン中の複数の液滴のそれぞれを反応場として利用する、液滴ベースの反応や分析に好適に用いることができる。例えば、油中水型エマルジョン中の複数の液滴のそれぞれを反応場としてＰＣＲを生じさせて分析を行う、ｄＰＣＲに好適に用いることができる。
【００５７】
以下、本実施形態に係る油性組成物（Ｏ）と組み合わせて用いることのできる、水性組成物（Ｗ）の各成分について、詳細に説明する。
【００５８】
＜水＞
水性組成物（Ｗ）は、水を含有する。水性組成物（Ｗ）の水の含有量は特に限定はされないが、水性組成物（Ｗ）全体を１００質量％としたときに、６０質量％以上９９．９質量％以下であることが好ましく、８０質量％以上９９．５質量％以下であることがより好ましい。
【００５９】
＜その他成分＞
水性組成物（Ｗ）が含有する水以外の成分については特に限定はされず、油中水型エマルジョンの用途に応じて選択することができる。例えば、油中水型エマルジョンを液滴ベースの反応に用いる場合には、水性組成物（Ｗ）は反応物を含有してもよい。また、油中水型エマルジョンを液滴ベースの分析に用いる場合には、水性組成物（Ｗ）は分析対象物を含有してもよい。以下、油中水型エマルジョンを液滴ベースの分析に用いる場合の水性組成物（Ｗ）が含有する成分について説明する。
【００６０】
（分析対象物）
本明細書において試料とは、本実施形態に係る分析に供するものをいい、本実施形態では試料中の分析対象物の濃度が測定される。水性組成物（Ｗ）は、少なくとも１つの分析対象物を含有する。本実施形態に係る分析対象物とは、例えばｄＰＣＲにおける分析対象核酸など、サンプル中に含まれ、定量分析などの分析の対象になる化合物や粒子をいう。本実施形態に係る分析対象物は、液滴中での反応によって検出可能にすることができるものであれば、特に限定はされない。分析対象物は、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、酵素などが挙げられ、これらが共存していてもよい。分析対象物は、核酸、ペプチド、タンパク質、酵素の少なくともいずれかが共有結合等で結合または付着した分子、マイクロ粒子、ナノ粒子、さらにはウイルス、細菌、細胞などであってもよい。
【００６１】
本明細書において検体とは、例えば、ヒトから採取した血液や、そこから抽出された核酸、微生物のコロニー、培養細胞のペレット、土壌、水を含む。ヒト等生体から採取した検体の分析により、例えばがんや感染症などの疾病に関わる遺伝子の情報など、当該疾病の診断や治療に有用な情報が得られると期待できる。また、食品を検体とする場合は、遺伝子組換え作物（ＧＭＯ）の評価などの食品検査を行うことができる。また、環境中の土壌や水を検体とする場合は、環境モニタリングを行うことができる。生体組織を検体とする場合、アルカリ溶解法等で得たライセートを試料としてよい。また、検体からエタノール沈殿法等により生成された核酸を試料としてよい。
【００６２】
本実施形態において核酸を分析対象物とする場合、核酸は、増幅の対象になる鋳型核酸であれば特に限定されず、ＤＮＡ（ＤｅｏｘｙｒｉｂｏＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であってもよいし、ＲＮＡ（ＲｉｂｏＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であってもよい。核酸の形態も特に限定されず、直鎖状の核酸であってもよく、また環状の核酸であってもよい。また、核酸は単一の塩基配列を有する１種類の核酸であってもよく、また、種々の塩基配列をそれぞれ有する複数種類の核酸（例えば相補的ＤＮＡライブラリーなど）であってもよい。
【００６３】
試料中の分析対象物の含有量は特に限定はされないが、生成されたそれぞれの液滴において液滴中に含まれる分析対象物の数が１個または０個となるような量であることが好ましい。液滴中の分析対象物の数を１個または０個とすることで、液滴を用いたｄＰＣＲの定量の精度を向上させることができる。
【００６４】
（分析対象物を検出可能にするための薬剤）
分析対象物が核酸である場合は、ＰＣＲ法に代表されるような、酵素を用いた核酸増幅反応を用いて核酸を増幅することで、検出可能にすることができる。ここで、核酸増幅反応としては、反応場をサーマルサイクルに供することで反応を進行させるＰＣＲ法やＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法や、反応場をサーマルサイクルに供さずに温度調整することで反応を進行させるＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄＣｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などを好ましく使用することができる。
【００６５】
核酸増幅反応を用いる場合は、核酸を増幅させるための増幅試薬と、核酸の増幅に伴って蛍光を発する蛍光発生試薬を、核酸を検出可能にするための薬剤として用いる。
【００６６】
増幅試薬は、分析対象物である標的核酸の有する所定の塩基配列に相補的な塩基配列を有する１つまたは一対のプライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）と、核酸合成反応を促進する生体触媒であるポリメラーゼと、を含有する。ポリメラーゼは、耐熱ポリメラーゼであることが好ましく、耐熱ＤＮＡポリメラーゼであることがより好ましい。また、増幅試薬は、核酸の原料としてのｄＮＴＰ（ＤｅｏｘｙｒｉｂｏＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−５’−ＴｒｉＰｈｏｓｐｈａｔｅ）などのリボ核酸を含有する。さらに、増幅試薬は、反応液中の水素イオン濃度（ｐＨ）をコントロールするための緩衝液または緩衝剤や、塩を含むことが好ましい。なお、増幅試薬は、上記各成分を含む市販のキットを用いてもよい。
【００６７】
プライマーとしては、標的核酸の一部の領域の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、核酸増幅反応に用いることができるオリゴヌクレオチドであれば特に限定されない。ここで、ストリンジェントな条件とは、プライマーと鋳型核酸との間に少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上の配列同一性があるときに、該プライマーが鋳型核酸に特異的にハイブリダイズできる条件である。プライマーは、標的核酸の塩基配列に基づいて適宜設計できる。また、プライマーは、核酸増幅法の種類に応じて設計されることが望ましい。プライマーの長さは、通常、５〜５０ヌクレオチド、好ましくは、１０〜４０ヌクレオチドである。なお、プライマーは、分子生物学領域において一般に用いられる核酸合成方法により生成することができる。
【００６８】
緩衝液または緩衝剤としては、任意の適切な緩衝液または緩衝剤を用いることができる。緩衝液または緩衝剤は、反応液の水素イオン濃度（ｐＨ）を、所望の反応が効率的に起こり得るｐＨ、または、その近傍に維持するよう構成することが好ましい。ＰＣＲを実施する場合、反応液のｐＨは、例えば６．５〜９．０の間で、使用する増幅試薬の各成分にあわせて任意に選択することができる。緩衝液または緩衝剤の種類は、分子生物学領域で一般に使用されるものを使用することができる。例えば、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）バッファー、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルフォン酸）バッファー、ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）バッファー等を用いることができる。
【００６９】
塩としては、例えば、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＮａＣｌ、およびこれらの組み合わせから適宜選択されたものを使用することができる。
【００７０】
蛍光試薬は、核酸と相互作用して蛍光を発する薬剤である。蛍光試薬は例えば、蛍光インターカレーター（蛍光色素）やプローブアッセイ用のプローブ（蛍光標識プローブ）である。蛍光インターカレーターとしては、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（「ＳＹＢＲ」はモレキュラープローブスの登録商標）、ＬＣ  Ｇｒｅｅｎなどを好適に用いることができる。蛍光標識プローブとしては、標的核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（プローブ）であって、一方の末端（５´末端）がレポーターで修飾され、もう一方の末端（３´末端）がクエンチャーで修飾されたものを用いることができる。レポーターとしてはＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−５−ＩｓｏＴｈｉｏＣｙａｎａｔｅ）やＶＩＣなどの蛍光物質を、クエンチャーとしてＴＡＭＲＡなどの蛍光物質や、Ｅｃｌｉｐｓｅ、ＤＡＢＣＹＬ、ＭＧＢなどを用いることができる。蛍光標識プローブとしては、ＴａｑＭａｎ（「ＴａｑＭａｎ」はロシュダイアグノスティックスの登録商標）プローブなどを用いることができる。なお、ここでは蛍光試薬を用いる場合について説明したが、蛍光以外の発光を利用する発光試薬を使用してもよい。
【００７１】
一方、分析対象物がペプチドやタンパク質等である場合は、ＥＬＩＳＡ法のような、分析対象物を特異的に反応する抗体（または抗原）と酵素を用いた抗原抗体反応および酵素反応により、分析対象物を検出可能にすることができる。より具体的には、例えば、分析対象物に酵素で標識された抗体（または抗原）を抗原抗体反応によって複合化させ、この酵素の酵素反応によって生じる発色または発光物質を検出する。なお、分析対象物と抗原抗体反応を生じさせる抗体（または抗原）は予め酵素標識されていなくてもよく、抗原抗体反応後に酵素によって標識されてもよい。ＥＬＩＳＡ法を用いる場合は、抗体（または抗原）と酵素を含む試薬を、分析対象物を検出可能にするための薬剤として用いる。ＥＬＩＳＡ法に用いる試薬として市販されているキットを用いてもよい。
【００７２】
なお、発生させる蛍光の波長が異なるなど、複数の分析対象物を区別できるようにそれぞれ検出可能にする複数種類の薬剤を用いることにより、複数種類の分析対象物を一度の分析でまとめて検出する構成としてもよい。
【００７３】
［油中水型エマルジョン］
上述のように、本実施形態に係る油性組成物（Ｏ）は、水性組成物（Ｗ）と組み合わせることで、油中水型エマルジョンを形成することができる。本実施形態に係る油性組成物（Ｏ）を用いて形成される油中水型エマルジョンは高い安定性を有するため、油中水型エマルジョン中の複数の液滴のそれぞれを反応場として利用する、液滴ベースの反応や分析に好適に用いることができる。
【００７４】
油中水型エマルジョンにおける、水性組成物（Ｗ）に対する油性組成物（Ｏ）の体積比は特に限定はされないが、１以上３００以下であることが好ましく、１以上１５０以下であることがより好ましい。
【００７５】
油中水型エマルジョン中の液滴のサイズは特に限定はされないが、直径で、１μｍ以上３００μｍ以下であることが好ましく、１０μｍ以上２００μｍ以下であることがより好ましく、２０μｍ以上１５０μｍ以下であることがさらに好ましい。液滴の直径を３００μｍ以下とすることで、油中水型エマルジョンを分析に用いる際の検体量やサンプル量が少ない場合であっても、十分な数の液滴に分割することができ、分析の精度を向上させることができる。また、液滴の直径を３００μｍ以下とすることで、エマルジョンの安定性を向上させることができる。
【００７６】
［油中水型エマルジョンを用いた分析方法］
上述の通り、本実施形態に係る油中水型エマルジョンは、油中水型エマルジョン中の複数の液滴のそれぞれを反応場として利用する、液滴ベースの反応や分析に好適に用いることができる。以下、本実施形態に係る油性組成物を用いた分析対象物の分析方法について説明する。
【００７７】
本実施形態に係る分析方法は、下記の工程を有する。
【００７８】
（ａ）水と、分析対象物と、分析対象物を検出可能にするための薬剤と、を含有する水性組成物と、油性組成物と、から、油中水型エマルジョンを形成するエマルジョン形成工程。
【００７９】
（ｂ）油中水型エマルジョン中の複数の液滴のそれぞれにおいて反応を進行させ、分析対象物を検出可能にする反応工程。
【００８０】
（ｃ）油中水型エマルジョン中の複数の液滴のそれぞれについて、分析対象物の検出と、液滴のサイズの計測と、を行う観察工程。
【００８１】
（ｄ）液滴のサイズと、分析対象物が検出された液滴の数と、に基づいて、水性組成物中に含まれていた分析対象物の濃度を取得する濃度取得工程。
【００８２】
以下、各工程について、詳細に説明する。
【００８３】
＜（ａ）エマルジョン形成工程＞
本工程は、水性組成物と、油性組成物と、から、油中水型エマルジョンを形成する工程である。水性組成物、油性組成物の組成や比率、油中水型エマルジョンの形成方法については上述の通りである。油中水型エマルジョンは生成装置１００により形成される。生成装置１００を油性組成物でみたし、投入部より水性組成物を投入する。水性組成物は乳化膜部１２０を通過し、油中水型エマルジョンが生成される。生成された油中水型エマルジョンは保持部１３０に保持される。そして、油中水型エマルジョンを構成する水相に含まれる前記分析対象物の分析を行うことができる。
【００８４】
＜（ｂ）反応工程＞
本工程は、油中水型エマルジョン中の複数の液滴のそれぞれにおいて反応を進行させ、分析対象物を検出可能にする工程である。反応工程は保持部１３０に保持された試料に対して行われる。
【００８５】
分析対象物が核酸である場合は、上述の通り、ＰＣＲ法に代表されるような、酵素反応を用いた核酸増幅反応を用いて核酸を増幅することで、検出可能にすることができる。核酸増幅反応としては、上述の通り、ＰＣＲ法やＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法などを好ましく使用することができる。本実施形態では、核酸分子１分子からの増幅を行うことを想定しているため、核酸増幅反応としてＰＣＲを行う場合は、サーマルサイクル処理を２０〜７０サイクル行うことが好ましく、３０〜５０サイクル行うことがより好ましい。例えば、本発明に係るシステムにおいては、エマルジョン中に含まれる核酸を増幅するための熱処理を行う処理手段と、前記熱処理を行った後のエマルジョンを撮影する撮影手段とを含み構成され得る。
【００８６】
本工程では、油中水型エマルジョンを保持する保持部１３０の温度を、温度調整装置を使用して調整することで、油中水型エマルジョンを温度制御やサーマルサイクルに供することが好ましい。保持部１３０の形状は特に限定はされず、マイクロチューブや、油中水型エマルジョン中の液滴を平面状に並べることが可能な、薄い平面状の空間を有する容器、マイクロ流路デバイス等を用いることができる。温度調整装置としては、従来公知のヒーター等を用いることができ、例えばペルチェヒーター等を用いることができる。
【００８７】
本工程では、油中水型エマルジョン中の液滴を平面状に並べた状態で、油中水型エマルジョンの温度を調整することが好ましい。これにより、それぞれの液滴における反応を均一に進行させることができる。また、後述する観察工程におけるシグナルの検出や、液滴サイズの計測を容易にすることができる。本実施形態に係る油性組成物によって形成される油中水型エマルジョンは上述の通り流動性が高いため、液滴を平面状に並べる際のスループットを高くすることができる。また、エマルジョンの安定性も高いため、反応工程の前後でエマルジョンの状態（液滴のサイズ等）を保持することができ、分析の精度を向上させることができる。
【００８８】
一方、分析対象物がペプチドやタンパク質である場合は、例えばＥＬＩＳＡ法のような、酵素反応と免疫反応とを組み合わせた分子生物学的手法で分析対象物の増幅を行い、検出可能にすることができる。
【００８９】
＜（ｃ）観察工程＞
本工程は、油中水型エマルジョンを観察し、複数の液滴のそれぞれについて、分析対象物の検出と、液滴のサイズの計測と、を行う工程である。観察工程は、保持部１３０に保持され、反応工程を経た試料に対して行われる。
【００９０】
油中水型エマルジョン中の複数の液滴のうち、（ｂ）反応工程の前に分析対象物が含まれていた液滴からはシグナルが検出される。そのため、このシグナルを検出することで、液滴中の分析対象物を検出することができる。なお、（ｂ）反応工程の前に分析対象物が含まれていなかった液滴からは、通常、シグナルが検出されないか、または分析対象物が含まれていた液滴と区別可能な程度に微弱なシグナルが検出される。
【００９１】
分析対象物が核酸であり、（ｂ）反応工程において増幅試薬と蛍光発生試薬を用いて核酸を検出可能にした場合は、蛍光励起手段と蛍光検出手段とを用いて蛍光検出を行うことで、シグナルの検出を行うことができる。例えば、一般的に利用されている蛍光励起手段と蛍光検出手段を備えたフローサイトメーター、またはこれと同様の機能を備えたマイクロ流体デバイスなどを使用して、蛍光検出することができる。また、上述のように油中水型エマルジョン中の複数の液滴を平面状に並べておけば、蛍光検出手段として撮像素子や該素子を備えた撮像装置を用いることで、複数の液滴について同時にシグナルの検出を行うことができる。この方法によれば多数の液滴についてスループット良くシグナルの検出を行うことができるので好ましい。撮像素子としてはＣＣＤ（電荷結合素子、Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）やＣＭＯＳ（相補型金属酸化膜半導体、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ＩｍａｇｅＳｅｎｓｏｒ）等を用いることができる。蛍光励起および蛍光検出においては、使用する蛍光試薬の特性に応じて、光学フィルターを用いて励起光または検出光の波長を調整することができる。さらに、蛍光波長が異なる、複数の種類の蛍光試薬を用いることによって、複数の種類の分析対象物を同時に計測することも可能である。
【００９２】
＜（ｄ）濃度取得工程＞
分析対象物の濃度の計算は、従来行われているデジタル分析における濃度計算方法を採用して実施することができる。例えば、反応工程の前に１つの液滴に複数個の分析対象物が含まれていなかったとみなせば、分析対象物が検出された液滴の数ｘを、観察工程において分析対象物の検出の対象とした体積Ｖｓの水性組成物中に含まれていた分析対象物の数とみなすことができる。よって、下記式（９）により、水性組成物中の分析対象物の濃度λを計算することができる。なお、観察工程において分析対象物の検出の対象とした水性組成物の体積Ｖｓは、観察工程において取得した液滴のサイズに基づいて算出することができる。
λ＝ｘ／Ｖｓ・・・式（９）
【００９３】
また、例えば、反応工程の前に、１つの液滴に複数個の分析対象物が入り得るとみなせる場合は、Ｐｏｉｓｓｏｎモデルによる補正を行うことで、分析対象物の濃度を計算することができる。この場合は、反応工程の前にそれぞれの液滴に含まれていた分析対象物の平均個数Ｃを推定することにより、分析対象物の濃度算出を行う。具体的には、液滴の個数をｎ、それぞれの液滴に含まれる分析対象物の平均個数をＣ、とすると、Ｐｏｉｓｓｏｎモデルの式から、下記式（１０）が成り立つ。
【００９４】
【数１】
2019208497.tif 000011
【００９５】
分析対象物を１つも含まない液滴を得る確率は、式（１０）においてｎ＝０として、下記式（１１）で表される。
Ｐ（ｎ＝０，Ｃ）＝ｅ−Ｃ・・・式（１１）
【００９６】
反応工程の前に１つの液滴中に少なくとも１つの分析対象物が含まれていれば、その液滴からはシグナルを検出することができるが、反応工程の前にその液滴に含まれていた分析対象物の数の情報までは分からない。そこで、検出対象とした液滴の総数に対する分析対象物が検出されなかった液滴の割合（＝シグナルが検出されなかった液滴の割合）に基づいて、式（１１）を用いて、検出対象とした水性組成物中に含まれていた分析対象物の個数を推定する。具体的には、シグナルが検出された反応場の個数と、検出対象とした液滴の総数とから、シグナルが検出されなかった液滴の割合Ｆ０を算出する。そして、下記式（１２）から、検出対象とした液滴に反応工程の前に含まれていた分析対象物の平均個数Ｃを推定する。
Ｃ＝−１ｎ（Ｆ０）・・・式（１２）
【００９７】
ここで、観察工程において分析対象物の検出の対象とした液滴の総体積をｖとすると、下記式（１３）により、水性組成物中の分析対象物の濃度λを計算することができる。なお、観察工程において分析対象物の検出の対象とした液滴の総体積ｖは、観察工程において取得した液滴のサイズに基づいて算出することができる。
λ＝Ｃ／ｖ・・・式（１３）
【００９８】
このようにして得られた、水性組成物中の分析対象物の濃度は、検体から水性組成物を調整する際の希釈倍率を用いることによって、検体中の分析対象物の濃度に換算することもできる。
【００９９】
なお、保持部１３０は反応工程を行う領域と観察工程を行う領域とに分割されていてもよい。
【実施例】
【０１００】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下に使用される「％」は、特に示さない限りすべて質量基準である。
【０１０１】
（実施例１）種々の膜を用いたエマルジョン生成
連続相には界面活性剤であるＫＦ−６０３８（信越化学工業製）をイソパラフィン系脂肪族炭化水素であるアイソパーＬ（エクソンモービル製）に溶解させた油相組成物を用いた。本実施例で用いた界面活性剤ＫＦ−６０３８（信越化学工業製）は側鎖にアルキル基を有するポリエーテル変性ポリシロキサンであり、上記式（１）に示される構造を有する。本実施例では、油性組成物全体を１００質量％としたときに界面活性剤の濃度が４質量％となるように油性組成物を調製した。アイソパーＬの２５℃における動粘度は２．０２ｍｍ２／ｓである。また、アイソパーＬは炭素原子数１１〜１５のイソパラフィンを主成分とする（８５質量％以上含有する）イソパラフィン系脂肪族炭化水素である。
【０１０２】
分散相には、水性組成物であるリン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」と称する。）を用いた。
【０１０３】
乳化膜として、ナイロンネットフィルター（メルクミリポア製）、又はナイロンメッシュ（Ｓｅｆａｒ製）、又は、ポリプロピレンプレフィルター（メルクミリポア製）、又は、マイテックス（メルクミリポア製）、又は、オムニポア（メルクミリポア製）、又は、アイソポア（材質はポリカーボネート）（メルクミリポア製）を高さ約２ｃｍの硬質塩化ビニル製のコネクターに接着させたもの、マイクロメッシュ（材質はポリエステル、又はナイロン）（ＮＢＣメッシュテック製）を高さ約２ｃｍのナイロン製のコネクターに接着させたものを使用した。水性組成物であるＰＢＳを採取したシリンジ（ＳＳ−０５ＬＺ、テルモ製）の先端に、乳化膜を接続した。シリンジをシリンジポンプ（ＳＰＳ−１、アズワン製）にセットし、シリンジの先端の乳化膜を上記油性組成物９ｍＬ中に浸す。そして、油性組成物を少量吸い上げてから、１ｍＬ／ｈｒ、又は５ｍＬ／ｈｒの乳化流速（水性組成物注入速度）で水性組成物（２５０〜５００μＬ）を注入した。これにより、油中水型エマルジョンを調製した。得られた油中水型エマルジョン中の液滴径分布を、レーザ回折／散乱式粒子径分布測定装置（ＬＡ−９５０、堀場製作所製）を用いて測定した。
【０１０４】
結果を図３の表１に示す。繊維を編んだ膜であるナイロンネットフィルター（メルクミリポア製）、ナイロンメッシュ（Ｓｅｆａｒ製）、マイクロメッシュ（材質はポリエステル、又はナイロン）（ＮＢＣメッシュテック製）を用いると、ＣＶが低いことがわかった。具体的には、本実施例に係る生成装置を用いれば、変動係数（ＣＶ）が２０％以下の液滴サイズの揃った均一な液滴と巨大な液滴が混在したエマルジョンを生成できることが分かった。
【０１０５】
（実施例２）複数連結した膜を用いたエマルジョン生成
実施例１と同様に、連続相には界面活性剤であるＫＦ−６０３８（信越化学工業製）をイソパラフィン系脂肪族炭化水素であるアイソパーＬ（エクソンモービル製）に溶解させた油相組成物を、分散相にはＰＢＳを用いて、同様の操作でエマルジョンを生成した。
【０１０６】
乳化膜としては以下のものを用いた。
【０１０７】
・ナイロンネットフィルター（メルクミリポア製）、乃至はナイロンメッシュ（Ｓｅｆａｒ製）を高さ約２ｃｍの硬質塩化ビニル製のコネクターに接着させたもの。
【０１０８】
・マイクロメッシュ（材質はポリエステル、乃至はナイロン）（ＮＢＣメッシュテック製）を高さ約２ｃｍのナイロン製のコネクターに接着させたもの。
【０１０９】
乳化膜を接着したコネクターを直列に連結させることにより、乳化膜を複数回通過させてエマルジョンを生成した。得られた油中水型エマルジョン中の液滴径分布を、レーザ回折／散乱式粒子径分布測定装置（ＬＡ−９５０、堀場製作所製）を用いて測定した。
【０１１０】
結果を図４の表２に示す。図１には、孔径１０μｍのナイロンネットフィルター（メルクミリポア製）を３回通過させた時のエマルジョンの光学顕微鏡画像を示す。
【０１１１】
孔径が１５μｍ以下の膜に関して、均一な液滴が生成できることを確認するとともに、膜を２回以上通過させることにより、巨大な液滴を大幅に抑制できることを確認した。
【０１１２】
（実施例３）油中水型エマルジョンを用いたＰＣＲ
Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｋｉｔ（  型番ＩＮＴ−ＤＮＡ−ＦＡＭおよびＩＮＴ−ＤＮＡ−ＹＹ、Ｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎ製）のプロトコルに従い、添付のコントロールＤＮＡ、プライマー・プローブを混合し、Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（型番  ＲＲ３９０、タカラバイオ製）、滅菌蒸留水を混合して、実施例１３の水性組成物を調製した。本実施例では、蛍光色素としてＦＡＭを使用した。
【０１１３】
上記水性組成物を採取したシリンジ（ＳＳ−０５ＬＺ、テルモ製）をシリンジポンプ（ＳＰＳ−１、アズワン製）にセットした。そして、シリンジの先端に、ナイロンネットフィルター（孔径１０μｍ、メルクミリポア製）を接着したコネクターを３個直列に連結したものを接続した。ナイロンネットフィルターを上記油性組成物９ｍＬ中に浸し、油性組成物を少量吸い上げてから、１ｍＬ／ｈｒの乳化流速（水性組成物注入速度）で水性組成物（約５００μＬ）を注入した。これにより、油中水型エマルジョンを調製した。
【０１１４】
得られたエマルジョンに下記のサーマルサイクル条件でサーマルサイクルを施してＰＣＲを行ったところ、油中水型エマルジョン中の液滴は合一や凝集することなく、安定であった。また、サーマルサイクル後のエマルジョンを蛍光顕微鏡観察したところ、蛍光が検出される液滴と蛍光が検出されない液滴とが確認できた（図２）。
【０１１５】
＜サーマルサイクル条件＞
１）９５℃で１０分間：１サイクル
２）９４℃で３０秒間、６０℃で１分間：５０サイクル
３）９８℃で１０分間：１サイクル
４）４℃で保持
【０１１６】
（実施例４）連続相にシクロパラフィン系脂肪族炭化水素を用いた液滴生成
実施例１のイソパラフィン系脂肪族炭化水素であるアイソパーＬをシクロパラフィン系脂肪族炭化水素であるエクソールＤ１３０（エクソンモービル製）に変え、実施例２と同様に操作して油中水型エマルジョンを生成した。乳化膜としては、孔径１０μｍのナイロンネットフィルター用いた。均一な液滴が生成できることを確認できるとともに、膜を２回以上通過させることにより、巨大な液滴を大幅に抑制できることを確認した。
【０１１７】
（実施例５）連続相にシリコーンオイルを用いた液滴生成
実施例１のイソパラフィン系脂肪族炭化水素をシリコーンオイルであるＫＦ−９６Ｌ−１．５ｃｓ（信越化学工業製）に変えた。そして、界面活性剤を２質量％  ＡＢＩＬ  ＥＭ９０（Ｅｖｏｎｉｋ製、「ＡＢＩＬ」はＥｖｏｎｉｋの登録商標）に変え、実施例２と同様に操作して油中水型エマルジョンを生成した。乳化膜としては、孔径１０μｍのナイロンネットフィルター用いた。均一な液滴が生成できることを確認できるとともに、膜を２回以上通過させることにより、巨大な液滴を大幅に抑制できることを確認した。
【０１１８】
（変形例）
生成装置１００がｄＰＣＲに用いられる場合、生成装置１００はｄＰＣＲを行う装置に統合されていてもよい。ｄＰＣＲを行う装置は、生成装置１００と共に反応工程を行う装置及び観察工程を行う装置の少なくともいずれかが含まれていてもよい。生成装置１００の動作及びｄＰＣＲを行う装置の動作はコンピュータにより管理されていてもよい。本発明は、上述の実施形態の１以上の機能を実現するプログラムを、ネットワーク又は記憶媒体を介してシステム又は装置に供給し、そのシステム又は装置のコンピュータにおける１つ以上のプロセッサがプログラムを読出し実行する処理でも実現可能である。また、１以上の機能を実現する回路（例えば、ＡＳＩＣ）によっても実現可能である。
【０１１９】
上述の各実施形態における情報処理装置は単体の装置としてもよいし、複数の装置を互いに通信可能に組合せて上述の処理を実行する情報処理システムとしてもよく、いずれも本発明の実施形態に含まれる。共通のサーバ装置あるいはサーバ群で、上述の処理を実行することとしてもよい。情報処理装置および情報処理システムを構成する複数の装置は所定の通信レートで通信可能であればよく、また同一の施設内あるいは同一の国に存在することを要しない。
【０１２０】
本発明の実施形態には、前述した実施形態の機能を実現するソフトウェアのプログラムを、システムあるいは装置に供給し、そのシステムあるいは装置のコンピュータが該供給されたプログラムのコードを読みだして実行するという形態を含む。
【０１２１】
したがって、実施形態に係る処理をコンピュータで実現するために、該コンピュータにインストールされるプログラムコード自体も本発明の実施形態の一つである。また、コンピュータが読みだしたプログラムに含まれる指示に基づき、コンピュータで稼働しているＯＳなどが、実際の処理の一部又は全部を行い、その処理によっても前述した実施形態の機能が実現され得る。
【０１２２】
上述の実施形態を適宜組み合わせた形態も、本発明の実施形態に含まれる。
【０１２３】
（実施例６）４枚連結した膜を用いたエマルジョン作製
実施例１、２と同様、連続相には界面活性剤であるＫＦ−６０３８（信越化学工業製）をイソパラフィン系脂肪族炭化水素であるアイソパーＬ（エクソンモービル製）に溶解させた油相組成物を、分散相にはＰＢＳを用い、同様の操作でエマルジョンを作製した。
【０１２４】
乳化膜としては、孔径１０μｍのナイロンネットフィルター（メルクミリポア製）を高さ約２ｃｍの硬質塩化ビニル製のコネクターに接着させたものを使用した。乳化膜を接着したコネクターを直列に４個連結させることにより、乳化膜を４回通過させてエマルジョンを作製した。得られた油中水型エマルジョン中の液滴径分布を、レーザ回折／散乱式粒子径分布測定装置（ＬＡ−９５０、堀場製作所製）を用いて測定した。その結果、液滴径５２μｍ、ＣＶ２７％となることを確認した。図６に、孔径１０μｍのナイロンネットフィルター（メルクミリポア製）を４回通過させた時のエマルジョンの光学顕微鏡画像を示す。膜を通す回数を増加させることにより、小さな液滴が増加し、ＣＶが大きくなったと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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