(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質富化微細小胞、その作製方法及び使用方法を提供する。【解決手段】第１二量体化領域を含む膜結合性タンパク質、及び第２二量体化領域を含む標的タンパク質を有する細胞を、細胞から微細小胞を生産するのに十分な状態で保持し、前記微細小胞が、前記標的タンパク質を含むことを特徴とする方法を開示する。また、前記微細小胞の作製に使用される細胞、試薬及びキットと、例えば、研究及び治療への応用においての微細小胞の使用方法も開示する。【選択図】図１
2019141093.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１二量体化領域を含む膜結合性タンパク質に係る第１コード配列を有する第１発現カセットと、
プロモータ及び第２二量体化領域を有する第２発現カセットと
を備えており、
前記第２発現カセットは、更に、標的タンパク質に係るコード配列を有している
ことを特徴とする細胞。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
細胞修飾は、研究、診療及び治療への応用等、様々な応用への使用が見出されている。細胞修飾は、外因性の核酸及び／又はタンパク質を細胞内に導入するといった多くの様々な手法により達成され得る。
【０００２】
タンパク質輸送は、その分野でタンパク質の形質導入として知られており、ペプチド又はタンパク質の配列が細胞の中に細胞膜を通過して輸送されることによる加工である。タンパク質輸送の方法としては、微量注入法及び電気穿孔法がある。タンパク質輸送の方法としては、また、脂質系試薬と複合体を形成することによる形質移入、ポリマー又はペプチド系の試薬と複合体を形成することによる形質移入、ペプチド形質導入領域（ＰＴＤ）の封入体を介しての対象のタンパク質への直接付加、ウイルス様粒子を介した導入、エキソソームを介したタンパク質の導入がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許出願公開第 2012／0322147号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在のタンパク質輸送の方法の欠点は、望まれる標的細胞への形質移入のために、精製されたタンパク質の貯蔵物を生産することが要求される点である。組み換えタンパク質の生産に係る通常の方法は、溶解性、生産性、折り畳みの正確性及び翻訳後修飾に関する問題を引き起こし得る。前記方法は、また、組み換え膜タンパク質の輸送ができない。これらの要因の多くは、形質移入が行われるタンパク質の活性に直接関係するので、重要である。タンパク質の活性は、直接輸送において高い優位性を有するので、輸送されたタンパク質は細胞に対して作用を発揮する。
【０００５】
現在のタンパク質輸送の方法の他の欠点は、輸送それ自体に存在する。脂質及びポリマー／ペプチドの両方に基づく形質移入の方法は、非効率的な輸送及び毒性の他にも、望ましくない電荷の差異によるタンパク質特有のパッケージング効率に問題が存在する。電気穿孔法もまた、毒性、輸送されるタンパク質の量の著しい不整合及び制御の欠如に関する問題が存在する。ＰＴＤの封入体は、輸送効率に悪影響を及ぼし得る凝集及び沈殿を引き起こすことが知られている。最後に、ウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）におけるタンパク質の輸送は、免疫応答を引き起こすウイルスのカプシドのタンパク質がパッケージングに使用されることを要する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
タンパク質富化微細小胞、その作製方法及び使用方法を提供する。本方法のいくつかの態様は、第１二量体化領域を含む膜結合性タンパク質、及び第２二量体化領域を含む標的タンパク質を有する細胞を、細胞から微細小胞を生産するのに十分な状態で保持し、前記微細小胞が、前記標的タンパク質を含むことを特徴とする。また、前記微細小胞の作製に使用される細胞、試薬及びキットと、例えば、研究及び治療への応用のおいての微細小胞の使用方法とを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】以下の実験の項にて記載するような微細小胞の準備及び使用を示す概略図である。
【図２Ａ】ＣＲＥリコンビナーゼ微細小胞が生産されている本発明の実施形態の一態様及び結果を示す図である。
【図２Ｂ】ＣＲＥリコンビナーゼ微細小胞が生産されている本発明の実施形態の一態様及び結果を示す図である。
【図２Ｃ】ＣＲＥリコンビナーゼ微細小胞が生産されている本発明の実施形態の一態様及び結果を示す図である。
【図２Ｄ】ＣＲＥリコンビナーゼ微細小胞が生産されている本発明の実施形態の一態様及び結果を示す図である。
【図３】標的タンパク質を含む微細小胞の分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
タンパク質富化微細小胞、その作製方法及び使用方法を提供する。本方法のいくつかの態様は、第１二量体化領域を含む膜結合性タンパク質、及び第２二量体化領域を含む標的タンパク質を有する細胞を、細胞から微細小胞を生産するのに十分な状態で保持し、前記微細小胞が、前記標的タンパク質を含むことを特徴とする。また、前記微細小胞の作製に使用される細胞、試薬及びキットと、例えば、研究及び治療への応用においての微細小胞の使用方法とを提供する。
【０００９】
本発明を更に詳細に説明する前に、本発明は、言うまでも無くそれ自体が変わり得るように、説明された特定の実施形態に限定されないことを理解すべきである。本発明は、当業者が理解するような様々な変更態様、変形例及び均等物を含む。更に、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用されている用語は単に特定の実施形態を説明するために用いられており、限定することを意図していないことを理解すべきである。
【００１０】
ある範囲の値が与えられる場合、その範囲の上限及び下限の間の、文脈が別段に明示しない限りは下限の単位の１０分の１までの各介在値、及びその記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在する値が本発明の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限度を条件として本発明の範囲内に更に包含される。記載された範囲が限度のうちの一方又は両方を含む場合、これらの含まれた限度の一方又は両方を除外した範囲も本発明に更に包含される。
【００１１】
ある範囲は、本明細書では用語「約」から始まる数値と共に示されている。用語「約」は、本明細書では「約」から始まる正確な数、及び「約」から始まる数に近い数又は「約」から始まる数に近似した数のための文字通りのサポートを提供するために用いられている。数が具体的に述べられた数に近いか否か又は近似しているか否かを判断する際に、述べられていない近い数又は近似した数は、その数が示されている文脈では、具体的に述べられた数に略相当する数であってもよい。
【００１２】
単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」が、本明細書及び添付の特許請求の範囲に用いられている場合、文脈が別段に明示しない限り、複数の指示対象を含むことを留意すべきである。更に、特許請求の範囲がいかなる選択的な要素も排除して記載されていることを留意すべきである。従って、この記述は、請求項の要素の記載に関する「唯一の（solely）」、「のみの（only）」等の排他的用語の使用、又は「否定的な（negative）」限定の使用のための先行記載として機能すべく意図される。
【００１３】
当業者が本開示を読むと明らかであるように、本明細書に説明され例示された個々の実施形態は夫々、別々の構成要素及び特徴を有しており、別々の構成要素及び特徴は、本発明の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他の複数の実施形態のいずれかの特徴から容易に分離されてもよく、又はいずれかの特徴と容易に組み合わされてもよい。全ての記載された方法は、記載された事象の順序で、又は論理的に可能な任意の他の順序で実行され得る。
【００１４】
本明細書に引用されている全ての刊行物及び特許は、個々の刊行物又は特許が、具体的に且つ個別に参照によって組み込まれると示されているかのように参照によって本明細書に組み込まれ、刊行物の引用に関連する方法及び／又は材料を開示して記載すべく、参照によって本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示に関するものであって、先行発明を理由として、本発明がそのような刊行物に先行する権限がないことを認めるものであるとみなされるべきではない。更に、提供される刊行物の日付は、実際の公開日とは異なる場合があり、個別に確認する必要があるかもしれない。
【００１５】
特に定義されていない限り、本明細書で使用されている全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通して理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は同等である全ての方法及び材料を、本発明の実施又は試験に更に使用することができるが、代表的な実例となる方法及び材料を本明細書に記載している。
【００１６】
タンパク質富化微細小胞の作製方法
上記で要点を述べたように、本発明のいくつかの態様は、タンパク質富化微細小胞の生産方法である。「タンパク質富化微細小胞」とは、脂質二重層封入体内に一又はそれ以上の標的タンパク質を含む膜融合構造を意味する。ここで使用される「膜融合」という用語は、標的細胞の膜への微細小胞の膜の融合を提供するする微細小胞の特性に言及している。微細小胞が膜融合性を有するので、微細小胞は、細胞内に標的タンパク質を含めた内包物を輸送するために標的細胞の脂質二重層膜と融合することができる。タンパク質富化微細小胞について更に詳述する前に、その生産方法を以下より詳細に確認する。
【００１７】
上記で要点を述べたように、本方法のいくつかの態様は、微細小胞生産細胞を、該微細小胞生産細胞から微細小胞の生産に十分な条件下で保持し、微細小胞は、一又はそれ以上の標的タンパク質を含むことを特徴とする。微細小胞生産細胞は、第１二量体化領域を有する膜結合性タンパク質及び第２二量体化領域を有する標的タンパク質を有する。
【００１８】
第１二量体化領域を含む膜結合性タンパク質
微細小胞の作製方法で使用される細胞は、第１二量体化領域を含む膜結合性タンパク質を有する。該細胞は、第１二量体化領域を有する任意の適当な膜結合性タンパク質を有していてもよい。膜結合性タンパク質は、例えば、結合相互作用によって微細小胞の膜と安定的に結合することができるタンパク質であり、微細小胞の膜と結合する際、第１二量体化領域が微細小胞の細胞基質に接触するように構成されていてもよい。膜結合性タンパク質の大きさは、場合によっては、１２キロダルトンから５０キロダルトンを含む、１０キロダルトンから１００キロダルトンのような５キロダルトンから２５０キロダルトンの範囲内で多様であってもよい。
【００１９】
膜結合性タンパク質は、（例えば、以下で詳細に記載するように）単一の二量体化領域、又は二若しくはそれ以上の二量体化領域を含むように修飾されていてもよい。場合によっては、対象となる細胞及び微細小胞は、二又はそれ以上の膜結合性タンパク質を備えていてもよい。二又はそれ以上の膜結合性タンパク質は夫々、標的タンパク質と二量体化複合体を形成する二量体化領域を独立に有していてもよい。
【００２０】
対象となる膜結合性タンパク質は、限定的ではないが、結合又は統合等により細胞膜（即ち、膜結合領域）に安定的結合をする領域を含む任意のタンパク質を有していてもよく、そのような領域としては、ミリストイル化領域、ファルネシル化領域、膜貫通領域及びこれらと同種類の領域等が含まれる。特に、対象となる膜結合性タンパク質は、限定的ではないが、ミリストイル化タンパク質、例えば、ｐ６０ｖ−ｓｒｃ又はこれと同種類のタンパク質がある。また、ファルネシル化タンパク質、例えば、Ｒａｓ、Ｒｈｅｂ、ＣＥＮＰ−Ｅ，Ｆと、特定の脂質二重層成分に結合するタンパク質、例えば、ホスファチジルセリンに結合するアネキシンＶと、細胞膜二重層の脂質成分と、これらと同種類のタンパク質とがある。更に、膜アンカータンパク質があり、膜透過型タンパク質、例えば、トランスフェリン受容体及びその一部がある。また、ウイルス膜融合タンパク質、例えば、以下で説明するＶＳＶ−Ｇ及びこれと同種類のタンパク質がある。
【００２１】
対象となる膜結合性タンパク質は膜結合領域に加えて、第１二量体化領域を含む。第１二量体化領域は広く多様であってよく、標的タンパク質の第２二量体化領域に直接結合する領域であってもよく、例えば以下に詳述するように、二量体化メディエータを介して、第２二量体化領域に結合する領域であってもよい。所定の膜結合性タンパク質は、単一の種の所定の領域（例えば、二量体化領域、膜結合性領域等）又は、所望であれば、所定の領域の複数、例えば、二若しくはそれ以上、又は三若しくはそれ以上の複製及び／又は複数の異なる二量体化領域を有していてもよい。所望であれば、所定の膜結合性タンパク質分子において、付加的な領域、例えば、リンカー領域、検出領域（例えば、蛍光タンパク質、その他ルシフェラーゼ及びこれと同種類の酵素レポーター）等が存在していてもよい。所定の膜結合性タンパク質においては、膜結合領域及び二量体化領域は、互いに、自然に結合しないように、非相同であってもよい。したがって、そのような実施形態の膜結合性タンパク質は、天然のタンパク質ではない。
【００２２】
微細小胞生産細胞は、単一の膜結合性タンパク質を有していてもよく、また、例えば、微細小胞の中に二又はそれ以上の別個の標的タンパク質が封入されることが要求される場合には、二又はそれ以上の別個の膜結合性タンパク質を有していてもよい。したがって、本発明のいくつかの態様において、微細小胞生産細胞は、単一の膜結合性タンパク質又は、例えば、３若しくはそれ以上、４若しくはそれ以上、５若しくはそれ以上等の異なる配列を有する二若しくはそれ以上の異なる膜結合性タンパク質を有していてもよい。場合によっては、異なる配列を有する別個の膜結合性タンパク質の数は、１から４を含み、１から５のような１から１０の範囲である。
【００２３】
標的タンパク質
標的タンパク質（即ち、対象となるタンパク質又はＰＯＩ）は、細胞内に移動することが望まれる任意のポリペプチドであってもよい。標的タンパク質は、様々な大きさでよく、場合によって１２キロダルトンから５０キロダルトンを含む、１０キロダルトンから１００キロダルトンのような５キロダルトンから２５０キロダルトンの範囲内である。対象となる標的タンパク質としては、限定的ではないが、核タンパク質、転写制御因子、ＤＮＡ結合及び／又は修飾酵素、ＲＮＡ結合及び／又は修飾酵素、タンパク質修飾酵素、蛍光タンパク質、細胞周期制御タンパク質、キナーゼ、構造タンパク質、シグナルタンパク質、アポトーシスタンパク質、翻訳制御因子、ペプチド抗原、細胞基質タンパク質又はこれらと同種類のものがある。具体的に対象となる標的タンパク質としては、限定的ではないが、以下の有用性の項に挙げた標的タンパク質がある。
【００２４】
場合によっては、標的タンパク質は、内因性タンパク質である。また、場合によっては、標的タンパク質は、非相同のタンパク質である。ここで、「非相同」という語は、タンパク質が、微細小胞生産細胞のゲノムから自然に見つかる遺伝子からは発現しないことをいう。標的タンパク質は、欠失突然変異体又は点突然変異体のような野生型タンパク質の突然変異体であってもよく、また機能の獲得又は喪失を示してもよく、例えば、野生型タンパク質の優性負変異体であってもよい。標的タンパク質は、新規な機能の標的タンパク質、例えば、新規な転写制御因子又は領域交換を介して得られるタンパク質を生産する、テトラサイクリンリプレッサ領域及びトランス活性化領域の融合体であるテトラサイクリン調節性トランス活性化因子等を生産するために一又はそれ以上のタンパク質領域を有するキメラであってもよい。ある実施形態においては、標的タンパク質は、ウイルス膜融合性タンパク質、ウイルス膜融合タンパク質の欠片、又は膜融合の特性を保つ誘導体をいずれも含んでいない。また、具体的に対象となる標的タンパク質は以下の実用性のセクションで更に述べる。
【００２５】
微細小胞生産細胞は、単一の標的タンパク質又は、微細小胞の中に封入されることが要求される異なる配列を有する二若しくはそれ以上の別個の標的タンパク質を有していてもよい。したがって、本発明のいくつかの態様において、微細小胞生産細胞は単一の標的タンパク質又は、異なる配列、例えば、３若しくはそれ以上、４若しくはそれ以上、５若しくはそれ以上等の配列を有する二若しくはそれ以上の別個の標的タンパク質を有していてもよく、場合によっては、別個の標的タンパク質の数は、１から４を含む、１から５のような、１から１０等の範囲内であってもよい。
【００２６】
本発明よれば、標的タンパク質は、第２二量体化領域を有する。第２二量体化領域は、広く様々であってよく、例えば以下に詳述するように、直接か又は二量体化メディエータを介するかいずれかで膜結合性タンパク質の第１二量体化領域と二量体化（例えば、直接か又はメディエータを介するかいずれかで非共有結合性の相互作用等により安定的に結合）する領域である。所定の標的タンパク質は、単一の種の所定の領域（例えば、二量体化領域）又は所定の領域の複数、例えば、二又はそれ以上、三又はそれ以上の複製を有していてもよい。所望であれば、所定の標的タンパク質の分子中に、付加的な領域、例えばリンカー領域等が存在していてもよい。所定の標的タンパク質中において、タンパク質領域及び二量体化領域は互いに自然には結合しないように非相同であってもよい。したがって、そのような実施形態の標的タンパク質は、天然のタンパク質ではない。
【００２７】
二量体化領域
膜結合性タンパク質及び標的タンパク質の二量体化領域は様々であってよく、二量体化領域は、例えば、以下に詳述するように、互いに直接又は二量体化メディエータを介して結合するように構成されていてもよい。膜結合性タンパク質及び標的タンパク質は、夫々、膜結合性領域又は標的タンパク質の領域と、二量体化領域とを有しているので、安定して互いに結合する少なくとも二つの別個で非相同の領域を有するキメラタンパク質又は融合タンパク質と評価されてもよい。「非相同」とは、これらキメラタンパク質の少なくとも二つの別個の領域が同一の分子中では自然には生じないことを意味する。したがって、これらのキメラタンパク質は、異なる起源の少なくとも二つの別個の領域から構成される。これらのタンパク質の二つの領域が互いに安定して結合しているので、例えば細胞表面の状態、細胞内部の状態等の細胞の条件下で、互いに分離しない。所望であれば、所定のキメラタンパク質又は融合タンパク質においては、二つの領域は、直接又はアミノ酸リンカーを介して、互いに結合していてもよい。アミノ酸リンカーは、任意の適当なアミノ酸配列及び長さを有していてもよい。
【００２８】
二量体化領域については、該領域は、直接又は二量体化メディエータを介して結合事象に加わる領域であり、結合事象では、所望の多量体、例えば、二量体、膜結合性タンパク質及び標的タンパク質の複合体を生産する結果となる。したがって、第１二量体化領域及び第２二量体化領域は、膜結合性タンパク質及び標的タンパク質を有する結合複合体に加わる領域である。第１二量体化領域及び第２二量体化領域は、互いに、又は所望ならば二量体化メディエータを介して特異的に結合する。ここで、「特異的な結合」「特異的に結合する」又はこれらに類する語は、異なる領域、例えば第１二量体化領域、第２二量体化領域、二量体化メディエータが有する、細胞内で他の分子又は成分と比較して優先的に互いに結合するという能力に言及している。ある実施形態において、結合している複合体中において、互いに特異的に結合する場合において、結合対間の親和性は、１０-5Ｍ若しくはそれ以下、１０-6Ｍ若しくはそれ以下、１０-7Ｍ若しくはそれ以下、１０-8Ｍ若しくはそれ以下、１０-9Ｍ若しくはそれ以下、１０-10 Ｍ若しくはそれ以下、１０-11 Ｍ若しくはそれ以下、１０-12 Ｍ若しくはそれ以下、１０-13 Ｍ若しくはそれ以下、１０-14 Ｍ若しくはそれ以下、又は１０-15 Ｍ若しくはそれ以下のＫD （解離定数）によって、特徴づけられる（これらの数値は、本明細書の他の部分、ある実施形態において述べる他の特異的結合対の相互作用に適用することができる）。
【００２９】
上述したように、第１二量体化領域及び第２二量体化領域は、多量体化、例えば、二量体化複合体において、互いに結合する能力を有する領域である。したがって、互いに複合体を形成することができる任意の適当な二つのポリペプチド領域が、第１二量体化領域及び第２二量体化領域としての使用において選択されてもよい。第１二量体化領域及び第２二量体化領域は、任意の適当な方法を使用して、夫々、膜結合性タンパク質及び一又はそれ以上の標的タンパク質夫々の一部として含まれていてもよい。場合によっては、膜結合性タンパク質及び／又は一若しくはそれ以上の標的タンパク質は、二量体化領域を含むように設計された融合タンパク質である。融合タンパク質中に存在する場合、二量体化領域は、リンク配列によって膜結合性タンパク質及び／又は標的タンパク質から分離していてもよい。場合によっては、二量体化領域は、膜結合性タンパク質及び／又は、一若しくはそれ以上の標的タンパク質の中に自然に含まれる領域であってもよい。
【００３０】
二量体化領域の任意の適当な組み合わせが使用される。第１二量体化領域及び第２二量体化領域は、同一のアミノ酸配列により形成されるようなホモ二量体、又は異なるアミノ酸配列により形成されるようなヘテロ二量体であってもよい。二量体化領域は様々であってよく、対象となる領域としては、限定的ではないが、対象の特定タンパク質に特異的に結合するリガンドのような標的生体分子のリガンド（例えば、タンパク質−タンパク質間相互作用領域）、ＳＨ２領域、Ｐａｚ領域、ＲＩＮＧ領域、転写活性因子領域、ＤＮＡ結合領域、酵素触媒領域、酵素調節領域、酵素サブユニット、明確な細胞の場所へ局在化するための領域、局在領域のための認識領域、http://pawsonlab.mshri.on.ca/index.php?o
ption=com_content&task=view&id=30&Itemid=63/に掲載された領域等がある。
【００３１】
目的の二量体化領域としては、限定的ではないが、「iDimerize 誘導ホモ二量体化システム（例えば、DmrB）」と、「iDimerize 誘導ヘテロ二量体化システム（例えば、DmrA及びDmrC）」と、「iDimerize 解離二量体化システム（例えば、DmrD）」がある（例えば、www.Clontech.comにおけるCat.番号635068, 635058, 635059, 635060, 635069, 635088, 635090及び635055参照）（Clackson他著（1998）「Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity 」、「Proceedings of the National Academy of Sciences of the United states of America （米国科学アカデミー紀要）」, 95(18), p.10437-10442 ）、Crabtree, G. R. 及びSchreiber, S. L.著（1996）「Three-part inventions: intracellular signaling and induced proximity」（「Trends in Biochemical Sciences」, 21(11), p.418-422 ）、Jin 他著（2000）「In vivo selection using a cell-growth switch」（「Nature Genetics （ネイチャージェネティクス）」, 26(1), p.64-66）、Castellano他著（1999）「Inducible recruitment of Cdc42 or WASP to a cell-surface receptor triggers actin polymerization and filopodium formation 」（「Current Biology （カレントバイオロジー）」,9(7), p.351-360 ）、Crabtree他著（1997）「Proximity and orientation underlie signaling by the non-receptor tyrosine kinase ZAP70」（「The Embo Journal」,16(18), p.5618-5628）、Muthuswamy他著（1999）「Controlled dimerization of ErbB receptors provides evidence for differential signaling by homo- and heterodimers」（「Molecular and Cellular Biology」,19(10), p.6845-6857）を参照）。
【００３２】
第１二量体化領域及び第２二量体化領域は、DmrA領域及びDmrC領域と、DmrB領域と、DmrD領域と、ジヒドロ葉酸還元酵素システムの二量体化領域と、ＴＡｇ及びｐ５３の二量体化領域と、ＳＨ２タンパク質及びＰＴＲＫタンパク質の二量体化領域とから選択されてもよい。
【００３３】
対象となる二量体化領域としてまた、転写活性化領域がある。対象の転写活性化領域としては、限定的ではないが、グループＨの核内受容体の転写活性化領域、ステロイド／甲状腺ホルモン核内受容体の転写活性化領域、合成又はキメラの転写活性化領域、ポリグルタミン転写活性化領域、塩基性アミノ酸又は酸性アミノ酸転写活性化領域、ＶＰ１６転写活性化領域、ＧＡＬ４転写活性化領域、ＮＦ−κＢ転写活性化領域、ＢＰ６４転写活性化領域、Ｂ４２酸性転写活性化領域（Ｂ４２ＡＤ）、ｐ６５転写活性化領域（ｐ６５ＡＤ）、又はこれらの類似物、組み合わせ、変形した物がある。
【００３４】
上述したように、第１二量体化領域及び第２二量体化領域はまた、膜結合性タンパク質及び標的タンパク質の所望の複合体を生産するために二量体化メディエータと結合してもよい。即ち、二量体化メディエータは、第１二量体化領域及び第２二量体化領域の複合体形成を促進してもよく、例えば、第１二量体化領域及び第２二量体化領域の両者が二量体化メディエータの異なる部分に特異的に結合する。任意の二量体化メディエータが使用されてもよい。二量体化メディエータは、細胞内の状態において、膜結合性タンパク質及び標的タンパク質の近接を誘導する化合物である。「近接を誘導する」とは、四又はそれ以上を含む、三又はそれ以上のような、二又はそれ以上の分子が、二量体化メディエータ化合物により仲介された結合事象を介して互いに空間的に結合していることを意味する。空間的結合は、二量体化メディエータと、少なくとも膜結合性タンパク質の分子及び標的タンパク質の分子とを有する結合複合体の存在によって特徴づけられる。結合複合体においては、各要素及び成分は、その複合体の少なくとも一つの他の要素と結合している。結合複合体においては、種々の成分における結合は様々な態様であって良い。例えば、二量体化メディエータは、膜結合性タンパク質の分子及び標的タンパク質の分子の領域の間の直接の結合事象を仲介してもよい。仲介による結合事象は、二量体化メディエータが存在しない場合に生じないもの、又は、二量体化メディエータがない場合に結合の状態を制御するときに比較して二量体メディエータが二量体の生産を強化するように、二量体化メディエータが存在しない場合により少ない程度で生じるものであってもよい。例えば、二量体化メディエータの存在下において、膜結合性タンパク質の第１二量体化領域は、標的タンパク質の分子の第２二量体化領域に結合してもよい。二量体化メディエータは、膜結合性タンパク質及び標的タンパク質の分子に同時に結合してもよく、その結果、結合複合体及び所望の空間的結合が形成されてもよい。場合によっては、二量体化領域は、膜結合性タンパク質の分子及び標的タンパク質の分子の近接を誘導し、これらの分子が、二量体化メディエータの存在下で互いに直接に結合してもよい。
【００３５】
二量体化メディエータとして機能する任意の適当な化合物が使用される。天然の物質及び合成物質を含む幅広い種類の合成物が二量体化メディエータとして使用され得る。二量体化メディエータの選択において、適用可能、かつ容易に識別又は測定できる基準としては、（A）リガンドが生理学的に受容可能である（即ち、使用される細胞又は動物に対して過度の毒性がない）、（B）合理的な範囲の治療用量であること、（C）必要に応じて、細胞内及びその他の膜を横断できる（場合によっては、細胞の外から二量体化を仲介できるものであってもよい）、（D）所望の応用のために、合理的な親和性を有して設計されたキメラタンパク質の標的領域に結合するということが挙げられる。第１の所望の基準は、化合物が生理学的に、比較的不活性であるが、二量体化メディエータとしての活性があるということである。場合によっては、リガンドは、非ペプチド性及び非核酸性となる。
【００３６】
対象となる二量体化メディエータ化合物としては、低分子があり、非毒性である。低分子とは、例えば、５００ダルトン又はそれ以下、１０００ダルトン若しくはそれ以下を含む２５００ダルトン又はそれ以下のような５０００ダルトン又はそれ以下の分子量を有する分子を意味する。非毒性とは、誘導物質が、実質的に毒性がないこと、即ち、もしあるとしても、体重１ｋｇ当たりで、５ｇ又はそれ以上を含む２．５ｇ又はそれ以上のような１ｇ又はそれ以上の濃度で、毒性を示すことを意味する。
【００３７】
対象となる二量体化メディエータの一種としては、ＦＫＢＰタンパク質及び／又はシクロフィリンタンパク質に対して結合できる化合物（同様に該化合物のホモオリゴマー及びヘテロオリゴマー（例えば二量体））である。該化合物としては、限定的でないが、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、ラパマイシン、及びこれらの派生物がある。要望に応じて、本方法における使用に適合可能なラパマイシンの合成類似体を含む前記化合物の派生物の多くがすでに公知である。
【００３８】
いくつかの実施形態においては、二量体化メディエータは、ラパマイシン類似体（即ち、ラパログ）である。本方法において、適用できる任意のラパログは、二量体化メディエータとして使用するために修飾されていてもよい。ここで、「ラパログ」という語は、ラパマイシンの種々の類似体、同族体、及び派生体を構成する化合物及びラパマイシンに構造的に関連する他の化合物の部類を指す。ラパログには、限定的ではないが、ラパマイシンと比較して一又はそれ以上の次に記載する修飾がなされたラパマイシンの変形物がある。該修飾は、Ｃ７、Ｃ４２及び／又はＣ２９におけるメトキシ基の脱メチル化、脱離又は置換、Ｃ１３、Ｃ４３及び／又はＣ２８におけるヒドロキシ基の脱離、誘導体化又は置換、Ｃ１４、Ｃ２４及び／又はＣ３０におけるケトンの還元、脱離又は誘導体化、ピペコリン酸六員環のプロリル五員環への置換、シクロヘキシル環の一又はそれ以上の置換基の脱離、誘導体化又は置換、シクロヘキシル環の、置換基を有する又は置換基を有しないシクロペンチル環への置換がある。ここで使用するラパログという語は、ラパマイシンそれ自体を含まず、場合によっては、Ｃ１及びＣ３０の間の酸素による架橋を含まない。本発明の実施形態において、二量体化メディエータとして使用され得るラパログとしては、限定的ではないが、米国特許第 7,067,526号明細書及び米国特許第 7,196,192号明細書に記載された化合物があり、その開示は参照によって本明細書に組み込まれる。更に、ラパログの実例が、米国特許第6,693,189号明細書、米国特許第 6,984,635号明細書、国際公開第 9641865号パンフレット、国際公開第 9710502号パンフレット、国際公開第9418207号パンフレット、国際公開第 9304680号パンフレット、米国特許第 5527907号明細書、米国特許第5225403号明細書、国際公開第 9641807号パンフレット、国際公開第9410843号パンフレット、国際公開第 9214737号パンフレット、米国特許第5484799号明細書、米国特許第5221625号明細書、国際公開第 9635423号パンフレット、国際公開第 9409010号パンフレット、国際公開第9205179号パンフレット、米国特許第5457194号明細書、米国特許第 5210030号明細書、国際公開第 9603430号パンフレット、国際公開第 9404540号パンフレット、米国特許第5604234号明細書、米国特許第 5457182号明細書、米国特許第5208241号明細書、国際公開第 9600282号パンフレット、国際公開第 9402485号パンフレット、米国特許第5597715号明細書、米国特許第 5,362,735号明細書、米国特許第5200411号明細書、国際公開第 9516691号パンフレット、国際公開第 9402137号パンフレット、米国特許第5583139号明細書、米国特許第 5324644号明細書、米国特許第5198421号明細書、国際公開第 9515328号パンフレット、国際公開第 9402136号パンフレット、米国特許第5563172号明細書、米国特許第 5318895号明細書、米国特許第5147877号明細書、国際公開第 9507468号パンフレット、国際公開第 9325533号パンフレット、米国特許第5561228号明細書、米国特許第 5310903号明細書、米国特許第5140018号明細書、国際公開第 9504738号パンフレット、国際公開第 9318043号パンフレット、米国特許第5561137号明細書、米国特許第 5310901号明細書、米国特許第5116756号明細書、国際公開第 9504060号パンフレット、国際公開第 9313663号パンフレット、米国特許第5541193号明細書、米国特許第 5258389号明細��、米国特許第5109112号明細書、国際公開第 9425022号パンフレット、国際公開第 9311130号パンフレット、米国特許第5541189号明細書、米国特許第 5252732号明細書、米国特許第5093338号明細書、国際公開第 9421644号パンフレット、国際公開第 9310122号パンフレット、米国特許第5534632号明細書、米国特許第 5247076号明細書、及び米国特許第5091389号明細書に開示されており、それらの開示は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３９】
二量体化メディエータと共に、膜結合性タンパク質及び標的タンパク質に組み込まれ得る二量体化領域の種類は、多岐にわたってもよい。場合によっては、天然のペプチジルプロリルイソメラーゼのファミリータンパク質又は誘導体、例えば、これらの突然変異体（点突然変異体及び欠失変異体を含む）から選択されてもよい。実施形態における対象となる領域の例は、限定的ではないが、ＦＫＢＰ、ＦＲＢ及びこれらと同種類のものがある。
【００４０】
ＦＫＢＰ二量体化領域は、ＦＫＢＰ領域のペプチド配列の全部又は一部を有していてもよい。対象となる領域は、直接結合測定（例えば、蛍光消光法）、競合結合測定（例えば、ＦＫ５０６と対比する）、ＦＫＢＰ酵素の活性（ロタマーゼ）の抑制、又はその他の分析方法論により測定されたＫｄ（解離定数）の値が、例えば、約１ｎＭ又はそれ以下、約１０ｎＭ又はそれ以下のような１００ｎＭ又はそれ以下である対応する二量体化メディエータ、例えば、ラパログに結合可能な領域である。対象となるＦＫＢＰ領域のペプチド配列は、二量体化メディエータに対する領域の特異的な結合に適合するように、例えば、３又はそれ以下、５又はそれ以下のような１０又はそれ以下、１５又はそれ以下、２０又はそれ以下のような２５又はそれ以下のアミノ酸残基の置換、挿入又は削除により、修飾されていてもよい。対象となるＦＲＢ領域は、ＦＫＢＰタンパク質と、二量体化メディエータ例えば、ラパログとの複合体に結合可能な領域を有する。ＦＲＢ融合タンパク質は、従来からの方法により測定された解離定数（Ｋｄ）の値が、１μＭ又はそれ以下、２μＭ又はそれ以下、約１０μＭ又はそれ以下のような約２００μＭ又はそれ以下の前記複合体に結合してもよい。ＦＲＢ領域は、ラパログのＦＫＢＰ融合タンパク質との複合体の高い親和性を維持するのに十分な長さ及び構成である。
【００４１】
対象となる他の種類の二量体化メディエータ化合物は、アルケニル置換脂肪族環式の（ＡＳＣ）二量体化メディエータ化合物である。ＡＳＣ二量体化メディエータ化合物は、アルケニル基が置換された脂肪族環を有している。ある実施形態においては、脂肪族環は更に、ヒドロキシル基及び／又はオキソ基に置換されている。場合によっては、脂肪族環の炭素は、ヒドロキシル基に置換されたアルケニル基に置換されている。脂肪族環に係る構造は、シクロヘキサ−２−エノン環の構造の類似体であってもよい。いくつかの実施形態において、ＡＳＣ二量体化メディエータ化合物は、シクロへキセノン基（例えば、シクロヘキサ−２−エノン）に見られるようなシクロヘキセン環又はシクロヘキサン環、シクロヘキサノン基、ヒドロキシシクロヘキサン基、ヒドロキシシクロヘキセン基（例えば、シクロヘキサ−２−エノール基）、メチレンシクロヘキサン基（例えば、３−メチレンシクロヘキサン−１−オール基）があり、脂肪族環は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の不飽和結合を含み、長さにおいて約２から２０の炭素のアルケニル基に置換されている。ある実施形態において、アルケニル置換は、共役系不飽和結合を有している。特定の実施形態においては、アルケニル置換基は、炭素数４の長さで二つの共役二重結合であってもよい。別の実施形態においては、アルケニル置換基は、脂肪族環の構造と共役している。更なる詳細は、国際公開第 2011/163029号パンフレットに開示されており、その開示は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４２】
二量体化領域がアブシジン酸のようなＡＳＣ誘導化合物である場合、対象となるＡＳＣ結合二量体化領域としては、限定的ではないが、細胞内タンパク質のパイラバクチンレジスタンス（ＰＹＲ）／ＰＹＬ（PYR1-like ）／ＲＣＡＲ（regulatory component of ABA receptor）ファミリーのアブシジン酸結合領域がある。ＰＹＲ／ＰＹＬ／ＲＣＡＲアブシジン酸結合領域は、ＰＹＲ／ＰＹＬ／ＲＣＡＲタンパク質（例えば、パイラバクチン抵抗体１、ＰＹＲ１−Ｌｉｋｅタンパク質等）のアブシジン酸に特異的に結合する領域又は部分である。したがって、ＡＳＣ誘導結合領域は、ＰＹＲ１タンパク質又はＰＹＬタンパク質（例えば、ＰＹＬ１、ＰＹＬ２、ＰＹＬ３、ＰＹＬ４、ＰＹＬ５、ＰＹＬ６、ＰＹＬ、ＰＹＬ８、ＰＹＬ９、ＰＹＬ１０、ＰＹＬ１１、ＰＹＬ１２、ＰＹＬ１３）の全長を含み、同様に、アブシジン酸に結合するこれらの一部又は突然変異体、例えば、シロイヌナズナ由来のＰＹＬ１のアミノ酸残基３３−２０９を含む。適当なＡＳＣ結合二量体化領域の更なる例としては、ＰＰ２Ｃ誘導領域がある。ＰＰ２Ｃ誘導領域は、グループＡのタンパク質ホスファターゼ２Ｃ群（ＰＰ２Ｃｓ）に見られるＰＹＲ／ＰＹＬ結合領域であり、ＰＰ２ＣｓはＰＹＬ（＋アブシジン酸）結合領域を有する。したがって、ＡＳＣ誘導結合領域は、ＰＰ２Ｃタンパク質（例えば、ＡＢＩ１）の全長を含み、また、アブシジン酸に結合するこれらの一部又は突然変異体、例えば、シロイヌナズナ由来のＡＢＩ１のアミノ酸残基１２６−４２３を含む。場合によっては、ＰＰ２ＣのＡＳＣ誘導領域は、ホスフォターゼの負変異体、例えば、ＰＹＲ／ＰＹＬ（＋アブシジン酸）に特異的に結合する能力を保持し、更にホスフォターゼ活性を失うことはなくとも減少したＰＰ２Ｃの突然変異体である。
【００４３】
対象となる二量体化メディエータ化合物の他のタイプは、Ｎ−オキサリル−ピペコリル型又はＮ−オキサリル−プロリル型化合物である。Ｎ−オキサリル−ピペコリル型又はＮ−オキサリル−プロリル型化合物は、国際公開第 1996/06097号パンフレットにおいて開示されているイムノフィリン多量体化剤を含んでおり、その開示は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４４】
対象となる二量体化メディエータ化合物の他のタイプは、オリゴヌクレオチドリガンドを含む化合物である。オリゴヌクレオチドリガンドを含む化合物は、国際公開第1993/03052号パンフレットにおいて開示されている多機能のオリゴヌクレオチドリガンドを含んでおり、その開示は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４５】
場合によっては、二量体化メディエータは、修飾可能な二量体化メディエータである。場合によっては、二量体化メディエータは、修飾可能である（例えば、ＭＤＭ）。ＭＤＭは、適当な状態のサンプル中において、膜結合性タンパク質及び標的タンパク質の近接を可逆的に誘導する化合物であり、近接は、刺激の適用により、逆行されてもよい。サンプルへの刺激の適用は、ＭＤＭの修飾可能な基を修飾し、これにより修飾されたＭＤＭがもはや膜結合性タンパク質及び標的タンパク質の近接を誘導又は維持できないようにＭＤＭの性質を変化させる。
【００４６】
「近接を可逆的に誘導する」又は「近接の可逆的な誘導」という語は、ＭＤＭに仲介された膜結合性タンパク質及び標的タンパク質の空間的な結合が、ＭＤＭを修飾する適当な刺激（例えば、光子、化学薬剤、又は酵素）の適用により逆行され得ることを意味する。適当な刺激の適用により二量体化複合体の膜結合性タンパク質成分及び標的タンパク質成分の解離が起きる。場合によっては、刺激は、修飾を行う刺激、例えば、修飾可能な基の修飾を起こす刺激として説明されてもよい。ある実施形態において、刺激の適用は、膜結合性タンパク質及び標的タンパク質の領域へのＭＤＭの結合の競合的阻害要素の適用ではない。ある実施形態において、刺激の適用はサンプルを希釈しない。
【００４７】
サンプルへの適当な刺激の適用は、ＭＤＭの修飾、例えば、適性を変化させるＭＤＭ分子の性質に変化をもたらすように、修飾可能な基を修飾する。いくつかの実施形態において、修飾されたＭＤＭにおいては、膜結合性タンパク質及び／又は標的タンパク質の二量体化領域に対する親和性が著しく減少し、親和性は、修飾されていないＭＤＭの対応する親和性と比べて、例えば、２倍又はそれ以上、３倍又はそれ以上のような、４倍又はそれ以上、５倍又はそれ以上、１０倍又はそれ以上、３０倍又はそれ以上、５０倍又はそれ以上、１００倍又はそれ以上、１０００倍又はそれ以上減少する。いくつかの実施形態において、二量体化領域（ＦＫＢＰ領域又はＡＳＣ結合領域）に対するＭＤＭ（例えばラパログ由来又はＡＳＣ由来のＭＣＩＰ）の解離定数Ｋｄの値は、１０ｎＭ又はそれ以下（例えば、約３ｎＭ若しくはそれ以下、又は約１ｎＭ若しくはそれ以下）から、約２０ｎＭ又はそれ以上、約３０ｎＭ又はそれ以上のような、約４０ｎＭ又はそれ以上、約５０ｎＭ又はそれ以上、約１００ｎＭ又はそれ以上、約２００ｎＭ又はそれ以上、約５００ｎＭ又はそれ以上、約１μＭ又はそれ以上まで上昇されてもよい。
【００４８】
いくつかの実施形態において、ＭＤＭは、刺激の適用によって開裂する開裂可能な基を含んでいる。刺激の適用は、二つの分裂したＭＤＭ生産物を生産することができ、ＭＤＭ生産物夫々は、独立的に、第１二量体化領域及び第２二量体化領域の一方のみに対する親和性を維持している。いくつかの実施形態において、ＭＤＭは、第１二量体化領域に特異的に結合する第１結合部分と、第２二量体化領域に特異的に結合する第２結合部分とを、開裂可能リンカーの開裂により膜結合性タンパク質及び標的タンパク質の解離をもたらすように連結する開裂可能リンカーを含んでいる。他の実施形態において刺激の適用は、修飾されたＭＤＭを生産し、第１結合部分及び第２結合部分の内の一つが、対応する二量体化領域に対する親和性を著しく（例えば、本明細書で述べるように）減少するように、本質的に変化させる。この場合、他の結合部分に対する結合親和性は、変化しないか、又は著しく（例えば本明細書で述べるように）減少してもよい。
【００４９】
ＭＤＭは、第１二量体化領域に特異的に結合する第１結合部分（Ａ）と、第２二量体化領域に特異的に結合する第２結合部分（Ｂ）と、修正可能な基（Ｘ）とを有していてもよい。本発明に係るＭＤＭは、式（Ｉ）によって、図示されてもよい。
【００５０】
【化１】
2019141093.tif 000003
【００５１】
式（Ｉ）においては、Ａが第１結合部分であり、Ｂが第２結合部分であり、Ｘが修飾可能な基である。ある実施形態中、式（Ｉ）において、Ｘは、Ａの一部又はＢの一部であってもよく、リンカーを介して、Ａ及び／又はＢに接続されていてもよい。場合によっては、ＭＤＭは、第１二量体化領域及び第２二量体化領域に独立して特異的に結合し、例えば、第１二量体化領域及び第２二量体化領域のいずれか一方へのＭＤＭの初期結合を経て三成分複合体の形成が生じてもよい。他の場合においては、ＭＤＭの第２二量体化領域への特異的な結合は、ＭＤＭ／第１二量体化領域複合体の先の形成に依存する。本文脈において「依存」とは、第２標的分子においては、ＭＤＭ単独に対する親和性よりも、ＭＤＭ／第１二量体化領域複合体に対する親和性の方が高いことを意味する。いくつかの実施形態においては、そのような三成分複合体を形成するＭＤＭは、第１二量体化領域に特異的に結合する第１結合部分（Ａ）（例えば、ＦＫＢＰ領域に特異的に結合するラパログ又は、ＰＹＬのＡＳＣ結合領域に特異的に結合するアルケニル置換脂肪族環（ＡＳＣ）誘導化合物）と、第２二量体化領域に特異的に結合する第２結合部分（Ｂ）（例えば、ＦＲＢ領域に特異的に結合するラパログ、又はＡＢＩのＡＳＣ結合領域に特異的に結合するＡＳＣ誘導化合物）とを有し、二量体化領域への結合は、Ａ及び第１二量体化領域の先の結合に依存する。ある場合においては、ＭＤＭ／第１二量体化領域複合体は、ＭＤＭ及び標的タンパク質間で形成される直接接触なしで、第２二量体化領域に特異的に結合する。この場合において、ＭＤＭは、膜結合性タンパク質及び標的タンパク質の結合を仲介する。
【００５２】
修飾可能な基（Ｘ）は、ＭＤＭの構造内において任意の適当な場所で含まれていてもよい。場合によって、修飾可能な基（Ｘ）は、第１結合部分（Ａ）の一部又は第２結合部分（Ｂ）の一部である。場合によっては、Ｘは、第１二量体化領域（例えば、ＦＫＢＰ領域又はＡＳＣ結合領域）に特異的に結合する構造の一部に含まれていてもよく、あるいは、第２二量体化領域（例えば、ＦＲＢ領域又はＡＳＣ結合領域）に特異的に結合する構造の一部に含まれていてもよい。また、場合によっては、Ｘは、第１結合部分Ａ又は第２結合部分Ｂから分離していてもよい。したがって、Ｘは、第１二量体化領域又は第２二量体化領域との特異的な結合における相互作用に関連しない構造内の配置、例えば、Ａ及びＢを接続するリンカー内に位置していてもよい。
【００５３】
対象のＭＤＭとして、２０１２年９月１３日に出願された米国仮出願第61/700,683号明細書に、ＭＣＩＰｓ及び二量体化機構が連動して開示されており、その開示は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５４】
微細小胞誘導物質
ここで、「微細小胞誘導物質」は、細胞からの微細小胞の生産を促進（即ち、増進）する薬剤を指す。場合によっては、微細小胞誘導物質は微細小胞の一部とはならない分子であるが、微細小胞誘導物質の存在により、細胞が微細小胞を生産することとなる。また、場合によっては、微細小胞誘導物質は生産された微細小胞の一部となる。場合によっては、微細小胞の生産は、哺乳類の細胞内で微細小胞誘導物質の過剰発現を経て達成され得る。場合によっては、細胞内での微細小胞誘導物質の過剰発現は、形質移入された細胞の周囲の媒質中への微細小胞の放出をもたらす。
【００５５】
微細小胞誘導物質は、タンパク質、低分子誘導物質、例えば、アポトーシスにおける内因性の「セルブレビング」、及びこれらと同種の物がある。タンパク質の微細小胞誘導物質は、限定的ではないが、膜の出芽を誘導するタンパク質、ウイルス膜融合タンパク質、小胞形成の低分子誘導物質等がある。
【００５６】
場合によっては、微細小胞誘導物質は、微細小胞の生産が増進されるように膜の発芽を誘導するタンパク質である。ここで、「膜の発芽を誘導するタンパク質」という表現は、脂質二重層の変形を促進し、また、小胞の形成の仲介することができる任意のタンパク質を指す。任意の適当な細胞タンパク質又はウイルスタンパク質が、膜の発芽を誘導するように利用されてもよい。膜の発芽を誘導する対象の細胞タンパク質としては、限定的ではないが、プロテオリピドタンパク質ＰＬＰ１（Trajkovic 他著, （2008）「サイエンス（Science ）」第 319巻, p.1244-1247 ）、クラスリンアダプター複合体ＡＰ１（Camus 他著, （2007）「Molecular Biology of the Cell 」第18巻, p.3193-3203 ）、フリッパーゼ、スクランブラーゼのような脂質の特性を改変するタンパク質、ＴＳＡＰ６（Yu他著, （2006）「Cancer Research 」第66巻, p.4795-4801 ）及びＣＨＭＰ４Ｃ（Yu他著, （2009）「FEBS Journal」第 276巻, p.2201-2212 ）のような非古典的な経路を経て分泌を促進するタンパク質がある。膜の発芽を誘導する対象のウイルスタンパク質としては、限定的でないが、ＨＩＶのＶｐｕタンパク質（Neil他著, （2008）「ネイチャー（Nature）」第 451巻, p.425-4431）のようなテセリン／ＣＤ３１７拮抗薬と、レトロウイルスのＧＡＧ（Camus 他著, （2007）「Molecular Biology of the Cell 」第18巻, p.3193-3203 ）及びエボラＶＰ４０（Timmins 他著, 「Virology 2001 」）のような種々のウイルス性構造のタンパク質がある。
【００５７】
場合によっては、微細小胞誘導物質は、ウイルス膜融合タンパク質（例えば、ウイルス融合糖タンパク質）である。ウイルス膜融合タンパク質は、インフルエンザウイルスの血球凝集素のようなクラスＩのウイルス膜融合タンパク質、クラスＩＩのウイルス膜融合タンパク質、又はクラスＩＩＩのウイルス膜融合タンパク質である（例えば、Backovic他著, （2009）「Current Opinion in Structural Biology 」19（2 ）, p.189-96、Courtney他著, 「Virology Journal 2008 」, 5:28に記載）。いくつかの実施形態においては、ウイルス膜融合タンパク質は、クラスＩのウイルス膜融合タンパク質である。対象となるクラスＩのウイルス膜融合タンパク質は、限定的でないが、バキュロウイルスＦタンパク質、シロイチモジヨトウＭＮＰＶ（ＳｅＭＮＰＶ）のＦタンパク質及びマイマイガＭＮＰＶ（ＬｄＭＮＰＶ）のＦタンパク質のような核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）属のＦタンパク質がある。微細小胞誘導物質は、クラスＩＩＩのウイルス膜融合タンパク質であってもよく、対象のクラスＩＩＩのウイルス膜融合タンパク質は限定的でないが、ラブドウイルスＧ（水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）の膜融合性のタンパク質Ｇ等）、ヘルペスウイルスｇＢ（単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１のｇＢ）の糖タンパク質Ｂ等）、ＥＢＶのｇＢ、ソゴトウイルスＧ、バキュロウイルスｇｐ６４（オートグラファカリフォルニアマルチプルＮＰＶ（Autographa California Multiple NPV, AcMNPV ）のｇｐ６４）、ボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）糖タンパク質（ＢＤＶ  Ｇ）がある。場合によっては、ウイルス膜融合タンパク質は、ＶＳＶ−Ｇ又はバキュロウイルスのｇｐ６４である。
【００５８】
ある実施形態において、微細小胞誘導物質は、ジェンバンクAN: M35219.1で定義されているＶＳＶ−ＧポリペプチドのようなＶＳＶ−Ｇ、又は膜融合性を維持する任意の機能的な断片若しくは機能的な誘導体である。ここで、膜融合性タンパク質に関連して、「膜融合性の」という語は、微細小胞の膜の標的細胞の形質膜への融合を誘導できるウイルス性のタンパク質であることを指す。対象のＶＳＶ−Ｇの膜融合性のポリペプチドは、限定的ではないが、米国特許第7,323,337号明細書、米国特許第 5,670,354号明細書、米国特許第 5,512,421号明細書、米国特許出願公開第2010/0167377号明細書等に開示されている。
【００５９】
小胞形成の低分子誘導体もまた、対象である。小胞形成の低分子誘導体としては、限定的ではないが、セルブレビングを生じるアポトーシス誘導物質、例えば、スタウロスポリン及びその他同種の物質がある。
【００６０】
所望であれば、微細小胞誘導物質は、任意の適当なプロトコルを使用することで、細胞内に供給されてもよい。例えば、細胞は、細胞内のコード配列から微細小胞誘導物質が発現するように構成されていてもよく、微細小胞誘導物質は、任意の適当な方法を使用して、細胞に付加されてもよい。微細小胞誘導物質を細胞に付加する方法としては、限定的ではないが、微細小胞誘導タンパク質をコードする構築物の細胞への形質移入若しくは形質導入と、細胞への化学的誘導物質（例えば、低分子）の接触等がある。
【００６１】
微細小胞生産細胞
微細小胞を生産できる任意の適当な細胞が利用されてもよい。場合によっては、該細胞は、真核細胞である。対象となる細胞としては、真核細胞、例えば、動物細胞があり、動物細胞の具体的な種としては、限定的ではないが、昆虫、蠕虫、鳥類又は哺乳類の細胞がある。様々な哺乳類の細胞が使用されてもよく、例として、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ネズミ、非ヒト霊長類及びヒトの細胞がある。様々な種における様々な種類の細胞が用いられてよく、例えば、造血細胞、神経細胞、グリア細胞、間葉細胞、皮膚細胞、粘膜細胞、間質細胞、筋細胞（平滑筋細胞を含む）、脾臓細胞、網内細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、腎臓細胞、消化管細胞、肺細胞、線維芽細胞、及び他の種類の細胞が用いられる。目的の造血細胞は、筋芽細胞及び線維芽細胞並びに、赤血球系、リンパ系又は骨髄単球系統に関する任意の有核細胞であってもよい。幹細胞及び始原細胞も対象であり、ＥＳ細胞、ｅｐｉ−ＥＳ細胞、及びｉＰＳ（induced Pluripotent Stem）細胞等の幹細胞であって、造血幹細胞、神経幹細胞、間質幹細胞、筋幹細胞、肝幹細胞、肺幹細胞、消化管幹細胞及び間葉幹細胞等がある。対象となる具体的な細胞としては、限定的ではないが、例えば、ＨＥＫ−２９３細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ７細胞、ヒーラ細胞、ＨＴ１０８０、３Ｔ３細胞等の哺乳類の細胞があり、例えば、Ｈｉｇｈ５細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１その他同種類の昆虫細胞がある。更に対象となる細胞は、限定的ではないが、米国特許出願公開第2012/0322147号明細書に開示されており、その開示は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６２】
上述したように、細胞は、膜結合性タンパク質及び標的タンパク質を有し、所望な場合、例えば上記で詳述したような微細小胞誘導物質を有している。したがって、該細胞は、膜結合性タンパク質及び標的タンパク質を有するように設計された細胞である。所望のタンパク質を有するように細胞を設計する方法は標的細胞の性質、分子の性質等、一又はそれ以上の異なる考慮事項に依存し、様々であってよい。細胞は、適当なプロモータの制御下で、タンパク質のコード配列を有する発現構築物を有していてよく、プロモータは、誘導可能なプロモータであってもよく、又は恒常的に活性であってもよい。コード配列は、これによりコードされたタンパク質の特性により、様々であり、少なくとも、二量体化領域をコードする第１領域と、膜結合領域又は標的領域をコードする第２領域を含む。二つの領域は、直接結合されていてもよく、リンク領域により互いに連結されていてもよい。これらの融合タンパク質をコードする領域は、必要な転写仲介因子又は転写制御因子と動作的に組み合わされている、即ち、動作可能に連結されている。発現モジュール内に存在し得る必要な転写仲介因子は、プロモータ（組織特異的プロモータ）、エンハンサ、ターミネーション及びポリアデニル酸化を行う因子、スプライシングシグナル因子、及びこれらと同種の物を含む。場合によっては、誘導発現システムが対象となる。所望であれば、細胞内の発現構築物は、染色体に組み込まれてもよく、又はエピソームにより保持されてもよい。したがって、場合によっては、発現構築物は細胞内にて、染色体に組み込まれている。あるいは、所望であれば、一又はそれ以上の発現構築物は、エピソームにより保持されていてもよい。必要／所望であれば、発現構築物は、細胞内において安定して又は一過的に発現してもよい。
【００６３】
細胞は、任意の適当なプロトコルを使用して作製され、そのプロトコルは、細胞の性質、細胞の場所、たとえば、インビトロ又はインビボであるかによって、様々であってよい。所望であれば、プラスミドやウイルスベクターのようなベクターが、様々な構成要素、例えば、膜結合性タンパク質及び標的タンパク質、選択的な所望の微細小胞誘導物質等を発現する細胞を設計するために使用されてもよい。対象のプロトコルとしては、国際公開第 1999/041258号パンフレットに開示された方法があり、その開示は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６４】
細胞及び／又は発現構築物の性質によって、対象のプロトコルとしては、電気穿孔、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿、直接の微量注入、ウイルス感染、及びこれに類似のプロトコルであってもよい。方法の選択は、一般的に、変化させる細胞の種類、細胞の変化が生じる場所（即ち、インビトロ、エクスビボ又はインビボ）における状況に依存する。これらの方法につての一般的な議論は、「Ausubel 他著（1995）, Short Protocols in Molecular Biology, 第３版, Wiley&Sons社」に記載されている。いくつかの実施形態においては、リポフェクタミン及びカルシウム媒介の遺伝子導入技術が使用されている。対象の核酸が細胞内に導入された後、キメラタンパク質が発現可能なように、約１時間から２４時間の期間、通常３７℃（選択する場合もある）で培養されてもよい。哺乳類の標的細胞においては、ウイルスを用いたいくつかの発現機構が、キメラタンパク質の発現に利用される。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、対象となるキメラタンパク質のコード配列は、アデノウイルスの転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモータ及び三区分リーダ配列に連結されてもよい。キメラ遺伝子は、インビトロ又はインビボにおける組み換えにより、アデノウイルスのゲノムに挿入されてもよい。ウイルスのゲノムの必須でない部位への挿入（例えば、部位Ｅ１又は部位Ｅ３）は、感染した宿主中で、生存でき、キメラタンパク質を発現できる組み換えウイルスを生じる（例えば、Logan 及びShenk 著（1984）米国科学アカデミー紀要, 第81巻, p.355-359 参照）。発現の効率は、適切な転写エンハンサ要素、転写ターミネータ等の含有により増進されてもよい（Bittner 他著（1987）Methods in Enzymol第 153巻, p.51-544参照）。
【００６５】
長期間かつ高収率のキメラタンパク質の生産が望まれる場合、安定的な発現プロトコルが使用され得る。例えば、安定的にキメラタンパク質を発現する細胞株が設計され得る。ウイルスの複製起源を含む発現ベクターを使用するよりもむしろ、キメラタンパク質発現カセット及び選択マーカーにより宿主細胞が変形され得る。外来性ＤＮＡの導入後、設計された細胞は、富化された培地において、１日から２日の間、成長するようにされてもよく、選択培地に移される。組み換えプラスミド内の選択マーカーは、選別に対する抵抗を与え、細胞が安定してプラスミドを染色体内に組み込み、成長して病巣を形成できるようにする、この病巣は次に細胞株にてクローン化され、拡大し得る。加えて、コード配列は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬエフェクタヌクレアーゼに挿入され、又は、ヒト又その他のゲノムの「セーフ・ハーバー」領域へのＨＲ又は相同組み換えに続くＲＧＥＮ仲介方法により挿入され得る。対象のセーフ・ハーバー領域は、単一の複製、二倍又は異数体である領域であり、また、成長を抑制する遺伝子又は、的確に抑制できないとしても、ガン化若しくは治療できない問題を引き起こしそうな遺伝子の近くにはない領域である。
【００６６】
微細小胞生産細胞からの微細小胞の生産
本方法のいくつかの態様は、例えば、上述したように、細胞から一又はそれ以上の微細小胞を生産するのに十分な状態で、微細小胞生産細胞を保持することを含んでおり、前記微細小胞は、膜結合性タンパク質及び標的タンパク質の二量体化複合体を有している。本方法中で、微細小胞を生産するのに十分な状態で細胞を保持する適当な方法が利用される。場合によっては、細胞は、１時間から２４時間を含む１時間から２日、１時間から３日のような３０分から１週間に亘る期間、保持される。場合によっては、細胞は、４８時間から７２時間を含む３６時間から７２時間、２４時間から７２時間、１２時間から７２時間、６時間から７２時間、２時間から７２時間のような３０分から７２時間に亘る期間保持される。細胞は、細胞からの微細小胞の生産を支援する温度に保持されてもよく、対象となる温度は、１５℃から３７℃のような４℃から４２℃である。細胞は、所望であれば、適当な培地で保持されていてもよく、対象となる培地としては、限定的ではないが、ＤＭＥＭ、ＨＡＭｓＦ１２、ＲＰＭＩ１６４０、無血清条件の培地、及びこれらに類する培地がある。
【００６７】
細胞の性質によっては、本方法のいくつかの態様は、一又はそれ以上の膜結合性タンパク質、標的タンパク質、存在するならば、微細小胞誘導物質における発現を誘導するステップを有していてもよい。一又はそれ以上のこれらのタンパク質の発現は、Ｌａｃに基づくシステム又はＴｅｔに基づくシステムにおける誘導性プロモータのような誘導性プロモータによって制御されてもよい。場合によっては、本方法は、例えば、誘導物質を含む培地への細胞の接触等により、細胞に発現誘導物質を導入することを含んでいてもよい。
【００６８】
所望であれば、本方法のいくつかの態様は、細胞からの微細小胞の生産を引き起こすのに十分なように、微細小胞誘導物質に細胞を接触させることを含んでいてもよい。例えば、微細小胞誘導物質が、低分子の誘導物質である場合、微細小胞誘導物質が十分に集中した部分を有する培地への細胞の接触を含んでいてもよい。場合によっては、例えば「Biochemistry（1998年11月 3日, 37巻44章, p.15383-91）」等に述べられているように、微細小胞の生産は、温度を例えば１５℃から４２℃の範囲とし、Ｃａ2+の濃度を変更するというように、細胞の培地条件を変更することにより誘導されてもよい。
【００６９】
細胞の性質によっては、本方法のいくつかの態様は、細胞に二量体化メディエータを導入するステップを有していてもよい。二量体化メディエータは、任意の適当なプロトコルを使用して細胞内に導入されてもよい。使用される個々のプロトコルは様々であってよく、例えば、微細小胞生産細胞が、インビトロ又はインビボであるかどうかによる。インビトロのプロトコルである場合は、細胞内への二量体化メディエータの導入が任意の適当なプロトコルを用いて達成されてもよい。場合によっては、サンプルが、適当な培地で保持されている細胞を含み、二量体化領域が、前記培地に導入される。インビボのプロトコルである場合は、任意の適当な投与プロトコルが使用され得る。二量体化メディエータの結合の親和性、所望される反応、投与の様式、例えば、静脈注射、皮下注射、腹腔内投与、経口投与等、半減期、存在する細胞数等によって、様々な方法が使用されてもよい。
【００７０】
いくつかの実施形態において、本方法は、更に、細胞からの微細小胞の分離を含む。任意の適当な分離プロトコルが使用されてもよい。適当な分離プロトコルの例としては、限定的ではないが、ろ過、遠心分離、沈殿、表面及び／又は抗体に基づく捕捉、及びこれらに類似するプロトコルがある。場合によっては、微細小胞は、形質移入後の細胞上清から回収される。場合によっては、本発明に係る細胞の細胞上清のろ過（例えば、０．４５μｍ孔フィルタ）により分離されてもよく、また、例えば、遠心力１１０，０００ｇで１．５時間の超遠心分離又は、遠心力７５００ｇで１６時間の遠心分離によって分離されてもよい。場合によっては、微細小胞は、標的細胞への素材の移動の能力を失わないように、−８０℃で凍結され、保管されてもよい。いくつかの実施形態においては、微細小胞は、対象の標的タンパク質をコードする核酸を含まない。ある実施形態において、微細小胞は、ウイルスを含まない。
【００７１】
微細小胞中の標的タンパク質の量は、本方法の過程の任意の適当な時点で、例えば、細胞を保持するステップの間若しくは選択的な分離のステップの前若しくは後で、任意の適当な方法を使用して評価されてもよい。
【００７２】
ある実施形態において、所定の方法は、膜結合性タンパク質／標的タンパク質の単一の対のみを使用する。他の実施形態においては、所定の方法は、二又はそれ以上の標的タンパク質が封入された微細小胞の生産が望まれる場合等には、二又はそれ以上の別個の膜結合性タンパク質／標的タンパク質の対が使用され得る。他の実施形態において、二又はそれ以上の別個の標的タンパク質は、微細小胞が二又はそれ以上の別個の標的タンパク質と共に単一の膜結合性タンパク質を有するように、膜結合性タンパク質の共通の二量体化領域を二量体化するように構成されていてもよい。
【００７３】
タンパク質富化微細小胞
本発明のいくつかの態様は、更に、上述の方法により生産されたようなタンパク質富化微細小胞を含む。微細小胞は、例えば、上述するように、脂質二重層封入体の内部に、一又はそれ以上の膜結合性タンパク質及び一又はそれ以上の標的タンパク質を有していてもよい。微細小胞が、例えば、上述したように、微細小胞生産細胞から生産されるので、微細小胞の脂質二重層成分は、微細小胞が生産される細胞の膜成分、例えば、リン酸質、膜タンパク質等を有している。更に、微細小胞は、微細小胞が生産される細胞でみられる成分、例えば、溶質、タンパク質、核酸等を含む細胞基質を有するが、細胞の成分の全てではなく、例えば、中核は除かれる。いくつかの実施形態において、微細小胞は、エクソソームに類似すると判断されている。微細小胞の大きさは様々であってよく、場合によっては、４０ｎｍから１００ｎｍを含む、３０ｎｍから１５０ｎｍのような３０ｎｍから３００ｎｍの直径を有する。
【００７４】
場合によっては、微細小胞中において、膜結合性タンパク質及び標的タンパク質は二量体化複合体内に存在する。場合によっては、第１二量体化領域及び第２二量体化領域は、二量体化複合体内で互いに特異的に結合している。他の場合においては、第１二量体化領域及び第２二量体化領域は、例えば、上述したように、二量体化メディエータにより互いに結合されている。場合によっては、微細小胞は、微細小胞誘導物質、例えば、ＶＳＶ−Ｇのようなウイルスの膜融合タンパク質を含んでいる。いくつかの実施形態においては、膜結合性タンパク質の第１二量体化領域は、微細小胞の細胞基質に接触している。
【００７５】
所定の微細小胞は、単一の標的タンパク質又は二若しくはそれ以上の別個の標的タンパク質により、富化されていてもよい。微細小胞中に、二又はそれ以上の別個の標的タンパク質が存在する場合、各標的タンパク質は、同一の膜結合性タンパク質と二量体化していてもよく、所望であれば、各標的タンパク質は、自身の対応する膜結合性タンパク質と二量体化していてもよい。したがって、場合によっては、微細小胞は、二量体化複合体の群を有していてもよく、該群は、群中に存在する二又はそれ以上の別個の標的タンパク質を除く共通の膜結合性タンパク質を有する。他の場合においては、二量体化複合体の群は、別個の膜結合性タンパク質と夫々二量体化した二又はそれ以上の別個の標的タンパク質を有していてもよい。したがって、微細小胞は更に、第３二量体化領域を含む第２標的タンパク質を有していてもよい。
【００７６】
微細小胞が仲介する細胞内へのタンパク質輸送
上述したように、本発明のいくつかの態様は、標的細胞へのタンパク質の導入の方法である。該方法では、例えば上述したように、微細小胞への標的細胞の接触を含んでおり、微細小胞は、微細小胞の群（例えば、微細小胞の数は、１０4 から１０9 を含む１０4 から１０12のような１０2 から１０16の範囲である）の構成物中に、微細小胞が標的細胞と融合し、微細小胞に含まれる標的タンパク質を標的細胞内に輸送するのに十分な状態で、存在してもよい。微細小胞に細胞を接触させる任意の適当なプロトコルが使用されてもよい。使用される個々のプロトコルは様々であってもよく、例えば、標的細胞が、インビトロ又はインビボにあるかどうかで決定される。インビトロのプロトコルの場合、標的細胞は、微細小胞が標的細胞に融合するのに十分な状態で、適当な培地中で微細小胞と共に保持されてもよい。適当な培地の例としては、限定的ではないが、ＤＭＥＭ、ＨＡＭｓＦ１２、ＲＰＭＩ１６４０、及びこれらに類する培地がある。標的細胞及び微細小胞は、微細小胞が細胞と融合するのに十分な時間、保持されていてもよく、時間の範囲は、場合によって、３０分から２時間のような５分から７２時間の範囲である。標的細胞及び微細小胞は、適当な温度で保持されていてもよく、例えば、１５℃から３７℃のような４℃から４２℃の範囲の温度である。インビボのプロトコルの場合、任意の適当な投与プロトコルが使用されてもよい。微細小胞及び標的細胞の屈性、所望される反応、投与の様式例えば、静脈注射、皮下注射、腹腔内投与、経口投与等、半減期、存在する細胞数等によって、様々な方法が使用されてもよい。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本方法は、更に、微細小胞中の二量体化複合体の分裂（即ち、解離）を含んでいる。二量体化複合体の解離は、細胞内のより早く、かつ／又は、より大きい生物学上の反応を引き起こす細胞内でのより早い標的タンパク質の放出をもたらしてもよい。二量体化複合体は、任意の適当なプロトコルを使用して分裂してもよい。いくつかの実施形態において、本方法は、微細小胞中の標的タンパク質及び膜結合性タンパク質の複合体を解離する溶解化合物、即ち二量体化分裂化合物への微細小胞の接触を含んでいてもよい。任意の適当な溶解化合物が使用されてもよい。対象の溶解化合物としては、限定的ではないが、Ｄ／Ｄ溶解化合物（クロンテック・ラボラトリーズ社（Clontech Laboratories,Inc.）（マウンテンビュ―, カリフォルニア州））がある。Ｄ／Ｄ溶解化合物は、ＤｍｒＤ二量体化領域を含む二量体化複合体を、自己会合を分裂する（逆行する）という方法で、ＤｍｒＤ領域に結合することにより、解離してもよい。Ｄ／Ｄ溶解剤は、また、ＤｍｒＢホモ二量体化領域を含む複合体を解離する。
【００７８】
［Ｄ／Ｄ溶解化合物の構造］
【化２】
2019141093.tif 000004
【００７９】
二量体化複合体が、二量体化メディエータを含んでいる場合、例えば、上述したように複合体を解離するために、過剰なメディエータが微細小胞内へ導入されてもよい。二量体化メディエータが、修飾可能な二量体化メディエータである場合、複合体の解離は、標的タンパク質及び膜結合性タンパク質の二量体化複合体を解離させる修飾可能な二量体化メディエータを修飾するために、微細小胞へ刺激を適用することを含んでいてもよい。そのような実施形態においては、標的細胞は、標的細胞への、例えば光子、化学薬剤又は酵素のような刺激の適用前に、任意の適当な時間保持されてもよい。したがって、本方法の実施形態の更なるいくつかの態様は、修飾可能な二量体化領域の修飾と、膜結合性タンパク質及び標的タンパク質に二量体化複合体の分裂とを夫々行うために、標的細胞及び微細小胞を有するサンプルへの刺激の適用を含む。
【００８０】
場合によっては、本方法は、更に、細胞内の標的タンパク質の機能を査定、即ち、評価することを含む。一旦、対象の標的タンパク質が標的細胞内に導入されれば、細胞への標的タンパク質の導入により引き起こされる特定の生物学上の事象の発生が、評価されてもよい。細胞の評価は、任意の適当な方法で、細胞への微細小胞の接触の間及び／又はその前後の任意の適当な時点で行われてもよい。細胞の評価は、継続的に行われるか、又は、本方法の間の一又はそれ以上の時点で試料を採取することによって行われてもよい。いくつかの実施形態において、評価のステップは、接触のステップよりも前に行われる。ある実施形態において、評価のステップは、刺激の適用よりも前に行われる。場合によっては、評価は、標的タンパク質により引き起こされる生物学上の事象の発生を測定する細胞に基づく分析を使用して行われる。対象となる任意の観察可能な生物学上の特性が、本発明に係る方法の評価のステップにおいて使用されてもよい。
【００８１】
本方法の実施形態は、標的細胞に輸送されるタンパク質の過渡的活性を提供することにより特徴づけられる。過渡的とは、輸送されたタンパク質が限られた期間活性のままであることを意味し、いくつかの実施形態においては、前記限られた期間は、２時間から４８時間を含む１０分から９６時間の範囲である。他の実施形態において、タンパク質は、より長期の期間、例えば、２００時間又はそれ以上を含む１００時間又はそれ以上のような９６時間又はそれ以上の期間活性のままであってもよい。
【００８２】
有用性
本発明に係る微細小胞、細胞及び方法は、例えば上述したように、対象となる単一又は複数のタンパク質の標的細胞への導入を対象とする様々な応用において有用性が見出される。対象となる応用としては、限定的ではないが、研究応用、診断応用、治療応用がある。したがって、本発明に係る方法の使用により、輸送され得る標的タンパク質としては、研究タンパク質、診断タンパク質、治療タンパク質がある。
【００８３】
研究タンパク質は、研究プロトコルにおいて有用性が見出される活性を有するタンパク質である。したがって、研究タンパク質は、実験手順において使用されるタンパク質である。研究タンパク質は、そのような有用性を有する任意のタンパク質であってもよく、場合によっては、研究タンパク質は、コードベクターから細胞内で発現することにより、研究プロトコル中で提供もされるタンパク質領域である。研究タンパク質の具体的な種類の例としては、限定的ではないが、誘導可能な発現機構の転写モジュレータと、シグナル生産機構のメンバー、例えば、酵素及びその基質と、ホルモンと、ホルモン前駆体と、タンパク質分解酵素と、酵素活性モジュレータと、パーターバイマー及びペプチドアプタマーと、抗体と、タンパク質−タンパク質相互作用のモジュレータと、ＣＲＥリコンビナーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−９ヌクレアーゼ、ＴＡＬエフェクタヌクレアーゼ等のゲノム修飾タンパク質と、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ−２８等の細胞リプログラミングタンパク質と、これらと同種の物とがある。
【００８４】
診断タンパク質は、診断プロトコルにおいて有用性が見出される活性を有するタンパク質である。したがって、診断タンパク質は、診断手順において使用されるタンパク質である。診断タンパク質は、そのような有用性を有する任意のタンパク質であってもよい。診断におけるタンパク質の具体的な種類の例としては、限定的ではないが、シグナル生産機構のメンバー、例えば、酵素及びその基質と、標識された結合メンバー、例えば、標識された抗体及びその結合フラグメントと、ペプチドアプタマーと、これらと同種の物がある。
【００８５】
対象となるタンパク質は、更に治療タンパク質を含んでいる。対象となる治療タンパク質としては、限定はなく、ホルモン、成長因子及び分化因子があり、ホルモン、成長因子及び分化因子としては、限定はなく、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、赤血球造成因子（ＥＰＯ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−Ｉ）及びインシュリン様成長因子２（ＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビンを含む形質転換成長因子β−スーパーファミリーの内のいずれか、ＢＭＰ１からＢＭＰ１５を含む骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の内のいずれか、成長因子のヘレグリン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ニュー分化因子（ＮＤＦ）ファミリーの内のいずれか、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンのＮＴ−３及びＮＴ−４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、セマフォリン／コラプシンのファミリーのいずれか、ネトリン−１及びネトリン−２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ、チロシンヒドロキシラーゼがある。
【００８６】
対象となるタンパク質としては、更に、限定的でないが、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔｐＡ）を非限定的に含む繊維素溶解タンパク質と、ＶＩＩａ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、及び繊維素原のような凝血原タンパク質と、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター１（ＰＡＩ−１）、フォンヴヴィレブランド因子、Ｖ因子、ＡＤＡＭＴＳ−１３及びプラスミノーゲン、血栓症の部位における止血バランスを変化させるのに使用されるプラスミノーゲン等とがある。
【００８７】
対象となるタンパク質としては、また、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ−１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ＥＴＳ−ｂｏｘ含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴ−ｂｏｘ結合タンパク質、インターフェロン制御因子（ＩＲＦ−１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡ−ｂｏｘ結合タンパク質（例えばＧＡＴＡ−３）、及び、翼状螺旋タンパク質のフォークヘッドファミリーがある。
【００８８】
対象となるタンパク質としては、また、カルバモイルシンセターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノサクシネイトシンターゼ、アルギノサクシネイトリアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、α１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、シスタチオンβ−シンターゼ、側鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソヴァレリル−ｃｏＡ脱水素酵素、プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、β−グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ−タンパク質、Ｔ−タンパク質、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）配列、ジストロフィンｃＤＮＡ配列がある。
【００８９】
本発明において、タンパク質が輸送されてもよい標的細胞は、広く様々であってもよい。対象となる標的細胞としては、限定的ではないが、細胞株、ヒーラ細胞、ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞及びこれらの類似物、マウス胚性幹細胞、ヒト幹細胞、間葉幹細胞、一次細胞、組織サンプル及びこれらと同種の物がある。
【００９０】
キット
本発明のいくつかの態様は更にキットを含み、該キットは、例えば上述したように、タンパク質富化微細小胞を作製する方法において使用される一又はそれ以上の構成要素を含む。場合によっては、キットは、微細小胞生産細胞を作製するのに使用され得る遺伝子構築物を有していてもよい。前記遺伝子構築物は、例えば上述したように、膜結合性タンパク質のコード配列を含んでいてもよく、該コード配列は、発現カセットの中に存在していてもよく、該発現カセットのプロモータは誘導性であってもなくてもよい。キットの中に存在する遺伝子構築物は、例えば上述するように、標的タンパク質のコード配列を含んでいてもよく、該コード配列は発現カセットの中に存在していてもよく、発現カセットのプロモータは、誘導性であってもなくてもよい。他の実施例においては、キットの中の遺伝子構築物は、標的タンパク質コード配列を有していないが、標的タンパク質のコード配列を受け取るように構成された発現カセットであってもよい。例えば、遺伝子構築物は、制限部位（例えば、マルチプルクローニング部位）によって二量体化領域から分離されたプロモータを有していてもよい。キット内に存在する遺伝子構築物は、例えば上述するように、微細小胞誘導物質のコード配列を含んでいてもよく、コード配列は、発現カセットの中に存在していてもよく、発現カセットのプロモータは、誘導性であってもなくてもよい。遺伝子構築物は、所望であれば、セパレートベクター上に存在していてもよく、また、単一のベクター上に結合していてもよく、対象となるベクターとしては、限定的ではないが、プラスミド、ウイルスベクター等がある。場合によっては、キットは、例えば上述したように微細小胞生産細胞を有している。所望であれば、キットは、付加的に、微細小胞誘導物質、二量体化メディエータ、二量体化分裂剤等のような試薬を有していてもよい。キットの様々な構成要素は、別の容器に存在していてもよく、所望であれば全部又は一部が、単一の容器中の試薬混合物に予め混合されていてもよい。キットは、また、制御用に、検出可能なタンパク質（例えば、ＡｃＧＦＰ等）を発現する制御微細小胞を所定量有していてもよい。また、所望であれば、キットは、微細小胞を検出する抗体、ルシフェラーゼのようなレポータタンパク質を含む微細小胞を定量化する基質、又は、形質移入試薬、又は、精製機構、微細小胞の濃縮、精製のためのキットを有していてもよい。
【００９１】
上述の構成要素に加え、本キットは、更に（ある実施形態において）、本発明に係る方法の実施のための説明書を有していてもよい。該説明書は、本発明に係るキットに様々な形式で存在し、キット中に一又はそれ以上存在していてもよい。該説明書の一つの形式として、キットのパッケージ内、パッケージの添付文書等において、適当な媒体及び基材、例えば、情報が印刷された一枚又は複数枚の紙において、印刷された情報として存在していてもよい。説明書の他の形式として、情報が記録されたコンピュータが読み取り可能な媒体、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、コンパクトディスク（ＣＤ）、可搬型フラッシュドライブ、ハードディスクドライブ等がある。説明書の他の形式として、離れた場所において情報にアクセスできるインターネットを介して使用され得るホームページのアドレスがあり得る。
【００９２】
以下の例は、当業者に、本発明の実現及び使用の方法の完全な開示及び記述を提供するために挙げられており、発明者らがその発明とみなした範囲を限定することを意図するものではなく、また、以下の実験が、実施された実験の全て又は唯一であると示すことを意図しているのではない。使用された数値（例えば、量、温度等）に関して正確さを確保するために尽力したが、多少の実験誤差及び偏差を考慮すべきである。特に示していない限り、比率は、重量比率であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧又はその近傍値である。
【００９３】
実験
実験Ｉ．
用意されたタンパク質のパッケージは、iDimerize システム（クロンテック・ラボラトリーズ社（マウンテンビュ―, カリフォルニア州））に含まれたリガンド誘導性ヘテロ二量体化領域を使用することにより結合パートナーの適合した結合対を作製することによって試験された。図２Ａに示すように、結合パートナーは、二つのＤｍｒＡ領域が融合されたCherryPickerタンパク質（膜を標的とする赤色蛍光タンパク質）及び単一のＤｍｒＣ領域が融合されたＣＲＥリコンビナーゼ酵素から構成されていた。CherryPickerタンパク質及びＣＲＥ発現プラスミドは、図１に示すようにＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドと共に２９３Ｔ細胞中に同時形質移入され、Ａ／Ｃヘテロ二量体化剤が存在する場合又は存在しない場合のいずれかにおいて、微細小胞を生産するように４８時間から７２時間培養された。
【００９４】
微細小胞は、回収され、抗ＤｍｒＣ抗体を使用したウェスタンブロット法により関連したＣＲＥタンパク質の量が測定された。
【００９５】
更に、微細小胞は、細胞に基づく測定において、ＣＲＥ活性もまた測定された。ＣＲＥ微細小胞は、ｌｏｘＰ部位に並べられたstopカセットの移動を通して、ＬａｃＺマーカーを発現するようにＣＲＥを必要とした細胞株に添加された。図２Ｂに示すように、ＣＲＥリコンビナーゼ微細小胞は、標的細胞に適用された場合、形質膜に融合し、細胞中にＣＲＥリコンビナーゼを放出する。ＣＲＥリコンビナーゼは、図２Ｃに示すように、核移行シグナルを介して、ＬｏｘＰ部位間におけるＣＲＥ仲介組み換えを実行できる中核へ輸送された。ＣＲＥリコンビナーゼ微細小胞は、使用された標的細胞が蛍光顕微鏡検査法により容易に視覚化され得るように、CherryPicker（クロンテック・ラボラトリーズ社（マウンテンビュ―, カリフォルニア州））により標識化されている。
【００９６】
ウェスタンブロット法による分析では、Ａ／Ｃヘテロ二量体化剤が無い場合よりもある場合の方が、生産された微細小胞中にＣＲＥ酵素が多く存在したという結果を示した。細胞に基づく分析は、標的細胞中でＬａｃＺ発現を誘導するために十分なＣＲＥを輸送するためにＡ／Ｃヘテロ二量体化剤が必要であったことを証明した。
【００９７】
ＣＲＥリコンビナーゼゲシクルを使用した急速かつ効率的なゲノム修飾をまた図２Ｄに示す。統合されたＬｏｘＰ条件のＬａｃＺ発現カセットを内部に有する細胞株は、ＣＲＥリコンビナーゼを発現するプラスミドと共に６時間形質移入されたか（中央図）、又は、２０μｌのＣＲＥリコンビナーゼを含む微細小胞と共に３時間処理された（右図）。処理の後２４時間、細胞は、クロンテック・ラボラトリーズ社の（Cat.番号６３１７８０）β−ガラクトシダーゼ染色キットを用いて、ＬａｃＺ発現のために染色された。β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、上流のＬｏｘＰに並ぶstopコドンがＣＲＥリコンビナーゼに切除された場合にのみ発現する。実験結果は、ＣＲＥリコンビナーゼのプラスミド形質移入輸送に比べて、微細小胞を使用する方が、より早く、かつ、より効果的に切除されたことを示した。
【００９８】
実験ＩＩ．
ゲシクルへのリガンド依存の富化は、ゲシクル中への標的タンパク質パッケージング効率の８倍から１０倍の増加をもたらす細胞質タンパク質（例：細胞基質のＡｃＧＦＰ）に対して示されている。CherryPicker及びＡｃＧＦＰ発現プラスミドは、Ａ／Ｃヘテロ二量体化剤がある場合又はない場合のいずれかの場合に、微細小胞を生産するために２９３Ｔ細胞中にＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドと共に同時形質移入された。微細小胞は、回収され、抗ＤｍｒＣ抗体を使用したウェスタンブロット法により関連するＡｃＧＦＰタンパク質の量が測定された。同様の強度の結合の濃度測定分析は、Ａ／Ｃヘテロ二量体化剤がある場合のＡｃＧＦＰのパッケージングは、Ａ／Ｃヘテロ二量体化剤が無い場合よりも８倍から１０倍以上効率が良かったことを明らかにした。結果を図３に示し、以下の表１にて提供する。
【００９９】
表１
サンプル                                量
１    ＤｍｒＣ  ＡｃＧＦＰ  微細小胞（−）            ５μＬ
２    ＤｍｒＣ  ＡｃＧＦＰ  微細小胞（−）        ２．５μＬ
３    ＤｍｒＣ  ＡｃＧＦＰ  微細小胞（−）      １．２５μＬ
４    ＤｍｒＣ  ＡｃＧＦＰ  微細小胞（−）    ０．６２５μＬ
５    ＤｍｒＣ  ＡｃＧＦＰ  微細小胞（＋）            ５μＬ
６    ＤｍｒＣ  ＡｃＧＦＰ  微細小胞（＋）        ２．５μＬ
７    ＤｍｒＣ  ＡｃＧＦＰ  微細小胞（＋）      １．２５μＬ
８    ＤｍｒＣ  ＡｃＧＦＰ  微細小胞（＋）    ０．６２５μＬ
９            ｒＡｃＧＦＰ                          ２５ｎｇ
１０            ｒＡｃＧＦＰ                      １２．５ｎｇ
１１            ｒＡｃＧＦＰ                      ６．２５ｎｇ
１２            ｒＡｃＧＦＰ                    ３．１２５ｎｇ
１３            ｒＡｃＧＦＰ                      １．５６ｎｇ
１４            ｒＡｃＧＦＰ                      ０．７８ｎｇ
【０１００】
添付の特許請求の範囲に関わらず、本開示は下記の付記により更に定義される。
【０１０１】
付記１．標的タンパク質を有する微細小胞を作製する方法であって、
（ａ）第１二量体化領域を含む膜結合性タンパク質、及び
（ｂ）第２二量体化領域を含む標的タンパク質
を有する細胞を、該細胞から微細小胞を生産するのに十分な状態で保持し、
前記微細小胞は、前記標的タンパク質を含む
ことを特徴とする方法。
【０１０２】
付記２．前記微細小胞は、前記膜結合性タンパク質及び標的タンパク質の二量体化複合体を有することを特徴とする付記１に記載の方法。
【０１０３】
付記３．前記第１二量体化領域及び第２二量体化領域は、前記二量体化複合体の内部にて、互いに特異的に結合していることを特徴とする付記２に記載の方法。
【０１０４】
付記４．第１二量体化領域及び第２二量体化領域は、二量体化メディエータにより互いに結合していることを特徴とする付記２に記載の方法。
【０１０５】
付記５．更に、前記細胞内で、前記二量体化メディエータを供給する付記４に記載の方法。
【０１０６】
付記６．前記二量体化メディエータは、前記細胞が前記二量体化メディエータに接触することにより、前記細胞の内部にて供給されることを特徴とする付記５に記載の方法。
【０１０７】
付記７．前記二量体化メディエータは修飾可能な二量体化メディエータであることを特徴とする付記４から付記６までのいずれかに記載の方法。
【０１０８】
付記８．前記複合体から前記標的タンパク質を放出するように前記微細小胞の内部にて前記二量体化メディエータを修飾することを特徴とする付記７に記載の方法。
【０１０９】
付記９．前記修飾は刺激を適用することを含むことを特徴とする付記８に記載の方法。
【０１１０】
付記１０．前記細胞は、更に、微細小胞誘導物質を有していることを特徴とする付記１から付記９までのいずれかに記載の方法。
【０１１１】
付記１１．前記微細小胞誘導物質は、ウイルス膜融合タンパク質、化学的誘導物質、プロテオリピドタンパク質ＰＬＰ１、クラスリンアダプタ複合体ＡＰ１、フロッパーゼ、フリッパーゼ、スクランブラーゼ、ＴＳＡＰ６及びＣＨＭＰ４Ｃから構成されるグループから選択されることを特徴とする付記１０に記載の方法。
【０１１２】
付記１２．前記細胞は、更に、
第１二量体化領域を含む膜結合性タンパク質に係る第１コード配列を有する第１発現カセットと、
プロモータ及び第２二量体化領域を有する第２発現カセットと
を有することを特徴とする付記１から付記１１までのいずれかに記載の方法。
【０１１３】
付記１３．前記第１発現カセット及び第２発現カセットの内、少なくとも一方は、誘導性のプロモータの制御下にあることを特徴とする付記１２に記載の方法。
【０１１４】
付記１４．更に、前記プロモータを誘導することを特徴とする付記１３に記載の方法。
【０１１５】
付記１５．更に、前記細胞を生産することを特徴とする付記１から付記１４までのいずれかに記載の方法。
【０１１６】
付記１６．前記細胞は、前記細胞の内部に、前記第１コード配列と、第２コード配列との内、少なくとも一方を導入することにより生産されることを特徴とする付記１５に記載の方法。
【０１１７】
付記１７．前記導入は、形質移入することを含むことを特徴とする付記１６に記載の方法。
【０１１８】
付記１８．更に、前記細胞からの前記微細小胞を分離することを特徴とする付記１から付記１７までのいずれかに記載の方法。
【０１１９】
付記１９．更に、前記微細小胞の内部の前記標的タンパク質の量を評価することを特徴とする付記１から付記１８までのいずれかに記載の方法。
【０１２０】
付記２０．更に、前記細胞は、第３二量体化領域を含む第２標的タンパク質を有していることを特徴とする付記１から付記１９までのいずれかに記載の方法。
【０１２１】
付記２１．第１二量体化領域を含む膜結合性タンパク質に係る第１コード配列を有する第１発現カセットと、
プロモータ及び第２二量体化領域を有する第２発現カセットと
を備えることを特徴とする細胞。
【０１２２】
付記２２．前記第２発現カセットは、更に、標的タンパク質に係るコード配列を有していることを特徴とする付記２１に記載の細胞。
【０１２３】
付記２３．前記第１二量体化領域及び第２二量体化領域は互いに特異的に結合していることを特徴とする付記２１又は付記２２に記載の細胞。
【０１２４】
付記２４．前記第１二量体化領域及び第２二量体化領域は、二量体化メディエータにより、互いに結合していることを特徴とする付記２１又は付記２２に記載の細胞。
【０１２５】
付記２５．更に、前記二量体化メディエータを備えることを特徴とする付記２４に記載の細胞。
【０１２６】
付記２６．前記二量体化メディエータは修飾可能な二量体化メディエータであることを特徴とする付記２４又は付記２５に記載の細胞。
【０１２７】
付記２７．前記第１二量体化領域及び第２二量体化領域は、ＤｍｒＡ領域及びＤｍｒＣ領域と、ＤｍｒＢ領域と、ＤｍｒＤ領域と、ジヒドロ葉酸還元酵素システムの二量体化領域と、ＴＡｇ及びｐ５３の二量体化領域と、ＳＨ２及びＰＴＲＫタンパク質の二量体化領域とから選択されることを特徴とする付記２１から付記２６までのいずれかに記載の細胞。
【０１２８】
付記２８．微細小胞誘導物質を備えることを特徴とする付記２１から付記２７のいずれかに記載の細胞。
【０１２９】
付記２９．前記微細小胞誘導物質は、ウイルス膜融合タンパク質、化学的誘導物質、プロテオリピドタンパク質ＰＬＰ１、クラスリンアダプタ複合体ＡＰ１、フロッパーゼ、フリッパーゼ、スクランブラーゼ、ＴＳＡＰ６及びＣＨＭＰ４Ｃからなるグループから選択されることを特徴とする付記２８に記載の細胞。
【０１３０】
付記３０．前記微細小胞誘導物質は、クラスＩＩＩのウイルス膜融合タンパク質であることを特徴とする付記２９に記載の細胞。
【０１３１】
付記３１．前記クラスＩＩＩのウイルス膜融合タンパク質は、ＶＳＶ−Ｇであることを特徴とする付記３０に記載の細胞。
【０１３２】
付記３２．前記第１二量体化領域は、微細小胞の内部にて、細胞基質に接触していることを特徴とする付記２１から付記３１までのいずれかに記載の細胞。
【０１３３】
付記３３．前記膜結合性タンパク質は、ミリストイル化タンパク質、ファルネシル化タンパク質、膜アンカータンパク質、膜透過型タンパク質、膜脂質結合タンパク質から構成されるグループから選択されることを特徴とする付記２１から付記３２までのいずれかに記載の細胞。
【０１３４】
付記３４．前記第１発現カセット及び第２発現カセットの内、少なくとも一つは誘導性プロモータを有することを特徴とする付記２１から付記３３までのいずれかに記載の細胞。
【０１３５】
付記３５．第１二量体化領域を含む膜結合性タンパク質と、第２二量体化領域を含む標的タンパク質とを有することを特徴とする微細小胞。
【０１３６】
付記３６．前記膜結合性タンパク質及び標的タンパク質は、二量体化複合体中に存在することを特徴とする付記３５に記載の微細小胞。
【０１３７】
付記３７．前記第１二量体化領域及び第２二量体化領域は、二量体化複合体中にて、互いに特異的に結合していることを特徴とする付記３６に記載の微細小胞。
【０１３８】
付記３８．前記第１二量体化領域及び第２二量体化領域は、二量体化メディエータにより互いに結合していることを特徴とする付記３６に記載の微細小胞。
【０１３９】
付記３９．前記二量体化メディエータは修飾可能な二量体化メディエータであることを特徴とする付記３８に記載の微細小胞。
【０１４０】
付記４０．更に、微細小胞誘導物質を有していることを特徴とする付記３５から付記３９までのいずれかに記載の微細小胞。
【０１４１】
付記４１．前記微細小胞誘導物質は、ウイルス膜融合タンパク質であることを特徴とする付記４０に記載の微細小胞。
【０１４２】
付記４２．前記ウイルス膜融合タンパク質は、ＶＳＶ−Ｇであることを特徴とする付記４１に記載の微細小胞。
【０１４３】
付記４３．前記膜結合性タンパク質は、ミリストイル化タンパク質、ファルネシル化タンパク質、膜アンカータンパク質、膜透過型タンパク質、膜脂質タンパク質から構成されるグループから選択されることを特徴とする付記３５から付記４２までのいずれかに記載の微細小胞。
【０１４４】
付記４４．前記第１二量体化領域及び第２二量体化領域は、ヘテロ二量体性であることを特徴とする付記３５から付記４３までのいずれかに記載の微細小胞。
【０１４５】
付記４５．前記第１二量体化領域及び第２二量体化領域は、ホモ二量体性であることを特徴とする付記３５から付記４４までのいずれかに記載の微細小胞。
【０１４６】
付記４６．前記第１二量体化領域及び第２二量体化領域は、ＤｍｒＡ領域及びＤｍｒＣ領域と、ＤｍｒＢ領域と、ＤｍｒＤ領域と、ジヒドロ葉酸還元酵素システムの二量体化領域と、ＴＡｇ及びｐ５３の二量体化領域と、ＳＨ２タンパク質及びＰＴＲＫタンパク質の二量体化領域とから選択されることを特徴とする付記３５から付記４５までのいずれかに記載の微細小胞。
【０１４７】
付記４７．更に、第３二量体化領域を含む第２標的タンパク質を有していることを特徴とする付記３５から付記４６までのいずれかに記載の微細小胞。
【０１４８】
付記４８．細胞への標的タンパク質の導入方法であって、
（ａ）第１二量体化領域を含む膜結合性タンパク質、及び
（ｂ）第２二量体化領域を含む標的タンパク質
を有する微細小胞を、前記微細小胞が前記細胞に融合し、前記細胞の内部へ前記標的タンパク質を導入するのに十分な状態で、
前記細胞に接触させることを特徴とする方法。
【０１４９】
付記４９．前記膜結合性タンパク質及び標的タンパク質は二量体化複合体中に存在することを特徴とする付記４８に記載の方法。
【０１５０】
付記５０．前記第１二量体化領域及び第２二量体化領域は、二量体化複合体中にて、互いに特異的に結合していることを特徴とする付記４９に記載の方法。
【０１５１】
付記５１．前記第１二量体化領域及び第２二量体化領域は、二量体化メディエータにより互いに結合していることを特徴とする付記４９に記載の方法。
【０１５２】
付記５２．前記二量体化メディエータは修飾可能な二量体化メディエータであることを特徴とする付記５１に記載の方法。
【０１５３】
付記５３．更に、前記標的タンパク質及び膜結合性タンパク質の複合体を解離させるために前記二量体化メディエータを修飾するように、前記微細小胞に刺激を適用することを特徴とする付記５２に記載の方法。
【０１５４】
付記５４．更に、前記膜結合性タンパク質から前記標的タンパク質を解離させるために、前記微細小胞を二量体化分裂剤に接触させることを特徴とする付記４８から付記５３までのいずれかに記載の方法。
【０１５５】
付記５５．更に、第３二量体化領域を含む第２標的タンパク質を有していることを特徴とする付記４８から付記５４までのいずれかに記載の方法。
【０１５６】
付記５６． 第１二量体化領域を含む膜結合性タンパク質に係るコード配列を有する第１発現カセットと、
プロモータ及び第２二量体化領域を有する第２発現カセットと
を有することを特徴とするキット。
【０１５７】
付記５７．前記第１発現カセット及び第２発現カセットは、異なるベクター上に存在していることを特徴とする付記５６に記載のキット。
【０１５８】
付記５８．前記第１発現カセット及び第２発現カセットは、同一のベクター上に存在していることを特徴とする付記５６に記載のキット。
【０１５９】
付記５９．前記第１発現カセット及び第２発現カセットは、細胞内に存在していることを特徴とする付記５６から付記５８までのいずれかに記載のキット。
【０１６０】
付記６０．更に、微細小胞誘導物質、又は微細小胞誘導物質に係るコード配列を含む発現カセットを有することを特徴とする付記５６から５９までのいずれかに記載のキット。
【０１６１】
付記６１．誘導性プロモータに係る誘導物質を有することを特徴とする付記５６から６０までのいずれかに記載のキット。
【０１６２】
付記６２．微細小胞精製要素、滴定要素及び制御要素の内、一又はそれ以上の要素を有することを特徴とする付記５６から付記６１までのいずれかに記載のキット。
【０１６３】
上記の発明は、理解の明瞭化のために、図示及び例示によりある程度詳しく説明されているが、ある変更及び調整が、本発明の趣旨又は添付の特許請求の範囲又は趣旨から逸脱することなく本発明になされてもよいことが、本発明の教示を考慮すると当業者に容易に明らかとなる。
【０１６４】
従って、前述の内容は本発明の本質を単に示しているに過ぎない。本明細書に明示的に説明されていないか又は示されていないが、本発明の本質を具体化して本発明の趣旨及び範囲に含まれる様々な構成を当業者が考案することが可能であることが明らかである。更に、本明細書に述べられている全ての例及び条件的な用語は、本発明の本質と、本技術分野を進展させるために本発明者により与えられた概念とを理解する際に読者を支援することを本質的に意図するものであり、このように具体的に述べられた例及び条件に限定するものではないと解釈されるべきである。更に、本発明の本質、態様及び実施形態だけでなく、本発明の具体的な例を述べている本明細書における全ての記載は、本発明の構造的且つ機能的な等価物の両方を含むことを意図するものである。加えて、このような均等物は、現時点で既知の均等物及び今後開発される均等物の両方、すなわち構造に関わらず同一の機能を有する開発された全ての要素を含むことを意図するものである。従って、本発明の範囲は、本明細書に示され説明された例示的な実施形態に制限されることを意図するものではない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は添付の特許請求の範囲により具体化される。
【０１６５】
関連出願の相互参照
本願は、２０１３年８月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／８７２，１１５号明細書と、２０１３年６月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／８３３，８８０号明細書との利益を主張しており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2019141093.tif 000005
【図２Ａ】
2019141093.tif 000006
【図２Ｂ】
2019141093.tif 000007
【図２Ｃ】
2019141093.tif 000008
【図２Ｄ】
2019141093.tif 000009
【図３】
2019141093.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月4日(2019.6.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１二量体化領域を含む膜結合性タンパク質と、第２二量体化領域を含む異種の標的タンパク質とを有する
ことを特徴とする微細小胞。
【請求項２】
前記膜結合性タンパク質及び標的タンパク質は、二量体化複合体中に存在する
ことを特徴とする請求項１に記載の微細小胞。
【請求項３】
前記第１二量体化領域及び第２二量体化領域は、前記二量体化複合体中にて、互いに特異的に結合している
ことを特徴とする請求項２に記載の微細小胞。
【請求項４】
前記第１二量体化領域及び第２二量体化領域は、二量体化メディエータにより互いに結合している
ことを特徴とする請求項２に記載の微細小胞。
【請求項５】
前記二量体化メディエータは修飾可能な二量体化メディエータである
ことを特徴とする請求項４に記載の微細小胞。
【請求項６】
更に、微細小胞誘導物質を有している
ことを特徴とする請求項１から請求項５までのいずれかに記載の微細小胞。
【請求項７】
前記膜結合性タンパク質は、ミリストイル化タンパク質、ファルネシル化タンパク質、膜アンカータンパク質、膜透過型タンパク質、及び膜脂質タンパク質から構成されるグループから選択される
ことを特徴とする請求項１から請求項６までのいずれかに記載の微細小胞。
【請求項８】
前記第１二量体化領域及び第２二量体化領域は、ＤｍｒＡ領域及びＤｍｒＣ領域と、ＤｍｒＢ領域と、ＤｍｒＤ領域と、ジヒドロ葉酸還元酵素システムの二量体化領域と、ＴＡｇ及びｐ５３の二量体化領域と、ＳＨ２タンパク質及びＰＴＲＫタンパク質の二量体化領域とから選択される
ことを特徴とする請求項１から請求項７までのいずれかに記載の微細小胞。
【請求項９】
細胞への標的タンパク質の導入方法であって、
請求項１から請求項８までのいずれかに記載の微細小胞を、前記微細小胞が前記細胞に融合し、前記細胞の内部へ前記標的タンパク質を導入するのに十分な状態で、前記細胞に接触させる
ことを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記細胞はインビボにある
ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第１二量体化領域を含む膜結合性タンパク質に係るコード配列を有する第１発現カセットと、
プロモータ及び第２二量体化領域を有する第２発現カセットと
を有する
ことを特徴とするキット。
【請求項１２】
前記第１発現カセット及び第２発現カセットは、異なるベクター上に存在している
ことを特徴とする請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記第１発現カセット及び第２発現カセットは、同一のベクター上に存在している
ことを特徴とする請求項１１に記載のキット。
【請求項１４】
前記第１発現カセット及び第２発現カセットは、細胞内に存在している
ことを特徴とする請求項１１から請求項１３までのいずれかに記載のキット。
【請求項１５】
更に、微細小胞誘導物質、または、微細小胞誘導物質に係るコード配列を含む発現カセットを有する
ことを特徴とする請求項１１から請求項１４までのいずれかに記載のキット。
【請求項１６】
更に、誘導性プロモータに係る誘導物質を有する
ことを特徴とする請求項１１から請求項１５までのいずれかに記載のキット。