(57)【要約】【目的】赤ニキビの発生を予測するための方法を提供する。【構成】皮膚上に常在するアクネ菌（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）のＲＮＡ量を指標とし、赤ニキビの発生を予測することが可能であることを見出した。ＲＮＡとしては、ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡや特定のタンパクのｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡでも良く、これらの総量でも良い。本方法は、検査対象の試料採取が非侵襲的、且つ容易であり、対象者の負担が少なく簡便に測定することができる。以上に加えて、赤ニキビの発生を予防する物質のスクリーニングに利用することができる。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚上に存在するアクネ菌のＲＮＡ量を指標とすることを特徴とする、赤ニキビの発生を予測する方法。
【請求項２】
アクネ菌の１６ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ量を指標とすることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
皮膚上に常在するアクネ菌を経時的に採取する工程と、採取したアクネ菌のＲＮＡ量を測定する工程と、対象としたＲＮＡの量の増加を確認する工程とを含むことを特徴とする、赤ニキビの発生を予測する方法。
【請求項４】
皮膚上に常在するアクネ菌を経時的に採取する工程と、採取したアクネ菌のＲＮＡ量を測定する工程と、対象としたＲＮＡの量がｎ時間前の相対量と比較して２（ｎ／２４）倍以上に増加したことを確認する工程とを含むことを特徴とする、赤ニキビの発生を予測する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤ニキビの発生を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニキビは脂腺性毛包に生じる炎症性の皮膚疾患であって、医学的には尋常性ざ瘡を指し、ざ瘡、アクネとも呼ばれる。ニキビの発生に関係する主要な因子としては、角化因子（毛包の閉塞）、内分泌因子（ホルモンの刺激による皮脂分泌）、細菌性因子（アクネ菌Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）が挙げられる。すなわち、異常角化により毛包漏斗部が閉塞すると、毛包に皮脂が貯留し、面皰（白ニキビ）が形成される。この中で、アクネ菌が増殖すると炎症が起き、赤色丘疹（赤ニキビ）となる。赤ニキビは、皮膚面から隆起する針頭大から米粒大ぐらいの限局性の炎症性発疹である。赤ニキビは、痛みを伴うこともあり、進行すると膿疱を形成し、皮膚組織を犯してのう腫となる。その後の組織修復過程で、瘢痕が形成されたり、色素沈着が残ることもある。
【０００３】
ニキビを予防又は改善するためには、ニキビの状態を把握するとともに、進行を予測し、進行に則した適切な処置をすることが理想的である。そのため、ニキビの進行を予測するための様々な検討がなされている。特許文献１には、皮膚試料中のＦＡＢＰ−５を測定し、正常な皮膚試料のＦＡＢＰ−５の測定値と対比し、発現の上昇をニキビの悪性化の指標とするニキビ肌の検査方法が記載されている。特許文献２には、ニキビ患者の血中の骨型ＡＬＰ（ＢＡＰ）濃度を測定することによりニキビの状態を評価する方法、さらに好中球の割合を測定して、その割合が高い場合にはニキビの素因をストレスであると特定し、ニキビ改善のためのアドバイスを行うことが提案されている。特許文献３には、血液中のＦｒｅＴ４、８−ＯＨｄＧ生成速度、鉄濃度、フェリチン量、ヘモグロビン量、ヘマトクリット量、コリンエステラーゼ活性、遊離脂肪酸量から選択される１〜２種類以上の測定値を指標として、ニキビのリスクを評価する方法が記載されている。しかし、これらは、ニキビ肌やニキビの状態、又はリスクの評価方法であり、ニキビの発生自体を的確に予測することは困難であった。また、アクネ菌の状態を指標としたニキビ発生の予測法はこれまでなかった。
【０００４】
ニキビの過程において、最も重要な症状の一つが炎症、すなわち赤ニキビの発生である。ニキビの発生メカニズムの面からは、赤ニキビは白ニキビの次となっているが、実際には白ニキビを経ず、急に赤ニキビが発生することも多い。反対に、白ニキビができても、赤ニキビにならないことも多くある。赤ニキビの発生を予測するためには、赤ニキビの発生原因の変化を捉える必要がある。
【０００５】
赤ニキビにおいて最も重要な因子はアクネ菌である。赤ニキビは、面皰の中でアクネ菌が増殖することによって発生する。しかし、ニキビの人と健常人で、皮膚表面に常在するアクネ菌の数に違いはなく（非特許文献１）、またニキビ発生の前に皮膚表面のアクネ菌数が増加するという報告もない。つまり、皮膚表面に常在するアクネ菌の数を指標として、ニキビの発生を予測することは困難であった。
【０００６】
【特許文献１】特開２０１６−９５１８５号公報
【特許文献２】特開２００７−１９９０２７号公報
【特許文献３】特開２０１０−２５６２１９号公報
【非特許文献１】Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２２８，ＰＰ．８６−９２（２０１３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
赤ニキビの発生を予測する方法の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題の解決に向け鋭意検討を行った結果、皮膚上に存在するアクネ菌のＲＮＡ量の変動を経時的に測定することにより、赤ニキビの発生を予測する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、経時的に皮膚表面から採取したものを試料とし、試料中のアクネ菌のＲＮＡ量を指標とし、そのＲＮＡ量の増加から赤ニキビ発生を予測する方法である。
【００１０】
本発明における赤ニキビとは、主として毛包漏斗部が閉塞した毛包の中でアクネ菌が増殖した炎症状態のことをいう。目視では、色は赤く、皮膚面から針頭大から米粒大ぐらいの大きさで隆起している。
【００１１】
皮膚表面からの試料の採取方法としては、綿棒による拭き取り法（スワブ法）、洗い出し法（スクラブ法）、テープストリップ法、及び皮膚組織切除法（バイオプシー法）が挙げられるが、非侵襲的である点で、拭き取り法、洗い出し法、又はテープストリップ法が望ましい。拭き取り法や洗い出し法における採取液としては、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０又はトリトンＸ−１００といった界面活性剤を添加した蒸留水、生理食塩液、リン酸緩衝液などを用いることができる。テープストリッピング法には、セロファンテープをはじめ、各種の市販されている粘着テープを用いることができる。
【００１２】
試料を採取する皮膚としては、ニキビが発生する顔面（額、頬、顎、鼻など）、頭皮、胸部、又は背部を対象部位とできる。
【００１３】
試料の採取は経時的に行う。試料の採取時間の間隔は、１〜２４時間が好ましく、１２〜２４時間がより好ましい。試料採取の間隔が１時間より短いと操作が煩雑且つ不経済であり、２４時間より長いと赤ニキビの的確な予測が困難である。測定は２回以上続けて行う必要があり、３回以上続けて行うことがより好ましく、５回以上続けて行うことが最も好ましい。
【００１４】
測定するアクネ菌のＲＮＡとしては、ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）や特定のタンパクのｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）でも良く、これらの総量でも良い。ｒＲＮＡはリボソームを構成しており、生体内で最も多く存在するＲＮＡである。ｍＲＮＡは蛋白質に翻訳され得る塩基配列情報と構造を持ったＲＮＡである。ｒＲＮＡとしては、５ｓ、１６ｓ及び２３ｓの各ｒＲＮＡを対象とできる。特定のｍＲＮＡの例としては、ヒアルロニダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、デヒドロゲナーゼ、エステラーゼ、セラミダーゼ、及びリゾチームが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
ｒＲＮＡ量やｍＲＮＡ量の測定は、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｒｙ  ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）への逆転写反応後、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）やリアルタイムＰＣＲによって行うことができる。ＲＮＡ総量の測定は、分光光度計によって行うことができる。
【００１６】
ＰＣＲを用いる場合、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分離、エチジウムブロマイド染色を行い、ある試料の発色量を基準とした発色量の比較によって、対象とするｒＲＮＡやｍＲＮＡの相対的な量を求めることができる。
【００１７】
リアルタイムＰＣＲを用いる場合、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ（Ｃｔ値）によって、対象とするｒＲＮＡやｍＲＮＡの相対的な量を求めることができる。
【００１８】
分光光度計を用いる場合、波長２６０ｎｍで測定を行い、ＲＮＡ総量を算出することができる。
【００１９】
対象としたＲＮＡの量が、一定の倍数以上に増加した時点、より詳しくはｎ時間前の量と比較して２（ｎ／２４）倍以上に増加した時点で、２４時間以内に起きる赤ニキビの発生が予測できる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の方法によれば、赤ニキビ発生の予測が可能である。さらに、検査対象の試料採取が非侵襲的、且つ容易であり、対象者の負担が少なく簡便に測定することができる。以上に加えて、赤ニキビの発生を予防する物質のスクリーニングを行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、被験者Ａにおける赤ニキビの発生、アクネ菌のＲＮＡ、ＤＮＡ及び生菌数の解析結果を示す。
【００２２】
【図２】図２は、被験者Ｂにおける赤ニキビの発生、アクネ菌のＲＮＡ、ＤＮＡ及び生菌数の解析結果を示す。
【００２３】
【図３】図３は、被験者Ｃにおける赤ニキビの発生、アクネ菌のＲＮＡ、ＤＮＡ及び生菌数の解析結果を示す。
【００２４】
【図４】図４は、被験者Ｄにおける赤ニキビの発生、アクネ菌のＲＮＡ、ＤＮＡ及び生菌数の解析結果を示す。
【００２５】
【図５】図５は、被験者Ｅにおける赤ニキビの発生、アクネ菌のＲＮＡ、ＤＮＡ及び生菌数の解析結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
次に本発明を詳細に説明するため、実施例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
実施例  ヒトの皮膚表面に常在するアクネ菌の１６ｓ  ｒＲＮＡ量と赤ニキビの関係
ニキビができやすい５名（被験者Ａ：３０歳男性、被験者Ｂ：２９歳男性、被験者Ｃ：３１歳男性、被験者Ｄ：２８歳男性、被験者Ｅ：４５歳女性）を被験者とし、額を被験部位とした。赤ニキビの発生は、２４時間おきに目視にて観察した。また、同時に２％ポリソルベート８０水溶液を含ませた綿棒を用いて、額の５ｃｍ２の範囲を拭き取り、試料とした。
ＲＮＡ量は文献（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７５，１９６１−１９６９，２００９）を参考にして測定した。すなわち、試料（綿棒の拭き取り部）をエッペンドルフチューブに入れ、ＲＮＡ ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を添加、撹拌し、２２．５℃で５分間処理した。液体部分を採取し、メンブランフィルター（０．４５μｍ）を用いてろ過した後、メンブランフィルターを凍結保存した。自然解凍後、溶菌バッファー（Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ（Ｑｉａｇｅｎ）３４６．５μＬ、メルカプトエタノール３．５μＬ、ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］）１００μＬ）とガラスビーズ（０．１ｍｍ）３００ｍｇを添加、撹拌した後、フィルターを取り除いた。水飽和フェノール５００μＬを添加し、６０℃１０分間反応させた。クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）抽出後、イソプロピルアルコール処理を行い、沈渣をＮｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水で溶解した。試料中に混在するＤＮＡはＤＮａｓｅ処理にて除去した。すなわち、２０ＵのＤＮａｓｅ（タカラ）を添加し、３７℃にて２０分間反応させた。水飽和フェノール及びクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）による抽出を行った後、イソプロピルアルコール処理を行い、沈渣をＮｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  水で溶解した。その後、採取したＲＮＡをｃＤＮＡに転写し、リアルタイムＰＣＲにて１６ｓ  ｒＲＮＡ相対量（Ｃｔ値）を測定した。なお、ＲＮＡ量の測定に使用したプライマーは、次の通りである。
【００２８】
アクネ菌の１６ｓ  ｒＲＮＡ用のプライマーセット
ＧＣＧＴＧＡＧＴＧＡＣＧＧＴＡＡＴＧＧＧＴＡ（配列番号１）
ＴＴＣＣＧＡＣＧＣＧＡＴＣＡＡＣＣＡ（配列番号２）
【００２９】
ＤＮＡ量は文献（Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ４３，９０６−９１１，２０１６）を参考にして測定した。すなわち、試料をチューブに入れ、１．５倍量のＬｙｓｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）を２００μＬ添加、撹拌した。１００℃１５分間の反応後、液体部分を採取し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）抽出、イソプロピルアルコール処理後、沈渣をＴＥ  ｂｕｆｆｅｒに溶解した。その後、ＲＮＡ測定と同様の方法で、１６ｓ  ｒＲＮＡ相対量（Ｃｔ値）を測定した。
生菌数は、培養法によって測定した。試料をリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に分散し、段階希釈後、変法ＧＡＭ寒天培地（日水製薬）に塗抹した。３５℃で７日間嫌気培養し、発現したコロニーのうち、グラム陽性桿菌をアクネ菌と判断し、コロニー数を計測した。
【００３０】
被験者Ａにおける赤ニキビの発生、アクネ菌のＲＮＡ、ＤＮＡ及び生菌数の解析結果を図１に示す。
【００３１】
赤ニキビが発生する２４時間前に、アクネ菌のＲＮＡ量が２倍以上に増加した。アクネ菌のＤＮＡ及び生菌数は、２倍以上の増加を示さなかった。
【００３２】
被験者Ｂにおける赤ニキビの発生、アクネ菌のＲＮＡ、ＤＮＡ及び生菌数の解析結果を図２に示す。
【００３３】
赤ニキビが発生する２４時間前に、アクネ菌のＲＮＡ量が２倍以上に増加した。アクネ菌のＤＮＡ及び生菌数は、２倍以上の増加を示さなかった。
【００３４】
被験者Ｃにおける赤ニキビの発生、アクネ菌のＲＮＡ、ＤＮＡ及び生菌数の解析結果を図３に示す。
【００３５】
赤ニキビが発生する２４時間前に、アクネ菌のＲＮＡ量が２倍以上に増加した。アクネ菌のＤＮＡ及び生菌数は、２倍以上の増加を示さなかった。
【００３６】
被験者Ｄにおける赤ニキビの発生、アクネ菌のＲＮＡ、ＤＮＡ及び生菌数の解析結果を図４に示す。
【００３７】
赤ニキビが発生する２４時間前に、アクネ菌のＲＮＡ量が２倍以上に増加した。アクネ菌のＤＮＡ及び生菌数は、２倍以上の増加を示さなかった。
【００３８】
被験者Ｅにおける赤ニキビの発生、アクネ菌のＲＮＡ、ＤＮＡ及び生菌数の解析結果を図５に示す。
【００３９】
赤ニキビが発生する２４時間前に、アクネ菌のＲＮＡ量が２倍以上に増加した。アクネ菌のＤＮＡ及び生菌数は、２倍以上の増加を示さなかった。
【００４０】
以上の結果から、アクネ菌のＲＮＡ量を測定することで、赤ニキビの発生を予測できることが判明した。また、本発明の方法は、赤ニキビの発生を予防する物質のスクリーニングに利用可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明の皮膚上に常在するアクネ菌のＲＮＡ量を指標とした方法によって、赤ニキビの発生を予測することが可能である。さらにまた、検査対象の試料採取が非侵襲的、且つ容易であり、対象者の負担が少なく簡便に測定することができる。以上に加えて、赤ニキビの発生を予防する物質のスクリーニングを行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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