(57)【要約】【課題】乳酸菌の機能性を高めて有効に利用するための新たな手段を提供する。【解決手段】ビフィドバクテリウム属乳酸菌と、ラクトバチルス属乳酸菌と、ラクトコッカス属乳酸菌と、ストレプトコッカス属乳酸菌とを含有し、前記乳酸菌はいずれも加熱殺菌体である、乳酸菌含有組成物である。また、ビフィドバクテリウム属乳酸菌と、ラクトバチルス属乳酸菌と、ラクトコッカス属乳酸菌と、ストレプトコッカス属乳酸菌とを含有し、前記乳酸菌はいずれも加熱殺菌体である、免疫賦活用組成物である。これらの組成物は、更にエンテロコッカス属乳酸菌の加熱殺菌体を含有していてもよい。また、前記乳酸菌として２０種以上の種の乳酸菌が含まれていてもよい。また、前記乳酸菌として腸内細菌に由来する乳酸菌が含まれていてもよい。更に、この組成物は、飲食品、医薬品、動物用飼料等の形態であってもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィドバクテリウム属乳酸菌と、ラクトバチルス属乳酸菌と、ラクトコッカス属乳酸菌と、ストレプトコッカス属乳酸菌とを含有し、前記乳酸菌はいずれも加熱殺菌体である、乳酸菌含有組成物。
【請求項２】
更にエンテロコッカス属乳酸菌の加熱殺菌体を含有する請求項１記載の乳酸菌含有組成物。
【請求項３】
前記乳酸菌として２０種以上の種の乳酸菌が含まれる請求項１又は２記載の乳酸菌含有組成物。
【請求項４】
前記乳酸菌として腸内細菌に由来する乳酸菌が含まれる請求項１〜３のいずれか１項に記載の乳酸菌含有組成物。
【請求項５】
飲食品、医薬品、又は動物用飼料の形態である請求項１〜４のいずれか１項に記載の乳酸菌含有組成物。
【請求項６】
ビフィドバクテリウム属乳酸菌と、ラクトバチルス属乳酸菌と、ラクトコッカス属乳酸菌と、ストレプトコッカス属乳酸菌とを含有し、前記乳酸菌はいずれも加熱殺菌体である、免疫賦活用組成物。
【請求項７】
更にエンテロコッカス属乳酸菌の加熱殺菌体を含有する請求項６記載の免疫賦活用組成物。
【請求項８】
前記乳酸菌として２０種以上の種の乳酸菌が含まれる請求項６又は７記載の免疫賦活用組成物。
【請求項９】
前記乳酸菌として腸内細菌に由来する乳酸菌が含まれる請求項６〜８のいずれか１項に記載の免疫賦活用組成物。
【請求項１０】
飲食品、医薬品、又は動物用飼料の形態である請求項６〜９のいずれか１項に記載の免疫賦活用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、健康増進の目的、特に免疫賦活の作用効果を得るのに有用な、乳酸菌含有組成物及び免疫賦活用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌には整腸作用、抗アレルギー作用、免疫賦活作用等があることが知られている。近年の研究から、経口摂取された乳酸菌（例えば加熱殺菌体）は、小腸下部のパイエル板を介して、基底膜側に接触している樹状細胞に取り込まれて分解され、その抗原断片が免疫担当細胞に提示されることによって体内の免疫系が活性化されることなどが、乳酸菌による機能性奏効の作用メカニズムの１つに挙げられている（非特許文献１）。
【０００３】
一方、一般にパイエル板を介する体内への取り込み効率は、粒径が１０ミクロン超ではあまりおこらずに、数ミクロンオーダーの粒径のものが有効であることが知られている（非特許文献２）。また、乳酸菌加熱殺菌体を微粒子化したうえデキストリン等の賦形剤を添加することにより、乳酸菌加熱殺菌体どうしが凝集してしまうのを防ぎ、数ミクロンオーダーの粒度が保たれて、培養マクロファージに対するＩＬ−１２産生誘導能がより有効に発現されることも示されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ryo INOUE, et al. Rapid Induction of an Immune Response in Rat Peyer's Patch after Oral Administration of Enterococcus faecalis Strain EC-12. Biosci.Biotechnol.Biochem.2013; 77(4):863-866.
【非特許文献２】Yasuhiko Tabata, et al. Size effect on systemic and mucosal immune responses induced by oral administration of biodegradable microspheres. accine 1996:14(17-18): 1677-1685.
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４６２１２１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記従来技術によれば、一般に乳酸菌の機能性を高めて有効に利用する手段としては、乳酸菌の加熱殺菌体を微粒子化したうえその分散状態を保つ方法が有用であるが、一方で調製に手間がかかるという側面もあった。
【０００７】
よって、本発明の目的は、乳酸菌の機能性を高めて有効に利用するための新たな手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、特定の種類の乳酸菌を複数併用すると、優れた免疫賦活の作用効果が奏されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の構成を有する乳酸菌含有組成物及び免疫賦活用組成物を提供するものである。
【００１０】
［１］ビフィドバクテリウム属乳酸菌と、ラクトバチルス属乳酸菌と、ラクトコッカス属乳酸菌と、ストレプトコッカス属乳酸菌とを含有し、前記乳酸菌はいずれも加熱殺菌体である、乳酸菌含有組成物。
［２］更にエンテロコッカス属乳酸菌の加熱殺菌体を含有する前記［１］記載の乳酸菌含有組成物。
［３］前記乳酸菌として２０種以上の種の乳酸菌が含まれる前記［１］又は［２］記載の乳酸菌含有組成物。
［４］前記乳酸菌として腸内細菌に由来する乳酸菌が含まれる前記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の乳酸菌含有組成物。
［５］飲食品、医薬品、又は動物用飼料の形態である前記［１］〜［４］のいずれか１項に記載の乳酸菌含有組成物。
［６］ビフィドバクテリウム属乳酸菌と、ラクトバチルス属乳酸菌と、ラクトコッカス属乳酸菌と、ストレプトコッカス属乳酸菌とを含有し、前記乳酸菌はいずれも加熱殺菌体である、免疫賦活用組成物。
［７］更にエンテロコッカス属乳酸菌の加熱殺菌体を含有する前記［６］記載の免疫賦活用組成物。
［８］前記乳酸菌として２０種以上の種の乳酸菌が含まれる前記［６］又は［７］記載の免疫賦活用組成物。
［９］前記乳酸菌として腸内細菌に由来する乳酸菌が含まれる前記［６］〜［８］のいずれか１項に記載の免疫賦活用組成物。
［１０］飲食品、医薬品、又は動物用飼料の形態である前記［６］〜［９］のいずれか１項に記載の免疫賦活用組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、特定の種類の乳酸菌を複数併用するので、優れた免疫賦活の作用効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】試験例１において２２種類の乳酸菌を含有する組成物によるＩＬ−１２産生誘導能を調べた結果を示す図表である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に用いられ得るビフィドバクテリウム属乳酸菌としては、ビフィドバクテリウム属に属する乳酸菌であればよく、特に制限はないが、例えば、ビフィドバクテリウム ラクティス（Bifidobacterium animalis subsp.lactis）、ビフィドバクテリウム ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム インファンティス（Bifidobacterium infantis）、ビフィドバクテリウム ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）等である。
【００１４】
本発明に用いられ得るラクトバチルス属乳酸菌としては、ラクトバチルス属に属する乳酸菌であればよく、特に制限はないが、例えば、ラクトバチルス アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバチルス カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス デルブリッキー ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス デルブリッキー ラクティス（Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis）、ラクトバチルス ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス ジョンソニー（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス  ブレヴィス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens subsp.kefiranofaciens）、ラクトバチルス ケフィリ(Lactobacillus kefiri)等である。
【００１５】
本発明に用いられ得るラクトコッカス属乳酸菌としては、ラクトコッカス クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、ラクトコッカス ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）、ラクトコッカス プランタラム（Lactococcus plantarum）、ラクトコッカス・ラフィノラクティス（Lactococcus raffinolactis）等である。
【００１６】
本発明に用いられ得るストレプトコッカス属乳酸菌としては、ストレプトコッカス属に属する乳酸菌であればよく、特に制限はないが、例えば、ストレプトコッカス サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）等である。
【００１７】
本発明に用いられ得るエンテロコッカス属乳酸菌としては、エンテロコッカス属に属する乳酸菌であればよく、特に制限はないが、例えば、エンテロコッカス フェシウム（Enterococcus facium）、エンテロコッカス フェカリス（Enterococcus faecalis）等である。
【００１８】
上記乳酸菌は、市販のものを利用したり、あるいは公的機関もしくは民間機関からの分譲を受けたりして、適宜入手することが可能である。また、必要に応じて、その乳酸菌に適した培養培地で培養して、菌数を増やすことにより、必要量を確保することができる。
【００１９】
好ましい培養方法としては、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス等を含む栄養分豊富な培地を含有する培養液中で、２０〜４０℃で通気撹拌培養あるいは嫌気培養する等が挙げられる。
【００２０】
本発明においては、上記乳酸菌を加熱殺菌した加熱殺菌体（死菌体）を用いる。これによれば、生体内に投与しても、安全である。また、より好ましくは粉末状の加熱殺菌体である。これによれば、菌体の保存や保管の際にも常温で管理しやすく、乳酸菌の複数種類を混合する際や必要に応じて他の素材との混合する際の作業性にも問題が少ない。加熱殺菌体を得る方法は、特に限定されないが、例えば、オートクレーブ処理する方法や、スプレードライする際に加熱殺菌する方法や、乳酸菌含有液をプレートヒーターに通して加熱殺菌する方法などが挙げられる。
【００２１】
本発明においては、上記乳酸菌のうち、特定の種類の乳酸菌を複数併用する。より具体的には、上記乳酸菌のうち、ビフィドバクテリウム属乳酸菌、ラクトバチルス属乳酸菌、ラクトコッカス属乳酸菌、及びストレプトコッカス属乳酸菌の４種の属に属する乳酸菌を少なくとも含有する乳酸菌含有組成物である。この組成物は、更にエンテロコッカス属乳酸菌の加熱殺菌体を含有していてもよい。また、上記乳酸菌として２０種以上の種の乳酸菌が含まれていてもよい。また、上記乳酸菌としてビフィドバクテリウム ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）やラクトバチルス ガセリ（Lactobacillus gasseri）などの腸内細菌に由来する乳酸菌が含まれていてもよい。
【００２２】
上記乳酸菌含有組成物中に含まれる乳酸菌の菌数としては、上記乳酸菌の１種類あたり２億個／ｇ以上などである。また、上記乳酸菌含有組成物中に含まれる総菌数として、１００億個／ｇ以上であることが好ましく、１０００億個／ｇ以上であることがより好ましい。
【００２３】
上記乳酸菌含有組成物には、上記乳酸菌の加熱殺菌体以外にも他の原料を含有せしめることができる。また、他の原料の含有量に特に制限はない。例えば、デキストリン、可溶性食物繊維、難消化性デキストリン等の多糖類、乳糖、トレハロース、麦芽糖等の低分子糖類、コラーゲン、ホエー分解物、大豆蛋白分解物等のタンパク質・ペプチド類などを好ましく例示することができる。これらは、上記乳酸菌の加熱殺菌体を分散させる分散剤としても機能する。また、黒糖、砂糖、果糖、オリゴ糖などの甘味料、クエン酸、酢酸等の酸味料、蛋白質加水分解物（呈味性）、呈味性核酸化合物などのフレーバー、食塩、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥなどのビタミン、乳蛋白質、粉乳などの乳由来成分、大豆蛋白質、豆乳などの大豆由来成分等を適宜含有せしめることに特に制限はない。
【００２４】
上記乳酸菌含有組成物の剤形的な形態としては、特に制限はなく、必要に応じて公知の基材や担体、溶媒等を含有して、固体状、液体状、乳化物状、ゼリー物状、ペースト物状等の任意の形態であってよい。また、必要に応じて公知の基材や担体、溶媒等を用いて、粉末剤、顆粒剤、錠剤、散剤、液剤、ハードカプセル剤、ソフトカプセル剤等の任意の形態に調製してよい。更に、それ以外の形態であってもよい。なお、上記乳酸菌の加熱殺菌体として粉末状に調製されたものを用いるときには、同様に粉末状に調製された他の種類の乳酸菌の加熱殺菌体と混合することにより、上記乳酸菌含有組成物としても粉末状に調製されることが好ましい。これによれば、複数種類の乳酸菌の加熱殺菌体の混合による調製工程が容易である。また、上記乳酸菌の加熱殺菌体が懸濁した懸濁液状のものを用いるときには、他の種類の乳酸菌の加熱殺菌体と混合し、混合後に適宜適当な乾燥手段により乾燥し、それを解砕等して粉末状に調製してもよい。この場合、その乾燥粉末化には、上述したようにして乳酸菌の加熱殺菌体を個別に粉末化する手段と同様に、凍結乾燥、スプレードライ、真空乾燥等の公知の手段を用いることができる。
【００２５】
上記乳酸菌含有組成物の利用形態に特に制限はない。例えば、健康食品やサプリメント、場合によっては認可を受けた医薬品などとして、水などとともに摂取するようにしてもよく、カレー、スープ、ドレッシング、パン、菓子などの食事の際に、それに混ぜたり振りかけたりして摂取するようにしてもよい。また、ヒトだけでなく動物にも利用してもよく、例えば、ペット動物用のサプリメント等の動物用飼料などとしても利用することが可能である。あるいは、そのような飲食品、医薬品、動物用飼料に含有せめることを企図した添加素材製品として利用することもできる。
【００２６】
一方、本発明のもう１つの観点は、免疫賦活用組成物の提供にある。すなわち、本発明により提供される上記乳酸菌含有組成物によれば、後述する実施例に示されるように、脾臓細胞培養系においてＩＬ−１２産生誘導能に優れている。よって、これを摂取することにより、生体に備わる自然免疫系が強化され、ひいては病態に陥ることが未然に防がれ、あるいは病態に陥るリスクが軽減される。
【００２７】
免疫賦活のための摂取形態としては、特に制限されるものではなく、上述したような飲食品、医薬品、動物用飼料等の形態であってよいが、日常的に継続して摂取するには、１日の生活リズムのなかで食事などとともにできるだけ習慣的に摂取するようにすることが好ましい。摂取量は、年齢や体調にも応じて適宜設定すればよく、特に制限はないが、典型的には、摂取される総乳酸菌数に換算して、成人１日当りおよそ１０億個以上であり、より好ましくはおよそ１００億個以上である。なお、上記乳酸菌としては加熱殺菌体を用いるので、成人１日当りの摂取量が１０００億個を超えても問題はない。
【実施例】
【００２８】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００２９】
＜調製例１＞  
表１に示す２２種類の乳酸菌を、それぞれ別個に培養して、得られた菌体を混合して凍結乾燥した。その後、加熱殺菌して、表２に示す他の原料とともにスプレードライに供し、粉末状の乳酸菌含有組成物を得た。
【００３０】
なお、ビフィドバクテリウム属乳酸菌は、ペプトン、乳糖等を含有する培養液中で、嫌気培養した。
【００３１】
また、ラクトバチルス属乳酸菌は、ペプトン、乳糖等を含有する培養液中で、通気撹拌培養した。
【００３２】
また、ラクトコッカス属乳酸菌は、ペプトン、乳糖等を含有する培養液中で、通気撹拌培養した。
【００３３】
また、ストレプトコッカス属乳酸菌は、ペプトン、ブドウ糖等を含有する培養液中で、通気撹拌培養した。
【００３４】
また、エンテロコッカス属乳酸菌は、ペプトン、ブドウ糖等を含有する培養液中で、通気撹拌培養した。
【００３５】
【表１】
2019208486.tif 000002
【００３６】
【表２】
2019208486.tif 000003
【００３７】
［試験例１］（ＩＬ−１２産生誘導能の測定）
調製例１で得られた乳酸菌含有組成物について、常法に従い、マウス脾臓細胞の試験管内培養系を用いてＩＬ−１２産生誘導能を調べた。具体的には、ＩＬ−１２産生誘導能を以下のようにして測定した。
【００３８】
〔ＩＬ−１２産生誘導能の測定〕
８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌）を２週間予備飼育後、脾臓を取り出し、その細胞浮遊液を調製した。具体的には、脾臓を擦りガラス付きスライドグラスでつぶし細胞をバラバラにし、これに溶血バッファー（ｐＨ７．２、０．１４４Ｍ 塩化アンモニウム、１７ｍＭ トリス塩酸緩衝液）を加えて赤血球をパンクさせたのち、８００×ｇで１０分間遠心し、沈査に２０％非働化ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを含む）を加えて、細胞浮遊液を調製した。
【００３９】
上記細胞浮遊液を９６穴マイクロプレートの各ウェルに５×１０６Ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で１００μＬ播き、一方、上記乳酸菌含有組成物は、添加した組成物分換算の濃度が２０ｍｇ／ｍＬ又は２００ｍｇ／ｍＬになるようにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に懸濁し、その１００μＬを各ウェルの細胞浮遊液に加えて、細胞浮遊液中の上記乳酸菌含有組成物分換算の濃度が１０ｍｇ／ｍＬ又は１００ｍｇ／ｍＬとなるようにした。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で７２時間培養後、培養液を細胞ごと採集して、７０００×ｇで１０分間（４℃）遠心し、遠心後の上清をＩＬ−１２測定に供した。対照としては、上記乳酸菌含有組成物を添加せず、緩衝液のみを細胞浮遊液に加えて、同様にしてＩＬ−１２測定に供した。ＩＬ−１２測定には、ＥＬＩＳＡ法に基づく測定キット（商品名「Quantikine R ELISA Mouse IL-12 p70 Immunoassay」、R&D Systems, Inc.社）を使用した。各試験群それぞれ３例のデータから、その平均を求めた。
【００４０】
その結果、図１に示すように、２２種類の乳酸菌を含有する組成物の添加により、脾臓細胞からのＩＬ−１２の産生量が顕著に増加した。
【図１】
2019208486.tif 000004