(57)【要約】      （修正有）【課題】低侵襲で実施可能な抗酸化能評価方法及びトレーニングメニューの最適化方法の提供。【解決手段】末梢血の単球を用いて抗酸化酵素遺伝子の発現状況を評価することで、抗酸化能の評価あるいはトレーニングメニューの最適化を行う。具体的には、採取した血液から分離した血球分離溶液から単球を含む単核細胞を分離するステップと、単球を含む単核細胞からｍＲＮＡを含んだｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出するステップと、抽出して精製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを逆転写反応させて相補的ＤＮＡを合成するステップと、相補的ＤＮＡを鋳型として抗酸化酵素遺伝子に特異的な配列のプライマーを用いて定量的リアルタイムＰＣＲを行うステップで抗酸化能の評価を行う。得られた抗酸化酵素遺伝子の発現量に基づき、トレーニングメニューの適性を判断する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の発現量を評価することで行う抗酸化能評価方法において、
採取した血液から分離した血球分離溶液から単球を含む単核細胞の分離するステップと、
この単球を含む単核細胞からmRNAを含んだtotal RNAの抽出するステップと、
抽出して精製したtotal RNAを逆転写反応させて相補的DNAを合成するステップと、
この相補的DNAを鋳型として前記標的遺伝子に特異的な配列のプライマーを用いて定量的リアルタイムPCRを行うステップと
を有する抗酸化能評価方法。
【請求項２】
前記標的遺伝子が、Catalase、SOD1、SOD2、GPX1、SIRT3の少なくともいずれか一つである請求項１に記載の抗酸化能評価方法。
【請求項３】
酸化ストレス耐性の向上を目的として行うトレーニングのメニューを最適化する方法において、
トレーニング後に採取した血液中の単球から得られた抗酸化酵素遺伝子の発現量に基づいてメニューの適正を判定するトレーニングメニューの最適化方法。
【請求項４】
前記抗酸化酵素遺伝子が、Catalase、SOD1、SOD2、GPX1、SIRT3の少なくともいずれか一つである請求項３に記載のトレーニングメニューの最適化方法。
【請求項５】
前記抗酸化酵素遺伝子の発現量は、
採取した血液から分離した血球分離溶液から単球を含む単核細胞の分離するステップと、
この単球を含む単核細胞からmRNAを含んだtotal RNAの抽出するステップと、
抽出して精製したtotal RNAを逆転写反応させて相補的DNAを合成するステップと、
この相補的DNAを鋳型として前記抗酸化酵素遺伝子に特異的な配列のプライマーを用いて定量的リアルタイムPCRを行うステップと
により評価する請求項３または請求項４に記載のトレーニングメニューの最適化方法。
【請求項６】
前記抗酸化酵素遺伝子の代わりに、ミトコンドリア機能に関する遺伝子であるシステインtRNA合成酵素の遺伝子または、硫化水素キノンレダクターゼの遺伝子を用いる請求項３に記載のトレーニングメニューの最適化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化能評価方法及びトレーニングメニューの最適化方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、日常における適度な運動が、健康に必要であることが指摘されており、例えばウォーキングの推奨など、様々な提案がなされている。
【０００３】
特に、運動することによって体内の活性酸素が増加することが知られているが、この活性酸素に対する酸化ストレス耐性も向上することで健康に良い影響が与えられており、ビタミンなどの抗酸化サプリメントの摂取では、効果的な酸化ストレス耐性の向上が見られないことも確認されている（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００４】
このように、運動することで向上する酸化ストレス耐性は、向上すること自体は知られていたが、どのような運動、あるいはどの程度の負荷量の運動が効果的であるかは知られておらず、特に、基礎体力や元々備えている酸化ストレス耐性による個人差の影響が存在することも考えられている。
【０００５】
酸化ストレス耐性の評価は、過酸化水素を分解する酵素であるCatalase、活性酸素から電子を取り除いて酸素と水素分子にする酵素であるSOD1やSOD2、過酸化水素や過酸化脂質などのペルオキシド構造を優先的に除去する酵素であるGPX1、カロリー制限下での酸化ストレス性の細胞死の抑制に寄与する酵素であるSIRT3のように、抗酸化機能を有している酵素の遺伝子の活性化状態を検査することで行っている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Michael Ristow, NATURE MEDICINE, VOLUME 20, NUMBER 7, JULY 2014, 709-711
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
抗酸化機能を有している酵素の遺伝子の活性化状態を検査するためには、筋肉の生検から得られたmRNAを用いる必要があり、侵襲の比較的大きい検査であって、簡便に行える検査ではなかった。
【０００８】
本発明者らは、抗酸化機能を有している酵素の遺伝子の活性化状態を、末梢血の単球を用いて検査することができることを見出し、本発明を成すに至ったものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の抗酸化能評価方法は、標的遺伝子の発現量を評価することで行う抗酸化能評価方法であって、以下の１）〜４）のステップを有するものである。
１）採取した血液から分離した血球分離溶液から単球を含む単核細胞の分離するステップ。
２）単球を含む単核細胞からmRNAを含んだtotal RNAの抽出するステップ。
３）抽出して精製したtotal RNAを逆転写反応させて相補的DNAを合成するステップ。
４）相補的DNAを鋳型として標的遺伝子に特異的な配列のプライマーを用いて定量的リアルタイムPCRを行うステップ。
【００１０】
さらに、本発明の抗酸化能評価方法では、標的遺伝子が、Catalase、SOD1、SOD2、GPX1、SIRT3の少なくともいずれか一つであることにも特徴を有するものである。
【００１１】
また、本発明のトレーニングメニューの最適化方法は、酸化ストレス耐性の向上を目的として行うトレーニングのメニューを最適化する方法であって、トレーニング後に採取した血液中の単球から得られた抗酸化酵素遺伝子の発現量に基づいてメニューの適正を判定するものである。
【００１２】
さらに、本発明のトレーニングメニューの最適化方法では、抗酸化酵素遺伝子が、Catalase、SOD1、SOD2、GPX1、SIRT3の少なくともいずれか一つであることにも特徴を有し、さらには、以下の１）〜４）のステップで抗酸化酵素遺伝子の発現量を評価することにも特徴を有するものである。
１）採取した血液から分離した血球分離溶液から単球を含む単核細胞の分離するステップ。
２）単球を含む単核細胞からmRNAを含んだtotal RNAの抽出するステップ。
３）抽出して精製したtotal RNAを逆転写反応させて相補的DNAを合成するステップ。
４）相補的DNAを鋳型として抗酸化酵素遺伝子に特異的な配列のプライマーを用いて定量的リアルタイムPCRを行うステップ。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、末梢血の単球を用いて抗酸化酵素遺伝子の発現を評価できるので、低侵襲の評価とすることができ、簡便に抗酸化能評価を行ったり、トレーニングメニューを最適化したりすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】運動前後での抗酸化酵素遺伝子の発現量の計測結果のグラフである。
【図２】運動前後でのミトコンドリア機能に関する遺伝子の発現量の計測結果のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の抗酸化能評価方法及びトレーニングメニューの最適化方法では、末梢血の単球を用いて抗酸化酵素遺伝子の発現状況を評価することで、抗酸化能の評価あるいはトレーニングメニューの最適化を行うものである。
【００１６】
抗酸化酵素遺伝子としては、Catalase、SOD1、SOD2、GPX1、SIRT3が知られており、これらのうちの少なくともいずれか一つを用いて評価あるいは最適化することができる。
【００１７】
具体的には、以下のように行っている。まず、第１ステップとして被験者から血液を採取して、採取した血液から血球分離溶液を分離し、分離した血球分離溶液から単球を含む単核細胞を分離している。
【００１８】
次いで、第２ステップとして、単球を含む単核細胞からmRNAを含んだtotal RNAの抽出している。すなわち、従来であれば、生検した筋肉組織からmRNAを採取していたが、末梢血の単球を含む単核細胞からmRNAを採取することで、被験者への負担を大きく軽減することができる。
【００１９】
次いで、第３ステップとして、抽出したtotal RNAを精製し、精製したtotal RNAを逆転写反応させて相補的DNAを合成している。
【００２０】
次いで、第４ステップとして、相補的DNAを鋳型として抗酸化酵素遺伝子に特異的な配列のプライマーを用いて定量的リアルタイムPCRを行って、抗酸化酵素遺伝子の発現量を評価している。
【００２１】
このようにして抗酸化酵素遺伝子の発現量を評価することで、被験者の抗酸化能を評価することが可能となり、あるいは抗酸化酵素遺伝子の発現量が向上するトレーニングメニューの作成を可能として、トレーニングメニューを最適化することができる。
【実施例１】
【００２２】
被験者４１名に対して、運動の開始前後に採血し、酸化酵素遺伝子であるSOD1、SOD2、Catalase、GPX1、SIRT3の発現量に比較を行った。
【００２３】
ここで、運動は、自転車エルゴメーターを用いた運動であって、下式の目標心拍数を維持する負荷の運動とした。
目標心拍数＝［（220−年齢）−安静時心拍数］・・・・＋安静時心拍数
【００２４】
なお、運動負荷を比較的小さく設定したため、上記運動を一日１時間で、週５日間行い、４週間行った後に、運動後の採血を行った。
【００２５】
運動の開始前の発現量を基準として、運動後の発現量を評価した結果を図１に示す。図１に示すように、いずれの酸化酵素遺伝子においても、運動後に発現量の有意な増加を確認できた。
【００２６】
このように、血液を用いて抗酸化酵素遺伝子の発現量を評価でき、この抗酸化酵素遺伝子の発現量を利用して、最適なトレーニングメニューの作成を可能とすることができる。
【００２７】
トレーニングメニューの最適化は、トレーニング後の血液中の単球から得られた抗酸化酵素遺伝子の発現量が、トレーニングの開始前に計測した抗酸化酵素遺伝子の発現量である平常時発現量の1.1〜1.5倍程度となるトレーニング内容が望ましく、好適には平常時発現量の1.2〜1.4倍程度となるトレーニング内容が望ましい。
【００２８】
また、ミトコンドリア機能に関する遺伝子として知られるシステインtRNA合成酵素(CARS)と、硫化水素キノンレダクターゼ(SQR)についても同様に発現量の比較を行った。
【００２９】
図２に示すように、いずれの遺伝子においても、運動後に発現量の有意な増加を確認できた。これは、運動によって亢進したミトコンドリア (エネルギー産生) の機能を評価しているものであり、運動によってミトコンドリア の機能が向上することを示している。すなわち、運動能力の向上をミトコンドリア の機能の向上として評価することで、最適なトレーニングメニューの作成に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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