(57)【要約】      （修正有）【課題】アルツハイマー病（ＡＤ）を治療又はイメージングするための組成物及び方法の提供。【解決手段】ビオチン部分及びｓｉＲＮＡ部分を含み、抗体、抗原、アビジン又はストレプトアビジンのような標的化剤を必要としない組成物。ある実施形態においては、診断剤を更に含む組成物。ＡＤの発病に関与するタンパク質をコードする遺伝子を部分的、実質的又は完全に欠失させ、サイレンシングし、不活性化し、妨害し、またはダウンレギュレーションする当該組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビオチン部分およびｓｉＲＮＡ部分を含む組成物であって、ｓｉＲＮＡ部分が、配列番号１〜１５のいずれか、または配列番号１〜１５のいずれかに対して少なくとも８５％の配列相同性を有する核酸からなる群から選択されるヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項２】
組成物がｓｉＲＮＡとビオチンとの間のリンカーを更に含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
組成物が抗体、抗原、アビジンまたはストレプトアビジンを含まない、請求項１または請求項２記載の組成物。
【請求項４】
組成物が診断剤を更に含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
診断剤が、発蛍光団、発色団、化学発光剤、放射性核種、不対スピン原子、フリーラジカルおよび造影剤からなる群から選択される、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
ｓｉＲＮＡ部分が、配列番号１〜８のいずれか、または配列番号１〜８のいずれかに対して少なくとも８５％の配列相同性を有する核酸からなる群から選択されるヌクレオチドを含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
ビオチン部分およびｓｉＲＮＡ部分からなる組成物。
【請求項８】
組成物がインビボで細胞をトランスフェクトしうる、請求項１〜７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
組成物が、ＡＤの発病に関与するタンパク質をコードする遺伝子を部分的、実質的または完全に欠失させ、サイレンシングし、不活性化し、妨害し、またはダウンレギュレーションする、請求項１〜８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】
ＡＤの発病に関与するタンパク質が、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ベータアミロイド切断酵素−１（ＢＡＣＥ１）、タウ、プレセニリン（例えば、プレセニリン１（ＰＳ１）またはプレセニリン２（ＰＳ２））、セレノプロテインＰ（ＳｅｌＰ）、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、インスリン分解タンパク質、ネプリリシンおよびアルファ−シヌクリジンからなる群から選択される、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
遺伝子が、ＭＡＲＫ２、ＰＡＫ３、ＰＡＫ２、ＡＤＣＫ５、ＡＫＡＰ１３、ＬＯＣ５５９７１、ＰＬＫ２、ＤＹＲＫ１Ａ、ＭＡＫ、ＩＴＫ、ＰＩＭ１、ＲＡＧＥ、ＩＴＰＫ１、ＣＫＢ、ＰＦＫＭ、ＤＧＫＢおよびＳＰＨＫ２からなる群から選択される、請求項９記載の組成物。
【請求項１２】
遺伝子が、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＣＤＫＬ１、ＤＣＫ、ＤＧＫＱ、ＰＦＫＦＢ３、ＥＲＫ８、ＳＴＫ１９、ＰＲＫＧ２およびＰＡＭ２Ｋ１ＩＰ１からなる群から選択される、請求項９記載の組成物。
【請求項１３】
ｓｉＲＮＡ部分が５’末端にグアノシンを含む、請求項１〜１２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１４】
ｓｉＲＮＡ部分のセンスまたはアンチセンス鎖が３０、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８または１７ヌクレオチド長以下である、請求項１〜１３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項記載の組成物の治療的有効量と医薬上許容される担体または希釈剤とを含む、医薬上許容される製剤。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか１項記載の組成物の治療的有効量を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物におけるアルツハイマー病の治療方法。
【請求項１７】
哺乳動物がヒトである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
対象のイメージの生成方法であって、
請求項４または請求項５記載の組成物の検出可能な量をイメージングを必要とする対象に投与する工程、および
イメージを生成する工程
を含む、方法。
【請求項１９】
対象がヒトである、請求項１８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアルツハイマー病の治療および診断のためのビオチン複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶低下、行動障害、日常生活の活動障害および独立した機能の喪失により特徴づけられる、脳の進行性神経変性障害である。世界中で１８００万〜２４００万人がＡＤに現在罹患していると考えられており、そのうちの３分の２は先進国または発展途上国に住んでいる。この数字は２０２５年までに３４００万人に到達すると予想されている。
【０００３】
アミロイド−ベータペプチド（Ａβ）の不溶性凝集物の蓄積がＡＤの発病の中心的メカニズムであると考えられている。Ａβペプチドはベータ−およびガンマ−セクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の切断から生じる。ＢＡＣＥ１（ベータアミロイド切断酵素−１）によるＡＰＰの切断はガンマ−セクレターゼ媒介プロセシングのための前提条件であると考えられている。
【０００４】
Ａβの蓄積を抑制することを目的とした幾つかの薬物は臨床試験において失敗している。尚も臨床試験中である他の薬物もＡβの蓄積を抑制することに向けられている。しかし、ほとんどの専門家は現在、患者が症状を示した後でＡβ抑制療法を開始するのでは遅すぎる可能性があると考えている。
【０００５】
例えば、ｓｈＲＮＡプラスミドを使用して、タウタンパク質の突然変異対立遺伝子がインビトロで標的化された。これは、ｓｉＲＮＡにより突然変異タウを抑制するために単一ヌクレオチド突然変異が用いられうることを示している。タウ遺伝子における優性遺伝突然変異はＡＤ以外の神経変性疾患における標的となりうる。第１７染色体に関連したパーキンソン症候群を伴う前頭側頭型痴呆はタウにおける突然変異を有し、これは配列変化または異常スプライシングを引き起こす。タウの異常発現は進行性核上性麻痺および皮質基底神経節変性症にも関連している。
【０００６】
ＡＤに対する追加的な標的には、アポリポタンパク質Ｅε４対立遺伝子（ＡｐｏＥ４）、セクレターゼおよびプレセニリン遺伝子が含まれる。加齢と共に、ＡｐｏＥ４はＡＤの最も重要なリスク因子であるとみなされている。ｓｉＲＮＡでのＡｐｏＥ４の抑制は、少なくともヘテロ接合において、ＡＤを発生する可能性を潜在的に低減し、またはその開始を遅らせうるであろう。ＡｐｏＥ４はコレステロールおよびトリグリセリド輸送において決定的に重要な役割を果たしているため、ＡｐｏＥ４ホモ接合体における遺伝子ターゲッティングのリスク−利益比はそれほど明らかではない。プレセニリン遺伝子においては、１５０個を超える突然変異が特定されており、それらはＡＤの早発性侵襲的形態を引き起こす。プレセニリンはγ−セクレターゼの触媒サブユニットであり、プレセニリンにおける突然変異は高度に自己凝集性のＡβ４２ペプチドの産生を増強し、これは、ｓｉＲＮＡで突然変異プレセニリンを抑制することにより逆転されうる。これは、セクレターゼが治療介入点となりうるかどうかという疑問につながる。β−セクレターゼ欠損マウスは見掛け上の欠損を有しないため、この特定の酵素は良好な治療標的となりうる。
【０００７】
したがって、該過程に関与するタウタンパク質または他のタンパク質の抑制に向けられた療法が益々注目されつつある。正常な状況下では、タウはニューロンにおける微小管構造の構築を補助する。しかし、罹患脳においては、４００個を超えるアミノ酸を有するこの長いタンパク質はミスフォールドし、凝集して、ニューロン内のタングル（もつれ）を形成する。脳脊髄液中の高レベルのタウはＡＤの進行に関連している。細胞外タウは、死んだニューロンにより放出される残骸ではなく、罹患ニューロンにより分泌される物質であり、それは疾患輸送体として作用し、シナプスに沿ってニューロンからニューロンへと往復し、より多くのミスフォールディング、より多くのタングルおよびより多くの神経毒性を誘発する、と考えられている。
【０００８】
アルツハイマー病の新規治療方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
（発明の要旨）
ある実施形態においては、本発明は、ビオチン部分とｓｉＲＮＡ部分とから実質的になる組成物に関する。
【００１０】
ある実施形態においては、本発明は、ビオチン部分とｓｉＲＮＡ部分とを含む組成物に関する。ある実施形態においては、該組成物は抗体、抗原、アビジンまたはストレプトアビジンを含まない。
【００１１】
ある実施形態においては、本発明は、ビオチン部分とｓｉＲＮＡ部分とからなる組成物に関する。
【００１２】
ある実施形態においては、本発明は前記組成物のいずれかに関するものであり、ここで、該ｓｉＲＮＡ部分は、ＣＴＡＧＣＡＡＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡ（配列番号１）、ＧＣＣＡＵＵＡＡＧＡＵＣＧＣＵＵＡＣＵｔｔ（配列番号２）、ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＵＵ（配列番号３）、ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＳＡＧＵＵ（配列番号４）、ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＵＵ（配列番号５）、ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＳＡＧＵＵ（配列番号６）、ＰＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＵＵ（配列番号７）およびＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＳＡＧＵＵ（配列番号８）、または配列番号１〜１５のいずれかに対して少なくとも８５％の配列相同性を有する核酸から選択される。
【００１３】
ある実施形態においては、本発明は、前記組成物のいずれかの治療的有効量と医薬上許容される担体または希釈剤とを含む医薬上許容される製剤に関する。
【００１４】
ある実施形態においては、本発明は、前記組成物のいずれかの治療的有効量を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物におけるアルツハイマー病の治療方法に関する。
【００１５】
ある実施形態においては、本発明は、前記組成物のいずれかの検出可能な量を、イメージングを要する対象に投与し、イメージを生成する工程を含む、対象のイメージの生成方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヒトＰ３０１Ｓタウトランスジェニックマウスにおける行動的進行を示す。Ｐ３０１Ｓ突然変異を有するヒトタウを過剰発現するマウスは、後脚立行動における欠損を示し、これは経時的に有意に進行する（Ａ）。また、開放野外における距離移動での歩行（Ｂ）およびロータロッド試験における成績において、欠損が捕捉されうる。これらの重篤かつ有意な欠損は６月齢で観察されうる。＊：全ての他の時点とは異なる。一元配置分散分析Ｆ（３，５９）＝４．９６３５，１１．１９９および２８．４０９、ならびにそれに続く、それぞれＡ、ＢおよびＣに関する各ペアのスチューデントｔ検定。全比較に関してｐ＜０．００４。
【図２】インビトロにおけるシクロフィリンＢおよびタウタンパク質のＡｃｃｅｌｌ−ｓｉＲＮＡノックダウンを示す。（Ａ）シクロフィリンＢ（ＣｙｃｌｏＢ）は、ヒト中脳ニューロン（ＬｕｈＭｅｓ；５００ｎＭにおいて７０％）およびマウス初代皮質ニューロン（２５０ｎＭにおいて８０％）において、トランスフェクション後のそれぞれ７２および１４０時間の時点で有効にノックダウンされた。（Ｂ〜Ｃ）同様に、ヒトＴＡＵに対するＡｃｃｅｌｌ−ｓｉＲＮＡはＬｕｈＭｅｓ（１２５〜５００ｎＭにおいて＞９５％；Ｂ）および初代皮質ニューロン（２５０ｎＭにおいて７５％；Ｃ）（Ｐ３０１Ｓマウスモデル由来）において有意なノックダウンを示した（ここでは、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後の１２０および１４４時間の時点におけるものが示されている）。
【図３】アクチン−ＥｅＧＦＰ発現マウスの線条体へのＰＥＩ−ｓｉＲＮＡ運搬およびＣ５７／Ｂ６マウスにおけるＡｃｃｅｌｌ−ｓｉＲＮＡトランスフェクションを示す。（Ａ）ＰＥＩ−ｓｉＲＮＡ−ＧＦＰ（右線条体における白色矢印）およびＰＥＩ−ルシフェラーゼ（左線条体における白色矢印）の単一注射が行われた動物。ここで、両側におけるＧＦＰ染色の非存在が認められうる。更に、ＮｅｕＮ染色においては、（Ｂ）線条体におけるＰＥＩ−注射（白色矢印）からのニューロン細胞喪失が明らかに認識されうる。（Ｃ）蛍光タグＦＡＭとのＡｃｃｅｌｌ−ｓｉＲＮＡの組合せの単一注射は、７２時間後、線条体における並びに脳梁（ｃｃ）および皮質におけるニューロンの頑強なトランスフェクションを示した。
【図４】本明細書に記載されているオリゴヌクレオチド＃１、＃３および＃４によりトランスフェクトされたＡ５４９肺癌細胞のイメージである。
【図５】本明細書に記載されているオリゴヌクレオチド＃１、＃３および＃４によりトランスフェクトされたＣＡＬ２７小扁平上皮癌細胞のイメージである。
【図６】本明細書に記載されているオリゴヌクレオチド＃１、＃３および＃４によりトランスフェクトされたＭＤＡ、Ｅ２Ｒ陰性乳癌細胞のイメージである。
【図７】本明細書に記載されているビオチン共役オリゴヌクレオチド＃１、＃３および＃４によりトランスフェクトされたＡ５４９肺癌細胞、ＣＡＬ２７小扁平上皮癌細胞、Ｅ２Ｒ陰性乳癌細胞およびＰＣ３前立腺癌細胞のイメージである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明の組成物
一般に、本発明は、リンカーの存在下または非存在下でビオチンとｓｉＲＮＡ配列とを含む新規組成物に関する。ある実施形態においては、該組成物はビオチン部分とｓｉＲＮＡ部分とから実質的になる。本明細書中で用いる「ｓｉＲＮＡ」は、有害なインターフェロン応答をヒト細胞において誘導しない、ＲＩＳＣ（ＲＮＡｉ誘発性サイレンシング複合体）内に進入しうる二本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＲＮＡを意味し、例えば、それは、６０個未満、好ましくは５０個未満、４０個未満または３０個未満のヌクレオチドペアの二本鎖領域を有する。該ｓｉＲＮＡまたはその切断産物は、例えば、標的ＲＮＡ、好ましくは内因性または病原体標的ＲＮＡに対するＲＮＡｉを誘発することにより、標的遺伝子をダウンレギュレーションしうる。ｓｉＲＮＡはタンパク質産生をサイレンシングすることが知られている。
【００１８】
本明細書中で用いる「コンジュゲート化（共役）」または「連結」は、イオン結合、または好ましくは共有結合（例えば、架橋剤を介するもの）による結合を意味する。
【００１９】
ある実施形態においては、本発明の組成物は標的化部分、例えば抗体、抗原、アビジンまたはストレプトアビジンを含まず、該組成物は、これらの伝統的な標的化部分を要することなく、細胞を標的化しうる。
【００２０】
ある実施形態においては、本発明の組成物は細胞をインビボでトランスフェクトしうる。ある実施形態においては、ビオチンは単独でｓｉＲＮＡ部分のための運搬プローブとして作用する。
【００２１】
本明細書に記載されている組成物は、ＡＤの発病に関与するタンパク質をコードする遺伝子を部分的、実質的または完全に欠失させ、サイレンシングし、不活性化し、妨害し、またはダウンレギュレーションしうる。ＡＤの発病に関与するタンパク質は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ベータアミロイド切断酵素−１（ＢＡＣＥ１）、タウ、プレセニリン（例えば、プレセニリン１（ＰＳ１）またはプレセニリン２（ＰＳ２））、セレノプロテインＰ（ＳｅｌＰ）、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、インスリン分解タンパク質、ネプリリシンまたはアルファ−シヌクリジンでありうる。ある実施形態においては、ｓｉＲＮＡは、Ａβを産生する又はＡβの凝集を引き起こす任意の過程において干渉する。ある実施形態においては、ｓｉＲＮＡは、タウフィブリルタングルを産生する任意の過程に干渉する。
【００２２】
ある実施形態においては、該遺伝子は、ＭＡＲＫ２、ＰＡＫ３、ＰＡＫ２、ＡＤＣＫ５、ＡＫＡＰ１３、ＬＯＣ５５９７１、ＰＬＫ２、ＤＹＲＫ１Ａ、ＭＡＫ、ＩＴＫ、ＰＩＭ１、ＲＡＧＥ、ＩＴＰＫ１、ＣＫＢ、ＰＦＫＭ、ＤＧＫＢおよびＳＰＨＫ２からなる群から選択される。ある実施形態においては、該遺伝子は、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＣＤＫＬ１、ＤＣＫ、ＤＧＫＱ、ＰＦＫＦＢ３、ＥＲＫ８、ＳＴＫ１９、ＰＲＫＧ２およびＰＡＭ２Ｋ１ＩＰ１からなる群から選択される。
【００２３】
該ｓｉＲＮＡ部分はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むことが可能であり、該センス鎖は３’末端および５’末端を含み、該アンチセンス鎖は３’末端および５’末端を含みうる。
【００２４】
「アンチセンス」核酸は、（例えば、転写および／または翻訳を抑制することにより）発現を抑制するために、細胞条件下、相補的センス核酸、例えば細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズ（例えば、結合）する核酸を意味する。該結合は通常の塩基対相補性によるもの、または例えばＤＮＡ二本鎖への結合の場合には二重らせんの主溝における特異的相互作用によるものでありうる。
【００２５】
ビオチン部分はセンス鎖に結合されうる。あるいは、ビオチン部分はアンチセンス鎖に結合されうる。結合はいずれかの鎖の３’または５’末端において生じうる。ある実施形態においては、該組成物は２以上のビオチン部分を含む。
【００２６】
ビオチンとｓｉＲＮＡとを含む組成物は、診断剤、例えば、標的への結合に際して検出可能なイメージを生成しうる組成物を更に含みうる。具体例には、発蛍光団（例えば、Ｄｙ５４７）、発色団、化学発光剤、放射性核種（例えば、Ｉｎ−１１１、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５  Ｆ−１８、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８）［陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）および単光子放射断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）用のもの］、不対スピン原子およびフリーラジカル（例えば、鉄、ランタニドおよびＧｄ）および造影剤（例えば、キレート化（ＤＴＰＡ）マンガン）［磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用のもの］が含まれる。ある実施形態においては、該組成物はｓｉＲＮＡ−ビオチン−診断剤または診断剤−ｓｉＲＮＡ−ビオチンの形態である。
【００２７】
適当なｓｉＲＮＡ部分は、本明細書において特定されている配列のいずれかを含みうる。ある実施形態においては、該ｓｉＲＮＡ部分は、ＣＴＡＧＣＡＡＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡ（配列番号１）、ＧＣＣＡＵＵＡＡＧＡＵＣＧＣＵＵＡＣＵｔｔ（配列番号２）、ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＵＵ（配列番号３）、ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＳＡＧＵＵ（配列番号４）、ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＵＵ（配列番号５）、ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＳＡＧＵＵ（配列番号６）、ＰＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＵＵ（配列番号７）、ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＳＡＧＵＵ（配列番号８）、配列番号９〜１５のいずれか、または配列番号１〜１５のいずれかに対して少なくとも８５％、９０％、９５％もしくは９９％の配列相同性を有する核酸を含む。
【００２８】
ある実施形態においては、該ｓｉＲＮＡ部分はＧＧＴＧＧＣＣＡＧＡＴＧＧＡＡＧＴＡＡＡ、またはＧＧＴＧＧＣＣＡＧＡＴＧＧＡＡＧＴＡＡＡに完全に相補的である配列を含む。
【００２９】
ある実施形態においては、該ｓｉＲＮＡ部分はＴＧＡＡＧＴＧＡＡＴＣＴＧＧＡＴＧＣＡＧ、またはＴＧＡＡＧＴＧＡＡＴＣＴＧＧＡＴＧＣＡＧに完全に相補的である配列を含む。
【００３０】
ある実施形態においては、本発明の態様は米国特許出願公開第２０１１／０２４４５６１号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【００３１】
該ｓｉＲＮＡ部分は５’末端にグアノシンを更に含む。
【００３２】
該ｓｉＲＮＡ部分のセンスおよび／またはアンチセンス鎖は３０、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８または１７ヌクレオチド長に等しいか又はそれらより短い。ｓｉＲＮＡ部分は１以上の突出部を含みうる。例えば、該ｓｉＲＮＡ部分は２〜３ヌクレオチドの、１個または２個の３’突出部を含みうる。ある実施形態においては、本発明は、該ｓｉＲＮＡ部分が、１９−ヌクレオチドの二本鎖領域と各３’末端における２−ｎｔ（ヌクレオチド）の３’突出部とを有するように対形成している２１−ｎｔのセンス鎖と２１−ｎｔのアンチセンス鎖とを含む前記組成物のいずれかに関する。ある実施形態においては、本発明は、該２−ｎｔの３’突出部がＵＵまたはｄＴｄＴのいずれかである前記組成物のいずれかに関する。対称性３’−突出部は、配列特異的エンドヌクレアーゼ複合体（ｓｉＲＮＰ）が、センスおよびアンチセンス標的ＲＮＡ切断性ｓｉＲＮＰのほぼ等しい比率で形成されることを保証する。該アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖が標的認識を導くため、該センス鎖における３’突出部は認識に寄与しない。したがって、該アンチセンス配列のＵＵまたはｄＴｄＴ  ３’−突出部は標的ｍＲＮＡに相補的であるが、該センスｓｉＲＮＡオリゴの対称性ＵＵまたはｄＴｄＴ  ３’−突出部は該ｍＲＮＡに対応している必要はない。ＵＵまたはｄＴｄＴ突出部を有するｓｉＲＮＡ二本鎖は同等に良好に機能するが、両方の３’−突出部におけるデオキシチミジンの使用はヌクレアーゼ抵抗性を増強しうる。３’突出部における２’−デオキシヌクレオチドはリボヌクレオチドと同等に効率的であるが、しばしば、より安価に合成される。
【００３３】
該ｍＲＮＡにおける標的化領域、そして該ｓｉＲＮＡの本鎖における配列は、以下の指針に従い選択される。該ｃＤＮＡ配列からのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域は、好ましくは、開始コドンの下流の少なくとも５０〜１００ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも７５〜１００ヌクレオチドの標的化に推奨される。５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）および開始コドン付近の領域は共に、標的化には推奨されない。なぜなら、これらは、調節タンパク質結合部位がより豊富でありうるからである。ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体はｓｉＲＮＰエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨げうる。
【００３４】
該ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの配列は、配列ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴを求めて検索される。約５０％のＧ／Ｃ含量（３０％〜７０％）を有する配列が使用される。適当な配列が見出されない場合には、該検索は配列ＡＡ（Ｎ２１）に拡張される。センスｓｉＲＮＡの配列はそれぞれ５’−（Ｎ１９）ｄＴｄＴ−３’またはＮ２１に対応する。後者の場合、該センスｓｉＲＮＡの３’末端はｄＴｄＴに変換される。この配列変換の根拠は、該センスおよびアンチセンス３’突出部の配列組成に関する対称性二本鎖を生成させるためである。対称性３’突出部は、センスおよびアンチセンス標的ＲＮＡ切断性ｓｉＲＮＰのほぼ等しい比率で該ｓｉＲＮＰが形成されることを保証することを助けると考えられている。該アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖が標的認識を導くため、該ｓｉＲＮＡ二本鎖のセンス配列の突出部の修飾は標的ｍＲＮＡ認識に影響を及ぼさないと予想される。
【００３５】
該標的ｍＲＮＡは適当なＡＡ（Ｎ２１）配列を含有しないため、ＮＡ（Ｎ２１）を検索することが推奨される。該アンチセンスｓｉＲＮＡの最も３’側のヌクレオチドの配列は特異性に寄与しないらしいため、該センスおよびアンチセンス鎖の配列は５’（Ｎ１９）ＴＴとして尚も合成されうる。
【００３６】
１つの遺伝子のみが標的化されることを保証するために、選択されたｓｉＲＮＡ配列を適当なデータベース（例えば、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴデータベース検索）におけるＥＳＴライブラリーに対して検索することが更に推奨される。
【００３７】
適切に設計されたｓｉＲＮＡは商業的入手元（例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ．；Ｘｅｒｇｏｎ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａ．；Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘ．）から入手され、あるいは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトおよび通常のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を使用して標準的な方法に従い化学合成される。該ｓｉＲＮＡがどのようにして得られたかに応じて、製造業者の仕様書または通常の方法に従い、該ＲＮＡオリゴヌクレオチドは２’−脱保護され、脱塩され、２本の鎖がアニールされる。全ての取り扱い工程は厳密な無菌ＲＮアーゼ非含有条件下で行われる。
【００３８】
本明細書中で用いる「ビオチン部分」は、ビオチン（ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−ペンタン酸）、２４４ダルトンのビタミン、その類似体および誘導体、ならびに複数のビオチン部分を含む化合物を含む。本発明の組成物においては使用されうる典型的なビオチン類似体はＥｌｍａｌｅｈら，米国特許第５，７１６，５９４号（この特許の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されており、本発明の組成物において使用されうる複数のビオチン部分（例えば、「ポリビオチン化合物」）を含む典型的な化合物は、Ｅｌｍａｌｅｈらにより２００４年１０月１日付けで出願されたＵ．Ｓ．Ｓｅｒｉａｌ  Ｎｏ．１０／９５６，６８７，“Ｐｏｌｙｂｉｏｔｉｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ”（この出願の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。本出願において使用される種々のスペーサー、連結基などを含む他の典型的なビオチン部分は特許および文献に豊富に記載されている。非限定的な例はＭ．Ｄ．Ｓａｖａｇｅら，（１９９２），Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ；ＤＥ  ３６２９１９４，米国特許第５，１８０，８２８号、第４，７０９，０３７号および第５，２５２，７４３号、第４，７９８，７９５号、第４，７９４，０８２号、ＷＯ  ８５／０５６３８（それらの全てを参照により本明細書に組み入れることとする）において見出されうる。
【００３９】
ビオチン部分を他の化学的実体にコンジュゲート化する方法（すなわち、ビオチン化の方法）は当技術分野でよく知られている。例えば、ビオチン部分（これは、所望によりスペーサーアームおよび／または脱離基を有していてもよい任意の所望のビオチン化合物でありうる）、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−ビオチン（ＮＨＳ−ビオチン）は、溶媒中およびバッファーの存在下、所望の生体分子（例えば、スカフォールド）と反応されうる。該ＮＨＳは脱離基として機能して、そのようにして形成するビオチン化スカフォールドを与える。これは、標準的な方法を用いて、例えば、該ビオチン化スカフォールドをＳｅｐｈａｄｅｘ．ＴＭクロマトグラフィーカラム上の精製に付して遊離ビオチン、ＮＨＳ−ビオチンおよび他の低分子量溶質を除去することにより精製されうる。また、ビオチン部分をオリゴヌクレオチドにコンジュゲート化するための多数の方法が当技術分野において記載されている。例えば、米国特許第５，１２８，４７６号、第４，６０５，７３５号、第４，７５１，３１３号、第４，７１１，９５５号および第４，９０８，４５３号を参照されたい。
【００４０】
ｓｉＲＮＡ、ビオチンおよび／またはリンカー分子のカップリングを可能にするために、表面化学基はカルボキシル（ＣＯＯＨ）、アミノ（ＮＨ２）、ヒドロキシル（ＯＨ）、ヒドラジド（ＮＨＮＨ２）、アミド（ＣＯＮＨ２）、クロロメチル（ＣＨ３Ｃｌ）およびアルデヒド（ＣＯＨ）基で誘導体化されうる。表面への脂質、炭水化物、ペプチド、ペプチド模倣体、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）、タンパク質、小分子、天然物およびオリゴヌクレオチドのカップリングを可能にするための、種々の化学基（例えば、表面ヒドロキシルまたはアミノ基）を誘導体化し修飾するためのそのような方法は当技術分野でよく知られている。
【００４１】
ビオチンおよびｓｉＲＮＡ分子をコンジュゲート化するために、リンカー（「リンカー分子」または「架橋剤」または「スペーサー」としても公知である）が使用されうる。公知架橋剤の大多数はアミン、カルボキシルおよびスルフヒドリル基と反応する。リンカー分子は該組成物の種々の特性をもたらす。リンカーの長さは、コンジュゲート化工程中の分子の柔軟性、および対応標的に関する該コンジュゲート化分子の利用可能性を考慮して考えられるべきである。したがって、より長いリンカーは本発明の組成物の生物活性およびそれらの製造の容易さを改善しうる。標的との最適な反応のために分子を配向させるために、リンカーの幾何学的特徴が用いられうる。柔軟な幾何学的特徴を有するリンカーは、ビオチン化組成物全体が、標的配列に結合する際にコンホメーション的に適合することを可能にしうる。リンカーの性質は他の種々の目的のために改変されうる。例えば、高分子リンカーの疎水性は該高分子に沿った単量体単位の順序により制御されうる（例えば、親水性単量体のブロックが介在して疎水性単量体のブロックが存在するブロック重合体）。
【００４２】
多種多様な分子リンカーを製造し利用するための化学が当技術分野でよく知られており、分子をコンジュゲート化するのに使用される多数の予め製造されたリンカーがＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌのような供給業者から商業的に入手可能である。本発明の組成物において使用される典型的なリンカー分子には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：アミノカプロン酸（ＡＣＡ）；ポリグリシンおよびいずれかの他のアミノ酸重合体、重合体、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリメチルメタクリラート（ＰＭＭＡ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）；ホモ二官能性試薬、例えばＡＰＧ、ＡＥＤＰ、ＢＡＳＥＤ、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＭ［ＰＥＯ］３、ＢＭ［ＰＥＯ］４、ＢＳ３、ＢＳＯＣＯＥＳ、ＤＦＤＮＢ、ＤＭＡ、ＤＭＰ、ＤＭＳ、ＤＰＤＰＢ、ＤＳＧ、ＤＳＰ（ローマント（Ｌｏｍａｎｔ’ｓ）試薬）、ＤＳＳ、ＤＳＴ、ＤＴＢＰ、ＤＴＭＥ、ＤＴＳＳＰ、ＥＧＳ、ＨＢＶＳ、スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ、スルホ−ＤＳＴ、スルホ−ＥＧＳ；ヘテロ二官能性試薬、例えばＡＢＨ、ＡＥＤＰ、ＡＭＡＳ、ＡＮＢ−ＮＯＳ、ＡＰＤＰ、ＡＳＢＡ、ＢＭＰＡ、ＢＭＰＨ、ＢＭＰＳ、ＥＤＣ、ＥＭＣＡ、ＥＭＣＨ、ＥＭＣＳ、ＫＭＵＡ、ＫＭＵＨ、ＧＭＢＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＬＣ−ＳＰＤＰ、ＭＢＳ、ＭＢｕＳ、Ｍ２Ｃ２Ｈ、ＭＰＢＨ、ＭＳＡ、ＮＨＳ−ＡＳＡ、ＰＤＰＨ、ＰＭＰＩ、ＳＡＤＰ、ＳＡＥＤ、ＳＡＮＤ、ＳＡＮＰＡＨ、ＳＡＳＤ、ＳＡＴＰ、ＳＢＡＰ、ＳＦＡＤ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＳＭＰＴ、ＳＰＤＰ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＨＳＡＢ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＡＳＡ、スルホ−ＳＡＤＰ、スルホ−ＳＡＮＰＡＨ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＰＢ、スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ、ＳＶＳＢ、ＴＦＣＳ；および三官能性リンカー、例えばスルホ−ＳＢＥＤ、ＴＨＰＰ  β−［トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィノ］プロパン酸（ベタイン）。使用されると想定される任意のリンカーには、該ｓｉＲＮＡのビオチン化に不適合な官能性を含有しない任意の分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
リンカー当たりに複数の部分が反応しうるように、分枝リンカーが製造または使用されうる。そのような多重反応性リンカーは多量体結合部位の生成を可能にする。
【００４４】
適当なリンカーは巨大分子重合体でありうる。前記重合体のいずれかは巨大分子重合体を含みうる。ある実施形態においては、そのような巨大分子重合体は１つのタイプの重合体分子から完全に構成されうる。他の実施形態においては、該巨大分子重合体は２以上のタイプの重合体分子から構成されうる。該巨大分子重合体は多数の可能な構造、例えば、直鎖状、櫛型分枝状、デンドリグラフト、デンドリマー、直鎖状デンドロン構造共重合体として存在しうる。例えば、種々の二価および多価リンカーを作製するためにＰＥＧおよびＰＰＧが使用されうる。分枝ＰＥＧ／ＰＰＧ重合体およびＰＥＧ／ＰＰＧブロック共重合体を合成し、活性化し、および修飾する方法は当技術分野でよく知られている。ＰＥＧは親水性であり、一方、ＰＰＧは疎水性である。例えば、リンカーは、ＰＰＧコアおよびＰＥＧ分枝を使用して合成されうるであろう。
【００４５】
ビオチン化ｓｉＲＮＡは、診断剤または治療剤、例えば抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、または放射性核種（例えば、Ｆ−１８、Ｉ−１２４、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｙ−９０、Ｂｉ−２１２、Ａｔ−２１１、Ｓｒ−８９、Ｈｏ−１６６、Ｓｍ−１５３、Ｃｕ−６７およびＣｕ−６４）を更に含みうる。診断剤なる語は、標的との結合に際して、検出可能なイメージを生成する組成物、例えば、蛍光部分、発色団、放射性核種または金属原子を意味する。ある実施形態においては、該診断剤は放射性核種、例えば、Ｉｎ−１１１、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５  Ｆ−１８、Ｇａ−６７またはＧａ−６８を含有する。該診断剤は、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）または単光子放出断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）を使用して可視化されうる。他の実施形態においては、該診断剤は不対スピン原子またはフリーラジカル（例えば、ＦｅまたはＧｄ）または造影剤（例えば、キレート化（ＤＴＰＡ）マンガン）（磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）のためのもの）である。磁気共鳴イメージングおよび蛍光イメージングのための追加的な診断剤は後記の「造影剤」および「蛍光イメージング」の節における考察に記載されている。
【００４６】
ある実施形態においては、該金属原子は、ＭＲＩ造影剤としての複雑な優れた特性が得られるように選択される。ある実施形態においては、該金属原子はＩｎ−１１１、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５  Ｆ−１８、Ｇａ−６７またはＧａ−６８である。ある実施形態においては、該金属原子はＹ−９０、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｅ−１８８、Ｐ−３２、Ｈｏ−１６６、Ｐｄ−１０９、Ｌａ−１４０、Ｓｍ−１５３、Ｄｙ−１６５またはＥｒ−１６９である。ある実施形態においては、該金属原子はＧｄ３＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｒ３＋、ジスプロシウム、ホルミウムまたはエルビウムである。
【００４７】
治療用または診断用イメージングの方法
本発明の１つの態様は、前記組成物のいずれかの治療的有効量を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物におけるアルツハイマー病の治療方法に関する。
【００４８】
ある実施形態においては、本発明は、該哺乳動物がヒトである、前記方法のいずれかに関する。
【００４９】
ｓｉＲＮＡのビオチン化は、例えばより有効なサイレンシングのための、該ｓｉＲＮＡ分子の、より有効な細胞内運搬を可能にする。そのような組成物は、治療剤または診断剤の運搬または標的化、例えば、ｉＲＮＡおよびアンチセンス物質の運搬または標的化において有用である。更に、ビオチン含有組成物は、問題が生じた又は非健常な細胞内に、健常細胞の場合と比べて優先的に吸着される。また、ｓｉＲＮＡ含有組成物は非健常細胞における取り込みに関する類似した優先性を示す。
【００５０】
標的化治療剤またはイメージング剤の「有効量」なる語は、感染、腫瘍または他の標的を排除、低減または維持（例えば、その広がりを予防）するのに必要または十分な量を意味する。該有効量は、治療される疾患または状態、投与される個々の標的化構築物、対象のサイズ、あるいは該疾患または状態の重症度のような要因に応じて変動しうる。当業者は、過度な実験を要することなく、個々の化合物の有効量を実験的に決定することが可能である。
【００５１】
ある実施形態においては、本発明は、サイレンシングのために標的化される遺伝子の選択に関するものであり、該サイレンシングは、その遺伝子の発現が抑制されるように、その対応ｍＲＮＡの分解によるものである。使用に適した遺伝子には、細胞内のＡβの存在を増加させることが公知であるものが含まれる。例えば、関心のある遺伝子としては、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ベータアミロイド切断酵素−１（ＢＡＣＥ１）、タウ、プレセニリン（例えば、プレセニリン１（ＰＳ１）またはプレセニリン２（ＰＳ２））、セレノプロテインＰ（ＳｅｌＰ）、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、インスリン分解タンパク質、ネプリリシンまたはアルファ−シヌクリジンをコードするものが挙げられる。ある実施形態においては、該ｓｉＲＮＡは、Ａβを産生する又はＡβの凝集を引き起こす任意の過程において干渉する。ある実施形態においては、該ｓｉＲＮＡは、タウフィブリルタングルを産生する任意の過程に干渉する。
【００５２】
該方法は更に、標的ｍＲＮＡにおける標的配列を選択し、該標的ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ二本鎖を設計する工程を含む。標的配列の選択およびｓｉＲＮＡ二本鎖の設計は、当技術分野で標準的になっているＴｕｓｃｈｌらの指針（Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．，Ｐ．Ｄ．Ｚａｍｏｒｅ，Ｒ．Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｄ．Ｐ．ＢａｒｔｅｌおよびＰ．Ａ  Ｓｈａｒｐ  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １３：３１９１−３１９７（１９９９）；Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  ｕｓｅｒ  ｇｕｉｄｅ［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｐｉｂｐｃ．ｇｗｄｇ．ｄｅ／ａｂｔｅｉｌｕ−ｎｇｅｎ／１００／１０５／ｓｉｍａ．ｈｔｍｌ］；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  Ｓ  Ｍ，Ｈａｒｂｏｒｔｈ  Ｊ，Ｗｅｂｅｒ  Ｋ，Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｅｂ；２６（２）：１９９−２１３，（２００２）；Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃００３−Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ｂ，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ．，２００２）に基づく。
【００５３】
タウ過剰リン酸化に関与するキナーゼのｓｉＲＮＡスクリーニングの例はＡｚｏｒｓａら，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２０１０，１１，２５（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。これらのｓｉＲＮＡはビオチンで誘導体化されて、本発明のｓｉＲＮＡ−ビオチンコンジュゲートを与え、これは適当なトランスフォーム細胞または非健常細胞に薬物を運搬する。
【００５４】
ＡＰＰまたはタウをコードする遺伝子の標的化領域に対するｓｉＲＮＡの製造方法の例はＭｉｌｌｅｒ，Ｖ．Ｍ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４，３２（２），６６１−６６８（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。これらのｓｉＲＮＡはビオチンで誘導体化されて、本発明のｓｉＲＮＡ−ビオチンコンジュゲートを与え、これは適当なトランスフォーム細胞または非健常細胞に薬物を運搬する。
【００５５】
ＢＡＣＥ１を標的化するｓｉＲＮＡの例はＳｉｎｇｅｒ，Ｏ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５，８，１３４３−１３４９（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【００５６】
ＰＳ１に対するｓｉＲＮＡのスクリーニングの例はＫａｎｄｉｍａｌｌａ，Ｒ．Ｊ．Ｌ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．２０１２，１９，２（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。これらのｓｉＲＮＡはビオチンで誘導体化されて、本発明のｓｉＲＮＡ−ビオチンコンジュゲートを与え、これは適当なトランスフォーム細胞または非健常細胞に薬物を運搬する。
【００５７】
ＳｅｌＰに対するｓｉＲＮＡの例はＴａｋｅｍｏｔｏ，Ａ．Ｓ．ら，Ｅｔｈｎｉｃｉｔｙ  ＆  Ｄｉｓｅａｓｅ  ２０１０，２０，ＳＩ−９２（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。これらのｓｉＲＮＡはビオチンで誘導体化されて、本発明のｓｉＲＮＡ−ビオチンコンジュゲートを与え、これは適当なトランスフォーム細胞または非健常細胞に薬物を運搬する。
【００５８】
ＡＰＰ遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡの例はＡｍｂｉｌｉ，Ｔ．Ｒ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉ．２０１２，４（３），３４１（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。これらのｓｉＲＮＡはビオチンで誘導体化されて、本発明のｓｉＲＮＡ−ビオチンコンジュゲートを与え、これは適当なトランスフォーム細胞または非健常細胞に薬物を運搬する。
【００５９】
ＢＡＣＥ１  ｍＲＮＡ発現を制御する調節性非コード化ＲＮＡの例はＦａｇｈｉｈｉ，Ｍ．Ａ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００８，１４（７），７２３（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。これらのｓｉＲＮＡはビオチンで誘導体化されて、本発明のｓｉＲＮＡ−ビオチンコンジュゲートを与え、これは適当なトランスフォーム細胞または非健常細胞に薬物を運搬する。
【００６０】
ＡＰＰのプロセッシングに対する効果に関する１５，２００個の遺伝子のｓｉＲＮＡスクリーニングの例はＭａｒｉｎｅ，Ｓ．ら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２００７，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｔｏ  Ｖｏｌ  ４３，ｘｘｉｉ（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。これらのｓｉＲＮＡはビオチンで誘導体化されて、本発明のｓｉＲＮＡ−ビオチンコンジュゲートを与え、これは適当なトランスフォーム細胞または非健常細胞に薬物を運搬する。
【００６１】
本発明のもう１つの態様は、イメージングを要する対象に、診断剤を含む前記組成物のいずれかの検出可能な量を投与し、イメージを生成する工程を含む、対象のイメージを生成する方法に関する。例えば、インビトロまたはエクスビボＡＤの診断のために、ｓｉＲＮＡ−ビオチン−診断剤または診断剤−ｓｉＲＮＡ−ビオチン（ここで、該診断剤はタグ、例えば発蛍光団である）をアミロイドベータまたは脳薄片と共にインキュベートし、イメージ生成のために現像することが可能であろう。あるいは、ＡＤ診断のために、ｓｉＲＮＡ−ビオチン−診断剤または診断剤−ｓｉＲＮＡ−ビオチン（ここで、該診断剤は放射性核種である）を哺乳動物に投与し、ついで脳に取り込ませ、速度論的挙動を用いることが可能であろう。正常脳領域は罹患脳領域とは異なることが見出されるであろう。
【００６２】
ある実施形態においては、該化合物は少なくとも１つのビオチン基を含む。ある実施形態においては、該化合物は少なくとも２つのビオチン基を含む。ある実施形態においては、該診断剤は金属を含み、該方法はＭＲＩを含む。ある実施形態においては、該診断剤はＧｄ３＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋またはＣｒ３＋を含む。
【００６３】
ある実施形態においては、本発明は、該対象がヒトである前記方法のいずれかに関する。
【００６４】
医薬組成物
もう１つの態様においては、本発明は、１以上の医薬上許容される担体（添加剤）および／または希釈剤と共に製剤化された前記のビオチン化組成物の１以上の治療的有効量を含む医薬上許容される組成物を提供する。後記に詳細に記載されているとおり、本発明の医薬組成物は、以下のものを包含する固体または液体形態での投与のために特別に製剤化されうる：（１）経口投与に適合化されたもの、例えば飲薬（水性または非水性溶液または懸濁液）、錠剤、例えば頬側、舌下および全身吸収を意図したもの、ボーラス、散剤、顆粒剤、舌への適用のためのペースト剤；（２）非経口投与に適合化されたもの、例えば皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外注射によるもの、例えば無菌溶液もしくは懸濁液、または徐放製剤；（３）局所適用に適合化されたもの、例えばクリーム剤、軟膏剤または制御放出パッチまたはスプレー剤（皮膚に適用されるもの）；（４）膣内または直腸内投与に適合化されたもの、例えばペッサリー、クリーム剤または泡剤；（５）舌下投与に適合化されたもの；（６）眼投与に適合化されたもの；（７）経皮投与に適合化されたもの；あるいは（８）鼻腔内投与に適合化されたもの。
【００６５】
前記のとおり、本化合物の或る実施形態は、塩基性官能基、例えばアミノまたはアルキルアミノを含有することが可能であり、したがって、医薬上許容される酸と医薬上許容される塩を形成しうる。この場合の「医薬上許容される塩」なる語は本発明の化合物の比較的無毒性の無機および有機酸付加塩を意味する。これらの塩は投与ビヒクル中で又は剤形製造プロセスにおいてインシトゥ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で製造されることが可能であり、あるいは、遊離塩基形態の本発明の精製化合物を適当な有機または無機酸と別個に反応させ、そのようにして生じた塩を後続の精製中に単離することにより製造されうる。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩およびラウリルスルホン酸塩などが含まれる（Ｂｅｒｇｅら（１９７７）“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ”，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９）。
【００６６】
本化合物の医薬上許容される塩には、例えば無毒性有機または無機酸に由来する、該化合物の通常の無毒性塩または第四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、そのような通常の無毒性塩には、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などのような無機酸に由来するもの；および例えば酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イソチオン酸などのような有機酸から製造される塩が含まれる。
【００６７】
他の場合には、本発明の化合物は１以上の酸性官能基を含有することが可能であり、したがって、医薬上許容される塩基との医薬上許容される塩を形成しうる。これらの場合における「医薬上許容される塩」なる語は、本発明の化合物の比較的無毒性の無機および有機塩基付加塩を意味する。これらの塩は、同様に、投与ビヒクル中で又は剤形製造プロセスにおいてインシトゥ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で製造されることが可能であり、あるいは、遊離酸形態の本発明の精製化合物を、適当な塩基、例えば医薬上許容される金属カチオンのヒドロキシド、カルボナートもしくはビカルボナートと、またはアンモニアと、または医薬上許容される有機第一級、第二級もしくは第三級アミンと別個に反応させることにより製造されうる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類塩には、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムおよびアルミニウム塩などが含まれる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが含まれる（例えば、Ｂｅｒｇｅら，前掲を参照されたい）。
【００６８】
湿潤剤、乳化剤および滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味、香味および芳香剤、保存剤および抗酸化剤も該組成物中に存在しうる。
【００６９】
医薬上許容される抗酸化剤の例には、（１）水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど；および（３）金属キレート化剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが含まれる。
【００７０】
本発明の製剤には、経口、鼻腔内、局所（頬側および舌下を含む）、直腸、膣および／または非経口投与に適したものが含まれる。該製剤は単位投与形として簡便に提供されることが可能であり、薬学分野でよく知られたいずれかの方法により製造されうる。単一剤形を製造するために担体物質と組合されうる有効成分の量は、治療される宿主、個々の投与方法に応じて変動するであろう。単一剤形を製造するために担体物質と組合されうる有効成分の量は、一般に、治療効果をもたらす、該化合物の量であろう。一般に、１００％のうち、この量は有効成分約０．１％〜約９９％、好ましくは約５％〜約７０％、最も好ましくは約１０％〜約３０％の範囲となるであろう。
【００７１】
ある実施形態においては、本発明の製剤は、シクロデキストリン、セルロース、リポソーム、ミセル形成剤、例えば胆汁酸、ならびに重合体担体、例えばポリエステルおよびポリ無水物からなる群から選択される賦形剤と、本発明の化合物とを含む。ある実施形態においては、前記製剤は本発明の化合物を経口的に生物利用可能にする。
【００７２】
これらの製剤または組成物の製造方法は、本発明の化合物を担体と一緒にし、所望により、１以上の補助成分と一緒にする工程を含む。一般に、該製剤は、本発明の化合物を液体担体または微粉砕固体担体またはそれらの両方と均一かつ密接に一緒にし、ついで必要に応じて、産物を成型することにより製造される。
【００７３】
経口投与に適した本発明の製剤は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、トローチ剤（風味基剤、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカントを使用する）、散剤、顆粒剤の形態であることが可能であり、あるいは、水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、またはトローチ剤（不活性基剤、例えばゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアを使用する）として、および／または洗口剤などとしての形態であることが可能であり、それぞれは本発明の化合物の所定量を有効成分として含有する。本発明の化合物はボーラス、舐剤またはペースト剤としても投与されうる。
【００７４】
経口投与用の本発明の固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣剤、散剤、顆粒剤、トローチ剤など）においては、１以上の医薬上許容される担体、例えばクエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、および／または（１）充填剤または増量剤、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸；（２）結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギナート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシア；（３）湿潤剤、例えばグリセロール；（４）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のシリカートおよび炭酸ナトリウム；（５）溶解遅延剤、例えばパラフィン；（６）吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物および界面活性剤、例えばポロキサマーおよびラウリル硫酸ナトリウム；（７）湿潤剤、例えばセチルアルコール、グリセロールモノステアラートおよび非イオン界面活性剤；（８）吸収剤、例えばカオリンおよびベントナイトクレー；（９）滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸およびそれらの混合物；（１０）着色剤；および（１１）制御放出用物質、例えばクロスポビドンまたはエチルセルロースのいずれかと、該有効成分とを混合する。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、該医薬組成物は緩衝剤をも含みうる。ラクトースまたは乳糖、および高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用して、軟および硬殻ゼラチンカプセルにおける充填剤として、類似タイプの固体組成物が使用されうる。
【００７５】
錠剤は、所望により１以上の補助成分と共に、圧縮または成形により製造されうる。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性剤または分散剤を使用して製造されうる。成形錠剤は、適当な機械で、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を成形することによって製造されうる。
【００７６】
錠剤、ならびに本発明の医薬組成物の他の固体剤形、例えば糖剤、カプセル剤、丸剤および顆粒剤は、所望により、刻み目が入れられ、またはコーティングおよび殻（例えば、腸溶コーティングおよび医薬製剤分野でよく知られた他のコーティング）を伴って製造されうる。それらはまた、例えば、所望の放出プロファイルをもたらす種々の比率のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他の重合体マトリックス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを使用して、その内部の有効成分の遅延または制御放出をもたらすように製剤化されうる。それらは迅速放出のために製剤化（例えば、凍結乾燥）されうる。それらは、例えば、細菌保持フィルターによる濾過により滅菌されることが可能であり、あるいは、使用直前に滅菌水または何らかの他の滅菌注射可能媒体中に溶解されうる滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を含有させることにより滅菌されうる。これらの組成物はまた、所望により、混濁化剤を含有することが可能であり、専ら又は優先的に胃腸管の或る部分において、場合によっては遅延様態で、有効成分を放出する組成物のものでありうる。使用されうる包埋組成物の例には、高分子物質およびロウが含まれる。また、該有効成分は、適当な場合には、前記の賦形剤の１以上を含有するマイクロカプセル形態でありうる。
【００７７】
本発明の化合物の経口投与用の液体剤形には、医薬上許容されるエマルション（乳剤）、マイクロエマルション、溶液（水剤）、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤が含まれる。該液体剤形は、該有効成分の他に、当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ、胚油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物を含有しうる。
【００７８】
該経口組成物は、不活性希釈剤の他に、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味剤、香味剤、着色剤、香料および保存剤のような補助物質をも含みうる。
【００７９】
懸濁剤は、該活性化合物の他に、懸濁化剤、例えばエトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカントならびにそれらの混合物を含有しうる。
【００８０】
本発明の化合物の局所または経皮投与用剤形には、散剤、スプレー剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、溶液（水剤）、パッチおよび吸入剤が含まれる。該活性化合物は、医薬上許容される担体、および要求されうるいずれかの保存剤、バッファーまたはプロペラントと無菌条件下で混合されうる。
【００８１】
非経口投与に適した本発明の医薬組成物は、本発明の１以上の化合物を、１以上の医薬上許容される無菌等張水性または非水性溶液、分散液、懸濁液もしくは乳液、または無菌の注射可能な溶液もしくは分散液へと使用直前に還元（再構成）されうる無菌粉末と共に含み、それは糖、アルコール、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、意図される被投与者の血液と該製剤を等張にする溶質、または懸濁もしくは増粘剤を含有しうる。
【００８２】
本発明の医薬組成物において使用されうる適当な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適当な混合物、植物油、例えばオリーブ油、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが含まれる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング材の使用により、および分散液の場合に、必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持されうる。
【００８３】
これらの組成物はまた、補助剤、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤のようなアジュバントを含有しうる。対象化合物に対する微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール  ソルビン酸などの配合により保証されうる。また、等張化剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを該組成物に含有させることが望ましいかもしれない。また、吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの配合により、注射可能な医薬形態の持続的吸収がもたらされうる。
【００８４】
本発明の化合物がヒトおよび動物に医薬品として投与される場合、それらは単独で投与されることが可能であり、あるいは、医薬上許容される担体と共に例えば０．１〜９９％（より好ましくは１０〜３０％）の有効成分を含有する医薬組成物として投与されうる。
【００８５】
本発明の製剤は経口的、非経口的、局所的または直腸に投与されうる。それらは、もちろん、各投与経路に適した形態で投与される。例えば、それらは、錠剤またはカプセル形態で、および注射、吸入、目薬、軟膏剤、坐剤などにより、および注射、注入または吸入による投与により、およびローション剤または軟膏剤により局所的に、および坐剤により直腸に投与される。経口投与が好ましい。
【００８６】
これらの化合物は、いずれかの適当な投与経路により、例えば、経口的、鼻腔内（例えば、スプレー剤によるもの）、直腸、膣内、非経口的、大槽内および局所的（例えば、散剤、軟膏剤または滴剤によるもの）、例えば頬側および舌下投与により、治療のためにヒトおよび他の動物に投与されうる。
【００８７】
選択された投与経路に無関係に、本発明の化合物は適当な水和形態および／または本発明の医薬組成物中で使用されることが可能であり、当業者に公知の通常の方法により、医薬上許容される剤形に製剤化される。
【００８８】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与レベルは、患者に対して毒性となることなく個々の患者、組成物および投与方法に関して所望の治療応答を達成するのに有効である該有効成分の量を得るために改変されうる。
【００８９】
選択される投与レベルは、使用される本発明の個々の化合物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与の時間、使用される個々の化合物の排泄または代謝の速度、吸収の速度および度合、治療の持続時間、使用される個々の化合物と併用される他の薬物、化合物および／または物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康状態および過去の病歴ならびに医学分野でよく知られている同様の要因を含む種々の要因に左右されるであろう。
【００９０】
当該技術分野における通常の技術を有する医師または獣医は、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方することが可能である。例えば、該医師または獣医は、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルより低いレベルの、該医薬組成物において使用される本発明の化合物の用量から開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させる。
【００９１】
一般に、本発明の化合物の適切な１日量は、治療効果をもたらすのに有効な最低用量である該化合物の量となろう。そのような有効用量は、一般に、前記の要因に左右されるであろう。一般に、患者に対する本発明の化合物の経口、静脈内、脳室内および皮下用量は、示されている鎮痛作用のために使用される場合、約０．０００１〜約１００ｍｇ／キログラム体重／日の範囲となるであろう。
【００９２】
所望により、該活性化合物の有効１日量は、１日の全体にわたって適当な間隔で別々に投与される２、３、４、５、６またはそれ以上の部分用量として、所望により単位投与形として、投与されうる。好ましい投与は１日１回の投与である。
【００９３】
本発明の化合物は単独で投与されることが可能であるが、該化合物を医薬製剤（組成物）として投与することが好ましい。
【００９４】
本発明の化合物は、他の医薬の類推により、ヒトまたは獣医学における使用のために、いずれかの簡便な方法で、投与のために製剤化されうる。
【００９５】
もう１つの態様においては、本発明は、１以上の医薬上許容される担体（添加剤）および／または希釈剤と共に製剤化された前記の本化合物の１以上の治療的有効量を含む医薬上許容される組成物を提供する。後記に詳細に記載されているとおり、本発明の医薬組成物は、以下のものを包含する固体または液体形態での投与のために特別に製剤化されうる：（１）経口投与に適合化されたもの、例えば飲薬（水性または非水性溶液または懸濁液）、錠剤、ボーラス、散剤、顆粒剤、舌への適用のためのペースト剤；（２）非経口投与に適合化されたもの、例えば皮下、筋肉内または静脈内注射によるもの、例えば無菌溶液または懸濁液；（３）局所適用に適合化されたもの、例えば、皮膚、肺または粘膜に適用されるクリーム剤、軟膏剤またはスプレー剤；（４）膣内または直腸内投与に適合化されたもの、例えばペッサリー、クリーム剤または泡剤；（５）舌下または頬側投与に適合化されたもの；（６）眼投与に適合化されたもの；（７）経皮投与に適合化されたもの；あるいは（８）鼻腔内投与に適合化されたもの。
【００９６】
この治療を受ける患者は、霊長類動物、特にヒト、および他の哺乳動物、例えばウマ、ウシ、ブタおよびヒツジならびに家禽およびペット全般を含む、該治療を要する任意の動物である。
【００９７】
本発明の化合物は単独で又は医薬上許容される担体と混合して投与されることが可能であり、抗微生物剤、例えばペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシドおよび糖ペプチドと共に投与されうる。したがって、併用療法は、活性化合物の逐次的投与、同時投与および別々の投与を含み、この場合、後続物が投与された際に、最初に投与されたものの治療効果が完全には消失しないようにする。
【００９８】
キット
ある実施形態においては、本発明は、アルツハイマー病を治療またはイメージングするためのキットに関する。例えば、キットは、前記の１以上のビオチン化組成物、および所望により、それらの使用のための説明を含みうる。更に他の実施形態においては、本発明は、１以上の医薬組成物もしくは診断用組成物、および／またはそのような組成物の投与を行うための１以上の装置を含むキットを提供する。例えば、本キットは、医薬組成物または診断用組成物と、直接注射を行うためのカテーテルとを含みうる。
【実施例】
【００９９】
本発明は一般的に記載されているが、以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。該実施例は本発明の或る態様および実施形態を単に例示する目的で記載されており、本発明を限定するものではない。
【０１００】
［実施例１］
５’−ビオチン−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＵＵ−Ｄｙ５４７−３’
【０１０１】
［実施例２］
５’−Ｄｙ５４７−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＵＵ−ビオチン−３’
【０１０２】
［実施例３］
５’−ビオチン−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＳＡＧＵＵ−Ｄｙ５４７−３’
【０１０３】
［実施例４］−インビボでの細胞取り込み
該ビオチン−ｓｉＲＮＡ組成物を５０ｎＭで加え、４時間培養し、ついで２０μｌのＦＢＳを加えて、培養を４０時間継続した。ウェルをＰＢＳで洗浄し、核対比染色剤としてのヘキスト（Ｈｏｅｃｈｅｓｔ）（１μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。Ｄｙ５４７（赤）、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）（青）および位相差のイメージを、Ｏｐｅｎｌａｂイメージングソフトウェアにより制御される蛍光顕微鏡を使用して捕捉し、それは３つのイメージを合体させた。該蛍光研究からの２つの最良のｓｉＲＮＡに関して生物発光をアッセイした。Ａ５４９Ｌｕｃ細胞を９６ウェルプレートの１ウェル当たり５，０００細胞でプレーティングした。該ｓｉＲＮＡを５、５０および２５０ｎＭで無血清培地（５０μｌ／ウェル）中で４時間インキュベートし、ついで通常の培地（Ｄ’ＭＥＭ中の１０％  ＦＢＳ）を加えて２００μｌにし、２日間培養した。細胞を新鮮培地で洗浄し、ルシフェリンを０．５ｍｇ／ｍｌで加えた。Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して発光を読取った。アッセイを３回重複して行い、平均値をプロットした。図４〜７を参照されたい。
【０１０４】
［実施例５］
本発明者らは、本発明において、ヒトタウタンパク質の突然変異発現および有害発現をノックダウンするためのｓｉＲＮＡ干渉技術を示唆し、それに取り組んだ。このために、本発明者らは、タウ遺伝子においてヒトＰ３０１Ｓ突然変異を発現するトランスジェニックマウスモデルを特徴づけした。Ａｌｌｅｎ，Ｂ．ら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２２，９３４０−５１（２００２）。このモデルはタウ凝集、および特に運動行動における、以下の重篤な行動障害を示す。該症状は成体初期においては微々たるものであり有意なものではないが、自発的後脚立行動のような試験において捕捉されうる（図１Ａ）。この行動はこのモデルにおいては数か月を経るにつれて徐々に低減し、３月齢における成体初期と比較して６月齢で有意になる。５〜６カ月後、該動物は特に後肢における麻痺の重篤な徴候をも示す。これらの行動は視覚的に観察され、歩行距離を測定する行動試験（開放野外条件中；図１Ｂ）および回転棒上で費やす時間を測定する行動試験（ロータロッド試験；図１Ｃ）において容易に捕捉されうる。これらのデータは該モデルに関する重要な情報を提供し、どのような試験形態を用いるべきか、およびタウタンパク質のｓｉＲＮＡ干渉のような治療戦略の有意な行動的効果がどの時点で評価されうるかに関する重要な情報を提供する。
【０１０５】
該ｓｉＲＮＡを細胞内に運搬するために、幾つかの技術が示唆され、試験されており、様々な成功を収めている。本発明者らは、本発明においてインビボにおいて複数のトランスフェクション剤を調べ、インビトロにおいてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に基づく及びＡｃｃｅｌｌ−ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）に基づく運搬を調べた。まず、本発明者らは、「裸」ｓｉＲＮＡ分子を使用して、強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）およびハウスキーピングタンパク質  グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のｓｉＲＮＡ干渉効力を評価した。Ｈｉ−Ｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｕｉｇｅｎ）、Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、Ｘ−ｔｒｅｍｅ  Ｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｓａｉｎｔ−ＲＥＤ（Ｓｙｎｖｏｌｕｘ）、Ｔｒａｎｓ−ＴＫＯ（Ｍｉｒｕｓ）およびＩｎｔｅｒｆｅｒｒｉｎ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）を含む幾つかのトランスフェクション剤を使用した。初代Ｅ１５−１７  アクチン−ｅＧＦＰトランスジェニックおよびＣ５７／Ｂ６胚由来の皮質培養ならびにヒト中脳細胞培養（ＬｕｈＭｅｓ）を調製し、使用した。
【０１０６】
更に、Ｃｕｌｍｓｅｅ教授が行った、トランスフェクション剤としてのリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の使用の検討を始めた。本発明者らは、本発明において、本発明者らのトランスジェニックＰ３０１Ｓ突然変異タウマウスに由来するＰ３０１Ｓ突然変異を発現する初代皮質細胞培養ならびにＬｕｈＭｅｓ細胞およびマウス神経芽細胞腫細胞（ＨＴ２２）において、ホームキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨおよびシクロフィリンＢ（ＣｙｃｌｏＢ）に対して「裸」および修飾（ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）ｓｉＲＮＡの両方を使用した。また、ホワイトヘッド（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ）のｓｉＲＮＡ予想ツール（ｈｔｔｐ：／／ｊｕｒａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｂｉｏｃ／ｓｉＲＮＡｅｘｔ／ｈｏｍｅ．ｐｈｐ）を用いて、ヒトＭＡＰＴ遺伝子に関する良好なｓｉＲＮＡ配列を予想した。ヒトおよびマウスＭＡＰＴ遺伝子間の異型遺伝子配列を標的化する、より低いアフィニティの内因性マウスタウを伴う、ヒト突然変異Ｐ３０１Ｓタウを標的化するｓｉＲＮＡを設計した。４個の配列を、マウスタウ遺伝子に対するそれらの不良な重複、および任意のマウス遺伝子に対する相対的に低い重複に基づいて選択した。ＧＤＰＤＨまたはＣｙｃｌｏＢの単体またはプール、あるいはそれらの４個のタウ配列を単独で又はプールとして使用したが、本発明者らは、リポフェクタミン２０００を使用するいずれの一貫したノックダウンも得ることができなかった。主目的はタンパク質レベルを低下（ノックダウン）させることであったため、ＲＮＡレベルを系統的に観察する代わりにウエスタンブロットを主要技術として用いた。該トランスフェクション剤は信頼しうる且つ一貫したタンパク質ノックダウンを全くもたらさなかったため、Ｄｈａｒｍａｃｏｎにより開発された新規ＡｃｃｅｌｌｓｉＲＮＡを実験的に試験することを開始した。Ａｃｃｅｌｌ−ｓｉＲＮＡは、トランスフェクション剤を使用しなくても細胞に進入するように改変されており、それは、インビボ用途に、より適している。初代ニューロン皮質培養およびＬｕｈＭｅｓ細胞の両方においてＡｃｃｅｌｌ−ｓｉＲＮＡを試験した。この場合、ウエスタンブロット（図２Ａ）により示されるとおり、ＧＡＰＤＨおよびＣｙｃｌｏＢタンパク質が両方の細胞型において有意にノックダウンされうることを示すことができた。両方の試験細胞に関して、より強力なタンパク質ノックダウンがＣｙｃｌｏＢについて観察された。更に、予め設計されたＡｃｃｅｌｌ−ｓｉＲＮＡをタウタンパク質（４個の配列のｓｍａｒｔＰｏｌｌ）に対して試験した。同様に、ここでも、初代皮質ニューロン（僅か２５０ｎＭの濃度のｓｉＲＮＡで）（６０〜９５％；図２Ｃ）およびヒト中脳（ＬｕｈＭｅｓ）細胞（１２５ｎＭで）（７５〜９５％；図２Ｄ）の両方において、ヒトおよびマウスタウタンパク質を有意にノックダウンすることができた。ＬｕｈＭｅｓ細胞においてはトランスフェクションの後の既に７２時間の時点で、そして該初代ニューロンにおいては９６〜１４４時間の時点で、相当なタンパク質ノックダウンが観察された。
【０１０７】
該ｓｉＲＮＡをインビボで運搬するために、げっ歯類脳における無ベクターＡｃｃｅｌｌ−ｓｉＲＮＡトランスフェクションおよびＰＥＩに基づく運搬を研究した。低分子量ＰＥＩ（Ｊｅｔ−ＰＥＩおよびＦ２５  ＰＥＩ）はＰＥＩおよびＲＮＡ分子の非共有結合形成に基づくものであり、ここで、該ＲＮＡは保護され、該複合体はエンドサイトーシスにより細胞内に進入する。本発明者らは、アクチン−ｅＧＦＰ発現マウスの線条体における単一ＰＥＩ注射の後でＧＦＰ蛍光およびＮｅｕＮ免疫染色の著しい喪失を見出した（図３ＡおよびＢ）。
【０１０８】
ＡｃｃｅｌｌｓｉＲＮＡ系を使用して、ｓｉＲＮＡトランスフェクションをインビボで試験した。インビボでの細胞のトランスフェクションおよび該分子の脳内注射の分布を評価するために、ｓｉＲＮＡ分子がフルオレセイン（ＦＡＭ）色素で標識されたＡｃｃｅｌｌ−ｓｉＲＮＡを使用した。２μｌ（０．０５μｍｏｌ／μｌ）ｓｉＲＮＡの単一注射は線条体および脳梁（ｃｃ）／皮質において強力な蛍光シグナルを与え、これは、３日後にインビボで、皮質の腹側部からｃｃを介して線条体へと伸長する柱状物として観察される（図３Ｃ）。進行中のものであるが、本発明者らは、タウに対する予め設計されたＡｃｃｅｌｌ−ｓｉＲＮＡの単一用量（３μｌ中の０．０６ｎｍｏｌ）を注射し、このｓｉＲＮＡは、ヒトＰ３０１Ｓ突然変異タウトランスジェニックマウスの海馬および皮質（該マウスモデルにおける突然変異ヒトタウの最も頑強な発現および過剰リン酸化を示す領域）において、初代ニューロン培養において、有意なノックダウンを示した。
【０１０９】
本発明者らのデータはヒトタウ関連疾患の臨床関連モデルにおけるｓｉＲＮＡ干渉の効果の研究のための重要な段階を表している。更に、該疾患の動物モデルにおける適用はｓｉＲＮＡ干渉ならびにタウオパチーおよび関連障害に対する治療としてのその適用の効果を更に解明するであろう。
【０１１０】
［実施例６］
ｓｈＲＮＡプラスミド構築
２つのプライマー、すなわち、フォワード：５’−ＣＡＧＧＡＣＴＡＧＴＣＴＴＴＴＡＧＧＴＣＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＴＴＴＧＴＡＡＣＣＧＴＴＧＧＴＴＴＣＣＧＴＡＧＴＧＴＡ−３’（配列番号９）およびリバース：５’−ＴＴＣＧＡＡＣＣＧＧＧＧＡＣＣＴＴＴＣＧＣＧＴＧＴＴＡＧＧＣＧＡＡＣＧＴＧＡＴＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＴＡＣＧＧＡＡ  ＡＣＣＡＡＣ−３’（配列番号１０）をアニールさせ、該プライマーをＰＣＲにより伸長させ、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してそれらをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター内にクローニングすることにより、ｔＲＮＡ−バリンプロモーターを構築した。鋳型としての該Ｔｏｐｏ  ＴＡベクター内の得られたｔＲＮＡ−バリンプロモーター、前記フォワードプライマーおよび後記リバースプライマーを使用して、頭部−尾部の２１ｂｐのｓｈＲＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。ついで各ｓｈＲＮＡ断片をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター内にクローニングした。ｔＲＮＡ−バリン駆動性ｓｈＲＮＡの生成のために使用したリバースプライマーは以下のとおりである。
【０１１１】
種々雑多なｔｖＭｉｓｓ．
ＡＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＣＴＴＣＣＣＣＧＴＣＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＧＧＧＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＧＡＡＣＣＧＧＧＧＡＣＣＴＴＴＣＧ（配列番号１１）。
【０１１２】
Ｔａｕ．ｔｖＴａｕ：
ＡＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＣＡＧＧＴＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＣＧＡＴＴＴＴＡＣＴＴＣＣＡＣＣＴＧＧＣＣＡＣＣＴＴＣＧ  ＡＡＣＣＧＧＧＧＡＣＣＴＴＴＣＧ（配列番号１２）。
【０１１３】
ｔｖＡ１０：
ＡＡＡＡＡＡＧＧＴＧＧＣＣＡＧＡＴＧＧＡＡＧＴＡＡＡＣＣＡＡＧＣＴＴＣＧＴＴＴＡＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＡＣＣＣＴＴＣＧＡＡＣＣＧＧＧＧＡＣＣＴＴＴＣＧ（配列番号１３）。
【０１１４】
ＡＰＰ．ｔｖＡＰＰ：
ＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＴＣＴＴＣＡＣＴＴＣＡＣＴＴＣＧＡ  ＡＣＣＧＧＧＧＡＣＣＴＴＴＣＧ（配列番号１４）。
【０１１５】
ｔｖＴ１０／Ｃ１１：
ＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＧＡＡＴＣＴＧＧＡＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡＴＴＣＡＣＴＴＣＡＣＴＴＣＧＡ  ＡＣＣＧＧＧＧＡＣＣＴＴＴＣＧ（配列番号１５）。
【０１１６】
細胞培養およびトランスフェクション
Ｃｏｓ−７およびＨｅＬａ細胞の培養方法は既に記載されている。プラスミドおよびｓｉＲＮＡを、７０〜９０％のコンフルエンシーでプレーティングされた細胞を含有する１２ウェルプレートにおいて、リポフェクタミン・プラス（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で一過性にトランスフェクトした。注記されている場合を除き、５：１の比のｓｉＲＮＡと発現プラスミドとを細胞内にトランスフェクトし、一方、ｔＲＮＡ−バリンｓｈＲＮＡ実験では、１０：１の比のｓｈＲＮＡプラスミドと発現プラスミドとを使用した。これらの条件下、ランダムフィールドにおける蛍光生細胞の視覚的計数によれば、トランスフェクション効率は５０〜７０％の範囲である（データ非表示）。
【０１１７】
ウエスタンブロット分析
ＧＦＰおよびタウ構築物を発現するＣｏｓ−７細胞からのライセートをトランスフェクションの２４時間後に集め、一方、ＡＰＰおよびＡＰＰｓｗ発現細胞ライセートを４８時間の時点で集めた。内因性ラミンを発現するＨｅＬａ細胞からのライセートを抗ラミンｓｉＲＮＡのトランスフェクションの後の７２時間の時点で集めた。既に報告されているとおりにウエスタンブロットによりライセートを分析した。ＧＦＰおよびラミンをそれぞれ抗ＧＦＰマウスモノクローナル抗体（１：１０００希釈；Ｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎａｋａ−ｋｕ  Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）および抗ラミンヤギポリクローナル抗体（１：２５希釈；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）で検出した。この研究において使用した追加的抗体には、抗タウマウスモノクローナル抗体（１：５００希釈）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、２２Ｃ１１抗ＡＰＰマウスモノクローナル抗体（１：５００希釈）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、およびローディング対照としての、α−チューブリンに対するマウスモノクローナル抗体（１：２０  ０００希釈）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）が含まれる。二次抗体はペルオキシダーゼ共役ロバ抗ヤギまたはペルオキシダーゼ共役ロバ抗マウス（１：１５  ０００希釈）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）であった。
【０１１８】
結果
関心のある遺伝子に対するｓｉＲＮＡを作製するための効率的方法は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写反応において、標的遺伝子に相補的な短いＲＮＡ二本鎖を製造することである。しかし、Ｔ７ポリメラーゼのためのプライミング要件は、Ｇが、転写を開始させるプライミングヌクレオチドであることを要求する。これは、対応するインビトロ転写ＲＮＡ二本鎖が産生されうる標的遺伝子におけるヌクレオチド位置を限定する。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼにより課されるこの制限を克服するために、本発明者らは、５’末端に非相補的Ｇヌクレオチドを含有するｓｉＲＮＡを設計した。生じたｓｉＲＮＡは、該標的に対する単一の５’ミスマッチを伴うアンチセンス鎖上の２０個の相補的ヌクレオチドを含有する。開始Ｇのこの含有は、原理上は、標的遺伝子の任意の２０ヌクレオチド断片に対してｄｓＲＮＡがインビトロで産生されることを可能にするはずである。
【０１１９】
この非相補的Ｇの付加が、有効なｓｉＲＮＡを尚も産生したかどうかを判定するために、本発明者らは、この新規「＋Ｇ」配置のサイレンシング能を、標的に対して完全に相補的なインビトロ合成ｓｉＲＮＡと比較した。レポーター遺伝子産物ＧＦＰおよび内因性遺伝子産物ラミンの抑制が評価されうる。ＧＦＰ  ｍＲＮＡに対する完全なマッチまたは単一５’Ｇミスマッチを含有するｓｉＲＮＡおよびＧＦＰをコードするプラスミドでＣｏｓ−７細胞をコトランスフェクトした。複数のミスマッチを含有するｓｉＲＮＡを、該トランスフェクションまたはｓｉＲＮＡの非特異的効果に関する陰性対照として使用した。蛍光顕微鏡法およびウエスタンブロットにより評価されたとおり、該５’ミスマッチｓｉＲＮＡは、該ＧＦＰ  ｍＲＮＡの同一領域に標的化された完全マッチｓｉＲＮＡの場合に類似したサイレンシング効率を示した。
【０１２０】
内因性遺伝子産物ラミンの発現を抑制するこれらのｓｉＲＮＡの能力を調べることが可能である。ＨｅＬａ細胞を、陰性対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＭｉｓｓ）、または内因性ラミニンに対するｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、トランスフェクションの７２時間後に発現を評価した。ラミン発現は、ｓｉラミン＋Ｇでトランスフェクトされた細胞においては顕著に低減したが、ｓｉＭｉｓｓ＋Ｇでトランスフェクトされた細胞においては頑強（ロウバスト）なままであった。したがって、「＋Ｇ」ｓｉＲＮＡは尚もＲＮＡ干渉の有効な誘発因子である。
【０１２１】
考察
ＲＮＡｉはヒト疾患に対する潜在的治療としての有望さを保持している。しかし、遺伝子特異的または対立遺伝子特異的ｓｉＲＮＡを成功裏に開発する場合の課題は、所望のサイレンシング特性を有するｓｉＲＮＡの選択および設計である。転写産物の種々の領域に標的化される個々のｓｉＲＮＡは、しばしば、効力および特異性における顕著な相違を示す。典型的に、幾つかの標的部位および設計は、最適サイレンシングが達成される前に試験される必要がある。本明細書において、本発明者らは、化学合成ｓｉＲＮＡ二本鎖の時間およびコストの欠点を回避するだけでなく、Ｔ７ポリメラーゼでのインビトロ転写により課される配列制限を除去する簡便な方法を記載している。
【０１２２】
ｓｉＲＮＡ二本鎖の５’における単一Ｇミスマッチの挿入は、生じるｓｉＲＮＡのサイレンシング効力を損なうことなく、Ｔ７ポリメラーゼによる効率的なプライミングを可能にした。そのような「＋Ｇ」ｓｉＲＮＡは標的化遺伝子における実質的に任意の点に対して迅速に作製され、効力に関して試験されうる。ｓｉＲＮＡ設計のためのこのアプローチは有効なｓｉＲＮＡのインビトロ作製を促進するはずである。タウおよびＡＰＰに関して本明細書中で示されているとおり、これらのインビトロ転写二本鎖は次いで、サイレンシング能および対立遺伝子特異性を保有するｓｈＲＮＡプラスミドを製造するためのガイド（ｇｕｉｄｅ）として働きうる。このアプローチは、関心のある実質的に全ての遺伝子の最適化サイレンシングのための、改良された逐次的方法に相当する。
【０１２３】
ＲＩＳＣ内への該ガイドまたはアンチセンス鎖の優先的進入は、該アンチセンス鎖内に５’ミスマッチを導入する一方でセンス鎖の５’末端において完全塩基対形成を維持することにより達成されうる。これはＲＩＳＣ複合体内への該アンチセンス鎖の進入を最大し、また、該センス鎖による潜在的標的外抑制を低減する。ｓｉＲＮＡ設計のための「＋Ｇ」アプローチは、該ガイド鎖の好ましいＲＩＳＣ進入を示すはずであるこの原理に基づくｄｓＲＮＡの設計に完全に合致している。
【０１２４】
ある実施形態においては、タウおよびＡＰＰに関しては、ミスマッチの中央配置は突然変異対立遺伝子の最適な対立遺伝子特異的サイレンシングをもたらす。例えば、ＡＰＰｓｗ二重突然変異に関しては、それらの２つのミスマッチを予想ＲＩＳＣ切断部位の真向かいに配置することは高特異的対立遺伝子識別をもたらした。他の研究者による最近の知見と総合すると、これらの結果は、対立遺伝子特異的サイレンシングの成功のための、突然変異の中央配置の重要性を示している。
【０１２５】
しかし、タウに関しては、中央配置ミスマッチを含有するｓｉＲＮＡは野生型対立遺伝子に対する幾らかの活性を尚も保有していたい。これは、該ガイド鎖に沿った該ミスマッチの位置と該ミスマッチの化学性質との両方が、与えられたｍＲＮＡをＲＩＳＣ関連ヌクレアーゼが切断するのかどうかを決定するために重要であることを示唆している。これは、ｍＲＮＡとＲＩＳＣ関連ガイド鎖との間の予想構造の破壊が切断を妨げることを示唆している結果に合致している。インビトロでのＲＩＳＣ媒介切断の系統的試験は、該ガイド鎖の中央ヌクレオチドの向かい（多分、５’末端から９〜１１ヌクレオチドの位置）で切断が生じることを強く示唆している。完全な塩基対形成が最適であるが、幾つかのミスマッチはそれほど破棄的ではなく、部分的切断活性を尚も可能にする。例えば、ポリグルタミン疾患遺伝子ＭＪＤ１における単一ヌクレオチド変化を標的化するＲＮＡｉ研究において、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と標的ｍＲＮＡとの間のＧ−Ｇクラッシュ（ｃｌａｓｈ）は、野生型対立遺伝子をサイレンシングすることを完全に不可能にし、一方、該対立遺伝子突然変異は強力に抑制された。これとは対照的に、該ｓｉＲＮＡの中央に最適に配置されたタウ（Ｖ３３７Ｍ）突然変異の場合でさえも、本発明者らは野生型タウの幾らかのサイレンシングを観察し続けた。このことは、タウ突然変異の場合のそれほど破壊的でないＧ−ＵクラッシュがｓｉＲＮＡによる完全な対立遺伝子識別を可能にしないことを示唆している。そのような場合、追加的なミスマッチが該ｓｉＲＮＡ内に組込まれることが必要となりうる。
【０１２６】
本発明において開発されたＲＮＡｉ試薬はＡＤおよび関連痴呆に対する実験的および潜在的な治療上の進歩に相当する。タウおよびＡＰＰ切断産物Ａβの異常沈着はＡＤの発病のための中心的なものであるが、脳内のこれらのタンパク質の厳密な役割は依然として不明である。これらのｓｉＲＮＡ試薬は、突然変異体または野生型タウおよびＡＰＰの発現を選択的にサイレンシングするために使用可能であり、これらのタンパク質のニューロン機能を特定することを目的とした機能喪失実験を促進させるはずである。
【０１２７】
ｓｉＲＮＡの潜在的な治療的適用のために、本発明者らは、タウおよびＡＰＰの突然変異体または野生型形態をサイレンシングする発現ベクターを確立している。優性遺伝性ＡＤまたはタウオパチーを有する個体の場合、突然変異タンパク質の選択的除去は疾患を改善または更には予防しうるであろう。突然変異対立遺伝子の特異的サイレンシングの実証は、重要または不可欠な機能を有する遺伝子に対するアプローチの潜在的有用性を拡張する。ＡＰＰに関して、本発明者らはスウェーデン（Ｓｗｅｄｉｓｈ）二重突然変異体または野生型ＡＰＰの広く研究されている特異的サイレンシングを達成した。ＡＰＰｓｗを抑制する試薬はＡＤのマウスモデルにおけるＲＮＡｉ療法の試験において有用なはずであり、野生型ＡＰＰの低減は一般的な散発性形態のＡＤに対する治療的潜在性をも有しうる。ＡＤのアミロイドカスケード仮説に基づけば、最も選択的な介入は、意図されない標的に対する最低限度の効果を伴ってＡＰＰタンパク質産生を抑制する試薬であろう。Ａβ産生は、２つのプロテアーゼ、すなわち、β部位ＡＰＰ切断酵素ＢＡＣＥおよびγ−セクレターゼ複合体（これはプレセニリンを含有する）によるＡＰＰの切断を要する。したがって、ＡＤにおける追加的遺伝子標的には、ＢＡＣＥ、およびほとんどの家族性ＡＤの場合の優性作用性プレセニリン突然変異が含まれる。
【０１２８】
参考文献
本明細書中で挙げられている全ての刊行物および特許（後記に挙げられているものを含む）の全体を、各個の刊行物または特許が参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個別に示されている場合と同様に、参照により本明細書に組み入れることとする。矛盾が生じる場合には、本明細書におけるあらゆる定義を含む本出願が優先する。
【０１２９】
均等物
本発明は、とりわけ、ｓｉＲＮＡを含むビオチン化組成物を提供する。本発明の特定の実施形態が記載されているが、前記明細書は例示的であり、限定的ではない。本明細書を精査すれば、本発明の多数の変更が当業者に明らかとなるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年11月29日(2018.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｓｉＲＮＡ部分にコンジュゲートしたビオチン部分を含む組成物であって、
前記組成物が、抗体、抗原、アビジン又はストレプトアビジンを含まず、
前記ｓｉＲＮＡ部分が、配列番号２のヌクレオチド又は配列番号２に対して少なくとも９０％の配列相同性を有する核酸を含み、
前記組成物が、セレノプロテインＰをコードする遺伝子を部分的、実質的又は完全に欠失させ、サイレンシングし、不活性化し、妨害し、又はダウンレギュレーションする、組成物。
【請求項２】
組成物が、ｓｉＲＮＡとビオチンとの間のリンカーをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
診断剤をさらに含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
診断剤が、発蛍光団、発色団、化学発光剤、放射性核種、不対スピン原子、フリーラジカル及び造影剤からなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ビオチン部分及びｓｉＲＮＡ部分からなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
ｓｉＲＮＡ部分が、５’末端にグアノシンを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
ｓｉＲＮＡ部分のセンス又はアンチセンス鎖が、３０、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８又は１７ヌクレオチド長以下である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物の治療的有効量と、薬理学的に許容される担体又は希釈剤とを含む、薬理学的に許容される製剤であって、抗体、抗原、アビジン又はストレプトアビジンを含まない、製剤。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物の治療的有効量を含む、哺乳動物におけるアルツハイマー病の治療のための医薬組成物であって、抗体、抗原、アビジン又はストレプトアビジンを含まない、医薬組成物。
【請求項１０】
哺乳動物がヒトである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項３又は請求項４に記載の組成物の検出可能な量を含む、対象のイメージを生成するための組成物。
【請求項１２】
対象がヒトである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
哺乳動物におけるアルツハイマー病の治療のための医薬の製造における、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
対象のイメージを生成するための組成物の製造における、請求項３又は４に記載の組成物の使用。