(57)【要約】【課題】微乳頭構造を有する肺腺癌の性状をより正確に反映したヒト細胞株を提供する。【解決手段】微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣から直接作製されたヒト細胞株。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣から直接作製されたヒト細胞株。
【請求項２】
受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２１５５である、請求項１に記載の細胞株。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の細胞株を移植した非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の細胞株を用いた腫瘍マーカーのスクリーニング方法。
【請求項５】
試験化合物を請求項１又は２に記載の細胞株と接触させる工程と、前記細胞株の増殖を測定する工程と、を備える、抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
試験化合物を請求項３に記載の非ヒト哺乳動物に投与する工程と、前記試験化合物が投与された前記非ヒト哺乳動物中の前記細胞株の増殖を測定する工程と、を備える、抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の細胞株を備える、腫瘍マーカーのスクリーニング用キット。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の細胞株を備える、抗癌剤のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣から直接作製されたヒト細胞株及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は日本のみならず世界で最も高い罹患率と死亡率を有する癌である。肺癌の中でも腺癌の罹患率が最も多く、中でも微乳頭構造を有する肺腺癌は、原発巣から容易に遊離することから、脈管侵襲やリンパ節転移を起こし、予後不良である（例えば非特許文献１〜３を参照）。したがって、微乳頭構造を有する肺腺癌の病態解明及びより有効な治療法の開発が急務であるが、研究材料に乏しいのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Miyoshi T., et al., Early-stage lung adenocarcinomas with a micropapillary pattern, a distinct pathologic marker for a significantly poor prognosis., Am. J. Surg. Pathol., 27, 101-109, 2003.
【非特許文献２】Hoshi R., et al., Micropapillary clusters in early-stage lung adenocarcinomas: a distinct cytologic sign of significantly poor prognosis., Cancer, 102, 81-86, 2004.
【非特許文献３】Kamiya K., et al., Histopathological features and prognostic significance of the micropapillary pattern in lung adenocarcinoma., Mod. Pathol., 21, 992-1001, 2008.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在まで、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来するヒト細胞株は樹立されていない。原発巣に由来しない細胞株は、対象とする癌に由来するものであるか否かが明確でない場合がある。そこで、本発明は、微乳頭構造を有する肺腺癌の性状をより正確に反映したヒト細胞株を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下の通りである。
（１）微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来するヒト細胞株。
（２）受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２１５５である、（１）に記載の細胞株。
（３）（１）又は（２）に記載の細胞株を移植した非ヒト哺乳動物。
（４）（１）又は（２）に記載の細胞株を用いた腫瘍マーカーのスクリーニング方法。
（５）試験化合物を（１）又は（２）に記載の細胞株と接触させる工程と、前記細胞株の増殖を測定する工程と、を備える、抗癌剤のスクリーニング方法。
（６）試験化合物を（３）に記載の非ヒト哺乳動物に投与する工程と、前記試験化合物が投与された前記非ヒト哺乳動物中の前記細胞株の増殖を測定する工程と、を備える、抗癌剤のスクリーニング方法。
（７）ホロトランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン及びセレナイトを含有する、微乳頭構造を有する肺腺癌細胞用培地。
（８）（７）に記載の培地中で微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来する細胞を培養する工程を備える、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来する細胞株の樹立方法。
（９）ホロトランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン及びセレナイトを含有する、微乳頭構造を有する肺腺癌細胞の培地用添加剤。
（１０）（１）又は（２）に記載の細胞株を備える、腫瘍マーカーのスクリーニング用キット。
（１１）（１）又は（２）に記載の細胞株を備える、抗癌剤のスクリーニング用キット。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、微乳頭構造を有する肺腺癌の性状をより正確に反映したヒト細胞株を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】（ａ）は微乳頭構造及び乳頭構造を有する癌組織の構造を示す断面図である。（ｂ）は（ａ）のｂ−ｂ線における切断面を上から見た図である。（ｃ）は乳頭構造を有する癌組織の構造を示す断面図である。（ｄ）は（ｃ）のｄ−ｄ線における切断面を上から見た図である。
【図２】微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣腫瘍組織に由来する細胞を初代培養し、２５日目の顕微鏡写真である（倍率１０倍）。
【図３】北里Ｐ２１ＬＳ細胞株（継代数１５代）の顕微鏡写真である（倍率５倍）。
【図４】北里Ｐ２１ＬＳ細胞株（継代数１５代）の顕微鏡写真である（倍率５倍）。
【図５】３次元培養した北里Ｐ２１ＬＳ細胞株の顕微鏡写真である（継代数１４代、倍率５倍）。
【図６】（ａ）〜（ｈ）は、実験例２において、肺腺癌組織の微乳頭構造部分の組織切片を染色した結果を示す顕微鏡写真である（倍率２０倍）。
【図７】（ａ）〜（ｈ）は、実験例２において、肺腺癌組織の乳頭構造部分の組織切片を染色した結果を示す顕微鏡写真である（倍率２０倍）。
【図８】（ａ）〜（ｈ）は、実験例２において、Ｉ型コラーゲンコートされた細胞培養用ディッシュで培養した北里Ｐ２１ＬＳ細胞株の付着細胞部分を染色した結果を示す顕微鏡写真である（倍率２０倍）。
【図９】（ａ）〜（ｈ）は、実験例２において、Ｉ型コラーゲンコートされた細胞培養用ディッシュで培養した北里Ｐ２１ＬＳ細胞株の浮遊細胞部分を染色した結果を示す顕微鏡写真である（倍率２０倍）。
【図１０】（ａ）〜（ｈ）は、実験例２において、３次元培養した北里Ｐ２１ＬＳ細胞株を染色した結果を示す顕微鏡写真である（倍率２０倍）。
【図１１】実験例３の実験結果を示すグラフである。
【図１２】実験例４の実験結果を示すグラフである。
【図１３】実験例４の実験結果を示すグラフである。
【図１４】実験例６において、北里Ｐ２１ＬＳ細胞株を移植したＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスの写真である。
【図１５】（ａ）及び（ｂ）は、北里Ｐ２１ＬＳ細胞株に由来する腫瘍組織の組織標本のヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
まず、微乳頭構造及び乳頭構造について説明する。図１（ａ）は微乳頭構造及び乳頭構造を有する癌組織の構造を示す断面図である。図１（ｂ）は図１（ａ）のｂ−ｂ線における切断面を上から見た図である。図１（ｃ）は乳頭構造を有する癌組織の構造を示す断面図である。図１（ｄ）は図１（ｃ）のｄ−ｄ線における切断面を上から見た図である。
【０００９】
図１（ａ）〜（ｄ）に示すように、乳頭構造を有する癌組織の切片には、線維血管性コアが存在する。これに対し、微乳頭構造を有する癌組織の切片には、線維血管性コアが存在しないという特徴がある。
【００１０】
［微乳頭構造を有するヒト肺腺癌細胞株］
１実施形態において、本発明は、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来するヒト細胞株を提供する。
【００１１】
従来、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来するヒト細胞株は樹立された例がなかった。原発巣に由来しない細胞株は、対象とする癌に由来するものであるか否かが明確でない場合がある。本実施形態の細胞株は、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣から樹立されたものであるため、微乳頭構造を有する肺腺癌細胞株であることが確実である。このため、微乳頭構造を有する肺腺癌の性状を反映した細胞株として信頼性が高い。本実施形態の細胞株は、微乳頭構造を有する肺腺癌の病態解明及びより有効な治療法の開発のための研究材料として好適である。例えば、微乳頭構造を有する腫瘍の発育・進展様式の解明、腫瘍マーカーのスクリーニング、抗癌剤のスクリーニング等に利用することができる。
【００１２】
本実施形態の細胞株は、細胞名「北里Ｐ２１ＬＳ」（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２１５５）であってもよい。なお、「北里Ｐ２１ＬＳ」の別名は「ＫＵ−Ｌｕ−ＭＰＰｔ３」であり、これらは同一の細胞を意味する。
【００１３】
肺腺癌の原発巣由来の細胞は、培地中での増殖が遅く、細胞株の樹立が困難であった。これに対し、実施例において後述するように、発明者らは、培地に、通常は無血清培養に使用する血清代替品及びウシ血清を添加することにより、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣から細胞株（細胞名「北里Ｐ２１ＬＳ」、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２１５５、以下、「北里Ｐ２１ＬＳ細胞株」という場合がある。）を樹立することに初めて成功した。
【００１４】
実施例において後述するように、北里Ｐ２１ＬＳ細胞株は、免疫組織化学染色により、肺の上皮性腫瘍細胞であることが確認された。また、北里Ｐ２１ＬＳ細胞株には、付着細胞と浮遊細胞の両者が混在し、病理形態像を非常に強く反映していた。したがって、北里Ｐ２１ＬＳ細胞株によれば、１つの細胞株で、異なる形態をとる付着細胞と浮遊細胞を個々に解析することが可能である。また、実施例において後述するように、北里Ｐ２１ＬＳ細胞株は、分子標的治療薬の有効性が最も高いとされる、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のエクソン１９の変異を有していた。したがって、北里Ｐ２１ＬＳ細胞株は、抗癌剤感受性試験をはじめとした研究を行う対象としても好適である。
【００１５】
［微乳頭構造を有する肺腺癌細胞株を移植した非ヒト哺乳動物］
１実施形態において、本発明は、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来するヒト細胞株を移植した非ヒト哺乳動物を提供する。本実施形態の非ヒト哺乳動物は、微乳頭構造を有する肺腺癌を研究するモデルとして有用である。
【００１６】
非ヒト哺乳動物としては、例えば、免疫不全マウスが挙げられる。マウスは、実験動物として様々な研究技術が確立されている。また、免疫不全マウスであれば、ヒト細胞株を移植した場合においても拒絶反応を示さないため、癌組織を形成させることができる可能性が高い。免疫不全マウスとしては、例えば、ＳＣＩＤマウス、ＮＯＤ−ｓｃｉｄマウス、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌマウス（ＮＯＧマウス）等が挙げられる。
【００１７】
実施例において後述するように、発明者らは、ＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスに移植した北里Ｐ２１ＬＳ細胞株が微乳頭様構造を有する腫瘍組織を形成することを確認した。したがって、本実施形態の非ヒト哺乳動物は微乳頭構造を有する腫瘍の解析モデルとして利用することができる。
【００１８】
［腫瘍マーカーのスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来する上記のヒト細胞株を用いた腫瘍マーカーのスクリーニング方法を提供する。本実施形態のスクリーニング方法としては、例えば、次のようなものが挙げられる。
【００１９】
（腫瘍特異的モノクローナル抗体の作製）
微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来する上記のヒト細胞株を免疫源としてモノクローナル抗体を多数作製し、固定した微乳頭構造を有する腫瘍組織や上記ヒト細胞株の染色性を指標として、微乳頭構造を有する腫瘍組織に特異的な反応性を示すモノクローナル抗体を選別することが挙げられる。
【００２０】
このようなモノクローナル抗体が認識する抗原は、微乳頭構造を有する腫瘍組織に特異的な腫瘍マーカーであると考えられる。当該腫瘍マーカーは、微乳頭構造を有する腫瘍組織の診断に利用することができる。また、上記モノクローナル抗体は微乳頭構造を有する腫瘍組織の診断や治療に利用することができる。
【００２１】
（２次元電気泳動によるスクリーニング）
微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来する上記のヒト細胞株及び微乳頭構造を有しない肺腺癌に由来するヒト細胞株から、それぞれタンパク質を抽出し、両者を２次元電気泳動法で比較する。得られた電気泳動像に基づいて、発現量に差のあるタンパク質を同定することが挙げられる。このようなタンパク質は、微乳頭構造を有する腫瘍組織に特異的な腫瘍マーカーであると考えられる。
【００２２】
ここで、微乳頭構造を有しない肺線癌に由来するヒト細胞株としては、例えばＡ５４９細胞株、ＬＣ２−ａｄ細胞株等が挙げられる。また、本実施形態のスクリーニング方法では、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来する上記のヒト細胞株と微乳頭構造を有しない肺線癌に由来するヒト細胞株との比較において、発現量に、例えば１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、更に好ましくは３倍以上の差が認められるタンパク質を腫瘍マーカーの候補として選択するとよい。
【００２３】
（培養上清中のセクレトーム解析）
微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来する上記のヒト細胞株を無血清培地で培養し、その培養上清中のタンパク質を特定することが挙げられる。例えば、培養上清中のタンパク質をアセトン沈殿法等で析出させ、２次元電気泳動で分離し、得られたタンパク質のスポットを質量分析装置で解析して当該タンパク質を同定することが挙げられる。これらのタンパク質は、微乳頭構造を有する腫瘍組織に特異的な腫瘍マーカーの候補である。
【００２４】
（患者血清と細胞株を用いた自己抗体解析）
上記のヒト細胞株が由来する微乳頭構造を有する肺腺癌患者又は微乳頭構造を有する癌患者の血清中の抗体から、上記のヒト細胞株に反応性を示す自己抗体を探索することが挙げられる。
【００２５】
例えば、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来する上記のヒト細胞株から抽出したタンパク質又は上記のヒト細胞株の培養上清中のタンパク質を２次元電気泳動し、患者の血清中の抗体と反応させる。続いて、反応性が認められたタンパク質のスポットを質量分析装置で解析して当該タンパク質を同定する。患者の血清中の抗体が反応したタンパク質は、微乳頭構造を有する腫瘍組織に特異的な腫瘍マーカーの候補である。
【００２６】
（マイクロアレイによる網羅的解析）
上記のヒト細胞株を対象として、マイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行い、微乳頭構造を有する腫瘍組織に特異的な腫瘍マーカーをスクリーニングすることが挙げられる。
【００２７】
例えば、上記のヒト細胞株及び微乳頭構造を有しない肺腺癌細胞株から、それぞれ全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成し、マイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行う。両細胞株で発現の異なる遺伝子又はそれにコードされるタンパク質は、微乳頭構造を有する腫瘍組織に特異的な腫瘍マーカーであると考えられる。
【００２８】
見出された遺伝子が微乳頭構造を有する腫瘍組織に特異的な腫瘍マーカーであるか否かの確認は、例えば、見出された遺伝子がコードするタンパク質に対する抗体群を用いて肺腺癌組織検体で免疫染色を行い、微乳頭構造部位が特異的に染色されるか否かを検討することにより行うことができる。
【００２９】
あるいは、微乳頭構造を有する細胞株の抽出タンパク質に対する上記抗体群の反応性を、ウエスタンブロッティング等により確認することによっても、見出された遺伝子がコードするタンパク質が、微乳頭構造を有する腫瘍組織に特異的な腫瘍マーカーであるか否かを確認することができる。
【００３０】
また、微乳頭構造を有する癌患者の血清を１次抗体とし、微乳頭構造を有する細胞株の抽出タンパク質に対する反応性を、ウエスタンブロッティング等により確認することにより、患者血清中の自己抗体の存在を確認することもできる。
【００３１】
［抗癌剤のスクリーニング方法］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、試験化合物を、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来する上記のヒト細胞株と接触させる工程と、前記細胞株の増殖を測定する工程と、を備える、抗癌剤のスクリーニング方法を提供する。
【００３２】
例えば、上記のヒト細胞株の培地に化合物ライブラリ中の化合物を添加し、細胞の増殖に対する影響を検討することが挙げられる。より具体的には、例えば、９６ウェルプレートに上記のヒト細胞株を播種し、化合物ライブラリの存在下で１〜５日間程度培養する。その後、例えばテトラゾリウム塩の還元による発色により、生細胞数を解析することが挙げられる。上記のヒト細胞株の増殖を抑制する化合物は、抗癌剤の候補である。
【００３３】
テトラゾリウム塩としては、市販の３−［４，５−ジメチルチアゾル−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（ＭＴＴ）等を利用することができる。
【００３４】
（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、微乳頭構造を有する肺腺癌細胞株を移植した上記の非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与する工程と、試験化合物が投与された非ヒト哺乳動物中の上記のヒト細胞株の増殖を測定する工程と、を備える、抗癌剤のスクリーニング方法を提供する。
【００３５】
非ヒト哺乳動物としては、上述したものが挙げられる。微乳頭構造を有する肺腺癌細胞株を移植した上記の非ヒト哺乳動物に経口投与又は非経口投与で試験化合物を投与する。続いて、非ヒト哺乳動物に移植された肺腺癌細胞株の増殖を測定し、試験化合物の効果を確認する。肺腺癌細胞株の増殖の測定方法としては、例えば、移植された肺腺癌細胞株に由来する癌組織の大きさ（体積、質量等）を測定すること等が挙げられる。上記癌組織を縮小させる試験化合物は、抗癌剤として利用することができる可能性が高い。
【００３６】
［肺腺癌細胞の培地用添培地及び肺腺癌細胞用添加剤］
１実施形態において、本発明は、ホロトランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン及びセレナイトを含有する、微乳頭構造を有する肺腺癌細胞用培地を提供する。
【００３７】
本明細書において、「微乳頭構造を有する肺腺癌細胞」とは、肺腺癌に由来する細胞であって、培養したときに微乳頭構造を形成する細胞を意味する。「微乳頭構造を有する肺腺癌細胞」は、例えば「微乳頭構造を形成する肺腺癌細胞」、「微乳頭構造形成能を有する肺腺癌細胞」等といい換えることができる。
【００３８】
実施例において後述するように、発明者らは、ホロトランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン及びセレナイトを含有する培地が、微乳頭構造を有する肺腺癌細胞の増殖を向上させることを見出した。また、通常の培地や、ＡＣＬ−４培地等の無血清培地では、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来する細胞株を樹立することは困難である。これに対し、発明者らは、本実施形態の培地を用いて微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来する細胞を培養することにより、細胞株を樹立することに初めて成功した。
【００３９】
本実施形態の培地は更に血清を含有していてもよい。血清としては、例えばウシ血清が挙げられる。ホロトランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン及びセレナイトを含有する培地は、通常は無血清培地として利用されるものであるが、発明者らは、上記の培地に敢えて血清を添加することにより、微乳頭構造を有する肺腺癌細胞の増殖が向上することを明らかにした。したがって、本実施形態の培地は、微乳頭構造を有する肺腺癌細胞の培養に好適である。
【００４０】
１実施形態において、本発明は、ホロトランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン及びセレナイトを含有する、微乳頭構造を有する肺腺癌細胞の培地用添加剤を提供する。本実施形態の培地用添加剤は更に血清を含有していてもよい。血清としては、例えばウシ血清が挙げられる。
【００４１】
［微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来する細胞株の樹立方法］
１実施形態において、本発明は、ホロトランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン及びセレナイトを含有する培地中で、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来する細胞を培養する工程を備える、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来する細胞株の樹立方法を提供する。微乳頭構造を有する肺腺癌細胞株の樹立は困難であるが、本方法により細胞株を樹立することができる。
【００４２】
本実施形態の方法において、上記の培地は更に血清を含有していてもよい。血清としては、例えばウシ血清が挙げられる。
【００４３】
［腫瘍マーカー又は抗癌剤のスクリーニング用キット］
１実施形態において、本発明は、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来するヒト細胞株を備える、腫瘍マーカー又は抗癌剤のスクリーニング用キットを提供する。
【００４４】
従来は、微乳頭構造を有する肺腺癌の病態解明、より有効な治療法の開発等に有用な研究材料に乏しかった。これに対し、本実施形態のキットは、微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来するヒト細胞株を備えるため、微乳頭構造を有する腫瘍に特異的な腫瘍マーカーのスクリーニング、微乳頭構造を有する癌に有効な抗癌剤のスクリーニング等を効率よく実施することができる。
【実施例】
【００４５】
次に実験例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。また、本研究は、北里大学医学部の倫理委員会に「微乳頭構造を有する肺腺癌をモデルとした癌の転移・浸潤メカニズムの解析」という課題名で申請し承認を得ており、その後も継続申請している（Ｂ０９−３３）。
【００４６】
［実験例１］
（細胞株の樹立）
微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来するヒト細胞株を樹立した。具体的には、まず、外科手術で摘出され、病理組織学的に微乳頭構造を有する肺腺癌であることが確認された原発巣腫瘍組織を、ハサミで細かくミンチ状に切断して組織片を得た。続いて、得られた組織片を、Ｉ型コラーゲンコートされた細胞培養用ディッシュ中で培養（初代培養）した。
【００４７】
培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地に、１０％ウシ血清、及び通常は無血清培養に使用する血清代替品（商品名「Ｎ−２サプリメント」、サーモフィッシャーサイエンティフィク社）、抗生物質及びＬ−グルタミンを添加したものを用いた。Ｎ−２サプリメントは、終濃度（培地中の濃度）で、ヒトホロトランスフェリン１００ｍｇ／Ｌ、インスリン５ｍｇ／Ｌ、プロゲステロン０．００６３ｍｇ／Ｌ、プトレシン１６．１１ｍｇ／Ｌ及びセレナイト０．００５２ｍｇ／Ｌを含有していた。抗生物質としては、終濃度で、１０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加した。また、Ｌ−グルタミンは終濃度で２ｍＭとなるように添加した。
【００４８】
図２は初代培養２５日目の細胞の顕微鏡写真である（倍率１０倍）。シート状及び隆起した房状の集塊が形成された。隆起した細胞をチップの先で回収し、新たなディッシュに直接播種した。付着細胞が６０〜７０％コンフルエントに達したらトリプシンを用いて剥離し、継代することを繰り返すことにより、細胞株を樹立した。樹立した微乳頭構造を有する肺腺癌の原発巣に由来するヒト細胞株を、独立行政法人製品評価技術基盤機構（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託した（受領日：平成２７年１０月３０日、受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２１５５、細胞名「北里Ｐ２１ＬＳ」）。
【００４９】
図３は、北里Ｐ２１ＬＳ細胞株（継代数１５代）の顕微鏡写真である（倍率５倍）。シート状及び隆起した房状の集塊が形成された。また、図４は、北里Ｐ２１ＬＳ細胞株（継代数１５代）の別の視野における顕微鏡写真である（倍率５倍）。図４に示されるように、付着せずに浮遊する房状の集塊も認められた。
【００５０】
続いて、北里Ｐ２１ＬＳ細胞株を用いて、生体の細胞外マトリックスを模倣した３次元培養を行った。より具体的には、Ｉ型コラーゲンコートされた細胞培養用ディッシュ中で１１代まで培養した北里Ｐ２１ＬＳ細胞株を、１２〜１４代で３次元培養した。３次元培養は、市販のプレート（商品名「ＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅ  ＭＨパターン低吸着、９６ウェル」、型式「ＮＣＰ−ＬＨ９６−２」、Ｓｃｉｖａｘ社）で培養を行った後、３５ｍｍディッシュ（型式「ＮＣＤ−ＬＨ３５−５」、Ｓｃｉｖａｘ社）に継代することにより行った。
【００５１】
図５は、３次元培養した北里Ｐ２１ＬＳ細胞株の顕微鏡写真である（継代数１４代、倍率５倍）。北里Ｐ２１ＬＳ細胞株は、３次元培養では、房状の集塊を形成し浮遊することが明らかとなった。また、ポリマータイプの足場型及び低吸着ディッシュを用いた浮遊型の３次元培養においても、北里Ｐ２１ＬＳ細胞株は、房状の集塊を形成し浮遊することが明らかとなった。
【００５２】
［実験例２］
（微乳頭構造を有する肺腺癌組織及び北里Ｐ２１ＬＳ細胞株の免疫組織化学染色）
微乳頭構造を有する肺腺癌組織及び北里Ｐ２１ＬＳ細胞株の免疫組織化学染色を行い比較した。より具体的には、肺腺癌組織の微乳頭構造部分及び乳頭構造部分の組織切片、並びに北里Ｐ２１ＬＳ細胞株の付着細胞部分及び浮遊細胞部分のホルマリン固定標本を、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）；上皮性細胞のマーカーである、サイトケラチン、Ｅ−カドヘリン、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＥｐＣＡＭ）及びＭｕｃｉｎ  １，  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｍｕｃ−１）に対する抗体；肺腺癌のマーカーであるＴｈｙｒｏｉｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ−１（ＴＴＦ−１）に対する抗体；上皮間葉転換のマーカーであるＮ−カドヘリン及びビメンチンに対する抗体で染色した。また、微乳頭構造を有する肺腺癌組織としては、北里Ｐ２１ＬＳ細胞株が由来する組織を使用した。
【００５３】
使用した抗体は次の通りであった。抗サイトケラチン抗体（型番「４１２８１１」、ニチレイ社）、抗ＥｐＣＡＭ抗体（型番「２４８Ｍ−１４」、Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ社）、抗ＴＴＦ−１抗体（型番「ＮＣＬ−Ｌ−ＴＴＦ−１」、ライカ社）、抗Ｍｕｃ−１抗体（型番「ＮＣＬ−Ｌ−ＭＵＣ−１」、ライカ社）、抗Ｅ−カドヘリン抗体（型番「Ｍ３６１２」、ダコ社）、抗Ｎ−カドヘリン抗体（型番「Ｍ３６１３」、ダコ社）、抗ビメンチン抗体（型番「Ｍ０７２５」、ダコ社）。
【００５４】
図６（ａ）〜図６（ｈ）は、肺腺癌組織の微乳頭構造部分の組織切片の染色結果を示す顕微鏡写真である（倍率２０倍）。図７（ａ）〜図７（ｈ）は、肺腺癌組織の乳頭構造部分の組織切片の染色結果を示す顕微鏡写真である（倍率２０倍）。図８（ａ）〜図８（ｈ）は、Ｉ型コラーゲンコートされた細胞培養用ディッシュで培養した北里Ｐ２１ＬＳ細胞株の付着細胞部分の染色結果を示す顕微鏡写真である（倍率２０倍）。図９（ａ）〜図９（ｈ）は、Ｉ型コラーゲンコートされた細胞培養用ディッシュで培養した北里Ｐ２１ＬＳ細胞株の浮遊細胞部分の染色結果を示す顕微鏡写真である（倍率２０倍）。
図１０（ａ）〜図１０（ｈ）は、実験例１と同様にして３次元培養した北里Ｐ２１ＬＳ細胞株の染色結果を示す顕微鏡写真である（倍率２０倍）。
【００５５】
その結果、図８に示す北里Ｐ２１ＬＳ細胞株の付着細胞部分、図９に示す北里Ｐ２１ＬＳ細胞株の浮遊細胞部分、図１０に示す３次元培養した北里Ｐ２１ＬＳ細胞株は、いずれもサイトケラチン、ＥｐＣＡＭ、ＴＴＦ−１、Ｍｕｃ−１、Ｅ−カドヘリンが陽性、ビメンチンが部分的に陽性、Ｎ−カドヘリンが陰性となり、図６に示す原発組織と同様の染色結果となった。これらの染色結果は、上皮性腫瘍であることを示す。以上の結果から、北里Ｐ２１ＬＳ細胞株は、微乳頭構造を有する肺腺癌組織の性状をよく反映していることが確認された。
【００５６】
［実験例３］
（培地の違いによる北里Ｐ２１ＬＳ細胞株の増殖の検討）
Ｉ型コラーゲンコートされた細胞培養用ディッシュ（直径約３５ｍｍ）を用いて、北里Ｐ２１ＬＳ細胞株を組成の異なる培地で培養し、細胞の増殖を検討した。培地としては、１０％ウシ血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（以下、「１０％ＦＣＳ培地」という。）、実験例１で使用した血清代替品（商品名「Ｎ−２サプリメント」、サーモフィッシャーサイエンティフィク社）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（以下、「Ｎ２培地」という。）、並びに１０％ウシ血清及び「Ｎ−２サプリメント」を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（以下、「１０％ＦＣＳ＋Ｎ２培地」という。）を使用した。
【００５７】
まず、北里Ｐ２１ＬＳ細胞株の付着細胞をディッシュ１枚当たり１×１０５個ずつ播種した。１０％ＦＣＳ培地群はｎ＝９であり、Ｎ２培地群はｎ＝１０であり、１０％ＦＣＳ＋Ｎ２培地群はｎ＝９であった。続いて、これらの細胞を８日間培養後、各ディッシュ中の浮遊細胞及び付着細胞の細胞数を計測し、平均値及び標準誤差を求めた。細胞数の計測においては生細胞数のみを計測した。
【００５８】
図１１は実験結果を示すグラフである。図１１中、「ｐ＜０．０１」は、危険率１％未満で有意差があることを表す。その結果、１０％ＦＣＳ培地群及びＮ２培地群と比較して、１０％ＦＣＳ＋Ｎ２培地群は細胞の増殖が有意に速いことが明らかとなった。
【００５９】
［実験例４］
（北里Ｐ２１ＬＳ細胞株における付着細胞及び浮遊細胞の増殖の検討）
Ｉ型コラーゲンコートされた細胞培養用ディッシュ中で、１０％ＦＣＳ＋Ｎ２培地を用いて北里Ｐ２１ＬＳ細胞株を培養し、付着細胞及び浮遊細胞の細胞数をそれぞれ計測し、各細胞の増殖を検討した。
【００６０】
まず、北里Ｐ２１ＬＳ細胞株の付着細胞をディッシュ１枚当たり１×１０５個ずつ播種した。続いて、培養開始から２４時間毎に付着細胞及び浮遊細胞の細胞数をそれぞれ計測し、平均値及び標準誤差を求めた。細胞数の計測は、各測定点についてそれぞれｎ＝３で行った。細胞数の計測においては生細胞数のみを計測した。同様の実験を２回行った。２回目の実験においては、１回目の実験におけるものとは異なるロットのウシ血清を使用した。
【００６１】
図１２は、１回目の実験における、北里Ｐ２１ＬＳ細胞株の増殖曲線を示すグラフである。１回目の実験において、付着細胞及び浮遊細胞の合計の倍加時間は７４．６時間であった。また、図１３は、２回目の実験における、北里Ｐ２１ＬＳ細胞株の増殖曲線を示すグラフである。２回目の実験において、付着細胞及び浮遊細胞の合計の倍加時間は５９．２時間であった。
【００６２】
［実験例５］
（ＥＧＦＲエクソン１９の塩基配列の解析）
北里Ｐ２１ＬＳ細胞株について、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のエクソン１８〜２１の塩基配列を解析した。塩基配列の解析には、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ３５００Ｄｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィク社）を使用した。その結果、北里Ｐ２１ＬＳ細胞株は、ＥＧＦＲのエクソン１９にＥ７４６−Ａ７５０の欠失変異（ＥＧＦＲのアミノ酸配列の第７４６〜７５０番目をコードする塩基配列の欠失変異）を有することが明らかとなった。
【００６３】
［実験例６］
（北里Ｐ２１ＬＳ細胞株を移植した非ヒト哺乳動物）
５×１０６個の北里Ｐ２１ＬＳ細胞株を、マトリゲル（型式「３５４２３４」、コーニング社）を添加したリン酸バッファー（ＰＢＳ）に懸濁し、免疫不全マウスであるＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスの皮下に注射し、腫瘍組織を形成することができるか否かを検討した。
【００６４】
図１４は、北里Ｐ２１ＬＳ細胞株を移植して３０日後のＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスの写真である。図中の矢印は、形成された腫瘍組織を示す。その結果、北里Ｐ２１ＬＳ細胞株を移植することにより、腫瘍組織を形成することができることが明らかとなった。
【００６５】
また、５×１０６個の北里Ｐ２１ＬＳ細胞株をＰＢＳに懸濁し、ＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスの皮下に注射した場合においても同様の結果が得られた。
【００６６】
続いて、形成された腫瘍組織の組織標本を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。図１５（ａ）は、染色結果を示す写真であり（倍率２倍）、図１５（ｂ）は、図１５（ａ）の四角で示す領域を拡大した写真である（倍率１０倍）。
【００６７】
その結果、形成された腫瘍組織中には、微乳頭様構造を取る部分が散見された。この結果は、北里Ｐ２１ＬＳ細胞株が、微乳頭構造を有する肺腺癌の病態解明の研究材料として有用であることを更に支持するものである。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明により、微乳頭構造を有する肺腺癌の性状をより正確に反映したヒト細胞株を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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