(57)【要約】      （修正有）【課題】軟骨細胞系統細胞及び／又は軟骨様組織を作製するための方法及び組成物。【解決手段】ａ．原始線条様中胚葉細胞集団をＦＧＦアゴニストとＢＭＰ阻害剤等を含む培地で培養し、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋及び／又はＰＤＧＦＲ−β＋沿軸中胚葉集団を特定化するステップと、ｂ．上記沿軸中胚葉集団を培養するステップと高細胞密度沿軸中胚葉集団を血清不含培地中でＴＧＦβアゴニストと培養して、高細胞密度Ｓｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を製造するステップとを含む軟骨細胞前駆体集団を作製するステップと、ｃ．高細胞密度軟骨細胞前駆体集団をＴＧＦβ３アゴニストと長期間培養して、関節様非肥大軟骨細胞及び／又は軟骨様組織を製造するステップ、又は高細胞密度軟骨細胞前駆体集団を、ＢＭＰ４アゴニストと長期間培養して、肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を製造するステップのいずれかを含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨細胞及び／又は軟骨、任意選択で、関節様非肥大軟骨細胞及び／若しくは軟骨様組織及び／又は肥大軟骨細胞様細胞及び／若しくは軟骨様組織を作製するための方法であって、
ａ．原始線条様中胚葉細胞集団、任意選択で、ＣＤ５６＋及びＰＤＧＦＲα＋原始線条様中胚葉集団を、
ｉ．ＦＧＦアゴニストと、
ｉｉ．ＢＭＰ阻害剤、任意選択で、ノギン、ＬＤＮ−１９３１８９、ドルソモルフィンと、そして
ｉｉｉ．任意選択で、１種又は複数のＴＧＦβ阻害剤、任意選択で、ＳＢ４３１５４２；及びＷｎｔ阻害剤、任意選択で、ＤＫＫ１、ＩＷＰ２又はＸＡＶ９３９と
を含む、沿軸中胚葉特定化カクテルとともに培養して、細胞表面ＣＤ７３、ＣＤ１０５及び／又はＰＤＧＦＲ−βを発現する沿軸中胚葉集団を特定化するステップと、
ｂ．ｉ．ＣＤ７３、ＣＤ１０５及び／又はＰＤＧＦＲ−βを発現する沿軸中胚葉集団を、任意選択で、血清不含又は血清含有培地中、高細胞密度で培養するステップと、
ｉｉ．高細胞密度ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋及び／又はＰＤＧＦＲβ＋沿軸中胚葉集団を、血清不含培地中でＴＧＦβアゴニストとともに培養して、高細胞密度Ｓｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を製造するステップと
を含む軟骨細胞前駆体集団を作製するステップと、そして
ｃ．ｉ．高細胞密度Ｓｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を、ＴＧＦβアゴニストとともに長期間培養して、関節様非肥大軟骨細胞及び／又は軟骨様組織を製造するステップか、又は
ｉｉ．高細胞密度Ｓｏｘ９＋コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を、ＢＭＰ４アゴニストとともに長期間培養して、肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を製造するステップのいずれか
を含む、上記方法。
【請求項２】
ステップｃ）が、高細胞密度Ｓｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を、ＴＧＦβアゴニストとともに長期間、任意選択で、３週間超培養して、関節様非肥大軟骨細胞及び／又は軟骨様組織を製造するステップを含む、関節様非肥大軟骨細胞及び／又は軟骨様組織を作製するための請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｃ）が、高細胞密度Ｓｏｘ９＋コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を、ＢＭＰ４アゴニストとともに長期間培養して、肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を製造するステップを含む、肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を作製するための請求項１に記載の方法。
【請求項４】
沿軸中胚葉集団が、胚様体、単層培養及び／又はそれらの組合せ中に含まれる、請求項１から請求項３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ａ．多能性幹細胞の出発集団を、原始線条誘導カクテルとともに培養して、ＣＤ５６及びＰＤＧＦＲ−αを発現する原始線条様中胚葉集団を誘導するステップと、
ｂ．原始線条様中胚葉細胞集団を
ｉ．ＦＧＦアゴニストと、
ｉｉ．ＢＭＰ阻害剤、任意選択で、ノギン、ＬＤＮ−１９３１８９、ドルソモルフィンと、
ｉｉｉ．１種又は複数のＴＧＦβ阻害剤、任意選択で、ＳＢ４３１５２４及びＷｎｔ阻害剤、任意選択で、ＤＫＫ１、ＩＷＰ２又はＸＡＶ９３９と
を含む沿軸中胚葉特定化カクテルとともに培養して、細胞表面ＣＤ７３、ＣＤ１０５及びＰＤＧＦＲ−βを発現する沿軸中胚葉集団を特定化するステップと、
ｃ．ｉ．ＣＤ７３、ＣＤ１０５及び／又はＰＤＧＦＲ−βを発現する沿軸中胚葉集団を、任意選択で、血清不含又は血清含有培地中、高細胞密度で培養するステップと、
ｉｉ．高細胞密度ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋及びＰＤＧＦＲβ＋沿軸中胚葉集団を、血清不含培地中でＴＧＦβアゴニストとともに培養して、高細胞密度Ｓｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を製造するステップと
を含む、軟骨細胞前駆体集団を作製するステップと、
ｄ．高細胞密度Ｓｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を、ＴＧＦβアゴニストとともに長期間培養して、関節様非肥大軟骨細胞及び／又は軟骨様組織を製造するステップと
を含む、関節様非肥大軟骨細胞及び／又は軟骨様組織を作製するための、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ａ．多能性幹細胞の出発集団を、原始線条誘導カクテルとともに培養して、ＣＤ５６及びＰＤＧＦＲ−αを発現する原始線条様中胚葉集団を誘導するステップと、
ｂ．原始線条様中胚葉細胞集団を
ｉ．ＦＧＦアゴニストと、
ｉｉ．ＢＭＰ阻害剤、任意選択で、ノギン、ＬＤＮ−１９３１８９、ドルソモルフィンと、
ｉｉｉ．任意選択で、１種又は複数のＴＧＦβ阻害剤、任意選択で、ＳＢ４３１５２４；及びＷｎｔ阻害剤、任意選択で、ＤＫＫ１、ＩＷＰ２又はＸＡＶ９３９と
を含む沿軸中胚葉特定化カクテルとともに培養して、細胞表面ＣＤ７３、ＣＤ１０５及びＰＤＧＦＲ−βを発現する沿軸中胚葉集団を特定化するステップと、
ｃ．ｉ．ＣＤ７３、ＣＤ１０５及び／又はＰＤＧＦＲ−βを発現する沿軸中胚葉集団を、任意選択で、血清不含又は血清含有培地中、高細胞密度で培養するステップと、
ｉｉ．高細胞密度ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋及びＰＤＧＦＲβ＋沿軸中胚葉集団を、血清不含培地中でＴＧＦβアゴニストとともに培養して、高細胞密度Ｓｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を製造するステップと
を含む、軟骨細胞前駆体集団を作製するステップと、そして
ｄ．高細胞密度Ｓｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を、ＢＰＭ４アゴニストとともに長期間培養して、肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を製造するステップと
を含む、肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を作製するための、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ａ．多能性幹細胞の出発集団を、原始線条誘導カクテルとともに培養して、ＣＤ５６及びＰＤＧＦＲ−αを発現する原始線条様中胚葉集団を誘導するステップと、
ｂ．原始線条様中胚葉細胞集団を
ｉ．ＦＧＦアゴニストと、
ｉｉ．ＢＭＰ阻害剤、任意選択で、ノギン、ＬＤＮ−１９３１８９、ドルソモルフィンと、
ｉｉｉ．１種又は複数のＴＧＦβ阻害剤、任意選択で、ＳＢ４３１５２４及びＷｎｔ阻害剤、任意選択で、ＤＫＫ１、ＩＷＰ２又はＸＡＶ９３９と
を含む沿軸中胚葉特定化カクテルとともに培養して、細胞表面ＣＤ７３、ＣＤ１０５及びＰＤＧＦＲ−βを発現する沿軸中胚葉集団を特定化するステップと、
ｃ．ｉ．細胞表面ＣＤ７３、ＣＤ１０５及び／又はＰＤＧＦＲ−βを発現する沿軸中胚葉集団を、任意選択で、血清不含又は血清含有培地中、高細胞密度で培養するステップと、
ｉｉ．高細胞密度ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋及びＰＤＧＦＲβ＋沿軸中胚葉集団を、血清不含培地中でＴＧＦβアゴニストとともに培養して、高細胞密度Ｓｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を製造するステップと
を含む、軟骨細胞前駆体集団を作製するステップと、
ｄ．ｉ．高細胞密度Ｓｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を、ＴＧＦβアゴニストとともに長期間培養して、関節様非肥大軟骨細胞及び／又は軟骨様組織を製造するステップか、又は
ｉｉ．高細胞密度Ｓｏｘ９＋コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を、ＢＭＰ４アゴニストとともに長期間培養して、肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を製造するステップのいずれかと
を含む、軟骨細胞を作製するための、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
出発集団が、ヒト胚幹細胞集団（ｈＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞集団（ｉＰＳＣ）、任意選択で、初代ｈＥＳＣ及び／又はｉＰＳＣである、請求項５から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ｈＥＳＣ集団が、ＨＥＳ２  Ｈ１、Ｈ９又は任意のヒトｉＰＳ細胞系統から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
出発集団が、胚様体に凝集される、請求項５から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
出発集団が、原始線条誘導カクテルと、約１〜約５日間接触される、請求項５から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
原始線条誘導カクテルが、アクチビンアゴニスト、任意選択で、アクチビンＡ又はｎｏｄａｌ、ＢＭＰ４アゴニスト、任意選択で、ＢＭＰ４、ＢＭＰ２、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７及び／又はＢＭＰ１０及びＦＧＦアゴニスト、任意選択で、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ９及び／又は任意選択で、ＦＧＦ１９、２１、３、５、６、８ａ、１６〜１８、２０及び／又は２３を含む、請求項５から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
原始線条誘導カクテルが、任意選択で、Ｗｎｔ３ａ及びＣＨＩＲ−９９０２１（Ｓｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）ＣＨＩＲ９９０２１  Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（カタログ：１３１２３））又はＳｔｅｍｇｅｎｔ製のＳｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）ＢＩＯ（カタログ：０４００３）などのＧＳＫ３ｂ阻害剤から選択されるｗｎｔアゴニストをさらに含む、請求項５から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
沿軸中胚葉が、単層培養で特定化される、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＢＭＰ阻害剤が、任意選択で、ドルソモルフィン（ＤＭ）、ノギン、コーディン、ＬＤＮ−１９３１８９、可溶性ＢＭＰＲ１ａ、可溶性ＢＭＰＲ１ｂから選択される、１型ＢＭＰ受容体阻害剤、ＢＭＰリガンド及び／又は可溶性ＢＭＰ受容体である、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
原始線条様中胚葉集団が、心筋細胞特定化を阻害するために、ＢＭＰ阻害剤と、約１、２、３又は４日接触される、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
原始線条様中胚葉集団及び／又は沿軸中胚葉集団を特定化するためのＦＧＦアゴニストが、ＦＧＦ２、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ４及びＦＧＦ９から選択される、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
原始線条様中胚葉集団が、ＦＧＦアゴニストと、少なくとも５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日又はそれ以上の間、接触され、ＣＤ７３及び／又はＣＤ１０５を発現する細胞の割合を、ＦＧＦアゴニスト未処理細胞と比較して、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％又は６５％増大させる、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
沿軸中胚葉集団がまた、転写因子Ｍｅｏｘ１及びＮｋｘ３．２も発現し、Ｎｋｘ２．５について陰性である、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
沿軸中胚葉集団が、マイクロマス培養、ペレット培養又はフィルター培養で、又は任意の高細胞密度形式でプレーティングされる、請求項１から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
沿軸中胚葉集団が、マイクロマス培養で、１０００万個細胞／ｍｌから５０００万個細胞／ｍｌの間、任意選択で、少なくとも１ｍｌあたり１０００万個細胞、２０００万個細胞／ｍｌ、３０００万個細胞／ｍｌ、４０００万個細胞／ｍｌ又は５０００万個細胞／ｍｌの細胞密度で、又は膜フィルター培養で、約５００，０００及び２００万個の間、任意選択で、約５００，０００個、約７５０，０００個、約１００万個、約１２５万個、約１５０万個、約１７５万個、約２００万個がプレーティングされる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
集団が、インスリン、トランスフェリン及び任意選択で、セレンを含む血清不含基礎培地（ＩＴＳ）中で培養される、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
基礎培地が、インスリン、トランスフェリン、セレンサプリメント、プロリン及びデキサメタゾンとともにＤＭＥＭを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
沿軸中胚葉集団が、ＴＧＦβ３アゴニストの添加の前に、高細胞密度で、約０〜約４日間、任意選択で、０、１、２、３又は４日間培養される、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋及び／又はＰＤＧＦＲβ＋沿軸中胚葉集団が、血清不含培地中でＴＧＦβ３アゴニストとともに少なくとも３日間又は約３日〜約１４日間、任意選択で、少なくとも１週間培養されて、Ｓｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を製造する、請求項１から２４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
Ｓｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団が、ＴＧＦβアゴニストとともに培養される長期間は、関節軟骨様組織を製造するためには、少なくとも４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間又はそれ以上である、請求項１、２、４から２４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
軟骨細胞前駆体集団が、ラブリシン及び／又は軟骨中間体層タンパク質２（ＣＩＬＰ２）が発現されるまでＴＧＦｂアゴニストとともに培養される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
沿軸中胚葉集団及び／又はＳｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団が、ＴＧＦｂ３、ＴＧＦｂ２及び／又はＴＧＦｂ１から選択されるＴＧＦｂアゴニストとともに培養される、請求項１から２７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
Ｇ肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織が、ＢＭＰ４アゴニストとともに培養されて、コラーゲン１０＋及び／又はＲｕｎｘ２＋肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を製造する、請求項１、３から２７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
高細胞密度Ｓｏｘ９＋コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団がＢＭＰ４アゴニストとともに培養される長期間が、コラーゲン２を発現する軟骨組織又はコラーゲン１０を発現する肥大軟骨細胞集団を作製するには、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間又はそれ以上である、請求項１、３から２７及び２９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ＣＤ７３＋ＣＤ１０５＋細胞及び／又はＣＤ７３＋ＰＤＧＦＲ−β＋細胞が、高細胞密度培養に先立って、細胞表面ＣＤ７３、ＣＤ１０５及び／又はＰＤＧＦＲ−βを発現する沿軸中胚葉集団から任意選択でフローサイトメトリーによって単離される、請求項１から３０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
軟骨細胞前駆体が、軟骨組織形成のためにＴＧＦβアゴニスト又はＢＭＰ４アゴニスト中で培養される、請求項１から３１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ａ．軟骨細胞前駆体細胞を、任意選択で、血清不含又は血清含有培地において高細胞密度で培養するステップと、
ｂ．高細胞密度軟骨細胞前駆体細胞を、血清不含培地中でＴＧＦβ３アゴニストとともに培養するステップと、そして
ｃ．ｉ．軟骨細胞前駆体細胞を、ＴＧＦβアゴニストとともに長期間培養して、関節軟骨様軟骨細胞集団を製造するステップか、又は
ｉｉ．軟骨細胞前駆体細胞を、ＢＭＰ４アゴニストとともに長期間培養して、肥大軟骨細胞集団及び／若しくは軟骨様組織を製造するステップのいずれかと
を含む、軟骨細胞様細胞を作製するための、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
軟骨細胞前駆体細胞が、初代胎児軟骨細胞又は継代された胎児軟骨細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
軟骨細胞前駆体細胞が、軟骨又は骨状態又は疾患を有する対象から得られた初代細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
ステップが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される、請求項１から３５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
作製された細胞及び／又は組織が、対象に投与される、請求項１から３６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１から３７までのいずれか一項に記載の方法に従って作製された、関節様非肥大軟骨細胞及び／若しくは軟骨様組織並びに／又は肥大軟骨細胞様細胞及び／若しくは軟骨様組織の単離された集団。
【請求項３９】
関節様非肥大軟骨細胞及び／若しくは軟骨様組織並びに／又は肥大軟骨細胞様細胞及び／若しくは軟骨様組織の集団と、任意選択で、希釈剤又は担体、任意選択で、ＰＥＧ、ヒドロゲル、骨足場、骨代用品足場又はマトリゲルを含む組成物。
【請求項４０】
組成物が、細胞スラリーである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
請求項３８に記載の単離された細胞集団又は内皮細胞若しくは線維芽細胞をさらに含む、請求項３９又は４０に記載の組成物。
【請求項４２】
細胞又は請求項１から４１までのいずれか一項に記載の組成物と、足場を含む、軟骨又は骨組織製品。
【請求項４３】
足場が、骨代用品である、請求項４２に記載の骨組織製品。
【請求項４４】
症状を寛解する及び／又はそれを必要とする対象を治療するための方法であって、請求項３８から４１までのいずれか一項に記載の細胞の集団及び／又は組織を投与するステップ及び／又は請求項４２又は４３に記載の製品を挿入するステップを含む、上記方法。
【請求項４５】
症状を寛解する及び／又はそれを必要とする対象を治療するための、請求項３８から４１までのいずれか一項に記載の細胞の集団及び／又は組織又は組成物及び／又は請求項４２又は４３に記載の製品の使用。
【請求項４６】
細胞の集団が、自己細胞から誘導される、請求項４４又は４５に記載の方法又は使用。
【請求項４７】
細胞の集団が、関節様非肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織について濃縮される、請求項４４から４６までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項４８】
対象が、変形性関節症、離断性骨軟骨炎、多発性軟骨炎及びその他の軟骨疾患又は軟骨に影響を及ぼす関節傷害などの関節状態を有する、請求項４４から４７までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項４９】
細胞の集団が、肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織について濃縮される、請求項４４又は４５に記載の方法又は使用。
【請求項５０】
濃縮された肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織は、足場に接着される、請求項４９に記載の方法又は使用。
【請求項５１】
対象が、骨の骨折、骨の破損などの骨状態を有するか、又は例えば、悪性腫瘍若しくは外傷によって骨置換を必要とする、又は軟骨無形成症、骨形成不全、骨粗鬆症又はその他のオステオパシーを有する、請求項４４から４６まで及び５０のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項５２】
沿軸中胚葉細胞の集団を作製する方法であって、
ａ．多能性幹細胞の出発集団を、原始線条誘導カクテルとともに培養して、ＣＤ５６及びＰＤＧＦＲ−αを発現する原始線条様中胚葉集団を誘導するステップと、
ｂ．原始線条様中胚葉集団を、
ｉ．ＦＧＦアゴニストと
ｉｉ．ＢＭＰ阻害剤、任意選択で、ノギン、ＬＤＮ−１９３１８９、ドルソモルフィンと、そして
ｉｉｉ．１種又は複数のＴＧＦβ阻害剤、任意選択で、ＳＢ４３１５２４及びＷｎｔ阻害剤、任意選択で、ＤＫＫ１、ＩＷＰ２又はＸＡＶ９３９と
を含む沿軸中胚葉特定化カクテルとともに培養して、細胞表面ＣＤ７３、ＣＤ１０５及び／又はＰＤＧＦＲ−βを発現する沿軸中胚葉集団を特定化するステップと
を含む、上記方法。
【請求項５３】
ＣＤ７３、ＣＤ１０５及び／又はＰＤＧＦＲβを発現する細胞を濃縮するステップをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
沿軸軟骨形成中胚葉細胞の集団を単離する方法であって、
ａ．沿軸軟骨形成中胚葉を含む細胞の集団を、ＣＤ７３特異的結合剤、ＣＤ１０５特異的結合剤及びＰＤＧＦＲβ特異的結合剤を含むカクテルと接触させるステップと、
ｂ．ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋及びＰＤＧＦＲｂｅｔａ＋細胞について濃縮するステップと
を含む、上記方法。
【請求項５５】
細胞が、フローサイトメトリーを使用して濃縮される、請求項５３又は５４に記載の方法。
【請求項５６】
請求項５２から５５までのいずれか一項に記載の方法に従って調製された、単離された沿軸軟骨形成中胚葉細胞の集団。
【請求項５７】
候補軟骨形成調節物質を試験する方法であって、
ａ．試験物質を、軟骨細胞前駆体系統細胞集団と接触させるステップであって、試験物質は、軟骨細胞前駆体系統細胞集団と、請求項１から３７、５２又は５３のいずれか一項に記載の方法において任意のステップで接触されるステップと、
ｂ．試験物質の不在下で作製された対照集団と比較した、軟骨細胞増殖、維持及び／又は分化に対する試験物質の効果を評価するステップと、そして
ｃ．試験物質が、対照と比較して、増殖を増大又は減少させるか、及び／又は軟骨細胞維持若しくは分化に影響を及ぼす場合に、試験物質を候補軟骨形成調節物質と同定するステップと
を含む、上記方法。
【請求項５８】
候補軟骨形成調節物質が、罹患軟骨又は骨を有する対象から単離された因子である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
因子が、関節炎及び／若しくは肥満を有する対象の関節、任意選択で、膝関節中の脂肪パッドから、又は対照として健常な対象から単離される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
試験物質が、ＢＭＰ４アゴニストとともに添加され、試験物質が、試験物質の不在下で処理された対象と比較して、肥大を阻害するその能力について評価される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
肥大が、フローサイトメトリーを使用して、任意選択で、前方及び側方散乱を評価することによって評価される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
関節軟骨細胞を単離する方法であって、
ａ．軟骨細胞を含む細胞の混合集団を、抗体：ＣＤ７３細胞複合体の形成を可能にする条件下で、ＣＤ７３と結合する抗体と接触させるステップと
ｂ．抗体：ＣＤ７３細胞複合体を単離するステップと
を含む、上記方法。
【請求項６３】
細胞の混合集団が、非軟骨細胞様細胞、非関節軟骨細胞様細胞及び肥大軟骨細胞様細胞を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
抗体が、セファロースビーズ又は磁性ビーズのようなビーズなどのタグに連結される、請求項６２又は６３に記載の方法。
【請求項６５】
候補関節軟骨細胞増殖インデューサーを評価する方法であって、
ａ．請求項１、２、４から３７までのいずれか一項に記載の方法に従って作製された関節様非肥大軟骨細胞及び／又は軟骨様組織を得るステップと、
ｂ．関節様非肥大軟骨細胞及び／又は軟骨様組織を、試験物質とともに培養するステップと、
ｃ．関節様非肥大軟骨細胞様細胞増殖を測定するステップと、そして
ｄ．試験物質の不在下で培養された関節様非肥大軟骨細胞及び／又は軟骨様組織と比較した、増殖の増大を検出し、試験物質が、候補関節軟骨細胞増殖インデューサーであることを示すステップと
を含む、上記方法。
【請求項６６】
候補肥大軟骨細胞増殖インデューサーを評価する方法であって、
ａ．請求項１、３から３７までのいずれか一項に記載の方法に従って作製された肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を得るステップと、
ｂ．肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を、試験物質とともに培養するステップと、
ｃ．肥大軟骨細胞増殖を測定するステップと、そして
ｄ．試験物質の不在下で培養された肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織と比較した、増殖の増大を検出し、試験物質が、候補肥大軟骨細胞増殖インデューサーであることを示すステップと
を含む、上記方法。
【請求項６７】
任意選択で、フローサイトメトリーによって単離される、試験物質とともの培養に先立って、ＣＤ７３関節様非肥大軟骨細胞及び／又は軟骨様組織が単離される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
関節様非肥大軟骨細胞及び／又は肥大軟骨細胞様細胞、細胞が、関節軟骨細胞特異的プロモーター、任意選択で、ラブリシンプロモーターエレメントと機能的に連結されたリポーター遺伝子（すなわち、関節軟骨細胞リポーター系）及び／又は肥大軟骨細胞特異的プロモーター、任意選択で、コラーゲン１０プロモーターエレメントと機能的に連結されたリポーター遺伝子（すなわち、肥大軟骨細胞リポーター系）を含み、関節軟骨細胞分化を誘導する化合物が、関節軟骨細胞リポーター系活性を測定することによって同定され、肥大軟骨細胞分化を誘導する化合物が、肥大軟骨細胞リポーター系活性を測定することによって同定される、請求項６５から６７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
増殖の増大が、以下の方法：３Ｈチミジン取り込みアッセイ、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込みアッセイ及びプロピジウムヨウ素アッセイのうち１種又は複数を使用して測定される、請求項６５から６８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
試験化合物のＡＣ細胞及び／又はＧＰＣ細胞保護活性及び／又は毒性を評価する方法であって、
ａ．請求項１から３７までのいずれか一項に記載の方法に従って、関節様非肥大軟骨細胞及び／又は軟骨様組織及び／又はＧＰＣ様細胞及び／又は成長板軟骨を作製するステップと、
ｂ．関節様非肥大軟骨細胞及び／又は軟骨様組織及び／又はＧＰＣ細胞及び／又は軟骨様組織を、試験物質とともに培養するステップと、
ｃ．試験物質の細胞／組織毒性又は軟骨細胞保護活性を測定するステップと、そして
ｄ．試験物質の不在下で培養された、関節様非肥大軟骨細胞及び／又はＧＰＣ細胞及び／又は組織と比較した、細胞毒性の増大を検出し、試験物質が、関節軟骨細胞及び／又はＧＰＣ細胞に対して毒性であることを示すステップか、又は試験物質の不在下で培養された、関節様非肥大軟骨細胞及び／又はＧＰＣ細胞及び／又は組織と比較した、保護活性の増大（例えば、細胞毒性の減少）を検出し、試験物質が保護的であることを示すステップと
を含む、上記方法。
【請求項７１】
細胞毒性が、以下のアッセイ：トリパンブルー色素アッセイ、ルシフェラーゼアッセイ、ＭＴＴアッセイ及びＷＳＴ−１アッセイなどのテトラゾリウム（ｔｅｔｒａｚｏｌｉｍ）塩変換アッセイのうち１種を使用して測定される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
増殖、細胞毒性及び／又は保護活性が、以下の解析又はアッセイ：組織学的解析、グリコサミノグリカン及びプロテオグリカンの製造を定量するものなどの生化学的アッセイ、遺伝子発現解析、顕微鏡又はフローサイトメトリーによるラブリシン又はコラーゲン１０などの蛍光リポーターの獲得／喪失、ＣＤ７３細胞表面受容体発現の獲得又は喪失、細胞死についてのアッセイ及び軟骨細胞肥大を示し得る細胞の大きさについてのフローサイトメトリーのうち１種又は複数を使用して評価される、請求項６５から７０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
ＡＣ様軟骨細胞及び／若しくは軟骨様組織又は肥大様軟骨細胞及び／又は軟骨様組織が、疾患メディエーターと、任意選択で、試験物質とともの培養に先立って接触される、請求項６５から７２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
疾患メディエーターが、サイトカイン、任意選択で、ＩＬ−１β又は関節脂肪パッド成分である、請求項７３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、２０１３年４月５日に出願された米国仮特許出願第６１／８０９，０５０号の優先権に基づいて、米国特許法第１１９条の利益を主張する特許協力条約出願である。
【０００２】
本開示は、軟骨細胞及び軟骨、特に、関節軟骨細胞及び関節軟骨様組織並びにヒト多能性幹細胞由来の組織に類似する肥大軟骨細胞及び成長板軟骨を製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで多能性幹細胞から分化した細胞型を効率的に、再現可能に作製する能力により、広い範囲の変性疾患及び衰弱性疾患の治療のための細胞ベースの治療法の開発への扉が開けられた。変形性関節症（ＯＡ）は、成人１０人中少なくとも１人に影響を及ぼし（Ｌａｗｒｅｎｃｅ、Ｆｅｌｓｏｎら２００８年）、関節の動きと関連する疼痛のために患者の生活の質を乏しいままにするので、このような治療法の候補である。ＯＡの病原となる特徴として、基礎をなす軟骨下骨の肥厚及び骨増殖体（骨棘）の形成とともに関節を覆う関節軟骨の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解が挙げられる。関節軟骨は、発生の初期に特定化され、成人期を通じて持続する関節軟骨細胞（ＡＣ）として知られる軟骨細胞の別個の亜集団によって作製される。ＡＣは、通常の状況下で、関節軟骨の完全性を維持するよう機能するが、傷害又は疾患によって損傷を受けた軟骨を修復する能力はほとんど示さない。結果として、疾患が進行するにつれ、軟骨への損傷が、極めて広範囲なものとなり、患者の生活の質を改善するために関節置換などの外科的介入が必要になることが多い。ＡＣは、その主要な機能が軟骨内骨化のプロセスを通して骨を形成することである成長板軟骨細胞（ＧＰＣ）とは異なる（Ｃｏｌｎｏｔ、２００５年）。興味深いことに、ＯＡの発症に伴って、ＡＣは、この疾患の発病の一因となり得る肥大を含めたＧＰＣの一部の特徴を獲得すると思われる。
【０００４】
軟骨細胞及び軟骨置換は、いくつかの点で機械的装置の必要性を著しく低減し得る、ＯＡの潜在的な新規治療法に相当する。しかし、この種の治療法は、適当な組織への接近及び十分な数の高度に濃縮されたＡＣに依存している。成人間葉系幹細胞（ＭＳＣ）がｉｎ  ｖｉｔｒｏで軟骨細胞に分化できることは十分に確立されているが、ＡＣを生じさせ得るかどうかは、それらから生じた軟骨様組織が早熟性の肥大を受けるので（Ｐｅｌｔｔａｒｉ、Ｗｉｎｔｅｒら２００６年、Ｓｔｅｉｎｅｒｔ、Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉら２００７年、Ｐｅｌｔｔａｒｉ、Ｓｔｅｃｋら２００８年）不明確である。代替的に、ＡＣが患者から直接採取され、それらの増殖する能力は限定的ではあるが、ｅｘ  ｖｉｖｏでの組織作製のために使用されてきた。継代された軟骨細胞によって作製された組織は、線維軟骨の特徴を示し、これは、患者の生活の質を短期間改善し得るが、十分な体重を支える能力を欠くので最終的には分解を受ける（Ｔｉｎｓ、ＭｃＣａｌｌら２００５年、ＬａＰｒａｄｅ、Ｂｕｒｓｃｈら２００８年）。胚性及び人工多能性幹細胞（ＥＳＣ、ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、これらの細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで適当な条件下で広範囲の細胞型を作製できるので、治療適用のための新規の、潜在的に制限のない軟骨細胞及び組織の供給源に相当し得る。
【０００５】
軟骨細胞は、造血及び心血管系統を生じるよう運命づけられた側板中胚葉（ＬＰＭ）の生成後に、順序付けられた時間的パターンで、初期胚において誘導され沿軸中胚葉から発生する（Ｌａｗｓｏｎ、Ｍｅｎｅｓｅｓら１９９１年、Ｋｉｎｄｅｒ、Ｔｓａｎｇら１９９９年）。誘導後、沿軸中胚葉のストリップは、体節に分割される（Ｔａｍ及びＴａｎ１９９２年、Ｋｕｌｅｓａ及びＦｒａｓｅｒ  ２００２年）。体節発生は、一部は、転写因子パラキシス（ＴＣＦ１５）及びその発現が沿軸中胚葉の誘導と一致するＴＢＸ１８によって調節される（Ｂｕｒｇｅｓｓ、Ｒａｗｌｓら１９９６年、Ｂｕｓｓｅｎ、Ｐｅｔｒｙら２００４年、Ｓｉｎｇｈ、Ｐｅｔｒｙら２００５年）。個々の体節は、次いで、軟骨及び脊柱を含めた中軸骨格を形成する腹側硬節と、背中の骨格筋及び真皮に発生する背側皮筋板にパターン形成される（Ｈｉｒｓｉｎｇｅｒ、Ｊｏｕｖｅら２０００年）。硬節の特定化は、２種の転写因子Ｍｅｏｘ１（Ｍａｎｋｏｏ、Ｓｋｕｎｔｚら２００３年）及びＮｋｘ３．２（Ｂａｐｘ１）の発現を特徴とする。軟骨形成の可能性を有するコラーゲン２（Ｃｏｌ２ａ１）陽性間葉系細胞の集団は、マウス発生のＥ１２．５で硬節由来細胞から発生する（Ａｋｉｙａｍａ、Ｃｈａｂｏｉｓｓｉｅｒら２００２年、Ｄａｏ、Ｊｏｎａｓｏｎら２０１２年）。
【０００６】
前駆体細胞を軟骨形成系統に分化させるための方法は確立されているが、ＡＣを特定化し、最終的に、非肥大軟骨細胞を含有する軟骨組織を安定化する能力は、不十分にしか理解されていないままである。ＡＣは、Ｗｎｔ９ａ／１４の並びに増殖及び分化因子５（ＧＤＦ５／ＢＭＰ１４）、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーの上方制御を特徴とする、将来の滑膜関節の部位に生じる細胞の線維性集団である、インターゾーン細胞に由来する（Ａｒｃｈｅｒ、Ｄｏｗｔｈｗａｉｔｅら２００３年、Ｐａｃｉｆｉｃｉ、Ｋｏｙａｍａら２００６年）。系統追跡研究から、ＧＤＦ５発現インターゾーン細胞は、ＡＣを含めたいくつかの関節組織を生じさせるが、ＧＰＣ集団には寄与しないことが示された（Ｋｏｙａｍａ、Ｓｈｉｂｕｋａｗａら２００８年）。対照的に、ＧＰＣは、濃縮軟骨形成間充織から発生し、ＢＭＰ２、４及び７並びにコラーゲン１０を含めた肥大関連遺伝子を発現する。二次的骨化中心が生じ始める出生直後の７〜８日目ほどの早期に、ＡＣ及びＧＰＣの別個の領域が観察される（Ｍｕｒａｋａｍｉ、Ｂａｌｍｅｓら２００４年、Ｂｌｕｍｅｒ、Ｌｏｎｇａｔｏら２００７年）。これらの知見は、ＡＣ及びＧＰＣが、発生の間に別々の前駆体集団から生じ、それ自体、別個の系統に相当し得るということを示唆している。
【０００７】
いくつかの研究によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでマウス（ｍ）及びヒトＥＳＣ及びｉＰＳＣから軟骨細胞を誘導することが可能であるということが実証されている。しかし、ほとんどが、分化の初期段階を支持するために血清ベースの培地を使用していた結果、混合性系統の最終段階培養物が生じた（Ｋｒａｍｅｒ、Ｈｅｇｅｒｔら２０００年、ｚｕｒ  Ｎｉｅｄｅｎ、Ｋｅｍｐｋａら２００５年、Ｈｗａｎｇ、Ｋｉｍら２００６年、Ｈｗａｎｇ、Ｖａｒｇｈｅｓｅら２００８年、Ｊｕｋｅｓ、Ｂｏｔｈら２００８年、Ｙａｍａｓｈｉｔａ、Ｋｒａｗｅｔｚら２００８年）。最近の研究は、分化へと向かわせる特定の経路のアゴニスト及びアンタゴニストを含む規定の培養培地の使用を報告した（Ｎａｋａｙａｍａ、Ｄｕｒｙｅａら２００３年、Ｄａｒａｂｉ、Ｇｅｈｌｂａｃｈら２００８年、Ｔａｎａｋａ、Ｊｏｋｕｂａｉｔｉｓら２００９年）。ｍＥＳＣでは、Ｔａｎａｋａら（２００９年）が、Ｗｎｔシグナル伝達にＢＭＰ阻害を組み合わせることにより、ＰＤＧＦＲαの発現及びＦｌｋ−１の発現の欠如によって同定される、軟骨形成能を有する沿軸中胚葉の生成がもたらされることを示した。この中胚葉はまた、いくつか心臓潜在性（cardiac potential）を示したが、造血細胞を生成する能力は示さず、ＢＭＰシグナル伝達に対する依存度が種々の種類の中胚葉を区別していることを示している。
【０００８】
Ｏｌｄｅｒｓｈａｗら（Ｏｌｄｅｒｓｈａｗ、Ｂａｘｔｅｒら２０１０年）は、血清不含プロトコールを使用した。Ｏｌｄｅｒｓｈａｗの方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで組織は観察されなかった。
【０００９】
Ｕｍｅｄａら（Ｕｍｅｄａ、Ｚｈａｏら２０１２年）は、Ｒｕｎｘ２発現細胞を含む小結節をもたらすＰＤＧＦ刺激を使用する方法を使用した。
【００１０】
変形性関節症は、主に、関節の関節を覆う関節軟骨に影響を及ぼす変性性疾患である。関節軟骨は、傷害の際に自身を再生する極めて限定された能力しか有さず、したがって、細胞及び組織置換戦略は、この組織を効率的に置換する唯一の手段である。創薬及び変形性関節症などの関節疾患を有する患者における軟骨置換戦略のために、このような組織が大いに必要とされているにもかかわらず、現在、多能性幹細胞からヒト軟骨を製造する方法を欠いている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願の一態様は、軟骨細胞系統細胞及び／又は軟骨様組織、任意選択で、関節様非肥大軟骨細胞及び／又は軟骨様組織及び／又は肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を作製するための方法を提供し、方法は、
（ａ）原始線条様中胚葉細胞集団（例えば、ステージ２）、任意選択で、ＣＤ５６＋、ＰＤＧＦＲα＋原始線条様中胚葉細胞集団を、
（ｉ）ＦＧＦアゴニストと、
（ｉｉ）ＢＭＰ阻害剤、任意選択で、ノギン、ＬＤＮ−１９３１８９及び／又はドルソモルフィンと、
（ｉｉｉ）任意選択で、１種又は複数のＴＧＦβ阻害剤、任意選択で、ＳＢ４３１５４２及びＷｎｔ阻害剤、任意選択で、ＩＷＰ２（Ｎ−（６−メチル−２−ベンゾチアゾリル）−２−［（３，４，６，７−テトラヒドロ−４−オキソ−３−フェニルチエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）チオ］−アセトアミド；Ｓｉｇｍａ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（ＤＫＫ１；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び／又はＸＡＶ９３９（３，５，７，８−テトラヒドロ−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４−オン；Ｓｉｇｍａ）と
を含む沿軸中胚葉特定化カクテルとともに培養して、細胞表面ＣＤ７３、ＣＤ１０５及び／又はＰＤＧＦＲ−βを発現する沿軸中胚葉細胞集団を特定化するステップと、
（ｂ）細胞表面ＣＤ７３、ＣＤ１０５及び／又はＰＤＧＦＲ−βを発現する沿軸中胚葉細胞集団から軟骨細胞前駆体集団を作製するステップとを含み、前記の軟骨細胞前駆体集団を作製するステップが、
（ｉ）細胞表面ＣＤ７３、ＣＤ１０５及び／又はＰＤＧＦＲ−βを発現する沿軸中胚葉細胞集団を、血清不含又は血清含有培地中、高細胞密度で培養するステップと、
（ｉｉ）高細胞密度ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋及び／又はＰＤＧＦＲβ＋沿軸中胚葉細胞集団を、血清不含培地中でＴＧＦβアゴニスト、任意選択で、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２及び／又はＴＧＦＢ３とともに培養して、高細胞密度Ｓｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団（例えば、ステージ３）を製造するステップと
を含み、
（ｃ）（ｉ）高細胞密度Ｓｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を、ＴＧＦβアゴニスト（任意選択で、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２及び／又はＴＧＦβ３）とともに長期間培養して、関節様非肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を製造するステップか、又は
（ｉｉ）高細胞密度Ｓｏｘ９＋コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を、ＢＭＰ４アゴニストとともに長期間培養して、肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織（例えば、ステージ４）を製造するステップのいずれか
を含む。
【００１２】
別の態様は、軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織、任意選択で、関節様非肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織及び／又は肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を作製するための方法を含み、方法は、
（ａ）多能性幹細胞の出発集団を、
ＣＤ５６及び／又はＰＤＧＦＲ−αを発現する原始線条様中胚葉細胞集団（例えば、ステージ１）を誘導するための原始線条誘導カクテルとともに培養するステップと、
（ｂ）ＣＤ５６及びＰＤＧＦＲ−αを発現する原始線条様中胚葉細胞集団を、
（ｉ）ＦＧＦアゴニストと、
（ｉｉ）ＢＭＰ阻害剤、任意選択で、ノギン、ＬＤＮ−１９３１８９及び／又はドルソモルフィンと、
（ｉｉｉ）１種又は複数のＴＧＦβ阻害剤、任意選択で、ＳＢ４３１５２４及びＷｎｔ阻害剤、任意選択で、ＤＫＫ１、ＩＷＰ２及び／又はＸＡＶ９３９と
を含む沿軸中胚葉特定化カクテルとともに培養して、細胞表面ＣＤ７３、ＣＤ１０５及びＰＤＧＦＲ−βを発現する沿軸中胚葉細胞集団を特定化するステップと
（ｃ）細胞表面ＣＤ７３、ＣＤ１０５及び／又はＰＤＧＦＲ−βを発現する沿軸中胚葉細胞集団から、軟骨細胞前駆体集団を作製するステップとを含み、前記の軟骨細胞前駆体集団を作製するステップが、
（ｉ）ＣＤ７３、ＣＤ１０５及び／又はＰＤＧＦＲ−βを発現する沿軸中胚葉細胞集団を、血清不含又は血清含有培地中、高細胞密度で培養するステップと、
（ｉｉ）高細胞密度ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋及びＰＤＧＦＲβ＋沿軸中胚葉細胞集団を、血清不含培地中でＴＧＦβアゴニストとともに培養して、高細胞密度Ｓｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を製造するステップと、
（ｄ）（ｉ）高細胞密度Ｓｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を、ＴＧＦβアゴニストとともに長期間培養して、関節様非肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を製造するステップか、又は
（ｉｉ）高細胞密度Ｓｏｘ９＋コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を、ＢＭＰ４アゴニストとともに長期間培養して、肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を製造するステップと
を含む。
【００１３】
一実施形態では、方法は、関節様非肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を作製するためのものである。別の実施形態では、方法は、肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を作製するためのものである。
【００１４】
一実施形態では、高細胞密度Ｓｏｘ９＋コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団が、ＴＧＦβアゴニストとともに培養される長期間は、例えば、ラブリシン及びＣＩＬＰ２を発現する、非肥大軟骨細胞様及び／又は軟骨様組織を作製するためには、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１１週間、少なくとも１２週間又はそれ以上である。
【００１５】
一実施形態では、高細胞密度Ｓｏｘ９＋コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団が、ＢＭＰ４アゴニストとともに培養される長期間は、コラーゲン２を発現する軟骨様組織又はコラーゲン１０を発現する肥大軟骨細胞を作製するためには、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１１週間、少なくとも１２週間又はそれ以上である。
【００１６】
軟骨細胞様細胞を作製する方法であって、
（ａ）軟骨細胞前駆体細胞を、血清不含又は血清含有培地中、高細胞密度で培養するステップと、
（ｂ）高細胞密度軟骨細胞前駆体細胞を、血清不含培地中でＴＧＦβアゴニストとともに培養するステップと、
（ｃ）（ｉ）軟骨細胞前駆体細胞を、ＴＧＦβアゴニストとともに長期間培養して、関節軟骨様軟骨細胞を製造するステップか、又は
（ｉｉ）軟骨細胞前駆体細胞を、ＢＭＰ４アゴニストとともに長期間培養して、肥大軟骨細胞系統細胞及び／若しくは軟骨様組織を製造するステップのいずれかと
を含む方法。
【００１７】
一実施形態では、軟骨細胞前駆体細胞は、初代胎児軟骨細胞又は継代された胎児軟骨細胞である。
【００１８】
一実施形態では、作製された細胞及び／又は組織が、対象に投与される。
【００１９】
また、別の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って作製された、関節様非肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織及び／又は肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織の単離された集団が提供される。
【００２０】
さらなる態様は、関節様非肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織及び／又は肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織の集団と、担体、任意選択で、ＰＥＧ、ヒドロゲル、骨足場、骨代用品足場及び／又はマトリゲルとを含む組成物を含む。一実施形態では、担体は、医薬品等級である。
【００２１】
一実施形態では、単離された集団は、希釈剤又は担体、任意選択で、製薬用希釈剤を含む組成物に含まれる。一実施形態では、希釈剤は、任意選択で、グリセロール及び／又はＤＭＳＯのような凍結保存剤、血清及び、ヒト血清アルブミンのようなアルブミンを含む培養培地である。
【００２２】
さらなる態様は、本明細書に記載される細胞又は組成物を含む軟骨及び／又は骨組織製品及び足場を含む。
【００２３】
別の態様は、本明細書に記載された方法を使用して作製された細胞及び／若しくは組織を投与するステップ並びに／又は本明細書に記載される軟骨及び／若しくは骨組織製品を移植するステップを含む、症状を寛解させる及び／又はそれを必要とする対象を治療するための方法を含む。
【００２４】
また、別の態様では、症状を寛解する及び／又はそれを必要とする対象を治療するための、本明細書に記載される方法を使用して作製された細胞及び／若しくは組織並びに／又は前記細胞及び／若しくは組織を含む軟骨及び／若しくは骨組織製品の使用が提供される。
【００２５】
さらなる態様は、沿軸中胚葉細胞集団を作製する方法であって、
（ａ）多能性幹細胞の出発集団を、原始線条誘導カクテルとともに培養して、ＣＤ５６及びＰＤＧＦＲ−αを発現する原始線条様中胚葉細胞集団（例えば、ステージ０）を誘導するステップと、
（ｂ）ＣＤ５６及びＰＤＧＦＲ−αを発現する原始線条様中胚葉細胞集団を
（ｉ）ＦＧＦアゴニストと、
（ｉｉ）ＢＭＰ阻害剤、任意選択で、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、ＬＤＮ−１９３１８９、ドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）と、そして
（ｉｉｉ）１種又は複数のＴＧＦβ阻害剤、任意選択で、ＳＢ４３１５２４；及びＷｎｔ阻害剤、任意選択で、ＤＫＫ１、ＩＷＰ２、及び／又はＸＡＶ９３９と
を含む沿軸中胚葉特定化カクテルとともに培養して、細胞表面ＣＤ７３、ＣＤ１０５及びＰＤＧＦＲ−βを発現する沿軸中胚葉細胞集団を特定化するステップと
を含む方法を含む。
【００２６】
細胞を単離する方法及びスクリーニングアッセイも提供される。
【００２７】
本開示のその他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。しかし、当業者には、この詳細な説明から本開示の趣旨及び範囲内で種々の変法及び改変が明らかとなるので、詳細な説明及び特定の例は、本開示の好ましい実施形態を示すが、単に例示として与えられると理解されなければならない。
【００２８】
本開示の一実施形態を、ここで、図面との関連で説明する：
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からの沿軸中胚葉、軟骨細胞前駆体及び軟骨組織の血清不含分化を示す図である。（Ａ）ｈＰＳＣは、胚様体としての分化の１〜４日目にアクチビンＡ、ＢＭＰ４及び塩基性（ｂ）ＦＧＦを使用する原始線条様中胚葉集団（ステージ１）の誘導を含む４ステージで分化される。４日目（Ｔ４）に、中胚葉集団は、フローサイトメトリーによる細胞表面でのＣＤ５６及びＰＤＧＦＲａの発現によってモニタリングされる。（Ｂ）４日目、中胚葉細胞は、４〜６日目のドルソモルフィン、ＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤ＳＢ４３１５４２及びｂＦＧＦ並びに４〜１５日目のｂＦＧＦの処理によって単層培養で沿軸中胚葉の運命に特定化される（ステージ２）。１５日目、沿軸中胚葉細胞は、ＴＧＦＢ３の存在下で、およそ１０日間、マイクロマスと呼ばれる高密度「スポット」でプレーティングすることによってか、又はコラーゲンコーティングされた膜フィルター上にプレーティングすることによって（示されていない）軟骨細胞前駆体を作製し得る（ステージ３）。軟骨細胞前駆体は、ＴＧＦＢ３（関節）又はＢＭＰ３（成長板様）を用いる長期刺激、例えば、１２週間によって、分化のステージ４の間に軟骨組織形式で、関節軟骨細胞又は成長板様軟骨細胞に特定化され得る。組織は、少なくとも７カ月間培養物で維持された。ｈＥＳＣ（Ｃ）及びｈＩＰＳＣ（Ｄ，Ｅ）からの原始線条様集団の効率的な誘導は、分化の３日目にフローサイトメトリーによってＣＤ５６及びＰＤＧＦＲαの発現によって確認された。ｈＥＳＣは、以下のサイトカインを用いて原始線条集団を作製するよう誘導された：アクチビンＡ（２ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（３ｎｇ／ｍｌ）及び塩基性（ｂ）ＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）。ｈｉＰＳＣは、胚様体としての分化の１〜３日目に、Ｗｎｔ経路アゴニストＣＨＩＲ９９０６１（１μＭ）の存在下（Ｃ）又は不在下（Ｄ）、アクチビンＡ（３ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（１ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）を使用して原始線条様中胚葉集団（ステージ１）を作製するよう誘導された。
【００３０】
【図２】ｈＰＳＣ由来の沿軸中胚葉の特性決定を示す図である。（Ａ）さらなる因子なし（０ＤＭ、ＦＧＦなし）、ＦＧＦ、４μＭ  ＤＭ又は４μＭ  ＤＭ＋ＦＧＦを用いて処理された５日目中胚葉のフローサイトメトリー解析。５日目プロファイルは、ＫＤＲ及びＰＤＧＦＲａ発現を表し、二重陽性集団（ゲーティングした）は、心臓潜在性（２０）を有する中胚葉を示す。ＦＧＦを用いる処理は、５日目に少ないＰＤＧＦＲａ発現をもたらす。（Ｂ）分化の１５日目の中胚葉集団での細胞表面マーカー、ＣＤ７３、ＣＤ１０５及びＰＤＧＦＲ−βの発現を示す図である。（Ｃ）Ｗｎｔ阻害はまた、ＣＤ７３及びＣＤ１０５発現の効率を改善し得る。４日目〜６日目の間の実験的細胞処理は、ｗｎｔ経路阻害剤ＩＷＰ２の存在下又は不在下でのドルソモルフィン、ｂＦＧＦ、ＴＧＦβ阻害剤（ＳＢ４３１５４２）の組合せを含む。示されるように導かれた１５日目中胚葉集団のＣＤ７３及びＣＤ１０５のフローサイトメトリー解析。（Ｄ）示された因子で導かれた１５日目中胚葉集団の遺伝子発現解析。Ｎｋｘ２．５は、心臓転写因子であり、Ｍｅｏｘ１及びＮｋｘ３．２は、沿軸中胚葉及び体節転写因子である。（Ｅ）示されるように１５日目中胚葉集団から導いた１日齢マイクロマス及び１週間齢マイクロマスを表す顕微鏡写真。（Ｆ）示されるように１５日目中胚葉から導かれた１週齢マイクロマスにおける心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）発現のフローサイトメトリー解析。（Ｇ）ＤＭ＋ＦＧＦ処理沿軸中胚葉から導かれた４週齢マイクロマスは、軟骨組織を作製するが、ＦＧＦ単独を用いて特定化された中胚葉は、軟骨様組織を作製しない（非接着性凝集体を参照のこと）。
【００３１】
【図３】ＣＤ７３＋ＣＤ１０５＋ＰＢｅｔａ＋細胞は、軟骨細胞潜在力及びｉｎ−ｖｉｔｒｏで軟骨様組織を作製する潜在力を含有する。（Ａ）１２日目及び１５日目のＤＭ＋ＦＧＦ処理沿軸中胚葉のフローサイトメトリー解析。二重陽性（ＣＤ７３＋ＣＤ１０５＋及びＣＤ７３＋ＰＢｅｔａ＋）集団が、細胞選別によって二重陰性集団から単離され、マイクロマス培養でプレーティングされた。（Ｂ）培養１０日後のマイクロマス培養物。（Ｃ）培養２週間後のマイクロマス培養物。（Ｄ）培養５週間後の選別された集団に由来する軟骨組織の写真。
【００３２】
【図４】ＴＧＦＢ３及びＢＭＰ４は、軟骨細胞並びに関節軟骨及び成長板軟骨表現型を有する軟骨様組織を特定化する。（Ａ）ＴＧＦＢ３又はＢＭＰ４を用いて導かれた５週間齢マイクロマスの顕微鏡写真、２０ｘ倍率。（Ｂ）ＴＧＦＢ３又はＢＭＰ４を用いて導かれた１３週間軟骨組織の組織学（トルイジンブルーを用いて染色された）。トルイジンブルーは、軟骨組織を異染性に染色し、これらの組織切片は、ピンク色／紫色であり、これは、軟骨組織が存在することを示す。（Ｃ）３週及び５週齢マイクロマスの前方及び側方細胞散乱パラメータのフローサイトメトリー解析。側方散乱は、細胞粒度を示し、前方細胞散乱は、細胞の大きさを示す。（Ｄ）ｈＰＳＣ由来マイクロマス組織の、胎児初代軟骨細胞由来のマイクロマス組織及び発生中のヒト胎児大腿骨軟骨に対する比較。関節軟骨領域は、拡大した（肥大）と思われる細胞を含有する成長板様領域と比較して、より小さい細胞の大きさを有すると思われる。マイクロマス中並びに胎児大腿骨中の軟骨組織は、トルイジンブルー染色を用いて均一に染まる（像は、ピンク色／紫色であり、軟骨タンパク質の存在を示す）。ＢＭＰ４処理マイクロマス組織は、多数の拡大した細胞を含有し、これは、成長板軟骨に相当する胎児軟骨の下のパネルと同様である。ＴＧＦＢ３処理マイクロマス培養物は、あったとしても、わずかな拡大した軟骨細胞しか含有せず、関節軟骨の部位である胎児軟骨の上のパネルと同様と思われる。（Ｅ）肥大軟骨細胞を作製するためにＢＭＰ４の代わりにＧＤＦ５を使用した顕微鏡写真。（Ｆ）１２週間後にトルイジンブルーを用いて染色されたｈｉＰＳＣ由来の軟骨組織の組織学的解析。（Ｇ，Ｈ）ＩＩ型コラーゲン（Ｇ、８週組織）及びラブリシン（Ｈ、１２週組織）の、ｈＥＳＣ由来軟骨組織の免疫組織化学的染色。
【００３３】
【図５】それぞれ、分化のステージ３及び４の間のＴＧＦＢ３又はＢＭＰ４の存在下での軟骨細胞特定化の遺伝子発現解析。一般的な軟骨細胞遺伝子Ｓｏｘ９（Ａ）及びコラーゲン２（Ｂ）、肥大遺伝子コラーゲン１０（Ｃ）、Ｒｕｎｘ２（Ｄ）、オステリックス（Ｅ）及びアルカリホスファターゼ（Ｆ）、関節軟骨関連遺伝子ラブリシン（Ｇ）及び軟骨中間体層タンパク質２（ＣＩＬＰ２）（Ｈ）、インターゾーン関連（関節前駆体）遺伝子ＧＤＦ５（Ｉ）、ＥＲＧ（Ｊ）及びＷｎｔ９ａ（Ｋ）。発現は、ＴＢＰに関連したコピー数（ｎ＝３〜８生物学的複製物）であり、初代胎児軟骨細胞（１６〜１９週間齢、ｎ＝４）、初代健常成人関節軟骨細胞（ｎ＝２）及び成人の腸骨稜から単離された成長板様軟骨細胞（ｎ＝１）に対して比較される。Ｔ１５中胚葉は、１５日目ｈＥＳＣ由来沿軸中胚葉（ＤＭ＋ＦＧＦ処理）を示す。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【００３４】
【図６】ＣＤ７３は、関節軟骨細胞によって発現される。ＴＧＦＢ３又はＢＭＰ４の存在下での、９〜１０週間のマイクロマス培養後の、初代軟骨細胞（Ａ）健常成人関節軟骨細胞及び腸骨稜ＧＰＣ様軟骨細胞（Ｂ）初代胎児軟骨細胞、初代（Ｃ）又は継代された（継代（Ｐ）２、Ｄ）胎児軟骨細胞並びに（Ｅ，Ｆ）ＴＧＦＢ３又はＢＭＰ４の存在下で導かれた１１週間後のｈＰＳＣ由来軟骨細胞のフローサイトメトリー解析。（Ｇ）３日、１０日及び２週間後の、ＴＧＦＢ３を用いて処理された、Ｔ１２及びＴ１５沿軸中胚葉集団並びにマイクロマス培養物でのＣＤ７３及びＰＤＧＦＲ−β細胞表面発現の経時的推移。（Ｈ）３日、７日、１０日及び２〜５週間後の、ＴＧＦＢ３処理マイクロマスでのＣＤ７３発現の経時的推移。
【００３５】
【図７】ｈＰＳＣ由来軟骨細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでそれぞれの関節又は肥大軟骨細胞表現型を維持する。ＴＧＦβ３又はＢＭＰ４を用いて処理されたマイクロマス組織（８〜１２週齢）が、コラゲナーゼ処理によって解離され、軟骨細胞が、１２週間、免疫不全マウス中に皮下注入された。１２週間後に移植片を回収し、組織学的に解析した。切片は、プロテオグリカンの存在を示すためにトルイジンブルー（Ａ、Ｃ）を用いて、石灰化の面積を同定するためにフォンコッサ（Ｂ）を用いて染色された。ＩＩ型（Ｄ）及びＸ型コラーゲン（Ｅ）が免疫組織化学的に検出された。ｉｎ  ｖｉｖｏで１２週間後、ＴＧＦβ３処理軟骨細胞由来移植片は、ＩＩ型コラーゲン（Ｄ）について染まり、トルイジンブルー（Ａ、Ｃ）を用いて異染性に染まり、フォンコッサ（Ｂ）又はＸ型コラーゲンの陽性の領域（Ｅ）は見られなかった。１２週間後に、ＢＭＰ４処理軟骨細胞由来の移植片において、石灰化（Ｂ）、フォンコッサ陽性、黒色の領域が同定されたが、これらの領域は、プロテオグリカンをほとんど（Ａ、Ｃ）含有しておらず、ＩＩ型（Ｄ）及びＸ型コラーゲン（Ｅ）について陽性に染まり、これは、石灰化した軟骨の発生を示す。
【００３６】
【図８】ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３は、ｈＰＳＣ由来沿軸中胚葉から関節軟骨細胞を作製した。示されるようなＴＧＦβアゴニストの存在下（１０ｎｇ／ｍｌ）でマイクロマス培養の１２週間後のＣＯＬ２Ａ１、ラブリシン及びＣＩＬＰ２遺伝子発現。値は、ＴＢＰに関連したコピー数ｍＲＮＡに相当する。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【００３７】
【図９】ｈＰＳＣ由来関節様軟骨は、炎症性分子ＩＬ１βに適宜反応する。（Ａ）実験計画が表されている。関節軟骨組織は、ＴＧＦβ３の存在下で１０週間、ｈＰＳＣから導かれた。軟骨組織（マイクロマス）は、示されるようにＴＧＦβ３又はＩＬ１β（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて２週間（１０〜１２週）処理された。軟骨組織は、組織学的に解析され、遺伝子発現解析のために解離された。ｈＰＳＣ由来関節軟骨細胞は、外因性ＩＬ１βに応じて、ＭＭＰ１３（Ｂ）、ＭＭＰ２（Ｃ）、ＡＤＡＭＴＳ４（Ｄ）及びＡＤＡＭＴＳ５（Ｅ）の発現を有意に上方制御した。（Ｆ、Ｇ）細胞外マトリックス成分、ＣＯＬ２Ａ１及びＡＣＡＮをコードする遺伝子は、ＩＬ１βに応じて有意に下方制御される。（Ｈ、Ｉ）表層軟骨細胞遺伝子ＰＲＧ４（ラブリシン）及びＣＩＬＰ２の発現は、ＩＬ１βの存在下で下方制御された。（Ｊ）ＶＥＧＦは、ＩＬ１βの存在下で上方制御された。値は、ＴＢＰに関連したコピー数ｍＲＮＡに相当する（ｎ＝７）。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を示す。（Ｋ）示されるように処理した後１２週の組織の組織学的解析。異染性トルイジンブルー染色は、プロテオグリカンを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
１．定義
【００３９】
用語「原始線条様中胚葉細胞集団」とは、本明細書において、ブラキュリ及び細胞表面マーカーＣＤ５６及びＰＤＧＦＲαを発現する中胚葉細胞の集団を意味する。例えば、原始線条様中胚葉細胞集団は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は約９０％のＣＤ５６を発現する細胞を含み得、例えば、５０％  ＣＤ５６／ＰＤＧＦＲα＋細胞を使用する開示された方法を用いて、ＰＤＧＦＲα軟骨分化が得られた。
【００４０】
用語「細胞表面ＣＤ７３、ＣＤ１０５及び／又はＰＤＧＦＲ−βを発現する沿軸中胚葉細胞集団」とは、本明細書において、ＣＤ７３、ＣＤ１０５及び／又はＰＤＧＦＲ−β及び沿軸中胚葉転写因子Ｍｅｏｘ１を発現する中胚葉細胞を意味する。例えば、沿軸中胚葉細胞集団は、図２Ｄに示されるようにＭｅｏｘ１、ＣＤ７３、ＣＤ１０５及び／又はＰＤＧＦＲ−βを発現する少なくとも７０％の細胞を含む。Ｍｅｏｘ１発現は、非ＦＧＦ及びドルソモルフィン処理細胞と比較して、ＦＧＦ及びドルソモルフィン処理細胞において増大される。
【００４１】
本明細書において、用語「発現する」とは、細胞におけるポリヌクレオチドの転写又はポリペプチドの翻訳を指し、その結果、分子を発現する細胞において、その分子を発現しない細胞中にあるよりも分子のレベルが高く測定される。分子の発現を測定する方法は、当業者に周知であり、制限されるものではないが、ノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ウエスタンブロッティング及びＦＡＣＳなどの免疫染色が挙げられる。
【００４２】
「＋」とも表される用語「発現している」とは、本明細書において、細胞タンパク質レベルに関して、例えば、ＦＡＣＳ解析によって測定されるような、タンパク質を発現していない細胞と比較して検出可能なタンパク質発現を意味する。ＦＡＣＳ解析を使用して、細胞は、シグナルの平均蛍光が、抗体で染色されなかった細胞（非染色対照）又は抗体を用いて染色されたが細胞表面にタンパク質を発現しない細胞より明るい場合に、細胞表面にタンパク質を陽性に発現していると考えられる。細胞集団に関して、「発現している」とは、本明細書において、その細胞集団中の細胞の少なくとも５０％がマーカーを発現することを意味する。一実施形態では、細胞のうち、例えば７０％、８０、９０％又はそれ以上が陽性であり、マーカーを発現するような、発現している細胞、例えば、ＣＤ７３又はその他のマーカーを発現している細胞が選別される。
【００４３】
「−」とも表される用語「発現を欠いている」とは、本明細書において、細胞タンパク質レベルに関して、例えば、ＦＡＣＳ解析によって測定されるような、タンパク質を発現している細胞と比較して検出不能なタンパク質発現を意味する。細胞集団に関して、「発現を欠いている」とは、本明細書において、細胞集団中の細胞の２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満又は１％未満が、マーカーを発現することを意味する。
【００４４】
用語「培養すること」とは、本明細書において、接着、懸濁液又は３Ｄ培養物で細胞をインキュベートすること及び／又は継代すること。本明細書において、用語「接着培養」とは、細胞が固体表面上で培養される細胞培養系を指し、固体表面は、順に、不溶性基板でコーティングされていてもよく、これは、順に、以下に列挙されるもの又は任意の、細胞が培養物中で増殖するか、若しくは安定化されるのを可能にするその他の化学的若しくは生物学的物質などの別の基板の表面コートでコーティングされてもよい。細胞は、固体表面とか、又は基板と堅固に接着している場合もしていない場合もある。接着培養の基板は、組織培養処理プラスチック、ポリオルニチン、ラミニン、ポリ−リシン、精製コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、テネイシン、ビトロネクチン、エンタクチン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、ポリグリコール酸(poly glycolytic acid)（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）及びポリ乳酸−グリコール酸（ＰＬＧＡ）のうち任意の１種又は組合せを含み得る。一実施形態では、細胞は、マトリゲル（登録商標）コーティングされたプレート上にプレーティングされる。別の実施形態では、細胞は、フィブロネクチンコーティングされたプレート上にプレーティングされる。細胞は、フィルター培養及びマイクロマス培養で培養され得る。一実施形態では、細胞は、膜フィルター、任意選択で、トランスウェルシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ａｌｖａｔｅｘが２ブランドである）の一部として組織培養ディッシュ中に入れられたものの上にプレーティングされる。基板はまた、ＣＰＰ（ポリリン酸カルシウム）などの骨足場代用品又はその他の利用可能な医薬上利用可能な足場であり得る。マイクロマス培養は、細胞の高密度懸濁液からなり、基板の小さい領域に接着することが許される（例えば、２００，０００〜５００，０００個細胞が、基板の０．２〜１ｃｍ径の円形領域に接着する）。例えば、３Ｄプリンティングによって、任意の形状又は大きさの基板が使用、調製され得る。細胞培養の関連で使用されるような、用語「懸濁液」は、その技術分野におけるように使用される。すなわち、細胞培養懸濁液は、細胞が表面と接着しない細胞培養環境である。当業者ならば、それだけには限らないが、フローフード、インキュベーターなどの設備及び／又は細胞を常に移動しているよう維持するために使用される設備、必要に応じて、例えば、回転板プラットフォーム、シェーカーなどの使用を含めた懸濁培養技術には精通しているであろう。
【００４５】
用語「接触している」又は「〜とともに培養している」は、成分（単数又は複数）及び細胞／組織を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで一緒にインキュベートすること（例えば、化合物を培養中の細胞に添加すること）を含むものとし、「接触している」又は「〜とともに培養している」のステップは、任意の適した方法で実施され得る。例えば、細胞は、接着培養で、又は懸濁培養で、又は３Ｄ培養で処理され得、成分は、時間的に実質的に同時に（例えば、カクテル中で一緒に）又は逐次（例えば、第１の成分の添加から１時間、１日又はそれ以上内に）添加され得る。細胞はまた、増殖因子などの別の物質又は細胞を安定化させるための、若しくは細胞をさらに分化させるためのその他の分化物質若しくは環境と接触され得、当技術分野で公知の条件下で細胞を培養することを含む。ステージ１は、例えば、通常、懸濁培養で実施される。ステージ２は、一実施形態では、懸濁液で実施される。例えば、細胞が、マイクロマス又はフィルター形式の代わりにペレット形式で凝集される場合には、ステージ３及び／又は４は、例えば、懸濁培養で実施され得る。ペレット培養物は、試験管中の懸濁液中で浮遊し得る高密度の細胞のクラスターである。一実施形態では、ステージの一部は、懸濁液又は混合懸濁液及び接着、任意選択で、３Ｄ培養で実施される。例えば、一部の組織は、経時的に非接着性になり、したがって、ステージ４の培養期間の一部について懸濁液中にある。
【００４６】
用語「高細胞密度」とは、本明細書において、約０．２ｃｍ〜約２ｃｍ径表面積（２Ｄ）あたり約２００，０００個細胞〜約１，０００，０００個細胞を意味するか、又はマイクロマスに関しては、細胞が、マイクロマス「スポット」のために許可される小さい表面積に接着するのを可能にするには、約２０マイクロリットルの培地あたり少なくとも約１００，０００個細胞又は約２０マイクロリットルの培地あたり、例えば、最大約２，０００，０００個細胞である。膜フィルターについては、面積は、購入される市販の膜に応じて変わり、細胞が接着することを可能にするよう、例えば、およそ４００，０００個細胞〜約２，０００，０００個細胞が、例えば、約１ｃｍ〜約２ｃｍのシリンダー型膜フィルター含有インサート中に、約２００マイクロリットル〜約５００マイクロリットルの培地でプレーティングされ得る。マイクロマス及び膜フィルター培養の両方において、細胞は、約１〜５細胞層で接着し、組織は、接着後に「より厚く」増殖することが許される。同様の細胞密度は、ＣＰＰなどの骨代用品足場上に播種するために使用され得る。
【００４７】
本明細書において、「血清不含」とは、所与の細胞集団を培養するために使用される溶液、例えば、培地中の血清の不在を指す。例えば、血清不含培地又は環境は、４、３、２又は１％未満の血清を含有し得る。好ましい実施形態では、血清不含組成物は、血清を含有しないか、又は既定の培地に添加される成分の単離から微量の血清のみを含有する（例えば、０％の添加された血清を含有する）。
【００４８】
用語「ＢＭＰ阻害剤」とは、本明細書において、ＢＭＰシグナル伝達の任意の阻害剤を意味し、例えば、任意選択で、ドルソモルフィン（ＤＭ）、ノギン、コーディン、ＬＤＮ−１９３１８９、可溶性ＢＭＰＲ１ａ及び／又は可溶性ＢＭＰＲ１ｂから選択される、１型ＢＭＰ受容体阻害剤、ＢＭＰリガンド及び／又は可溶性ＢＭＰ受容体を含む。
【００４９】
用語「ＦＧＦアゴニスト」とは、本明細書において、例えば、ＦＧＦ又はＦＧＦシグナル伝達経路を活性化する、例えば、ＦＧＦ受容体と結合し、活性化する小分子を含めた、サイトカインなどの分子を意味する。
【００５０】
用語「ＦＧＦ」とは、本明細書において、任意選択で、天然に存在する活性コンジュゲート及び断片を含めた、その活性コンジュゲート及び断片を含めた、線維芽細胞増殖因子及び任意選択で、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ９及び／又は任意選択で、ＦＧＦ１９、２１、３、５、６、８ａ、１６〜１８、２０及び／又は２３、例えば、ヒトＦＧＦ１（遺伝子番号：２２４６）、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦとしても知られる；遺伝子番号：２２４７）、ＦＧＦ３（遺伝子番号：２２４８）、ＦＧＦ４（遺伝子番号：２２４９）、ＦＧＦ５（遺伝子番号：２２５０）、ＦＧＦ６（遺伝子番号：２２５１）、ＦＧＦ７（遺伝子番号：２２５２）、ＦＧＦ８（遺伝子番号：２２５３）、ＦＧＦ９（遺伝子番号：２２５４）及びＦＧＦ１０（遺伝子番号：２２５５）を指す。特定の実施形態では、ＦＧＦは、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４及び／又はＦＧＦ９である。本明細書において、「ＦＧＦの活性コンジュゲート及び断片」は、ＦＧＦ受容体と結合し、活性化する、任意選択で、ＦＧＦシグナル伝達を活性化する、線維芽細胞増殖因子のコンジュゲート及び断片を含む。
【００５１】
用語「ＴＧＦβアゴニスト」又はＴＧＦｂアゴニストとは、本明細書において、ＴＧＦβシグナル伝達を促進する任意の分子、例えば、ＴＧＦｂ１、ＴＧＦｂ２及び／又はＴＧＦｂ３を含む。
【００５２】
用語「ＴＧＦβ阻害剤」とは、本明細書において、受容体ＡＬＫ４及びＡＬＫ７及び／又はＴＧＦ−３ＲＩを阻害する任意の分子、例えば、ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）Ａ８３−０１（Ｔｏｃｒｉｓ、２９２９）、Ｄ４４７６、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＲｅｐＳｏｘ、ＳＢ５０５１２４、ＳＢ５２５３３４（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＳＤ２０８を意味する。
【００５３】
用語「ＢＭＰ４アゴニスト」とは、本明細書において、例えば、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ４、ＢＭＰ２、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７及び／又はＢＭＰ１０を含めた、ＢＭＰ４の受容体を活性化する任意の分子、任意選択で、任意のＢＭＰ又はＧＤＦ意味する。
【００５４】
用語「ＢＭＰ４」（例えば、遺伝子番号：６５２）は、本明細書において、骨形成タンパク質４、例えば、ヒトＢＭＰ４、並びに、任意選択で、例えば、ＢＭＰ４受容体シグナル伝達を活性化し得る、天然に存在する活性コンジュゲート及び断片を含めたその活性コンジュゲート及び断片を指す。
【００５５】
用語「ｎｏｄａｌアゴニスト」とは、本明細書において、肝細胞系統細胞において「ｎｏｄａｌ」（例えば、遺伝子番号：４３３８などのヒトｎｏｄａｌ）又は「アクチビン」などのｎｏｄａｌシグナル変換を活性化する任意の分子を意味する。
【００５６】
用語「アクチビン」又は「ＡｃｔＡ」は、本明細書において、「アクチビンＡ」（例えば、遺伝子番号：３６２４）、例えば、ヒトアクチビン、並びに、例えば、ｎｏｄａｌシグナル変換を活性化し得る、任意選択で、天然に存在する活性コンジュゲート及び断片を含めたその活性コンジュゲート及び断片、並びに、天然に存在する活性コンジュゲート及び断片を含めた、その活性コンジュゲート及び断片を指す。
【００５７】
用語「ｗｎｔアゴニスト」とは、本明細書において、軟骨細胞系統細胞においてｗｎｔ／β−カテニン受容体シグナル伝達を活性化する任意の分子を意味し、例えば、Ｗｎｔ３ａ並びにＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）ＣＨＩＲ９９０２１  Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（カタログ：１３１２３））又はＳｔｅｍｇｅｎｔ製のＳｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）ＢＩＯ（カタログ：０４００３）などのＧＳＫ３選択的阻害剤を含む。ＣＨＩＲ９９０２１は、ＧＳＫ３の選択的阻害剤である。考慮されるＧＳＫ３選択的阻害剤は、例えば、Ｗｎｔシグナル伝達経路におけるＧＳＫ−３α／βの選択的阻害剤である。
【００５８】
用語「Ｗｎｔ３ａ」は、本明細書において、ウイングレス型ＭＭＴＶ組込み部位ファミリー、メンバー３Ａ因子（例えば、遺伝子番号：８９７８０）、例えば、ヒトＷｎｔ３ａ、並びに、天然に存在する活性コンジュゲート及び断片を含めた、その活性コンジュゲート及び断片を指す。
【００５９】
用語「Ｗｎｔアンタゴニスト」又は「ｗｎｔ阻害剤」とは、本明細書において、例えば、ＩＷＰ２（Ｎ−（６−メチル−２−ベンゾチアゾリル）−２−［（３，４，６，７−テトラヒドロ−４−オキソ−３−フェニルチエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）チオ］−アセトアミド；Ｓｉｇｍａ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（ＤＫＫ１；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び／又はＸＡＶ９３９（３，５，７，８−テトラヒドロ−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４−オン；Ｓｉｇｍａ）を含めた、軟骨細胞系統細胞においてｗｎｔ／βカンテニン(cantenin)受容体シグナル伝達を阻害する任意の分子を意味する。
【００６０】
用語「アゴニスト」とは、本明細書において、例えば、経路又はシグナル伝達分子のアクチベーターを意味する。分子のアゴニストは、分子（例えば、ｎｏｄａｌ）の生物活性の実質的に同一のもの又はその一部を保持し得る。例えば、ｎｏｄａｌアゴニストとは、ｎｏｄａｌシグナル伝達を選択的に活性化する分子を意味する。
【００６１】
用語「阻害剤」とは、本明細書において、例えば、経路又はシグナル伝達分子の選択的阻害剤を意味する。分子（例えば、ＢＭＰ４阻害剤）の阻害剤又はアンタゴニストは、分子の天然に存在する形態の１種又は複数の活性を阻害し得る。例えば、ＢＭＰ４阻害剤は、ＢＭＰ４シグナル伝達を選択的に阻害する分子である。
【００６２】
用語「選択的阻害剤」とは、本明細書において、阻害剤が、選択的実体又は経路を、関連分子よりも少なくとも１．５×、２×、３×、４×又は１０×より効率的に阻害することを意味する。
【００６３】
用語「特定化する」とは、本明細書において、細胞を特定の細胞の運命に向けて委ねるプロセスを意味し、その前には、細胞型はまだ決定されておらず、細胞が特定の運命に向けて有するあらゆる傾向も、別の運命に逆転又は変換され得る。特定化は、細胞の運命が通常の条件下では変更され得ない状態を誘導する。特定化は、分化の第１のステップである。
【００６４】
用語「幹細胞」は、本明細書において、増殖、自己再生可能であり、多数の、順に、分化した嬢細胞又は分化可能な娘細胞を生じさせることができる母細胞を作製する能力を有する前駆体又は前駆体細胞をより多く生じさせることができる未分化細胞を指す。娘細胞は、例えば、親の発生能力を有する１種又は複数の細胞を保持しながら、増殖し、続いて、１種又は複数の成熟した細胞型に分化する後代細胞を製造するよう誘導され得る。用語「幹細胞」は、胚幹細胞及び多能性幹細胞を含む。
【００６５】
用語「胚幹細胞」は、胚由来胚盤胞(embryonic blastcyst)の内部細胞塊の多能性幹細胞を指すよう使用される（例えば、米国特許第５，８４３，７８０号、同６，２００，８０６号を参照のこと）。このような細胞はまた、体細胞核移植に由来する胚盤胞の内部細胞塊から得ることができる（例えば、米国特許第５，９４５，５７７号、同５，９９４，６１９号、同６，２３５，９７０号を参照のこと）。
【００６６】
用語「多能性幹細胞」は、本明細書において、異なる条件下で、２種以上の分化した細胞型に分化する能力、例えば、３種の生殖細胞層に特徴的な細胞型に分化する能力を有する細胞を指す。多能性細胞は、例えば、ヌードマウス奇形腫形成アッセイを使用して、２種以上の細胞型に分化するその能力によって特性決定される。多能性はまた、胚幹（ＥＳ）細胞マーカーの発現によって証明される。多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）及び胚幹細胞を含む。一実施形態では、多能性幹細胞は、体細胞に由来する。一実施形態では、多能性幹細胞は、ヒト体細胞に由来する。
【００６７】
本明細書において、用語「ｉＰＳＣ」及び「人工多能性幹細胞」は、同義的に使用され、例えば、ＰＯＵ４Ｆ１／ＯＣＴ４（遺伝子番号；５４６０）を、それに制限されないが、ＳＯＸ２（遺伝子番号；６６５７）、ＫＬＦ４（遺伝子番号；９３１４）、ｃＭＹＣ（遺伝子番号；４６０９）、ＮＡＮＯＧ（遺伝子番号；７９９２３）、ＬＩＮ２８／ＬＩＮ２８Ａ（遺伝子番号；７９７２７））と組み合わせて含む１種又は複数の遺伝子の発現を誘導することによって、非多能性細胞、通常、成体体細胞から人工的に導かれた（例えば、誘導された又は完全な逆転によって）多能性幹細胞を指す。発現は、例えば、強制的な遺伝子発現によってか、又は小分子、小さいＲＮＡ、非組込み遺伝子発現ベクター若しくはタンパク質を使用して誘導され得る。
【００６８】
用語「軟骨細胞様細胞」とは、本明細書において、軟骨細胞及び細胞化学的に同様であり、例えば、Ｓｏｘ９及びコラーゲン２を含めた軟骨細胞マーカーを発現し、軟骨細胞として挙動する細胞を意味する。軟骨細胞は、関節軟骨様軟骨細胞若しくは前駆体又は肥大可能である軟骨細胞（任意選択で、ＧＰＣ様細胞とも呼ばれる）若しくはその前駆体であり得る。
【００６９】
用語「軟骨様組織」とは、本明細書において、軟骨組織並びに組織学的に同様であり、軟骨マーカー、例えば、コラーゲン２及びアグリカンを発現し、関節軟骨組織及び／又は成長板軟骨様組織を含めた軟骨として挙動する組織を意味する。
【００７０】
用語「関節軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨組織」とは、本明細書において、例えば、関節軟骨細胞様細胞を含む軟骨様組織を含めた、関節軟骨細胞及び／又は関節軟骨細胞様細胞を含む、任意選択で、濃縮されたか、又は混合した集団を意味する。
【００７１】
用語「肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨組織」又は「ＧＰＣ様細胞及び／又は軟骨組織」とは、本明細書において、例えば、肥大軟骨細胞様細胞を含む軟骨様組織を含めた、肥大軟骨細胞及び／又は肥大軟骨細胞様細胞（例えば、腸骨稜軟骨細胞）を含む、任意選択で、濃縮されたか、又は混合した集団を意味する。
【００７２】
用語「関節軟骨様組織」又は「軟骨含有非肥大軟骨細胞様細胞」は、組織学的に同様であり、ラブリシン及び／又はＣＩＬＰ２などの関節軟骨マーカーを発現し、関節軟骨として挙動する。例えば、関節軟骨は、ｉｎ  ｖｉｖｏで安定な軟骨として維持される。
【００７３】
用語「成長板軟骨様組織」とは、本明細書において、組織学的に同様であり、コラーゲンＸ、ＲＵＮＸ２、ＳＰ７及び／又はアルカリホスファターゼ(alkaline phosphates)を含めた、成長板軟骨組織において見出される軟骨マーカーを発現し、成長板軟骨として挙動する軟骨組織を意味する。例えば、成長板軟骨は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、新規骨が生じる足場を提供するよう機能する。
【００７４】
細胞の単離された集団に関して、用語「単離された集団」は、本明細書において、細胞の混合集団又は不均一な集団から回収され、分離された細胞の集団を指す。いくつかの実施形態では、単離された集団は、細胞が単離されるか、又は濃縮された不均一な集団と比較して、実質的に純粋な細胞の集団である。
【００７５】
特定の細胞集団に関して、用語「実質的に純粋な」は、総細胞集団を構成する細胞に関して、少なくとも約６５％、好ましくは、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、より好ましくは、少なくとも約９０％及び最も好ましくは、少なくとも約９５％純粋である細胞の集団を指す。
【００７６】
用語「濃縮すること」又は「濃縮された」は、本明細書において同義的に使用され、１種の細胞の収率（割合）が、出発培養物又は調製物中のその種類の細胞の割合を上回って、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％又は少なくとも約６０％増大されることを意味する。濃縮すること及び部分的に精製することは、同義的に使用され得る。
【００７７】
細胞の集団は、細胞表面マーカーなどのマーカーをベースとする方法（例えば、ＦＡＣＳ選別など）などの種々の方法を使用して濃縮され得る。
【００７８】
用語「対象」は、本明細書において、ヒト、サル又は類人猿などの霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、ウサギ、ヒツジ又はラット若しくはマウスなどのげっ歯類などの、及びそれらを含めた哺乳動物を含めた動物界のすべてのメンバーを含み、適宜、ヒトを指す。
【００７９】
単離された細胞に適用されるような、用語「処理する」、「処理すること」、「処理」などは、細胞を任意の種類のプロセス若しくは条件に付すこと又は細胞に対して任意の種類の操作若しくは手順を実施することを含む。対象に適用されるように、この用語は、対象に医学的又は外科的配慮、ケア又は管理を提供することを指す。
【００８０】
対象に適用されるような、用語「処理」は、本明細書において、臨床的結果を含めた有益な又は所望の結果を得ることを目的としたアプローチを指し、例えば、医薬的介入、手術、放射線療法及び自然療法的介入を含めた医学的手順及び適用並びに関節／骨障害を治療するための試験的治療を含む。有益な又は所望の臨床結果は、それだけには限らないが、検出可能か又は検出不能であるかにかかわらず、１種又は複数の症状又は状態の軽減又は寛解、疾患の程度の減少、疾患の安定化した（すなわち、悪化していない）状態、疾患の蔓延を妨げること、疾患進行の遅延又は減速、疾状の寛解又は緩和及び緩解（部分的又は完全かどうかにかかわらず）を含み得る。
【００８１】
本明細書において、用語「投与すること」、「埋め込むこと」及び「移植すること」は、所望の部位での導入される細胞の少なくとも部分的局在性をもたらす方法又は経路によって、本明細書に記載される細胞組織及び／又は製品を対象中に送達することに関連して同義的に使用される。細胞は、関節に直接的に埋め込まれるか、或いは、埋め込まれる細胞又は細胞の成分の少なくとも一部が生存したままである対象中の所望の位置への送達をもたらす任意の適当な経路によって投与され得る。
【００８２】
本開示の範囲を理解するうえで、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及びその派生語は、本明細書において、述べられた特徴、要素、成分、群、整数及び／又はステップの存在を特定するが、その他の述べられていない特徴、要素、成分、群、整数及び／又はステップの存在を排除しない制約がない用語であると意図される。前述のことは、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」及びその派生語などの同様の意味を有する語句にも当てはまる。最後に、「実質的に」、「約」及び「およそ」などの程度の用語は、本明細書において、最終結果が大幅に変更されないような修飾された用語の合理的な量の逸脱を意味する。これらの程度の用語は、この逸脱が修飾する語句の意味を無効にしない場合には、修飾された用語の少なくとも±５％の逸脱を含むと考えられなければならない。
【００８３】
本開示の範囲を理解するうえで、用語「からなる」及びその派生語は、本明細書において、述べられた特徴、要素、成分、群、整数及び／又はステップの存在を特定し、その他の述べられていない特徴、要素、成分、群、整数及び／又はステップの存在を排除する制約のある用語であると意図される。
【００８４】
本明細書における終点による数的範囲の列挙は、その範囲内に包含されるすべての数及び分数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４及び５を含む）。すべての数及びその分数は、用語「約」によって修飾されていると推定されることも理解されるべきである。さらに、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、内容が別のことを明確に示さない限り、複数の言及を含むということも理解されるべきである。用語「約」は、言及がなされている数字の、プラス又はマイナス０．１〜５０％、５〜５０％又は１０〜４０％、好ましくは、１０〜２０％、より好ましくは、１０％又は１５％を意味する。
【００８５】
さらに、特定の節において記載される定義及び実施形態は、当業者によって理解されるように適している本明細書において記載されるその他の実施形態に適用可能であるものとする。例えば、以下の節では、本発明の種々の態様がより詳細に定義される。そのように定義される各態様は、反対に明確に示されない限り、その他の態様（単数又は複数）と組み合わされ得る。特に、好ましい又は有利であると示される任意の特徴は、好ましい又は有利であると示される任意のその他の特徴（単数又は複数）と組み合わされ得る。
【００８６】
２．方法及び製品
ヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）から沿軸／軟骨形成中胚葉細胞を製造する方法、ｉｎ−ｖｉｔｒｏで、関節軟骨マーカーラブリシンを発現し、例えば、膝関節のヒト軟骨組織と組織学的に区別され得ない関節軟骨様組織を作製する方法並びにヒトにおいて見られる第２の種類の軟骨であり、肥大を受け、コラーゲン１０を発現する性質のために長骨の成長に関与している軟骨である成長板様特性を有する軟骨様組織を作製する方法が、本明細書において記載される。本明細書に記載される方法を使用して調製された軟骨細胞は、安定であり、移植後にその関節軟骨様又は成長板軟骨様特性を維持するとさらに実証される。さらに、ＣＤ７３細胞表面マーカーは、関節軟骨細胞によって発現されるとわかった。
【００８７】
ＣＤ７３は、初代成人及び胎児健常軟骨細胞並びにｈＥＳＣ由来関節様軟骨細胞によって発現されるが、ｈＥＳＣに由来する成長板様軟骨細胞では発現されないことが、本明細書において実証される。
【００８８】
記載される方法は、一実施形態では、沿軸／軟骨形成中胚葉（ＣＤ７３＋ＣＤ１０５＋ＰＤＧＦＲβ＋）並びに例えば、膝のヒト軟骨に似ている組織化された軟骨様組織を作製するために、血清不含方法を使用する。本明細書に開示される血清不含方法は、細胞及び組織ベースのエンジニアリング戦略にとって有用であり、例えば、関節軟骨置換のために使用され得る。これらの細胞はまた、変形性関節症の患者における軟骨の分解に関与している可能性がある分子を同定すること、自己軟骨細胞移植手術への可能性ある適用のためにｉｎ−ｖｉｔｒｏでこれらの軟骨細胞の拡大を可能にし得る分子を同定する創薬適用又は変形性関節症を減弱し(attentuate)得る薬物にとって有用である。さらに、多能性幹細胞由来関節及び成長板様軟骨組織両方への接近によって、変形性関節症並びにその他の関節及び骨障害の治療のための細胞及び組織ベースの治療法の開発が可能となる。
【００８９】
例えば、軟骨細胞特定化は、短期間（例えば、１０日間）のＴＧＦｂ３、ＴＧＦｂ２又はＴＧＦｂ１を含有する血清不含培地中での沿軸中胚葉集団の高密度培養において達成され得るということが本明細書において実証される。継続されたか又は長期のＴＧＦｂアゴニスト刺激は関節軟骨特徴（組織学及び遺伝子発現）を有する軟骨組織を作製するが、ＢＭＰ４を用いる刺激は肥大軟骨細胞を含有する成長板様軟骨組織を誘導する。
【００９０】
長期の培養は、例えば、１２週間にわたって、又はより長く、任意選択で、１４週間実施され、その間に、ラブリシン＋又はコラーゲン１０＋軟骨組織への組織の成熟が実証された。
【００９１】
本明細書に記載される方法を使用して、その他の細胞との同時培養は、必要ではなく、条件付培地又は足場も必要ではないが、これらは、いくつかの実施形態では使用され得る。
【００９２】
ＣＤ７３発現、細胞表面マーカーは、健常な初代成人及び胎児関節軟骨細胞を示すが、腸骨稜の成人成長板軟骨細胞では発現されないと実証される。初代健常関節軟骨細胞と同様に、ｈＥＳＣ由来関節様軟骨細胞（ＴＧＦＢ３処理）は、ＣＤ７３を発現する。逆に、ｈＥＳＣ由来成長板様軟骨細胞（ＢＭＰ４処理）は、大幅に少ないＣＤ７３しか発現しない。このマーカーは、これら２種の軟骨細胞亜集団を区別するために使用され得、ここでは、ＣＤ７３が初代及びｈＥＳＣ由来関節軟骨細胞の両方によって発現されるが、成長板様軟骨細胞では（実質的に）発現されない。
【００９３】
したがって、開示される態様は、軟骨細胞及び／又は軟骨、任意選択で、関節様非肥大軟骨細胞及び／若しくは軟骨様組織並びに／又は肥大軟骨細胞様細胞及び／若しくは軟骨様組織を作成する方法を含み、方法は、
（ａ）原始線条様中胚葉細胞集団、任意選択で、ＣＤ５６＋及び／又はＰＤＧＦＲα＋原始線条様中胚葉細胞集団を、
（ｉ）ＦＧＦアゴニストと、
（ｉｉ）ＢＭＰ阻害剤、任意選択で、ノギン、ＬＤＮ−１９３１８９、ドルソモルフィンと、
（ｉｉｉ）任意選択で、１種又は複数のＴＧＦβ阻害剤、任意選択で、ＳＢ４３１５４２；及びＷｎｔ阻害剤と
を含む沿軸中胚葉特定化カクテルとともに培養して、細胞表面ＣＤ７３、ＣＤ１０５及び／又はＰＤＧＦＲ−βを発現する沿軸中胚葉細胞集団を特定化するステップと、
（ｂ）（ｉ）ＣＤ７３、ＣＤ１０５及び／又はＰＤＧＦＲ−βを発現する沿軸中胚葉集団を、血清不含又は血清含有培地中、高細胞密度で培養するステップと、
（ｉｉ）高細胞密度ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋及び／又はＰＤＧＦＲβ＋沿軸中胚葉集団を、血清不含培地中でＴＧＦβアゴニストとともに培養して、高細胞密度Ｓｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を製造するステップと
を含む、軟骨細胞前駆体集団を作製するステップと、
（ｃ）（ｉ）高細胞密度Ｓｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を、ＴＧＦβアゴニストとともに長期間培養して、関節様非肥大軟骨細胞及び／又は軟骨様組織を製造するステップか、又は
（ｉｉ）高細胞密度Ｓｏｘ９＋コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を、ＢＭＰ４アゴニストとともに長期間培養して、肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を製造するステップのいずれか
を含む。
【００９４】
一実施形態では、ＴＧＦβアゴニストは、ＴＧＦｂ１、ＴＧＦｂ２、ＴＧＦｂ３及び／又はそれらの組合せから選択される。一実施形態では、ＴＧＦβアゴニストは、ＴＧＦｂ１である。
【００９５】
本明細書に記載される方法では、アゴニスト、阻害剤又は成分は、特定の期間の期間の１日目に添加され得るか、又は例えば、培地交換を用いて期間の間に反復して添加され得る。例えば、ＦＧＦは、例えば、４日目に必要であり、１５日目まで培養培地置換を用いて添加される。
【００９６】
一実施形態では、１つ又は複数の又はすべてのステップにおいて使用される培地は、血清不含である。ｗｎｔアンタゴニスト（例えば、ｗｎｔ経路阻害剤）は、人工ＰＳＣ由来の原始線条中胚葉集団を誘導する場合にＣＤ７３及びＣＤ１０５発現を増大し得ることが実証される。
【００９７】
一実施形態では、方法は、関節様非肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を作製するためのものであり、ステップｃ）は、高細胞密度Ｓｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を、ＴＧＦβアゴニストとともに長期間培養して、関節様非肥大軟骨細胞及び／又は軟骨様組織を製造するステップを含む。
【００９８】
別の実施形態では、ＢＭＰ４アゴニストは、ＢＭＰ４である。
【００９９】
別の実施形態では、方法は、肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を作製するためのものであり、ステップｃ）は、高細胞密度Ｓｏｘ９＋コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を、ＢＭＰ４アゴニストとともに長期間培養して、肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を製造するステップを含む。
【０１００】
一実施形態では、ＴＧＦβ阻害剤は、ＳＢ４３１５４２  Ａ  ８３−０１、Ｄ４４７６、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＲｅｐＳｏｘ、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ５０５１２４、ＳＢ５２５３３４、ＳＤ２０８（例えば、受容体ＡＬＫ４及びＡＬＫ７及び／又はＴＧＦ−３ＲＩの任意の阻害剤）から選択される。
【０１０１】
中胚葉特定化カクテルと接触される原始線条様中胚葉は、例えば、ＣＤ５６＋及びＰＤＧＦＲα＋であるが、心筋細胞特異的前駆体分化マーカーを発現しない。
【０１０２】
中胚葉特定化カクテルの一実施形態では、ＴＧＦβ阻害剤、任意選択で、ＳＢ４３１５２４を含む。
【０１０３】
一実施形態では、原始線条様中胚葉細胞集団は、ＴＧＦβ阻害剤とともに少なくとも２日間（任意選択で、Ｔ３〜５）、３日間又は４日間培養される。
【０１０４】
一実施形態では、中胚葉特定化カクテルは、Ｗｎｔ阻害剤、任意選択で、ＤＫＫ１、ＩＷＰ２又はＸＡＶ９３９をさらに含む。一実施形態では、Ｗｎｔ阻害剤は、例えば、ＣＤ７３及びＣＤ１０５又はＰＤＧＦＲβを発現する細胞のパーセンテージが、７０％未満、６０％未満、５０％、４０％未満、３０％未満又は２０％未満である場合に添加される。
【０１０５】
ＣＤ７３及びＣＤ１０５又はＰＤＧＦＲβを発現する細胞のパーセンテージは、Ｗｎｔアンタゴニストが分化のステージ２に間に約２日間使用される場合に増大し得る。一実施形態では、中胚葉特定化カクテルは、ｗｎｔ阻害剤、任意選択で、２日、３日又は４日間含む。
【０１０６】
一実施形態では、出発原始線条様中胚葉集団は、約４日目までに誘導され（例えば、ＫＤＲ＋／ＰＤＧＦＲα＋細胞は、例えば、５日目に現れる）、例えば、ＣＤ７３、ＣＤ１０５及びＰＤＧＦＲ−βマーカーが、沿軸中胚葉特定化相の間に、ＢＭＰ阻害及びＦＧＦに応じて上方制御されるよう誘導する。
【０１０７】
一実施形態では、沿軸中胚葉集団は、胚様体、単層培養及び／又はそれらの組合せ中に含まれる。
【０１０８】
沿軸中胚葉集団は、例えば、ＣＤ７３及びＣＤ１０５及び／又はＰＤＧＦＲ−βを含めた細胞表面マーカーの発現をベースとする細胞選別方法を使用して、非効率的な分化からのものを含めた任意の培養物から単離され得る。例えば、ＣＤ７３、ＣＤ１０５及びＰＤＧＦＲβ細胞について濃縮することによって。沿軸中胚葉集団はまた、対象から得られた人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から製造され得る。
【０１０９】
したがって、さらなる態様は、軟骨細胞及び／又は軟骨、任意選択で、関節様非肥大軟骨細胞及び／若しくは軟骨様組織並びに／又は肥大軟骨細胞様細胞及び／若しくは軟骨様組織を作製するための方法を含み、方法は、
（ａ）多能性幹細胞の出発集団を、
ＣＤ５６及び／又はＰＤＧＦＲ−αを発現する原始線条様中胚葉細胞集団を誘導するための原始線条誘導カクテルとともに培養するステップと、
（ｂ）原始線条様中胚葉細胞集団を、
；    （ｉ）ＦＧＦアゴニストと、
（ｉｉ）ＢＭＰ阻害剤、任意選択で、ノギン、ＬＤＮ−１９３１８９、ドルソモルフィンと、
（ｉｉｉ）任意選択で、１種又は複数のＴＧＦβ阻害剤、任意選択で、ＳＢ４３１５２４；及びＷｎｔ阻害剤と
を含む沿軸中胚葉特定化カクテルとともに培養して、細胞表面ＣＤ７３、ＣＤ１０５及びＰＤＧＦＲ−βを発現する沿軸中胚葉細胞集団を特定化するステップと
（ｃ）（ｉ）細胞表面ＣＤ７３、ＣＤ１０５及び／又はＰＤＧＦＲ−βを発現する沿軸中胚葉細胞集団を、任意選択で、血清不含又は血清含有培地中、高細胞密度で培養するステップと、
（ｉｉ）高細胞密度ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋及びＰＤＧＦＲβ＋沿軸中胚葉細胞集団を、血清不含培地中でＴＧＦβアゴニストとともに培養して、高細胞密度Ｓｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を製造するステップと
を含む、軟骨細胞前駆体集団を作製するステップと、
（ｄ）（ｉ）高細胞密度Ｓｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を、ＴＧＦβアゴニストとともに長期間培養して、関節様非肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を製造するステップか、又は
（ｉｉ）高細胞密度Ｓｏｘ９＋コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を、ＢＭＰ４アゴニストとともに長期間培養して、肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を製造するステップのいずれか
を含む。
【０１１０】
一実施形態では、方法は、関節様非肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を作製するためのものであって、ステップｄ）は、高細胞密度Ｓｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を、ＴＧＦβアゴニスト、任意選択で、ＴＧＦβ１、２及び／又は３とともに長期間培養して、関節様非肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を製造するステップを含む。異なるステップにおいて使用されるＴＧＦβアゴニストは、同一であっても異なっていてもよい。一実施形態では、軟骨細胞前駆体集団を作製するために使用されるＴＧＦβアゴニストは、関節様非肥大軟骨細胞及び／又は軟骨様組織を製造するために長期間使用される、同一のＴＧＦβアゴニストである。別の実施形態では、軟骨細胞前駆体集団を作製するために使用されるＴＧＦβアゴニストは、関節様非肥大軟骨細胞及び／又は軟骨様組織を製造するために長期間使用されるものとは異なるＴＧＦβアゴニストである。
【０１１１】
別の実施形態では、方法は、肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を作製するためのものであって、高細胞密度Ｓｏｘ９＋コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を、ＢＭＰ４アゴニストとともに長期間培養して、肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を製造するステップを含む。
【０１１２】
一実施形態では、原始線条誘導カクテルは、アクチビンＡなどのｎｏｄａｌアゴニスト、ＢＭＰ４アゴニスト、ＦＧＦアゴニスト及びｗｎｔアゴニストを含む。
【０１１３】
本明細書に開示される方法に従って、通常、出発集団のステージに応じて、軟骨細胞及び／又は関節様軟骨及び肥大軟骨を作製するための最大４「ステージ」があり、１．原始線条誘導、２．沿軸中胚葉特定化、３．軟骨細胞様細胞の作製及び４．軟骨様組織の作製を含む。出発集団に応じて、方法はまた、体細胞からの人工多能性幹細胞の作製、自己再生培養培地の存在下又は不在下での、培養中のｈＰＳＣから胚様体を作製するステップによってか、又は培養中のｈＰＳＣから単細胞懸濁液を作製するステップのいずれかによるＰＳＣの凝集の作製を含むステージ０を含み得る。
【０１１４】
本明細書に記載される方法は、一実施形態では、ヒトＥＳＣ及び組織から軟骨細胞(chondrodcytes)及び軟骨組織を作製するためのものである。これらのステージを含む一実施形態を、以下にさらに詳細に記載する。
【０１１５】
ステージ１−原始線条誘導
ヒト原始線条中胚葉は、例えば、分化の１及び４日目に、及び／又は分化の１及び４日目の間に、多能性細胞を、原始線条誘導カクテルと、例えば、アクチビン、ＢＭＰ４及び塩基性ＦＧＦと接触させるステップによって誘導される。いくつかの実施形態では、例えば、ＣＤ５６＋／ＰＤＧＦＲａ＋集団がより早く作製される場合には、接触させるステップは、１〜３日目の間である。内因性Ｗｎｔシグナル伝達が存在しないか、低い細胞系統及び出発集団では、Ｗｎｔアゴニストを添加するステップが、ＰＳＣからの原始線条形成の効率を改善し得、アンタゴニストを用いてＷｎｔシグナル伝達を遮断するステップが、原始線条形成を阻害する。内因性Ｗｎｔシグナル伝達は、例えば、実施例に記載される細胞系統（例えば、ＨＥＳ２）では十分である。ｉＰＳＣ株を使用して、Ｗｎｔアゴニストは、１日目〜３日目に添加される場合に、ＣＤ５６＋ＰＤＧＦＲａ＋原始線条様集団の発生を改善することがわかった。
【０１１６】
一実施形態では、ｗｎｔアゴニストは、Ｗｎｔ３ａ又はＣＨＩＲ−９９０２１（Ｓｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）ＣＨＩＲ９９０２１  Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（カタログ：１３１２３））又はＳｔｅｍｇｅｎｔ製のＳｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）ＢＩＯ（カタログ：０４００３）などのＧＳＫ−３選択的阻害剤である。
【０１１７】
ブラキュリ発現はまた、およそ２〜３日目に遺伝子発現並びに４日目までの細胞表面マーカーＰＤＧＦＲａ及びＣＤ５６の発現によってモニタリングされるように、この時間の間に誘導される。ヒトＰＳＣでは、ＰＳ様中胚葉誘導は、アクチビン及びｗｎｔシグナル伝達に依存し（例えば、１９  ２０を参照のこと）、ブラキュリ及びＰＤＧＦＲａ発現によってモニタリングされる。ＣＤ５６は、例えば、例えば、ヒト原始線条細胞形成をモニタリングするために使用され得る。
【０１１８】
ステージ２−沿軸中胚葉
次のステージは、転写因子Ｍｅｏｘ１及びＮｋｘ３．２の発現を特徴とする沿軸中胚葉の作製である。原始線条（ＰＳ）様細胞が、例えば、単層培養で沿軸運命に特定化され得、このステージの間（例えば、４〜６日目）に、ＢＭＰシグナル伝達は、ドルソモルフィンなどの小分子を使用して阻害され得、ＴＧＦｂシグナル伝達は、ＳＢ４３１５４２などの小分子を使用して阻害され得る。ヒト沿軸中胚葉は、ＦＧＦ（ｂＦＧＦなど）の添加を必要とし、例えば、単層培養の４〜１５日目の間に、培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ｗｎｔアンタゴニストもまた、添加される。ヒト沿軸中胚葉の出現は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５及びＰＤＧＦＲβを含めた細胞表面マーカーの発現によって示される。
【０１１９】
ヒト沿軸中胚葉は、例えば、分化の４から１５日目の間の単層培養の間にＢＭＰ阻害剤ドルソモルフィン（例えば、４〜６日目）及びｂＦＧＦを用いて特定化され得る。１５日目ヒト沿軸中胚葉は、細胞表面マーカーＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＰＤＧＦＲβの発現並びに１５日目でのＭｅｏｘ１及びＮｋｘ３．２遺伝子発現を特徴とする。これらのマーカーの発現は、例えば、１２日目に始まり、例えば、１５日目あたりで最大である。
【０１２０】
ステージ３−軟骨細胞の作製及びステージ４−組織の作製
例えば、１５日目から得られた沿軸中胚葉は、マイクロマス又はフィルター培養などの高細胞密度軟骨組織形成アッセイ中に直接プレーティングされ得る。軟骨形成は、一実施形態では、ＴＧＦｂアゴニストを用いて、例えば、ＴＧＦｂ３とともに約１０日〜約２週間培養するステップによって誘導され、Ｓｏｘ９及びコラーゲン２の発現を特徴とする。ＢＭＰ４などのＢＭＰ４アゴニスト又はＧＤＦを含有する培地への切り替えが、肥大軟骨細胞表現型を誘導する。任意選択で、ＴＧＦｂ１又はＴＧＦｂ３を用いるｈＥＳＣ由来軟骨細胞及び軟骨組織において、長期のＴＧＦｂアゴニスト処理が、関節軟骨細胞様表現型を誘導し、ＧＤＦ５もまた、肥大表現型を誘導する。
【０１２１】
ヒト沿軸中胚葉からの軟骨細胞は、１５日目ＣＤ７３＋／ＣＤ１０５＋又はＣＤ７３＋／ＰＤＧＦＲβ＋細胞を高細胞密度で、ＴＧＦｂ１又はＴＧＦｂ３などのＴＧＦアゴニストを含有する血清不含培地中のマイクロマス又はフィルター培養中に直接プレーティングするステップによって作製される。軟骨組織は、ＴＧＦｂアゴニスト又はＢＭＰ４アゴニストを用いる長期の処理によってこの高細胞密度培養相の間に作製される。
【０１２２】
任意のヒト胚幹細胞集団は、人工多能性幹細胞集団を含む出発集団として使用され得る。一実施形態では、出発集団は、ヒト胚幹細胞集団（ｈＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞集団（ｉＰＳＣ）、任意選択で、初代ｈＥＳＣ及び／又は初代ｉＰＳＣである。多数のヒトＥＳＣ株が市販されており、例えば、ＮＩＨ  ＨＥＳＣ登録簿に列挙されている。一実施形態では、ヒトＥＳＣ集団は、任意選択で、ＨＥＳ２、Ｈ１、Ｈ９若しくは任意のＮＩＨ  ＥＳＣ登録簿で利用可能なｈＥＳＣ細胞系統から選択される細胞系統又は例えば、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから利用可能であるような、任意の市販のｉＰＳ細胞系統など任意のヒトｉＰＳ細胞系統である。
【０１２３】
一実施形態では、出発集団は、胚様体に凝集される。別の実施形態では、出発集団は、単層で培養される。
【０１２４】
一実施形態では、出発集団は、原始線条誘導カクテルと、約１〜約５日間接触されその後、心筋細胞特定化される。一実施形態では、原始線条誘導カクテルは、アクチビンアゴニスト、任意選択で、アクチビンＡ又はｎｏｄａｌ、ＢＭＰ４アゴニスト、任意選択で、ＢＭＰ４、ＢＭＰ２、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７及び／又はＢＭＰ１０並びにＦＧＦアゴニスト、任意選択で、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ９及び／又は任意選択でＦＧＦ１９、２１、３、５、６、８ａ、１６〜１８、２０及び／又は２３を含む。一実施形態では、原始線条誘導カクテルは、任意選択で、Ｗｎｔ３ａ及びＣＨＩＲ−９９０２１（Ｓｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）ＣＨＩＲ９９０２１  Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（カタログ：１３１２３））及び／又はＳｔｅｍｇｅｎｔ製のＳｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）ＢＩＯ（カタログ：０４００３）などのＧＳＫ３ｂ阻害剤から選択されるｗｎｔアゴニストをさらに含む。
【０１２５】
原始線条様中胚葉集団は、例えば、フローサイトメトリーによって測定されるように（図１Ｂ）、ＣＤ５６及びＰＤＧＦＲαの両方を発現する。いくつかの細胞系統では、誘導は、Ｔ１（１日目）〜Ｔ４かかり（実施例において使用されるＨＥＳ２  ｈＥＳＣ株の場合におけるように）。例えば、ｉＰＳＣなどのその他の細胞系統では、この誘導は、２日のみを必要とし得る（Ｔ１〜Ｔ３）。ＣＤ５６及びＰＤＧＦＲαなどの細胞表面マーカーの出現は、ステージ１が完了し、ステージ２が始まり得ることを示す。
【０１２６】
ｈｉＰＳＣは、以下の、図１Ａに示されるプロトコールの改変を用いて分化し、Ｗｎｔ経路アゴニストＣＨＩＲ９９０６１（１マイクロモル）がステージ１培養物に添加され、ステージ１は、３から２日に短縮された。沿軸中胚葉の運命は、単層培養で、３日目〜５日目のドルソモルフィン（ＤＭ）及びＳＢ４３１５４２並びに３日目〜１４日目のＦＧＦを用いる処理によって特定化された（ステージ２）。
【０１２７】
一実施形態では、ｉＰＳＣは、３日の誘導を受け、別の実施形態では、ｉＰＳＣ集団は、２日の誘導を受ける。一実施形態では、ｈＥＳＣ集団は、２日の誘導を受け、別の実施形態では、ｈＥＳＣ集団は、３日の誘導を受ける。
【０１２８】
ステージ２は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５及び／又はＰＤＧＦＲ−βの発現を特徴とする集団の作製をもたらす２ステップが考慮され得る。細胞は、ＢＭＰ阻害剤（例えば、ドルソモルフィンなど）及び塩基性ＦＧＦなどのＦＧＦアゴニストの存在下で単層培養でプレーティングされ得る。ドルソモルフィンは、例えば、４日目〜６日目（Ｔ４〜Ｔ６）の時間帯の間の心筋細胞特定化の阻害において有効であり、ドルソモルフィンを用いる処理は、この２日の期間に限定され得る。ＦＧＦアゴニスト、任意選択で、塩基性ＦＧＦは、例えば中胚葉集団を沿軸中胚葉の運命に特定化するために、単層培養の期間の間、必要である。
【０１２９】
したがって、一実施形態では、沿軸中胚葉は、単層培養で特定化される。
【０１３０】
別の実施形態では、ＢＭＰ阻害剤は、任意選択で、ドルソモルフィン（ＤＭ）、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、コーディン（Ｃｈｏｒｄｉｎ）、ＬＤＮ−１９３１８９、可溶性ＢＭＰＲ１ａ及び／又は可溶性ＢＭＰＲ１ｂから選択される、１型ＢＭＰ受容体阻害剤及び／又は可溶性ＢＭＰ受容体である。
【０１３１】
別の実施形態では、原始線条様中胚葉集団は、心筋細胞特定化を阻害するために、ＢＭＰ阻害剤と約１、２、３又は４日間接触される。
【０１３２】
一実施形態では、原始線条様中胚葉集団及び／又は沿軸中胚葉集団を特定化するためのＦＧＦアゴニストは、ＦＧＦ２、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ４及び／又はＦＧＦ９から選択される。
【０１３３】
記載されるように、この沿軸中胚葉の出現は、細胞表面でのＣＤ７３、ＣＤ１０５及び／又はＰＤＧＦＲ−βの発現を検出することによってモニタリングされ得る（例えば、図２Ｂ、３Ａに示されるように、フローサイトメトリーによって観察される）。これら３種のマーカーを発現する中胚葉の集団が出現する時点で（１５日目／Ｔ１５まで）、このステージは終了する。図３Ａは、Ｔ１２からＴ１５の間のこれらのマーカーの上方制御を示す。これらのマーカーは、Ｔ４からＴ１０の間の細胞のかなりの部分では発現されない。単層分化の過程にわたって（例えば、Ｔ４〜Ｔ１５）、沿軸中胚葉及び体節において発現される２種の転写因子Ｍｅｏｘ１及びＮｋｘ３．２の上方制御が検出される。例えば、１５日目までの培養物におけるこれらのマーカーの発現は、沿軸中胚葉が作製されたことを示す。
【０１３４】
一実施形態では、原始線条様中胚葉集団は、ＦＧＦアゴニストとともに、少なくとも５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日又はそれ以上の間（例えば、Ｔ３〜Ｔ１４）接触され、ＣＤ７３及び／又はＣＤ１０５を発現する細胞の割合を、例えば、ＦＧＦアゴニスト未処理細胞と比較して、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％又は６５％増大させる。
【０１３５】
一実施形態では、沿軸中胚葉集団はまた、転写因子Ｍｅｏｘ１及びＮｋｘ３．２を発現し、Ｎｋｘ２．５について陰性である。
【０１３６】
沿軸中胚葉集団は、例えば、マイクロマス培養、ペレット培養又はフィルター培養を含む、任意の高細胞密度形式でプレーティングされ得る。例えば、マイクロマス組織を作製するために、通常、組織形成を開始するために、１つの２０マイクロリットル「スポット」に約２００，０００〜約５００，０００個細胞がプレーティングされる。それ以上の細胞とそれらは、スポット／組織培養プラスチック領域中に利用可能な領域がないために接着せず、少ない細胞と「スポット」は、細胞でコンフルエントではない。別の例として、膜フィルター培養では、１２ｍｍ径フィルターあたり、最小プレーティングは、約５００，０００個細胞であり、最大は、約２００万個細胞である。
【０１３７】
一実施形態では、沿軸中胚葉集団は、例えば、マイクロマス培養において、１０００万個細胞／ｍｌから５０００万個細胞／ｍｌの間、任意選択で、少なくとも１ｍｌあたり１０００万個細胞、２０００万個細胞／ｍｌ、３０００万個細胞／ｍｌ、４０００万個細胞／ｍｌ又は５０００万個細胞／ｍｌの細胞密度でプレーティングされる。一実施形態では、約５００，０００及び２００万個細胞の間、任意選択で、約５００，０００個、約７５０，０００個、約１００万個、約１２５万個、約１５０万個、約１７５万個、約２００万個細胞が１２ｍｍ径膜フィルター培養でプレーティングされる。
【０１３８】
特定の実施形態では、血清不含方法は、例えば、ｂＦＧＦ及びＢＭＰ阻害を使用して、例えば、原始線条様中胚葉集団からＣＤ７３＋ＣＤ１０５＋ＰＤＧＦＲβ＋沿軸中胚葉を作製するために使用される。
【０１３９】
一実施形態では、任意選択で、ステージ３及び／又は４の間、培地は、血清不含であり、基礎培地、任意選択で、高グルコースＤＭＥＭ＋デキサメタゾン、アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及びプロリンを含む。基礎培地の例は、例えば、参照１８に提供される。
【０１４０】
本明細書において、基礎培地は、細胞に、正常な細胞代謝に必要な水及び特定の大量の無機イオンを提供し、細胞内及び細胞外浸透圧の平衡を維持し、エネルギー供給源として炭水化物を提供し、生理学的ｐＨ範囲内に培地を維持するための緩衝システムを提供する塩の混合物を指す。基礎培地の例として、それだけには限らないが、「ダルベッコ改変イーグル培地」（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）、ＲＰＭ１  １６４０、ＨａｍのＦ−１０、ＨａｍのＦ−１２、α−最小必須培地（ａＭＥＭ）、Ｇｌａｓｇｏｗの最小必須培地（Ｏ−ＭＥＭ）及びＩｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｓｔｅｍ  Ｐｒｏ及びそれらの混合物が挙げられる。特定の一実施形態では、基礎塩栄養分溶液は、ＤＭＥＭとＨａｍのＦ１２のおよそ５０：５０混合物である。一実施形態では、基礎培地は、高グルコースＤＭＥＭである。
【０１４１】
別の実施形態では、培地は、インスリン、トランスフェリン及び任意選択で、セレンを、ＤＭＥＭ、Ｓｔｅｍ  Ｐｒｏ（登録商標）、Ｍｅｓｏｆａｔｅ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＲＭＰＩ１６４０又はＩＭＤＭと組み合わせて含む基礎培地を含む。
【０１４２】
培地及び／又は組成物が微量元素をさらに含み得ることが考慮される。微量元素は、例えば、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈから商業的に購入され得る。微量元素の限定されない例として、それだけには限らないが、アルミニウム、塩素、硫酸塩、鉄、カドミウム、コバルト、クロム、ゲルマニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、リン酸及びマグネシウムを含む化合物が挙げられる。微量元素を含有する化合物の特定の例として、それだけには限らないが、ＡｌＣｌ３、ＡｇＮＯ３、Ｂａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、ＣｄＣｌ２、ＣｄＳＯ４、ＣｏＣｌ２、ＣｒＣｌ３、Ｃｒ２（ＳＯ４）３、ＣｕＳＯ４、クエン酸第二鉄、ＧｅＯ２、Ｋｌ、ＫＢｒ、ＬＩ、モリブデン酸、ＭｎＳＯ４、ＭｎＣｌ２、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＯ３、ＮａＶＯ３、ＮＨ４ＶＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４、ＮｉＳＯ４、ＲｂＣｌ、セレン、Ｎａ２ＳｅＯ３、Ｈ２ＳｅＯ３、亜セレン酸Ｎａ、セレノメチオノン（selenomethionone）、ＳｎＣｌ２、ＺｎＳＯ４、ＺｒＯＣｌ２及びそれらの混合物及び塩が挙げられる。
【０１４３】
アミノ酸は、規定の培地に添加され得ることが考慮される。このようなアミノ酸の限定されない例として、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン／Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｌ−アルギニンヒドロクロリド、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシンヒドロクロリド、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン及びＬ−バリンがある。特定の実施形態では、アミノ酸は、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−バリン及びそれらの混合物である。
【０１４４】
基礎培地は、アスコルビン酸を含み得ることも考慮される。
【０１４５】
さらに、組成物及び方法はまた、アルブミン、トランスフェリン、Ｌ−グルタミン、脂質、抗生物質、βメルカプトエタノール、ビタミン、ミネラル、ＡＴＰなどのその他の成分を含み得、同様の成分が存在してもよい。別の特定の実施形態では、組成物及び方法は、ビタミンＤ３及びＡＴＰを含む。
【０１４６】
一実施形態では、高細胞密度スポットは、約０〜４日間維持され、例えば、沿軸中胚葉集団は、高細胞密度で、ＴＧＦβ３アゴニストの添加の前に、約０〜約４日間、任意選択で、０、１、２、３又は４日培養される。
【０１４７】
一実施形態では、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋及び／又はＰＤＧＦＲβ＋沿軸中胚葉集団は、血清不含培地中でＴＧＦβアゴニストとともに少なくとも３日間又は約３日〜約１４日間、任意選択で、少なくとも１週間培養されて、Ｓｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団を製造する。
【０１４８】
本明細書において実証されるように、長期のＴＧＦβシグナル伝達は、関節様軟骨組織の作製をもたらし得る。一実施形態では、Ｓｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団が、ＴＧＦβアゴニストとともに培養される長期間は、関節軟骨様組織を製造するためには、少なくとも４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間又はそれ以上である。一実施形態では、軟骨細胞前駆体集団は、ラブリシン及び／又は軟骨中間体層タンパク質２（ＣＩＬＰ２）が発現されるまでＴＧＦｂアゴニストとともに培養される。一実施形態では、沿軸中胚葉集団及び／又はＳｏｘ９＋、コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団は、ＴＧＦｂ３、ＴＧＦｂ２及び／又はＴＧＦｂ１から選択されるＴＧＦｂアゴニストとともに培養される。
【０１４９】
培養をＴＧＦｂアゴニストからＢＭＰアゴニストを含ませることに切り替えることは、成長板様である肥大軟骨細胞集団を誘導する。一実施形態では、肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織は、ＢＭＰ４アゴニストとともに培養されて、コラーゲン１０＋及び／又はＲｕｎｘ２＋肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を製造する。一実施形態では、高細胞密度Ｓｏｘ９＋コラーゲン２＋軟骨細胞前駆体集団がＢＭＰ４アゴニスト、任意選択で、ＢＭＰ４又はＧＤＦ５とともに培養される長期間は、コラーゲン２を発現する軟骨組織及び／又はコラーゲン１０を発現する肥大軟骨細胞集団を作製するには、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間又はそれ以上である。
【０１５０】
例えば、ステージ３は、２％血清含有培地又は血清不含で行われ得る２〜３日の「スポッティング」相を含み得る。これは、高細胞密度の細胞が、例えば、組織培養ディッシュ又は膜フィルターの小さい領域と接着することを可能にする。任意選択で、３日（＋３日）のこのステージの最後に、マイクロマス中の大部分及び／又は実質的にすべての細胞が、ＣＤ７３、ＣＤ１０５及びＰＤＧＦＲβを発現する。一実施形態では、このステップに、任意選択で、最小で約１週間（例えば、＋１０日での、培養は、２５日目である）である期間の血清不含培地でのＴＧＦＢアゴニスト処理が続けられる。約２週間までに（約１０〜約１４日）、Ｓｏｘ９及びコラーゲン２などの早期軟骨細胞遺伝子が発現される。培養物は、関節軟骨（ＡＣ）様組織（例えば、ステージ４）を作製するために、ＴＧＦｂ３などのＴＧＦｂアゴニスト中、例えば、数週間〜数カ月の期間にわたって維持され得る。ＡＣ遺伝子ラブリシンの上方制御は、例えば、約５〜１０週間のマイクロマス培養後に検出される。
【０１５１】
この長期間にわたる組織学的解析は、培養が長いほど、例えば、６週間と比較して１２週間後に、高い品質の組織の作製を示す。
【０１５２】
肥大成長板様軟骨組織の作製は、ＴＧＦｂアゴニスト含有培地を代わりにＢＭＰ４アゴニストを含有する培地に切り替えるステップによって達成される。ＢＭＰ４アゴニスト切り替えは、通常、細胞がＴＧＦｂ３などのＴＧＦｂアゴニストを用いて少なくとも１週間刺激された後、約２５日目に起こる。この切り替えは、マイクロマス細胞が、成長板分化と関連する遺伝子（例えば、コラーゲン１０及びＲｕｎｘ２）を発現する拡大した細胞である（例えば、図４Ｃを参照のこと）肥大軟骨細胞表現型に変換することを引き起こす。
【０１５３】
約３日のマイクロマス（ＴＧＦｂ３アゴニストが普通添加される時点）でのＢＭＰ４を用いる即時刺激の結果、マイクロマスが球状化し(balling up)、非接着性になる、及び／又は、生存しない、及び／又は、組織を作製することがわかった。例えば、ステージ３培養の約１０日から６週間の間のＢＭＰ４への切り替えは、いつも、ＴＧＦｂアゴニスト処理マイクロマスにおいてこの肥大反応を誘導できる。一実施形態では、ＢＭＰ４アゴニスト、任意選択で、ＢＭＰ４への切り替えは、成長板様軟骨を作製するには、約２５日目である。
【０１５４】
成長板肥大軟骨細胞を示すコラーゲン１０発現は、例えば、数週間後に（例えば、例１における細胞系統において９〜１２週間後に）発現され、ＴＧＦｂアゴニスト処理マイクロマスにおけるラブリシンに関しても同様のタイミングである。したがって、長期のＢＭＰ４アゴニスト処理は、ｈＰＳＣからコラーゲン１０発現成長板様軟骨組織の作製をもたらす。
【０１５５】
したがって、一実施形態では、軟骨細胞前駆体は、軟骨組織形成のためにＴＧＦβアゴニスト又はＢＭＰ４アゴニストで培養される。
【０１５６】
１つ又は複数のステージで所望の集団が濃縮され得る。例えば、ＣＤ７３＋ＣＤ１０５＋細胞及び／又はＣＤ７３＋ＰＤＧＦＲ−β＋が、高細胞密度培養に先立って、細胞表面ＣＤ７３、ＣＤ１０５及び／又はＰＤＧＦＲ−βを発現する沿軸中胚葉集団から任意選択でフローサイトメトリーによって単離され得る。
【０１５７】
記載される方法はまた、例えば、その他の方法を使用して作製された、及び／又は対象から単離される軟骨細胞前駆体細胞で使用され得る。
【０１５８】
したがって、別の態様では、本開示は、
（ａ）軟骨細胞前駆体細胞を、血清不含又は血清含有培地において高細胞密度で培養するステップと、
（ｂ）高細胞密度軟骨細胞前駆体細胞を、血清不含培地中でＴＧＦβアゴニストとともに培養するステップと、
（ｃ）（ｉ）軟骨細胞前駆体細胞を、ＴＧＦβアゴニストとともに長期間培養して、関節軟骨様軟骨細胞集団を製造するステップか、又は
（ｉｉ）軟骨細胞前駆体細胞を、ＢＭＰ４アゴニストとともに長期間培養して、肥大軟骨細胞集団及び／若しくは軟骨様組織を製造するステップのいずれかと
を含む、軟骨細胞様細胞を作製する方法を含む。
【０１５９】
一実施形態では、軟骨細胞前駆体細胞は、初代胎児軟骨細胞又は継代された胎児軟骨細胞である。別の実施形態では、軟骨細胞前駆体細胞は、軟骨又は骨状態又は疾患を有する対象から得られた初代細胞である。対象から得られた細胞は、高細胞密度培養に先立って多能性を誘導するための方法に付され得る。例えば、初代軟骨細胞は、患者から単離され、マイクロマス方法を使用して直接的に試験され得るか、又は患者から任意の体細胞が、患者に特異的なＩＰＳ細胞を作製するために使用され得、これは、次いで、軟骨組織を作製するために本明細書に記載される４ステージの方法を使用して分化される。対象から、例えば、疾患部位から得られた細胞は、寛解薬物について試験するために使用され、及び／又は、例えば、対象が変形性関節症を有する場合、１種又は複数の症状を増やす、及び／又は寛解する成分を同定しようとするために滑液成分又はその他の試験物質とともに培養され得る。細胞又は流体成分はまた、対象から、例えば、非疾患部位から得られ、自己軟骨細胞移植のための、細胞及び／又は組織を作製するために使用され得、例えば、これでは、作製された細胞及び／又は組織が、対象に投与される。一実施形態では、細胞は、同種移植のために使用される。
【０１６０】
ステップは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施され得る。或いは、細胞又は組織を含む細胞及び／又は組成物は、例えば、完全軟骨様組織形成及びｉｎ  ｖｉｖｏでの軟骨形成のモニタリングに先立って、対象に投与され得る。例えば、本明細書に記載された方法を使用して調製され、任意選択で、投与に先立って解離される細胞。
【０１６１】
方法は、沿軸中胚葉細胞集団を作製するために使用され得る。一実施形態では、方法は、
（ａ）多能性幹細胞の出発集団を、原始線条誘導カクテルとともに培養して、ＣＤ５６及びＰＤＧＦＲ−αを発現する原始線条様中胚葉集団を誘導するステップと、
（ｂ）原始線条様中胚葉集団を
（ｉ）ＦＧＦアゴニストと、
（ｉｉ）ＢＭＰ阻害剤、任意選択で、ノギン、ＬＤＮ−１９３１８９又はドルソモルフィンと、
（ｉｉｉ）任意選択で１種又は複数のＴＧＦβ阻害剤、任意選択で、ＳＢ４３１５２４及び／又はＷｎｔ阻害剤、任意選択で、ＤＫＫ１、ＩＷＰ２又はＸＡＶ９３９と
を含む沿軸中胚葉特定化カクテルとともに培養して、細胞表面ＣＤ７３、ＣＤ１０５及びＰＤＧＦＲ−βを発現する沿軸中胚葉集団を特定化するステップと
を含む。
【０１６２】
一実施形態では、方法は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５及び／又はＰＤＧＦＲβを発現する細胞を濃縮するステップをさらに含む。
【０１６３】
一実施形態では、使用される成分（例えば、アゴニスト、阻害剤など）の濃度は、有効な、例えば、所望の細胞型を示すマーカーの発現を誘導するのに有効な量である。
【０１６４】
一実施形態では、ＦＧＦアゴニストは、ＦＧＦである。
【０１６５】
一実施形態では、ＦＧＦの濃度は、約２ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの間の任意の濃度、任意選択で、約２０ｎｇ／ｍｌである。
【０１６６】
一実施形態では、ＢＭＰ阻害剤は、ドルソモルフィン（ＤＭ）である。
【０１６７】
一実施形態では、ＤＭの濃度は、約０．５μＭから約５μＭの間の任意の濃度、任意選択で、約４μＭ（例えば、マイクロモル）である。
【０１６８】
一実施形態では、ＴＧＦｂアゴニストは、ＴＧＦｂ１、２及び／又は３である。
【０１６９】
一実施形態では、ＴＧＦｂ１、２及び／又は３の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌの間の任意の濃度、任意選択で、約１０ｎｇ／ｍｌである。
【０１７０】
特定の範囲の間の任意の数は、例えば、０．１単位毎又は０．５単位毎の増分を含む。
【０１７１】
一実施形態では、ＴＧＦβ３の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌの間の任意の濃度、任意選択で、約１０ｎｇ／ｍｌである。
【０１７２】
一実施形態では、ＢＭＰ４アゴニストは、ＢＭＰ４である。
【０１７３】
一実施形態では、ＢＭＰ４の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌの間の任意の濃度、任意選択で、約５０ｎｇ／ｍｌである。
【０１７４】
方法はまた、例えば、フォンコッサ染色による、プロテオグリカン製造及び／又はカルシウム沈着及び／又は石灰化についての、任意選択で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでのモニタリングのステップを含み得る。例えば、フォンコッサ染色は、石灰化を確認するために使用され得、成長板様軟骨の発生を示す。
【０１７５】
本開示のさらなる態様は、任意選択で、本明細書に記載される有用性のために使用するための、本明細書に記載された方法を使用して作製された細胞の集団又は組織を含む。
【０１７６】
したがって、軟骨細胞様細胞、任意選択で、関節様非肥大軟骨細胞様細胞及び／若しくは軟骨様組織並びに／又は肥大軟骨細胞様細胞及び／若しくは軟骨様組織の単離された集団又は本明細書に記載される方法に従って作製された前駆体集団が提供される。
【０１７７】
一実施形態では、単離された集団は、細胞表面ＣＤ７３、ＣＤ１０５及びＰＤＧＦＲ−βを発現する沿軸中胚葉集団である。
【０１７８】
一実施形態では、軟骨細胞様細胞の単離された集団は、１種又は複数の軟骨細胞マーカー及び／又は遺伝子、例えば、関節インターゾーン細胞と同様の、ＧＤＦ５、ＷＮＴ９Ａ及び／若しくはＥＲＧ、関節軟骨細胞と同様のラブリシンＭｅｏｘ１及び／若しくはＣＩＰ２又は肥大軟骨細胞と同様のＲＵＮＸ２、ＳＰ７、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ／ＡＬＰＬ）及び／若しくはＣＯＬ１０Ａ１を発現する細胞を含む。
【０１７９】
さらなる態様は、関節様非肥大軟骨細胞様細胞及び／若しくは軟骨様組織並びに／又は肥大軟骨細胞様細胞及び／若しくは軟骨様組織並びに／又は本明細書に記載される方法に従って作製された前駆体細胞の集団と、担体を含む組成物である。使用に応じて、担体は、任意選択で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロゲル、骨足場、骨代用品足場及び／又はマトリゲルであり得る。その他の担体として、例えば、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸及びその誘導体、ゼラチン、コラーゲン、キトサン、アルギン酸塩、緩衝ＰＢＳ、デキストラン及びポリマーからなる群のうち１種又は複数を含む担体が挙げられる。例えば、担体は、移植適用において使用するのに適している担体、例えば、医薬品等級担体であり得る。担体はまた、輸送及び／又は貯蔵のために細胞を安定化するために適したものであり得る。細胞は、例えば、クライオ凍結され得、及び／又は組織は、室温及び／又は室温から約４℃の間の任意で輸送され得る。
【０１８０】
組成物は、例えば、対象への投与のために解離された細胞を含む、例えば、スラリーであり得る。一実施形態では、組成物は、例えば、成長板細胞／軟骨移植のために、その他の細胞、例えば、内皮細胞及び／又は線維芽細胞を含み得る。
【０１８１】
さらなる態様は、本明細書に記載される細胞及び／又は組織を含む、軟骨又は骨組織製品並びに足場又は膜を含む。例えば、移植適用の際に、軟骨細胞は、損傷を受けた領域に膜（例えば、脛骨骨膜又は生体膜）と組み合わせて投与され得るか、又は足場マトリックス中に予め播種され得る。一実施形態では、足場は、骨代用品である。
【０１８２】
本明細書に開示される方法に従って作製された細胞及び組織は、例えば、関節又は骨障害に苦しむ対象において症状を寛解するために使用され得る。
【０１８３】
したがって、別の態様は、本明細書に記載される細胞の集団及び／又は組織を投与するステップ及び／又は前記細胞を含む製品を挿入する／埋め込むステップを含む、症状を寛解する及び／又はそれを必要とする対象を治療するための方法を含む。
【０１８４】
別の態様において、細胞、組織及び製品の使用もまた提供される。一実施形態では、本開示は、症状を寛解する及び／又はそれを必要とする対象を治療するための、本明細書に記載される細胞の集団及び／又は組織又は組成物又は製品の使用を提供する。
【０１８５】
一実施形態では、例えば、対象に投与されるべき、本明細書に記載される使用又は方法のための細胞の集団は、自己細胞から誘導される。
【０１８６】
一実施形態では、細胞の集団は、関節様非肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織について濃縮される。
【０１８７】
一実施形態では、対象は、変形性関節症、離断性骨軟骨炎、多発性軟骨炎及びその他の軟骨疾患又は軟骨に影響を及ぼす関節傷害などの関節状態を有する。
【０１８８】
さらなる実施形態では、細胞の集団は、肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織について濃縮される。
【０１８９】
さらに別の実施形態では、濃縮された肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織は、足場又は膜に接着される。
【０１９０】
別の実施形態では、対象は、骨の骨折、骨の破損などの骨状態を有するか、又は例えば、悪性腫瘍又は外傷、軟骨無形成症、骨形成不全、骨粗鬆症又はその他のオステオパシーのために骨置換を必要とする。
【０１９１】
作製された細胞は、例えば、候補物質を、促進、阻害、維持するその能力についてか、又は関節軟骨細胞若しくは肥大軟骨細胞において活性である候補物質を試験するために使用され得るモデル細胞を提供するために、例えば、ラブリシンプロモーターなどの関節軟骨細胞様細胞において通常発現される、及び／又はコラーゲン１０プロモーター（例えば、リポーター系）などの肥大軟骨細胞において通常発現される遺伝子のプロモーターと作動可能に連結しているリポーター遺伝子を安定的に発現するよう、任意選択で、不死化及び／又は修飾され得る。例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ｄｓＲｅｄなど、ルシフェラーゼなどの蛍光タンパク質を含めた多数のリポーター遺伝子が、当技術分野で公知である。リポーター遺伝子アッセイは、多用途のものであり、感度の高い方法であり、多数の候補物質をハイスループット薬物スクリーニングプログラムでアッセイするために使用され得る。
【０１９２】
また、本明細書に記載される方法に従って作製された細胞又は組織のうち１種又は複数、作製された細胞又は組織を含む製品又は組成物を含み、任意選択で、本明細書に記載される方法に従って、リポーター系又はその他の修飾、アゴニスト、阻害剤、培地、装置又は本明細書に記載される方法において使用され得るその他の成分及び使用のための使用説明書、例えば、細胞の作製し、アッセイを実施するか、又は細胞、組織、組成物若しくは製品を投与する方法に関する使用説明書並びにこれらの前記の細胞、組織、組成物、製品、アゴニスト、阻害剤、培地などを収容するためのバイアル又はその他の容器から選択される少なくとも２種の組合せを含むキットが、本明細書において提供される。
【０１９３】
本明細書に記載される方法に従って作製された細胞及び組織は、種々の適用のために使用され得る。例えば、細胞及び組織は、予測薬物毒性学及び創薬のために使用され得る。例えば、濃縮されたｈＰＳＣ由来軟骨細胞の集団、関節又は成長板様が、予測薬物毒性学スクリーニングにおいて、並びに軟骨細胞生物学及び生理学に影響を及ぼす新規化合物を同定することを目的としたスクリーニングのために使用され得る。過去に患者から得た初代関節軟骨細胞の拡大が、軟骨細胞の間葉系様表現型への脱分化につながり、理想的とはいえない軟骨置換をもたらすので、任意選択で、１種又は複数の疾患メディエーターの存在下で、関節軟骨細胞の増殖だけでなく維持も促進する薬物は、興味深いものとなる。
【０１９４】
したがって、実施形態は、候補軟骨形成調節物質を試験する方法を含み、方法は、
（ａ）試験物質を、軟骨細胞前駆体系統細胞集団と接触させるステップであって、試験物質は、軟骨細胞前駆体系統細胞集団と、本明細書に記載される方法において任意のステップで接触されるステップと、
（ｂ）試験物質の不在下で作製された対照集団と比較した、軟骨細胞増殖、維持及び／又は分化に対する試験物質の効果を評価するステップと、
（ｃ）試験物質が、対照と比較して、増殖を増大又は減少させるか、及び／又は軟骨細胞維持若しくは分化に影響を及ぼす場合に、試験物質を候補軟骨形成調節物質と同定するステップと
を含む。
【０１９５】
調節物質は、例えば、疾患メディエーター又は保護活性を有する成分であり得る。疾患メディエーターはまた、疾患メディエーターの疾患誘導効果を阻害及び／又は減少させる薬剤についてスクリーニングするために試験物質の存在下又は不在下で使用され得る。
【０１９６】
細胞及び組織は、任意選択で、細胞移植プロトコールを評価するために使用され、細胞移植のために使用され得る。例えば、これらの方法によって、例えば、ａ）自己軟骨細胞移植又は成人間葉系幹細胞由来軟骨細胞又は軟骨組織に対する、関節又は成長板様ｈＰＳＣ由来軟骨細胞又は軟骨組織を移植する効果及び効率、ｂ）変動するレベルの、変形性関節症を含めた関節疾患を有する動物モデル又は患者において種々の関節軟骨欠陥を治療するための、関節様軟骨組織及び／又は軟骨細胞スラリーを移植する効果、ｃ）ｈＥＳＣ由来成長板様軟骨細胞又は軟骨様組織が骨再生（軟骨鋳型中間体を介した）のために使用される能力の比較が可能となる。
【０１９７】
細胞及び組織は、例えば、組織エンジニアリング適用において使用され得る。例えば、ｈＰＳＣ培養物から得られた軟骨細胞の濃縮された集団が作製され、例えば、規定の割合の軟骨細胞及びその他の細胞型を有するエンジニアリングされた構築物又は足場において使用され得る。ｈＰＳＣ由来軟骨細胞は、例えば、骨代用品上に播種され得、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでの軟骨／骨インターフェースを可能にし得る。このような製品は、骨−軟骨接合物に損傷を有する患者又は動物に移植され得る。
【０１９８】
方法は、患者特異的疾患モデルを確立するために使用され得る（例えば、遺伝子成分を含む疾患のために患者からｉＰＳ細胞系統を作製することによって）。軟骨細胞様細胞及び組織集団は、本明細書に記載される方法を使用してヒト患者から確立され得る。これらの罹患細胞の分化並びに表現型を解析するために、本開示に記載されるプロトコールを使用して、沿軸中胚葉集団が作製され得、それらの細胞が、軟骨細胞の運命に、最終的に関節又は成長板様軟骨組織に特定化され得る。
【０１９９】
本明細書に記載される方法はまた、変形性関節症と関連するものを含めた軟骨疾患（例えば、肥大）の一般的なモデルを確立するために使用され得る。理論に縛られることを望まないが、ＢＭＰ４は、関節様軟骨細胞及び軟骨組織において肥大の運命を誘導している可能性があり、これは、変形性関節症の発症時に関節軟骨において上方制御されることが多い経路である。別の例として、変形性関節症患者から単離された因子の、本明細書に記載される培養物への添加は、代謝的に活性な化合物（ＯＡ患者の膝の脂肪パッドにおいて見られるものなど）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで組織の質に影響を及ぼし得るかどうかを決定するために使用され得る
【０２００】
また、ＣＤ７３が関節軟骨細胞様細胞を同定するとわかっているので、フローサイトメトリーによるＣＤ７３の使用及びフローサイトメトリーによる肥大を示す細胞の大きさの定量的尺度並びにマーカーベースの評価方法による組織自体の組織学は、関節又は成長板様運命を促進し得る因子のハイスループットスクリーニングを促進し得る。肥大は、例えば、マウスモデルにおいて変形性関節症と関連しており、患者において同様に原因となると考えられる。これらの適用は、例えば、肥大のモジュレーターを同定するために使用され得る。
【０２０１】
一実施形態では、候補軟骨形成調節物質は、罹患軟骨又は骨を有する対象から単離された因子である。一実施形態では、因子は、関節炎及び／若しくは肥満を有する対象の関節、任意選択で、膝関節中の脂肪パッドから、又は対照として健常な対象から単離される。別の実施形態では、試験物質は、ＢＭＰ４アゴニストとともに添加され、試験物質は、試験物質の不在下で処理された対照と比較して、肥大を阻害するその能力について評価される。さらに別の実施形態では、肥大は、フローサイトメトリーを使用して、任意選択で、前方及び側方散乱を評価することによって評価される。
【０２０２】
別の実施形態では、方法は、
（ａ）本明細書に記載される方法に従って作製された関節様非肥大軟骨細胞及び／又は軟骨様組織を得るステップと、
（ｂ）関節様非肥大軟骨細胞及び／又は軟骨様組織を、試験物質とともに培養するステップと、
（ｃ）関節様非肥大軟骨細胞様細胞増殖を測定するステップと、
（ｄ）試験物質の不在下で培養された関節様非肥大軟骨細胞及び／又は軟骨様組織と比較した、増殖の増大を検出し、試験物質が、候補関節軟骨細胞増殖インデューサーであることを示すステップと
を含む、候補関節軟骨細胞増殖インデューサーを評価する方法を含む。
【０２０３】
さらなる実施形態は、
（ａ）本明細書に記載される方法に従って作製された肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を得るステップと、
（ｂ）肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織を、試験物質とともに培養するステップと、
（ｃ）肥大軟骨細胞、細胞増殖を測定するステップと、
（ｄ）試験物質の不在下で培養された肥大軟骨細胞様細胞及び／又は軟骨様組織と比較した、増殖の増大を検出し、試験物質が、候補肥大軟骨細胞増殖インデューサーであることを示すステップと
を含む、候補肥大軟骨細胞増殖インデューサーを評価する方法を含む。
【０２０４】
一実施形態では、任意選択で、フローサイトメトリーによって単離される、試験物質とともの培養に先立って、ＣＤ７３関節様非肥大軟骨細胞及び／又は軟骨様組織が単離される。
【０２０５】
別の実施形態では、関節様非肥大軟骨細胞及び／又は肥大軟骨細胞様細胞は、関節軟骨細胞特異的プロモーター、任意選択で、ラブリシンプロモーターエレメントと機能的に連結されたリポーター遺伝子（すなわち、関節軟骨細胞リポーター系）及び／又は肥大軟骨細胞特異的プロモーター、任意選択で、コラーゲン１０プロモーターエレメントと機能的に連結されたリポーター遺伝子（すなわち、肥大軟骨細胞リポーター系）並びに関節軟骨細胞分化を誘導する化合物（関節軟骨細胞リポーター系活性を測定することによって同定される）及び／又は肥大軟骨細胞分化を誘導する化合物（例えば、肥大軟骨細胞リポーター系活性を測定することによって同定される）を含む。
【０２０６】
一実施形態では、増殖の増大は、以下の方法：３Ｈチミジン取り込みアッセイ；５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込みアッセイ及びプロピジウムヨウ素アッセイのうち１種又は複数を使用して測定される。
【０２０７】
さらなる実施形態は、
（ａ）本明細書に記載される方法に従って、関節様非肥大軟骨細胞及び／又は軟骨様組織及び／又はＧＰＣ様細胞及び／又は成長板軟骨を作製するステップと
（ｂ）関節様非肥大軟骨細胞及び／又は軟骨様組織及び／又はＧＰＣ細胞を、試験物質とともに培養するステップと、
（ｃ）試験物質の細胞毒性及び／又は細胞保護活性を測定するステップと、
（ｄ）試験物質の不在下で培養された、関節様非肥大軟骨細胞及び／又はＧＰＣ細胞及び／又は組織と比較した、細胞毒性の増大を検出し、試験物質が、関節軟骨細胞及び／又はＧＰＣ細胞に対して毒性であることを示すステップか、又は試験物質の不在下で培養された、関節様非肥大軟骨細胞及び／又はＧＰＣ細胞及び／又は組織と比較した、保護活性の増大（例えば、細胞毒性の減少）を検出し、試験物質が保護的であることを示すステップと
を含む、試験化合物のＡＣ細胞及び／又はＧＰＣ細胞毒性又は保護活性を評価する方法を含む。
【０２０８】
一実施形態では、細胞毒性は、以下のアッセイ：トリパンブルー色素アッセイ、ルシフェラーゼアッセイ、ＭＴＴアッセイ及びＷＳＴ−１アッセイなどのテトラゾリウム(tetrazolim)塩変換アッセイのうち１種を使用して測定される。
【０２０９】
本明細書において実証されるように、ＩＬ−１βは、軟骨細胞集団において変形性関節症様変化を誘導し得る。Ｉｌ−１ｂ及びその他のメディエーター、例えば、その他のサイトカイン及び膝脂肪パッド成分（例えば、疾患メディエーター）並びに機械的破壊が、本明細書において記載されるスクリーニング方法において使用され得る。例えば、本明細書に記載される方法を使用して製造される細胞は、試験物質の疾患メディエーター機能を阻害する又は逆転させる能力を評価するために、試験物質の存在下又は不在下でこのような疾患メディエーター又は機械的破壊と接触され得る（例えば、疾患メディエーターの添加若しくは機械的破壊に先立って添加されるか、又は細胞が接触された及び／若しくは機械的に破壊された後のいずれか）。
【０２１０】
一実施形態では、ＡＣ様軟骨細胞及び／又は軟骨様組織又は肥大様軟骨細胞及び／又は軟骨様組織は、疾患メディエーターと、任意選択で、試験物質とともの培養に先立って接触される。
【０２１１】
一実施形態では、疾患メディエーターは、サイトカイン、任意選択で、ＩＬ−βである。別の実施形態では、疾患メディエーターは、関節脂肪パッド成分、任意選択で、膝の脂肪パッド成分である。
【０２１２】
一実施形態では、スクリーニングアッセイは、以下の解析又はアッセイ：組織学的解析、グリコサミノグリカン及びプロテオグリカンの製造を定量するものなどの生化学的アッセイ、遺伝子発現解析、顕微鏡又はフローサイトメトリーによるラブリシン又はコラーゲン１０などの蛍光リポーターの獲得／喪失、ＣＤ７３細胞表面受容体発現の獲得又は喪失、細胞死についてのアッセイ及び軟骨細胞肥大を示し得る細胞の大きさについてのフローサイトメトリーのうち１種又は複数を含む。
【０２１３】
ＣＤ７３は、関節様軟骨細胞について濃縮するための、細胞選別実験の陽性選択マーカーとして使用され得る。これらのマーカーは、現在使用中の同種間又は自己軟骨修復戦略とともに使用されるべき、組織の一次供給源からの関節軟骨細胞の単離を促進し得る。
【０２１４】
したがって、さらなる態様は、軟骨細胞を含む細胞の混合集団を、抗体（又はその他の結合分子）：ＣＤ７３細胞複合体の形成を可能にする条件下でＣＤ７３と結合する抗体（又はその他の結合分子）と接触させるステップ及び抗体ＣＤ７３細胞複合体を単離するステップとを含む、関節軟骨細胞を単離する方法を含む。これは、細胞選別ベースの方法を含めた当技術分野で公知のいくつかの既知免疫学的方法によって行われ得る。
【０２１５】
一実施形態では、細胞の混合集団は、非軟骨細胞、非関節軟骨細胞様細胞及び／又は肥大軟骨細胞様細胞を含む。
【０２１６】
一実施形態では、抗体は、例えば、単離を促進するセファロースビーズ又は磁性ビーズのようなビーズなどのタグに連結される。
【０２１７】
ＣＤ７３、ＣＤ１０５及びＰＤＧＦＲ−βの組合せは、その他の系統又はその他の系統の前駆体から沿軸／軟骨形成中胚葉を単離するための陽性選択マーカーとして使用され得る。心臓系統などのその他の系統は、沿軸中胚葉を作製するために使用されるものと同様のプロトコールを使用して誘導されることが多いので、これらの細胞表面マーカーを使用する細胞選別による沿軸中胚葉の単離は、この集団について濃縮するための手段を提供する。例えば、細胞は、フローサイトメトリーを使用して濃縮される。
【０２１８】
したがって、一実施形態は、沿軸軟骨形成中胚葉細胞を含む細胞の集団を、ＣＤ７３特異的結合剤、ＣＤ１０５特異的結合剤及びＰＤＧＦＲβ特異的結合剤を含むカクテルと接触させるステップ並びにＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋及びＰＤＧＦＲβ＋細胞について濃縮するステップとを含む、沿軸軟骨形成中胚葉細胞の集団を単離する方法を含む。一実施形態では、結合剤は、抗体である。別の実施形態では、細胞は、フローサイトメトリーを使用して濃縮される。また、本明細書に記載された方法に従って調製された単離された沿軸軟骨形成中胚葉細胞の集団も提供され、これは、本明細書に記載されるような組成物中又は製品中に含まれ得る。これらの細胞はまた、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。沿軸中胚葉集団は、例えば、その他の細胞型を作製するために、例えば、骨格筋前駆体、脂肪細胞前駆体（脂肪細胞）及び可能性ある骨前駆体（骨芽細胞）を作製するために使用され得る。
【０２１９】
さらに、特定のセクションにおいて記載される定義及び実施形態は、当業者によって理解されるようにそれらが適している本明細書に記載されるその他の実施形態に適用可能であるものとする。種々のアゴニスト、阻害剤及び／又は例えば、定義において列挙されるアゴニスト、阻害剤などを含めたその他の成分の選択及び組合せも考慮される。例えば、以下のセクションでは、本発明の種々の態様は、より詳細に定義される。そのように定義される各態様は、反対に明確に示されない限り、任意のその他の態様（単数又は複数）と組み合わされ得る。特に、好ましい又は有利であると示される任意の特徴は、好ましい又は有利であると示される任意のその他の特徴（単数又は複数）と組み合わされ得る。
【０２２０】
上記の開示は、本願を全般的に記載する。より完全な理解は、以下の特定の実施例を参照することによって得られ得る。これらの実施例は、単に例示目的で記載されるのであって、本願の範囲を制限しようとするのではない。状況が示唆し得るか、好都合にする場合には、等価物の形態の変化及び置き換えが考慮される。本明細書において特定の用語が使用されてきたが、このような用語は、記述的意味で意図され、制限を目的としない。
【０２２１】
以下の限定されない例は、本開示の例示である。
【実施例】
【０２２２】
（例１）
結果
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの軟骨細胞形成は、胚様体（ステージ１）、単層培養での沿軸中胚葉の特定化（ステージ２）、高細胞密度マイクロマス培養での、又はコラーゲンコーティングされた膜フィルター上での軟骨細胞前駆体の作製（ステージ３）及びマイクロマス又はフィルター培養での関節及び成長板軟骨細胞及び軟骨組織の特定化（ステージ４）としての原始線条様（ＰＳ）集団の誘導を含む（図１Ａ）。
【０２２３】
多能性幹細胞（ＰＳＣ）状態からの分化における第１のステップは、胚では、３種の胚様（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）が形成される原腸陥入の際に起こるＰＳ集団の形成である。ＰＳ集団及び内胚葉及び中胚葉サブセットは、アクチビンＡ（アクチビン、Ｎｏｄａｌの代用品）、Ｗｎｔ及びＢＭＰシグナル伝達分子（Ｎｏｓｔｒａ、Ｃｈｅｎｇら２００８年、Ｋａｔｔｍａｎ、Ｗｉｔｔｙら２０１１年、Ｃｒａｆｔ、Ａｈｍｅｄら２０１３年）の組合せを使用してＰＳＣから誘導され得る。アクチビン、ＢＭＰ４及びｂＦＧＦを用いて誘導されたＰＳ集団は、細胞表面マーカーＣＤ５６及びＰＤＧＦ受容体α（ＰＤＧＦＲａ）の発現によって観察され得る（図１Ｂ）。
【０２２４】
ｈＥＳＣ由来原始線条（ＰＳ）中胚葉は、図１Ｃに示されるように、ＣＤ５６、ＰＤＧＦＲα及びＫＤＲを発現する。ｈＩＰＳＣは、誘導の１日目及び３日目の間に、アクチビンＡ（３ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（１ｎｇ／ｍｌ）、塩基性ＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）及びＣＨＩＲ９９０６１（１マイクロモル）、小分子Ｗｎｔアゴニストを使用してＰＳ中胚葉集団に誘導された。ｈＩＰＳＣは、ＨＥＳ２  ｈＥＳ細胞系統の場合には３日間（１日目〜４日目）の代わりに２日間（１日目〜３日目）誘導された（図１Ｃ）。ｈＩＰＳＣ由来ＰＳ中胚葉もまた、ＣＤ５６、ＰＤＧＦＲα及びＫＤＲを発現する（図１Ｄ）が、これらの細胞表面マーカーは、ｈｉＰＳＣが、ＣＨＩＲ９９０６１の不在下で誘導される場合には発現されない（図１Ｅ）。
【０２２５】
さらなる因子が培養の４日目を超えない場合、この集団内に含有される前駆体は、Ｔ５での細胞表面マーカーＫＤＲ及びＰＤＧＦＲａの同時発現（図２Ａ、０ＤＭ、０ＦＧＦ）及び１５日目（Ｔ１５）での心臓転写因子Ｎｋｘ２．５のその後の発現（Ｋａｔｔｍａｎ、Ｗｉｔｔｙら２０１１年）、図２Ｃ）によって観察されるように、心原性の運命に特定化され得る。
【０２２６】
軟骨細胞を作製するために、このＰＳ集団を、沿軸中胚葉の運命にまず特定化することが必要である。これまでの研究は、間葉系幹細胞で見られることが多い細胞表面マーカー、ＣＤ７３及びＣＤ１０５を発現する中胚葉集団が、軟骨形成能を有することを示した（Ｈｗａｎｇ、Ｋｉｍら２００６年）。沿軸中胚葉集団の出現をモニタリングするために、Ｎｋｘ２．５の発現の欠如と組み合わされた、これら２種の細胞表面マーカーの発現並びに転写因子Ｍｅｏｘ１及びＮｋｘ３．２の発現が使用された。マウスＥＳＣモデル系におけるこれまでの実験は、心臓中胚葉の出現を妨げ、沿軸中胚葉の発生を促進するための、ＦＧＦシグナル伝達の関連でＢＭＰシグナル伝達経路を阻害することの重要性を示した（Ｃｒａｆｔ、Ａｈｍｅｄら２０１３年）。２日間Ｔ４〜Ｔ６（分化の４〜６日目）のＩ型ＢＭＰ受容体ドルソモルフィン（ＤＭ）の阻害剤の添加は、細胞が、未処理中胚葉よりも少ないＰＤＧＦＲａを発現したように、早ければＴ５までにＰＤＧＦＲａ及びＫＤＲの発現パターンを変更した（図２Ａ）。ｂＦＧＦの添加は、ＰＤＧＦＲａ／ＫＤＲ集団を徹底的には変更しなかった。未処理中胚葉状態では、極めて少ない細胞が、ＣＤ７３及びＣＤ１０５を発現した（７．４６％、図２Ｂ）。ＤＭを用いる処理は、この集団をわずかにのみ増大したが、４日目から１５日目のＦＧＦを用いる処理は、ＣＤ７３及びＣＤ１０５を発現する細胞の割合を著しく増大させた（５２％、図２Ｂ）。これらの表面マーカーの発現の変化は、沿軸遺伝子Ｍｅｏｘ１及びＮｋｘ３．２の上方制御を伴っていた（図２Ｃ）。Ｔ４〜Ｔ６のＤＭ及びＴ４〜Ｔ１５のｂＦＧＦの両方を用いる処理は、より頑強なＣＤ７３／ＣＤ１０５集団（６７％）及びさらにはＭｅｏｘ１及びＮｋｘ３．２のより高い発現（図２Ｃ）もたらし、これは、ＢＭＰ阻害及びＦＧＦ処理の両方が、ＰＳ集団からの沿軸中胚葉特定化のために必要であることを示唆する。ＣＤ７３／ＣＤ１０５発現に加えて、ＦＧＦ−由来のＣＤ７３陽性細胞又はＤＭ＋ＦＧＦ処理された単層も、ＰＤＧＦ受容体β（ＰＤＧＦＲ−β、ＰＢｅｔａ）を発現し、これは、沿軸中胚葉もこの細胞表面マーカーを発現することを示唆する（図２Ｂ）。
【０２２７】
単層培養での沿軸中胚葉特定化の際に、Ｗｎｔ経路阻害（ＰＳ中胚葉誘導（ｈＥＳＣについては４〜６日目、ｈＩＰＳＣについては５〜７日目）後の２日間の間）が、分化の１５日目での細胞表面マーカーＣＤ７３及びＣＤ１０５を発現する細胞のパーセンテージの増大をもたらしたということが観察された（図２Ｃ）。したがって、いくつかの細胞系統では、沿軸中胚葉特定化の効率は、ＰＳ中胚葉誘導相の直後にＷｎｔ経路アンタゴニストの存在下で改善され得る。
【０２２８】
これまでの研究は、ＴＧＦβ／ＢＭＰシグナル伝達が、沿軸中胚葉から軟骨細胞前駆体を作製するために必要であるということを示した。ＢＭＰ４含有培地へのこの中胚葉の直接プレーティングが、軟骨組織を形成しなかった非接着細胞凝集体の発生をもたらしたので、ステージ３（例えば、１５日目で出発する）のために、ＴＧＦＢ３（並びに、ＴＧＦβ１又はＴＧＦβ２）刺激が必要であることがわかった。ＴＧＦｂ３処理の１０日後に（合計で２５日目）、培養物は、ＢＭＰ４を含有する培地に切り替えられ、又は軟骨細胞（関節／非肥大又は成長板／肥大）のサブセットを特定化するためにＴＧＦｂ３（ステージ４）で維持され得る。１５日目中胚葉集団の軟骨細胞の潜在力を決定するために、細胞を、２０マイクロリットルの容量で高細胞密度で組織培養処理されたペトリディッシュ上に１時間（マイクロマス）プレーティングし、次いで、「スポット」を培地で浸し／覆った。本発明者らの最初の研究では、細胞を、２％ウシ胎児血清を含有する培地中で「スポット」した。しかし、この短い血清曝露は、後のステージでの軟骨形成に対する効果を伴わずに省かれることもあり、これは、このプロトコールを、任意選択で、血清不含にする。２〜３日後、軟骨細胞前駆体を作製するために、ＴＧＦｂ３を含有する血清不含培地が培養物に添加される。４種の異なる中胚葉（０ＤＭ＋／−ＦＧＦ；４μＭ  ＤＭ＋／−ＦＧＦ）に由来する集団を、このマイクロマスアッセイにおいて試験した。１日の培養内に４種の中胚葉集団のすべてがディッシュと接着したが（図２Ｄ）、１週間後に異なる表現型が観察された。フローサイトメトリーによって心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）の発現によって定量化される、収縮する（拍動する）心筋細胞（図２Ｅ）が、未処理中胚葉（０ＤＭ、０ＦＧＦ）由来のマイクロマスで観察された。ＤＭ単独で処理された中胚葉は、軟骨細胞を形成するのに接着したままではなく、代わりに、培地交換で洗い流される長いストランドに凝集した。ＦＧＦ処理された、並びに、ＤＭ＋ＦＧＦ処理された細胞は、マイクロマス培養の最初の１週間を細胞の接着層として生き残り、心筋細胞は全く作製しなかった。４週間のマイクロマス培養後、ＤＭ＋ＦＧＦを用いて単層相で処理された細胞は、肉眼で観察され得る軟骨様組織（およそ１ｃｍの直径）を作製した。ＦＧＦ単独を用いる単層相において処理された細胞は、軟骨組織表現型を維持せず、培養ディッシュから剥離した（図２Ｆ）。ＦＧＦ処理及びＤＭ＋ＦＧＦ処理単層培養物の両方が、同様のレベルのＣＤ７３／ＣＤ１０５／ＰＤＧＦＲ−βを発現したが、１５日目の沿軸遺伝子発現並びに軟骨組織の全体的な生存は、ｉｎ−ｖｉｔｒｏで軟骨様組織を形成する能力を有する沿軸中胚葉の運命を特定化するためには、ＢＭＰ阻害（ここでは、ＤＭ処理の形での）及びＦＧＦ刺激の両方が必要であることを示唆する。
【０２２９】
ＣＤ７３、ＣＤ１０５及びＰＢｅｔａが、ｈＥＳＣ分化培養物中の軟骨細胞の潜在力を有する集団で発現されるかどうかを決定するために、１５日目にＤＭ＋ＦＧＦ処理単層からＣＤ７３＋ＣＤ１０５＋及びＣＤ７３−ＣＤ１０５−及びＣＤ７３＋ＰＢｅｔａ＋及びＣＤ７３−ＰＢｅｔａ−画分を単離し、マイクロマス培養でアッセイした（図３Ａ）。マイクロマスで１０日後、ＣＤ７３＋ＣＤ１０５＋細胞及びＣＤ７３＋ＰＢｅｔａ＋細胞が接着し、生き延びた。両実験における二重陰性細胞は、これらの条件下で生き延びることができなかった（図３Ｂ）。２週間後、ＣＤ７３＋ＣＤ１０５＋及びＣＤ７３＋ＰＢｅｔａ＋選別細胞に由来する培養物（ＴＧＦＢ３で維持されるか、又はＢＭＰ４含有培地に切り替えられたのいずれか）において軟骨組織が発生した。対照的に、両場合における二重陰性細胞は、軟骨組織を全く形成できなかった（図３Ｃ）。軟骨組織を作製する潜在力の相違が、図３Ｄに示されている。これらのデータは、ＣＤ７３＋ＣＤ１０５＋ＰＢｅｔａ＋細胞が、軟骨細胞及び軟骨様組織を作製するための潜在力を有するが、一方で、これらのマーカーの発現を欠く細胞はそうではないことを実証する。
【０２３０】
ステージ２の最後に導かれた適当な沿軸中胚葉集団への接近及びステージ３の最後での軟骨細胞前駆体の作製は、関節軟骨細胞（ＡＣ）及び成長板軟骨細胞（ＧＰＣ）の２つの軟骨細胞サブタイプの発生を研究する機会を提供した。沿軸中胚葉細胞がＴＧＦｂ３を用いて約１０日間刺激された後、これらの軟骨細胞／軟骨培養物は、数カ月間、ＴＧＦｂ３含有培地で維持されるか、又はＢＭＰ４含有培地に切り替えられ得る（ステージ４）。ＴＧＦｂ３又はＢＭＰ４処理された培養物は、１２週間の過程にわたって軟骨様組織を形成し、これは、軟骨特異的細胞外マトリックスの存在を示す染色（トルイジンブルー）を使用して、また関節軟骨又は成長板軟骨のいずれかと関連している遺伝子の発現によって組織学的に解析され得る。形態学的に、ＴＧＦｂ３処理軟骨組織に見られる軟骨細胞は、小さい線維芽細胞様表現型を有するが、ＢＭＰ４処理軟骨細胞は、敷石のような外観を有する円形である（図４Ａ）。トルイジンブルーを用いて均一に染まるＴＧＦｂ３処理軟骨は、組織中に等しく分散された小さい細胞（軟骨細胞）を含有する（１３週齢組織、図４Ｂ）。対照的に、ＢＭＰ４処理組織は、拡大した肥大軟骨細胞を含有する。ＢＭＰ４処理軟骨組織における軟骨細胞の大きさの顕著な増大は、ＧＰＣ分化と関連する正常なプロセスである軟骨細胞肥大を示し得る。ｉｎ−ｖｉｖｏでは成長板中の肥大軟骨細胞は、コラーゲン１０発現を特徴とする。成長板分化プログラムは、最終的に、細胞死につながり、上に新規骨が形成され得る石灰化したマトリックスを残す。肥大はまた、生細胞の前方及び側方散乱プロットを使用するフローサイトメトリー解析によってＢＭＰ４処理軟骨組織においても観察された（図４Ｃ）。ＴＧＦｂ３処理軟骨細胞は、より小さい、あまり粒状ではない細胞の堅固な集団を形成するのに対し、ＢＭＰ４処理細胞は、評価されたすべての時点で、より大きな細胞の大きさを表すより大きな前方散乱（ＦＳＣ）を示し、並びにより高い細胞粒度を表すより大きな側方散乱（ＳＳＣ）を示す（３週及び５週マイクロマスが示されている）。
【０２３１】
組織学的に、ＴＧＦｂ３処理軟骨組織は、１９週齢の胎児大腿骨の関節軟骨の将来の部位の多数の同一の特徴を有すると思われる（上のパネル、図４Ｄ）が、一方で、ＢＭＰ４処理軟骨において見られる肥大軟骨細胞は、胎児大腿骨の軟骨下骨領域付近に見られる成長板軟骨細胞の外観と似ている（下のパネル）。これらの表現型は、ヒトＰＳＣから、軟骨の２種の独特のサブタイプの特徴を有する軟骨組織がｉｎ−ｖｉｔｒｏで作製されたことを示唆する。膝関節から単離された初代胎児軟骨細胞も、１５日目ｈＰＳＣ由来沿軸中胚葉に使用したプロトコールと同一のマイクロマスアッセイにおいて培養し、ｉｎ−ｖｉｔｒｏで同様に軟骨組織を作製した。組織学的に、ＴＧＦＢ３処理及びＢＭＰ４処理胎児軟骨細胞由来軟骨組織はまた、ｈＰＳＣ由来の軟骨組織と極めて類似して見える。図４Ｅは、ＢＭＰ−４をＧＤＦ５と置換することが、図４Ａにおけるものと同様の肥大軟骨細胞を作製することを示す。
【０２３２】
ｈｉＰＳＣからＴＧＦβ３及びＢＭＰ４で作製された１２週齢軟骨組織において細胞の大きさ及び形態学における同様の相違が観察された。組織は、トルイジンブルーを用いて異染性に染まり、これは、プロテオグリカンの存在を示す（図４Ｆ）。予測されたように、両条件下で作製されたｈＰＳＣ由来組織中にＩＩ型コラーゲンタンパク質が存在する（図４Ｇ）。Ｘ型コラーゲンは、この時点ではいずれの組織においても検出されなかった。ＴＧＦβ３処理マイクロマス中に、ラブリシンタンパク質は存在していたが、ＢＭＰ４処理マイクロマス組織中には存在しておらず（図４Ｈ）、組織構造の頂部を並ぶ平板化された細胞において優先的に見出された。総合すると、これらの知見は、持続したＴＧＦβ３シグナル伝達は、関節軟骨様組織を作製し得る関節軟骨細胞の発生を促進するのに対し、ＢＭＰ４シグナル伝達は、成長板特徴を有する軟骨を形成する肥大（拡大した）軟骨細胞の分化を誘導するという解釈に対して強力な支持を提供する。
【０２３３】
２種の条件下で作製された組織を、次いで、ｑＲＴ−ＰＣＲによって遺伝子発現パターンについて（図５）、及び免疫組織化学及び免疫染色によって軟骨発生と関連する特定のタンパク質の存在について（図４）解析した。関節及び肥大軟骨細胞の両方によって発現される遺伝子ＳＯＸ９及びＣＯＬ２Ａ１の発現は、ＴＧＦβ３及びＢＭＰ４処理組織の両方において２週間の培養まで上方制御された（図５Ａ〜Ｂ）。発現のレベルは、初代ヒト胎児ＡＣ、健常成人ＡＣ及び腸骨稜（肥大）軟骨細胞において見られるものと同様であった。ＲＵＮＸ２、ＳＰ７、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ／ＡＬＰＬ）及びＣＯＬ１０Ａ１を含めた、肥大軟骨細胞と関連している遺伝子の発現は、ＴＧＦｂ３で維持された組織においてよりも、８〜１２週齢ＢＭＰ４処理組織において有意に高かった（図５Ｃ〜Ｆ）。ラブリシン（ＰＲＧ４）及び軟骨中間体層タンパク質２（ＣＩＬＰ２）を含めた、表層関節軟骨細胞によって発現されるとわかっている遺伝子について（図５Ｇ−Ｈ）、並びに、ＧＤＦ５、ＷＮＴ９Ａ及びＥＲＧなどの、関節インターゾーン細胞、ＡＣの前駆体集団において発現されるものについて（図１〜Ｋ）は逆転パターンが観察された。
【０２３４】
総合すると、ＴＧＦＢ３処理細胞及びＢＭＰ４処理細胞由来のｈＰＳＣ由来軟骨の組織学及び遺伝子発現解析は、２種の独特の軟骨細胞集団及び軟骨様組織が、ｉｎ−ｖｉｔｒｏで作製されたことを示唆する。ＴＧＦＢ３処理軟骨組織の長期間（最大１２週間）の成熟は、ラブリシン及びＣＩＬＰ２などの成熟したＡＣ遺伝子の発現を可能にする。ＴＧＦＢ３培養物のＢＭＰ４を用いる処理は、肥大反応を誘導し、これは、組織学によって及び成長板中に見られる肥大軟骨細胞と関連する遺伝子、コラーゲン１０及びＲｕｎｘ２の上方制御によって容易に観察される。したがって、ＴＧＦＢ３処理に由来するｈＰＳＣ由来軟骨組織は、関節様軟骨に相当し、一方で、ＢＭＰ４処理軟骨組織は、成長板様肥大軟骨に相当する。
【０２３５】
ｈＰＳＣ分化培養物から、又は自己軟骨細胞移植の目的のために患者から単離された軟骨組織のいずれかからのＡＣの濃縮のために利用され得る細胞表面マーカーを同定する試みでは、本発明者らは、３５０種の抗体を含むフローサイトメトリーベースの抗体スクリーニングを実施した。同種異系の移植に使用されたヒト健常成人関節軟骨の少なくとも２種のサンプル、１６〜１９週齢の年齢の少なくとも４種のヒト胎児軟骨細胞を含めた膝関節から得た初代軟骨細胞のいくつかの供給源並びに成長板特徴を有する、臀部領域中の腸骨稜から単離されたヒト成人軟骨細胞の１種のサンプルをスクリーニングした。本発明者らは、これらのスクリーニングから、ＣＤ７３を関節軟骨細胞のマーカーとして同定した（図６）。ＣＤ７３は、膝から単離された健常成人関節軟骨細胞の実質的にすべて（＞９６％）によって発現されるが、腸骨稜ＧＰＣ様軟骨細胞の約２２％のみによって発現される（図６Ａ）。ＣＤ７３は、胎児軟骨細胞のおよそ半分によって発現され（図６Ｂ）、これは、青年期の間に起こる、二次的骨化中心がまだ骨化していない場合には成長板軟骨細胞からこれらの細胞だけを単離することが困難であるので、関節軟骨細胞の純粋でない集団を表す。
【０２３６】
初代（Ｐ０）及び継代された（Ｐ２）胎児軟骨細胞もまた、ｈＰＳＣ由来の軟骨組織が形成された方法と同様に、ＴＧＦＢ３又はＢＭＰ４とともにマイクロマスで培養され得る。ＴＧＦＢ３処理胎児Ｐ０由来又は胎児Ｐ２由来軟骨組織は、９３％超のＣＤ７３陽性細胞を含有し、一方で、ＢＭＰ４処理は、ＣＤ７３＋細胞のパーセンテージを、それぞれ、７０％及び６１％に低下させる（図６Ｃ、Ｄ）。ＣＤ７３発現はまた、ＴＧＦＢ３処理に由来するｈＰＳＣ由来軟骨組織の９８％超によって発現される（図６Ｅ）。ＣＤ７３＋細胞のパーセンテージは、ＢＭＰ４処理後に細胞のわずか約５７％に低下される。したがって、ＣＤ７３は、初代健常成人ＡＣ、健常胎児軟骨細胞の集団、胎児軟骨細胞又はＴＧＦＢ３中マイクロマスとして培養された継代された胎児軟骨細胞及びヒトＰＳＣ由来のＴＧＦＢ３処理関節軟骨細胞様細胞を示す。
【０２３７】
ＣＤ７３などの間葉系細胞表面マーカーが、分化の初期のｈＰＳＣ由来沿軸中胚葉並びにその中胚葉に由来する末期の関節様軟骨細胞を示すことは興味深い。１２日目（Ｔ１２）及び１５日目（Ｔ１５）の沿軸中胚葉は、ＣＤ７３及びＰＤＧＦＲ−βの両方を発現し、「スポッティング」相の３日後（合計で１８日目）、すべての細胞は、ＣＤ７３＋ＰＤＧＦＲ−β＋である（図６Ｆ）。興味深いことに、これらの細胞表面受容体の両方が、１０日〜２週間のマイクロマス培養後に下方制御される。４〜５週間後、ＣＤ７３は、ＴＧＦＢ３処理マイクロマス培養物において再度発現されるようになり（図６Ｇ）、これは、ＣＤ７３が、軟骨細胞前駆体が関節軟骨細胞の運命に向けて分化しているときに発現されるようになる可能性があることを示唆する。
【０２３８】
２種の種類の軟骨細胞の潜在力をさらに特性決定するために、解離された８〜１２週齢の組織から得た細胞を、ＮＳＧ免疫不全マウスに皮下注射した。両集団が、移植後４週間まで石灰化の証拠がない、ＩＩ型コラーゲンを発現するプロテオグリカンの豊富な軟骨組織を作製した。移植の１２週間後に、移植片に別個の相違が観察された。ＢＭＰ４処理軟骨細胞由来の組織は、プロテオグリカンをほとんど保持しておらず（図７Ａ、Ｃ）、それぞれ、陽性フォンコッサ（図７Ｂ）及びＸ型コラーゲン染色（図７Ｅ）によって示されるように、カルシウム沈着／石灰化及び肥大の領域を含有していた。興味深いことに、ＴＧＦβ３処理軟骨細胞から得られた移植片は、プロテオグリカンの豊富な（図７Ａ、Ｃ）及びＩＩ型コラーゲンの豊富なＥＣＭ（図７Ｄ）を維持しており、カルシウム沈着／石灰化又は肥大の証拠はなかった（図７Ｂ、Ｅ）。これらの移植研究から得られたこれらの知見は、２種の軟骨細胞集団が機能的に別個であることを実証し、ＴＧＦβ３処理細胞は、それらが安定な軟骨を作製し、ｉｎ  ｖｉｖｏで１２週間にわたって維持するので関節軟骨細胞に相当するというさらなる証拠を提供する。対照的に、ＢＭＰ４の存在下で発生した軟骨細胞は、それらがｉｎ  ｖｉｖｏで軟骨内骨化を開始する組織を生じさせるので、成長板において見られるものの特徴を示す。
【０２３９】
ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２を用いて１２週間処理されたマイクロマス組織において、ＣＯＬ２Ａ１、ＰＲＧ４（ラブリシン）及びＣＩＬＰ２もまた上方制御され（図８）、これは、ｈＰＳＣ由来沿軸中胚葉反応からの関節軟骨細胞の作製が、リガンド特異的ではなかったことを示す。
【０２４０】
ｈＰＳＣ由来関節様軟骨の制限されない供給への接近は、変形性関節症（ＯＡ）の初期ステージにおいて役割を果たすと知られている、インターロイキン−１α（ＩＬ１β）などの炎症性サイトカインを解析するためのプラットフォームを確立する機会を提供する。ＴＧＦｂ３の不在下での、２週間の１０週齢のｈＰＳＣ由来ＡＣの、ＩＬ１βを用いる処理（図９Ａ）は、マトリックスメタロペプチダーゼ１３（ＭＭＰ１３）（図９Ｂ）及びＭＭＰ２（図９Ｃ）並びにＡＤＡＭＴＳ４＆Ｓ５（図９Ｄ，Ｅ）を含めた異化酵素の発現の上方制御をもたらした。これらの酵素は、コラーゲン及びアグリカンなどの、軟骨細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に見られるタンパク質を切断し、これは、軟骨組織の分解につながる。ＭＭＰ１３及びＡＤＡＭＴＳ４の有意な上方制御は、ＴＧＦβ３の不在下でのみ観察された。ＡＤＡＭＴＳ５は、ＴＧＦβ３の存在下又は不在下で誘導された。ラブリシン（ＰＲＧ４）及びＣＩＬＰ２の発現も、ＩＬ１βがＴＧＦβ３の不在下（図９Ｈ〜Ｉ）又は存在下で組織に添加された場合に、下方制御された。ＩＬ１βの添加はまた、ＣＯＬ２Ａ１及びＡＣＡＮ発現の減少（図９Ｆ〜Ｇ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）発現の増大（図９Ｊ）、及び組織におけるプロテオグリカンの注目すべき喪失（図９Ｋ）につながった。総合すると、これらの知見は、ＩＬ１βシグナル伝達は、早期のＯＡが発病する期間に生来の軟骨中で観察されるものと同様に、ｈＰＳＣ由来ＡＣにおいて同化環境から異化状態への移行を開始し得るということを示唆する。
【０２４１】
（例２）
ＣＤ７３＋細胞は、関節非肥大軟骨細胞に相当し、ＣＤ７３陽性の欠如は、成長板様肥大軟骨細胞を同定し得る。
【０２４２】
軟骨細胞及び軟骨様組織は、本明細書に記載される方法、例のために、例１に記載される方法を使用して作製され得る。関節軟骨細胞は、ＣＤ７３細胞マーカーを使用して前駆体又は成長板様軟骨細胞から単離及び／又は分離され得る。本明細書において記載されるように、ＡＣ様細胞は、ＢＭＰ４を用いて刺激される時に、肥大になり、その細胞表面でのＣＤ７３の発現を失う。使用され得るＣＤ７３細胞表面マーカーの発現をモニタリングする方法は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）解析である。
【０２４３】
（例３）
薬物毒性学スクリーニングのためのｈＥＳＣ由来軟骨細胞又は軟骨の使用
本明細書に、例えば、例１に記載された方法を使用して得られたＨＥＳＣ由来軟骨細胞は、予測薬物毒性学スクリーニング並びに創薬のために使用され得る。例えば、軟骨組織及び／又は成長板様軟骨組織系統並びにその前駆体に特有の肥大軟骨細胞は、試験物質と接触され得、細胞死などの１種又は複数の生物学的エンドポイントが測定される。例えば、細胞死は、例えば、トリパンブルーアッセイなどの生存細胞色素排除アッセイを使用して測定され得る。例えば、試験物質（薬物）に曝露されるＡＣ様軟骨細胞は、トリパンブルー色素に対して透過性である細胞をカウントすることによって、所望の時点後に細胞毒性についてモニタリングされ得る。その他のアッセイとして、テトラゾリウム(tetrazolim)塩変換アッセイが挙げられる。このようなアッセイの例として、ＭＴＴアッセイ並びにＷＳＴ−１アッセイが挙げられる。アッセイは、ハイスループットスクリーニングのために自動化され得る。
【０２４４】
（例４）
試験物質によって誘導されるような細胞増殖の試験におけるｈＥＳＣ由来軟骨細胞又は軟骨の使用
ｈＥＳＣ由来軟骨細胞の使用の別の例は、細胞分化又は増殖に対して効果を有する薬物の試験である。特に対象とするものは、ＡＣ様の運命を示すＣＤ７３マーカーの使用によってモニタリングされるような、初代関節軟骨細胞の関節軟骨組織への増殖に影響を及ぼし得る薬物の試験であろう。種々の細胞増殖アッセイが、利用可能であり、対象の試験物質に対する反応をモニタリングできる。例えば、３Ｈチミジン取り込みアッセイは、試験物質又は増殖因子を用いる処理後の細胞の増殖をモニタリングする。このような処理の後、細胞を３Ｈ−チミジンとともに１６〜２４時間インキュベートする。代替アッセイとして、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込みアッセイがある。さらに別の代替法として、プロピジウムヨウ素試験の使用の使用がある。蛍光は、サンプル中のＤＮＡ含量に対して直接比例する。細胞増殖をモニタリングするこの方法は、単層で増殖される細胞を用いて使用され得るので、ｈＥＳＣ由来軟骨細胞との関連で特に有用であり得る。
【０２４５】
（例５）
細胞系統を区別する方法としての軟骨細胞の大きさ及び粒度の使用
本開示は、異なる系統の軟骨細胞、より詳しくは、ＡＣ様軟骨細胞、同様に成長板様軟骨細胞を作製する方法を記載する。これらの系統は、例えば、大きさに基づいて区別され得る。例えば、ｈＥＳＣ由来軟骨細胞の前方散乱（ＦＳＣ−Ａ）及び側方散乱（ＳＳＣ−Ａ）を使用して、生細胞のフローサイトメトリー解析の際に観察される抗体ベースの染色の不在下で使用され得る。ＴＧＦＢ３処理ＡＣ様細胞集団は、全般的に均一な大きさ及び粒度を有する堅固な細胞の集団として示し、一方で、ＢＭＰ４処理肥大軟骨細胞は、全般的により大きいＦＳＣ−Ａ及びＳＳＣ−Ａ特性を有する不均一な細胞集団を示す。したがって、生細胞のＦＳＣ−Ａ及びＳＳＣ−Ａ特性は、軟骨細胞肥大を誘導又は阻害する因子が試験されている実験における有用な読み出し情報であり得る。
【０２４６】
（例６）
リポーター遺伝子アッセイを使用する細胞発生及び細胞系統のモニタリング
ラブリシン又はコラーゲン１０などの成熟した軟骨遺伝子を含めた軟骨細胞特異的遺伝子の発現を維持又は変更する因子及び物質を同定するために、リポーター遺伝子アッセイが本明細書に記載される方法とともに使用され得る。例えば、ラブリシンプロモーター−ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）によって標的とされるｈＥＳＣ株が、ラブリシンプロモーター活性を誘導する試験物質のスクリーニング及び蛍光顕微鏡によって検出可能なＲＦＰの発現のために使用され得る。ラブリシンプロモーターＲＦＰ＋発現、蛍光の増大又はラブリシンプロモーターＲＦＰ＋を発現する細胞のパーセンテージの増大が、非肥大関節様軟骨細胞特徴を示した細胞のパーセンテージの増大を示す。対照的に、ラブリシンプロモーターＲＦＰ＋の喪失は、これらの細胞及び／又は関節軟骨細胞様特徴の喪失を示し得る。
【０２４７】
同様に、コラーゲン１０リポーター（コラーゲン１０プロモーター−緑色蛍光タンパク質−ＧＦＰなど）は、軟骨細胞又は組織におけるコラーゲン１０発現のレベルの増大又は減少の検出において有用であろう。コラーゲン１０−ＧＦＰ＋発現、蛍光の増大又はコラーゲン１０−ＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージの増大が、肥大軟骨細胞特徴を示した細胞のパーセンテージの増大を示す。対照的に、コラーゲン１０−ＧＦＰの喪失は、肥大の喪失を示し得る。
【０２４８】
リポーター株はまた、フローサイトメトリーベースのスクリーニングにおいて使用され得る。
【０２４９】
或いは、非肥大軟骨細胞及び／又は肥大軟骨細胞は、リポーター遺伝子が、関節軟骨細胞特異的プロモーター、任意選択で、ラブリシンプロモーターエレメントと機能的に連結されているリポーター遺伝子系（すなわち、関節軟骨細胞リポーター系）及び／又は肥大軟骨細胞特異的プロモーター、任意選択で、コラーゲン１０プロモーターエレメントと機能的に連結されているリポーター遺伝子（すなわち、肥大軟骨細胞リポーター系）を用いて一時的に又は安定的にトランスフェクトされ得る。細胞は、選択され、次いで、試験物質と接触され得る。関節軟骨細胞分化を誘導する試験物質は、関節軟骨細胞リポーター系活性（例えば、対照に対して相対的な）を測定することによって同定され得、肥大軟骨細胞分化を誘導する試験物質は、肥大軟骨細胞リポーター系活性（例えば、対照に対して相対的な）を測定することによって同定され得る。
【０２５０】
本願を、好ましい例であると現在考えられるものを参照して記載したが、本願は開示される例に制限されないと理解されるべきである。対照的に、本願は、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に含まれる、種々の改変及び同等の配置を対象とするものとする。
【０２５１】
すべての刊行物、特許及び特許出願が、参照によりその全文は、各個々の刊行物、特許又は特許出願が、参照によってその全文が組み込まれるよう、具体的に、個別に示されるかのような同程度に、本明細書に組み込まれる。具体的には、表又は別の場所に提供される、例えば、受託番号及び／又はバイオマーカー配列（例えば、タンパク質及び／又は核酸）を含めた、本明細書において提供された各受託番号と関連している配列が、参照によりその全文が組み込まれる。
本明細書において参照される参照文献に関する引用
Akiyama, H., M. C. Chaboissier, J. F. Martin, A. Schedl and B. de Crombrugghe (2002). "The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6." Genes Dev 16(21): 2813-2828.
Archer, C. W., G. P. Dowthwaite and P. Francis-West (2003). "Development of synovial joints." Birth Defects Res C Embryo Today 69(2): 144-155.
Blumer, M. J., S. Longato, C. Schwarzer and H. Fritsch (2007). "Bone development in the femoral epiphysis of mice: the role of cartilage canals and the fate of resting chondrocytes." Dev Dyn 236(8): 2077-2088.
Burgess, R., A. Rawls, D. Brown, A. Bradley and E. N. Olson (1996). "Requirement of the paraxis gene for somite formation and musculoskeletal patterning." Nature 384(6609): 570-573.
Bussen, M., M. Petry, K. Schuster-Gossler, M. Leitges, A. Gossler and A. Kispert (2004). "The T-box transcription factor Tbx18 maintains the separation of anterior and posterior somite compartments." Genes Dev 18(10): 1209-1221.
Craft, A. M., N. Ahmed, J. S. Rockel, G. S. Baht, B. A. Alman, R. A. Kandel, A. E. Grigoriadis and G. M. Keller (2013). "Specification of chondrocytes and cartilage tissues from embryonic stem cells." Development 140(12): 2597-2610.
Dao, D. Y., J. H. Jonason, Y. Zhang, W. Hsu, D. Chen, M. J. Hilton and R. J. O'Keefe (2012). "Cartilage-specific ss-CATENIN signaling regulates chondrocyte maturation, generation of ossification centers, and perichondrial bone formation during skeletal development." J Bone Miner Res.
Darabi, R., K. Gehlbach, R. M. Bachoo, S. Kamath, M. Osawa, K. E. Kamm, M. Kyba and R. C. Perlingeiro (2008). "Functional skeletal muscle regeneration from differentiating embryonic stem cells." Nat Med 14(2): 134-143.
Hirsinger, E., C. Jouve, J. Dubrulle and O. Pourquie (2000). "Somite formation and patterning." Int Rev Cytol 198: 1-65.
Hwang, N. S., M. S. Kim, S. Sampattavanich, J. H. Baek, Z. Zhang and J. Elisseeff (2006). "Effects of three-dimensional culture and growth factors on the chondrogenic differentiation of murine embryonic stem cells." Stem Cells 24(2): 284-291.
Hwang, N. S., S. Varghese, H. J. Lee, Z. Zhang, Z. Ye, J. Bae, L. Cheng and J. Elisseeff (2008). "In vivo commitment and functional tissue regeneration using human embryonic stem cell-derived mesenchymal cells." Proc Natl Acad Sci U S A 105(52): 20641-20646.
Jukes, J. M., S. K. Both, A. Leusink, L. M. Sterk, C. A. van Blitterswijk and J. de Boer (2008). "Endochondral bone tissue engineering using embryonic stem cells." Proc Natl Acad Sci U S A 105(19): 6840-6845.
Kattman, S. J., A. D. Witty, M. Gagliardi, N. C. Dubois, M. Niapour, A. Hotta, J. Ellis and G. Keller (2011). "Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines." Cell Stem Cell 8(2): 228-240.
Kinder, S. J., T. E. Tsang, G. A. Quinlan, A. K. Hadjantonakis, A. Nagy and P. P. Tam (1999). "The orderly allocation of mesodermal cells to the extraembryonic structures and the anteroposterior axis during gastrulation of the mouse embryo." Development 126(21): 4691-4701.
Koyama, E., Y. Shibukawa, M. Nagayama, H. Sugito, B. Young, T. Yuasa, T. Okabe, T. Ochiai, N. Kamiya, R. B. Rountree, D. M. Kingsley, M. Iwamoto, M. Enomoto-Iwamoto and M. Pacifici (2008). "A distinct cohort of progenitor cells participates in synovial joint and articular cartilage formation during mouse limb skeletogenesis." Dev Biol 316(1): 62-73.
Kramer, J., C. Hegert, K. Guan, A. M. Wobus, P. K. Muller and J. Rohwedel (2000). "Embryonic stem cell-derived chondrogenic differentiation in vitro: activation by BMP-2 and BMP-4." Mech Dev 92(2): 193-205.
Kulesa, P. M. and S. E. Fraser (2002). "Cell dynamics during somite boundary formation revealed by time-lapse analysis." Science 298(5595): 991-995.
LaPrade, R. F., L. S. Bursch, E. J. Olson, V. Havlas and C. S. Carlson (2008). "Histologic and immunohistochemical characteristics of failed articular cartilage resurfacing procedures for osteochondritis of the knee: a case series." Am J Sports Med 36(2): 360-368.
Lawrence, R. C., D. T. Felson, C. G. Helmick, L. M. Arnold, H. Choi, R. A. Deyo, S. Gabriel, R. Hirsch, M. C. Hochberg, G. G. Hunder, J. M. Jordan, J. N. Katz, H. M. Kremers and F. Wolfe (2008). "Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States. Part II." Arthritis Rheum 58(1): 26-35.
Lawson, K. A., J. J. Meneses and R. A. Pedersen (1991). "Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo." Development113(3): 891-911.
Mankoo, B. S., S. Skuntz, I. Harrigan, E. Grigorieva, A. Candia, C. V. Wright, H. Arnheiter and V. Pachnis (2003). "The concerted action of Meox homeobox genes is required upstream of genetic pathways essential for the formation, patterning and differentiation of somites." Development 130(19): 4655-4664.
Murakami, S., G. Balmes, S. McKinney, Z. Zhang, D. Givol and B. de Crombrugghe (2004). "Constitutive activation of MEK1 in chondrocytes causes Stat1-independent achondroplasia-like dwarfism and rescues the Fgfr3-deficient mouse phenotype." Genes Dev 18(3): 290-305.
Nakayama, N., D. Duryea, R. Manoukian, G. Chow and C. Y. Han (2003). "Macroscopic cartilage formation with embryonic stem-cell-derived mesodermal progenitor cells." J Cell Sci 116(Pt 10): 2015-2028.
Nostro, M. C., X. Cheng, G. M. Keller and P. Gadue (2008). "Wnt, activin, and BMP signaling regulate distinct stages in the developmental pathway from embryonic stem cells to blood." Cell Stem Cell 2(1): 60-71.
Oldershaw, R. A., M. A. Baxter, E. T. Lowe, N. Bates, L. M. Grady, F. Soncin, D. R. Brison, T. E. Hardingham and S. J. Kimber (2010). "Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes." Nat Biotechnol 28(11): 1187-1194.
Pacifici, M., E. Koyama, Y. Shibukawa, C. Wu, Y. Tamamura, M. Enomoto-Iwamoto and M. Iwamoto (2006). "Cellular and molecular mechanisms of synovial joint and articular cartilage formation." Ann N Y Acad Sci 1068: 74-86.
Pelttari, K., E. Steck and W. Richter (2008). "The use of mesenchymal stem cells for chondrogenesis." Injury 39 Suppl 1: S58-65.
Pelttari, K., A. Winter, E. Steck, K. Goetzke, T. Hennig, B. G. Ochs, T. Aigner and W. Richter (2006). "Premature induction of hypertrophy during in vitro chondrogenesis of human mesenchymal stem cells correlates with calcification and vascular invasion after ectopic transplantation in SCID mice." Arthritis Rheum 54(10): 3254-3266.
Singh, M. K., M. Petry, B. Haenig, B. Lescher, M. Leitges and A. Kispert (2005). "The T-box transcription factor Tbx15 is required for skeletal development." Mech Dev 122(2): 131-144.
Steinert, A. F., S. C. Ghivizzani, A. Rethwilm, R. S. Tuan, C. H. Evans and U. Noth (2007). "Major biological obstacles for persistent cell-based regeneration of articular cartilage." Arthritis Res Ther 9(3): 213.
Tam, P. P. and S. S. Tan (1992). "The somitogenetic potential of cells in the primitive streak and the tail bud of the organogenesis-stage mouse embryo." Development 115(3): 703-715.
Tanaka, M., V. Jokubaitis, C. Wood, Y. Wang, N. Brouard, M. Pera, M. Hearn, P. Simmons and N. Nakayama (2009). "BMP inhibition stimulates WNT-dependent generation of chondrogenic mesoderm from embryonic stem cells." Stem Cell Res 3(2-3): 126-141.
Tins, B. J., I. W. McCall, T. Takahashi, V. Cassar-Pullicino, S. Roberts, B. Ashton and J. Richardson (2005). "Autologous chondrocyte implantation in knee joint: MR imaging and histologic features at 1-year follow-up." Radiology234(2): 501-508.
Umeda, K., J. Zhao, P. Simmons, E. Stanley, A. Elefanty and N. Nakayama (2012). "Human chondrogenic paraxial mesoderm, directed specification and prospective isolation from pluripotent stem cells." Sci Rep 2: 455.
Yamashita, A., R. Krawetz and D. E. Rancourt (2008). "Loss of discordant cells during micro-mass differentiation of embryonic stem cells into the chondrocyte lineage." Cell Death Differ.
zur Nieden, N. I., G. Kempka, D. E. Rancourt and H. J. Ahr (2005). "Induction of chondro-, osteo- and adipogenesis in embryonic stem cells by bone morphogenetic protein-2: effect of cofactors on differentiating lineages." BMC Dev Biol 5: 1.
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年4月18日(2019.4.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書及び／又は図面に記載された方法、細胞集団、又は組成物。
【外国語明細書】
2019141074000001.pdf