(57)【要約】      （修正有）【課題】医学的診断装置に用いられる、核酸を配列決定する方法の提供。【解決手段】マイクロトランスポンダ上にキャプチャされたターゲットヌクレオチド塩基の配列を、複数の配列決定反応にかけて、ターゲットヌクレオチド塩基の配列に相補的であり、かつこの配列に結合するヌクレオチド塩基の配列を付加することと、各配列決定反応の後に、付加された各ヌクレオチド塩基を識別することと、配列の付加された各ヌクレオチド塩基を、マイクロトランスポンダの識別番号と関連付けることとを含む、方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロトランスポンダ上にキャプチャされたターゲットヌクレオチド塩基の配列を、複数の配列決定反応にかけて、ターゲットヌクレオチド塩基の配列に相補的であり、かつこの配列に結合するヌクレオチド塩基の配列を付加することと、
各配列決定反応の後に、付加された各ヌクレオチド塩基を識別することと、
配列の付加された各ヌクレオチド塩基を、マイクロトランスポンダの識別番号と関連付けることと
を含む、方法。
【請求項２】
ターゲットヌクレオチド塩基が、キャプチャプローブを介してキャプチャされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ターゲットヌクレオチド塩基が、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ターゲットヌクレオチド塩基をクローン増幅することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記クローン増幅が、配列決定反応の前に、エマルジョンポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
付加されるヌクレオチド塩基の少なくとも１つが標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
付加されるヌクレオチド塩基の少なくとも１つが光学標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
付加されるヌクレオチド塩基の少なくとも１つが電気化学標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
付加されたヌクレオチド塩基の識別が、フローメータを用いることによる、付加されたヌクレオチド塩基の検出を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記識別が、付加された前記塩基を、装置の反応ステーションから、前記フローメータを用いる前記装置の識別ステーションに移動させることを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記識別ステーションが、付加された前記塩基を検出するディテクタを含み、前記ディテクタは、１つ以上の光学信号、電気信号、および化学信号を検出する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
付加された前記塩基が、蛍光、発光、ｐＨ、熱、水素イオン濃度、ピロホスフェート濃度および放射活性の変化によって検出される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
単一の標識が、付加される複数のヌクレオチド塩基に用いられる、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
種々の複数の標識が、付加される各ヌクレオチド塩基に用いられて、付加された種々のヌクレオチド塩基を区別する、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
付加される前記塩基が、単一の塩基として付加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
付加される前記塩基が、オリゴヌクレオチドとして付加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチドが、最大約３０のヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
複数のマイクロトランスポンダを、複数の核酸ターゲットを含有する多重アッセイに用いることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
微流量チップデバイスにおける方法の少なくとも一部を実行することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
配列決定反応が、ターゲットヌクレオチド塩基の配列の全体が実質的に識別されるまで、繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
核酸ターゲットがキャプチャプローブを介してキャプチャされることとなる表面を有するマイクロトランスポンダと、
表面結合核酸ターゲットを複数の配列決定反応にかけて、ターゲットヌクレオチド塩基の配列に相補的であり、かつこの配列に結合するヌクレオチド塩基の配列を付加する反応ステーションと、
複数の配列決定反応に由来する無関係な配列決定試薬を取り除く洗浄ステーションと、
各配列決定反応の後に、付加された各ヌクレオチド塩基を識別する識別ステーションと
を備える装置。
【請求項２２】
表面上の核酸ターゲットをクローン増幅して、表面結合クローンターゲットを形成する増幅ステーションをさらに備える、請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
増幅ステーションが、表面結合核酸ターゲットを、続く第２から第ｎ回の配列決定反応にかける、請求項２１に記載の装置。
【請求項２４】
続く第２から第ｎ回の配列決定反応が、核酸ターゲットの配列内の第２から第ｎのヌクレオチド塩基に相補的である第２から第ｎのヌクレオチド塩基を付加し、ｎが、核酸ターゲットの配列内のヌクレオチド塩基の数以下である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
洗浄ステーションが、第２から第ｎの各ヌクレオチド塩基の付加後に、第２から第ｎの配列決定反応に由来する無関係な配列決定試薬を取り除くものである、請求項２３に記載の装置。
【請求項２６】
識別ステーションが、核酸ターゲットの配列内の第２から第ｎの各ヌクレオチド塩基のアイデンティティを決定するものである、請求項２３に記載の装置。
【請求項２７】
識別ステーションが、配列の付加された各ヌクレオチド塩基を、マイクロトランスポンダの識別番号と関連付ける、請求項２１に記載の装置。
【請求項２８】
ヌクレオチド塩基が、標識を含む、請求項２１に記載の装置。
【請求項２９】
キャプチャプローブが、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項２１に記載の装置。
【請求項３０】
核酸ターゲットが、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項２１に記載の装置。
【請求項３１】
増幅ステーションが、エマルジョンポリメラーゼ連鎖反応を用いて、核酸ターゲットをクローン増幅するものである、請求項２１に記載の装置。
【請求項３２】
ヌクレオチド塩基が、光学標識を含む、請求項２１に記載の装置。
【請求項３３】
ヌクレオチド塩基が、電気化学標識を含む、請求項２１に記載の装置。
【請求項３４】
識別ステーションが、フローメータを含む、請求項２１に記載の装置。
【請求項３５】
識別ステーションが、付加された各ヌクレオチド塩基を検出するディテクタを含む、請求項２１に記載の装置。
【請求項３６】
前記ディテクタが、１つ以上の光学信号、電気信号および化学信号を検出する、請求項３５に記載の装置。
【請求項３７】
識別ステーションが、付加された前記塩基を、装置の反応ステーションから、前記フローメータを用いる前記装置の識別ステーションへ移動させる、請求項３４に記載の装置。
【請求項３８】
ディテクタが、蛍光、発光、ｐＨ、熱、水素イオン濃度、ピロホスフェート濃度または放射活性の変化によって、付加された前記塩基を検出する、請求項３５に記載の装置。
【請求項３９】
反応ステーションが、単一の標識を複数のヌクレオチド塩基に用いるものである、請求項２８に記載の装置。
【請求項４０】
反応ステーションが、各ヌクレオチドに異なる標識を用いて、種々のヌクレオチド塩基を区別するものである、請求項２８に記載の装置。
【請求項４１】
付加される各ヌクレオチド塩基が、単一の塩基として付加される、請求項２１に記載の装置。
【請求項４２】
付加される各ヌクレオチド塩基が、オリゴヌクレオチドとして付加される、請求項２１に記載の装置。
【請求項４３】
オリゴヌクレオチドが、最大約３０のヌクレオチドを含む、請求項４２に記載の装置。
【請求項４４】
複数の核酸ターゲットを含有する多重アッセイ用の複数のマイクロトランスポンダを含む、請求項２１に記載の装置。
【請求項４５】
微流量チップデバイスをさらに含む、請求項２１に記載の装置。
【請求項４６】
微流量チップデバイスが、１つ以上の反応ステーション、洗浄ステーションまたは識別ステーションを備える、請求項４５に記載の装置。
【請求項４７】
ｎの数は、実質的に配列全体の末端を表す、請求項２３に記載の装置。
【請求項４８】
マイクロトランスポンダ上にキャプチャされたターゲットヌクレオチド塩基の配列を、複数の配列決定反応にかけて、ターゲットヌクレオチド塩基の配列に相補的であり、かつこの配列に結合するヌクレオチド塩基の配列を付加することと、
付加された各ヌクレオチド塩基を、装置の反応ステーションから、フローメータを用いる前記装置の識別ステーションへ移動させることと、
各配列決定反応の後に、付加された各ヌクレオチド塩基を識別することと
を含む方法。
【請求項４９】
マイクロトランスポンダの表面上に核酸ターゲットをキャプチャすることをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
核酸ターゲットが、キャプチャプローブによってキャプチャされる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
核酸ターゲットを増幅して表面結合クローンターゲットを形成することをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
無関係な配列決定試薬を取り除くことをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
ターゲットヌクレオチド塩基の配列の全体が実質的に識別されるまで、配列決定反応を繰り返すことを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
ターゲットヌクレオチド塩基が、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
ターゲットヌクレオチド塩基をクローン増幅することをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
前記クローン増幅が、配列決定反応の前に、エマルジョンポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
付加されるヌクレオチド塩基の少なくとも１つが、標識を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５８】
付加されるヌクレオチド塩基の少なくとも１つが、光学標識を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５９】
付加されるヌクレオチド塩基の少なくとも１つが、電気化学標識を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項６０】
付加されたヌクレオチド塩基の前記識別が、フローメータを用いることによる、付加されたヌクレオチド塩基の検出を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項６１】
前記識別ステーションが、付加された前記塩基を検出するディテクタを含み、前記ディテクタは、１つ以上の光学信号、電気信号および化学信号を検出する、請求項４８に記載の方法。
【請求項６２】
付加された前記塩基が、蛍光、発光、ｐＨ、熱、水素イオン濃度、ピロホスフェート濃度または放射活性の変化によって検出される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
単一の標識が、付加される複数のヌクレオチド塩基に用いられる、請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
種々の複数の標識が、付加される各ヌクレオチド塩基に用いられて、付加された種々のヌクレオチド塩基を区別する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６５】
付加される前記塩基が、単一の塩基として付加される、請求項４８に記載の方法。
【請求項６６】
付加される前記塩基が、オリゴヌクレオチドとして付加される、請求項４８に記載の方法。
【請求項６７】
オリゴヌクレオチドが、最大約３０のヌクレオチドを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
複数のマイクロトランスポンダを、複数の核酸ターゲットを含有する多重アッセイに用いることをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項６９】
微流量チップデバイスにおける方法の少なくとも一部を実行することをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項７０】
微流量チップデバイスが、１つ以上の反応ステーションまたは識別ステーションを備える、請求項６９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般に医学的診断装置、より詳細には核酸を配列決定する方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸は、ヌクレオチドと呼ばれるユニットがリンクした鎖によって形成される。ヌクレオチドは、連結されて、核酸であるリボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の構造ユニットを生じる分子である。ヌクレオチドは、リン酸基、糖（ＲＮＡの場合はリボース、そしてＤＮＡではデオキシリボース）および核酸塩基を含む。核酸塩基は、ヌクレオチドストランドの塩基対形成に用いられて、周知の二重螺旋のようなより高次の構造を形成する。ＤＮＡに見られる４つの塩基は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）である。ＤＮＡ二重螺旋において、一方のストランド上の各タイプの核酸塩基は、通常、他方のストランド上の１タイプの核酸塩基とだけしか相互作用せず、これは、相補的な塩基対形成として知られている。具体的に、ＡはＴにのみ結合し、そしてＣはＧにのみ結合する。ＲＮＡ核酸塩基は、チミンの代わりにウラシル（Ｕ）を含む。ＤＮＡおよびＲＮＡの重要性のため、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列についての知識は、多くの目的（例えば、病理的疾患、伝染性疾患、または遺伝的疾患の治療を識別し、診断し、かつ開発することが挙げられる）のために、有用である。
【０００３】
核酸配列決定ケミストリとして、シーケンシング−バイ−シンセシス（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（ＳＢＳ）またはシーケンシング−バイ−ライゲーション（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）（ＳＢＬ）戦略が挙げられる。これらの戦略は、一般的に、配列アイデンティティデータを追跡するために、ランダムな、または規則的な２次元（２Ｄ）アレイを用いる。これらのアレイ密度は極めて高く、１０５から１０７のフィーチャ（ｆｅａｔｕｒｅ）に及ぶ（または単一分子の検出ではより高くなる）。ヌクレオチド鎖がポリメラーゼ（ＳＢＳ）またはリガーゼ（ＳＢＬ）の作用で増えるのに従い、標識が組み込まれて、リーダによって検出される。標識を伴う塩基または核酸が識別されると、２Ｄ光学画像をキャプチャすることによって、塩基は、アレイ上のフィーチャが割り当てられる。しかしながら、これらの高密度アレイからスペクトルデータを分離するために必要な光学分割（ｏｐｔｉｃａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、非常に長い露光時間を必要とし、平均ラン時間が数時間から数日となる。また、継続的な配列決定サイクルから得られる光学画像は、容易にテラバイトサイズに達し得、アルゴリズムの計算時間およびデータストレージに対する要求が大きくなる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】図１は、例となるマイクロトランスポンダ（ｍｉｃｒｏｔｒａｎｓｐｏｎｄｅｒ）の概略図である。
【図２】図２は、図１の例となるマイクロトランスポンダを用いて核酸を配列決定する、例となる系のブロック図である。
【図３】図３は、本明細書中に開示される例となる系を実施するのに用いられてよい、例となる方法を表すフローチャートである。
【図４】図４は、本明細書中に開示される例となる系を実施するのに用いられてよい、例となる方法を表すフローチャートである。
【図５】図５は、図３および／もしくは図４の方法を実行するための命令、ならびに／または、より詳細には、本明細書中に開示される例となる方法、系および／もしくは装置のいずれかもしくは全てを実施するための命令を実行し得る、例となるプロセッサプラットホームを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
本開示は、例えば、医学的診断装置に用いられるような、核酸を配列決定する方法および装置に関する。本明細書中に開示される例は、マイクロトランスポンダ技術を、シーケンシング−バイ−シンセシス（ＳＢＳ）またはシーケンシング−バイ−ライゲーション（ＳＢＬ）ケミストリが挙げられるがこれらに限定されない次世代の配列決定法と組み合わせて用いることによって、生物、遺伝子および／または増幅されたターゲットの核酸配列を決定するのに用いられ得る。これらの例は、病原性生物（細菌および／またはウィルス）の検出、ＲＮＡ検出、ＤＮＡ検出、全ゲノムの新規の（ｄｅ  ｎｏｖｏ）配列決定、遺伝子発現、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、および／または次世代の配列決定法がバックエンド検出系として用いられる遺伝的試験のための一般的な診断系および方法として用いられ得る。これらの例は、例えば、臨床診断、院内感染性の感染症診断、疫学的サーベランス、法医学、研究ディスカバリ、および／または他の適切な利用等の多くの用途に用いられ得る。
【０００６】
配列決定法は、当該技術において知られている任意の方法によるものであってよい。ある実施形態において、配列決定法はシーケンシング−バイ−シンセシスである。他の実施形態において、配列決定法は、合成による、単一分子の配列決定法である。そして、一部の実施形態において、配列決定法は、シーケンシング−バイ−ライゲーション（ＳＢＬ）によるものである。技術によって包含される他の配列決定技術が、至る所で議論されている。シーケンシング−バイ−シンセシスとして、染料標識ヌクレオチドの組込み、鎖ターミネーション法（ｃｈａｉｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）、イオン／プロトン配列決定法、またはピロホスフェート（ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）配列決定法等が挙げられ得る。単一分子の技術として、配列決定反応が中断されて、組み込まれたヌクレオチドのアイデンティティを決定するスタガード配列決定法（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）が挙げられ得る。
【０００７】
ある実施形態において、配列決定は、プライマーをテンプレート（例えば、配列決定されるべき核酸）にハイブリダイズさせてテンプレート／プライマーデュプレックスを形成すること、テンプレートに応じてポリメラーゼがヌクレオチドをプライマーに付加するのを可能とする条件下で、検出可能に標識されたヌクレオチドの存在下で、デュプレックスをポリメラーゼ酵素に接触させること、組み込まれた標識ヌクレオチドから信号を検出すること、ならびに当該接触ステップおよび検出ステップを少なくとも１回、順次繰り返すことを含み、組み込まれた標識ヌクレオチドの順次的な検出が、核酸の配列を決定する。例示的な検出可能な標識として、放射性標識、金属標識、量子ドット、蛍光標識、発光標識、質量標識、酵素標識等が挙げられる。特定の実施形態において、検出可能な標識は、蛍光標識等の光学的に検出可能な標識であってよい。例示的な蛍光標識（配列決定用、および／または核酸、プライマー、プローブ等の標識等の他の目的用）として、シアニン、ローダミン、フルオレセイン、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ、ａｌｅｘａまたは接合型（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）マルチ染料が挙げられる。
【０００８】
一部の実施形態において、ターゲット核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）が固定される。例えば、一部の実施形態において、ターゲット核酸が、例えば、相補的な核酸（例えば、ターゲット核酸にハイブリダイズする）のようなキャプチャプローブ、抗体、または別のキャプチャ技術（例えば、一部の実施形態において、例えば、固定されたアビジン部分に結合されたビオチン化核酸の場合、核酸は、キャプチャエンティティによって認識（例えば、結合）されるタグまたは他の部分を含む）等の別のエンティティに結合される。
【０００９】
特定の、かつ例示的なＳＢＳプロセスが、ＤＮＡサンプルをセグメント化すること、およびポリ（Ａ）テールを一端に取り付けて、例えば、ポリ（Ｔ）分子でコーティングされたガラスカバースリップ上で洗浄されることを含む。Ａは、Ｔとハイブリダイズして、ＤＮＡセグメントを適所に（ｉｎ  ｐｌａｃｅ）保持する。例えば染料分子等の標識に連結された種々のＤＮＡ塩基が、固定されたセグメント上で複数回、洗浄される。塩基対ができ、二重螺旋を構築する。標識は、どの塩基が対で結合しているかを示す。画像が撮られて、配列は、標識を読むことによって決定される。
【００１０】
特定の、例示的なＳＢＬプロセスは、未知のＤＮＡ配列のターゲットストランドの少なくとも一端上に既知の配列がフランクされる（ｆｌａｎｋｅｄ）ことを含む。アンカーストランドが導入されて、既知の配列に結合する。標識オリゴヌクレオチド（一般的に５０以下の塩基を有する、短い核酸ポリマー）の混合プールが導入される。オリゴヌクレオチドは、アンカーに隣接するターゲットにハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドの塩基が未知の（ターゲット）ＤＮＡ配列にマッチすると、ＤＮＡリガーゼがオリゴヌクレオチドをアンカーに連結する。標識（例えば、放射性標識、金属標識、量子ドット、蛍光標識、発光標識、質量標識、酵素標識）に基づいて、未知のターゲットヌクレオチド配列は識別されてよい。
【００１１】
本明細書中に開示される例となる系および方法は、配列決定反応において付加されたヌクレオチドを選択的に識別するためのマイクロトランスポンダを用いる。一部の実施形態において、技術は、例えば、複数のマイクロトランスポンダのそれぞれに固有の識別タグ、およびヌクレオチド配列に付加されるヌクレオチド塩基が伴う標識の双方を識別する、フローリーダ等の識別ツールの使用を含む。一部の実施形態において、識別ツール（例えば、識別ステーションおよび／またはフローメータ）は、ヌクレオチド塩基が伴う標識を検出するためのディテクタを含む。一部の実施形態において、ディテクタは、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ、ＣＭＯＳを覆うイオン感応層等のイオンセンサ、または電流ディテクタ等である。一部の実施形態において、ディテクタは、信号を送るために、蛍光色素等の標識を生じさせるための励起系を伴う。一部の実施形態において、ディテクタは、アークランプ、レーザ、または発光ダイオード（ＬＥＤ）等の照射源を伴う。特定の実施形態において、ディテクタは、照射源からサンプルへ、またはサンプルから画像センサもしくは検出センサへの光伝送のため光学素子を伴う。あるいはまた、一部の実施形態において、例えば、信号が配列決定反応の結果として自然発生的に生じる場合等、ディテクタは照射源を伴わない。例えば、信号が、イオン感応層と相互作用して放出されるイオン、または酵素もしくは他の触媒と反応して化学発光信号を生じるピロホスフェート等の放出部分の相互作用によって生じてよい。別の例において、ディテクタが、照射源の必要なく、電流、電圧または電気抵抗の変化を検出する。
【００１２】
したがって、記載される実施形態に従う技術の使用（例えば、複数のマイクロトランスポンダのそれぞれに固有の識別タグ、およびヌクレオチド配列に付加されるヌクレオチド塩基が伴う標識の双方を識別することを含む）が、２次元（２Ｄ）アレイから３次元（３Ｄ）アレイへと検出フォーマットを変えることによって、配列識別のための２Ｄデカルト座標（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）の使用を除外する。
【００１３】
例となるマイクロトランスポンダは、例えば、フローメータ（例えば、本明細書中に記載されるように、例えば、ディテクタを含むフローリーダ）等の識別デバイス（例えば、識別ツールを含む）で読まれるので、ランダムな、または規則的な高密度アレイを光学的に検出する必要がない。合成またはライゲーションの各ラウンドの後、マイクロトランスポンダはフローリーダに通され、そこで各トランスポンダが識別され、そして標識（例えば蛍光）が検出される。陽性の蛍光が、付加された塩基を示す；陰性の蛍光が、塩基が付加されなかったことを示す。各検出の後、マイクロトランスポンダは、塩基の付加および検出の続くラウンドのために、試薬中に再懸濁されてよい。高密度２Ｄアレイフィーチャを解像するための複雑な光学画像化ハードウェアが必要ない。したがって、ランタイムはかなり短くなる。また、マイクロトランスポンダからの信号の、デジタル方式の「イエス」または「ノー」による検出が、各ラン中に大きなデータ画像ファイルが保存される従来の系と比較して、ストレージ空間をかなり節約する。さらに、高スループットが、フローリーダで可能である。例となるフローリーダが、例えば、毎秒約１，０００マイクロトランスポンダの伝送率で操作されて、毎時約３５０万の検出イベントに変換し得る。例となるメモリまたはストレージが、６４ビットＲＯＭを含み、１０１７を超える種々の識別に変換し、これは、ヒトゲノムを配列決定するのに十分な情報を超えている。
【００１４】
本明細書中に開示される例となる系が、キャプチャプローブを介して核酸ターゲットがキャプチャされることとなる表面を有するマイクロトランスポンダを含む。一部の実施形態において、系が、表面結合クローンターゲットを形成するために、核酸ターゲットを表面上でクローン増幅する増幅ステーションを備える。また、例となる系は、表面結合ターゲット（例えば、一部の実施形態では、増幅されたクローンターゲット）を配列決定反応（例えば、第１の配列決定反応）（例えば、重合反応（例えば、第１の重合反応）、ライゲーション反応（例えば、第１のライゲーション反応）等）にかけて、第１の核酸塩基（例えば、標識核酸塩基）またはヌクレオチド塩基に相補的であるヌクレオチド塩基（例えば、第１のヌクレオチド塩基）を核酸ターゲットの配列内に付加する反応ステーションを備える。例となる系はまた、無関係な配列決定反応試薬および／または副産物（例えば、重合反応（例えば、第１の重合反応）に由来する重合試薬、またはライゲーション反応（例えば、第１のライゲーション反応）に由来する無関係なライゲーション試薬）を取り除く洗浄ステーションを備える。さらに、例となる系は、それぞれ、マイクロトランスポンダの識別番号、および、一部の実施形態において、標識ヌクレオチド塩基（例えば、第１の標識ヌクレオチド塩基）の標識（例えば、第１の標識）を用いることで、核酸ターゲットの配列内の（例えば、それぞれの）ヌクレオチド塩基（例えば、第１のヌクレオチド塩基）のアイデンティティ、および／またはヌクレオチド塩基（例えば、第１のヌクレオチド塩基；例えば、標識ヌクレオチド塩基）のアイデンティティを決定する識別ステーションを備える。
【００１５】
増幅ステーションは、表面結合クローンターゲットを、続く第２から第ｎ回の重合またはライゲーション反応にかけて、順次、核酸ターゲットの配列内の第２から第ｎのヌクレオチド塩基とそれぞれ相補的である第２から第ｎの標識ヌクレオチド塩基を付加するものであり、ｎの数は、核酸ターゲットの配列内のヌクレオチド塩基数に基づく。また、洗浄ステーションは、第２から第ｎの各標識ヌクレオチド塩基の追加後に、第２から第ｎの重合またはライゲーション試薬に由来する無関係な重合またはライゲーション試薬を取り除くものである。さらに、識別ステーションは、第２から第ｎの各標識ヌクレオチド塩基の追加後に、それぞれ、マイクロトランスポンダの識別番号、および第２から第ｎの標識ヌクレオチド塩基の第２から第ｎの標識を用いることで、核酸ターゲットの配列内の第２から第ｎの各ヌクレオチド塩基のアイデンティティ、および第２から第ｎの各標識ヌクレオチド塩基のアイデンティティを決定するものである。
【００１６】
一部の例において、キャプチャプローブはＤＮＡまたはＲＮＡを含んでよく、そして核酸ターゲットはＤＮＡまたはＲＮＡを含んでよい。また、一部の例において、増幅ステーションは、エマルジョンポリメラーゼ連鎖反応を用いて、核酸ターゲットをクローン増幅するものである。
【００１７】
技術は、核酸配列決定技術で限定されない。核酸配列決定プラットホームの種々の実施形態（例えば、核酸シーケンサ）が、下記のようなコンポーネントを備える。種々の実施形態に従えば、配列決定装置が、流体送達制御ユニット、サンプルプロセシングユニット、信号検出ユニット、およびデータ収集分析制御ユニットを備える。装置の種々の実施形態が、オートメーション化配列決定を実現し、これは、複数の配列から配列情報を、並列して、そして／または実質的に同時に集めるために用いられる。
【００１８】
一部の実施形態において、流体送達制御ユニットは、試薬送達系を備える。試薬送達系は、種々の試薬のストレージ用の試薬リザーバを備える。試薬は、ＲＮＡベースのプライマー、フォワード／リバースＤＮＡプライマー、シーケンシング−バイ−シンセシス用のヌクレオチド混合物、バッファ、洗浄試薬、ブロッキング試薬、およびストリッピング試薬等を含んでよい。加えて、試薬送達系は、サンプルプロセシングユニットを試薬リザーバと接続するピペッティング系または連続フロー系を備えてよい。
【００１９】
一部の実施形態において、データ収集分析制御ユニットは、種々の系パラメータを監視する。系パラメータとして、サンプルプロセシングユニットもしくは試薬リザーバ等の装置の種々の部分の温度、種々の試薬の容量、マニピュレータ、ステッパモータ、もしくはポンプ等の種々の系サブコンポーネントの状態、またはそれらの任意の組合せが挙げられ得る。
【００２０】
装置および系の種々の実施形態が、シーケンシング−バイ−シンセシス、単一分子の方法等の配列決定法、および他の配列決定技術を実践するために用いられることは、当業者によって理解されるであろう。シーケンシング−バイ−シンセシスとして、染料標識ヌクレオチドの組込み、鎖ターミネーション、イオン／プロトン配列決定法、またはピロホスフェート配列決定法等が挙げられ得る。単一分子の技術として、配列決定反応が中断されて、組み込まれたヌクレオチドのアイデンティティを決定するスタガード配列決定法が挙げられ得る。
【００２１】
一部の実施形態において、配列決定装置は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド等の核酸の配列を決定する。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられ得、そして、ｓｓＤＮＡおよびＲＮＡ等の単一ストランドであってもよいし、ｄｓＤＮＡまたはＲＮＡ／ｃＤＮＡ対等の二重ストランドであってもよい。一部の実施形態において、核酸は、フラグメントライブラリ、接合対（ｍａｔｅ  ｐａｉｒ）ライブラリ、またはＣｈＩＰフラグメント等が挙げられ得、またはそこから誘導されてよい。特定の実施形態において、配列決定装置は、単一の核酸分子から、または実質的に同じ核酸分子の群から、配列情報を得ることができる。
【００２２】
一部の実施形態において、配列決定装置は、種々の異なるアウトプットデータファイルタイプ／フォーマットの核酸配列決定リードデータを出力してよい：＊．ｔｘｔ、＊．ｆａｓｔａ、＊．ｃｓｆａｓｔａ、＊ｓｅｑ．ｔｘｔ、＊ｑｓｅｑ．ｔｘｔ、＊．ｆａｓｔｑ、＊．ｓｆｆ、＊ｐｒｂ．ｔｘｔ、＊．ｓｍｓ、＊ｓｒｓ、および／または＊．ｑｖが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
一部の実施形態において、技術は、次世代の配列決定技術を含む。技術によって意図される特定の配列決定技術が、超並列高スループット戦略の共通のフィーチャを共有し、以前の配列決定法と比較してよりコストを下げることを目的とする、次世代の配列決定（ＮＧＳ）法である（例えば、Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．，５５：６４１−６５８，２００９およびＭａｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７：２８７−２９６参照；それぞれその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。ＮＧＳ法は、一般的にテンプレート増幅を利用するものと、利用しないものとに広く分けられ得る。増幅要求法として、Ｒｏｃｈｅによって４５４技術プラットホームとして商品化されている（例えば、ＧＳ  ２０およびＧＳ  ＦＬＸ）パイロシーケンス法（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａによって商品化されているＳｏｌｅｘａプラットホーム、およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって商品化されているＳｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）プラットホームが挙げられる。単一分子の配列決定法としても知られている非増幅アプローチが、Ｈｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓによって商品化されているＨｅｌｉＳｃｏｐｅプラットホーム、ならびにＶｉｓｉＧｅｎ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｏｎ  ＴｏｒｒｅｎｔおよびＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによってそれぞれ商品化されている新生のプラットホームによって、例示される。
【００２４】
パイロシーケンス法（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．，５５：６４１−６５８，２００９；ＭａｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７：２８７−２９６；米国特許第６，２１０，８９１号明細書；米国特許第６，２５８，５６８号明細書；それぞれその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）において、ＮＧＳフラグメントライブラリは、単一のテンプレート分子を、アダプタに相補的なオリゴヌクレオチドを支持するビーズによってキャプチャすることによって、インシトゥクローン増幅される。単一のテンプレートタイプを支持するビーズはそれぞれ、油中水の微小胞に区画され、そしてテンプレートは、エマルジョンＰＣＲと呼ばれる技術を用いてクローン増幅される。エマルジョンは増幅後に破壊されて、ビーズは、配列決定反応中、フローセルとして機能する、ピコタイタープレートの個々のウェル中に入れられる。４つのｄＮＴＰ試薬のそれぞれの規則的な反復的導入（ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）が、フローセルにおいて、配列決定酵素およびルシフェラーゼ等の発光リポータの存在下で起こる。適切なｄＮＴＰが配列決定プライマーの３’末端に付加された場合、結果として生じるＡＴＰの産生により、ウェル内で突発的な（ａ  ｂｕｒｓｔ  ｏｆ）発光が生じ、これがＣＣＤカメラを用いて記録される。４００塩基以上のリード長を達成することが可能であり、そして１０６の配列リードが達成され得、最大５億塩基対（Ｍｂ）の配列が得られる。
【００２５】
Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットホーム（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．，５５：６４１−６５８，２００９；ＭａｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７：２８７−２９６；米国特許第６，８３３，２４６号明細書；米国特許第７，１１５，４００号明細書；米国特許第６，９６９，４８８号明細書；それぞれその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）において、配列決定データは、より短い長さのリードの形態で生じる。この方法において、ＮＧＳフラグメントライブラリのフラグメントは、オリゴヌクレオチドアンカーがちりばめられた（ｓｔｕｄｄｅｄ）フローセルの表面上にキャプチャされる。アンカーは、ＰＣＲプライマーとして用いられるが、テンプレートの長さから、そして他のすぐ近くのアンカーオリゴヌクレオチドに近いことから、ＰＣＲによる伸張は、隣接するアンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする分子の「アーチオーバ（ａｒｃｈｉｎｇ  ｏｖｅｒ）」をもたらして、フローセルの表面上に架橋構造を形成する。ＤＮＡのこれらのループが、変性され、かつ切断される。続いて、フォワードストランドが、可逆的染料ターミネータで配列決定される。組み込まれたヌクレオチドの配列は、各蛍光およびブロックが、ｄＮＴＰ付加の次のサイクルの前に取り除かれている、組込み後の（ｐｏｓｔ−ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）蛍光を検出することによって、決定される。配列決定リード長は、３６ヌクレオチドから１００を超えるヌクレオチドに及び、アウトプット全体では分析ランにつき１０億ヌクレオチド対を越える。
【００２６】
ＳＯＬｉＤ技術を用いる核酸分子の配列決定（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．，５５：６４１−６５８，２００９；ＭａｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７：２８７−２９６；米国特許第５，９１２，１４８号明細書；米国特許第６，１３０，０７３号明細書；それぞれその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）は、エマルジョンＰＣＲによるＮＧＳフラグメントライブラリのクローン増幅も伴う。この後、テンプレートを支持するビーズが、ガラスフローセルの誘導体化された表面上に固定され、そして、アダプタオリゴヌクレオチドに相補的なプライマーが、アニールされる。しかしながら、このプライマーを３’伸張用に利用するのではなく、その代わりとして、２つのプローブ特異的塩基に続いて、６つの変性塩基、および４つの蛍光標識の１つを含有するインタロゲーション（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）プローブへのライゲーション用に５’ホスフェート基を提供するのに用いられる。ＳＯＬｉＤ系において、インタロゲーションプローブは、各プローブの３’末端の２つの塩基、および５’末端の４つの蛍光の１つの、１６の組合せがあり得る。蛍光カラー、そしてしたがって各プローブのアイデンティティが、特定の色空間コーディングスキームに対応する。プローブアニーリング、ライゲーション、および蛍光検出の複数ラウンド（通常７回）の後に変性が、そして次に、最初のプライマーと比較して１つの塩基によってオフセットされるプライマーを用いる配列決定の第２のラウンドが続く。このように、テンプレート配列は、算定的に再構築され得、そしてテンプレート塩基は、２回インターロゲートされて、精度が増す。配列リード長は平均すると３５ヌクレオチドになり、アウトプット全体では配列決定ランにつき４０億塩基を越える。
【００２７】
ある実施形態において、Ｈｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓによるＨｅｌｉＳｃｏｐｅが用いられる（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．，５５：６４１−６５８，２００９；ＭａｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７：２８７−２９６；米国特許第７，１６９，５６０号明細書；米国特許第７，２８２，３３７号明細書；米国特許第７，４８２，１２０号明細書；米国特許第７，５０１，２４５号明細書；米国特許第６，８１８，３９５号明細書；米国特許第６，９１１，３４５号明細書；米国特許第７，５０１，２４５号明細書；それぞれその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。配列決定は、ポリメラーゼの付加、および蛍光標識ｄＮＴＰ試薬の連続的付加によって達成される。組込みイベントは、ｄＮＴＰに対応する蛍光信号をもたらし、そして信号は、ｄＮＴＰ付加の各ラウンド前に、ＣＣＤカメラによってキャプチャされる。配列決定リード長は、２５から５０ヌクレオチドに及び、アウトプット全体では分析ランにつき１０億ヌクレオチド対を越える。
【００２８】
一部の実施形態において、Ｒｏｃｈｅによる４５４配列決定法が用いられる（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３７：３７６−３８０）。４５４配列決定法は、２つのステップを伴う。第１ステップでは、ＤＮＡが、約３００から８００塩基対のフラグメントに剪断されて、フラグメントは平滑末端を有する（ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄｅｄ）。続いて、オリゴヌクレオチドアダプタが、フラグメントの末端にライゲーションされる。アダプタは、フラグメントの増幅および配列決定のためのプライマーとして役立つ。フラグメントは、例えば、５’−ビオチンタグを含有するアダプタを用いて、例えば、ストレプトアビジンコーティングされたビーズのような、ＤＮＡキャプチャビーズに取り付けられてよい。ビーズに取り付けられたフラグメントは、油−水エマルジョンの小滴内でＰＣＲ増幅される。ビーズ上にはそれぞれ、クローン増幅されたＤＮＡフラグメントの複数のコピーが生じる。第２のステップでは、ビーズはウェル（ピコリットルのサイズ）内にキャプチャされる。パイロシーケンスが、各ＤＮＡフラグメントに並列して実行される。１つ以上のヌクレオチドの付加が光信号を生じ、これがＣＣＤカメラによって配列決定装置内に記録される。信号強度は、組み込まれるヌクレオチドの数に比例する。パイロシーケンスは、ヌクレオチド付加の直後に放出されるピロホスフェート（ＰＰｉ）を利用する。ＰＰｉは、アデノシン５’ホスホ硫酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ５’  ｐｈｏｓｐｈｏｓｕｌｆａｔｅ）の存在下でＡＴＰスルフリラーゼによってＡＴＰに変換される。ルシフェラーゼが、ＡＴＰを用いて、ルシフェリンをオキシルシフェリンに変換する。この反応が光を生じ、これが検出され、かつ分析される。
【００２９】
Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ技術は、ＤＮＡの重合中に放出される水素イオンの検出に基づくＤＮＡ配列決定法である（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７（５９７０）：１１９０（２０１０）；米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号明細書；米国特許出願公開第２００９／０１２７５８９号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０３０１３９８号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０１９７５０７号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０１８８０７３号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０１３７１４３号明細書（それらの全体が、全ての目的について、参照によって組み込まれる）参照）。マイクロウェルが、配列決定されるべきＮＧＳフラグメントライブラリのフラグメントを含有する。マイクロウェルの層の下に、高感度ＩＳＦＥＴイオンセンサがある。全ての層は、エレクトロニクス産業において用いられるものと同様のＣＭＯＳ半導体チップ内に含有される。ｄＮＴＰが、増大する相補ストランド中に組み込まれると、水素イオンが放出され、これが高感度イオンセンサのトリガとなる。ホモポリマーリピートがテンプレート配列内に存在する場合、複数のｄＮＴＰ分子が、単一サイクル中に組み込まれることとなる。このことが、放出される水素の対応する数に比例して、より高い電子信号をもたらす。この技術は、修飾ヌクレオチドも光学素子も用いられないという点で、他の配列決定技術と異なる。Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンサの塩基あたりの精度は、５０塩基リードについて約９９．６％である（ランにつき約１００Ｍｂが生じる）。リード長は、１００塩基対である。５リピート長のホモポリマーリピートの精度は、約９８％である。イオン半導体配列決定法の利点は、迅速な配列決定速度、ならびに低い先行コストおよび運転コストである。しかしながら、ｐＨ介在性シーケンサを入手するコストは、サンプル調製装置およびデータ分析用サーバを除いて、約５０，０００ドルである。
【００３０】
本発明の用途に適し得る別の例示的な核酸配列決定アプローチが、Ｓｔｒａｔｏｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．によって開発されており、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒｓの使用を伴うものである。この配列決定プロセスは、一般的に、テンプレート指向型（ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）合成によって生じる娘ストランドを提供することを含む。娘ストランドは、一般に、ターゲット核酸の全体または一部の連続したヌクレオチド配列に対応する配列内で結合する複数のサブユニットを含み、個々のサブユニットは、テザー、少なくとも１つのプローブまたは核酸塩基残基、および少なくとも１つの選択的に切断可能な結合を含む。選択的に切断可能な結合は、切断されて、娘ストランドの複数のサブユニットよりも長い長さのＸｐａｎｄｏｍｅｒを産生する。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、一般的に、ターゲット核酸の全体または一部の連続したヌクレオチド配列に対応する配列内に、遺伝的情報を解析するためのテザーおよびリポータ要素を含む。続いて、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒのリポータ要素が検出される。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒベースのアプローチに関する付加的な詳細が、例えば、米国特許出願公開第２００９／００３５７７７号明細書（表題「ＨＩＧＨ  ＴＨＲＯＵＧＨＰＵＴ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＢＹ  ＥＸＰＡＮＳＩＯＮ」、２００８年６月１９日出願（その全体が本明細書中に組み込まれる））に記載されている。
【００３１】
他の単一分子の配列決定法として、ＶｉｓｉＧｅｎプラットホームを用いた合成によるリアルタイム配列決定法が挙げられる（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．，５５：６４１−６５８，２００９；米国特許第７，３２９，４９２号明細書；米国特許出願第１１／６７１，９５６号明細書；米国特許出願第１１／７８１，１６６号明細書；それぞれその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。ここでは、ＮＧＳフラグメントライブラリのフラグメントが、固定されて、プライムされ（ｐｒｉｍｅｄ）てから、蛍光修飾ポリメラーゼおよび蛍光アクセプタ分子を用いたストランド伸張にかけられて、ヌクレオチド付加の直後に検出可能な蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が生じる。
【００３２】
Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって開発された別の単一分子のリアルタイム配列決定系（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．，５５：６４１−６５８，２００９；ＭａｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７：２８７−２９６；米国特許第７，１７０，０５０号明細書；米国特許第７，３０２，１４６号明細書；米国特許第７，３１３，３０８号明細書；米国特許第７，４７６，５０３号明細書；全て参照によって本明細書中に組み込まれる）が、直径５０から１００ｎｍの、約２０ゼプトリットル（１０−２１ｌ）の反応容量を含む反応ウェルを利用するものである。固定されたテンプレート、修飾ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、および高い局部的濃度の、蛍光標識ｄＮＴＰを用いて、配列決定反応が実行される。高い局部的濃度および連続反応条件により、組込みイベントが、レーザ励起、光導波路およびＣＣＤカメラを用いた蛍光信号検出によって、リアルタイムにキャプチャされ得る。
【００３３】
ある実施形態において、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって開発されたゼロ−モード導波路（ＺＭＷ）を用いた単一分子のリアルタイム（ＳＭＲＴ）ＤＮＡ配列決定法、または同様の方法が、用いられる。この技術により、ＤＮＡ配列決定は、それぞれ何千ものゼロ−モード導波路（ＺＭＷ）を含有するＳＭＲＴチップ上で実行される。ＺＭＷは、二酸化ケイ素基質上に堆積した１００ｎｍの金属フィルム内に製造される、直径が何十ナノメートルという穴である。各ＺＭＷは、ちょうど２０ゼプトリットル（１０Ｌ）の検出容量を提供するナノフォトニック視覚化チャンバとなる。この容量で、単一分子の活性は、何千という標識ヌクレオチドのバックグラウンド中で検出され得る。ＺＭＷは、シーケンシング−バイ−シンセシスを実行するので、ＤＮＡポリメラーゼを見るためのウインドウを提供する。各チャンバ内で、単一のＤＮＡポリメラーゼ分子が、検出容量内で常時存在するように、底面に取り付けられている。続いて、異なる着色蛍光体で各タイプが標識されている、ホスホリンクされた（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｎｋｅｄ）ヌクレオチドが、酵素速度、精度および進行性（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）を促進する高い濃度で、反応溶液中に導入される。ＺＭＷのサイズが小さいために、これらの高い、生物学的に適切な濃度であっても、検出容量は、ほんの僅かな時間だけヌクレオチドによって占有される。また、拡散がヌクレオチドを持ち去るはずの距離が非常に短いために、検出容量の査察（ｖｉｓｉｔ）は速く、僅か数マイクロ秒しか続かない。結果、非常に低いバックグラウンドとなる。
【００３４】
一部の実施形態において、ナノポア配列決定法が用いられる（Ｓｏｎｉ  Ｇ  Ｖ  ａｎｄ  Ｍｅｌｌｅｒ  Ａ．（２００７）Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５３：１９９６−２００１）。ナノポアは、直径が１ナノメートル程度の小さな穴である。ナノポアの、導電流体中への浸漬、およびそこへの電位の印加が、ナノポアを通るイオンの伝導により、僅かな電流を生じさせる。流れる電流の量は、ナノポアのサイズに影響される。ＤＮＡ分子がナノポアを通過するに従い、ＤＮＡ分子上の各ヌクレオチドが、ナノポアを異なる程度に塞ぐ。したがって、ＤＮＡ分子がナノポアを通過するに従い、ナノポアを通る電流が変化し、これがＤＮＡ配列のリーディングを表す。
【００３５】
一部の実施形態において、配列決定技術が、化学感応性電界効果トランジスタ（ｃｈｅｍＦＥＴ）アレイを用いてＤＮＡを配列決定する（例えば、米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号明細書に記載されている）。技術の１つの例において、ＤＮＡ分子は、反応チャンバ中に配置され、そしてテンプレート分子は、ポリメラーゼに結合された配列決定プライマーにハイブリダイズされる。配列決定プライマーの３’末端での、新しい核酸ストランド中への１つ以上のトリホスフェートの組込みが、電流の変化によって、ｃｈｅｍＦＥＴによって検出され得る。アレイが、複数のｃｈｅｍＦＥＴセンサを有してよい。別の例では、単一の核酸が、ビーズに取り付けられてよい。核酸は、ビーズ上で増幅され得、そしてビーズは個々に、ｃｈｅｍＦＥＴアレイ上の個々の反応チャンバ（各チャンバは、ｃｈｅｍＦＥＴセンサを有する）へ移されてよい。そして核酸は、配列決定され得る。
【００３６】
一部の実施形態において、配列決定技術が、電子顕微鏡を用いる（Ｍｏｕｄｒｉａｎａｋｉｓ  Ｅ．Ｎ．ａｎｄ  Ｂｅｅｒ  Ｍ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９６５  Ｍａｒｃｈ；５３：５６４−７１）。技術の１つの例において、個々のＤＮＡ分子が、電子顕微鏡を用いて区別可能な金属標識を用いて標識される。続いて、この分子は、平らな表面上で引き伸ばされ（ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ）、かつ電子顕微鏡を用いて画像化されて、配列を測定する。
【００３７】
一部の実施形態において、Ｔｕｒｒｏ，ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  １０３：１９６３５−４０（２００６）に記載されるような「切断可能な蛍光ヌクレオチド可逆ターミネータを用いた４色シーケンシング−バイ−シンセシス（ｆｏｕｒ−ｃｏｌｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｓ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）」（例えば、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｂｉｏ−Ｓｙｓｔｅｍｓによって商品化されている）が用いられる。技術は、米国特許出願公開第２０１０／０３２３３５０号明細書；米国特許出願公開第２０１０／００６３７４３号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０１５９５３１号明細書；米国特許出願公開第２０１０／００３５２５３号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０１５２０５０号明細書に記載されており、全ての目的について、参照によって本明細書中に組み込まれる。
【００３８】
本発明の用途に適し得るようなリアルタイム配列決定のためのプロセスおよび系が、例えば、米国特許第７，４０５，２８１号明細書（表題「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｅｆｏｒ」、２００８年７月２９日Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．に発行）；米国特許第７，３１５，０１９号明細書（表題「Ａｒｒａｙｓ  ｏｆ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ」、２００８年１月１日Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に発行）；米国特許第７，３１３，３０８号明細書（表題「Ｏｐｔｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、２００７年１２月２５日Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に発行）；米国特許第７，３０２，１４６号明細書（表題「Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、２００７年１１月２７日Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に発行）；米国特許第７，１７０，０５０号明細書（表題「Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、２００７年１月３０日Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に発行）；米国特許出願公開第２００８／０２１２９６０号明細書（表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｏｕｒｃｅｓ」、２００７年１０月２６日Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００８／０２０６７６４号明細書（表題「Ｆｌｏｗｃｅｌｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」、２００７年１０月２６日Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００８／０１９９９３２号明細書（表題「Ａｃｔｉｖｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ」、２００７年１０月２６日Ｈａｎｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００８／０１９９８７４号明細書（表題「ＣＯＮＴＲＯＬＬＡＢＬＥ  ＳＴＲＡＮＤ  ＳＣＩＳＳＩＯＮ  ＯＦ  ＭＩＮＩ  ＣＩＲＣＬＥ  ＤＮＡ」、２００８年２月１１日Ｏｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００８／０１７６７６９号明細書（表題「Ａｒｔｉｃｌｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｄｉｓｐｏｓｅｄ  ｔｈｅｒｅｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｓａｍｅ」、２００７年１０月２６日Ｒａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００８／０１７６３１６号明細書（表題「Ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｔｏｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ」、２００７年１０月３１日Ｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００８／０１７６２４１号明細書（表題「Ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｔｏｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ」、２００７年１０月３１日Ｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００８／０１６５３４６号明細書（表題「Ｍｅｔｈｏ���ｓ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｏｕｒｃｅｓ」、２００７年１０月２６日Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００８／０１６０５３１号明細書（表題「Ｕｎｉｆｏｒｍ  ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｆｏｒ  ｈｙｂｒｉｄ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｕｓｉｎｇ  ｓａｍｅ」、２００７年１０月３１日Ｋｏｒｌａｃｈによって出願）；米国特許出願公開第２００８／０１５７００５号明細書（表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｏｕｒｃｅｓ」、２００７年１０月２６日Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００８／０１５３１００号明細書（表題「Ａｒｔｉｃｌｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｄｉｓｐｏｓｅｄ  ｔｈｅｒｅｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｓａｍｅ」、２００７年１０月３１日Ｒａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００８／０１５３０９５号明細書（表題「ＣＨＡＲＧＥ  ＳＷＩＴＣＨ  ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ」、２００７年１０月２６日Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００８／０１５２２８１号明細書（表題「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ」、２００７年１０月３１日Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００８／０１５２２８０号明細書（表題「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ」、２００７年１０月３１日Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００８／０１４５２７８号明細書（表題「Ｕｎｉｆｏｒｍ  ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｆｏｒ  ｈｙｂｒｉｄ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｕｓｉｎｇ  ｓａｍｅ」、２００７年１０月３１日Ｋｏｒｌａｃｈによって出願）；米国特許出願公開第２００８／０１２８６２７号明細書（表題「ＳＵＢＳＴＲＡＴＥＳ，ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＡＮＡＬＹＺＩＮＧ  ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ」、２００７年８月３１日Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号明細書（表題「Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」、２００７年１０月２２日Ｒａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００８／００９５４８８号明細書（表題「ＳＵＢＳＴＲＡＴＥＳ  ＦＯＲ  ＰＥＲＦＯＲＭＩＮＧ  ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ  ＲＥＡＣＴＩＯＮＳ」、２００７年６月１１日Ｆｏｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．に���って出願）；米国特許出願公開第２００８／００８００５９号明細書（表題「ＭＯＤＵＬＡＲ  ＯＰＴＩＣＡＬ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ  ＡＮＤ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＮＧ  ＳＡＭＥ」、２００７年９月２７日Ｄｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００８／００５０７４７号明細書（表題「Ａｒｔｉｃｌｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｄｉｓｐｏｓｅｄ  ｔｈｅｒｅｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｕｓｉｎｇ  ｓａｍｅ」、２００７年８月１４日Ｋｏｒｌａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００８／００３２３０１号明細書（表題「Ａｒｔｉｃｌｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｄｉｓｐｏｓｅｄ  ｔｈｅｒｅｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｓａｍｅ」、２００７年３月２９日Ｒａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００８／００３０６２８号明細書（表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｏｕｒｃｅｓ」、２００７年２月９日Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００８／０００９００７号明細書（表題「ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ  ＩＮＩＴＩＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＩＭＥＲ  ＥＸＴＥＮＳＩＯＮ」、２００７年６月１５日Ｌｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００７／０２３８６７９号明細書（表題「Ａｒｔｉｃｌｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｄｉｓｐｏｓｅｄ  ｔｈｅｒｅｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｓａｍｅ」、２００６年３月３０日Ｒａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００７／０２３１８０４号明細書（表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ」、２００６年３月３１日Ｋｏｒｌａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００７／０２０６１８７号明細書（表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｏｕｒｃｅｓ」、２００７年２月９日Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００７／０１９６８４６号明細書（表題「Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ」、２００６年１２月２１日Ｈａｎｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００７／０１８８７５０号明細書（表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｏｕｒｃｅｓ」、２００６年７月７日Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａ���．によって出願）；米国特許出願公開第２００７／０１６１０１７号明細書（表題「ＭＩＴＩＧＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＨＯＴＯＤＡＭＡＧＥ  ＩＮ  ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ  ＲＥＡＣＴＩＯＮＳ」、２００６年１２月１日Ｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００７／０１４１５９８号明細書（表題「Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」、２００６年１１月３日Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００７／０１３４１２８号明細書（表題「Ｕｎｉｆｏｒｍ  ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｆｏｒ  ｈｙｂｒｉｄ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｕｓｉｎｇ  ｓａｍｅ」、２００６年１１月２７日Ｋｏｒｌａｃｈによって出願）；米国特許出願公開第２００７／０１２８１３３号明細書（表題「Ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｔｏｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ」、２００５年１２月２日Ｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００７／００７７５６４号明細書（表題「Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｓｕｒｆａｃｅｓ，ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｓａｍｅ」、２００５年９月３０日Ｒｏｉｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００７／００７２１９６号明細書（表題「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ」、２００５年９月２９日Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；米国特許出願公開第２００７／００３６５１１号明細書（表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ
ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｏｕｒｃｅ」、２００５年８月１１日Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．によって出願）；およびＫｏｒｌａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｐａｓｓｉｖａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｚｅｒｏ−ｍｏｄｅ  ｗａｖｅｇｕｉｄｅ  ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ」ＰＮＡＳ  １０５（４）：１１７６−８１に記載されており、これらは全て、それらの全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。
【００３９】
一部の例において、標識ヌクレオチド塩基の少なくとも１つは、１セットの標識ヌクレオチド塩基を含む。用語「標識」または「タグ」は、本明細書中で互換的に用いられており、ヌクレオチドまたは核酸に取り付けられる任意の化学部分を指す。取付けは、共有結合性であっても非共有結合性であってもよい。好ましくは、標識は、検出可能であり、そしてヌクレオチドまたは核酸を、技術の実践者にとって検出可能とする。本明細書中に提供される技術との使用を満たす例示的な検出可能な標識として、例えば、蛍光標識、化学発光標識、クエンチャ、放射性標識、ビオチンおよび金、またはこれらの組合せが挙げられる。検出可能な標識として、発光分子、蛍光色素、蛍光クエンチング剤、着色分子（例えば、インシトゥハイブリダイゼーション（ＩＳＨ、ＦＩＳＨ）および明視野画像化（ｂｒｉｇｈｔ  ｆｉｅｌｄ  ｉｍａｇｉｎｇ）用途に使われるクロモゲン）、放射性同位元素、またはシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔｓ）が挙げられる。検出可能な標識としてはまた、任意の有用なリンカー分子（ビオチン、アビジン、ジゴキシゲニン、ストレプトアビジン、ＨＲＰ、Ａタンパク質、Ｇタンパク質、抗体またはそのフラグメント、Ｇｒｂ２、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ等）、重金属、酵素（例として、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、およびルシフェラーゼが挙げられる）、電子ドナー／アクセプタ、アクリジニウムエステル、染料およびカロリメトリック基質（ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）も挙げられる。例えば、表面プラスモン共鳴検出での使用を満たすとして、質量の変化が、検出可能な標識と考えられ得るとも想定される。
【００４０】
一部の実施形態において、標識は、染料に基づく蛍光検出可能部分を含み、染料は、キサンテン、フルオレセイン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、シアニン、クマリン、ピレン、フタロシアニン、フィコビリタンパク質、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（Ｒ）３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（Ｒ）４０５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（Ｒ）４３０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（Ｒ）４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（Ｒ）５１４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（Ｒ）５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（Ｒ）５４６、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（Ｒ）５５５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（Ｒ）５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（Ｒ）５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（Ｒ）５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（Ｒ）６１０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（Ｒ）６３３、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（Ｒ）６４７、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（Ｒ）６６０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（Ｒ）６８０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（Ｒ）７００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（Ｒ）７５０、蛍光半導体結晶またはスクアライン染料である。一部の実施形態において、タグまたは標識は、放射性同位元素、スピン標識、量子ドットまたは生物発光部分を含む。一部の実施形態において、標識は、例えばＨａｕｇｌａｎｄ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００５）ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ（１０ｔｈ  ｅｄ．）（その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載される蛍光検出可能部分である。
【００４１】
一部の実施形態において、標識（例えば、蛍光検出可能な標識）は、ＡＴＴＯ−ＴＥＣ  ＧｍｂＨ（Ａｍ  Ｅｉｃｈｅｎｈａｎｇ  ５０、５７０７６  Ｓｉｅｇｅｎ、ドイツ）から入手可能なものがあり、例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２２３６７７号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０１９０４８６号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０１７２４２０号明細書；米国特許出願公開第２００６／０１７９５８５号明細書；米国特許出願公開第２００３／０００３４８６号明細書；米国特許第７，９３５，８２２号明細書（全て参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載されている。
【００４２】
一部の実施形態において、標識ヌクレオチド塩基の少なくとも１つが、１つ以上の、放射性標識、金属標識、量子ドット、蛍光標識、発光標識、質量標識、酵素標識等を含む。特定の実施形態において、検出可能な標識は、蛍光標識等の光学的に検出可能な標識であってよい。例示的な蛍光標識（配列決定用、および／または核酸、プライマー、プローブ等の標識等の他の目的用）として、シアニン、ローダミン、フルオレセイン、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ、ａｌｅｘａまたは接合型マルチ染料が挙げられる。一部の例において、標識ヌクレオチド塩基の少なくとも１つは、光学標識を含んでよく、そして／または標識ヌクレオチド塩基の少なくとも１つは、電気化学標識を含んでよい。
【００４３】
一部の例となる系において、識別ステーションは、フローメータを含む。一部の例において、反応ステーションは、複数のヌクレオチド塩基に単一の標識を用いるものである。一部の例において、反応ステーションは、種々のヌクレオチド塩基を区別するために各ヌクレオチド塩基に異なる標識を用いるものである。一部の例において、反応ステーションは、第１、第２または第ｎの標識ヌクレオチド塩基の少なくとも１つを、単一の塩基として付加するものである。一部の例において、反応ステーションは、第１、第２または第ｎの標識ヌクレオチド塩基の少なくとも１つを、オリゴヌクレオチドとして付加するものである。一部の例において、オリゴヌクレオチドは、最大約３０のヌクレオチドを含む。
【００４４】
本明細書中に開示される一部の例となる系が、複数の核酸ターゲットを含有する多重アッセイ用の複数のマイクロトランスポンダを含む。また、本明細書中に開示される一部の例となる系が、１つ以上の増幅ステーション、反応ステーション、洗浄ステーションまたは識別ステーションを備える微流量チップデバイスを含む。
【００４５】
一部の例において、ｎの数は、実質的に配列全体の末端を表す。
【００４６】
本明細書中に開示される例となる方法が、マイクロトランスポンダ上にキャプチャされたターゲットヌクレオチド塩基の配列を、複数の配列決定反応にかけて、ターゲットヌクレオチド塩基の配列に相補的であり、かつこの配列に結合する標識ヌクレオチド塩基の配列を構築することを含む。例となる方法はまた、標識ヌクレオチド塩基の配列の各標識ヌクレオチド塩基、および標識ヌクレオチド塩基が結合されるターゲットヌクレオチド塩基の配列の各相補的ターゲットヌクレオチド塩基を、各配列決定反応の後に、そして続く配列決定反応の前に、識別することをも含む。また、例となる方法は、標識ヌクレオチド塩基の配列の各標識ヌクレオチド塩基、および標識ヌクレオチド塩基が結合されるターゲットヌクレオチド塩基の配列の各相補的ターゲットヌクレオチド塩基を、マイクロトランスポンダの識別番号と関連付けることを含む。
【００４７】
また、一部の例が、配列決定反応の前に、エマルジョンポリメラーゼ連鎖反応を介して、ターゲットヌクレオチド塩基をクローン増幅することをも含む。一部の例において、標識ヌクレオチド塩基の識別が、フローメータで標識ヌクレオチド塩基を検出することを含む。
【００４８】
また、本明細書中に開示される一部の例となる方法が、複数のヌクレオチド塩基に単一の標識を用いることをも含む。一部の例となる方法が、異なる標識を各ヌクレオチド塩基に用いて、種々のヌクレオチド塩基を区別することを含む。また、一部の例となる方法が、標識ヌクレオチド塩基を単一の塩基として付加することをも含む。また、本明細書中に開示される一部の例となる方法が、第ｎの標識ヌクレオチド塩基をオリゴヌクレオチドとして付加することを含む。一部の例となる方法が、複数のマイクロトランスポンダを、複数の核酸ターゲットを含有する多重アッセイに用いることを含む。また、一部の例となる方法が、微流量チップデバイスにおける方法の少なくとも一部を実行することをも含む。さらに、一部の例において、配列決定反応は、ターゲットヌクレオチド塩基の配列の全体が実質的に識別されるまで、繰り返される。
【００４９】
本明細書中に開示される別の例となる方法が、キャプチャプローブを介してマイクロトランスポンダの表面上に核酸ターゲットをキャプチャすること、表面上の核酸ターゲットをクローン増幅して、表面結合クローンターゲットを形成すること、および表面結合クローンターゲットを第１の重合反応または第１のライゲーション反応にかけて、核酸ターゲットの配列内の第１のヌクレオチド塩基に相補的である第１の標識ヌクレオチド塩基を付加することを含む。例となる方法はまた、第１の重合反応に由来する無関係な重合試薬または第１のライゲーション反応に由来する無関係なライゲーション試薬を取り除くこと、ならびに、マイクロトランスポンダの識別番号および第１の標識ヌクレオチド塩基の第１の標識を用いて、核酸ターゲットの配列内の第１のヌクレオチド塩基のアイデンティティおよび第１の標識ヌクレオチド塩基のアイデンティティをそれぞれ決定することを含む。さらに、例となる方法は、表面結合クローンターゲットを、続く第２から第ｎ回の重合またはライゲーション反応にかけて、核酸ターゲットの配列内の第２から第ｎのヌクレオチド塩基とそれぞれ相補的である第２から第ｎの標識ヌクレオチド塩基を順次付加することを含む。ｎの数は、核酸ターゲットの配列内のヌクレオチド塩基の数に基づく。また、例となる方法は、第２から第ｎの各標識ヌクレオチド塩基の付加後に、第２から第ｎの重合またはライゲーション試薬に由来する無関係な重合またはライゲーション試薬を取り除くこと、ならびに、第２から第ｎの各標識ヌクレオチド塩基の付加後に、マイクロトランスポンダの識別番号および第２から第ｎの標識ヌクレオチド塩基の第２から第ｎの標識を用いて、核酸ターゲットの配列内の第２から第ｎの各ヌクレオチド塩基のアイデンティティおよび第２から第ｎの各標識ヌクレオチド塩基のアイデンティティをそれぞれ決定することを含む。
【００５０】
一部の実施形態において、本明細書中で提供される技術は、方法（例えば、核酸を配列決定する方法）に関するものであり、当該方法は、マイクロトランスポンダ上にキャプチャされたターゲットヌクレオチド塩基の配列を複数の配列決定反応にかけて、ターゲットヌクレオチド塩基の配列に相補的であり、かつこの配列に結合するヌクレオチド塩基の配列を付加すること；各配列決定反応の後に、付加された各ヌクレオチド塩基を識別すること；および配列の付加された各ヌクレオチド塩基を、マイクロトランスポンダの識別番号と関連付けることを含む。一部の実施形態において、ターゲットヌクレオチド塩基は、キャプチャプローブを介してキャプチャされる。一部の実施形態において、ターゲットヌクレオチド塩基は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。一部の実施形態において、方法はさらに、ターゲットヌクレオチド塩基をクローン増幅すること（例えば、配列決定反応より前の、例えば、エマルジョンポリメラーゼ連鎖反応）を含む。一部の実施形態において、付加されるヌクレオチド塩基の少なくとも１つは、標識を含む。技術は、用いられる標識のタイプで限定されない。例えば、一部の実施形態において、付加されるヌクレオチド塩基の少なくとも１つが光学標識を含み、そして一部の実施形態において、付加されるヌクレオチド塩基の少なくとも１つが電気化学標識を含む。
【００５１】
一部の実施形態において、付加されたヌクレオチド塩基の識別は、フローメータを用いることによる、付加されたヌクレオチド塩基の検出を含む。一部の実施形態において、識別は、付加された前記塩基を、装置の反応ステーションから、前記フローメータを用いる前記装置の識別ステーションに移動させることを含む。一部の実施形態において、識別ステーションは、付加された前記塩基を検出するディテクタを含み、前記ディテクタは、１つ以上の光学信号、電気信号、および化学信号を検出する。技術は、例えば、標識またはヌクレオチドを検出するために用いられる、ディテクタおよび／または検出モードのタイプで限定されない。例えば、一部の実施形態において、付加された塩基が、蛍光、発光、ｐＨ、熱、水素イオン濃度、ピロホスフェート濃度または放射活性の変化によって検出される。さらに、一部の実施形態において、単一の標識が、付加される複数のヌクレオチド塩基に用いられ、そして一部の実施形態において、種々の複数の標識が、付加される各ヌクレオチド塩基に用いられて、付加された種々のヌクレオチド塩基を区別する。そして、一部の実施形態において、付加される塩基は、単一の塩基として付加され、そして一部の実施形態において、付加される塩基は、オリゴヌクレオチド（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５のヌクレオチドの、最大約３０のヌクレオチドを含む、例えばオリゴヌクレオチド）として付加される。
【００５２】
さらなる実施形態において、方法は、複数のマイクロトランスポンダを、複数の核酸ターゲットを含有する多重アッセイに用いることを含む。そして、一部の実施形態は、微流量チップデバイスにおける方法の少なくとも一部を実行することを含む方法を提供する。方法は、核酸の配列決定での使用を満たす；したがって、一部の実施形態において、配列決定反応は、ターゲットヌクレオチド塩基の配列の全体が実質的に識別されるまで、繰り返される。
【００５３】
付加的な実施形態が、核酸ターゲットがキャプチャプローブを介してキャプチャされることとなる表面を有するマイクロトランスポンダ；表面結合核酸ターゲットを複数の配列決定反応にかけて、ターゲットヌクレオチド塩基の配列に相補的であり、かつこの配列に結合するヌクレオチド塩基の配列を付加する反応ステーション；複数の配列決定反応に由来する無関係な配列決定試薬を取り除く洗浄ステーション；および各配列決定反応の後に、付加された各ヌクレオチド塩基を識別する識別ステーションを備える装置を提供する。一部の実施形態において、装置はさらに、表面上の核酸ターゲットをクローン増幅して、表面結合クローンターゲットを形成する増幅ステーション（例えば、一部の実施形態において、増幅ステーションは、表面結合核酸ターゲットを、続く第２から第ｎ回の配列決定反応にかけるものである）を備える。一部の実施形態において、続く第２から第ｎ回の配列決定反応は、核酸ターゲットの配列内の第２から第ｎのヌクレオチド塩基に相補的である第２から第ｎのヌクレオチド塩基を付加し、ｎは、核酸ターゲットの配列内のヌクレオチド塩基の数以下である。
【００５４】
洗浄ステーションを備える実施形態において、一部の実施形態は、洗浄ステーションが、第２から第ｎの各ヌクレオチド塩基の付加後に、第２から第ｎの配列決定反応に由来する無関係な配列決定試薬を取り除くものであることを定めている。さらに、一部の実施形態において、識別ステーションは、核酸ターゲットの配列内の第２から第ｎの各ヌクレオチド塩基のアイデンティティを決定するものである。そして、さらに、識別ステーションが、配列の付加された各ヌクレオチド塩基を、マイクロトランスポンダの識別番号と関連付ける実施形態が提供される。
【００５５】
一部の実施形態において、ヌクレオチド塩基が、標識を含む。装置は、検出に用いられる標識のタイプで限定されない。例えば、一部の実施形態において、ヌクレオチド塩基が光学標識を含み、そして一部の実施形態において、ヌクレオチド塩基が電気化学標識を含む。一部の実施形態において、反応ステーションは、単一の標識を複数のヌクレオチド塩基に用いるものである。一部の実施形態において、反応ステーションは、各ヌクレオチドに異なる標識を用いて、種々のヌクレオチド塩基を区別するものである。
【００５６】
一部の実施形態において、キャプチャプローブはＤＮＡまたはＲＮＡを含む。一部の実施形態において、核酸ターゲットはＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【００５７】
一部の実施形態において、増幅ステーションは、エマルジョンポリメラーゼ連鎖反応を用いて、核酸ターゲットをクローン増幅するものである。一部の実施形態において、識別ステーションは、フローメータを含む。一部の実施形態において、識別ステーションは、付加された各ヌクレオチド塩基を検出するディテクタを含む。
【００５８】
装置は、検出される信号のタイプで限定されない。例えば、一部の実施形態において、ディテクタが、１つ以上の光学信号、電気信号および化学信号を検出する。一部の実施形態において、ディテクタは、蛍光、発光、ｐＨ、熱、水素イオン濃度、ピロホスフェート濃度または放射活性の変化によって、付加された前記塩基を検出する。
【００５９】
一部の実施形態において、識別ステーションは、付加された前記塩基を、装置の反応ステーションから、前記フローメータを用いる前記装置の識別ステーションへ移動させる。
【００６０】
一部の実施形態において、付加される各ヌクレオチド塩基は、単一の塩基として付加され、そして一部の実施形態において、付加される各ヌクレオチド塩基は、オリゴヌクレオチド（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５のヌクレオチドの、最大約３０のヌクレオチドを含む、例えばオリゴヌクレオチド）として付加される。
【００６１】
さらなる実施形態が、複数の核酸ターゲットを含有する多重アッセイ用の複数のマイクロトランスポンダを含む装置を提供する。また、一部の実施形態が、微流量チップデバイス、例えば、１つ以上の反応ステーション、洗浄ステーションもしくは識別ステーション、および／または一部の実施形態において、増幅ステーションを備える微流量チップデバイスを含む装置を提供する。
【００６２】
装置は、ヌクレオチド配列を提供する際の使用を満たす；したがって、一部の実施形態において、ｎの数は、実質的に配列全体の末端を表す。
【００６３】
付加的な方法の実施形態が、マイクロトランスポンダ上にキャプチャされたターゲットヌクレオチド塩基の配列を、複数の配列決定反応にかけて、ターゲットヌクレオチド塩基の配列に相補的であり、かつこの配列に結合するヌクレオチド塩基の配列を付加すること；付加された各ヌクレオチド塩基を、装置の反応ステーションから、フローメータを用いる前記装置の識別ステーションへ移動させること；および各配列決定反応の後に、付加された各ヌクレオチド塩基を識別することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、方法がさらに、マイクロトランスポンダの表面上に核酸ターゲットをキャプチャすることを含み、例えば、一部の実施形態において、核酸ターゲットは、キャプチャプローブによってキャプチャされる。さらなる実施形態において、技術は、核酸ターゲットを増幅して表面結合クローンターゲットを形成することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、方法がさらに、ターゲットヌクレオチド塩基をクローン増幅することを含み、例えば一部の実施形態において、クローン増幅は、（例えば、配列決定反応の前に）エマルジョンポリメラーゼ連鎖反応を含む方法を提供する。
【００６４】
一部の実施形態において、方法は、無関係な配列決定試薬を取り除くことを含む。そして、一部の実施形態において、方法が、ターゲットヌクレオチド塩基の配列の全体が実質的に識別されるまで、配列決定反応を繰り返すことを含む。
【００６５】
一部の実施形態において、ターゲットヌクレオチド塩基は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【００６６】
技術は、一部の実施形態において、標識を含むヌクレオチドの使用を含む。例えば、一部の実施形態において、付加されるヌクレオチド塩基の少なくとも１つが、標識を含む。技術は、用いられる特定の標識で限定されない。例えば、一部の実施形態において、付加されるヌクレオチド塩基の少なくとも１つが、光学標識を含み、そして例えば、一部の実施形態において、付加されるヌクレオチド塩基の少なくとも１つが、電気化学標識を含む。一部の実施形態において、単一の標識が、付加される複数のヌクレオチド塩基に用いられ、そして一部の実施形態において、種々の複数の標識が、付加される各ヌクレオチド塩基に用いられて、付加された種々のヌクレオチド塩基を区別する。一部の実施形態において、付加される塩基は、単一の塩基として付加され、そして一部の実施形態において、付加される塩基は、オリゴヌクレオチド（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５のヌクレオチドの、最大約３０のヌクレオチドを含む、例えばオリゴヌクレオチド）として付加される。
【００６７】
一部の実施形態において、付加されたヌクレオチド塩基の識別は、フローメータを用いることによる、付加されたヌクレオチド塩基の検出を含む。一部の実施形態において、識別ステーションは、付加された前記塩基を検出するディテクタを含み、前記ディテクタは、１つ以上の光学信号、電気信号および化学信号を検出する。一部の実施形態において、付加された塩基は、蛍光、発光、ｐＨ、熱、水素イオン濃度、ピロホスフェート濃度または放射活性の変化によって検出される。
【００６８】
方法の一部の実施形態において、方法が、複数のマイクロトランスポンダを、複数の核酸ターゲットを含有する多重アッセイに用いることを含む。一部の実施形態が、微流量チップデバイス、例えば、１つ以上の反応ステーション、増幅ステーション、洗浄ステーションおよび／または識別ステーションを備える微流量チップデバイスにおける方法の少なくとも一部を実行することを含む。
【００６９】
一部の実施形態において、本明細書中で提供される技術は、方法（例えば、核酸を配列決定する方法）に関するものであり、当該方法（例えば、微流量チップデバイス上で、１つ以上の以下のステップを任意の順で実行することを含む）は、マイクロトランスポンダ（例えば、複数の核酸ターゲットを含有する多重アッセイに用いられる、例えば複数のマイクロトランスポンダ）上に（例えば、キャプチャプローブによって）キャプチャされたターゲットヌクレオチド塩基（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）の配列を、複数の配列決定反応にかけて、ターゲットヌクレオチド塩基の配列に相補的であり、かつこの配列に結合するヌクレオチド塩基の配列（例えば、標識（例えば、光学標識、電気化学標識、質量標識等）、例えば、付加される複数のヌクレオチド塩基に用いられる単一の標識、および／または付加される各ヌクレオチド塩基に用いられて、付加された種々のヌクレオチド塩基を区別する種々の複数の標識を含む）を付加すること（例えば、単一の塩基として、そして／またはオリゴヌクレオチド（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または、３５のヌクレオチドの、最大約３０のヌクレオチドを含む、例えばオリゴヌクレオチド）として、塩基を付加すること）；各配列決定反応の後に、付加された各ヌクレオチド塩基を識別すること（例えば、フローメータを用いること、例えば、付加された前記塩基を、装置の反応ステーションから、前記フローメータを用いる前記装置の識別ステーション（例えば、付加された前記塩基を検出する、例えば、蛍光、発光、ｐＨ、熱、水素イオン濃度、ピロホスフェート濃度または放射活性の変化によって、付加された塩基を検出するディテクタを含み、前記ディテクタは、１つ以上の光学信号、電気信号および化学信号を検出する）へ移動させることによって、付加されたヌクレオチド塩基を検出すること）；配列の付加された各ヌクレオチド塩基を、マイクロトランスポンダの識別番号と関連付けること；ターゲットヌクレオチド塩基をクローン増幅すること（例えば、配列決定反応より前の、例えば、エマルジョンポリメラーゼ連鎖反応）；および／またはターゲットヌクレオチド塩基の配列の全体が実質的に識別されるまで、１つ以上のステップを繰り返すことを含む。
【００７０】
付加的な実施形態が、核酸ターゲット（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）がキャプチャプローブ（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む）を介してキャプチャされることとなる表面を有するマイクロトランスポンダ（例えば、複数の核酸ターゲットを含有する多重アッセイ用の複数のマイクロトランスポンダ）；表面結合核酸ターゲットを複数の配列決定反応にかけて、ヌクレオチド塩基の配列（例えば、標識（例えば、光学標識、電気化学標識、質量標識）を含む）を付加する反応ステーション；例えば、複数のヌクレオチド塩基に用いられる単一の標識、および／または、各ヌクレオチドに用いられる異なる標識であって、ターゲットヌクレオチド塩基（例えば、単一の塩基として、そして／またはオリゴヌクレオチド（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５のヌクレオチドの、最大約３０のヌクレオチドを含む、例えばオリゴヌクレオチド）として付加される）の配列に相補的であり、かつこの配列に結合する種々のヌクレオチド塩基を区別する異なる標識；複数の配列決定反応に由来する無関係な配列決定試薬を取り除く（例えば、第２から第ｎの各ヌクレオチド塩基の付加後に、第２から第ｎの配列決定反応に由来する無関係な配列決定試薬を取り除く）洗浄ステーション；ならびに各配列決定反応の後に、付加された各ヌクレオチド塩基を識別する（例えば、核酸ターゲットの配列内の第２から第ｎの各ヌクレオチド塩基のアイデンティティを決定する；例えば、配列の付加された各ヌクレオチド塩基を、マイクロトランスポンダの識別番号と関連付ける）、そして／または付加された前記塩基を、装置の反応ステーションから、フローメータを用いる前記装置の識別ステーションへ移動させる識別ステーション（例えば、フローメータおよび／または付加された各ヌクレオチド塩基を（例えば、光学信号、電気信号および／もしくは化学信号によって、そして／または蛍光、発光、ｐＨ、熱、水素イオン濃度、ピロホスフェート濃度もしくは放射活性の変化によって）検出するディテクタを含む）；表面上の核酸ターゲットをクローン増幅して表面結合クローンターゲットを形成する（例えば、エマルジョンポリメラーゼ連鎖反応を用いて核酸ターゲットをクローン増幅する；例えば、表面結合核酸ターゲットを、続く第２から第ｎ回の配列決定反応にかける、例えば、核酸ターゲットの配列内の第２から第ｎのヌクレオチド塩基に相補的である第２から第ｎのヌクレオチド塩基を付加する（ｎは、核酸ターゲットの配列内のヌクレオチド塩基の数以下であり、そしてｎの数は、実質的に配列全体の末端を表す））増幅ステーションを備える装置（例えば、微流量チップデバイス、例えば、先に記載された１つ以上の反応ステーション、洗浄ステーション、識別ステーションおよび／または増幅ステーションを備える微流量チップデバイスを含む）を提供する。
【００７１】
履行されると、例えば、開示される例となる方法を機械に実行させる命令を有する、例となる有形の（ｔａｎｇｉｂｌｅ）機械読出し可読なストレージ媒体が、本明細書中に開示される。例となる命令が、機械に、キャプチャプローブを介してマイクロトランスポンダの表面上に核酸ターゲットをキャプチャさせ、表面上の核酸ターゲットをクローン増幅させて表面結合クローンターゲットを形成させ、そして表面結合クローンターゲットを第１の重合反応または第１のライゲーション反応にかけさせて、核酸ターゲットの配列内の第１のヌクレオチド塩基に相補的である第１の標識ヌクレオチド塩基を付加させる。例となる命令はまた、機械に、第１の重合反応に由来する無関係な重合試薬または第１のライゲーション反応に由来する無関係なライゲーション試薬を取り除かせ、そして、マイクロトランスポンダの識別番号および第１の標識ヌクレオチド塩基の第１の標識を用いて、核酸ターゲットの配列内の第１のヌクレオチド塩基のアイデンティティおよび第１の標識ヌクレオチド塩基のアイデンティティをそれぞれ決定させる。さらに、例となる命令は、機械に、表面結合クローンターゲットを、続く第２から第ｎ回の重合またはライゲーション反応にかけさせて、核酸ターゲットの配列内の第２から第ｎのヌクレオチド塩基にそれぞれ相補的である第２から第ｎの標識ヌクレオチド塩基を順次付加させる。ｎの数は、核酸ターゲットの配列内のヌクレオチド塩基の数に基づく。また、例となる命令は、機械に、第２から第ｎの各標識ヌクレオチド塩基の付加後に、第２から第ｎの重合またはライゲーション試薬に由来する無関係な重合またはライゲーション試薬を取り除かせ、そして、第２から第ｎの各標識ヌクレオチド塩基の付加後に、マイクロトランスポンダの識別番号および第２から第ｎの標識ヌクレオチド塩基の第２から第ｎの標識を用いて、核酸ターゲットの配列内の第２から第ｎの各ヌクレオチド塩基のアイデンティティおよび第２から第ｎの各標識ヌクレオチド塩基のアイデンティティをそれぞれ決定させる。
【００７２】
ここで図を参照して、図１は、本明細書中に開示される系および方法に用いられる例となるマイクロトランスポンダ１００を示す。例となるマイクロトランスポンダ１００は、例えば、シリコンを含む小さなチップベースのデバイスである。一部の例において、マイクロトランスポンダ１００は、寸法が２５０μｍ×２５０μｍ×１００μｍである。例となるマイクロトランスポンダ１００は、固有の数の識別番号またはタグ１０２を備え、これは、一部の例において、無線周波識別（ＲＦＩＤ）タグであってよい。例となるマイクロトランスポンダ１００は、例えばループアンテナ等のアンテナ１０４を備える。アンテナ１０４により、マイクロトランスポンダ１００は、識別タグ１０２に保存された、またはこれと関連付けられたマイクロトランスポンダの識別を識別デバイス（またはリーダ）に送信して、マイクロトランスポンダ１００を識別することができる。一部の例において、マイクロトランスポンダの識別は、固有の英数字コードまたは番号である。マイクロトランスポンダ１００はまた、マイクロトランスポンダ１００に結合される任意の標識ヌクレオチド塩基に内在する（ｒｅｓｉｄｅｎｔ）蛍光を検出する光電セル１０６を備え、この蛍光は、以下でより詳細に開示されるように、変換されて、デジタル方式の「イエス」または「ノー」信号として送信される。
【００７３】
例となるマイクロトランスポンダ１００は、キャプチャプローブを担持するように、表面が表面ケミストリで誘導体化されている。キャプチャプローブは、特異的な核酸配列とハイブリダイズすることができ、そして、識別されるべき核酸ターゲットをキャプチャするために用いられる。一部の例において、キャプチャプローブはＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【００７４】
例えば、未知の核酸および／もしくは潜在的に１つ以上の核酸ターゲットを含有する血液または他の体液サンプル等のサンプルが洗浄され、そうでない場合はマイクロトランスポンダ１００の表面に導入される。一部の例において、核酸ターゲットは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。一部の例において、図２の例となる系２００において示されるように、複数のマイクロトランスポンダ１００が、サンプル２０２に加えられる。例となる系２００において、複数のマイクロトランスポンダ１００は、例えば、複数の核酸ターゲットを含有する多重アッセイに用いられてよい。また、サンプル２０２およびマイクロトランスポンダ１００は、診断コンポーネントまたはデバイス２０４内で処理されるマイクロチップに（例えば、ピペットまたは他の送達機構を介して）加えられてよい。
【００７５】
例となる診断コンポーネント２０４は、いくつかのステーションを備え、これらは図２において別々のステーションとして示されているが、一体化されたコンポーネントであってもよい。診断コンポーネント２０４は、増幅ステーション２０６を備える。核酸ターゲットは、増幅ステーション２０６にて、マイクロトランスポンダ１００の表面上でクローン増幅される。一部の例において、増幅は、エマルジョンポリメラーゼ追跡（ｃｈａｓｅ）反応を通して達成される。増幅されたターゲットは、表面結合クローンターゲットを形成する。
【００７６】
例となる系２００はまた、反応ステーション２０８を備える。マイクロトランスポンダ１００は、輸送機構２１０（例えば、ロボットアーム、微流量キャピラリまたは任意の他の輸送機構が挙げられる）を通して、増幅ステーション２０６から反応ステーション２０８へ輸送され、そこで、ステーションは種々の物理的位置に配置される。反応ステーション２０８にて、表面結合クローンターゲットは、重合反応（ＳＢＳ）またはライゲーション反応（ＳＢＬ）にかけられて、第１の標識ヌクレオチド塩基を付加する。ＳＢＳまたはＳＢＬ反応中にターゲットが曝されるヌクレオチド塩基が、核酸ターゲットの配列内の第１のヌクレオチド塩基に相補的であれば、標識ヌクレオチド塩基はターゲットと結合する。したがって、キャプチャされたターゲットの第１のヌクレオチド塩基がＡであれば、標識（例えば、蛍光染色された）ＴがＡと対を形成することとなる。キャプチャされたターゲットの第１のヌクレオチド塩基としてＡを有する、サンプル中の全てのマイクロトランスポンダ１００が、そのＡに結合したＴを有する。ターゲットの第１のヌクレオチド塩基が、ＳＢＳまたはＳＢＬ反応中に示されるヌクレオチド塩基と相補的でなければ、マイクロトランスポンダ１００およびキャプチャされたターゲットは、塩基が付加されずに進む。一部の例において、付加される標識ヌクレオチド塩基は、１セットの標識ヌクレオチド塩基である。また、標識は、光学標識、蛍光色素、放射性標識および／または電気化学標識であってもよい。一部の例において、単一タイプの標識が、複数のヌクレオチド塩基に用いられる。しかしながら、他の例において、種々のタイプの標識（例えば、種々の色）が、種々のヌクレオチド塩基を区別するために用いられる。一部の例において、標識ヌクレオチド塩基が、単一の塩基として付加される。しかしながら、他の例において、標識ヌクレオチド塩基が、オリゴヌクレオチドとして付加される。オリゴヌクレオチドが、例えば約３０のヌクレオチド塩基等のいくつかのヌクレオチド塩基を含み得る。
【００７７】
例となる系２００は、重合反応に由来する任意の無関係な重合試薬またはライゲーション反応に由来する無関係なライゲーション試薬を取り除くために用いられる洗浄ステーション２１２を備える。加えられた標識ヌクレオチド塩基がターゲットの第１のヌクレオチド塩基と相補的であれば、各マイクロトランスポンダ１００に、キャプチャターゲット、および配列の、第１の相補的な標識ヌクレオチド塩基が残される。上記されたように、標識ヌクレオチド塩基が、ターゲットの第１のヌクレオチド塩基と相補的でなければ、そのようなターゲットを有するマイクロトランスポンダ１００は、ヌクレオチド塩基が付加されずに進む。
【００７８】
例となる系２００はまた、核酸ターゲットの配列内の第１のヌクレオチド塩基のアイデンティティを決定する識別ステーション２１４を備える。一部の例において、識別ステーション２１４は、アンテナ１０４によって送信される信号を読んで、例えば、標識の存在／不在を示すイエス／ノーを表すデジタル方式の１または０を検出する、フローリーダまたはメータである。一部の例において、フローリーダは、蛍光または他の色の存在または不在を検出して、反応ステーション２０８にて導入されたヌクレオチド塩基が、キャプチャされたターゲットの第１のヌクレオチド塩基に結合しているかを決定する。また、一部の例において、フローリーダは、色の強度を決定してもよい。例えば、キャプチャされたターゲットの第１の２つのヌクレオチド塩基が同じであり、そして反応ステーション２０８に導入された標識ヌクレオチド塩基が相補的であれば、導入された標識ヌクレオチド塩基の２つが、順番に（ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ターゲットに結合する。標識を有する２つのヌクレオチド塩基が結合されるので、検出可能な色の強度は、２倍になる。例えば、ターゲットが２つの順次的なＴを含有し、そして反応ステーション２０８がＡをサンプルに導入すれば、２つのＡが第１の２つのＴと結合する。識別ステーション２１４は、単一の連結Ａ塩基の蛍光の２倍であるピーク蛍光を検出する。
【００７９】
一部の例において、鎖終止（ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ）ヌクレオチドが用いられる。そのような例では、１つのヌクレオチド塩基が、ターゲット配列に相補的な塩基対として付加されると、反応が停止する。付加されたヌクレオチドは識別され、そしてプロセスは繰り返されて、続くヌクレオチド塩基が付加されてよい。これらの例において、４つのタイプのヌクレオチド塩基について４つの標識が用いられてよく、そしてサンプルは、４つ全て（または４つのいくつかの組合せ）のヌクレオチド塩基に同時に曝されてよい。種々の標識は、識別ステーション２１４によって認識されて、どのヌクレオチド塩基がどのマイクロトランスポンダ１００に付加されたかを決定することができる。
【００８０】
識別ステーション２１４はまた、アンテナ１０４から送信される、マイクロトランスポンダ１００の識別タグ１０２と関連付けられた識別またはトランスポンダ番号を検出する。ヌクレオチドの存在または不在を表すデジタル信号は、マイクロトランスポンダ番号とマッチされる。マイクロトランスポンダ番号は、反応ステーション２０８で付加された標識ヌクレオチド塩基の相補的な対に基づいて決定される、ターゲット配列の第１のヌクレオチド塩基と共に、データベース２１６内に維持される。ヌクレオチド塩基が反応ステーション２０８中に付加されていなければ、識別ステーション２１４は、マイクロトランスポンダ番号を読むが、ヌクレオチド塩基を、データベース中に保存される配列に加えない。
【００８１】
例となる系２００はまた、例えば、スクリーン、他のタイプのディスプレイおよび／または任意の適切な通信デバイスであってよいアウトプットインターフェース２１８を備える。アウトプットインターフェース２１８は、ヌクレオチド塩基が検出されるに従い、ターゲット配列のヌクレオチド塩基を示すのに用いられてよい。したがって、系２００の操作者が、ターゲット配列の検出および識別をリアルタイムで見ることができる。
【００８２】
マイクロトランスポンダ１００が識別ステーション２１４を通って送られた後、マイクロトランスポンダ１００は、第２の導入されたヌクレオチド塩基と混合するために、反応ステーション２０８に戻る。輸送機構２１０は、マイクロトランスポンダ１００を輸送して反応ステーション２０８へ戻すために用いられてよい。付加的なヌクレオチド塩基が、サンプルに導入される。第１のヌクレオチド塩基が、第１の反応の標識ヌクレオチド塩基と結合したならば、ターゲットの第２のヌクレオチド塩基は、相補的であれば、付加的な標識ヌクレオチドと結合する。ターゲットの第１のヌクレオチド塩基が、第１の反応中に第１の標識ヌクレオチド塩基と結合しなかったならば、第２の反応の第２の標識ヌクレオチド塩基は、相補的であれば、ターゲットの第１のヌクレオチド塩基と結合し得る。第１の反応における第１の標識ヌクレオチド塩基のうちの２つが、第１の反応中にターゲットの第１の２つのヌクレオチド塩基と結合するならば（鎖終止ヌクレオチドが用いられなかった場合）、第２の反応の第２の標識ヌクレオチド塩基は、相補的であれば、ターゲットの第３のヌクレオチド塩基と結合し得る。すなわち、反応ステーション２０８での第２のＳＢＳまたはＳＢＬ反応中に、第２のタイプの標識ヌクレオチド塩基が導入され、そして、加えられた標識ヌクレオチド塩基に相補的であれば、鎖内の隣のヌクレオチド塩基（そのヌクレオチド塩基が第１、第２、第３等であるかどうかにかかわらない）にてターゲット配列に結合する。したがって、ターゲット配列の鎖および相補的な塩基対が、生じ始める。
【００８３】
洗浄ステーション２１２および識別ステーション２１４での操作は繰り返されて、ターゲットの鎖内の隣の配列は、識別され、データベース２１６中に保存され、そしてアウトプットインターフェース２１８を介して操作者に示される。マイクロトランスポンダ１００は、ここでも、さらに別の付加的な標識ヌクレオチド塩基の導入のために、反応ステーション２０８中に再導入される。プロセスは、ターゲット配列が識別されるまで、一連のステーション２０８、２１２、２１４を通して何回も（例えば、ｎ回）続く。サイクル数ｎは、核酸ターゲットの配列内のヌクレオチドの数に基づいてよい。一部の例において、操作が繰り返される回数ｎは、実質的に配列全体の末端に対応してよい。
【００８４】
核酸配列を識別する例となる系２００を実施する例となる方法が、図２において示されているが、図２において示される１つ以上の要素、プロセスおよび／またはデバイスは、組み合わされても、分割されても、再配置されても、省略されても、除外されても、そして／または他の任意のやり方で実施されてもよい。さらに、１つ以上の例となるマイクロトランスポンダ１００、例となる診断コンポーネント２０４、例となる増幅ステーション２０６、例となる反応ステーション２０８、例となる洗浄ステーション２１２、例となる識別ステーション２１４、例となるデータベース２１６、例となるアウトプットインターフェース２１８、ならびに／または、より一般的に、図１および図２の例となる系２００の１つ以上の部分は、ハードウェア、ソフトウェア、ファームウェア、ならびに／またはハードウェア、ソフトウェアおよび／もしくはファームウェアの任意の組合せによって、実施されてよい。したがって、例えば、１つ以上の例となるマイクロトランスポンダ１００、例となる診断コンポーネント２０４、例となる増幅ステーション２０６、例となる反応ステーション２０８、例となる洗浄ステーション２１２、例となる識別ステーション２１４、例となるデータベース２１６、例となるアウトプットインターフェース２１８、ならびに／または、より一般的に、図１および図２の例となる系２００の１つ以上の任意の部分は、１つ以上の回路、プログラマブルプロセッサ、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、プログラマブル論理デバイス（ＰＬＤ）、および／またはフィールドプログラマブル論理デバイス（ＦＰＬＤ）等によって、実施されてよい。さらになお、図２の例となる系２００は、１つ以上の要素、プロセス、および／もしくはデバイスを、図２に示されるものに加えて、もしくはそれらの代わりに備えてよく、そして／または、示される要素、プロセスおよびデバイスのいずれか、もしくは全てのうちの２つ以上を備えてよい。
【００８５】
図１および図２の装置および系を実施する、例となる方法を表すフローチャートが、図３および図４において示される。この例において、方法は、図５に関連して以下で議論される、例となるコンピュータ５００において示されるプロセッサ５１２等のプロセッサによる履行用プログラムを用いて、実施されてよい。プログラムは、ＣＤ−ＲＯＭ、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、ブルーレイディスク、またはプロセッサ５１２が伴うメモリ等の有形のコンピュータ読出し可能な媒体に保存されたソフトウェアで実現されてよいが、代わりに、プログラムの全体および／もしくはその部分が、プロセッサ５１２以外のデバイスによって履行されてもよいし、そして／またはファームウェアもしくは専用のハードウェアで実現されてもよい。さらに、例となるプログラムは、図３および図４において示されるフローチャートを参照して記載されているが、代わりに、例となる系２００を実施する他の多くの方法が用いられてよい。例えば、ブロックの履行の順序が変えられてもよいし、および／または記載されるブロックの一部が変えられてもよいし、除外されてもよいし、組み合わされてもよい。
【００８６】
先に述べられたように、図３および図４の例となるプロセスまたは方法は、情報が任意の期間（例えば、長時間、常時、短いインスタンス（ｂｒｉｅｆ  ｉｎｓｔａｎｃｅ）、一時的なバッファリングの間および／または情報のキャッシングの間）保存されるハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、読出し専用メモリ（ＲＯＭ）、コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、キャッシュ、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）および／または任意の他のストレージ媒体等の有形のコンピュータ読出し可能な媒体に保存されるコード化された命令（例えば、コンピュータ読出し可能な命令）を用いて実施されてよい。本明細書中で用いられる用語、有形のコンピュータ読出し可能な媒体は、任意のタイプのコンピュータ読出し可能なストレージを含み、かつ信号の伝播を除くように、明示的に定義される。加えて、または代わりに、図３および図４の例となる方法は、情報が任意の期間（例えば、長時間、常時、短いインスタンス、一時的なバッファリングの間および／または情報のキャッシングの間）保存されるハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、読出し専用メモリ、コンパクトディスク、デジタル多用途ディスク、キャッシュ、ランダムアクセスメモリおよび／または任意の他のストレージ媒体等の非一過性の（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｉｔｏｒｙ）コンピュータ読出し可能な媒体に保存されるコード化された命令（例えば、コンピュータ読出し可能な命令）を用いて実施されてよい。本明細書中で用いられるように、句「少なくとも」は、請求項のプリアンブルにおいて移行語（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｔｅｒｍ）として用いられる場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」がオープンエンドであるのと同様に、オープンエンドである。したがって、移行語として「少なくとも」をプリアンブルにおいて用いる請求項は、請求項で明示的に列挙される要素の他に、要素を含んでよい。
【００８７】
図３は、核酸を配列決定する方法３００を示す。例となる方法３００は、例えば、マイクロトランスポンダ（例えば、図１のマイクロトランスポンダ１００）の表面上への、ターゲット核酸配列のキャプチャ（ブロック３０２）を含む。例となる方法３００はまた、例えば、（例えば、図２の増幅ステーション２０６での）ポリメラーゼ連鎖反応を介して、ターゲット核酸配列を増幅すること（ブロック３０４）を含む。
【００８８】
また、例となる方法３００は、例えば、標識ヌクレオチド塩基等の加えられたヌクレオチド塩基との、ターゲット配列の反応（ブロック３０６、ブロック３０８）を含む。反応は、例えばＳＢＳ等の重合反応（ブロック３０６）であってもよいし、例えばＳＢＬ等のライゲーション反応（ブロック３０８）であってもよい。反応は、例えば、図２の反応ステーション２０８にて起こり得る。先に開示されるように、反応により、標識ヌクレオチド塩基が、ターゲット核酸配列のヌクレオチド塩基と結合して、ターゲット核酸鎖の隣の塩基対を形成することができる。反応が重合反応である場合、例となる方法３００は、無関係な重合試薬を取り除くこと（ブロック３１０）を含み、そして反応がライゲーション反応である場合、例となる方法３００は、無関係なライゲーション試薬を取り除くこと（ブロック３１２）を含む。無関係な試薬の除去は、例えば、図２の洗浄ステーション２１２にて起こり得る。
【００８９】
例となる方法３００はまた、ターゲット配列内のヌクレオチド塩基を識別すること（ブロック３１４）を含む。識別は、付加されたヌクレオチド塩基の検出された標識、および識別／マイクロトランスポンダ番号に基づいて、どのヌクレオチド塩基がどのマイクロトランスポンダ表面に付加されたかを決定する。塩基対形成の制限的な性質（各タイプのヌクレオチド塩基が、１タイプのヌクレオチド塩基とのみ結合する）のため、どのヌクレオチド塩基がマイクロトランスポンダに付加されたかを知ることが、ターゲット核酸配列内のヌクレオチド塩基の識別に至る。記録が（例えば、図２の例となるデータベース２１６中に）維持されて、どのヌクレオチド塩基が、ターゲット配列のどの鎖に付加されているかをチャートにすることができ、そしてどのヌクレオチド塩基が付加されているかの結果は、操作者にリアルタイムに、すなわち、付加されたヌクレオチド塩基およびターゲット配列の塩基対の鎖が構築されるに従い、示され得る。
【００９０】
例となる方法３００は、ターゲット内に付加的なヌクレオチド塩基が付加されるべきかを決定する（ブロック３１６）。付加的なヌクレオチド塩基が配列にあれば、例となる方法３００は、ボック３０６（重合用）またはブロック３０８（ライゲーション用）のいずれかでの反応に戻る。例となる方法３００は、配列内の隣のヌクレオチドを付加し、かつ識別し続ける。方法３００は、ターゲット配列の全てまたは実質的に全てが識別されるまで、必要に応じてｎ回繰り返される。続いて、もはやヌクレオチド塩基が配列になければ（ブロック３１６）、例となるプロセスは終わる（ブロック３１８）。方法３００のエンドにて、ターゲット核酸の全てまたは実質的に全てが識別されている。
【００９１】
図４は、核酸を配列決定する別の例となる方法４００を示す。例となる方法４００は、１つ以上のマイクロトランスポンダ上にキャプチャされたターゲットヌクレオチド塩基の配列がかけられる複数の配列決定反応（ブロック４０２）を含む。この例において、マイクロトランスポンダは、例えば、図１および図２のマイクロトランスポンダ１００であってよい。また、配列決定反応は、例えば、先に開示されるように、ＳＢＳであってもＳＢＬであってもよく、そして、例えば、図２の反応ステーション２０８にて起こり得る。例となる方法４００において、配列決定反応は、ターゲットヌクレオチド塩基の配列に相補的であり、かつこの配列に結合する標識ヌクレオチド塩基の配列を構築する。
【００９２】
例となる方法４００はまた、標識ヌクレオチド塩基の配列の各標識ヌクレオチド塩基（すなわち、付加された標識ヌクレオチド塩基）、および各配列決定反応の後に標識ヌクレオチド塩基が結合されるターゲットヌクレオチド塩基の配列の相補的な各ターゲットヌクレオチド塩基を識別すること（ブロック４０４）を含む。例となる方法４００の識別部分はまた、マイクロトランスポンダの識別番号を読む（ブロック４０４）。この例では、ブロック４０４での識別は、図２の識別ステーション２１４において起こり得、そしてマイクロトランスポンダの識別番号は、図１のマイクロトランスポンダ１００の識別タグ１０２から読まれ得る。また、標識ヌクレオチド塩基の配列の各標識ヌクレオチド塩基、および標識ヌクレオチド塩基が結合されるターゲットヌクレオチド塩基の配列の相補的な各ターゲットヌクレオチド塩基が、マイクロトランスポンダの識別番号と関連付けられ得る。識別は、先に開示されるように、操作者へアウトプットされ得る。
【００９３】
図４の例となる方法４００はまた、付加的なターゲットヌクレオチド塩基が配列にあるかを決定する（ブロック４０６）。付加的なターゲットヌクレオチド塩基が配列にあれば、制御により、続く配列決定反応のブロック４０２に戻って、付加的な標識ヌクレオチド塩基を付加する。続いて、方法４００は、続く識別（ブロック４０４）を通して続く。一部の例において、付加された各標識ヌクレオチド塩基が、続くそれぞれの配列決定反応間で識別される。付加的なターゲットヌクレオチド塩基が配列になければ（ブロック４０６）、例となる方法は終わる（ブロック４０８）。
【００９４】
図５は、図３および図４の方法を履行して、図２の系２００を実施することができる例となるコンピュータ５００のブロック図である。コンピュータ５００は、例えば、サーバ、パーソナルコンピュータ、または他の任意のタイプのコンピューティングデバイスであってよい。
【００９５】
実例（ｉｎｓｔａｎｔ  ｅｘａｍｐｌｅ）のコンピュータ５００は、プロセッサ５１２を備える。例えば、プロセッサ５１２は、任意の所望のファミリまたは製造者から、１つ以上のマイクロプロセッサまたはコントローラによって実施されてよい。
【００９６】
プロセッサ５１２は、ローカルメモリ５１３（例えば、キャッシュ）を備え、そして揮発性メモリ５１４および不揮発性メモリ５１６を含むメインメモリと、バス５１８を介して通信する。揮発性メモリ５１４は、同期ダイナミックランダムアクセスメモリ（ＳＤＲＡＭ）、ダイナミックランダムアクセスメモリ（ＤＲＡＭ）、ＲＡＭＢＵＳダイナミックランダムアクセスメモリ（ＲＤＲＡＭ）および／または任意の他のタイプのランダムアクセスメモリデバイスによって実施されてよい。不揮発性メモリ５１６は、フラッシュメモリ、および／または任意の他の所望のタイプのメモリデバイスによって実施されてよい。メインメモリ５１４、５１６へのアクセスは、メモリコントローラによって制御される。
【００９７】
コンピュータ５００はまた、インターフェース回路５２０を備える。インターフェース回路５２０は、イーサネット（登録商標）インターフェース、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）および／またはＰＣＩ  ｅｘｐｒｅｓｓインターフェース等の任意のタイプのインターフェース規格によって実施されてよい。
【００９８】
１つ以上のインプットデバイス５２２が、インターフェース回路５２０に接続される。インプットデバイス５２２により、ユーザは、データおよびコマンドをプロセッサ５１２に入力することができる。インプットデバイスは、例えば、キーボード、マウス、タッチスクリーン、トラックパッド、トラックボール、アイソポイント（ｉｓｏｐｏｉｎｔ）および／または音声認識系によって実施されてよい。
【００９９】
また、１つ以上のアウトプットデバイス５２４が、インターフェース回路５２０に接続される。アウトプットデバイス５２４は、例えば、ディスプレイデバイス（例えば、液晶ディスプレイ、ブラウン管ディスプレイ（ＣＲＴ）、プリンタおよび／またはスピーカ）によって実施されてよい。したがって、インターフェース回路５２０は一般的に、グラフィックスドライバカードを備える。
【０１００】
インターフェース回路５２０はまた、モデムまたはネットワークインターフェースカード等の通信デバイスを備えて、外部のコンピュータとのデータ交換を、ネットワーク５２６（例えば、イーサネット接続、デジタル加入者回線（ＤＳＬ）、電話線、同軸ケーブル、携帯電話系等）を介して促進する。
【０１０１】
コンピュータ５００はまた、ソフトウェアおよびデータを保存する１つ以上の質量ストレージデバイス５２８を備える。そのような質量ストレージデバイス５２８の例として、フロッピーディスクドライブ、ハードドライブディスク、コンパクトディスクドライブおよびデジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）ドライブが挙げられる。
【０１０２】
図５のコード化された命令５３２は、質量ストレージデバイス５２８、揮発性メモリ５１４、不揮発性メモリ５１６、および／またはＣＤもしくはＤＶＤ等のリムーバブル記憶媒体に保存されてよい。
【０１０３】
前述のことから、先に開示された方法、装置、系および製造品は、例えば、病原体または遺伝的疾患のＤＮＡに関連する、疾患の診断に用いられ得る配列等の、未知の核酸配列を識別するために用いられてよいことが理解されよう。ここで開示される例は、複数のターゲットの核酸配列を、速いスループット速度にて、低いプロセシングおよびストレージ要件で、同時に決定するために用いられ得る。また、本明細書中に開示される例は、核酸が配列決定されるに従い、未知のターゲットのリアルタイム識別を操作者に提供する。
【０１０４】
ある例となる方法、装置および製造品が本明細書中に記載されてきたが、本特許の適用範囲は、これらに限定されない。反対に、本特許は、特許請求の範囲内に適正に入る方法、装置および製造品を全て包含する。
【図１】
2019054805.tif 000003
【図２】
2019054805.tif 000004
【図３】
2019054805.tif 000005
【図４】
2019054805.tif 000006
【図５】
2019054805.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月11日(2018.12.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロトランスポンダ上にキャプチャされたターゲットヌクレオチド塩基の配列を、複数の配列決定反応にかけて、ターゲットヌクレオチド塩基の配列に相補的であり、かつこの配列に結合するヌクレオチド塩基の配列を付加することと、
各配列決定反応の後に、付加された各ヌクレオチド塩基を識別することと、
配列の付加された各ヌクレオチド塩基を、マイクロトランスポンダの識別番号と関連付けることと
を含む、方法。
【外国語明細書】
2019054805000001.pdf