(57)【要約】      （修正有）【課題】プロトロンビンの吸着剤として所与のＢａＳＯ４試薬を用いてプロトロンビンの供給源からトロンビンを生産するための方法、並びにトロンビンの調製で用いる所与のＢａＳＯ４試薬の適合性を評価するための方法の提供。【解決手段】所与のＢａＳＯ４試薬のサンプルとプロトロンビンの供給源とを接触させてＢａＳＯ４吸着プロトロンビンを得ることと、続いてＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含む方法。凝血促進活性の評価では、正常な哺乳類血漿の凝血促進活性に対して評価する工程を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロトロンビンの吸着剤として所与のＢａＳＯ４試薬を使用してプロトロンビンの供給源からトロンビンを調製するための方法であって、
ａ．前記所与のＢａＳＯ４試薬及び前記プロトロンビンの供給源を準備することと、
ｂ．前記所与のＢａＳＯ４試薬によって前記プロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、前記所与のＢａＳＯ４試薬のサンプルと前記プロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりＢａＳＯ４吸着プロトロンビンを得ることと、
ｃ．前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、
ｄ．プロトロンビン吸着を可能にする条件下で好適なＢａＳＯ４と前記プロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりＢａＳＯ４吸着プロトロンビンを得ることと、
ｅ．溶出緩衝液を使用して、前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンから、プロトロンビン含有画分を溶出することと、
ｆ．前記溶出したプロトロンビン含有画分を、プロトロンビンのトロンビンへの変換を可能にする条件下におき、これによりトロンビンを得ることと、を含む、方法。
【請求項２】
プロトロンビンの供給源からのトロンビンの調製において、プロトロンビン吸着剤として使用するための所与のＢａＳＯ４試薬の適合性を評価するための方法であって、
ａ．前記所与のＢａＳＯ４試薬及び前記プロトロンビンの供給源を準備することと、
ｂ．前記所与のＢａＳＯ４試薬によって前記プロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、前記所与のＢａＳＯ４試薬のサンプルと前記プロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりＢａＳＯ４吸着プロトロンビンを得ることと、
ｃ．前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含む、方法。
【請求項３】
前記凝血促進活性を評価することが、凝血促進アッセイを実行することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記凝血促進アッセイが、機能アッセイを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記機能アッセイが、凝固アッセイである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記凝固アッセイが、ＮＡＰＴＴアッセイ、ＡＰＴＴアッセイ、及びプロテアーゼ発色アッセイからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記プロトロンビンの供給源が、血漿、又は血漿画分からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記血漿が、シュウ酸塩添加血漿を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記プロトロンビンの供給源が、哺乳類から採取された血漿を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳類が、ヒト、ウマ、ウシ、及びブタからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記所与のＢａＳＯ４試薬によって前記プロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする前記条件が、ｐＨ７．４〜８．６を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記所与のＢａＳＯ４試薬のサンプルと前記プロトロンビンの供給源とを接触させることが、１％（ｗ／ｖ）のＢａＳＯ４試薬を前記プロトロンビンの供給源である前記採取された血漿に追加することを含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性を評価することが、前記ＢａＳＯ４試薬に吸着される間の前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
「ｂ」の後かつ「ｃ」の前に、前記ＢａＳＯ４試薬から前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンのうち少なくともいくらかを溶出することを更に含み、
前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性を評価することが、前記溶出したＢａＳＯ４吸着プロトロンビンのうち少なくともいくらかの凝血促進活性を評価することである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンから前記プロトロンビン含有画分を溶出することが、６．３〜７．４のｐＨでのカルシウムキレート塩の使用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記カルシウムキレート塩が、クエン酸ナトリウムを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記クエン酸ナトリウムの濃度が、３％（ｗ／ｖ）〜４．４％（ｗ／ｖ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記プロトロンビンの供給源が、ブタ血漿を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
１つを超えるＢａＳＯ４試薬を評価するとき、好適なＢａＳＯ４試薬が、プロトロンビンの吸着について選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トロンビン生産の分野、より具体的には、トロンビンの調製においてプロトロンビン吸着剤として使用するための所与のＢａＳＯ４試薬の適合性を評価するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トロンビンは、フィブリノゲンのフィブリンへの変換を触媒することによって血液凝固を促進するセリンプロテアーゼである。トロンビンはまた、血小板の活性化の原因、並びにそれ自体の生産の調節及び複数のタンパク質分解フィードバック機構を介した抑制の間接的な原因でもある。トロンビンはまた、血漿第ＶＩＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、及びプロテインＣの活性化にも関与している。トロンビンは、フィブリノゲンのフィブリンへの変換によって創傷の出血を止めるための凝固因子として臨床用途において広く使用されている。トロンビンは、縫合剤の共通成分であり、フィブリン糊、接着剤、及び封止剤などの２成分性止血系においてフィブリノゲン及びその他の凝固タンパク質と組み合わせて使用されてきた。
【０００３】
トロンビンは、前駆体（酵素原）プロトロンビンのタンパク質分解活性によって生成される。トロンビンの生産に関しては、プロトロンビンを、中間産物を生成する２つの部位で切断する必要がある。体内におけるプロトロンビンのトロンビンへの変換は、活性化した第Ｘ因子及び第Ｖ因子を含み、カルシウムイオンの存在下で負に帯電したリン脂質膜上に会合する、プロトロンビナーゼ複合体によって触媒される。
【０００４】
トロンビンは、プロトロンビンの供給源（血漿又は血液画分など）を、プロトロンビンの供給源からプロトロンビンを吸着できる固体吸着剤、例えば、硫酸バリウム（ＢａＳＯ４）と接触させることによってプロトロンビンから製造され得る。固体吸着剤は、非結合タンパク質などの汚染物質を除去するために、通常、洗浄液を使用して洗浄され、続いて、溶離液を使用してプロトロンビンをそこから溶出する。追加的な任意の精製及び処理工程の後で、溶出されたプロトロンビンを、例えばカルシウムイオンなどの活性化剤を使用した活性化によってトロンビンに変換することができる。
【０００５】
異なるＢａＳＯ４試薬（異なる製造業者から入手したＢａＳＯ４試薬又は更には特定の製造業者によって生産された試薬の異なるバッチなど）を使用すると、一定量のプロトロンビンの供給源からのトロンビンの収率に有意差が見られることが報告されている。
【０００６】
報告では、トロンビン収率の差は、少なくとも部分的に、異なるＢａＳＯ４試薬によるプロトロンビンの吸着の変化に起因すること、及び吸着容量は、プロトロンビン吸着のためのＢａＳＯ４試薬の選択において重要な要素であることが提唱されてきた。Ｓｕｒｇｅｎｏｒ及びＮｅｏｒｔｋｅｒ（１９５２）は、特定のＢａＳＯ４試薬が、血漿からのプロトロンビンの吸着において他のものよりも効果があると述べ、更にＶｏｓｓ  Ｄ．（１９６５）は、プロトロンビン複合体の吸着に異なるＢａＳＯ４試薬を使用するとき、同じ量のプロトロンビン（prothormbin）複合体を吸着するのに必要なＢａＳＯ４の量に有意差が見られたと指摘し、このことは、それらの結晶構造の違いのためであったと推測した。しかし、本出願人の場合は、ＢａＳＯ４の異なるバッチの形態を試験して、有意差は判定されなかった。また一部のイオン（例えば、Ｃａ２＋）は、異なるＢａＳＯ４バッチでの異なる吸着量に寄与することが報告されており、この場合には、ＢａＳＯ４の異なるバッチにおけるＣａ２＋の存在もそれほど差がなかった。
【０００７】
トロンビン製造業者らは、複数の異なるＢａＳＯ４試薬の中から好適なＢａＳＯ４試薬を選択する試行錯誤法に頼ることによってトロンビン収率を増加させようと試みている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、プロトロンビンの吸着剤として所与のＢａＳＯ４試薬を用いてプロトロンビンの供給源からトロンビンを生産するための方法、並びに所与のＢａＳＯ４試薬とプロトロンビンの供給源を接触させてＢａＳＯ４吸着プロトロンビンを得ること、及びいくつかの実施形態においては正常な哺乳類血漿の凝血促進活性に対するＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することによって、トロンビンの調製に用いる所与のＢａＳＯ４試薬の適合性を評価するための方法に関する。
【０００９】
接触は、本明細書において広義に使用され、結合相互作用がＢａＳＯ４と供給源内のプロトロンビンとの間で生じるような、例えば、プロトロンビンの供給源をＢａＳＯ４に十分に近接させる、任意のタイプの結合作用を指す。接触には、混合、混和、及び／又はＢａＳＯ４への供給源の添加、若しくは供給源へのＢａＳＯ４の添加が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１０】
本発明では、意外にも、いくつかのＢａＳＯ４試薬とのプロトロンビンの接触が、トロンビンへの変換（すなわち、プロトロンビンのその中間生成物及び／又はトロンビンへの変換）を引き起こすことがわかった。これは、生産工程の終了時でトロンビン収率に支障を来す早期変換であることがわかった。
【００１１】
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、凝血促進活性は、プロトロンビンのその中間生成物及び／又はトロンビンへの変換に続いて発生する。そのような中間生成物は、プロトロンビンのトロンビンへのタンパク質分解変換中に形成され得る。中間生成物の非限定的な例は、プレトロンビン及びメイゾトロンビンである。
【００１２】
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態は、プロトロンビン吸着剤としての使用に好適なＢａＳＯ４試薬を、好ましくは、実規模のトロンビン生産プロセスの一部として所与のＢａＳＯ４試薬を吸着剤として使用する前に、特定できるようにする。
【００１３】
具体的には、いくつかの実施形態において、所与のＢａＳＯ４試薬のサンプルは、ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンを得るために、プロトロンビンの供給源と接触してそこからプロトロンビンを吸着し、続いて、ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性が評価される。典型的には、ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性が低いほど、所与のＢａＳＯ４試薬がプロトロンビン吸着剤としての使用により好適である。いくつかの実施形態において、トロンビンを調製するためのプロセスでプロトロンビン吸着剤として使用するための所与のＢａＳＯ４試薬の適合性は、ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性が正常な哺乳類血漿（例えば、正常なヒト血漿）の凝血促進活性以下であることによって示される。
【００１４】
ヒト血漿などの正常な哺乳類血漿は、様々な凝固試験で較正血漿として使用することを意図した、周知のプール又は単一ドナーの血漿製剤である。
【００１５】
正常なヒト血漿は、クエン酸カリウム若しくはクエン酸ナトリウム、又はその両方の溶液を加えた、例えば８人又はそれ以上の健康な成人からの全血の液体部分をプールすることによって、並びにそれを紫外線に露出して細菌性及びウイルス性の汚染物質を破壊することによって得られる無菌血漿であり得る。
【００１６】
正常なヒト血漿は、Ｕｎｉｃａｌｉｂｒａｔｏｒ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｐｌａｓｍａ  ｆｏｒ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔｓ  ００６２５であり得る。
【００１７】
少なくともいくつかの場合において、本明細書に記載される方法は、試行錯誤による好適なＢａＳＯ４試薬の選択の必要性を排除する。
【００１８】
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態は、使用するのに迅速かつ簡便であり、時間及び／又は生産コストの節約を潜在的にもたらす。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態は、所与のプロトロンビンの供給源からのトロンビンの収率の増加を可能にする。
【００１９】
本発明の態様及び実施形態は、以下の本明細書に、及び添付の請求項に記載されている。
【００２０】
本明細書に記載されるいくつかの実施形態の態様によると、プロトロンビンの吸着剤として所与のＢａＳＯ４試薬を使用してプロトロンビンの供給源からトロンビンを調製するための方法であって、
ａ．所与のＢａＳＯ４試薬及びプロトロンビンの供給源を準備することと、
ｂ．所与のＢａＳＯ４試薬によってプロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、所与のＢａＳＯ４試薬のサンプルとプロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりＢａＳＯ４吸着プロトロンビンを得ることと、
ｃ．ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含み、
ｃ．の評価がＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性と正常な哺乳類血漿の凝血促進活性とを比較することにより行われるとき、トロンビンの調製に使用するための所与のＢａＳＯ４試薬の適合性は、ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性が正常な哺乳類血漿の凝血促進活性以下であることによって示される、方法が提供される。
【００２１】
更なる態様によると、プロトロンビンの吸着剤として所与のＢａＳＯ４試薬を使用してプロトロンビンの供給源からトロンビンを調製するための方法であって、上記工程ａ〜ｃを含み、
ｄ．プロトロンビン吸着を可能にする条件下で好適なＢａＳＯ４とプロトロンビンの供給源とを接触させることと、
ｅ．溶出緩衝液を使用して、ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンから、プロトロンビン含有画分を溶出することと、
ｆ．溶出した画分を、プロトロンビンのトロンビンへの変換を可能にする条件下におき、これによりトロンビンを得ることと、を更に含む方法が、提供される。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本方法は、工程「ｅ」に続いて、溶出した画分を採取することを含む。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本方法は、プロトロンビンのトロンビンへの早期変換を実質的に回避する。「プロトロンビンからトロンビンへの早期変換」は、工程「ｄ」でのプロトロンビンのトロンビンへの変換を意味する。
【００２４】
多くの場合、本明細書に開示されるような「溶出」という用語は、「脱着」という用語と交換可能である。
【００２５】
一実施形態において、トロンビンの調製におけるＢａＳＯ４へのプロトロンビン吸着を可能にする条件は、ｐＨ７．４〜８．６及び／又は約１％〜２２％（ｗ／ｖ）、例えば約１％の濃度範囲のＢａＳＯ４を含む。
【００２６】
一実施形態において、トロンビンの調製中の溶出緩衝液は、クエン酸ナトリウムなどのカルシウムキレート塩を、例えば、３．０〜４．４％（ｗ／ｖ）の濃度で含み、かつ／又は６．３〜７．４のｐＨを有する。
【００２７】
一実施形態において、プロトロンビンのトロンビンへの変換を可能にする条件は、プロトロンビンにカルシウムイオンなどの活性化剤を施すことを含む。
【００２８】
本明細書に記載されるいくつかの実施形態の更なる態様によると、プロトロンビンの供給源からトロンビンの調製に使用するための所与のＢａＳＯ４試薬の適合性を評価するための方法であって、
ａ．所与のＢａＳＯ４試薬及びプロトロンビンの供給源を準備することと、
ｂ．プロトロンビンの供給源から所与のＢａＳＯ４試薬へのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、所与のＢａＳＯ４試薬のサンプルとプロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりＢａＳＯ４吸着プロトロンビンを得ることと、
ｃ．ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含み、
ｃ．の評価がＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性と正常な哺乳類血漿の凝血促進活性とを比較することにより行われるとき、トロンビンの調製に使用するための所与のＢａＳＯ４試薬の適合性は、ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性が正常な哺乳類血漿の凝血促進活性以下であることによって示される、方法が提供される。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、プロトロンビン吸着剤として所与のＢａＳＯ４試薬を使用してプロトロンビンの供給源からトロンビンを調製するための方法であって、
ａ．所与のＢａＳＯ４試薬及びプロトロンビンの供給源を準備することと、
ｂ．所与のＢａＳＯ４試薬によってプロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、所与のＢａＳＯ４試薬のサンプルとプロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりＢａＳＯ４吸着プロトロンビンを得ることと、
ｃ．ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、トロンビンを調製するためのプロセスでプロトロンビン吸着剤として使用するための所与のＢａＳＯ４試薬の適合性は、ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性が正常な哺乳類血漿の凝血促進活性以下であることによって示される。いくつかの実施形態において、ｃ．の評価は、ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性を正常な哺乳類血漿の凝血促進活性と比較することにより行われる。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、プロトロンビンの供給源からのトロンビンの調製において、プロトロンビン吸着剤として使用するための所与のＢａＳＯ４試薬の適合性を評価するための方法であって、
ａ．所与のＢａＳＯ４試薬及びプロトロンビンの供給源を準備することと、
ｂ．所与のＢａＳＯ４試薬によってプロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、所与のＢａＳＯ４試薬のサンプルとプロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりＢａＳＯ４吸着プロトロンビンを得ることと、
ｃ．ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、トロンビンを調製するためのプロセスでプロトロンビン吸着剤として使用するための所与のＢａＳＯ４試薬の適合性は、ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性が正常な哺乳類血漿の凝血促進活性以下であることによって示される。いくつかの実施形態において、ｃ．の評価は、ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性を正常な哺乳類血漿の凝血促進活性と比較することにより行われる。
【００３１】
本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、凝血促進活性を評価することは、凝血促進アッセイを実行することを含む。
【００３２】
本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、凝血促進アッセイは、凝固アッセイ（例えば、ＮＡＰＴＴアッセイ、ＡＰＴＴアッセイ）、プロテアーゼ発色アッセイ又は表示アッセイ（例えば、イムノアッセイ）からなる群から選択される機能アッセイなどの機能アッセイを含む。
【００３３】
いくつかの実施形態において、ＮＡＰＴＴ比が０．８以上である溶出液を生じたＢａＳＯ４試薬は、トロンビンの調製において使用するのに好適であると考えられた。
【００３４】
いくつかの実施形態において、ＮＡＰＴＴ比が０．８以下である溶出液を生じる又は凝塊が直ちに目視観察される（カルシウムの添加時に、かつ凝固時間が凝固剤測定機で記録可能になるまでに発生する凝固）ＢａＳＯ４試薬は、トロンビンの調製において使用するのに好適ではないと考えられる。
【００３５】
本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、プロトロンビンの供給源は、血漿（シュウ酸塩添加血漿など）又は血漿画分からなる群から選択される。いくつかのそのような実施形態では、プロトロンビンの供給源は、哺乳類（ヒト、ウマ、ウシ、及びブタなど）から採取された血漿を含む。いくつかの実施形態において、プロトロンビンの供給源は、ブタの血漿を含む。いくつかの実施形態において、プロトロンビンの供給源は、リコンビナントプロトロンビンである。いくつかの実施形態において、プロトロンビンの供給源には、ウイルス不活性化処理が施される。例えば、供給源は、溶媒／洗剤（ＳＤ）処理血漿である。
【００３６】
「溶媒洗剤（ＳＤ）ウイルス不活性化処理」は、典型的には、それらの脂質エンベロープを破壊することによって、エンベロープウイルス又は脂質被覆ウイルスを不活性化するプロセスを指す。この処理は、洗剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００又はポリソルベート８０など）及び溶媒［トリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴｎＢＰ）、ジ又はトリアルキルホスフェートなど］の添加によって行うことができる。脂質被覆ウイルスを不活性化するのに使用される溶媒−洗剤の組み合わせは、ＴｎＢＰ及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０及びコール酸ナトリウム、並びにその他の組み合わせなど、当該技術分野において既知の任意の溶媒−洗剤の組み合わせであってよい。
【００３７】
使用される溶媒（複数可）洗剤（複数可）の濃度は、例えば、米国特許第５０９４９６０Ａ号、同第４７８９５４５Ａ号で行われるような当該技術分野において一般的に使用されるものであり得る。使用される溶媒（複数可）洗剤（複数可）の濃度は、＞０．１％のＴｎＢＰ及び＞０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の組み合わせであり得る。使用される溶媒（複数可）洗剤（複数可）の濃度は、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び０．３％のＴｎＢＰの組み合わせであり得る。しかしながら、溶媒／洗剤のその他の組み合わせ、及びその他の好適な条件は、当業者には明らかであろう。
【００３８】
一実施形態では、０．５％のＴｗｅｅｎ−８０及び０．１５％のＴｎＢＰが、ＳＤ処理に使用される。ｐＨは、７．４〜８．６の範囲である。この溶液を室温にて１時間にわたってインキュベートする。
【００３９】
一実施形態では、１％のＴｗｅｅｎ−８０及び０．３％のＴｎＢＰが、ＳＤ処理に使用される。ｐＨは、７．４〜８．６の範囲である。この溶液を室温にて６時間にわたってインキュベートする。
【００４０】
本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、所与のＢａＳＯ４試薬のサンプルとプロトロンビンの供給源とを接触させることは、約１％〜約２２％又は約１％〜約１０％（ｗ／ｖ）のＢａＳＯ４試薬をプロトロンビンの供給源（例えば、採取された血漿）に添加することを含む。いくつかの実施形態では、約１％（ｗ／ｖ）のＢａＳＯ４試薬を添加する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、所与のＢａＳＯ４試薬によってプロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする条件は、ｐＨ７．４〜８．６を含む。いくつかの実施形態では、この条件は、例えば、２０℃〜２５℃の範囲の室温を含む。
【００４２】
ＢａＳＯ４試薬によるプロトロンビンの吸着は、バッチ方式で、又はＢａＳＯ４を充填したカラムで行うことができる。
【００４３】
一実施形態において、ＢａＳＯ４によるプロトロンビンの吸着は、バッチ方式で室温にて、例えば２５℃にて、２時間にわたってｐＨ７．４〜８．６で行われる。
【００４４】
本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することは、ＢａＳＯ４試薬に吸着される間のＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することである。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、「ｂ」に続いてかつ「ｃ」の前に、ＢａＳＯ４試薬からＢａＳＯ４吸着プロトロンビンのうち少なくともいくらかを溶出することを更に含み、ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することは、溶出したＢａＳＯ４吸着プロトロンビンのうち少なくともいくらかの凝血促進活性を評価することである。いくつかのそのような実施形態において、ＢａＳＯ４試薬からのＢａＳＯ４吸着プロトロンビンのうち少なくともいくらかの溶出は、ＢａＳＯ４試薬をｐＨ６．０以上かつ７．０以下で溶離液と接触させることを含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、溶離液のｐＨは、６．１以上、６．２以上及び更には６．３以上である。いくつかの実施形態では、溶離液のｐＨは、６．５以下、６．６以下、及び更には６．７以下、又は約ｐＨ６．３〜６．７である。いくつかの実施形態では、溶離液のｐＨは、６．３〜７．４である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、溶離液は、キレート塩を含む。いくつかの実施形態では、溶離液中のキレート塩の濃度は、約０．２％（ｗ／ｖ）〜約４．４％（ｗ／ｖ）、又は約３．０％（ｗ／ｖ）〜約４．４％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、キレート塩は、クエン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、溶離液中のクエン酸ナトリウムの濃度は、約０．２％（ｗ／ｖ）〜約４．４％（ｗ／ｖ）、又は約３．０％（ｗ／ｖ）〜約４．４％（ｗ／ｖ）である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、所与のＢａＳＯ４試薬は、少なくとも７５％（ｗ／ｗ）（（重量／重量）による）のＢａＳＯ４、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、及び更には少なくとも８８％（ｗ／ｗ）のＢａＳＯ４を含む試薬である。
【００４９】
別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。加えて、説明、材料、方法、及び実施例は、単に例示的なものであり、限定することを意図するものではない。本発明を実施する上で、本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料を使用することができる。
【００５０】
本明細書において使用するとき、用語「所与のＢａＳＯ４試薬」は、特定の供給元の特定のロットからのＢａＳＯ４試薬を指す。したがって、異なる所与のＢａＳＯ４試薬は、異なる供給元によって提供される試薬、又は同じ供給元によって提供される異なるロットの試薬であってもよい。
【００５１】
本明細書において使用するとき、用語「凝血促進活性」は、血液凝固の促進を指す。
【００５２】
本明細書において使用するとき、用語「含む（comprising）」、「含む（including）」、「有する」、及びその文法的変形は、記載される特徴、完全体、工程、又は構成要素を特定するものとして理解されるが、１つ以上の追加的特徴、完全体、工程、構成要素、又はこれらの群の添加を排除するものではない。これらの用語は、用語「〜からなる」、及び「〜から本質的になる」を包含する。
【００５３】
本明細書において使用するとき、不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、文脈が明確にそうでない旨を表さない限り、「少なくとも１つの」又は「１つ以上の」を意味する。
【００５４】
本明細書で使用するとき、「約」という用語は、±１０％を指す。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態は、添付の図面を参照して、本明細書において記載される。図面と共に説明を読むことにより、本発明のいくつかの実施形態がどのように実施され得るかということが、当業者にとって明らかとなる。図面は、例示的な説明の目的のためであり、実施形態の構造の詳細を、本発明の基本的理解に必要である以上に詳細に示そうとするものではない。明確性のため、図面に示されるいくつかの物体は、縮尺通りではない。
【００５６】
図面の説明
【図１】異なる供給元からのＢａＳＯ４試薬を使用して生産規模のトロンビンの製造中に調製された実規模のＢａＳＯ４吸着プロトロンビンサンプルから得られた溶出液のウエスタンブロット解析を示す。
【図２】同じ供給元からの異なるロットのＢａＳＯ４試薬を使用して調製された、ブタ血漿から得られた溶出液のウエスタンブロット解析を示す。
【図３】異なる供給元からのＢａＳＯ４試薬を使用して調製された、ブタ血漿から得られた溶出液のウエスタンブロット解析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、プロトロンビンの吸着剤として所与のＢａＳＯ４試薬を使用してプロトロンビンの供給源からトロンビンを調製するための方法、並びに所与のＢａＳＯ４試薬とプロトロンビンの供給源を接触させてＢａＳＯ４吸着プロトロンビンを得ること、及びいくつかの実施形態において、正常な哺乳類血漿の凝血促進活性に対するＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することによって、トロンビンの調製で用いる所与のＢａＳＯ４試薬の適合性を評価するための方法に関する。
【００５８】
本明細書における教示の原理、使用法、及び実施は、添付の説明を参照してよりよく理解され得る。この説明を精査することにより、当業者は、過度な努力又は実験を行うことなく、本発明を実施することができる。
【００５９】
少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、理解されたいこととして、本発明は、その用途において、以下の説明に記載した構成要素及び／又は方法の構造又は構成の詳細に必ずしも限定されない。本発明は他の実施形態が可能であり、様々な方法によって実行又は実施することが可能である。本明細書において使用される表現及び用語は、記述的目的のためであり、限定としてみなされるべきではない。
【実施例】
【００６０】
材料及び方法
材料
表１で以下に示されるようなＢａＳＯ４試薬が準備された。
【００６１】
【表１】
2019141044.tif 000002
【００６２】
塩化ナトリウムは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（Ｃａｔ＃Ｓ１６７９、分析グレード、少なくとも９９．０重量％）。
【００６３】
クエン酸三ナトリウム二水和物は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（Ｃａｔ＃Ｓ１８０４、分析グレード、少なくとも９９．０重量％）。シュウ酸塩添加ブタ血液（０．２５％（ｗ／ｗ）のシュウ酸塩溶液を含む）は、Ｋｉｂｂｕｔｚ  Ｌａｈａｖ，Ｉｓｒａｅｌの食肉処理場（abbatoir）から入手した。
【００６４】
ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンは、トロンビンの本格的な生産中に入手され（本明細書では実規模サンプルとも呼ばれる）、プロトロンビンを吸着するために使用されるＢａＳＯ４は、表１で上記規定されたＢａＳＯ４−試薬Ａ、Ｂ１のうちの１つから選択された。
【００６５】
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−８０は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（Ｃａｔ＃Ｐ８０７４、ＢｉｏＸｔｒａ、ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート）。
【００６６】
トリ−ｎ−ブチルホスフェート（ＴｎＢＰ）は、Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手した（Ｃａｔ＃１００００２、医薬品グレード）。
【００６７】
フィルタ１．２μｍは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｉｎｄｉａ  Ｐｖｔ  Ｌｔｄ．（Ｂａｎｇａｌｏｒｅ，Ｉｎｄｉａ）から入手し（Ｃａｔ＃Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２  ３００）、フィルタ０．４５＋０．２μｍは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｉｎｄｉａ  Ｐｖｔ  Ｌｔｄから入手した（Ｃａｔ＃Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）３００）。
【００６８】
ゲル電気泳動に関しては、プレキャストポリアクリルアミドゲルを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．から入手した（Ｍｉｎｉ−ｇｅｌ  ４〜２０％は、Ｃａｔ．＃：４５６−１０９６から入手した）。
【００６９】
ヒツジ抗ヒトトロンビンは、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（Ｃａｎａｄａ）から入手した（Ｃａｔ＃ＳＡＨＴ−ＩＧ）。
【００７０】
抗ヒツジＩｇＧアルカリホスファターゼ抱合体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（Ｃａｔ＃Ａ−５１８７）。
【００７１】
実施例１：溶媒／洗剤（ＳＤ）ウイルス不活性化血漿の調製
シュウ酸塩添加ブタ血液を氷上で供給した。この血液を、５，０００ｇ（５４４０ｒｐｍ）の相対遠心力（ｒｃｆ）及び４℃の温度で１５分間にわたって遠心分離した。血漿を含む上清を採取し、アリコート（３００〜５００ｍＬ）に分割し、必要とされるまで−３０℃で凍結保存した。
【００７２】
ＳＤ処理血漿（「ＳＤ血漿」）の調製に関しては、凍結保存した血漿のアリコートを、約１時間にわたって３７℃で解凍し、それから１．２μｍフィルタ、次いで０．４５＋０．２μｍフィルタを通過させた。０．５％のＴｗｅｅｎ−８０及び０．１５％（ｖ／ｖ）のＴｎＢＰを、ＳＤ処理のためにｐＨ７．４〜８．６で添加した。溶液を、室温にて１時間にわたって攪拌し、ｐＨを７．４〜８．６で監視した。
【００７３】
実施例２：ブタＳＤ血漿からのＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの実験室規模の溶出液の調製
表１に列挙された所与のＢａＳＯ４試薬のサンプルにプロトロンビンの供給源として実施例１で上述したＳＤ血漿を接触させた。
【００７４】
具体的には、表１に列挙された６種のＢａＳＯ４試薬の１種ずつに関して以下のとおりである。
（ｉ）ＢａＳＯ４（１％ｗ／ｖ）試薬のサンプルをＳＤ血漿の単位に添加した。
（ｉｉ）ＳＤ血漿／ＢａＳＯ４試薬混合物を、磁気攪拌器を使用して２５℃で２時間にわたって攪拌し（ｐＨ７．４〜８．６）、ＢａＳＯ４試薬によってＳＤ血漿中のプロトロンビンを吸着させた。
（ｉｉｉ）混合物を、５，０００ｇ（５，４４０ｒｐｍ）にて、４℃で１５分間にわたって遠心分離した。
（ｉｖ）上清及び沈降物（ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンを含む）を分離し、各沈降物を必要とされるまで−８０℃で別個に保存した。
（ｖ）使用する前に、沈降物を室温（２０〜２５℃）で１５分間にわたって解凍した。
（ｖｉ）沈降物を、ＢａＳＯ４：洗浄緩衝液（ｗ／ｗ）の比１：１．４で洗浄緩衝液（７８ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．９〜７．１）中に再懸濁させ、チューブローラーを使用して室温にて１５分間にわたって混合した。
（ｖｉｉ）次に、洗浄緩衝液中の沈降物を５，０００ｇ（５，４４０ｒｐｍ）にて、４℃で１５分間にわたって遠心分離し、上清を採取し、必要とされるまで−８０℃で保存した。この工程を２回繰り返した（すなわち、合計３回の洗浄を行った）。
（ｖｉｉｉ）洗浄工程の後に、洗浄した沈降物（ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンを含む）を、ＢａＳＯ４：溶出緩衝液（ｗ／ｗ）の比１：１．４で溶出緩衝液（３％クエン酸ナトリウムｐＨ６．３〜６．７）中に再懸濁させ、チューブローラーを使用して１５分間にわたって混合した。
（ｉｘ）次いで、沈降物／溶出緩衝液を、５，０００ｇ（５，４４０ｒｐｍ）にて、４℃で１５分間にわたって遠心分離した。プロトロンビンを含む溶出液を氷上に定置した清潔な容器の中に採取し、この溶出工程を４回繰り返した（すなわち、合計５回の溶出サイクルを実行した）。
（ｘ）５回の溶出サイクルから得た溶出液（脱着されたプロトロンビンを含む）を単一の溶出液中に混ぜ合わせ、０．２μｍのＰＶＤＦフィルタによって濾過し、ＮＡＰＴＴ又はウエスタンブロットで試験されるまで清潔な容器内に−８０℃で保存した。
【００７５】
実施例３：ブタＳＤ血漿からのＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの実規模の溶出液の調製
ブタ血漿から凍結プロトロンビン吸着ＢａＳＯ４の実規模サンプルを調製した。
【００７６】
使用されたＢａＳＯ４試薬は、表１に定義されたＡ及びＢ１であった。
【００７７】
ＳＤ処理のために１％のＴｗｅｅｎ−８０及び０．３％のＴｎＢＰを使用してＳＤを行った。ｐＨは、７．４〜８．６の範囲であった。溶液を２４〜２６℃で６時間にわたってＳＤでインキュベートした。
【００７８】
実規模サンプルでは、工程ｖは、実験室規模サンプルの対応する工程に代わり、サンプルは工程ｘまで処理された。
【００７９】
実施例４：溶出液のプロトロンビン及びトロンビン含量のウエスタンブロット解析
ウエスタンブロットアッセイ用のローディング容量を計算するために、及び残留の非結合タンパク質及びその他の汚染物質が洗浄工程（ｖｉ及びｖｉｉ）によって除去されたことを確認するために、ビウレット法を使用して、実施例２及び３で上述のように得られたそれぞれの溶出液（表１の６種のＢａＳＯ４試薬のうちの１種に対応するそれぞれの溶出液）中の総タンパク質測定を実行した。
【００８０】
各溶出液からタンパク質のより良好な分解能を得るために、溶出液サンプルから得たタンパク質を、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥグラディエントミニプレキャストゲル（４％〜２０％）を使用して分離した。タンパク質を、ゲルからニトロセルロース膜に移した。ウエスタンブロットを、ヒツジ抗ヒトトロンビン及び二次抗体、アルカリホスファターゼに抱合された抗ヒツジＩｇＧを使用して実行した。
【００８１】
いくつかのＢａＳＯ４吸着プロトロンビンサンプルが、トロンビンを含んでいたことがわかった（下記「結果」セクション参照）。
【００８２】
実施例５：溶出液の凝血促進活性
基本的にＰｈ．Ｅｕｒ．（２．６．２２）に記載されるように非活性化部分トロンボプラスチン時間（ＮＡＰＴＴ）アッセイを使用して、ブタＳＤ血漿から調製された８種（実施例２にある６種及び実施例３にある２種）の溶出液の１種ずつの凝血促進活性を評価した。簡潔にかつ当業者に周知のように、ＮＡＰＴＴアッセイは、リン脂質（ウサギ脳セファリン）及びカルシウムイオン（ＣａＣｌ２のままで）を、試験された溶出液又は吸着されたＢａＳＯ４吸着プロトロンビンサンプル、及び正常なヒト血漿コントロール［Ｕｎｉｃａｌｉｂｒａｔｏｒ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｐｌａｓｍａ  ｆｏｒ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔｓ  ００６２５］（本来プロトロンビンを含む）に同時に添加することを含み、カルシウムイオンは、プロトロンビンのトロンビンへの変換によって試験サンプル中で凝固を開始する。トロンビンは、可溶性フィブリノゲンの不溶性フィブリンへの変換によって凝塊形成を引き起こす。凝固時間を、凝固計（ＳＴ  ＡＲＴ４  Ｓｔａｇｏ  ｍａｃｈｉｎｅ）を使用して測定する。
【００８３】
より具体的には、４つの試験ウェルのそれぞれに４５μＬのヒト血漿を加えた。コントロールサンプルについては、２つのコントロールウェルのそれぞれに４５μＬのＴＢＳ／アルブミン緩衝液を加え、２つの更なるコントロールウェルのそれぞれに４５μＬの希釈した試験サンプルを加えた。次いで、４つの試験ウェルのそれぞれに４５μＬのウサギ脳セファリン０．０２％溶液を加え、続いて穏やかに振盪することによってウェルの内容物を混合し、３７℃で１分間にわたってインキュベーションを行った。４５μＬの０．０２５Ｍ  ＣａＣｌ２（予め３７℃でインキュベートされた）を全てのウェルに加えることにより反応が開始され、凝固時間を測定した。試験サンプルの凝固時間（秒単位）を正常なヒト血漿コントロールの凝固時間で除して、ＮＡＰＴＴ比を計算した。
【００８４】
活性トロンビンが特定された溶出液（実施例４）では、凝固時間が、正常なヒト血漿コントロールの凝固時間よりも実質的に短かったことがわかった。一部の溶出液では、凝固が即時であったことがわかった。一部の溶出液では、凝固時間が４５０秒超であったことがわかった。
【００８５】
ＢａＳＯ４  Ｂ１及びＢ２から得られる溶出液は、プロセス終了時に高いトロンビンの収率をもたらしたことがわかった。
【００８６】
結果は、トロンビン生産に好適なＢａＳＯ４試薬を特定するためにＮＡＰＴＴアッセイを使用することができることを示している。
【００８７】
実施例６：ブタＳＤ血漿からのＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの調製
表１中の６つのＢａＳＯ４試薬のそれぞれに関して上記工程（ｉ）〜（ｉｉ）を繰り返す。
【００８８】
ブタＳＤ血漿から調製された、吸着されたＢａＳＯ４吸着プロトロンビンのサンプルの凝血促進活性を、非活性化部分トロンボプラスチン時間（ＮＡＰＴＴ）アッセイを使用して評価する。
【００８９】
結果
ウエスタンブロット解析
ＢａＳＯ４試薬Ａ及びＢ１（表１）を使用した溶出液（実施例３）のウエスタンブロット解析を図１に示す。
【００９０】
レーン番号は、以下を表す。
１−ＭＷラダー
２−ヒトプロトロンビン標準
３−ＢａＳＯ４試薬Ａを使用して得られた実規模溶出液
４−ＢａＳＯ４試薬Ｂ１を使用して得られた実規模溶出液
５−ヒトプレトロンビン２標準
６−ヒトαトロンビン標準
【００９１】
図１において、ＢａＳＯ４試薬Ｂ１を使用して得られた実規模溶出液では（レーン４）、プロトロンビンに対応する帯は、はっきり見える。
【００９２】
図１において、ＢａＳＯ４試薬Ａを使用して得られた実規模溶出液では（レーン３）、プロトロンビンに対応する帯は、かろうじて見える。プロトロンビン中間タンパク質並びにαトロンビンに対応するその他の帯は、明らかである。
【００９３】
ＢａＳＯ４試薬Ａ、Ｂ１、及びＢ２（表１）を使用してブタＳＤ血漿から得られた溶出液（実施例２）のウエスタンブロット解析を図２に示す。
【００９４】
レーン番号は、以下を表す。
１−ＭＷラダー
２−ヒトプロトロンビン標準
３−ＢａＳＯ４試薬Ａを使用して得られた溶出液
４−ＢａＳＯ４試薬Ｂ１を使用して得られた溶出液
５−ＢａＳＯ４試薬Ｂ２を使用して得られた溶出液
６−ヒトαトロンビン標準
【００９５】
図２に示される結果は、同じ製造業者によって供給された異なるロットのＢａＳＯ４を使用して得られた溶出液（Ｂ１−レーン４、Ｂ２−レーン５）が、類似の横縞模様を表示したことを示す。ＢａＳＯ４試薬Ａ（レーン３）を使用して得られた溶出液を参照として実行した。
【００９６】
ＢａＳＯ４試薬Ａ、Ｂ２、Ｄ２、Ｄ１及びＣを使用してブタＳＤ血漿から得られた溶出液（実施例２）のウエスタンブロット解析を図３に示す。
【００９７】
レーン番号は、以下を表す。
１−ＭＷラダー
２−ヒトプロトロンビン標準
３−ＢａＳＯ４試薬Ａを使用して得られた溶出液
４−ＢａＳＯ４試薬Ｂ２を使用して得られた溶出液
５−ＢａＳＯ４試薬Ｄ２を使用して得られた溶出液
６−ＢａＳＯ４試薬Ｄ１を使用して得られた溶出液
７−ＢａＳＯ４試薬Ｃを使用して得られた溶出液
８−ヒトプレトロンビン２標準
９−ヒトαトロンビン標準
【００９８】
図３に示される結果は、医薬品グレードのＢａＳＯ４を使用してブタＳＤ血漿から得られた溶出液（Ｃ−レーン７、Ｄ１−レーン６）は、プロトロンビン及び中間生成物と一致する帯を含む類似の横縞模様を示したことを示す。この横縞模様は、ＢａＳＯ４試薬Ａを使用して得られた溶出液（レーン３）のものと同様であった。ホワイト標準グレードＢａＳＯ４を用いて得られた溶出液（「Ｄ２」−レーン５）は、プロトロンビンに対応する非常に弱い帯並びに中間生成物及びαトロンビンに対応するより強い帯を示した。試薬Ｂ２を使用して得られた溶出液（レーン４）は、最も強いプロトロンビンの帯、及び中間生成物に対応する最も暗い帯を示した。
【００９９】
ＮＡＰＰＴアッセイの結果
【０１００】
【表２】
2019141044.tif 000003
【０１０１】
ＢａＳＯ４試薬Ａ、Ｂ１、Ｂ２、Ｃ、Ｄ１、及びＤ２を使用して得られた実規模及び実験室規模の溶出液に関するＮＡＰＴＴアッセイの結果を表２に示す。
【０１０２】
結果は、プロトロンビン供給源に関係なく、ウエスタンブロットによってトロンビンを殆ど又は全く有しないことが示されたＢａＳＯ４試薬Ｂ１及びＢ２が、コントロール血漿より遅い凝固を引き起こしたことを示す。
【０１０３】
結果はまた、プロトロンビン供給源に関係なく、ウエスタンブロットによって有意なトロンビン含量を有することが示されたＢａＳＯ４試薬Ａが、コントロール血漿より速い凝固を引き起こしたことも示す。
【０１０４】
異なるＢａＳＯ４試薬を使用して血漿から得られたＢａＳＯ４吸着プロトロンビンを含む溶出液は、ウエスタンブロットによってタンパク質組成について、及びＮＡＰＴＴによって凝血促進活性について分析された。
【０１０５】
ウエスタンブロット解析結果（図１）は、ＢａＳＯ４試薬Ａ及びＢ（それぞれレーン３及び４）を使用して得られたサンプルからの溶出液間での横縞模様の違いを示している。この結果は、試薬Ａを使用して得られたサンプル中のプロトロンビンが、トロンビンへ部分変換していたことを示唆するものである。
【０１０６】
ＮＡＰＴＴ凝固アッセイにおいて、ＢａＳＯ４試薬Ａを使用して得られた溶出液を試験すると直ちに凝塊が形成されたのに対して、試薬Ｂを使用して得られた溶出液では、４５０秒後でも凝固は観察されなかった。正常なヒト血漿は、ＮＡＰＴＴアッセイにおいて約２００〜３００秒以内に凝塊を発生させることが期待されるが、実際に、表２に見られるように観察されたことに留意するべきである。
【０１０７】
ブタＳＤ血漿からプロトロンビンを分離するために、かつトロンビン生産のために、様々な異なるＢａＳＯ４試薬を使用した。医薬品グレードのＢａＳＯ４試薬Ａ、Ｃ、及びＤ１は、低いグレードのＢａＳＯ４試薬Ａ及びＤ２など不満足な結果をもたらしたが、一部の医薬品グレードのＢａＳＯ４試薬Ｂ１及びＢ２は、優れた結果を提供する。
【０１０８】
結果は、使用された特定のＢａＳＯ４試薬が、ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性、及びトロンビンの収率に大きな影響を及ぼすことを示した。
【０１０９】
プロトロンビンのうち少なくともいくらかが、トロンビン及び／又はトロンビン中間生成物に変換されることも示される。実験結果は、本明細書に記載されるように凝血促進アッセイを使用して、所与のＢａＳＯ４試薬が、プロトロンビン吸着剤としての使用及びプロセスの終了時に増大したトロンビンの収率の生成に適しているかどうかを定性的に判定できることを示す。
【０１１０】
本発明の特定の特徴は、明確性のために別個の実施形態の文脈において記載されているが、これはまた、単一の実施形態において組み合わせて提示されてもよいことが認識される。逆に、本発明の様々な特徴は、簡潔さのために、単一の実施形態の文脈において記載されているが、これはまた、別個に、若しくは任意の好適なサブコンビネーションで、又は本発明のその他の記載される実施形態において好適に提供され得る。様々な実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしには動作不可能である場合を除き、これらの実施形態の本質的特徴であるとして考慮されるべきではない。
【０１１１】
本発明は、その特定の実施形態と共に記載されてきたが、多くの代替、修正、及び変異が当業者には明白であることが、明らかである。したがって、添付の請求項の範囲内にあるこれらの代替、修正、及び変異全てを包含することが意図される。
【０１１２】
本出願におけるいずれの参照文献の引用又は指定も、このような文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものと解釈されるべきではない。
【０１１３】
実施例７：ＢａＳＯ４試薬からのプロトロンビン溶出後のプロトロンビン活性化
ＢａＳＯ４Ａ及びＢ１（以下で定義）から溶出されたプロトロンビンを次のように活性化した。
【０１１４】
【表３】
2019141044.tif 000004
【０１１５】
溶出されたプロトロンビン溶液を、ＣａＣｌ２（６ｇ／リットル）及びグリシン（１０ｇ／リットル）と混合し、ｐＨを調整した。次に、溶液を、０．２２μＭフィルタを通して濾過し、２０〜２５℃で８時間にわたってインキュベートし、続いて２〜８℃で最大７２時間にわたってインキュベーションを行った。吸着剤としてＢａＳＯ４Ｂ１を使用して得られたトロンビン収率は、吸着剤としてＢａＳＯ４Ａを使用して得られた収率と比較して約９倍であった。
【０１１６】
この実施例は、トロンビン収率を最大にするために、実規模トロンビン製造の前に好適なＢａＳＯ４試薬を選択することが有利であることを実証する。
【０１１７】
〔実施の態様〕
（１）  プロトロンビンの吸着剤として所与のＢａＳＯ４試薬を使用してプロトロンビンの供給源からトロンビンを調製するための方法であって、
ａ．前記所与のＢａＳＯ４試薬及び前記プロトロンビンの供給源を準備することと、
ｂ．前記所与のＢａＳＯ４試薬によって前記プロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、前記所与のＢａＳＯ４試薬のサンプルと前記プロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりＢａＳＯ４吸着プロトロンビンを得ることと、
ｃ．前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含み、
ｃの前記評価が前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性と正常な哺乳類血漿の凝血促進活性とを比較することにより行われるとき、トロンビンの調製に使用するための前記所与のＢａＳＯ４試薬の適合性は、前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性が正常な哺乳類血漿の前記凝血促進活性以下であることによって示される、方法。
（２）  プロトロンビンの吸着剤として所与のＢａＳＯ４試薬を使用してプロトロンビンの供給源からトロンビンを調製するための方法であって、実施態様１に記載の工程「ａ」〜「ｃ」を含み、
ｄ．プロトロンビン吸着を可能にする条件下で前記好適なＢａＳＯ４とプロトロンビンの供給源とを接触させることと、
ｅ．溶出緩衝液を使用して、前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンから、プロトロンビン含有画分を溶出することと、
ｆ．前記溶出した画分を、プロトロンビンのトロンビンへの変換を可能にする条件下におき、これによりトロンビンを得ることと、を更に含む、方法。
（３）  プロトロンビンの供給源からのトロンビンの調製において、プロトロンビン吸着剤として使用するための所与のＢａＳＯ４試薬の適合性を評価するための方法であって、
ａ．前記所与のＢａＳＯ４試薬及びプロトロンビンの供給源を準備することと、
ｂ．前記所与のＢａＳＯ４試薬によって前記プロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、前記所与のＢａＳＯ４試薬のサンプルと前記プロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりＢａＳＯ４吸着プロトロンビンを得ることと、
ｃ．前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含み、
ｃの前記評価が前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性と正常な哺乳類血漿の凝血促進活性とを比較することにより行われるとき、トロンビンを調製するためのプロセスにおいてプロトロンビン吸着剤として使用するための前記所与のＢａＳＯ４試薬の適合性は、前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性が正常な哺乳類血漿の前記凝血促進活性以下であることによって示される、方法。
（４）  凝血促進活性を評価することが、凝血促進アッセイを実行することを含む、実施態様１〜３のいずれかに記載の方法。
（５）  前記凝血促進アッセイが、機能アッセイを含む、実施態様４に記載の方法。
【０１１８】
（６）  前記機能アッセイが、凝固アッセイである、実施態様５に記載の方法。
（７）  前記凝固アッセイが、ＮＡＰＴＴアッセイ、ＡＰＴＴアッセイ、及びプロテアーゼ発色アッセイからなる群から選択される、実施態様６に記載の方法。
（８）  前記プロトロンビンの供給源が、血漿、又は血漿画分からなる群から選択される、実施態様１〜７のいずれかに記載の方法。
（９）  前記血漿が、シュウ酸塩添加血漿を含む、実施態様８に記載の方法。
（１０）  前記プロトロンビンの供給源が、哺乳類から採取された血漿を含む、実施態様１〜９のいずれかに記載の方法。
【０１１９】
（１１）  前記哺乳類が、ヒト、ウマ、ウシ、及びブタからなる群から選択される、実施態様１０に記載の方法。
（１２）  前記所与のＢａＳＯ４試薬によって前記プロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする前記条件が、ｐＨ７．４〜８．６を含む、実施態様１〜１１のいずれかに記載の方法。
（１３）  前記所与のＢａＳＯ４試薬のサンプルと前記プロトロンビンの供給源とを接触させることが、約１％（ｗ／ｖ）のＢａＳＯ４試薬を前記プロトロンビンの供給源である前記採取された血漿に追加することを含む、実施態様９〜１２のいずれかに記載の方法。
（１４）  前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することが、前記ＢａＳＯ４試薬に吸着される間の前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することである、実施態様１〜１３のいずれかに記載の方法。
（１５）  「ｂ」の後かつ「ｃ」の前に、前記ＢａＳＯ４試薬から前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンのうち少なくともいくらかを溶出することを更に含み、
前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性を評価することが、前記溶出したＢａＳＯ４吸着プロトロンビンのうち少なくともいくらかの凝血促進活性を評価することである、実施態様１〜１３のいずれかに記載の方法。
【０１２０】
（１６）  前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンからプロトロンビン含有画分を溶出することが、約６．３〜７．４のｐＨでのカルシウムキレート塩の使用を含む、実施態様１５に記載の方法。
（１７）  前記キレート塩が、クエン酸ナトリウムを含む、実施態様１６に記載の方法。
（１８）  前記クエン酸ナトリウムの濃度が、約３％（ｗ／ｖ）〜約４．４％（ｗ／ｖ）である、実施態様１７に記載の方法。
（１９）  前記プロトロンビンの供給源が、ブタ血漿を含む、実施態様１〜１８のいずれかに記載の方法。
（２０）  １つを超えるＢａＳＯ４試薬を評価するとき、好適なＢａＳＯ４試薬が、プロトロンビンの吸着について選択される、実施態様１〜１９のいずれかに記載の方法。
【図１】
2019141044.tif 000005
【図２】
2019141044.tif 000006
【図３】
2019141044.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月15日(2019.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロトロンビンの吸着剤として所与のＢａＳＯ４試薬を使用して、トロンビン調製用のプロトロンビンの供給源からトロンビンを調製するための方法であって、
ａ．前記所与のＢａＳＯ４試薬及びＢａＳＯ４試薬評価用のプロトロンビンの供給源を準備することと、
ｂ．前記所与のＢａＳＯ４試薬によって前記ＢａＳＯ４試薬評価用のプロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、前記所与のＢａＳＯ４試薬のサンプルと前記ＢａＳＯ４試薬評価用のプロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりＢａＳＯ４吸着プロトロンビンを得ることと、
ｃ．前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、
ｄ．プロトロンビン吸着を可能にする条件下で好適なＢａＳＯ４と前記トロンビン調製用のプロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりＢａＳＯ４吸着プロトロンビンを得ることと、
ｅ．溶出緩衝液を使用して、「ｄ」で得られた前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンから、プロトロンビン含有画分を溶出することと、
ｆ．前記溶出したプロトロンビン含有画分を、プロトロンビンのトロンビンへの変換を可能にする条件下におき、これによりトロンビンを得ることと、を含む、方法。
【請求項２】
トロンビン調製用のプロトロンビンの供給源からのトロンビンの調製において、プロトロンビン吸着剤として使用するための所与のＢａＳＯ４試薬の適合性を評価するための方法であって、
ａ．前記所与のＢａＳＯ４試薬及びＢａＳＯ４試薬評価用のプロトロンビンの供給源を準備することと、
ｂ．前記所与のＢａＳＯ４試薬によって前記ＢａＳＯ４試薬評価用のプロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、前記所与のＢａＳＯ４試薬のサンプルと前記ＢａＳＯ４試薬評価用のプロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりＢａＳＯ４吸着プロトロンビンを得ることと、
ｃ．前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含む、方法。
【請求項３】
前記凝血促進活性を評価することが、凝血促進アッセイを実行することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記凝血促進アッセイが、機能アッセイを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記機能アッセイが、凝固アッセイである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記凝固アッセイが、ＮＡＰＴＴアッセイ、ＡＰＴＴアッセイ、及びプロテアーゼ発色アッセイからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記トロンビン調製用のプロトロンビンの供給源および前記ＢａＳＯ４試薬評価用のプロトロンビンの供給源が、血漿、又は血漿画分からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記血漿が、シュウ酸塩添加血漿を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記トロンビン調製用のプロトロンビンの供給源および前記ＢａＳＯ４試薬評価用のプロトロンビンの供給源が、哺乳類から採取された血漿を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳類が、ヒト、ウマ、ウシ、及びブタからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記所与のＢａＳＯ４試薬によって、前記ＢａＳＯ４試薬評価用のプロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする前記条件が、ｐＨ７．４〜８．６を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記所与のＢａＳＯ４試薬のサンプルと前記ＢａＳＯ４試薬評価用のプロトロンビンの供給源とを接触させることが、１％（ｗ／ｖ）のＢａＳＯ４試薬を前記ＢａＳＯ４試薬評価用のプロトロンビンの供給源である前記採取された血漿に追加することを含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性を評価することが、前記ＢａＳＯ４試薬に吸着される間の前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
「ｂ」の後かつ「ｃ」の前に、前記ＢａＳＯ４試薬から前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンのうち少なくともいくらかを溶出することを更に含み、
前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性を評価することが、前記溶出したＢａＳＯ４吸着プロトロンビンのうち少なくともいくらかの凝血促進活性を評価することである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＢａＳＯ４吸着プロトロンビンから前記プロトロンビン含有画分を溶出することが、６．３〜７．４のｐＨでのカルシウムキレート塩の使用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記カルシウムキレート塩が、クエン酸ナトリウムを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記クエン酸ナトリウムの濃度が、３％（ｗ／ｖ）〜４．４％（ｗ／ｖ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記トロンビン調製用のプロトロンビンの供給源および前記ＢａＳＯ４試薬評価用のプロトロンビンの供給源が、ブタ血漿を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
１つを超えるＢａＳＯ４試薬を評価するとき、好適なＢａＳＯ４試薬が、プロトロンビンの吸着について選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記トロンビン調製用のプロトロンビンの供給源が前記ＢａＳＯ４試薬評価用のプロトロンビンの供給源と同じである、請求項１または２に記載の方法。