(57)【要約】【課題】本発明が解決しようとする課題は、アレルギー性免疫応答の発生又は重症度の防止又は低減の分野、及びアレルギー性免疫応答の発生又は重症度を防止するか、又は低減させるための組成物を提供することである。【解決手段】前記課題は、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)の不活化及び/若しくは死滅させた細胞又はその細胞溶解物を含む組成物によって解決することができることを見出した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
不活化若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ細胞又はその細胞溶解物と、薬学的に許容される担体とを含む組成物であって、アジュバントを含まず、約106個の細胞〜約1012個の細胞に対応する範囲の量の細菌細胞又はその細胞溶解物を含む、組成物。
【請求項２】
ヘリコバクター・ピロリの全細胞溶解物を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
ヘリコバクター・ピロリ細胞又はその細胞溶解物が、超音波処理、凍結乾燥、熱、化学的手段又は照射により不活化又は死滅している、請求項1又は2に記載の組成物。
【請求項４】
ヘリコバクター・ピロリ細胞又はその細胞溶解物が、超音波処理又は凍結乾燥により不活化又は死滅している、請求項3に記載の組成物。
【請求項５】
薬学的に許容される担体を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
粘膜送達又は摂取又は吸入のために調合された、請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
食品又は栄養補助食品として調合された、請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
食品が乳幼児用調製乳を含む、請求項7に記載の組成物。
【請求項９】
錠剤の形態、粉末の形態又は液体の形態である、請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
約107個の細胞〜約1011個の細胞、約108個の細胞〜約1010個の細胞又は約109個の細胞〜約1010個の細胞に対応する範囲の量の細菌細胞又はその溶解物を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
保存剤又は安定化剤を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
対象におけるアトピーマーチ又はアトピーマーチの進行を中断させる、又は減速させる、又は停止させる、又は防止するための、請求項1から11のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
対象におけるアレルゲンに対するアレルギー性免疫応答を防止するための、又は対象におけるアレルゲンに対するアレルギー性免疫応答の重症度若しくは発生を低減させるための、請求項1から11のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
対象がヒト対象である、請求項12又は13に記載の組成物。
【請求項１５】
アレルギー性免疫応答が、以下のアレルギー疾患：アレルギー性湿疹、アトピー性皮膚炎、乾癬、蕁麻疹、じんましん、鼻炎、喘鳴、気道抵抗、気道制限、気道過敏性若しくは過活動、肺炎症、食物アレルギー、又は喘息の一つ又は複数である、請求項12又は13に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー性免疫応答の発生又は重症度の防止又は低減の分野、及びアレルギー性免疫応答の発生又は重症度を防止するか、又は低減させるための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー反応は、一般に、組織肥満細胞及び関連するエフェクター分子(例えば、好塩基球)のIgE依存的刺激により開始される免疫反応である。細胞表面に結合したIgE分子と抗原との結合事象は、生物応答改変剤の迅速な放出をもたらし、血管透過性、血管拡張、平滑筋収縮及び局所炎症の増大をもたらす。この一連の事象は、即時型過敏反応と呼ばれ、急速に、通常は、感作された個体中での曝露の数分以内に始まる。その最も重篤な全身性のものであるアナフィラキシーにおいては、そのような即時型過敏反応は、窒息状態をもたらし、心血管虚脱をもたらし、更には死をももたらし得る。強い即時型過敏性応答を起こしやすい個体は、「アトピー」と呼ばれる。アレルギー又はアトピーの臨床所見としては、花粉症(鼻炎)、喘息、蕁麻疹(じんましん)、皮膚刺激(慢性湿疹等の湿疹)、アナフィラキシー、及び関連する状態が挙げられる。
【０００３】
アトピーの有病率は、アレルギーの有病率が欧州、英国及び米国において0.1%未満であると見積もられた20世紀初頭以来、先進国において増大してきた(Schadewaldt H、1980、Geschichte der Allergies in vier Dustri-Verlag; Matthias Wjst、2009、Allergy, Asthma & Clinical Immunology. 5:8頁により引用)。現在、世界人口の約30〜40%が、1つ又は複数のアレルギー状態に罹患している。現在、喘息、鼻炎、及び湿疹は先進国において普及しており、アレルギー障害は先進国における小児の間で最も一般的な慢性疾患である。例えば、オーストラリアにおいては、25%を超える乳幼児が今日、湿疹を示し、20%を超える1歳児が食品感作されており、25%を超える小児が喘息を有し、40%を超える成人がアレルギー性鼻炎の病歴を有する(Pawnkar R、Walter Canonica G、Holgate ST、Lockey RF、2001、World Allergy Organization (WAO) White Book on Allergy)。また、アレルギーは米国における全個人の約20%が罹患している。アトピーは、2050年までにオーストラリアの人口の約26%に増加すると予測されている。
【０００４】
小児喘息は小児期の間に改善することが多いが、喘息及び鼻炎は成人期を通して持続し、喘息関連死は60歳を超える年齢について実質的に増加する(Martin PEら、2011、J. Allergy Clin. Immunol. 127:1473〜1479頁)。
【０００５】
アレルギー状態と関連する有意な経済的負担が存在する。例えば、2007年には、オーストラリアにおける関連する経済的費用は94億ドルであり、健康を失った人(例えば、身体障害及び早死)からは更に213億ドルであると見積もられた。英国においては、アトピー性湿疹の年間総出費は4.65億ポンド(5.21億ユーロ)と見積もられている。ドイツにおいては、アトピー性湿疹患者に総平均費用は、約4400ユーロであると見積もられている。米国においては、米国経済に対する喘息の直接的及び間接的費用は、2010年には207億米ドルに達したと予測され、小児喘息のみを処置する直接的費用は毎年、患者1人あたり1,100米ドルを超える。0〜5歳の患者における湿疹のみの発生を処置する費用は、毎年、患者1人あたり約360米ドルであり、1年の費用は、オーストラリアにおいては400,000ドル、西洋においては500万ユーロ及び米国においては300万米ドルを超える。
【０００６】
いくつかの研究が、最近10年間で、小児におけるアレルギー性喘息及び花粉症の有病率(Mullins RJ、2007、Med J Aust. 186: 618〜621頁)から、湿疹及び食物アレルギーの増加に向かう、先進国におけるアレルギーのパターンの時間的変化を実証してきた。アレルギー流行のこの第二波において、小児の10%が、何らかの形態の食物アレルギーを有する(Osborne NJら、2011、J. Clin. Immunol. 127:668〜676頁; Prescott S及びAllen KJ、2011、Pediatr. Allergy Immunol. 22:155〜160頁)。アレルギー障害に関するこの変化する疫学は、依然として大部分は説明されていない。
【０００７】
図1のパネル(A)に例示されるように、中等度から重度の湿疹を有する乳幼児は、以後の人生で、例えば、小児期に、食物アレルギー及び/又はアレルギー性喘息を発症するリスクがより高く、これらの個体の有意な割合が、成人としてアトピー又は呼吸器アレルギーを有する。これが、いわゆる「アトピーマーチ」又は「アレルギーマーチ」である(Martin PEら、2011、J. Allergy Clin. Immunol. 127:1473〜1479頁)。食物アレルギーを有する現世代は、呼吸器アレルギーを有する前世代よりも人生の早期に症状を呈すると考えられ、成人早期にそのアレルギーが見られなくなる可能性は少ないと考えられる(Prescott S及びAllen KJ、2011、Pediatr. Allergy Immunol. 22:155〜160頁)。
【０００８】
いわゆる「衛生仮説」は、先進国におけるアトピーの増加を、乳幼児期及び/又は小児期における微生物感染を処置するための抗生物質の使用の増加を原因とするものである(Strachan DP、1989、BMJ、299:1259〜1260頁; Strachan DP、Harkins LS、Golding J、1997、Clin. Exp. Allergy. 27:151〜155頁; Renz H及びHerz U、2002、Eur. Respir. J. 19:158〜171頁)。衛生仮説によれば、微生物環境、ヒト微生物叢の生物学的多様性の変化、及び宿主免疫系を調節する微生物への曝露の減少は、小児アレルギーを引き起こし、アトピーマーチをもたらす。何故ならば、例えば、抗生物質は、病原体の発生を減少させるだけでなく、バランスのとれた免疫系の発達にとって有益である微生物の発生を減少させるからである(Guarner Fら、2006、Nat. clin. Pract. Gastroenterol. Hepatol. 3: 275〜284頁)。
【０００９】
適切なT細胞集団の選択は、未発達の免疫系を有する新生児(neonate)及びニューボーン(new born)及び乳幼児等のナイーブな非感作宿主における初期段階の免疫応答の間に起こる。選択がアレルゲン特異的TH1細胞の誘導に向かって宿主免疫系をプライミングすることを好む場合、IgG及びIgA応答が結果として起こり得る。TH1細胞は、細菌、ウイルス及び真菌感染を含む様々な微生物抗原に対する防御において役割を果たすと考えられ、未制御のTH1応答は、例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、甲状腺炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、実験的自己免疫性ぶどう膜網膜炎(Dubeyら、1991、Eur. Cytokine Network、2:147〜152頁)、実験的自己免疫性脳炎(EAE)(Beraudら、1991、Cell Immunol. 133:379〜389頁)、インスリン依存性糖尿病(Hahnら、1987、Eur. J Immunol. 18:2037〜2042頁)、接触性皮膚炎(Kapsenbergら、Immunol Today、12:392〜395頁)、及びいくつかの慢性炎症障害における、臓器特異的自己免疫に関与する。TH1細胞により生成される主な炎症性サイトカインは、IFN-γである(例えば、Romragnani、編、TH1 and TH2 Cells in Health and Disease. Chem. Immunol.、Karger、Basel、63、158〜170頁及び187〜203頁(1996)を参照されたい)。
【００１０】
他方、TH2細胞の出現は、IgE生成並びに好酸球増加症及び最終的には、アトピー性疾患をもたらし得る。例えば、WO2005/030249を参照されたい。アレルギー、喘息、湿疹、乾癬、アレルギー性鼻炎、花粉症及びアトピー性皮膚炎はそれぞれ、TH2細胞の過剰生成を特徴とする強い免疫学的脱調節と関連し(Romragnani、上掲; van der Heijdenら、1991、J Invest Derm. 97:389〜394頁; Walkerら、1992、Am. Rev. Resp. Dis. 148:109〜115頁;並びにRenz H及びHerz U、2002、上掲)、未制御のTH2型応答は、環境アレルゲン及び化学アレルゲンに対するアレルギー障害を誘発する原因となる。TH2型応答はまた、高IgE症候群(Del Preteら、1989、J. Clin. Invest. 84:1830〜1835頁)及びオーメン症候群(Schandeneら、1993、Eur. J. Immunol. 23:56〜60頁)等のある特定の原発性免疫不全において優先的に誘導される。
【００１１】
TH2エフェクター機能は、TH1細胞によって負に調節され得る。衛生仮説は、例えば、抗生物質の頻繁な使用による、微生物感染の頻度の低下、重症度の低い感染、及び感染の防止が、TH1免疫の成熟を防止し、アレルゲンへのその後の曝露の後にアレルゲン特異的TH-2免疫応答を生じ得ると提言している(Renz H及びHerz U、2002、上掲)。
【００１２】
重症のアトピーに関しては、現在治癒はなく、限られた処置しかない。処置選択肢は、一般に、ステロイド、抗ヒスタミン剤、免疫調節薬の使用及びアドレナリンの投与に限定される。よくても、これらの処置レジメンは、一時的な緩和を提供し、一般には、持続的使用にとって好適ではない。従って、アレルギー障害の防止のための組成物及び方法のための当業界における満たされていない必要性が依然として存在する。
【００１３】
ヘリコバクター・ピロリ(H.pylori)は、世界の半分を超える人口が慢性的に罹患する胃の細菌病原体である。ヘリコバクター・ピロリによる感染は通常、小児期の初期に獲得され、未処置のまま放置した場合、感染した個人の大部分について無症状のまま生涯持続し得る。他方、ヘリコバクター・ピロリ感染は、消化性潰瘍疾患の主な原因であり、10%を超える感染した対象において現れる(Kuipersら、1995、Aliment Pharmacol Ther、9 Suppl 2: 59〜69頁)。ヘリコバクター・ピロリ感染はまた、最も頻繁に致死的となる悪性腫瘍の1つである非心臓性胃腺がんのリスクの増加、及び胃粘膜関連リンパ組織(MALT)リンパ腫(Suerbaum & Michetti、2002、N Engl J Med、347: 1175〜1186頁; Atherton (2006)、Annu Rev Pathol. 1:63〜96頁)、並びに慢性蕁麻疹(じんましん)とも関連する。
【００１４】
疫学的人口研究は、胃粘膜における生きたヘリコバクター・ピロリの有病率は、先進国におけるアレルギーの発生と反比例することを示唆している。例えば、Zevitら(2011)、Helicobacter、17: 30〜35頁; Shiotaniら(2008)、BMJ、320: 412〜7頁; Chen & Blaser (2007)、Arch Intern Med、167: 281〜7頁; McCuneら(2003)、Eur J Gastroenterol Hepatol、15: 637〜40頁; Reibmanら(2008)、PLoS ONE、3: e4060頁; Konturekら(2008)、Med Sci Monit、14:CR453〜8頁を参照されたい。しかしながら、いくつかの他の研究は、下降するヘリコバクター・ピロリ感染率と上昇するアレルギー率との相関は正確ではないことを示唆してきた。例えば、Zevitら(2011)、上掲; Rajら(2009)、J Infect Dis、199:914〜5頁を参照されたい。これらの矛盾する報告は、ヘリコバクター・ピロリによる胃粘膜の定着の減少がアトピーマーチに直接関与するかしないかに関する不確実性を示唆している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】WO2005/030249
【特許文献２】米国特許第4,708,871号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Schadewaldt H、1980、Geschichte der Allergies in vier Dustri-Verlag
【非特許文献２】Matthias Wjst、2009、Allergy, Asthma & Clinical Immunology. 5:8頁
【非特許文献３】Pawnkar R、Walter Canonica G、Holgate ST、Lockey RF、2001、World Allergy Organization (WAO) White Book on Allergy
【非特許文献４】Martin PEら、2011、J. Allergy Clin. Immunol. 127:1473〜1479頁
【非特許文献５】Mullins RJ、2007、Med J Aust. 186: 618〜621頁
【非特許文献６】Osborne NJら、2011、J. Clin. Immunol. 127:668〜676頁
【非特許文献７】Prescott S及びAllen KJ、2011、Pediatr. Allergy Immunol. 22:155〜160頁
【非特許文献８】Strachan DP、1989、BMJ、299:1259〜1260頁
【非特許文献９】Strachan DP、Harkins LS、Golding J、1997、Clin. Exp. Allergy. 27:151〜155頁
【非特許文献１０】Renz H及びHerz U、2002、Eur. Respir. J. 19:158〜171頁
【非特許文献１１】Guarner Fら、2006、Nat. clin. Pract. Gastroenterol. Hepatol. 3: 275〜284頁
【非特許文献１２】Dubeyら、1991、Eur. Cytokine Network、2:147〜152頁
【非特許文献１３】Beraudら、1991、Cell Immunol. 133:379〜389頁
【非特許文献１４】Hahnら、1987、Eur. J Immunol. 18:2037〜2042頁
【非特許文献１５】Kapsenbergら、Immunol Today、12:392〜395頁
【非特許文献１６】Romragnani、編、TH1 and TH2 Cells in Health and Disease. Chem. Immunol.、Karger、Basel、63、158〜170頁及び187〜203頁(1996)
【非特許文献１７】van der Heijdenら、1991、J Invest Derm. 97:389〜394頁
【非特許文献１８】Walkerら、1992、Am. Rev. Resp. Dis. 148:109〜115頁
【非特許文献１９】Del Preteら、1989、J. Clin. Invest. 84:1830〜1835頁
【非特許文献２０】Schandeneら、1993、Eur. J. Immunol. 23:56〜60頁
【非特許文献２１】Kuipersら、1995、Aliment Pharmacol Ther、9 Suppl 2: 59〜69頁
【非特許文献２２】Suerbaum & Michetti、2002、N Engl J Med、347: 1175〜1186頁
【非特許文献２３】Atherton (2006)、Annu Rev Pathol. 1:63〜96頁
【非特許文献２４】Zevitら(2011)、Helicobacter、17: 30〜35頁
【非特許文献２５】Shiotaniら(2008)、BMJ、320: 412〜7頁
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
1.一般
本発明をもたらす研究において、本発明者らは、例えば、対象におけるアトピー又はアトピーマーチの発達を防止するか、又は遅延させることにより、アレルギーに対する哺乳動物対象の免疫系の寛容性を改善するための組成物を同定及び/又は調製しようとした。特に、本発明者らは、哺乳動物対象におけるアレルゲンに対するアレルギー性免疫応答の重症度若しくは発生を防止するか、若しくは減少させることができるか、又はアレルゲンへの対象の曝露後の哺乳動物対象における気道過敏性等のアレルギー疾患の重症度を防止するか、若しくは減衰させることができる組成物を同定及び/又は調製しようとした。本発明者らはまた、小児、例えば、新生児及び年少者における湿疹等のアレルギー疾患の、例えば、青年期及び/又は成人期の以後の人生で食物アレルギー及び/又は重症喘息へのアトピーマーチ及び進行を防止するか、又は中断するか、又は制限することができる組成物を同定及び/又は調製しようとした。
【００１８】
本発明者らは、最適にバランスのとれた免疫系は新生児期の初期に発達し、結果として、対象におけるアトピーマーチを防止するための薬剤の投与並びに青年期及び成人におけるアレルギーの発達が、新生児に、又は小児期早期に最適に送達可能であると結論付けた。
【００１９】
本明細書に例示されるように、本発明者らは、アレルギーのマウスモデルにおいて新生児又は成体に投与された不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリを含む経口組成物が、例えば、気道又は肺の抵抗の測定により決定されるように、抗原チャレンジに対するアレルギー応答の発生又は重症度を低下させることを示した。かくして、不活化及び/若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ（例えば、不活化されたヘリコバクター・ピロリは、それが投与される哺乳動物の粘膜に定着する生きているヘリコバクター・ピロリの同じ能力を有さない、或いは、不活化若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリが、それが投与される哺乳動物の粘膜に定着することができない）又はヘリコバクター・ピロリ細胞溶解物の投与は、例えば、アレルギー性湿疹、蕁麻疹、じんましん、鼻炎、喘鳴、気道抵抗、気道制限、又は気道過敏性若しくは過活動、食物アレルギー、喘息等の1つ又は複数のアレルギー状態の開始を遅延させるか、又は防止するか、又は中断させるか、又は減速させることにより、対象におけるアトピーマーチ又はさらなるアトピーマーチを中断させるか、又は減速させるか、又は停止させるか、又は防止すると考えられる。
【００２０】
従って、本発明は、1つ又は複数のアレルゲンに対する個体の過敏性の全体的な減少を提供することによって、1つ又は複数のアレルギー状態の開始を遅延させるか、又は防止するか、又は中断させるか、又は減速させる。低下した過敏性は、特異的アレルゲン、例えば、過敏性の許容されたモデルアレルゲン、例えば、エアロゾル化形態で、又は強制飼養により、マウス動物、例えば、BALB/c又はC57/BL/6又はSJL/Jマウスに対するチャレンジとして投与されるオブアルブミン及び/又はブタクサに対する対象の感度の低下により証明することができる。例えば、Renzら、J. Allergy Clin. Immunol. 89:1127〜1138頁(1992); Renzら、J. Immunol. 151:1907〜1917頁(1993); Salogaら、J. Clin. Invest. 91:133〜140頁(1993); Larsenら、J. Clin. Invest. 89:747〜752頁(1992); Oshibaら、J. Clin, Invest. 97: 1938〜1408頁(1996)を参照されたい。
【００２１】
例えば、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ、例えば、単離された不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリを、湿疹について無症状であるか、又は、例えば、鼻炎又は喘鳴又は気道抵抗若しくは制限又は気道過敏性を特徴とするアレルギーについて無症状であるか、又は喘息について無症状である対象に投与することにより、その後の湿疹及び/又はアレルギー及び/又は喘息の開始を防止することができる。1つの特定例においては、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリを新生児又は乳幼児等の年少の対象に投与して、乳幼児における湿疹又は以後の人生、例えば、青年期若しくは成人期におけるアレルギー若しくは喘息のその後の開始を防止する。別の例においては、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ、例えば、単離された不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリを青年期又は成人の対象に投与して、対象における湿疹又は以後の人生等におけるアレルギー若しくは喘息のその後の開始を防止する。これは、アレルギー性湿疹、アレルギー又は喘息が、1つ又は複数の環境アレルゲン、例えば、花粉アレルゲン、チリダニアレルゲン、動物アレルゲン、化学アレルゲン等の1つ又は複数のチャレンジアレルゲンへの対象の曝露により、人生の任意の段階で誘導される背景である。
【００２２】
或いは、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ、例えば、単離された不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリを、例えば、鼻炎又は喘鳴又は気道抵抗若しくは制限、又は喘息を特徴とする、アレルギー性湿疹、アレルギーの1回又は複数回の発生に以前に罹患した対象に投与することにより、その後の発作を防止することができるか、又はその後の発作の重症度を低下させることができる。1つの特定例においては、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ、例えば、単離された不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリを、アレルギー性湿疹に罹患した年少の対象に投与して、その後の発作を防止するか、又はその後の発作の重症度を低下させ、場合により、対象におけるさらなるアトピーマーチを防止するか、又は減速させる。別の例においては、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ、例えば、単離された不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリを、アレルギー性疾患及び/又はアレルギー及び/又は喘息に以前に罹患した青年期又は成人の対象に投与して、その後の発作を防止するか、又はその後の発作の重症度を低下させ、場合により、対象におけるさらなるアトピーマーチを防止するか、又は減速させる。
【００２３】
疫学的な文脈では、対象への不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ、例えば、単離された不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリの投与は、集団におけるアレルギー性免疫応答の発生を減少させ、特に、彼らが年少者であった時に処置された集団の青年期及び/又は成人メンバーにおけるアレルギー性免疫応答の発生を減少させる。
【００２４】
不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ細菌がアレルギー性気道疾患のマウスモデルにおいて対象を保護することの証明は、消化性潰瘍及び/又は胃がんの誘導等の、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞の使用と関連する健康上のリスクを回避する有意な利点を提供する。換言すれば、不活化及び/若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ又はヘリコバクター・ピロリの溶解物は、免疫系の発達に正の影響を及ぼし、アレルゲンに対するアレルギー応答を防止するか、又は減少させるための安全で制御されたアプローチを提供する。同様に、不活化及び/若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ又はヘリコバクター・ピロリの溶解物は、人生の早期、例えば、新生児及び/又は年少者等の小児における事象を標的とすることによりアトピーマーチを遅延させるか、又は防止するための安全で制御されたアプローチを提供する。
【００２５】
本発明は、かくして、例えば、0〜5歳等の小児又は乳幼児への、不活化及び/若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ細菌並びに/又はその溶解物の投与、例えば、反復投与によって、例えば、アレルギー性湿疹及び/又は生涯にわたる食物アレルギー及び/又はアレルギー性喘息としてのアレルギーの重症度又は発生を減少させるためのバランスのとれた免疫の発達の促進を提供する。不活化及び/若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ細菌並びに/又はその溶解物はまた、哺乳動物対象の免疫系をモジュレートする、及び/又はアレルギーに対する免疫系の寛容性を改善するのにも有用である。
【００２６】
本明細書に開示されるように、不活化及び/若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ細菌並びに/又はその溶解物は、食物成分又はメディカルフード、例えば、ミルクを含む、若しくはミルクを含まない、及び/若しくは栄養補助食品等の食品として、並びに/又は錠剤として、並びに/又はカプセルとして製剤化及び/又は使用される。そのような製剤は、好ましくは、アレルゲンに対する免疫系の寛容性を改善する、及び/又は例えば、成人及び/若しくは青年期におけるアレルギー症状を防止するか、若しくは減少させるための粘膜組成物である。製剤は、好ましくは、湿疹及び/若しくは食物アレルギーに罹患しているか、又は湿疹若しくは食物アレルギーの発生に罹りやすい、例えば、0〜5歳の小児及び/又は乳幼児への、反復投与、例えば、毎日の投与のためのものである。これに関して、対象は、0〜5歳又は0〜4歳又は0〜3歳又は0〜2歳又は0.5〜5歳又は0.5〜4歳又は0.5〜3歳又は0.5〜2歳又は0.5〜1歳又は1〜2歳又は1〜3歳又は1〜4歳又は1〜5歳又は2〜3歳又は2〜4歳又は2〜5歳又は3〜4歳又は3〜5歳でアレルギーの発生に罹りやすくてもよい。例えば、以後の人生で食物アレルギー及び/又はアレルギー性喘息への進行等の、対象におけるアトピーマーチを防止又は制限するために、対象は、不活化されたヘリコバクター・ピロリ又はその細胞抽出物若しくは溶解物を含む複数の用量の製剤を投与され、第1の用量は対象がアレルギーの発生に罹りやすくなる後の時点で投与される。例えば、対象は、特に、アレルギーの発生に罹りやすい乳幼児又は小児の場合、抗生物質療法又は処方された抗生物質療法を取ってもよい。
【００２７】
理論又は特定の作用様式により束縛されるものではないが、本発明者らは、本発明の不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリが、細胞構造足場及び/又は細胞構造足場の集合体若しくは凝集体を保持及び/又は形成すると主張した。理論又は特定の作用様式により束縛されるものではないが、本発明者らはまた、この足場及び/又は集合体若しくは凝集体が、アレルゲンに対するバランスのとれた免疫応答、例えば、対象におけるバランスのとれたTh1/Th2免疫応答に向かう対象における免疫モジュレーションを容易にする、並びに/又は例えば、本明細書に記載の1つ若しくは複数のアレルギー状態の開始を遅延させるか、若しくは防止するか、若しくは中断させるか、若しくは減速させることにより、対象におけるアトピーマーチ若しくはさらなるアトピーマーチを中断させるか、若しくは減速させるか、若しくは停止させるか、若しくは防止するのに重要であり得ると主張した。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明の特定例
本発明の範囲は、以下の実施例の後に続く、本出願と共に出願された特許請求の範囲から明らかであろう。本出願と共に出願された特許請求の範囲は、本明細書に組込まれる。本発明の範囲はまた、以下の特定の実施形態の説明及び/又は好ましい実施形態の詳細な説明から明らかであろう。
【００２９】
従って、一例において、本発明は、ヘリコバクター・ピロリ細胞、その細胞溶解物又はその組合せと、薬学的に許容される担体とを含む組成物であって、前記ヘリコバクター・ピロリが、例えば、不活化された細胞と同じ遺伝子型を有する生きているヘリコバクター・ピロリ細胞等の生きているヘリコバクター・ピロリ細胞と比較した哺乳動物の粘膜に定着する能力の低下に基づいて、又は前記哺乳動物の粘膜に定着することができないことに基づいて不活化され、好ましくは、ヘリコバクター・ピロリが、例えば、熱処理によって死滅している、前記組成物を提供する。
【００３０】
いくつかの実施形態においては、本発明の組成物は、薬学的に許容される担体と共に、ヘリコバクター・ピロリ細胞及び/又はその細胞溶解物から本質的になり、ここで、前記ヘリコバクター・ピロリ細胞は、例えば、不活化された細胞と同じ遺伝子型を有する生きているヘリコバクター・ピロリ細胞と比較した哺乳動物の粘膜に定着する能力の低下に基づいて、又は前記哺乳動物の粘膜に定着することができないことに基づいて不活化され、好ましくは、ヘリコバクター・ピロリは、例えば、熱処理によって死滅している。
【００３１】
当業者であれば、任意のヘリコバクター・ピロリ株が用いられるが、いくつかの例においては、ヘリコバクター・ピロリ株がcagAマイナス(cagA-)であることを理解できるであろう。いくつかの例においては、ヘリコバクター・ピロリ株はcagA-であり、また、vacA遺伝子の毒素原性s1及びm1対立遺伝子について陽性でもある。
【００３２】
いくつかの例においては、本発明は、National Measurement Instituteに受託番号V09/009101の下で寄託されたOND737; National Measurement Instituteに受託番号V09/009102の下で寄託されたOND738; National Measurement Instituteに受託番号V09/009103の下で寄託されたOND739; National Measurement Instituteに受託番号V10/014059の下で寄託されたOND248; National Measurement Instituteに受託番号V10/014060の下で寄託されたOND256; National Measurement Instituteに受託番号V09/009104の下で寄託されたOND740; National Measurement Instituteに受託番号V13/023374の下で寄託されたOND79、及び/若しくはNational Measurement Instituteに受託番号V14/013016の下で寄託されたOND86、又はその継代された株、変異体若しくは誘導体からなる群から選択される株の特徴を有するヘリコバクター・ピロリの株を提供する。
【００３３】
いくつかの例においては、本発明のヘリコバクター・ピロリ株は、ヒト宿主等の動物宿主を介して継代されている。例えば、本発明のヘリコバクター・ピロリ株は、ヒト対象におけるOND79株の継代の後に、例えば、ヘリコバクター・ピロリOND79株によるヒト対象の胃粘膜の感染及び/又は定着の後に、ヘリコバクター・ピロリ株OND79から誘導される。1つのそのような例においては、本発明のヘリコバクター・ピロリ株は、OND86である。
【００３４】
本発明において用いられるヘリコバクター・ピロリ株は、典型的には、非遺伝子改変細菌であるが、いくつかの例においては、ヘリコバクター・ピロリ株は、少なくとも1つの異種抗原又はその機能的断片をコードする1つ又は複数の核酸分子を含むように遺伝的に改変される。
【００３５】
いくつかの例においては、核酸分子は、染色体外に、例えば、シャトルベクター等のプラスミドベクター上に存在する。好ましくは、プラスミドベクターは、(a)異種抗原をコードする核酸配列及び(b)ベクターがヘリコバクター・ピロリ株に形質転換された場合に核酸の発現を制御することができるそれに作動可能に連結された制御又は調節配列を含む。他の例においては、核酸分子は、ヘリコバクター・ピロリ中への形質転換の際にヘリコバクター・ピロリ染色体中に挿入される。
【００３６】
好適な抗原は、当業者には公知である。好ましくは、抗原は、環境抗原であり、単独で、又は2つ以上のそのような抗原の組合せとして用いることができる。
【００３７】
いくつかの例においては、本発明の組成物は、アジュバントを含む。アジュバントは、当業界で公知の任意のアジュバントであってもよい;しかしながら、好ましくは、アジュバントは、ミョウバン、百日咳毒素、ラクトフコペンタオースIII、ホスホポリマー、完全Freundアジュバント、モノホスホリルリピドA、3-デ-O-アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)、アルミニウム塩、CpG含有オリゴヌクレオチド、免疫刺激DNA配列、サポニン、モンタニドISA720、SAF、ISCOMS、MF-59、SBAS-3、SBAS-4、Detox、RC-529、アミノアルキルグルコサミニド4-リン酸、及びLbeIF4A、又はその組合せからなる群から選択される。或いは、他の例においては、本発明の粘膜組成物は、アジュバントを含まない、及び/又はアジュバントの非存在下で投与される。
【００３８】
本発明は、アレルギーを発症するか、又はアレルギーを有するリスクのある哺乳動物におけるアレルギーを防止する、及び/又は処置するのに有用である。いくつかの例においては、アレルギーは、接触皮膚炎、慢性炎症障害、アレルギー性アトピー性障害、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、高IgE症候群、オーメン症候群、乾癬、花粉症、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、湿疹及び食物アレルギーからなる群から選択される。
【００３９】
従って、さらなる例においては、本発明は、単離されたヘリコバクター・ピロリ細胞等のヘリコバクター・ピロリ細胞、その細胞溶解物又はその組合せと、薬学的に許容される担体とを含む哺乳動物におけるアレルギーを防止するか、又は処置するのに使用するための組成物であって、前記ヘリコバクター・ピロリ細胞が死滅しているか、又は前記哺乳動物の粘膜に定着することができない、前記組成物を提供する。場合により、細胞溶解物は、不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞の全細胞溶解物(WCL)である。
【００４０】
さらなる例においては、本発明は、単離されたヘリコバクター・ピロリ細胞等のヘリコバクター・ピロリ細胞、又はその細胞溶解物又はその組合せと、薬学的に許容される担体とを含む組成物であって、前記ヘリコバクター・ピロリ細胞が、例えば、不活化された細胞と同じ遺伝子型を有する生きているヘリコバクター・ピロリ細胞と比較した哺乳動物の粘膜に定着する能力の低下に基づいて、又は哺乳動物の粘膜に定着することができないことに基づいて不活化される、前記組成物を提供する。好ましくは、組成物は、粘膜送達のためのものである。場合により、細胞溶解物は、不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞の全細胞溶解物(WCL)である。
【００４１】
別の例においては、本発明は、単離された不活化及び/若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ細胞等の、不活化及び/若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ細胞、又はその細胞溶解物を含む組成物であって、対象におけるアトピーマーチ又はアトピーマーチの進行を中断させるか、又は減速させるか、又は停止させるか、又は防止するために対象に粘膜投与されるように調合される、前記組成物を提供する。例えば、細胞溶解物は、WCLである。1つのそのような例においては、対象におけるアトピーマーチ又はアトピーマーチの進行を中断させること、又は減速させること、又は停止させること、又は防止することは、対象における1つ又は複数のアレルギー状態の開始を遅延させること、又は防止すること、又は中断させること、又は減速させることを含む。
【００４２】
例えば、アレルギー状態は、アレルギー性湿疹、蕁麻疹、じんましん、鼻炎、喘鳴、気道抵抗、気道制限、肺炎症、食物アレルギー、又は喘息を含んでもよい。好ましくは、アレルギー状態は、気道抵抗又はアレルゲンに応答した気道過敏性若しくは過活動を含み、ここで、組成物は、前記気道抵抗を低減させるためのものである。或いは、又は更に、アレルギー状態は、アレルゲンに応答した肺炎症を含み、ここで、組成物は、例えば、肺における細胞浸潤のレベルの低下を特徴とする、前記肺炎症を低減させるためのものである。或いは、又は更に、アレルギー状態は、アレルゲン特異的IgE抗体の血清レベルの上昇及び/又は気管支肺胞洗浄(BAL)中の1つ若しくは複数の炎症性サイトカインのレベルの上昇及び/又は肺中の細胞浸潤レベルの上昇を特徴とする。例えば、組成物は、アレルゲン特異的IgE抗体の血清レベル及び/又は気管支肺胞洗浄(BAL)中の1つ若しくは複数の炎症性サイトカインのレベル及び/又は肺中の細胞浸潤レベルを、アレルゲンに曝露され、前記組成物を投与されない対象におけるそのレベルと比較して低下させる。或いは、組成物は、アレルゲン特異的IgE抗体の血清レベルの増加を防止するか、若しくは遅延させる、及び/又は気管支肺胞洗浄(BAL)中の1つ若しくは複数の炎症性サイトカインのレベルの増加を防止するか、若しくは遅延させる、及び/又はアレルゲンに曝露された対象における肺中の細胞浸潤レベルの増加を防止するか、若しくは遅延させる。
【００４３】
好ましくは、本明細書に記載の任意の例に従って記載される組成物は、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞又は株と比較して対象の粘膜に定着する能力が低下したか、又は対象の粘膜に定着することができないヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を含む。或いは、又は更に、本明細書に記載の任意の例による組成物は、例えば、ガンマ照射及び/若しくは紫外線照射等の照射並びに/又は熱処理並びに/又は化学的手段並びに/又は際への曝露並びに/又は塩基への曝露並びに/又は圧力等の物理的手段並びに/又は凍結乾燥並びに/又は凍結-解凍により不活化されるヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を含む。或いは、又は更に、本明細書の任意の例による組成物は、例えば、細胞が不可逆的に代謝的に不活性となるように、熱処理によって死滅させたヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を含む。別の例においては、本明細書の任意の例による組成物は、ヘリコバクター・ピロリ細胞を不活化するためのプロセス及びヘリコバクター・ピロリ細胞を死滅するためのプロセスにかけられたヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を含む。1つの特定例においては、本明細書の任意の例に従って記載される不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞又は株は、死滅している。
【００４４】
或いは、又は更に、本明細書の任意の例に従って記載される組成物は、ヘリコバクター・ピロリ細胞の溶解物、例えば、WCLを含み、ここで、細胞は、ヘリコバクター・ピロリ細胞を不活化するためのプロセス及び/又はヘリコバクター・ピロリ細胞を死滅するためのプロセスにかけられている。
【００４５】
例えば、本明細書の任意の例に従って記載される不活化されたヘリコバクター・ピロリは、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、ガンマ照射及び/若しくは紫外線照射等の照射に曝露することにより、並びに/又は約375nm〜約500nmの範囲の波長若しくは約400nm〜約420nmの範囲、例えば、405nmの紫色光等の可視光への曝露により調製される。一例においては、本明細書の任意の例に従って記載される不活化されたヘリコバクター・ピロリは、約257.3nm等の約100nm〜約280nmの範囲の波長等の紫外線C(UVC)照射及び/又は約280nm〜約315nmの範囲の波長等の紫外線B(UVB)照射及び/又は約315nm〜約400nmの範囲の波長等の紫外線A(UVA)照射に、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を曝露することを含む。好ましくは、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞は、約257.3nm等の約100nm〜約280nmの範囲のUVC光に曝露され、及び/又は生きているヘリコバクター・ピロリは約405nmの紫色光に曝露される。
【００４６】
或いは、又は更に、本明細書の任意の例に従って記載される不活化されたヘリコバクター・ピロリは、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、ホルムアルデヒド及び/若しくはβ-プロピオラクトン及び/若しくはエチレンイミン及び/若しくはバイナリーエチレンイミン及び/若しくはチメロサール及び/若しくはポリエチレンイミン官能化酸化亜鉛ナノ粒子等の1つ若しくは複数の化学物質、又はその誘導体に曝露することにより調製される。例えば、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、約0.01%〜約1%(w/w)又は約0.01%〜約0.1%(w/w)又は約0.025%〜約0.1%(w/w)の濃度のホルムアルデヒドへの曝露により不活化することができる。
【００４７】
或いは、又は更に、本明細書の任意の例に従って記載される不活化されたヘリコバクター・ピロリは、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、約40℃〜約70℃以上の範囲の温度等での熱処理に曝露することにより調製される。或いは、又は更に、本明細書の任意の例に従って記載される不活化されたヘリコバクター・ピロリは、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、1つ若しくは複数の酸又はpH3.0以下等の低いpH環境及び/又は1つ若しくは複数の塩基又はpH9.0以上等の高いpH環境に曝露することにより調製される。
【００４８】
或いは、又は更に、本明細書の任意の例に従って記載される不活化されたヘリコバクター・ピロリは、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、亜硫酸水素ナトリウム等の1つ若しくは複数の還元剤及び/又は過酸化水素等の1つ若しくは複数の酸化剤に曝露することにより調製される。
【００４９】
或いは、又は更に、本明細書の任意の例に従って記載される不活化されたヘリコバクター・ピロリは、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、胆汁塩に曝露することにより調製される。
【００５０】
或いは、又は更に、本明細書の任意の例に従って記載される不活化されたヘリコバクター・ピロリは、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞又は株の突然変異誘発により調製される。
【００５１】
或いは、又は更に、本明細書の任意の例に従って記載される不活化されたヘリコバクター・ピロリは、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を凍結乾燥するか、又は凍結-乾燥することにより調製される。或いは、又は更に、本明細書に任意の例に従って記載される不活化されたヘリコバクター・ピロリは、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を凍結及び解凍する1回以上のサイクルを実施することにより調製される。
【００５２】
例えば、本明細書の任意の例に従って記載される死滅させたヘリコバクター・ピロリは、生きている、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、少なくとも約60秒間にわたる約60℃以上の温度、好ましくは、約60℃又は約70℃又は約80℃又は約90℃又は約100℃又は約110℃又は約120℃又は約130℃又は約140℃又は約150℃への曝露による等の熱処理に曝露することにより調製され、前記温度への曝露は、少なくとも2分間又は少なくとも3分間又は少なくとも4分間又は少なくとも5分間又は少なくとも6分間又は少なくとも7分間又は少なくとも8分間又は少なくとも9分間又は少なくとも10分間又は少なくとも20分間又は少なくとも30分間又は少なくとも40分間又は少なくとも50分間又は少なくとも1時間又は少なくとも2時間又は少なくとも3時間又は少なくとも4時間又は少なくとも5時間又は少なくとも6時間又は少なくとも7時間又は少なくとも8時間又は少なくとも9時間又は少なくとも10時間又は少なくとも11時間又は少なくとも12時間又は少なくとも13時間又は少なくとも14時間又は少なくとも15時間又は少なくとも16時間又は少なくとも17時間又は少なくとも18時間又は少なくとも19時間又は少なくとも20時間又は少なくとも21時間又は少なくとも22時間又は少なくとも23時間又は少なくとも1日間又は少なくとも2日間又は少なくとも3日間又は少なくとも5日間又は少なくとも5日間又は少なくとも6日間又は少なくとも7日間である。1つの好ましい例においては、生きている、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリは、単一のそのような高温への曝露によるか、又は約70℃の第1の温度への曝露の後、約90℃若しくは約95℃の第2の温度への曝露等の少なくとも2つの異なる高温への曝露により死滅させる。1つのそのような好ましい例においては、生きている、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリは、約70℃の温度に約10分間の曝露、次いで、約90℃又は約95℃の温度に約5分間の曝露により死滅させる。
【００５３】
或いは、又は更に、本明細書の任意の例に従って記載される死滅させたヘリコバクター・ピロリは、生きている、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞又は株をオートクレーブすること等により、生きている、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を蒸気及び高圧の存在下で高温に曝露することにより調製される。例えば、生きている、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリは、細菌細胞又は株を約15分間、約121℃及び約15psiで、又は約3分間、約132℃及び約30psiでオートクレーブすることにより死滅させる。
【００５４】
或いは、又は更に、本明細書の任意の例に従って記載される死滅させたヘリコバクター・ピロリは、生きている、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、1つ又は複数の殺菌剤に曝露することにより調製される。例えば、生きている、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリを、リファンピン、アモキシシリン、クラリスロマイシン、リファマイシン、リファキシミン、リファマイシン誘導体3'-ヒドロキシ-5'-(4-イソブチル-1-ピペラジニル)ベンゾオキサジノリファマイシン、同義、KRM-1648及び/又はリファマイシン誘導体3'-ヒドロキシ-5'-(4-プロピル-1-ピペラジニル)ベンゾオキサジノリファマイシン、同義、KRM-1657から選択される1つ又は複数の抗生物質を用いる処理にかけることができる。
【００５５】
或いは、又は更に、本明細書の任意の例に従って記載される死滅させたヘリコバクター・ピロリは、生きている、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、ガンマ照射及び/若しくは紫外線照射等の照射に曝露することにより、並びに/又は約375nm〜約500nmの範囲若しくは約400nm〜約420nmの範囲の波長等の可視光への曝露により調製される。例えば、死滅させたヘリコバクター・ピロリは、生きている、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、約257.3nm等の約100nm〜約280nmの範囲の波長等の紫外線C(UVC)照射及び/又は約280nm〜約315nmの範囲の波長等の紫外線B(UVB)照射及び/又は約315nm〜約400nmの範囲の波長等の紫外線A(UVA)照射に曝露することを含むプロセスによって調製される。好ましくは、生きている、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリを、約257.3nm等の約100nm〜約280nmの範囲のUVC光に曝露する、並びに/又は生きている、及び/若しくは不活化されたヘリコバクター・ピロリを、約405nmの紫色光に曝露する。
【００５６】
或いは、又は更に、本明細書の任意の例に従って記載される死滅させたヘリコバクター・ピロリは、例えば、約20kHz以上等の超音波周波数での超音波処理により調製される。
【００５７】
或いは、又は更に、本明細書の任意の例に従って記載される死滅させたヘリコバクター・ピロリは、生きている、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞又は株の突然変異誘発により調製される。
【００５８】
好ましくは、本明細書の任意の例に従って記載される死滅させたヘリコバクター・ピロリは、最初に、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、ガンマ照射等の照射及び/若しくはUVC光等の紫外線照射に曝露すること、並びに/又は約375nm〜約500nmの範囲若しくは約400nm〜約420nmの範囲の波長等の可視光への曝露によりヘリコバクター・ピロリを不活化した後、不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、本明細書の任意の例に従って記載される熱処理に曝露することによって、不活化されたヘリコバクター・ピロリを死滅するか、又は不活化されたヘリコバクター・ピロリを不可逆的に代謝的に不活性にすることにより調製される。
【００５９】
例えば、不活化されたヘリコバクター・ピロリは、少なくとも約60秒間にわたる約60℃以上の温度、好ましくは、約60℃又は約70℃又は約80℃又は約90℃又は約100℃又は約110℃又は約120℃又は約130℃又は約140℃又は約150℃の温度に曝露され、前記温度曝露は、少なくとも2分間又は少なくとも3分間又は少なくとも4分間又は少なくとも5分間又は少なくとも6分間又は少なくとも7分間又は少なくとも8分間又は少なくとも9分間又は少なくとも10分間又は少なくとも20分間又は少なくとも30分間又は少なくとも40分間又は少なくとも50分間又は少なくとも1時間又は少なくとも2時間又は少なくとも3時間又は少なくとも4時間又は少なくとも5時間又は少なくとも6時間又は少なくとも7時間又は少なくとも8時間又は少なくとも9時間又は少なくとも10時間又は少なくとも11時間又は少なくとも12時間又は少なくとも13時間又は少なくとも14時間又は少なくとも15時間又は少なくとも16時間又は少なくとも17時間又は少なくとも18時間又は少なくとも19時間又は少なくとも20時間又は少なくとも21時間又は少なくとも22時間又は少なくとも23時間又は少なくとも1日間又は少なくとも2日間又は少なくとも3日間又は少なくとも5日間又は少なくとも5日間又は少なくとも6日間又は少なくとも7日間である。1つのそのような例においては、不活化されたヘリコバクター・ピロリは、単一のそのような高温又は約70℃の第1の温度への、例えば、約10分間の曝露、次いで、約90℃若しくは約95℃の第2の温度への、例えば、約5分間の曝露等の少なくとも2つの異なる高温に曝露される。
【００６０】
1つの好ましい例においては、本明細書の任意の例に従って記載される死滅させたヘリコバクター・ピロリは、最初に、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、UVC光、例えば、約257.3nm等の紫外線照射に曝露することによって、ヘリコバクター・ピロリを不活化した後、不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、本明細書の任意の例に従って記載される熱処理に曝露することによって、不活化されたヘリコバクター・ピロリを死滅するか、又は不活化されたヘリコバクター・ピロリを不可逆的に代謝的に不活性にすることにより調製される。
【００６１】
従って、1つの好ましい例において、本明細書の任意の例による組成物は、照射によりヘリコバクター・ピロリを不活化するためのプロセス及び熱処理により不活化されたヘリコバクター・ピロリを死滅するためのプロセスにかけられたヘリコバクター・ピロリを含む。
【００６２】
或いは、又は更に、本明細書の任意の例に従って記載されるヘリコバクター・ピロリは、生きているか、又は不活化されたヘリコバクター・ピロリを、嫌気的条件に曝露することにより、例えば、ヘリコバクター・ピロリが培養される気圧を、微好気的環境から嫌気的環境に変化させて、例えば、胃から下部消化管(例えば、小腸及び/又は大腸)へのヘリコバクター・ピロリの流出中のin vivoの気圧条件を模倣することにより、不活化及び/又は死滅させる。例えば、生きている(新鮮に増殖させたもの等)ヘリコバクター・ピロリは、細菌細胞を嫌気的条件に約1日〜約5日間以上、例えば、少なくとも約24時間、又は少なくとも約48時間若しくは少なくとも約72時間若しくは少なくとも約96時間若しくは少なくとも約120時間にわたって曝露すること(例えば、増殖又はインキュベートすること)により不活化される。1つのそのような例においては、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞は、該細胞を嫌気的条件に曝露することにより、及び該細胞の熱処理により不活化される。
【００６３】
別の例においては、本明細書の任意の例に従って記載される生きているか、又は不活化されたヘリコバクター・ピロリは、生きているか、又は不活化された細菌細胞を、嫌気的条件に約1日〜約5日間以上、例えば、少なくとも約24時間、又は少なくとも約48時間若しくは少なくとも約73時間若しくは少なくとも約96時間若しくは少なくとも約120時間にわたって曝露すること(例えば、インキュベートする)により死滅させる。
【００６４】
1つの好ましい例においては、本明細書の任意の例による組成物は、細菌細胞を嫌気的条件に約1日〜約5日間以上、例えば、少なくとも約24時間、又は少なくとも約48時間若しくは少なくとも約73時間若しくは少なくとも約96時間若しくは少なくとも約120時間にわたって曝露する(例えば、増殖させるか、若しくはインキュベートする)ことによりヘリコバクター・ピロリを不活化するためのプロセス、及び細胞の熱処理により不活化されたヘリコバクター・ピロリを死滅するためのプロセスにかけられたヘリコバクター・ピロリを含む。
【００６５】
さらなる例において、本明細書に記載の任意の例による組成物は、薬学的に許容される担体を含む。1つの好ましい例においては、組成物は、アジュバントを含まない。
【００６６】
さらなる例においては、本明細書に記載の任意の例による組成物は、摂取のために調合された経口製剤である。或いは、本明細書に記載の任意の例による組成物は、吸入のために調合される。例えば、本明細書に記載の任意の例による組成物は、食品又は栄養補助食品として調合される。1つのそのような例においては、組成物は、乳幼児用調製乳及び/又はタンパク質補助食品を含むか、又はそれとして調合される。一例においては、組成物は、乳製品又は非乳製品である。一例においては、組成物は、例えば、摂取のための錠剤として調合される。或いは、組成物は、例えば、摂取及び/又は吸入のための粉末形態にある。或いは、組成物は、液体形態にある。一例においては、組成物は、アジュバントを含まない。
【００６７】
一例においては、本明細書に記載の任意の例による組成物は、発達したリンパ構造を有さない乳幼児等の乳幼児への投与(例えば、飲食による)のために調合される。例えば、本明細書に記載の任意の例による組成物は、0〜約5歳、又は0〜約4歳、又は0〜約3歳、又は0〜約2歳、又は0〜約1歳の年齢の乳幼児への投与のために調合される。一例においては、本明細書に記載の任意の例による組成物は、0〜約2歳の年齢の乳幼児への投与(例えば、飲食による)のために調合される。別の例においては、組成物は、約4ヶ月〜約12ヶ月又は約4ヶ月〜約18ヶ月又は約4ヶ月〜約24ヶ月の月齢の乳幼児への投与のために調合される。別の例においては、組成物は、約6ヶ月未満の月齢の乳幼児への投与(例えば、飲食による)のために調合される。
【００６８】
別の例においては、本明細書に記載の任意の例による組成物は、約5歳より大きい小児及び/又は青年及び/又は成人への投与(例えば、飲食による)のために調合される。
【００６９】
別の例においては、本明細書に記載の任意の例による組成物は、反復投与のために調合されるか、又は例えば、週に1回、若しくは週に2回、若しくは週に3回、若しくは週に4回、若しくは週に5回、若しくは週に6回、若しくは週に7回、若しくは週に7回を超えて、若しくは1日に2回を超えて反復的に投与される。
【００７０】
一例においては、本明細書に記載の任意の例による組成物は、複数用量単位組成物として調合されるか、又は投与される。例えば、組成物の各用量は、約102個の細胞〜約1014個の細胞、又は約103個の細胞〜約1013個の細胞、又は約104個の細胞〜約1013個の細胞、又は約105個の細胞〜約1013個の細胞、又は約106個の細胞〜約1013個の細胞、又は約106個の細胞〜約1012個の細胞、又は約107個の細胞〜約1011個の細胞、又は約108個の細胞〜約1010個の細胞、又は約109個の細胞〜約1010個の細胞に対応する範囲のヘリコバクター・ピロリ細菌又はその溶解物の量を含む。例えば、組成物の各用量は、約108個の細胞、又は約109個の細胞、又は約1010個の細胞に対応するヘリコバクター・ピロリ細菌又はその溶解物の量を含む。一例においては、本明細書に記載の任意の例による組成物は、毎日の投与のために調合されるか、又は毎日投与され、ここで、前記組成物の1日用量は、約102個の細胞〜約1014個の細胞、又は約103個の細胞〜約1013個の細胞、又は約104個の細胞〜約1013個の細胞、又は約105個の細胞〜約1013個の細胞、又は約106個の細胞〜約1013個の細胞、又は約106個の細胞〜約1012個の細胞、又は約107個の細胞〜約1011個の細胞、又は約108個の細胞〜約1010個の細胞、又は約109個の細胞〜約1010個の細胞に対応する範囲のヘリコバクター・ピロリ細菌又はその溶解物の量を含む。例えば、組成物の各1日用量は、約108個の細胞、又は約109個の細胞、又は約1010個の細胞に対応するヘリコバクター・ピロリ細菌又はその溶解物の量を含む。
【００７１】
一例においては、本明細書に記載の任意の例による組成物は、少なくとも約2週間又は少なくとも約4週間又は少なくとも約6週間又は少なくとも約8週間又は少なくとも約10週間又は少なくとも約11週間又は少なくとも約12週間又は少なくとも約13週間又は少なくとも約14週間又は少なくとも約15週間又は少なくとも約16週間又は少なくとも約17週間又は少なくとも約18週間又は少なくとも約19週間又は少なくとも約20週間又は少なくとも約21週間又は少なくとも約22週間又は少なくとも約23週間又は少なくとも約24週間又は少なくとも約25週間、又は少なくとも約6ヶ月間、又は少なくとも1年間又は1年間を超えて、投与のために調合されるか、又は投与される。好ましくは、本明細書に記載の任意の例による組成物は、少なくとも約13週間又は少なくとも約3ヶ月間にわたって、投与のために調合されるか、又は投与される。
【００７２】
一例においては、本明細書に記載の任意の例による組成物は、アジュバントの非存在下で、投与のために調合されるか、若しくは投与される、及び/又は前記組成物はアジュバントを含まない。
【００７３】
別の例においては、本明細書に記載の任意の例による組成物又は組成物の用量(例えば、1日用量)は、年少の対象における免疫系のバランスのとれた発達を促進する。別の例においては、本明細書に記載の任意の例による組成物又は組成物の用量(例えば、1日用量)は、対象における適応免疫及び/又は自然免疫の獲得を促進する。別の例においては、本明細書に記載の任意の例による組成物又は組成物の用量(例えば、1日用量)は、対象におけるCD1d受容体活性化並びに/又はCD4陰性及びCD8陰性ナチュラルキラー(NK)細胞を促進するか、又は増強する。別の例においては、本明細書に記載の任意の例による組成物又は組成物の用量(例えば、1日用量)は、γδT細胞活性化を促進するか、又は増強する。別の例においては、本明細書に記載の任意の例による組成物又は組成物の用量(例えば、1日用量)は、抗原提示細胞(APC)に対する免疫認識及び提示を含む粘膜免疫を促進するか、又は増強する。別の例においては、本明細書に記載の任意の例による組成物又は組成物の用量(例えば、1日用量)は、1つ又は複数のアレルゲンに対するバランスのとれたTh1/Th2免疫応答を促進する。
【００７４】
別の例においては、本明細書に記載の任意の例による組成物は、死滅させたヘリコバクター・ピロリ細胞及び/若しくは不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞並びに/又は前記死滅させたか、若しくは不活化された細胞の細胞溶解物のある量を含む。
【００７５】
本発明は、哺乳動物におけるアレルギーを防止又は処置するのに使用するための組成物の製造であって、前記製造が、単離されたヘリコバクター・ピロリ細胞、その細胞溶解物の使用を含み、前記ヘリコバクター・ピロリ細胞が死滅しているか、又は前記哺乳動物の粘膜に定着することができない、前記製造に明確に拡張される。
【００７６】
一例においては、本発明は、単離されたヘリコバクター・ピロリ細胞、及び/又はその細胞溶解物又はその組合せ等のヘリコバクター・ピロリ細胞の使用に関し、前記ヘリコバクター・ピロリ細胞は、哺乳動物におけるアレルギーを防止又は処置ための組成物の調製において不活化又は死滅され、例えば、不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞は、それが投与される哺乳動物の粘膜に定着する、同じ遺伝子型を有する生きているヘリコバクター・ピロリ細胞の同じ能力を有さないか、又は不活化された、若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリは、それが投与される哺乳動物の粘膜に定着することができない。場合により、細胞溶解物は、不活化されたか、又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ細胞の全細胞溶解物(WCL)である。
【００７７】
別の例においては、本発明は、対象におけるアトピーマーチ又はアトピーマーチの進行を中断させるか、又は減速させるか、又は停止させるか、又は防止するための、本明細書に記載の任意の例による組成物の調製における、単離され、不活化及び/若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ等の不活化及び/若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ、又はその細胞溶解物又はその組合せの使用に関する。場合により、細胞溶解物は、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリの全細胞溶解物(WCL)である。
【００７８】
別の例においては、本発明は、対象における1つ又は複数のアレルギー状態の開始を遅延させるか、又は防止するか、又は中断させるか、又は減速させるための、本明細書に記載の任意の例による組成物の調製における、単離され、不活化及び/若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ等の不活化及び/若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ、又はその細胞溶解物又はその組合せの使用に関する。場合により、細胞溶解物は、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリの全細胞溶解物(WCL)である。
【００７９】
別の例においては、本発明は、1つ又は複数のアレルギー性湿疹、蕁麻疹、じんましん、鼻炎、喘鳴、気道抵抗、気道制限、肺炎症、食物アレルギー、又は喘息の開始を遅延させるか、又は防止するか、又は中断させるか、又は減速させるための、本明細書に記載の任意の例による組成物の調製における、単離され、不活化及び/若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ等の不活化及び/若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ、又はその細胞溶解物又はその組合せの使用に関する。場合により、細胞溶解物は、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ細胞の全細胞溶解物(WCL)である。
【００８０】
別の例においては、本発明は、アレルゲンに応答した気道抵抗の開始を遅延させるか、又は防止するか、又は中断させるか、又は減速させるための、本明細書に記載の任意の例による組成物の調製における、単離され、不活化及び/若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ等の不活化及び/若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ、又はその細胞溶解物又はその組合せの使用に関する。場合により、細胞溶解物は、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリの全細胞溶解物(WCL)である。
【００８１】
別の例においては、本発明は、アレルゲンに応答した肺炎症の開始を遅延させるか、又は防止するか、又は中断させるか、又は減速させるための、本明細書に記載の任意の例による組成物の調製における、単離され、不活化及び/若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ等の不活化及び/若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ、又はその細胞溶解物又はその組合せの使用に関する。場合により、細胞溶解物は、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリの全細胞溶解物(WCL)である。
【００８２】
別の例においては、本発明は、例えば、抗原に応答した肺への細胞浸潤を遅延させるか、又は防止するか、又は中断させるか、又は減速させるための、本明細書に記載の任意の例による組成物の調製における、単離され、不活化及び/若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ等の不活化及び/若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ、又はその細胞溶解物又はその組合せの使用に関する。場合により、細胞溶解物は、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリの全細胞溶解物(WCL)である。
【００８３】
別の例においては、本発明は、アレルゲン特異的IgE抗体の血清レベルの上昇及び/又は気管支肺胞洗浄(BAL)中の1つ若しくは複数の炎症性サイトカインのレベルの上昇及び/又は肺への細胞浸潤のレベルの上昇を特徴とするアレルギー状態の開始を遅延させるか、又は防止するか、又は中断させるか、又は減速させるための、本明細書に記載の任意の例による組成物の調製における、単離され、不活化及び/若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ等の不活化及び/若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ、又はその細胞溶解物又はその組合せの使用に関する。場合により、細胞溶解物は、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリの全細胞溶解物(WCL)である。
【００８４】
好ましくは、本明細書に記載の任意の例による使用において、前記組成物は、アジュバントの非存在下での投与のために調合され、アジュバントを含まない。
【００８５】
一例においては、本明細書に記載の任意の例による使用において、前記組成物は、発達したリンパ構造を有さない乳幼児及び/又は0〜約5歳の年齢の乳幼児等の乳幼児への投与(例えば、飲食による)のために調合される。例えば、乳幼児は、0〜約5歳、又は0〜約4歳、又は0〜約3歳、又は0〜約2歳、又は0〜約1歳の年齢である。一例においては、乳幼児は、0〜約2歳の年齢である。別の例においては、乳幼児は、約4ヶ月〜約12ヶ月又は約4ヶ月〜約18ヶ月又は約4ヶ月〜約24ヶ月の月齢である。別の例においては、乳幼児は、約6ヶ月未満の月齢である。
【００８６】
一例においては、本明細書に記載の任意の例による使用において、前記組成物は、約5歳より大きい小児及び/又は青年及び/又は成人への投与(例えば、飲食による)のために調合される。
【００８７】
一例においては、本明細書に記載の任意の例による使用において、前記組成物は、例えば、週に1回、又は週に2回、又は週に3回、又は週に4回、又は週に5回、又は週に6回、又は週に7回の、又は週に7回を超える、又は1日に2回を超える、反復投与のために調合される。1つのそのような例においては、前記組成物は、複数用量単位組成物として調合される。例えば、組成物の各用量は、約102個の細胞〜約1014個の細胞、又は約103個の細胞〜約1013個の細胞、又は約104個の細胞〜約1013個の細胞、又は約105個の細胞〜約1013個の細胞、又は約106個の細胞〜約1013個の細胞、又は約106個の細胞〜約1012個の細胞、又は約107個の細胞〜約1011個の細胞、又は約108個の細胞〜約1010個の細胞、又は約109個の細胞〜約1010個の細胞に対応する範囲のヘリコバクター・ピロリ細菌又はその溶解物の量を含む。例えば、組成物の各用量は、約108個の細胞、又は約109個の細胞、又は約1010個の細胞に対応するヘリコバクター・ピロリ細菌又はその溶解物の量を含む。1つのそのような例においては、前記組成物は、毎日の投与のために調合され、ここで、前記組成物の1日用量は、約102個の細胞〜約1014個の細胞、又は約103個の細胞〜約1013個の細胞、又は約104個の細胞〜約1013個の細胞、又は約105個の細胞〜約1013個の細胞、又は約106個の細胞〜約1013個の細胞、又は約106個の細胞〜約1012個の細胞、又は約107個の細胞〜約1011個の細胞、又は約108個の細胞〜約1010個の細胞、又は約109個の細胞〜約1010個の細胞に対応する範囲のヘリコバクター・ピロリ細菌又はその溶解物の量を含む。例えば、組成物の各1日用量は、約108個の細胞、又は約109個の細胞、又は約1010個の細胞に対応するヘリコバクター・ピロリ細菌又はその溶解物の量を含む。
【００８８】
一例においては、本明細書に記載の任意の例による使用において、前記組成物の用量、例えば、1日用量は、少なくとも約2週間又は少なくとも約4週間又は少なくとも約6週間又は少なくとも約8週間又は少なくとも約10週間又は少なくとも約11週間又は少なくとも約12週間又は少なくとも約13週間又は少なくとも約14週間又は少なくとも約15週間又は少なくとも約16週間又は少なくとも約17週間又は少なくとも約18週間又は少なくとも約19週間又は少なくとも約20週間又は少なくとも約21週間又は少なくとも約22週間又は少なくとも約23週間又は少なくとも約24週間又は少なくとも約25週間、又は少なくとも約6ヶ月間、又は少なくとも1年間又は1年間を超える期間にわたって、好ましくは、少なくとも約13週間又は少なくとも約3ヶ月間の期間にわたって、対象に投与されるべきである(例えば、飲食による)。
【００８９】
一例においては、本明細書に記載の任意の例による使用において、組成物又は組成物の用量(例えば、1日用量)は、年少の対象における免疫系のバランスのとれた発達を促進する。一例においては、本明細書に記載の任意の例による使用において、組成物又は組成物の用量(例えば、1日用量)は、対象における適応免疫及び/又は自然免疫の獲得を促進する。一例においては、本明細書に記載の任意の例による使用において、組成物又は組成物の用量(例えば、1日用量)は、対象におけるCD1d受容体活性化並びに/又はCD4陰性及びCD8陰性ナチュラルキラー(NK)細胞を促進するか、又は増強する。一例においては、本明細書に記載の任意の例による使用において、組成物又は組成物の用量(例えば、1日用量)は、γδT細胞活性化を促進するか、又は増強する。一例においては、本明細書に記載の任意の例による使用において、組成物又は組成物の用量(例えば、1日用量)は、抗原提示細胞(APC)に対する免疫認識及び提示を含む粘膜免疫を促進するか、又は増強する。一例においては、本明細書に記載の任意の例による使用において、組成物又は組成物の用量(例えば、1日用量)は、1つ又は複数のアレルゲンに対するバランスのとれたTh1/Th2免疫応答を促進する。
【００９０】
一例においては、本明細書に記載の任意の例による使用において、前記組成物は、死滅させたヘリコバクター・ピロリ細胞及び/若しくは不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞並びに/又は前記死滅させたか、若しくは不活化された細胞の細胞溶解物のある量を含む。
【００９１】
本発明はまた、本明細書に記載の任意の例による組成物の使用又は単離されたヘリコバクター・ピロリ細胞、その細胞溶解物の使用であって、前記ヘリコバクター・ピロリ細胞が死滅しているか、又は前記哺乳動物の粘膜に定着することができない、前記使用に明確に拡張される。
【００９２】
一例においては、本発明は、対象におけるアレルギーの防止又は処置における本明細書に記載の任意の例に従って記載される組成物の使用を提供する。
【００９３】
別の例においては、本発明は、対象におけるアトピーマーチ又はアトピーマーチの進行を中断させるか、又は減速させるか、又は停止させるか、又は防止するための本明細書に記載の任意の例による組成物の使用を提供する。
【００９４】
別の例においては、本発明は、対象における1つ又は複数のアレルギー状態の開始を遅延させるか、又は防止するか、又は中断させるか、又は減速させるための本明細書に記載の任意の例による組成物の使用を提供する。
【００９５】
別の例においては、本発明は、1つ又は複数のアレルギー性湿疹、蕁麻疹、じんましん、鼻炎、喘鳴、気道抵抗、気道制限、肺炎症、食物アレルギー、又は喘息の開始を遅延させるか、又は防止するか、又は中断させるか、又は減速させるための本明細書に記載の任意の例による組成物の使用を提供する。
【００９６】
別の例においては、本発明は、アレルゲンに応答した気道抵抗の開始を遅延させるか、又は防止するか、又は中断させるか、又は減速させるための本明細書に記載の任意の例による組成物の使用を提供する。
【００９７】
別の例においては、本発明は、アレルゲンに応答した肺炎症の開始を遅延させるか、又は防止するか、又は中断させるか、又は減速させるための本明細書に記載の任意の例による組成物の使用を提供する。
【００９８】
別の例においては、本発明は、肺への細胞浸潤を遅延させるか、又は防止するか、又は中断させるか、又は減速させるための本明細書に記載の任意の例による組成物の使用を提供する。
【００９９】
別の例においては、本発明は、アレルゲン特異的IgE抗体の血清レベルの上昇及び/又は気管支肺胞洗浄(BAL)中の1つ若しくは複数の炎症性サイトカインのレベルの上昇及び/又は肺への細胞浸潤のレベルの上昇を特徴とするアレルギー状態の開始を遅延させるか、又は防止するか、又は中断させるか、又は減速させるための、本明細書に記載の任意の例による組成物の使用を提供する。
【０１００】
別の例においては、本発明は、アレルゲンへの対象の曝露後の対象の肺におけるアレルギー性気道過敏性を防止するか、又は減衰させるための、治療上有効量の死滅させた、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞、又はその細胞溶解物又はその組合せの使用を提供する。好ましくは、前記使用は、治療上有効量の死滅させた、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞の使用を含む。
【０１０１】
別の例においては、本発明は、アレルゲンへの対象の曝露後の対象の肺におけるアレルギー性気道過敏性を防止するか、又は減衰させるための、治療上有効量の死滅させた、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞、又はその細胞溶解物又はその組合せの使用を提供する。好ましくは、前記使用は、治療上有効量の死滅させた、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞の使用を含む。
【０１０２】
別の例においては、本発明は、アレルゲンへの喘息の対象の曝露後の前記対象の肺における気道抵抗を防止するか、又は軽減するための、治療上有効量の死滅させた、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞、又はその細胞溶解物又はその組合せの使用を提供する。好ましくは、前記使用は、治療上有効量の死滅させた、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞の使用を含む。
【０１０３】
別の例においては、本発明は、対象におけるアレルゲンに対するアレルギー性免疫応答を防止するための、又は対象におけるアレルゲンに対するアレルギー性免疫応答の重症度若しくは発生を低減させるための、治療上有効量の死滅させた、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞、又はその細胞溶解物又はその組合せの使用を提供する。好ましくは、前記使用は、治療上有効量の死滅させた、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞の使用を含む。
【０１０４】
好ましくは、本明細書に記載の任意の例による使用において、ヘリコバクター・ピロリ又は溶解物又は組成物は、アジュバントの非存在下で用いられる。
【０１０５】
更に別の例においては、本発明は、アレルギーを発症するリスクのある哺乳動物における前記アレルギーを防止する方法であって、哺乳動物に、単離されたヘリコバクター・ピロリ細胞、その細胞溶解物又はその組合せと、薬学的に許容される担体とを含む有効量の組成物を投与する工程を含み、前記ヘリコバクター・ピロリ細胞が死滅しているか、又は前記哺乳動物の粘膜に定着することができず、前記組成物が、投与の際に、前記アレルギーに対する防御免疫を提供する、方法を提供する。
【０１０６】
従って、一例においては、本発明は、哺乳動物対象におけるアレルギーを処置又は防止する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の任意の例による組成物を投与する工程を含む、方法を提供する。
【０１０７】
別の例においては、本発明は、アレルゲンへの対象の曝露後の対象の肺におけるアレルギー性気道過敏性を防止するか、又は減衰させる方法であって、アレルゲンへの前記対象の曝露後に対象における気道過敏性を防止するのに十分な、治療上有効量の死滅させた、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞、又はその細胞溶解物又はその組合せを対象に投与する工程を含む、方法を提供する。好ましくは、前記方法は、治療上有効量の死滅させた、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞を投与する工程を含む。
【０１０８】
別の例においては、本発明は、喘息の対象における気道抵抗を防止するか、又は軽減する方法であって、それを必要とする対象に、アレルゲンへの前記対象の曝露後に対象の肺における気道過敏性を防止するのに十分な、治療上有効量の死滅させた、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞、又はその細胞溶解物又はその組合せを対象に投与する工程を含む、方法を提供する。好ましくは、前記方法は、治療上有効量の死滅させた、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞を投与する工程を含む。
【０１０９】
別の例においては、本発明は、対象におけるアレルゲンに対するアレルギー性免疫応答を防止するか、又は対象におけるアレルゲンに対するアレルギー性免疫応答の重症度若しくは発生を減少させる方法であって、それを必要とする対象に、治療上有効量の死滅させた、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞、又はその細胞溶解物又はその組合せを対象に投与する工程を含む、方法を提供する。好ましくは、前記方法は、治療上有効量の死滅させた、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞を投与する工程を含む。
【０１１０】
別の例においては、本発明は、対象におけるアトピーマーチ又はアトピーマーチの進行を中断させるか、又は減速させるか、又は停止させるか、又は防止する方法であって、本明細書に記載の任意の例による組成物を前記対象に投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【０１１１】
別の例においては、本発明は、対象における1つ又は複数のアレルギー状態の開始を遅延させるか、又は防止するか、又は中断させるか、又は減速させる方法であって、本明細書に記載の任意の例による組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
【０１１２】
別の例においては、本発明は、対象における1つ又は複数のアレルギー性湿疹、蕁麻疹、じんましん、鼻炎、喘鳴、気道抵抗、気道制限、肺炎症、食物アレルギー、又は喘息の開始を遅延させるか、又は防止するか、又は中断させるか、又は減速させる方法であって、本明細書に記載の任意の例による組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
【０１１３】
別の例においては、本発明は、対象におけるアレルゲンに応答した気道抵抗の開始を遅延させるか、又は防止するか、又は中断させるか、又は減速させる方法であって、本明細書に記載の任意の例による組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
【０１１４】
別の例においては、本発明は、対象におけるアレルゲンに応答した肺炎症の開始を遅延させるか、又は防止するか、又は中断させるか、又は減速させる方法であって、本明細書に記載の任意の例による組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
【０１１５】
別の例においては、本発明は、アレルゲンに応答した対象の肺への細胞浸潤を遅延させるか、又は防止するか、又は中断させるか、又は減速させる方法であって、本明細書に記載の任意の例による組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
【０１１６】
別の例においては、本発明は、対象におけるアレルギー状態の開始を遅延させるか、又は防止するか、又は中断させるか、又は減速させる方法であって、前記状態が、アレルゲン特異的IgE抗体の血清レベルの上昇及び/又は気管支肺胞洗浄(BAL)中の1つ若しくは複数の炎症性サイトカインのレベルの上昇及び/又は対象の肺への細胞浸潤のレベルの上昇を特徴とし、本明細書に記載の任意の例による組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
【０１１７】
好ましくは、本明細書の任意の例に従って記載される方法において、ヘリコバクター・ピロリ又は溶解物又は組成物は、アジュバントの非存在下で投与され、組成物はアジュバントを含まない。
【０１１８】
本明細書に記載の任意の例による方法の一例においては、前記組成物又は不活化された、若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ細胞及び/又はその溶解物は、経口経路により(すなわち、対象による摂取のため)、及び/又は埋葬(inhumation)により対象に投与される。
【０１１９】
本明細書に記載の任意の例による方法の一例においては、前記組成物又は不活化若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ細胞及び/又はその溶解物は、発達したリンパ構造を有さない、及び/又は乳幼児は0〜約5歳の年齢である乳幼児等の乳幼児に投与される(例えば、飲食による)。例えば、乳幼児は、0〜約5歳、又は0〜約4歳、又は0〜約3歳、又は0〜約2歳、又は0〜約1歳の年齢である。一例においては、乳幼児は、0〜約2歳の年齢である。別の例においては、乳幼児は、約4ヶ月〜約12ヶ月又は約4ヶ月〜約18ヶ月又は約4ヶ月〜約24ヶ月の月齢である。別の例においては、乳幼児は、約6ヶ月未満の月齢である。
【０１２０】
別の例においては、本明細書に記載の任意の例による方法においては、前記組成物又は不活化若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ細胞及び/又はその溶解物は、約5歳より大きい小児及び/又は青年及び/又は成人に投与される(例えば、飲食による)。
【０１２１】
別の例においては、本明細書に記載の任意の例による方法は、前記組成物又は不活化若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ細胞及び/又はその溶解物の対象への反復投与を含む。一例においては、前記組成物又は不活化若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリ細胞及び/又はその溶解物は、週に1回、又は週に2回、又は週に3回、又は週に4回、又は週に5回、又は週に6回、又は週に7回、又は週に7回を超えて、又は1日に2回を超えて、対象に投与される。
【０１２２】
1つのそのような例においては、本明細書に記載の任意の例による方法は、約102個の細胞〜約1014個の細胞、又は約103個の細胞〜約1013個の細胞、又は約104個の細胞〜約1013個の細胞、又は約105個の細胞〜約1013個の細胞、又は約106個の細胞〜約1013個の細胞、又は約106個の細胞〜約1012個の細胞、又は約107個の細胞〜約1011個の細胞、又は約108個の細胞〜約1010個の細胞、又は約109個の細胞〜約1010個の細胞に対応する範囲のヘリコバクター・ピロリ細菌又はその溶解物の量を含む組成物の用量を投与する工程を含む。例えば、組成物の各用量は、約108個の細胞、又は約109個の細胞、又は約1010個の細胞に対応するヘリコバクター・ピロリ細菌又はその溶解物の量を含む。1つのそのような例においては、本明細書に記載のいずれかによる本発明による方法は、組成物の1日用量を投与する工程を含み、ここで、組成物の1日用量は、約102個の細胞〜約1014個の細胞、又は約103個の細胞〜約1013個の細胞、又は約104個の細胞〜約1013個の細胞、又は約105個の細胞〜約1013個の細胞、又は約106個の細胞〜約1013個の細胞、又は約106個の細胞〜約1012個の細胞、又は約107個の細胞〜約1011個の細胞、又は約108個の細胞〜約1010個の細胞、又は約109個の細胞〜約1010個の細胞に対応する範囲のヘリコバクター・ピロリ細菌又はその溶解物の量を含む。例えば、組成物の各1日用量は、約108個の細胞、又は約109個の細胞、又は約1010個の細胞に対応するヘリコバクター・ピロリ細菌又はその溶解物の量を含む。
【０１２３】
別の例においては、本明細書に記載の任意の例による方法は、少なくとも約2週間又は少なくとも約4週間又は少なくとも約6週間又は少なくとも約8週間又は少なくとも約10週間又は少なくとも約11週間又は少なくとも約12週間又は少なくとも約13週間又は少なくとも約14週間又は少なくとも約15週間又は少なくとも約16週間又は少なくとも約17週間又は少なくとも約18週間又は少なくとも約19週間又は少なくとも約20週間又は少なくとも約21週間又は少なくとも約22週間又は少なくとも約23週間又は少なくとも約24週間又は少なくとも約25週間、又は少なくとも約6ヶ月間、又は少なくとも1年間又は1年間を超える期間にわたって、好ましくは、少なくとも約13週間又は少なくとも約3ヶ月間の期間にわたって、ヘリコバクター・ピロリ又は溶解物又は組成物の1日用量を投与する工程を含む。
【０１２４】
本明細書に記載の任意の例による本発明の記載の方法の別の例においては、ヘリコバクター・ピロリ又は溶解物又は組成物の投与は、年少の対象における免疫系のバランスのとれた発達の発達を促進する。
【０１２５】
本明細書に記載の任意の例による方法の別の例においては、ヘリコバクター・ピロリ又は溶解物又は組成物の投与は、対象における適応免疫の獲得を促進する。
【０１２６】
本明細書に記載の任意の例による方法の別の例においては、ヘリコバクター・ピロリ又は溶解物又は組成物の投与は、対象における適応免疫の獲得を促進する。
【０１２７】
本明細書に記載の任意の例による方法の別の例においては、ヘリコバクター・ピロリ又は溶解物又は組成物の投与は、CD1d受容体活性化並びに/又はCD4陰性及びCD8陰性ナチュラルキラー(NK)細胞を促進するか、又は増強する。
【０１２８】
本明細書に記載の任意の例による方法の別の例においては、ヘリコバクター・ピロリ又は溶解物又は組成物の投与は、γδT細胞活性化を促進するか、又は増強する。
【０１２９】
本明細書に記載の任意の例による本発明による方法の別の例においては、ヘリコバクター・ピロリ又は溶解物又は組成物の投与は、抗原提示細胞(APC)に対する免疫認識及び提示を含む粘膜免疫を促進するか、又は増強する。
【０１３０】
本明細書に記載の任意の例による方法の別の例においては、ヘリコバクター・ピロリ又は溶解物又は組成物の投与は、1つ又は複数のアレルゲンに対するバランスのとれたTh1/Th2免疫応答を促進する。
【０１３１】
本明細書に記載の任意の例による方法の別の例においては、対象は、湿疹について無症状であるか、又はアレルギーについて無症状であるか、又は喘息について無症状であり、前記方法は、例えば、アレルゲンへの対象の曝露後に、対象における湿疹及び/又はあれるギー及び/又は喘息のその後の開始を防止する。1つのそのような例においては、前記方法は、乳幼児における湿疹又は以後の人生におけるアレルギー若しくは喘息のその後の開始を防止するために、年少の対象に単離され、不活化されたヘリコバクター・ピロリを投与する工程を含む。或いは、前記方法は、対象における湿疹又は対象における以後の人生におけるアレルギー若しくは喘息のその後の開始を防止するために、青年又は成人の対象に単離され、不活化されたヘリコバクター・ピロリを投与する工程を含む。しかしながら、湿疹及び/又はアレルギー及び/又は喘息のその後の開始は、ヘリコバクター・ピロリ又は組成物がアレルゲンへの未処置の対象の曝露により投与されていない未処置の対象において誘導され得る。例えば、アレルゲンは、環境アレルゲン、花粉アレルゲン、チリダニアレルゲン、動物アレルゲン、又は化学アレルゲンである。
【０１３２】
本明細書に記載の任意の例による方法の別の例においては、対象は、アレルギー性湿疹、アレルギー、又は喘息の1つ又は複数の発生に以前に罹患しており、前記方法は、対象におけるその後の発作を防止するか、又はその後の発作の重症度を低下させる。1つのそのような例においては、前記方法は、単離された、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ等の不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ、又はその細胞溶解物又はその組合せを、アレルギー性湿疹及び/又はアレルギー及び/又は喘息に以前に罹患していた青年又は成人の対象に投与することによって、対象におけるその後の発作を防止するか、又はその後の発作の重症度を低下させ、場合により、さらなるアトピーマーチを防止するか、又は減速させる工程を含む。或いは、前記方法は、単離された、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ等の不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ、又はその細胞溶解物又はその組合せを、アレルギー性湿疹及び/又はアレルギー及び/又は喘息に以前に罹患していた青年又は成人の対象に投与することによって、対象におけるその後の発作を防止するか、又はその後の発作の重症度を低下させ、場合により、さらなるアトピーマーチを防止するか、又は減速させる工程を含む。しかしながら、湿疹及び/又はアレルギー及び/又は喘息のその後の発作は、ヘリコバクター・ピロリ又は組成物が、アレルゲンへの未処置の対象の曝露により投与されていない未処置の対象においては誘導され得る。例えば、アレルゲンは、環境アレルゲン、花粉アレルゲン、チリダニアレルゲン、動物アレルゲン、又は化学アレルゲンである。
【０１３３】
本明細書に記載の任意の例による方法の別の例においては、単離された、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ等の不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ、又はその細胞溶解物又はその組合せの対象への投与は、対象の集団におけるアレルギー性免疫応答の発生を減少させる。
【０１３４】
本明細書に記載の任意の例による方法の別の例においては、単離された、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ等の不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ、又はその細胞溶解物又はその組合せの対象への投与は、彼らが年少者であった時に処置された集団の青年及び/又は成人のメンバーにおけるアレルギー性免疫応答の発生を減少させる。
【０１３５】
いくつかの実施形態においては、哺乳動物は、ナイーブな哺乳動物である。かくして、さらなる例において、本発明は、アレルギーを発症するリスクのある免疫学的にナイーブな哺乳動物におけるアレルギーを防止する方法であって、(i)アレルギーを発症するリスクのある哺乳動物を同定する工程;(ii)前記哺乳動物に、死滅させたか、又は前記哺乳動物の粘膜に定着することができない、単離されたヘリコバクター・ピロリ細胞、その細胞溶解物又はその組合せと、薬学的に許容される担体とを含む組成物を投与する工程及び(iii)アレルギーの発症を可能にする十分な時間経過させる工程を含む、方法を提供する。
【０１３６】
さらなる例においては、本発明は、哺乳動物に、単離されたヘリコバクター・ピロリ細胞、その細胞溶解物又はその組合せと、薬学的に許容される担体とを含む組成物の有効量を投与する工程を含み、前記ヘリコバクター・ピロリ細胞が死滅しているか、又は前記哺乳動物の粘膜に定着することができず、前記組成物が、投与の際に、前記アレルギーに対する防御免疫を提供する、前記哺乳動物におけるアレルギーを処置する方法を提供する。
【０１３７】
哺乳動物又は対象は、イヌ、ネコ、家畜動物、霊長類又はウマを含む。いくつかの実施形態においては、哺乳動物又は対象は、ヒト対象である。好ましくは、ヒト対象は、約5歳より下である。より好ましくは、ヒト対象は、2歳より下である。
【０１３８】
一例においては、本発明は、(i)本明細書の任意の例による組成物と、(ii)本明細書の例のいずれか1つによる方法における使用のための説明書とを含む、哺乳動物におけるアレルギーを処置及び/又は防止するためのキットを提供する。
【０１３９】
本発明はまた、(i)本明細書の任意の例に従って記載される不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ又は溶解物又は組成物と、場合により、(ii)本明細書の例のいずれか1つによる方法又は使用における使用のための説明書とを含む、対象におけるアレルギーを処置及び/又は防止するためのキットにも明確に拡張される。例えば、キットは、アレルゲンへの、喘息の対象等の対象の曝露後に、対象の肺におけるアレルギー性気道過敏性を防止するか、又は減衰させるのに使用するためのものである。或いは、又は更に、キットは、アレルゲンへの喘息の対象の曝露後に前記対象の肺における気道抵抗又は気道過敏性を防止するか、又は軽減するのに使用するためのものである。或いは、又は更に、キットは、対象におけるアレルギー性免疫応答を防止するか、又は対象におけるアレルゲンに対するアレルギー性免疫応答の重症度若しくは発生を減少させるのに使用するためのものである。或いは、又は更に、キットは、対象におけるアトピーマーチ又はアトピーマーチの進行を中断させるか、又は減速させるか、又は停止させるか、又は防止するのに使用するためのものである。或いは、又は更に、キットは、例えば、1つ又は複数の状態が、アレルゲン特異的IgE抗体の血清レベルの上昇及び/又は気管支肺胞洗浄(BAL)中の1つ若しくは複数の炎症性サイトカインのレベルの上昇及び/又は対象の肺への細胞浸潤のレベルの上昇を特徴とする、対象における1つ又は複数のアレルギー状態の開始を遅延させるか、又は防止するか、又は中断させるか、又は減速させるのに使用するためのものである。或いは、又は更に、キットは、対象における1つ又は複数のアレルギー性湿疹、蕁麻疹、じんましん、鼻炎、喘鳴、気道抵抗、気道制限、肺炎症、食物アレルギー、又は喘息の開始を遅延させるか、又は防止するか、又は中断させるか、又は減速させるのに使用するためのものである。或いは、又は更に、キットは、対象におけるアレルゲンに対する気道抵抗及び/又は肺炎症応答の開始を遅延させるか、又は防止するか、又は中断させるか、又は減速させるためのものである。或いは、又は更に、キットは、アレルゲンに応答した対象の肺への細胞浸潤を遅延させるか、又は防止するか、又は中断させるか、又は減速させるためのものである。
【０１４０】
さらなる例においては、本発明は、アレルギーに対する防御免疫を提供することができるヘリコバクター・ピロリ株を作成する方法であって、
(a)(i)哺乳動物の粘膜に定着することができない、及び/又は
(ii)cagAマイナス(cagA-)及び場合により、vacA遺伝子の毒素原性s1及びm1対立遺伝子について陽性である、
単離されたヘリコバクター・ピロリ細胞を提供する工程、
(b)場合により、前記ヘリコバクター・ピロリ細胞を、動物宿主を介して継代する工程;並びに
(c)場合により、前記ヘリコバクター・ピロリ細胞を不活化又は死滅する工程
を含む、方法を提供する。
【０１４１】
文脈がそれとは反対に別途又は特に記述されることを必要としない限り、単数の整数、工程又は要素として本明細書に記載される本発明の整数、工程、又は要素は、単数形及び複数形の両方の記載された整数、工程又は要素を明確に包含する。
【０１４２】
本明細書で用いられる用語「から誘導される」は、特定される整数が特定の供給源から取得することができるが、その供給源に必ずしも直接由来する必要はないことを示すように取られるべきである。
【０１４３】
本明細書を通じて、文脈が別途要求しない限り、単語「含む(comprise)」又は「含む(comprises)」若しくは「含む(comprising)」等の変形は、任意の他の工程又は要素又は整数又は要素若しくは整数の群の排除ではなく、記述された工程又は要素又は整数又は工程若しくは要素若しくは整数の群の含有を暗示すると理解される。
【０１４４】
本明細書を通じて、別途特に記述されない限り、又は文脈が別途要求しない限り、単一の工程、物質の組成物、工程の群又は物質の組成物の群は、1つ及び複数の(すなわち、1つ又は複数)のこれらの工程、物質の組成物、工程の群又は物質の組成物の群を包含すると取られるべきである。従って、本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈が別途明確に区別しない限り、複数の参照を含む。例えば、「細菌(a bacterium)」に対する参照は、複数のそのような細菌を含み、「アレルゲン(an allergen)」に対する参照は、1つ又は複数のアレルゲンに対する参照である。
【０１４５】
本明細書に記載のそれぞれの例は、別途明確に記述しない限り、それぞれ及び全ての他の例に対して、変更すべきところは変更して適用されるべきである。
【０１４６】
当業者であれば、本明細書に記載の発明が、特に記載されるもの以外の変更及び改変の影響を受けやすいことを理解できる。本発明は、全てのそのような変更及び改変を含むことが理解されるべきである。本発明はまた、個別的に、又は集合的に、本明細書で言及されるか、又は示される全ての工程、特徴、組成物及び化合物、並びに任意かつ全ての組合せ又は任意の2つ以上の前記工程又は特徴を含む。
【０１４７】
本発明は、例示のためだけに意図される、本明細書に記載の特定例によってその範囲を限定されるべきではない。機能的に等価な生成物、組成物及び方法は、明確に、本明細書に記載の本発明の範囲内にある。
【０１４８】
本明細書に引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、上掲にしても、下掲にしても、その全体が参照により本明細書に組込まれる。しかしながら、本明細書に記載の刊行物は、その刊行物で報告され、本発明と関連して用いることができるプロトコール、試薬及びベクターを記載及び開示するために引用される。本明細書は、本発明が先行する発明のためにそのような開示に先行する資格を与えられないとの許諾として解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１Ａ】人生の初期に始まることが多いアレルギー疾患の典型的な進行を指す「アレルギー(又はアトピー)マーチ」を示し、個体の年齢によるアレルギー疾患の臨床症状及び臨床所見の相対有病率を示す図である。アレルギー疾患としては、アトピー性皮膚炎(湿疹)、食物アレルギー、アレルギー性鼻炎(花粉症)及び喘息が挙げられる。一般に、誕生時には臨床症状は検出されない。湿疹を有する小児の大部分は、食物アレルギー及び/又はアレルギー性喘息を発症するように進行し、これらの個体の有意な割合は、成人としてアトピー又は呼吸器アレルギーを有する。また、喘息性喘鳴は乳児期に既に観察され、早期の喘鳴者の大部分は一時的に症状を示すようになるが、いくらかの小児においては、喘鳴は学童期及び青年期を通じて持続し得る。
【図１Ｂ】消化管におけるヘリコバクター・ピロリの勾配的又は相対的分布を示す図である。ヘリコバクター・ピロリ細菌は、多くの他の細菌と一緒に消化管内に存在し得る哺乳動物消化管共生生物である。ヘリコバクター・ピロリは、一般に、経口経路により獲得され、消化管に定着し、ヒトの場合は80%以上において無症状であり得るが、胃の持続的定着は消化性潰瘍、胃がん及び慢性蕁麻疹(じんましん)等の他の障害のより高いリスクと関連する。ヘリコバクター・ピロリは、胃から腸管下部に向かって大量に継続的に流れ落ち、そこでパイアー斑により取込まれ、パイアー斑により免疫系をモジュレートして、持続的な胃感染を確立する(Gerirtz AT及びSitaraman SV、2007、Gastroenterology 133: 1044〜1045頁; Nagi Sら、2007、Proc Natl Acad Sci USA 109: 8971〜8976頁; Watanabe Nら、2008、Gastroenterology 134: 642〜643頁)。ヘリコバクター・ピロリによる活発な定着は、ヘリコバクター・ピロリの免疫寛容に向かって宿主免疫系をモジュレートして、持続的な定着を可能にし、これは宿主におけるアレルギー状態のリスクの低下と関連する(Amedei Aら、2010、J Asthma Allergy. 3:139〜147頁; Kosunen TUら、2002、Clin Exp Allergy. 32:373〜378頁; Chen及びBlaster MJ、2007、Arch Intern Med. 167:821〜827頁)。
【図１Ｃ】未処理のヘリコバクター・ピロリ(「生きているHp(Live HP)」と印を付けた)並びに処理されたヘリコバクター・ピロリ、すなわち、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ(「死滅させたHp(Killed Hp)」と印を付けた)を、それぞれ、アレルギーのマウスモデルに投与し、示された時点でチャレンジする、OVA感作/チャレンジを用いる急性アレルギー性喘息モデルを示す図である。
【図２】UV-C照射による処理(「UV」と印を付けた)及び場合により熱処理(「UV+熱(UV + HEAT)」と印を付けた)の後、又は嫌気的条件下で48時間のインキュベーション(「O2制限(O2 Restriction)」と印を付けた)及び場合により、熱処理(「O2制限+熱(O2 Restriction + HEAT)」と印を付けた)の後の、生きている未処理のヘリコバクター・ピロリOND86対照細胞(「生きている(Live)」と印を付けた)並びに処理されたヘリコバクター・ピロリ、すなわち、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリの複製有効性を示す図である。生きている、及び処理された細胞の複製有効性は、5%(v/v)のCO2及び5%(v/v)未満のO2を含有する微好気的環境中、37℃で3日間、生きている、及び処理されたヘリコバクター・ピロリ、すなわち、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリをインキュベートした後にCBAプレート上で測定される細胞計数、すなわち、コロニー形成単位(CFU)により決定される。2つの独立した実験から得られた結果を示す(「反復1(Repeat 1)」及び「反復2(Repeat 2)」と印を付けた)。
【図３】未処理の生きているヘリコバクター・ピロリ細胞(「生きている(Live)」と印を付けた)中でのウレアーゼ活性と比較した、熱処置(「熱(HEAT)」と印を付けた)、UV-C照射(「UV」と印を付けた)及び場合により、熱処理(「UV+熱(UV + HEAT)」と印を付けた)の後、又は酸素飢餓(「O2制限(O2 Restriction)」と印を付けた)及び場合により、熱処理(「O2制限+熱(O2 Restriction + HEAT)」と印を付けた)の後の、処理された、すなわち、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ中でのウレアーゼ活性のパーセンテージを示す図である。
【図４】熱処理(「熱(HEAT)」と印を付けた)の前後での、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞(「生きている(Live)」と印を付けた)又は酸素飢餓(「O2r」若しくは「O2R」と印を付けた)若しくはUV-C照射(「UV」と印を付けた)による処理に曝露されたヘリコバクター・ピロリの膜酸化還元電位比を示す図である。
【図５】未処理のヘリコバクター・ピロリ(「生きているヘリコバクター・ピロリ」と印を付けた)並びに処理されたヘリコバクター・ピロリ、すなわち、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ(「死滅させたヘリコバクター・ピロリ」と印を付けた)がそれぞれ、アレルギー性気道疾患のOVAモデルにおいてアレルギー性喘息の転帰を改善することを示す図である。
【図６】未処理のヘリコバクター・ピロリ(「Hp」と印を付けた)並びに処理されたヘリコバクター・ピロリ、すなわち、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ(「死滅させた(Killed)」と印を付けた)がそれぞれ、アレルギー性気道疾患のOVAモデルにおいて全細胞計数(パネルA)及び好酸球増多(パネルB)を減少させることを示す図である。
【図７】アレルギー性喘息モデルにおいて未処理のヘリコバクター・ピロリ(「Hp」と印を付けた)並びに処理されたヘリコバクター・ピロリ、すなわち、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ(「死滅させた(Killed)」と印を付けた)に感染させたマウスにおける減少したOVA特異的IgE(パネルA)及びOVA特異的IgG(パネルB)応答を示す図である。
【図８】アレルギー性喘息モデルにおいて未処理のヘリコバクター・ピロリ(「生きているヘリコバクター・ピロリ(Live H. pylori)」と印を付けた)並びに処理されたヘリコバクター・ピロリ、すなわち、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ(「死滅させた(killed)」と印を付けた)に感染させたマウスの肺においてIL-13が減少することを示す図である。
【図９】OVA/ミョウバンチャレンジ後の対照マウス(「ナイーブ(Naive)」と印を付けた)と比較した、ヘリコバクター・ピロリ感染マウス(「生きているヘリコバクター・ピロリ(Live H. pylori)と印を付けた)における減少したOVA特異的CD8 T細胞の数(パネルA)及び機能(パネルB)を示す図である。
【図１０】一次(パネルA)及び二次(パネルB)OVA/ミョウバンチャレンジ後の、対照マウス(「ナイーブ(naive)」と印を付けた)と比較した、ヘリコバクター・ピロリ感染マウス(「生きているヘリコバクター・ピロリ(Live H. pylori)」と印を付けた)における減少した抗原特異的IgGを示す図である。
【図１１】非特異的刺激に応答して対照マウス(「ナイーブ(naive)」と印を付けた)と比較した、ヘリコバクター・ピロリ感染マウス(「生きているヘリコバクター・ピロリ(Live H. pylori)」と印を付けた)に由来するCD4(パネルA)及びCD8 T(パネルB)細胞の減少した応答性を示す図である。
【図１２】ヘリコバクター・ピロリの定着が、新生児アレルギー性喘息モデルにおいてアレルギー性気道疾患の転帰を改善することを示す図である。
【図１３】未処理のヘリコバクター・ピロリ(x軸において「生きているヘリコバクター・ピロリ(live H. pylori)」と印を付けた)並びに処理されたヘリコバクター・ピロリ、すなわち、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ(x軸において「死滅させた(killed)」と印を付けた)がそれぞれ、新生児アレルギー性喘息モデルにおいて免疫学的転帰を改善することを示す図である。
【図１４】未処理のヘリコバクター・ピロリ(「生きているHp(Live Hp)」と印を付けた)並びに処理されたヘリコバクター・ピロリ、すなわち、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ(「死滅させたHp(Killed Hp)」と印を付けた)がそれぞれ、成体及び新生児マウスにおいてアレルゲンに対するアレルギー性気道応答を減少させるのに有効であることを示す図である。パネルAは、未処理のヘリコバクター・ピロリ並びに処理されたヘリコバクター・ピロリ、すなわち、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリに感染した成体マウスにおけるメタクロリン(MCh)チャレンジの用量の増加に応答した肺組織の気道過敏性(AHR)の結果を示す。ヘリコバクター・ピロリを受けなかった、すなわち、感染せず、感作及びチャレンジしたアレルギー成体マウス対照には「陽性(Positive)」と印を付け、ヘリコバクター・ピロリを受けなかった、すなわち、感染せず、感作のみされた未処理の健康な成体マウスには「陰性(Negative)」と印を付けた。パネルBは、未処理のヘリコバクター・ピロリに感染した新生児マウスにおけるメタクロリン(MCh)チャレンジの用量の増加に応答した肺組織の気道過敏性(AHR)の結果を示す。パネルCは、未処理のヘリコバクター・ピロリ並びに処理されたヘリコバクター・ピロリ、すなわち、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリに感染した新生児マウスにおけるメタクロリン(MCh)チャレンジの用量の増加に応答した肺組織の気道過敏性(AHR)の結果を示す。パネルA及びBにおいて、ヘリコバクター・ピロリを受けなかった、すなわち、感染せず、感作及びチャレンジしたアレルギー成体新生児マウス対照には「陽性(Positive)」の印を付け、ヘリコバクター・ピロリを受けなかった、すなわち、感染せず、感作のみされた未処理の健康な新生児マウス対照には「陰性(Negative)」と印を付けた。パネルA、B及びCに示される結果は、3つの独立した実験を表す。
【図１５】成体アレルギー性喘息モデルにおけるアレルギー対象における未処理のヘリコバクター・ピロリ(「生きている(live)」と印を付けた)並びに処理されたヘリコバクター・ピロリ、すなわち、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ(「処理(treated)」と印を付けた)の定着有効性の結果を示す図である。
【図１６】生きているOND79ヘリコバクター・ピロリ細胞の、UV-C照射(「OND79 UV」と印を付けた)及び場合により、熱処理(「OND79 UV+熱(Heat)」と印を付けた)を用いる処理により、又は酸素飢餓(「OND79 O2R」と印を付けた)及び場合により、熱処理(「OND79 O2R+熱(Heat)」と印を付けた)により生成される不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリのマウスにおける定着有効性の結果を示す図である。定着有効性は、感染したマウスの胃において検出されるコロニー形成単位(CFU)の数として示される。
【図１７】異なる起源のUV処理された、すなわち、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリOND79(「OND79」と印を付けた)及びヘリコバクター・ピロリJ99(「J99」と印を付けた)株が、新生児アレルギー性喘息マウスモデルにおいてアレルゲン(OVA)特異的IgE(パネルA)及びIgG(パネルB)抗体の減少において有効であったことを示す図である。対照マウスを、感染させず、感作し、チャレンジする(陽性対照、すなわち、未処理のアレルギー性マウス;「Pos」と印を付けた)か、又は感作のみした(陰性対照、すなわち、未処理の健康なマウス;「Neg」と印を付けた)。OVA特異的抗体の力価を、1:60に希釈されたマウス血清中で測定し、OD405nmでの個々の平均吸光度として表した。
【図１８】ヘリコバクター・ピロリOND79の単一コロニー単離物と、ヒト宿主におけるヘリコバクター・ピロリOND79の継代後の胃生検試料から得られたヘリコバクター・ピロリ誘導体の6つの臨床単離物の単一コロニー単離物との無作為に増幅された多型DNA(RAPD)分析を示す図である。ヘリコバクター・ピロリ誘導体の6つの臨床単離物には、「#1157 clone 1」、「#1157 clone 9」、「#86198 clone 1」、「#86198 clone 9」、「#45156 clone 1」及び「#45156 clone 9」と標識した。配列番号3に記載され、5'-CCG CAG CCA A-3'を有するプライマー「1254」(パネルA)、又は配列番号4に記載され、5'-AAC GCG CAA C -3'を有するプライマー「1281」(パネルB)を用いて、Akopyanzら(1992) Nucleic Acids Research、20:5137〜5142頁により記載されたように遺伝子フィンガープリンティングを実施した。パネルA又はパネルBのそれぞれにおいて、レーンM、1キロベース(kb)のDNAラダーマーカー(New England Biolabs Inc.社、Ipswich、MA、US);レーン1、OND79(親株);レーン2、#1157 clone 1;レーン3、#1157 clone 9;レーン4、#86198 clone 1;レーン5、#86198 clone 9;レーン6、#45156 clone 1;レーン7、#45156 clone 9である。遺伝子フィンガープリンティングは、親入力株OND79について、及びヒト継代誘導株のそれぞれの臨床単離物について同一であった。
【図１９】ヒト宿主においてヘリコバクター・ピロリOND79を継代した後に得られたヘリコバクター・ピロリの6つ臨床単離物のマウスにおける感染及び定着有効性の結果を示す図である。臨床単離物の感染及び定着有効性は、感染したマウスの胃において検出されるコロニー形成単位(CFU)の数として示される。6つのヘリコバクター・ピロリ臨床単離物には、「#1157 clone 1」、「#1157 clone 9」、「#86198 clone 1」、「#86198 clone 9」、「#45156 clone 1」及び「#45156 clone 9」と標識する。ヘリコバクター・ピロリ臨床単離物#1157 clone 9は、NMI受託番号V14/013016の下で寄託されたヘリコバクター・ピロリOND86株と一致する。
【図２０】C57BL/6マウスモデルにおける単離物の経口投与の2週間後に特異的抗ヘリコバクター・ピロリIgG抗体応答を誘導する、ヒト宿主においてヘリコバクター・ピロリOND79を継代した後に得られたヘリコバクター・ピロリの6つの臨床単離物の有効性を示す図である。抗体応答力価は、405nmで測定されたOD値として表される。6つのヘリコバクター・ピロリ臨床単離物には、「#1157 clone 1」、「#1157 clone 9」、「#86198 clone 1」、「#86198 clone 9」、「#45156 clone 1」及び「#45156 clone 9」と標識する。ヘリコバクター・ピロリ臨床単離物#1157 clone 9は、NMI受託番号V14/013016の下で寄託されたヘリコバクター・ピロリOND86株と一致する。
【図２１】用量上昇評価を含むアレルギー成人対象における安全性及び許容性試験を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１５０】
1.ヘリコバクター・ピロリ
本発明は、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ又はその細胞溶解物を含む組成物を提供する。
【０１５１】
一例においては、ヘリコバクター・ピロリは、不活化されたヘリコバクター・ピロリである。用語「不活化されたヘリコバクター・ピロリ」は、胃潰瘍若しくは悪性腫瘍等の他の病理を誘導する同じ遺伝子型を有する生きているヘリコバクター・ピロリ細菌と同じ能力を有さない、及び/又は同じ遺伝子型を有する生きているヘリコバクター・ピロリ細菌と同じ定着能力を有さない、及び/又は同じ遺伝子型を有する生きているヘリコバクター・ピロリ細菌の機能的な、若しくは無傷のゲノムを有さないヘリコバクター・ピロリの細胞又は株を意味すると取られるべきである。例えば、不活化されたヘリコバクター・ピロリは、無傷のゲノムを有さないが、それが対応する生きているヘリコバクター・ピロリの代謝活性の少なくとも一部を保持するように機構的トランスクリプトーム及び/又は翻訳機構を保持してもよい。かくして、不活化されたヘリコバクター・ピロリは、対応する生きているヘリコバクター・ピロリの部分的又は完全な代謝活性を保持することが好ましい。この文脈における「生きているヘリコバクター・ピロリ」とは、それを不活化及び/又は死滅させるために本明細書の任意の例に従って記載されるように処理されるヘリコバクター・ピロリを意味する。
【０１５２】
不活化されたヘリコバクター・ピロリは哺乳動物の胃粘膜と一時的に会合することができるにもかかわらず、そのような不活化された細菌は胃粘膜の慢性的又は持続的感染を確立するために哺乳動物の胃粘膜に定着することができないのが好ましい。例えば、不活化されたヘリコバクター・ピロリは、限定されるものではないが、通常は粘膜への持続的なヘリコバクター・ピロリ定着と関連する消化性潰瘍、非心臓性胃腺がん又はMALTリンパ腫等の胃がん、及び慢性蕁麻疹(じんましん)等の他の障害の形成を含む、1つ又は複数のヘリコバクター・ピロリ関連病原効果を誘導する能力が低下していてもよい。
【０１５３】
好ましくは、不活化されたヘリコバクター・ピロリは、生きているヘリコバクター・ピロリの細胞構造を保持する。例えば、不活化されたヘリコバクター・ピロリは、それが破壊されるか、又は溶解されないように、生きているヘリコバクター・ピロリの細菌細胞壁及び/又は細胞膜の構造的完全性を保持する。
【０１５４】
或いは、又は更に、不活化されたヘリコバクター・ピロリは、哺乳動物の腸下部中のパイアー斑により取込まれる生きているヘリコバクター・ピロリの能力を保持する。例えば、不活化されたヘリコバクター・ピロリは、複製及び定着機能を有する対応する生きているヘリコバクター・ピロリの免疫原性及び/又は抗原性及び/又は受容体-リガンド相互作用を保持してもよい。
【０１５５】
或いは、又は更に、不活化されたヘリコバクター・ピロリは、1つ又は複数の代謝的変化、例えば、リポ多糖合成及びその表面提示の増強並びに/又は細胞タンパク質の分解の増強並びに/又はその不活化の間及び/若しくは後のウレアーゼ生成の減少を受ける。
【０１５６】
別の例においては、ヘリコバクター・ピロリは、死滅させたヘリコバクター・ピロリである。用語「死滅させたヘリコバクター・ピロリ」は、不可逆的に代謝的に不活性である、ヘリコバクター・ピロリの細胞又は株を意味すると取られるべきである。例えば、死滅させたヘリコバクター・ピロリは、胃潰瘍若しくは悪性腫瘍等の他の病理を誘導することができない、及び/又は哺乳動物の胃粘膜に定着することができない、及び/又は同じ遺伝子型を有する生きているヘリコバクター・ピロリ細菌の機能的若しくは無傷のゲノムを有さない。かくして、死滅させたヘリコバクター・ピロリは、機能的トランスクリプトーム及び/又は翻訳機構を保持しないのが好ましい。
【０１５７】
好ましくは、死滅させたヘリコバクター・ピロリは、生きているヘリコバクター・ピロリの細胞構造を保持する。例えば、死滅させたヘリコバクター・ピロリは、それが破壊又は溶解されないように、不活化された、又は生きているヘリコバクター・ピロリの細菌細胞壁及び/又は細胞膜の構造的完全性を保持する。
【０１５８】
或いは、又は更に、死滅させたヘリコバクター・ピロリは、哺乳動物の腸下部中のパイアー斑により取込まれる生きているヘリコバクター・ピロリの能力を保持する。例えば、死滅させたヘリコバクター・ピロリは、複製及び定着機能を有する対応する生きているヘリコバクター・ピロリの免疫原性及び/又は抗原性及び/又は受容体-リガンド相互作用を保持してもよい。
【０１５９】
別の例においては、本発明は、細菌を不活化するためのプロセス及びヘリコバクター・ピロリを死滅するためのプロセスにかけられたヘリコバクター・ピロリを用いる。例えば、細胞の死滅は、ヒトでの使用のための生物の安全性の付加を確保しながら、その投与後に免疫系に対する不活化された細胞の利益を捕捉する。
【０１６０】
本発明の文脈において、「細胞溶解物」は、細菌の細胞成分が細菌細胞から分解又は遊離されるように不活性な、及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ細胞が破壊された本明細書の任意の例に従って記載される不活性な、及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ細胞から作製される調製物である。
【０１６１】
当業者であれば、細菌細胞溶解物を生成するための手段を知っている。例えば、ヘリコバクター・ピロリ細胞を沈降させた後、例えば、Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(PBS; 10mMリン酸、0.14M NaCl、pH7.4)中に再懸濁し、W-375 sonication Ultrasonic processor (Heat Systems-Ultrasonics, Inc.社、Farmingdale、N.Y.)を用いて、パルス及び強度設定5で3回の1minのセッションで50%の負荷サイクルで氷上で超音波処理にかける。必要に応じて、その後、不溶性材料及び破壊されていない細菌細胞を、遠心分離により除去することができる。或いは、ヘリコバクター・ピロリ細胞を沈降させた後、25mM Tris、pH7.5、1mM MgCl2、1mMアミノポリカルボン酸(EGTA)、150mM NaCl、1%v/vノニルフェノキシポリエトキシエタノール(例えば、Sigma-Aldrich Inc.社からのTergitol型NP-40)並びに1%v/vプロテアーゼ及び/又はホスファターゼ阻害剤を含有する溶解バッファー中に再懸濁する。全細胞溶解物を、例えば、細胞スクレイパーを用いて収集し、1,200g、4℃で15min遠心分離する。或いは、ヘリコバクター・ピロリ細胞を遠心分離により収集し、PBS中に再懸濁した後、20,000LB/inでFrenchプレス(SLM Instrument Inc.社、Urbana、Ill.)を介する通過により溶解する。再度、必要に応じて、細菌溶解物を、102,000Xgで10分間遠心分離して、細菌破片を除去する、及び/又は0.45μM膜(Nalgene社、Rochester、N.Y.)を通して濾過する。ヘリコバクター・ピロリの細胞溶解物を生成する別の方法は、例えば、リゾチームの存在下での細菌ペレットの凍結及び解凍の1回又は複数回のサイクルを含む。ヘリコバクター・ピロリ細胞溶解物の特定例は、例えば、濾過後に得られる、不活化されたヘリコバクター・ピロリの超音波処理された培養物の可溶性画分である。或いは、又は更に、ヘリコバクター・ピロリ細胞を、高圧ホモジェナイザ(例えば、Avestin社モデルEmulsiFlexC5)を用いて断片化する。場合により、細胞溶解物を、ホルマリンを用いて更に処理する。一例においては、例えば、本明細書に記載のように得られるヘリコバクター・ピロリの全細胞溶解物(WCL)を、さらなる分画化及び/又は精製にかけて、細胞タンパク質及び/又は脂質等の、ヘリコバクター・ピロリ細胞溶解物の1つ又は複数の成分を単離又は精製又は分離する。
【０１６２】
別の例においては、生きている、及び/又は不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリは、単離された形態にあってもよい。本明細書で用いられる用語「単離された」は、生きている、及び/又は不活化された、及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ等のヘリコバクター・ピロリを参照して用いられる場合、生きているヘリコバクター・ピロリが天然に存在するナイーブ環境とは異なる環境中に存在するヘリコバクター・ピロリ又はその細胞若しくは株を指す。例えば、単離されたヘリコバクター・ピロリは、そのナイーブ環境から除去若しくは単離されたものである、及び/又は生きているヘリコバクター・ピロリのナイーブ環境中に見出される少なくとも1つの成分を実質的に含まないものであってもよい。この文脈における用語「単離された」は、ヘリコバクター・ピロリ細胞培養物、部分的に純粋なヘリコバクター・ピロリ細胞調製物、及び実質的に純粋なヘリコバクター・ピロリ細胞調製物を含む。
【０１６３】
1つの特定例においては、ヘリコバクター・ピロリは、生物学的に純粋な形態で提供される。本明細書で用いられる用語「生物学的に純粋」とは、他の種の微生物を実質的に含まないヘリコバクター・ピロリのin vitro又はex vivoでの培養物を指す。場合により、生物学的に純粋なヘリコバクター・ピロリは、ヘリコバクター・ピロリの単一の株の培養物の形態にある。
【０１６４】
更に別の例においては、死滅させた、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリは、細胞溶解物を含んでもよい。例えば、細胞溶解物は、ヘリコバクター・ピロリの全細胞溶解物であってもよい。
【０１６５】
或いは、本発明は、本明細書の任意の例に従って記載される不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリと、本明細書の任意の例に従って記載される不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリの全細胞溶解物等の細胞溶解物との混合物を含む組成物を使用して用いられる。
【０１６６】
2.ヘリコバクター・ピロリの培養
株
当業界で公知の任意のヘリコバクター・ピロリ株を、本発明のヘリコバクター・ピロリ組成物の調製において用いることができる。一例においては、ヘリコバクター・ピロリ株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下で国際寄託当局に寄託された任意の生きているヘリコバクター・ピロリ株であってもよい。例えば、ヘリコバクター・ピロリ株、例えば、受託番号ATCC 43504又は受託番号ATCC 26695又は受託番号ATCC BAA-945又は受託番号ATCC 700392又は受託番号ATCC 49503又は受託番号ATCC 53726又は受託番号53727又は受託番号ATCC 43526又は受託番号ATCC: 43579又は受託番号ATCC 700824の下で寄託されたヘリコバクター・ピロリ等を、American Type Culture Collection (ATCC)から取得することができる。例えば、ヘリコバクター・ピロリ株は、J99株(ATCC 700824)であってもよい。或いは、又は更に、例示的なヘリコバクター・ピロリ株は、Moodley Yら(2009)、Science、323: 527〜530頁及び/又はFalush Dら(2003)、Science、299: 1582〜1585頁により記載されたものである。或いは、又は更に、本発明の組成物の調製において用いることができる例示的なヘリコバクター・ピロリ株は、以下のような、ブダペスト条約の規定に準じて、National Measurement Institute(NMI)、1/153 Bertrie Street、Port Melbourne、Victoria、Australiaに寄託されたものである。
【０１６７】
【表１】
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【０１６８】
別の例においては、ヘリコバクター・ピロリは、慢性胃炎、消化性潰瘍、例えば、胃潰瘍及び十二指腸潰瘍、及び/又は胃悪性腫瘍を示す患者等の、ヘリコバクター・ピロリに感染していると診断された患者に由来する哺乳動物、例えば、ヒト胃生検試料から得られた任意のヘリコバクター・ピロリ臨床単離物であってもよい。1つのそのような例においては、患者生検中のヘリコバクター・ピロリ細菌を、5%ヒツジ血液(Invitrogen社)を含有するColumbia寒天等の好適な培養培地上に接種し、例えば、Cheng-Chou Yuら(2013)、PLoS ONE, 1: e55724頁により記載されたように、10%CO2、5%O2及び85%N2中、微好気性チャンバ(Don Whitley社、West Yorkshire、UK)中で37℃で増殖させる。別の例においては、患者生検中のヘリコバクター・ピロリ細菌を、例えば、Thermoscientific社、Australiaから商業的に入手可能な、DENTの補給物質、ナリジクス酸及びバシトラシンを含むF12寒天培地プレート等のヘリコバクター・ピロリ選択培地上に接種する。1つのそのような例においては、ヘリコバクター・ピロリ株は、Cheng-Chou Yuら(2013)、上掲により記載されたTA1(Cag+及びVacA+)である。
【０１６９】
従って、いくつかの例においては、本発明のヘリコバクター・ピロリ株は、ヒト等の動物宿主を介して継代されたものである。例えば、本発明のヘリコバクター・ピロリ株は、例えば、ヘリコバクター・ピロリOND79株によるヒト対象の胃粘膜の感染及び/又は定着後、ヒト対象中でのOND79株の継代後にヘリコバクター・ピロリ株OND79から誘導される。1つのそのような例においては、ヘリコバクター・ピロリ株は、OND79細胞を投与されたヒト対象のヒト胃生検試料から得られる。例えば、本発明のヘリコバクター・ピロリ株は、OND86である。
【０１７０】
培養培地
細菌の増殖及び/又は維持のためにヘリコバクター・ピロリを培養するために用いられる培地は、当業者には公知の、例えば、BD Diagnostics社(Manual of Microbiological Culture Media、Sparks、Maryland、第2版、2009); Versalovicら(In Manual of Clinical Microbiology、American Society for Microbiology、Washington D.C、第10版、2011)、Garrityら(In Bergey's Manual of Systematic Bacteriology、Springer、New York、第2版、2001); Ndipら、2003、J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 36: 616〜622頁及びTestermanら、2001、J. Clin. Microbiol. 39: 3842〜3850頁に記載された手順により調製される。当業者には明らかであるように、ヘリコバクター・ピロリの形態を、グラム染色(例えば、Coico 2005 Curr. Protoc. Micorbiol. Appendix 3を参照されたい)を実施することにより評価し、生存能力を、例えば、Murrayら(In: Manual of Clinical Microbiology、American Society for Microbiology、Washington D.C.、第9版、2007)により記載されたようにコロニー計数を用いて評価することができる。
【０１７１】
好ましい細胞培養培地は、ウシ血清を添加されるか、又は改変細胞培養培地は、哺乳動物細胞の培養にとって好適な血清代替物を含み、発酵プロセスにおいてヘリコバクター・ピロリの増殖を支援するための十分な炭素及びエネルギー源を含む。好ましい細胞培養培地は、ヒト治療剤の生成における使用のための規制当局の認可を有する。
【０１７２】
例えば、ヘリコバクター・ピロリを、ウシ血清を添加し、Fe3+で補強された規定培地上で培養することができる。例示的な培地は、NaHCO3、ウシ胎仔血清(FBS)10%(v/v)及びFeSO4(75μM)を添加したF12液体培地である。
【０１７３】
特に好ましい例においては、ヘリコバクター・ピロリの培養のための培地は、塩化カルシウム(例えば、無水塩化カルシウム)、硫酸銅(例えば、硫酸銅・5H2O)、硫酸鉄(例えば、FeSO4・7H2O)、塩化マグネシウム(例えば、無水塩化マグネシウム)、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム(例えば、リン酸水素ナトリウム[無水])、硫酸亜鉛・7H2O(例えば、硫酸亜鉛・7H2O)、L-アラニン、L-アルギニン(例えば、L-アルギニン・HCl)、L-アスパラギン(例えば、L-アスパラギン・H2O)、L-アスパラギン酸、L-システイン(例えば、L-システイン・HCl又はL-システイン・HCl・H2O)、L-グルタミン酸、L-グルタミン、グリシン、L-ヒスチジン(例えば、L-ヒスチジン・HCl又はL-ヒスチジン・HCl・H2O)、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リシン(例えば、L-リシン・HCl)、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-トレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン(例えば、L-チロシン2Na・2H2O)、L-バリン、D-ビオチン、塩化コリン、葉酸、ミオイノシトール、ナイアシンアミド、D-パントテン酸(ヘミカルシウム)、ピロドキシン(例えば、ピリドキシン・HCl)、リボフラビン、チアミン(例えば、チアミン・HCl)、ビタミンB-12、D-グルコース、ヒポキサンチン、リノール酸、フェノールレッド(例えば、フェノールレッド・Na)、プトレシンジヒドロクロリド、ピルビン酸(例えば、ピルビン酸・Na)、チオクト酸、チミジン及びウシ血清を含む。
【０１７４】
1つのそのような好ましい例においては、ヘリコバクター・ピロリの培養のための培地は、0.0333g/L塩化カルシウム(無水)、0.0000025g/L硫酸銅・5H20、0.000834g/L硫酸鉄・7H20、0.0576g/L塩化マグネシウム[無水]、0.224g/L塩化カリウム、7.599g/L塩化ナトリウム、0.14204g/Lリン酸水素ナトリウム(無水)、0.000863g/L硫酸亜鉛・7H20、0.009g/L L-アラニン、0.211g/L L-アルギニン・HCl、0.01501g/L L-アスパラギン・H20、0.0133g/L L-アスパラギン酸、0.035g/L L-システイン・HCl・H20、0.0147g/L L-グルタミン酸、0146g/L L-グルタミン、0.00751g/Lグリシン、0.02096g/L L-ヒスチジン・HCl・H20、0.00394g/L L-イソロイシン、0.0131g/L L-ロイシン、0.0365g/L L-リシン・HCl、0.00448g/L L-メチオニン、0.00496g/L L-フェニルアラニン、0.0345g/L L-プロリン、0.0105g/L L-セリン、0.0119g/L L-トレオニン、0.00204g/L L-トリプトファン、0.00778g/L L-チロシン2Na・2H20、0.0117g/L L-バリン、0.0000073g/L D-ビオチン、0.01396g/L塩化コリン、0.00132g/L葉酸、0.018g/Lミオイノシトール、0.000037g/Lナイアシンアミド、0.00048g/L D-パントテン酸(ヘミカルシウム)、0.000062g/Lピリドキシン・HCl、0.000038g/Lリボフラビン、0.00034g/Lチアミン・HCl、0.00136g/LビタミンB-12、1.802g/L D-グルコース、0.00408g/Lヒポキサンチン、0.000084g/Lリノール酸、0.0013g/Lフェノールレッド・Na、0.000161g/Lプトレシンジヒドロクロリド、0.11g/Lピルビン酸・Na、0.00021g/Lチオクト酸、0.00073g/Lチミジン及びウシ血清100 mlを含む。
【０１７５】
ヘリコバクター・ピロリを培養するための培地中で、FBSを、脂質補給をして、又はせずにウシ血清アルブミンに置換することができる。或いは、血漿は細胞の生理、例えば、その脂質プロファイル及び/又はタンパク質プロファイル及び/又はLPSプロファイルに影響し得る凝固カスケードの成分を含むため、血漿をFBSに置換することができる。
【０１７６】
植物タンパク質又は他の細胞培養培地に基づく、他の半合成培地を用いることもできる。
【０１７７】
ヘリコバクター・ピロリを、液体、半固体又は固体形態で培養することができる。液体培地の例としては、Brucella Broth、Columbia Broth、ブレインハートインフュージョンブロス、Wilkins-Chalgrenブロス、Ham's F-10栄養培地、Ham's F-12栄養培地、Mueller-Hintonブロス、Skirrow Campylobacter培地、Belo Horizonte培地、Dent's CP培地及び例えば、Stevensonら、2000 Lett. Appl. Microbiol. 30: 192〜196頁により記載されたようなヘリコバクター・ピロリペプトンブロスが挙げられる。半固体及び固体培地を、例えば、寒天等の固形化剤の添加により、本明細書の任意の例に記載される液体培地のいずれかから調製することができる。或いは、例えば、チョコレート寒天、Tryptic Soy Agar、Glupszynski's Brusselsカンピロバクターチャコール寒天及びJohnson-Murano寒天等の、特定の半固体及び/又は固体培地を用いることができる。
【０１７８】
培地に、血液又は血液成分を添加することができる。本明細書で用いられる用語「血液」は、全血を意味すると取られるべきであり、「血液成分」とは、血清及び/又は血漿及び/又は血漿画分及び/又は赤血球及び/又は白血球及び/又は血小板及び/又はタンパク質画分を指す。好ましくは、血液又は血液成分は脱線維素される。一例においては、血液成分は、哺乳動物に由来するものである。好適な哺乳動物としては、例えば、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウス、又はヒトが挙げられる。好ましい例においては、血液成分は、血清を含んでもよい。一例においては、血清は、ウシ胎仔血清又はウシ新生仔血清又はウシ血清であってもよい。培地に、1%(vol/vol)又は少なくとも2%(vol/vol)又は少なくとも3%(vol/vol)又は少なくとも4%(vol/vol)又は少なくとも5%(vol/vol)又は少なくとも6%(vol/vol)又は少なくとも7%(vol/vol)又は少なくとも8%(vol/vol)又は少なくとも9%(vol/vol)又は少なくとも10%(vol/vol)又は少なくとも15%(vol/vol)又は少なくとも20%(vol/vol)又は少なくとも25%(vol/vol)の培地中での最終濃度で血液又は血液生成物を添加することができる。別の例においては、血液は、熱不活化された血液を含んでもよい。別の例においては、培地は、熱不活化された血液と熱不活化されていない血液との混合物を含んでもよい。血液を熱不活化する方法は、当業界で公知であり、例えば、Ayacheら、2006、J. Transl. Med. 4:40頁に記載されている。
【０１７９】
或いは、ヘリコバクター・ピロリを、例えば、Westblomら、1991、J. Clin. Microbiol. 29:819〜821頁により記載された卵黄乳濁培地等の血液非含有培地、又は例えば、Vegaら、2003、J. Clin. Micrbiol. 41: 5384〜5388頁により記載されたシアノバクテリア抽出物に基づく培地中で培養することができる。
【０１８０】
別の例においては、培地に、例えば、アデニン及び/又はシステインヒドロクロリド及び/又はシクロデキストリン及び/又は硝酸鉄及び/又は硫酸鉄及び/又はペプトン及び/又はIsoVitaleX及び/又はVitox及び/又はスターチ及び/又は重炭酸ナトリウム及び/又はピルビン酸ナトリウム及び/又はムチン及び/又はビタミンB12及び/又はL-グルタミン及び/又はグアニン及び/又はp-アミノ安息香酸及び/又はL-シスチン及び/又は酵母抽出物等の化学的補給物質を添加することができる。
【０１８１】
更に別の例においては、培地に、非ヘリコバクター・ピロリ微生物の増殖を阻害することができる抗生物質を添加することができる。好適な抗生物質としては、バンコマイシン及び/又はトリメトプリム及び/又はセフスロジン及び/又はアンホテリシンB及び/又はポリミキシンが挙げられる。
【０１８２】
好ましくは、ヘリコバクター・ピロリを、抗生物質を含まない培地中で培養する。
【０１８３】
環境条件
当業者には公知であるように、ヘリコバクター・ピロリを、例えば、CO2インキュベータ中等の微好気的雰囲気で、又は微好気的雰囲気を有する嫌気的チャンバ中で、又は記載のような気体生成キットを用いる気体ジャー中で培養することができる。好適な微好気的雰囲気は、例えば、Mobleyら(In H. pylori: Physiology and Genetics. American Society for Microbiology、Washington D.C.、2001)により記載されている。一例においては、ヘリコバクター・ピロリを、約1%〜約10%酸素、約5%〜約10%二酸化炭素、及び約0%〜約10%水素を含む雰囲気中で培養することができる。
【０１８４】
ヘリコバクター・ピロリを培養するのに用いられる温度条件は、当業界で公知である。例えば、ヘリコバクター・ピロリを、約25℃〜約45℃の温度で培養することができる。好ましくは、ヘリコバクター・ピロリを、約30℃〜約40℃の温度で培養することができる。より好ましくは、ヘリコバクター・ピロリを、約37℃の温度で培養することができる。
【０１８５】
一例においては、ヘリコバクター・ピロリに、培養中にストレスを加えることができる。本明細書で用いられる用語「ストレスを加える」は、環境条件の変化を意味すると取られるべきである。例えば、ヘリコバクター・ピロリを、例えば、酸化的ストレス、pHストレス、浸透圧ストレス、炭素飢餓、リン酸飢餓、窒素飢餓、アミノ酸飢餓、例えば、嫌気的条件下でヘリコバクター・ピロリを増殖させることによる酸素ストレス、熱若しくは低温ショック又は変異原性ストレス等の環境ストレスに曝露することができる。好ましくは、培養中の環境ストレスへのヘリコバクター・ピロリの曝露は、リポ多糖合成及びその表面提示並びに/又はヘリコバクター・ピロリ細胞タンパク質の分解の増強等のヘリコバクター・ピロリにおける1つ又は複数の代謝的変化をもたらす。
【０１８６】
細胞培養容器
ヘリコバクター・ピロリを、例えば、マルチウェルプレート、ペトリ皿、ローラーボトル、Tフラスコ、Dフラスコ、培養チャンバ、ハイパーフラスコ容器、スピナーフラスコ及びErlenmeyerフラスコ等の、当業者には公知の標準的な細胞培養容器を用いて培養することができる。
【０１８７】
好ましい細胞培養条件は、大規模培養におけるヘリコバクター・ピロリの最適な増殖を提供するために、細胞培養培地、剪断感度、酸素及び他の気体の要件、及びpH制御、例えば、短い時間枠での細胞培養物の高い光密度について最適化される。
【０１８８】
好ましくは、ヘリコバクター・ピロリを、バイオリアクタ中で培養することができる。本明細書で用いられる用語「バイオリアクタ」は、制御された条件下で原核及び/又は真核細胞培養物の培養のための装置を意味すると取られるべきである。バイオリアクタを、バッチ式又はフェドバッチ式又は拡張バッチ式又は反復バッチ式又はドロー/フィル又は回転壁又はスピニングフラスコ又は半連続又はかん流又は連続モードで運転してもよい。
【０１８９】
一例においては、バイオリアクタは、例えば、培養物による液体又は気体のロッキング、撹拌、又はチャネリング等の方法を用いて、通気のために細胞培養物を撹拌してもよい。そのようなバイオリアクタの例としては、例えば、混合装置を回転させることにより撹拌される撹拌タンク発酵器又はバイオリアクタ、ケモスタット、振とう装置により撹拌されるバイオリアクタ、エアリフト発酵器/バイオリアクタ、流動床バイオリアクタ、波動誘導性撹拌を用いるバイオリアクタ、遠心分離バイオリアクタ又はローラーボトルが挙げられる。
【０１９０】
別の例においては、バイオリアクタは、例えば、培養培地の光密度を測定すること等による、バイオマスの定量のための手段を含んでもよい。バイオマスの定量のための好適な手段としては、例えば、光センサ又は導波管センサ又はRaman分光法が挙げられる。
【０１９１】
更に別の例においては、バイオリアクタは、1つ又は複数の生体プロセスパラメータをモニタリング及び/又は測定及び/又は調整するための手段を含んでもよい。本明細書で用いられる用語「生体プロセスパラメータ」は、ヘリコバクター・ピロリの増殖速度を変化させ得る化学的又は物理的特性を意味すると取られるべきである。好適な生体プロセスパラメータとしては、例えば、温度、pH、溶解酸素、二酸化炭素濃度、炭素源濃度、胆汁酸濃度、光、グルコース濃度、圧力、イオン種の濃度、細胞代謝物の濃度、モル濃度、オスモル濃度、グルコース濃度、血清濃度及び撹拌の程度が挙げられる。
【０１９２】
当業者には明らかであるように、いくつかの方法を用いて、ヘリコバクター・ピロリの増殖速度を決定することができる。
【０１９３】
好ましくは、バイオリアクタは、マイクロリアクタである。本明細書で用いられる用語「マイクロリアクタ」とは、1000mL未満又は900mL未満又は800mL未満又は700mL未満又は600mL未満又は500mL未満又は400mL未満又は300mL未満又は200mL未満又は100mL未満又は90mL未満又は80mL未満又は70mL未満又は60mL未満又は50mL未満又は40mL未満又は30mL未満又は20mL未満又は15mL未満又は10mL未満又は9mL未満又は8mL未満又は7mL未満又は6mL未満又は5mL未満又は4mL未満又は3mL未満又は2mL未満又は1mL未満の容量を有するバイオリアクタを指す。商業的に入手可能なマイクロリアクタとしては、例えば、マイクロ-Matrix(Applikon BIotechnology社)、マイクロ-フラスコ(Applikon Biotechnology社)及び進化型マイクロスケールバイオリアクタ(Tap Biosystems社)が挙げられる。
【０１９４】
或いは、バイオリアクタは、大規模バイオリアクタである。本明細書で用いられる用語「大規模バイオリアクタ」とは、販売のための製品を生成するのに用いられる、又は販売のための製品の中間体の生成のためのバイオリアクタを指す。好ましくは、大規模バイオリアクタは、少なくとも1L、少なくとも2L、少なくとも3L、少なくとも4L、少なくとも5L、少なくとも6L、少なくとも7L、少なくとも8L、少なくとも9L、少なくとも10L、少なくとも20L、少なくとも50L、少なくとも100L、少なくとも200L、少なくとも300L、少なくとも400L、少なくとも500L、少なくとも600L、少なくとも700L、少なくとも800L、少なくとも900L、少なくとも1000L、特に、少なくとも2000L、少なくとも3000L又は少なくとも4000Lの内部容量を有する。
【０１９５】
特に好ましい例においては、ヘリコバクター・ピロリは、例えば、約3mLのストック容量でヘリコバクター・ピロリを用いる、凍結された、又は凍結されていないグリセロールストック又は他の液体ストック又はプレートストックから培養された後、マルチチャンネル小型バイオリアクタシステム又は拡張性撹拌タンクバイオリアクタ、例えば、2Lの卓上型撹拌タンクリアクタ中に播種し、培養される。パイロットスケールのバイオリアクタのための接種物を調製する種系列を用いることができる。例えば、ヘリコバクター・ピロリの400Lのパイロットスケールバッチを、それぞれの種段階が約600nmのODにより決定される細菌培養密度の10倍増幅を提供する1又は2又は3又は4又は5の種段階から生成することができる。同様のスケールアッププロセスにおいて、パイロットスケールのバイオリアクタからの接種物を用いて、製造スケールのバイオリアクタに接種する。例えば、パイロットスケールのバイオリアクタプロセスに由来する2L〜20Lの培養物のバッチを、製造スケールのバイオリアクタの接種のために適切な容量が得られるまで混合する。各段階のインキュベーション時間は、約16時間〜約120時間、例えば、16時間〜約96時間の範囲で変化する。
【０１９６】
別の例においては、種培養を用いて、パイロットスケールのバイオリアクタのための接種物を作成するために細胞及びプロセス容量を増幅した後、製造スケールのバイオリアクタ中の培地に接種する。例えば、-80℃で凍結保存されたヘリコバクター・ピロリ細胞(0.5mL)を、室温で解凍することにより蘇生させ、0.4mLを20〜100mLの培地に移し、光密度(600nmで測定)が約0.4〜約20の範囲になるまで、培養物を37℃で16〜96時間、微好気的環境中でインキュベートする。次いで、この種培養を用いて、約200mL〜約2000mLの容量を有するより大きい培養物に接種した後、以前と同じ細胞濃度を達成するために同じ条件下でインキュベートする。次いで、より大きい培養物を用いて、2L(例えば、Biostat B、Sartorius-Stedim社、Germany)又は10L(例えば、Biostat C10、Sartorius-Stedim社、Germany)又は16L(例えば、New Brunswick Bioflo 510、Eppendorf社、USA)又は50L(例えば、Biostat D50、Sartorius-Stedim社、Germany)の運転容量を有する小型バイオリアクタに接種する。バイオリアクタは、pH、溶解酸素、及び気泡を制御しながら37℃で運転される。pHは、10%(v/v)のリン酸又は10%(v/v)のアンモニア溶液の自動添加等により、pH6〜pH8の範囲の設定点で制御される。好ましくは、バイオリアクタに、窒素、二酸化炭素及び少量の酸素(又は圧縮空気)を含有する気体混合物を拡散させ、溶解酸素飽和を、例えば、撹拌速度及び/又は気体流速及び/又は容器背圧を変化させること等により、0.5%〜10%の飽和度に制御する。気泡を、必要に応じて添加される、化学的消泡剤、例えば、ポロプロピレングリコールの自動添加により制御することができる。
【０１９７】
製造スケールのバイオリアクタプロセスの例においては、約400L〜約10,000Lの容量を有するバイオリアクタを、高収率のヘリコバクター・ピロリ細胞を可能にする構成で運転する。システムを、自動滅菌プロセス及び一連の再滅菌可能な試料及び添加バルブを用いて構成し、発酵中の試薬及び生成物のサンプリング及び添加を可能にすることができる。接種時に、接種物を製造バイオリアクタに無菌的に移す。バイオリアクタを、本質的にはパイロットスケールの製造プロセス中に、pH、溶解酸素及び気泡を制御しながら37℃で運転する。
【０１９８】
フェドバッチ式又は「セミバッチ式」培養が、ヘリコバクター・ピロリの大規模製造にとって特に好ましい。フェドバッチ式培養においては、1つ又は複数の栄養素が、培養中にバイオリアクタに供給され、細胞生成物は実行の終わりまでバイオリアクタ中に残存する。いくつかの場合、全ての栄養素を、バイオリアクタ中に供給する。フェドバッチ式培養は、培養液中の栄養素濃度のより良好な制御を可能にする。一般に、フェドバッチ式ヘリコバクター・ピロリ培養を、溶解酸素濃度、細胞数を増加させるための供給組成、細胞数を増加させるための供給速度、細胞数を増加させるのに必要な気体要件、及び細胞数を増加させるのに必要な培地の栄養素組成の1つ又は複数についてモニタリングする。これは、ヘリコバクター・ピロリの高い栄養要求のためである。細胞の高い光密度が最も短い時間枠で得られるように、培地処方及び細胞増殖の比較分析のために光密度をモニタリングする。例えば、600nmでの20を超える光密度単位及び/又は600nmでの約40までの光密度等の、バッチ式培養において典型的に観察されるレベルを超える細胞濃度が得られる。
【０１９９】
3.ヘリコバクター・ピロリの不活化及び死滅
ヘリコバクター・ピロリを、化学的手段及び/又は物理的手段及び/又は遺伝的手段によって不活化及び/又は死滅することができる。本明細書で用いられる用語「化学的手段」とは、ヘリコバクター・ピロリを化学物質に曝露することによりヘリコバクター・ピロリを不活化及び/又は死滅する方法を指す。本明細書で用いられる用語「物理的手段」とは、ヘリコバクター・ピロリを、化学物質の使用を含まない1つ又は複数の物理的処理に曝露することによりヘリコバクター・ピロリを不活化及び/又は死滅する方法を指す。本明細書で用いられる用語「遺伝的手段」とは、ヘリコバクター・ピロリのゲノムを改変することによりヘリコバクター・ピロリを不活化及び/又は死滅する方法を指す。
【０２００】
ヘリコバクター・ピロリを不活化及び/又は死滅するための好適な化学的手段は、ホルムアルデヒド及び/又はβ-プロピオラクトン及び/又はエチレンイミン及び/又はバイナリーエチレンイミン及び/又はチメロサール及び/又は酸及び/又はアルカリ及び/又は1つ若しくは複数の殺菌剤及び/又は1つ若しくは複数の還元剤及び/又は胆汁塩等の1つ又は複数の化学物質の添加を含む。当業界で公知のこれらの化学物質の誘導体を用いることもできる。
【０２０１】
1つの好ましい例においては、ヘリコバクター・ピロリは、約0.01%〜約1%(w/w)又は約0.01%〜約0.1%(w/w)又は約0.025%〜約0.1%(w/w)の濃度のホルムアルデヒドへの曝露により不活化及び/又は死滅させる。
【０２０２】
或いは、又は更に、ヘリコバクター・ピロリは、例えば、Chakrabortiら、2012、Langmuir、28:11142〜11152頁により記載されたポリエチレンイミン官能化酸化亜鉛ナノ粒子への曝露により不活化及び/又は死滅させる。
【０２０３】
或いは、又は更に、本明細書の任意の例に従って記載される死滅させたヘリコバクター・ピロリは、生きている、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、1つ又は複数の殺菌剤に曝露することにより調製される。例えば、生きている、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリを、リファンピン、アモキシシリン、クラリスロマイシン、リファマイシン、リファキシミン、リファマイシン誘導体3'-ヒドロキシ-5'-(4-イソブチル-1-ピペラジニル)ベンゾオキサジノリファマイシン、同義、KRM-1648及び/又はリファマイシン誘導体3'-ヒドロキシ-5'-(4-プロピル-1-ピペラジニル)ベンゾオキサジノリファマイシン、同義、KRM-1657から選択される1つ又は複数の抗生物質を用いる処理にかけることができる。
【０２０４】
或いは、又は更に、本明細書の任意の例に従って記載される不活化されたヘリコバクター・ピロリは、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、1つ若しくは複数の酸又はpH3.0以下等の低いpH環境及び/又は1つ若しくは複数の塩基又はpH9.0以上等の高いpH環境に曝露することにより調製される。
【０２０５】
或いは、又は更に、本明細書の任意の例に従って記載される不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリは、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、重硫酸ナトリウム等の1つ若しくは複数の還元剤及び/又は過酸化水素等の1つ若しくは複数の酸化剤に曝露することにより調製される。
【０２０６】
或いは、又は更に、本明細書の任意の例に従って記載される不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリは、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、胆汁塩に曝露することにより調製される。
【０２０７】
ヘリコバクター・ピロリを不活化及び/又は死滅するための好適な物理的手段は、可視光及び/又はUV-C光等の紫外光及び/又は低出力レーザー光増感剤及び/又は熱(例えば、乾熱若しくは蒸気中等の湿熱)及び/又は高圧及び/又は温度シフト及び/又は凍結-解凍及び/又は凍結-乾燥(凍結乾燥)及び/又は超音波処理への曝露を含む。
【０２０８】
或いは、又は更に、ヘリコバクター・ピロリは、約375nm〜約500nmの範囲又は約400nm〜約420nmの範囲の波長の可視光への曝露により不活化及び/又は死滅させる。
【０２０９】
或いは、又は更に、ヘリコバクター・ピロリは、例えば、Hayesら、2006、Appl. Environ. Microbiol. 72: 3763〜3765頁に記載のように、紫外光への曝露により不活化及び/又は死滅させる。
【０２１０】
例えば、本明細書の任意の例に従って記載される不活化されたヘリコバクター・ピロリは、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、紫外線曝露等の照射に曝露することにより、及び/又は約375nm〜約500nmの範囲若しくは約400nm〜約420nmの範囲の波長等の可視光、例えば、405nmの紫色光への曝露により調製される。一例においては、本明細書の任意の例に従って記載される不活化されたヘリコバクター・ピロリは、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、約100nm〜約280nmの範囲、例えば、約257.3nmの波長等の紫外線C(UVC)照射及び/又は約280nm〜約315nmの範囲の波長等の紫外線B(UVB)照射及び/又は約315nm〜約400nmの範囲の波長等の紫外線A(UVA)に曝露することを含むプロセスにより調製される。好ましくは、生きているヘリコバクター・ピロリを、約100nm〜約280nmの範囲、例えば、約257.3nmのUVC光に曝露する、及び/又は生きているヘリコバクター・ピロリを、約405nmの紫色光に曝露することによってヘリコバクター・ピロリを不活化する。
【０２１１】
或いは、本明細書の任意の例に従って記載される死滅させたヘリコバクター・ピロリは、生きているか、又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、約100nm〜約280nmの範囲、例えば、約257.3nmの波長等の紫外線C(UV-C)照射及び/又は約280nm〜約315nmの範囲の波長等の紫外線B(UV-B)照射及び/又は約315nm〜約400nmの範囲の波長等の紫外線A(UV-A)照射に曝露することを含むプロセスによって調製される。好ましくは、生きているか、又は不活化されたヘリコバクター・ピロリを、約100nm〜約280nmの範囲、例えば、約257.3nmのUV-C光に曝露する。或いは、生きているか、又は不活化されたものを、約405nmの紫色光に曝露することによって、ヘリコバクター・ピロリを死滅する。
【０２１２】
或いは、又は更に、ヘリコバクター・ピロリは、ガンマ照射への曝露により不活化及び/又は死滅させる。
【０２１３】
或いは、又は更に、ヘリコバクター・ピロリは、生きているか、又は不活化されたヘリコバクター・ピロリを、例えば、MILLSONら、1996、J. Med. Microbiology、44:245〜252頁により記載された光増感剤の存在下で低出力レーザーに曝露することにより不活化及び/又は死滅させる。或いは、又は更に、ヘリコバクター・ピロリは、細胞の熱処理により不活化及び/又は死滅させる。
【０２１４】
例えば、ヘリコバクター・ピロリを、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞を約40℃〜約70℃以上の範囲の温度等の熱処理に曝露する熱処理によって不活化することができる。この文脈における好ましい熱処理は、約60℃以上の温度に少なくとも約60秒間、好ましくは約60℃又は約70℃又は約80℃又は約90℃又は約100℃又は約110℃又は約120℃又は約130℃又は約140℃又は約150℃の温度に、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞を曝露することを含んでもよく、前記温度への曝露は、少なくとも3分間又は少なくとも4分間又は少なくとも5分間又は少なくとも6分間又は少なくとも7分間又は少なくとも8分間又は少なくとも9分間又は少なくとも10分間又は少なくとも20分間又は少なくとも30分間又は少なくとも40分間又は少なくとも50分間又は少なくとも1時間又は少なくとも2時間又は少なくとも3時間又は少なくとも4時間又は少なくとも5時間又は少なくとも6時間又は少なくとも7時間又は少なくとも8時間又は少なくとも9時間又は少なくとも10時間又は少なくとも11時間又は少なくとも12時間又は少なくとも13時間又は少なくとも14時間又は少なくとも15時間又は少なくとも16時間又は少なくとも17時間又は少なくとも18時間又は少なくとも19時間又は少なくとも20時間又は少なくとも21時間又は少なくとも22時間又は少なくとも23時間又は少なくとも1日間又は少なくとも2日間又は少なくとも3日間又は少なくとも5日間又は少なくとも5日間又は少なくとも6日間又は少なくとも7日間にわたるものである。
【０２１５】
或いは、本明細書の任意の例に従って記載される死滅させたヘリコバクター・ピロリは、生きている、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、約60℃以上の温度に少なくとも約60秒間、好ましくは約60℃又は約70℃又は約80℃又は約90℃又は約100℃又は約110℃又は約120℃又は約130℃又は約140℃又は約150℃の温度に曝露すること等による熱処理に曝露することにより調製され、前記温度への曝露は、少なくとも2分間又は少なくとも3分間又は少なくとも4分間又は少なくとも5分間又は少なくとも6分間又は少なくとも7分間又は少なくとも8分間又は少なくとも9分間又は少なくとも10分間又は少なくとも20分間又は少なくとも30分間又は少なくとも40分間又は少なくとも50分間又は少なくとも1時間又は少なくとも2時間又は少なくとも3時間又は少なくとも4時間又は少なくとも5時間又は少なくとも6時間又は少なくとも7時間又は少なくとも8時間又は少なくとも9時間又は少なくとも10時間又は少なくとも11時間又は少なくとも12時間又は少なくとも13時間又は少なくとも14時間又は少なくとも15時間又は少なくとも16時間又は少なくとも17時間又は少なくとも18時間又は少なくとも19時間又は少なくとも20時間又は少なくとも21時間又は少なくとも22時間又は少なくとも23時間又は少なくとも1日間又は少なくとも2日間又は少なくとも3日間又は少なくとも5日間又は少なくとも5日間又は少なくとも6日間又は少なくとも7日間にわたるものである。
【０２１６】
1つの好ましい例においては、生きている、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリは、単一のそのような上昇した温度への曝露によるか、又は約70℃の第1の温度への曝露、次いで、約90℃若しくは約95℃の第2の温度への曝露等の少なくとも2つの異なる上昇した温度への曝露により死滅させる。1つのそのような好ましい例においては、生きている、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリは、約70℃の温度に約10分間の曝露、次いで、約90℃又は約94℃又は約95℃の温度に約5分間の曝露により死滅させる。
【０２１７】
或いは、又は更に、本明細書の任意の例に従って記載される死滅させたヘリコバクター・ピロリは、生きている、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、蒸気及び高圧の存在下、高温に曝露することにより、例えば、生きている、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞又は株をオートクレーブすることにより調製される。例えば、生きている、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリは、細菌細胞又は株を、約121℃及び約15psiで約15分間、又は約132℃及び約30psiで約3分間、オートクレーブすることにより死滅させる。
【０２１８】
1つの好ましい例においては、ヘリコバクター・ピロリは、単一のそのような高温への曝露等の温度シフトにより、又は約70℃の第1の温度への曝露、次いで、約90℃若しくは約94℃若しくは約95℃の第2の温度への曝露等の少なくとも2つの異なる高温への曝露により不活化及び/又は死滅させる。
【０２１９】
或いは、又は更に、ヘリコバクター・ピロリは、1回又は複数回の凍結-解凍サイクルへの細胞の曝露、例えば、2又は3又は4又は5又は6又は7又は8又は9又は10回の凍結-解凍サイクルへの曝露により、不活化及び/又は死滅させる。例示的な凍結-解凍サイクルは、ドライアイス/エタノール浴中でヘリコバクター・ピロリを凍結した後、37℃で材料を解凍する工程を含む。
【０２２０】
或いは、又は更に、ヘリコバクター・ピロリは、細胞を凍結-乾燥することにより不活化及び/又は死滅させる。
【０２２１】
或いは、又は更に、ヘリコバクター・ピロリは、細胞を超音波処理することにより不活化及び/又は死滅させる。例えば、本明細書の任意の例に従って記載される死滅させたヘリコバクター・ピロリは、例えば、約20kHz以上等の超音波周波数での生きている、及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリの超音波処理により調製される。
【０２２２】
好ましくは、本明細書の任意の例に従って記載される不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリは、最初に生きているヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、ガンマ照射及び/若しくはUV-C光等の紫外線照射等の照射に曝露すること、並びに/又は約375nm〜約500nmの範囲若しくは約400nm〜約420nmの範囲の波長等の可視光に曝露することによって、ヘリコバクター・ピロリを不活化した後、不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、本明細書の任意の例に従って記載される熱処理に曝露することによって、不活化されたヘリコバクター・ピロリを死滅するか、又は不活化されたヘリコバクター・ピロリを不可逆的に代謝的に不活性にすることによって調製される。
【０２２３】
例えば、その後、不活化されたヘリコバクター・ピロリを、約60℃以上の温度に少なくとも約60秒間、好ましくは約60℃又は約70℃又は約80℃又は約90℃又は約100℃又は約110℃又は約120℃又は約130℃又は約140℃又は約150℃の温度に曝露し、前記温度への曝露は、少なくとも2分間又は少なくとも3分間又は少なくとも4分間又は少なくとも5分間又は少なくとも6分間又は少なくとも7分間又は少なくとも8分間又は少なくとも9分間又は少なくとも10分間又は少なくとも20分間又は少なくとも30分間又は少なくとも40分間又は少なくとも50分間又は少なくとも1時間又は少なくとも2時間又は少なくとも3時間又は少なくとも4時間又は少なくとも5時間又は少なくとも6時間又は少なくとも7時間又は少なくとも8時間又は少なくとも9時間又は少なくとも10時間又は少なくとも11時間又は少なくとも12時間又は少なくとも13時間又は少なくとも14時間又は少なくとも15時間又は少なくとも16時間又は少なくとも17時間又は少なくとも18時間又は少なくとも19時間又は少なくとも20時間又は少なくとも21時間又は少なくとも22時間又は少なくとも23時間又は少なくとも1日間又は少なくとも2日間又は少なくとも3日間又は少なくとも5日間又は少なくとも5日間又は少なくとも6日間又は少なくとも7日間にわたるものである。1つのそのような例においては、不活化されたヘリコバクター・ピロリを、単一のそのような高温に、又は約70℃の第1の温度への、例えば、約10分間の曝露、次いで、約90℃若しくは約95℃の第2の温度への、例えば、約5分間の曝露等による少なくとも2つの異なる高温に曝露する。
【０２２４】
1つの好ましい例においては、本明細書の任意の例に従って記載される死滅させたヘリコバクター・ピロリは、最初に生きているヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、UVC光、例えば、約257.3nm等の紫外線照射に曝露することによって、ヘリコバクター・ピロリを不活化した後、不活化されたヘリコバクター・ピロリ細胞又は株を、本明細書の任意の例に従って記載される熱処理に曝露することによって、不活化されたヘリコバクター・ピロリを死滅するか、又は不活化されたヘリコバクター・ピロリを不可逆的に代謝的に不活性にすることによって調製される。
【０２２５】
従って、1つの好ましい例においては、本明細書の任意の例による組成物は、照射によりヘリコバクター・ピロリを不活化するためのプロセス及び熱処理により不活化されたヘリコバクター・ピロリを死滅するためのプロセスにかけられたヘリコバクター・ピロリを含む。
【０２２６】
或いは、又は更に、本明細書の任意の例に従って記載されるヘリコバクター・ピロリは、生きているか、又は不活化されたヘリコバクター・ピロリを、例えば、ヘリコバクター・ピロリを培養する気圧を、例えば、胃から腸下部(例えば、小腸及び/又は大腸)へのヘリコバクター・ピロリの流出中のin vivoでの気圧条件を模倣するために、微好気的環境から嫌気的環境に変化させることにより、嫌気的条件に曝露することにより不活化及び/又は死滅させる。例えば、生きている(新鮮に増殖させたもの等)ヘリコバクター・ピロリは、細菌細胞を嫌気的条件に約1日間〜約5日間以上、例えば、少なくとも約24時間、又は少なくとも約48時間又は少なくとも約73時間又は少なくとも約96時間又は少なくとも約120時間曝露すること(例えば、増殖させるか、又はインキュベートすることによる)により不活化される。1つのそのような例においては、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞は、細胞を嫌気的条件に曝露すること、及び細胞の熱処理により不活化される。
【０２２７】
別の例においては、本明細書の任意の例に従って記載される生きているか、又は不活化されたヘリコバクター・ピロリは、生きているか、又は不活化された細菌細胞を、嫌気的条件に約1日間〜約5日間以上、例えば、少なくとも約24時間、又は少なくとも約48時間又は少なくとも約73時間又は少なくとも約96時間又は少なくとも約120時間曝露すること(例えば、インキュベーションによる)により死滅させる。
【０２２８】
1つの好ましい例においては、本明細書の任意の例による組成物は、細菌細胞を嫌気的条件に約1日間〜約5日間以上、例えば、少なくとも約24時間、又は少なくとも約48時間又は少なくとも約73時間又は少なくとも約96時間又は少なくとも約120時間曝露することにより(例えば、増殖させるか、又はインキュベートすることによる)、ヘリコバクター・ピロリを不活化するためのプロセス、及び細胞の熱処理により不活化されたヘリコバクター・ピロリを死滅するためのプロセスにかけられたヘリコバクター・ピロリを含む。
【０２２９】
本明細書の任意の例に従って記載される不活化されたヘリコバクター・ピロリを生成するための好適な遺伝的手段は、ヒト対象の胃及び腸粘膜におけるヘリコバクター・ピロリの効率的な定着及び/又は維持にとって必要とされる1つ又は複数の遺伝子の発現を改変するための生きているヘリコバクター・ピロリ細胞又は株の突然変異誘発を含む。例えば、そのような遺伝子を、組換えにより欠失させるか、又はトランスポゾン若しくは他の遺伝子エレメントの挿入により改変することができるか、又はそれらを化学的突然変異誘発によって不活化することができる。そのような手段は、当業界で記載されている。
【０２３０】
不活化及び/又は死滅を、液体、半固体又は固体形態にあるヘリコバクター・ピロリ細胞に対して実施することができる。一例においては、液体中で培養されたヘリコバクター・ピロリを、細胞数が培養物中で指数的に増加している対数増殖期に、又は培養物中の生細胞が対数期の後であり、数が増加していない増殖定常期に不活化及び/又は死滅することができる。
【０２３１】
特に好ましい例においては、パイロットスケールの培養物又は他の大規模培養物、例えば、2Lより多い、又は5Lより多い、又は10Lより多い、又は約100L〜約400Lの容量、例えば、100L又は150L又は200L又は250L又は300L又は350L又は400L、又はより大きい容量の培養物を、例えば、本明細書に記載のパイロットスケールリアクタと同じオペレーティングシステムを有する、定置蒸気バイオリアクタ又は定置滅菌バイオリアクタ中で処理する。そのようなバイオリアクタ中で、不活化及び/又は死滅プロセスは、細胞が所望の細胞密度を達成したら、細胞に適用される蒸気を生成するための高温及び高圧を用いることによって、細胞を不活化及び/又は死滅する。
【０２３２】
別の例においては、フェドバッチ式プロセス中の培養物を、600nmのOD単位あたり100Joulesより高い放射照度の紫外線、例えば、UV-C照射にかけた後、細胞を60℃〜約120℃の範囲、例えば、121℃の温度で、約15分間〜約6時間の範囲の時間にわたって熱処理する。
【０２３３】
本発明はまた、本明細書に記載のように調製される本発明の処理されたヘリコバクター・ピロリを含むマスターセルバンクも提供する。例えば、マスターセルバンクは、処理されたヘリコバクター・ピロリ細胞のアリコート、例えば、細胞生成物を含む100又は200又は300又は400又は500個のバイアルを含んでもよい。好ましくは、マスターセルバンクは、例えば、-80℃で凍結保存される。
【０２３４】
4.処理されたヘリコバクター・ピロリ細胞の収獲
微生物を収獲するための方法は、当業界で周知であり、例えば、Ausubelら(In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience、ISBN 047 150338、1987)又はSambrookら(In: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratories、New York、第3版、2001)により記載されている。本明細書で用いられる用語「収獲すること」とは、ヘリコバクター・ピロリの集団が培養された培地からのヘリコバクター・ピロリの収集を指す。好適な方法としては、例えば、遠心分離、例えば、超遠心分離、又は濾過、例えば、限外濾過若しくはマイクロ濾過若しくは深層濾過が挙げられる。
【０２３５】
ヘリコバクター・ピロリ細胞は、一般に、不活化及び/又は死滅の後に収獲される。
【０２３６】
好ましい例においては、処理された細胞を、培養物、例えば、バイオリアクタから、約5,000xg〜約20,000xgの範囲の遠心力等での連続遠心分離を用いることにより回収する。好ましくは、収獲された細胞を、製剤化バッファー、例えば、リン酸緩衝生理食塩水又は他の薬学的に許容される賦形剤若しくは希釈剤を用いて洗浄する。洗浄溶液に、デキストラン又はカプセル封入製剤を添加することができる。
【０２３７】
次いで、細胞生成物を、保存又は使用に備えて包装する。好ましくは、細胞を凍結乾燥又は噴霧乾燥して、長期保存にとって好適な固体生成物を作成する。
【０２３８】
包装は、細胞生成物の1つ又は複数の仕様、例えば、細胞濃度、バッファー組成、液体製剤、乾燥製剤、包装サイズ等を含む。
【０２３９】
5.不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリの決定又は同定
本明細書の任意の例に記載の組成物及び/又は方法におけるヘリコバクター・ピロリ又はその細胞の有用性を測定するための方法は、ヘリコバクター・ピロリ若しくはその細胞が、哺乳動物の胃粘膜で複製及び/若しくは定着する能力を測定する任意の方法並びに/又はヘリコバクター・ピロリ若しくはその細胞が、胃粘膜若しくはその上皮細胞に付着する能力を測定する任意の方法並びに/又は例えば、本明細書の任意の例に従って記載されるストレス及び/若しくは不活化及び/若しくはヘリコバクター・ピロリの死滅処理後の、ヘリコバクター・ピロリの生存能力及び/若しくは代謝活性を測定する任意の方法を含む。
【０２４０】
一例においては、ヘリコバクター・ピロリ又はその細胞が、哺乳動物の胃粘膜で複製及び定着する能力は、コロニー計数等による生きた細菌の定量により決定される。例えば、Drumm及びSheman 1991、J. Med. Microbiol 35:197〜202頁を参照されたい。
【０２４１】
例えば、本明細書の任意の例に従って記載のように、培養され、ストレス及び/若しくは不活化及び/若しくは死滅処理にかけられた保存されたヘリコバクター・ピロリ細菌の660nmで約0.2〜約5.0以上の光密度の細胞等価物を測定する試料0.5mlを、10%ウシ胎仔血清(例えば、Boknek Laboratories社、Ontario、Canada)を添加したBrucella Broth(例えば、Gibco Laboratories社、Madison、WI、USA)、又は例えば、本明細書の任意の例に従って記載されるような、ヘリコバクター・ピロリの増殖にとって好適な他の培地の新鮮な培地11mlを含有する250mlのErlenmeyerフラスコ中に再懸濁する。必要に応じて、培養培地に、トリメトプリム(例えば、Sigma Chemicals社、St.Louis、MO、USA)5mg/L及び/又はバンコマイシン(例えば、Sigma社)10mg/Lを添加する。フラスコを、緩く固定したスクリューキャップで閉じ、インキュベーションジャーの中に入れた後、CO210%、O25%、N285%を含有する気体を通して排出及びフラッシュし、回転式振とう器上、37℃でインキュベートし、100rpmで振とうしながら37℃でインキュベートする。約24時間後、約1mlの細菌培養物を、Brucella Brothの新鮮な培地に移し、再度インキュベートする。生きている、及び複製しているヘリコバクター・ピロリの非存在を、添加されたBrucella寒天プレート上でのブロスのサブ培養及び位相差顕微鏡による細菌の形態の検査により確認する。例えば、Drumm及びSherman、1989、J. Clin Microbiol、27:1655〜1656頁を参照されたい。
【０２４２】
或いは、又は更に、生きている、及び複製しているヘリコバクター・ピロリ細菌の定量を、例えば、6、12、18、24、30及び36時間のインキュベーション後に、連続希釈及び600nmでの培養物の光密度の連続測定により、並びに/又はコロニー計数により、ブロス培養物中で実施する。例えば、存在する場合、生きている、及び複製しているヘリコバクター・ピロリ細菌の細胞計数を、培養物の連続希釈液を3組、Brucella寒天上に接種し、微好気的条件で37℃で5日間、プレートをインキュベートすることにより決定する。生きている、及び複製しているヘリコバクター・ピロリは、Brucella寒天上で平滑な、半透明のコロニーを生成する。生菌数(cfu)の精度を改善するために、4mg/Lのテトラゾリウム塩をBrucella寒天に添加した後、寒天に細菌培養物を接種する。微好気的条件で37℃で5日間インキュベートした後、生きている、及び複製しているヘリコバクター・ピロリ細胞は、この培地上で赤色のコロニーを生成する。本明細書に記載のヘリコバクター・ピロリコロニーの非存在は、ヘリコバクター・ピロリが不活化及び/又は死滅しており、胃粘膜で複製及び定着することができないことを確認する。
【０２４３】
別の例においては、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリを、例えば、ウレアーゼ生成及び/又はATP消費等の、ヘリコバクター・ピロリの代謝活性を測定する任意のアッセイにより確認することができる。
【０２４４】
1つの好ましい例においては、カンピロバクター様生物(CLO)試験としても知られる、迅速ウレアーゼ試験を用いて、尿素のアンモニア及びCO2への変換を触媒するウレアーゼ酵素を分泌するヘリコバクター・ピロリの能力に基づいて部分的又は完全に代謝的に活性であるヘリコバクター・ピロリの存在を検出する。この例によれば、培養され、例えば、本明細書の任意の例に従って記載されるような、ストレス及び/若しくは不活化及び/若しくは死滅処理にかけられた保存されたヘリコバクター・ピロリ細菌の660nmでの約0.2〜約5.0以上の光密度の細胞等価物を測定する試料の約1μl〜約100μlのアリコート、又は任意の好適な培地、例えば、上記のBrucella Broth培地中で培養された細菌細胞の約1μl〜100μlのアリコートを、新鮮に調製されたウレアーゼ指示試薬を含有する滅菌Eppendorfチューブに、200μlの全量となるように添加する。例えば、0.01Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に、約2%(w/v)〜約5%(w/v)尿素と、約0.1%(w/v)又は約0.05%(w/v)の濃度のフェノールレッド、ブロモチモールブルー、ブロモクレゾールパープル、及びメチルレッド等の少なくとも1つのpH指示薬とを含有するウレアーゼ指示試薬を用いることができる。必要に応じて、それぞれのウレアーゼ指示試薬製剤のpHを、0.1N又は1.0NのHClの使用により、各指示薬の既知のpH範囲の下限に調整することができる。例えば、フェノールレッド指示薬は、6.6〜8.0のpH範囲を有し、フェノールレッドを含むウレアーゼ指示試薬製剤をpH6.6に調整することができる;ブロモチモールブルー指示薬は、6.0〜7.6のpH範囲を有し、ブロモチモールブルーを含むウレアーゼ指示試薬製剤を、pH6.0に調整することができる;ブロモクレゾールパープル指示薬は、5.2〜6.8のpH範囲を有し、ブロモクレゾールパープルを含むウレアーゼ指示試薬製剤を、pH5.2に調整することができる;メチルレッド指示薬は4.8〜6.2のpH範囲を有し、ブロモクレゾールパープルを含むウレアーゼ指示試薬製剤をpH4.8に調整することができる。或いは、ウレアーゼ指示試薬を、Nedrud JG、Blanchard TG、Helicobacter animal models、In: Coligan JE、Bierer B、Margulies DH、Shevach EM、Strober W、Coico R(編)、Current Protocols in Immunology.  Philadelphia: John Wiley and Sons; 2000. 19.8.1〜26頁により記載されたように調製する。或いは、ウレアーゼ指示試薬を、例えば、ASAN pharm.Co.社、Seoul、Koreaから商業的に入手することができる。次いで、チューブをボルテックスし、室温でインキュベートする。4時間後、チューブをRCF6000で5分間遠心分離し、約100μlの上清を96ウェルプレートに移して、550nmで分光光度的に読取る。必要に応じて、例えば、以下に記載のように調製されたヘリコバクター・ピロリに感染していないマウスからの胃粘膜組織ホモジェネートは、ウレアーゼアッセイのための陰性対照として役立ち得る。また、必要に応じて、粘膜で複製し、定着することができる野生型ヘリコバクター・ピロリ等の既知の濃度の培養されたヘリコバクター・ピロリを含有する陽性対照を用いることができる。迅速ウレアーゼ試験により決定された場合に5%未満のウレアーゼ活性を示すヘリコバクター・ピロリの試料は、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリを示す。
【０２４５】
当業者には明らかであるように、例えば、CLOtest(Kimberly-Clark社)、Hpfast(Sigma社)及びPyloritek(Serim社)等の、いくつかのウレアーゼ試験が商業的に利用可能である。
【０２４６】
別の例においては、ヘリコバクター・ピロリの不活化及び/又は死滅は、オキシダーゼ試験を実施することにより確認される。本明細書で用いられる用語「オキシダーゼ試験」は、例えば、N,N,N,N-テトラメチル-p-フェニレンジアミン(TMPD)又はN,N-ジメチル-p-フェニレンジアミン(DMPD)等の、酸化還元指示薬を用いてシトクロムcオキシダーゼの存在を検出するために用いられるアッセイを指す。好適なオキシダーゼ試験は、例えば、Tsukitaら、1999 J. Biochem. 1235:194〜201頁又はMurrayら(In: Manual of Clinical Microbiology、American Society for Microbiology、Washington D.C.、第9版、2007)により記載されている。
【０２４７】
別の例においては、ヘリコバクター・ピロリの不活化及び/又は死滅は、カタラーゼ試験を実施することにより確認される。用語「カタラーゼ試験」は、カタラーゼ分解により過酸化水素から酸素ガスを遊離させるヘリコバクター・ピロリの能力を決定する任意のアッセイを包含すると取られるべきである。好適なカタラーゼ試験は、当業者には明らかである。
【０２４８】
更に別の例においては、ヘリコバクター・ピロリの不活化及び/又は死滅は、例えば、Workuら、1999、Microbiology 145: 2803〜2811頁により記載されたような運動性アッセイを実施することにより確認される。
【０２４９】
別の例においては、哺乳動物の胃粘膜で複製及び/又は定着するヘリコバクター・ピロリ又はその細胞の能力は、ヒト胃組織へのヘリコバクター・ピロリ付着のin vitroアッセイを用いて決定される。例えば、Hemalathaら、1991、J. Med. Microbiol 35:197〜202頁; Falkら、1993、Proc. Natl. acad. Sci. USA. 90:2035〜2039頁; Hsiehら、2012、Helicobacter 17:466〜477頁を参照されたい。
【０２５０】
別の例においては、哺乳動物の胃粘膜で複製し、定着するヘリコバクター・ピロリ又はその細胞の能力は、感染した動物、例えば、マウスのin vivoでの胃定着の分析により決定される。例えば、培養され、本明細書の任意の例に従って記載されるような、ストレス及び/又は不活化及び/又は死滅処理にかけられたヘリコバクター・ピロリ細菌を、収獲し、滅菌塩水中に再懸濁する。陽性対照として、哺乳動物の胃粘膜で複製及び定着することができないことが知られ、以下に記載の接種チャレンジの前にストレス及び/又は不活化及び/又は死滅処理にかけられていないヘリコバクター・ピロリの培養物を用いる。胃粘膜で複製し、定着することができる好適なヘリコバクター・ピロリは、当業界で公知である。簡単に述べると、BHIブロス+4%ウシ胎仔血清(FCS)を含有するフラスコに、陽性対照のヘリコバクター・ピロリストックのアリコートを接種し、10%CO2+5%O2の雰囲気中、37℃で25〜48時間、125rpmで振とうしながらインキュベートさせて、感染に用いられる予想された形態を有するヘリコバクター・ピロリ細菌の純粋な培養物を得る。接種材料のチャレンジのために、培養され、ストレス及び/又は不活化及び/又は死滅処理にかけられたヘリコバクター・ピロリ細菌を含む滅菌塩水懸濁液の1:10希釈液の光密度を、660nmで読取り、0.07〜0.002の読取りをもたらす接種材料試料を、マウスの接種のために用いる。
【０２５１】
或いは、例えば、血球計により決定された場合、約1x107〜2x1010細胞/ml又はCFU/mlに等価な範囲の、培養され、ストレス及び/又は不活化及び/又は死滅処理にかけられたヘリコバクター・ピロリ細菌の量を含む接種のための試料を用いる。陽性対照のヘリコバクター・ピロリのために、約1x108個の細胞の接種材料を用いる。6〜8週齢のC57BL/6マウス[Charles River Laboratories社(Wilmington、MA)から]及び/又はBALB/c[Charles River Laboratories社(Wilmington、MA)から]に、ストレス及び/若しくは不活化及び/若しくは死滅処理にかけたヘリコバクター・ピロリ細菌の108〜1010個の細胞、好ましくは109個の細胞に対応する範囲の細菌量を含む用量及び対照ヘリコバクター・ピロリを含む約1x108個の細胞の接種材料を、1週間以内に2回、好ましくは各チャレンジの間に少なくとも1日あけた強制摂取により経口的にチャレンジする。
【０２５２】
或いは、マウスを、上記の接種材料用量を含む約0.25ml又は約0.5ml又は約1ml容量を、皮下注射筒に結合させたポリエチレンチューブを介する挿管により軽くエーテル麻酔にかけたマウスの胃に送達する胃内免疫化によりチャレンジする。必要に応じて、この手順を、投与間を24時間にしながら5日間で3回実施することができる。
【０２５３】
この例によれば、チャレンジの2週間後に胃の定着を分析するために、マウスを、例えば、CO2吸入により犠牲にし、胃及び十二指腸を定着の定量的評価のために取り出す。例えば、胃及び十二指腸を、5〜10mlの滅菌PBSを含有する標識された滅菌ペトリプレートに移した後、バイオセーフティキャビネットに移し、胃を正中切開により開き、滅菌ガーゼを用いて内容物を穏やかに洗浄する。前庭部を可視化し、胃の残りの部分から無菌的に切除し、廃棄する。次いで、滅菌された片刃かみそりを用いて、前庭部切片をさいの目に切り、ブレインハートインフュージョンブロス(BHI)培地を含有する予め計量した5mlチューブ中に小片を入れる。必要に応じて、前庭部切片を含有するチューブを、0.001gの精度で再計量し、バイオセーフティキャビネットに入れる。次いで、切片を、例えば、滅菌プラスチック組織ホモジェナイザを用いて機械的に柔らかくし、ホモジェネートの連続1:10、1:100、及び1:1000希釈液をBHI培地中で作製する。それぞれの希釈チューブから、100μlのアリコートを滅菌BHI寒天プレート上に入れ、完全なプレート拡散を実施する。例えば、ホモジェネートを入れる培地は、BHI寒天(Difco社)、4%ウシ胎仔血清、バシトラシン、ナリジクス酸、アンホテラシンB、及びカンピロバクター選択補給物質(Oxoid社、Lenexa、KS)。プレートをBBL CampyPak Plus(登録商標)微好気的エンベロープ(Becton Dickinson社、Franklin Lakes、NJ;製品番号271045)を含有する嫌気的ジャーに入れ、好ましくは、37℃で6〜7日間インキュベートする。増殖対照プレートを、それぞれのジャーに含有させ、上記の陽性対照ヘリコバクター・ピロリの新鮮に増殖された調製物を接種する。このアッセイにおける検出の限界は、胃組織1グラムあたり約500個のヘリコバクター・ピロリ細胞である。ヘリコバクター・ピロリコロニーの非存在は、ヘリコバクター・ピロリが不活性であり、胃粘膜で複製及び定着することができないことを示す。しかしながら、コロニーがプレート上に観察される場合、例えば、1つのウレアーゼ活性アッセイ及び/又はオキシダーゼ活性アッセイ及び/又はカタラーゼ活性アッセイ及び/又はコロニー形態を用いて、本明細書の任意の例に記載される手段により、コロニーがヘリコバクター・ピロリであると確認することができる。
【０２５４】
更に別の例においては、ヘリコバクター・ピロリ又はその細胞が哺乳動物における胃粘膜で複製及び定着する能力は、ヘリコバクター・ピロリ16Sリボソーム遺伝子配列の検出に基づく、従来の正常な胸腺を持つマウスにおけるヘリコバクター・ピロリの定着のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)検出により決定される。例えば、Smithら、1996、Clinic. Diagn. Lab. Immuno. 3:66〜72頁を参照されたい。例えば、本明細書の任意の例に従って記載されるように、培養され、ストレス及び/又は不活化及び/又は死滅処理にかけられたヘリコバクター・ピロリ細胞を収獲し、滅菌塩水中に再懸濁する。必要に応じて、陽性対照として、哺乳動物の胃粘膜で複製及び定着することができることが知られ、以下に記載の接種チャレンジの前にストレス及び/又は不活化及び/又は死滅処理にかけられていない、ヘリコバクター・ピロリ、例えば、野生型(WT)ヘリコバクター・ピロリの培養物を、別々に収獲し、滅菌塩水中に再懸濁する。胃粘膜で複製及び定着することができる好適なヘリコバクター・ピロリは、当業界で公知であり、本明細書に記載されている。接種材料のチャレンジのために、接種材料の1:10希釈液の光密度を660nmで読取り、0.07〜0.002の読取りをもたらす接種材料試料を、マウスの接種のために用いる。
【０２５５】
或いは、例えば、血球計により決定された場合に約2x107〜2x108細胞/ml又はCFU/mlに対応する範囲の細菌量を含む接種材料試料を用いる。8〜12週齢のVAF及びGF Swiss-Websterマウス又はVAF CD-1マウス[Taconic Laboratories社(Germantown、N.Y.)から]及び/又はVAF-CD-1マウス[Charles River Laboratories社(Wilmington、Mass)から]及び/又はC57BL/6マウス[Charles River Laboratories社(Wilmington、Mass)から]及び/又はBALB/c[Charles River Laboratories社(Wilmington、Mass)から]及び/又はSJL/Jマウス(The Jackson Laboratory社、Bar Harbor、Maine、USAから)に、1週間以内に2回、好ましくは各チャレンジの間に少なくとも1日あけた強制摂取により、上記のように調製された0.5mlのヘリコバクター・ピロリ接種材料を経口的にチャレンジする。全てのマウスを、滅菌水と共に無菌マイクロアイソレータケージ中で飼育し、マウスに自由に食餌を取らせる。必要に応じて、GFマウスを、無菌GF手順を用いて、全ての表面を消毒した層流フード中で維持及び操作し、GFマウスのためのケージを滅菌ラップ中でオートクレーブし、水もオートクレーブし、フィルターを使用前に滅菌する。チャレンジしたマウスにおける胃粘膜のヘリコバクター・ピロリ定着を評価するために、チャレンジ後約1〜約4週間、好ましくはチャレンジ後約4週間で、マウスを、例えば、CO2の吸入により犠牲にし、無菌的技術により胃を取り出す。次いで、胃を縦方向に切断し、滅菌脱イオン化H2Oを用いて洗浄することにより、胃の内容物を洗浄除去する。次いで、滅菌ガラス顕微鏡スライドを用いて粘膜を穏やかに擦り取ることにより、胃の内膜組織から胃粘膜を分離する。次いで、粘膜試料をTris-塩化ナトリウム-EDTA(TNE)バッファー中に入れ、氷上で保存するか、又はPCR分析のためのDNA抽出まで凍結する。PCR分析のために粘膜懸濁液からDNAを抽出するための方法は、当業界で公知であり、容易に用いることができる。例えば、DNAを、12,000rpmで3min、TNEバッファー中の胃粘膜懸濁液を遠心分離することにより抽出する。次いで、上清を除去し、細胞ペレットを、1mlあたり1%のTriton X-100(Sigma社)及び0.5mgのリゾチーム(Sigma)を含有する570mlのTNE中に再懸濁する。次いで、試料を37℃で30minインキュベートする。次に、1mlあたり1mgのプロテイナーゼK(Boehringer GmbH社、Mannheim、Germany)を添加し、混合物を65℃で2時間又は37℃で一晩インキュベートする。消化物を、等量のフェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール(25:24:1)と混合した後、10,000 3gで6min遠心分離する。次いで、上の水性層を除去し、好ましくは、フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコールを用いる2回目の抽出を実施する。次いで、水性層を等量のクロロホルム-イソアミルアルコール(24:1)と混合し、以前の2回の抽出と同様に処理する。次いで、DNAを、1/10容量の3M酢酸ナトリウム及び2倍容量の無水エタノールを添加することにより沈降させ、氷上に20min置く。DNAを、上記のように遠心分離によりペレット化し、70%エタノールで洗浄する。好ましくは、ペレットを、例えば、スピードバキュームにより乾燥し、100mlの0.13TE(13TEは、10mM Tris[pH7.4]、0.1mM EDTAである)中に再懸濁する。PCRを実行するまで4℃で試料を保存する。
【０２５６】
用いられる16S rRNAをコードするヘリコバクター・ピロリのDNA配列の増幅のために用いられるPCRプライマーは、配列5'- TTG GAG GGC TTA GTC TCT-3'を有する配列番号1に記載の上流プライマー(HPフォワード)、及び配列番号5'- AAG ATT GGC TCC ACT TCA CA-3'を有する配列番号2に記載の下流プライマー(HPリバース)を含む。配列番号1及び配列番号2に記載のプライマーは、ヘリコバクター・ピロリDNA配列の塩基793〜1252に及ぶ459bpのPCR産物に対して設計される。配列番号1及び配列番号2のプライマーは、H.フェリス(H. felis)(遺伝子バンク受託番号M57398)、H.ムリダルム(H. muridarum)(遺伝子バンク受託番号M80205)、及びカンピロバクター(Campylobacter)種(遺伝子バンク受託番号L04315)について列挙された配列とは異なる、遺伝子バンク受託番号U00679、U01328、U01329、U01330、U01331、及びU01332に列挙されたヘリコバクター・ピロリの6つの単離物に関する相同領域に基づいて設計される。従って、これらのプライマーの使用は、密接に関連する細菌との交差反応を回避する。
【０２５７】
必要に応じて、内部PCT対照DNA鋳型を、PCR反応における使用のために構築することもできる。例えば、Smithら、1996、上掲を参照されたい。例えば、本明細書の任意の例に従って記載される配列番号1及び配列番号2に記載のプライマーを用いてWTヘリコバクター・ピロリから増幅された495bpのPCR産物を、多コピープラスミド中に閉じる。続いて、Sty1部位に都合良くフランキングする237bpの内部制限断片を、クローニングされたヘリコバクター・ピロリDNA内から欠失させて、HPプライマーとの完全な相同性を有するが、はるかにより短い配列をこれらのプライマーを用いて増幅することができる鋳型を作出する。459bpのPCR増幅されたヘリコバクター・ピロリDNA断片を、Genecleanキット(Bio 101,Inc.社、La Jolla、Calif.)を用いることにより精製し、アンピシリン耐性を付与し、lacZaペプチドをコードする、pBluescript II SK1プラスミド(Stratagene Co.社、La Jolla、Calif.)のEcoRV部位にT4 DNAリガーゼ(GIBCO BRL社、Gaithersburg、Md.)を用いてライゲートした。組換えプラスミドを、大腸菌(Escherichia coli)DH5a(GIBCO BRL社)中に形質転換する。アンピシリン耐性形質転換体を、X-Gal(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-b-D-ガラクトピラノシド)を含有するLuriaブロスプレート上で選択し、挿入されたDNAを担持するプラスミドを、白色のコロニーを与えるものとして同定する。Qiagenプラスミド精製キット(Qiagen Inc.社、Chatsworth、Calif.)を用いて、選択されたコロニーからプラスミドを抽出し、ヘリコバクター・ピロリDNA挿入物から内部237bpのDNA断片を除去するStyI制限エンドヌクレアーゼ(New England BioLabs社、Beverly、Mass.)を用いて切断する。残りのDNAを、T4 DNAリガーゼを用いて再環状化し、DH5a株に形質転換し、アンピシリン耐性としてコロニーを選択する。形質転換体により、配列番号1及び配列番号2に記載のHPプライマーを用いてPCRにおいて増幅された場合、所望の222bpの断片が得られた。1つの形質転換体を選択し、プラスミドDNAを内部PCT対照鋳型としての使用のために抽出する。
【０２５８】
PCT分析を、滅菌条件下で、マスター反応混合物を調製することにより行う。それぞれのマスター混合物は、1.5mlのマイクロ遠心管中で作製され、45の試料反応のための反応物を含有する。それぞれのマスターミックスに、826.9mlの脱イオン化H2O、112.5mlの103Taqバッファー(Stratagene社)、45mlのデオキシヌクレオシド三リン酸(5mM)、22.5mlの配列番号1又は配列番号2の各プライマー(25〜50mM)、及び5.6mlのTaqポリメラーゼ(5U/ml;Stratagene社)を添加する。必要に応じて、マスター混合物を、反応あたり23mlで200mlのPCRチューブ中にアリコートする。PCRのための各反応混合物の容量を、典型的には、2mgの量の抽出されたDNAを含む、上記で抽出されたマウス粘膜DNAから抽出された2mlのDNA鋳型を添加することにより、25mlにする。必要に応じて、PCR反応チューブを、簡潔に遠心分離して、反応物を混合する。ストレス及び/又は不活化及び/又は死滅処理にかけられたヘリコバクター・ピロリでチャレンジしたマウスから、並びに、必要に応じて、WTヘリコバクター・ピロリでチャレンジした陰性対照マウスから抽出された粘膜DNAを含有するPCR反応混合物を、Perkin-Elmer 9600 Systemサーマルサイクラー(Perkin-Elmer社、Norwalk、Conn.)中でサイクルにかける。DNAを、94℃で15s、55℃で30s、及び72℃で1minの35サイクルで増幅し、72℃で10min、最終的な伸長サイクルを行う。陽性及び陰性対照反応を、それぞれの増幅について実施することができる。必要に応じて、脱イオン化H2O、1、10、及び100個の細胞に対応するヘリコバクター・ピロリDNA、並びにマウス粘膜組織DNA(2mg)からなる、それぞれのPCR実行における対照鋳型を用いることができる。PCR産物を、臭化エチジウムを含有する2%アガロースゲル電気泳動により分析し、UV光の下で可視化する。PCR産物の検出は、定着としてスコア化されるが、PCR産物の非存在は非定着としてスコア化され、ヘリコバクター・ピロリが不活性であり、哺乳動物の胃粘膜で複製及び定着することができない陽性の確認を提供する。
【０２５９】
本明細書の任意の例に記載される組成物及び/又は方法におけるヘリコバクター・ピロリ又はその細胞の有用性を測定するための他の方法は、当業者には明らかであり、本発明により包含される。
【０２６０】
6.製剤
不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ又はその細胞溶解物をヒト又は哺乳動物への経口投与のために調合することができる。
一例においては、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ又はその細胞溶解物は封入される。本明細書で用いられる用語「封入」は、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ又は細胞溶解物が、分解性障壁内に包み込まれることを意味すると取られるべきである。例えば、分解性障壁は、胃腸管の所定の位置で分解し得る。
【０２６１】
一例においては、組成物は、錠剤又はカプセルの形態にある。
【０２６２】
別の例においては、本発明の組成物は凍結乾燥される。別の例においては、本発明の組成物は、粉末である。
【０２６３】
本発明の組成物を、食品又は栄養補助食品として調合することができる。本明細書で用いられる用語「食品」とは、任意の食品生成物又は飲料を指し、用語「栄養補助食品」とは、ビタミン及び/又はミネラル及び/又はハーブ若しくは他の植物及び/又は酸を含む、ヒト又は哺乳動物の食事を補給することを意図される生成物を指す。
【０２６４】
一例においては、食品又は栄養補助食品は、すぐに飲むことができる生成物であってもよい。本明細書で用いられる用語「すぐに飲むことができる」とは、生成物がさらなる調製なしに経口投与にとって好適な形態にあることを意味すると取られるべきである。好適なすぐに飲むことができる生成物としては、例えば、炭酸水、フレーバーウォータ、フレーバー炭酸水、ジュース(任意の果物又は果物の任意の組合せから誘導されるジュース、任意の野菜又は野菜の任意の組合せから誘導されるジュース)を含有する飲料、動物から得られたミルク飲料、大豆、米、ココナッツ又は他の植物材料から誘導されるミルク飲料、ヨーグルト飲料、スポーツ飲料、エネルギードリンク、コーヒー、脱カフェインコーヒー、茶、果物生成物から誘導される茶、ハーブ生成物から誘導される茶、脱カフェイン茶及び流動食代用品が挙げられる。一例においては、すぐに飲むことができる生成物は、濾過水、スキムミルクパウダー、サトウキビ、小麦マルトデキストリン、大豆タンパク質、植物油、デンプン、イヌリン、固形コーンシロップ、フルクトース、シリアル、香料、カルシウム、リン、発酵赤米、ビタミンC、ナイアシン、ビタミンA、ビタミンB12、ビタミンB6、ビタミンB2、ビタミンB1、葉酸及び塩を含んでもよい。別の例においては、すぐに飲むことができる生成物は、炭酸水、コーンシロップ、キャラメル色、カフェイン、リン酸、コカ抽出物、ライム抽出物、バニラ及びグリセリンを含んでもよい。更に別の例においては、すぐに飲むことができる生成物は、炭酸水、スクロース、グルコース、クエン酸ナトリウムタウリン、グルクロノラクトン、カフェイン、イノシトール、ナイアシンアミド及びビタミンB12を含んでもよい。
【０２６５】
別の例においては、食品又は栄養補助食品は、すぐに食べることができる生成物であってもよい。本明細書で用いられる用語「すぐに食べることができる」とは、生成物がさらなる調製なしに経口投与にとって好適な形態にあることを意味すると取られるべきである。好適なすぐに食べることができる生成物としては、例えば、食事代用バー、プロテインバー、スナックフード及び菓子製品が挙げられる。一例においては、すぐに食べることができる生成物は、全粒シリアル、グルコース、糖、植物油、トウモロコシデンプン、保湿剤、米粉、オート麦粉、スキムミルクパウダー及びハチミツを含んでもよい。
【０２６６】
更に別の例においては、食品又は栄養補助食品は、投与前に液体又は希釈剤中での懸濁及び/又は再構成を必要としてもよい。例えば、食品又は栄養補助食品は、液体又は液体濃縮物又は粉末であってもよい。
【０２６７】
一例においては、食品又は栄養補助食品は、乳幼児用調製乳又はフォローオン(follow-on)調製乳又は特殊な食事的使用のための乳幼児用調製乳又は早産児用(pre-term)調製乳であってもよい。本明細書で用いられる用語「乳幼児用調製乳」とは、約4〜約6ヶ月までの月齢の乳幼児の栄養要求を満たす母乳代用物を指す。一例においては、乳幼児用調製乳は、約2500kJ/L以上かつ約3150kJ/L以下のエネルギー含量を有してもよい。一例においては、乳幼児用調製乳は、100kJあたり0.45g〜100kJあたり0.7gの量のタンパク質、100kJあたり1.05g〜100kJあたり1.5gの量の脂肪を含んでもよい。別の例においては、乳幼児用調製乳は、100mLあたり0.05mg未満のアルミニウムを含んでもよい。本明細書で用いられる用語「フォローオン調製乳」とは、約6ヶ月からの月齢の乳幼児のための滋養の主な液体源である母乳代用物又は乳幼児用調製乳の代替物を指す。例えば、乳幼児用フォローオン調製乳は、約2500kJ/L以上かつ約3550kJ/L以下のエネルギー含量を有してもよい。一例においては、乳幼児用調製乳は、100kJあたり0.45g〜100kJあたり1.3gのタンパク質の量、100kJあたり1.05g〜100kJあたり1.5gの量の脂肪を含んでもよい。別の例においては、乳幼児用調製乳は、100mLあたり0.05mg未満のアルミニウムを含んでもよい。本明細書で用いられる用語「特殊な食事的使用のための乳幼児用調製乳製品」は、特定の代謝的及び/又は免疫学的及び/又は腎臓及び/又は肝臓及び/又は吸収不良状態を有する乳幼児の特定の必要性を満たすために処方された乳児用調製乳製品を意味すると取られるべきである。例えば、特定の食事的使用のための乳児用調製乳製品は、2500kJ/L以上かつ約3550kJ/L以下のエネルギー含量を有してもよい。一例においては、乳幼児用調製乳は、100kJあたり0.45g〜100kJあたり1.3gの量のタンパク質、100kJあたり0.93g〜100kJあたり1.5gの量の脂肪を含んでもよい。別の例においては、乳児用調製乳は、100mLあたり0.05mg未満のアルミニウムを含んでもよい。用語「早産児用調製乳」は、妊娠の36週以前に生まれた乳幼児の特定の必要性を満たすために特に処方された乳児用調製乳製品を意味すると広く解釈されるべきである。好ましくは、早産児用調製乳は、100kJあたり0.45g〜100kJあたり1.3gの量のタンパク質、100kJあたり0.93g〜100kJあたり1.5gの量の脂肪を含んでもよい。別の例においては、乳幼児用調製乳は、100mLあたり0.02mg未満のアルミニウムを含んでもよい。
【０２６８】
本発明の組成物は、例えば、食料、飲料、栄養補助食品又は動物飼料等の、1つ又は複数のプレバイオティクス又はパラプロバイオティクス又はプロバイオティクスを含んでもよい。
【０２６９】
本明細書で用いられる用語「プロバイオティクス」は、十分な量で投与された場合、宿主に対して健康上の利益を提供する生きている微生物を意味すると取られるべきである。好適なプロバイオティクスとしては、例えば、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス・レンタス(Bacillus lentus)、バチルス・リチェニホルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)、バクテロイデス・アミロフィルス(Bacteroides amylophilus)、バクテロイデス・カピロサス(Bacteroides capillosus)、バクテロイデス・ルミノコラ(Bacteroides ruminocola)、バクテロイデス・スイス(Bacteroides suis)、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス(Bifidobacterium adolescentis)、ビフィドバクテリウム・アニマリス(Bifidobacterium animalis)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、ビフィドバクテリウム・インファンティス(Bifidobacterium infantis)、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)、ビフィドバクテリウム・サーモフィルム(Bifidobacterium thermophilum)、エンテロコッカス・クレモリス(Enterococcus cremoris)、エンテロコッカス・ジアセチラクティス(Enterococcus diacetylactis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エンテロコッカス・インテルメディウス(Enterococcus intermedius)、エンテロコッカス・ラクティス(Enterococcus lactis)、エンテロコッカス・サーモフィルス(Enterococcus thermophilus)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクトバチルス・ブルガリクス(Lactobacillus bulgaricus)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・セロビオサス(Lactobacillus cellobiosus)、ラクトバチルス・クルバタス(Lactobacillus curvatus)、ラクトバチルス・デルブルエキ(Lactobacillus delbruekii)、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ラクトバチルス・ヘルベティクス(Lactobacillus helveticus)、ラクトバチルス・ラクティス(Lactobacillus lactis)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)、ロイコノストク・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ペジオコッカス・アシジラクチシ(Pediococcus acidilacticii)、ペジオコッカス・ペントサセウス(Pediococcus pentosaceus)、プロピオニバクテリウム・フレウデンレイチ(Propionibacterium freudenreichii)、プロピオニバクテリウム・シェルマニ(Propionibacterium shermanii)、サッカロミセス・セレビジア(Saccharomyces cerevisiae)が挙げられる。
【０２７０】
用語「パラプロバイオティクス」は宿主の健康に正に影響し得る死滅又は不活化された微生物を含む生成物を指すために造られた(Taverniti V及びGuglielmetti S、2011、Genes Nutr. 6(3): 261〜274頁)。
【０２７１】
本明細書で用いられる用語「プレバイオティクス」は、腸における1つ又は複数の微生物の増殖及び/又は活性を選択的に刺激することにより、宿主に有益に影響する非消化性食物成分を意味すると取られるべきである。好適なプレバイオティクスとしては、例えば、フルクトオリゴ糖、トランスガラクトオリゴ糖、イヌリン、アカシアゴム、キシロオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ラクツロース及び大豆オリゴ糖が挙げられる。
【０２７２】
7. 投与
本発明の組成物を、毎日の、又は定期的な投与のために調合することができる。例えば、組成物を、少なくとも約1週間又は少なくとも約2週間又は少なくとも約3週間又は少なくとも約4週間又は少なくとも約5週間又は少なくとも約6週間又は少なくとも約7週間又は少なくとも約8週間又は少なくとも約9週間又は少なくとも約10週間又は少なくとも約11週間又は少なくとも約12週間又は少なくとも約13週間又は少なくとも約14週間又は少なくとも約15週間又は少なくとも約16週間又は少なくとも約17週間又は少なくとも約18週間又は少なくとも約19週間又は少なくとも約20週間又は少なくとも約21週間又は少なくとも約22週間又は少なくとも約23週間又は少なくとも約24週間又は少なくとも約25週間又は少なくとも約6ヶ月、又は少なくとも約1年、又は1年を超える期間にわたって毎日投与することができる。好ましくは、組成物は、少なくとも約13週間又は少なくとも約3ヶ月の期間にわたって投与される。
【０２７３】
別の例においては、組成物を、例えば、少なくとも約1週間又は少なくとも約2週間又は少なくとも約3週間又は少なくとも約4週間又は少なくとも約5週間又は少なくとも約6週間又は少なくとも約7週間又は少なくとも約8週間又は少なくとも約9週間又は少なくとも約10週間又は少なくとも約11週間又は少なくとも約12週間又は少なくとも約13週間又は少なくとも約14週間又は少なくとも約15週間又は少なくとも約16週間又は少なくとも約17週間又は少なくとも約18週間又は少なくとも約19週間又は少なくとも約20週間にわたって、1日おきに又は2日おきに又は3日おきに又は4日おきに又は5日おきに又は1週おきに等、定期的に投与することができる。更に別の例においては、組成物を、間欠的に投与することができる。例えば、組成物を、少なくとも約1週間又は少なくとも約2週間又は少なくとも約3週間又は少なくとも約4週間又は少なくとも約5週間又は少なくとも約6週間又は少なくとも約7週間又は少なくとも約8週間又は少なくとも約9週間又は少なくとも約10週間又は少なくとも約11週間又は少なくとも約12週間又は少なくとも約13週間又は少なくとも約14週間又は少なくとも約15週間又は少なくとも約16週間又は少なくとも約17週間又は少なくとも約18週間又は少なくとも約19週間又は少なくとも約20週間又は少なくとも約21週間又は少なくとも約22週間又は少なくとも約23週間又は少なくとも約24週間又は少なくとも約25週間又は少なくとも約6ヶ月間の投与期間、次いで、中断期間、次いで、少なくとも1週間又は少なくとも2週間又は少なくとも3週間又は少なくとも4週間又は少なくとも5週間又は少なくとも6週間又は少なくとも7週間又は少なくとも8週間又は少なくとも9週間又は少なくとも10週間又は少なくとも11週間又は少なくとも12週間又は少なくとも13週間又は少なくとも14週間又は少なくとも15週間又は少なくとも16週間又は少なくとも17週間又は少なくとも18週間又は少なくとも19週間又は少なくとも20週間又は少なくとも約21週間又は少なくとも約22週間又は少なくとも約23週間又は少なくとも約24週間又は少なくとも約25週間又は少なくとも約6ヶ月間の投与期間にわたって投与することができる。好ましくは、組成物を少なくとも約13週間又は少なくとも
約3ヶ月間にわたって投与した後、中断期間、次いで、少なくとも約13週間又は少なくとも約3ヶ月間の投与期間にわたって投与する。別の例においては、組成物を、少なくとも1又は2又は3又は4又は5又は6又は7又は8又は9又は10又は15又は20又は25又は30又は35又は40年の投与期間にわたって投与することができる。
【０２７４】
一例においては、組成物を、約106個の細胞又は約107個の細胞又は約108個の細胞又は約109個の細胞又は約1010個の細胞又は約1011個の細胞又は約1012個の細胞又は約106個の細胞〜約1012個の細胞又は107個の細胞〜約1011個の細胞又は約108個の細胞〜約1010個の細胞又は約109個の細胞〜約1010個の細胞に対応する量のヘリコバクター・ピロリ又はその細胞溶解物を含む1日用量として調合することができる。当業者には明らかであるように、単回又は複数回用量単位を投与して、1日用量を作り上げることができる。
【０２７５】
別の例においては、組成物を、0〜約5歳、又は0〜約4歳、又は0〜約3歳、又は0〜約2歳、又は0〜約1歳の年齢の乳幼児への投与のために調合することができる。一例においては、組成物を、0〜約2歳の年齢の乳幼児への投与のために調合することができる。別の例においては、組成物を、約4ヶ月〜約12ヶ月の月齢の乳幼児への投与のために調合することができる。別の例においては、組成物を、約6ヶ月未満の月齢の乳幼児への投与のために調合することができる。
【０２７６】
更に別の例においては、組成物を、約5歳より大きい小児及び/又は青年及び/又は成人への投与のために調合することができる。
【０２７７】
さらなる例においては、本明細書の任意の例による本発明の組成物は、アレルギー又はアレルギー性湿疹、蕁麻疹、じんましん、鼻炎、喘鳴、気道抵抗、気道制限、肺炎症、食物アレルギー、若しくは喘息のうちの1つ若しくは複数等の、本明細書に記載の医学的状態に罹患していないか、又はそのような医学的状態の防止を必要とする対象への投与のための、食品、錠剤、カプセル、又は液体飲料等の化粧品又は栄養製剤である。例えば、本発明の化粧品又は栄養製剤は、一般的な意味での福祉を促進する、及び/又は免疫系を強化する、及び/又は任意の医学的状態に由来する療法若しくは予防を必要としない対象の免疫系に対するバランスを提供する。
【０２７８】
一例においては、本発明は、本明細書の任意の例による不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ又はその細胞溶解物を含む組成物を、アレルギー又はアレルギー性湿疹、蕁麻疹、じんましん、鼻炎、喘鳴、気道抵抗、気道制限、肺炎症、食物アレルギー、若しくは喘息のうちの1つ若しくは複数等の、本明細書に記載の医学的状態に罹患していないか、又はそのような医学的状態の防止を必要とする対象に投与することを含む、化粧品的又は栄養的使用の方法を提供する。1つのそのような例においては、本発明の方法は、一般的な意味での福祉を促進する、及び/又は免疫系を強化する、及び/又は任意の医学的状態に由来する療法若しくは予防を必要としない対象の免疫系に対するバランスを提供する。
【０２７９】
本発明は、以下の非限定例において更に説明される。
【実施例】
【０２８０】
（実施例１：ヘリコバクター・ピロリ細胞を不活化及び/又は死滅するための処理-方法I）
本実施例は、ヘリコバクター・ピロリ細胞を不活化及び/又は死滅するための、紫外線照射、及び場合によるさらなる凍結-解凍の有用性を証明する。
【０２８１】
受託番号V13/023374の下でNaional Measurement Institute(NMI) of Australiaに寄託されたヘリコバクター・ピロリOND79株を、標準的な手順に従う、Columbia寒天ベース(Product Code CM0311、Thermo Fisher Scientific, Oxoid Ltd社)及び7%(v/v)滅菌脱線維素ウマ血液を含むColumbia寒天(CBA)プレート上での24時間の増殖及び塩水溶液[0.9%(w/v)塩化ナトリウム]中への増殖した細胞の再懸濁、次いで、遠心分離による細胞の収獲により取得した。次いで、細胞を塩水溶液中に再懸濁し、再懸濁された細胞の濃度を、1mlあたり1光密度(OD)単位の600nm波長で測定された吸光度に調整した。等量(1ml)の再懸濁された細胞を、7%(v/v)滅菌脱線維素ウマ血液を含むCBAプレート上に塗布した。プレートを、5%(v/v)CO2及び5%(v/v)未満のO2を含有する微好気的環境中、37℃で24時間インキュベートした。
【０２８２】
次いで、プレート試料を、塗布された細胞の4Joules/cm2又は12Joules/OD600の放射照度で、Bio-Link BLX架橋剤UVチャンバ(Vilber Lourmat社、France)中、紫外線C(UV-C)(200〜290nmの波長)を用いる紫外線照射にかけた。例えば、9cm直径のプレートを、約240JoulesのUV-Cへの曝露により照射することができる。次いで、照射された細菌を、プレートから収集し、塩水溶液中に再懸濁し、再懸濁された細胞の濃度を、1mlあたり20光密度(OD)単位の600nm波長での測定された吸光度に調整した。
【０２８３】
未処理の対照として、上記のように培養、収獲及び塗布されたが、UV-Cを用いて照射されなかったOND79ヘリコバクター・ピロリ細胞も収集し、塩水溶液中に再懸濁し、未処理の再懸濁された細胞の濃度を、1mlあたり20光密度(OD)単位の600nm波長での測定された吸光度に調整した。
【０２８４】
照射された細胞のアリコートを直接アッセイして、細胞複製能力及びウレアーゼ活性を決定したか、又は或いは、細胞複製及びウレアーゼ試験を実施する前に、-20℃で凍結した後、解凍した。
【０２８５】
場合により照射及び凍結-解凍にかけられた照射された細胞が複製する能力について試験するために、細菌懸濁液を塩水中で連続希釈し、CBAプレート上に塗布し、プレートを5%(v/v)CO2及び5%(v/v)未満のO2を含有する微好気的環境中、37℃で3日間インキュベートした。次いで、細胞計数を、試験した様々な希釈液について決定した。
【０２８６】
2つの独立した実験において、1mlあたり0.056〜3.6OD単位の600nmの波長での測定された吸光度に対応する濃度範囲中では懸濁液についてコロニー形成単位は同定されなかった。UV-C及び凍結-解凍のサイクルを受ける細胞に関して、UV-Cのみを受ける細胞について同じ結果が得られた。
【０２８７】
処理された細胞のウレアーゼ活性を、再懸濁された細胞の標準的なアッセイにより決定した。簡単に述べると、0.1Mクエン酸、2g/lの尿素及びフェノールレッド0.01%を含む25μlのウレアーゼバッファーを、等量の処理された細胞懸濁液に添加し、混合物のpHを、室温で30minの期間にわたって決定した。このアッセイにおいて、黄色から赤色へのアッセイ試料の色の変化は、尿素の破壊及びアンモニアの生成によるpHの増加を示す。2つの独立した実験について得られたデータは、UV-Cを照射された細胞が未処理の細胞と比較して残留するウレアーゼ活性を有することを示し、例えば、UV照射の前に、未処理のヘリコバクター・ピロリ細胞のウレアーゼ活性の10%未満であると見積もられる。
【０２８８】
照射された細胞のウレアーゼ活性の低下と一致して、UV-C照射に曝露されたヘリコバクター・ピロリ細胞からの抽出物のSDS/PAGEは、照射された細胞が、未処理の細胞と比較して、タンパク質分解及び高分子量の複合体へのタンパク質の凝集を受けることを示す(データは示さない)。1〜4J/cm2のUV-C用量範囲において、そのような分解及び凝集のレベルは、用量依存的である、すなわち、より高用量のUV-C、例えば、2J/cm2又は4J/cm2は、分解及び凝集の増加をもたらす(データは示さない)。
【０２８９】
集合的に、データは、ヘリコバクター・ピロリのUV-C照射、及び場合により、さらなる凍結-解凍は、ヘリコバクター・ピロリを不活化及び/又は死滅するための有効な手段をもたらすことを示す。
【０２９０】
（実施例２：ヘリコバクター・ピロリ細胞を不活化及び/又は死滅するための処理-方法II）
本実施例は、ヘリコバクター・ピロリ細胞の不活化及び/又は死滅するための、紫外線照射若しくは酸素制限、及び紫外線照射若しくは酸素制限後の場合によるさらなる熱処理及び/又は熱処理のみの有用性を証明する。
【０２９１】
ヘリコバクター・ピロリ株OND79の細胞、受託番号V14/013016の下でNational Measurement Institute(NMI) of Australiaに寄託されたヘリコバクター・ピロリ株OND86の細胞、又はヘリコバクター・ピロリ株J99の細胞を、標準的な手順に従って、Columbia寒天ベース(Product Code CM0311、Thermo Fisher Scientific, Oxoid Ltd社)及び7%(v/v)滅菌脱線維素ウマ血液を含むColumbia寒天(CBA)プレート上での24時間増殖させ、及び塩水溶液[0.9%(w/v)塩化ナトリウム]中への増殖した細胞の再懸濁、次いで、遠心分離により細胞を収獲した。次いで、細胞を塩水溶液中に再懸濁し、再懸濁された細胞の濃度を、1mlあたり1光密度(OD)単位の600nm波長で測定された吸光度に調整した。等量(1ml)の再懸濁された細胞を、7%(v/v)滅菌脱線維素ウマ血液を含むCBAプレート上に塗布した。プレートを、5%(v/v)CO2及び5%(v/v)未満のO2を含有する微好気的環境中、37℃で、細胞をUV照射にかけた場合は24時間、又は或いは、細胞を酸素飢餓にかけた場合は18時間インキュベートした。
【０２９２】
次いで、24時間で、微好気的条件のプレート試料を、UV-C光を用いて紫外線照射にかけた後、照射された細菌をプレートから収集し、塩水溶液中に再懸濁し、再懸濁された細胞の濃度を、実施例1に記載のように、1mlあたり20光密度(OD)単位の600nmの波長で測定された吸光度に調整した。次いで、場合により、再懸濁された細胞を、正常な気圧条件で、約70℃の第1の高温で10分間曝露した直後に、約94℃又は95℃の第2の高温で5分間曝露することにより、熱処理にかけた。
【０２９３】
或いは、上記のような微好気的条件中での18時間のインキュベーションの後、培養されたヘリコバクター・ピロリ細胞を、プレートを、嫌気的条件を作成するためのガスサチェットを含有する、プレートを密封したジャー(AnaeroGen、AN0025A、ThermoScientific社)に移すことにより、ヘリコバクター・ピロリ培養物から酸素を枯渇させる酸素制限処理にかけた。次いで、プレートを、37℃で24h又は48時間又は72時間、嫌気的条件下でインキュベートした。次いで、酸素飢餓処理にかけられた細菌を、プレートから収集し、塩水溶液中に再懸濁し、再懸濁された細胞の濃度を、1mlあたり20光密度(OD)単位の600nmの波長での測定された吸光度に調整した。次いで、場合により、再懸濁された細胞を、正常な気圧条件で、約70℃の第1の高温への10分間の曝露、その直後に、約94℃又は95℃の第2の高温への5分間の曝露により熱処理にかけた。
【０２９４】
或いは、上記のように微好気的条件で24時間、CBAプレート上で培養されたヘリコバクター・ピロリ細胞を、塩水溶液中に再懸濁し、濃度を、1mlあたり20光密度(OD)単位の600nm波長で測定された吸光度に調整した。次いで、再懸濁された細胞を、約70℃の第1の高温に10分間、次いで、約94℃又は95℃の第2の高温に5分間、正常な気圧条件で細胞を曝露することによる熱処理のみによって不活化及び/又は死滅させた。
【０２９５】
ヘリコバクター・ピロリ処理された細胞が複製する能力について試験するために、生きている未処理のヘリコバクター・ピロリOND86細胞(生きている対照)の細菌懸濁液及びUV-C光(UV)を用いて紫外線照射にかけ、場合により、更に熱処理(UV+熱)にかけたか、又は酸素飢餓処理に48時間かけ(O2制限)、場合により、更に熱処理(O2制限+熱)にかけたヘリコバクター・ピロリOND86細胞の細菌懸濁液を、塩水中に連続希釈し、CBAプレート上に塗布し、プレートを、5%(v/v)CO2及び5%(v/v)未満のO2を含有する微好気的環境中、37℃で3日間インキュベートした。次いで、細胞計数を様々な希釈液について決定した。2つの独立した実験から得られた結果を、図2に示す。その結果は、UV照射、UV照射と熱処理、酸素制限と熱処理によるヘリコバクター・ピロリ細胞の処理が、処理されたヘリコバクター・ピロリ細胞が複製し、コロニーを形成する能力を無効化したことを示す。ヘリコバクター・ピロリ細胞をさらなる熱処理なしに48時間の酸素制限にかけた1つの独立した実験においては、CBAプレート上にヘリコバクター・ピロリのコロニーが得られたが、処理された細胞が複製する能力は未処理の生きているヘリコバクター・ピロリと比較して実質的に低下した。さらなる独立した実験において、細胞を不活化及び/又は死滅するために熱処理のみにかけたヘリコバクター・ピロリ細胞は、一貫してCBAプレート上でコロニーを生成しなかった(データは示さない)が、これは、例えば、本明細書に記載のような熱処理のみへの曝露もまたヘリコバクター・ピロリ細胞の複製能力を無効化することを示している。
【０２９６】
ヘリコバクター・ピロリ細胞が複製する能力に対する様々な酸素制限処理期間の効果について試験するために、さらなる熱処理なしに24時間又は48時間又は72時間の期間にわたる酸素制限にかけたヘリコバクター・ピロリOND86細胞を、上記のような嫌気的条件下でのインキュベーションの後にプレートから収集し、塩水溶液中に再懸濁し、再懸濁された細胞の濃度を、1mlあたり1光密度(OD)単位の600nm波長で測定された吸光度に調整し、10倍連続希釈した後に新鮮なCBAプレート上に播種した。次いで、プレートを、5%(v/v)CO2及び5%(v/v)未満のO2を含有する微好気的環境中、37℃で3日間インキュベートした。ヘリコバクター・ピロリは、酸素制限処理の24時間後にコロニーを形成することができたが、酸素制限の48時間後には、ヘリコバクター・ピロリ培養物はCBAプレート上での限定的な増殖を示し、酸素制限の72時間後には、ヘリコバクター・ピロリコロニーはCBAプレート上で形成されなかった(結果は示さない)。これらの結果は、約48時間以上、例えば、48時間〜72時間以上の期間にわたる酸素制限による生きているヘリコバクター・ピロリ細胞の処理が、ヘリコバクター・ピロリの複製能力を低下させる、及び/又は防止することによって、ヘリコバクター・ピロリ細胞を不活化及び/又は死滅するのに有効であることを示している。
【０２９７】
生きている未処理のヘリコバクター・ピロリOND86細胞(生きている対照)の細菌懸濁液及びUV-C光(UV)を用いる紫外線照射にかけられ、場合により、熱処理に更にかけられた(UV+熱)、又は48時間の酸素飢餓処理(O2制限)にかけられ、場合により熱処理に更にかけられた(O2制限+熱)ヘリコバクター・ピロリOND86細胞の細菌懸濁液のウレアーゼ活性を、標準的なウレアーゼ試験により決定した。簡単に述べると、0.1Mクエン酸、2g/l尿素及びフェノールレッド0.01%を含む25μlのウレアーゼバッファーを、等量の生きている未処理の細胞及び処理された細胞懸濁液に添加し、室温で5minにわたって細胞をインキュベートした後、560nmで分光法により混合物のpHを決定した。このアッセイにおいて、定性的ウレアーゼ活性は、処理された細胞の代謝活性の尺度として決定された。ヘリコバクター・ピロリウレアーゼ酵素活性を、尿素の破壊及びアンモニアの生成のためpHの増加を示す、黄色から赤色へのアッセイ試料の色の変化に基づいて評価した。
【０２９８】
定性的ウレアーゼ活性の結果を、以下のTable 1(表2)に提供する。
【０２９９】
【表２】
2019059770.tif 000003
【０３００】
第2の独立した実験において、生きている未処理のヘリコバクター・ピロリOND86細胞(生きている対照)の細菌懸濁液及び処理されたヘリコバクター・ピロリOND86細胞の細菌懸濁液のウレアーゼ活性を、ウレアーゼ酵素活性を、室温で細胞を1分間インキュベートした後、560nmで測定した以外は、上記のウレアーゼ試験により行った。生きている未処理の細菌のウレアーゼ活性を100%に設定し、処理された、すなわち、不活化及び/又は死滅させた細菌に関する相対ウレアーゼ活性読取り出力を、生きている未処理のヘリコバクター・ピロリについて測定されたウレアーゼ活性のパーセンテージとして算出した。また、この実験懸濁液中、ヘリコバクター・ピロリOND86細胞を、熱処理のみの後、すなわち、上記のような、約70℃の高温に10分間、次いで、94℃又は95℃に5分間の曝露により、ウレアーゼ活性について試験した。生きている未処理の細胞のウレアーゼ活性読出しと比較した、熱処理のみ(熱)、UV-C照射(UV)及び場合により、さらなる熱処理(UV+熱)、48時間の酸素飢餓(O2制限)及び場合により更に熱処理(O2制限+熱)にかけられたヘリコバクター・ピロリ細胞のウレアーゼ活性の結果を、図3に示す。
【０３０１】
図2に示される結果並びにTable 1(表2)及び図3に示されるウレアーゼ活性の結果は、例えば、UV処理のみ、UV+熱処理、酸素飢餓+熱、又は熱処理のみによる、ヘリコバクター・ピロリを不活化及び/又は死滅するための処理はヘリコバクター・ピロリの複製能力を無効化することができるが、処理された細胞はウレアーゼ試験により決定された場合、残留する代謝活性を示すことを示している。
【０３０２】
処理されたヘリコバクター・ピロリ細胞の代謝活性を更に調査するために、処理されたヘリコバクター・ピロリ細胞が呼吸する能力を、Invitrogen社製のBacLight(商標)RedoxSensor(商標)CTC(製品カタログ番号B34956)(Molecular Probes(商標)Invitrogen検出技術)を製造業者の説明書に従って用いるフローサイトメトリーにより処理された細胞の膜酸化還元電位を測定することにより評価した。ヘリコバクター・ピロリOND86株の生きている細胞を、上記のように熱処理のみ、48時間の酸素飢餓及び場合によりさらなる熱処理、又はUV-C照射及び場合によりさらなる熱処理にかけて、細胞を不活化及び/又は死滅した。チューン(tune)あたり約107個の細胞の等価物を、暗室中で6時間、5-シアノ-2,3-ジトリルテトラゾリウムクロリド(CTC)と共にインキュベートした後、製造業者の説明書に従って4%ホルムアルデヒドの添加により固定した。熱処理後の生きているか、又は処理された細胞について得られた酸化還元電位と比較した、生きている未処理のヘリコバクター・ピロリ細胞又は酸素飢餓若しくはUV-C照射により処理された細胞についてFACS分析により得られた酸化還元電位の比率を算出して、異なる不活化及び/又は死滅処理レジメンの酸化還元電位を正規化した。作用様式のいかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、本発明者らは、本明細書に記載のヘリコバクター・ピロリ細胞の熱処理は、処理された細胞における多くの代謝活性の破壊をもたらし、細胞形状及び/又は細胞凝集パターンの変化を更にもたらし得ると考えた。従って、細胞の熱処理に起因して生じ得る細胞形状又は細胞凝集の差異から生じるFACS細胞選別の変動を考慮に入れるために、熱処理後の細胞の酸化還元電位の正規化を行った。その結果を、図4に示す。結果は、生きている細胞とUV-C処理された細胞が両方とも代謝的に活性であり、熱処理前には呼吸していたが(それぞれ、0.85及び1.1の比)、酸素制限への曝露による生きているヘリコバクター・ピロリ細胞の処理は、0.1の比をもたらし、酸素飢餓による細胞の処理がヘリコバクター・ピロリの代謝活性を有意に減衰させたことを示している。酸素制限による処理は、生きている細胞について得られた酸化還元電位比と比較して、酸化還元電位比の8.5倍の低下をもたらしたが、UV-C照射は、生きている細胞と比較して酸化還元電位比に対する効果をほとんど有さなかった。
【０３０３】
集合的に、本明細書のデータは、UV-C照射及び場合により細胞の熱処理、又は酸素飢餓及び場合により細胞の熱処理は、ヘリコバクター・ピロリを不活化及び/又は死滅するための有効な手段を提供することを示している。
【０３０４】
（実施例３：ヘリコバクター・ピロリは、アレルギー性気道疾患のOVAモデルにおけるアレルギー性喘息の転帰を改善する）
成体のC57BL/6マウス(6〜8週)を、野生型ヘリコバクター・ピロリ(WT)、喘息誘導抗原を発現する野生型ヘリコバクター・ピロリ(OVA)、若しくは処理されたヘリコバクター・ピロリ(KD)に感染させたか、又は感染させなかった。ヘリコバクター・ピロリ接種材料は、1mlあたり20OD単位の600nm波長の測定された吸光度に調整された塩水溶液中に0.2mlのヘリコバクター・ピロリ株OND79細胞の懸濁液を含んでいた。処理されたヘリコバクター・ピロリを、実施例1に記載のように不活化及び/又は死滅した。8週間後、アレルギー性喘息表現型を、OVA/ミョウバンでi.pで感作されたマウスにより誘導した(0日目及び14日目)後、21日目〜25日目まで5日間、OVAエアロゾルでチャレンジした。対照マウスは感染させない、感作及びチャレンジ(陽性)するか、又は感作のみ(陰性)した。26日目に、マウスは増加する用量でメタコリン(MCh)チャレンジを受け、肺における気道抵抗を測定した。図5は、ヘリコバクター・ピロリが、アレルギー性喘息表現型の誘導からマウスを保護したことを示す。
【０３０５】
（実施例４：ヘリコバクター・ピロリは、アレルギー性気道疾患のOVAモデルにおいて全細胞数及び好酸球増加症を軽減する）
成体のC57BL/6マウス(6〜8週)を、野生型ヘリコバクター・ピロリ(WT)、喘息誘導抗原を発現する野生型ヘリコバクター・ピロリ(HpOVA)、処理されたヘリコバクター・ピロリ(KD)を用いる強制摂取により経口的に感染させたか、又は感染させなかった。ヘリコバクター・ピロリ接種材料は、1mlあたり20OD単位の600nm波長の測定された吸光度に調整された塩水溶液中に0.2mlのヘリコバクター・ピロリ株OND79細胞の懸濁液を含んでいた。処理されたヘリコバクター・ピロリを、実施例1に記載のように不活化及び/又は死滅した。8週間後、アレルギー性喘息表現型を、OVA/ミョウバンでi.pで感作されたマウスにより誘導した(0日目及び14日目)後、21日目〜25日目まで5日間、OVAエアロゾルでチャレンジした。対照マウスは感染させない、感作及びチャレンジ(陽性)するか、又は感作のみ(陰性)した。26日目に、マウスを犠牲にし、気管支肺胞肺液を収集した。BALF中の全細胞数(パネルA)及び好酸球数(パネルB)を数え、肺に動員された好酸球の平均数を、1群あたり10匹のマウスから表す。図6は、ヘリコバクター・ピロリが全細胞数及び好酸球増加症を軽減することを示す。
【０３０６】
（実施例５：ヘリコバクター・ピロリは、アレルギー性気道疾患のOVAモデルにおいてOVA特異的IgE及びOVA特異的IgG応答を減少させる）
成体のC57BL/6マウスを、野生型ヘリコバクター・ピロリ(WT)、喘息誘導抗原を発現する野生型ヘリコバクター・ピロリ(HpOVA)、処理されたヘリコバクター・ピロリ(KD)を用いる強制摂取により経口的に感染させたか、又は感染させなかった。ヘリコバクター・ピロリ接種材料は、1mlあたり20OD単位の600nm波長の測定された吸光度に調整された塩水溶液中に0.2mlのヘリコバクター・ピロリ株OND79細胞の懸濁液を含んでいた。処理されたヘリコバクター・ピロリを、実施例1に記載のように不活化及び/又は死滅した。8週間後、マウスを20μgのOVA/1mgのミョウバンでi.p.により感作した(0日目及び14日目)後、21日目〜24日目まで4日間、塩水中の2μgのOVAで鼻内的にチャレンジした。対照マウスは感染させない、感作及びチャレンジ(陽性)するか、又は感作のみ(陰性)した。25日目に、マウスを出血させ、OVA特異的IgE(パネルA)及びIgG(パネルB)抗体を、それぞれ、1:60及び1:6000に希釈された血清から、ELISAにより測定した。結果を、OD405nmでの個々の、及び平均の吸光度として表す。図7は、ヘリコバクター・ピロリが、アレルギー性気道疾患のovaモデルにおいてOVA特異的IgE(パネルA)及びOVA特異的IgG(パネルB)応答を減少させることを示す。
【０３０７】
（実施例６：ヘリコバクター・ピロリはIL-13を減少させる）
成体のC57BL/6マウスを、ヘリコバクター・ピロリ(WT)、処理されたヘリコバクター・ピロリ(KD)を用いる強制摂取により経口的に感染させたか、又は感染させなかった。ヘリコバクター・ピロリ接種材料は、1mlあたり20OD単位の600nm波長の測定された吸光度に調整された塩水溶液中に0.2mlのヘリコバクター・ピロリ株OND79細胞の懸濁液を含んでいた。処理されたヘリコバクター・ピロリを、実施例1に記載のように不活化及び/又は死滅した。比較として、ヘリコバクター・ピロリ株10700も試験した。8週間後、マウスを20μgのOVA/1mgのミョウバンでi.p.により感作した(0日目及び14日目)後、21日目〜24日目まで4日間、塩水中の2μgのOVAで鼻内的にチャレンジした。対照マウスは感染させない、感作及びチャレンジ(陽性)するか、又は感作のみ(陰性)した。25日目に、気管支肺胞肺液(BALF)を、麻酔したマウスの肺から収集した。IL-13を、サイトカインビーズアレイを用いて希釈されていないBALFから測定し、pg/mlで1群あたり10匹のマウスの平均として表す。図8は、IL-13が、アレルギー性喘息モデルにおいてヘリコバクター・ピロリ感染したマウスの肺中で減少することを示す。
【０３０８】
（実施例７：ヘリコバクター・ピロリはOVA特異的CD8 T細胞を減少させる）
成体のC57BL/6マウスを、約1x109CFUのヘリコバクター・ピロリ(WT)を用いる強制摂取により経口的に感染させたか、又は8ヶ月間未感染のままにした後、0日目及び28日目に2回用量の20μg OVA/2mgのミョウバンを受けさせた。ヘリコバクター・ピロリ接種材料は、1mlあたり20OD単位の600nm波長の測定された吸光度に調整された塩水溶液中に0.2mlのヘリコバクター・ピロリ株OND79細胞の懸濁液を含んでいた。OVA/ミョウバンチャレンジの1日前に、マウスは5x104のMACS精製されたCD8 OT-1細胞をi.v.により受けた。35日目に脾臓を収獲し、脾臓細胞の単一細胞懸濁液を、BrefAの存在下で4時間、SIINFEKLペプチドで刺激した。細胞内サイトカイン染色を行って、FACSによりIFNγ分泌を測定した。CD8 OT-1細胞を、CD45.1発現により同定した。胃からの定着の結果は、全てのWT感染マウスが定着することを示していた。ヘリコバクター・ピロリは、OVA特異的CD8 T細胞応答を減少させ、OVA特異的CD8 T細胞の機能を弱める。図9は、OVA/ミョウバンチャレンジ後の対照マウスと比較した、ヘリコバクター・ピロリ感染マウスにおけるOVA特異的CD8 T細胞の数(パネルA)及び機能(パネルB)の減少を示す。
【０３０９】
（実施例８：ヘリコバクター・ピロリは抗原特異的IgGを減少させる）
成体のC57BL/6マウスを、約1x109CFUのヘリコバクター・ピロリ(WT)を用いる強制摂取により経口的に感染させたか、又は8週間未感染のままにした後、20μgのOVA/ミョウバンi.p.注射した。14日後、血清を収集し、ELISAによりOVA特異的IgGを決定した。
【０３１０】
いくらかのマウスにおいては、第2のi.p.用量のOVA/ミョウバンを14日目に投与した。21日目(追加接種の7日後)で、OVA特異的IgG力価の差異は観察されなかった。マウスは、十分な免疫刺激の存在下ではヘリコバクター・ピロリにより媒介される免疫抑制を克服することができる。図10(パネルA)は、初回OVA/ミョウバンチャレンジ後に対照マウスと比較してヘリコバクター・ピロリ感染における抗原特異的IgGの減少を示す。図10(パネルB)は、2回目のチャレンジの7日後の抗原特異的IgG応答を示す。
【０３１１】
（実施例９：ヘリコバクター・ピロリは、CD4及びCD8 T細胞の応答性を減少させる）
成体のC57BL/6マウスを、約1x109CFUのヘリコバクター・ピロリ(WT)を用いる強制摂取により経口的に感染させたか、又は感染させなかった。チャレンジの7ヶ月後、脾臓細胞を単離し、細胞の単一の懸濁液を、ブレフェルジンAの存在下で4時間、PMA/イオノマイシンで刺激した。IFNγ  CD4+及びCD8+ T細胞の数を、細胞内サイトカイン染色及びFACSを用いて評価した。図11は、非特異的刺激に対するヘリコバクター・ピロリ感染マウスに由来するCD4及びCD8 T細胞の応答性の減少を示す。
【０３１２】
（実施例１０：新生児アレルギー性喘息モデルにおけるヘリコバクター・ピロリ定着の効果）
5日齢のメスのC57BL/6マウス(n=5〜10)に、5日間連続で約109CFUの生きているヘリコバクター・ピロリを供給したか、又は感染させなかった。8週間後、マウスを2回用量の50μg OVA/1mgミョウバンでi.p.で感作した(0日目及び14日目)後、21日目〜25日目まで5日間、OVAエアロゾルでチャレンジした。対照マウスを感染させない、感作及びチャレンジする(陽性対照、すなわち、未処理のアレルギーマウス)又は感作のみ(陰性対照、すなわち、未処理の健康なマウス)した。26日目に、マウスは増加する用量のメタコリン(MCh)を受け、肺組織の気道過敏性(AHR)を測定し、気管支肺胞肺液(BALF)を収集した。
【０３１３】
図12、パネルAは、AHRの結果を、マウス1群あたりの平均cmH2o.s/mlとして表す結果を示す。p<0.5である場合の正規ガウス分布を推定する片側スチューデントのt検定を用いて、統計的有意性を決定した。非ガウス分布にとって好適であるWilcoxon順位検定は、MChの3つの最も高い濃度での統計的有意性を示した。図12、パネルBにおいて、肺からの全細胞浸潤を決定し、マウス1群あたりのBALFに由来する全生細胞の平均数として表す。バーは、平均からの標準偏差を表す。p<0.5である場合の正規ガウス分布を推定する片側スチューデントのt検定を用いて、統計的有意性を決定した。
【０３１４】
ここでの結果は、ヘリコバクター・ピロリがアレルギー性喘息の症状を軽減することを示す。図12(パネルA)は、気道抵抗が、生きているヘリコバクター・ピロリに感染していないアレルギー性成体マウスにおいて増加したが、生きているヘリコバクター・ピロリでチャレンジしたマウスは5日目から非アレルギーマウスのものと同等の気道抵抗を示した。図12(パネルB)は、ヘリコバクター・ピロリ定着がアレルゲンチャレンジ後の肺における細胞浸潤を防止し、全細胞数が非アレルギー対照マウスと類似していたことを更に示すものである。従って、生きているヘリコバクター・ピロリは、以後の人生でのアレルゲン曝露に応答したアレルギー性喘息の発症から新生児マウスを保護し、肺における細胞浸潤を減少させる。
【０３１５】
図12は、例えば、新生児における、ヘリコバクター・ピロリの定着は、例えば、本明細書に記載の新生児アレルギー性喘息モデルを用いて示されるように、アレルギー性気道疾患の転帰を改善し、アレルギー性気道疾患を発症するリスクを低下させることを示す。
【０３１６】
（実施例１１：新生児アレルギー性喘息モデルにおける免疫学的転帰に対するヘリコバクター・ピロリの効果）
本発明者らは、特に、新生児マウスへの生きている定着細菌の投与又は処理されたヘリコバクター・ピロリの反復経口投与により達成される、アレルギー性気道疾患等のアレルギー疾患に対する防御に対する効果の対照比較を行った。ヘリコバクター・ピロリ接種材料は、1mlあたり20OD単位の600nm波長の測定された吸光度に調整された塩水溶液中の0.2mlのヘリコバクター・ピロリ株OND79細胞の懸濁液を含んでいた。処理されたヘリコバクター・ピロリを、実施例1に記載のように不活化及び/又は死滅した。簡単に述べると、5日齢のC57BL/6マウス(n=10)に、5日連続で約109CFUの生きているヘリコバクター・ピロリ若しくは処理された細菌(10週間にわたって、週に3日間)を供給したか、又は未感染のままにした。8週間後、マウスを2回用量の50μg OVA/1mgのミョウバンをi.p.で感作した(0日目及び14日目)後、21日目〜25日目まで5日間にわたってOVAエアロゾルでチャレンジした。対照マウスは感染させない、感作及びチャレンジ(陽性対照、すなわち、未処理のアレルギーマウス)するか、又は感作のみ(陰性対照、すなわち、未処理の健康なマウス)した。26日目に、マウスを犠牲にし、血清及び気管支肺胞肺液(BALF)を収集した。肺中へのマウス1群あたりの全細胞浸潤を決定し、BALFからの全生細胞の個々の、及び平均の数として表す。図13に示されるように、処理された、又は生きているヘリコバクター・ピロリの投与は、ヘリコバクター・ピロリで処理されたマウスの肺への細胞浸潤を減少させた(パネルA)。更に、アレルゲン(OVA)特異的IgE抗体を、1:60に希釈した血清から標準的なELISA法により測定した。抗体力価を、OD405nmでの個々の及び平均の吸光度として表した。図13(パネルB)に示されるように、処理されたヘリコバクター・ピロリ又は生きているヘリコバクター・ピロリの投与はまた、ヘリコバクター・ピロリで処置された対象においてアレルゲン特異的IgE抗体を減少させた。*統計的有意性を、p<0.5である正規ガウス分布を推定する片側スチューデントのt検定を用いて決定した。集合的に、図13のパネル(A)及び(B)に示されるデータは、処理された、すなわち、不活化及び/又は死滅させた(又は生きている)ヘリコバクター・ピロリの投与が、アレルギー性炎症及び/又はアレルギー性免疫応答を減少させるのに有効であることを示す。
【０３１７】
炎症性サイトカイン、IL-5及びIL-13を、サイトカインビーズアレイを用いて希釈されていないBALFから測定し、結果を、pg/mlで1群あたりのサイトカインの平均濃度として表し、図13に示す(パネルC及びD)。図13に示される結果(パネルC及びD)は、処理された(又は生きている)ヘリコバクター・ピロリの投与が、サイトカインメディエータ並びに喘息及びアレルギー性呼吸器疾患の生物マーカー、IL-5及びIL-13の、肺中での生成を低下させるのに成功したことを示す。
【０３１８】
図14に示される別の実験において、本発明者らはまた、処理された(すなわち、不活化及び/若しくは死滅させた)、又は生きているヘリコバクター・ピロリを投与された成体及び新生児マウスがアレルギー性気道抵抗応答を低下させたことも示した。肺気道過敏性(AHR)を、5日齢のメスのC57BL/6マウス(n=5〜10)並びに成体C57BL/6マウス(6〜8週、n=10)を用いて、本質的には実施例10に記載のように測定した。簡単に述べると、新生児及び成体マウスに、約109CFU/用量の処理された細菌を、8週間にわたって週に3回供給したか、又は約109CFU/用量の生きている新鮮に培養された細菌を6日間連続で供給した。処理されたヘリコバクター・ピロリを、実施例1に記載のように不活化及び/又は死滅した。0日目及び14日目に、全てのマウスは腹腔内でOVA/ミョウバンを受けた。アレルギー性喘息表現型を、21日目から5日連続で1%のOVAエアロゾルを用いて誘導した。対照マウスは感染させない、感作及びチャレンジ(陽性対照、すなわち、未処置のアレルギーマウス)するか、又は感作のみ(陰性対照、すなわち、未処置の健康なマウス)した。換言すれば、陽性及び陰性対照は、細菌を受けなかった。26日目に、マウスは増加する用量のメタコリン(MCh)を受け、MChチャレンジに応答した肺組織の気道過敏性(AHR)を測定し、マウスを犠牲にした。
【０３１９】
図14、パネルAに示されるように、ヘリコバクター・ピロリを受けなかったアレルギー成体マウス(陽性対照)は、処理されたヘリコバクター・ピロリ又は生きているヘリコバクター・ピロリの製剤を受けた成体マウスの気道抵抗と比較してアレルゲンチャレンジ後に気道抵抗の上昇を示した。図14、パネルB及びCに示されるように、ヘリコバクター・ピロリを受けなかったアレルギー新生児マウス(陽性対照)は、処理されたヘリコバクター・ピロリ又は生きているヘリコバクター・ピロリの製剤を受けた新生児マウスの気道抵抗と比較してアレルゲンチャレンジ後に気道抵抗の上昇を示した。図14のパネルA、B及びCに示される結果は、3つの独立した実験を表し、ヘリコバクター・ピロリが、例えば、成体と新生児対象の両方においてアレルゲンに応答する喘息等のアレルギー性気道疾患のアレルギー応答を軽減するか、又は減衰させることができることを示している。これらの結果は更に、この効果が生きているヘリコバクター・ピロリ又は不活化及び/若しくは死滅させたヘリコバクター・ピロリを用いた場合に同様に同等に生じることを示している。換言すれば、この結果は、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ細菌が、例えば、成体と新生児対象の両方においてアレルゲンに応答する喘息等のアレルギー性気道疾患のアレルギー応答を軽減するか、又は減衰させるのに生きているヘリコバクター・ピロリ細菌と同程度に有効であり、それによって、喘息等のアレルギー等のアレルギー疾患から対象を保護することを示している。
【０３２０】
（実施例１２：不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ細胞は、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞と同じ定着能力を有さない）
本実施例は、成体アレルギー性喘息モデルにおけるアレルギー対象の胃粘膜に定着するヘリコバクター・ピロリ細胞の有効性を低下させる際のヘリコバクター・ピロリ細胞を不活化及び/又は死滅する処理の有用性を証明するものである。
【０３２１】
成体C57BL/6マウス(6〜8週、n=10)を、約1x109CFUのOND79ヘリコバクター・ピロリ(WT)又は処理されたヘリコバクター・ピロリを用いる強制摂取により経口的に、8週間の期間にわたって週に3回感染させた。ヘリコバクター・ピロリ接種材料は、1mlあたり20OD単位の600nm波長の測定された吸光度に調整された塩水溶液中の0.2mlのヘリコバクター・ピロリ株OND79細胞の懸濁液を含んでいた。処理されたヘリコバクター・ピロリを、実施例1に記載のように不活化及び/又は死滅した。8週間の終わりに、マウスを2回用量の50μg OVA/1mgミョウバンでi.p.により感作した(0日目及び14日目)後、31日目〜35日目まで5日間にわたってOVAエアロゾルでチャレンジした。対照マウスは、感染させない、感作及びチャレンジ(陽性)する、又は感作のみ(陰性)した。マウスを36日目に犠牲にし、胃組織を収獲した。胃を、大きい方の湾曲部に沿って切断し、PBSで穏やかに洗浄することにより残留する食物を除去した。開いた胃を、500μlのPBS中に入れ、30の周波数で30秒間、5mmのステンレススチール製ビーズを用いてホモジェナイズした(Qiagen TissueLyser II)。試料を、10の周波数で更に2minホモジェナイズした。ホモジェネートの連続希釈液を、アンホテリシンB(8μg/ml)、トリメトプリム(5μg/ml)及びバンコマイシン(6μg/ml)、ナリジクス酸(10μg/ml)、ポリミキシンB(10μg/ml)及びバシトラシン(200μg/ml)を添加したBHI寒天プレート上に塗布した。プレートを、2つのCampygenキットガスパック(製品コードCN0025A、Thermo Fisher Scientific, Oxoid Ltd社)を含有する気体制御チャンバ中に入れ、37℃でインキュベートした。細菌の増殖を、塗布後5〜7日間決定した。感染したマウスにおける胃粘膜のヘリコバクター・ピロリ定着の結果を、図15に示し、コロニー形成単位(CFU)数/胃/マウスとして表す。
【０３２２】
図15中の結果は、生きている未処理のヘリコバクター・ピロリはアレルギーマウスの胃粘膜に定着することができたが、処理されたヘリコバクター・ピロリは感染したアレルギー成体マウスの胃粘膜に定着しなかったことを示す。これは、処理されたヘリコバクター・ピロリ細胞が、同じ遺伝子型を有する生きている細菌と同じ定着能力を有さないことを示す。
【０３２３】
本発明者らはまた、新生児アレルギー性喘息モデルにおけるヘリコバクター・ピロリ定着の効果も試験した。特に、本発明者らは、成体マウスを用いる代わりに、5日齢のメスのC57BL/6マウス(n=5〜10)を、8週間の期間にわたって週に3回、約1x109CFUのOND79ヘリコバクター・ピロリ(WT)又は処理されたヘリコバクター・ピロリを用いる強制摂取により経口的に感染させた。ヘリコバクター・ピロリ接種材料は、1mlあたり20OD単位の600nm波長の測定された吸光度に調整された塩水溶液中の0.2mlのヘリコバクター・ピロリ株OND79細胞の懸濁液を含んでいた。処理されたヘリコバクター・ピロリを、実施例1に記載のように不活化及び/又は死滅した。8週間の終わりに、マウスを上記のように処置した。得られた結果は、生きている未処理の(WT)ヘリコバクター・ピロリを用いる定着は試験の開始時に5匹の新生児マウスのうちの1匹において達成されたことを示す。他方、ホモジェナイズされた胃試料の未希釈のもの、並びに1:10及び1:100の連続希釈液を塗布されたBHI寒天プレート上での検出可能なヘリコバクター・ピロリCFUの欠如により示されるように、処置されたヘリコバクター・ピロリに感染したマウスについてはいずれも定着は観察されなかった(データは示さない)。これらの結果は、不活化及び/又は死滅させた処理されたヘリコバクター・ピロリ細胞もまた、新生児対象において同じ遺伝子型を有する生きているヘリコバクター・ピロリと比較して低下した定着能力を有することを確認するものである。
【０３２４】
（実施例１３：不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ細胞は胃粘膜に定着することができない）
本実施例は、実施例12における知見を支持するものであり、ヘリコバクター・ピロリ細胞を不活化及び/又は死滅するための処理が成体マウスの胃粘膜に定着するヘリコバクター・ピロリ細胞の能力を無効化することを更に証明するものである。
【０３２５】
成体C57BL/6マウス(6〜8週、n=5)を、2週間にわたって週に3回、約1x109CFUの処理されたOND79ヘリコバクター・ピロリを用いて強制摂取により経口的に反復接種した。ヘリコバクター・ピロリ接種材料は、1mlあたり20OD単位の600nm波長の測定された吸光度に調整された塩水溶液中の0.2mlのヘリコバクター・ピロリ株OND79細胞の懸濁液を含んでいた。処理されたヘリコバクター・ピロリを、実施例2に記載のように、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞をUV-C光を用いる紫外線照射にかけ、場合により、熱処理に更にかけるか、又は生きているヘリコバクター・ピロリ細胞を48時間の酸素飢餓処理にかけ、場合により、更に熱処理にかけることにより、不活化及び/又は死滅した。
【０３２６】
定着のレベルを決定するために、胃組織を、最後の経口摂取の2週間後に、動物から収獲した。胃を、大きい方の湾曲部に沿って切断し、PBSで穏やかに洗浄することにより、残留する食物を除去した。開いた胃を500μlのPBS中に入れ、30の周波数で30秒間、5mmのステンレススチール製ビーズを用いてホモジェナイズした(Qiagen TissueLyser II)。試料を、10の周波数で2min更にホモジェナイズした。ホモジェネートの連続希釈液を、ヘリコバクター・ピロリ選択(DENTの補給物質、ナリジクス酸及びバシトラシン)F12寒天培地プレート上に塗布した。プレートを上記のようにインキュベートし、37℃で3日間のインキュベーション後(Anoxomat、83%N2、7%CO2、6%O2及び4%H2)、単一のコロニーを計数して、塗布の5〜7日後に細菌の増殖を決定した。
【０３２７】
処理されたヘリコバクター・ピロリのマウス胃粘膜の感染及び定着の有効性を、胃あたりのコロニー形成単位(CFU)の数に基づいて評価した。結果は、図16に示され、UV-C照射、及び場合により熱処理による、又は48時間の酸素飢餓及び場合により、さらなる熱処理によるヘリコバクター・ピロリの処理が、ヘリコバクター・ピロリの定着能力を無効化することを示す。これらの結果は、実施例12における知見を確認するものであり、生きているヘリコバクター・ピロリ細胞を処理するただ1つを超える手段によって、ヘリコバクター・ピロリを不活化及び/又は死滅し、ヘリコバクター・ピロリによる定着を防止することができることを更に証明するものである。
【０３２８】
（実施例１４：新生児アレルギーにおける不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリの免疫学的有効性は株特異的ではない）
本実施例は、異なる地理的起源に由来し、ヘリコバクター・ピロリの遺伝的に除去された先祖集団に属する、処理された、すなわち、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ株の投与により達成される、アレルギー疾患に対する免疫学的保護に対する効果の対照比較を示すものである。多遺伝子座配列型決定分析により同定されたヘリコバクター・ピロリの同定された6つの異なる先祖集団が存在し、先祖European 1、先祖European 2、先祖East Asia、先祖Africa 1、先祖Africa 2、及び先祖Sahu1と命名された。本実施例において用いられたヘリコバクター・ピロリ株OND79はEuropean株であり、本実施例において用いられたヘリコバクター・ピロリ株J99はAfrican株である。
【０３２９】
生きているヘリコバクター・ピロリOND79細胞又はヘリコバクター・ピロリJ99細胞を、実施例1及び実施例2に記載のようにUV-C照射処理により不活化及び/又は死滅した。処理されたヘリコバクター・ピロリOND79細胞及び処理されたヘリコバクター・ピロリJ99細胞を、5日齢のC57BL/6マウスに投与し、マウスを、実施例11に記載のものと同じ方法に従うことにより、アレルゲン(OVA)で感作及びチャレンジした。対照マウスは、感染させない、感作及びチャレンジ(陽性対照、すなわち、未処置のアレルギーマウス)するか、又は感作のみ(陰性対照、すなわち、未処理の健康なマウス)した。26日目に、マウスを犠牲にし、血清を収集した。更に、アレルゲン(OVA)特異的IgE及びIgG抗体を、1:60に希釈された血清から標準的なELISA法により測定した。抗体力価を、OD405nmでの個々の、及び平均の吸光度として表した。
【０３３０】
図17に示されるように、UV-C処理されたヘリコバクター・ピロリOND79細胞又はUV-C処理されたヘリコバクター・ピロリJ99細胞は、マウスにおいてアレルギー性アレルゲン特異的IgE及びIgG抗体を減少させた。これらの結果は、アレルギー性喘息マウスモデルにおいて処理された、すなわち、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリ(UV-C処理されたヘリコバクター・ピロリ等)を投与することにより付与される有効性が株特異的なものではないことを示している。これは、異なる起源の処理された、すなわち、不活化及び/又は死滅させたヘリコバクター・ピロリが、未処置のアレルギーマウスと比較してアレルゲンに対するアレルギー性免疫応答を減少させるのに有効であったためである。
【０３３１】
（実施例１５：本発明の組成物及び/又は方法における使用のためのヒト宿主において継代されたヘリコバクター・ピロリ株の生成）
本実施例は、ヒト宿主における継代後に得られるヘリコバクター・ピロリ株OND79の継代された株又は誘導体の生成及び特性評価を示すものである。ヘリコバクター・ピロリの得られる継代された株又は誘導体株は、細胞を不活化及び/又は死滅するための処理並びに本発明の組成物及び/又は方法における使用にとって好適である。
【０３３２】
ヒトへの投与のためのヘリコバクター・ピロリOND79の拡張
ヘリコバクター・ピロリOND79株を、以下の方法によりヒトへの投与のために拡張した。特に、商業的に入手可能なPyloriAgar(PA)プレート(BioMerieux社製、France)を、ヘリコバクター・ピロリOND79株の培養のために購入して、ヒトチャレンジのためのOND79株の接種材料を調製した。これを行うために、-80℃で保存されたヘリコバクター・ピロリOND79株のグリセロールストックバイアル(20%(v/v)グリセロール及び10%(v/v)のヘリコバクター・ピロリOND79細胞を含有するハートインフュージョン[HI]ブロス)を解凍し、5つのPA寒天プレート上に接種した。細菌を接種されたプレートを、Anoxomat(ANCTS2、Mart Microbiology社、Drachten、The Netherlands)を用いる大気排出/置換サイクルにかけて、微好気的条件(約83%N2、7%CO2、6%O2及び4%H2)を作成し、37℃で72hインキュベートした。次いで、全プレート含量を新しいPAプレート上で拡張した。細菌を収獲し、1mlの滅菌生理食塩溶液(0.9%)中に懸濁した。次いで、6つのプレートに、100μlの細菌懸濁液を接種した。滅菌使い捨てループを用いてプレート上に細胞を等量に分配し、上記のように37℃で72h、微好気的条件下でインキュベートした。24h後、4つのプレートを、10mlのレギュラービーフストック溶液(0.2μmのMilliporeシリンジフィルターを通して濾過滅菌された80mlの予め加熱された水中の1グラム[Continental社、Unilever、Australia])中に収獲した。ウレアーゼ、カタラーゼ及びオキシダーゼ試験を含む生化学試験並びにグラム染色を実施して、ストック溶液が純粋なヘリコバクター・ピロリ培養物を含むことを確認した。細菌ストック溶液を氷上に置き、SCGH Human Research Ethics Committee認可番号2009-062の下でのヒト対象ボランティアへの投与のためにDepartment of Gastroenterology and Hepatology at Sir Charles Gairdner Hospital (SCGH) (Western Australia)に輸送した。次いで、約109個の生細菌を、接種によりヒト対象ボランティアに経口的に投与した。投与の2週間後、患者は内視鏡検査を受け、胃生検を採取して、胃粘膜のヘリコバクター・ピロリ定着を確認し、ヒト対象におけるヘリコバクター・ピロリの胃定着を維持するために投与後少なくとも12週間にわたって患者を未処置のままにした。
【０３３３】
ヒト胃生検からのヘリコバクター・ピロリOND86株の単離
細菌接種の12週間後、ヒト対象は内視鏡検査を受けて、いくつかの胃生検を収集した。対象から得られた1つの胃洞生検を、ホモジェナイゼーション[Qiagen Tissue Lyser]によりプロセッシングし、ヘリコバクター・ピロリ選択(DENTの補給物質、ナリジクス酸及びバシトラシン)F12寒天培地プレート(Thermoscientific社、Australia)上で胃生検に由来する細菌を培養するために滅菌生理食塩水中に連続希釈した。細菌培養物を、上記のように微好気的条件(約83%N2、7%CO2、6%O2及び4%H2)下、37℃で72hインキュベートした後、単一の細菌コロニーを単離し、3〜4倍拡張させて、患者の胃生検から単離されたヘリコバクター・ピロリ株のクローン培養物を生成した。純粋なクローンヘリコバクター・ピロリ培養物を、上記のようなグラム染色及び生化学試験により検証し、拡張された単一のコロニーを3組凍結させて、20%(v/v)植物性グリセロールを含むF12ブロス(凍結培地)中、-80℃で保存した。ヒト対象中での継代後、ヘリコバクター・ピロリOND79から誘導されたヘリコバクター・ピロリ株の純粋なクローン培養物を、ヘリコバクター・ピロリOND86株と命名し、試料を、ブダペスト条約の規定に準じて2014年6月10日にNational Measurement Institute (NMI)、1/153 Bertrie Street、Port Melbourne、Victoria、Australiaに寄託し、NMI受託番号V14/013016が割り当てられた。
【０３３４】
ヒト宿主中での継代後のOND79から誘導されたヘリコバクター・ピロリの臨床単離物の特性評価
ヘリコバクター・ピロリ親株OND79と、親OND79株を投与された3人のヒトボランティアの胃生検から上記のように得られたヘリコバクター・ピロリの6つの臨床単離物との間のゲノムDNA多様性の分析を、Akopyanzら(1992) Nucleic Acids Research、20:5137〜5142頁により記載さえたようなPCRに基づく無作為増幅多型DNA(RAPD)フィンガープリンティング法を用いて実施した。ヘリコバクター・ピロリの6つの臨床単離物を、「#1157 clone 1」、「#1157 clone 9」、「#86198 clone 1」、「#86198 clone 9」、「#45156 clone 1」及び「#45156 clone 9」と標識した。臨床単離物#1157 clone 1、及び#1157 clone 9は、親OND79株を投与された同じヒト対象(ボランティア1)の同じ胃生検から得られた2つのクローン単離物である。同様に、臨床単離物#86198 clone 1、及び#86198 clone 9は、親OND79株を投与された同じヒト対象(ボランティア2)の同じ胃生検から得られた2つのクローン単離物である。臨床単離物#86198 clone 1、及び#86198 clone 9は、親OND79株を投与された同じヒト対象(ボランティア3)の同じ胃生検から得られた2つのクローン単離物である。ヘリコバクター・ピロリ臨床単離物#1157 clone 9の純粋なクローン培養物を、上記のようなNMI受託番号V14/013016の下でのヘリコバクター・ピロリOND86株としての寄託のために選択した。
【０３３５】
RAPDフィンガープリンティングを、ヘリコバクター・ピロリ親株OND79及び6つの臨床単離物に対して、配列番号3に記載され、配列5'-CCG CAG CCA A-3'を有するプライマー「1254」、又は配列番号4に記載され、配列5'-AAC GCG CAA C -3'を有するプライマー「1281」を用いて実施した。図18に示されるように、ゲノムRAPDフィンガープリンティングは、親OND79株について、及び寄託されたOND86株を含むヒト継代誘導体株のそれぞれの臨床単離物について同一であった。そのような結果は、ヒト宿主継代臨床単離物等の動物宿主を介して継代されたヘリコバクター・ピロリ株が、同一でない場合、親OND79株と類似する遺伝子構成を有することを示している。
【０３３６】
（実施例１６：ヒトにおいて継代されたOND79から誘導されたヘリコバクター・ピロリ株は、感染した動物において胃粘膜の強い定着有効性を示す）
本実施例は、ヒト宿主における継代後に得られたヘリコバクター・ピロリ株OND79の継代された株又は誘導体が、動物の胃粘膜に定着することができることを示すものである。
【０３３７】
成体C57BL/6マウス(n=5)に、実施例15に記載のヒト宿主においてヘリコバクター・ピロリOND79を継代した後に得られたヘリコバクター・ピロリの6つの臨床単離物のそれぞれの1つ、すなわち、#1157 clone 1、#1157 clone 9、#86198 clone 1、#86198 clone 9、#45156 clone 1及び#45156 clone 9の純粋培養物に由来する約1x109個の生きている細菌を経口胃的に接種した。6つの臨床単離物(NMI受託番号V14/013016の下で寄託されたヘリコバクター・ピロリOND86株の臨床単離物を含む)の定着レベルを決定するために、胃組織を細菌投与の2週間後に動物から収獲した。胃を、大きい方の湾曲部に沿って切断し、PBSで穏やかに洗浄することにより、残留する食物を除去した。開いた胃を500μlのPBS中に入れ、30の周波数で30秒間、5mmのステンレススチール製ビーズ(Qiagen TissueLyser II)を用いてホモジェナイズした。試料を10の周波数で更に2minホモジェナイズした。ホモジェネートの連続希釈液をヘリコバクター・ピロリ選択(DENTの補給物質、ナリジクス酸及びバシトラシン)F12寒天培地プレート上に塗布した。プレートを、上記のように37℃で72h、微好気的条件(Anoxomat、約83%N2、7%CO2、6%O2及び4%H2)下でインキュベートした後、単一のコロニーを計数し(すなわち、細菌増殖)、塗布後5〜7日間決定した。ヒト宿主においてヘリコバクター・ピロリOND79を継代した後に得られたヘリコバクター・ピロリ誘導体株の6つの単離物のそれぞれの1つに関するマウス胃粘膜の感染及び定着の有効性を、胃あたりのコロニー形成単位(CFU)数に基づいて測定した。図19に示されるように、6つの臨床単離物(寄託されたヘリコバクター・ピロリOND86株を含む)は全て、マウス胃粘膜に効率的に感染し、定着することができた。
【０３３８】
（実施例１７：ヒト宿主において継代されたOND79から誘導されるヘリコバクター・ピロリ株は、動物の胃粘膜に定着する強力な有効性を示す）
本実施例は、ヒト宿主において継代した後に得られたヘリコバクター・ピロリ株OND79の継代された株又は誘導体が、動物において特異的抗ヘリコバクター・ピロリIgG抗体を誘導することを証明するものである。
【０３３９】
また、実施例14に記載のヘリコバクター・ピロリの6つの臨床単離物のそれぞれの1つの純粋な培養物に由来する生きている細菌を経口胃的に接種した成体C57BL/6マウスを用いて、上記のヘリコバクター・ピロリの6つの臨床単離物の免疫原性有効性を決定した。血清を、実施例16に記載の定着実験の終点でマウスから収集した。96ウェルプレート(Nunc Maxisorb)を、10μg/mlのヘリコバクター・ピロリX47株細胞溶解物で被覆し、4℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを、PBS/0.05%Tween-20中で5回洗浄し、37℃で2時間、2%ウシ血清アルブミン(BSA)で遮断した。プレートを2回洗浄し、血清試料(1/20希釈)をウェルに2組添加した。次いで、プレートを室温(RT)で1hインキュベートした後、洗浄し、検出抗体(アルカリホスファターゼにコンジュゲートした抗マウスIgG、1/1000、Sigma社)を添加した。プレートをRTで1h、更にインキュベートした後、洗浄した。プレートをp-NPPを用いて60min展開した後、2M NaOHを用いて反応を停止させた。抗体力価を405nmで測定されたOD値として表した。図20に示されるように、6つの臨床単離物(寄託されたヘリコバクター・ピロリOND86株を含む)の全てが、ヘリコバクター・ピロリに対する抗体特異的免疫応答を誘導することができた。
【０３４０】
総合すれば、本明細書に提示される結果は、特に、哺乳動物対象への生きている、死滅させた、又は不活化された形態のヘリコバクター・ピロリの投与が、アレルギーに対するアレルギー性免疫応答を抑制するか、若しくは減衰させる、及び/又はアレルギー性喘息等のアレルギー性気道疾患を抑制するか、若しくは減衰させるように哺乳動物宿主免疫応答をモジュレートすることができることを示している。本明細書に提示される結果はまた、特に、生きている、死滅させた、又は不活化されたヘリコバクター・ピロリを含む製剤が、アレルギー性気道疾患等のアレルギー性免疫応答又はアレルギー疾患の発症を防止し、対象におけるアトピーマーチ及びアレルギー疾患の進行を防止するか、又は制限するため、例えば、後の人生において食物アレルギー及び/又は重症喘息に対する湿疹を有する小児におけるアレルギー疾患の進行を防止又は制限するための、新生児及び/又は年少者等の小児における免疫療法としての有用性を有し得ることも示している。更に、本明細書に示されるように、死滅及び/又は不活化されたヘリコバクター・ピロリにより付与されるアレルゲンに対応するアレルギー性免疫応答を抑制するか、又は減衰させる有効性は、株特異的なものではない。
【０３４１】
本発明のさらなる非限定例
[001]場合により、ヘリコバクター・ピロリ全細胞から調製された抽出物又は部分的若しくは完全に精製された、及び/若しくは予備処理されたヘリコバクター・ピロリ細胞から単離されたタンパク質等の、プロセッシングされたヘリコバクター・ピロリ調製物を生成するように更にプロセッシングされた、単離されたヘリコバクター・ピロリ細胞、その細胞溶解物又はその組合せと、薬学的に許容される担体とを含む組成物であって、前記ヘリコバクター・ピロリ細胞は、死滅しているか、又は前記哺乳動物の粘膜に定着することができない、前記組成物。本明細書で用いられる用語「組成物」とは、場合により、哺乳動物に投与されるのに好適な薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤との混合物中にある、治療上有効量又は予防上有効量のヘリコバクター・ピロリ細菌又はヘリコバクター・ピロリ細胞溶解物又はその組合せを指す。一般に、組成物は、治療上有効量として投与されるように調製される。薬学的に許容される担体は、哺乳動物の粘膜への投与にとって好適な任意の有機又は無機不活性材料、例えば、場合により、医薬化合物化の許容される実務に従って添加される、1つ又は複数の他の薬学的に活性な薬剤、香料、保存剤、安定化剤、乳化剤、バッファー等を更に含む、水、ゼラチン、アラビアゴム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ポリアルキレングリコール、ワセリン等である。本発明の組成物の「治療上有効量」は、所望の応答、例えば、アネルギーを惹起するのに有効であるが、毒性反応を引き起こすには不十分である量を含むと理解される。本明細書で用いられる用語「アネルギー」とは、抗原に対する免疫細胞の応答性の低下をもたらす可逆的抗増殖状態をおそらく必要とする、減少した免疫反応、又は適切な免疫応答の欠如により示されるような抗原に対する免疫反応の非存在を指す。本明細書で用いられる用語「その細胞溶解物」とは、細菌の細胞成分が分解されるか、又は遊離するようにヘリコバクター・ピロリ細胞が破壊された、本発明のヘリコバクター・ピロリ細胞の調製物を指す。当業者であれば、細菌の細胞溶解物を生成するための技術をよく知っている。例えば、ヘリコバクター・ピロリ細胞をペレット化した後、例えば、Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(PBS; 10mMリン酸、0.14M NaCl、pH7.4)中に再懸濁し、W-375 sonication Ultrasonic processor (Heat Systems-Ultrasonics, Inc.社、Farmingdale、N.Y.)を用いて、パルス及び強度設定5で3回の1minのセッションで50%の負荷サイクルで氷上で超音波処理にかける。必要に応じて、その後、不溶性材料及び破壊されていない細菌細胞を、遠心分離により除去することができる。或いは、ヘリコバクター・ピロリ細胞を遠心分離により収集し、PBS中に再懸濁した後、20,000LB/inでFrenchプレス(SLM Instrument Inc.社、Urbana、Ill.)を介する通過により溶解する。再度、必要に応じて、細菌溶解物を、102,000Xgで10分間遠心分離して、細菌破片を除去する、及び/又は0.45μM膜(Nalgene社、Rochester、N.Y.)を通して濾過する。ヘリコバクター・ピロリの細胞溶解物を生成する別の方法は、リゾチームの存在下での細菌ペレットの凍結及び解凍を含む。ヘリコバクター・ピロリ細胞溶解物の特定例は、例えば、濾過後に得られる、ヘリコバクター・ピロリの超音波処���された培養物の可溶性画分である。或いは、又は更に、ヘリコバクター・ピロリを、高圧ホモジェナイザ(例えば、Avestin社モデルEmulsiFlexC5)を用いて断片化する。場合により、細胞溶解物を、ホルマリン、又は同等の薬剤を用いる処理により更に不活化する。或いは、本発明による免疫療法組成物を、ヘリコバクター・ピロリ培養培地の溶解物からの1つ又は複数のタンパク質の分画化及び/又は精製により取得する。明らかに、当業者であれば、細胞溶解物を本明細書に記載の本発明の方法において用いようとする場合、それは既に破壊されているであろうため、ヘリコバクター・ピロリを不活化又は「死滅」する必要はないが、上記又は下記のように、全ヘリコバクター・ピロリについては、死滅するか、又は前記哺乳動物の粘膜に定着することができないことが必要である。
【０３４２】
[002]薬学的に許容される担体と共に、単離されたヘリコバクター・ピロリ細胞及びその細胞溶解物から本質的になる組成物。用語「組成物」と「細胞溶解物」は、段落1で与えられた意味を有する。
【０３４３】
[003]単離されたヘリコバクター・ピロリ細胞、その細胞溶解物又はその組合せと、薬学的に許容される担体とを含む、哺乳動物におけるアレルギーを防止又は処置するのに使用するための組成物であって、前記ヘリコバクター・ピロリ細胞は、死滅させるか、又は前記哺乳動物の粘膜を定着することができない、前記組成物。用語「組成物」と「細胞溶解物」は、上記の段落1で与えられた意味を有する。死滅させたヘリコバクター・ピロリは、不可逆的な静菌の状態にある。ヘリコバクター・ピロリ細胞は、その構造を保持し、かくして、例えば、野生型ヘリコバクター・ピロリ細胞と関連する免疫原性、抗原性、及び/又は受容体-リガンド相互作用を保持するが、複製することはできない。紫外線(UV)照射への曝露、極端な熱及び/又は圧力への曝露及び/又はバクテリオファージによる感染等の、ヘリコバクター・ピロリを含む死滅させた(全)細菌を生成するための当業界で公知の様々な方法が存在する。いくつかの実施形態においては、死滅又は不活化されたヘリコバクター・ピロリは、代謝活性を保持してもよい、例えば、それは、細胞壁及び細胞膜並びに遊離ラジカル収獲のためのカタラーゼ及びスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)活性の存在等のある特定の酵素機能を全体的に保持するか、又は部分的に保持してもよいが、それが投与される対象の胃粘膜に定着することはできない。死滅又は不活化されたヘリコバクター・ピロリを生成する好ましい方法は、熱、UV照射、圧力又は化学的手段によるものである。照射による不活化の例示的手段としては、紫外線照射又はガンマ線照射への曝露が挙げられる。一度、死滅若しくは不活化されたヘリコバクター・ピロリ株、又は自然では哺乳動物の粘膜に定着することができないヘリコバクター・ピロリ株、又はヘリコバクター・ピロリ細胞溶解物が生成されたら、それを本発明の組成物中に調合する。
【０３４４】
[004]ヘリコバクター・ピロリが、例えば、株を不活化若しくは死滅することにより本発明における使用の前に死滅させる、又は株が自然では哺乳動物の粘膜に定着することができない、段落1〜3のいずれか1つに記載の組成物。
【０３４５】
[005]ヘリコバクター・ピロリがcagA欠損又はcagA-株であり、好ましくは、VacA遺伝子の毒素原性s1及びm1対立遺伝子についても陽性である株である、段落1〜4のいずれか1つに記載の組成物。用語「cagA-」、「cagAマイナス」、「cagA欠損」等は、40kbのcag病原性アイランド(PAI)上にコードされる120〜145kDaのタンパク質である、ヘリコバクター・ピロリビルレンス因子cagA(細胞毒素関連遺伝子A)の非存在を指す(Hatakeyama & Higashi、(2005)、Cancer Science.、96: 835〜843頁)。ヘリコバクター・ピロリ株は、cagA+(陽性)又はcagA-(陰性)株に分けられ、西洋諸国におけるヘリコバクター・ピロリ単離物の約60%が陽性であるが、東アジアの単離物の大部分は陰性であり、例えば、Hatakeyama & Higashi、(2005)を参照されたい。
【０３４６】
[006]ヘリコバクター・ピロリが、National Measurement Instituteに受託番号V09/009101の下で寄託されたOND737; National Measurement Instituteに受託番号V09/009102の下で寄託されたOND738; National Measurement Instituteに受託番号V09/009103の下で寄託されたOND739; National Measurement Instituteに受託番号V10/014059の下で寄託されたOND248; National Measurement Instituteに受託番号V10/014060の下で寄託されたOND256; National Measurement Instituteに受託番号V09/009104の下で寄託されたOND740; National Measurement Instituteに受託番号V13/023374の下で寄託されたOND79、及び/若しくはNational Measurement Instituteに受託番号V14/013016の下で寄託されたOND86、又はその継代された株、変異体若しくは誘導体からなる群から選択されるヘリコバクター・ピロリの株の特徴を有する、段落1〜5のいずれか1つに記載の組成物。本明細書で用いられる用語「変異体」又は「誘導体」は、本明細書に記載のヘリコバクター・ピロリの株から生成されるか、又はそれから誘導されるヘリコバクター・ピロリを指し、そのようなものとして、ヘリコバクター・ピロリ株OND737、OND738、OND739、OND740、OND248、OND256、OND79又はOND86のものと、少なくとも約80%、好ましくは少なくとも約90%、及び最も好ましくは少なくとも約95%同一であるゲノムDNAを有する。
【０３４７】
[007]ヘリコバクター・ピロリが、本発明における使用のために不活化される前に動物宿主を介して継代された、段落1〜6のいずれか1つに記載の組成物。
【０３４８】
[008]ヘリコバクター・ピロリが、少なくとも1つの異種抗原又はその機能的断片をコードする1つ又は複数の核酸分子を含むように、不活化される前に遺伝的に更に改変される、段落1〜7のいずれか1つに記載の組成物。これは、ヘリコバクター・ピロリが、それが不活化される前に抗原を全体として発現することを意味する。「遺伝的に改変された」ヘリコバクター・ピロリは、それがヘリコバクター・ピロリ中に存在する遺伝子構成に対する変化又は付加を含む点で、対応する野生型ヘリコバクター・ピロリのものとその表現型及び/又は遺伝子型において異なるヘリコバクター・ピロリ細菌を指す。ヘリコバクター・ピロリの遺伝的改変のための方法は、当業界で周知である。例えば、Sambrook & Russell、(2001)、「Molecular Cloning--A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、第3版を参照されたい。単離された遺伝的に改変されたヘリコバクター・ピロリ細胞は、ヘリコバクター・ピロリ細胞の混合集団中に存在してもよい。いくつかの実施形態においては、遺伝的に改変されたヘリコバクター・ピロリは、少なくとも1つの異種抗原又はその機能的断片をコードする1つ又は複数の核酸分子を含む。核酸分子は、染色体外に存在してもよく、又は好ましくは、ヘリコバクター・ピロリのゲノム中に組込まれてもよい。本明細書で用いられる用語「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドを指す。かくして、この用語は、限定されるものではないが、一本鎖、二本鎖、又は多鎖DNA又はRNA、ゲノムDNA、cDNA、DNA-RNAハイブリッド、又はプリン及びピリミジン塩基若しくは他の天然の、化学的若しくは生化学的に改変された、非天然の、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。本明細書で用いられる用語「異種核酸」とは、以下の少なくとも1つが当てはまる核酸を指す:(a)核酸がヘリコバクター・ピロリに対して外来(「外因性」)である(すなわち、天然には見出されない);(b)核酸が天然で互いに同じ関係で見出されない2つ以上のヌクレオチド配列又は断片を含む、例えば、核酸が組換えである。本明細書で用いられる「組換え」は、特定の核酸(DNA又はRNA)が、天然系に見出される内因性核酸とは識別可能な構造的コード又は非コード配列を有する構築物をもたらすクローニング、制限、及び/又はライゲーション工程の様々な組合せの生成物であることを意味する。一般に、構造的コード配列をコードするDNA配列を、cDNA断片及び短いオリゴヌクレオチドリンカーから、又は一連の合成オリゴヌクレオチドから集合させて、細胞中又は無細胞転写及び翻訳系中に含まれる組換え転写単位から発現され得る合成核酸を提供する。そのような配列は、典型的には、真核遺伝子中に存在する、内部非翻訳配列、又はイントロンにより中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供される。関連配列を含むゲノムDNAを、組換え遺伝子又は転写単位の形成において用いることもできる。非翻訳DNAの配列は、オープンリーディングフレームから5'又は3'側に存在してもよく、そのような配列はコード領域の操作又は発現を阻害せず、実際、様々な機構により所望の生成物の生成をモジュレートするように作用することができる。かくして、例えば、用語「組換え」���リヌクレオチド又は「組換え」核酸は、天然には存在しない、例えば、ヒトの介入により2つのそうでなければ分離された配列断片の人工的な組合せにより作製されたものを指す。人工的組合せは、化学的合成手段によるか、又は例えば、遺伝子操作技術による、単離された核酸の断片の人工的操作により達成されることが多い。そのようなことは通常、典型的には、配列認識部位を導入又は除去しながら、あるコドンを、同じか、又は保存的なアミノ酸をコードする冗長コドンと置き換えるために行われる。或いは、それは、所望の機能の核酸断片と一緒に連結して、機能の所望の組合せを作成するために実施される。この人工的組合せは、化学的合成手段によるか、又は例えば、遺伝子操作技術による核酸の単離された断片の人工的操作により達成されることが多い。いくつかの実施形態においては、異種核酸配列は、ベクターによって本発明のヘリコバクター・ピロリ株に導入される。「ベクター」は、特定の核酸配列の発現及び/若しくは増殖のために作成された、又は他の組換え核酸配列の構築において用いられる、組換え核酸、一般的には、組換えDNAを意味する。ベクターは、DNA調節配列並びに対象の核酸配列を含むことが多い。用語「DNA調節配列」、「制御エレメント」及び「調節エレメント」は、ヘリコバクター・ピロリ細胞中での核酸配列の発現を提供する、及び/又は調節する、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル等の転写及び翻訳制御配列を指す。用語「形質転換」は、本明細書では「遺伝子改変」と互換的に用いられ、新しい核酸の導入後にヘリコバクター・ピロリ細胞中で誘導される永続的又は一過的な遺伝子変化を指す。遺伝子変化(「改変」)は、ヘリコバクター・ピロリ細胞のゲノム中への新しいDNAの組込みによるか、又は組換えヘリコバクター・ピロリ細胞中での維持に役立つ1つ若しくは複数の選択マーカーを含有してもよい発現ベクター等のエピソームエレメントとしての新しいDNAの一過的若しくは安定的な維持により達成される。遺伝子改変の好適な方法としては、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈降、直接マイクロインジェクション等が挙げられる。これらの方法の一般的考察は、Ausubelら、Short Protocols in Molecular Biology、第3版、Wiley & Sons、1995に見出される。DNA調節配列と、対象の核酸配列は、「作動可能に連結」されることが多く、これは、そのように記載された成分が、それらがその意図される様式で機能することを可能にする関係にある並置を指す。例えば、プロモーターがその転写又は発現を行う場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結される。本明細書で用いられる用語「異種プロモーター」及び「異種制御領域」は、特定の天然の核酸と通常は会合しないプロモーター及び他の制御領域を指す。例えば、「コード領域に対して異種である転写制御領域」は、天然のコード領域と通常は会合しない転写制御領域である。いくつかの実施形態においては、核酸配列は、異種抗原をコードする。「異種抗原」は、ヘリコバクター・ピロリにとって天然ではないもの、すなわち、天然で、又はヘリコバクター・ピロリ中へ���導入前にはヘリコバクター・ピロリにより発現されないものである。「抗原」は、哺乳動物において免疫応答を惹起することができる、任意の免疫原性部分又は薬剤、一般には、高分子を指す。この用語を、
個々の高分子又は抗原性高分子の同種又は異種集団を指すように用いることができる。本明細書で用いられる場合、「抗原」は一般に、本明細書で定義される核酸配列によりコードされる、1つ又は複数のエピトープを含有するタンパク質分子又はその一部を指すように用いられる。本発明の様々な例においては、抗原は、1つ又は複数のT細胞エピトープを含有する。「T細胞エピトープ」とは、一般に、T細胞応答を誘導することができるペプチド構造のこれらの特徴を指す。これに関して、T細胞エピトープはMHC分子のペプチド結合の裂け目内で拡張されたコンフォメーションを取る線状ペプチド決定基を含むことが当業界で受け入れられている(Unanueら(1987)、Science、236:551〜557頁)。本明細書で用いられる場合、T細胞エピトープは一般に、少なくとも約3〜5アミノ酸残基、及び好ましくは少なくとも5〜10以上のアミノ酸残基を有するペプチドである。特定の抗原が細胞媒介性免疫応答を刺激する能力を、リンパ増殖(リンパ球活性化)アッセイ、CTL細胞傷害性細胞アッセイ等のいくつかの周知のアッセイにより、又は感作された対象において抗原に特異的なTリンパ球についてアッセイすることにより決定することができる。例えば、Ericksonら(1993)、J. Immunol.、151:4189〜4199頁;及びDoeら(1994)、Eur. J. Immunol.、24:2369〜2376頁を参照されたい。本発明の他の例においては、抗原は、1つ又は複数のB細胞エピトープを含有する。「B細胞エピトープ」は、一般に、特異的抗体分子が結合する抗原上の部位を指す。抗体応答を惹起することができるエピトープの同定は、当業界で周知の技術を用いて容易に達成される。例えば、Geysenら(1984)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81:3998〜4002頁(所与の抗原中の免疫原性エピトープの位置を決定するためにペプチドを迅速に合成する一般的方法);米国特許第4,708,871号(抗原のエピトープを同定し、化学的に合成するための手順);及びGeysenら(1986)、Molecular Immunology、23:709〜715頁(所与の抗体に対する高い親和性を有するペプチドを同定するための技術)を参照されたい。いくつかの実施形態においては、1つ又は複数の抗原(アレルゲン)をコードする核酸配列は、その形質転換性を評価するために、選択マーカー、例えば、抗生物質マーカーを含む好適なヘリコバクター・ピロリシャトルベクター、例えば、シャトルプラスミド中に挿入される。概して、好適なシャトルベクターは、以下の特徴、クローニング部位、ヘリコバクター・ピロリ複製起点、大腸菌複製起点、並びに抗生物質耐性遺伝子及び/又は選択マーカーの1、2、3つ以上を含む。この目的にとって好適な、又はこの目的にとって容易に適合可能な当業界で公知のベクターとしては、例えば、Robertsら(Appl Env Mircobiol.、54: 268〜270頁(1988))により記載された組換えシャトルプラスミドpHR106; Bannamら(Plasmid、29:233〜235頁(1993))により記載されたPJIR750及びPJIR751プラスミド;Matsushitaら(Plasmid、31、317〜319頁(1994))のプロモーター非含有PPSVプロモーター選択ベクター;Lyrasら(Plasmid、39、160〜164頁(1988))により記載された、シャトルプラスミドpJIR1456及びpJIR1457;並びにKimら(Appl Environ Microbiol.、55、360〜365頁(1989))により記載されたpAK201シャトルベクターが挙げられ、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組込まれる。或いは、相同組換えを用いて、ヘリコバクター・ピロリのゲノム中に外因性配列を導入する。一度、ベクター、例えば、シャトルベクターが生成されたら、形質転換/トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性核酸導入、N-[1-(2,3-ジオロイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチルサルフェート媒介性形質転換等の核酸導入プロトコールを用いる。当業者であれば、当業界における知識及び設計選択に従ってヘリコバクター・ピロリの遺伝的改変のための適切な道具及び方法を容易に選択することができる。一度、本発明のヘリコバクター・ピロリ又は遺伝的に改変されたヘリコバクター・ピロリが、単離された、宿主を介して継代された、及び/又は、例えば、培養により調製されたら、それを本発明の方法において用いる。
【０３４９】
[009]核酸分子が染色体外に存在する、段落8に記載の組成物。
【０３５０】
[010]核酸分子が染色体に挿入される、段落8に記載の組成物。
【０３５１】
[011]異種抗原又はその機能的断片が環境抗原をコードする、段落8〜10のいずれか1つに記載の組成物。例えば、抗原は、組換え抗原等の、任意の公知のアレルゲンから得られるか、又は誘導される。例示的な組換えアレルゲンは、以下に表形式で提供される。
【０３５２】
【表３Ａ】
2019059770.tif 000004
【０３５３】
【表３Ｂ】
2019059770.tif 000005
【０３５４】
【表３Ｃ】
2019059770.tif 000006
【０３５５】
【表３Ｄ】
2019059770.tif 000007
【０３５６】
[012]異種抗原をコードする核酸分子が、(a)異種抗原をコードするヌクレオチド配列及び(b)ベクターがヘリコバクター・ピロリ株に形質転換された場合に核酸の発現を制御することができる、それに作動可能に連結された制御又は調節配列を含む、プラスミドベクター中に存在する、段落8〜11のいずれか1つに記載の組成物。
【０３５７】
[013]組成物がアジュバントを更に含む、段落1〜12のいずれか1つに記載の組成物。当業界で公知の任意のアジュバントを用いることができる。
【０３５８】
[014]アジュバントが、ミョウバン、百日咳毒素、ラクトフコペンタオースIII、ホスホポリマー、完全Freundアジュバント、モノホスホリルリピドA、3-デ-O-アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)、アルミニウム塩、CpG含有オリゴヌクレオチド、免疫刺激DNA配列、サポニン、モンタニドISA720、SAF、ISCOMS、MF-59、SBAS-3、SBAS-4、Detox、RC-529、アミノアルキルグルコサミニド4-リン酸、及びLbeIF4A又はその組合せからなる群から選択される、段落13に記載の組成物。
【０３５９】
[015]組成物が哺乳動物におけるアネルギー及び/又はアレルギーを防止又は処置するために調合される、段落1〜14のいずれか1つに記載の組成物。哺乳動物への組成物の投与の用量及び持続期間は、処置を必要とする哺乳動物対象を看護する医療専門家により決定され、対象の年齢、性別及び体重、発現される特定のヘリコバクター・ピロリ及び核酸分子又は例えば、ヘリコバクター・ピロリが死滅されているにしても、若しくは生きているにしても、ヘリコバクター・ピロリ及び/若しくはその細胞溶解物又はヘリコバクター・ピロリの株が用いられる状態を考慮する。特定のヘリコバクター・ピロリの特定の型及び比率、プラスミドベクター及び本明細書に記載の他の送達機構、並びに本文が参照により本明細書に特に組込まれるRemington's Pharmaceutical Sciences、第20版、Mack Publishing Companyに記載されるような、調剤業界の当業者には公知の調合技術を考慮して、本発明の実施における使用のための様々な送達形態の組成物が容易に調製される。本発明の組成物の1つの適用は、1つ又は複数のアレルゲン(抗原)に対する免疫応答を変化させる、改善する、又は変更することによって、アネルギーをもたらすことである。用語「変化させること、若しくは変化した」、「行うこと、若しくは行われた」又は「と比較して変化させること」は、全て、本発明の方法を用いる前の特定の免疫応答と比較した場合に個体の特定の免疫応答が改変されていることを暗示又は示唆するために本明細書で用いられる。本発明の方法により防止及び/又は処置されると特に考えられるアレルギー疾患としては、限定されるものではないが、接触皮膚炎(Kapsenbergら、Immunol Today 12:392〜395頁)、アレルギー性喘息(Walkerら(1992)、Am. Rev. Resp. Dis. 148:109〜115頁)、アトピー性皮膚炎(van der Heijdenら(1991)、J. Invest. Derm. 97:389〜394頁)を含むアレルギー性アトピー障害(一般的な環境アレルゲンに対する)等の慢性炎症性障害;高IgE症候群、オーメン症候群、乾癬、花粉症、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、湿疹及び食物アレルギーが挙げられる。ヘリコバクター・ピロリ含有組成物を、「経口的に」、「経腸的に」又は「非経口的に」、すなわち、消化管に沿った経路又は様式による投与又は送達のために調合することができる。
【０３６０】
[0016]アレルギーが、接触皮膚炎、慢性炎症性障害、アレルギー性アトピー障害、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、高IgE症候群、オーメン症候群、乾癬、花粉症及びアレルギー性鼻炎からなる群から選択される、段落15に記載の組成物。
【０３６１】
[0017]組成物が経口投与されるように調合される、段落1〜16のいずれか1つに記載の組成物。組成物の投与の「経口」経路の例としては、限定されるものではないが、液体又は固体形態の組成物の口からの嚥下、経鼻空腸又は胃瘻管を介する組成物の投与、組成物の十二指腸内投与、及び例えば、本明細書に記載のヘリコバクター・ピロリ株を、消化管の腸管下部に放出する坐剤を用いる直腸投与が挙げられる。
【０３６２】
[0018]発症するリスクのある哺乳動物におけるアレルギーの処置又は防止のための方法であって、前記哺乳動物に、単離されたヘリコバクター・ピロリ細胞、その細胞溶解物又はその組合せと、薬学的に許容される担体とを含む有効量の組成物を投与する工程を含み、前記ヘリコバクター・ピロリ細胞が死滅しているか、又は前記哺乳動物の粘膜に定着することができず、前記組成物が、投与の際に、前記アレルギーに対する防御免疫を提供する、方法。好ましくは、組成物は、段落1〜17のいずれか1つに記載の組成物である。本文脈における用語「粘膜」とは、限定されるものではないが、口腔粘膜、食道粘膜、胃粘膜、鼻粘膜、気管支粘膜及び子宮粘膜を含む、哺乳動物組織の内膜を指す。好ましくは、粘膜は、胃粘膜である。粘膜送達は、粘膜への送達を包含してもよい。口腔粘膜送達は、頬、舌下、及び歯肉経路の送達を含む。従って、本発明は、前記粘膜送達が頬送達、肺送達、眼内送達、経鼻送達及び経口送達からなる群から選択される方法に関する。好ましくは、前記粘膜送達は、経口送達である。用語「哺乳動物」又は「哺乳動物対象」又は「個体」は、本明細書では互換的に用いられ、限定されるものではないが、ヒト及び他の霊長類、例えば、チンパンジー及び他の類人猿及びサル種等の非ヒト霊長類;ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマ等の農業用動物;イヌ及びネコ等の家庭用動物;マウス、ラット及びモルモット等のげっ歯類を含む実験動物;家庭用、野生及び試合用鳥類、例えば、ニワトリ、七面鳥及び他の家禽鳥類、アヒル、ガン等の脊索動物亜門の任意のメンバーを指す。前記方法は、上記の脊椎動物種のいずれかにおける使用について意図される。本明細書で用いられる用語「処置」は、(a)アレルギー疾患の素因があるが、それらを有するとまだ診断されていない対象においてアレルギー疾患が生じるのを防止すること;(b)アレルギー疾患を阻害すること、すなわち、その発症を停止させること;又は(c)アレルギー疾患の症状を軽減するか、若しくは改善すること、すなわち、アレルギー疾患の症状の軽減を引き起こすことを含む、予防、すなわち、アレルギー疾患又はその兆候若しくは症状の完全な、若しくは部分的な防止により、又は療法、すなわち、アレルギー疾患の部分的な、若しくは完全な治癒等により、所望の薬理学的及び/又は生理学的効果を得るように個体又は対象、その組織又は細胞に影響させることを意味する。
【０３６３】
[0019]アレルギーを発症するリスクのある免疫学的にナイーブな哺乳動物における前記アレルギーの処置又は防止のための方法であって、(i)アレルギーを発症するリスクがある哺乳動物を同定する工程;(ii)前記哺乳動物に、ヘリコバクター・ピロリ細胞が死滅しているか、又は前記哺乳動物の粘膜に定着することができない、単離されたヘリコバクター・ピロリ細胞、その細胞溶解物又はその組合せと、薬学的に許容される担体とを含む組成物を投与する工程及び(iii)アネルギーが生じるのを可能にする十分な時間を経過させる工程を含む、方法。好ましくは、前記組成物は、段落1〜17のいずれか1つに記載の組成物である。用語「粘膜」及び「哺乳動物」及び「処置」は、段落18に与えられた意味を有する。
【０３６４】
[0020]哺乳動物に、単離されたヘリコバクター・ピロリ細胞、その細胞溶解物又はその組合せと、薬学的に許容される担体とを含む有効量の組成物を投与する工程を含み、前記ヘリコバクター・ピロリ細胞が死滅しているか、又は前記哺乳動物の粘膜に定着することができず、前記組成物が、投与の際に、アレルギーに対する防御免疫を提供する、哺乳動物におけるアレルギーの処置又は防止のための方法。好ましくは、前記組成物は、段落1〜17のいずれか1つに記載の組成物である。用語「粘膜」及び「哺乳動物」及び「処置」は、段落18に与えられた意味を有する。
【０３６５】
[0021]哺乳動物がイヌ、ネコ、家畜動物、霊長類又はウマである、段落18〜20のいずれか1つに記載の方法。
【０３６６】
[0022]霊長類がヒトである、段落21に記載の方法。ヒト成人及び新生児及び乳幼児が、本発明により処置されることが意図される。いくつかの実施形態においては、哺乳動物は、3ヶ月齢〜7歳、6ヶ月齢以上、より好ましくは、9ヶ月齢以上のヒト小児である。いくつかの実施形態においては、哺乳動物は、7歳より上のヒト個人である。小児期早期においては、多くの個人が環境アレルゲンによる感作にまだ曝露されていないため、この期間はアレルギーの開始の可能性を予測するための最適な機会を提供すると考えられる。
【０３６７】
[0023]ヒトが約5歳よりも下である、段落22に記載の方法。
【０３６８】
[0024]ヒトが2歳よりも下である、段落23に記載の方法。
【０３６９】
[0025]アレルギーが、接触皮膚炎、慢性炎症性障害、アレルギー性アトピー障害、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、高IgE症候群、オーメン症候群、乾癬、花粉症及びアレルギー性鼻炎からなる群から選択される、段落18〜24のいずれか1つに記載の方法。
【０３７０】
[0026]哺乳動物におけるアレルギーを処置及び/又は防止するためのキットであって、
i)段落1〜17のいずれか1つに記載の組成物;及び
ii)段落18〜25のいずれか1つに記載の方法における使用のための説明書
を含む、前記キット。
【０３７１】
[0027]アレルギーに対する防御免疫を提供することができるヘリコバクター・ピロリ株を作成する方法であって、
(a)(i)哺乳動物の粘膜に定着することができない、及び/又は
(ii)cagAマイナス(cagA-)であり、場合により、VacA遺伝子の毒素原性s1及びm1対立遺伝子について陽性である、
単離されたヘリコバクター・ピロリ細胞を提供する工程;
(b)場合により、動物宿主を介して前記ヘリコバクター・ピロリ細胞を継代する工程;並びに
(c)場合により、前記ヘリコバクター・ピロリ細胞を不活化又は死滅する工程
を含む、方法。
【図１Ａ】
2019059770.tif 000008
【図１Ｂ】
2019059770.tif 000009
【図１Ｃ】
2019059770.tif 000010
【図２】
2019059770.tif 000011
【図３】
2019059770.tif 000012
【図４】
2019059770.tif 000013
【図５】
2019059770.tif 000014
【図６】
2019059770.tif 000015
【図７】
2019059770.tif 000016
【図８】
2019059770.tif 000017
【図９】
2019059770.tif 000018
【図１０】
2019059770.tif 000019
【図１１】
2019059770.tif 000020
【図１２】
2019059770.tif 000021
【図１３】
2019059770.tif 000022
【図１４】
2019059770.tif 000023
【図１５】
2019059770.tif 000024
【図１６】
2019059770.tif 000025
【図１７】
2019059770.tif 000026
【図１８】
2019059770.tif 000027
【図１９】
2019059770.tif 000028
【図２０】
2019059770.tif 000029
【図２１】
2019059770.tif 000030
【配列表】
2019059770000001.app
【外国語明細書】
2019059770000001.pdf