(57)【要約】      （修正有）【課題】ウナギの甲状腺刺激ホルモン（Ｔｈｙｒｏｉｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ＴＳＨ）を特異的に探知することができる抗体の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上を含むウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の甲状腺刺激ホルモン探知用ペプチドマーカを抗原として使用して製造され、ウナギのＴＳＨと特異的に結合する抗体。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上を含むウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の甲状腺刺激ホルモン（Ｔｈｙｒｏｉｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ＴＳＨ）探知用ペプチドマーカを抗原として使用して製造され、ウナギのＴＳＨと特異的に結合する抗体。
【請求項２】
前記抗体は、ウナギの濾胞刺激ホルモン（ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ｆｏｌｌｉｔｒｏｐｉｎ；ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ｌｕｔｒｏｐｉｎ；ＬＨ）、および性腺刺激ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ、ＧＴＨ）には結合せず、ウナギのＴＳＨに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体は、ポリクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗原は、キャリア蛋白質をさらに含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
前記キャリア蛋白質は、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）、ＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）、Ｔｇ（ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、ＴＴ（ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｏｉｄ）、ジフテリアトキソイド（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｏｉｄ、Ｔｄ）、およびＰＰＤ（ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）からなる群より選択された１種以上である、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項の抗体を含む、生物学的試料内ウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の甲状腺刺激ホルモン（Ｔｈｙｒｏｉｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ＴＳＨ）の特異的探知用組成物。
【請求項７】
前記生物学的試料は、ウナギのＦＳＨ、ＬＨおよびＧＴＨからなる群より選択された１種以上をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１から５のいずれか一項の抗体を生物学的試料と接触させる工程、および
前記試料内で抗原−抗体複合体の形成有無を探知する工程を含む、生物学的試料内ウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の甲状腺刺激ホルモン（Ｔｈｙｒｏｉｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ＴＳＨ）を特異的に探知する方法。
【請求項９】
前記抗原−抗体複合体の形成有無を探知する工程は、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、放射能免疫分析法（ＲＩＡ）、免疫蛍光法（ＩＦＡ）、ウェスタンブロッティングおよびフローサイトメトリー分析法のうちの少なくとも一つの方法によって行う、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上のペプチド、または
配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列および配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択された１種以上のポリヌクレオチドを含む、
ウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の甲状腺刺激ホルモン（Ｔｈｙｒｏｉｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ＴＳＨ）探知用マーカ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウナギの甲状腺刺激ホルモンを特異的に認識する抗体およびこれを用いた甲状腺刺激ホルモンを特異的に検出する方法、並びに検出用キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ウナギ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｅｌ）は、脊索動物門、硬骨魚類綱、ウナギ目、ウナギ科に属し、海と淡水習性を有する複雑な生活史を有する降河性魚類（ｃａｔａｄｒｏｍｏｕｓ  ｆｉｓｈ）である。ウナギは稚魚の時、海から河に移動し、移動する間に黄色（ｙｅｌｌｏｗ）から銀色（ｓｉｌｖｅｒ）ウナギへと形態的、生理的な変化を経て、河で６〜２０年間成長し、成長が終わったウナギは性成熟過程を経た後、海に再び移住し、移住する間に配偶子形成（ｇａｍｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）を完全になす。ウナギは極東産ウナギ、ニホンウナギ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｅｌ、Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）とも呼ばれ、日本と中国に広く生息している。ウナギは北方限界線として北海道、渤海湾沿岸（ｔｈｅ  ｇｕｌｆ  ｏｆ  Ｐｏｈａｉ）と遼河（Ｌｉａｏ  ｒｉｖｅｒ）まで分布生息しており、南方限界線として中国の海南島（Ｈａｉｎａｎ  ｉｓｌａｎｄ）と中国とベトナムの間にあるトンキン湾（ｔｈｅ  ｇｕｌｆ  ｏｆ  Ｔｏｎｋｉｎ）まで生息し、その他にも台湾、フィリピン、ヨーロッパなどに生息する。ウナギ成体は主に甲殻類、魚類、昆虫類を捕食し、回遊様相によって川ウナギ（ｒｉｖｅｒ  ｅｅｌｓ）、河口ウナギ（ｅｓｔｕａｒｉｎｅ  ｅｅｌｓ）、海ウナギ（ｓｅａ  ｅｅｌｓ）に大きく３部類に分けられる。
【０００３】
一般的な脊椎動物の脳下垂体糖蛋白質ホルモン（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ；ＧＰＨ）には甲状腺刺激ホルモン（Ｔｈｙｒｏｉｄ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ；ＴＳＨ）、濾胞刺激ホルモン（Ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ｆｏｌｌｉｔｒｏｐｉｎ；ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ｌｕｔｒｏｐｉｎ；ＬＨ）、性腺刺激ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ、ＧＴＨ）、絨毛性性腺刺激ホルモン（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ、ＣＧ）などがある。前記ホルモンは共通的に二つの互いに異なるサブユニット（ｓｕｂｕｎｉｔ）アルファ（−α）とベータ（−β）から構成され、同一種（ｓｐｅｃｉｅｓ）は同一のアルファサブユニットアミノ酸配列を有しており、ベータサブユニットの各ホルモン別に相異なる特異的な配列によって各ホルモンの特異的な活性および種特異性（ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を示す。アルファとベータサブユニットはそれぞれ異なる遺伝子によって形成され、生物学的活性を有するホルモン分子を形成するために前記アルファサブユニットとベータサブユニットは非共有結合（ｎｏｎ−ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｂｏｎｄｉｎｇ）で連結される。
【０００４】
甲状腺刺激ホルモン（Ｔｈｙｒｏｉｄ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｈｏｒｍｏｎｅ、ＴＳＨ）はサイロトロピンとも呼ばれ、ＴＳＨの合成と分泌は視床下部（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ）サイロトロピン分泌ホルモン（Ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｈｏｒｍｏｎｅ、ＴＲＨ）と負のフィードバック（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｆｅｅｄｂａｃｋ）でサイロトロピン（ＴＳＨ）、トリヨードチロニン（Ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎ、Ｔ３）、チロキシン（Ｔｈｙｒｏｘｉｎｅ、Ｔ４）によって調節され、これは視床下部−脳下垂体−甲状腺（Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ−Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ−Ｔｈｙｒｏｉｄ、ＨＰＴ）軸から構成される。
【０００５】
ＴＳＨはウナギの発達（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、成長（ｇｒｏｗｔｈ）、新陳代謝（ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）、行動（ｂｅｈａｖｉｏｒ）と繁殖（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）において重要な影響を及ぼす因子であり、遡河魚類（ａｎａｄｒｏｍｏｕｓ  ｆｉｓｈ）の移動、移住、脱皮、海適応などに関連があると知られている。特に、ＴＳＨは幼い魚類の体にグアニンを沈着させ、体を銀色化（ｂｏｄｙ  ｓｉｌｖｅｒｌｉｎｇ）させてシルバーウナギに変異させることと関連がある。アナゴ（ｃｏｎｇｅｒ  ｅｅｌ）の場合、ＴＳＨはレプトセファルス（ｌｅｐｔｏｃｅｐｈａｌｕｓ、葉形幼生）からシラスウナギ（ｅｌｖｅｒ、ウナギの幼魚）への脱皮を調節するのに重要な役割を果たすと知らされている。また、ウナギの視床下部−脳下垂体−甲状腺軸（ＨＰＴ  ａｘｉｓ）は繁殖とも密接な関連があり、甲状腺（ｔｈｙｒｏｉｄ  ｓｔａｔｕｓ）と生殖腺（ｇｏｎａｄａｌ  ｓｔａｔｕｓ）に一時的、瞬間的に重要な影響を及ぼし、硬骨魚類の場合、ＴＳＨの活性は生殖腺の初期発達の間に増加、維持され、産卵後には一般に減少すると知られている。
【０００６】
しかし、現在までウナギの生理内分泌研究、環境汚染などによる内分泌系障害物質による魚類生体内の変化は詳しく知られていない。これはウナギが河と海の両方で棲息する複雑なライフサイクルを有する降河性魚類であり、人工養殖の不完全性によってウナギの生体内分泌研究が容易ではないためである。特に、ウナギの幼虫脱皮、成長、発達などを調節するＴＳＨのみを特異的に検出するマーカに関しては現在まで知られているところがなく、これによってウナギにおいてＨＰＴ軸の機序に関しても明確に明らかになることはなかった。
【０００７】
一方、ウナギの人工養殖のために性腺刺激ホルモンを探知するマーカに関しては一部研究されたことがあるが、ＴＳＨはウナギの生殖機能に直接的な影響を及ぼさないと知られていて、前記性腺刺激ホルモンに比べて関連研究が微少であり、ＴＳＨホルモンの生産および確保、ＴＳＨ探知マーカ、抗体などの開発が不足しているのが実情である。
【０００８】
現在まで人工種苗養殖のために他種ホルモンの反復投与または環境調節実験と研究中に発生するウナギの生体内ホルモンの変化を判定する基準は大部分肉眼に依存してきたが、このような基準はウナギ個体および人ごとに異なって正確度が非常に落ちた。したがって、ウナギの生理内分泌の変化を明確に測定することができるマーカ、特にウナギの発達、成長、新陳代謝、行動および繁殖などに重要な影響を及ぼすＴＳＨホルモンを探知することができるマーカの開発が必要である。このようなＴＳＨホルモンマーカは環境汚染がウナギの生体内ＨＰＧ軸に及ぼす内分泌系障害を測定する生物学的指標として利用可能である。
【０００９】
従って、本発明は前記問題点を解決し、ウナギの成長、発達、性成熟、ウナギ捕獲後の健康生態確認または外部要因によるウナギの生理状態変化などを測定するために、ＴＳＨを特異的に探知することができるマーカを開発し、さらにこれを用いてウナギ試料のＴＳＨを探知し、ウナギの生理状態を測定することができる方法を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−１５３１１２８６号公報
【特許文献２】韓国登録特許第１０−１４９３９５７号公報
【特許文献３】韓国登録特許第１０−０７４２１１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は前述の従来技術の問題点を解決するために提案されたものであって、ウナギの甲状腺刺激ホルモン（Ｔｈｙｒｏｉｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ＴＳＨ）を特異的に探知することができる抗体を提供する。
【００１２】
本発明の一例は、配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上を含むＴＳＨ探知用ペプチドマーカを抗原として使用して製造され、ウナギのＴＳＨと特異的に結合する抗体を提供する。
また、本発明は、前記抗体を含む、生物学的試料内ウナギＴＳＨホルモンの特異的探知用組成物を提供する。
【００１３】
また、本発明は、前記抗体を生物学的試料と接触させて、抗原−抗体複合体形成を探知する工程を含む、生物学的試料内ウナギＴＳＨホルモンを特異的に探知する方法を提供する。
【００１４】
また、本発明の一例は、配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上のペプチド、または配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列および配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択された１種以上のポリヌクレオチドを含む、ウナギのＴＳＨ探知用マーカを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、ウナギの類似ホルモンは除いてウナギの甲状腺刺激ホルモン（Ｔｈｙｒｏｉｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ、ＴＳＨ）のみを特異的に認識、探知することができるマーカ抗原およびこれと結合する抗体に関するものであって、前記抗体を用いてウナギの生理状態、内分泌系変化を測定することができ、ウナギ完全養殖の実現に役立つ。以下、本発明をさらに詳しく説明する。
【００１６】
本発明は、下記表１の配列番号１（ＣＤＰＡＲＤＥＣＴＨＲ）および配列番号２（ＣＴＨＲＡＳＡＤＧＤＲ）のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上を含むウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）のＴＳＨ探知用ペプチドマーカを抗原として使用して製造され、ウナギのＴＳＨと特異的に認識する抗体を提供する。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
前記“ウナギＴＳＨ探知用ペプチドマーカ”とは、ウナギの他の性成熟ホルモン（ＬＨ、ＦＳＨ、ＧＴＨなど）および他魚種由来の性成熟ホルモンからウナギのＴＳＨのみを特異的に選抜することができるマーカを意味する。
【００１９】
前記“ペプチドマーカを抗原として使用して製造され、ウナギのＴＳＨを特異的に認識する抗体”とは、濾胞刺激ホルモン（Ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ｆｏｌｌｉｔｒｏｐｉｎ；ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ｌｕｔｒｏｐｉｎ；ＬＨ）、性腺刺激ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ、ＧＴＨ）には結合せず、ウナギのＴＳＨのみに特異的に結合する抗体であってもよい。
【００２０】
本発明の一例によれば、前記ＴＳＨ探知用ペプチドマーカ抗原はキャリア蛋白質を追加的に含んでもよく、前記キャリア蛋白質はＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）、ＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）、Ｔｇ（ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、ＴＴ（ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｏｉｄ）、ジフテリアトキソイド（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｏｉｄ；Ｔｄ）、およびＰＰＤ（ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）などからなる群より選択された１種以上であってもよく、例えば、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるマーカのＮ−末端にシステイン（Ｃｙｓ）を導入し、システインの−ＳＨ官能基とＮ−（７−ジメチルアミノ−４−メチルクマリニル）マレイミドを結合させ、キャリア蛋白質を結合させて製作した架橋ペプチドを免疫感作（ｉｍｍｕｎｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ）に用いることも可能である。
【００２１】
本発明の前記“抗体”とは、当該分野で公知された用語であって抗原性部位に対して指示される特異的な蛋白質分子を意味する。本発明の目的上、抗体は本発明の配列番号１（ＣＤＰＡＲＤＥＣＴＨＲＡ）および配列番号２（ＤＥＣＴＨＲＡＳＡＤＧＤＲＣ）のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上を含むウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）のＴＳＨ探知用ペプチドマーカに特異的に結合する抗体を意味し、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドマーカ（以下、第１マーカ）と配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドマーカ（以下、第２マーカ）の二つのマーカの両方に特異的に結合する抗体であってもよい。
【００２２】
本発明の抗体の形態は特に制限されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体または抗原結合性を有するものであればそれの一部も本発明の抗体に含まれ、全ての免疫グロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、Ｉｇ）抗体が含まれる。さらに、本発明の抗体にはヒト化抗体などの特殊抗体も含まれる。前記免疫グロブリン抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのクラスの中の最も普遍的な抗体であり、大部分血液や体液の全体Ｉｇの７５％を占めるＩｇＧであるのが好ましい。また、本発明の抗体の由来は特に制限しないが、マウス、ラット、ウサギ、鶏、昆虫細胞などを用いることができ、製作の便宜、大量生産を考慮してウサギ由来ポリクローナル抗体であるのが好ましい。
【００２３】
また、本発明で、抗体は前記ＴＳＨ−βアミノ酸配列の一部の第１マーカまたは第２マーカまたはこの二つのマーカの両方に特異的に結合する抗体、抗原結合断片またはアプタマーであってもよい。好ましくは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、さらに好ましくは体液の中で複雑且つ微細なホルモンの変化を感作することができ、正確にＴＳＨのみを検出することができるポリクローナル抗体であるのが好ましい。
本発明の一例は、前記抗体を含む、生物学的試料内ウナギＴＳＨホルモン特異的探知用組成物を提供する。
【００２４】
前記生物学的試料はＦＳＨ、ＬＨおよびＧＴＨからなる群より選択された１種以上を含むことができ、本発明の抗体を含む、生物学的試料内ウナギＴＳＨホルモン探知用組成物は、生物学的試料に含まれているＦＳＨ、ＬＨまたはＧＴＨとは結合せず、ＴＳＨに特異的に結合する。生物学的試料にＴＳＨが含まれていない場合、結合反応が起こらないことがある。
【００２５】
本発明の抗体の特徴は前述のとおりであり、前記抗体を含むＴＳＨホルモン探知用組成物の活用形態を特に限定しないが、キットの形態に実現されて提供されてもよい。
【００２６】
本発明のキットは、ＴＳＨホルモンを検出するためのものであって、抗体の免疫学的検出のために基質、適当な緩衝溶液、発色酵素または蛍光物質で標識された２次抗体、発色基質などを含んでもよい。前記基質はニトロセルロース膜、ポリビニル樹脂で合成された９６ウェルプレート、ポリスチレン樹脂で合成された９６ウェルプレートおよびガラスからなったスライドガラスなどが用いられてもよく、発色酵素はペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）が用いられてもよく、蛍光物質はＦＩＴＣ、ＲＩＴＣなどが用いられてもよく、発色基質液はＡＢＴＳ（２，２´−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））またはＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン）、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）が用いられてもよい。
【００２７】
本発明の一例は、前記抗体を生物学的試料と接触させて前記試料内で抗原−抗体複合体の形成有無を探知する工程を含む、生物学的試料内ウナギＴＳＨホルモンを探知する方法を提供する。
【００２８】
前記生物学的試料の特徴は前述のとおりであり、前記抗原−抗体複合体の形成は酵素免疫吸着法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）、例えば、直接ＥＬＩＳＡ（Ｄｉｒｅｃｔ  ＥＬＩＳＡ）、間接ＥＬＩＳＡ（ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ＥＬＩＳＡ）、競合ＥＬＩＳＡ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＥＬＩＳＡ）、サンドウィッチＥＬＩＳＡ（ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ）、放射能免疫分析法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）、免疫蛍光法（Ｉｍｍｕｎｏ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｅｓｔ、ＩＦＡ）、ウェスタンブロッティングおよびフローサイトメトリー分析法のうちの少なくとも一つ以上の方法で検出することができ、検出方法をこれに制限するのではない。前記分析方法を通じて、ＴＳＨホルモン蛋白質とこれに対する抗体の間の“抗原−抗体複合体”形成有無を判断して、試料内ＴＳＨの存在有無と含量を測定することができる。
【００２９】
本願で“抗原−抗体複合体”とはＴＳＨホルモン蛋白質とこれに特異的な抗体の結合物を意味し、抗原−抗体複合体の形成有無は検出ラベル（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｌａｂｅｌ）のシグナルを通じて測定可能である。このような検出ラベルは酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微小粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、レドックス（ｒｅｄｏｘ）分子および放射線同位元素からなる群より選択することができ、必ずしもこれに制限されるのではない。
【００３０】
一具体例として、ＴＳＨホルモン蛋白質とこれに対する抗体の間の抗原−抗体複合体測定は、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ法）を用いることができる。また、ＴＳＨホルモン蛋白質に対する一つ以上の抗体が基板上の定められた位置に配列され、高密度で固定化されている蛋白質チップを用いることもできる。
【００３１】
また、本発明は、前記ＴＳＨを特異的に認識する抗体を生物学的試料と接触させ、前記試料内で抗原−抗体複合体の形成有無を探知してウナギの生理状態を測定する工程を含む、ウナギの生理状態測定方法を提供することができる。
【００３２】
前記ウナギの生理状態とはＴＳＨホルモンによって影響を受ける全てのウナギ生体内機序を意味し、例えば、ウナギの成長程度、発達状態、新陳代謝、行動、繁殖などを含むことができる。ＴＳＨ抗原−抗体複合体の形成有無および定量的にＴＳＨの量を測定することによって、検体のＴＳＨ状態を正確に把握することができ、ＴＳＨが及ぼす検体ウナギの生理状態を把握可能である。
【００３３】
本発明の一例は、配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上のペプチド、または配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列および配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択された１種以上のポリヌクレオチドを含む、ウナギのＴＳＨ探知用マーカを提供する。
【００３４】
好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを全て含むウナギのＴＳＨ探知用マーカであってもよく、または配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列および配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を全て含むＴＳＨ探知用マーカを提供することができる。
【００３５】
前記配列番号１のアミノ酸から構成されたペプチドマーカ（以下、第１マーカ）または配列番号２のアミノ酸から構成されたペプチドマーカ（以下、第２マーカ）はＴＳＨ−βサブユニット（配列番号３）の一部であり、下記の実施例１で確認したように、前記二つのマーカはＴＳＨの遺伝子配列とウナギの他のホルモン（ＬＨ、ＦＳＨなど）との類似性を考慮してＴＳＨベータにおいてシグナルペプチド部位除外、Ｎ−グリコシル化（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）修飾位置を除外、疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）部分を除いて親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）部分を選択すると同時に、ウナギの他の性成熟ホルモン配列の相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を比較して最も有力な候補ペプチドを選抜したものである。本発明のペプチドマーカ抗原は、第１マーカおよび第２マーカからなる群より選択された１種以上を含んでもよいが、好ましくは第１マーカおよび第２マーカを全て含むことが適切である。
【００３６】
下記の実験例で確認したように、本発明の第１マーカおよび第２マーカからなる群より選択された１種以上を含むペプチドマーカは多様なホルモンが含まれている検体においてＴＳＨのみを特異的に検出することができ、前記ペプチドマーカを抗原として使用して製造された抗体は他のウナギホルモンとは結合せず、ただＴＳＨのみに特異的に抗原−抗体反応が起こるので、ウナギのＴＳＨ特異検出抗体として使用するのに適切である。
【００３７】
また、本発明は、前記ウナギのＴＳＨ探知用ペプチドマーカ（第１マーカおよび／または第２マーカ）または前記マーカをコードするポリヌクレオチドを検出できる製剤を含むウナギのＴＳＨ検出用組成物およびキットを提供し、ウナギの生理状態を判断するために、ウナギの生物学的試料から前記ウナギＴＳＨ探知用ペプチドマーカとこれをコードするポリヌクレオチドを検出して、ウナギＴＳＨのホルモンを探知する方法を提供する。
【００３８】
また、本発明は、前記配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列および配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択された１種以上のポリヌクレオチドを含む、ウナギのＴＳＨ探知用マーカを提供することができ、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列および配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を全て含むＴＳＨ探知用マーカを提供することができる。
【００３９】
前記“ポリヌクレオチドを検出できる製剤”は、生物学的試料内でＴＳＨをコードするポリヌクレオチドを検出するために用いることができる物質を意味する。具体的な一例として、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１マーカまたは配列番号２のアミノ酸配列を有する第２マーカをコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）、プローブ（ｐｒｏｂｅ）、アンチセンス核酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｓ）などであってもよい。
【００４０】
この時、相補的に結合するということは、所定の混成化またはアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）条件、好ましくは生理学的条件下でアンチセンス核酸がターゲットに選択的に混成化できる程度に十分に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）および完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）なことを全て含む意味を有し、好ましくは完全に相補的なことを意味する。
【００４１】
本発明で“蛋白質を検出できる製剤”は、試料内でＴＳＨ蛋白質を検出するために用いることができる物質を意味する。好ましく、前記ＴＳＨ蛋白質をターゲット（ｔａｒｇｅｔ）とする特定化合物または合成物質であってもよい。具体的な一例として、前記ＴＳＨ−βアミノ酸配列の一部の第１マーカまたは第２マーカまたはこの二つのマーカの両方に特異的な抗体、抗原結合断片またはアプタマーであってもよい。好ましくはモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、さらに好ましくは体液の中で複雑且つ微細なホルモンの変化を感作することができ、正確にＴＳＨのみを検出することができるポリクローナル抗体であってもよい。
【発明の効果】
【００４２】
本発明は、ウナギの甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に特異的に結合する抗体を生物学的試料と接触させ、抗原−抗体複合体が形成されるかを探知して、当該試料内にウナギ甲状腺刺激ホルモンの存在有無を容易に探知することができ、複合体形成程度によってウナギ甲状腺刺激ホルモンを定量的に分析可能であり、ウナギ生体内変化を容易に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】実施例１−１によって、ウナギＴＳＨ−βサブユニットのトランスメンブレン領域を分析した結果である。
【図２】実施例１−１によって、ウナギＴＳＨ−βサブユニットの信号配列（ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ、成熟蛋白質後に脱落する部分）部分分析結果を示したものである。
【図３】実施例１−１によって、ウナギＴＳＨ−βサブユニットの糖鎖修飾（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）部分分析結果を示したものである。
【図４】実施例１−１によって、ウナギＴＳＨ−βサブユニットの疎水性分析（ｈｙｄｒｏｐｈｔｈｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）後、一番目に予測された親水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）配列部分を示したものである。
【図５】実施例１−１によって、ウナギＴＳＨ−βサブユニットの疎水性分析（ｈｙｄｒｏｐｈｔｈｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）後、二番目に予測された親水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）配列部分を示したものである。
【図６】実施例１−２によって、ウナギＦＳＨ、ＬＨ、ＴＳＨβサブユニットのアミノ酸配列の相同性を比較したものであって、黒い部分は三種類のホルモンの全てに共通的に存在する配列であり、灰色部分は三種類のホルモンのうちの二種類のホルモンに共通的に存在する配列であり、赤いボックスで表示した部分はウナギＴＳＨ−βアミノ酸配列の中の抗体を生産するために使用した部分を表示したものである。
【図７】ウナギＴＳＨ抗体生産の全過程の模式図を示したものである。
【図８】実施例２によって、ＴＳＨ−βのＮ−末端から１０８−１１８番目の１１個のアミノ酸から構成されたペプチド抗原（配列番号１）およびウナギのＴＳＨ−βのＮ−末端から１１５−１２４番目の１１個のアミノ酸から構成されたペプチド抗原（配列番号２）の混合物をウサギに免疫した後に血液を採取して抗体価をＥＬＩＳＡを用いて分析したものであって、二回反復した結果を示す。
【図９】実施例２によって、ＴＳＨ−βのＮ−末端から１０８−１１８番目の１１個のアミノ酸から構成されたペプチド抗原（配列番号１）およびウナギのＴＳＨ−βのＮ−末端から１１５−１２４番目の１１個のアミノ酸から構成されたペプチド抗原（配列番号２）の混合物をウサギに免疫した後に得られたポリクローナル抗体の中のＩｇＧを精製した後、ＳＤＳ電気泳動した結果を示す。
【図１０】実験例１−１によって、蚕蛹から生産したＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβ、ＪｅＧＴＨαを対象にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥしてＣＢＢ染色した結果である。
【図１１】実験例１−２によって、蚕蛹から生産したＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβ、ＪｅＧＴＨαを対象にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ニトロセルロースメンブレンに移して、Ｈｉｓ抗体でウェスタンブロッティングした結果である。
【図１２】実験例１−３によって、蚕蛹から生産したＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβ、ＪｅＧＴＨαを対象にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ニトロセルロースメンブレンに移した後に実施例２で製造したウナギＴＳＨ−βペプチドに対するポリクローナル抗体でウェスタンブロッティングした結果である。
【図１３】実験例２によって、蚕蛹から生産したＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβを対象にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥしてニトロセルロースメンブレンに移した後、１：５，０００、１：１０，０００、１：２０，０００の比率で希釈した実施例２で製造したウナギＴＳＨ−βペプチドに対するポリクローナル抗体でウェスタンブロッティングした結果である。
【図１４】実験例３によって、蚕蛹から生産したＪｅＦＳＨ、ＪｅＬＨ、ＪｅＴＳＨ１．６μｇ混合後、ＪｅＴＳＨの含量を１．４、１．２、１．０、０．８、０．４、０．２、０μｇの順に減少させ他のホルモンは同量で混合した試料を対象にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ニトロセルロースメンブレンに移して、ウナギＴＳＨ−βペプチドに対する本発明のポリクローナル抗体でウェスタンブロッティングした結果である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
以下、実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。しかし、これら実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれら実施例によって限定されるのではない。
【実施例】
【００４５】
実施例１：ウナギのＴＳＨに特異的なマーカ選定
１−１：ＴＳＨ−βサブユニットの分析
ウナギＴＳＨ−βサブユニットの構造確認のために、トランスメンブレンおよび信号配列を検索し、蛋白質の親水性と疎水性をコンピュータプログラムを用いて分析した。具体的に、ウナギＴＳＨ−βサブユニット（配列番号３）においてトランスメンブレン（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ、ＴＭ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）領域、分泌信号配列（Ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＳＰ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）、糖鎖修飾（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ／）と疎水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ、ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ／）、親水性（ｈｙｄｏｐｈｉｌｉｃ、ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ／）部位を分析し、分析結果を図１乃至図５に示した。トランスメンブレン領域は図１に示し、分泌信号配列は図２に、糖鎖修飾部分を図３に、疎水性および親水性部分分析結果の一番目に予測された親水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）配列部分は図４に、二番目に予測された親水性配列部分は図５に示した。
【００４６】
図１乃至図５から分かるように、ウナギＴＳＨ−βサブユニットの構造においてトランスメンブレン（ＴＭ）領域は存在せず（図１）、分泌信号配列はＮ−末端から１−２１番目アミノ酸配列部分（配列番号４）が存在するのを確認し（図２）、Ｎ−末端から４３番目アミノ酸のＮ（Ｎ−Ｔ−Ｔ、アスパラギン酸（Ｎ）−トレオニン（Ｔ）−トレオニン（Ｔ）配列においてＮの位置）部分がＮ−糖鎖修飾されており（図３）、Ｎ−末端から１０１番目〜１３０番目まで総３０個のアミノ酸配列（配列番号５）が親水性の高い部分（図４）であって、そのうちのＣＤＰＡＲＤＥＣＴＨＲ（配列番号１）が親水性領域であり、１１１番目〜１４０番目まで総３０個のアミノ酸配列（ＡＲＤＥＣＴＨＲＡＳ  ＡＤＧＤＲＣＳＫＰＬ  ＬＬＨＭＨＡＹＰＧＱ−配列番号６）領域が二番目に確認した親水性の高い部分であって（図５）、そのうちのＣＴＨＲＡＳＡＤＧＤＲ（配列番号２）が親水性領域であるのを確認した。
【００４７】
１−２：ＴＳＨ−βサブユニットをＦＳＨ、ＬＨβサブユニットと比較分析
ウナギ脳下垂体糖蛋白質ホルモンのＦＳＨ−βサブユニット、ＬＨ−βサブユニット、およびＴＳＨ−βサブユニットのアミノ酸配列の相同性をｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ−ｂｉｎ／ｃｌｕｓｔａｌｗで多重配列アラインメント（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ、ＭＳＡ）方法を用いて比較分析した。
【００４８】
ＴＳＨとＬＨのホモロジースコア（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｓｃｏｒｅ）は２９、ＴＳＨとＦＳＨは２９と示され、具体的な三種類の糖蛋白質ホルモンのβサブユニット配列の相同性分析結果を図６に示した。図６において黒い色で表示した部分は三種類のホルモン全部に共通的に存在する配列を示し、灰色部分は三種類のホルモンのうちの二種類のホルモンに共通的に存在する配列であり、赤いボックスで表示した部分はウナギＴＳＨベータサブユニットの配列のうちのＴＳＨのみに存在するアミノ酸配列領域であって、本発明のポリクローナル抗体を生産するために用いたポリペプチド配列部分を表示したものである。
【００４９】
１−３：ＴＳＨ抗体製造用抗原ポリペプチドの選定
前記実施例１−１から得られた分泌信号配列、Ｎ−糖鎖修飾配列および疎水性領域に関する情報と、前記実施例１−２によってＴＳＨとＦＳＨ、ＬＨのβサブユニットのアミノ酸配列相同性分析結果から、アミノ酸配列相同性の低い配列を総合して、最終的にＴＳＨ−βサブユニットのＮ末端から１０８−１１８番目のアミノ酸配列部分（ＣＤＰＡＲＤＥＣＴＨＲ−配列番号１）と１１５−１２４番目アミノ酸配列部分（ＣＴＨＲＡＳＡＤＧＤＲ−配列番号２）をＴＳＨ−βポリクローナル抗体製造用マーカペプチドに選定した。
【００５０】
実施例２：マーカペプチドを用いたポリクローナル抗体製作
前記実施例１で選抜した配列番号１のアミノ酸から構成されたペプチドマーカ（以下、第１マーカ）および配列番号２のアミノ酸から構成されたペプチドマーカ（以下、第２マーカ）を混合しウサギに免疫化してウサギポリクローナル抗体を製造した。
【００５１】
より具体的に、前記第１マーカおよび第２マーカを混合してウサギの腹腔内に総３回注射してポリクローナル抗体を製造した。まず、２００μｇの精製されたマーカ抗原混合物に２μＬの１０％ＳＤＳを添加した後に２分間加熱し、２００μＬのコンプリートアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ´ｓ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｕｖａｎｔ、Ｓｉｇｍａ）を添加して超音波処理した。その後、ウサギの腹腔に１次に抗原を注入してから４−５週経過後に採血し、２次抗原を注入した。これから２週経過後に採血し、３次抗原を注入し、抗原をウサギに３次ブースティング（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）し、９週後に血液を採取した。その次に、採取した血液とＴＢＳＴバッファーを１：１００、１：１，０００、１：５，０００、１：１０，０００、１：５０，０００、１：１００，０００の比率で混合したウナギＴＳＨ探知用組成物を処理して１時間室温で反応させた。その後、ＴＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ基質を用いて４５０ｎｍ波長で（Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ  ｖｉｃｔｏｒ  Ｘ３）で測定して直接ＥＬＩＳＡ（ｄｉｒｅｃｔ  ＥＬＩＳＡ）分析を行った（図８）。
【００５２】
図８から分かるように、ＥＬＩＳＡ分析の結果、血液とＴＢＳＴバッファーを１：１００，０００の比率以上に混合したウナギＪｅＴＳＨ探知用組成物を処理した時にＯＤ値が２．０と測定され、以後免疫反応活性が高いことを確認した。二匹のウサギに免疫したサンプルは全て類似の傾向を示した。
【００５３】
追加的に、前記で生産したＪｅＴＳＨ−βサブユニットを特異的に認識するポリクローナル抗体の中のＩｇＧを精製した後にＳＤＳ電気泳動し、その結果を図９に示した。図９の４−６番レーンは前記精製したポリクローナル抗体をそれぞれ０．５、１、２μｇローディングしたものであり、１、２番レーンは濃度確認のためにＢＧＧ（ｂｏｖｉｎ  ｇａｍｍａ  ｇｌｏｂｕｌｉｎ）１、２μｇをそれぞれローディングしたものであり、３番は蛋白質サイズマーカである。矢印で提示した部分が本発明抗体の重鎖（Ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）を示す。
【００５４】
実験例１：抗体のＴＳＨ特異性評価
１−１．ＣＢＢ染色結果
韓国登録特許１０−１４９３９５７号公報に開示されたカイコの幼虫および蛹発現システムと実質的に同様な方法を用いて製造し分離したＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβ、ＪｅＧＴＨαを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに電気泳動し、クマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ、ＣＢＢ）染色を行い、その結果を図１０に示した。
【００５５】
具体的に、それぞれのポリペプチドホルモンを製造するために、ホルモンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（ＪｅＦＳＨ：配列番号７、ＪｅＦＳＨβ：配列番号８、ＪｅＬＨ：配列番号９、ＪｅＬＨβ：配列番号１０、ＪｅＴＳＨ：配列番号１１、ＪｅＴＳＨβ：配列番号３、ＪｅＧＴＨα：配列番号１２）を市販されるバキュロウイルス転移ベクター（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ）に製造会社から提供されるプロトコルに沿ってクローニングして組換え転移ベクターを製造し、このように製造した組換え転移ベクターを宿主細胞（ＢｍＤＨ１０Ｂａｃコンフィデント細胞）に形質転換させて組換えバクミドを製造した。形成されたバクミドを通常のプラスミド抽出法を用いて細胞から分離した。分離した組換えバクミドをカイコ（ＢｍＮ）細胞内に形質感染させ、形質感染された昆虫細胞から組換えバキュロウイルスを分離して、これをカイコの幼虫または蛹生体に注入し形質転換した後にそれぞれのＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβ、ＪｅＧＴＨα蛋白質を発現させる。その次に、前記カイコの幼虫または蛹の細胞または体液からそれぞれの発現させた蛋白質を通常の方法を用いて分離、精製した。
【００５６】
図１０から分かるように、ＣＢＢ染色の結果、ＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβ、ＪｅＧＴＨαはそれぞれ約３３、１９、３３、１８、３３、１８、１８ｋＤａで蛋白質のバンドが現れ、これはそれぞれの塩基配列から予想されたサイズより約７−８ｋＤａ高い数値であって、糖鎖修飾による結果である。
【００５７】
【表２】
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【００５８】
１−２．Ｈｉｓ抗体のウェスタンブロット分析
実験例１−１と同様な方法で合成して分離したＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβ、ＪｅＧＴＨαをＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ニトロセルロースメンブレンに移してＨｉｓ抗体でウェスタンブロッティングを行い、その結果を図１１に示した。
【００５９】
図１１から分かるように、Ｈｉｓ抗体を処理した時、Ｈｉｓ抗体は全てのホルモン蛋白質と結合するのを確認し、さらにＣＢＢ染色から確認されたタンパク質バンドと同様に約３３、１８ｋＤａで確認され、それぞれの組換えタンパク質全部が検出された。
【００６０】
１−３．本発明のポリクローナル抗体のウェスタンブロット分析
実験例１−１と同様な方法で合成して分離したＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβ、ＪｅＧＴＨαをＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ニトロセルロースメンブレンに移して前記実施例２で製造した本発明の配列番号１のポリペプチドと配列番号２のポリペプチド混合物をウサギに注射して得られたポリクローナル抗体でウェスタンブロッティングを行い、その結果を図１２に示した。
【００６１】
図１２から分かるように、本発明のポリクローナル抗体はただＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβと特異的に結合し、ウナギの脳下垂体ホルモンの共通配列のＧＴＨαはもちろん（８レーン）、ＪｅＦＳＨとＪｅＬＨの特異配列（２、３、４、５レーン）にもバンドが現れず、これから本発明のポリクローナル抗体はＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＧＴＨとは結合せず、ＪｅＴＳＨのみを特異的に認識して選別することができる抗体であるのを確認した。従って、試料内ＪｅＴＳＨ検出において本発明のポリクローナル抗体が優れたＪｅＴＳＨ検出特異性を有するのが分かった。
【００６２】
実験例２：抗体の検出感度測定
実験例１−１と同様な方法で合成して分離したＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβをＳＤＳ−ＰＡＧＥし、ニトロセルロースメンブレンに移した後、前記実施例２で製造した本発明の配列番号１のポリペプチドと配列番号２のポリペプチド混合物をウサギに注射して得られたポリクローナル抗体を１：５，０００、１：１０，０００または１：２０，０００の比率で希釈した後にウェスタンブロッティングを行い、その結果を図１３に示した。
【００６３】
図１３に示されているように、ポリクローナル抗体を１：２０，０００の比率で希釈して処理した時にもバンドが現れ、本発明ポリクローナル抗体のＴＳＨβ特異性を確認することができた。さらに、Ｈｉｓ抗体を処理した場合と比較してマイナーバンドの認識なくＴＳＨのみを明確に検出されるのを確認した。
【００６４】
実験例３：抗体を用いた試料中のＪｅＴＳＨ検出
ウナギの血液には多様なホルモンが混合されており、ウナギの血液と類似な環境で本願発明ポリクローナル抗体のＪｅＴＳＨの検出特異性を確認した。ウナギの血液と類似な環境をセッティングするために、実験例１−１と同様な方法で合成して分離したＪｅＴＳＨ、ＪｅＦＳＨ、およびＪｅＬＨをそれぞれ１．６μｇずつ混合した試料、その次にそれぞれの混合量を０．２μｇずつ減少させて（１．６、１．４、１．２、１．０、０．８、０．６、０．４、０．２、０）混合した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ニトロセルロースメンブレンに移し、前記実施例２で製造した本発明のポリクローナル抗体を処理してウェスタンブロッティングを行い、その結果を図１４に示した。
【００６５】
図１４に示されているように、ＪｅＦＳＨ、ＪｅＬＨと混合された状態でＪｅＦＳＨ、ＪｅＬＨ認識なくＪｅＴＳＨのみが投与量に比例してバンドの強度が減少するのを確認することができ、本発明のポリクローナル抗体がＪｅＴＳＨに特異的に結合するのが分かった。また、競争法（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）を通じて本願のポリクローナル抗体を用いる場合、ホルモンが混合された状態の検体でもＪｅＴＳＨのみを特異的に検出することができるのが分かった。
【配列表フリーテキスト】
【００６６】
配列番号１：JeTSHβ  N'108-118番目アミノ酸配列
配列番号２：JeTSHβ  N'115-124番目アミノ酸配列
配列番号３：JeTSHβ  Fullアミノ酸配列
配列番号４：JeTSH-β  分泌信号配列
配列番号５：N'1-21番目アミノ酸配列
配列番号６：JeTSH-β親水性部分1
配列番号７：JeTSH-β親水性部分2
配列番号８：JeFSHのポリペプチド配列
配列番号９：JeFSHβのポリペプチド配列
配列番号１０：JeLHのポリペプチド配列
配列番号１１：JeLHβのポリペプチド配列
配列番号１２：JeTSHのポリペプチド配列
配列番号１３：JeGTHαのポリペプチド配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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