(57)【要約】      （修正有）【課題】抗血栓性と内皮形成能を共に備え、臨床で長期間の使用に耐え得る程度に長期開存を可能にした人工血管を提供する。【解決手段】単糸繊度が０．０３ｄｔｅｘ〜０．３ｄｔｅｘのフィラメントを含み、かつ、各緯糸の織密度が８０本／２．５４ｃｍ〜２００本／２．５４ｃｍである筒状織物と、筒状織物の内表面に形成された、フィブリンとポリカチオンとが共有結合した複合体を含むフィブリン層及びフィブリンとイオン結合したアルブミンを含むアルブミン層を有する抗血栓層を備え、アルブミン層の厚みは、５μｍ〜５０μｍである、人工血管。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単糸繊度が０．０３ｄｔｅｘ〜０．３ｄｔｅｘのフィラメントを含み、かつ、各緯糸の織密度が８０本／２．５４ｃｍ〜２００本／２．５４ｃｍである筒状織物と、
前記筒状織物の内表面に形成された、フィブリンとポリカチオンとが共有結合した複合体を含むフィブリン層及び前記フィブリンとイオン結合したアルブミンを含むアルブミン層を有する抗血栓層を備え、
前記アルブミン層の厚みは、５μｍ〜５０μｍである、人工血管。
【請求項２】
前記アルブミン層の単位面積あたりのアルブミン量は、１０μｇ／ｃｍ２〜２００μｇ／ｃｍ２である、請求項１記載の人工血管。
【請求項３】
前記フィブリン層の単位面積あたりのフィブリン量は、１０μｇ／ｃｍ２〜２００μｇ／ｃｍ２である、請求項１又は２記載の人工血管。
【請求項４】
前記フィブリン層は、Ｄ−ダイマーを含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の人工血管。
【請求項５】
単糸繊度が０．０３ｄｔｅｘ〜０．３ｄｔｅｘのフィラメントを含み、かつ、各緯糸の織密度が８０本／２．５４ｃｍ〜２００本／２．５４ｃｍである筒状織物に、フィブリノーゲンとポリカチオンが共有結合した複合体を浸透させる浸透工程と、
トロンビンを加えて前記複合体中のフィブリノーゲンを分解し、前記筒状織物の内表面にフィブリンとポリカチオンとが共有結合した複合体を形成させる分解工程と、
アルブミンを加えて、前記複合体中のポリカチオンに前記アルブミンをイオン結合させる結合工程と、
を備える、人工血管の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工血管に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化やメタボリックシンドロームの人口増加によって、動脈硬化を煩う患者の数が増加している。動脈硬化は動脈壁の異常であり、血液の高血糖状態や高脂質状態が血管壁を変性させ、血管壁が脆弱になったり、肥厚したり、あるいは石灰化して硬く脆くなる。このような血管の変性は体中の血管のいたる所で起こるが、特に末梢の血管ではその影響が著しい。
【０００３】
変性した血管の治療には、従来からカテーテルを使ったバルーン拡張術やステント留置術等の低侵襲な血管内治療が行われている。また、別の治療法としては、損傷した血管を自己の血管又は人工血管で置換する外科手術が行われている。
【０００４】
しかしながら、人工血管を留置した際に生体はこれを異物として認識し、人工血管の血液と接触する面では血液凝固反応が進行して血栓が形成される。また、生体の血管は血液と接触する面に血管内皮細胞を有する内膜があり、血栓形成を阻害する役割を担っているが、留置された人工血管でも、血管内皮細胞が人工血管の血液と接触する面を被覆して内膜を形成する。しかしながら、この内膜が、内皮細胞に被覆されるまでの間、人工血管は異物として認識されるため、内膜が形成されるまで血栓の形成を防ぐ手段が必要となる。特に、細径の人工血管が使用される部位は血流量が少ないため血栓が沈着しやすく、少量の血栓でも血管を塞ぎ易い。細径の人工血管は長期的な成績が良好でなく臨床において使用できるものが無いのが現状である。
【０００５】
これらの問題を解決するため、従来から早期の内膜形成と抗血栓性の付与が、人工血管の開発において重要なポイントであった。
【０００６】
内膜形成を促進する方法として、とりわけ１０ミクロン未満の極細繊維を含有させた場合には、極細繊維のサイズあるいは繊維間隙のサイズが細胞の増殖や浸潤に適していることが知られており、人工血管そのものの構造素材としてポリエステル等の繊維の織物、編物あるいは不織布が使用されてきた。また、コラーゲンやフィブリン等の細胞の接着因子、血管内皮細胞増殖因子等の増殖因子あるいは誘導因子を人工血管に担持させる方法（特許文献１及び２）も試みられてきた。
【０００７】
一方、人工血管に抗血栓性を付与する方法としては、従来からヘパリンを担持する方法が行われてきた。また、血液中に含まれるアルブミンも血液凝固を抑制する働きがあることから（非特許文献１）、アルブミンを血液と接触する面に被覆した人工血管も知られている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第３０１４３２５号公報
【特許文献２】特開平１０−１３７３３４号公報
【特許文献３】特許第３５７３５５４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】今井庸二、人工臓器、１９８３年、第１２巻、第６号、第９６３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、特許文献１及び２に記載の人工血管のように、細胞接着を促す因子を含む人工血管は血小板や白血球の接着も同時に促進してしまうため、生体血管に移植して血液を流すと、人工血管の血液と接触する面で血栓形成反応が起こり、特に小口径の人工血管においては短期間で閉塞が起こった。
【００１１】
非特許文献１に記載されるように、アルブミンの抗血栓性が発揮されるためにはアルブミンが非変性状態で材料表面に存在している必要があるが、特許文献３に記載の方法のようにアルブミン吸着後に加熱するとアルブミンが変性してしまい、抗血栓性が発揮できず血栓形成により人工血管が閉塞するという問題がある。さらに、血液と接触する面をアルブミンで被覆した場合には、抗血栓性には優れるものの、アルブミンには血管内皮細胞、線維芽細胞、血管平滑筋細胞あるいはそれらの細胞の前駆細胞を接着する性質がないため、長期にわたって安定した内皮形成が起こらず閉塞するという問題がある。また特許文献３ではアルブミンをエラスチンのバインダーとして使用しているに過ぎず、アルブミンの抗血栓性は発揮されない。
【００１２】
このように、従来の技術を使ったとしても、従来の人工血管は、移植直後に血液と接触することによって発生する急性期の血栓形成を抑えるだけの抗血栓性と、長期にわたって血栓形成を抑制するための細胞群を接着、誘導するための細胞親和性との両立が達成されておらず、特に、臨床で長期間の使用に耐えうる細径の人工血管は未だに世の中に無い。
【００１３】
そこで本発明は、上記課題を解決することで、抗血栓性と内皮形成能を共に備え、臨床で長期間の使用に耐え得る程度に長期開存を可能にした人工血管を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の発明者等は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、以下の（１）〜（５）の人工血管を見出した。
（１）  単糸繊度が０．０３ｄｔｅｘ〜０．３ｄｔｅｘのフィラメントを含み、かつ、各緯糸の織密度が８０本／２．５４ｃｍ〜２００本／２．５４ｃｍである筒状織物と、上記筒状織物の内表面に形成された、フィブリンとポリカチオンとが共有結合した複合体を含むフィブリン層及び上記フィブリンとイオン結合したアルブミンを含むアルブミン層を有する抗血栓層を備え、上記アルブミン層の厚みは、５μｍ〜５０μｍである、人工血管。
（２）  上記アルブミン層の単位面積あたりのアルブミン量は、１０μｇ／ｃｍ２〜２００μｇ／ｃｍ２である、（１）記載の人工血管。
（３）  上記フィブリン層の単位面積あたりのフィブリン量は、１０μｇ／ｃｍ２〜２００μｇ／ｃｍ２である、（１）又は（２）記載の人工血管。
（４）  上記フィブリン層は、Ｄ−ダイマーを含む、（１）〜（３）のいずれか記載の人工血管。
（５）  単糸繊度が０．０３ｄｔｅｘ〜０．３ｄｔｅｘのフィラメントを含み、かつ、各緯糸の織密度が８０本／２．５４ｃｍ〜２００本／２．５４ｃｍである筒状織物に、フィブリノーゲンとポリカチオンが共有結合した複合体を浸透させる浸透工程と、トロンビンを加えて上記複合体中のフィブリノーゲンを分解し、上記筒状織物の内表面にフィブリンとポリカチオンとが共有結合した複合体を形成させる分解工程と、アルブミンを加えて、上記複合体中のポリカチオンに上記アルブミンをイオン結合させる結合工程と、を備える、人工血管の製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、アルブミンとフィブリンを筒状織物の内表面に担持させることで抗血栓性と内皮形成能を共に持たせることが出来、また、フィブリンに共有結合させたポリカチオンにアルブミンをイオン結合させることにより、ポリカチオンの溶出を抑えつつ、アルブミンを非変性状態のまま、筒状織物の内表面に適切な厚みで配置することができるため、急性期には優れた抗血栓性を発揮し、その後速やかに内皮形成が起こり、長期的に抗血栓性を発揮する人工血管を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の人工血管は、単糸繊度が０．０３ｄｔｅｘ〜０．３ｄｔｅｘのフィラメントを含み、かつ、各緯糸の織密度が８０本／２．５４ｃｍ〜２００本／２．５４ｃｍである筒状織物と、上記筒状織物の内表面に形成された、フィブリンとポリカチオンとが共有結合した複合体を含むフィブリン層及び上記フィブリンとイオン結合したアルブミンを含むアルブミン層を有する抗血栓層を備え、上記アルブミン層の厚みは、５μｍ〜５０μｍであることを特徴としている。
【００１７】
上記アルブミンは、ヒト由来アルブミンであることが好ましく、アルブミン由来のペプチド、オリゴペプチド又はポリペプチドが含まれていても良い。
【００１８】
上記アルブミンは、フィブリンとポリカチオンの複合体に含まれるポリカチオンとイオン結合をしている。これにより、人工血管は、筒状織物の内表面にアルブミンを含むアルブミン層を有する。このアルブミン層については、ＮａＣｌ（１ｍｏｌ／ｌ）等の高濃度の塩溶液やＳＤＳ等の界面活性剤を用いて、上記人工血管からアルブミンを抽出し、抽出液中のアルブミン濃度をビシンコニン酸（ＢＣＡ）法等の方法で測定した場合に抽出液中にアルブミンが検出されることで検証できる。
【００１９】
アルブミン層における単位面積あたりのアルブミン量は、十分な抗血栓性を発揮しつつ、フィブリンの持つ細胞を接着させる機能を阻害しないようにするためには、１０μｇ／ｃｍ２〜２００μｇ／ｃｍ２であることが好ましい。ここで言う単位面積とは、人工血管を構成する筒状織物を単純な筒状の平面体と見なした場合の表面の単位面積を意味し、筒状織物を構成する繊維の表面の単位面積という意味ではない。アルブミン層における単位面積あたりのアルブミン量は、人工血管中のアルブミン層を１辺の長さが０．５ｃｍの正方形のシートにカットし、１重量％ＳＤＳを３００μＬ添加して３７℃で２４時間振とうしながら抽出し、抽出液中のアルブミン量をアルブミンＥＬＩＳＡキット（Ａｌｂｕｍｉｎ，Ｈｕｍａｎ，ＥＬＩＳＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｅｔ；ＢＥＴＨＹＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で定量し、得られたアルブミン量（μｇ）をシートの面積である０．０２５ｃｍ２で除して算出する。
【００２０】
また、アルブミン層の厚みは、５μｍ〜５０μｍが好ましい。アルブミン層の厚みは、以下の方法により測定することができる。人工血管を１０容量％中性緩衝ホルマリン溶液で固定化した後、長軸方向に分断した断片をパラフィンに包埋し、ミクロトームを用いて厚さ５μｍに薄切し、切片を作製する（病理組織標本の作り方第６版、慶應義塾大学医学部病理学教室著、医学書院、１９８６）。作製した切片を抗ウシアルブミン抗体及びＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  ｋｉｔ（ベクター社製）を用い免疫組織化学を行う。染色した切片につき、顕微鏡下で人工血管の断面の画像を倍率１００倍にて撮影し、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪ（アメリカ国立衛生研究所製）を用いて、画像メニューから補正サブメニューを選択し、閾値を設定した後、分析メニューから茶色に染色されたアルブミン陽性部分を抽出する。閾値は色相：２０〜３５、飽和度：５０〜２５５、明るさ：１５０〜２５５に設定する。抽出された部分をアルブミン層とする。アルブミン層の両端にそれぞれ直線を引き、片端の直線上の任意の１点からもう一方の端に垂線を引いたときの垂線の長さをＩｍａｇｅＪで計測する。異なる１０箇所について計測し、平均値を求め、これをアルブミン層の厚みとする。
【００２１】
上記アルブミンは、十分な抗血栓性を発揮するために非変性状態であることが好ましい。ここでいう非変性状態とは、例えばポリカチオンなどの他の物質との共有結合による構造の変化が起こっていない状態、疎水性相互作用による吸着による構造の変化が起こっていない状態、熱や酸、アルカリ、界面活性剤による構造の変化が起こっていない状態を指す。
【００２２】
上記フィブリンはヒト由来フィブリンであることが好ましく、フィブリン由来のペプチド、オリゴペプチド又はポリペプチドが含まれていても良い。とりわけ、ウロキナーゼやプラスミン等の、血栓を溶解する線溶系酵素によって分解を受けたフィブリンが含まれていることが好ましい。これらの酵素によってフィブリンが分解を受けるとフィブリンの分解物として、Ｄ−ダイマーと呼ばれるポリペプチドが産生される。一方、生体内で開存している人工血管の内表面に吸着されたフィブリン表面におけるプラスミンの存在が報告されており、プラスミンによりフィブリンが分解されて産生されたＤ−ダイマーを含むフィブリンは、抗血栓性の発揮に関与している可能性がある。そのため、フィブリン層は、Ｄ−ダイマーを含むことが好ましい。
【００２３】
上記ポリカチオンは特に限定されないが、ポリアルキレンイミンを用いることが好ましく、ポリエチレンイミン（以下、「ＰＥＩ」）を用いることがより好ましい。上記ポリカチオンは、カチオン性を有する化合物のため、細胞毒性等の生体作用を発現する可能性があり、血液等の体液中に溶出することは好ましくない。そのため、上記ポリカチオンは、フィブリンと共有結合し複合体を形成することで、人工血管からの溶出を防止している。さらに、アルブミンはアニオン性を有する化合物のため、上記ポリカチオンとイオン結合することができる。
【００２４】
ここで、共有結合とは、原子同士で互いの電子を共有することによって生じる化学結合を指す。共有結合の種類は、限定されるものではないが、例えば、アミン結合、アジド結合、アミド結合及びイミン結合等が挙げられる。その中でも特に共有結合の形成しやすさや結合後の安定性等の観点からアミド結合がより好ましい。
【００２５】
フィブリンにポリカチオンを共有結合させる方法は特に限定されないが、フィブリンの前駆体であるフィブリノーゲンにポリカチオンを共有結合させておき、続いてトロンビンやその他化合物を反応させてフィブリンを生じさせる方法が、フィブリンを形成した際にもポリカチオンが解離しないため、好ましい。これ以外の方法として、市販のフィブリンとポリカチオンとを縮合剤の存在下で共有結合させてもよいし、市販のフィブリンにポリカチオンを吸着させてもよい。
【００２６】
フィブリンとポリカチオンが共有結合した複合体は、筒状織物に含まれている。上記複合体の位置は、筒状織物の内部、内表面及び外表面のどこに含まれていてもよく、特に限定されないが、上記複合体が人工血管の繊維間に入り込み、上記複合体をより強固に織物に付着させることができることから、筒状織物の経糸と緯糸の間であることが好ましい。また、筒状織物の内部に含まれるフィブリンは、人工血管の生体への移植後、人工血管の外表面から筒状織物の内部に向けて移入する線維芽細胞等の細胞成分の足場となることで、人工血管の内表面に形成される血管内皮細胞の足場を提供することもできる。一方、フィブリンが人工血管の内表面の近傍に存在する場合、フィブリンが血管内皮細胞の足場となることができ、血管内皮細胞が剥離せず、人工血管の内表面に安定に生着することができる。さらにフィブリンに共有結合されたポリカチオンにアルブミンが結合することにより、人工血管の内表面にフィブリンとアルブミンの両方を配置することが可能となる。
【００２７】
フィブリンとポリカチオンが共有結合した複合体を含むフィブリン層の単位面積あたりのフィブリン量は、細胞接着性を十分に発揮しつつ、血小板付着を防ぐためには、１０μｇ／ｃｍ２〜２００μｇ／ｃｍ２であることが好ましい。フィブリン層における単位面積あたりのフィブリン量は、人工血管中のフィブリン層を、１辺の長さが０．５ｃｍの正方形のシートにカットし、１％ＳＤＳを３００μＬ添加して３７℃で２４時間振とうしながら抽出し、抽出液中のフィブリノーゲン濃度を凝固時間測定法にて定量してフィブリン量（μｇ）とし、得られたフィブリン量（μｇ）をシートの面積である０．０２５ｃｍ２で除して算出する。
【００２８】
抗血栓層とは、上記筒状織物の内表面に形成された、上記のフィブリン層及びフィブリン層を備えた層を指す。この抗血栓層を備えることで、アルブミンとフィブリンを筒状織物の内表面に担持させ、抗血栓性と内皮形成能を人工血管に持たせることが可能となる。
【００２９】
上記筒状織物を構成する素材は特に限定されず、ポリエステル、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアミド及びナイロン等が例示されるが、生体内で安定であり、様々な加工ができるという点でポリエステルが好ましく用いられる。特に、ポリエチレンテレフタレートは繊維に加工することが可能であり、アルブミンやフィブリンの付着性も高く、人工血管素材としての実績もあるため好ましく用いられる。
【００３０】
上記筒状織物は、細胞が最も接着しやすいサイズや配向性を備えているという点で、単糸繊度が０．０３ｄｔｅｘ〜０．３ｄｔｅｘのマルチフィラメントを含む。ここで、単糸繊度とは、ＪＩＳ  Ｌ  １０１（２０１０）８．３．１  Ａ法にしたがって、所定荷重の０．０４５ｃＮ／ｄｔｅｘで正量繊度を測定した数値を総繊度とし、それを単繊維数で除して算出した数値を指す。
【００３１】
上記筒状織物は、織密度が高すぎると人工血管が機械的に硬くなり、周囲の組織に追従して自由に動けなくなってしまうだけでなく、細胞が繊維間隙に浸潤しにくくなって人工血管が安定化しない。一方、織密度が低すぎると、人工血管の機械強度が弱くなるだけでなく、繊維間隙が広すぎて、侵入する細胞や組織によって繊維どうしを橋渡しできなくなる。従って、筒状織物の各緯糸の織密度は、８０本／２．５４ｃｍ〜２００本／２．５４ｃｍであることが好ましい。
【００３２】
織密度（本／２．５４ｃｍ）は、ＪＩＳ  Ｌ  １０９６：２０１０  ８．６．１に基づき測定した。試料を平らな台上に置き、不自然なしわや張力を除いた。試料中の異なる５カ所について、０．５ｃｍ間の経糸及び緯糸の本数を数え、それぞれの平均値を算出し、２．５４ｃｍ当たりの本数に換算した。
【００３３】
上記人工血管の製造方法は、単糸繊度が０．０３ｄｔｅｘ〜０．３ｄｔｅｘのマイクロファイバー・マルチフィラメントを含み、かつ、各緯糸の織密度が８０本／２．５４ｃｍ〜２００本／２．５４ｃｍである、筒状織物に、フィブリノーゲンとポリカチオンが共有結合した複合体を浸透させる工程と、トロンビンを加えて、上記複合体中のフィブリノーゲンを分解しフィブリンを形成させる工程と、アルブミンを加えて、上記複合体中のポリカチオンにアルブミンをイオン結合させる工程を有する。
【００３４】
上記方法により、人工血管の内表面に配置されたアルブミンが人工血管を移植した直後の急性期血栓形成を抑える抗血栓性に寄与し、人工血管の内部に配置されたフィブリンが長期間、血管内皮細胞を含む細胞群を接着及び誘導するための細胞親和性に寄与することから、抗血栓性と細胞親和性を両立した人工血管が提供される。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例及び比較例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３６】
（実施例１）
製織工程において、下記の経糸（経糸Ａ及びＢ）並びに緯糸（緯糸Ｃ及びＤ）を使用した。
経糸Ａ（海島複合繊維）：ポリエチレンテレフタレート繊維、６６ｄｔｅｘ、９フィラメント（脱海処理後：５２．８ｄｔｅｘ、６３０フィラメント）
経糸Ｂ（溶解糸）：５−ナトリウムスルホイソフタル酸を共重合した易アルカリ溶解性のポリエステル繊維、８４ｄｔｅｘ、２４フィラメント
緯糸Ｃ（内層）（海島複合繊維）：ポリエチレンテレフタレート繊維、６６ｄｔｅｘ、９フィラメント（脱海処理後：５２．８ｄｔｅｘ、６３０フィラメント）
緯糸Ｄ（外層）：ポリエチレンテレフタレート繊維、５６ｄｔｅｘ、１８フィラメント
【００３７】
そして、製織時において、ジャガードシャトル織機を用いて、経糸Ｂの張力を０．９ｃＮ／ｄｔｅｘ、経糸Ａの張力を０．１ｃＮ／ｄｔｅｘとして、経糸Ａ（後加工後の織密度が２０１本／２．５４ｃｍ）、緯糸Ｃ（後加工後の織密度が１２１本／２．５４ｃｍ）、緯糸Ｄ（後加工後の織密度が１２１本／２．５４ｃｍ）となる、内径３ｍｍの筒状織物を製織した。なお、経糸Ａと経糸Ｂの配置は、経糸Ａ３本に対して経糸Ｂ１本の比率で配置した。また、経糸Ｂは、内層に位置する緯糸Ｃと外層に位置する緯糸Ｄの間に配置した。
次に、下記の工程により、後加工を行った。
（ａ）湯洗工程
筒状織物を９８℃のお湯に２０分浸漬し、筒状織物を湯洗した。
（ｂ）プレ熱セット工程
外径２．８ｍｍの丸棒（材質：ＳＵＳ）を筒状織物の内腔に挿入し、両端を針金で固定した。筒状織物及び丸棒をオーブンに入れ、丸棒に取り付けた温度計が１８０℃であることを確認してから５分間加熱することで、プレ熱セットを行った。
（ｃ）脱海処理工程
経糸Ａ及び緯糸Ｃの脱海処理を行うとともに、経糸Ｂの溶解除去を行うため、（ｃ−１）酸処理工程及び（ｃ−２）アルカリ処理工程を行った。
（ｃ−１）酸処理工程
実施例１では、酸としてマレイン酸を使用した。筒状織物を０．２重量％のマレイン酸水溶液に浸漬し、１３０℃まで昇温した後、３０分加熱することで酸処理を行った。
（ｃ−２）アルカリ処理工程
実施例１ではアルカリとして水酸化ナトリウムを使用した。筒状織物を１重量％の水酸化ナトリウム水溶液に浸漬し、８０℃まで昇温した後、９０分加熱することでアルカリ処理を行った。
（ｄ）熱セット（１回目）工程
外径３ｍｍの丸棒（材質：ＳＵＳ）を筒状織物の内腔に挿入し、経糸Ａ方向にシワが入らないよう最大限圧縮した状態で、両端を針金等で固定した。筒状織物及び丸棒をオーブンに入れ、丸棒に取り付けた温度計が１８０℃であることを確認してから５分間加熱することで、熱セット（１回目）を行った。
（ｅ）熱セット（２回目）工程
外径３ｍｍの丸棒（材質：ＳＵＳ）を筒状織物の内腔に挿入し、経糸Ａ方向に３０％伸長した状態で、両端を針金等で固定した。筒状織物及び丸棒をオーブンに入れ、丸棒に取り付けた温度計が１７０℃であることを確認してから５分間加熱することで、熱セット（２回目）を行った。
【００３８】
得られた筒状織物において、経糸及び緯糸が有するマイクロファイバー・マルチフィラメント糸の単糸繊度は、０．０８ｄｔｅｘであった。
【００３９】
フィブリノーゲンとポリカチオンであるＰＥＩの結合した複合体の作成は、１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド（以下、「ＥＤＣ」）カップリング法により行った。フィブリノーゲンのカルボキシル基とＰＥＩのアミノ基をアミド結合させ、フィブリノーゲン−ＰＥＩの複合体を得た。フィブリノーゲン−ＰＥＩの複合体を、フィブリノーゲンの濃度が３０ｍｇ／ｍＬとなるようＰＢＳ（−）に溶解し、それぞれヒト第１３因子（ニプロ株式会社製）を３０ＩＵ／ｍＬ、アプロチニン（シグマアルドリッチ社製）を１０００ＫＩＵ／ｍＬ添加し、これを溶液Ａとした。１０００ＩＵ／ｍＬのトロンビン溶液（持田製薬株式会社製）を、ＰＢＳ（−）で１００ＩＵ／ｍＬに希釈し、塩化カルシウムを終濃度が６ｍｇ／ｍＬとなるよう添加し、これを溶液Ｂとした。溶液Ａ５ｍＬを注射筒に充填し、コネクタを介して圧力をかけた状態で、筒状織物に注入した。次いで、５ｍＬの溶液Ｂを同様の方法で筒状織物に注入し、筒状織物の内表面及び繊維間にフィブリンとポリカチオンが共有結合した複合体を形成させた。なおアプロチニンの単位ＫＩＵについては、トリプシンによる加水分解反応を１分間当り１×１０−６ｍｏｌ阻害する時の数値を、３２．５ＫＩＵとして算出する。
【００４０】
ウシ血清アルブミン粉末（シグマアルドリッチ社製）をＰＢＳ（−）に加えて溶解させ、終濃度が５０ｍｇ／ｍＬのアルブミン溶液を作製した。アルブミン溶液２ｍＬを注射筒に充填し、コネクタを介して圧力をかけた状態で筒状織物に注入し、実施例１の人工血管を得た。実施例１の人工血管について、単位面積あたりのフィブリン量（μｇ／ｃｍ２）、単位面積あたりのアルブミン量（μｇ／ｃｍ２）及びアルブミン層の厚み（ｃｍ）を表１に示した。
【００４１】
（実施例２）
実施例１に記載の溶液Ａのフィブリノーゲン濃度を５０ｍｇ／ｍＬ、アルブミン溶液の終濃度を８０ｍｇ／ｍＬとした以外は実施例１と同様の処理を行い、実施例２の人工血管を得た。実施例２の人工血管について、単位面積あたりのフィブリン量（μｇ／ｃｍ２）、単位面積あたりのアルブミン量（μｇ／ｃｍ２）及びアルブミン層の厚み（ｃｍ）を表１に示した。
【００４２】
（実施例３）
長さ３ｃｍのｅＰＴＦＥ製チューブ（延伸多孔性チューブ；製品名：ゴアテックス（登録商標）；ＷＬゴア＆アソシエイツ社製）を使用した以外は実施例１と同様の処理を行い、実施例３の人工血管を得た。実施例３の人工血管について、単位面積あたりのフィブリン量（μｇ／ｃｍ２）、単位面積あたりのアルブミン量（μｇ／ｃｍ２）及びアルブミン層の厚み（ｃｍ）を表１に示した。
【００４３】
（比較例１）
筒状織物の内表面及び繊維間にフィブリンとポリカチオンが共有結合した複合体を形成させる工程を含まない以外は実施例１と同様の処理を行い、比較例１の人工血管を得た。比較例１の人工血管について、単位面積あたりのフィブリン量（μｇ／ｃｍ２）、単位面積あたりのアルブミン量（μｇ／ｃｍ２）及びアルブミン層（ｃｍ）の厚みを表１に示した。
【００４４】
（比較例２）
筒状織物の内表面及び内部にアルブミン溶液を注入する工程以外は実施例１と同様の処理を行い、比較例２の人工血管を得た。比較例２の人工血管について、単位面積あたりのフィブリン量（μｇ／ｃｍ２）、単位面積あたりのアルブミン量（μｇ／ｃｍ２）及びアルブミン層の厚み（ｃｍ）を表１に示した。
【００４５】
（比較例３）
筒状織物の内表面及び内部にフィブリンとポリカチオンが共有結合した複合体を形成させる工程において、溶液Ａに第１３因子を含まず、溶液Ｂに塩化カルシウムを含まず、溶液Ｂの注入量を１ｍＬとした以外は実施例１と同様の処理を行い、比較例３の人工血管を得た。比較例３の人工血管について、単位面積あたりのフィブリン量（μｇ／ｃｍ２）、単位面積あたりのアルブミン量（μｇ／ｃｍ２）及びアルブミン層の厚み（ｃｍ）を表１に示した。
【００４６】
（比較例４）
筒状織物の内表面及び内部にフィブリンとポリカチオンが共有結合した複合体を形成させる工程において、溶液Ａのフィブリノーゲン濃度を５０ｍｇ／ｍＬとし、溶液Ａ及びＢの注入量を各８ｍＬとした以外は、実施例１と同様の処理を行い、比較例４の人工血管を得た。比較例４の人工血管について、単位面積あたりのフィブリン量（μｇ／ｃｍ２）、単位面積あたりのアルブミン量（μｇ／ｃｍ２）及びアルブミン層の厚み（ｃｍ）を表１に示した。
【００４７】
（比較例５）
アルブミン溶液の終濃度を８０ｍｇ／ｍＬとし、筒状織物への注入量を５ｍＬとした以外は実施例１と同様の処理を行い、比較例５の人工血管を得た。比較例５の人工血管について、単位面積あたりのフィブリン量（μｇ／ｃｍ２）、単位面積あたりのアルブミン量（μｇ／ｃｍ２）及びアルブミン層の厚み（ｃｍ）を表１に示した。
【００４８】
（比較例６）
筒状織物の製織において、緯糸Ｃの後加工後の緯糸の織密度を６０本／２．５４ｃｍ、緯糸Ｄの後加工後の緯糸の織密度を１２１本／２．５４ｃｍに変更した以外は実施例１と同様に製織し、その後の処理は実施例１と同様の処理を行い、比較例６の人工血管を得た。比較例６の人工血管について、単位面積あたりのフィブリン量（μｇ／ｃｍ２）、単位面積あたりのアルブミン量（μｇ／ｃｍ２）及びアルブミン層の厚み（ｃｍ）を表１に示した。
【００４９】
（比較例７）
緯糸に５６ｄｔｅｘ、２４フィラメントのマルチフィラメント糸（東レ株式会社製）、緯糸に３３３ｄｔｅｘ、３５５２フィラメントの海島複合繊維であるマルチフィラメント糸（遠東新世紀株式会社製）を用いて、繻子織りにより筒状織物を作製し、これを内層織物とした。次に、１６７ｄｔｅｘ、１０８フィラメントのマルチフィラメント糸（東レ株式会社製）を用いて綾織りにより内層織物の外面を覆うようにして、筒状織物を作製し、これを外層織物とし、内径３ｍｍの二重構造の筒状織物を製織した。１００℃の０．２５重量％水酸化ナトリウム水溶液による洗浄を２回行い、次いで１００℃の熱湯による洗浄工程、０．０５％酢酸による中和処理工程及び１００℃の熱湯による洗浄工程の３段階からなる洗浄処理工程を２回行うことにより海成分を完全に溶脱させた。洗浄処理により海島複合繊維であるマルチフィラメント糸から露出したマイクロファイバー・マルチフィラメント糸の単糸繊度は０．４０ｄｔｅｘであった。その後の処理は実施例１と同様の処理を行い、比較例７の人工血管を得た。比較例７の人工血管について、単位面積あたりのフィブリン量（μｇ／ｃｍ２）、単位面積あたりのアルブミン量（μｇ／ｃｍ２）及びアルブミン層の厚み（ｃｍ）を表１に示した。
【００５０】
（比較例８）
ヒトフィブリノーゲン（シグマアルドリッチ社製）を５０ｍｌの蒸留水に溶解し、ゼラチン−セファロース４Ｂゲル（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を充填したカラム、次いでリジン−セファロース４Ｂゲル（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を充填したカラムに通し、フィブロネクチン及びプラスミノーゲン（プラスミン）を除去後、滅菌済の０．２０μｍフィルターに通し、フィブリノーゲン溶液を濾過滅菌した。濾過滅菌後のフィブリノーゲン溶液の濃度を凝固時間測定法にて測定後、凍結乾燥した。凍結乾燥したフィブリノーゲンを２０ｍｏｌ／ｍ３のＣａＣｌ２、２ｍｏｌ／ｍ３のＭｇＣｌ２、１５０ｍｏｌ／ｍ３のＮａＣｌを含む５ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ＰＨ  ７．５）でフィブリノーゲン濃度が３０ｍｇ／ｍｌとなるよう溶解し、ヒトフィブリノーゲン溶液を作成した。次に、内径３ｍｍ、長さ３０ｍｍのニット製の筒状編物（Ｇｏｌａｓｋｉ  Ｌａｂ．Ｉｎｃ．製）に５０ＩＵ／ｍｌのトロンビン（持田製薬株式会社製）溶液５ｍｌを圧入し、次いで上記のフィブリノーゲン溶液２．５ｍｌを圧入し、生理食塩水で十分洗浄後、３７℃で２４時間インキュベートし、フィブリン層（厚さ：５μｍ）を内表面に有する筒状編物を作製した。その後、５０ｍＭリン酸緩衝液にて、０．０５ＩＵ／ｍｌのプラスミン溶液（シグマアルドリッチ社製）を作成し、この溶液中に３７℃で１５分間浸漬し、フィブリン層の表面にプラスミン溶液を接触させた。その後、大豆トリプシンインヒビター（シグマアルドリッチ社製）を最終濃度が２００μｇ／ｍｌとなるよう添加し、生理食塩水にて十分洗浄し、フィブリン層の表面にプラスミン処理された加水分解部分を形成させ、比較例８の人工血管を得た。比較例８の人工血管について、単位面積あたりのフィブリン量（μｇ／ｃｍ２）、単位面積あたりのアルブミン量（μｇ／ｃｍ２）及びアルブミン層の厚み（ｃｍ）を表１に示した。
【００５１】
（比較例９）
実施例１の筒状織物の代わりに、内径３ｍｍ、長さ３０ｍｍのｅＰＴＦＥグラフトチューブ（延伸多孔性チューブ；商品名：ゴアテックス（登録商標）、ＷＬゴア＆アソシエイツ社製）を用いた以外は、比較例８に記載の処理と同様の処理を行い、比較例９の人工血管を得た。比較例９の人工血管について、単位面積あたりのフィブリン量（μｇ／ｃｍ２）、単位面積あたりのアルブミン量（μｇ／ｃｍ２）及びアルブミン層の厚み（ｃｍ）を表１に示した。
【００５２】
（比較例１０）
実施例１の筒状織物の代わりに、ポリエチレンテレフタレート製の筒状編物（内径３ｍｍφ）を用いた。ウシ血清アルブミン粉末（和光純薬株式会社製）２ｇを純水１０ｍｌに室温にて溶解し、アルブミン溶液を作製した。上記ポリエチレンテレフタレート製の筒状編物を長さ５ｃｍに切断し、内径４．５ｍｍφ、長さ６ｃｍのガラス製試験管の内壁に貼付けた。ガラス試験管内にアルブミン溶液０．４ｍｌを充填し、シリコーン栓を取付け、更にガラス試験管をモーターによって回転できるようにしたステンレス製の管状の治具の中に挿入した。モーターのチャックに治具を取付け、モーターを１０ｒｐｍの速度で回転させながら、全体を６０℃で２０分間加熱した後、モーターを止めガラス管内のアルブミン溶液を排出し、ポリエチレンテレフタレート製の筒状編物の内表面にアルブミン層を形成させた。次にグルタールアルデヒドグルタルアルデヒド２０重量％溶液（和光純薬株式会社製）５ｍｌに純水を加えて希釈し、１００ｍｌの架橋剤溶液とした。この架橋剤溶液０．４ｍｌを、ポリエチレンテレフタレート製の筒状編物の内腔に充填し、５０℃にて１２時間架橋し、架橋剤を排出した。続いて、リン酸二水素カリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）１．５ｍｌに対し、ウシ頸靱帯製α−エラスチン（和光純薬株式会社製）１５０ｍｇを溶解し、エラスチン水溶液を調製した。このエラスチン水溶液０．４ｍｌを、ポリエチレンテレフタレート製の筒状編物の内腔に充填し、シリコーン栓をポリエチレンテレフタレート製の筒状編物の端部に取付けた。ステンレス製の管状の治具の中に挿入した。モーターのチャックに治具を取付け、５ｒｐｍの速度でモーターを回転させながら、６０℃で１２時間加熱した。モーターの回転を止め、管内の溶液を捨て、０．４ｍｇの水溶エポキシ架橋剤（デナコール（登録商標）ＥＸ−６１４Ｂ、ナガセケムテックス株式会社製）をｐＨ＝７．０のリン酸緩衝液０．４ｍｌに溶解した水溶液をポリエチレンテレフタレート製の筒状編物の内腔に充填した。５ｒｐｍの速度でモーターを回転させながら６０℃にて２４時間架橋反応を行い、ポリエチレンテレフタレート製の筒状編物の内表面にアルブミン層とエラスチンを含む層を形成し、生理食塩水（株式会社大塚製薬工場製）１００ｍｌにグリセリン（和光純薬工業株式会社製）１ｇを溶解したグリセリン溶液に５時間浸し、比較例１０の人工血管を得た。比較例１０の人工血管について、単位面積あたりのフィブリン量（μｇ／ｃｍ２）、単位面積あたりのアルブミン量（μｇ／ｃｍ２）及びアルブミン層の厚み（ｃｍ）を表１に示した。
【００５３】
（比較例１１）
３ｍＵの塩化カルシウムを含む５０ＩＵ／ｍＬのトロンビン溶液５ｍＬを注射筒Ａに入れ、３％ヒトフィブリノーゲン溶液５ｍＬを入れた別の注射筒Ｂを用意した。筒状編物からなる多孔質ポリウレタン弾性体に圧をかけながらＡ液、Ｂ液の順で注入し、５分間静置した。２０ｍＬの生理食塩水で洗浄し、比較例１１の人工血管を得た。比較例１１の人工血管について、単位面積あたりのフィブリン量（μｇ／ｃｍ２）、単位面積あたりのアルブミン量（μｇ／ｃｍ２）及びアルブミン層の厚み（ｃｍ）を表１に示した。
【００５４】
（比較例１２）
比較例１１の人工血管に対し、さらに、０．１容量％グルタルアルデヒド／生理食塩水に浸漬した後、十分に洗浄することで、比較例１２の人工血管を得た。比較例１２の人工血管について、単位面積あたりのフィブリン量（μｇ／ｃｍ２）、単位面積あたりのアルブミン量（μｇ／ｃｍ２）及びアルブミン層の厚み（ｃｍ）を表１に示した。
【００５５】
（比較例１３）
ヒトフィブリノーゲン（シグマアルドリッチ社製）を５０ｍｌの蒸留水に溶解し、リジン−セファロース４Ｂゲル（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を充填したカラムを通過させ、プラスミノーゲンを除去した。次いでゼラチン−セファロース４Ｂゲル（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を充填したカラムを通過させ、フィブロネクチンを除去した。プラスミノーゲンとフィブロネクチンを除去したフィブリノーゲンを用いて３％ヒトフィブリノーゲン溶液を調製した。２ｍＭ塩化カルシウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液に５０Ｕ／ｍＬとなるようトロンビン（日本薬局方品）を溶解した。比較例１１の人工血管（内径４ｍｍ、長さ４５ｍｍ）にトロンビン３ｍＬ、フィブリノーゲン２．５ｍＬを注入した。５〜１０分静置したのち、１０ｍＬの生理食塩水で洗浄し、比較例１３の人工血管を得た。比較例１３の人工血管について、単位面積あたりのフィブリン量（μｇ／ｃｍ２）、単位面積あたりのアルブミン量（μｇ／ｃｍ２）及びアルブミン層の厚み（ｃｍ）を表１に示した。
【００５６】
（比較例１４）
３０ｍｇ／ｍｌのヒトフィブリノーゲン溶液（シグマアルドリッチ社製）を試験管に入れ、当該試験管内に、予め内径３．３ｍｍのポリエステル製の筒状編物を投入し浸漬させた。次に、筒状編物を液体窒素に素早く浸漬して急速凍結させた。凍結させた筒状編物を再びフィブリノーゲン溶液に素早く浸漬して、直ちに取り出し、再度、液体窒素で急速凍結させた。ついで、筒状編物を予め２５ＩＵ／ｍＬのトロンビン溶液（持田製薬株式会社製）を収容した試験管に投入して、浸漬操作を行った。フィブリノーゲンが液化し、フィブリンとポリカチオンが共有結合した複合体が筒状編物の内表面に全体的に形成されたことを確認してから筒状編物を取り出し、内腔に外径３．８ｍｍのステンレス製心棒を通過させ、比較例１４の人工血管を得た。比較例１４の人工血管について、単位面積あたりのフィブリン量（μｇ／ｃｍ２）、単位面積あたりのアルブミン量（μｇ／ｃｍ２）及びアルブミン層の厚み（ｃｍ）を表１に示した。
【００５７】
（比較例１５）
３０ｍｇ／ｍｌのヒトフィブリノーゲン溶液（シグマアルドリッチ社製）を試験管に入れ、内径５ｍｍ、長さ１０ｃｍのポリエステル製の筒状編物を投入し浸漬し、脱気操作を加えた後に取りだして、２５ＩＵ／ｍＬのトロンビン溶液（持田製薬株式会社製）に浸漬した。フィブリンとポリカチオンが共有結合した複合体が筒状編物の内表面に形成されたことを確認してから取りだし、筒状編物の片端をクランプし、１０ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲンを管腔内に注入し、先の被覆操作で用いたトロンビンの残存活性を利用して管腔内にフィブリンとポリカチオンが共有結合した複合体を形成させた。クランプを外すことで、未反応物を流し、内腔に内径４．６ｍｍのステンレス棒を挿入し管腔を確保し、比較例１５の人工血管を得た。比較例１５の人工血管について、単位面積あたりのフィブリン量（μｇ／ｃｍ２）、単位面積あたりのアルブミン量（μｇ／ｃｍ２）及びアルブミン層の厚み（ｃｍ）を表１に示した。
【００５８】
（実験１：ヒト全血液試験）
実施例１〜３の人工血管及び比較例１〜１５の人工血管を表面積が１．０ｃｍ２となるようカットし、各実施例及び比較例のヒト全血液試験用のサンプルを得た。各サンプルを生理食塩水で３７℃、３０分間洗浄してから２ｍＬのマイクロチューブに入れた。ヒト新鮮血に０．４Ｕ／ｍＬとなるようにヘパリンナトリウム注（味の素製薬株式会社製）を添加した後、このヒト血液を２ｍＬ添加し、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベート後に各サンプルを取り出し、生理食塩水（株式会社大塚製薬工場製）でリンスした後、２．５％グルタルアルデヒド／生理食塩水で一晩固定した。流水洗により固定液を洗い流した後、各サンプルを一晩、真空乾燥させた。試験前のサンプルと真空乾燥後のサンプルの乾燥重量をそれぞれ測定し、その差によって付着血栓重量を求めた。実施例１〜３の人工血管及び比較例１〜１５の人工血管の各サンプルにおける付着血栓重量（ｍｇ）を表１に示した。
【００５９】
（実験２：細胞伸展性能評価）
実施例１〜３の人工血管及び比較例１〜１５の人工血管を、直径１．０ｃｍの円形にカットし、各実施例及び比較例の細胞伸展性能評価用のサンプルを得た。エチレンオキサイドガス滅菌したのち、２４穴プレートに入れ、パイプ状のおもり（肉厚１ｍｍ、金属製）をのせて固定した。１０容量％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を１ｍＬ添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で一晩インキュベートし、培地を各サンプルに吸収させた。各サンプルを新しいウェルに移しパイプ状のおもりをのせ、中央部に円筒状（直径５ｍｍ）の樹脂製仕切りを載せた。仕切り内にＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ）を２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で５日間培養し、コンフルエントの状態にした。円筒状の仕切りを取り外し、培地を交換してさらに７日間培養した。培養後の各サンプルを取り出しＰＢＳ（−）（日水製薬株式会社製）でリンスした後に、２．５％グルタルアルデヒド／生理食塩水に各サンプルを浸漬して一晩、固定した。各サンプルを０．２％クリスタルバイオレット／２０％メタノール液で染色し、水洗、乾燥したのち２００倍のマイクロスコープ下で画像撮影し、画像解析ソフトで染色された面積（ｍｍ２）を計測し、これを細胞伸展面積（ｍｍ２）とした。実施例１〜３の人工血管及び比較例１〜１５の人工血管の各サンプルにおける細胞伸展面積（ｍｍ２）を表１に示した。
【００６０】
（実験３：イヌ移植実験における内皮化率評価）
実施例１及び比較例８の人工血管を、エチレンオキサイドガスで滅菌した後、イヌ２頭の左右頸動脈に移植し、内皮形成能を検討した。雄のビーグル犬に移植２日前から摘出日までアスピリン及びジピリダモールを投与した。イソフルラン吸入麻酔を行った。頸部を切開して頸動脈を露出させた後、ヘパリン１００ＩＵ／ｋｇを静脈内投与により全身ヘパリン化した。血流を遮断し、人工血管を端端吻合にて頸動脈に移植した。血流を再開させ、閉創し、麻酔から覚醒させた。移植４週間後にイソフルラン吸入麻酔下で放血により動物を安楽死させたのち、人工血管を摘出した。人工血管の長さ方向に切り出し、１０％中性緩衝ホルマリンにて固定した。常法によりパラフィン包埋切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色を施して組織標本を作製した。組織標本は光学顕微鏡下で画像撮影した。人工血管の全長と、内表面を被覆している内皮細胞の先端までの長さを計測し、以下の式１に示すように内皮化率を計算した。
Ｅ＝Ｌｅ／Ｌｔ×１００  ・・・式１
Ｅ：内皮化率（％）
Ｌｅ：内表面を被覆している内皮細胞の先端までの長さ（ｃｍ）
Ｌｔ：人工血管の全長（ｃｍ）
得られた実施例１及び比較例８の人工血管の内皮化率（％）を表１に示した。
【００６１】
【表１】
2019063214.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の人工血管は、抗血栓性と内皮形成能を共に備え、臨床で長期間の使用に耐え得る程度に長期開存を可能にするため、医療分野において好適に用いることができる。