(57)【要約】【課題】  骨量減少と関連する疾病を治療又は予防し、骨格構造及び生体力学的骨強度を改善する組成物を提供することを目的とする。【解決手段】  前記組成物は、この治療を必要とする使用者に投与するための有効量のゲニステインリン酸コンジュゲートを含む。本発明に係る組成物は、更年期女性の症状及び合併症のリスクを減少させ、骨ミネラル含量、骨密度及び生体力学的骨強度を高め、骨粗鬆症を軽減することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨量（ｂｏｎｅ  ｍａｓｓ）減少と関連する疾病を治療又は予防する組成物であって、
前記組成物は、この治療を必要とする使用者に投与するための有効量のゲニステインリン酸コンジュゲートを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記組成物のゲニステインリン酸コンジュゲートの前記有効量は約０．５ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙであることを特徴とする請求項１に記載の骨量減少と関連する疾病を治療又は予防する組成物。
【請求項３】
前記組成物のゲニステインリン酸コンジュゲートの前記有効量は約０．８６ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ〜約１．７３ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙであることを特徴とする請求項２に記載の骨量減少と関連する疾病を治療又は予防する組成物。
【請求項４】
前記組成物は、経口投与することを特徴とする請求項２に記載の骨量減少と関連する疾病を治療又は予防する組成物。
【請求項５】
前記組成物は、毎日少なくとも一回投与することを特徴とする請求項２に記載の骨量減少と関連する疾病を治療又は予防する組成物。
【請求項６】
前記組成物は、２４時間内に１〜６回投与し、ゲニステインリン酸コンジュゲートの一日量は約０．５ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.〜約２．５ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.であることを特徴とする請求項５に記載の骨量減少と関連する疾病を治療又は予防する組成物。
【請求項７】
前記組成物は、丸剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤、バイアル又は滴剤の形態であることを特徴とする請求項４に記載の骨量減少と関連する疾病を治療又は予防する組成物。
【請求項８】
前記組成物は更に１つ又は複数の薬学的に許容され得るアジュバント、担体及び／又は賦形剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の骨量減少と関連する疾病を治療又は予防する組成物。
【請求項９】
前記疾病は原発性骨粗鬆症であることを特徴とする請求項１に記載の骨量減少と関連する疾病を治療又は予防する組成物。
【請求項１０】
前記原発性骨粗鬆症は老化、更年期、又は卵巣摘出を原因として引き起こされる骨粗鬆症であることを特徴とする請求項９に記載の骨量減少と関連する疾病を治療又は予防する組成物。
【請求項１１】
前記使用者は哺乳類であることを特徴とする請求項１０に記載の骨量減少と関連する疾病を治療又は予防する組成物。
【請求項１２】
前記哺乳類はヒトであることを特徴とする請求項１１に記載の骨量減少と関連する疾病を治療又は予防する組成物。
【請求項１３】
前記ヒトは女性であることを特徴とする請求項１２に記載の骨量減少と関連する疾病を治療又は予防する組成物。
【請求項１４】
骨構造を改善する組成物であって、
前記組成物は、この治療を必要とする使用者に投与するための有効量のゲニステインリン酸コンジュゲートを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１５】
前記組成物のゲニステインリン酸コンジュゲートの前記有効量は約０．５ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙであることを特徴とする請求項１４に記載の骨構造を改善する組成物。
【請求項１６】
前記使用者はヒトであることを特徴とする請求項１５に記載の骨構造を改善する組成物。
【請求項１７】
生体力学的骨強度を高める組成物であって、
前記組成物は、この治療を必要とする使用者に投与するための有効量のゲニステインリン酸コンジュゲートを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１８】
前記使用者はヒトであることを特徴とする請求項１７に記載の生体力学的骨強度を高める組成物。
【請求項１９】
前記人類は女性であることを特徴とする請求項１８に記載の生体力学的骨強度を高める組成物。
【請求項２０】
前記骨は大腿骨であることを特徴とする請求項１９に記載の生体力学的骨強度を高める組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨量減少と関連する疾病を治療又は予防し、骨格構造及び生体力学的骨強度を改善する組成物に関する。特に、閉経後骨粗鬆症を治療又は予防するのに用いるゲニステインリン酸コンジュゲートを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
正常な成人であれば、骨吸収量と骨形成量は共に厳密にコントロールされているため、骨量の変化は微々たるものでしかない。しかし、骨量減少と関連する疾病を患う患者については、骨吸収量と骨形成量のバランスが崩れ、骨量が減少し、骨組織が退化する現象が起こる。骨量減少と関連する疾病の代表としては骨粗鬆症がある。とある研究によると、骨粗鬆症の疫学ではその大多数が更年期の女性で発生しているため、このような骨粗鬆症を特に閉経後骨粗鬆症と呼ぶ。
【０００３】
閉経後骨粗鬆症を治療又は予防する方法は多くあり、例えばサプリメントや薬品の服用が挙げられる。このうち、最も一般的な治療又は予防の方法はエストロゲン補充療法（ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ，ＥＲＴ）である。ＥＲＴは骨密度の低下を抑えるのに効果的だが、腫瘍への影響が増加するリスクがある。腫瘍への影響のリスクに鑑み、ＥＲＴに取って代わるものとして大豆イソフラボンを使用する更年期の女性が顕著に増加している。
【０００４】
ゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）は大豆の中に高濃度で存在する植物性エストロゲンであり、大豆イソフラボンの中で最も生理活性の高い化学構造を持っており、更年期症状を軽減するためのサプリメントの成分でもある。初期の研究ではゲニステインは更年期女性の更年期障害及び合併症を予防する効果が期待されていた。しかし、最近の長期臨床試験では、更年期障害及び合併症、特に骨量減少においては、顕著な効果はないことが指摘されている。
【０００５】
Ａｌｅｋｅｌらによる「骨量減少抑制のための大豆イソフラボン（ＳＩＲＢＬ）研究：更年期女性における3年間の無作為化対照試験（アメリカ臨床栄養学会誌，２０１０；９１：２１８−３０）」（Ａｌｅｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｔｈｅ  Ｓｏｙ  Ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｂｏｎｅ  Ｌｏｓｓ  （ＳＩＲＢＬ）  Ｓｔｕｄｙ：  ａ  ３−ｙ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｉｎ  ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｗｏｍａｎ”，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ２０１０；９１：２１８−３０）では、更年期女性の腰椎と大腿骨近位部の骨密度に対し、大豆から抽出した２つの用量（８０及び１２０ｍｇ／ｄ）のイソフラボン（アグリコン型であるゲニステイン、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）、グリシテイン（ｇｌｙｃｉｔｅｉｎ）の比率は１．３：１．０：０．３）による３年間の影響を研究しており、その結果、大豆イソフラボン抽出物に骨温存効果は現れず、大腿骨頸部で軽微な効果があるのみとしている。Ｌｅｖｉｓらによる「大豆イソフラボンによる更年期における骨量減少及び更年期障害の予防（アーカイブスオブインターナルメディシン，２０１１；１７１（１５）：１３６３−１３６９）」（Ｌｅｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｏｙ  Ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  Ｂｏｎｅ  Ｌｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  Ｓｙｍｐｔｏｍｓ”，  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１１；１７１（１５）：１３６３−１３６９）では同様に、大豆イソフラボン抽出物による骨量減少及び更年期障害の予防への影響を研究しており、毎日２００ｍｇの大豆イソフラボンを２年間摂取しても骨量減少及び更年期障害を予防することはできないとしている。Ｔｕｒｎｅｒらによる「ゲニステインをサプリメントとして毎日一回服用しても閉経後骨量減少ラット脛骨モデルに効果は無かった（Ｍｅｎｏｐａｕｓｅ，２０１３  Ｊｕｎ；  ２０（６）：  ６７７−６８６）」（Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ａｓ  ａ  ｏｎｃｅ  ｄａｉｌｙ  ｏｒａｌ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｈａｄ  ｎｏ  ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｔｉｂｉａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｂｏｎｅ  ｌｏｓｓ”，  Ｍｅｎｏｐａｕｓｅ．  ２０１３  Ｊｕｎ；  ２０（６）：  ６７７−６８６）では、卵巣摘出ラットに毎日ゲニステイン３．２ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.をサプリメントとして長期（５か月間）服用した影響を研究しており、このような治療はラットの骨量、骨密度又は骨構造に影響がないとしている。上述のとおり、ゲニステインの骨量減少に対する効果は顕著ではなく、ＦＤＡの推奨用量（４０〜５０ｍｇ）を超える量を摂取したとしても同様である。よって、この分野においては、骨粗鬆症を治療し、骨形成を促進する新しい組成物又は方法が必要であり、本発明はその需要を満たすものである。
【発明の概要】
【０００６】
前述の問題するため、本発明は骨量減少と関連する疾病を治療又は予防する組成物を提供することを目的とする。前記組成物は、この治療を必要とする使用者に投与するための有効量のゲニステインリン酸コンジュゲートを含む。
【０００７】
好ましい実施形態においては、前記組成物のゲニステインリン酸コンジュゲートの前記有効量は約０．５ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙである。好ましい実施形態においては、前記組成物のゲニステインリン酸コンジュゲートの前記有効量は約０．８６ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ〜約１．７３ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙである。前記組成物のゲニステインリン酸コンジュゲートの前記有効量は体表面積正規化法（ｂｏｄｙ−ｓｕｒｆａｃｅ−ａｒｅａ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）により得られる。ヒトに適した有効量の範囲を求める式は以下のとおりである。
【数１】
2019099579.tif 000002
【０００８】
好ましい実施形態においては、前記組成物は経口投与する。
【０００９】
好ましい実施形態においては、前記組成物は毎日少なくとも一回投与する。
【００１０】
好ましい実施形態においては、前記組成物は２４時間内に１〜６回投与し、ゲニステインリン酸コンジュゲートの一日量は約０．５ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.〜約２．５ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.である。
【００１１】
好ましい実施形態においては、前記組成物は丸剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤、バイアル又は滴剤の形態である。
【００１２】
好ましい実施形態においては、前記組成物は更に１つ又は複数の薬学的に許容され得るアジュバント、担体及び／又は賦形剤を含む。
【００１３】
好ましい実施形態においては、前記疾病は原発性骨粗鬆症である。
【００１４】
好ましい実施形態においては、前記原発性骨粗鬆症は老化、更年期、又は卵巣摘出を原因として引き起こされる骨粗鬆症である。
【００１５】
好ましい実施形態においては、前記使用者は哺乳類である。
【００１６】
好ましい実施形態においては、前記哺乳類はヒトである。
【００１７】
好ましい実施形態においては、前記ヒトは女性である。
【００１８】
本発明は更に、骨構造を改善する組成物を提供することを目的とする。前記組成物は、この治療を必要とする使用者に投与するための有効量のゲニステインリン酸コンジュゲートを含む。
【００１９】
本発明は更に、生体力学的骨強度を高める組成物を提供することを目的とする。前記組成物は、この治療を必要とする使用者に投与するための有効量のゲニステインリン酸コンジュゲートを含む。
【００２０】
好ましい実施形態においては、前記骨は大腿骨である。
【００２１】
上述のとおり、本発明は従来の技術と比べ、更年期女性の症状及び合併症のリスクを減少させ、骨ミネラル含量、骨密度及び生体力学的骨強度を高め、この治療を必要とする使用者に有効量のゲニステインリン酸コンジュゲートを含む組成物を投与することで骨粗鬆症を軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の実施例における体重増加を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例における子宮の重さを示す棒グラフである。
【図３】本発明の実施例における大腿骨近位部の骨密度を示す棒グラフである。
【図４】本発明の実施例における大腿骨近位部の総体積に対する骨の割合を示す棒グラフである。
【図５】本発明の実施例における大腿骨近位部の三次元Ｘ線ＣＴスキャン画像である。
【図６】本発明の実施例におけるラットの大腿骨遠位部スライドのＨＥ染色を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の技術内容を図面に基づいて説明する。なお、これら図面は説明のためのものであるため、実際の比率に従い描かれたものではなく、本発明の技術的範囲を限定するものではない。
【００２４】
別途明記しない限り、本明細書及び特許請求の範囲記載の科学技術用語は全て、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。例えば本明細書及び特許請求の範囲記載の以下の用語は以下の意味を有する。
【００２５】
別途明記しない限り、本明細書及び特許請求の範囲記載の「又は」は「及び／又は」と同じ意味である。「含む」又は「備える」の語は、本明細書及び特許請求の範囲では、挙げられた要素を備えるユニット、構造、物品、または装置は、必ずしもこれらの要素のみに限定されるものでなく、明示的に挙げられていないか、又はこのようなユニット、構造、物品、または装置に本来備わっている他の要素も含んでよい。同様に、「含んでいる」、「備えている」、「有する」、「有している」、「含有する」、「含有している」またはそれらの変化形は、非排他的包含であることを意図するものである。
【００２６】
本発明は、骨量減少と関連する疾病を治療又は予防する方法を提供する。前記方法は、この治療を必要とする使用者に組成物を投与することを含む。前記組成物は、有効量のゲニステインリン酸コンジュゲートを含む。また本発明は、骨量減少と関連する疾病を治療又は予防するのに用いる組成物を提供する。前記組成物は、この治療を必要とする使用者に投与するための有効量のゲニステインリン酸コンジュゲートを含む。本発明は更に、骨構造を改善する方法を提供する。前記方法は、この治療を必要とする使用者に組成物を投与することを含む。前記組成物は、有効量のゲニステインリン酸コンジュゲートを含む。また本発明は更に、骨格構造及び生体力学的骨強度を改善する組成物を提供する。前記組成物は、この治療を必要とする使用者に組成物を投与するための有効量のゲニステインリン酸コンジュゲートを含む。本発明ではまた、生体力学的骨強度を高める方法について言及する。前記方法は、この治療を必要とする使用者に組成物を投与することを含む。前記組成物は、有効量のゲニステインリン酸コンジュゲートを含む。また、生体力学的骨強度を高める組成物について言及する。前記組成物は、この治療を必要とする使用者に組成物を投与するための有効量のゲニステインリン酸コンジュゲートを含む。
【００２７】
本発明は更に、有害な副作用が比較的少ない優位性を備えた骨格系疾患を治療及び／又は予防する組成物を提供する。前記骨格系疾患は例えば、閉経後骨粗鬆症、原発性骨粗鬆症、又は骨密度、骨量及び骨ミネラル含量の減少である。また本発明は、有害な副作用が比較的少ない優位性を備えた骨構造及び生体力学的骨強度を改善する組成物を提供する。好ましくは、前記原発性骨粗鬆症は老化、更年期、又は卵巣摘出を原因として引き起こされる骨粗鬆症である。
【００２８】
「使用者」の語は、本明細書及び特許請求の範囲では、哺乳類及び哺乳類以外の動物であり、骨量減少のリスク又は骨量減少の症状があると診断された、本発明の方法及び組成物の受益者を指す。前記哺乳類は、ヒト、ヒト以外の霊長類、羊、犬、齧歯類（例えば：マウス、ラットなど）、モルモット、猫、ウサギ、牛、馬を含み、これに限定しない。前記哺乳類以外の動物は、鶏、両生類及び爬虫類を含み、これに限定しない。好ましくは、前記使用者はヒトである。より好ましくは、前記ヒトは女性である。
【００２９】
「治療」の語は、本明細書及び特許請求の範囲では、前記使用者がゲニステインリン酸コンジュゲートを投与する前の同一症状について、ゲニステインリン酸コンジュゲート投与後にその症状が維持又は減少していることとして定義される。「予防」の語は、本明細書及び特許請求の範囲では、使用者の骨格系疾病（例えば、骨量減少）の発病を遅らせることとして定義される。
【００３０】
「ゲニステインリン酸コンジュゲート（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，Ｐ−ＧＥＮ）」の語は、本明細書及び特許請求の範囲では、水溶性且つ体内で吸収され利用されやすい化合物である。本発明において、前記ゲニステインリン酸コンジュゲートは、ゲニステイン７―Ｏ―リン酸（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ  ７−Ｏ−ｐｈｏｐｈａｔｅ，Ｇ７Ｐ，下記構造式（Ｉ））及びゲニステイン４’−Ｏ−リン酸（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ  ４’−Ｏ−ｐｈｏｐｈａｔｅ，Ｇ４’Ｐ，下記構造式（ＩＩ））を含む。好ましい実施形態においては、前記ゲニステインリン酸コンジュゲートはイソフラボンを納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｖａｒ．  ｎａｔｔｏ，台湾生物資源保存及び研究センターに保存，番号ＢＣＲＣ  ８０５１７）によって生物変換（ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）することで得られる。その調製方法はＦｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌでＨｓｕらにより発表された研究（２０１３，第５３編４８７−４９５ページ）（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ５３  （２０１３）  ４８７−４９５）を参照のこと。好ましい実施形態においては、前記ゲニステインリン酸コンジュゲートは骨量減少を予防及び治療するための効果的な薬理学的介入である。好ましい実施形態においては、前記ゲニステインリン酸コンジュゲートは骨密度、骨量及び骨ミネラル含量の減少を抑制し、骨構造と最大負荷エネルギー及び弾性係数等の生体力学的骨強度を維持するものである。好ましい実施形態においては、前記ゲニステインリン酸コンジュゲートは原発性骨粗鬆症のような骨量減少と関連する疾病を予防及び治療するための効果的な薬理学的介入である。前記骨はより好ましくは脛骨及び大腿骨である。
【化１】
2019099579.tif 000003
【００３１】
好ましい実施形態においては、本発明に係る方法の前記ゲニステインリン酸コンジュゲートの前記有効量は約０．５ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙであり、例えばこれに限定しないが、０．５ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、０．６ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、０．７ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、０．８ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、０．９ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．０ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．１ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．２ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．３ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．４ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．５ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．６ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．７ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．８ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．９ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、２．０ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、２．１ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、２．２ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、２．３ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、２．４ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ又は２．５ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙである。より好ましい実施形態においては、本発明に係る前記ゲニステインリン酸コンジュゲートの前記有効量は約０．８６ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ〜約１．７３ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙであり、例えばこれに限定しないが、０．８６ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、０．８８ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、０．９０ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、０．９２ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、０．９４ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、０．９６ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、０．９８ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．００ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．０２ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．０４ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．０６ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．０８ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．１０ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．１２ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．１４ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．１６ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．１８ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．２０ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．２２ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．２４ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．２６ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．２８ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．３０ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．３２ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．３４ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．３６ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．３８ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．４０ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．４２ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．４４ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．４６ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．４８ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．５０ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．５２ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．５４ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．５６ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．５８ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．６０ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．６２ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．６４ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．６６ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．６８ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．７０ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ、１．７２ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ又は１．７３ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙである。これらの形態のそれぞれにおいて、経口投与、注射（筋肉注射又は皮下注射を��む）、経皮投与又は経鼻投与により投与することができる。好ましい実施形態においては、本発明に係る方法の投与設計は経口投与によるものである。好ましい実施形態においては、本発明に係る方法の投与設計は毎日少なくとも一回投与するものである。
【００３２】
他の実施形態においては、投与される前記有効量はこれに限定しないが、対象の種、品種、大きさ、身長、体重、年齢、使用者の総合的な健康状態、製剤のタイプ、量、方法又は投与設計、又は骨粗鬆症の重症度を含む任意の数の変数に応じて決定する。
【００３３】
好ましい実施形態においては、本発明に係る方法又は組成物は１つ又は複数の経口送達可能な用量単位を含む。前記用量単位は、約０．５ｍｇ〜約１５ｍｇのゲニステインリン酸コンジュゲート及び１つ又は複数の薬学的に許容されるアジュバント、担体及び／又は賦形剤を含む。
【００３４】
「賦形剤」の語は、本明細書及び特許請求の範囲では、前記ゲニステインリン酸コンジュゲートを対象（本明細書及び特許請求の範囲における使用者）に送達するための物質であり、前記組成物のゲニステインリン酸コンジュゲートと共に製剤される任意の物質を含む。前記賦形剤は、潤滑性、流動性、崩壊性、味を助長し、かつ何らかの形態の抗菌作用を付与し、又は前記組成物が必要とする形状と粘稠度を有する経口送達可能な用量単位に形成することができるものである。
【００３５】
「アジュバント」の語は、本明細書及び特許請求の範囲では、前記ゲニステインリン酸コンジュゲートを含む前記組成物に添加すると、前記ゲニステインリン酸コンジュゲートの作用を増幅又は改良する物質を指す。
【００３６】
「経口送達可能な用量単位」の語は、本明細書及び特許請求の範囲では、治療のために対象の口腔を経由して前記対象の胃腸に投与する組成物の用量単位を指す。好ましい実施形態においては、前記用量単位は丸剤、錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤、懸濁剤、バイアル又は滴剤の形態である。本発明に係る方法は用量単位を定期的に投与するものである。例えば、一用量単位を一日一回から複数回、毎食後一回、又は四時間ごと又はその他の時間間隔ごとに一回投与する。
【００３７】
「用量単位」の語は、本明細書及び特許請求の範囲では、対象を治療するために一度に投与される前記組成物中の前記ゲニステインリン酸コンジュゲートの量を指す。好ましい実施形態においては、本発明に係る組成物の前記ゲニステインリン酸コンジュゲートの用量単位は約１ｍｇ〜約３５０ｍｇであり、例えばこれに限定しないが、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ、２．０ｍｇ、２．５ｍｇ、３．０ｍｇ、３．５ｍｇ、４．０ｍｇ、４．５ｍｇ、５．０ｍｇ、５．５ｍｇ、６．０ｍｇ、６．５ｍｇ、７．０ｍｇ、７．５ｍｇ、８．０ｍｇ、８．５ｍｇ、９．０ｍｇ、９．５ｍｇ、１０．０ｍｇ、１０．５ｍｇ、１１．０ｍｇ、１１．５ｍｇ、１２．０ｍｇ、１２．５ｍｇ、１３．０ｍｇ、１３．５ｍｇ、１４．０ｍｇ、１４．５ｍｇ、１５．０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１２０ｍｇ、１４０ｍｇ、１５０ｍｇ、１６０ｍｇ、１８０ｍｇ、２００ｍｇ、２２０ｍｇ、２４０ｍｇ、２５０ｍｇ、２６０ｍｇ、２８０ｍｇ、３００ｍｇ、３２０ｍｇ、３４０ｍｇ又は３５０ｍｇである。
【００３８】
他の実施形態においては、前記ゲニステインリン酸コンジュゲートは高い溶解性を有し、本発明に係る前記組成物は前記使用者に注射するために調製される。注射する際は、前記組成物は水又はアルコールのような水溶液中に調製し、又はハンクス緩衝液、リンゲル液又は生理食塩水のような緩衝液の中に調製する。前記溶液は、懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤のような処方剤を含む。注射製剤はまた、固形製剤の形態でもよく、例えば滅菌水、食塩水又はアルコールなど適したものによって使用前の短い時間内に注射に適した液体製剤の形態に変換することができる。
【００３９】
好ましい実施形態においては、本発明に係る方法は２４時間内に前記組成物を１〜６回服用し、ゲニステインリン酸コンジュゲートの一日量は約０．５ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.〜約２．５ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.である。また、本発明に係る組成物は、食料品、薬品又は飲用、摂取可能又は食用の組成物に組み込むことができる。
【００４０】
「骨構造（Ｂｏｎｅ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）」の語は、本明細書及び特許請求の範囲では、骨全体の形状と幾何学形状並びに小柱骨及び皮質骨に細分化したものを指す。骨構造を示す変数は皮質の厚み、骨量（ｂｏｎｅ  ｍａｓｓ）、骨密度（ｂｏｎｅ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ，ＢＭＤ）、小柱骨の体積及び小柱骨の数である。「生体力学的骨強度（Ｂｉｏ−ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｏｆ  ｂｏｎｅ）」の語は、本明細書及び特許請求の範囲では、測定期間の変形率、密度、異なる骨部位の変化等多くの強度基準と関係する力学の性質を指す。生体力学測定の評価は最大負荷（ｍａｘｉｍａｌ  ｌｏａｄ）、最大負荷エネルギー（ｍａｘｉｍａｌ  ｅｎｅｒｇｙ）、破壊荷重（ｆｒａｃｔｕｒｅ  ｌｏａｄ）及びヤング率（Ｙｏｕｎｇ’ｓ  ｍｏｄｕｌｕｓ）又は弾性係数（Ｅ）等である。
【００４１】
「小柱骨」の語は、本明細書及び特許請求の範囲では、海綿状の外観を有する格子状のマトリックスネットワーク（骨梁とも呼ぶ）を特徴とする、骨格の内層を構成するものを指す。「皮質骨」の語は、本明細書及び特許請求の範囲では、骨格の皮質又は外殻を構成するものを指す。皮質骨は小柱骨よりもはるかに密度が高く、人体の骨の約８０％の重量を占める。しかし、骨形成及び骨吸収（骨リモデリングとも呼ぶ）の不均衡は、小柱骨の結合性の喪失及び皮質骨の皮質の菲薄化又は小孔の増加に影響する。
【００４２】
「卵巣摘出ラットモデル（ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ）」の語は、本明細書及び特許請求の範囲では、閉経後骨粗鬆症の研究で最もよく利用されるものを指す。卵巣摘出術の後、初期は骨吸収が骨形成を上回り、骨量減少を引き起こす。それからほどなくして、骨リモデリングが安定する。すなわち、骨吸収と骨形成のバランスがとれる。
【００４３】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の理解を助けるためのものであり、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
Ａ．方法
【００４５】
（１）実験動物
【００４６】
実験には１２週齢の雌性ウィスターラットを使用する。すべての実験用ラットは台湾楽斯科生物科技社（ＢｉｏＬＡＳＣＯ）から購入した。飼育は台北医学大学実験動物センターの、２１〜２４℃を維持、相対湿度は３０〜７０％、１２時間ごとに明暗を切り替える自動照明のある動物室で行った。実験期間は十分な飲用水と、一般的な飼料を与えた。ラットの飼育及び手術はすべて台北医学大学の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）の規定に従った。
【００４７】
（２）卵巣摘出術及び偽手術
【００４８】
卵巣摘出ラットについては、ＦＤＡガイドラインおよび骨粗鬆症動物モデルに従って、１２週齢でＺｏｌｅｔｉｌ５０（Ｔｉｌｅｔａｍｉｎｅ２０−４０ｍｇ／ｋｇ＋Ｚｏｌａｚｅｐａｍ５−１０ｍｇ／ｋｇ）及びＲｏｍｐｕｎを用いた麻酔下で両側卵巣摘出手術を行った。対照グループとして設定した偽手術ラットについては、１２週齢でＺｏｌｅｔｉｌ５０（Ｔｉｌｅｔａｍｉｎｅ２０−４０ｍｇ／ｋｇ＋Ｚｏｌａｚｅｐａｍ５−１０ｍｇ／ｋｇ）及びＲｏｍｐｕｎを用いた麻酔下で手術を行い、卵巣は切除しなかった。卵巣摘出術後、２４匹の卵巣摘出ラットをランダムに４組、１組につき６匹のラットに分けた。手術から２週間後、それぞれのラットが属する組ごとに、毎日一回異なる組の試験サンプル及び水を経口投与した。ラットは１２週の間毎週重さを測り、投与用量のベースとし、体重を記録した。最後に、屠殺したラットの卵巣を確認し卵巣摘出術が成功しているか確認した。卵巣摘出に失敗しているラットのデータは採用せず削除した。
【００４９】
（３）実験期間
【００５０】
ＦＤＡガイドライン及び以前の研究によると、骨構造は卵巣摘出術後１２週間以内に明らかに変化する（ＦＤＡガイドラインおよび骨粗鬆症の動物モデル１９９５；  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２００９、９０（５）、５１２〜５１９）。
【００５１】
（４）用量
【００５２】
ＦＤＡは、大豆タンパク質を２５ｇ（イソフラボン４０〜５０ｍｇに相当）と飽和脂肪及びコレステロールが低い食事を毎日摂ることで、心臓病を軽減することができると述べている。市販の大豆イソフラボンサプリメントの用量の多くは４０〜６０ｍｇ／ｄａｙである。よって、人体における４０ｍｇ／ｄａｙのＧ７Ｐを参照用量と見なす。体表面積正規化法（ｂｏｄｙ−ｓｕｒｆａｃｅ−ａｒｅａ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）に従って、ラットに対するＧ７Ｐの投与量を以下の式により定義する。
【数２】
2019099579.tif 000004
【００５３】
一実施形態において、イソフラボンの１日の推奨量は４０ｍｇ／ｄａｙ、一般的なヒトの女性の体重は６０ｋｇ、ヒトの体表面積定数は３７、ラットの体表面積定数は６、Ｇ７ＰＭＷは約３５０、ゲニステインの分子量は約２７０である。上述の式にこれらの値を適用すると、以下のようになる。
【数３】
2019099579.tif 000005
【００５４】
よって、この実施例でラットに使用するＧ７Ｐの一日量は５．３３ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙである。
【００５５】
（５）サンプル管理及びグループ化
【００５６】
計３０匹のラットを次の５グループ（ＳＨＡＭ、ＯＶＸ、Ｇ７Ｐ、Ｇ７Ｐ２Ｘ、Ｅ２）に分ける。
ａ．ＳＨＡＭグループ：偽手術ラット、対照グループとして設定。経管栄養法によって滅菌水を与えた。
ｂ．ＯＶＸグループ：卵巣摘出ラット、ネガティブ対照グループとして設定。経管栄養法によって滅菌水を与えた。 
c． Ｇ７Ｐグループ：卵巣摘出ラット。経管栄養法により毎日一回５．３３ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.１日１回のＧ７Ｐ溶液を投与。この用量は成人の大豆イソフラボン量の４０ｍｇ ／ｄａｙに等しい。
ｄ． Ｇ７Ｐ２Ｘグループ：卵巣摘出ラット。経管栄養法により毎日一回１０．６６ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.のＧ７Ｐ溶液を投与。この用量は成人の大豆イソフラボン量の８０ｍｇ ／ｄａｙに等しい。
ｅ．Ｅ２グループ：卵巣摘出ラット、ポジティブ対照グループとして設定。経管栄養法により毎日一回２００μｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.の１７−βエストラジオールを投与。
【００５７】
（６）骨量指数測定
【００５８】
実験期間の第０、３、６、９及び１２週の時に、気体麻酔を行ったラットの右太腿の大腿骨頭に対し動物用マイクロＣＴ  ＳｋｙＳｃａｎ１１７６を使用しマイクロＣＴスキャンを行い、３Ｄトモグラフィ画像を得た。得られた３Ｄトモグラフィ画像をさらにソフトウェアで解析して骨量指標データを得た。指標データは、骨密度及び総体積に対する骨体積比（ｂｏｎｅ  ｖｏｌｕｍｅ／ｔｏｔａｌ  ｖｏｌｕｍｅ，  ＢＶ／ＴＶ，  ％）を含む。
【００５９】
（７）ラットの屠殺及び動物サンプルの採取
【００６０】
ラットを屠殺後、脛骨と大腿骨を採取し、骨密度及び骨応力を測定した。更に子宮を採取し、周りの脂肪を除去して重さを記録した。
【００６１】
（８）骨の力学解析
【００６２】
左足大腿骨周囲の軟組織を除去した後、生体力学的試験機器（ＲＴ１−ＴＳＴ、Ｒｏｙａｌｔｙ  Ｔｅｃ．Ｉｎｓ．Ｌｔｄ）を用いて測定した。まず、デジタルノギスで大腿骨の長さを測定し、大腿骨の中央位置が骨応力計で大腿骨の垂直方向に物理的な力で圧迫するときに合わせる目盛りの基準になるように設定した。大腿骨を生理食塩水で湿った状態に保ち、試験台に固定し、三点曲げ試験（ｔｈｒｅｅ−ｐｏｉｎｔ  ｂｅｎｄｉｎｇ）を行った。骨応力計のモーター回転速度を０．０５ｍｍ／ｓｅｃに設定し、大腿骨が折れるまで圧迫した後、試験システムによって得られた骨力学解析の変数は以下の通りであった。
１．最大負荷（ｍａｘｉｍａｌ  ｌｏａｄ）：記録の最大重量から換算した力。単位はニュートン。
２．最大負荷エネルギー（ｍａｘｉｍａｌ  ｅｎｅｒｇｙ）：記録曲線下の面積積分。単位はｍＪ。
３．破壊荷重（ｆｒａｃｔｕｒｅ  ｌｏａｄ）
４．ヤング率（Ｙｏｕｎｇ’ｓ  ｍｏｄｕｌｕｓ）又は弾性係数（Ｅ）
【００６３】
（９）組織病理学的観察
【００６４】
右足大腿骨周囲の軟組織を除去した後、パラホルムアルデヒドで組織を固定し、酸による脱灰を行った後、パラフィン包埋し、ミクロトームで断面が円形になるよう縦方向に厚さ２μｍでスライスし、スライドに接着させ、Ｈ＆Ｅ染色した後、スライドを固定し骨の組織病理学的観察を行った。
【００６５】
（１０）統計解析
【００６６】
動物実験データを線形モデルで分散分析し、グループ間の差異をスチューデントのｔ検定によって測定した。 データは平均値±標準偏差（Ｍｅａｎ  ±  ＳＤ）で示した。
【００６７】
Ｂ．結果
【００６８】
（１）体重の変化
【００６９】
卵巣摘出ラットは術後にエストロゲンの分泌が欠乏するため、自律神経失調症を引き起こし、ひいては更年期障害のような症状を引き起こす。このモデルは、更年期女性の生理学的状態をシミュレートすることができるため、本実施例ではこのモデルを骨粗鬆症試験のプラットフォームとした。一般的に、生物は長期的にエストロゲンが欠乏した状態になると体重が増加すると言われている。図１に示すように、すべての卵巣摘出ラットのグループで同様の状態が観察できた。卵巣摘出ラットの体重は卵巣摘出術後２週間後から顕著に増加しており、偽手術（ＳＨＡＭ）グループと明確な差異があった。また、卵巣摘出ラットの体重は実験期間の経過とともに増加し、最も重いＧ７Ｐグループは術後１２週の体重が約４００ｇ前後だった。エストロゲンを与えたラットグループ（即ちＥ２グループ）の体重は他の卵巣摘出術を受けたグループ（即ちＯＶＸグループ、Ｇ７Ｐグループ、Ｇ７Ｐ２Ｘグループ）と比べ第３週から軽くなり始め、第１２週まで他のものより体重が軽かった。高用量のエストロゲンを経口投与することでエストロゲンの欠乏による体重の上昇を抑制することができることは明らかであり、Ｇ７Ｐを与えたグループ（即ちＧ７Ｐグループ及びＧ７Ｐ２Ｘグループ）は肥満を抑制する効果は無かった。
【００７０】
（２）子宮の発育への影響
【００７１】
文献によると、卵巣的術後の生物の子宮はエストロゲンが不足することにより急速に委縮するという。実験結果時の各グループの子宮の重量は図２に示すとおりである。卵巣摘出術後１２週の卵巣摘出ラットの子宮の重量は偽手術ラットと比べ明らかに軽かった。より具体的には、卵巣摘出ラットの子宮の重量は正常な子宮の重量の四分の一しかなく、卵巣摘出術が成功していることを表している。また、実験中に経口投与したサンプルはすでに委縮した子宮の重量及び外観に顕著な影響を与えなかった。
【００７２】
（３）骨密度及び骨体積への影響
【００７３】
第１２週時点の各グループの骨密度は図３に示すとおりである。結果から、偽手術（ＳＨＡＭ）グループの骨密度は試験期間の経過とともに正常に成長しており、第１２週には１．１４ｇ／ｃｍ２ほどに成長した。それに対しＯＶＸグループは０．０３ｇ／ｃｍ２しかなかった。Ｇ７Ｐグループ、Ｇ７Ｐ２Ｘグループ及びＥ２グループのすべての骨密度の平均は明らかにＯＶＸグループより高いことから、Ｇ７Ｐを経口投与したグループ（即ちＧ７Ｐグループ及びＧ７Ｐ２Ｘグループ）は骨ミネラル質の減少を抑制することができており、試験中に骨密度を維持することができていることから、１７−βエストラジオールを２００μｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.を経口投与したグループ（即ちＥ２グループ）と同様の効果が現れていることは明らかである。
【００７４】
図４に示すとおり、各グループのうちＯＶＸグループのＢＶ／ＴＶが最低であった。また、Ｇ７Ｐグループ、Ｇ７Ｐ２Ｘグループ及びＥ２グループのＢＶ／ＴＶは皆ＯＶＸグループより高く、統計学的にも顕著な差異が見られた。このうち、Ｇ７Ｐ２ＸグループのＢＶ／ＴＶはＧ７Ｐグループ及びＥ２グループよりやや高かった。卵巣摘出術後にＧ７Ｐを経口投与することで骨体積を維持することができることを表しており、エストロゲンを経口投与したグループ（即ちＥ２グループ）と基本的には同様の効果があった。
【００７５】
（４）骨形成への効果と小柱骨の発育への影響
【００７６】
図５はマイクロＣＴ造影した骨構造の３Ｄ画像であり、異なる番号は各グループにおいて異なる個体であることを示す。図から、ＳＨＡＭグループは大腿骨頭に近い部分に緻密な小柱骨構造が分布しており、その分布範囲も他のグループと比べ広く、３Ｄ画像からはその小柱網も非常に整っていることが観察できた。ＳＨＡＭグループと比べ、ＯＶＸグループは小柱骨の減少が明らかな状態であり、大腿骨頭には小柱網がほとんどなかった。Ｇ７ＰグループとＧ７Ｐ２Ｘグループで観察できた小柱骨の数は明らかにＯＶＸグループより多く、その構造も整っていることから、Ｇ７Ｐを経口投与することで骨吸収を抑制する効果があり、Ｇ７Ｐが骨量減少を抑制するのに効果的なサプリメントであることがわかる。Ｇ７Ｐグループと比べ、ポジティブ対照グループとしたＥ２グループは小柱網がカバーする範囲がＧ７Ｐグループより広いが、その組織は比較的粗いことが観察できる。その結果、Ｇ７Ｐを与えたグループ（Ｇ７Ｐグループ及びＧ７Ｐ２Ｘグループ）とエストロゲンを経口投与したグループ（Ｅ２グループ）はともに大腿骨の小柱骨構造を維持することができているが、Ｅ２グループが維持できていた大腿骨構造は形態的にＧ７Ｐグループのものと有意に異なっていた。
【００７７】
組織病理学的観察の結果は図６に示すとおりである。ＳＨＡＭグループの骨組織中には、豊富なミネラル質（紫色の部分）及び緻密な小柱網（ピンク色の部分）がはっきり見て取れる。成長板の下にも一定数の骨芽細胞があり、強い骨形成活性を有することが現れている。しかしＯＶＸグループのラットは骨組織中に多くの空洞があり、ミネラル質の減少が深刻であることが見て取れる。小柱骨組織も分散し断片化しており、組織中には骨形成活性がはっきりとは現れていなかった。Ｇ７Ｐグループ及びＧ７Ｐ２Ｘグループは骨ミネラル質の維持状態が良好であり、小柱骨の緻密さも高く、成長板の周囲にはっきりと骨芽細胞が作用しているのが見て取れる。破骨細胞も少なく、組織切片のスライドから骨量減少を抑制する作用がＥ２グループと同程度まであることが観察できるため、Ｇ７Ｐを経口投与することは有効なエストロゲン補充療法であり、骨粗鬆症の発生を抑制する効果があることを示している。本実施例においては、ラットに５．３３ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙのＧ７Ｐを経口投与することで骨粗鬆症の発生を抑制し、１０．６６ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙを経口投与することでその効果はより良いものとなった。
【００７８】
よって、体表面積正規化法に基づき、次に示す式によりヒトに適したＧ７Ｐの好ましい用量の範囲を求めることができる。
【数４】
2019099579.tif 000006
【数５】
2019099579.tif 000007
【００７９】
式中、ヒトの体表面積定数は３７であり、ラットの体表面積定数は６である。ヒトに適したＧ７Ｐの好ましい一日量の範囲は約０．８６ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙ〜約１．７３ｍｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.／ｄａｙである。
【００８０】
（５）骨応力への影響
【００８１】
骨量が減少すると、機械的強度が劇的に変化し、骨の最大負荷や弾力性が低下し、骨折や骨の破砕の危険性が高まる。本実施例の第１２週目におけるＳＨＡＭグループ、ＯＶＸグループ、Ｇ７Ｐグループ、Ｇ７Ｐ２Ｘグループ及びＥ２グループの生体力学的強度試験の結果は表１のとおりである。Ｇ７Ｐを経口投与したＧ７Ｐグループ及びＧ７Ｐ２Ｘグループは、卵巣摘出ラットにおける大腿骨の最大負荷エネルギーを有意に増加させ、そして弾性係数を偽手術（ＳＨＡＭ）グループと同様の水準まで大幅に増加させることができ、統計上も大きな差異は見られなかった。Ｇ７Ｐの投与は骨粗鬆症の発生を抑制し、骨量減少と関連する疾患の治療又は予防に対して大きな可能性を有する。
【表１】
2019099579.tif 000008
【００８２】
上述のとおり、本発明はこの治療を必要とする使用者に有効量のゲニステインリン酸コンジュゲートを含む組成物を投与することで、骨量減少と関連する疾病を治療又は予防し、骨ミネラル含量、骨密度及び生体力学的骨強度を高め、骨粗鬆症の発生を抑制することが可能である。
【００８３】
以上、本発明について詳細に説明したが、上述したのはあくまでも一実施形態であり、本発明は更に別の態様でも実施でき、その主旨を逸脱しない範囲で種々変更を加え得るものである。
【図１】
2019099579.tif 000009
【図２】
2019099579.tif 000010
【図３】
2019099579.tif 000011
【図４】
2019099579.tif 000012
【図５】
2019099579.tif 000013
【図６】
2019099579.tif 000014
【外国語明細書】
TITLE OF INVENTION
COMPOSITION FOR TREATMENT OR PREVENTION OF A DISEASE ASSOCIATED WITH A DECREASE IN BONE MASS AND COMPOSITION FOR IMPROVING BONE ARCHITECTURE AND BIO-MECHANICAL STRENGTH OF BONE
DETAILED DESCRIPTION OF INVENTION
BACKGROUND of the Invention
1. Technical Field
[0001]              The present invention relates to a composition for treatment or prevention of a disease associated with a decrease in bone mass and methods of improving bone architecture and bio-mechanical strength of bone. More particularly, the present invention relates to a composition for treatment or prevention of postmenopausal osteoporosis with genistein phosphate conjugate.
2. Description of Related Art
[0002]              In a normal adult, both bone resorption and bone formation are strictly controlled, so there is only a little change in total bone mass. However, if a patient suffering from diseases associated with decrease in bone mass, balance between bone resorption and bone formation is lost and lowering bone mass and deterioration of bone tissue occur. A representative disease associated with decrease in bone mass includes osteoporosis. Previous studies revealed that the epidemiology of osteoporosis vast majority occurs in postmenopausal woman and this type of osteoporosis is called postmenopausal osteoporosis. 
[0003]              The therapeutic approaches for the treatment or prevention of postmenopausal osteoporosis are multiple such as a dietary supplement or an actual medicine. While the most wide-spread therapy consists in estrogen replacement therapy (ERT). ERT can effectively delay the loss of bone density, however, it also increase the risk of tumors. Concerns regarding this risk, the use of soy isoflavones are significant increasing by postmenopausal woman who seek alternatives to ERT.
[0004]              Genistein, a phytoestrogen present in high concentrations in soy, possesses the most physiologically active chemical structure in soy isoflavones and is an ingredient in dietary supplements for reducing menopausal symptoms. Earlier researches considered that genistein has the potential to prevent menopausal symptoms and complications in postmenopausal woman. However, the efficacy of genistein in preventing menopause symptoms and complications, especially bone loss, in a recent, long-duration clinical trial was not significant.
[0005]              Alekel et al., “The Soy Isoflavones for Reducing Bone Loss (SIRBL) Study: a 3-y randomized controlled trial in postmenopausal woman”, American Journal of Clinical Nutrition 2010;91:218-30, studied the 3-y effect of 2 doses (80 and 120 mg/d) of isoflavones extracted from soybeans (the ratio of genistein to daidzein to glycitein (aglycone form) in these extracts was 1.3:1.0:0.3) on lumbar spine and total proximal femur BMD in at-risk postmenopausal woman and the results revealed that the extracted soy isoflavones did not show a bone-sparing effect, except for a modest effect at the femoral neck. Levis et al., “Soy Isoflavones in the Prevention of Menopausal Bone Loss and Menopausal Symptoms”, Archives Internal Medicine 2011;171(15):1363-1369, studied the efficacy of the same soy isoflavone extracts in preventing bone loss and menopausal symptoms and revealed that the daily administration of 200 mg of soy isoflavones for 2 years did not prevent bone loss or menopausal symptoms. Turner et al., “Genistein delivered as a once daily oral supplement had no beneficial effect on the tibia rat models for postmenopausal bone loss”, Menopause. 2013 Jun; 20(6): 677-686, investigated the long-term (5 months) effects of 3.2 mg/kg B.W. genistein, administered as a daily oral supplement for ovarietomized rats, but the treatment had no effect on bone mass, density or architecture in rats. As the aforesaid, the efficacy of genistein in preventing bone loss is not significant even an amount of genistein higher than that of FDA suggested (40-50 mg) was administrated. Therefore, what is needed in the art is a new composition or method for treating osteoporosis and promoting bone growth. Surprisingly, the present invention meets these and other needs. 
SUMMARY OF THE INVENTION
[0006]              To overcome foresaid drawback, the primary object of the present invention is to provide a composition for treatment or prevention of a disease associated with a decrease in bone mass comprising an effective amount of genistein phosphate conjugate for administering to a subject in need of such treatment. 
[0007]              Further, the effective amount of genistein phosphate conjugate of the composition is from about 0.5 mg/kg B.W./day to about 2.5 mg/kg B.W./day. In a preferable embodiment, the effective amount of genistein phosphate conjugate of the composition is from about 0.86 mg/kg B.W./day to about 1.73 mg/kg B.W./day. The aforesaid the effective amount of genistein phosphate conjugate of the composition is obtained according to the body-surface-area normalization method, and the range of the effective amount for human was defined by the following formula:
2019099579.tif 000015
[0008]              Further, the composition is administered orally.
[0009]              Further, the composition is administered at least once per day.
[0010]              Further, the composition is administered from 1 to 6 times in a 24 hour period so as to give a daily dosage of genistein phosphate conjugate of from about 0.5 to about 2.5 mg/kg B.W.
[0011]              Further, the composition is in a form of pills, tablets, capsules, granulates, syrups, vials or drops.
[0012]              Further, the composition further comprises one or more pharmaceutically acceptable adjuvants, carriers and/or excipients.
[0013]              Further, the disease is primary osteoporosis.
[0014]              Further, the primary osteoporosis is osteoporosis followed by aging, postmenopausal primary osteoporosis, or osteoporosis followed by ovariectomy.
[0015]              Further, the subject is mammal.
[0016]              Further, the mammal is human.
[0017]              Further, the human is female.
[0018]              Another object of the present invention is to provide a composition for improving bone architecture, wherein the composition comprising an effective amount of genistein phosphate conjugate for administering to a subject in need of such treatment.
[0019]              Still another object of the present invention is to provide a composition for increasing bio-mechanical strength of bone, wherein the composition comprising an effective amount of genistein phosphate conjugate for administering to a subject in need of such treatment.
[0020]              Further, the bone is femur.
[0021]              As above, comparing to the prior art, the present invention can reduce the symptoms and the risk of complications of menopausal women, increase bone mineral content, bone density and bio-mechanical strength of bone, and slow down osteoporosis through administering to a subject in need of such treatment a composition comprising an effective amount of genistein phosphate conjugate. 
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS 
[0022]              Fig. 1 is a line chart of weight gain of Example of the present invention.
[0023]              Fig. 2 is bar chart of uterus weight of Example of the present invention.
[0024]              Fig. 3 is a bar chart of BMD level of proximal femur of Example of the present invention.
[0025]              Fig. 4 is a bar chart of bone volume/ total volume of proximal femur of Example of the present invention.
[0026]              Fig. 5 is a 3D μ-CT scanning diagram of proximal femur o Example 1 of the present invention.
[0027]              Fig. 6 is an H&E staining diagram of rat distal femur slide of Example of the present invention.
DETAILED DESCRIPTION OF THE EMBODIMENT OF THE INVENTION 
[0028]              A detailed description and the technical contents of the present invention are given below with reference to the accompanying drawings. Furthermore, for easier illustrating, the drawings of the present invention are not a certainly the practical proportion and are not limited to the scope of the present invention.
[0029]              Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood to one of ordinary skill in the art to which this disclosure belongs. As used throughout the instant application, the following terms shall have the following meanings.
[0030]              The use of "or" means "and/or" unless stated otherwise. The use of "comprise" means not excluding the presence or addition of one or more other components, steps, operations, or elements to the described components, steps, operations, or elements, respectively. Similarly, "comprise," "comprises," "comprising" "include," "includes," and "including" are interchangeable and not intended to be limiting. As used herein and in the appended claims, the singular forms "a," "an," and "the" include plural referents unless the context dictates otherwise. The terms "a", "an," "the," "one or more," and "at least one," for example, can be used interchangeably herein.
[0031]              The present disclosure is directed to a method for treatment or prevention of a disease associated with a decrease in bone mass comprising administering to a subject in need of such treatment a composition comprising an effective amount of genistein phosphate conjugate or a composition for treatment or prevention of a disease associated with a decrease in bone mass, wherein the composition comprising an effective amount of genistein phosphate conjugate for administering to a subject in need of such treatment. Further, the present disclosure is also directed to a method of improving bone architecture comprising administering to a subject in need of such treatment of a composition comprising an effective amount of genistein phosphate conjugate or a composition for improving bone architecture, wherein the composition comprising an effective amount of genistein phosphate conjugate for administering to a subject in need of such treatment. Yet further, the present disclosure is also directed to a method of increasing bio-mechanical strength of bone comprising administering to a subject in need of such treatment of a composition comprising an effective amount of genistein phosphate conjugate or a composition for increasing bio-mechanical strength of bone, wherein the composition comprising an effective amount of genistein phosphate conjugate for administering to a subject in need of such treatment.
[0032]              The present invention also provides a composition useful for, but not limited to, treatment and/or prevention of bone diseases such as postmenopausal osteoporosis, primary osteoporosis, or symptoms for the loss of bone density, mass, or mineral content with the additional benefit of having significantly less harmful side effect. The present invention also provides a composition useful for change of bone architecture and bone bio-mechanical strength with the additional benefit of having significantly less harmful side effect. Preferably, the primary osteoporosis is osteoporosis followed by aging, postmenopausal primary osteoporosis, or osteoporosis followed by ovariectomy. 
[0033]              The term "subject" refers to mammals including, but not limited to, humans, non-human primates, sheep, dogs, rodents (e.g., mouse, rat, etc.), guinea pigs, cats, rabbits, cows, horses, and non-mammals including chickens, amphibians, and reptiles, who are at risk for or have been diagnosed with a condition that causes bone loss and benefits from the methods and compositions described herein. Preferably, the subject is human, and more preferably, the human is female.
[0034]              The term "treatment" as used herein is defined as maintaining or reducing the symptoms of a pre-existing condition when administered genistein phosphate conjugate compared to the same symptom in the subject prior to the administration of genistein phosphate conjugate to the subject.  The term “prevention” is defined as retarding the onset of a bone disease (e.g., bone loss) in a subject.
[0035]              “Genistein phosphate conjugate” (abbreviated as P-GEN in this disclosure) is a water-soluble and highly bioavailable compound. In the subject application, the genistein phosphate conjugate includes genistein 7-O-phophate (abbreviated as G7P in this disclosure, of the following formula (I)) and genistein 4’-O-phophate (abbreviated as G4’P in this disclosure, of the following formula (II). In certain embodiments, genistein phosphate conjugate was biotransformed from isoflavone by Bacillus subtilis var. natto BCRC 80517 (Bioresource Collection and Research Center, Taiwan), and the preparation method can be found in Hsu et al., Food Research International 53 (2013) 487-495. In certain embodiments, genistein phosphate conjugate is an effective pharmacological intervention to prevent and treatment the bone loss. In certain embodiments, genistein phosphate conjugate is used for delaying the loss of bone density, mass, and mineral content and retaining bone architecture so as to maintain the strength of bone mechanics such as maximal energy, and elastic modulus. In certain embodiments, genistein phosphate conjugate is an effective pharmacological intervention to prevent and treatment a disease associated with bone loss such as primary osteoporosis. More preferred the bone includes tibias and femurs.
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[0036]              In one embodiments, the effective amount of genistein phosphate conjugate of the method or the composition of the present invention is from about 0.5 mg/kg B.W./day to about 2.5 mg/kg B.W./day, for example: 0.5 mg/kg B.W./day, 0.6 mg/kg B.W./day, 0.7 mg/kg B.W./day, 0.8 mg/kg B.W./day, 0.9 mg/kg B.W./day, 1.0 mg/kg B.W./day, 1.1 mg/kg B.W./day, 1.2 mg/kg B.W./day, 1.3 mg/kg B.W./day, 1.4 mg/kg B.W./day, 1.5 mg/kg B.W./day, 1.6 mg/kg B.W./day, 1.7 mg/kg B.W./day, 1.8 mg/kg B.W./day, 1.9 mg/kg B.W./day, 2.0 mg/kg B.W./day, 2.1 mg/kg B.W./day, 2.2 mg/kg B.W./day, 2.3 mg/kg B.W./day, 2.4 mg/kg B.W./day, or 2.5 mg/kg B.W./day. In a preferable embodiment, the effective amount of genistein phosphate conjugate of the composition is from about 0.86 mg/kg B.W./day to about 1.73 mg/kg B.W./day, for example: 0.86 mg/kg B.W./day, 0.88 mg/kg B.W./day, 0.90 mg/kg B.W./day, 0.92 mg/kg B.W./day, 0.94 mg/kg B.W./day, 0.96 mg/kg B.W./day, 0.98 mg/kg B.W./day, 1.00 mg/kg B.W./day, 1.02 mg/kg B.W./day, 1.04 mg/kg B.W./day, 1.06 mg/kg B.W./day, 1.08 mg/kg B.W./day, 1.10 mg/kg B.W./day, 1.12 mg/kg B.W./day, 1.14 mg/kg B.W./day, 1.16 mg/kg B.W./day, 1.18 mg/kg B.W./day, 1.20 mg/kg B.W./day, 1.22 mg/kg B.W./day, 1.24 mg/kg B.W./day, 1.26 mg/kg B.W./day, 1.28 mg/kg B.W./day, 1.30 mg/kg B.W./day, 1.32 mg/kg B.W./day, 1.34 mg/kg B.W./day, 1.36 mg/kg B.W./day, 1.38 mg/kg B.W./day, 1.40 mg/kg B.W./day, 1.42 mg/kg B.W./day, 1.44 mg/kg B.W./day, 1.46 mg/kg B.W./day, 1.48 mg/kg B.W./day, 1.50 mg/kg B.W./day, 1.52 mg/kg B.W./day, 1.54 mg/kg B.W./day, 1.56 mg/kg B.W./day, 1.58 mg/kg B.W./day, 1.60 mg/kg B.W./day, 1.62 mg/kg B.W./day, 1.64 mg/kg B.W./day, 1.66 mg/kg B.W./day, 1.68 mg/kg B.W./day, 1.70 mg/kg B.W./day, 1.72 mg/kg B.W./day, or 1.73 mg/kg B.W./day. In each of these aspects, administration may be via oral administration, injection including intramuscular or subcutaneous injection, transdermal or transcutaneous routes or via nasal administration.  In a preferable embodiment, the administration strategy of the method of the present invention is administered orally. In a preferable embodiment, the administration strategy of the method of the present invention is administered at least once per day. 
[0037]              In alternative embodiments, the effective amount to be administered can be dependent on any number of variables, including without limitation, the species, breed, size, height, weight, age, overall health of the subject, the type of formulation, the mode or manner or administration, or the severity of the osteoporosis. 
[0038]              In one embodiment, the method or the composition of the present invention comprises one or more orally deliverable dose units comprising genistein phosphate conjugate in an amount from about 0.5 mg to about 15 mg and one or more pharmaceutically acceptable adjuvants, carriers and/or excipients. 
[0039]              "Excipient" as used herein includes any substance formulated alongside genistein phosphate conjugate of the composition, used as a vehicle for delivery of genistein phosphate conjugate to a subject. The excipients might aid in lubricity, flowability, disintegration, taste and may confer some form of antimicrobial function or to permit the composition to be formed into an orally deliverable dose unit having the desired shape and consistency. 
[0040]              "Adjuvant" as used herein refers to a substance that modifies the effect of genistein phosphate conjugate of the composition.
[0041]              "Orally deliverable dose unit" as used herein refers to a dose unit of a therapeutical composition intended to be administered to the gastrointestinal tract of a subject via the mouth of the subject. In one embodiment, the dose unit can be in the form of pills, tablets, capsules, bulk powders, granulates, solutions, syrups, suspension, vials or drops. The method of the present invention can be a periodic administration of unit doses, for example: one unit dose once to multiple times a day, one with each meal, or one every four hours or other interval. 
[0042]              "Unit dose" as used herein refers to an amount of genistein phosphate conjugate of the composition intended for a single administration to treat a subject. In certain embodiments, the unit dose of genistein phosphate conjugate of the composition of the present invention is from about 1 mg to about 350 mg, for example: 1.0 mg, 1.5 mg, 2.0 mg, 2.5 mg, 3.0 mg, 3.5 mg, 4.0 mg, 4.5 mg, 5.0 mg, 5.5 mg, 6.0 mg, 6.5 mg, 7.0 mg, 7.5 mg, 8.0 mg, 8.5 mg, 9.0 mg, 9.5 mg, 10.0 mg, 10.5 mg, 11.0 mg, 11.5 mg, 12.0 mg, 12.5 mg, 13.0 mg, 13.5 mg, 14.0 mg, 14.5 mg, 15.0 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 120 mg, 140 mg, 150 mg, 160 mg, 180 mg, 200 mg, 220 mg, 240 mg, 250 mg, 260 mg, 280 mg, 300 mg, 320 mg, 340 mg, or 350 mg.
[0043]              In alternative embodiments, the composition of the present invention is formulated for injection into a subject because the high solubility of genistein phosphate conjugate. For injection, the composition can be formulated in aqueous solutions such as water or alcohol, or in physiologically compatible buffers such as Hanks's solution, Ringer's solution, or physiological saline buffer. The solution can contain formulatory agents such as suspending, stabilizing and/or dispersing agents. Injection formulations can also be prepared as solid form preparations which are intended to be converted, shortly before use, to liquid form preparations suitable for injection, for example, by constitution with a suitable vehicle, such as sterile water, saline solution, or alcohol, before use.
[0044]              In one embodiment, the method of the present invention is to administer the composition from 1 to 6 times in a 24 hour period so as to give a daily dosage of genistein phosphate conjugate of from about 0.5 to about 2.5 mg/kg B.W.  In other aspects, the composition of the present invention can be incorporated into foodstuffs, medication, or additional potable, ingestible, or edible compositions.
[0045]              "Bone architecture" as used herein refers to the overall shape and geometry of bone as well as the differentiation into trabecular and cortical bone. The parameters describing architecture can be cortical thickness, bone mass, bone mineral density (BMD), trabecular bone volume, and trabecular number. "Bio-mechanical strength of bone" used herein refers to mechanical properties which are correlated with many strength criteria, for example, deformation rate during testing, density, variations in different regions of the bone. The evaluation for the degree of biomechanical test can be maximal load, maximal energy, fracture load, and Young’s modulus or elastic modulus (E).
[0046]              "Trabecular bone" as used herein makes up the inner layer of bone and is characterized by a lattice-like matrix network (called trabeculae) that gives it its spongy appearance. "Cortical bone" as used herein forms the cortex, or outer shell, of the bones. Cortical bone is much denser than trabecular bone and contributes about 80% of the weight of a human skeleton. However, the imbalance in bone formation and resorption (or called bone remodeling) has effects on trabecular bone (loss of connectivity) and cortical bone (cortical thinning and porosity).
[0047]              The "ovariectomized rat model" is most commonly used in research on postmenopausal osteoporosis. After ovariectomy, bone resorption exceeds bone formation initially, causing bone loss. Soon thereafter, bone remodeling reaches a steady state, where resorption and formation are balanced.
[0048]              The present invention is more detailed illustrated by the example embodiments as below. While example embodiments are disclosed herein, it should be understood that they are used for illustrating the present invention, not for limiting the scope of the present invention.
EXAMPLES
A. Methods 
(1) Experimental animal 
[0049]              12-week-old female Wistar rats were used. All of experimental rats were purchased from BioLASCO Taiwan Co., Ltd. The rats were housed in the Experimental Animal Center of Taipei Medical University. The animal room was maintained under temperature of 21-24 ℃, relative humidity of 30-70%, and 12 hours of automatic light for alternating dark and bright. During the experimental periods, the animals were given adequate drinking water and fed with standard feed. The feeding and surgery were in accordance with the regulations of the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of Taipei Medical University.
(2) Ovariectomy and sham surgery
[0050]              For ovariectomy rats, bilateral ovariectomy surgery was conducted at 12-week-old under anesthesia with Zoletil 50 (Tiletamine 20-40 mg/kg + Zolazepam 5-10 mg/kg) and Rompun, following the FDA Guidelines and Animal Models for Osteoporosis. For sham surgery rats, set as control group, the surgery performed surgical incision without removing the ovaries was also conducted at 12-week-old under anesthesia with Zoletil 50 (Tiletamine 20-40 mg/kg + Zolazepam 5-10 mg/kg) and Rompun. After ovariectomy surgery, 24 rats of ovariectomy group were randomly divided into 4 groups, namely, 6 rats in each group. After 2 weeks of surgery, the rats were oral administered once a day with different samples based on their groups. The rats were weighed once a week as the basis for the dose of administration for 12 weeks and the weight data were recorded. Finally, when sacrificed, the ovarian of the rats were checked to determine whether the ovariectomy surgery was successful or not, wherein the data of failed ovariectomy rat(s) would be eliminated.
(3) Experimental periods
[0051]              According to FDA guidelines and previous research, bone structures would change obviously within 12 weeks after ovariectomy surgery (FDA Guidelines and Animal Models for Osteoporosis 1995; International Journal of Experimental Pathology 2009, 90(5), 512-519).
(4) Dosage 
[0052]              The FDA states that 25 g of soy protein (equal to 40~50 mg of isoflavones) per day with a diet low in saturated fat and cholesterol may reduce the heart disease. Most of the dosages of soy isoflavones dietary supplements on the market are ranged in 40~60 mg/day. Therefore, 40 mg/day of G7P in human is regarded as reference dosage. According to the body-surface-area normalization method, the dosage of G7P for rats was defined by the following formula:
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.                                                                          
In one embodiment, the daily recommendation of isoflavone is 40 mg/day, general female human body weight is 60 kg, human body-surface-area constant is 37, rat body-surface-area constant is 6, G7P MW is about 350, and genistein MW is about 270 in the above formula. Applying theses values in the above formula gives the following:
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Therefore, the daily dosage of G7P used in this example was 5.33 mg/kg/day.
(5) Administration and grouping
[0053]              Total 30 rats were grouped into following 5 groups (i.e., “SHAM”, “OVX”, “G7P”, “G7P2X”, “E2”).
a. SHAM group: sham surgery rats, set as control group, fed with sterile water by oral gavage; 
b. OVX group: ovariectomized rats, set as negative control, fed with sterile water by oral gavage;
c. G7P group: ovariectomized rats, administered with 5.33 mg/kg B.W. G7P solution once per day by oral gavage, wherein the dosage was equal to 40 mg/day of the amount of soy isoflavones for adult; 
d. G7P2X group: ovariectomized rats, administered with 10.66 mg/kg B.W. G7P once per day by oral gavage, wherein the dosage was equal to 80 mg/day of the amount of soy isoflavones for adult;
e. E2 group: ovariectomized rats, set as positive control, administered with 200 μg/kg B.W. 17-β estradiol once per day by tube feeding. 
(6) bone index test
[0054]              At week 0, 3, 6, 9 and 12 of the experimental period, in vivo micro-CT scan were conducted on the caput femoris of right leg of the rats by animal CT scanner system SkyScan 1176 to obtain the 3D tomography image. The obtained 3D tomography images were further analyzed by software so as to obtain bone index data. The data include bone mineral density (BMD) and bone volume-to-total volume ratio (bone volume/total volume, BV/TV, %).
(7) Sacrifice and sample collection
[0055]              After sacrificed the rats, tibias and femurs were collected for the detection of bone density and bone stress. Further, uteruses were collected and weighed after removing the surrounding fat, and the weight data was recorded.
(8) Bone mechanics analysis
[0056]              The bio-mechanical strength of femur was measured using bio-mechanical testing instrument (RT1-TST, Royalty Tec.Ins. Ltd) after removing the soft tissue of left leg. First, the length of the femur was measured by the electronic vernier and the mid-position of the femur was set so as to be the scale standard which must be aligned when compressing the vertical physical strength of the femur by the bone stress meter. The femur was kept moist with physiological saline and fixed on a test bench for a three-point bending test. The motor revolution speed of the bone stress meter was set at 0.05 mm/sec. After the femur was compressed to fracture, the parameters of the bone mechanics analysis obtained by the test system were as follows:
a. maximal load: the force converted from the maximum weight of the record, the unit is Newton;
b. maximal energy: the area integratal under the record curve, the unit is mJ;
c. fracture load;
d. Young’s modulus or elastic modulus (E).
(9) Histopathological observation
[0057]              The bone tissue of the caput femoris of right leg was fixed with para-formaldehyde after removing the soft tissue around the femur, and conducted decalcification by acid and then embedded in paraffin. The sample was sliced by a tissue microtome (slitting: circular section) to form slices having the thickness of 2 μm. The slices were adhered to a slide and stained with H&E and then the slide was fixed for bone histopathological observation.
(10) Statistical Analysis
[0058]              Animal experiment data was analyzed with linear model for variance analysis and the differences between the groups were determined by Student’s t-test. The data was showed in mean ± standard deviation (Mean ± SD).
B. Results
(1) Weight changes 
[0059]              The ovariectomized rat model simulated the physiological condition of menopause women which could be a platform to observe osteoporosis. Generally, organisms would gain weight if lacking of estrogen for a long time. As shown in Fig. 1, the same phenomenon was observed in all ovariectomized groups. The body weight of the ovariectomized rats increased significantly in 2 weeks after ovariectomy compared to that of the SHAM group. Furthermore, the ovariectomized rats gained weight with the experimental period, and the weight of the heaviest G7P group showed almost 400 g at week 12 after the surgery. At week 3, the rats in the E2 group began to be lighter than other ovariectomized groups, i.e. the OVX group, the G7P group, and the G7P2X group; at week 12, the weight of the E2 group were much lower than that of other ovariectomized groups. The result showed that oral administration of high dose of estrogen could reduce the weight gain caused by the deficiency of estrogen, but administration of G7P, i.e. the G7P group and the G7P2X group, did not reverse the weight gain. 
(2) uterus development
[0060]              Previous studies revealed that, after removing the ovary, uterus atrophying occurs rapidly due to estrogen insufficiency. The weights of uterus of each group at the end of the experiment are showed in fig. 2. After 12 weeks of ovariectomized surgery, the uterus weight of the ovariectomized rats was significantly lower than that of the sham surgery rats. Specifically, the uterus weight of the ovariectomized rats was almost a quarter of the normal uterus weight value, showing that the ovariectomy has been successfully done. Furthermore, all treatment in ovariectomized groups did not have any significant effect on the weight and the appearance of the atrophied uterus.
(3) Bone mineral density and volume changes
[0061]              The BMD of each group at week 12 is shown in Fig. 3. The result showed that the BMD of the SHAM group increased normally with the experimental time, and the BMD reached about 1.14 g/cm2 at week 12. However, the BMD of the OVX group was only about 0.03 g/cm2. Obviously, all of the BMD level of the G7P group, the G7P2X group, and the E2 group were significantly higher than that of the OVX group, indicating that oral administration of G7P (the G7P group and the G7P2X group) was able to inhibit bone mineral loss and maintain BMD in the trial and generated similar effects as oral administration of 17-β estradiol of 200 μg/kg B.W. (the E2 group). 
[0062]              As shown in Fig. 4, the BV/TV of the OVX group was lowest in the groups. Furthermore, the BV/TV of the G7P group, the G7P2X group, and the E2 group were higher than that of the OVX group with statistical significance, wherein the BV/TV of the G7P2X group was slightly higher than that of the G7P group and the E2 group. As a result, oral administration of G7P maintained bone volume after ovariectomy and generated substantially the same effect as oral administration of estradiol. 
(4) Osteoblastic change and trabecular bone development
[0063]              Fig. 5 shows the bone structure of the μCT 3D imaging diagram, wherein the number represents different individual experimental animal in each group. The result showed that the SHAM group had a dense distribution of trabecular structure near the caput femoris, and the range of the distribution was wider than other groups. Comparing to the SHAM group, the OVX group showed a depleted trabecular structure, especially, the meshwork of trabecular structure was almost loss at the caput femoris. In the G7P group and the G7P2X group, both of the trabecular structures were much integrated than that of the OVX group and the amount of the trabecular structures were significantly improved. Therefore, oral administration of G7P retards bone resorption and is an effectively dietary supplement for reducing bone loss. Comparing to the G7P group, a wide but loose trabecular distribution was observed in the positive control E2 group. Consequently, both oral administration of G7P and estradiol can maintain the trabecular structure of femur, but the remaining femur structures in the E2 group was significantly different from those in the G7P group in morphology.
[0064]              The result of histopathological observation is shown in Fig. 6. In the SHAM group, rich mineral (deep red) and dense trabecular meshwork (pink) were clearly observed in the bone tissue. There were also a certain number of osteoblasts under the growth plate, showing a strong bone formation activity in the SHAM group. Resorption in bone tissue, serious mineral loss, dispersed trabecular tissue with fragmented shape, and rare bone formation activity were observed in the OVX group. Bone mineral retention and trabecular bone density were good in the G7P group and G7P2X group, and osteoblasts can be observed around the growth plate. The retarding effects of bone loss observed in the tissue section slide in the G7P group and G7P2X group were the similar to that of the E2 group. As a result, oral administration of G7P is an effective alternative to estrogen therapy. In this embodiment, 5.33 mg/kg B.W./day of G7P retards the occurrence of osteoporosis and 10.66 mg/kg B.W./day of G7P presents better effect.
[0065]              Therefore, according to the body-surface-area normalization method, the preferred dosage range of G7P for human was calculated by the following formulas:
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Wherein human body-surface-area constant is 37, rat body-surface-area constant is 6 in the above formula. The obtained preferred daily dosage range of G7P for human is from about 0.86 mg/kg B.W./day to about 1.73 mg/kg B.W./day.
(5) Bone stress
[0066]              Bone loss causes a dramatic change in the mechanical strength and increases the risk of fracture or fragmentation of bone, even reducing the maximal load and the elasticity of bone. The result of the bio-mechanical strength test of the SHAM, OVX, G7P, G7P2X, and E2 groups at week 12 is shown in Table 1. The oral administration of G7P, i.e. the G7P group and the G7P2X, significantly increases the maximal energy of femur on the ovariectomized rats, and greatly increases the elastic modulus to the same level (no statistical significant difference) of the SHAM group. As a result, administration of G7P retards the occurrence of osteoporosis and has great potential to the treatment or prevention of a disease associated with a decrease in bone mass.
Table 1
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[0067]              In conclusion, through administering to a subject in need of such treatment a composition comprising an effective amount of genistein phosphate conjugate, a disease associated with a decrease in bone mass can be prevented or treated, i.e. increasing bone mineral content, bone density and bio-mechanical strength of bone, and slowing down osteoporosis. 
[0068]              The present invention is more detailed illustrated by the above preferable example embodiments. While example embodiments have been disclosed herein, it should be understood that other variations may be possible. Such variations are not to be regarded as a departure from the spirit and scope of example embodiments of the present application, and all such modifications as would be obvious to one skilled in the art are intended to be included within the scope of the following claims.
WHAT IS CLAIMED IS:
1.        A composition for treatment or prevention of a disease associated with a decrease in bone mass, wherein the composition comprising an effective amount of genistein phosphate conjugate for administering to a subject in need of such treatment.
2.        The composition of Claim 1, wherein the effective amount of genistein phosphate conjugate of the composition is from about 0.5 mg/kg B.W./day to about 2.5 mg/kg B.W./day.
3.        The composition of Claim 2, wherein the effective amount of genistein phosphate conjugate of the composition is from about 0.86 mg/kg B.W./day to about 1.73 mg/kg B.W./day.
4.        The composition of Claim 2, wherein the composition is administered orally.
5.        The composition of Claim 2, wherein the composition is administered at least once per day.
6.        The composition of Claim 5, wherein the composition is administered from 1 to 6 times in a 24 hour period so as to give a daily dosage of genistein phosphate conjugate of from about 0.5 to about 2.5 mg/kg B.W.
7.        The composition of Claim 4, wherein the composition is in a form of pills, tablets, capsules, granulates, syrups, vials or drops.
8.        The composition of Claim 1, wherein the composition further comprises one or more pharmaceutically acceptable adjuvants, carriers and/or excipients.
9.        The composition of Claim 1, wherein the disease is primary osteoporosis.
10.    The composition of Claim 9, wherein the primary osteoporosis is osteoporosis followed by aging, postmenopausal primary osteoporosis, or osteoporosis followed by ovariectomy.
11.    The composition of Claim 10, wherein the subject is mammal.
12.    The composition of Claim 11, wherein the mammal is human.
13.    The composition of Claim 12, wherein the human is female.
14.    A composition for improving bone architecture, wherein the composition comprising an effective amount of genistein phosphate conjugate for administering to a subject in need of such treatment.
15.    The composition of Claim 14, wherein the effective amount of genistein phosphate conjugate of the composition is from about 0.5 mg/kg B.W./day to about 2.5 mg/kg B.W./day.
16.    The composition of Claim 15, wherein the subject is human.
17.    A composition for increasing bio-mechanical strength of bone, wherein the composition comprising an effective amount of genistein phosphate conjugate  for administering to a subject in need of such treatment.
18.    The composition of Claim 17, wherein the subject is human.
19.    The composition of Claim 18, wherein the human is female.
20.    The composition of Claim 19, wherein the bone is femur.
ABSTRACT
The present invention provides a composition for treatment or prevention of a disease associated with a decrease in bone mass, wherein the composition comprising an effective amount of genistein phosphate conjugate for administering to a subject in need of such treatment. The present invention also provides a composition for improving bone architecture and bio-mechanical strength of bone, wherein the composition comprising an effective amount of genistein phosphate conjugate for administering to a subject in need of such treatment. The composition of the present invention can effectively increase the oral bioavailability so as to reduce the symptoms and the risk of complications of menopausal women, increase bone mineral content, bone density and bio-mechanical strength of bone, and slow down osteoporosis.
Fig.1
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Fig.2
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Fig.3
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Fig.4
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Fig.5
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Fig.6
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