(57)【要約】      （修正有）【課題】色素沈着された実際の皮膚に近接するように模写された人工皮膚、及びその製造方法の提供。【解決手段】角化細胞だけを用いて色素沈着を示す人工皮膚を製造する方法であって、線維芽細胞およびコラーゲンを混合して真皮模写層を形成する段階、前記真皮模写層上に角化細胞を適用した後に培養する段階、前記真皮模写層を角化細胞培地である第１培地で培養する段階、そして前記第１培地で培養された真皮模写層をＤＭＥＭ培地およびＦ１２培地が混合された第２培地で培養する段階を含む人工皮膚製造方法。【選択図】図１
2019010089.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維芽細胞およびコラーゲンを混合して真皮模写層を形成する段階、
前記真皮模写層上に角化細胞を適用した後に培養する段階、
前記真皮模写層を角化細胞培地である第１培地で培養する段階、そして
前記第１培地で培養された真皮模写層をＤＭＥＭ培地およびＦ１２培地が混合された第２培地で培養する段階
を含む
人工皮膚製造方法。
【請求項２】
前記角化細胞は、メラニン形成細胞の幹細胞を含む、請求項１に記載の人工皮膚製造方法。
【請求項３】
前記第２培地は、前記メラニン形成細胞の幹細胞の分化を誘導する成分を含有する、請求項２に記載の工皮膚製造方法。
【請求項４】
前記第１培地は、前記真皮模写層の下面に接触するように設けられ、当該真皮模写層において前記第１培地が設けられた面の反対面は空気に露出させる、請求項１に記載の人工皮膚製造方法。
【請求項５】
前記第２培地での培養段階は、前記第１培地での培養段階が終結した後直ちに続いて行われる、請求項１に記載の人工皮膚製造方法。
【請求項６】
前記第１培地での培養期間および前記第２培地での培養期間の合算は、２０日以内である、請求項１に記載の人工皮膚製造方法。
【請求項７】
前記第１培地での培養期間は、前記第２培地での培養期間と比較して長いかまたは同じである、請求項６に記載の人工皮膚製造方法。
【請求項８】
前記第２培地は、前記ＤＭＥＭ培地および前記Ｆ１２培地が１：１乃至４：１の比率で混合されたものである、請求項１に記載の人工皮膚製造方法。
【請求項９】
前記第２培地は、ヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、トリヨードサイロニン（Ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）、コレラ毒素（Ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ）、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）および塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の中から選択される一つまたは二つ以上をさらに含む、請求項１に記載の人工皮膚製造方法。
【請求項１０】
前記第２培地での培養段階は、前記第１培地で培養された真皮模写層が空気に露出された状態で行われる、請求項１に記載の人工皮膚製造方法。
【請求項１１】
真皮模写層および前記真皮模写層上に位置する表皮模写層を含む人工皮膚であって、
前記表皮模写層は、前記真皮模写層に隣接している表皮基底層部分および空気中に露出されている角質層部分を含み、
前記角質層部分には角化細胞が存在すると共に、前記表皮基底層部分にはメラニン形成細胞が存在し、これら角質層部分に存在する角化細胞と前記表皮基底層部分に存在するメラニン形成細胞とは、同一ヒト由来のものである
人工皮膚。
【請求項１２】
色素化調整剤の効能評価方法であって、
請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の方法により製造された人工皮膚、または請求項１１に記載の人工皮膚に、前記色素化調整剤を適用する段階、そして
前記色素化調整剤が適用された人工皮膚の色素沈着程度と前記色素化調整剤が適用されていない人工皮膚の色素沈着程度とを比較する段階
を含む
色素化調整剤の効能評価方法。
【請求項１３】
前記色素化調整剤は、前記人工皮膚と直接接触により適用される、請求項１２に記載の色素化調整剤の効能評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本記載は、人工皮膚を製造する方法に関する。本記載は、具体的に皮膚色素沈着が示された人工皮膚の製造方法を提供する。また、本記載は、角化細胞とメラニン形成細胞を全て含む人工皮膚を提供する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、身体の外部を覆っている器官で、外側から表皮、真皮および皮下脂肪層の３つの層から構成されている。表皮は、重層扁平上皮の角化細胞が大部分を占めている。コラーゲン線維と弾力線維のような基質蛋白質からなる真皮は、表皮の下に位置し、真皮には血管、神経、汗腺などがある。皮下脂肪層は、脂肪細胞から構成されている。皮膚は、前記のような多様な細胞と構成物質が相互作用してその形態を維持し、体温調節と外部環境に対する障壁としての機能など多様な機能を有する。
【０００３】
人工皮膚（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｓｋｉｎ）は、皮膚細胞と皮膚構成物質であるコラーゲン、エラスチンなどを利用して３次元的に前記のような皮膚を再構成したものであって、生きている線維芽細胞と角化細胞から構成されて実際の皮膚と類似する構造的、機能的特性を示すため、皮膚模写体（ｓｋｉｎ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔまたはｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ  ｓｋｉｎ）とも呼ばれる。人工皮膚は、主に皮膚と弾力、強度、物質透過などにおいて類似する物性を示す高分子複合体で、皮膚のような生命現象を示さないという点で差異がある。人工皮膚は、火傷、外傷など損傷を受けた皮膚の代替（永久生着型）または再生（一時被覆型）のために利用されるだけでなく、皮膚生理研究、皮膚刺激評価、皮膚効能評価など多様な領域で利用されている。
【０００４】
色素沈着が誘導された人工皮膚モデルは、例えば化粧品の美白効能評価に用いられ得る。皮膚の色素沈着は、表皮内メラニン色素の存在に主に起因するが、メラニンは表皮の基底層に位置する樹状細胞であるメラニン形成細胞により合成される。従来知られた色素沈着人工皮膚は、角化細胞とメラニン形成細胞をそれぞれ分離培養した後、これを共にシーディング（ｃｏ−ｓｅｅｄｉｎｇ）して培養することによって表皮層の発達を誘導させる方法を利用した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
表皮層を形成するに当たり、角化細胞とメラニン形成細胞をそれぞれ分離培養した後、これらを再び共にシーディング（ｃｏ−ｓｅｅｄｉｎｇ）する方法は、人工皮膚製作過程を複雑にすることがある。また、実質的に角化細胞とメラニン形成細胞を共に培養できる培養条件を設定することは難しいため、最終の人工皮膚モデルでメラノサイトが良好に存在しなくなって正常的な色素沈着人工皮膚モデルとして機能し難いという問題点があった。
【０００６】
そこで、一実施形態による人工皮膚製造方法は、角化細胞だけを用いて色素沈着を示す人工皮膚を製造することによって、色素沈着された実際の皮膚にさらに近接するように模写された人工皮膚を提供することにその目的がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一実施形態によれば、線維芽細胞およびコラーゲンを混合して真皮模写層を形成する段階、前記真皮模写層上に角化細胞を適用した後に培養する段階、前記真皮模写層を角化細胞培地である第１培地で培養する段階、そして前記第１培地で培養された真皮模写層をＤＭＥＭ培地およびＦ１２培地が混合された第２培地で培養する段階を含む人工皮膚製造方法を提供する。
【０００８】
前記角化細胞は、メラニン形成細胞の幹細胞を含んでもよい。
【０００９】
前記第２培地は、前記メラニン形成細胞の幹細胞の分化を誘導する成分を含有してもよい。
【００１０】
前記第１培地は、前記真皮模写層の下面に接触するように設けられ、当該真皮模写層において前記第１培地が設けられた面の反対面は空気に露出させるものであってもよい。
【００１１】
前記第２培地での培養段階は、前記第１培地での培養段階が終結した後直ちに続いて行われてもよい。
【００１２】
前記第１培地での培養期間および前記第２培地での培養期間の合算は、２０日以内であってもよい。
【００１３】
前記第１培地での培養期間は、前記第２培地での培養期間と比較して長いかまたは同じであってもよい。
【００１４】
前記第２培地は、前記ＤＭＥＭ培地および前記Ｆ１２培地が１：１乃至４：１の比率で混合されたものであってもよい。
【００１５】
前記第２培地は、ヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、トリヨードサイロニン（Ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）、コレラ毒素（Ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ）、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）および塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の中から選択される一つまたは二つ以上をさらに含んでもよい。
【００１６】
前記第２培地での培養段階は、前記第１培地で培養された真皮模写層が空気に露出された状態で行われてもよい。
【００１７】
他の実施形態によれば、真皮模写層および前記真皮模写層上に位置する表皮模写層を含む人工皮膚であって、前記表皮模写層は、前記真皮模写層に隣接している表皮基底層部分および空気中に露出されている角質層部分を含み、前記角質層部分には角化細胞が存在すると共に、前記表皮基底層部分にはメラニン形成細胞が存在し、これら角質層部分に存在する角化細胞と前記表皮基底層部分に存在するメラニン形成細胞とは、同一ヒト由来のものである人工皮膚を提供することができる。
【００１８】
また他の一実施形態によれば、前述の製造方法により製造された人工皮膚、または前述の構造の人工皮膚に、色素化調整剤を適用する段階、そして前記色素化調整剤が適用された人工皮膚の色素沈着程度と前記色素化調整剤が適用されていない人工皮膚の色素沈着程度とを比較する段階を含む色素化調整剤の効能評価方法を提供することができる。
【００１９】
前記色素化調整剤は、前記人工皮膚と直接接触により適用されてもよい。
【発明の効果】
【００２０】
一実施形態による製造方法は、角化細胞の間に存在するメラニン形成細胞の幹細胞の分化を誘導することによって、メラニン形成細胞を用いることなく色素沈着を示す人工皮膚を製造することができる。前記製造方法により製造された人工皮膚は、実際の皮膚にさらに近接するようになって皮膚美白評価用モデルとして用いる場合、信頼性が向上した評価データを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、一実施形態による人工皮膚製造方法を説明するためのフローチャートである。
【図２】図２は、実施例１で得られた人工皮膚の断面であって、ＨＥ組織染色した後の顕微鏡写真である。
【図３】図３は、比較例１で得られた人工皮膚の断面であって、ＨＥ組織染色した後の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の実施形態について本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施することができるように詳細に説明する。しかし、本発明は、多様な異なる形態に実現することができ、ここで説明する実施形態に限定されない。
【００２３】
本明細書で「人工皮膚（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｓｋｉｎ）」とは、皮膚細胞と皮膚構成物質であるコラーゲンなどを利用して３次元的に皮膚を再構成したものを意味し、実際の皮膚と類似する構造的、機能的特性を示す高分子複合体であれば全て含む、最広義の意味である。
【００２４】
本明細書で層、膜、領域、板などの部分が他の部分の「上」にあるという時、これは他の部分の「直上」にある場合だけでなく、その中間にまた他の部分がある場合も含む。反対に、ある部分が他の部分の「直上」にあるという時には中間にまた他の部分がないことを意味する。
【００２５】
以下、一実施形態による人工皮膚製造方法について図１を参照して説明する。
【００２６】
図１は、一実施形態による人工皮膚製造方法を説明するためのフローチャートである。
【００２７】
図１を参照すると、一実施形態による人工皮膚製造方法は、真皮模写層を形成する段階（Ｓ１）、前記真皮模写層上に角化細胞を適用した後に培養する段階（Ｓ２）、前記真皮模写層を第１培地で培養する段階（Ｓ３）、そして前記第１培地で培養された真皮模写層を第２培地で培養する段階（Ｓ４）を含む。
【００２８】
まず、真皮模写層を形成する段階（Ｓ１）を説明する。
真皮（ｄｅｒｍｉｓ）は、連結組織からなる表皮下の皮膚層で、緩衝作用をして身体を圧力と張力（ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｓｔｒａｉｎ）から保護する。真皮は、基底膜（ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通じて表皮と固く連結されている。真皮は、その構造に内在している血管、神経などの多様な付属物を支持する基質を供給する。
【００２９】
前記真皮模写層は、実際の皮膚との人体相関性の観点で線維芽細胞およびコラーゲンを混合した材料を用いて形成する。前記真皮模写層は、２層以上から構成してもよく、例えば含んでもよく、コラーゲンを含有する第１真皮層および線維芽細胞を含有する第２真皮層に分けて構成してもよい。この場合、人工皮膚の真皮収縮現象をさらに緩和することができる。
【００３０】
前記第１真皮層は、コラーゲンを含有してもよく、エラスチン（Ｅｌａｓｔｉｎ）、キトサン（Ｃｈｉｔｏｓａｎ）、グリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ;ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ）、ヒアルロン酸（ＨＡ;ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）のような真皮を構成する細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）をさらに含有してもよい。
【００３１】
前記第２真皮層は、前記第１真皮層の上部に位置してもよく、線維芽細胞を含有し、エラスチン（Ｅｌａｓｔｉｎ）、キトサン（Ｃｈｉｔｏｓａｎ）、グリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ;ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ）、ヒアルロン酸（ＨＡ;ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）のような真皮を構成する細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）をさらに含有してもよい。
【００３２】
使用されるコラーゲンは、ウシ由来、ラット尻尾からまたは魚類から、または天然コラーゲンまたは遺伝工学により生成されたコラーゲン中の任意の他の由来のコラーゲンであってもよいが、これは線維芽細胞の存在下で収縮することができる。
【００３３】
真皮模写層の厚さは、一般に０．０５ｃｍ以上、特にほぼ０．０５乃至２ｃｍであるが、本発明による人工皮膚の有利な特性に損傷を与えない限り増加または減少することができる。
【００３４】
前述のように線維芽細胞およびコラーゲンを混合した材料を用いて真皮模写層を製作した後、例えば約５日乃至９日、約６日乃至約８日、または約７日間培養することができる。
【００３５】
真皮模写層が形成されるとその上に角化細胞を適用した後に培養する段階（Ｓ２）を経る。
【００３６】
角化細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）は、表皮層細胞の約８０％乃至９０％を構成し、表皮層の最も深い層である基底層での有糸分裂を通じて形成された後、皮膚表面に向かって上層へ上がってくる。
【００３７】
角化細胞を適用した後に培養する段階（Ｓ２）は、人工皮膚の表皮模写層を形成するための第１段階として、ここで使用される角化細胞は、例えばヒト由来の角化細胞であってもよい。前記角化細胞は、商用の如何なる角質細胞でも用いることができ、ヒトから直接分離または分離した後に培養された角化細胞だけでなく、他の細胞から誘導された角化細胞も使用可能である。商業的に入手可能なヒト角化細胞としては、ロンザ社（Ｌｏｎｚａ）が提供するＮＨＥＫ−Ｎｅｏ、Ｐｏｏｌｅｄ（Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ、Ｐｏｏｌｅｄ：製品番号００１９２９０６、組織取得番号Ｐ８６７、白人ら）、ＮＨＥＫ−Ｎｅｏ（製品番号００１９２９０７、組織取得番号：２０６４７、白人）、ＮＨＥＫ−Ａｄｕｌｔ（製品番号００１９２６２７、組織取得番号：２１１５５、白人）、ＮＨＥＫ−Ｎｅｏ（製品番号００１９２９０７、組織取得番号：１８０８０、黒人）が挙げられる。そして、サーモフィッシャー社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）が提供するＨＥＫｎ（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ、ｎｅｏｎａｔａｌ：製品番号Ｃ００１５Ｃ、組織取得番号１７８１１２９、白人）、ＨＥＫｎ（製品番号Ｃ００１５Ｃ、組織取得番号１８０３８２７、黒人）が挙げられる。角化細胞が基底膜（ｂａｓｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に付着して増殖する性質を維持するために、ディッシュは０．１〜０．２％ゼラチンあるいは０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌコラーゲンタイプＩＶでコーティングして用いることが好ましい。前記細胞は３５〜３７℃、５〜１０％ＣＯ２インキュベータで培養されてもよく、約７０〜８０％の密度になった時に継代培養をすることができる。
【００３８】
前記角化細胞は、例えばシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）により前記真皮模写層上に適用されてもよく、培養期間は例えば１日乃至４日、１日乃至３日、または１日乃至２日であってもよいが、これに限定されるのではない。
【００３９】
前記角化細胞の間にはメラニン形成細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）の幹細胞が少量含まれてもよい。メラニン形成細胞の幹細胞は、後述する第１培地および第２培地の培養段階を経てメラニン形成細胞に分化するようになる。
【００４０】
角化細胞の適用および培養段階（Ｓ２）を経た後、角化細胞培地である第１培地で培養する段階（Ｓ３）を経る。
【００４１】
ここで、「角化細胞培地」は、ヒトの角化細胞を培養するための培地を意味し、これは当業界に公知となった如何なる培地も用いることができる。例えば、前記角化細胞培地は、ウシ脳下垂体抽出物（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｐｉｔｕｔａｒｙ  Ｅｘｔｒａｃｔ、ＢＰＥ）、ヒト上皮成長因子（ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ｈＥＧＦ）、ウシインスリン（ｂｏｖｉｎｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ）、ヒドロコルチゾン（Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、およびゲンタマイシンおよびアムホテリシン−Ｂ（ＧＡ−１０００（Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ、Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ−Ｂ））を含む培地であってもよい。また、前記成分にエピネフリン（Ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）およびトランスフェリン（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）がさらに含まれている培地であってもよい。前記培地の商業的に入手可能な例としては、ＣｎＴ−３Ｄ−ＰＲ（ＣｅｌｌｎＴＥＣ社）が挙げられる。
【００４２】
前記第１培地は、前記真皮模写層の下面に接触するように設けられ、当該真皮模写層において前記第１培地が設けられた面の反対面は空気に露出されるようにしてもよい。このような第１培地での培養は、例えば３日乃至１０日、４日乃至１０日、５日乃至９日、または４日乃至８日の期間の間に行われてもよいが、これに限定されるのではない。
【００４３】
次に、前記第１培地で培養された真皮模写層をＤＭＥＭ培地およびＦ１２培地が混合された第２培地で培養する段階（Ｓ４）を経る。
【００４４】
前記混合培地は、商用のＤＭＥＭ培地およびＦ１２培地が混合された培地であって、これらは例えば１：１乃至４：１の比率で混合されてもよく、より具体的に２：１乃至３：１の比率で混合されてもよいが、これに限定されるのではない。ＤＭＥＭ（Ｄｕｂｅｌｃｏ'ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ）培地は、一般に使用される動物細胞培養用培地として、アミノ酸、ビタミン、無機塩分、葡萄糖、脂質、指示薬、血清などを含むことができる。
【００４５】
前記第２培地は、ＤＭＥＭ培地およびＦ１２培地を総培養液基準に１００％で含み、これに追加的にヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、トリヨードサイロニン（Ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）、コレラ毒素（Ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ）、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）および塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の中から選択される一つまたは二つ以上をさらに含んでもよい。
【００４６】
前記第２培地での培養段階は、第１培地の培養段階と同様に、前記第１培地で培養された真皮模写層が空気に露出された状態で行われてもよい。
【００４７】
前記第２培地での培養段階は、前記第１培地での培養段階が終結した後直ちに続いて行ってもよく、培養期間は、例えば４日乃至１５日、５乃至１３日、６日乃至１０日、または７日乃至９日の期間の間に行われてもよいが、これに限定されるのではない。ただし、前記第１培地での培養期間および前記第２培地での培養期間の総合計は、例えば２０日以内に調節してもよい。例えば前記第１培地での培養期間は、前記第２培地での培養期間と比較して長いかまたは同一に設定してもよい。
【００４８】
前記段階Ｓ２乃至Ｓ４を経ることによって真皮模写層上に表皮模写層が形成された人工皮膚構造を得る。
【００４９】
一実施形態による人工皮膚製造方法は、第１培地での培養段階（Ｓ３）と第２培地での培養段階（Ｓ４）を順次に経ることによって、それ以前に真皮模写層上にシーディングされていた角化細胞の間に存在するメラニン形成細胞の幹細胞をメラニン形成細胞に分化させることができる。
【００５０】
前述の方法により人工皮膚を製造する場合、メラニン形成細胞が表皮基底層に均質に分布し、これらの分布密度が真皮代替物の表面に対する平行面で実質的に一定であり、ヒトの実際の皮膚で発見されるものと実質的に類似する人工皮膚モデルを得ることができる。
【００５１】
つまり、別途にメラニン形成細胞を培養する過程を経ることなく、角化細胞に存在するメラニン形成細胞の幹細胞の分化を誘導することによって、角化細胞とメラニン形成細胞が有効に存在する人工皮膚モデルを実現することができる。
【００５２】
本発明の他の実施形態によれば、真皮模写層および前記真皮模写層上に位置する表皮模写層を含む人工皮膚であって、前記表皮模写層は、前記真皮模写層に隣接している表皮基底層部分および空気中に露出されている角質層部分を含み、前記角質層部分には角化細胞が存在すると共に、前記表皮基底層部分にはメラニン形成細胞が存在し、これら角質層部分に存在する角化細胞と前記表皮基底層部分に存在するメラニン形成細胞とは、同一ヒト由来のものである人工皮膚を提供する。
【００５３】
前記人工皮膚の角化細胞とメラニン形成細胞とが同一ヒト由来のものとは、前記人工皮膚の製造過程で角化細胞およびメラニン形成細胞を別に培養したのでなく、角化細胞内に存在するメラニン形成細胞の幹細胞の分化によりメラニン形成細胞を得たことを意味する。
【００５４】
本発明のまた他の実施形態によれば、色素化調整剤の効能評価方法であって、前述の人工皮膚、または前述の製造方法から得られた人工皮膚に、前記色素化調整剤を適用する段階、そして前記色素化調整剤が適用された人工皮膚の色素沈着程度と前記色素化調整剤が適用されていない人工皮膚の色素沈着程度とを比較する段階を含む色素化調整剤の効能評価方法を提供する。
【００５５】
「色素化調整」という用語は、皮膚の構成的または誘導的色素化の水準を直接的にまたは間接的に増加させるか、または減少させるかまたは抑制することによって変更させることを意味する。前記色素化調整剤は、色素化増加剤であってもよく、色素化減少剤であってもよい。
【００５６】
前記色素化調整剤は、前記人工皮膚と直接接触により適用される色素化調整剤であってもよい。前記色素化調整剤は、例えば美白用化粧品であってもよいが、これに限定されるのではない。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例を通じて前述の本発明の実施形態をより詳細に説明する。ただし、下記の実施例は単に説明の目的のためのものであり、本発明の範囲を制限するのではない。
【００５８】
［人工皮膚の製作］
実施例１
（１）１段階：真皮模写層の製造
線維芽細胞とコラーゲンを混合して真皮模写層を製作した後、１週間培養した。
【００５９】
（２）２段階：角化細胞の適用および培養段階
前記１段階以降、前記真皮模写層上に角化細胞（ＨＥＫｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を載せて２日間培養した。
【００６０】
（３）３段階：第１培地での培養段階
前記２段階以降、前記真皮模写体の下の部分に第１培地（ＣｎＴ−３Ｄ−ＰＲ、ＣｅｌｌｎＴＥＣ）が接触するように設け、表皮層部分は空気に露出させる空気露出８日間培養を行った。
【００６１】
（４）４段階：第２培地での培養段階
前記３段階以降、第２培地で、追加で空気露出６日間培養を行って人工皮膚モデルを得た。第２培地の組成は、ＤＭＥＭ培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ、ＬＭ００１−０５）とＦ１２培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ、ＬＭ０１０−０１）を２．５：１比率で混合し、ここにヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、トリヨードサイロニン（Ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）、コレラ毒素（Ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ）、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）および塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を含むものである。
得られた人工皮膚モデルの顕微鏡断面写真を図２に示す。
【００６２】
比較例１
第２培地での培養段階（４段階）を経ないことを除いては、実施例１と同様にして人工皮膚を製作した。
得られた人工皮膚モデルの顕微鏡断面写真を図３に示す。
【００６３】
［評価：人工皮膚モデルの断面観察］
実施例１および比較例１で得られた人工皮膚モデルの断面を顕微鏡で観察する。
【００６４】
図２および３は、実施例１および比較例１で得られた人工皮膚の断面であって、ＨＥ組織染色した後の顕微鏡写真である。
【００６５】
図２および３を参照すると、人工皮膚を培養する培地を調節して角化細胞だけを用いて色素沈着を示す人工皮膚を製造できることが分かる。より詳細に説明すると、同一の角化細胞を用いたにも拘わらず、本発明による実施例１では表皮層基底部にメラニン形成細胞の幹細胞から分化されたメラニン形成細胞を観察することができる反面（図２）、一般的方法による比較例１では表皮層基底部でメラニン形成細胞を観察することができない（図３）。
【００６６】
以上で本発明の好ましい実施例について詳細に説明したが、本発明の権利範囲はこれに限定されるのではなく、特許請求の範囲で定義している本発明の基本概念を利用した当業者の多様な変形および改良形態も本発明の権利範囲に属する。
【図１】
2019010089.tif 000003
【図２】
2019010089.tif 000004
【図３】
2019010089.tif 000005