(57)【要約】      （修正有）【課題】非ヒドロキシル化コラーゲンを産生するために遺伝子操作された酵母株の提供。【解決手段】コラーゲン、プロモーター、及びヒドロキシル化酵素を産生するために必要なＤＮＡを含むオールインワン・ベクター。酵母株が、アルクスラ属、キャンディダ属、コマガタエラ属、ピキア属、ハンゼヌラ属、オガタエア属、サッカロミセス属、クリプトコッカス属及びこれらの組み合わせ由来のものからなる群より選択される。コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子羊、恐竜コラーゲン、海洋生物、細菌及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒドロキシル化コラーゲンを産生するために遺伝子操作された酵母株であって、
（ｉ）酵母株；及び
（ｉｉ）コラーゲンのＤＮＡ配列；コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；コラーゲンターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列、前記選択マーカーのプロモーターのＤＮＡ配列、前記選択マーカーのターミネーターのＤＮＡ配列；細菌及び酵母から選択される複製起点のＤＮＡ配列；及び前記酵母ゲノムと相同性を含有するＤＮＡ配列を含むベクターを含み、かつ
前記ベクターが前記酵母株に挿入されているか、またはエピソームに保持されている前記酵母株。
【請求項２】
前記酵母株が、アルクスラ属、キャンディダ属、コマガタエラ属、ピキア属、ハンゼヌラ属、オガタエア属、サッカロミセス属、クリプトコッカス属及びこれらの組み合わせ由来のものからなる群より選択される、請求項１に記載の酵母株。
【請求項３】
前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子羊、恐竜コラーゲン、海洋生物、細菌及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の酵母株。
【請求項４】
前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、天然コラーゲンＤＮＡ、操作されたコラーゲンＤＮＡ及びコドン最適化コラーゲンＤＮＡから選択される、請求項３に記載の酵母株。
【請求項５】
前記プロモーターのＤＮＡ配列が、ＡＯＸ１メタノール誘発プロモーターのＤＮＡ、ＰＤＦ脱抑制プロモーターのＤＮＡ、ＰＣＡＴ脱抑制化プロモーターのＤＮＡ、Ｄａｓ１−Ｄａｓ２メタノール誘発双方向性プロモーターのＤＮＡ、ＰＨＴＸ１構成性双方向性プロモーターのＤＮＡ、ＣＨＯヒストンプロモーターのＤＮＡ、ＰＧＣＷ１４−ＰＧＡＰ１構成性双方向性プロモーターのＤＮＡ及びこれらの組み合わせなる群から選択される、請求項１に記載の酵母株。
【請求項６】
前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、抗生物質耐性のＤＮＡ及び栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、請求項１に記載の酵母株。
【請求項７】
前記抗生物質が、ハイグロマイシン、ゼオシン、ジェネテシン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載の酵母株。
【請求項８】
前記ベクターが、エレクトロポレーション、化学的形質転換、及び交配からなる群から選択される方法によって前記酵母に挿入される、請求項１に記載の酵母株。
【請求項９】
非ヒドロキシル化コラーゲンの製造方法であって、
（ｉ）請求項１に記載の酵母株を提供すること；及び
（ｉｉ）前記株を、コラーゲンを産生するのに十分な時間、培地中で増殖させること
を含む前記方法。
【請求項１０】
前記酵母株が、アルクスラ属、キャンディダ属、コマガタエラ属、ピキア属、ハンゼヌラ属、オガタエア属、サッカロミセス属、クリプトコッカス属及びこれらの組み合わせ由来のものからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記培地が、緩衝グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）、緩衝メタノール複合培地（ＢＭＭＹ）、及び酵母抽出ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記時間が２４時間〜７２時間である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記酵母が、アルクスラ属、キャンディダ属、コマガタエラ属、ピキア属、ハンゼヌラ属、オガタエア属、サッカロミセス属、クリプトコッカス属及びこれらの組み合わせ由来のものからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子羊、恐竜コラーゲン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記プロモーターのＤＮＡ配列が、ＰＨＴＸ１構成性双方向性プロモーターのＤＮＡ及びＰＧＣＷ１４−ＰＧＡＰ１構成性双方向性プロモーターのＤＮＡからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、抗生物質耐性ＤＮＡのＤＮＡ及び栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
ヒドロキシル化コラーゲンを産生するように遺伝子操作された酵母株であって、
（ｉ）酵母株、
（ｉｉ）コラーゲンのＤＮＡ配列、コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列、ターミネーターのＤＮＡ配列、選択マーカーのＤＮＡ配列、前記選択マーカーのプロモーターのＤＮＡ配列、前記選択マーカーのターミネーターのＤＮＡ配列、細菌及び／または酵母の複製起点のＤＮＡ配列、前記酵母ゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列を含むベクター（かつ前記ベクターは前記酵母株に挿入されている）、及び
（ｉｉｉ）Ｐ４ＨＡ１のＤＮＡ配列、Ｐ４ＨＢのＤＮＡ配列、及びプロモーターの少なくとも１つのＤＮＡ配列を含む第２のベクター（かつ前記ベクターは前記酵母株に挿入されている）を含む、前記酵母株。
【請求項１８】
前記酵母株が、アルクスラ属、キャンディダ属、コマガタエラ属、ピキア属、ハンゼヌラ属、オガタエア属、サッカロミセス属、クリプトコッカス属及びこれらの組み合わせ由来のものからなる群より選択される、請求項１７に記載の酵母株。
【請求項１９】
前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子羊、恐竜コラーゲン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載の酵母株。
【請求項２０】
前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、天然のコラーゲンＤＮＡ、操作されたコラーゲンＤＮＡ及び最適化されたコラーゲンＤＮＡから選択される、請求項１９に記載の酵母株。
【請求項２１】
前記プロモーターのＤＮＡ配列が、ＡＯＸ１メタノール誘発プロモーターのＤＮＡ、ＰＤＦ脱抑制プロモーターのＤＮＡ、ＰＣＡＴ脱抑制プロモーターのＤＮＡ、Ｄａｓ１−Ｄａｓ２メタノール誘発双方向性プロモーターのＤＮＡ、ＰＨＴＸ１構成性双方向性プロモーターのＤＮＡ、ＣＨＯヒストンプロモーターのＤＮＡ、ＰＧＣＷ１４−ＰＧＡＰ１構成性双方向性プロモーターのＤＮＡ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載の酵母株。
【請求項２２】
前記プロモーターのＤＮＡ配列が、ＰＨＴＸ１構成性双方向性プロモーターのＤＮＡ及びＰＧＣＷ１４−ＰＧＡＰ１構成性双方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、請求項２１に記載の酵母株。
【請求項２３】
前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、抗生物質耐性ＤＮＡのＤＮＡ及び栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、請求項１７に記載の酵母株。
【請求項２４】
前記抗生物質が、ハイグロマイシン、ゼオシン、ジェネテシン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２３に記載の酵母株。
【請求項２５】
前記ベクターが、エレクトロポレーション、化学的形質転換、及び交配からなる群から選択される方法によって酵母に挿入される、請求項１７に記載の酵母株。
【請求項２６】
ヒドロキシル化コラーゲンの製造方法であって、
（ｉｉｉ）請求項１７に記載の酵母株を提供すること；及び
（ｉｖ）前記株を、コラーゲンを産生するのに十分な時間、培地中で増殖させること
を含む前記方法。
【請求項２７】
前記酵母株が、アルクスラ属、キャンディダ属、コマガタエラ属、ピキア属、ハンゼヌラ属、オガタエア属、サッカロミセス属、クリプトコッカス属及びこれらの組み合わせ由来のものからなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記培地が、ＢＭＧＹ、ＢＭＭＹ、及びＹＰＤからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記時間が２４時間〜７２時間である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記酵母が、アルクスラ属、キャンディダ属、コマガタエラ属、ピキア属、ハンゼヌラ属、オガタエア属、サッカロミセス属、クリプトコッカス属及びこれらの組み合わせ由来のものからなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子羊、恐竜コラーゲン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記プロモーターのＤＮＡが、ＰＨＴＸ１構成性双方向性プロモーターのＤＮＡ及びＰＧＣＷ１４−ＰＧＡＰ１構成性双方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記選択マーカーのＤＮＡが、抗生物質耐性ＤＮＡのＤＮＡ及び栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
オールインワン・ベクターであって、
（ｉ）プロモーター及びターミネーターを含むコラーゲン産生に必要なＤＮＡ；
（ｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＢからなる群から選択されるヒドロキシル化酵素のＤＮＡ；
（ｉｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む選択マーカー用のＤＮＡ；
（ｉｖ）酵母及び細菌の複製開始点のＤＮＡ；
（ｖ）ゲノムに組み込むための酵母ゲノムと相同性を有するＤＮＡ；及び
（ｖｉ）モジュラークローニングを可能にする、上記のＤＮＡ内の５’、３’、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される位置の制限部位、
を含む前記オールインワン・ベクター。
【請求項３５】
前記コラーゲンの産生に必要なＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子羊、恐竜及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３４に記載のオールインワン・ベクター。
【請求項３６】
前記プロモーターのＤＮＡ配列が、ＰＨＴＸ１構成性双方向性プロモーターのＤＮＡ及びＰＧＣＷ１４−ＰＧＡＰ１構成性双方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、請求項３４に記載のオールインワン・ベクター。
【請求項３７】
前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、抗生物質耐性のＤＮＡ及び栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、請求項３４に記載のオールインワン・ベクター。
【請求項３８】
前記抗生物質が、ハイグロマイシン、ゼオシン、ジェネテシン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３７に記載のオールインワン・ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年６月２９月日に出願された米国特許出願第６２／５２６，９１２号に関し、その全内容は参照により本明細書に取り込まれている。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、酵母の遺伝子操作された株、及びコラーゲンを産生するための方法に関する。株は、産生されるコラーゲンの量を増加させ、産生されるコラーゲンの安定性を改善するために操作される。コラーゲンは、バイオ製作された（ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ）革材料などの製造に有用であり得る。
【０００３】
関連技術の説明
革。革は、家具の室内装飾品、衣類、靴、ラゲッジ、ハンドバッグ、アクセサリー、自動車用途など、幅広い用途に使用されている。革の世界貿易推定額は年間約１０００億ドル（Ｆｕｔｕｒｅ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｌｅａｔｈｅｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｒａｄｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｎａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｖｉｅｎｎａ，２０１０）であり、皮革製品の需要はますます高まっている。革を製造する経済的、環境的、社会的コストの観点から、この需要を満たす新しい方法が必要である。革製品の生産者及びユーザーは、技術的及び美的傾向に遅れずついていくために、優れた強度、均一性、加工性、及び天然成分を組み込んだファッショナブルで魅力的な美的特性を示す新しい材料を探し求めている。
【０００４】
人口の増加と地球環境を考えると、革様審美性と改良された機能性を備えた代替材料が必要となるだろう。革は動物の皮であり、ほとんどがコラーゲンで構成されている。バイオ製作された革材料に変換することができるコラーゲンの供給源が必要である。
【０００５】
コラーゲン。コラーゲンは革の主成分である。皮膚、または動物の皮は、繊維状タンパク質であるコラーゲンを相当量含有する。コラーゲンは、少なくとも２８の異なるコラーゲンタイプのファミリーの総称であり；動物の皮は典型的にはＩ型コラーゲンであるが、ＩＩＩ型コラーゲン等の他のタイプのコラーゲンも皮革の形成に使用できる。
【０００６】
コラーゲンは、アミノ酸の繰り返しトリプレット、−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−により特徴づけられ、コラーゲン中のアミノ酸残基の約１／３がグリシンである。最大４００のＧｌｙ−Ｘ−Ｙトリプレットの可能性があるが、Ｘはしばしばプロリンであり、Ｙはしばしばヒドロキシプロリンである。異なる動物がコラーゲンの異なるアミノ酸組成物を生成する可能性があり、これは、異なる特性、及び得られる皮革の相違をもたらし得る。
【０００７】
コラーゲンの構造は、異なる長さの３つの絡み合ったペプチド鎖からなることができる。コラーゲン三重らせん（または単量体）は約１，０５０個のアミノ酸長のアルファ鎖から生成され、これにより三重らせんは約３００ｎｍの長さの棒の形をとっており、直径は約１．５ｎｍである。
【０００８】
コラーゲン線維は、動物の皮の種類に応じて、ある範囲の直径を有し得る。Ｉ型コラーゲンに加えて、皮膚（皮）は、ＩＩＩ型コラーゲン（レチキュリン）、ＩＶ型コラーゲン、及びＶＩＩ型コラーゲンを含む他のタイプのコラーゲンも含み得る。
【０００９】
様々なタイプのコラーゲンが哺乳動物の体全体には存在する。例えば、Ｉ型コラーゲンは、皮膚及び動物の皮の主成分であるだけでなく、軟骨、腱、血管結紮、器官、筋肉及び骨の有機部分にも存在する。動物の皮膚または皮に加えて、哺乳類の体の様々な領域からコラーゲンを単離するために、努力がなされて成功している。数十年前、研究者らは、中性ｐＨにおいて、酸可溶化コラーゲンが自己縮合して、天然組織で観察されるのと同じ横縞模様からなるフィブリルになることを見出した；Ｓｃｈｍｉｔｔ  Ｆ．Ｏ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９４２，２０：１１）。このことは、組織工学及び様々な生物医学的用途におけるコラーゲンの使用をもたらした。より近年では、コラーゲンは、組換え技術を用いて細菌及び酵母から採取されている。
【００１０】
コラーゲンの種類にかかわらず、塩架橋、水素結合、ファンデルワールス相互作用、双極子−双極子力、分極力、疎水性相互作用、及びしばしば酵素反応によって触媒される共有結合等の静電相互作用を含む物理的及び化学的相互作用の組み合わせによって、すべてが形成され、安定化される。Ｉ型コラーゲンフィブリル、繊維及び繊維束について、その複雑なアセンブリは、発達中にインビボで達成され、細胞の運動性及び栄養素の輸送を可能にしながら、組織に機械的支持を提供する上で重要である。様々な異なるコラーゲンタイプが脊椎動物において特定されている。これらには、ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、及びヒトのコラーゲンが含まれる。
【００１１】
一般に、コラーゲンタイプはローマ数字で番号が付けられ、各コラーゲンタイプに見られる鎖はアラビア数字によって特定される。様々な異なるタイプの天然に存在するコラーゲンの構造及び生物学的機能の詳細な説明は、当技術分野で利用可能である；例えば、Ａｙａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｂｕｒｇｅｓｏｎ，Ｒ  Ｅ., ａｎｄ  Ｎｉｍｍｉ（１９９２）“Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ”ｉｎ  Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．２８２：２５０−２７２；Ｋｉｅｌｔｙ，ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）“Ｔｈｅ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｆａｍｉｌｙ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ，”Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ，Ｒｏｙｃｅ，Ｐ．Ｍ．ａｎｄ  Ｂ．Ｓｔｅｉｎｍａｎｎ  ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．１０３−１４７；及びＰｒｏｃｋｏｐ，Ｄ．Ｊ−ａｎｄ  Ｋ．Ｉ．  Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ（１９９５）“Ｃｏｌｌａｇｅｎｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｄｉｓｅａｓｅｓ，ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４：４０３−４３４．）を参照。
【００１２】
Ｉ型コラーゲンは、生物の総コラーゲンの約８０〜９０％を構成する骨及び皮膚の主要なフィブリル状コラーゲンである。Ｉ型コラーゲンは、多細胞生物の細胞外マトリクスに存在する主要な構造巨大分子であり、全タンパク質質量の約２０％を構成する。Ｉ型コラーゲンは、ＣＯＬ１Ａ１及びＣＯＬ１Ａ２遺伝子によってそれぞれコードされる２つのα１（Ｉ）鎖及び１つのα２（Ｉ）鎖を含むヘテロ三量体分子である。他のコラーゲンタイプは、Ｉ型コラーゲンよりも豊富でなく、異なる分布パターンを示す。例えば、ＩＩ型コラーゲンは、軟骨及び硝子体液中の優勢なコラーゲンであり、ＩＩＩ型コラーゲンは、血管内において高レベルで、皮膚においてはより低いレベルで見出される。
【００１３】
ＩＩ型コラーゲンは、ＣＯＬ２Ａ１遺伝子によってコードされる３つの同一のａｌ（ＩＩ）鎖を含むホモ三量体コラーゲンである。精製されたＩＩ型コラーゲンは、例えば、Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｈｏｄｅｓ（１９８２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ８２：３３−６４に記載されている手順により、当該技術分野で公知の方法により、組織から調製することができる。
【００１４】
ＩＩＩ型コラーゲンは、皮膚及び血管組織に見られる主要なフィブリル状コラーゲンである。ＩＩＩ型コラーゲンは、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子によってコードされる３つの同一のα１（ＩＩＩ）鎖を含むホモ三量体コラーゲンである。組織からのＩＩＩ型コラーゲンを精製する方法は、例えば、Ｂｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：５２４３−５２４８；及び上記のＭｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｈｏｄｅｓに見ることができる。
【００１５】
ＩＶ型コラーゲンは、フィブリルよりもむしろシートの形態で基底膜に見られる。最も一般的には、ＩＶ型コラーゲンは２つのα１（ＩＶ）鎖及び１つのα２（ＩＶ）鎖を含む。ＩＶ型コラーゲンを含む特定の鎖は組織特異的である。ＩＶ型コラーゲンは、例えば、Ｆｕｒｕｔｏ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１４４：４１−６１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに記載の手順を用いて精製することができる。
【００１６】
Ｖ型コラーゲンは、主に骨、腱、角膜、皮膚及び血管に見出されるフィブリル状コラーゲンである。Ｖ型コラーゲンは、ホモ三量体及びヘテロ三量体の両方の形態で存在する。Ｖ型コラーゲンの１つの形態は、２つのα１（Ｖ）鎖及び１つのα２（Ｖ）鎖のヘテロ三量体である。Ｖ型コラーゲンの別の形態は、α１（Ｖ）、α２（Ｖ）及びα３（Ｖ）鎖のヘテロ三量体である。Ｖ型コラーゲンのさらなる形態は、α１（Ｖ）のホモ三量体である。天然供給源からＶ型コラーゲンを単離する方法は、例えば、Ｅｌｓｔｏｗ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ（１９８３）Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．３：１８１−１９３，及びＡｂｅｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．２：４９３−５０２に見ることができる。
【００１７】
ＶＩ型コラーゲンは、小さい三重らせん領域と２つの大きな非コラーゲン残余部分を有する。ＶＩ型コラーゲンは、α１（ＶＩ）、α２（ＶＩ）及びα３（ＶＩ）鎖を含むヘテロ三量体である。ＶＩ型コラーゲンは、多くの結合組織に見られる。天然供給源からのＶＩ型コラーゲンの精製方法の説明は、例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４８：３７３−３８１、及びＫｉｅｌｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．９９：７９７−８０７に見ることができる。
【００１８】
ＶＩＩ型コラーゲンは、特定の上皮組織に見られるフィブリル状コラーゲンである。ＶＩＩ型コラーゲンは、３つのα１（ＶＩＩ）鎖のホモ三量体分子である。組織からＶＩＩ型コラーゲンを精製する方法の説明は、例えば、Ｌｕｎｓｔｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２６１：９０４２−９０４８及びＢｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：３１６８−３１７２に見ることができる。ＶＩＩＩ型コラーゲンは、角膜のデスメ膜に見出すことができる。ＶＩＩＩ型コラーゲンは、２つのα１（ＶＩＩＩ）鎖及び１つのα２（ＶＩＩＩ）鎖を含むヘテロ三量体であるが、他の鎖組成も報告されている。天然由来のＶＩＩＩ型コラーゲンの精製方法は、例えば、Ｂｅｎｙａ  ａｎｄ  Ｐａｄｉｌｌａ（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：４１６０−４１６９、及びＫａｐｏｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：３９３０−３９３７に見ることができる。
【００１９】
ＩＸ型コラーゲンは、軟骨及び硝子体液中に見出されるフィブリル関連コラーゲンである。ＩＸ型コラーゲンは、α１（ＩＸ）、α２（ＩＸ）及びα３（ＩＸ）鎖を含むヘテロ三量体分子である。ＩＸ型コラーゲンは、非三重らせんドメインによって分離されたいくつかの三重らせんドメインを有する、ＦＡＣＩＴ（中断三重らせんを有するフィブリル関連コラーゲン）コラーゲンとして分類されている。ＩＸ型コラーゲンを精製するための手順は、例えば、Ｄｕａｎｃｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２１：８８５−８８９；Ａｙａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６２：７５３−７６１；及びＧｒａｎｔ ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄａｍａｇｅ，Ｇｌａｕｅｒｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｐｐ．３−２８に見ることができる。
【００２０】
Ｘ型コラーゲンは、α１（Ｘ）鎖のホモ三量体化合物である。Ｘ型コラーゲンは、例えば、成長プレート中に見られる肥大性軟骨から単離されている；例えば、Ａｐｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０６（１）：２１７−２４を参照。
【００２１】
ＸＩ型コラーゲンは、ＩＩ型及びＩＸ型コラーゲンに関連する軟骨組織、及び体内の他の位置に見られ得る。ＸＩ型コラーゲンは、α１（ＸＩ）、α２（ＸＩ）及びα３（ＸＩ）鎖を含むヘテロ三量体分子である。ＸＩ型コラーゲンを精製する方法は、例えば、上記のＧｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．に見ることができる。
【００２２】
ＸＩＩ型コラーゲンは、主にＩ型コラーゲンと関連して見られるＦＡＣＩＴコラーゲンである。ＸＩＩ型コラーゲンは、３つのα１（ＸＩＩ）鎖を含むホモ三量体分子である。ＸＩＩ型コラーゲン及びその変異体を精製するための方法は、例えば、Ｄｕｂｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１３１５０−１３１５６；Ｌｕｎｓｔｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２００８７−２００９２；及びＷａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２００９３−２００９９に見ることができる。
【００２３】
ＸＩＩＩ型は、例えば、皮膚、腸、骨、軟骨、及び線条筋で見られる非フィブリル状コラーゲンである。ＸＩＩＩ型コラーゲンの詳細な説明は、例えば、Ｊｕｖｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２４７００−２４７０７に見ることができる。
【００２４】
ＸＩＶ型は、α１（ＸＩＶ）鎖を含むホモ三量体分子として特徴づけられるＦＡＣＩＴコラーゲンである。ＸＩＶ型コラーゲンを単離するための方法は、例えば、Ａｕｂｅｒｔ−Ｆｏｕｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５７５９−１５７６４、及び上記Ｗａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．に見ることができる。
【００２５】
ＸＶ型コラーゲンは、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンと構造的に相同である。天然型ＸＶコラーゲンの構造及び単離に関する情報は、例えば、Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０１４４−１０１４８；Ｈｕｅｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １４：２２０−２２４；Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：４７７３−４７７９；及びＭｕｒａｇａｋｉ，Ｊ．（１９９４）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：４０４２−４０４６に見ることができる。
【００２６】
ＸＶＩ型コラーゲンは、例えば、皮膚、肺線維芽細胞、及びケラチノサイトに見られるフィブリル関連コラーゲンである。ＸＶＩ型コラーゲン及びＸＶＩ型コラーゲンをコードする遺伝子の構造に関する情報は、例えば、Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６５６５−６５６９；及びＹａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１２：８５６−８６３に見ることができる。
【００２７】
ＸＶＩＩ型コラーゲンは、水疱性類天疱瘡抗原でも知られている半接着斑（ｈｅｍｉｄｅｓｍｏｓａｌ）膜貫通コラーゲンである。ＸＶＩＩ型コラーゲン及びＸＶＩＩ型コラーゲンをコードする遺伝子の構造に関する情報は、例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１２）：８８２５−８８３４；及びＭｃＧｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１１（１）：８３−８６に見ることができる。
【００２８】
ＸＶＩＩＩ型コラーゲンは、ＸＶ型コラーゲンと構造が類似しており、肝臓から単離することができる。天然源由来のＸＶＩＩＩ型コラーゲンの構造及び単離の説明は、例えば、Ｒｅｈｎ  ａｎｄ  Ｐｉｈｌａｊａｎｉｅｍｉ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ  ９１：４２３４−４２３８；Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：４２２９−４２３３；Ｒｅｈｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３９２４−１３９３５；及びＯｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９：４９４−４９９に見ることができる。
【００２９】
ＸＩＸ型コラーゲンは、ＦＡＣＩＴコラーゲンファミリーの別のメンバーであると考えられており、横紋筋肉腫細胞から単離されたｍＲＮＡにおいて見出されている。ＸＩＸコラーゲンの構造及び単離の説明は、例えば、Ｉｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７：１３７−１４６；Ｙｏｓｈｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３：８８４−８８６；及びＭｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９：１８５４９−１８５５７（１９９４）に見ることができる。
【００３０】
ＸＸ型コラーゲンは、ＦＡＣＩＴコラーゲンファミリーの新たに発見されたメンバーであり、ニワトリ角膜で同定されている。（例えば、Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １３：Ａ１１１９；及びＧｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），ＩＯＶＳ  ３９：Ｓ１１２８を参照）。
【００３１】
本明細書に記載される方法によってフィブリル化及び架橋化され得る、コラーゲン、切断コラーゲン、未修飾または翻訳後修飾、またはアミノ酸配列修飾コラーゲンの任意のタイプを用いて、バイオ製作材料またはバイオ製作された革を製造することができる。バイオ製作された革は、実質的に均質なコラーゲン、例えばＩ型またはＩＩＩ型コラーゲンのみを含有してもよく、または２、３、４またはそれ以上の異なる種類のコラーゲンの混合物を含有してもよい。
【００３２】
組換えコラーゲン
コラーゲン及びコラーゲン様タンパク質の組換え発現は、Ｂｅｌｌ、ＥＰ  １２３２１８２Ｂ１，Ｂｏｖｉｎｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｅｌａｔｉｎ；Ｏｌｓｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，４２８，９７８号，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｌａｔｉｎ  ａｎｄ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｔｒｉｐｌｅ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃｅｌｌｓ；ＶａｎＨｅｅｒｄｅ，  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第８，１８８，２３０号，Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｌｉｋｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓにより知られており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれている。このような組換えコラーゲンは、皮革を製造するために使用されていない。
【００３３】
原核生物の発現。細菌系などの原核生物系では、多くの発現ベクターを、発現されたポリペプチドに意図された用途に応じて、有利に選択することができる。本発明の動物コラーゲン及びゼラチンの大量生産が、例えば抗体の生成のために、実施される場合、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルでの発現を誘導するベクターが望ましい可能性がある。このようなベクターには、コード配列が、ｌａｃ  Ｚコード領域とフレームでベクターに連結されて、ハイブリッドＡＳ−ｌａｃＺタンパク質が産生されるＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９及びＶａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９）等が含まれるが、これらに限定されない。これらの開示内容は参照により本明細書に組み込まれている。ｐＧＥＸベクターも、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるために使用することができる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着、続いて遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解した細胞から容易に精製することができる。目的のクローニングされたポリペプチドがＧＳＴ部分から放出され得るように、ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。組換えコラーゲンは、翻訳後修飾されていない、例えばグリコシル化またはヒドロキシル化されていない、コラーゲン分子を含むことができ、または、１つ以上の翻訳後の修飾、例えば、フィブリル化、及びコラーゲン分子が切り離されてランダムに配向したフィブリルの形成を促進する修飾を含むことができる。
【００３４】
組換えコラーゲン分子は、三量体コラーゲンフィブリル、または天然コラーゲンアミノ酸配列（またはそのフィブリル形成領域または実質的に「Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ」ｎを含むセグメント）、例えば、配列番号１、２または３及びＣｏｌ１Ａ１、Ｃｏｌ１Ａ２及びＣｏｌ３Ａ１のアミノ酸配列によって記載されるウシコラーゲンと少なくとも７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％同一または類似のアミノ酸配列を有する修飾コラーゲン分子もしくは切断コラーゲン分子を形成することができる、天然コラーゲン分子のアミノ酸配列の断片を含むことができる。前記Ｃｏｌ１Ａ１、Ｃｏｌ１Ａ２及びＣｏｌ３Ａ１のアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿００１０２９２１１．１（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／７７４０４２５２、最終アクセス日が２０１７年２月９日）、ＮＰ＿７７６９４５．１（ｈｔｔｐｓ：／／＿ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／２７８０６２５７、最終アクセス日が２０１７年２月９日）、及びＮＰ＿００１０７０２９９．１（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／１１６００３８８１、最終アクセス日が２０１７年２月９日）に記載されており、これらは参照により取り込まれている。（これらのリンクは二重スラッシュの後に下線を付けることで無効になっている）
【００３５】
このような組換えまたは修飾コラーゲン分子は、一般に、本明細書に記載の反復−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−配列を含む。
【００３６】
ＢＬＡＳＴＮは、コラーゲンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または配列番号１、２または３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドなどの参照ポリヌクレオチドと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を同定するために使用され得る。非常によく似た配列を見出すために最適化された代表的なＢＬＡＳＴＮ設定は、１０の期待値閾値及び２８の語長、０のクエリー範囲における最大一致、１／−２の一致／不一致スコア及び線形ギャップコストを使用する。低複雑度領域は、フィルタリングまたはマスクをすることができる。標準的ヌクレオチドＢＬＡＳＴのデフォルト設定が、ｈｔｔｐｓ：／／＿ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｎ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ（最終アクセス日が２０１７年１月２７日）に記載され、参照により取り込まれている。
【００３７】
ＢＬＡＳＴＰは、ＢＬＯＳＵＭ４５、ＢＬＯＳＵＭ６２またはＢＬＯＳＵＭ８０のような類似性マトリクスを使用する（ＢＬＯＳＵＭ４５が密接に関連する配列に、ＢＬＯＳＵＭ６２は関連が中程度の配列に、ＢＬＯＳＵＭ８０は関連がより遠い配列について使用される）コラーゲンアミノ酸配列のような参照アミノ酸と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％または９９％の配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を同定するために使用することができる。別段の指示がない限り、類似スコアはＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づく。ＢＬＡＳＴＰが使用される場合、パーセント類似性はＢＬＡＳＴＰ陽性スコアに基づき、パーセント配列同一性はＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰ「同一性」は、同一の高スコア配列対における総残基の数及び割合を示し；ＢＬＡＳＴＰ「陽性」は、整列スコアが正の値を有し、相互に類似している残基の数及び割合を示す。これらの同一性度または類似性度、または本明細書中に開示されるアミノ酸配列との同一性または類似性のいずれかの中等度を有するアミノ酸配列は、本開示によって意図されており、包含される。１０の期待値閾値、３のワードサイズ３、マトリクスとしてのＢＬＯＳＵＭ  ６２、及び１１（存在）及び１（拡張）のギャップペナルティ、及び条件付き構成スコアマトリクス調整を使用する代表的なＢＬＡＳＴＰ設定。ＢＬＡＳＴＰのためのその他のデフォルト設定についてはｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ（最終アクセス日が２０１７年１月２７日）で入手可能な開示を参照することにより記載され、取り込まれている。
【００３８】
酵母発現。コラーゲン分子は、酵母発現系において産生され得る。酵母では、当該技術分野で公知の構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含む多くのベクターを使用することができる；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ，Ｖｏｌ．２，Ｃｈａｐｔｅｒ  １３；Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｙｅａｓｔ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ｗｕ  ＆  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．１５３：５１６−５４４；Ｇｌｏｖｅｒ（１９８６）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．ＩＩ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．，Ｃｈ．３；Ｂｉｔｔｅｒ（１９８７）Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｂｅｒｇｅｒ  ＆  Ｋｉｍｍｅｌ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．１５２：６７３−６８４；及びＴｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｅｄｓ．Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｖｏｌｓ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（１９８２）、これらの開示は参照により本明細書に取り込まれている。
【００３９】
コラーゲンは、例えば、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の宿主細胞を用いて発現させることができる。この特定の酵母は、多数の発現ベクターのいずれかと共に使用することができる。一般に使用される発現ベクターは、外来遺伝子の効率的な転写のために、酵母における増殖のための２Ｐ複製起点及びＥ．ｃｏｌｉのためのＣｏｌ  Ｅ１起点を含むシャトルベクターである。２Ｐプラスミドに基づくこのようなベクターの典型的な例は、２Ｐ  ＯＲＩ−ＳＴＢエレメント、ＧＡＬ１−１０プロモーター、及び２Ｐ  Ｄ遺伝子ターミネーターを有するｐＷＹＧ４である。このベクターでは、Ｎｃｏｌクローニング部位を用いて、発現されるポリペプチドの遺伝子を挿入し、ＡＴＧ開始コドンを提供する。別の発現ベクターは、完全な２αＯＲＩ、ＳＴＢ、ＲＥＰ１及びＲＥＰ２、及びＧＡＬ１−１０プロモーターを有し、かつＦＬＰターミネーターを使用する、ｐＷＹＧ７Ｌである。このベクターでは、コードするポリヌクレオチドは、５’末端を有するポリリンカーにＢａｍ  ＨＩまたはＮｃｏｌ部位で挿入される。挿入されたポリヌクレオチドを含むベクターは、細胞壁を除去して、カルシウム及びポリエチレングリコールによる処理時にＤＮＡを取り込むスフェロプラストを生成させるか、あるいは無傷細胞をリチウムイオンで処理することにより、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに形質転換される。
【００４０】
あるいは、エレクトロポレーションによってＤＮＡを導入することができる。形質転換体は、例えば、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、またはＬＥＵ２−Ｄのような選択マーカー遺伝子と共に、ロイシン、トリプトファン、ウラシル、またはヒスチジンに対して栄養要求性である宿主酵母細胞を用いて、選択することができる。
【００４１】
一実施形態において、コラーゲンをコードするポリヌクレオチドは、酵母ピキアの宿主細胞に導入される。ピキア・パストリスのような非サッカロマイセス酵母の種は、大規模手順の組換えタンパク質の高収率生産に特別な利点を有するようである。さらに、ピキア発現キットはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能である。
【００４２】
ピキア・パストリスなどのメチロトローフ酵母には多数のメタノール応答性遺伝子があり、それぞれの発現はメタノール応答調節領域（プロモーターとも呼ばれる）によって制御される。このようなメタノール応答性プロモーターのいずれも、本発明の実施に使用するのに適している。特定の調節領域の例としては、ＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳ）、Ｐ４０プロモーター、及びＰ．パストリス由来のカタラーゼ遺伝子のためのプロモーターなどが挙げられる。
【００４３】
メチロトローフ酵母ハンゼヌラ・ポリモルファも使用されている。メタノールでの増殖は、メタノール代謝の重要な酵素、例えばＭＯＸ（メタノールオキシダーゼ）、ＤＡＳ（ジヒドロキシアセトンシンターゼ）、及びＦＭＤＨ（ギ酸脱水素酵素）の誘導をもたらす。これらの酵素は、全細胞タンパク質の３０〜４０％まで構成することができる。ＭＯＸ、ＤＡＳ及びＦＭＤＨ産生をコードする遺伝子は、メタノール上での増殖によって誘導され、そしてグルコース上での増殖によって抑制される強力なプロモーターによって制御される。これらのプロモーターのいずれかまたは３つすべてを、Ｈ．ポリモルファにおける異種遺伝子の高レベル発現を得るために使用することができる。したがって、一態様では、動物コラーゲンまたはその断片もしくは変異体をコードするポリヌクレオチドを、誘導性Ｈ．ポリモルファプロモーターの制御下で発現ベクターにクローニングする。産物の分泌が望まれる場合、酵母における分泌のためのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドとフレーム単位で融合される。さらなる実施形態では、発現ベクターは、好ましくは、栄養要求性宿主の欠損を補完するために使用され得る、栄養要求性マーカー遺伝子、例えばＵＲＡ３またはＬＥＵ２を含む。
【００４４】
次いで、発現ベクターを使用して、当業者に公知の技術を用いてＨ．ポリモルファ宿主細胞を形質転換する。Ｈ．ポリモルファ形質転換の有用な特徴は、１００コピーまでの発現ベクターのゲノムへの自発的統合である。ほとんどの場合、統合されたポリヌクレオチドは、頭−尾配列を示す多量体を形成する。統合された外来ポリヌクレオチドは、非選択的条件下でさえ、いくつかの組換え株において有糸分裂的に安定であることが示されている。この高度なコピー統合の現象は、システムの高い生産性の可能性をさらに高める。
【００４５】
真菌発現。糸状菌も、本発明のポリペプチドを産生するために使用されている。糸状菌において組換えタンパク質を発現及び／または分泌するためのベクターは周知であり、当業者はこれらのベクターを用いて本発明の組換え動物コラーゲンを発現させることができる。
【００４６】
植物発現。動物コラーゲンは、植物または植物細胞において産生されている。植物発現ベクターが使用される場合、本発明のコラーゲンをコードする配列の発現は、多数のプロモーターのいずれかによって駆動され得る。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡ及び１９Ｓ  ＲＮＡプロモーター（Ｂｒｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：５１１−５１４）、またはＴＭＶのコートタンパク質プロモーター（Ｔａｋａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３０７−３１１）などのウイルスプロモーターを使用することができ；あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット（Ｃｏｒｕｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６７１−１６８０；Ｂｒｏｇｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８−８４３）などの植物プロモーター、またはダイズｈｓｐ１７．５−Ｅまたはｈｓｐ１７．３−ｂ（Ｇｕｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９−５６５）などの熱ショックプロモーターを使用することができる。これらの構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを使用することなど、当業者に公知の様々な方法によって植物細胞に導入することができる。このような技術のレビューは、例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ＆  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＶＩＩＩ，ｐｐ．４２１−４６３（１９８８）；Ｇｒｉｅｒｓｏｎ  ＆  Ｃｏｒｅｙ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｉｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｃｈ．７−９（１９８８）；Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ：Ａ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｏｗｅｎ  ａｎｄ  Ｐｅｎ  ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｉｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９６；Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｇａｌｕｎ  ａｎｄ  Ｂｒｅｉｍａｎ  ｅｄｓ，Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７；及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｏｐｒａ，Ｍａｌｉｋ，ａｎｄ  Ｂｈａｔ  ｅｄｓ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９９を参照。
【００４７】
植物細胞は、安定したコラーゲンを効率的に産生するのに十分な量の翻訳後酵素を自然に産生はしない。したがって、ヒドロキシル化が望まれる場合、動物コラーゲンを発現するために使用される植物細胞は、安定したコラーゲンを十分に産生するのに必要な翻訳後酵素が補充される。本発明の好ましい態様において、翻訳後酵素は、プロリル４−ヒドロキシラーゼである。
【００４８】
植物系において動物コラーゲンを産生する方法は、植物または植物細胞からバイオマスを提供することによって達成されているが、その際植物または植物細胞は、少なくとも１つのコード配列がプロモーターに作動可能に連結され、ポリペプチドを発現させ、その後ポリペプチドはバイオマスから抽出される。あるいは、ポリペプチドは、抽出されないで、例えば胚乳中に発現され得る。
【００４９】
植物発現ベクター及びレポーター遺伝子は、当該技術分野で一般的に知られている；例えば、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ参照。典型的には、発現ベクターは、例えば組換えまたは合成により作製され、かつ植物細胞内で機能するプロモーター（このようなプロモーターは動物コラーゲンまたはその断片もしくは変異体をコードする核酸配列、またはコラーゲンの生合成に重要な翻訳後酵素に作動可能に連結されている）を含む核酸構築物を含む。
【００５０】
プロモーターは、植物におけるタンパク質発現レベルを活発にする。植物において所望のレベルのタンパク質発現を生じさせるために、発現は、植物プロモーターの誘導下にあり得る。使用に適したプロモーターは、一般的に当該技術分野で入手可能である；例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１９８０６を参照。使用され得るプロモーターの例としては、非構成的プロモーターまたは構成的プロモーターが挙げられる。これらのプロモーターとしては、リブロース−１，５−ビス−ホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニットのプロモーター；ＲＵＢＩＳＣＯノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）及びオクトピンシンターゼプロモーターのようなアグロバクテリウム・ツメファシエンスの腫瘍誘導性プラスミド由来のプロモーター；ｍａｓ及びｏｃｓプロモーターなどの細菌Ｔ−ＤＮＡプロモーター；ならびにカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓ及び３５Ｓプロモーターまたはゴマノハグサ（ｆｉｇｗｏｒｔ）モザイクウイルス３５Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーターが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
ポリヌクレオチド配列は、構成的プロモーターの転写制御下におかれ、植物の大部分の組織においてコラーゲンまたは翻訳後酵素の発現を導くことができる。このポリヌクレオチド配列は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターの制御下にある。二本鎖カリモウイルス（ｃａｕｌｉｍｏｒｖｉｒｕｓ）ファミリーは、植物におけるトランスジーン発現のための単一の最も重要なプロモーター、特に３５Ｓプロモーターの発現を提供した；例えば、Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２９９を参照。このファミリーの他のプロモーター、例えばゴマノハグサモザイクウイルスプロモーターなどは、当該技術分野において記載されており、また使用することもできる；例えばＳａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４：４３３−４４３；Ｍｅｄｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：１９５−１９２；及びＹｉｎ及びＢｅａｃｈｙ（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．７：９６９−９８０を参照。
【００５２】
コラーゲンを発現するためのポリヌクレオチド構築物に使用されるプロモーターは、所望により、それらの制御特性に影響を及ぼすように修飾することができる。例えば、ＣａＭＶプロモーターを、光の非存在下でＲＵＢＩＳＣＯの発現を抑制して、葉において活性であるが根では活性ではないプロモーターを作製する、ＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子の部分に連結することができる。得られたキメラプロモーターは、本明細書に記載のように使用することができる。
【００５３】
当該技術分野で知られている一般的な発現特性を有する構成的植物プロモーターを、本発明の発現ベクターと共に使用することができる。これらのプロモーターは、ほとんどの植物組織において豊富に発現されており、例えば、アクチンプロモーター及びユビキチンプロモーターを含む。例えば、ＭｃＥｌｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１６３−１７１；及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９を参照。
【００５４】
あるいは、ポリペプチドは、特定の組織、細胞型で、またはより正確な環境条件または発生制御下で発現され得る。これらの場合に発現を誘導するプロモーターは、誘導性プロモーターとして知られている。組織特異的プロモーターが使用される場合、タンパク質発現はタンパク質の抽出が望まれる組織において特に高い。所望の組織に依存して、発現は、胚乳、アリューロン層、胚（または胚及び子葉としてのその部分）、果皮、茎、葉塊茎、根などを標的とすることができる。既知の組織特異的プロモーターの例としては、塊茎指向性クラスＩパタチンプロモーター、ジャガイモ塊茎ＡＤＰＧＰＰ遺伝子に関連するプロモーター、種子指向性転写を駆動するβ−コングリシニン（７Ｓタンパク質）の大豆プロモーター、及びトウモロコシ胚乳のゼイン遺伝子からの種子指向性プロモーターが挙げられる；例えば、Ｂｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：４６２５−３８；Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２４：１３６−４６；Ｂｒａｙ（１９８７）Ｐｌａｎｔａ  １７２：３６４−３７０；及びＰｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｃｅｌｌ  ２９：１０１５−２６を参照。
【００５５】
コラーゲンポリペプチドは、例えば、キャノーラ、トウモロコシ、大豆、イネ及びオオムギなどの種子を用いた種子ベースの生産技術によって、種子中で産生することができる。このようなプロセスでは、例えば、種子の発芽の間に生成物が回収される；例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９４０２１０；ＷＯ９９１６８９０；ＷＯ９９０７２０６；米国特許第５，８６６，１２１号；米国特許第５，７９２，９３３号；及び本明細書に引用されているすべての参考文献を参照。ポリペプチドの発現を誘導するために使用され得るプロモーターは、異種または非異種であり得る。これらのプロモーターはまた、アンチセンス核酸の発現を駆動して、所望の組織中の本発明の動物コラーゲンの濃度及び組成を減少させ、増加させ、または変化させるために使用することができる。
【００５６】
植物または植物細胞において転写ポリペプチドを増加及び／または最大化するためになされ得る他の修飾は標準的であり、当業者に公知である。例えば、プロモーターに作動可能に連結された、組換え動物コラーゲンまたはその断片もしくは変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターは、コラーゲンまたは関連する翻訳後酵素の転写速度を修飾する少なくとも１つの因子（例えば、ペプチド輸出シグナル配列、コドン使用、イントロン、ポリアデニル化、及び転写終結部位が挙げられるが、これらに限定されない）をさらに含み得る。植物における発現レベルを増加させるために構築物を修飾する方法は、当該技術分野で一般的に知られている；例えば、Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３７３１；及びＣｏｒｎｅｊｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３：５６７−５８を参照。コラーゲン及び関連する翻訳後酵素の転写速度に影響を及ぼす植物系の操作において、正または負に作用する配列、エンハンサー及びサイレンサーならびにクロマチン構造のような調節配列を含む当該技術分野で公知の様々な因子が、植物における転写の速度に影響を与え得る。これらの因子の少なくとも１つは、組換え動物コラーゲン（限定されないが、上記のコラーゲンタイプを含む）を発現する場合に利用され得る。
【００５７】
ポリヌクレオチドを含むベクターは、典型的には、植物細胞上の選択可能な表現型を付与するマーカー遺伝子を含む。通常、選択マーカー遺伝子は、抗生物質スペクチノマイシンに対する耐性をコードする少なくとも１組の遺伝子、ストレプトマイシン耐性をコードするストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）遺伝子、カナマイシンまたはジェネテシン耐性、ハイグロマイシン耐性をコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＨ）遺伝子、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、特にスルホニルウレア型除草剤の作用を阻害するように作用する除草剤に対する耐性をコードする遺伝子；例えば、このような耐性をもたらす突然変異、特にＳ４及び／またはＨｒａ突然変異を含むアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子、ホスフィノスリシンまたはバスタのようなグルタミンシンターゼの作用を阻害するように作用する除草剤に対する耐性をコードする遺伝子；例えばｂａｒ遺伝子、または当該技術分野で公知の他の同様の遺伝子を含む適切な遺伝子で抗生物質耐性をコードする。ｂａｒ遺伝子は除草剤バスタに対する耐性をコードし、ｎｐｔＩＩ遺伝子は抗生物質カナマイシン及びジェネテシンに対する耐性をコードし、ＡＬＳ遺伝子は除草剤クロルスルフロンに対する耐性をコードする。
【００５８】
植物における外来遺伝子の発現に有用な典型的なベクターは当該技術分野で公知であり、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミドに由来するベクターを含むが、これに限定されない。これらのベクターは、形質転換時にＤＮＡの一部を宿主植物のゲノムに統合する植物統合ベクターである。例えばＲｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：２５３−２７７；Ｓｃｈａｒｄｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅ  ６１：１−１１；及びＢｅｒｇｅｒ  ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：８４０２−８４０６を参照。
【００５９】
ポリペプチドをコードする配列を含むベクター、及び翻訳後酵素またはそのサブユニットを含むベクターは、所望の植物に同時導入され得る。植物細胞を形質転換するための手順としては、例えば、直接遺伝子導入、インビトロプロトプラスト形質転換、植物ウイルス媒介形質転換、リポソーム媒介形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、アグロバクテリウム媒介形質転換、及び粒子衝突などが当該技術分野で利用可能である；例えば、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．  ３：２７１７−２７２２；米国特許第４，６８４，６１１号；欧州特許出願第０  ６７  ５５３号；米国特許第４，４０７，９５６号；米国特許第４，５３６，４７５号；Ｃｒｏｓｓｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：３２０−３３４；Ｒｉｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：５６０２−５６０６；Ｈｉｎｃｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９１５−９２１；及び米国特許第４，９４５，０５０号）を参照。例えばイネ、コムギ、トウモロコシ、モロコシ及びオオムギの形質転換のための標準的な方法は、当該技術分野において記載されている；例えば、Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２３９及び  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：６３８９を参照。コムギは、トウモロコシまたは米を形質転換するために用いられる技術と同様の技術によって形質転換することができる。さらに、Ｃａｓａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１２１２には、モロコシを形質転換する方法が記載されており、一方Ｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １０４：  ３７には、大麦を形質転換する方法を教示する。トウモロコシ形質転換に適した方法は、Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：８３３及び上記のＧｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ  ｅｔ  ａｌ．によって提供されている。
【００６０】
動物コラーゲンを産生する植物を生成するために使用することができるさらなる方法は、当該技術分野で確立されている；例えば、米国特許第５，９５９，０９１号；米国特許第５，８５９，３４７号；米国特許第５，７６３，２４１号；米国特許第５，６５９，１２２号；米国特許第５，５９３，８７４号；米国特許第５，４９５，０７１号；米国特許第５，４２４，４１２号；米国特許第５，３６２，８６５号；米国特許第５，２２９，１１２号；米国特許第５，９８１，８４１号；米国特許第５，９５９，１７９号；米国特許第５，９３２，４３９号；米国特許第５，８６９，７２０号；米国特許第５，８０４，４２５号；米国特許第５，７６３，２４５号；米国特許第５，７１６，８３７号；米国特許第５，６８９，０５２号；米国特許第５，６３３，４３５号；米国特許第５，６３１，１５２号；米国特許第５，６２７，０６１号；米国特許第５，６０２，３２１号；米国特許第５，５８９，６１２号；米国特許第５，５１０，２５３号；米国特許第５，５０３，９９９号；米国特許第５，３７８，６１９号；米国特許第５，３４９，１２４号；米国特許第５，３０４，７３０号；米国特許第５，１８５，２５３号；米国特許第４，９７０，１６８号；欧州公開第ＥＰＡ００７０９４６２号；欧州公開第ＥＰＡ００５７８６２７号；欧州公開第ＥＰＡ００５３１２７３号；欧州公開第００４２６６４１号； ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／３１２４８号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９８／５８０６９号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９８／４５４５７号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９８／３１８１２号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９８／０８９６２号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９７／４８８１４号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９７／３０５８２号；及びＰＣＴ公開第ＷＯ９７１７４５９号を参照。
【００６１】
昆虫発現。コラーゲンの別の代替発現系は昆虫系である。バキュロウイルスは、昆虫細胞における様々な組換えタンパク質の大規模生産のための非常に効率的な発現ベクターである。Ｌｕｃｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９及びＧｒｕｅｎｗａｌｄ，Ｓ．及びＨｅｉｔｚ，Ｊ．（１９９３）Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡに記載の方法を用いて、本発明のコラーゲンのコラーゲンコード配列及び適切な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。例えば、昆虫細胞において、ポリペプチドをコードするバキュロウイルスベクターの感染によって、タンパク質の組換え産生を達成することができる。安定な三重らせんを有する組換えコラーゲン、コラーゲン様ポリペプチドまたはコラーゲンポリペプチドの産生は、昆虫細胞の、３つのバキュロウイルス、即ち、発現される動物コラーゲンをコードするもの、それぞれ、プロリル４−ヒドロキシラーゼのαサブユニット及びβサブユニットをコードするものとの同時感染を含み得る。この昆虫細胞系は、組換えタンパク質の大量生産を可能にする。このような系の１つでは、キンウワバ科（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が外来遺伝子を発現するベクターとして使用される。このウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞で増殖する。コラーゲンまたはコラーゲン様ポリペプチドのコード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば多面体遺伝子）にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば多面体プロモーター）の制御下におくことができる。コード配列の挿入が成功すると、多面体遺伝子の不活性化及び非閉塞組換えウイルスの産生が生じる；例えば、多面体遺伝子によってコードされたタンパク質性コートを欠くウイルスなどである。次いで、これらの組換えウイルスを用いて、挿入された遺伝子が発現するスポドプテラ・フルギペルダ細胞を感染させる；例えば、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６：５８４；及び米国特許第４，２１５，０５１号を参照。この発現系のさらなる例は、例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．に見ることができる。
【００６２】
動物発現。動物宿主細胞では、多くの発現系を利用することができる。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、コラーゲンまたはコラーゲン様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーター及び三者構成のリーダー配列に結紮され得る。次いで、このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）への挿入は、感染宿主中でコードされたポリペプチドを発現することができる生存可能な組換えウイルスをもたらす；例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３６５５−３６５９（１９８４）を参照。あるいは、ワクシニア７．５Ｋプロモーターを使用することができる；例えば、Ｍａｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７９：７４１５−７４１９；  Ｍａｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８２）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９：８５７−８６４；及びＰａｎｉｃａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：４９２７−４９３１を参照。
【００６３】
哺乳動物宿主細胞における好ましい発現系は、セムリキ森林（Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ）ウイルスである。哺乳動物宿主細胞、例えば、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、の感染は、非常に高い組換え発現レベルをもたらすことができる。セムリキ森林ウイルスは、哺乳動物細胞株の感染が可能となるような幅広い宿主範囲を有するため、好ましい発現系である。より具体的には、セムリキ森林ウイルスは、システムが染色体組み込みに基づいていないため、広範な宿主で使用することができ、したがって、構造機能関連の同定及び様々なハイブリッド分子の効果の試験を目的とした研究において組換え動物コラーゲンの修飾を得るより簡便な方法を提供する。哺乳動物宿主細胞における外因性タンパク質の発現のためのセムリキ森林ウイルスベクターを構築する方法は、例えば、Ｏｌｋｋｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ４３：４３−５３に記載されている。
【００６４】
非ヒトトランスジェニック動物を用いてポリペプチドを発現させることもできる。そのような系は、本発明のポリヌクレオチドを、乳腺において発現を生じさせ得る他の必要なまたは任意の調節配列と共に、プロモーターに作動可能に連結することによって構築することができる。同様に、必要または任意の翻訳後酵素は、適切な発現系を用いて標的細胞内で同時に産生され得る。非ヒトトランスジェニック動物を用いてタンパク質を組換え的に産生する方法は、当該技術分野で公知である；例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；米国特許第５，８２４，８３８号；米国特許第５，４８７，９９２号；及び米国特許第５，６１４，３９６号を参照。
【００６５】
組換えコラーゲンの産生を記載している上記のセクションで引用した参考文献はそれぞれ参照により組み込まれる。先行技術の教示にもかかわらず、増大したコラーゲン産生及び増大したコラーゲン安定性を有する酵母株が引き続き必要とされている。
【発明の概要】
【００６６】
他の実施形態においては、本発明は、非ヒドロキシル化コラーゲンを産生するために遺伝子操作された酵母株に関する。別の実施形態では、本発明は、ヒドロキシル化コラーゲンを産生するための操作された酵母株を提供する。一実施形態では、本発明は、コラーゲン、プロモーター、及び／またはヒドロキシル化酵素を産生するために必要なＤＮＡを含むオールインワン・ベクターを提供する。非ヒドロキシル化またはヒドロキシル化コラーゲンの製造方法もまた提供される。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】非ヒドロキシル化コラーゲンを産生するように設計されたＭＭＶ６３のベクター図表を示す。
【図２】非ヒドロキシル化コラーゲンを産生するように設計されたＭＭＶ７７のベクター図表を示す。
【図３】非ヒドロキシル化コラーゲンを産生するように設計されたＭＭＶ１２９のベクター図表を示す。
【図４】非ヒドロキシル化コラーゲンを産生するように設計されたＭＭＶ１３０のベクター図表を示す。
【図５】ヒドロキシル化コラーゲンを産生するように設計されたＭＭＶ７８のベクター図表を示す。
【図６】ヒドロキシル化コラーゲンを産生するように設計されたＭＭＶ９４のベクター図表を示す。
【図７】ヒドロキシル化コラーゲンを産生するように設計されたＭＭＶ１５６のベクター図表を示す。
【図８】ヒドロキシル化コラーゲンを産生するように設計されたＭＭＶ１９１のベクター図表を示す。
【図９】非ヒドロキシル化またはヒドロキシル化コラーゲンを産生するように設計されたオールインワン・ベクターＭＭＶ２０８を示す。
【図１０】ＭＭＶ８４のベクター図表を示す。
【図１１】ＭＭＶ１５０のベクター図表を示す。
【図１２】ＭＭＶ１４０のベクター図表を示す。
【００６８】
発明の詳細な説明
本発明は、コラーゲンを産生するために酵母を利用する。適切な酵母としては、アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属及びこれらの組み合わせのものが挙げられるが、これらに限定されない。酵母は、修飾されていてもハイブリダイズされていてもよい。ハイブリダイズされた酵母は、同じ種の異なる株、同じ属の異なる種、または異なる属の株の混合育種である。
【００６９】
外来ＤＮＡを酵母ゲノムに挿入するか、またはエピソームを維持してコラーゲンを産生する。コラーゲンのＤＮＡ配列は、ベクターを介して酵母に導入される。コドン最適化のようなＤＮＡの修飾は、ＤＮＡを翻訳する酵母の能力及び効率を改善し得ることが当該技術分野において知られている。外来ＤＮＡは、任意の非酵母宿主ＤＮＡであり、例えば、哺乳動物、シノラブディス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）及び細菌が挙げられるが、これらに限定されない。酵母におけるコラーゲン産生のための適切な哺乳類のＤＮＡとしては、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子羊、恐竜及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
ＤＮＡはベクターに挿入され、適切なベクターとしては、ｐＨＴＸ１−ＢｉＤｉ−Ｐ４ＨＡ−Ｐｒｅ−Ｐ４ＨＢ  ｈｙｇｒｏ、ｐＨＴＸ１−ＢｉＤｉ−Ｐ４ＨＡ−ＰＨＯ１−Ｐ４ＨＢ  ｈｙｇｒｏ、ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１−ＢｉＤｉ−Ｐ４ＨＡ−Ｐｒｅｐｒｏ−Ｐ４ＨＢ  Ｇ４１８、ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１−ＢｉＤｉ−Ｐ４ＨＡ−ＰＨＯ１−Ｐ４ＨＢ  Ｈｙｇｒｏ、ｐＤＦ−Ｃｏｌ３Ａ１最適化ゼオシン、ｐＣＡＴ−Ｃｏｌ３Ａ１最適化ゼオシン、ＡＯＸ１ランディングパッドを有するｐＤＦ−Ｃｏｌ３Ａ１最適化ゼオシン、ｐＨＴＸ１−ＢｉＤｉ−Ｐ４ＨＡ−Ｐｒｅ−Ｐｒｏ−Ｐ４ＨＢ  ｈｙｇｒｏが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ベクターは、典型的には、ＤＮＡの線状化のための少なくとも１つの制限部位を含む。
【００７１】
プロモーターはタンパク質の産生を改善することができることが当該技術分野において知られている。プロモーターは、ベクターに含まれるＤＮＡ配列である。本発明での使用に適したプロモーターとしては、ＡＯＸ１メタノール誘発プロモーター、ＰＤＦ脱抑制プロモーター、ＰＣＡＴ脱抑制プロモーター、Ｄａｓ１−Ｄａｓ２メタノール誘発双方向プロモーター、ＰＨＴＸ１構成的双方向プロモーター、ＣＨＯヒストンプロモーター、ＰＧＣＷ１４−ＰＧＡＰ１構成的双方向性プロモーター及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
ターミネーターは、酵母に組み込まれたベクターに利用される各オープンリーディングフレームの末端で必要とされる。ターミネーターのＤＮＡ配列をベクターに挿入する。
【００７３】
複製の起点は複製を開始するために必要である。複製起点のＤＮＡ配列をベクターに挿入する。ベクターは、さらに、エピソームに保持されてもよい。
【００７４】
酵母ゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列が必要であり、ベクターに組み込まれる。
【００７５】
選択マーカーは、首尾よく形質転換されている酵母細胞を選択するために使用される。マーカーは、抗生物質耐性に関連することがある。マーカーはまた、特定のアミノ酸（栄養要求性マーカー）の有無にかかわらず増殖する能力に関連し得る。適切な栄養要求性マーカーには、ＡＤＥ、ＨＩＳ、ＵＲＡ、ＬＥＵ、ＬＹＳ、ＴＲＰ及びこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。選択マーカーのＤＮＡ配列をベクターに組み込む。
【００７６】
翻訳後修飾の前に、コラーゲンは非ヒドロキシル化されており、高いペプシン濃度の存在下で分解する、例えば、コラーゲンのＮ末端及びＣ末端のプロペプチドを切断し、フィブリル化を可能にし、コラーゲンをバイオ製作材料に変換することを可能にするために、１：２００のペプシンを使用することができる。したがって、ヒドロキシル化コラーゲンを提供することが有用である。ヒドロキシル化コラーゲンの産生を可能にするために、少なくとも１つの第２のタンパク質が必要であり得る。この第２のタンパク質は、プロリル４−ヒドロキシラーゼサブユニットアルファ−１（以後、「Ｐ４ＨＡ１」）、及びプロリル４−ヒドロキシラーゼサブユニットベータ（以後、「Ｐ４ＨＢ」）として知られる酵素である。Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＢ  ＤＮＡはベクター上の酵母に挿入してコラーゲンをヒドロキシル化することができる。ヒドロキシル化コラーゲンは、非ヒドロキシル化コラーゲンと比較してより良好な熱安定性を有し、高濃度ペプシン消化（例えば１：２５から１：１、全タンパク質対ペプシン比）に耐性である
【００７７】
上記の操作された酵母は、複数のベクターを必要とし、ベクターを細胞に取り込ませるプロセスの各ステップは非常に多くの時間が消費され得る。複数のベクターには複数の選択マーカーが含まれているため、新しいＤＮＡを追加する際にマーカーを再利用することが困難である。驚くべきことに、コラーゲンのＤＮＡ、及びＰ４ＨＡ及びＰ４ＨＢのＤＮＡを単一ベクター上で組み合わせて「オールインワン・ベクター」を構築できることを見出した。プロモーター及びシグナル配列は、特定のクローニング部位でモジュール式に追加することができる。ＤＮＡは、プロモーターの存在または非存在に応じて、ヒドロキシル化または非ヒドロキシル化コラーゲンのために酵母に挿入することができる。オールインワン・ベクターは、ゲノムへのランダム及び部位特異的組込みの両方を含む酵母へのＤＮＡの挿入のために、線状化のための部位を含む。
【００７８】
用語「コラーゲン」は、コラーゲンタイプＩ〜ＸＸを含む既知のコラーゲンタイプのいずれか１つ、ならびに天然、合成、半合成または組換えのいずれかの他のコラーゲンを指す。これには、本明細書に記載のコラーゲン、修飾コラーゲン及びコラーゲン様タンパク質のすべてが含まれる。この用語はまた、モチーフ（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ（ｎは整数）を含むプロコラーゲン及びコラーゲン様タンパク質またはコラーゲン性タンパク質を包含する。それは、コラーゲン及びコラーゲン様タンパク質の分子、コラーゲン分子の三量体、コラーゲンのフィブリル、及びコラーゲンフィブリルの繊維を包含する。それはまた、フィブリル化することができる化学的、酵素的または組換え的に修飾されたコラーゲンまたはコラーゲン様分子、ならびにナノファイバーに組み立てることができるコラーゲンの断片、コラーゲン様分子及びコラーゲン分子を指す
【００７９】
いくつかの実施形態では、コラーゲンまたはコラーゲン様タンパク質中のリジン及びプロリンなどのアミノ酸残基は、ヒドロキシル化を欠いていてもよく、あるいは対応する天然または非修飾コラーゲンまたはコラーゲン様タンパク質よりもヒドロキシル化の程度が小さくても大きくてもよい。他の実施形態では、コラーゲンまたはコラーゲン様タンパク質のアミノ酸残基は、グリコシル化を欠いていてもよく、あるいは対応する天然または非修飾コラーゲンまたはコラーゲン様タンパク質よりもグリコシル化の程度が小さくても大きくてもよい。
【００８０】
コラーゲン組成物中のコラーゲンは、１００％ウシＩ型コラーゲンまたは１００％ＩＩI型ウシコラーゲンのような単一のタイプのコラーゲン分子を均質に含有することができ、あるいは異なる種類のコラーゲン分子またはコラーゲン様の混合物（例えばウシＩ型及びＩＩＩ型分子の混合物）を含有してもよい。このような混合物は、＞０％、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９または＜１００％の個々のコラーゲンまたはコラーゲン様タンパク質成分を含み得る。この範囲にはすべての中間値が含まれる。例えば、コラーゲン組成物は、３０％のＩ型コラーゲン及び７０％のＩＩＩ型コラーゲンを含有してもよく、あるいは３３．３％のＩ型コラーゲン、３３．３％のＩＩ型コラーゲン、及び３３．３％のＩＩＩ型コラーゲンを含有してもよく、コラーゲンの％は、組成物中のコラーゲンの総質量またはコラーゲン分子の分子百分率に基づく。
【００８１】
上記の操作された酵母細胞は、コラーゲンを産生するために利用され得る。これを行うために、細胞を発酵室または槽の中の培地に入れ、１２時間〜１週間の範囲の期間、制御されたｐＨ条件下で溶存酸素及び炭素源を供給する。適切な培地としては、限定されないが、緩衝グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）、緩衝メタノール複合培地（ＢＭＭＹ）、及び酵母抽出ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）が挙げられる。コラーゲンが酵母細胞で産生されるという事実により、コラーゲンを単離するために、酵母の分泌株を使用するか、コラーゲンを放出するために酵母細胞を溶解する必要がある。その後、コラーゲンは、遠心分離、沈殿などの公知の技術によって精製することができる。
【００８２】
本明細書に開示されるコラーゲンは、バイオ製作された革の製造を可能にする。コラーゲンをバイオ製作した革に変換する方法は、同時係属中の出願である米国特許出願第１５／４３３５６６号、第１５／４３３６５０号、第１５／４３３６３２号、第１５／４３３６９３号、第１５／４３３７７７号、第１５／４３３６７５号、第１５／４３３６７６号及び第１５／４３３８７７号に教示されており、これらの開示内容は参照により本明細書に組み込まれている。
【００８３】
本発明の実施形態
本発明は、酵母の遺伝子操作された株及びコラーゲンを産生するための方法を含むが、これに限定されない。
【００８４】
第１の実施形態において、本発明は、酵母宿主を含む非ヒドロキシル化コラーゲンを産生する酵母株；標的タンパク質の組換えＤＮＡ；及びプロモーターに関する。
【００８５】
第２の実施形態において、本発明は、酵母宿主を含むヒドロキシル化コラーゲンを産生する酵母株;；標的タンパク質の組換えＤＮＡ；第２の標的タンパク質のＤＮＡ；及び少なくとも１つのプロモーターに関する。
【００８６】
第３の実施形態において、本発明は、標的タンパク質のＤＮＡを含むオールインワン・ベクター；第２の標的タンパク質のＤＮＡ；少なくとも１つのプロモーターのＤＮＡに関する。例：ゼラチン、コラーゲンＩ、及び１を超える遺伝子を導入すること。
【００８７】
第４の実施形態では、本発明は、コラーゲンの製造方法に関する。
【００８８】
第５の実施形態では、本発明はヒドロキシル化コラーゲンの製造方法に関する。
【００８９】
実施形態の詳細な説明
本明細書中で使用される場合、ＤＮＡとの用語は、デオキシリボ核酸を意味する。
【００９０】
本明細書中で使用される場合、力価との用語は、産生される標的タンパク質の量を意味する。
【００９１】
本明細書中で使用される場合、バイオ製作された革との用語は、生物学、工学及びデザインを使用して、皮革様特性を有する材料を生成することを意味する。
【００９２】
本明細書中で使用される場合、オールインワン・ベクターとの用語は、所望の組換えタンパク質を産生するために必要なすべてのＤＮＡを含むベクターを意味する。
【００９３】
本明細書中で使用される場合、安定コラーゲンとの用語は、高濃度のペプシンに曝露された後、コラーゲンの初期濃度の少なくとも７５％が依然として存在することを意味する。
【００９４】
以下の非限定的な実施例は、本発明を反映したものである。本発明の範囲は、これらの実施例に記載された詳細に限定されない。
【００９５】
実施例１
組換えコラーゲンを産生することを意図された酵母
ＤＮＡ２．０由来の野生型ピキア・パストリスが得られた。コラーゲン配列を含むＭＭＶ６３（配列番号９）ＤＮＡ配列を、ＰＰ２８株を生成する野生型ピキア・パストリスに挿入した。ＭＭＶ６３をＰｍｅ  Ｉで消化し、ＰＰ１（野生型ピキア・パストリス株）に形質転換してＰＰ２８を生成させた。ベクターＭＭＶ６３を図１に示す。
【００９６】
天然ウシコラーゲンを配列決定し（配列１）、その配列を、以下のポリメラーゼ連鎖反応「ＰＣＲ」プロトコルを用いて増幅して、線状ＤＮＡ配列を作製した：
ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ融合ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼプロトコル
５０ｕlの反応の場合：
【表１】
2019010096.tif 000002
＊当業者は、増幅されるＤＮＡに基づいて複数のプライマーを使用し得ることを理解する。＜１０ｋｂのＤＮＡに対するサーモサイクラープロトコル：
９５℃で２分、９５℃で２０秒の３０サイクル、[プライマー融解温度−５℃]で２０秒
＜１ｋｂであれば７２℃で１５秒間、そうでない場合は１ｋＢあたり１５秒間、７２℃で３分間、及び４℃で永久。
【００９７】
線状ＤＮＡをＧｉｂｓｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅに従って以下のようにクローニングした；
２〜３の断片について、０．０２〜０．５ｐｍｏｌのＤＮＡを使用した。４〜６断片については、０．２〜１．０ｐｍｏｌのＤＮＡを使用した。
Ｐモル=（ｎｇ重量）×１０００／（塩基対×６５０ダルトン）
またはＮＥＢｉｏＣａｌｃｕｌａｔｏｒを使用する
最適化された効率は、２〜３倍の余分なインサートを有する５０〜１００ｎｇのベクターである（＜２００ｂｐでは５倍過剰を用いる）。ＰＣＲ断片の総量は２０％を超えてはならない。
１．次の反応を設定する：
【表２】
2019010096.tif 000003
２．サーモサイクラーにて５０℃で１５分間（２〜３断片）または６０分間（４〜６断片）インキュベートする。形質転換前に氷または−２０℃で保存する
３．２ｕｌのアセンブリ反応でＮＥＢ５−アルファ細胞を形質転換する。
【００９８】
クローンを以下の手順に従ってＥ．Ｃｏｌｉに形質転換した：
−氷上で５０ｕｌのコンピテント細胞（典型的には５アルファ）を解凍する
−２ｕｌの容量で１０〜１００ｎｇのＤＮＡを添加する
−５分間氷上に置く
−４２℃で１０秒間ヒートショック
−５分間氷上に置く
−一方、カタボライト抑制（「ＳＯＣ」）液体培地を有する１ｍｌ超最適液体培養液でチューブまたはプレートを調製する。
−  コンピテント細胞を適切なチューブまたはプレート上のウェルに移す
−  ３７℃で１時間振とうさせて、増殖させる
−  一方、プレートにラベルを貼り、３７℃のインキュベーターに入れて温める。
−  １０，０００ｇで３０秒間回転させ、細胞を底に集中させる
−  ８００ｕｌのＳＯＣを除去して廃棄する。約２００ｕｌを残す必要がある
−  ２００ｕｌ全体を室温の寒天プレートに加える。あるいは、プレート１に１０％（２０ｕｌ）、プレート２に９０％（１８０ｕｌ）を加える。
−  滅菌ガラスビーズを用いてプレート上に広げる。
−  ３７℃で一晩インキュベートする
【００９９】
形質転換された細胞をコロニー中に増殖させ、Ｅ．ＣｏｌｉコロニーＰＣＲを以下の手順に従って行った：
ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘプロトコル（Ｔａｑポリメラーゼ）
２０uｌ反応の場合：
【表３】
2019010096.tif 000004
サーモサイクラープロトコル：
９５℃で２分間
２８サイクル
----------------
９５℃で３０秒間
[プライマー融解温度−５℃]で３０秒間
７２℃で１ｋＢ当たり１分
----------------
７２℃で５分間
永遠に４℃
【０１００】
形質転換の有効性を得るためにコロニーをスクリーニングするため、アガロースＤＮＡゲル手順を以下に記載するように行った：
ｘ％アガロースゲル（典型的には８〜１２％）を作製するために：
１．Ｘｇアガロースを測定して、所望のパーセンテージを達成する。１ｇ＝１ｍｌ。例えば、１％ゲルを作製するために、１ｇのアガロースを１００ｍｌのＴｒｉｓ塩基、酢酸、及びエチレンジアミン四酢酸の緩衝液（「ＴＡＥ」）中に測定する
２．アガロースを２５０ｍｌのフラスコに加える
３．１００ｍｌのＴＡＥ緩衝液、または必要な容量を入れる
４．液体が透明になるまでのマイクロ波。１００ｍｌ中１％の場合、約１分３０秒かかる。
５．ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ染色を１×まで添加する（それは１０，０００×であるため、ｍｌ／１０の総アガロース容量を加えて、追加する合計ｕｌを得る。例えば、１００ｍｌのアガロースである場合は１０ｕｌを加える）
６．金型に注ぐ。ウェルスロットを追加することを忘れないこと。
７．ゲルが乾燥するまで４５分から１時間待つ。
ゲルを使用するには：
１．乾燥したゲルからウェル金型を取り外す
２．ゲル＋プラスチック支持体を取り外し（プラスチック支持体からゲルを取らない）、ゲルボックスに移す
３．完全に浸水するようにＴＡＥをゲルに注ぐ
４．１０〜２０ｕｌのラダーを載せる。１００ｎｇは十二分に視覚化されなければならない。
５．ＤＮＡサンプルをロードする（ゲルローディング色素と混合した後）。ゲルローディング色素は６×であり、サンプルをロードするために１×に希釈すべきである（例えば、４ｕｌの色素＋２０ｕｌのＤＮＡを混合し、２４ｕｌをすべてロードする）。ＧｏＴａｑ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘでＰＣＲを行ったＤＮＡには、すでにミックスに組み込まれている色素が含まれており、色素を添加する必要はない。１００ｎｇは十二分に視覚化されなければならない。いくつかのサンプルは希釈する必要がある。
６．ワイヤードトップをゲルボックスに置く。ネガ（黒）はウェルの横にあるべきである。
７．ゲルボックスを電源に接続する。１００〜１２０の電圧で１０〜３０分間作動させる。
＊色素はＤＮＡの反対側に移動する（（−）電荷に向かって）。これが、ゲルを長時間／複数回使用することを勧められない、また何も視覚化することができない理由である。ゲルを再使用しないこと。代わりに新しいものを注ぐ。バッファー自体に染料を入れることもでき、これは視覚化に役立つ場合がある。
【０１０１】
Ｅ．Ｃｏｌｉからのベクターを精製するため、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈミニプレップキットに記載されているように、製造元のプロトコルに従ってＤＮＡプレップキットを利用した。
【０１０２】
サンガー配列決定は、ＧｅｎｅｗｉｚまたはＥｕｒｏｆｉｎｓによって業者のプロトコルに従って実施した。その結果、形質転換されたクローンを得た後、ＤＮＡ配列が正しいことを確認した。
【０１０３】
大規模ＤＮＡ調製を、製造業者のプロトコルに記載されているように、Ｍｉｄｉ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて行った。キットをＺｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手した。結果は、有意な量の環状ＤＮＡまたはプラスミドが生成したことを示している。
【０１０４】
以下に記載するように、制限消化ガイド（Ａｄｄｇｅｎｅ製）を用いて、プラスミドを線状ＤＮＡに変換した：
プラスミドを消化するための制限酵素を選択する。
注：どの制限酵素がＤＮＡ配列を切断するのか（及びそれらが切断される場所）を決定するには、ＡｄｄｇｅｎｅのＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒなどの配列解析プログラムを使用する。
酵素のための指示書を読んで、適切な反応緩衝液を決定する。
注：二重消化（同時に２つの酵素で消化）を行う場合は、両方の酵素に働く最良の緩衝液を決定する必要がある。ほとんどの企業は、ＮＥＢのｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｇｅｓｔ  ｆｉｎｄｅｒツールなどの互換性チャートを持っている。両方の酵素に適した緩衝液が見つからない場合、酵素１の緩衝液においてまず１つの酵素で消化し、切断されたプラスミドを再精製し、その後、酵素２の緩衝液において２回目の消化を行う必要がある。
１．５ｍＬチューブ中で以下のものを混ぜる：
ＤＮＡ
制限酵素（複数可）
緩衝液（１×）
ＢＳＡ（メーカー推奨の場合）
最大で総容量のｄＨ２Ｏ
注：切断するＤＮＡの量は適用によって異なる。診断消化は、典型的には約５００ｎｇのＤＮＡを含むが、分子クローニングはしばしば１〜３μｇのＤＮＡを必要とする。全反応容量は、通常、適用に応じて１０〜５０μＬで変化し、主に切断すべきＤＮＡの容量によって決定される。
注：使用する制限酵素の容量の決定に関する注記については、以下のヒント及びＦＡＱセクションを参照すること。
注：典型的な制限消化反応は次のようになる：
１μｇのＤＮＡ
各制限酵素１μＬ
３μＬ１０×緩衝液
３μＬ１０×ＢＳＡ（推奨される場合）
×μＬｄＨ２Ｏ（総容積を３０μＬにする）
ピペットで軽く混合する。
チューブを適切な温度（通常３７℃）で１時間インキュベートする。常にメーカーの指示に従うこと。
注：適用及び反応中のＤＮＡの量に応じて、インキュベーション時間は４５分から一晩までとすることができる。
【０１０５】
ＤＮＡを、以下に記載するフェノール−クロロホルムＤＮＡ抽出及び精製手順を使用して精製した：
材料
１．３Ｍ  ＮａＯＡｃ（酢酸ナトリウム）
２．冷１００％エタノール、
３．冷７０％エタノール、
４．フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１比）
手順
１．１０％容量のＮａＯＡｃをＤＮＡに加える（例えば、５０ｕｌ〜５００ｕｌ）
２．等容量のフェノール−クロロホルム−イソプロパノールを添加し、底部／重質相から注意深く取り；ボルテックスする
３．１２，０００ｇで５分間遠心分離する
４．上相を新しいチューブに移す
５．２．５容量の冷１００％エタノールを添加し、ボルテックスする。多くのＤＮＡがある場合、液体は濁って見えるはずである。
６．−８０℃で１０分間置く、またはドライアイス上に置く
７．できるだけ４℃で１０分間、最大速度で遠心分離する。上清の大部分を除去する（約５０ｕｌを残す）
８．１ｍｌの冷７０％エタノールで洗浄し、追加の機械的作用なしで洗浄を加える（ペレットを積極的に乱さない）。
９．最高速度で５分間遠心分離する
１０．７０％エタノールの大部分を除去する；１０〜３０分間風乾させる
１１．２０〜３０ｕｌの水またはＴＥ緩衝液に再懸濁する
注：
マイクロチューブの最適化容積：
ｏ  ４００ｕｌのＤＮＡ
ｏ  ４０ｕｌのＮａＯＡｃ
ｏ  ４４０ｕｌのフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール
ｏ  上相が約４００ｕｌ回収された。
ｏ  １ｍｌ１００％ＥＴＯＨを添加する
【０１０６】
ＤＮＡを、以下の手順に従って酵母細胞に形質転換した：
ピキアエレクトロポレーションプロトコル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（商標）Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ＃１６５２６６０）
ピキア株−ＤＮＡ２．０由来のＷＴピキアを、Ｐ４ＨＡ／Ｂ共発現プラスミドで形質転換し、Ｈｙｇｒｏプレート（２００μｇ／ｍｌ）上で選択した。クローン＃４
１．単一コロニーを１００ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、振とう（２１５ｒｐｍ）しながら３０度で一晩増殖させた。
２．翌日、培養物はＯＤ６００約３．５に達する（約３〜５×１０７細胞／ＯＤ６００）。新鮮なＹＰＤで培養液をＯＤ６００約１．７に希釈し、振とう（２１５ｒｐｍ）しながら３０℃でさらに１時間増殖させる。
３．細胞を３５００ｇで５分間沈降させる；水で１回洗浄し、１０ｍｌの、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＬｉＡｃ、１０ｍＭ  ＤＴＴ（新鮮添加）、０．６Ｍソルビトールに再懸濁する
４．各形質転換について、８×１０８細胞を、８ｍｌの、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＬｉＡｃ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．６Ｍソルビトールに分注し、室温で３０分間インキュベートする。
５．細胞を５０００ｇで５分間沈降させ、氷冷した１．５ｍｌの１Ｍソルビトールで３回洗浄し、８０ｕｌの氷冷１Ｍソルビトールで再懸濁する
６．種々の量（約５μｇ）の線状化ＤＮＡを細胞に加え、ピペッティングにより混合する
７．細胞及びＤＮＡ混合物（８０〜１００ｕｌ）を０．２ｃｍキュベットに加え、ピキア−プロトコル（１５００ｖ、２５ｕＦ、２００Ω）を用いてパルスする
８．直ちに、細胞をＹＰＤと１Ｍ  Ｓｏｒｂｉｔｏｌ（１：１）の１ｍｌ混合液に移し、３０℃で＞２時間インキュベートする
９．異なる密度で細胞をプレートにする。
【０１０７】
単一のコロニーを２４の深いウェルプレート中の２ｍＬ  ＢＭＧＹ培地に接種し、９００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で少なくとも４８時間増殖させた。得られた細胞を、以下の手順に従って、細胞溶解、ＳＤＳ−ページ及びペプシンアッセイを用いてコラーゲンについて試験した。
【０１０８】
細胞を、以下の手順を用いて溶解させた：
１×溶解緩衝液の調製。以下のレシピは、５０サンプルの組み合わせを調製するのに適している。
２．５ｍｌの１ＭのＨＥＰＥＳ；最終濃度５０ｍＭ。
４３８．３ｍｇのＮａＣｌ；最終濃度１５０ｍＭ。
５ｍｌのグリセロール；最終濃度１０％。
０．５ｍｌのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；最終濃度１％。
４２ｍｌのＭｉｌｌｉｐｕｒｅ水。
緩衝液を４℃で１ヶ月間保存する。
Ｑｉａｇｅｎ  ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒを使用して、ピキア・パストリス細胞を溶解する。
スピード：３０ｈｚ
時間：１５分（連続）
卓上遠心分離機で２５００ｒｐｍにて１５分間溶解物を遠心分離する。新鮮なチューブまたは９６の深いウェルプレートに約６００ｕｌの上清を集める。ペレットを捨てる。
ＳＤＳ−Ｐａｇｅは以下の手順で行った。
バッファーと溶液の調製
５０ｍｌのＰｉｅｒｃｅ（商標）２０×Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ  ＳＤＳ  Ｂｕｆｆｅｒを９５０ｍｌのＭｉｌｌｉｐｕｒｅ水と混合して１×Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ  ＳＤＳ  Ｂｕｆｆｅｒにする。
ミニまたはミディゲルタンクの各チャンバーに１５００ｍｌの１×Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ  ＳＤＳ  Ｂｕｆｆｅｒを加える。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−各ゲルには以下が含まれる：
分子量マーカー、陰性対照、陽性対照（複数可）、サンプル。
ゲルの調製
ゲルの周りのプラスチックケーシングを開く。
ゲルからウェルコームを外す。
白いテープをゲルから外す。
製造元の指示に従ってゲルをミディゲルタンクに入れる。
ゲルウェルを５ｍｌの１×Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ  ＳＤＳ  Ｂｕｆｆｅｒで１度に１ｍｌでリンスする。
気泡を吸引し、すべてのウェルを１×Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ  ＳＤＳ  Ｂｕｆｆｅｒに確実に浸す。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをロードするためのサンプル調製。
氷上でサンプルと対照を解凍する。
ＬＤＳ緩衝液を２×に希釈し、１０％の２−メルカプトエタノールの最終容量を加え、水で容量を形成する。
各サンプルとＬＤＳ＋２−ＭＥを１：１の比で混合する
サンプルを短時間ボルテックスし、遠心分離する。
すべてのサンプルを７０℃で７分間インキュベートする
サンプルを室温に冷却し、短時間遠心する。
サンプルローディング
２０μＬの対照及びサンプル及び１０ｕｌの分子量標準を各ウェルに加える
１〜４個のミディゲルタンクの電気泳動
ＰｏｗｅｒＥａｓｅ（登録商標）３００Ｗでワンステッププログラムを作成する。
ステップ１は１５０Ｖで１時間１０分である。
製造元の指示に従って、ミディゲルタンクの蓋をベースに取り付ける。
電源ケーブルをＰｏｗｅｒＥａｓｅ（登録商標）３００Ｗの正しいコンセントに接続し、赤色のケーブルが赤色のコンセントに接続され、黒色のケーブルが黒色のコンセントに接続されていることを確認する。
必要に応じて、最大４個のミディゲルタンクに必要に応じて繰り返す。
ワンステッププログラムを実行する。
ゲルを移動のために準備する。
ＰｏｗｅｒＥａｓｅ（登録商標）３００Ｗをオフにする。
ＰｏｗｅｒＥａｓｅ（登録商標）３００Ｗからミディゲルタンクケーブルのプラグを抜く。
ミディゲルタンクから蓋を取り外す。
ミディゲルタンクからゲルを取り出す。
ミディゲルタンクに付属のゲルナイフを使用して、ナイフの刃をプラスチックの隙間に入れ、ナイフにトルクをかけてゲルのプラスチックケーシングを開く。プラスチックケースが２つに分離するまで、隙間に沿ってこの動きを繰り返す。
プラスチックケースを、水を含有するＮａｌｇｅｎｅ（商標）Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｏｘの上のゲル側の下でプラスチックケースに取り付けられたそのゲルで保持し、ゲルナイフをアノードグローブに静かに押し付けてゲルをＳｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｏｘに放出させる。
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水でゲルを洗浄するために、以下の手順を３回繰り返す。
３０秒間インキュベートする
水を静かに注ぐ
クマシー染色：
１０〜２０ｍｌのＰａｇｅＢｌｕｅタンパク質染色溶液を加え、シェーカー上で穏やかに攪拌しながら室温で６０分間インキュベートする。ゲルはバックグラウンドに影響を与えることなく一晩染色され得る。
染色溶液を捨て、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＭｉｌｌｉｐｕｒｅ水でゲルを２回リンスする。汚染された溶液及び水は、排水管ではなく、指定されたバイオハザード廃棄物容器に廃棄すること。
脱染するために２０ｍｌの水を加える。完全な脱染のためには、１０〜１２時間かかる。より速く脱染するために、水にいくらかのメタノールを加える。水を頻繁に交換すると、脱染が促進される。
【０１０９】
ペプシンアッセイは以下の手順で行った：
１．ペプシン処理の前に、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃプロトコル当たりの各サンプルの全タンパク質を得るためにＢＣＡアッセイを行う。総タンパク質をすべてのサンプルの最低濃度に標準化する。（注：最低総タンパク質濃度が０．５ｍｇ／ｍＬ未満の場合は、その濃度を標準化に使用しないこと）
２．１００μＬの溶解物をマイクロ遠心チューブに入れる。
３．以下を含むマスターミックスを作製する：
ａ．３７％ＨＣｌ（１００ｍＬあたり０．６ｍＬの酸）及び
ｂ．ペプシン（ストックは脱イオン水中に１ｍｇ／ｍＬであり、ペプシンの最終添加によりペプシン：全タンパク質（重量：重量）が１：２５の比にならなければならない。
ｃ．全タンパク質のステップ＃１の正常化に基づいて、ペプシンの量は最終的な添加で変化するので、作製されたスプレッドシートを用いて調節する。
４．ペプシンを加えた後、ピペットで３×混合し、サンプルを室温で１時間インキュベートしてペプシン反応を起こさせる。
５．１時間後、１：１容量のβ−メルカプトエタノールを含むＬＤＳローディング緩衝液を各サンプルに加え、７０℃で７分間インキュベートする。（この場合、１００ｕＬのＬＤＳを追加する必要がある）。
６．その後、１４，０００ｒｐｍで１分間回転させて濁りを除去する。
７．サンプルの上部の１８ｕＬを３〜８％ＴＡＥ（ＴＡＥ緩衝液を使用）に添加し、１５０Ｖで１時間１０分間ゲルを流す。あるいはゲルを流すことが必要になるまで、沸騰させた後、すぐにサンプルを−８０℃に置くことができる。
【０１１０】
結果を以下の表１に示す。
【０１１１】
実施例２
組換えコラーゲンを産生する酵母
実施例１を、以下の変更を伴う同じ手順及びプロトコルに従って繰り返した：ピキア発現のために最適化したウシコラーゲン配列（最適化ウシｃｏｌ３Ａ１、配列２）を含むＤＮＡ  ＭＭＶ７７（配列１０）配列を、酵母に挿入した。ｐＡＯＸ１プロモーター（配列３）を用いてコラーゲン配列の発現を駆動した。５００ｕｇ／ｍｌのゼオシンを含むＹＰＤプレートを用いて、成功形質転換体を選択した。得られた株はＰＰ８であった。ベクターＭＭＶ７７を図２に示す。
制限消化はＰｍｅ  Ｉを用いて行った。
【０１１２】
菌株をＢＭＭＹ培地で増殖させ、コラーゲンについて試験した。結果を以下の表１に示す。
【０１１３】
実施例３
増加した量の組換えコラーゲンを産生する酵母
実施例１を、以下の変更を伴う同じ手順及びプロトコルに従って繰り返した：ピキア発現に最適化されたウシコラーゲン配列を含むＤＮＡ  ＭＭＶ−１２９（配列１１）配列を酵母に挿入した。ｐＣＡＴプロモーター（配列７）を用いてコラーゲン配列の発現を駆動した。５００ｕｇ／ｍｌのゼオシンを含むＹＰＤプレートを用いて、成功形質転換体を選択した。得られた株はＰＰ１２３であった。ＭＭＶ１２９をＳｗａ  Ｉで消化し、ＰＰ１に形質転換してＰＰ１２３を生成させた。ベクターＭＭＶ１２９を図３に示す。
【０１１４】
菌株をＢＭＧＹ培地で増殖させ、コラーゲンについて試験した。結果を以下の表１に示す。
【０１１５】
実施例４
最適量の組換えコラーゲンを産生する酵母
実施例１を、以下の変更を伴う同じ手順及びプロトコルに従って繰り返した：
【０１１６】
ピキア発現用に最適化されたウシコラーゲン配列（配列２）を含むＤＮＡ  ＭＭＶ−１３０（配列１２）配列を酵母に挿入した。コラーゲン配列の発現を駆動するために、ｐＤＦプロモーター（配列６）を使用した。ピキアゲノムへのベクターの部位特異的統合を助けるために、ＡＯＸ１ランディングパッド（Ｐｍｅ  Ｉで切断、配列８）を用いた。５００ｕｇ／ｍｌのゼオシンを含むＹＰＤプレートを用いて、成功形質転換体を選択した。得られた株はＰＰ１５３であった。ＭＭＶ１３０をＰｍｅ  Ｉで消化し、ＰＰ１に形質転換してＰＰ１５３（最適化ウシｃｏｌ３Ａ１、配列２）を作製した。
フェノール抽出は使用せず、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＰＣＲ精製キットを使用して、線状化ＤＮＡを回収した。
【０１１７】
菌株をＢＭＧＹ培地で増殖させ、コラーゲンについて試験した。結果を以下の表１に示す。
【０１１８】
実施例５
組換えヒドロキシル化コラーゲンの産生を意図した酵母
実施例２を、以下の変更を伴う同じ手順及びプロトコルに従って繰り返した：ウシＰ４ＨＡ（配列４）及びウシＰ４ＨＢ（配列５）配列の両方を含む１つのＤＮＡベクター、ＭＭＶ−７８（配列１３）を、酵母に挿入した。ＭＭＶ７８をＰｍｅ  Ｉで消化し、ＰＰ１に形質転換してＰＰ８を生成させた。Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢの両方は、それらの内因性シグナルペプチドを含み、Ｄａｓ１−Ｄａｓ２双方向性プロモーター（配列２５）によって駆動される。ＤＮＡをＫｐｎ  Ｉで消化し、ＰＰ８に形質転換してＰＰ３を生成させた。配列２。ベクターＭＭＶ７８を図５に示す.
【０１１９】
菌株をＢＭＭＹ培地で増殖させ、コラーゲン及びヒドロキシル化について試験した。結果を以下の表１に示す。
【０１２０】
実施例６
組換えヒドロキシル化コラーゲンを産生する酵母
実施例２を、以下の変更を伴う同じ手順及びプロトコルに従って繰り返した：ウシＰ４ＨＡ配列及びウシＰ４ＨＢ配列の両方を含有する１つのＤＮＡベクター、ＭＭＶ−７８を、酵母に挿入した。Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢの両方は、それらの内因性シグナルペプチドを含み、Ｄａｓ１−Ｄａｓ２双方向性プロモーターによって駆動される。ＤＮＡをＫｐｎ  Ｉで消化し、ＰＰ８に形質転換してＰＰ３を生成させた。配列２。
【０１２１】
ｐＡＯＸ１プロモーターによって駆動されるＰ４ＨＢを含む別のベクター、ＭＭＶ−９４（配列１４）を使用し、また酵母に挿入した。Ｐ４ＨＢの内因性シグナルペプチドは、ＰＨＯ１シグナルペプチドによって置換された。得られた株はＰＰ３８であった。ＭＭＶ９４をＡｖｒ  ＩＩで消化し、ＰＰ３に形質転換してＰＰ３８を生成させた。ベクターＭＭＶ９４を図６に示す。
【０１２２】
菌株をＢＭＭＹ培地で増殖させ、コラーゲン及びヒドロキシル化について試験した。結果を以下の表１に示す。
【０１２３】
実施例７
増加した量の組換えヒドロキシル化コラーゲンを産生する酵母
【０１２４】
実施例４を、以下の変更を伴う同じ手順及びプロトコルに従って繰り返した：ウシＰ４ＨＡ配列及びウシＰ４ＨＢ配列の両方を含む１つのＤＮＡベクター、ＭＭＶ−１５６（配列１５）を、酵母に挿入した。Ｐ４ＨＡはその内因性シグナルペプチドを含み、Ｐ４ＨＢシグナル配列はアルファ因子プレ（配列２１）配列で置換された。両方の遺伝子は、ｐＨＴＸ１双方向性プロモーター（配列２５）によって駆動された。ＭＭＶ１５６をＢａｍ  ＨＩで消化し、ＰＰ１５３に形質転換してＰＰ１５４を生成させた。配列２。ベクターＭＭＶ１５６を図７に示す。株をＢＭＧＹ培地で増殖させ、コラーゲン及びヒドロキシル化について試験した。結果を以下の表１に示す。
【０１２５】
実施例８
最適量の組換えヒドロキシル化コラーゲンを産生する酵母
実施例４を、以下の変更を伴う同じ手順及びプロトコルに従って繰り返した：ウシＰ４ＨＡ配列及びウシＰ４ＨＢ配列の両方を含有する１つのＤＮＡベクター、ＭＭＶ−１５６を酵母に挿入した。Ｐ４ＨＡはその内因性シグナルペプチドを含み、Ｐ４ＨＢシグナル配列はアルファ−因子プレ配列で置換された。両方の遺伝子は、ｐＨＴＸ１双方向プロモーターによって駆動された。ＤＮＡをＳｗａ  Ｉで消化し、ＰＰ１５３に形質転換してＰＰ１５４を生成させた。配列２。
【０１２６】
Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢの両方を含む別のベクター、ＭＭＶ−１９１（配列１６）も酵母に挿入した。Ｐ４ＨＡの余分なコピーはその内因性シグナルペプチドを含み、Ｐ４ＨＢの余分なコピーのシグナル配列はアルファ因子プレ−プロ（配列２２）配列に置き換えられた。Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢの余分なコピーは、ｐＧＣＷ１４−ＧＡＰ１双方向性プロモーター（配列２３）によって駆動された。ＭＭＶ１９１をＢａｍ  ＨＩで消化し、ＰＰ１５４に形質転換してＰＰ２６８を生成させた。ベクターＭＭＶ１９１を図８に示す。株をＢＭＧＹ培地で増殖させ、コラーゲン及びヒドロキシル化について試験した。結果を以下の表１に示す。
【０１２７】
実施例９
オールインワン・ベクター
実施例１の方法及び手順を利用してオールインワン・ベクターを作製した。オールインワン・ベクターは、コラーゲン及び関連するプロモーター及びターミネーターのＤＮＡ、コラーゲン及び関連するプロモーター及びターミネーターをヒドロキシル化する酵素のＤＮＡ、マーカー発現及び関連するプロモーター及びターミネーターのＤＮＡ、細菌及び酵母の複製起点（複数可）のＤＮＡ、ならびに組込みのための酵母ゲノムとの相同性を有するＤＮＡ（複数可）を含む。オールインワン・ベクターは、戦略的に配置された固有の制限部位５’，３’を含むか、または上記の成分内に含む。コラーゲン発現の修飾または他のベクター成分の修飾が望まれる場合、選択された成分のＤＮＡは、制限酵素で容易に切除され得、そして使用者の選択されたクローニング方法で置換され得る。オールインワン・ベクター（ＭＭＶ２０８、配列１７）の最も簡単なバージョンは、ヒドロキシラーゼ酵素のプロモーター（複数可）を除いて、上記の成分のすべてを含む。ベクターＭＭＶ２０８は、下記の成分：ＭＭＶ８４（配列１８）からのＡＯＸ相同性、ＭＭＶ１５０（配列１９）からのリボソーム相同性、ＭＭＶ１４０（配列２０）から複製された細菌及び酵母起源、ＭＭＶ１４０由来のゼオシンマーカー及びＭＭＶ１２９由来のＣｏｌ３Ａ１を用いて作製された。Ｐ４ＨＡ及びＢ及び関連ターミネーターの修飾バージョンを、下記の制限部位：ＡｖｒＩＩ、ＮｏｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｍｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩＩ、ＳｗａＩ、ＸｂａＩ、ＳｐｅＩを除去したＧｅｎｓｃｒｉｐｔから合成した。ベクターをＰＰ１株に形質転換した。
【０１２８】
菌株をＢＭＧＹ培地で増殖させ、コラーゲン及びヒドロキシル化について試験した。結果を下記の表１に示す。
【表４】
2019010096.tif 000005
＊比較例；コラーゲンを定量するために、クマシー染色ゲルを使用した。コラーゲン標準曲線を用いて、サンプル中のコラーゲン濃度を決定した。ヒドロキシル化コラーゲンの量は、サンプルバンドを１：２５ペプシン処理後の標準バンドと比較することによって評価した。
【０１２９】
上記のように、ヒドロキシル化コラーゲンは、高濃度のペプシン中で安定であり、したがって、発酵からのコラーゲン量の増加のみならず、ヒドロキシル化コラーゲンを有することも有用である。
【０１３０】
記載の解釈
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。例えば、本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈に特段の要求がない限り、複数形も含むことが意図されている。さらに、本明細書で使用される場合、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」及び／または「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含むこと）」は、記載された特徴、ステップ、操作、要素、及び／または成分の存在を特定するが、他の特徴、ステップ、動作、要素、成分、及び／またはそれらのグループのうちの１つまたはそれ以上の存在または追加を除外するものではないと理解される。
【０１３１】
「第１」及び「第２」との用語は、様々な特徴／要素（ステップを含む）を説明するために本明細書で使用することができるが、文脈に特段の指示がない限り、これらの特徴／要素はこれらの用語によって限定されるべきではない。これらの用語は、ある特徴／要素を別の特徴／要素と区別するために使用することができる。したがって、以下に説明する第１の特徴／要素は第２の特徴／要素と呼ぶことができ、同様に、以下に説明する第２の特徴／要素は本発明の教示から逸脱することなく第１の特徴／要素と呼ぶことができる。
【０１３２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲を通して、文脈に特段の要求がない限り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」という単語、及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変形は、様々な構成要素が方法及び物品において一緒に使用され得ることを意味する（例えば、組成物、及びデバイス及び方法を含む装置）。例えば、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は、任意の記載された要素またはステップの包含を意味するが、他の任意の要素またはステップの排除を意味するものではないと理解される。
【０１３３】
上記に様々な実施形態が記載されているが、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態に対して多くの変更のいずれかがなされ得る。例えば、記載された様々な方法ステップが実行される順序は、代替実施形態ではしばしば変更されてもよく、他の代替実施形態では、１つ以上の方法ステップが完全に省略されてもよい。様々な装置及びシステムの実施形態の任意の特徴は、いくつかの実施形態に含まれてもよく、他の実施形態に含まれなくてもよい。したがって、上記の説明は、主に例示的な目的のために提供され、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１３４】
本明細書に含まれる実施例及び図は、限定ではなく例示として、主題が実施され得る特定の実施形態を示す。上述したように、他の実施形態は、本開示の範囲から逸脱することなく、構造的及び論理的な置換及び変更を行うことができるように、利用され、そしてそこから誘導することができる。本発明の主題のこのような実施形態は、本明細書において、実際に複数の発明が開示されている場合、本出願の範囲を任意の単一の発明または発明の概念に自発的に限定することを意図することなく、単に便宜的に「発明」という用語によって個々にまたは集合的に言及されてもよい。したがって、特定の実施形態を本明細書に図示し説明してきたが、同じ目的を達成するために計算された任意の構成を、示された特定の実施形態に置き換えることができる。本開示は、様々な実施形態における任意の及びすべての適合または変形を網羅することを意図している。上記の実施形態の組み合わせ、及び本明細書に具体的に記載されていない他の実施形態は、上記の説明を検討することにより当業者には明らかであろう。
【０１３５】
参照による取り込み
本明細書で言及されたすべての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個々に示されて参照により取り込まれているかのように、参照によりその全体が本明細書に同程度に取り込まれており、特に、参照による取り込みがある明細書の同じ文章、段落、ページまたはセクションに現れる開示が参照される。
【図１】
2019010096.tif 000006
【図２】
2019010096.tif 000007
【図３】
2019010096.tif 000008
【図４】
2019010096.tif 000009
【図５】
2019010096.tif 000010
【図６】
2019010096.tif 000011
【図７】
2019010096.tif 000012
【図８】
2019010096.tif 000013
【図９】
2019010096.tif 000014
【図１０】
2019010096.tif 000015
【図１１】
2019010096.tif 000016
【図１２】
2019010096.tif 000017
【配列表】
2019010096000001.app
【外国語明細書】
2019010096000001.pdf