(57)【要約】      （修正有）【課題】ある特定のがん細胞を標的化するが、同じ抗原を有する他の細胞は標的化しない、治療用ベクターおよび治療用細胞を開発すること。【解決手段】ＣＤ１３８特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびこれと機能的に関連する１つまたは複数の低酸素状態応答性調節エレメントをコードし、誘導性自殺遺伝子をコードする配列をさらに含む発現ベクターを開発する。該ベクターを含み、その発現が環境特異的調節の制御下にあるＣＤ１３８特異的キメラ抗原受容体を有する細胞を作成する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１３８特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびこれと機能的に関連する１つまたは複数の低酸素状態応答性調節エレメントをコードする発現ベクター。
【請求項２】
誘導性自殺遺伝子をコードする配列をさらに含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
ＣＤ１３８特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、ａ）該ＣＤ１３８特異的ＣＡＲと機能的に関連する１つもしくは複数の低酸素状態応答性調節エレメント、および／またはｂ）誘導性自殺遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項４】
非ウイルスベクターまたはウイルスベクターである、請求項１または３に記載のベクター。
【請求項５】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１または３に記載のベクター。
【請求項６】
前記ＣＤ１３８特異的ＣＡＲが、ＩｇＧ１のヒンジ領域を含む、請求項１または３に記載のベクター。
【請求項７】
前記ＣＤ１３８特異的ＣＡＲが、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４〜１ＢＢ、ＩＣＯＳ、およびこれらの組合せからなる群から選択される細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１または３に記載のベクター。
【請求項８】
前記ＣＤ１３８特異的ＣＡＲが、ＣＤ３−ゼータおよびＣＤ２８からなる群から選択される、膜貫通ドメインを含む、請求項１または３に記載のベクター。
【請求項９】
前記自殺遺伝子が、カスパーゼ９、単純ヘルペスウイルス、チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、およびチトクロームＰ４５０からなる群から選択される、請求項２または３に記載のベクター。
【請求項１０】
前記低酸素状態応答性調節エレメントが、ＶＥＧＦ低酸素状態応答性調節エレメント、α１Ｂ−アドレナリン作動性受容体低酸素状態応答性調節エレメント、脂肪酸シンターゼ低酸素状態応答性調節エレメント、またはこれらの組合せを含む、請求項１または２に記載のベクター。
【請求項１１】
請求項１、２、または３に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１２】
真核細胞としてさらに規定される、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
ヒト細胞としてさらに規定される、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１４】
特定の個体との関連で、自己細胞、同系細胞、同種細胞、または異種細胞としてさらに規定される、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１５】
前記個体が、がんの処置を必要とする、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
前記個体が、Ｂ細胞系造血器悪性腫瘍のための処置を必要とする、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１７】
前記個体が、多発性骨髄腫のための処置を必要とする、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１８】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ナチュラルキラー細胞、またはナチュラルキラーＴ細胞としてさらに規定される、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１９】
ウイルス特異的である、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
前記ウイルスが、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ＢＫウイルス、ＨＨＶ６、ＲＳＶ、インフルエンザ、パラインフルエンザ、ボカウイルス、コロナウイルス、ＬＣＭＶ、ムンプス、麻疹、メタ肺炎ウイルス、パルボウイルスＢ、ロタウイルス、ウェストナイルウイルス、ＪＣ、ＨＨＶ７、またはＨＩＶである、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
ＣＤ１３８以外の抗原に特異的である少なくとも１つの他のＣＡＲを含む、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２２】
前記ＣＡＲが、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、黒色腫優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、スルビビン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ｋ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥｒｂＢ二量体、ＥＧＦｒ  ｖＩＩＩ、癌胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体ａ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−Ａ１  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣＡ、葉酸受容体ａ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ａｖｂ６インテグリン、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、二重抗原、およびユニバーサルからなる群から選択される抗原に特異的である、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２３】
分泌性エンゲージャータンパク質を発現し、前記タンパク質が、活性化ドメインおよび抗原認識ドメインを含む、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２４】
前記活性化ドメイン、抗原認識ドメイン、または両方のドメインが、一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）抗体部分を含む、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
前記活性化ドメインが、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群から選択される分子を認識するｓｃＦＶである、請求項１に記載の細胞。
【請求項２６】
前記抗原認識ドメインが、ＣＤ１３８に結合する、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２７】
個体におけるがんを処置する方法であって、請求項１から１０のいずれか一項に記載のベクターの治療有効量を該個体に送達するステップを含む方法。
【請求項２８】
個体におけるがんを処置する方法であって、請求項１１から２６のいずれか一項に記載の細胞の治療有効量を該個体に送達するステップを含む方法。
【請求項２９】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のベクターを含むキット。
【請求項３０】
請求項１１から２６のいずれか一項に記載の細胞を含むキット。
【請求項３１】
腫瘍抗原特異的ＣＡＲおよびこれと機能的に関連する１つまたは複数の低酸素状態応答性調節エレメントをコードする発現ベクター。
【請求項３２】
誘導性自殺遺伝子をコードする配列をさらに含む、請求項３１に記載のベクター。
【請求項３３】
腫瘍抗原特異的ＣＡＲをコードし、ａ）該腫瘍抗原特異的ＣＡＲと機能的に関連する１つもしくは複数の低酸素状態応答性調節エレメント、および／またはｂ）誘導性自殺遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項３４】
前記腫瘍抗原が、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、黒色腫優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、スルビビン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ｋ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥｒｂＢ二量体、ＥＧＦｒ  ｖＩＩＩ、癌胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体ａ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−Ａ１  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣＡ、葉酸受容体ａ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ａｖｂ６インテグリン、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、二重抗原、およびユニバーサルからなる群から選択される、請求項３１または３３に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月７日出願の米国特許仮出願第６１／７７４，０４０号に基づく優先権を主張する。これらの出願はすべて、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示の実施形態は、少なくとも、細胞療法、免疫学、免疫療法、分子生物学、細胞生物学、およびがん医学を含めた医学の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
過去１５年間の、高用量化学療法および幹細胞レスキューの使用における、サリドマイド、レナリドマイド、およびボルテゾミブにより、多発性骨髄腫（ＭＭ）患者の生存（１０年間の生存は、約３０％である）が延長されている。しかし、ＭＭは、依然として本質的に治癒不可能である。悪性形質細胞（ＰＣ）は、骨髄破壊的同種幹細胞移植または非骨髄破壊的同種幹細胞移植で処置された患者における、移植片対ＭＭ効果により媒介される腫瘍退縮により示される通り、Ｔ細胞による免疫認識および消失に対して感受性である。この観察により、ＭＭにおける腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のｅｘ  ｖｉｖｏ生成に基づく養子Ｔ細胞療法であって、腫瘍性ＰＣ内で過剰発現される、複数の標的化可能な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を指向する、養子Ｔ細胞療法の開発が刺激された。
【０００４】
造血器悪性腫瘍におけるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）技術は、過去数年間で爆発的に増大している。ＣＡＲとは、特異的モノクローナル抗体（抗原結合性部位）から得られる一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、ＣＤ３ζ鎖の細胞質内ドメインおよび共刺激性エンドドメインへと連結された、ｓｃＦｖから構成される人工的受容体である。Ｔ細胞により発現されると、ＣＡＲは、ＭＨＣに制限されない抗原認識と、Ｔ細胞による共刺激とを、同時に媒介する。
【０００５】
ＣＡＲ技術を使用して、悪性ＰＣを標的化するため、悪性ＰＣの細胞表面上で不変的に過剰発現されるＣＤ１３８分子（シンデカン１）を選択した。この標的抗原は、臨床試験において有望な予備的報告をもたらした、ＣＤ１３８特異的ヒト化モノクローナル抗体を開発する取組みの成功によって、ＭＭについて検証されている。ＣＡＲ技術を使用することによって、ＣＤ１３８抗体の特異性を、Ｔリンパ球の細胞傷害作用および寿命と組み合わせることは、有意な治療的進歩を表すことになるだろう。
【０００６】
ＣＤ１３８は、単純上皮細胞の側底面に生理学的に局在化し、層状化された上皮細胞を取り囲むが、おそらくこれらの正常組織上のＣＤ１３８の発現の密度は低いため、ＣＤ１３８モノクローナル抗体のＭＭ患者への投与は安全であるとわかっている。しかし、Ｔ細胞上のＣＡＲとしてのＣＤ１３８抗体の発現は、抗体のアビディティーを増大させ、追加のＴ細胞エフェクター機構をもたらすに至る可能性があり、それによって、正常組織において低レベルで発現された抗原を標的化する他のＣＡＲについて既に観察されている、「オン・ターゲット」であるが「オフ器官」の毒性を引き起こしうる。効果的な自殺遺伝子の活性化によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞を急速に消失させれば、この望ましくない作用を回避することもでき、ＣＡＲが、例えば、ｍＲＮＡトランスフェクションの後で、Ｔ細胞により一過性に発現されるだけであれば、これを低減することもできる。しかし、いずれのアプローチが安全性を増大させても、長期にわたる免疫によるＭＭのコントロールである、養子Ｔ細胞療法の主要な利点は失効化される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本開示は、当業界における、少なくともＭＭを含めた、ＣＤ１３８を発現するがんを伴う個体に有効な養子Ｔ細胞療法をもたらす必要を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、細胞療法と関連する方法および組成物を対象とする。特定の実施形態では、細胞療法は、ヒトを含めた哺乳動物など、細胞療法を必要とする個体のための細胞療法である。細胞療法は、任意の医学的状態に適しうるが、特定の実施形態では、細胞療法は、がんのための細胞療法である。がんは、いかなる種類のがんでもよく、いかなる病期のがんでもよい。個体は、どのような年齢であってもよく、どちらの性別であってもよい。特定の実施形態では、個体は、がんを有するか、がんを有する危険性があるか、またはがんを有することが疑われることが知られている。がんは、原発性がんであってもよく、転移性がんであってもよく、がんは、処置に対して不応性でありうる。個体は、がんを再発していてもよい。特定の実施形態では、がんは、Ｂ細胞系造血器悪性腫瘍など、造血器悪性腫瘍である。いくつかの場合では、がんは、造血器悪性腫瘍ではない。いくつかの場合では、がんは、多発性骨髄腫を含めた骨髄腫である。特定の実施形態では、がんは、例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫、乳がん、肺がん、脳腫瘍、結腸がん、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、甲状腺がん、骨がん、子宮頚がん、脾臓がん、肛門がん、食道がん、頭頸部がん、胃がん、胆嚢がん、黒色腫、非小細胞肺がんなどである。特定の態様では、がんは、１つまたは複数の腫瘍抗原を発現し、特定の実施形態では、細胞療法は、１つまたは複数の腫瘍抗原を標的化する。特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ１３８（これは、シンデカン１とも称しうる）である。
【０００９】
本開示の特定の実施形態では、免疫療法における使用に適した細胞と関連する方法および組成物がある。ある特定の態様では、本開示の方法および組成物は、当業界で活用される技法に対する改善である。特定の場合には、本開示の実施形態は、いかなる種類の免疫療法に活用される細胞に対する改善にも有用であるが、特定の場合には、免疫療法用細胞は、がん療法に利用される。
【００１０】
本開示のある特定の態様では、個体に、療法を個体に提供する細胞が提供される。細胞は、いかなる種類でもよいが、特定の実施形態では、細胞は、ＣＤ１３８抗原を発現するがん細胞を有する個体に療法を提供することができる。ある特定の実施形態では、多発性骨髄腫などのＢ細胞系造血器悪性腫瘍など、ＣＤ１３８を発現するがんを有することが知られた個体に細胞が提供されるが、ある特定の場合には、ＣＤ１３８抗原の存在は決定されない。細胞は、Ｔ細胞などの免疫細胞でありうる。いくつかの場合では、細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞などでありうる。
【００１１】
本開示の実施形態では、治療用ベクターおよび／またはベクターを保有する治療用細胞と関連する方法および組成物がある。本開示の態様では、本開示の治療用細胞は、ＣＤ１３８抗原を含むある特定のがん細胞を標的化するが、ＣＤ１３８抗原を有する他の細胞を標的化せず、このような二分法は、治療用細胞内のＣＤ１３８受容体の環境特異的発現の結果である。特定の実施形態では、本開示の方法および組成物は、その発現が環境特異的調節の制御下にある、ＣＤ１３８特異的キメラ抗原受容体を有する細胞に関する。特定の実施形態では、環境は、低酸素状態である。ある特定の実施形態では、本開示の方法および組成物は、その発現が組織特異的調節の制御下にある、ＣＤ１３８特異的キメラ抗原受容体を有する細胞に関する。いくつかの場合では、この物質は、環境的調節および／または組織特異的調節に加えて、またはこの代わりに、自殺遺伝子を含む。
【００１２】
低酸素状態特異的調節下にある本開示のある特定の態様では、ＣＤ１３８以外のＣＡＲを含めた、任意のＣＡＲを活用する。ＣＤ１３８の代わりとしての例示のＣＡＲまたはＣＤ１３８に加えた例示のＣＡＲには、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、黒色腫優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、スルビビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ｋ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥｒｂＢ二量体、ＥＧＦｒ  ｖＩＩＩ、癌胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体ａ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−Ａ１  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣＡ、葉酸受容体ａ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ａｖｂ６インテグリン、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、二重抗原、およびユニバーサルからなる群から選択される抗原に特異的なＣＡＲが含まれる。
【００１３】
本開示のある特定の態様では、ＣＡＲ．ＣＤ１３８を、構成的にではなく、腫瘍環境内で発現する、Ｔ細胞などの免疫細胞がある。低酸素性のＭＭ微小環境は、罹患部位における酸素分圧の直接的な測定により実証されており（２２）、ＨＩＦ−１α（低酸素状態誘導性応答の主要な調節因子）の過剰発現により間接的に実証されている（２３、２４）。Ｔ細胞内のＣＡＲ．ＣＤ１３８の発現は、低酸素状態応答エレメントによりその発現を制御することを介して、操作されたＴ細胞が、低酸素性のＭＭ微小環境内だけにおいて、機能的なレベルでＣＡＲを発現するように調節し、それによって、他の器官内の抗原の標的化を制限することができる。
【００１４】
本開示のいくつかの実施形態では、ＣＤ１３８特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびこれと機能的に関連する１つまたは複数の低酸素状態応答性調節エレメントをコードする発現ベクターがある。特定の実施形態では、ベクターは、誘導性自殺遺伝子をコードする配列をさらに含む。
【００１５】
一実施形態では、ＣＤ１３８特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、ａ）ＣＤ１３８特異的ＣＡＲと機能的に関連する１つもしくは複数の低酸素状態応答性調節エレメント、および／またはｂ）誘導性自殺遺伝子（カスパーゼ９、単純ヘルペスウイルス、チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、およびチトクロームＰ４５０が例である）を含む発現ベクターがある。特定の実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターまたはウイルスベクター（レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなど）である。特定の実施形態では、ＣＤ１３８特異的ＣＡＲは、ＩｇＧ１のヒンジ領域を含む。少なくともいくつかの場合には、ＣＤ１３８特異的ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４〜１ＢＢ、ＩＣＯＳ、およびこれらの組合せからなる群から選択される、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ＣＤ１３８特異的ＣＡＲは、ＣＤ３−ゼータおよびＣＤ２８からなる群から選択される、膜貫通ドメインを含みうる。
【００１６】
低酸素状態応答性調節エレメントは、ＶＥＧＦ低酸素状態応答性調節エレメント、α１Ｂ−アドレナリン作動性受容体低酸素状態応答性調節エレメント、脂肪酸シンターゼ低酸素状態応答性調節エレメント、またはこれらの組合せを含みうる。
【００１７】
本開示の実施形態では、本開示のベクターを含む細胞がある。細胞は、ヒト細胞を含めた真核細胞でありうる。細胞は、特定の個体との関連で、自己細胞、同系細胞、同種細胞、または異種細胞でありうる。いくつかの場合では、本開示の方法および／または組成物が提供される個体は、特定の種類のがんのための処置を含めたがんの処置を必要とする。いくつかの場合では、個体は、Ｂ細胞系造血器悪性腫瘍のための処置を必要とする。特定の場合には、個体は、少なくとも多発性骨髄腫を含めた、ＣＤ１３８を発現するがんのための処置を必要とする。細胞は、いかなる種類でもよいが、特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞などの免疫細胞である。細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ナチュラルキラー細胞、またはナチュラルキラーＴ細胞でありうる。例えば、細胞は、エフェクター細胞でありうる。細胞は、ウイルス特異的なＴ細胞である可能性があり、ウイルスは、例えば、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ＢＫウイルス、ＨＨＶ６、ＲＳＶ、インフルエンザ、パラインフルエンザ、ボカウイルス、コロナウイルス、ＬＣＭＶ、ムンプス、麻疹、メタ肺炎ウイルス、パルボウイルスＢ、ロタウイルス、ウェストナイルウイルス、ＪＣ、ＨＨＶ７、またはＨＩＶでありうる。
【００１８】
いくつかの場合では、細胞は、ＣＤ１３８以外の抗原またはＣＤ１３８の代わりとしての抗原に特異的な、少なくとも１つの他のＣＡＲを含む。本開示の特定の実施形態では、ＣＡＲは、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、黒色腫優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、スルビビン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ｋ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥｒｂＢ二量体、ＥＧＦｒ  ｖＩＩＩ、癌胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体ａ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−Ａ１  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣＡ、葉酸受容体ａ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ａｖｂ６インテグリン、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、二重抗原、およびユニバーサルからなる群から選択される抗原に特異的である。
【００１９】
ＣＤ１３８特異的ＣＡＲの使用に加えた実施形態またはこれらの代わりの実施形態では、本開示の細胞は、ＣＤ１３８を指向する分泌性エンゲージャータンパク質を発現し、前記タンパク質は、活性化ドメインおよび抗原認識ドメインを含む。活性化ドメイン、抗原認識ドメイン、または両方のドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）抗体部分を含むことができ、活性化ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群から選択される分子を認識するｓｃＦＶを含みうる。ＣＡＲと組み合わせた特定の実施形態では、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、Ｔｉｍ−３などの結合性モチーフまたは阻害モチーフと組み合わされたＣＤ１３８結合性モチーフをコードする、エンゲージャーがありうる。ある特定の実施形態では、抗原認識ドメインは、ＣＤ１３８に結合するが、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、黒色腫優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、スルビビン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ｋ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥｒｂＢ二量体、ＥＧＦｒ  ｖＩＩＩ、癌胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体ａ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−Ａ１  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣＡ、葉酸受容体ａ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ａｖｂ６インテグリン、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、二重抗原、またはユニバーサル腫瘍抗原にも結合しうる。
【００２０】
本開示の実施形態では、個体におけるがんを処置する方法であって、本開示のベクターの治療有効量を個体に送達するステップを含む、方法がある。ある特定の実施形態では、個体におけるがんを処置する方法であって、本開示の細胞の治療有効量を個体に送達するステップを含む、方法がある。
【００２１】
本開示の実施形態では、腫瘍抗原特異的ＣＡＲおよびこれと機能的に関連する１つまたは複数の低酸素状態応答性調節エレメントをコードする発現ベクターがある。ベクターは、誘導性自殺遺伝子をコードする配列をさらに含みうる。本開示の実施形態では、腫瘍抗原特異的ＣＡＲをコードし、ａ）腫瘍抗原特異的ＣＡＲと機能的に関連する１つもしくは複数の低酸素状態応答性調節エレメント、および／またはｂ）誘導性自殺遺伝子を含む発現ベクターがある。本開示のいずれのベクターにも、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、黒色腫優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、スルビビン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ｋ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥｒｂＢ二量体、ＥＧＦｒ  ｖＩＩＩ、癌胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体ａ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−Ａ１  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣＡ、葉酸受容体ａ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ａｖｂ６インテグリン、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、二重抗原、およびユニバーサルからなる群から選択される腫瘍抗原に特異的なＣＡＲが含まれる。本開示には、これらのベクターでがんを処置する方法が包含される。本開示には、これらのベクターを発現する細胞および細胞を使用してがんを処置する方法も包含される。
【００２２】
本開示の実施形態では、本明細書に記載のベクターおよび／または本明細書に記載の細胞を含むキットがある。
【００２３】
本発明の実施形態では、少なくとも１つのＣＤ１３８特異的認識部分をコードし、これと機能的に関連する１つまたは複数の低酸素状態応答性調節エレメントを有するポリヌクレオチドがある。特定の実施形態では、ＣＤ１３８特異的認識部分は、ＣＤ１３８特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＣＤ１３８特異的エンゲージャー分子、またはこれらの両方を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現ベクターとしてさらに規定される。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、誘導性自殺遺伝子をコードする配列をさらに含む。いくつかの場合では、ベクターは、非ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターを含めた、ウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、ＣＤ１３８特異的ＣＡＲは、ＩｇＧ１のヒンジ領域を含む。いくつかの場合では、ＣＤ１３８特異的ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４〜１ＢＢ、ＩＣＯＳ、およびこれらの組合せからなる群から選択される細胞内シグナル伝達ドメインを含む。特定の場合には、ＣＤ１３８特異的ＣＡＲは、ＣＤ３−ゼータおよびＣＤ２８からなる群から選択される、膜貫通ドメインを含む。特定の態様では、自殺遺伝子は、カスパーゼ９、単純ヘルペスウイルス、チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、およびチトクロームＰ４５０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、低酸素状態応答性調節エレメントは、ＶＥＧＦ低酸素状態応答性調節エレメント、α１Ｂ−アドレナリン作動性受容体低酸素状態応答性調節エレメント、脂肪酸シンターゼ低酸素状態応答性調節エレメント、またはこれらの組合せを含む。
【００２４】
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドを含む細胞が提供される。特定の実施形態では、細胞は、免疫細胞を含めた、ヒト細胞などの真核細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、特定の個体との関連で、自己細胞、同系細胞、同種細胞、または異種細胞としてさらに規定される。個体は、少なくとも、多発性骨髄腫など、Ｂ細胞系造血器悪性腫瘍のための処置を含めた、がんの処置を必要としうる。いくつかの場合では、細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ナチュラルキラー細胞、またはナチュラルキラーＴ細胞としてさらに規定される。細胞は、ウイルス潜伏感染タンパク質に特異的な天然受容体を含みうる。例示のウイルスには、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ＢＫウイルス、ＨＨＶ６、ＲＳＶ、インフルエンザ、パラインフルエンザ、ボカウイルス、コロナウイルス、ＬＣＭＶ、ムンプス、麻疹、メタ肺炎ウイルス、パルボウイルスＢ、ロタウイルス、ウェストナイルウイルス、ＪＣ、ＨＨＶ７、またはＨＩＶが含まれる。特定の実施形態では、細胞は、ＣＤ１３８以外の抗原に特異的な、少なくとも１つの他のＣＡＲを含む。ＣＡＲは、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、黒色腫優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、スルビビン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ｋ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥｒｂＢ二量体、ＥＧＦｒ  ｖＩＩＩ、癌胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体ａ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−Ａ１
ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣＡ、葉酸受容体ａ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ａｖｂ６インテグリン、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、二重抗原、およびユニバーサルからなる群から選択される抗原に特異的でありうる。特定の実施形態では、ＣＤ１３８特異的認識部分は、活性化ドメインおよび抗原認識ドメインを有するＣＤ１３８特異的エンゲージャー分子を含み、この場合、両方のドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）抗体部分を含む。いくつかの場合では、活性化ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群から選択される分子を認識するｓｃＦＶである。
【００２５】
一実施形態では、個体におけるがんを処置する方法であって、本開示のポリヌクレオチドの治療有効量を個体に送達するステップを含む方法がある。いくつかの実施形態では、個体におけるがんを処置する方法であって、本開示の細胞の治療有効量を個体に送達するステップを含む方法がある。特定の実施形態では、本開示のベクターを含むキットがある。特定の実施形態では、１つまたは複数の本開示の細胞を含むキットがある。いくつかの態様では、腫瘍抗原特異的ＣＡＲおよびこれと機能的に関連する１つまたは複数の低酸素状態応答性調節エレメントをコードする発現ベクターがある。ある特定の実施形態では、ベクターは、誘導性自殺遺伝子をコードする配列をさらに含む。ベクターは、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、黒色腫優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、スルビビン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ｋ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥｒｂＢ二量体、ＥＧＦｒ  ｖＩＩＩ、癌胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体ａ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−Ａ１  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣＡ、葉酸受容体ａ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ａｖｂ６インテグリン、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、二重抗原、および／またはユニバーサルからなる群から選択される腫瘍抗原を含みうる。
【００２６】
後述の「発明を実施するための形態」をよりよく理解するために、上記で本発明の特徴および技術的な利点についてある程度広く概説した。本発明の請求の範囲の主題を形成する本発明のさらなる特徴および利点を、以下に記載する。当業者ならば、本開示の概念および具体的な実施形態は、本発明の同じ目的を実行するように他の構造を改変または設計するための基礎として容易に利用できることを理解するであろう。当業者ならば、そのような同等な構造は、添付の請求の範囲に記載される本発明の趣旨および範囲から逸脱しないことも認識するであろう。その構成および操作の方法の両方に関する、本発明の特色と考えられる新規な特徴は、さらなる目的および利点と併せて、添付の図面を参照して考慮した場合、以下の記述から、さらによく理解されるものと予想される。しかし、図面のそれぞれは、例示と説明のみを目的として提供されたものであって、本発明の限定を規定しないことが明示的に理解されるものと予想される。
【００２７】
本発明をよりいっそう理解するために、添付の図面と併せて考慮される以下の記述をここで参照する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ−Ｆ】ＣＡＲ．ＣＤ１３８の生成および特徴づけを示す図である。パネルＡ：レトロウイルスベクター内でコードされるＣＡＲ．ＣＤ１３８の概略表示。パネルＢ：レトロウイルスによる形質導入の後、ＣＡＲは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞内およびＣＤ８＋Ｔ細胞内で効率的に発現される。パネルＣは、ＣＤ１３８＋標的（ＲＰＭＩおよびＵ２６６）、ＣＤ１３８−標的（Ｒａｊｉ）、およびＮＫ標的（Ｋ５６２）に対する、対照Ｔ細胞およびＣＡＲ．ＣＤ１３８Ｔ細胞の、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイで評価された細胞傷害活性を示す。データは、４種の異なるドナーの平均±ＳＤを表す。パネルＤ：対照Ｔ細胞およびＣＡＲ＋Ｔ細胞を、ＣＤ１３８＋標的（Ｕ２６６およびＲＰＭＩ）またはＣＤ１３８−標的（Ｒａｊｉ）（Ｔ細胞：腫瘍細胞の比＝５：１）と共に共培養した。培養の４日後、細胞を回収し、ＣＤ３およびＣＤ１３８で染色して、腫瘍細胞の成長を評価した。ＣＡＲ＋Ｔ細胞と共に共培養したところ、腫瘍細胞は検出されなかった。データは、４種の異なるドナーの平均±ＳＤを表す。パネルＥは、２種のドナーに由来するＣＤ１３８＋悪性ＰＣを含有するＢＭ試料を使用する共培養実験を示す。ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、悪性ＰＣを消失させるが、対照細胞は、悪性ＰＣを消失させない。パネルＦは、ＣＤ１３８＋標的Ｕ２６６細胞に応答したＴ細胞のＴｈ１プロファイルを示す。
【図２ａ−２ｂ】ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔリンパ球が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗ＭＭ効果を及ぼすことを示す図である。対照Ｔ細胞およびＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞を、ＦＦＬｕｃで標識されたＵ２６６細胞を保有するＳＣＩＤマウスにｉ．ｖ．注入した。外因性サイトカインは、使用しなかった。腫瘍成長は、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ−ＩＶＩＳ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用してモニタリングした。左パネルは、シグナルの強度（光子／秒／ｃｍ２／ステラジアン）として測定される腫瘍成長は、対照を施されるマウスでは、ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞を施されるマウスと対比して、有意に高度であったことを示す。右パネルは、２回の異なる実験における、１群当たりのマウス５匹ずつの平均±ＳＤを示す。
【図３Ａ−Ｃ】ｈＣＡＲ．ＣＤ１３８の生成および特徴づけを示す図である。パネルＡ：レトロウイルスベクター内でコードされるｈＣＡＲ．ＣＤ１３８の概略表示。パネルＢ：４８時間にわたる低酸素状態下における、構成的ＣＡＲ．ＣＤ１３８Ｔ細胞内およびｈＣＡＲ．ＣＤ１３８Ｔ細胞内の、正常酸素状態下と比較した発現。パネルＣ：対照Ｔ細胞、構成的ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞、およびｈＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞を、低酸素状態下で、ＣＤ１３８＋標的（Ｕ２６６）と共に（Ｔ細胞：腫瘍細胞の比＝２：１）共培養した。培養の３日後、細胞を回収し、ＣＤ３およびＣＤ１３８で染色して、これらの細胞を、構成的ＣＡＲ．ＣＤ１３８を発現するＴ細胞またはｈＣＡＲ．ＣＤ１３８を発現するＴ細胞と共に共培養したところ、腫瘍細胞は検出されなかった。
【図４】ＣＡＲ．ＣＤ１３８は、健常ドナー試料および多発性骨髄腫（ＭＭ）試料のいずれに由来するＴ細胞内でも、効率的かつ安定的に発現されうることを示す図である。（Ａ）ＣＤ２８エンドドメインを組み込む、ＣＤ１３８特異的ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクター。（Ｂ）ＣＡＲ．ＣＤ１３８の発現は、ＣＤ８＋Ｔ細胞上およびＣＤ４＋Ｔ細胞上のいずれにおいても検出された。（Ｃ）ＣＡＲ．ＣＤ１３８の形質導入効率は、健常ドナーから生成された７つの異なる細胞株では７４％±９％であり、ＭＭ患者から生成された６つの細胞株では８２％±５％であった。（Ｄ）健常ドナーに由来する対照Ｔ細胞および形質導入されたＴ細胞のいずれも、均衡した比率のＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（５７％±２６％および５４％±１４％）およびＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（３５％±１７％および３７％±１３％）を含有したが、ＭＭ患者に由来するＴ細胞は、ＣＤ８＋細胞（８０％±１０％）を含有する不均衡が大きかった。ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋細胞は、細胞の２％未満であった。健常ドナーおよびＭＭ患者に由来する、形質導入されたＴ細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける拡張手順と適合的な、メモリー細胞とエフェクターメモリー細胞との比率（それぞれ、ＣＤ４５ＲＯ＋：８２％±１６％および７９％±９％；それぞれ、ＣＤ６２Ｌ＋＝５１％±１７％および４２％±１４％）も含有した。
【図５】ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞は、ＣＤ１３８＋腫瘍細胞株を標的化することを示す図である。ＣＡＲ．ＣＤ１３８を発現する、健常ドナーに由来するＴ細胞は、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、ＣＤ１３８＋ＭＭ由来細胞株であるＵ２６６、ＲＰＭＩ−８２６６、ＯＰＭ−２、およびＭＭ．１Ｓを、（１０：１のＥ：Ｔ比で、それぞれ、３１％±８％、３０％±８％、３９％±７％および６５％±１３％）対照Ｔ細胞（１０：１のＥ：Ｔ比で、それぞれ、９％±２％、７％±６％、２％±６％および５％±２％）と比較して、有意に高い割合で溶解させた（Ａ、Ｄ）。殺滅の同様のパターンは、形質導入されたＴ細胞が、ＭＭ患者から生成された場合にも観察された（Ｂ）。これに対し、ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞の、ＣＤ１３８−標的（Ｒａｊｉ、ＡＲＨ−７７、およびＫ５６２）（Ａ、Ｂ、Ｄ）に対する活性は、無視できる程度であった。無視できる程度の殺滅は、対照Ｔ細胞についても観察された（Ｃ）。（Ｄ）少なくとも５回の独立の実験の平均±ＳＤを示す。
【図６】ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞は、共培養実験において、ＣＤ１３８＋腫瘍細胞を消失させることを示す図である。（Ａ）ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞の、ＣＤ１３８＋腫瘍細胞を消失させる、長期にわたる能力を評価するために、ＣＡＲ＋Ｔ細胞または対照Ｔ細胞を、外因性サイトカインの非存在下においてＣＤ１３８＋（Ｕ２６６、ＲＰＭＩ−８２６６、ＯＰＭ−２、およびＭＭ．１Ｓ）腫瘍細胞またはＣＤ１３８−（ＲａｊｉまたはＡＲＨ７７）腫瘍細胞と共に共培養し、５〜７日後に、ＦＡＣＳ解析によって、残留腫瘍細胞を数え上げた。ＣＡＲ＋Ｔ細胞の存在下では、ＣＤ１３８＋腫瘍は完全に消失したが、対照Ｔ細胞を伴う培養物中では、腫瘍細胞は過剰成長した（Ｕ２６６：５７％±１８％；ＲＰＭＩ：２９％±１３％；ＯＰＭ−２：６３％±１３％；ＭＭ．１Ｓ：６７％±１％）。これに対し、ＣＤ１３８−標的細胞に対する抗腫瘍効果の欠如が観察された。（Ｂ）５回の独立の実験の平均±ＳＤを示す。
【図７】ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞は、腫瘍細胞に応答したＴｈ１プロファイルを示すことを示す図である。ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイルを評価するため、ＣＡＲ＋Ｔ細胞または対照Ｔ細胞を、ＣＤ１３８＋（Ｕ２６６、ＲＰＭＩ−８２６６、ＯＰＭ−２、およびＭＭ．１Ｓ）腫瘍細胞またはＣＤ１３８−（Ｒａｊｉ）腫瘍細胞と共に共培養した。２４時間後に培養物上清を回収し、Ｔｈ１およびＴｈ１サイトカインの存在について解析した。
【図８】ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞は、推定がん幹細胞を標的化することを示す図である。アプローチは、推定がん幹細胞も標的化することを確認するため、ＲＰＭＩ−８２６６腫瘍細胞内に含有されるＳＰ細胞によるＣＤ１３８の発現を研究し、その後、このサブセットも、ＣＡＲ＋Ｔ細胞によって効果的に消失させうるのかどうかを、モニタリングした。対照Ｔ細胞を伴う共培養物中では、ＲＰＭＩ−８２６６細胞がなおも存在した（７３％±７％）だけでなく、平均６％の（０．１１％〜２６．７％の範囲の）ＳＰ細胞もやはり存在した（Ａ、Ｂ）。これに対し、ＣＡＲ＋Ｔ細胞を伴う培養物中では、ＲＰＭＩ細胞は有意に低減され（１１％±１０％）、ＳＰ細胞（０．０４％±０．０７％）は検出されなかった（Ａ、Ｂ）。この能力をさらに確認するため、ＳＰ細胞を、ＲＰＭＩ細胞株から直接分取し、対照Ｔ細胞またはＣＡＲ＋Ｔ細胞と共に培養した（Ｃ）。分取されたＳＰ細胞が完全に消失したのは、形質導入されたＴ細胞の存在下に限られた。２つの代表的な共培養実験が示される。
【図９】ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞は、初代骨髄腫細胞を標的化することを示す図である。（Ａ）健常ドナーから生成されたＣＡＲ＋Ｔ細胞は、対照Ｔ細胞とは対照的に、ＭＭ患者に由来する、ＣＤ１３８で選択された腫瘍細胞を消失させる（＜８０％の低減）ことに成功した。（Ｂ）同様に、自己ＣＡＲ＋Ｔ細胞（３７％±１４％）も、初代ＭＭ細胞を、対照Ｔ細胞（２％±２％）と比較して消失させた（９０％±１０％の低減）。（Ｃ）これらの実験におけるサイトカインプロファイルは、Ｔｈ１プロファイルと符合した。
【図１０】ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性を有することを示す図である。ＮＳＧマウスに、４×１０６個の、ホタルルシフェラーゼで標識されたＯＰＭ−２細胞の静脈内投与を行った後で、ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞（１×１０７個）の注入を伴う、３回にわたるｉ．ｖ．注入を行った。２３日目から、生物発光イメージング（ＢＬＩ）を実施して、腫瘍成長をモニタリングした。（Ａ）ＢＬＩによって決定され、対照Ｔ細胞（ＮＴ；ｎ＝１１、黒丸）またはＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞（ｎ＝１１、グレーの四角）で処置されたマウスを比較する、マウス１匹当たりの平均光子／秒／ｃｍ２／ステラジアン。平均±ＳＥＭ、＊５９日目におけるｐ＝０．０５。３回の独立の実験のまとめ。（Ｄ）ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞または対照Ｔ細胞で処置されたマウスのカプラン−マイヤー生存曲線（ｐ＜０．０１）。
【図１１】低酸素状態誘導性ＣＡＲ．ＣＤ１３８（ＨＲＥ．ＣＡＲ．ＣＤ１３８）の生成および機能を示す図である。（Ａ）レトロウイルスベクター内でコードされるＨＲＥ．ＣＡＲ．ＣＤ１３８の概略表示。（Ｂ）対照Ｔ細胞、構成的ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞、またはＨＲＥ．ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞を、正常酸素状態（２０％のＯ２分圧）下または低酸素状態（１％のＯ２分圧）下のＣＤ１３８＋標的（Ｕ２６６）と共に共培養した。培養の４日後、細胞を回収し、ＣＤ３およびＣＤ１３８で染色して、腫瘍細胞の成長を評価した。Ｔ細胞上のＣＡＲの発現も評価した。ＨＲＥ．ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞は、低酸素状態下の腫瘍細胞を消失させた。（Ｃ）対照Ｔ細胞、構成的ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞、またはＨＲＥ．ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞を、ＣＳＦＥで標識付けし、正常酸素状態（２０％のＯ２分圧）下または低酸素状態（１％のＯ２分圧）下のＣＤ１３８＋標的（Ｕ２６６）と共に共培養した。培養の４日後、細胞を回収し、ＣＤ３で染色し、フローサイトメトリーによって、ＣＳＦＥの希釈率を測定した。ＨＲＥ．ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞は、低酸素状態下で増殖した。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
長年にわたる特許法の慣例に沿って、請求項を含め本明細書において、語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）という語と共に使用される場合、「１つまたは複数」を意味する。本開示のいくつかの実施形態は、開示の１種または複数の要素、方法ステップ、および／または方法からなるか、本質的になるものでありうる。本明細書に記載のいずれの方法または組成物も、本明細書に記載の任意の他の方法または組成物に関して実行できることが企図されている。
【００３０】
本明細書で使用される「低酸素性」という用語は、２０％のＯ２分圧を指し、本明細書で使用される「低酸素状態」は、１％のＯ２分圧を指す。特定の実施形態では、生理学的組織の低酸素状態は、＜約６０ｍｍＨｇであると考えられる。
【００３１】
Ｉ．一般的な実施形態
本開示の実施形態では、ＣＤ１３８を発現するがん細胞を処置するための方法および組成物がある。特定の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫（ＭＭ）などの造血器悪性腫瘍、または乳がんなどの固形腫瘍、およびほぼ不変的に低酸素性である固形腫瘍である。方法および組成物は、必要がある特定の組織または細胞へと療法を送達するが、ＣＤ１３８を発現する非がん性細胞への送達は回避する処置を提供することと関連する。方法および組成物は、ＣＤ１３８を発現するがん性組織またはがん性細胞へと療法を送達するが、ＣＤ１３８を発現するが、がん療法を必要としない細胞への送達は回避する処置を提供することと関連する。特定の実施形態では、療法は、低酸素性の組織または環境では有効であり、正常酸素性の組織または環境では無効である。本開示の態様では、療法は、低酸素性の組織または環境では有効であり、正常酸素性組織または正常酸素性環境には治療用部分が存在しないため、正常酸素性の組織または環境では有効でない。いくつかの場合では、細胞療法は、低酸素性の組織または環境では有効であることができ、正常酸素性組織または正常酸素性環境では、細胞が治療用部分を発現しないため、正常酸素性の組織または環境では有効でないが、この治療用部分は、低酸素性組織または低酸素環境には存在する。本開示の実施形態では、治療用部分は、少なくともＣＤ１３８抗原に特異的なＣＡＲを含む。他の組織特異的抗原も、組織特異的発現または環境特異的発現を示す対応する部分で標的化することができる。
【００３２】
本開示の特定の態様は、ＭＭための療法であって、ＭＭを有することが知られるか、ＭＭを有することが疑われるか、またはＭＭを発症する危険性がある個体のための療法を提供する。いくつかの場合では、個体がＭＭを有することを、ＣＤ１３８陽性がん細胞の同定以外の手段によって決定することもできる。特定の実施形態では、ＭＭのための療法は、既に個体に提供されているか、または提供されつつある。個体は、療法の初期において、または治療法を施してある期間が経過した後において、１つまたは複数のいかなる種類のＭＭ療法（本開示以外の療法）に対しても、不応性でありうる。
【００３３】
本開示の特定の態様は、乳がんための療法であって、乳がんを有することが知られるか、乳がんを有することが疑われるか、または乳がんを発症する危険性がある（１つまたは複数の指標となる遺伝子マーカーまたは家族歴もしくは個人歴を有するなどの）個体のための療法を提供する。いくつかの場合では、個体が乳がんを有することを、ＣＤ１３８陽性がん細胞の同定以外の手段によって決定することもできる。特定の実施形態では、乳がんのための療法は、既に個体に提供されているか、または提供されつつある。個体は、療法の初期において、または療法を施してある期間が経過した後において、１つまたは複数のいかなる種類の乳がん療法（本開示以外の療法）に対しても、不応性でありうる。
【００３４】
ＭＭのための治療選択肢の有意な改善にも関わらず、ＭＭは、依然として本質的に治癒不可能である。特に、本発明者らおよび他の発明者らは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に標的化され、適切な共刺激性エンドドメインを組み込む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞が、Ｂ細胞系造血器悪性腫瘍を処置する有望な手段であることを示した。悪性形質細胞（ＰＣ）は、高レベルのＣＤ１３８抗原を発現するため、この抗原を標的化するようにリダイレクトされたＴ細胞によって、効果的に消失させうることが推論された。実際、初期の研究では、ＣＤ１３８特異的ＣＡＲ（ＣＡＲ．ＣＤ１３８）は、ＣＤ１３８＋腫瘍細胞に対する有用な活性を示した。ＣＤ１３８の使用に対する１つの警告は、抗原は、例えば、上皮細胞、間葉細胞、血管平滑筋細胞、内皮細胞、および神経細胞の側底面上でも低レベルで発現され、ＣＡＲで改変されたＴ細胞による、「オン・ターゲット」ではあるが、「オフ器官」または「オフ組織」である毒性の危険性を増大させることである。したがって、本開示の特定の実施形態では、低酸素状態応答性エレメントの誘導的制御下でＣＡＲ．ＣＤ１３８を発現することによって、正常骨髄微小環境およびＭＭ骨髄（ＢＭ）微小環境の低酸素的性質を利用することができる。ＣＡＲで改変されたＴ細胞を低酸素環境内で共刺激するのに最も有利な免疫エレメントを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、および、異種マウスモデルなど、ｉｎ  ｖｉｖｏの両方において規定することもできる。最後に、本開示の実施形態の安全性をさらに増大させるために、コンストラクト内に、誘導性カスパーゼ９（ｉＣ９）に基づき前に検証された自殺遺伝子などの自殺遺伝子を組み込むこともできる。この戦略は、予測より多数のＴ細胞が、低酸素性ＢＭ環境を回避し、「オン・ターゲット」ではあるが「オフ器官」である毒性を引き起こすのに十分な程度に機能的なＣＡＲ発現を保持する場合、ＣＡＲで改変されたＴ細胞の急速な除去を可能にする。ある特定の態様では、臨床グレードのレトロウイルスベクターと、ＭＭ患者に由来する、ＣＡＲで改変された自己Ｔ細胞株とを製造し、これらの細胞を、再発したＭＭを有する患者であって、フェーズＩの臨床試験に登録された患者へと注入することができる。ある特定の場合には、手順の安全性、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、注入されたＴ細胞の生存、およびＢＭ中のこれらの細胞の蓄積、ならびにＢＭ中と対比された、末梢血（ＰＢ）中のＴ細胞によるＣＡＲの示差的発現を評価することができる。毒性が生じる場合は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｉＣ９安全性遺伝子の活性を決定することができる。Ｔ細胞の注入が、検出可能な疾患を有する患者における疾患のコントロールをもたらすのかどうかを評価することもできる。
【００３５】
低酸素状態応答性エレメント（ＨＲＥ）の誘導的制御下でＣＡＲ．ＣＤ１３８を発現することによって、ＭＭにおけるＢＭ微小環境の低酸素的性質を利用することが本開示の目的である。ＣＡＲで改変されたＴ細胞を低酸素環境内で共刺激するのに最も有利な免疫エレメントを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、および、異種マウスモデルであるｉｎ  ｖｉｖｏの両方において規定することもできる。最後に、提起されたアプローチの安全性をさらに増大させるために、コンストラクト内に、誘導性カスパーゼ９（ｉＣ９）に基づき前に検証された自殺遺伝子を組み込むこともできる。ある特定の実施形態では、低分子、例えば、ＡＰ１９０３を使用して、誘導性カスパーゼ９（ｉカスパーゼ９）が、二量体化可能である。例えば、Ｓｔｒａａｔｈｏｆら、Ｂｌｏｏｄ、１０５：４２４７〜４２５４（２００５）を参照されたい。
【００３６】
臨床グレードのベクター（レトロウイルスベクターなど）と、ＭＭ患者に由来する、ＣＡＲで改変された自己Ｔ細胞株とを製造し、これらを、再発したＭＭを有する患者者へと注入することができる。手順の安全性を評価し、毒性が生じる場合は、二量体化薬を投与して、ｉＣ９安全性遺伝子を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて活性化させることができる。Ｔ細胞の注入が、検出可能な疾患を有する患者における疾患のコントロールをもたらすのかどうかを評価することもできる。
【００３７】
それらのｉｎ  ｖｉｖｏにおける生存、および二量体化薬のこれらの細胞に対するその後の効果を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて測定し、（臨床的に適応である場合は）ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても測定することによって、注入されたＣＡＲ−Ｔ細胞の運命を特徴付けることが本開示の目的である。ＢＭ中および末梢血中のこれらの細胞の蓄積、各環境におけるＴ細胞によるＣＡＲの示差的発現、ならびに、これらと関連する、腫瘍細胞を殺滅させる能力を比較することもできる。細胞、および、必要な場合、二量体化薬は、それらを必要とする個体へと、臨床において提供することができる。
【００３８】
本開示における実施形態は、ワクチン接種によって、ＭＭ患者において、スルビビン特異的ＣＴＬを誘発するであろう。補完的なアプローチでは、本開示は、造血器悪性腫瘍におけるＣＡＲ技術を使用して、標的の腫瘍性ＰＣを提供する。
【００３９】
ＩＩ．造血器悪性腫瘍
造血器悪性腫瘍には、血液、骨髄、およびリンパ節に影響を及ぼすがんの種類が含まれる。造血器悪性腫瘍は、２つの主要な血液細胞系統：骨髄細胞株またはリンパ細胞株のいずれかに由来しうる。骨髄細胞株は通常、顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージ、および肥満細胞を産生する；リンパ細胞株は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、および形質細胞を産生する。リンパ腫、リンパ性白血病、および骨髄腫は、リンパ細胞株に由来するが、急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、および骨髄増殖性疾患は、骨髄由来である。ある特定の実施形態では、これらの造血器悪性腫瘍のいずれも、本開示の方法および／または組成物で処置可能である。
【００４０】
多発性骨髄腫（ＭＭ；これは、形質細胞骨髄腫またはカーラー病としても知られている）は、本開示の方法および組成物で処置することができる。ＭＭとは、通常は抗体の産生の一因となる白血球の一種である、形質細胞のがんである。ＭＭでは、複数種の異常な形質細胞が骨髄中に蓄積され、正常な血液細胞の産生を破壊する。ＭＭは、血液検査（例えば、血清タンパク質電気泳動または血清中遊離カッパ／ラムダ軽鎖アッセイ）、骨髄検査、尿タンパク質電気泳動、および最も罹患しやすい骨のＸ線など、様々な形で診断することができる。治癒不可能であると考えられているが、ステロイド、化学療法、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、免疫調節薬（ＩＭｉＤ）など、サリドマイドまたはレナリドマイド、放射線、および／または幹細胞移植で処置することもできる。ある種の症状には、例えば、例えば、カルシウムの増大、腎不全、貧血、および／または骨病変が含まれる。本開示の処置は、病期Ｉ、病期ＩＩ、または病期ＩＩＩのＭＭに有用である。ＭＭのための精密検査の一部には、例えば、血清中遊離軽鎖アッセイ、骨検索、骨髄生検、および／またはＩｇＧの定量的測定が含まれうる。
【００４１】
本開示の実施形態に加えて、ＭＭを有する患者には、特に、個体が６５歳未満の場合、自己造血幹細胞移植を伴う高用量化学療法も提供することができる。幹細胞移植の前に、これらの個体には、サリドマイド、デキサメタゾン、ボルテゾミブベースのレジメン、レナリドマイド、またはこれらの組合せなどの誘導化学療法の初期コースを施すことができる。自己または同種幹細胞移植（ＡＳＣＴ）も利用することができる。６５歳を超える個体は、メルファラン、プレドニゾン、ボルテゾミブ、メルファラン、レナリドマイド、またはこれらの組合せで処置することができる。
【００４２】
ＩＩＩ．ＣＤ１３８
ＣＤ１３８（シンデカン１としても知られている）とは、ヒトでは、ＳＤＣ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。例示として、それらのいずれも、参照によりそれらの全体として本明細書に組み込む、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＢＣ００８７６５は、例示のＣＤ１３８ポリヌクレオチドを提供しており、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＡＨ０８７６５は、例示のＣＤ１３８ポリペプチドを提供している。このような配列は、例えば、ＣＤ１３８特異的ＣＡＲ分子を生成するのに、当業者に有用である。
【００４３】
ＩＶ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
いくつかの場合では、ＣＤ１３８特異的ＣＡＲを発現するように細胞を改変する。腫瘍指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように、ヒトＴリンパ球を遺伝子操作することにより、タンパク質抗原のプロセシングおよび提示の異常に起因する腫瘍の免疫回避機構をバイパスする、抗腫瘍エフェクター細胞をもたらすことができる。さらに、これらのトランスジェニック受容体は、タンパク質由来ではない腫瘍関連抗原も指向しうる。本開示のある特定の実施形態では、少なくとも１つのＣＡＲを含むように改変されたＣＴＬがある。特定の態様では、特定の細胞は、２つ以上のＣＤ１３８特異的ＣＡＲを含めた、２種以上のＣＤ１３８特異的認識部分の発現を含む。
【００４４】
本開示には、ＣＡＲ（これは、キメラＴ細胞受容体またはキメラ免疫受容体とも呼ぶことができる）と称する人工的Ｔ細胞受容体が含まれる。本開示の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１３８に特異的である。ＣＡＲには一般に、エクトドメイン、膜貫通ドメイン、およびエンドドメインが含まれうる。特定の実施形態では、ＣＡＲは、第一世代のＣＡＲ、第二世代のＣＡＲ、または第三世代のＣＡＲでありうる。
【００４５】
特定の場合には、免疫細胞には、キメラであり、非天然であり、少なくとも部分的に人為によって操作されており、ＣＤ１３８を指向するＣＡＲが含まれる。特定の場合には、操作されたＣＡＲは、１つ、２つ、３つ、４つ以上の構成要素を有し、いくつかの実施形態では、１つまたは複数の構成要素は、Ｔリンパ球の、腫瘍抗原を含むがん細胞への標的化または結合を容易にする。特定の実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原に対する抗体、細胞質シグナル伝達ドメインの一部もしくは全部、および／または１つもしくは複数の共刺激性分子の一部もしくは全部、例えば、共刺激性分子のエンドドメインを含む。特定の実施形態では、抗体は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。ある特定の態様では、抗体は、例えば、ＣＤ１３８を発現するがん細胞の細胞表面上の標的抗原を指向する。ある特定の実施形態では、キメラ受容体の、標的抗原とのエンゲージメントに続き、Ｔ細胞受容体ζ鎖に由来する細胞質シグナル伝達ドメインなどの細胞質シグナル伝達ドメインを、Ｔリンパ球の増殖およびエフェクター機能のための刺激性シグナルをもたらすために、キメラ受容体の少なくとも一部として利用する。例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４〜１ＢＢ、およびＯＸ４０などの共刺激性分子、またはＩＬ７およびＩＬ１５など、サイトカイン受容体のシグナル伝達構成要素に由来するエンドドメインが含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、共刺激性分子を利用して、抗原のエンゲージメントの後でＣＡＲによってもたらされる、Ｔ細胞の活性化、増殖、および細胞傷害作用を強化する。特定の実施形態では、共刺激性分子は、ＣＤ２８、ＯＸ４０、および４〜１ＢＢであり、サイトカインおよびサイトカイン受容体は、ＩＬ７およびＩＬ１５である。
【００４６】
一般に、ＣＡＲのエクトドメインは、シグナルペプチド、抗原認識ドメイン、および抗原認識ドメインを、膜貫通ドメインへと連結するスペーサーを包含する。抗原認識ドメインは一般に、ＣＤ１３８に特異的な一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含むであろう。しかし、２つ以上のＣＡＲが同じ細胞内にある場合は、第２のＣＡＲは、例えば、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、黒色腫優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、スルビビン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦｒ  ｖＩＩＩ、癌胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体ａ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−Ａ１  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体ａ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、またはＣＤ４４ｖ６のいずれか１つに特異的なｓｃＦｖを含みうる。
【００４７】
エクトドメインのヒンジ領域の例には、免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域、ＩｇＧ１に由来するヒンジ領域、およびＣＤ３の部分が含まれる。膜貫通領域は、いかなる種類でもよいが、いくつかの場合では、ＣＤ２８でありうる。
【００４８】
一般に、本開示のＣＡＲのエンドドメインは、抗原認識後における細胞内のシグナル伝達および受容体のクラスターに活用される。最も一般に使用されるエンドドメイン構成要素は、抗原が結合した後で、活性化シグナルをＴ細胞へと伝達する、３つのＩＴＡＭ（免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ）を含有する、ＣＤ３−ゼータである。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８、４〜１ＢＢ、および／またはＯＸ４０と組み合わせたＣＤ３−ゼータなど、追加の共刺激性シグナル伝達も活用する。
【００４９】
Ｖ．自殺遺伝子
本開示の実施形態では、特定の発現ベクター内で自殺遺伝子を利用して、細胞が、例えば、所望の時点または地点または生理学的イベントにおいて、アポトーシスにより自殺することを可能にする。自殺遺伝子は、ＣＤ１３８−ＣＡＲベクターと同じ発現ベクター上に存在しうる。自殺遺伝子は、当業界で公知であり、慣例的に使用されるが、特定の実施形態では、本開示で使用される自殺遺伝子は、カスパーゼ９、単純ヘルペスウイルス、チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、またはチトクロームＰ４５０である。特定の態様では、自殺遺伝子は、誘導性であり、特異的な化学的二量体化誘導剤（ＣＩＤ）を使用して活性化される（Ｒａｍｏｓら、２０１０）。
【００５０】
ＶＩ．低酸素状態応答性調節エレメント
本開示の実施形態は、治療用細胞内の人工的抗原受容体の発現の制御を含めた、治療用細胞の活性の環境的制御を可能にする、調節エレメントを利用する。特定の実施形態では、ＣＡＲの発現を、低酸素状態の存在下または低酸素性組織内など、環境的または組織特異的に調節する。１つまたは複数のエレメントは、ＣＤ１３８特異的ＣＡＲをコードし、ＣＤ１３８特異的ＣＡＲをコードする配列と機能的に関連する、発現ベクター内で活用される。「機能的に関連する」は、１つまたは複数のエレメントが、ＣＤ１３８特異的ＣＡＲポリペプチドをコードする配列の発現を調節しうるのに適した形で構成されていることを意味しうる。いくつかの実施形態では、このようなエレメントは、定義によって、正常酸素性環境内でＣＤ１３８特異的ＣＡＲの転写に影響を及ぼすことがまったく可能でないか、または無視できる程度に影響を及ぼすに過ぎない。
【００５１】
利用されうる例示のＨＲＥには、例えば、配列ＮＣＧＴＧが含まれ、特定の実施形態では、配列は、７、８、９、１０回以上であってもよいが、少なくとも６回など、タンデムで反復される。
【００５２】
ＶＩＩ．エンゲージャー分子
本開示のいくつかの実施形態では、ＣＤ１３８特異的ＣＡＲを含む本開示の細胞を、エンゲージャー分子を発現するようにも改変する。特定の実施形態では、このような細胞は、二特異的Ｔ細胞エンゲージャー分子を分泌することができる。特定の実施形態における二特異性は、活性化ドメインおよび抗原認識ドメインの存在を包含する。抗原認識ドメインは、標的細胞内もしくは標的細胞上に存在するかまたは標的細胞によって分泌される分子に結合し、活性化ドメインは、レシピエント細胞を最終的に活性化させる過程を誘発する、Ｔ細胞上、ＮＫ細胞上、またはＮＫＴ細胞上に存在する、細胞表面受容体に結合する。結合性ドメインおよび抗原認識ドメインは、いかなる種類でもありうるが、特定の実施形態では、１つのｓｃＦｖは、活性化を媒介する細胞表面分子に特異的であり、他のｓｃＦｖは、ＣＤ１３８または別の腫瘍抗原を含めた、特定のえり抜きの腫瘍抗原に特異的である。腫瘍抗原に対する特定のｓｃＦｖは、特定の腫瘍抗原を有する、対応するがん細胞を認識するように調整することができる。
【００５３】
特定の態様では、エンゲージャー分子は、免疫細胞表面（または操作された免疫細胞表面）上の活性化分子に結合する活性化ドメインと、標的細胞抗原、例えば、腫瘍細胞またはがん細胞の表面上で発現される抗原に結合する抗原認識ドメインとを含む。
【００５４】
エンゲージャーは、二部分（例えば、任意選択で、リンカーによって接合されうる、活性化ドメインと、抗原認識ドメインとを含む）であってもよく、三部分または多部分（例えば、１つもしくは複数の活性化ドメインおよび／もしくは抗原認識ドメイン、または他のドメインを含む）であってもよい。特定の実施形態では、エンゲージャーの活性化ドメインが、抗体またはその抗原結合性断片もしくは部分、例えば一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）であるか、またはこれを含む。他の特定の実施形態では、抗原認識ドメインは、抗体あるいは抗原結合性断片またはこれらの一部、例えば、モノクローナル抗体、またはｓｃＦｖであるかもしくはこれを含むか、または、リガンド、ペプチド、可溶性のＴ細胞受容体、もしくはこれらの組合せを含みうる。ある特定の実施形態では、活性化ドメインおよび抗原認識ドメインが、リンカー、例えば、ペプチドリンカーによって連結されている。
【００５５】
当業者は、免疫細胞が、異なる活性化受容体を有し、エンゲージャーが、活性化される細胞に照らして調整されることを認識する。例えば、ＣＤ３は、Ｔ細胞上の活性化受容体であるが、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、またはＮＫｐ３０は、ＮＫ細胞上の活性化受容体であり、そして、ＣＤ３またはインバリアントＴＣＲは、ＮＫＴ細胞上の活性化受容体である。したがって、Ｔ細胞を活性化するエンゲージャー分子は、ＮＫ細胞を活性化するエンゲージャー分子とは異なる活性化ドメインを有しうる。特定の実施形態、例えば、免疫細胞がＴ細胞である実施形態では、活性化分子が、ＣＤ３、例えば、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、もしくはＣＤ３ε；またはＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ２７８のうちの１つまたは複数である。他の特定の実施形態、例えば、免疫細胞がＮＫ細胞である実施形態では、活性化分子がＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、またはＮＫｐ３０であり、免疫細胞がＮＫＴ細胞である実施形態では、活性化分子がＣＤ３またはインバリアントＴＣＲである。
【００５６】
ある特定の他の実施形態では、エンゲージャーが、１つまたは複数のアクセサリードメイン、例えば、１つもしくは複数のサイトカイン、共刺激性ドメイン、Ｔ細胞活性化の負の調節分子を抑制するドメイン、またはこれらの組合せをさらに含む。特定の実施形態では、サイトカインがＩＬ−１５、ＩＬ−２、および／または、ＩＬ−７である。他の特定の実施形態では、共刺激性ドメインがＣＤ２７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７である。他の特定の実施形態では、Ｔ細胞活性化の負の調節分子を抑制するドメインが、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、またはＢ７−Ｈ４である。
【００５７】
いくつかの場合では、エンゲージャーのｓｃＦＶは、ＥｐｈＡ２、ＣＤ１９、８Ｈ９、ＣＡＩＸ、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＦＡＰ、ＦＡＲ、ＦＢＰ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＩＬ１１Ｒα、ＩＬ１３Ｒα２、κ軽鎖、ＫＤＲ、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃ１、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、ＣＥＡ、ＰＳＣＡ、およびＰＳＭＡに特異的である。
【００５８】
ＶＩＩＩ．ウイルス特異性
本開示の実施形態では、ＣＤ１３８−ＣＡＲ細胞は、それらの天然受容体が、ＥＢＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１などに由来するウイルス潜伏感染タンパク質など、ウイルス潜伏感染タンパク質に特異的なＣＴＬである。これらのウイルス特異的ＣＴＬは、潜伏感染性ウイルス抗原をプロセシングする、プロフェッショナルな抗原提示細胞からの生理学的共刺激を受け、それらのＣＡＲを介して、腫瘍細胞を殺滅させることができる。この二重特異性は、リダイレクトされたＣＴＬが、ＣＡＲを介する抗腫瘍活性を利用しながら、プロフェッショナルな抗原提示細胞からの生理学的共刺激を受けることも可能にする。
【００５９】
当業者は、このような細胞型を生成することは慣例的であることを認識する。
【００６０】
ＩＸ．ＣＤ１３８特異的ＣＡＲを含む宿主細胞
本開示の細胞の実施形態には、ＣＤ１３８特異的ＣＡＲを発現しうる細胞が含まれ、これらには、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞が含まれる。本明細書で使用される用語「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」は、互換的に使用することができる。これらの用語のすべてには、任意かつすべての後続の世代である、それらの子孫細胞も含まれる。すべての子孫細胞が、意図的であるかまたは予測外の突然変異のために必ずしも同一でない場合もあることが理解される。異種核酸配列の発現の文脈では、「宿主細胞」は、原核細胞または真核細胞を指し得、これには、ベクターを複製し、かつ／またはベクターによりコードされる異種遺伝子を発現することができる、任意の形質転換可能な生物が含まれる。宿主細胞は、ベクターのレシピエントとして使用することができ、そのように使用されている。宿主細胞は、「トランスフェクト」してもよく、「形質転換」してもよく、これらは、外因性核酸が、宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。形質転換された細胞には、初代対象細胞およびその子孫細胞が含まれる。本明細書で使用される、用語「操作された」細胞および「組換え」細胞または宿主細胞は、例えば、ベクターなどの外因性核酸配列が導入された細胞を指すことが企図されている。したがって、組換え細胞は、組換えにより導入された核酸を含有しない、天然に存在する細胞から識別可能である。本開示の実施形態では、宿主細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ、細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＴＬ、キラーＴ細胞（Ｔ−Ｋｉｌｌｅｒ−ｃｅｌｌ）、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはキラーＴ細胞（ｋｉｌｌｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ）としても知られている）を含めたＴ細胞などの免疫細胞であり、本開示には、エフェクター機能を誘発しうる、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、および他の免疫細胞も包含される。
【００６１】
ある特定の実施形態では、ＲＮＡまたはタンパク質性配列を、同じ宿主細胞内の、他の選択されたＲＮＡまたはタンパク質性配列と共に共発現しうることが企図されている。共発現は、宿主細胞に、２つ以上の異なる組換えベクターを共トランスフェクトすることによって達成することができる。代わりに、単一の組換えベクターを構築して、ＲＮＡの複数の異なるコード領域を含めることができ、その後、これを、単一のベクターをトランスフェクトされた宿主細胞内で発現することもできるであろう。
【００６２】
いくつかのベクターは、それが原核細胞内および真核細胞内のいずれにおいても複製および／または発現されることを可能にする、制御配列を利用しうる。当業者ならば、上記に記載の宿主細胞のすべてを、それらを維持し、ベクターの複製を可能にするようにインキュベートする条件もさらに理解するであろう。ベクターの大スケールの作製のほか、ベクターによってコードされる核酸、およびそれらのコグネイトのポリペプチド、タンパク質、またはペプチドの作製も可能にする、技法および条件も理解されており、知られている。
【００６３】
本開示で使用される細胞は、哺乳動物細胞を含めた真核細胞であるが、原核細胞を、ベクターまたはベクターへと組み込むＤＮＡの組換え操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）における操作（ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）のために利用することもできる。細胞は、特に、ヒト細胞であるが、それらのそれぞれの動物における使用のための、任意の対象の動物、特に、ウマ、ウシ、マウス、ヒツジ、イヌ、ネコなどの馴致動物と関連した細胞でありうる。これらの種では、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞など、多様な細胞型を関与しうる。
【００６４】
細胞は、自己細胞、同系細胞、同種細胞であってよく、いくつかの場合では、細胞を施される個体との関連における異種細胞などの異種細胞でさえありうる。細胞は、主要組織適合性複合体（「ＭＨＣ」）プロファイルを変化させることによって改変することもでき、β２−マイクログロブリンを不活化して、機能的なクラスＩ  ＭＨＣ分子の形成を防止することによって改変することもでき、クラスＩＩ分子の不活化によって改変することもでき、１つまたは複数のＭＨＣ分子の発現をもたらすことによって改変することもでき、細胞傷害活性と関連した遺伝子の発現を強化または不活化することを介して、細胞傷害能を強化または不活化することなどによって改変することもできる。
【００６５】
細胞が、特異的な抗原特異性またはホーミングにおける標的部位特異性を有するＴ細胞およびＢ細胞など、特定の特異性を有する、いくつかの場合には、特異的なクローン細胞またはオリゴクローンも対象でありうる。
【００６６】
ＣＤ１３８特異的ＣＡＲを有する本開示の細胞は、第２のＣＡＲを発現してもよく、エンゲージャー分子を発現してもよく、かつ／またはウイルス特異的であってもよく、任意の組換え発現コンストラクトを、ＨＲＥの制御下に置いてもよく、置かなくてもよい。
【００６７】
ＣＤ１３８特異的ＣＡＲをコードする発現ベクターは、細胞へと、１つまたは複数のＤＮＡ分子として導入することもでき、コンストラクトを含有する宿主細胞の選択を可能にする少なくとも１つのマーカーがありうるコンストラクトとして導入することもできる。コンストラクトは、好都合な方途であって、遺伝子および調節領域を単離してもよく、必要に応じて、ライゲーションしてもよく、適切なクローニング宿主内でクローニングしてもよく、制限またはシークェンシングによって解析してもよい方途により調製することもでき、他の好都合な手段により調製することもできる。特に、ＰＣＲを使用して、機能的単位の全部または一部を含めた個々の断片を単離することができ、この場合、必要に応じて、「プライマー修復」、ライゲーション、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける突然変異誘発などを使用して、１カ所または複数カ所の突然変異を導入することができる。ひとたび完成し、適切な配列を有することが実証されたコンストラクトは、その後、任意の好都合な手段によって、ＣＴＬに導入することができる。コンストラクトは、細胞へと感染させるかまたは形質導入するための、非複製型の欠損ウイルスゲノム様アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）またはレトロウイルスベクターを含めた他のウイルスへと組み込み、パッケージングすることができる。コンストラクトには、所望の場合、トランスフェクションのためのウイルス配列が含まれうる。代替的に、コンストラクトは、融合体、エレクトロポレーション、遺伝子銃、トランスフェクション、リポフェクションなどによって導入することもできる。宿主細胞は、コンストラクトを導入する前に、培養物中で成長させ、拡張するのに続いて、コンストラクトの導入およびコンストラクトの組込みのための適切な処置をこれらに施すことができる。細胞は、その後、拡張され、コンストラクト内に存在するマーカーによってスクリーニングされる。使用されて成功しうる多様なマーカーには、ｈｐｒｔマーカー、ネオマイシン耐性マーカー、チミジンキナーゼマーカー、ハイグロマイシン耐性マーカーなどが含まれる。
【００６８】
多くの状況において、処置を終了させたいと望む場合、細胞が腫瘍性となっている場合、それらの存在の後における細胞の非存在が対象である研究において、または他の事象では、改変された細胞を殺滅させうることを望むこともできる。この目的では、制御された条件下で、改変細胞を殺滅しうる、ある特定の遺伝子産物の発現をもたらしうる。カスパーゼ９などの自殺遺伝子産物は、このような産物の例である。
【００６９】
例示を目的として述べると、がん患者、またはがんに対して感受性であるかもしくはがんを有することが疑われる患者は、以下の通りに処置することができる。本明細書で記載される通りに改変された細胞は、患者に投与し、長期間にわたり保持することができる。個体には、１回または複数回の細胞の投与を行うことができる。例示の細胞には、低酸素状態応答性ＣＤ１３８特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞が含まれる。細胞は、少なくとも低酸素状態応答性ＣＤ１３８特異的ＣＡＲを発現するように少なくとも改変され、それらを必要とする個体に提供される。
【００７０】
Ｘ．コンストラクトの細胞への導入
本明細書に記載の、低酸素状態応答性ＣＤ１３８特異的ＣＡＲコンストラクト、または任意のコンストラクトは、１つまたは複数のＤＮＡ分子として導入することもでき、コンストラクトを含有する宿主細胞の選択を可能にする少なくとも１つのマーカーがありうるコンストラクトとして導入することもできる。コンストラクトは、従来の方途により調製することができる。必要に応じて、遺伝子領域と調節領域とを隔離し、ライゲートし、適切なクローニング宿主内でクローニングし、制限もしくはシークェンシング、または他の好都合な手段によって解析した。特に、ＰＣＲを使用して、機能的な単位の全部または一部を含めた個別の断片を単離することができる。必要に応じて、「プライマー対」、ライゲーション、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける突然変異誘発などを使用して、１つまたは複数の突然変異を導入することができる。ひとたび完成され、適切な配列を有することが実証されたコンストラクトは、その後、任意の好都合な手段によって、宿主細胞に導入することができる。コンストラクトは、細胞への感染または形質導入のために、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、もしくは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）またはレトロウイルスベクターを含めた他のウイルスなど、非複製性の欠損ウイルスゲノムに組み込み、パッケージングすることができる。所望の場合、コンストラクトには、トランスフェクションのためのウイルス配列を含めることができる。代わりに、融合、エレクトロポレーション、遺伝子銃、トランスフェクション、リポフェクションなどによって、コンストラクトを導入することもできる。コンストラクトの導入前に、宿主細胞を、培養物中で成長させ、拡張するのに続いて、コンストラクトの導入およびコンストラクトの組込みのための適切な処理を施すことができる。その後、細胞を拡張し、コンストラクト内に存在するマーカーによって、スクリーニングする。使用して成功しうる様々なマーカーには、ｈｐｒｔ、ネオマイシン耐性、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン耐性などが含まれる。
【００７１】
いくつかの場合では、コンストラクトを特定の遺伝子座に組み込むことが所望される相同組換えのための標的部位を有しうる。例えば、相同組換えについて当業界で公知である材料および方法を使用して、内因性遺伝子をノックアウトし、コンストラクトによってコードされた遺伝子で置き換える（同じ遺伝子座または他の場所において）ことができる。相同組換えには、Ω−ベクターまたはＯ−ベクターを使用することができる。例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ（１９８７）５１，５０３−５１２；Ｍａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３６，３４８−３５２；ならびにＪｏｙｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３３８，１５３−１５６を参照されたい。
【００７２】
コンストラクトＤＮＡの原液を調製し、トランスフェクションを実行するのに使用されうる有用なエレメントであって、細菌または酵母による複製起点、選択および／または増幅マーカー、原核生物または真核生物における発現のためのプロモーター／エンハンサーエレメントなどのエレメントを含有するベクターは、当業界で周知であり、多くが市販されている。
【００７３】
ＸＩ．細胞の投与
本開示は、ＣＤ１３８特異的ＣＡＲを発現するように細胞を操作し、少なくともいくつかの場合では、個体への投与の前に細胞を拡張することを含め、ひとたび細胞を適正に調製したら、それらを必要とする個体への細胞の投与を包含する。
【００７４】
ＤＮＡコンストラクトで改変された細胞は、選択条件下にある培養物中で成長させ、コンストラクトを有する細胞として選択された細胞は、その後、拡張し、例えば、宿主細胞内のコンストラクトの存在を決定するためのポリメラーゼ連鎖反応を使用して、さらに解析することができる。ひとたび、改変宿主細胞を同定し、または確認したら、その後、計画した通りに使用することができる、例えば、培養物中で拡張することもでき、宿主生物に導入することもできる。
【００７５】
細胞の性質により、細胞を、多種様々な方途により、宿主生物、例えば、哺乳動物に導入することができる。特定の実施形態では、細胞を、骨髄中など、局所的に導入するが、代わりの実施形態では、細胞を全身に施し、がんにホーミングさせるか、細胞を、がんにホーミングするように改変する。利用される細胞の数は、多数の状況、導入の目的、細胞の寿命、使用されるプロトコール、例えば、投与回数、細胞の増殖能力、組換えコンストラクトの安定性などに依存するであろう。細胞は、対象の部位において、またはその近傍において一般に注射される、分散液として適用することができる。細胞は、生理学的に許容できる培地中の細胞でありうる。
【００７６】
ＤＮＡの導入は、必ずしも全ての場合で組込みをもたらす必要はない。状況によって、導入されたＤＮＡの一過性の維持で十分な場合もある。そのような場合、細胞が宿主に導入されて、所定時間後に、例えば細胞が特定の部位にホーミングできた後に機能できるようになるといった、短期的な効果を達成することができる。
【００７７】
細胞は、所望される通りに投与することができる。所望される応答、投与の様式、細胞の寿命、存在する細胞の数により、様々なプロトコールを利用することができる。投与回数は、上記で記載した因子に、少なくとも部分的に依存するであろう。
【００７８】
系は、リガンドに対する細胞応答、発現の効率、および、必要に応じて、分泌レベル、発現産物の活性、時期および状況と共に変化しうる患者の特定の必要、細胞または個々の細胞の発現活性の喪失の結果としての細胞活性の喪失率などの多くの変数下に置かれることを理解されたい。したがって、各個別の患者について、集団全体に投与されうる万能細胞があったとしても、各患者を個体に適正な投与量についてモニタリングすることが予測され、このような患者のモニタリングの実施は、当業界では慣例的である。
【００７９】
ＣＡＲにより改変されたＴ細胞は、静脈内注入を介して投与する。用量は、例えば、１ｍ２当たり１×１０７〜１ｍ２当たり２×１０８の範囲でありうる。
【００８０】
特定の場合には、複数のＣＤ１３８  ＣＡＲを発現する免疫細胞を、ＣＤ１３８を発現するがん抗原を伴う個体に送達する。特定の実施形態では、単回投与が必要とされる。他の実施形態では、細胞の複数回投与が必要とされる。例えば、操作された免疫細胞の初回投与の後で、例えば、がんの存在または非存在について、個体の検査を行うこともでき、腫瘍の数および／またはサイズの低減について個体の検査を行うこともできる。万一、がんが、初回投与後における腫瘍の成長など、さらなる処置に対する必要を示す場合は、追加の１回または複数回の同じＣＤ１３８ＣＡＲ発現細胞（または、任意選択で、別の種類の免疫療法および／もしくは化学療法、外科手術および／もしくは放射線照射を含めた、別の種類のがん療法）の送達が個体に施される。いくつかの場合では、個体における腫瘍サイズの低減は、ＣＤ１３８ＣＡＲ発現免疫療法が有効であることを示すので、さらなる投与が個体に提供される。
【００８１】
ＸＩ．ＣＤ１３８特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド
本開示は、本明細書で規定される、ＣＤ１３８特異的ＣＡＲをコードする核酸配列と、核酸配列を保有する細胞とを含む組成物も包含する。特定の態様では、核酸分子は、組換え核酸分子であり、合成核酸分子でありうる。核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡのほか、ＰＮＡ（ペプチド核酸）を含む可能性があり、これらのハイブリッド体でありうる。
【００８２】
さらに、さらなる目的で、核酸分子が、例えば、チオエステル結合および／またはヌクレオチド類似体を含有しうることも企図されている。修飾は、細胞内のエンドヌクレアーゼおよび／またはエクソヌクレアーゼに対する核酸分子の安定化に有用でありうる。核酸分子は、細胞内の前記核酸分子の転写を可能にするキメラ遺伝子を含む適切なベクターによって転写されうる。この点で、このようなポリヌクレオチドは「遺伝子標的化」アプローチまたは「遺伝子治療的」アプローチに使用することができることが理解される。別の実施形態では、核酸分子を標識する。核酸を検出するための方法、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、ＰＣＲまたはライマー伸長は、当業界で周知である。この実施形態は、遺伝子治療アプローチにおける、上記で記載した核酸分子の導入の成功を検証するためのスクリーニング法に有用なでありうる。
【００８３】
核酸分子は、組換えによりもたらされたキメラ核酸分子であって、上で述べた核酸分子のいずれかを、単独または組合せで含むキメラ核酸分子でありうる。特定の態様では、核酸分子は、ベクターの一部である。
【００８４】
したがって、本開示は、本開示に記載の核酸分子を含むベクターを含む組成物にも関する。
【００８５】
多くの適したベクターが、分子生物学の当業者に公知であり、その選択は、所望の機能に依存し、これらには、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、および遺伝子操作で従来使用されている他のベクターが含まれるであろう。当業者に周知の方法を使用して、多様なプラスミドおよびベクターを構築することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、（１９９４）に記載の技法を参照されたい。代替的に、本開示のポリヌクレオチドおよびベクターは、標的細胞に送達するために、リポソームへと再構成することができる。クローニングベクターを使用して、個々のＤＮＡ配列を単離することができる。特定のポリペプチドの発現が必要とされる場合は、関与性の配列を、発現ベクターに導入することができる。典型的なクローニングベクターには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、およびｐＧＢＴ９が含まれる。典型的な発現ベクターには、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＥＳＰ−１、ｐＯＰ１３ＣＡＴが含まれる。
【００８６】
特定の実施形態では、本明細書で規定される、ＣＤ１３８特異的ＣＡＲをコードする核酸配列に作動可能に連結された調節配列である核酸配列を含むベクターがある。このような調節配列（制御エレメント）は、当業者に公知であり、これらには、プロモーター、スプライスカセット、翻訳開始コドン、翻訳部位、および挿入配列をベクターに導入するための挿入部位が含まれうる。特定の実施形態では、核酸分子を、真核細胞内または原核細胞内の発現を可能にする、前記発現制御配列に作動的に連結する。
【００８７】
ベクターは、本明細書で規定される、ＣＤ１３８特異的ＣＡＲをコードする核酸分子を含む発現ベクターであることが企図される。特定の態様では、ベクターは、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）またはＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）製のレンチウイルスベクターを含め、市販されている。
【００８８】
「調節配列」という用語は、それらがライゲーションされた、コード配列の発現を行うのに必要なＤＮＡ配列を指す。このような制御配列の性質は、宿主生物によって異なる。原核生物では、制御配列には一般に、プロモーター、リボソーム結合性部位、およびターミネーターが含まれる。真核生物では、制御配列には一般に、プロモーター、ターミネーター、および、いくつかの場合では、エンハンサー、トランス活性化因子、または転写因子が含まれる。「制御配列」という用語には、少なくとも、それらの存在が、発現に必要な、すべての構成要素が含まれることを意図し、これらには、追加の有利な構成要素も含まれる。
【００８９】
「作動可能に連結された」という用語は、そのように記載された構成要素が、それらが、それらの意図された形で機能することを可能にする関係にある並置を指す。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が、制御配列と適合的な条件下で達成されるような形でライゲーションされている。制御配列がプロモーターである場合、当業者には、その二本鎖核酸を使用することが好ましいことが明らかである。
【００９０】
したがって、ある特定の実施形態では、列挙されたベクターは、発現ベクターである。「発現ベクター」は、選択された宿主を形質転換し、選択された宿主内のコード配列の発現をもたらすのに使用しうるコンストラクトである。発現ベクターは、例えば、クローニングベクター、バイナリーベクター、または組込みベクターでありうる。発現は、核酸分子の、好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。原核細胞内および／または真核細胞内の発現を確保する調節エレメントは、当業者に周知である。真核細胞の場合、調節エレメントは通常、転写の開始を確保するプロモーターと、任意選択で、転写の終結および転写物の安定化を確保するｐｏｌｙ−Ａシグナルとを含む。原核宿主細胞内の発現を可能にする、可能な調節エレメントは、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のＰＬプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、またはｔａｃプロモーターを含み、真核宿主細胞内の発現を可能にする調節エレメントの例は、酵母内のＡＯＸ１プロモーターもしくはＧＡＬ１プロモーター、または哺乳動物細胞内および他の動物細胞内のＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー、もしくはグロビンイントロンである。
【００９１】
転写の開始の一因となるエレメントのほかに、このような調節エレメントは、ポリヌクレオチドの下流のＳＶ４０−ｐｏｌｙ−Ａ部位またはｔｋ−ｐｏｌｙ−Ａ部位などの転写終結シグナルも含みうる。さらに、使用される発現系によって、ポリペプチドを、細胞内区画へと配向性付けるか、または培地へと分泌することができるリーダー配列を、列挙された核酸配列のコード配列へと付加することができ、これらも当業界で周知である。リーダー配列は、翻訳配列、開始配列、および終結配列と適切に調和させてアセンブルされ、リーダー配列は、翻訳されたタンパク質またはその一部の、ペリプラズム空間または細胞外培地への分泌を配向性付けうることが好ましい。任意選択で、異種配列は、所望の特徴、例えば、発現された組換え産物の安定化または簡略化された精製を付与するＮ末端同定ペプチド（前出を参照されたい）を含めた融合タンパク質をコードしうる。この文脈では、岡山−バーグによるｃＤＮＡ発現ベクターであるｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＦ−Ｎｅｏ、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＦ−ＤＨＦＲおよびｐＥＦ−ＡＤＡ（Ｒａｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２００１）、５０（３）、１４１〜１５０）またはｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）など、適した発現ベクターが、当業界で公知である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、発現制御配列は、真核宿主細胞にトランスフェクトしうるベクター内の真核生物プロモーター系であるが、原核生物宿主のための制御配列も使用することができる。ひとたびベクターを、適切な宿主へと組み込んだら、宿主を、高レベルのヌクレオチド配列の発現に適した条件下で維持し、所望に応じ、本開示のポリペプチドの回収および精製を後続させることができる。特定の実施形態では、１つまたは複数のコード可能な配列を、低酸素環境に応答性の発現制御配列によって調節する。
【００９３】
追加の調節エレメントには、転写エンハンサーのほか、翻訳エンハンサーも含まれうる。上記に記載の本開示のベクターは、選択マーカーおよび／または評定マーカーを含むと有利である。形質転換された細胞の選択に有用な選択マーカー遺伝子は、当業者に周知であり、例えば、ｄｈｆｒについての選択の基盤としての代謝拮抗耐性遺伝子であって、メトトレキサートに対する耐性を付与する代謝拮抗耐性遺伝子（Ｒｅｉｓｓ、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｉｆｅ−Ｓｃｉ．Ａｄｖ．）１３（１９９４）、１４３〜１４９）；アミノグリコシドであるネオマイシン、カナマイシン、およびパロマイシンに対する耐性を付与するｎｐｔ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ、ＥＭＢＯ  Ｊ．、２（１９８３）、９８７〜９９５）；およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｍａｒｓｈ、Ｇｅｎｅ、３２（１９８４）、４８１〜４８５）を含む。追加の選択用遺伝子、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを使用することを可能にするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを使用することを可能にするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５（１９８８）、８０４７）；細胞がマンノースを使用することを可能にするマンノース−６−リン酸イソメラーゼ（ＷＯ９４／２０６２７）；およびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン（ＤＦＭＯ）に対する耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ、１９８７、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ編）、またはブラストサイジンＳに対する耐性を付与する、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓに由来するデアミナーゼ（Ｔａｍｕｒａ、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５９（１９９５）、２３３６〜２３３８）も記載されている。
【００９４】
有用な評定マーカーも当業者に公知であり、市販されている。前記マーカーは、ルシフェラーゼ（Ｇｉａｃｏｍｉｎ、Ｐｌ．Ｓｃｉ．、１１６（１９９６）、５９〜７２；Ｓｃｉｋａｎｔｈａ、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１７８（１９９６）、１２１）、緑色蛍光タンパク質（Ｇｅｒｄｅｓ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、３８９（１９９６）、４４〜４７）、またはβ−グルクロニダーゼ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、ＥＭＢＯ  Ｊ．、６（１９８７）、３９０１〜３９０７）をコードする遺伝子であると有利である。この実施形態は特に、列挙されたベクターを含有する細胞、組織、および生物の簡単で迅速なスクリーニングに有用である。
【００９５】
上記に記載の通り、列挙された核酸分子は、コードされたポリペプチドを細胞内で発現するように、細胞内で、単独で使用することもでき、ベクターの一部として使用することもできる。ＣＤ１３８特異的ＣＡＲコンストラクトのうちのいずれか１つをコードするＤＮＡ配列を含有する核酸分子またはベクターを、細胞に導入し、細胞は、対象のポリペプチドを産生する。列挙された核酸分子およびベクターは、直接的な導入のために設計することもでき、リポソームまたはウイルスベクターを介する（例えば、アデノウイルス、レトロウイルスを介する）細胞への導入のために設計することもできる。ある特定の実施形態では、細胞は、例えば、Ｔ細胞、ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＭＳＣ、神経幹細胞、または造血幹細胞である。
【００９６】
上記に従い、本開示は、ベクター、特に、遺伝子操作で従来使用されている、プラスミド、コスミド、ウイルス、およびバクテリオファージであって、本明細書で規定される、ＣＤ１３８特異的ＣＡＲポリペプチド配列をコードする核酸分子を含むベクターを導出する方法に関する。前記ベクターは、発現ベクターおよび／もしくは遺伝子導入ベクターまたは標的化ベクターであることが好ましい。列挙されたポリヌクレオチドまたはベクターを、標的化された細胞集団に送達するために、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターを使用することができる。当業者に周知の方法を使用して、組換えベクターを構築することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（同上）、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８９、同上）または他の標準的な教科書に記載の技法を参照されたい。代替的に、列挙された核酸分子およびベクターは、標的細胞に送達するために、リポソームへと再構成することができる。本開示の核酸分子を含有するベクターは、細胞宿主の種類によって変化する、よく知られている方法によって、宿主細胞に導入することができる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは一般に、原核細胞に活用されるが、他の細胞宿主には、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションを使用することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出を参照されたい。
【００９７】
ＸＩＩ．ベクター一般
本開示のベクターは、ＣＤ１３８特異的ＣＡＲまたはＣＤ１３８特異的エンゲージャー分子を含めた、ＣＤ１３８特異的認識部分を作製し、少なくともいくつかの場合では、これを発現する組換え操作のために使用することができる。
【００９８】
「ベクター」という用語は、細胞に導入するために核酸配列をその中に挿入でき、細胞内で複製可能である担体核酸分子を指すのに用いられる。核酸配列は、「外因性」であってもよく、これは、その配列が、ベクターがその中に導入される細胞にとって外来のものであること、またはその配列が細胞内の配列に相同であるが、宿主細胞核酸中において、その配列が通常は存在しない位置にあることを意味する。ベクターには、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、および人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が含まれる。当業者ならば、標準的な組換え技法でベクターを構築するのに十分な装備を備えている（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８８、およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９９４を参照。両文献を参照により本明細書に組み込む）。
【００９９】
「発現ベクター」という用語は、転写可能なＲＮＡをコードする核酸を含む、任意のタイプの遺伝子コンストラクトを指す。場合によっては、その後、ＲＮＡ分子がタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。その他の場合、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの生成においては、これらの配列は翻訳されない。発現ベクターは、様々な「制御配列」を含有することができる。「制御配列」は、特定の宿主細胞における、動作可能に連結されたコード配列の転写、場合によって翻訳に必要な核酸配列を指す。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能を果たす、下に記載される核酸配列を含有することもできる。
【０１００】
本開示で利用される調節配列には、その発現が調節される発現コンストラクトへと機能的に連結された、１つまたは複数の低酸素状態応答性エレメントが含まれる。以下では、利用されうる他の調節エレメントについて記載する。
【０１０１】
「プロモーター」は、転写の開始および速度がそこで制御される核酸配列領域である制御配列である。「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子など、調節タンパク質および調節分子が、核酸配列の特異的な転写を開始するために結合しうる遺伝エレメントを含有しうる。「動作可能に配置された」、「動作可能に連結された」、「制御下」、および「転写制御下」という句は、プロモーターが、核酸配列との関係において、その配列の転写開始および／または発現を制御するのに正しい機能的な位置および／または方向で存在することを意味する。
【０１０２】
プロモーターは、一般に、ＲＮＡ合成の開始部位の位置を決めるのに機能する配列を含む。この最もよく知られている例がＴＡＴＡボックスであるが、例えば、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターなど、プロモーターの中にはＴＡＴＡボックスをもたないものもあり、開始部位自体を覆う異なるエレメントが、開始箇所を定めるのを助ける。さらに別のプロモーターエレメントが、転写開始の頻度を調節する。典型的な場合、これらは開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置している。ただし、開始部位の下流に機能エレメントを含有していることが示されているプロモーターもいくつもある。コード配列をプロモーターの「制御下」に置くには、転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端を、選択されたプロモーターの「下流」（すなわち、３’側）に配置する。「上流」のプロモーターが、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされたＲＮＡの発現を促進する。
【０１０３】
プロモーターエレメント間の間隔は、しばしば柔軟であり、そのため、エレメントが反転するか、お互いと比較して動いた場合でも、プロモーター機能が保存される。ｔｋプロモーターでは、活性を低下させずに、プロモーターエレメント間の間隔を５０ｂｐまで広げることができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、転写を活性化するために協力して機能することも、独立して機能することもできるようである。プロモーターは、「エンハンサー」と共に用いても、そうでなくともよい。「エンハンサー」は、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用の調節配列を指す。
【０１０４】
プロモーターは、コーディングセグメントおよび／またはエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得ることのできる、核酸配列に天然に随伴しているものでもよい。そのようなプロモーターを「内因性」と呼ぶことができる。同様に、エンハンサーは、核酸配列に天然に随伴し、その配列の下流または上流のいずれかに位置するものでもよい。代わりに、コーディング核酸セグメントを、組換え体または異種のプロモーターの制御下に置くことによって、ある種の利点が得られるであろう。組換え体または異種のプロモーターとは、その天然の環境にある核酸配列には通常は随伴していないプロモーターを指す。組換え体または異種のエンハンサーも、その天然の環境にある核酸配列には通常は随伴していないエンハンサーを指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、および任意の他のウイルスまたは原核もしくは真核細胞から単離されるプロモーターまたはエンハンサー、および「天然に存在」しない、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメントおよび／または発現を改変する変異を含有するプロモーターまたはエンハンサーが含まれうる。例えば、組換えＤＮＡの構築で最も一般的に用いられるプロモーターには、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース、およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が含まれる。プロモーターおよびエンハンサー核酸配列の合成による生成に加えて、本明細書に開示されている組成物に関して、ＰＣＲ（商標）を含めた組換えクローニングおよび／または核酸増幅技術を用いて、配列を生成することができる（それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，６８３，２０２号および第５，９２８，９０６号を参照）。さらに、ミトコンドリア、葉緑体などの非核オルガネラ内の配列の転写および／または発現を指示する制御配列も利用できることが企図されている。
【０１０５】
当然ながら、発現用に選択されたオルガネラ、細胞型、組織、器官、または生物内でＤＮＡセグメントの発現を効率的に指示するプロモーターおよび／またはエンハンサーを利用することが重要となる。分子生物学の当業者ならば、タンパク質発現用のプロモーター、エンハンサー、および細胞型の組合せの使用について一般的に知っている（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９参照）。利用するプロモーターは、導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を指示するのに適切な条件下で構成的なもの、組織特異的なもの、誘導可能なもの、ならびに／または、組換えタンパク質および／もしくはペプチドの大規模生成に有利なものなど、有用なものでありうる。プロモーターは、異種のものでも、内因性のものでもよい。
【０１０６】
さらに、発現を駆動させるために、あらゆるプロモーター／エンハンサーの組合せを使用することもできる。Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６の細胞質発現系の使用も、別の可能な実施形態である。真核細胞は、送達複合体の一部として、または追加の遺伝子発現コンストラクトとして適切な細菌ポリメラーゼが与えられれば、ある種の細菌プロモーターからの細胞質転写をサポートすることができる。
【０１０７】
組織特異的プロモーターまたは組織特異的エレメントの識別のほか、それらの活性を特徴付けるアッセイも、当業者に周知である。特定の実施形態では、低酸素性特異的調節エレメントなどの、環境特異的プロモーターまたは環境特異的エレメントを活用する。組織特異的プロモーター、細胞系統特異的プロモーター、および／または活性化特異的プロモーターを利用することができ、例には、活性化Ｔ細胞エレメント、ＮＦＡＴ（細胞系統制限活性化）、初期成長応答遺伝子（活性化）、肝臓Ｘ受容体応答エレメント（活性化）、低酸素状態応答エレメント（環境的）などが含まれる。
【０１０８】
コード配列の効率的な翻訳には、特異的な開始シグナルも必要でありうる。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接の配列が含まれる。ＡＴＧ開始コドンを含めた、外因性の翻訳制御シグナルの提供が必要でありうる。当業者ならば、この決定および必要なシグナルの提供を容易に行うことができるだろう。
【０１０９】
本開示のある特定の実施形態では、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを用いて、多重遺伝子または多シストロン性メッセージが生成され、これらを、本開示で用いることができる。
【０１１０】
ベクターは、多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含むことができる。ＭＣＳは、複数の制限酵素部位を含有する核酸領域である。これらの制限酵素部位はいずれも、ベクターを消化する標準的な組換え技術と共に用いることができる。「制限酵素消化」は、核酸分子内の特定の位置のみで機能する酵素を用いて核酸分子を触媒により切断することを指す。これらの制限酵素の多くは市販されている。そのような酵素の使用は、当業者によって広く理解されている。しばしば、ベクターは、外因性の配列をベクターにライゲートすることが可能となるように、ＭＣＳ内で切断する制限酵素を用いて線形化または断片化される。「ライゲーション」は、相互に連続していても、いなくてもよい２つの核酸断片間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスを指す。制限酵素およびライゲーション反応を用いる技法は、組換え技術の当業者に周知である。
【０１１１】
スプライシング部位、終結シグナル、複製起点、および選択マーカーも利用することができる。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、プラスミドベクターが、宿主細胞を形質転換するための使用に企図されている。一般に、宿主細胞と適合性の種に由来するレプリコンおよび制御配列を含有するプラスミドベクターがこれらの宿主と共に使用される。通常、ベクターは、複製部位と、形質転換細胞における表現型選択を提供できるマーキング配列とを有する。非限定的な例では、Ｅ．ｃｏｌｉは、しばしば、Ｅ．ｃｏｌｉ種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有しており、したがって、形質転換細胞を同定するための簡単な手段を提供する。ｐＢＲプラスミドまたは他の微生物プラスミドもしくはファージは、例えば、微生物がそれ自体のタンパク質の発現に用いることができるプロモーターも含有しているか、含有するように改変されていなければならない。
【０１１３】
加えて、宿主微生物と適合性であるレプリコンおよび制御配列を含有するファージベクターを、これらの宿主と共に形質転換ベクターとして用いることができる。例えば、組換えファージベクターを作製する際に、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２などの宿主細胞を形質転換するのに使用できるラムダファージＧＥＭ（商標）１１を利用することができる。
【０１１４】
さらなる有用なプラスミドベクターには、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅら、１９８５）およびｐＧＥＸベクターが含まれる。ｐＧＥＸベクターは、後の精製および分離または切断のために、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）可溶性融合タンパク質を生成するのに使用される。他の適した融合タンパク質は、βガラクトシダーゼやユビキチンなどとの融合タンパク質である。
【０１１５】
発現ベクターを含む細菌宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、いくつかの適した培地のいずれか、例えば、ＬＢ中で培養される。当業者には理解されるように、ある種のベクターにおける組換えタンパク質の発現は、宿主細胞を、ある種のプロモーターに特異的な薬剤と接触させることによって、例えば、ＩＰＴＧを培地に添加するか、インキュベーション温度をより高温に切り換えることによって、誘導することができる。細菌をさらなる期間、通常は２〜２４時間培養した後、遠心分離によって細胞を収集し、洗浄して、残りの培地を除去する。
【０１１６】
Ａ．ウイルスベクター
ある種のウイルスは、細胞を感染させるか、受容体媒介のエンドサイトーシスを介して細胞に進入し、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、ウイルス遺伝子を安定的かつ効率的に発現する能力を有するので、そのようなウイルスは、外来の核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）内に導入する魅力的な候補となっている。本開示の構成要素は、ヘパラナーゼをコードするウイルスベクターでありうる。本開示の核酸を送達するのに使用できるウイルスベクターの非限定な例を以下に記載する。
【０１１７】
１．アデノウイルスベクター
核酸の送達のための特定の方法は、アデノウイルス発現ベクターを使用するものである。アデノウイルスベクターは、ゲノムＤＮＡに組み込まれる能力が低いことが知られているが、この特徴は、これらのベクターによってもたらされる遺伝子移入の効率が高いことで相殺される。「アデノウイルス発現ベクター」には、（ａ）コンストラクトのパッケージングをサポートし、（ｂ）最終的に、その中にクローニングされた組織または細胞特異的なコンストラクトを発現するのに十分なアデノウイルス配列を含有するコンストラクトが含まれると企図されている。アデノウイルス（３６ｋｂの直鎖状二本鎖ＤＮＡウイルス）の遺伝学的構成に関する知識により、アデノウイルスＤＮＡの大きな領域を７ｋｂまでの外来配列で置換することが可能である（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２）。
【０１１８】
２．ＡＡＶベクター
核酸は、アデノウイルス支援のトランスフェクションを用いて細胞内に導入できる。アデノウイルスを組み合わせた系を用いた細胞系でトランスフェクション効率の増大が報告されている（ＫｅｌｌｅｈｅｒおよびＶｏｓ、１９９４；Ｃｏｔｔｅｎら、１９９２；Ｃｕｒｉｅｌ、１９９４）。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、組み込まれる頻度が高く、かつ非分裂性の細胞を感染させることができ、それにより遺伝子を哺乳動物細胞に、例えば組織培養中（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９９２）またはｉｎ  ｖｉｖｏで、送達するのに有用となっているので、本開示の細胞で使用するのに魅力的なベクター系である。ＡＡＶは、感染の宿主域が広い（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、１９８４；Ｌａｕｇｈｌｉｎら、１９８６；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、１９８８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８８）。ｒＡＡＶベクターの生成および使用に関する詳細は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，１３９，９４１号および第４，７９７，３６８号に記載されている。
【０１１９】
３．レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、それらの遺伝子を宿主ゲノムに組み込み、多量の外来遺伝物質を輸送し、広い範囲の種および細胞型を感染させ、特別な細胞株でパッケージングされる能力を有するため、送達ベクターとして有用である（Ｍｉｌｌｅｒ、１９９２。）
【０１２０】
ヘパラナーゼレトロウイルスベクターを構築するために、複製欠損であるウイルスを生成する特定のウイルス配列の箇所に核酸（例えば、ヘパラナーゼの部分またはすべてをコードするもの）をウイルスゲノムに挿入する。ビリオンを生成するために、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含有するがＬＴＲおよびパッケージング構成要素が無いパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎら、１９８３）。レトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列と共に、ｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドが、特別な細胞株に導入される（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）と、パッケージング配列によって、組換えプラスミドのＲＮＡ転写産物をウイルス粒子にパッケージングすることが可能になり、その後、ウイルス粒子が培養培地中に分泌される（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８；Ｔｅｍｉｎ、１９８６；Ｍａｎｎら、１９８３）。次いで、組換え体レトロウイルスを含有する培地を収集し、場合によっては濃縮し、遺伝子移入に用いる。レトロウイルスベクターは、多様な細胞型を感染させることができる。しかし、組み込みおよび安定した発現には、宿主細胞の分裂が必要である（Ｐａｓｋｉｎｄら、１９７５）。
【０１２１】
レンチウイルスは、複雑なレトロウイルスであり、共通のレトロウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖに加えて、調節または構造的な機能を有する他の遺伝子も含有している。レンチウイルスベクターは、当業界で周知である（例えば、Ｎａｌｄｉｎｉら、１９９６；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９７；Ｂｌｏｍｅｒら、１９９７年；米国特許第６，０１３，５１６号および第５，９９４，１３６号を参照）。レンチウイルスのいくつかの例としては、ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびサル免疫不全ウイルス：ＳＩＶが挙げられる。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ病原性遺伝子を多重弱毒化することによって生成された。例えば、遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、およびｎｅｆが欠失しており、それにより、ベクターが生物学的に安全になっている。
【０１２２】
組換え体レンチウイルスベクターは、非分裂性細胞を感染させることができ、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの遺伝子移入ならびに核酸配列の発現の両方に用いることができる。例えば、適した宿主細胞が、パッケージング機能、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｒｅｖ、およびｔａｔを有する２つ以上のベクターでトランスフェクトされる、非分裂性細胞を感染させることができる組換え体レンチウイルスが、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９９４，１３６号に記載されている。エンベロープタンパク質を、特定の細胞型の受容体へとターゲティングする抗体または特定のリガンドと連結することによって、組換え体ウイルスをターゲティングすることができる。対象とする配列（調節領域を含む）を、特定の標的細胞上にある受容体のリガンドをコードする別の遺伝子と共にウイルスベクターに挿入することによって、例えば、ベクターが標的特異的となる。
【０１２３】
４．他のウイルスベクター
他のウイルスベクターも、本開示におけるワクチンコンストラクトとして利用できる。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８）、シンドビスウイルス、サイトメガロウィルス、および単純ヘルペスウイルスなどのウイルス由来のベクターを利用することができる。これらは、様々な哺乳動物細胞用に魅力的な特徴をいくつかもっている（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０）。
【０１２４】
５．改変ベクターを用いる送達
送達する核酸を、特異的な結合リガンドを発現するように遺伝子操作された感染性のウイルス中に収容することができる。したがって、ウイルス粒子は、標的細胞の同族受容体に特異的に結合し、内容物を細胞に送達することになる。ウイルスエンベロープにラクトース残基を化学的に付加することによるレトロウイルスの化学修飾に基づいて、レトロウイルスベクターの特異的なターゲティングを可能にするように設計された新規なアプローチが開発された。この修飾は、シアロ糖タンパク質受容体を介した肝細胞の特異的な感染を可能にすることができる。
【０１２５】
レトロウイルスエンベロープタンパク質および特定の細胞受容体に対するビオチン化抗体が用いられる、組換え体レトロウイルスをターゲティングする別のアプローチが設計された。抗体は、ストレプトアビジンを用いることにより、ビオチン構成要素を介して結合させた（Ｒｏｕｘら、１９８９）。Ｒｏｕｘらは、主要組織適合複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を用いて、それらの表面抗原を有する様々なヒト細胞の、エコトロピックウイルスによる感染をｉｎ  ｖｉｔｒｏで実証した（Ｒｏｕｘら、１９８９）。
【０１２６】
Ｂ．ベクター送達と細胞形質転換
細胞をトランスフェクトまたは形質転換するための核酸送達のための適した方法は、当業者に公知である。そのような方法には、ＤＮＡのｅｘ  ｖｉｖｏでのトランスフェクションや注入などによる直接的送達が含まれるが、これらに限定されない。当業界で公知の技法の適用によって、細胞を安定的にまたは一過性に形質転換することができる。
【０１２７】
Ｃ．Ｅｘ  Ｖｉｖｏ形質転換
ｅｘ  ｖｉｖｏセッティングにおいて、生物から摘出された真核細胞および組織にトランスフェクトするための方法は、当業者に公知である。したがって、細胞または組織を摘出し、ヘパラナーゼまたは本開示の他の核酸を使用して、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいてトランスフェクトしうることが企図されている。特定の態様では、移植細胞または組織が生物内に入れられる。好ましい様相では、核酸が移植細胞内で発現される。
【０１２８】
ＸＩＩＩ．併用療法
本開示のある特定の実施形態では、臨床的態様のための本開示の方法、例えば、ＣＤ１３８を発現するがん免疫細胞を有する個体への、例えば、ＣＤ１３８特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞の投与を、抗がん剤など、過剰増殖性疾患の処置に有効な他の薬剤と組み合わせる。例えば、「抗がん」剤は、がん細胞を殺滅する、がん細胞のアポトーシスを誘導する、がん細胞の成長速度を低減させる、転移の発生率または数を低減させる、腫瘍の大きさを低減させる、腫瘍成長を抑制する、腫瘍もしくはがん細胞への血液供給を低減させる、がん細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進する、がんの進行を防止もしくは抑制する、またはがんを有する対象の寿命を延長することによって、対象体内のがんに負の影響を与えることができる。より一般的には、これらの他の組成物は、細胞を殺滅するか、その増殖を抑制するのに有効な総量で提供することになる。このプロセスは、がん細胞を、発現コンストラクトおよび薬剤または複数の因子と同時に接触させることを含みうる。これは、細胞を、両方の薬剤を含む１つの組成物または薬理学的製剤と接触させることによって、または細胞を、一方の組成物が発現コンストラクトを含み、他方が第２の薬剤を含む２つの異なる組成物もしくは製剤と同時に接触させることによって達成できる。
【０１２９】
本開示の実施形態では、本開示の治療用細胞に加えて、以下：ステロイド、化学療法、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、免疫調節薬（ＩＭｉＤ）など、サリドマイドまたはレナリドマイド、放射線、および／または幹細胞移植の１つまたは複数を、ＭＭを伴う個体に提供する。
【０１３０】
化学療法および放射線療法薬剤に対する腫瘍細胞の耐性は、臨床腫瘍学における重大な問題となっている。現在のがん研究の１つの目標は、化学療法および放射線療法の有効性を、それを遺伝子療法と併用することによって改善する方法を見出すことである。例えば、レトロウイルスベクター系によって脳腫瘍に送達される場合の、単純ヘルペス−チミジンキナーゼ（ＨＳ−ｔＫ）遺伝子は、抗ウイルス剤ガンシクロビルに対する感受性を誘導することに成功した（Ｃｕｌｖｅｒら、１９９２）。本開示の文脈では、細胞療法は、他のアポトーシス促進剤または細胞周期調節剤に加えて、化学療法的介入、放射線療法的介入、または免疫療法的介入と共に、同様に使用しうることが企図されている。
【０１３１】
代わりに、本発明の療法は、他方の薬剤処置と数分間から何週間かの間隔を置いて、その前にまたはその後に行うことができる。他方の薬剤と本開示が個体に別々に適用される実施形態では、一般に、各送達時の間で有意な期間が期限切れにならないことを確実にして、それにより、薬剤療法および本発明の療法が細胞に対してなお有利な併用効果を及ぼすことができるようにすることになる。そのような場合、細胞を、両方の様式と、相互に約１２〜２４時間の内、より好ましくは、相互に約６〜１２時間の内に接触させることができることが企図されている。しかし、状況によっては、処置の期間をかなり延長し、それぞれの投与の間で数日（２、３、４、５、６、または７）から数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８）が経過することが望ましい可能性がある。
【０１３２】
次のような様々な組合せを利用することができる。ここで、本開示は「Ａ」であり、放射線療法または化学療法など、第２の薬剤は「Ｂ」である。
【０１３３】
Ａ／Ｂ／Ａ        Ｂ／Ａ／Ｂ        Ｂ／Ｂ／Ａ        Ａ／Ａ／Ｂ        Ａ／Ｂ／Ｂ        Ｂ／Ａ／Ａ        Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ        Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
【０１３４】
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ              Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ              Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ          
Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ            Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ            Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
【０１３５】
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ              Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ              Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ          
Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ            Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ            Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
【０１３６】
必要に応じて処置サイクルを反復することが予期されている。様々な標準的療法および外科的介入を本発明の細胞療法と組み合わせて適用できることも企図されている。
【０１３７】
Ａ．化学療法
がん療法には、化学的処置および放射線照射ベースの処置の両方の様々な併用療法も含まれる。組合せ化学療法には、例えば、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン；アデルスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；アメタントロン酢酸塩；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；ブレオマイシン硫酸塩；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴール；セレコキシブ（ＣＯＸ−２阻害剤）；クロランブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジコン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；ドロロキシフェンクエン酸塩；プロピオン酸ドロスタノロン；ズアゾマイシン；エダトレキサート；エフロルニチン塩酸塩；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロメート；エピプロピジン；エピルビシン塩酸塩；エルブルゾール；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸エステルナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；エトポシドリン酸塩；エトプリン；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；フルダラビンリン酸エステル；フルオロウラシル；フルオロシタビン；フォスキドン；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキシ尿素；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモフォシン；イプロプラチン；イリノテカン；イリノテカン塩酸塩；ランレオチド酢酸塩；レトロゾール；ロイプロリド酢酸塩；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコール；メイタンシン；メクロレタミン塩酸塩；メゲストロール酢酸塩；メレンゲストロール酢酸エステル；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；マイトカルシン；マイトクロミン；マイトギリン；マイトマルシン；マイトマイシン；マイトスペル；ミトタン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；ペプロマイシン硫酸塩；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロキサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン；スパルホセートナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；テコガランナトリウム；タキソテール；テガフール；テロキサントロン塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；トレミフェンクエン酸塩；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；ツブロゾール塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン硫酸塩；ビンクリスチン硫酸塩；ビンデシン；ビンデシン硫酸塩；ビネピジン硫酸塩；硫酸ビングリシネート；硫酸ビンレウロシン；ビノレルビン酒石酸塩；硫酸ビンロシジン；ビンゾリジン硫酸塩；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩；２０−ｅｐｉ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アデルスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管新生阻害剤；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アントラレリックス；反ｄｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ形成タンパク質１（ａｎｔｉ−ｄｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）；前立腺癌用の抗アンドロゲン；抗エストロゲン；抗ネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシネート；アポトーシス遺伝子調整剤；アポトーシス調節剤；アプリン酸；ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータラクタム誘導体；ベータ−アレチン；ベータクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビサジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラトレンＡ；ビゼレシン；ブレフレート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキサミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡＲＮ  ７００；軟骨由来阻害剤；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリックス；クロリン；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；ｃｉｓ−ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クランベシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラ��ンＡ；シクロペントアントラキノン；シクロプラタム；シペマイシン；シタラビンオクホスフェート；細胞溶解因子；サイトスタチン；ダクリキシマブ；デシタビン；デヒドロジデミンＢ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシホスファミド；デキスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジコン：ジデミンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；９−ジヒドロタキソール；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドキソルビシン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン；エデルフォシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；エトポシドリン酸塩；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；フルオロダウノルビシン塩酸塩；フォルフェニメックス；ホルメスタン；フォストリエシン；ホテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリックス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモフォシン；イロマスタット；イマチニブ（例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））、イミキモド；免疫刺激ペプチド；インスリン様成長因子１受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；イオベングアン；ヨードドキソルビシン；４−イポメアノール；イロプラクト；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリンＮトリアセテート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；レンチナン硫酸塩；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病阻害性因子；白血球アルファインターフェロン；ロイポロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミソール；リアロゾール；直鎖状ポリアミン類似体；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リソクリナミド７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロキソリビン；ルルトテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン；溶解性ペプチド；メイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリリシン阻害剤；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似体；ミトナフィド；マイトトキシンである線維芽細胞成長因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；ヒト絨毛性ゴナドトロピンであるＥｒｂｉｔｕｘ；モノホスホリルリピドＡ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ；モ��ダモール；マスタード系抗がん剤；ミカペロキシドＢ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ置換ベンザミド；ナファレリン；ナグレスチップ；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン：ネリドロン酸；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素調整剤；窒素酸化物による抗酸化剤；ニトルリン；オビメルセン（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））；Ｏ６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘導剤；オルマプラチン；オサステロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペガスパルガーゼ；ペルデシン；ポリ硫酸ペントサンナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール；ペルフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；酢酸フェニル；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニール；ピロカルピン塩酸塩；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ；プラセチンＢ；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤；白金複合体；白金化合物；白金−トリアミン複合体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；プロテインＡベースの免疫調節剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤；小型藻類のプロテインキナーゼＣ阻害剤；プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルプロテイントランスフェラーゼ阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤；脱メチル化レテリプチン；レニウムＲｅ１８６エチドロネート；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチナミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメックス；ルビジノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ１模倣体；セムスチン；老齢由来阻害剤１；センスオリゴヌ
クレオチド；シグナル伝達阻害剤；シゾフラン；ソブゾキサン；ボロカプテートナトリウム；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール；ソマトメジン結合性タンパク質；ソネルミン；スパルホス酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンギスタチン１；スクァラミン；スチピアミド；ストロメリシン阻害剤；スルフィノシン；過活動血管作動性腸管ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ；スラミン；スワインソニン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；タリブラスチン；チロコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣体；チマルファシン；チモポエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；甲状腺刺激性ホルモン；エチルエチオプルプリンすず；チラパザミン；チタノセンジクロリド；トプセンチン；トレミフェン；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チルホスチン；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメクス；尿生殖洞由来成長阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンＢ；ベラレソール；ベラミン；ベルジン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ビタキシン；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；およびジノスタチンスチマラマー、または以上の任意の類似体バリアントもしくは誘導体バリアントが含まれる。
【０１３８】
Ｂ  放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、かつ広く利用されている他の因子には、γ線、Ｘ線および／または腫瘍細胞への放射性同位元素の指向的送達として一般に知られているものが含まれる。マイクロ波およびＵＶ照射などの他の形態のＤＮＡ損傷因子も企図されている。これらの因子すべてが、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体の集合および維持に広範な損傷をもたらす可能性がきわめて高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３〜４週間）にわたる場合の５０〜２００レントゲンの１日線量から、２０００〜６０００レントゲンの単回線量までである。放射性同位元素の投与量範囲は、広範に様々であってもよく、同位元素の半減期、照射される放射線の強度およびタイプ、ならびに新生細胞による取り込みによって左右される。
【０１３９】
細胞に用いられる場合、「接触」および「曝露」という用語は、本明細書では、治療用コンストラクトおよび化学療法剤または放射線療法剤を標的細胞に送達するか、標的細胞の直近に置くプロセスを述べるのに使用される。細胞の殺滅または分裂停止を行うため、細胞を殺滅するか、細胞が分裂するのを妨げるのに有効な総量で両薬剤を細胞に送達する。
【０１４０】
Ｃ．免疫療法
一実施形態では、ＣＤ１３８特異的認識部分（ＣＤ１３８特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞またはＣＤ１３８特異的エンゲージャー分子を有するＴ細胞）以外の免疫療法を、本開示の方法と共に利用する。
【０１４１】
免疫療法薬は、一般に、免疫エフェクター細胞および分子の使用に依存して、がん細胞を標的にし、破壊する。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面のなんらかのマーカーに特異的な抗体でありうる。抗体だけで、治療のエフェクターとして働いても、細胞殺滅を実際に行うのに他の細胞を動員してもよい。抗体は、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）とコンジュゲートさせてもよく、ターゲティング剤として働く。代わりに、エフェクターは、直接的または間接的に腫瘍細胞標的と相互作用する表面分子を有するリンパ球でもよい。様々なエフェクター細胞には、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞およびＮＫ細胞が含まれる。
【０１４２】
したがって、免疫療法を、本開示の細胞療法との併用療法の一部として用いることもあり得る。併用療法の一般的なアプローチについて以下に論じる。一般に、腫瘍細胞には、標的にすることができる、すなわち、大部分の他の細胞には存在しないなんらかのマーカーがあるはずである。多くの腫瘍マーカーが存在しており、これらのいずれも、本開示の関係において、ターゲティングに適したものでありうる。一般的な腫瘍マーカーには、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、泌尿器腫瘍関連抗原、胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂ  Ｂ、ｐ１５５、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、黒色腫優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、スルビビン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ｋ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥｒｂＢ二量体、ＥＧＦｒ  ｖＩＩＩ、癌胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体ａ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−Ａ１  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣＡ、葉酸受容体ａ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ａｖｂ６インテグリン、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、二重抗原、およびユニバーサルが含まれる。
【０１４３】
Ｄ．遺伝子
さらに別の実施形態では、第２の処置が、治療用ポリヌクレオチドが本開示の臨床実施形態の前もしくは後、またはそれと同時に投与される遺伝子療法である。細胞増殖の誘導因子、細胞増殖の抑制因子、またはプログラム細胞死の調節因子を含めた様々な発現産物が、本開示に包含される。
【０１４４】
Ｅ．外科手術
がんを有するヒトの６０％が、予防、診断、病期分類、根治、および緩和のための手術を含めたなんらかのタイプの手術を行うことになる。根治手術は、本開示の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、および／または代替療法など、他の療法とともに施用されうるがん治療である。
【０１４５】
根治手術には、がん組織の全体または一部を物理的に摘出、切除、および／または破壊する切除術が含まれる。腫瘍切除術は、少なくとも腫瘍の一部の物理的な摘出を指す。腫瘍切除術に加えて、外科手術による処置には、レーザー外科療法、低温外科手術、電気外科手術、および顕微鏡下手術（モース手術）が含まれる。本開示は、表在がん、前がん病変、または付帯的な量の正常組織の摘出とともに使用できることがさらに企図されている。
【０１４６】
がん細胞、組織、または腫瘍の全部または一部の切除に際し、体内に空洞が形成されうる。さらなる抗がん療法の潅流、直接注射、または当該領域への局所適用によって、処置を達成させてもよい。そのような処置は、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、もしくは７日毎に、または１週、２週、３週、４週、および５週毎に、または１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、もしくは１２カ月毎に、反復することができる。これらの処置は、投薬量が可変的なものでもよい。
【０１４７】
Ｆ．他の薬剤
処置の治療有効性を向上させるために、本開示と組み合わせて、他の薬剤を用いてもよいことが企図されている。これらの追加薬剤には、免疫調節剤、細胞表面受容体およびギャップ結合の上方制御に作用する薬剤、細胞分裂停止および分化薬剤、細胞接着の阻害剤、またはアポトーシス誘導因子に対する過増殖細胞の感受性を増強する薬剤が含まれる。免疫調節剤には、腫瘍壊死因子；インターフェロンα、β、およびγ；ＩＬ−２および他のサイトカイン；Ｆ４２Ｋおよび他のサイトカイン類似体；ＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、および他のケモカインが含まれる。Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド、ＤＲ４もしくはＤＲ５／ＴＲＡＩＬなど、細胞表面受容体またはそのリガンドの上方制御は、過増殖細胞に対するオートクリンまたはパラクリン作用を確立することによって、本開示のアポトーシス誘導能を強化するであろうことがさらに企図されている。ギャップ結合の数の増大によって、細胞間シグナル伝達が増大すれば、近傍の過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖性効果が増大するであろう。他の実施形態では、処置の抗過増殖有効性を向上させるために、本開示と組み合わせて、細胞分裂停止または分化薬剤を用いることができる。細胞接着の阻害剤は、本開示の有効性を向上させることが企図されている。細胞接着阻害剤の例は、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。処置の有効性を向上させるために、抗体ｃ２２５など、アポトーシスに対する過増殖細胞の感受性を増強する他の薬剤を、本開示と組み合わせて使用できるであろうことがさらに企図されている。
【０１４８】
ＸＩＩ．医薬組成物
本開示に従い、「医薬組成物」という用語は、個体への投与のための組成物に関する。本開示の特定の態様では、医薬組成物は、がん細胞上のＣＤ１３８抗原を指向する複数の免疫細胞を含む。好ましい実施形態では、医薬組成物は、非経口投与、経皮投与、管腔内投与、動脈内投与、髄腔内投与、または静脈内投与のための組成物またはがんへの直接的な注射のための組成物を含む。前記医薬組成物を、注入または注射を介して個体に投与することが特に企図されている。適した組成物の投与は、異なる方途、例えば、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、筋内投与、局所投与、または皮内投与によって行うことができる。
【０１４９】
本開示の医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含みうる。適した医薬担体の例は、当業界で周知であり、これらには、リン酸緩衝生理食塩液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、多様な種類の保湿剤、滅菌溶液などが含まれる。このような担体を含む組成物は、よく知られている好都合な方法によって製剤化することができる。これらの医薬組成物は、適した用量で対象に投与することができる。
【０１５０】
投与量レジメンは、主治医および臨床的因子によって決定されるであろう。医療技術分野で周知の通り、任意の１人の患者の投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与回数および投与経路、全般的健康、および共時的に投与される他の薬物を含めた多くの因子によって決まる。投与に好ましい投与量は、１日当たり体重１キログラム当たり０．２４μｇ〜４８ｍｇ、好ましくは０．２４μｇ〜２４ｍｇ、より好ましくは０．２４μｇ〜２．４ｍｇ、なおより好ましくは０．２４μｇ〜１．２ｍｇの範囲である可能性があり、最も好ましくは０．２４μｇ〜２４０ｍｇの単位でありうるだろう。特に好ましい投与量を、本明細書の以下に列挙する。進行は、定期的な評価によってモニタリングすることができる。ＣＡＲにより改変されたＴ細胞は、静脈内注入を介して投与される。用量は、１ｍ２当たりの細胞１×１０７個〜１ｍ２当たりの細胞２×１０８個の範囲でありうる。
【０１５１】
本開示の組成物は、局所投与することもでき、全身投与することもできる。投与は一般に、非経口投与、例えば、静脈内投与であり、ＤＮＡは、例えば、遺伝子銃による内部もしくは外部の標的部位への送達、またはカテーテルによる動脈内の部位への送達など、標的部位へと直接的に投与することができる。好ましい実施形態では、医薬組成物を皮下投与し、なおより好ましい実施形態では、静脈内投与する。非経口投与のための調製物には、滅菌水溶液または滅菌非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体には、生理食塩液および緩衝媒質を含めた、水、アルコール溶液／水溶液、エマルジョン、または懸濁液が含まれる。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または固定油が含まれる。静脈内媒体には、流体および栄養物補充液、電解質補充液（リンゲルデキストロースに基づく電解質補充液など）などが含まれる。例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなど、保存剤および他の添加剤も存在してよい。加えて、本開示の医薬組成物は、例えば、好ましくはヒト由来の、血清アルブミンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質性担体も含みうるであろう。本開示の医薬組成物は、医薬組成物の意図される使用によって、ＣＡＲコンストラクトもしくはＣＡＲ核酸分子またはこれらをコードするベクター（本開示に記載の）に加えて、さらに、生物学的に活性の薬剤も含みうることが企図される。
【０１５２】
本明細書に記載の組成物のいずれかを、ＣＤ１３８を発現するがんを処置するためのキットに含めることができる。非限定的な例では、細胞療法における使用のための、１つまたは複数のＣＤ１３８指向性免疫細胞、および／または細胞療法における使用のための１つまたは複数の細胞であって、組換え発現ベクターを保有する細胞を生成する試薬を、キットに含めることができる。キットの構成要素は、適した容器手段で提供される。
【０１５３】
キットのいくつかの構成要素は、水性媒体に入れるか、凍結乾燥形態でパッケージングすることができる。キットの容器手段には、通常、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器手段が含まれることになり、その中に、構成要素を入れる、好ましくは、適切にアリコートに分けることができる。キット内に複数の構成要素がある場合、キットは、通常、第２、第３、または他の追加の容器を含有することになり、その中に追加の構成要素を個別に入れることができる。しかし、構成要素の様々な組合せを１つのバイアルに含めることもできる。キットは、典型的には、販売用に構成要素をしっかりと封じ込めるための手段も含むことになる。そのような容器には、その中に所望のバイアルが保持される射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器が含まれることになる。
【０１５４】
キットの構成要素を１種および／または２種以上の液体溶液中で提供する場合、液体溶液は水溶液であり、無菌水溶液が特に有用である。場合によっては、容器手段が、それ自体、シリンジ、ピペット、および／または装置などの他のものであってもよく、そこから、製剤を身体の感染領域に適用すること、動物に注射すること、ならびに／またはキットの他の構成要素にさえ適用し、かつ／もしくはこれと混合することができる。
【０１５５】
しかし、キットの構成要素は、乾燥粉末として提供することができる。試薬および／または構成要素を乾燥粉末として提供する場合、この粉末を、適した溶媒の添加によって再構成することができる。溶媒を別の容器手段に入れて提供できることが企図されている。キットは、無菌の薬学的に許容できるバッファーおよび／または他の希釈剤を含有するための第２の容器手段を含むことができる。
【０１５６】
特定の実施形態では、細胞療法に用いられる細胞をキットに入れて提供し、場合によっては、細胞がキットの本質的に唯一の構成要素となる。キットは、必要とされた細胞を作成する試薬および材料を含みうる。特定の実施形態では、試薬および材料には、所望の配列を増幅するためのプライマー、ヌクレオチド、適した緩衝液または緩衝液試薬、塩などが含まれ、いくつかの場合では、試薬には、本明細書に記載のエンゲージャー分子および／またはそのための調節エレメントをコードするベクターおよび／またはＤＮＡも含まれる。
【０１５７】
特定の実施形態では、キット内に、個体から１つまたは複数の試料を抽出するのに適した１つまたは複数の装置がある。この装置は、シリンジ、メスなどであってもよい。
【０１５８】
特定の態様では、キットは、本開示の細胞療法を含み、それに対して細胞が免疫性である化学療法も含む。いくつかの場合に、キットには、細胞療法の実施形態に加えて、例えば、化学療法、ホルモン療法、および／または免疫療法など、二次がん療法も含まれる。キットは、個体の特定のがんに照らして調整することができ、個体のためのそれぞれの二次がん療法を含みうる。
【０１５９】
ＸＩＩ．ＣＤ１３８  ＣＡＲを発現する宿主Ｔ細胞の治療的使用
例示を目的として述べると、がん患者、またはがんに罹患しやすい患者、またはがんを有することが疑われる患者は、本明細書に記載の通りに処置することができる。本明細書に記載の通りに改変された免疫細胞は、個体に投与し、長期にわたり保持することができる。個体には、１回または複数回の細胞の投与を行うことができる。いくつかの実施形態では一般に、改変された細胞を封入して、免疫認識を阻害し、腫瘍部位に配置する。
【０１６０】
多様な実施形態では、発現コンストラクト、核酸配列、ベクター、宿主細胞、および／またはこれらを含む医薬組成物を、腫瘍性疾患など、がん性疾患の防止、処置、または改善のために使用する。特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、例えば、固形腫瘍を含めたがんの防止、改善、および／または処置において、特に、有用でありうる。
【０１６１】
本明細書で使用される場合、「処置」または「処置すること」は、疾患または病的状態の症状または病態への有益または望ましいいかなる作用も含み、処置されている疾患または状態（例えば、がん）の１種または複数の測定可能マーカーにおける最小限の低減さえ含みうる。処置は、場合によって、疾患もしくは状態の症状の軽減もしくは改善または疾患もしくは状態の進行の遅延を伴うことがある。「処置」は、必ずしも、疾患もしくは状態またはそれに伴う症状の完全な根絶または治癒を示すわけではない。
【０１６２】
本明細書で使用される場合、「予防する」および「予防される」、「予防すること」などの類似の語は、疾患または状態、例えば、がんの発生または再発を予防する、阻害する、またはその可能性を低減するためのアプローチを示す。この語は、疾患もしくは状態の発症もしくは再発を遅らせること、または疾患もしくは状態の症状の発症もしくは再発を遅らせることも指す。本明細書で使用される場合、「予防」および類似の語は、疾患または状態の発症または再発の前に、疾患または状態の強度、影響、症状、および／または負荷を軽減させることも含む。
【０１６３】
特定の実施形態では、本発明は、発現コンストラクト、核酸分子、および／またはベクターを保有する細胞であって、単独で、または別の療法との任意の組合せで投与することができ、少なくともいくつかの態様では、薬学的に許容される担体または賦形剤と併せて投与することができる細胞を部分的に企図する。ある特定の実施形態では、細胞を投与する前に、前記核酸分子またはベクターを、細胞のゲノムへと安定的に組み込むことができる。特定の実施形態では、ある特定の細胞または組織に特異的であり、前記細胞内に滞留するウイルスベクターを使用することができる。適した医薬担体および医薬賦形剤は、当業界で周知である。本開示に従い調製された組成物は、上記で同定された疾患を防止するか、処置するか、または遅延させるために使用することができる。
【０１６４】
さらに、本開示は、がん性疾患（腫瘍性疾患を含めた）を防止、処置、または改善するための方法であって、それを必要とする対象に、抗原認識部分分子および化学療法耐性分子、それらをコードする核酸配列、それらをコードするベクターを保有する細胞であり、本明細書で企図され、かつ／または本明細書で企図される工程によって作製される細胞の有効量を投与するステップを含む方法にも関する。
【０１６５】
例示の改変された免疫細胞の組成物の投与の可能な適応は、ＭＭ、乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、皮膚がん、泌尿生殖器がん、例えば、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頚がん、および腎がん、肺がん、胃がん、小腸がん、肝がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、食道がん、唾液腺がん、および甲状腺がんなど、乳がん、前立腺がん、肺がん、および結腸がん、または上皮がん／癌を含めた、腫瘍性疾患を含めた、がん性疾患である。細胞組成物投与の例示の適応は、例えば、ＣＤ１３８を発現する任意の悪性腫瘍を含めたがん性疾患である。加えて、細胞組成物投与の例示の適応には、他の腫瘍抗原を異常に発現する悪性腫瘍も含まれ、これらも標的化することができる。本開示の組成物の投与は、例えば、微小残存病変、初期がん、進行がん、および／または転移がんおよび／または不応性がんを含めたすべてのステージおよびタイプのがんに有用である。
【０１６６】
本開示はさらに、他の化合物、例えば、免疫細胞を介して作用する、二特異性抗体コンストラクト、標的化された毒素、または他の化合物との共投与プロトコールも包含する。本発明の組成物の共投与のための臨床レジメンは、他方の構成要素を投与するのと同時に、その前に、および／またはその後に行う共投与を包含しうる。特定の組合せ療法には、化学療法、放射線照射、外科手術、ホルモン療法、または他のタイプの免疫療法が含まれる。
【０１６７】
実施形態は、本明細書に記載の１つまたは複数の免疫細胞、本明細書に記載の核酸配列、本明細書に記載のベクター、および／または本明細書に記載の宿主を含む、キットに関する。本開示のキットが、本明細書の上記に記載の医薬組成物を、単独で、または医療処置もしくは医療介入を必要とする個体に投与される、さらなる医薬と組み合わせて含むことも企図される。
【０１６８】
コンストラクトで改変されたＣＴＬは、その後、選択的条件下の培養物中で成長させ、コンストラクトを有するものとして選択された細胞は、その後、拡張し、例えば、宿主細胞内のコンストラクトの存在を決定するためのポリメラーゼ連鎖反応を使用して、さらに解析することもできる。改変された宿主細胞をひとたび同定したら、その後、それらを計画された通りに使用する、例えば、培養物中で拡張するか、または宿主生物に導入する。
【０１６９】
細胞の性質によって、多種多様な方途により、細胞を、宿主生物、例えば、哺乳動物に導入することができる。特定の実施形態では、細胞を、腫瘍部位に導入することができるが、代わりの実施形態では、細胞を、がんにホーミングさせるか、細胞を、がんにホーミングするように改変する。利用される細胞の数は、多数の状況、導入のための目的、細胞の寿命、使用されるプロトコール、例えば、投与回数、細胞が増殖する能力、組換えコンストラクトの安定性などによって決まるであろう。細胞は一般に、対象の部位またはその近傍において注射される、分散液として適用することができる。細胞は、生理学的に許容可能な培地中の細胞でありうる。
【０１７０】
ＤＮＡの導入は、あらゆる場合に組込みをもたらす必要があるわけではない。状況によっては、導入されたＤＮＡの一過性の維持で十分でありうる。このようにすれば、短期的な効果を及ぼすことができ、この場合、細胞を宿主に導入し、その後、所定の時間の後で、例えば、細胞が特定の部位にホーミングすることができた後で、オンにすることもできよう。
【０１７１】
細胞は、所望に応じて投与することができる。所望の応答、投与様式、細胞の寿命、存在する細胞の数によって、多様なプロトコールを利用することができる。投与回数は、上記に記載の因子によって、少なくとも部分的に決まるであろう。
【０１７２】
系は、リガンドに対する細胞応答、発現の効率、および、必要に応じて、分泌レベル、発現産物の活性、時期および状況と共に変化しうる患者の特定の必要、細胞または個々の細胞の発現活性の喪失の結果としての細胞活性の喪失率など、多くの変数の下に置かれることを理解されたい。したがって、各個別の患者について、集団全体に投与されうる万能細胞があったとしても、各患者を個体に適正な投与量についてモニタリングすることが予測され、このような患者のモニタリングの実施は、当業界では慣例的である。
【実施例】
【０１７３】
以下の実施例は、本開示の好ましい実施形態を実証する目的で含める。当業者ならば、後続の実施例で開示される技法が、本発明者によって本開示の実施においてよく機能することが発見された技法を表し、したがって、その実施のための好ましい方式を構成すると考えられうることを理解するであろう。しかし、当業者ならば、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において、多くの変化を施し、本開示の趣旨および範囲から逸脱せずに、やはり同じ結果または同様の結果を得うることも理解するであろう。
【０１７４】
実施例１初期研究ＸＩＩ．初期研究／予備データ
ＣＡＲベースの技術を使用して、ＣＤ１９、ヒト免疫グロブリンのκ軽鎖、およびリンパ腫内のＣＤ３０を標的化する臨床試験が開発されている。戦略は、臨床的探索下にあり、近年、ＣＡＲ．ＣＤ１９で処置された患者の最初の群について報告された。本開示の実施形態では、ＣＡＲ技術を使用して、このアプローチによる処置のためにいまだ選択されていない、例示の造血器障害を標的化する。
【０１７５】
ＣＡＲ．ＣＤ１３８でリダイレクトされたＴ細胞は、ＣＤ１３８＋悪性ＰＣを標的化する。本発明者らは、ＣＤ１３８特異的一本鎖（ｓｃＦｖ）を、前に記載した通り、ＩｇＧ１のヒンジ−ＣＨ２ＣＨ３領域、ＣＤ２８エンドドメイン、およびζ鎖とインフレームでクローニングした（第二世代のＣＡＲ）。図１は、活性化されたＴリンパ球内のＣＡＲ．ＣＤ１３８の発現、ならびにそれらによるＣＤ１３８＋ＭＭ細胞株（Ｕ２６６およびＲＰＭＩ）および初代腫瘍性ＰＣの特異的な殺滅を示す。
【０１７６】
ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＭＭの成長を制御する。ＣＡＲでリダイレクトされたＴ細胞の抗腫瘍効果を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて評価するため、本発明者らは、ＳＣＩＤマウスにおいて異種移植モデルを確立し、生物発光システムを使用して、ＭＭの成長を追跡した。これらの実験では、マウスに、ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬｕｃ）で標識されたＵ２６６細胞（細胞０．５×１０６個）を静脈内（ｉ．ｖ）注射した。腫瘍細胞が発光によって検出可能となったら、マウスに、対照Ｔ細胞およびＣＡＲ＋Ｔ細胞（マウス１匹当たりの細胞１０７個）を、外因性サイトカインを伴わずにｉ．ｖ．注射した。図２において示される通り、ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＭＭの成長の制御をもたらす。
【０１７７】
ＣＡＲ．ＣＤ１３８の低酸素状態誘導性発現：低酸素状態誘導性ＣＡＲ．ＣＤ１３８を生成するため、本発明者らは、ＣＡＲ．ＣＤ１３８カセットの配向性を、ＳＦＧレトロウイルス骨格へと反転させ、これに、その３’末端でミニマルＣＭＶプロモーター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と融合させた、ＨＲＥの６回反復配列を含めた。図３は、正常酸素状態下および低酸素状態（１％のＯ２分圧）下における、活性化されたＴリンパ球内の、低酸素状態誘導性ＣＡＲ．ＣＤ１３８（ｈＣＡＲ．ＣＤ１３８）の発現および機能を示す。
【０１７８】
全体として、これらの初期研究は、本開示の実用性を示す。ＨＲＥの制御下で発現されたＣＡＲ．ＣＤ１３８は、完全な抗ＭＭ機能を保持することは重要である。
【０１７９】
実施例２例示の方法
慣例的に使用されているいくつかの方法は、以前の刊行物（９、２５）に十分に記載されている。
【０１８０】
本開示の実施形態では、低酸素状態応答性エレメント（ＨＲＥ）の誘導的制御下でＣＡＲ．ＣＤ１３８を発現することによる、ＭＭにおけるＢＭ微小環境の低酸素的性質の利用がある。ＣＡＲ  Ｔ細胞を低酸素環境内で共刺激するのに最も有利な免疫エレメントを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、および、ｉｎ  ｖｉｖｏの異種マウスモデルの両方において規定することもできる。最後に、提起されたアプローチの安全性をさらに増大させるために、当業者は、コンストラクト内に、誘導性カスパーゼ９（ｉＣ９）に基づき前に検証された自殺遺伝子を組み込むこともできる。
【０１８１】
初期研究（図１および２）は、ＣＡＲ．ＣＤ１３８を構成的に発現するＴ細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、および、ｉｎ  ｖｉｖｏの異種マウスモデルの両方において、抗ＭＭ効果を及ぼすことを明確に示す。図３において示される通り、Ｔ細胞が低酸素状態へと曝露されると、ｈＣＡＲ．ＣＤ１３８が有意に上方制御され、Ｔ細胞は抗ＭＭ活性を保持する。これらの研究におけるＣＡＲ．ＣＤ１３８は、ＣＤ２８共刺激性エンドドメインをコードする。低酸素状態下における、４〜１ＢＢを含めた共刺激性エンドドメインおよびそれらの組合せの効果を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて比較することができる。一連の抗原刺激の後における増殖、サイトカインの放出、および細胞傷害活性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて測定することができ、抗腫瘍活性を、ｉｎ  ｖｉｖｏのマウスモデルにおいて測定することができる（図２）。加えて、二量体化ＣＡＲの発現が、正常酸素状態下でさえ、なおも観察される（図３）ため、発現をさらに低減するように、ＨＲＥとベクターの３’末端ＬＴＲとの間にインシュレーターを含めることもできる。ＢＭ低酸素状態において、ｈＣＡＲ．ＣＤ１３８が機能的に発現したら、自己再生能を有するＴ細胞は、ＢＭ環境を回避し、再循環し、潜在的な毒性をもたらす可能性がある。Ｔ細胞が、ＣＡＲ発現を、下方制御するには、４８〜７２時間かかるため、低酸素状態から正常酸素状態へと移行したら（少なくともいくつかの実施形態では）、構成的プロモーター下で、誘導性カスパーゼ９（ｉＣ９）に基づき、自殺遺伝子を共発現することができるので、それらが毒性を引き起こす場合は、Ｔ細胞を急速に消失させることができる。ｉＣ９遺伝子は、５’ＬＴＲの構成的制御下において、逆の配向性で、図３に記載のレトロウイルスベクター内に施すことができる。ベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける機能性を評価する。
【０１８２】
本開示の実施形態では、有用なベクターは、低酸素状態下における、主要かつ機能的なＣＡＲ．ＣＤ１３８の発現を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方において可能にする。加えて、自殺遺伝子の包含は、毒性の場合に細胞を消失させることが期待される。低酸素状態下におけるＣＡＲの発現が、機能的に不十分である場合、それを、インシュレーターを含めたカセットのサイズ（全体のサイズ：３．５ｋｂ）に帰することができ、カセットを、レトロウイルスベクターと比較してカーゴ容量を増大させた、レンチウイルスベクター内に導入することができる。これらのベクターの製造が、頑健であり、再現可能性が高いため、レトロウイルスによるアプローチを利用しうるが、いくつかの場合では、レンチウイルスも活用される。
【０１８３】
本開示の実施形態では、臨床グレードのレトロウイルスベクターと、ＭＭ患者に由来する、ＣＡＲで改変されたＴ細胞株を製造し、それらを、再発したＭＭを有する患者へと注入することを包含する方法がある。当業者は、手順の安全性を評価することができ、毒性が生じる場合は、二量体化薬を投与して、ｉＣ９安全性遺伝子をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて活性化させる。Ｔ細胞の注入が、検出可能な疾患を有する患者における疾患のコントロールをもたらすのかどうかを評価することもできる。
【０１８４】
ｈＣＡＲ．ＣＤ１３８および構成的ｉＣ９をコードする、安定的なレトロウイルスによる産生細胞株を作製する。前に記載した通り、ＰＧ１３によるパッケージングを利用することができる。産生細胞株を調製するための詳細な手順は、記載の中心部において提示されている。このパッケージングから得られた臨床グレードの上清を使用して、ＭＭ患者から得られたＰＢ試料に由来するＴ細胞に形質導入することができる。
【０１８５】
再発したＭＭ／不応性ＭＭを有する患者において、ｈＣＡＲ．ＣＤ１３８およびｉＣ９を発現する、用量を増大させるＴリンパ球の効果を評価することができる（他の実施形態と対照的に、標準的な第一選択療法に応答性の患者を処置することができる）。まず、ＣＡＲ−Ｔ細胞の単回静脈内投与を、３つの異なる用量レベルで評価することができる。ベンダムスチンは、ある程度の抗ＭＭ活性を有し、おそらく、養子移入されたＣＡＲ  Ｔ細胞の拡張に好適な環境を創出するため、ベンダムスチンによる処置の後でＴ細胞を投与する。
【０１８６】
１ｍＬ当たりの力価が＞１０６である、安定的な産生細胞株を開発することができる。Ｔ細胞の形質導入効率は、低酸素状態下において、３０％〜４０％の範囲でありうる（図３）。リダイレクトされたＴ細胞は、低酸素状態下の共培養実験において、ＣＤ１３８＋標的を消失させることができ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ｉＣ９自殺遺伝子を活性化させる低分子二量体化剤であるＡＰ１９０３（２０〜５０ｎＭ）への曝露の２４時間以内に、急速に消失させる（形質導入された細胞の＞９０％）こともできる。
【０１８７】
本開示の実施形態では、注入されたＣＡＲ−Ｔ細胞の運命を、それらのｉｎ  ｖｉｖｏにおける生存を測定することによって特徴づけ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける、二量体化薬のこれらの細胞に対するその後の効果も決定することができる。ＢＭ中および末梢血中のこれらの細胞の蓄積、各環境におけるＴ細胞によるＣＡＲの示差的発現、ならびにこれらと関連する、腫瘍細胞を殺滅させる能力も比較することができる。
【０１８８】
導入されたＴ細胞の存続および拡張は、Ｔ細胞注入後の異なる時点において回収されたＰＢから抽出されたＤＮＡにおいて、免疫表現型アッセイおよびリアルタイム定量的ＰＣＲアッセイ（Ｑ−ＰＣＲ）を使用して推定する。ＢＭ試料を、これらの患者の臨床評価の一部として、６週目に回収する。間隔を置いて、血漿試料を回収し、瞬時凍結させて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞によって放出された、ＩＬ−２、ＩＬ６、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαを検出する。例えば、６、１２、および２４週間後における、パラプロテインレベルおよびＰＣのＢＭへの浸潤をモニタリングすることによって、抗腫瘍活性の臨床的証拠を検索することもできる。患者は、ＮＣＩ基準に従い、毒性の発生について緊密にモニタリングされる。グレードＩＩＩ〜ＩＶの毒性の場合は、前に報告された通り、患者をＡＰ１９０３で処置して、ｉＣ９遺伝子を活性化させる。ｉＣ９の効果は、ＣＡＲの＋循環細胞の喪失を測定すること、およびＱＰＣＲを介するｉＣ９トランス遺伝子の変化によって定量化する。
【０１８９】
ＣＡＲの分子シグナル（これは、低酸素状態によって決まらない）は、６週目まで、ＰＢ試料およびＢＭ試料のいずれにおいても検出されるが、ＣＡＲ  Ｔ細胞の蓄積のために、ＢＭ中で高度なシグナルが生じる可能性さえある。ＭＭのＢＭは、低酸素性であるため、Ｔ細胞内のフローサイトメトリーによるＣＡＲの発現（これは、タンパク質の合成を検出するので、低酸素状態によって決まる）は、ＢＭ中で、ＰＢ中と比較してはるかに高度であることが期待される。特定の実施形態では、同等数のＴ細胞が、ＰＢ中およびＢＭ中の両方において、表現型的にＣＡＲ陽性である場合、これは、低酸素状態により活性化されたＴ細胞の再循環を反映し、細胞が正常酸素性環境に戻るときに予測される、期待されたＣＡＲの下方制御を伴わない。この持続的発現が、毒性と関連するのかどうかを決定し、毒性と関連する場合は、ｉＣ９自殺遺伝子を活性化させるＡＰ１９０３の投与によって失効化させうるのかどうかを決定することができる。ｉＣ９の活性化は、ＡＰ１９０３投与の３時間以内に＞９０％のｈＣＡＲ．ＣＤ１３８Ｔを消失させる。ＡＰ１９０３の投与にも関わらず、副作用が増大し続ける場合は、ＡＰ１９０３の追加投与を実施し、高用量のステロイドを投与することができる。特定の実施形態では、ｈＣＡＲ．ＣＤ１３８  Ｔ細胞の注入は、腫瘍の有意な低減をもたらす。万一、Ｔ細胞の単回投与が、完全寛解を誘導するのに不十分である場合は、Ｔ細胞の追加投与を実施することができる。
【０１９０】
特定の実施形態では、ＭＭを有する患者に「在庫」産物をもたらすために、ＣＡＲ．ＣＤ１３８を、対象外のＥＢＶ特異的ＣＴＬへと生着させるが、これは、重度のＭＭを有する高齢のＭＭ患者のために使用されうる、非骨髄破壊的同種幹細胞移植の後において、特に価値のあるアプローチである。いくつかの実施形態では、ＭＭ  ＴＡＡを指向するＴＣＲを使用する、他の腫瘍関連抗原（ＭＡＧＥ、ＰＲＡＭＥ、スルビビン）の標的化がある。いくつかの実施形態では、ＴＣＲではなく、ＣＡＲによって媒介される、第３の特異性の包含は、抗原またはＨＬＡ分子の発現／抗原のプロセシングの喪失による腫瘍の回避を有意に低減しうる。ＣＤ１３８  ｓｃＦｖを、分泌性「エンゲージャー」タンパク質として発現することもできる。
【０１９１】
実施例３進行性形質細胞増多症のための、ＣＤ１３８特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞の研究
本開示の実施形態では、一般に、構成的な活性プロモーター下において、（ａ）低酸素状態依存性プロモーター下でＣＤ１３８分子を標的化する人工的Ｔ細胞受容体（キメラ抗原受容体またはＣＡＲ）（ＣＤ１３８．ＣＡＲ）、および（ｂ）誘導性カスパーゼ−９（ｉＣ９）自殺タンパク質を発現するように改変された、用量を増大させる、自己または同系の活性化末梢血Ｔリンパ球（ＡＴＬ）の安全性を評価することができる。本開示の方法の特定の実施形態には、（１）これらのＣＤ１３８．ＣＡＲ−ＡＴＬの生存および機能を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて測定すること；（２）不応性形質細胞増多症を有する患者において、ＣＤ１３８．ＣＡＲ−ＡＴＬの抗腫瘍効果を定量化し、改定Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｙｅｌｏｍａ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＩＭＷＧ）Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ基準によって臨床的応答を評価すること；および（３）毒性が生じた場合に、末梢血に由来するトランス遺伝子陽性細胞の消滅を測定することによって、自殺遺伝子を活性化させるのに使用される二量体化剤である、ＡＰ１９０３の投与の有効性を評価することが含まれる。
【０１９２】
初期研究の少なくともいくつかの場合には、Ｔ細胞処置のための、例示の適格性基準がある。（１）不応性／再発した形質細胞増多症（または患者が標準的な治療を受けるかもしくは完了することができないのかどうかを新規に診断する）；（２）少なくとも１２週間の平均余命；（３）十分な臓器機能；（４）フローサイトメトリーによって決定されるＣＤ１３８．ＣＡＲ／ｉＣ９の発現が＞２０％である、形質導入された自己末梢血Ｔ細胞の利用可能性；（５）説明同意文書への署名；（６）マウスタンパク質含有産物への過敏反応履歴がないこと。
【０１９３】
処置計画の例：ベンダムスチンの投与。患者にベンダムスチン（例えば、毎日４５ｍｇ／ｍ２ずつ２日間にわたる）を施して、リンパ枯渇をもたらし、注入されたＣＡＲ＋Ｔ細胞の生着を促進する。
【０１９４】
ベンダムスチンも、限定的な抗骨髄腫効果を及ぼしうる。Ｔ細胞の投与。ベンダムスチンによる処置後４〜７日目にＴ細胞を注入して、それらのＩＬ−７およびＩＬ−１５を含めた、再生性サイトカインの発生環境への曝露を最大化する。ＣＲＭ（ｃｏｎｔｉｎｕａｌ  ｒｅａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ）変法を使用して、３種の用量レベルを評価し、各用量レベルにサイズ２のコホートを登録した。各患者には、以下の投与計画：群１：１ｍ２当たり２×１０７個、群２：１ｍ２当たり１×１０８個、群３：１ｍ２当たり２×１０８個に従い、１回の注射を施す。直接的な毒性の非存在下では、Ｔ細胞の逐次投与を実施する許可を得ることができるが、これは、以前の例示の研究で取られた戦略である。
【０１９５】
臨床パラメータおよび生物学的パラメータのモニタリング：ある特定のパラメータをモニタリングすることができ、これには、Ｔ細胞注入前、ならびにＴ細胞注入の４時間後、および１、２、４、６週間後に実施される、病歴、身体検査、および慣例的な検査室検査が含まれる。レトロウイルス組込み細胞を検出するように設計された他の研究について記載の、特異的Ｑ−ＰＣＲアッセイによって、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の存続もモニタリングすることができる。複製コンピテントレトロウイルス（ＲＣＲ）およびレトロウイルス組込み細胞のクローン性の検出は、ＦＤＡガイドラインに準拠して実施する。処置前および処置の６週間後における、ＢＭを含めた疾患負荷の評価を活用する。
【０１９６】
用量制限毒性（ＤＬＴ）：ＤＬＴは、以下の毒性：（１）グレード３またはグレード４の任意の、造血器以外における毒性；（２）グレード４の任意の造血器ＤＬＴ（血球減少症は、ベンダムスチンに伴うと予測され、ＤＬＴと評定されない；広範にわたる骨髄病変を伴う患者は、造血器ＤＬＴについて評価可能でない）であって、場合により、おそらく、または確実に改変Ｔ細胞と関連すると考えられうる毒性のいずれかとして規定することができる。造血器以外におけるＤＬＴが生じた場合、患者は、二量体化薬物（０．４ｍｇ／ｋｇ）の単回投与で処置し、循環する遺伝子改変Ｔ細胞に対する効果を研究する。４８時間以内に毒性が減少しない場合、プロトコールは、ステロイド（毎日１ｍｇ／ｋｇずつのメチルプレドニゾロン）と組み合わせた、最大３回の二量体化薬の追加投与を可能にするであろう。
【０１９７】
研究の終了：最低１０例の患者を処置し、現行の用量で６例の患者を登録し、ＤＬＴがないか、またはＤＬＴの予測確率が＞２０％である場合、試験を終了することができる。最大１８例の患者を登録することができる。毒性は、ＮＣＩ基準（ＣＴＣＡＥ）を使用して評価する。特定の実施形態では、６週間で処置コースを構成し、これが、ＤＬＴを評価するためのベースとして用いられる。
【０１９８】
実施例４ＣＤ１３８  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて有効である
本実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける測定によって、例示のＣＤ１３８特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞が、腫瘍細胞に対して有効であることを示す。
【０１９９】
図４は、ＣＡＲ．ＣＤ１３８は、健常ドナー試料および多発性骨髄腫（ＭＭ）試料のいずれに由来するＴ細胞内でも、効率的かつ安定的に発現されうることを実証する。図４Ｄにおいて示される通り、健常ドナーに由来する対照Ｔ細胞および形質導入されたＴ細胞のいずれも、均衡した比率のＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（５７％±２６％および５４％±１４％）およびＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（３５％±１７％および３７％±１３％）を含有したが、ＭＭ患者に由来するＴ細胞は、ＣＤ８＋細胞（８０％±１０％）を含有する不均衡が大きかった。健常ドナーおよびＭＭ患者に由来する、形質導入されたＴ細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける拡張手順と適合的な、メモリー細胞とエフェクターメモリー細胞との比率（それぞれ、ＣＤ４５ＲＯ＋：８２％±１６％および７９％±９％；それぞれ、ＣＤ６２Ｌ＋＝５１％±１７％および４２％±１４％）を含有した。
【０２００】
図５では、ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞は、ＣＤ１３８＋腫瘍細胞株を標的化する。ＣＡＲ．ＣＤ１３８を発現する、健常ドナーに由来するＴ細胞は、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、選択されたＣＤ１３８＋ＭＭ由来細胞株を、対照Ｔ細胞より有意に高い割合で溶解させた（図５Ａ、５Ｄ）。殺滅の同様のパターンは、形質導入されたＴ細胞が、ＭＭ患者から生成された場合にも観察された（図５Ｂ）。これに対し、ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞の、特定のＣＤ１３８−標的（図５Ａ、５Ｂ、５Ｄ）または対照Ｔ細胞（図５Ｃ）に対する活性は、無視できる程度であった。
【０２０１】
図６は、ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞は、共培養実験において、ＣＤ１３８＋腫瘍細胞を消失させることを実証する。ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞の、ＣＤ１３８＋腫瘍細胞を消失させる、長期にわたる能力を評価するために、ＣＡＲ＋Ｔ細胞または対照Ｔ細胞を、外因性サイトカインの非存在下においてＣＤ１３８＋腫瘍細胞またはＣＤ１３８−腫瘍細胞と共に共培養し（図６Ａ）、５〜７日後に、ＦＡＣＳ解析によって、残留腫瘍細胞を数え上げた。ＣＡＲ＋Ｔ細胞の存在下では、ＣＤ１３８＋腫瘍は完全に消失したが、対照Ｔ細胞を伴う培養物中では、腫瘍細胞は過剰成長した。
【０２０２】
ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞は、腫瘍細胞に応答したＴｈ１プロファイルを示す（図７）。ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイルを評価するため、ＣＡＲ＋Ｔ細胞または対照Ｔ細胞を、ＣＤ１３８＋腫瘍細胞またはＣＤ１３８−腫瘍細胞と共に共培養した。２４時間後に培養物上清を回収し、特定のＴｈ１およびＴｈ１サイトカインの存在について解析した。
【０２０３】
ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞は、推定がん幹細胞を標的化する（図８）。アプローチはまた、推定がん幹細胞も標的化することを確認するため、ＲＰＭＩ−８２６６腫瘍細胞内に含有されるＳＰ細胞によるＣＤ１３８の発現を研究し、その後、このサブセットもまた、ＣＡＲ＋Ｔ細胞によって効果的に消失させうるのかどうかを、モニタリングした。対照Ｔ細胞を伴う共培養では、ＲＰＭＩ−８２６６細胞がなおも存在しただけでなく、平均６％のＳＰ細胞もやはり存在した（図８Ａ、８Ｂ）。これに対し、ＣＡＲ＋Ｔ細胞を伴う培養物中では、ＲＰＭＩ細胞は有意に低減され 、ＳＰ細胞は検出されなかった（図８Ａ、８Ｂ）。この能力をさらに確認するため、ＳＰ細胞を、ＲＰＭＩ細胞株から直接分取し、対照Ｔ細胞またはＣＡＲ＋Ｔ細胞と共に培養した（図８Ｃ）。分取されたＳＰ細胞が完全に消失したのは、形質導入されたＴ細胞の存在下に限られた。
【０２０４】
図９は、ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞は、初代骨髄腫細胞を標的化することを示す。健常ドナーから生成されたＣＡＲ＋Ｔ細胞は、対照Ｔ細胞とは対照的に、ＭＭ患者に由来する、ＣＤ１３８で選択された腫瘍細胞を消失させる（＜８０％の低減）ことに成功した（図９Ａ）。図９Ｂでは、同様に、自己ＣＡＲ＋Ｔ細胞も、初代ＭＭ細胞を、対照Ｔ細胞と比較して消失させ、これらの実験におけるサイトカインプロファイルは、Ｔｈ１プロファイルと符合した（図９Ｃ）。
【０２０５】
図１０は、ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性を有することを実証する。ＮＳＧマウスに、４×１０６個の、ホタルルシフェラーゼで標識されたＯＰＭ−２細胞の静脈内投与を行った後で、ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞（１×１０７個）の注入を伴う、３回にわたるｉ．ｖ．注入を行った。２３日目から、生物発光イメージング（ＢＬＩ）を実施して、腫瘍成長をモニタリングした。図１０Ａは、ＢＬＩによって決定され、対照Ｔ細胞またはＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞で処置されたマウスを比較する、マウス１匹当たりの平均光子／秒／ｃｍ２／ステラジアンを示す。３回の独立の実験のまとめ。図１０Ｂは、ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞または対照Ｔ細胞で処置されたマウスのカプラン−マイヤー生存曲線（ｐ＜０．０１）を示す。
【０２０６】
図１１では、低酸素状態誘導性ＣＡＲ．ＣＤ１３８（ＨＲＥ．ＣＡＲ．ＣＤ１３８）の生成および機能がある。図１１Ａは、レトロウイルスベクター内でコードされるＨＲＥ．ＣＡＲ．ＣＤ１３８の概略表示を提示する。対照Ｔ細胞、構成的ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞、またはＨＲＥ．ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞を、正常酸素状態下または低酸素状態下のＣＤ１３８＋標的と共に共培養した（図１１Ｂ）。培養の４日後、細胞を回収し、ＣＤ３およびＣＤ１３８で染色して、腫瘍細胞の成長を評価した。また、Ｔ細胞上のＣＡＲの発現も評価した。ＨＲＥ．ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞は、低酸素状態下の腫瘍細胞を消失させた。（図１１Ｃ）対照Ｔ細胞、構成的ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞、またはＨＲＥ．ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞を標識し、正常酸素状態下または低酸素状態下のＣＤ１３８＋標的と共に共培養した。培養の４日後、細胞を回収し、ＣＤ３で染色し、フローサイトメトリーによって、ＣＳＦＥの希釈率を測定した。ＨＲＥ．ＣＡＲ．ＣＤ１３８＋Ｔ細胞は、低酸素状態下で増殖した。
【０２０７】
本発明およびその利点を詳細に説明したが、添付されている本発明の請求の範囲の趣旨および範囲から逸脱せずに、様々な変更、置換、および改変をここに加えることができると理解するべきである。さらに、本出願の範囲は、本明細中に記載されたプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、およびステップの特定の実施形態に限定されるものではない。当業者ならば、本発明の開示内容から容易に理解するように、本明細書に記載の対応する実施形態と実質的に同じ機能を果たすか、そのような実施形態と実質的に同じ結果をもたらす、現存する、または後に開発されるプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、またはステップも、本発明に従って使用できる。したがって、添付されている請求の範囲には、そのようなプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、またはステップも包含されるものとする。
【図１Ａ】
2019010117.tif 000002
【図１Ｂ】
2019010117.tif 000003
【図１Ｃ】
2019010117.tif 000004
【図１Ｄ】
2019010117.tif 000005
【図１Ｅ】
2019010117.tif 000006
【図１Ｆ】
2019010117.tif 000007
【図２Ａ】
2019010117.tif 000008
【図２Ｂ】
2019010117.tif 000009
【図３Ａ】
2019010117.tif 000010
【図３Ｂ】
2019010117.tif 000011
【図３Ｃ】
2019010117.tif 000012
【図４】
2019010117.tif 000013
【図５】
2019010117.tif 000014
【図６】
2019010117.tif 000015
【図７】
2019010117.tif 000016
【図８】
2019010117.tif 000017
【図９】
2019010117.tif 000018
【図１０】
2019010117.tif 000019
【図１１】
2019010117.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月15日(2018.10.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。