(57)【要約】      （修正有）【課題】ウナギの濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を特異的に認識する抗体及びウナギのＦＳＨを特異的に探知する方法の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を含むウナギの濾胞刺激ホルモンのペプチドマーカを抗原として使用して製造され、ウナギのＦＳＨと特異的に結合する抗体、該抗体を含む生物学的試料内のウナギのＦＳＨの特異的探知用組成物及び探知方法、並びに特定のアミノ酸配列からなるペプチド又は該配列をコードするポリヌクレオチドを含むウナギのＦＳＨ探知用マーカ。【選択図】図６
2019099548.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上を含むウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の濾胞刺激ホルモン（ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ＦＳＨ）のペプチドマーカを抗原として使用して製造され、ウナギのＦＳＨと特異的に結合する抗体。
【請求項２】
前記抗体は、ウナギの甲状腺刺激ホルモン（Ｔｈｙｒｏｉｄ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ；ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ｌｕｔｒｏｐｉｎ；ＬＨ）、および性腺刺激ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ、ＧＴＨ）には結合せず、ウナギのＦＳＨに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体は、ポリクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗原は、キャリア蛋白質を追加的に含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
前記キャリア蛋白質は、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）、ＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）、Ｔｇ（ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、ＴＴ（ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｏｉｄ）、ジフテリアトキソイド（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｏｉｄ；Ｔｄ）、およびＰＰＤ（ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）からなる群より選択された１種以上である、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項の抗体を含む、生物学的試料内のウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の濾胞刺激ホルモン（ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ＦＳＨ）の特異的探知用組成物。
【請求項７】
前記生物学的試料は、ウナギＴＳＨ、ＬＨおよびＧＴＨからなる群より選択された１種以上をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１から５のいずれか一項の抗体を生物学的試料と接触させる工程、および前記試料内で抗原−抗体複合体の形成有無を探知する工程を含む、
生物学的試料内ウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の濾胞刺激ホルモン（ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ＦＳＨ）を特異的に探知する方法。
【請求項９】
前記抗原−抗体複合体の形成有無を探知する工程は、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、放射能免疫分析法（ＲＩＡ）、免疫蛍光法（ＩＦＡ）、ウェスタンブロッティング（ＷＢ）およびフローサイトメトリー分析法（ＦＣＡ）のうちの少なくとも一つの方法によって行う、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上のペプチド、または
配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列および配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択された１種以上のポリヌクレオチドを含む、
ウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の濾胞刺激ホルモン（ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ＦＳＨ）探知用マーカ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウナギの濾胞刺激ホルモンを特異的に認識する抗体およびこれを用いたウナギの濾胞刺激ホルモンを特異的に検出する方法、並びに検出用キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
魚類の養殖において、魚類種苗（ｆｉｓｈ  ｓｅｅｄｉｎｇ）の安定的な生産、供給と純血種ｂｌｏｏｄｓｔｏｃｋ）の性成熟調節と評価は重要である。ウナギを含む一部魚種は不適切な養殖環境では性成熟（ｇｏｎａｄａｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）、排卵（ｏｖｕｌａｔｉｏｎ）、精子遊離（ｓｐｅｒｍｉａｔｉｏｎ）などが発生しないので、養殖魚類の生殖活性を人工的に調節するためには光周期（ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ）、水温（ｗａｔｅｒ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）、ホルモン処理（ｈｏｒｍｏｎｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）のような環境要素を複合的でありながらも細心に調節する必要がある。
【０００３】
ウナギ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｅｌ）は、脊索動物門、硬骨魚類綱、ウナギ目、ウナギ科に属し、海と淡水習性を有する複雑な生活史を有する降河性魚類（ｃａｔａｄｒｏｍｏｕｓ  ｆｉｓｈ）である。ウナギは稚魚の時、海から河に移動し、移動する間に黄色（ｙｅｌｌｏｗ）から銀色（ｓｉｌｖｅｒ）ウナギへと形態的、生理的な変化を経て、河で６〜２０年間成長し、成長が終わったウナギは性成熟過程を経た後、海に再び移住し、移住する間に配偶子形成（ｇａｍｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）を完全になす。ウナギは極東産ウナギ、ニホンウナギ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｅｌ、Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）とも呼ばれ、日本と中国に広く生息している。ウナギは北方限界線として北海道、渤海湾沿岸（ｔｈｅ  ｇｕｌｆ  ｏｆ  Ｐｏｈａｉ）と遼河（Ｌｉａｏ  ｒｉｖｅｒ）まで分布生息しており、南方限界線として中国の海南島（Ｈａｉｎａｎ  ｉｓｌａｎｄ）と中国とベトナムの間にあるトンキン湾（ｔｈｅ  ｇｕｌｆ  ｏｆ  Ｔｏｎｋｉｎ）まで生息し、その他にも台湾、フィリピン、ヨーロッパなどに生息する。ウナギ成体は主に甲殻類、魚類、昆虫類を捕食し、回遊様相によって川ウナギ（ｒｉｖｅｒ  ｅｅｌｓ）、河口ウナギ（ｅｓｔｕａｒｉｎｅ  ｅｅｌｓ）、海ウナギ（ｓｅａ  ｅｅｌｓ）に大きく３部類に分けられる。
【０００４】
ウナギを人工飼育する場合、性的に未熟な状態で産卵を行う場合が多い。未だに自然系の未成熟なウナギの産卵行動が十分に研究されておらず、繁殖生理学分野でウナギの繁殖産卵行動に関しては知られていることが多くない。現在までの研究結果によれば、自然状態の雌ウナギは１０月〜１２月に性成熟を始めるが、卵母細胞は卵黄形成初期までのみなされ、雄の場合は精子形成が開始されないまま河下流に移動して産卵場所に移住すると推測され、未成熟状態の養殖ウナギを海水養殖する場合、天然雌ウナギのような卵黄形成初期に至ると知られている（Ｋａｇａｗａ  Ｈ．，  Ｉｉｎｕｍａ  Ｎ．，  Ｔａｎａｋａ  Ｈ．，  Ｏｈｔａ  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｏｋｕｚａｗａ  Ｋ．，１９９８．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｒｅａｒｉｎｇ  ｐｅｒｉｏｄ  ｉｎ  ｓｅａｗａｔｅｒ  ｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆｅｍａｌｅ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｅｌ  Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ．  Ｆｉｓｈ  Ｓｃｉ．，  ６４  ７７−８２．）
【０００５】
従来はウナギ飼育において天然または養殖雌ウナギの性成熟を進行させることが非常に難しかった。最近になってサケ脳下垂体抽出物（ｓａｌｍｏｎ  ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ｅｘｔｒａｃｔ、ＳＰＥ）で性成熟誘導を成功した事例が報告されたことがあるが、まだその成功頻度が低く、サケ脳下垂体抽出物、組換え蛋白質などを反復投与する場合、他の性成熟誘導ホルモンとの拮抗作用（ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ）、上昇作用（ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ）または速い活性喪失などによって卵母細胞と排卵された卵子内の染色体異常を誘発することがあり、卵質に影響を与えて受精率（ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ）が低くなり、奇形魚発生率が高くなる危険がある。また、サケ脳下垂体抽出物と組換え蛋白質の需給が難しいため、人工養殖場でウナギ種苗生産が依然として難しいという問題点がある。
【０００６】
一方、現在まで人工種苗養殖においてホルモンの反復投与または環境調節などで行われる性成熟度を判定する基準は大部分肉眼に依存してきたところ、人ごとに差があるため正確度が非常に落ちた。したがって、ウナギの性成熟程度に直接的な影響を与える各ホルモンのマーカ（ｍａｒｋｅｒ）または基準因子（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｆａｃｔｏｒ）開発が要求されている。
【０００７】
一般的な脊椎動物の性成熟度を判断できる糖蛋白質ホルモン（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ；ＧＰＨ）には甲状腺刺激ホルモン（Ｔｈｙｒｏｉｄ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ；ＴＳＨ）、濾胞刺激ホルモン（Ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ｆｏｌｌｉｔｒｏｐｉｎ；ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ｌｕｔｒｏｐｉｎ；ＬＨ）、性腺刺激ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ、ＧＴＨ）、絨毛性性腺刺激ホルモン（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ、ＣＧ）などがある。前記ホルモンは共通的に二つの互いに異なるサブユニット（ｓｕｂｕｎｉｔ）アルファ（−α）とベータ（−β）から構成され、同一種（ｓｐｅｃｉｅｓ）は同一のアルファサブユニットアミノ酸配列を有しているが、ベータサブユニットは各種別およびホルモン別に特異的なアミノ酸配列を有している。よって、ベータサブユニットは各ホルモンの特異的な活性および種特異性（ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を示す。したがって、全ての脊椎動物の各種（ｓｐｅｃｉｅｓ）において互いに異なる性ホルモンのベータサブユニットをコードするために少なくとも３つの遺伝子（ＦＳＨβ、ＬＨβ、ＴＳＨβ）が存在する。アルファとベータサブユニットは互いに異なる遺伝子によって蛋白質で形成され、生物学的活性を有するホルモン分子を形成するために前記アルファサブユニットとベータサブユニットは非共有結合（ｎｏｎ−ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｂｏｎｄｉｎｇ）によって連結される。
【０００８】
従って、本発明は前記問題点を解決し、ウナギの性成熟程度を正確に測定するために、性成熟度に直接的な影響を与える濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）特異的なペプチドマーカ（ｍａｒｋｅｒ）、およびこれに結合するポリクローナル抗体を開発し、前記抗体はＦＳＨ−βと結合することによって他の性ホルモンと異なりＦＳＨにのみ特異的に結合して、ウナギ生物学的試料内のＦＳＨを探知可能であり、ウナギの性成熟度を測定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−１５３１１２８６号公報
【特許文献２】韓国登録特許第１０−１４９３９５７号公報
【特許文献３】韓国登録特許第１０−０７４２１１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は前述の従来技術の問題点を解決するために提案されたものであって、ウナギの性成熟の変化を探知するために、ウナギの濾胞刺激ホルモン（ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ＦＳＨ）を特異的に探知することができる抗体を提供する。
【００１１】
本発明の一例は、配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上を含むＦＳＨ探知用ペプチドマーカを抗原として使用して製造され、ウナギのＦＳＨと特異的に結合する抗体を提供する。
また、本発明は、前記抗体を含む、生物学的試料内ウナギＦＳＨホルモンの特異的探知用組成物を提供し、
【００１２】
また、本発明は、前記抗体を生物学的試料と接触させて、抗原−抗体複合体形成を探知する工程を含む、生物学的試料内ウナギＦＳＨホルモンを特異的に探知する方法を提供する。
【００１３】
また、本発明の一例は、配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上のペプチド、または配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列および配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択された１種以上のポリヌクレオチドを含む、ウナギのＦＳＨ探知用マーカを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、ウナギの類似ホルモンは除いてウナギの濾胞刺激ホルモン（ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ＦＳＨ）のみを特異的に認識、判別することができるマーカ抗原およびこれと結合する抗体に関するものであって、前記抗体を用いてウナギの性成熟度を測定することができ、ウナギ完全養殖の実現に役立つ。
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
【００１５】
本発明は、下記表１の配列番号１（ＤＳＶＹＫＳＳＬＫＳＹＰＱ、Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ）および配列番号２（ＣＧＰＬＮＴＥＶＳＧ、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上を含むウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）のＦＳＨ探知用ペプチドマーカを抗原として使用して製造され、ウナギのＦＳＨと特異的に結合する抗体を提供する。
【００１６】
【表１】
2019099548.tif 000003
2019099548.tif 000004
【００１７】
前記“ウナギＦＳＨ探知用ペプチドマーカ”とは、ウナギの他の性成熟ホルモン（ＬＨ、ＴＳＨ、ＣＧなど）および他魚種由来の性成熟ホルモンから、ウナギのＦＳＨのみを特異的に探知することができるマーカを意味する。
【００１８】
前記“ペプチドマーカを抗原として使用して製造され、ウナギのＦＳＨを特異的に認識する抗体”とは、甲状腺刺激ホルモン（Ｔｈｙｒｏｉｄ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ；ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ｌｕｔｒｏｐｉｎ；ＬＨ）、性腺刺激ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ、ＧＴＨ）には結合せず、ウナギのＦＳＨに特異的に結合する、抗体であってもよい。
【００１９】
本発明の一例によれば、前記ＦＳＨ探知用ペプチドマーカ抗原はキャリア蛋白質を追加的に含んでもよく、前記キャリア蛋白質はＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）、ＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）、Ｔｇ（ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、ＴＴ（ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｏｉｄ）、ジフテリアトキソイド（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｏｉｄ；Ｔｄ）、およびＰＰＤ（ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）などからなる群より選択された１種以上であってもよく、例えば配列番号１のアミノ酸配列からなるマーカのＮ−末端にシステイン（Ｃｙｓ）を導入し、システインの−ＳＨ官能基とＮ−（７−ジメチルアミノ−４−メチルクマリニル）マレイミドを結合させ、キャリア蛋白質を結合させて製作した架橋ペプチドを免疫感作（ｉｍｍｕｎｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ）に用いることも可能である。
【００２０】
本発明の前記“抗体”とは、当該分野で公知された用語であって抗原性部位に対して指示される特異的な蛋白質分子を意味する。本発明の目的上、抗体は本発明の配列番号１（ＤＳＶＹＫＳＳＬＫＳＹＰＱ、Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ）および配列番号２（ＣＧＰＬＮＴＥＶＳＧ、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上を含むウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）のＦＳＨ探知用ペプチドマーカに特異的に結合する抗体を意味し、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドマーカ（以下、第１マーカ）と配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドマーカ（以下、第２マーカ）の二つのマーカの両方に特異的に結合する抗体であってもよい。本発明の抗体の形態は特に制限されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体または抗原結合性を有するものであればそれの一部も本発明の抗体に含まれ、全ての免疫グロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、Ｉｇ）抗体が含まれる。さらに、本発明の抗体にはヒト化抗体などの特殊抗体も含まれる。前記免疫グロブリン抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのクラスの中の最も普遍的な抗体であり、大部分血液や体液の全体Ｉｇの７５％を占めるＩｇＧであるのが好ましい。また、本発明の抗体の由来は特に制限しないが、マウス、ラット、ウサギ、鶏、昆虫細胞などを用いることができ、製作の便宜、大量生産を考慮してウサギ由来ポリクローナル抗体であるのが好ましい。
【００２１】
また、本発明で、抗体は前記ＦＳＨ−βアミノ酸配列の一部の第１マーカまたは第２マーカまたはこの二つのマーカの両方に特異的に結合する抗体、抗原結合断片またはアプタマーであってもよい。好ましくは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、さらに好ましくは体液の中で複雑且つ微細なホルモンの変化を感作することができ、正確にＦＳＨのみを検出することができるポリクローナル抗体であるのが好ましい。
本発明の一例は前記抗体を含む、生物学的試料内ウナギＦＳＨホルモン特異的探知用組成物を提供する。
【００２２】
前記生物学的試料はＴＳＨ、ＬＨおよびＧＴＨからなる群より選択された１種以上を含むことができ、本発明の抗体を含む、生物学的試料内ウナギＦＳＨホルモン探知用組成物は、生物学的試料に含まれているＴＳＨ、ＬＨまたはＧＴＨとは結合せず、ＦＳＨに特異的に結合する。生物学的試料にＦＳＨが含まれていない場合、結合反応が起こらないことがある。
【００２３】
本発明の抗体の特徴は前述のとおりであり、前記抗体を含むＦＳＨホルモン探知用組成物の活用形態を特に限定しないが、キットの形態に実現されて提供されてもよい。
【００２４】
本発明のキットは、ＦＳＨホルモンを検出するためのものであって、抗体の免疫学的検出のために基質、適当な緩衝溶液、発色酵素または蛍光物質で標識された２次抗体、発色基質などを含んでもよい。前記基質はニトロセルロース膜、ポリビニル樹脂で合成された９６ウェルプレート、ポリスチレン樹脂で合成された９６ウェルプレートおよびガラスからなるスライドガラスなどが用いられてもよく、発色酵素はペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）が用いられてもよく、蛍光物質はＦＩＴＣ、ＲＩＴＣなどが用いられてもよく、発色基質液はＡＢＴＳ（２，２'−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））またはＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン）、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）が用いられてもよい。
【００２５】
本発明の一例は、前記抗体を生物学的試料と接触させ、前記試料内で抗原−抗体複合体の形成有無を探知する工程を含む、生物学的試料内ウナギＦＳＨホルモンを特異的に探知する方法を提供する。
【００２６】
前記生物学的試料の特徴は前述のとおりであり、前記抗原−抗体複合体の形成は酵素免疫吸着法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）、例えば、直接ＥＬＩＳＡ（Ｄｉｒｅｃｔ  ＥＬＩＳＡ）、間接ＥＬＩＳＡ（ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ＥＬＩＳＡ）、競合ＥＬＩＳＡ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＥＬＩＳＡ）、サンドウィッチＥＬＩＳＡ（ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ）、放射能免疫分析法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）、免疫蛍光法（Ｉｍｍｕｎｏ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｅｓｔ、ＩＦＡ）、ウェスタンブロッティングおよびフローサイトメトリー分析法のうちの少なくとも一つ以上の方法で検出することができ、検出方法をこれに制限するのではない。前記分析方法を通じて、ＦＳＨホルモン蛋白質とこれに対する抗体の間の“抗原−抗体複合体”形成有無を判断して、試料内ＦＳＨの存在有無と含量を測定することができる。
【００２７】
本願で“抗原−抗体複合体”とはＦＳＨ蛋白質とこれに特異的な抗体の結合物を意味し、抗原−抗体複合体の形成有無は検出ラベル（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｌａｂｅｌ）のシグナルを通じて測定可能である。このような検出ラベルは酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微小粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、レドックス（ｒｅｄｏｘ）分子および放射線同位元素からなる群より選択することができ、必ずしもこれに制限されるのではない。
【００２８】
一具体例として、ＦＳＨ蛋白質とこれに対する抗体の間の抗原−抗体複合体測定は、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ法）を用いることができる。また、ＦＳＨ蛋白質に対する一つ以上の抗体が基板上の定められた位置に配列され、高密度で固定化されている蛋白質チップを用いることもできる。
【００２９】
また、本発明は前記抗体を生物学的試料と接触させ、前記試料内で抗原−抗体複合体の形成有無を探知してウナギの性成熟度を測定する工程を含む、ウナギの性成熟度測定方法を提供する。
【００３０】
現在までウナギの性ホルモンを高い正確度で探知する抗体が開発されていなくてウナギの性成熟機序、ホルモンの作用機序が十分に明らかになっておらず、明確なウナギの性成熟度測定方法が開発されていない状態である。本願発明はウナギの複雑な性ホルモンの生理変化を性ホルモン中のＦＳＨを高い正確度で探知して予測可能であり、ウナギの生理変化を明らかにすることができる端緒を提供し、ウナギの性成熟度を簡単に高い効率で測定できる方法を提供することができる。
【００３１】
ウナギの成体の性成熟度を判断する既存の方法の一つとして、成体ウナギの血液を採血して血清を分離した後、テストステロンが存在すれば雄、エストロゲン２が存在すれば雌と判断する方法があるが、この方法ではウナギの雄雌区分のみ可能であり、ウナギが性成熟度のどの位置にあるかまでは明確に判断しにくい。
【００３２】
また他の方法として、ウナギ稚魚を飼育して４〜６週後にウナギの急激な体重増加が起こるかどうかによってウナギの性成熟度を確認する方法があるが、これは正確度が非常に落ちる方法であり、雌の卵母細胞を一部摘出して１次減数分裂によって卵核胞の核膜消失を確認するか、生殖腺重量指数を測定する方法があるが、これは測定方法が複雑であり、費用と時間が多くかかるという短所がある。
【００３３】
本願発明の前記抗体を用いて生物学的試料内の抗原−抗体複合体の形成有無を探知してウナギの性成熟度を測定する方法は、ウナギの既存の方法より遥かに簡単であり、検体内ＦＳＨの存在を特異的に探知し、定量的に分析可能であって、より正確にウナギの性ホルモン生理変化、それによる性成熟程度を判断可能である。
【００３４】
本発明の一例は、配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上のペプチド、または配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列および配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択された１種以上のポリヌクレオチドを含む、ウナギのＦＳＨ探知用マーカを提供する。
【００３５】
前記配列番号１のアミノ酸から構成されたペプチドマーカ（以下、第１マーカ）または配列番号２のアミノ酸から構成されたペプチドマーカ（以下、第２マーカ）はＦＳＨ−βサブユニット（配列番号７）の一部であり、下記の実施例１で確認したように、前記二つのマーカはＦＳＨの遺伝子配列とウナギの他のホルモン（ＬＨ、ＴＳＨなど）との類似性を考慮してＦＳＨベータで膜蛋白質（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）サイトがないのを確認し、シグナルペプチド部位除外、Ｎ−グリコシル化（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）修飾位置を除外、疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）部分を除いて親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）部分を選択すると同時に、ウナギの性成熟ホルモン配列の相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を比較して最も有力な候補ペプチドを選抜したものである。本発明のペプチドマーカ抗原は、第１マーカおよび第２マーカからなる群より選択された１種以上を含んでもよいが、好ましくは第１マーカおよび第２マーカを全て含むことが適切である。
【００３６】
現在、ウナギの性成熟ホルモンを免疫学的に分析するための努力が諸所で起こっており、ウナギ体内の病原菌による内分泌系変化、一般的生理状態のウナギ血液内に含まれている性成熟ホルモンの濃度を測定するためのシステムを構築する試みが起こっている。以前に知られたＪｅＦＳＨ−β／ＪｅＦＳＨ−α単一鎖ポリペプチド抗原に対するモノクローナル抗体およびＪｅＦＳＨ−β／ｍＧＴＨ−α（ｍｏｕｓｅ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｃ  ｈｏｒｍｏｎｅ  α）キメラ抗原に対するポリクローナル抗体は、ＪｅＦＳＨだけでなくその他の性成熟ホルモン（ＪｅＬＨ、ＪｅＴＳＨ、ＧＴＨなど）とも抗原−抗体結合反応を起こすためＦＳＨのみを特異的に検出するための抗体として使用するには不適切であった。
【００３７】
これとは異なり、本発明の第１マーカおよび第２マーカからなる群より選択された１種以上を含むペプチドマーカはＪｅＦＳＨのみを特異的に検出することができ、前記ペプチドマーカを抗原として使用して製造された抗体は他のウナギ性成熟ホルモンとは結合せず、ただＪｅＦＳＨのみに特異的に抗原−抗体反応が起こるので、ＪｅＦＳＨ特異検出抗体として使用するのに適切である。
【００３８】
また、本発明は、前記ウナギのＪｅＦＳＨ探知用ペプチドマーカ（第１マーカ、第２マーカ）および／または前記マーカをコードするポリヌクレオチドを検出できる製剤を含むＪｅＦＳＨ検出用組成物およびキットを提供し、ウナギの性成熟度を判断するために、ウナギの生物学的試料から第１マーカおよび／または第２マーカ、または前記マーカをコードするポリヌクレオチドまたはＪｅＦＳＨ蛋白質を検出する方法を提供する。
【００３９】
また、本発明は、前記配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列および配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択された１種以上のポリヌクレオチドを含む、ウナギのＦＳＨ探知用マーカを提供することができ、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列および配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を全て含むＦＳＨ探知用マーカを提供することができる。
【００４０】
前記“ポリヌクレオチドを検出できる製剤”は、生物学的試料内でＦＳＨをコードするポリヌクレオチドを検出するために用いることができる物質を意味する。具体的な一例として、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１マーカまたは配列番号２のアミノ酸配列を有する第２マーカをコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）、プローブ（ｐｒｏｂｅ）、アンチセンス核酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｓ）などであってもよい。
【００４１】
この時、相補的に結合するということは、所定の混成化またはアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）条件、好ましくは生理学的条件下でアンチセンス核酸がターゲットに選択的に混成化できる程度に十分に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）および完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）なことを全て含む意味を有し、好ましくは完全に相補的なことを意味する。
【００４２】
本発明で“蛋白質を検出できる製剤”は、試料内でＦＳＨ蛋白質を検出するために用いることができる物質を意味する。好ましく、前記ＦＳＨ蛋白質をターゲット（ｔａｒｇｅｔ）とする特定化合物または合成物質であってもよい。具体的な一例として、前記ＦＳＨ−βアミノ酸配列の一部の第１マーカまたは第２マーカまたはこの二つのマーカの両方に特異的な抗体、抗原結合断片またはアプタマーであってもよい。好ましくはモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、さらに好ましくは体液の中で複雑且つ微細なホルモンの変化を感作することができ、正確にＦＳＨのみを検出することができるポリクローナル抗体であってもよい。
【発明の効果】
【００４３】
本発明は、ウナギの濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）に特異的に結合する抗体を生物学的試料と接触させ、抗原−抗体複合体が形成されるかを探知して、当該試料内にウナギ濾胞刺激ホルモンの存在有無を容易に検出することができ、複合体形成程度によってウナギ濾胞刺激ホルモンを定量的に分析可能であり、ウナギの性成熟程度を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】実施例１−１によって、ウナギＦＳＨ−βサブユニットのトランスメンブレン領域を分析した結果である。
【図２】実施例１−１によって、ウナギＦＳＨ−βサブユニットの信号配列（ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ、成熟蛋白質後に脱落する部分）部分分析結果を示したものである。
【図３】実施例１−１によって、ウナギＦＳＨ−βサブユニットの糖鎖修飾（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）部分分析結果を示したものである。
【図４】実施例１−１によって、ウナギＦＳＨ−βサブユニットの疎水性分析（ｈｙｄｒｏｐｈｔｈｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）後、一番目に予測された親水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）配列部分を示したものである。
【図５】実施例１−１によって、ウナギＪｅＦＳＨ−βサブユニットの疎水性分析（ｈｙｄｒｏｐｈｔｈｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）後、二番目に予測された親水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）配列部分を示したものである。
【図６】実施例１−２によって、ウナギＪｅＦＳＨ、ＪｅＬＨ、ＪｅＴＳＨ−βサブユニットのアミノ酸配列の相同性を比較したものであって、黒い部分は三種類のホルモンの全てに共通的に存在する配列であり、灰色部分は三種類のホルモンのうちの二種類のホルモンに共通的に存在する配列であり、赤いボックスで表示した部分はウナギＪｅＦＳＨ−βアミノ酸配列の中の抗体を生産するために使用した部分を表示したものである。
【図７】比較例１によって、Ｅ．ｃｏｌｉシステムで生産した遺伝子組換えＪｅＦＳＨ抗原をＳＤＳ電気泳動で確認した結果を示す。
【図８】比較例２によって、ウナギＪｅＦＳＨ−βサブユニットのアミノ酸配列とマウスのＧＴＨ−αアミノ酸配列が連結されたキメラＪｅＦＳＨ抗原をＳＤＳ電気泳動で確認したものである。
【図９】三つのタイプ（Ａ）実施例２のウナギＪｅＦＳＨ−βサブユニットに対するポリクローナル抗体、（Ｂ）比較例１のウナギＪｅＦＳＨ−βサブユニットに対するモノクローナル抗体、（Ｃ）比較例２のウナギＪｅＦＳＨ−βサブユニットとマウスのＧＴＨ−αサブユニットのキメラポリクローナル抗体）の抗体生産の全過程の模式図を示す。
【図１０】実施例２によって、ＪｅＦＳＨ−βのＮ−末端から５６−６８番目の１４個のアミノ酸から構成されたペプチド抗原（配列番号１）およびウナギのＪｅＦＳＨ−βのＮ−末端から１１４−１２３番目の１０個のアミノ酸から構成されたペプチド抗原（配列番号２）の混合物をウサギに免疫した後に血液を採取して抗体価をＥＬＩＳＡを用いて分析したものであって、二回反復した結果を示す。
【図１１】比較例１によって、ＪｅＦＳＨ単一鎖抗原（配列番号３）をマウスに免疫した後に血液を採取して抗体価をＥＬＩＳＡを用いて分析したものであって、二回反復実験の結果を示したものである。
【図１２】比較例２によって、ウナギＪｅＦＳＨ−βサブユニットとマウスのＧＴＨ−αサブユニットを組換えしたキメラＦＳＨ抗原をウサギに免疫した後に血液を採取して抗体価をＥＬＩＳＡを用いて分析したものであって、二回反復実験の結果を示したものである。
【図１３】実施例２によって、ＦＳＨ−βのＮ−末端から５６−６８番目の１４個のアミノ酸から構成されたペプチド抗原（配列番号１）およびウナギのＪｅＦＳＨ−βのＮ−末端から１１４−１２３番目の１０個のアミノ酸から構成されたペプチド抗原（配列番号２）混合物をウサギに免疫化して得られたポリクローナル抗体の中のＩｇＧを精製した後、ＳＤＳ電気泳動した結果を示す。
【図１４】実験例１−１によって、蚕蛹から生産したＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβ、ＪｅＧＴＨαを対象にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥしてＣＢＢ染色した結果である。
【図１５】実験例１−２によって、蚕蛹から生産したＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβ、ＪｅＧＴＨαを対象にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ニトロセルロースメンブレンに移して、Ｈｉｓ抗体でウェスタンブロッティングした結果である。
【図１６】実験例１−３によって、蚕蛹から生産したＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβ、ＪｅＧＴＨαを対象にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ニトロセルロースメンブレンに移した後、比較例１で製造したＪｅＦＳＨ単一鎖抗原に対するモノクローナル抗体でウェスタンブロッティングした結果である。
【図１７】実験例１−４によって、蚕蛹から生産したＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβ、ＪｅＧＴＨαを対象にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ニトロセルロースメンブレンに移した後に比較例２で製造したＪｅＦＳＨ−βサブユニットとマウスのＧＴＨ−αサブユニットのキメラ抗原に対するポリクローナル抗体でウェスタンブロッティングした結果である。
【図１８】実験例１−５によって、蚕蛹から生産したＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβ、ＪｅＧＴＨαを対象にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ニトロセルロースメンブレンに移した後に実施例２で製造したウナギＦＳＨ−βペプチドに対するポリクローナル抗体でウェスタンブロッティングした結果である。
【図１９】実験例２によって、蚕蛹から生産したＪｅＦＳＨ、ＪｅＧＴＨαを対象にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥしてニトロセルロースメンブレンに移した後、１：５，０００、１：１０，０００、１：２０，０００の比率で希釈した実施例２で製造したウナギＦＳＨ−βペプチドに対するポリクローナル抗体でウェスタンブロッティングした結果である。
【図２０】実験例３によって、蚕蛹から生産したＪｅＦＳＨ、ＪｅＬＨ、ＪｅＴＳＨ１．６μｇ混合後、ＪｅＦＳＨの含量を１．４、１．２、１．０、０．８、０．４、０．２、０μｇの順に減少させ他のホルモンは同量で混合した試料を対象にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ニトロセルロースメンブレンに移して、ウナギＪｅＦＳＨ−βペプチドに対するポリクローナル抗体でウェスタンブロッティングした結果である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
以下、実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。しかし、これら実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれら実施例によって限定されるのではない。
【実施例】
【００４６】
実施例１：ウナギのＦＳＨに特異的なマーカ選定
１−１：ＦＳＨ−βサブユニットの分析
ウナギＦＳＨ−βサブユニットの構造確認のために、トランスメンブレンおよび信号配列を検索し、蛋白質の親水性と疎水性をコンピュータプログラムを用いて分析した。具体的に、ウナギＦＳＨ−βサブユニット（配列番号７）においてトランスメンブレン（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ、ＴＭ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）領域、分泌信号配列（Ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＳＰ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）、糖鎖修飾（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ／）と疎水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ、ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ／）、親水性（ｈｙｄｏｐｈｉｌｉｃ  ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ／）部位を分析し、分析結果を図１乃至図４に示した。トランスメンブレン領域は図１に示し、分泌信号配列は図２に、糖鎖修飾部分を図３に、疎水性および親水性部分分析結果は図４に示した。
【００４７】
図１乃至図４から分かるように、ウナギＦＳＨ−βサブユニットの構造においてトランスメンブレン（ＴＭ）領域は存在せず（図１）、βサブユニットのＮ−末端領域の２１個のアミノ酸配列（ＭＨＬＡＶＴＡＬＣＬＴＬＡＰＶＬＡＲＡＳＴ−配列番号８）が分泌信号配列として存在するのを確認し（図２）、Ｎ−末端から２７番目および４４番目アミノ酸のＮ（Ｎ−Ｘ−Ｔ、アスパラギン酸（Ｎ）−任意のアミノ酸（Ｘ）−セリンまたはトレオニン（Ｔ）配列においてＮの位置）部分がＮ−糖鎖修飾されており（図３）、５１番目〜８０番目まで総３０個のアミノ酸配列（ＬＣＦＴＱＤＳＶＹＫ  ＳＳＬＫＳＹＰＱＱＡ  ＣＮＦＲＤＶＶＹＥＴ−配列番号９）が親水性の高い部分であり（図４）、１０１〜１２７番目まで総２７個のアミノ酸配列（ＳＣＥＣＳＫＣＤＴＤ  ＳＴＤＣＧＰＬＮＴＥ  ＶＳＧＣＬＴＨ−配列番号１０）領域が疎水性の高い部分（図５）であるのを確認した。
【００４８】
１−２：ＦＳＨ−βサブユニットをＬＨおよびＴＳＨのβサブユニットと比較分析
ウナギ脳下垂体糖蛋白質ホルモンのＦＳＨ−βサブユニット、ＬＨ−βサブユニット、およびＴＳＨ−βサブユニットのアミノ酸配列の相同性をｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ−ｂｉｎ／ｃｌｕｓｔａｌｗで多重配列アラインメント（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ、ＭＳＡ）方法を用いて比較分析した。
【００４９】
ＦＳＨとＬＨのホモロジースコア（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｓｃｏｒｅ）は３９、ＦＳＨとＴＳＨは２９と示され、具体的な三種類の糖蛋白質ホルモンのβサブユニット配列の相同性分析結果を図６に示した。図６において黒い色で表示した部分は三種類のホルモン全部に共通的に存在する配列を示し、灰色部分は三種類のホルモンのうちの二種類のホルモンに共通的に存在する配列であり、赤いボックスで表示した部分はウナギＦＳＨベータサブユニットの配列のうちのＦＳＨのみに存在するアミノ酸配列領域であって、本発明のポリクローナル抗体を生産するために用いたポリペプチド部分を表示したものである。
【００５０】
１−３：ＦＳＨ抗体製造用抗原ポリペプチドの選定
前記実施例１−１から得られた分泌信号配列、Ｎ−糖鎖修飾配列および疎水性領域に関する情報と、前記実施例１−２によってＬＨおよびＴＳＨのβサブユニットのアミノ酸配列相同性分析結果から、アミノ酸配列相同性の低い配列を総合して、最終的にＦＳＨ−βサブユニットのＮ末端から５６−６８番目のアミノ酸配列部分（ＤＳＶＹＫＳＳＬＫＳＹＰＱ−配列番号１）と１１４−１２３番目アミノ酸配列部分（ＣＧＰＬＮＴＥＶＳＧ−配列番号２）をＦＳＨポリクローナル抗体製造用マーカペプチドに選定した。
【００５１】
実施例２：マーカペプチドを用いたポリクローナル抗体製作
前記実施例１で選抜した配列番号１のアミノ酸から構成されたペプチドマーカ（以下、第１マーカ）および配列番号２のアミノ酸から構成されたペプチドマーカ（以下、第２マーカ）を混合しウサギに免疫化してウサギポリクローナル抗体を製造した。
【００５２】
より具体的に、前記第１マーカおよび第２マーカを混合してウサギの腹腔内に総３回注射してポリクローナル抗体を製造した。まず、２００μｇの精製されたマーカ抗原混合物に２μＬの１０％ＳＤＳを添加した後に２分間加熱し、２００μＬのコンプリートアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ´ｓ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｕｖａｎｔ、Ｓｉｇｍａ）を添加して超音波処理した。その後、ウサギの腹腔に１次に抗原を注入してから４−５週経過後に採血し、２次の抗原注入を実施した。これから２週経過後に採血し、３次の抗原を注入し、抗原をウサギに３次ブースティング（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）し、９週後に血液を採取した後、血液とＴＢＳＴバッファーを１：１００、１：１，０００、１：５，０００、１：１０，０００、１：５０，０００、１：１００，０００の比率で混合したウナギＦＳＨ探知用組成物を処理して１時間室温で反応させた。その後、ＴＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ基質を用いて４５０ｎｍ波長で（Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ  ｖｉｃｔｏｒ  Ｘ３）で測定して直接ＥＬＩＳＡ（ｄｉｒｅｃｔ  ＥＬＩＳＡ）分析を行った（図１０）。
【００５３】
ＥＬＩＳＡ分析結果、血液とＴＢＳＴバッファーを１：５０，０００の比率で混合したウナギＦＳＨ探知用組成物を処理した時にＯＤ値が１．０と測定され、以後免疫反応活性が高いことを確認した。二匹のウサギに免疫したサンプルは全て同一な傾向を示した。
【００５４】
追加的に、前記で生産したＦＳＨ−βサブユニットを特異的に認識するポリクローナル抗体の中のＩｇＧを精製した後にＳＤＳ電気泳動し、その結果を図１３に示した。図１３の１−３番レーンは前記精製したポリクローナル抗体をそれぞれ０．５、１、２μｇローディングしたものであり、４、５番レーンは濃度確認のためにＢＧＧ（ｂｏｖｉｎ  ｇａｍｍａ  ｇｌｏｂｕｌｉｎ）１、２μｇをそれぞれローディングしたものであり、６番は蛋白質サイズマーカである。矢印で提示した部分が本発明抗体の重鎖（Ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）を示す。
【００５５】
比較例１：ＪｅＦＳＨ単一鎖抗原を用いたマウスモノクローナル抗体生産
韓国登録特許１０−１５３１２８６号公報に開示された方法と実質的に同様な方法を用いてウナギＦＳＨのαサブユニットとβサブユニットを融合したＪｅＦＳＨ単一鎖抗原（配列番号３）を製造した後、前記抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体を製造した（図９の（Ｂ））。
【００５６】
より具体的に、Ｅ．ｃｏｌｉシステムで韓国登録特許１０−１５３１２８６号公報に開示された方法を用いてＪｅＦＳＨ単一鎖抗原を製造し、製造したＪｅＦＳＨ単一鎖抗原をＳＤＳ電気泳動で確認した（図７）。
【００５７】
その次に、モノクローナル抗体を製造するために、製造したＪｅＦＳＨ単一鎖抗原５０μｇをＢａｌｂ／ｃマウス（６−８週齢）３匹に２週ごとに３回免疫を実施した。最後の免疫後、１週後に血液を採取してＥＬＩＳＡで抗体の力価を分析し、骨髄細胞と融合させる３日前にＪｅＦＳＨ２０μｇを尾血管（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）に投与し、最も高い抗体力価を示すマウスの脾臓を粉砕した。その次に、前記脾臓粉砕物をマウス骨髄細胞と５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１，５００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて融合し、エイチエーティー（ＨＡＴ）培養液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてハイブリッド細胞（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）を選別し、選別された培養上層を希釈してＥＬＩＳＡ方法を用いてクローンを分離した後、Ｈｉ−Ｔｒａｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて精製した。具体的に、培養上層を０．４５ｕｍフィルタリングをした後、ｐＨを７．５に固定し、溶出はＧｌｙｃｉｎｅ  ＨＣＩ（０．１Ｍ、ｐＨ＝２．７）を用いて行った。溶出された抗体はＰＢＳ（ｐＨ＝７．５）で透析した。
【００５８】
その次に、ＪｅＦＳＨ単一鎖抗原をマウスに３次ブースティング（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）して１０週後に血液を採取し、採取した血液をそれぞれ１μｇ／ｍｌ、５００、２５０、１２５、６２、３１、１５ｎｇ／ｍｌの比率でＴＢＳＴバッファーと混合して抗原との反応をテストした。抗体価をＥＬＩＳＡを用いて二回反復して分析測定し、その結果を図１１に示した。
ＥＬＩＳＡ分析結果、３１ｎｇ／ｍｌでＯＤ値が１．０と測定され、前記値が以後免疫反応実験において反応最小濃度であるのが分かった（図１１）。
【００５９】
比較例２：ＪｅＦＳＨβ／ｍＣＧαキメラ抗原を用いたポリクローナル抗体生産
ウナギＦＳＨのβサブユニットは維持し、αサブユニットをマウスのｍＣＧ−αサブユニット（ｍｏｕｓｅ  ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ、ｍＣＧ、ｍＧＴＨ）で置換した配列番号５のアミノ酸からなるキメラ形態（ＪｅＦＳＨβ／ｍＣＧα）のＦＳＨ抗原をウサギに注射して、前記キメラ抗原を特異的に認識するポリクローナル抗体を製造した（図９の（Ｃ））。
【００６０】
より具体的に、韓国登録特許１０−１４９３９５７号公報に開示されたカイコの幼虫および蛹発現システムを用いて配列番号５のアミノ酸からなるキメラ形態のＦＳＨ抗原を製造し、ＳＤＳ電気泳動を通じて確認した（図８参照）。
前記で製造したキメラ形態のＦＳＨ抗原を実施例２と同様な方法でウサギに注射して、キメラ抗原を特異的に認識するポリクローナル抗体を製造した。
【００６１】
その次に、ＪｅＦＳＨβ／ｍＣＧαキメラ抗原をウサギに３次ブースティング（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）し、９週後に血液を採取し、これを１：１００、１：１，０００、１：５，０００、１：１０，０００、１：５０，０００、１：１００，０００の比率でＴＢＳＴバッファーと混合して抗原との反応をテストした。抗体価をＥＬＩＳＡを用いて二回反復して分析し、その結果を図１２に示した。
【００６２】
ＥＬＩＳＡ分析結果、１：５０，０００でＯＤ値が１．０と測定され、前記値が以後免疫反応実験において反応最小反応比率であるのが分かった。二匹のウサギに免疫したサンプルは同一な傾向を示すのを確認した。
【００６３】
実験例１：抗体のＦＳＨ特異性評価
１−１．ＣＢＢ染色結果
韓国登録特許１０−１４９３９５７号公報に開示されたカイコの幼虫および蛹発現システムと実質的に同様な方法を用いて製造し分離したＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに電気泳動し、クマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌａｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ、ＣＢＢ）染色を行い、その結果を図１４に示した。
【００６４】
具体的に、それぞれのポリペプチドホルモンを製造するために、ホルモンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（ＪｅＦＳＨ：配列番号１１、ＪｅＦＳＨβ：配列番号７、ＪｅＧＴＨα：配列番号１２、ＪｅＬＨ：配列番号１３、ＪｅＬＨβ：配列番号１４、ＪｅＴＳＨ：配列番号１５、ＪｅＴＳＨβ：配列番号１６）を市販されるバキュロウイルス転移ベクター（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ）に製造会社から提供されるプロトコルに沿ってクローニングして組換え転移ベクターを製造し、このように製造した組換え転移ベクターを宿主細胞（ＢｍＤＨ１０Ｂａｃコンフィデント細胞）に形質転換させて組換えバクミドを製造する。形成されたバクミドを通常のプラスミド抽出法を用いて細胞から分離する。分離した組換えバクミドをカイコ（ＢｍＮ）細胞内に形質感染させ、形質感染された昆虫細胞から組換えバキュロウイルスを分離して、これをカイコの幼虫または蛹生体に注入し形質転換してそれぞれのＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβ蛋白質を発現させる。その次に、前記カイコの幼虫または蛹の細胞または体液からそれぞれの発現させた蛋白質を通常の方法を用いて分離、精製した。
【００６５】
図１４から分かるように、ＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβはそれぞれ約３３、１９、１８、３３、１８、３３、１８ｋＤａで蛋白質のバンドが現れ、これはそれぞれの塩基配列から予想されたサイズより約７−８ｋＤａ高い数値であって、糖鎖修飾による結果である。
【００６６】
【表２】
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【００６７】
１−２．Ｈｉｓ抗体ウェスタンブロット分析
実験例１−１と同様な方法で合成して分離したＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβをＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ニトロセルロースメンブレンに移してＨｉｓ抗体でウェスタンブロッティングを行い、その結果を図１５に示した。
【００６８】
図１５から分かるように、ＣＢＢと同様なサイズのＪｅＦＳＨ、ＪｅＬＨ、ＪｅＴＳＨは約３３ｋＤａで、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＬＨβ、ＪｅＴＳＨβは約１８ｋＤａでバンドが現れ、Ｈｉｓ抗体は全てのホルモン蛋白質と結合するのを確認した。
【００６９】
１−３．比較例１抗体ウェスタンブロット分析
実験例１−１と同様な方法で合成して分離したＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβをＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ニトロセルロースメンブレンに移して、前記比較例１で製造したウナギＪｅＦＳＨモノクローナル抗体でウェスタンブロッティングを行い、その結果を図１６に示した。
【００７０】
図１６から分かるように、比較例１の抗体はＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ以外にも共通配列のＧＴＨａを非特異的に認識して４、７、１０レーンでバンドが現れ、また２、５、８番レーンで二つのバンドを形成してアルファサブユニットとも結合することを確認した。したがって、比較例１抗体は非特異的な反応をするところ、ＪｅＦＳＨのみを特異的に検出するには不適切であるのを確認した。
【００７１】
１−４．比較例２抗体ウェスタンブロット分析
実験例１−１と同様な方法で合成して分離したＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβをＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ニトロセルロースメンブレンに移して前記比較例２で製造したウナギＦＳＨ−βとマウスのｍＣＧ−αのキメラポリクローナル抗体でウェスタンブロッティングを行い、その結果を図１７に示した。
【００７２】
図１７から分かるように、比較例２の抗体はＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβと結合して２番と３番レーンでバンドが明確に現れるが、その他のＧＴＨα蛋白質とも弱いが結合し、抗体が種間類似性を認識してＬＨ（５レーン）、ＬＨβ（６レーン）、ＧＴＨα（７レーン）とＴＳＨ（８レーン）、ＴＳＨβ（９レーン）、ＧＴＨα（１０レーン）とも弱くても結合を形成するのを確認した。
したがって、比較例２抗体はＪｅＦＳＨのみを特異的に検出するに不適切であるのが分かった。
【００７３】
１−５．本発明ポリクローナル抗体ウェスタンブロット分析
実験例１−１と同様な方法で合成して分離したＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβをＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ニトロセルロースメンブレンに移して前記実施例２で製造した本発明の有効配列１のポリペプチドと有効配列２のポリペプチド混合物をウサギに注射して得られたポリクローナル抗体でウェスタンブロッティングを行い、その結果を図１８に示した。
【００７４】
図１８から分かるように、本発明のポリクローナル抗体はただＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβと特異的に結合し、ウナギの脳下垂体ホルモンの共通配列のＧＴＨαはもちろん（４、７、１０レーン）、ＬＨとＴＳＨの特異配列のベータ（５、６、８、９レーン）にもバンドが現れず、これから本発明のポリクローナル抗体はＧＴＨ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβとは結合せず、ＪｅＦＳＨのみを特異的に認識して選別することができる抗体であるのを確認した。
【００７５】
本発明のポリクローナル抗体は比較例１のＪｅＦＳＨモノクローナル抗体と比較例２のＪｅＦＳＨβ／ｍＣＧαを連結したキメラ抗原から得られたポリクローナル抗体のＦＳＨ以外の他のＧＴＨとも非特異的に結合する問題点を解決したものであって、ＦＳＨ検出特異性において本発明のポリクローナル抗体が優れた効能を有するのが分かった。
【００７６】
実験例２：抗体の検出感度測定
実験例１−１と同様な方法で合成して分離したＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＧＴＨαをＳＤＳ−ＰＡＧＥし、ニトロセルロースメンブレンに移した後、前記実施例２で製造した本発明の有効配列１のポリペプチドと有効配列２のポリペプチド混合物をウサギに注射して得られたポリクローナル抗体を１：５，０００、１：１０，０００または１：２０，０００の比率で希釈した後にウェスタンブロッティングを行い、その結果を図１９に示した。
【００７７】
図１９に示されているように、ポリクローナル抗体を１：２０，０００の比率で希釈した時もバンドが明確に現れ、本発明ポリクローナル抗体のＦＳＨβ特異性を確認することができた。
【００７８】
実験例３：抗体を用いた試料中のＪｅＦＳＨ検出
ウナギの血液にはＧＴＨが混合されており、このような血液と類似な環境を形成して本願発明ポリクローナル抗体のＪｅＦＳＨ検出特異性を確認した。ウナギの血液と類似な環境をセッティングするために、実験例１−１と同様な方法で合成して分離したＪｅＦＳＨ、ＪｅＬＨおよびＪｅＴＳＨをそれぞれ１．６μｇずつ混合した試料、その次にそれぞれの混合量を０．２μｇずつ減少させて（１．６、１．４、１．２、１．０、０．８、０．６、０．４、０．２、０）混合した試料を対象にして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ニトロセルロースメンブレンに移し、前記実施例２で製造した本発明のポリクローナル抗体を処理してウェスタンブロッティングを行い、その結果を図２０に示した。
【００７９】
図２０に示されているように、ＪｅＬＨとＪｅＴＳＨが検出されなければならない部分でバンドが現れず、本発明のポリクローナル抗体がＪｅＦＳＨに特異的に結合するのを確認することができた。また、競争法（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）を通じて本願のポリクローナル抗体を用いる場合、ホルモンが混合された状態の検体でもＪｅＦＳＨのみを特異的に検出することができるのを確認した。
【配列フリーテキスト】
【００８０】
配列番号１：  JeFSHβ  N'56-68番目アミノ酸配列
配列番号２：  JeFSHβ  N'114-123番目アミノ酸配列
配列番号３：  JeFSH-β/JeFSH-α単一鎖抗原アミノ酸配列
配列番号４：  JeFSH-β/JeFSH-α単一鎖抗原塩基配列
配列番号５：  JeFSH-β/mGTH-αキメラ抗原アミノ酸配列
配列番号６：  JeFSH-β/mGTH-αキメラ抗原塩基配列
配列番号７：  JeFSHβFullアミノ酸配列
配列番号８：  JeFSH-β分泌信号配列
配列番号９：  JeFSH-β親水性部分
配列番号１０：  JeFSH-β疎水性部分
配列番号１１：  JeFSHのポリペプチド配列
配列番号１２：  JeGTHαのポリペプチド配列
配列番号１３：  JeLHのポリペプチド配列
配列番号１４：  JeLHβのポリペプチド配列
配列番号１５：  JeTSHのポリペプチド配列
配列番号１６：  JeTSHβのポリペプチド配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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