(57)【要約】【課題】被検査対象者からより簡便に（望ましくは被検査対象者が自身で）採取可能な子宮頸がん検査用検体を提供すること。【解決手段】子宮頸腟部及び腟からの粘液からなる群より選択される少なくとも1種を含むことを特徴とする、子宮頸がん検査用検体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮頸腟部及び腟からの粘液からなる群より選択される少なくとも1種を含むことを特徴とする、子宮頸がん検査用検体。
【請求項２】
前記子宮頸がん検査が、（1）前記検体におけるmiRNAを検出する工程を含む検査である、請求項１に記載の検体。
【請求項３】
前記miRNAがmiR-20b-5p、miR-126-3p、miR-144-3p、及びmiR-451aからなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項２に記載の検体。
【請求項４】
前記子宮頸がんが扁平上皮がん又は腺がんである、或いは前記検査が、CIN2以上の病変及び細胞診判定においてHSIL以上の病変からなる群より選択される少なくとも1種の前がん病変を検出することである、請求項１〜３のいずれかに記載の検体。
【請求項５】
検体として、子宮頸腟部及び腟からの粘液からなる群より選択される少なくとも1種を含む検体を用いることを特徴とする、子宮頸がんの検査方法。
【請求項６】
（1）前記検体におけるmiRNAを検出する工程を含む、請求項５に記載の検査方法。
【請求項７】
前記miRNAがmiR-20b-5p、miR-126-3p、miR-144-3p、及びmiR-451aからなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項６に記載の検査方法。
【請求項８】
前記子宮頸がんが扁平上皮がん又は腺がんである、或いは前記検査が、CIN2以上の病変及び細胞診判定においてHSIL以上の病変からなる群より選択される少なくとも1種の前がん病変を検出することである、請求項５〜７のいずれかに記載の検査方法。
【請求項９】
miR-20b-5p、miR-126-3p、miR-144-3p、及びmiR-451aからなる群より選択される少なくとも1種のmiRNAの、子宮頸腟部及び腟からの粘液からなる群より選択される少なくとも1種を含む検体における検出剤を含有する、子宮頸がんの検査薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子宮頸がん検査用検体、子宮頸がんの検査方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本においては、年間約8000〜10,000人が子宮頸がんに罹患しており、この数は近年微増傾向にある。日本においては、年間3500人が子宮頸がんによる原因で死亡している。さらに、世界では、子宮頸がんは、乳がんについで2番目に多いがんである。
【０００３】
子宮頸がんの発がん因子の1つとしてヒトパピローマウイルス（HPV）持続感染が知られており、HPVに対する感染予防ワクチンが上市されている。しかしながら、種々の事情から、日本では、現在、積極的接種が中止されている。このため、子宮頸がんを、その前段階でより早期に発見し、予防、治療することが重要である。
【０００４】
しかし、日本においては子宮頸がん検診（通常は、細胞診）受診率が約30％程度と著しく低い。このため現在の検診システムでは子宮頸がんの予防、治療は完全であるとは言い難い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Cell Cycle, Vol.11, Issue 15, 2876-2884, 2012.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
細胞診に用いる細胞検体の採取は、独特のヘラやブラシを用いて子宮頸腟部を擦過することにより採取する。この採取は医師によって行われないと、正診率が下がるとされており、自己採取は推奨されていない。しかしながら、被検査対象者等の採取者にとって、より簡便に、望ましくは自らが採取可能な検体であれば、子宮頸がん検診率をより高めることができると考えられる。
【０００７】
非特許文献１では、子宮頸がんで特定のmiRNAの発現量が亢進することが示されているが、用いられている検体は腫瘍組織自体であり、これは被検査対象者等が簡便に採取できるものではない。一般に細胞診による検診では、腺がんの検出率は低い。
【０００８】
そこで、本発明は、被検査対象者からより簡便に（望ましくは被検査対象者が自身で）採取可能な子宮頸がん検査用検体を提供することを課題とする。また、子宮頸がんについて、扁平上皮がんのみならず、腺がんをも検出可能な検体を提供することを課題とする。さらには、子宮頸がん検査に有用なバイオマーカーを提供することをも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、子宮頸部粘液検体を用いることにより、扁平上皮がんのみならず、腺がんをも検出可能であることを見出した。さらには前がん状態からの検出も可能である。さらに、これらの粘液検体中のバイオマーカーとして、4種のmiRNAを見出した。これらの知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。即ち、本発明は下記の態様を包含する。
【００１０】
項１．  子宮頸腟部及び腟からの粘液からなる群より選択される少なくとも1種を含むことを特徴とする、子宮頸がん検査用検体。
【００１１】
項２．  前記子宮頸がん検査が、（1）前記検体におけるmiRNAを検出する工程を含む検査である、項１に記載の検体。
【００１２】
項３．  前記miRNAがmiR-20b-5p、miR-126-3p、miR-144-3p、及びmiR-451aからなる群より選択される少なくとも1種を含む、項２に記載の検体。
【００１３】
項４．  子宮頸腟部粘液を含む、項１〜３のいずれかに記載の検体。
【００１４】
項５．  前記子宮頸がんが腺がんである、或いは前記検査が、CIN2以上の病変及び細胞診判定においてHSIL以上の病変からなる群より選択される少なくとも1種の前がん病変を検出することである、項１〜４のいずれかに記載の検体。
【００１５】
項６．  検体として、子宮頸腟部及び腟からの粘液からなる群より選択される少なくとも1種を含む検体を用いることを特徴とする、子宮頸がんの検査方法。
【００１６】
項７．  （1）前記検体におけるmiRNAを検出する工程を含む、項６に記載の検査方法。
【００１７】
項８．  前記miRNAがmiR-20b-5p、miR-126-3p、miR-144-3p、及びmiR-451aからなる群より選択される少なくとも1種を含む、項７に記載の検査方法。
【００１８】
項９．  さらに、（2）前記工程（1）で検出されたmiR-20b-5p、miR-126-3p、miR-144-3p、及びmiR-451aからなる群より選択される少なくとも1種のmiRNAの量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検査対象が子宮頸がんに罹患している、或いは前記被検査対象が、CIN2以上の病変及び細胞診判定においてHSIL以上の病変からなる群より選択される少なくとも1種の前がん病変を有する、と判定する工程を含む、項８に記載の検査方法。
【００１９】
項１０．  前記カットオフ値が、子宮頸がんに罹患していない対象から採取された、子宮頸腟部及び腟からの粘液からなる群より選択される少なくとも1種を含む検体における対応miRNAの量又は濃度の値の平均値、パーセンタイル値、又は最小値である、項９に記載の検査方法。
【００２０】
項１１．  前記検体が子宮頸腟部粘液を含む、項６〜１０のいずれかに記載の検査方法。
【００２１】
項１２．  前記子宮頸がんが腺がんである、或いは前記検査が、CIN2以上の病変及び細胞診判定においてHSIL以上の病変からなる群より選択される少なくとも1種の前がん病変を検出することである、項６〜１１のいずれかに記載の検査方法。
【００２２】
項１３．  子宮頸腟部及び腟からの粘液からなる群より選択される少なくとも1種の採取器具を含む、子宮頸がん検査用検体採取キット。
【００２３】
項１４．  miR-20b-5p、miR-126-3p、miR-144-3p、及びmiR-451aからなる群より選択される少なくとも1種のmiRNAの、子宮頸腟部及び腟からの粘液からなる群より選択される少なくとも1種を含む検体における検出剤を含有する、子宮頸がんの検査薬。
【００２４】
項１５．  被検物質で処理されたヒトから採取された子宮頸腟部及び腟からの粘液からなる群より選択される少なくとも1種を含む試料における、miR-20b-5p、miR-126-3p、miR-144-3p、及びmiR-451aからなる群より選択される少なくとも1種のmiRNAの量又は濃度を指標とする、子宮頸がんの予防又は治療効果の評価方法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、被検査対象者からより簡便に（望ましくは被検査対象者が自身で）採取可能な子宮頸がん検査用検体を提供することができ、該検体を用いれば子宮頸がんについて、扁平上皮がんのみならず、腺がんをも検出可能である。さらには前がん状態からの検出が可能である。したがって、本発明によれば、子宮頸がん検査に有用なバイオマーカーをも提供することができる。
【００２６】
また、従来、余剰の粘液は子宮頸部細胞診の妨げになるといわれ、その場合にはまず粘液を除去してから細胞診検体を採取していた。しかし、本発明で見出した子宮頸がん検査用検体は、細胞診用の細胞検体の採取に先立ち採取して検討していたことから、従来は廃棄していた検体を用いて検査を施行できる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】細胞診（試験例1-2）による各分類群における、miR-144-3pの発現量を示す。横軸は各分類群を示し、NILMは陰性を示し、LSILは軽度扁平上皮内病変の存在を示し、HSILは高度扁平上皮内病変の存在を示し、ASC-USは意義不明な異型扁平上皮細胞の存在を示し、ASC-HはHSILを除外できない異型扁平上皮細胞の存在を示し、SCCは扁平上皮がんを示し、ADは腺がんを示す。縦軸は、miR-144-3pの発現量の、NILMを1とした場合の相対値を示す。値は平均値を示す。
【図２】細胞診（試験例1-2）による各分類群における、miR-451aの発現量を示す。横軸及び縦軸については図１と同様である。
【図３】細胞診（試験例1-2）による各分類群における、miR-20b-5pの発現量を示す。横軸及び縦軸については図１と同様である。
【図４】細胞診（試験例1-2）による各分類群における、miR-126-3pの発現量を示す。横軸及び縦軸については図１と同様である。
【図５】組織診（試験例1-2）による各分類群における、miR-144-3pの発現量を示す。横軸は各分類群を示し、normalは正常を示し、CIN1は異形成（軽度）を示し、CIN2は異形成（中等度）を示し、CIN3は異形成（高度）を示し、SCCは扁平上皮がんを示し、ADは腺がんを示す。縦軸は、miR-144-3pの発現量の、normalを1とした場合の相対値を示す。値は平均値を示す。
【図６】組織診（試験例1-2）による各分類群における、miR-451aの発現量を示す。横軸及び縦軸については図５と同様である。
【図７】組織診（試験例1-2）による各分類群における、miR-20b-5pの発現量を示す。横軸及び縦軸については図５と同様である。
【図８】組織診（試験例1-2）による各分類群における、miR-126-3pの発現量を示す。横軸及び縦軸については図５と同様である。
【図９】HPV検査（試験例1-2）による各分類群における、miR-144-3pの発現量を示す。横軸は各分類群を示し、1はHPV陰性を示し、2は31種のHPVのいずれかに陽性であることを示し、3はHPV16又は18陽性を示し、4は日本において子宮頸がん高リスクHPVといわれている7種のHPV：HPV16、18、31、33、45、52及び58のいずれかに陽性であることを示し、5は世界において子宮頸がん高リスクHPVといわれている13種のHPV：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59及び68のいずれかに陽性であることを示す。縦軸は、miR-144-3pの発現量の、分類群1を1とした場合の相対値を示す。値は平均値を示す。*は1（HPV陰性）に対してP<0.05（Bonferroni 補正したMann-Whitney U テスト）であることを示す。
【図１０】HPV検査（試験例1-2）による各分類群における、miR-451aの発現量を示す。横軸及び縦軸については図９と同様である。
【図１１】HPV検査（試験例1-2）による各分類群における、miR-20b-5pの発現量を示す。横軸及び縦軸については図９と同様である。
【図１２】HPV検査（試験例1-2）による各分類群における、miR-126-3pの発現量を示す。横軸及び縦軸については図９と同様である。
【図１３】細胞診（試験例2-2）による各分類群における、miR-144-3pの発現量を示す箱ひげ図である。AGCは異型腺細胞の存在を示す。その他については、図１と同様であるが、値は中央値である。図中、各点はそれぞれの検体のデータを表す。グラフ中の数値は中央値を示す。「箱」の上端は75パーセンタイル値を示し、下端は25パーセンタイル値を示す。「ひげ」の上端は75パーセンタイル値に四分位範囲の1.5倍の値を加えて得られる値を示し、「ひげ」の下端は25パーセンタイル値から四分位範囲の1.5倍の値を減じて得られる値を示す。統計処理としてBonferroni 補正したMann-Whitney U テストを用いた場合について、NILMとの有意差  ：* P < 0.01, LSILとの有意差  ：† P < 0.01, HSILとの有意差：‡ P < 0.01 を示す。
【図１４】細胞診（試験例2-2）による各分類群における、miR-451aの発現量を示す箱ひげ図である。横軸、縦軸、及び各記号については図１３と同様である。
【図１５】細胞診（試験例2-2）による各分類群における、miR-20b-5pの発現量を示す箱ひげ図である。横軸、縦軸、及び各記号については図１３と同様である。
【図１６】細胞診（試験例2-2）による各分類群における、miR-126-3pの発現量を示す箱ひげ図である。横軸、縦軸、及び各記号については図１３と同様である。
【図１７】組織診（試験例2-2）による各分類群における、miR-144-3pの発現量を示す箱ひげ図である。横軸については図５と同様である。縦軸は中央値である。図中、各点はそれぞれの検体のデータを表す。グラフ中の数値は中央値を示す。「箱」の上端は75パーセンタイル値を示し、下端は25パーセンタイル値を示す。「ひげ」の上端は75パーセンタイル値に四分位範囲の1.5倍の値を加えて得られる値を示し、「ひげ」の下端は25パーセンタイル値から四分位範囲の1.5倍の値を減じて得られる値を示す。統計処理としてBonferroni 補正したMann-Whitney U テストを用いた場合について、Normalとの有意差：* P < 0.05, CIN1との有意差：† P < 0.05、CIN2との有意差 ‡ P < 0.05, CIN3との有意差：¶ P < 0.05 で示す。
【図１８】組織診（試験例2-2）による各分類群における、miR-451aの発現量を示す箱ひげ図である。横軸、縦軸、及び各記号については図１７と同様である。
【図１９】組織診（試験例2-2）による各分類群における、miR-20b-5pの発現量を示す箱ひげ図である。横軸、縦軸、及び各記号については図１７と同様である。
【図２０】組織診（試験例2-2）による各分類群における、miR-126-3pの発現量を示す箱ひげ図である。横軸、縦軸、及び各記号については図１７と同様である。
【図２１】HPV検査（試験例2-2）による各分類群における、miR-144-3pの発現量を示す箱ひげ図である。横軸及び横軸については図９と同様である。図中、各点はそれぞれの検体のデータを表す。グラフ中の数値は中央値を示す。「箱」の上端は75パーセンタイル値を示し、下端は25パーセンタイル値を示す。「ひげ」の上端は75パーセンタイル値に四分位範囲の1.5倍の値を加えて得られる値を示し、「ひげ」の下端は25パーセンタイル値から四分位範囲の1.5倍の値を減じて得られる値を示す。統計処理としてBonferroni 補正したMann-Whitney U テストを用いた場合について、1（HPV陰性）との有意差  ：* P < 0.01で示す。
【図２２】HPV検査（試験例2-2）による各分類群における、miR-451aの発現量を示す箱ひげ図である。横軸、縦軸、及び各記号については図２１と同様である。
【図２３】HPV検査（試験例2-2）による各分類群における、miR-20b-5pの発現量を示す箱ひげ図である。横軸、縦軸、及び各記号については図２１と同様である。
【図２４】HPV検査（試験例2-2）による各分類群における、miR-126-3pの発現量を示す箱ひげ図である。横軸、縦軸、及び各記号については図２１と同様である。
【図２５】4種類のmiRNA別のROC曲線のYouden インデックスを用いたカットオフ値の決定と検査としての感度・特異度の決定（試験例2-3）。疾患としては扁平上皮がんを標的としている。
【図２６】4種類のmiRNA別のROC曲線のYouden インデックスを用いたカットオフ値の決定と検査としての感度・特異度の決定（試験例2-3）。疾患としては扁平上皮がん・腺がんの両者を標的としている。
【図２７】4種類のmiRNA別のROC曲線のYouden インデックスを用いたカットオフ値の決定と検査としての感度・特異度の決定（試験例2-3）。疾患としてはCIN3以上の病変を有するものを標的としている。
【図２８】4種類のmiRNA別のROC曲線のYouden インデックスを用いたカットオフ値の決定と検査としての感度・特異度の決定（試験例2-3）。疾患としてはCIN2以上の病変を有するものを標的としている。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００２９】
1．子宮頸がん検査用検体
本発明は、その一態様において、子宮頸腟部及び腟からの粘液からなる群より選択される少なくとも1種を含むことを特徴とする、子宮頸がん検査用検体（本明細書において、「本発明の検体」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。  検査対象である子宮頸がんには、扁平上皮がん及び腺がんのいずれも包含される。従来の子宮頸がん検診（細胞診）では腺がんの検出が困難であったが、本発明の検体を用いることにより、腺がん等をより効率的に検出することが可能である。
【００３０】
子宮頸腟部粘液は、子宮頸部及び子宮腟部の表面に存在する粘液であり、この限りにおいて特に制限されない。子宮頸腟部粘液は、子宮頸腟部表面に、例えば、吸水性を有する材料（例えば、綿球、綿棒、スポンジ等）、ヘラ、ブラシ等を接触させることにより、簡便に採取することが可能である。
【００３１】
腟粘液は、腟表面に存在する粘液であり、この限りにおいて特に制限されない。腟粘液は、腟表面に、例えば上記、子宮頸腟部粘液と同様な方法で簡便に採取することが可能である。
【００３２】
子宮頸腟部粘液及び腟粘液それぞれには、特に限定しないが、細胞が含まれていてもよい。細胞診検体の採取時のように子宮頸腟部や腟の表面を強く擦って採取するのではなく、粘液採取を意図した採取方法（例えば、吸水性材料を接触させることによる採取方法等）で採取したとしても、粘液中に細胞等が混入してくる可能性がある。本発明が対象とする粘液は、粘液のみや、このような細胞等が含まれる粘液も包含する。
【００３３】
採取対象（被検査対象）の状態は、特に制限されない。採取対象（被検査対象）としては、例えば子宮頸がんに罹患しているかどうか不明な対象、子宮頸がんに罹患している疑いがあると判定されている対象、子宮頸がんに罹患していると既に別の方法により判定されている対象、子宮頸がんに罹患していないと既に別の方法により判定されている検体、子宮頸がんの治療中の検体、HPV陰性の検体、HPV陽性の検体、HPV感染の有無が不明の検体等が挙げられる。
【００３４】
本発明の検体は、子宮頸がん検査用に用いられる。この「検査」には、子宮頸がんの検出のみならず、子宮頸がんの前がん病変の検出、子宮頸がんに関するあらゆる検査（例えば、子宮頸がんの病態解明、子宮頸がんの予後予測、患者の層別化、治療方法の選択等）が包含される。前がん病変としては、好ましくはCIN2以上の病変、細胞診判定においてHSIL以上の病変等が挙げられる。
【００３５】
好ましくは、本発明の検体が、子宮頸腟部からの粘液を検査対象とする子宮頸がん検査用に用いられる。
【００３６】
本発明の検体は、子宮頸腟部及び腟からの粘液からなる群より選択される少なくとも1種を含んでいれば、特に限定しないが、好ましくは、子宮頸腟部粘液である。
【００３７】
子宮頸がんの検査は、好ましくは（1）前記検体におけるmiRNAを検出する工程（工程1）を含む検査である。
【００３８】
miRNAの検出は、通常は、対象miRNAの量又は濃度を測定することによって行われる。「濃度」とは、絶対濃度に限らず、相対濃度や、単位体積辺りの重量や、絶対濃度を知るために測定した生データなどでもよい。miRNAの検出は、公知の方法に従って又は準じて行うことができる。例えば、プローブやプライマーを用いて、例えばRT-PCR法、DNAチップ解析法等公知の方法が挙げられる。
【００３９】
RT-PCR法を利用する場合は、適当なプライマーを用いることによって、試料中のmiRNA若しくはそれに由来する核酸の有無やその量を測定することができる。
【００４０】
具体的には、例えば、試料のRNAから常法に従ってcDNAを調製して、これを鋳型として標的領域が増幅できるように、一対のプライマー（上記cDNA（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってPCR法を行い、得られた増幅二本鎖DNAを検出する方法を例示することができる。
【００４１】
なお、増幅された二本鎖DNAの検出は、上記PCRを予めRIや蛍光物質等で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖DNAを検出する方法、産生された二本鎖DNAを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識したプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。
【００４２】
なお、生成された標識二本鎖DNA産物は、測定できれば特に限定しないが、例えばマイクロチップ型電気泳動装置などで測定することができる。また、例えば、市販品(SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 社製) 等)のプロトコールに従ってRT-PCR反応液を調製し、例えばABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems社製)等で反応させて、該反応物を検出することもできる。
【００４３】
DNAチップ解析を利用する場合は、特に限定しないが、適当なDNAプローブ（1本鎖または2本鎖）として貼り付けたDNAチップを用意し、これに試料のRNAから常法によって調製されたcRNAとハイブリダイズさせて、形成されたDNAとcRNAとの二本鎖を、標識プローブと結合させて検出する方法を挙げることができる。
【００４４】
検出対象であるmiRNAは、好ましくはmiRNAがmiR-20b-5p、miR-126-3p、miR-144-3p、及びmiR-451aからなる群より選択される少なくとも1種、好ましくは2種、より好ましくは3種、さらに好ましくは4種（全て）を含む。これらのmiRNA配列及び成熟型の配列は、公知のデータベース、例えばmiRBase（URL：http://www.mirbase.org/）から入手することができる。
【００４５】
miR-20b-5pは、例えばヒトの場合であれば、そのステムループ配列は配列番号1（5´-AGUACCAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAGUUUUGGCAUGACUCUACUGUAGUAUGGGCACUUCCAGUACU）で示される塩基配列であり、miR-20b-5pは、例えばヒトの場合であれば、配列番号2（5´-CAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAG）で示される塩基配列である。
【００４６】
miR-126-3pは、例えばヒトの場合であれば、そのステムループ配列は配列番号3（5´- CGCUGGCGACGGGACAUUAUUACUUUUGGUACGCGCUGUGACACUUCAAACUCGUACCGUGAGUAAUAAUGCGCCGUCCACGGCA）で示される塩基配列であり、miR-126-3pは、例えばヒトの場合であれば、配列番号4（5´- UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG）で示される塩基配列である。
【００４７】
miR-144-3pは、例えばヒトの場合であれば、そのステムループ配列は配列番号5（5´- UGGGGCCCUGGCUGGGAUAUCAUCAUAUACUGUAAGUUUGCGAUGAGACACUACAGUAUAGAUGAUGUACUAGUCCGGGCACCCCC）で示される塩基配列であり、miR-144-3pは、例えばヒトの場合であれば、配列番号6（5´- UACAGUAUAGAUGAUGUACU）で示される塩基配列である。
【００４８】
miR-451aは、例えばヒトの場合であれば、そのステムループ配列は配列番号7（5´- CUUGGGAAUGGCAAGGAAACCGUUACCAUUACUGAGUUUAGUAAUGGUAAUGGUUCUCUUGCUAUACCCAGA）で示される塩基配列であり、miR-451aは、例えばヒトの場合であれば、配列番号8（5´- AAACCGUUACCAUUACUGAGUU）で示される塩基配列である。
【００４９】
子宮頸がんの検査が工程1を含む場合、子宮頸がんの検査は、より好ましくは、さらに、（2）前記工程（1）で検出されたmiR-20b-5p、miR-126-3p、miR-144-3p、及びmiR-451aからなる群より選択される少なくとも1種のmiRNAの量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検査対象が子宮頸がんに罹患していると判定する工程（工程2）を含む検査である。
【００５０】
カットオフ値は、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などの観点から当業者が適宜設定することができ、例えば、子宮頸がんに罹患していない対象から採取された本発明の検体における対応miRNA（すなわち、工程1で検出したmiRNAと同じmiRNA）の量及び／又は濃度に基づいて、その都度定められた値、或いは予め定められた値とすることができる。カットオフ値は、例えば、子宮頸がんに罹患していない対象から採取された本発明の検体における対応miRNAの量及び／又は濃度の平均値、パーセンタイル値、又は最小値とすることができる。或いは、対応miRNAの量及び／又は濃度（被検体が複数の場合は、平均値、中央値など）よりも高い値（例えば1.2倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍等の値）とすることもできる。
【００５１】
2．子宮頸がんの検査方法
本発明は、その一態様において、検体として、子宮頸腟部及び腟からの粘液からなる群より選択される少なくとも1種を含む検体を用いることを特徴とする、子宮頸がんの検査方法（本明細書において、「本発明の検査方法」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
【００５２】
子宮頸腟部粘液、腟粘液、子宮頸がん、子宮頸がんの検査等については、上記「1．子宮頸がん検査用検体」の項で述べた通りである。
【００５３】
本発明の検査方法は、工程1を含むことが好ましい。工程1については、上記「1．子宮頸がん検査用検体」の項で述べた通りである。
【００５４】
上記本発明の検査方法によれば、子宮頸がんの検出指標となり得るmiRNAの量及び／又は濃度を提供することができ、これにより子宮頸がんの検出などを補助することができる。また、本発明の検査方法は、HPV感染を指標としていない。従って本発明の検査方法は、HPV検査を行わない場合や、HPV陰性であっても、子宮頸がんを検査することが可能になる。
【００５５】
本発明の検査方法が工程1を含む場合、本発明の検査方法は、さらに工程2を含むことがより好ましい。工程2については、上記「1．子宮頸がん検査用検体」の項で述べた通りである。
【００５６】
また、本発明の検査方法に、さらに他の検査(HPV検査等) をする工程を組み合わせてもよい。それにより、より高い精度で子宮頸がんを検査することができる。
【００５７】
3．子宮頸がんのより高い精度での診断
工程2を含む本発明の検査方法により、被検査対象が子宮頸がんに罹患していると判定された場合、又は被検査対象が子宮頸がんの前がん病変を有すると判定された場合、本発明の検査方法に、さらに子宮頸がんの医師による診断（例えば、細胞診、組織診、HPV検査結果による診断等）を適用する工程を組み合わせることによって、より高い精度で子宮頸がん罹患の有無、又は子宮頸がんの前がん病変の有無を診断することができる。また、本発明の検査方法はより正確に子宮頸がんを検出できるので、本発明の検査方法に上記工程を組み合わせることによって、より効率的且つより正確に「子宮頸がんに罹患している」又は「子宮頸がんの前がん病変を有する」と診断できる。
【００５８】
4．子宮頸がんの治療
工程2を含む本発明の検査方法により被検査対象が子宮頸がんに罹患していると判定された場合は本発明の検査方法に対してさらに、或いは上記「3．子宮頸がんのより高い精度での診断」に記載の様に子宮頸がんに罹患していると診断された場合は本発明の検査方法と医師による診断を適用する工程との組合せに対してさらに、（3）子宮頸がんに罹患していると判定又は診断された被検査対象に対して、該疾患の治療を行う工程（工程3）を行うことによって、被検査対象の子宮頸がんを治療することが可能となる。また、本発明の検査方法は、より正確に子宮頸がんを検出できるので、本発明の検査方法に対して、或いは本発明の検査方法と医師による診断を適用する工程との組合せに対して工程3を組み合わせることによって、子宮頸がんに罹患している被検体をより効率的に、より確実に治療できることが可能である。
【００５９】
子宮頸がんの治療方法は、特に制限されない。治療方法としては、手術、放射線治療、抗がん剤治療、化学療法等が挙げられる。これらは、1種、2種、又は3種以上を組み合わせて採用することができる。
【００６０】
5．子宮頸がん検査用検体採取キット
本発明は、その一態様において、子宮頸腟部及び腟からの粘液からなる群より選択される少なくとも1種の採取器具を含む、子宮頸がん検査用検体採取キット（本明細書において、「本発明のキット」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
【００６１】
子宮頸腟部粘液、腟粘液、子宮頸がん、子宮頸がんの検査等については、上記「1．子宮頸がん検査用検体」の項で述べた通りである。
【００６２】
採取器具は、例えば、吸水性を有する材料（例えば、綿球、綿棒、スポンジ等）、ヘラ、ブラシ等が挙げられる。このような材料であれば、子宮頸腟部表面や腟表面に接触させることにより、簡便に子宮頸腟部粘液、腟粘液を採取することができる。
【００６３】
本発明のキットには、上記採取器具の他に、子宮頸腟部及び腟からの粘液からなる群より選択される少なくとも1種の採取、保存等に使用し得るものを含んでいてもよい。具体的には、例えば、子宮頸腟部粘液・腟粘液や、これらの粘液が付着した採取器具の保存容器や保存液等が挙げられる。
【００６４】
6．子宮頸がんの検査薬
本発明は、その一態様において、miR-20b-5p、miR-126-3p、miR-144-3p、及びmiR-451aからなる群より選択される少なくとも1種のmiRNA（本明細書において、「本発明のmiRNA」と示すこともある。）の、子宮頸腟部及び腟からの粘液からなる群より選択される少なくとも1種を含む検体における検出剤を含有する、子宮頸がんの検査薬（本明細書において、「本発明の検査薬」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
【００６５】
子宮頸腟部粘液、腟粘液、子宮頸がん、子宮頸がんの検査、各種miRNA等については、上記「1．子宮頸がん検査用検体」の項で述べた通りである。
【００６６】
検出剤は、miR-20b-5p、miR-126-3p、miR-144-3p、及びmiR-451aからなる群より選択される少なくとも1種のmiRNAの検出剤であって、子宮頸腟部及び腟からの粘液からなる群より選択される少なくとも1種を含む検体におけるこれらのmiRNAの検出に用いられるものである限り、特に制限されない。
【００６７】
検出剤としては、例えばプライマーやプローブ等が挙げられる。
【００６８】
プライマーやプローブ等は、本発明のmiRNAやそれに由来する核酸等を選択的に（特異的に）認識するものであれば、特に限定されない。ここで、「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばノーザンブロット法においては、本発明のmiRNAが特異的に検出できること、またRT-PCR法においては本発明のmiRNA若しくはそれに由来する核酸（cDNA等）が特異的に増幅されることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物または増幅物が本発明のmiRNAに由来するものであると判断できるものであればよい。
【００６９】
プライマーやプローブの具体例としては、下記（a）に記載するポリヌクレオチド並びに下記（b）に記載するポリヌクレオチド：
（a）本発明のmiRNAの塩基配列において連続する少なくとも10塩基を有するポリヌクレオチド及び／若しくは当該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、並びに
（b）本発明のmiRNAの塩基配列若しくはそれに相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも10塩基を有するポリヌクレオチド
からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。
【００７０】
本明細書において、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、核酸と同義であって、DNAおよびRNAの両方を含むものとする。また、これらは2本鎖であっても1本鎖であってもよく、ある配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」）といった場合、特に言及しない限り、これに相補的な配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」）も包括的に意味するものとする。さらに、「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」）がRNAである場合、配列表に示される塩基記号「T」は「U」と読み替えられるものとする。
【００７１】
また、ヌクレオチドには、次に例示するように、公知の化学修飾が施されていてもよい。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の2位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2´-O-Me）、CH2CH2OCH3（2´-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これに限定されない。また、ヌクレオチドの糖部の2´酸素と4´炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したものであるBNA（LNA）等もまた、好ましく用いられ得る。
【００７２】
相補的なポリヌクレオチド又は相補的な塩基配列（相補鎖、逆鎖）とは、本発明のmiRNAの塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、または該塩基配列において少なくとも連続した10塩基長の塩基配列を有するその部分配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう）に対して、A:TおよびG:Cといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチド又は塩基配列を意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも90％、好ましくは95％、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
【００７３】
プライマーやプローブ等は、例えば本発明のmiRNAの塩基配列をもとに、例えばソフトウエアを利用して設計することができる。具体的には本発明のmiRNAの塩基配列をベクターNTI（Infomax社製）のソフトウエアにかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配列、若しくは少なくとも該配列を一部に含む配列を、プライマーまたはプローブとして使用することができる。
【００７４】
プライマーやプローブ等の塩基長は、上述のように連続する少なくとも10塩基の長さを有するものであれば特に制限されず、用途に応じて適宜設定することができる。塩基長としては、例えば10塩基〜100塩基、好ましくは15塩基〜50塩基、より好ましくは15塩基〜35塩基が例示できる。
【００７５】
プライマーやプローブ等は、その機能が著しく損なわれない限りにおいて、修飾が施されていてもよい。修飾としては、例えば、標識物、例えば蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等の付加が挙げられる。
【００７６】
本発明において用いられる蛍光色素としては、一般にヌクレオチドを標識して、核酸の検出や定量に用いられるものが好適に使用でき、例えば、HEX（4,7,2’,4’,5’,7’-hexachloro-6-carboxylfluorescein、緑色蛍光色素）、フルオレセイン（fluorescein）、NED（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄色蛍光色素）、あるいは、6-FAM（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄緑色蛍光色素）、ローダミン（rhodamin）またはその誘導体〔例えば、テトラメチルローダミン（TMR）〕を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素でヌクレオチドを標識する方法は、公知の標識法のうち適当なものを使用することができる〔例えば、Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996)参照〕。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、アマシャム・ファルマシア社製、オリゴヌクレオチドECL 3’-オリゴラベリングシステム等）。
【００７７】
プライマーやプローブは、任意の固相に固定化して用いることもできる。このため本発明の検査薬は、プローブ（オリゴまたはポリヌクレオチド）を固定化プローブ（例えばプローブを固定化したDNAチップ、cDNAマイクロアレイ、オリゴDNAアレイ、メンブレンフィルター等。以下「DNAチップ等」と総称する。）の形態として提供することができる。
【００７８】
固定化に使用される固相は、オリゴまたはポリヌクレオチドを固定化できるものであれば特に制限されることなく、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーまたはその他の基板等を挙げることができる。固相へのオリゴまたはポリヌクレオチドの固定は、予め合成したオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上に載せる方法であっても、また目的とするオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上で合成する方法であってもよい。固定方法は、特に限定しないが、例えばDNAマイクロアレイであれば、市販のスポッター（Amersham社製など）を利用するなど、固定化プローブの種類に応じて当該技術分野で周知である方法を用いることができる〔例えば、photolithographic技術(Affymetrix社)、インクジェット技術(Rosetta Inpharmatics社)によるオリゴヌクレオチドのin situ合成等〕。
【００７９】
本発明の検査薬は、上記した検出剤を含有するものであれば特に限定されず、該検出剤のみからなるもの、該検出剤の他に、例えば各種miRNAの検出に必要なものを含んでいてもよい。このような物の具体例としては、ハイブリダイゼーション用の試薬、プローブの標識、ラベル体の検出剤、緩衝液、器具等が挙げられる。本発明の検査薬は、これらを含んだ検査薬キットの形態であってもよい。
【００８０】
7．子宮頸がんの予防又は治療効果の評価方法
本発明は、その一態様において、被検物質で処理された動物から採取された子宮頸腟部及び腟からの粘液からなる群より選択される少なくとも1種を含む試料における、miR-20b-5p、miR-126-3p、miR-144-3p、及びmiR-451aからなる群より選択される少なくとも1種のmiRNAの量又は濃度を指標とする、子宮頸がんの予防又は治療効果の評価方法（本明細書において、「本発明の評価方法」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
【００８１】
子宮頸腟部粘液、腟粘液、子宮頸がん、子宮頸がん、各種miRNA等については、上記「1．子宮頸がん検査用検体」の項で述べた通りである。
【００８２】
被検物質としては、天然に存在する化合物又は人工に作られた化合物を問わず広く使用することができる。また、精製された化合物に限らず、多種の化合物を混合した組成物や、動植物の抽出液も使用することができる。化合物には、低分子化合物に限らず、タンパク質、核酸、多糖類等の高分子化合物も包含される。被検物質としては、子宮頸がんの治療薬として知られているものを用いてもよい。
【００８３】
被検物質による処理の態様は、特に制限されない。例えば、医薬の通常の投与方法を各種採用することができる。
【００８４】
本発明の評価方法は、より具体的には、上記指標の値が、被検物質で処理されていないヒトから採取された子宮頸腟部及び腟からの粘液からなる群より選択される少なくとも1種を含む試料における対応miRNA（すなわち、指標としているmiRNA）の量又は濃度（対照値）よりも低い場合に、前記被検物質を、子宮頸がんの予防又は治療効果があると判定する工程含む。
【００８５】
「低い」とは、例えば指標の値が、対照値の1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100であることを意味する。
【００８６】
本発明の評価方法により、既存の子宮頸がんの予防又は治療薬の評価、子宮頸がんの予防又は治療薬のスクリーニング、ドラッグリポジショニング等が可能となる。
【実施例】
【００８７】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００８８】
試験例1．子宮頸がんの検査
試験例1-1．検体の調製
被検査対象者（n＝229）の子宮頸腟部を綿球で拭い、子宮頸腟部粘液を採取した（粘液検体）。その後、ヘラを用いて粘液除去後の子宮頸腟部の擦過することにより子宮頸腟部表面の細胞を採取し（細胞検体）、さらに子宮頸腟部の組織を一部切り取って採取した（組織検体）。
【００８９】
試験例1-2．被検査対象者の分類
1）細胞診によるベセスダ分類
試験例1-1で得られた細胞検体を用いて子宮頸がんの細胞診を行い、ベセスダ分類に従って被検査対象者を分類した。その結果、NILM（n＝39）、ASC-US（n＝10）、LSIL（n＝21）、HSIL（n＝75）、ASC-H（n＝8）、SCC（n＝24）、AD（n＝16）に分類された。なお、NILMは陰性を示し、LSILは軽度扁平上皮内病変の存在を示し、HSILは高度扁平上皮内病変の存在を示し、ASC-USは意義不明な異型扁平上皮細胞の存在を示し、ASC-HはHSILを除外できない異型扁平上皮細胞の存在を示し、SCCは扁平上皮がんを示し、ADは腺がんを示す。なお、SCC, ADは、子宮頸がん群である。
【００９０】
2）組織診によるCIN分類
試験例1-1で得られた組織検体を用いて子宮頸がんの組織診を行い、CIN分類に従って被検査対象者を分類した。その結果、normal（n＝56）、CIN1（n＝19）、CIN2（n＝33）、CIN3（n＝43）、SCC（n＝35）、AD（n＝18）に分類された。なお、normalは正常を示し、CIN1は異形成（軽度）を示し、CIN2は異形成（中等度）を示し、CIN3は異形成（高度）を示し、SCCは扁平上皮がんを示し、ADは腺がんを示す。
【００９１】
3）ヒトパピローマウイルス（HPV）検査
試験例1-1で得られた細胞検体を用いてヒトパピローマウイルス（HPV）検査（HPVの検出及びジェノタイピング）を行った。試験例1-1で得られた細胞検体から、常法に従ってDNAを抽出した。DNAを鋳型として、PGMYプライマーを用いたPCRによりHPVの検出を行い、ウイルスの感染有無を判定した。続いて、リバースブロッティング法（31種のHPV：HPV6、11、16、18、26、31、33、34、35、39、40、42、44、45、51、52、53、54、55、56、57、58、59、66、68、69、70、73、82、83及び84を検出可能。Jpn J Clin Oncol. 2014; 44: 910-7.）によりHPVのジェノタイピングを行った。その結果、被検査対象者は、HPV陽性（n＝163）、HPV陰性（n＝66）に分類された。また、各種HPV（日本において子宮頸がん高リスクHPVといわれている7種のHPV：HPV16、18、31、33、45、52及び58、世界において子宮頸がん高リスクHPVといわれている13種のHPV：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59及び68）陽性の被検査対象者も分類した。
【００９２】
なお、上記細胞診及び組織診の結果と合わせ、HPV陰性であり、且つ子宮頸がんである被検査対象者は7名であった。
【００９３】
試験例1-3．miRNAの検出、定量
試験例1-1で得られた粘液検体から、常法に従ってTotal RNAを抽出した。Total RNA を鋳型としてTaqMan（登録商標） MicroRNA RT Kitを用いて逆転写反応を行った。具体的には、8μLの逆転写反応液（10x RT buffer、0.08μLの 100mM dNTPs（dTTP含む）、0.1μLのRNAse-inhibitor (20 units/μL)、0.53μLのMultiScribeTM Reverse Transcriptase(50 units/μL)、1.6μLの各miRNA特異的 ステムループプライマー(hsa-miR-20b-5p, 001014; hsa-miR-126-3p, 002228; hsa-miR-451a, 001141; hsa-miR-144-3p, 4440887, RNU48 as Mature miRNA Control, 001006 ; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)、及び2.67μLの鋳型RNAを含む）を調製し、16℃で30分間インキュベートした後、42℃で30分間、続いて85℃で5分間インキュベートすることにより、逆転写反応を行った。続いて7900 Real-Time PCR system (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)を用いて、定量リアルタイムPCRを行った。具体的には、20μLのPCR反応液（20x TaqMan(R) MicroRNA Assays（PCRプライマー及びプローブ(5’-FAM and 3’-TAMRA) を含む）、1.5μLの逆転写反応物、及び10μLの2x TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) を調製し、50℃で2分間続いて95℃で10分間インキュベートした後、95℃で15秒間、続いて60℃で1分間インキュベートするというサイクルを50サイクル繰り返すことにより、PCR反応を行った。データは、自動でCtを設定できる解析ソフト（RQ Manager 1.2、Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を用いて解析した。
【００９４】
被検査対象者の各分類群における4種のmiRNAの発現量を図１〜１２に示す。
図１〜４は細胞診による各分類群における4種のmiRNAの発現量を示し、
図５〜８は組織診による各分類群における4種のmiRNAの発現量を示し、
図９〜１２はHPV検査による各分類群における4種のmiRNAの発現量を示す。
なお、分類群1はHPV陰性を示し、分類群2は31種のHPVのいずれかに陽性であることを示し、分類群3はHPV16又は18陽性を示し、分類群4は日本において子宮頸がん高リスクHPVといわれている7種のHPV：HPV16、18、31、33、45、52及び58のいずれかに陽性であることを示し、5は世界において子宮頸がん高リスクHPVといわれている13種のHPV：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59及び68のいずれかに陽性であることを示す。
【００９５】
図１〜８に示されるように、子宮頸がん群（SCC, AD）においては、他の群に比べてmiR-20b-5p、miR-126-3p、miR-144-3p、及びmiR-451aの発現量が高かった。
【００９６】
また、miR-20b-5p、miR-126-3p、miR-144-3p、及びmiR-451aの発現量は、HPV（特に子宮頸がん高リスクHPV）への感染群において亢進していた（図９〜１２）。
なお、図の縦軸は、miRNAの発現量を示し、分類群1を1とした場合の相対値を示す。
【００９７】
統計的解析は、R（The R Foundation for Statistical Computing）用のグラフィカルユーザーインターフェースであるEZR（自治医科大学）を用いて行った。EZRは、より具体的には、Rコマンダー（バージョン 1.35）の改変バージョンであり、生物統計学において頻用されている統計機能が追加されたものである。miR-20b-5p、miR-126-3p、miR-144-3p、及びmiR-451aそれぞれの発現量に基づいて、子宮頸がん群（SCC）と非子宮頸がん群とを判定するROC曲線グラフを描き、カットオフ値、ROC面積、感度、及び特異度を算出した。その結果、全てのmiRNAについて、ROC面積0.9以上、感度0.8以上、特異度0.9以上であった。子宮頸がん群（SCC及びAD）と非子宮頸がん群とを判定する場合についても同様の解析を行った結果、同様の結果が得られた。
【００９８】
本試験で得られた粘液は、通常は、細胞診用の細胞検体を採取する前に拭い取られたものである。上記試験より、廃棄されていた子宮頸腟部粘液が子宮頸がん検査用検体として有用であることが見出された。また、子宮頸腟部の粘液は腟内にも移行すると考えられ、このことから腟粘液も同様に子宮頸がん検査用検体として有用であると考えられた。さらに、これらの粘液中のmiR-20b-5p、miR-126-3p、miR-144-3p、及びmiR-451aは、子宮頸がんのバイオマーカーとして有用であることも分かった。
【００９９】
試験例2．子宮頸がんの検査2
試験例2-1．検体の調製
被検査対象者数を230とする以外は、試験例1-1と同様にして行った。
【０１００】
試験例2-2．被検査対象者の分類
1）細胞診によるベセスダ分類
試験例1-2と同様にして分類した。その結果、NILM（n＝39）、ASC-US（n＝10）、LSIL（n＝21）、HSIL（n＝75）、ASC-H（n＝8）、AGC(n=1), SCC（n＝24）、AD（n＝16）に分類された。AGCは腺異型細胞の存在を示す。その他の略号の意味は、試験例1-2における説明と同様である。
【０１０１】
2）組織診によるCIN分類
試験例1-2と同様にして分類した。その結果、normal（n＝56）、CIN1（n＝19）、CIN2（n＝33）、CIN3（n＝43）、SCC（n＝35）、AD（n＝19）に分類された。略号の意味は、試験例1-2における説明と同様である。
【０１０２】
3）ヒトパピローマウイルス（HPV）検査
試験例1-2と同様にして検査した。その結果、被検査対象者は、HPV陽性（n＝164）、HPV陰性（n＝66）に分類された。また、各種HPV（日本において子宮頸がん高リスクHPVといわれている7種のHPV：HPV16、18、31、33、45、52及び58、世界において子宮頸がん高リスクHPVといわれている13種のHPV：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59及び68）陽性の被検査対象者も分類した。
【０１０３】
なお、上記細胞診及び組織診の結果と合わせ、HPV陰性であり、且つ子宮頸がんである被検査対象者は7名であった。
【０１０４】
試験例2-3．miRNAの検出、定量
試験例1-3と同様にして検査、定量した。
【０１０５】
被検査対象者の各分類群における4種のmiRNAの発現量を図１３〜２４に示す。
図１３〜１６は細胞診による各分類群における4種のmiRNAの発現量を示し、
図１７〜２０は組織診による各分類群における4種のmiRNAの発現量を示し、
図２１〜２４はHPV検査による各分類群における4種のmiRNAの発現量を示す。
なお、分類群1〜4の意味は、試験例1-3における説明と同様である。
【０１０６】
図１３〜２４においては、図１〜１２と同様の傾向が見られた。また、図１３〜２０に示されるように、正常に比べCIN2,およびHSIL以上の病変で有意差を示して発現量が高かった。病変が前がん病変から浸潤がんへと進行するにつれ、発現量が高いことは、Jonckheere-Terpstra傾向解析で確認した。
【０１０７】
統計学的解析も、試験例1-3と同様に行った。カットオフ値はYoudenインデックスより算出した。その結果、全てのmiRNAについて、ROC面積0.91以上、感度0.83以上、特異度0.91以上であった（図２５）。子宮頸がん群（SCC及びAD）と非子宮頸がん群とを判定する場合についても同様の解析を行った結果、ROC面積0.89以上、感度0.74以上、特異度0.89以上であった（図２６）。CIN3以上の病変を検出する場合には、ROC面積0.80以上、感度0. 69以上、特異度0.77以上であった（図２７）。CIN2以上の病変を検出する場合には、ROC面積0.78以上、感度0.66以上、特異度0.70以上であった（図２８）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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