(57)【要約】【課題】幹細胞に対して優れた増殖促進活性を発揮する物質の提供。【解決手段】ｂＦＧＦ断片ペプチド、ＦＧＦレセプター結合ペプチド、ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチド、ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチド、又は、コリンエステラーゼ阻害剤、フェノチアジン誘導体、ステロイド、アセチルコリンレセプターアゴニスト及びプロスタグランジンレセプターアゴニストから選ばれる低分子化合物、並びにこれらを含む幹細胞培養用の培地等を提供する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ヘパリン結合領域含有ペプチドを含む、幹細胞培養用の培地。
【請求項２】
前記ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、請求項１記載の培地。
（Ａ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
【請求項３】
前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、請求項１又は２に記載の培地。
【請求項４】
前記幹細胞が、ヒト由来である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の培地。
【請求項５】
前記培地が無血清培地である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の培地。
【請求項６】
ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドを含む、幹細胞の増殖促進剤。
【請求項７】
前記ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、請求項６記載の増殖促進剤。
（Ａ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
【請求項８】
前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、請求項６又は７に記載の増殖促進剤。
【請求項９】
前記幹細胞が、ヒト由来である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の増殖促進剤。
【請求項１０】
ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する手順を含む、幹細胞の培養方法。
【請求項１１】
前記ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、請求項１０記載の培養方法。
（Ａ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
【請求項１２】
前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、請求項１０又は１１記載の培養方法。
【請求項１３】
前記幹細胞が、ヒト由来である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項１４】
前記培地が無血清培地である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項１５】
ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する工程を含む、幹細胞を含む細胞組成物の製造方法。
【請求項１６】
前記ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、請求項１５記載の製造方法。
（Ａ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
【請求項１７】
前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、請求項１５又は１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記幹細胞が、ヒト由来である、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１９】
前記培地が無血清培地である、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２０】
ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する工程と、幹細胞の分化を誘導する工程、とを含む、分化細胞を含む細胞組成物の製造方法。
【請求項２１】
前記ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、請求項２０記載の製造方法。
（Ａ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
【請求項２２】
前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、請求項２０又は２１に記載の製造方法。
【請求項２３】
前記幹細胞が、ヒト由来である、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２４】
前記培地が無血清培地である、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２５】
ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドと、幹細胞及び／又は幹細胞から誘導された分化細胞と、を含む細胞組成物。
【請求項２６】
前記ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、請求項２５記載の細胞組成物。
（Ａ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
【請求項２７】
前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、請求項２５又は２６に記載の細胞組成物。
【請求項２８】
前記幹細胞が、ヒト由来である、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の細胞組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞の培養用培地、増殖促進剤及び培養方法、並びに幹細胞を含む細胞組成物及びその製造方法に関する。より詳しくは、幹細胞に対して優れた増殖促進活性を発揮する物質を含む、幹細胞培養用の培地等に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療分野における課題の一つとして、目的の細胞をより効率的に増殖させることが求められている。幹細胞に対する有効な増殖因子の一つとして塩基性線維芽細胞増殖因子（以下ｂＦＧＦと記載するが、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２とも称する）が広く用いられている（非特許文献１）。一方で、ｂＦＧＦは非常に高価であるため、幹細胞を大量に培養する場合には、培地に添加するｂＦＧＦのコストが問題となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−１３７８９９号公報
【特許文献２】特開２００５−１５４３３８号公報
【特許文献３】特開２００９−２０９０６４号公報
【特許文献４】特開２０１５−１２８４３１号公報
【特許文献５】国際公開第２００７／０３２０２９号
【特許文献６】特開昭６２−２５９５９８号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２００５，２３，８，ｐ．１２００−１２１１
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８８，８５，７，ｐ．２３２４−２３２８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のとおり、ｂＦＧＦは非常に高価であるため、その代替物質の開発が行われているが（例えば、特許文献１〜４）、幹細胞に対して十分な増殖促進機能を有する物質は得られていない。
【０００６】
そこで、本発明は、幹細胞に対して優れた増殖促進活性を発揮する物質を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
［ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチド］
上記課題解決のため、本発明は、以下の［１］〜［２８］を提供する。
［１］  ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドを含む、幹細胞培養用の培地。
［２］  前記ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、［１］の培地。
（Ａ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
［３］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［１］又は［２］の培地。
［４］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［１］〜［３］のいずれかの培地。
［５］  前記培地が無血清培地である、［１］〜［４］のいずれかの培地。
［６］  ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドを含む、幹細胞の増殖促進剤。
［７］  前記ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、［６］の増殖促進剤。
（Ａ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
［８］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［６］又は［７］の増殖促進剤。
［９］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［６］〜［８］のいずれかの増殖促進剤。
［１０］  ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する手順を含む、幹細胞の培養方法。
［１１］  前記ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、［１０］の培養方法。
（Ａ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
［１２］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［１０］又は［１１］の培養方法。
［１３］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［１０］〜［１２］のいずれかの培養方法。
［１４］  前記培地が無血清培地である、［１０］〜［１３］のいずれかの培養方法。
［１５］  ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する工程を含む、幹細胞を含む細胞組成物の製造方法。
［１６］  前記ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、［１５］の製造方法。
（Ａ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
［１７］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［１５］又は［１６］の製造方法。
［１８］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［１５］〜［１７］のいずれかの製造方法。
［１９］  前記培地が無血清培地である、［１５］〜［１８］のいずれかの製造方法。
［２０］  ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する工程と、幹細胞の分化を誘導する工程、とを含む、分化細胞を含む細胞組成物の製造方法。
［２１］  前記ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、［２０］の製造方法。
（Ａ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
［２２］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［２０］又は［２１］の製造方法。
［２３］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［２０］〜［２２］のいずれかの製造方法。
［２４］  前記培地が無血清培地である、［２０］〜［２３］のいずれかの製造方法。
［２５］  ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドと、幹細胞及び／又は幹細胞から誘導された分化細胞と、を含む細胞組成物。
［２６］  前記ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、［２５］の細胞組成物。
（Ａ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
［２７］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［２５］又は［２６］の細胞組成物。
［２８］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［２５］〜［２７］のいずれかの細胞組成物。
【０００８】
［ｂＦＧＦ断片ペプチド］
また、本発明は、以下の［２９］〜［５６］を提供する。
［２９］  ｂＦＧＦ断片ペプチドを含む、幹細胞培養用の培地。
［３０］  前記ｂＦＧＦ断片ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、［２９］の培地。
（Ａ）配列番号２，５，１６に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号２，５，１６に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
［３１］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［２９］又は［３０］の培地。
［３２］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［２９］〜［３１］のいずれかの培地。
［３３］  前記培地が無血清培地である、［２９］〜［３２］のいずれかの培地。
［３４］  ｂＦＧＦ断片ペプチドを含む、幹細胞の増殖促進剤。
［３５］  前記ｂＦＧＦ断片ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、［３４］の増殖促進剤。
（Ａ）配列番号２，５，１６に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号２，５，１６に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
［３６］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［３４］又は［３５］の増殖促進剤。
［３７］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［３４］〜［３６］のいずれかの増殖促進剤。
［３８］  ｂＦＧＦ断片ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する手順を含む、幹細胞の培養方法。
［３９］  前記ｂＦＧＦ断片ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、［３８］の培養方法。
（Ａ）配列番号２，５，１６に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号２，５，１６に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
［４０］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［３８］又は［３９］の培養方法。
［４１］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［３８］〜［４０］のいずれかの培養方法。
［４２］  前記培地が無血清培地である、［３８］〜［４１］のいずれかの培養方法。
［４３］  ｂＦＧＦ断片ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する工程を含む、幹細胞を含む細胞組成物の製造方法。
［４４］  前記ｂＦＧＦ断片ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、［４３］の製造方法。
（Ａ）配列番号２，５，１６に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号２，５，１６に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
［４５］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［４３］又は［４４］の製造方法。
［４６］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［４３］〜［４５］のいずれかの製造方法。
［４７］  前記培地が無血清培地である、［４３］〜［４６］のいずれかの製造方法。
［４８］  ｂＦＧＦ断片ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する工程と、幹細胞の分化を誘導する工程、とを含む、分化細胞を含む細胞組成物の製造方法。
［４９］  前記ｂＦＧＦ断片ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、［４８］の製造方法。
（Ａ）配列番号２，５，１６に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号２，５，１６に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
［５０］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［４８］又は［４９］の製造方法。
［５１］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［４８］〜［５０］のいずれかの製造方法。
［５２］  前記培地が無血清培地である、［４８］〜［５１］のいずれかの製造方法。
［５３］  ｂＦＧＦ断片ペプチドと、幹細胞及び／又は幹細胞から誘導された分化細胞と、を含む細胞組成物。
［５４］  ｂＦＧＦ断片ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、［５３］の細胞組成物。
（Ａ）配列番号２，５，１６に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号２，５，１６に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
［５５］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［５３］又は［５４］の細胞組成物。
［５６］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［５３］〜［５５］のいずれかの細胞組成物。
【０００９】
［ＦＧＦレセプター結合ペプチド］
さらに、本発明は、以下の［５７］〜［８４］を提供する。
［５７］  ＦＧＦレセプター結合ペプチドを含む、幹細胞培養用の培地。
［５８］  前記ＦＧＦレセプター結合ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、［５７］の培地。
（Ａ）配列番号１１〜１４に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１１〜１４に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
［５９］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［５７］又は［５８］の培地。
［６０］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［５７］〜［５９］のいずれかの培地。
［６１］  前記培地が無血清培地である、［５７］〜［６０］のいずれかの培地。
［６２］  ＦＧＦレセプター結合ペプチドを含む、幹細胞の増殖促進剤。
［６３］  前記ＦＧＦレセプター結合ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、［６２］の増殖促進剤。
（Ａ）配列番号１１〜１４に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１１〜１４に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
［６４］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［６２］又は［６３］の増殖促進剤。
［６５］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［６２］〜［６４］のいずれかの増殖促進剤。
［６６］  ＦＧＦレセプター結合ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する手順を含む、幹細胞の培養方法。
［６７］  前記ＦＧＦレセプター結合ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、［６６］の培養方法。
（Ａ）配列番号１１〜１４に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１１〜１４に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
［６８］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［６６］又は［６７］の培養方法。
［６９］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［６６］〜［６８］のいずれかの培養方法。
［７０］  前記培地が無血清培地である、［６６］〜［６９］のいずれかの培養方法。
［７１］  ＦＧＦレセプター結合ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する工程を含む、幹細胞を含む細胞組成物の製造方法。
［７２］  前記ＦＧＦレセプター結合ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、［７１］の製造方法。
（Ａ）配列番号１１〜１４に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１１〜１４に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
［７３］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［７１］又は［７２］の製造方法。
［７４］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［７１］〜［７３］のいずれかの製造方法。
［７５］  前記培地が無血清培地である、［７１］〜［７４］のいずれかの製造方法。
［７６］  ｂＦＧＦレセプター結合ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する工程と、幹細胞の分化を誘導する工程、とを含む、分化細胞を含む細胞組成物の製造方法。
［７７］  前記ＦＧＦレセプター結合ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、［７６］の製造方法。
（Ａ）配列番号１１〜１４に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１１〜１４に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
［７８］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［７６］又は［７７］のいずれかの製造方法。
［７９］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［７６］〜［７８］のいずれかの製造方法。
［８０］  前記培地が無血清培地である、［７６］〜［７９］のいずれかの製造方法。
［８１］  ＦＧＦレセプター結合ペプチドと、幹細胞及び／又は幹細胞から誘導された分化細胞と、を含む細胞組成物。
［８２］  前記ＦＧＦレセプター結合ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、［８１］の細胞組成物。
（Ａ）配列番号１１〜１４に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１１〜１４に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
［８３］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［８１］又は［８２］の細胞組成物。
［８４］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［８１］〜［８３］のいずれかの細胞組成物。
【００１０】
［ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチド］
本発明は、以下の［８５］〜［１１２］をも提供する。
［８５］  ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチドを含む、幹細胞培養用の培地。
［８６］  前記ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、［８５］の培地。
（Ａ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
［８７］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［８５］又は［８６］の培地。
［８８］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［８５］〜［８７］のいずれかの培地。
［８９］  前記培地が無血清培地である、［８５］〜［８８］のいずれかの培地。
［９０］  ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチドを含む、幹細胞の増殖促進剤。
［９１］  前記ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、［９０］の増殖促進剤。
（Ａ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
［９２］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［９０］又は［９１］の増殖促進剤。
［９３］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［９０］〜［９２］のいずれかの増殖促進剤。
［９４］  ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する手順を含む、幹細胞の培養方法。
［９５］  前記ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、［９４］の培養方法。
（Ａ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
［９６］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［９４］又は［９５］の培養方法。
［９７］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［９４］〜［９６］のいずれかの培養方法。
［９８］  前記培地が無血清培地である、［９４］〜［９７］のいずれかの培養方法。
［９９］  ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する工程を含む、幹細胞を含む細胞組成物の製造方法。
［１００］  前記ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、［９９］の製造方法。
（Ａ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
［１０１］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［９９］又は［１００］の製造方法。
［１０２］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［９９］〜［１０１］のいずれかの製造方法。
［１０３］  前記培地が無血清培地である、［９９］〜［１０２］のいずれかの製造方法。
［１０４］  ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する工程と、幹細胞の分化を誘導する工程、とを含む、分化細胞を含む細胞組成物の製造方法。
［１０５］  前記ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、［１０４］の製造方法。
（Ａ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
［１０６］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［１０４］又は［１０５］の製造方法。
［１０７］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［１０４］〜［１０６］のいずれかの製造方法。
［１０８］  前記培地が無血清培地である、［１０４］〜［１０７］のいずれかの製造方法。
［１０９］  ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチドと、幹細胞及び／又は幹細胞から誘導された分化細胞と、を含む細胞組成物。
［１１０］  前記ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチドが、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドである、［１０９］の細胞組成物。
（Ａ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｂ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
［１１１］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［１０９］又は［１１０］の細胞組成物。
［１１２］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［１０９］〜［１１１］のいずれかの細胞組成物。
【００１１】
［低分子化合物］
併せて、本発明は、以下の［１１３］〜［１４０］を提供する。
［１１３］  コリンエステラーゼ阻害剤、フェノチアジン誘導体、ステロイド、アセチルコリンレセプターアゴニスト、及びプロスタグランジンレセプターアゴニストからなる群より選ばれる１以上の低分子化合物を含む、幹細胞培養用の培地。
［１１４］  前記低分子化合物が、Ｅｐｉｂｏｘｉｄｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅからなる、［１１３］の培地。
［１１５］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［１１３］又は［１１４］の培地。
［１１６］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［１１３］〜［１１５］のいずれかの培地。
［１１７］  前記培地が無血清培地である、［１１３］〜［１１６］のいずれかの培地。
［１１８］  コリンエステラーゼ阻害剤、フェノチアジン誘導体、ステロイド、アセチルコリンレセプターアゴニスト、及びプロスタグランジンレセプターアゴニストからなる群より選ばれる１以上の低分子化合物を含む、幹細胞の増殖促進剤。
［１１９］  前記低分子化合物が、Ｅｐｉｂｏｘｉｄｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅからなる、［１１８］の増殖促進剤。
［１２０］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［１１８］又は［１１９］の増殖促進剤。
［１２１］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［１１８］〜［１２０］のいずれかの増殖促進剤。
［１２２］  コリンエステラーゼ阻害剤、フェノチアジン誘導体、ステロイド、アセチルコリンレセプターアゴニスト、及びプロスタグランジンレセプターアゴニストからなる群より選ばれる１以上の低分子化合物を含む培地で幹細胞を培養する手順を含む、幹細胞の培養方法。
［１２３］  前記低分子化合物が、Ｅｐｉｂｏｘｉｄｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅからなる、［１２２］の培養方法。
［１２４］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［１２２］又は［１２３］の培養方法。
［１２５］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［１２２］〜［１２４］のいずれかの培養方法。
［１２６］  前記培地が無血清培地である、［１２２］〜［１２５］のいずれかの培養方法。
［１２７］  コリンエステラーゼ阻害剤、フェノチアジン誘導体、ステロイド、アセチルコリンレセプターアゴニスト、及びプロスタグランジンレセプターアゴニストからなる群より選ばれる１以上の低分子化合物を含む培地で幹細胞を培養する工程を含む、幹細胞を含む細胞組成物の製造方法。
［１２８］  前記低分子化合物が、Ｅｐｉｂｏｘｉｄｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅからなる、［１２７］の製造方法。
［１２９］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［１２７］又は［１２８］の製造方法。
［１３０］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［１２７］〜［１２９］のいずれかの製造方法。
［１３１］  前記培地が無血清培地である、［１２７］〜［１３０］のいずれかの製造方法。
［１３２］  コリンエステラーゼ阻害剤、フェノチアジン誘導体、ステロイド、アセチルコリンレセプターアゴニスト、及びプロスタグランジンレセプターアゴニストからなる群より選ばれる１以上の低分子化合物を含む培地で幹細胞を培養する工程と、幹細胞の分化を誘導する工程、とを含む、分化細胞を含む細胞組成物の製造方法。
［１３３］  前記低分子化合物が、Ｅｐｉｂｏｘｉｄｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅからなる、［１３２］の製造方法。
［１３４］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［１３２］又は［１３３］の製造方法。
［１３５］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［１３２］〜［１３４］のいずれかの製造方法。
［１３６］  前記培地が無血清培地である、［１３２］〜［１３５］のいずれかの製造方法。
［１３７］  コリンエステラーゼ阻害剤、フェノチアジン誘導体、ステロイド、アセチルコリンレセプターアゴニスト、及びプロスタグランジンレセプターアゴニストからなる群より選ばれる１以上の低分子化合物と、幹細胞及び／又は幹細胞から誘導された分化細胞と、を含む細胞組成物。
［１３８］  前記低分子化合物が、Ｅｐｉｂｏｘｉｄｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅからなる、［１３７］の細胞組成物。
［１３９］  前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞又は間葉系幹細胞である、［１３７］又は［１３８］の細胞組成物。
［１４０］  前記幹細胞が、ヒト由来である、［１３７］〜［１３９］のいずれかの細胞組成物。
【００１２】
本発明において、「ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチド」は、ｂＦＧＦのヘパリン結合領域を含有するヒトｂＦＧＦ全長ペプチド（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：ＮＰ＿００１９９７）やマウスｂＦＧＦ全長ペプチド（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：ＮＰ＿０３２０３２）等のｂＦＧＦの部分ペプチドを意味する。
「ｂＦＧＦ断片ペプチド」は、ｂＦＧＦのヘパリン結合領域を含まない、ｂＦＧＦの部分ペプチドを意味する。
【００１３】
また、「ＦＧＦレセプター結合ペプチド」は、ＦＧＦレセプターへ結合するペプチドであって、ｂＦＧＦに由来しないアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。
「ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチド」は、ｂＦＧＦと結合してｂＦＧＦ複合体タンパク質を形成し、ｂＦＧＦのｂＦＧＦレセプターへの結合親和性を高める機能を有するタンパク質（ｂＦＧＦ結合タンパク質）の部分ペプチドを意味する。
【００１４】
本発明において、「幹細胞の増殖を促進する活性」とは、ある物質について、当該物質の存在下で培養される幹細胞の生存及び増殖が、当該物質の非存在下で培養される幹細胞の生存及び増殖に比して促進されることを意味する。具体的には、当該物質の存在下で一定期間培養した後の幹細胞数が、当該物質の非存在下で同期間培養した後の幹細胞数に比べて、５％以上、１０％以上又は２０％以上、好ましくは３０％以上、４０％以上、５０％以上、より好ましくは６０％以上、７０％以上又は８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、１００％以上又はそれ以上増加することを意味する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、幹細胞に対して優れた増殖促進活性を発揮する物質が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ｂＦＧＦ代替物の候補物質の細胞増殖促進活性を評価した結果を示す図である。縦軸は、陰性コントロール（図中「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）の平均値を１とした細胞数の相対値を示す。
【図２】ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドのｉＰＳ細胞増殖促進活性を評価した結果を示す図である（実施例１）。縦軸は、コントロールの平均値を１とした細胞数の相対値を示す（＊：Ｐ＜０．０５，ｎ＝３）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１８】
１．ｂＦＧＦ代替物
本発明に係る幹細胞培養用の培地は、幹細胞の増殖を促進することを目的として、従来用いられているｂＦＧＦに替わる物質（以下「ｂＦＧＦ代替物」と称する）を含有することを特徴とする。ただし、「ｂＦＧＦ代替物」との用語は、ｂＦＧＦに代替的に用いることが可能であることを意味するものであり、ｂＦＧＦ代替物がｂＦＧＦとともに用いられることを排除する趣旨ではない。すなわち、ｂＦＧＦ代替物は、ｂＦＧＦとともに用いることも可能である。幹細胞に対して優れた増殖促進活性を発揮するｂＦＧＦ代替物としては、ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチド、ｂＦＧＦ断片ペプチド、ＦＧＦレセプター結合ペプチド、ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチド、又は特定の低分子化合物が挙げられる。これらのｂＦＧＦ代替物は、幹細胞に対し、優れた増殖促進活性を発揮し、増殖促進剤として機能し得る。以下、これらのｂＦＧＦ代替物について順に説明する。
【００１９】
（１）ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチド
「ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチド」は、ｂＦＧＦのヘパリン結合領域を含有する、ｂＦＧＦの部分ペプチドを意味する。ｂＦＧＦは、ヘパラン硫酸と強く結合するドメイン（ヘパリン結合領域）を有することが知られており、マウスｂＦＧＦ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：ＮＰ＿０３２０３２）のＮ末端から１６６〜２１０番目のアミノ酸の部位及び２３５〜２６２番目のアミノ酸の部位が当該ドメインに相当する（非特許文献２）。
【００２０】
幹細胞自身から分泌されるｂＦＧＦや培地中に添加されたｂＦＧＦがヘパリン硫酸に吸着すると、ｂＦＧＦの幹細胞に対する増殖促進機能が阻害されるおそれがある。ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドは、幹細胞自身から分泌されるｂＦＧＦや培地中に添加されたｂＦＧＦがヘパリン硫酸に吸着するのを競合的に阻害することよって、幹細胞の生存及び増殖を促進している可能性が考えられる。
【００２１】
ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドの由来種は、幹細胞増殖促進活性を有する限り特に限定されず、ヒトの他、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類であってよい。
【００２２】
ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドの長さは、アミノ酸残基数で、好ましくは９〜１９であるが、幹細胞増殖促進活性が維持される限りにおいて、９以下又は１９以上であってもよく、例えば４〜９又は１９〜５０程度であってよい。ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドは、幹細胞増殖促進活性が維持される限りにおいて、アミノ酸残基の側鎖及び／又はアミノ末端及び／又はカルボキシ末端に従来公知の修飾基や保護基を有していてもよい。
【００２３】
ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドの具体例としては、例えば、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドが挙げられる。
（Ａ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド、好ましくは配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列からなるペプチド。
（Ｂ）配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド、好ましくは配列番号１，３，４，６〜１０に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
【００２４】
上記（Ａ）及び（Ｂ）に関し、特に好ましいｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドは、マウスｂＦＧＦのｍａｔｕｒｅ体のＮ末端から１０６〜１１５番目のアミノ酸配列「ＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹ」（配列番号１）からなるペプチドが挙げられる。配列番号１に示されるアミノの酸配列からなるペプチドは、ＦＧＦ拮抗物質（特許文献６）として報告されており、これを用いた皮膚のシワ低減方法（特許文献５）が提案されているが、当該ペプチドが幹細胞の増殖を促進することはこれまで知られていない。
【００２５】
上記（Ｂ）に関し、欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸数は、１０個以下、好ましくは７個以下、より好ましくは５個以下、最も好ましくは１又は２個である。
【００２６】
「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により欠失、置換、挿入又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下、最も好ましくは１又は２個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を意味する。
【００２７】
タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、当該タンパク質の構造又は機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、天然に存在するタンパク質において、当該タンパク質の構造又は機能を有意に変化させない多型（ポリモルフィズム）が存在することもまた周知である。従って、「１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列」には、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に変異を導入して得られる改変配列に加えて、天然に存在する多型配列も含まれる。
【００２８】
（２）ｂＦＧＦ断片ペプチド
「ｂＦＧＦ断片ペプチド」は、ｂＦＧＦのヘパリン結合領域を含まない、ｂＦＧＦの部分ペプチドを意味する。
【００２９】
ｂＦＧＦ断片ペプチドの由来種は、幹細胞増殖促進活性を有する限り特に限定されず、ヒトの他、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類であってよい。
【００３０】
ｂＦＧＦ断片ペプチドの長さは、アミノ酸残基数で、好ましくは１５〜２５であるが、幹細胞増殖促進活性が維持される限りにおいて、１５以下又は２５以上であってもよく、例えば９〜１５又は２５〜５０程度であってよい。ｂＦＧＦ断片ペプチドは、幹細胞増殖促進活性が維持される限りにおいて、アミノ酸残基の側鎖及び／又はアミノ末端及び／又はカルボキシ末端に従来公知の修飾基や保護基を有していてもよい。
【００３１】
ｂＦＧＦ断片ペプチドの具体例としては、例えば、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドが挙げられる。
（Ａ）配列番号２，５，１６に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド、好ましくは配列番号２，５，１６に示されるいずれか一つのアミノ酸配列からなるペプチド。
（Ｂ）配列番号２，５，１６に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド、好ましくは配列番号２，５，１６に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
【００３２】
上記（Ｂ）に関し、欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸数は、１０個以下、好ましくは５個以下、より好ましくは３個以下、最も好ましくは１又は２個である。
【００３３】
「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により欠失、置換、挿入又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下、最も好ましくは１又は２個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を意味する。
【００３４】
タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、当該タンパク質の構造又は機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、天然に存在するタンパク質において、当該タンパク質の構造又は機能を有意に変化させない多型（ポリモルフィズム）が存在することもまた周知である。従って、「１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列」には、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に変異を導入して得られる改変配列に加えて、天然に存在する多型配列も含まれる。
【００３５】
（３）ＦＧＦレセプター結合ペプチド
「ＦＧＦレセプター結合ペプチド」は、ＦＧＦレセプターへ結合するペプチドであって、ｂＦＧＦに由来しないアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。
【００３６】
ＦＧＦレセプター結合ペプチドは、幹細胞増殖促進活性を有する限り特に限定されず、ヒトのＦＧＦレセプターに結合するものの他、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類などのＦＧＦレセプターに結合するものであってよい。
【００３７】
ｂＦＧＦ断片ペプチドの長さは、アミノ酸残基数で、好ましくは１４〜２９であるが、幹細胞増殖促進活性が維持される限りにおいて、１４以下又は２９以上であってもよく、例えば９〜１４又は２９〜１０５程度であってよい。ｂＦＧＦ断片ペプチドは、幹細胞増殖促進活性が維持される限りにおいて、アミノ酸残基の側鎖及び／又はアミノ末端及び／又はカルボキシ末端に従来公知の修飾基や保護基を有していてもよい。
【００３８】
ｂＦＧＦ断片ペプチドの具体例としては、例えば、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドが挙げられる。
（Ａ）配列番号１１〜１４に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチド、好ましくは配列番号１１〜１４に示されるいずれか一つのアミノ酸配列からなるペプチド。
（Ｂ）配列番号１１〜１４に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド、好ましくは配列番号１１〜１４に示されるいずれか一つのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
【００３９】
上記（Ｂ）に関し、欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸数は、１０個以下、好ましくは５個以下、より好ましくは３個以下、最も好ましくは１又は２個である。
【００４０】
「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により欠失、置換、挿入又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下、最も好ましくは１又は２個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を意味する。
【００４１】
タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、当該タンパク質の構造又は機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、天然に存在するタンパク質において、当該タンパク質の構造又は機能を有意に変化させない多型（ポリモルフィズム）が存在することもまた周知である。従って、「１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列」には、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に変異を導入して得られる改変配列に加えて、天然に存在する多型配列も含まれる。
【００４２】
（４）ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチド
「ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチド」は、ｂＦＧＦと結合してｂＦＧＦ複合体タンパク質を形成し、ｂＦＧＦのｂＦＧＦレセプターへの結合親和性を高める機能を有するタンパク質（ｂＦＧＦ結合タンパク質）の部分ペプチドを意味する。
【００４３】
ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチドの由来種は、幹細胞増殖促進活性を有する限り特に限定されず、ヒトの他、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類であってよい。
【００４４】
ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチドの長さは、アミノ酸残基数で、好ましくは４１〜４３であるが、幹細胞増殖促進活性が維持される限りにおいて、４１以下又は４３以上であってもよく、例えば３４〜４１又は４３〜５０程度であってよい。ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチドは、幹細胞増殖促進活性が維持される限りにおいて、アミノ酸残基の側鎖及び／又はアミノ末端及び／又はカルボキシ末端に従来公知の修飾基や保護基を有していてもよい。
【００４５】
ｂＦＧＦ結合タンパク質の具体例としては、例えばＦＧＦ−ＢＰ１タンパク質が挙げられ、ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチドの具体例としては、例えばヒトＦＧＦ−ＢＰ１タンパク質の部分ペプチドに由来する以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のペプチドが挙げられる。
（Ａ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むペプチド、好ましくは配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（Ｂ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド、好ましくは配列番号１５に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、幹細胞の増殖を促進する活性を有するペプチド。
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）に記載のペプチドが二量体化されたペプチド。
【００４６】
上記（Ｂ）に関し、欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸数は、１０個以下、好ましくは５個以下、より好ましくは３個以下、最も好ましくは１又は２個である。
【００４７】
「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により欠失、置換、挿入又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下、最も好ましくは１又は２個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を意味する。
【００４８】
タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、当該タンパク質の構造又は機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、天然に存在するタンパク質において、当該タンパク質の構造又は機能を有意に変化させない多型（ポリモルフィズム）が存在することもまた周知である。従って、「１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列」には、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に変異を導入して得られる改変配列に加えて、天然に存在する多型配列も含まれる。
【００４９】
以上に説明した各ペプチドは、従来公知の化学的手法又は遺伝子工学的手法により調製することができる。
化学的合成方法としては、例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ジクロロメタン法、活性エステル法、カルボイミダゾール法又は酸化還元法等が挙げられる。合成方法は、固相合成法および液相合成法のいずれをも適用することができ、自動ペプチド合成機が用いられてもよい。
ペプチドへの修飾基又は保護基の結合も従来公知の手法によって行えばよく、ペプチド合成後に化学修飾等する方法、化学修飾等されたアミノ酸を用いてペプチド合成する方法、ペプチド合成の最終脱保護の反応条件を適当に選ぶ方法等を適用できる。
【００５０】
遺伝子工学的手法としては、従来公知の手法により、ペプチドをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入して組換えベクターを作製し、該組換えベクターを適当な宿主細胞に導入し発現させることにより製造できる。
【００５１】
ペプチドの精製も、従来公知の手法によって行うことができ、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー又は再結晶等を必要に応じて組み合わせて行なうことができる。
【００５２】
（５）低分子化合物
低分子化合物としては、コリンエステラーゼ阻害剤、フェノチアジン誘導体、ステロイド、アセチルコリンレセプターアゴニスト、及びプロスタグランジンレセプターアゴニストからなる群より選ばれる１以上の化合物が挙げられる。
【００５３】
コリンエステラーゼ阻害剤としては、例えばＥｔｈｏｐｒｏｐａｚｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ等が挙げられる。
【００５４】
フェノチアジン誘導体としては、例えばＡｃｅｐｒｏｍａｚｉｎｅ  ｍａｌｅａｔｅ、Ｂｅｎｚｏｙｌ  ｌｅｕｃｏ  ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｌｕｅ、Ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｍｅｓｏｒｉｄａｚｉｎｅ  ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ、Ｐｅｒｐｈｅｎａｚｉｎｅ、Ｐｒｏｍａｚｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｒｉｄｅ、Ｐｒｏｍｅｔｈａｚｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ等が挙げられる。
【００５５】
ステロイドとしては例えば、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ等が挙げられる。
【００５６】
アセチルコリンレセプターアゴニストとしては、例えばＥｐｉｂｏｘｉｄｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ等が挙げられる。
【００５７】
プロスタグランジンレセプターアゴニストとしては、例えばＦｌｕｐｒｏｓｔｅｎｏｌ等が挙げられる。
【００５８】
これらの低分子化合物のなかで、アセチルコリンレセプターアゴニストが好ましく、特にＥｐｉｂｏｘｉｄｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅが好ましい。
【００５９】
（６）ｂＦＧＦ代替物のスクリーニング方法
マウス胎児線維芽細胞は、細胞膜表面にＦＧＦＲ１を発現している。ＦＧＦＲ１はｂＦＧＦの結合により活性化されることが知られており、上記細胞はｂＦＧＦ組換えタンパク質の活性を評価するためのアッセイ系に用いられている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  １９８８，  Ａｕｇ  １，４８（１５），ｐ．４２６６−７１）。ｂＦＧＦ代替物のスクリーニング評価においても同アッセイ系を用いることができる。マウス胎児線維芽細胞としては、例えばＢＡＬＢ／３Ｔ３  ｃｌｏｎｅ  Ａ３１などが公知である。
【００６０】
２．幹細胞培養用の培地
［基礎培地］
本発明に係る幹細胞培養用の培地の組成は、上記のｂＦＧＦ代替物を含有する点を除いて、従来幹細胞培養に用いられている培地と同様であってよい。すなわち、本発明に係る培地は、動物組織に由来する細胞の培養に従来用いられている基礎培地にｂＦＧＦ代替物を添加することにより調製できる。基礎培地として具体的には以下を挙げることができる。
【００６１】
ＲＰＭＩ-１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地、Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ  ＭＥＭ培地、α-ＭＥＭ培地、１９９培地、ＩＭＤＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ培地、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ培地（インビトロジェン社）、Ｈａｍ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｆ-１２、Ｈａｍ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｆ-１０、  Ｈａｍ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｆ１２Ｋ、ＡＴＣＣ-ＣＲＣＭ３０、ＤＭ-１６０、ＤＭ-２０１、ＢＭＥ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ-１５、ＲＩＴＣ８０-７、ＭＣＤＢ１０５、ＭＣＤＢ１０７、ＭＣＤＢ１３１、ＭＣＤＢ１５３、ＭＣＤＢ２０１、ＮＣＴＣ１０９、ＮＣＴＣ１３５、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ  ＭＢ７５２／１、ＣＭＲＬ-１０６６、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’  ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ’ｓ  ＢＭＯＣ-３  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８  Ｍｅｄｉｕｍ（以上サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ｍＴｅＳＲ１（ステムセルテクノロジーズ社）、ＴｅＳＲ−Ｅ８  ｍｅｄｉｕｍ（ステムセルテクノロジーズ社）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（和光純薬社）、ｍＥＳＦ培地（和光純薬社）、ＳｔｅｍＦｉｔ（味の素社）、Ｓ−ｍｅｄｉｕｍ（ＤＳファーマ社）、ＲｅｐｒｏＸＦ（リプロセル社）、ＰＳＧｒｏ-ｆｒｅｅ  Ｈｕｍａｎ  ｉＰＳＣ/ＥＳＣ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＲＤ社）、ｈＰＳＣ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（タカラバイオ社）、ＲｅｐｒｏＦＦ２（リプロセル社）、ＥＸ-ＣＥＬＬ  ３０２培地（ＳＡＦＣ社）、ＥＸ-ＣＥＬＬ-ＣＤ-ＣＨＯ（ＳＡＦＣ社）又はＳＴＥＭｄｉｆｆ  ＡＰＥＬ  Ｍｅｄｉｕｍ（ステムセルテクノロジーズ社）など及びこれらの混合物。
【００６２】
［ｂＦＧＦ代替物の添加］
ｂＦＧＦ代替物は単独で培地に添加されてもよく、複数を組み合せて培地に添加されてもよい。また、ｂＦＧＦ代替物は、ｂＦＧＦに加えて添加されてもよい。ｂＦＧＦ代替物の添加濃度は、幹細胞増殖促進活性を示す限り特に限定されないが、例えば１〜５００μＭ、好ましくは５〜２５０μＭ、より好ましくは１０〜２００μＭである。
【００６３】
ｂＦＧＦ代替物としてｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチド、ｂＦＧＦ断片ペプチド、あるいはｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチドを用いる場合、当該ペプチドの由来種は、培養する幹細胞の由来種に応じて適宜選択することができ、好ましくは培養する幹細胞と同じ種とされる。例えば、ヒト由来の細胞を培養する場合は、ヒト由来のｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチド等を用いるのが好ましい。また、ＦＧＦレセプター結合ペプチドは、培養する幹細胞の由来種に応じて、その種のＦＧＦレセプターに結合するペプチドを適宜選択すればよい。
【００６４】
［ｂＦＧＦ代替物以外の添加物］
培地には、細胞の生存又は増殖に必要な生理活性物質及び／又は栄養因子等を添加できる。これらの添加物は、培地に予め添加されていてもよく、細胞培養中に添加されてもよい。培養中に添加する方法は、１溶液または２種以上の混合溶液などいかなる形態によってもよく、連続的または断続的な添加であってもよい。
【００６５】
生理活性物質としては、インシュリン、ＩＧＦ−１、トランスフェリン、アルブミンまたは補酵素Ｑ10などが挙げられる。
栄養因子としては、糖、アミノ酸、ビタミン、加水分解物または脂質などが挙げられる。
糖としては、グルコース、マンノースまたはフルクトースなどの中性糖、シアル酸などの酸性糖、アミノ糖又は糖アルコールなどが挙げられ、１種または２種以上を組み合わせて用いられる。
アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンまたはＬ−バリンなどが挙げられ、１種または２種以上を組み合わせて用いられる。
ビタミンとしては、ｄ−ビオチン、Ｄ−パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピロドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミンまたはＤＬ−α―トコフェロールなどが挙げられ、１種または２種以上を組み合わせて用いられる。
加水分解物としては、大豆、小麦、米、えんどう豆、とうもろこし、綿実、酵母抽出物などを加水分解したものが挙げられる。
脂質としては、コレステロール、リノール酸またはリノレイン酸などが挙げられる。
【００６６】
さらに、培地には、カナマイシン、ストレプトマイシン、ペニシリン又はハイグロマイシンなどの抗生物質を必要に応じて添加してもよい。シアル酸等の酸性物質を培地に添加する場合には、培地のｐＨを細胞の成育に適した中性域であるｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８に調整することが望ましい。
【００６７】
［血清等の添加］
本発明に係る培地は、血清含培地であっても無血清培地であってもよい。異種動物由来成分の混入防止の観点からは血清を含有しないか、培養される幹細胞と同種動物由来の血清が用いられることが好ましい。
【００６８】
ここで、無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。無血清培地は、精製された血液由来成分や増殖因子などの動物組織由来成分や遺伝子組換え技術により生産されたタンパク質、もしくは、合成されたペプチドを含有していてもよい。
【００６９】
本発明に係る培地は、血清と同様に、血清代替物を含んでいても含んでいなくともよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、脂質リッチアルブミン及び組換えアルブミン等のアルブミン代替物、植物デンプン、デキストラン、タンパク質加水分解物、トランスフェリン又は他の鉄輸送体、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２-メルカプトエタノール、３’−チオグリセロールあるいはこれらの均等物などが挙げられる。
【００７０】
血清代替物の具体例としては、例えば、国際公開第９８／３０６７９号記載の方法により調製されるものや、市販のｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ社）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ-ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及びＧｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などが挙げられる。
【００７１】
３．幹細胞の培養方法等
［幹細胞］
本発明が対象とする「幹細胞」は、自己複成能及び分化増殖能を有する未熟な細胞をいい、分化能力に応じて、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ)、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ)、単能性幹細胞(ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ)等が含まれる。「幹細胞」は、一般に、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と、三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞と定義されている。
【００７２】
多能性幹細胞とは、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
【００７３】
幹細胞の由来種も特に限定されず、例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類などの細胞であってもよい。
【００７４】
幹細胞の具体例としては、筋芽細胞、血管内皮細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、心筋細胞、軟骨細胞等へ分化する間葉系幹細胞、ニューロンやグリア細胞へ分化する神経幹細胞、白血球、赤血球、血小板、肥満細胞、樹状細胞等へ分化する造血幹細胞又は骨髄幹細胞、スフェロイド状態から胚様体（ＥＢ体）と呼ばれる擬似的な胚の形成を経て様々な組織への分化・誘導のステップに進むことが知られている胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）や誘導性多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）、始原生殖細胞に由来する胚性生殖（ＥＧ）細胞、精巣組織からのＧＳ細胞の樹立培養過程で単離されるｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｓｔｅｍ（ｍＧＳ）細胞、骨髄から単離されるｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ａｄｕｌｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ（ＭＡＰＣ）等の多能性幹細胞などが挙げられる。
【００７５】
多能性幹細胞としては、特に、上述のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を挙げることができる。体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した幹細胞も、多能性幹細胞としてまた好ましい（Ｎａｔｕｒｅ，１９９７，３８５，ｐ．８１０、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８０，ｐ．１２５６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，１７，ｐ．４５６、Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９４，ｐ．３６９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９９，２２，ｐ．１２７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９９，９６，ｐ．１４９８４、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００，２４，ｐ．１０９）。
【００７６】
ヒトＥＳ細胞株は、例えばＷＡ０１（Ｈ１）およびＷＡ０９（Ｈ９）は、ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから、ＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２及びＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所（京都、日本）から入手可能である。
【００７７】
ｉＰＳ細胞としては、例えば、皮膚細胞等の体細胞に複数の遺伝子（初期化因子）を導入して得られる、ＥＳ細胞同様の多分化能を獲得した細胞が挙げられる。例えばＯｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、Ｃ-Ｍｙｃ遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２６，ｐ．１０１-１０６）等が挙げられる。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Ｏｃｔ３/４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ-Ｍｙｃ、Ｎ-Ｍｙｃ、Ｌ-Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５-２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ-ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３またはＧｌｉｓ１等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８８２０、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００９／０３２１９４、ＷＯ２００９／０５８４１３、ＷＯ２００９／０５７８３１、ＷＯ２００９／０７５１１９、ＷＯ２００９／０７９００７、ＷＯ２００９／０９１６５９、ＷＯ２００９／１０１０８４、ＷＯ２００９／１０１４０７、ＷＯ２００９／１０２９８３、ＷＯ２００９／１１４９４９、ＷＯ２００９／１１７４３９、ＷＯ２００９／１２６２５０、ＷＯ２００９／１２６２５１、ＷＯ２００９／１２６６５５、ＷＯ２００９／１５７５９３、ＷＯ２０１０／００９０１５、ＷＯ２０１０／０３３９０６、ＷＯ２０１０／０３３９２０、ＷＯ２０１０／０４２８００、ＷＯ２０１０／０５０６２６、ＷＯ ２０１０／０５６８３１、ＷＯ２０１０／０６８９５５、ＷＯ２０１０／０９８４１９、ＷＯ２０１０／１０２２６７、ＷＯ ２０１０／１１１４０９、ＷＯ ２０１０／１１１４２２、ＷＯ２０１０／１１５０５０、ＷＯ２０１０／１２４２９０、ＷＯ２０１０／１４７３９５、ＷＯ２０１０／１４７６１２、Ｎａｔ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ., ２００８，２６，ｐ．７９５−７９７、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ, ２００８，２，ｐ．５２５−５２８、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ. ２００８，２６，ｐ．２４６７−２４７４、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. ２００８，２６，ｐ．１２６９−１２７５、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ, ２００８，３, ｐ．５６８−５７４、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ, ２００８，３，ｐ．４７５−４７９、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ, ２００８，３, ｐ．１３２−１３５、Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ.，２００９，１１，ｐ．１９７−２０３、Ｎａｔ. Ｂｉｏｔｅｃｈ., ２００９，２７，ｐ．４５９−４６１、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ.，２００９，１０６，ｐ．８９１２−８９１７、Ｎａｔｕｒｅ，２００９，４６１，ｐ．６４３−６４９、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２００９， ５，ｐ．４９１−５０３、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１０，６，ｐ．１６７−７４、Ｎａｔｕｒｅ，２０１０，４６３，ｐ．１０９６−１００、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２０１０，���８，ｐ．７１３−７２０、Ｎａｔｕｒｅ，２０１１，４７４，ｐ．２２５−９に記載の組み合わせが例示される。ｉＰＳ細胞は、所定の機関（理研バイオリソースセンター、京都大学など）より入手可能である。
【００７８】
複能性幹細胞としては、特に、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経系幹細胞、骨髄幹細胞及び生殖幹細胞等の体性幹細胞等が挙げられる。複能性幹細胞は、好ましくは間葉系幹細胞である。なお、間葉系幹細胞とは、骨芽細胞、軟骨芽細胞及び脂肪芽細胞等の間葉系の細胞全て又はいくつかへの分化が可能な幹細胞又はその前駆細胞の集団を広義に意味する。間葉系幹細胞としてより具体例には、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ−ＢＭ，Ｔａｋａｒａ）、ヒト臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ−ＵＣ，Ｔａｋａｒａ）、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ−ＡＴ，Ｔａｋａｒａ） などを挙げることができる。
【００７９】
本発明に係る培地は、いずれの幹細胞の増殖にも好適に使用することができるが、好ましくは、間葉系幹細胞、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の培養に、より好ましくはｉＰＳ細胞の培養に、特に好ましくはヒトｉＰＳ細胞の培養に使用することができる。ヒトｉＰＳ細胞としてより具体的には２５３Ｇ１株（理研セルバンクＮｏ. ＨＰＳ０００２）、２０１Ｂ７株（理研セルバンクＮｏ. ＨＰＳ００６３）、４０９Ｂ２株（理研セルバンクＮｏ. ＨＰＳ００７６）、４５４Ｅ２株（理研セルバンクＮｏ. ＨＰＳ００７７）、ＨｉＰＳ-ＲＩＫＥＮ-１Ａ株（理研セルバンクＮｏ. ＨＰＳ０００３）、ＨｉＰＳ-ＲＩＫＥＮ-２Ａ株（理研セルバンク Ｎｏ. ＨＰＳ０００９）、ＨｉＰＳ-ＲＩＫＥＮ-１２Ａ株（理研セルバンク Ｎｏ. ＨＰＳ００２９）、Ｎｉｐｓ-Ｂ２株（理研セルバンクＮｏ. ＨＰＳ０２２３）などを挙げることができる。
【００８０】
［培養方法］
本発明に係る幹細胞の培養方法は、ｂＦＧＦ代替物を含む培地で幹細胞を培養する手順を含むことを特徴とする。具体的には、本発明に係る培養方法では、上述のｂＦＧＦ断片ペプチド、ＦＧＦレセプター結合ペプチド、ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチド、ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチド及び低分子化合物のいずれか一以上の存在下で、幹細胞をバッチ培養（Ｂａｃｈ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加培養（Ｆｅｄ−Ｂａｃｈ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続培養（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）又は灌流培養（Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）等により培養する。
【００８１】
バッチ培養は、培養中の培養槽にｂＦＧＦ代替物を含む培地を補給せずに培養する方法である。
流加培養は、培養中の培養槽にｂＦＧＦ代替物を含む培地を補給しながら培養する方法である。
連続培養は、培養中の培養槽からｂＦＧＦ代替物を含む培地の一部を引き抜き、引き抜き量相当分の培地を補給しながら培養する方法である。
灌流培養は、培養中の培養槽から液分のみを引き抜き、引き抜き量相当分のｂＦＧＦ代替物を含む培地を補給しながら培養する方法である。
これらいずれの培養方法においても、ｂＦＧＦ代替物の作用によって、幹細胞の生存と増殖を促進することができる。すなわち、本発明において、ｂＦＧＦ断片ペプチド、ＦＧＦレセプター結合ペプチド、ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチド、ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチド、並びに、コリンエステラーゼ阻害剤、フェノチアジン誘導体、ステロイド、アセチルコリンレセプターアゴニスト及びプロスタグランジンレセプターアゴニストから選ばれる低分子化合物は、幹細胞の増殖促進剤として機能し得るものである。
【００８２】
本発明に係る培養方法に用いられる培養器は、特に限定されないが、フラスコ、ディッシュ、シャーレ、マイクロウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック又はタンクなどの培養槽などが挙げられる。これらの培養器の基材も、特に限定されず、ガラスや、ポリプロピレン及びポリスチレンなどの各種プラスチック、ステンレスなどの金属又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００８３】
本発明に係る幹細胞の培養方法としては、培養器の基材表面への足場依存性細胞の接着を誘導するため、基材表面にコラーゲン、ゼラチン、ポリ-Ｌ-リジン、ポリ-Ｄ-リジン、ラミニン、ラミニンの一部構造体、フィブロネクチン及びこれら混合物（例えばマトリゲル）並びに溶解細胞膜調製物（Ｌａｎｃｅｔ，２００５，３６５，ｐ１６３６-１６４１）などの足場をコーティングする接着培養や、メチルセルロースなどの高分子ポリマー（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４，２，５,７３４−７４５）、ＭＦＧ−Ｅ８（Ｍｉｌｋ  ｆａｔ  ｇｌｏｂｕｌｅ−ＥＧＦ  ｆａｃｔｏｒ  ８）又は該タンパク質の断片を用いた上記足場が不要な浮遊培養が挙げられる。
【００８４】
培養される幹細胞は、分散細胞又は非分散細胞であり得る。分散細胞とは、細胞分散を促進するために処理された細胞をいう。分散細胞としては、例えば、２〜５０個、２〜２０個、又は２〜１０個の細胞からなる小さな細胞塊を形成している細胞が挙げられる。分散細胞は、浮遊（懸濁）細胞又は接着細胞であり得る。
【００８５】
幹細胞の培養密度は、細胞の生存及び増殖を促進する効果を達成し得るような密度である限り特に限定されない。培養密度は、例えば１．０×１０1〜１．０×１０7細胞／ｍｌ、好ましくは１．０×１０2〜１．０×１０7細胞／ｍｌ、より好ましくは１．０×１０3〜１．０×１０7細胞／ｍｌ、さらに好ましくは３．０×１０4〜１．０×１０7細胞／ｍｌである。
【００８６】
温度、溶存ＣＯ2濃度、溶存酸素濃度及びｐＨなどの培養条件は、動物組織に由来する細胞の培養に従来用いられている技術に基づいて適宜設定できる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが３３〜３９℃、好ましくは３６〜３７℃であり得る。溶存ＣＯ2濃度は、１〜１０％、好ましくは２〜５％であり得る。酸素分圧は、１０〜２２％であり得る。
【００８７】
幹細胞の接着培養を行う場合、フィーダー細胞の存在下で培養してもよい。フィーダー細胞には、胎児線維芽細胞等のストローマ細胞を用いることができる（例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９４、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，１９８１，７８，１２，ｐ．７６３４−７６３８、Ｎａｔｕｒｅ，１９８１，２９２，５８１９，ｐ．１５４−１５６、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，１９６９，４，５，ｐ．５４９−５５３、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，２７２，５２６２，ｐ．７２２−７２４、Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９８２，１１２，１，ｐ．８９−９５、国際公開第０１／０８８１００号、同第２００５／０８０５５４号参照）。
【００８８】
幹細胞の浮遊培養とは、培地中において、培養器又はフィーダー細胞を用いる場合に対して非接着性の条件下で幹細胞を培養することをいう。幹細胞の浮遊培養としては、幹細胞の分散培養及び幹細胞の凝集浮遊培養が挙げられる。
幹細胞の分散培養とは、懸濁された幹細胞を培養することをいい、例えば、２〜２０個の幹細胞からなる小さな細胞塊の分散培養が挙げられる。分散培養を継続した場合、培養された分散細胞がより大きな幹細胞塊を形成し、その後凝集浮遊培養が実行され得る。
凝集浮遊培養としては、胚様体培養法（Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１９９５，７，６，ｐ．８６２-８６９参照）、ＳＦＥＢ法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００５，８，３，ｐ．２８８-２９６、国際公開第２００５／１２３９０２号）、メッシュフィルターを用いて機械的処理により細胞株を継代させるスフェア培養法（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４，２，５,ｐ．７３４−７４５）が挙げられる。
【００８９】
本発明に係る培養方法では、ｂＦＧＦ代替物の存在下で幹細胞を培養する手順によって幹細胞の生存と増殖を促進することができるので、幹細胞、特に分散及び分散後の浮遊培養等のストレスに弱いことが知られているｉＰＳ細胞、を効率的に培養するために利用できる。本発明に係る培養方法により得られるｂＦＧＦ断片ペプチド、ＦＧＦレセプター結合ペプチド、ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチド、ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチド、又は、コリンエステラーゼ阻害剤、フェノチアジン誘導体、ステロイド、アセチルコリンレセプターアゴニスト及びプロスタグランジンレセプターアゴニストから選ばれる低分子化合物と、幹細胞と、を含む細胞組成物は、さらなる幹細胞の培養のためあるいは再生医療用の細胞ソースのために利用され得る。
【００９０】
［幹細胞又は分化細胞を含む細胞組成物の製造方法］
本発明に係る培養方法は、幹細胞を含む細胞組成物の製造方法あるいは幹細胞から誘導される分化細胞を含む細胞組成物の製造方法に応用できる。
【００９１】
本発明に係る幹細胞を含む細胞組成物の製造方法は、上述したｂＦＧＦ代替物の存在下で幹細胞を培養する工程を含み、必要に応じて幹細胞を継代する工程を含む。また、本発明に係る分化細胞を含む細胞組成物の製造方法は、ｂＦＧＦ代替物の存在下で幹細胞を培養する工程と幹細胞の分化を誘導する工程を含み、必要に応じて細胞を継代する工程を含む。ｂＦＧＦ代替物の存在下で幹細胞を培養する工程は、上述の幹細胞の培養方法と同様に実施できる。
【００９２】
幹細胞の継代や分化誘導は、従来公知の手法によって行えばよい。分化誘導剤には、ＢＭＰ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、Ｎｏｄａｌ阻害剤、レチノイン酸などを用いることができる。分化誘導は、例えば、軟骨細胞の分化誘導プロセスでは、分化誘導培地（９０％αＭＥＭ培地、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ  Ｌ-グルタミン、０．１μＭのデキサメタゾン）中で、間葉系幹細胞を培養することによって行うことができる。
【００９３】
幹細胞の心筋細胞への分化誘導プロセスでは、例えば、心筋細胞をＳＴＥＭｄｉｆｆ  ＡＰＥＬ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社）に０．５ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ-４を添加した培地で１日培養後、ＳＴＥＭｄｉｆｆ  ＡＰＥＬ  Ｍｅｄｉｕｍに１０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ-４、１０ｎｇ／ｍｌ  Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ代替物をそれぞれ添加した培地に交換して更に４日間培養を継続する。その後、ＳＴＥＭｄｉｆｆ  ＡＰＥＬ  Ｍｅｄｉｕｍに１０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ、１５０ｎｇ／ｍｌ  Ｄｋｋ１をそれぞれ添加した培地に交換して８日間培養後、ＳＴＥＭｄｉｆｆ  ＡＰＥＬ  Ｍｅｄｉｕｍに１０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ、１５０ｎｇ／ｍｌ  Ｄｋｋ１、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ代替物をそれぞれ添加した培地に交換することで自律的な拍動を伴う心筋細胞を確認できる。
幹細胞の血小板への分化誘導プロセスの過程で必要となる巨核球の形成には、血清含有培地（２０％ＦＣＳ）にトロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン６（ＩＬ６）及び幹細胞因子（ＳＣＦ）等の因子が添加され得る。
また、レチノイン酸などの分化誘導剤を培地に添加することにより、幹細胞を神経系細胞などに分化させることが可能となる。
【００９４】
本発明に係る幹細胞又は分化細胞を含む細胞組成物の製造方法では、ｂＦＧＦ代替物の存在下で幹細胞を培養する工程によって幹細胞の生存と増殖を促進することができるので、幹細胞及びこれから誘導される分化細胞を含む細胞組成物を効率的に製造できる。本発明に係る幹細胞又は分化細胞を含む細胞組成物の製造方法により得られる、ｂＦＧＦ断片ペプチド、ＦＧＦレセプター結合ペプチド、ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチド、ｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチド、又は、コリンエステラーゼ阻害剤、フェノチアジン誘導体、ステロイド、アセチルコリンレセプターアゴニスト、あるいはプロスタグランジンレセプターアゴニストから選ばれる低分子化合物と、幹細胞及び／又は分化細胞とを含む細胞組成物は、さらなる幹細胞の培養のためあるいは再生医療用の細胞ソースのために利用され得る。
【００９５】
本発明に係る細胞組成物は、小さな細胞塊のような分散した幹細胞を含む組成物であり得る。本発明に係る細胞組成物は、例えば、凍結保存による幹細胞の保存、輸送、及び継代に用いられ得る。凍結保存等の保存に用いられる場合、本発明に係る細胞組成物は、血清あるいはその代替物、又はＤＭＳＯ等の有機溶剤をさらに含んでいてもよい。本発明に係る細胞組成物は、フィーダー細胞を含むものであってもよい。
【実施例】
【００９６】
［参考例１：マウス胎児線維芽細胞を用いたｂＦＧＦ代替物のスクリーニング］
マウス胎児線維芽細胞（ＢＡＬＢ／３Ｔ３  ｃｌｏｎｅ  Ａ３１）を用いて、細胞増殖促進活性を有し、ｂＦＧＦ代替物となり得る物質のスクリーニングを行った。
【００９７】
マウス胎児線維芽細胞（ＢＡＬＢ／３Ｔ３  ｃｌｏｎｅ  Ａ３１）は、理化学研究所より入手した。該細胞に添付のマニュアル（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｎｏ．ＲＢＲＣ−ＲＣＢ００００５）に従い、プラスチック培養皿の上でＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞を培養した。具体的には、ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  Ｄ５７９６）に最終濃度１０％のＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）を添加した培養液を用いて、３７℃、５％  ＣＯ2下で培養を行った。植え継ぎは３日毎に行い、解離液（０．２５％トリプシン、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて細胞を解離させ、新たなプラスチック培養皿の上に蒔いた。
【００９８】
候補物質として、ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチド(配列番号１)、ｂＦＧＦ断片ペプチド（配列番号２）、ＦＧＦレセプター結合ペプチド（配列番号１１，１３，１４）、低分子化合物（Ｆｌｕｐｒｏｓｔｅｎｏｌ（ＳＡＮＴＡＣＲＵＺ），Ｅｐｉｂｏｘｉｄｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ），Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（和光純薬工業），Ｐｅｒｐｈｅｎａｚｉｎｅ（東京化成工業），Ｐｒｏｍａｚｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｒｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ），Ｐｒｏｍｅｔｈａｚｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ(和光純薬工業)，Ｍｅｓｏｒｉｄａｚｉｎｅ  ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｒａｔｅ（ＳＩＧＭＡ），Ｅｔｈｏｐｒｏｐａｚｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ），Ｂｅｎｚｏｙｌ  ｌｅｕｃｏ  ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｌｕｅ（東京化成工業），Ａｃｅｐｒｏｍａｚｉｎｅ  ｍａｌｅａｔｅ（和光純薬工業），Ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（和光純薬工業）を用いた。
【００９９】
培養したＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞を解離後、細胞カウントを行い、２４ウェル培養プレートを用いて、中程度の密度（１×１０4個／０．８ｃｍ2、培地容量１．０ｍＬ中）で播種した。候補物質（１０μＭ）を加えた培養液中で３日間培養後に細胞数を計測した。陽性コントロールには、ヒトｂＦＧＦ（リプロセル社）を５ｎｇ／ｍｌ又は５０ｎｇ／ｍｌで添加した培養液を用いた。候補物質及びヒトｂＦＧＦのいずれをも加えていない群を、陰性コントロール（図１中「ｃｏｎｔｒｏｌ」）とした。
【０１００】
その結果、配列番号１のｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチド添加では、ヒトｂＦＧＦ添加（５０ｎｇ／ｍｌ）と同程度の細胞増殖促進活性を有することが確認された。また、配列番号２のｂＦＧＦ断片ペプチド、配列番号１１のヒトＦＧＦレセプター結合ペプチド、及びＥｐｉｂｏｘｉｄｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅの添加についても細胞増殖促進活性が確認された（図１）。
【０１０１】
［実施例１：ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドのｉＰＳ細胞増殖促進活性の評価］
ｂＦＧＦ代替物としてのｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドのｉＰＳ細胞増殖促進活性を評価した。ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドには、マウスｂＦＧＦに由来する配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドを、Ｃ末端をアミド化して用いた。
【０１０２】
ｉＰＳ細胞は、京都大学ｉＰＳ細胞研究所  山中伸弥教授が樹立したヒト人工多能性幹細胞（２０１Ｂ７）を、理化学研究所セルバンク（Ｎｏ.ＨＰＳ００６３）より入手した。
【０１０３】
ｉＰＳ細胞は、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００７，２５，ｐ．６８１−６８６に記載の方法に従って、フィーダー層としてマウス胎児線維芽細胞（マイトマイシン処理で不活化、ＭＥＦ）を蒔いたプラスチック培養皿で培養した。
【０１０４】
培養液は、Ｄ−ＭＥＭＦ１２（ＳＩＧＭＡ、Ｄ６４２１）に最終濃度２０％のＫＳＲ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、最終濃度１％のＮＯＮ−ＥＳＳＥＮＴＩＡＬＡＭＩＮＯＡＣＩＤ（ＳＩＧＭＡ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸及び８０μＭ  ２−メルカプトエタノールを添加したものを用いた。
【０１０５】
３７℃、５％ＣＯ2下で培養し、３〜４日毎に継代を行った。解離液（リン酸バッファー緩衝生理学的食塩水に０．２５％トリプシン、１ｍｇ/ｍｌコラゲナーゼＩＶ液、１ｍＭ  ＣａＣｌ2を添加したもの、全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ｉＰＳ細胞をフィーダー層から解離し、ピペッティングで小細胞塊（約５０−１００個）に分散した後、前日にＭＥＦを播種し形成させたフィーダー層の上に蒔いた。
【０１０６】
上記のように培養したｉＰＳ細胞を、フィーダー細胞から小細胞塊として解離し、さらに混入するフィーダー細胞を除去するために細胞接着性の培養プレート（０．１％  ゼラチンコート）の底に吸着させ、培養液で３７℃、１時間培養した。その後、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ）上にｉＰＳ細胞塊を播種し、フィーダーレス培養を数継代行い、混入するＭＥＦを完全に取り除いた。
【０１０７】
ｉＰＳ細胞に対するｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドの細胞増殖促進活性は、下記のように検討した。アッセイ前日に培養液をアッセイ培地（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ６、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、血清不含）に替え、２４時間後培養を行った。ｉＰＳ細胞を解離後、９６ウェル培養プレートを用いて、ｉＭａｔｒｉｘ−５１１（ニッピ）上に、５×１０4個／０．３２ｃｍ2／培地液量０．２ｍｌで播種した。１０μＭ  ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチド（配列番号１）又は５ｎｇ/ｍｌ  リコンビナントヒトｂＦＧＦ（リプロセル社）を添加したアッセイ培地中で４日間培養を行った。培地交換を行って、さらに１０μＭ  ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチド又は５ｎｇ/ｍｌ  リコンビナントヒトｂＦＧＦを添加したアッセイ培地中で４日間培養し、形成されたアルカリフォスファターゼ染色陽性（ＡＬＰ＋）のコロニー面積を生存細胞量として計測した。コントロールには、アッセイ培地のみで培養した細胞を用いた。
【０１０８】
結果を図２に示す。ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドを添加した場合（図中「Ｐｅｐｔｉｄｅ」）、コントロール（「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）に比べてアルカリフォスファターゼ染色陽性細胞数が有意に増加し、ｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチドがヒトｉＰＳ細胞の増殖を促進する活性を有することが明らかとなった。
【配列表フリーテキスト】
【０１０９】
配列番号１：マウスｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチド
配列番号２：ヒトｂＦＧＦ断片ペプチド
配列番号３：ヒトｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチド
配列番号４：ヒトｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチド
配列番号５：ヒトｂＦＧＦ断片ペプチド
配列番号６：ヒトｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチド
配列番号７：ヒトｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチド
配列番号８：ヒトｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチド
配列番号９：ヒトｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチド
配列番号１０：ヒトｂＦＧＦヘパリン結合領域含有ペプチド
配列番号１１：ヒトＦＧＦレセプター結合ペプチド
配列番号１２：ヒトＦＧＦレセプター結合ペプチド
配列番号１３：ヒトＦＧＦレセプター結合ペプチド
配列番号１４：ヒトＦＧＦレセプター結合ペプチド
配列番号１５：ヒトｂＦＧＦ結合タンパク断片ペプチド
配列番号１６：ヒトｂＦＧＦ断片ペプチド
【図１】
2019010001.tif 000003
【図２】
2019010001.tif 000004
【配列表】
2019010001000001.app