(57)【要約】      （修正有）【課題】経口投与により、タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗生剤又は抗ウイルス剤等の薬剤を、十二指腸へ送達する方法の提供。【解決手段】積荷積載小胞の集団を含む医薬組成物であって、少なくとも１つの薬学的活性剤が前記小胞の核内で表面層によってカプセル化され、該表面層は１種以上のコレステリルエステルから主としてなり、前記小胞は、胃酸に安定であり、前記患者又は対象への投与後の前記積荷積載小胞の吸収の間に十二指腸腸細胞の表面上のコレステリルエステル輸送体によって壊されず、前記積荷積載小胞は損傷することなく前記十二指腸腸細胞に入り、前記十二指腸腸細胞は、前記患者又は対象の体細胞への前記積荷積載小胞の輸送用の形質転換カイロミクロンを産生するために損傷のない前記積荷積載小胞をカイロミクロンに加え、前記医薬組成物は腸溶コーティングされる、医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者又は対象の十二指腸への経口投与に適用される、積荷積載小胞の集団を含む医薬組成物であって、少なくとも１つの薬学的活性剤が前記小胞の核内で表面層によってカプセル化され、該表面層は１種以上のコレステリルエステルから主としてなり、前記小胞は、胃酸に安定であり、前記患者又は対象への投与後の前記積荷積載小胞の吸収の間に十二指腸腸細胞の表面上のコレステリルエステル輸送体によって壊されず、前記積荷積載小胞は損傷することなく前記十二指腸腸細胞に入り、前記十二指腸腸細胞は、前記患者又は対象の体細胞への前記積荷積載小胞の輸送用の形質転換カイロミクロンを産生するために損傷のない前記積荷積載小胞をカイロミクロンに加え、前記医薬組成物は腸溶コーティングされる、医薬組成物。
【請求項２】
前記積荷積載小胞中の前記薬学的活性剤は、前記小胞がカイロミクロンに取り込まれるまで前記十二指腸腸細胞で無傷のまま残っている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記積荷積載小胞中の前記薬学的活性剤は、前記小胞の前記患者又は対象の体細胞への通過の後に、前記小胞表面のコレステリルエステルへの細胞内のコレステロールヒドロラーゼ酵素の作用によって前記体細胞内で損傷のない状態で放出される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記小胞の前記表面層は、コレステロールから作られた非イオン性の１種以上のコレステリルエステルと、少なくとも１つのＣ8−Ｃ26脂肪酸とから形成され、前記１種以上のコレステリルエステルに対する前記薬学的活性剤の質量比は４：９６〜９６：４の間であり、前記積荷積載小胞は、該小胞がない場合に得られる濃度の少なくとも２倍の濃度まで前記薬学的活性剤を前記患者又は対象の前記体細胞内に送達可能である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記形質転換カイロミクロンは、前記患者又は対象の体細胞へリンパ管及び血管内で輸送され、前記体細胞は前記医薬組成物をとり込み、前記小胞へのコレステロールヒドロラーゼの作用後に、前記薬学的活性剤は前記体細胞の細胞質内に放出される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記薬学的活性剤は、親水性ペプチド、ヒト成長ホルモン、プロラクチン、オキシトシン、カルシトニン、ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、グレリン、ＧＬＰ−１、ＰＹＹ３６、オキシントモジュリン、ＧＬＰ−２、グルカゴン、インスリン組成物及びそれらの混合物からなる群より選択されるペプチドを含み、前記小胞の前記表面層は少なくとも２種のコレステリルエステルから主としてなり、前記医薬組成物は、該医薬組成物をｐＨ５．５〜６．５で放出するために腸溶コーティングされる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記インスリン組成物は、レギュラーインスリン、ＮＰＮインスリン、レンテインスリン、組み換えインスリン、インスリングラルギン、インスリンリスプロ、インスリンデグルデク及びそれらの混合物である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記薬学的活性剤は、タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗生剤又は抗ウイルス剤である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記小胞を含有する経口剤形の表面層は腸溶コーティングされ、前記経口剤形はカプセル又は錠剤である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記小胞の前記表面層は、２〜１４のｐＨの範囲において損なわれない、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記小胞の集団は、１００ｎｍ〜１０、０００ｎｍの範囲の平均直径を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記小胞は中性表面を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記コレステリルエステルは、薬学的活性剤−コレステリルエステル官能基相互作用に基づいて１種以上の前記コレステリルエステルを選択することにより、１種以上の前記コレステリルエステルに対する前記薬学的活性剤の質量比を最大化する交互嵌合型の交互アルキル鎖モデルを用いて選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記薬学的活性剤は、親水性ペプチド、インスリン組成物、ヒト成長ホルモン、プロラクチン、オキシトシン、カルシトニン、ＧＬＰ−１又はリキシセナチド、エキセナチド、リラグルチド、及びアルビグルチドからなる群から選択されるＧＬＰ−１の類似体、ＰＹＹ３６、オキシントモジュリン、ＧＬＰ−２、グルカゴン、インターフェロン、二フッ素化クルクミン、セフタロリン、ＷＡＰ−８２９４Ａ、バンコマイシン、ベバシズマブ、トラスツズマブ、アダリムマブ、及び抗ＰＣＳＫ−９モノクローナル抗体からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記医薬組成物はＧＬＰ−１を含み、前記医薬組成物は、ＤＰＰ−ＩＶ酵素分解に対する前記ＧＬＰ−１の安定性を改善する薬剤又は血液における前記ＧＬＰ−１の循環時間を長くする薬剤を更に含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記医薬組成物は、ＧＬＰ−１又はリキシセナチド、エキセナチド、リラグルチド、及びアルビグルチドからなる群から選択されるＧＬＰ−１の類似体を含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記小胞中の前記薬学的活性剤は、抗脂質異常症モノクローナル抗体及びスタチンである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記薬学的活性剤は、前記小胞がない場合に、認め得るほどには十二指腸の腸細胞を通過してカイロミクロンに入ることができない、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記小胞は、中性表面を有しており、経口的に吸収される栄養素脂質の方法で前記患者又は対象の十二指腸の腸細胞を通過する能力を有する、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記活性剤は、マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−１２２、いずれかのヌクレオチド配列、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はそれらの断片である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記活性剤はワクチンであり、前記小胞は、前記ワクチンの免疫原性効果を高めるために任意で更にアジュバントを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記抗生剤は、アミノグリコシド、アンサマイシン、カルバペネム、セファロスポリン、グリコペプチド抗生剤、リンコサミド抗生剤、リポペプチド抗生剤、マクロライド抗生剤、モノバクタム抗生剤、オキサゾリジノン、ペニシリン、ペニシリン合剤、ポリペプチド抗生剤、キノロン／フルオロキノリン抗生剤、スルホンアミド抗生剤、テトラサイクリン抗生剤、抗ミコバクテリア又はそれらの混合物である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記抗生剤は、グリコペプチド抗生剤、ポリペプチド抗生剤又はリポペプチド抗生剤である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
患者又は対象の細胞内の標的に薬学的活性剤を送達するための請求項１に記載の医薬組成物の製造における積荷積載小胞の使用であって、前記医薬組成物は前記患者又は対象に投与され、前記患者又は対象の十二指腸腸細胞に吸収された前記小胞がカイロミクロンに取り込まれ、前記カイロミクロンは細胞と結合して前記薬学的活性剤を放出し、前記細胞内の活性濃度は、前記小胞なしで前記薬学的活性剤が前記細胞に送達された場合より大きい、使用。
【請求項２５】
前記積荷積載小胞は、前記小胞なしで前記薬学的活性剤が細胞に送達される場合の少なくとも１０倍の量で標的細胞に前記薬学的活性剤を送達する、請求項２２に記載の使用。
【請求項２６】
積荷積載小胞を含む、患者又は対象の十二指腸への送達に適用される経口剤形の医薬組成物であって、前記積荷積載小胞は、前記薬学的活性剤を含有する核と、前記核及び前記薬学的活性剤を取り囲む表面層とを含む中性表面を有し、前記表面層は、コレステロールから作られた非イオン性の１種以上のコレステリルエステルと、少なくとも１つのＣ8−Ｃ26脂肪酸とから主としてなり、前記積荷積載小胞における前記１種以上のコレステリルエステルに対する前記薬学的活性剤の質量比は４：９６〜９６：４の間であり、前記積荷積載小胞は、該小胞がない場合に経口投与によって得られる濃度の少なくとも２倍の濃度まで、前記薬学的活性剤を患者又は対象の細胞内に送達可能であり、前記医薬組成物は腸溶コーティングされる、医薬組成物。
【請求項２７】
積荷積載小胞を含む、患者又は対象に投与されるための医薬組成物であって、前記積荷積載小胞は、前記薬学的活性剤を含有する核と、前記核及び前記薬学的活性剤を取り囲む表面層とを含む中性表面を有し、前記表面層は、コレステロールから作られた非イオン性の１種以上のコレステリルエステルと、少なくとも１つのＣ8−Ｃ26脂肪酸とから主としてなり、前記積荷積載小胞における前記１種以上のコレステリルエステルに対する前記薬学的活性剤の質量比は４：９６〜９６：４の間であり、前記積荷積載小胞は、該小胞がない場合に経口投与によって得られる濃度の少なくとも２倍の濃度まで、前記薬学的活性剤を患者又は対象の細胞内に送達可能であり、前記積荷積載小胞は、前記患者又は対象に投与した後に前記細胞の表面でコレステロールエステル輸送体によって破壊されず、前記積荷積載小胞は損傷することなく前記細胞に入り、経口剤形で製剤された場合に前記医薬組成物は任意で腸溶コーティングされる、医薬組成物。
【請求項２８】
前記医薬組成物は、経口又は非経口剤形である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記医薬組成物は、静脈内投与又は皮下投与剤形である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、発明の名称が同一である、２０１３年３月１４日に出願された仮出願番号ＵＳ６１／７８３，００３に対する優先権を主張し、その全体の内容が本願に参照によって援用される。
【０００２】
本発明は、１種以上の非イオン性のコレステリルエステルと１種以上のカプセル化された活性分子とから本質的になる、中空部を有した積荷積載コレステリルエステル（脂質）ナノ粒子（「コレストソーム」）に関する。その活性分子は、コレストソーム内でのカプセル化がない場合には、コレストソームに積載されずに、腸細胞膜を認め得るほどには通過することができない。コレストソームは、中性表面を有しており、ゴルジ体に到逹する細胞経路を用いて経口的に吸収される栄養素脂質の方法で腸細胞を通過する能力を有している。本発明によると、本発明の新規な積荷積載コレストソームが、患者又は対象の細胞内に活性分子を届けることができ、患者又は対象の治療又は診断をもたらす。本発明による組成物は、コレステリルエステルナノ粒子を用いない先行技術の組成物に比べてかなり有効である。
【０００３】
一実施形態において、本発明は、中性電荷の表面層によってカプセル化される活性分子、例えば、薬学的活性剤（この用語は、治療剤及び診断剤を含む）を含むコレステリルエステルナノ粒子の医薬組成物（「積荷積載コレストソーム」）を提供する。表面層は、コレステロール及び１種以上の飽和又は不飽和脂肪酸から生成される１種以上のコレステリルエステルを含む。本発明によるコレストソームは、様々な寸法及び重量の１種以上の異なる活性分子をカプセル化し、特にリポソームを含めて、先行技術の方法を用いて送達が困難である薬学的活性分子をカプセル化する。
【０００４】
本発明によると、積荷積載コレストソームは、患者又は対象への投与後に、損傷することなくカイロミクロンに取り込まれて（一般的に、小腸腸細胞への吸収後）、ナノ粒子を含有するカイロミクロンを生成し、このナノ粒子を含有するカイロミクロンは、リンパ管に送達され、続いて動脈血に送達され、更にこの動脈血の供給を受ける全ての細胞に送達される。カイロミクロンが細胞と結合した後、コレストソームが損傷することなくその細胞に送達される。ここで、コレストソームは解体され、カプセル化された活性分子を細胞膜の内部で放出する。本発明の効果は、活性分子を細胞の内部に直接送達して治療又は診断をもたらすことである。
【０００５】
コレステリルエステルは、それらと小腸（十二指腸）腸細胞の表面上のコレステロール輸送体との反応性に基づいてナノ粒子組成物のために選択され、それらの腸細胞への迅速かつ完全な吸収を促進する。一旦内部に入ると、腸細胞内部におけるカイロミクロンの形成中に、コレステリルエステルナノ粒子は、ナノ粒子の内容物を保護する付加された利益を提供する。ナノ粒子のコレステリルエステル成分の更なる有利な特性は次の通りである：１）それらの表面中性電荷は、腸細胞がそれらの粒子を食品成分として見なすようにすることができる、２）安全な食用成分由来のコレストソームのそれらの全体組成、及び３）特に互いに「集まる」それらの電位及びナノ粒子自体に組み込まれる薬剤の要件。リポソームの製造技術が教示するものは、中性表面を有した小胞でのコレステリルエステルの利用とは異なる。実際に、ナノ粒子が先行技術に開示されたリポソームの方法でリン脂質から作られたならば、本発明の有益な特徴のいずれもが失われる。
【０００６】
コレステリルエステルでカプセル化されると、本発明の医薬組成物及び経口の治療方法は、保護処理されていない状態では生体内での分解により効果のない、多様な活性成分のカイロミクロン−標的化された細胞内送達を可能とする。例えば、一部の特定の実施形態において、本願に定義される炎症関連代謝障害の治療に有用な巨大分子の有効な送達、ワクチンの身体特定部位への有効な送達、リボソーム及び核に作用する遺伝子物質の細胞内部への有効な送達、並びに皮膚バリア通過の潜在性を有した皮膚上での局所送達を可能にする。更に、本発明による組成物を用いた疾病及び／又は疾患のその他の治療方法が開示される。実際に、いずれの活性分子も患者又は対象の標的細胞へ有効に送達されることができ、先行技術の送達方法によっては匹敵されない有効な治療をもたらす。
【０００７】
治療が必要な患者への本発明の組成物の投与による疾病及び疾患の治療方法は、本発明の更なる実施形態を示す。本発明による治療方法の実施形態についての組成物の有効投与量は、１日当たり１ｍｇ以下の非常に小さな量から１ｇ以上までの範囲であり得る。その他の有効な投与量は、多くの要因の中でも特に、患者又は対象の大きさ及び年齢、患者の全体的な健康による。約０．００１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ未満〜約１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上の範囲の投与量が想定され、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ〜約２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの範囲がより利用される。
【背景技術】
【０００８】
巨大タンパク質又は他の巨大分子が治療又は診断物質としての役割を果たす、多数の新規な治療製品がある。慢性疾患の治療用では、患者の便宜及びコンプライアンスの向上のために、皮下注射のような非静脈経路を通じた大型分子の送達に大きな関心がある。ペプチド（モノクローナル抗体のようなポリペプチドを含む）、タンパク質及びＤＮＡの経口投与は、より一層便利であり、同様に安全である。しかしながら、ヒトにおいては、巨大タンパク質分子の経口的吸収を達成することは不可能であると思うのが大勢である。経口投与されたタンパク質、ペプチド及び遺伝子物質のような分子は、胃腸管（ＧＩ）で消化されたり、腸細胞の細胞膜を通過しての拡散に失敗したり、或いはその両方であるため、非経口的経路のみが、これらの活性成分を投与する信頼性のあるものとして広く思われている。経口的経路により提供される場合、タンパク質は、小腸細胞によって損傷することなく吸収されない。むしろ、それらは、酵素によってアミノ酸成分に分解され、そしてバイオテクノロジー産業により提供される大部分の治療タンパク質は、胃腸管分解経路に非常に敏感である。
【０００９】
一方で、一般的な投与経路である非経口投与は、さまざまな理由により、巨大分子の送達のための最善策にはなれない。経口投与に比べて非経口的送達は、より多くの費用がかかり、ハードウェア及びより高度に熟練した人材を必要とする。
【００１０】
非経口投与後にも、巨大分子は、膜通過という問題に直面する。それらは、多数の標的細胞から排除され、その結果、除去又は分解されるまで血中を循環するが、決して良好に身体細胞に入り込むことはない。巨大分子は、脳血管障壁のような局地的障壁を通過することに失敗し得るため、脳のような選択された臓器及び組織に対する巨大分子の標的化を、実際には阻止する。これは、アミロイドを脳から除去してアルツハイマー病を反転させようとした、アミロイド経路内の標的に対する多数のモノクローナル抗体の臨床試験の失敗、及びそれらの十分な活性の不足に内在する理由となり得る。一般的に、これらのタンパク質の大きな寸法及び脂質溶解度の欠乏が、別の新規な標的モノクローナル抗体の細胞内有効性を制限することがある。
【００１１】
明らかに、経口用タンパク質の成否は、ＧＩ管における酸及び／又は酵素分解を克服し、その後に小腸の腸細胞膜を通過する透過性の低さを克服し、最終的に、細胞に入って他側から通過する流れができないことを克服する新規な製剤の創出に依存する。
【００１２】
胃腸管分解の課題のみを克服した最近の製剤は、約５％の吸収を達成することができる。そのような進展は、確実に重要であるものの、不十分であるため、タンパク質を腸細胞に吸収できるようにする新規な手段でタンパク質の乏しい生物学的利用能を更に改善する必要が依然としてあり、これは本願において初めて開示される。
【００１３】
更に、本発明の送達手段は、ナノ粒子上で行われる変更ステップによって、脂質ナノ粒子をその分子積載物を損傷することなくカイロミクロンに取り込まれるようにして、その次の問題である細胞内送達の問題を初めて解決する。カイロミクロンへの取り込みの成功は、本願に開示されたコレステリルエステルを用いて脂質ナノ粒子を構築してのみ可能である。
【００１４】
腸細胞による経口的吸収のために巨大分子を送達しようとした先行技術の試みでは、ナノ規模の粒子内でのカプセル化に頼っていた。殆どの業績が、組成を多様にしたリポソームを用いて行われた。
【００１５】
下記の特許文献１の抜粋で説明されるように、リポソームは、上述した問題点を解決することができなかった。
「リポソームは、小型分子用の送達ビヒクルとして広範に利用されている。しかし、リポソーム内において、多くの巨大分子薬物に関する高濃度のカプセル化の達成は、依然として困難である。更に、多くの薬物製剤は、余りにも迅速にリポソームから漏出し、有用な薬物送達動態を維持することができない。マイクロ及びナノ粒子による薬物送達が、タンパク質及び小型分子薬物をカプセル化できるが、これは依然として粒子質量当たり非常に低いカプセル化薬物の総質量を提供し、この場合にはタンパク質：リン脂質混合物で、典型的にはおおよそ１：１０００〜１：１０、０００の質量比である（例えば、ＵＳ７，６６２，４０５参照）。その上、重合体粒子合成で用いられる有機溶媒及びこれらの粒子内の疎水性／酸性環境が、治療剤の破壊をもたらし得る。（Ｚｈｕら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００  １８：５２−５７参照。）」
【００１６】
上述の水溶性タンパク質又は小型分子の少量のカプセル化以外にも、リポソームの使用に伴う他の問題点がある。具体的には、大部分のリポソームの中身はリン脂質、通常はホスファチジルコリンである。そのようなナノサイズの脂質粒子は、高い陽電荷で帯電されており、したがって腸細胞の外膜により、また末梢細胞の細胞膜により反発される。
【００１７】
したがって、リン脂質ベースのリポソームは経口的に吸収されず、また非経口的に投与した場合、その中身を細胞に通過させることができない。したがって、現在の組成物のリポソームは、タンパク質又はペプチド（ポリペプチド、例えば、モノクローナル抗体を含む）のカプセル化に不適であり、十分な分子をそれらの粒子に積載するとしても経口的吸収の課題は解決することができない。更に、いずれのホスファチジルコリンベースのリポソームも、その積載物を損傷することなくカイロミクロンに取り込まれることはできない。
【００１８】
Ｔｓｅｎｇ及び彼の仲間は、そのような問題点を２００７年に記述しており（非特許文献１）、そこでコレステロールをホスファチジルリポソームに付加することが、そのような特性を変更して積載を改善するという仮説を試した。彼らは積載において僅かな改善を見出したが、外側表面の陽電荷を変更させるのに十分なコレステロールはなかった。彼らにとってのより大きな意義は、リポソーム内のコレステロールを増加することは、積載された分子の脱出を防止するという観察事実であった。「リポソーム内のコレステロール含有量を増加した結果、非電解質及び電解質溶質についての膜透過性において莫大な増加をもたらす。リポソームによる最適化された薬物の送達は、最終的に透過性になり、標的化領域へカプセル化された薬物を放出するようにするリポソーム担体を必要とするが、それはまた血流での高い安定性を必要とする」。したがって、全体的にコレステロール含有リポソームの分子放出特性における悪化を挙げて、本発明の特異なナノ粒子とは完全に無関係な分野を教示しており、リポソーム分野全体においてリポソーム成分としてのコレステロールをほぼ諦めている。
【００１９】
本発明においては、発明者らは、ＧＩ管腸細胞の膜を通過してカイロミクロンに入り、そして細胞膜を通過する間に分子を保護しようとする特定の目的で、高い積載性及び遅い放出特性を有したコレステリルエステルを選択したことに留意されたい。コレストソームのカプセル化タンパク質の開梱（ｕｎｐａｃｋｉｎｇ）は、身体細胞の内部でのみ起こり、これは現存するどのようなシステムにも優って、本願に開示された送達方法に非常に大きな長所を与える。出願人は、特許が存在する前に発明されたが、これまで薬物送達システムでは用いられたことのないトロイの木馬に類似したものを開示する。
【００２０】
開示された方法は、脂質の中でもコレステリルエステルのみが、カイロミクロンによる細胞内送達中の全ての行程で損傷されることなく取り扱われるので、コレステリルエステルを用いてのみ意図されたように働くということにも注意されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】米国特許出願第２０１１０２２９５２９号明細書
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ｔｓｅｎｇら、J of Medical and biological engineering ２００７年、２７：２９−３４、「Liposomes incorporated with cholesterol for drug release triggered ｂy magnetic field」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
既存の巨大分子治療の限界を考えれば、経口的のような、より便利な経路で薬学的に活性な巨大分子を投与する製剤及び治療法への需要が持続しており、タンパク質及びその他の分子が細胞に入ることを可能にする製剤への需要も持続している。これらの２つの側面を達成する製剤の使用が、本発明の主要な課題である。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
一実施形態において、本発明は、薬学的活性剤を含むコレステリルエステルナノ粒子の医薬組成物（積荷積載コレストソーム）を提供し、薬学的活性剤は、１種以上の非イオン性のコレステリルエステルを含有する表面層によりカプセル化される。本発明に用いられるコレステリルエステルは、コレステロール（本願に定義された通り）及び本願において別途記載される１種以上の飽和又は不飽和脂肪酸、好ましくはＣ4−Ｃ36脂肪酸、しばしばＣ8−Ｃ26脂肪酸、しばしばミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール酸、リノレライド酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、ドコサヘキサエン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、又はそれらの混合物からなる群から選択される脂肪酸から生成される。本発明によるコレストソームは、胃腸管の腸細胞により非常によく吸収され、その内容物とともにカイロミクロンに迅速に移動し、それによりカプセル化された分子を身体細胞に直接輸送する手段を提供し、更に付随的かつ重要なことに、その過程中に、肝における初回通過吸収経路（ｈｅｐａｔｉｃ  ｆｉｒｓｔ  ｐａｓｓ  ｕｐｔａｋｅ  ｐａｔｈｗａｙ）を迂回する手段を提供する。全く予想外なことに、本願において請求する積荷積載コレステリルエステル小胞は、治療及び診断がもたらされるようにして、ペプチド（ポリペプチド、例えばモノクローナル抗体）及びタンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡといったポリヌクレオチドなどの他の巨大分子、巨大分子抗微生物剤（抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤及び抗プリオン剤）などの、寸法及び分子量が非常に多様な様々な分子を細胞に送達することができる。
【００２５】
本発明において、１種以上のコレステリルエステルに対する活性分子（好ましくは、薬学的活性剤を含む）の質量比は、約４：９６〜約９６：４、約１０：９０〜約９６：４、しばしば約１０：９０〜約９６：４、しばしば約２０：８０〜約９０：１０、約２０：８０〜約５０：５０、約５０：５０〜約９６：４、約９０：１０〜約９６：４である。
【００２６】
物理的特性
特定の実施形態において、医薬組成物は、小胞体積の約１０％〜約９８％、約２０％〜約９６％、しばしば約５０％〜約９６％、しばしば約９０％〜約９６％が、薬学的活性剤により占有される単一薄膜小胞である。
【００２７】
別の実施形態において、交互嵌合型の交互アルキル鎖モデル（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｅｄ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ａｌｋｙｌ  ｃｈａｉｎ  ｍｏｄｅｌ）を用いて、薬学的活性剤−コレステリルエステル官能基相互作用に基づいて１種以上のコレステリルエステルを選択することにより、１種以上のコレステリルエステルに対する薬学的活性剤を含む活性分子の質量比を最大化する。下記実施例２は、最適の薬学的活性剤−コレステリルエステル官能基相互作用を確保する製剤の基準を記述する。
【００２８】
更に別の実施形態において、医薬組成物は、１種以上のコレステリルエステルをジエチルエーテル中で反応させて、得られる有機相を真空下に除去し、水相を導入することを含む方法によって作られるコレストソーム小胞である。
【００２９】
更に別の実施形態において、コレステリルエステルは、それらの十二指腸腸細胞の表面上のコレステロール輸送体との反応性、及びカイロミクロンへの取り込み時まで腸細胞で無傷のまま残っている能力に基づいて選択される。
【００３０】
本発明の実施形態において、コレステリルエステルは、コレステロールをＣ4−Ｃ36の飽和又は不飽和脂肪酸、しばしばＣ8−Ｃ26脂肪酸でエステル化して得られる。特定の実施形態において、コレステリルエステルは、しばしば、コレステリルミリステート、コレステリルラウレート、コレステリルドデコネート、コレステリルパルミテート、コレステリルアラキドネート、コレステリルベヘネート、コレステリルリノレート、コレステリルリノレナート、コレステリルオレエート及びコレステリルステアレートからなる群から選択される。
【００３１】
コレストソームにおける抗感染分子
好ましい実施形態において、本発明は、抗感染化合物を含む積荷積載コレストソームの医薬組成物を提供し、抗感染化合物は、（１）ミコナゾール、テルコナゾール、エコナゾール、イソコナゾール、チオコナゾール、ビホナゾール、クロトリマゾール、ケトコナゾール、ブドコナゾール、イトラコナゾール、オキシコナゾール、フェンチコナゾール、ナイスタチン、ナフチフィン、アムホテリシンＢ、ジノコナゾール及びシクロピロクスオラミン、ミカファンギン、カスポファンギン、アンチデュラファンギン、バンコマイシン、ダプトマイシン、オリタバンシン、ＷＡＰ８２９４Ａ、ダルババンシン、セフタロリン、セフェピム、セフタジジム、キヌプリスチン／ダルフォプリスチン（シナシッド）、ホスホマイシン、コリスチン、チゲサイクリンからなる群から選択され、（２）本願において別途記載されるコレステリルエステルから本質的になる表面層によりカプセル化される。その組成物は、感染治療に用いることができ、経口又は膣内経路を含めて局所的に投与されることができる。
【００３２】
ペプチド分子インスリン及びその他
更に別の好ましい実施形態において、本発明は、ペプチドを含む積荷積載コレストソームの医薬組成物を提供し、ペプチドは、しばしば、親水性ペプチド、ヒト成長ホルモン、プロラクチン、オキシトシン、カルシトニン、ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、グレリン、ＧＬＰ−１、ＰＹＹ３６、オキシントモジュリン、ＧＬＰ−２、グルカゴン及びインスリンからなる群より選択され、本願において別途記載されるコレステリルエステルによりカプセル化される。その組成物は、牛乳生産の増大、膵臓若しくは肝臓などの臓器及び組織の構造又は機能の改善、哺乳類の成長の増大又は開始、又はインスリン治療が有益な個体へのインスリン投与のために投与されることができる。
【００３３】
特定の実施形態において、ナノ粒子の表面層は、胃腸管内での医薬組成物の分解を防止するために、更に腸溶コーティングされる。
【００３４】
特定の実施形態において、積荷積載コレストソームの表面層は、約２〜約１４のｐＨの範囲において損なわれないでいる。
【００３５】
更に別の実施形態において、積荷積載コレストソームは、材料が押出ステップを受けるか、又は押し出されないかに依存して、約５ｎｍ〜１０、０００ｎｍ（１０マイクロメートル）、約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍ、しばしば約５０ｎｍ〜約７５０ｎｍ、約１００〜約５００ｎｍ、約２００〜約３００ｎｍの直径を有する単一薄膜小胞である。したがって、活性分子が大きな場合には、大きなコレストソームが用いられ、活性分子が小さな時には、小さなコレストソームが用いられるということに注意されたい。
【００３６】
経口吸収特徴及び有利な関連特性
理論によって制限されることなく、本発明は、コレストソームに分子をカプセル化する製剤の経口送達を可能とし、コレストソームは、分子認識によってＧＩ腸細胞に入り込み、摂取され、カイロミクロンに取り込まれ、それにより胃腸管、腸細胞、リンパ系、血液において、そして身体細胞の膜の通過において、分子の元の状態を完全に保護する。本発明の製剤は、身体の細胞に吸収されるまで活性成分を放出しない。したがって、本発明の特徴は、以下を含む。
１）Ｃａｃｏ２腸細胞障壁の完全通過
２）細胞膜障壁の完全通過
３）エンドソーム吸収を大幅に回避する細胞内送達方法
４）経口送達が、活性分子寸法、電荷、結合又は分解経路と無関係であり、積荷積載コレストソームの表面は、それ自体が中性である
５）活性成分が、肝周辺のリンパ管で循環する−初回通過肝吸収を回避する経口的送達、及び
６）分子送達が、カイロミクロンの表面へのアポリポタンパク質の結合により促進され、細胞と結合することができ、細胞内に充填されて、続いて細胞質においてカプセル化された分子が開梱される。
【発明の効果】
【００３７】
したがって、本発明による積荷積載コレストソームは、積荷（すなわち、活性分子）を、コレストソームでの投与でない場合に（すなわち、リポソーム内での送達を含む従来の薬学的送達手段により）提供される濃度の少なくとも２倍の濃度で、本発明の組成物が投与（好ましくは、経口的に）される患者又は対象の細胞内に送達することができる。ほとんどの実施形態において、本発明は、コレストソームがない場合に提供される濃度の１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍及び１、０００倍又はそれ以上の濃度で細胞内に活性分子を提供する。したがって、本発明は、これまでに提供されることができなかった多様な寸法及び分子量の分子をカプセル化する手段（それ自体が予測されなかった結果）を提供し、寸法とは関係なく、本発明の組成物は、先行技術より非常に高いレベルの濃度で活性分子を細胞内標的に送達することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
（表１）コレストソームと他の送達法の間の特徴比較を示し、コレストソームが全てのカテゴリーにおいて優れるか、又は少なくとも同等であるということを証明する。そのような比較の特に重要な１つの側面は、ほとんど全ての分子が、分子それ自体の変更なしに、コレストソームにカプセル化されることができるということである。これらの特徴は、他の送達システムとは共有されない、その分子自体に特有の傾向である。
【図１】カイロミクロン、コレストソーム及びリポソームの構造的特性を比べる略図、及びコレストソームのカプセル化分子を含むカイロミクロンのアセンブリを示す。図は、カイロミクロンへのコレストソームの取り込み前のコレストソーム内部の分子を示す。カイロミクロンへのアポリポタンパク質（ＡＰＯ）構造体の取り込みは、それらが細胞と結合して、コレストソーム及びその内容物を含むそれらの内容物を放出するようにする。これと対照的に、リポソームは、リン脂質から本質的に構成されており、陽電気を荷電した表面を持つ、完全に異なる物理的構造体である。陽電荷を有したリポソームは腸細胞に吸収されないため、カイロミクロンに入り込むことができない。リポソームは、一般的に、静脈内注射の後に、肝により１次的に消去される。コレストソーム及びカイロミクロンは、リンパ管を通じて肝をバイパスし、このことは、それらがカプセル化された構築物を細胞に充填する主な理由である。
【図２】１：１モル濃度比のコレステリルラウレート／コレステリルミリステートの３Ｄモデルを示す。Ａ）底面図スライス、Ｂ）上面図スライス。赤色は陰電荷（細い白色矢印）を、青色は陽電荷（太い白色矢印）を示しており、黄色表面は、１つの荷電された領域から他の所への移動を示す（黒色矢印）。Ｂにおける白色矢尻は、エステル化された脂肪酸部分の予想される位置を示す。そのような断面図では、結合が発生し得る領域として表面を提示することができ、エステル化される脂質の性質に依存して、空洞が分子を結合するための複数の分離された部位を有することができるということに注意されたい。
【図３】ＤＬＬＳを用いて測定される、まだ積載していないコレストソームの製剤におけるコレストソーム寸法のガウス分布を示す。これらの製剤中のコレストソームは、直径が２１７＋／−１１６ｎｍであった。寸法は、約５０ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲である。スケールは、１ミクロンと等しい１０００ｎｍである。
【図４】透過電子顕微鏡からの画像の考察におけるコレストソームの寸法を示す。コレストソームは、モリブデン酸アンモニウムを用いてネガティブ染色され、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈ−５００透過電子顕微鏡で画像が取得された。スケールバーは、寸法判断のために示されている。１０００ｎｍのスケール単位は１ミクロンと等しく、これは１マイクロメートルと等しく、１メートルの百万分の１と等しい。その顕微鏡においてコレストソームについて観察されるメジアン径の範囲である約２５０ｎｍは、ＤＬＬＳにより決定された寸法分布と一致する。
【図５】２４時間の培養後に測定された、コレストソームを介したＦＩＴＣのＭＣＦ７細胞への送達を示す。（Ａ）ＦＩＴＣカプセル化コレストソーム（ＣｈＦ）の添加。（Ｂ）遊離されたＦＩＴＣ溶液（ＦＩＴＣ、０．５Ｍ）の添加。（Ｃ）１００μｌの蒸溜水の添加。完全培地で細胞を一晩中、ＣｈＦ、ＦＩＴＣ（１００ｕＬ）、又はビヒクル（水）と一緒に培養した。細胞を培地で２回洗浄し、次いで１５分間、１０ｕＭのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２と培養し、核を染色した。その後、細胞の生存を証明する。ＣｈＦ処理細胞（Ａの左側パネル）における均質な蛍光が、細胞質における一様な分布を表すことに注意されたい。
【図６】ＨＰ  ＸＷ８０００ワークステーションでＳＹＢＹＬ（Ｔｒｉｐｏｓ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を用いての、コレステロールエステルの分子モデリングの間におけるエステル鎖長の影響力を示す。略等しいアルキル鎖長のコレステロールエステルの異なる対を用いて形成された、対照的なモデルが示されている。ＧＡＳＴＩＧＥＲ  Ｈｕｃｋｅｌの方法を用いて電荷を算出しており、これは静電気等電位分布図（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｉｓｏｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍａｐ）への入力値である。示された等電位表面は−１０〜＋１０ｋｃａｌにあり、エステル連結及びステロール核をハイライトする。赤色は−１０であり、青色は＋１０ｋｃａｌである。結果として求められた図面中心での差は、エステル連結である。モデルにおけるエステルの長さ変化は表面又は内部に変化をもたらさないが、そのような変化は、ステロール核を互いにより近接させたことに注意されたい。これはまた、内部径だけでなく、疎水性「トラック」の特徴も変化させる。
【図７】ミリステート及びラウレートのコレステリルエステルで形成されたマトリックスの画像セクションを示す。電荷を算出し、静電ポテンシャル図を作成した。青色／赤色領域は、二重層を形成する交互嵌合型のアルキル鎖があるより親水性の領域を表示することに注意されたい。示された分子は、約６００ダルトンのｍｗ及びその最大幅地点の寸法が１．８ｎｍの親水性分子であるセフタロリンである。
【図８】ＨＰ  ＸＷ８０００ワークステーションでＳＹＢＹＬ（Ｔｒｉｐｏｓ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を用いての、コレステロールエステルミリステート及びラウレートの分子モデリングによって形成及び図示されたマトリックスに対するセフタロリンを示す。交互嵌合型のアルキル鎖は、この実施例ではミリステート及びラウレートの２つのコレステロールエステルから示される。それらの構造体は、この場合、分子セフタロリンと相溶性のある内部表面及び外膜を形成する。セフタロリンは、その最大幅地点で１．８ｎｍである。コレストソームの直径は２５０ｎｍである。膜の寸法に基づくと、完全に積載したコレストソームは、内部において９６％の水溶性分子での含有量を有する。
【図９】環内に並んでいる基本コレストソームマトリックス内のセフタロリンの図を拡大して示す。セフタロリンは、非常に小さな１．８ｎｍの分子であり、相対的な寸法の図解を目的に１１５ｎｍのコレストソーム内に積載された。環は、コレステリルエステルの鎖である。
【図１０】示された１つの分子での、セフタロリン周辺の部分的にアセンブリされたコレストソームを示す。部分的にアセンブリされたコレストソームマトリックスは、セフタロリン分子に対する壁と構造物を現わしている。寸法は、以下のものを含む：示された膜の幅は、４ｎｍである。セフタロリンは、長さが１．８ｎｍである。親水性の内部コアポケットの内径は、６５ｎｍである。
【図１１】ＨＰ  ＸＷ８０００ワークステーションでＳＹＢＹＬ（Ｔｒｉｐｏｓ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を用いての、コレステロールエステルのマトリックスとの関係でのインスリンの分子モデリングを示す。交互嵌合型のアルキル鎖は、この実施例ではミリステート及びラウレートの２つのコレステロールエステルから示される。これらの構造物は、この場合はインスリンである示された分子と相溶性のある内部表面及び外膜を形成する。寸法は、以下のものを含む：示された膜の長さが３６ｎｍであり、幅が４ｎｍである。インスリンは、最大幅地点で４ｎｍである。コレストソームの直径は、２５０ｎｍである。膜の寸法に基づき、水溶性分子で密に充填される中心を仮定すると、完全に積載されたコレストソームの中空内部コアは、内部内容物が９６％程度の大きさであり得る。
【図１２】インスリン周辺の交互嵌合型の交互アルキル鎖モデルにおいて、アセンブリされたミリステート及びラウレートから形成されるマトリックスの画像セクションを示す。電荷を算出し、静電気ポテンシャル図を作成した。交互嵌合型のアルキル鎖のあるより親水性領域を示す青色／赤色領域は、小胞を形成することに注意されたい。インスリンマトリックス（黄色）の内部に示された分子は、約６００ダルトンのｍｗを有した親水性分子のセフタロリンである。オーバーレイ（ｏｖｅｒｌａｙ）は寸法差を図示するために行われており、同一のコレストソームでこれらの２つの分子を組み合わせることは、本発明者による何の意図もない。
【図１３】ミリステート及びラウレートのコレステロールエステルから形成される場合において、基本的なコレストソームマトリックス中のインスリンの図を拡大して示す。寸法は、以下のものを含む：マトリックスとして示された膜の長さが３６ｎｍであり、幅が４ｎｍである。インスリンは、最大幅地点で４ｎｍである。図解の目的に示されたコレストソーム小胞の直径は、１００ｎｍである。
【図１４】ＨＰ  ＸＷ８０００ワークステーションでＳＹＢＹＬ（Ｔｒｉｐｏｓ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を用いての、コレステロールエステルに対するベバシズマブの分子モデリングを示す。交互嵌合型のアルキル鎖は、この実施例ではミリステート及びラウレートの２つのコレステロールエステルから示される。これらの構造物は、この場合はベバシズマブである示された分子と相溶性のある内部表面及び外膜を形成する。寸法は、以下のものを含む：ベバシズマブは、長さが１７ｎｍであり、幅が４ｎｍであるが、単一マトリックス環において示された膜は、長さが３６ｎｍであり、幅が４ｎｍである。押し出されていないベバシズマブに対するコレストソームの直径は１０、０００ｎｍであるが、押し出されたものは２５０ｎｍである。膜の寸法に基づくと、単一の二重層環と結合された完全に積載されたコレストソームは、内部において重量比で９６重量％の水溶性分子での含有量を有する。
【図１５】この場合にはミリステート及びラウレートのコレステロールエステルから形成された、基本的なコレストソームマトリックスにおける、ベバシズマブの図を拡大して示す。２５０ｎｍのコレストソームの体積は７００万立方ナノメートル、又は７×１０-15ｍｌである。単一薄膜であると仮定すれば、それから積載指数を算出すると、コレストソームは体積の４％を包含し、その内部溶液は体積の９６％を包含する。寸法は、以下のものを含む：ベバシズマブは、長さが１７ｎｍであり、幅が４ｎｍであり、示された膜の直径は１００ｎｍである。
【図１６】ＨＰ  ＸＷ８０００ワークステーションでＳＹＢＹＬ（Ｔｒｉｐｏｓ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を用いての、コレステロールエステルから形成される基本的なコレストソームマトリックスでのベバシズマブ、インスリン、セフタロリンの分子モデリングを示す。交互嵌合型のアルキル鎖は、この実施例ではミリステート及びラウレートの２つのコレステロールエステルで示される。これらの構造物は、この場合はベバシズマブ、インスリン及びセフタロリンである示された分子と相溶性のある内部表面及び外膜を形成する。膜の寸法に基づくと、完全に積載されたコレストソームは、水溶性分子が積載される場合、内部において９６％の含有量である。積載は、ｖ／ｖ（小胞の体積及び分子の体積）を基準に算出することができる。仮定：コレストソームは、直径が２５０ｎｍの球体である。次いで、親水性の内部コアポケットの直径は２４２ｎｍであり、半径が１２１ｎｍである。これは、約７００万ｎｍ3（立方ナノメートル）のコレストソームの全体積をもたらす。分子の体積を算出することができ、総電位（溶媒を含まない）を算出することができ、そのような方法で小胞対分子の質量比を算出することができる。別の方法は、小胞の体積を考慮し、カプセル化される類似物の濃度を考慮するものである。例えば、溶液中で１００ｍｇ／ｍｌのベバシズマブを、立方ナノメートルをｍｌに変換し、次いでコレストソームに入れることができる量を定めて、その方法で質量を比べる。変換時、それは、内容物中のベバシズマブ対脂質の比率が約９６：４％となる質量比を生じる。
【図１７】Ｃａｃｏ２細胞の単一層の頂端側の、コレストソームのカプセル化された分子に対する暴露に続く、基底液の収集に用いられる器機の図を示す。全ての寸法のコレストソームのカプセル化された分子がＣａｃｏ−２細胞に摂取され、そこから積載されたコレストソームが、ゴルジ体により損傷することなくカイロミクロンに取り込まれる。腸細胞による吸収プロセスは、Ｃａｃｏ−２細胞に対してここで提示されるプロセスよりも更に迅速且つ効率的である。カイロミクロンのその他の典型的な構成成分はＡＰＯ−Ｂ、他のアポリポタンパク質及びトリグリセリドである。形成後、カイロミクロンは、Ｃａｃｏ−２細胞によって単一層の基底側でリンパ液に分泌される。コレストソームを積載したカイロミクロンは、Ｃａｃｏ２の単一層の基底側において液体中で捕えられる。
【図１８】（コレストソーム中ではなく）Ｃａｃｏ−２細胞上に１時間位置する、ＦＩＴＣインスリンの頂端側配置を示す。画像は、１時間になったところで蛍光顕微鏡によって撮影され、ここで画像は全細胞系の両側面の撮影であり、緑はＦＩＴＣの標識である。紛れもなく、ＦＩＴＣ信号は主に頂端層に留まる。しかし、ＦＩＴＣインスリン（又は消化されたインスリンの場合はＦＩＴＣ断片）がＣａｃｏ−２細胞に摂取され得るという信号がある。凝集粒子に注意されたい（例えば、矢印）。これは、下端右側において大きな蛍光構造を提供するＦＩＴＣ又はＦＩＴＣインスリン断片のカイロミクロン吸収と見なすことができる（矢尻）。
【図１９】基底側での液体の画像でベースライン条件を見せるために撮影された画像とともに、トレンスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）実験の結果を示す。Ｃａｃｏ２（ＰＢＳ／グルコースのみ）の頂端層には何も適用されておらず、基底側チャンバにはＰＢＳのみがあり、したがって、画像は本発明の試験に用いられたＣａｃｏ−２細胞系の本来の蛍光を反映する。液体を基底側から取った後、２００×倍率で画像を撮影した。スケールは１０μｍで、１０、０００ｎｍである。
【図２０】上記と完全に同一の条件下で、ＦＩＴＣコレストソームを用いたトレンスウェル実験の結果を示す。今度は、本発明者が、ＰＢＳ中にＦＩＴＣを有したコレストソームを頂端側に適用し、２時間放置した。そのように画像化したカイロミクロンを基準にすると（２０〜３０μｍ＝２７、０００ナノメートル）、これらは、頂端側に適用されたＦＩＴＣコレストソームよりも１００倍更に大きい。本発明の発明者は、おそらく、それが内部の取り込まれた多数の２５０ｎｍＦＩＴＣ−コレストソームを有した大きな寸法のカイロミクロンに対する中央値であるだろうと結論した。そのような画像が、基底側からの液体のみで提供され、液体除去前の製剤の画像ではないという点に注意されたい。ここで、画像は、２０倍の倍率のものである。頂端側に適用された溶液に遊離されたＦＩＴＣ−コレストソームが残存する公算があるが、この画像は、ただトレンスウェル製剤からの除去後の基底液を示すものであるので、それをここで定量することはできない。
【図２１】上記と完全に同一の条件下のトレンスウェル実験の結果を示し、今度は、本発明者が、ＰＢＳ中にコレストソーム−ＦＩＴＣ−インスリンを適用して、２時間放置した。カイロミクロン画像（４０〜６０μｍで、これは４０、０００〜６０、０００ナノメートル）の寸法判断に基づくと、これは内部に取り込まれたＦＩＴＣ−インスリン−コレストソームを有した比較的大きなカイロミクロンである。本発明者は、基底側からの液体のみを画像撮影したことに注意されたい。ここで、画像は２００倍で撮影され、スケールは１０、０００ｎｍを示す。
【図２２】ＭＣＦ−７細胞でのＦＩＴＣ−インスリン暴露のための本来の出発濃度が４６６ｍｃｇ／ｍｌであることを示すが、これは、Ａ列においてＭＣＦ−７細胞の内部で測定可能な量のＦＩＴＣインスリンを提供してはいない。その下方にある２つの図（Ｂ及びＣ例）について、ＦＩＴＣインスリンコレストソームの濃度は０．４６ｍｃｇ／ｍｌであり、これは、最後の２つの図にまとめた実験に対しても同一である。ＦＩＴＣインスリンコレストソームからの０．４６ｍｃｇ／ｍｌ（Ｂ列）は、コレストソームのないＦＩＴＣインスリンの４６６ｍｃｇ／ｍｌ（Ａ列）とほぼ同一の細胞内蛍光を提供する。コレストソームのないＦＩＴＣインスリンの４６６ｍｃｇ／ｍｌ（Ａ列）と比べると、Ｃａｃｏ−２細胞によるＦＩＴＣインスリンコレストソームのカイロミクロンへの更なる加工は、ＦＩＴＣインスリンコレストソーム−カイロミクロンからの細胞内部のインスリンの量（Ｃ列）において、ＦＩＴＣ−インスリンのみの量より１００倍より大きく、確固たる改善を提供し、Ｃａｃｏ−２細胞により加工されない場合、０．４６ｍｃｇ／ｍｌのインスリンの有効性より遥かに大きい。Ｃａｃｏ２細胞を通過する量が、頂端側に投与されるインスリンの全部であると仮定すれば、Ｃ列のＦＩＴＣインスリンコレストソームカイロミクロンのインスリン濃度は、Ｂ列の中央でのインスリン濃度と同一である。これらの特定の製剤には遊離されたインスリンが残っており、Ｃａｃｏ−２細胞を通り過ぎる移動が１００％未満である場合、これらの細胞内の積載の比率はより大きい。明らかに、ＦＩＴＣインスリンコレストソーム−カイロミクロンは、細胞内部により大きな積載を達成し、ＦＩＴＣコレストソーム単独で先に示したように、再びコレストソーム単独により、ペプチドが細胞膜を通って細胞に入るようにするということを証明する。下端のＣ列での画像は、観察された細胞内部でのＦＩＴＣインスリンコレストソームカイロミクロンの浸透を反映する。本画像において、細胞膜がＦＩＴＣインスリンを劇的により大きく濃縮するだけでなく、これらの細胞の細胞質にはＦＩＴＣインスリンが積載される。これは単に２時間の暴露後であるため、カイロミクロンがより大量で積載するだけでなく、それ自体でコレストソームより更に速く積載するということが確認される。
【図２３】ＦＩＴＣトブラマイシンの製剤に暴露されたＭＣＦ−７細胞を、明視野でＦＩＴＣ蛍光画像と比べたものを示しており、以下を提示する。１）ＦＩＴＣ−コレストソームに対する２４時間の暴露後、ＭＣＦ−７細胞の全体的な成功的積載、これはコレストソームを用いた本発明者の作業において繰り返して提示されている。２）において、７００ｍｃｇ／ｍｌの外部濃度から本質的に影響を受けずに、前記応答性が、ＦＩＴＣ−トブラマイシンに暴露時のＭＦＦ−７細胞の細胞内積載の全般的な不足と比較される。これは、トブラマイシンが殆どの身体細胞には入り込まずに、能動的にトブラマイシンを吸収した任意の細胞は、トブラマイシンによる細胞内死滅を受けるからであると予想される。これは、トブラマイシン腎臓及び耳毒性に対する根拠となる。多大な関心の対象でもある３）において、ＭＣＦ−７細胞が、ＦＩＴＣ−トブラマイシン−コレストソームに２４時間暴露された時、これらのＭＣＦ−７細胞は、最終フレームの上端及び下端から分かるように全て死滅した。ここで、目的は、トブラマイシンが細胞に入り込む時、どのようにしてミトコンドリアに一般毒素となるのか、また、トブラマイシンが、その上、その細胞内有効性に対して耐性である細胞に入り込む時、どのようにして細胞内吸収に対して潜在的であり、害するのかを見せることである。
【図２４】２４時間目におけるＭＣＦ−７細胞へのバンコマイシンの入り込み。今度の一連の実験においては、バンコマイシンの本来の出発濃度は４１〜６６６ｍｃｇ／ｍｌであった。各コラムにおいて、上端の画像は蛍光であり、下端は暗視野である。コラムＢにおけるこのＦＩＴＣ−バンコマイシンでは、ＦＩＴＣバンコマイシンが８３ｍｃｇ／ｍｌと表示された。コラムＡにおいて、ＦＩＴＣ−バンコマイシン−コレストソームが０．８３ｍｃｇ／ｍｌにおいて、ＦＩＴＣ−バンコマイシンのコラムＢでのバンコマイシン濃度よりも１００倍より低い値でより多くの吸収を提供した。コラムＡでの蛍光画像は、コラムＢでの画像よりも更に多くの積載を示すが、これは、ＭＣＦ−７細胞の積載比率が、ＦＩＴＣ−バンコマイシン−コレストソームよりも１００倍更に大きいという点を示唆する。ＦＩＴＣ−バンコマイシンの濃度が、コラムＣにおいて６６６ｍｃｇ／ｍｌまで増加した時、これらの細胞は、コラムＡでのそれよりもっと多く積載してはいない。したがって、ＦＩＴＣバンコマイシンの積載に対する蛍光データは、コレストソームが用いられた時よりも１０００倍より大きな値に近接する。高含量のＦＩＴＣバンコマイシンコレストソームは、これらのＭＣＦ−７細胞に影響力がないことに留意しなければならない。３つのパネルにおける画像は、本発明者が観察したＦＩＴＣバンコマイシンコレストソームの細胞内部への浸透を立証する。上記画像において、細胞膜がＦＩＴＣバンコマイシンをより大きく濃縮するだけでなく、これらの細胞の細胞質にはＦＩＴＣバンコマイシンが積載される。これは、ただ２４時間の暴露後であることから、コレストソームが細胞においてバンコマイシンを大量でより多く積載するという点を立証する。
【図２５】ＭＣＦ−７細胞のＦＩＴＣインスリンコレストソームの積載が、ＦＩＴＣインスリンコレストソームを用いた本発明者の先行実験のうち、一部を凌いで改善されることを示すが、ここで、積載は、ＦＩＴＣインスリンコレストソームカイロミクロンより遥かに多い。いずれの場合においても、ＦＩＴＣインスリンコレストソームのＣａｃｏ−２細胞によるカイロミクロンへの加工は、ＦＩＴＣインスリンコレストソーム−カイロミクロンからの細胞内部インスリンの量において確固たる改善を提供する（Ｂ列）。この画像において、細胞膜がＦＩＴＣインスリンをより大きく濃縮するだけでなく、これらの細胞の細胞質にＦＩＴＣインスリンが積載される。これは、単に２時間の暴露後であることから、カイロミクロンが大量でより多く積載するだけでなく、それが、コレストソーム自体よりも更に迅速に積載するということを立証する。このような製剤は、４匹のマウスに投与された。
【図２６】４匹のマウスに対してＦＩＴＣインスリンコレストソーム製剤を経口的に与えて、３０分後に血糖計を用いて血糖の測定を行った。４匹のマウスのうち、３匹はＦＩＴＣインスリンコレストソーム製剤で、経口摂食後の３０分〜６０分の間にかなり血糖が下がった。４匹目のマウスは、投与後２時間になるまで血糖は下がっていないが、類似した減少及び回復時間を示した。データは、この図面に個別的でかつ共に示される。
【図２７】標的濃度１７３ｍｃｇ／ｍｌのＦＩＴＣベバシズマブをＭＣＦ−７細胞に適用した後、２時間、４時間及び２４時間目の暗視野及び蛍光画像を示す（上端列）。これらの濃度は、ベバシズマブ処理患者において一般的に観察されるよりも５〜１０倍更に大きいものである。ＦＩＴＣベバシズマブが、これらのＭＣＦ−７細胞のＭＣＦ−７細胞膜に統合されたという証拠はなかった。任意の時点にＦＩＴＣベバシズマブのＭＣＦ−７細胞による任意の蛍光吸収の証拠はどこにもなく、それらのＭＣＦ−７細胞に対するＦＩＴＣ−ベバシズマブの影響力の証拠もなかった。ＭＣＦ−７細胞に対抗するベバシズマブに対するＩＣ５０は、約１．０ｍｃｇ／ｍｌであった。
【図２８】ＭＣＦ−７細胞に対して調製及び試験されたＦＩＴＣベバシズマブコレストソーム及びＦＩＴＣ−ベバシズマブコレストソームカイロミクロンを示す。ＭＣＦ−７細胞がＦＩＴＣベバシズマブコレストソームの微量吸収を示した時点である２時間目に、有効性はなかった。この同一のＦＩＴＣベバシズマブコレストソームがＣａｃｏ−２細胞の頂端側に配置され、その結果、ＦＩＴＣベバシズマブコレストソームカイロミクロンが収集されたため、これらのＦＩＴＣベバシズマブコレストソームカイロミクロンは、ＭＣＦ−７細胞上で試験したものである。下端列の最初フレームは、ＦＩＴＣベバシズマブコレストソームカイロミクロンの大量吸収を示しており、後続フレームに示されたように、全てのＭＣＦ−７細胞は、実験４時間内に死滅した。これは、公知されたベバシズマブの作用機序に基づいて、全く予想以外のことである。
【図２９】中空コア内のコレステリルミリステート、コレステリルラウレート及びインスリンによる脂質ナノ粒子のアセンブリを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明の上記及びその他の側面が、発明を実施するための形態において更に詳細に記載される。
【００４０】
コレストソームは全ての先行技術よりも特異且つ新規なものである
本発明によるコレストソームは、分子のための送達システムの中で特異である。薬物送達手段の中でも特異であり、本発明の発明者らは、タンパク質及びその他分子並びに化学的化合物を、食品分野において広く公知された成分で成功的に偽装した。より具体的には、経口的吸収のために選択された物質が、食用コレステリルエステルであった。驚くべきことに、コレステリルエステルは、コレストソームのカプセル化された製品（特に、この方法以外では、患者に成功的に送達することができない巨大分子）をリポソーム又は任意のその他のナノ粒子とは差別化する以下の特性を有した、特異なコレステリルエステルナノ粒子を提供する。
１．送達手段及びシステムの全ての成分物質は、一般的な食用成分であり、ほとんどの適用において、これらの物質の１日当たりの総投与量が食品からよりも少ない。
２．コレストソームにカプセル化する作用温度は、多くの場合に３５〜４５℃であるが、これは、ペプチド及びタンパク質の身体循環形態での安定性のための最適温度である。
３．上記送達手段は、分子寸法、電荷、結合又は分解経路を考慮することもなく、全ての好ましい側面を提供する。
４．コレストソームのカプセル化されたタンパク質は、Ｃａｃｏ２腸細胞障壁の完全な通過を示し、カイロミクロンに無傷のまま取り込まれる。
５．肝及び関連の初回通過消去経路のバイパス
６．コレストソーム及びそれを含むカイロミクロンが、経口摂取から細胞内吸収までの全ての経路で細胞膜を通過するため、これらは、分子に対する保護を提供する。
７．細胞との結合、定量的な細胞内積載、細胞膜障壁の完全な通過
８．内在的な経路であるコレステリルエステルヒドロラーゼによる細胞質でのカプセル化された内容物の開梱
９．コレストソームは、エンドソーム吸収経路を用いないが、細胞内部位において積載物分子の堅固な細胞内濃度
１０．コレストソーム及びそのカプセル化された内容物は、本態形成カイロミクロンに取り込まれる時、全ての細胞に分配される。
【００４１】
一部の送達システムが上記９つの特徴のうち１つ又は一部を達成するものの、特にこれまで、未吸収タンパク質の経口的利用を可能とした場合、このような好ましい特性を広範囲に達成しつつ、積載物分子を変更することなく、本質的に任意の分子又は化学的化合物に採用することができる送達システムはなかった。コレストソームは、任意の分子に適用することができる最初の細胞内送達システムである。実際に、コレストソームは、それが小型分子とともに存在すること以上に、他のものの中でも、特にタンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド（他のものの中でも特に、ＲＮＡ及びＤＮＡ、例えば、裸のＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、干渉ＲＮＡ又は「ＲＮＡｉ」、例えば、小型干渉ＲＮＡ又は「ｓｉＲＮＡ」、小型ヘアピン型「ｓｈＲＮＡ」、二官能性ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ並びに、ＤＮＡ及びＲＮＡの多様なオリゴヌクレオチド）を含む巨大分子及び巨大分子抗生剤と効率的に存在する。
【００４２】
活性分子を患者又は対象の細胞内標的に送達する特異な機序のため、本発明による積荷積載コレストソームは、積荷（すなわち、活性分子）を、コレストソームがない場合に（すなわち、リポソーム内の送達を含めた従来の薬剤学物送達手段によって）提供される濃度よりも２倍以上の濃度で、本発明の組成物が投与される（好ましくは経口で）患者又は対象の細胞に送達することができる。大部分の実施形態において、本発明は、コレストソームがない場合に提供される（細胞に送達される）濃度よりも１０倍以上、２５倍以上、５０倍以上、１００倍以上、２５０倍以上、５００倍以上、及び１、０００倍以上の濃度で活性分子を細胞に送達する。
【００４３】
コレストソームが、分子及び化学的化合物の送達のための先行技術に比べて新規であるため、本発明者は、先行技術が任意の類似したシステムを開示しない理由を指摘するために、詳細な比較情報を提供する。
【００４４】
このような比較に次いで、非限定的な実施例が提供される。
【００４５】
下記用語は、本発明を説明するために明細書の全般にわたって使用される。本願において特に定義されていない用語の場合、その用語には、当業者が理解するものと同じ意味を付与する。本発明による１つ以上の脂質ナノ粒子カプセル化化合物を用いて治療し得る疾病又は疾患に対する定義は、当業者にとって一般的に公知されている。
【００４６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形（「a」、「an」及び「the」）は、明白に、疑う余地も無く１つを言及するものでなければ、複数の対象まで含むものである。したがって、例えば、「化合物」（a compound）という言及は、２つ以上の異なる化合物を含む。本願において使用されるように、用語「含む」及びその文法的活用型は、非限定を意図しており、リスト内の当該項目を代替し得るか、又は挙げられた項目に追加され得る他の項目を排除するものではない。
【００４７】
コレステロールは、一般的に膜及び脂質の代謝において重大な構造的役割をする。これは、胆汁酸、ビタミンＤ及びステロイドホルモン（グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲステロン、アンドロゲン及びアルドステロン）の生合成前駆体である。更に、これは、中枢神経系の発生及び作用に寄与し、信号送達及び精子発生にも重要な機能を行う。特定の膜タンパク質又はプロテオリピド（「ｈｅｄｇｅｈｏｇ≡タンパク質）に対する共有結合からも発見されるが、これは、胎芽発生において重大な機能を行う。
【００４８】
好ましくは、ヒドロキシル基に連結された長鎖脂肪酸（しばしば、８個以上２６個以下の炭素原子を含む脂肪酸）を有したコレステロールエステルは、遊離されたコレステロールより極性ではなく、細胞質での輸送のための好ましい形態に、また生物学的不活性貯蔵（解毒）形態に現われる。これらは、生物学的膜には分布しないが、細胞内脂質粒子に充填される。
【００４９】
動物においてコレステロールエステルヒドロラーゼは、膜及びリポタンパク質の形成に必要な時、コレステロール及び遊離された脂肪酸をエステル形態から遊離させる。これらは、また、副腎細胞においてホルモン合成のためにコレステロールを提供する。カルボキシルエステルヒドロラーゼ、リゾソーム酸コレステロールエステルリパーゼ、ホルモン敏感性リパーゼ及び肝細胞質コレステロールエステルヒドロラーゼを含む、多数のコレステロールエステルヒドロラーゼが同定されている。これらは、多数の異なる組織及び細胞機関に散在しており、様々な機能を有している。
【００５０】
本出願人は、コレストソームと呼ばれるコレステリルエステル粒子内に分子をカプセル化する新規な送達技術を開示し、この粒子は、小腸の細胞により経口的に吸収された後に、リンパ輸送を通じて全ての身体細胞への送達のためにカイロミクロンに入れられる。このナノ粒子がカイロミクロン輸送粒子から細胞に吸収された後、コレステロールエステルヒドロラーゼは粒子を開梱し、その分子を細胞内部位に遊離させる。
【００５１】
本出願において、コレストソームの構造に関して関連のある背景情報は、発明の名称が「Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｍｅａｎｓ」である、２００７年３月２０日に出願された米国特許出願第２００７０２２５２６４号にある。
【００５２】
本願に用いられた交互嵌合（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｉｏｎ）の原理は、当業者に公知されている。例えば、Ｙｅａｇｌｅ、Ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ２０１０）を参照。
【００５３】
「カイロミクロン」は、直径が約７５０〜４０、０００ｎｍの範囲である非常に大きな、非均質性の脂質リッチ粒子である。これらは、ＧＩ管の腸細胞で形成され、摂取した脂肪及び脂溶性ビタミンを、血流循環を介して細胞に輸送する機能を行う。コレストソーム及びその他脂質粒子由来のカイロミクロン形成の略図が、図１に示されている。分泌されたカイロミクロン粒子の寸法の非均一性は、脂肪吸収速度、吸収された脂肪の類型及び量に左右される。コレストソームが非常に大きな場合、その大きなコレストソームが取り込まれる、結果として得られるカイロミクロンがまた同様に大きくなり得る。
【００５４】
「コレストソーム」は、ＧＩ管の不利な条件下で安定し、より大きな設計融通性、大幅の多様な分子に対するより大きなカプセル化効率を保有し、更に容易な加工可能性の長所を有する。この好ましいコレストソームの特性は表１に強調されており、ここで、送達システムを比較する。コレストソーム及びリポソームの間の構造的な差は、コレストソーム上に異なる物理的及び化学的特性を与え、したがって、コレステロールに所望の特性及び機能の面で卓越性を提供する。例えば、コレストソームは、２〜１３の広範囲なｐＨで安定するものと示された。対照的に、リポソームを記載した文献、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅの２００５年度概括論文によると、「胃液（ｐＨ１．９）、小腸（ｐＨ８）内の胃腸管酵素及び胆汁酸に対するリポソームの耐性が小さくて、それらの経口的適用は無駄である。」。コレストソームは、ｐＨ分解に抵抗し、したがって、特に本発明の新規な側面である分子の経口送達のための１次的手段として用いられる潜在性を有する。
【００５５】
「積荷積載コレストソーム」は、薬学的活性剤をカプセル化したコレストソームを意味し、排他的な必要条件ではないが、コレストソーム小胞のコアに主にその薬剤を含んでいる。
【００５６】
次に、コレステリルエステルの相互作用に基づく構造的特徴は、血中システムにおいて拡張される時間を与えるためにリポソームが用いるＰＥＧ表面と近似するように算出された静電気的表面特性である。これは、コレストソーム内に含まれる薬物又は分子により長い体内滞留時間を与える。これは、一般的に薬物送達システムの長所であるが、分子が薬物送達ナノ粒子から放出できなければ、必須の長所になるものではない。
【００５７】
これに対する証拠は、一剤形のコレストソームにおいて、中性表面を有したコレストソームが−１４の測定されたゼータ電位を有することを示す、ゼータ電位の測定値であるが、それらの積載されていない形態において単独コレストソームに対する中性電荷の典型である。ゼータ電位に対する中性電荷の境界値は、約−２０〜約＋２０、しばしば約−４０〜＋１０、−５〜＋５、又は略０のゼータ電位を有していることを意味する。中性表面電荷に対する要求は、別の類型の製剤において用いられるＰＥＧの使用を誘導する。コレストソームは、多様な発明の中でも、特に実施形態の特定の比較においてＰＥＧの中性表面と近似する。
【００５８】
コレストソームの構造的変更は、異なる内部及び外部の表面特性を結果として提供するエステルのモル比変更に基づいており、コレストソームにおいてそれらの特性が（リポソーム及び他の先行技術の送達手段でのように）親水性／疎水性隔離に基づく構成によって定められないので、より容易に定められて製造される。（超音波処理の結果としての寸法、しばしば温度、しばしばｐＨ（中性ｐＨの水溶液は、脂質ナノ粒子の寸法を定義するそれらの能力に影響を及ぼすことができるカプセル化のために、分子上に異なる電荷を有する）の証拠）。これらの全ての有益な特性は、下記表１にまとめており、他の送達システムのそれと比較した。
【００５９】
表１に示されるように、コレストソーム及び他の送達法の間の特性の比較は、コレストソームが、全てのカテゴリーにおいて優れるか又は少なくとも同等であることを証明する。このような比較のうち、特に重要な１つの側面は、ほぼ全ての分子がそれ自体の変化なしにコレストソームにカプセル化され得るという点である。そのような特徴は、その他送達システムと共有されないものであり、分子それ自体で特異的な傾向である。本発明において明白に立証される設計の融通性は、薬物送達システムのための有利な特性である。
【００６０】
（表１）
コレストソームと他の一般的な薬物送達手段との特性比較
2019070031.tif 000002
【００６１】
上記表１において、合成重合体は、一般的にＰＥＧ化のような技術を意味する。担体タンパク質は、ウイルスベクターのような付着される生物学的分子を意味する。ＰＥＧ化及び担体タンパク質の構築物は静脈内に提供され、本来ＧＩ管において分解されるため、リポソームと同様に、経口的に提供する時に吸収されない。
【００６２】
リポソームと対比したコレストソームの積載特性
リポソームは、たとえドキソルビシンのような親脂質性分子を用いる場合であっても、１％重量：重量すらほとんど積載しない。本発明者によって開発されたコレストソームは、多くの場合、本願の他のところに記載されたように、２０％以上及び理論的にはより多く積載するものである。
【００６３】
リポソームはタンパク質を積載しないが、コレストソームはそれを優先して積載する
リポソームは、タンパク質、遺伝子物質（ポリヌクレオチド、例えば、本願の他のところに記載されたようなＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）、ペプチド（特にポリペプチド、例えば、モノクローナル抗体）及び利用可能な量の、巨大分子抗生剤を含めた多数の巨大分子（２％未満とは、ペプチド又はモノクローナル抗体に典型的である１００〜１０００ｍｇの投与量のカプセル化時に担体の量が非常に多いことを意味する）を積載しない。水溶性であり、電荷が陽性である多数の分子が、リン脂質系リポソームのようなナノ粒子に有利に積載されない。対照的に、コレストソーム（コア）の内部は、カプセル化膜の寸法に比べて大きく、親水性であるが、中性であり、タンパク質、ペプチド、遺伝子だけでなく、荷電された親水性小型分子を積載するにおいて交換性のあるシステムである。これらの全てがＧＩ管障壁を通過することはできないため、コレストソームの利用は、初めてタンパク質及びペプチドが経口的に吸収される可能性を提供する。
【００６４】
リポソームの陽電荷と対比されるコレストソームの中性電荷
リポソームは、Ｃａｃｏ−２腸細胞障壁を通過することができないが、実際、大部分がＧＩ管の初入において破壊され、それらの個別成分のリン脂質を収穫するようになる。したがって、リポソーム及びそれらの積載物は、おそらくそれらの表面電荷のため、腸細胞によって取られない。コレストソームは、すでにコレステロールエステラーゼによって吸収可能な部分に変換されているコレステリルエステルを含めて構成される。これらは、コレステリルエステル由来のその組成により既に中性粒子であり、完全な吸収及びカイロミクロン形成での利用のために、十二指腸の腸細胞細胞にはそのような形態が好ましい。カプセル化された分子が完全に中空中心の内部に存在する限り、コレストソームは完全に取られ、腸細胞のゴルジ体中のカイロミクロンに無傷のまま配置される。
【００６５】
リポソームは細胞膜を通過しない
リポソームは、その積載物と経口的に吸収されないばかりか、細胞に入り込むこともなく、おそらくそれらの表面でＡＰＯの欠乏時、脂質を必要とする細胞と結合する能力も備えていない。静脈内注射時、リポソームは肝により収穫され、そこでそれらの成分のリン脂質に破壊される。標的細胞が肝細胞である場合、肝における積載物分子の高い局地的濃度が大きな長所を提供できるにもかかわらず、これらは、普通、その内容物の細胞内送達を提供しない。
【００６６】
リポソーム及びそれによるその内容物がカイロミクロンに入り込まない
リポソームのリン脂質コーティングはＧＩ管で分解され、したがって、リポソーム自体で分解され、その内容物がＧＩ管で、そして、更には十二指腸の吸収部位に到着するも前に放出される。したがって、タンパク質がリポソームに積載され得るとしても、それが腸細胞により吸収できるようになる前に、リポソームとともに破壊される。リン脂質がカイロミクロンに取り込まれるリポソームを構成する機会はない。
【００６７】
コレストソームはそれ自体では細胞に入り込まない
静脈内投与されると、コレストソームは、細胞との結合に必須な表面アポリポタンパク質が欠乏しているため、細胞と結合することができない。しかし、細胞膜は、コレストソームを捕獲するものと現われ、そのような有利な点によりコレストソームの非経口的利用が特定の分子の一部の細胞内吸収を許容する。細胞内吸収は、これらの同一のコレストソームが経口的に提供される場合にはるかに多い。膣内投与を含めた局所投与が、また好ましい。
【００６８】
コレストソームは、優先的にカイロミクロンに取られるため、経口的吸収後、明らかにより多い量が細胞に吸収され得るようにする。次いで、カイロミクロンは、それらを必要とする細胞に脂質を選別的に送達する。必要とする細胞は、続いてカイロミクロンの表面上でＡＰＯ−Ｂに連結し得る結合部位タンパク質を発現して、カイロミクロンから細胞の細胞質への結合及び放出を行うようになる。その上、コレストソームから形成されたカイロミクロンは、全ての細胞に到逹する表面上のアポリポタンパク質認識特性を有する。カイロミクロンが細胞と接触する時、表面タンパク質を発現している細胞と結合し、これによりトリグリセリド及びコレステリルエステルを含む脂質の輸送を要請するようになる。リパーゼが細胞から排出された後、トリグリセリド及びコレストソームのような前記脂質が、それらのカプセル化された積載物を含む細胞に取られる。
【００６９】
対照的に、リポソームが血液に注射される場合、それらは、細胞探索脂質との結合のためのＡｐｏＥ内容物が欠乏しているため、細胞と結合すると予測されない。リポソームは、薬物送達において延長した血漿放出特徴を創出するように提供される。更に、リポソーム内のカプセル化された薬物が放出システムを遅延させることが好ましい状況において、遅延放出システムは細胞に入り込むようになり、次いで、それが担持リポソームから遊離された後の薬物特性により積載物の細胞内送達があるものと予測される。
【００７０】
積荷積載コレストソームの製剤−当業者は、容易に任意の分子を見て、どのコレステリルエステル（等）がコレストソームの形成に用いられるべきなのかを予言することができる
コレストソームは幾つかのステップで形成されるが、先に選択されたコレステリルエステルをエーテルのような有機溶媒に溶解させた後、有機溶媒を除去し、続いて超音波処理とともにカプセル化する分子を含んでいる水性の構成成分を添加して単一薄膜を形成し、水で分子周辺に親水性の比較的荷電されていない中空ポケットを生成する。
【００７１】
いずれの形成ステップも、エステルの最低溶融温度に基づいた重要な特定の温度の水槽で行われる。選択されたエステル対の溶融温度が、カプセル化のために選択される分子を分解する温度と同一であるか、又はより低くなければならないので、作業温度は、コレステリルエステル対の選択のための１次的な条件である。温度の限界を念頭に置いて、コレステリルエステル対は、４０゜Ｃ未満の温度で二重層膜を形成するように選択しなければならず、これは、開示される本発明において、カプセル化されるモノクローナル抗体の多くの実施例のためのコレステリルミリステート及びコレステリルラウレートの選択のための根拠である。
【００７２】
図２は、コレステリルラウレート／コレステリルミリステート（１：１モル濃度）コレストソームの３次元モデルを表わす。コレストソームは、図３及び図４に示されたように広範囲の寸法を有することができる。活性成分の積載は、図１５及び図１６の説明に示されたような算出を通じて決定することができる。
【００７３】
一旦、水性分子又は構築物が添加されると、濁った溶液が形成されるまで混合物を超音波処理し、単一薄膜小胞の形成のためのエネルギーを供給する超音波処理を用いて、未溶解エステルからの廃棄物を最小化する。水性の構成成分は、またその添加前に標的温度で維持され、大部分のペプチド、タンパク質及び遺伝子について先に言及したように容認し得る最高の温度は、ただ約４０゜Ｃである。
【００７４】
次いで、溶液をろ過し、ろ過液を寸法一致（ｓｉｚｅ  ｃｏｎｆｏｒｍｉｔｙ）のための押出しのために残した。次いで、試料を冷蔵庫に保管した。
【００７５】
新たにカプセル化された分子を単一薄膜コレステリルエステル小胞で取り囲み、中空ポケットの内部では、カプセル化された分子をＧＩ管の苛酷な環境との接触から保護し、酵素及び免疫係細胞から遠く保持されるようにした。内部の分子は、荷電されないまま残っている。したがって、本発明による積荷積載コレストソームの提供は、容易であり、平坦な作業である。
【００７６】
コレステリルエステル鎖長
コレストソームの外膜は、一般的に複数のコレステリルエステルが同一であるか、又は類似した分子長を有した場合、コレステリルエステルベースの脂質ナノ粒子を形成するように配列されるコレステリルエステルからなり、前記コレストソームによりカプセル化される巨大分子の周辺に均一なカプセルを形成する。コレステリルエステルは、共に可溶性である限り、異なる長さで存在することができるが、これは、それらがともに凝集するように許容して、脂質ナノ粒子の全体寸法に比べて比較的大きな中空コアを有した小胞を形成するようになる。実際に、一部の構造配置は、全体ナノ粒子の８０％を超えてコア変位（ｃｏｒｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を有しており、インスリンのような水溶性分子の有益な高水準の積載を提供する。
【００７７】
これは、小胞の形成が、コレステリルエステルの本性及びそれらの相対的モル分率によって決定される最小エネルギー配置で共存及び凝集することができる異なるエステルの差等モル分率の能力に基づいている。
【００７８】
図２９には分子、この場合はインスリン周辺のナノ粒子のアセンブリの図が示されている。ここで、鎖は円形フォーマットに配置されており、中性又は弱い陰の電荷を有した中空中心を形成する（ゼータ電位の測定は、各開示された製剤に対する実施例に示されたように、このような特性を定義するために行われた。コレストソーム単独では、−１４のゼータ電位読出値を有する）。
【００７９】
コレストソーム内部のインスリンでは、それのゼータ電位が、更に陰（ｎｅｇａｔｉｖｅ）となる。コレストソームのカプセル化製剤は、リポソームと対照的に、高い陽電荷を有しないが、ここでゼータ電位は、一部の実験で＋７６程度の範囲であり得る。
【００８０】
本例示及びその他の例示において、コレステリルエステルは、共に可溶性である限り、異なる長さを有することができ、これは、それらが共に凝集するように許容して、単一薄膜小胞を形成するようになる。これは、ナノ粒子の中空コアが、コレステリルエステルの本性及びそれらの相対的モル分率によって決定される最小エネルギー配置で共存及び凝集することができる異なるエステルの差等モル分率の能力に基づいている。
【００８１】
コレストソームのアセンブリを考慮し、図２と同様に３Ｄ略図を参照すると、ステロール核が空洞の内部と表面の外部の両方に向けてコレストソームマトリックスの内部及び外部が構造的に同一であるという過程が先ず考慮される。
【００８２】
コレステリルエステルの選択により変更され得るものは、エステルの尾の長さである。より短い尾の長さを有するほど、ステロール核は互いにもっと近くなり、（鎖長によって）小胞の疎水性本性はより減少する。これは、コレストソームの親水性特徴を強化する影響力を有することができる。これはモデルになり得、例示が図６及び７に示されている。
【００８３】
更に、鎖長とは関係なく、脂質ナノ粒子の内部コアの同一の充填を仮定すると、より大きな分子周辺のより短い鎖は、分子対脂質の質量対質量の比率を増加させる。明らかに、より大きな分子はより大きな内部コアを必要とし、よって、エステル鎖長は、モノクローナル抗体のようなより大きな分子を収容するするためのより大きなコレストソームの構築に重要である。
【００８４】
これらの考慮事項に対してバランスを取ることは、内部コアの相対的な親水性に対するエステル鎖長に影響される。より長いエステル鎖は疎水性特徴を増加させ、より多い疎水性分子がコアに充填されるようにする。
【００８５】
溶媒と相互作用するマトリックスコレステリルエステルの相互作用の論題もある。エチルアルコールを含む水性溶媒合剤は、カプセル化プロセスを全般的に補助し、固定された比率のコレステリルエステルでカプセル化される量を増やすものである。これは、構築物の電荷及びコレストソームの内部コアの電荷の影響である。
【００８６】
例えば、オキシステロールの結晶構造において、エチルアルコールのようなアルコールを含むことによる溶媒比率の変化は、酸素分子が互いにより近づけられるように補助し、これは、コレストソームにおいてエステル配列を補助することができ、また分子がコレストソーム小胞のコアにより容易に入り込むように補助する。
【００８７】
そのような相互作用のモデリングにおいて、本発明の発明者は、コレステリルエステルマトリックス構造体のモデルを試すことができ、どのエステルが特定の分子又は薬物のための最善の選択になるかを予測することができる。エステル、電荷、溶媒及び分子の間の相互作用を同時に考慮する時、システム的な接近が可能である。
【００８８】
標的に対する粒子寸法の影響力
コレストソーム成分の混合物は、巨大分子構成成分のイオン及び物理化学的特徴によって新規な方式で異なる。積荷積載コレストソームの寸法は、しばしば特定のコレステロールエステルでの標的に影響を与え、コレストソームに形成される時、特定の分子送達、したがってエステル鎖長の影響についてより良好に適合される。
【００８９】
電荷及び分子パターンがコレストソーム寸法にどのように影響を与えるか
より大きな正味の陽電荷を有するより大きな分子は、最適のカプセル化にもっと長い鎖長を必要とするが、条件は、カプセル化プロセスの間に溶融温度がカプセル化される分子の安定性と両立できるという点である。より低い正味の陽電荷を有するより小さな分子は、もっと短い鎖長のコレステロールエステルにカプセル化することができる。本発明によってコレステリルエステルに基づいた脂質ナノ粒子を提供するためのコレステリルエステル鎖長の調整は、十分にありふれた技術の範囲内である。
【００９０】
上記コレストソーム上の表面は、構成成分のバランス及び混合物の特徴により滑らかであうか、或いは粗くてもよい。小胞表面の特徴は、エステル自体だけではなく、エステル間の相互作用によるものである。予測されることは、エステルが分子の相互作用を最適化し、それらの間のホール又は空間を最小化するように凝集することである。したがって、そのような配列は、多分粗い表面を提供する。
【００９１】
本開示内容の図において、大部分のグラフィック例示が粗い構造配置を有するが、これは、エステルがそれ自体で配列されて、構造構成成分が小胞の表面上で交互嵌合され、平坦ではない（粗い）構造配置を提供するからである。一部の場合、エステルがそれ自体で配列され、一定の形態及び規模の（滑らかな）表面を提供したりもする。
【００９２】
最終表面構造配置の本性は、用いられるエステルの組み合わせ及び製剤でのそれらの相対的濃度に左右される。要約すると、エステルの選択及び分子の選択のいずれも脂質ナノ粒子の最終配列に影響を与える。多様な構成成分が表面の構造配置に影響を与える一方、それ自体で腸細胞による吸収を可能とする新規な表面特性である中性表面は、最終の製剤において選択された分子の電荷の総体的影響であるはずである。表面はいつも中性でなければならない。
【００９３】
形成されたコレストソームの特性及び提示される例示
より大きな正味の陽電荷を有するより大きな分子が、最適のカプセル化のためにもっと長い鎖長のコレステリルエステルを必要とする。
【００９４】
タンパク質及びペプチドのようなより大きな水溶性巨大分子と用いるのに好ましいコレステリルエステルは、Ｃ8−Ｃ26の飽和又は不飽和脂肪酸、多くの場合、ミリストレイン酸、パルミトオレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール酸、リノレライド酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、ドコサヘキサエン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、又はそれらの混合物からなる群から選択される脂肪酸のエステル化（又は対応するコレステリルエステルを提供する関連のプロセス）によって作られる。
【００９５】
コレストソームを形成するための１つ以上（好ましくは２つ以上）のコレステリルエステルの混合は、多様な送達特徴を有した異なる規模の活性分子を収容することができる。
【００９６】
図２は、コレステリルラウレート／コレステリルミリステート（１：１のモル濃度）コレストソームの３次元モデルを示す。コレストソームは、図３及び４に示されたように、広範囲な寸法を有することができる。活性成分の積載は、図１５及び１６の説明に示されたような算出を通じて定めることができる。
【００９７】
タンパク質及びペプチドに対して成功したことなく試みられた先行技術の送達方法の論議が提示されて、先行技術の送達方法は、ヒト患者におけるタンパク質の成功的な経口的使用に必須の重要な実施形態をほとんど保有していないという点を実務者が理解するようにさせる。このような開示内容により、また、経口吸収及びカイロミクロンへの取り込み後の後続する身体細胞への送達と関連して、コレストソームがそのような先行技術の欠点の全部及びそれぞれを解決する方法が、当業者にとって明白になる。
【００９８】
例えば、図５は、ＦＩＴＣのＭＣＦ７癌細胞へのコレストソームを介した送達を示しており、活性成分を、正確な活性成分標的化を必要とする治療部位に送達する本発明の能力を立証する。後続する実施例は、図５の方式で細胞膜を通過するより多くのコレストソーム製剤を示すが、実際にコレストソームが腸細胞に吸収された後、損傷することなくカイロミクロンを通過する時、細胞内部への送達ははるかに大きくなる。より多くの細胞内浸透を説明するこのような実施例がまた提示される。
【００９９】
個別分子に対する特定の商業的機会
先行技術で開示された送達方法及び製剤に脂質を伴う組成物は、胃腸管の腸細胞を通過せず、カイロミクロンに取り込まれず、大部分の細胞の膜を通過しないという点は広く公知されている。
【０１００】
コレストソームのカプセル化によって提供される先進能力は、先行技術の複合体の側面で驚くべきである。簡単に言及すると、いずれの送達システムも、大型親水性分子（ポリペプチド（特にモノクローナル及びポリクローナル抗体を含む）、タンパク質及びポリヌクレオチド、小型干渉ＲＮＡ、小型ヘアピン型ＲＮＡ、マイクロＲＮＡを含むＲＮＡ、並びに、特にプラスミドＤＮＡ及び裸のＤＮＡを含むＤＮＡのような巨大分子）の経口的送達の課題において順調に機能したことがない。
【０１０１】
このような分子の中でも、現在は注射されなければならないが、続いてコレストソームに剤形化後には、口腔に提供することができ、或いは軟膏又はクリームで皮膚に適用されるか、又は脂質ナノ粒子として吸入され得るという単純な理由で、疾患治療における慢性的使用のための必要に応じて好ましい候補がある。それらが開示される。
【０１０２】
２ステップのコレストソームが巨大分子の細胞への送達を促進した。
本発明において、図１に示されたように、インスリンのような巨大分子が、剤形化及び応用生物学的製法の２つの連鎖したステップの後に身体細胞内部へ送達され得る。第一番目のステップにおいて、コレストソームを調製して、上記巨大分子を形成したコレストソームにカプセル化するが、ここでコレストソームは、各選択された分子との相溶性に対して選択される特異的コレステリルエステルを含んでなるという点を前提にする。また、十二指腸腸細胞の表面上に輸送体があることを保障するようにコレストソームのコレステリルエステル内容物が選択されなければならない。巨大分子送達システムの調製における第二番目のステップは、十二指腸腸細胞がコレストソーム−巨大分子構築物をカイロミクロンに取り込み、これらの積載されて新規に変形されたカイロミクロンを、カイロミクロンを胸管に持っていき、結局上記患者の血中で循環するリンパ液に分泌する時に起きる。
【０１０３】
カイロミクロンへのＡＰＯ−Ｂの取り込みによる結合
コレストソーム内にカプセル化され、カイロミクロン内に取り込まれる巨大分子の細胞内送達は、活性分子積載物を含む積荷積載コレストソームを含むカイロミクロンは、コレステロール及びトリグリセリドを必要とする細胞と結合し、上記コレストソームを含む上記構成成分を、エンドソームカプセル化を必要条件とせず、細胞に送達する時に達成される。本発明の方法の更なる新規性は、コレストソームに取り込まれた巨大分子を完全な形態で細胞の細胞質に放出することであるが、これは、外側表面のコレステリルエステルが細胞質から除去され、それにより、そのコレストソーム送達カプセルから分子を放出するからである。次いで、コレストソームの表面が標的細胞により必要なコレステリルエステルと認識される限り、標的細胞は積載物を収容するものであり、コレステリルエステルヒドロラーゼによる表面の開梱後、巨大分子は、標的身体細胞の膜の内部で遊離されるものである。
【０１０４】
図２２においてＭＣＦ−７細胞の画像から明らかなように、ほとんどいつも図５におけるコレストソームのカプセル化されたＦＩＴＣ（対照）として示されたように、コレストソーム単独由来の分子の一部の吸収がある。しかし、ＦＩＴＣコレストソームが先にＣａｃｏ−２細胞に暴露された時、ＭＣＦ−７細胞による、予測しない大規模（１、０００倍以上）の分別吸収があり、結果として得られるＦＩＴＣ−コレストソーム−カイロミクロンが器具の基底側から収集され（図１７に示す）、次いでＭＣＦ−７細胞に対する暴露に用いられる。これらのＦＩＴＣ−インスリン−コレストソームカイロミクロンは、Ｃａｃｏ−２細胞上において同量でＦＩＴＣ−インスリン−コレストソームを用いて調製され、したがって本質的に全てのＦＩＴＣ−インスリン−コレストソームが、Ｃａｃｏ−２細胞によってＦＩＴＣインスリンカイロミクロンに取り込まれるという点に留意しなければならない。
【０１０５】
コレストソームのカイロミクロンへの積載
ゴルジ体によるコレストソーム及びその分子積載物のカイロミクロンへの積載は、Ｃａｃｏ−２の頂端側再測定、及び基底側でカイロミクロンに回収される量から残存する量を差し引くことにより立証されるように定量的なものと示される。したがって、コレストソームに対するＣａｃｏ−２細胞の親和性は非常に高いものと現われる。Ｃａｃｏ−２細胞は、頂端側に位置した利用可能なコレストソームの全てを基底側上のカイロミクロンに消去する。したがって、活性分子（等）をカプセル化するために用いられるコレステリルエステルの早期の選択が、本発明の実施において核心的なステップである。
【０１０６】
ＧＩ管における酸及び／又は酵素分解からの分子積載物の保護
コレストソームが２〜１４の範囲のｐＨ値で損なわれずに存在することとは対照的に、リポソームは同一条件で迅速に分解されて、本発明による組成物に比べて相対的に不安定である。不安定な積載物を備えて調製されたコレストソームは、その積載物の内容物が胃腸管における分解から保護されなければならない場合に、腸を標的にした外側の層でコーティングされることがあり、積荷積載コレストソームが十二指腸（コレストソームを取り込んだカイロミクロンを提供する腸細胞のＧ．Ｉ．部位）に到逹するようになる。
【０１０７】
インスリン及びその他タンパク質／ポリペプチドのような積載物は、酸に不安定であり、酸又は酵素分解に対する潜在性のある生体内システム又は動物に使用する前に適用されなければならない、コレストソーム内のインスリン保護用の腸溶コーティングの追加ステップを必要とする。当分野の実施における一般的な状況において、コレストソームの内容物が酸に不安定なペプチド及びタンパク質である場合、更に、そのような製品が経口摂取用製剤にカプセル化されるコレストソームである場合、胃腸内の酸からコレストソームの内容物を保護する腸溶コーティングを有した最終の投与製品が存在しなければならない。ほとんどの場合、十二指腸でのコレストソームの放出後、十二指腸において酵素分解又は胆汁塩を介したサポニン化の可能性があって、胆汁塩、膵臓リパーゼ及び膵臓エステラーゼとの接触時、個別コレストソームの安定性の研究が行われる必要がある。したがって、タンパク質又はペプチドが酸分解から自由なものと明確に立証されるまで、或いは立証されない限り、剤形は、コレストソーム構築物で充填された後、ｐＨ５．５〜６．０で内容物を放出する腸溶コーティングでコーティングされている小型カプセルとなる。そのような目的に適合したコーティングは、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（６４、６５）又は酸に安定であるが、Ｅｕｄｒａｇｉｔ重合体と類似した分解特徴を有する他の腸溶コーティングになるものであり、コレストソームがそれ自体で低いｐＨで安定であっても、酸分解からコレストソームの内容物を保護するために、当業界において公知された腸溶コーティングを採用する必要がある。
【０１０８】
特定の実施形態において、医薬組成物は、約１００〜約７５０ｎｍ、好ましくは約２２５〜約２７５ｎｍ、より好ましくは２５０ｎｍ程度の直径を有した単一薄膜小胞である。ＤＬＬＳ測定値は、５０ｎｍ〜１、０００ｎｍ超の範囲の直径を有した小胞を示す。用いられる最終寸法は、適切な細孔径及び超音波処理時間の制御とともに、その他の調製パラメーターでの選択的押出しにより決定することができる。
【０１０９】
「イムノミセル（Ｉｍｍｕｎｏｍｉｃｅｌｌ）」及び「ミセル（ｍｉｃｅｌｌ）」は、それらの極性末端又は部分が水又は水性溶媒と接触し、それらの無極性末端又は部分が凝集体の内部に存在するように水又は水性溶媒で両親媒性分子により形成される凝集体である。ミセルは、これに限定されないが、水又は水性溶媒の一部を閉鎖しない非層状の「界面活性剤様」凝集体、又は水又は水性溶媒の一部を閉鎖する単層又は多層状の「小胞様」凝集体、例えば、リポソームを含む任意の形象又は形態を取ることができる。「ミセル」の定義に具体的に含まれるものには、小型単一薄膜小胞又はリポソーム（「ＳＵＶ」）、小型多重層状小胞又はリポソーム（「ＳＭＶ」）、大型単一薄膜小胞又はリポソーム（「ＬＵＶ」）及び大型多重層状小胞又はリポソーム（「ＬＭＶ」）がある。
【０１１０】
米国特許出願文献第２０１１０２６８６５３号において定義されたように、「「脂質系粒子」とは、両親媒性脂質分子が水性相に配向されたそれらの極性基を有して整列している膜構造体を有する粒子を意味する。脂質膜構造体の例示は、リポソーム、多重層状小胞（ＭＬＶ）、及びミセル構造体のような構造配置を含む。「リポソーム」は、内側に位置した疎水性部分及び外側に位置した親水性部分を有するリン脂質分子の水中での二重層膜形成、及び二重層膜末端の閉鎖により形成される閉鎖されたナノ球体を意味する。リポソームの例示は、リン脂質二重層膜に形成される単一層を有したナノ球体、及び複数のリン脂質二重層に形成された多重層を有したナノ球体を含む。リポソームがそのような構造を有するため、水溶液がリポソームの内部及び外部のいずれにも存在し、脂質二重層は境界として提供される。「ミセル」は、両親媒性分子の凝集体を意味する。ミセルは、水性媒質でそれらの両親媒性分子の親脂質部分がミセルの中心に向けて位置しており、親水性部分がその外側に向けて位置している形態を有する。そのようなミセルにおいて球体の中心は親脂質性であり、周辺部は親水性である。ミセル構造の例示は、球体型、板状型、コラム型、楕円形、マイクロソーム型及び板状構造、並びに液晶を含む」。そのような構造体は、ペプチド及びタンパク質のような親水性分子をカプセル化するに当たって非常に劣悪であるが、ここで積載率は、１：１０００以下である点に注意されたい。親水性の中心（エステル官能基の配向から）及び疎水性の外部を有したコレストソームでは、それと対照的である。特定の実施形態において、内部及び外部は、擬似二重層類型の分子において交互嵌合しているエステルの尾を有した内部空洞及び外側表面上のステロール核と同一であり得る。カイロミクロンがコレストソームを取る時、真の親水性である外部は変形して、積載されたカイロミクロンのアポリポタンパク質成分により再確立され、アポリポタンパク質がまた変形したカイロミクロンと細胞との結合を促進する。簡略に、カイロミクロンでのコレストソームの２ステップの形成は、先行技術の成果と比べて完全に新規なものであり、また予測不可のものである。
【０１１１】
用語「患者」又は「対象」は、明細書の全体にわたって本発明による組成物を用いて予防的治療を含む治療が提供される動物、好ましくはヒトを記述するために用いられる。ヒト患者のような特定の動物に特異的な感染、状態又は疾病の治療のためには、用語の患者はそのような特定の動物を意味する。
【０１１２】
用語「化合物」は、任意の特定の化学的化合物又は本願において開示されたものを意味する。文脈上、上記用語は、一般的に本願に開示された単一小型分子を意味するが、特定の場合、開示された化合物の立体異性体及び／又は光学異性体（ラセミ混合物を含む）を意味したりもする。用語の化合物は、化合物の活性代謝物及び／又はその薬学的活性塩を含む。
【０１１３】
用語「活性分子」、「活性剤」又は「活性化合物」は、生物学的系において活性であり、本願に記載されたようにコレストソームに取り込まれることができる任意の分子を意味する。本発明によるコレストソームは、特に、他に経口で効率的に送達することができない化合物を含む、小型分子及び大型分子を含めた多数の活性分子を容易に収容することができる。これは、積荷積載コレストソームが送達において、活性化合物を腸細胞を通じてカイロミクロンに、その後、積荷積載コレストソームが投与される患者又は対象の細胞に提供する（本願に記載されたような）独特の機序のためである。これらの活性分子には、標準経口送達技術では不安定であって、一般に非経口的に投与される小型分子及び巨大分子、例えば、タンパク質（糖蛋白質を含む）及びポリペプチド（例えば、インスリン、インターフェロン、ｈＣＧ、Ｃ−反応性タンパク質、多様なインターロイキンを含むサイトカイン、成長因子）、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のような抗体（本願に別途で詳しく記載される抗体断片（単鎖可変断片又はｓｃＦｖ、抗体結合断片又はＦａｂ、3Ｇ抗体）を含むその他のポリペプチド、免疫原性ポリペプチド及びオリゴペプチド、ＤＮＡ及びＲＮＡ、例えば、裸のＤＮＡ、血漿ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、二官能性ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（他のものの中でも、特にｍｉＲ−１２２を含むもの）、並びにＤＮＡ及びＲＮＡの多様なオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが含まれる。抗生物質（例えば、バンコマイシン及びペニシリン）及び抗ウイルス剤、及び特に巨大分子抗生剤を含むその他の活性分子を含め、本願に詳しく開示された多数の抗癌剤を含む多数の抗感染剤がまた、本発明により送達することができる。本発明によるコレストソームが、非常に多様な寸法及び分子量の、事実上任意の活性分子の送達に用いることができることに注意されたい。本発明によるコレストソームはまた、患者又は対象の皮膚を通じて高い生物学的利用能を提供する、局所用抗生剤、局所用抗真菌剤、局所用血小板由来成長因子、その他成長因子、例えば、乾癬に対する局所用抗ＴＮＦ、及び局所用ワクチンを含む多数の活性分子の局所的送達、及び他のものの中でも特に化粧品剤の局所的送達に用いることができる。多数の化学治療剤、抗生剤及び抗ウイルス剤が、本発明によってコレストソームに取り込まれることができる。本発明によるコレストソームは、しかも小型分子であっても、そのような化合物に特に好適であるが、これは、本発明の組成物による活性分子送達の機序による化合物の細胞への送達が、バクテリア及びウイルスを含む多様な微生物に対抗する特に有効な治療を示すからである。
【０１１４】
本発明における使用のための抗真菌剤には、例えば、ミコナゾール、テルコナゾール、エコナゾール、イソコナゾール、チオコナゾール、ビホナゾール、クロトリマゾール、ケトコナゾール、ブドコナゾール、イトラコナゾール、オキシコナゾール、フェンチコナゾール、ナイスタチン、ナフチフィン、アムホテリシンＢ、ジノコナゾール、シクロピロクスオラミン又はそれらの混合物が含まれる。
【０１１５】
本発明における使用のための抗生剤には、アミノグリコシド、例えば、ゲンタマイシン、ガラマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、スペクチノマイシン；アンサマイシン、例えば、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、リファキシミン及びストレプトマイシン；カルバペネム、例えば、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン及びメロペネム；セファロスポリン、例えば、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン（Cefalotin/Cefalothin）、セファレキシン、セファクター、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフェピム、セフタロリンフォサミル及びセフトビプロール；グリコペプチド、例えば、テイコプラニン、バンコマイシン及びテラバンシン；リンコサミド、例えば、クリンダマイシン及びリンコマイシン；リポペプチド、例えば、ダプトマイシン、オリタバンシン、ＷＡＰ８２９４Ａ；マクロライド、例えば、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン及びスピラマイシン；モノバクタム、例えば、アズトレオナム；ニトロフラン、例えば、フラゾリドン及びニトロフラントイン；オキサゾリジノン、例えば、リネゾリド、ポシゾリド、ラデゾリド及びトレゾリド；ペニシリン、例えば、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、テモシリン及びチカルシリン；ペニシリン合剤、例えば、アモキシシリン／クラブラン酸、アンピシリン／スルバクタム、ピペラシリン／タゾバクタム、及びチカルシリン／クラブラン酸；ポリペプチド、例えば、バシトラシン、コリスチン及びポリミキシンＢ；キノロン／フルオロキノリン、例えば、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン及びテマフロキサシン；スルホンアミド、例えば、マフェニド、スルファセタミド、スルファダイアジン、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファサラジン、スルフィソクサゾール、トリメトプリム−スルファメトキサゾール及びスルホンアミドクリソイジン；テトラサイクリン、例えば、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ビブラマイシン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン及びテトラサイクリン；抗ミコバクテリア、例えば、クロファジミン、カプレオマイシン、シクロセリン、エタンブトール、リファンピシン、リファブチン、リファペンチン、アルスフェナミン、クロラムフェニコール、ホスホマイシン、フシジン酸、メトロニダゾール、ムピロシン、プラテンシマイシン、キヌプリスチン／ダルフォプリスチン、チアムフ���ニコール、チゲサイクリン、チニダゾール及びトリメトプリムが含まれる。
【０１１６】
抗ウイルス剤には、当業界に公知された抗ＨＩＶ剤、抗ＨＢＶ剤及び抗ＨＣＶ剤が含まれる。抗ＨＩＶ剤には、３ＴＣ（ラミブジン）、ＡＺＴ（ジドブジン）、（−）−ＦＴＣ、ｄｄｌ（ジダノシン）、ｄｄＣ（ザルシタビン）、アバカビル（ＡＢＣ）、テノホビル（ＰＭＰＡ）、Ｄ−Ｄ４ＦＣ（レバーセット）、Ｄ４Ｔ（スタブジン）、ラシビル、Ｌ−ＦｄｄＣ、Ｌ−ＦＤ４Ｃ（エルブシタビン）、ペンスティナビル、ＮＶＰ（ネビラピン）、ＤＬＶ（デラビルジン）、ＥＦＶ（エファビレンツ）、ＳＱＶＭ（サキナビルメシラート）、ＲＴＶ（リトナビル）、ＩＤＶ（インジナビル）、ＳＱＶ（サキナビル）、ＮＦＶ（ネルフィナビル）、ＡＰＶ（アンプレナビル）、ＬＰＶ（ロピナビル）、特にＴ２０などの融合抑制剤、融合物及びそれらの混合物、例えば、臨床試験又は開発中に提示された抗ＨＩＶ化合物が含まれる。
【０１１７】
本発明に用いられることができるその他の抗ＨＩＶ剤には、他のものの中で特に、ネビラピン（ＢＩ−Ｒ６−５８７）、デラビルジン（Ｕ−９０１５２Ｓ／Ｔ）、エファビレンツ（ＤＭＰ−２６６）、ＵＣ−７８１（Ｎ−［４−クロロ−３−（３−メチル−２−ブテニルオキシ）フェニル］−２−メチル３−フランカルボチオアミド）、エトラビリン（ＴＭＣ１２５）、トロビルジン（Ｌｙ３０００４６．ＨＣｌ）、ＭＫＣ−４４２（エミビリン、共同アクチノン）、ＨＩ−２３６、ＨＩ−２４０、ＨＩ−２８０、ＨＩ−２８１、リルピビリン（ＴＭＣ−２７８）、ＭＳＣ−１２７、ＨＢＹ０９７、ＤＭＰ２６６、バイカリン（ＴＪＮ−１５１）、Ｕ−１０４４８９又はＰＮＵ−１０４４８９）、カプラビリン、アテビルジンカラノリドＡ（ＮＳＣ６７５４５１）、カラノリドＢ及びフォスカーネット（フォスカヴィール）からなる群から選択される多様なＮＮＲＴＩが含まれる。
【０１１８】
本発明によるコレストソームに剤形化することができる抗ＨＢＶ剤には、ヘプセラ（アデフォビルジピボキシル）、ラミブジン、エンテカビル、テルビブジン、テノホビル、エムトリシタビン、クレブジン、バルトリシタビン、アムドキソビル、プラデホビル、ラシビル、ＢＡＭ２０５、ニタゾキサニド、ＵＴ２３１−Ｂ、Ｂａｙ４１−４１０９．ＥＨＴ８９９、ザダキシン（チモシンα−１）、及びそれらの混合物が含まれる。
【０１１９】
本発明によるコレストソームに剤形化することができる抗ＨＣＶ剤には、リバビリン、インターフェロン、ペグ化インターフェロン、ボセプレビル、ダクラタスビル、アスナプレビル、ＩＮＸ−１８９、ＦＶ−１００、ＮＭ２８３、ＶＸ−９５０（テラプレビル）、ＳＣＨ５０３０４、ＴＭＣ４３５、ＶＸ−５００、ＢＸ−８１３、ＳＣＨ５０３０３４、Ｒ１６２６、ＩＴＭＮ−１９１（Ｒ７２２７）、Ｒ７１２８、ＰＦ−８６８５５４、ＴＴ０３３、ＣＧＨ−７５９、ＧＩ５００５、ＭＫ−７００９、ＳＩＲＮＡ−０３４、ＭＫ−０６０８、Ａ−８３７０９３、ＧＳ９１９０、ＧＳ９２５６、ＧＳ９４５１、ＧＳ５８８５、ＧＳ６６２０、ＧＳ９６２０、ＧＳ９６６９、ＡＣＨ−１０９５、ＡＣＨ−２９２８、ＧＳＫ６２５４３３、ＴＧ４０４０（ＭＶＡ−ＨＣＶ）、Ａ−８３１、Ｆ３５１、ＮＳ５Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＡＮＡ５９８、Ａ−６８９、ＧＮＩ−１０４、ＩＤＸ１０２、ＡＤＸ１８４、ＡＬＳ−２２００、ＡＬＳ−２１５８、ＢＩ２０１３３５、ＢＩ２０７１２７、ＢＩＴ−２２５、ＢＩＴ−８０２０、ＧＬ５９７２８、ＧＬ６０６６７、ＰＳＩ−９３８、ＰＳＩ−７９７７、ＰＳＩ−７８５１、ＳＣＹ−６３５、ＴＬＲ９アゴニスト、ＰＨＸ１７６６、ＳＰ−３０、及びそれらの混合物が含まれる。
【０１２０】
本発明に用いるための他の化合物がまた、以下の実施例において記載される。
【０１２１】
活性分子のコレストソームへの取り込み及び患者又は対象に対する投与が、同一の投与水準で、先行技術方法により送達される同一の活性分子よりもより大きな治療有効性を提供するという点に注意されたい。実際に、カイロミクロンに積荷積載コレストソームをパッケージする機序は、その実際の活性部位（細胞内）においてかなり多い量又は濃度の活性分子を提供するようになり、先行技術の方法よりもかなり大きな効能を提供する。多くの場合、本発明により細胞の内部に送達する活性剤濃縮物の量は、先行技術（同時代）手段による送達に比べて２倍以上、及びしばしば１０〜１００倍で活性濃度を提供する。
【０１２２】
用語「有効量」は、本明細書の全体にわたって本発明により意図される効果を提供するために、それらの使用の脈絡において所定量用いられる製剤又はその他の構成成分の濃度又は量を記述するために用いられる。製剤又は構成成分は、治療すべき疾患又は疾病において好ましい変化を提供するために用いることができるが、ここでその変化とは、治療すべき疾患又は疾病によって緩解、好ましい生理学的結果、治療すべき疾患又は疾病の逆転又は減衰、疾患又は疾病発生の予防又は兆しの減少である。製剤が組み合わせて用いられる場合、それぞれの製剤は有効量で用いられ、ここで有効量は、相乗作用的量を含むことができる。本発明に用いられる製剤の量は、製剤の本性、患者の年齢及び体重、並びに製剤の生物学的利用能及び薬物動態学に影響を及ぼす多数の様々な要因によって可変的であり、患者に投与される製剤の量は、一般的に、１日当たり約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ及びその他の本願に記載された範囲内である。疑う余地も無く、上記動物に提供される上記製剤のうち構成成分の投与量は、送達システムの追加される質量に対する補正後に、非経口手段によって提供されるものとほぼ同一である。当業者は、治療過程中に行われる投与スケジュール又は量での変化を容易に認識することができる。
【０１２３】
用語「同時投与」とは、２つ以上の活性化合物の投与を記述するために用いられるが、この場合、本発明による化合物を有効量の追加の薬剤又はその他の生物学的活性剤と併用する。用語の同時投与は、好ましくは患者に対する２つ以上の活性化合物の同時投与を含むが、化合物が実際に（好ましいであるとしても）必ずしも正確に同時又は同一組成物に投与されなければならないものではなく、単にここで有効な濃度が同時に血液、血清又は血漿中で発見されるようにする量で、化合物が患者又は対象に投与されるものである。
【０１２４】
用語「回腸ブレーキホルモン放出剤」とは、回腸内ホルモンを調節する栄養物質の技術に用いられる。そのような栄養物質には、限定でないが、タンパク質及び関連アミノ酸、飽和脂肪、モノ飽和脂肪、多重不飽和脂肪を含む脂肪、必須脂肪酸、オメガ−３及びオメガ−６脂肪酸、トランス脂肪酸、コレステロール、脂肪代替物、炭水化物、例えば、食物繊維（可溶性及び不溶性繊維をいずれも含む）、澱粉、糖（例えば、単糖類、フルクトース、ガラクトース、グルコース、二糖類、ラクトース、マルトース、蔗糖及びアルコール）、重合体糖、例えば、イヌリン及びポリデキストロース、天然人工甘味料（ブラゼイン、クルクリン、エリトリトール、フルクトース、グリチルリジン、グリチルリジン、グリセロール、水素添加された澱粉加水分解物、イソマルト、ラクチトール、マビンリン、マルチトール、マンニトール、ミラキュリン、モネリン、ペンタジン、ソルビトール、ステビア、タガトース、タウマチン及びキシリトール）、ｓａｈｌｅｐ、及びｈａｌｗａ根の抽出物が含まれる。Ｄ‐グルコース（ポリデキストロース）は、好ましい栄養物質である。栄養物質には、これらの栄養物の重合体形態を含む、消化時、上記言及された栄養物を提供するか、又は上記栄養物を含む全ての組成物を含む。そのような組成物が患者の回腸内に泊まる時、回腸ブレーキホルモンが調整され、しばしば活性の増加をもたらし、したがって多数の疾患及び疾病に有益な治療有効性を提供する。回腸ブレーキホルモン放出剤の有効性は、２０１１年１１月３日に公開されたＵＳ特許公報第２０１１−０２６８７９５号、２０１０年３月１０日に公開されたＷＯ２０１０／０２７４９８及び２０１３年５月２日に公開された国際特許公報ＷＯ２０１３／０６３５２７により詳しく論議されており、本願に含まれる教示に参照となり得る。好ましい回腸ブレーキホルモン放出剤は、患者の回腸に約７．５ｇ〜約１２ｇ、又はそれ以上の投与量で投与されるグルコースである。
【０１２５】
用語「回腸ホルモン」には、患者又は対象の回腸に当業界の教示内においてインスリン分泌又はグルカゴン分泌抑制、或いは栄養物質の送達の回腸関連刺激によって誘発され得る、上記ホルモンの放出を刺激する管こう内食品物質と連関した全てのホルモンが含まれる。したがって、「回腸ホルモン」には、限定でないが、ＧＬＰ−１、グリセンチン、Ｃ−末端グリシン−延長されたＧＬＰ−１（７  ３７）、（ＰＧ（７８  １０８））；仲介ペプチド−２（ＰＧ（１１１  １２２）アミド）；ＧＬＰ−２（ＰＧ（１２６  １５８）、ＧＲＰＰ（ＰＧ（１  ３０））、オキシントモジュリン（ＰＧ（３３６９）、及び単離されるその他ペプチド分画、ＰＹＹ（ＰＹＹ１−３６）及び（ＰＹＹ３−３６）、コルレシストキニン（ＣＣＫ）、ガストリン、エンテログルカゴン及びセクレチンが含まれる。
【０１２６】
用語「栄養物質の回腸ホルモン刺激量」は、回腸で測定可能なホルモン放出の誘発に有効であり、インスリン分泌又はグルカゴン分泌抑制の回腸又は回腸関連刺激の満腹感フィードバック又はインスリン耐性の停止又は減少、及びグルコース耐性の増加のようなその他の有効性を誘導するのに有効である、任意の量の栄養物質を意味する。その結果、「栄養物質の回腸ホルモン刺激量」は、問題視される特定の栄養物、所望の投与効果、所望のカロリー摂取最小化の目的、及び栄養物質が投与される対象の特徴のような要因によって、投薬において広範囲に可変的であり得る。例えば、約５００ｍｇ以上のＤ−グルコースが用いられ、Ｄ−グルコースの好ましい回腸ホルモン刺激量は、約７．５から８ｇ〜約１２から１２．５ｇ、又はそれ以上（好ましくは１０ｇ程度）を含む。
【０１２７】
本発明による組成物に含むことができる追加の栄養成分には、ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６及びＣ、カリウム、マグネシウム及び亜鉛のような高度に代謝可能なビタミン及びミネラルの豊かな供給源と公知されている大麦若葉が含まれる。更に、大麦若葉はまた、高濃度の酵素スーパーオキシドデスムターゼ（ＳＯＤ）を有しており、高水準の抗酸化活性を有するものと示される。大麦若葉は、消化過程の調節に重要な栄養素と思われるが、これは、大麦若葉中の微細栄養物、酵素（例えば、ＳＯＤ）及び繊維が腸の機能を改善するものと思われるからである。
【０１２８】
アルファルファの新鮮な葉又は乾燥した葉茶がまた、本発明における食用促進のために、更にクロロフィル及び繊維の好ましい供給源として用いられる。アルファルファは、ビオチン、カルシウム、コリン、イノシトール、鉄、マグネシウム、ＰＡＢＡ、リン、カリウム、タンパク質、ナトリウム、硫黄、トリプトファン（アミノ酸）及びビタミンＡ、Ｂ複合体、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｐ及びＵを含む。アルファルファ補充剤は、消化不良の治療に勧奨され、動物実験においてはコレステロール水準を低くするものと示された。アルファルファは、ＦＤＡで一般に安全なものと見なされる（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｇａｒｄｅｄ  ａｓ  Ｓａｆｅ（ＧＲＡＳ））と分類された。投与量は、１日当たり乾燥した葉で２５〜１５００ｍｇ、好ましくは５００〜１０００ｍｇの範囲であり得る。
【０１２９】
クロレラは、栄養物質（好ましくは、Ｄ−グルコース又はデキストローズ）と併用して本発明に利用可能なもう別の物質であるが、単細胞性緑藻類であって、タンクで生長及び収穫し、精製して、加工し、粉末を形成するように乾燥する。クロレラには、クロロフィル、カロチンが豊富である、全体ビタミンＢ複合体、ビタミンＥ及びＣを含み、マグネシウム、カリウム、鉄及びカルシウムを含めた広範囲なミネラルを有している。クロレラはまた、食物繊維、核酸、アミノ酸、酵素、ＣＧＦ（クロレラ成長因子）及びその他の物質を提供する。投与量は、３００〜１５００ｍｇ／ｄａｙの範囲であり得る。
【０１３０】
クロロフィリンはもう１つの栄養物質であって、公知された食品添加物であり、代替医学として用いられてきた。クロロフィリンは、クロロフィルの水溶性半合成ナトリウム／銅誘導体であり、失禁、人工肛門及び類似の過程に関連した悪臭及び一般的な身体悪臭の減少を意図する、多数の体内取食製剤の活性成分である。これはまた、傷、損傷及びその他の皮膚状態、例えば、放射線による火傷の治療及び悪臭の抑制に有用であると知られた局所製剤として利用可能である。
【０１３１】
アルギン酸ナトリウムはまた、Ｄ−グルコース又はデキストローズとの併用により栄養物質として用いることができる。
【０１３２】
用語「予防的」とは、患者又は対象において疾患又は疾病の発生傾向を減少させる、本願に記載された製剤の用途を記述するために用いられる。用語「傾向を減少」とは、与えられた患者集団において、本発明が全ての患者において疾患の発生、再発又は転移を防止するというより、全ての患者の集団のうち１人以上の患者における疾患の発生、再発又は転移の傾向を減少させるために利用可能であることを意味する。
【０１３３】
用語「薬学的に許容される」とは、投与される対象に許容不可能な毒性ではない本発明の化合物の塩形態、又はその他の誘導体（例えば、活性代謝物又はプロドラッグ形態）、又は担体、添加剤或いは賦形剤を意味する。
【０１３４】
炎症関連代謝障害
「炎症関連代謝障害」には、限定でないが、肺疾患、糖尿病及びインスリン抵抗性から生じる障害を含む高血糖障害（例えば１型及び２型糖尿病並びに重度のインスリン抵抗性）、高インスリン血症及び異常脂肪血症（例えば、高脂血症（例えば、肥満対象で発症する）、上昇した低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、減少した高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、及び上昇したトリグリセリド）及びインスリン抵抗性及び炎症と連関された肝臓（又は肝）損傷、例えば、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪肝疾患、肝硬変、ウイルスによって誘発される肝炎、例えば、Ａ、Ｂ又はＣ型肝炎、又は毒素及びインスリン抵抗性糖尿病、例えば、メンデンホール症候群（Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ≡ｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ウェルナー症候群、妖精症及びリポ萎縮性糖尿病、腎臓障害、例えば、急性および慢性腎不全、末期慢性腎不全、糸球体腎炎、間質性腎炎、腎盂腎炎、糸球体硬化症、例えば、糖尿病患者におけるＫｉｍｍｅｌｓｔｉｅｌ−Ｗｉｌｓｏｎ及び腎移植後の腎不全、肥満、ＧＨ欠損症、ＧＨ抵抗、ターナー症候群、Ｌａｒｏｎ症候群、低身長、脂肪量対筋肉量の比率減少、ＣＤ４+Ｔ細胞数の減少及び免疫不全症又は化学療法によって誘発された組織損傷を含む免疫不全、骨髄移植、心臓構造又は機能疾患又は不全症、例えば、心臓の機能障害と鬱血性心不全、アテローム性動脈硬化症、神経、神経学的又は神経筋障害、例えば、中枢神経系の疾患、例えば、アルツハイマー病又はパーキンソン病又は多発性硬化症及び末梢神経系及び筋肉系の疾患、例えば、末梢神経症、筋肉萎縮病又は筋緊張性ジストロフィー、及び異化状態、例えば任意の疾患、例えば、精神健康疾患（例えば、拒食症）、精神的外傷又は外傷によって誘発される消耗性と連関されたもの、又は例えば、バクテリア又はヒトウイルスによる感染、例えばＨＩＶ、Ｃ型又はＢ型肝炎、外傷、皮膚障害、復元が必要な胃腸管構造及び機能などが含まれる。
【０１３５】
「炎症関連の代謝障害」にはまた、本願において定義された癌及び「感染性疾患」だけでなく、低身長を含む乳児の骨又は軟骨の障害、及び関節炎及び骨粗鬆症を含む乳児及び大人における軟骨及び骨障害が含まれる。「炎症関連の代謝障害」には、上記障害（例えば、異化状態の後遺症である骨粗鬆症）の２つ以上の組み合わせを含む。本願において治療の標的となる特に関心となる特定の障害は、糖尿病及び肥満、心臓機能異常、腎臓障害、神経学的障害、骨障害、全身成長障害及び免疫学的障害である。
【０１３６】
一実施形態において、「炎症関連代謝障害」には、以下のものが含まれる：内臓肥満、異常脂肪血症、例えば、特に高重性脂肪血症、低いＨＤＬコレステロール、小型の密集したＬＤＬ粒子及び食後脂肪血症；グルコース過敏症、例えば、空腹血糖障害；インスリン抵抗性及び高血圧、及び糖尿病。用語「糖尿病」は、１型及び２型糖尿病を記述するために用いられる。本発明は、膵臓機能、肝機能、脳機能、胃腸管機能、心血管機能、腎臓機能及び本願に他に記述されていない患者及び対象における機能不全に対して２次的に発生する病態、疾患及び疾病を改善するための方法に関するものである。１型及び２型糖尿病において腎臓機能は、コラーゲン沈積によって不全されたものであり、本発明により治療される他の疾患での嚢腫によるものではないことに留意しなければならない。
【０１３７】
マイコバクテリア感染は、しばしば結核などの疾患のように現れる。マイコバクテリアによって誘発されるヒト感染症は、古代から広範囲に広がっていたが、結核は、現代の死亡の主な原因として残っている。１９世紀中盤から生活水準がよくなるにつれ、疾患の発生は減少したが、制限された医療資源がある国では、マイコバクテリア疾患が依然として疾病と死亡の主な原因となっている。更に、マイコバクテリア感染は、免疫力が弱化した患者では対応し難い種まき的疾患を誘導するおそれがある。全世界的に多数の保健機関の努力にもかかわらず、マイコバクテリア疾患の根絶は達成されたことがないばかりか、根絶に近づいてもいない。全世界の人口のほぼ３分の１が、普通結核（ＴＢ）と呼ばれるマイコバクテリウム結核複合体で感染され、およそ８百万の新規患者があり、毎年、ＴＢでヒトの２〜３百万の死亡者が発生する。結核（ＴＢ）は、単一原因微生物に起因するものの中、ヒトの死亡発生の最大原因である（Ｄｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、２８２、６７７−６８６、（１９９９）；及び２０００  ＷＨＯ／ＯＭＳ  Ｐｒｅｓｓ  Ｒｅｌｅａｓｅ参照）。
【０１３８】
マイコバクテリウムツベルクル（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ）以外のマイコバクテリアが、ＡＩＤＳ患者を悩ます機会感染で発見されることが増加している。マイコバクテリウムアビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）−細胞内複合体（ＭＡＣ）由来の有機体、特に血清型４及び８は、ＡＩＤＳ患者から単離されたマイコバクテリアの６８％を占める。甚だしい数のＭＡＣが発見され（組織グラム当たり１０10個までの抗酸菌）、結果的に感染されたＡＩＤＳ患者に対する予後は不十分である。
【０１３９】
多くの国において、ＴＢ防除のための唯一の方法は、マイコバクテリウムボビスカルメットゲラン桿菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ））をワクチン接種することである。しかし、ＴＢに対抗するＢＣＧの全体的ワクチン効能は、異なる分野の試みにおいて０％〜８０％の範囲の激しい変化のある約５０％である。多剤薬物耐性のマイコバクテリウムツベルクル菌株の広範に広がった危険性もまた、懸念される事項である。
【０１４０】
マイコバクテリウムツベルクルは、休眠マクロファジの食胞性空胞内で複製する細胞内バクテリアの群に属し、ＴＢに対抗する保護は、Ｔ細胞媒介免疫性に左右される。しかし、マウス及びヒトにおける幾つかの研究は、マイコバクテリアが抗原特異的な主組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ−又はクラスＩ−制限ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞をそれぞれ刺激するという点を見せていた。ＭＨＣクラスＩ−制限ＣＤ８Ｔ細胞の重要な役割は、対照の実験のマイコバクテリウムツベルクル感染に対比した２−マイクログロブリン欠乏マウスの不全によって、説得力あるように証明された。
【０１４１】
本願で用いられたように、用語「結核」は、一般的にマイコバクテリウムツベルクル複合体を含むマイコバクテリア種によって誘発される感染と関連した疾患を含む。用語「結核」はまた、マイコバクテリウムツベルクル以外のマイコバクテリアによって誘発されるマイコバクテリア感染と関連がある。その他のマイコバクテリア種には、Ｍ．ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｒｉｉ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、及びＭ．ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｍ．ａｖｉｕｍ  ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ、Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓが含まれる。
【０１４２】
感染性疾患
「感染性疾患」には、限定でないが、バクテリア、菌類、寄生虫及びウイルス剤によって誘発されるものが含まれる。そのような感染剤の例示は、以下のものを含む：他のものの中で特に、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、ｎｅｉｓｓｅｒｉａａｃｅａｅ、ｃｏｃｃｉ、ｅｎｔｅｒ  ｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ、ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、ｂｒｕｃｅｌｌａ、ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｉｌｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｉｌｌｉ、ａｎｔｈｒａｘ、ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、ｎｏｃａｒｄｉａ、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、ｂｏｒｒｅｌｉａ、ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ、全身性真菌症、機会性真菌症、原生動物、線虫類、吸虫類、条虫類、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、パポーバウイルス、肝炎ウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、コロナウイルス、ピコルナウイルス、レオウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、ブンヤウイルス、ラブドウイルス、ヒト免疫不全ウイルス及びレトロウイルス。
【０１４３】
特定の実施形態において、「感染性疾患」は、結核、ハンセン病、クロン病、後天性免疫不全症侯群、ライム病、猫ひっかき病、ロッキー山紅斑熱及びインフルエンザからなる群から選択される。
【０１４４】
癌
用語「癌」は、明細書の全体にわたって癌又は悪性新生物、すなわち細胞増殖により、多くの場合、正常な細胞よりも早く成長して、新しい成長中断を開始する刺激後にも成長する、異常組織の形成及び成長を誘発する病理学的プロセスを意味する。悪性新生物は、正常組織との構造的組織化及び機能的協力の部分的又は完全な欠乏を示し、ほとんど周辺組織を攻撃し、多くの部位に転移され、未遂に終わる除去後には再発して、適切に治療しない時、患者の死亡を誘発する傾向がある。本願で用いられたように、上記用語の新生物は、全ての癌疾患状態を記述するために用いられ、悪性造血性の、苦しい固形腫瘍と関連した病理学的プロセスを包括又は包含する。
【０１４５】
本発明の製剤中の構成成分
本発明の製剤は、薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又はアジュバントを含むことができる。許容可能な製剤は、好ましくは、採用される投与量及び濃度において受容者に無毒性である。薬学的製剤は、例えば、組成物のｐＨ、滲透性、粘度、透明度、色相、等張性、安定性、溶解又は放出速度、吸収又は浸透を変更、維持又は保存するための物質を含むことができる。適合した製剤材料には、限定でないが、以下のものが含まれる：アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン）；抗菌物質；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム又はナトリウム亜硫酸水素塩）；バッファ（例えば、ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩又はその他の有機酸）；増量剤（例えば、マンニトール又はグリシン）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデクストリン又はヒドロキシプロピル−β−シクロデクストリン）；フィラ；単糖類、二糖類、他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノース又はデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン）；着色剤、風味剤及び賦形剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量のポリペプチド；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトール又はソルビトール）；懸濁化剤；界面活性剤又は湿潤剤（プルロニック、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０及びとポリソルベート８０、Ｔｗｅｅｎは、本発明の実施例で用いられる；Ｔｗｅｅｎは、押出しステップの前にエマルジョンの収率を改善するために用いることができる；Ｔｗｅｅｎは、脂質への追加より前に、あるいは脂質に水性製剤に添加することができ、その後、水分を加える。可能な限りの最小量のＴｗｅｅｎを用い、これは、１００ｍｌの水分中で約１００マイクロリットル未満である。トリトン、トリメタミン、レシチン、コレステロール、又はチロキサポール）；安定性向上剤（例えば、蔗糖又はソルビトール）；等張性強化剤（例えば、アルカリ金属ハライド、好ましくは、ナトリウム又は塩化カリウム、マンニトール又はソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤及び／又は製薬アジュバント。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ≡Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、１８．ｓｕｐ．ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．），１９９０、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ参照。
【０１４６】
最適の薬学的製剤は、例えば、意図する投与経路、送達フォーマット及び所望の投与量に応じて、当業者が決定することができる。例えば、上記で言及したＲＥＭＩＮＧＴＯＮ≡Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ参照。これらの製剤は、物理的状態、生体内放出速度、及び本発明の抗体の生体内除去速度に影響を与えることができる。
【０１４７】
薬学的製剤中の１次的なビヒクル又は担体には、限定でないが、非経口投与用組成物に通常用いられるその他の物質を補充することができる注射用水、生理学的食塩水溶液、又は人工脳脊髄液が含まれる。中性緩衝化食塩水又は血清アルブミンを混合した食塩水が、追加の例示のビヒクルである。薬学的製剤は、およそｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝液、又はおよそｐＨ４．０−５．５のアセテート緩衝液を含むことができ、これは、更にソルビトール又は適切な代替物を含むことができる。本発明の薬学的製剤は、所望の純度を有した選択された組成物を、選択的剤形化剤（上記で言及したＲＥＭＩＮＧＴＯＮ≡Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳを参照）と混合して、凍結乾燥したケーキ又は水溶液の形態で保存用に調製されることができる。ひいては、製剤は、スクロースのような適切な賦形剤を用い、凍結乾燥物として剤形化することができる。
【０１４８】
製剤構成成分は、投与部位に許容可能な濃度で存在する。緩衝剤は、有利には、組成物を、通常約５〜約８のｐＨの範囲である生理学的ｐＨ、又はより低いｐＨに維持するために用いられる。
【０１４９】
本発明の薬学的製剤は、非経口的で送達することができる。非経口投与が考慮される場合、本発明に用いるための治療製剤は、発熱物質のない、非経口的に許容可能な水溶液の形態で存在することができる。製剤は、所望のイムノミセルの剤形を伴い、これは、その後蓄積注射を通じて送達することができる製品の制御又は徐放型放出を提供することができる。ヒアルロン酸のある製剤は、循環時、持続期間を強化する有効性を有する。
【０１５０】
本発明による製剤は、吸入用に剤形化することができる。そのような実施形態において、不可視のコレストソーム−分子製剤が吸入用乾燥粉末として剤形化されるか、又は吸入溶液がまた、例えば、噴霧化によるエアゾル送達のための推進体を用いて剤形化することができる。肺への投与は、化学的に修飾されたタンパク質の肺送達を記述し、本願に参考文献として含まれるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５に追加に記載されている。
【０１５１】
製剤は、皮膚に対する局所適用のために剤形化することができる。そのような実施形態において、不可視のコレストソーム−分子製剤が軟膏又はクリームに剤形化され、皮膚表面に適用される。
【０１５２】
本発明の製剤は、胃腸管を通じて、例えば、経口的に送達することができ、これは、投与の好ましい経路を示す。そのような薬学的に許容される組成物の調製が本願に開示されており、当業界に属する。その様式で投与される、本願に開示された製剤は、錠剤及びカプセルのような固体投薬形態のコンパウンディングに通常用いられる担体の存在又は不在下で剤形化することができる。カプセルは、生物学的利用能が最大化され、予備全身分解が最小化された時、胃腸管内の地点で製剤の活性部分を放出するように設計され得る。酸では安定であるが、十二指腸のｐＨ（約５．０〜約６．０又はそれより高い）では、分解可能な腸溶コーティングが好適であり得る。追加の薬剤が、吸収促進のために含まれていてもよい。希釈剤、風味剤、低融点ワックス、植物性オイル、潤滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、及び結合剤がまた採用されてもよい。
【０１５３】
製剤は、錠剤の製造に適合した無毒性賦形剤との混合物で、有効量のコレストソーム、最も好ましくはコレストソーム製剤及び本願に開示された医薬組成物のうち分子を伴う。錠剤を滅菌水又は他の適切なビヒクルに溶解させることにより、溶液は、単位−投与量形態で調製され得る。好適な賦形剤には、限定でないが、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム又は重炭酸塩、ラクトース又はリン酸カルシウム；又は結合剤、例えば、澱粉、ゼラチン又はアカシア；又は潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクが含まれる。
【０１５４】
生体内投与に用いる医薬組成物は、一般的に滅菌性である。特定の実施形態において、これは、滅菌ろ過膜を通じたろ過によって達成することができる。特定の実施形態において、組成物が凍結乾燥される時、その方法を用いた滅菌は、凍結乾燥及び再建の以前に、或いは以後に行うことができる。特定の実施形態において、非経口投与用組成物は、凍結乾燥形態、又は溶液で保存することができる。特定の実施形態において、非経口組成物は、一般的に滅菌接近ポート、例えば、皮下注射針で貫通可能な栓のある静脈内溶液バック又はバイアルを有した容器に位置する。
【０１５５】
一旦、本発明の製剤が剤形化されると、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体又は脱水又は凍結乾燥粉末として滅菌バイアルに保存することができる。そのような製剤は、即時使用形態又は投与前に再建される形態（例えば、凍結乾燥された形態）で保存することができる。
【０１５６】
本発明の製剤の投与経路は、経口、静脈内、腹膜内、大脳内（脳実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、又は病巣内経路による注射；徐放型放出システム又は移植装置によるものを含む。薬学的製剤は、大量注射によって又は注入によって、連続的に又は移植装置によって投与することができる。医薬組成物はまた、所望の分子が吸収又はカプセル化される膜、スポンジ又は他の適切な物質の移植によって局所的に投与することができる。移植装置が用いられる場合、装置は、任意の適合した組織又は臓器に移植又は局所的に適用することができ、所望の分子の送達は、拡散、徐放性巨丸剤又は連続的投与を通じたものであり得る。
【０１５７】
本願で用いられたように、「腸溶コーティング」は、約５．０から７．０〜約７．６（上記範囲において、好ましくは約５．０〜約６．０又はそれより多く）の範囲未満のｐＨで実質的に不溶性であり、限定でないが、ポリ（ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）で安定化されたｄｌ−ラクチド−コ−グリコリド、キトサン（Ｃｈｉ））、脂質、アルギン酸塩、カルボキシメチルエチルセルロース（ＣＭＥＣ）、酢酸セルローストリメリテート（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタル酸塩（ＨＰＭＣＰ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、カラーコン（ｃｏｌｏｒ  ｃｏｎ）、フードグレーズ及びヒドロキシプロピルメチルセルロース及びエチルセルロースの混合物、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、シェラック、メタクリル酸とエチルアクリル酸塩の共重合体、及びメチルアクリル酸塩モノマーが重合される間に添加されるメタクリル酸とエチルアクリル酸塩の共重合体からなる群から選択される１つ以上の組成物である多様な物質を含むことができる。
【０１５８】
腸溶コーティングは、従来のコーティング技術、例えば、パンコーティング又は液体層コーティングにより、或いは水又は適合した有機溶媒中の重合体の溶液を用いて、又は水性重合体分散液を用いて適用することができる。代案的な実施形態として、放出剤御腸溶コーティングは、コア上に追加の抗原及び／又は薬物層を分離することができ；例えば、放出剤御物質を用いたコーティング後には、更に他の抗原及び／又は薬物層を適用することができ、次いで更に別の放出剤御コーティング層等が後続してもよい。例えば、放出剤御コーティング用の適合した物質には、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）（アクリル及びメタクリル酸エステルの共重合体）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＳ（アクリル及びメタクリル酸エステルの共重合体）、セルロース誘導体、例えば、エチルセルロース水性分散液（ＡＱＵＡＣＯＡＴ（登録商標）、ＳＵＲＥＬＥＡＳＥ）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニル共重合体、ＯＰＡＤＲＹ（登録商標）等が含まれる。
【０１５９】
本発明の上記及び他の側面が、下記非限定的な実施例において更に記述される。
【０１６０】
本出願の非限定的な実施例
実施例１．段階的：コレストソームのカプセル化タンパク質、ペプチド及び遺伝子物質の一般的調製及び試験
経口用タンパク質又はペプチドに適用されるコレストソーム
経口薬物分子、経口用タンパク質、経口用ペプチド、経口用遺伝子又は遺伝子物質の構築物（用語「分子」は、本願の実施例において、以後これらのものの中の１つ又は全部を定義する）の調製及びＣａｃｏ２細胞での吸収に対する上記分子の試験ステップは、以下のとおりである。
１．コレステリルエステル及びカプセル化のための組成物構成要素を調製する。
２．カプセル化標的分子を得て、３７゜Ｃ〜４５゜Ｃで純度及び安定性に対して試験する。
３．上記分子の最大のコレストソーム積載を達成するエステルと分子の間の相互作用のコンピューターモデルを用いて、コレストソーム混合物中のコレステリルエステルの成分を最適化する。
４．コレストソームのカプセル化分子を調製し、顕微鏡を含めた生物学的研究遂行の目的でフルオレッセンイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識を含むようにする、上記ＦＩＴＣ標識は、人体試験又は治療用途を意図する製品の構成成分ではない。
５．Ｃａｃｏ２細胞単層でＦＩＴＣ標識された分子を試験し、カイロミクロンカプセル化ＦＩＴＣ−コレストソーム−分子を収集して、コレストソーム積載されたカイロミクロンに取り込まれたものと定義する。
６．細胞をカイロミクロン含有ＦＩＴＣ−コレストソーム−分子に暴露し、それらの試験細胞によるＦＩＴＣ−分子の吸収を決定する。使用の容易さ及び癌との関連性のためにＭＣＦ−７細胞がよく選択されるが、多数の生物活性分子の細胞内吸収と同様に細胞標的化が科学的研究の対象となる場合、吸収に対する多数の異なる細胞株試験が、薬物送達分野の先行技術より優れており、新規かつ予期していないものであることを操作者は実感できるだろう。
７．顕微鏡を用いて細胞内ＦＩＴＣ−分子がエンドゾムに含まれるか否か、又はそれが細胞質に遊離されているか否かを決定する。エンドゾムを画像捕捉する典型的な時期は、最初の暴露後、約２４時間になる時である。
８．ＧＬＵＴ−輸送体のウエスタンブロット発現を用いて、分子の細胞内作用が細胞内分子の作用によって制御される追加の物質又は分子の細胞表面媒介吸収として発現されるか否かを決定する。
９．動物又はヒトへの投与のために、ＦＩＴＣ−分子−コレストソームのある腸溶コーティングされたｐＨ５．５放出カプセルを調製する（酸不安定タンパク質、ペプチド、遺伝子又は生きている構築物、例えば、ワクチン又はウイルスに対する好ましい経口投与形態）。
１０．ＦＩＴＣ−分子−コレストソームの経口剤形をマウス又はヒトに投与する。
１１．ステップ１０の実験において、腸溶コーティングされたカプセル中のＦＩＴＣ−分子−コレストソームと同一の投与量のＦＩＴＣ−分子−コレストソームを経口的に投与し、ＩＶ。同一の投与量のＦＩＴＣ−分子−コレストソームをＩＶ投与する。
１２．以下の三つの方式の間で、各方式に対し、ＦＩＴＣ−分子−コレストソームの投与後の分子のバイオマーカーに対する有効性を比較する。
ａ．ＦＩＴＣ分子コレストソームで経口投与、これは、ＦＩＴＣ分子で積載したリンパカイロミクロンを結果として提供する。
ｂ．ＦＩＴＣ−分子コレストソームで静脈内投与、これは、カイロミクロンを形成せず、分子の細胞への吸収を促進することができるか、或いは促進できない場合がある。
ｃ．ＦＩＴＣ−分子を静脈内投与するが、コレストソーム中になく、よってカイロミクロン中にない。
１３．蛍光顕微鏡を用いて、上記ステップ１２における３つの投与方式（ａ対ｂ対ｃ）を提供されたマウスから取った組織でＦＩＴＣ−分子の生物学的分配を試験する。死後剖検で試験した組織には、肝、腎臓、脳、膵臓、十二指腸、回腸、大腸、脾臓、筋肉、腹部脂肪が含まれる。分子の高い細胞内濃度がこの方法により達成することができ、細胞での分配がエンドソーム又は消化胞に制限される代わりに均一であるものと予想された。分子の有効性の測定は、細胞内分配プロファイルと相関関係があり、全般的な生物活性対投与量の測定は、有効性測定から派生されたものである。
【０１６１】
図１２．カプセル化されたタンパク質を有したコレストソームの構造
図１２に示されたのは、例示としてカプセル化されたインスリンを有した、積載されたコレストソーム構造モデルである。そのような理想的な脂質粒子は、塊の原製品の寸法が約１０００〜５０００ｎｍである脂質塊に凝集される。そのような大きい粒子の一様な２５０ｎｍの粒子径での押出しが、好ましい実施例である。これは、当業界に広く公知された標準の高圧押出装置を用いて行うことができる。
【０１６２】
実施例２．コレステリルエステル組成物及び層形成
コレストソームの製造における使用のために考慮されるコレステリルエステルの予備調査
各エステルの融点を決定する。例示として、ミリステートは、摂氏６５度の溶融転移温度を有しており、その温度を超えると、固体構成成分が溶融する。
【０１６３】
剤形の目的は、溶融温度未満でコレステリルエステルを用いることであり、（リポソーム製剤と一致）、タンパク質が温度約４０度では変性し始めることを考慮する。
【０１６４】
追加の温度試験を、選択されたエステルミリステート及びラウレート上で行った。有機溶媒をロータリーエバポレーター中の脂質から完全に除去した後、ＤＳＣを行うが、これは２つの溶融温度を示して、１つは約６０℃であり、もう１つはより高い温度であった。
【０１６５】
上記発見した事実に基づいて、剤形化するタンパク質及びペプチドの安定性を考慮し、カプセル化プロセスの操作温度は４５℃〜５５℃に維持した。
【０１６６】
コレステリルエステルの選択及びコレストソーム内の分子のカプセル化のための組成物
カプセル化小胞の適切な形成のための特定のコレステリルエステルの選択は、新規接近法及び電算化された分子モデリングを伴う。コレステリルエステルの特性及びカプセル化のための標的分子と、分子周辺のエステルから形成された小胞の中空コア内部との間の相互作用が、体積対体積基準又は重量対重量基準の積載のような好ましいコレストソーム−分子特性の定義に用いられる。
【０１６７】
内部に積載される分子なしに調製されたコレストソーム小胞は、押出後に２５０ｎｍの平均直径を有する。寸法は、コレステリルエステルの寸法、異なるコレステリルエステルの混合物のモル比、ろ過技術、超音波処理の回数及び温度の関数で調整することができる。
ａ．コレストソームを形成する請求されたコレステリルエステルは、以下のものを含む：コレステロール及び脂肪酸から生成される任意のコレステリルエステル、ここで脂肪酸は、限定でないが、下記表２における以下の化合物を含む飽和及び不飽和脂肪酸を含む。
【０１６８】
（表２）
構造、炭素数対二重結合個数の比率であるＣ：Ｄ及び二重結合の位置を特徴とする、コレステリルエステルの形成に用いられる脂肪酸のリスト
2019070031.tif 000003
【０１６９】
上記表において、脂肪酸分子のアルキル鎖におけるＣは炭素数であり、Ｄは二重結合の数であり、分子のＣ：Ｄ比率は提示された通りである。二重結合の位置は、鎖で位置１であるカルボニル以後の炭素個数で示す。そのような方式で、ミリストレイン酸に対するｎ−５は、二重結合が位置１４−５＝位置９で発見されるという意味である。
【０１７０】
用語「コレステロール」は、本発明において、本発明によりコレストソームの形成に用いられるコレステリルエステルの調製に用いることができる任意のコレステロール化合物を記述するために使用される。用語「コレステロール」は、（限定でないが）例えば、７−ケトコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、７−ベータ−ヒドロキシコレステロール、コレステロール、５−アルファ、６−アルファエポキシド、４−ベータヒドロキシコレステロール、２４−ヒドロキシコレステロール、２７−ヒドロキシコレステロール、２４、２５−エポキシコレステロールのような追加の酸素添加部位を有したコレステロール分子（「コレステロールの酸素添加類似体」）、及びそれ自体でコレステロールと識別される化合物を含む。オキシステロールは、類型（ヒドロペルオキシ、ヒドロキシ、ケト、エポキシ）、導入する酸素添加された官能基の個数及び位置並びにそれらの立体化学の本性によって多様である。このような多様なコレステロールが、コレステロールエステル分子内に親水性を提供し得る基及び中性表面を有したコレストソームの提供において、所定の融通性を提供するための溶解度特性が多様なコレステロールエステルの提供に用いられてもよい。コレステロール類型分子はまた、ビタミンＤのようなエステル形成に必須的であるＯＨを含む任意のステロール構造ベースの化合物を含むことができる。
【０１７１】
コレストソームの有益な形成において請求されるモル比は、上記表２に挙げられた（エステルの一対が用いられる場合）エステルの任意の対の０．０５〜０．９５の範囲である。ほぼ同等なアルキル鎖長のコレステリルエステル及び活性分子の対の間の組成物の製品比率は、約２：２：９６〜４８：４８：４、しばしば４５：４５：１０〜約２：２：９６、約４０：４０：２０〜約５：５：９０、約４０：４０：２０〜約２５：２５：５０の範囲である。２つ（以上の）コレステリルエステルが用いられる時、多数のコレストソーム製剤において、その比率は、用いられるコレステリルエステルに対して１：１の比率の上下に可変的である点に注意されたい。
【０１７２】
請求されるろ過技術は、最初の寸法選別のための真空ろ過、及び引き続き、より精巧な寸法選別のための製剤の押出しを含む。
【０１７３】
超音波処理時間は、３０分〜１２０分の範囲である。そのような時間は、一定の範囲で提示されるが、ここで遠心分離時間が可変的である。最適の超音波処理時間は、超音波処理器における最適の超音波処理地点を捜し出す能力によるものであり、最適の時間に溶液は濁る外観を形成し、固体物質の量が、その時点で目視による決定時、最小にならなければならない。
【０１７４】
表２において、大部分のコレステリルエステルで作業の時、コレストソーム小胞の生成の間の温度範囲は、３５℃〜４５℃である。小胞を調製する間には、温度が一定に（＋／−５℃）維持される。温度は、任意の個別エステルの溶融温度未満に維持される。例示として、ミリステート／ラウレートを用いたコレストソーム調製のためには、温度が４０℃＋／−５℃に維持される。超音波処理前、混合物の間に少量追加する時、コレストソームの全体の収率が増大し、より均一な粒子の生成を促進するようになる。
【０１７５】
例示として、下記の原則が、カプセル化目的のエステル又はエステル対の選択手段であるコレストソームにおける構成成分エステルの選択のための基準を定義し、表２で挙げられたコレステリルエステルの開示された物理化学的特性を信頼する。
【０１７６】
１）組合せのために選択されるエステルは、エステル対の間のエステル連結相互作用の最適化のために、それ自体で整列することができる。そのような静電気的相互作用は、小胞の必要な疎水性外部及び親水性中心を持たせるための配向の目的上、重要である。
【０１７７】
２）アルキル相互作用は、ファンデルワールス力を最適化することができる。
【０１７８】
３）静電気的相互作用及びアルキル相互作用ファンデルワールス力の和は、小胞形態を維持して分子内部を維持する基本的な特性である。コレストソーム小胞の安定性のための重要な追加の要因は、エステルの二重疎水性末端と、カプセル化される分子（等）を含む水性構成成分との間の反発力程度を含む。
【０１７９】
４）小胞の全体的寸法は、アルキル鎖長の関数となる。選択されたエステルの長さが長くなると、全体の小胞の全体的な疎水性特徴が増加する。
【０１８０】
５）より小さな鎖長のエステルを用いると、小胞の全体的な親水性特徴が実際に増加する（各エステルの全体構造の側面で）。
【０１８１】
６）小胞内のカプセル化を補助するためにより大きな疎水性領域を必要とする分子は、より長いアルキル鎖を有したエステルから有益を取ることができる。
【０１８２】
７）より小さくて、カプセル化において補助するより親水性の構成成分を必要とする分子は、長さがより短いエステル対から有益を取ることができる。
【０１８３】
８）更なる選択事項は、表２に挙げられたような不飽和アルキル鎖を用いることであり、ここでそのような脂肪酸は、コレステリルエステルの形成に用いるためのエステル側鎖の生成に用いられる。
【０１８４】
９）不飽和脂肪酸の利用は、水性及び二重結合特徴の間に追加の静電気的相互作用を組み込む小胞構造に、更なる構造的変更を提供する。
【０１８５】
１０）小胞形成のためのエステルの選択プロセスにおいて、小胞内アルキル鎖の相互作用を最大化するようにしたアルキル鎖採択における競争挑戦の結果、例えば、長さにおいて２個のＣＨ2単位体〜２７個未満のＣＨ2の範囲のＣＨ２鎖長の選択は、あまり緻密でない構造を提供する。小胞壁のコレステロール成分は変化しない。ＣＨ2単位体の内部でのファンデルワールス相互作用は、アルキル相互作用の柔軟性を支配する。しかし、有益な親水性小胞の中心に対し、そのような小胞内の最適の構造配置はより長いアルキル鎖であり、これは、より長いエステル分子が、製剤の安定性において水性環境に暴露された小胞のより親水性の小胞中心を安定化させるためにもっと大きな有用性を有するという点を意味する。
【０１８６】
図６〜７は、表２で選択するコレステリルエステルの２つの異なる対由来のコレストソーム小胞マトリックスの例示を手段とする分子モデリング略図を示す。ここで選択されたミリステート−ラウレートマトリックスの図８〜１０において、発明者は、小型水溶性分子セフタロリン上の影響力を説明するために分子モデリングを用いた。セフタロリンに対して形成されたコレストソームは、コレステリルエステルの選択された対で５：５：９０の組成比を提供する。図１１〜１３において、代表的なペプチド分子は、一般的に水溶性であり、大きさが６ｋｄのペプチドである、インスリンである。図１４〜１５において、コレストソーム小胞の構造は、大きさが約１５０ｋｄである代表的なモノクローナル抗体であるベバシズマブのカプセル化に適用された。図１６において、全ての３つの代表的な分子を、コレステリルエステルミリステート及びラウレートで形成されたコレストソーム小胞と関連して示す。
【０１８７】
長さが異なる６個のＣＨ2単位体より大きなエステル対（中間体として定義する）に対して、エステル相互作用を維持し、反対方向に分子を回して小胞内に充填されたアルキル鎖を依然として保有するのが可能である。そのような整列は、疎水性／親水性特徴が交代する構造的領域を有した分子内の充填に有用であり、上記小胞への組み込み時、それを基準に異なる分子類型に分離するようになる。
【０１８８】
エステル対の選択は、カプセル化される必要のある分子の構造及びその小胞と相互作用する能力の関数である。
【０１８９】
図８〜１０において、全体のコレストソームの輪郭構造が挿入された分子セフタロリンとともに示された。インスリンは、図１１〜１３に示されており、図１４〜１５で示された分子は、ベバシズマブである。図１６において、マトリックスは互いに並んで示されたセフタロリン、インスリン及びベバシズマブの周辺に示されるが、コレストソームマトリックスの大きさと相関して、それらの分子の相対的な大きさがよく示されている。これらの３つの分子の全ては、そのような方法により有効にカプセル化することができ、経口投与後、ヒトにおいて用いることができる。それぞれの場合、本発明に開示されたもの以外に経口的吸収のための公知された有効な手段はない。
【０１９０】
実施例３．経口的使用のためのコレストソーム内の抗生剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤及びその他の小型分子
本発明において、感染性疾患治療に用いる分子は、一般的にコレストソームへのカプセル化に適合しており、経口用として用いられる。大部分の抗生剤は、一般的に親水性であり、他の方法では経口的に吸収されないため、静脈内（ＩＶ）投与されなければならない。したがって、コレストソームでの使用は、それらの経口的吸収が可能となるようにする。本発明によるコレストソームには、多数の抗生剤が用いられてもよい。本発明に用いられる抗生剤には、以下のものが含まれる：アミノグリコシド、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、スペクチノマイシン；アンサマイシン、例えば、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、リファキシミン及びストレプトマイシン；カルバペネム、例えば、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン及びメロペネム；セファロスポリン、例えば、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン／セファロチン、セファレキシン、セファクター、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフェピム、セフタロリンフォサミル及びセフトビプロール；グリコペプチド、例えば、テイコプラニン、バンコマイシン及びテラバンシン；リポペプチド、例えば、ダプトマイシン、オリタバンシン、ＷＡＰ８２９４Ａ；マクロライド、例えば、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン及びスピラマイシン；リンコサミド、例えば、クリンダマイシン及びリンコマイシン；モノバクタム、例えば、アズトレオナム；ニトロフラン、例えば、フラゾリドン及びニトロフラントイン；オキサゾリジノン、例えば、リネゾリド、ポシゾリド、ラデゾリド及びトレゾリド；ペニシリン、例えば、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、テモシリン及びチカルシリン；ペニシリン合剤、例えば、アモキシシリン／クラブラン酸、アンピシリン／スルバクタム、ピペラシリン／タゾバクタム、及びチカルシリン／クラブラン酸；ポリペプチド、例えば、バシトラシン、コリスチン及びポリミキシンＢ；キノロン／フルオロキノリン、例えば、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、及びスパルフロキサシン；スルホンアミド、例えば、マフェニド、スルファセタミド、スルファダイアジン、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファサラジン、スルフィソクサゾール、トリメトプリム−スルファメトキサゾール及びスルホンアミドクリソイジン；テトラサイクリン、例えば、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ビブラマイシン、ミノサイクリン、チゲサイクリン、オキシテトラサイクリン及びテトラサイクリン；抗ミコバクテリア、例えば、クロファジミン、カプレオマイシン、シクロセリン、エタンブトール、リファンピシン、リファブチン、リファペンチン、アルスフェナミン、未分類のもの、例えば、クロラムフェニコール、ホスホマイシン、フシジン酸、メトロニダゾール、ムピロシン、プラテンシマイシン、キヌプリスチン／ダルフォプリスチン、チアムフェニコール、チゲサイクリン、チニダゾール及びトリメトプリム。
【０１９１】
これらの中で、いずれもそのままの状態では経口的に吸収されず、各場合、経口的吸収は、感染性疾患の治療においてそれを非経口的に注入しなければならない現在の必要条件を越える主な長所を構成する。
【０１９２】
コレストソームのカプセル化に適用されたものと同様に当分野の実施において用いる抗真菌化合物の例示には、限定でないが、以下のミコナゾール、テルコナゾール、エコナゾール、イソコナゾール、チオコナゾール、ビホナゾール、クロトリマゾール、ケトコナゾール、ブドコナゾール、イトラコナゾール、オキシコナゾール、フェンチコナゾール、ナイスタチン、ナフチフィン、アムホテリシンＢ、ジノコナゾール及びシクロピロクスオラミン、ミカファンギン、カスポファンギン、アンチデュラファンギンが含まれる。
【０１９３】
コレストソームのカプセル化に適用されたものと同様に当分野の実施において用いる抗ウイルス化合物の例示には、下記リバビリン、テラプレビル、ダクラタスビル、アスナプレビル、ボセプレビル、ソホスブビル、ＢＩ２０１３３５、ＢＩ１３３５；ＡＣＨ−２９２８、ＡＣＨ１６２５；ＡＬＳ−２１５８；ＡＬＳ２２００；ＢＩＴ−２２５；ＢＬ−８０２０；アリスポリビル；ＩＤＸ１９３６８；ＩＤＸ１８４；ＩＤＸ７１９；シメプレビル；ＢＭＳ−７９００５２；ＢＭＳ−０３２；ＢＭＳ−７９１３２５；ＡＢＴ０７２；ＡＢＴ３３３；ＴＭＣ４３５；ダノプレビル；ＶＸ２２２；メリシタビン；ＭＫ−８７４２、ＧＳ−５８８５又はそれらの混合物、インターフェロン、ペグ化インターフェロン、ペグ化インターフェロンラムダ又はこれらインターフェロンのいずれかの他の適合した製剤が含まれる。
【０１９４】
コレストソームにおける抗感染性製剤の代表的例示が本願に開示されており、コレストソーム中の抗感染性物質の特性を説明する。
【０１９５】
トブラマイシン
本願に開示された分子を説明する好ましい実施形態は、実施例１で挙げられた原則によってコレストソームのカプセル化されたトブラマイシンの調製及び試験のためのリストから選択されるトブラマイシンである。特定の製剤が経口用で、またシュードモナス‐アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のような標的グラム陰性バクテリアに対抗する抗生剤のトブラマイシンの全体的活性を増加させるために設計された。
【０１９６】
特定の例示として、平均直径が２５０〜１、０００ｎｍであるトブラマイシンコレストソームが、実施例２において好ましいものと開示されたエステルからコレステリルエステルを選択し、実施例１に記載されたように本発明の方法で調製された。トブラマイシンを含むコレストソームを、２種類のコレステリルエステル、コレステリルミリステート及びコレステリルラウレートの新規なブレンドを用いて調製した。
【０１９７】
トブラマイシン製剤の特性
バッチ特性
ＤＬＬＳ粒子寸法：２７００ｎｍ
ゼータ電位：−２１．７
脂質の濃度：１．９ｍｇ／ｍｌ、トブラマイシン濃度：２．０ｍｇ／ｍｌ
細胞暴露：ＭＣＦ−７細胞（図２３参照）
コレストソーム単独：２４時間にわたって成長又は生存力に影響を与えない
ＦＩＴＣ単独：２４時間にわたって成長又は生存力に影響を与えない
トブラマイシン単独：１０ｍｃｇ／ｍｌ〜０．０１ｍｃｇ／ｍｌ、２４時間にわたって成長又は生存力に影響を与えない
ＦＩＴＣトブラマイシン単独：１０ｍｃｇ／ｍｌ、２４時間にわたって成長又は生存力に影響を与えない
ＦＩＴＣトブラマイシンコレストソーム：３．０ｍｃｇ／ｍｌ２４時間で死滅、繰り返して同一の結果。外部に比べて内部で１００倍であることを想定すると、腎尿細管障壁細胞と類似した細胞内死滅閾値を有する。
結論：コレストソーム単独、ＦＩＴＣコレストソーム単独、トブラマイシン単独ではＭＣＦ−７細胞を死滅させない。ＭＣＦ−７細胞上のＦＩＴＣ−トブラマイシンはまた、それらを害さない。しかし、ＦＩＴＣ−トブラマイシン−コレストソームは、２４時間目に死滅させる。
ＦＩＴＣトブラマイシンコレストソームでは、カイロミクロンの調査は行っていない。
【０１９８】
図２３  ＦＩＴＣトブラマイシンコレストソーム
明視野対ＦＩＴＣ蛍光画像提供によるＭＣＦ−７細胞の比較は、１）ＦＩＴＣ−コレストソームに対する２４時間の暴露後、ＭＣＦ−７細胞の全般的な成功的積載を示したが、これは、コレストソームを用いた本出願人の作業で繰り返して提示された。
【０１９９】
２）では、特にコレストソームによる細胞の積載を単独的ＦＩＴＣ−トブラマイシンに暴露した時、ＭＣＦ−７細胞内部で約１００倍より大きなトブラマイシン濃度のそのような応答性は、ＭＣＦ−７細胞の細胞内積載の一般的な欠乏と比較する時、予測していないものである。トブラマイシンは、身体細胞にほとんど入り込まず、トブラマイシンを能動的に取る任意の細胞は、ＡＴＰ生産を通じた細胞エネルギー供給及びミトコンドリアに対するその影響によって、トブラマイシンで細胞内殺傷に適用されるということが広く公知されているため、少ない積載は予想される結果であった。これは、トブラマイシンの広く公知された腎臓毒性及び耳毒性に対する根拠となる。
【０２００】
多大な関心の対象である３）では、ＭＣＦ−７細胞が、ＦＩＴＣ−トブラマイシン−コレストソームに２４時間暴露された時、最終フレームの上端及び下端から分かるように、これらのＭＣＦ−７細胞は全て死滅した。ここで、目的は、トブラマイシンが細胞に入り込む時、どのようにしてミトコンドリアに一般毒素となるのか、及びトブラマイシンが、その上、その細胞内有効性に対して耐性である細胞にまで入り込む時、どのようにして細胞内吸収に対して潜在性を有し、害するのかを見せることである。
【０２０１】
セフタロリン
経口的には吸収されず、したがって、現在、ＩＶ投与でのみ提供されているセファロスポリン抗生剤と関連した特定の例示として、抗ＭＲＳＡセファロスポリン抗生剤セフタロリンポサミルを選択した。
【０２０２】
市販されているセフタロリンは、病院の薬局から購入し、セフタロリンコレストソームは、実施例２において好ましいものと開示されたコレステリルエステルを用いて、実施例１に記載されたような本発明の方法で調製した。本出願人は、セフタロリンをＦＩＴＣ標識することができなかったが、そこで、バッチは、製剤の効能定義の１次的手段として、それらの抗微生物特性に対して試験した。
【０２０３】
セフタロリンを含むコレストソームの試験バッチは、２種類のコレステリルエステル、コレステリルミリステート及びコレステリルラウレートの新規ブレンドを用いて調製された。組成物のためのコレステリルエステルの選択は、実施例２に開示された化合物から行うことができるが、これに限定されるものではなく、セフタロリン又は類似の分子との剤形化のためのその他の適合したコレステリルエステルがあれば、本製剤において許容され得る。
【０２０４】
セフタロリンを含む最適のコレストソーム製剤の特定の製剤において、任意のコレステロールエステルがコレストソームの構成成分として選択されてもよく、コレストソーム製品の最終ゼータ電位が中性に荷電されている限り、本発明の精神に符合する。
【０２０５】
セフタロリン製剤の特性
バッチ：
ＦＩＴＣ標識分画：未実施
ＤＬＬＳ粒子寸法は測定されず、押し出されていない
遊離されたセフタロリンを除去するために透析して調製：行ったが、遊離されたセフタロリンは製剤中に残っている
百分率収率：脂質の出発量の１３％
ゼータ電位：未実施
【０２０６】
透析したセフタロリンを用いたバクテリア試験；抗ＭＲＳＡ作用を保有し、ＭＩＣ値は親セフタロリンより１０倍以上もっと低い。コレストソーム製剤からＭＲＳＡによる能動吸収を表示する。
細胞：ＭＣＦ−７：融合性製剤で２４時間目に４００、０００個の細胞。ＭＣＦ−７細胞の寸法は２０００ｎｍ
コレストソーム単独：２４時間にわたってＭＣＦ−７細胞の成長又は生存力に有効性なし
ＦＩＴＣ単独：２４時間にわたってＭＣＦ−７細胞の成長又は生存力に有効性なし
セフタロリン単独：２４時間にわたってＭＣＦ−７細胞の成長又は生存力に有効性なし
ＦＩＴＣセフタロリン単独：調製されなかったため未実施
ＦＩＴＣセフタロリンコレストソーム：２４時間にわたってＭＣＦ−７細胞の成長又は生存力に有効性なし。外部に比べて内部で１００倍であることを想定。
【０２０７】
カイロミクロン形成細胞：セフタロリンをＣａｃｏ−２細胞で試験しない。
【０２０８】
バンコマイシン
経口的に吸収されず、現在、ＩＶ投与でのみ提供されているグリコペプチド抗生剤であることを考慮した特定の実施例として、本出願人は、抗ＭＲＳＡグリコペプチド抗生剤バンコマイシンを選択した。
【０２０９】
市販されているバンコマイシンは、Ｓｉｇｍａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ社から購入し、ＦＩＴＣバンコマイシンコレストソームは、実施例２において好ましいものと開示されたエステル由来のコレステリルエステルを選択し、実施例１に記載されたような本発明の方法で調製された。バッチは、ＭＣＦ−７細胞、Ｃａｃｏ−２細胞に対して完全に試験し、更に、製剤の効能を定義するための第２の１次的手段として、ＭＲＳＡに対抗するそれらの抗微生物特性について試験した。
【０２１０】
２種類のコレステリルエステル、コレステリルミリステート及びコレステリルラウレートの新規ブレンドを用いて、ＦＩＴＣ−バンコマイシン含有コレストソームの試験バッチを調製した。組成物のためのコレステリルエステルの選択は、実施例２に開示された化合物から行ったが、これに限定されるものではなく、バンコマイシン又は類似のグリコペプチド抗生剤分子との剤形化のためのその他の適合したコレステリルエステルがあれば、本製剤において許容され得る。
【０２１１】
バンコマイシンを含む最適コレストソーム製剤の特定の製剤において、任意のコレステロールエステルがコレストソームの構成成分として選択されてもよく、コレストソーム製品の最終ゼータ電位が中性に荷電されている限り、本発明の精神に符合する。
【０２１２】
バンコマイシン製剤の特性
バッチ：７５６、製造１０−２３−１３
ＤＬＬＳ粒子寸法  １０１６ｎｍ未押出
ＤＬＬＳ粒子寸法：８００ｎｍ押出し
製剤の透析で遊離されたバンコマイシン除去
百分率収率は、脂質の出発量の１．０％未満
ゼータ電位：−１３
体積対体積算出：
脂質の濃度：１０ｍｌの中、１．０ｍｇ。バンコマイシンの濃度：５０００ｍｃｇ／ｍｌ
重量対重量算出：
脂質の濃度：＜１．０ｍｇ／ｍｌ。本製剤には、遊離されたバンコマイシンがある。
この透析されたバージョンを用いてバクテリア試験を行ったが、ＭＲＳＡを非常によく死滅し、バンコマイシン単独で用いたものに比べて、コレストソームでは約１０倍より活性であった。
【０２１３】
細胞：ＭＣＦ−７；融合製剤で２４時間目に４００、０００個の細胞。ＭＣＦ−７細胞の寸法は２０００ｎｍ。
コレストソーム単独：２４時間、有効性なし
ＦＩＴＣ単独：２４時間、有効性なし
バンコマイシン単独：有効性なし；６６６ｍｃｇ／ｍｌまでか試験の最大値。
ＦＩＴＣバンコマイシン単独；６６６ｍｃｇ／ｍｌ〜４１ｍｃｇ／ｍｌ：２４時間、有効性なし
ＦＩＴＣバンコマイシンコレストソーム：２４時間目に有効性なし。コレストソームからのバンコマイシン濃度が０．８３ｍｃｇ／ｍｌである時、ＦＩＴＣ標識の調査は、ＭＣＦ−７細胞で非常に高い内部バンコマイシン濃度を示したが、これは、６６６ｍｃｇ／ｍｌの画像標識と同等であり、図２４を参照する。
上記データから、外部に対比して内部での１０００倍のＦＩＴＣ−バンコマイシン濃度は、コレストソーム積載の有効性と観察することができる。
【０２１４】
４種の異なるＭＲＳＡ菌株に対する微生物学的活性：コレストソームバンコマイシンのＭＩＣ値は、バンコマイシンと同等であるか、又は一部の場合、バンコマイシン単独に比べて１０倍までより低かった。
【０２１５】
図２４．ＦＩＴＣバンコマイシンコレストソーム
図２４に示されたように、バンコマイシンは、細胞内部で幾つかの有効な特性を有する。本図面は、２４時間目におけるＭＣＦ−７細胞へのバンコマイシンの入り込みを示す。この一連の実験において、バンコマイシンの本来の出発濃度は４１〜６６６ｍｃｇ／ｍｌであった。各コラムにおいて、上端の画像は蛍光であり、下端は暗視野である。コラムＢにおけるこのＦＩＴＣ−バンコマイシン系列は、８３ｍｃｇ／ｍｌのＦＩＴＣバンコマイシンを示す。コラムＡにおいて、０．８３ｍｃｇ／ｍｌでのＦＩＴＣ−バンコマイシン−コレストソームが、ＦＩＴＣ−バンコマイシンのコラムＢでのバンコマイシン濃度よりも１００倍より低い値でより多くの吸収を提供する。コラムＡでの蛍光画像は、コラムＢでの画像よりも更に多くの積載を示し、ＭＣＦ−７細胞の積載ＦＩＴＣ−バンコマイシン−コレストソームを用いるものよりも１００倍超えて大きいという点を示唆する。コラムＣにおいて、ＦＩＴＣ−バンコマイシンの細胞外濃度が６６６ｍｃｇ／ｍｌまで増加した時、依然として、コラムＡでのそれほど多く積載は存在しない。したがって、ＦＩＴＣバンコマイシンの積載に対する蛍光データは、コレストソームを用いた時よりも１０００倍より大きな値に近接する。これらのＭＣＦ−７細胞上では、ＦＩＴＣバンコマイシンコレストソームの高容量が効果ないということに留意しなければならない。３つのパネルにおける画像は、本発明者が観察したＦＩＴＣバンコマイシンコレストソームの細胞内部への浸透を立証する。上記画像において、細胞膜がＦＩＴＣバンコマイシンをより大きく濃縮するだけでなく、これらの細胞の細胞質にＦＩＴＣバンコマイシンが積載される。これは、ただ２４時間の暴露後であって、コレストソームが細胞においてより多くのバンコマイシンを大量で積載することを立証する。
【０２１６】
カイロミクロン形成細胞：バンコマイシンはＣａｃｏ−２細胞で試験しない
【０２１７】
結論：バンコマイシン単独、ＦＩＴＣバンコマイシン、ＦＩＴＣ−バンコマイシンコレストソームは、いずれも高い濃度においてＭＣＦ−７細胞を害さない。バンコマイシンは、コレストソームにカプセル化される時、ＭＲＳＡ有機体に対するその抗微生物作用を保有する。
【０２１８】
実施例４．インスリンコレストソーム
コレストソーム中でのインスリン調製における特定のステップ
具体例として、Ｒｅｇｕｌａｒ  Ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｈｕｍｕｌｉｎ、Ｌｉｌｌｙ）コレストソームを、実施例２に好ましいものと開示されたコレステリルエステルを用いて、実施例１に記載されたような本発明の方法で調製した。インスリンを含んでいるコレストソームの試験バッチは、２種類のコレステリルエステル、コレステリルミリステート及びコレステリルラウレートの新規したブレンドを用いて調製した。組成物のためのコレステリルエステルの選択は、実施例２に開示された化合物から行ったが、これに限定されるものではなく、インスリン又は類似分子との剤形化のためのその他の適合したコレステリルエステルがあれば、本製剤において許容され得る。
【０２１９】
インスリンを含む最適のコレストソーム製剤の特定の調製において、任意のコレステロールエステルがコレストソームの構成成分として選択されてもよく、コレストソーム製品の最終ゼータ電位が中性に荷電されている限り、本発明の精神に符合する。実施例２に開示された原則を用いてインスリンに対して選択された２つのエステルはミリステート及びラウレートであるが、エステル鎖長において、これらは単に２個のＣＨ2単位体だけ差があり、開示されたように組み合わせた時、そのような方法で調製されたコレストソーム小胞に対して大きな内部親水性中心を提供する。
【０２２０】
特定のコレステリルエステルの量を最適化することは、全的に生体内使用のためのインスリン含有コレストソームの最適の積載及び放出プロファイルを提供しようとする目的で本発明の範囲に属する。
【０２２１】
初期の出発条件は、ラウレート／ミリステートの１：１モル比に基づくが、多様なインスリン分子の製剤における最終比率は、それに限定されない。各インスリン分子は、最適の積載のためのコレステリルエステルの最終の選別の手段として、その自体構造及び推定されるコレステリルエステルとの分子相互作用の側面で検証しなければならない必要がある。結局、最適の最終製剤はより疎水性の領域を必要とし、疎水性空間の全体の比率がアルキル鎖の長さを基準に変化するものであるため、より長鎖の脂肪酸エステルが用いられる。特定のインスリン分子に対し、より中央集中された親水性構造が必要であれば、その意図は、脂肪酸を用いてエステルで作製される７−ケトコレステロールのようなオキシステロールのうち１つを用いることである。
【０２２２】
カプセル化分子は、限定でないが、レギュラーインスリン、ＮＰＮインスリン、インスリングラルギン、インスリンデグルデク、又はインスリン有効性試験において生物活性に調製されて提示された任意のインスリン製剤を含むインスリンである。コレストソーム製剤の調製ステップは、以下のものを含む。
【０２２３】
水槽を適切な温度（３５−４５）Ｃで準備する；ＰＢＳ中で、水性インスリン製剤（１ｍｇ／ｍｌ）を水槽に入れて温度を平衡させる；等モル量のコレステリルラウレート及びコレステリルミリステート（それぞれ７５ｍｇ）を秤量し、丸底フラスコに入れる；有機溶媒（ジエチルエーテル）を添加してエステルを溶解する；手動でかき混ぜて溶解する；丸底フラスコをロータリーエバポレーターに位置させ、５分間回転する；ロータリーエバポレーターに取り付けられたフラスコを水槽に位置させる；真空とし、１０分間回転する；ロータリーエバポレーター及び真空を止め、水を丸底フラスコに添加する；Ｔｗｅｅｎを添加する；水槽で２０分間、ロータリーエバポレーター（真空は作用しない）を回転する；濁った製剤が形成されるまで、１０〜３０分間超音波処理を行い、最小固体をフラスコから見つけ出す；超音波処理から分離し、真空ろ過を用いてろ過する；濁ったろ過液を取る；ろ過液を押し出す；使用するまで製剤を冷蔵庫に保管する。
【０２２４】
図１７  トレンスウェルでのＣａｃｏ−２の研究；カイロミクロンの形成
細孔径が０．４μｍである１２ウェルフォーマットのＣｏｒｎｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓを採用した。Ｃａｃｏ２細胞が７５ｃｍフラスコで８０〜９０％融合した後、各トレンスウェル実験を開始した。細胞を通常通りトリプシン処理し、血球計算器を用いて計数した。細胞の濃度は、培養培地ｍＬ当たり２×１０5細胞に調整した。トレンスウェルプレートのウェルに０．５ｍＬの細胞希釈物を播種した。体積１．５ｍｌの培地を基底側に添加した。細胞を上記のように培養し、培地は、１９〜２０日間一日おきに替えた。その時、Ｃａｃｏ２細胞は分化して、処理に備えるようになる。トレンスウェルプレートの上端及び下端チャンバ由来の全ての培地を除去して、２つのチャンバを１ｍｇ／ｍＬのグルコースを含むＰＢＳ（ＰＢＳＧ）で３回洗浄した。ＰＢＳＧをプレートの上端及び下端チャンバに添加し、１時間、培養を行った。全てのＰＢＳＧを２つのチャンバから除去し、グルコースを添加したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳＧ）１．５ｍＬを下端チャンバに添加した。
【０２２５】
上端チャンバには、０．５ｍＬの適切な処理（ＰＢＳＧ単独、ＰＢＳＧ中のＦＩＴＣコレストソーム、又はＰＢＳＧ中のＦＩＴＣ−インスリンコレストソーム）を受けた。いずれのウェルにおいても、グルコースは１．０ｍｇ／ｍＬの最終濃度で存在した。次いで、プレートを２時間、培養した。全ての溶液を除去し、ＺｅｉｓｓコンフォーカルＬＳＭ５１０顕微鏡上で観察した。
【０２２６】
図１８は、ＦＩＴＣ標識インスリン（すなわち、コレストソーム中にいない）に対する暴露後、１時間目のトレンスウェルプレードの頂点側画像である。
【０２２７】
図１９で、基底液をコンフォーカル顕微鏡上で画像を取った。上記の場合、頂端側には単にＰＢＳ緩衝液及び培地のみがあった（ＦＩＴＣなし、インスリンなし、コレストソームなし）。蛍光は見られず、上記画像は後続基底側画像に対する画像背景を提供する。
【０２２８】
図２０において、画像は、２時間、頂端側に適用された後続ＦＩＴＣコレストソームであり、これは、基底液にＦＩＴＣを含む小型カイロミクロンを見せている。上記液体は、基底液収集後の画像を提供し、全体製剤全般の顕微鏡観察を反映しないという点に注意することが重要である。したがって、これらのカイロミクロンは、明らかにＣａｃｏ２細胞により形成される。
【０２２９】
図２１において、画像は、２時間、頂端側に適用された後続ＦＩＴＣインスリンコレストソームであり、これは、基底液にＦＩＴＣ−インスリンを含む、全体的により大きなカイロミクロンを見せている。上記液体は、基底液収集後の画像を提供し、全体製剤全般の顕微鏡観察を反映しないという点に注意することが重要である。したがって、これらのＦＩＴＣインスリン含有カイロミクロンは、明らかにＣａｃｏ２細胞により形成された。
【０２３０】
コレストソームインスリン製剤特性の概要
バッチ：７３３及び蓄えたバッチ
ＤＬＬＳ粒子寸法１７００ｎｍ未押出
ＤＬＬＳ粒子寸法：押出後１４９〜２７４ｎｍ
百分率収率：脂質出発量の１３．０％
ゼータ電位：−２４．７
積載の比率：積載重量対レギュラーインスリンに対する重量は、１３％インスリン対８７％コレステリルミリステート及びコレステリルラウレートの和。
【０２３１】
細胞：ＭＣＦ−７：融合的製剤で２４時間目にｎ＝４００、０００細胞；寸法は２０００ｎｍである。
コレストソーム単独：２４時間にわたって成長又は生存力に有効性なし
ＦＩＴＣ単独：２４時間にわたって成長又は生存力に有効性なし
インスリン単独：１．５ｍｌ体積の３ｍｃｇ／ｍｌ；（４．５ｍｃｇ）２４時間、有効性なし
ＦＩＴＣインスリン単独：４６６ｍｃｇ／ｍｌ  ２４時間にわたって成長又は生存力に有効性なし（図２２参照）
ＦＩＴＣインスリンコレストソーム：０．４６ｍｃｇ／ｍｌ；２４時間にわたって成長又は生存力に有効性なし
インスリン吸収は、２時間ぶりに開始（図２２参照）
ＦＩＴＣインスリンコレストソームカイロミクロン：占有された全ての細胞膜で２時間目に細胞質内に遊離されたインスリンを大量吸収。
【０２３２】
細胞：Ｃａｃｏ−２
濃度頂端側：Ｐｒｅ：頂点上に３５０μｌの０．４６ｍｃｇ／ｍｌコレストソーム溶液
ＦＩＴＣコレストソーム単独：２４時間にわたってＣａｃｏ−２細胞に何らの影響力なし；カイロミクロンは、図２０のように形成される
ＦＩＴＣインスリン単独：２４時間にわたってＣａｃｏ−２細胞上に何らの影響力なし；図１８のように、基底側上にはカイロミクロンが形成されない
ＦＩＴＣ単独：２４時間、Ｃａｃｏ−２細胞上に何らの影響力なし；基底側上にはカイロミクロンなし（図１９）
インスリンコレストソーム：遊離されたインスリンとともに０．４６ｍｃｇ／ｍｌ−全てのコレストソームが、基底側にカイロミクロンで移動される。（図２１）
ＦＩＴＣインスリンコレストソームで形成されたカイロミクロン：インスリン濃度０．４６ｍｃｇ／ｍｌ以下。（図２２）
【０２３３】
図２２：ＦＩＴＣインスリンコレストソームカイロミクロン
図２２．ＭＣＦ−７細胞でのＦＩＴＣ−インスリン暴露のための本来の出発濃度は４６６ｍｃｇ／ｍｌであるが、これは、Ａ列においてＭＣＦ−７細胞の内部で測定可能な量のＦＩＴＣインスリンを提供していない。その下方にある２つの図（Ｂ及びＣ例）において、ＦＩＴＣインスリンコレストソームの濃度は０．４６ｍｃｇ／ｍｌであったが、これは、最後の２つの図にまとめた実験に対して同一である。ＦＩＴＣインスリンコレストソーム由来の０．４６ｍｃｇ／ｍｌ（Ｂ列）は、コレストソームのないＦＩＴＣインスリンの４６６ｍｃｇ／ｍｌ（Ａ列）とほぼ同一の細胞内蛍光を提供する。コレストソームのない、４６６ｍｃｇ／ｍｌのＦＩＴＣインスリン（Ａ列）と比べるとき、Ｃａｃｏ−２細胞によるＦＩＴＣインスリンコレストソームのカイロミクロンへの更なる加工は、ＦＩＴＣインスリンコレストソーム−カイロミクロン由来の細胞内部のインスリンの量において（Ｃ列）、ＦＩＴＣ−インスリンのみの量より１０００倍大きく、確固たる改善を提供しており、Ｃａｃｏ−２細胞により加工されない場合の０．４６ｍｃｇ／ｍｌのインスリンの有効性より遥かに大きい。Ｃａｃｏ２細胞を通過する量が、頂端側に投与されるインスリンの全部であると仮定すれば、ＦＩＴＣインスリンコレストソームカイロミクロンのＣ列でのインスリン濃度は、中央列であるＢ列でのインスリン濃度と同一である。これらの特定の製剤には遊離されたインスリンが残っており、Ｃａｃｏ−２細胞を通り過ぎる移動が１００％未満である場合、これらの細胞内の積載の比率はより大きい。明らかに、ＦＩＴＣインスリンコレストソーム−カイロミクロンは、細胞内部により大きな積載を達成し、ＦＩＴＣコレストソーム単独で先に示したように、再びコレストソーム単独により、ペプチドが細胞膜を通って細胞に入るようにするということを証明する。下端のＣ列での画像は、観察された細胞内部でのＦＩＴＣインスリンコレストソームカイロミクロンの浸透を反映する。本画像において、細胞膜がＦＩＴＣインスリンを劇的により大きく濃縮するだけでなく、これらの細胞の細胞質にはＦＩＴＣインスリンが積載される。これは単に２時間の暴露後であるため、カイロミクロンがより大量で積載するだけでなく、それ自体でコレストソームより更に速く積載するということを立証する。
【０２３４】
図２５  ＦＩＴＣインスリンコレストソームキロミクロン積載ＭＣＦ−７細胞
カプセル化されたＦＩＴＣ−インスリンを含むコレストソームを、市販のＦＩＴＣ標識されたレギュラーインスリンを用いて、本願に開示されたように調製した。Ｃａｃｏ−２細胞は、コレストソームが完全なインスリンを腸細胞を通じて移動させ（すなわち、インスリンがコレストソーム内に滞留）、キロミクロンに入り込んだ後、キロミクロンがＣａｃｏ−２膜の基底側で検出されるようにするために用いられた。ＥＬＩＳＡを用いて、酸保護されたインスリンが頂点Ｃａｃｏ−２障壁を通過せず（＜５％）、基底側上の全てのインスリンがキロミクロン内に存在することを証明した。ＦＩＴＣ−インスリンを頂端側で用いて、インスリン単独では腸細胞障壁を通過しないが、コレストソーム内のＦＩＴＣインスリンはＣａｃｏ２腸細胞障壁を通過するということを明らかにした。そのような実験から、吸収効率は、インスリンの基底側及び頂端側内容物の間の差で決定された。追加の実験は、コレストソームのカプセル化インスリン上の変更されたｐＨ及び胆汁塩の有効性を比較した。更に、コレストソームに積載されたインスリン含有時のキロミクロンの安定性を定量し、生体内の積載されたコレストソームからのインスリンの放出に必要な条件を調査した。
【０２３５】
図２５において、ＦＩＴＣインスリンコレストソームが積載されたキロミクロンをＭＣＦ−７細胞に近接して位置させて、細胞への吸収を証明した。これらの細胞は、コレストソームに容易に取り込まれ、細胞内の分布が一様であるものと示された。
【０２３６】
この実験において、ＭＣＦ−７細胞のＦＩＴＣインスリンコレストソームキロミクロンの積載は、ＦＩＴＣインスリンコレストソームを用いた本出願人の先行技術実験のうち、一部を凌いで改善されており、ここで、積載は、ＦＩＴＣインスリンコレストソームキロミクロンよりも１０００倍更に大きい。いずれの場合においても、Ｃａｃｏ−２細胞によるＦＩＴＣインスリンコレストソームのキロミクロンへの加工は、ＦＩＴＣインスリンコレストソーム−キロミクロンに比べて、インスリン内部細胞の量において確固たる改善を提供する（Ｂ列）。この画像において、細胞膜がＦＩＴＣインスリンを劇的により大きく濃縮するだけでなく、これらの細胞の細胞質にＦＩＴＣインスリンが積載される。これは、単に２時間の暴露後であることから、キロミクロンが大量でより多く積載するだけではなく、これら自体でコレストソームよりも更に迅速に積載するという点を立証した。
【０２３７】
これらの特定の製剤を、４匹のマウスに投与した。
【０２３８】
図２６．４匹のマウスに提供したＦＩＴＣインスリンコレストソーム
Ｃａｃｏ−２細胞及びＭＣＦ−７細胞での試験管内研究の完了後、コレストソームインスリン製剤をマウスに投与することができ、ＥＬＩＳＡは、インスリンの吸収及びカイロミクロンからの放出を決定し、それを生体内コレストソーム中の循環するインスリンの生物学的滞留を定義する手段で用いられる。
【０２３９】
マウスにおいて血糖を測定し、製剤投与後、マウスモデルでインスリンの有効性を定義する。
【０２４０】
図２６はそれぞれ、ＦＩＴＣ−インスリン−コレストソームを経口的に提供した４匹のマウスの血糖を、血糖計を用いて血糖測定を行った。マウスは、いずれも当該過程をよく耐えた。４匹の動物の中、３匹において、経口投与後３０〜３４分まで血糖降下が後続した。４番目の動物において、血糖の降下は２時間後開始したが、類似の減少及び回復時間を有した。全ての場合、グルコースは、迅速にベースラインに戻った。
【０２４１】
全体的に、そのようなデータは、経口的インスリン吸収及び血糖に対する全身的有効性、マウスのモデルにおけるコレストソーム製剤に対する概念の立証を提供する。
【０２４２】
実施例５．コレストソームのカプセル化抗癌剤
癌治療における小型及び大型分子の利用は、しばしば細胞内部の標的部位に到逹するために横断しなければならない障壁により制限される。本発明者及び専門家は、全ての類型の癌治療手段として、細胞膜障壁を横断して小型及び大型分子を送達する手段を探している。
【０２４３】
したがって、抗癌剤の経口的吸収を促進し、細胞プロセスとの分子相互作用の細胞内経路に寄与し得るコレストソームの利用は、下記列挙される殆どの分子が、細胞内送達の問題点、経口吸収の問題点、又はこの２つの両方を共に有しているので、大きな関心の対象である。
【０２４４】
本願では、内生的に形成されたカイロミクロンを用いた坑癌分子の経口的送達及び細胞内積載の好ましい実施形態を記載する。ほとんどの場合、本実施例で開示される列記された抗癌剤は、タンパク質、遺伝子物質等ではない。それらは小型分子と考えられ、小型分子が一般的に本願に記載されたカプセル化及び経口的吸収及び細胞内吸収の原則に従うので癌に対して活性である小型分子の群の選択は限定的である、と考えられるべきではない。いずれの場合においても、本発明が属した分野の当業者は、本発明の重要な特徴が、完全な形態である分子の信頼性のある経口的吸収及び細胞内送達であり、同等な代案的実施形態があることを理解するはずである。それぞれの代表的な場合において、分子は、実施例１及び実施例２で開示された方法でカプセル化され、実施例３における抗生剤に対して定義された類似のモデル及びプロセスを用いて開発及び試験される。そのような方法は限定でなく、その実施例で提供された代表的分子のうち一部の物理的特性は、従来の実施例の範囲外の経路を定義することができる。したがって、それらは本発明の精神を保持する。
【０２４５】
コレストソームのカプセル化に好ましい抗癌剤
代表的抗癌剤分子には、以下のものが含まれる：５−アザシチジン；アリトレチノイン；アルトレタミン；アザチオプリン；アミホスチン；アムサクリン；アナグレリド；アスパラギナーゼ；Ｎ−（ホスホニル）Ｌ−アスパラギン酸；ベキサロテン（タルグレチン）；ブレオマイシン；ブリオスタチン；ブスルファン；カペシタビン；カンプトセシン；カルボプラチン；カルムスチン；カルボプロスト（カルボプロストトロメタミン）；カルグルミン酸；カルモフール；クロラムブシル；クラドリビン；クロファラビン；クロファジミン；コルヒチン；クルクミン；二フッ素化クルクミン（ＣＤＦ）；シクロホスファミド；シタラビン；シトシンアラビノシド；Ｄ−アミノレブリン酸；ダカルバジン；ダウノルビシン／ダウノマイシン；デフェラシロクス；デニロイキンジフチトクス（Ｏｎｔａｋ）；ドセタキセル／タキソテール；ドキシフルリジン；ドキソルビシン／アドリアマイシン；エフロルニチン；エピルビシン；エレファントピン；エストラムスチン；リン酸エトポシド；フルダラビン；フルオロウラシル；フルオロオロチン酸；ホテムスチン；ゲムシタビン；グスペリムス；ヒドロキシカルバミド；水酸化尿素；イダルビシン／４−デメトキダウノルビシン；イホスファミド；インカドロネート；イリノテカン；ペグイリノテカン；ラパチニブ／ラパチニブジトシレート；ロムスチン；マソプロコール；メルファランＨｃｌ；メルカプトプリン；メトトレキサート（アメトプテリン）；メチルアミノレブリン酸；ミトマイシン；ミトタン；ミトキサントロン；塩酸ニムスチン；オキタデシルホスホコリン；オルマプラチン；オキサリプラチン；パクリタキセル；ペグアスパラギナーゼ；ペメトレキセド；ペントスタチン／デオキシコホルマイシン；ポルフィマーナトリウム；プロカルバジン；プロテインキナーゼＣ抑制剤；ラルチトレキセド；フェニル酪酸塩ナトリウム；スタウロスポリン；ストレプトゾシン；タフルポシド；テモゾロマイド；テニポシド；チオグアニン；チオテパ；サイモポエチン；チオグアニン；トムデックス；トポテカン；トレチノイン；トロピセトロン塩酸塩；ウラムスチン（ウラシルマスタード）；バルルビシン；ベルテポルフィン；ビンブラスチン；ビンクリスチン；ビンデシン；ビノレルビン；ボリノスタット。
【０２４６】
二フッ素化クルクミン（ＣＤＦ）の実施例
本願に開示された分子を説明する好ましい実施形態は、ＣＤＦとも称されるクルクミン、二フッ素化クルクミンである。ＣＤＦの有益な坑癌特性は、当業界でよく説明されている（１６、８５〜９２）。ＣＤＦの作用中の１つは、ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２であるが、これは、細胞生存、増殖及び癌幹細胞（ＣＳＣ）機能の中心的な後成的調節者である。ＥＺＨ２の発現は、非常に攻撃的な膵臓癌を含む多様なヒト癌で増加されているが、その生物学的有効性に内在した機序は未だあまり理解されていない実情である。著者は、抗酸化特性を保有したウコン香辛構成成分の新規類似体である二フッ素化クルクミン（ＣＤＦ）を用いて、膵臓癌でのＥＺＨ２機能を調査した。ＣＤＦは、ヒト膵臓癌細胞において膵臓癌細胞の生存、増殖性細胞、パンクレアトスフィアー（ｐａｎｃｒｅａｔｏｓｐｈｅｒｅｓ）形成、侵略性細胞移動及びＣＳＣ機能を減少させる。そのような有効性は、膵臓癌で一般的に消失されるｌｅｔ−７ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１４６ａ、ａｎｄｍｉＲ−２００ｂ、ｃを含めた腫瘍抑制性のｍｉｃｒｏＲＮＡｓ（ｍｉＲＮＡ）のパネルの発現増加と関連している。機序の研究は、ｍｉＲ−１０１の再発現が、ＥＺＨ２及びプロ侵略的（ｐｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ）細胞の表面接着分子ＥｐＣＡＭの発現制限に十分であるということを明らかにした。ヒト膵臓癌の同素異種移植モデルにおけるＣＤＦの投与は、ＥＺＨ２、Ｎｏｔｃｈ−１、ＣＤ４４、ＥｐＣＡＭ及びＮａｎｏｇの減少された発現、及びｌｅｔ−７、ｍｉＲ−２６ａ及びｍｉＲ−１０１の増加した発現に関連のある方式で腫瘍の成長を抑制する。取り合わせると、その結果は、ＣＤＦが後成的に制御される遺伝子発現のためのＥＺＨ２−ｍｉＲＮＡ調節回路を標的ちすることで、膵臓癌腫瘍の成長及び悪性を抑制することを示唆する。（８９）
【０２４７】
コレストソームのカプセル化ＣＤＦは、実施例１の過程による試験のために調製されることができる。ＦＩＴＣ標識されたＣＤＦは、生物学的分配を評価するために利用されており、上記言及された後成的経路は、ｃａｃｏ２細胞を通じた通過前、そしてその後にＣＤＦコレストソームに暴露時、集められたカイロミクロンが細胞信号伝逹経路実験に用いられる時に研究した。
【０２４８】
試験管内及び細胞分配実験の結論によると、ＣＤＦコレストソームは、カプセル化されていないＣＤＦを対照として用いて、濃度及び投与量対生物活性を定義するために細胞内暴露及び作用評価用マウスモデルに適用することができる。経口及びＩＶ投与がともに生物学的利用能のみならず、細胞吸収及び偏在化を定義するために行われた。第二の好ましい実施形態はドキソルビシンであり、それ自体がよくリポソーム薬物送達システムに組みこまれて癌治療に広範囲に用いられる分子である。
【０２４９】
実施例６．モノクローナル抗体の代表であるベバシズマブ
本願には、モノクローナル抗体、遺伝子物質等を含むペプチド、タンパク質を含む巨大分子の経口的送達の好ましい実施形態が記載されている。それらは、６ｋｄを超え、最も頻繁には１００ｋｄを超える分子量を有した、考慮される大型生物学的分子であり、生物分子が一般的に本願に記載されたカプセル化及び経口的吸収及び細胞内吸収の原則に従うことから、疾患に対抗して活性である大型生物分子群の選択は、本発明を特定の疾患又は治療にのみ限定するものと考えられるべきでない。いずれの場合においても、本発明が属した分野の当業者は、同等な代案的実施形態があり、本発明の重要な特徴がタンパク質治療剤分野においてヒト患者での疾病治療のための完全な形態の生物分子の信頼性のある経口的吸収及び細胞内送達であることが理解できるはずである。モノクローナル抗体のベバシズマブ及びトラスツズマブは、カプセル化のための主な分子であるが、これらは限定と考えられるべきでなく、実際に、類似した長さ、電荷及び分子量を有した大部分のモノクローナル抗体は、本願に記載されたコレストソームのカプセル化と関連して類似に挙動するものである。
【０２５０】
コレストソーム中のベバシズマブ
本願に開示された分子を説明する好ましい実施形態は、実施例１で説明した原理によってコレストソームのカプセル化されたベバシズマブを調製及び試験するためにそのリストから選択されたベバシズマブである。細胞表面受容体受容体標的部位の標的化のための経口的使用及び細胞内送達及び対応するＩＶ使用のための特定の製剤を設計した。
【０２５１】
具体的な例示により、平均直径が２５０〜１０、０００ｎｍであるベバシズマブコレストソームを、実施例２において好ましいものと開示されたエステルからコレステリルエステルを選択し、実施例１に記載されたような本発明の方法で調製することができる。ベバシズマブを含むコレストソームを、２種類のコレステリルエステルの新規なブレンドを用いて調製した。
【０２５２】
ナノ粒子のようなベバシズマブの代案的製剤が、Ｗｏｊｔｉｓｋｉの文献（６）に開示されたように調製されることができる。そのようなナノ粒子は、Ｃａｃｏ−２実験のためにコーティングされるアルブミンであり、コーティングが、それらの特定のナノ粒子製剤においてインスリンの吸収を改善させるため、最大の吸収能力を期待することができる。
【０２５３】
ベバシズマブコレストソームを用いた積載及び細胞吸収
製剤タンパク質ベバシズマブを、コレストソームへの取り込み前に、実施例１に記載された方式と同様にＦＩＴＣで標識した。
【０２５４】
重量対重量基準でベバシズマムを積載したコレストソームは、２５０〜１０、０００ｎｍの寸法範囲の粒子で約２０％であった。
【０２５５】
全ての製剤は、インスリンに対して本発明の発明者が開示したように、コンフォーカル顕微鏡、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）及びトレンスウェル実験を用いて試験した。
【０２５６】
ベバシズマブコレストソーム試験のためのＣａｃｏ−２細胞
トレンスウェル実験に用いられるＣａｃｏ−２細胞は、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン及び１００ｍｃｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭ１−グルタミン、１％不必須アミノ酸及び１０％加熱不活性化ウシ胎児血清を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ≡ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）で、５％Ｃ０２／９５％Ｏ２の雰囲気及び９０％相対湿度下、３７℃で培養した。Ｃａｃｏ−２細胞は、吸収性の両極化された単層を形成し、頂点フラシ形境界を発生させて、２１日間の培養後、酵素を分泌する。
【０２５７】
顕微鏡観察に加え、経上皮電気抵抗（ｔｒａｎｓ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を、上皮ボルトオームメータを用いて、トランス−ウェル拡散セルの１ｃｍ2ポリカーボネートフィルタ上で成長する細胞を通じて測定し、て密着結合を評価した。
【０２５８】
カプセル化されたＦＩＴＣ−ベバシズマブを含むコレストソームを、市販されるＦＩＴＣ標識ベバシズマブを用いて、本願に開示されたように調製した。Ｃａｃｏ−２細胞を用いてコレストソームが完全なベバシズマブを腸細胞を通じて移動させ（すなわち、ベバシズマブがコレストソーム内に滞留）、カイロミクロンに入り込んだ後、カイロミクロンをＣａｃｏ２膜の基底側で検出できるようにした。ＦＩＴＣ−ベバシズマブ製剤の蛍光読取を用いて、頂点Ｃａｃｏ−２障壁を通過せず（＜５％）、コレストソーム内のカプセル化された頂端側に位置した大部分のＦＩＴＣ−ベバシズマブが、ＦＩＴＣ−ベバシズマブ−コレストソームを含むカイロミクロンで、基底側に実質的に移動されるということを立証した。
【０２５９】
蛍光読取に基づくと、Ｃａｃｏ−２腸細胞障壁の頂端側に添加された７５％のＦＩＴＣ−ベバシズマブ−コレストソームが、Ｃａｃｏ２腸細胞障壁を通過する。そのような実験から、吸収効率は、ＦＩＴＣ−ベバシズマブ−コレストソームの基底側及び頂端側含有量の間の差として決定される。２４時間目の実験終了時、蛍光読取値の全部の合計がＦＩＴＣ−ベバシズマブ−コレストソームの蛍光出発量となり、実験自体で質量均衡を果たした。
【０２６０】
ベバシズマブコレストソーム及びベバシズマブコレストソームカイロミクロンに対するＭＣＦ−７細胞実験
ＭＣＦ−７細胞は、図５、２２及び２３で各構築物に対する全ての対照実験に示されたように、コレストソームを容易に取る。それ以外は、本願に提示しなかった。上記は蛍光画像であるため、上記画像中のコレストソームの唯一の内容物は、コレストソームでカプセル化されたＦＩＴＣに由来する。コレストソームによって積載した細胞膜の輪郭及びその後画像から、細胞全体的に、そして更にはその核を含むＦＩＴＣ標識の均一な分布に注意されたい。
【０２６１】
ＭＣＦ−７細胞は、試験管内試験に適用する時、約１．０ｍｃｇ／ｍｌのＩＣ５０値を有し、ベバシズマブに対して相対的に抵抗性である。もちろんその薬物は、細胞増殖抑制剤として間接的に機能するが、これは、ＶＥＧＦを遮断し、成長中の腫瘍に対する血管供給を減らす総体的な有効性である。
【０２６２】
全く上記言及された試験管内耐性に基づいて予測するが、ＭＣＦ−７細胞は、１００ｍｇの投与量が癌治療条件下のヒトに提供される時の典型的頂点よりも約１０倍更に高い濃度である１７３ｍｃｇ／ｍｌの外部濃度で、ＦＩＴＣ−ベバシズマブの吸収を示さない。そのようなデータは、図２７の一部分である。
【０２６３】
次いで、そのような同一のＭＣＦ−７細胞を、実施例１の方法によってミリステート及びラウレートコレステリルエステルを用いて調製したＦＩＴＣ−ベバシズマブコレストソームに曝した。そのようなコレストソームは、寸法が約５０００〜１０、０００ｎｍであり、ＭＣＦ−７細胞は、寸法が約１５、０００ｎｍであった。これらのＭＣＦ−７細胞の暗視野及び蛍光画像をいずれも２４時間撮影して、図２８に示す。そのような細胞は、ベバシズマブコレストソームを測定可能に吸収せず、ＦＩＴＣ−ベバシズマブ分布は、細胞内で均一なものと示された。ＭＣＦ−７細胞は、その実験において２４時間可視的に残っており、これは、ＦＩＴＣベバシズマブ−コレストソームが、そのような細胞上のベバシズマブの作用を増加させないことを示唆する。
【０２６４】
次いで、ベバシズマブ−ＦＩＴＣ−コレストソームの同一の製剤をＣａｃｏ−２細胞に暴露させ、結果として得られたカイロミクロン含有ＦＩＴＣ−ベバシズマブ−コレストソームを、２４時間の暴露後にトレンスウェル基底側から集めた。このような実験において、ベバシズマブ−ＦＩＴＣ−コレストソームの７５％がＣａｃｏ−２障壁を通過し、結果として得られたカイロミクロンに取り込まれた。
【０２６５】
コレストソームの７５％はカイロミクロンの内部にあるため、ＭＣＦ−７細胞は、先に示したコレストソーム製剤におけるベバシズマブの濃縮と類似したベバシズマブ濃縮に暴露される。興味深いことに、ＭＣＦ−７細胞への吸収は、コレストソーム単独から送達されるか、ＭＣＦ−７細胞を遊離したベバシズマブに単に暴露する時よりも、カイロミクロンがＦＩＴＣ−ベバシズマブ−コレストソームの細胞内送達に用いられる時に劇的により多いという点である。
【０２６６】
更には、カイロミクロン送達ＦＩＴＣベバシズマブに暴露されるＭＣＦ−７細胞は、暴露後、４時間ほどの短い時間、非可視性である。これは、ベバシズマブの作用機序に対する公知の細胞毒性構成成分がないため、非常に注目すべきことである。今まで、そのモノクローナル抗体は、ＶＥＧＦに間接的に作用して血管成長を制御する細胞分裂抑制機序を有している。また、ベバシズマブは細胞に入り込むことができないため、細胞内送達由来の迅速な細胞毒性経路の予想しない発見は、そのような古いタンパク質に対する新規製品及び新規経路を創り出す。
【０２６７】
ベバシズマブ製剤特性
製造日：２０１３年８月３日
ＤＬＬＳ粒子寸法１０、５１０ｎｍ；未押出
百分率収率脂質出発量の２０％
ゼータ電位：ベバシズマブに対しては未実施。トラスツズマブ：６．４
細胞：ＭＣＦ−７；融合性製剤中で２４時間目に４００、０００個の細胞。ＭＣＦ−７細胞。寸法は２０００ｎｍ
コレストソームだけ単独であるＭＣＦ−７細胞；２４時間にわたって成長に有効性なし
ＦＩＴＣ単独：２４時間にわたって成長に有効性なし
ベバシズマブ単独：試験しない
ＦＩＴＣベバシズマブ単独；１７３ｍｃｇ／ｍｌまで：２４時間にわたって成長に有効性なし
（図２７）
ＦＩＴＣベバシズマブコレストソーム：約２０ｍｃｇ／ｍｌ；細胞によりよく容認される；２時間目に可視的な細胞内吸収を開始。
Ｃａｃｏ−２細胞由来のＦＩＴＣベバシズマブコレストソームカイロミクロン：視野にある全ての細胞が完全に死滅する４時間のＭＣＦ−７細胞上で１５ｍｃｇ／ｍｌ。（図２８）
【０２６８】
図２７．ＭＣＦ−７細胞上のＦＩＴＣベバシズマブ
図２７は、１７３ｍｃｇ／ｍｌの標的濃度のＦＩＴＣベバシズマブをＭＣＦ−７細胞に適用後の２時間、４時間及び２４時間目の暗視野（上端の熱）及び蛍光画像を示す。その濃度は、ベバシズマブ処理患者において一般的に観察されるより５〜１０倍より大きい。ＦＩＴＣベバシズマブがそのようなＭＣＦ−７細胞の細胞膜と統合されるという証拠はない。ＭＣＦ−７細胞による任意の時点におけるＦＩＴＣベバシズマブの任意の蛍光吸収の証拠はなく、そのようなＭＣＦ−７細胞上にＦＩＴＣ−ベバシズマブの有効性の証拠もない。
【０２６９】
図２８  ＦＩＴＣベバシズマブコレストソームカイロミクロンがＭＣＦ−７細胞を死滅させる
図２８．本実験において、ＦＩＴＣベバシズマブコレストソームを調製し、ＭＣＦ−７細胞に対して試験した、２時間目には有効性がなく、細胞は、ＦＩＴＣベバシズマブコレストソームの吸収を示さなかった。次いで、これらの同一のＦＩＴＣベバシズマブコレストソームをＣａｃｏ−２細胞の頂端側に位置させ、結果として得られたＦＩＴＣベバシズマブコレストソームカイロミクロンをＭＣＦ−７細胞上で試験した。下端列の第一番目のフレームは、ＦＩＴＣベバシズマブコレストソームカイロミクロンの大量吸収を示し、他の集中的に観察された有効性は、ＭＣＦ−７細胞の迅速な細胞死滅であるが、それらが実験４時間になるまで全部死滅されたからである。
【０２７０】
代表的なモノクローナル抗体及び巨大タンパク質
本発明の利用による経口用又は細胞内部での改善された作用のための代表的な巨大分子は、以下に挙げられたもののいずれか１つ又はそれらの組合せを含むことができ、本願に挙げられた化合物の開示後に発見された類似した寸法及び電荷の分子を含む：アダリムマブ（ヒュミラ）；アブシキシマブ；アレムツズマブ；ベバシズマブ（アバスチン）；バピニューズマブ；セツキシマブ；エタナーセプト（エムブレル）；エロツズマブ；ゲムツズマブ；イノツズマブ；Ｉｓｉｓ−Ｇｅｎｚｙｍｅ社のＫｙｎａｍｒｏTMミポメルセン；マブセラ／リツキシマブ；ナタリズマブ、Ｅｌａｎ／Ｂｉｏｇｅｎ社のタイサブリ；Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ社のネシツムマブ；パリビズマブ（シナジス）；パニツムマブ；ＬＤＬコレステロール降下のためのＲＮ３１６（Ｐｆｉｚｅｒ社の抗ＰＣＳＫ９）、ＲＥＧＮ７２７（ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ社の抗ＰＣＳＫ９）；ソラネズマブ；トラスツズマブ（ハーセプチン）；トシツモマブ；Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社の抗体薬物複合体であるＴ−ＤＭｌ、これはトラスツズマブ（ハーセプチン）、ＤＭ１（エムタンシン）及びＤＭ１をトラスツズマブに連結するリンカーからなる；Ｔ−ＤＭｌは、ＨＥＲ２信号伝逹を標的化して阻害し、ＤＭ１をＨＥＲ２−陽性癌細胞内部に直接送達するために設計される；ＢＲＡＦＶ６００突然変異陽性転移性黒色腫に対するＺｅｌｂｏｒａｆ（登録商標）；アトロリムマブ；ベリムマブ；ブロダルマブ；カルルマブ；デュピマルマブ；フレソリムマブ；ゴリムマブ；レルデリムマブ；リリルルマブ（Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ）；ブリリムマブ；メテリムマブ；モロリムマブ；ナミルマブ；オキセルマブ；プラクルマブ；サリルマブ（Ｓａｒｉｌｕｍａｂ）；シファリムマブ；タバルマブ（Ｔａｂａｌｕｍａｂ）；イピリムマブ；トレメリムマブ；ニボルマブ；ウレルマブ；ベルチリムマブ；ザノリムマブ；アフェリモマブ；エルシリモマブ；ファラリモマブ；ガビリモマブ；イノリモマブ；マスリモマブ；ネレリモマブ；オズリモマブ；テリモマブ；ベパリモマブ；ゾリモマバリトキス；バシリキシマブ；クレノリキシマブ；ガリキシマブ；ゴミリキシマブ；インフリキシマブ（Ｊａｎｓｓｅｎ社のレミケード）；ケリキシマブ；ルミリキシマブ；プリリキシマブ；テネリキシマブ；バパリキシマブ；アセリズマブ；アポリズマブ；ベンラリズマブ（Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ）；セデリズマブ；セルトリズマブペゴール；ダクリズマブ；エクリズマブ；エファリズマブ；エプラツズマブ；エルリズマブ；エトロリズマブ（Ｅｔｒｏｌｉｚｕｍａｂ）；ホントリズマブ；イトリズマブ；ラムパリズマブ（Ｌａｍｐａｌｉｚｕｍａｂ）；リゲリズマブ（Ｌｉｇｅｌｉｚｕｍａｂ）；メポリズマブ；モガムリズマブ（Ｍｏｇａｍｕｌｉｚｕｍａｂ）；ナタリズマブ；オクレリズマブ；オファツムマブ；オマリズマブ；オゾラリズマブ（Ｏｚｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）；パスコリズマブ；パテクリズマブ（Ｐａｔｅｃｌｉｚｕｍａｂ）；ペキセリズマブ；ピジリズマブ（Ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）；レスリズマブ；ロンタリズマブ；ロベリズマブ；ルプリズマブ；クィリズマブ（Ｑｕｉｌｉｚｕｍａｂ）；サマリズマブ（Ｓａｍａｌｉｚｕｍａｂ）；シプリズマブ；タリズマブ；テ��リズマブ；トシリズマブ；トラリズマブ；ツレガリズマブ（Ｔｒｅｇａｌｉｚｕｍａｂ）；ヴァテリズマブ（Ｖａｔｅｌｉｚｕｍａｂ）；ベドリズマブ；ビシリズマブ；イバリズマブ；オテリキシズマブ；ブリアキヌマブ；カナキヌマブ；フェザキヌマブ；セクキヌマブ（Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ）；シルクマブ（Ｓｉｒｕｋｕｍａｂ）；ツラロキヌマブ（Ｔｒａｌｏｋｉｎｕｍａｂ）；ウステキヌマブ；アンルキヌズマブ（Ａｎｒｕｋｉｎｚｕｍａｂ）；クラザキズマブ（Ｃｌａｚａｋｉｚｕｍａｂ）；エノキズマブ（Ｅｎｏｋｉｚｕｍａｂ）；ゲヴォキズマブ（Ｇｅｖｏｋｉｚｕｍａｂ）；イクセキズマブ（Ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ）；レブリキズマブ；オロキズマブ（Ｏｌｏｋｉｚｕｍａｂ）；ペラキズマブ（Ｐｅｒａｋｉｚｕｍａｂ）；チルドラキズマブ（Ｔｉｌｄｒａｋｉｚｕｍａｂ）；ベシレソマブ；ファノレソマブ；レマレソマブ；スレソマブ。
【０２７１】
実施例７  経口用汎用脂質抑制組合せ：ブレーキ（Ｂｒａｋｅ）及びスタチンを有したＰＣＳＫ−９に対する抗体
本願に開示された分子中の好ましい実施形態は、ＰＣＳＫ−９に対するモノクローナル抗体であり、ＲＥＧＮ７２７とも公知されたアリロクマブである。ＰＣＳＫ−９に対する代案的なモノクローナル抗体には、非限定的な例示としてエボロクマブ又はボコシズマブが含まれる。
【０２７２】
アリロクマブが、実施例１で列挙した原則によるＰＣＳＫ−９に対するコレストソームのカプセル化抗体の調製及び試験のために上記リストから選択される。ＰＣＳＫ−９が、上記化合物に対する抗体に対する細胞内標的という知識及び確信下で、特定の製剤を経口用及び細胞内送達用に設計した。
【０２７３】
特定の実施例の手段で、平均直径が２５０〜１０、０００ｎｍであるアリロクマブコレストソームが、実施例２において好ましいものと開示されたエステルから選択されたコレステリルエステルを用いて、実施例１に記載されたような本発明の方法で調製されることができる。アリロクマブを含むコレストソームは、２種類のコレステリルエステルの新規ブレンドを用いて調製される。
【０２７４】
高脂血症治療ではコレステロールを抑制することが必要であるが、これは、ＨＤＬを上昇させ、ＬＤＬを低下させるという臨床的ガイドラインで定義されるとおりであり、更に血漿中性脂肪の水準を低下させることが必要である。本実施例で開示される経口併用製品は、ただ高脂血症の全局面の完全抑制の利用可能な手段であり、加えて、これはＰＣＳＫ−９モノクローナル抗体治療の全ての構成員の主な短所である２週間毎の皮下注射の必要性を終息させるだろう。ＰＣＳＫ−９モノクローナル抗体の経口投与は、そのような新規な治療形態の患者収容を顕著に改善させる。
【０２７５】
併用製品のＰＣＳＫ−９モノクローナル抗体の構成成分
実施例で開示された治療有益のタンパク質に特異的なＰＣＳＫ９に対するモノクローナル抗体の経口用製剤は、強力な方式で上昇されたＬＤＬ及び経口用コレストソームのカプセル化のために選択されたタンパク質を制御する。
本願に開示された分子を説明する好ましい実施形態は、実施例１で説明された原則によるコレストソームのカプセル化の調製及び試験のための該リストから選択される、当業界においてアリロクマブとも公知されたＲＥＧＮ７２７である。治療時に毎月約１００ｍｇを服用する経口使用のための特定の製剤が設計された。
具体例として、平均直径が２５０〜４５０ｎｍであるＲＥＧＮ７２７積載されたコレストソームが、実施例１に記載されたような本発明の方法で調製されることができる。ＲＥＧＮ７２７を含むコレストソームは、２種類のコレステリルエステルの新規なブレンドを用いて調製される。そのような構築物は、用いられたより少ないＬＤＬコレステロールであろう。その構築物は、スタチン系薬剤と併用して提供されるものであり、任意では、回腸ブレーキホルモン放出物質と併用して提供される。
【０２７６】
併用製品のスタチン構成成分
ＨＤＬコレステロールを上昇させ、全てコレステロールを低下させるために、経口的ＲＥＧＮ７２７が即時放出スタチン系薬剤とともに剤形化される。経口的ＰＣＳＫ−９処理との併用に適したスタチンのリストは、以下のものを含む：ロバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、シムバスタチン、プラバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン。例示として、１０ｍｇ投与量のアトルバスタチンが好ましいが、全て単にフィルム−コーティングのみを必要条件とする即時放出性であるため、大部分の利用可能なスタチン分子が適合であることから、本発明は、アトルバスタチンのみに限定されない。
【０２７７】
ＰＣＳＫ−９併用製品のブレーキ構成成分
中性脂肪を低下させるために、ＲＥＧＮ７２７及びスタチンの製剤が任意では、その全体内容及び全体製剤が本願に参考文献として含まれるＵＳ２０１１／０２６８７９５に開示された回腸ブレーキホルモン放出物質の約１０グラムと併用される。この製剤は、活性回腸ブレーキホルモン放出物質を対象の回腸から放出し、上昇された中性脂肪濃度を完全に制御する。本発明の発明者の研究結果、回腸に直接送達するＡｐｈｏｅｌｉｎｅ  ＢｒａｋｅTMを用いた回腸ホルモンの慢性的な毎日刺激が身体恒常性を安定化して維持する傾向があるだけなく、断食状態でインスリン、グルコース、トリグリセリド及び測定される肝酵素の全ての異常な水準を減らすことを示す。また、アルファ−ペトタンパク質での有意な減少が、肝の炎症を減少させるものと見られる。インスリン耐性、中性脂肪及び肝での炎症の減少及び肝酵素の減少の組合せが、肝健康における有意な改善を示し、それらのホルモンが肝細胞再生及び肝健康維持において活動するように役割を示唆する。そのような有益な特性をスタチン及びＰＣＳＫ９モノクローナル抗体と組み合わせることは、高脂血症の原因であり、結果的に粥状硬化性血管疾患を誘発するメタボリックシンドロームを抑制する、新規且つ総合的な接近法を患者に提供する。
そのような構成成分に起因する併用製品は、１日１回基準で高脂血症のある患者に投与され、結局、最小限の副作用で高脂血症を完全に抑制する結果をもたらす。
【０２７８】
実施例８．ｓｉＲＮＡ送達のためのコレストソーム及びカイロミクロンの利用
遺伝子物質
古典的遺伝学において、有性生殖有機体（一般的に真核生物類）では、生殖細胞が体細胞染色体の半分を有しており、ゲノムは、染色体の全体集合である。生殖細胞において遺伝子物質が半分となることは、減数分裂の間、相同染色体の分離によって行われる。完全又は半数体染色体から誘導される任意の物質が、遺伝子物質である。
【０２７９】
用語ゲノムは、具体的に完全なセットの核ＤＮＡ（すなわち、「核ゲノム」）上に貯蔵されたものを意味するのに適用され得るが、また「ミトコンドリアゲノム」又は「葉緑体ゲノム」のように、それら自体のＤＮＡを含む細胞巣機関内に貯蔵されるものに適用されてもよい。更に、ゲノムは、ウイルス、プラスミド、及び転移性構成員のような非染色体遺伝子構成員を含んでいてもよい。
【０２８０】
ＲＮＡの機能を変更するＲＮＡ及び短鎖のＲＮＡ干渉又は挿入がまた、コレストソームへのカプセル化を目的とし、標的細胞内部部位に遺伝子物質を送達しようとする目的で考慮される遺伝子物質である。
【０２８１】
例示として、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）属のＲＮＡウイルスであるＣ型肝炎治療のための併用接近法を開示する。そのような属の構成員は、陽性極性であり、長さが９．６〜１２．３キロベースである単粒型、線形、一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。フラビウイルス科の５’−末端は、メチル化されたヌクレオチドキャップを保有し、そのようなファミリの他の構成員にはキャップがなく、内部リボゾーム進入部位をエンコードする。ウイルス粒子は被覆されており、直径が約４０〜６０ｎｍの球形である。そのような属中、６０種を超えるウイルスが疾病を誘発するものと公知されているが、本出願人は、ヘパシウイルス（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）属（Ｃ型肝炎ウイルス類）に集中しようとする。
【０２８２】
Ｃ型肝炎ウイルスは、普通観察される脂質粒子に隠れており、個体の間でそれの生涯周期、侵入又は通行を妨害しようとする場合、そのような隠れた部位でウイルスを追跡する必要があると示されるので、コレストソーム治療のための特におもしろい標的である。
【０２８３】
後者として言及した目標は、Ｃ型肝炎感染治療に有用な本出願人の特定の構築物の調製を誘導する。
【０２８４】
本願に開示された分子を説明する好ましい実施形態は、当業界にミラビルセン（Ｍｉｒａｖｉｒｓｅｎ）と公知されたｍｉＲ−１２２である。非限定的な例示として、Ｃ型肝炎ウイルス及びその他のウイルスに対する代案的遺伝子構築物は細胞内部位に、かつ更にＣ型肝炎ウイルスを庇護するものと公知されたカイロミクロン残渣のようなその他の循環脂質粒子への接近を得る新規手段を必要とする以上、各ウイルスに対する代案的治療法に用いることができる。
【０２８５】
ｍｉＲ−１２２は、実施例１で説明した原則によってＣ型肝炎ウイルスを標的とするコレストソームのカプセル化遺伝子物質の調製及び試験のために選択された。Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞が、このウイルスに対する遺伝子改変戦略のための必須の細胞内標的であるという知識及び確信に基づいて、特定の製剤が経口用及び細胞内送達のために設計された。最適の送達には至らなくとしても、患者にｍｉＲ−１２２構築物を非経口的で提供する治療に対するＣ型肝炎ウイルス感染の有効な応答の臨床的証拠がある。そのような結果は、下記において提示される。
【０２８６】
特定の実施例として、平均直径が２５０〜１０、０００ｎｍであるｍｉＲ−１２２コレストソームが、実施例２において好ましいものと開示されたエステルから選択されるコレステリルエステルを用いて、実施例１に記載されたように本発明の方法で調製されることができる。コレストソーム含有ｍｉＲ−１２２は、２種類のコレステリルエステルの新規なブレンドを用いて調製される。
【０２８７】
コレストソーム中のＨｅｐＣに対するｍｉＲ−１２２
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の安定性及び増殖は、ＨＣＶゲノム及び肝発現ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１２２（ｍｉＲ−１２２）の間の機能−相互作用に依存する。ＭｉｃｒｏＲＮＡは、遺伝子発現を転写的に、そして転写後に改質するヒトゲノムによってエンコードされる小型非コーディングＲＮＡである。ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１２２（ｍｉＲ−１２２）は肝で支配的なｍｉｃｒｏＲＮＡを形成し、肝細胞で独歩的に発現される。これは、脂質代謝、細胞分化、鉄代謝及び肝で生物学的周期の調節を含む多様な異なるプロセスに連関されている。ＨＣＶの５０個の未翻訳領域（ＵＴＲ）が遺伝子型の間で高度に保存性であり、２個のｍｉＲ−１２２結合部位を含んでいるが、これの混乱は、ＨＣＶ複製を遮断する。
【０２８８】
ミラビルセン（Ｍｉｒａｖｉｒｓｅｎ）は、高度に安定したヘテロ二本鎖で成熟型ｍｉＲ−１２２を隔離してその機能を抑制する、挿入された核酸−改質ＤＮＡホスホロチオネートアンチ−センスオリゴヌクレオチドである。ｍｉＲ−１２２に相補的な１５ヌクレオシド長のオリゴヌクレオチドであって、ミラビルセンは、ｍｉＲ−１２２と安定したヘテロ二本鎖を形成することができる。ウイルス生涯周期に必須的な脂質経路混乱を通じて間接的に又はその他の機序を通じて、ミラビルセンが利用可能なｍｉＲ−１２２の隔離を通じて、その抗ウイルス有効性を優勢に発揮できるか否かは、活発な研究中である。
【０２８９】
慢性ＨＣＶ感染に対するその効能は、唯一の自然ＨＣＶ動物モデルであるチンパンジーにおける研究で始めて示された。５ｍｇ／ｋｇである最高投与量を、毎週の注入を通じて提供受けたチンパンジーは、血漿及び肝ＨＣＶＲＮＡで明らかな減少があり、これは、ミラビルセンの臨床的な試験を誘導した。Ｊａｎｓｓｅｎ及び同僚は、ＨＣＶ遺伝子型１で慢性的に感染されたナイーブ非肝硬変患者の治療での２ａ相の研究から観察した事実を報告した。これらは、３つの異なる投与量のミラビルセン（３、５又は７ｍｇ／ｋｇ）又はプラシーボを、５回毎週皮下注射する群とランダムに分類した３６人の患者を扱った。これらは、ＨＣＶ  ＲＮＡがミラビルセンの全５回の投与後、５ｍｇ／ｋｇの群で患者１人（１１％）及び７ｍｇ／ｋｇの群で患者４人（４４％）が検出不可のＨＣＶ  ＲＮＡ水準に到逹し、投与量に依存する減少を見せるという点を見出した。特に、著者が提示した個別応答性曲線は、ひいては最高投与量でも相当可変的であった。患者の中で３人は、ＨＣＶ  ＲＮＡが４〜５週の経過後、検出不可となり、１人の患者は、ＰｅｇｌＦＮ／ＲＢＶを用いて治療を持続した。研究第１４週目に検出不可ＨＣＶ  ＲＮＡを達成した残りの患者及び第１８週間にも検出不可に残った長期間の成果は報告しなかった。ミラビルセン投与と関連するものと思われる注射部位反応だけがある不利なイベントは、一般的に軽微であった。
【０２９０】
ミラビルセンに対するＨＣＶ患者の弱くて可変的な応答性に関する最も説得力のある説明は、ミラビルセンの不規則な細胞吸収である。これは、細胞標的到達失敗がアンチセンス治療を商業化しようとするほとんどの試みを煩雑にさせるという点で、驚くべきものでもない。劣悪な細胞内浸透は、ｍｉＲ−１２２製剤の投与量が７ｍｇ／ｋｇであるもっともらしい理由である。コレストソームを用いた構築物の有効な細胞内送達は、有効投与量を１０〜１００倍更に低い値に下げることができる。追加に、非経口用で現在採用されるものよりも更に低い全般的投与量の経口的使用の長所があるようになる。
【０２９１】
コレストソーム製剤は、現在のミラビルセン構築物のために作られ、良好に得られた製剤の起こりそうな結果は、有効な細胞内送達によるＨＣＶウイルス積載に対する劇的に改善された作用と考えられる。更に、コレストソーム製剤は経口的に用いられるはずであるが、これは、皮下注射を凌ぐ多大な改善点である。コレストソーム−ｍｉＲ−１２２の経口的吸収の独特の特徴は、コレストソーム−ｍｉＲ−１２２の細胞内送達で補完されるものであるが、これは、製品がより低い投与量でも有効となるようにする。そのようなナノ粒子は、カイロミクロン積載を通じて細胞に入り込み、一応内部では、Ｃ型肝炎ウイルスを沈黙させる。
【０２９２】
ｍｉＲ−１２２アンチセンス技術を成功的に商品化するためには、多数の開発作業が行われなければならない。コレストソームのカプセル化ｍｉＲ−１２２を用いた経口用治療の影響力は、その構築物の更に改善されたバージョンを提供する一方、経口用製剤は、ソホスブビル（Ｓｏｖａｌｄｉ）のような抗ＨＣＶ薬物とともに投与される公算が大きく、そのような組合せは、ＨＣＶ感染治療に用いるために請求される。
【０２９３】
その上、抗ＨＣＶ薬物治療が、高脂血症と関わって実施例７で更に説明するように、伴われるメタボリックシンドロームの侵犯を管理し、原則的にそのような患者の肝を収復して再生するためにブレーキ製剤（Ｂｒａｋｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）の付随的使用により改善される追加の可能性がある。
【０２９４】
Ｃ型肝炎に対する併用療法におけるブレーキの使用と関連して、そのような製剤及び戦略の詳細な事項は、本願に参考文献として含まれる２０１３年５月２日に公開されたＷＯ２０１３／０６３５２７、２０１２年９月７日に公開されたＷＯ／２０１２−１１８７１２Ａ２、及びＵＳ２０１２０２６５６１に記載されている。
【０２９５】
したがって、全ての類型の患者においてＨＣＶの管理のために開示された理想的な組合せ物は、経口用ブレーキと組み合わされ、経口用ソホスブビルと併用する経口用コレストソーム−ｍｉＲ−１２２である。
【０２９６】
ＨＣＶに対する経口用ワクチンの例示が実施例９に示されており、上記ワクチンは、本実施例で定義したものと同一のＨＣＶ患者に提供することができる。
【０２９７】
ＨＩＶウイルス感染治療での遺伝子編集
ヒトゲノムに部位−特異的改質を提供（又は「編集」）する能力は、遺伝子の認識が遺伝の基本的な単位であるため、医薬において目標となって来た。ゲノム編集の挑戦課題は、ＤＮＡ分子内に特異地点で一本一二本−破断を生成する能力である。メガヌクレアーゼを含む多数の薬物、ＤＮＡ三重本を形成するオリゴヌクレオチド及びペプチド核酸を試験した事があり、非効率性によって制限されるものと現われた。他のクラスの試薬であるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ゲノム編集に多芸多才なものと示され、ＺＦＮの利用は、現在多数のモデル有機体で、またヒト細胞で広く確立されている。
【０２９８】
ＺＦＮは、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）のＤＮＡ認識特異性を制限酵素ＦｏｋＩ（ヌクレアーゼ）の切断ドメインの確固であるものの節度のある酵素活性と組み合わせるため、遺伝工学用としては適格である。ＺＦＰは、ＤＮＡ−結合特異性を提供するが、それぞれのＤＮＡの約３塩基対を認識するＣｙｓ２Ｈｉｓ２ジンクフィンガーのタンデムアレイを含む。それに比べて、バクテリア類型ＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼ、Ｆｏｋｌは配列特異性を持たず、ＤＮＡを切断するためには必ずしも二量体化しなければならない。ＺＦＮ−媒介二本鎖の切断後、ＤＮＡは、同種組換え又は非同種末端結合によって修復され得る。同種組換えは、本来ＤＮＡ配列を保存しつつ、損傷されたものを修理する。しかし、そのような細胞は、ＺＦＮによって再切断されやすい。対照的に、非同種性末端結合は、破断部位においてヌクレオシドのランダム挿入又は欠失をもたらすことができ、１次ＤＮＡ配列の永久的混乱を提供するようになる。したがって、非同種性末端結合は特異的遺伝子を突然変異化し、その機能的ノックアウト誘導に活用される。
【０２９９】
ヒトケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５遺伝子（ＣＣＲ５）内部で標的部位に結合する２個の４−フィンガータンパク質からなるＺＦＮ対の設計が先行技術において報告された。全ての臨床試験で、ＣＣＲ５−修飾ＣＤ４Ｔ細胞が増殖され、ミトゲンに対する応答で正常的に機能したが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染から保護され、ＨＩＶ感染のヒト化されたマウスモデル（異種機関移植が伴われる）でＨＩＶ  ＲＮＡの水準を減少させた。
【０３００】
Ｔｅｂａｓ及び同僚は、ＣＣＲ５を選別したが、これは幾つかの理由でＨＩＶ進入のための補助受容体をエンコードする。まず、その混乱は、ＣＤ４Ｔ細胞の生存を増加させるものと思われ；ＣＣＲ５で３２−ｂｐ欠失（デルタ３２／デルタ３２）に対してホモ接合性である個人は、ＨＩＶ感染に対して抵抗的であった。試験管内で、そのような個人由来のＣＤ４Ｔ細胞は、ＨＩＶのＣＣＲ５−使用菌株を用いた感染に非常に抵抗的であるが、上記菌株は、生体内で優性の菌株である。更に、ＣＣＲ５デルタ３２に対してヘテロ接合性であり、ＨＩＶ感染を有した個人は後天性免疫不全症侯群に対してより遅い進行を提供する。更に、小型−分子阻害剤を用いたＣＣＲ５の遮断又は阻害の有効性がヒトにおいて示された。最終的に、ＣＣＲ５−デルタ２欠失に対してホモ接合性である肝細胞を用いた同種異系移植の提供を受けた個人は、血液、骨髓及び直臓粘膜でＨＩＶ  ＲＮＡ及びプロウイルスＤＮＡ街検出不であり、４年超えて抗ウイルス治療を利用しないようになった。そのような過程と連関された明らかな治癒を専担する機序が確立されなければならないものとして残ってはいるが、後天的なＣＣＲ５欠乏が１つの可能性である。Ｔｅｂａｓは、現在、標的化された遺伝子混乱（すなわち、ＺＦＮによるＣＣＲ５で改質された自己由来ＣＤ４Ｔ細胞の仕込み）後、ＨＩＶ感染に対する後天的遺伝子抵抗性の部分的誘導を報告した。
【０３０１】
そのような場合、ＺＦＮは、アデノウイルスベクターと関連して提供されており、細胞は、形質感染前、身体から除去された。本発明者の作業で、細胞内部でのＺＦＮの機能集中でそのような欠陷を克服することは、コレストソーム製剤で可能である。
【０３０２】
特定の例示として、平均直径が２５０〜１０、０００ｎｍであるコレストソームでＣＣＲ５に対して活性であるＺＦＮ構築物は、実施例２において好ましいものと開示されたエステルから選択されたコレステリルエステルを用いて、実施例１に記載されたような本発明の方法で調製されることができる。コレストソーム含有ＺＦＮは、腸細胞によって取られ、カイロミクロン上に蓄積されるように選択された２種類のコレステリルエステルの新規なブレンドを用いて調製される。
【０３０３】
このようなリストは、疾病改善及び治療に用いる一定の範囲の分子寸法でコレストソーム製剤中の遺伝子物質ポリヌクレオチドの例示として提供され、全ての寸法の分子のカプセル化のためのコレストソームの適用時、そして公知されるか、又は新規な疾病の治療のための使用時に制限がない。
【０３０４】
実施例９．細胞内部で隠れるウイルス感染の経口ワクチン接種のためのコレストソーム及びそれ由来のカイロミクロンの使用
Ｃ型肝炎ウイルスの伝染生活周期
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、アポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）及びＥ（ａｐｏＥ）と相互作用して感染性リポウイルス性粒子を形成する。ｐｅｇ−インターフェロンに対する応答は、インターフェロン−刺激遺伝子（ＩＳＧｓ）及びＩＬ２８Ｂ遺伝子型によって影響を受ける。ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）がまた、インターフェロン応答性を予測する。
【０３０５】
肝炎ワクチンは、脂質粒子中に隠れるウイルスであるＣ型肝炎ウイルスの場合、アジュバント及びｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを含むことができる。実施例８由来の適したアンチセンス治療の例示は、ｍｉＲ−１２２である。ｍｉＲ−１２２が免疫系由来の応答性を解明しない点が留意すべきであり、実際、Ｃ型肝炎も免疫系由来の応答性を解明しない点も留意すべきである。これは、除去し難い理由でもある。
【０３０６】
有効なＣ型肝炎ワクチン
有効なＣ型肝炎ワクチンは、脂質経路を通過してウイルスに追っていかなければならず、細胞及びたぶん脂質粒子自体中のその存在の免疫学的認識を提供する。したがって、送達のために、ワクチン構築物をカイロミクロンに位置させる経口的で吸収されるコレストソーム製剤は、ワクチン接種に対する新規な接近法である。
【０３０７】
ウイルスを追って全ての身体細胞に入り込むワクチンはなく、したがって、Ｃ型肝炎ウイルス構築物のコレストソーム−カイロミクロン送達への適応は、有機体に対して直接的に慢性感染の生涯周期を用いる最初になるのである。伴われるアジュバントの利用がまた選択的であるが、経口用コレストソームＣ型肝炎ワクチン構築物の必須的な構成成分になるものである。そのようなワクチンは、十二指腸で経口的に吸収される。
【０３０８】
アジュバントの存在又は不在下のコレストソーム中の経口用ワクチン
アジュバントが存在する経口用コレストソームのカプセル化ワクチンのその同一の接近法が、Ｔ−リンパ球に隠れるＨＩＶ、神経組織に隠れる帯状ヘルペス、及び肝炎ウイルスと類似した特性を有するその他のフラビウイルス構築物を含むウイルスが、身体細胞に隠れるその他の慢性ウイルス感染に用いることができる。
【０３０９】
回腸のパイエル板樹状細胞に経口的にアジュバントとともにＣ型肝炎ワクチンを送達することが、第二番目の好ましい実施形態であり、このために、ＷＯ２０１３／１４８２５８  Ｍａｒｃｈ  １０、２０１３年３月１０日にＷＯ２０１３／１４８２５８で公開されたＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３１４８３に完全開示されたような本出願人の回腸ワクチン放出技術が採用されるものである。上記開示されたワクチンは、コレストソーム製剤ではなく、実際に、本出願人は回腸に送達するＣ型肝炎ワクチン構築物が経口的に吸収されるとは予想しておらず、効能のための必須條件とも考えていない点に留意しなければならない。
【０３１０】
したがって、そのような開示された例示における新規の併用製品に対する潜在性があり、ここで、その一ワクチン構成成分は、身体の脂質経路に侵透し、ウイルス複製ステップ（及び薬物との併用時、Ｃ型肝炎ウイルスを直接殺傷する）を改質するコレストソームベースのものであり、二番目の回腸標的化ワクチンは、Ｔ−リンパ球が樹状細胞で機能しているパイエル板において樹状Ｔ−リンパ球での応答性を触発させる。
【０３１１】
ブレーキ（Ｂｒａｋｅ）とともにそのようなＣ型肝炎ワクチンの利用は、脂肪肝疾患及び早期肝硬変の修復を必要とする場合に選択されるものであり、これは、Ｃ型肝炎感染のある患者に最大の有益を与える。ブレーキ治療は実施例７で開示されており、本願にはコレストソームによって送達され、樹状細胞上の作用のために回腸に送達するＣ型肝炎ワクチンと組み合わせて含まれる。そのような製品はまた、ソホスブビルのような抗ウイルス化合物とともに用いられて、ウイルス負荷を軽減することができる。
【０３１２】
実施例１０．傷の治癒、感染及び炎症のためのタンパク質の局所送達及び化粧品の局所送達のためのコレストソームの使用
本発明において、感染性疾患の治療のためにＩＶ注射により用いられる分子が、一般的にコレストソームへのカプセル化に好適であり、軟膏又はクリームとして局所的に用いられる。
【０３１３】
実施例３で開示された大部分の抗生剤は、分子が一般的に親水性であり、他に経口的に吸収することができないので、静脈内注射（ＩＶ）をする必要がある。したがって、コレストソームでの使用は、外部表皮へのその吸収が可能となるようにする。抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗癌剤及び成長因子で用いられるタンパク質及びペプチドを含めて、多数のその他の小型及びより大きな大型分子がコレストソームに用いることができ、局所的に投与することができる。
【０３１４】
分子のコレストソームのカプセル化によって可能となる疾患治療用の多数の局所的用途がある。一部の非限定的な例示には、当分野において傷の治癒に有益なものと公知されたその他の成長因子を組み合わせて含む、局所血小板由来成長因子を用いた傷の治癒が含まれる。
【０３１５】
追加の例示は、現在、皮下注射によって提供されている、乾癬及びその他の皮膚炎症疾患に対して局所的に用いられるアダルリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）又はインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）又は多数のその他類似分子のような抗ＴＮＦ抗体の局所的使用である。ほぼ４．１百万の人口が２０１３年に軽度〜重度乾癬の所定の形態を有したと診断された。そのような数値は、２０２０年まで４．４百万と若干上昇するはずであり、その集団の中１．５百万が全身用剤で治療されるものと予測される。乾癬の全体有病率における上昇及び改善した診断法による診断率の増加が、注射可能なモノクローナル抗体に対する需要を増加させるだけでなく、そのような製品の中でより多いものが、局所的コレストソームに適用することが妥当であると示すものである。乾癬は、単純な皮腐病と言うより、生活の質及び障害と結びついた深刻な全身的疾患と徐々に認識されており、保健医療専門家は、コレストソームのカプセル化タンパク質及びペプチドを過去の次善の治療法より好ましいと見なすはずである。現在注射するワクチンの局所的投与はまたコレストソーム製剤によって促進されるものであり、その例示が実施例９に示され、本発明者の先行技術が本願に非限定的な例示として含まれる。
【０３１６】
そのような分子のいずれもがそのままの状態では経口的に吸収されず、各場合において、経口的吸収は、現在非経口でそれらを注入しなければならない必要性を乗り越える、主な長所を構成するものである。これらはまた、疾患の偏在された領域の治療に用いることができ、これにより注射によって全身的に提供される薬物の副作用を完全回避することができる。
【０３１７】
皮膚感染治療用トブラマイシン
本願に開示された分子を説明する好ましい実施形態は、実施例１で挙げられた原則によってコレストソームのカプセル化トブラマイシンの調製及び試験のための当該リストから選択されたトブラマイシンである。特定の製剤が経口的使用のために、またシュードモナスアエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のような標的グラム陰性バクテリアに対する抗生剤トブラマイシンの全般的作用を増加させるために設計された。局所用トブラマイシンの製剤は、シュードモナス疾患である悪性外耳炎を有効に抑制することができるか、又は嚢胞性繊維症のある患者でシュードモナス菌を有効に防除するために吸入することができる。
【０３１８】
具体例として、平均直径が２５０〜１、０００ｎｍであるトブラマイシンコレストソームは、実施例２において好ましいものと開示されたエステルから選択されるコレステリルエステルを用いて、実施例１に記載されたような本発明の方法で調製された。コレストソーム含有トブラマイシンは、コレステリルエステル、コレステリルミリステート及びコレステリルラウレートの新規ブレンドを用いて調製した。
【０３１９】
コレステリルエステルが皮膚送達を促進する
化粧品の適用で働くコレストソームのカプセル化分子の能力は、当分野で予想される発見である。
【０３２０】
主な脂質は、セラマイド、コレステロール及び遊離された脂肪酸である。角質層脂質マトリックスのそのような構成成分は、哺乳類の皮膚障壁機能において主な役割を遂行する。
【０３２１】
生体内及び試験管内角質層の浸透におけるコレステロールエステルの有効性は、Ｋｒａｖｃｈｅｎｋｏ及び同僚によってラット及びマウスで研究されており、リポソームのレシチンの流動性に対するコレステロールエステルの有効性は、蛍光測定法によって研究された。
【０３２２】
そのような研究は、そのような経皮送達システム（ＴＤＳ）へのコレステロールエステルの包含は、フェナゼパムの角質層への透過性を増加させることを示す。これらは、コレステリルラウリン酸塩、コレステリルペラルゴン酸塩、コレステリルウンデシル酸塩及びコレステリルカプロン酸塩の存在下の脂質環境の最大流動化を観察した。したがって、コレステロールエステルは、経皮送達のための有効な強化剤であることを見出し、本願に開示された現在の用途を誘導する。
【０３２３】
黒色腫に対するクルクミンの局所的使用
実施例５に開示されたような二フッ素化クルクミン（ＣＤＦ）のコレストソーム製剤がまた、皮膚癌の治療に局所的に用いることができる。
【０３２４】
Ｃｈｅｎによる２０１２年度のリポソーム及びクルクミンを用いた先行技術作業では、リポソームを経皮薬物送達システムに用いることによるクルクミンの試験管内皮膚浸透及び生体内抗腫瘍有効性を研究した。大豆リン脂質（ＳＰＣ）、卵黄リン脂質（ＥＰＣ）、及び水添された大豆リン脂質（ＨＳＰＣ）が、クルクミンがロードされたリポソームを成す異なる種のリン脂質製剤用として選択された：Ｃ−ＳＰＣ−Ｌ（クルクミンがロードされたＳＰＣリポソーム）、Ｃ−ＥＰＣ−Ｌ（クルクミンがロードされたＥＰＣリポソーム）、及びＣ−ＨＳＰＣ−Ｌ（クルクミンがロードされたＨＳＰＣリポソーム）。異なるリポソームの物理的特性を、次の通り調査した：光子相関分光法は、３つの類型のクルクミンがロードされたリポソームの平均粒子寸法をそれぞれ、８２．３７±２．１９ｎｍ（Ｃ−ＳＰＣ−Ｌ）、８３．１３±４．８９ｎｍ（Ｃ−ＥＰＣ−Ｌ）、及び９２．４２±４．５６ｎｍ（Ｃ−ＨＳＰＣ−Ｌ）であると明らかにした。カプセル化効率値（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖａｌｕｅ）は、それぞれ、８２．３２±３．９１％、８１．５９±２．３８％及び８０．７７±４．１２％であるものと示された。試験管内皮膚浸透研究は、Ｃ−ＳＰＣ−Ｌが最も著しく薬物浸透及び沈積を促進し、引き継いで、Ｃ−ＥＰＣ−Ｌ、Ｃ−ＨＳＰＣ−Ｌ及びクルクミン溶液の順であることを示した。更に、全てのロードされたリポソームの中でＣ−ＳＰＣ−Ｌが、Ｂ１６ＢＬ６黒色腫細胞の成長を抑制する最大能力を示した。したがって、Ｃ−ＳＰＣ−Ｌが追加の薬力学的評価用に選定された。抗黒色腫活性に対する有意な有益性は、生体内クルクミン溶液を用いた治療と比べてＣ−ＳＰＣ−Ｌを用いて観察した。その結果は、Ｃ−ＳＰＣ−Ｌが癌の治療においてクルクミンに対する有望な経皮担体であることを示唆する。
【０３２５】
このような二フッ素化クルクミンＣＤＦのコレストソーム製剤を用いた癌の局所治療の例示は、限定と考えられるべきではなく、実施例５で開示された任意の坑癌化合物が、コレストソームでのカプセル化によって局所的使用に適合するようになる。
【０３２６】
実施例１１．肺への局所送達のためのコレストソームの使用
本発明において、感染性疾患の治療のためにＩＶ注射によって用いられる分子が、一般的にコレストソームへのカプセル化に適合して、吸入用に用いられるが、ここで、コレストソームによる送達は、カプセル化された化合物の肺胞及び気管支内側を取り囲む細胞への浸透を強化するものと予測される。これは、細胞浸透を強化せず、より長い期間当該部位においてリポソームに化合物を担持しているだけの先行技術のリポソームの用途を凌ぐ、新規なものである。
【０３２７】
したがって、コレストソームのカプセル化ナノ粒子のエアゾル化によるそのような送達経路は合理的なものであって、喘息、ＣＯＰＤ、肺癌腫、嚢胞性繊維症、及びもっと珍しい疾患、例えば、アルファ−１アンチトリプシン欠乏のような肺疾患の治療において大きく効能を強化することができる。
【０３２８】
実施例３に開示された大部分の抗生剤は、分子が一般的に親水性であり、他に経口的に吸収されないため、静脈内注射（ＩＶ）されなければならない。したがって、吸入によるコレストソームでの使用は、本願に開示されたそれらの強化された細胞浸透機序を通じて、肺への直接吸収が可能となすようにする。本発明により、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗癌剤及び成長因子に用いられるタンパク質及びペプチドを含む多数のその他の小型及びより大きな分子がコレストソームに用いることができ、本発明により吸入によって投与される。
【０３２９】
分子のコレストソームのカプセル化によって可能となる疾患の治療に対する多数の肺疾患適応がある。一部の非限定的な例示には、当分野における傷の治癒に有益なものと公知されたその他の成長因子との組合せを含む、血小板誘導性成長因子を用いた肺胞に対するウイルス又は化学的熱傷の修復が含まれる。
そのような適用のためには、できるように１００ｎｍ未満の非常に小さなナノ粒子が、吸入器内のコレストソームのカプセル化分子の包含に必要であることに留意しなければならない。
【０３３０】
リポソームで用いられる化合物の一部の非限定的な例示が、コレストソームのカプセル化を通じた肺における改善した細胞内送達のためのコンセプト及びロードマップの証拠として示される。
【０３３１】
イロプロストの実施例：
Ｋｌｅｅｍａｎｎらの文献Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２００７：肺動脈高血圧（ＰＡＨ）は、重度の進行性疾患である。プロスタサイクリン類似体のイロプロストはＰＡＨに有効であるが、１日当たり６〜９回の吸入を必要とする。吸入頻度を減らす徐放型放出製剤を提供するリポソームの実現可能性を、技術的観点から評価した。
【０３３２】
ジ−パルミトイル−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロール（ＣＨ）及びポリエチレングリコール−ジ−パルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ−ＰＥＧ）からなるポソーム製剤を調製した。それらの物理化学的特性を動的光散乱、原子力顕微鏡及び示差走査熱量測定法を用いて研究した。３つの異なるネビュライザー（エアジェット、超音波および振動網）を用いたエアゾル化の間のリポソームの安定性は、薬物積載及びリポソーム寸法で噴霧化前及び噴霧化後に調査した。
【０３３３】
リン脂質の組成は、２００〜４００ｎｍの範囲で専らリポソームの直径に若干影響を与えた。最高のイロプロスト積載（１２ｍｃｇ／ｍｌ）及び十分なリポソーム安定性（噴霧化後７０％の薬物カプセル化）は、ＤＰＰＣ／ＣＨ（７０：３０モル比）リポソームに対して観察した。製剤の安定性は、相対的に高い相転移温度（摂氏５３度）及び未変更粒子の寸法によって立証された。ＤＰＰＥ−ＰＥＧのリポソーム（ＤＰＰＣ／ＣＨ／ＤＰＰＥ−ＰＥＧ、５０：４５：５モル比）への組み込みは、安定性減少（噴霧化後２０〜５０％の薬物カプセル化）及び摂氏３５度の相転移温度をもたらした。振動網ネブライザーは、小型エアゾル液滴、高い出力、及び全ての調査したリポソームに対する最低の有害な物理的影響を含んで、他のネブライザーを凌ぐ多数の有意な長所を示した。
【０３３４】
ＤＰＰＣ及びＣＨ構成成分を含むイロプロストがロードされたリポソームは、振動網ネブライザーによるエアゾル化に非常に適合した製剤を提供する。
【０３３５】
２００〜４００ｎｍ寸法のリポソームの使用は、成功的な商品開発用ではあまりにも大きいものである。
【０３３６】
サルブタモール
Ｅｌｈｉｓｓｉ  ＡＭらの文献、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００６；５８：８８７−９４．マルチラメラ及びオリゴラメラリポソームを、等張性塩化ナトリウム又はスクロース溶液の添加によるエタノール系大豆ホスファチジル−コリンプロリポソーム製剤から調製した。結果として得られるリポソームは、従来通り調製されたリポソームによっては１．２３％のみが捕獲されることに比べて、利用可能なサルブタモールサルフェートの６２％まで捕獲した。製剤は、エアジェットネブライザー（Ｐａｒｉ  ＬＣ  Ｐｌｕｓ）又は振動網ネブライザー（Ａｅｒｏｎｅｂ  Ｐｒｏ  ｓｍａｌｌ  ｍｅｓｈ、Ａｅｒｏｎｅｂ  Ｐｒｏ  ｌａｒｇｅ  ｍｅｓｈ、又はＯｍｒｏｎ  ＮＥ  Ｕ２２）を用いてエアゾル化した。ＡＨ振動網ネブライザーは、エアジェットネブライザーに比べてより大きな体積中間直径（ＶＭＤ）及びより狭い寸法分布を有したエアゾル液滴を提供した。リポソーム分散媒の選択は、Ｐａｒｉネブライザーの性能にほとんど影響がなかった。しかし、Ａｅｒｏｎｅｂ  Ｐｒｏ小型網及びＯｍｒｏｎ  ＮＥ  Ｕ２２に対しては、スクロース溶液の使用が液滴のＶＭＤを増加させ、ネブライザーからのエアゾル質量及びリン脂質出力を減少させる傾向があった。Ａｅｒｏｎｅｂ  Ｐｒｏ大型網に対しては、スクロース溶液が、ネブライザー提供の液滴のＶＭＤを増加し、リン脂質の出力を増加し、エアゾル質量出力に影響を与えなかった。Ｏｍｒｏｎ  ＮＥ  Ｕ２２ネブライザーは、製剤とは関係なく最高質量出力（約１００％）を提供し、送達速度は、スクロース−分散製剤と比較する時、ＮａＣｌ−分散リポソームに対して遥かにより高かった。噴霧化は、リポソーム由来の捕獲された薬物の相当な損失を提供し、これは、小胞寸法の減少を伴う。薬物損失は、ジェットネブライザーよりは振動網ネブライザーにおいてより少ない傾向がある。大型穿孔寸法網（８ｍｕｍ）Ａｅｒｏｎｅｂ  Ｐｒｏネブライザーは、ツイン集塵装置のより低いステップに送達される、捕獲された薬物の比率を増加させる。そのような研究は、プロリポソーム製剤から生成されたリポソームがエアジェット又は振動網ネブライザーを用いて、小型液滴にエアゾル化可能であることを立証した。ジェットネブライザーとは対照的に、振動網ネブライザーの性能は製剤に大きく依存する。採用されたネブライザーによって提供される高いリン脂質の出力は、エアジェット及び振動網ネブライザーが、いずれもリポソーム捕獲又は可溶化された疎水性薬物の気道への送達潜在性を提供できることを示唆する。
【０３３７】
吸入用コレストソーム製剤
１００ｎｍ以下のコレストソームへのカプセル化及びエアゾル送達によって用いられる標的化合物には、嚢胞性線維腫感染に対するトブラマイシン、肺癌腫に対する二フッ素化クルクミン、肺癌腫に対するｓｉＲＮＡ、ＭＲＳＡによって誘発される肺炎に対するバンコマイシン、グラム陰性肺炎に対するホスホマイシンが含まれる。
【０３３８】
好酸性喘息に対するメポリズマブ
臨床開発中に最近開発されたモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体の吸入されるコレストソーム製剤の追加の例示である。臨床試験中である、完全ヒト化されたＩｇＧｌＩＬ−５−特異的モノクローナル抗体であるメポリズマブは、高容量で吸入されるコルチコステロイド及び追加の制御剤薬物を用いては悪化減少を示さない、重度の好酸性喘息がある患者における臨床第２相ＩＩＩ期研究においてその１次的な終端点に符合した。二重盲検法併用群、多重中心、プラシーボ制御、無作為ＭＥＡｌ１５５８８研究において、１２歳以上の５７６人の患者に７５ｍｇの静脈内メポリズマブ又は１００ｍｇの皮下（ＳＣ）メポリズマブを合計３２週間の期間にかけて４株毎に提供した。７５−ｍｇ  ＩＶ処理部における患者の４７％及び１００−ｍｇ  ＳＣ処理部における患者の５３％が、研究中の悪化減少の１次終端点に符合した。ＭＥＡｌ１５５７５で公知されている、第２の二重盲検法併用群、多重中心、プラシーボ制御、無作為研究において、１２歳以上の１３５人の患者に１００ｍｇのＳＣメポリズマブを合計２４週間の期間にかけて４週毎に提供した。上記研究は、第２０〜２４週間喘息の抑制を維持しながら、経口用コルチコステロイド使用減少の１次的終端点に符合した。会社では、メポリズマブに対する規制承認の申し込みを計画しており、また、ＣＯＰＤ及び多発性脈管炎のある好酸性肉芽腫症でのメポリズマブの調査開発を続ける。
【０３３９】
明らかに、メポリズマブの吸入されるコレストソーム製剤は、その製品を皮下注射することに対する可視的代案であり、細胞内浸透は、現在１ヶ月に１回ずつ１００ｍｇである必要量よりも１０〜１００倍減少した投薬必要量を許容するものである。したがって、吸入用としてそのようなモノクローナル抗体の約５ｍｇのコレストソーム製剤を開発することは、１つの好ましい実施形態である。投薬必要量を減らすことに加え、吸入によるそのような製品の局所的使用は、それを必要とする患者において即刻応答を提供し、その後、好酸性免疫応答性、寄生虫による攻撃に対する宿主の保護に対抗する力強い抑制剤への全身暴露を有益に減少させる。
【０３４０】
このような列挙内容は、疾患治療の一般的な使用において、分子寸法の範囲にかけて公知された分子の吸入されるコレストソーム製剤の例示として提供され、全ての寸法の分子のカプセル化のためのコレストソームの適用及び肺疾患の吸入治療に使用する時に限定を与えるものではない。
【０３４１】
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【図１（１）】
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【図１（２）】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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