(57)【要約】      （修正有）【課題】筋萎縮を抑制できるペプチド等の提供。【解決手段】（１）ValHisLeuLeu、（２）AlaAsnProLeu、（３）AsnLeu、（４）AlaMet、（５）LeuHisPheSer、（６）GlnGlnThrHis、（７）HisValProGlu、（８）AlaValLeuSer、（９）ArgAspValLeu、（１０）ThrAspAsnLysValGlyMet、（１１）ThrMetGlnLys、（１２）HisValLeuAla、又は（１３）HisGlnGlyValMetのいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド、上記ペプチドを有効成分とする組成物、及び上記ペプチドを有効成分とする筋萎縮抑制用組成物の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
配列番号１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とする組成物。
【請求項３】
配列番号１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とする筋萎縮抑制用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋肉は、生体において重要な組織の一つであり、成人の筋肉量は体重の約４０％を占めるといわれている。しかし、加齢、運動不足、ギプス等による身体の固定といった様々な要因により筋肉量は減少しやすく、筋肉量の減少は、筋萎縮による運動能力の低下、ひいては日常生活における不都合を引き起こす。
【０００３】
生体内では、常に、筋タンパク質の合成と分解が生じており、筋タンパク質分解の亢進は、筋肉量の減少につながる。このため、筋タンパク質の分解を抑制することは、筋萎縮を抑制する上で重要である。
【０００４】
これまでに、例えば、アキノワスレグサ（Hemerocallis fulva var. sempervirens）が筋萎縮を改善する作用を有することが報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１５−１８９６８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、筋萎縮を抑制できるペプチド等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記課題に鑑み鋭意検討を行ったところ、特定のペプチドが筋萎縮を抑制できることを見いだした。本発明者らは、該知見に基づき更に検討を重ねた結果、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
本発明は、次に掲げるものを包含する。
項１．配列番号１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
項２．配列番号１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とする組成物。
項３．配列番号１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とする筋萎縮抑制用組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のペプチドによれば、筋萎縮を抑制することができる。また、本発明のペプチドを含有する組成物によれば、筋萎縮を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】各群における筋組織維持率を示す。
【図２】各群における筋組織維持率を示す。
【図３】各群におけるMuRF1の発現率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について、より詳細に説明する。
１．ペプチド
本発明は、配列番号１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。該ペプチドは、筋萎縮を抑制する作用を有する。
【００１２】
本発明のペプチドの入手手段は制限されず、例えば、従来公知の遺伝子工学的手法や化学合成法等によって作製することができる。一例として、本発明のペプチドは、配列番号１〜１３のいずれかで表されるペプチドをコードするポリヌクレオチドをベクター等に挿入し、該ベクター等が組み込まれた形質転換体を培養して所望のペプチドを取得することにより、作製することができる。また、本発明のペプチドは、該ペプチドをコードするアミノ酸配列を有する対象物を酵素処理等して、所望の断片を取得することにより作製することができる。また、本発明のペプチドは、配列番号１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列やこれをコードするヌクレオチド配列の情報に従って従来公知の化学合成法により合成して、作製することができる。化学合成法として、液相法や固相法によるペプチド合成法が包含される。当業者であれば、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列等の情報も、本発明のペプチドの配列等に基づいて、容易に入手、理解することができる。
【００１３】
本発明のペプチドは、筋萎縮抑制作用を有する限り、そのＮ末端、Ｃ末端、内部において適宜修飾されていてもよく、また、塩の形態であってもよい。
【００１４】
本発明のペプチドによれば、筋萎縮を抑制することができる。
【００１５】
筋肉は、大きく分けると骨格筋、平滑筋、心筋に分類できる。例えば、骨格筋は、加齢、運動不足、ギプス等による身体の固定、宇宙での無重力状態、寝たきり、疾患や怪我等による安静時の不活動、低栄養といった様々な要因により減少する傾向にあり、その減少は、筋萎縮による運動能力の低下、ひいては日常生活における不都合を引き起こす。本発明のペプチドによれば、筋肉の減少を抑制することができ、すなわち、筋萎縮を抑制することができる。
【００１６】
本発明において筋萎縮の抑制は、骨格筋重量、骨格筋中のAtrogin-1の発現量、骨格筋中のMuRF1(muscle RING finger 1)の発現量の少なくともいずれかにより評価される。Atrogin-1やMuRF1は、筋萎縮に関連する遺伝子であり、筋タンパク質の分解亢進や筋萎縮において、その発現量が増加することが従来知られている。このため、本発明のペプチドを用いて骨格筋重量の減少抑制、骨格筋中のAtrogin-1の発現量抑制、骨格筋中のMuRF1の発現量抑制の少なくともいずれかが認められれば、本発明のペプチドは筋萎縮抑制作用を有すると判断し、抑制の程度が高いほど筋萎縮抑制作用が高いと判断する。骨格筋重量、Atrogin-1やMuRF1の発現量、これらの増減の程度等は、本分野で従来公知の手法に従い決定すればよく、例えば後述の実施例に記載する手法を参考にして決定できる。
【００１７】
２．ペプチドを含有する組成物
本発明は、配列番号１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とする組成物を提供する。
【００１８】
配列番号１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、本発明のペプチドと称する場合がある）は、前述と同様に説明される。
【００１９】
本発明の組成物は、本発明のペプチドを有効成分として含有し、本発明のペプチドを１種単独で含有していてもよく、２種以上で含有していてもよい。
【００２０】
本発明の組成物は、本発明のペプチドのほか、必要に応じて薬学的に許容可能な成分、可食性の成分、飼料に使用可能な成分といった任意の成分を更に含有してもよい。    
【００２１】
本発明を制限するものではないが、任意の成分として、賦形剤、結合剤、崩壊剤、崩壊抑制剤、滑沢剤、安定剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、充填剤、溶剤（水、メタノール、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール等のアルコール類（無水、含水の別を問わない）、イソパラフィン等の炭化水素類等）、希釈剤、香料、着色料、矯味剤、懸濁剤、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、分散剤、緩衝剤、増量剤、増粘剤、界面活性剤、吸収促進剤、吸着剤、コーティング剤、皮膜形成剤、清涼剤、ゲル化剤、甘味料、抗炎症剤、各種栄養成分等が例示される。
【００２２】
任意の成分は、組成物の形態、適用対象、適用経路、症状の程度、期待される効果の程度等に応じて適宜決定すればよく、１種単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよく、その配合量も適宜決定すればよい。
【００２３】
本発明の組成物は、経口用、非経口用を問わず、その形態も制限されず、適用対象、適用経路等に応じて適宜設定すればよい。本発明の組成物の形態として、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤、注射剤等の液状形態、散剤、顆粒剤、細粒剤、錠剤（トローチ、チュアブル等を含む）、丸剤、カプセル剤（ハードカプセル、ソフトカプセルを含む）、ゲル状、クリーム状、ペースト状、ムース状、シート状、液状形態の凍結乾燥物等の半固形または固形形態等の各種形態が例示される。
【００２４】
また、例えば本発明の組成物が固形形態である場合、これは水等の液体と混合して使用してもよく、また、本発明の組成物は徐放性の剤形であってもよい。また、例えば錠剤は、必要に応じて、従来公知の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠、また、二重錠、多層錠とすることができる。
【００２５】
本発明の組成物の使用態様も制限されず、目的に応じて適宜設定すればよい。本発明の組成物の使用態様として、食品組成物（飲料を含む、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、サプリメント等を含む）、病者用食品を含む）、医薬組成物、飼料組成物、また、食品組成物、医薬組成物、飼料等への添加剤等が例示される。  
【００２６】
本発明の組成物は、前記形態、使用態様等における従来公知の通常の手順に従い製造すればよく、本発明のペプチドと、必要に応じて前記任意の成分とを混合等して製造すればよい。
【００２７】
本発明において、組成物の適用対象も制限されないが、ヒト、ヒト以外の哺乳動物等が例示される。
【００２８】
本発明の組成物の適用量は、本発明の効果が得られる限り制限されず、対象者（対象動物）の体格、年齢、症状、適用経路、適用形態、症状の程度、期待される効果の程度等に応じて適宜設定すればよい。本発明を制限するものではないが、本発明の組成物が経口組成物である場合、投与（摂取）量は、１日投与（摂取）量として、体重６０ｋｇの成人を基準として、本発明のペプチドを、好ましくは０．１〜５０００ｍｇ、より好ましくは０．５〜５０００ｍｇとなるように投与（摂取）することが例示される。本発明の組成物は、１日あたり単回投与（摂取）であってもよく複数回投与（摂取）であってもよい。
【００２９】
本発明の組成物中、本発明のペプチドの含有量は、本発明の効果が得られる限り制限されず、１日投与（摂取）量が好ましくは前記範囲となるように、また、前記範囲を参考にして、適宜設定すればよい。この限りにおいて制限されないが、本発明の組成物に配合される本発明のペプチドの含有量として、組成物中、好ましくは０．００１〜９９．９質量％、より好ましくは０．０９５〜９５質量％、更に好ましくは０．１〜９５質量％が例示される。
【００３０】
本発明の組成物によれば、筋肉量の減少を抑制することができる。このため、本発明の組成物によれば、筋萎縮を抑制することができる。本発明において筋萎縮の抑制は、骨格筋重量、骨格筋中のAtrogin-1の発現量、骨格筋中のMuRF1の発現量の少なくともいずれかにより評価され、これは前述と同様に説明される。
【００３１】
このことから、本発明は、配列番号１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とする筋萎縮抑制用組成物を提供するともいえる。
【００３２】
また、これらのことから、前述の本発明のペプチド、また、該ペプチドを含有する本発明の組成物は、加齢、運動不足、ギプス等による身体の固定、宇宙等での無重力状態、寝たきり、疾患や怪我等による安静時の不活動、低栄養といった様々な要因による筋萎縮の抑制に有用である。従って、本発明のペプチド、また、該ペプチドを含有する組成物は、例えば、サルコペニア（一次性、二次性）、身体運動にかかわる筋肉、骨、関節等の機能が衰えて寝たきりや要介護になったりその危険が高いロコモティブシンドローム（運動器症候群）等の抑制を目的として好ましく使用でき、特に、加齢性筋萎縮、廃用性筋萎縮等の抑制を目的として好ましく使用できる。また、本発明のペプチド、また、該ペプチドを含有する組成物は、例えば、加齢等による筋肉減少による動きの老化の抑制を目的として、シニア世代の就業の機会の維持を目的として、ゴルフ、テニス、ダンス等の筋力が必要な趣味の楽しみの維持を目的として、また、シニアアスリートの筋肉や筋力の維持を目的として好ましく使用できる。
【００３３】
また、このことから、本発明の本発明のペプチド、また、該ペプチドを含有する組成物は、例えば、筋肉の衰え、加齢、運動不足、疾患や怪我等による不活動、低栄養、身体能力の低下、無重力状態での活動、寝たきりや要介護、筋肉づくり、日々の健康維持、動きの若々しさの維持、ゴルフ、テニス、ダンス等の筋力の必要な趣味の楽しみの維持、シニアアスリートの筋肉、筋力低下等が気になる対象者（対象動物）に好ましく使用できる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３５】
試験例１．ペプチドの作製
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを合成した。配列番号２〜１３のそれぞれで表されるアミノ酸配列からなるペプチドも同様に合成した。
【００３６】
試験例２．筋萎縮抑制試験
２−１．試験及び評価手順
次の手順に従い、各ペプチドの筋萎縮抑制効果を評価した。
【００３７】
マウス筋芽細胞株C2C12（ATCC社製）を、10% FBS（ウシ胎児血清；fetal bovine serum）含有ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Wako社製）に接種し、炭酸ガスインキュベーター内（37℃）で培養した。得られた培養液を24ウェルプレートに播種し、セミコンフルエントになるまで培養した。次いで、得られた培養液を、2%ウマ血清含有DMEMに交換して、5日間培養し、C2C12細胞を筋管細胞へ分化させた。
【００３８】
筋管細胞の形成を確認後、前記ペプチドを添加したDMEM培地（ウシ胎児血清不含有）を筋管細胞に添加した。この際、各ウェルのペプチド量を0.01mg/ml、0.001mg/mlとなるように、培地を添加した。DMEM培地（前記ペプチド不含有、ウシ胎児血清不含有）を筋管細胞に添加したものを、コントロールとした。試験は各群n＝3で実施した。
【００３９】
各ペプチドと筋管細胞とを、炭酸ガスインキュベーター内（37℃）で6時間反応させたのち、ISOGEN II（株式会社ニッポンジーン製）を用いてtotal RNAを回収した。
【００４０】
回収したRNAを鋳型とし、PrimeScript（商標）RT reagent Kit（タカラバイオ株式会社製）を用いて手順に従い、cDNAを合成した。得られたcDNAを鋳型とし、SYBR（登録商標）Premix EX Taq（商標）II（タカラバイオ株式会社製）及びThermal Cycler Dice（登録商標）Real Time System III（タカラバイオ株式会社製）を用いて手順に従い、リアルタイムPCRを行い、Atrogin-1遺伝子の発現量を定量した。内部標準遺伝子にはGAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）を用いた。また、Atrogin-1遺伝子の発現量を、Thermal Cycler Dice（登録商標） Real Time System III専用ソフトウェア（タカラバイオ株式会社製）を用いて解析した。解析結果を、コントロール群のAtrogin-1遺伝子の発現量に対する相対値で示した。
【００４１】
２−２．結果
結果を表１に示す。
【００４２】
【表１】
2019099488.tif 000002
【００４３】
表中、例えば「２０％」は、コントロール群でのAtrogin-1遺伝子の発現量を１とした場合、ペプチド添加群でのAtrogin-1遺伝子の発現量が０．８であり、ペプチドの添加によって、Atrogin-1遺伝子の発現量が２０％低減されたことを意味する。
【００４４】
表１から明らかなように、前述のペプチドを添加した群ではいずれも、コントロール群より、Atrogin-1遺伝子の発現量が減少した。
【００４５】
Atrogin-1遺伝子は、筋組織で特異的に発現する遺伝子であり、該遺伝子の発現が高いと筋タンパク質の分解が亢進していると判断される。表１に示す結果から明らかなように、本試験で使用したペプチドによれば、Atrogin-1遺伝子の発現量を低減することができた。このことから、本試験で使用したペプチドは、筋タンパク質の分解抑制、特に骨格筋タンパク質の分解抑制に有用であり、すなわち筋萎縮抑制に有用であることが分かった。
【００４６】
試験例３．筋萎縮抑制評価
３−１．試験手順
次の手順に従い、ペプチドの筋萎縮抑制効果を評価した。本試験例では、配列番号４、５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを用いた。
【００４７】
被験動物としてSD系ラット（雄、6週齢、日本エスエルシー株式会社より入手）を用いた。ラット1匹／飼育ケージ（136mm W×208mm D×115mm H）、室温約23℃、照明時間12時間／日（7〜19時）、通常のラット用飼料及び水は自由摂取にて、ラットを個別飼育した。各ラットの体重を測定し、体重をもとに乱塊法で群分けした。試験は各群n＝６で実施した。
【００４８】
7日間の馴化飼育後、イソフルラン吸入麻酔（2.5%）により各ラットに麻酔を施した。その後、左側下肢を非処置（正常足）とし、右側下肢の坐骨神経を切除した（神経切除足）。次いで、各ラットに被験試料を7日間連続投与し、投与終了日の翌日にイソフルランの吸入深麻酔下に放血し、安楽死させた。その後、直ちに両側（正常足及び神経切除足）の筋肉（ヒラメ筋）を分離し摘出し、それぞれの重量を測定し、約50mg切り分け、RNA-Later （0.75mL）に浸漬後、凍結保存した。
【００４９】
なお、試料投与として、試験直前2〜3日のラット1匹あたりの飼料摂取量（約18ｇ／1日）、体重（試料投与日）等を考慮して、配列番号４で表されるペプチドを水1mlに添加した分散液（被験試料１）を1日1回ラットに経口摂取させた（ペプチド量2.22mg／kg／day）。これを試験群１とした。
【００５０】
同様に、配列番号５で表されるペプチドを水1mlに添加した分散液（被験試料２）を1日1回ラットに経口摂取させ（ペプチド6.90mg／kg／day）、これを試験群２とした。
【００５１】
被験試料１、２に代えて、水1mlを1日1回ラットに経口摂取させ、これをコントロール群とした。
【００５２】
また、被験試料１、２に代えて、筋肉の維持を求める人を対象とする市販品（ロイシン、リジン、バリン、イソロイシン、スレオニン、フェニルアラニン、メチオニン、クエン酸、ショ糖脂肪酸エステル、ヒスチジン、甘味料、トリプトファン、貝Ca、レシチン、香料、着色料、ビタミンD／還元麦芽糖を含有）を、該市販品の説明書に従って、ラットへの投与換算を考慮して、水1mlに添加した分散液を1日1回ラットに経口摂取させ（3000 mg／kg／day）、これを試験群３とした。
【００５３】
被験試料１、２、コントロール、市販品の投与7日間中、これらを与える以外は、通常のラット用飼料及び水を自由摂取とした。
【００５４】
３−２．評価手順
前述の通り、筋肉の重量を測定した。
【００５５】
測定した重量に基づいて、各群の正常足筋重量（左側）に対する神経切除足筋重量（右側）の筋組織維持率（神経切除足筋重量×100／正常足筋重量）を求めた。算出結果を図１に示す。
【００５６】
また、測定した重量に基づいて、コントロール群の正常足筋重量（左側）に対する神経切除足筋重量（右側）の筋組織維持率を100%とした時の、試験群１〜３における筋組織維持率を求めた。算出結果を図２に示す。
【００５７】
また、前述の通りRNA-Later （RNA Stabilization Reagent（Qiagen社製））にて保存した筋肉から、Pure Link（商標）RNA mini kit（invitrogen社製）を用いてtotal RNAを抽出した。抽出したRNAは、SuperScript（商標）VILO（商標）MasterMix（invitrogen社製）を用いてcDNAに逆転写し、リアルタイムPCR法に従いMuRF1（muscle RING finger 1）のmRNA量を定量した。内部標準として、ベータアクチンのmRNA量を定量した。なお、リアルタイムPCRに用いたプライマーはSIGMA-ALDLICH(http://www.genosys.jp/news/news_ssl.html)で合成したものを使用した。具体的には、次の通りである。
ベータアクチン(Actb)用プライマー：cccgcgagtacaaccttct（配列番号１４、Forward primer）、cgtcatccatggcgaact（配列番号１５、ReversePrimer）
MuRF1用プライマー：aggactcctgccgagtgac（配列番号１６、Forward primer）ttgtggctcagttcctcctt（配列番号１７、ReversePrimer）
結果を図３に示す。
【００５８】
３−３．結果
前述の通り、図１には、各群の正常足筋重量（左側）に対する神経切除足筋重量（右側）の筋組織維持率を示す。図１に示す通り、コントロール群と比較して、試験群１及び２（本発明のペプチドを含有する被験試料１、２を与えた群）では筋組織維持率が向上した。一方、試験群３（市販品を与えた群）ではコントロール群と同等であり、筋組織維持率の向上は認められなかった。このことから、本発明のペプチドによれば、筋重量の減少を抑制できたことが分かった。
【００５９】
図２には、コントロール群の正常足筋重量（左側）に対する神経切除足筋重量（右側）の筋組織維持率を100%とした時の、試験群１〜３における筋組織維持率を示す。図１と同様に、図２においても、コントロール群と比較して、試験群１及び２は筋組織維持率が向上した。一方、試験群３ではコントロール群よりも筋組織維持率が低くなった。このことからも、本発明のペプチドによれば、筋重量の減少を抑制できたことが分かった。
【００６０】
図３には、MuRF1の発現率を示す。図３から理解できる通り、コントロール群と比較して、試験群１及び２では、MuRF1の発現量が低下した。これに対して、試験群３ではコントロール群よりもMuRF1のmRNA量の発現量が増加した。MuRF1遺伝子の発現量が多いと筋タンパク質の分解が亢進していると判断される。このことから、本発明のペプチドは、筋タンパク質の分解抑制に有用であることが分かった。
【００６１】
なお、本試験の結果に基づけば、体重６０ｋｇの成人を基準とした１日投与（摂取）量として、本発明のペプチドを、例えば、好ましくは０．１〜５０００ｍｇ、より好ましくは０．５〜５０００ｍｇを投与（摂取）することが例示される。更に、本発明を制限するものではないが、体重６０ｋｇの成人を基準とした１日投与（摂取）量として、配列番号４で表されるペプチドは、例えば、更に好ましくは１〜２０００ｍｇ、特に好ましくは２〜１２０ｍｇを投与（摂取）することが例示される。また、本発明を制限するものではないが、体重６０ｋｇの成人を基準とした１日投与（摂取）量として、配列番号５で表されるペプチドは、例えば、更に好ましくは１〜３０００ｍｇ、特に好ましくは６〜３６０ｍｇを投与（摂取）することが例示される。該投与（摂取）量は経口投与の場合の一例であり、非経口投与においては、該値を参考にして適宜決定すればよい。
【００６２】
これらの結果から、配列番号１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸からなるペプチド、これを含有する組成物は、筋タンパク質の分解抑制、特に骨格筋タンパク質の分解抑制に有用であることが分かった。また、該ペプチド、これを含有する組成物は、筋萎縮抑制、特に骨格筋の筋萎縮抑制に有用であることが分かった。また、該ペプチド、これを含有する組成物は、サルコペニア、ロコモティブシンドローム等、特に、加齢性筋萎縮、廃用性筋萎縮等といった筋萎縮に有用であることが分かった。
【図１】
2019099488.tif 000003
【図２】
2019099488.tif 000004
【図３】
2019099488.tif 000005
【配列表】
2019099488000001.app