(57)【要約】【課題】自家あるいは同種幹細胞あるいは幹細胞由来成分を移植しない場合であっても、効果的な歯組織再生を可能とする非細胞性歯組織再生促進キットを提供する。【解決手段】セリンプロテアーゼを含む前処理剤と、CCR3アンタゴニスト、CCL11中和抗体及びALK5阻害剤の少なくとも何れか一つを含む再生促進化合物と、細胞外基質と、を有する非細胞性根管充填材と、を有する。中高齢個体に使用されることが好ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
CCR3アンタゴニスト、CCL11中和抗体及びALK5阻害剤の少なくとも何れか一つを含む再生促進化合物と、細胞外基質と、を有することを特徴とする非細胞性根管充填材。
【請求項２】
CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤を含む再生促進化合物と、細胞外基質と、を有することを特徴とする請求項１に記載の非細胞性根管充填材。
【請求項３】
G-CSF、bFGF及びSDF-1の少なくとも一つを有する遊走因子を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の非細胞性根管充填材。
【請求項４】
若齢個体に使用されることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の非細胞性根管充填材。
【請求項５】
セリンプロテアーゼを含む前処理剤と、
CCR3アンタゴニスト、CCL11中和抗体及びALK5阻害剤の少なくとも何れか一つを含む再生促進化合物と、細胞外基質と、を有する非細胞性根管充填材と、
を有することを特徴とする非細胞性歯組織再生促進キット。
【請求項６】
セリンプロテアーゼを含む前処理剤と、
CCR3アンタゴニスト若しくはCCL11中和抗体及びALK5阻害剤を含む再生促進化合物と、細胞外基質と、を有する非細胞性根管充填材と、
を有することを特徴とする請求項５に記載の非細胞性歯組織再生促進キット。
【請求項７】
前記非細胞性根管充填材は、G-CSF、bFGF及びSDF-1の少なくとも一つを有する遊走因子を有することを特徴とする請求項５又は６に記載の非細胞性歯組織再生促進キット。
【請求項８】
中高齢個体に使用されることを特徴とする請求項５乃至７の何れか１項に記載の非細胞性歯組織再生促進キット。
【請求項９】
前記セリンプロテアーゼは、キモトリプシン様(chymotrypsin-like)セリンプロテアーゼであることを特徴とする請求項５乃至８の何れか１項に記載の非細胞性歯組織再生促進キット。
【請求項１０】
前記キモトリプシン様(chymotrypsin-like)セリンプロテアーゼは、トリプシンであることを特徴とする請求項９に記載の非細胞性歯組織再生促進キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯髄、象牙質及び根尖歯周組織の再生を促進する、幹細胞あるいは幹細胞成分を用いない、非細胞性根管充填材及び非細胞性歯組織再生促進キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
超高齢化社会において、歯が健康でしっかり噛めることは健康長寿のために重要である。しかしながら、中高齢者では、すでに歯の神経を除去（抜髄）した歯が数十年後に再感染して根の下に膿が溜まる病気（感染根管）に陥っている場合が20%を超え、さらに約25%は治療を受けてもなかなか完治できない。その慢性的な感染病巣が免疫力の低下した高齢者の全身に与える影響は大きい。高齢者では骨粗鬆症治療薬服用中で抜歯できない場合も多い。また、抜歯してもインプラントを適用できる症例は中高齢者では減少する。
【０００３】
一方、歯喪失は咬合・発音・味覚・触覚・審美性低下、QOL低下を招く。最近では、歯や口腔機能低下によるオーラル・フレイルが低筋力や低身体機能等のサルコペニアや低栄養等による生活機能の低下を招き、ひいては要介護状態に陥ることが懸念されている。
【０００４】
従って、歯及び口腔機能の維持のために、自己の不用歯から分取した歯髄幹細胞を自家移植して、あるいは他者の不用歯から分取した歯髄幹細胞を同種移植して、抜髄しても感染根管・抜歯に至らないように歯を元通りに回復させる歯髄再生治療法が開発されている（特許文献１−３）。また、歯髄幹細胞のみならず、骨髄や脂肪由来の他の組織幹細胞を自家あるいは同種移植しても歯髄は再生される。
【０００５】
しかしながら、歯髄幹細胞移植に比べて歯髄再生量、血管新生量、神経再生量が劣る（特許文献４）。すでに自家歯髄幹細胞移植による歯髄再生治療法は臨床研究により安全性が確認され、有効性が示唆されている（非特許文献１）。
【０００６】
一方、歯髄再生治療においては、前者のstem cell therapy(幹細胞移植法)に対して、cell homing（細胞遊走法）がある。ヒト若齢の歯根未完成歯に対しては、歯髄幹細胞を用いずに根管内に血餅を満たす方法が主流である（非特許文献２）。あるいは血餅の代わりにPRP(Platelet-Rich Plasma)を注入する方法もある（非特許文献３）。
【０００７】
しかしながら、歯髄固有組織の再生はほとんどみられず、主に血管に富む線維性・骨様組織が再生されるにすぎないといわれている（非特許文献４）。動物実験においては、幹細胞を使わず、stromal cell derived factor (SDF1α)、basic fibroblast growth factor (bFGF)、platelet-derived growth factor (PDGF)、stem cell factor (SCF)、及びgranulocyte colony-stimulating factor (G-CSF)等の細胞成長因子growth factorやサイトカインを遊走因子として用いるcell homing(細胞遊走法)も開発されている（非特許文献５）。
【０００８】
しかしながら、十分な量の歯髄再生にはいたらず、大部分は血管を伴うかなり密な線維性結合組織であり、根管全部が石灰化する場合もあると報告されている（非特許文献６、７）。よってこれまで、特に根完成歯では歯髄組織再生には幹細胞が必須であると考えられている（非特許文献８）。
【０００９】
しかしながら、自家幹細胞移植は、歯髄幹細胞を用いる場合は智歯等の自己の不用歯が必要であること、細胞加工物の安全性確認に高額のコストがかかること、必要な時にすぐには細胞を供給できないこと、さらに、中高齢者では幹細胞形質が変化し、分取できる歯髄幹細胞総数が減少し増幅にも時間がかかるという欠点がある。同種移植では、一ロットあたりの細胞製品数の増加により細胞製造加工後の安全性確認に要するコストは自家移植に比べて減少するが、安全性が担保された歯の供給源の問題、ヒト歯髄幹細胞製品化による歯を供給したヒトに対する権利や報酬等の法律の問題、ヒトでの免疫反応の安全性の問題等、未解決な部分が残されている。
【００１０】
従って、幹細胞あるいは幹細胞由来成分を用いることなく、抜髄あるいは感染根管治療後の歯組織、すなわち、歯髄、象牙質、根尖部歯周組織を再生促進する技術開発が望まれる。一方、歯髄再生のために用いる、宿主細胞を遊走促進する幹細胞源のさらなる研究により、適切なシグナル因子を選択できると考えられている。すなわち、血管新生能、神経分化能をもつ宿主の幹細胞の遊走を促進し、骨形成やセメント質形成能をもつ細胞の遊走を抑制する適切なシグナル因子による歯髄再生法の今後の開発が望まれている（非特許文献９）。
【００１１】
その中で、中高齢個体の歯髄の再生は若齢個体に比べて遅延する。近年、イヌ動物実験により、中高齢の歯髄幹細胞移植による歯髄再生治療において、CCL11中和抗体/CCR3アンタゴニスト（拮抗剤）あるいはALK5インヒビター（阻害剤）を歯髄幹細胞とともに移植すると歯髄再生が促進された。あるいは、歯髄幹細胞移植前にトリプシンを用いて中高齢の歯の根管内を前処理すると歯髄再生が促進された（特許文献５）。CCL11中和抗体あるいはCCR3アンタゴニストはCCL11がCCR3に結合するのを阻害し、シグナル伝達をブロックする。またGDF11はtype I TGF-beta superfamily receptors ACVR1B (ALK4)、TGFBR1 (ALK5)及びACVR1C (ALK7)と結合するが、シグナル伝達はALK4及びALK5で行われる。ALK5阻害剤はGDF11のシグナル伝達をブロックする。歯髄再生時には、象牙質に蓄積されている歯髄幹細胞からの分泌因子が象牙質から遊離されて、歯髄再生が促されると考えられる（非特許文献１０）。in vitroにおいて老化歯髄幹細胞の分泌因子を含む培養上清にCCR3アンタゴニストを添加することにより培養上清の神経突起伸長促進作用及び遊走促進作用が有意に増加した。またALK5阻害剤を添加することにより、培養上清の血管誘導能及び神経突起伸長促進作用が有意に増加した。よって、中高齢イヌでのCCR3アンタゴニストあるいはALK5阻害剤の歯髄再生促進作用は血管誘導促進、神経突起伸長促進及び遊走促進作用によることが示唆された。
【００１２】
しかしながら、若齢イヌの歯髄再生においては、CCR3アンタゴニストあるいはALK5阻害剤を歯髄幹細胞とともに移植しても全く効果は認められなかった（特許文献５）。一方、トリプシンは、医薬品として、壊死組織や凝血、変性タンパクを融解させ、創面を正常にして抗生物質の作用を容易にする目的で使用されている（非特許文献１１）。in vitroにおいてトリプシンで処理した象牙質面上に歯髄幹細胞を播種すると、細胞の付着性が増し、象牙芽細胞への分化促進がみられた。
【００１３】
よって、中高齢イヌでのトリプシン前処理での歯髄再生促進作用は蛋白融解作用による中高齢象牙質に蓄積されているインヒビターの不活性化あるいは前駆体の切断による活性化、象牙質への細胞付着促進、象牙芽細胞分化促進作用によることが示唆された。
【００１４】
しかしながら、若齢イヌの歯髄再生においては、トリプシン前処理による効果は全く認められなかった（特許文献５）。また、トリプシン前処理のみで歯髄幹細胞を移植しない場合、あるいはCCR3アンタゴニストあるいはALK5阻害剤のみで歯髄幹細胞を移植しない場合、歯髄再生はほとんど認められなかった（特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特許５６２１１０５号公報
【特許文献２】特許６０３１６５８号公報
【特許文献３】特許５７４８１９４号公報
【特許文献４】特許５９３９５５９号公報
【特許文献５】特願2016-072306、PCT/JP2017/13572
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Nakashima M.,Iohara K., Murakami M., Nakamura H., Sato Y., Ariji Y., Matsushita K.: Pulp regeneration by transplantation of dental pulp stem cells in pulpitis: A pilot clinical study. Stem Cell Res Therapy. 8(1):61, 2017.
【非特許文献２】Galler KM.：Clinical procedures for revitalization: current knowledge and considerations. Int Endod J. 2016 Oct;49(10):926-36.
【非特許文献３】Kontakiotis EG, Filippatos CG, Tzanetakis GN, Agrafioti A.: Regenerative endodontic therapy: a data analysis of clinical protocols. J Endod. 41(2):146-54. 2015.
【非特許文献４】Del Fabbro M, Lolato A, Bucchi C, Taschieri S, Weinstein RL.: Autologous platelet concentrates for pulp and dentin regeneration: a literature reviewof animal studies. J Endod. 42(2):250-7, 2016.
【非特許文献５】Yang J., Yuan G., Chen Z.: Pulp Regeneration: Current Approaches and Future Challenges. Front Physiol.: 7:58, 2016.
【非特許文献６】He L, Kim SG, Gong Q,Zhong J, Wang S,Zhou X, Ye L, Ling J, Mao JJ.: Regenerative endodontics for adult patients. J Endod. 43(9S):S57-S64, 2017.
【非特許文献７】Iohara K, Murakami M, Takeuchi N, Osako Y, Ito M, Ishizaka R, Utunomiya S, Nakamura H, Matsushita K, Nakashima M.: A novel combinatorial therapy with pulp stem cells and granulocyte colony-stimulating factor for total pulp regeneration. Stem Cells Transl. Med. 2(7): 521-533, 2013.
【非特許文献８】Cao Y, Song M, Kim E, Shon W, Chugal N, Bogen G, Lin L, Kim RH, Park NH, Kang MK.：Pulp-dentin Regeneration: Current State and Future Prospects. J Dent Res. 94(11):1544-51, 2015.
【非特許文献９】Yang J, Yuan G, Chen Z.: Pulp Regeneration: Current Approaches and Future Challenges. Front Physiol. 7:58, 2016. eCollection 2016.
【非特許文献１０】Kawamura R, Hayashi Y, Murakami H, Nakashima M.:EDTA soluble chemical components and the conditioned medium from mobilized dental pulp stem cells contain an inductive microenvironment, promoting cell proliferation, migration and odontoblastic differentiation. Stem Cell Res.Ther. 7(1):77, 2016.
【非特許文献１１】皮膚科性病科雑誌 64巻, 野口義圀他, 497-506頁1954年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、歯組織再生を行う際、非細胞性、特に、自家あるいは同種幹細胞あるいは幹細胞由来成分を移植しない場合であっても、効果的に歯組織再生を可能とする非細胞性根管充填材を提供することを目的とする。またその非細胞性根管充填材を用いる非細胞性歯組織再生促進キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明にかかる歯組織再生のための非細胞性根管充填材は、CCR3アンタゴニスト、CCL11中和抗体及びALK5阻害剤の少なくとも何れか一つを含む再生促進化合物と、細胞外基質と、を有することを特徴とする。非細胞性根管充填材には、G-CSF、bFGF及びSDF-1等の少なくとも一つの遊走因子を包含させることが可能である。
【００１９】
本発明にかかる歯組織再生のための非細胞性歯組織再生促進キットは、セリンプロテアーゼを含む前処理剤と、CCR3アンタゴニスト、CCL11中和抗体及びALK5阻害剤の少なくとも何れか一つを含む再生促進化合物と、細胞外基質と、を有する。非細胞性歯組織再生促進キットには、G-CSF、bFGF及びSDF-1等の少なくとも一つの遊走因子を包含させることが可能である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、自家あるいは同種歯髄幹細胞あるいはそれらの幹細胞由来成分（上清、secretomeあるいはexosome）を移植しない場合であっても、効果的に歯組織再生が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】イヌ２歳齢において、非細胞性歯組織再生促進キットによる再生歯髄組織を従来の細胞性根管充填材による再生歯髄組織と比較した移植後28日のH-E染色写真図で、Ａ、Ｂは低倍であり、arrow headは再生組織最上部、Ｃ、Ｄは高倍であり、黒矢印は象牙芽細胞様細胞、白矢印は象牙質様硬組織形成を示す。そのうちＡ及びＣはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物（CCR3アンタゴニスト、ALK5阻害剤）をアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材、及び遊走因子G-CSFを移植したものである。Ｂ及びＤは前処理を行わずに、同種歯髄幹細胞（MDPSCs）と遊走因子G-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた細胞性根管充填材を移植したものである。Ｅは歯髄再生量の統計学的解析を行ったものである。
【図２】イヌ２歳齢において、再生組織中の血管新生及び神経線維伸長を、非細胞性歯組織再生促進キットと従来の細胞性根管充填材によるものと比較した移植後28日の写真図で、Ａ、Ｂは血管新生（BS-1 lectin染色）であり、Vは新生血管を示し、Ｃ、Ｄは神経線維伸長（PGP9.5染色）であり、矢印は神経突起を示す。そのうちＡ及びＣはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、CCR3アンタゴニスト、ALK5阻害剤及びG-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものであり、Ｂ及びＤは前処理を行わずに、同種歯髄幹細胞（MDPSCs）とG-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた細胞性根管充填材を移植したものである。Ｅは血管新生量の統計学的解析、Ｆは神経線維伸長量の統計学的解析を行ったものである。
【図３】イヌ２歳齢において、歯髄及び象牙芽細胞マーカーを用いた移植後28日の再生組織の写真図であり、Ａ、Ｂは歯髄マーカー（TRH-DE免疫染色）で矢印は陽性細胞であり、Ｃ、Ｄは象牙芽細胞マーカー  Enamelysin mRNAのin situ hybridizationであり、矢印は陽性細胞を示す。そのうちＡ、及びＣはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物（CCR3アンタゴニスト、ALK5阻害剤）をアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材、及び遊走因子G-CSFを移植したものであり、Ｂ、及びＤは前処理を行わずに、同種歯髄幹細胞（MDPSCs）とG-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた細胞性根管充填材を移植したものである。
【図４】イヌ８か月齢において、再生促進化合物ALK5阻害剤の有無による非細胞性根管充填材の再生歯髄組織を比較した移植後13日のH-E染色写真図で、Ａ、Ｂは低倍であり、arrow headは再生組織最上部を示し、Ｃ、Ｄは高倍であり、黒矢印は象牙芽細胞様細胞、白矢印は象牙質様硬組織形成を示す。そのうちＡ及びＣはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤をアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。Ｂ及びＤはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、CCR3アンタゴニストのみをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。
【図５】イヌ８か月齢において、再生促進化合物ALK5阻害剤の有無による非細胞性根管充填材の、再生組織中の血管新生及び神経線維伸長を比較した移植後13日の写真図である。Ａ、Ｂは血管新生（BS-1 lectin染色）、Vは新生血管を示し、Ｃ、Ｄは神経線維伸長（PGP9.5染色）であり、矢印は神経突起を示す。そのうちＡ及びＣはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤をアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。Ｂ及びＤはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニストのみをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。
【図６】イヌ８か月齢において、再生促進化合物ALK5阻害剤の有無による非細胞性根管充填材の、再生組織中の歯髄及び象牙芽細胞マーカーを用いた移植後13日の再生組織の写真図であり、Ａ、Ｂは歯髄マーカー（TRH-DE免疫染色）で矢印は陽性細胞であり、Ｃ、Ｄは象牙芽細胞マーカーEnamelysin mRNAのin situ hybridizationである。そのうちＡ及びＣはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤をアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。Ｂ及びＤはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、CCR3アンタゴニストのみをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。
【図７】イヌ８か月齢において、遊走因子bFGF又はG-CSFを添加した非細胞性歯組織再生促進キットによる再生歯髄組織を比較した移植後13日のH-E染色写真図で、Ａ、Ｂは低倍であり、arrow headは再生組織最上部を示し、Ｃ、Ｄは高倍であり、黒矢印は象牙芽細胞様細胞、白矢印は象牙質様硬組織形成を示す。そのうちＡ及びＣはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤及び遊走因子bFGFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。Ｂ及びＤはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤及び遊走因子G-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。
【図８】イヌ８か月齢において、遊走因子bFGF又はG-CSFを添加した非細胞性歯組織再生促進キットによる再生歯髄組織中の血管新生及び神経線維伸長を比較した移植後13日の写真図で、Ａ、Ｂは血管新生（BS-1 lectin染色）を示し、Vは新生血管を示し、Ｃ、Ｄは神経線維伸長（PGP9.5染色）であり、矢印は神経突起を示す。そのうちＡ及びＣはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤及び遊走因子bFGFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。Ｂ及びＤはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤及び遊走因子G-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。
【図９】イヌ８か月齢において、遊走因子bFGF又はG-CSFを添加した非細胞性歯組織再生促進キットによる再生歯髄組織中の歯髄及び象牙芽細胞マーカーを用いた移植後13日の再生組織の写真図であり、Ａ、Ｂは歯髄マーカー（TRH-DE免疫染色）で矢印は陽性細胞であり、Ｃ、Ｄは象牙芽細胞マーカーEnamelysin mRNAのin situ hybridizationである。そのうちＡ及びＣはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤及び遊走因子bFGFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。Ｂ及びＤはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤及び遊走因子G-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性歯髄再生促進剤を移植したものである。
【図１０】イヌ２歳齢において、トリプシン前処理の有無による非細胞性根管充填材の再生歯髄組織を比較した移植後28日のH-E染色写真図で、Ａ、Ｂは低倍、arrow headは再生組織最上部を示し、Ｃ、Ｄは高倍であり、黒矢印は象牙芽細胞様細胞、白矢印は象牙質様硬組織形成を示す。そのうちＡ及びＣはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤及び遊走因子G-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。Ｂ及びＤはトリプシン前処理を行わず、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤及び遊走因子G-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。
【図１１】イヌ２歳齢において、トリプシン前処理の有無による非細胞性根管充填材の再生歯髄組織中の血管新生及び神経線維伸長を比較した移植後28日の写真図で、Ａ、Ｂは血管新生（BS-1 lectin染色）、Ｃ、Ｄは神経線維伸長（PGP9.5染色）であり、矢印は神経突起を示す。そのうちＡ及びＣはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤及び遊走因子G-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。Ｂ及びＤはトリプシン前処理を行わず、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤及び遊走因子G-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。
【図１２】イヌ２歳齢において、トリプシン前処理の有無による非細胞性根管充填材の再生歯髄組織中の歯髄及び象牙芽細胞マーカーを用いた移植後28日の再生組織の写真図であり、Ａ、Ｂは歯髄マーカー（TRH-DE免疫染色）で矢印は陽性細胞であり、Ｃ、Ｄは象牙芽細胞マーカーEnamelysin mRNAのin situ hybridizationである。そのうちＡ及びＣはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤及び遊走因子G-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。Ｂ及びＤはトリプシン前処理を行わず、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤及び遊走因子G-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。
【図１３】ヒト若齢及び高齢者由来歯髄幹細胞（DPSCs）の各ロットにおけるCCL11とCCR3のmRNA発現を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００２３】
本実施形態にかかる歯組織再生のための非細胞性根管充填材は、CCR3アンタゴニスト、CCL11中和抗体及びALK5阻害剤の少なくとも何れか一つを含む再生促進化合物と、細胞外基質と、を有する。非細胞性根管充填材には、G-CSF、bFGF及びSDF-1等の少なくとも一つの遊走因子を包含させることが可能である。
【００２４】
本実施形態にかかる歯組織再生のための非細胞性歯組織再生促進キットは、セリンプロテアーゼを含む前処理剤と、CCR3アンタゴニスト、CCL11中和抗体及びALK5阻害剤の少なくとも何れか一つを含む再生促進化合物と、細胞外基質と、を有する。非細胞性歯組織再生促進キットには、G-CSF、bFGF及びSDF-1等の少なくとも一つの遊走因子を包含させることが可能である。
【００２５】
歯組織再生とは、歯髄、象牙質、及び、根尖歯周組織の少なくとも何れか一つを包含する組織の再生である。
【００２６】
ALK5阻害剤及びCCR3アンタゴニスト若しくはCCL11中和抗体はともに歯髄再生において効果的であるが、ALK5阻害剤はCCR3アンタゴニスト若しくはCCL11中和抗体よりも血管新生において効果的であり、一方で、CCR3アンタゴニスト若しくはCCL11中和抗体はALK5阻害剤よりも神経新生において効果的である。ALK5阻害剤及びCCR3アンタゴニスト若しくはCCL11中和抗体の混合物を使用する場合においてはその混合割合は特に限定されるものではなく、例えば10重量％：90重量％〜90重量％：10重量％とすることが可能である。
【００２７】
ALK5阻害剤は、特に限定されるものではないが、例えば下記化合物である。
【００２８】
【化１】
2019063191.tif 000003
【００２９】
【化２】
2019063191.tif 000004
【００３０】
【化３】
2019063191.tif 000005
【００３１】
またCCR3アンタゴニストは、特に限定されるものではないが、例えば下記化合物である。
【００３２】
【化４】
2019063191.tif 000006
【００３３】
【化５】
2019063191.tif 000007
【００３４】
ここでＡはCH2又はOであり、R1はNHR(RはC1〜C6アルキル)であり、R2はC1〜C6アルキレン-フェニルであり、R3はH又はC1〜C6アルキルであり、R4はH又はC1〜C6アルキルである。
【００３５】
CCL11はCCR3をレセプターとしてシグナルが伝達されるが、抗CCL11中和抗体はCCL11と結合しCCL11がCCR3に結合するのを阻害する作用を有しCCL11のシグナル伝達が抑制される。一方CCR3アンタゴニストもレセプターCCR3に結合し、同様にCCL11がCCR3に結合するのを阻害する作用を有する。抗CCL11中和抗体は、市販のものを使用することができる。
【００３６】
本実施形態にかかるCCL11を抑制するCCL11中和抗体あるいはCCR3アンタゴニスト、あるいはGDF11のシグナル伝達を阻害するALK5阻害剤は、例えば50 ng/ml〜50μg/mlであり、好ましくは3μg/ml〜30μg/mlである。
【００３７】
細胞外基質は、特に限定されるものではないが、例えば、コラーゲン、人工プロテオグリカン、ゼラチン、ハイドロゲル、フィブリン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、PLA、PLGA、PEG、PGA、PDLLA、PCL、ハイドロキシアパタイト、β-TCP、炭酸カルシウム、チタン及び金のうち少なくとも何れか一つを含む。
【００３８】
非細胞性根管充填材には、遊走因子を包含させることが可能である。遊走因子は、例えば、G-CSF、SDF-1、bFGF、TGF-β、NGF、PDGF、BDNF、GDNF、EGF、VEGF、SCF、MMP3、Slit、GM-CSF、LIF及びHGFのうち少なくとも何れか一つを含むものである。年齢とともに衰える歯周囲の宿主幹細胞の遊走能を促進させる等の目的で添加する。遊走因子はG-CSFあるいはbFGFあるいはSDF-1であることが好ましい。
【００３９】
本実施形態にかかる非細胞性根管充填材は若齢個体に使用されることが好ましいが中高齢個体でも適用可能である。なお、若齢個体とは、特に限定されるものではないが、例えば、ヒトである場合は年齢１歳以上２９歳以下であり、ラットである場合は生後1週齢以上29週齢以下であり、イヌである場合は生後1週齢以上１年齢以下である。
【００４０】
本実施形態にかかる非細胞性歯組織再生促進キットは、セリンプロテアーゼを含む前処理剤と、前述の非細胞性根管充填材と、を有する。
【００４１】
前処理剤は、非細胞性根管充填材を根管に挿入する前に使用するものである。前処理とは、セリンプロテアーゼを含有する液体を根管内に注入することである。前処理剤を使用することにより、歯や歯周組織中の組織再生を抑制するインヒビターを分解する、あるいは遊走因子を活性化する、あるいは潜在型latent formを活性型active formに変える処理を行うことができる。
【００４２】
セリンプロテアーゼは、触媒残基として求核攻撃を行うセリン残基をもつプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）である。セリンプロテアーゼは、アミノ酸配列や立体構造の類似性から、スブチリシン様(subtilisin-like)セリンプロテアーゼと、キモトリプシン様(chymotrypsin-like)セリンプロテアーゼとに分類される。前者にはsubtilisin BPN'、thermitase、proteinase K、lantibiotic peptidase、kexin、cucumisin等があり、後者にはトリプシン、キモトリプシン、thrombin、Xa因子、elastase等がある。好適には、セリンプロテアーゼは、キモトリプシン様(chymotrypsin-like)セリンプロテアーゼであり、より好適にはトリプシンである。
【００４３】
前処理剤に包含されるセリンプロテアーゼの濃度は、歯や歯周組織中の組織再生を抑制するインヒビターを分解する、あるいは遊走因子を活性化する処理を行うことができる限り特に限定されるものではないが、例えば10μg/ml（0.001%）〜50 mg/ml（5 %）であり、好ましくは500μg/ml（0.05%）〜5 mg/ml（0.5%）である。
【００４４】
前処理剤を根管内に注入させる時間は、歯や歯周組織中の組織再生を抑制するインヒビターを分解する、あるいは遊走因子を活性化する処理を行うことができる限り特に限定されるものではないが、例えば3分〜30分、好ましくは5分〜20分であり、より好ましくは10分である。
【００４５】
本実施形態にかかる前処理剤には、セリンプロテアーゼに加えてナノバブルを包含することも可能である。ナノバブルは、脂質で形成される小胞と、この小胞内を充填するガス又はガス前駆体とを有する。ナノバブルの直径は、特に限定されるものではないが、例えば10〜500ｎｍであり、好適には70〜300ｎｍである。なお、ナノバブルの直径は、例えばナノ粒子分布測定装置（ＳＡＬＤ−７１００、島津製作所）により測定される。ナノバブルの脂質組成、帯電状態、密度、重量、粒子径等は、適宜設計することができる。小胞を調製するために使用される脂質は、特に限定されるものではないが、脂質類を含有する膜構成成分からなる。脂質類は、例えばリン脂質、グリセロ糖脂質及びスフィンゴ糖脂質の他、これらの脂質に、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基又は第４級アンモニウム基が導入されたカチオン性脂質である。
【００４６】
前処理剤にナノバブルが含まれる場合、ナノバブル濃度は前処理剤中におけるナノバブルの個数にて示される。ナノバブル濃度は、特に限定されるものではないが、例えば、2×107個/cm3〜2×109個/cm3とすることが可能である。ナノバブル濃度は、例えば電子スピン共鳴法(ESR)により定量解析可能である。
【００４７】
本実施形態にかかる非細胞性歯組織再生促進キットは、中高齢個体に使用されることが好ましい。中齢個体とは、特に限定されるものではないが、例えば、ヒトである場合は年齢３０歳以上４９歳以下であり、ラットである場合は生後30週齢以上39週齢以下であり、イヌである場合は生後２年齢以上４年齢以下である。高齢個体とは、特に限定されるものではないが、例えば、ヒトである場合は年齢５０歳以上であり、ラットである場合は生後40週齢以上であり、イヌである場合は生後５年齢以上である。従って本明細書においてヒト中高齢個体とは３０歳以上の個体を規定するものであり、ラット中高齢個体とは生後30週齢以上の個体を規定するものであり、イヌ中高齢個体とは生後２年以上の個体を規定するものである。
【実施例】
【００４８】
［実施例１］
（イヌ同種膜分取歯髄幹細胞）
イヌ若齢において全身麻酔を施した後、上顎犬歯を抜去し、歯冠から歯根部に歯髄に達しない程度の割線をタービンバーにて縦方向に入れて、20μg/ml ゲンタマイシン（ゲンタロール(登録商標)、株式会社日本点眼薬研究所）及び0.25μg/ml アンホテリシンB（ファンギゾン(登録商標)、ブリストル・マイヤーズ株式会社）含有Hanks液を輸送液として、特殊な運搬容器を用いて温度管理下で歯を１時間以内に輸送した。クリーベンチ内で歯髄を摘出、細切し、0.04 mg/mlリベラーゼ溶液を5 ml加え転倒混和した後、サーモミキサー コンフォート（エッペンドルフ株式会社）の上で37℃、500 rpmで30分振盪した。振盪後、30回懸濁した後、200 rpmで1分遠心し、遠心チューブ内の上清を採取した。この上清を2,000 rpm、5分遠心し、沈殿した細胞に10%イヌ血清含有DMEMを加え、懸濁後2,000 rpm、5分で遠心した。再び遠沈した細胞に10%イヌ血清含有DMEMを5 ml加え、30回懸濁した。細胞懸濁液をトリパンブルー（0.4%, SIGMA）と等量混ぜ、10回懸濁し、生細胞数をカウントした。残りの懸濁液をT25フラスコへ均一に播種後、CO2インキュベータ（パナソニック株式会社）（37℃, CO2 5%）内にて培養し形態を観察した。60〜70%コンフルエントに達した後に細胞を継代した。その後、2代目において、幹細胞膜分取法にて膜分取歯髄幹細胞を分取した。すなわち、2×104 cells/100 μlで膜上部に播種し、下部構造体の24 well中に10%イヌ自己血清を含むDMEM中に遊走因子G-CSF (ノイトロジン、中外製薬) を最終濃度で100 ng/ml入れ、48時間後にG-CSFを取り除き、10%イヌ自己血清を含むDMEMに培地交換した。さらに培養して、70 %コンフルエント後に継代し、6代目まで継代し、凍結した。
【００４９】
細胞表面抗原については、７代目において、20％血清を含むPBS中に1×107 cells/mlで細胞を分散させ、Blocking（FcγIII/II receptor blocking）4℃、20分反応後、幹細胞表面マーカー（CD31 (PE) (JC70A) (Dako)、CD29 (PE-Cy7) (HMb1-1) (eBioscience)、CD44 (Phycoerythrin-Cy7, PE-Cy7) (IM7) (eBioscience)、CD73 (APC) (AD2) (BioLegend)、CD90 (PE) (YKIX337.217) (eBioscience)、CD105 (PE) (43A3) (BioLegend),、及びCXCR4 (FITC) (12G5) (R&D)を90分4℃で暗所にて反応させた。ネガティブコントロールとしては、マウスIgG1 negative control (AbD Serotec)、マウス IgG1 negative control (fluorescein isothiocyanate、FITC) (MCA928F) (AbD Serotec)、マウス IgG1 negative control (Phycoerythrin-Cy7、PE-Cy7) (299Arm) (eBioscience)を用いた。フローサイトメーター (FACS Aria II (BD bioscience)) にて、陽性率を比較した。
【００５０】
凍結保存した6代目細胞を解凍し、フローサイトメトリーによる表面抗原の発現をみると、CD29、CD44、CD73、CD90及びCD105陽性率は95%以上で、CD31は陰性であり、幹細胞・前駆細胞が多く含まれると考えられた。また、CXCR4陽性率は約18%であった。
【００５１】
なお、イヌ膜分取歯髄幹細胞は、DLA（Dog leukocyte antigen、イヌ主要組織適合抗原）のハプロタイプを一致させずに同種移植を根管内に移植した場合でも、ハプロタイプを一致させた場合と、歯髄再生において質的及び量的な差はみられないことが判明している。
【００５２】
（非細胞性歯組織再生促進キットを用いたイヌ中齢の抜髄後歯髄再生：幹細胞治療法との比較）
全身麻酔を施した後、中齢（２歳齢）のイヌ上下顎前歯部に抜髄処置を行い、根尖部まで#50~55で拡大後、5%次亜塩素酸ナトリウム溶液と3%過酸化水素水で交互洗浄し、さらに生理食塩水で洗浄し、ペーパーポイントで根管内を完全乾燥、止血した後、セメントとレジンにて完全に仮封した。抜髄処置4日後、仮封をはずし、再度交互洗浄、生理食塩水で洗浄後、根管内を3％EDTA（スメアクリーン、日本歯科薬品株式会社）で2分反応させ、さらに生理食塩水で洗浄、乾燥させた。この後、右側根管内にトリプシン製剤（フランセチンTパウダー（10 mgあたり結晶Trypsin 2,500 USP）、持田製薬株式会社) 500μg/ml（0.05%、ナノバブル水に溶解）を10分浸し前処理を行い、生理食塩水で洗浄した。その後、再生促進化合物としてCCR3アンタゴニスト（SB328437、TOCRIS bioscience) 200 ng及びALK5阻害剤（SB431542、TOCRIS bioscience）200 ng、遊走因子G-CSF（ノイトロジン、中外製薬株式会社）150ng及び細胞外基質コラーゲン20μl（コーケンアテロコラーゲンインプラント、株式会社高研）を備える非細胞性根管充填材を根管に充填した。コントロールとして左側の根管には、根管内のトリプシンによる前処理は行わず、同種の膜分取歯髄幹細胞5×105個を20μlのコラーゲンにサスペンドし、さらにG-CSF（ノイトロジン）150 ngを添加して根管充填材(細胞性根管充填材)を作成し、この根管充填材を根管内に気泡を入れないよう注意しながら注入した。なお膜分取歯髄幹細胞は、上述した膜分取培養器を用いて分取した歯髄幹細胞である。その後、その上に止血用ゼラチンスポンジ（スポンジェル、アステラス製薬）を置き、グラスアイオノマーセメント（GC Fuji IX EXTRA、GC）及び光重合レジン(Clearfil Mega Bond 及びClearfil DC core automix、クラレノリタケデンタル)にて窩洞を完全封鎖した。移植28日後に抜歯し、通法に従って縦断面の5μmパラフィン切片を作製し、H-E染色後形態観察を行った。それぞれの標本（n=3）の歯髄再生量は1サンプルにつき、4枚の切片を測定し、3サンプルの平均で表した。血管新生は、30日標本において、Fluorescence Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin 1/fluorescein-galanthus nivalis (snowdrop) lectin、BS-1 lectin、Vector lab.) 20μg/ml にて15分免疫染色し比較検討を行った。神経突起伸長は28日標本において、PGP9.5（Ultra Clone、1:10,000）にて免疫染色し比較検討を行った。さらに歯髄及び象牙芽細胞分化を確認するため、それぞれ、歯髄マーカーTRH-DE (Thyrotropin-releasing hormone-degrading ectoenzyme) の免疫染色及び象牙芽細胞マーカー enamelysinのin situ hybridizationを28日標本で行った（Iohara, et al., 2011, Tissue Engineering part A参照）。なお、TRH-DE免疫染色は一次抗体(anti-canine TRH-DE, mouse IgM clone #6E5E, 1: 100, MBL) および二次抗体（Goat anti-mouse IgM, poly-biotin, 1:50, Vector）を用いて、DAB（VECTASTAIN ABCキット、Vector lab.）で発色した。
【００５３】
トリプシン前処理後、再生促進化合物(ALK5阻害剤及びCCR3アンタゴニスト)及び遊走因子G-CSFを含有する非細胞性根管充填材を中齢イヌの歯の抜髄後の根管内に注入したところ、28日後、炎症性細胞浸潤や内部吸収はみられず、従来法の、トリプシン前処理せず同種膜分取歯髄幹細胞及びG-CSFを含有する細胞性根管充填材の注入に比べて同様の、血管に富む疎性結合組織の歯髄様組織の再生がみられた（図１A-D）。また両者とも象牙芽細胞様細胞が象牙質側壁に付着して象牙質を形成しているのがみられた（図１C、D）。歯髄再生量に統計学的有意差はみられなかった（図１E）。非細胞性歯組織再生促進キットを適用すると細胞性根管充填材と同様に血管新生(図2 A、B)や神経突起伸長(図2 C、D)がみられ、血管新生量は、28日後において、非細胞性歯組織再生促進キットを適用したものは、従来の細胞性根管充填材に比べて有意差はみられなかった(図2 E)。神経突起伸長量も、28日後において、両者に有意差はみられなかった(図2F)。さらに、非細胞性歯組織再生促進キットを適用した再生組織において、従来の細胞性根管充填材適用と同様に、一部の細胞にTRH-DE陽性細胞がみられた(図3 A、B)。また、象牙質壁にはenamelysinのmRNAを発現する細胞がみられた(図3C、D)。
【００５４】
これらの結果により、トリプシン前処理後、再生促進化合物(ALK5阻害剤及びCCR3アンタゴニスト)及び遊走因子G-CSFを含有する非細胞性根管充填材を注入すると、従来の歯髄幹細胞及びG-CSF移植による歯髄再生と同様に、血管新生と神経伸長を伴う歯髄が再生され、象牙質側壁に象牙質様硬組織が形成されることが明らかとなった。
【００５５】
［実施例２］
（非細胞性歯組織再生促進キットによるイヌ若齢の抜髄後歯髄再生）
全身麻酔を施した後、若齢（８か月齢）のイヌ上下顎左右前歯部に抜髄処置を行い、根尖部まで#55で拡大後、5%次亜塩素酸ナトリウム溶液と3%過酸化水素水で交互洗浄し、さらに生理食塩水で洗浄し、ペーパーポイントで根管内を完全乾燥、止血した後、セメントとレジンにて完全に仮封した。抜髄処置3日後、仮封をはずし、再度交互洗浄、生理食塩水で洗浄後、根管内を３％EDTA（スメアクリーン）で2分反応させ、さらに生理食塩水で洗浄、乾燥させた。その後、根管内にトリプシン製剤（フランセチンTパウダー（10 mgあたり結晶Trypsin 2,500 USP））5 mg/ml（0.5%、ナノバブル水に溶解）を10分浸し前処理を行い、生理食塩水で洗浄した。さらに、右側上下顎の根管には再生促進化合物としてCCR3アンタゴニスト（（SB328437、200 ng）及びALK5阻害剤（SB431542、200 ng）並びに細胞外基質コラーゲン20μl（コーケンアテロコラーゲンインプラント）を備える非細胞性根管充填材を根管に充填した。一方、左側上下顎の根管には、再生促進化合物としてCCR3アンタゴニスト（SB328437、200 ng）及び細胞外基質コラーゲン20μl（コーケンアテロコラーゲンインプラント）を備える非細胞性根管充填材を根管に充填した。その後、その上に止血用ゼラチンスポンジ（スポンジェル）を置き、グラスアイオノマーセメント及び光重合レジンにて窩洞を完全封鎖した。移植13日後に抜歯し、通法に従って縦断面の5μmパラフィン切片を作製し、H-E染色後形態観察を行った。血管新生はBS-1 lectinにて、神経突起伸長はPGP9.5にて免疫染色し比較検討を行った。さらにTRH-DEの免疫染色及びenamelysinのin situ hybridizationを13日標本で行った。
【００５６】
トリプシン前処理後、ALK5阻害剤及びCCR3アンタゴニスト並びにコラーゲンを含有する非細胞性根管充填材を若齢イヌの歯の抜髄後の根管内に注入したところ、13日後、炎症性細胞浸潤や内部吸収はみられず、豊富な血管を伴う疎性結合組織の歯髄再生がみられた（図4A、C）。また、トリプシン前処理後、CCR3アンタゴニスト及びコラーゲンを含有する非細胞性根管充填材を注入したところ、ALK5阻害剤及びCCR3アンタゴニスト両方を含有する根管充填剤に比べて再生量はやや減少傾向はみられたが、同様に歯髄組織の再生がみられた（図4B、D）。また両者とも象牙芽細胞様細胞が象牙質側壁に付着して象牙質を形成しているのがみられた（図4C、D）。また、両者とも、同様に血管新生(図5 A、B)や神経突起伸長(図5 C、D)がみられた。両者の非細胞性歯組織再生促進キットによる再生組織において、同様に一部の細胞にTRH-DE陽性細胞がみられた(図6 A、B)。また、象牙質壁にはenamelysinのmRNAを発現する細胞が同様にみられた(図6C、D)。
【００５７】
これらの結果により、トリプシン前処理後、CCR3アンタゴニスト及びコラーゲンを含有する非細胞性根管充填材を注入すると、ALK5阻害剤及びCCR3アンタゴニスト並びにコラーゲンを含有する非細胞性根管充填材とほぼ同様に、血管新生と神経伸長を伴う歯髄が再生され、象牙質側壁に象牙芽細胞様細胞が付着し、象牙質様硬組織が形成されることが明らかとなった。
【００５８】
［実施例3］
（遊走因子bFGFあるいはG-CSFを含有した非細胞性歯組織再生促進キットによるイヌ若齢の抜髄後歯髄再生の比較）
全身麻酔を施した後、若齢（８か月齢）のイヌ上下顎左右前歯部に抜髄処置を行い、根尖部まで#55で拡大後、5%次亜塩素酸ナトリウム溶液と3%過酸化水素水で交互洗浄し、さらに生理食塩水で洗浄し、ペーパーポイントで根管内を完全乾燥、止血した後、根管内を３％EDTA（スメアクリーン）で2分反応させ、さらに生理食塩水で洗浄、乾燥させた。その後、根管内にトリプシン製剤（フランセチンTパウダー（10 mgあたり結晶Trypsin 2,500 USP））(持田製薬株式会社) 5 mg/ml（0.5%、ナノバブル水に溶解）を10分浸し前処理を行い、生理食塩水で洗浄した。さらに、右側上下顎の根管には再生促進化合物としてCCR3アンタゴニスト（（SB328437、200 ng）及びALK5阻害剤（SB431542、200 ng）、遊走因子としてbFGF（フィブラストスプレー、科研製薬株式会社）150ng、並びに、細胞外基質コラーゲン20μl（コーケンアテロコラーゲンインプラント）を有する非細胞性根管充填材を根管に充填した。一方、左側上下顎の根管には、再生促進化合物としてCCR3アンタゴニスト（（SB328437、200 ng）及びALK5阻害剤（SB431542、200 ng）、遊走因子としてG-CSF（ノイトロジン）150ng、並びに、細胞外基質コラーゲン20μl（コーケンアテロコラーゲンインプラント）を有する非細胞性根管充填材を根管に充填した。その後、その上に止血用ゼラチンスポンジ（スポンジェル）を置き、グラスアイオノマーセメント及び光重合レジンにて窩洞を完全封鎖した。移植13日後に抜歯し、通法に従って縦断面の5μmパラフィン切片を作製し、H-E染色後形態観察を行った。血管新生はBS-1 lectinにて、神経突起伸長はPGP9.5にて免疫染色し比較検討を行った。さらにTRH-DEの免疫染色及びenamelysinのin situ hybridizationを13日標本で行った。
【００５９】
トリプシン前処理後、ALK5阻害剤及びCCR3アンタゴニスト、bFGF、並びに、コラーゲンを含有する非細胞性根管充填材を若齢イヌの歯の抜髄後の根管内に注入したところ、13日後、G-CSFを含有する非細胞性根管充填材と同様に新生血管を伴う歯髄様組織の再生がみられたが、歯髄再生量はやや減少傾向がみられた（図7A-D）。また両者とも象牙芽細胞様細胞が象牙質側壁に付着して象牙質を形成しているのがみられた（図7C、D）。象牙質形成はG-CSFの方がやや高い傾向がみられた。さらに、両者とも、同様に血管新生(図8 A、B)や神経突起伸長(図8C、D)がみられた。両者の根管充填剤による再生組織において、同様に一部の細胞にTRH-DE陽性細胞がみられた(図9 A、B)。また、象牙質壁にはenamelysinのmRNAを発現する細胞が同様にみられた(図9C、D)。
【００６０】
これらの結果により、トリプシン前処理後、ALK5阻害剤及びCCR3アンタゴニスト並びにコラーゲンに、遊走因子としてbFGF若しくはG-CSFを含有する非細胞性根管充填材を注入すると、ほぼ同様に、血管新生と神経伸長を伴う歯髄が再生され、象牙質側壁に象牙質様硬組織が形成されることが明らかとなった。
【００６１】
［実施例４］
（トリプシン前処理の有無による非細胞性根管充填材によるイヌ中齢の抜髄後歯髄再生の比較）
全身麻酔を施した後、中齢（２歳齢）のイヌ上顎左右中切歯に抜髄処置を行い、根尖部まで#50で拡大後、5%次亜塩素酸ナトリウム溶液と3%過酸化水素水で交互洗浄し、さらに生理食塩水で洗浄し、ペーパーポイントで根管内を完全乾燥、止血した後、セメントとレジンにて完全に仮封した。抜髄処置後、仮封をはずし、再度交互洗浄、生理食塩水で洗浄後、根管内を３％EDTA（スメアクリーン）で2分反応させ、さらに生理食塩水で洗浄、乾燥させた。その後、右側根管内にトリプシン製剤(フランセチンTパウダー（10 mgあたり結晶Trypsin 2,500 USP））5 mg/ml（0. 5%）を10分浸し前処理を行い、生理食塩水で洗浄した。一方、左側根管はトリプシン前処理を行わなかった。さらに、すべての根管に、ALK5阻害剤（SB431542、200 ng）及びCCR3アンタゴニスト（SB328437、200 ng）、細胞外基質コラーゲン20μl（コーケンアテロコラーゲンインプラント）、並びに、遊走因子としてG-CSF（ノイトロジン、150ng）含有する非細胞性根管充填材を根管に充填した。その後、その上に止血用ゼラチンスポンジ（スポンジェル）を置き、グラスアイオノマーセメント及び光重合レジンにて窩洞を完全封鎖した。移植28日後に抜歯し、通法に従って縦断面の5μmパラフィン切片を作製し、H-E染色後形態観察を行った。血管新生はBS-1 lectinにて、神経突起伸長はPGP9.5にて免疫染色し比較検討を行った。さらにTRH-DEの免疫染色及びenamelysinのin situ hybridizationを28日標本で行った。
【００６２】
トリプシン前処理後、ALK5阻害剤及びCCR3アンタゴニスト、コラーゲン、並びに、G-CSFを含有する非細胞性根管充填材を中齢イヌの歯の抜髄後の根管内に注入したところ、28日後、トリプシン前処理なしとほぼ同様に歯髄組織の再生がみられたが、歯髄再生量はトリプシン前処理の方がやや増加傾向がみられた（図10A-D）。また、トリプシン前処理を行った場合は、象牙芽細胞様細胞がより象牙質側壁に付着し、象牙質様硬組織形成量もやや高い傾向がみられた（図10C、D）。さらに、両者とも、同様に血管新生(図11A、B)や神経突起伸長(図11C、D)がみられた。両者の根管充填剤による再生組織において、同様に一部の細胞にTRH-DE陽性細胞がみられた(図12 A、B)。また、象牙質壁にはenamelysinのmRNAを発現する細胞が同様にみられた(図12C、D)。
【００６３】
これらの結果により、ALK5阻害剤及びCCR3アンタゴニスト、コラーゲン、並びに、G-CSF含有する非細胞性根管充填材を注入すると、血管新生と神経伸長を伴う歯髄が再生されるが、非細胞性歯組織再生促進キットとして、トリプシン前処理を行った後に非細胞性根管充填材を注入すると、より象牙質側壁に細胞が付着し、象牙芽細胞への分化、象牙質様組織形成が促進されることが明らかとなった。
【００６４】
［実施例５］
（ヒト歯髄幹細胞培養とCCL11およびCCR3 mRNA発現の解析）
同意を得た後に、高齢者 (60、70歳) および若齢者(19、26歳) の第3大臼歯より歯髄を取り出し、Hanks液中で細切後、37℃ 1時間、0.04 mg/mlリベラーゼ溶液 (Roche diagnostics, Pleasanton, CA, USA) にて酵素消化して歯髄細胞を分離し、10%ヒト血清含有DMEM (D6429) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) に、2〜4×104/mlの細胞濃度で35mm dishに播種した。以後、培地は、2〜3日ごとに交換し、70%コンフルエントになった時に継代した。細胞剥離には、TrypLE(登録商標) Select (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)を使用した。
【００６５】
Trizol (Life Technologies)を用いて、各種細胞からtotal RNAを抽出し、DNase (Roche diagnostics) 処理後、ReverTra Ace-a (TOYOBO, Tokyo, Japan)にてFirst-strand cDNAを合成した。Real-time RT-PCRは、CCL11mRNAについてはPowerUp(登録商標) SYBR(登録商標) Green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)、b-actin 及びCCR3mRNAについてはPower SYBR(登録商標) Green master mix (Applied Biosystems)を用いて、Applied Biosystems 7500 Real-time PCR system (Applied Biosystems)にて、増幅・検出した。Real-time RT-PCRの反応条件は、95℃ 15秒、65℃ 1分を1サイクルとし、40サイクル行った。用いたプライマーの塩基配列は、表1に示す通りである。増幅した遺伝子のmRNA発現はb-actinmRNAにて補正した。
【００６６】
【表１】
2019063191.tif 000008
【００６７】
ヒト若齢および高齢歯髄幹細胞とも、短期継代 (6〜10代)では、CCR3 mRNA発現が非常に低くCCL11 mRNA発現も全くみられないか低い傾向がみられた。また、若齢、高齢とも、長期継代 (19〜21代)すると、CCL11 mRNA及びCCR3 mRNA発現の増加がみられた (図13)。一方、高齢個体由来の細胞では、CCL11の受容体であるCCR3発現が増加することで、CCL11の感受性が上がることが報告されている(Wang H et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011)。すなわち、CCL11発現とCCL11の受容体であるCCR3発現は、特に年齢とともに相関性が現れる可能性が示唆されている。
【００６８】
したがって、非細胞性根管充填材を用いた歯髄再生において、CCL11と結合するCCL11中和抗体と、CCL11のレセプターCCR3と結合するCCR3アンタゴニストはほぼ同様の作用を有するものと示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
歯組織再生に利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００７０】
配列番号１〜６：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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