(57)【要約】【課題】ＲＮＡ医薬等の送達性や細胞膜透過性に寄与できるＲＮＡ導入試薬を提供する。【解決手段】ＲＮＡ導入試薬は、２個以上の細胞性接着モチーフ単位と、１個以上のスペーサー単位と、を備え、前記１個以上のスペ−サー単位が前記２個以上の細胞性接着モチーフ単位を互いに離間している。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ導入試薬であって、
２個以上の細胞性接着モチーフ単位と、
１個以上のスペーサー単位と、
を備え、
前記１個以上のスペ−サー単位が前記２個以上の細胞性接着モチーフ単位を互いに離間している、ＲＮＡ導入試薬。
【請求項２】
前記細胞性接着モチーフ単位はペプチドを含んでいる、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
前記細胞接着性モチーフ単位はＲＧＤペプチドを含む、請求項１又は２に記載の試薬。
【請求項４】
前記スペーサー単位は、ポリオキシアルキレン基を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の試薬。
【請求項５】
前記スペーサー単位は、前記２個以上の細胞接着性モチーフ単位を、少なくとも２ｎｍ以上離間する、請求項１〜４のいずれかに記載の試薬。
【請求項６】
ぺプチド誘導体であって、
２個以上のペプチド単位と、
１個以上の非ペプチド性単位と、
を備え、
前記ペプチド単位は、任意の２個以上のアミノ酸残基を有し、
前記１個以上の非ペプチド単位が、前記２個以上のペプチド単位を互いに離間している、誘導体。
【請求項７】
前記ペプチド単位はＲＧＤモチーフを含み、前記非ペプチド単位は、ポリアルキレンオキシ基を含む、請求項５に記載の誘導体。
【請求項８】
オリゴリボヌクレオチド誘導体であって、
オリゴリボヌクレオチドと、
２個以上の細胞性接着モチーフ単位と、１個以上のスペーサー単位と、を備え、前記１個以上のスペーサー単位が前記２個以上細胞接着性モチーフ単位を互いに離間する、細胞接着領域と、
を備える、誘導体。
【請求項９】
前記オリゴリボヌクレオチドは、以下の式（１）又は（２）に示すヌクレオシド誘導体を含む、請求項８に記載の誘導体。
【化１４】
2019010035.tif 000016
（式（１）中、Ｒ1は、水酸基、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基又は保護された基を表し、式（２）中、Ｘは、ハロゲン原子を表す。式（１）及び式（２）中、Ｒ2及びＲ4は互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、又は−Ｐ（＝Ｏ）nＲ5Ｒ6（nは０又は１を示し、Ｒ5及びＲ6は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、ｎが１のときには、Ｒ5及びＲ6が共に水素原子となることはない。）を示し、Ｒ3は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ7（Ｒ7は、水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアミノ基の保護基を表す。）、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基を表し、Ｂは、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基、置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基のいずれかを表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、ＲＮＡ導入試薬及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんをはじめ、遺伝子変異や遺伝子発現異常が原因又は関連している遺伝子関連疾患は多数知られている。がん細胞を始めとして各種細胞は、その表面に細胞接着因子を発現している。例えば、がん細胞の表面には細胞接着因子としてインテグリンαｖβ3が強く発現していることが知られている。
【０００３】
ｓｉＲＮＡ等のＲＮＡ医薬は、ｍＲＮＡに直接作用する薬剤であって、細胞へ浸透後は、標的分子に対する特異性が高く、細胞質で働くため核内ゲノムＤＮＡへの影響が少なく、しかも作用メカニズムも明確である。このためＲＮＡ医薬は、遺伝子関連疾患への適用が期待されている。
【０００４】
一方、ＲＮＡ医薬は、標的選択性は高いものの、標的組織までの選択的輸送及び細胞膜透過が困難であるほか分解されやすいため、リポソームなどのリピッドナノパーティクル（Lipid Nano Particle、LNP）を用いてＲＮＡ複合体を調製し、ＲＮＡ医薬に、細胞選択能、送達機能、細胞膜透過機能及び保護機能を持たせようとする開発や、有効性強化のためリボース環への修飾などがこれまで進められてきている（特許文献１〜４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】HELVATICA CHIMICA ACTA Vol. 83 (2000) 128-151
【非特許文献２】The Journal of Organic Chemistry 2012, 77, 3233-3245
【非特許文献３】Bioorganic & Chemistry letters(1999)2667-2672
【非特許文献４】The Journal of Organic Chemistry 2013, 78, 9956-9962
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、こうした試みにもかかわらず、ＲＮＡ医薬の有効性の一層の向上が求められている。特に、ＲＮＡ医薬の細胞選択性、送達性や細胞膜透過性に関し、ＬＮＰを用いる送達では、リポソームの粒子径の均一化や微小化が課題となっているが、未だ十分な細胞選択性、送達性や細胞膜透過性が達成されていないという問題があった。
【０００７】
本明細書は、ＲＮＡ医薬等の送達性や細胞膜透過性に寄与できるＲＮＡ導入試薬及びその利用を開示する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＲＮＡの送達性や細胞膜透過性の向上に関して、細胞接着性モチーフの利用に着目した。本発明者らが種々検討したところ、こうした細胞接着性モチーフを複数個用いる場合に、複数個の当該モチーフを複数個スペーサーで互いに離間して備える化合物でＲＮＡを修飾することで、ＲＮＡの細胞膜透過性が高まるという知見を得た。本明細書によれば、かかる知見に基づき以下の手段が提供される。
【０００９】
［１］ＲＮＡ導入試薬であって、
２個以上の細胞性接着モチーフ単位と、
１個以上のスペーサー単位と、
を備え、
前記１個以上のスペ−サー単位が前記２個以上の細胞性接着モチーフ単位を互いに離間している、ＲＮＡ導入試薬。
［２］前記細胞性接着モチーフ単位はペプチドを含んでいる、［１］に記載の試薬。
［３］前記細胞接着性モチーフ単位はＲＧＤペプチドを含む、［１］又は［２］に記載の試薬。
［４］前記スペーサー単位は、ポリアルキレンオキシ基を含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の試薬。
［５］前記スペーサー単位は、前記２個以上の細胞接着性モチーフ単位を、少なくとも２ｎｍ以上離間する、［１］〜［４］のいずれかに記載の試薬。
［６］ペプチド誘導体であって、
２個以上のペプチド単位と、
１個以上の非ペプチド性単位と、
を備え、
前記ペプチド単位は、任意の２以上のアミノ酸残基を有し、
前記１個以上の非ペプチド単位が、前記２個以上のペプチド単位を互いに離間している、誘導体。
［７］前記ペプチド単位はＲＧＤモチーフを含み、前記非ペプチド単位は、ポリオキシアルキレン基を含む、［５］に記載の誘導体。
［８］オリゴリボヌクレオチド誘導体であって、
オリゴリボヌクレオチドと、
２個以上の細胞性接着モチーフ単位と、１個以上のスペーサー単位と、を備え、前記１個以上のスペーサー単位が前記２個以上の細胞接着性モチーフ単位を互いに離間する、細胞接着領域と、を備える、誘導体。
［９］前記オリゴリボヌクレオチドは、以下の式（１）に示すヌクレオシド誘導体を含む、［８］に記載の誘導体。
（式（１）中、Ｒ1は、水酸基、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基又は保護された基を表し、式（２）中、Ｘは、ハロゲン原子を表す。式（１）及び式（２）中、Ｒ2及びＲ4は互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、又は−Ｐ（＝Ｏ）nＲ5Ｒ6（nは０又は１を示し、Ｒ5及びＲ6は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、ｎが１のときには、Ｒ5及びＲ6が共に水素原子となることはない。）を示し、Ｒ3は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ7（Ｒ7は、水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアミノ基の保護基を表す。）、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基を表し、Ｂは、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基、置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基のいずれかを表す。）
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＲＮＡ導入用試薬の構成要素を示す図である。
【図２】ＲＮＡ導入用試薬の概要を示す図である。
【図３】細胞接着性モチーフ単位導入用モノマーに対して細胞接着性モチーフ単位を導入するスキームを示す図である。なお、スキームの最後の化合物には、２個の細胞接着性モチーフ単位と３個のスペーサー単位が導入された状態を示す。
【図４】コンジュゲートによる細胞膜透過性の評価結果を示す図である。
【図５】コンジュゲートによる遺伝子発現抑制の評価結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書の開示は、ＲＮＡ医薬等に好適である、ＲＮＡの細胞への導入試薬及びその利用に関する。図１及び図２に例示するように、本明細書に開示されるＲＮＡ導入試薬（以下、本試薬ともいう。）は、２以上の細胞接着性モチーフ単位が１以上のスペーサー単位で離間した構造を有することができる。推論であって本開示を必ずしも拘束するものではないが、このような離間構造を有するため、２以上の細胞接着性モチーフ単位が、細胞表面において多数かつ流動的に存在すると考えられるインテグリンなどの細胞接着分子との間で相互作用を生じやすくなり、その結果、本試薬と複合体を形成するオリゴリボヌクレオチドが細胞表面と相互作用しやすくなり、その結果、オリゴリボヌクレオチドの細胞内への導入効率が高まるものと考えられる。
【００１２】
本試薬は、２以上の細胞接着性モチーフ単位を、１以上のスペーサー単位を介在させるようにしてこれらの単位を直列して連結させた直鎖状構造を有することができる。本発明者らによれば、分岐した骨格の先端部に細胞接着性モチーフ単位を並列的に有する分岐状構造よりも、既述の直鎖状構造を有するようにすることで、離間構造の設計の自由度が高いため、容易にかつ高い自由度で離間構造を設計できるとともに、意外にも細胞表面の細胞接着分子と相互作用する確率を確保又は向上できることを見出している。なお、本試薬は、少なくとも直鎖状構造を有していることが好ましいが、こうした直鎖状構造を複数分岐又は並列して備える分枝状構造を有していてもよい。
【００１３】
本試薬のいずれかの末端にオリゴリボヌクレオチドを共有結合により結合して複合体とするか、あるいはかかる直鎖状構造体とオリゴリボヌクレオチドと共有結合以外の相互作用で複合化して複合体とすることで、オリゴリボヌクレオチドの細胞内への導入効率を高めることができる。
【００１４】
以下、本明細書の開示の各種実施形態について詳細に説明する。
【００１５】
（ＲＮＡ導入試薬）
本試薬は、２以上の細胞性接着モチーフ単位と、１以上のスペーサー単位と、とを備えることができる。
【００１６】
（細胞接着性モチーフ単位）
細胞接着性モチーフ単位は、細胞表面に発現する細胞接着分子に対して相互作用して結合することができる分子を有するモチーフであって、細胞接着分子との相互作用に寄与するモチーフ（以下、細胞接着性モチーフともいう。）を含むことができる。
【００１７】
細胞接着性モチーフは、例えば、公知の細胞接着分子に結合するリガンドに由来することができる。例えば、細胞接着分子は、概してタンパク質であり、細胞外タンパク質であってもよいし、細胞膜タンパク質であってもよい。また、細胞接着分子は、細胞−細胞接着を担うものであってもよく、細胞−細胞外マトリックス接着を担うものであってもよい。
【００１８】
細胞接着分子としては種々知られている。動物細胞において、細胞−細胞接着を担う細胞接着分子としては、カドヘリン、免疫グロブリンスーパーファミリー、ネクチン等が挙げられる。また、細胞−細胞外マトリックス接着を担う細胞接着分子（細胞側：レセプター、タンパク質）としては、インテグリン、サルコグリカン、βジストログリカンが挙げられ、タンパク質である細胞接着分子（細胞外マトリックス側：リガンド）としては、フィルブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、コラーゲン、テネイシン、フィブリノゲン、オステオポンチン、ネトリン、トロンボスポンジン、エンタクチン、αジストログリカン等が挙げられ、プロテオグリカンである細胞接着分子（細胞外マトリックス側：リガンド）としては、アグリン、アグレカン、シンデカン、ニューロカン、バーシカン、ブレビカン等が挙げられる。
【００１９】
また、動物も、植物も、昆虫も、細胞接着に関して、それぞれ特定のタンパク質や複合多糖類あるいは糖タンパクを細胞間介在物として利用している。それらの構造体中の機能性ペプチドやオリゴ糖をRNA医薬に結合させることにより、動物薬、農薬、殺虫薬として適用させることができる。
【００２０】
これらのうち、本明細書において用いる細胞接着性モチーフが由来する細胞接着分子としては、特に限定するものではないが、ＲＮＡ医薬を導入すべき細胞において多数あるいは特異的に発現している細胞接着分子に対する細胞外マトリックスリガンドである細胞接着部分子とすることができる。また、本明細書において用いる細胞接着性モチーフが由来する細胞接着性の機能性分子としては、タンパク質やペプチドやオリゴ糖であってもよいし、プロテオグリカンなどの糖タンパク質であってもよい。さらに、細胞接着性を有することが知られているビタミン、脂質、コレステロールなどの脂質などであってもよい。
【００２１】
細胞接着性モチーフとしては、例えば、インテグリン、カドヘリン、免疫グロブリンスーパーファミリ（ＩｇＳＦ）をレセプターとして細胞接着を担う細胞外マトリックスリガンドであるフィブロネクチン、ラミニン、ＩＣＡＭ（Intercellular Adhesion Molecule）等が好適である。ある種のインテグリンやラミニンは、例えば、がん細胞などの細胞表面において多数発現しており、がん細胞をターゲットとするＲＮＡ医薬を適用すべき細胞として有用であるからである。また、ある種のインテグリンやラミニンは、神経細胞等の表面において多数又は特異的に発現しており、神経細胞をターゲットとするＲＮＡ医薬を適用すべき細胞として有用であるからである。このほか、ＲＮＡがターゲットとする細胞表面における細胞接着因子の発現状態や種類に応じて、細胞接着性モチーフが由来する細胞接着因子を適宜選択できる。
【００２２】
細胞接着性モチーフとしては、免疫学的抗原性を減じることができるため、分子量が小さいペプチドであることが好ましい。こうした細胞接着性モチーフとしては、例えば、フィブロネクチン中のＲＧＤ（アルファベットは、アミノ酸の一文字表記を示す。以下、同様である。）配列、ＲＥＤＶ配列、ＬＤＶ配列、ＮＧＲ配列、ＰＲＡＱ配列、ＫＬＤＡＰＴ配列、ＡＧＥＧＩＰ配列、ＫＮＥＥＤＤ配列、ＰＨＳＲＮ配列、ＥＤＧＩＨＥＬ配列、ＰＲＡＲＩ配列、ＩＤＡＰＳ配列等が挙げられる。また、ラミニン中のＹＩＧＳＲ配列等が挙げられる。また、細胞接着性モチーフはターゲットとする細胞において発現している膜タンパク質レセプターに結合する細胞外マトリックスリガンドのアミノ酸配列に基づいて複数のペプチド断片を合成して、スクリーニングすることによっても適宜決定することができる。こうしたスクリーニングは、当業者において周知である。
【００２３】
また、例えば、細胞接着性モチーフは、当該モチーフがペプチドの外部に露出されるように環状化されていてもよい。例えば、ＲＧＤモチーフについては、Ｆ（フェニルアラニン）やＣ（システイン）などを介して環状化されたペプチドが商業的に入手可能である。
【００２４】
細胞接着性モチーフに含まれるアミノ酸残基数は、特に限定するものではないが、概して、３個〜２０個程度であり、上記したアミノ酸配列に対して、上記アミノ酸配列に基づく細胞接着性を完全に損なわない範囲でアミノ酸を付加することができる。
【００２５】
一つの細胞接着性モチーフ単位は、こうした細胞接着性モチーフを１個又は２個以上を含むことができるが、好ましくは１個〜５個程度であり、また例えば１個〜４個であり、また例えば１個〜３個であり、また例えば１個又は２個であり、また例えば１個である。
【００２６】
本試薬は、２個以上の細胞接着性モチーフ単位を備えることができる。また例えば、本試薬は、３個以上の細胞接着性モチーフ単位を備えていてもよいし、４個以上の細胞接着性モチーフ単位を備えていてもよい。細胞接着性モチーフ単位の上限は特に限定するものではないが、例えば、１０個以下とすることができる。
【００２７】
本試薬が備える２個以上の細胞接着性モチーフ単位は、互いに同一であってもよいし、異なっていてもよいが、スペーサー単位を介して隣接する細胞接着性モチーフ単位には、同一の細胞接着性モチーフが含まれていることが好ましい。こうすることで、隣接する細胞接着性モチーフ単位中の同一の細胞接着性モチーフ間の距離が概ねスペーサー単位で規定されることになるからである。
【００２８】
図２に示すように、細胞接着性モチーフ単位は、例えば、固相合成法で使用できる例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＧＮＡ、ＰＮＡなどの骨格に対して、ペプチド性のリンカーや非ペプチド性の領域等を用いて、ＧＮＡ骨格に対する側鎖などとして備えられることができる。
【００２９】
（スペーサー単位）
本試薬は、２以上の細胞接着性モチーフ単位を離間するように１以上のスペーサー単位を備えることができる。すなわち、スペーサー単位は、２個の細胞接着性モチーフ単位間に介在して当該モチーフ単位が備える細胞接着性モチーフを、概ねスペーサー単位の長さに基づいて離間することができる。
【００３０】
スペーサー単位の長さは、本試薬における細胞接着性モチーフ単位あるいは細胞接着性モチーフを離間しようとする距離等に応じて適宜決定される。例えば、ターゲットとする細胞において発現する細胞膜レセプター間距離情報が取得できる場合には、当該距離を参考にしてスペーサー単位の長さを決定することができる。また、例えば、スペーサー単位の長さは、あるターゲットレセプターに対して接着することがわかっている細胞接着性モチーフに種々の長さのスペーサー単位を付与して、好適なスペーサー単位を選択するスクリーニングによっても決定できる。
【００３１】
スペーサー単位で離間する細胞接着性モチーフ単位の距離は、特に限定するものではないが、例えば、少なくとも２ｎｍ以上離間することができる。また例えば、３ｎｍ以上とすることができ、また例えば４ｎｍ以上とすることができ、また例えば５ｎｍ以上とすることができる。なお、スペーサー単位によって離間する細胞接着性モチーフ単位間距離、あるいはスペーサー単位の長さは、当業者であれば、スペーサー単位を構成する分子構造に基づいて取得することができる。
【００３２】
スペーサー単位を構成する構造や物質については特に限定するものではないが、一般的なリンカーほか、各種公知のタンパク質とタンパク質とを連結するリンカー、タンパク質とヌクレオチド（ヌクレオシド）とを連結するリンカー、ヌクレオシドとヌクレオシドとを連結するリンカー等を適宜用いることができる。
【００３３】
スペーサー単位としては、特に限定するものではないが、非ペプチド性であることが好ましい。細胞接着レセプターはタンパク質であるため、スペーサー単位がペプチドを含むことにより、意図しない接着が生じる可能性もあるからである。プロテアーゼなどタンパク分解酵素により分解されることを防ぐためにも非ペプチド性であることが望ましい。
また、スペーサーは、例えば、ポリエチレングリコール鎖などタンパク質や脂肪など細胞表面に存在する物質と無差別に結合しない素材よりなるものが好ましい。
【００３４】
スペーサー単位は、特に限定するものではないが、自由回転可能な連結基を備えることも好適である。例えば、スペーサー単位は、一重結合を含む直鎖状構造を有することが好ましい。一重結合としては、例えば、炭素−炭素一重結合、炭素−酸素一重結合、炭素−窒素一重結合、Ｓ−Ｓ一重結合などが挙げられる。スペーサー単位は、こうした一重結合を主体とすることが好ましい。なお、スペーサー単位は、一重結合を含む限り一部に芳香環あるいはシクロアルカンを含んでいてもよい。
【００３５】
スペーサー単位としては、置換されていてもよいアルキレン鎖又はポリオキシアルキレン鎖を含むことが好ましい。こうした鎖状の連結構造は、細胞接着性モチーフ単位間距離の設計が容易であり、かつ全体として回転運動が可能であるからである。
【００３６】
こうしたスペーサー単位としては、例えば、以下の式（１）で表されるスペーサー単位が挙げられる。なお、以下の式（１）及び（２）においては、一例として、リン酸ジエステル結合を介してスペーサー単位が連結されている態様として示す。
５’−Ｏ−ＣmＨ2m−Ｏ−３’               式（１）
（式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、ｍは２以上の整数を表す。）
【００３７】
式（１）においてｍは、好ましくは２以上４０以下であり、より好ましくは３以上２０以下である。式（１）中のＨの置換基は、典型的には、アルキル基、アルコキシ基、水酸基等が挙げられる。アルキル基及びアルコキシ基の炭素数は１〜８であることが好ましく、より好ましくは１〜４である。また、２以上の置換基を有する場合には、置換基は同一であっても異なっていてもよい。さらに、置換基を有していないことも好ましい。
【００３８】
また、他のスペーサー単位としては、以下の式（２）で表される単位が挙げられる。
５’−（ＯＣnＨ2n）l−３’                式（２）
（式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、ｎは２以上４以下の整数を表し、ｌは、２以上の整数を表す。）
【００３９】
式（２）において（ｎ＋１）×ｌは、好ましくは２以上４０以下であり、より好ましくは３以上２０以下である。式（２）中のＨの置換基は、式（１）中の置換基と同様の態様が適用される。
【００４０】
スペーサー単位は、２以上の細胞接着性モチーフ単位を離間するのに必要な個数を細胞接着性モチーフ単位間に備えることができる。したがって、本試薬が備える細胞接着性モチーフ単位の数に応じ必要なスペーサー単位を備えることができる。例えば、本試薬が細胞接着性モチーフ単位を３個備える場合には、スペーサー単位は、これらを離間するために少なくとも２個必要であり、同様に、細胞接着性モチーフ単位を４個備える場合には、これらの離間のために少なくとも３個必要であり、細胞接着性モチーフ単位を５個備える場合には、これらを離間するために少なくとも４個必要である。
【００４１】
図２に示すように、スペーサー単位は、例えば、ＤＮＡやＲＮＡ等の固相合成法を利用して、側鎖というよりもむしろ骨格として備えられることができる。
【００４２】
図１及び図２に示すように、本試薬は、１以上のスペーサー単位が前記２以上の細胞性接着モチーフ単位を互いに離間している。例えば、本試薬は、２個の細胞接着性モチーフ単位を、１個のスペーサー単位を介在させるようした構造単位を直列して連結させた直鎖状構造を有することができる。
【００４３】
本試薬は、特に限定するものではないが、例えば、細胞接着性モチーフ単位を３個以上備えることが好ましく、また例えば、同単位を４個以上備えることが好ましく、同単位を５個以上備えることが好ましく、また例えば、同単位を６個以上備えることが好ましい。これらのいずれもが、スペーサー単位で離間されていることが好ましい。多数個の細胞接着性モチーフ単位をスペーサー単位で離間して備えることで、細胞表面のレセプターとの相互作用確率を向上させることができ、細胞内への取り込みが向上する。
【００４４】
本試薬は、こうした直鎖状構造部分を１つのみ有していてもよいし、２以上有していてもよい。例えば、分岐するリンカーを用いて各リンカーに対してこうした直鎖状構造部分を連結してもよい。本試薬の直鎖状構造部分の末端や非末端以外の細胞接着性を損なわない個所にリンカーの枝を架橋反応等によって連結することができる。こうした分岐するリンカー化合物は、種々の化合物が当業者に周知である。かかる分岐リンカーとしては、例えば、公知の種々の２官能性又は３官能性以上の架橋剤等が挙げられる。
【００４５】
このような構造を有する本試薬を合成するためには、特に限定されないで公知の種々の方法で合成することができるが、例えば、細胞接着性モチーフ単位とスペーサー単位との選択の自由度や連結形態の自由度を考慮すると、オリゴリボヌクレオチドの固相合成方法を用いることができる。なお、本試薬の製造方法については、後段で詳述するが、医薬品製造などにおいて産業応用が容易な方法が望ましい。
【００４６】
（本試薬の製造）
本試薬は、細胞接着性モチーフ単位とスペーサー単位の種類と配列とに応じて適宜製造することができる。特に限定するものではないが、本試薬は、例えば、ＤＮＡやＲＮＡの固相合成法を利用して合成することができる。具体的には、細胞接着性モチーフ単位及びスペーサー単位等を、固相合成のための誘導体、例えば、ホスホロアミダイト誘導体として準備することなどにより、任意の組合せで本試薬を製造することができる。
【００４７】
一般的なオリゴリボヌクレオチドの固相合成法は、概して、オリゴリボヌクレオチドの３’末端側のリボヌクレオチド単位であって塩基、リン酸基及び水酸基等が適宜保護されたリボヌクレオチド単位がリンカー等を介してビーズなどの固相担体を準備し（固相担体準備工程（Ａ））、その後、５’末端水酸基を脱保護し（脱保護工程（Ｂ））、その後、適宜保護された所望のリボヌクレオチドのアミダイト誘導体を供給して、５'末端水酸基に所望のリボヌクレオチドをカップリング（カップリング工程（Ｃ））していくというものである。工程（Ａ）後に、（Ｂ）及び（Ｃ）を繰り返していき、最終的に塩基部分の脱保護と固相担体からの分離によって所望のオリゴリボヌクレオチドを得ることができる。本試薬は、この固相合成方法の工程（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を利用し、リボヌクレオチドに替えて、種々の公知の核酸アナログ（グリコール核酸（ＧＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、架橋型核酸（ＢＮＡ）等）にその他の類似骨格に細胞接着性モチーフ単位やスペーサー単位を任意の配列で連結することで得ることができる。
【００４８】
また、本試薬の製造に適用するホスホロアミダイトなどを用いるアミダイト法等においては、適宜、例えば、リン酸ジエステル部分の酸素原子の一つを硫黄原子、メチル基などの低級アルキル基、ボラノ基で置換するほか、モルホリノホスホロジアミデート修飾、３’位の酸素原子を窒素原子に替えたＮ３’−Ｐ５ホスホロアミデート型修飾など、公知の修飾態様を適用することができる。
【００４９】
以下、オリゴリボヌクレオチドの３’末端側に導入する本試薬の合成例について例示する。例えば、３’末端側から、細胞接着性モチーフ単位／スペーサー単位／細胞接着性モチーフ単位／スペーサー単位という配列を有する本試薬を得る場合には、各単位の前駆体となる以下の３種のモノマーを準備する。
【００５０】
（細胞接着性モチーフ単位導入用モノマー）
まず、以下のスキーム１に示す方法で、末端にトリフルオロアセチル基を有するホスホロアミダイト誘導体モノマーを準備する。このモノマーは、末端のトリフルオロアセチル基を介した共有結合により細胞接着性モチーフ単位を導入することができる。以下のスキームに示すように、アミノヘキサン酸［２］のアミノ基に、トリフルオロアセチル基を導入し（化合物［３］）、次いで、カルボキシル基の水酸基を保護するために、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ基）を導入し（化合物［４］）、２−シアノエチルＮ，Ｎ-ジイソプロピルアミノクロロホスホロアミダイトを添加して、細胞接着性モチーフ単位導入用のモノマーとして化合物［５］を得ることができる。
【００５１】
【化１】
2019010035.tif 000002
【００５２】
後述するように、トリフルオロアセチル基に対して二官能性架橋剤によりマレイミド基が導入され、当該マレイミド基を介して細胞接着性モチーフ単位が導入されるが、必要に応じて、上記のように、固相合成法における骨格部分となるＧＮＡから細胞接着性モチーフ単位がある程度離間されるようにすることができる。
【００５３】
（細胞接着性モチーフ単位導入用固相担体）
次に、以下に示すスキーム２で、オリゴリボヌクレオチドの３’末端に細胞接着性モチーフ単位を導入するための固相担体を得る。スキーム１で得た化合物［４］と無水コハク酸とＮ，Ｎ-ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）とをピリジンに溶解して室温で撹拌後、酢酸エチルと水で抽出後、有機層を脱水し、最終的にスクシニル体を取得し、このスクシニル体に、不活性雰囲気下で、［1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）とＣＰＧ樹脂とを加えて静置し、ＤＭＴｒ基で保護された水産基と、トリフルオロアセチル基と、ＣＰＧと、を備える、３’末端に細胞接着性モチーフ単位導入するための細胞接着性モチーフ単位導入用固相担体を得ることができる。
【００５４】
【化２】
2019010035.tif 000003
【００５５】
（スペーサー単位導入用モノマー）
さらに、以下のスキーム３で、スペーサー単位導入用のホスホロアミダイト誘導体モノマーを準備する。このモノマーは、スペーサー単位を予め含有することができる。以下に示すスキーム３では、ヘキサエチレングリコール鎖をスペーサー単位としている。不活性雰囲気下で、ヘキサエチレングリコール酸をピリジンに溶解後、ＤＭＴｒＣｌを加えて室温で撹拌後、酢酸エチルと水で抽出した有機層を脱水し、減圧濃縮することで、スペーサー単位と、ＤＭＴｒ基で保護した水酸基と、ホスホロアミダイト基とを備えるスペーサー単位導入用モノマーを得ることができる。
【００５６】
【化３】
2019010035.tif 000004
【００５７】
なお、細胞接着性モチーフ単位は、例えば、図３に示すように、トリフルオロアセチル基等を介してマレイミド基を導入し、当該マレイミド基と、細胞接着性モチーフ単位に付与したチオール基との間で反応を生じさせてモノマーや固相担体に導入される。こうした細胞接着性モチーフ単位は、カップリング工程前のモノマーや固相担体に予め導入されていてもよいし、すべてのモノマーをカップリング後に一括して導入されてもよい。同一の細胞接着性モチーフ単位を導入する場合には、後修飾で一括して導入することが好都合である。
【００５８】
こうした２種のモノマーと１種類の固相担体を用いることで、本試薬の前駆体ポリマー及び本試薬を得ることができる。
【００５９】
以下、後修飾により細胞接着性モチーフ単位を備える本試薬の合成例について説明する。まず、スキーム２で得た固相担体のＤＭＴｒ基を除去して、５’−ＯＨ基を活性化後、スキーム３で得たスペーサー単位導入用モノマーのホスホロアミダイト基をカップリングさせて、当該モノマーを、固相担体の５’−ＯＨ基に連結させる。
【００６０】
次いで、残存する５’−ＯＨ基をキャッピングし、３価のリンから５価のリンによるホスホジエステル結合を形成するように酸化する。
【００６１】
引き続き、カップリングしたスペーサー単位導入用モノマーのＤＭＴｒ基を除去し、スキーム１で合成した細胞接着性モチーフ単位導入用モノマーのカップリング等を行う。さらに、導入したモノマーのＤＭＴｒ基を除去に、スキーム３で合成したスペーサー単位導入用モノマーのカップリングを行った後は、酸化してＤＭＴｒ基を除去後は、固相担体から細胞接着性モチーフ単位導入用モノマー／スペーサー単位導入用モノマー／細胞接着性モチーフ単位導入用モノマー／スペーサー単位が重合したポリマーであって、細胞接着性モチーフ単位が導入されていない本試薬の前駆体を分離精製する。
【００６２】
次いで、例えば、図３に示すように、こうして得られたポリマーに対して、Ｎ―（６−マレイミドカプロキシオキシ）スクシンミド（ＥＭＣＳ）などを適用して、トリフルオロアセチル基を介して細胞接着性モチーフ単位導入用モノマーの末端にマレイミド基を導入する。このマレイミド化したポリマーに、チオール基を備えた、例えば、商業的に入手可能である環状ＲＧＤペプチドなどの細胞接着性モチーフ単位を含む化合物を反応させることで、細胞接着性モチーフ単位／スペーサー単位／細胞接着性モチーフ単位／スペーサー単位からなる本試薬を得ることができる。
【００６３】
なお、以上の説明においては、本試薬の前駆体を固相担体から分離後に、細胞接着性モチーフ単位を導入したが、固相担体に本試薬前駆体が分離されていない状態で細胞接着性モチーフ単位を導入することも可能である。
【００６４】
また、以上の説明においては、予め細胞接着性モチーフ単位を備える細胞接着性モチーフ単位導入用モノマーを用いる場合には、細胞接着性モチーフ単位による後修飾を要しない。また、２種類以上の細胞接着性モチーフ単位を用いる場合には、予め細胞接着性モチーフ単位を備えるモノマーを用いた前導入形態を採用することが好適であるが、前導入と後修飾とを組み合わせることもできる。
【００６５】
さらに、以上の説明においては、オリゴリボヌクレオチドの３’末端側に本試薬を備えるようにすることを想定して説明したが、オリゴリボヌクレオチドの５’末端側に本試薬を備えるように本試薬を合成することも当業者であれば適宜実施可能である。
【００６６】
さらにまた、以上の説明においては、各モノマーは、リン酸ジエステル結合により連結されているが、モノマーの連結形態は、これに限定するものではなく、既述のように公知の技術に基づいて、種々の連結形態を適宜選択することができる。
【００６７】
このように、アミダイト法などの固相合成法を用いることで、任意の細胞接着性モチーフ単位とスペーサー単位とを備える本試薬を容易に合成することができる。しかも、本試薬を適用するオリゴリボヌクレオチドの合成と同時に本試薬も合成することができる。
【００６８】
本試薬は、上記のようにＤＮＡやＲＮＡの合成に広く用いられているアミダイト固相合成法ほか、当業者であれば、公知のＤＮＡやＲＮＡの合成手法を適宜適用して合成することができる。細胞接着性モチーフ単位を導入用モノマーに導入する方法は、上記したほか、種々の公知の二価性試薬を用いて、モノマーと細胞接着性モチーフ単位とを連結することができる。また、当業者は、適宜、かかる二価性試薬を導入可能な官能基をモノマーに付与することができる。さらにまた、当業者は、スペーサー単位導入用モノマーにおけるスペーサーを公知のスペーサーから適宜選択することができる。
【００６９】
本試薬によれば、細胞接着性モチーフ単位を、スペーサー単位を介在させて任意の距離離間させることができる。細胞接着性モチーフ単位は、スペーサー単位によって予め所定距離を離間しているため、細胞表面に離間して存在している細胞接着レセプターに対して、効果的に結合できる。すなわち、個々の相互作用が弱くても全体として、すなわち、複数の細胞接着性モチーフが複数のレセプターに結合可能であるため、より強く相互作用して細胞表面に接着することができる。しかも、細胞接着性モチーフ単位間距離を、例えば、細胞表面における、細胞接着性モチーフが結合するレセプター間距離に対応させることができる。さらに、細胞接着性モチーフ単位の離間距離は、スペーサー単位が介在されることによって付与されるため、確実にかつ容易に付与されているとともに、スペーサー単位を介して直列的に細胞接着性モチーフ単位が離間されているために、細胞接着性モチーフ単位のレセプターに対するアクセス自由度も高くなっている。したがって、分岐状に細胞接着性モチーフ単位を備える場合に比較して、簡易にかつ効果的に本試薬はターゲット細胞の表面に接着することができる。また、直列に並んだスペーサー単位と細胞接着性モチーフ単位は細胞膜上を浮遊するレセプターを捜索し、複数個を結合し、抱き込み、クラスター化することができると考えられる。
【００７０】
また、本試薬は、スペーサー単位を介して直列的に、例えば、好ましくはリンカーを介してスペーサー単位が連続する方向及び／又はオリゴリボヌクレオチドにおける鎖長方向に対して側鎖状に細胞接着性モチーフ単位を備えることができる。このため、分岐状に細胞接着性モチーフ単位を備える場合に比較して、比較的嵩高い細胞接着性モチーフ単位であっても、ターゲットとなる細胞表面に対して近接しやすくなっている。この点においても、分岐状に細胞接着性モチーフ単位を備える場合に比較して、簡易にかつ効果的に本試薬はターゲット細胞の表面に接着することができる。
【００７１】
本試薬は、上記例示において用いられたポリエチレングリコール鎖などのスペーサー単位と、細胞接着性モチーフ単位と、を、タンデム（交互に）等で並んだ状態を採ることができ、これらの単位をそれぞれ任意の数繰り返すことができる構造になっている。したがって、本試薬は、一定の距離を離間できるスペーサー単位で細胞接着性モチーフ単位を離間する繰り返し構造を有するものであってもよいし、２以上の異なる距離を離間するように２種類以上のスペーサー単位又は複数のスペーサー単位によって細胞接着性モチーフ単位を離間する構造を有するものとしてもよい。このように、本試薬は、細胞接着性モチーフ単位の配置を容易に最適化することができる。
【００７２】
さらに、本試薬は、スペーサー単位として、ポリエチレングリコール鎖などのある種の細胞選択性を発揮する化合物単位を細胞接着性モチーフ単位を離間する直鎖部分として備えることができる。このため、かかるスペーサー単位に、細胞選択性等の機能など、本試薬によるターゲティングを補助することができる。
【００７３】
以上説明したように、本試薬は、よりしなやかに細胞接着性モチーフ単位を保持し、しかも、細胞接着性モチーフ単位の嵩高さに係わらず独立して細胞表面のレセプターと相互作用可能であるために、本試薬と複合化されたオリゴリボヌクレオチドを細胞表面に効率的に近接させることができ、オリゴリボヌクレオチドの細胞内導入を促進することができる。
【００７４】
本試薬の細胞接着性モチーフ単位が細胞接着性モチーフとしてペプチド性のモチーフを有する場合、本試薬は、２個のペプチド性モチーフ単位が、少なくとも１個の非ペプチド性のスペーサー単位で離間されたペプチド誘導体と理解することができる。かかるペプチド誘導体は、新規化合物である。
【００７５】
（細胞導入コンジュゲート）
本明細書に開示される細胞導入コンジュゲート（以下、単に、本コンジュゲートともいう。）は、２個以上の細胞性接着モチーフ単位と、１以上のスペーサー単位と、を備え、前記１以上のスペーサー単位が前記２個以上の細胞接着性モチーフ単位を互いに離間する、細胞接着領域（以上、本試薬に相当する。）と、オリゴリボヌクレオチドと、を備え、共有結合によって本試薬とオリゴリボヌクレオチドとが複合化されているコンジュゲートである。本コンジュゲートによれば、本試薬によって、オリゴリボヌクレオチドが非特定の血中タンパク質からのトラップを回避して細胞表面に近接され相互作用しやすくなる。このため、オリゴリボヌクレオチドが細胞内に導入されやすくなる。
【００７６】
本コンジュゲートは、細胞接着領域、すなわち、本試薬とオリゴリボヌクレオチドとを共有結合によって複合化されていてもよい。なお、かかる形態の本コンジュゲートは、オリゴリボヌクレオチド誘導体であるといえる。本試薬とオリゴリボヌクレオチドとの共有結合は、オリゴリボヌクレオチドの５’末端及び／又は３’末端に対して本試薬を結合することが好ましい。例えば、ｓｉＲＮＡとして用いる場合には、細胞質内でＲＩＳＣ複合体を形成してＲＮＡ干渉に作用するのはアンチセンス鎖であるため、例えば、センス鎖の３’末端及び／又は５’末端に対して本試薬を備えることが好ましい。
【００７７】
本試薬とオリゴリボヌクレオチドとの結合は、別々に準備したオリゴリボヌクレオチドと本試薬とを、いわゆるバイオコンジュゲートなどを用いて共有結合させることができる。例えば、一方に反応性の高い架橋反応基を導入して、他方にかかる架橋性官能チオールを導入することで、両者を連結することができる。このような結合形態としては、この他、バイオコンジュゲーションとして知られている、本試薬中に備えることができる第１級アミノ基、カルボキシ基、スルフヒドリル基、カルボニル基と、カルボジイミド基、マレイミド、ＮＨＳエステル、イミドエステルなどとの間による架橋反応を利用できる。
【００７８】
また、既に説明したように、本試薬をオリゴリボヌクレオチドの固相合成法に準じて合成する場合には、固相合成法を用いて、本試薬の前駆体となる細胞接着性モチーフ単位導入用モノマーとスペーサー単位導入用モノマーとを含むポリマー鎖の合成を伴ってオリゴリボヌクレオチドを合成することで、本コンジュゲートを合成することができる。固相合成による場合においても、本試薬をオリゴリボヌクレオチドの３’末端に付与することもできるし、５’末端に付与することもできる。
【００７９】
本コンジュゲートに用いるオリゴリボヌクレオチドは、以下の式（１）又は（２）で表されるヌクレオシド誘導体（以下、単に、本ヌクレオシド誘導体ともいう。）又はその塩を含むことができる。本ヌクレオシド誘導体は、当業者の周知の方法で、オリゴヌクレオチドの部分構造に含めることができる。
【００８０】
【化４】
2019010035.tif 000005
（式（１）中、Ｒ1は、水酸基、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基又は保護された基を表し、式（２）中、Ｘは、ハロゲン原子を表す。式（１）及び式（２）中、Ｒ2及びＲ4は互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、又は−Ｐ（＝Ｏ）nＲ5Ｒ6（nは０又は１を示し、Ｒ5及びＲ6は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、ｎが１のときには、Ｒ5及びＲ6が共に水素原子となることはない。）を示し、Ｒ3は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ7（Ｒ7は、水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアミノ基の保護基を表す。）、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基を表し、Ｂは、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基、置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基のいずれかを表す。）
【００８１】
本ヌクレオシド誘導体は、リボースの第４’位に塩基性を有する置換基を備えることで、本ヌクレオシド誘導体に由来する部分構造を備えるオリゴリボヌクレオチドにおいて、オリゴリボヌクレオチドが有するリン酸基などに起因する負電荷の少なくとも一部を中和することができるという電荷調節能を備えることができる。
【００８２】
また、本ヌクレオシド誘導体は、当該部分構造を備えるオリゴリボヌクレオチドの細胞膜透過性を向上させることができる。さらに、本ヌクレオシド誘導体に由来する部分構造を備えるオリゴリボヌクレオチドにおいて、リボヌクレアーゼ耐性を向上することができる。
【００８３】
このようなオリゴリボヌクレオチドと本試薬とのコンジュゲートによれば、オリゴリボヌクレオチドは、本試薬によって細胞表面に近接しやすくなり、しかも、ヌクレアーゼ耐性や細胞膜透過性が向上されているため、一層細胞内に導入されやすくなっている。
【００８４】
本明細書中、構造式等で表される化合物における置換基における「低級」の意は、該置換基を構成する炭素数が、最大１０個までであることを意味している。例えば、通常は炭素数１〜６個、又は炭素数１〜５個が例示され、さらには炭素数１〜４個、又は炭素数１〜３個であることが好ましい例として挙げられる。
【００８５】
以下、本ヌクレオシド誘導体又はその塩及びこれらの利用について説明する。
【００８６】
（ヌクレオシド誘導体及びその塩）
本ヌクレオシド誘導体又はその塩の一つの態様は、以下の式（１）で表されるヌクレオシド誘導体又はその塩である。
【００８７】
【化５】
2019010035.tif 000006
【００８８】
また、本ヌクレオシド誘導体又はその塩の他の一つの態様は、以下の式（２）で表されるヌクレオシド誘導体又はその塩である。
【００８９】
【化６】
2019010035.tif 000007
【００９０】
[Ｒ1について]
式（１）中、Ｒ1は水酸基、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基又は保護された水酸基を表す。
【００９１】
[Ｘについて]
式（２）中、Ｘは、ハロゲン原子を表す。ハロゲン原子としては、特に限定するものではないが、塩素原子、ヨウ素原子、フッ素原子及び臭素原子等が挙げられる。Ｒ1がハロゲン原子のとき、本ヌクレオシド誘導体は、デオキシリボヌクレオシド誘導体である。なお、ハロゲン原子は、式（２）からも明らかなように、リボースの２’位の炭素原子に対する結合方向は特に限定するものではないが、天然のリボースの水酸基に相当するようにハロゲン原子が結合することが好適である。
【００９２】
（アルキル基）
本明細書中、アルキル基としては、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである飽和炭化水素基が挙げられる。通常は、低級アルキル基が好ましく、例えば炭素数１〜６個の低級アルキル基、又は炭素数１〜５個の低級アルキル基がより好ましい例として挙げられ、さらに炭素数１〜４個又は炭素数１〜３個の低級アルキル基が特に好ましい例として挙げられる。直鎖状の炭素数１から４までのアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、又ｎ−ブチル基等が好適な例として挙げられ、このうち、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基が好ましく、また例えばメチル基、エチル基が好ましく、また例えばメチル基が好ましい。また分枝状の炭素数１から４までのアルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基等が挙げられ、このうち、イソプロピル基が特に好ましい例として挙げられる。又、環状の炭素数１から４までのアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、又はシクロプロピルメチル基等が挙げられる。
【００９３】
（アルケニル基）
本明細書中、アルケニル基としては、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである飽和炭化水素基が挙げられる。通常は、低級アルケニル基が好ましく、低級アルケニル基としては、例えばエテニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−メチル−２−プロペニル基、１−メチル−１−プロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基などが挙げられる。
【００９４】
（水酸基の保護基又は保護された水酸基）
本明細書において、水酸基の保護基としては、当業者に周知であって、例えばＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、２００７年版）を参考にすることができる。水酸基の保護基としては、代表的な例を挙げると、例えば、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、低級アルコキシメチル基、適宜の置換基があってもよいオキシカルボニル基、適宜の置換基があってもよいテトラヒドロピラニル基、適宜の置換基があってもよいテトラチオピラニル基、合わせて１から３個の置換又は無置換のアリール基にて置換されたメチル基（但し前述の置換アリールにおける置換基としては、低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン原子、又はシアノ基を意味する。）、又はシリル基、等が例示される。
【００９５】
なお、本明細書中、アルコキシ基としては、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである飽和アルキルエーテル基が挙げられる。低級アルコキシ基が好ましく、低級アルコキシ基としては、例えば炭素数１〜６個の低級アルコシキ基、又は炭素数１〜５個の低級アルコシキ基が挙げられ、さらには炭素数１〜４個、又は炭素数１〜３個のアルコキシ基が好ましく、炭素数１〜４個のアルコキシ基が特に好ましい。炭素数１〜４個のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、又はｎ−ブトキシ基等が好ましい例として挙げられる。また、イソプロポキシ基、イソブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、又はｔ−ブトキシ基等も好ましい例として挙げられる。また、シクロプロポキシ基、シクロブトキシ基も好ましく、シクロプロピルメトキシ基も好ましい例として挙げられる。
【００９６】
本明細書中、アルキルチオ基としては、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである飽和アルキルチオ基が挙げられる。低級アルキルチオ基が好ましく、低級アルキルチオ基としては、例えば炭素数１〜６個の低級アルキルチオ基、又は炭素数１〜５個の低級アルキルチオ基が好ましく、さらには炭素数１〜４個の低級アルキルチオ基、又は炭素数１〜３個までのアルキルチオ基が特に好ましい例として挙げられる。炭素数１〜４個の飽和アルキルチオ基としては、例えば、メチルチオ基、エチオルチオ基、ｎ−プロピルチオ基、ｎ−ブチルチオ基等が好ましい例として例示される。またイソプロピルチオ基、イソブチルチオ基、ｓ−ブチルチオ基、又はｔ−ブチルチオ基等も好ましい例として例示される。またシクロプロピルチオ基、又はシクロブチルチオ基が好ましい例として挙げられ、さらにシクロプロピルメチルチオ基がさらに好ましい例として例示される。
る。）
【００９７】
これらのうち、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、シリル基が特に好ましい例として挙げられる。また、合わせて１から３個の置換又は無置換のアリール基にて置換されたメチル基（但しその置換アリールにおける置換基は、前述の通り）も好ましい例として挙げられる。
【００９８】
上記の脂肪族アシル基としては、例えば、アルキルカルボニル基、カルボキシアルキルカルボニル基、ハロゲノ低級アルキルカルボニル基、又は低級アルコキシ低級アルキルカルボニルが挙げられる。
【００９９】
なお、前記アルキルカルボニル基におけるアルキルは前述の説明の通りである。すなわち、アルキルカルボニル基としては、例えばホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、ノナノイル基、デカノイル基、３−メチルノナノイル基、８−メチルノナノイル基、３−エチルオクタノイル基、３，７−ジメチルオクタノイル基、ウンデカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、１−メチルペンタデカノイル基、１４−メチルペンタデカノイル基、１３，１３−ジメチルテトラデカノイル基、ヘプタデカノイル基、１５−メチルヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基、１−メチルヘプタデカノイル基、ノナデカノイル基、アイコサノイル基、又はヘナイコサイル基が挙げられる。このうち、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基が好ましい例として挙げられ、さらにはアセチル基が特に好ましい例として挙げられる。また前記カルボキシ化アルキルカルボニル基におけるアルキルは前述の説明の通りである。カルボキシ化の置換位置などについても適宜選択できる。すなわち、カルボキシ化アルキルカルボニル基としては、例えばスクシノイル基、グルタロイル基、アジポイル基が挙げられる。
【０１００】
前記ハロゲノ低級アルキルカルボニル基における、ハロゲン、低級、及びアルキルについては前述の説明の通りである。ハロゲンの置換位置などについても適宜選択できる。すなわち、ハロゲノ低級アルキルカルボニル基としては、例えばクロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基が挙げられる。
【０１０１】
前記低級アルコキシ低級アルキルカルボニル基における、アルコキシ及びアルキル、さらに低級については前述の説明の通りである。低級アルコキシが置換する位置などについても適宜選択できる。すなわち、低級アルコキシ低級アルキルカルボニル基として、例えばメトキシアセチル基が挙げられる。
【０１０２】
上記の芳香族アシル基としては、例えば、アリールカルボニル基、ハロゲノアリールカルボニル基、低級アルキル化アリールカルボニル基、低級アルコキシ化アリールカルボニル基、カルボキシ化アリールカルボニル基、ニトロ化アリールカルボニル基、又はアリール化アリールカルボニル基が挙げられる。
【０１０３】
前記アリールカルボニル基としては、例えばベンゾイル基、α−ナフトイル基、β−ナフトイル基が挙げられ、さらに好ましくはベンゾイル基が挙げられる。前記ハロゲノアリールカルボニル基としては、例えば、２−ブロモベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基が挙げられる。前記低級アルキル化アリールカルボニル基としては、２，４，６−トリメチルベンゾイル基、４−トルオイル基、３−トルオイル基、２−トルオイル基が挙げられる。前記低級アルコキシ化アリールカルボニル基としては、例えば４−アニソイル基、３−アニソイル基、２−アニソイル基が挙げられる。
【０１０４】
前記カルボキシル化アリールカルボニル基としては、例えば２−カルボキシベンゾイル基、３−カルボキシベンゾイル基、４−カルボキシベンゾイル基が挙げられる。前記ニトロ化アリールカルボニル基としては、例えば、４−ニトロベンゾイル基、３−ニトロベンゾイル基、２−ニトロベンゾイル基が挙げられる。前記アリール化アリールカルボニル基としては、例えば、４−フェニルベンゾイル基が挙げられる。
【０１０５】
低級アルコキシメチル基としては、例えばメトキシメチル基、１，１−ジメチル−１−メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イソプロポキシメチル基、ブトキシメチル基、ｔ−ブトキシメチル基が挙げられる。特に好ましくはメトキシメチル基が挙げられる。
【０１０６】
適宜の置換基があってもよいオキシカルボニル基としては、低級アルコキシカルボニル基、ハロゲン又はシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基、又はアルケニルオキシカルボニル基が挙げられる。
【０１０７】
前記低級アルコキシカルボニル基としては、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニルイソブトキシカルボニル基が挙げられる。前記ハロゲン又はシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基としては、２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル基が挙げられる。
【０１０８】
前記アルケニルオキシカルボニル基としては、ビニルオキシカルボニル基が挙げられる。上記の、適宜の置換基があってもよいテトラヒドロピラニル基としては、例えばテトラヒドロピラン−２−イル基、又は、３−ブロモテトラヒドロピラン−２−イル基が好ましい例として挙げられ、特に好ましくはテトラヒドロピラン−２−イル基が挙げられる。
【０１０９】
適宜の置換基があってもよいテトラチオピラニル基としては、例えばテトラヒドロチオピラン−２−イル基、４−メトキシテトラヒドロチオピラン−４−イル基が挙げられ、さらに好ましくはテトラヒドロチオピラン−２−イル基が挙げられる。合わせて１から３個の置換又は無置換のアリール基にて置換されたメチル基、においては、前述の置換アリールにおける置換基としては、低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、又はシアノ基を意味する。
【０１１０】
合わせて１から３個の置換又は無置換のアリール基にて置換されたメチル基としては、例えばベンジル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基が挙げられ、好ましくはベンジル基、トリフェニルメチル基が挙げられる。その他に、例えば９−アンスリルメチル４−メチルベンジル基、２，４，６−トリメチルベンジル基、３，４，５−トリメチルベンジル基が挙げられ、好ましくは、２，４，６−トリメチルベンジル基、３，４，５−トリメチルベンジル基が挙げられる。その他の種類として、例えば４−メトキシベンジル基、４−メトキシフェニルジフェニルメチル基、４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル基が挙げられ、好ましくは４−メトキシベンジル基、４−メトキシフェニルジフェニルメチル基、４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル基が挙げられる。さらには、例えば４−クロロベンジル基、４−ブロモベンジル基が挙げられる。またその他に、例えば４−シアノベンジル基も好ましい例として挙げられる。
【０１１１】
本明細書中、シリル基としては、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ−ｔ−ブチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジフェニルメチルシリル基、ジフェニルブチルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリルフェニルジイソプロピルシリル基が挙げられる。このなかでさらに好ましくは、トリメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジフェニルメチルシリル基が挙げられ、特に好ましくは、トリメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ジフェニルメチルシリル基が挙げられる。
【０１１２】
本明細書における水酸基の保護基としては、化学的方法（例えば、加水素分解、加水分解、電気分解、又は光分解など）、又は生物学的方法（例えば、人体内で加水分解等。想像するに微生物等での誘導など）、のいずれかの方法により開裂し、脱離する置換基を意味する場合もある。水酸基の保護基としては、特に、加水素分解、又は加水分解により脱離する置換基が好ましい例として挙げられる。なお、保護された水酸基は、かかる保護基で水素原子が置換された水酸基ということができる。
【０１１３】
[Ｒ2及びＲ4について]
式（１）及び式（２）中、Ｒ2及びＲ4は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、又は−Ｐ（＝Ｏ）n（Ｒ5）Ｒ6を表す。水酸基の保護基は既に説明したとおりである。
【０１１４】
（保護されたリン酸基）
保護されたリン酸基における保護基は当業者公知であり、上述の参考文献や説明を参考にすることができる。
【０１１５】
リン酸基の保護基としては、例えば、低級アルキル基、シアノ基で置換された低級アルキル基、シリル基で置換されたエチル基、ハロゲンで置換された低級アルキル基、低級アルケニル基、シアノ基で置換された低級アルケニル基、シクロアルキル基、シアノ基で置換された低級アルケニル基、アラルキル基、ニトロ基でアリール環が置換されたアラルキル基、ハロゲンでアリール環が置換されたアラルキル基、低級アルキル基で置換されたアリール基、ハロゲンで置換されたアリール基、又はニトロ基で置換されたアリール基が挙げられる。
【０１１６】
前記の低級アルキル基としては、前述したとおりである。前記のシアノ基で置換された低級アルキル基としては、例えば２−シアノエチル基、２−シアノ−１、１−ジメチルエチル基が挙げられ、特に好ましくは、２−シアノエチル基が挙げられる。前記のシリル基で置換されたエチル基としては、例えば２−メチルジフェニルシリルエチル基、２−トリメチルシリルエチル基、２−トリフェニルシリルエチル基が挙げられる。
【０１１７】
前記のハロゲンで置換された低級アルキル基としては、例えば２，２，２−トリクロロエチル基、２，２，２−トリブロモエチル基、２，２，２−トリフルオロエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基が挙げられ、特に好ましくは、２，２，２−トリクロロエチル基が挙げられる。前記の低級アルケニル基としては、例えばエテニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−メチル−２−プロペニル基、１−メチル−１−プロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基などが挙げられる。
【０１１８】
前記のシアノ基で置換された低級アルケニル基としては、例えば２−シアノエチル基、２−シアノプロピル基、２−シアノブテニル基が挙げられる。前記のアラルキル基としては、例えばベンジル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフチルメチル基、インデニルメチル基、フェナンスレニルメチル基、アントラセニルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、１−フェネチル基、２−フェネチル基、１−ナフチルエチル基、２−ナフチルエチル基、１−フェニルプロピル基、２−フェニルプロピル基、３−フェニルプロピル基、１−ナフチルプロピル、２−ナフチルプロピル、３−ナフチルプロピル、１−フェニルブチル基、２−フェニルブチル基、３−フェニルブチル基、４−フェニルブチル基が挙げられ、さらに好ましくは、ベンジル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、１−フェネチル基、２−フェネチル基が挙げられ、特に好ましくは、ベンジル基が挙げられる。
【０１１９】
前記のニトロ基でアリール環が置換されたアラルキル基としては、２−（４−ニトロフェニル）エチル基、０−ニトロベンジル基、４−ニトロベンジル基、２，４−ジニトロベンジル基、４−クロロ−２−ニトロベンジル基などが挙げられる。
【０１２０】
本明細書においてリン酸の保護基としては、化学的方法（例えば、加水素分解、加水分解、電気分解、又は光分解など）、又は生物学的方法（例えば、人体内で加水分解等。想像するに微生物等での誘導など）、のいずれかの方法により開裂し、脱離する置換基を意味する場合もある。リン酸の保護基としては、特に、加水素分解、又は加水分解により脱離する置換基が好ましい例として挙げられる。
【０１２１】
（−Ｐ（＝Ｏ）n（Ｒ5）Ｒ6）
本発明のヌクレオシド類縁体のＲ2及びＲ4は、−Ｐ(＝Ｏ)ｎ(Ｒ5)Ｒ6となる場合がある。ｎは０又は１を示し、Ｒ5及びＲ6は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、ｎが１のときには、Ｒ5及びＲ6が共に水素原子となることはない。保護された水酸基及び低級アルコキシ基については、既に説明したとおりである。
【０１２２】
（保護されたメルカプト基）
保護されたメルカプト基は、当業者において周知である。保護されたメルカプト基としては、例えば上記水酸基の保護基として挙げたものの他、例えばアルキルチオ基、アリールチオ基、脂肪族アシル基、芳香族アシル基が挙げられる。好ましくは、脂肪族アシル基、芳香族アシル基が挙げられ、特に好ましくは、芳香族アシル基が挙げられる。アルキルチオ基としては、低級アルキルチオ気が好ましく、例えば、メチルチオ、エチルチオ、ｔ−ブチルチオ基が好ましい例として挙げられる。アリールチオ基としては、例えばベンジルチオが挙げられる。また芳香族アシル基としてはベンゾイル基が挙げられる。
【０１２３】
前記のシアノ低級アルコキシ基としては、例えば、シアノ基が置換した直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである炭素数１〜５個のアルコキシ基（なお、シアノ基中の炭素の数を含めずに数えた場合）が好ましい例として挙げられ、具体的には例えば、シアノメトキシ、２−シアノエトキシ、３−シアノプロポキシ、４−シアノブトキシ、３−シアノ―２−メチルプロポキシ、又は１−シアノメチル−１，１−ジメチルメトキシ等が挙げられ、特に好ましくは、２−シアノエトキシ基が挙げられる。
【０１２４】
Ｒ5及びＲ6として、置換されたアミノ基が選択できる。そのアミノ基の置換基は、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、シアノ低級アルコキシ基、又は低級アルキル基のいずれかを示す。なお前記Ｒ5及びＲ6が共に、置換されたアミノ基である場合では、該置換されたアミノ基として互いに異なった置換されたアミノ基であってもよい。前記の低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、シアノ低級アルコキシ基、及び低級アルキル基は、前述に説明された通りである。
【０１２５】
−Ｐ（＝Ｏ）n（Ｒ5）Ｒ6としては、より具体的には、ホスホロアミダイド基、H−ホスホネート基、又はホスホニル基が好ましい例として挙げられ、ホスホロアミダイド基が特に好ましい例として挙げられる。
【０１２６】
−Ｐ（＝Ｏ）n（Ｒ5）Ｒ6において、ｎが０であり、Ｒ5及びＲ6の少なくとも一方が置換されたアミノ基であり、他方は何であってもよい場合には、ホスホロアミダイド基となる。ホスホロアミダイド基としては、Ｒ5及びＲ6の一方が置換されたアミノ基であり、他方が低級アルコキシ基、又はシアノ低級アルコキシ基であるホスホロアミダイド基が、縮合反応の反応効率が良好であり、特に好ましい。その置換されたアミノ基としては、例えば、ジエチルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基等が好ましい例として挙げられ、特に好ましくはジイソプロピルアミノ基が例示される。また、Ｒ5及びＲ6の他方の置換基における低級アルコキシ基としては、メトキシキ基が好ましい例として挙げられる。また、シアノ低級アルコキシ基としては、２−シアノエチル基が好ましい例として挙げられる。ホスホロアミダイド基としては、具体的には、−Ｐ（ＯＣ2Ｈ4ＣＮ）（Ｎ（ＣＨ（ＣＨ3）2）、又は−Ｐ（ＯＣＨ3）（Ｎ（ＣＨ（ＣＨ3）2）が好ましい例として挙げられる。
【０１２７】
−Ｐ（＝Ｏ）n（Ｒ5）Ｒ6において、ｎが１であり、Ｒ5及びＲ6の少なくとも一方が水素原子であり、他方は水素原子以外であれば何であってもよい場合には、H−ホスホネート基となる。その、水素以外の置換基としては、例えば、ヒドロキシル基、メチル基、メトキシ基、チオール基等が挙げられ、特に好ましくはヒドロキシル基が例示される。
【０１２８】
また、−Ｐ（＝Ｏ）n（Ｒ5）Ｒ6において、ｎが１であり、Ｒ5及びＲ6が共に低級アルコキシ基である場合には、ホスホニル基となる。なお、Ｒ5及びＲ6における低級アルコキシ基は互いに同一でも相違していてもよい。その低級アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基等が好ましい例として挙げられる。ホスホニル基としては、具体的には、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＣＨ3）2が挙げられる。
【０１２９】
本ヌクレオシド誘導体におけるＲ2としては、例えば、−Ｐ（＝Ｏ）n（Ｒ5）Ｒ6であることが特に好ましい。−Ｐ（＝Ｏ）ｎ（Ｒ5）Ｒ6としては、ホスホロアミダイド基、Ｈ−ホスホネート基、又はホスホニル基が好ましい例として挙げられる。Ｒ2としては、その他にリン酸基、又は保護されたリン酸基であることも好ましい。さらにＲ2としては、水素原子、又は水酸基の保護基であることも好ましい。
【０１３０】
Ｒ2の具体的な他の例示としては、水素原子、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、−Ｐ（ＯＣ2Ｈ4ＣＮ）（Ｎ（ＣＨ（ＣＨ3）2）、−Ｐ（ＯＣＨ3）（Ｎ（ＣＨ（ＣＨ3）2）、又はホスホニル基が好ましい例として挙げられる。
【０１３１】
本ヌクレオシド誘導体におけるＲ4としては、例えば、水素原子又は水酸基の保護基が好ましい。また例えば、リン酸基、保護されたリン酸基、又は−Ｐ（＝Ｏ）n（Ｒ5）Ｒ6であることも好ましい。Ｒ4としての具体的な例示を挙げると、水素原子、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、又はトリメチルシリル基が好ましい例として挙げられる。
【０１３２】
[Ｒ3について]
式（１）及び式（２）中、Ｒ3は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ7、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基を表すことができる。すなわち、ＮＨＲ7、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基は、それぞれが連結基を介して４’位の炭素原子に結合している。
【０１３３】
連結基としては、例えば、炭素数１個以上の２価炭化水素基を表すことができる。すなわち、２価の炭化水素基としては、炭素数１〜８個以下のアルキレン基、炭素数２〜８個以下のアルケニレン基などが挙げられる。
【０１３４】
連結基としてのアルキレン基としては、直鎖状、分枝状であってもよいが、好ましくは直鎖状である。例えば、低級アルキル基が好ましく、例えば炭素数１〜６個の低級アルキル基、また例えば、炭素数２〜６個の低級アルキル基が好ましく、また例えば、炭素数２〜４個又は炭素数２〜３個の低級アルキル基が好ましい。直鎖状の炭素数１から４までのアルキル基としては、メチレン基、エチレン基、プロパンー１、３−ジイル基、ｎ−ブタン−１，１−ジイル基、ｎ−ペンチル−１−５，−ジイル基、ｎ−ヘキシル−１，６−ジイル基等が挙げられる。また、例えば、ブタン−１，２−ジイル基等が挙げられる。また例えば、エチレン基、プロパンー１、３−ジイル基、ｎ−ブタン−１，１−ジイル基が特に好ましい例として挙げられる。
【０１３５】
連結基としてのアルケニレン基としては、直鎖状、分枝状であり、好ましくは直鎖状である。例えば、低級アルケニレン基が好ましく、低級アルケニレン基としては、例えば、エテン−１，２−ジイル基、プロペンー１，３−ジイル基、ブテン−１，４−ジイル基等が挙げられる。
【０１３６】
式（１）で表されるヌクレオシド誘導体においては、例えばエチレン基などの炭素数２以上のアルキレン基などの２価炭化水素基であることがオリゴヌクレオチド誘導体のヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性の観点から好適である。また、式（２）で表されるヌクレオシド誘導体においては、例えばエチレン基などの炭素数１以上のアルキレン基などの２価炭化水素基であってもヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性の観点から好適である。
【０１３７】
Ｒ7としては、水素原子、アルキル基又はアルケニル基又はアミノ基の保護基が挙げられる。アルキル基は、既に説明したアルキル基のほか、低級アルキル基が好ましく挙げられる。アルケニル基としては、既に説明したアルケニル基のほか、低級アルケニル基が好ましく挙げられる。Ｒ7が水素原子などこれらの基であるとき、連結基は、炭素数２以上、また例えば３以上、また例えば４以上で、例えば６以下、また例えば５以下、また例えば４以下のアルキレン基であることが好適である。
【０１３８】
また、Ｒ7が水素原子のとき、Ｒ3は、連結基を有するＮＨ2（アミノ基）、すなわち、連結基がアルキレン基やアルケニレン基のときには、アミノアルキル基やアミノアルケニル基などとなる。式（１）及び式（２）中、Ｒ3がアミノアルキル基などであることにより、本ヌクレオシド誘導体及び本ヌクレオシド誘導体に由来するモノマーユニットを備えるオリゴヌクレオチド誘導体は、周囲のｐＨ環境において電荷が変化するという特徴を伴う電荷付与性を発揮することができる。例えば、酸性下ではカチオニックであり、生理的条件下の中性ではプラス電荷が減少して電荷ゼロとなりうる。すなわち、かかる電荷調節能によれば、ｐＨ環境を変化させることで、必要時にヌクレオシド誘導体の電荷をダイナミックに変化させたり、所望の電荷を付与したりすることができる。したがって、このような本ヌクレオシド誘導体によれば、オリゴヌクレオチドの電荷を従来とは異なる態様であるいは従来よりも一層高い自由度で調整できるようになる。以上のことから、Ｒ3がかかるアミノアルキル基などである本ヌクレオシド誘導体は、オリゴヌクレオチド等に対する電荷（正電荷）付与剤又は電荷調節剤として有用である。
【０１３９】
Ｒ3としては、それぞれ連結基を有する、アジド基、アミジノ基、すなわち、ＣＨ3（ＮＨ）Ｃ（ＮＨ）−（アミジンのアミノ基から水素原子1個を除いたもの）、グアニジノ基、すなわち、ＮＨ2（ＮＨ）Ｃ（ＮＨ）−（グアニジンのアミノ基から水素原子1個を除いたもの）が挙げられる。なかでも、グアニジノ基が挙げられる。Ｒ3が、これらの基を有するとき、連結基は、炭素数１以上、また例えば２以上などのアルキレン基又はアルケニレン基などとすることができる。なお、Ｒ3が、連結基を有するアミジノ基、グアニジノ基のときには、既述のアミノアルキル基などのときとは異なり、常にカチオニックとなる。かかる本ヌクレオシド誘導体は、Ｒ3がアミノアルキル基などである本ヌクレオシド誘導体と組み合わせて用いるのに有用である。
【０１４０】
アミノ基に対する保護基は、当業者に周知されており、前述の参考文献を参照することができる。具体的には、上記にて水酸基の保護基として挙げたものの他、例えばベンジル基、メチルベンジル基、クロロベンジル基、ジクロロベンジル基、フルオロベンジル基、トリフルオロメチルベンジル基、ニトロベンジル基、メトキシフェニル基、メトキシメチル（ＭＯＭ）基、Ｎ−メチルアミノベンジル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノベンジル基、フェナシル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、フタルイミド基、アリルオキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、１−メチル−１−（４−ビフェニル）エトキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）基、９−フルオレニルメトキシカルボニル基、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）基、又は２−（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭ）基などが挙げられる。さらに好ましくは、ベンジル基、メトキシフェニル基、アセチル基、トリフルオロアセチル（ＴＦＡ）基、ピバロイル基、ベンゾイル基、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、１−メチル−１−（４−ビフェニル）エトキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）基、９−フルオレニルメトキシカルボニル基、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）基、又は２−（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭ）基が挙げられ、特に好ましくは、ベンジル基、メトキシフェニル基、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジルオキシメチル基が挙げられる。
【０１４１】
本発明においてアミノ基の保護基としては、化学的方法（例えば、加水素分解、加水分解、電気分解、又は光分解など）、又は生物学的方法（例えば、人体内で加水分解等。想像するに微生物等での誘導など）、のいずれかの方法により開裂し、脱離する置換基を意味する場合もある。特に、加水素分解、又は加水分解により脱離する置換基がアミノ基の保護基として好ましい。
【０１４２】
[Ｂ：塩基について]
本ヌクレオシド誘導体におけるＢ：塩基としては、公知の天然塩基ほか、人工塩基が挙げられる。例えば、Ｂとしては、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基、置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基が選択できる。
【０１４３】
すなわち、Ｂとしては、プリン−９−イル基、又は２−オキソ−ピリミジン−１−イル基が挙げられるほか、２，６−ジクロロプリン−９−イル、又は２−オキソ−ピリミジン−１−イルが挙げられる。さらに、２−オキソ−４−メトキシ−ピリミジン−１−イル、４−（１H−１，２，４−トリアゾール‐１−イル）−ピリミジン−１−イル、又は２，６−ジメトキシプリン−９−イルが挙げられる。
【０１４４】
さらに、アミノ基が保護された２−オキソ−４−アミノ−ピリミジン−１−イル、アミノ基が保護された２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル、アミノ基が保護された２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル、アミノ基及び／又は水酸基が保護された２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル、アミノ基が保護された２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル、アミノ基が保護された６−アミノプリン−９−イル、又はアミノ基が保護された４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−ピリミジン−１−イル基が挙げられる。なお、水酸基及びアミノ基の各保護基については、既に説明したとおりである。
【０１４５】
さらに、６−アミノプリン−９−イル（アデニン）、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル（グアニジン）、２−オキソ−４−アミノ−ピリミジン−１−イル（シトシン）、２−オキソ−４−ヒドロキシ−ピリミジン−1−イル（ウラシル）、又は２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチルピリミジン−１−イル（チミン）が挙げられる。
【０１４６】
さらにまた、４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−ピリミジン−１−イル（メチルシトシン）、２，６−ジアミノプリン−９−イル、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル、６−メルカプトプリン−９−イル、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−ピリミジン−１−イル、又は２−オキソ−４−メルカプト−ピリミジン−１−イルが挙げられる。
【０１４７】
また、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル、又は２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イルが挙げられる。
【０１４８】
置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基それぞれにおける置換基は、水酸基、保護された水酸基、低級アルコキシ基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルキルチオ基、アミノ基、保護されたアミノ基、低級アルキル基で置換されたアミノ基、低級アルキル基、低級アルコキシメチル基、又はハロゲン原子のいずれか一つ、又はそれらの複数の組み合わせのいずれかである。これらの置換基は、既に説明したとおりである。
【０１４９】
本ヌクレオシド誘導体におけるＢとしては、置換プリン−９−イル基、又は置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基における置換基が既述の各置換基が好ましいが、これに加えてさらに、トリアゾール基、低級アルコキシメチル基が加わることも好ましい。
【０１５０】
置換プリン−９−イル基の好ましい例としては、例えば、６−アミノプリン−９−イル、２，６−ジアミノプリン−９−イル、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル、２，６−ジメトキシプリン−９−イル、２，６−ジクロロプリン−９−イル、又は６−メルカプトプリン−９−イル等が挙げられる。上述の置換基中にアミノ基や水酸基があれば、それらのアミノ基及び／又は水酸基が保護化された置換基が好ましい例として挙げられる。
【０１５１】
置換２−オキソ−ピリミジン−１−イルとしては、例えば２−オキソ−４−アミノ−ピリミジン−１−イル、１Ｈ−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）−ピリミジン−１−イル、４−１Ｈ−１，４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−ピリミジン−１−イル、２−オキソ−４−メトキシ−ピリミジン−１−イル、２−オキソ−４−メルカプト−ピリミジン−１−イル、２−オキソ−４−ヒドロキシ−ピリミジン−1−イル、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチルピリミジン−１−イル、又は４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−ピリミジン−１−イル等が挙げられる。
また、２−オキソ−４−メトキシ−ピリミジン−１−イル、又は４−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール‐１−イル）−ピリミジン−１−イルが好ましい例として挙げられる。
【０１５２】
こうしたＢのうち、置換基中にアミノ基や水酸基があれば、それらのアミノ基又は水酸基が保護化された置換基が好ましい例として挙げられる。
【０１５３】
本ヌクレオシド誘導体は、塩であってもよい。塩の形態は特に限定されないが、一般的には酸付加塩が例示され、分子内対イオンの形態をとっていてもよい。又は置換基の種類によっては塩基付加塩が形成される場合もある。塩としては、薬学的に許容される塩が好ましい。薬学的に許容しうる塩を形成する酸及び塩基の種類は当業者には周知であり、例えばＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１−１９（１９７７）に記載しているものなどを参考にすることができる。例えば、酸付加塩としては、鉱酸塩、有機酸塩が挙げられる。また、一個以上の置換基が酸性部分を含有する場合、塩基付加塩も好ましい例として挙げられる。
【０１５４】
鉱酸塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素酸塩、リン酸塩、リン酸水素酸塩などが挙げられる。通常は、塩酸塩、リン酸塩、が好ましい例として挙げられる。有機酸塩としては、例えば、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、又はｐ−トルエンスルホン酸塩などが挙げられる。通常は、酢酸塩等が好ましい例として挙げられる。塩基付加塩としては、アルカリ金属の塩、アルカリ土類金属の塩、有機アミン塩、アミノ酸の付加塩が挙げられる。
【０１５５】
前記のアルカリ金属の塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などが挙げられる。また、アルカリ土類金属の塩としては、例えば、マグネシウム塩、カルシウム塩などが挙げられる。有機アミン塩としては、例えば、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、プロカイン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩等が例示される。また、アミノ酸の付加塩としては、例えば、アルギニン塩、リジン塩、オルニチン塩、セリン塩、グリシン塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などが挙げられる。
【０１５６】
本ヌクレオシド誘導体又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあり、これらの物質も本明細書の開示の範囲に含まれる。本ヌクレオシド誘導体又はその塩は、後述の合成例や公知の方法に準じて、当業者は容易に製造することができる。
【０１５７】
本ヌクレオシド誘導体は、オリゴリボヌクレオチドの少なくとも一部としてオリゴリボヌクレオチドに導入することで、一本鎖としてのオリゴリボヌクレオチド、二本鎖オリゴリボヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を向上させうることができるほか、哺乳動物細胞等の細胞膜透過性を向上させることができる。すなわち、本ヌクレオシド誘導体は、それ自体は、ヌクレアーゼ耐性向上剤及び／又は細胞膜透過性付与剤として有用である。また、本ヌクレオシド誘導体は、４’に塩基性の置換基を備えることができる。これにより、オリゴリボヌクレオチド等におけるリン酸基などに由来する負電荷を調整することができるという電荷調節剤又は正電荷付与剤として機能することができる。
【０１５８】
なお、本明細書に開示されるオリゴリボヌクレオチドは、式（３）及び式（４）で表される部分構造を少なくとも１個含有することができる。式（３）及び式（４）で表される部分構造は、それぞれ、式（１）及び式（２）で表されるヌクレオシド誘導体又はその塩に基づいて取得されうる。
【０１５９】
【化７】
2019010035.tif 000008
【０１６０】
式（３）及び式（４）で表される部分構造におけるＲ1、Ｘ，Ｒ3及びＢについては、式（１）及び式（２）におけるのとそれぞれ同義である。
【０１６１】
式（３）及び式（４）で表される部分構造は、オリゴリボヌクレオチド中において２個以上含んでいてもよい。その場合、これらの部分構造は、互いに同一であっても異なっていてもよい。また、オリゴリボヌクレオチドに含まれる部分構造の全体は、式（３）で表される部分構造のみから構成されていてもよいし、式（４）で表される部分構造のみから構成されていてもよい。また、式（３）で表される部分構造１又は２以上有し、かつ式（４）で表される部分構造を１又は２以上有していてもよい。
【０１６２】
また、式（３）及び式（４）で表される部分構造の配置としては、互いに隣り合ってもよいし、離れて存在してもよい。例えば、オリゴリボヌクレオチドは、前記部分構造を少なくとも３個備えることができる。この場合、各部分構造を、オリゴリボヌクレオチドの５’末端側、中央部及び３’末端側に略均等に備えることができる。部分構造をオリゴリボヌクレオチドのこれら各部に略均等に備える、とは、これらの各部において、同数個を必ずしも部分構造を備えることを限定するものではなく、これら各部に少なくとも１個をそれぞれ備えることを少なくとも充足すれば足りる。例えば、各部に１〜３個程度の部分構造を備える場合には、略均等ということができる。部分構造は、オリゴリボヌクレオチドにおいて、少なくとも６個備えることができる。
【０１６３】
式（３）で表される部分構造は、糖鎖部分がリボース又はデオキシリボースに由来していることから、オリゴリボヌクレオチドは、オリゴリボヌクレオチドであってもよいし、オリゴデオキシリボヌクレオチドであってもよい。また、オリゴリボヌクレオチドは、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとのキメラであってもよい。
【０１６４】
オリゴリボヌクレオチドは、それ自体一本鎖であるが、オリゴリボヌクレオチド、及びオリゴデオキシリボ／リボヌクレオチド（キメラ鎖）とのハイブリッド、すなわち、二本鎖の形態を採ることもできる。
【０１６５】
オリゴリボヌクレオチドは、式（３）及び式（４）で表される部分構造以外の部分構造としては、その他の天然のヌクレオチド、又は公知のヌクレオシド誘導体及び／又はヌクレオチド誘導体などに該当する部分構造を備えることができる。本明細書において規定する部分構造及びその他の部分構造は、互いに、例えば、リン酸ジエステル結合、リン酸モノエステル結合、チオリン酸エステル結合等によって結合されうる。
【０１６６】
オリゴリボヌクレオチドは、部分構造及びその他のヌクレオシド誘導体の個数を単位として、少なくとも２個以上、さらには８個以上であることが好ましく、特に好ましくは１５個以上であることが挙げられる。上限としては特に限定されないが、例えば１００個以下であり、また例えば、８０個以下であり、また例えば、６０個以下であり、また例えば、５０個以下であり、また例えば、４０個以下であり、また例えば、３０個以下であり、また例えば、２０個以下であってもよい。
【０１６７】
オリゴリボヌクレオチドは、式（３）及び式（４）で表される部分構造ほか、その他の部分構造において、一個以上の不斉中心を有する場合があり、立体異性体が存在する場合も同様であって、立体異性体の任意の混合物、又はラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。また互変異性体として存在しうる場合もある。
【０１６８】
オリゴリボヌクレオチドは、塩であってもよい。塩の形態は特に限定されないが、薬学的に許容される塩が好ましい例として挙げられる。塩については、既述の本ヌクレオシド誘導体における塩の態様を適用することができる。オリゴリボヌクレオチド又はその塩としては、水和物や溶媒和物であってもよく、これらも本発明の範囲に含まれる。
【０１６９】
（本ヌクレオシド誘導体及びオリゴリボヌクレオチドの製造）
本ヌクレオシド誘導体及びオリゴリボヌクレオチドは、当業者であれば、後段の具体的な合成例のほか、本願出願時において公知のヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドについての合成技術に基づいて、容易に合成されうる。
【０１７０】
本ヌクレオシド誘導体及びオリゴリボヌクレオチドは、例えば下記の方法により製造できるが、本発明のヌクレオシド類縁体又はオリゴリボヌクレオチドの製造方法は下記の方法に限定されるものではない。
【０１７１】
それぞれの反応において、反応時間は特に限定されないが、後述の分析手段により反応の進行状態を容易に追跡できるため、目的物の収量が最大となる時点で終了すればよい。また、それぞれの反応は必要により、例えば、窒素気流下又はアルゴン気流下などの不活性ガス雰囲気下で行うことができる。それぞれの反応において、保護基による保護及びその後の脱保護が必要な場合は、後述の方法を利用することにより適宜反応を行うことができる。
【０１７２】
なお、本明細書においては、Ｂｎはベンジル基を示し、Ａｃはアセチル基を示し、Ｂｚはベンゾイル基を示し、ＰＭＢはｐ−メトキシベンジル基を示し、Ｔｒはトリフェニルメチル基を示し、ＴＨＡは、トリフルオロアセチル基を示し、ＴｓＯは、トシルオキシ基を示し、ＭＭＴｒは４−メトキシトリフェニルメチル基を示し、ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル基を示し、ＴＭＳはトリメチルシリル基を示し、ＴＢＤＭＳはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基を示し、ＴＢＤＰＳはｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基を示し、ＭＯＭはメトキシメチル基を示し、ＢＯＭはベンジルオキシメチル基を示し、ＳＥＭは２−（トリメチルシリル）エトキシメチル基を示す。
【０１７３】
例えば、本ヌクレオシド誘導体の一例は、以下のスキームに従い合成することができる。なお、以下のスキームは、グルコースを出発物質として、チミンリボヌクレオシド誘導体を合成し、オリゴリボヌクレオチドの合成のためのホスホロアミダイト剤を合成するまでのスキームの一例である。
【０１７４】
【化８】
2019010035.tif 000009
【０１７５】
【化９】
2019010035.tif 000010
【０１７６】
常法に従い、グルコース１から、上記化合物２を取得した。化合物２から、Bioorganic & Medical Chemistry 11(2003)211-2226, Bioorganic & Chemistry letters(1999)2667-2672, The Journal of Organic Chemistry 2013, 78, 9956-9962, HELVATICA CHIMICA ACTA Vol. 83 (2000) 128-151等のほか、Bioorganic & Medical Chemistry 11(2003)211-2226, Bioorganic & Chemistry letters(1999)2667-2672の記載に基づいて化合物３ないし化合物２０を得ることができる。
【０１７７】
式（３）及び（４）で表される部分構造を備えるオリゴリボヌクレオチドは、式（１）又は（２）で表される各種の本ヌクレオシド誘導体を、アミダイト剤等として利用することで容易に製造できる。すなわち、こうしたヌクレオシド誘導体を用いることで、公知のＤＮＡ合成機を用いて合成することができ、得られるオリゴヌクレオチド誘導体は、カラムを用いて精製し、生成物の純度を逆相ＨＰＬＣやＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析することにより、精製されたオリゴリボヌクレオチドを得ることができる。なお、オリゴリボヌクレオチドを酸付加塩とする方法は、当業者に周知である。
【０１７８】
オリゴリボヌクレオチドによれば、リボース４’位に連結基を介して所定のＮ含有基を備えることで、ＲＮＡ干渉能等の生体におけるＲＮＡ機能を維持しつつ、ＲＮＡの実質電荷量を調節でき、脂溶性（ファンデルワールス分子間力）を増強し、ｄｓＲＮＡ溶融温度をさげることを実現できる。これにより、リボヌクレアーゼ耐性を向上させることができるほか、細胞膜透過性を向上させることができる。さらに、リン酸基等によるマイナス電荷を中和し、全体としての電荷を調節することもできる。
【０１７９】
オリゴリボヌクレオチドにおいては、本部分構造を少なくとも２個備えることができる。本部分構造を複数個備えることで、細胞膜透過性、リボヌクレアーゼ耐性等を確実に向上させ、また調整することができる。また、オリゴリボヌクレオチドは、本部分構造を少なくとも３個備えることもできる。
【０１８０】
オリゴリボヌクレオチドにおいては、１個又は２個以上の本部分構造の備える部位は特に限定するものではないが、例えば、５’末端側及び３’末端側のいずれか及び双方に備えることができる。５’末端側及び３’末端側とは、それぞれ、本オリゴヌクレオチドのポリマー鎖の各末端から適数個の範囲の領域をいい、それぞれ、ポリマー鎖の全構成単位の、例えば３０％を超えない構成単位からなる領域をいう。上記末端からの範囲の割合は、ポリマー鎖の全長によっても異なるが、例えば２５％以下、また例えば２０％以下、また例えば１０％以下、また例えば５％以下などとすることができる。より具体的には、５’末端側及び３’末端側とは、例えば各末端から１個〜３０個、また例えば例えば１個〜２５個、また例えば１個〜２０個、また例えば１個〜１５個、また例えば１個〜１０個、また例えば１個〜８個、また例えば１個〜６個、また例えば１個〜５個、また例えば１個〜４個、また例えば１〜３個、また例えば例えば１〜２個のヌクレオシド誘導体由来の構成単位の領域とすることができる。オリゴリボヌクレオチドは、こうした末端領域のいずれかに１個又は２個以上の本部分構造を備えることができる。好ましくは、２個以上備えることができる。また、オリゴリボヌクレオチドは、５’末端及び３’末端（すなわち、各末端から１個目の構成単位）のいずれか又は双方に本部分構造を備えることもできる。
【０１８１】
オリゴリボヌクレオチドにおいては、１個又は２個以上の本部分構造を、５’末端側及び３’末端側以外の部分である中央部に備えることもできる。オリゴリボヌクレオチドが、中央部に本部分構造を備えることで、リボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性の向上や調整が一層容易になる。また、オリゴヌクレオチド全体の電荷の調整もより容易になる。
【０１８２】
オリゴリボヌクレオチドは、５’末端側及び３’末端側のいずれか又は双方と中央部に本部分構造を備えることもできる。好ましくは５’末端側、３’末端側及び中央部の各部に１個又は２個以上の本部分構造を備えることができる。このように、全体として、おおよそ均等にあるいは分散して本部分構造を備えることで、リボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性さらには電荷調節性を向上させることができる。オリゴリボヌクレオチドの中央部には、本部分構造を２個以上備えることが、特性向上の観点から有用である。
【０１８３】
オリゴリボヌクレオチドにおける本部分構造としては、式（３）で表されるリボヌクレオシド誘導体由来する部分構造、式（４）で表されるデオキシリボヌクレオチド誘導体に由来する部分構造を用いることができる。なお、式（３）で表されるリボヌクレオシド誘導体及び式（４）の部分構造は、Ｂの塩基として、ＲＮＡにおける塩基であるウラシル（Ｕ）他を備えることで、リボヌクレオシド誘導体の代替物として用いることができる。
【０１８４】
また、本部分構造は、式（３）及び（４）におけるＲ3が、炭素数１又は２以上のアルキレン基を連結基として、ＮＨＲ7を有することが、リボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性さらには電荷調節性の観点から好適である。この場合、Ｒ7は、水素原子であってもよいし、炭素数１〜６程度のアルキル基を有するアシル基であってもよい。当該アルキレン基は、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基などとすることができる。また、例えばエチレン基、プロピレン基、ブチレン基などとすることができる。また例えば例えばエチレン基、プロピレン基などとすることができる。エチレン基、プロピレン基を連結基とすることで、メチレン基を用いた場合に比較して高いリボヌクレアーゼ耐性と細胞膜透過性さらには電荷調節性とを得ることができる。
【０１８５】
また、本部分構造は、連結基を備えるアミジノ基、アジド基及びグアニジノ基であってもよい。かかる官能基を備えることでも、高いリボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性を得ることができる。この場合、連結基は、炭素数１以上のアルキレン基であってもよい。
【０１８６】
また、本部分構造は、式（３）及び式（４）のＲ3の連結基が炭素数１〜６程度のアルキル基、さらに、例えば、炭素数の下限が２以上、また例えば３以上であることが好適である。かかる構造は、リボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性に有効である。
【０１８７】
オリゴリボヌクレオチドは、少なくとも本部分構造を少なくとも６個備えることが好適である。６個以上備えることで、リボヌクレアーゼ耐性や細胞膜透過性、さらには電荷調節性に有利である。
【０１８８】
本コンジュゲートにおけるオリゴリボヌクレオチドにおいては、細胞質内において実質的に機能するＲＮＡ鎖ではないＲＮＡ鎖やその部分において、本部分構造を備えることが好適である。例えば、本コンジュゲートが、オリゴリボヌクレオチドの二重鎖を備えるｓｉＲＮＡを意図する場合には、センス鎖に本部分構造を備えることで、本コンジュゲートの細胞透過性とヌクレアーゼ耐性とを期待することができる。また、ｓｉＲＮＡ以外の短鎖ＲＮＡへの導入に関しては、ＲＮＡの立体構造上表面に位置する箇所へは本部分構造を備えるようにし、５’末端及び／又は３‘末端へは、本試薬を備えるようにすることが好ましい。
【０１８９】
本コンジュゲートは、例えば、ｓｉＲＮＡとして利用できる。すなわち、オリゴリボヌクレオチド二重鎖を備える本コンジュゲートは、生体内成分（ＲＩＳＣタンパク質）と複合体を形成して、配列特異的にｍＲＮＡを切断することにより、ｍＲＮＡ上の情報がリボソームにより特定のタンパク質へ翻訳されることをできなくする。また、ｍｉＲＮＡを構成する構成物として、あるいはまたアプタマーＲＮＡの構成物としても取り込まれて、リボヌクレアーゼ耐性や細胞膜透過性向上の特徴を生かしつつ、利用できると考えられる。さらに、他の化合物と連結してコンジュゲートを構成することもできる。さらにまた、本コンジュゲートは、リボザイムの構成物としても利用できる。
【０１９０】
これらのことから本コンジュゲートは、天然ヌクレオチドにはない特徴を生かして、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤をはじめとする遺伝子の働きを阻害して疾病を治療する種々のＲＮＡ医薬品の構成物として、天然ヌクレオチドに優る有用性が期待される。すなわち、本コンジュゲートは、こうしたＲＮＡ医薬のほか、その原料又は中間体試薬として有用である。
【０１９１】
本コンジュゲートにおけるオリゴリボヌクレオチドの電荷調節性、リボヌクレアーゼ耐性、細胞膜透過性、電荷調節能ならびにオリゴリボヌクレオチドを含む種々のＲＮＡの生物活性については、当業者であれば、適宜、後述する実施例や本願出願時における当業者の周知の手法を参照することで容易に評価することができる。  
【実施例】
【０１９２】
以下、本明細書の開示をより具体的に説明するために具体例としての実施例を記載する。以下の実施例は、本明細書の開示を説明するためのものであって、その範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１９３】
（アミノ修飾アミダイトの合成）
本実施例では、以下のスキームに従い、細胞接着性モチーフ（ＲＧＤモチーフ）単位導入用モノマーとして以下の化合物５を合成した。
【０１９４】
【化１０】
2019010035.tif 000011
【０１９５】
6-trifluoroacetamido-hexanoic acid (3)
アルゴン雰囲気下、６−ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ（２）（０．６０ｇ，４．５７ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１５ｍＬ）に溶解させた。続いてＴＥＡ（１．０ｍＬ、６．８６ｍｍｏｌ）、ＣＦ３ＣＯＯＥｔ（０．８ｍＬ，６．８６ｍｍｏｌ）を加え室温で一晩撹拌した。得られた反応液を減圧濃縮し、化合物３（０．４５ｇ，１．９８ｍｍｏｌ，４３％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.36 (s, 1H), 3.39 (dd, 2H, J = 6.9), 2.39 (t, 2H, J = 7.3), 1.70-1.60 (m, 4H), 1.16-1.09 (m, 2H).
【０１９６】
(S)-3-[(6-trifluoroacetamido)hexanamido]-1-(4,4’-dimethoxytrityloxy)-2-propanol (4)
アルゴン雰囲気下、化合物３（０．４５ｇ，１．９８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させた。続けてＴＥＡ（０．４ｍＬ，１．９８ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させた化合物１１，２（０．６５ｇ，１．６５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣｌ（０．３８ｇ，１．９８ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．２４ｇ，１．９８ｍｍｏｌ）を加え室温で一晩撹拌した。生成物を酢酸エチルとＨ２Ｏで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。揮発性溶媒をエバポレータにより減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝３０：１）にて精製することで、化合物４（０．７８ｇ，１．２８ｍｍｏｌ，７８％）を得た。
【０１９７】
(S)-3-[(6-trifluoroacetamido)hexanamido]-1-(4,4’-dimethoxytrityloxy)propyl-2-O-[(2-cyanoethyl)(N,N-diisopropylamino)]phosphoramidite (5)
アルゴン雰囲気下、化合物４（０．６４ｇ，１．０６ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２に溶解させた。続けてＤＩＰＥＡ（０．７ｍＬ，４．２４ｍｍｏｌ）、２−ＣｙａｎｏｅｔｈｙｌＮ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（０．５ｍＬ，２．１２ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間撹拌した。生成物をクロロホルムとＨ２Ｏで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。揮発性の溶媒をエバポレーターにより減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：２）にて精製し、化合物５（０．４３ｇ，０．５４ｍｍｏｌ，５１％）を得た。
31P NMR (242 MHz, CDCl3) δ 149.7, 149.0.
【実施例２】
【０１９８】
（固相担体の合成）
本実施例では、以下のスキームに従い、細胞接着性モチーフ単位導入用モノマーが結合された固相担体として以下の化合物を合成した。
【０１９９】
【化１１】
2019010035.tif 000012
【０２００】
実施例１で合成した化合物４（０．１０ｇ，０．１７ｍｍｏｌ）、ｓｕｃｃｉｎｉｃａｎｈｙｄｒｉｄｅ（０．１０ｇ，１．００ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（６１ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）をｐｙｒｉｄｉｎｅ（２ｍＬ）に溶解し、室温で一晩撹拌した。生成物を酢酸エチルとＨ２Ｏで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。揮発性溶媒をエバポレーターで減圧濃縮し、スクシニル体を得た。続けて、Ａｒ雰囲気下でスクシニル体をＤＭＦ（１．７ｍＬ）に溶解し、ＥＤＣ（３２ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）、ＣＰＧ樹脂（０．２６ｇ，０．０４ｍｍｏｌ）を加えて室温で３日間静置した。ＣＰＧ樹脂をフィルターに移し、Ｐｙｒｉｄｉｎｅで洗浄した後、Ａｒ雰囲気下でｐｙｒｉｄｉｎｅ（５ｍＬ）、ＤＭＡＰ（０．１８ｇ，１．４７ｍｍｏｌ）、Ａｃｅｔｉｃａｎｈｙｄｒｉｄｅ（１．５ｍＬ，１５．８７ｍｍｏｌ）を加え一晩静置した。ＣＰＧ樹脂をフィルターに移し、Ｐｙｒｉｄｉｎｅ、ＥｔＯＨ、ＭｅＣＮで洗浄後、樹脂を乾燥し目的の固相担体を導入効率２５．８μｍｏｌ／ｇで得た。
【実施例３】
【０２０１】
（スペーサーアミダイトの合成）
本実施例では、以下のスキームに従い、スペーサー単位導入用モノマーとして、以下の化合物８を合成した。
【０２０２】
【化１２】
2019010035.tif 000013
【０２０３】
18-O-Dimethoxytritylhexaethyleneglycol (7)
Ａｒ雰囲気下、Ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｇｌｙｃｏｌ（６）（１．７ｍＬ，５．３１ｍｍｏｌ）をｐｙｒｉｄｉｎｅ（３０ｍＬ）に溶解し、ＤＭＴｒＣｌ（１．３６ｇ，４．００ｍｍｏｌ）を加えて室温で一晩撹拌した。生成物を酢酸エチルとＨ２Ｏで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。揮発性溶媒をエバポレーターで減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝２０：１）で精製し、化合物７（１．４９ｇ，２．５５ｍｍｏｌ，４８％）で得た。
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.46 (d, 2H, J = 7.56), 7.35-7.33 (m, 4H), 7.28 (d, 2H, J = 7.56), 7.20 (t, 1H, J= 7.56), 6.83-6.80 (m, 4H), 3.78 (s, 6H), 3.70 (m, 2H,), 3.69-3.63 (m, 17H), 3.59 (t, 2H, J = 4.80), 3.22 (t, 2H, J= 5.46), 1.99 (s, 1H).
【０２０４】
18-O-Dimethoxytritylhexaethyleneglycol-1-[(2-cyanoethyl)(N,N-diisopropylamino)]phosphoramidite (8)
アルゴン雰囲気下、化合物７（１．４９ｇ，２．５５ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２に溶解させた。続けてＤＩＰＥＡ（１．８ｍＬ，１０．２０ｍｍｏｌ）、２−ＣｙａｎｏｅｔｈｙｌＮ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（１．１ｍＬ，５．１０ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間撹拌した。生成物をクロロホルムとＨ２Ｏで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。揮発性の溶媒をエバポレーターにより減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：２）にて精製し、化合物８（１．０８ｇ，１．３８ｍｍｏｌ，５４％）を得た。
31P NMR (242 MHz, CDCl3) δ 149.9, 148.9.
【実施例４】
【０２０５】
（オリゴヌクレオチド誘導体の合成）
核酸自動合成機を用いてホスホロアミダイト法に従い、実施例１〜３で合成した細胞接着性モチーフ単位導入用モノマー、固相担体及びスペーサー単位導入用モノマー及び各種ヌクレオチドを用いて、０．２μｍｏｌスケールでオリゴヌクレオチド誘導体を合成した。塩基の脱保護と樹脂からの切り出しは、ＮＨ４ＯＨ：ＥｔＯＨ＝３：１溶液１ｍＬ中で５５°Ｃ、４時間インキュベートにより行った。糖部２’−位のＴＢＤＭＳ基の脱保護は、ＤＭＳＯ１００μＬ、ＴＥＡ・３ＨＦ１２５μＬ溶液中で６５°Ｃ、１．５時間インキュベートにより行った。更に、７Ｍ ｕｒｅａを含む２０％ＰＡＧＥを用いて精製を行い、目的の配列のオリゴヌクレオチドを合成した。
【０２０６】
以下の表中、０Ｎ１、３及び７がＲｅｃＱＬ１ＲＮＡの化学修飾したガイド鎖であり、ＯＮ２、４、５及び６が、ＲｅｃＱＬ１ＲＮＡの天然及び化学修飾したパッセンジャー鎖であり、ＯＮ８がルシフェラーゼＲＮＡの天然ガイド鎖であり、ＯＮ９がルシフェラーゼのＲＧＤ修飾したパッセンジャー鎖である。
【０２０７】
【表１】
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【０２０８】
なお、表中、小文字の塩基は２’−ＯＭｅヌクレオチドを表し、アンダーバーの塩基はリボースの２’−Ｆヌクレオチドを表し、ｐは、ＰＥＧスペーサー単位導入用モノマーを表し、Ｘは細胞接着性モチーフ単位としてｃＲＧＤを有する細胞接着性モチーフ単位導入用モノマーを表し、「・」は、ホスホロチオエート結合を表す。
【実施例５】
【０２０９】
（cRGDコンジュゲートオリゴヌクレオチドの合成）
実施例４で合成したオリゴヌクレオチド誘導体（２０ｎｍｏｌ）を３２０μＬの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）に溶解し、５０ｍＭ ６−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｏｉｃａｃｉｄＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅｅｓｔｅｒ（ＥＭＣＳ）／ＤＭＳＯ溶液を８０μＬ（４００ｎｍｏｌ）加え、室温で一晩インキュベートした。マレイミド化したオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣで分取し、回収した溶液に、５０ｍＭｃＲＧＤ（フナコシ株式会社製、構造式を以下に示す。）／ＤＭＳＯ溶液１６μＬ（８０ｎｍｏｌ）を直接加えた。室温で一晩インキュベートして、マイケル付加反応により、オリゴリボヌクレオチド誘導体のマレイミド基と、ｃＲＧＤのチオール基とを連結させた後、反応液をＨＰＬＣで精製し、目的のｃＲＧＤオリゴヌクレオチドコンジュゲートを得た。
【０２１０】
【化１３】
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【実施例６】
【０２１１】
（蛍光顕微鏡による観察）
メラノーマ細胞Ａ２０５８を０．３×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬで３５ｍｍガラスボトムディッディッシュに播種し、ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。培地を除去した後、ディッシュをＯＰＴＩ−ＭＥＭで洗浄し、実施例４及び５で調製したオリゴリボヌクレオチド誘導体２５０ｎＭを用いてｓｉＲＮＡコンジュゲートＭ／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ溶液を添加した。なお、用いたｓｉＲＮＡは、以下の組合せとした。
【０２１２】
ｓｉＲＮＡ（１）：ＯＮ３／ＯＮ２：ｃＲＧＤモチーフ単位及びスペーサー単位を備えない
ｓｉＲＮＡ（２）：ＯＮ３／ＯＮ４：ｃＲＧＤモチーフ３個を備えスペーサー単位を備えない
ｓｉＲＮＡ（３）：ＯＮ３／ＯＮ５：ｃＲＧＤモチーフ３個を備えスペーサー単位１個を備える
ｓｉＲＮＡ（４）：ＯＮ３／ＯＮ６：ｃＲＧＤモチーフ３個とスペーサー単位３個を交互に備える
【０２１３】
ディッシュにｓｉＲＮＡを添加後、ＣＯ２インキュベーターで１８時間培養し、その後Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を終濃度２５μｇ／ｍＬとなるように添加した。ＣＯ２インキュベーターで１０分間培養した後、染色試薬を除去し、ディッシュをＰＢＳで洗浄した。ディッシュにＰＢＳを添加し、蛍光顕微鏡で細胞を観察した。結果を図４に示す。
【０２１４】
図４に示すように、ｃＲＧＤモチーフとスペーサー単位とを組み合わせることによって、細胞内取り込みが向上していることがわかった。特に、ｃＲＧＤモチーフとスペーサー単位とを交互に３個備えて、ｃＲＧＤモチーフ間がスペーサー単位で離間された構造を備えるｓｉＲＮＡ（４）は、高い細胞内取り込み率を示した。
【０２１５】
（ウェスタンブロッティング）
メラノーマ細胞Ａ２０５８を０．３×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬで６ｗｅｌｌプレートに播種し、ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。培地を除去した後、６ｗｅｌｌプレートをＯＰＴＩ−ＭＥＭで洗浄し、実施例４及び５で合成したオリゴリボヌクレオチド誘導体を用いた５０ｎＭまたは２５０ｎＭのｓｉＲＮＡコンジュゲート／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ溶液を添加した。ＣＯ２インキュベーターで１８時間培養した後、全細胞を回収し、ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１％ＮＰ−４０，０．１％ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ，０．１％ＳＤＳ，１５０ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，１％Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ）を加えて２０分間氷上に静置した。
【０２１６】
ｓｉＲＮＡ（４）：ＯＮ７／ＯＮ２：ｃＲＧＤモチーフ単位及びスペーサー単位を備えない
ｓｉＲＮＡ（５）：ＯＮ８／ＯＮ９：ｃＲＧＤモチーフ３個とスペーサー単位３個を交互に備える
ｓｉＲＮＡ（６）：ＯＮ７／ＯＮ６：ｃＲＧＤモチーフ３個とスペーサー単位３個を交互に備える
【０２１７】
得られた細胞懸濁液を４°Ｃ、１３０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、上清をタンパク溶液として回収した。溶液中の濃度はＤＣｐｒｏｔｅｉｎａｓｓａｙｋｉｔ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）で測定した。１０μｇのタンパク溶液を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦメンブレン上にブロッティングした。メンブレンを５％スキムミルク溶液でブロッキング処理し、ＲｅｃＱＬ１抗体溶液中、４°Ｃで一晩静置した。メンブレンを洗浄し、ＨＲＰ結合２次抗体を加えて１時間浸透した後、ＡｍｍｅｒｓｈａｍＥＣＬＰｌｕｓＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇＤｅｔｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）をメンブレン上に直接添加し、ＲｅｃＱＬ１タンパクを検出した。結果を図５に示す。
【０２１８】
図５に示すように、ｓｉＲＮＡ（４）（ｓｉ−ＲｅｃＱＬ１）とｓｉＲＮＡ（６）（ｓｉ−ＲｅｃＱＬ１＋ＲＧＤ）を比較すると、＋ＲＧＤでのみタンパク質の発現量の減少が見られた。これはＲＧＤ修飾がなければｓｉＲＮＡが細胞内に取り込めないのに対し、本試薬によるＲＧＤ修飾によってｓｉＲＮＡが効率的に細胞内に取り込まれたことを示している。さらに、ｓｉＲＮＡ（５）（ｓｉ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ＋ｃＲＧＤ）とｓｉＲＮＡ（６）（ｓｉ−ＲｅｃＱＬ１＋ＲＧＤ）とを比較すると、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの方ではタンパク質の発現量に変化が見られていない。このことから、ｓｉ−ＲｅｃＱＬ１＋ＲＧＤはＲｅｃＱＬ１  ｍＲＮＡに対して選択的に働き、ｓｉ−ＲｅｃＱＬ１のＲＮＡｉ活性によってタンパク質の発現が抑制されたことが明らかとなった。以上のことから、本試薬によるＲＧＤ修飾様式によってｓｉＲＮＡの効率的な細胞内取り込み及びＲＩＳＣ形成を介したＲＮＡｉ活性による標的遺伝子の発現抑制を可能にすることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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