(57)【要約】【課題】本発明の課題は、煩雑な培養方法又は高価な装置を用いるのではなく、簡便かつ効率的に、ワックスエステル高含有ユーグレナを製造する方法、及びユーグレナからワックスエステルを大量に生産する増加剤を提供することである。  本発明の他の課題は、ユーグレナの遺伝子組み換え体を使わずに、安全にユーグレナからワックスエステルを増産させることである。  本発明の他の課題は、ユーグレナから燃料に適した炭素鎖長の長いワックスエステルを増産させることである。  本発明の他の課題は、貯蔵多糖パラミロンの分解及びワックスエステル発酵の促進する方法の提供である。【解決手段】ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させる工程を含む、ワックスエステル高含有ユーグレナの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させる工程を含む、ワックスエステル高含有ユーグレナの製造方法。
【請求項２】
ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させる工程を含む、ワックスエステルの製造方法。
【請求項３】
ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させる工程を含む、ワックスエステルの増加方法。
【請求項４】
ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させる工程を含む、炭素鎖長の長いワックスエステルの増加方法。
【請求項５】
ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させる工程を含む、ワックスエステル発酵の促進方法。
【請求項６】
ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させる工程を含む、貯蔵多糖パラミロンの分解促進方法。
【請求項７】
前記芳香環化合物が、芳香族炭素環化合物又は芳香族複素環化合物である、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記芳香族炭素環化合物が、単環炭素環化合物、２環式炭素環化合物又は３環式炭素環化合物である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記芳香族炭素環化合物が、ナフタレン化合物、ナフトキノン化合物、アントラセン化合物、アントロン化合物又はアントラキノン化合物である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記芳香族複素環化合物が、含窒素複素環化合物である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記含窒素複素環化合物が、ピリジン化合物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れか一項に記載の方法で製造されたことを特徴とする燃料油。
【請求項１３】
置換基を有していてもよい芳香環化合物を有効成分として含有する、ユーグレナ由来のワックスエステル増加剤。
【請求項１４】
置換基を有していてもよい芳香環化合物を有効成分として含有する、炭素鎖長の長いワックスエステルの増加剤。
【請求項１５】
置換基を有していてもよい芳香環化合物を有効成分として含有する、ユーグレナのワックスエステル発酵促進剤。
【請求項１６】
置換基を有していてもよい芳香環化合物を有効成分として含有する、貯蔵多糖パラミロンの分解促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はワックスエステル高含有ユーグレナの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユーグレナ（属名：Euglena、和名：ミドリムシ）は、バイオ燃料、食品等への利用が期待されることから、近年、非常に注目されている。
【０００３】
このユーグレナは、好気的条件下で貯蔵多糖パラミロン（β-1,3グルカン）を大量に蓄積し、次いで、嫌気的条件に移行すると、該パラミロンを分解し脂肪酸と脂肪族アルコールとがエステル結合したワックスエステル（以下、「WE」ということもある。）を合成すること（以下、「WE発酵」ということもある。）が知られている（特許文献１）。
【０００４】
当該ワックスエステルは、工業用原料、ジェット燃料等としての利用価値が高く、現在、多くの企業及び大学が、ワックスエステルの増産に関する研究を精力的に行っている。
【０００５】
例えば、特許文献１には、微細藻ユーグレナを好気的に培養する第１の工程と、前記微細藻ユーグレナが培養されている培地を窒素飢餓状態としてさらに培養する第２の工程と、細胞を嫌気状態下に保持する第３の工程とから成るワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法が記載されている。
【０００６】
しかしながら、この特許文献１に記載の方法は、煩雑な培養方法を用いるものであって、ワックスエステルの生産量も満足できるものではなかった。
【０００７】
また、近年、ワックスエステルを多く産生するユーグレナ変異体を選抜する品種改良法の開発に成功したことが報告された（非特許文献１）。この方法は、ユーグレナに変異原処理（重イオンビーム照射）を行い、様々な特徴をもったユーグレナが含まれる集団を作りだし、それと併せて、脂質蛍光染色法によりユーグレナ細胞内に蓄積された油脂を可視化し、蛍光強度の違いを利用して、作り出した多様な細胞集団の中から特に油脂を多く含むユーグレナを取得する方法である。
【０００８】
しかしながら、この方法は、非常に高価な装置、かつ煩雑な工程を必要とするものであって、また、ワックスエステル等の油脂が野生株より約40%程度多く含むユーグレナ変異体を取得できたにすぎなかった。そこで、高価な装置を使わずに、簡便かつ効率的にワックスエステルを増産する方法が切望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第５０５２６５２号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Scientific Reports 6, Article number: 26327 (2016)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、煩雑な培養方法又は高価な装置を用いるのではなく、簡便かつ効率的に、ワックスエステル高含有ユーグレナを製造する方法、及びユーグレナからワックスエステルを増加させる増加剤を提供することである。
【００１２】
本発明の他の課題は、ユーグレナの遺伝子組み換え体を使わずに、安全にユーグレナからワックスエステルを増産させる方法を提供することである。
【００１３】
本発明の他の課題は、ユーグレナから燃料に適した炭素鎖長の長いワックスエステルを増産させる方法を提供することである
【００１４】
本発明の他の課題は、貯蔵多糖パラミロンの分解及びワックスエステル発酵の促進する方法の提供である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、置換基を有していてもよい芳香環化合物を用いることによって、ユーグレナ由来のワックスエステルを増加できることを見出した。本発明は、このような知見に基づき完成されたものである。
【００１６】
すなわち、本発明は、下記に示すワックスエステル高含有ユーグレナを製造する方法等に関する。
項１．
ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させる工程を含む、ワックスエステル高含有ユーグレナの製造方法。
項２．
ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させる工程を含む、ワックスエステルの製造方法。
項３．
ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させる工程を含む、ワックスエステルの増加方法。
項４．
ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させる工程を含む、炭素鎖長の長いワックスエステルの増加方法。
項５．
ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させる工程を含む、ワックスエステル発酵の促進方法。
項６．
ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させる工程を含む、貯蔵多糖パラミロンの分解促進方法。
項７．
前記芳香環化合物が、芳香族炭素環化合物又は芳香族複素環化合物である、項１〜６の何れか一項に記載の方法。
項８．
前記芳香族炭素環化合物が、単環炭素環化合物、２環式炭素環化合物又は３環式炭素環化合物である、項７に記載の方法。
項９．
前記芳香族炭素環化合物が、ナフタレン化合物、ナフトキノン化合物、アントラセン化合物、アントロン化合物又はアントラキノン化合物である、項７又は８に記載の方法。
項１０．
前記芳香族複素環化合物が、含窒素複素環化合物である、項７に記載の方法。
項１１．
前記含窒素複素環化合物が、ピリジン化合物である、項１０に記載の方法。
項１２．
項１〜１１の何れか一項に記載の方法で製造されたことを特徴とする燃料油。
項１３．
ジェット燃料用である、項１２に記載の燃料油。
【００１７】
項１４．
置換基を有していてもよい芳香環化合物を有効成分として含有する、ユーグレナ由来のワックスエステル増加剤。
項１５．
前記芳香環化合物が、芳香族炭素環化合物又は芳香族複素環化合物である、項１４に記載のユーグレナ由来のワックスエステル増加剤。
項１６．
前記芳香族炭素環化合物が、単環炭素環化合物、２環式炭素環化合物又は３環式炭素環化合物である、項１５に記載のユーグレナ由来のワックスエステル増加剤。
項１７．
前記芳香族炭素環化合物が、ナフタレン化合物、ナフトキノン化合物、アントラセン化合物、アントロン化合物又はアントラキノン化合物である、項１５又は１６に記載のユーグレナ由来のワックスエステル増加剤。
項１８．
前記芳香族複素環化合物が、含窒素複素環化合物である、項１５に記載のユーグレナ由来のワックスエステル増加剤。
項１９．
前記含窒素複素環化合物が、ピリジン化合物である、項１８に記載のユーグレナ由来のワックスエステル増加剤。
【００１８】
項２０．
置換基を有していてもよい芳香環化合物を有効成分として含有する、炭素鎖長の長いワックスエステルの増加剤。
項２１．
前記芳香環化合物が、芳香族炭素環化合物又は芳香族複素環化合物である、項２０に記載の炭素鎖長の長いワックスエステルの増加剤。
項２２．
前記芳香族炭素環化合物が、単環炭素環化合物、２環式炭素環化合物又は３環式炭素環化合物である、項２１に記載の炭素鎖長の長いワックスエステルの増加剤。
項２３．
前記芳香族炭素環化合物が、ナフタレン化合物、ナフトキノン化合物、アントラセン化合物、アントロン化合物又はアントラキノン化合物である、項２１又は２２に記載の炭素鎖長の長いワックスエステルの増加剤。
項２４．
前記芳香族複素環化合物が、含窒素複素環化合物である、項２１に記載の炭素鎖長の長いワックスエステルの増加剤。
項２５．
前記含窒素複素環化合物が、ピリジン化合物である、項２４に記載の炭素鎖長の長いワックスエステルの増加剤。
【００１９】
項２６．
置換基を有していてもよい芳香環化合物を有効成分として含有する、ユーグレナのワックスエステル発酵促進剤。
項２７．
前記芳香環化合物が、芳香族炭素環化合物又は芳香族複素環化合物である、項２６に記載のユーグレナのワックスエステル発酵促進剤。
項２８．
前記芳香族炭素環化合物が、単環炭素環化合物、２環式炭素環化合物又は３環式炭素環化合物である、項２７に記載のユーグレナのワックスエステル発酵促進剤。
項２９．
前記芳香族炭素環化合物が、ナフタレン化合物、ナフトキノン化合物、アントラセン化合物、アントロン化合物又はアントラキノン化合物である、項２７又は２８に記載のユーグレナのワックスエステル発酵促進剤。
項３０．
前記芳香族複素環化合物が、含窒素複素環化合物である、項２７に記載のユーグレナのワックスエステル発酵促進剤。
項３１．
前記含窒素複素環化合物が、ピリジン化合物である、項３０に記載のユーグレナのワックスエステル発酵促進剤。
【００２０】
項３２．
置換基を有していてもよい芳香環化合物を有効成分として含有する、貯蔵多糖パラミロンの分解促進剤。
項３３．
前記芳香環化合物が、芳香族炭素環化合物又は芳香族複素環化合物である、項３２に記載の貯蔵多糖パラミロンの分解促進剤。
項３４．
前記芳香族炭素環化合物が、単環炭素環化合物、２環式炭素環化合物又は３環式炭素環化合物である、項３３に記載の貯蔵多糖パラミロンの分解促進剤。
項３５．
前記芳香族炭素環化合物が、ナフタレン化合物、ナフトキノン化合物、アントラセン化合物、アントロン化合物又はアントラキノン化合物である、項３３又は３４に記載の貯蔵多糖パラミロンの分解促進剤。
項３６．
前記芳香族複素環化合物が、含窒素複素環化合物である、項３３に記載の貯蔵多糖パラミロンの分解促進剤。
項３７．
前記含窒素複素環化合物が、ピリジン化合物である、項３６に記載の貯蔵多糖パラミロンの分解促進剤。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、煩雑な培養方法又は高価な装置を用いることなく、簡便かつ効率的に、ユーグレナからワックスエステルを増加させることができる。
【００２２】
本発明によれば、ユーグレナの遺伝子組換え体を使わないことから、遺伝子組換え体が実験室外又は実験区域外に拡散する心配が無く、安全にユーグレナからワックスエステルを増産させることができる。
【００２３】
本発明によれば、ユーグレナから燃料に適した炭素鎖長の長いワックスエステルを増産させることができる。
【００２４】
本発明によれば、貯蔵多糖パラミロンの分解及びワックスエステル発酵を促進させることができる。これによって、ワックスエステルの生産効率が飛躍的に向上し、生産コストが低くなることが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、本発明のワックスエステル増加剤を用いる一実施態様を示す工程図である。
【図２】図２は、実施例1a-6(OATQ008)とDMSO区におけるWE蓄積量の時間変化を示した図である。
【図３】図３は、実施例1a-6(OATQ008)とDMSO区におけるパラミロンの分解量を示した図である。
【図４】図４は、実施例1a-6(OATQ008)とDMSO区における炭素鎖長ごとのWE量を示した図である。
【図５】図５は、実施例1a-1(OATQ003)〜1a-5(OATQ007)とDMSO区における炭素鎖長ごとのWE量を示した図である。
【図６】図６は、実施例1b-1(OATC003)、1b-2(OATC004)、1b-3(OATC006)、1b-4（OATC007）、1b-6(OATC008)とDMSO区における炭素鎖長ごとのWE量を示した図である。
【図７】図７は、実施例1c-1(OATN001)、1c-2(OATN003)とDMSO区における炭素鎖長ごとのWE量を示した図である。
【図８】図８は、実施例1d-1(ONAQ001)、1d-8(ONAQ008)、1d-9(ONAQ009)とDMSO区における炭素鎖長ごとのWE量を示した図である
【図９】図９は、実施例1e-1(ONAP008)、1e-4(ONAP011)、1e-5(ONAP013)、1e-8(ONAP017) 、1e-11(ONAP020)とDMSO区における炭素鎖長ごとのWE量を示した図である。
【図１０】図１０は、無処理区とDMSO区におけるユーグレナ1×106 cell中の総WE質量（μg）を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２７】
ワックスエステル高含有ユーグレナの製造方法
本発明は、ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させる工程を含む、ワックスエステル高含有ユーグレナの製造方法（以下、「ワックスエステル高含有ユーグレナの製造方法」ということもある。）である。すなわち、該ワックスエステル高含有ユーグレナは、ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させることで得ることができる。
【００２８】
ワックスエステルの製造方法
本発明は、ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させる工程を含む、ワックスエステルの製造方法（以下、「ワックスエステルの製造方法」ということもある。）である。すなわち、該ワックスエステルは、ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させることで得ることができる。
【００２９】
ワックスエステルの増加方法
本発明は、ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させる工程を含む、ワックスエステルの増加方法（以下、「ワックスエステルの増加方法」ということもある。）である。すなわち、該ワックスエステルは、ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させることで増加させることができる。
【００３０】
炭素鎖長の長いワックスエステルの増加方法
本発明は、ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させる工程を含む、炭素鎖長の長いワックスエステルの増加方法（以下、「炭素鎖長の長いワックスエステルの増加方法」ということもある。）である。すなわち、炭素鎖長の長いワックスエステルは、ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させることで増加させることができる。
【００３１】
本発明によれば、炭素数２４〜３２程度の直鎖状の飽和脂肪酸エステルの中でも、より炭素鎖長の長い（例えば、炭素数２９〜３２、好ましくは炭素数３０〜３２、より好ましくは炭素数３０の）ワックスエステルを製造することができる。炭素鎖長の長い（炭素数が大きい）ワックスエステルは、ジェット燃料に好適である。
【００３２】
ワックスエステル発酵の促進方法
本発明は、ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させる工程を含む、ワックスエステル発酵の促進方法（以下、「ワックスエステル発酵の促進方法」ということもある。）である。すなわち、ユーグレナ中のワックスエステル発酵（ワックスエステルの蓄積）は、ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させることで促進させることができる。これによって、ワックスエステルの生産効率が飛躍的に向上し、生産コストが低くなることが期待できる。また、ユーグレナを利用したバイオマス変換の潜在力をほぼ100%利用することができる。
【００３３】
貯蔵多糖パラミロンの分解（促進）方法
本発明は、ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させる工程を含む、貯蔵多糖パラミロンの分解促進方法（以下、「貯蔵多糖パラミロンの分解促進方法」ということもある。）である。すなわち、ユーグレナ中の貯蔵多糖パラミロンの分解は、ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物（以下、「芳香環化合物」ということもある。）を作用させることで促進させることができる。これによって、ワックスエステルの生産効率が飛躍的に向上し、生産コストが低くなることが期待できる。また、ユーグレナを利用したバイオマス変換の潜在力をほぼ100%利用することができる。
【００３４】
本発明において用いる化合物の用語について以下説明する。
【００３５】
「芳香環化合物」としては、特に限定はなく、例えば、芳香族炭素環化合物、芳香族複素環化合物等が挙げられる。
【００３６】
「芳香族炭素環化合物」としては、特に限定はなく、例えば、ベンゼン環、ベンゾキノン環等の単環炭素環；ペンタレン環、インデン環、ナフタレン環、ナフトキノン環、ジヒドロ−１，４−ナフトキノン環、アズレン環、ヘプタレン環、ビフェニレン環、インダセン環、アセナフチレン環、フルオレン環、フェナレン環、フェナントレン環、アントラセン環、アントロン環、アントラキノン環等の炭素数６〜１４の芳香族炭化水素環基（縮合炭素環、２環式又は３環式等ともいう）を有する化合物が挙げられる。
【００３７】
かかる芳香族炭素環化合物として好ましくは、ベンゼン環、ナフタレン環、ナフトキノン環、ジヒドロ−１，４−ナフトキノン環、フェナントレン環、アントラセン環、アントロン環、及びアントラキノン環であり、より好ましくは、ナフタレン環、ナフトキノン環、ジヒドロ−１，４−ナフトキノン環、フェナントレン環、アントラセン環、アントロン環、及びアントラキノン環である。
【００３８】
「芳香族複素環化合物」としては、特に限定はなく、例えば、単環ヘテロ環、縮合ヘテロ環（２環式又は３環式）等を有する化合物が挙げられ、窒素原子、硫黄原子及び酸素原子から群より選ばれるヘテロ原子を１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個含有していてもよい。
【００３９】
該芳香族複素環化合物として具体的には、例えば、ピロール環、ピリジン環、ピリドン環、ピリダジン環、ピリミジン環、ピラジン環、ピラゾール環、イミダゾール環等の含窒素単環ヘテロ環；インドール環、イソインドール環、インドリジン環、プリン環、インダゾール（ベンズピラゾール）環、キノリン環、イソキノリン環、キノリジン環、フタラジン環、ナフチリジン環、キノキサリン環、キナゾリン環、シンノリン環、プテリジン環等の含窒素縮合２環式ヘテロ環；ベンズイソキノリン環、アクリジン環、フェナントリジン環、カルバゾール環、ペリミジン環、フェナントロリン環等の含窒素縮合３環式ヘテロ環；チオフェン環等の含硫黄単環ヘテロ環；ベンゾチオフェン環等の含硫黄縮合２環式ヘテロ環；フラン環、ピラン環等の含酸素単環ヘテロ環；ベンゾフラン環、イソベンゾフラン環等の含酸素縮合２環式ヘテロ環；チアゾール環、イソチアゾール環等の含硫黄酸素単環ヘテロ環；ベンズチアゾール環、ベンズチアジアゾール環等の含硫黄酸素２環式ヘテロ環；フェノチアジン環等の含硫黄酸素縮合３環式ヘテロ環；イソキサゾール環、フラザン環等の含窒素酸素単環ヘテロ環；ピラゾロオキサゾール環等の含窒素酸素２環式ヘテロ環；フェノキサジン環等の含窒素酸素縮合３環式ヘテロ環；イミダゾチアゾール環等の含窒素硫黄２環式ヘテロ環等が挙げられる。
【００４０】
かかる「芳香族複素環」としては、好ましくはピロール環、ピリジン環、ピリドン環、ピリミジン環、イミダゾール環、インドール環、キノリン環、イソキノリン環、キノリジン環、フタラジン環、ナフチリジン環、キナゾリン環、ベンズイソキノリン環、アクリジン環、チオフェン環、ベンゾチオフェン環、フラン環、ピラン環、ベンゾフラン環、チアゾール環、ベンズチアゾール環、及びフェノチアジン環であり、より好ましくはピリジン環、ベンズイソキノリン環、及びアクリジン環であり、特に好ましくはピリジン環である。
【００４１】
「置換基を有していてもよい芳香環化合物」における「置換基」としては、特に限定はなく、例えば、
（１）ハロゲン原子、
（２）水酸基、
（３）チオール基、
（４）ニトロ基、
（５）置換基を有していてもよいアミノ基、
（６）ニトリル基、
（７）ホルミル基、
（８）塩を形成していてもよいカルボキシ基、
（９）置換基を有していてもよいアルキル基、
（１０）置換基を有していてもよいアルケニル基、
（１１）置換基を有していてもよいアルキニル基、
（１２）置換基を有していてもよいシクロアルキル基、
（１３）置換基を有していてもよい芳香族炭化水素環基、
（１４）置換基を有していてもよい芳香族複素環基、
（１５）置換基を有していてもよい非芳香族複素環基、
（１６）置換基を有していてもよいアルコキシ基、
（１７）置換基を有していてもよいアルケニルオキシ基、
（１８）置換基を有していてもよいアルキニルオキシ基、
（１９）置換基を有していてもよいシクロアルコキシ基、
（２０）置換基を有していてもよいアルキルチオ基、
（２１）置換基を有していてもよいアルケニルチオ基、
（２２）置換基を有していてもよいアルキニルチオ基、
（２３）置換基を有していてもよいシクロアルキル基チオ基、
（２４）置換基を有していてもよい芳香族炭化水素−オキシ基、
（２５）置換基を有していてもよい複素環−オキシ基、
（２６）置換基を有していてもよい芳香族炭化水素−チオ基、
（２７）置換基を有していてもよい複素環−チオ基、
（２８）アジド基、
（２９）イソシアナート基、
（３０）イソチオシアナート基、
（３１）置換基を有していてもよいアルキルカルボニル基、
（３２）置換基を有していてもよいアルキルカルボニル−オキシ基、
（３３）ヒドロキシカルボニル−アルキル基、
（３４）置換基を有していてもよいアルコキシカルボニル−アルキル基、
（３５）置換基を有していてもよいアルキルスルフィニル基、
（３６）置換基を有していてもよいアルキルスルホニル基、
（３７）塩を形成していてもよいスルホン酸基等が挙げられる。
【００４２】
該「置換基」は、上記芳香環化合物に１個〜５個、好ましくは１個〜４個、より好ましくは１個〜３個置換されていてもよい。また、上記（５）、（９）〜（２７）、（３１）〜（３２）、及び（３４）〜（３６）の基における「置換基」の種類及び数についてもこれと同様に定義できる。
【００４３】
「ハロゲン原子」としては、特に限定はなく、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００４４】
「置換基を有していてもよいアミノ基」としては、特に限定はなく、例えば、無置換のアミノ基（NH2）；メチルアミノ、エチルアミノ、イソプロピルアミノ基等のモノアルキルアミノ基；ジメチルアミノ、メチルエチルアミノ、ジエチルアミノ基等のジアルキルアミノ基；アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル基等のアミノアルキル基等が挙げられる。
【００４５】
「塩」としては、特に限定はなく、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩、ジメチルアンモニウム塩等のアンモニウム塩；塩酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、硝酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、シュウ酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩等の有機酸塩等が挙げられる。好ましい塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩である。
【００４６】
「塩を形成していてもよいカルボキシ基」としては、例えば、-COOH；-COONH4等のカルボン酸アンモニウム塩；-COOLi、-COONa、-COOK基等のカルボン酸アルカリ金属塩等が挙げられる。
【００４７】
「アルキル基」としては、特に限定はなく、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル基等の炭素数１〜８０、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜６の鎖状又は分岐鎖状のアルキル基が挙げられる。
【００４８】
本明細書中において「ｎ−」とはノルマルタイプ又は１級置換基であることを意味し、「ｓｅｃ−」とは２級置換基であることを意味し、「ｔ−」とは３級置換基であることを意味する。
【００４９】
「アルケニル基」としては、特に限定はなく、例えば、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル（アリル）、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル基等の炭素数２〜８０、好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜６の鎖状又は分岐鎖状のアルケニル基が挙げられる。なお、アルケニル基としては、イソプレン単位の繰り返しを有する基であってもよく、このようなアルケニルを有する芳香環化合物としては、例えば、側鎖のイソプレン単位が６〜１０のユビキノン等が挙げられ、中でも、側鎖のイソプレン単位が１０のコエンザイムＱ１０（ユビデカレノン）を用いることができる。
【００５０】
「アルキニル基」としては、特に限定はなく、例えば、アセチレニル、１−プロピニル、２−プロピニル（プロパルギル）、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル基等の炭素数２〜８０、好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜６の鎖状又は分岐鎖状のアルキニル基が挙げられる。
【００５１】
「シクロアルキル基」としては、特に限定はなく、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル基等の炭素数３〜８のシクロアルキル基が挙げられる。
【００５２】
「芳香族炭化水素環基」とは、上記芳香族炭素環化合物で示した芳香族炭素環の基が挙げられる。
【００５３】
「芳香族複素環基」とは、上記芳香族複素環化合物で示した芳香族複素環の基が挙げられる。
【００５４】
「非芳香族複素環基」としては、特に限定はなく、例えば、炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子及び酸素原子から選ばれるヘテロ原子を１個以上（例えば、１〜４個）含む５〜１４員、好ましくは、５〜１０員の非芳香族複素環基等が挙げられる。例えば、環構成原子として炭素原子以外に酸素原子、硫黄原子（該硫黄原子は、酸化されていてもよい）及び窒素原子から選ばれるヘテロ原子を１〜４個含有する４〜７員（好ましくは５又は６員）の単環式非芳香族複素環基及び縮合非芳香族複素環基が挙げられる。
【００５５】
該縮合非芳香族複素環基としては、例えば、これら４〜７員の単環式非芳香族複素環基と、１又は２個の窒素原子を含む５又は６員の芳香族又は非芳香族複素環（例、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピラジン、ピリジン、ピリミジン）、１個の硫黄原子を含む５員の芳香族又は非芳香族複素環（例、チオフェン）、あるいはベンゼン環等とが１又は２個縮合した基等が挙げられる。具体的には、ピロリジニル（例、１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル）、ピペリジニル（例、ピペリジノ、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−ピペリジニル）、モルホリニル（例、モルホリノ、２−モルホリニル）、ピペラジニル（例、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル）、テトラヒドロフリル（例、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロフラン−２−イル）等の単環式非芳香族複素環基；ジヒドロインドリル（例、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−１−イル）、ジヒドロキノリニル（例、１，２−ジヒドロキノリン−４−イル、３，４−ジヒドロキノリン−１（２Ｈ）−イル）等の縮合非芳香族複素環基が挙げられる。
【００５６】
「アルコキシ基」としては、特に限定はなく、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ペントキシ、ヘキシロキシ等の炭素数１〜８０、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜６の鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基が挙げられる。
【００５７】
「アルケニルオキシ基」としては、特に限定はなく、例えば、ビニルオキシ、１−プロペニルオキシ、２−プロペニルオキシ（アリルオキシ）、イソプロペニルオキシ、１−ブテニルオキシ基等の上記アルケニル基を有するオキシが挙げられる。
【００５８】
「アルキニルオキシ基」としては、特に限定はなく、例えば、アセチレニルオキシ、１−プロピニルオキシ、２−プロピニルオキシ（プロパルギルオキシ）、１−ブチニルオキシ基等の上記アルキニル基を有するオキシが挙げられる。
【００５９】
「シクロアルコキシ基」としては、特に限定はなく、例えば、シクロプロポキシ、シクロブトキシ、シクロペントキシ、シクロヘキシオキシ、シクロヘプチルオキシ、シクロオクチルオキシ基等の炭素数３〜８のシクロアルコキシ基が挙げられる。
【００６０】
「アルキルチオ基」としては、特に限定はなく、例えば、メチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、ｎ−ブチルチオ基等の炭素数１〜８０、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜６の鎖状又は分岐鎖状のアルキルチオ基が挙げられる。
【００６１】
「アルケニルチオ基」としては、特に限定はなく、例えば、ビニルチオ、１−プロペニルチオ、２−プロペニルチオ（アリルチオ）、イソプロペニルチオ、１−ブテニルチオ基等の上記アルケニル基を有するオキシが挙げられる。
【００６２】
「アルキニルチオ基」としては、特に限定はなく、例えば、アセチレニルチオ、１−プロピニルチオ、２−プロピニルチオ（プロパルギルチオ）、１−ブチニルチオ基等の上記アルキニル基を有するオキシが挙げられる。
【００６３】
「シクロアルキルチオ基」としては、特に限定はなく、例えば、シクロプロピルチオ、シクロブチルチオ、シクロペンチルチオ、シクロヘキシルチオ基等の炭素数３〜８のシクロアルキルチオ基が挙げられる。
【００６４】
「芳香族炭化水素−オキシ基」としては、上記芳香族炭化水素環基を有するオキシ基であれば特に限定はなく、例えば、フェニルオキシ、１−ナフチルオキシ、２−ナフチルオキシ等の炭素数６〜１４の芳香族炭化水素−オキシ基が挙げられる。
【００６５】
「複素環−オキシ基」としては、記芳香族複素環化合物で挙げた基を有するオキシ基であれば特に限定はなく、例えば、上記芳香族複素環化合物で挙げた基を有する５〜１４員複素環−オキシ基が挙げられる。
【００６６】
「芳香族炭化水素−チオ基」としては、上記芳香族炭化水素環基を有するオキシ基であれば特に限定はなく、例えば、フェニル−チオ、１−ナフチル−チオ、２−ナフチル−チオ基等の炭素数６〜１４の芳香族炭化水素−オキシ基が挙げられる。
【００６７】
「複素環−チオ基」としては、記芳香族複素環化合物で挙げた基を有するオキシ基であれば特に限定はなく、例えば、上記芳香族複素環化合物で挙げた基を有する５〜１４員複素環−チオ基が挙げられる。
【００６８】
「アルキルカルボニル基」としては、特に限定はなく、例えば、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル基等の炭素数１〜６の鎖状又は分岐鎖状のアルキルカルボニル基が挙げられる。
【００６９】
「アルキルカルボニル−オキシ基」としては、特に限定はなく、例えば、メチルカルボニルオキシ（別名アセチルオキシ）、エチルカルボニルオキシ、ｎ−プロピルカルボニルオキシ、イソプロピルカルボニルオキシ、シクロプロピルカルボニルオキシ、ｎ−ブチルカルボニルオキシ、イソブチルカルボニルオキシ、ｓ−ブチルカルボニルオキシ、ｔ−ブチルカルボニルオキシ基等の炭素数１〜６の鎖状又は分岐鎖状のアルキルカルボニル−オキシ基が挙げられる。
【００７０】
「ヒドロキシカルボニル−アルキル基」としては、特に限定はなく、例えば、ヒドロキシカルボニルメチル、ヒドロキシカルボニルエチル基等のヒドロキシカルボニル−炭素数１〜６の鎖状又は分岐鎖状のアルキル基が挙げられる。
【００７１】
「アルコキシカルボニルアルキル基」としては、特に限定はなく、例えば、メトキシカルボニルメチル、エトキシカルボニルエチル基等の炭素数１〜６の鎖状又は分岐鎖状のアルコキシカルボニル−炭素数１〜６の鎖状又は分岐鎖状のアルキル基が挙げられる。
【００７２】
「アルキルスルフィニル基」としては、特に限定はなく、例えば、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、ｎ−プロピルスルフィニル、イソプロスルフィニル、シクロプロピルスルフィニル、ｎ−ブチルスルフィニル、ｓ−ブチルスルフィニル、ｔ−ブチルスルフィニル基等の炭素数１〜６の鎖状又は分岐鎖状のアルキルスルフィニル基が挙げられる。
【００７３】
「アルキルスルホニル基」としては、特に限定はなく、例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル、ｎ−プロピルスルホニル、イソプロスルホニル、シクロプロピルスルホニル、ｎ−ブチルスルホニル、ｓ−ブチルスルホニル、ｔ−ブチルスルホニル基等の炭素数１〜６の鎖状又は分岐鎖状のアルキルスルホニル基が挙げられる。
【００７４】
「塩を形成していてもよいスルホン酸基」としては、例えば、-SO3H；-SO2ONH4等のスルホン酸アンモニウム塩；-SO2OLi、-SO2ONa、-SO2OK基等のスルホン酸アルカリ金属塩等が挙げられる。
【００７５】
中でも、本発明において用いられる化合物として、好ましくは、下記の化合物が挙げられる。
【００７６】
一般式(１Ａ)：
【化１】
2019010054.tif 000002
（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、及びＸ８は、同一又は異なって、ＣＲ基、又は窒素原子を示す。Ｒは、水素原子又は置換基を示す。）
で表されるアントラキノン化合物；
【００７７】
一般式(１ＡＡ）：
【化２】
2019010054.tif 000003
（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４は、前記と同じ。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を示す。）
で表されるアントラキノン化合物；
【００７８】
一般式(１ＡＢ）：
【化３】
2019010054.tif 000004
（式中、Ｘ１、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、前記と同じ。Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を示す。）
で表されるアントラキノン化合物；
【００７９】
一般式(１ＡＣ）：
【化４】
2019010054.tif 000005
（式中、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、前記と同じ。Ｒ８は、水素原子又は置換基を示す。）
で表されるアントラキノン化合物；
【００８０】
一般式(１ＡＤ)：
【化５】
2019010054.tif 000006
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、前記と同じ。Ｒ９、及びＲ１０は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を示す。）
で表されるアントラキノン化合物；
【００８１】
一般式(１Ｂ)：
【化６】
2019010054.tif 000007
（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、及びＸ８は、前記と同じ。Ｘ９及びＸ１０は、同一又は異なって、ＣＲ基、又は窒素原子を示す。Ｒは、水素原子又は置換基を示す。）
で表されるアントラセン化合物；
【００８２】
一般式(１ＢＡ)：
【化７】
2019010054.tif 000008
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、前記と同じ。Ｘ９及びＸ１０は同一又は異なって、ＣＲ基、又は窒素原子を示す。Ｒは、水素原子又は置換基を示す。）
で表されるアントラセン化合物；
【００８３】
一般式(１ＢＢ)：
【化８】
2019010054.tif 000009
（式中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、及びＲ２０は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を示す。）
で表されるフェナントレン化合物；
【００８４】
一般式(１Ｃ)：
【化９】
2019010054.tif 000010
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、前記と同じ。Ｒ２１及びＲ２２は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を示す。）
で表されるアントロン化合物；
【００８５】
一般式(１Ｄ)：
【化１０】
2019010054.tif 000011
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、前記と同じ。Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、及びＸ８は、同一又は異なって、Ｃ＝Ｏ基、ＣＲ基、ＣＲ’Ｒ’’基、又は窒素原子を示す。Ｒ、Ｒ’及びＲ’’は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を示す。Ｘ５とＸ６、Ｘ６とＸ７、又はＸ７とＸ８との結合部位は、単結合又は二重結合を示す。）
で表されるナフタレン化合物；
【００８６】
一般式(１ＤＡ)：
【化１１】
2019010054.tif 000012
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、前記と同じ。Ｒ２４及びＲ２５は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を示す。）
で表される１，４−ナフトキノン化合物；
【００８７】
一般式(１ＤＢ)：
【化１２】
2019010054.tif 000013
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、前記と同じ。Ｒ２３及びＲ２４は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を示す。）
で表される１，２−ナフトキノン化合物；
【００８８】
一般式(１ＤＣ)：
【化１３】
2019010054.tif 000014
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、前記と同じ。Ｒ２３及びＲ２６は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を示す。）
で表される２，３−ナフトキノン化合物；
【００８９】
一般式(１ＤＤ)：
【化１４】
2019010054.tif 000015
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、前記と同じ。Ｒ２７、Ｒ２８、Ｒ２９、及びＲ３０は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を示す。）
で表されるジヒドロ−１，４−ナフトキノン化合物；
【００９０】
一般式(１Ｅ)：
【化１５】
2019010054.tif 000016
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、前記と同じ。Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、及びＲ２６は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を示す。）
で表されるナフタレン化合物；
【００９１】
一般式(１Ｆ)：
【化１６】
2019010054.tif 000017
（式中、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を示す。）
で表されるピリジン化合物；
【００９２】
一般式(１Ｇ)：
【化１７】
2019010054.tif 000018
（式中、Ｒ３６、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、Ｒ４０、及びＲ４１は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を示す。）
で表されるベンゼン化合物；
【００９３】
一般式(１Ｈ)：
【化１８】
2019010054.tif 000019
（式中、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、及びＲ４５は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を示す。）
で表される１，４−ベンゾキノン化合物；
【００９４】
一般式(１Ｉ)：
【化１９】
2019010054.tif 000020
（式中、Ｒ４６、Ｒ４７、Ｒ４８、及びＲ４９は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を示す。）
で表される１，２−ベンゾキノン化合物；
等が挙げられる。
【００９５】
この中でも、本発明において用いられる化合物として、より好ましくは、下記の化合物が挙げられる。
一般式(１ＡＣ)で表されるアントラキノン化合物；
一般式(１ＡＤ)で表されるアントラキノン化合物；
一般式(１ＢＡ)で表されるアントラセン化合物；
一般式(１ＢＢ)で表されるフェナントレン化合物；
一般式(１Ｃ)で表されるアントロン化合物；
一般式(１ＤＡ)で表される１，４−ナフトキノン化合物；
一般式(１ＤＢ)で表される１，２−ナフトキノン化合物
一般式(１ＤＤ)で表されるジヒドロ−１，４−ナフトキノン化合物；
一般式(１Ｅ)で表されるナフタレン化合物；
一般式(１Ｆ)で表されるピリジン化合物；及び
一般式(１Ｇ)で表されるベンゼン化合物；
一般式(１Ｈ)で表される１，４−ベンゾキノン化合物；及び
一般式(１Ｉ)で表される１，２−ベンゾキノン化合物である。
【００９６】
さらに、この中でも、好ましい化合物としては、
上記一般式(１ＡＣ)で表されるアントラキノン化合物のうち、Ｘ２が窒素原子、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ８が、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルコキシ基、置換基を有していてもよいアミノ基、水酸基、又はニトロ基であるベンズイソキノリン化合物；
上記一般式(１ＡＤ)で表されるアントラキノン化合物のうち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８が、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルコキシ基、置換基を有していてもよいアミノ基、水酸基、又はニトロ基であるアントラキノン化合物；
上記一般式(１ＢＡ)で表されるアントラセン化合物のうち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８が、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルコキシ基、置換基を有していてもよいアミノ基、ニトロ基、置換基を有していてもよいアルキルカルボニル基、又は水酸基であり、Ｘ９及びＸ１０は同一又は異なって、−ＣＲ基、又は窒素原子を示す。Ｒは、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアミノ基、ニトロ基、置換基を有していてもよいアルキルカルボニル基、又は水酸基であるアントラキノン化合物；
上記一般式(１ＢＢ)で表されるフェナントレン化合物のうち、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、及びＲ２０が、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルコキシ基、置換基を有していてもよいアミノ基、ニトロ基、置換基を有していてもよいアルキルカルボニル基、又は水酸基であるフェナントレン化合物；
上記一般式(１Ｃ)で表されるアントロン化合物のうち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ２１、及びＲ２２が、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルコキシ基、置換基を有していてもよいアミノ基、ニトロ基、置換基を有していてもよいアルキルカルボニル基、又は水酸基であるアントロン化合物；
上記一般式(１ＤＡ)で表される１，４−ナフトキノン化合物のうち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ２４、及びＲ２５が、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルコキシ基、置換基を有していてもよいアミノ基、ニトロ基、置換基を有していてもよいアルキルカルボニル基、スルホン酸ナトリウム基又は水酸基である１，４−ナフトキノン化合物；
上記一般式(１ＤＢ)で表される１，２−ナフトキノン化合物のうち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ２３、及びＲ２４が、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルコキシ基、置換基を有していてもよいアミノ基、ニトロ基、アルキルカルボニル基、スルホン酸ナトリウム基又は水酸基である１，２−ナフトキノン化合物；
上記一般式(１ＤＤ)で表されるジヒドロ−１，４−ナフトキノン化合物のうち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ２７、Ｒ２８、Ｒ２９、及びＲ３０が、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルコキシ基、置換基を有していてもよいアミノ基、ニトロ基、アルキルカルボニル基、スルホン酸ナトリウム基又は水酸基であるジヒドロ−１，４−ナフトキノン化合物；
上記一般式(１Ｅ)で表されるナフタレン化合物のうち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、及びＲ２６が、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルコキシ基、置換基を有していてもよいアミノ基、ニトロ基、ホルミル基、置換基を有していてもよいアルキルカルボニル基、置換基を有していてもよいアルキルカルボニルオキシ基、ヒドロキシカルボニルアルキル基、スルホン酸ナトリウム基又は水酸基であるナフタレン化合物；
上記一般式(１Ｆ)で表されるピリジン化合物のうち、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５が、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルコキシ基、置換基を有していてもよいアミノ基、ニトロ基、ホルミル基、置換基を有していてもよいアルキルカルボニル基、置換基を有していてもよいアルキルカルボニルオキシ基、ヒドロキシカルボニルアルキル基、塩を形成していてもよいカルボキシ基、スルホン酸ナトリウム基又は水酸基であるピリジン化合物；
及び
上記一般式(１Ｇ)で表されるベンゼン化合物のうち、Ｒ３６、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ３９、Ｒ４０及びＲ４１が、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルコキシ基、置換基を有していてもよいアミノ基、ニトロ基、ホルミル基、置換基を有していてもよいアルキルカルボニル基、置換基を有していてもよいアルキルカルボニルオキシ基、ヒドロキシカルボニルアルキル基、塩を形成していてもよいカルボキシ基、スルホン酸ナトリウム基又は水酸基であるピリジン化合物である。
である。
【００９７】
この中でも、特に好ましくは、
上記一般式(１ＡＣ)で表されるアントラキノン化合物のうち、Ｘ２が窒素原子、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ８が、何れも水素原子であるベンズイソキノリン化合物；
上記一般式(１ＡＤ)で表されるアントラキノン化合物のうち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８が、同一又は異なって、水素原子、アルキルアミノ基、アミノ基、水酸基、又はニトロ基であるアントラキノン化合物；
上記一般式(１ＢＡ)で表されるアントラセン化合物のうち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８が、同一又は異なって、水素原子、ジアルキルアミノ基、アルキル基、アミノ基、ニトロ基、アルキルカルボニル基、又は水酸基であり、Ｘ９及びＸ１０は同一又は異なって、−ＣＲ基、又は窒素原子を示す。Ｒは、水素原子、ジアルキルアミノ基、アミノ基、ニトロ基、アルキルカルボニル基、又は水酸基であるアントラキノン化合物；
上記一般式(１ＢＢ)で表されるフェナントレン化合物のうち、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、及びＲ２０が、何れも水素原子であるフェナントレン化合；
上記一般式(１Ｃ)で表されるアントロン化合物のうち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ２１、及びＲ２２が、同一又は異なって、水素原子、又は水酸基であるアントロン化合物；
上記一般式(１ＤＡ)で表される１，４−ナフトキノン化合物のうち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ２４、及びＲ２５が、同一又は異なって、水素原子、アルキル基、スルホン酸ナトリウム基又は水酸基である１，４−ナフトキノン化合物；
上記一般式(１ＤＢ)で表される１，２−ナフトキノン化合物のうち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ２３、及びＲ２４が、同一又は異なって、水素原子、スルホン酸ナトリウム基である１，２−ナフトキノン化合物；
上記一般式(１ＤＤ)で表されるジヒドロ−１，４−ナフトキノン化合物のうち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ２７、Ｒ２８、Ｒ２９、及びＲ３０が、同一又は異なって、水素原子、アルキル基、又はスルホン酸ナトリウム基であるジヒドロ−１，４−ナフトキノン化合物；
上記一般式(１Ｅ)で表されるナフタレン化合物のうち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、及びＲ３６が、同一又は異なって、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、ニトロ基、ホルミル基、アルキルカルボニルオキシ基、ヒドロキシカルボニルアルキル基、スルホン酸ナトリウム基又は水酸基であるナフタレン化合物；
；及び
上記一般式(１Ｆ)で表されるピリジン化合物のうち、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５が、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、アミノ基、ニトロ基、ホルミル基、アルキルカルボニルオキシ基、ヒドロキシカルボニルアルキル基、塩を形成していてもよいカルボキシ基、スルホン酸ナトリウム基又は水酸基であるピリジン化合物である。
【００９８】
この中でも、さらに好ましくは、
上記一般式(１ＡＤ)で表されるアントラキノン化合物のうち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８が、同一又は異なって、アミノ基、又はニトロ基であるアントラキノン化合物；
上記一般式(１ＢＡ)で表されるアントラセン化合物のうち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８が、同一又は異なって、水素原子、ジアルキルアミノ基、ニトロ基、又は水酸基であり、Ｘ９及びＸ１０が、同一又は異なって、窒素原子又はるアントラキノン化合物；
上記一般式(１Ｃ)で表されるアントロン化合物のうち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ２１、及びＲ２２が、同一又は異なって、水素原子、又は水酸基であるアントロン化合物；及び
上記一般式(１ＤＤ)で表されるジヒドロ−１，４−ナフトキノン化合物のうち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ２７、Ｒ２８、Ｒ２９、及びＲ３０が、同一又は異なって、水素原子、アルキル基、又はスルホン酸ナトリウム基であるジヒドロ−１，４−ナフトキノン化合物である。
【００９９】
本発明では、これらの化合物という用語以外にも、公知の農薬（例えば、脂質生合成阻害剤、呼吸阻害剤等）、公知の染料・色素（例えば、アクリジンオレンジ等）等の概念に含まれる化合物、ユーグレナを刺激（誘発）する化合物、又はユーグレナ代謝を改変する化合物を用いることができる。
【０１００】
本発明では、上記化合物の中から、一種単独で又は二種以上を混合して使用することができる。
【０１０１】
本発明で用いる上記芳香環化合物は、市販の化合物を用いるか、又は既知の合成方法により製造することができる。
【０１０２】
ユーグレナ（ミドリムシ）は、ユーグレナ植物門（Euglenophyta）ユーグレナ藻綱ユーグレナ目に属する微細藻ユーグレナは鞭毛虫ミドリムシ属 Euglena の総称である。本発明ではEuglena gracilis Z株を用いた実施例を記載するが，ワックスエステル高含有ユーグレナの製造には用いるのはEuglena gracilis Z株に限定されるものではなく、例えば、、ユーグレナ・グラシリス・クレブス（Euglena gracilis Klebs）、ユーグレナ・グラシリス・バルバチラス（Euglena gracilis var. bacillaris）等の種又はEuglena gracilis Zの変異株SM-ZK株等が挙げられる。
【０１０３】
ユーグレナは、光合成により、二酸化炭素を固定し、細胞内に炭水化物として、貯蔵多糖であるパラミロン（Paramylon；β-1,3 グルカン）を蓄積する。
【０１０４】
そして、その後、嫌気条件下で、解糖系を経て、パラミロンを分解し、脂肪酸と脂肪アルコールとからなるワックスエステルを生合成する。これをワックスエステル発酵（WE発酵）という。
【０１０５】
ワックスエステル高含有ユーグレナとしては、例えば、ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させる工程を含む上記製造方法によって得られたユーグレナ、該ユーグレナを濃縮した濃縮液、該ユーグレナから特定の成分を除去したユーグレナ等が挙げられる。
【０１０６】
ユーグレナ由来の「ワックスエステル」とは、炭素数２４〜３２程度の直鎖状の飽和脂肪酸エステルであり、中でも、炭素数１４（Ｃ１４）のミリスチン酸と炭素数１４（Ｃ１４）のミリスチルアルコールとのエステルである炭素数２８（Ｃ２８）のミリスチルミリステートが主成分である。
【０１０７】
本発明の上記ワックスエステル高含有ユーグレナの製造方法、ワックスエステルの製造方法、ワックスエステルの増加方法、炭素鎖長の長いワックスエステルの増加方法、ワックスエステル発酵の促進方法、及び貯蔵多糖パラミロンの分解促進方法としては、上記の置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させる工程を含む方法であれば特に限定はなく、例えば、好気条件下でユーグレナを培養する工程１、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させる（芳香環化合物を添加する）工程２、及び嫌気条件下（窒素雰囲気）条件下で培養する工程３を含む方法が挙げられる。さらに、ワックスエステルを分析する工程４を含むこともできる。
【０１０８】
（工程１）
好気条件下でユーグレナを培養する工程１としては、例えば、継代後のユーグレナを含む培地に、二酸化炭素源として大気、二酸化炭素、二酸化炭素を含むガス等を通気する方法等が挙げられる。中でも、培養効率を上げるため、二酸化炭素ガスを培地に通気する方が好ましい。
【０１０９】
また、二酸化炭素ガスは、例えば、工場、発電所等から排出される排気ガスを利用することができる。
【０１１０】
当該工程１は、光照射下で光合成を行うことが好ましい。光は、蛍光灯等の人工光、太陽光等が挙げられる。中でも、低エネルギー、低コストに培養する観点から、太陽光のみで培養を行うことがより好ましい。
【０１１１】
当該培養に用いる培地としては、特に限定はなく、例えば、Koren-Hunter（KH）培地、Cramer-Myers（CM）培地、HEPESバッファー培地等の公知の培地が挙げられる。
【０１１２】
具体的に、KH培地としては、((NH4)2SO4 0.5g/L、NH4HCO3 0.25g/L、KH2PO4 0.25g/L、MgCO3 0.6g/L、CaCO3 0.12g/L、EDTA・2Na 0.05g/L、FeSO4 (NH4)2SO4・6H2O 0.05g/L、MnSO4・H2O 18mg/L、ZnSO4・7H2O 25mg/L、(NH4)6Mo7O24・4H2O 4mg/L、CuSO4 1.2mg/L、NH4VO3 0.5mg/L、CoSO4・7H2O 0.5mg/L、H3BO3 0.6mg/L、NiSO4・6H2O 0.5mg/L、チアミン塩酸塩（ビタミンB1） 2.5mg/L、
シアノコバラミン（ビタミンB12） 0.005mg/L、アルギニン塩酸塩 0.5g/L、アスパラギン酸 0.3g/L、グルタミン酸 4g/L、グリシン 0.3g/L、ヒスチジン塩酸塩 0.05g/L、リンゴ酸 6.5g/L、クエン酸ナトリウム 0.5g/L、コハク酸ナトリウム 0.1g/L、グルコース 12g/L、（ｐＨ5.0））を用いることができる。
【０１１３】
CM培地としては、((NH4) 2HPO4 1.0g/L、KH2PO4 1.0g/L、MgSO4・7H2O 0.2g/L、CaCl2・2H2O 0.02g/L、EDTA・2Na 0.05g/L、Fe2(SO2)3・7H2O 3mg/L、MnCl2・4H2O 1.8mg/L、CoSO4・7H2O 1.5mg/L、ZnSO4・7H2O 0.4mg/L、Na2MoO4・2H2O 0.2mg/L、CuSO4・5H2O 0.02g/L、チアミン塩酸塩（ビタミンＢ1） 0.1mg/L、シアノコバラミン（ビタミンB12）、（ｐＨ3.5））を用いることができる。
HEPESバッファー培地としては、(HEPES  20 mM、（ｐＨ7.8）を用いることができる。
【０１１４】
当該培養に用いる培地の温度は、通常、２０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃である。
【０１１５】
工程１におけるｐＨは、極端に低い又は高い値でなければよく、通常、２〜７．５の範囲、好ましくは３．５〜５．５の範囲である。特に、４．５以下の酸性とすることで、動物性プランクトン、細菌等のコンタミネーションを有効に抑制することができる。
【０１１６】
工程１における培養時間は、特に限定はなく、例えば、通常、６〜１６８時間、好ましくは、１２〜１４８時間、より好ましくは２４〜１２０時間である。
【０１１７】
当該工程１の後、例えば、20 mM HEPES バッファー（pH 7.8）で複数回洗浄することができる。
【０１１８】
工程１の窒素飢餓状態における培養により、ユーグレナに炭水化物を十分に蓄積させることができる。
【０１１９】
（工程２）
工程１で得られたユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を作用させる工程２としては、例えば、他の成分を加えずに、上記置換基を有していてもよい芳香環化合物だけを添加する工程；上記置換基を有していてもよい芳香環化合物に溶媒を加えた溶液を添加する工程、上記置換基を有していてもよい芳香環化合物に溶媒及びその他成分を加えた溶液を添加する工程等が挙げられる。
【０１２０】
工程１で得られたユーグレナの細胞密度は、通常、0.01×107 〜100×107 cell/ml、好ましくは、0.1×107 〜10×107 cell/ml、より好ましくは、1×107 〜3×107 cell/mlである。
【０１２１】
添加する溶液（ストック溶液）の濃度としては、特に限定はなく、例えば、通常、0.01 mM〜10 M、好ましくは0.1 mM〜1 M、より好ましくは1 mM〜100 mM程度とすることができる。
【０１２２】
上記溶液をユーグレナに添加した後の終濃度としては、通常、0.01 μM〜10 mM、好ましくは0.1 μM〜1 mM、より好ましくは1 μM〜100 μM程度とすることができる。
【０１２３】
通常、ユーグレナは、液体培地（KH培地）で維持することができる。ユーグレナ（継代後4日、定常状態基に達したユーグレナ9×106 cells/ml）懸濁液を6×104 cells/mlになるように新たに継代し、維持することができる。
【０１２４】
本発明において、WE発酵に使うユーグレナは、KH培地の容量を増やして大量培養することができるが、通常、6×104 cells/mlになるようにユーグレナを継代することができる。
【０１２５】
また、ユーグレナを保存・保管する場合は、KH培地の寒天培地（植物用Agar 1%）を作成して、培養することができる。液体培地に移す場合は、ユーグレナを一部とり、チューブ内でKH液体培地との懸濁液を作成した後、フラスコのKH液体培地に6×104 cells/mlになるように継代することができる。
【０１２６】
該芳香環化合物の溶媒としては、特に限定はなく、例えば、ジメチルスルホキシド（DMSO）；エタノール等のアルコール等の有機溶媒が挙げられる。
【０１２７】
添加する溶液量としては、ユーグレナ懸濁液の0.1%〜1%で添加することが好ましい。その添加の回数としては、特に限定はなく、一度に又は複数回にわたりユーグレナに添加することができる。添加の順序としては、ユーグレナに、置換基を有していてもよい芳香環化合物を添加するだけでなく、その逆に、置換基を有していてもよい芳香環化合物にユーグレナを添加することもできる。
【０１２８】
添加するタイミングとしては、特に限定はなく、例えば、ワックスエステル発酵時に、上記置換基を有していてもよい芳香環化合物を添加することができる。
【０１２９】
添加する際の温度としては、特に限定はなく、通常、室温である。
【０１３０】
（工程３）
嫌気条件下（窒素雰囲気）条件下で培養する工程３としては、具体的には、工程２で得られたユーグレナと上記芳香環化合物を含む懸濁液を、嫌気条件下で静置処理する方法が挙げられる。
【０１３１】
嫌気条件における処理は、通常、工程２の培養後の培地に窒素ガス等の不活性ガスを通気する方法、工程２の培養後の培地を密閉し静置する方法（以下、「静置方法」ということもある。）等が挙げられる。静置方法は、培地を攪拌せずに静置することで、細胞が沈降し、高密度になることによって結果的に酸素不足となる。なお、細胞が沈降した培地を遠心分離により高密度状態を作り出すことで嫌気処理を行うこともできる。
【０１３２】
工程３におけるｐＨは、極端に低い又は高い値でなければよく、通常、２〜７．８の範囲、好ましくは３．５〜５．５の範囲である。
【０１３３】
工程３における光照射の有無はワックスエステル発酵には影響がないが、通常、暗所の条件で行うことが好ましい。
【０１３４】
工程３における保持温度は、ユーグレナが死滅するような高温、培地が凍結するような低温でなければよく、通常、２０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃である。
【０１３５】
工程３における保持（培養）時間は、特に限定はなく、例えば、通常、１２〜７２時間、好ましくは、１２〜４８時間、より好ましくは１２〜３６時間である。
このため、工程３にて、工程１及び２で培養した細胞を嫌気状態に置くことにより、工程１及び２で十分に蓄積された炭水化物をワックスエステルに変換させることとなるため、結果的に工程３におけるワックスエステル蓄積量は飛躍的に増加することとなる。
【０１３６】
また、下記実施例にて詳述するが、窒素飢餓状態で培養したユーグレナの細胞は嫌気処理直後でも培養時と同じ緑色を呈し、死滅する細胞はほとんどなく、細胞の大きさも嫌気処理前と変化しない。
【０１３７】
従来は、培養方法のみによって、ワックスエステル高含有のユーグレナの生産方法が知られていただけであったが、本発明は、芳香環化合物を用いるワックスエステル高含有のユーグレナの生産方法、すなわち、上記工程１→工程２→工程３を組み合わせることによって、従来と比して飛躍的多量のワックスエステルを含有した細胞活性の高いユーグレナを得ることができる。
【０１３８】
本発明のワックスエステル高含有ユーグレナの製造方法によって得られた「ワックスエステル高含有ユーグレナ」とは、ワックスエステルが、無処理区又はDMSO区に比べて増加したユーグレナ懸濁液を意味しており、最初のユーグレナの細胞数によって異なるため、それから得られるワックスエステルの量を特定できないが、通常、ユーグレナ1×106 cell中に、0.1〜10000 μg、好ましくは1〜1000 μg、より好ましくは10〜500 μg含んでいるユーグレナ懸濁液である。
【０１３９】
本発明によって得られるワックスエステルは、ユーグレナから抽出（精製）することにより得ることができる。例えば、特開２０１１−２４６６０５号公報、特開２０１２−２３９７７号公報等に記載の抽出（精製）方法を参考にすることができる。
【０１４０】
このようにして精製されたワックスエステルはこれを含有する燃料油（バイオ燃料）として有効に利用することができる。
【０１４１】
燃料油（バイオ燃料）
本発明の上記ワックスエステル高含有ユーグレナの製造方法、ワックスエステルの製造方法、ワックスエステルの増加方法、炭素鎖長の長いワックスエステルの増加方法、ワックスエステル発酵の促進方法、又は貯蔵多糖パラミロンの分解促進方法で製造された燃料油は、上記ワックスエステルを含有し、中でも、Ｃ１４ミリスチン酸とＣ１４ミリスチルアルコールとのエステルであるＣ２８ミリスチルミリステートが主成分である。
【０１４２】
一般に、藻類を含む植物油脂の成分は、主骨格の炭素分布が１６以上となる軽油、又はそれよりも重質な石油留分であるのに対して、本発明によって得られた燃料油は、炭素数１０〜１６の範囲内であるため、他の植物油脂（バイオマス燃料）よりも、例えば、ジェット燃料用の燃料油として利用しやすい。
【０１４３】
なお、該燃料油の発明は、プロダクトバイプロセスクレームと判断される可能性があるが、その場合は、現時点で、該燃料油の内容物を完全に特定することが不可能又はおよそ実際的ではない程度に困難であるため、プロダクトバイプロセスクレームによって燃料油を記載している。
【０１４４】
ユーグレナ由来のワックスエステル増加剤
本発明は、置換基を有していてもよい芳香環化合物を有効成分として含有する、ユーグレナ由来のワックスエステル増加剤（以下、「ワックスエステル増加剤」ということもある。）である。すなわち、上記の置換基を有していてもよい芳香環化合物は、上記ユーグレナ由来のワックスエステルを増加させることができる。
【０１４５】
ユーグレナのワックスエステル発酵促進剤
本発明は、置換基を有していてもよい芳香環化合物を有効成分として含有する、ユーグレナのワックスエステル発酵促進剤（以下、「ワックスエステル発酵促進剤」ということもある。）である。すなわち、上記の置換基を有していてもよい芳香環化合物は、ユーグレナのワックスエステル発酵（又は蓄積）を促進させることができる。
【０１４６】
炭素鎖長の長いワックスエステルの増加剤
本発明は、置換基を有していてもよい芳香環化合物を有効成分として含有する、炭素鎖長の長いワックスエステルの増加剤（以下、「炭素鎖長の長いワックスエステルの増加剤」ということもある。）である。すなわち、上記の置換基を有していてもよい芳香環化合物は、炭素鎖長の長いワックスエステルを増加させることができる。
【０１４７】
貯蔵多糖パラミロンの分解促進剤
本発明は、置換基を有していてもよい芳香環化合物を有効成分として含有する、貯蔵多糖パラミロンの分解剤（以下、「貯蔵多糖パラミロンの分解促進剤」ということもある。）である。すなわち、上記の置換基を有していてもよい芳香環化合物は、貯蔵多糖パラミロンの分解を促進させることができる。
【０１４８】
本発明のワックスエステル増加剤、ワックスエステル発酵促進剤、炭素鎖長の長いワックスエステルの増加剤、又は貯蔵多糖パラミロンの分解促進剤は、他の成分を加えずに、上記置換基を有していてもよい芳香環化合物を配合するだけでもよいが、通常は、溶媒を加えて溶液として用いることができる。
【０１４９】
該溶媒としては、特に限定はなく、例えば、ジメチルスルホキシド（DMSO）；エタノール等のアルコール等の有機溶媒が挙げられる。
【０１５０】
添加する該溶液（ストック溶液）の濃度としては、特に限定はなく、例えば、終濃度として、通常0.01 μM〜10 mM程度、好ましくは0.1 μM〜1 mM、より好ましくは1 μM〜100 μM程度となるように、通常、0.01 mM〜10 M、好ましくは0.1 mM〜1 M、より好ましくは1 mM〜100 mM程度とすることができる。
【０１５１】
上記溶液をユーグレナに添加した後の終濃度としては、通常、0.01 μM〜10 mM、好ましくは0.1 μM〜1 mM、より好ましくは1 μM〜100 μM程度とすることができる。
【０１５２】
添加の回数としては、特に限定はなく、ワックスエステル増加剤、ワックスエステル発酵促進剤、炭素鎖長の長いワックスエステルの増加剤、又は貯蔵多糖パラミロンの分解促進剤を、一度に又は複数回にわたりユーグレナに添加することができる。
【０１５３】
添加の順序としては、ユーグレナに、ワックスエステル増加剤、ワックスエステル発酵促進剤、炭素鎖長の長いワックスエステルの増加剤、又は貯蔵多糖パラミロンの分解促進剤を添加するだけでなく、その逆に、ワックスエステル増加剤、ワックスエステル発酵促進剤、炭素鎖長の長いワックスエステルの増加剤、又は貯蔵多糖パラミロンの分解促進剤にユーグレナを添加することもできる。
【０１５４】
添加するタイミングとしては、特に限定はなく、例えば、ワックスエステル発酵時に、ワックスエステル増加剤、ワックスエステル発酵促進剤、炭素鎖長の長いワックスエステルの増加剤、又は貯蔵多糖パラミロンの分解促進剤を添加することができる。
【実施例】
【０１５５】
以下、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。但し、本発明は、以下の実施例により限定されるものではない。
【０１５６】
スクリーニング方法
本発明のワックスエステル増加剤（ワックスエステル発酵促進剤、炭素鎖長の長いワックスエステルの増加剤、又は貯蔵多糖パラミロンの分解促進剤）のスクリーニング方法については、図１に基づいて説明する。
【０１５７】
置換基を有していてもよい芳香環化合物溶液（ストック溶液）の調製
本発明のワックスエステル増加剤、ワックスエステル発酵促進剤、炭素鎖長の長いワックスエステルの増加剤又は貯蔵多糖パラミロンの分解促進剤としては、上記の芳香環化合物を含む溶液を用いることができる。具体的には、該芳香環化合物を有機溶媒（例えば、DMSO）に溶解し、1 mM〜100 mMに調整した芳香環化合物含有溶液（以下、「ストック溶液」ということもある。）を調製した（調製工程）。
【０１５８】
GC-MS分析条件
分析機器
GC：Agilent 6890N（Agilent Technologies）
MS：Micromass GCT Premier Mass Spectrometer（Waters）
Auto sampler：PAL GC-xt（CTC Analytics AG）
インジェクション温度：230℃
キャリアーガス：ヘリウム（1 ml/min)
カラム：HP-5MS, 30 m × 0.25 mm × 0.25 μm（Agilent Technologies）
カラム温度：70 ℃（1 min）、70-76 ℃（1 ℃/min）、76-350 ℃（6 ℃/min）、350 ℃（1 min）
イオン源温度：320℃
【０１５９】
実施例1a-1（ストック溶液の製造）
表１に記載の1-(メチルアミノ)アントラキノン（OATQ003）23.7 mgをジメチルスルホキシド（DMSO）1 mlに溶解し、濃度100 mMの本発明のワックスエステル増加剤、ワックスエステル発酵促進剤、炭素鎖長の長いワックスエステルの増加剤、又は貯蔵多糖パラミロンの分解促進剤（ストック溶液）を製造した。
【０１６０】
実施例1a-2〜1g-6（ストック溶液の製造）
下記表１〜表７に示した化合物に代えた以外は同様の方法でDMSOに溶解し、濃度100 mMの実施例1a-2〜1g-6のワックスエステル増加剤、ワックスエステル発酵促進剤、炭素鎖長の長いワックスエステルの増加剤又は貯蔵多糖パラミロンの分解促進剤（ストック溶液）を製造した。
【０１６１】
実施例２(ユーグレナの培養：KH培地)
下記の培地を用いた方法により、ユーグレナを培養した。
１．継代後、上記KH培地でユーグレナを96時間振盪培養（好気条件）した（工程１）。
２．その後、得られたユーグレナ懸濁液に、終濃度100 μMで、本発明の下記表１〜表６−２に示す各芳香環化合物を添加した（工程２）。
３．得られた混合液を、96ウェルプレートに、1ウェルあたり200 μlを分注し、その後、密封した。
４．その後、密閉した96ウェルプレートを遮光し、28℃インキュベーターで24時間静置培養した（工程３）。
【０１６２】
実施例３（WE抽出）
実施例２で得られた各ユーグレナ懸濁液200 μlに1.8 mlのメタノール：クロロホルム：10% 酢酸＝5:2:0.2の混合溶液を加えて15分間超音波破砕をした。得られた懸濁液を10000 gで遠心分離した後、上清（以後、「抽出液」とする）を回収した。該抽出液200 μlに500 μlの超純水と400 μlのクロロホルムを加え、攪拌後10000 gで遠心分離し有機層と水層に分離した。ワックスエステルが含まれる有機層を回収し減圧条件下で有機層を乾固した。
得られた有機層の乾固物に対して20 μlの40 mg/ml塩酸メトキサミン（溶媒：ピリジン）を加え、30℃で90分間インキュベート後、80 μlのN-メチル-N-（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（MSTFA）を加え、37℃で30分間インキュベート（誘導体化）した。
【０１６３】
試験例１（工程４：WE分析、KH培地）
上記GC-MS分析によって、実施例３で得られた抽出物におけるWEの相対ピーク面積を測定した。また、標準物質として濃度の異なるミリスチルミリステート（C28WE）を分析し、相対ピーク面積をもとに検量線を作成した。得られた検量線と抽出物のWEの相対ピーク面積から、抽出物におけるWE質量（μg）をミリスチルミリステートの換算値として計算した。なお、DMSOを用いた場合のWE量を、ネガティブコントールとして比較した。また、それぞれの化合物を添加した場合のWE質量を「試験区」と表記した。また、表１〜表６−２中の値はユーグレナ1×106 cell中の総WE質量（μg）を示した。さらに、試験区/DMSOで増加率を表した。その結果を、表１〜表６−２に示した。
【０１６４】
【表１】
2019010054.tif 000021
【表２】
2019010054.tif 000022
【表３】
2019010054.tif 000023
【表４】
2019010054.tif 000024
【表５】
2019010054.tif 000025
【表６−１】
2019010054.tif 000026
【表６−２】
2019010054.tif 000027
【０１６５】
＜試験結果＞
表１〜表６−２に記載の化合物は、何れも対照区（DMSO）に比べて、ワックスエステルが増加した。中でも、ワックスエステルの増加率が対照区と比べて２．６７倍となる化合物があり、これは、従来技術である非特許文献１に記載された煩雑な培養方法や高価な装置を用いてワックスエステル等を含む油脂を１.４倍増加させたものと比べても、明らかにワックスエステルを簡便かつ効率的に増加させることが分かった。したがって、本発明によれば、ワックスエステルの生産効率は飛躍的に向上し、生産コストが低くすることができる。
【０１６６】
実施例４（ユーグレナの培養：HEPES培地）
１．継代後、上記KH培地でユーグレナを96時間振盪培養（好気条件）した（工程１）。
２．その後、当該培地を20 mM HEPES培地（pH 7.8）で2回洗浄した。
３．得られたユーグレナ懸濁液に、終濃度100 μMで、本発明の下記表７に示す各芳香環化合物を添加した（工程２）。
４．得られた混合液を、96ウェルプレートに、1ウェルあたり200 μlを分注し、その後、密封した。
５．その後、密閉した96ウェルプレートを遮光し、28℃インキュベーターで24時間静置培養した（工程３）。
【０１６７】
試験例２（HEPES培地）
表７に記載の芳香環化合物を用いて、KH培地をHEPES培地に代えた以外は、試験例１と同様の方法で試験した。なお、DMSOを用いた場合のWE量を、ネガティブコントールとして比較した。また、それぞれの化合物を添加した場合のWE質量を「試験区」と表記した。また、表７の値はユーグレナ1×106中の総WE質量（μg）を示した。さらに、試験区/DMSOで増加率を表した。その結果を、表７に示した。
【表７】
2019010054.tif 000028
【０１６８】
＜試験結果＞
その結果、KH培地をHEPES培地に代えても、表７に記載の化合物は、何れも対照区（DMSO）に比べて、同様にワックスエステルが増加した。中でも、ワックスエステルの増加率が対照区と比べて６倍程度となる化合物があり、これは、上述した非特許文献１に記載された方法のワックスエステル等を含む油脂を１.４倍増加させたものと比べても、明らかにワックスエステルを簡便かつ効率的に増加させることが分かった。したがって、本発明によれば、ワックスエステルの生産効率は飛躍的に向上し、生産コストが低くすることができる。
【０１６９】
試験例３：WE蓄積量の時間変化について（ユーグレナのワックスエステル発酵促進剤）
ユーグレナ懸濁液に、DMSOとOATQ008（実施例1a-6）ストック溶液（100 mM）をそれぞれ懸濁液の0.1%（終濃度100 μM）添加し混合液を作成した。混合液を96ウェルプレートに200 μlずつ分注し、暗所、28℃で静置培養した。静置培養4、8、12、24、36、48及び72時間のユーグレナ1×106 cellあたりの総WE蓄積量（μg）を試験例１と同様の方法で計測した。その結果を、表８及び図２に示した。
【表８】
2019010054.tif 000029
【０１７０】
＜試験結果＞
その結果、OATQ008（実施例1a-6）においては、静置培養後、12時間で最大量のWEを蓄積したことが分かった。一方、DMSO添加区では24時間で最大量に達した。よって、OATQ008（実施例1a-6）は、DMSO添加区の24時間に比べて、12時間に短縮でき、約2倍WE発酵を加速（促進）させることが分かった。すなわち、本発明によれば、ワックスエステルの生産効率（速度）が約2倍向上したことになる。
【０１７１】
試験例４：パラミロン量の測定について（貯蔵多糖パラミロンの分解促進剤）
ユーグレナ懸濁液に、DMSOとOATQ008（実施例1a-6）ストック溶液（100 mM）をそれぞれ懸濁液の0.1%（終濃度100 μM）添加し混合液を作成した。混合液を96ウェルプレートに200 μlずつ分注し、暗所、28℃で24時間静置培養した。また、DMSOとOATQ008（実施例1a-6）を添加する前のユーグレナ懸濁液を0 hとした。それぞれのユーグレナ懸濁液200 μl（0 h、24 h DMSO、24 h OATQ008）に30%過塩素酸を20 μl加え攪拌後、1250 gで2 分間遠心分離した。上清を除いたペレットに1%ラウリル硫酸ナトリウム（SDS）を1 ml加え、15分間煮沸した後、1800 gで遠心分離した。上清を除き0.1% SDSを1 ml加えて攪拌後1800 gで遠心分離した。上清を除いた後、1 N水酸化ナトリウムを1 ml加えてパラミロンを溶解した。パラミロン量を、フェノール硫酸法を用いて計測した。なお、該パラミロン量は、グルコース換算として計算し、ユーグレナ1×106 cell中のパラミロン量を計算した。その結果を、表９及び図３に示した。
【表９】
2019010054.tif 000030
【０１７２】
＜試験結果＞
その結果、図３に示すとおり、OATQ008（実施例1a-6）においては、静置培養24時間で貯蔵多糖パラミロンの90%以上を分解することが分かった。一方、コントロールのDMSOを添加したユーグレナは貯蔵多糖パラミロンの約45%しかWE発酵に利用できないことが分かった。この結果は、ユーグレナを利用したバイオマス変換の潜在力をほぼ100%利用できていることを示すものである。
【０１７３】
試験例５：炭素鎖長が長いWEの増加について（炭素鎖長の長いワックスエステルの増加剤）
ユーグレナ懸濁液に、DMSOとOATQ008（実施例1a-6）ストック溶液（100 mM）をそれぞれ懸濁液の0.1%（終濃度100 μM）添加し混合液を作成した。混合液を96ウェルプレートに200 μlずつ分注し、暗所、28℃で24時間静置培養後、ユーグレナ1×106 cell中に含まれる各炭素鎖長のWE質量（μg）をGC-MSの相対ピーク面積からミリスチルミリステート換算値として算出した。その結果を、表１０及び図４に示した。また、Ｃは、以下、炭素数を意味する。
【表１０】
2019010054.tif 000031
【０１７４】
＜試験結果＞
その結果、図４に示すとおり、OATQ008（実施例1a-6）においては、総WE蓄積量の増加と共に、炭素鎖長が長いWE（特にC30WE）が増加することが分かった。
【０１７５】
試験例６：炭素鎖長が長いWEの増加について（炭素鎖長の長いワックスエステルの増加剤）
下記表１１に記載の化合物に代えた以外は、試験例５と同様の方法で、ユーグレナ1×106 cell中に含まれる各WEの質量（μg）を測定した。その結果を、表１１及び図５に示した。
【表１１】
2019010054.tif 000032
【０１７６】
＜試験結果＞
その結果、図５に示すとおり、実施例1a-1〜1a-5においては、総WE蓄積量の増加と共に、炭素鎖長が長いWE（特にC30WE）が増加することが分かった。
【０１７７】
試験例７：炭素鎖長が長いWEの増加について（炭素鎖長の長いワックスエステルの増加剤）
下記表１２に記載の化合物に代えた以外は、試験例５と同様の方法で、ユーグレナ1×106 cell中に含まれる各WEの質量（μg）を測定した。その結果を、表１２及び図６に示した。
【表１２】
2019010054.tif 000033
【０１７８】
＜試験結果＞
その結果、図６に示すとおり、実施例1b-1、1b-2、1b-4、及び1b-6においては、総WE蓄積量の増加と共に、炭素鎖長が長いWE（特にC30WE）が増加することが分かった。
【０１７９】
試験例８：炭素鎖長が長いWEの増加について（炭素鎖長の長いワックスエステルの増加剤）
下記表１３に記載の化合物に代えた以外は、試験例５と同様の方法で、ユーグレナ1×106 cell中に含まれる各WEの質量（μg）を測定した。その結果を、表１３及び図７に示した。
【表１３】
2019010054.tif 000034
【０１８０】
＜試験結果＞
その結果、図７に示すとおり、実施例1c-2においては、総WE蓄積量の増加と共に、炭素鎖長が長いWE（特にC30WE）が増加することが分かった。
【０１８１】
試験例９：炭素鎖長が長いWEの増加について（炭素鎖長の長いワックスエステルの増加剤）
下記表１４に記載の化合物に代えた以外は、試験例５と同様の方法で、ユーグレナ1×106 cell中に含まれる各WEの質量（μg）を測定した。その結果を、表１４及び図８に示した。
【表１４】
2019010054.tif 000035
【０１８２】
＜試験結果＞
その結果、図８に示すとおり、実施例1d-8及び1d-9においては、総WE蓄積量の増加と共に、炭素鎖長が長いWE（特にC30WE）が増加することが分かった。
【０１８３】
試験例１０：炭素鎖長が長いWEの増加について（炭素鎖長の長いワックスエステルの増加剤）
下記表１５に記載の化合物に代えた以外は、試験例５と同様の方法で、ユーグレナ1×106 cell中に含まれる各WEの質量（μg）を測定した。その結果を、表１５及び図９に示した。
【表１５】
2019010054.tif 000036
【０１８４】
＜試験結果＞
その結果、図９に示すとおり、実施例1e-1、1e-4、1e-5、及び1e-8においては、総WE蓄積量の増加と共に、炭素鎖長が長いWE（特にC30WE）が増加することが分かった。
【０１８５】
試験例１１：化合物の溶媒DMSOについて
ユーグレナ懸濁液（無添加）とユーグレナ懸濁液にDMSOを0.1%添加した混合液を、96ウェルプレートに200 μlずつ分注し、暗所、28℃で24時間静置培養した。ユーグレナ1×106 cellあたりの総WE蓄積量（μg）を試験例１と同様の方法で計測した。その結果を、表１６及び図１０に示した。
【表１６】
2019010054.tif 000037
【０１８６】
＜試験結果＞
その結果、図１０に示すとおり、DMSOの添加ではワックスエステル発酵に影響がないことが分かった。すなわち、本発明の芳香環化合物の添加によりワックスエステルが増加したことを意味する。
【図１】
2019010054.tif 000038
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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