(57)【要約】【課題】  ピルフェニドンを含有するＰＡＲＫ２発現促進剤を提供する。【解決手段】  本発明に係るピルフェニドンを含有するＰＡＲＫ２発現促進剤は、ＰＡＲＫ２発現促進作用によりオートファジー及びマイトファジー促進効果を有するため、細胞老化に関連する疾患や慢性閉塞性肺疾患などの治療剤として有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピルフェニドンを含有する、ＰＡＲＫ２発現促進剤（但し、肺線維症の治療に用いるものを除く。）。
【請求項２】
細胞老化抑制に用いるものである、請求項１記載のＰＡＲＫ２発現促進剤。
【請求項３】
神経変性疾患の治療に用いるものである、請求項１又は２記載のＰＡＲＫ２発現促進剤。
【請求項４】
神経変性疾患が、パーキンソン病である、請求項３記載のＰＡＲＫ２発現促進剤。
【請求項５】
神経変性疾患が、レビー小体型認知症である、請求項３記載のＰＡＲＫ２発現促進剤。
【請求項６】
慢性閉塞性肺疾患の治療に用いるものである、請求項１記載のＰＡＲＫ２発現促進剤。
【請求項７】
オートファジーを促進するものである、請求項１〜６のいずれかに記載のＰＡＲＫ２発現促進剤。
【請求項８】
マイトファジーを促進するものである、請求項７記載のＰＡＲＫ２発現促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピルフェニドンを含有するＰＡＲＫ２発現促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピルフェニドン（５−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピリジン−２−オン、ＰＦＤ）は線維症に対して治療効果を有することが知られており（特許文献１）、特発性肺線維症に対して世界で初めて承認取得された抗線維化剤である。その作用機序は、炎症性サイトカイン、抗炎症性サイトカイン等の各種サイトカイン及び線維化形成に関与する増殖因子に対する産生調節作用であり、線維芽細胞増殖抑制作用やコラーゲン産生抑制作用等複合的な作用に基づき抗線維化作用を示す。ピルフェニドンとプレドニゾロンとの比較により、プレドニゾロンは抗炎症作用のみを示したのに対し、ピルフェニドンは抗炎症作用と抗線維化作用の両方を示し、ステロイドよりも有効な治療結果をもたらすことができると期待されている。
【０００３】
ＰＡＲＫ２は若年性パーキンソン病の発症に関連することが知られており、若年性パーキンソン病患者においてＰＡＲＫ２遺伝子の変異が認められる患者が存在することが示されている（非特許文献１）。ＰＡＲＫ２が関与する疾患として、パーキンソン病以外に、レビー小体型認知症など（非特許文献２）の神経変性疾患、慢性閉塞性肺疾患（非特許文献３）、線維症（非特許文献４）、統合失調症、双極性障害などの精神疾患（非特許文献５）などが知られている。
【０００４】
細胞老化は、細胞がある一定回数増殖した後、又は過度のストレス刺激によって、増殖が不可逆的に停止し老化関連分泌現象が亢進した状態を意味する。細胞老化に関するマーカーとしてｐ２１、老化関連βガラクトシダーゼ（ＳＡ−ＢＧ）、ヒストンＨ２ＡＸなどが知られている。
【０００５】
オートファジーは不要なタンパク質と小器官の細胞内分解機構であり、細胞内恒常性の維持と細胞老化の抑制に関与すると考えられている（非特許文献６及び７）。
マイトファジーはミトコンドリアに選択的なオートファジーであり、不必要なミトコンドリアをリソソームにおいて分解除去する作用である。オートファジーによる細胞老化の抑制において、マイトファジーが特に重要な役割を示すことが知られており、ヒト気管支上皮細胞において、ＰＡＲＫ２がマイトファジーを促進することが非特許文献３に開示されている。
【０００６】
特許文献２には、ピルフェニドンがＭＡＰキナーゼの一つであるｐ３８ＭＡＰキナーゼ（ｐ３８ＭＡＰＫ）阻害活性を有することが示され、対象疾患の例としてパーキンソン病や慢性閉塞性肺疾患が記載されている。しかし、ピルフェニドンがＰＡＲＫ２発現を促進することにより、細胞老化を抑制することは開示されていない。
【０００７】
特許文献３には、ピルフェニドンを含有する吸入剤が、呼吸器における局所的な炎症モデルである卵白由来オボアルブミン感作モデル動物に対し治療効果があり、光過敏症の副作用が軽減されていることが示されている。しかし、ピルフェニドンがＰＡＲＫ２発現を促進することにより、細胞老化を抑制することは開示されていない。
【０００８】
特許文献４には、ミネラルコルチコイド受容体阻害剤について、パーキンソン病など加齢に伴う疾患の予防、治療に有効であることが示されており、ミネラルコルチコイド受容体阻害剤の一例としてピルフェニドンが記載されている。しかし、ピルフェニドンがＰＡＲＫ２発現を促進することにより、細胞老化を抑制することは開示されていない。
【０００９】
非特許文献４には、ピルフェニドンによる、ＰＡＲＫ２ノックダウン筋線維芽細胞の分化誘導抑制効果が示されている。しかし、ピルフェニドンがＰＡＲＫ２発現を促進することにより、細胞老化を抑制することは示唆されていない。
【００１０】
非特許文献８には、ピルフェニドンがＰＡＲＫ２を介して筋線維芽細胞の分化と肺線維化の進行を抑制することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開平２−２１５７１９号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／１２２１５４号
【特許文献３】国際公開第２０１３／０３９１６７号
【特許文献４】国際公開第２０１２／１２３５６１号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Nature、1998年、392巻、605-8頁
【非特許文献２】American Journal of Pathology、2002年、160巻、5号、1655-67頁
【非特許文献３】Autophagy、2015年、11巻、3号、547-59頁
【非特許文献４】The Journal of Immunology、 2016年、197巻、2号、504-16頁
【非特許文献５】Molecular Brain、2013年、6:35
【非特許文献６】上原記念生命科学財団研究報告集、2011年、25巻、150
【非特許文献７】Cell、2011年、146巻、682-95頁
【非特許文献８】Respiratory Research、2017年、18:114
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、細胞老化に関連する疾患や慢性閉塞性肺疾患などの治療剤としてピルフェニドンを含有するＰＡＲＫ２発現促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、以下に関する。
（１）ピルフェニドンを含有する、ＰＡＲＫ２発現促進剤（但し、肺線維症の治療に用いるものを除く。）。
（２）細胞老化抑制に用いるものである、上記（１）記載のＰＡＲＫ２発現促進剤。
（３）神経変性疾患の治療に用いるものである、上記（１）又は（２）記載のＰＡＲＫ２発現促進剤。
（４）神経変性疾患が、パーキンソン病である、上記（３）記載のＰＡＲＫ２発現促進剤。
（５）神経変性疾患が、レビー小体型認知症である、上記（３）記載のＰＡＲＫ２発現促進剤。
（６）慢性閉塞性肺疾患の治療に用いるものである、上記（１）記載のＰＡＲＫ２発現促進剤。
（７）オートファジーを促進するものである、上記（１）〜（６）のいずれかに記載のＰＡＲＫ２発現促進剤。
（８）マイトファジーを促進するものである、上記（７）記載のＰＡＲＫ２発現促進剤。
【００１５】
（１−２）線維症の治療に用いるものを除く、上記（１）記載のＰＡＲＫ２発現促進剤。
（１−３）慢性閉塞性肺疾患の治療に用いるものを除く、上記（１）記載のＰＡＲＫ２発現促進剤。
（１−４）線維症及び／または慢性閉塞性肺疾患の治療に用いるものを除く、上記（１）記載のＰＡＲＫ２発現促進剤。
【００１６】
（１’Ａ）ピルフェニドンを投与することを特徴とする、ＰＡＲＫ２関連疾患（但し、肺線維症を除く。）の治療又は予防方法。
（１’Ｂ）ＰＡＲＫ２関連疾患（但し、肺線維症を除く）を治療又は予防するための、ピルフェニドン。
（１’Ｃ）ＰＡＲＫ２関連疾患（但し、肺線維症を除く）の治療剤又は予防剤を製造するための、ピルフェニドンの使用。
（２’）細胞老化を抑制する、上記（１’Ａ）記載の方法、上記（１’Ｂ）記載のピルフェニドン又は上記（１’Ｃ）記載の使用。
（３’）ＰＡＲＫ２関連疾患が、神経変性疾患である、上記（１’Ａ）記載の方法、上記（１’Ｂ）記載のピルフェニドン又は上記（１’Ｃ）記載の使用。
（４’）神経変性疾患が、パーキンソン病である、上記（３’）記載の方法、ピルフェニドン又は使用。
（５’）神経変性疾患が、レビー小体型認知症である、上記（３’）記載の方法、ピルフェニドン又は使用。
（６’）ＰＡＲＫ２関連疾患が、慢性閉塞性肺疾患である、上記（１’Ａ）記載の方法、上記（１’Ｂ）記載のピルフェニドン又は上記（１’Ｃ）記載の使用。
（７’）オートファジーを促進する、上記（１’Ａ）記載の方法、上記（１’Ｂ）記載のピルフェニドン又は上記（１’Ｃ）記載の使用。
（８’）マイトファジーを促進する、上記（７’）記載の方法、ピルフェニドン又は使用。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係るピルフェニドンを含有するＰＡＲＫ２発現促進剤は、ＰＡＲＫ２発現促進作用によりオートファジー及びマイトファジー促進効果を有するため、細胞老化に関連する疾患や慢性閉塞性肺疾患などの治療剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ピルフェニドンによるオートファジー促進効果を示す。オートファジー誘導は、ウエスタンブロット法により細胞内のＬＣ３Ｂ−ＩＩ発現量で評価した。グラフはタンパク発現量比の五回分のデータの平均±標準誤差を示している。＊はｐ＜0.05であることを示す。
【図２】ピルフェニドンによるＰＡＲＫ２発現促進効果を示す。ウエスタンブロット法により細胞内のＰＡＲＫ２を検出した。グラフはタンパク発現量比の七回分のデータの平均±標準誤差を示している。＊はｐ＜0.05であることを示す。
【図３】ピルフェニドンによるマイトファジー促進効果を示す。マイトファジー誘導は、ＴＯＭＭ２０及びＬＣ３Ｂ−ＩＩの各細胞内局在及び共局在（Merge）を共焦点顕微鏡（４００倍）により検出して評価した。
【図４】ピルフェニドンによるマイトファジー促進効果に対するPARK2 siRNAの影響を示す。マイトファジー誘導は、ＴＯＭＭ２０及びＬＣ３Ｂ−ＩＩの各細胞内局在及び共局在（Merge）を共焦点顕微鏡（４００倍）により検出して評価した。
【図５】ピルフェニドンによる活性酸素種（ＲＯＳ）産生抑制効果と、その抑制効果に対するPARK2 siRNAの影響を示す。細胞内ＲＯＳ産生は、MitoSOX Redを用いて蛍光顕微鏡（４００倍）により検出して評価した。
【図６】ピルフェニドンによるｐ２１発現抑制効果と、その抑制効果に対するPARK2 siRNAの影響を示す。ウエスタンブロット法により細胞内のｐ２１を検出した。グラフはタンパク発現量比の三回分のデータの平均±標準誤差を示している。＊はｐ＜0.05であることを示す。
【図７】ピルフェニドンによる老化関連βガラクトシダーゼ（ＳＡ−ＢＧ）陽性細胞産生抑制効果と、その抑制効果に対するPARK2 siRNAの影響を示す。グラフはＳＡ−ＢＧ陽性細胞率の五回分のデータの平均±標準誤差を示している。＊はｐ＜0.05であることを示す。
【図８】ピルフェニドンによるヒストンＨ２Ａ.Ｘ陽性細胞産生抑制効果と、その抑制効果に対するPARK2 siRNAの影響を示す。ヒストンＨ２ＡＸ陽性細胞は、抗リン酸化ヒストンＨ２Ａ.Ｘ抗体を用いて共焦点顕微鏡（４００倍）により検出した。
【図９】ピルフェニドンによるＭＡＰキナーゼ阻害効果を示す。ウエスタンブロット法により細胞内の各ＭＡＰキナーゼを検出した。
【図１０】ＭＡＰキナーゼ阻害剤のＰＡＲＫ２発現への影響を示す。ウエスタンブロット法により細胞内の各ＭＡＰキナーゼ及びＰＡＲＫ２を検出した。
【図１１】神経細胞におけるピルフェニドンのＰＡＲＫ２発現促進効果を示す。ウエスタンブロット法により細胞内のＰＡＲＫ２を検出した。グラフはタンパク発現量比の五回分のデータの平均±標準誤差を示している。＊はｐ＜0.05であることを示す。
【図１２】神経細胞におけるピルフェニドンのＰＡＲＫ２発現促進効果及びｐ２１発現抑制効果を示す。ウエスタンブロット法により細胞内のＰＡＲＫ２及びｐ２１を検出した。
【図１３】神経細胞におけるピルフェニドンの老化関連βガラクトシダーゼ（ＳＡ−ＢＧ）陽性細胞産生抑制効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に本明細書において用いられる各用語の意味を説明する。各用語は特に断りのない限り、単独で用いられる場合も、または他の用語と組み合わせて用いられる場合も、同一の意味で用いられる。
【００２０】
「ピルフェニドン」とは、５−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピリジン−２−オンを意味し、以下の構造式で表される。
【化１】
2019099547.tif 000002
【００２１】
「ピルフェニドン」の一つ以上の水素、炭素、窒素及び／又は酸素は、それぞれ水素、炭素、窒素および／または酸素の同位体で置換され得る。そのような同位体の例としては、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ及び１７Ｏのように、水素、炭素、窒素及び酸素が包含される。「ピルフェニドン」は、そのような同位体で置換された化合物も包含する。該同位体で置換された化合物は、医薬品としても有用であり、ピルフェニドンのすべての放射性標識体を包含する。
【００２２】
ピルフェニドンの放射性標識体は、当該技術分野で周知の方法で調製できる。例えば、トリチウム標識されたピルフェニドンは、例えば、トリチウムを用いた触媒的脱ハロゲン化反応によって、ピルフェニドンにトリチウムを導入することで調製できる。この方法は、適切な触媒、例えばＰｄ／Ｃの存在下、塩基の存在下または非存在下で、ピルフェニドンが適切にハロゲン置換された前駆体とトリチウムガスとを反応させることを包含する。他のトリチウム標識化合物を調製するための適切な方法としては、文書Isotopes in the Physical and Biomedical Sciences,Vol.1,Labeled Compounds (Part A),Chapter 6  （1987年）を参照にできる。１４Ｃ−標識化合物は、１４Ｃ炭素を有する原料を用いることによって調製できる。
【００２３】
「ＰＡＲＫ２関連疾患」とは、ＰＡＲＫ２の発現が促進されることにより症状が軽減される疾患を意味する。より具体的には、ＰＡＲＫ２の発現が促進されることにより、オートファジー及びマイトファジーが促進され、その結果として症状が軽減される疾患を意味する。前記ＰＡＲＫ２の発現が促進されることにより症状が軽減される疾患には、ＰＡＲＫ２の発現が促進されることにより症状が軽減されることが示唆されている疾患も含む。例えば、ＰＡＲＫ２発現促進により細胞老化に関するマーカー（例えば、ｐ２１、老化関連βガラクトシダーゼ、ヒストンＨ２ＡＸなど）が減少するため、ＰＡＲＫ２の発現が促進されることにより症状が軽減されることが示唆されている疾患としては、細胞老化に関連する疾患が含まれる。
【００２４】
ＰＡＲＫ２の発現が促進されることにより症状が軽減される「ＰＡＲＫ２関連疾患」の例として、パーキンソン病、レビー小体型認知症などの神経変性疾患、統合失調症、双極性障害などの精神疾患、線維症、慢性閉塞性肺疾患、加齢性黄斑変性症、尋常性白斑、糖尿病性腎症、動脈硬化、骨関節炎、椎間板ヘルニア、肝硬変、慢性膵炎が挙げられる。好ましくは、パーキンソン病、レビー小体型認知症などの神経変性疾患及び慢性閉塞性肺疾患、さらに好ましくはパーキンソン病、レビー小体型認知症などの神経変性疾患、特に好ましくはパーキンソン病及びレビー小体型認知症、最も好ましくはパーキンソン病が挙げられる。
【００２５】
細胞老化に関連する疾患は、ｐ２１、老化関連βガラクトシダーゼ、ヒストンＨ２ＡＸなどの細胞老化に関するマーカーの発現の亢進、オートファジー又はマイトファジーの低下、酸化ストレスの促進などを特徴としている。細胞老化に関連する疾患の例としては、パーキンソン病、レビー小体型認知症などの神経変性疾患、線維症、加齢性黄斑変性症、尋常性白斑、糖尿病性腎症、動脈硬化、骨関節炎、椎間板ヘルニア、肝硬変、慢性膵炎が挙げられる。
【００２６】
神経変性疾患は、中枢神経系に発症し、特定の神経細胞群の減少などを特徴としている。神経変性疾患の例としては、パーキンソン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋委縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症が挙げられる。
【００２７】
精神疾患は、脳の機能的な障害などを特徴としている。精神疾患の例としては、統合失調症、双極性障害、うつ病、アルコール依存症、解離性障害、強迫性障害、睡眠障害、摂食障害、適応障害、パーソナリティ障害、発達障害、パニック障害、ＰＴＳＤ、薬物依存症、性同一性障害、てんかんが挙げられる。
【００２８】
線維症は、様々な組織における炎症の慢性化の結果として起こる、過修復によるコラーゲンなどの異常蓄積などを特徴としている。線維症の例としては、特発性肺線維症などの肺線維症、肝硬変などの肝線維症、糸球体腎炎などの腎線維症、強皮症、ケロイドなどの皮膚線維症、膵嚢胞性線維症、心筋線維症、筋骨格系線維症が挙げられる。
【００２９】
本発明の特徴は、ピルフェニドンを含有するＰＡＲＫ２発現促進剤が、ＥＲＫ、ｐ３８ＭＡＰＫなどのＭＡＰキナーゼ阻害を介さずに、細胞老化に関連する疾患や慢性閉塞性肺疾患などのＰＡＲＫ２関連疾患に対して治療効果を示すことである。
【００３０】
本発明の特徴は、ピルフェニドンを含有するＰＡＲＫ２発現促進剤が、オートファジー促進効果を有することである。
【００３１】
本発明の特徴は、ピルフェニドンを含有するＰＡＲＫ２発現促進剤が、マイトファジー促進効果を有することである。
【００３２】
本発明の特徴は、ピルフェニドンを含有するＰＡＲＫ２発現促進剤が、細胞老化抑制効果を有するため、細胞老化関連疾患の治療に用いるものであることである。
【００３３】
本発明の特徴は、ピルフェニドンを含有するＰＡＲＫ２発現促進剤が、神経変性疾患の治療に用いるものであることである。
【００３４】
本発明の特徴は、ピルフェニドンを含有するＰＡＲＫ２発現促進剤が、慢性閉塞性肺疾患の治療に用いるものであることである。
【００３５】
本発明に係るピルフェニドンを含有するＰＡＲＫ２発現促進剤は、ＰＡＲＫ２発現促進作用を有し、オートファジー／マイトファジー促進効果及び細胞老化の抑制効果を示すため、パーキンソン病、レビー小体型認知症などの神経変性疾患、統合失調症、双極性障害などの精神疾患、線維症、慢性閉塞性肺疾患、加齢性黄斑変性症、尋常性白斑、糖尿病性腎症、動脈硬化、骨関節炎、椎間板ヘルニア、肝硬変、慢性膵炎などのＰＡＲＫ２関連疾患に対する治療剤及び／又は予防剤として有用である。
【００３６】
本発明に係るピルフェニドンを含有するＰＡＲＫ２発現促進剤を投与する場合、経口的、非経口的のいずれの方法でも投与することができる。経口投与は常法に従って錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の通常用いられる剤型に調製して投与すればよい。非経口投与は、注射剤、吸入剤等の通常用いられるいずれの剤型でも好適に投与することができる。ピルフェニドンを含有する治療用医薬組成物は経口吸収性が高いため、経口剤として好適に使用できる。また、吸入剤として使用することにより、光過敏症などの副作用を軽減することができる。
【００３７】
本発明に係るピルフェニドンを含有するＰＡＲＫ２発現促進剤の有効量にその剤型に適した賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等の各種医薬用添加剤を必要に応じて混合し、医薬組成物とすることができる。
【００３８】
本発明に係るピルフェニドンを含有するＰＡＲＫ２発現促進剤の投与量は、患者の年齢、体重、疾病の種類や程度、投与経路等を考慮した上で設定することが望ましいが、成人に経口投与する場合、通常０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ／日であり、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内である。非経口投与の場合には投与経路により大きく異なるが、通常０．００５〜１０ｍｇ／ｋｇ／日であり、好ましくは０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内である。これを１日１回〜数回に分けて投与すれば良い。
【実施例】
【００３９】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００４０】
実施例１  オートファジー誘導評価
細胞内のオートファジーを反映するマーカーであるＬＣ３Ｂ−ＩＩをウエスタンブロット法で検出することにより、オートファジー誘導を評価した。
評価に用いるヒト気道上皮細胞（ＨＢＥＣ）は、Araya et al, The Journal of Clinical Investigation、117巻、11号、3551-62頁（2007年）、The lung: Scientific Foundations、Lippincott Williams & Wilkins（1997年）などに記載された方法で得た。気道検体を抗生物質含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、プロテアーゼで一晩処理した後、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を添加して振盪した。気道から剥離したＨＢＥＣが含まれた培地を遠心し、上清を除去した。沈殿物をトリプシン処理し、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭを添加して遠心し、上清を除去してＨＢＥＣを得た。
得られたＨＢＥＣを１％喫煙刺激（ＣＳＥ）／無刺激のBronchial epithelial cell growth medium（ＢＥＧＭ）（Lonza）により、ピルフェニドン（ＰＦＤ）（50 μg/ml）添加／無添加条件下で２４時間培養し、トリス塩酸、グリセロール及び２−メルカプトエタノールを含有するＳＤＳサンプルバッファーでタンパク検体を採集した。なお、１００％ＣＳＥ培地としては、一本のタバコの煙をシリンジで40 mlずつ引き、10 mlの無血清培地に添加し、0.22 μmフィルター（Milipore）により不溶成分を除去したものを使用した。ＬＣ３Ｂ−ＩＩはプロテアーゼで分解されやすいため、Protease inhibitor処理群には、Ｅ−６４−ｄ（10 μg/ml）（ペプチド研究所）及びぺプスタチンＡ（10 μg/ml）（ペプチド研究所）を含有するProtease inhibitorをタンパク検体採集の６時間前に培地に添加した。得られたタンパク検体を用い、抗ＬＣ３Ｂ抗体（Novus, 600-1384）及び抗β−アクチン抗体（Sigma-Aldrich, A5316）を用いて、それぞれウエスタンブロット法にて発現量を検討した。
結果を図１に示す。Protease inhibitor処理群は未処理群に比べ、ＬＣ３Ｂ−ＩＩが増加し、オートファジー活性が確認された。加えて、喫煙刺激がオートファジーを誘導し、ピルフェニドンがオートファジーをさらに促進することが示された。
【００４１】
実施例２  ＰＡＲＫ２発現評価
ＨＢＥＣを、ピルフェニドン（0.5〜50 μg/ml）添加／無添加のＢＥＧＭにより２４時間培養し、トリス塩酸、グリセロール及び２−メルカプトエタノールを含有するＳＤＳサンプルバッファーでタンパク検体を採集した。得られたタンパク検体を用い、抗ＰＡＲＫ２抗体（Cell Signaling technology, 2132）及び抗β−アクチン抗体を用いて、それぞれウエスタンブロット法にて、ＰＡＲＫ２の発現量を検討した。
結果を図２に示す。ピルフェニドンがＰＡＲＫ２発現を濃度依存的に促進することが示された。
【００４２】
実施例３  マイトファジー誘導評価
ミトコンドリア外膜に発現するＴＯＭＭ２０及びオートファジーを反映するマーカーであるＬＣ３Ｂの各細胞内局在及び共局在を共焦点顕微鏡（Carl Zeiss, LSM880）により検出し、マイトファジー誘導を評価した。
【００４３】
（１）ピルフェニドンによるマイトファジー誘導評価
ＨＢＥＣの株化細胞であるＢＥＡＳ−２Ｂ細胞（ATCC, CRL-9609）を、１０％ＦＣＳ及び抗生物質含有ＲＰＭＩ１６４０培地により、ピルフェニドン（10, 50 μg/ml）添加／無添加条件下で２４時間培養し、メタノールを用いて細胞を培養プレートに固定した。細胞固定の６時間前に、20 nMのバフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）（Sigma-Aldrich）を添加した。固定化細胞について、抗ＴＯＭＭ２０抗体（Santa Cruz Biotechnology, sc-17764）及び抗ＬＣ３Ｂ抗体（Cell Signaling technology, 3868）を用いて、それぞれの細胞内局在及び共局在を共焦点顕微鏡により検出した。
結果を図３に示す。ピルフェニドンがマイトファジーを促進することが示された。
【００４４】
（２）ピルフェニドンのマイトファジー促進におけるＰＡＲＫ２の影響
negative control siRNAs (Applied Biosystems Life Technologies, AM4635 and AM4641) 又はPARK2 siRNA（UniGene IDHs. 132954）（Applied Biosystems Life Technologies, 4392420）を遺伝子導入したＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を、１％ＣＳＥ／無刺激の１０％ＦＣＳ及び抗生物質含有ＲＰＭＩ１６４０培地により、ピルフェニドン（50 μg/ml）添加／無添加条件下で２４時間培養し、メタノールを用いて細胞を培養プレートに固定した。なお、１００％ＣＳＥ培地は実施例１の方法に準じて作製した。細胞固定の６時間前に、20 nMのＢａｆＡ１を添加した。固定化細胞について、抗ＴＯＭＭ２０抗体及び抗ＬＣ３Ｂ抗体を用いて、それぞれの細胞内局在及び共局在を共焦点顕微鏡により検出した。
結果を図４に示す。喫煙刺激によるマイトファジー誘導はピルフェニドンにより促進され、該マイトファジー誘導はＰＡＲＫ２のノックダウンにより抑制された。つまり、喫煙刺激の際にピルフェニドンにより促進されるマイトファジーはＰＡＲＫ２発現促進に依存することが示された。
【００４５】
実施例４  活性酸素種（ＲＯＳ）産生評価
ミトコンドリア由来のＲＯＳ産生を評価できるMitoSOX Redを用いて、細胞内ＲＯＳ産生を蛍光顕微鏡により検出した。
control siRNA又はPARK2 siRNAを遺伝子導入したＨＢＥＣを、１％ＣＳＥ／無刺激のＢＥＧＭにより、ピルフェニドン（50 μg/ml）添加／無添加条件下で２４時間培養し、４％パラホルムアルデヒドを用いて細胞を培養プレートに固定した。なお、１００％ＣＳＥ培地は実施例１の方法に準じて作製した。固定化細胞について、Hoechst33258（Sigma-Aldrich）及びMitoSOX Red（Molecular Probes）を用いて、細胞内ＲＯＳ産生を蛍光顕微鏡（キーエンス、BZ-X700）により検出した。
結果を図５に示す。ピルフェニドンは喫煙刺激によるミトコンドリアＲＯＳ産生を抑制した。一方、ＰＡＲＫ２をノックダウンすると該抑制が認められなくなり、ＰＡＲＫ２発現促進によるマイトファジーがＲＯＳ産生制御に関与する可能性が示された。
【００４６】
実施例５  抗老化作用の評価
（１）細胞内のｐ２１発現
細胞老化のマーカーであるｐ２１をウエスタンブロット法で検出することにより、ピルフェニドンの抗老化作用を評価した。
control siRNA又はPARK2 siRNAを遺伝子導入したＨＢＥＣを、１％ＣＳＥ／無刺激のＢＥＧＭにより、ピルフェニドン（50 μg/ml）添加／無添加条件下で４８時間培養し、トリス塩酸、グリセロール及び２−メルカプトエタノールを含有するＳＤＳサンプルバッファーでタンパク検体を採集した。なお、１００％ＣＳＥ培地は実施例１の方法に準じて作製した。得られたタンパク検体を用い、抗ｐ２１抗体（Cell Signaling Technology, 2947）、抗ＴＯＭＭ２０抗体及び抗β−アクチン抗体を用いて、それぞれウエスタンブロット法にて発現量を検討した。
結果を図６に示す。喫煙刺激によりｐ２１発現が誘導されたが、ピルフェニドンを添加することにより抑制が認められた。一方、ＰＡＲＫ２をノックダウンすることで該抑制が認められなくなった。
【００４７】
（２）老化関連βガラクトシダーゼ（ＳＡ−ＢＧ）陽性細胞
細胞老化のマーカーであるＳＡ−ＢＧの陽性細胞を検出することにより、ピルフェニドンの抗老化作用を評価した。
control siRNA又はPARK2 siRNAを遺伝子導入したＨＢＥＣを、１％ＣＳＥ／無刺激のＢＥＧＭにより、ピルフェニドン（50 μg/ml）添加／無添加条件下で４８時間培養した。なお、１００％ＣＳＥ培地は実施例１の方法に準じて作製した。ＳＡ−ＢＧ陽性細胞の検出は、β-Galactosidase Staining Kit（BioVision, K802-250）を用いて行った。
結果を図７に示す。喫煙刺激によりＳＡ−ＢＧ陽性細胞の増加が認められたが、ピルフェニドンを添加することにより減少した。一方、ＰＡＲＫ２をノックダウンすることで該作用が認められなくなった。
【００４８】
（３）ヒストンＨ２ＡＸ陽性細胞
細胞老化のマーカーであるヒストンＨ２ＡＸの陽性細胞を検出することにより、ピルフェニドンの抗老化作用を評価した。
control siRNA又はPARK2 siRNAを遺伝子導入したＨＢＥＣを、１％ＣＳＥ／無刺激のＢＥＧＭにより、ピルフェニドン（50 μg/ml）添加／無添加条件下で４８時間培養し、４％パラホルムアルデヒドを用いて細胞を培養プレートに固定した。なお、１００％ＣＳＥ培地は実施例１の方法に準じて作製した。固定化細胞について、Hoechst33258及び抗リン酸化ヒストンＨ２ＡＸ（Phospho-Histone H2A.X）抗体（Cell Signaling Technology, 2577）を用いて、ヒストンＨ２ＡＸ陽性細胞を蛍光顕微鏡（キーエンス、BZ-X700）により検出した。
結果を図８に示す。喫煙刺激によりヒストンＨ２ＡＸ陽性細胞の増加が認められたが、ピルフェニドンを添加することにより減少した。一方、ＰＡＲＫ２をノックダウンすることで該作用が認められなくなった。
【００４９】
実施例６  ＰＡＲＫ２発現促進へのＭＡＰキナーゼの影響
ピルフェニドンによるＰＡＲＫ２発現促進における、ＥＲＫ及びｐ３８ＭＡＰＫの影響有無を評価した。
ＨＢＥＣを、ピルフェニドン（50μg/ml）、ＥＲＫ阻害剤のPD98059（20μM）（Sigma-Aldrich）、またはｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤であるSB203580（1μM）（Sigma-Aldrich）を含有するＢＥＧＭで２４時間培養後、トリス塩酸、グリセロール及び２−メルカプトエタノールを含有するＳＤＳサンプルバッファーでタンパク検体を採取した。得られたタンパク検体を用い、抗ＥＲＫ抗体（Cell Signaling Technology, 4695）、抗リン酸化ＥＲＫ（ｐ−ＥＲＫ）抗体（Thr202/Tyr204）（Cell Signaling Technology, 4370）、抗ｐ３８ＭＡＰＫ抗体（Cell Signaling Technology,8690）、抗リン酸化ｐ３８ＭＡＰＫ（ｐ−ｐ３８ＭＡＰＫ）抗体（Thr180/Tyr182）（Cell Signaling Technology, 4511）、抗ＰＡＲＫ２抗体及び抗β−アクチン抗体を用いて、それぞれウエスタンブロット法にて発現量を検討した。
結果を図９及び図１０に示す。ＨＢＥＣにおいて、ＰＡＲＫ２発現促進活性を示す濃度（50μg/ml）のピルフェニドンはＥＲＫ及びｐ３８ＭＡＰＫのキナーゼ活性に対し阻害作用を示したが、ＥＲＫ阻害剤およびｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤によりＰＡＲＫ２発現は促進されなかった。以上の結果により、ピルフェニドンによるＰＡＲＫ２発現促進には、ＥＲＫ及びｐ３８ＭＡＰＫ阻害作用は関与していないことが示された。
【００５０】
実施例７  神経細胞におけるＰＡＲＫ２発現評価
神経細胞としてアストロサイトを用い、ピルフェニドンのＰＡＲＫ２発現に対する影響を評価した。
アストロサイト（Lonza, CC-2565）をAstrocyte growth medium（ＡＧＭ）（Lonza）を用いて培養し、６穴プレートで８０％コンフルエント程度に増殖した段階で検討に使用した。0.5〜100 μg/mlのピルフェニドンを含むＡＧＭで２４時間培養し、トリス塩酸、グリセロール及び２−メルカプトエタノールを含有するＳＤＳサンプルバッファーでタンパク検体を採取した。抗ＰＡＲＫ２抗体及び抗β−アクチン抗体を用いて、それぞれウエスタンブロット法にて、ＰＡＲＫ２の発現量を検討した。
結果を図１１に示す。ピルフェニドンが神経細胞においてもＰＡＲＫ２発現を濃度依存的に促進することが示された。
【００５１】
実施例８  神経細胞における抗老化作用の評価
（１）細胞内のｐ２１発現
実施例５と同様に、細胞老化のマーカーであるｐ２１をウエスタンブロット法で検出することにより、神経細胞におけるピルフェニドンの抗老化作用を評価した。
アストロサイトをＡＧＭを用いて培養し、６穴プレートで８０％コンフルエント程度に増殖した段階で検討に使用した。0.5〜100 μg/mlのピルフェニドンを含むＡＧＭで４８時間培養し、トリス塩酸、グリセロール及び２−メルカプトエタノールを含有するＳＤＳサンプルバッファーでタンパク検体を採取した。抗ＰＡＲＫ２抗体、抗ｐ２１抗体及び抗β−アクチン抗体を用いて、それぞれウエスタンブロット法にて、ＰＡＲＫ２の発現量を検討した。
結果を図１２に示す。神経細胞においても、ピルフェニドンが濃度依存的にＰＡＲＫ２発現を促進するのに対し、ｐ２１発現を抑制することが示された。
【００５２】
（２）老化関連βガラクトシダーゼ（ＳＡ−ＢＧ）陽性細胞
実施例５と同様に、細胞老化のマーカーであるＳＡ−ＢＧの陽性細胞を検出することにより、神経細胞におけるピルフェニドンの抗老化作用を評価した。
アストロサイトをＡＧＭによりピルフェニドン（50 μg/ml）添加／無添加条件下で４８時間培養した。ＳＡ−ＢＧ陽性細胞の検出は、老化細胞組織化学染色キット（Sigma-Aldrich, CS0030）を用いて行った。
結果を図１３に示す。ピルフェニドンが神経細胞においてもＳＡ−ＢＧ陽性細胞を減少させることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明に係るピルフェニドンを含有するＰＡＲＫ２発現促進剤は、ＰＡＲＫ２発現促進作用によりオートファジー及びマイトファジー促進効果を有するため、細胞老化に関連する疾患や慢性閉塞性肺疾患などの治療剤として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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