(57)【要約】【課題】本発明は、性成熟後の反芻動物、特にウシにおける卵胞刺激ホルモン分泌を促進する剤を提供することを課題とする。【解決手段】アンチミューラリアンホルモンを有効成分とする性成熟後の反芻動物における卵胞刺激ホルモン分泌促進剤を作製する。反芻動物がウシであることや、卵胞刺激ホルモンの分泌がゴナドトロフ細胞からの分泌であることが好ましい。また、卵胞刺激ホルモンの分泌が、ゴナドトロフ放出ホルモン非存在下における卵胞刺激ホルモンの分泌であることが好ましい。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンチミューラリアンホルモンを有効成分とする性成熟後の反芻動物における卵胞刺激ホルモン分泌促進剤。
【請求項２】
反芻動物がウシであることを特徴とする請求項１記載の卵胞刺激ホルモン分泌促進剤。
【請求項３】
卵胞刺激ホルモンの分泌がゴナドトロフ細胞からの分泌であることを特徴とする請求項１又は２記載の卵胞刺激ホルモン分泌促進剤。
【請求項４】
ゴナドトロフ放出ホルモン非存在下における卵胞刺激ホルモンの分泌を促進することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の卵胞刺激ホルモン分泌促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンチミューラリアンホルモンを有効成分とする性成熟後の反芻動物における卵胞刺激ホルモン分泌促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウシは単胎動物であり、通常１回の性周期で１個しか排卵しないため、基本的には１回の妊娠で１頭が生まれることとなる。そこで、ウシの繁殖においては過剰排卵を誘起させて、多数の卵子を雌ウシから回収して他の雌ウシに移植し、一度に多数の産子を得る方法が広く行われている。
【０００３】
また、ウシの繁殖管理においては１年に１産が理想的であり、分娩後再受胎するまでの空胎日数が所定の日数を超えると経済的な損失が生じてしまう。そのため、排卵を誘起して空胎日数をコントロールする方法も広く行われている。
【０００４】
排卵の誘起には、性腺刺激ホルモン（ＬＨ）や卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）という、生殖のために非常に重要なホルモンが関与していることが知られており、これらＬＨやＦＳＨの分泌を制御することがウシの繁殖において重要となる。かかるＬＨやＦＳＨは、下垂体前葉に存在するゴナドトロフ細胞から分泌される。このゴナドトロフ細胞は性機能調節の中心的な役割を担っており、近年、ゴナドトロフ細胞の解析が本発明者らを中心に進められている。
【０００５】
たとえば本発明者らは、ウシ下垂体前葉中のゴナドトロフ細胞を蛍光免疫染色法で観察し、ゴナドトロフ放出ホルモンレセプター（ＧｎＲＨＲ）はゴナドトロフ細胞の細胞膜上の特殊構造である脂質イカダ（Ｌｉｐｉｄ  Ｒａｆｔ）に限局することを解明した（非特許文献１参照）。次に本発明者らは、ウシの下垂体前葉に発現する全遺伝子を、次世代シーケンサーを用いて解析し、新規のウシのゴナドトロフ細胞で発現する受容体としてＧＰＲ６１の発見に至った（非特許文献２参照）。
【０００６】
一方、ウシのＬＨやＦＳＨ分泌に関して研究が進められ、いくつかその方法が提示されている。例えば、本発明者らは、キスペプチンを用いたウシゴナドトロフ細胞からのＬＨ分泌刺激方法について提示した（特許文献１参照）。
【０００７】
また、雌ウシに抗インヒビン抗体を注入して受動免疫させて、インヒビンを分泌している優勢卵胞の機能を抑制し、内因性の性腺刺激ホルモンによって小卵胞を増加させた後、外因性の性腺刺激ホルモンによって雌ウシの過剰排卵を誘起する方法（特許文献２参照）や、インヒビンを能動免疫し、ついで卵胞刺激ホルモンを投与して、発育した卵胞を多数排卵させる、ウシの過剰排卵誘起方法（特許文献３参照）が提示されている。かかる方法では、血中ＦＳＨ濃度を高めることができるが、複雑でコストが高いわりに確実性が乏しかった。
【０００８】
さらに、ブタ由来ＦＳＨをポリビニルピロリドン又はカルボキシメチルセルロースを含有する水溶液として、１回の注射によりウシにおいて過剰排卵を誘起する方法（特許文献４参照）が提示されている。かかる方法では、ＦＳＨの分泌を刺激することができるが、異種であるブタ由来のタンパクであるＦＳＨをウシに投与するため、投与されたウシにおいて、前記ブタ由来のＦＳＨに対する抗体ができるという問題があった。
【０００９】
ところで、アンチミューラリアンホルモン（ＡＭＨ：別名ＭＩＳ）は卵巣内の小卵胞が分泌するホルモンである。その作用としては卵巣内におけるものだけが主に知られており、ＡＭＨレセプタータイプ２（ＡＭＨＲ２）が受容体である。ラットの下垂体はＡＭＨＲ２を発現していることは知られている（非特許文献３、４参照）。またＡＭＨは、マウスの下垂体の癌細胞に由来するセルラインの一種ＬβＴ２細胞での、ＬＨβサブユニットと、ＦＳＨβサブユニットのｍＲＮＡ発現を誘導することも知られている（非特許文献３、４参照）。しかしＬβＴ２細胞は、ＬＨβサブユニットと、ＦＳＨβサブユニットのｍＲＮＡ発現はできるが、糖タンパクのホルモンであるＬＨやＦＳＨを細胞外に分泌することはできないという、正常ではない細胞であり、ＡＭＨが糖タンパクのホルモンであるＬＨやＦＳＨの分泌を刺激するかどうかは不明である。またＡＭＨは、培養下のラット下垂体において、ＬＨβサブユニットと、ＦＳＨβサブユニットのｍＲＮＡ発現量を４時間後と２４時間後には増加させるという報告があるが（非特許文献４参照）、性成熟前の雌ラットの下垂体に限定すると報告されており、その上、４時間よりも前のＡＭＨの作用は未解明である。また非特許文献４では、ＡＭＨを性成熟前の雌ラットに腹腔内投与すると、１８時間後には血中ＦＳＨ濃度が増加すると報告しているが、そのメカニズムは不明であり、ＡＭＨが下垂体前葉に直接作用してＦＳＨ分泌を促進したため血中ＦＳＨ濃度が増加したのか、ＡＭＨＲ２が発現していることがよく知られている卵巣に作用して、卵巣の何らかの機能を介して間接的に下垂体前葉に直接作用してＦＳＨ分泌を促進したため血中ＦＳＨ濃度が増加したのかは不明である。またマウス視床下部内のＧｎＲＨニューロン（ゴナドトロフを調節する細胞）もＡＭＨＲ２を発現していることが知られており（非特許文献５参照）、ＡＭＨはＧｎＲＨニューロンに作用してＬＨ分泌を活発化させるため、非特許文献４でのＡＭＨによる投与１８時間後の血中ＦＳＨ濃度の増加は、視床下部内のＧｎＲＨニューロンを介して間接的に下垂体前葉に直接作用してＦＳＨ分泌を促進した可能性も考えられる。加えて、そもそも、非特許文献４、５は、あくまで一度の分娩で１０匹程度産むラットやマウスによる結果であり、一度に基本的に１頭しか産まないウシなどの反芻動物については何ら検討されていかなった。さらに、上述のようにＦＳＨの分泌刺激作用は、性成熟前の雌でのみ確認されており、このことから、ＡＭＨによるＦＳＨ分泌刺激法には産業的な価値が無いと考えられていた。
【００１０】
また、所定以上の血清ＡＭＨレベルを有する患者にＦＳＨを投与して不妊症を治療する方法が知られているが、あくまでＦＳＨを投与するものであり、しかもヒトを対象としている（特許文献５参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０１５−１４５３５１号公報
【特許文献２】特開平１０−０７２３７０号公報
【特許文献３】特開平０８−１５４９５７号公報
【特許文献４】特開平０５−０３８３４４号公報
【特許文献５】特開２０１７−１４１２５３号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Gonadotropin-releasing hormone(GnRH) receptors of cattle aggregate on the surface of gonadotrophs and areincreased by elevated GnRH concentrations. Anim. Reprod. Sci. Kadokawa H,Pandey K, Nahar A, Nakamura U, Rudolf FO.
【非特許文献２】Deep sequencing of thetranscriptome in the anterior pituitary of heifers before and after ovulation.J. Vet. Med. Sci. Pandey K, Mizukami Y, Watanabe K, Sakaguti S, Kadokawa H.
【非特許文献３】Bedecarrats, G. Y., O'Neill, F.H., Norwitz, E. R., Kaiser, U. B., and Teixeira, J. (2003). Regulation ofgonadotropin gene expression by Mullerian inhibiting substance. Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A. 100, 9348-9353. doi: 10.1073/pnas.1633592100
【非特許文献４】Garrel, G., Racine, C., L' Hote, D., Denoyelle, C., Guigon, C. J., diClemente, N., and Cohen-Tannoudji, J. (2016). Anti- Mullerian hormone: a new actor of sexual dimorphism in pituitarygonadotrope activity before puberty. Sci. Rep. 6, 23790. doi: 10.1038/srep23790
【非特許文献５】Cimino I,Casoni F, Liu X, Messina A, Parkash J, Jamin SP, Catteau-Jonard S, Collier F,Baroncini M, Dewailly D, Pigny P, Prescott M, Campbell R, Herbison AE, PrevotV, Giacobini P. Novel role for anti- Mullerian hormone in the regulation of GnRH neuronexcitability and hormone secretion.Nat Commun. 2016;7:10055. doi:10.1038/ncomms10055.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、性成熟後の反芻動物、特にウシにおける卵胞刺激ホルモン分泌を促進する剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、ウシＡＭＨＲ２の細胞外領域に対するニワトリ抗体の作製に成功し、さらにその抗体を用いた蛍光免疫染色により、性成熟後（post-puberty）のウシのゴナドトロフ細胞がＡＭＨＲ２を発現していることを確認した。そこで、さらに本発明者らは、ＡＭＨを、性成熟後のウシ下垂体前葉の培養系に添加する実験を行った。その結果、ＡＭＨの添加によって性成熟後のウシ下垂体前葉細胞からのＦＳＨ分泌を促進することを見出した。また、このＦＳＨ分泌促進には、ゴナドトロフ放出ホルモン（ＧｎＲＨ）は必要が無いことを確認し、本発明を完成した。
【００１５】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）アンチミューラリアンホルモンを有効成分とする性成熟後の反芻動物における卵胞刺激ホルモン分泌促進剤。
（２）反芻動物がウシであることを特徴とする上記（１）記載の卵胞刺激ホルモン分泌促進剤。
（３）卵胞刺激ホルモンの分泌がゴナドトロフ細胞からの分泌であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の卵胞刺激ホルモン分泌促進剤。
（４）ゴナドトロフ放出ホルモン非存在下における卵胞刺激ホルモンの分泌を促進することを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載の卵胞刺激ホルモン分泌促進剤。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、ゴナドトロフ細胞からＦＳＨを分泌させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】下垂体前葉組織の免疫組織化学的解析の結果を示す図である。図中、矢印はＦＳＨ陽性細胞においてＡＭＨＲ２とＦＳＨが共存している箇所を示す
【図２】様々な濃度のＡＭＨを投与した場合の、培養した性成熟後のウシ下垂体前葉細胞からのＦＳＨ分泌量を調べた結果を示すグラフである。図中、“ｂ”はコントロール（プラズマローゲン及びＧｎＲＨなし）に対する有意差（Ｐ＜０．０５）があることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、アンチミューラリアンホルモン（以下、「ＡＭＨ」ともいう）を有効成分とする性成熟後の反芻動物における卵胞刺激ホルモン分泌促進剤である。ここで、ＡＭＨはＴＧＦ−βファミリーに属する１４０ｋＤａの二量体糖タンパク質であり、「抗ミューラー管ホルモン」とも呼ばれている。主にヒトや動物における卵巣内の小卵胞が分泌するホルモンであり、その作用はほとんどが卵巣内におけるものである。
【００１９】
ＡＭＨは市販品を購入して用いても、自らが化学合成したものを用いてもよい。
【００２０】
本発明において、「性成熟」とは、新たに誕生した雌子牛が成長し、約８〜１０ヶ月齢の頃に、生後初めての排卵が卵巣でおき、その排卵後に正常な性周期の反復をするという、成熟をすることをいう。
【００２１】
本発明において、「反芻動物」とは、一度飲み込んだ食物を再び口中に戻し、噛みなおして再嚥下する３〜４つの胃を有する動物を意味する。かかる反芻動物としては、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカなどを挙げることができ、ウシを好適に挙げることができる。
【００２２】
本発明における「卵胞刺激ホルモン分泌」とは、投与対象において卵胞刺激ホルモンが分泌していればよく、投与対象における下垂体前葉のゴナドトロフ細胞から分泌されることも含まれる。
【００２３】
本発明において、卵胞刺激ホルモンの分泌を促進する際には、ゴナドトロフ放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の存在下であっても非存在下であってもよいが、非存在下であることが好ましい。
【００２４】
本発明の卵胞刺激ホルモン分泌促進剤は、当業者に公知の方法で製剤化することができる。例えば、薬学的に許容しうる担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化された組成物であってもよい。
【００２５】
前記組成物において、経口投与用としては、本発明の卵胞刺激ホルモン分泌促進剤を当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体と混合することにより、錠剤、丸薬、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方することができる。担体としては、当該技術分野において公知のものを広く使用することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸などの賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グルコース液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖などの崩壊剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤；グリセリン、澱粉などの保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの潤沢剤などを用いることができる。さらに錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠、あるいは二重錠、多層錠とすることができる。
【００２６】
前記組成物において、非経口投与用としては、本発明の卵胞刺激ホルモン分泌促進剤を当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる賦形剤を用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
【００２７】
注射剤用の水溶性賦形剤としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
【００２８】
油性賦形剤としてはゴマ油、大豆油が挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
【００２９】
また、本発明の卵胞刺激ホルモン分泌促進剤の分散を制御するなどの目的で、担体、例えば、コラーゲン、ハイドロキシアパタイト、ヒアルロン酸、フィブリン、多糖、水酸化アルミニウムゲル、リポゾームと配合してもよい。調製された製剤は、経口剤または非経口投与剤として使用できる。
【００３０】
本発明の卵胞刺激ホルモン分泌促進剤の適当な投与経路としては特に限定されず、経口、直腸内、経粘膜、腸内、筋肉内、皮下、骨髄内、鞘内、直接心室内、静脈内、硝子体内、腹腔内、鼻腔内、又は眼内注射が含まれる。投与経路は、患畜の年齢や病状、併用する他の薬剤などを考慮して適宜選択することができる。
【００３１】
本発明の卵胞刺激ホルモン分泌促進剤の投与量としては、ＦＳＨを分泌促進しうる量であればよく、投与方法、年齢、症状などにより適宜決定することができる。例えば、本実施例の結果に基づきウシの血中のＡＭＨ濃度が１〜５００００ｎｇ／Ｌ、好ましくは３〜５０００ｎｇ／Ｌ、より好ましくは１０〜１０００ｎｇ／Ｌとなるようにすることが好ましい。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの
例示に限定されるものではない。
【００３３】
１．下垂体前葉細胞の調製
下垂体前葉細胞は、性成熟後の２６月齢の中黄体期黒毛和種雌子ウシ（ｎ＝１０）から得た。得られた下垂体前葉細胞をHashizumeらの方法（Biology of Reproduction,
Volume 64, Issue 3, 1 March 2001, Pages 898-903）に従い、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼを用いて酵素的に分散した。分散した細胞の生細胞率は、トリパンブルー染色により９０％以上であることを確認した。
【００３４】
次に、上記で分散した下垂体前葉細胞を１０％  ウマ血清（Thermo Fisher
Scientific社製）、２．５％ＦＢＳ、１％非必須アミノ酸（Thermo Fisher
Scientific社製）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び２．５％胎児ウシ血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）培地（Thermo Fisher Scientific社製）で懸濁した。
【００３５】
懸濁した上記細胞（２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、計０．３ｍＬ）を４８ウェルプレート（住友ベークライト社製）に播き、顕微鏡観察用チャンバー（μ-Slide VI 0.4, Ibidi社製）を用いて５％ＣＯ２、３７℃条件下で８２時間培養した。なお、培養した細胞を用いる際には、ＦＳＨ合成を刺激するために組換えヒトアクチビンＡ（終濃度１０ｎｇ／ｍＬ；R&D systems社製）をＡＭＨ添加の２４時間前に加えた。
【００３６】
免疫染色解析に用いる場合の培養した細胞の固定は、角川らの文献（Reprod.
Sci. 150, 84-95. doi: 10.1016/j.anireprosci.2014.09.008）に従い、４％パラフォルムアルデヒドで３分固定した後０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００処理を１分、又はＣｅｌｌＣｏｖｅｒ（Anacyte aboratories UG社製)で２分ほど固定し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００処理なしのいずれかで行った。
【００３７】
２．ＡＭＨＲ２に対する抗体の作製
ウシＡＭＨＲ２の細胞外領域のＮ末端側に対するニワトリ抗体を以下の方法で作製した。抗原ペプチドとしては、配列番号１に示すＡＭＨＲ２のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ  アクセッションＮｏ．ＮＰ＿００１１９２２５７．１）における細胞外領域のＮ末端側に位置する３１番目〜４５番目のアミノ酸残基（ＧＶＲＧＳＴＱＮＬＧＫＬＬＤＡ：配列番号２）を用いた。このペプチドを用いたのは３つの理由がある。１つ目は、このペプチドは、ニワトリＡＭＨＲ２の対応する領域と相同性を有しないため、ニワトリに免疫すると良い抗体を得られる確率が高いこと。２つ目は、このペプチドシークエンスは、翻訳直後のウシＡＭＨＲ２の先端にあり、細胞膜に到達する前に削除されるシグナル配列であるアミノ酸１−１７の下流領域に位置するため、細胞膜外に存在する抗体が結合できる部位であること。３つ目は、プロテインＢＬＡＳＴを用いて、ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋＴＭ／ＥＢＩ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋから入手した配列との比較により、ウシのゲノムにおいてＡＭＨＲ２のペプチドシークエンスとの相同性が無いことを確認できたため、他のウシ蛋白と抗体が交差することが無いことである。
【００３８】
上記抗原ペプチド、すなわち配列番号２に示す３１番目〜４５番目のアミノ酸残基（ＧＶＲＧＳＴＱＮＬＧＫＬＬＤＡ）はスクラム社にて合成したものを用いた。合成したのち高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び質量分析により純度９９．０％を超えるように精製した。その後、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を抗原ペプチドのシステインのスルフヒドリル基にコンジュゲートした。免疫源は完全フロイントアジュバントで乳化し、ニワトリに１４日間隔で５回注入した。最後の注入から７日後に血液を回収した。抗体はＳｕｌｆｏＬｉｎｋ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Thermo Scientific社製）で調整した抗原コンジュゲート  ゲルを含むアフィニティークロマトグラフィー（ＰＤ１０：ＧＥヘルスケア社製）で精製した。
【００３９】
３．下垂体に対する蛍光免疫染色
４％パラフォルムアルデヒド含有ＰＢＳ中、４℃で１６時間保存後、下垂体前葉（ｎ＝３）又は卵巣がん組織ブロック（ｎ＝３）を、３０％スクロースがブロックに浸透するまでスクロース含有ＰＢＳ中に置いた。下垂体前葉組織の免疫蛍光解析は、次の文献に従って行った（Kadokawa, H., et al., (2014). Anim. Reprod. Sci. 150, 84-95. doi:
10.1016/j.anireprosci.2014.09.008）。簡潔に記載すると、１５μｍの矢状切片を作製してスライドに載せた。その切片を０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳで１５分処理し、ブロッキングのために１時間ほど１０％ヤギ正常血清（和光純薬工業社製）を含むＰＢＳ０．５ｍＬでインキュベートした。一次抗体（抗ＧｎＲＨＲギニアブタ抗体、抗ＡＭＨＲ２ニワトリ抗体、及び、抗ＦＳＨβマウス抗体（すべて１：１０００希釈））のカクテルにより１２時間４℃でインキュベートし、その後蛍光色素結合二次抗体（Thermo Scientific社製）及び１μｇ／ｍＬの４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ：和光純薬工業社製）により２時間室温でインキュベートした。さらに、上記で作製した抗ＡＭＨＲ２ニワトリ抗体（１：１０００）でインキュベートした１５μｍの卵巣切片を調整し、抗ＡＭＨＲ２抗体の確認のためにポジティブコントロールとして１μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ニワトリＩｇＧ及びＤＡＰＩでインキュベートした。スライド上の染色した切片は４０５ｎｍのダイオードレーザー、４８８ｎｍのアルゴンレーザー、５３３ｎｍのＨｅＮｅレーザー、及び６３３ｎｍのＨｅＮｅレーザーを備えた共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７１０：CarlZeiss社製）で観察した。蛍光顕微鏡で得たイメージは４０倍又は６３倍の油浸対物レンズでスキャンし、ＺＥＮ２０１２  ｂｌａｃｋ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ソフトウェア（Carl Zeiss社製）によってコントロールしたＣＣＤカメラシステムによって記録した。ＧｎＲＨＲ、ＡＭＨＲ２及びＦＳＨβの局在は、３次元免疫標識標本の共焦点イメージにより調べた。なお、上記抗ＧｎＲＨＲギニアブタ抗体は次の文献（Kadokawa, H.,  et al.,  (2014).  Anim. Reprod.   Sci.   150,   84-95.   doi:  10.1016/j.anireprosci.2014.09.008）に記載されたＧｎＲＨＲのＮ末端側の細胞外領域を認識する抗体を用い、抗ＦＳＨβマウス抗体は次の文献（Borromeo,   V., Amsterdam,A.,  Berrini,  A.,  aggioli,  D.  Dantes,  A.,  and  Secchi,  C.  (2004).  Gen. Comp. Endocrinol.  139,  179-189. doi:10.1016/j.ygcen.2004.09.005）に記載された、下垂体前葉組織の免疫組織化学的解析における他の脳下垂体ホルモンとクロス反応を行わない抗ＦＳＨβサブユニット  マウスモノクローナル抗体（クローンＡ３Ｃ１２）を用いた。結果を図１に示す。図１において矢印はＦＳＨ陽性細胞においてＡＭＨＲ２とＦＳＨが共存している箇所を示す。
【００４０】
図１の矢印の箇所に示すように、ＦＳＨ陽性細胞においてＡＭＨＲ２とＦＳＨが共存していることが確認された。
【００４１】
４．ＦＳＨの分泌
ＧｎＲＨ非存在下におけるＦＳＨの分泌に対するＡＭＨの影響を評価するために、上記と同様に下垂体前葉細胞を８２時間培養後のＤＭＥＭ培地を０．１％ＢＳＡ及び１０ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを含む２９５μＬのＤＭＥＭ培地で置換して２時間培養した。次に、５μＬのＤＭＥＭのみ、又は様々な濃度のヒト組換えＡＭＨ：終濃度０，１，１０，１００,１０００ｐｇ／ｍＬ：R&D systems社製）を含む５μＬのＤＭＥＭを加えてさらに２時間培養した。培養後、それぞれのウェルの培地をＦＳＨレベルの放射免疫測定（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）のために回収した。
【００４２】
＜ＲＩＡ解析＞
上記で回収した培地中のＦＳＨ濃度は、１２５Ｉ−標識ｂＦＳＨと抗ｏＦＳＨ抗血清（AFP5318C,   AFP5346D,及びAFPC5288113,   National  Hormone  and  Pituitary  Program  of  the  National  Institute  of  Diabetes  and  Digestive  and  Kidney  Diseases：NIDDK）を用いた二抗体ＲＩＡによって二重解析した。検出限界値は０．２０ｎｇ／ｍＬであった。
【００４３】
図２に、様々な濃度のウシ脳由来のＡＭＨを投与した場合の、培養した性成熟後のウシ下垂体前葉細胞からのＦＳＨ分泌量を調べた結果を示す。図中、Ｘ軸は加えたＡＭＨ濃度、Ｙ軸は、ＡＭＨ無しで培養液のみを添加した場合(０ｐｇ／ｍＬ：Ｃｏｎｔｒｏｌ)の培養液中ＦＳＨ濃度に対する、各濃度のＡＭＨを添加した場合の培養液中ＦＳＨ濃度の比率を示す。図２に示すように、１０ｐｇ／ｍＬ（Ｐ＜０．０５）、１００ｐｇ／ｍＬ（Ｐ＜０．０５）、１０００ｐｇ／ｍＬ（Ｐ＜０．０５）のウェルではＡＭＨ、及びＧｎＲＨ無し（コントロール）と比較してＦＳＨ濃度が有意に高かった。
【００４４】
上記結果より、ウシから抽出されたＡＭＨをウシに添加すると、ウシ下垂体前葉細胞よりＦＳＨ分泌を刺激することが明らかとなった。また、かかるＦＳＨ分泌はＧｎＲＨに依存しない、すなわちＧｎＲＨがなくてもＦＳＨの分泌を刺激可能であることが明らかとなった。本発明者らのこれまでのゴナドトロフ細胞の解析を考慮すると、このＦＳＨ分泌はＡＭＨがＧｎＲＨＲの細胞内伝達経路を活性化させたことによって生じたと考えられる。そのため、生体内でＧｎＲＨがほとんど分泌されていない分娩直後であっても、ウシ脳から抽出したＡＭＨを添加することでＧｎＲＨＲの細胞内伝達経路を活性化させＦＳＨを分泌させることが可能であることが示唆された。
【００４５】
また、１０ｐｇ／ｍＬ、１００ｐｇ／ｍＬというごく微量で作用するため、投与量が少なくてすみ、様々な投与法を選べて低コストで済むという観点で実用性が高い。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
ＦＳＨは、卵巣・子宮の分娩後回復、発情明瞭化、受胎促進などを調節する重要なホルモンである。ウシのゴナドトロフ細胞からのＦＳＨ分泌を、ＡＭＨによって刺激できることから、本発明は、ウシにおける過剰排卵や、繁殖障害の治療などに用いることが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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