(57)【要約】【課題】新規な８−プレニルナリンゲニンの製造方法を提供する。【解決手段】スイカを用意するスイカ用意工程と、前記スイカからスイカ抽出物を得る抽出工程と、前記抽出工程で得られた前記スイカ抽出物から８−プレニルナリンゲニンを分離する分離工程と、を行うことを特徴とする８−プレニルナリンゲニンの製造方法である。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スイカを用意するスイカ用意工程と、
前記スイカからスイカ抽出物を得る抽出工程と、
前記抽出工程で得られた前記スイカ抽出物から８−プレニルナリンゲニンを分離する分離工程と、
を行うことを特徴とする８−プレニルナリンゲニンの製造方法。
【請求項２】
前記スイカがシトラスラナタス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）であることを特徴とする請求項１に記載の８−プレニルナリンゲニンの製造方法。
【請求項３】
前記シトラスラナタス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）は、アフリカ・カラハリ砂漠由来の野生スイカであることを特徴とする請求項２に記載の８−プレニルナリンゲニンの製造方法。
【請求項４】
前記スイカ抽出物が前記シトラスラナタス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）の果実から得られる果汁であることを特徴とする請求項２又は３に記載の８−プレニルナリンゲニンの製造方法。
【請求項５】
前記果実は、該果実の果肉，果皮及び種子を含むことを特徴とする請求項４に記載の８−プレニルナリンゲニンの製造方法。
【請求項６】
８−プレニルナリンゲニンを有効成分として含有し、
ウイルス感染症の予防又は改善に用いられることを特徴とする抗ウイルス用食品組成物。
【請求項７】
前記ウイルス感染症は、インフルエンザウイルス、ノロウイルス及びロタウイルスからなる群より選択される少なくとも１種のウイルスの感染症であることを特徴とする請求項６に記載の抗ウイルス用食品組成物。
【請求項８】
前記ウイルス感染症は、インフルエンザウイルスの感染症であることを特徴とする請求項７に記載の抗ウイルス用食品組成物。
【請求項９】
８−プレニルナリンゲニンを有効成分として含有し、
ウイルス感染症の予防又は治療に用いられることを特徴とする抗ウイルス剤。
【請求項１０】
前記ウイルス感染症は、インフルエンザウイルス、ノロウイルス及びロタウイルスからなる群より選択される少なくとも１種のウイルスの感染症であることを特徴とする請求項９に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１１】
前記ウイルス感染症は、インフルエンザウイルスの感染症であることを特徴とする請求項１０に記載の抗ウイルス剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な８−プレニルナリンゲニンの製造方法、抗ウイルス用食品組成物及び抗ウイルス剤、特にスイカを原料とする８−プレニルナリンゲニンの製造方法、ウイルス感染症の予防又は治療に用いられる抗ウイルス用食品組成物及び抗ウイルス剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス感染症は、環境中（大気、水、土壌、動物など）に存在する病原体であるウイルスが、ヒトの体内に侵入することで引き起こされる感染性疾患であって、局地的な流行で終息することもあるが、動物（特にヒト）の移動によって世界的な規模で感染が拡大し、公衆衛生上の問題となることがある。
ウイルスは、一般に約０．０２〜０．３μｍの大きさからなる微小な寄生体であって、主にタンパク質の殻（カプシド）と、その殻内部にある核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）から構成されている。
ウイルスは、その複製については完全に細胞に依存しており、まず宿主細胞に吸着して細胞内に侵入する。そして、細胞内でＤＮＡやＲＮＡを放出（脱殻）して複製されるが、その過程では特異的酵素を必要とする。ウイルスに感染した宿主細胞は、正常に機能できなくなって通常は死滅し、その宿主細胞から新しいウイルスが放出されて他の宿主細胞へさらに感染する。
ウイルスは、ゲノムとしてＤＮＡを有するＤＮＡウイルスと、ＲＮＡを有するＲＮＡウイルスとに大別され、ＲＮＡウイルスの中には、代表的なウイルスとして呼吸器疾患を引き起こすインフルエンザウイルスや、消化器疾患を引き起こすロタウイルス及びノロウイルスが知られている。
【０００３】
インフルエンザウイルスは、急性の呼吸器感染症であるインフルエンザを引き起こし、国内では毎年冬に数百万人のインフルエンザ患者が報告されており、インフルエンザは高い罹患率と死亡率を伴うものである。特に、乳幼児や高齢者にとっては重要な疾患であって、高齢者では肺炎の合併率が高く、インフルエンザによる死亡の多くが高齢者で占められている。
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科に属し、核タンパクの抗原性の違いによってＡ型、Ｂ型及びＣ型に分類されている。その中で、Ａ型とＢ型のウイルス表面にある糖タンパク質は変異が大きく、インフルエンザの種類が多い要因となっている。特に、Ａ型インフルエンザウイルスは、抗原性が変異しやすいため、毎年インフルエンザウイルス感染を大流行させている。
【０００４】
インフルエンザウイルス感染の予防として、インフルエンザワクチンが用いられており、ワクチンを皮下注射や筋肉注射することで、インフルエンザウイルスに対する免疫を予め体内に確立しておき、感染を予防することが一般に行われている。
またインフルエンザの治療剤としては、例えば、ウイルスの脱殻過程において細胞内でＲＮＡを放出する際に必要なＭ２蛋白を阻害することで、ウイルス増殖を抑制するアマンタジン（商品名：シンメトレル）が用いられている。また、ウイルスの放出過程において感染した宿主細胞からのウイルス放出に必要なノイラミニダーゼを阻害することで、ウイルス増殖を抑制するオセルタミビル（商品名：タミフル）やザナミビル（商品名：リレンザ）が用いられている。
【０００５】
しかしながら、予防ワクチンについて特にＡ型インフルエンザウイルスでは、抗原性が変異しやすい性質のため、流行の抗原タイプの予測が困難であるのに加えて、ワクチン製造に時間がかかるため、有効なワクチンを十分に製造及び供給することが困難である。
また、インフルエンザ治療剤については、その有効性が認知されている一方で、副作用や耐性株の出現等の問題がある。またアマンタジンでは、Ａ型ウイルスのＭ２蛋白を阻害する効果があるがＢ型ウイルスの蛋白には結合できず効果がない等、同じ活性成分でもウイルスの型によって効果が異なる（非特許文献１参照）。
インフルエンザは、現代においてもその強烈な伝播力によって大きな流行を繰り返す伝染病であって、社会に莫大な被害を及ぼしている。インフルエンザウイルスに有効で安全性の高い薬剤は少ないうえに、耐性ウイルスの出現なども問題視されているため、新規メカニズムの抗インフルエンザウイルス剤の開発が強く望まれているところである。
【０００６】
また、ロタウイルスは、消化器疾患である感染性胃腸炎を引き起こすウイルスであって、一般に乳児下痢症や嘔吐下痢症の原因として知られている。特に、冬季に見られる乳児下痢症は、主に２歳以下の幼児に対して発熱、嘔吐、下痢及び脱水症状を引き起こす重症の下痢症疾患である。
わが国では、ロタウイルス胃腸炎による年間の患者数は約８０万人、入院者数は約７〜８万人に及ぶと推計されており、毎年数名の死亡者が報告されている。ロタウイルスは感染力が非常に強く、衛生環境の整った先進国であっても、概ね５歳までにほぼ１００％のヒトがロタウイルスに一度は感染すると考えられている。アメリカ合衆国では年間約５０万人以上が主に下痢症状で受診し、特に小児は重篤な下痢を起こし易く、罹患患者の約１０％は入院すると言われている。地域差があると考えられるが、全世界で毎年約７０万人程度が亡くなっていると考えられている。
先進国の疫学調査によると、衛生状態の改善ではロタウイルスの有病率を減少させることはできないとされている。また、ロタウイルスに対するワクチンが一応開発されているものの、ワクチンの無効な型や組み替え体が存在するため、それらの対策が求められている。そこで、新規メカニズムのロタウイルス治療剤の開発が期待されている。
【０００７】
また、ノロウイルスは、消化器疾患である感染性胃腸炎を引き起こすウイルスであって、カキなどの貝類の摂食による食中毒の原因になるほか、感染したヒトの糞便や吐瀉物、あるいはそれらが乾燥したものから出る塵埃を介して経口感染する。ノロウイルス属による集団感染は、世界各地の学校や乳幼児施設、高齢者施設などで散発的に発生しており、脱水症状から重症となって死亡する例もある。
ノロウイルス感染症は近年増加傾向にあり、ノロウイルスは変異を繰り返して、ヒトからヒトへ感染するよう変異することがあり、新型のノロウイルスに対する抗体をもたないために大流行することが多い。しかしながら、ノロウイルスに対するワクチンは、一部有効性が認められるものもあるがまだ開発途上にあって、ノロウイルスワクチンの開発や、新規メカニズムのノロウイルス治療剤の開発が期待されている。
【０００８】
一方で、近年、遊離アミノ酸の一種であるシトルリンを高濃度に含んだ野生種のスイカ（シトラスラナタス：Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）が注目されている。
野生スイカの代表的なものとして、アフリカ・カラハリ砂漠に自生するボツワナ原産のスイカが知られており、日本国内の比較的温和な環境に適応したスイカとは異なって、厳しい砂漠環境を生き抜くための環境ストレス耐性能力を有している（非特許文献１参照）。
野生スイカは、シトルリンを高濃度に蓄積し、強い紫外線から身を守る能力と、水分を保持する能力とに優れていることから、各種機能や、機能性発現のメカニズムの解明、ひいては、この物質の利用法等の開発が望まれている。
【０００９】
例えば、特許文献１には、野生種スイカの果肉抽出液を有効成分とする活性酸素消去剤、保湿剤が挙げられている。そして、野性種スイカの果肉に含まれるシトルリンを単独で用いるよりも、野生種スイカの果肉抽出液そのものを活性酸素消去剤として用いる方が、約１０倍活性酸素消去活性が高いこと、また、野生種スイカの果肉抽出液が高い保湿効果を有することが明らかとなっている。
また特許文献２には、野生種スイカの抽出物を有効成分とするメラニン生成抑制剤が挙げられている。そして、野生種スイカの果肉抽出物よりも葉抽出物の方が、優れた活性酸素消去作用やチロシナーゼ阻害作用があることも明らかとなっている。
【００１０】
こうした野生スイカの抽出物の機能性は、一部はシトルリンを高濃度に蓄積することによる効果であるが、大部分については未同定の物質によるものと考えられている。そして、野生スイカの抽出物の機能性について未だ一部しか明らかになっておらず、上述した機能以外の機能の解明、この物質の利用法等の開発が期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特許第４８８７４９９号公報
【特許文献２】特開２００７−１９７３６０号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Yokota et al.:Annals of botany89:825-832(2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、新規な８−プレニルナリンゲニンの製造方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、８−プレニルナリンゲニンの新規な利用方法となる抗ウイルス用食品組成物及び抗ウイルス剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、鋭意研究した結果、スイカ、特に野生スイカの抽出物が、８−プレニルナリンゲニンを含有し、８−プレニルナリンゲニンがウイルス、特にＲＮＡウイルスであるインフルエンザウイルス、ロタウイルス及びノロウイルスの増殖を阻害させる作用を有することを見出した。
【００１５】
従って、前記課題は、本発明の８−プレニルナリンゲニンの製造方法によれば、スイカを用意するスイカ用意工程と、前記スイカからスイカ抽出物を得る抽出工程と、前記抽出工程で得られた前記スイカ抽出物から８−プレニルナリンゲニンを分離する分離工程と、を行うこと、により解決される。
このとき、前記スイカがシトラスラナタス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）であるとよい。
このとき、前記シトラスラナタス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）は、アフリカ・カラハリ砂漠由来の野生スイカであるとよい。
このとき、前記スイカ抽出物が前記シトラスラナタス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）の果実から得られる果汁であるとよい。
このとき、前記果実は、該果実の果肉，果皮及び種子を含むとよい。
【００１６】
また、前記課題は、本発明の抗ウイルス用食品組成物によれば、８−プレニルナリンゲニンを有効成分として含有し、ウイルス感染症の予防又は改善に用いられること、により解決される。
上記構成により、例えばヒト、特にウイルス感染患者に８−プレニルナリンゲニンを投与すると、８−プレニルナリンゲニンが生体内においてウイルス増殖を阻害する作用を果たすため、本発明をウイルス感染症の予防剤又は治療剤として用いることができる。
そして、８−プレニルナリンゲニンを投与することで、ウイルス増殖の阻害作用が向上する。
そして、ウイルス感染症のうち、特にその強烈な伝播力によって社会に莫大な被害を及ぼすインフルエンザウイルス感染症、ロタウイルス感染症又はノロウイルス感染症の予防剤又は治療剤として好適に用いることができる。
【００１７】
また、８−プレニルナリンゲニンを有効成分として含有し、感染性胃腸炎の予防又は治療に用いられる抗ウイルス用食品組成物や、ウイルス感染症の予防又は改善に用いられる抗ウイルス用食品組成物も提供することができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、新規な８−プレニルナリンゲニンの製造方法を提供することができる。
また、８−プレニルナリンゲニンの新規な利用方法となる抗ウイルス用食品組成物及び抗ウイルス剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本実施形態の８−プレニルナリンゲニンの製造方法を示すフロー図である。
【図２】試験１において検討を行った、抗インフルエンザ成分の分画試験の結果を示すグラフである。
【図３Ａ】試験３において測定を行った、８−プレニルナリンゲニン標準溶液（０．１ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムである。
【図３Ｂ】試験３において測定を行った、試験液のクロマトグラムである。
【図４】試験４において測定を行った、８−プレニルナリンゲニン（８−ＰＮ）によるインフルエンザウイルス増殖阻害率の結果を示すデータである。
【図５】試験５において測定を行った、８−プレニルナリンゲニンのＭＴＴアッセイの結果を示すデータである。
【図６】試験６において測定を行った、８−プレニルナリンゲニンによるインフルエンザウイルスの吸着時期、培養時期、吸着・培養時期における増殖阻害試験の結果を示すデータ及び、インフルエンザウイルス感染細胞の培養時の異なる期間において、８−プレニルナリンゲニンを添加しておいた場合のインフルエンザウイルス増殖阻害試験の結果を示すデータである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の実施形態について、図１乃至図６を参照しながら説明する。
本実施形態は、スイカを原料とする８−プレニルナリンゲニンの製造方法に関するものである。
また、本実施形態は、８−プレニルナリンゲニンを有効成分とし、ヒトに投与することでヒト体内のウイルスの増殖を阻害して、ウイルス感染症の予防又は治療に用いられることを特徴とする抗ウイルス用食品組成物及び抗ウイルス剤の発明に関するものである。
【００２１】
＜８-プレニルナリンゲニン＞
８-プレニルナリンゲニン（ＣＡＳ登録番号：５３８４６−５０−７）は、以下の構造式（化１）に示すように、フラボノイド（フラバノン）であるナリンゲニンの８位にプレニル基が結合した構造を有している。ここで、プレニル基は炭素数５のイソプレン単位で構成される構造単位の総称であり、炭素数５（Ｃ５）のものはジメチルアリル基と呼ばれる。
【００２２】
【化１】
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【００２３】
８-プレニルナリンゲニン（８−ＰＮ）は、フラバプレリン（ｆｌａｖａｐｒｅｎｉｎ）、（Ｓ）−８−ジメチルアリルナリンゲニン（（Ｓ）−８−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙｌｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）、ホペイン（ｈｏｐｅｉｎ）、ソフォラフラバノンＢ（ｓｏｐｈｏｒａｆｌａｖａｎｏｎｅ  Ｂ）などとも呼ばれる。
【００２４】
＜スイカ＞
本発明の８−プレニルナリンゲニンの製造方法において、８−プレニルナリンゲニンの原料となる「スイカ」とは、ウリ科スイカ属に分類されるつる性一年草であって、主に果実を食用にするために栽培される植物である。
スイカのうち、特に「野生スイカ」とは、アフリカ・カラハリ砂漠に自生するボツワナ原産のカラハリスイカであって栽培物も含むものである。そのほか、乾燥地帯や砂漠地帯を自生地とする他の野生種のスイカも含むものである。
また、スイカの中には、遺伝的方法、例えば組換え、形質導入、形質転換等により得られるものも含まれる。
【００２５】
スイカの果肉部分には、約９０％の水分が含まれ、その果汁には約６％の糖質と、少量のシトルリンやリンゴ酸、アルギニン、カリウムとが含まれ、その色素にはリコピンとカロチンが含まれている。また、その種子には約２０％の脂肪と約５０％以上のタンパク質が含まれ、フィトステロース、ウレアーゼ等も含まれている。
その中でシトルリンに注目すると、野生スイカには、１００ｇあたり約２０〜２００ｍｇのシトルリン量が含まれている。
野生スイカには、通常のスイカに含まれる成分に加えて、高濃度に蓄積されたシトルリンや未同定の有効成分によってもたらされる、通常のスイカとは全く異なる作用・効果がある。
【００２６】
また、スイカの果肉部分の糖含有率に注目すると、通常のスイカの糖含有率は、果糖が約５．０３％、ブドウ糖が１．５７％、ショ糖が０．９８％であるのに対し（スイカの成分と効能：株式会社萩原農場）、野生スイカの糖含有率は、果糖が約０．５０〜１．００％、ブドウ糖が約０．３０〜０．６０％、ショ糖が約０．０５％以下である。
上記の通り、野生スイカは、糖濃度が低く、甘さが少ないことから、通常のスイカと比較しても利用できる範囲が非常に広くなっている。
【００２７】
＜８-プレニルナリンゲニンの製造方法＞
本実施形態の８−プレニルナリンゲニンの製造方法は、スイカを用意するスイカ用意工程と、前記スイカからスイカ抽出物を得る抽出工程と、前記抽出工程で得られた前記スイカ抽出物から８−プレニルナリンゲニンを分離する分離工程と、を行うことを特徴とする。
以下、各工程について、図１を参照して詳細に説明する。
【００２８】
（スイカ用意工程）
スイカ用意工程では、８−プレニルナリンゲニンの原料となるスイカを用意する（ステップＳ１）。
原料となるスイカとしては、好ましくはシトラスラナタス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）、特にアフリカ・カラハリ砂漠由来の野生スイカであることが好ましい。
【００２９】
（抽出工程）
抽出工程では、スイカ用意工程で用意したスイカから８−プレニルナリンゲニンを含有するスイカ抽出物を得る（ステップＳ２）。
【００３０】
「スイカ抽出物」とは、スイカから抽出されるものを言い、スイカの果実、果実を磨り潰したもの、果実を搾汁して得られる果汁、果実を搾汁した後に残る残渣、これら果実を磨り潰したものや果汁、残渣をそれぞれ濾過した濾液もしくは遠心分離した上清液を含むものである。
【００３１】
また、極性溶媒又は非極性溶媒等で抽出した抽出物も含むものである。極性溶媒を抽出溶媒として用いる場合には、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で用いると良い。
親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
なお、抽出溶媒や抽出手段は、８−プレニルナリンゲニンを抽出可能なものであれば特に限定されることなく、いかなる溶媒や手段を用いても良い。
【００３２】
スイカ抽出物は、濃縮又は乾燥して用いることが良いが、そのまま用いても良いし、濃縮物又は乾燥物をさらに適当な溶剤に溶解又は懸濁して用いても良い。また、得られた抽出物を、液体クロマトグラフィー等の公知な精製法を用いて、抗ウイルス作用を有する画分を取得し、精製して用いても良い。
【００３３】
ここで、本実施形態の８−プレニルナリンゲニンの製造方法において、スイカの抽出物としてスイカの果実を用いることが好ましく、より好ましくは、果実を果肉のほか、果皮、種子も含めた状態で搾汁（圧搾）して果汁として用いると良い。さらに好ましくは果汁を限外濾過してエキスとして用いると良い。また、果実を搾汁した後に残る残渣（果汁以外のもの）を用いても良く、その場合には残渣を乾燥させて粉末化したもの（残渣粉末）を用いると良い。また、市販のスイカの抽出物として果実、果汁又はエキスを用いても良く、その場合にはスイカエキスを濃縮したものを用いると良い。
【００３４】
（分離工程）
分離工程では、前記抽出工程で得られた前記スイカ抽出物から８−プレニルナリンゲニンを分離する（ステップＳ３）。
８−プレニルナリンゲニンを分離することができれば、分離（分画）の方法は特に限定されるものではないが、例えば、適当な分離手段（例えば、分配抽出、ゲル濾過法、シリカゲルクロマト法、逆相若しくは順相の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）など）により８−プレニルナリンゲニン含有量の高い画分を分画して得る方法や、スイカ抽出物をろ過し、抽出液と残渣に分離し、抽出液を濃縮して液体クロマトググラフィーにより分画する方法が挙げられる。
分離工程において、８−プレニルナリンゲニンを精製してもよい。精製の方法は特に限定されるものではないが、例えば、適切な分離カラムや再結晶によって８−プレニルナリンゲニンを精製する方法が挙げられる。
【００３５】
＜ウイルスの概要＞
ウイルスは、ゲノムがＤＮＡであるかＲＮＡであるかによって、ＤＮＡウイルスとＲＮＡウイルスに大別される。
またＤＮＡウイルスは、ＤＮＡが一本鎖であるか二本鎖であるかによって、主に２つに分類することができる。
具体的には、一本鎖のＤＮＡウイルスとして、パルボウイルス科などが存在し、また、二本鎖のＤＮＡウイルスのうち、エンベロープを有するものとしてヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科及びヘパドナウイルス科などが存在し、エンベロープを有しないものとしてアデノウイルス科及びパピローマウイルス科などのウイルスが存在する。
一本鎖のＤＮＡウイルスによって引き起こされるウイルス性疾患としては、ヒトパルボＢ１９（伝染性紅班）などが挙げられ、また、二本鎖のＤＮＡウイルスによって引き起こされるウイルス性疾患としては、単純ヘルペス（歯肉口内炎、唇ヘルペス、性器ヘルペスウイルス感染症）、水痘・帯状疱疹、痘瘡、Ｂ型肝炎、アデノ（咽頭結膜熱、急性出血性結膜炎、流行性角結膜炎）、ヒトパピローマなどが挙げられる。
【００３６】
ＲＮＡウイルスは、ＲＮＡが一本鎖であるか二本鎖であるか、一本鎖ＲＮＡウイルスの場合にはゲノムのセンスがプラス鎖(＋鎖)であるかマイナス鎖(−鎖)であるかによって、主に３つに分類することができる。
具体的には、まず一本鎖の−鎖ＲＮＡウイルス（エンベロープを有するもの）として、オルトミクソウイルス科、ラブドウイルス科、パラミクソウイルス科、フィロウイルス科、ブニヤウイルス科及びアレナウイルス科などのウイルスが存在する。なお、インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科に属している。
これら一本鎖の−鎖ＲＮＡウイルスによって引き起こされるウイルス性疾患としては、インフルエンザ、鳥インフルエンザ、狂犬病、麻疹、ムンプス（流行性耳下腺炎）、ＲＳ（呼吸器感染症）、エボラ（出血熱）、マールブルグ（出血熱）、クリミア・コンゴ出血熱、ＳＦＴＳ、ラッサ（出血熱）、フニン／サビア／ガナリト／マチュポ（出血熱）などが挙げられる。
【００３７】
次に、一本鎖の＋鎖ＲＮＡウイルスのうち、エンベロープを有するものとしてフラビウイルス科、コロナウイルス科、トガウイルス科及びレトロウイルス科などが存在し、エンベロープを有しないものとしてカリシウイルス科及びピコルナウイルス科などのウイルスが存在する。なお、ノロウイルスは、カリシウイルス科に属している。
これら一本鎖の＋鎖ＲＮＡウイルスによって引き起こされるウイルス性疾患としては、デング、ウエストナイル、日本脳炎、Ｃ型肝炎、黄熱、ＳＡＲＳコロナ、ＭＥＲＳコロナ、風疹、ヒト免疫不全（ＡＩＤＳ）、ヒトＴリンパ好性（成人Ｔ細胞白血病）、Ｅ型肝炎、ノロ（感染性胃腸炎）、ポリオ（急性灰白髄炎）、Ａ型肝炎、コクサッキー（手足口病、ヘルパンギーナ）、ライノ（感冒）などが挙げられる。
【００３８】
最後に、二本鎖ＲＮＡウイルス（エンベロープを有しないもの）として、レオウイルス科などが存在する。
なお、ロタウイルスは、レオウイルス科に属している。
二本鎖ＲＮＡウイルスによって引き起こされるウイルス性疾患としては、ロタ（感性性胃腸炎）などが挙げられる。
【００３９】
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科に属するＲＮＡウイルスであって、呼吸器に炎症を誘発させ、感染者の咳及び唾液で空気中に直接伝達されるか、インフルエンザ患者の接触物などによって間接的にもヒトに伝染し得る伝染力の強いウイルスである。
インフルエンザウイルスは、ウイルス表面に存在する抗原性糖タンパク質であるヘマグルチニン（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔiｎiｎ：ＨＡ）とノイラミニダーゼ（Ｎeuｒaｍiｎiｄaｓe：ＮＡ）の活性によって宿主細胞へ吸着し、また、ノイラミニダーゼの活性によって宿主細胞内に侵入することができる。
インフルエンザウイルスは、これら抗原性糖タンパク質の違いによってＡ型、Ｂ型及びＣ型に分類されている。特に、Ａ型インフルエンザウイルスは、ヘマグルチニン１６種と、ノイラミニダーゼ９種との型によって１４４種類の亜型に分けられる。そして、これらの組み合わせが頻繁に変化し、これに起因して抗原性の異なる新たな亜型のウイルスが出現することが知られている。
【００４０】
インフルエンザウイルスは、急性の呼吸器感染症を引き起こし、その臨床症状は、急激な発熱、頭痛、関節痛、全身倦怠などの全身症状とともに、鼻汁、咳などの風邪にみられる種々の呼吸器症状および３８℃以上の高熱を伴うのが特徴である。
健常人では、通常約２４〜４８時間の潜伏期間をおいて発症し、１〜２週間程度で治癒するが、乳幼児、高齢者や呼吸器、循環器、腎臓に慢性疾患を持つ患者、糖尿病などの代謝疾患や免疫機能が低下している患者などでは、細菌などによる二次感染や肺炎を併発して死に至る場合も少なくない。また、呼吸器の局所感染にとどまらず、インフルエンザ脳炎・脳症などに代表される重症神経系合併症といった極めて重篤な症例も報告されている。このほか、腹痛、悪心・嘔吐、下痢などの消化器症状がみられることもあり、特に小児では注意を要する。
【００４１】
ロタウイルスは、レオウイルス科のロタウイルス属に属するＲＮＡウイルスである。
ロタウイルス粒子は、コア、内殻及び外殻の３層で構成される二重殻粒子からなり、ウイルス粒子内にＲＮＡポリメラーゼやキャップ合成関連酵素を有する。コアは、タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３からなり、内殻タンパク質ＶＰ６によって覆われて一重殻粒子を形成し、さらに外殻タンパク質ＶＰ４、ＶＰ７で覆われて二重殻粒子つまり感染性ウイルス粒子を形成する。
ロタウイルスは、内殻タンパク質ＶＰ６の抗原性によってＡ〜Ｈ群の８種類に分類される。ヒトへの感染が報告されているロタウイルスは主にＡ群〜Ｃ群である。
ロタウイルスは、ヒトの小腸の腸管上皮細胞に感染し、微絨毛の配列の乱れや欠落などの組織病変の変化を引き起こす。これによって腸からの水の吸収が阻害され下痢症を発症する。通常約４８時間の潜伏期間をおいて発症し、主に乳幼児に急性胃腸炎を引き起こす。
主症状は下痢（血便、粘血便は伴わない）、嘔気、嘔吐、発熱、腹痛であり、通常約１〜２週間で自然に治癒するが、脱水がひどくなるとショック、電解質異常、時には死に至ることもある。
【００４２】
インフルエンザウイルス、ロタウイルスを含むＲＮＡウイルスが細胞内で増殖する過程を説明すると、ウイルスが宿主細胞に吸着する「吸着時期」、吸着したウイルスが細胞内に侵入する「侵入時期」、侵入したウイルスが細胞内でＲＮＡを放出する（脱殻する）「脱殻時期」、脱殻したＲＮＡから新たなウイルスが複製される「複製時期」、そして、複製されたウイルスが細胞から放出される「放出時期」を経ていく。
ウイルスは、核酸やタンパク質の合成に必要な素材を有しておらず、必ず生体細胞を必要とする。生体細胞内に寄生して、細胞の代謝を利用して増殖し、材料、宿主細胞の代謝酵素、タンパク質合成のための宿主細胞リボソームを利用して自己成分を合成する。
例えば細菌は基本的に２分裂によって増殖していくのに対し、ウイルスは１つの粒子が感染した宿主細胞内で一気に数を増やしていく。
【００４３】
「吸着時期」では、ウイルス表面にあるエンベロープ又はカプシドの結合タンパク質（リガンド）が、宿主細胞の表面の受容体（レセプター）に結合する。ウイルスへの感染性は、そのウイルスに対するレセプターを宿主細胞が有しているかどうかに依存する。
インフルエンザウイルスの場合、ウイルス表面にあるヘマグルチニンが細胞側にあるシアル酸受容体に結合する。
ロタウイルスの場合、ウイルス表面にある結合タンパク質（外殻タンパク質ＶＰ４、ＶＰ７）が細胞側にある受容体に結合する。
【００４４】
「侵入時期」では、ウイルスは、一般に細胞の飲食作用（エンドサイトーシス）によって細胞内のエンドソームに取り込まれまる。そして、エンドソーム内の酸性化によって、ウイルス表面のエンベロープと、宿主細胞の細胞膜とが融合する。
インフルエンザウイルスの融合には、宿主細胞由来のエンドプロテアーゼによるヘマグルチニンの特異的配列部位でのペプチド結合の開裂が必須である。この開裂によってヘマグルチニンの膜融合ドメインが露出し、エンドソーム膜との融合が起こる。
ロタウイルスの場合、宿主細胞由来のプロテアーゼ（トリプシン）によって、外殻タンパク質ＶＰ４が、タンパク質ＶＰ５とタンパク質ＶＰ８に開裂している必要がある。この開裂の後、まずタンパク質ＶＰ８がシアル酸を含む分子（第１レセプター）と接触し、次にタンパク質ＶＰ５及び外殻タンパク質ＶＰ７がインテグリン（第２レセプター）と結合することによって、直接侵入あるいはエンドサイトーシスで細胞内へ侵入すると考えられている。
【００４５】
「脱殻時期」では、細胞内へ侵入したウイルスのカプシドが分解され、ＲＮＡが宿主細胞内を遊離する（脱殻）。脱殻からウイルス粒子が再構成されるまでの期間は、ウイルス粒子が見かけ上存在しなくなり、この期間を暗黒期とも言う。
Ａ型インフルエンザウイルスの表面には、Ｍ２蛋白と呼ばれる膜タンパク質が存在しており、Ｍ２蛋白はＨ＋を通過させるイオンチャネルを形成している。エンドソーム内がさらに酸性化（ｐＨの低下）していくと、このイオンチャネルのゲートが開き、Ｈ＋がウイルス内へ取り込まれる。これを契機として、ウイルスの脱殻が生じ、ＲＮＡが細胞内に放出される。
ロタウイルスの場合、細胞侵入の際に外殻タンパク質ＶＰ４、ＶＰ７が除去される。外殻タンパク質ＶＰ４、ＶＰ７が外れることで、細胞内に放出された内殻タンパク質ＶＰ６の再配置が起こり、ＲＮＡ転写が開始される。
【００４６】
「複製時期」では、脱殻したＲＮＡが宿主細胞の核内に取り込まれて、新たなＲＮＡが大量に複製されると同時にＲＮＡの転写（ｍＲＮＡの合成）を経てウイルス独自のタンパク質が大量に合成される。ＲＮＡの複製の際には、ＲＮＡ複製酵素となるＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼが機能する。また、ｍＲＮＡからタンパク質への合成の際には、宿主細胞の持つリボソームなどのタンパク質合成系が機能する。複製されたＲＮＡと、合成されたタンパク質とが細胞内で集合し、新たなウイルスが組み立てられる（複製される）。
【００４７】
「放出時期」では、ウイルスは、宿主細胞の細胞膜や核膜をかぶって出芽することや宿主細胞が死滅することで、宿主細胞外へ放出される。
インフルエンザウイルスの場合、細胞内で増殖した後、感染した宿主細胞から放出される際には、ウイルス由来のノイラミニダーゼによるヘマグルチニンとシアル酸受容体との切断が必須である。
【００４８】
ここで、既存の抗インフルエンザウイルス剤について説明すると、アマンタジンは、インフルエンザウイルスのＭ２蛋白のイオンチャンネル作用を阻害し、標的細胞に侵入した後のインフルエンザウイルスの脱殻を抑制することができるものの、Ｍ２蛋白のないＢ型、Ｃ型ウイルスに対する効果はなく、また、強い副作用や耐性菌の発現が問題とされている。
また、オセルタミビルやザナミビルは、インフルエンザウイルスのエンベロープに存在するスパイクタンパク質の１つであるノイラミニダーゼの作用を阻害し、複製されたインフルエンザウイルスが宿主細胞から出芽して他の宿主細胞へ感染を広げることを抑制することができるものの、近年、若年者に対する副作用が問題となっている。
【００４９】
また現在のところでは、ロタウイルスに効果のある一般的な抗ウイルス剤はなく、脱水症状を防止するための水分補給や、体力消耗を防ぐために栄養補給をすることが治療の中心となっている。
【００５０】
ノロウイルスは、カリシウイルス科に属するＲＮＡウイルスであって、培養細胞や実験動物への感染がいまだに成功しておらず、ヒトが唯一の感受性動物であると言われている。
ノロウイルスは、ヒトに対して嘔吐、下痢等の急性胃腸炎症状を引き起こし、症状が消失した後も約３〜７日間ほど患者の便中に排出されるため、２次感染に注意が必要である。
ノロウイルスはヒトの空腸の上皮細胞に感染して繊毛の委縮と扁平化、さらに剥離と脱落を引き起こして下痢を生じると考えられている。
潜伏期間は約２４〜４８時間であると考えられ、嘔気、嘔吐、下痢が主症状であるが、腹痛、頭痛、発熱、悪寒、筋痛、咽頭痛、倦怠感などを伴うこともある。特別な治療を必要とせずに軽快するが、乳幼児や高齢者およびその他、体力の弱っている者での嘔吐、下痢による脱水や窒息には注意をする必要がある。
現在のところ、ノロウイルスに効果のある一般的な抗ウイルス剤はなく、通常、対症療法が行われており、脱水症状を防止するための水分補給や、体力消耗を防ぐために栄養補給をすることが治療の中心となっている。また臨床症状からだけではノロウイルス感染症を特定することは難しいとされている。
【００５１】
＜ウイルス増殖阻害作用＞
本実施形態の抗ウイルス剤は、８−プレニルナリンゲニンが有するウイルス増殖の阻害作用、特にＲＮＡウイルス増殖の阻害作用を通じて、抗ウイルス作用を発揮するものである。
具体的な作用メカニズムは、以下の通りである。
（１）８−プレニルナリンゲニンは、ＲＮＡウイルスの増殖過程のうち「吸着時期」において当該ウイルス表面にある結合タンパク質（リガンド）が宿主細胞表面にある受容体（レセプター）に結合する際に、当該ウイルスの宿主細胞への吸着を阻害する作用を果たす。
詳しく言うと、ＲＮＡウイルスがインフルエンザウイルスの場合、８−プレニルナリンゲニンが、当該ウイルスの吸着時期に必要となる糖タンパク質（ヘマグルチニン等）の活性を阻害する作用を果たす。
また、ＲＮＡウイルスがロタウイルスの場合、８−プレニルナリンゲニンが、当該ウイルスの吸着時期に関与する結合タンパク質（外殻タンパク質ＶＰ４、ＶＰ７）や特異的酵素の活性を阻害する作用を果たす。
【００５２】
（２）また、８−プレニルナリンゲニンは、ＲＮＡウイルスの増殖過程のうち「複製時期」において複製されたＲＮＡと、合成されたタンパク質とが集合し、新たなウイルスが組み立てられる際に、当該ウイルスの宿主細胞内での複製を阻害する作用を果たす。
詳しく言うと、ＲＮＡウイルスがインフルエンザウイルスの場合、８−プレニルナリンゲニンが、当該ウイルスの複製時期に必要となる特異的酵素の活性を阻害する作用を果たす。
また、ＲＮＡウイルスがロタウイルス又はノロウイルスの場合、８−プレニルナリンゲニンが、これらウイルスの複製時期に関与する結合タンパク質や特異的酵素の活性を阻害する作用を果たす。
【００５３】
従って、抗ウイルス剤の有効主成分となる８−プレニルナリンゲニンは、従来の抗ウイルス剤にはない作用として、ウイルスの増殖過程のうち少なくとも「吸着時期」及び「複製時期」において当該ウイルス増殖を阻害する作用を果たす。
そのため、ウイルスの増殖過程のうち特定の一時期においてのみ抗ウイルス活性を発揮する従来の抗ウイルス剤と比較して、本抗ウイルス剤であれば、ウイルス増殖過程の前半の吸着時期であったとしても、また後半の複製時期であったとしても抗ウイルス活性を発揮することが可能となる。
また、本抗ウイルス剤は、例えばＡ型インフルエンザウイルスには効果を発揮するもののＢ型、Ｃ型には効果を有さないアマンタジンのような抗ウイルス剤と比較して、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型を問わず、全てのインフルエンザウイルスに対して抗ウイルス活性を発揮する。
従って、従来の抗ウイルス剤として使用認可されているアマンタジンやオセルタミビル、ザナミビルに次ぐ新たな抗ウイルス剤として、臨床応用の可能性がある。
【００５４】
＜用途＞
本実施形態の８−プレニルナリンゲニンを有効成分として含有する抗ウイルス剤は、ウイルス感染症患者、ウイルス感染症に罹患したヒト以外の動物に投与されることで、ウイルス感染症の治療剤として、またウイルス性疾患の治療剤として用いることができる。
また、ウイルス感染症を罹患する前のヒト、ウイルス感染症予備軍のヒト、これらヒト以外の動物を対象としたウイルス感染症の予防剤として、またウイルス性疾患の予防剤として用いることもできる。
また、本実施形態の抗ウイルス剤は、ウイルスを病原体とする感染性胃腸炎の予防剤又は治療剤として用いることもできる。
【００５５】
本実施形態の抗ウイルス剤は、ウイルスのうち、特にインフルエンザウイルス、ロタウイルス及びノロウイルスに感染した患者に対して投与されることが望ましい。
インフルエンザウイルスの場合、Ａ型インフルエンザウイルスに感染した患者に対して投与されることが望ましく、さらに当該ウイルスの亜型がＨ１Ｎ１であることが望ましい。
ロタウイルスの場合、Ａ群ロタウイルスに感染した患者に対して投与されることが望ましく、さらに当該ウイルスがＡ群ロタウイルスＷａ株（Ｇ１Ｐ[８]）であることが望ましい。
【００５６】
本実施形態の抗ウイルス剤は、ウイルスのうち、特にインフルエンザウイルス、ロタウイルス及びノロウイルスに対して上記作用効果を発揮する抗ウイルス剤を含有する医薬組成物、食品組成物等の組成物等として利用することができる。
【００５７】
（医薬組成物）
医薬の分野では、ウイルス増殖を阻害する作用、すなわち、ウイルスの宿主細胞への吸着阻害作用、または、ウイルスの宿主細胞からの放出阻害作用を有効に発揮できる量の８−プレニルナリンゲニンと共に、薬学的に許容される担体や添加剤を配合することにより、当該作用を有する医薬組成物が提供される。当該医薬組成物は、医薬品であっても医薬部外品であってもよい。
当該医薬組成物は、内用的に適用されても、また外用的に適用されても良い。従って、当該医薬組成物は、内服剤、静脈注射、皮下注射、皮内注射、筋肉注射及び／又は腹腔内注射等の注射剤、経粘膜適用剤、経皮適用剤等の製剤形態で使用することができる。
当該医薬組成物の剤型としては、適用の形態により、適当に設定できるが、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、粉末剤、散剤などの固形製剤、液剤、懸濁剤などの液状製剤、軟膏剤、またはゲル剤等の半固形剤が挙げられる。
【００５８】
（食品組成物）
食品の分野では、ウイルス増殖を阻害する作用を生体内で発揮できる有効な量の８−プレニルナリンゲニンを、各種食品に配合することにより、当該作用を有する食品組成物を提供することができる。
すなわち、本発明は、食品の分野において、抗ウイルス用、ウイルス増殖阻害用等と表示された食品組成物を提供することができる。当該食品組成物としては、一般の食品のほか、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、病院患者用食品、サプリメント等が挙げられる。また、食品添加物として用いることもできる。
当該食品組成物としては、例えば、調味料、畜肉加工品、農産加工品、飲料（清涼飲料、アルコール飲料、炭酸飲料、乳飲料、果汁飲料、茶、コーヒー、栄養ドリンク等）、粉末飲料（粉末ジュース、粉末スープ等）、濃縮飲料、菓子類（キャンディ（のど飴）、クッキー、ビスケット、ガム、グミ、チョコレート等）、パン、シリアル等が挙げられる。また、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等の場合、カプセル、トローチ、シロップ、顆粒、粉末等の形状であっても良い。
【００５９】
ここで特定保健用食品とは、生理学的機能等に影響を与える保健機能成分を含む食品であって、消費者庁長官の許可を得て特定の保健の用途に適する旨を表示可能なものである。本発明においては、特定の保健用途としてウイルス感染症の予防、治療、ウイルス増殖の阻害、感染性胃腸炎の予防、治療などと表示して販売される食品となる。
また栄養機能食品とは、栄養成分（ビタミン、ミネラル）の補給のために利用される食品であって、栄養成分の機能を表示するものである。栄養機能食品として販売するためには、一日当たりの摂取目安量に含まれる栄養成分量が定められた上限値、下限値の範囲内にある必要があり、栄養機能表示だけでなく注意喚起表示等もする必要がある。
また機能性表示食品とは、事業者の責任において、科学的根拠に基づいた機能性を表示した食品である。販売前に安全性及び機能性の根拠に関する情報などが消費者庁長官へ届け出られたものである。
【００６０】
上記において本発明は、８−プレニルナリンゲニンを有効成分として含み、ウイルス感染症患者、ウイルス感染症を罹患したヒト以外の動物を対象とした抗ウイルス剤用特定保健用食品や、抗ウイルス剤栄養機能食品、抗ウイルス剤機能性表示食品として用いることができる。
また本発明は、８−プレニルナリンゲニンを有効成分として含み、生体、例えばウイルス感染症を罹患する前のヒト、ウイルス感染症予備軍のヒト、これらヒト以外の動物を対象とした抗ウイルス剤用特定保健用食品や、抗ウイルス剤用栄養機能食品、抗ウイルス剤用機能性表示食品として用いることができる。
【００６１】
＜用法及び用量＞
本実施形態の抗ウイルス剤の用法としては、例えばインフルエンザウイルスの場合、ヒトの上気道（鼻腔や咽頭）で感染し易いため、例えば、スプレーによって鼻腔内又は口腔内へ直接噴霧することや、吸入器によって鼻腔内又は口腔内へ導入すると良い。また、うがい薬によって口腔内へ導入すると良い。そのほか、点鼻等で経鼻投与しても良いし、のど飴やトローチ、ガム等で経口投与しても良いし、マスクや消毒お手拭きに利用しても良い。
また例えばロタウイルスやノロウイルスの場合、ヒトの腸内で感染し易いため、腸内で抗ウイルス剤が溶解するように（胃では溶解しないように）処方すると良い。例えば、カプセル剤、錠剤、顆粒又はシロップ等によって経口投与すると良い。
【実施例】
【００６２】
＜実施例１＞
野生スイカの抽出物を、以下の手順により調製した。
アフリカ・カラハリ砂漠由来の野生スイカ（シトラスラナタス：Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）の果実を果皮、種子も含めた状態で、公知な搾汁機を用いて搾汁（圧搾）することで果汁を得た。当該果汁を沈殿物の形成を防ぐ等の目的で限外濾過し、分子量３０００以上の成分を取り除くことで野生スイカの抽出物エキスを得た。
当該エキスをスイカ抽出物として、８−プレニルナリンゲニンの原料として用いた。
【００６３】
＜試験１  抗インフルエンザ成分の分画試験＞
（試験１の試験方法）
（１）ＯＤＳＣ１８  ２０ｇをメタノール２００ｍｌに溶かし、脱気を行いカラムに充填した。
（２）アセトニトリル５０ｍｌで置換し、一晩放置した。
（３）超純水を５０ｍｌ×２回流した後、試料４ｍｌ（濃縮無し）をゲルに浸透させた。
（４）下記表１に示す溶媒を流し、分画を行った。分画試料は各フラクション（Ｆｒ）５０ｍｌを２５ｍｌ×２本で採取した。
（５）得られた画分（Ｆｒ２以降）は、エバポレータで溶媒を飛ばし、凍結乾燥した後、超純水１ｍｌで溶解した。
（６）添加実験のため、０．４５μｍフィルターで滅菌した。
（７）２４ｗｅｌｌプレートにてインフルエンザウイルス株（Ｐ／Ｒ／８／３４）を感染させたＭＤＣＫ細胞に培地５００μｌ／ｗｅｌｌに対して１０％になるように各フラクションの溶解液を添加し、２４時間後に上清を回収し、フォーカス法にてウイルスの定量を行った。
【００６４】
【表１】
2019099521.tif 000004
【００６５】
（試験１の結果）
２４時間後２４ｗｅｌｌプレートを顕微鏡で観察を行った。結果を図２及び表２に示す。
【表２】
2019099521.tif 000005
【００６６】
（試験１の考察）
以上の結果より、カラハリスイカろ過果汁中の有効成分の一部はＯＤＳＣ１８に吸着することがわかった。添加実験及びフォーカス法の結果より、Ｆｒ１，１’（非吸着画分）とＦｒ３（吸着画分）が抗ウイルス活性を示し、特にＦｒ３に強い活性が見られた。
【００６７】
＜試験２  ＬＣ／ＭＳ，ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる活性画分の定性及び有効成分の同定＞
試験１にて得られた活性画分中に含まれる抗インフルエンザウイルス成分の検索を行う。
（試験２の試験方法）
試験１にて得られた活性画分と非活性画分をそれぞれ複数回、同条件にて採取し、ＭＳ測定に必要な凍結乾燥重量となるまで採取した。採取後、ＬＣ−ＭＳ，ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定を行い、有効成分の解析を行った。ＬＣ−ＭＳで分子量を測定し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分子量と分子式を測定した。両測定器での分子量と活性画分と非活性画分間のピークを比較しながら解析を行った。
【００６８】
（解析条件）
・ＬＣ−ＭＳ
ＬＣ装置：Ａｇｉｌｅｎｔ１２６０
カラム：ｓｙｎｅｒｇｉ  Ｈｙｄｒｏ−ＲＰ−１００Ａ（１００ｍｍ×３ｍｍ，Φ２．５μｍ）
温度：４０℃
移動相：Ａ液−２％酢酸溶液、Ｂ液−（０．５％酢酸溶液：アセトニトリル１：１（ｖ／ｖ））、移動相グラジエントを以下の表３に示す。
流速：０．４ｍｌ／ｍｉｎ
注入量：５．０μｌ
【００６９】
【表３】
2019099521.tif 000006
【００７０】
ＭＳ装置：Ａｇｉｌｅｎｔ  ＬＣＭ６４３０
乾燥窒素ガス：３５０℃（１２Ｌ／分）
ネブライザー圧：６０ｐｓｉ
キャピラリー電圧：２５００Ｖ
フラグメンター電圧：１００Ｖ
イオン化法はＥＳＩのＰｏｓｉｔｉｖｅ／Ｎｅｇａｔｉｖｅ同時に測定し、Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  Ａｂａｌｙｓｉｓ  Ｖｅｒ．Ｂ  ０６．００  Ｂｕｉｒｄ６．０．３３．１０ＳＰで解析した。
【００７１】
・ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ
ＬＣ装置：島津製作所ＬＣ２０Ａ
カラム：ｓｙｎｅｒｇｉ  Ｈｙｄｒｏ−ＲＰ−１００Ａ（１００ｍｍ×３ｍｍ，Φ２．５μｍ）
温度：４０℃
移動相：Ａ液−２％酢酸溶液、Ｂ液−（０．５％酢酸溶液：アセトニトリル１：１（ｖ／ｖ））
流速：０．４ｍｌ／ｍｉｎ
注入量：５．０μｌ
【００７２】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの条件は、上記表３と同じ移動相グラジエント条件で行った。
【００７３】
ＭＳ装置は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＬＣＭ６４３０、乾燥窒素ガスは２００℃（８Ｌ／分）、ネブライザー圧は１．６ｂａｒ、キャピラリー電圧は−４５００Ｖ／２８００Ｖ、イオン化法はＥＳＩ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ／Ｎｅｇａｔｉｖｅを各測定）、ＡｕｔｏＭＳＭＳで同時に測定し、Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｖｅｒ４．０  ＳＰ２（Ｂｕｉｌｄ２７．４）で解析した。
【００７４】
（試験２の結果）
凍結乾燥重量は、Ｆｒ１で０．３３４ｇ、Ｆｒ１’で０．０４ｇ、Ｆｒ２で０．０１１ｇ、Ｆｒ３で０．０７３ｇ、Ｆｒ４で０．０１１ｇであった。
【００７５】
解析の結果、有効成分の候補として８−プレニルナリンゲニンが挙がった。以下の試験では、８−プレニルナリンゲニンに着目をして検討を行った。
【００７６】
＜試験３  スイカ抽出物中の８−プレニルナリンゲニンの定量試験＞
試験３では、実施例１のスイカ抽出物（スイカ果汁）に含まれる８−プレニルナリンゲニンの定量を行った。
【００７７】
（試験３の試験方法）
（１．概要）
スイカ抽出物１ｍＬを分取して、水及びメタノール（１／１）混液で１０ｍＬ定容として試験液を調製した。試験液を液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）に供して試料中の８−プレニルナリンゲニンを定量した。８−プレニルナリンゲニンの標準品は依頼者提供品（純度９８％）を用いた。
【００７８】
（２．機器条件）
・ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの測定条件
装置：［ＬＣ］Ｎｅｘｅｒａ  ＸＲ（島津製作所製）
［ＭＳ／ＭＳ］ＱＴＲＡＰ  ５５００（エービーサイエックス製）
カラム：Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ２  ＯＤＳ  １５０ｍｍ×２．０ｍｍ，３μｍ（（一財）化学物質評価研究機構製）
カラム温度：４０℃
移動相：移動相（Ａ）０．１％ぎ酸水溶液
移動相（Ｂ）０．１％ぎ酸メタノール溶液
Ｂ３０％（０ｍｉｎ）→１０ｍｉｎ→Ｂ９０％（５ｍｉｎ）
流量：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：５μＬ
イオン化法：ＥＳＩ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）
測定モード：選択反応検出法（ＳＲＭ）
測定イオン：定量イオンｍ／ｚ３３９．８＞２１９．９
確認イオンｍ／ｚ３３９．８＞１７６．０
【００７９】
（試験３の結果）
８-プレニルナリンゲニン標準溶液（０．１ｎｇ／ｍＬ）及び試験液のクロマトグラムを図３Ａ及び図３Ｂに示す。
試料中の８−プレニルナリンゲニン定量分析結果を表４に示す。
【００８０】
【表４】
2019099521.tif 000007
【００８１】
＜試験４  インフルエンザウイルスの増殖阻害試験＞
８−プレニルナリンゲニンを用いて、インフルエンザウイルス増殖を阻害する作用を確認する試験を行った。宿主細胞としてＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  ｃａｎｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞を使用し、またウイルスとしてインフルエンザウイルスＡ型／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）株を使用し、また培地として１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）含有のＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地を使用した。
【００８２】
まず、ＭＤＣＫ細胞を１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように２４ｗｅｌｌプレートにそれぞれ播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間単層培養した。
そして、培養したＭＤＣＫ細胞にインフルエンザウイルスを０．００１ｍｏi（感染多重度）で感染させて３７℃で１時間放置した（吸着させた）。
その後、液体培地に対して、８−プレニルナリンゲニンを所定濃度含むように添加し、ＣＯ２インキュベータにて２４時間培養した。
その後、感染細胞から放出されたウイルスを含む上清を回収し、フォーカス法を用いて細胞のウイルス力価（ＦＦＵ／ｍｌ）を測定し、ウイルス増殖阻害率（％）を算出した。また、細胞のウイルス感染を５０％阻害する８−プレニルナリンゲニンの濃度（ＩＣ５０）を算出した。
【００８３】
（試験４の結果）
上記試験結果を解析して、８−プレニルナリンゲニンによる各濃度のウイルス増殖阻害率を比較したグラフを図４に示す。
ウイルス増殖阻害率は、エキス濃度が高くなるにつれてさらに増加した。
なお、「濃度１μｇ／ｍｌ」とは、液体培地１ｍｌに対して１μｇの８−プレニルナリンゲニンが含まれる濃度であることを示す。
【００８４】
（試験４の考察）
試験４の結果から、８−プレニルナリンゲニンは、全ての濃度においてインフルエンザウイルス増殖を阻害する作用が確認された。また、濃度依存的にウイルス増殖を阻害する作用が高くなった。
このことから、スイカに含まれる成分のうち、８−プレニルナリンゲニンが、インフルエンザウイルス増殖を阻害する作用をよりもたらすことが分かった。
また、インフルエンザウイルス増殖を阻害する作用における８−プレニルナリンゲニンの好適な濃度（ＩＣ５０）は０．０８７μｇ／ｍｌであることが分かった。
アグリコンであるナリンゲニンのＩＣ５０値が７０μｇ／ｍｌであり、８−プレニルナリンゲニンは非常に高いインフルエンザウイルスの阻害活性を示した。モル数に換算すると、ナリンゲニン（分子量：２７２）で０．２６×１０−３Ｍ、８−プレニルナリンゲニン（分子量：３４０）で０．２６×１０−６Ｍであり、８−プレニルナリンゲニンはナリンゲニンと比較して１０３倍高い活性を示した。
【００８５】
＜試験５  ８−プレニルナリンゲニンのＭＴＴアッセイ＞
８−プレニルナリンゲニンを用いて、８−プレニルナリンゲニンの細胞毒性の有無を検討する試験を行った。マイクロプレートに単層培養したＭＤＣＫ細胞に８−プレニルナリンゲニンと終濃度４μｇ／ｍｌアセチルトリプシン含有無血清ＤＭＥＭ培地の混合液を添加し、３７℃で１日間培養した。ＭＴＴ標識試薬を加えて３７℃で４時間更に培養し、可溶化溶液を加えて３７℃で一晩培養した。マイクロプレートリーダーを用いて、リファレンス波長を６５０ｎｍとし、５７５ｎｍで吸光度を測定した。
【００８６】
（試験５の結果）
上記試験結果を解析して、８−プレニルナリンゲニンによる各濃度の吸光度をプロットしたグラフを図５に示す。
コントロールと比較して、吸光度の減少は観測されなかった。
【００８７】
（試験５の考察）
試験５の結果から、０〜２５μｇ／ｍｌの範囲で８−プレニルナリンゲニンに細胞毒性はないことが示唆された。
【００８８】
＜試験６  インフルエンザウイルスの増殖過程における感染阻害試験＞
８−プレニルナリンゲニンを用いて、インフルエンザウイルスが増殖するために必要な過程のうち、どの増殖過程を阻害しているかを確認する試験を行った。宿主細胞としてＭＤＣＫ細胞を使用し、またウイルスとしてインフルエンザウイルスＡ型／ＰＲ／８／３４株を使用し、また培地として１０％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地を使用した。
まず、試験１と同様に単層培養したＭＤＣＫ細胞にインフルエンザウイルスを０．０１ｍｏi（感染多重度）で感染させて（添加して）３７℃で１時間放置した（吸着させた）。
【００８９】
そして、１０μｇ／ｍｌの８−プレニルナリンゲニンを添加したＤＭＥＭ培地を、ウイルス感染させたＭＤＣＫ細胞に対して所定のタイミングで添加した。
対照として、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を添加した。
ウイルス吸着から８時間経過後に、−８０℃から３７℃の凍結融解を２回繰り返し、細胞内のウイルス力価を、フォーカス法を用いて測定し、ウイルス増殖阻害率を算出した。
【００９０】
８−プレニルナリンゲニンを添加しておくタイミングとして、（０）前処理時のみ、（１）吸着時（ウイルス増殖過程のうち、「吸着時期」に相当するタイミング、ウイルス感染から１時間後まで）、（２）ウイルス培養時（培養０時間から８時間）、（３）吸着時及び培養時の双方、（４）培養０時間から４時間（ウイルス増殖過程のうち、「侵入・脱殻時期」に相当するタイミング、ウイルス吸着から４時間後まで）、（５）培養４時間から８時間（ウイルス増殖過程のうち、「複製・放出時期」に相当するタイミング、ウイルス吸着の４時間後から８時間後まで）、（６）培養０時間から２時間、（７）培養２時間から４時間、（８）培養４時間から６時間、（９）培養６時間から８時間に設定した。
【００９１】
詳しく言うと、（０）では前処理時にのみ８−プレニルナリンゲニンを添加して、８−プレニルナリンゲニンを添加していない培地と交換した。（１）ではウイルス感染と同時に８−プレニルナリンゲニンを添加し、ウイルス感染から１時間後に８−プレニルナリンゲニンを添加していない培地と交換した。（２）ではウイルス培養開始時に８−プレニルナリンゲニンを添加し、８時間後まで８−プレニルナリンゲニンの存在下で培養を行った。（３）ではウイルス感染と同時に８−プレニルナリンゲニンを添加し、ウイルス培養開始時にも８−プレニルナリンゲニンを添加し、８時間後まで８−プレニルナリンゲニンの存在下で培養を行った。（４）ではウイルス吸着と同時に８−プレニルナリンゲニンを添加し、ウイルス吸着から４時間後に８−プレニルナリンゲニンを添加していない培地と交換した。（５）ではウイルス吸着から４時間後に８−プレニルナリンゲニンを添加し、ウイルス吸着から８時間後に８−プレニルナリンゲニンを添加していない培地と交換した。（６）ではウイルス吸着と同時に８−プレニルナリンゲニンを添加し、ウイルス吸着から２時間後に８−プレニルナリンゲニンを添加していない培地と交換した。（７）ではウイルス吸着から２時間後に８−プレニルナリンゲニンを添加し、ウイルス吸着から４時間後に８−プレニルナリンゲニンを添加していない培地と交換した。（８）ではウイルス吸着から４時間後に８−プレニルナリンゲニンを添加し、ウイルス吸着から６時間後に８−プレニルナリンゲニンを添加していない培地と交換した。（９）ではウイルス吸着から６時間後に８−プレニルナリンゲニンを添加し、ウイルス吸着から８時間後に８−プレニルナリンゲニンを添加していない培地と交換した。
【００９２】
（試験６の結果）
上記試験結果を解析して、８−プレニルナリンゲニンによる前処理時のみ、ウイルスの吸着時、培養時、吸着・培養時における増殖阻害活性を比較したグラフを図６に示す。
前処理時のみ、ウイルスの吸着時、培養時、吸着時及び培養時の双方における増殖阻害率は、順に５７％、９６％、５１％、９６％であった。
抽出物の添加期間が培養０時間から４時間、培養４時間から８時間、培養０時間から２時間、培養２時間から４時間、培養４時間から６時間、培養６時間から８時間、における増殖阻害率は、順に９％、５９％、−４％、−１３％、１３％、２９％であった。
【００９３】
（試験６の考察）
試験６の結果から、８−プレニルナリンゲニンを添加することで、ウイルスの細胞への吸着時、ウイルスの細胞内での増殖時の双方でウイルスの増殖を阻害していることが判明した。また、「細胞への吸着時」のほうが「細胞内での増殖時」よりもウイルス増殖を阻害する作用が高くなった。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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