(57)【要約】      （修正有）【課題】抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体およびバッファー系を含む、安定な医薬抗体製剤の提供。【解決手段】式ＶＬ１−リンカー−ＶＬ２の軽鎖および式ＶＨ１−リンカー−ＶＨ２の重鎖を含み、ＶＬ１およびＶＨ１はＩＬ−１３抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ２およびＶＨ２はＩＬ−４抗原結合ドメインを形成する、二特異的抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３抗体またはその抗原結合断片；ならびに製剤のｐＨを約ｐＨ７に維持するのに適するバッファー系；を含み、製剤のイオン強度を低減するために低い塩濃度を有する前記抗体製剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定な抗体製剤であって、
式ＶＬ１−リンカー−ＶＬ２の軽鎖および式ＶＨ１−リンカー−ＶＨ２の重鎖を含み、ＶＬ１およびＶＨ１はＩＬ−１３抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ２およびＶＨ２はＩＬ−４抗原結合ドメインを形成する、二特異的抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３抗体またはその抗原結合断片；ならびに
製剤のｐＨを約ｐＨ７に維持するのに適するバッファー系；
を含み、製剤のイオン強度を低減するために低い塩濃度を有する前記抗体製剤。
【請求項２】
ＶＬ１は、配列番号１のＣＤＲ配列を含み；
ＶＨ１は、配列番号２のＣＤＲ配列を含み；
ＶＬ２は、配列番号３のＣＤＲ配列を含み；
ＶＨ２は、配列番号４または５のＣＤＲ配列を含む、
請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
ＶＬ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含み；
ＶＨ１は、配列番号２のアミノ酸配列を含み；
ＶＬ２は、配列番号３のアミノ酸配列を含み；
ＶＨ２は、配列番号４または５のアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
軽鎖は式Ｎ−ＶＬ１−リンカー−ＶＬ２−ＣＬを含み、ＣＬは抗体の軽鎖定常ドメインであり、重鎖は式Ｎ−ＶＨ１−リンカー−ＶＨ２−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、ＣＨ２−ＣＨ３は抗体のＦｃドメインに対応する、請求項１に記載の製剤。
【請求項５】
リンカーが配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項６】
抗体またはその抗原結合断片が定常領域ドメインをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項７】
定常領域ドメインが、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＬからなる群から選択される、請求項６に記載の製剤。
【請求項８】
二特異的抗体またはその抗原結合断片が、ヒト化ＩｇＧ４二特異的抗体またはその抗原結合断片である、請求項１に記載の製剤。
【請求項９】
抗体またはその抗原結合断片の濃度が約１００ｍｇ／ｍＬである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１０】
バッファー系が少なくとも２つのバッファーを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１１】
バッファー系の濃度が約１０ｍＭである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１２】
バッファー系がＴｒｉｓバッファーおよびリン酸バッファーを含む、請求項１０に記載の製剤。
【請求項１３】
Ｔｒｉｓバッファーの濃度が約３．７ｍＭである、請求項１２に記載の製剤。
【請求項１４】
リン酸バッファーの濃度が約６．３ｍＭである、請求項１２に記載の製剤。
【請求項１５】
Ｔｒｉｓバッファーの濃度が約３．７ｍＭであり、リン酸バッファーの濃度が約６．３ｍＭである、請求項１２に記載の製剤。
【請求項１６】
非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１７】
非イオン性界面活性剤の濃度が約０．０５％〜約０．２％（ｗ／ｖ）である、請求項１６に記載の製剤。
【請求項１８】
非イオン性界面活性剤がポリソルベートである、請求項１６に記載の製剤。
【請求項１９】
ポリソルベートがポリソルベート８０である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項２０】
ポリソルベート８０の濃度が約０．０５％〜約０．２％（ｗ／ｖ）である、請求項１９に記載の製剤。
【請求項２１】
ポリソルベート８０の濃度が約０．２％（ｗ／ｖ）である、請求項２０に記載の製剤。
【請求項２２】
糖をさらに含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項２３】
糖の濃度が約５％（ｗ／ｖ）である、請求項２２に記載の製剤。
【請求項２４】
糖が二糖である、請求項２２に記載の製剤。
【請求項２５】
二糖がスクロースである、請求項２４に記載の製剤。
【請求項２６】
スクロースの濃度が約５％（ｗ／ｖ）である、請求項２５に記載の製剤。
【請求項２７】
非イオン性安定化剤をさらに含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項２８】
非イオン性安定化剤の濃度が約１％から約３％（ｗ／ｖ）である、請求項２７に記載の製剤。
【請求項２９】
非イオン性安定化剤がアミノ酸または糖である、請求項２７に記載の製剤。
【請求項３０】
アミノ酸がプロリンである、請求項２９に記載の製剤。
【請求項３１】
糖がマンニトールである、請求項２９に記載の製剤。
【請求項３２】
プロリンの濃度が約１％から約３％（ｗ／ｖ）である、請求項３０に記載の製剤。
【請求項３３】
プロリンの濃度が約３％（ｗ／ｖ）である、請求項３２に記載の製剤。
【請求項３４】
マンニトールの濃度が約３％（ｗ／ｖ）である、請求項３０に記載の製剤。
【請求項３５】
凍結乾燥製剤である、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項３６】
眼に見える粒子、眼に見えない粒子、低分子量タンパク質および高分子量タンパク質に関して優れた安定性を示す、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項３７】
安定な凍結乾燥抗体製剤であって、
配列番号２および４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号１および３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、約１００ｍｇ／ｍＬの二特異的抗体またはその抗原結合断片；
約３．７ｍＭのＴｒｉｓバッファー濃度および約６．３ｍＭのリン酸バッファー濃度を含む、約１０ｍＭのバッファー系；
約０．２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０；
約５％（ｗ／ｖ）のスクロース；ならびに
約３％（ｗ／ｖ）のプロリン
を含み、製剤のｐＨは約ｐＨ７である、前記凍結乾燥抗体製剤。
【請求項３８】
安定な凍結乾燥抗体製剤であって、
配列番号２および４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号１および３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、約１００ｍｇ／ｍＬの二特異的抗体またはその抗原結合断片；
約３．７ｍＭのＴｒｉｓバッファー濃度および約６．３ｍＭのリン酸バッファー濃度を含む、約１０ｍＭのバッファー系；
約０．２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０；
約５％（ｗ／ｖ）のスクロース；ならびに
約３％（ｗ／ｖ）のマンニトール；
を含み、製剤のｐＨは約ｐＨ７である、前記凍結乾燥抗体製剤。
【請求項３９】
請求項１〜３８のいずれか１項に記載の製剤を含む容器ならびに製剤の投与および使用のための指示書を含むキット。
【請求項４０】
アレルギー性疾患、がん、喘息、ＩＬ−４および／もしくはＩＬ−１３の異常な生成に関連する疾患、または上昇したＴＨ−２によって媒介される応答に関連する疾患を処置するための方法であって、それを必要とする対象に請求項１〜３８のいずれか１項に記載の製剤を投与することを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体およびバッファー系を含む、凍結乾燥製剤を含む安定な医薬抗体製剤であって、製剤のｐＨは約ｐＨ７であり、製剤は、製剤のイオン強度を低減するために低い塩濃度を有する、前記医薬抗体製剤を提供する。製剤は、場合により、非イオン性界面活性剤、糖および／または非イオン性安定化剤をさらに含むことができる。製剤は、様々な疾患の処置で使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
ＩＬ−４およびＩＬ−１３は、それらの生物学的機能に基づき治療的に重要なサイトカインであり、喘息を含む多くの疾患で決定的な役割を演ずる（非特許文献１）。ＩＬ−４は自己免疫性疾患を抑制することができることが示されており、ＩＬ−４およびＩＬ−１３の両方は抗腫瘍免疫応答を増強する潜在能力を示している。両サイトカインはアレルギー性疾患の発症に関与するので、これらのサイトカインの阻害剤は治療的な有益性を提供することができるであろう。
【０００３】
皮下投与にとって好適な抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体を含有する医薬製剤を開発するためには、抗体を約１００ｍｇ／ｍＬ以上に濃縮しなければならない。しかしながら、そのような高濃度では、粘度の増加、ｐＨのシフト、溶液の色の変化、ならびに眼に見える、および眼に見えない粒子の形成などの多くの合併症が生じ得る。それが高濃度で凝集する傾向が強いという事実によって、この抗体の製剤化はさらに複雑である。一般的な抗体は５℃で４年の間に５％未満の高分子量凝集体（ＨＭＷ）を通常形成するが、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体は２５℃で毎時０．５〜１％の速度で、５℃では毎時０．１％の速度でＨＭＷを形成する。実際、この抗体は凝集する強力な性質を有するので、目標とする濃度範囲において液体で製剤化することができない。最後に、抗ＩＬ４／抗ＩＬ１３二特異的抗体は特に低い等電点を有し、溶解性の問題のために製剤化することをより困難にしている。例えば、抗ＩＬ４／抗ＩＬ１３二特異的抗体は５．８から６．２の間の等電点を有するが、ほとんどの抗体は８から１０の間の等電点を有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５、５巻、１６１〜１６６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、これらの複雑性に対処することができる、改良されて安定な医薬製剤の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
これらおよび他の必要性を満たすために、高度に安定な抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体製剤が本明細書で提供される。驚くべきことに、高度に安定な抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体製剤が、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体およびバッファー系を含む液体および凍結乾燥粉末の形で見出され、ここで、製剤のｐＨは約ｐＨ７であり、製剤は、製剤のイオン強度を低減するために低い塩濃度を有する。製剤は、場合により、非イオン性界面活性剤、糖および／または非イオン性安定化剤をさらに含むことができる。これらの製剤は、製剤中の抗体の濃度を増加させることによる抗体の分子凝集（ＨＭＷ）ならびに眼に見える粒子および眼に見えない粒子の形成にしばしばつながる従来の製
剤より改良される。特に、本発明の製剤は、眼に見える粒子、眼に見えない粒子、低分子量タンパク質および高分子量タンパク質に関して優れた安定性を示す。
【０００７】
本発明の実施形態は、安定な抗体製剤であって、式ＶＬ１−リンカー−ＶＬ２の軽鎖および式ＶＨ１−リンカー−ＶＨ２の重鎖を含み、ＶＬ１およびＶＨ１はＩＬ−１３抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ２およびＶＨ２はＩＬ−４抗原結合ドメインを形成する、二特異的抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３抗体またはその抗原結合断片；ならびに製剤のｐＨを約ｐＨ７に維持するのに適するバッファー系；製剤のイオン強度を低減するために低い塩濃度を有する前記抗体製剤を提供する。
【０００８】
具体的な実施形態では、ＶＬ１は配列番号１のＣＤＲ配列を含み；ＶＨ１は、配列番号２のＣＤＲ配列を含み；ＶＬ２は、配列番号３のＣＤＲ配列を含み；ＶＨ２は配列番号４または５のＣＤＲ配列を含む。代替の具体的な実施形態では、ＶＬ１は配列番号１のアミノ酸配列を含み；ＶＨ１は、配列番号２のアミノ酸配列を含み；ＶＬ２は、配列番号３のアミノ酸配列を含み；ＶＨ２は配列番号４または５のアミノ酸配列を含む。
【０００９】
具体的な実施形態では、軽鎖は式Ｎ−ＶＬ１−リンカー−ＶＬ２−ＣＬを含み、ＣＬは抗体の軽鎖定常ドメインであり、重鎖は式Ｎ−ＶＨ１−リンカー−ＶＨ２−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、ＣＨ２−ＣＨ３は抗体のＦｃドメインに対応する。具体的な実施形態では、リンカーは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。
【００１０】
具体的な実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、定常領域ドメインをさらに含む。具体的な実施形態では、定常領域ドメインは、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＬからなる群から選択される。
【００１１】
具体的な実施形態では、二特異的抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化ＩｇＧ４二特異的抗体またはその抗原結合断片である。
【００１２】
具体的な実施形態では、抗体またはその抗原結合断片の濃度は、約１００ｍｇ／ｍＬである。
【００１３】
本発明のある特定の実施形態では、バッファー系は、少なくとも２つのバッファーを含む。具体的な実施形態では、バッファー系の濃度は、約１０ｍＭである。具体的な実施形態では、バッファー系は、Ｔｒｉｓバッファーおよびリン酸バッファーを含む。具体的な実施形態では、Ｔｒｉｓバッファーの濃度は、約３．７ｍＭである。具体的な実施形態では、リン酸バッファーの濃度は、約６．３ｍＭである。具体的な実施形態では、Ｔｒｉｓバッファーの濃度は約３．７ｍＭであり、リン酸バッファーの濃度は約６．３ｍＭである。
【００１４】
本発明のある特定の実施形態では、製剤は、非イオン性界面活性剤をさらに含む。具体的な実施形態では、非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．０５％から約０．２％（ｗ／ｖ）である。具体的な実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ポリソルベートである。具体的な実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート８０である。具体的な実施形態では、ポリソルベート８０の濃度は、約０．０５％から約０．２％（ｗ／ｖ）である。具体的な実施形態では、ポリソルベート８０の濃度は、約０．２％（ｗ／ｖ）である。
【００１５】
本発明のある特定の実施形態では、製剤は、糖をさらに含む。具体的な実施形態では、糖の濃度は、約５％（ｗ／ｖ）である。具体的な実施形態では、糖は二糖である。具体的な実施形態では、二糖はスクロースである。具体的な実施形態では、スクロースの濃度は、約５％（ｗ／ｖ）である。
【００１６】
本発明のある特定の実施形態では、製剤は非イオン性安定化剤をさらに含む。具体的な実施形態では、非イオン性安定化剤の濃度は、約１％から約３％（ｗ／ｖ）である。具体的な実施形態では、非イオン性安定化剤は、アミノ酸または糖である。具体的な実施形態では、アミノ酸はプロリンである。具体的な実施形態では、糖はマンニトールである。具体的な実施形態では、プロリンの濃度は、約１％から約３％（ｗ／ｖ）である。具体的な実施形態では、プロリンの濃度は、約３％（ｗ／ｖ）である。具体的な実施形態では、マンニトールの濃度は、約３％（ｗ／ｖ）である。
【００１７】
本発明のある特定の実施形態では、製剤は、凍結乾燥製剤である。
【００１８】
本発明のある特定の実施形態では、製剤は、眼に見える粒子、眼に見えない粒子、低分子量タンパク質および高分子量タンパク質に関して優れた安定性を示す。
【００１９】
本発明の実施形態は、安定な凍結乾燥抗体製剤であって、配列番号２および４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号１および３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、約１００ｍｇ／ｍＬの二特異的抗体またはその抗原結合断片；約３．７ｍＭのＴｒｉｓバッファー濃度および約６．３ｍＭのリン酸バッファー濃度を含む、約１０ｍＭのバッファー系；約０．２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０；約５％（ｗ／ｖ）のスクロース；ならびに約３％（ｗ／ｖ）のプロリンを含み、製剤のｐＨは約ｐＨ７である、前記凍結乾燥抗体製剤を提供する。
【００２０】
本発明の実施形態は、安定な凍結乾燥抗体製剤であって、配列番号２および４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号１および３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、約１００ｍｇ／ｍＬの二特異的抗体またはその抗原結合断片；約３．７ｍＭのＴｒｉｓバッファー濃度および約６．３ｍＭのリン酸バッファー濃度を含む、約１０ｍＭのバッファー系；約０．２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０；約５％（ｗ／ｖ）のスクロース；ならびに約３％（ｗ／ｖ）のマンニトールを含み、製剤のｐＨは約ｐＨ７である、前記凍結乾燥抗体製剤を提供する。
【００２１】
本発明の実施形態は、本発明の製剤を含む容器ならびに製剤の投与および使用のための指示書を含むキットを提供する。
【００２２】
本発明の実施形態は、アレルギー性疾患、がん、喘息、ＩＬ−４および／もしくはＩＬ−１３の異常な生成に関連する疾患、または上昇したＴＨ−２によって媒介される応答に関連する疾患を処置するための方法であって、それを必要とする対象に本発明の製剤を投与することを含む前記方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】２つの軽鎖および２つの重鎖を含む例示的な二特異的抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３抗体分子を示す概略図である。２つの軽鎖は、部分Ｎ−ＶＬｈＢ−Ｂ１３−リンカー−ＶＬｈ８Ｄ４−８−ＣＬ−Ｃを含み、２つの重鎖は、部分Ｎ−ＶＨｈＢ−Ｂ１３−リンカー−ＶＨｈ８Ｄ４−８−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｃを含む。リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）２またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６）を含む。
【図２】例示的な抗体のアミノ酸配列、すなわち、Ｂ−Ｂ１３抗ＩＬ−１３抗体のヒト化可変ドメイン（配列番号１および２）および８Ｄ４−８抗ＩＬ−４抗体のヒト化可変ドメイン（配列番号３、４および５）を例示する図である。下線は、アミノ酸の変更が加えられたことを示す。太字は、ＣＤＲ配列を示す（配列番号７〜２１）。
【図３】振盪ストレスの後のアッセイ＃Ｐ５（ｐＨバッファースクリーニング）の粒子汚染を示す一群の写真である。
【図４】アッセイ＃Ｐ６（ｐＨバッファースクリーニング）のいくつかのストレスの後の眼に見えない粒子＞１．５μｍ汚染を示すグラフである。
【図５】アッセイ＃Ｐ６（ｐＨバッファースクリーニング）のいくつかのストレスの後の眼に見えない粒子＞１０μｍ汚染を示すグラフである。
【図６】温熱ストレスの後のアッセイ＃Ｐ６（ｐＨバッファースクリーニング）のＨＭＷレベルを示すグラフである。
【図７】４５℃で２週間後のアッセイ＃Ｐ５（ｐＨバッファースクリーニング）のＳＥＣクロマトグラムを示すグラフである。
【図８】４５℃で２週間後のアッセイ＃Ｐ５（ｐＨバッファースクリーニング）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
【図９】アッセイ＃Ｐ５および６（ｐＨバッファースクリーニング）の４５℃で２週間後のＩＥＦゲルの写真である。
【図１０】アッセイ＃Ｐ１３（塩効果）でのストレスプログラムの後のＨＭＷレベルを示すグラフである。
【図１１】機械的ストレスの後のアッセイ＃Ｐ１２（界面活性剤）の双眼画像の写真を示す。
【図１２】５℃で６週間保存した間のアッセイ＃Ｐ１２（界面活性剤）のＨＭＷモニタリングを示すグラフである。
【図１３】５℃で６週間保存した間のアッセイ＃Ｐ１２（添加剤）のＨＭＷモニタリングを示すグラフである。
【図１４】５℃で４週間保存した間のアッセイ＃Ｐ２０−ＦＤＳ（添加剤）のＨＭＷモニタリングを示すグラフである。
【図１５】５℃で２週間保存した間のアッセイ＃Ｐ２１（添加剤）のＨＭＷモニタリングを示すグラフである。
【図１６】リード製剤で１％プロリン対３％プロリンを比較した時間の関数としての単量体含有量の逆数のグラフである。
【図１７】製剤＃Ｐ１６−１の凍結乾燥工程中の温度を追跡したグラフである。
【図１８】１５ｍＬ成形ガラスバイアル中の＃Ｐ１８−１ケーキの写真を示す。
【図１９】凍結乾燥工程後のアッセイ＃Ｐ１４（添加剤）のＨＭＷレベルを示すグラフである。
【図２０】凍結乾燥後のアッセイ＃Ｐ２０（添加剤）のＨＭＷレベルを示すグラフである。
【図２１】製剤化されていないＤＳ（アッセイ＃９）での凍結／解凍サイクルの後のＨＭＷレベルを示すグラフ（ａ）および写真（ｂ）である。
【図２２】再構成後のアッセイ＃Ｐ１４（添加剤）のＨＭＷレベルを示すグラフである。
【図２３】再構成後のアッセイ＃Ｐ２０（添加剤）のＨＭＷレベルを示すグラフである。
【図２４】ケーキ保存および再構成後のアッセイ＃Ｐ１７（添加剤）のＨＭＷレベルを示すグラフである。
【図２５】ケーキ保存および再構成後のアッセイ＃Ｐ２０（添加剤）のＨＭＷレベルを示すグラフである。
【図２６】第１のスクリーニング（アッセイ＃Ｈ０４−１５０から１７２−ｐＨバッファースクリーニング）のＤＳＣ結果を示すグラフである。
【図２７】ヒスチジンおよびコハク酸塩製剤（アッセイ＃Ｐ−Ｈ０４−１４４および１４８、＃Ｈ０４−１５０のＡ１からＡ６）の視覚的態様を示す写真である。
【図２８Ａ】ＳＥＣによる５℃（アッセイ＃Ｈ０４−１５０  Ｂ１）およびＲＴ（アッセイ＃Ｈ０４−１６３  Ａ１、Ｂ１、Ｂ２およびＨ０４−１７２  Ａ１、Ａ２）でのバッファースクリーニングのＨＭＷ発生を示すグラフである。
【図２８Ｂ】図２８Ａの続き。
【図２８Ｃ】図２８Ｂの続き。
【図２９】リン酸／ＴｒｉｓバッファーでのｐＨスクリーニング（アッセイ＃Ｈ０４−１８７）のＤＳＣ結果を示すグラフである。
【図３０】ＳＥＣによるリン酸／ＴｒｉｓバッファーでのｐＨスクリーニング（アッセイ＃Ｈ０４−１８７）のＨＭＷ発生を示すグラフである。
【図３１】バッファー濃度スクリーニング（アッセイ＃Ｈ０４−１８５）のＤＳＣ結果を示すグラフである。
【図３２Ａ】ＳＥＣによるＲＴでのバッファー濃度によるＨＭＷ発生を示すグラフである（アッセイ＃Ｈ０４−１８５）。
【図３２Ｂ】図３２Ａの続き。
【図３３】ＳＥＣによるＲＴでのＮａＣｌのＨＭＷ発生を示すグラフである（アッセイ＃Ｈ０４−１８５）。
【図３４】ＳＥＣによるＲＴでのグリシン対スクロースのＨＭＷ発生を示すチャートである（アッセイ＃Ｈ０４−１８５）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、本明細書に記載される特定の方法、プロトコール、細胞系、ベクターまたは試薬に限定されないが、その理由は、それらが本発明の精神および範囲から逸脱することなく異なることができるからである。さらに、本明細書で用いられる用語は特定の実施形態を例示することだけが目的であり、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書に記載されるそれらに類似するかまたは同等であるいかなる方法および材料も本発明の実施で用いることができ、例示的な方法、装置および材料だけが本明細書に記載される。
【００２５】
本明細書に記載の全ての特許および刊行物は、本発明と一緒におよびそこにおいて使用することができる、その中で報告されているタンパク質、酵素、ベクター、宿主細胞および方法を記載および開示するために、参照によって全体が本明細書に組み入れられる。しかし、本明細書において、いかなるものも先行発明のために本発明がそのような開示に優先する権利がないことの承認と解釈するべきではない。
【００２６】
Ａ．定義
別途定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本文が別途明確に記載しない限り、複数の参照も含むことが本明細書で指摘される。
【００２８】
用語「約」または「およそ」は所与の値または範囲の１０％以内、より好ましくは５％以内（または１％以下）を意味する。
【００２９】
用語「投与する」または「投与」は、粘膜、皮内、静脈内、皮下、筋肉内送達および／または本明細書に記載されるか、もしくは当業界で公知の物理的送達の任意の他の方法などにより、体外に存在するような物質（例えば、本発明の製剤）を患者に注入するか、またはさもなければ物理的に送達する動作を指す。ある疾患、またはその症状を処置しようとする場合、物質の投与は、典型的には、疾患またはその症状の開始後に行われる。疾患またはその症状を予防しようとする場合、物質の投与は、典型的には、疾患またはその症状の開始前に行われる。
【００３０】
ポリペプチドの文脈において、用語「類似体」は、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的ポリペプチド、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的ポリペプチドの断片、抗ＩＬ−４／抗
ＩＬ−１３二特異的エピトープ、または抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体と類似するか、もしくは同一の機能を有するが、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的ポリペプチド、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的ポリペプチドの断片、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的エピトープ、または抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体の類似するか、もしくは同一のアミノ酸配列を含む必要はなく、または抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的ポリペプチド、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的ポリペプチドの断片、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的エピトープ、または抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体の類似するか、もしくは同一の構造を有するポリペプチドを指す。類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、以下のこと：（ａ）本明細書に記載の抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的ポリペプチド（例えば、配列番号１〜５）、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的ポリペプチドの断片、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的エピトープ、または抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体のアミノ酸配列と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、および好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、もしくは最も好ましくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド；（ｂ）少なくとも５アミノ酸残基、少なくとも１０アミノ酸残基、少なくとも１５アミノ酸残基、少なくとも２０アミノ酸残基、少なくとも２５アミノ酸残基、少なくとも４０アミノ酸残基、少なくとも５０アミノ酸残基、少なくとも６０アミノ酸残基、少なくとも７０アミノ酸残基、少なくとも８０アミノ酸残基、少なくとも９０アミノ酸残基、少なくとも１００アミノ酸残基、少なくとも１２５アミノ酸残基、もしくは少なくとも１５０アミノ酸残基の本明細書に記載の抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的ポリペプチド、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的ポリペプチドの断片、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的エピトープ、または抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体（またはそのＶＨもしくはＶＬ領域）をコードするヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照されたい）；および（ｃ）本明細書に記載の抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的ポリペプチド、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的ポリペプチドの断片、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的エピトープ、または抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体（またはそのＶＨもしくはＶＬ領��）をコードするヌクレオチド配列と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、および好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、もしくは最も好ましくは少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、のうちの少なくとも１つを満たすポリペプチドを指す。抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体ポリペプチド、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的ポリペプチドの断片、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的エピトープ、または抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体と類似する構造を有するポリペプチドとは、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的ポリペプチド、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的ポリペプチドの断片、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的エピトープ、または抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体の類似する二次、三次または四次構造を有するポリペプチドを指す。ポリペプチドの構造を、限定されるものではないが、Ｘ線結晶学、核磁気共鳴、および結晶電子顕微鏡などの当業者には公知の方法により決定することができる。
【００３１】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列
を、最適な比較のために整列させる（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列との最適なアラインメントのために第１のアミノ酸または核酸配列の配列中にギャップを導入することができる）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占有される場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の重複する位置の数／全位置数Ｘ１００％）。一実施形態においては、２つの配列は同じ長さである。
【００３２】
２つの配列（例えば、アミノ酸配列または核酸配列）間の同一性パーセントの決定を、数学的アルゴリズムを用いて達成することもできる。２つの配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの好ましい非限定例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３〜５８７７頁として改変された、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２２６４〜２２６８頁のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３頁のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム中に組込まれている。対象の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータセット、例えば、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施することができる。対象のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラムパラメータセット、例えば、スコア５０、ワード長＝３を用いて実施することができる。比較のためのギャップ付アラインメントを得るために、ギャップ付ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２頁に記載のように用いることができる。あるいは、ＰＳＩ  ＢＬＡＳＴを用いて、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施することができる（同上）。ＢＬＡＳＴ、ギャップ付ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ  Ｂｌａｓｔプログラムを用いる場合、対応するプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いることができる（例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのワールドワイドウェブ上のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）を参照されたい）。配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ、１９８８、ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１〜１７頁のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを用いる場合、ＰＡＭ１２０重み残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを用いることができる。
【００３３】
２つの配列間の同一性パーセントを、可能なギャップを用いるか、または用いずに、上記のものと類似する技術を用いて決定することができる。同一性パーセントを算出する際に、典型的には、正確な一致だけを計数する。
【００３４】
「アンタゴニスト」または「阻害剤」は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３によるシグナル伝達などの、標的分子の１つまたはそれ以上の生物学的活性を阻害することが可能な分子を指す。アンタゴニストは、リガンドによる活性化された細胞を無力化するか、もしくは殺傷することにより、および／または受容体もしくはリガンド活性化（例えば、チロシンキナーゼ活性化）または受容体へのリガンド結合後のシグナル伝達を妨害することにより、受容体のリガンドへの結合およびその逆を妨害することができる。アンタゴニストは、受容体−リガンド相互作用を完全に遮断するか、またはそのような相互作用を実質的に低下させることができる。本発明のある特定の実施形態では、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−
１３二特異的抗体は、ヒト化されたアンタゴニスト抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体、好ましくはヒト化されたモノクローナルのアンタゴニスト抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体である。
【００３５】
用語「抗体」、「免疫グロブリン」または「Ｉｇ」は、本明細書で互換的に用いることができる。用語、抗体は、限定されるものではないが、合成抗体、モノクローナル抗体、組換え産生された抗体、多特異的抗体（二特異的抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、イントラボディ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えば、一特異的、二特異的などを含む）、ラクダ化抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合断片を含む。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、ＩＬ−４またはＩＬ−１３抗原（例えば、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体の１つまたはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ））に特異的に結合する抗原結合部位を含有する抗原結合ドメインまたは分子を含む。抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、または任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ）のものであってもよい。好ましい実施形態では、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体はヒト化されており、例えば、ヒト化モノクローナル抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体である。ある特定の実施形態では、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体は、ＩｇＧ抗体、ヒトＩｇＧ４抗体である。
【００３６】
用語「抗原」は、本発明の抗体が結合することが可能な分子または分子の一部を指す。抗原は、１つまたはそれ以上のエピトープを有することができる。本発明の抗体によって認識される抗原の例には、限定されずに、血清タンパク質、例えばＩＬ−４、ＩＬ５、ＩＬ９およびＩＬ−１３などのサイトカイン、生理活性ペプチド、細胞表面分子、例えば受容体、輸送体、イオンチャネル、ウイルスおよび細菌のタンパク質が含まれる。
【００３７】
用語「抗原結合部位」は、抗原の一部または全体に特異的に結合し、相補的である領域を含む抗体の一部を指す。抗原が大きい場合は、抗体は抗原の特定部分に結合することができるだけであり、その部分はエピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、１つまたはそれ以上の抗体可変ドメインによって提供することができる。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の結合で作製される。
【００３８】
用語「結合剤」は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３、またはその変異体もしくは断片に結合するか、または特異的に結合する、抗体、ｓｉＲＮＡ、核酸、アプタマー、タンパク質、または低分子有機化合物のような任意の分子を意味する。
【００３９】
用語「二特異的抗体」または「二特異的抗体（複数）（ＢｓＡｂｓ）」は、単一分子中の２つの抗体の抗原結合部位を合わせ持つ分子を指す。したがって、二特異的抗体は、同時に２つの異なる抗原に結合することができる。診断目的のための適用の他に、病的領域に強力なエフェクター系を向け直すこと、または抗体の中和もしくは刺激活性を増加させることによって、ＢｓＡｂは新しい治療適用への道を開く。二特異的抗体はモノクローナルであってよいが、好ましくはヒトのものであるかまたはヒト化されている。二重特異的抗体の作製方法は、当技術分野で周知である。
【００４０】
用語「副産物」は、所与の製剤中の、抗体のような治療的／予防的結合剤の割合を減少または縮小させる望ましくない生成物を含む。例えば、典型的な副産物としては、抗体の凝集体、例えば、脱アミド化もしくは加水分解による抗体の分解により産生された抗体の
断片、またはその混合物が挙げられる。典型的には、凝集体は、モノマー抗体よりも大きい分子量を有する複合体である。抗体分解産物は、例えば、脱アミド化または加水分解によりもたらされた、例えば、抗体の断片を含んでもよい。典型的には、分解産物は、モノマー抗体よりも低い分子量を有する複合体である。ＩｇＧ抗体の場合、そのような分解産物は、約１５０ｋＤ未満である。
【００４１】
用語「組成物」および「製剤」は、場合により、特定量の特定構成成分（例えば、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体）を含有する生成物、ならびに場合により特定量の特定構成成分の組合せから直接または間接に生じる任意の生成物を包含することが意図される。
【００４２】
用語「定常領域」または「定常ドメイン」とは、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、Ｆｃ受容体との相互作用のような様々なエフェクター機能を示す軽鎖および重鎖のカルボキシ末端部分を指す。この用語は、抗原結合部位を含有する、免疫グロブリンの他の部分、可変ドメインと比較して、より多くの保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常ドメインは、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインと、軽鎖のＣＨＬドメインとを含有する。
【００４３】
用語「障害」は、本発明の製剤による処置が有益である任意の状態を指す。これには、哺乳動物、特にヒトが問題の障害を起こしやすくする病的状態を含む、慢性および急性の障害または疾患が含まれる。本明細書で処置される障害の非限定例には、がん、炎症、自己免疫性疾患、感染症、心血管疾患、呼吸器疾患、神経学的疾患および代謝疾患が含まれる。
【００４４】
用語「エピトープ」とは、抗体のような結合剤の１つまたはそれ以上の抗原結合領域に結合することができ、免疫応答を惹起することができる、動物、好ましくは哺乳動物、および最も好ましくはヒトにおける抗原性または免疫原性活性を有する、ＩＬ−４もしくはＩＬ−１３ポリペプチド、またはＩＬ−４もしくはＩＬ−１３ポリペプチド断片のような抗原の表面上の局在化された領域を指す。免疫原性活性を有するエピトープは、動物において抗体応答を惹起するポリペプチドの一部である。抗原性活性を有するエピトープは、例えば、免疫アッセイのような、当業界で周知の任意の方法により決定された場合、抗体が特異的に結合するポリペプチドの一部である。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖のような化学的に活性な分子表面基からなり、特定の三次元構造特性、ならびに特定の電荷特性を有する。エピトープに寄与するポリペプチドの領域は、ポリペプチドの連続するアミノ酸であってもよく、またはエピトープはポリペプチドの２つ以上の非連続領域に由来してもよい。エピトープは、抗原の三次元表面特性であっても、またはなくてもよい。ある実施形態においては、ＩＬ−４またはＩＬ−１３エピトープは、三次元表面特性のＩＬ−４またはＩＬ−１３ポリペプチドである。他の実施形態においては、ＩＬ−４またはＩＬ−１３エピトープは、線状特性のＩＬ−４またはＩＬ−１３ポリペプチドである。抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体は、変性形態のＩＬ−４もしくはＩＬ−１３のエピトープ、天然形態のＩＬ−４もしくはＩＬ−１３のエピトープ、または変性形態および天然形態の両方のＩＬ−４もしくはＩＬ−１３に特異的に結合することができる。
【００４５】
用語「添加剤」とは、薬物のための、賦形剤、ビヒクル、保存剤、結合剤、安定化剤などとして一般的に用いられる不活性物質を指し、限定されるものではないが、タンパク質（例えば、血清アルブミンなど）、アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、グリシン、ヒスチジンなど）、脂肪酸およびリン脂質（例えば、スルホン酸アルキル、カプリレートなど）、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、ポリソルベート、非イオン性界面活性剤など）、サッカライド（例えば、スクロース、マルトース、トレ
ハロースなど）ならびにポリオール（例えば、マンニトール、ソルビトールなど）が挙げられる。また、全体が参照により本明細書に組み入れられるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．も参照されたい。
【００４６】
ペプチドまたはポリペプチドの文脈において、用語「断片」とは、完全長より少ないアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。そのような断片は、例えば、アミノ末端でのトランケーション、カルボキシ末端でのトランケーション、および／またはアミノ酸配列からの残基の内部的欠失から生じてもよい。断片は、例えば、代替的ＲＮＡスプライシングまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのプロテアーゼ活性から生じてもよい。ある実施形態においては、ｈＩＬ−４またはｈＩＬ−１３断片は、ＩＬ−４もしくはＩＬ−１３ポリペプチドまたはＩＬ−４もしくはＩＬ−１３ポリペプチドに特異的に結合する抗体のアミノ酸配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも７０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基、または少なくとも２５０個の連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００４７】
抗体または抗原の「機能的断片、変異体、誘導体または類似体」などの語句および用語、ならびにその形は、対象の完全長抗体または抗原と共通する質的生物学的活性を有する化合物または分子である。例えば、抗ＩＬ−４抗体の機能的断片または類似体は、ＩＬ−４分子に結合することができるもの、またはＩＬ−４に結合するリガンドもしくはアゴニストもしくはアンタゴニスト抗体の能力を阻止もしくは実質的に低減することができるものである。
【００４８】
用語「重鎖」は、抗体を参照して用いられる場合、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、アルファ（α）、デルタ（Δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）およびミュー（μ）と呼ばれる５つの異なる型を指す。これらの異なる型の重鎖は当業界で周知であり、それぞれ、ＩｇＧの４つのサブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む、５つのクラスの抗体、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭを生じる。好ましくは、重鎖は、ヒト重鎖である。
【００４９】
用語「ヒンジ」または「ヒンジ領域」は、抗体の第１および第２の定常ドメインの間のアミノ酸を含むフレキシブルなポリペプチドを指す。
【００５０】
「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、ヒト抗体と比較して、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または他の標的結合サブ配列など）である。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全部または実質的に全部が、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全部または実質的に全部が、ヒト免疫グロブリン鋳型配列のものである、１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含む。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的には、選択されたヒト免疫グロブリン鋳型のものを含んでもよい。一般に、目標は、ヒトにおける免疫原性が最小である抗体分子を有することである。かくして、１つまたはそれ以上のＣＤＲ中の１つまたはそれ以上のアミノ酸を、１つまたはそれ以上のＣＤＲの、ＩＬ−４
および／またはＩＬ−１３への特異的結合機能を実質的に最小化することなく、ヒト宿主に対する免疫原性が低いものに変化させることもできる。あるいは、ＦＲは、非ヒトであってもよいが、最も免疫原性であるこれらのアミノ酸を、免疫原性が低いものと置きかえる。それにも拘らず、上記で考察されたＣＤＲ移植は、ヒト化抗体を得るための唯一の方法ではない。例えば、ＣＤＲ領域だけの改変はＣＤＲループの三次元構造および抗体のそのリガンドに対する全体の親和性を決定する際に役割を果たすフレームワーク残基にとって一般的ではないため、ＣＤＲ領域だけの改変では不十分であり得る。したがって、非ヒト親抗体分子が、ヒトに対する免疫原性が低いものとなるように改変され、ヒト抗体との全体的配列同一性が常に必要ではないような任意の手段を実施することができる。したがって、例えば、ごくわずかの残基、特に、抗体分子上に露出され、分子内に埋まらず、したがって、宿主免疫系にとって容易に接近可能ではない残基のわずかな置換により、ヒト化を達成することもできる。例えば、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ７（６）８０５〜８１４頁、１９９４；Ｍｏｌ  Ｉｍｍ  ４４：１９８６〜１９８８頁、２００７；Ｓｉｍら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５１：２２９６頁（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１頁（１９８７）；Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：４２８５頁（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５１：２６２３頁（１９９３）、ＷＯ２００６／０４２３３３および米国特許第５，８６９，６１９号を参照されたい。あるいは、抗体は、他の技術、例えばＣＤＲ移植（ＥＰＯ０２３９４００；ＷＯ９１／０９９６７；および米国特許第５，５３０，１０１号および第５，５８５，０８９号）、ベニヤリングまたはリサーフェシング（ＥＰＯ０５９２１０６；ＥＰＯ０５１９５９６；Ｐａｄｌａｎ、１９９１、Ｍｏｌｅｃ  Ｉｍｍ  ２８（４／５）：４８９〜４９８頁；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、１９９４、Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ７（６）：８０５〜８１４頁；およびＲｏｇｕｓｋａら、１９９４、ＰＮＡＳ  ９１：９６９〜９７３頁）および鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）によってヒト化することができる。ヒト抗体は、限定されずにファージディスプレイ方法を含む、当技術分野で公知である様々な方法によって作製することができる、齧歯動物などのトランスジェニック動物、キメラ細胞その他を用いる、米国特許第４，４４４，８８７号、第４，７１６，１１１号、第５，５４５，８０６号および第５，８１４，３１８号；ならびにＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９１／１０７４１を参照。
【００５１】
「インターロイキン−４」（ＩＬ−４）は、天然に存在するか、または内因性の哺乳動物のＩＬ−４タンパク質、および、天然に存在するかまたは内因性の対応する哺乳動物のＩＬ−４タンパク質のそれと同じであるアミノ酸配列を有するタンパク質に関する（例えば、組換えタンパク質、合成タンパク質（すなわち、有機合成化学の方法を使用して生成される））。したがって、本明細書に規定されるように、この用語は、成熟したＩＬ−４タンパク質、多形性または対立遺伝子の変異体、ならびにＩＬ−４の他のアイソフォームおよび上述の改変されたまたは未改変の形を含む（例えば、リピド化、グリコシル化されたもの）。天然に存在するまたは内因性のＩＬ−４は、哺乳動物（例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類）に天然に存在する野生型タンパク質、例えば成熟したＩＬ−４、多形性または対立遺伝子の変異体、ならびに他のアイソフォームおよび突然変異形を含む。そのようなタンパク質は、例えば、ＩＬ−４を天然に生成する供給源から回収または単離することができる。これらのタンパク質および天然に存在するかまたは内因性の対応するＩＬ−４と同じアミノ酸配列を有するタンパク質は、対応する哺乳動物の名前によって呼ばれる。例えば、対応する哺乳動物がヒトである場合は、タンパク質はヒトＩＬ−４と呼ばれる。ＷＯ０３／０３８０４１で開示されるそれらなどの、いくつかの突然変異体ＩＬ−４タンパク質が当技術分野で公知である。
【００５２】
「インターロイキン−１３」（ＩＬ−１３）は、天然に存在するか、または内因性の哺
乳動物のＩＬ−１３タンパク質、および、天然に存在するかまたは内因性の対応する哺乳動物のＩＬ−１３タンパク質のそれと同じであるアミノ酸配列を有するタンパク質を指す（例えば、組換えタンパク質、合成タンパク質（すなわち、有機合成化学の方法を使用して生成される））。したがって、本明細書に規定されるように、この用語は、成熟したＩＬ−１３タンパク質、多形性または対立遺伝子の変異体、ならびにＩＬ−１３の他のアイソフォーム（例えば、選択的スプライシングまたは他の細胞プロセスによって生成されるもの）および上述の改変されたまたは未改変の形を含む（例えば、リピド化、グリコシル化されたもの）。天然に存在するまたは内因性のＩＬ−１３は、哺乳動物（例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類）に天然に存在する野生型タンパク質、例えば成熟したＩＬ−１３、多形性または対立遺伝子の変異体ならびに他のアイソフォームおよび突然変異形を含む。例えば、本明細書で用いるように、ＩＬ−１３は、喘息（アトピー性および非アトピー性喘息）と関連する、成熟したヒトＩＬ−１３の１１０位のＡｒｇがＧｌｎで置き換えられた（成熟したＩＬ−１３の１１０位は先駆タンパク質の１３０位に対応する）ヒトＩＬ−１３変異体およびＩＬ−１３の他の変異体を包含する。（Ｈｅｉｎｚｍａｎｎら、Ｈｕｍ
ＭｏＩ  Ｇｅｎｅｔ．９：５４９〜５５９頁（２０００）。）そのようなタンパク質は、例えば、ＩＬ−１３を天然に生成する供給源から回収または単離することができる。これらのタンパク質および天然に存在するかまたは内因性の対応するＩＬ−１３と同じアミノ酸配列を有するタンパク質は、対応する哺乳動物の名前によって呼ばれる。例えば、対応する哺乳動物がヒトである場合は、タンパク質はヒトＩＬ−１３と呼ばれる。ＷＯ０３／０３５８４７で開示されるそれらなどの、いくつかの突然変異体ＩＬ−１３タンパク質が当技術分野で公知である。
【００５３】
抗体のような、「単離された」または「精製された」結合剤は、結合剤が由来する細胞もしくは組織供給源に由来する細胞材料もしくは他の汚染タンパク質を実質的に含まないか、または化学的に合成された場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。例えば、用語「細胞材料を実質的に含まない」は、抗体が、それが単離されるか、または組換え的に産生される細胞の細胞成分から分離される抗体の調製物を含む。かくして、細胞材料の実質的に含まない抗体は、約３０％、２０％、１０％、または５％（乾燥重量で）未満の異種タンパク質（本明細書では「汚染タンパク質」とも呼ばれる）を有する抗体の調製物を含む。抗体が組換え産生される場合、それは培養培地を実質的に含まない、すなわち、培養培地がタンパク質調製物の約２０％、１０％、または５％未満の容量であるのも好ましい。抗体が化学的合成により産生される場合、それは化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない、すなわち、それはタンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されることが好ましい。したがって、抗体のそのような調製物は、約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量で）未満の、対象の抗体以外の化学的前駆体または化合物を有する。好ましい実施形態においては、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体は、単離または精製される。
【００５４】
用語「Ｋａｂａｔ番号付け」および同様の用語は当業界で認識されており、抗体、またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域中の他のアミノ酸残基より可変性（すなわち、超可変性）であるアミノ酸残基の番号付けシステムを指す（Ｋａｂａｔら（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２〜３９１頁およびＫａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ
ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２頁）。重鎖可変領域については、超可変領域は、典型的には、ＣＤＲ１のアミノ酸３１位から３５位、ＣＤＲ２のアミノ酸５０位〜６５位、およびＣＤＲ３のアミノ酸９５位〜１０２位の範囲である。軽鎖可変領域については、超可変領域は、典型的には、ＣＤＲ１のアミノ酸２４〜３４位、ＣＤＲ２のアミノ酸５０〜５６位、およびＣＤＲ３のアミノ酸８９〜９７位の範囲である。
【００５５】
抗体を参照して用いられる場合、用語「軽鎖」とは、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）またはラムダ（λ）と呼ばれる２つの異なる型を指す。軽鎖アミノ酸配列は当業界で周知である。好ましい実施形態においては、軽鎖はヒト軽鎖である。
【００５６】
用語「リンカー」は、抗体の抗原結合ドメインを接続する分子を指す。リンカーは、任意の種類のリンカー分子であってもよい。好ましくは、リンカーはポリペプチドである。リンカーは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの間で、およびその中で、等しいかまたは互いに異なってもよい。さらに、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸の長さであってもよい。軽鎖ドメインに関しての重鎖ドメインの好ましいペプチドリンカー単位は、（Ｇ４Ｓ）２、すなわちＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６）である。重鎖および軽鎖のリンカー単位の数は、等しいか（対称的オーダー）または互いと異なってもよい（非対称的オーダー）。ペプチドリンカーは、好ましくは、適切なタンパク質折畳みを可能にするために、および必要に応じて、抗体分子を同じ細胞上の２つ以上のおそらく広く間隔のあいている受容体と交互作用させるために、抗原結合部分が、例えば立体障害によって互いの活性を妨害することを阻止するのに十分な柔軟度を提供するのに十分に長い。それでも、それは好ましくは、抗体部分を細胞内で安定であり続けさせるために十分短い。したがって、多価抗体の所望の特性を最適化するために、ペプチドリンカーの長さ、組成および／またはコンホメーションは、当業技術者が容易に選択することができる。
【００５７】
用語「低塩」および「低塩濃度」は、０または無塩の塩濃度を含む、１５ｍＭ以下の比較的低い塩濃度を意味する。塩濃度は、製剤中の塩およびバッファーの量によって判定される。製剤のイオン強度を下げるために、バッファー系は製剤中に低い濃度、すなわち約１５ｍＭ以下で存在することが好ましい。あるいは、一部の好ましい実施形態は、塩およびバッファーを含有しない。製剤のイオン強度をできるだけ低くしておくために、ＮａＣｌなどの追加の塩を製剤に加えないことも好ましい。
【００５８】
用語「管理する」、「管理すること」および「管理」とは、感染の治癒をもたらさない、対象が治療（例えば、予防剤または治療剤）から導かれる有益な効果を指す。ある特定の実施形態では、その疾患の進行または悪化を阻止するために、ＩＬ−４またはＩＬ−１３によって媒介される疾患（例えば、がん、炎症、自己免疫性疾患、感染症、心血管疾患、呼吸器疾患、神経学的疾患および代謝疾患）、１つまたはそれ以上のその症状を「管理する」ために、対象は、１つまたはそれ以上の治療（例えば、本発明の製剤などの予防的または治療的な薬剤）を投与される。
【００５９】
用語「モノクローナル抗体」とは、同種または実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、それぞれのモノクローナル抗体は、典型的には、抗原上の単一のエピトープを認識する。好ましい実施形態においては、「モノクローナル抗体」は、単一のハイブリドーマまたは他の細胞により産生される抗体である。用語「モノクローナル」は、抗体を作製するための任意の特定の方法に限定されない。例えば、モノクローナル抗体を、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５頁（１９７５）に記載のハイブリドーマ法により作製するか、またはファージライブラリーから単離することができる。クローン細胞系およびそれにより発現されるモノクローナル抗体の調製のための他の方法は、当業界で周知である（例えば、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）第５版；Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋの第１１章を参照されたい）。
【００６０】
本発明で用いる用語「医薬組成物」は、様々な調製物の製剤を指す。抗体の治療的有効量を含有する製剤は、無菌の液体溶液、液体懸濁液または凍結乾燥バージョンであり、安
定剤または賦形剤を場合によっては含有する。
【００６１】
用語「薬学的に許容される」とは、連邦もしくは州政府の規制当局によって認可されるか、または米国薬局方、欧州薬局方もしくは動物、より特には、ヒトにおける使用のための他の一般的に認識される薬局方に列挙されることを意味する。
【００６２】
「薬学的に許容される添加剤」とは、同意できるか、または都合のよい剤形を調製するための、モノクローナル抗体のような活性分子と組み合わされる任意の不活性物質を意味する。「薬学的に許容される添加剤」は、用いられる用量および濃度でレシピエントに対して非毒性的であり、モノクローナル抗体を含む製剤の他の構成成分と適合する添加剤である。
【００６３】
用語「防止する」、「防止すること」および「防止」とは、本明細書に提供される治療または治療の組合せ（例えば、本発明の製剤のような、予防剤または治療剤の組合せ）の投与の結果生じる、ＩＬ−４もしくはＩＬ−１３媒介性疾患および／またはそれと関連する症状の発生、再発、開始または拡散の全体的または部分的阻害を指す。
【００６４】
用語「予防剤」とは、対象におけるＩＬ−４もしくはＩＬ−１３媒介性疾患および／またはそれと関連する症状の発生、再発、開始または拡散を全体的または部分的に阻害することができる任意の薬剤を指す。ある実施形態においては、用語「予防剤」とは、本発明の製剤を指す。ある他の実施形態においては、用語「予防剤」とは、本発明の製剤以外の薬剤を指す。好ましくは、予防剤は、ＩＬ−４もしくはＩＬ−１３媒介性疾患および／またはそれと関連する症状を防止するか、またはＩＬ−４もしくはＩＬ−１３媒介性疾患および／またはそれと関連する症状の開始、発生、進行および／もしくは重症度を妨げるために有用であることが知られるか、または用いられてきたか、または現在用いられている薬剤である。特定の実施形態においては、予防剤は、ヒト化抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体である。
【００６５】
語句「組換え抗体」は、宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックおよび／もしくはトランスクロモソーマルである動物（例えば、マウスもしくはウシ）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７〜６２９５頁を参照されたい）のような、組換え手段により調製、発現、作出、もしくは単離された抗体またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製、発現、作出、もしくは単離された抗体を含む。そのような組換え抗体は、免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有してもよい（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２頁を参照されたい）。しかしながら、ある実施形態においては、そのような組換え抗体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に関してトランスジェニックである動物を用いる場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞突然変異誘発）にかけ、かくして、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、生殖細胞系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、それと関連するが、ｉｎ  ｖｉｖｏでは抗体生殖細胞系列レパートリー中に自然には存在しなくてもよい。
【００６６】
用語「サッカライド」とは、多価アルコールの誘導体である分子のクラスを指す。サッカライドは、一般的には炭水化物と呼ばれ、異なる量の糖（サッカライド）単位、例えば、モノサッカライド、ジサッカライド、およびポリサッカライドを含有してもよい。
【００６７】
用語「特異的に結合する」または「特異的に結合すること」とは、ある抗原またはその断片には特異的に結合するが、他の抗原には特異的に結合しないことを意味する。例えば、抗原に特異的に結合する抗体は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＢＩＡＣＯＲＥ、または当業界で公知の他のアッセイにより決定された場合、より低い親和性で他のペプチドまたはポリペプチドに結合することができる。抗原に特異的に結合する抗体またはその変異体もしくは断片は、関連する抗原と交差反応性であってもよい。好ましくは、抗原に特異的に結合する抗体またはその変異体もしくは断片は、他の抗原と交差反応しない。ＩＬ−４および／もしくはＩＬ−１３抗原に特異的に結合する抗体またはその変異体もしくは断片を、例えば、免疫アッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ、または当業者には公知の他の技術により同定することができる。典型的には、特異的または選択的反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、より典型的には、バックグラウンドの１０倍を超える。例えば、抗体特異性に関する考察については、Ｐａｕｌ（編）、１９８９、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、３３２〜３３６頁を参照されたい。
【００６８】
「安定な」または「安定化された」製剤は、その中の抗体のような結合剤が、保存時にその物理的安定性、同一性、完全性、および／または化学的安定性、同一性、完全性、および／または生物活性を本質的に保持するものである。タンパク質安定性を測定するための様々な分析技術が当業界で利用可能であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２４７〜３０１頁、Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ（編）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、Ｐｕｂｓ．（１９９１）およびＪｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０：２９〜９０頁（１９９３）に概説されている。安定性を、選択された期間にわたって、選択された温度および他の保存条件で測定することができる。安定性を、視覚的検査、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＩＥＦ、ＨＰＳＥＣ、ＲＦＦＩＴ、およびカッパ／ラムダＥＬＩＳＡからなる群から選択される少なくとも１つの方法により決定することができる。例えば、抗体が、色および／もしくは透明度の視覚的検査の際に、またはＵＶ光散乱、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、もしくは（高速）サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）により測定された場合、凝集、沈降、および／または変性の兆候を示さない場合、それは医薬製剤中で「その物理的安定性を保持する」。好ましくは、本発明の製剤を用いる場合、ＨＰＳＥＣまたは凝集形成を測定するための任意の他の好適な方法により測定された場合、５％以下、典型的には、４％以下、好ましくは、３％以下、より好ましくは、２％以下、および特に１％以下の抗体が凝集体を形成する。例えば、抗体モノマーが特定の製剤中、特定の保存条件下で特定の所定の期間後に、約９０％、好ましくは、約９５％、特に、約９８％の純度を有する場合、抗体は特定の製剤中で安定であると考えられる。化学的に変化した形態のタンパク質を検出および定量することにより、化学的安定性を評価することができる。化学的変化は、例えば、（ＨＰ）ＳＥＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および／またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ  ＭＳ）を用いて評価することができるサイズ改変（例えば、クリッピング）を含んでもよい。他の型の化学的変化としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィーにより評価することができる電荷変化（例えば、脱アミド化の結果として起こる）が挙げられる。例えば、抗原結合アッセイまたはウイルス中和アッセイにおいて決定された場合、所与の時間での抗体の生物活性が、医薬製剤が調製された時間で示された生物活性の少なくとも約９０％（アッセイの誤差の範囲内）である場合、抗体は所与の時間で医薬製剤中で「その生物活性を保持する」。
【００６９】
用語「対象」および「患者」は互換的に用いられる。本明細書で用いられる場合、対象は、好ましくは、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）また
は霊長類（例えば、サルおよびヒト）ような哺乳動物、最も好ましくはヒトである。一実施形態においては、対象は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３媒介性疾患を有する、哺乳動物、好ましくはヒトである。別の実施形態においては、対象は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３媒介性疾患を発症する危険性がある哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００７０】
抗体鎖ポリペプチド配列に関する語句「実質的に同一である」は、参照ポリペプチド配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の配列同一性を示す抗体鎖と解釈することができる。核酸配列に関するこの用語は、参照核酸配列と少なくとも約８５％、９０％、９５％または９７％以上の配列同一性を示すヌクレオチド配列と解釈することができる。
【００７１】
「置換型」変異体は、天然配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が取り除かれて、同じ位置にその代わりに挿入された異なるアミノ酸で置き換えられたものである。置換は、分子中の１つのアミノ酸だけが置換される単一型、または同じ分子で２個以上のアミノ酸が置換される複数型であってもよい。複数の置換は、連続する部位であってもよい。さらに、１つのアミノ酸を複数の残基で置き換えることができ、その場合には、そのような変異体は置換および挿入を含む。「挿入型」変異体は、天然配列中の特定位置のアミノ酸の直ぐ隣に挿入された１つまたはそれ以上のアミノ酸を有するものである。アミノ酸の直ぐ隣は、アミノ酸のα−カルボキシルまたはα−アミノ官能基に接続されることを意味する。「欠失型」変異体は、天然アミノ酸配列中の１つまたはそれ以上のアミノ酸が取り除かれたものである。通常、欠失型変異体は、分子の特定領域で１、２のアミノ酸が削除される。
【００７２】
用語「治療上有効量」とは、所与の疾患および／またはそれと関連する症状の重症度および／または持続期間を軽減および／または改善するのに十分である治療（例えば、本発明の製剤）の量を指す。この用語はまた、所与の疾患の前進もしくは進行の軽減もしくは改善、所与の疾患の再発、発症もしくは開始の軽減もしくは改善、および／または別の治療（例えば、本発明の製剤以外の治療）の予防もしくは治療効果の改善もしくは増強にとって必要な量も包含する。一部の実施形態では、本発明の抗体の治療的有効量は、約５から２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１０から２０ｎｇ／ｍｌの間の局所濃度を提供する。いくつかの実施形態においては、本明細書で用いられる「治療上有効量」はまた、特殊な結果（例えば、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３サイトカインの阻害）を達成する本発明の抗体の量も指す。
【００７３】
用語「治療剤」とは、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３媒介性疾患および／またはそれと関連する症状の処置、管理または改善において用いることができる任意の薬剤を指す。ある実施形態においては、用語「治療剤」とは、本発明の製剤を指す。ある他の実施形態においては、用語「治療剤」とは、本発明の製剤以外の薬剤を指す。好ましくは、治療剤は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３媒介性疾患またはそれと関連する１つもしくはそれ以上の症状の処置、管理または改善にとって有用であることが知られるか、またはそのために用いられてきた、またはそのために現在用いられている薬剤である。
【００７４】
用語「治療」は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３によって媒介される疾患（例えば、がん、炎症、自己免疫性疾患、感染症、心血管疾患、呼吸器疾患、神経学的疾患および代謝疾患）の防止、管理、処置および／または改善で使用することができる任意のプロトコール、方法および／または薬剤を指す。ある実施形態においては、用語「複数の治療」および「治療」とは、生物学的治療、支持的治療、および／または医療関係者のような当業者には公知のＩＬ−４および／またはＩＬ−１３媒介性疾患の防止、管理、処置、および／もしくは改善において有用な他の治療を指す。
【００７５】
用語「処置する」、「処置」および「処置すること」は、１つまたはそれ以上の治療の投与（限定されずに、本発明の製剤などの１つまたはそれ以上の予防的または治療的薬剤の投与を含む）からもたらされる、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３によって媒介される疾患（例えば、がん、炎症、自己免疫性疾患、感染症、心血管疾患、呼吸器疾患、神経学的疾患および代謝疾患）の進行、重症度および／または持続期間の低減または改善を指す。
【００７６】
用語「可変領域」または「可変ドメイン」とは、結合において用いられる抗体間で配列およびその特定の抗原に対するそれぞれの特定の抗体の特異性が大きく異なる、軽鎖および重鎖の一部、典型的には、重鎖中のアミノ末端の約１２０〜１３０アミノ酸および軽鎖中の約１００〜１１０アミノ酸を指す。配列の変動性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれるこれらの領域に集中するが、可変ドメイン中のより高度に保存された領域はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。軽鎖および重鎖のＣＤＲは主に、抗体の抗原との相互作用を担う。アミノ酸位置の番号付けは、Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）第５版（「Ｋａｂａｔら」）に記載のようなＥＵ指数によるものである。好ましい実施形態においては、可変領域は、ヒト可変領域である。
【００７７】
Ｂ．製剤および製剤成分
前述のように、本発明の製剤は、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体およびバッファー系を含み、ここで、製剤のｐＨは約ｐＨ７であり、製剤は、製剤のイオン強度を低減するために低い塩濃度を有する。製剤は、場合により、非イオン性界面活性剤、糖および／または非イオン性安定化剤をさらに含むことができる。本発明の製剤は、製剤中の抗体の濃度を増加させることによる抗体の分子凝集ならびに眼に見える粒子および眼に見えない粒子の形成にしばしばつながるこれまでの抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体製剤より、有意な改良を提供することが見出された。特に、本発明の製剤は、眼に見える粒子、眼に見えない粒子、低分子量タンパク質および高分子量タンパク質に関して優れた安定性を示す。
【００７８】
ｉ．抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体、ならびにその変異体および断片
ある特定の実施形態では、本発明の製剤は、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体を含む。二特異的抗体は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３またはその変異体もしくは断片に結合するかまたは特異的に結合する。ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３分子は、任意の種からのものであってもよい。好ましくは、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３分子は、ヒトからのものである。ＩＬ−４およびＩＬ−１３の両方のアミノ酸配列およびタンパク質構造は、当技術分野で周知である。
【００７９】
ある例示的実施形態においては、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体は、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、またはその変異体またはその抗原結合断片である。好ましい抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体は、ＩＬ−４およびＩＬ−１３のその受容体との結合を防止し、ＩＬ−４およびＩＬ−１３生物活性を阻害する。
【００８０】
具体的な実施形態では、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＩＬ−１３に結合する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む（下線は、加えられたアミノ酸変更を示す。太字はＣＤＲを示す；ＣＤＲ１は配列番号７のＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＱＳＹＭＨであり；ＣＤＲ２は配列番号８のＬＡＳＮＬＥＳであり；ＣＤＲ３は配列番号９のＱＱＮＡＥＤＳＲＴである）。
【００８１】
抗ＩＬ１３  ｈＢ−Ｂ１３  ＶＬ３（配列番号１）
【化１】
2019070025.tif 000002
【００８２】
具体的な実施形態では、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＩＬ−１３に結合する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む（下線は、加えられたアミノ酸変更を示す。太字はＣＤＲを示す；ＣＤＲ１は配列番号１０のＧＦＳＬＴＤＳＳＩＮであり；ＣＤＲ２は配列番号１１のＤＧＲＩＤであり；ＣＤＲ３は配列番号１２のＤＧＹＦＰＹＡＭＤＦである）。
【００８３】
抗ＩＬ１３  ｈＢ−Ｂ１３  ＶＨ２（配列番号２）
【化２】
2019070025.tif 000003
【００８４】
具体的な実施形態では、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＩＬ−４に結合する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む（下線は、加えられたアミノ酸変更を示す。太字はＣＤＲを示す；ＣＤＲ１は配列番号１３のＨＡＳＱＮＩＤＶＷＬＳであり；ＣＤＲ２は配列番号１４のＫＡＳＮＬＨＴＧであり；ＣＤＲ３は配列番号１５のＱＱＡＨＳＹＰＦＴである）。
【００８５】
抗ＩＬ４  ｈ８Ｄ４−８  ＶＬ１（配列番号３）
【化３】
2019070025.tif 000004
【００８６】
具体的な実施形態では、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＩＬ−４に結合する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む（下線は、加えられたアミノ酸変更を示す。太字はＣＤＲを示す；ＣＤＲ１は配列番号１６のＧＹＳＦＴＳＹＷＩＨであり；ＣＤＲ２は配列番号１７のＩＤＰＳＤＧＥＴＲであり；ＣＤＲ３は配列番号１８のＬＫＥＹＧＮＹＤＳＦＹＦＤＶである）。
【００８７】
抗ＩＬ４  ｈ８Ｄ４−８  ＶＨ１（配列番号４）
【化４】
2019070025.tif 000005
【００８８】
別の具体的な実施形態では、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体またはその抗原結合断片は、配列番号５のアミノ酸配列を含むＩＬ−４に結合する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む（下線は、加えられたアミノ酸変更を示す。太字はＣＤＲを示す；ＣＤＲ１は配列番
号１９のＧＹＳＦＴＳＹＷＩＨであり；ＣＤＲ２は配列番号２０のＩＤＡＳＤＧＥＴＲであり；ＣＤＲ３は配列番号２１のＬＫＥＹＧＮＹＤＳＦＹＦＤＶである）。
【００８９】
抗ＩＬ４  ｈ８Ｄ４−８  ＶＨ２（配列番号５）
【化５】
2019070025.tif 000006
【００９０】
一部の具体的な実施形態では、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＩＬ−１３に結合する重鎖可変領域、および配列番号１のアミノ酸配列を含むＩＬ−１３に結合する軽鎖可変領域を含む。
【００９１】
他の具体的な実施形態では、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＩＬ−４に結合する重鎖可変領域、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＩＬ−４に結合する軽鎖可変領域を含む。
【００９２】
さらに他の具体的な実施形態では、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体またはその抗原結合断片は、配列番号５のアミノ酸配列を含むＩＬ−４に結合する重鎖可変領域、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＩＬ−４に結合する軽鎖可変領域を含む。
【００９３】
より具体的な実施形態では、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２および４または２および５のアミノ酸配列を含むＩＬ−１３およびＩＬ−４の両方に結合する重鎖可変領域、ならびに配列番号１および３のアミノ酸配列を含むＩＬ−１３およびＩＬ−４の両方に結合する軽鎖可変領域を含む。
【００９４】
最も具体的な実施形態では、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体は、配列番号２および４のアミノ酸配列を含むＩＬ−１３およびＩＬ−４の両方に結合する重鎖可変領域、ならびに配列番号１および３のアミノ酸配列を含むＩＬ−１３およびＩＬ−４の両方に結合する軽鎖可変領域を含む（「リード抗体」）。抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体の実施形態の概略図は図１に示し、例示的な重鎖および軽鎖可変領域は図２に示す。質量分析によって判定されるリード抗体の分子量は、１９８ｋＤａである。等電点電気泳動によって判定されるリード抗体の等電点は、５．８から６．２の間である。
【００９５】
代替の最も具体的な実施形態では、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体またはその抗原結合断片は、式ＶＬ１−リンカー−ＶＬ２の軽鎖および式ＶＨ１−リンカー−ＶＨ２の重鎖を含み、ここで、ＶＬ１およびＶＨ１はＩＬ−４抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ２およびＶＨ２はＩＬ−１３抗原結合ドメインを形成する。一部の実施形態では、ＶＬ１は配列番号１のＣＤＲ配列を含み；ＶＨ１は、配列番号２のＣＤＲ配列を含み；ＶＬ２は、配列番号３のＣＤＲ配列を含み；ＶＨ２は配列番号４または５のＣＤＲ配列を含む。代替実施形態では、ＶＬ２は配列番号１のアミノ酸配列を含み；ＶＨ２は、配列番号２のアミノ酸配列を含み；ＶＬ１は、配列番号３のアミノ酸配列を含み；ＶＨ１は配列番号４または５のアミノ酸配列を含む。
【００９６】
一部の実施形態では、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体またはその抗原結合断片は、抗体の抗原結合ドメインの間にリンカーを含む。リンカーは、任意の種類のリンカー分子であってもよい。好ましくは、リンカーはポリペプチドである。リンカーは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの間で、およびその中で、等しいかまたは互いに異な
ってもよい。さらに、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸の長さであってもよい。軽鎖ドメインに関しての重鎖ドメインの好ましいペプチドリンカー単位は、（Ｇ４Ｓ）２、すなわちＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６）である。最も好ましくは、配列番号２および４は第１のペプチドリンカーによって連結され、配列番号１および３は第２のペプチドによって連結され、ここで、第１および第２のペプチドリンカーは配列番号６のアミノ酸配列を各々含む。重鎖および軽鎖のリンカー単位の数は、等しいか（対称的オーダー）または互いと異なってもよい（非対称的オーダー）。ペプチドリンカーは、好ましくは、適切なタンパク質折畳みを可能にするために、および必要に応じて、抗体分子を同じ細胞上の２つ以上のおそらく広く間隔のあいている受容体と交互作用させるために、抗原結合部分が、例えば立体障害によって互いの活性を妨害することを阻止するのに十分な柔軟度を提供するのに十分に長い。それでも、それは好ましくは、抗体部分を細胞内で安定であり続けさせるために十分短い。したがって、多価抗体の所望の特性を最適化するために、ペプチドリンカーの長さ、組成および／またはコンホメーションは、当業技術者が容易に選択することができる。
【００９７】
本発明の好ましい実施形態では、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体アイソタイプの例には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが含まれる。好ましくは、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体は、ＩｇＧ抗体である。ＩｇＧの４つの形がある。好ましくは、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体は、ＩｇＧ４抗体である。本発明のより好ましい実施形態では、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体は、ヒトＩｇＧ４抗体である。
【００９８】
一部の実施形態では、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体またはその抗原結合断片は、定常領域、例えばＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＬをさらに含む。
【００９９】
本発明の製剤のある特定の実施形態には、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体またはその抗原結合断片の変異体も含まれる。抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体の変異体は、それらの高い類似性に基づいて類似の物理化学的特性を有することができ、したがって本発明の範囲内に同じく含まれる。変異体は、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体と少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％または９９％相同性であり、ＩＬ−４および／もしくはＩＬ−１３ポリペプチド、ＩＬ−４および／もしくはＩＬ−１３ポリペプチド断片、またはＩＬ−４および／もしくはＩＬ−１３エピトープへの結合に関して競合することが可能であるアミノ酸配列を有する抗体と規定される。好ましくは、変異体は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３生物学的活性を改善、中性化、さもなければ抑制する。標的への結合に関する競合の判定は、当業者に公知である常套的方法によって実行することができる。好ましくは、変異体はヒトのまたはヒト化された抗体であり、好ましくはＩｇＧ４分子である。好ましい実施形態では、変異体は、配列番号２、４および５のアミノ酸配列を含むＩＬ−１３およびＩＬ−４の両方に結合する重鎖可変領域と、ならびに配列番号１および３のアミノ酸配列を含むＩＬ−１３およびＩＬ−４の両方に結合する軽鎖可変領域と、アミノ酸配列が少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。用語「変異体」とは、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体のアミノ酸配列と比較して１つまたはそれ以上のアミノ酸により変化したアミノ酸配列を含む抗体を指す。変異体は、アミノ酸置換、改変、付加、および欠失などの保存的配列改変を有してもよい。
【０１００】
改変の例としては、限定されるものではないが、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、および細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結が挙げられる。アミノ酸改変を、抗体をコードする核酸中での部位特異的突然変異誘発、分子クローニング、オリゴヌクレオチド
特異的突然変異誘発、および無作為ＰＣＲ媒介性突然変異誘発のような、当業界で公知の標準的な技術により導入することができる。保存的アミノ酸置換としては、アミノ酸残基が類似する構造的または化学的特性を有するアミノ酸残基で置きかえられたものが挙げられる。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業界で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ−分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）が挙げられる。上記で用いられたもの以外のアミノ酸残基ファミリーの分類を用いることもできることが当業者には明らかであろう。さらに、変異体は、非保存的アミノ酸置換、例えば、あるアミノ酸の、異なる構造的または化学的特性を有するアミノ酸残基による置きかえを有してもよい。類似する小さい変異はまた、アミノ酸欠失もしくは挿入、またはその両方を含んでもよい。どのアミノ酸残基を、免疫学的活性を無効化することなく置換する、改変する、挿入する、または欠失させることができるかを決定する際の指針を、当業界で周知のコンピュータプログラムを用いて見出すことができる。当業者には公知である、特にＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔのようなコンピュータアルゴリズムを用いて、比較しようとするアミノ酸配列を最適に整列させ、類似するか、または同一のアミノ酸残基を定義することができる。変異体は、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体と比較して、同じか、または異なる、より高いか、またはより低い結合親和性を有してもよいが、依然としてＩＬ−４および／またはＩＬ−１３に特異的に結合することができ、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体と同じであるか、より高いか、またはより低い生物活性を有してもよい。
【０１０１】
本発明の実施形態はまた、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体の抗原結合断片を含んでもよい。用語「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」、「抗原結合断片」および同様の用語は、抗原と相互作用し、結合剤に、抗原に対するその特異性および親和性を付与するアミノ酸残基を含む抗体の部分（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ））を指す。抗原結合領域は、げっ歯類（例えば、ウサギ、ラットまたはハムスター）およびヒトのような任意の動物種に由来することができる。好ましくは、抗原結合領域は、ヒト起源のものである。抗原結合断片の非限定例としては：Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、ｄＡｂ断片、および抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位が挙げられる。
【０１０２】
本発明の好ましい実施形態においては、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体（またはその変異体またはその抗原結合断片）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＩＬ−４および／またはＩＬ−１３生物活性を改善する、中和する、またはさもなければ阻害する。
【０１０３】
本発明の好ましい実施形態においては、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体（またはその変異体またはその抗原結合断片）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＩＬ−４および／またはＩＬ−１３生物活性を改善する、中和する、またはさもなければ阻害するアンタゴニスト抗体である。
【０１０４】
配列番号２および４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号１および３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体を含む、ＩＬ−１３およびＩＬ−４の両方に結合する、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体またはその変異体もしくは断片の同定、単離、調製および特徴付けは、参照により本明細書に組み入れられるＰＣＴ公開ＷＯ２００９／０５２０８１に詳細に記載されている。
【０１０５】
好ましくは、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体（またはその変異体もしくはその抗原結合断片）は、約５ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬ、例えば約５０ｍｇ／ｍＬから約１５０ｍｇ／ｍＬ、約７５ｍｇ／ｍＬから約１２５ｍｇ／ｍＬおよび約１００ｍｇ／ｍＬの量で製剤中に存在する。あるいは、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体（またはその変異体もしくはその抗原結合断片）は、約５ｍｇ／ｍＬから約６５ｍｇ／ｍＬ、約６６ｍｇ／ｍＬから約１３０ｍｇ／ｍＬ、約１３１ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬの量で製剤中に存在する。例えば、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体は、約５ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約４５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約５５ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約６５ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ、約７５ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約８５ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ、約９５ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１０５ｍｇ／ｍＬ、約１１０ｍｇ／ｍＬ、約１１５ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ、約１２５ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍＬ、約１３５ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ、約１４５ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１５５ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ、約１６５ｍｇ／ｍＬ、約１７０ｍｇ／ｍＬ、約１７５ｍｇ／ｍＬ、約１８０ｍｇ／ｍＬ、約１８５ｍｇ／ｍＬ、約１９０ｍｇ／ｍＬ、約１９５ｍｇ／ｍＬ、または約２００ｍｇ／ｍＬの量で製剤中に存在してもよい。
【０１０６】
ある例示的実施形態においては、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体は、約１００ｍｇ／ｍＬの量で存在する。別の例示的な実施形態では、配列番号２および４または２および５のアミノ酸配列を含むＩＬ−１３およびＩＬ−４の両方に結合する重鎖可変領域、ならびに配列番号１および３のアミノ酸配列を含むＩＬ−１３およびＩＬ−４の両方に結合する軽鎖可変領域を含むヒト化ＩｇＧ４抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体は、約１００ｍｇ／ｍＬの量で製剤中に存在する。
【０１０７】
ｉｉ．バッファー、バッファー系、イオン強度およびｐＨ
バッファーは、生理的条件に近似した範囲に製剤のｐＨを維持するのを助ける。バッファーは、好ましくは約１ｍＭから約５０ｍＭまでの範囲内の濃度で製剤中に存在する。本発明での使用に適するバッファーには、有機および無機の酸ならびにその塩、例えばクエン酸バッファー（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合液、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合液、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合液など）、コハク酸バッファー（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合液、コハク酸−水酸化ナトリウム混合液、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合液など）、酒石酸バッファー（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合液、酒石酸−酒石酸カリウム混合液、酒石酸−水酸化ナトリウム混合液など）、フマル酸バッファー（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合液、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合液、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合液など）、グルコン酸バッファー（例えば、グルコン酸−グリコン酸ナトリウム混合液、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合液、グルコン酸−グリコン酸カリウム混合液など）、シュウ酸バッファー（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合液、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合液、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合液など）、乳酸バッファー（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合液、乳酸−水酸化ナトリウム混合液、乳酸−乳酸カリウム混合液など）および酢酸バッファー（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合液、酢酸−水酸化ナトリウム混合液など）が含まれる。リン酸バッファー、炭酸バッファー、ヒスチジンバッファー、トリメチルアミン塩、例えばＴｒｉｓ、ＨＥＰＥＳおよび他のそのような公知のバッファーも好適であり、使用することができる。好ましくは、本発明の製剤では、バッファーの組合せ、すなわち２つ以上のバッファーが使用される。２つ以上のバッファーの組合せは、本明細書においてバッファー系と呼ばれる。
【０１０８】
本発明の製剤は、バッファー系を含む。バッファー系は、生理的に好適なｐＨを維持す
る。さらに、バッファー系は、製剤の等張性および化学的安定性の達成に関与する。二特異的抗体のために安定な抗体製剤を開発することが困難なために、２つ以上のバッファーの利点を利用するために組み合わせたバッファー系を使用することが好ましい。２つ以上のバッファーの利点を組み合わせることによって、より安定な抗体製剤を開発することができる。
【０１０９】
好ましくは、バッファー系は、約１ｍＭから約５０ｍＭ、例えば約５ｍＭから約２５ｍＭ、約５ｍＭから約１５ｍＭまたは約１０ｍＭの濃度で製剤中に存在する。あるいは、バッファー系は、約１ｍＭから約１５ｍＭ、約１６から約３０ｍＭ、約３１から約４５ｍＭまたは約４６ｍＭから約５０ｍＭの濃度で製剤中に存在する。例えば、バッファー系は、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭ、約３０ｍＭ、約３１ｍＭ、約３２ｍＭ、約３３ｍＭ、約３４ｍＭ、約３５ｍＭ、約３６ｍＭ、約３７ｍＭ、約３８ｍＭ、約３９ｍＭ、約４０ｍＭ、約４１ｍＭ、約４２ｍＭ、約４３ｍＭ、約４４ｍＭ、約４５ｍＭ、約４６ｍＭ、約４７ｍＭ、約４８ｍＭ、約４９ｍＭ、および約５０ｍＭの濃度で製剤中に存在してもよい。より好ましくは、バッファー系は約５ｍＭから約１５ｍＭ、さらにより好ましくは約８ｍＭから約１２ｍＭの濃度で製剤中に存在する。最も好ましい実施形態では、バッファー系は、約１０ｍＭの濃度で存在する。
【０１１０】
好ましくは、バッファー系は、Ｔｒｉｓバッファーおよびリン酸バッファーを含む。好ましくは、Ｔｒｉｓバッファーは、約１から約５ｍＭの濃度で製剤中に存在する。例えば、Ｔｒｉｓバッファーは、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭまたは約５ｍＭの濃度で製剤中に存在することができる。より好ましくは、Ｔｒｉｓバッファーは約２ｍＭから約４ｍＭ、さらにより好ましくは約３ｍＭから約４ｍＭの濃度で製剤中に存在する。最も好ましい実施形態では、Ｔｒｉｓバッファーは約３．７ｍＭの濃度で存在する。
【０１１１】
好ましくは、リン酸バッファーは、約１から約１０ｍＭの濃度で製剤中に存在する。例えば、リン酸バッファーは、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭまたは約１０ｍＭの濃度で製剤中に存在することができる。より好ましくは、リン酸バッファーは、約３ｍＭから約８ｍＭ、さらにより好ましくは約５ｍＭから約７ｍＭの濃度で製剤中に存在する。最も好ましい実施形態では、リン酸バッファーは、約６．３ｍＭの濃度で存在する。
【０１１２】
本発明の最も好ましい実施形態では、バッファー系は、約３．７ｍＭの濃度のＴｒｉｓバッファーおよび約６．３ｍＭの濃度のリン酸バッファーを含む。バッファー系でのＴｒｉｓバッファーおよびリン酸バッファーのこの組合せは非常に珍しく、当技術分野で公知でない。
【０１１３】
製剤のイオン強度を下げるために、バッファー系は製剤中に低い濃度、すなわち約１５ｍＭ以下で存在することも好ましい。これは、製剤のイオン強度が増加するにつれて、抗体の凝集の動態が増加するという事実による。製剤の安定性を改善するために、抗体の凝集および／または抗体の凝集速度を低減することが必要である。
【０１１４】
ある実施形態においては、本発明の製剤は、約ｐＨ７のｐＨを有する。好ましくは、製剤のｐＨは、約５．０〜約８．０の範囲である。例えば、製剤のｐＨは、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６
．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、および約８．０であってもよい。より好ましくは、製剤のｐＨは、約６．５から約７．５の範囲内であってよい。最も好ましい実施形態では、ｐＨは約７．０である。製剤のｐＨが約７であるときに、製剤は、眼に見える粒子、眼に見えない粒子、低分子量タンパク質および高分子量タンパク質に関して優れた安定性を示す。製剤のｐＨは、当業者に公知である任意の手段によって測定することができる。ｐＨを測定するための好ましい手段は、微小電極を含むｐＨメーターを用いることである。製剤のｐＨを、当業界で公知の任意の手段を用いて調整することができる。製剤のｐＨを変化させるための好ましい化学物質は、塩酸（ＨＣｌ）および水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）である。
【０１１５】
ある実施形態においては、本発明の製剤は、抗体の等電点（ｐＩ）超のｐＨを有する。等電点は、特定の分子または表面が正味の電荷を担持しないｐＨである。二特異的抗体のｐＩを、当業者には公知の任意の手段により決定することができる。好ましくは、二特異的抗体のｐＩは、変性等電点電気泳動により決定される。配列番号２および４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号１および３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体のｐＩは、５．８〜６．２である。
【０１１６】
ｉｉｉ．非イオン性界面活性剤
本発明の製剤は、場合により、非イオン性界面活性剤をさらに含んでもよい。界面活性剤は、製剤中の生物分子および／または一般的な医薬添加剤を安定化する化学化合物である。界面活性剤は一般に、空気／溶液境界面で誘導されるストレスおよび溶液／表面で誘導されるストレスから分子および添加剤を保護し、そうでなければ分子の凝集をもたらし得る。界面活性剤は、眼に見える粒子および眼に見えない粒子形成も阻止する。
【０１１７】
好ましくは、非イオン性界面活性剤は、約０．０１％から約１％（ｗ／ｖ）、例えば約０．０１％から約０．５％、約０．０１％から約０．３％または約０．０１％から約０．２％の濃度で製剤中に存在する。あるいは、非イオン性界面活性剤は、約０．０１％から約０．０５％（ｗ／ｖ）、約０．０６％から約０．１０％（ｗ／ｖ）、約０．１１％から約０．１５％（ｗ／ｖ）、約０．１６％から約０．２０％（ｗ／ｖ）、約０．２０％から約０．３０％（ｗ／ｖ）、約０．３０％から約０．４０％（ｗ／ｖ）、約０．４０％から約０．５０％（ｗ／ｖ）、約０．５０％から約０．６０％（ｗ／ｖ）、約０．６０％から約０．７０％（ｗ／ｖ）、約０．７０％から約０．８０％（ｗ／ｖ）、約０．８０％から約０．９０％（ｗ／ｖ）または約０．９０％から約１．０％（ｗ／ｖ）の濃度で製剤中に存在する。例えば、非イオン性界面活性剤は、約０．０１％（ｗ／ｖ）、約０．０２％（ｗ／ｖ）、約０．０３％（ｗ／ｖ）、約０．０４％（ｗ／ｖ）、約０．０５％（ｗ／ｖ）、約０．０６％（ｗ／ｖ）、約０．０７％（ｗ／ｖ）、約０．０８％（ｗ／ｖ）、約０．０９％（ｗ／ｖ）、約０．１％（ｗ／ｖ）、約０．２％（ｗ／ｖ）、約０．３％（ｗ／ｖ）、約０．４％（ｗ／ｖ）、約０．５％（ｗ／ｖ）、約０．６％（ｗ／ｖ）、約０．７％（ｗ／ｖ）、約０．８％（ｗ／ｖ）、約０．９％（ｗ／ｖ）および約１％（ｗ／ｖ）の量で製剤中に存在することができる。特定の実施形態では、非イオン性界面活性剤は、約０．０５％から約０．２％（ｗ／ｖ）で製剤中に存在する。
【０１１８】
界面活性剤の例には、限定されずに、ポリソルベート、グリセリン、ジカルボン酸、シュウ酸、コハク酸、フマル酸、フタル酸およびその組合せが含まれる。それらが薬学的に許容される、すなわち対象への投与に適する限り、他の非イオン性界面活性剤が使用できることを当業者は承知する。非イオン性界面活性剤は、好ましくはポリソルベートである。ポリソルベートの例には、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５およびポリソルベート８０が含まれる。最も好ましくは、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０である。
【０１１９】
例示的な実施形態では、ポリソルベート８０は、約０．０１％から約１％（ｗ／ｖ）の量で製剤中に存在する。例えば、ポリソルベート８０は、約０．０１％（ｗ／ｖ）、約０．０２％（ｗ／ｖ）、約０．０３％（ｗ／ｖ）、約０．０４％（ｗ／ｖ）、約０．０５％（ｗ／ｖ）、約０．０６％（ｗ／ｖ）、約０．０７％（ｗ／ｖ）、約０．０８％（ｗ／ｖ）、約０．０９％（ｗ／ｖ）、約０．１％（ｗ／ｖ）、約０．２％（ｗ／ｖ）、約０．３％（ｗ／ｖ）、約０．４％（ｗ／ｖ）、約０．５％（ｗ／ｖ）、約０．６％（ｗ／ｖ）、約０．７％（ｗ／ｖ）、約０．８％（ｗ／ｖ）、約０．９％（ｗ／ｖ）および約１％（ｗ／ｖ）の量で製剤中に存在することができる。特定の実施形態では、ポリソルベート８０は、約０．０３％から約０．２％（ｗ／ｖ）で製剤中に存在する。例えば、ポリソルベート８０は、約０．０１％から約１％（ｗ／ｖ）、約０．０２％から約０．５％（ｗ／ｖ）および約０．０３％から約０．２％（ｗ／ｖ）の量で存在することができる。本発明の最も好ましい実施形態では、ポリソルベート８０は、０．２％（ｗ／ｖ）の量で製剤中に存在する。
【０１２０】
ｉｖ．糖
本発明の製剤は、場合により糖をさらに含むことができる。一般的に、糖は高分子量タンパク質のための安定化剤として、または凍結保護物質として、または凍結乾燥保護剤として使用される。
【０１２１】
好ましくは、糖は、約１％から約１０％（ｗ／ｖ）、例えば約２％から約８％（ｗ／ｖ）、約３％から約７％（ｗ／ｖ）、約４％から約６％（ｗ／ｖ）または約５％（ｗ／ｖ）の濃度で製剤中に存在する。あるいは、糖は、約１％から約３％（ｗ／ｖ）、約３％から約６％（ｗ／ｖ）または約６％から約１０％（ｗ／ｖ）の濃度で製剤中に存在する。例えば、糖は、約１％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３％（ｗ／ｖ）、約４％（ｗ／ｖ）、約５％（ｗ／ｖ）、約６％（ｗ／ｖ）、約７％（ｗ／ｖ）、約８％（ｗ／ｖ）、約９％（ｗ／ｖ）または約１０％（ｗ／ｖ）の量で製剤中に存在することができる。特定の実施形態では、糖は、約３％から約７％（ｗ／ｖ）、より好ましくは約５％で製剤中に存在する。
【０１２２】
糖の例には、限定されずに、単糖、二糖および多糖が含まれる。サッカライドの例には、グルコース、スクロース、マルトース、トレハロース、ブドウ糖、キシリトール、フルクトースおよびマンニトールが含まれる。それらが薬学的に許容される、すなわち対象への投与に適する限り、他の糖が使用できることを当業者は承知する。好ましくは、糖は二糖である。より好ましくは、糖はスクロースである。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、スクロースは、約１％から１０％（ｗ／ｖ）の量で製剤中に存在する。例えば、スクロースは、約１％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３％（ｗ／ｖ）、約４％（ｗ／ｖ）、約５％（ｗ／ｖ）、約６％（ｗ／ｖ）、約７％（ｗ／ｖ）、約８％（ｗ／ｖ）、約９％（ｗ／ｖ）または約１０％（ｗ／ｖ）の量で製剤中に存在することができる。好ましくは、スクロースは、約３％から約７％（ｗ／ｖ）または約４％から約６％（ｗ／ｖ）の量で存在することができる。最も好ましくは、スクロースは、約５％（ｗ／ｖ）の量で製剤中に存在する。
【０１２４】
ｖ．非イオン性安定化剤
本発明の製剤は、場合によっては非イオン性安定化剤をさらに含むことができる。安定化剤は、増量剤から治療剤を可溶化するまたは変性もしくは容器壁への接着を阻止するのを助ける添加剤まで、機能が様々である広いカテゴリーの賦形剤を指す。安定化剤は、高分子量タンパク質の形成を最小にもする。
【０１２５】
好ましくは、非イオン性安定化剤は、約１％から約１０％（ｗ／ｖ）、例えば約２％から約８％（ｗ／ｖ）、約２％から約５％（ｗ／ｖ）、約２％から約４％（ｗ／ｖ）または約３％（ｗ／ｖ）の濃度で製剤中に存在する。あるいは、非イオン性安定化剤は、約１％から約２％（ｗ／ｖ）、約２％から約４％（ｗ／ｖ）、約４％から約６％（ｗ／ｖ）、約６％から約８％（ｗ／ｖ）または約８％から約１０％（ｗ／ｖ）の濃度で製剤中に存在する。例えば、非イオン性安定化剤は、約１％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３％（ｗ／ｖ）、約４％（ｗ／ｖ）、約５％（ｗ／ｖ）、約６％（ｗ／ｖ）、約７％（ｗ／ｖ）、約８％（ｗ／ｖ）、約９％（ｗ／ｖ）または約１０％（ｗ／ｖ）の量で製剤中に存在することができる。特定の実施形態では、非イオン性安定化剤は、約１％から約５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは約１％から約３％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは約３％（ｗ／ｖ）で製剤中に存在する。
【０１２６】
安定化剤の例には、限定されずに、多価の糖アルコール；アミノ酸、例えばプロリン、アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニンなど；有機糖または糖アルコール、例えばラクトース、トレハロース、スタキオース、アラビトール、エリスリトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセリンなど、例えばイノシトールなどのシクリトール；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；含硫黄還元剤、例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセリン、α−モノチオグリセリンおよびチオ硫酸ナトリウム；低分子量ポリペプチド（すなわち、１０未満の残基）；タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、サッカライド、単糖、例えばキシロース、マンノース、フルクトース、グルコース；二糖、例えばラクトース、マルトースおよびスクロース；ラフィノースなどの三糖；デキストランなどの多糖、その他が含まれる。それらが薬学的に許容される、すなわち対象への投与に適する限り、他の非イオン性安定化剤が使用できることを当業者は承知する。好ましくは、非イオン性安定化剤は、アミノ酸である。より好ましくは、非イオン性安定化剤は、プロリンまたはグリシンである。最も好ましくは、非イオン性安定化剤は、プロリンである。あるいは、非イオン性安定化剤は、マンニトールである。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、プロリンは、約１％から１０％（ｗ／ｖ）の量で製剤中に存在する。例えば、プロリンは、約１％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３％（ｗ／ｖ）、約４％（ｗ／ｖ）、約５％（ｗ／ｖ）、約６％（ｗ／ｖ）、約７％（ｗ／ｖ）、約８％（ｗ／ｖ）、約９％（ｗ／ｖ）または約１０％（ｗ／ｖ）の量で製剤中に存在することができる。好ましくは、プロリンは、約１％から約５％（ｗ／ｖ）または約１％から約３％（ｗ／ｖ）の量で存在することができる。最も好ましくは、プロリンは、約３％（ｗ／ｖ）の量で製剤中に存在する。
【０１２８】
ある特定の代替の実施形態では、マンニトールは、約１％から１０％（ｗ／ｖ）の量で製剤中に存在する。例えば、マンニトールは、約１％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３％（ｗ／ｖ）、約４％（ｗ／ｖ）、約５％（ｗ／ｖ）、約６％（ｗ／ｖ）、約７％（ｗ／ｖ）、約８％（ｗ／ｖ）、約９％（ｗ／ｖ）または約１０％（ｗ／ｖ）の量で製剤中に存在することができる。好ましくは、マンニトールは、約１％から約５％（ｗ／ｖ）または約１％から約３％（ｗ／ｖ）の量で存在することができる。最も好ましくは、マンニトールは、約３％（ｗ／ｖ）の量で製剤中に存在する。
【０１２９】
ｖ．他の賦形剤
さらに、本発明の製剤は、場合により、限定されずに注射用水、希釈剤、可溶化剤、無痛化薬、追加のバッファー、無機または有機の塩、抗酸化剤、保存剤、増量剤、キレート
化剤、張性剤その他を含む、他の賦形剤をさらに含むことができる。しかしながら、好ましくは、本発明の製剤は、上記のもの以外の他の添加剤を含まない。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．（編）（１９８０）に記載のもののような、他の薬学的に許容される担体、添加剤、または安定剤が製剤の所望の特性に有害に影響しないという条件で、それらを製剤中に含有させることができる。特定の実施形態においては、製剤は保存剤を実質的に含まないが、代替的な実施形態においては、必要に応じて保存剤を添加してもよい。例えば、凍結防止剤またはリオプロテクタントを、凍結乾燥製剤中に含有させることができる。
【０１３０】
ｖｉ．液体または凍結乾燥製剤
本発明の製剤は、液体製剤または凍結乾燥製剤であってもよい。好ましくは、製剤は液体製剤である。より好ましくは、液体製剤は、すぐに注射できる。あるいは、製剤は凍結乾燥粉末であってもよい。好ましくは、凍結乾燥粉末は、投与の直前に溶媒とすぐに混合される。
【０１３１】
ｖｉｉ．製剤例
本発明の１つの例示的な実施形態では、本発明は、皮下投与に適する液体抗体製剤であって、
配列番号２および４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号１および３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、約１００ｍｇ／ｍＬの二特異的抗体またはその抗原結合断片；
約３．７ｍＭのＴｒｉｓバッファー濃度および約６．３ｍＭのリン酸バッファー濃度を含む、約１０ｍＭのバッファー系；
約０．２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０；
約５％（ｗ／ｖ）スクロース；ならびに
約３％（ｗ／ｖ）プロリン
を含み、製剤のｐＨは約ｐＨ７である、前記液体抗体製剤を提供する。
【０１３２】
本発明の別の例示的な実施形態では、本発明は、皮下投与に適する液体抗体製剤であって、
配列番号２および４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号１および３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、約１００ｍｇ／ｍＬの二特異的抗体またはその抗原結合断片；
約３．７ｍＭのＴｒｉｓバッファー濃度および約６．３ｍＭのリン酸バッファー濃度を含む、約１０ｍＭのバッファー系；
約０．２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０；
約５％（ｗ／ｖ）スクロース；ならびに
約３％（ｗ／ｖ）マンニトール
を含み、製剤のｐＨは約ｐＨ７である、前記液体抗体製剤を提供する。
【０１３３】
本発明の代替の例示的な実施形態では、本発明は、皮下投与に適する安定な凍結乾燥抗体製剤であって、
配列番号２および４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号１および３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、約１００ｍｇ／ｍＬの二特異的抗体またはその抗原結合断片；
約３．７ｍＭのＴｒｉｓバッファー濃度および約６．３ｍＭのリン酸バッファー濃度を含む、約１０ｍＭのバッファー系；
約０．２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０；
約５％（ｗ／ｖ）スクロース；ならびに
約３％（ｗ／ｖ）プロリン
を含み、製剤のｐＨは約ｐＨ７である、前記凍結乾燥抗体製剤を提供する。
【０１３４】
本発明の別の代替の例示的な実施形態では、本発明は、皮下投与に適する安定な凍結乾燥抗体製剤であって、
配列番号２および４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号１および３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、約１００ｍｇ／ｍＬの二特異的抗体またはその抗原結合断片；
約３．７ｍＭのＴｒｉｓバッファー濃度および約６．３ｍＭのリン酸バッファー濃度を含む、約１０ｍＭのバッファー系；
約０．２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０；
約５％（ｗ／ｖ）スクロース；ならびに
約３％（ｗ／ｖ）マンニトール
を含み、製剤のｐＨは約ｐＨ７である、前記凍結乾燥抗体製剤を提供する。
【０１３５】
ｖｉｉ．安定性
本発明の製剤は、２〜８℃で、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６カ月以上にわたって安定である。例示的実施形態においては、それらは２〜８℃で、少なくとも約６カ月以上にわたって安定である。他の例示的実施形態においては、それらは２〜８℃で、少なくとも約９カ月にわたって安定である。さらなる例示的実施形態においては、それらは２〜８℃で、少なくとも約１年以上、より好ましくは約２年、さらにより好ましくは約３年にわたって安定である。
【０１３６】
Ｃ．投与様式
本発明のある実施形態においては、製剤は、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、またはその組合せにとって好適である。本発明の製剤は、様々な技術による送達にとって好適である。本発明の好ましい実施形態においては、製剤は皮下投与される。例えば、１００ｍｇ／ｍＬの抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体を含有する製剤を皮下投与するのが好ましい。したがって、製剤は、好ましくは滅菌される。無菌製剤を作製するための方法は当業界で周知であり、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過または約１２０℃で約３０分間の抗体を除く製剤の構成成分のオートクレーブが挙げられる。
【０１３７】
Ｄ．用量および剤形
本発明の製剤の有効用量は、投与手段、標的部位、対象の生理的状態、対象がヒトまたは動物であるかどうか、投与される他の薬剤、および処置が予防的なものであるか、または治療的なものであるかなどの、多くの様々な因子に応じて変化する。通常、対象はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物などの非ヒト哺乳動物を処置することもできる。処置用量は安全性および効能を最適化するために滴定する必要がある。好ましくは、用量範囲は１００〜２００ｍｇ／バイアルである。
【０１３８】
本発明の製剤を、複数回投与することができる。単回投与間の間隔は、１日、１週間、２週間、１カ月または１年であってもよい。間隔は不規則であってもよい。いくつかの方法においては、用量を、抗体のような結合剤の特定の血漿濃度を達成するために調整する。用量および頻度は、対象中での、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体の半減期に応じて変化するであろう。一般に、ヒト抗体は、最も長い半減期を示し、次いで、ヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体と続く。
【０１３９】
さらなる実施形態においては、本発明は、対象への剤形の投与による対象における１つまたはそれ以上の疾患の処置のための、治療上有効量の本発明の製剤を含む医薬単位剤形
を提供する。好ましい実施形態においては、対象はヒトである。ヒトは、成人または幼児であってもよい。用語「医薬単位剤形」とは、それぞれの単位が、必要とされるクエン酸バッファーおよびｐＨと関連して所望の治療／予防効果をもたらすと算出された所定量の活性化合物を含有する、処置しようとする対象のための単位用量として好適な物理的に別々の単位を指す。
【０１４０】
単位剤形は、製剤を含む容器であってもよい。好適な容器としては、限定されるものではないが、密封されたアンプル、バイアル、ボトル、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックのような様々な材料から形成されたものであってよく、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパを有するバイアルであってもよい）。好ましい実施形態においては、容器はバイアルである。一般に、容器は、製剤の無菌性および安定性を維持するべきである。
【０１４１】
特定の実施形態においては、製剤は、透明な無色のＩ型ガラス製の７、１０、１５または２０ｍＬのバイアル中に包装され、フランジ（ポリプロピレン）を備えたフリップオフキャップで密封されたストッパ（フルオロポリマー被覆ブロモブチル）で密閉される。
【０１４２】
特定の実施形態においては、製剤は、バイアルを光から保護するカードボードボックスのような容器中に二次的に包装される。
【０１４３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために用いられる製剤は、無菌でなければならない。それは、例えば、濾過滅菌膜を通す濾過によって達成することができる。例えば、本発明の液体製剤は、０．２μｍまたは０．２２μｍフィルターを用いる濾過によって滅菌することができる。
【０１４４】
Ｅ．処置方法
対象に本発明の製剤を投与することを含む、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３媒介性疾患または障害を処置するための方法が、本明細書でさらに提供される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３によって媒介される疾患は、がん、炎症、自己免疫性疾患、感染症、心血管疾患、呼吸器疾患、神経学的疾患および代謝疾患である。
【０１４５】
本発明の製剤は、アレルギー性疾患、Ｔｈ２媒介疾患、ＩＬ−１３媒介疾患、ＩＬ−４媒介疾患および／またはＩＬ−４／ＩＬ−１３媒介疾患などの疾患を処置、抑制または防止するために使用することができる。そのような疾患の例には、ホジキン病、喘息、アレルギー性喘息、アトピー皮膚炎、アトピー性アレルギー、潰瘍性大腸炎、強皮症、アレルギー性鼻炎、ＣＯＰＤ３特発性肺線維症、慢性移植片拒絶、ブレオマイシン誘導肺線維症、放射線障害性肺線維症、肺肉芽腫、進行性全身性硬化、住血吸虫病、肝線維症、腎臓がん、バーキットリンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、セーザリー症候群、喘息、敗血性関節炎、疱疹状皮膚炎、慢性特発性のじんま疹、潰瘍性大腸炎、強皮症、肥大性瘢痕化、ホイップル病、前立腺肥大、ＩＬ−４受容体が役割を果たす肺障害、ＩＬ−４受容体媒介上皮障壁破壊が役割を果たす状態、ＩＬ−４受容体が役割を果たす消化器系の障害、医薬へのアレルギー性反応、川崎病、鎌状赤血球症、チャーグ−ストラウス症候群、グレーブス病、子癇前症、シェーグレン症候群、自己免疫性リンパ球増殖症候群、自己免疫性溶血性貧血、バーレットの食道、自己免疫性ブドウ膜炎、結核、嚢胞性線維症、アレルギー性気管支肺真菌症、慢性閉塞性肺疾患、ブレオマイシンによって誘導される肺障害および線維症、肺胞タンパク症、成体呼吸窮迫症候群、サルコイドーシス、高ＩｇＥ症候群、特発性好酸球増加症候群、自己免疫性ブリスタリング疾患、尋常天疱瘡、水疱性類天疱瘡、重症筋無力症、慢性疲労症候群、ネフローゼが含まれる。
【０１４６】
用語「アレルギー性疾患」は、通常は非免疫原性である物質に対して患者が過剰感作し、免疫反応を開始する病態を指す。アレルギー性疾患は、鼻水のように良性の症状から生命にかかわるアナフィラキシーショックおよび死亡をもたらすことができる、炎症性応答（例えば、局所応答、全身応答）をもたらすＩｇＥによる肥満細胞の活性化によって一般に特徴付けられる。アレルギー性疾患の例には、限定されずに、アレルギー性鼻炎（例えば、花粉症）、喘息（例えば、アレルギー性喘息）、アレルギー性皮膚炎（例えば、湿疹）、接触性皮膚炎、食物アレルギーおよびじんま疹（発疹）が含まれる。
【０１４７】
用語「Ｔｈ２媒介疾患」は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９およびＩＬ−１３を特徴的に生成するＣＤ４＋  Ｔｈ２  Ｔリンパ球によって調節される免疫応答（Ｔｈ２型免疫応答）によって病状が生成される（全部または一部）疾患を指す。Ｔｈ２型免疫応答は、ある特定のサイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１３）および抗体のある特定のクラス（例えば、ＩｇＥ）の生成に関連し、液性免疫に関連する。Ｔｈ２媒介疾患はＴｈ２サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１３）および／または抗体のある特定のクラス（例えば、ＩｇＥ）の高いレベルの存在によって特徴付けられ、例には、アレルギー性疾患（例えば、アレルギー性鼻炎、アトピー皮膚炎、喘息（例えば、アトピー性喘息）、アレルギー性気道疾患（ＡＡＤ）、アナフィラキシーショック、結膜炎）、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の高いレベルに関連した自己免疫性障害（例えば、慢性関節リウマチ、宿主対移植片疾患、腎疾患（例えば、腎炎症候群、狼瘡性腎炎））、ならびにＩＬ−４および／またはＩＬ−１３の高いレベルに関連した感染症（例えば、ウイルス性、寄生性、真菌性（例えば、カンジダアルビカンス（C. albicans））の感染症）が含まれる。ある特
定のがんは、ＩＬ−４および／もしくはＩＬ−１３の高いレベルと関連し、またはＩＬ−４誘導および／もしくはＩＬ−１３誘導がん細胞増殖と関連する（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、頭けい部がん、乳がんおよび卵巣がん）。これらのがんは、本発明の製剤を用いて処置、抑制または防止することができる。
【０１４８】
用語「がん」は、哺乳動物、特にヒトにおける、無秩序な細胞増殖によって一般的に特徴付けられる生理的状態を指すかまたは記載する。がんの例には、限定されずに、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病が含まれる。
【０１４９】
用語「自己免疫性疾患」は、個体自身の組織から発生するおよびそれに向けられる、非悪性の疾患または障害を指す。自己免疫性の疾患または障害の例には、限定されずに、乾癬および皮膚炎を含む炎症性皮膚疾患などの炎症性応答；湿疹および喘息などのアレルギー性の状態；Ｔ細胞の浸潤および慢性炎症性応答を含む他の状態；アテローム硬化症；真性糖尿病（例えばＩ型糖尿病またはインスリン依存型糖尿病）；多発性硬化症ならびに中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性障害が含まれる。
【０１５０】
ある実施形態においては、本発明の製剤を、１つまたはそれ以上の治療（例えば、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３媒介性疾患を防止、処置、管理、および／または改善するために現在投与されている本発明の製剤ではない治療）と共に投与することができる。用語「と共に」の使用は、治療を対象に投与する順序を限定するものではない。第１の治療を、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３媒介性疾患を有していた、有する、またはそれが疑われる対象への第２の治療の投与の前（例えば、１分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、もしくは１２週間）、それと同時、またはその後（例えば、１分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、もしくは１２週間）に投与することができる。任意のさらなる治療を、他のさらなる治療と共に任意の順序で投与することができる。本発明の抗体と共に投与することができる治療の非限定例としては、米国薬局方および／また
は米医薬品便覧に列挙された認可された抗炎症剤が挙げられる。
【０１５１】
Ｆ．キット
本発明のある実施形態は、本発明の製剤を含むキットを含む。キットは、薬学的に許容される添加剤を含む１つまたはそれ以上の容器をさらに含んでもよく、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料、例えば、フィルター、針およびシリンジなどを含んでもよい。例えば、適応症、使用、用量、製造、投与、禁忌、および／または治療用、予防用もしくは診断用製品の使用に関する警告に関する情報を含有する、治療用、予防用または診断用製品の商業的包装中に慣用的に含まれる指示書を、キットに添付してもよい。
【実施例】
【０１５２】
本発明を例示するのを助けるために、以下の実施例が提供される。実施例は、いかなる意味でも本発明の範囲を制限することを意図するものではない。一般に、本発明の実施は、別途指摘しない限り、医薬製剤、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、抗体技術のような免疫学の従来の技術、ならびに例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第５１巻、Ｐａｕｌ  Ｓ．（編）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ、１６９）、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  Ｊ．ら（編）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９２）に記載されたポリペプチド調製の標準的な技術を用いる。
【０１５３】
実施例２〜６で使用する略記号は以下の通りである：
ＢＤ：バイオテクノロジー開発
ＢｓＡｂ：二特異的抗体
ＤＬＳ：動的光散乱
ＤｏＥ：実験計画法
ＤＰ：医薬品
ＤＳ：薬物
ＤＳＣ：示差走査熱量測定
ＦＣＭ：フローセル鏡検
ＦＤＳ：製剤化された薬物
ＦＴ−ＩＲ：フーリエ変換−赤外線
ＨＡＰ：ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー
ＨＤＰＥ：高密度ポリエチレン
ＨＭＷ：高分子量
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＩＥＦ：等電点電気泳動
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ
ＩＬ：インターロイキン
ｋＤａ：キロダルトン
ＬＭＷ：低分子量
Ｎｄ：判定されず
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール
ＰＥＳ：ポリエーテルスルホン
ＰＳ８０：ポリソルベート８０
ＰＶＤＦ：ポリビニリデンジフルオリド
ｒｐｍ：分あたりの回転数
ＳＣ：皮下
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィー
ＳＬＳ：静的光散乱
Ｓｑ：十分量
ＴＧＡ：熱重量分析
ＵＦ／ＤＦ：限外濾過／ダイアフィルトレーション
ＵＳＰ：米国薬局方
ＵＶ−Ｖｉｓ：紫外線−可視光
ｗ／ｖ：重量／容量
ＷＦＩ：注射用水
ＸＲＰＤ：粉末Ｘ線回折法
【０１５４】
最適な製剤条件を判定するために、以下の実施例では、配列番号２および４のアミノ酸配列を含むＩＬ−１３およびＩＬ−４の両方に結合する重鎖可変領域、ならびに配列番号１および３のアミノ酸配列を含むＩＬ−１３およびＩＬ−４の両方に結合する軽鎖可変領域を含む、ヒト化されたＩｇＧ４抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二特異的抗体（「リード抗体」）を使用した。
【０１５５】
以下の製剤研究（実施例２〜６）の目的は、溶液中の、および凍結乾燥状態でのリード抗体の行動を理解すること（すなわち、主要な分解経路を同定すること）、ならびにさらなる製剤開発のために、約１００ｍｇ／ｍＬのリード抗体に優れた安定性を提供する、適するバッファー−ｐＨ系および添加剤を判定することであった。
【０１５６】
以下は、実施例２〜６で使用した薬物を示す：
【０１５７】
ＨＡＰ精製工程（下流プロセシングの最終工程）後のリード抗体：
バッチ＃ＲＳＮ０１６９（研究＃Ｐ５からＰ６）
製剤バッファー：リン酸ナトリウムバッファー７５ｍＭ、ｐＨ６．７
濃度：１０．４ｍｇ／ｍＬ；
バッチ＃ＲＳＮ０１６９−ＳＺＷ３２０、３２６および３２７（研究＃Ｐ７からＰ１３）
製剤バッファー：リン酸ナトリウムバッファー５９ｍＭ、ｐＨ６．９
濃度：４．５ｍｇ／ｍＬ；
バッチ＃ＲＳＮ０１６９−ＳＺＷ  ３３０（研究＃Ｐ１４）
製剤バッファー：リン酸ナトリウムバッファー５５ｍＭ、ＮａＣｌ  ２０ｍＭ、ｐＨ６．８
濃度：４．４ｍｇ／ｍＬ；および
バッチ＃ＲＳＮ０１５２（研究＃Ｐ１５からＰ２１）
製剤バッファー：リン酸ナトリウムバッファー５５ｍＭ、ＮａＣｌ  ２０ｍＭ、ｐＨ６．８
濃度：３．９ｍｇ／ｍＬ。
【０１５８】
各製剤アッセイのために、水または最終バッファーでＵＦ／ＤＦの終わりにリード抗体濃度を調整し、次に濃縮したバッファーおよび添加剤溶液の適当な量で所望の最終製剤までさらに希釈した（詳細は表１を参照する）。
【０１５９】
【表１】
2019070025.tif 000007
【０１６０】
層流下で各製剤を濾過滅菌し（Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）ＧＶ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０．２２μｍ、ＰＶＤＦ）、ポリプロピレン管を使用した凍結／解凍研究を除いて、各安定性時点のために適宜分画をタイプ１ガラスバイアルに一定量注入した。
【０１６１】
実施例２〜６の製剤のために、機械的ストレスおよび熱的ストレス条件を判定した。
【０１６２】
製剤アッセイ＃Ｐ５−７に対する振盪ストレスの影響を評価するために、Ｒｏｔａ  Ｔｅｓｔ  ７４４０１を使用して室温で２〜１５時間、バイアルを３５０ｒｐｍで振盪し、その後分析した。
【０１６３】
製剤アッセイ＃Ｐ１２、１３、１６〜１８および２０に対する注射針通過ストレスの影響を評価するために、注射針通過の潜在的影響（すなわち、針の中の剪断ストレス）を小容量の試料が入手できたときはＨＰＬＣシリンジ（Ｕｎｉｍｅｔｒｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、１００μＬ）で、より大きな容量の試料が入手できたときはＴｅｒｕｍｏ  ２６Ｇ×１／２〜０．４５×１２ｍｍシリンジで評価した。
【０１６４】
製剤アッセイ＃Ｐ５−７および１３に対する熱的ストレスの影響を評価するために、バイアルを１および２週間の間４５℃に保存し、その後分析した。熱的ストレスに関連する温度は、ＤＳＣによって判定した。アッセイ＃Ｐ５−７および１３は、２週間の間５℃でも保存し、その後分析した。
【０１６５】
製剤アッセイ＃Ｐ１２、１５および２１に対する熱的ストレスの影響を評価するために、バイアルを３〜６週間の間５℃に保存し、毎週分析した。アッセイ＃Ｐ１６〜１８および２０のための製剤化薬物（ＦＤＳ）と呼ばれる凍結乾燥前の溶液は、４〜５週間の間５℃に保存し、毎週分析した。アッセイ＃Ｐ１４、１６〜１８および２０のための凍結乾燥後の再構成溶液は、２４時間５℃に保存し、その後分析した。
【０１６６】
実施例１−ｐＨ最適化
製剤開発過程で第１の工程は、リード抗体製剤の最適なｐＨを判定することであった。最適なｐＨを判定するために、最適なｐＨを判定するのにその低濃度のリード抗体が十分
だったので、低濃度のリード抗体を使用した（１００ｍｇ／ｍｌに対して１ｍｇ／ｍｌ）。表２は、この研究で試験した製剤を示す。
【０１６７】
【表２】
2019070025.tif 000008
【０１６８】
この研究では、製剤１はリード抗体のコンホメーション不安定性につながったので、安定でなかった。具体的には、リード抗体は、アンフォールドする傾向があった。さらに、製剤９はアミド分解につながった。したがって、リード抗体製剤の最適なｐＨは、ｐＨ７．０前後の狭い範囲内にあると判定された。
【０１６９】
バッファー、界面活性剤および安定化剤などの他の製剤パラメータの以降の研究には、リード抗体のより高い濃度が含まれた。これらの以降の研究は、高い濃度のリード抗体を使用したときの、リード抗体製剤の最適なｐＨに関する上記の結論を追認した。
【０１７０】
実施例２−バッファー系／イオン強度（塩）
バッファー
製剤開発過程での次の工程は、リード抗体製剤の最適なバッファーを判定することであった。いくつかの異なるアッセイにおいて、ヒスチジン、リン酸塩、Ｔｒｉｓおよびその組合せなどの、いくつかの異なるバッファーを試験した。
【０１７１】
【表３】
2019070025.tif 000009
【０１７２】
【表４】
2019070025.tif 000010
【０１７３】
【表５】
2019070025.tif 000011
【０１７４】
【表６】
2019070025.tif 000012
【０１７５】
処理および製剤混合の結果、濾過製剤アッセイおよび対照は、眼に見える粒子および眼に見えない粒子を含まず、ＳＥＣ分析は、５．５％のＨＭＷを含有する出発ＤＳのために≦９２．０％の純度を示した。
【０１７６】
ＤＳＣによって得られた開始および変性温度は、以下のバッファー−ｐＨ系のより優れた熱的安定性を示した：
・リン酸塩ｐＨ６．５および７．０：＃Ｐ５−５、Ｐ５−６、Ｐ６−２、Ｐ６−３
・ＴｒｉｓｐＨ７．０および７．５：＃Ｐ６−５、Ｐ６−６
その開始温度は、例えば、ｐＨ４．５の４８℃およびヒスチジンバッファーの５９℃と比較して、６１℃前後であった。
【０１７７】
ＳＬＳによって得られたコロイド安定性は、以下のバッファー−ｐＨ系のより優れた安定性を示した：
・リン酸塩ｐＨ７．５：＃Ｐ６−４
・ＴｒｉｓｐＨ７．０および７．５：＃Ｐ６−５、Ｐ６−６
その第２のビリアル係数は、例えば、ヒスチジンバッファーの０．４  １０−４ｍＬ．ｍｏｌ／ｇ２およびリン酸塩ｐＨ７．０バッファーの１．５  １０−４ｍＬ．ｍｏｌ／ｇ２と比較して約３．０  １０−４ｍＬ．ｍｏｌ／ｇ２近くであった。
【０１７８】
１時間３０分の振盪ストレス後に、異なるレベルの粒子汚染が観察された（図３を参照する）。
【０１７９】
眼に見える粒子に関して、アッセイ＃Ｐ５の優れた安定性を示すバッファー−ｐＨ系候補は、以下の通りだった：
・リン酸塩ｐＨ６．５、７．０および７．５：＃Ｐ５−５、Ｐ５−６およびＰ５−７
・ＴｒｉｓｐＨ８．０および８．５：＃Ｐ５−８およびＰ５−９
【０１８０】
６．５から７．５の間のｐＨを有するこれら２つのバッファー系のために、アッセイ＃６を実施した。最良の安定性を示す候補は、以下の通りだった：
・リン酸塩ｐＨ７．０および７．５：＃Ｐ６−３およびＰ６−４
・ＴｒｉｓｐＨ７．０および７．５：＃Ｐ６−５およびＰ６−６
【０１８１】
粒子形成を最小にするために、塩基性のｐＨがより優れているようだった。
【０１８２】
振盪ストレスおよび熱的ストレス（４５℃で２週間）が、眼に見えない粒子に関するバッファー−ｐＨ系識別のための妥当な方法である。
【０１８３】
優れた安定性を提供するバッファー−ｐＨ系候補は、以下の通りであった：
アッセイ＃５：製剤＃Ｐ５−６からＰ５−９、すなわち、ｐＨ≧７．０
アッセイ＃６（図４および図５を参照する）：
−リン酸塩７．５：＃Ｐ６−４
−Ｔｒｉｓ７．５：＃Ｐ６−６
続いて：
−リン酸塩ｐＨ７．０：＃Ｐ６−３
−ＴｒｉｓｐＨ７．０：＃Ｐ６−５
【０１８４】
全てのストレス条件について、ヒスチジンバッファー（＃Ｐ６−１）が重大な不安定化作用を示したことに留意する。
【０１８５】
ＨＩＡＣ測定は、目視検査を追認した：粒子形成を最小にするために、塩基性のｐＨがより優れていた。さらに、同じｐＨでは、リン酸ベースの製剤は、Ｔｒｉｓバッファー系よりわずかに少ない眼に見えない粒子を提供した。
【０１８６】
アッセイ＃５および６に関して、熱的ストレスは、ＨＭＷおよびＬＭＷの両方に関して興味深い結果を示した。製剤＃Ｐ５−１（ｐＨ４．５）は４５℃で１週間後に、製剤＃Ｐ５−２も４５℃で２週間後に完全に分解されたことに注意すべきである。これらの２つの試料は、以下の分析から排除される。
【０１８７】
ＨＭＷに関して、ｐＨが６．５から５．５に低下するに従い、４５℃で２週間後の結果は、製剤＃Ｐ５−６からＰ５−９（ｐＨ≧７．０）について類似し、＃Ｐ５−５からＰ５−３についてより優れていた。アッセイ＃６について、この傾向は確認され、優れた安定性を提供するバッファー−ｐＨ系候補は以下の通りであった（図６を参照する）：
・リン酸塩ｐＨ６．５：＃Ｐ６−２
・ＴｒｉｓｐＨ７．０：＃Ｐ６−５
・ヒスチジンｐＨ６．５：＃Ｐ６−５
【０１８８】
したがって、ｐＨ６．５はＨＭＷ形成を最小にするためにｐＨ７．０より優れた安定性を提供し、それ自体はｐＨ７．５より優れていた。さらに、同じｐＨ（７．０および７．５）では、Ｔｒｉｓベースの製剤はリン酸バッファー系よりわずかに少ないＨＭＷを与えた。
【０１８９】
ＬＭＷに関して、製剤＃Ｐ５−３からＰ５−５（ｐＨ≦６．５）は、４５℃で２週間後に優れた安定性を示した。実質的なＬＭＷの形成およびＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の余分のバンドが、製剤＃Ｐ５−６からＰ５−９（７．０≦ｐＨ≦８．５）で生じた。ＬＭＷ分解は製剤＃Ｐ５−９（ＴｒｉｓｐＨ８．５）でより目立ち（図７を参照する）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の余分のバンドは＃Ｐ５−７（リン酸塩ｐＨ７．５）で特に眼に見える粒子だった（図８を参照する）。分解生成物はリン酸塩およびＴｒｉｓバッファー系で異なるようだったことに注意すべきである。
【０１９０】
アッセイ＃６はこれらの結論を追認し、同じｐＨで、リン酸ベースの製剤がＴｒｉｓバッファー系よりわずかに多くのＬＭＷを与えたことを示した。
【０１９１】
ＨＭＷおよびＬＭＷに関して、酸性ｐＨは塩基性のものより優れた安定性を提供するようであり、リン酸バッファー系よりＴｒｉｓバッファー系がわずかに有利であった。
【０１９２】
４５℃で４週間の熱的ストレスは、ＩＥＦによって立証されるリード抗体の化学的分解（すなわち、酸性パターンの変化）を強制するための、したがってリード抗体の優れた安定性を提供するバッファー−ｐＨ系を選択するための妥当な手段であった（図９を参照する）。アイソフォームパターンが両方とも２つの余分の酸性型を提示し、主要な型は副次的になったので、最も低い安定性の製剤は、ＴｒｉｓｐＨ８．５（＃Ｐ５−９）およびリン酸塩ｐＨ７．５（＃Ｐ６−４）であった。優れた安定性を示すバッファー−ｐＨ系候補は、ＴｒｉｓｐＨ７．０（＃Ｐ６−５）であった。
【０１９３】
結論として、アッセイ＃Ｐ５および６（１ｍｇ／ｍＬ溶液）での初期状態分析およびストレスプログラム結果に基づいて、ｐＨは７．０に設定された。この選択は、眼に見える粒子および眼に見えない粒子に関する優れた安定性（塩基性ｐＨ）とＨＭＷおよびＬＭＷに関する安定性（酸性ｐＨ）の間の折衷案である。バッファー系に関して、リン酸塩およびＴｒｉｓの両方は、選択されたｐＨの利点を示した：眼に見える粒子／眼に見えない粒子に関するリン酸塩およびＨＭＷおよびＬＭＷに関するＴｒｉｓ。
【０１９４】
第１の添加剤評価のために、以下のためにバッファー系リン酸塩１０ｍＭまたはＴｒｉｓ１０ｍＭを使用したことに留意する：
・１００ｍｇ／ｍＬリード抗体溶液に関する上記の結果を確認するために、
・および両バッファー系で凍結乾燥工程を別々に試験するために。
【０１９５】
上の結果は確認され、両バッファー系（＃Ｐ１４−３およびＰ１４−８）は凍結乾燥工程で優れた結果を示した（図１９を参照する）。
【０１９６】
ｐＨ７．０で、リン酸塩はＴｒｉｓより強力な緩衝能を有する。しかし、Ｔｒｉｓとは異なり、その塩基は凍結工程で沈殿する傾向を有する。Ｔｒｉｓおよびリン酸塩の両方の利点を組み合わせるために、これらの２つのバッファー系の混合物が選択された：リン酸塩６．３ｍＭおよびＴｒｉｓ３．７ｍＭ。Ｔｒｉｓバッファーまたはリン酸バッファーの使用は当技術分野で公知である（それぞれ別個の使用）としても、バッファー系でのＴｒｉｓバッファーおよびリン酸バッファーの組合せは非常に珍しく、当技術分野で公知でない。
【０１９７】
伝導率（ｐＨおよびバッファー選択）
凍結乾燥前の溶液は約３００μＳ／ｃｍの伝導率を有し、それは再構成後のＤＰの８５０μＳ／ｃｍの理論的伝導率を与える。
【０１９８】
我々は、ｍＡｂのために一般的に使用されるバッファーヒスチジンを、ｐＨ６．２およ
び６．６でのその緩衝領域で、ならびに１０ｍＭの濃度で先ず試みた。ｐＨ６．２では、難溶性の問題が室温でのリード抗体の沈殿に遭遇した（図２９を参照する）。ｐＨ６．６では、溶液は室温でわずかに乳白色であり、第２のビリアル係数は低い０．４  １０−４ｍＬ．ｍｏｌ／ｇ２であった。ほとんどのｍＡｂと異なって、ヒスチジンはリード抗体のための優れたバッファーでない。
【０１９９】
我々は、次に別の一般的に使用されるバッファーリン酸塩を、ｐＨ６．５、７．０および７．５でのその緩衝領域で、ならびに１０ｍＭの濃度で試みた。ｐＨ６．５および７．０については、第２のビリアル係数は１．５  １０−４ｍＬ．ｍｏｌ／ｇ２であり、それは低いコロイド安定性を意味する。ｐＨ７．５については、第２のビリアル係数は３．０
１０−４ｍＬ．ｍｏｌ／ｇ２近くであり、それは優れたコロイド安定性を意味するが、熱的ストレス（４５℃で２週間）は、ｐＨ６．５および７．０についてより重要な純度の低下（ＨＭＷおよびＬＭＷの両方の増加）を示した。リン酸塩は優れたバッファーであるが、酸性ｐＨではコロイド安定性は低く、塩基性ｐＨではリード抗体は熱的ストレスに感受性である。
【０２００】
バッファースクリーニングを拡張するために、ＴｒｉｓをｐＨ７．０および７．５でのその緩衝領域で、ならびに１０ｍＭの濃度で試験した。両ｐＨは優れたコロイド安定性を示し、ビリアル係数は３．０  １０−４ｍＬ．ｍｏｌ／ｇ２近くであった。熱的ストレス（４５℃で２週間）は、ｐＨ７．０よりｐＨ７．５についてより重要な純度の低下（ＨＭＷおよびＬＭＷの両方の増加）を示した。しかし、ｐＨ７．０のＴｒｉｓは、同じｐＨのリン酸塩よりＨＭＷに関して非常に優れた安定性を、およびＬＭＷに関してわずかにより優れた安定性を提供した。ＴｒｉｓｐＨ７．０は、ＴｒｉｓｐＨ７．５およびリン酸塩ｐＨ７．０より優れたバッファー系である。しかし、このｐＨでのＴｒｉｓの優れた緩衝能（ｐｋａ＝８．１）を得るために、必要とされる量は市販品で使用される最大値より大きい。
【０２０１】
リード抗体のバッファーを最適化するために、リン酸塩（ｐｋａ＝７．２）によるｐＨ７．０での優れた緩衝能およびＴｒｉｓによるリード抗体の優れた安定化を得るために、リン酸塩６．５ｍＭ／Ｔｒｉｓ３．７ｍＭの組合せを選択した。
【０２０２】
上記のように、Ｔｒｉｓバッファーまたはリン酸バッファーの使用は当技術分野で公知である（それぞれ別個の使用）としても、バッファー系でのＴｒｉｓバッファーおよびリン酸バッファーの組合せは非常に珍しく、当技術分野で公知でない。
【０２０３】
イオン強度／塩濃度
１００ｍｇ／ｍＬリード抗体溶液について７０ｍＭの濃度の２つの選択されたバッファー−ｐＨ候補で塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を試験した。
【０２０４】
ＤＳＣによって得られた開始および変性温度ならびにＳＬＳによって得られたコロイド安定性は、溶液の安定性に及ぼすＮａＣｌのいかなる実質的な影響も示さなかった。製剤アッセイ＃Ｐ１３の機械的ストレスおよび同じ製剤の５℃で２週間の保存の後、候補＃Ｐ１３−１およびＰ１３−３、すなわちＮａＣｌ無しのものは、ＨＭＷ形成に関してより優れた安定性を示した（図１０を参照する）。図３３で同じｃ／ｃ。
【０２０５】
塩濃度を増加させることはイオン強度の増加を引き起こし、それはリード抗体の凝集動態の増加を引き起こした。したがって、製剤は塩または浸透圧剤を含有するべきでないと判定された。さらに、低いイオン強度を有するために、最適な製剤は低い濃度のバッファーを含むべきであると判定された。
【０２０６】
実施例３−界面活性剤
製剤開発過程での次の工程は、リード抗体製剤の最適な賦形剤を判定することであった。賦形剤はリード抗体を安定させるのに十分でなければならず、凍結乾燥に適合しなければならない。ポリソルベートおよびポロキサマーなどのいくつかの異なる界面活性剤を、様々な濃度で試験した。
【０２０７】
【表７】
2019070025.tif 000013
【０２０８】
【表８】
2019070025.tif 000014
【０２０９】
０．２２μｍ濾過の直後に、製剤アッセイおよび対照は、眼に見える粒子および眼に見えない粒子を含んでいなかった。ＳＥＣ分析は、４．５ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬのリード抗体の濃度のために、≦９２．０％の純度を示した（出発ＤＳは３．０％のＨＭＷを含有した）。
【０２１０】
機械的ストレスは、製剤候補を区別する妥当な手段であった。出発物質の限定された量の利用可能性のために、標準の目視は可能でなく、したがって拡大鏡の下での毛細管での観察を用いた。眼に見える粒子／眼に見えない粒子に関して、アッセイ＃Ｐ１２の優れた安定性を示す候補は、以下の通りだった（図１１を参照する）：
・ＰＳ８０  ０．１％：＃Ｐ１２−６
・ＰＳ２０  ０．１％：＃Ｐ１２−８
【０２１１】
試験した界面活性剤の中で、５℃で６週間の保存の間にわずかな負の影響を及ぼした＃
Ｐ１２−８（ＰＳ２０  ０．１％）を除いて、界面活性剤無しの製剤と比較していずれもＨＭＷ形成に影響を及ぼさなかった（図１２を参照する）。
【０２１２】
結論として、界面活性剤の間に大きな差はなかった。眼に見える粒子／眼に見えない粒子形成を阻止するために、以下の界面活性剤、ＰＳ８０が選択された。
【０２１３】
次に、リード抗体製剤で様々な濃度のＰＳ８０を試験した（表２３を参照する）。３５０ｒｐｍ（室温）で１５時間の振盪ストレスのために、０．０５〜０．２％のＰＳ８０濃度を試験した。試料をフローセル鏡検によって分析し、結果を表９に示す。表９は、０．０５〜０．２％のＰＳ８０濃度が振盪ストレスに関して全ての濃度で同等の安定化作用を有したことを示す。したがって、０．０５〜０．２％のＰＳ８０濃度を製剤で使用することができる。
【０２１４】
【表９】
2019070025.tif 000015
【０２１５】
実施例４−スクロース
上記の通り製剤開発過程での次の工程は、リード抗体製剤の最適な賦形剤を判定することであった。賦形剤はリード抗体を安定させるのに十分でなければならず、凍結乾燥に適合しなければならない。スクロース、トレハロースおよびマンニトールなどのいくつかの異なる糖を、様々な濃度で試験した。
【０２１６】
【表１０】
2019070025.tif 000016
【０２１７】
【表１１】
2019070025.tif 000017
【０２１８】
【表１２】
2019070025.tif 000018
【０２１９】
【表１３】
2019070025.tif 000019
【０２２０】
【表１４】
2019070025.tif 000020
【０２２１】
結論として、上記の研究に基づき、スクロースはリード抗体を安定させたので、賦形剤として選択した。さらに、スクロースは凍結乾燥保護剤であり、凍結乾燥製剤を向上させることが周知である。実際、スクロース無しの凍結乾燥は、ＨＭＷの増加につながる（図１９を参照する）。さらに、５％スクロースが、製剤に最適であることが見出された。
【０２２２】
実施例５−安定化剤
上記の通り、製剤開発過程での次の工程は、リード抗体製剤の最適な賦形剤を判定することであった。賦形剤はリード抗体を安定させるのに十分でなければならず、凍結乾燥に適合しなければならない。マンニトール、アスパラギン酸、プロリン、グリシン、アルギニンおよびロイシンなどのいくつかの異なる安定化剤を様々な濃度で試験した。これは、下の表および上の表１０〜１４で見ることができる。
【０２２３】
【表１５】
2019070025.tif 000021
【０２２４】
【表１６】
2019070025.tif 000022
【０２２５】
【表１７】
2019070025.tif 000023
【０２２６】
【表１８】
2019070025.tif 000024
【０２２７】
これらのスクリーニングの目的は、ＨＭＷ形成に関してリード抗体をさらに安定させる添加剤を見出すことであった（アッセイ＃１２、１５、２０−ＦＤＳおよび２１）。リード抗体の凝集に対する高い感受性のために、意図された長期保存温度（すなわち、５℃）は、添加剤の効果を監視するために妥当であることが見出された。
【０２２８】
ＨＭＷ形成に及ぼす異なる糖、ポリオール、アミノ酸および溶媒の影響をスクリーニングするために、実験計画（ＤｏＥ）−スクリーニングモデル、第１度のＤ−最適マトリックス−を実行した（アッセイ＃１５）。このＤｏＥの結果を、表１９に要約する。
【０２２９】
【表１９】
2019070025.tif 000025
【０２３０】
ＨＭＷに影響を及ぼすことが見出された添加剤は、アッセイ＃１２および２０−ＦＤＳで別々に試験した：
・アミノ酸グリシン（＃Ｐ１２−１およびＰ２０−４−ＦＤＳ）およびプロリン（＃Ｐ２０−３−ＦＤＳ）は、ＨＭＷ形成の最小化において最良の効果を有することが見出された（図１３および図１４を参照する）
・マンニトール（＃Ｐ２０−１−ＦＤＳ）は、それに続いた（図１４を参照する）
・スクロース（＃Ｐ１２−３）およびトレハロース（＃Ｐ１２−４）が後に続いたが、効果はずっと劣った（図１３を参照する）
・最後に、４％の濃度でアスパラギン酸８％（＃Ｐ２０−２−ＦＤＳ）の正の効果は確認されなかった（図１４を参照する）。
【０２３１】
いくつかの他の添加剤を、アッセイ＃２１で試験した：
・リジン（＃Ｐ２１−５）は、ＨＭＷ形成にわずかな正の影響を及ぼすことが見出された（図１５を参照する）
・マンニトール（＃Ｐ２１−１）は、このアッセイで最良であることが見出された。
【０２３２】
製剤へのプロリンの添加は２つの効果を有することが見出された：それは、液体製剤中の凝集速度を低減することによってＨＭＷ形成を制御し、それは、凍結乾燥製剤でケーキをよりエレガントにする増量剤の働きをした。凍結乾燥製剤へのマンニトールの添加がケーキをエレガントにすることも見出された。
【０２３３】
次に、リード抗体製剤で様々な濃度のプロリンを試験した（表２３を参照する）。１％および３％の濃度を試験した。試料をＵＰＬＣによって分析し、結果を表２０および２１、および図１６に示す。表２０および２１は、１または３％のプロリン濃度を製剤で使用することができることを示す。これらのデータは、ＨＭＷ動態に及ぼすプロリンの正の効果を確認する。さらに、プロリン３％でケーキはわずかによりエレガントであり（引き込みがちでない）、このことはバラストとしてのプロリンの役割を確認する（結果は示さず）。
【０２３４】
【表２０】
2019070025.tif 000026
【０２３５】
【表２１】
2019070025.tif 000027
【０２３６】
結論として、ＨＭＷ形成は、賦形剤、すなわちマンニトールならびにグリシンおよびプロリンなどのアミノ酸の添加によって有意に低減されたが、１００ｍｇ／ｍＬのリード抗体濃度の有益な効果は、満足な有効期間を達成するのに十分強力でない。したがって、凍結乾燥製剤は、凍結乾燥工程と一緒に開発された。
【０２３７】
実施例６−凍結乾燥製剤
凍結／乾燥工程のために、リード抗体濃度が２０〜３８ｍｇ／ｍＬの範囲の所望のＦＤＳプロトタイプの５〜５．５ｍＬを、１５ｍＬバイアルに一定量注入した（例として、表１３および表１４を参照する）。
【０２３８】
凍結／乾燥工程は、１５ｍＬバイアルに一定量注入された５〜５．５ｍＬの最終製剤近くのものに２０〜３８ｍｇ／ｍＬの濃縮前溶液で実行した。
【０２３９】
Ｕｓｉｆｒｏｉｄからの３つの異なる種類の凍結乾燥システムを使用した：ＰＬ４５（アッセイ＃１４）、ＳＭＨ−３００（アッセイ＃１７）およびＳＭＨ−９０（アッセイ＃１６、１８、２０）。凍結乾燥サイクルの詳細については、表２２を参照する。凍結乾燥工程間で変化する温度の勾配は、１℃／分である。
【０２４０】
【表２２】
2019070025.tif 000028
【０２４１】
得られた乾燥物質は、ＷＦＩの適当な量（１．０〜１．６ｍＬ）を加えることによって、１００ｍｇ／ｍＬの目標濃度で次に再構成した。
【０２４２】
凍結乾燥アッセイ＃Ｐ１６−２０については、１ｍＬのＦＤＳ溶液を−２０℃で凍結させ、室温で一度解凍し、次に分析した。
【０２４３】
中間体ＤＳの凍結および解凍（ＨＡＰ工程の終わり−ＢＤ）も試験した（アッセイ＃９）。このアッセイのために、５０ｍＬのＨＤＰＥ  Ｎａｌｇｅｎｅボトル中の２０ｍＬのＤＳを−２０℃および−７０℃の両方で凍結させ、室温で一度解凍し、次に分析した。
【０２４４】
以下の分析法を実施した：
・外観（透明度および色）の目視検査
・眼に見えない粒子の数量化のための光吸収（ＨＩＡＣ）
・タンパク質純度のためのＳＥＣ
・タンパク質純度のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
・電荷不均一性のためのＩＥＦ
・眼に見えない粒子の数量化のためのＦＣＭ
・凝集のためのＤＬＳ
・変性温度のためのＤＳＣ
・コロイド安定性のためのＳＬＳ
・二次構造のためのＦＴ−ＩＲ分光法
・三次構造のための蛍光分光法
・残留水百分率判定のためのカールフィッシャー（凍結乾燥物のために）
・ケーキの結晶質／非晶質マトリックス判定のためのＸＲＰＤ（凍結乾燥物のために）
【０２４５】
製剤および凍結乾燥工程の選択のための主な基準は以下の通りであった：
以下のパラメータを監視した：
・凍結乾燥工程の間のリード抗体の安定性
・再構成された溶液の安定性
・ＦＤＳ（凍結乾燥前の溶液）の安定性
・ケーキのエレガンス
・再構成時間
・ケーキの安定性
【０２４６】
凍結乾燥サイクルは、ケーキの崩壊を避けるように選択した（表２２を参照する）：
・凍結温度は完全固化の温度未満、すなわちガラス転移温度（Ｔｇ’）よりわずかに低く設定し、それは各ＦＤＳ候補（凍結乾燥前の溶液）についてＤＳＣによって測定した（図１７を参照する）。
・一次乾燥温度は、試料の温度がＴｇ’の近くである崩壊温度未満にとどまるように設定した（図１７を参照する）。
【０２４７】
様々な凍結乾燥アッセイの間に得られたケーキは全てエレガントであり（図１８を参照する）、再構成時間は５分以内であった。それらのパラメータが開発の過程で監視するのが重要であるとしても、それらは製剤を区別するために妥当でなかった。
【０２４８】
凍結工程の間、リード抗体の濃度およびｐＨの有意なシフトを避けるために、１℃／分の冷却速度を選択した。カールフィッシャーによって測定された１％未満のケーキ中の残留水のレベルを得るために、二次乾燥温度を選択した（表２２を参照する）。
【０２４９】
リード抗体の安定化は、純度についてはＳＥＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、粒子形成についてはＤＬＳおよびＦＣＭによって評価した。製剤を区別する妥当な基準は、再構成の前後のＨＭＷのレベルおよび再構成後の眼に見えない粒子数であった。
【０２５０】
凍結乾燥工程の影響を評価するために、各製剤について凍結乾燥前および再構成後のＨＭＷのレベルを、ならびにこのレベルの増加を、凍結乾燥前のレベルに対する百分率で表した（図１９および図２０を参照する）。点線は、各図で１０％の増加を示す。優れた安定性を提供する候補は、以下の通りであった：
・スクロース１０％を有するリン酸塩：＃Ｐ１４−２
・スクロース５％＋マンニトール３％を有するリン酸塩およびＴｒｉｓ：＃Ｐ１４−３およびＰ１４−８
・マンニトール３％＋グリシン１％を有するリン酸塩：＃Ｐ１４−６
・スクロース５％＋マンニトール３％を有するＴｒｉｓ／リン酸塩：＃Ｐ２０−１
・スクロース５％＋アスパラギン酸３％を有するＴｒｉｓ／リン酸塩：＃Ｐ２０−２
・スクロース５％＋プロリン３％を有するＴｒｉｓ／リン酸塩：＃Ｐ２０−３
・スクロース５％＋グリシン３％を有するＴｒｉｓ／リン酸塩：＃Ｐ２０−４
【０２５１】
いかなる賦形剤も無い場合（＃Ｐ１４−１）、凍結乾燥の前後にＨＭＷの約１３０％の増加が観察されたので、リード抗体は凍結乾燥工程に対して強く不安定である点に留意する。ＤＳで−２０℃および−７０℃で実行された（アッセイ＃９）凍結／解凍サイクルがリード抗体の強力な不安定化を示したので、この結果は予想されており（図２１を参照する）、凍結は凍結乾燥工程の第１の工程であった。
【０２５２】
眼に見えない粒子に関して、ＦＣＭによる再構成された溶液の間の比較は、以下の候補のより優れた安定性を示した：
・スクロース５％＋プロリン３％を有するＴｒｉｓ／リン酸塩：＃Ｐ２０−３
・スクロース５％＋グリシン３％を有するＴｒｉｓ／リン酸塩：＃Ｐ２０−４
注：アッセイ＃１４については判定されていない
【０２５３】
ケーキの再構成の後のリード抗体を安定させるために、凝集を遅くすることが以前に見出された賦形剤を使用した（液体製剤のための賦形剤スクリーニングに関するセクションを参照する）。再構成後のリード抗体の安定化は、純度についてはＳＥＣによって、粒子形成についてはＤＬＳおよびＦＣＭによって評価した。製剤を区別する妥当な基準は、以下の通りであった：
・再構成から２４時間後のＨＭＷのレベル（５℃で保存）
・機械的ストレス後の粒子数。
【０２５４】
再構成から２４時間後（５℃で保存）のＨＭＷ形成に関して、最良の安定性を提供した候補は以下の通りであった（図２２および図２３を参照する）：
・マンニトール３％＋グリシン１％を有するリン酸塩：＃Ｐ１４−６
・スクロース５％＋プロリン３％を有するＴｒｉｓ／リン酸塩：＃Ｐ２０−３
・スクロース５％＋グリシン３％を有するＴｒｉｓ／リン酸塩：＃Ｐ２０−４
続いて：
・スクロース１０％を有するリン酸塩：＃Ｐ１４−２
・スクロース５％＋マンニトール３％を有するリン酸塩およびＴｒｉｓ：＃Ｐ１４−３、Ｐ１４−７およびＰ１４−８
・スクロース５％＋マンニトール３％を有するＴｒｉｓ／リン酸塩：＃Ｐ２０−１
【０２５５】
凍結乾燥物の安定性を評価するために、製造直後およびその後１カ月（アッセイ＃１６−２０）から２カ月（アッセイ＃１８−２０）後に再構成を行った。凍結乾燥物候補は、５℃（アッセイ＃１６−２０）および２０℃（アッセイ＃１７）に保存した。ケーキの安定性は、純度についてはＳＥＣによって、粒子形成についてはＦＣＭによって、ケーキ構造についてはＸＲＰＤによって評価した。
【０２５６】
ＨＭＷおよび眼に見える粒子／眼に見えない粒子形成に関して、製剤の全ては５℃で保存する間、安定していることが見出された（図２４および図２５を参照する）。５℃で１カ月後にアッセイ＃１７および２０の両方で観察されたＨＭＷレベルのわずかな増加は、以下のアッセイでは再現されなかった（示さず）。さらに、２０℃で保存する間、ＨＭＷレベルのわずかな増加が観察された（図２４を参照する）。
【０２５７】
アッセイ＃１６−１８および２０については、高品質のＤＰを確かなものにする重要なパラメータであるＦＤＳ安定性を考慮した。工程のこの段階でのリード抗体の安定化は、純度についてはＳＥＣによって、粒子形成についてはＤＬＳおよびＦＣＭによって評価した。リード抗体の安定性に及ぼす添加剤の効果を監視するために、５℃での保存が妥当であることが見出された。ＦＤＳで実行される１サイクルの凍結／解凍も、製剤を区別するために妥当だった。
【０２５８】
５℃で保存中のリード抗体の安定性に関して、結果は添加剤に関するセクションで記載した（図１４を参照する）。最良の安定性は、以下で得られた：
・スクロース１．７５％＋プロリン１．０５％を有するＴｒｉｓ／リン酸塩：＃Ｐ２０−３−ＦＤＳ
・スクロース１．７５％＋グリシン１．０５％を有するＴｒｉｓ／リン酸塩：＃Ｐ２０−４−ＦＤＳ
続いて：
・スクロース１．７５％＋マンニトール１．０５％を有するＴｒｉｓ／リン酸塩：＃Ｐ２０−１−ＦＤＳ
【０２５９】
１サイクルの凍結／解凍の後のリード抗体の安定性に関して、ＦＣＭによって行った粒子計数は、以下の製剤候補が安定していることを示した：
・スクロース１．６７％＋マンニトール１％を有するＴｒｉｓ／リン酸塩：＃Ｐ１７−２−ＦＤＳ
・スクロース１．７５％＋プロリン１．０５％を有するＴｒｉｓ／リン酸塩：＃Ｐ２０−１−ＦＤＳ
・スクロース１．７５％＋プロリン１．０５％を有するＴｒｉｓ／リン酸塩：＃Ｐ２０−３−ＦＤＳ
【０２６０】
結論として、以下の基準：工程の間のリード抗体の安定性、ケーキの態様および安定性ならびに再構成時間、再構成された溶液およびＦＤＳの安定性を考慮すると、２つの製剤候補が明らかに卓越している：
・スクロース５％＋マンニトール３％を有するＴｒｉｓ／リン酸塩
・スクロース５％＋プロリン３％を有するＴｒｉｓ／リン酸塩
【０２６１】
実施例２〜６の結論
前製剤作業の間、眼に見える粒子／眼に見えない粒子の形成は、バッファー系（Ｔｒｉｓ／リン酸塩）のある範囲のｐＨの選択（≧７．０）により、特に界面活性剤：０．２％濃度のポリソルベート８０の添加により管理された。
【０２６２】
しかし、ＨＭＷの形成は、なお液体製剤にとって問題であった。最適なｐＨ（７．０）および一部の賦形剤（すなわち、スクロース、マンニトールならびにグリシンおよびプロリンなどのアミノ酸）の選択によってＨＭＷ形成は有意に低減されたが、１００ｍｇ／ｍＬでの有益な効果は液体製剤の満足な有効期間を予想するのに十分なほどＨＭＷの形成を阻止しなかった。
【０２６３】
したがって、凍結乾燥製剤は、凍結乾燥工程と一緒に開発した。凍結乾燥工程の間の凝集を阻止するために、凍結保護物質：５％濃度のスクロースを選択した。凍結乾燥前の液体（濃度：３５ｍｇ／ｍＬ）および再構成された溶液（濃度：１００ｍｇ／ｍＬ）の両方を安定させるために、液体製剤のために選択された安定化賦形剤を凍結乾燥工程で試験した。これらの賦形剤の少数は凍結乾燥工程に適合し、その中の２つ：３％濃度のマンニトールおよびプロリンを選択した。選択のための主な基準は、以下の通りであった：ケーキのエレガンスおよび安定性ならびにＦＤＳ（凍結乾燥前の溶液）および再構成された溶液の安定性。
【０２６４】
長期安定性に置かれた２つの製剤は、１つの賦形剤が異なる（表２３を参照する）：
・プロトタイプ１：プロリン
・プロトタイプ２：マンニトール
【０２６５】
【表２３】
2019070025.tif 000029
【０２６６】
追加の製剤研究（実施例７〜８）
実施例７〜８で使用した略記号は、以下の通りである：
ＤＰ：医薬品
ＤＳ：薬物
ＦＤ：製剤開発
ＦＤＳ：製剤化された薬物
ＦＩＭ：ヒトで最初
ＧＲＡＳ：一般的に安全
ＨＤＰＥ：高密度ポリエチレン
ＨＭＷ：高分子量
ＩＥＦ：等電点電気泳動
ＩＬ：インターロイキン
ＬＭＷ：低分子量
ＰＣ：ポリカーボネート
ＰＥＳ：ポリエーテルスルホン
ＰＰ：ポリプロピレン
ＰＶＤＦ：ポリフッ化ビニリデン
ＲＴ：室温
ＳＣ：皮下
Ｔｄ１：変性の第１の温度
ＴＯＲ：冷凍からの時間
【０２６７】
要約
これらの研究（実施例７〜８）の目的は、液状のリード抗体のＨＭＷ形成への高い傾向に関してＦＤＳ安定性を改善することであった。
【０２６８】
研究計画は前製剤研究（実施例２〜６）で取得した事前知識に基づいて規定され、３５ｍｇ／ｍＬのＦＤＳにおける室温でのＨＭＷ形成の動態を重視する。
【０２６９】
使用する全てのバッファーおよび賦形剤は、市販抗体製品または非経口使用のための他の製品で既に使用されており、詳細にはそれらは全てＧＲＡＳ（一般的に安全）である。ｐＨは、６．２から７．４の間である。
【０２７０】
合計５０個の異なる形成を、表２３に記載される製剤と並べて比較した。主要な結論は以下の通りであった：
・約６．２のｐＨ値はリード抗体溶解性を低下させる：コハク酸塩およびヒスチジンによりゲルの形成および沈殿がそれぞれ観察された
・さらに、溶液が乳白色でわずかに熱安定性が低いので、ｐＨ６．６でヒスチジンは避けるべきである
・６．６から７．４の間のｐＨ範囲では、ＨＭＷ形成動態に及ぼす明らかなｐＨ効果はなかった
・イオン強度の増加は、ＨＭＷ形成動態に不安定化効果を及ぼした
・リン酸塩およびクエン酸塩は、それらが１．７５ｍＭなどの低い濃度であるならば、試験した最良のバッファーであった
・試験した全ての賦形剤の中で、最良の安定化効果は、グリシン１０および７２ｍＭならびにスクロース２．４％で得られた。しかし、この安定化効果はＨＭＷ形成を有意に遅くすることを可能にしなかった
【０２７１】
結論として、実施例７〜８の結果は、ＨＭＷ形成に関して表２３に記載される製剤を有意に改善することができる賦形剤の新しい組合せを特定しなかった。推奨は、以下の製剤（表２４を参照する）を保つことであった：リン酸塩６．５ｍＭ／Ｔｒｉｓ３．７ｍＭ、ｐＨ７．０、ＰＳ８０  ０．２％（ｗ／ｖ）、スクロース５％（ｗ／ｖ）、プロリン３％（ｗ／ｖ）。
【０２７２】
【表２４】
2019070025.tif 000030
【０２７３】
序論
リード抗体は、サイトカインＩＬ−４およびＩＬ−１３を標的にする操作されたヒト化二特異的抗体（ＢｓＡｂ）である。質量分析によって判定されるその分子量は１９８ｋＤａであり、ＩＥＦによって判定されるそのＩｐは５．８から６．２の間である。
【０２７４】
主要な製造ＤＳ工程変更が相ＩＩｂのために実施され、比較研究が相Ｉ／ＩＩａと相ＩＩｂのＤＳおよびＤＰ品質の間で計画される。ＤＳ製造変更の一部として、液体状態でのＨＭＷ形成を低減する目的で製剤研究を実施することに決定された。したがって、製剤の潜在的な改良を比較研究で含めることができた。
【０２７５】
同じ時間では、スケールアップ、ＦＤＳ解凍および１５０ｍｇ／１５ｍＬバイアルの代わりに１００ｍｇ／７ｍＬバイアルへのＤＰ用量／バイアルへの変更のために、相ＩＩｂのためのＤＰ製造工程が最適化されている点に留意する。この研究は、製剤開発と並行して実行されている。
【０２７６】
この研究（実施例７〜８）のための現在の標的製品プロファイルは、医薬品の以下の特徴を規定する：
・投与経路：ＳＣ注射
・ＤＰの形：凍結乾燥
・濃度：１００ｍｇ／ｍＬで溶液を再構成
・有効期間：２４カ月
・保存温度：２℃〜８℃
・用量強度：１００ｍｇ／バイアル
・一次容器：７ｍＬの１型チューブ透明ガラスバイアル
【０２７７】
薬物は、１Ｌポリカーボネートボトルに−２０℃で保存する前に３５ｍｇ／ｍＬで製剤化するべきである。凍結乾燥前に追加の賦形剤または希釈は実施されない。
【０２７８】
ＦＩＭのための前製剤および製剤研究は、以下の結論を可能にした：
・酸性ｐＨ＜６．０（低い熱およびコロイド安定性）および塩基性のｐＨ＞７．５（熱ストレス下でＬＭＷ形成および電荷アイソフォームが変化する）を避ける。
・バッファー系リン酸塩／ＴｒｉｓｐＨ．０と一緒にポリソルベート８０を０．２％の濃度で用いることによって、眼に見える粒子／眼に見えない粒子は有意に低減された
・ＨＭＷ形成動態はリード抗体濃度と一緒に増加し、試験した製剤は、１００ｍｇ／ｍＬにおいて液体製剤の満足な有効期間が予想されるほど十分にＨＭＷ形成を阻止しなかった。
・液体状態でのＨＭＷ形成は、３５ｍｇ／ｍＬのＦＤＳから１００ｍｇ／ｍＬを達成するために初期容量（凍結乾燥前）の１／３よりわずかに少ない量で再構成される凍結乾燥ＤＰの方面に開発を推進した。凍結保護物質および凍結乾燥保護剤が選択された：５％濃度のスクロース。
・相ＩおよびＩＩａのために選択された製剤は、以下の通りであった：リン酸塩６．５ｍＭ／Ｔｒｉｓ３．７ｍＭ、ｐＨ７．０、ＰＳ８０  ０．２％（ｗ／ｖ）、スクロース５％（ｗ／ｖ）、プロリン３％（ｗ／ｖ）。
・わずかな正の効果を有すると同定された賦形剤、すなわち、スクロース、マンニトールならびにグリシンおよびプロリンなどのアミノ酸を組み合わせることによって、この製剤は、ＨＭＷ形成に関して最適化することができるかもしれない。
【０２７９】
液体状態でのＨＭＷ形成は、分解の主要な経路であると同定された。動態は溶液の温度（ＤＰではＲＴより５℃で１０倍遅い）およびリード抗体濃度と一緒に増加する：
・ＲＴで３５ｍｇ／ｍＬのＦＤＳ：ΔＨＭＷ＝７時間で＋１．６％、２４時間で＋４．１％
・ＲＴで１００ｍｇ／ｍＬのＤＰ：ΔＨＭＷ＝１時間で＋０．６％、５時間で＋３．５％
【０２８０】
目的
この研究（実施例７〜８）の目的は、ＨＭＷ形成に関して液体状態のリード抗体の安定性を増加させることであった。この研究の定量的目標を設定するために、以下の値が提案された：
・使用中の安定性のためのＤＰ再構成からＲＴで５時間：５時間でΔＨＭＷ＜＋１％、
・ＤＰ製造を容易にするためのＦＤＳの１２時間のＴＯＲ：１２時間でΔＨＭＷ＜＋１％。
【０２８１】
これらの目標値は、１００ｍｇ／ｍＬの再構成されたＤＰの使用条件、および３５ｍｇ／ｍＬのＦＤＳが冷凍条件から出たときの工程の製造条件を考慮する。これらの値は、品質目標製品プロファイルに従って調整するべきである。
【０２８２】
研究デザイン
この研究（実施例７〜８）のために提案されたアプローチは、３５ｍｇ／ｍＬのリード抗体濃度で広範囲の製剤にわたって組み合わせた賦形剤をスクリーニングすることであった。
【０２８３】
製剤のスクリーニングは、ＨＭＷ形成に潜在的に影響を与えることができる安定化賦形剤に重点を置いた。この研究のために、以下が決定された：
・それらの濃度でＨＭＷ形成に負の影響は実証されず、製造工程および／または再構成への強い正の影響が観察されたので、製剤相ＩのＰＳ８０およびスクロースの濃度がスクリーニングで保たれた。
・以前の研究は約ｐＨ７にｐＨを保つ利点を示していたので、ｐＨ範囲は６．２から７．４の間に引き締められた
・このｐＨ範囲内の５つの注射可能なバッファーを、単独でまたはいくつかの賦形剤と一緒にスクリーニングした：他のバッファー系および／または添加剤（主にアミノ酸、スクロース（相Ｉ製剤に既に含有されたものに加えて）および塩）。
【０２８４】
薬物
この研究（実施例７〜８）で使用したＤＳは、表２５に記載する。
【０２８５】
【表２５】
2019070025.tif 000031
【０２８６】
医薬品
この研究（実施例７〜８）で使用したＤＰは、製剤相Ｉ／ＩＩａ（リン酸塩６．５ｍＭ／Ｔｒｉｓ３．７ｍＭ、ｐＨ７．０、ＰＳ８０  ０．２％、スクロース５％、プロリン３％）で製剤化した（表２６を参照する）。
【０２８７】
【表２６】
2019070025.tif 000032
【０２８８】
処方（Ｓ）
実施例７〜８の各アッセイのための処方は、下の表２７に掲載する。
【０２８９】
【表２７】
2019070025.tif 000033
【０２９０】
【表２８】
2019070025.tif 000034
【０２９１】
製造工程
実施例７〜８の製剤は、スクロース２．１％に４２ｍｇ／ｍＬの濃度でＵＦ／ＤＦによって得られたリード抗体の濃縮溶液で製造した。このリード抗体溶液は、賦形剤の濃縮保存溶液で希釈した。
【０２９２】
ＵＦ／ＤＦ工程
ＵＦ／ＤＦ工程（実施例７〜８）の間、３５ｍｇ／ｍＬの初期タンパク質溶液を４０ｍ
ｇ／ｍＬに先ず濃縮し、次にバッファーを交換した。ダイアフィルトレーションの後、タンパク質溶液を目標の最終濃度であった４２ｍｇ／ｍＬを超えて濃縮した（表２８を参照する）。
【０２９３】
使用した材料および各ＵＦ／ＤＦの工程条件を、表２８に記載する。ＵＦ／ＤＦの終わりに、リード抗体濃度をスクロース２．１％溶液に４２ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０２９４】
【表２９】
2019070025.tif 000035
【０２９５】
製剤調整
ＵＦ／ＤＦ後リード抗体溶液（実施例７〜８）を、所望の最終製剤まで適当な量の濃縮保存溶液で希釈した。この研究のために製造された濃縮溶液の参照および組成を、表２９に要約する。
【０２９６】
【表３０】
2019070025.tif 000036
【０２９７】
【表３１】
2019070025.tif 000037
【０２９８】
各製剤を層流下で滅菌濾過し（Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）ＧＶ）、各安定性時点について少量を適宜２ｍＬのＩ型ガラスバイアルに注入し（１から２ｍＬ）、栓をした。
【０２９９】
ストレス条件
熱ストレス
製剤アッセイに従って実施例７〜８で実施した熱ストレス条件は、表３０に掲載する。
【０３００】
【表３２】
2019070025.tif 000038
【０３０１】
分析法の説明
実施例７〜８で以下の分析法を実施した：
・外観（透明度および色）の目視検査
−７ｍＬバイアル中の溶液を自然光で観察した
・タンパク質純度のためのＨＰＬＣ−ＳＥＣ
−３５℃の２つのカラムＰＲＯＳＥＣ  ３００Ｓ−２５０×４．６ｍｍ
−移動相：リン酸塩０．１Ｍ／ＮａＣｌ  ０．２Ｍ  ｐＨ７．０
−検出：２８０ｎｍ
−注入：１０μＬ（濃度５ｍｇ／ｍＬ）
−流量：０．２ｍＬ／分
−全実行時間：４０分間
【０３０２】
以下の分析法を実施した：
・タンパク質純度のためのＵＰＬＣ−ＳＥＣ
−カラム：４０℃の１つのＡｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ２００  ＳＥＣ（１５０×４．６ｍｍｄｐ＝１．７μｍ）
−移動相：ｐＨ７．０のＮａ２ＨＰＯ４  ５０ｍＭ／ＮａＣｌＯ４  ３００ｍＭ
−検出：２８０ｎｍのＵＶ
−注入：１μＬ（５ｍｇ／ｍＬの溶液）標準３０１４ＥＴ
−注入：２μＬ（２．０ｍｇ／ｍＬの溶液）
−流量：０．３ｍＬ／分
−全実行時間：８分間
【０３０３】
以下の分析法を監視した：
・変性温度のためのＤＳＣ：
−異なる製剤での抗体の熱安定性を推定するために示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用した。
−熱量測定は、１℃／分の加熱速度により、２５℃から１００℃のＶＰ−毛細管ＤＳＣで実施した。
−能力曲線は、変性温度Ｔｄ（℃）に関する情報を与えた（ピーク最大値）。
【０３０４】
評価の基準
・ＳＥＣ：差がＨＭＷの０．５％以下であったとき、結果は同等であると考えた。
・ＤＳＣ：Ｔｄ１の差が０．４℃以下であったとき、結果は同等であると考えた。
【０３０５】
ＵＰＬＣ対ＨＰＬＣ方法
第１のスクリーニング（アッセイ＃Ｈ０４−１５０から１７２）は、相Ｉのために開発されたＨＰＬＣ方法で実施されていた。多数の試料を続けて分析したときに、ＨＭＷレベル判定に影響を与えたベースラインの変動に関する問題が観察されていた。
【０３０６】
第２のスクリーニング（アッセイ＃Ｈ０４−１８５から１９０）については、正確なＨＭＷレベルの発生を得るために、ベースライン変動が観察されなかったＵＰＬＣ方法を使用した。２００個を超える試料を同じカラムに注入した後でさえ、標準の同じクロマトグラフィープロファイルが観察された。
【０３０７】
ＳＥＣ測定のための参照
経時的ＨＭＷ発生に関して異なる系列を比較するために、製剤相Ｉを参照として使用した：
・第１のスクリーニング（アッセイ＃Ｈ０４−１５０から１７２）については、３５ｍｇ／ｍＬのＤＰ凍結乾燥物＃Ｈ０４−０１６でＷＦＩによる再構成によって、３つの系列の各々についてＦＤＳ相Ｉを得た。
・第２のスクリーニング（アッセイ＃Ｈ０４−１８５から１９０）については、以前のＦＤＳ相Ｉ（Ｈ０４−０１６）に加えて、３つの系列の各々について試験製剤と一緒に新たに製造された別のＦＤＳ相Ｉを使用した。さらに、第３のＦＤＳ相Ｉ参照（＃ＬＴ−１０００６− ＤＳ）を使用した：ＦＤＳは凍結乾燥されずに解凍されるだけであった。
【０３０８】
予想外にも、ＨＭＷ動態は様々な参照の間で異なるようであった。比較のために、２つの追加のＤＰ凍結乾燥物を、ＤＰ凍結乾燥物＃Ｈ０４−０１６と一緒に試験した。ＤＰ凍結乾燥物の中での差は、ＲＴで４０時間後に有意になった。しかし、ＲＴで１６時間後から、解凍された参照＃ＬＴ−１０００６−ＤＳはＤＰ凍結乾燥物の全てと有意に異なった。ＤＰ凍結乾燥物は解凍された参照＃ＬＴ−１０００６−ＤＳより速いＨＭＷ動態を示し、したがって、この研究で製造された製剤（この研究のための製剤は解凍されたＦＤＳから製造された（製造工程に関するセクションを参照））を製剤相Ｉ／ＩＩａと比較するために使用することができない。
【０３０９】
同じバッチおよび新たに調製された凍結乾燥ＤＰを用いると、解凍されたＦＤＳとＤＰ凍結乾燥物の間でＨＭＷ動態の有意な差は観察されなかった。したがって、この研究のために新たに製造された製剤で観察されたＨＭＷ動態は、凍結乾燥後の同じ製剤でも同様に観察されるであろう。
【０３１０】
それらのアッセイから導かれた結論は、全てのＤＰ凍結乾燥物および全ての解凍されたＦＤＳに一般化できるとは限らない。異なるバッチの間でのＨＭＷ動態の比較は様々なパラメータに依存することができ、特異的で別個の研究を必要とする。
【０３１１】
結果および考察
実施例７〜８で製造された全ての製剤は、少なくとも１．７５％（ｗ／ｖ）のスクロースおよび約０．０７％（ｗ／ｖ）のＰＳ８０を含有した。これらの濃度は公称値であり、
リード抗体出発溶液に適用される希釈係数に基づく。ＰＳ８０濃度に関して、ＵＦ／ＤＦの間のＰＳ８０吸着は無視できると仮定された。これらの賦形剤濃度は、製剤相Ｉと同じだった。
【０３１２】
実施例７−バッファースクリーニング
この実施例でのｐＨは６．２から７．４でスクリーニングされ、この範囲の中で以下の全ての注射可能なバッファーが試験された：コハク酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩、リン酸塩およびＴｒｉｓ。
【０３１３】
Ａ）バッファーの種類およびｐＨ
第１のスクリーニング（アッセイ＃Ｈ０４−１５０から１７２）では、実施例８−添加剤スクリーニング−でさらに詳述されるいくつかの賦形剤と一緒に、上記のバッファーを１０ｍＭの濃度で試験した。バッファー濃度は１０ｍＭに固定され、ＨＭＷ形成へのその影響がバッファー濃度に関するセクションで見られることに留意する（実施例７）。
【０３１４】
ＤＳＣ
ＤＳＣ結果は、熱安定性がわずかに低かった（Ｔｄ１＝６４．７℃から６５．１℃）ヒスチジン製剤を除いて、全ての製剤が参照と同等である（Ｔｄ１＝６５．５℃）ことを示した（図２６を参照する）。
【０３１５】
初期時間での目視検査
ｐＨ６．２の製剤およびｐＨ６．６のヒスチジン製剤を除いて、全ての製剤は透明で参照と同等だった。
【０３１６】
ｐＨ６．２で、試験した両バッファーで溶解性の低下が観察された：
・ヒスチジン製剤はＲＴで沈殿する（図２７を参照する）
・ＲＴでコハク酸塩製剤はわずかに乳白色であり、５℃でゲルの形成を観察することができ（図２７を参照する）、それは、溶液をＲＴに戻して静かに振盪したときに可逆的であった。コハク酸塩は、キレート特性を有することができる。
ＲＴにおいて、ｐＨ６．６のヒスチジン製剤は、参照よりわずかに乳白色であった。
【０３１７】
ＳＥＣによるＨＭＷ発生
ここで示す結果は３つの異なる系列からであったので、ＨＭＷ発生を直接に比較することができず、参照と比較することができただけである。
・ヒスチジンｐＨ６．６はＲＴで参照と同等で、５℃でわずかにより優れていた（ヒスチジン単独では＋２．４％、参照については１４４時間で＋３．２％）。
・クエン酸塩ｐＨ６．６はＲＴで参照よりわずかに優れ（クエン酸塩単独では＋４．６％、参照については２４時間で＋５．２％）、５℃で参照と同等であった。
・リン酸塩ｐＨ６．６はＲＴで参照よりわずかに優れ（リン酸塩単独では＋８．２％、参照については４８時間で＋９．０％）、５℃で参照と同等であった。
・リン酸塩ｐＨ７は、ＲＴおよび５℃で参照と同等であった。
・ＴｒｉｓｐＨ７はＲＴで参照よりわずかに悪く（Ｔｒｉｓ単独では＋７．８％、参照については４８時間で＋７．０％）、５℃で参照と同等であった。
・ＴｒｉｓｐＨ７．４は、ＲＴおよび５℃で参照と同等であった。
図２８を参照する。
【０３１８】
ＨＭＷ形成に関して、ｐＨ６．６でリン酸塩およびクエン酸塩は同等で、ｐＨ７．０でリン酸塩はＴｒｉｓよりわずかに安定化させた。このスクリーニングのために使用した参照が別のバッチから製造された凍結乾燥物であったので、１０ｍＭの上記のバッファーは製剤相Ｉ／ＩＩａと直接に比較することができない（ＳＥＣ測定のための参照に関する上
のセクションを参照する）。
【０３１９】
結論
１０ｍＭの濃度でのバッファー系スクリーニングに関して、以下が結論づけられる：
・約６．２（ｐＩの近く）のｐＨ値は、リード抗体の溶解性を低下させた：
−ゲル形成は、ｐＨ６．２のコハク酸塩で観察された
【０３２０】
沈殿は、ｐＨ６．２のヒスチジンで観察された
・さらに、溶液が乳白色でわずかに熱安定性が低いので、ｐＨ６．６でヒスチジンは避けるべきである
・試験したバッファー：ヒスチジン、クエン酸塩、リン酸塩およびＴｒｉｓに関して、ＨＭＷ形成に及ぼす６．６から７．４の範囲内のｐＨの影響に明らかな傾向はなかった
・クエン酸塩およびリン酸塩は１０ｍＭで最良のバッファーであるようだったが、ＨＭＷ形成に関してバッファー効果は非常に弱かった
【０３２１】
Ｂ）相Ｉ／ＩＩａ製剤へのｐＨの微調整
ＨＭＷ形成に及ぼすｐＨの影響を同じ操作で判定するために、相Ｉ製剤（アッセイ＃Ｈ０４−１８７）でｐＨを６．７から７．２の範囲にわたってスクリーニングした。
【０３２２】
ＤＳＣ
ＤＳＣ結果は、全ての製剤が参照と同等であることを示した（ｐＨ７．０）（図２９を参照する）。
【０３２３】
ＳＥＣによるＨＭＷ発生
ｐＨを６．７から７．２まで上昇させたとき、ＨＭＷ形成のわずかな減少傾向があった（図３０を参照する）が、これはＲＴで２４時間後に有意になっただけである（ｐＨ６．７では＋４．１％、ｐＨ７．２では＋３．４％）。
【０３２４】
結論
バッファーリン酸塩２．２ｍＭ／Ｔｒｉｓ１．３ｍＭ（製剤相Ｉ）では、ＲＴで２４時間後に６．７から７．２の範囲のｐＨのわずかな影響があった。しかし、この効果は最初の１６時間の間有意でなかったので弱かった。このことは、このｐＨ範囲でのＨＭＷ形成へのｐＨの弱い効果を確認した。
【０３２５】
Ｃ）バッファー濃度
ＨＭＷ形成に及ぼすバッファー濃度の影響を調査するために、クエン酸塩およびリン酸塩を１０ｍＭより低い濃度：０、１．７５および５．２５ｍＭで試験した（アッセイ＃Ｈ０４−１８５）。ｐＨは、試験した範囲の中間点：ｐＨ＝６．８に設定した。全ての製剤は、オスモル濃度を調整するために７２ｍＭのグリシン、ならびに結果および考察に関するセクションの最初で記載した通り、１．７５％のスクロースおよび約０．０７％のＰＳ８０を含有した。
【０３２６】
ＤＳＣ
ＤＳＣ結果は、全ての製剤が参照（製剤相Ｉ）と同等であることを示した（図３１を参照する）。バッファー無しのグリシン（１８５Ａ２）は、他の試験製剤よりわずかに安定性が低かったことに留意する（Ｔｄ１で約１℃の差）。
【０３２７】
ＳＥＣによるＨＭＷ発生
試験した両バッファーについて、バッファー濃度を低下させたときにＨＭＷ形成のわずかな減少傾向があり、最良の結果はバッファー無しおよびバッファーに１．７５ｍＭで得
られた（例えば、ＲＴの４８時間でクエン酸塩１０ｍＭについては＋７．８％およびバッファー無しでは＋７．０％）（図３２を参照する）。１．７５ｍＭのクエン酸塩およびバッファー無しは、参照と同等だった（例えば、ＲＴの４８時間でクエン酸塩については＋７．１％およびバッファー無しでは＋７．０％であったが、参照については＋６．８％であった）。
【０３２８】
結論
バッファー濃度を低下させることは、ＨＭＷ形成動態にわずかに安定させる効果を及ぼした。この効果は、おそらくイオン強度に関係があった。ＨＭＷ形成の点でバッファー無しおよびバッファークエン酸塩１．７５ｍＭが最良の候補であり、わずかに劣ったリン酸塩１．７５ｍＭが続いた。グリシン７２ｍＭで試験したそれらのバッファーは、製剤相Ｉ／ＩＩａと同等だった。
【０３２９】
実施例８−添加剤スクリーニング
賦形剤の間の潜在的相乗効果を判定するために、添加剤グリシン、プロリン、ヒスチジンおよびＴｒｉｓのスクリーニングは、バッファースクリーニングと組み合わせて行った（第１のスクリーニング：アッセイ＃Ｈ０４−１５０から１７２）。添加剤塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、グリシンおよびスクロースのスクリーニング（第２のスクリーニング：アッセイ＃Ｈ０４−１８５から１９０）は、第１のスクリーニングから選択された最良のバッファーリン酸塩またはクエン酸塩で行った（実施例７）。
【０３３０】
製剤は、１．７５％のスクロースおよび約０．０７％のＰＳ８０を含有した。
【０３３１】
Ａ）塩化ナトリウムおよび安息香酸ナトリウム
ＨＭＷ形成に及ぼすイオン強度および疎水性相互作用の効果をそれぞれ評価するために、塩化ナトリウムおよび安息香酸ナトリウムを試験した。製剤相Ｉオスモル濃度（ＦＤＳで１６５ｍＯｓｍ／ｋｇ）を超えない濃度で、これらの添加剤をリン酸塩１．７５ｍＭ  ｐＨ６．８で試験した。
【０３３２】
ＤＳＣ
ＤＳＣ結果は、ＮａＣｌ製剤は参照と同等である（ＮａＣｌでＴｄ１＝６５．７℃、参照で６５．６℃）が、安息香酸ナトリウム製剤は熱安定性がわずかに低い（Ｔｄ１＝６５．０℃）ことを示した。
【０３３３】
ＳＥＣによるＨＭＷ発生
試験した両添加剤に関して、参照と比較してＨＭＷ形成に明らかな負の効果があった（例えば、ＲＴの２４時間で、３８．５ｍＭのＮａＣｌでは＋５．２％、３７．８ｍＭの安息香酸ナトリウムでは＋５．２％、および参照では＋３．２％）。発生は両賦形剤で類似しているので、ＮａＣｌの結果だけをここで示す（図３３を参照する）。
【０３３４】
結論
バッファー濃度について見られる通り、ＮａＣｌまたは安息香酸ナトリウムでイオン強度を増加させることは、ＨＭＷ形成動態に明らかな負の効果を及ぼした。さらに、安息香酸ナトリウムの添加によるＨＭＷ動態に及ぼす疎水性相互作用の効果は、観察されなかった。
【０３３５】
Ｂ）グリシン、プロリン、ヒスチジンおよびＴｒｉｓ
これらの添加剤（グリシン、プロリン、ヒスチジンおよびＴｒｉｓ）は、１０ｍＭの濃度で試験した（第１のスクリーニング：アッセイ＃Ｈ０４−１５０から１７２）。
【０３３６】
ＤＳＣ
ＤＳＣ結果は、上記の添加剤を有する全ての製剤がそれらのない製剤（バッファーだけ）と同等であることを示した。
【０３３７】
ＳＥＣによるＨＭＷ発生
製剤間の差は弱かったが、ＲＴで４８時間後および５℃で６日後に傾向を見ることができた：
・ヒスチジンバッファー：
−ＲＴ：φ（添加剤無し）＝グリシン＞プロリン＞Ｔｒｉｓ
−５℃：φ＞グリシン＝プロリン＞Ｔｒｉｓ
・クエン酸バッファー：
−ＲＴ：グリシン＞プロリン＝ヒスチジン＝Ｔｒｉｓ＝（Ｔｒｉｓ＋グリシン）＞φ
−５℃：グリシン＞プロリン＝ヒスチジン＝Ｔｒｉｓ＝（Ｔｒｉｓ＋グリシン）＝φ
・リン酸バッファー：
−ＲＴ：グリシン＝プロリン＝φ＞ヒスチジン＝Ｔｒｉｓ
−５℃：グリシン＞プロリン＝φ＝ヒスチジン＝Ｔｒｉｓ
・Ｔｒｉｓバッファー：
−ＲＴ：グリシン＞φ＝ヒスチジン
−５℃：グリシン＝φ＝ヒスチジン
【０３３８】
結論
ＨＭＷ形成に関して、これらの添加剤の効果は弱かったが、傾向を見ることができた：
・１０ｍＭのグリシンは、わずかな正の効果を有した
・１０ｍＭのヒスチジンおよびプロリンは、効果を有しないようだった
・１０ｍＭのＴｒｉｓは、安定化効果を有さず、わずかな不安定効果を有することさえできた
【０３３９】
ｃ）スクロースおよびグリシン
第２のスクリーニング（アッセイ＃Ｈ０４−１８５）では、２．４％のスクロースの追加の量（合計４．１５％（ｗ／ｖ）のスクロースを与えた、全ての製剤に含有された１．７５％の既存のスクロースに加えて）および７２ｍＭの濃度のグリシンを、選択された最良のバッファーで試験した（バッファースクリーニングに関するセクションを参照する）。製剤相Ｉのオスモル濃度（ＦＤＳで１６５ｍＯｓｍ／ｋｇ）を超えないように、これらの濃度を最大にした。
【０３４０】
ＤＳＣ
ＤＳＣ結果は、全てのスクロース２．４％およびグリシン７２ｍＭ製剤が参照と同等であったことを示した（例えば、スクロースの場合、リン酸塩１．７５ｍＭではＴｄ１＝６５．７℃、参照では６５．６℃）。
【０３４１】
ＳＥＣによるＨＭＷ発生
クエン酸塩１．７５ｍＭおよびバッファー無しについてスクロースを含有する製剤と比較したときだけ、グリシンのわずかな正の効果が確認された（図３４を参照する）。しかし、この正の効果は、ＲＴで４８時間後に有意なだけだった。
【０３４２】
結論
ＨＭＷ形成に関しては、対象のタイムスケール（ＲＴで＜２４時間）で、最良のバッファー候補で試験したスクロースおよびグリシン製剤は、製剤相Ｉと同等であった。
【０３４３】
実施例７〜８の結論
この研究のために、約５０個の製剤を製造して、現行の相Ｉ／ＩＩａ製剤と並べて比較した。ｐＨスクリーニングは６．２から７．４にわたり、賦形剤の間の潜在的相乗効果を評価するために、単独、またはいくつかの賦形剤（全てＧＲＡＳ）と組み合わせたこのｐＨ範囲内の全ての注射可能なバッファーを含んだ。
【０３４４】
主要な結論は、以下の通りであった：
・約６．２のｐＨ値は、リード抗体溶解性を低下させる：コハク酸塩およびヒスチジンによりゲルの形成および沈殿がそれぞれ観察された；
・さらに、溶液が乳白色でわずかに熱安定性が低いので、ｐＨ６．６でヒスチジンは避けるべきである；
・６．６から７．４の間のｐＨ範囲では、ＨＭＷ形成動態に及ぼす明らかなｐＨ効果はなかった；
・イオン強度の増加は、ＨＭＷ形成動態に不安定化効果を及ぼした；
・リン酸塩およびクエン酸塩は、それらが１．７５ｍＭなどの低い濃度であるならば、試験した最良のバッファーであった；
・試験した全ての賦形剤の中で、最良の安定化効果は、グリシン１０および７２ｍＭならびにスクロース２．４％で得られた。しかし、この安定化効果はＨＭＷ形成を有意に遅くすることを可能にしなかった；ならびに
・１０ｍＭで効果を有しないプロリンは等張剤として使用することができた（９１ｍＭ（ＦＤＳ相Ｉ製剤中のプロリン濃度）のプロリンの効果は、ＨＭＷ形成に関して評価されていなかった（例えば、プロリンの有る無しでＦＤＳ製剤相Ｉを評価すること）。
【０３４５】
結論として、実施例７〜８の結果は、ＨＭＷ形成に関して現行の製剤を有意に改善することができる賦形剤の新しい組合せを特定しなかった。すなわち、実施例７〜８の結果は、実施例１〜６の結果を追認する。推奨は、相ＩＩｂ研究のために現行の相Ｉ／ＩＩａ製剤を保つことであった。したがって、現行の製剤は、以下の通りであった（表３１を参照する）：リン酸６．５ｍＭ／Ｔｒｉｓ３．７ｍＭ、ｐＨ７．０、ＰＳ８０  ０．２％（ｗ／ｖ）、スクロース５％（ｗ／ｖ）、プロリン３％（ｗ／ｖ）。
【０３４６】
【表３３】
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【０３４７】
現行製剤の量的調整（新しい賦形剤を加えずに賦形剤濃度を微調整する）を、相ＩＩＩ／市販製剤のために実行することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2019070025.tif 000049
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月16日(2019.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定な抗体製剤であって、
式ＶＬ１−リンカー−ＶＬ２の軽鎖および式ＶＨ１−リンカー−ＶＨ２の重鎖を含み、ＶＬ１およびＶＨ１はＩＬ−１３抗原結合ドメインを形成し、ＶＬ２およびＶＨ２はＩＬ−４抗原結合ドメインを形成する、二特異的抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３抗体またはその抗原結合断片；ならびに
製剤のｐＨを約ｐＨ７に維持するのに適するバッファー系；
を含み、製剤のイオン強度を低減するために低い塩濃度を有する前記抗体製剤。
【外国語明細書】
2019070025000001.pdf