(57)【要約】【課題】薬物のターゲット部位への移行性を改善できる新たな眼科用医薬組成物を提供すること。【解決手段】本発明に係る眼科用医薬組成物は、薬物と、前記薬物と共有結合せずに存在する細胞膜透過性ペプチド又はその塩とを含有する。細胞膜透過性ペプチドを薬物と共存させることにより眼組織中への薬物の移行性が改善し、また、細胞膜透過性ペプチドと薬物とを共有結合させた複合体を形成させる必要がないため、細胞膜透過性ペプチドと薬物を別個に配合するだけで簡便に調製することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物と、前記薬物と共有結合せずに存在する細胞膜透過性ペプチド又はその塩とを含有する眼科用医薬組成物。
【請求項２】
細胞膜透過性ペプチドがＲ８、Ｒ８−ＮＨ２、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ  ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、ＨＩＶ−ＴＡＴ  （４７−５７）  ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＨＩＶ−ＴＡＴ  （４８−６０）  ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ、ｐＶＥＣ  ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ−ＮＨ２、  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ  （ＴＰ１０）  ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ−ＮＨ２、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＡＲＫＫＡＡＫＡ、２８９−Ｗ  ＲＷＩＫＩＷＦＷＷＲＲＭＫＷＫＫ、Ｌ１７Ｅ  ＩＷＬＴＡＬＫＦＬＧＫＨＡＡＫＨＥＡＫＱＱＬＳＫＬ、及びＬ−Ｋ６  ＩＫＩＬＳＫＩＫＫＬＬＫからなる群より選択される一又は複数の細胞膜透過性ペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
細胞膜透過性ペプチド又はその塩を０．００００１〜１０％（ｗ／ｖ）含有する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
細胞透過性ペプチド又はその塩と、薬物とのモル比が、１０００：１〜１：１０００である、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
細胞膜透過性ペプチド又はその塩を含有し、送達対象の薬物と共有結合させずに用いられる眼科用ドラッグデリバリーシステム。
【請求項６】
眼科用医薬組成物に細胞膜透過性ペプチド又はその塩を薬物と共有結合させずに含有させることによる、前記薬物の眼組織への移行性を向上させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜透過性ペプチド（以下、「ＣＰＰ」ともいう。）又はその塩と薬物を含有する眼科用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
眼科用の薬物を投与する方法として、点眼剤による点眼投与が汎用されている。しかし、点眼投与された薬物が角膜に移行する割合は決して高くなく、さらに内部にある前房、虹彩、毛様体、水晶体、硝子体、網膜等に到達する割合はわずかである。このような点眼剤の低いバイオアベイラビリティを改善する目的で、リポソーム、エマルジョン、マイクロスフェア、デポ製剤、徐放デバイス等、種々のドラッグデリバリーシステムが開発されている。アルコール類や界面活性剤等は角膜移行性を向上させる目的で使用されるが、毒性の問題等が懸念されるために、高濃度での使用には適さない。
【０００３】
また、細胞膜透過性ペプチドを利用した眼科用ドラッグデリバリーシステムも報告されている。例えば、非特許文献１には、ＰＯＤ−ＧＦＰ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎの点眼投与により、角膜上皮への取り込みが改善することが報告されている。また、非特許文献２には、ＴＡＴ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａＦＧＦ−Ｈｉｓの点眼投与により、網膜への移行が向上することが報告されている。しかし、これらは薬物と細胞膜透過性ペプチドが直接又はリンカー等を介して共有結合した複合体を利用する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓ．，２０１０，５０（７），６８６−６９７
【非特許文献２】Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２０１０，１４（７），１９９８−２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、薬物のターゲット部位への移行性を改善できる新たな眼科用医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究の結果、細胞膜透過性ペプチドは薬物と共有結合させなくとも、薬物と共存させて点眼投与することにより、薬物の角膜上皮細胞への移行性を改善させることができ、しかも、角膜への顕著な毒性を生じることなく安全に利用できることを見出して、本発明を完成させた。具体的に、本発明は以下を提供する。
【０００７】
（１）薬物と、前記薬物と共有結合せずに存在する細胞膜透過性ペプチド又はその塩とを含有する眼科用医薬組成物。
（２）細胞膜透過性ペプチドがＲ８、Ｒ８−ＮＨ２、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ  ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、ＨＩＶ−ＴＡＴ  （４７−５７）  ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＨＩＶ−ＴＡＴ  （４８−６０）  ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ、ｐＶＥＣ  ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ−ＮＨ２、  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ  （ＴＰ１０）  ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ−ＮＨ２、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＡＲＫＫＡＡＫＡ、２８９−Ｗ  ＲＷＩＫＩＷＦＷＷＲＲＭＫＷＫＫ、Ｌ１７Ｅ  ＩＷＬＴＡＬＫＦＬＧＫＨＡＡＫＨＥＡＫＱＱＬＳＫＬ、及びＬ−Ｋ６  ＩＫＩＬＳＫＩＫＫＬＬＫからなる群より選択される一又は複数の細胞膜透過性ペプチドである、（１）に記載の組成物。
（３）細胞膜透過性ペプチド又はその塩を０．００００１〜１０％（ｗ／ｖ）含有する、（１）又は（２）に記載の組成物。
（４）細胞透過性ペプチド又はその塩と、薬物とのモル比が、１０００：１〜１：１０００である、（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）細胞膜透過性ペプチド又はその塩を含有し、送達対象の薬物と共有結合させずに用いられる眼科用ドラッグデリバリーシステム。
（６）眼科用医薬組成物に細胞膜透過性ペプチド又はその塩を薬物と共有結合させずに含有させることによる、前記薬物の眼組織への移行性を向上させる方法。
【０００８】
なお、前記（１）から（６）の各構成は、任意に２以上を選択して組み合わせることができる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、細胞膜透過性ペプチドを薬物と共存させることにより、眼組織中への薬物の移行性を改善した眼科用医薬組成物を提供することができる。細胞膜透過性ペプチドと薬物とを共有結合させた複合体を形成させる必要がないため、細胞膜透過性ペプチドと薬物を別個に配合するだけで簡便に調製することができる。また、アルコール類や界面活性剤等ではなく細胞膜透過性ペプチドを利用したものであることから、医薬品として安全に眼に投与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】各製剤例における蛍光写真と画像解析の結果を示す。
【図２】各製剤例における蛍光写真と画像解析の結果を示す。
【図３】各製剤例における蛍光写真と画像解析の結果を示す。
【図４】各製剤例における生細胞率を示す。
【図５】各製剤例における生細胞率を示す。
【図６】各被験溶液０．５ｍＭにおけるＲ８−ＮＨ２とのアフィニティの比較を示す。
【図７】各被験溶液０．５ｍＭにおけるＲ８−ＮＨ２とのアフィニティの比較を示す。
【図８】各被験溶液０．５ｍＭにおけるＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ−ＮＨ２とのアフィニティの比較を示す。
【図９】各被験溶液０．５ｍＭにおけるＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ−ＮＨ２とのアフィニティの比較を示す。
【図１０】各被験溶液０．５ｍＭにおけるＤ−Ｒ８−ＮＨ２とのアフィニティの比較を示す。
【図１１】各被験溶液０．５ｍＭにおけるＡＲＫＫＡＡＫＡ−ＮＨ２とのアフィニティの比較を示す。
【図１２】各被験溶液０．５ｍＭにおけるＴＡＴ（４７−５７）−ＮＨ２とのアフィニティの比較を示す。
【図１３】各被験溶液０．５ｍＭにおけるＨＩＶ−ＴＡＴ  （４８−６０）−ＮＨ２とのアフィニティの比較を示す。
【図１４】各製剤例における画像解析の結果を示す。
【図１５】各製剤例における画像解析の結果を示す。
【図１６】各製剤例における画像解析の結果を示す。
【図１７】各製剤例における画像解析の結果を示す。
【図１８】各製剤例における画像解析の結果を示す。
【図１９】各製剤例における生細胞率を示す。
【図２０】各製剤例における生細胞率を示す。
【図２１】各製剤例における生細胞率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に、本発明の実施形態を詳細に説明するが、本発明はこれに特に限定されない。
【００１２】
本発明の医薬組成物は、薬物と、前記薬物と共有結合せずに存在する細胞膜透過性ペプチドとを含有する眼科用医薬組成物である。なお、細胞膜透過性ペプチドは、薬物と非共有結合的相互作用（金属イオンを用いた架橋以外の静電的相互作用、水素結合、疎水結合、π−スタッキング相互作用、ファンデルワールス引力による相互作用など）を介した結合をしてもよいし、していなくてもよい。
【００１３】
本発明の組成物に含有される細胞膜透過性ペプチドは、細胞膜を透過する性質を有するペプチドであり、具体的には、所望の薬物と共存した状態で投与した際、その薬物単独での投与時に比べ、薬物の透過性を向上（例えば、透過速度の増加）できる任意のペプチドを指す。従って、細胞膜透過性ペプチドは、眼組織への移行を促進すべき薬物の種類に応じて適宜選択されてよい。
【００１４】
本発明の組成物に含有される細胞膜透過性ペプチドのアミノ酸残基の数は、特に制限されないが、６〜５０が好ましく、６〜４０がより好ましく、６〜３０であることが特に好ましい。ペプチドは、アルギニン残基に富むことが好ましく、具体的にはペプチド中に、３以上、より好ましくは４以上、特に好ましくは５以上のアルギニン残基を含んでよい。６〜５０のアミノ酸残基を含み、そのうち３以上の残基がアルギニン残基であるペプチドが好ましく、６〜４０のアミノ酸残基を含み、そのうち４以上の残基がアルギニン残基であるペプチドがより好ましく、６〜３０のアミノ酸残基を含み、そのうち５以上の残基がアルギニン残基であるペプチドが特に好ましい。アルギニンは、各々独立してＬ体でもＤ体でもよい。また、細胞膜透過性ペプチドには、Ｃ末端及び／又はＮ末端及び／又は側鎖が修飾されたペプチドも含まれる。カルボキシル基の修飾の具体例としては、アミド化（ＣＯＮＨ２）、メチルアミド化等のアミド化；メチルエステル化、エチルエステル化等のエステル化等が挙げられ、アミノ基の修飾の具体例としては、アセチル化、ホルミル化等のアミド化；メチル化、ジメチル化等のアルキル化等が挙げられ、水酸基の修飾の具体例としては、アセチル化等のエステル化；リン酸化等が挙げられ、チオール基の修飾の具体例としては、メチル化等のアルキル化等が挙げられる。細胞膜透過性ペプチドは、具体的には、Ｒ８（アミノ酸配列；ＲＲＲＲＲＲＲＲ）、配列番号１）、Ｒ８−ＮＨ２（アミノ酸配列；ＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＮＨ２）、配列番号２）、ＨＩＶ−ＴＡＴ  （４８−６０）（アミノ酸配列；ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ、配列番号３）、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ  ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号４），  ＨＩＶ−ＴＡＴ  （４７−５７）  ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号５）、ｐＶＥＣ  ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ（配列番号６）−ＮＨ２、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ  （ＴＰ１０）  ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号７）−ＮＨ２，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＡＲＫＫＡＡＫＡ（配列番号８）、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖ  （３４−５０）  ＫＱＡＩＰＶＡＫ（配列番号９）−ａｍｉｄｅ，  ＦＨＶ  ｃｏａｔ（３５−４９）  ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ（配列番号１０）−ａｍｉｄｅ、  Ｏｌｉｇｏａｒｇｉｎｉｎｅｓ  （Ｒ９−Ｒ１２）  ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号１１）／  ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号１２），  ＣＣＭＶ  Ｇａｇ  （７−２５）  ＫＬＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＫＮＫＲＮＴＲＧＣ（配列番号１３），  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｄｅｒｍａｓｅｐｔｉｎ  Ｓ４  ａｎｄ  ＳＶ４０  ‘Ｓ４１３−ＰＶ’  ＡＬＷＫＴＬＬＫＫＶＬＫＡＰＫＫＫＲＫＶＣ（配列番号１４），  Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  （２６７−３００）  ＶＰ２２  ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＥ（配列番号１５），  （Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｇａｌａｎｉｎ／ｍａｓｔｏｐａｒａｎ）  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ  ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号１６）−ａｍｉｄｅ，  ���ＰＰ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｄｅ  ＹＴＡ２  ＹＴＡＩＡＷＶＫＡＦＩＲＫＬＲＫ（配列番号１７）−ａｍｉｄｅ，  Ｐｅｐ−１  Ａｃ−ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１８）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨ，  ＭＰＧα  Ａｃ−ＧＡＬＦＬＡＦＬＡＡＡＬＳＬＭＧＬＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１９）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨ，  ＭＰＧβ  Ａｃ−ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２０）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨ，  ＭＰＧ８β  ＡＦＬＧＷＬＧＡＷＧＴＭＧＷＳＰＫＫＲＫ（配列番号２１）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨ，  ＣＡＤＹ  Ａｃ−ＧＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ（配列番号２２）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨ，  Ｐｅｐｆｅｃｔ６  Ｓｔｅａｒｙｌ−ＡＧＹＬＬＧＫ（ε−ＴＭＱ）ＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号２３），  ＰｅｐＦｅｃｔ１４  Ｓｔｅａｒｙｌ−ＡＧＹＬＬＧＫＬＬＯＯＬＡＡＡＡＬＯＯＬＬ（配列番号２４）−ａｍｉｄｅ，  ＰｅｐＦｅｃｔ  １５  Ｓｔｅａｒｙｌ−ＡＧＹＬＬＧＫ（Ｋ３ＱＮ４）ＬＬＯＯＬＡＡＡＡＬＯＯＬＬ（配列番号２５）−ａｍｉｄｅ，  ＮｉｃｋＦｅｃｔ  ＮＦ６１：  Ｓｔｅａｒｙｌ−ＡＧＹＬＬＧＯＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号２６）−ａｍｉｄｅ，  Ｈｅｌ  １１−２７  ＫＬＬＫＬＬＬＫＬＷＫＬＬＬＫＬＬＫ（配列番号２７），  ＩｎｆｌｕｅｎｃａＨＡ−２  （１−２０）  ＫＡＬＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＡＣＥＡ（配列番号２８），  ＫＬＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｃｅｔｙｌ−ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号２９）−ａｍｉｄｅ，  ｓＣ１８  ＧＬＲＫＲＬＲＫＦＲＮＫＩＫＥＫ（配列番号３０），  （Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｄｈｅｒｉｎ）  ｐＶＥＣ  ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ（配列番号３１）−ａｍｉｄｅ，  Ｋａｐｏｓｉｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｋａｐｏｓｉ  ＦＧＦ  ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号３２），  Ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｉｇ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｃａｉｉｍａｎ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｕｓ  ＭＧＬＧＬＨＬＬＶＬＡＡＡＬＱＧＡＭＧＬＧＬＨＬＬＬＡＡＡＬＱＧＡ（配列番号３３），  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  β３−ｆｒａｇｍｅｎｔ  ＶＴＶＬＡＧＡＬＡＧＶＧＶＧ（配列番号３４），  Ｇｒｂ２  （ＳＨ２  ｄｏｍａｉｎ）  ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号３５），  Ｆｕｓｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＨＩＶ−１  ｇｐ４１（１−２３）  ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡ（配列番号３６），  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ  ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰ（配列番号３７），  Ｓｐｅｒｍ−ｅｇｇ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （８９−１１１）  ＳＦＰ２３：  Ａｃ−ＫＬＩＡＴＧＩＳＳＩＰＰＩＲＡＬＦＡＡＩＱＩＰ（配列番号３８）−ａｍｉｄｅ，  Ｈｕｍａｎ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｐａｒｔｉａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ９−３２，  ｈＣＴ（９−３２）−ｂｒ，  ＬＧＴＹＴＱＤＦＮＫ（Ｘ）ＦＨＴＦＰＱＴＡＩＧＶＧＡＰ（配列番号３９）−ａｍｉｄｅ  Ｘ：  ＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＧＶＧＦＡ（配列番号４０），  ｈＣＴ（１８−３２）−ｂｒ，  Ｃａｐｒ−Ｋ（Ｘ）ＦＨＴＦＰＱＴＡＩＧＶＧＡＰ（配列番号４１）−ａｍｉｄｅ  Ｘ：ＫＫＲＫＡＰＫＫＫＲＫＦＡ（配列番号４２），  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ  ａｎｄ  ａｎａｌｏｇｓ  ＲＰＫＰＱＱＦＧＬＭ（配列番号４３）−ａｍｉｄｅ，  ＲＧＤ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  αｖβ３  ＲＧＤ−Ｔｅｍｐｏｒｉｎ−ＬＡ，  ＲＧＤ−Ｄｙｅ  ＲＧＤ−ｂｅａｒｉｎｇ  ＰＡＭＡＭ  ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ，  ＲＧＤ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  αｖβ３，  αｖβ５  Ｃｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅ：  Ｃｙｃｌｏ［ＲＧＤｆＮｍｅＶ］，  ＲＧＤ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｙｃｌｏ（ＲＧＤｆＫ）；  ｃｙｃｌｏ（ＲＧＤｙＫ），  ＲＧＤ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  α５β１  ＲＧＤ  ｍｉｍｉｃ，  ＡＧＲ  （ｐｒｏｓｔａｔａ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）  ＣＡＧＲＲＳＡＹＣ（配列番号４４），  ＬｙＰ−２  （ｓｋｉｎ  ａｎｄ  ｃｅｒｖｉｘ  ｔｕｍｏｒ）  ＣＮＲＲＴＫＡＧＣ（配列番号４５），  ＲＥＡ  （ｐｒｏｓｔａｔａ，  ｃｅｒｖｉｘ，  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）  ＣＲＥＡＧＲＫＡＣ（配列番号４６），  ＬＳＤ  （ｍｅｌａｎｏｍａ，  ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）  ＣＬＳＤＧＫＲＫＣ（配列番号４７），  Ｍａｓｔｏｐａｒａｎ  ＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号４８）−ａｍｉｄｅ，  Ｍｅｌｌｉｔｉｎ  ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（配列番号４９）−ａｍｉｄｅ，  Ｓｃｏｒｐｉｏｎ  ｔｏｘｉｎ  ＭＡＵＲＯＣＡＬＣＩＮＥ  ｗｉｔｈ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃ  ｂｙ  Ａｂｕ  ＧＤＡｂｕＬＰＨＬＫＬＡｂｕＫＥＮＫＤＡｂｕＡｂｕＳＫＫＡｂｕＫＲＲＧＴＮＩＥＫＲＡｂｕＲ（配列番号５０），  Ｍｉｎｉ  ｍａｕｒｏｃａｌｃｉｎｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ＭＣａＵＦ１−９：  ＧＤＡｂｕＬＰＨＬＫＬ（配列番号５１），  Ｒａｔｔｌｅ  ｓｎａｋｅ  ｔｏｘｉｎ  （Ｃｒｏｔａｍｉｎｅ）  ｄｅｒｉｖｅｄ  ＮｒＴＰ６  ＹＫＱＳＨＫＫＧＧＫＫＧＳＧ（配列番号５２），  ＣＰＰ５  ＶＰＴＬＫ，  ＣＰＰ５  ＫＬＰＶＭ，  Ｂａｃ７  （１−３５）  ＲＲＩＲＰＲＰＲＬＰＲＰＲＰＲＰＬＰＦＰＲＧＰＲＰＩＰＲＰＬＰＦＰ（配列番号５３），  Ｂａｃ７  （５−３５）  ＰＲＰＲＬＰＲＰＲＰＲＰＲＰＬＰＦＰＲＧＰＲＰＩＰＲＰＬＰＦＰ（配列番号５４），  Ｐｒｏｔｅｇｒｉｎ−１  ＲＧＧＲＬＣＹＣＲＲＲＦＣＶＣＶＧＲ（配列番号５５），  Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ＶＳＱＰＥＡＴＫＣＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲＤＳＰＩＱＩ（配列番号５６），  Ｐａｒｔｉａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  １−２４  Ｂｏｖｉｎｅ  ＰｒＰ  １−２４：  ＭＶＫＳＫＩＧＳＷＩＬＶＬＦＶＡＭＷＳＤＶＧＬＣ（配列番号５７），  Ｐａｒｔｉａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  １−３０  Ｂｏｖｉｎｅ  ＰｒＰ  １−３０：  ＭＶＫＳＫＩＧＳＷＩＬＶＬＦＶＡＭＷＳＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰ（配列番号５８），  Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ＣＰＰ  ＨＲ９：  Ｃ−ＨＨＨＨＨ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＨＨＨＨＨ−Ｃ（配列番号５９），  Ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｐｏｌｙ（Ｌｙｓ），  ｐｏｌｙ（Ｏｒｎ），  ｐｏｌｙ［Ｌｙｓ（Ｇｌｕｎ，Ａｌａｍ）��，  Ｓｗｅｅｔ  ａｒｒｏｗ  ｐｅｐｔｉｄｅ  （ＳＡＰ）  （ＶＲＬＰＰＰ（配列番号６０））３，  Ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＣＰＰ  ＳＡＰ（Ｅ）：  （ＶＥＬＰＰＰ（配列番号６１））３，  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｈａｒｇｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ，  ＭＭＰ  （２，９）−ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  ＣＰＰ  Ｓｕｃ−（Ｄ−Ｇｌｕ）８−ＰＬＧＣ（Ｍｅ）ＡＧ（配列番号６２）−（Ｄ−Ａｒｇ）９−ａｍｉｄｅ，  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  ＣＰＰ  Ｓｕｃ−（Ｄ−Ｇｌｕ）８−ｘＰＬＧＬＡＧ（配列番号６３）−（Ｄ−Ａｒｇ）９−Ｄ−Ｃ−Ｃｙ５  Ｓｕｃ−（Ｄ−Ｇｌｕ）８−Ｏｘ−ＤＰＲＳＦＬ（配列番号６４）−（Ｄ−Ａｒｇ）９−ａｍｉｄｅ，  ｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  （ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ）  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｐＨＬＩＰ：  ＡＥＱＮＰＩＹＷＡＲＹＡＤＷＬＦＴＴＰＬＬＬＬＥＬＡＬＬＶＤＡＤＥＧＴ（配列番号６５），  ＫＫＬＡＤａｐ（Ｍｅ２）ＡＬ  Ｄａｐ（Ｍｅ２）ＬＬＡＬＬＷＬＤａｐ（Ｍｅ２）ＬＡＤａｐ（Ｍｅ２）ＡＬＫＫＡ−ａｍｉｄｅ，  ε−Ｌｙｓ  ｓｕｃｃｉｎｙｌ  ａｍｉｄｅ，  Ｖｉｒａｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｅａｔ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ：  ＥＡＬＡＷＥＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＨＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＡ（配列番号６６），  ｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｒ８−ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  Ｓｔｅａｒｏｙｌ−ＲＲＲＲＲＲＲＲ−（ＥＡＬＡ）ｎ，  Ｒｅｄｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｚｕｒｉｎ  ‘ｐ１８’  Ａｚｕｒｉｎ  Ｌｅｕ５０−Ｇｌｙ６７：  ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＭＧＡＳＧ（配列番号６７），  Ｒｅｄｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｚｕｒｉｎ  ‘ｐ２８’  Ａｚｕｒｉｎ  Ｌｅｕ５０−Ａｓｐ７７：  ＬＳＴＡＡＤＭＱＧＶＶＴＤＭＧＡＳＧＬＤＫＤＹＬＫＰＤＤ（配列番号６８），  Ｉｎｆｌｕｅｎｃａ  ＨＡ−２  （１−２０）  ＫＡＬＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＡＣＥＡ（配列番号６９），  Ｎ
ｉｃｋＦｅｃｔｓ  ＮＦ６１：  Ｓｔｅａｒｙｌ−ＡＧＹＬＬＧＯＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号７０）−ａｍｉｄｅ，  Ｎｏｎａａｒｇｉｎｉｎｅ  （Ｒ９）  ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ，  Ｓｔｅａｒｙｌａｔｅｄ  ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｓｔｅａｒｙｌ−ＲＲＲＲＲＲＲＲ，  Ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｄ３７０１  ＴＲＹＬＲＩＨＰＲＳＷＶＨＱＩＡＬＲＬＲＹＬＲＩＨＰＲＳＷＶＨＱＩＡＬＲＳ（配列番号７１），  Ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｐＴＧ１  ＧＬＰＫＡＬＬＫＬＬＫＳＬＷＫＬＬＬＫＡ（配列番号７２），  Ｈｕｍａｎ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｐａｒｔｉａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ９−３２，  ｈＣＴ（９−３２）−ｂｒ  ＬＧＴＹＴＱＤＦＮＫ（Ｘ）ＦＨＴＦＰＱＴＡＩＧＶＧＡＰ（配列番号７３）−ａｍｉｄｅ  Ｘ：  ＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＧＶＧＦＡ（配列番号７４），  Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲ（配列番号７５）、  （Ｈｐｈ−１）−ＧＡＬ４（ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ），  Ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔ−ａｎｔｉｇｅｎ  （ＮＬＳ）  ＰＫＫＫＲＫ（配列番号７６），  Ｓｔｅａｒｙｌａｔｅｄ  ＮＬＳ  Ｓｔｅａｒｙｌ−ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号７７），  Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｃ  ＮＬＳ  （Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）  （ＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧＣ（配列番号７８））２，  Ｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎ  ＮＬＳ，  ｂｉｐａｒｔｉｔｅ  ＮＬＳ  ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号７９），  Ｋｕ７０２−ＮＬＳ  Ｃ−ＧＳＫＧＡＲＰＡＫＫＲＫＰＫＲＧＡＡＨＫ−ＨＡＧＡＫＶＲＫＴＶＴＧＡＫＫ（配列番号８０），  ＡＤＡＲ１  ＮＬＳ  ＭＭＰＮＶＫＲＫＩＧＥＬＶＲＹＬＮＴＮＰＶＧ（配列番号８１），  ＧｌｕＯｃｔ６  ＥＥＥＡＡＧＲＫＲＫＫＲＴ（配列番号８２），  ＲｅＩＢ  ４０５ＹＧＶＤＫＫＲＫＲＧＭＰＤＶＬＧＥＬＮＳ４２４−４２５ＳＤＰＭＧＩＥＳＫＲＲＫＫＫＰＡＩＬＤＨＦＬ４４６（配列番号８３），  Ｄｅｒｍａｓｅｐｔｉｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｋ４−ＮＬＳ  ＰＶＫ：  ＰＫＫＫＲＬＫＶＡＫＷＫＴＬＬＫＫＶＬＫＡ（配列番号８４）−ａｍｉｄｅ，  Ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＹＫＱＣＨＫＫＧＧＸＫＫＧＳＧ（配列番号８５），  Ｏｐｉｏｉｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｄｉｍｅｔｈｙｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｒＦＫＦ−ＮＨ２，  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｆ−ｒ−Ｆ−Ｋ−Ｆ−ｒ−Ｆ−Ｋ，  Ｍｉｔｏｐａｒａｎ  ＮＬＫＫＬＡＫＬ（Ａｉｂ）ＫＫＩＬ（配列番号８６），  Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｌ１  ＹＱＲＬＣ（配列番号８７），  Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｌ２  ＣＮＰＧＹ（配列番号８８），２８９−Ｗ：  ＲＷＩＫＩＷＦＷＷＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号８９），Ｌ１７Ｅ：  ＩＷＬＴＡＬＫＦＬＧＫＨＡＡＫＨＥＡＫＱＱＬＳＫＬ（配列番号９０），Ｌ−Ｋ６：  ＩＫＩＬＳＫＩＫＫＬＬＫ（配列番号９１）等が挙げられ、Ｒ８、Ｒ８−ＮＨ２、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ  ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ，  ＨＩＶ��ＴＡＴ  （４７−５７）  ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ，  ＨＩＶ−ＴＡＴ  （４８−６０）  ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ，  ｐＶＥＣ  ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ−ＮＨ２，  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ  （ＴＰ１０）  ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ−ＮＨ２，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＡＲＫＫＡＡＫＡ、２８９−Ｗ、Ｌ１７Ｅ、Ｌ−Ｋ６が好ましく、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、Ｒ８、Ｒ８−ＮＨ２、ｐＶＥＣ、２８９−Ｗ、Ｌ１７Ｅ、Ｌ−Ｋ６がより好ましく、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、Ｒ８−ＮＨ２が特に好ましい。なお、これら細胞膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸の立体配置は、特に断りのない限りＬ体であり、Ｄ体のアミノ酸から構成される場合は、例えば、Ｄ−Ｒ８−ＮＨ２のように立体を明記することとする。Ｄ体のアミノ酸から構成される細胞膜透過性ペプチドとしては、Ｄ−Ｒ８−ＮＨ２が好ましい。
【００１５】
本発明の組成物に含有される細胞膜透過性ペプチドの分子量としては、特に制限はないが、８００〜８０００が好ましく、９００〜６０００がより好ましく、１０００〜４０００が特に好ましい。
【００１６】
本発明の組成物に含有される細胞膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸は、多くのアルギニン残基を含むことが好ましく、それ以外に特に制限はなく、天然アミノ酸でも非天然アミノ酸でもよい。
【００１７】
本発明の組成物に含有される細胞膜透過性ペプチドは、細胞膜透過性ペプチドの塩であってもよく、医薬として許容される塩であれば特に制限はない。細胞膜透過性ペプチドの塩としては無機酸との塩、有機酸との塩等が挙げられる。
【００１８】
無機酸との塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等との塩が挙げられ、塩酸塩が好ましい。
【００１９】
有機酸との塩の例としては、酢酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、アジピン酸、グルコン酸、グルコヘプト酸、グルクロン酸、テレフタル酸、メタンスルホン酸、アラニン、乳酸、馬尿酸、１，２−エタンジスルホン酸、イセチオン酸、ラクトビオン酸、オレイン酸、没食子酸、パモ酸、ポリガラクツロン酸、ステアリン酸、タンニン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、硫酸ラウリル、硫酸メチル、ナフタレンスルホン酸、スルホサリチル酸、トリフルオロ酢酸等との塩が挙げられる。
【００２０】
本発明の組成物において、細胞膜透過性ペプチド及びその塩は、水和物又は溶媒和物の形態をとってもよい。
【００２１】
本発明の組成物において、細胞膜透過性ペプチド又はその塩の含有量は、医薬として許容される量であれば、特に制限されず、その下限が、例えば０．００１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは１％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは５％（ｗ／ｖ）であり、その上限が、例えば３５％（ｗ／ｖ）、好ましくは３０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは２５％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは２０％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは１５％（ｗ／ｖ）である。さらに、それらの上限と下限は適宜組み合わせて使用することができる。例えば、下限の５％（ｗ／ｖ）と上限の３５％（ｗ／ｖ）、３０％（ｗ／ｖ）、２５％（ｗ／ｖ）、２０％（ｗ／ｖ）及び１５％（ｗ／ｖ）を組み合わせて、５〜３５％（ｗ／ｖ）、５〜３０％（ｗ／ｖ）、５〜２５％（ｗ／ｖ）、５〜２０％（ｗ／ｖ）、５〜１５％（ｗ／ｖ）のように範囲を設定することができる。より具体的には、本発明の組成物において、細胞膜透過性ペプチド又はその塩の含有量は、例えば、０．００１〜３５％（ｗ／ｖ）が好ましく、０．０１〜３０％（ｗ／ｖ）がより好ましく、０．１〜２５％（ｗ／ｖ）がさらにより好ましく、１〜２０％（ｗ／ｖ）が特に好ましく、５〜１５％（ｗ／ｖ）が最も好ましい。
【００２２】
本発明の組成物では、細胞透過性ペプチド又はその塩と、薬物とのモル比を自由に設定することができ、細胞透過性ペプチド又はその塩：薬物のモル比は、特に制限されないが、例えば１：１０００、１：２００、１：１００、１：１０、１：２、１：１、２：１、１０：１、１００：１、２００：１または１０００：１の任意の組合せの間であってよい。具体的には、細胞透過性ペプチド又はその塩と、薬物とのモル比は、例えば、１：１０００〜１０００：１、１：２００〜２００：１、１：１００〜１００：１、１：１０〜１０：１、１：２〜２：１の範囲内であってよい。別の観点で、細胞透過性ペプチド又はその塩は、薬物に対して当量未満であっても眼組織中への薬物の移行性を改善可能なことから、上記モル比は１：１．１以上であってよい。具体的には、細胞透過性ペプチド又はその塩と、薬物とのモル比は、例えば、１：１０００〜１：１．１、１：２００〜１：１．１、１：１００〜１：１．１、１：１０〜１：１．１、１：２〜１：１．１の範囲内であってよい。また、薬物の量が少なくても眼組織へ十分に移行し得るから、上記モル比は１．１以上：１であってよい。具体的には、細胞透過性ペプチド又はその塩と、薬物とのモル比は、例えば、１０００：１〜１．１：１、２００：１〜１．１：１、１００：１〜１．１：１、１０：１〜１．１：１、２：１〜１．１：１の範囲内であってよい。
【００２３】
なお、本発明の組成物において細胞膜透過性ペプチドの塩が含有される場合、これらの値は塩の質量を基準にした含有量である。なお、「％（ｗ／ｖ）」は、本発明の組成物１００ｍＬ中に含まれる対象成分（ここでは、細胞膜透過性ペプチド）の質量（ｇ）を意味する。対象成分が界面活性剤等の添加剤等である場合も同様であり、またその塩や水和物が含有される場合は、これらの値は塩や水和物の質量を基準にした含有量である。
【００２４】
本発明の組成物は、必要に応じて添加剤を含有することができる。添加剤の例としては、界面活性剤、緩衝化剤、等張化剤、安定化剤、防腐剤、抗酸化剤、粘稠化剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。
【００２５】
本発明の組成物には、医薬品の添加物として使用可能な界面活性剤を適宜配合することができる。ただし、本発明では細胞膜透過性ペプチドによって薬の眼組織への移行性が向上しているため、界面活性剤の使用は必須ではない。この観点で、組成物中の界面活性剤の含有量は、好ましくは０．２％（ｗ／ｖ）未満、より好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）未満、さらに好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）未満、最も好ましくは０．００１％（ｗ／ｖ）未満である。
【００２６】
本発明の組成物には、医薬品の添加物として使用可能な緩衝剤を配合することができる。緩衝剤の例としては、リン酸又はその塩、或いはそれらの水和物等が挙げられる。
【００２７】
本発明の組成物は、１つ又は複数の、好ましくは１〜３つの、より好ましくは１つ又は２つの薬物を含有することができる。薬物としては、フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、ＦＤ（ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ）４、ＦＤ１０、リン酸ブレドニゾロン、ペミロラスト、ホスミドマイシン、リン酸ベタメサゾン、ジクロフェナク、リン酸ヒドロコルチゾン、ローダミン、ブリンゾラミド、ドルゾラミド塩酸塩、オロパタジン塩酸塩、プロプラノロール塩酸塩、チモロールマレイン酸塩、ブリモニジン酒石酸塩等の低分子医薬のほか、核酸医薬、抗体医薬、タンパク質医薬等の高分子医薬が挙げられる。好ましい薬物の具体的な例としては、分子内にカルボキシル基（ＣＯ２Ｈ）、スルホン酸基（ＳＯ３Ｈ）、リン酸基（ＯＰＯ３Ｈ）及び水酸基（ＯＨ）からなる群より選択される置換基を１又は複数個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個有する薬物が挙げられ、分子内にカルボキシル基及び水酸基からなる群より選択される置換基を１又は複数個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個有する薬物がより好ましく、分子内にカルボキシル基及びフェノール性水酸基からなる群より選択される置換基を１又は複数個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個有する薬物が特に好ましい。
【００２８】
また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を利用して細胞膜透過性ペプチドと薬物の間の相互作用を測定する評価系により、本発明の組成物に含まれる好ましい薬物を、使用する細胞膜透過性ペプチドに応じて選択することができる。
【００２９】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）測定を利用した評価系は、表面プラズモン共鳴分析装置、好ましくは、例えばＢｉａｃｏｒｅＴ２００（ＧＥヘルスケア）を使用して、レゾナンスユニット（ＲＵ）値を測定することにより細胞膜透過性ペプチドと薬物の相互作用の強度を評価する系である。細胞膜透過性ペプチドは、センサーチップにアミド結合やジスルフィド結合を介して直接固定化されてもよいし、ビオチン−アビジン相互作用を介して固定化されてもよく、例えば細胞膜透過性ペプチドをビオチンと共有結合させた分子をアビジンを介してセンサーチップ（例えば、Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＳＡ／ＧＥヘルスケア）に固定化させるのが好ましい。細胞膜透過性ペプチドをセンサーチップに固定化した後、薬物を０．０００１〜１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０００５〜０．１％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．００１〜０．０１％（ｗ／ｖ）含有する溶液を０．５〜１０分間、好ましくは１〜７分間、より好ましくは２〜５分間かけてインジェクトする。この時、移動相（バッファー）は、好ましくはＨＢＳ−Ｐ、ＨＢＳ−Ｎ、ＰＢＳ、ＨＢＳ−ＥＰなどが用いられ、５〜５０μＬ／分、好ましくは１０〜４０μＬ／分、より好ましくは２０〜３０μＬ／分の流速で流すとよい。薬物のインジェクション開始前のＲＵ値とインジェクション終了１〜１０分後、好ましくは３〜７分後、より好ましくは５分後のＲＵ値の差（ΔＲＵ）を求めることにより、本発明の組成物に含まれる好ましい薬物を、使用する細胞膜透過性ペプチドに応じて選択することができる。
【００３０】
本発明の組成物に含まれる好ましい薬物は、表面プラズモン共鳴分析試験を利用した評価系において測定に用いた薬物を含有する溶液の薬物濃度によっても異なるが、ΔＲＵ×１００／Ｍｗ（ここで、Ｍｗは薬物の分子量（Ｄａ））の値が０．０１以上、好ましくは０．１以上、より好ましくは０．２以上、特に好ましくは０．４以上である薬物である。本発明の組成物に含まれる好ましい薬物として、ΔＲＵ×１００／Ｍｗの上限に特に制限はないが、好ましくは３００以下、より好ましくは２００以下、特に好ましくは１５０以下、最も好ましくは１００以下である。本発明の組成物に含まれる好ましい薬物は、ΔＲＵ×１００／Ｍｗが０．０１〜３００、より好ましくは０．１〜２００、特に好ましくは０．２〜１５０、最も好ましくは０．４〜１００である薬物である。これらΔＲＵは、使用する細胞膜透過性ペプチド毎に測定できる。
【００３１】
本発明の組成物に薬物を配合する場合、その含有量は、薬物の種類等により適宜調整することができ、０．００００１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましく、０．０００５〜５％（ｗ／ｖ）がより好ましく、０．００１〜３％（ｗ／ｖ）がさらに好ましく、０．００１〜２％（ｗ／ｖ）が最も好ましい。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、例えば、溶液のほか懸濁剤、エマルジョン、リポソーム、マイクロスフェア、デポ剤などであってもよく、溶媒又は分散媒は水であることが好ましく、水溶液であることが最も好ましい。
【００３３】
本発明の組成物の剤形は、眼科用医薬品として使用可能なものであれば特に制限されないが、例えば、点眼剤、眼軟膏、注射剤が挙げられ、点眼剤が好ましい。注射剤としては、硝子体内投与、前房内投与、結膜嚢内投与、前房内投与、結膜下投与又はテノン嚢下投与用の注射剤が挙げられる。これらの剤形は、当該技術分野における通常の方法に従って製造することができる。
【００３４】
本発明の組成物は、薬物の眼組織への移行性に優れる。薬物が移行される眼組織は、角膜のほか、結膜、ブドウ膜、眼瞼、前房、毛様体、虹彩、水晶体、硝子体、網膜、脈絡膜等が挙げられる。
【００３５】
上記の本発明の組成物の詳細な説明は、本発明のドラッグデリバリーシステム、薬物の眼組織への移行性を向上させる方法にも適用される。
【００３６】
本発明のドラッグデリバリーシステムは、細胞膜透過性ペプチド又はその塩を含有し、送達対象の薬物と共有結合させずに用いられる眼科用ドラッグデリバリーシステムである。
【００３７】
本発明の薬物の眼組織への移行性を向上させる方法は、眼科用医薬組成物に細胞膜透過性ペプチド又はその塩を薬物と共有結合させずに含有させることを含む。
【００３８】
本発明の方法によれば、薬物の眼組織への移行性が向上し、より低用量の薬物で薬効を発揮することができる。
【実施例】
【００３９】
以下に製剤例、薬物透過性試験、安全性試験及び表面プラズモン共鳴分析試験の結果を示すが、これらは本発明をより良く理解するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４０】
製剤例
以下に本発明の代表的な製剤例を示す。なお、下記製剤例において各成分の配合量は製剤１ｍＬ中の含量である。
【００４１】
製剤例１
Ｒ８−ＮＨ２                          １０ｍｇ
リン酸緩衝液                          適量
精製水                                適量
【００４２】
製剤例２
Ｒ８                                １０ｍｇ
リン酸緩衝液                          適量
精製水                                適量
【００４３】
製剤例３
ＨＩＶ−ＴＡＴ  （４８−６０）                １０ｍｇ
リン酸緩衝液                          適量
精製水                                適量
【００４４】
なお、前記製剤例１〜３における細胞膜透過性ペプチド及び添加剤の種類や配合量、並びに、ｐＨを適宜調整し所望の組成物を得ることができる。
【００４５】
１．薬物移行性試験１
１−１．被験製剤の調製
Ｒ８−ＮＨ２・９ＴＦＡ塩（９．０９ｍｇ）を０．９６％ＰＢＳ溶液に溶解し、１０００μＭの溶液を調製した（溶液Ａ）。６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）（７．５２ｍｇ）を０．９６％ＰＢＳ溶液に溶解し、２０００μＭの溶液を調製した（溶液Ｂ）。
溶液Ｂを０．９６％ＰＢＳ溶液で希釈して、１０００μＭの６−ＦＡＭ溶液を調製し比較例１とした。
溶液Ｂと０．９６％ＰＢＳ溶液で５０倍希釈した溶液Ａを１：１で混合したものを実施例１とした。溶液Ａと溶液Ｂを１：１で混合したものを実施例２とした。
【００４６】
【表１】
2019099578.tif 000002
【００４７】
１−２．試験方法
ヒト３次元角膜上皮（ＬａｂＣｙｔｅ  ＣＯＲＮＥＡ−ＭＯＤＥＬ，Ｊ−ＴＥＣ社製）を付属の培地中でＣＯ２インキュベータ内にて１時間培養後、各ウェルの培地を除去し上記サンプルを５０μＬずつ添加し、ＣＯ２インキュベータ内で５分間暴露した。上清を除去し、細胞表面にＰＢＳを５００ｕＬずつ添加し、吸引除去する操作を３回繰り返した。ＰＢＳを５０ｕＬずつ添加し、蛍光顕微鏡（ＢＺ−Ｘ７００）で各ウェルのフルオレセインの蛍光顕微鏡写真を撮影した（露光時間；５０ｍｓ）。顕微鏡写真は画像解析ソフトＩｍａｇｅＪのＡｎａｌｙｚｅメニューのＭｅａｓｕｒｅモードを用いて解析した。
【００４８】
１−３．試験結果及び考察
試験結果を図１に示す。図１から分かるように、Ｒ８−ＮＨ２非共存下に比べて、Ｒ８−ＮＨ２共存下で６−ＦＡＭの角膜上皮細胞への移行率が向上した。以上の結果より、細胞膜透過性ペプチド又はその塩を含有する医薬組成物は、薬物の眼組織への移行性を向上させることが分かった。
【００４９】
２．薬物移行性試験２
２−１．被験製剤の調製
Ｒ８−ＮＨ２・９ＴＦＡ塩（４．５４ｍｇ）を０．９６％ＰＢＳ溶液に溶解させ、１０００μＭの溶液を調製した（溶液Ｃ）。フルオレセイン（３．３４ｇ）を０．９６％ＰＢＳ溶液に溶解させ、５００μＭの溶液を調製した（溶液Ｄ）。
溶液Ｄを０．９６％ＰＢＳ溶液で希釈して、２５０μＭの  フルオレセイン溶液を調製し比較例２とした。
また、溶液Ｃと溶液Ｄを１：１で混合したものを実施例３とした。
【００５０】
【表２】
2019099578.tif 000003
【００５１】
２−２．試験方法
薬物移行性試験１と同様の方法により試験を行った。蛍光顕微鏡写真の撮影の露光時間は１０ｍｓとした。
【００５２】
２−３．試験結果及び考察
試験結果を図２に示す。図２から分かるように、Ｒ８−ＮＨ２非共存下に比べて、Ｒ８−ＮＨ２共存下でフルオレセインの角膜上皮細胞への移行率が向上した。以上の結果より、細胞膜透過性ペプチド又はその塩を含有する医薬組成物は、薬物の眼組織への移行性を向上させることが分かった。
【００５３】
３．薬物移行性試験３
３−１．被験製剤の調製
ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−ＮＨ２・７ＴＦＡ塩（０．３ｍｇ）を０．９６％ＰＢＳ溶液に溶解させ、１０００μＭの溶液を調製した（溶液Ｅ）。
溶液Ｂと溶液Ｅを１：１で混合したものを実施例４とした。
【００５４】
【表３】
2019099578.tif 000004
【００５５】
３−２．試験方法
薬物移行性試験１と同様の方法により試験を行った。蛍光顕微鏡写真の撮影の露光時間は５０ｍｓとした。
【００５６】
３−３．試験結果及び考察
試験結果を図３に示す。図３から分かるように、ｐｅｎｅｔｒｔｉｎ−ＮＨ２非共存下に比べて、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−ＮＨ２共存下で６−カルボキシフルレセイン（６ＦＡＭ）の角膜上皮細胞への移行率が向上した。以上の結果より、細胞膜透過性ペプチド又はその塩を含有する医薬組成物は、薬物の眼組織への移行性を向上させることが分かった。
【００５７】
４．安全性試験１
４−１．被験製剤の調製
Ｒ８−ＮＨ２・９ＴＦＡ塩（９．０９ｍｇ）を０．９６％ＰＢＳ溶液に溶解させ、５００μＭの溶液を調製した（溶液Ｆ）。溶液Ｆを０．９６％ＰＢＳ溶液で希釈して、１０μＭ、１００μＭ、５００μＭの溶液を調製し、それぞれ実施例５、実施例６、実施例７とした。
【００５８】
４−２．試験方法
ＭＴＴ試薬（６．７４ｍｇ）を１３．４８ｍｌのアッセイ培地で希釈して調製したＭＴＴ培地を０．５ｍＬずつ新たな２４穴プレートに分注し、０．９６％ＰＢＳ溶液（陰性対照）、実施例５、実施例６または実施例７に２時間暴露したヒト３次元角膜上皮（ＬａｂＣｙｔｅ  ＣＯＲＮＥＡ−ＭＯＤＥＬ，Ｊ−ＴＥＣ社製）の入ったウェルを上述のプレートに設置した。ＣＯ２インキュベータ内で３時間静置し、各ウェルを取り外し、細胞部分を切り取った。切り取った細胞を１．５ｍＬのＰＰチューブに入れ３００  ｕＬのイソプロパノールに２時間以上浸漬した。このイソプロパノールを９６ウェルプレートに２００μＬずつ注入し、吸光度（５４０ｎｍ−６５５ｎｍの吸光度の差を使用）をプレートリーダーで測定し以下の計算式で生細胞率を算出した。
【数１】
2019099578.tif 000005
【００５９】
４−３．試験結果及び考察
試験結果を図４に示す。図４から分かるように、１０〜５００μＭのＲ８−ＮＨ２を２時間暴露しても角膜細胞に対して細胞障害性を示さなかった。以上の結果より、細胞膜透過性ペプチド又はその塩を含有する医薬組成物は、眼科適用できる安全性を示すことが分かった。
【００６０】
５．安全性試験２
５−１．被験製剤の調製
上記１−１．で調製した比較例１及び３−１．で調製した実施例４を用いた。
【００６１】
５−２．試験方法
ＭＴＴ試薬（６．７４ｍｇ）を１３．４８ｍｌのアッセイ培地で希釈して調製したＭＴＴ培地を０．５ｍＬずつ新たな２４穴プレートに分注し、０．９６％ＰＢＳ溶液（陰性対照）、実施例４または比較例１に５分間暴露したヒト３次元角膜上皮（ＬａｂＣｙｔｅ  ＣＯＲＮＥＡ−ＭＯＤＥＬ，Ｊ−ＴＥＣ社製）の入ったウェルを上述のプレートに設置した。ＣＯ２インキュベータ内で２時間静置し、各ウェルを取り外し、細胞部分を切り取った。切り取った細胞を１．５ｍＬのＰＰチューブに入れ３００  ｕＬのイソプロパノールに２時間以上浸漬した。このイソプロパノールを９６ウェルプレートに２００μＬずつ注入し、吸光度（５４０ｎｍ−６５５ｎｍの吸光度の差を使用）をプレートリーダーで測定し「数１」の計算式で生細胞率を算出した。
【００６２】
５−３．試験結果及び考察
試験結果を図５に示す。図５から分かるように、５００μＭのｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−ＮＨ２・７ＴＦＡ塩も角膜細胞に対して細胞障害性を示さなかった。以上の結果より、細胞膜透過性ペプチド又はその塩を含有する医薬組成物は、眼科適用できる安全性を示すことが分かった。  
【００６３】
６．表面プラズモン共鳴分析試験
６−１  ビオチン化細胞膜透過性ペプチドの合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−アルギニンとＲｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（登録商標））を用いて固相合成したＦｍｏｃ−Ｒ８−レジン（０．１２４ｍｍｏｌ）を２０％  Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ／ＤＭＦ８ｍｌ中で１時間常温で撹拌し脱Ｆｍｏｃを行った。
レジンをＤＭＦ、ジクロロメタン、メタノールで洗浄後、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）  ９１．３  ｍｇ，縮合剤（ＨＢＴＵ）１４２．４  ｍｇ，ジイソプロピルエチルアミン  ６４．５  μＬ，ＤＭＦ  １１ｍｌを加え終夜室温で撹拌した。反応後、レジンを洗浄し乾燥した。
【００６４】
ビオチン化Ｒ８−レジン（７６４．３  ｍｇ）をＴＦＡ、フェノール、チオアニソール、水、エタンジチオール（８３：６．３：４．３：４．３：２．１）混合溶液を用いて室温で４時間撹拌した。反応後レジンを濾過にて除去した。濾液を減圧濃縮し溶媒を留去したのち分取ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル系）により精製を行い、目的のビオチン化Ｒ８−ＮＨ２・８ＴＦＡ塩を得た（４６．７ｍｇ）。また、ビオチン化Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−ＮＨ２、ビオチン化Ｄ−Ｒ８−ＮＨ２、ビオチン化ＡＲＫＫＡＡＫＡ−ＮＨ２ビオチン化ＴＡＴ（４７−５７）−ＮＨ２、ビオチン化ＨＩＶ−ＴＡＴ  （４８−６０）−ＮＨ２は、ビオチン化Ｒ８−ＮＨ２と同様の方法により合成した。
【００６５】
６−２．ビオチン化細胞膜透過性ペプチド溶液の調製
ビオチン化Ｒ８−ＮＨ２・８ＴＦＡ塩（１．４９ｍｇ）を４．９ｍｌのバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）  に溶解させ１０倍希釈後、遠心分離（１２０００  ｒｐｍ，１０分）し３０μｇ／ｍｌの溶液を調製した。
【００６６】
また、同様にビオチン化Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−ＮＨ２・７ＴＦＡ塩（１．３３ｍｇ）を４．４ｍｌのバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）  に溶解させ１０倍希釈後、遠心分離（１２０００  ｒｐｍ，１０分）し３０μｇ／ｍｌのビオチン化Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−ＮＨ２・７ＴＦＡ塩溶液を調製した。
同様にビオチン化Ｄ−Ｒ８−ＮＨ２・８ＴＦＡ塩（２．１３ｍｇ）を７．１ｍｌのバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）  に溶解させ１０倍希釈後、遠心分離（１２０００  ｒｐｍ，１０分）し３０μｇ／ｍｌの溶液を調製した。
ビオチン化ＡＲＫＫＡＡＫＡ−ＮＨ２・４ＴＦＡ塩（０．４ｍｇ）を１．３ｍｌのバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）  に溶解させ１０倍希釈後、遠心分離（１２０００  ｒｐｍ，１０分）し３０μｇ／ｍｌの溶液を調製した。
ビオチン化ＴＡＴ（４７−５７）−ＮＨ２・８ＴＦＡ塩（１．６ｍｇ）を５．４ｍｌのバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）  に溶解させ１０倍希釈後、遠心分離（１２０００  ｒｐｍ，１０分）し３０μｇ／ｍｌの溶液を調製した。
ビオチン化ＨＩＶ−ＴＡＴ  （４８−６０）−ＮＨ２・８ＴＦＡ塩（４．２ｍｇ）を１３．９ｍｌのバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）  に溶解させ１０倍希釈後、遠心分離（１２０００  ｒｐｍ，１０分）し３０μｇ／ｍｌの溶液を調製した。
【００６７】
６−３．被験溶液の調製
６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）（３．７５ｍｇ）を１０ｍｌのバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）に溶解し、遠心分離（１２０００  ｒｐｍ，１０分）し５００μＭの溶液を調製し被験溶液１とした。
ローダミン１２３（１．９５ｍｇ）を  １０ｍｌのバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）に溶解させ遠心分離（１２０００  ｒｐｍ，１０分）し５００μＭの溶液を調製し被験溶液２とした。
フルオレセイン（３．３２ｍｇ）を  ２０ｍｌのバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）に溶解させ遠心分離（１２０００  ｒｐｍ，１０分）し５００μＭの溶液を調製し被験溶液３とした。
ＦＤ４（８．１９ｍｇ）を  ２ｍｌのバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）に溶解し、遠心分離（１２０００  ｒｐｍ，１０分）し５００μＭの溶液を調製し被験溶液４とした。
ＦＤ１０（１９．６３ｍｇ）を  ２ｍｌのバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）に溶解し、遠心分離（１２０００  ｒｐｍ，１０分）し５００μＭの溶液を調製し被験溶液５とした。
リン酸プレドニゾロン（４．８４ｍｇ）を  １０ｍｌのバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）に溶解し、遠心分離（１２０００  ｒｐｍ，１０分）し５００μＭの溶液を調製被験溶液６とした。
ペミロラストカリウム（２．６７ｍｇ）を  １０ｍｌのバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）に溶解し、遠心分離（１２０００  ｒｐｍ，１０分）し５００μＭの溶液を調製し被験溶液７とした。
ホスミドマイシン（１．１０ｍｇ）を  ２ｍｌのバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）に溶解し、遠心分離（１２０００  ｒｐｍ，１０分）し５００μＭの溶液を調製し被験溶液８とした。
リン酸ベタメサゾン（１．８ｍｇ）を  ３．５ｍｌのバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）に溶解し、遠心分離（１２０００  ｒｐｍ，１０分）し５００μＭの溶液を調製し被験溶液９とした。
ジクロフェナクナトリウム（１．１ｍｇ）を  ３．５ｍｌのバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）に溶解し、遠心分離（１２０００  ｒｐｍ，１０分）し５００μＭの溶液を調製し被験溶液１０とした。
リン酸ヒドロコルチゾン（０．５ｍｇ）を  １．２ｍｌのバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）に溶解し、遠心分離（１２０００  ｒｐｍ，１０分）し５００μＭの溶液を調製し被験溶液１１とした。
ブリンゾラミド（３．８ｍｇ）を  １０ｍｌのバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）に溶解し、１０００μＭの溶液を調製した。本溶液をさらにバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）で５００μＭに希釈後、遠心分離（１２０００  ｒｐｍ，１０分）し、被験溶液１２とした。
ドルゾラミド塩酸塩（３．６ｍｇ）を  １０ｍｌのバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）に溶解し、遠心分離（１２０００  ｒｐｍ，１０分）し１０００μＭの溶液を調製した。本溶液をさらにバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）で５００μＭに希釈後、遠心分離（１２０００  ｒｐｍ，１０分）し、被験溶液１３とした。
オロパタジン塩酸塩（３．７ｍｇ）を  １０ｍｌのバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）に溶解し、１０００μＭの溶液を調製した。本溶液をさらにバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）で５００μＭに希釈後、遠心分離（１２０００  ｒｐｍ，１０分）し、被験溶液１４とした。
プロプラノロール塩酸塩（３．０ｍｇ）を  １０ｍｌのバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）に溶解し、１０００μＭの溶液を調製した（溶液Ｄ）。本溶液をさらにバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）で５００μＭに希釈後、遠心分離（１２０００  ｒｐｍ，１０分）し、被験溶液１５とした。
チモロールマレイン酸塩（４．３ｍｇ）を        １０ｍｌのバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）に溶解し、１０００μＭの溶液を調製した。本溶液をさらにバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）で５００μＭに希釈後、遠心分離（１２０００  ｒｐｍ，１０分）し、被験溶液１６とした。
ブリモニジン酒石酸塩（４．４ｍｇ）を  １０ｍｌのバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）に溶解し、１０００μＭの溶液を調製した（溶液Ｇ）。本溶液をさらにバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）で５００μＭに希釈後、遠心分離（１２０００  ｒｐｍ，１０分）し、被験溶液１７とした。
【００６８】
６−４．試験方法
表面プラズモン共鳴分析装置（ＢｉａｃｏｒｅＴ２００／ＧＥヘルスケア）を用いて、ビオチン化Ｒ８−ＮＨ２溶液又はビオチン化Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−ＮＨ２、ビオチン化Ｄ−Ｒ８−ＮＨ２、ビオチン化ＡＲＫＫＡＡＫＡ−ＮＨ２、ビオチン化ＴＡＴ（４７−５７）−ＮＨ２、ビオチン化ＨＩＶ−ＴＡＴ  （４８−６０）−ＮＨ２をそれぞれセンサーチップ（Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＳＡ／ＧＥヘルスケア）に固定化（ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ  ：  ５  μＬ／ｍｉｎ、ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ：５ｍｉｎ）した後、被験溶液を１００μＬ注入した（ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ  ：  ２０μＬ／ｍｉｎ、ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ：５ｍｉｎ）。バッファーは（ＨＢＳ−ＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ／ＧＥヘルスケア）を用いた。被験溶液のインジェクション開始前のＲＵ値（ｂａｓｅｌｉｎｅ）とインジェクション５分後のＲＵ値（ｂｉｎｄｉｎｇ）を測定してその差（ΔＲＵ）を求め、ΔＲＵ×１００／Ｍｗ（ここで、Ｍｗは薬物の分子量（Ｄａ））を相互作用の指標とした。なお、被験溶液のインジェクション前後のＲＵ値は、２流路使用により、Ｒ８−ＮＨ２  センサーチップ固定化面のＲＵ値からセンサーチップの非固定化面のＲＵ値をブランクとして引いた値を測定した。また、次の被験溶液を注入する前には、１ＭＮａＣｌ水溶液を３０秒流しセンサーチップを再生した。
【００６９】
６−５．試験結果及び考察
試験結果を図６から図１３に示す。Ｒ８−ＮＨ２の共存により角膜上皮細胞への移行率の向上が確認された６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）及びフルオレセインは、表面プラズモン共鳴分析試験においてＲ８−ＮＨ２への高いアフィニティを示している（図６）。この事実は、細胞膜透過性ペプチドと薬物のアフィニティが、細胞膜透過性ペプチドを、眼組織への移行を促進すべき薬物の種類に応じて選択する際の指標となりうることを示唆している。
【００７０】
７．角膜上皮細胞による細胞膜透過性ペプチドの移行性試験１
７−１．６−ＦＡＭ結合細胞膜透過性ペプチドの合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−アルギニンとＲｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（登録商標））を用いて固相合成したＦｍｏｃ−Ｒ８−レジン（０．１４０ｍｍｏｌ）を２０％  Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ／ＤＭＦ８ｍｌ中で１時間常温で撹拌し脱Ｆｍｏｃを行った。
レジンをＤＭＦ、ジクロロメタン、メタノールで洗浄後、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）１０５ｍｇ，縮合剤（ＨＢＴＵ）１６０．０  ｍｇ，ジイソプロピルエチルアミン  ７３．０  μＬ，ＤＭＦ  １０ｍｌを加え終夜室温で撹拌した。反応後、レジンを洗浄し乾燥した。
【００７１】
６−ＦＡＭ−Ｒ８−レジン（６００．０  ｍｇ）をＴＦＡ、トリイソプロピルシラン、水、（９５：２．５：２．５）混合溶液を用いて室温で６時間撹拌した。反応後レジンを濾過にて除去した。濾液を減圧濃縮し溶媒を留去したのち分取ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル系）により精製を行い、目的の６−ＦＡＭ−Ｒ８−ＮＨ２・８ＴＦＡ塩を得た（３０．０ｍｇ）。また、６−ＦＡＭ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−ＮＨ２・７ＴＦＡ塩、６−ＦＡＭ−ＴＡＴ（４７−５７）−ＮＨ２・８ＴＦＡ塩、６−ＦＡＭ−ＨＩＶ−ＴＡＴ  （４８−６０）−ＮＨ２・８ＴＦＡ塩、６−ＦＡＭ−ｐＶｅｃ−ＮＨ２・６ＴＦＡ塩は、６−ＦＡＭ−Ｒ８−ＮＨ２・８ＴＦＡ塩と同様の方法により合成した。
【００７２】
７−２．被験製剤の調製
６−ＦＡＭ−Ｒ８−ＮＨ２・８ＴＦＡ塩（１．２６ｍｇ）を０．９６％ＰＢＳ溶液に溶解し、５０μＭの溶液に調製した。この溶液をさらに０．９６％ＰＢＳ溶液で希釈して、１０μＭの６−ＦＡＭ−Ｒ８−ＮＨ２・８ＴＦＡ塩  溶液を調製し、実施例８とした。
６−ＦＡＭ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−ＮＨ２・７ＴＦＡ塩（３．３９ｍｇ）を０．９６％ＰＢＳ溶液に溶解し、１００μＭの溶液を調製し、実施例１３とした。この溶液をさらに０．９６％ＰＢＳ溶液で希釈して、１０μＭの６−ＦＡＭ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−ＮＨ２・７ＴＦＡ  塩溶液を調製し、実施例９とした。
６−ＦＡＭ−ＨＩＶ−ＴＡＴ（４７−５７）−ＮＨ２・８ＴＦＡ塩（１．４３ｍｇ）を０．９６％ＰＢＳ溶液に溶解し、５０μＭの溶液に調製した。この溶液をさらに０．９６％ＰＢＳ溶液で希釈して、１０μＭの６−ＦＡＭ−ＨＩＶ−ＴＡＴ（４７−５７）−ＮＨ２・８ＴＦＡ塩  溶液を調製し、実施例１０とした。
６−ＦＡＭ−ＨＩＶ−ＴＡＴ（４８−６０）−ＮＨ２・８ＴＦＡ塩（１．４５ｍｇ）を０．９６％ＰＢＳ溶液に溶解し、５０μＭの溶液に調製した。この溶液をさらに０．９６％ＰＢＳ溶液で希釈して、１０μＭの６−ＦＡＭ−ＨＩＶ−ＴＡＴ（４８−６０）−ＮＨ２・８ＴＦＡ塩  溶液を調製し、実施例１１とした。
６−ＦＡＭ−ｐＶｅｃ−ＮＨ２・６ＴＦＡ塩（１．３２ｍｇ）  を０．９６％ＰＢＳ溶液に溶解し、５０μＭの溶液に調製した。この溶液をさらに０．９６％ＰＢＳ溶液で希釈して、１０μＭの６−ＦＡＭ−ｐＶｅｃ−ＮＨ２・６ＴＦＡ塩  溶液を調製し、実施例１２とした。
６−カルボキシフルレセイン（６ＦＡＭ）（１．８９ｍｇ）を０．９６％ＰＢＳ溶液に溶解し、５０μＭの溶液に調製した。この溶液をさらに０．９６％ＰＢＳ溶液で希釈して、１０μＭの６−カルボキシフルレセイン（６ＦＡＭ）溶液を調製し、比較例３とした。
６−カルボキシフルレセイン（６ＦＡＭ）（３．７６ｍｇ）を０．９６％ＰＢＳ溶液に溶解し、１００μＭの溶液に調製し、比較例４とした。
【００７３】
７−３．試験方法
ヒト３次元角膜上皮（ＬａｂＣｙｔｅ  ＣＯＲＮＥＡ−ＭＯＤＥＬ，Ｊ−ＴＥＣ社製）を付属の培地中でＣＯ２インキュベータ内にて１時間培養後、各ウェルの培地を除去し上記サンプルを５０μＬずつ添加し、ＣＯ２インキュベータ内で２時間暴露した。上清を除去し、細胞表面にＰＢＳ溶液を５００ｕＬずつ添加し、吸引除去する操作を３回繰り返した。ＰＢＳ溶液を５０ｕＬずつ添加し、蛍光顕微鏡（ＢＺ−Ｘ７００）で各ウェルのフルオレセインの蛍光顕微鏡写真を撮影した（露光時間；５０ｍｓ）。顕微鏡写真は画像解析ソフトＩｍａｇｅＪのＡｎａｌｙｚｅメニューのＭｅａｓｕｒｅモードを用いて解析した。
【００７４】
７−４．試験結果及び考察
試験結果を図１４及び図１５に示す。図１４及び図１５から分かるように、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、Ｒ８−ＮＨ２、ＨＩＶ−ＴＡＴ  （４７−５７）、ＨＩＶ−ＴＡＴ  （４８−６０）及びｐＶＥＣから誘導した蛍光性分子による蛍光が観測された。以上の結果により、細胞膜透過性ペプチド又はその塩は、角膜移行性を示すことが分かった。
【００７５】
８．角膜上皮細胞による細胞膜透過性ペプチドの移行性試験２
８−１．６−ＦＡＭ結合細胞膜透過性ペプチドの合成
上記７−１．と同様の手法により、目的の６−ＦＡＭ−Ｌ１７Ｅ−ＮＨ２・１０ＴＦＡ塩、６−ＦＡＭ−２８９−Ｗ−ＮＨ２・７ＴＦＡ塩、６−ＦＡＭ−Ｌ−Ｋ６−ＮＨ２・８ＴＦＡ塩を得た。
【００７６】
８−２．被験製剤の調製
６−ＦＡＭ−Ｌ１７Ｅ−ＮＨ２・１０ＴＦＡ塩（１．５８ｍｇ）を０．９６％ＰＢＳ溶液に溶解し、５０μＭの溶液に調製した。この溶液をさらに０．９６％ＰＢＳ溶液で希釈して、１００μＭの６−ＦＡＭ−Ｌ１７Ｅ−ＮＨ２・１０ＴＦＡ塩  溶液を調製し、実施例１４とした。
６−ＦＡＭ−２８９−Ｗ−ＮＨ２・７ＴＦＡ塩（０．３６ｍｇ）を０．９６％ＰＢＳ溶液に溶解し、５０μＭの溶液に調製した。この溶液をさらに０．９６％ＰＢＳ溶液で希釈して、１００μＭの６−ＦＡＭ−２８９−Ｗ−ＮＨ２・７ＴＦＡ塩  溶液を調製し、実施例１５とした。
６−ＦＡＭ−Ｌ−Ｋ６−ＮＨ２・８ＴＦＡ塩（２．５１ｍｇ）  を０．９６％ＰＢＳ溶液に溶解し、５０μＭの溶液に調製した。この溶液をさらに０．９６％ＰＢＳ溶液で希釈して、１００μＭの６−ＦＡＭ−Ｌ−Ｋ６−ＮＨ２・８ＴＦＡ塩  溶液を調製し、実施例１６とした。
【００７７】
８−３．試験方法
ヒト３次元角膜上皮（ＬａｂＣｙｔｅ  ＣＯＲＮＥＡ−ＭＯＤＥＬ，Ｊ−ＴＥＣ社製）を付属の培地中でＣＯ２インキュベータ内にて１時間培養後、各ウェルの培地を除去し上記サンプルを５０μＬずつ添加し、ＣＯ２インキュベータ内で２時間暴露した。上清を除去し、細胞表面にＰＢＳ溶液を５００ｕＬずつ添加し、吸引除去する操作を３回繰り返した。ＰＢＳ溶液を５０ｕＬずつ添加し、蛍光顕微鏡（ＢＺ−Ｘ７００）で各ウェルのフルオレセインの蛍光顕微鏡写真を撮影した（露光時間；１０ｍｓ）。顕微鏡写真は画像解析ソフトＩｍａｇｅＪのＡｎａｌｙｚｅメニューのＭｅａｓｕｒｅモードを用いて解析した。
【００７８】
８−４．試験結果及び考察
試験結果を図１６に示す。図１６から分かるように、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、Ｌ１７Ｅ、２８９−Ｗ及びＬ−Ｋ６から誘導した蛍光性分子による蛍光が観測された。以上の結果により、細胞膜透過性ペプチド又はその塩は、角膜移行性を示すことが分かった。
【００７９】
９．摘出眼球による細胞膜透過性ペプチドの移行性試験１
９−１．被験製剤の調製
上記７−２．と同様の方法で調製した、１０μＭの６−ＦＡＭ−Ｒ８−ＮＨ２・８ＴＦＡ塩  溶液（実施例８）、１０μＭの６−ＦＡＭ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−ＮＨ２・７ＴＦＡ  塩溶液（実施例９）及び１０μＭの６−ＦＡＭ−ＨＩＶ−ＴＡＴ（４７−５７）−ＮＨ２・８ＴＦＡ塩  溶液（実施例１０）を用いた。
【００８０】
９−２．試験方法
１２ウェルプレートの各ウェルの上記サンプルを２ｍｌずつ添加したのち、日本白色家兎の摘出眼球を角膜が下になるように各ウェル中のサンプル溶液に浸漬させ、１時間および４時間暴露した。暴露後、各眼球内の房水をシリンジで採取し、蛍光プレートリーダーで房水の蛍光強度を測定した。また、各眼球の角膜を切除し、プレパラート上にのせ、蛍光顕微鏡で各角膜の蛍光顕微鏡写真を撮影した。撮影した顕微鏡写真は画像解析ソフトＩｍａｇｅＪのＡｎａｌｙｚｅメニューのＭｅａｓｕｒｅモードを用いて解析した。
【００８１】
９−３．試験結果及び考察（角膜移行性）
試験結果を図１７（１時間暴露）及び図１８（４時間暴露）に示す。図１７及び図１８から分かるように、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、Ｒ８−ＮＨ２及びＨＩＶ−ＴＡＴ  （４７−５７）から誘導した蛍光性分子による蛍光が観測された。以上の結果により、細胞膜透過性ペプチド又はその塩は、摘出眼球においても角膜移行性を示すことが分かった。
【００８２】
９−４．試験結果及び考察（房水移行性）
試験結果を表４に示す。
【００８３】
【表４】
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【００８４】
表４から分かるように、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、Ｒ８−ＮＨ２及びＨＩＶ−ＴＡＴ  （４７−５７）から誘導した蛍光性分子は、いずれも房水中への移行が確認された。特に、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎから誘導した蛍光性分子は、投与４時間後において、高い房水移行を示した。以上の結果により、細胞膜透過性ペプチド又はその塩は、摘出眼球においても房水移行性を示すことが分かった。
【００８５】
１０．安全性試験３
１０−１．被験製剤の調製
上記７−２．で調製した実施例８、実施例９、実施例１０、実施例１１、実施例１２及び実施例１３を用いた。
【００８６】
１０−２．試験方法
上記３−１．と同様の方法により、角膜上皮の生細胞率を算出した。
１０−３．試験結果及び考察
試験結果を図１９及び図２０に示す。図１９及び図２０から分かるように、６−ＦＡＭ−Ｒ８−ＮＨ２・８ＴＦＡ塩のほか６−ＦＡＭ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−ＮＨ２・７ＴＦＡ塩、６−ＦＡＭ−ＨＩＶ−ＴＡＴ  （４７−５７）−ＮＨ２・８ＴＦＡ塩、６−ＦＡＭ−ＨＩＶ−ＴＡＴ  （４８−６０）−ＮＨ２・８ＴＦＡ塩及び６−ＦＡＭ−ｐＶＥＣ−ＮＨ２・６ＴＦＡ塩も角膜細胞に対して細胞障害性を示さなかった。以上の結果より、細胞膜透過性ペプチド又はその塩を含有する医薬組成物は、眼科適用できる安全性を示すことが分かった。
【００８７】
１１．安全性試験４
１１−１．被験製剤の調製
上記７−２．で調製した比較例３及び実施例４、並びに、上記８−２．で調製した実施例１４、実施例１５及び実施例１６を用いた。
【００８８】
１１−２．試験方法
上記４−２．と同様の方法により、角膜上皮の生細胞率を算出した。
【００８９】
１１−３．試験結果及び考察
試験結果を図２１に示す。図２１から分かるように、６−ＦＡＭ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−ＮＨ２・７ＴＦＡ塩のほか６−ＦＡＭ−Ｌ１７Ｅ−ＮＨ２・１０ＴＦＡ塩、６−ＦＡＭ−２８９−Ｗ−ＮＨ２・７ＴＦＡ塩及び６−ＦＡＭ−Ｌ−Ｋ６−ＮＨ２・８ＴＦＡ塩も角膜細胞に対して細胞障害性を示さなかった。以上の結果より、細胞膜透過性ペプチド又はその塩を含有する医薬組成物は、眼科適用できる安全性を示すことが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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