(57)【要約】【課題】癌治療に使用される組換えキメラ融合タンパク質の提供。【解決手段】本発明は、抗ＥＧＦＲｌ−ＴＧＦβＲＩＩ、抗ＥＧＦＲ１−ＰＤ１、及び抗ＣＴＬＡ４−ＰＤ１の融合分子、並びに融合分子の作製方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療効果のある融合タンパク質を調製する方法であって、前記融合タンパク質が、腫瘍標的部分及び少なくとも１つの免疫調節分子を含み、前記腫瘍標的部分が、ＣＴＬＡ−４又はＥＧＦＲ１に結合する抗体であり、且つ前記融合タンパク質が次のステップ：
前記融合タンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を調製するステップであって、前記抗体の前記コドン最適化ヌクレオチド配列が、前記抗体の重鎖のＣ末端におけるリジンの発現のためのヌクレオチドを欠失している、ステップ；
一過性の又は安定した発現が可能な宿主細胞で前記融合タンパク質の前記最適化配列をクローニングするステップ；
前記宿主細胞を増殖させ且つ前記宿主細胞による前記融合タンパク質の発現を可能にするのに適した条件下で、前記宿主細胞を培地で増殖させるステップ；及び
任意選択的にさらなる精製のために、分泌された融合タンパク質を収集するステップ
によって調製される、方法。
【請求項２】
前記免疫調節分子が、癌細胞の免疫寛容を弱める、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫調節分子が、前記融合タンパク質の二重特異的結合を可能にするのに十分な長さのアミノ酸配列によって前記抗体に連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫調節分子が、直接又はリンカーを介して、前記抗体の重鎖、前記抗体の軽鎖、若しくは両鎖に連結される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫調節分子が、直接又はリンカーを介して、前記抗体の重鎖のＮ若しくはＣ末端、前記抗体の軽鎖のＮ若しくはＣ末端、又は両鎖のＮ及びＣ末端の両方に連結される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫調節分子が、（ｉ）形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）及び／又は（ｉｉ）プログラム死−１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体がＥＧＦＲ１に結合し、且つ前記免疫調節部分が形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記コドン最適化ヌクレオチド配列が配列番号１、２、４、及び７を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体がＥＧＦＲ１に結合し、且つ前記免疫調節部分がＰＤ−１Ｌに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記コドン最適化ヌクレオチド配列が配列番号１、２、３、及び４を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体がＣＴＬＡ４に結合し、且つ前記免疫調節部分がＰＤ−１Ｌに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記コドン最適化ヌクレオチド配列が配列番号５、６、３、及び４を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
均質な治療効果のある融合タンパク質を含む調製物であって、前記融合タンパク質が、腫瘍標的部分及び少なくとも１つの免疫調節分子を含み、前記腫瘍標的部分が、ＣＴＬＡ−４又はＥＧＦＲ１に結合する抗体であり、且つ前記融合タンパク質が次のステップ：
前記融合タンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を調製するステップであって、前記抗体のコドン最適化配列が、前記抗体の重鎖のＣ末端におけるリジンの発現のためのヌクレオチドを欠失している、ステップ；
一過性の又は安定した発現が可能な宿主細胞で前記融合タンパク質の前記コドン最適化配列をクローニングするステップ；
前記宿主細胞を増殖させ且つ前記宿主細胞による前記融合タンパク質の発現を可能にするのに適した条件下で、前記宿主細胞を培地で増殖させるステップ；及び
任意の精製のために分泌された融合タンパク質を収集するステップ
によって調製される、調製物。
【請求項１４】
キメラ融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記キメラ融合タンパク質が、癌細胞に対して親和性を有する少なくとも１つの標的部分、及び前記癌細胞の免疫寛容を弱める少なくとも１つの免疫調節部分を含み、前記標的部分が抗体であり、且つ前記抗体の核酸配列が、前記抗体の重鎖のＣ末端におけるリジンの発現のためのヌクレオチドを欠失している、核酸配列。
【請求項１５】
前記抗体の前記重鎖をコードする前記核酸配列が、配列番号１又は配列番号５から選択される、請求項１４に記載の核酸配列。
【請求項１６】
前記キメラ融合タンパク質の核酸配列が配列番号１、２、４、及び７を含む、請求項１４に記載の核酸配列。
【請求項１７】
前記キメラ融合タンパク質の核酸配列が配列番号１、２、３、及び４を含む、請求項１４に記載の核酸配列。
【請求項１８】
前記キメラ融合タンパク質の核酸配列が配列番号５、６、３、及び４を含む、請求項１４に記載の核酸配列。
【請求項１９】
ヒト対象における癌の処置のために最適化された遺伝子を含むベクターであって、前記最適化された遺伝子が、ＣＧ配列が増加するように修飾されており、前記ベクターが、少なくとも１つの標的部分をコードするヌクレオチド配列、少なくとも１つの免疫調節部分、及び連結部分を含み、前記最適化ヌクレオチド配列が、配列番号１〜７から選択される、ベクター。
【請求項２０】
前記ヌクレオチド配列が配列番号１、２、４、及び７を含む、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２１】
前記ヌクレオチド配列が配列番号１、２、３、及び４を含む、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２２】
前記ヌクレオチド配列が配列番号５、６、３、及び４を含む、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２３】
対象における癌を処置する方法であって：
ａ）治療効果のある融合タンパク質を調製するステップであって、前記融合タンパク質が、腫瘍標的部分及び少なくとも１つの免疫調節分子を含み、前記腫瘍標的部分が、ＣＴＬＡ−４又はＥＧＦＲ１に結合する抗体であり、且つ前記融合タンパク質が次のステップ：
ｉ）前記融合タンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を調製するステップであって、前記抗体の前記コドン最適化ヌクレオチド配列が、前記抗体の重鎖のＣ末端におけるリジンの発現のためのヌクレオチドを欠失している、ステップ；
ｉｉ）一過性の又は安定した発現が可能な宿主細胞で前記融合タンパク質の前記最適化配列をクローニングするステップ；
ｉｉｉ）前記宿主細胞を増殖させ且つ前記宿主細胞による前記融合タンパク質の発現を可能にするのに適した条件下で、前記宿主細胞を培地で増殖させるステップ；及び
ｉｖ）任意選択の精製のために分泌された融合タンパク質を収集するステップ
によって調製される、ステップと；
ｂ）治療効果のある量の前記融合タンパク質を前記対象に投与するステップと
を含む、方法。
【請求項２４】
前記融合タンパク質が、配列番号１５及び９のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記融合タンパク質が、配列番号８及び１６のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記融合タンパク質が、配列番号１７及び９のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記融合タンパク質が、配列番号８及び１８のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記融合タンパク質が、配列番号２７及び９のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記融合タンパク質が、配列番号８及び２８のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記融合タンパク質が、配列番号２９及び９のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記融合タンパク質が、配列番号８及び３０のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記融合タンパク質が、配列番号３１及び２８のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記融合タンパク質が、配列番号３１及び３０のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
前記融合タンパク質が、配列番号２９及び２８のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
前記融合タンパク質が、配列番号２９及び３０のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
前記融合タンパク質が、配列番号３２及び１４のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３７】
前記融合タンパク質が、配列番号１３及び３３のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３８】
前記融合タンパク質が、配列番号３４及び１４のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３９】
前記融合タンパク質が、配列番号１３及び３５のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項４０】
前記融合タンパク質が、配列番号３２及び３３のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項４１】
前記融合タンパク質が、配列番号３２及び３５のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項４２】
前記融合タンパク質が、配列番号３４及び３３のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項４３】
前記融合タンパク質が、配列番号３４及び３５のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、あらゆる目的のために参照によりその開示内容が本明細書に組み入れられる２０１３年３月１２日出願の米国仮特許出願第６１／７７７，０１６号の優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の背景
技術分野
本発明は、概して、癌治療に使用される組換えキメラ融合タンパク質の作製の分野に関し、詳細には、抗ＥＧＦＲｌ−ＴＧＦβＲＩＩ、抗ＥＧＦＲ１−ＰＤ１、及び抗ＣＴＬＡ４−ＰＤ１の融合分子、並びにこれらの作製方法に関し、この方法は、組換えキメラ融合タンパク質の生産コストを削減し、且つ組換えキメラ融合タンパク質の同質性を高める。
【背景技術】
【０００３】
関連技術
医学研究の様々な進展にもかかわらず、癌は、米国では依然として第２の死因である。従来の臨床ケア方式、例えば、外科的切除、放射線療法、及び化学療法は、特に充実性腫瘍では失敗率が相当高い。失敗は、初発腫瘍が反応しないため、又は発生部位での再増殖又は転位による再発のために起きる。癌は、依然として医学の研究開発の中心的な焦点である。
【０００４】
癌の免疫療法は、一世紀を超えて研究されているが、様々な抗体ベースの製品が多様な形態の癌の患者の管理に導入されるようになったのは僅かこの１０年である。現在、免疫療法は、臨床研究の最も活発な分野の１つであり、癌に対する様々な抗体療法の製品が既に承認されている。
【０００５】
治療薬としての特定の抗体の使用は、非標的療法、例えば、薬物の経口投与若しくは静脈内投与による全身化学療法又は放射線療法よりも優れている。２種類の抗体ベースの治療法が存在する。よく見られる種類では、腫瘍抗原（即ち、腫瘍及び癌細胞上で発現するが、正常組織では発現しないタンパク質）が同定され、腫瘍抗原に対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が開発されている。このため、任意の治療薬、例えば、化学療法薬、放射性核種、修飾毒素などをこの抗体にコンジュゲートさせて、腫瘍に対する治療薬による標的療法を達成することができる。他の種類の抗体ベースの治療法では、それ自体が標的とする腫瘍／癌細胞に対して治療特性を有する抗体を供給する。この第２の形式の抗体ベースの治療法のさらなる利点は、別の治療薬を治療抗体にさらにコンジュゲートさせてより効果的な処置を達成することができる。任意の抗体依存性療法、特にモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用する治療法の大きな利点は、正常組織の治療薬による副作用を十分に回避して、用量を増やした治療薬を腫瘍に送達できることである。
【０００６】
癌治療用のいくつかの抗体の同定にもかかわらず、免疫寛容を克服し、且つＴ細胞応答を活性化させる新規のより効果的な治療を依然として見出す必要がある。さらに、たとえ分子操作がこのような抗体ベースの治療法の可能性を改善したとしても、作製される組換え産物の持続性についての問題が依然として残る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、均質な組換え融合免疫調節分子、より具体的には免疫調節タンパク質に連結された標的抗体を含む組換えキメラポリペプチドを作製するための新規且つ安定した合成法を提供する。
【０００８】
癌に対する免疫応答を媒介するために、Ｔ細胞の活性化及び同時刺激の両方が重要である。Ｔ細胞の同時刺激は、ＣＤ２８の、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＢ７ファミリーのそのリガンドへの結合によって主に媒介される。しかしながら、活性化後、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）と呼ばれる分子を発現し、ＣＴＬＡ−４は、ＣＤ２８よりも遥かに高い親和性でＢ７リガンドに結合し、このような結合がＴ細胞の活性を下方調節する。従って、ＣＴＬＡ−４受容体に結合する抗体を含めることにより、Ｂ７ファミリーのリガンドとの相互作用を遮断し、抗腫瘍応答が増強されるであろう。
【０００９】
プログラム死リガンド１（ＰＤＬ１）は、上記のＢ７のリガンドの１つであり、（ｉ）Ｔ細胞上のその受容体ＰＤ１（ＣＤ２７９）に結合して腫瘍反応性Ｔ細胞を寛容化すること；（ｉｉ）腫瘍細胞から発現されるＰＤＬ１によるＰＤ−１シグナル伝達によって、ＦａｓＬ媒介性溶解及びＣＤ８＋Ｔ細胞に対する耐性を腫瘍細胞に付与すること；及び（ｉｉｉ）誘導される制御性Ｔ細胞の発生及び維持を促進することによって、抗腫瘍免疫を阻害する。従って、ＰＤＬ１は、天然の抗腫瘍免疫、及び宿主Ｔ細胞性抗腫瘍免疫の活性化を必要とする癌免疫療法に対する主な障害である。この概念は、ＰＤＬ１とＰＤ１との相互作用を遮断する抗体がＴ細胞の活性化を改善して腫瘍の進行を遅延させることを実証する研究によって裏付けられている。ＰＤＬ１又はＰＤ１に対する抗体は、癌患者の小集団において治療効果を示したが、患者の大部分は、抗体処置による恩恵を受けない。従って、癌患者におけるＰＤ−Ｌ１性免疫抑制を最小限にする、新たな普遍的に適用可能な処置を可能にし、且つ現在利用可能なｍＡｂよりもＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１に対してより効果的であるＰＤ−Ｌ１機能を調節するための機構が必要とされている。
【００１０】
多くの上皮癌、例えば、結腸癌、頭部及び頸部の癌、乳癌、卵巣癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬ）、及び膵臓癌の特徴は、癌細胞の表面上の異常に高いレベルの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）である。上皮成長因子受容体のファミリー（ＥＧＦＲ；ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ４）は、様々なリガンドの結合に応答して生体生理学的シグナル伝達反応のカスケードをトリガする内因性チロシンキナーゼ活性を有する細胞膜受容体を含む。これらの受容体は、増殖の増加の誘導、アポトーシスの減少、並びに腫瘍細胞の移動性及び血管形成の促進など、様々なヒト腫瘍における悪性細胞の挙動に重要な役割を果たす。従って、本発明は、ＥＧＦＲファミリーのメンバーを標的とする抗体を含む。
【００１１】
本発明は、癌細胞の免疫寛容を弱めて、Ｔ細胞の活性を維持し、腫瘍に対する免疫系の応答を抑制することが知られている制御性Ｔの動員を抑制することによって癌細胞の増殖を低減する方法をさらに提供する。従って、本発明のポリヌクレオチド配列によって産生されるキメラポリペプチドは、発現される融合ポリペプチド又はキメラポリペプチドにより癌治療に有用である。
【００１２】
一態様では、本発明は、癌細胞を標的とする少なくとも１つの標的部分及び癌細胞の免疫寛容を弱める少なくとも１つの免疫調節部分を含むキメラポリペプチドを提供し、この標的部分と免疫調節部分は、これらの両方の部分がそれぞれの標的にうまく結合できるように十分な長さのアミノ酸残基のアミノ酸スペーサーによって連結されている。あるいは、標的部分と、癌細胞の免疫寛容を弱める免疫調節部分とを、互いに直接結合しても良い。本発明のキメラ／融合ポリペプチドは、癌細胞受容体への結合、及び癌細胞が免疫応答を回避する能力の低減に有用である。
【００１３】
好ましくは、標的部分は、ＣＴＬＡ−４又はＥＧＦＲ１に対する結合親和性を有する抗体であり、この抗体は、発現される抗体の重鎖のＣ末端のリジンの発現のためのヌクレオチドが欠失したポリヌクレオチド配列から転写される。転写中に抗体の重鎖のＣ末端のリジンが排除されることにより、最終産物が高い同質性を有し、これによりさらなる精製の必要性が低減され、且つそのコストを削減できることが分かった。
【００１４】
ＣＨＯ細胞におけるＩｇＧ分子の転写及び翻訳のプロセスの最中に、重鎖のＣ末端のリジン（Ｋ）が発現されることが知られている。市販の製品では、このような発現されるリジンは純度を高めるために除去しなければならない。図１に示されているように、作製された産物では異種性が高い。これは、発現される抗体が細胞内でなお利用可能である限り、ＣＨＯ細胞が、Ｃ末端のリジンを切断する内因性酵素カルボキシペプチダーゼＢ（ＣＰＢ）を有するために生じる。しかしながら、この酵素は、抗体が培地に分泌されるとリジンを切断しなくなる。従って、この内因性ＣＰＢの切断効率は、細胞内での利用可能性に基づいている。従って、抗体の一部はリジンと共に分泌され、他はリジンと共に分泌されず、このような組み合わせは、分泌される産物に著しい異種性をもたらし、一部の抗体はＣ末端のリジンを有し、他の抗体はＣ末端のリジンを有していない。組換え産物は治療用途に使用されるため、精製して同質性にする必要がある。従って、従来技術の組換え産物は、追加の精製ステップを必要とし、このステップでは、組換え産物は、最初に酵素ＣＰＢで処置され、追加のステップで再び精製されて、最終産物から全てのリジン及び酵素ＣＰＢが除去される。これらの追加のステップは、製造プロセスのコストを著しく増大させる。
【００１５】
本発明は、発現される抗体の重鎖のＣ末端のリジンの発現のためのヌクレオチドを欠失しているポリヌクレオチド配列から発現タンパク質を転写することによって組換え抗ＣＴＬＡ−４抗体及び抗ＥＧＦＲ１抗体を合成する従来の方法の欠点を回避する。
【００１６】
本発明は、癌細胞の免疫寛容を弱める又は転じる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現によるキメラ／融合タンパク質の調製に基づいている。癌細胞は、腫瘍微小環境における特定の免疫抑制機構による腫瘍標的抗体又は化学治療剤による除去を回避することができ、このような癌細胞の能力は、免疫寛容として認識されている。このような免疫抑制機構は、免疫抑制サイトカイン（例えば、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β））及び制御性Ｔ細胞及び／又は免疫抑制骨髄樹状細胞（ＤＣ）を含む。腫瘍性免疫寛容を弱めることにより、本発明は、任意選択で別の既存の癌治療と併用される、癌治療に有効な組成物及び方法を提供する。本発明は、腫瘍性免疫寛容を弱めて、耐性癌細胞又は播種性癌細胞に対するＴ細胞媒介性の適応抗腫瘍（adaptive antitumor）を活性化及び梃入れすることによって化学療法の抗腫瘍効果を増強する戦略を提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの免疫調節部分に融合した少なくとも１つの標的部分を含む分子を提供する。この標的部分は、標的分子に特異的に結合し、免疫調節部分は、次の分子：（ｉ）形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）及び又は（ｉｉ）プログラム死−１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の１つに特異的に結合する。
【００１８】
さらなる一態様では、標的部分は、重鎖及び軽鎖の両方を含む抗体を含み、この抗体は、腫瘍細胞の成分、腫瘍抗原、腫瘍血管系、腫瘍微小環境、又は腫瘍浸潤免疫細胞に特異的に結合する。特に、重鎖及び／又は軽鎖は、同じ種類の免疫調節部分又は別個の異なる免疫調節部分に個々に連結することができる。さらに、抗体標的部分の重鎖又は軽鎖は、免疫調節部分に連結することができ、この免疫調節部分は、第２の免疫調節部分にさらに連結することができ、この２つの免疫調節部分の間にはリンカーが存在する。
【００１９】
なおさらなる一態様では、腫瘍標的部分及び形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）に結合する分子を含む免疫調節部分を含むキメラポリペプチドが提供され、この腫瘍標的部分は、ＥＧＦＲ１に結合する抗体であり、この抗体は、完全な抗体、重鎖、又は軽鎖であり得る。
【００２０】
腫瘍標的部分は、癌細胞を標的とするモノクローナル抗体を含むことができ、このようなモノクローナル抗体としては、限定されるものではないが、セツキシマブ、トラスツズマブ、リツブキシマブ（ritubximab）、イピリムマブ、トレメリムマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、アブシキシマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、アダリムマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、Ｉ−１３１トシツモマブ、エファリズマブ、ベバシズマブ、パリツムマブ、ペルツズマブ、ナタリズマブ、エタネルセプト、ＩＧＮ１０１（Aphton）、ボロシキシマブ（Biogen Idec及びPDL BioPharm）、抗ＣＤ８０  ｍＡｂ（Biogen Idec）、抗ＣＤ２３  ｍＡｂ（Biogen Idel）、ＣＡＴ−３８８８（Cambridge Antibody Technology）、ＣＤＰ−７９１（Imclone）、エラプツズマブ（eraptuzumab）（Immunomedics）、ＭＤＸ−０１０（Medarex及びBMS）、ＭＤＸ−０６０（Medarex）、ＭＤＸ−０７０（Medarex）、マツズマブ（Merck）、ＣＰ−６７５、２０６（Pfizer）、ＣＡＬ（Roche）、ＳＧＮ−３０（Seattle Genetics）、ザノリムマブ（Serono及びGenmab）、アデカツムマブ（Sereno）、オレゴボマブ（United Therapeutics）、ミモツズマブ（YM Bioscience）、ＡＢＴ−８７４（Abbott Laboratories）、デノスマブ（Amgen）、ＡＭ１０８（Amgen）、ＡＭＧ７１４（Amgen）、フォントリズマブ（Biogen Idec及びPDL BioPharm）、ダクリズマブ（Biogent Idec及びPDL BioPharm）、ゴリムマブ（Centocor及びSchering-Plough）、ＣＮＴＯ１２７５（Centocor）、オクレリズマブ（Genetech及びRoche）、ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０（Genmab）、ベリムマブ（HGS及びGSK）、エプラツズマブ（Immunomedics）、ＭＬＮ１２０２（Millennium Pharmaceuticals）、ビジリズマブ（PDL BioPharm）、トシリズマブ（Roche）、オクレリズマブ（Roche）、セルトリズマブペゴル（UCB、以前はCelltech）、エクリズマブ（Alexion Pharmaceuticals）、ペキセリズマブ（Alexion Pharmaceuticals及びProcter & Gamble）、アブシキシマブ（Centocor）、ラニビジムマブ（ranibizimumab）（Genetech）、メポリズマブ（GSK）、ＴＮＸ−３５５（Tanox）、又はＭＹＯ−０２９（Wyeth）が挙げられる。
【００２１】
好ましい一実施形態では、腫瘍標的部分は、本発明の方法によって作製されるＣＴＬＡ−４又はＥＧＦＲ１に結合するモノクローナル抗体であり、この方法は、次のステップ：
ａ．融合タンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を調製するステップであって、この抗体のコドン最適化配列が、この抗体の重鎖のＣ末端におけるリジンの発現のためのヌクレオチドを欠失している、ステップ；
ｂ．一過性の又は安定した発現が可能な宿主細胞で前記融合タンパク質の最適化配列をクローニングするステップ；
ｃ．宿主細胞を増殖させ、且つ、宿主細胞による融合タンパク質の発現を可能にするのに適した条件下で宿主細胞を培地で増殖させるステップ；及び
ｄ．分泌された融合タンパク質を収集するステップ
を含む。
【００２２】
なお別の態様では、免疫調節部分は、ＴＧＦ−βに結合し、且つその機能を阻害する分子を含む。特に、免疫調節部分は、形質転換成長因子β受容体ＴＧＦ−βＲＩＩ、ＴＧＦ−βＲＩＩｂ、ＴＧＦ−βＲＩＩＩの細胞外リガンド結合ドメインを含む。別の態様では、免疫調節部分は、ＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外リガンド結合ドメイン（ＥＣＤ）を含む。
【００２３】
なおさらなる一態様では、標的部分は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲｌ、ＣＤ２０、又は細胞障害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）に特異的に結合する抗体を含み、免疫調節部分は、ＴＧＦ−βＩＩの細胞外リガンド結合ドメインを含む。
【００２４】
なお別の態様では、免疫調節部分は、プログラム死−１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に特異的に結合してその活性を阻害する分子を含む。
【００２５】
さらなる態様では、標的部分は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲｌ、ＣＤ２０、細胞障害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、ＣＤ２５（１Ｌ−２ａ受容体；ＩＬ−２ａＲ）、又はＣＤ４に特異的に結合する抗体、抗体断片、又はポリペプチドを含み、免疫調節部分は、プログラム死−１（ＰＤ−１）の細胞外リガンド結合ドメイン又は外部ドメインを含む。
【００２６】
なおさらなる一態様では、標的部分は、ＥＧＦＲ１及びＣＴＬＡ−４に特異的に結合する抗体を含み、免疫調節部分は、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）と相互作用する配列を含む。
【００２７】
一態様では、本発明は、ヒト対象における癌治療のための、少なくとも１つの標的部分及び少なくとも１つの免疫調節部分を含む融合ポリペプチドをコードする最適化遺伝子を提供し、この遺伝子は、ヒト対象及び／又は細胞における発現を増加させるように最適化されている。
【００２８】
別の態様では、本発明は、ヒト対象における癌治療のための最適化遺伝子を含むベクターを提供し、この最適化遺伝子は、ＣＧ配列を増加させるように修飾されている。好ましくは、ベクターは、少なくとも１つの標的部分、少なくとも１つの免疫調節部分、及び連結部分をコードするヌクレオチド配列を含み、最適化ヌクレオチド配列は、図２に示されている配列番号１〜７から選択される。
【００２９】
なお別の態様では、本発明は、対象の癌を治療する方法を提供し、この方法は：
少なくとも１つの標的部分、少なくとも１つの免疫調節部分、及びこの標的部分と免疫調節部分との間に位置する連結部分をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの組換えベクターを作製するステップであって、このヌクレオチド配列が配列番号１〜７から選択される、ステップ；及び
治療有効量のコードされた融合タンパク質を対象で産生するレベルで前記ヌクレオチド配列が発現されるような条件下で組換えベクターを対象に投与するステップを含む。
【００３０】
なお別の態様では、本発明は、本発明の融合タンパク質ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列で形質転換された組換え宿主細胞を提供し、このポリヌクレオチド配列は、配列番号１〜７から選択される。
【００３１】
なおさらなる態様では、本発明は、本発明のキメラ融合タンパク質を調製するプロセスも企図し、このプロセスは次のステップ：
キメラ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列で宿主細胞をトランスフェクトして形質転換宿主細胞を作製するステップであって、このポリヌクレオチド配列が、少なくとも１つの標的部分及び少なくとも１つの免疫調節部分をコードし、このポリヌクレオチド配列が、配列番号１〜７から選択される配列の組み合わせを含む、ステップ；及び
キメラ融合タンパク質の発現に十分な生物学的条件下で形質転換宿主細胞を維持するステップ
を含む。
【００３２】
別の態様では、本発明は、癌治療用の薬剤の使用におけるキメラ融合タンパク質の使用に関し、このキメラ融合タンパク質は、図３、図４、及び図５にそれぞれ示されている、抗ＥＧＦＲ１リンカーＰＤ１（配列番号８、９、１０、及び１０）；抗ＥＧＦＲ１−リンカー−ＴＧＦβＲＩＩ（配列番号８、９、１０、及び１２）；抗ＣＴＬＡ−４−リンカー−ＰＤ１（配列番号１３、１４、１０、及び１１）を含む。好ましくは、融合タンパク質は、宿主細胞で発現され、このような発現されるタンパク質は、癌の影響を軽減するための治療量で、これを必要とする対象に投与される。
【００３３】
なおさらなる一態様では、本発明は、腫瘍性疾患を処置する方法を提供する。この方法は、本発明の１つ以上の融合タンパク質を、これを必要する対象に投与することを含み、様々な態様では、対象に、別の抗癌治療と併用して本発明の１つ以上の融合タンパク質が投与される。一態様では、抗癌治療は、化学療法分子、抗体、小分子キナーゼ阻害剤、ホルモン剤、又は細胞傷害剤を含む。抗癌治療は、電離放射線、紫外線放射、冷凍アブレーション、熱アブレーション、又は高周波アブレーションも含み得る。
【００３４】
好ましい一実施形態では、治療効果のある抗体−ペプチド融合タンパク質が、癌細胞の免疫寛容を弱める１つ以上の免疫調節部分に融合した標的抗体である。一態様では、免疫調節部分は、分子の二重特異的結合を可能にする十分な長さのアミノ酸スペーサーによって連結することができる。免疫調節部分は、抗体の重鎖のＮ末端若しくはＣ末端又は軽鎖のＮ末端若しくはＣ末端のいずれかに結合することができる。
【００３５】
本発明の方法は、治療効果のある抗体−ペプチド誘導タンパク質をコードするヌクレオチド配列を提供し、この発現は、一過性細胞系又は安定細胞系で行うことができる。一過性発現は、コードされる融合タンパク質を哺乳動物宿主細胞に導入するベクターで宿主細胞をトランスフェクト又は形質転換することによって達成される。
【００３６】
融合ペプチドが発現されたら、好ましくは、これらの融合ペプチドを、標的部分及び免疫調節部分の両方に結合する能力を有する二重特異性であるかをチェックするために精製してインビトロで試験する。このような試験には、インビトロ試験、例えば、二機能性標的結合（bi-functional target binding）又は免疫細胞刺激を確認するＥＬＩＳＡ又はＮＫ／Ｔ細胞結合アッセイが含まれ得る。
【００３７】
特に、特定の融合ペプチドが所望の二重特性を実証したら、このような融合ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、大量の発現及び精製のために安定細胞系へのサブクローニング用に選択される。このような安定細胞系は、既に開示され、例えば、限定されるものではないが、ＨＥＫ９２３、ＣＨＯ、又はＮＳＯを含む哺乳動物細胞系である。
【００３８】
別の態様では、本発明は、ＰＤＬ１のＰＤ１への結合を阻害し、且つ／又は低減して、腫瘍細胞に対する免疫応答を増大させる方法を提供し、この方法は次のステップ：
ａ．ＰＤ１及び抗ＥＧＦＲ１又は抗ＣＴＬＡ−４抗体を含むキメラポリペプチドを用意するステップ；及び
ｂ．腫瘍細胞をキメラポリペプチドに接触させるステップであって、このキメラポリペプチドが少なくとも腫瘍細胞のＰＤＬ１に結合する、ステップ
を含む。
【００３９】
なお別の態様では、本発明は、治療効果のある抗体−ペプチド融合タンパク質を調製する方法を提供し、この方法は次のステップ：
ａ．前記融合タンパク質のコドン最適化配列を調製するステップであって、抗ＥＧＦＲ１抗体及び抗ＣＴＬＡ−４抗体のコドン最適化配列が、この抗体の重鎖のＣ末端のリジンの発現のためのヌクレオチドを欠失している、ステップ；
ｂ．一過性の又は連続的な発現が可能な宿主細胞で前記融合タンパク質の最適化配列をクローニングするステップ；
ｃ．宿主細胞を増殖させ、且つ、宿主細胞による融合タンパク質の発現を可能にするのに適した条件下で宿主細胞を培地で増殖させるステップ；及び
ｄ．分泌された融合タンパク質を収集するステップ
を含む。
【００４０】
なおさらなる一態様では、本発明は、キメラ融合タンパク質をコードする核酸配列を提供し、このキメラ融合タンパク質は、癌細胞に対して親和性を有する少なくとも１つの標的部分、及び癌細胞の免疫寛容を弱める少なくとも１つの免疫調節部分を含み、標的部分が抗体であり、標的部分の核酸配列が、抗体の重鎖のＣ末端におけるリジンの発現のためのヌクレオチドを欠失している。抗体の重鎖をコードする核酸配列は、好ましくは、配列番号１又は配列番号５を含む。キメラ融合タンパク質をコードする核酸配列は、好ましくは、配列番号１、２、４、及び７；配列番号１、２、３、及び４；並びに配列番号５、６、３、及び４からなる群から選択される配列を含む。
【００４１】
なお別の態様では、本発明は、対象の癌を治療する方法を提供し、この方法は次のステップ：
ａ）治療効果のある融合タンパク質を調製するステップであって、この融合タンパク質が、腫瘍標的部分及び少なくとも１つの免疫調節分子を含み、この腫瘍標的部分が、ＣＴＬＡ−４又はＥＧＦＲ１に結合する抗体であり、且つこの融合タンパク質が次のステップ：
［００４４］融合タンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を調製するステップであって、抗体のコドン最適化ヌクレオチド配列が、抗体の重鎖のＣ末端のリジンの発現のためのヌクレオチドを欠失している、ステップ；
ａ）ｉｉ）一過性の又は連続的な発現が可能な宿主細胞で前記融合タンパク質の最適化配列をクローニングするステップ；
ｂ）ｉｉｉ）宿主細胞を増殖させ、且つ、宿主細胞による融合タンパク質の発現を可能にするのに適した条件下で宿主細胞を培地で増殖させるステップ；及び
ｃ）ｉｖ）分泌された融合タンパク質を収集するステップ
によって調製される、ステップと；
ｂ．ｂ）治療効果のある量の分泌された融合タンパク質を対象に投与するステップと
を含む。
【００４２】
この融合タンパク質は、配列番号１５及び９；配列番号８及び１６；配列番号１７及び９；配列番号８及び１８；配列番号２７及び９；配列番号８及び２８；配列番号２９及び９；配列番号８及び３０；配列番号３１及び２８；配列番号３１及び３０；配列番号２９及び２８；配列番号２９及び３０；配列番号３２及び１４；配列番号１３及び３３；配列番号３４及び１４；配列番号１３及び３５；配列番号３２及び３３；配列番号３２及び３５；配列番号３４及び３３、並びに配列番号３４及び３５からなるアミノ酸配列の群から選択される。
【００４３】
別の態様では、本発明は、腫瘍性疾患を治療する方法を提供し、この方法は、配列番号１、２、４、及び７；配列番号１、２、３、及び４；並びに配列番号５、６、３、及び４からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列によってコードされる１つ以上の融合タンパク質を、これを必要とする対象に投与するステップを含む。特に、上記定義されたポリヌクレオチド配列を使用することにより、抗ＥＧＦＲ１リンカーＰＤ１（配列番号８、９、１０、及び１１）；抗ＥＧＦＲ１−リンカー−ＴＧＦβＲＩＩ（配列番号８、９、１０、及び１２）；並びに抗ＣＴＬＡ−４−リンカー−ＰＤ１（配列番号１３、１４、１０、及び１１）を含む組み合わせの融合タンパク質を発現させることができる。
【００４４】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、重鎖におけるリジンの置換の様々な可能性を示しており、このような異種性により精製を行う必要がある。
【図２−１】図２は、抗ＥＧＦＲ１重鎖（配列番号１）；抗ＥＧＦＲ１軽鎖（配列番号２）；ＰＤ１（配列番号３）；リンカー（配列番号４）；抗ＣＴＬＡ−４重鎖（配列番号５）；抗ＣＴＬＡ−４軽鎖（配列番号６）；及びＴＧＦβＲＩＩ（配列番号７）を含む本発明の抗体−ペプチド融合タンパク質の発現に使用される最適化コドンヌクレオチド配列を示している。
【図２−２】図２は、抗ＥＧＦＲ１重鎖（配列番号１）；抗ＥＧＦＲ１軽鎖（配列番号２）；ＰＤ１（配列番号３）；リンカー（配列番号４）；抗ＣＴＬＡ−４重鎖（配列番号５）；抗ＣＴＬＡ−４軽鎖（配列番号６）；及びＴＧＦβＲＩＩ（配列番号７）を含む本発明の抗体−ペプチド融合タンパク質の発現に使用される最適化コドンヌクレオチド配列を示している。
【図２−３】図２は、抗ＥＧＦＲ１重鎖（配列番号１）；抗ＥＧＦＲ１軽鎖（配列番号２）；ＰＤ１（配列番号３）；リンカー（配列番号４）；抗ＣＴＬＡ−４重鎖（配列番号５）；抗ＣＴＬＡ−４軽鎖（配列番号６）；及びＴＧＦβＲＩＩ（配列番号７）を含む本発明の抗体−ペプチド融合タンパク質の発現に使用される最適化コドンヌクレオチド配列を示している。
【図３】図３は、抗ＥＧＦＲ１リンカーＰＤ１構築物（配列番号８、９、１０、及び１１）のアミノ酸残基を示している。
【図４】図４は、抗ＥＧＦＲ１−リンカー−ＴＧＦβＲＩＩ構築物（配列番号８、９、１０、及び１２）のアミノ酸残基を示している。
【図５】図５は、抗ＣＴＬＡ−４−リンカー−ＰＤ１（配列番号１３、１４、１０、及び１１）のアミノ酸残基を示している。
【図６】図６は、ＦＭａｂ５、ＦＭａｂ６、ＦＭａｂ７、及びＦＭａｂ８に対する抗ＥＧＦＲ１抗体におけるＰＤ１分子の置換の様々な可能性を示している。
【図７】図７は、抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＰＤ１＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣのアミノ酸配列を示し、ＰＤ１分子は、リンカーによって離隔された重鎖のＣ末端に連結され、配列番号１５及び９を含む。
【図８】図８は、抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ−ＰＤ１のアミノ酸配列を示し、ＰＤ１分子は、リンカーによって離隔された軽鎖のＣ末端に連結され、配列番号８及び１６を含む。
【図９】図９は、抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ−ＰＤ１のアミノ酸配列を示し、ＰＤ１分子は、リンカーによって離隔された重鎖のＮ末端に連結され、配列番号１７及び９を含む。
【図１０】図１０は、抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＰＤ１−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣのアミノ酸配列を示し、ＰＤ１分子は、リンカーによって離隔された軽鎖のＮ末端に連結され、配列番号８及び１８を含む。
【図１１】図１１は、配列番号１、２、及び３で示されている、ｃＤＮＡを用いて作製された発現構築物を示している。
【図１２】図１２は、抗ＥＧＦＲ１抗体、ＦＭａｂ１、ＦＭａｂ２、ＦＭａｂ３、ＦＭａｂ４、ＦＭａｂ９、ＦＭａｂ１０、ＦＭａｂ１ｌ、及びＦＭａｂ１２におけるＴＧＦβＲＩＩ分子の置換の様々な可能性を示している。
【図１３】図１３は、抗ＥＧＦＲｌ  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲｌ  ＬＣのアミノ酸配列を示し、ＴＧＦβＲＩＩ分子は、リンカーによって離隔された重鎖のＣ末端に連結され、配列番号２７及び９を含む。
【図１４】図１４は、抗ＥＧＦＲｌ  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲｌ  ＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩのアミノ酸配列を示し、ＴＧＦβＲＩＩ分子は、リンカーによって離隔された軽鎖のＣ末端に連結され、配列番号８及び２８を含む。
【図１５】図１５は、ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲｌ  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲｌ  ＬＣのアミノ酸配列を示し、ＴＧＦβＲＩＩ分子は、リンカーによって離隔された重鎖のＮ末端に連結され、配列番号２９及び９を含む。
【図１６】図１６は、抗ＥＧＦＲｌ  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲｌ  ＬＣのアミノ酸配列を示し、ＴＧＦβＲＩＩ分子は、リンカーによって離隔された軽鎖のＮ末端に連結され、配列番号８及び３０を含む。
【図１７】図１７は、抗ＥＧＦＲｌ  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲｌ  ＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩのアミノ酸配列を示し、ＴＧＦβＲＩＩ分子は、リンカーによって離隔された重鎖及び軽鎖のＣ末端に連結され、配列番号３１及び２８を含む。
【図１８】図１８は、抗ＥＧＦＲｌ  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲｌ  ＬＣのアミノ酸配列を示し、ＴＧＦβＲＩＩ分子は、リンカーによって離隔された重鎖のＣ末端及び軽鎖のＮ末端に連結され、配列番号３１及び３０を含む。
【図１９】図１９は、ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲｌ  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲｌ  ＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩのアミノ酸配列を示し、ＴＧＦβＲＩＩ分子は、リンカーによって離隔された重鎖のＮ末端及び軽鎖のＣ末端に連結され、配列番号２９及び２８を含む。
【図２０】図２０は、ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲｌ  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲｌ  ＬＣのアミノ酸配列を示し、ＴＧＦβＲＩＩ分子は、リンカーによって離隔された重鎖のＮ末端及び軽鎖のＮ末端に連結され、配列番号２９及び３０を含む。
【図２１】図２１は、配列番号１、２、及び７で示されている、ｃＤＮＡを用いて作製された発現構築物を示している。
【図２２】図２２は、１２％還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析されたプロテインＡ精製サンプルを示している。
【図２３】図２３は、６％非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析されたプロテインＡ精製サンプルを示している。
【図２４】図２４は、抗ＣＴＬＡ４抗体におけるＰＤ１分子の置換の様々な可能性を示している。
【図２５】図２５は、抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ−ＰＤ１＋抗ＣＴＬＡ４  ＬＣのアミノ酸配列を示し、ＰＤ１分子は、リンカーによって離隔された重鎖のＣ末端に連結され、配列番号３２及び１４を含む。
【図２６】図２６は、抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ＋抗ＣＴＬＡ４  ＬＣ−ＰＤ１のアミノ酸配列を示し、ＰＤ１分子は、リンカーによって離隔された軽鎖のＣ末端に連結され、配列番号１３及び３３を含む。
【図２７】図２７は、ＰＤ１−抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ＋抗ＣＴＬＡ４  ＬＣのアミノ酸配列を示し、ＰＤ１分子は、リンカーによって離隔された重鎖のＮ末端に連結され、配列番号３４及び１４を含む。
【図２８】図２８は、抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ＋ＰＤ１−抗ＣＴＬＡ４  ＬＣのアミノ酸配列を示し、ＰＤ１分子は、リンカーによって離隔された軽鎖のＮ末端に連結され、配列番号１３及び３５を含む。
【図２９】図２９は、抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ−ＰＤ１＋抗ＣＴＬＡ４  ＬＣ−ＰＤ１のアミノ酸配列を示し、ＰＤ１分子は、リンカーによって離隔された重鎖及び軽鎖のＣ末端に連結され、配列番号３２及び３３を含む。
【図３０】図３０は、抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ−ＰＤ１＋ＰＤ１−抗ＣＴＬＡ４  ＬＣのアミノ酸配列を示し、ＰＤ１分子は、リンカーによって離隔された重鎖のＣ末端及び軽鎖のＮ末端に連結され、配列番号３２及び３５を含む。
【図３１】図３１は、ＰＤ１−抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ＋抗ＣＴＬＡ４  ＬＣ−ＰＤ１のアミノ酸配列を示し、ＰＤ１分子は、リンカーによって離隔された重鎖のＮ末端及び軽鎖のＣ末端に連結され、配列番号３４及び３３を含む。
【図３２】図３２は、ＰＤ１−抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ＋ＰＤ１−抗ＣＴＬＡ４  ＬＣのアミノ酸配列を示し、ＰＤ１分子は、リンカーによって離隔された重鎖のＮ末端及び軽鎖のＮ末端に連結され、配列番号３４及び３５を含む。
【図３３】図３３は、配列番号３、５、及び６で示されている、ｃＤＮＡを用いて作製された発現構築物を示している。
【図３４】図３４は、ＥＧＦＲ１標的結合ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その固定標的ＥＧＦＲ１に結合する。
【図３５】図３５は、ＴＧＦβ標的結合ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＴＧＦβに結合する。
【図３６】図３６は、二機能性ＥＬＩＳＡ（Bifunctional ELISA）を示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＥＧＦＲ１及びＴＧＦβの両方に同時に結合する。
【図３７】図３７は、抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合ＭａｂのＥＧＦＲ１発現Ａ４３１細胞の結合のフローサイトメトリー分析を示している。
【図３８】図３８は、ＥＧＦＲ１発現Ａ−４３１細胞に対するＡＤＣＣを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、ＥＧＦＲ１発現Ａ−４３１細胞に対するＡＤＣＣを媒介し、その効果は用量依存性である。
【図３９】図３９は、増殖アッセイの阻害を示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、ＥＧＦＲ１発現Ａ−４３１細胞の増殖を阻害する。
【図４０】図４０は、ＥＧＦＲ１標的結合ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合Ｍａｂが、その固定標的ＥＧＦＲ１に結合する。
【図４１】図４１は、ＴＧＦβ標的結合ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合Ｍａｂが、その標的ＴＧＦβに結合する。
【図４２】図４２は、二機能性ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合Ｍａｂが、その標的ＥＧＦＲ１及びＴＧＦβの両方に同時に結合する。
【図４３】図４３は、増殖アッセイの阻害を示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合Ｍａｂが、ＥＧＦＲ１発現Ａ−４３１細胞の増殖を阻害する。
【図４４】図４４は、ＥＧＦＲ１標的結合ＥＬＩＳＡを示している。ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その固定標的ＥＧＦＲ１に結合する。
【図４５】図４５は、ＴＧＦβ標的結合ＥＬＩＳＡを示している。ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＴＧＦβに結合する。
【図４６】図４６は、二機能性ＥＬＩＳＡを示している。ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＥＧＦＲ１及びＴＧＦβの両方に同時に結合する。
【図４７】図４７は、増殖アッセイの阻害を示している。ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、ＥＧＦＲ１発現Ａ−４３１細胞の増殖を阻害する。
【図４８】図４８は、ＥＧＦＲ１標的結合ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その固定標的ＥＧＦＲ１に結合する。
【図４９】図４９は、ＴＧＦβ標的結合ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＴＧＦβに結合する。
【図５０】図５０は、二機能性ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＥＧＦＲ１及びＴＧＦβの両方に同時に結合する。
【図５１】図５１は、抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合ＭａｂのＥＧＦＲ１発現Ａ４３１細胞の結合のフローサイトメトリー分析を示している。
【図５２】図５２は、ＥＧＦＲ１標的結合ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その固定標的ＥＧＦＲ１に結合する。
【図５３】図５３は、ＴＧＦβ標的結合ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＴＧＦβに結合する。
【図５４】図５４は、二機能性ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＥＧＦＲ１及びＴＧＦβの両方に同時に結合する。
【図５５】図５５は、ＥＧＦＲ１標的結合ＥＬＩＳＡを示している。ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その固定標的ＥＧＦＲ１に結合する。
【図５６】図５６は、ＴＧＦβ標的結合ＥＬＩＳＡを示している。ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＴＧＦβに結合する。
【図５７】図５７は、二機能性ＥＬＩＳＡを示している。ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＥＧＦＲ１及びＴＧＦβの両方に同時に結合する。
【図５８】図５８は、二機能性ＥＬＩＳＡを示している。抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ−ＰＤ１＋抗ＣＴＬＡ４  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＣＴＬＡ４及びＰＤＬ１の両方に同時に結合する。
【図５９】図５９は、二機能性ＥＬＩＳＡを示している。抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ＋抗ＣＴＬＡ４  ＬＣ−ＰＤ１融合Ｍａｂが、その標的ＣＴＬＡ４及びＰＤＬ１の両方に同時に結合する。
【図６０】図６０は、二機能性ＥＬＩＳＡを示している。ＰＤ１−抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ＋抗ＣＴＬＡ４  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＣＴＬＡ４及びＰＤＬ１の両方に同時に結合する。
【図６１】図６１は、二機能性ＥＬＩＳＡを示している。抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ−ＰＤ１＋ＰＤ１−抗ＣＴＬＡ４  ＬＣ−ＰＤ１、抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ−ＰＤ１＋抗ＣＴＬＡ４  ＬＣ−ＰＤ１、及び抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ−ＰＤ１＋ＰＤ１−抗ＣＴＬＡ４  ＬＣ融合Ｍａｂが、それらの標的ＣＴＬＡ４及びＰＤＬ１の両方に同時に結合する。
【図６２】図６２は、二機能性ＥＬＩＳＡを示している。ＰＤ１−抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ＋抗ＣＴＬＡ４  ＬＣ−ＰＤ１及びＰＤ１−抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ＋ＰＤ１−抗ＣＴＬＡ４  ＬＣ融合Ｍａｂが、それらの標的ＣＴＬＡ４及びＰＤＬ１の両方に同時に結合する。
【図６３】図６３は、二機能性ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＰＤ１＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＥＧＦＲ及びＰＤＬ１の両方に同時に結合する。
【図６４】図６４は、二機能性ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ−ＰＤ１融合Ｍａｂが、その標的ＥＧＦＲ及びＰＤＬ１の両方に同時に結合する。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
発明の詳細な説明
本発明の様々な実施形態の説明を容易にし、且つ本発明の実施及び使用に用いられる様々な要素及び構成物を理解しやすくするために、本発明の説明で使用される以下の語は次の意味を有する。
【００４７】
本明細書で使用される「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」という語は、長さ又は翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリスチル化、ユビキチン化など）にかかわらず、アミド結合によって共有結合された少なくとも２つのアミノ酸の配列ポリマーを示すために互換的に使用される。Ｄアミノ酸及びＬアミノ酸、並びにＤアミノ酸とＬアミノ酸の混合物も含まれる。
【００４８】
キメラポリペプチドは、天然ではアミノ酸配列において通常は一緒に確認されない２つ以上の部分を有するアミノ酸配列を指す。
【００４９】
本明細書で使用される「スペーサー／リンカー」という語は、２つの単量体タンパク質単位を結合してキメラ分子を形成し、なおかつ所望の受容体への一部の結合を可能にする分子を指す。スペーサー／リンカーの特定の例として、アミノ酸スペーサーを挙げることができ、３つのアミノ酸配列は、本質的に任意の長さ、例えば、僅か５又は２００以上ものアミノ酸残基、好ましくは約５〜３０のアミノ酸残基とすることができる。
【００５０】
本明細書で使用される「治療」という語は、病理の兆候を示す患者に、その兆候を軽減又は排除することを目的として施される処置を意味する。
【００５１】
本明細書で使用される「治療有効量」という語は、キメラタンパク質が投与される対象に十分な有益な効果を与えるキメラタンパク質の量を意味する。
【００５２】
修飾の別の例は、キメラポリペプチドに対して別の機能性を付与する異種ドメインの追加である。異種ドメインは、追加の機能を付与するのであれば、任意の小さい生物分子若しくは無機分子、又は巨大分子とすることができる。別の機能を付与する異種ドメインの特定の例として、標的（例えば、受容体リガンド、抗体など）、免疫増強機能（例えば、免疫グロブリン、アジュバント）を付与し、且つ精製、単離、又は検出（例えば、ｍｙｃ、Ｔ７タグ、ポリヒスチジン、アビジン、ビオチン、レクチンなど）を可能にするアミノ酸配列が挙げられる。
【００５３】
本明細書に例示されるように、ポリペプチド配列は、修飾キメラポリペプチドが非修飾キメラポリペプチドと同じ活性又は機能を実質的に有するのであれば、キメラポリペプチドを構成する一方又は両方のポリペプチド配列のアミノ酸配列の置換、変異、又は誘導体化を含み得る。
【００５４】
本明細書で使用される「実質的に同じ活性又は機能」という語は、そのように修飾されたキメラポリペプチドについて使用される場合は、本明細書に記載される又は当技術分野で公知の非修飾ポリペプチドに関連した殆どの活性、全ての活性、又はより多くの活性をポリペプチドが維持することを意味する。
【００５５】
本明細書に含まれる「活性」又は「機能的」である修飾キメラポリペプチドは、ルーチンの機能的アッセイによって見出すことができる。例えば、抗体結合アッセイ又は補助受容体結合アッセイを使用することにより、修飾キメラポリペプチドが活性を有するか否かを容易に決定することができる。修飾キメラポリペプチドは、非修飾キメラポリペプチドに関連した活性又は機能を維持するため、修飾キメラポリペプチドは、通常は、非修飾ポリペプチドのアミノ酸配列と「実質的に同一」又は「実質的に同種の」アミノ酸配列を有する。
【００５６】
本明細書で使用される「実質的に同一」又は「実質的に同種の」という語は、ポリペプチド配列について使用される場合は、ポリペプチド配列が基準配列と少なくとも５０％同一であることを意味する。修飾ポリペプチド及び実質的に同一のポリペプチドは、典型的には、基準ポリペプチドに対して少なくとも７０％、あるいは８５％、より高い可能性としては９０％、最も高い可能性としては９５％の相同性を有する。
【００５７】
本明細書に説明されるように、実質的に同一又は相同のポリペプチドは、キメラポリペプチドの機能を破壊しないアミノ酸配列の位置（例えば、本明細書に説明される機能アッセイによって決定される）における付加、切断、内部欠失若しくは挿入、保存的及び非保存的置換、又は他の修飾を含む。置換の特定の例は、１つ以上のアミノ酸が、別の化学的又は生物学的に同様の残基によって置換される場合である。本明細書で使用される「保存的な置換」という語は、１つの残基の化学的又は生物学的に同様の残基での置換を指す。保存的な置換の例としては、疎水性残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、又はメチオニンの別の疎水性残基での置換、極性残基の別の極性残基での置換、例えば、アルギニンのリジンでの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸での置換、又はグルタミンのアスパラギンでの置換などが挙げられる。当業者であれば、実質的に活性を変更することなく、他の化学的に類似した残基で修飾又は置換することができる多数のアミノ酸は分かるであろう。
【００５８】
修飾ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸がその中に化学的に変化又は誘導体化された側鎖を有する「化学誘導体」をさらに含む。このような誘導体化ポリペプチドとしては、例えば、遊離アミノ基がアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カロベンズオキシ基（carobenzoxy group）を形成するアミノ酸；遊離カルボキシ基が塩、メチル及びエチルエステルを形成するアミノ酸；遊離ヒドロキシル基が、Ｏ−アシル又はＯ−アルキル誘導体を形成するアミノ酸、並びに自然発生のアミノ酸誘導体、例えば、プロリンの誘導体、４−ヒドロキシプロリン、リジンの誘導体、５−ヒドロキシリジン、セリンの誘導体、ホモセリン、及びリジンの誘導体、オルニチンなどが含まれる。また、共有結合、例えば、環化ポリペプチドを形成する２つのシステイン残基間に形成するジスルフィド結合を変更することができるＤ−アミノ酸及びアミノ酸誘導体も含まれる。
【００５９】
本明細書で使用される「単離された」又は「実質的に純粋な」という語は、本発明のキメラポリペプチド、その配列断片、及びポリヌクレオチドの修飾因子として使用される場合は、これらが人間の介入によって産生され、それらの天然のインビボ細胞環境で分離されたことを意味する。一般に、このように分離されたポリペプチド及びポリヌクレオチドは、これらが自然に結合する他のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、又は他の物質を実質的に含まない。
【００６０】
本発明のポリペプチドは、当業者に周知の標準的な技術によって作製することができる。このような技術としては、限定されるものではないが、そのポリペプチドを含むことが知られている組織からの単離及び精製、並びに形質転換細胞を用いた、このようなポリペプチドをコードするクローンＤＮＡからの発現が挙げられる。キメラポリペプチドは、宿主細胞、例えば、細菌、酵母、又は哺乳動物細胞でポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させ、そして典型的な生化学的方法（例えば、免疫親和性精製、ゲル精製、発現スクリーニングなど）を用いた精製によって、この発現キメラポリペプチドを精製することによって得ることができる。他の周知の方法は、Deutscher et al., 1990に記載されている。あるいは、キメラポリペプチドは、化学的に合成することができる。純度は、任意の適切な方法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、及び続くゲルの染色（例えば、銀染色）又はＨＰＬＣ分析によって測定することができる。
【００６１】
本発明は、キメラポリペプチド、その断片、及び相補配列をコードするポリヌクレオチド配列をさらに提供する。本明細書で使用される「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「プライマー」という語は、二本鎖又は一本鎖、線状又は環状のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核（ＲＮＡ）を指すために互換的に使用される。ＲＮＡは、スプライシングされていない又はスプライシングされたｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡｉであり得る。ＤＮＡは、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、又はアンチセンスであり得る。特に、本発明のキメラポリペプチドをコードするように機能し得るヌクレオチド類似体及び誘導体、例えば、ヌクレアーゼ分解に耐性のあるものが含まれる。ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、本明細書に記載される本発明の核酸ワクチンに特に有用である。
【００６２】
「単離された」又は「実質的に純粋な」ポリヌクレオチドは、核酸が、起源とする生物の自然発生のゲノムに直接的に隣接した５’末端又は３’末端のいずれかを備えたコード配列と直接的に隣接していないことを意味する。従って、この語は、例えば、組換えＤＮＡ（例えば、ＰＣＲによって生じるｃＤＮＡ、又はクローニング中に生じる制限エンドヌクレアーゼ処置によって生じるゲノムＤＮＡ断片）、並びにベクターに組み込まれた組換えＤＮＡ、自己複製プラスミド若しくはウイルス、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡを含む。
【００６３】
本発明のポリヌクレオチド配列は、当技術分野で公知の標準的な技術（例えば、分子クローニング、化学合成）を用いて得ることができ、純度は、ポリアクリルアミド若しくはアガロースゲル電気泳動法、及び配列解析などによって決定することができる。ポリヌクレオチドはまた、当技術分野で周知のハイブリダイゼーション又はコンピュータベースの技術を用いて単離することもできる。このような技術としては、限定されるものではないが：（１）相同なヌクレオチド配列を検出するためのゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブリーのプローブとのハイブリダイゼーション；（２）ＤＮＡ配列によって発現されるポリペプチドの抗体スクリーニング（例えば、発現ライブラリーを用いる）；（３）目的の核酸配列にアニーリングすることができるプライマーを用いたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；（４）関連した配列についての配列データベースのコンピューター検索；（５）核酸サブトラクションライブラリーのディファレンシャルスクリーニングが挙げられる。
【００６４】
本発明はまた、実質的に相同なポリヌクレオチドも含む。本明細書で使用される「相同」という語は、核酸分子について使用される場合は、２つのヌクレオチド配列間の類似性を指す。両方の分子のヌクレオチド位置が同一のヌクレオチドによって占められている場合は、これらの分子は、その位置で相同である。「実質的に相同な」核酸配列は、少なくとも５０％相同、より高い可能性としては少なくとも７５％相同、最も高い可能性としては９０％以上相同である。実質的に相同な本発明のキメラポリペプチドと同様に、キメラポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドに実質的に相同なポリヌクレオチドは、相同である配列に関連した活性又は機能の殆ど又は全てを維持するポリペプチドをコードする。ポリヌクレオチドの場合、配列間の比較の長さは、通常は、少なくとも３０ヌクレオチド、あるいは少なくとも５０ヌクレオチド、より高い可能性としては少なくとも７５ヌクレオチド、最も高い可能性としては１１０ヌクレオチド以上である。ポリヌクレオチド配列のギャップ及びミスマッチオリゴヌクレオチドの原因となる相同配列を見つけ出すためのアルゴリズムは当技術分野で公知であり、例えば、ＢＬＡＳＴ（Altschul, 1990を参照）がある。
【００６５】
本発明のポリヌクレオチドは、必要に応じて：裸とするか、若しくは細胞膜を通過するのに適した担体（例えば、ポリヌクレオチド−リポソーム複合体若しくはコロイド分散系）に含める、ベクター（例えば、レトロウイルスベクター、及びアデノウイルスベクターなど）に含める、又はビーズ若しくは他の異種ドメイン（例えば、抗体、リガンド、ビオチン、ストレプトアビジン、及びレクチンなど）を挿入するために連結する、又は本明細書に開示される若しくは当技術分野で公知の他の適切な組成物とすることができる。従って、ポリヌクレオチド送達のウイルス手段又は非ウイルス手段を達成することができ、これらの手段が想定される。本発明のポリヌクレオチドは、別の機能性、例えば、本明細書に説明される様々な異種ドメインを有するポリペプチドをコードする、このポリヌクレオチドに連結された追加の核酸配列も含み得る。
【００６６】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、医薬製剤中での安定性を高めるためにヌクレアーゼに耐性を有するように修飾することもできる。記載されるポリヌクレオチドは、特に、本明細書に開示される又は当技術分野で公知の発現系にこのようなポリヌクレオチドが含められる場合に、本発明のキメラポリペプチドをコードするのに有用である。従って、発現ベクターを含むポリヌクレオチドも含まれる。
【００６７】
細胞での増殖又は発現の場合は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドをベクターに挿入することができる。「ベクター」という語は、核酸の挿入又は取込によって操作することができるプラスミド、ウイルス、又は当技術分野で公知の他のビヒクルを指す。このようなベクターは、遺伝子操作に使用することができる（即ち、クローニング「ベクター」）、又は挿入されたポリヌクレオチドを転写若しくは翻訳するために使用することができる（即ち、「発現ベクター」）。ベクターは、通常は、細胞での増殖のための複製起源及びプロモーターを少なくとも含む。発現ベクター内に存在するプロモーターを含む制御要素は、適切な転写及び翻訳を促進するために含められる（例えば、イントロンのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのインフレーム翻訳及び停止コドンを可能にする遺伝子の正しい読み枠の維持）。本明細書に記載されるポリヌクレオチドのインビボ又はインビトロでの発現は、核酸に機能的に連結されたプロモーターによって実現することができる。
【００６８】
「プロモーター」は、プロモーターが機能的に連結された核酸の転写を誘導するのに十分な最小の核酸配列を指す（Bitter 1987を参照）。プロモーターは、構成的に転写を誘導することができる、組織特異的とすることができる、又は誘導性若しくは抑制性の転写を実現することができ、このような要素は、通常は、そのように制御される遺伝子の５’領域若しくは３’領域に位置する。
【００６９】
本明細書で使用される「機能的に連結された」という語は、選択されたポリヌクレオチド（例えば、キメラポリペプチドをコードする）及び調節配列が、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列に結合されると転写を可能にするように結合されていることを意味する。典型的には、プロモーターは、ポリヌクレオチドの５’末端に位置し、プロモーターがポリヌクレオチドの発現を調節することを可能にするように転写開始部位に近接することができる。
【００７０】
細菌系でクローニングする場合は、構成的プロモーター、例えば、Ｔ７など、及び誘導プロモーター、例えば、バクテリオファージλ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃなどのｐＬを使用することができる。哺乳動物細胞系でクローニングする場合は、構成的プロモーター、例えば、ＳＶ４０及びＲＳＶなど、又は哺乳動物細胞のゲノムに由来する誘導プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）若しくは哺乳動物ウイルスに由来する誘導プロモーター（例えば、マウス乳癌ウイルスの長い末端反復配列、アデノウイルス後期プロモーター）を使用することができる。組換えＤＮＡ又は合成技術によって作製されるプロモーターを使用して、本発明の核酸配列の転写を可能にすることもできる。
【００７１】
組換えウイルス又はウイルス要素を利用して発現を誘導する哺乳動物発現系を操作することができる。例えば、アデノウイルス発現ベクターを使用する場合は、核酸配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーター及び三部リーダー配列（tripartite leader sequence）に結合することができる。あるいは、ワクチンウイルス７．５Ｋプロモーターを使用することができる（Mackett 1982；Mackett 1984；Panicali 1982を参照）。
【００７２】
酵母での発現の場合は、構成的プロモーター又は誘導プロモーターを含む多数のベクターを使用することができる（Ausubel 1988；Grant 1987；Glover 1986；Bitter 1987；及びStrathem 1982を参照）。ポリヌクレオチドを、（例えば、市販されているインビトロ転写／翻訳キットを用いて）インビトロでの発現のために発現ベクターに挿入しても良いし、又はインビボの適した細胞、臓器、組織、又は生物への適切な核酸の導入によって原核生物又は真核生物での発現を促進するプロモーター配列を含む発現ベクターに挿入しても良い。
【００７３】
本明細書で使用される「導入遺伝子」は、技術によって宿主細胞に導入されるポリヌクレオチドの任意の断片であり、その細胞から発生する生物の一部となる。導入遺伝子は、１つ以上のプロモーター及びその他のＤＮＡ、例えば、全てが選択されたＤＮＡに機能的に連結される、選択されたＤＮＡの発現に必要なイントロンを含むことができ、且つエンハンサー配列を含み得る。導入遺伝子は、トランスジェニック生物に対して部分的若しくは完全に異種（即ち、外来性）であるポリヌクレオチドを含んでも良いし、又はこの生物の内在性遺伝子と同種の遺伝子であっても良い。導入遺伝子は、宿主細胞のゲノムに組み込んでも良いし、又は自己複製プラスミドとして維持しても良い。
【００７４】
本明細書で使用される「宿主細胞」は、増殖される、転写される、又は発現されるポリペプチドをコードすることができるポリヌクレオチドが導入される細胞である。この語は、導入される宿主細胞のあらゆる子孫も含む。全ての子孫は、複製中に生じる突然変異によって親細胞と同一ではないこともあることを理解されたい。宿主細胞は、限定されるものではないが、細菌、酵母、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を含む。例えば、組換えバクテリオファージポリヌクレオチド、プラスミド核酸、又はコスミド核酸発現ベクターで形質転換された細菌；組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した、若しくは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系、組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、又は組換えウイルス発現ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクチンウイルス）に感染した動物細胞系、又は安定発現のために操作された形質転換動物細胞系。
【００７５】
本明細書で使用される「形質転換」という語は、細胞にとって外来性のポリヌクレオチド（例えば、導入遺伝子）の組み込みの後での細胞における遺伝子の変化を意味する。従って、「形質転換細胞」は、組換え技術によってポリヌクレオチドが導入された細胞又はその子孫である。宿主細胞の形質転換は、当業者に公知の従来技術によって行うことができる。宿主細胞が真核細胞である場合は、ＤＮＡ形質転換の方法として、例えば、リン酸カルシウム、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム、及びウイルスベクターが挙げられる。真核細胞もまた、本発明のポリヌクレオチド配列又はその断片、及び本明細書に記載される又は当技術分野で公知の、選択マーカーをコードする第２のＤＮＡ分子で形質転換することもできる。別の方法では、真核生物ウイルスベクター、例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）又はウシパピローマウイルスを使用して真核細胞を一過性に感染させる又は形質転換して、タンパク質を発現させる（Gluzman 1982を参照）。宿主が原核細胞（例えば、大腸菌（E. coli））である場合は、ＤＮＡを取り込むことができるコンピテント細胞を、指数増殖期の後に採取され、続いて当技術分野で周知の手順を用いるＣａＣｌ２法によって処置された細胞から調製することができる。原核生物の形質転換もまた、宿主細胞の原形質融合によって行うことができる。
【００７６】
本発明のキメラポリペプチド、ポリヌクレオチド、及びこのポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、標準的な技術を用いてリポソーム内に封入して、細胞又は生物全体に導入することができる。ポリヌクレオチドの送達にはカチオン性リポソームが好ましい。インビトロ又はインビボでのタンパク質及びポリヌクレオチドを含む様々な組成物の導入でのリポソームの使用は当業者に公知である。
【００７７】
リポソームは、対応する細胞受容体が見つかるように、リガンド、例えば、ポリペプチドのリポソーム調製物への添加によって目的の細胞型又は組織を標的とすることができる。モノクローナル抗体も標的化に使用することができる。多様な細胞表面タンパク質に特異的な多くのこのような抗体は、当業者に公知であり、且つ利用可能である。選択されたリガンドは、予め形成されたリポソームの脂質アンカーに共有結合するか、又はリポソーム調製中に取り込まれる（Lee 1994及びLee 1995を参照）。
【００７８】
本発明のキメラポリペプチド又はポリヌクレオチドをヒトに投与するために、本発明は、開示されるキメラポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む医薬製剤も提供する。従って、対象に投与される組成物は、「薬学的に許容され得る」又は「生理学的に許容され得る」製剤に含められる。
【００７９】
本明細書で使用される「薬学的に許容され得る」及び「生理学的に許容され得る」という語は、好ましくは過度の有害な副作用（例えば、悪心、頭痛など）を引き起こすことなく、対象に投与することができる担体、希釈剤、及び賦形剤などを指す。投与されるこのような調製物は、滅菌水溶液又は非水溶液、懸濁液、及びエマルションを含む。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルが挙げられる。水性担体としては、生理食塩水及び緩衝媒質を含め、水、アルコール／水溶液、エマルション、又は懸濁液が挙げられる。ビヒクルとしては、塩化ナトリウム液、リンガーデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンガー液、又は固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体及び栄養補給物、並びに電解質補給物（例えば、リンガーデキストロースをベースとするもの）などが挙げられる。防腐剤及び他の添加物、例えば、抗菌剤、抗酸化物質、キレート剤、及び不活性ガスなども含めることができる。当技術分野で周知の対象に投与するのに適した様々な医薬製剤は、本発明の方法に利用可能である（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)；及びThe Merck Index, 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ (1996)）。
【００８０】
投与される組成物の作用又は制御された送達の期間の調節は、この組成物を粒子又はポリマー物質、例えば、ポリエステル、ポリアミン酸、ヒドロゲル、ポリビニルピロリドン、エチレン酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン、又はラクチド／グリコリドコポリマー、ポリラクチド／グリコリドコポリマー、又はエチレン酢酸ビニルコポリマーに含めることによって達成することができる。組成物の放出速度は、このような巨大分子の濃度又は組成を変更することによって制御することができる。コロイド分散系としては、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、並びに水中油型エマルション、ミセル、混合物ミセル、及びリポソームを含む脂質系が挙げられる。
【００８１】
本発明の方法によって投与される組成物は、注射による非経口投与によって、時間をかけた漸進的潅流によって、又はボーラス投与によって、又は微細加工植え込み装置によって投与することができる。本組成物は、吸入、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内（例えば、膣又は肛門）、経皮的、局所的、又は血管内に投与することができる。本組成物は、複数回投与で投与することができる。有効量は、当業者が容易に決定することができる。
【００８２】
特段の記載がない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する分野の一般的な技術者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料が以下に説明される。本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。本発明は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない以下の実施例にさらに記載される。
【実施例】
【００８３】
１．癌の標的用の抗ＥＧＦＲ１−ＰＤ１融合タンパク質構築物
抗ＥＧＦＲ（セツキシマブ）は、頭部及び頸部の扁平上皮癌（放射線療法で局在的又は局所的に進行し、白金を用いた治療法の後に転移した）及びＥＧＦＲ発現転移性大腸癌（オキサリプラチン及びイリノテカンの両方を用いた化学療法で失敗した後の患者、又はイリノテカンを用いた化学療法に対して不耐性の患者での単剤療法）に対して承認された。Ｋ−ＲＡＳ突然変異を有する大腸癌（ＣＲＣ）患者には利用できない。
【００８４】
様々な試験では、ｍＣＲＣ患者の約５５〜６０％が、ファーストライン設定（first line setting）においてセツキシマブに応答するが、この応答も一過性である（１．５〜２か月の無進行生存（ＰＦＳ）利点）（ＥＰＡＲ）。相当数の患者が、セツキシマブに応答しない、又は治療法に対して耐性を有するようになる。頭部及び頸部の再発転移性癌では、３５％の患者しかセツキシマブに応答せず、化学療法では僅か２〜３か月の全生存（ＯＳ）及び（ＰＦＳ）利点である。
【００８５】
明らかに、これらの両方の指標においてセツキシマブ療法の効果を改善するための、殆ど満たされていない要望が存在する。さらに、ＥＧＦＲは、胃癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、及び膵臓癌でも発現する。しかしながら、セツキシマブは、標準治療において、これらの指標において有意な利点を一切証明することができなかった。従って、本発明は、セツキシマブを免疫調節療法と組み合わせることによって改善を提供する。
【００８６】
プログラム死−１（ＰＤ−１）は、活性化後にＴ細胞で発現される抑制性受容体である。ＰＤ−１は、ＡＰＣ上でそのリガンドＰＤ−Ｌ１に結合するとＴ細胞の活性を下方制御することが示されている。多くの腫瘍は、ＰＤ−Ｌ１を構成的に発現し、その過剰発現は、低下した腫瘍免疫、より侵攻性の疾患、及び生存の低下に関連している（Thompson 2004を参照）。これまでに、ＰＤ−Ｌ１の発現は、腎細胞癌（ＲＣＣ）、卵巣癌、及び黒色腫の患者の予後不良に関連することが実証されている。卵巣癌、肺癌、及び乳癌、腎細胞癌、頭部及び頸部の扁平上皮癌、食道癌、グリア芽腫、胸腺腫、結腸癌、膵臓癌、及び黒色腫の患者から新たに単離された腫瘍サンプルの免疫組織化学的分析により、大部分がＢ７−Ｈ１を発現することが分かった（Flies 2011；Nomi 2007を参照）。いくつかの前臨床試験により、ＰＤ１とＰＤＬ１との相互作用を阻害することによる腫瘍拒絶の増大が実証された。近年、抗ＰＤ１及びＰＤ−Ｌ１を用いる治療法により、黒色腫及び他の充実性腫瘍におけるかなりの活性が実証され、これらの利用が、最も有望な抗癌療法の１つであることが確認された。
【００８７】
セツキシマブを用いる治療法は、免疫調節と組み合わせることによって、免疫抑制環境の排除又は耐性の発生の遅延を改善することができる。さらに、下流経路での突然変異によってセツキシマブに対する耐性ができた患者はなお、本発明の融合タンパク質がＥＧＦＲ受容体に結合して、腫瘍によって発現されるＰＤ−Ｌ１の効果をなくすため、抗ＥＧＦＲｌ−ＰＤ−１から恩恵を受けることができ、Ｔ細胞が抗腫瘍応答をマウントすることが可能となる。従って、本発明の融合タンパク質は、腫瘍細胞の表面上のＥＧＦＲ及びＰＤ−Ｌ１の両方に結合することができる。
【００８８】
本発明の抗ＥＧＦＲｌ−ＰＤ１融合タンパク質構築物は、大腸癌、頭部及び頸部の扁平上皮癌、非小細胞肺癌、胃癌、及び膵臓癌に使用することができる。
【００８９】
分子の設計及び選択：
本発明の抗体融合分子は、勝負治療特性を有する。この分子は、抗ＥＧＦＲ１（セツキシマブ）の完全な活性を維持すると同時に、腫瘍環境ではＰＤ−Ｌ１受容体結合活性も有する。本明細書で癌治療のために開発された抗ＥＧＦＲｌ−ＰＤ１融合タンパク質の新たな分子は、上述の理由から、重鎖のＣ末端のアミノ酸リジン「Ｋ」が欠失している。この融合タンパク質の設計の主な目的は、機能が損なわれることなく抗ＥＧＦＲ１分子を無傷のまま維持し、且つ抗ＥＧＦＲ１抗体の様々な位置へのＰＤ１分子の融合を可能にすることである。即ち、ＨＣ  Ｃ末端、ＬＣ  Ｃ末端、ＨＣ  Ｎ末端、及び／又はＬＣ  Ｎ末端への融合、並びに図６に示されているように両方の鎖への二重融合である。
【００９０】
以下の構築物が設計された。
【００９１】
【表１】
2019010111.tif 000002
【００９２】
ＣＨＯ細胞での上記の融合構築物の発現：
抗ＥＧＦＲ１−ＰＤ１の個々のドメインのコドン最適化ヌクレオチド配列をＣＨＯ細胞での発現のために最適化した。このような最適化配列（配列番号１、２、３、及び４）を、表２に記載されているプライマーを用いて哺乳動物発現ベクターで構築した。
【００９３】
【表２】
2019010111.tif 000003
【００９４】
上の表に示されているｃＤＮＡプライマーセットを用いて、構築物を図１１に示されているように構築した。
【００９５】
２．癌治療のための抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質
高レベルのＴＧＦβが、黒色腫、並びに乳癌、結腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、及び前立腺癌、さらには血液悪性腫瘍を含む多くの種類の腫瘍によって産生される（Teicher 2001；Dong 2006を参照）。ＴＧＦβは、ＩＬ−２の遮断及びＴ−ｒｅｇｓの産生を含む他の機構によりＴ細胞及びＮＫ細胞に対して免疫抑制性であることが知られている。いくつかの証拠となる情報は、ＴＧＦβの活性を無効にすることにより、Ｔ細胞の抗腫瘍効果を増強できることを示唆している（Wrzesinski 2007）。さらに、ＴＧＦβは、上皮を介して間葉に広がる腫瘍の成長を助長し、血管形成を促進することができる。ＴＧＦβの発現はまた、患者の予後不良及び早期再発にも関連している。しかしながら、免疫応答の調節におけるＴＧＦβの多面効果を考慮すると、ＴＧＦβ活性の全体的な阻害により、広範な抗炎症活性が生じ得ることが示されている。従って、腫瘍近傍におけるＴＧＦβの局所的な減少は、免疫抑制環境を調節する別の方法であり得る。本発明の抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質は、腫瘍細胞上のＥＧＦＲに結合してＴＧＦβを腫瘍の周りに固定し、腫瘍細胞に対する免疫応答を増強する。
【００９６】
分子の設計及び選択：
この目的は、勝負治療特性を有する抗体融合分子を設計することである。この分子は、抗ＥＧＦＲ１（セツキシマブ）の完全な活性を維持するべきである一方、腫瘍環境ではＴＧＦβ結合活性を有するべきである。抗ＥＧＦＲ１  ＩｇＧ分子のアミノ酸配列は、リジンが重鎖のＣ末端で発現しなかったことを除いて維持された。単一融合及び二重融合の両方並びに発現レベルが表３に示され、ＴＧＦβＲＩＩは抗ＥＧＦＲ１に融合した。
【００９７】
【表３】
2019010111.tif 000004
【００９８】
ＣＨＯ細胞での上記の融合構築物の発現：
抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩの個々のドメインのコドン最適化ヌクレオチド配列をＣＨＯ細胞での発現のために最適化した。このような配列（配列番号１、２、４、及び７）を哺乳動物発現ベクターで構築した。発現構築物は図２１に示されている。
【００９９】
所望の細胞系を得るための上記のベクターの組み合わせのトランスフェクション：
上記の作製された発現構築物を、表４に示されている以下の組み合わせでＣＨＯ細胞にトランスフェクトして、図２１に示されている構築物を用いて以下の融合タンパク質を産生させた。
【０１００】
【表４】
2019010111.tif 000005
【０１０１】
プロテインＡカラムを用いる融合Ｍａｂ上清の精製：
組換えタンパク質を産生するＣＨＯ細胞の培養上清を用いる融合モノクローナル抗体（ＭＡｂ）。
【０１０２】
手順：
手順は、Ｃ１０／１０又はＸＫ２６カラム及びMab Select Xtra親和性樹脂を用いるＩｇＧの小規模精製プロセスを詳細に説明する。このプロトコルによって調製されるサンプルは様々な分析に使用することができる。
【０１０３】
工程：
滅菌条件下でモノクローナル抗体又は融合モノクローナル抗体を産生する組換え細胞系から分泌される培養上清を力価及び内毒素について試験した；
Mab Select XtraプロテインＡ樹脂を用いる親和性クロマトグラフィーを、結合緩衝液で洗浄して平衡化した；
上清のｐＨを０．５Ｍリン酸塩を用いてカラムと同じｐＨに調整した；
上清を、最大の結合を達成するために０．５ｍｌ／分の流速でカラムに通し、カラムに結合させた；
全ての融合ＭａｂがＦｃ領域を介して結合し、通された残りの不純物は、流れるときに通過する；
カラムを平衡緩衝液で洗浄した；
結合した融合Ｍａｂを、０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０で溶出させた；
溶出したタンパク質を調整して中性ｐＨ又は安定な製剤のｐＨに戻した；
精製されたタンパク質を、安定性によって−２０℃又は２〜８℃で保存した。
【０１０４】
SDS PAGEを用いるプロテインＡ精製融合Ｍａｂの分析：
得られたトランスフェクト上清を、プロテインＡ親和性カラムを用いて精製した。後に、これらを還元及び非還元SDS-PAGEで分析して、図２２に示されているように分子の完全性を調べ、プロテインＡ精製サンプルでは１２％還元SDS-PAGEで分析した。予想通り、全ての融合パートナーは、SDS-PAGEに予想パターンを示している。ＬＣ融合とＨＣは、近くを泳動しているが、バンドは分離している。この高い移動性は、８Ｎ−グリコシル化部位によるものであり得る（ＬＣ上でＴＧＢＲＩＩ  ３＊２＝６＋２）。
【０１０５】
図２３は、６％非還元SDS-PAGEで分析されたプロテインＡ精製サンプルの結果を示し、アミノ酸組成物は同じであるが、移動性が異なっている。これは、分子内でのＴＧＦβＲＩＩの位置及びアクセスに基づいたグリコシル化パターンの変動レベルによるものであり得る。
【０１０６】
３．癌標的のための抗ＣＴＬＡ４−ＰＤ１融合タンパク質構築物
卵巣癌、肺癌、及び乳癌、腎細胞癌、頭部及び頸部の扁平上皮癌、食道癌、グリア芽腫、胸腺腫、結腸癌、膵臓癌、及び黒色腫の患者から新たに単離された腫瘍サンプルの免疫組織化学的分析により、大部分がＢ７−Ｈ１を発現することが分かった（Flies 2011；Nomi 2007を参照）。いくつかの前臨床試験により、ＰＤ１とＰＤＬ１との相互作用を阻害することによる腫瘍拒絶の増大が実証された。近年、抗ＰＤ１及びＰＤ−Ｌ１を用いる治療法により、黒色腫及び他の充実性腫瘍におけるかなりの活性が実証され、これらの利用が、最も有望な抗癌療法の１つであることが確認された。
【０１０７】
抗ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞の同時刺激を可能にし得るが、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との相互作用によってなお抑制され得る。これは、少数の患者しか抗ＣＴＬＡ４抗体に対する応答を有していない理由の１つであり得る。抗ＣＴＬＡ４及びＰＤ１の両方の融合抗体は、抗ＣＴＬＡ４がＴ細胞の同時刺激を可能にし、ＰＤ１が腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１に結合して腫瘍微小環境におけるＴ細胞の免疫抑制を無効にするため、いずれか一方の作用物質単独よりも効果的である。これは、抗ＣＴＬＡ４の単独使用が免疫の破綻的な有害事象をもたらすため、抗ＣＴＬＡ４よりも安全でさえあり得る。
【０１０８】
分子の設計及び選択：
この目的は、勝負治療特性を有する抗体融合分子を設計することである。この分子は、抗ＣＴＬＡ４（イピリムマブ）の完全な活性を維持するべきである一方、腫瘍環境ではＰＤ  Ｌ１受容体結合活性を有するべきである。重鎖のＣ末端のリジンの除去を除いて、抗ＣＴＬＡ４  ＩｇＧ分子の完全なアミノ酸配列を使用した。１５個のアミノ酸のリンカーが、ＰＤ１と抗ＣＴＬＡ４との間に位置していた。表５に示されている以下の構築物の組み合わせは、図２４に示されているように設計した。上記の融合タンパク質構築物の詳細は以下の通りである。
【０１０９】
【表５】
2019010111.tif 000006
【０１１０】
ＣＨＯ細胞での上記の融合構築物の発現：
抗ＣＴＬＡ４−ＰＤ１の個々のドメインの完全なヌクレオチド配列をＣＨＯ細胞での発現のためにコドン最適化した（配列番号３、４、５、及び６）。ｃＤＮＡを合成した。構築物を哺乳動物発現ベクターで構築した。図３３に示される構築物を用いた抗ＣＴＬＡ４−ＰＤ１融合タンパク質の発現。
【０１１１】
図３３に示されている開発された発現構築物を、以下の組み合わせ（表６）でＣＨＯ細胞にトランスフェクトして以下の融合タンパク質を産生させた。各構築物に対して得られた力価が最後の列に示されている。
【０１１２】
【表６】
2019010111.tif 000007
【０１１３】
融合タンパク質の精製及び特徴付け：
手順は、Ｃ１０／１０又はＸＫ２６カラム及びMab Select Xtra親和性樹脂を用いるＩｇＧの小規模精製プロセスの使用を説明する。このプロトコルによって調製されるサンプルは様々な分析に使用することができる。
【０１１４】
工程：
滅菌条件下でモノクローナル抗体又は融合モノクローナル抗体を産生する組換え細胞系から分泌される培養上清を力価及び内毒素について試験した；
Mab Select XtraプロテインＡ樹脂を用いる親和性クロマトグラフィーを、結合緩衝液で洗浄して平衡化した；
上清のｐＨを０．５Ｍリン酸塩を用いてカラムと同じｐＨに調整した；
上清を、最大の結合を達成するために０．５ｍｌ／分の流速でカラムに通し、カラムに結合させた；
全ての融合ＭａｂはＦｃ領域を介して結合し、通された残りの不純物は、流れるときに通過する；
カラムを平衡緩衝液で洗浄した；
結合した融合Ｍａｂを、０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０で溶出させた；
溶出したタンパク質を調整して中性ｐＨ又は安定な製剤のｐＨに戻した；そして
精製されたタンパク質を、安定性によって−２０℃又は２〜８℃で保存する。
【０１１５】
４．抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ（Ｆｍａｂ１）
結合ＥＬＩＳＡ手順：
融合Ｍａｂを、３つの異なるＥＬＩＳＡ：（１）ＥＧＦＲ１標的結合ＥＬＩＳＡ、（２）ＴＧＦβ標的結合ＥＬＩＳＡ、及び（３）二機能性ＥＬＩＳＡにおいて、その標的に結合する能力について試験した。
【０１１６】
標的結合ＥＬＩＳＡでは、標的（ｒｈＥＧＦＲ−Ｆｃキメラ又はＴＧＦβ）をNUNC maxisorbプレートで、４℃で一晩コーティングした。このプレートを洗浄し、次いでスーパーブロック（superblock）で、室温で２時間ブロックした。異なる希釈度の融合Ｍａｂ又は陰性対照抗体をプレートに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。融合Ｍａｂの結合を、ビオチン化抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２二次抗体の添加、これに続くペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンとの室温での１時間のインキュベートによって検出した。ＴＭＢ基質溶液を添加し、反応を１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。吸光度をBioTek Synergy H4 Hybridリーダーで、４５０ｎｍで測定した。
【０１１７】
二機能性ＥＬＩＳＡでは、ｒｈＥＧＦＲ−ＦｃキメラをNUNC maxisorbプレートで、４℃で一晩コーティングした。このプレートを洗浄し、次いでスーパーブロックで、室温で２時間ブロックした。異なる希釈の融合Ｍａｂ又は陰性対照抗体をプレートに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＧＦβを添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、抗ＴＧＦβ−ビオチンを添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰを添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質溶液を添加し、反応を１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。吸光度をBioTek Synergy H4 Hybridリーダーで、４５０ｎｍで測定した。
【０１１８】
結果：
抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂの標的ＥＧＦＲ１（図３４）及びＴＧＦβ（図３５）の両方に対する結合は、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩと同等であった。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂもまた、二機能性ＥＬＩＳＡで試験して、Ｍａｂの抗ＥＧＦＲ１ドメイン及びＴＧＦβＲＩＩドメインがそれぞれの標的に互いに干渉することなく結合できるか否かを決定した。図３６から分かるように、抗ＥＧＦＲ１ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂがその両方の標的に結合し、融合Ｍａｂの構造により、いずれかの標的への結合において干渉が全く存在しないことを示唆している。
【０１１９】
ＥＧＦＲ１を発現する細胞への結合：
手順：
Ａ−４３１細胞を、７０〜８０％のコンフルエンスに達するまでフラスコで増殖させた。これらの細胞をトリプシン処理して回収した。これらの細胞を、異なる希釈度の抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂ又は対照Ｉｇで、２〜８℃で３０分間染色した。これらの細胞を洗浄し、抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣコンジュゲートと共に２〜８℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、これらの細胞をフローサイトメーターで分析した。ＦＳＣ対ＳＳＣプロフィールに基づいて生細胞にゲートをかけた。ゲートがかけられた集団の全ＭＦＩを記録した。
【０１２０】
結果：
抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合体はＡ−４３１細胞を発現するＥＧＦＲに用量依存的に結合する（図３７）。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣの結合は、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩの結合と同等である。
【０１２１】
抗体依存性細胞傷害活性
手順：
Ａ−４３１細胞を、７０〜８０％のコンフルエンスに達するまでフラスコで増殖させた。これらの細胞をトリプシン処理して回収し、そして９６ウェルプレートに播種した。これらの細胞を、異なる希釈度の抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂ又は対照Ｉｇで、２〜８℃で３０分間標識した。標識した細胞を、新たに単離されたヒトＰＢＭＣと３７℃、５％ＣＯ２で２４時間共インキュベートした。Cyto-Tox-Glo細胞傷害性アッセイキットを用いて細胞傷害性を測定した。
【０１２２】
結果：
抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合体は、ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞によるＥＧＦＲ発現Ａ−４３１細胞のＡＤＣＣを媒介する。ＡＤＣＣは用量依存性である（図３８）。これらの結果は、融合ＭａｂのＦｃ部分が無傷で機能性であることを示唆している。
【０１２３】
増殖の抑制
手順：
Ａ−４３１細胞を、７０〜８０％のコンフルエンスに達するまでフラスコで増殖させた。これらの細胞をトリプシン処理して回収し、そして９６ウェルプレートに播種した。異なる希釈度の抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂ又は対照Ｉｇをこれらの細胞に添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートした。３日目に、細胞増殖をAlamarBlue法によって測定した。
【０１２４】
結果：
抗ＥＧＦＲ抗体、例えば、セツキシマブは、ＥＧＦＲ１発現細胞の増殖を抑制することが知られている。図３９に示されているように、抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂの抗ＥＧＦＲ部分は無傷であり、抗増殖活性を有する。
【０１２５】
５．抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ（Ｆｍａｂ２）
結合ＥＬＩＳＡ：手順：
抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合Ｍａｂを、３つの異なるＥＬＩＳＡ：（１）ＥＧＦＲ１標的結合ＥＬＩＳＡ、（２）ＴＧＦβ標的結合ＥＬＩＳＡ、及び（３）二機能性ＥＬＩＳＡにおいて、その標的に結合する能力について試験した。
【０１２６】
標的結合ＥＬＩＳＡでは、標的（ｒｈＥＧＦＲ−Ｆｃキメラ又はＴＧＦβ）をNUNC maxisorbプレートで、４℃で一晩コーティングした。このプレートを洗浄し、次いでスーパーブロックで、室温で２時間ブロックした。異なる希釈度の融合Ｍａｂ又は陰性対照抗体をプレートに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。融合Ｍａｂの結合を、ビオチン化抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２二次抗体の添加、これに続くペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンとの室温での１時間のインキュベートによって検出した。ＴＭＢ基質溶液を添加し、反応を１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。吸光度をBioTek Synergy H4 Hybridリーダーで、４５０ｎｍで測定した。
【０１２７】
二機能性ＥＬＩＳＡでは、ｒｈＥＧＦＲ−ＦｃキメラをNUNC maxisorbプレートで、４℃で一晩コーティングした。このプレートを洗浄し、次いでスーパーブロックで、室温で２時間ブロックした。異なる希釈の融合Ｍａｂ又は陰性対照抗体をプレートに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＧＦβを添加し、プレートを室温で、１時間インキュベートする。プレートを洗浄し、抗ＴＧＦβ−ビオチンを添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰを添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質溶液を添加し、反応を１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。吸光度をBioTek Synergy H4 Hybridリーダーで、４５０ｎｍで測定した。
【０１２８】
結果：
抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合Ｍａｂの標的ＥＧＦＲ１（図４０）及びＴＧＦβ（図４１）の両方に対する結合は、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩと同等であった。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合Ｍａｂもまた、二機能性ＥＬＩＳＡで試験して、Ｍａｂの抗ＥＧＦＲ１ドメイン及びＴＧＦβＲＩＩドメインがそれぞれの標的に互いに干渉することなく結合できるか否かを決定した。図４２から分かるように、抗ＥＧＦＲ１ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合Ｍａｂがその両方の標的に結合し、融合Ｍａｂの構造により、いずれかの標的への結合において干渉が全く存在しないことを示唆している。
【０１２９】
増殖の抑制
手順：
Ａ−４３１細胞を、７０〜８０％のコンフルエンスに達するまでフラスコで増殖させた。これらの細胞をトリプシン処理して回収し、そして９６ウェルプレートに播種した。異なる希釈度の抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合Ｍａｂ又は対照Ｉｇをこれらの細胞に添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートした。３日目に、細胞増殖をAlamarBlue法によって測定した。
【０１３０】
結果：
抗ＥＧＦＲ抗体、例えば、セツキシマブは、ＥＧＦＲ１発現細胞の増殖を抑制することが知られている。図４３に示されているように、抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合Ｍａｂの抗ＥＧＦＲ部分は無傷であり、抗増殖活性を有する。
【０１３１】
６．ＴＧＦβＲＩＩ抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ（Ｆｍａｂ３）
結合ＥＬＩＳＡ：手順：
融合Ｍａｂを、３つの異なるＥＬＩＳＡ：（１）ＥＧＦＲ１標的結合ＥＬＩＳＡ、（２）ＴＧＦβ標的結合ＥＬＩＳＡ、及び（３）二機能性ＥＬＩＳＡ（Bifunctional ELISA）において、その標的に結合する能力について試験した。
【０１３２】
標的結合ＥＬＩＳＡでは、標的（ｒｈＥＧＦＲ−Ｆｃキメラ又はＴＧＦβ）をNUNC maxisorbプレートで、４℃で一晩コーティングした。このプレートを洗浄し、次いでスーパーブロックで、室温で２時間ブロックした。異なる希釈度の融合Ｍａｂ又は陰性対照抗体をプレートに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。融合Ｍａｂの結合を、ビオチン化抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２二次抗体の添加、これに続くペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンとの室温での１時間のインキュベートによって検出した。ＴＭＢ基質溶液を添加し、反応を１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。吸光度をBioTek Synergy H4 Hybridリーダーで、４５０ｎｍで測定した。
【０１３３】
二機能性ＥＬＩＳＡでは、ｒｈＥＧＦＲ−ＦｃキメラをNUNC maxisorbプレートで、４℃で一晩コーティングした。このプレートを洗浄し、次いでスーパーブロックで、室温で２時間ブロックした。異なる希釈の融合Ｍａｂ又は陰性対照抗体をプレートに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＧＦβを添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、抗ＴＧＦβ−ビオチンを添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰを添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質溶液を添加し、反応を１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。吸光度をBioTek Synergy H4 Hybridリーダーで、４５０ｎｍで測定した。
【０１３４】
結果：
ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂの標的ＥＧＦＲ１（図４４）及びＴＧＦβ（図４５）の両方に対する結合は、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩと同等であった。ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂもまた、二機能性ＥＬＩＳＡで試験して、Ｍａｂの抗ＥＧＦＲ１ドメイン及びＴＧＦβＲＩＩドメインがそれぞれの標的に互いに干渉することなく結合できるか否かを決定した。図４６から分かるように、ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂの結合は、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩと比較すると減少し、融合Ｍａｂの構造により、いずれかの標的への結合においてある程度の干渉が存在することを示唆している。
【０１３５】
ＥＧＦＲ１を発現する細胞への結合：
手順：
Ａ−４３１細胞を、７０〜８０％のコンフルエンスに達するまでフラスコで増殖させた。これらの細胞をトリプシン処理して回収した。これらの細胞を、異なる希釈度のＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂ又は対照Ｉｇで、２〜８℃で３０分間染色した。これらの細胞を洗浄し、抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣコンジュゲートと共に２〜８℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、これらの細胞をフローサイトメーターで分析した。ＦＳＣ対ＳＳＣプロフィールに基づいて生細胞にゲートをかけた。ゲートがかけられた集団についての全ＭＦＩを記録した。
【０１３６】
結果：
ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合体はＡ−４３１細胞を発現するＥＧＦＲに用量依存的に結合する。ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣの結合は、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩの結合と同等である。
【０１３７】
増殖の抑制
手順：
Ａ−４３１細胞を、７０〜８０％のコンフルエンスに達するまでフラスコで増殖させた。これらの細胞をトリプシン処理して回収し、そして９６ウェルプレートに播種した。異なる希釈度のＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂ又は対照Ｉｇをこれらの細胞に添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートした。３日目に、細胞増殖をAlamarBlue法によって測定した。
【０１３８】
結果：
抗ＥＧＦＲ抗体、例えば、セツキシマブは、ＥＧＦＲ１発現細胞の増殖を抑制することが知られている。図４７に示されているように、ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂの抗ＥＧＦＲ部分は無傷であり、抗増殖活性を有する。
【０１３９】
７．抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ（Ｆｍａｂ４）
結合ＥＬＩＳＡ：手順：
融合Ｍａｂを、３つの異なるＥＬＩＳＡ：（１）ＥＧＦＲ１標的結合ＥＬＩＳＡ、（２）ＴＧＦβ標的結合ＥＬＩＳＡ、及び（３）二機能性ＥＬＩＳＡにおいて、その標的に結合する能力について試験した。
【０１４０】
標的結合ＥＬＩＳＡでは、標的（ｒｈＥＧＦＲ−Ｆｃキメラ又はＴＧＦβ）をNUNC maxisorbプレートで、４℃で一晩コーティングした。このプレートを洗浄し、次いでスーパーブロックで、室温で２時間ブロックした。異なる希釈度の融合Ｍａｂ又は陰性対照抗体をプレートに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。融合Ｍａｂの結合を、ビオチン化抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２二次抗体の添加、これに続くペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンとの室温での１時間のインキュベートによって検出した。ＴＭＢ基質溶液を添加し、反応を１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。吸光度をBioTek Synergy H4 hybridリーダーで、４５０ｎｍで測定した。
【０１４１】
二機能性ＥＬＩＳＡでは、ｒｈＥＧＦＲ−ＦｃキメラをNUNC maxisorbプレートで、４℃で一晩コーティングした。このプレートを洗浄し、次いでスーパーブロックで、室温で２時間ブロックした。異なる希釈の融合Ｍａｂ又は陰性対照抗体をプレートに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＧＦβを添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、抗ＴＧＦβ−ビオチンを添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰを添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質溶液を添加し、反応を１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。吸光度をBioTek Synergy H4 Hybridリーダーで、４５０ｎｍで測定した。
【０１４２】
結果：
抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂの標的ＥＧＦＲ１（図４８）及びＴＧＦβ（図４９）の両方に対する結合は、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩと同等であった。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂもまた、二機能性ＥＬＩＳＡで試験して、Ｍａｂの抗ＥＧＦＲ１ドメイン及びＴＧＦβＲＩＩドメインがそれぞれの標的に互いに干渉することなく結合できるか否かを決定した。図５０から分かるように、抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂの結合は、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩと比較すると減少し、融合Ｍａｂの構造により、いずれかの標的への結合においてある程度の干渉が存在することを示唆している。
【０１４３】
ＥＧＦＲ１を発現する細胞への結合：
手順：
Ａ−４３１細胞を、７０〜８０％のコンフルエンスに達するまでフラスコで増殖させた。これらの細胞をトリプシン処理して回収した。これらの細胞を、異なる希釈度の抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂ又は対照Ｉｇで、２〜８℃で３０分間染色した。これらの細胞を洗浄し、抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣコンジュゲートと共に２〜８℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、これらの細胞をフローサイトメトリーで分析した。ＦＳＣ対ＳＳＣプロフィールに基づいて生細胞にゲートをかけた。ゲートがかけられた集団についての全ＭＦＩを記録した。
【０１４４】
結果：
抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合体はＡ−４３１細胞を発現するＥＧＦＲに用量依存的に結合する（図５１）。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣの結合は、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩの結合と比較すると減少している。
【０１４５】
８．抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ（Ｆｍａｂ１０）
結合ＥＬＩＳＡ：手順：
融合Ｍａｂを、３つの異なるＥＬＩＳＡ：（１）ＥＧＦＲ１標的結合ＥＬＩＳＡ、（２）ＴＧＦβ標的結合ＥＬＩＳＡ、及び（３）二機能性ＥＬＩＳＡにおいて、その標的に結合する能力について試験した。
【０１４６】
標的結合ＥＬＩＳＡでは、標的（ｒｈＥＧＦＲ−Ｆｃキメラ又はＴＧＦβ）をNUNC maxisorbプレートで、４℃で一晩コーティングした。このプレートを洗浄し、次いでスーパーブロックで、室温で２時間ブロックした。異なる希釈度の融合Ｍａｂ又は陰性対照抗体をプレートに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。融合Ｍａｂの結合を、ビオチン化抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２二次抗体の添加、これに続くペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンとの室温での１時間のインキュベートによって検出した。ＴＭＢ基質溶液を添加し、反応を１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。吸光度をBioTek Synergy H4 Hybridリーダーで、４５０ｎｍで測定した。
【０１４７】
二機能性ＥＬＩＳＡでは、ｒｈＥＧＦＲ−ＦｃキメラをNUNC maxisorbプレートで、４℃で一晩コーティングした。このプレートを洗浄し、次いでスーパーブロックで、室温で２時間ブロックした。異なる希釈の融合Ｍａｂ又は陰性対照抗体をプレートに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＧＦβを添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、抗ＴＧＦβ−ビオチンを添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰを添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質溶液を添加し、反応を１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。吸光度をBioTek Synergy H4 hybridリーダーで、４５０ｎｍで測定した。
【０１４８】
結果：
抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂの標的ＥＧＦＲ１に対する結合は、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩの結合と比較すると僅かに減少したが（図５２）、ＴＧＦβに対しては増加した（図５３）。抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂもまた、二機能性ＥＬＩＳＡで試験して、Ｍａｂの抗ＥＧＦＲ１ドメイン及びＴＧＦβＲＩＩドメインがそれぞれの標的に互いに干渉することなく結合できるか否かを決定した。図５４から分かるように、抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂの結合は、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩと同等であり、融合Ｍａｂの構造により、いずれかの標的への結合において干渉が全く存在しないことを示唆している。
【０１４９】
９．ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ（Ｆｍａｂ１２）
結合ＥＬＩＳＡ：手順：
融合Ｍａｂを、３つの異なるＥＬＩＳＡ：（１）ＥＧＦＲ１標的結合ＥＬＩＳＡ、（２）ＴＧＦβ標的結合ＥＬＩＳＡ、及び（３）二機能性ＥＬＩＳＡにおいて、その標的に結合する能力について試験した。
【０１５０】
標的結合ＥＬＩＳＡでは、標的（ｒｈＥＧＦＲ−Ｆｃキメラ又はＴＧＦβ）をNUNC maxisorbプレートで、４℃で一晩コーティングした。このプレートを洗浄し、次いでスーパーブロックで、室温で２時間ブロックした。異なる希釈度の融合Ｍａｂ又は陰性対照抗体をプレートに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。融合Ｍａｂの結合を、ビオチン化抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２二次抗体の添加、これに続くペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンとの室温での１時間のインキュベートによって検出した。ＴＭＢ基質溶液を添加し、反応を１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。吸光度をBioTek Synergy H4 Hybridリーダーで、４５０ｎｍで測定した。
【０１５１】
二機能性ＥＬＩＳＡでは、ｒｈＥＧＦＲ−ＦｃキメラをNUNC maxisorbプレートで、４℃で一晩コーティングした。このプレートを洗浄し、次いでスーパーブロックで、室温で２時間ブロックした。異なる希釈の融合Ｍａｂ又は陰性対照抗体をプレートに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＧＦβを添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、抗ＴＧＦβ−ビオチンを添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰを添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質溶液を添加し、反応を１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。吸光度をBioTek Synergy H4 Hybridリーダーで、４５０ｎｍで測定した。
【０１５２】
結果：
ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂの標的ＥＧＦＲ１に対する結合は、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩの結合と比較すると僅かに減少したが（図５３）、ＴＧＦβに対しては増加した（図５６）。ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂもまた、二機能性ＥＬＩＳＡで試験して、Ｍａｂの抗ＥＧＦＲ１ドメイン及びＴＧＦβＲＩＩドメインがそれぞれの標的に互いに干渉することなく結合できるか否かを決定した。図５７から分かるように、ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂの結合は、抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩと比較すると減少し、融合Ｍａｂの構造により、いずれかの標的への結合において干渉が存在することを示唆している。
【０１５３】
参考文献
本明細書に列挙する全ての参考文献は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられる。
Altschul, et al, 1990, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol. 15:403- 10.
Ausubel, et al, (ed), 1998, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ch. 13, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience.
Bitter, et al, 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast; Methods in Enzymology, 153:5 16-544.
Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Vol. 152, pp. 673-684.
Dong M., et al., 2006, Role of transforming growth factor-β in hematologic malignancies. Blood. 107:4589-4596.
Deutscher, M., et al., Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology,
Vol. 182, Academic Press (1990).
Flies, et al, 2011, Blockade of the B7-H1/PD-1 Pathway for Cancer Immunotherapy, J Biol Med. , 84(4): 409-421.
Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. II, Ch. 3, IRL Press, Wash., D.C. Gluzman (ed.), 1982, Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor, N.Y.:
Cold Spring Harbor Laboratory.
Grant, et al, 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, Methods in Enzymology, Vol. 153, 516-544.
Lee, et al, 1994, Delivery of liposomes into cultured KB cells via folate receptor-mediated endocytosis. J Biol. Chem., 269:3 198.
Lee, et al, 1995, Folate-mediated tumor cell targeting of liposome-entrapped doxorubicin in vitro. Biochem. Biophys. Actu, 1233: 134-144.
Mackett, et al., 1982, Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:7415-7419.
Mackett, et al., 1984, General method for production and selection of infectious vaccinia virus, J. Virol, 49:857-864.
Nomi, et al., 2007, Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death- 1 ligand/programmed death- 1 pathway in human pancreatic cancer. Clin Cancer Res., 13:2151-7.
Okazaki, et al., 2007, PD-1 and PD-1 ligands: from discovery to clinical
Application. International Immunology, Vol. 19, No. 7, pp. 813-824.
Panicali, et al.,1982, Construction of poxviruses as cloning vectors: insertion of the thymidine, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:4927-4931.
Pardoll, DM., 2012, The blockage of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat. Rev. Cancer, 12(4): 252-64.
Strathem, et al., 1982, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces,
Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II.
Thompson RH, et al., 2004, Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target. Proc Natl Acad Sci US A., 101(49): 17174-9.
Teicher BA., 2001, Malignant cells, directors of the malignant process: role of transforming growth factor beta. Cancer Metastasis Rev; 20:133-143.
Wrzesinski, et al., 2007, Transforming Growth Factor-β and the Immune Response: Implications for Anticancer Therapy, Clin Cancer Res, 13; 5262.
【図１】
2019010111.tif 000008
【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【配列表】
2019010111000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月5日(2018.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療効果のある融合タンパク質を調製する方法であって、前記融合タンパク質が、腫瘍標的部分及び、癌細胞の免疫寛容を弱める少なくとも１つの免疫調節分子を含み、前記腫瘍標的部分が、ＣＴＬＡ−４又はＥＧＦＲ１に結合する抗体であり、且つ前記融合タンパク質が次のステップ：
ＣＨＯ細胞での発現のために、前記融合タンパク質をコードするコドン最適化核酸であって、ＣＧ核酸含量を増加するように修飾されており、前記抗体の重鎖については配列番号１又は５、前記抗体の軽鎖については配列番号２又は６、免疫調節分子については配列番号３又は７であり、それぞれＥＧＦＲ１又はＣＴＬＡ４に結合する前記抗体の重鎖についての配列番号１又は５が、前記抗体の重鎖のＣ末端におけるリジンの発現のためのヌクレオチドを欠失している、コドン最適化核酸、を調製するステップ；
一過性の又は安定した発現が可能なＣＨＯ細胞で前記融合タンパク質の前記最適化核酸をクローニングするステップ；
前記宿主細胞を増殖させ且つ前記ＣＨＯ細胞による前記融合タンパク質の発現を可能にするのに適した条件下で、前記ＣＨＯ細胞を培地で増殖させるステップ；及び
さらなる精製のために、分泌された融合タンパク質を収集するステップ
によって調製される、方法。
【請求項２】
前記免疫調節分子が、前記融合タンパク質の二重特異的結合を可能にするのに十分な長さの、配列番号４の核酸によって発現するアミノ酸配列によって前記抗体に連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫調節分子が、直接又はリンカーを介して、前記抗体の重鎖のＮ若しくはＣ末端、前記抗体の軽鎖のＮ若しくはＣ末端、又は両鎖のＮ及びＣ末端の両方に連結される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記コドン最適化核酸が配列番号１、２、４、及び７を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記コドン最適化核酸が配列番号１、２、３、及び４を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記コドン最適化核酸が配列番号５、６、３、及び４を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
重鎖及び軽鎖をそれぞれコードする、配列番号１及び２、又は配列番号５及び６と、配列番号３又は７とを含む、核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸を含むベクター。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
【図１】図１は、重鎖におけるリジンの置換の様々な可能性を示しており、このような異種性により精製を行う必要がある。
【図２−１】図２は、抗ＥＧＦＲ１重鎖（配列番号１）；抗ＥＧＦＲ１軽鎖（配列番号２）；ＰＤ１（配列番号７）；リンカー（配列番号４）；抗ＣＴＬＡ−４重鎖（配列番号５）；抗ＣＴＬＡ−４軽鎖（配列番号６）；及びＴＧＦβＲＩＩ（配列番号７）を含む本発明の抗体−ペプチド融合タンパク質の発現に使用される最適化コドンヌクレオチド配列を示している。
【図２−２】図２は、抗ＥＧＦＲ１重鎖（配列番号１）；抗ＥＧＦＲ１軽鎖（配列番号２）；ＰＤ１（配列番号７）；リンカー（配列番号４）；抗ＣＴＬＡ−４重鎖（配列番号５）；抗ＣＴＬＡ−４軽鎖（配列番号６）；及びＴＧＦβＲＩＩ（配列番号７）を含む本発明の抗体−ペプチド融合タンパク質の発現に使用される最適化コドンヌクレオチド配列を示している。
【図２−３】図２は、抗ＥＧＦＲ１重鎖（配列番号１）；抗ＥＧＦＲ１軽鎖（配列番号２）；ＰＤ１（配列番号３）；リンカー（配列番号４）；抗ＣＴＬＡ−４重鎖（配列番号５）；抗ＣＴＬＡ−４軽鎖（配列番号６）；及びＴＧＦβＲＩＩ（配列番号７）を含む本発明の抗体−ペプチド融合タンパク質の発現に使用される最適化コドンヌクレオチド配列を示している。
【図３】図３は、抗ＥＧＦＲ１リンカーＰＤ１構築物（配列番号８、９、１０、及び１１）のアミノ酸残基を示している。
【図４】図４は、抗ＥＧＦＲ１−リンカー−ＴＧＦβＲＩＩ構築物（配列番号８、９、１０、及び１２）のアミノ酸残基を示している。
【図５】図５は、抗ＣＴＬＡ−４−リンカー−ＰＤ１（配列番号１３、１４、１０、及び１１）のアミノ酸残基を示している。
【図６】図６は、ＦＭａｂ５、ＦＭａｂ６、ＦＭａｂ７、及びＦＭａｂ８に対する抗ＥＧＦＲ１抗体におけるＰＤ１分子の置換の様々な可能性を示している。
【図７】図７は、抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＰＤ１＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣのアミノ酸配列を示し、ＰＤ１分子は、リンカーによって離隔された重鎖のＣ末端に連結され、配列番号１５及び９を含む。
【図８】図８は、抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ−ＰＤ１のアミノ酸配列を示し、ＰＤ１分子は、リンカーによって離隔された軽鎖のＣ末端に連結され、配列番号８及び１６を含む。
【図９】図９は、抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ−ＰＤ１のアミノ酸配列を示し、ＰＤ１分子は、リンカーによって離隔された重鎖のＮ末端に連結され、配列番号１７及び９を含む。
【図１０】図１０は、抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＰＤ１−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣのアミノ酸配列を示し、ＰＤ１分子は、リンカーによって離隔された軽鎖のＮ末端に連結され、配列番号８及び１８を含む。
【図１１】図１１は、配列番号１、２、及び７で示されている、ｃＤＮＡを用いて作製された発現構築物を示している。
【図１２】図１２は、抗ＥＧＦＲ１抗体、ＦＭａｂ１、ＦＭａｂ２、ＦＭａｂ３、ＦＭａｂ４、ＦＭａｂ９、ＦＭａｂ１０、ＦＭａｂ１ｌ、及びＦＭａｂ１２におけるＴＧＦβＲＩＩ分子の置換の様々な可能性を示している。
【図１３】図１３は、抗ＥＧＦＲｌ  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲｌ  ＬＣのアミノ酸配列を示し、ＴＧＦβＲＩＩ分子は、リンカーによって離隔された重鎖のＣ末端に連結され、配列番号２７及び９を含む。
【図１４】図１４は、抗ＥＧＦＲｌ  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲｌ  ＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩのアミノ酸配列を示し、ＴＧＦβＲＩＩ分子は、リンカーによって離隔された軽鎖のＣ末端に連結され、配列番号８及び２８を含む。
【図１５】図１５は、ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲｌ  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲｌ  ＬＣのアミノ酸配列を示し、ＴＧＦβＲＩＩ分子は、リンカーによって離隔された重鎖のＮ末端に連結され、配列番号２９及び９を含む。
【図１６】図１６は、抗ＥＧＦＲｌ  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲｌ  ＬＣのアミノ酸配列を示し、ＴＧＦβＲＩＩ分子は、リンカーによって離隔された軽鎖のＮ末端に連結され、配列番号８及び３０を含む。
【図１７】図１７は、抗ＥＧＦＲｌ  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲｌ  ＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩのアミノ酸配列を示し、ＴＧＦβＲＩＩ分子は、リンカーによって離隔された重鎖及び軽鎖のＣ末端に連結され、配列番号３１及び２８を含む。
【図１８】図１８は、抗ＥＧＦＲｌ  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲｌ  ＬＣのアミノ酸配列を示し、ＴＧＦβＲＩＩ分子は、リンカーによって離隔された重鎖のＣ末端及び軽鎖のＮ末端に連結され、配列番号３１及び３０を含む。
【図１９】図１９は、ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲｌ  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲｌ  ＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩのアミノ酸配列を示し、ＴＧＦβＲＩＩ分子は、リンカーによって離隔された重鎖のＮ末端及び軽鎖のＣ末端に連結され、配列番号２９及び２８を含む。
【図２０】図２０は、ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲｌ  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲｌ  ＬＣのアミノ酸配列を示し、ＴＧＦβＲＩＩ分子は、リンカーによって離隔された重鎖のＮ末端及び軽鎖のＮ末端に連結され、配列番号２９及び３０を含む。
【図２１】図２１は、配列番号１、２、及び３で示されている、ｃＤＮＡを用いて作製された発現構築物を示している。
【図２２】図２２は、１２％還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析されたプロテインＡ精製サンプルを示している。
【図２３】図２３は、６％非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析されたプロテインＡ精製サンプルを示している。
【図２４】図２４は、抗ＣＴＬＡ４抗体におけるＰＤ１分子の置換の様々な可能性を示している。
【図２５】図２５は、抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ−ＰＤ１＋抗ＣＴＬＡ４  ＬＣのアミノ酸配列を示し、ＰＤ１分子は、リンカーによって離隔された重鎖のＣ末端に連結され、配列番号３２及び１４を含む。
【図２６】図２６は、抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ＋抗ＣＴＬＡ４  ＬＣ−ＰＤ１のアミノ酸配列を示し、ＰＤ１分子は、リンカーによって離隔された軽鎖のＣ末端に連結され、配列番号１３及び３３を含む。
【図２７】図２７は、ＰＤ１−抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ＋抗ＣＴＬＡ４  ＬＣのアミノ酸配列を示し、ＰＤ１分子は、リンカーによって離隔された重鎖のＮ末端に連結され、配列番号３４及び１４を含む。
【図２８】図２８は、抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ＋ＰＤ１−抗ＣＴＬＡ４  ＬＣのアミノ酸配列を示し、ＰＤ１分子は、リンカーによって離隔された軽鎖のＮ末端に連結され、配列番号１３及び３５を含む。
【図２９】図２９は、抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ−ＰＤ１＋抗ＣＴＬＡ４  ＬＣ−ＰＤ１のアミノ酸配列を示し、ＰＤ１分子は、リンカーによって離隔された重鎖及び軽鎖のＣ末端に連結され、配列番号３２及び３３を含む。
【図３０】図３０は、抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ−ＰＤ１＋ＰＤ１−抗ＣＴＬＡ４  ＬＣのアミノ酸配列を示し、ＰＤ１分子は、リンカーによって離隔された重鎖のＣ末端及び軽鎖のＮ末端に連結され、配列番号３２及び３５を含む。
【図３１】図３１は、ＰＤ１−抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ＋抗ＣＴＬＡ４  ＬＣ−ＰＤ１のアミノ酸配列を示し、ＰＤ１分子は、リンカーによって離隔された重鎖のＮ末端及び軽鎖のＣ末端に連結され、配列番号３４及び３３を含む。
【図３２】図３２は、ＰＤ１−抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ＋ＰＤ１−抗ＣＴＬＡ４  ＬＣのアミノ酸配列を示し、ＰＤ１分子は、リンカーによって離隔された重鎖のＮ末端及び軽鎖のＮ末端に連結され、配列番号３４及び３５を含む。
【図３３】図３３は、配列番号７、５、及び６で示されている、ｃＤＮＡを用いて作製された発現構築物を示している。
【図３４】図３４は、ＥＧＦＲ１標的結合ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その固定標的ＥＧＦＲ１に結合する。
【図３５】図３５は、ＴＧＦβ標的結合ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＴＧＦβに結合する。
【図３６】図３６は、二機能性ＥＬＩＳＡ（Bifunctional ELISA）を示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＥＧＦＲ１及びＴＧＦβの両方に同時に結合する。
【図３７】図３７は、抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合ＭａｂのＥＧＦＲ１発現Ａ４３１細胞の結合のフローサイトメトリー分析を示している。
【図３８】図３８は、ＥＧＦＲ１発現Ａ−４３１細胞に対するＡＤＣＣを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、ＥＧＦＲ１発現Ａ−４３１細胞に対するＡＤＣＣを媒介し、その効果は用量依存性である。
【図３９】図３９は、増殖アッセイの阻害を示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、ＥＧＦＲ１発現Ａ−４３１細胞の増殖を阻害する。
【図４０】図４０は、ＥＧＦＲ１標的結合ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合Ｍａｂが、その固定標的ＥＧＦＲ１に結合する。
【図４１】図４１は、ＴＧＦβ標的結合ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合Ｍａｂが、その標的ＴＧＦβに結合する。
【図４２】図４２は、二機能性ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合Ｍａｂが、その標的ＥＧＦＲ１及びＴＧＦβの両方に同時に結合する。
【図４３】図４３は、増殖アッセイの阻害を示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ−ＴＧＦβＲＩＩ融合Ｍａｂが、ＥＧＦＲ１発現Ａ−４３１細胞の増殖を阻害する。
【図４４】図４４は、ＥＧＦＲ１標的結合ＥＬＩＳＡを示している。ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その固定標的ＥＧＦＲ１に結合する。
【図４５】図４５は、ＴＧＦβ標的結合ＥＬＩＳＡを示している。ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＴＧＦβに結合する。
【図４６】図４６は、二機能性ＥＬＩＳＡを示している。ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＥＧＦＲ１及びＴＧＦβの両方に同時に結合する。
【図４７】図４７は、増殖アッセイの阻害を示している。ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、ＥＧＦＲ１発現Ａ−４３１細胞の増殖を阻害する。
【図４８】図４８は、ＥＧＦＲ１標的結合ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その固定標的ＥＧＦＲ１に結合する。
【図４９】図４９は、ＴＧＦβ標的結合ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＴＧＦβに結合する。
【図５０】図５０は、二機能性ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＥＧＦＲ１及びＴＧＦβの両方に同時に結合する。
【図５１】図５１は、抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合ＭａｂのＥＧＦＲ１発現Ａ４３１細胞の結合のフローサイトメトリー分析を示している。
【図５２】図５２は、ＥＧＦＲ１標的結合ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その固定標的ＥＧＦＲ１に結合する。
【図５３】図５３は、ＴＧＦβ標的結合ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＴＧＦβに結合する。
【図５４】図５４は、二機能性ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＴＧＦβＲＩＩ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＥＧＦＲ１及びＴＧＦβの両方に同時に結合する。
【図５５】図５５は、ＥＧＦＲ１標的結合ＥＬＩＳＡを示している。ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その固定標的ＥＧＦＲ１に結合する。
【図５６】図５６は、ＴＧＦβ標的結合ＥＬＩＳＡを示している。ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＴＧＦβに結合する。
【図５７】図５７は、二機能性ＥＬＩＳＡを示している。ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋ＴＧＦβＲＩＩ−抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＥＧＦＲ１及びＴＧＦβの両方に同時に結合する。
【図５８】図５８は、二機能性ＥＬＩＳＡを示している。抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ−ＰＤ１＋抗ＣＴＬＡ４  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＣＴＬＡ４及びＰＤＬ１の両方に同時に結合する。
【図５９】図５９は、二機能性ＥＬＩＳＡを示している。抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ＋抗ＣＴＬＡ４  ＬＣ−ＰＤ１融合Ｍａｂが、その標的ＣＴＬＡ４及びＰＤＬ１の両方に同時に結合する。
【図６０】図６０は、二機能性ＥＬＩＳＡを示している。ＰＤ１−抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ＋抗ＣＴＬＡ４  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＣＴＬＡ４及びＰＤＬ１の両方に同時に結合する。
【図６１】図６１は、二機能性ＥＬＩＳＡを示している。抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ−ＰＤ１＋ＰＤ１−抗ＣＴＬＡ４  ＬＣ−ＰＤ１、抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ−ＰＤ１＋抗ＣＴＬＡ４  ＬＣ−ＰＤ１、及び抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ−ＰＤ１＋ＰＤ１−抗ＣＴＬＡ４  ＬＣ融合Ｍａｂが、それらの標的ＣＴＬＡ４及びＰＤＬ１の両方に同時に結合する。
【図６２】図６２は、二機能性ＥＬＩＳＡを示している。ＰＤ１−抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ＋抗ＣＴＬＡ４  ＬＣ−ＰＤ１及びＰＤ１−抗ＣＴＬＡ４  ＨＣ＋ＰＤ１−抗ＣＴＬＡ４  ＬＣ融合Ｍａｂが、それらの標的ＣＴＬＡ４及びＰＤＬ１の両方に同時に結合する。
【図６３】図６３は、二機能性ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ−ＰＤ１＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ融合Ｍａｂが、その標的ＥＧＦＲ及びＰＤＬ１の両方に同時に結合する。
【図６４】図６４は、二機能性ＥＬＩＳＡを示している。抗ＥＧＦＲ１  ＨＣ＋抗ＥＧＦＲ１  ＬＣ−ＰＤ１融合Ｍａｂが、その標的ＥＧＦＲ及びＰＤＬ１の両方に同時に結合する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
ＣＨＯ細胞での上記の融合構築物の発現：
抗ＥＧＦＲ１−ＰＤ１の個々のドメインのコドン最適化ヌクレオチド配列をＣＨＯ細胞での発現のために最適化した。このような最適化配列（配列番号１、２、７、及び４）を、表２に記載されているプライマーを用いて哺乳動物発現ベクターで構築した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
ＣＨＯ細胞での上記の融合構築物の発現：
抗ＥＧＦＲ１−ＴＧＦβＲＩＩの個々のドメインのコドン最適化ヌクレオチド配列をＣＨＯ細胞での発現のために最適化した。このような配列（配列番号１、２、４、及び３）を哺乳動物発現ベクターで構築した。発現構築物は図２１に示されている。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
ＣＨＯ細胞での上記の融合構築物の発現：
抗ＣＴＬＡ４−ＰＤ１の個々のドメインの完全なヌクレオチド配列をＣＨＯ細胞での発現のためにコドン最適化した（配列番号７、４、５、及び６）。ｃＤＮＡを合成した。構築物を哺乳動物発現ベクターで構築した。図３３に示される構築物を用いた抗ＣＴＬＡ４−ＰＤ１融合タンパク質の発現。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2019010111000001.app
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２−１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２−１】
2019010111.tif 000074
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２−２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２−２】
2019010111.tif 000075
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２−３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２−３】
2019010111.tif 000076
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１４】
2019010111.tif 000077
【外国語明細書】
2019010111000001.pdf