(57)【要約】      （修正有）【課題】関節疾患の治療に必要とされる良質な軟骨組織塊、及び軟骨組織塊を簡便に調製するために有用な技術の提供。【解決手段】フリズルド８タンパク質又はその断片を含む培地中で幹細胞を培養し軟骨細胞に分化させる方法、及び当該軟骨細胞から形成されてなる軟骨組織塊。フリズルド８タンパク質断片は、ある特定のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はそのアミノ酸配列において１或いは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞からの軟骨組織隗の分化・形成を促進する活性を有するポリペプチド。前記幹細胞が間葉系幹細胞又は多能性幹細胞であることが好ましく、更にヒト由来の幹細胞が望ましい軟骨組織塊。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）８タンパク質又はその断片を含む培地中で幹細胞から分化させた軟骨細胞から形成されてなる軟骨組織塊。
【請求項２】
前記断片が、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドである、請求項１記載の軟骨組織塊。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞からの軟骨組織塊の形成を促進する活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
前記幹細胞が間葉系幹細胞又は多能性幹細胞である、請求項１又は２記載の軟骨組織塊。
【請求項４】
前記幹細胞がヒト由来である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の軟骨組織塊。
【請求項５】
前記培地が無血清培地である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の軟骨組織塊。
【請求項６】
フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）８タンパク質又はその断片を含む培地中で幹細胞から軟骨細胞の分化を誘導する工程を含む、軟骨組織塊の製造方法。
【請求項７】
前記断片が、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドである、請求項６記載の製造方法。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞からの軟骨組織塊の形成を促進する活性を有するポリペプチド。
【請求項８】
前記幹細胞が間葉系幹細胞又は多能性幹細胞である、請求項６又は７記載の製造方法。
【請求項９】
前記幹細胞がヒト由来である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記培地が無血清培地である、請求項６〜９のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１１】
フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）８タンパク質又はその断片を含む、幹細胞から軟骨組織塊を分化、形成するための培地。
【請求項１２】
前記断片が、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドである、請求項１１記載の培地。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞からの軟骨組織塊の形成を促進する活性を有するポリペプチド。
【請求項１３】
前記幹細胞が間葉系幹細胞又は多能性幹細胞である、請求項１１又は１２記載の培地。
【請求項１４】
前記幹細胞がヒト由来である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１５】
前記培地が無血清培地である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨組織塊及びその製造方法、並びに幹細胞から軟骨組織塊を誘導するための培地に関する。より詳しくは、フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）８タンパク質又はその断片を含む培地中で幹細胞から分化させた軟骨細胞から形成されてなる軟骨組織塊等に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節の軟骨組織は加齢、疾患、過度の運動や事故により劣化、破損ないし欠損すると、変形性膝関節症、関節リウマチ、離断性骨軟骨炎や軟骨欠損症を発症し生活の質を低下させる。これら関節疾患に対する治療法として、ヒアルロン酸投与、マイクロフラクチャー、自家骨軟骨移植法、骨切り手術、人工関節などが開発されている。
【０００３】
また、膝関節における外傷性軟骨欠損症又は離断性骨軟骨炎を自家培養軟骨を用いて治療する方法も開発されている（非特許文献１）。この治療方法では、治療に用いる自家培養軟骨を調製するため、手術前に、荷重がかからない部位から軟骨組織を採取する必要がある。また、軟骨細胞の分裂回数にも制限がある。このため、良質な軟骨組織塊を多量に調製することは困難であった。
【０００４】
そこで、間葉系幹細胞から軟骨組織塊を分化、形成させ、治療に用いる試みがなされてきている。間葉系幹細胞は、臍帯血、さい帯、胎盤、骨髄、滑膜、歯髄、脂肪組織などの種々の組織から得られ、軟骨組織に比べ入手が容易である。また、間葉系幹細胞は、軟骨細胞に比べ高い分裂増殖能を持っている。しかし、間葉系幹細胞から分化させて得られた軟骨組織塊は、本来の軟骨組織に比べて質的に劣る細胞壊死、骨化、細胞希薄な部位や結節が確認されるため、関節疾患治療への応用はされていない（非特許文献２）。
【０００５】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（ＦＺＤ）遺伝子ファミリーのメンバーは、Ｗｎｔシグナル伝達タンパク質の受容体である７回膜貫通ドメインタンパク質をコードする。ヒトＦＺＤ遺伝子ファミリーとしてＦＺＤ１〜１０が知られている。Ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質の細胞外にあるシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）がＷｎｔ結合決定因子を含んでいること、ＦＺＤ可溶化受容体がＦｒｉｚｚｌｅｄタンパク質と競合的にＷｎｔタンパク質と結合し、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害することが報告されている（非特許文献３，４）。これまで、動物細胞の培地にＦＺＤ８タンパク質又はその断片を添加することや、ＦＺＤ８タンパク質又はその断片存在下で幹細胞を培養することは報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，１７，４，ｐ．４１３−４２４
【非特許文献２】Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１２，１２，１０，ｐ．１３６１−１３８２
【非特許文献３】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９８，５５９３，ｐ．６０１−６０４
【非特許文献４】Ｃｅｌｌ，２０１２，１５，２，ｐ．３５１−３６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、関節疾患の治療に必要とされる良質な軟骨組織塊を簡便に調製するために有用な技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題解決のため、本発明は、以下の［１］〜［１７］を提供する。
［１］  フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）８タンパク質又はその断片を含む培地中で幹細胞から分化させた軟骨細胞から形成されてなる軟骨組織塊。
［２］  フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）８タンパク質又はその断片と、軟骨細胞と、を含んでなる軟骨組織塊。
［３］  前記断片が、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドである、［１］又は［２］の軟骨組織塊。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞からの軟骨組織塊の形成を促進する活性を有するポリペプチド。
［４］  前記幹細胞が間葉系幹細胞又は多能性幹細胞である、［１］〜［３］のいずれかの軟骨組織塊。
［５］  前記幹細胞がヒト由来である、［１］〜［４］のいずれかの軟骨組織塊。
［６］  前記培地が無血清培地である、［１］〜［５］のいずれかの軟骨組織塊。
［７］  フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）８タンパク質又はその断片を含む培地中で幹細胞から軟骨細胞の分化を誘導する工程を含む、軟骨組織塊の製造方法。
［８］  前記断片が、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドである、［７］の製造方法。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞からの軟骨組織塊の形成を促進する活性を有するポリペプチド。
［９］  前記幹細胞が間葉系幹細胞又は多能性幹細胞である、［７］又は［８］の製造方法。
［１０］  前記幹細胞がヒト由来である、［７］〜［９］のいずれかの製造方法。
［１１］  前記培地が無血清培地である、［７］〜［１０］のいずれかの製造方法。
［１２］  フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）８タンパク質又はその断片を含む、幹細胞から軟骨組織塊を分化、形成するための培地。
［１３］  前記断片が、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドである、［１２］の培地。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞からの軟骨組織塊の形成を促進する活性を有するポリペプチド。
［１４］  前記幹細胞が間葉系幹細胞又は多能性幹細胞である、［１２］又は［１３］の培地。
［１５］  前記幹細胞がヒト由来である、［１２］〜［１４］のいずれかの培地。
［１６］  前記培地が無血清培地である、［１２］〜［１５］のいずれかの培地。
［１７］  ［１］〜［６］のいずれかの軟骨組織塊又は［７］〜［１１］のいずれかの製造方法により得られた軟骨組織塊を用いる、関節疾患の治療方法。
【０００９】
本発明において、「軟骨組織塊」とは、シート状に培養された軟骨細胞が細胞集積を起こして、立体的な軟骨組織を形成したものをいう。「幹細胞からの軟骨組織塊の形成を促進する活性（軟骨組織塊形成促進活性）」とは、幹細胞から分化誘導された軟骨細胞の集積と立体的な軟骨組織塊の形成を誘導する活性を意味する。また、「幹細胞からの軟骨組織塊の形成を促進する活性」には、ある物質について、当該物質の存在下での培養における幹細胞からの軟骨組織塊の形成が、当該物質の非存在下での培養における軟骨組織塊の形成に比して促進されることも意味する。具体的には、当該物質の存在下で一定期間培養した後に得られる軟骨組織塊のサイズあるいは数が、当該物質の非存在下で同期間培養した後に得られる軟骨組織塊のサイズあるいは数に比べて、５％以上、１０％以上又は２０％以上、好ましくは３０％以上、４０％以上、５０％以上、より好ましくは６０％以上、７０％以上又は８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、１００％以上又はそれ以上増大することを意味する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、関節疾患の治療に必要とされる良質な軟骨組織塊を簡便に調製するために有用な技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＦＺＤ８ポリペプチドの存在下で間葉系幹細胞から分化誘導して形成した軟骨組織塊を示す図である（実施例１）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１３】
１．幹細胞から軟骨組織塊を分化、形成するための培地
［ＦＺＤ８］
本発明に係る培地は、幹細胞から軟骨細胞を分化、誘導し、軟骨組織塊を形成させるために用いられるものであって、フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）８タンパク質又はその断片を含むことを特徴とする。本発明に係る培地の組成は、フリズルド８タンパク質（ＦＺＤ８）又はその断片を含有する点を除いて、従来、幹細胞から軟骨細胞を誘導するために用いられている培地と同様であってよい。すなわち、本発明に係る培地は、従来の軟骨細胞誘導用培地に、ＦＺＤ８又はその断片を添加することにより調製できる。
【００１４】
ＦＺＤ８及びその断片は、幹細胞からの軟骨組織塊の形成を促進する活性（軟骨組織塊形成促進活性）を有する限りにおいて由来種は限定されず、ヒトの他、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類であってよい。ヒトＦＺＤ８のアミノ酸配列を配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０４３７０３）に示す。
【００１５】
ＦＺＤ８及びその断片の由来種は、培養する幹細胞の由来種に応じて適宜選択することができ、好ましくは培養する幹細胞と同じ由来種とされる。例えば、ヒト由来の細胞を培養する場合は、ヒト由来のＦＺＤ８等を用いるのが好ましい。
【００１６】
ＦＺＤ８の断片は、幹細胞からの軟骨組織塊の形成を促進する活性（軟骨組織塊形成促進活性）を有する限りにおいて、ＦＺＤ８の全長アミノ酸配列のうちの一部のアミノ酸配列を有する任意長のポリペプチドであってよい。具体的には、ヒトＦＺＤ８のアミノ酸配列（配列番号１）の２５番目〜１７２番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド（１４８アミノ酸残基）が挙げられる。ポリペプチドの長さとしては、アミノ酸残基数で、例えば、１２０〜２４０、より好ましくは１２０〜１５０とされる。
【００１７】
ＦＺＤ８及びその断片は、軟骨組織塊形成促進活性を有する限りにおいて、野生型ＦＺＤ８等のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなる改変タンパク質等であってもよい。
【００１８】
「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により欠失、置換、挿入もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下、最も好ましくは１又は２個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を意味する。
【００１９】
タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、当該タンパク質の構造又は機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、天然に存在するタンパク質において、当該タンパク質の構造又は機能を有意に変化させない多型（ポリモルフィズム）が存在することもまた周知である。従って、「１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列」には、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に変異を導入して得られる改変配列に加えて、天然に存在する多型配列も含まれる。
【００２０】
ＦＺＤ８の断片の具体例としては、例えば、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドが挙げられる。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、好ましくは配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞からの軟骨組織塊の分化、形成を促進する活性を有するポリペプチド、好ましくは配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、幹細胞からの軟骨組織塊の分化、形成を促進する活性を有するポリペプチド。
【００２１】
上記（Ａ）に関し、配列番号２で示されるアミノ酸配列は、ヒトＦＺＤ８の細胞外ドメインに位置し、ヒトＦＺＤ８のアミノ酸配列（配列番号１）の２５番目〜１７２番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド（１４８アミノ酸残基）に相当する。ＦＺＤ８の断片の他の好適な具体例としては、ヒトＦＺＤ８の細胞外ドメインに位置し、ヒトＦＺＤ８のアミノ酸配列（配列番号１）の３０番目〜１５１番目のアミノ酸（１２２アミノ酸残基）等も挙げられる。
【００２２】
さらに、ＦＺＤ８及びその断片は、軟骨組織塊形成促進活性を有する限りにおいて、天然から単離・精製されたタンパク質に加えて、組換えタンパク質又は融合タンパク質であってよく、化学修飾されたものであってもよい。天然タンパク質の単離、組換えタンパク質の発現、タンパク質の合成あるいはこれらのタンパク質の精製は、従来公知の手法によって行うことができる。
【００２３】
融合タンパク質としては、ＦＺＤ８及びその断片のＣ末側にＦｃタンパク質やＨｉｓ  ｔａｇを融合させたタンパク質等が挙げられる。好ましい組換えタンパク質の具体例としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列のＣ末端にＦｃタンパク質のアミノ酸配列（Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ1、Ｐｒｏ１００−Ｌｙｓ３３０）を融合した組換えタンパク質（実施例１参照）が挙げられる。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用されるものとする。以下、ＦＺＤ８及びその断片を、単に「ＦＺＤ８ポリペプチド」とも称する。
【００２５】
［軟骨細胞誘導用培地］
ＦＺＤ８ポリペプチドが添加される軟骨細胞誘導用培地としては、例えば、９０％  αＭＥＭ培地、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ  Ｌーグルタミン、０．１μＭデキサメタゾンの組成の培地がある。また、市販のキット（Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ、Ｔａｋａｒａ社）を用いた場合には、その内容成分（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅｂ、ａｓｃｏｒｂａｔｅ、ＩＴＳ  ＋  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＧＡ−１０００、ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、ｐｒｏｌｉｎｅ、Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、ＴＧＦ−ｂ３）を分化誘導剤として添加した基礎培地を用いることができる。本発明に係る幹細胞培養用の培地の組成は、上記のＦＺＤ８ポリペプチドを含有する点を除いて、従来幹細胞培養に用いられている培地と同様であってよい。すなわち、本発明に係る培地は、動物組織に由来する細胞の培養に従来用いられている基礎培地にＦＺＤ８ポリペプチドを添加することにより調製できる。基礎培地として具体的には以下を挙げることができる。
【００２６】
ＲＰＭＩ-１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地、Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ  ＭＥＭ培地、α-ＭＥＭ培地、１９９培地、ＩＭＤＭ培地、ＤＭＥＭ培地Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ培地、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｆ-１２、Ｈａｍ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｆ-１０、  Ｈａｍ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｆ１２Ｋ、ＡＴＣＣ-ＣＲＣＭ３０、ＤＭ-１６０、ＤＭ-２０１、ＢＭＥ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ-１５、ＲＩＴＣ８０-７、ＭＣＤＢ１０５、ＭＣＤＢ１０７、ＭＣＤＢ１３１、ＭＣＤＢ１５３、ＭＣＤＢ２０１、ＮＣＴＣ１０９、ＮＣＴＣ１３５、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ  ＭＢ７５２／１、ＣＭＲＬ-１０６６、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ’ｓ  ＢＭＯＣ-３  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８  Ｍｅｄｉｕｍ（以上サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ｍＴｅＳＲ１（ステムセルテクノロジーズ社）、ＴｅＳＲ−Ｅ８  ｍｅｄｉｕｍ（ステムセルテクノロジーズ社）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（和光純薬社）、ｍＥＳＦ培地（和光純薬社）、ＳｔｅｍＦｉｔ（味の素社）、Ｓ−ｍｅｄｉｕｍ（ＤＳファーマ社）、ＲｅｐｒｏＸＦ（リプロセル社）、ＰＳＧｒｏ-ｆｒｅｅ  Ｈｕｍａｎ  ｉＰＳＣ/ＥＳＣ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＲＤ社）、ｈＰＳＣ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（タカラバイオ社）、ＲｅｐｒｏＦＦ２（リプロセル社）、ＥＸ-ＣＥＬＬ  ３０２培地（ＳＡＦＣ社）、ＥＸ-ＣＥＬＬ-ＣＤ-ＣＨＯ（ＳＡＦＣ社）又はＳＴＥＭｄｉｆｆ  ＡＰＥＬ  Ｍｅｄｉｕｍ（ステムセルテクノロジーズ社）など及びこれらの混合物。
【００２７】
本発明に係る培地は、これらの基礎培地にＢＭＰ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、Ｎｏｄａｌ阻害剤、レチノイン酸などの分化誘導剤とＦＺＤ８ポリペプチドを予め添加あるいは細胞培養中に添加することによっても調製できる。
【００２８】
本発明に係る培地におけるＦＺＤ８ポリペプチドの添加濃度は、軟骨組織塊形成促進活性を示す限りにおいて特に限定されないが、例えば、１．０ｐｇ／ｍｌ〜１００．０μｇ／ｍｌ、好ましくは１．０ｎｇ／ｍｌ〜１０．０μｇ／ｍｌ、より好ましくは１０．０ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌである。
【００２９】
［添加物］
本発明に係る培地には、必要に応じて細胞の生存又は増殖に必要な生理活性物質及び栄養因子などを添加できる。これらの添加物は、培地に予め添加されていてもよく、細胞培養中に添加されてもよい。培養中に添加する方法は、１溶液または２種以上の混合溶液などいかなる形態によってもよく、連続的又は断続的な添加であってもよい。
【００３０】
生理活性物質としては、インシュリン、ＩＧＦ−１、トランスフェリン、アルブミンまたは補酵素Ｑ10などが挙げられる。
栄養因子としては、糖、アミノ酸、ビタミン、加水分解物または脂質などが挙げられる。
糖としては、グルコース、マンノースまたはフルクトースなどの中性糖、シアル酸などの酸性糖、アミノ糖、糖アルコールなどが挙げられ、１種または２種以上を組み合わせて用いられる。
アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンまたはＬ−バリンなどが挙げられ、１種または２種以上を組み合わせて用いられる。
ビタミンとしては、ｄ−ビオチン、Ｄ−パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピロドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミンまたはＤＬ−α―トコフェロールなどが挙げられ、１種または２種以上を組み合わせて用いられる。
加水分解物としては、大豆、小麦、米、えんどう豆、とうもろこし、綿実、酵母抽出物などを加水分解したものが挙げられる。
脂質としては、コレステロール、リノール酸またはリノレイン酸などが挙げられる。
さらに、培地には、カナマイシン、ストレプトマイシン、ペニシリンまたはハイグロマイシンなどの抗生物質を必要に応じて添加してもよい。シアル酸等の酸性物質を培地に添加する場合には、培地のｐＨを細胞の成育に適した中性域であるｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８に調整することが望ましい。
【００３１】
本発明に係る培地は、血清含培地であっても無血清培地であってもよい。異種動物由来成分の混入防止の観点からは血清を含有しないか、培養される幹細胞と同種動物由来の血清が用いられることが好ましい。
【００３２】
無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。無血清培地は、精製された血液由来成分や増殖因子などの動物組織由来成分を含有していてもよい。
【００３３】
本発明に係る培地は、血清と同様に、血清代替物を含んでいても含んでいなくともよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、脂質リッチアルブミン及び組換えアルブミン等のアルブミン代替物、植物デンプン、デキストラン、タンパク質加水分解物、トランスフェリン又は他の鉄輸送体、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２-メルカプトエタノール、３’-チオグリセロールあるいはこれらの均等物などが挙げられる。
【００３４】
血清代替物の具体例としては、例えば、国際公開第９８／３０６７９号記載の方法により調製されるものや、市販のｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ社）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ-ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及びＧｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などが挙げられる。
【００３５】
２．軟骨組織塊の製造方法
［幹細胞］
本発明が対象とする「幹細胞」は、自己複成能及び分化増殖能を有する未熟な細胞をいい、分化能力に応じて、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ)、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ)、単能性幹細胞(ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ)等が含まれる。「幹細胞」は、一般に、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と、三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞と定義されている。
【００３６】
多能性幹細胞とは、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
【００３７】
幹細胞の由来種も特に限定されず、例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ブタ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類などの細胞であってもよい。また、本発明に用いられる幹細胞は、自家、他家のいずれであってもよい。
【００３８】
幹細胞としては、間葉系幹細胞、スフェロイド状態から胚様体（ＥＢ体）と呼ばれる擬似的な胚の形成を経て様々な組織への分化・誘導のステップに進むことが知られている胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）や誘導性多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）、始原生殖細胞に由来する胚性生殖（ＥＧ）細胞、精巣組織からのＧＳ細胞の樹立培養過程で単離されるｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｓｔｅｍ（ｍＧＳ）細胞、骨髄から単離されるｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ（ＭＰＣ）等の多能性幹細胞などが挙げられるが、機能を有する骨芽細胞、軟骨細胞等へ分化能を保持する細胞であれば特に限定されない。
【００３９】
多能性幹細胞としては、特に、上述のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を挙げることができる。体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した幹細胞も、多能性幹細胞としてまた好ましい（Ｎａｔｕｒｅ，１９９７，３８５，ｐ．８１０、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８０，ｐ．１２５６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，１７，ｐ．４５６、Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９４，ｐ．３６９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９９，２２，ｐ．１２７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９９，９６，ｐ．１４９８４、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００，２４，ｐ．１０９）。
【００４０】
ヒトＥＳ細胞株は、例えばＷＡ０１（Ｈ１）およびＷＡ０９（Ｈ９）は、ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから、ＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２及びＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所（京都、日本）から入手可能である。
【００４１】
ｉＰＳ細胞としては、例えば、皮膚細胞等の体細胞に複数の遺伝子（初期化因子）を導入して得られる、ＥＳ細胞同様の多分化能を獲得した細胞が挙げられる。例えばＯｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、Ｃ-Ｍｙｃ遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２６，ｐ．１０１-１０６）等が挙げられる。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Ｏｃｔ３/４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ-Ｍｙｃ、Ｎ-Ｍｙｃ、Ｌ-Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５-２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ-ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３またはＧｌｉｓ１等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８８２０、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００９／０３２１９４、ＷＯ２００９／０５８４１３、ＷＯ２００９／０５７８３１、ＷＯ２００９／０７５１１９、ＷＯ２００９／０７９００７、ＷＯ２００９／０９１６５９、ＷＯ２００９／１０１０８４、ＷＯ２００９／１０１４０７、ＷＯ２００９／１０２９８３、ＷＯ２００９／１１４９４９、ＷＯ２００９／１１７４３９、ＷＯ２００９／１２６２５０、ＷＯ２００９／１２６２５１、ＷＯ２００９／１２６６５５、ＷＯ２００９／１５７５９３、ＷＯ２０１０／００９０１５、ＷＯ２０１０／０３３９０６、ＷＯ２０１０／０３３９２０、ＷＯ２０１０／０４２８００、ＷＯ２０１０／０５０６２６、ＷＯ２０１０／０５６８３１、ＷＯ２０１０／０６８９５５、ＷＯ２０１０／０９８４１９、ＷＯ２０１０／１０２２６７、ＷＯ２０１０／１１１４０９、ＷＯ２０１０／１１１４２２、ＷＯ２０１０／１１５０５０、ＷＯ２０１０／１２４２９０、ＷＯ２０１０／１４７３９５、ＷＯ２０１０／１４７６１２、Ｎａｔ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ., ２００８，２６，ｐ．７９５−７９７、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ, ２００８，２，ｐ．５２５−５２８、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ. ２００８，２６，ｐ．２４６７−２４７４、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. ２００８，２６，ｐ．１２６９−１２７５、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ, ２００８，３, ｐ．５６８−５７４、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ, ２００８，３，ｐ．４７５−４７９、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ, ２００８，３, ｐ．１３２−１３５、Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ.，２００９，１１，ｐ．１９７−２０３、Ｎａｔ. Ｂｉｏｔｅｃｈ., ２００９，２７，ｐ．４５９−４６１、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ.，２００９，１０６，ｐ．８９１２−８９１７、Ｎａｔｕｒｅ，２００９，４６１，ｐ．６４３−６４９、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２００９， ５，ｐ．４９１−５０３、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１０，６，ｐ．１６７−７４、Ｎａｔｕｒｅ，２０１０，４６３，ｐ．１０９６−１００、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２０１０，２���，ｐ．７１３−７２０、Ｎａｔｕｒｅ，２０１１，４７４，ｐ．２２５−９に記載の組み合わせが例示される。ｉＰＳ細胞は、所定の機関（理研バイオリソースセンター、京都大学など）より入手可能である。
【００４２】
ヒトｉＰＳ細胞としてより具体的には２５３Ｇ１株（理研セルバンクＮｏ. ＨＰＳ０００２）、２０１Ｂ７株（理研セルバンクＮｏ. ＨＰＳ００６３）、４０９Ｂ２株（理研セルバンクＮｏ. ＨＰＳ００７６）、４５４Ｅ２株（理研セルバンクＮｏ. ＨＰＳ００７７）、ＨｉＰＳ-ＲＩＫＥＮ-１Ａ株（理研セルバンクＮｏ. ＨＰＳ０００３）、ＨｉＰＳ-ＲＩＫＥＮ-２Ａ株（理研セルバンク Ｎｏ. ＨＰＳ０００９）、ＨｉＰＳ-ＲＩＫＥＮ-１２Ａ株（理研セルバンク Ｎｏ. ＨＰＳ００２９）、Ｎｉｐｓ-Ｂ２株（理研セルバンクＮｏ. ＨＰＳ０２２３）などを挙げることができる。
【００４３】
複能性幹細胞としては、特に、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経系幹細胞、骨髄幹細胞及び生殖幹細胞等の体性幹細胞等が挙げられる。複能性幹細胞は、好ましくは間葉系幹細胞、より好ましくは骨髄間葉系幹細胞である。なお、間葉系幹細胞とは、骨芽細胞、軟骨芽細胞及び脂肪芽細胞等の間葉系の細胞全て又はいくつかへの分化が可能な幹細胞又はその前駆細胞の集団を広義に意味する。間葉系幹細胞としてより具体例には、ヒト間葉系幹細胞（ＰＴ０３４，Ｔａｋａｒａ）、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ−ＢＭ，Ｔａｋａｒａ）、ヒト臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ−ＵＣ，Ｔａｋａｒａ）、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ−ＡＴ，Ｔａｋａｒａ）などを挙げることができる。
【００４４】
［軟骨組織塊の製造方法］
本発明に係る軟骨組織塊の製造方法は、ＦＺＤ８ポリペプチドを含む培地中で幹細胞から軟骨細胞の分化を誘導する工程を含むことを特徴とする。また、本発明に係る軟骨組織塊の製造方法は、前段工程として、幹細胞を培養し増殖させる培養工程を含んでいてもよい。
【００４５】
本発明に係る幹細胞の培養工程は、従来公知のバッチ培養（Ｂａｃｈ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加培養（Ｆｅｄ−Ｂａｃｈ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続培養（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）又は灌流培養（Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）等により行えばよい。
【００４６】
培養器は、特に限定されないが、フラスコ、ディッシュ、シャーレ、マイクロウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック又はタンクなどの培養槽などが挙げられる。これらの培養器の基材も、特に限定されず、ガラスや、ポリプロピレン又はポリスチレンなどの各種プラスチック、ステンレスなどの金属並びにそれらの組み合わせが挙げられる。
【００４７】
本発明に係る幹細胞の培養方法としては、培養器の基材表面への足場依存性細胞の接着を誘導するため、基材表面にコラーゲン、ゼラチン、ポリ-Ｌ-リジン、ポリ-Ｄ-リジン、ラミニン、ラミニンの一部構造体、フィブロネクチン及びこれら混合物（例えばマトリゲル）並びに溶解細胞膜調製物（Ｌａｎｃｅｔ，２００５，３６５，ｐ．１６３６-１６４１）などの足場をコーティングする接着培養や、メチルセルロースなどの高分子ポリマー（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４，２，５，ｐ．７３４−７４５）、ＭＦＧ−Ｅ８（Ｍｉｌｋ  ｆａｔ  ｇｌｏｂｕｌｅ−ＥＧＦ  ｆａｃｔｏｒ  ８）又は該タンパク質の断片を用いた上記足場が不要な浮遊培養が挙げられる。
【００４８】
培養される幹細胞は、分散細胞又は非分散細胞であり得る。分散細胞とは、細胞分散を促進するために処理された細胞をいう。分散細胞としては、例えば、２〜５０個、２〜２０個、又は２〜１０個の細胞からなる小さな細胞塊を形成している細胞が挙げられる。分散細胞は、浮遊（懸濁）細胞又は接着細胞であり得る。
【００４９】
培養工程における幹細胞の培養密度は、細胞の生存及び増殖を促進する効果を達成し得るような密度である限り特に限定されない。培養密度は、例えば１．０×１０1〜１．０×１０7細胞／ｍｌ、好ましくは１．０×１０2〜１．０×１０7細胞／ｍｌ、より好ましくは１．０×１０3〜１．０×１０7細胞／ｍｌ、さらに好ましくは３．０×１０4〜１．０×１０7細胞／ｍｌである。
【００５０】
温度、溶存ＣＯ2濃度、溶存酸素濃度及びｐＨなどの培養条件は、動物組織に由来する細胞の培養に従来用いられている技術に基づいて適宜設定できる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが３０〜３９℃、好ましくは３７℃であり得る。溶存ＣＯ2濃度は、１〜１０％、好ましくは２〜５％であり得る。酸素分圧は、１〜２２％であり得る。
【００５１】
幹細胞の培養工程を接着培養で行う場合、フィーダー細胞の存在下で培養してもよい。フィーダー細胞には、胎児線維芽細胞等のストローマ細胞を用いることができる（例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９４、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，１９８１，７８，１２，ｐ．７６３４−７６３８、Ｎａｔｕｒｅ，１９８１，２９２，５８１９，ｐ．１５４−１５６、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，１９６９，４，５，ｐ．５４９−５５３、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，２７２，５２６２，ｐ．７２２−７２４、Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９８２，１１２，１，ｐ．８９−９５、国際公開第０１／０８８１００号、同第２００５／０８０５５４号参照）。
【００５２】
幹細胞の培養工程を浮遊培養で行う場合、担体上での浮遊培養（Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，１３２，２，ｐ．２２７−２３６）またはメチルセルロースなどの高分子ポリマーを用いた浮遊培養（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４，２，５，ｐ．７３４−７４５）などが挙げられる。
【００５３】
幹細胞の浮遊培養とは、培地中において、培養器又はフィーダー細胞を用いる場合に対して非接着性の条件下で幹細胞を培養することをいう。幹細胞の浮遊培養としては、幹細胞の分散培養及び幹細胞の凝集浮遊培養が挙げられる。
幹細胞の分散培養とは、懸濁された幹細胞を培養することをいい、例えば、２〜２０個の幹細胞からなる小さな細胞塊の分散培養が挙げられる。分散培養を継続した場合、培養された分散細胞がより大きな幹細胞塊を形成し、その後凝集浮遊培養が実行され得る。
凝集浮遊培養としては、胚様体培養法（Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１９９５，７，６，ｐ．８６２-８６９参照）、ＳＦＥＢ法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００５，８，３，ｐ．２８８-２９６、国際公開第２００５／１２３９０２号）、メッシュフィルターを用いて機械的処理により細胞株を継代させるスフェア培養法（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４，２，５,ｐ．７３４−７４５）が挙げられる。
【００５４】
幹細胞からの軟骨細胞の分化誘導工程は、上述の本発明に係るＦＺＤ８ポリペプチドを含む培地中で幹細胞を培養することによって行うことができる。本発明に係る軟骨組織塊の製造方法では、幹細胞から軟骨細胞への分化誘導培地にＦＺＤ８ポリペプチドを添加して培養することで、簡便なシャーレ等で平板培養において良質な軟骨組織塊を製造することが可能である。
【００５５】
ここで、軟骨組織塊が良質であるとは、軟骨組織塊内部に、均一に密集した軟骨細胞が観察され、細胞壊死、骨化、細胞希薄な部位や結節が確認されないことを意味する。良質な軟骨組織塊では、軟骨が形成され、組織の内部に硝子軟骨が含まれる。
【００５６】
従来、平板培養法によって良質な軟骨組織塊を得ることは難しいとされている。遠心機などを用いた物理的処理により細胞の積層を行ったり、足場を用いて培養を行ったりすることで三次元的な培養を行い、これによって良質な軟骨組織塊を形成する試みがなされてきた（非特許文献２）。これまで、平板培養によって良質な軟骨組織塊を調製できたことは報告されていない。
【００５７】
本発明に係る軟骨組織塊の製造方法では、ＦＺＤ８ポリペプチドの軟骨組織塊形成促進作用により、平板培養であっても良質な軟骨組織塊を形成させることができるので、細胞に対する何らかの物理的処理や足場が不要となり、簡便に良質な軟骨組織塊を製造することが可能である。
【００５８】
平板培養に用いられる培養器は、特に限定されないが、フラスコ、ディッシュ、シャーレ、マイクロウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、トレイなどが挙げられ得る。これらの培養器の基材も、特に限定されず、ガラスや、ポリプロピレン及びポリスチレンなどの各種プラスチック、ステンレスなどの金属又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００５９】
分化誘導工程における幹細胞の播種密度は、軟骨組織塊への組織化及び良質な軟骨組織塊の形成を阻害しない密度であればよく、特に限定されないが、好ましくはコンフルエントまたはサブコンフルエント（８０％以上の細胞密度）である。
【００６０】
形成された軟骨組織塊は、例えば、アルシアンブルーを用いて細胞を染色することにより確認できる。
【００６１】
３．軟骨組織塊
上述の製造方法によって得られた軟骨組織塊は、関節疾患の再生医療治療のために利用できる。関節疾患としては、変形性関節症、半月板損傷、関節リウマチ、外傷性関節炎等が挙げられる。ヒト以外の動物由来の軟骨組織塊を同じ動物に利用することもできるが、好ましくはヒト由来の軟骨組織塊をヒト軟骨組織を代替する目的又はヒト軟骨の機能を補完する目的で利用され得る。
【００６２】
培養器を大きくしたり、得られた軟骨組織塊を寄せ集めたりすることで、より大きな軟骨組織塊を製造することも可能である。軟骨組織塊は、患部に適した大きさに成形して提供され得る。また、軟骨組織塊は、症状に応じて複数を患部へ投与、埋設することができる。
【００６３】
本発明に係る軟骨組織塊は、製造工程に起因するＦＺＤ８ポリペプチドを含有していてもよい。
【実施例】
【００６４】
［実施例１：ＦＺＤ８ポリペプチドによる間葉系幹細胞からの軟骨組織塊形成の促進］
ヒト間葉系幹細胞（Ｔａｋａｒａ、ＰＴ０３４）を、ヒト間葉系幹細胞専用完全合成培地キット（ＭＳＣＧＭ-ＣＤTM、Ｔａｋａｒａ、Ｂ０６３２）を用いて２４ウェルプラスチックディッシュ上でコンフルエントになるまで培養した。配列番号２に示されるヒトＦＺＤ８細胞外ドメイン（Ａｌａ２５−Ｐｒｏ１７２、ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバー：Ｑ９Ｈ４６１）と、Ｆｃタンパク質（Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ1、Ｐｒｏ１００−Ｌｙｓ３３０）が融合したヒトＦＺＤ８可溶化受容体（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、Ｒ＆Ｄ、６１２９-ＦＺ-０５０）を１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ又は１０００ｎｇ／ｍｌ添加したヒト間葉系幹細胞軟骨細胞分化培地（ｈＭＳＣ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔTM、  Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ，Ｔａｋａｒａ、Ｂ３００３、血清不含）に交換し、２日毎に該培地を交換しながら２０日間培養した。ヒトＦＺＤ８可溶化受容体のアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【００６５】
軟骨組織塊を識別するために細胞をアルシアンブルー染色し、染色陽性の軟骨組織塊の直径を測定した。結果を「図１」及び「表１」に示す。ヒトＦＺＤ８可溶化受容体を添加した実験群では、軟骨組織塊の形成が確認された。一方、ヒトＦＺＤ８可溶化受容体を添加していないコントロール群では、アシアンブルー染色陽性の軟骨細胞が観察されるものの、軟骨組織塊の形成は認められなかった。
【００６６】
【表１】
2019010002.tif 000002
【００６７】
さらに、形成された軟骨組織塊から切片を作成し、アルシアンブルー染色を行って、軟骨組織塊内部における染色陽性の細胞を観察した（ｎ＝３）。組織所見の結果を「表２」に示す。（＋）は良好に観察されたこと、（＋＋）はより良好に観察されたことを示し、（−）は観察されなかったことを示す。軟骨組織塊内部には均一に密集した軟骨細胞が観察され、細胞壊死、骨化、細胞希薄な部位や結節も確認されず、良質な軟骨組織塊が形成されていることが確認できた。
【００６８】
【表２】
2019010002.tif 000003
【配列表フリーテキスト】
【００６９】
配列番号１：ヒトＦＺＤ８のアミノ酸配列
配列番号２：ヒトＦＺＤ８断片のアミノ酸配列
配列番号３：ヒトＦＺＤ８可溶化受容体のアミノ酸配列
【図１】
2019010002.tif 000004
【配列表】
2019010002000001.app