(57)【要約】【課題】ヒトの固形がんの治療、転移抑制、及び再発抑制に有効な新規な手段を提供すること。【解決手段】高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、又は細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体若しくはその抗原結合性断片を有効成分として含有する、固形がんの治療剤であって、前記抗CD4抗体は、ヒトCD4に対するヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、治療剤を提供した。該治療剤は、免疫チェックポイント分子に対するアンタゴニストやアゴニスト、低分子抗がん剤等との併用により、さらに優れた効果を奏する。また、該治療剤は、固形がんの再発及び転移の抑制にも有効である。【選択図】図９
2019070056.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、又は細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体若しくはその抗原結合性断片を有効成分として含有する、固形がんの治療剤であって、前記抗CD4抗体は、ヒトCD4に対するヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、治療剤。
【請求項２】
高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体を有効成分として含有する請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
前記固形がんは、天然に生じたがん細胞で構成される固形がんである、請求項１又は２記載の治療剤。
【請求項４】
前記固形がんが上皮性固形がんである請求項１ないし３のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項５】
前記上皮性固形がんが、大腸がん、肺がん、膵臓がん、腎臓がん、及び乳がんからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項４記載の治療剤。
【請求項６】
前記上皮性固形がんが、大腸がん、肺がん、膵臓がん、及び腎臓がんからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項４記載の治療剤。
【請求項７】
前記固形がんがメラノーマ及びグリオーマから選択される少なくとも１種である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項８】
前記細胞傷害活性はADCC活性である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項９】
前記細胞傷害活性はCDC活性である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項１０】
ステージI〜IVの固形がんに対して用いられる、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項１１】
抑制性の免疫チェックポイント分子に対するアンタゴニスト、共刺激性の免疫チェックポイント分子に対するアゴニスト、細胞性免疫を賦活する活性又はNK細胞を活性化する作用を有する物質、免疫細胞療法、及び低分子抗がん剤から選択される少なくとも１種と組み合わせて用いられる、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項１２】
抑制性の免疫チェックポイント分子に対するアンタゴニスト、共刺激性の免疫チェックポイント分子に対するアゴニスト、細胞性免疫を賦活する活性又はNK細胞を活性化する作用を有する物質、及び免疫細胞療法から選択される少なくとも１種と組み合わせて用いられる、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項１３】
抑制性の免疫チェックポイント分子は、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、BTLA、PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、GAL9、及びHVEMからなる群より選択される少なくとも１種であり、共刺激性の免疫チェックポイント分子は、CD137、OX40、GITR、CD137L、OX40L、及びTNFSF18からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１１又は１２記載の治療剤。
【請求項１４】
抑制性の免疫チェックポイント分子は、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、及びGAL9からなる群より選択される少なくとも１種であり、共刺激性の免疫チェックポイント分子は、CD137、OX40、GITR、CD137L、及びOX40Lからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１１又は１２記載の治療剤。
【請求項１５】
前記アンタゴニスト及び前記アゴニストが免疫チェックポイント分子に対する抗体である、請求項１１ないし１４のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項１６】
組み合わせて用いられる抗体が、アンタゴニスト性抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体及び抗PD-L2抗体から選択される少なくとも１種を含む、請求項１５記載の治療剤。
【請求項１７】
組み合わせて用いられる抗体が、アゴニスト性抗CD137抗体、アゴニスト性抗OX40抗体、及びアンタゴニスト性抗CTLA-4抗体からなる群より選択される少なくとも１種をさらに含む、請求項１６記載の治療剤。
【請求項１８】
組み合わせて用いられる抗体が、アンタゴニスト性抗PD-1抗体、アンタゴニスト性抗CTLA-4抗体、アンタゴニスト性抗LAG-3抗体、アンタゴニスト性抗TIM-3抗体、アンタゴニスト性抗BTLA抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、アゴニスト性抗CD137抗体、アゴニスト性抗OX40抗体、及びアゴニスト性抗GITR抗体からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１５記載の治療剤。
【請求項１９】
組み合わせて用いられる抗体が、アンタゴニスト性抗PD-1抗体、アンタゴニスト性抗CTLA-4抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、アゴニスト性抗CD137抗体、及びアゴニスト性抗OX40抗体からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１５記載の治療剤。
【請求項２０】
組み合わせて用いられる抗体が、アンタゴニスト性抗CTLA-4抗体を含む、請求項１５記載の治療剤。
【請求項２１】
組み合わせて用いられる抗体が、アンタゴニスト性抗LAG-3抗体、アンタゴニスト性抗TIM-3抗体、アンタゴニスト性抗BTLA抗体、及びアゴニスト性抗GITR抗体からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１５記載の治療剤。
【請求項２２】
細胞性免疫を賦活する活性又はNK細胞を活性化する作用を有する物質が、IFN-α/β、IL-12、GM-CSF及びケモカイン類からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１１ないし２１のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項２３】
免疫細胞療法が、TIL療法、LAK療法、CTL療法、及びCAR-T療法からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１１ないし２２のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項２４】
全身投与で用いられる請求項１ないし２３のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項２５】
高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、又は細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体若しくはその抗原結合性断片を有効成分として含有する、固形がんの再発抑制剤であって、前記抗CD4抗体は、ヒトCD4に対するヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、再発抑制剤。
【請求項２６】
抑制性の免疫チェックポイント分子に対するアンタゴニスト、共刺激性の免疫チェックポイント分子に対するアゴニスト、細胞性免疫を賦活する活性又はNK細胞を活性化する作用を有する物質、免疫細胞療法、及び低分子抗がん剤から選択される少なくとも１種と組み合わせて用いられる、請求項２５記載の再発抑制剤。
【請求項２７】
抑制性の免疫チェックポイント分子に対するアンタゴニスト、共刺激性の免疫チェックポイント分子に対するアゴニスト、細胞性免疫を賦活する活性又はNK細胞を活性化する作用を有する物質、及び免疫細胞療法から選択される少なくとも１種と組み合わせて用いられる、請求項２５記載の再発抑制剤。
【請求項２８】
高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、又は細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体若しくはその抗原結合性断片を有効成分として含有する、固形がんの転移抑制剤であって、前記抗CD4抗体は、ヒトCD4に対するヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、転移抑制剤。
【請求項２９】
抑制性の免疫チェックポイント分子に対するアンタゴニスト、共刺激性の免疫チェックポイント分子に対するアゴニスト、細胞性免疫を賦活する活性又はNK細胞を活性化する作用を有する物質、免疫細胞療法、及び低分子抗がん剤から選択される少なくとも１種と組み合わせて用いられる、請求項２８記載の転移抑制剤。
【請求項３０】
抑制性の免疫チェックポイント分子に対するアンタゴニスト、共刺激性の免疫チェックポイント分子に対するアゴニスト、細胞性免疫を賦活する活性又はNK細胞を活性化する作用を有する物質、及び免疫細胞療法から選択される少なくとも１種と組み合わせて用いられる、請求項２８記載の転移抑制剤。
【請求項３１】
固形がん患者において、当該固形がんが発現している腫瘍抗原に特異的なCD8+ T細胞の活性を増強し、増殖を促進し、分化を促進し、及び／又は前記腫瘍抗原特異的CD8+ T細胞を腫瘍部に動員するための剤であって、高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、又は細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体若しくはその抗原結合性断片を有効成分として含有し、前記抗CD4抗体は、ヒトCD4に対するヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、剤。
【請求項３２】
固形がんの治療を必要とする患者に対し、高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、又は細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体若しくはその抗原結合性断片の有効量を投与することを含む、固形がんの治療方法であって、前記抗CD4抗体は、ヒトCD4に対するヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、方法。
【請求項３３】
固形がんの再発の抑制を必要とする患者に対し、高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、又は細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体若しくはその抗原結合性断片の有効量を投与することを含む、固形がんの再発抑制方法であって、前記抗CD4抗体は、ヒトCD4に対するヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、方法。
【請求項３４】
固形がんの転移の抑制を必要とする患者に対し、高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、又は細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体若しくはその抗原結合性断片の有効量を投与することを含む、固形がんの転移抑制方法であって、前記抗CD4抗体は、ヒトCD4に対するヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、方法。
【請求項３５】
固形がん患者において、当該固形がんが発現している腫瘍抗原に特異的なCD8+ T細胞の活性を増強し、増殖を促進し、分化を促進し、及び／又は前記腫瘍抗原特異的CD8+ T細胞を腫瘍部に動員する方法であって、高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、又は細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体若しくはその抗原結合性断片の有効量を前記患者に投与することを含み、前記抗CD4抗体は、ヒトCD4に対するヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固形がんの治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん免疫療法が盛んにニュースになっている。2013年米国がん治療学会ではこのニュースが紙面をにぎわしている。ゲノム解析が進展し、個々の患者のがん遺伝子異常と薬剤の効果が明瞭に議論できる時代になってきた。しかし、遺伝子異常と薬剤効果をリンクするのは良いが、該当しない患者に対してどういった治療方針が提示できるかが問題である。がん免疫療法では、発がんと係る遺伝子変異が直接薬剤の効果と相関している事はない。しかしながら同様に、がん免疫療法も全ての患者に有効であるわけではない事が明らかになってきている。有効性を高める方策の研究開発が急務である。
【０００３】
一つの方策は、いくつかの薬剤の併用による上乗せ効果を狙うものである。既に抗CTLA-4抗体と抗PD-1抗体の併用療法で、副作用の加重は思ったほど重篤になるわけではなく、有効性が上昇したという報告（非特許文献１）がなされている。CTLA-4、PD-1分子共に免疫チェックポイントで作用する分子として機能が理解されているため、各分子に対する抗体は免疫チェックポイント阻害剤として認知されている（非特許文献２）。
【０００４】
制がん剤の分野でも、分子標的薬の登場により、比較的副作用の少ない抗がん剤が開発されてきている。しかしながら生体が受けるネガティブな作用は避けて通れない。免疫療法の一環であるペプチドがんワクチンの研究開発が進んできたが、効果があまり高くない（有効性を示す患者の頻度が低い）ため、注目度はあまり高くないのが現状である。その後、抗体医薬品（例えばher2/neuという分子に対する抗体：ハーセプチン）が登場し、合成医薬品ではない分子標的薬として脚光を浴びてきたが、再発・薬剤耐性の問題等も新たな議論になっている。このような結合阻害型抗体の登場で、患者は期待をしてきたが、なおその有効性といえば若干の延命効果を示すにとどまっているに過ぎない。
【０００５】
そこで登場してきたのが抗体医薬の中で、特に免疫チェックポイント阻害剤である。例えばメラノーマという比較的免疫原性が強いがんとして知られているがんに対して、CTLA-4（制御性T細胞サブセット上に発現している分子）をターゲットとする抗体のメラノーマの退縮効果はそれほど高くないが、生存率でみると有意な延長が認められるに至り、がぜん注目を浴びている所である（非特許文献３）。がんが有する免疫抑制状態を解除する事で、殺傷性免疫細胞が活躍できる環境を増強するものと理解されている。同様な分子の一つがPD-1分子であり、その分子に対する抗体医薬は著効として固形がん（例えば肺癌、大腸がん）でさえ約30%程度の患者で効果が認められている（非特許文献４）。しかしながら単独での効果は全てのがん患者に福音をもたらしている訳ではない。
【０００６】
そこで、機能の異なる免疫療法剤の併用という工夫がなされている。最初は抗CD4抗体と抗CD137（別名4-1BBとも呼ばれる）抗体の併用がマウスモデルで提示され（非特許文献５）、次に抗PD-1抗体と抗CTLA-4抗体の併用が臨床治験データとして非常に有効であると報告されている（非特許文献１）。CD137分子は免疫チェックポイントのアゴニスト活性を有している。またPD-1分子、CTLA-4分子は免疫チェックポイント抑制活性を有している。これらを考えると免疫チェックポイント活性を有していても、異なるシグナル系を制御する薬剤を併用する事で臨床上のメリットは得られるものと理解できる。抗CD4抗体単独でもがん退縮効果はあるとの報告があるが（非特許文献６）、がん細胞株を人為的に加工して免疫原性を高めた特殊ながんを用いたマウスモデルでの研究報告であり、自然発症の固形がんでの効果を証明するものではない。また、マウスモデルで使用されているマウス抗CD4抗体（例えばGK1.5クローン）は補体依存性細胞殺傷活性（CDC活性）が極めて高い抗体として知られているが、ヒト型化された抗CD4抗体でそこまでのCD4陽性（CD4+）細胞殺傷効果を有する抗体は未だに臨床適用にまで開発されたものはない（非特許文献７）。また臨床試験に進んだ経緯のある過去のヒト型化された抗CD4抗体は、いずれも悪性リンパ腫等の、CD4を発現する腫瘍細胞を含み得る血液がんに対して用いられるものであり、固形がんに対する抗CD4抗体医薬は未開発である。
【０００７】
また、これまで歴史上第一選択薬物として使用されてきた低分子化合物の抗がん剤（制癌剤）は、その有効性は科学の発展とともに改善され、問題となっていた副作用も、用量や投与法を工夫することにより従来よりも軽減されてきた。しかしながら、やはり、このような効果と毒性とのバランスを取りながらの使用では、その抗腫瘍効果に限界があり、根治が難しい疾患であるがん治療薬としては、必ずしも十分満足のいくものには現在でもなっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Wolchok JD et al., The New England journal of medicine. 2013;369:122-33.
【非特許文献２】Pardoll DM., Nature reviews Cancer. 2012;12:252-64.
【非特許文献３】Prieto PA et al., Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 2012;18:2039-47.
【非特許文献４】Hamid O et al., The New England journal of medicine. 2013;369:134-44.
【非特許文献５】Choi BK et al., Cancer research. 2007;67:8891-9.
【非特許文献６】Yu P et al., The Journal of experimental medicine. 2005;201:779-91.
【非特許文献７】Kim YH et al., Blood. 2007;109:4655-62.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ヒトの固形がんに対し有効な新規な治療及び予防手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
抗CD4抗体をヒトに対し臨床展開するためには、何らかの手段で抗体依存性或いは補体依存性による強力な細胞殺傷能力を付与したヒト型化抗CD4抗体を念頭に置かざるを得ない。このように期待される抗CD4抗体は、CD4+ 細胞全てを対象に除去できる性質を有していることから、単に制御性Tリンパ球だけを除去するのではなく、広くがん組織に浸潤しているCD4+免疫系細胞群を除去できるので、組合せ効果は広いものが出てくる可能性が期待されている。
【００１１】
本願発明者らは、広くCD4+ 細胞を除去できる、高い細胞傷害活性を有するヒト型化抗CD4抗体の樹立に成功し、その抗体をベースとした併用の組み合わせで効果が広く認められる手法開発を念頭に、モデルマウスレベルでの研究を鋭意努力し、今回の発明に至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、又は細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体若しくはその抗原結合性断片を有効成分として含有する、固形がんの治療剤であって、前記抗CD4抗体は、ヒトCD4に対するヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、治療剤を提供する。また、本発明は、高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、又は細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体若しくはその抗原結合性断片を有効成分として含有する、固形がんの再発抑制剤であって、前記抗CD4抗体は、ヒトCD4に対するヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、再発抑制剤を提供する。さらに、本発明は、高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、又は細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体若しくはその抗原結合性断片を有効成分として含有する、固形がんの転移抑制剤であって、前記抗CD4抗体は、ヒトCD4に対するヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、転移抑制剤を提供する。さらに、本発明は、固形がん患者において、当該固形がんが発現している腫瘍抗原に特異的なCD8+ T細胞の活性を増強し、増殖を促進し、分化を促進し、及び／又は前記腫瘍抗原特異的CD8+ T細胞を腫瘍部に動員するための剤であって、高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、又は細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体若しくはその抗原結合性断片を有効成分として含有し、前記抗CD4抗体は、ヒトCD4に対するヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、剤を提供する。さらに、本発明は、固形がんの治療を必要とする患者に対し、高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、又は細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体若しくはその抗原結合性断片の有効量を投与することを含む、固形がんの治療方法であって、前記抗CD4抗体は、ヒトCD4に対するヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、方法を提供する。さらに、本発明は、固形がんの再発の抑制を必要とする患者に対し、高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、又は細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体若しくはその抗原結合性断片の有効量を投与することを含む、固形がんの再発抑制方法であって、前記抗CD4抗体は、ヒトCD4に対するヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、方法を提供する。さらに、本発明は、固形がんの転移の抑制を必要とする患者に対し、高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、又は細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体若しくはその抗原結合性断片の有効量を投与することを含む、固形がんの転移抑制方法であって、前記抗CD4抗体は、ヒトCD4に対するヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、方法を提供する。さらに、本発明は、固形がん患者において、当該固形がんが発現している腫瘍抗原に特異的なCD8+ T細胞の活性を増強し、増殖を促進し、分化を促進し、及び／又は前記腫瘍抗原特異的CD8+ T細胞を腫瘍部に動員する方法であって、高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、又は細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体若しくはその抗原結合性断片の有効量を前記患者に投与することを含み、前記抗CD4抗体は、ヒトCD4に対するヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、ヒト体内のCD4+ 細胞に対して十分に細胞傷害活性を発揮できるヒト型化された抗CD4抗体等を用いて、固形がんを治療し、さらには固形がんの転移・再発を抑制することが可能になる。血液がんに対する細胞傷害性の抗CD4抗体の作用は、CD4を発現している腫瘍細胞自体を殺傷することにより治療効果を得るものであるが、本発明の固形がんに対する治療剤は、免疫抑制に係るCD4+ 細胞の除去により固形がんにおける免疫不全環境を解除し、CD8+ CTL(T細胞)によるがん細胞の破壊を促進して治療効果を得るものであり、さらには固形がんの転移や再発をも防止することができる。従来の技術では、固形がんの免疫治療においては、制御性T細胞（CD4+ CD25+ Treg細胞）を除去することが重要であり、細胞傷害性の抗CD25抗体を用いて該細胞を除去すればよいと考えられてきた。しかしながら、抗CD4抗体によりCD4+ 細胞を幅広く対象として除去することが重要であり、強力な細胞傷害活性を有するヒト型化抗CD4抗体を確立することで初めてヒトの固形がんを効果的に治療可能になる。細胞傷害性抗CD4抗体にさらに免疫チェックポイント分子に対するアンタゴニスト・アゴニストやその他の細胞性免疫賦活物質等を併用することで、CD8+ T細胞のCTL活性をさらに促進し、相乗的な治療効果を得ることができる。また、細胞傷害性抗CD4抗体に低分子化学療法としての抗がん剤等を併用することで、がん細胞の増殖抑制や致死によりがんの勢いを弱めると、相乗的な治療効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ヒト末梢血単核球中のCD4+ 細胞に対する抗CD4ヒト化抗体IT1208のADCC活性を市販のアッセイキットで測定した結果である。
【図２】メラノーマ細胞株B16F10を移植したC57BL/6マウスに対し、移植２日前〜移植１２日後に抗CD4抗体を単回投与し、Day14の時点で固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を計算した結果である。**は有意水準p<0.01。
【図３】大腸がん細胞株Colon26を移植したBALB/c系統マウスに対し、移植２日前〜移植１２日後に抗CD4抗体を単回投与し、Day15の時点で固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を計算した結果である。*は有意水準p<0.05、**は有意水準p<0.01。
【図４】肺がん細胞株LLCを移植したC57BL/6系統マウスに対し、移植２日前〜移植１２日後に抗CD4抗体を単回投与し、Day21の時点で固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を計算した結果である。**は有意水準p<0.01。
【図５】メラノーマ細胞株B16F10をC57BL/6マウスに移植し、投与量を変えて抗CD4抗体を投与し、Day7の時点で脾臓を摘出、そこから抽出したリンパ球中のCD4+ T細胞の存在比を調べた結果である。
【図６】メラノーマ細胞株B16F10をC57BL/6マウスに移植し、投与量を変えて抗CD4抗体を投与した各群について、Day15の時点で固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を計算した結果である。
【図７】大腸がん細胞株Colon26を移植したBALB/cマウスに、投与量を変えて抗CD4抗体を投与し、Day7の時点で脾臓を摘出、そこから抽出したリンパ球中のCD4+ T細胞の存在比を調べた結果である。
【図８】大腸がん細胞株Colon26を移植したBALB/cマウスに、投与量を変えて抗CD4抗体を投与した各群について、Day18の時点で固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を計算した結果である。
【図９】メラノーマ細胞株B16F10を移植したC57BL/6マウスの各群について、Day18の時点で固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を計算した結果である。抗CD4抗体は単回投与、抗PD-1抗体は5回投与とし、併用群ではこれらを組み合わせて投与した。**は有意水準p<0.01、***は有意水準p<0.001。
【図１０】大腸がん細胞株Colon26を移植したBALB/cマウスの各群について、Day29の時点で固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を計算した結果である。抗CD4抗体は単回投与、抗PD-1抗体は5回投与とし、併用群ではこれらを組み合わせて投与した。**は有意水準p<0.01。
【図１１】メラノーマ細胞株B16F10を移植したC57BL/6マウスの各群について、Day18の時点で固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を計算した結果である。抗CD4抗体＋抗PD-1抗体併用は、1回/5回の併用又は2回/10回の併用とした。
【図１２】乳がん細胞株4T1を移植したBALB/cマウスの各群に対し、Day17の時点で固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を計算した結果である。抗CD4抗体は2回投与した。***は有意水準p<0.001（t-test）。
【図１３】メラノーマ細胞株B16F10を移植したC57BL/6マウスの各群について、Day15の時点で固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を計算した結果である。抗CD4抗体単独群は1回又は2回の投与とし、抗CD4抗体＋抗CD137抗体併用群は1回/5回の併用とした。
【図１４】抗CD4抗体＋抗PD-1抗体併用により腫瘍が完全退縮した大腸がん細胞株Colon26移植マウスに、再度Colon26細胞を移植し、腫瘍のサイズを観察した結果である。
【図１５】抗CD4抗体＋抗PD-1抗体併用により腫瘍が完全退縮した大腸がん細胞株Colon26移植マウスに、再度Colon26細胞を移植し、腫瘍のサイズを観察した結果である（図１４中の枠内を拡大したグラフ）。
【図１６】抗CD4抗体＋抗PD-L1抗体併用により腫瘍が完全退縮した大腸がん細胞株Colon26移植マウスに、再度Colon26細胞を移植し、腫瘍のサイズを観察した結果である。
【図１７】抗CD4抗体＋抗PD-L1抗体併用により腫瘍が完全退縮した大腸がん細胞株Colon26移植マウスに、再度Colon26細胞を移植し、腫瘍のサイズを観察した結果である（図１６中の枠内を拡大したグラフ）。
【図１８】大腸がん細胞株Colon26を移植したBALB/cマウスの各群について、Day29の時点で固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を計算した結果である。
【図１９】抗CD4抗体＋抗PD-1又はPD-L1抗体併用により腫瘍が完全退縮した大腸がん細胞株Colon26移植マウス（r）に、再度Colon26細胞又は乳がん細胞株4T1を移植し、腫瘍のサイズを観察した結果である。（n）は、腫瘍接種も抗体投与も受けていないナイーブマウスに腫瘍細胞を接種、腫瘍サイズを観察した結果である。
【図２０】図１９に示したマウス各群の、Day11（再接種後11日目）における腫瘍体積の平均値である。
【図２１】メラノーマ細胞株B16F10を移植したC57BL/6マウスの各群について、Day16の時点で固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を計算した結果である。抗CD4抗体に、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗OX40抗体、または抗CTLA-4抗体を併用した効果を検討した。
【図２２】メラノーマ細胞株B16F10を移植したC57BL/6マウスの各群について、Day1５の時点で固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を計算した結果である。抗CD4抗体に、抗BTLA抗体、抗GITR抗体、抗LAG-3抗体、または抗TIM-3抗体を併用した効果を検討した。
【図２３】メラノーマ細胞株B16F10を移植したC57BL/6マウスの各群について、Day15の時点で固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を計算した結果である。抗CD4抗体＋低分子抗がん剤の併用は、2回/4回の併用とした。**は有意水準p<0.01。
【図２４】4T1細胞株を移植したBALB/cマウスの各群について、Day28の時点で解剖、肺の摘出を行い、肺への転移数を計数した結果である。
【図２５】(A) 実施例９の実験プロトコールである。(B) 養子移入を受けたマウス群についての、フローサイトメトリーによる腫瘍所属リンパ節細胞の解析結果の一例である。(C) Bの展開で同定したリンパ節Pmel-1, OT-1およびPolyclonal CD8+ T細胞の分裂回数を、CFSEの蛍光強度を指標に解析した結果の一例である。(D) B16F10(+)抗CD4抗体(-)群およびB16F10(+)抗CD4抗体(+)群の、腫瘍所属リンパ節Pmel-1 CD8+ T細胞に占める、分裂回数0-1、2-4、5-8の細胞の割合である。(E) B16F10(+)抗CD4抗体(-)群およびB16F10(+)抗CD4抗体(+)群の末梢血（blood）、腫瘍所属リンパ節（dLN）、非所属リンパ節（ndLN）、脾臓（spleen）、腫瘍（tumor）における、分裂回数5-8のPmel-1 CD8+ T細胞数である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明で対象とするがんは固形がんであり、血液がん（悪性リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫）以外の種々のがんが包含される。典型的な具体例として、例えば、肺がん、乳がん、胃がん、肝がん、大腸がん、舌がん、甲状腺がん、腎臓がん、前立腺がん、子宮がん、子宮頸がん、卵巣がん等の上皮性固形がんを挙げることができるが、固形がんであれば特に限定されず、メラノーマ及びグリオーマ等の、上皮性固形がんには分類されないその他の固形がんも挙げることができる。固形がんの好ましい具体例は、例えば、大腸がん、肺がん、膵臓がん、腎臓がん、及び乳がんからなる群より選択される少なくとも１種の上皮性固形がん、又は大腸がん、肺がん、膵臓がん、及び腎臓がんからなる群より選択される少なくとも１種の上皮性固形がん、又は大腸がん、肺がん、及び乳がんからなる群より選択される少なくとも１種の上皮性固形がん、又はメラノーマ及びグリオーマから選択される少なくとも１種の固形がんであり得るが、これらに限定されない。「固形がんの治療」には、がんの増殖抑制と、がん患者の延命効果の両者が包含される。また、「固形がんの治療」には原発がんの治療が包含され、例えば初回原発がんとは異なる原発がんを発症した患者に対し、2回目以降の原発がんの治療のために本発明の治療剤が適用され得る。
【００１６】
本発明において、固形がんは、典型的にはヒトにおいて自然発症した固形がんである。自然発症の固形がんは、天然に生じたがん細胞で構成される固形がんである。固形がんは免疫系ではない細胞で生じるがんであり、免疫系細胞に発現するCD4は固形がんでは発現していない。
【００１７】
本発明の剤は、ステージI〜IVの固形がんの治療に好ましく用いることができる。マウスがん細胞株を移植したマウスにおいて、移植後５日目頃の腫瘍は、ヒトではステージIに相当し、B16F10移植9日目の腫瘍、およびColon26、LLC移植12日目の腫瘍はステージIVに相当する。
【００１８】
本発明の治療剤は、以下のいずれかを有効成分とする。両者を組み合わせて用いてもよい。以下、本明細書において、(1)及び(2)の有効成分を総称して「抗CD4成分」と呼ぶことがある。
(1)  高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体
(2)  細胞毒成分が結合された、抗CD4抗体又はその抗原結合性断片
【００１９】
上記(1)及び(2)のいずれの場合も、抗CD4抗体は、典型的にはヒトCD4に対する抗体であり、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体（非ヒト由来抗体のCDR領域をヒト抗体の相当する領域に移植したもの）、又はヒト抗体（非ヒト動物又はヒト細胞株を用いて製造される、ヒトの体内で産生されるものと同じ抗体）である。
【００２０】
抗体が有する細胞傷害活性には、抗体依存性細胞傷害活性（ADCC活性）と補体依存性細胞傷害活性（CDC活性）がある。抗CD4成分が上記(1)の場合、抗CD4抗体はADCC活性とCDC活性のいずれを有するものであってもよいが、CD4+ 細胞に対し十分に高い殺傷能力を発揮できる、高い細胞傷害活性を有する抗体を用いる必要がある。
【００２１】
「高い細胞傷害活性」とは、ADCC活性の場合、公知の測定方法を用いてCD4発現細胞に対するADCC活性を測定したときに、ADCC活性を有することが知られている公知の抗CD4抗体6G5やCE9.1よりも高いADCC活性を有することをいう。また、CDC活性の場合、公知の測定方法を用いて、同一の補体を用いた実験系でCD4発現細胞に対するCDC活性を測定したときに、CDC活性を有することが知られている公知の抗CD4抗体OKT4よりも強いCDC活性を示すことをいう。
【００２２】
抗体のADCC活性やCDC活性を測定方法は、Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)等に記載され公知であり、また市販のキット類も存在する。そのような市販のキットを用いて、公知の抗CD4抗体よりも細胞傷害活性が高いかどうかを評価してよい。市販のキットを用いた細胞傷害活性の測定方法の具体例が下記実施例に記載されている。あるいは、ヒト末梢血単核球と抗CD4抗体を混合して37℃で数時間反応させ、フローサイトメトリー解析により反応液中のCD8+ 細胞に対するCD3+ 細胞の割合を測定し、得られた測定値を、ADCC活性を有しない抗CD4抗体や上記した公知の抗CD4抗体を用いた場合の測定値と比較することにより、抗CD4抗体のADCC活性の強さを評価することができる。
【００２３】
好ましくは、高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体は、公知の抗CD4抗体6G5やCE9.1の10倍以上、より好ましくは100倍以上のADCC活性を有するか、公知の抗CD4抗体OKT4の10倍以上、より好ましくは100倍以上のCDC活性を有する。ここでいう「10倍以上」とは、例えば、一定量の細胞に対して細胞傷害活性を示す抗体濃度の最小値が、公知の上記抗体のそれの1/10以下であることを意味する。なお、抗CD4抗体のCD4に対するアフィニティーについては、抗体結合活性KDが1×10-9 M程度以下であればよい。
【００２４】
高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体は、例えば、公知の手法により作出したモノクローナル抗CD4抗体又は既に確立されている公知の抗CD4抗体から、この分野で公知の手法によりその細胞傷害活性を高めることによって作出することができる。あるいは、細胞表面に発現するCD4を特異的に認識し、かつ強力な細胞傷害活性を有する抗CD4抗体が公知であれば、そのような抗体を本発明の剤の有効成分として利用してもよい。例えば、WO 2010/074266には、従来の抗CD4抗体よりもADCC活性が高められた抗CD4抗体が開示されている。
【００２５】
モノクローナル抗体の作製方法自体はこの分野で周知の常法である。例えば、周知のハイブリドーマ法により作製する場合、CD4タンパク質ないしはその適当な断片（細胞外領域、例えばCD4のN末より394番目までの領域）を免疫原として用いて動物（ヒトを除く）に免疫し、該動物から脾細胞やリンパ球のような抗体産生細胞を採取し、これをミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを調製し、CD4タンパク質と結合する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングし、これを増殖させて培養上清から抗CD4モノクローナル抗体を得ることができる。CD4の遺伝子配列、アミノ酸配列及び立体構造等の情報は、公的データベースに登録されており、例えばNCBIのGenBankにはM12807のアクセッション番号で登録されている。免疫原として用いるCD4タンパク質ないしはその適当な断片は、このような配列情報に基づいて周知の遺伝子工学的手法により容易に調製することができる。
【００２６】
キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体の作製方法も、この分野で周知の方法として確立している。例えば、抗CD4ヒト抗体は、CD4認識を担保するCDR配列断片をカセット改変法にて調製することができる。
【００２７】
抗体の細胞傷害活性を高める手法も公知であり、いずれの手法を用いてもよい。公知の手法の一例を以下に記載する。
【００２８】
ADCC活性を増強する方法の一つとして、抗体のFc部分に存在している糖鎖に含まれるフコース（コアフコース）を除去するポテリジェント（登録商標）技術が挙げられる（Yamane-Ohnuki N, Satoh M, Production of therapeutic antibodies with controlled fucosylation, MAbs 2009; 1: 230-236.）。このコアフコースを付加する酵素はFucT-8（Fut-8）と称される遺伝子にコードされているので、Fut-8をノックアウトした動物細胞内で組換え抗体をコードする遺伝子を発現させることにより、ADCC活性が増強された抗体分子を得ることができる（Yamane-Ohnuki N, et al., Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity, Biotechnol Bioeng 2004; 87: 614-622.）。フコース基質供与を遮ってしまう手法も存在するが、コアフコースに限らず全てのフコースを除去してしまうためコアフコース特異的な手法ではなく、上記したポテリジェント（登録商標）技術がより好ましい。
【００２９】
ADCC活性を増強する他の方法として、抗体のFc部位に存在する糖鎖を変換する方法が挙げられる。当該方法では、アンテナ型分岐糖鎖部のGlcNAcをGnT-III遺伝子操作で導入することによりコアフコース付加を回避する（M. Schuster et al., Improved effector functions of a therapeutic monoclonal Lewis Y-specific antibody by glycoform engineering, Cancer Res 2005; 65: 7934-7941.）。このような手法により作出されたADCC活性が増強された抗CD4抗体を用いてもよい。
【００３０】
CDC活性が増強する方法としては、例えば、アイソタイプIgG1の一部にアイソタイプIgG3の配列を組み合わせてCDC活性を高めるコンプリジェント（登録商標）技術が知られている（Natsume A, In M, Takamura H, et al. Engineered antibodies of IgG1/IgG3 mixed isotype with enhanced cytotoxic activities, Cancer Res. 2008; 68: 3863-3872.）。
【００３１】
さらに、上記したポテリジェント（登録商標）技術とコンプリジェント（登録商標）技術を組み合わせて抗体の細胞傷害活性を強力に高めるアクリタマブ（登録商標）技術も知られている（Natsume A, et al., Improving effector functions of antibodies for cancer treatment: Enhancing ADCC and CDC, Drug Des Devel Ther. 2009; 3: 7-16）。このような手法でADCC活性及びCDC活性の両者を高めた抗CD4抗体を用いてもよい。
【００３２】
抗CD4抗体に細胞毒成分を結合して用いる場合、該抗体は高い細胞傷害活性を有していなくてよく、細胞毒成分によってCD4+ 細胞が傷害される。CD4との結合性を維持した抗体断片（抗原結合性断片）に細胞毒成分を結合させたものも、本発明の剤の有効成分として使用可能である。
【００３３】
本発明において、細胞毒成分とは、生細胞を破壊する活性を有する物質をいい、生物由来の毒物、化学物質、放射性物質等が包含される。
【００３４】
抗原結合性断片は、もとの抗体の対応抗原に対する結合性（抗原抗体反応性）を維持している限り、いかなる抗体断片であってもよい。具体例としては、Fab、F(ab')2、scFv等を挙げることができるが、これらに限定されない。FabやF(ab')2は、周知の通り、モノクローナル抗体をパパインやペプシンのようなタンパク分解酵素で処理することにより得ることができる。scFv（single chain fragment of variable region、単鎖抗体）の作製方法も周知であり、例えば、上記の通りに作製したハイブリドーマのmRNAを抽出し、一本鎖cDNAを調製し、免疫グロブリンH鎖及びL鎖に特異的なプライマーを用いてPCRを行なって免疫グロブリンH鎖遺伝子及びL鎖遺伝子を増幅し、これらをリンカーで連結し、適切な制限酵素部位を付与してプラスミドベクターに導入し、該ベクターで大腸菌を形質転換してscFvを発現させ、これを大腸菌から回収することにより、scFvを得ることができる。
【００３５】
抗CD4成分の投与により、がん患者のCD4+ 細胞を一過性に除去することで、固形がん組織における免疫不全環境を解除し、CD8+ T細胞のCTL機能を促進してがん細胞を効果的に除去することが可能になる。担癌生体においてCD4+ 細胞を除去すると、当該癌の抗原（腫瘍抗原）に特異的なCD8+ T細胞が増殖することが確認されており、抗CD4成分の投与によって免疫組織や腫瘍組織内で増殖・分化が促進され、あるいは活性が増強され、あるいは腫瘍部に動員された腫瘍抗原特異的CD8+ T細胞が抗CD4成分の抗腫瘍効果をもたらしていると考えられる。抗CD4成分のみを用いても十分ながん退縮効果が得られるが、抗CD4成分に加えて、免疫チェックポイント阻害剤や細胞性免疫を賦活する活性を有する各種の物質、免疫細胞療法等と併用することにより、さらに高い抗がん効果（がんの増殖抑制及び／又は延命効果）を得ることができるため、好ましい。
【００３６】
「免疫チェックポイント分子」という語には、免疫チェックポイントとして機能する受容体とリガンドの両者が包含される。免疫チェックポイントとは、免疫系が自己の体を攻撃しないための免疫逃避機構である。T細胞上には免疫チェックポイント受容体が存在し、抗原提示細胞上に発現しているリガンドと相互作用する。T細胞はMHC分子上に提示された抗原を認識して活性化し、免疫反応を起こすが、並行して生じる免疫チェックポイント受容体−リガンドの相互作用によりT細胞の活性化が調節を受ける。免疫チェックポイント受容体には共刺激性のものと抑制性のものがあり、両者のバランスによってT細胞の活性化及び免疫反応が調節を受けている。
【００３７】
がん細胞は、抑制性の免疫チェックポイント受容体に対するリガンドを発現し、該受容体を利用して細胞傷害性T細胞による破壊から逃避している。従って、抑制性の受容体に対するアンタゴニストを投与することで、がん細胞による免疫チェックポイント機構の利用を妨害し、CD8+ T細胞によるがん細胞の殺傷を促進することができる。また、共刺激性の免疫チェックポイント受容体に対するアゴニストを投与することで、免疫反応を促進し、それによりCD8+ T細胞によるがん細胞の殺傷を促進することも可能である。本発明では、抗CD4成分と組み合わせて、１種若しくは２種以上のそのようなアンタゴニスト、及び１種若しくは２種以上のそのようなアゴニストの少なくともいずれかを好ましく用いることができる。
【００３８】
「アンタゴニスト」という語には、受容体とリガンドとの結合による受容体の活性化を妨害する各種の物質が包含される。例えば、受容体に結合して受容体−リガンド間の結合を妨害する物質、及びリガンドに結合して受容体−リガンド間の結合を妨害する物質を挙げることができる。
【００３９】
例えば、「抑制性の免疫チェックポイント分子に対するアンタゴニスト」は、抑制性の免疫チェックポイント分子（抑制性の受容体又は該受容体のリガンド）と結合するアンタゴニスト性抗体、抑制性の免疫チェックポイントリガンドに基づいて設計された、受容体を活性化しない可溶性のポリペプチド、又は該ポリペプチドを発現可能なベクター等であり得る。対象となる抑制性の免疫チェックポイント分子として、受容体としてはPD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、BTLA等を挙げることができ、リガンドとしてはPD-L1（PD-1のリガンド）、PD-L2（PD-1のリガンド）、CD80（CTLA-4のリガンド）、CD86（CTLA-4のリガンド）、GAL9（TIM-3のリガンド）、HVEM（BTLAのリガンド）等を挙げることができる。抗体の製造方法、化学合成又は遺伝子工学的手法によるポリペプチドの製造方法は、この分野で周知の常法であり、当業者であれば上記のような抑制性の免疫チェックポイント分子に対するアンタゴニストを常法により調製することができる。
【００４０】
「共刺激性の免疫チェックポイント分子に対するアゴニスト」は、共刺激性の免疫チェックポイント受容体と結合する、アゴニスト活性を有する抗体、共刺激性の免疫チェックポイントリガンドに基づいて設計された、受容体を活性化する作用を有する可溶性のポリペプチド、又は該ポリペプチドを発現可能なベクター等であり得る。対象となる共刺激性の免疫チェックポイント分子として、受容体としてはCD137、OX40、GITR等を挙げることができ、リガンドとしてはCD137L（CD137のリガンド）、OX40L（OX40のリガンド）、TNFSF18（GITRのリガンド）等を挙げることができる。
【００４１】
抗CD4成分と抗体を併用する場合、上記したアンタゴニスト抗体の好ましい具体例としては、例えば、受容体に結合して該受容体へのリガンドの結合を阻害する、抗PD-1抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗BTLA抗体を挙げることができ、アゴニスト抗体の好ましい具体例としては、例えば、受容体に結合して下流のシグナル経路を作動させる活性を有する、抗CD137抗体、抗OX40抗体、抗GITR抗体を挙げることができる。さらには、抑制性の免疫チェックポイント受容体に対するリガンドに結合して該リガンドの受容体への結合を阻害する、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CD80抗体、抗CD86抗体、抗GAL9抗体、抗HVEM抗体を好ましい具体例として挙げることができる。抗CD4成分と併用する免疫チェックポイント分子に対する抗体（抗免疫チェックポイント抗体）の数は特に限定されない。抗CD4成分と1種類の抗免疫チェックポイント抗体を併用してもよいし、抗CD4成分と2種類の抗免疫チェックポイント抗体を併用してもよく、さらには抗CD4成分と3種類又はそれ以上の抗免疫チェックポイント抗体を併用してもよい。
【００４２】
上記した抗体の中でも、抗CD4成分と好ましく用いることができる抗体として、アンタゴニスト性抗PD-1抗体、アンタゴニスト性抗CTLA-4抗体、アンタゴニスト性抗LAG-3抗体、アンタゴニスト性抗TIM-3抗体、アンタゴニスト性抗BTLA抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、アゴニスト性抗CD137抗体、アゴニスト性抗OX40抗体、及びアゴニスト性抗GITR抗体からなる群より選択される少なくとも１種を、より好ましくは、アンタゴニスト性抗PD-1抗体、アンタゴニスト性抗CTLA-4抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、アゴニスト性抗CD137抗体、及びアゴニスト性抗OX40抗体からなる群より選択される少なくとも１種、あるいはアンタゴニスト性抗LAG-3抗体、アンタゴニスト性抗TIM-3抗体、アンタゴニスト性抗BTLA抗体、及びアゴニスト性抗GITR抗体からなる群より選択される少なくとも１種を挙げることができる。
【００４３】
とりわけ好ましい例として、アンタゴニスト性抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、及び抗PD-L2抗体からなる群より選択される少なくとも１種を挙げることができる。抗CD4成分とアゴニスト性抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、及び抗PD-L2抗体から選択される少なくとも1種とを併用するのみでも非常に顕著な抗がん作用を得ることができるが、さらに他の免疫チェックポイントアンタゴニスト又はアゴニスト等（好ましい例として、アゴニスト性抗CD137抗体、アゴニスト性抗OX40抗体、及びアンタゴニスト性抗CTLA-4抗体等）の１種又は２種以上も併用することで、さらに高い治療効果を得ることができる。
【００４４】
あるいは、抗CD4成分と併用するとりわけ好ましい抗体のさらなる例として、アンタゴニスト性抗CTLA-4抗体を挙げることができる。抗CD4成分とアンタゴニスト性CTLA-4抗体のみを併用してもよいし、さらに他の免疫チェックポイントアンタゴニスト又はアゴニスト等（好ましい例として、アンタゴニスト性抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、アゴニスト性抗CD137抗体、及びアゴニスト性抗OX40抗体等）の1種又は2種以上を併用してもよく、これによりさらに高い治療効果を得ることができる。
【００４５】
あるいはまた、抗CD4抗体と併用するとりわけ好ましい抗体のさらなる例として、アゴニスト性CD137抗体を挙げることができる。抗CD4成分とアゴニスト性CD137抗体のみを併用してもよいし、さらに他の免疫チェックポイントアンタゴニスト又はアゴニスト等（好ましい例として、アンタゴニスト性抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、及びアンタゴニスト性抗CTLA-4抗体等）の1種又は2種以上を併用してもよく、これによりさらに高い治療効果を得ることができる。
【００４６】
一部の免疫チェックポイント分子については既に抗体の開発が進んでおり、そのような公知の抗体を使用することも可能である。好ましい抗体の組み合わせの具体例として、例えば、抗CD4成分と、アンタゴニスト性抗PD-1抗体と、アンタゴニスト性抗CTLA-4抗体の３種の組み合わせや、抗CD4成分と、抗PD-L1抗体と、アンタゴニスト性抗CTLA-4抗体の３種の組み合わせを挙げることができるが、本発明において使用可能な抗体の組み合わせはこれに限定されない。
【００４７】
抗CD4成分と組み合わせて使用することができるその他の物質としては、IFN-α/β、IL-12やGM-CSF、各種ケモカイン類（CCL10, CCL5, RANTES, MIP-1等）などの、細胞性免疫を賦活する活性又はNK（ナチュラルキラー）細胞を活性化する作用を有する物質を挙げることができる。これらの物質を抗CD4成分と併用することで、免疫系によるがん細胞の破壊をさらに促進することができる。
【００４８】
免疫細胞療法は、自己の免疫細胞を用いてがん細胞を攻撃する治療法のことである。がん患者から採取された血液や摘出されたがん組織から免疫細胞を取り出し、生体外で培養して免疫細胞を増殖ないしは活性化させ、これを回収して同患者に投与することにより、患者体内のがん細胞を攻撃する。抗CD4成分と組み合わせて使用可能な免疫細胞療法は特に限定されず、がんの治療に用いられている公知の細胞療法のいずれであってもよい。例えば、腫瘍組織に存在するリンパ球（腫瘍内浸潤リンパ球）を分離、増殖させて投与するTIL療法、NK細胞を中心としたリンパ球を患者から採取、増殖させて投与するLAK療法、患者から採取したリンパ球とがん細胞を用いてリンパ球を刺激し、患者の癌細胞に特異的なCTLを増殖させて投与するCTL療法、遺伝子改変で作成するT細胞（chimeric antigen receptor; CAR-T）移入療法などを挙げることができるが、これらに限定されない。本発明の剤と免疫細胞療法との併用によっても、さらに高い治療効果を得ることができる。
【００４９】
抗CD4成分と組み合わせて使用することができるその他の物質のさらなる例として、低分子抗がん剤を挙げることができる。低分子抗がん剤とは、低分子化合物を有効成分とする抗がん剤である。医薬分野における「低分子化合物」「低分子医薬」とは、抗体医薬や核酸医薬とは異なる、分子量が概ね１０００〜１５００程度以下（一般には数百程度）の化学物質ないしはそれを有効成分とする医薬を指す語であり、本発明においても同様の意味で用いられる。抗CD4成分と組み合わせて使用可能な低分子抗がん剤は特に限定されない。公知の低分子抗がん剤の具体例としては、ゲフィチニブ、エルロチニブ、Tivantinibをはじめとする、EGFR、Her2、ALK、MET、JAK等の各種チロシンキナーゼに対する阻害剤；Vemurafenib、Dabrafenib等のBRAFキナーゼ阻害剤；及びTrametinib等のMEK阻害剤を包含する、各種のキナーゼ阻害剤を挙げることができる。その他の具体例として、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン等のプラチナ製剤（DNA合成阻害）；フルオロウラシル、ゲムシタビン等のピリミジン系薬剤（DNA合成阻害）；イリノテカン、トポテカン等のカンプトテシン系薬剤（DNA合成阻害）；エトポシド等のエピポドフィロトキシン系薬剤（DNA合成阻害）；ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン等のビンカアルカロイド系薬剤（細胞分裂阻害）；ドキソルビシン、エピルビシン、ピラルビシン等のアントラサイクリン系薬剤（DNA合成阻害）；パクリタキセル、ドセタキセル等のタキサン系薬剤（アポトーシス誘導剤）；シクロホスファミド、イホスファミド等のアルキル化剤（DNA合成阻害）などを挙げることができる。抗CD4成分は、上記のような低分子抗がん剤の1種又は2種以上と組み合わせて使用可能である。
【００５０】
ある有効成分ないしは薬剤を「併用する」、あるいは「組み合わせて用いる」とは、複数の有効成分を患者に対し同時に、順次に、又は別々に投与することを意味する。組み合わせて用いられる複数の有効成分は、別々の製剤として提供されてもよいし、同時に投与される場合には、同一の製剤中に複数の有効成分が含有された形態であってもよい。
【００５１】
抗CD4成分の投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよいが、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与が好ましい。固形がん組織内又は固形がん組織の近傍に局所投与してもよく、あるいは固形がん近傍の所属リンパ節に投与してもよいが、全身投与で用いることが好ましい。抗CD4成分と組み合わせて用いる他の物質の投与経路も同様である。
【００５２】
抗CD4成分の投与量は、対象となる固形がんの治療に有効な量であればよい。有効量は、腫瘍の大きさや症状、患者の年齢や体重等に応じて適宜選択される。特に限定されないが、抗CD4成分の投与量は、対象の患者に対し１日当たりの有効量として体重1kg当たり0.001mg/kg〜1000mg/kg程度、例えば0.01mg/kg〜100mg/kg程度であり得る。１日の投与は１回でもよく、数回に分けて投与してもよい。また、治療期間中の抗CD4成分の投与は１回でもよく、あるいは数日間毎日、又は数日、数週若しくは数月おきに複数回投与してもよい。
【００５３】
免疫チェックポイント分子に対するアンタゴニストの投与量も、腫瘍の大きさや症状等に応じて適宜選択される。通常、抗CD4成分よりも投与総量及び投与回数を多くすることで望ましい併用の効果が得られる。免疫チェックポイント分子に対する抗体をアンタゴニストとして用いる場合、例えば、１回の投与量を抗CD4成分の1/5〜5倍とし、投与回数を３倍〜１０倍ないしはそれ以上に増やして投与することができる。アンタゴニストの投与は長期間継続して行なってもよい。抗CD4成分の単回投与とアンタゴニストの数回投与を組み合わせる場合、アンタゴニストの投与は、抗CD4成分の投与の前に、同時に、又は後に開始することができる。免疫チェックポイント分子に対するアゴニストを抗CD4成分と併用する場合も、その投与量等はアンタゴニストと同様でよい。
【００５４】
抗CD4成分と組み合わせて用いられ得るその他の物質・療法は、それらを単独でがん治療に使用する場合と同様に使用してもよいが、抗CD4成分との併用により効果が高まるため、薬剤の投与量や投与回数、投与期間等を減じることも可能である。
【００５５】
抗CD4成分及びこれと組み合わせて使用され得る他の物質は、各投与経路に適した、薬剤的に許容される担体、希釈剤、賦形剤等の添加剤と適宜混合して製剤することができる。製剤形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口剤や、吸入剤、注射剤、座剤、液剤などの非経口剤などを挙げることができる。製剤方法及び使用可能な添加剤は、医薬製剤の分野において周知であり、いずれの方法及び添加剤をも用いることができる。
【００５６】
抗CD4成分の投与により、固形がんの治療効果が得られるほか、固形がんの転移や再発を抑制する効果も得ることができる。下記実施例では、高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体と抗PD-1抗体との併用により固形腫瘍が完全退縮したマウス個体において、再度移植された同一の固形腫瘍細胞の増殖が抑制されることが確認されている。このことは、本発明の剤には固形がんの再発や転移を防止する作用があるということを示している。従って、本発明の治療剤は、固形がんの転移抑制剤及び再発抑制剤としても用いることができる。固形がんの治療と同様に、転移・再発の抑制もまた、抗CD4成分を免疫チェックポイント分子に対するアンタゴニストやアゴニスト等と併用することでより高い効果を得ることができる。また、本発明の剤は、固形がん患者において、当該患者の固形がんが発現する抗原（腫瘍抗原）に特異的なCD8+ T細胞の活性を増強し、増殖を促進し、分化を促進し、及び／又は当該腫瘍抗原特異的CD8+ T細胞を腫瘍部に動員するための、腫瘍抗原特異的CD8+ T細胞の活性増強剤、増殖促進剤、分化促進剤、及び／又は動員剤としても用いることができる。
【実施例】
【００５７】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００５８】
実施例１：高いADCC活性を有する抗CD4ヒト化抗体の作製
WO 2010/074266に記載された方法により、ADCC活性が増強された抗ヒトCD4ヒト化抗体IT1208（可変領域としてWO 2010/074266に記載のHV2及びLV0を含む、サブタイプはIgG1）を作製した。Biacore T100を用いて測定された抗体結合活性はKD(nM)＜0.009であり、高い結合活性を有していた。
【００５９】
IT1208のADCC活性の測定は、プロメガ社が市販している、ADCC活性測定キットのプロトコールに従って次の条件で実施した。健常人由来PBMC12500個、anti-CD4mAb（IT1208）、およびプロメガキットに含まれているADCC Bioassay Effector cellの75000個を加え穏やかによく混ぜたのち、CO2インキュベーター中で37℃、6時間培養し、発光試薬Bio-Glo reagentを加え、室温で20分培養し、発光プレートリーダーで化学発光を測定した。
【００６０】
その結果を図１に示す。IT1208は1nM以上でADCC活性を示し、濃度依存的に増強し50nMで最大値に達している。コントロール抗体として使用したリツキシマブ（antiCD20）は、ADCC活性がみられ始めた濃度が10nM以降で、かつ、最大に達する濃度も1μM以降であった。
【００６１】
実施例２−１：マウス固形がんモデルに対する抗CD4抗体の作用−投与時期の検討
C57BL/6系統マウス（雌、７週齢、n=8）の右側腹部にマウスメラノーマ細胞株B16F10（5x105 cells/mouse）を、BALB/c系統マウス（雄、７週齢、n=8）の右側腹部にマウス大腸がん細胞株Colon26（2x105 cells/mouse）を、C57BL/6系統マウス（雌、７週齢、n=8）の右側腹部にマウス肺がん細胞株LLC（5x105 cells/mouse）を、それぞれ皮下移植した。Day-2（がん細胞移植の２日前）、Day0（＝がん細胞移植日）、Day3、Day5、Day9又はDay12に、抗CD4抗体（GK1.5、CDC活性によりマウス体内のCD4+ 細胞を枯渇させることができることが知られている抗体、BioXcell社製）0.2mgを腹腔内に単回投与し、Day14の時点で固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を短径x短径x長径xπ/6で計算した。
【００６２】
メラノーマ細胞株B16F10を移植したC57BL/6マウスについての結果を図２に、大腸がん細胞株Colon26を移植したBALB/c系統マウスについての結果を図３に、肺がん細胞株LLCを移植したC57BL/6系統マウスについての結果を図４に示す。これらの結果から、抗CD4抗体単回投与での抗腫瘍効果の発現には、腫瘍移植後０〜１２日目、特に３〜５日目が投与に最適な時期であることが確認された。
【００６３】
がん細胞移植マウスにおける固形がんの増殖を観察したところ、B16F10メラノーマでは、移植後５日目の抗体投与時に固形腫瘍はほとんど確認できないサイズであったが、Colon26及びLLCでは確認できるサイズまで増殖していた。B16F10メラノーマでは、固形腫瘍の形成がColon26及びLLCと比較して３日程度遅れたが、その後の増殖は速く、死亡例も早期に発生した。全てのがん細胞株において、抗CD4抗体の投与により、固形腫瘍確認後のDay7以降の増殖が、抗体非投与の個体における増殖と比べて明らかに差が出るという結果であった。
【００６４】
実施例２−２：CD4+ T細胞の存在比と抗腫瘍効果の関係
C57BL/6系統マウス（雌、7週齢、n=8）の右側腹部にマウスメラノーマ細胞株B16F10（5x105 cells/mouse）を皮下移植した（Day0＝がん細胞移植日）。Day5に抗CD4抗体を3.125μg、12.5μg、50μgまたは200μg投与した（陰性対照群：抗体投与なし）。
【００６５】
抗体投与2日後（Day7）に、各群3頭のマウスから脾臓を摘出し、そこから抽出したリンパ球中のCD4+ T細胞の存在比を求めた。その結果を図５に示す。抗CD4抗体を3.125μg、12.5μg投与した群ではそれぞれ3.86%、2.77%のCD4+ T細胞が残存していたのに対して（陰性対照群：11.4%）、50μgの投与では0.02％、200μgの投与では0.04%であり、完全に除去されていた。
【００６６】
マウスの固形腫瘍径を測定し、腫瘍体積を計算（短径x短径x長径xπ/6）した。図６にDay15の各群の腫瘍体積を示す。CD4+ T細胞がほぼ完全に除去されていた50μg投与群および200μg投与群では陰性対照群と比べて有意な（Dunnett, 有意水準p<0.05）腫瘍増殖の抑制効果が見られたのに対して、CD4+ T細胞が残存していた3.125μg投与群および12.5μg投与群では陰性対照群と差が見られなかった。
【００６７】
以上の結果は、抗原性の低いとされているがん種の場合、抗CD4抗体によりCD4+ T細胞を完全に除去することによって腫瘍増殖抑制効果を得られることを示唆している。なお、実際に固形がん患者に抗CD4抗体を適用する場合、末梢血サンプル等にてCD4＋ T細胞の存在比を調べて、投与量が適切かどうかをモニターしてもよい。
【００６８】
実施例２−３：CD4+ T細胞の存在比と抗腫瘍効果の関係
BALB/c系統マウス（雄、7週齢、n=8）の右側腹部に大腸がん細胞株Colon26（2×105 cells/mouse）を皮下移植した（Day0=がん細胞移植日）。Day5に抗CD4抗体を3.125μg、12.5μgまたは50μg投与した（陰性対照群：抗体投与なし）。
【００６９】
抗体投与2日後（Day7）に、各群3頭のマウスから脾臓を摘出し、そこから抽出したリンパ球中のCD4+ T細胞の存在比を求めた。その結果を図７に示す。抗CD4抗体を3.125μg投与した群では10.14%のCD4+ T細胞が残存していたのに対して（陰性対照群：24.77%）、12.5μgの投与では0.79％まで減少しており、50μgの投与では完全に除去されていた（0.08%）。
【００７０】
マウスの固形腫瘍径を測定し、腫瘍体積を計算（短径x短径x長径xπ/6）した。図８にDay18の各群の腫瘍体積を示す。3.125μg投与群ではCD4+ T細胞が10.14%（陰性対照群の約41%）残存していたにもかかわらず、陰性対照群と比べて有意な（Dunnett, 有意水準p<0.05）腫瘍増殖の抑制効果が見られた。12.5μg、50μg投与群でも同様に、腫瘍増殖が抑制された傾向が見られた。
【００７１】
以上の結果は、抗原性が高いとされているがん種の場合、抗CD4抗体によりCD4+ T細胞を完全に除去しなくても十分な腫瘍増殖抑制効果を得られることを示唆している。なお、前述した通り、実際に固形がん患者に抗CD4抗体を適用する場合、末梢血サンプル等にてCD4＋ T細胞の存在比を調べて、投与量が適切かどうかをモニターしてもよい。
【００７２】
実施例３−１：抗CD4抗体単独での抗腫瘍効果と、抗PD-1抗体単独あるいは抗CD4抗体＋抗PD-1抗体併用での抗腫瘍効果との比較
C57BL/6系統マウス（雌、７週齢）の右側腹部にマウスメラノーマ細胞株B16F10（5x105 cells/mouse）を、BALB/c系統マウス（雄、７週齢）の右側腹部にマウス大腸がん細胞株Colon26（2x105 cells/mouse）をそれぞれ皮下移植した後、下記の通りに抗体投与を行なった（Day0＝がん細胞移植日）。
【００７３】
【表１】
2019070056.tif 000003
【００７４】
図９は、B16F10細胞株を移植したC57BL/6マウスの各群について、Day18の時点で固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を計算（短径x短径x長径xπ/6）した結果である。
【００７５】
抗CD4抗体はB16メラノーマの固形腫瘍の増殖を、対照群のそれの1/5（21%）までに有意に抑制した（Dunnett, 有意水準p<0.01）。一方、抗PD-1抗体は、対照群のそれの約半分（55%）まで有意に抑制した（Dunnett, 有意水準p<0.01）。抗CD4抗体は投与総量として抗PD-1抗体の1/5であるが、その抗腫瘍作用は抗PD-1抗体のそれより有意に強かった（Dunnett, 有意水準p<0.01）。
【００７６】
一方、抗CD4抗体と抗PD-1抗体を併用すると、B16メラノーマの固形腫瘍の増殖はほぼ完全に（対照群の6%まで）抑制され、その平均値の差は有意であった（Dunnett, 有意水準p<0.01）。さらに、併用群と抗CD4抗体単独群との間、および、併用群と抗PD-1抗体単独群との間で、腫瘍体積の平均値はどちらも有意水準1％（Dunnett）で有意に差があり、抗CD4抗体と抗PD-1抗体の併用による相乗効果が強く示唆された。
【００７７】
図１０は、Colon26細胞株を移植したBALB/cマウスの各群について、Day29の時点で固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を計算（短径x短径x長径xπ/6）した結果である。
【００７８】
抗CD4抗体はColon26大腸がんの固形腫瘍の増殖を、対照群のそれの1/4（22%）までに有意に抑制した（Dunnett, 有意水準p<0.01）。一方、抗PD-1抗体は、ほとんど抑制せず有意な差はなかった（対照群の91%まで, Dunnett, NS、T-test、NS）。抗CD4抗体は投与総量として抗PD-1抗体の1/5であるが、その抗腫瘍作用は抗PD-1抗体のそれより有意に強かった（Dunnett, 有意水準p<0.01）。
【００７９】
一方、抗CD4抗体と抗PD-1抗体を併用すると、Colon26大腸がんの固形腫瘍の増殖はほぼ（対照群の13%まで）抑制され、その平均値の差は有意であった（Dunnett, 有意水準p<0.01）。さらに、併用群と抗CD4抗体群の腫瘍体積の平均値は、有意ではないが差がみられ、併用群と抗PD-1抗体投与群の腫瘍体積の平均値は、1％（Dunnett）で有意に差があることから、抗CD4抗体と抗PD-1抗体の併用による相乗効果が強く示唆された。
【００８０】
実施例３−２：抗CD4抗体単独での抗腫瘍効果と、抗PD-1抗体単独あるいは抗CD4抗体＋抗PD-1抗体併用での抗腫瘍効果との比較（投与回数の増加による影響）
C57BL/6系統マウス（雌、７週齢）の右側腹部にマウスメラノーマ細胞株B16F10（5x105 cells/mouse）を、BALB/c系統マウス（雄、７週齢）の右側腹部にマウス大腸がん細胞株Colon26（2x105 cells/mouse）をそれぞれ皮下移植した後、下記の通りに抗体投与を行なった（Day0＝がん細胞移植日）。
【００８１】
【表２】
2019070056.tif 000004
【００８２】
図１１は、B16F10細胞株を移植したC57BL/6マウスの各群について、Day18の時点で固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を計算（短径x短径x長径xπ/6）した結果である。
【００８３】
抗CD4抗体はB16メラノーマの固形腫瘍の増殖を、対照群のそれの1/4（27%）までに有意に抑制した（Dunnett, 有意水準p<0.01）。一方、抗PD-1抗体は、対照群のそれに対して24%抑制した。抗CD4抗体は投与総量として抗PD-1抗体の1/5であるが、その抗腫瘍作用は抗PD-1抗体のそれより有意に強かった（Dunnett, 有意水準p<0.01）。さらに、抗CD4抗体と抗PD-1抗体を併用すると、B16メラノーマの固形腫瘍の増殖はほとんど（対照群の11%まで）抑制され、その平均値の差は有意であった（Dunnett, 有意水準p<0.01）。さらに、この1回/5回併用群と抗CD4抗体単独群との間では有意水準1％（T検定）、および、併用群と抗PD-1抗体単独群との間では有意水準0.1％（T検定）で、腫瘍体積の平均値はどちらも有意に差があり、抗CD4抗体と抗PD-1抗体の併用による相乗効果実施例３−１の実験結果を再現できた。
【００８４】
一方、抗CD4抗体の投与回数を2回、抗PD-1抗体の投与回数を10回にした2回/10回併用群では、B16メラノーマの固形腫瘍の増殖はほぼ完全に（対照群の2%まで）抑制され、その平均値の対照群との差は有意であった（Dunnett, 有意水準p<0.01）。さらに、2回/10回併用群と抗CD4抗体単独群との間、2回/10回併用群と1回/5回併用群との間で、腫瘍体積の平均値はどちらも有意水準0.1％（T検定）で有意に差があり、抗CD4抗体と抗PD-1抗体の併用による相乗効果は投与回数を増やすことにより増強されることが強く示唆された。
【００８５】
実施例３−３：マウス乳がん細胞株4T1に対する、抗CD4抗体単独による抗腫瘍効果の検討
BALB/c系統マウス（雌、7週齢）のmammary fat pad（乳腺脂肪組織）にマウス乳がん細胞株4T1（1x105 cells/mouse）を移植した後、下記の通りに抗体投与を行った（Day0＝がん細胞移植日）。
【００８６】
【表３】
2019070056.tif 000005
【００８７】
図１２は、4T1細胞株を移植したBALB/cマウスの各群について、Day17の時点で固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を計算（短径x短径x長径xπ/6）した結果である。抗CD4抗体は4T1固形腫瘍の増殖を、対照群のそれの76%にまで有意に抑制した（t-test, 有意水準p<0.001）。これにより、抗CD4抗体は、乳がん細胞株である4T1の腫瘍増殖も抑制することが示唆された。
【００８８】
実施例４：抗CD4抗体単独での抗腫瘍効果と、抗CD4抗体＋抗CD137抗体併用または抗CD4抗体＋5-FU併用での抗腫瘍効果との比較
C57BL/6系統マウス（雌、７週齢）の右側腹部にマウスメラノーマ細胞株B16F10（5x105 cells/mouse）を、BALB/c系統マウス（雄、７週齢）の右側腹部にマウス大腸がん細胞株Colon26（2x105 cells/mouse）をそれぞれ皮下移植した後、下記の通りに抗体投与を行なった（Day0＝がん細胞移植日）。
【００８９】
【表４】
2019070056.tif 000006
【００９０】
図１３は、B16F10細胞株を移植したC57BL/6マウスの各群について、Day15の時点で固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を計算（短径x短径x長径xπ/6）した結果である。
【００９１】
抗CD4抗体はB16メラノーマの固形腫瘍の増殖を、対照群のそれの半分以上（対照群の43%まで）有意に抑制した（Dunnett, 有意水準p<0.01）。抗CD4抗体単回投与の効果は5-FUを４回投与の効果と同等であった。抗CD4抗体２回投与で単回投与の２倍以上の増殖抑制効果が確認された。抗CD4抗体の３回投与でがんの完全な退縮も可能と期待される。一方、抗CD137抗体は、ほとんど抑制せず有意な差はなかった（対照群の95%まで, Dunnett, NS、T-test、NS）。抗CD4抗体は投与総量として抗CD137抗体の1/2.5であるが、その抗腫瘍作用は抗CD137抗体のそれより有意に強かった（Dunnett, 有意水準p<0.01）。
【００９２】
一方、抗CD4抗体と抗CD137抗体を併用すると、B16メラノーマの固形腫瘍の増殖は、ほぼ完全に（12%まで）抑制され、その平均値の差は有意であった（Dunnett, 有意水準p<0.05）。さらに、腫瘍体積の平均値は、併用群と抗CD4抗体単独群との間では有意水準5％（T-test）、併用群と抗CD137抗体単独群との間では1％（Dunnett）で有意に差があり、抗CD4抗体と抗CD137抗体の併用による相乗効果が強く示唆された。
【００９３】
すでに臨床で汎用されている、化学療法剤5-FUは、B16メラノーマ固形腫瘍の増殖を対照群のそれの1/3（36%）まで有意に抑制した（Dunnett, 有意水準p<0.01）。そして、抗CD4抗体と5-FUとの併用では、有意ではないが、それぞれの単独群に比べて強く腫瘍増殖を抑制していた（対照群のそれの21%まで）ことから、併用の相加効果が示唆された。
【００９４】
実施例５−１：抗CD4抗体＋抗PD-1抗体併用での抗腫瘍効果
BALB/c系統マウス（雄、７週齢）の右側腹部にマウス大腸がん細胞株Colon26（2x105 cells/mouse）をそれぞれ皮下移植した後、下記の通りに抗体投与を行なった（Day0＝がん細胞移植日）。
【００９５】
【表５】
2019070056.tif 000007
【００９６】
抗体投与後のマウスの固形腫瘍径を測定し、腫瘍体積を計算（短径x短径x長径xπ/6）した。その結果、抗CD4抗体と抗PD-1抗体を併用すると、腫瘍増殖はDay12日以降全頭抑制され、Day29にはその腫瘍体積の平均値は対照群の13%になった。
【００９７】
個体ごとに評価すると、Day18以降、８頭中４頭では腫瘍体積が退縮し、さらにそのうち、Day36には、8頭中３頭は腫瘍が完全退縮した（図１４）。
【００９８】
一方、上記、Day36に完全退縮したマウス3頭の腹側皮下に、初期に接種した細胞数の5倍量（1x106 cells/mouse）のColon26細胞を、腫瘍が完全退縮した10日後（Day46）に、再度接種した。
【００９９】
その結果を図１４及び図１５に示す。再接種5日後（Day51）に3頭中2匹に腫瘍の痕跡が観察され、再接種7日後（Day53）に腫瘍の塊が3頭全部に観察された。しかしながら、そのDay53の腫瘍体積の平均値を初期接種7日後（Day7）のマウスと比べると、対照群のDay7の平均値の1/7、抗CD4抗体＋抗PD-1抗体併用群のDay7の平均値の1/4であった。
【０１００】
この再接種によって増殖が観察された腫瘍は、再接種11日後（Day57）には全頭で体積が退縮し、さらに、再接種14日後（Day64）には全頭で全く見られなくなり、腫瘍が完全に拒絶された。
【０１０１】
これらの結果は、抗CD4抗体による療法には生体内で再度生じた固形がんに対する防御効果があること、すなわち本発明の剤によれば固形がんの再発や転移をも抑制できることを示している。
【０１０２】
実施例５−２：抗CD4抗体＋抗PD-L1抗体併用での抗腫瘍効果
BALB/c系統マウス（雄、７週齢）の右側腹部にマウス大腸がん細胞株Colon26（2x105 cells/mouse）をそれぞれ皮下移植した後、下記の通りに抗体投与を行なった（Day0＝がん細胞移植日）。
【０１０３】
【表６】
2019070056.tif 000008
【０１０４】
抗体投与後のマウスの固形腫瘍径を測定し、腫瘍体積を計算（短径x短径x長径xπ/6）した。その結果、抗CD4抗体と抗PD-L1抗体を併用すると、腫瘍増殖はDay10日以降全頭抑制され、Day21にはその腫瘍体積の平均値は対照群の2.5%になった。
【０１０５】
個体ごとに評価すると、Day18以降、10頭中９頭では腫瘍体積が退縮し、さらにそのうち、Day28には、１０頭中６頭は腫瘍が完全退縮した（図１６）。
【０１０６】
一方、上記、Day28に完全退縮したマウス6頭の腹側皮下に、初期に接種した細胞数の5倍量（1x106 cells/mouse）のColon26細胞を、腫瘍が完全退縮した14日後（Day42）に、再度接種した。
【０１０７】
その結果を図１６及び図１７に示す。再接種4日後（Day46）に6頭中4匹に腫瘍の痕跡が観察された。しかしながら、そのDay46の腫瘍体積の平均値を初期接種7日後（Day7）のマウスと比べると、抗CD4抗体＋抗PD-L1抗体併用群のDay7の平均値の1/20であった。
【０１０８】
この再接種によって増殖が観察された腫瘍は、再接種7日後（Day49）には全頭で体積が縮小し、さらに、再接種10日後（Day52）には全頭で全く見られなくなり、腫瘍が完全に拒絶された。
【０１０９】
これらの結果もまた、実施例５−１と同様、抗CD4抗体による療法には生体内で再度生じた固形がんに対する防御効果があること、すなわち本発明の剤によれば固形がんの再発や転移をも抑制できることを示している。
【０１１０】
実施例５−３：抗CD4抗体＋抗PD-1抗体併用および抗CD4抗体＋抗PD-L1抗体併用での抗腫瘍効果−がん抗原の細胞株特異性
BALB/c系統マウス（雄、７週齢）の右側腹部にマウス大腸がん細胞株Colon26（2x105 cells/mouse）をそれぞれ皮下移植した後、下記の通りに抗体投与を行なった（Day0＝がん細胞移植日）。
【０１１１】
【表７】
2019070056.tif 000009
【０１１２】
抗体投与後のマウスの固形腫瘍径を測定し、腫瘍体積を計算（短径x短径x長径xπ/6）した。その結果、抗CD4抗体と抗PD-1抗体を併用すると、腫瘍増殖はDay14以降全頭抑制が始まり、Day29にはその腫瘍体積の平均値は対照群の39%になった（図１８）。抗CD4抗体と抗PD-L1抗体を併用すると、腫瘍増殖はDay14以降全頭抑制され、Day29にはその腫瘍体積の平均値は対照群の1%になった（図１８）。
【０１１３】
個体ごとに評価すると、抗CD4＋抗PD-1併用群では、8頭中4頭でDay32には腫瘍が完全退縮した。同様に、抗CD4＋抗PD-L1併用群では8頭中7頭で腫瘍体積が退縮しDay26には腫瘍が完全退縮した。
【０１１４】
一方、上記、完全退縮したマウスのうち10頭を5匹ずつ2群に分け、そのマウスの腹側皮下に、初期に接種した細胞数の5倍量（1x106 cells/mouse）のColon26細胞、あるいは4T1細胞を、腫瘍が完全退縮した17日後（Day49）に再度接種し、腫瘍の増殖を調べた。比較対象として、同時に調製したColon26（2x105 cells/mouse）、あるいは4T1（2x105 cells/mouse）をそれぞれBALB/c系統正常マウス（雄、７週齢）の右側腹部に皮下移植した後に腫瘍の増殖を調べた。その結果を図１９及び図２０に示す。
【０１１５】
初めてColon26（2x105 cells/mouse）、あるいは4T1（2x105 cells/mouse）を移植したBALB/c系統マウス（n, Naive）では、どちらのがん細胞株でもはっきりとした腫瘍増殖が見られ、両方のがん細胞株の増殖活性が維持されていることが明らかだった。
【０１１６】
一方、Colon26拒絶マウス（r, Rejected）では、一度拒絶した大腸がん細胞株と同じColon26を再接種した群では、正常マウスの場合と異なり、全頭新たな腫瘍増殖は見られず、腫瘍が完全に拒絶された。それに対して、Colon26拒絶マウスに、一度拒絶したColon26と異なる乳がん細胞株4T1を接種した群では、接種5日後（Day54）にはがんの発症が見られ、その後継時的に増殖し、拒絶されることはなかった。ただし、乳がん細胞株4T1は、Colon26拒絶マウスにおいて拒絶こそされなかったが、その腫瘍増殖速度は正常マウスに移植した場合よりも有意に抑制されていた。
【０１１７】
これらの結果は、抗CD4抗体による療法には生体内で再度生じた固形がんに対する防御効果があること、すなわち本発明の剤によれば固形がんの再発や転移をも抑制できることを示している。特に同種のがんの増殖には当然であるが、他の部位に発症した原発がんの増殖も抑制する可能性が強く示唆された。
【０１１８】
実施例６：抗CD4抗体＋抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗OX40抗体、または抗CTLA-4抗体併用での抗腫瘍効果
C57BL/6系統マウス（雌、７週齢、n=8）の右側腹部にマウスメラノーマ細胞株B16F10（5x105 cells/mouse）を皮下移植した後、下記の通りに抗体投与を行なった（Day0＝がん細胞移植日）。
【０１１９】
【表８】
2019070056.tif 000010
【０１２０】
図２１は、B16F10細胞株を移植したC57BL/6マウスの各群について、Day16の時点で固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を計算（短径x短径x長径xπ/6）した結果である。
【０１２１】
抗CD4抗体はB16メラノーマの固形腫瘍の増殖を、対照群のそれの約1/3までに有意に抑制した（Dunnett, 有意水準p<0.01）。ここで単剤としての腫瘍増殖抑制効果を観察すると、抗CD4抗体が他の抗免疫チェックポイント抗体単剤の抑制効果よりも明白に優れている事が示されている。
【０１２２】
一方、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗OX40抗体、または抗CTLA-4抗体の単独投与は、抗CD4抗体より弱いが、対照群のそれに対して、それぞれ有意に抑制した（Dunnett, 有意水準p<0.01）。さらに、抗CD4抗体と、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗OX40抗体、または抗CTLA-4抗体とを併用すると、B16メラノーマの固形腫瘍の増殖は、抗CD4抗体を投与しない単独投与群よりも強く抑制され、免疫チェックポイント抗体単独投与群と抗CD4抗体併用投与群との平均値との差は有意であり（Dunnett, 有意水準p<0.05、あるいはp<0.01）、併用効果が明らかになった。特に、抗CD4抗体と抗PD-L1抗体との併用群は、抗CD4抗体単独群との間で、腫瘍体積の平均値はどちらも有意（有意水準５％、Dunnet）に差があり、抗CD4抗体と抗PD-L1抗体の併用による相乗効果が顕著に表れた。
【０１２３】
実施例７：抗CD4抗体＋抗BTLA抗体、抗GITR抗体、抗LAG-3抗体、または抗TIM-3抗体併用での抗腫瘍効果
C57BL/6系統マウス（雌、７週齢、n=8）の右側腹部にマウスメラノーマ細胞株B16F10（5x105 cells/mouse）を皮下移植した後、下記の通りに抗体投与を行なった（Day0＝がん細胞移植日）。
【０１２４】
【表９】
2019070056.tif 000011
【０１２５】
図２２は、B16F10細胞株を移植したC57BL/6マウスの各群について、Day15の時点で固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を計算（短径x短径x長径xπ/6）した結果である。
【０１２６】
抗CD4抗体はB16メラノーマの固形腫瘍の増殖を、対照群のそれの約半分までに有意に抑制した（Dunnett, 有意水準p<0.01）。ここで単剤としての腫瘍増殖抑制効果を観察すると、抗CD4抗体が他の抗免疫チェックポイント抗体単剤の抑制効果よりも明白に優れている事が示されている。
【０１２７】
一方、抗LAG-3抗体の単独投与は、抗CD4抗体より弱いが、対照群のそれに対して有意に抑制した（Dunnett, 有意水準p<0.05）。さらに、抗CD4抗体と、抗BTLA抗体、抗GITR抗体、抗LAG-3抗体、または抗TIM-3抗体とを併用すると、B16メラノーマの固形腫瘍の増殖は、抗CD4抗体を投与しない単独投与群よりも強く抑制され、免疫チェックポイント抗体単独投与群と抗CD4抗体併用投与群との平均値との差は有意であり（Dunnett, 有意水準p<0.05、あるいはp<0.01）、併用効果が明らかになった。特に、抗CD4抗体単独投与群の平均値と、抗BTLA抗体、抗GITR抗体、または抗TIM-3抗体との併用投与群の平均値との差は有意であり（Dunnett, 有意水準p<0.01）、相乗効果が顕著に表れた。
【０１２８】
実施例7：抗CD4抗体＋低分子抗がん剤との併用での抗腫瘍効果
C57BL/6系統マウス（雌、７週齢）の右側腹部にマウスメラノーマ細胞株B16F10（5x105 cells/mouse）を皮下移植した後、下記の通りに薬物投与を行なった（Day0＝がん細胞移植日）。
【０１２９】
【表１０】
2019070056.tif 000012
【０１３０】
図２３は、B16F10細胞株を移植したC57BL/6マウスの各群について、Day15の時点で固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を計算（短径x短径x長径xπ/6）した結果である。
【０１３１】
抗CD4抗体はB16メラノーマの固形腫瘍の増殖を、対照群のそれの半分以上（対照群の47%まで）有意に抑制した（Dunnett, 有意水準p<0.01）。一方、OXA単独投与群は抗CD4抗体単独投与群と同程度（対照群の46%まで）に抑制した（Dunnett, 有意水準p<0.01）。しかしながら、OXAはこの用量で体重減少が見られており、副作用が現れていた。また、GEM単独投与群は抗CD4抗体単独投与群より弱く対照群の63％まで抑制した（Dunnett, 有意水準p<0.05）。一方、CPAは、単独では少ししか抑制せず（対照群の75％まで）、対照群との有意な差はなかった。
【０１３２】
次に、抗CD4抗体と、OXA、GEM、またはCPAを併用すると、B16メラノーマの固形腫瘍の増殖は、抗CD4抗体単独投与よりも強く抑制され、特にCPAとの併用では抗CD4抗体単独群との平均値の差は有意であった（Dunnett, 有意水準p<0.05）。ちなみに、OXA、GEM、またはCPA単独群との比較では、すべての併用群で著しく効果が増強され平均値の差は有意であり（Dunnett, OXA:有意水準p<0.05, GEM:有意水準p<0.05, CPA:有意水準p<0.001）、抗CD4抗体と抗がん剤の併用による相乗効果が強く示唆された。
【０１３３】
実施例8：マウス乳がん細胞株4T1に対する、抗CD4抗体単独での転移抑制効果と、抗CD4抗体＋抗PD-1抗体併用あるいは抗CD4抗体＋抗PD-L1抗体併用での転移抑制効果との比較
BALB/c系統マウス（雌、7週齢）のmammary fat pad（乳腺脂肪組織）にマウス乳がん細胞株4T1（1x105 cells/mouse）を移植した後、下記の通りに抗体投与を行った（Day0＝がん細胞移植日）。
【０１３４】
【表１１】
2019070056.tif 000013
【０１３５】
図２４は、4T1細胞株を移植したBALB/cマウスの各群について、Day28の時点で解剖、肺の摘出を行い、肺への転移数を計数した結果である。
【０１３６】
抗CD4抗体は4T1の肺転移数を、対照群のそれの15%にまで有意に抑制した（Dunnet, 有意水準p<0.001）。また、抗CD4抗体＋抗PD-1抗体併用群は、対照群のそれの32%にまで有意に抑制した（Dunnet, 有意水準p<0.001）。
【０１３７】
一方、抗PD-L1抗体単独投与群では、転移抑制の傾向は見られたものの有意差はなかった。しかし、抗CD4抗体＋抗PD-L1抗体併用群では、対照群のそれの44%にまで有意に抑制されており（Dunnet, 有意水準p<0.001）、併用による転移抑制効果の向上が見られた。
【０１３８】
実施例９：抗CD4抗体単独投与時に腫瘍所属リンパ節で増加するCD8+ T細胞の抗原特異性の検証
C57BL/6系統マウス(コンジェニックマーカーCD45.1- CD45.2+ CD90.1- CD90.2+)の右側背部にマウスメラノーマ細胞株B16F10（5x105 cells/mouse）を皮下接種し、5日目に抗CD4抗体（GK1.5）0.2 mgを腹腔内に単回投与した。6日目に、Vybrant(登録商標) CFDA SE Cell Tracer Kit（Life technologies）を用いてCFSE標識した、抗原特異性が異なる下記3種類のCD8+ T細胞の同数混合懸濁液を、尾静脈から移入した（養子移入）。
(1)  Pmel-1 CD8+ T細胞：
gp100メラノーマ抗原特異的MHC class I拘束性TCRを遺伝子導入したPmel-1 マウスから調製したCD8+ T細胞(コンジェニックマーカー：CD45.1- CD45.2+ CD90.1+ CD90.2-)。
(2)  OT-1 CD8+ T細胞：
卵白アルブミン特異的MHC class I拘束性TCRを遺伝子導入したOT-1マウスから調製したCD8+ T細胞(コンジェニックマーカー：CD45.1+ CD45.2- CD90.1- CD90.2+)
(3)  Polyclonal CD8+ T細胞：
野生型マウスから調製したCD8+ T細胞(コンジェニックマーカー：CD45.1+ CD45.2+ CD90.1- CD90.2+)
【０１３９】
また、B16F10(+)抗CD4抗体(+)群に加えて、対照群としてB16F10(-)抗CD4抗体(-)群、B16F10(-)抗CD4抗体(+)群、B16F10(+)抗CD4抗体(-)群を設定した。
【０１４０】
養子移入後3日目に、腫瘍（tumor）、腫瘍所属上腕リンパ節（dLN）、非所属上腕リンパ節（ndLN）、末梢血（blood）、脾臓（spleen）から細胞懸濁液を調製し、各種表面抗原特異的蛍光標識抗体で染色後、フローサイトメトリーにより移入したドナーCD8+ T細胞数ならびに細胞分裂回数を解析した。
【０１４１】
本実験で用いたマウス群において、B16F10(+)群におけるPmel-1 CD8+ T細胞は、特異抗原を認識可能であり、一方OT-1およびpolyclonal CD8+ T細胞は、いずれの群においても特異抗原を認識することは出来ない。すなわち、抗CD4抗体投与によって、B16F10(+)群におけるPmel-1 CD8+ T細胞のみならず、いずれかの群においてOT-1およびpolyclonal CD8+ T細胞の増殖応答が促進された場合、抗原非特異的な増殖応答であると解釈でき、一方B16F10(+)群におけるPmel-1 CD8+ T細胞のみ増殖応答が促進された場合、腫瘍抗原特異的な増殖応答であると解釈できる。
【０１４２】
図２５Aに実験プロトコールを示す。
【０１４３】
図２５Bは、フローサイトメトリーによる腫瘍所属リンパ節細胞の解析例を示す。IVS-CD45- CD8+画分を、CD90.1/FSCの発現で展開することにより、CD90.1+ Pmel-1細胞を同定した。CD90.1- 画分をCD45.1/CD45.2の発現で展開することにより、それぞれCD45.1- CD45.2+ 宿主CD8+ T細胞、CD45.1+ CD45.2+ Polyclonal CD8+ T細胞、CD45.1+ CD45.2+ OT-1 CD8+ T細胞を同定した。
【０１４４】
図２５Cは、図２５Bの展開で同定したリンパ節Pmel-1, OT-1およびPolyclonal CD8+ T細胞の分裂回数を、CFSEの蛍光強度を指標に解析した一例を示す。移入前に染色したCFSEの蛍光シグナルは、細胞分裂に伴い減衰するため、CFSEの蛍光強度で細胞分裂回数を同定する事が可能である。B16F10(-)抗CD4抗体(-)群およびB16F10(-)抗CD4抗体(+)群の上腕リンパ節、B16F10(+)抗CD4抗体(-)群およびB16F10(+)抗CD4抗体(+)群の腫瘍所属上腕リンパ節を解析した。OT-1およびPolyclonal CD8+ T細胞は、いずれの群においても細胞分裂を認めず、またPmel-1 CD8+ T細胞はB16F10担癌（+）条件下においてのみ増加したことから、抗CD4抗体投与による腫瘍所属リンパ節におけるCD8+ T細胞の増加は、腫瘍抗原特異的であることが示唆された。また、B16F10(+)抗CD4抗体(-)群およびB16F10(+)抗CD4抗体(+)群の比較では、B16F10(+)抗CD4抗体(+)群においてより分裂回数の進んだPmel-1 CD8+ T細胞を認めたことから、抗CD4抗体投与は腫瘍特異的CD8+ T細胞の増殖を促進することが示唆された。
【０１４５】
図２５Dは、B16F10(+)抗CD4抗体(-)群およびB16F10(+)抗CD4抗体(+)群の、腫瘍所属リンパ節Pmel-1 CD8+ T細胞に占める、分裂回数0-1、2-4、5-8の細胞の割合を示す。抗CD4抗体投与群では非投与群に比較し、統計的有意差を持って、分裂回数の少ない0-1、2-4の割合が低く、分裂回数の多い5-8の割合が高かった (n=5, Multiple t-tests, 有意水準 **, P < 0.01; ***, P < 0.001)。
【０１４６】
図２５Eは、B16F10(+)抗CD4抗体(-)群およびB16F10(+)抗CD4抗体(+)群の末梢血（blood）、腫瘍所属リンパ節（dLN）、非所属リンパ節（ndLN）、脾臓（spleen）、腫瘍（tumor）における、分裂回数5-8のPmel-1 CD8+ T細胞数を示す。分裂回数5-8の細胞は、主に腫瘍所属リンパ節において認められ、抗CD4抗体投与群（αCD4）において非投与群（Control）に比較し有意に増加していた(n=5, Multiple t-tests, 有意水準 *, P < 0.05; **, P < 0.01)。
【０１４７】
以上の結果から、抗CD4抗体単独投与時に腫瘍所属リンパ節で増加するCD8+ T細胞は、腫瘍抗原特異的であり、リンパ球減少条件下でしばしば認められる非特異的なT細胞の増加（Homeostatic proliferation）ではないことが強く示唆された。
【図１】
2019070056.tif 000014
【図２】
2019070056.tif 000015
【図３】
2019070056.tif 000016
【図４】
2019070056.tif 000017
【図５】
2019070056.tif 000018
【図６】
2019070056.tif 000019
【図７】
2019070056.tif 000020
【図８】
2019070056.tif 000021
【図９】
2019070056.tif 000022
【図１０】
2019070056.tif 000023
【図１１】
2019070056.tif 000024
【図１２】
2019070056.tif 000025
【図１３】
2019070056.tif 000026
【図１４】
2019070056.tif 000027
【図１５】
2019070056.tif 000028
【図１６】
2019070056.tif 000029
【図１７】
2019070056.tif 000030
【図１８】
2019070056.tif 000031
【図１９】
2019070056.tif 000032
【図２０】
2019070056.tif 000033
【図２１】
2019070056.tif 000034
【図２２】
2019070056.tif 000035
【図２３】
2019070056.tif 000036
【図２４】
2019070056.tif 000037
【図２５】
2019070056.tif 000038
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月15日(2019.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、又は細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体若しくはその抗原結合性断片を有効成分として含有する、固形がんの治療剤であって、前記抗CD4抗体は、ヒトCD4に対するヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、治療剤（ただし、アンタゴニスト性抗PD-1抗体、及び抗PD-L1抗体からなる群より選択される少なくとも１種と組み合わせて用いられるものを除く）。
【請求項２】
高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体を有効成分として含有する請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
前記固形がんは、天然に生じたがん細胞で構成される固形がんである、請求項１又は２記載の治療剤。
【請求項４】
前記固形がんが上皮性固形がんである請求項１ないし３のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項５】
前記上皮性固形がんが、大腸がん、肺がん、膵臓がん、腎臓がん、及び乳がんからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項４記載の治療剤。
【請求項６】
前記上皮性固形がんが、大腸がん、肺がん、膵臓がん、及び腎臓がんからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項４記載の治療剤。
【請求項７】
前記固形がんがメラノーマ及びグリオーマから選択される少なくとも１種である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項８】
前記細胞傷害活性はADCC活性である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項９】
前記高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体は、抗CD4抗体6G5又はCE9.1よりも高いADCC活性を有する抗CD4抗体である、請求項８記載の治療剤。
【請求項１０】
前記細胞傷害活性はCDC活性である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項１１】
前記高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体は、抗CD4抗体OKT4よりも強いCDC活性を有する抗CD4抗体である、請求項１０記載の治療剤。
【請求項１２】
ステージI〜IVの固形がんに対して用いられる、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項１３】
高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、又は細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体若しくはその抗原結合性断片を有効成分として含有する、固形がんの再発抑制剤であって、前記抗CD4抗体は、ヒトCD4に対するヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、再発抑制剤（ただし、アンタゴニスト性抗PD-1抗体、及び抗PD-L1抗体からなる群より選択される少なくとも１種と組み合わせて用いられるものを除く）。
【請求項１４】
高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、又は細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体若しくはその抗原結合性断片を有効成分として含有する、固形がんの転移抑制剤であって、前記抗CD4抗体は、ヒトCD4に対するヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、転移抑制剤（ただし、アンタゴニスト性抗PD-1抗体、及び抗PD-L1抗体からなる群より選択される少なくとも１種と組み合わせて用いられるものを除く）。
【請求項１５】
固形がん患者において、当該固形がんが発現している腫瘍抗原に特異的なCD8+ T細胞の活性を増強し、増殖を促進し、分化を促進し、及び／又は前記腫瘍抗原特異的CD8+ T細胞を腫瘍部に動員するための剤であって、高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、又は細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体若しくはその抗原結合性断片を有効成分として含有し、前記抗CD4抗体は、ヒトCD4に対するヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、剤（ただし、アンタゴニスト性抗PD-1抗体、及び抗PD-L1抗体からなる群より選択される少なくとも１種と組み合わせて用いられるものを除く）。
【請求項１６】
前記高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、又は細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体若しくはその抗原結合性断片のヒトCD4に対する抗体結合活性KDが1×10-9 M以下である、請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の剤。
【請求項１７】
全身投与で用いられる、請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の剤。
【請求項１８】
単回投与又は２回投与で用いられる、請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の剤。