(57)【要約】【課題】少量の原料穀類サンプルから得られるデータから当該原料穀類の醸造特性を予測することを可能にする新規な手段を提供すること。【解決手段】醸造特性が未知の原料穀類について、該原料穀類を用いて醸造物を製造する際の醸造特性を予測するための予測式の作成方法を提供した。該方法では、複数の醸造物原料穀類サンプルのそれぞれより１以上のメタボローム分析用サンプルを調製し、複数セットのメタボローム分析データ取得するとともに、醸造物原料穀類サンプルのそれぞれについて醸造特性データを取得する。次いで、メタボローム分析データを説明変数、醸造特性データを目的変数として、目的変数ごとに重回帰分析を行なう。該方法により作成された予測式は、例えば、所望の醸造特性を有する新規穀類品種の育成に利用することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
醸造特性が未知の原料穀類について、該原料穀類を用いて醸造物を製造する際の醸造特性を予測するための、醸造特性予測式の作成方法であって、
複数の醸造物原料穀類サンプルのそれぞれより、１以上のメタボローム分析用サンプルを調製する工程；
前記メタボローム分析用サンプルを用いて、原料穀類中に含まれる化合物群を網羅的に解析するメタボローム分析を行い、各化合物の原料穀類中存在量についての定量的数値データで構成されるメタボローム分析データを取得する工程；
前記醸造物原料穀類サンプルのそれぞれについて、醸造特性に関連する少なくとも１つの醸造特性データを取得する工程；
各メタボローム分析データから選択される２個以上の定量的数値データを説明変数とし、醸造特性データを目的変数として、目的変数ごとに重回帰分析を行なう工程；
を含む、方法。
【請求項２】
前記原料穀類が、米、大麦、大麦麦芽、小麦、又は大豆である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記醸造物が、清酒、焼酎、ビール、ウイスキー、醤油、又は味噌である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記原料穀類が米であり、前記醸造物が清酒又は焼酎である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記醸造特性データが、酒米統一分析法により得られる原料米分析値、原料米より製造した米麹の酵素力価、原料米より清酒又は焼酎を製造する過程でのモロミ経過、並びに原料米より製造した清酒又は焼酎の一般成分及び香気成分の分析値から選択される少なくとも１種を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
複数のメタボローム分析データのうちの一部を用いて重回帰分析を行ない、予測式候補を作成し、次いで、該予測式候補に別のメタボローム分析データを適用して交差検証を行ない、該予測式候補の予測性能を検証することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
重回帰分析がOPLS回帰分析である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
メタボローム分析用サンプルは、原料穀類を親水性溶媒中で粉砕して化合物群を抽出した抽出液である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
メタボローム分析は、液体クロマトグラフィー又はガスクロマトグラフィーと質量分析との組み合わせにより行われる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記質量分析が飛行時間型質量分析である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
５個以上の定量的数値データを説明変数として用いる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法により、醸造特性予測式を作成する工程；
育成中の穀類個体集団又は穀類系統集団より穀類サンプルを取得し、該サンプルよりメタボローム分析用サンプルを調製し、メタボローム分析データを取得する工程；
取得されたメタボローム分析データを醸造特性予測式に代入し、醸造特性の予測値を算出する工程；
前記予測値に基づいて所望の醸造特性を有すると予測された個体又は系統を、前記集団より選抜する工程；
を含む、穀類品種の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所望の醸造原料穀類の醸造特性（醸造関連分析値）を予測するための予測式の作成方法と、その予測式を用いた新規穀類品種の作出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
原料穀類の性質は、清酒をはじめ、味噌や醤油、ビール、ウイスキー、焼酎など、様々な穀類を用いた醸造製品において重要であることから、より高品質の原料を開発すると共に、原料を評価する様々な方法が開発されてきた。しかしながら、原料穀類の評価方法は十分ではなく種々の問題も有している。
【０００３】
例えば、清酒や焼酎は水と米、米麹を発酵させたものであり、原料穀類である米の性質は、これらの製造工程での作業性や、製麹・発酵経過、最終的には清酒・焼酎の品質に多大な影響を与える。そのため、より良質な原料米を開発、栽培するために、新たな原料米の育種や栽培方法の改良など様々な取り組みが行われている。近年、地域独自の原料米を使った清酒を製造する動きが盛んになっており、ますます育種の必要性が増していると言える。清酒用の原料米品種の中でとりわけ人気が高いのは山田錦であり、この理由として、加工性に優れ良質な清酒が造れることや、酒造経験や醸造技術の蓄積が多く使いやすいことが挙げられる。しかし、山田錦は誕生から80年以上が経つものの、いまだにこれを超える原料米が少ないのも現状である。その理由には、原料米品種の育種・選抜を効率的に進めるのが難しいということが挙げられる。
【０００４】
原料米の育種では、交配後の初期選抜を栽培特性や玄米の粒大、心白の発現といった外観を指標にして行われてきた。この選抜指標により、最初の個体選抜で500〜4,400個体から10〜399個体に選抜され、さらに醸造特性を調べる頃には数系統に絞られることがほとんどである（非特許文献1-8）。そこで近年では、育種の早い段階で数点の指標（精米特性や吸水性、タンパク質含量など）を調べることで選抜を効率化する取り組みがなされている（非特許文献4, 7, 9, 10）。しかし、この場合でも個体選抜から2世代後の3回目の選抜である。育種の初期段階から醸造特性による選抜が行われない理由として、分析に必要な玄米の量が挙げられる。例えば、精米特性を調べるためには100 gオーダー（少ない例でも数十g）の玄米が必要であり、この量の玄米を収穫するためには、対象とする選抜イネ個体に対し、十分量の栽培面積と、必要量の種籾を得るための相応の世代（年月）とが必要になる。さらに、試験醸造をする場合には、小仕込みスケールでも kg オーダーの玄米が必要となり、栽培面積はより広いスペースが必要となる、加えて試験精米機や相応の製麹装置、蒸し器、恒温槽などの施設や十分量のスペースも必要である。例えば、原料米の玄米収量を500 kg/10aとして、精米特性を調べるのに300 g、小仕込みスケールの試験醸造に3 kg、大仕込みスケールの試験醸造に300 kgの玄米が必要であるとする。1,000系統の原料米を調べるには、精米特性の調査に600 m2（テニスコート (261 m2）2面分）、小仕込みスケールの試験醸造に6,000 m2（アメフトのフィールド (5,400 m2) 1面分）、大仕込みスケールの試験醸造に600,000 m2（東京ドーム (46,755 m2) 約13個分）の栽培面積が必要である。また、小仕込みスケールの試験醸造を行うには、1,000系統をn = 3で45 m2（27帖、2LDKほどの大きさ）の恒温槽が必要になる。特に、玄米中のミネラル分の拡散移動が少ない期間内で精米を終わらせる必要があり、200ｇを15分で70%精米出来たとしても、1,000系統では3,000時間が必要である。10台のテストミルで行ったとしても、1ヶ月程度かかることになる。50％精米では、6倍の90分が必要であることから、半年程度かかってしまう。つまり、醸造特性の評価に必要な玄米の量が第1のネックであり、より少ない試料で醸造特性を評価することができれば、より効率的な原料米の育種が可能になると言える。
【０００５】
さらに、原料米の品質は、栽培地の気候や土壌環境、施肥の量や組成なども大きな影響を与える。このような栽培環境は毎年異なり、そのため原料米の醸造特性も毎年変動することとなる。原料米の特性の変化は、醸造工程での物理的特性や成分の変化、さらに最終産物である醸造物の成分や品質、醸造物の収得率や原料利用率に大きく影響を与える。しかし、製造前に醸造試験を行うためには月単位の時間が必要で、時間的に不可能である。そのため、本格的な醸造シーズンに入る前に、いち早く原料米の特徴をとらえ、精米方法や製麹方法、発酵方法など醸造法を調整する必要がある。
【０００６】
そのため、原料米の評価には、酒米研究会の酒造用原料米全国統一分析法（非特許文献11）（以降、酒米統一分析法）が多く用いられている。酒米統一分析法による分析結果は、原料米の溶けや麹菌・酵母の生育等の傾向と関連があるため、発酵管理や醸造特性を推測することに用いられている。しかし、酒米統一分析法の分析項目は14項目あり、醸造特性の評価には多大な労力を要する。そのため、本法中の比較的分析が容易な分析項目から他の分析値を予測する試み（非特許文献12）や、全く異なる方法から予測する試み（非特許文献13）がなされているが、特定の分析値に限られ、十分な精度の予測モデルは構築されていない。さらに、酒米統一分析法による分析値では、原料米そのものの分析値は得られるものの、麹の経過や酵素活性、発酵中の成分変化や製成酒成分など、醸造工程中、醸造産物の特性を予測する事は出来ない。つまり、原料米の評価方法にも大いに改善の余地があると言える。
【０００７】
近年、GC-MSやLC-MS、UPLC-QTof-MS等によるメタボローム分析により取得したデータから、projections to latent structures (PLS) 回帰分析等により、最終製品に含まれる成分から官能評価スコアや品評会のランキングを予測するモデルが報告されている。これは、日本酒（非特許文献14）や醤油（非特許文献15）、ワイン（非特許文献16）、ビール（非特許文献17）、Chinese rice wine（非特許文献18）、チーズ（特許文献１、２）、カカオマス（特許文献３）、コーヒー（特許文献４）、茶葉（特許文献５）で報告がある。一方、原料のメタボローム解析により、醸造上の特性や発酵経過、最終製品の成分や品質を予測するモデルは報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2013-7732号公報
【特許文献２】特開2015-55494号公報
【特許文献３】特開2017-26558号公報
【特許文献４】特開2017-32326号公報
【特許文献５】特開2009-14700号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】酒造好適米新品種「夢吟香」の育成, 加藤満, 杉浦直樹, 辻孝子, 中村充, 城田雅毅, 加藤恭宏, 船生岳人, 工藤悟, 加藤博美, 澤田恭彦, 鈴木敏夫, 釋一郎, 井上正勝, 山本晃司, 伊藤彰敏, 愛知農総試研報, 43, 17-24 (2011)
【非特許文献２】酒米品種「山田錦」の育成経過と母本品種「山田穂」, 「短稈渡船」の来歴, 池上勝, 三好昭宏, 世古晴美, 渋谷幾夫, 西田清数, 兵庫農技総セ研報（農業）, 53, 37-50 (2005)
【非特許文献３】酒米品種「改良山田錦」の育成経過と灘酒研究会による醸造適性評価, 池上勝, 西田清数, 兵庫農技総セ研報（農業）, 55, 27-38 (2007)
【非特許文献４】水稲酒造好適米新品種「越淡麗」, 石崎和彦, 小林和幸, 松井崇晃, 金田智, 星豊一, 佐々木行雄, 東聡志, 阿部徳文, 近藤敬, 阿部聖一, 樋口恭子, 重山博信, 平尾賢一, 新潟県農業総合研究所研究報告, 9, 81-87 (2008)
【非特許文献５】水稲新品種「フクノハナ」について, 平野哲也, 内山田博士, 近藤幸悦, 前田浩敬, 松本顕, 赤間芳洋, 東北農業試験場研究速報, 7, 9-16 (1967)
【非特許文献６】酒造好適米新品種「八反錦1号」の育成について, 前重道雅, 鳥生久嘉, 江戸義治, 滝広徳男, 広島県立農業試験場報告, 48, 1-6 (1984)
【非特許文献７】酒米新品種「山形酒49号」の育成, 櫻田博, 佐藤晨一, 菊池栄一, 中場勝, 佐野智義, 谷藤雄二, 中場理恵子, 黒木斌雄, 横尾信彦, 結城和博, 後藤清三, 山川淳, 山形県立農業試験場研究報告, 30, 1-15 (1996)
【非特許文献８】水稲新品種「秋の精」の育成, 眞崎聡, 加藤武光, 畠山俊彦, 松本眞一, 川本朋彦, 山本寅雄, 嶽石進, 斎藤正一, 福田兼四郎, 嶋貫和夫, 池田直美, 秋田県農業試験場研究報告, 40, 23-43 (1999)
【非特許文献９】水稲酒米新品種「越淡麗（こしたんれい）」の開発と新潟県の酒米育種, 小林和幸, 金田智, 松井崇晃, 石崎和彦, 鍋倉義仁, 渡邊健一, 育種学研究, 8, 55-61 (2006)
【非特許文献１０】酒造好適米新品種「秋田酒こまち」の開発と酒造特性, 高橋仁, 田口隆信, 醸協, 98, 598-609 (2003)
【非特許文献１１】酒米研究会編：「酒造用原料米全国統一分析法」, 酒米研究会 (1996)
【非特許文献１２】酒米適性についての研究（第11報）−蒸米の被消化性、蒸米の消化残渣および麹の消化残渣の予測について, 花本秀生, 中沢英五郎, 竹村成三, 醸協, 73, 580-581 (1978)
【非特許文献１３】気象データと原料米の酒造適性との関係, 奥田将生, 橋爪克己, 沼田美子代, 上用みどり, 後藤奈美, 三上重明, 醸協, 104, 699-711 (2009)
【非特許文献１４】Gas chromatography/mass spectrometry based component profiling and quality prediction for Japanese sake, Natsuki Mimura, Atsuko Isogai, Kazuhiro Iwashita, Takeshi Bamba, and Eiichiro Fukusaki, Journal of Bioscience and Bioengineering, 118, 4, 406-414 (2014)
【非特許文献１５】Metabolite profiling of soy sauce using gas chromatography with time-of-flight mass spectrometry and analysis of correlation with quantitative descriptive analysis, Shinya Yamamoto, Takeshi Bamba, Atsushi Sano, Yukako Kodama, Miho Imamura, Akio Obata, and Eiichiro Fukusaki, Journal of Bioscience and Bioengineering, 114, 2, 170-175 (2012)
【非特許文献１６】Wine Metabolomics: Objective Measures of Sensory Properties of Semillon from GC-MS Profiles, Leigh M. Schmidtke, John W. Blackman, Andrew C. Clark, and Paris Grant-Preece, J. Agric. Food Chem., 61, 49, 11957-11967 (2013)
【非特許文献１７】Predictive analysis of beer quality by correlating sensory evaluation with higher alcohol and ester production using multivariate statistics methods, Jian-Jun Dong, Qing-Liang Li, Hua Yin, Cheng Zhong, Jun-Guang Hao, Pan-Fei Yang,  Yu-Hong Tian, Shi-Ru Jia, Food Chemistry, 161, 15, 376-382 (2014)
【非特許文献１８】Intelligent sensing sensory quality of Chinese rice wine using near infrared spectroscopy and nonlinear tools, Qin Ouyang, Quansheng Chen, Jiewen Zhao, Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 154, 5, 42-46 (2016)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、少量の原料穀類サンプルから得られるデータから当該原料穀類の醸造特性を予測することを可能にする新規な手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、清酒原料米のメタボローム分析データから当該原料米の醸造特性を予測するための予測式を構築する手法を開発し、当該手法を清酒原料米だけではなく各種の醸造物の原料穀類に適用可能であることを見出し、本願発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、醸造特性が未知の原料穀類について、該原料穀類を用いて醸造物を製造する際の醸造特性を予測するための、醸造特性予測式の作成方法であって、
複数の醸造物原料穀類サンプルのそれぞれより、１以上のメタボローム分析用サンプルを調製する工程；
前記メタボローム分析用サンプルを用いて、原料穀類中に含まれる化合物群を網羅的に解析するメタボローム分析を行い、各化合物の原料穀類中存在量についての定量的数値データで構成されるメタボローム分析データを取得する工程；
前記醸造物原料穀類サンプルのそれぞれについて、醸造特性に関連する少なくとも１つの醸造特性データを取得する工程；
各メタボローム分析データから選択される２個以上の定量的数値データを説明変数とし、醸造特性データを目的変数として、目的変数ごとに重回帰分析を行なう工程；
を含む、方法を提供する。
また、本発明は、上記本発明の方法により、醸造特性予測式を作成する工程；
育成中の穀類個体集団又は穀類系統集団より穀類サンプルを取得し、該サンプルよりメタボローム分析用サンプルを調製し、メタボローム分析データを取得する工程；
取得されたメタボローム分析データを醸造特性予測式に代入し、醸造特性の予測値を算出する工程；
前記予測値に基づいて所望の醸造特性を有すると予測された個体又は系統を、前記集団より選抜する工程；
を含む、穀類品種の作出方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、原料米のメタボローム分析データにより、原料米そのものの特性分析値、米麹の酵素活性、発酵経過等の醸造中の特性、最終製品または蒸留原料であるもろみの成分、最終醸造物の成分や品質を予測できる予測モデルが初めて提供される。本発明の方法により作成される予測式を用いることで、醸造関連分析値が未知の原料米系統について、その系統の原料米のメタボローム分析データから醸造関連分析値（酒米統一分析法により評価される原料米特性、麹の酵素力価、モロミ経過、製成酒の特性）を予測することができる。メタボローム分析では、0.1g程度とごく少量の原料米サンプルからでも十分なデータを取得できることから、原料米の育種過程の早い段階で醸造特性を予測し評価することが可能になり、原料米の育種の迅速化に大いに貢献する。また、本発明により得られる予測式は、育種の選抜の指標のみならず、醸造方法の検討や発酵管理の指標にも応用することができる。また、米や清酒に限らず、焼酎、ビール、ウイスキー、醤油、味噌などの各種醸造物の原料穀類、例えば大麦麦芽、小麦、大豆などについても、その醸造特性を予測する予測式を本発明の方法により作成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明による予測式作成方法の概要を説明する図である。
【図２】予測式作成のための実際の作業手順を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、醸造特性が未知の原料穀類について、該原料穀類を用いて醸造物を製造する際の醸造特性を予測するための、醸造特性予測式の作成方法である。「醸造特性が未知の原料穀類」という語は、新たに作出された原料穀類系統であるために醸造特性が未知であるものの他、既に実用化されている公知の品種であるが、栽培環境の違いにより醸造特性に変動が生じている可能性のある原料穀類も包含される。
【００１６】
原料穀類の具体例としては、米、大麦、大麦麦芽、小麦、大豆等を挙げることができる。また醸造物の具体例としては、清酒、焼酎（特に米焼酎）、ビール、ウイスキー、醤油、味噌等を挙げることができる。醸造物と原料穀類の組み合わせの具体例としては、ビールと麦芽（大麦麦芽）；ウイスキーと発芽させた穀類；大麦、小麦、醤油と小麦、大豆；味噌と小麦、米、大豆を挙げることができる。下記実施例では、清酒製造における原料米の醸造特性の予測式を構築し、該予測式はそのまま米焼酎製造における原料米の醸造特性予測にも利用できるが、本発明の範囲はこれに限定されるものではなく、各種の原料穀類、醸造物に対して本発明の方法を適用できる。
【００１７】
本発明の方法では、醸造物原料穀類のサンプルを複数サンプル使用する。１つの原料穀類サンプルより、１以上のメタボローム分析用サンプルを調製する。従って、本発明では、原料穀類サンプル数と同数又はそれ以上の複数のメタボローム分析用サンプルを調製することになる。原料穀類サンプルは、品種や栽培環境が異なるサンプルをできるだけ多数使用することが望ましい。１つの原料穀類サンプルよりメタボローム分析用サンプルを１つだけ調製し、メタボローム分析データを１セットだけ取得する場合、原料穀類サンプルとして最低限必要な数は、予測式構築のために３サンプル、検証用に１サンプルの合計４サンプルである。すなわち、メタボローム分析用サンプルの数は４サンプル以上必要である。予測精度が十分に高い予測式を得るためには、メタボローム分析用サンプルを９サンプル以上調製する（メタボローム分析データは９セット以上得られる）ことが望ましい。原料穀類サンプルを９サンプル以上用いてもよいし、原料穀類サンプルを３サンプル以上とし、各原料穀類サンプルからそれぞれ３つ以上のメタボローム分析用サンプルを調製してもよい。
【００１８】
メタボローム分析では、複数のメタボローム分析用サンプルをそれぞれ分析して、複数セットのメタボローム分析データを取得する。メタボローム分析データとは、原料穀類より調製されたメタボローム分析用サンプルを用いて、原料穀類中に含まれる化合物群（主として低分子量の代謝産物）を網羅的に解析して得られるデータ群であり、各化合物の原料穀類中存在量に関する定量的数値データで構成される。ここでいう定量的数値データとは、典型的には、各化合物の原料穀類中存在量を相対的に定量した数値データである。
【００１９】
本発明でメタボローム分析の対象となる化合物群には、メタボロミクスの分野における「メタボローム」の一般的な意味と同様に、アミノ酸、アミン、ヌクレオチド、糖、脂質等の低分子量の代謝産物や、DNA、RNA、タンパク質等の高分子量の生体化合物の分解物及び断片、並びに2次代謝物が含まれる。従って、本明細書において、メタボローム分析対象の化合物群を「メタボローム」と呼ぶことがある。特に限定されないが、本発明では、概ね分子量50〜1,000程度の低分子量の化合物群を対象にメタボローム分析を行えばよい。
【００２０】
メタボローム分析用サンプルとしては、原料穀類サンプル中に含まれる種々の化合物群を網羅的に抽出した抽出物を用いればよい。例えば、原料穀類サンプル（原料米の玄米など）を適当な溶媒中で破砕して化合物群を抽出した抽出液をメタボローム分析サンプルとして用いることができる。本発明では、主として親水性の化合物群がメタボローム分析のターゲットとなるので、溶媒としては低級アルコール溶液などの親水性溶媒を好ましく用いることができる。低級アルコール溶液は、例えば、濃度３０〜７０％程度のメタノールやアルコールの水溶液でよい。もっとも、本発明では、疎水性の化合物群をメタボローム分析のターゲットとしてもよいので、疎水性溶媒を用いて化合物群を抽出した抽出液をメタボローム分析用サンプルとして用いることも可能である。原料穀類抽出物は、穀類粉砕後に遠心等により残渣を除いた後、限外濾過に付してもよい。
【００２１】
メタボローム分析における化合物の分離工程がガスクロマトグラフィーにより行われる場合には、ジエチルエーテル、イソペンタン、ペンタン等の有機溶媒を用いて抽出した後、分析対象の化合物群を気化しやすいように誘導体化したサンプルや、原料穀類サンプルの熱分解物をメタボローム分析用サンプルとして用いることができる。生体内物質の上記誘導体化の方法は周知の常法である。
【００２２】
メタボローム分析における分析手法自体は特に限定されず、メタボローム分析用サンプル中の化合物群を網羅的に解析できる方法であればよい。一般的には、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動又はガスクロマトグラフィーと質量分析とを組み合わせた方法や、NMR解析によりメタボローム分析を実施できる。メタボローム分析に適した各種の液体クロマトグラフ、キャピラリー電気泳動、ガスクロマトグラフ、及び質量分析システムが公知であり、市販品も存在する。そのような市販の分析装置を用いてメタボローム分析を実施することができる。あるいは、メタボローム分析サービスが種々の企業から提供されているので、そのような分析サービスを利用してメタボローム分析データセットを取得してもよい。
【００２３】
液体クロマトグラフィーには、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、超高速液体クロマトグラフィー（UHPLC、UPLC(登録商標)）が包含される。膨大な数の化合物を分析するメタボローム分析では、一般に超高速液体クロマトグラフィーが好ましく用いられるが、特に限定されず、本発明においてはHPLCとUHPLCのいずれを用いてもよい。分離モードとしては、一般に親水性相互作用クロマトグラフィーを好ましく用いることができるが、これに限定されるものではなく、原料米から抽出した化合物群の性質、例えば親水性であるか疎水性であるか等に応じて、適当な分離モードや移動相を組み合わせて液体クロマトグラフィーを行なえばよい。
【００２４】
ガスクロマトグラフィーを採用する場合は、GC/質量分析によりメタボローム分析を行なう場合の一般的な方法によりガスクロマトグラフィー工程を実施すればよい。
【００２５】
質量分析の手法も特に限定されず、メタボロミクス分野で一般的に採用されている、一定以上の定量性能を有する質量分析法を用いることができる。そのような質量分析法としては、磁場型フーリエ変換質量分析計、QMS（四重極型質量分析）、TOF-MS（飛行時間型質量分析）、Triple QMS（三連四重極型質量分析）、QMS/TOF-MS等を挙げることができ、中でもTOF-MS及びQMS/TOF-MSを好ましく採用することができるが、これらに限定されない。本発明において、単に「飛行時間型質量分析」といった場合、飛行時間型質量分析計を含む質量分析システムによる質量分析を指し、TOF-MS及びQMS/TOF-MS等が包含される。
【００２６】
メタボローム分析により得られた各化合物の含有量に関する生データは、適当なソフトウェアを用いて相対定量値の数値データに変換すればよい。各化合物の相対定量値を算出する方法としては、マススペクトルの各ピークの相対面積値として算出する方法や、マススペクトルの測定値を質量、時間、強度の3次元データとして円錐状のピーク体積を算出する方法などがあり、本発明ではいずれの方法を採用してもよい。クロマトグラフと質量分析計を連結したメタボローム分析用の市販の分析システムを用いる場合、通常はシステムに相対定量値を算出するためのソフトウェアが付属されているので、そのような付属のソフトウェアを使用すればよい。
【００２７】
本発明において、「醸造特性データ」という語は、原料穀類の醸造特性に関わる、原料穀類又はそれから得られる麹、モロミについての種々の分析データをいう。原料穀類が米であり、醸造物が清酒又は焼酎である場合の醸造特性データの具体例としては、酒米統一分析法により得られる原料米分析値、原料米より製造した米麹の酵素力価、原料米より清酒又は焼酎を製造する過程でのモロミ経過、原料米より製造した清酒又は焼酎の一般成分及び香気成分の分析値などが挙げられる。これらの醸造関連分析値より選択される少なくとも１種、好ましくは複数の分析値を含む分析データを、醸造特性データとして取得すればよい。麹、モロミ、及び清酒又は焼酎は、標準的な清酒又は焼酎の製造方法により製造すればよい。
【００２８】
酒米統一分析法により得られる原料米分析値とは、原料米の玄米水分、調整前千粒重、調整後千粒重、みかけ精米歩合、真精米歩合、無効精米歩合、砕米率、白米水分、20分吸水率、120分吸水率、蒸米吸水率、消化性 brix、粗タンパク質、カリウムについての分析値である。これら14項目の分析値は、酒米研究会の酒造用原料米全国統一分析法に従い常法により取得することができる。
【００２９】
原料米より製造した米麹の酵素力価には、α−アミラーゼ（AAase）活性、グルコアミラーゼ（GAase）活性、酸性カルボキシペプチダーゼ（ACPase）活性、酸性プロテアーゼ（APase）活性、及びα-グルコシターゼ活性の測定値が包含される。原料米の精米歩合を変えて米麹を作製し、それぞれの米麹について酵素力価を測定してもよい。第四回改正国税庁所定分析法注解に従い、米麹から酵素を抽出して米麹酵素液とし、市販のキット等を用いてこの酵素液の各種酵素活性を測定すればよい。
【００３０】
原料米より清酒又は焼酎を製造する過程でのモロミ経過（発酵経過）の分析値としては、一日当たりの炭酸ガス減量の最大値、一日当たりの炭酸ガス減量が最大値に達した日数、炭酸ガス減量の積算値、粕歩合のデータを挙げることができる。粕歩合とは、モロミを遠心分離または濾紙による濾過、圧搾などで固液分離した際の固体部分の重量を原料米重量で割り100をかけた値である。一般的な条件で小仕込み試験を行ない、これらの項目について調べればよい。モロミ経過についても、原料米の精米歩合を変えて小仕込み試験を行い、各試験からモロミ経過の分析データを得ることができる。
【００３１】
モロミ上清又は製成酒の一般成分の分析値としては、エタノール濃度、酸度、アミノ酸度、日本酒度、原エキス分の測定値を挙げることができる。また製成酒の香気成分としては、酢酸エチル（EtOAc）、n-プロピルアルコール（nPrOH）、イソブチルアルコール（iBuOH）、酢酸イソアミル（iAmOAc）、イソアミルアルコール（iAmOH）、カプロン酸エチル（EtOCap）を挙げることができる。これらの製成酒成分は常法通りに測定すればよい。製成酒の一般成分及び香気成分についても、適宜原料米の精米歩合を変えて小仕込み試験を行い、得られた製成酒それぞれについて一般成分及び香気成分を測定し、醸造特性データとして用いることができる。
【００３２】
焼酎の一般成分の分析値としては、pH、酸度、紫外部吸収、チオバルビツール酸（TBA）価、着色度、2,4,6-トリクロロアニソール（TCA）を挙げることができる。また焼酎の香気成分としては、アセトアルデヒド、酢酸エチル、n-プロピルアルコール、イソブチルアルコール、酢酸イソアミル、イソアミルアルコール、フルフラール、モノテルペンアルコール（リナロール、α-テルピネオール、シトロネロール、ネロール、ゲラニオール）、カプロン酸エチル、カプリル酸エチル、カプリン酸エチル、β-フェネチルアルコール、酢酸β-フェネチル、高級脂肪酸エチルエステル（ラウリン酸エチル、ミリスチン酸エチル、パルミチン酸エチル、リノール酸エチル、オレイン酸エチル、ステアリン酸エチル）を挙げることができる。これらの成分についても、適宜原料米の精米歩合を変えて一般的な条件で焼酎を製造し、常法により測定を行い、醸造特性データとして用いることができる。
【００３３】
醸造特性データは、メタボローム分析に供する原料穀類サンプルの全てについて取得する。予測したい醸造特性の項目を選択し、その項目について、原料穀類サンプルの分析を行えばよい。下記実施例では、合計２８サンプルの原料米サンプルより２８×３のメタボローム分析用サンプルを調製し、２８×３のメタボローム分析データと２８サンプル分の醸造特性データを重回帰分析した結果、玄米水分含量；調整前千粒重；調整後千粒重；真精米歩合；無効精米歩合；砕米率；120分吸水率；消化性brix；玄米カリウム含量；原料米より製造した米麹のα−アミラーゼ活性、グルコアミラーゼ活性、α−グルコシダーゼ活性、酸性カルボキシペプチダーゼ活性、及び酸性プロテアーゼ活性；原料米より製造したモロミの粕歩合、1日当たり炭酸ガス減量最大値、1日当たりの炭酸ガス減量の最大値に達した日数、及び炭酸ガス減量の積算値；原料米より製造した清酒のエタノール含量、酸度、アミノ酸度、日本酒度、酢酸エチル含量、n-プロピルアルコール含量、イソブチルアルコール含量、酢酸イソアミル含量、イソアミルアルコール含量、及びカプロン酸エチル含量について、予測性能の高い予測式を作成できたことが示されている。作成された予測式は、焼酎（特に米焼酎）の製造における原料米の醸造特性予測にもそのまま利用することができる。これらの醸造特性項目は、本発明の方法で予測式を作成できる項目の具体例であるが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００３４】
重回帰分析の工程では、メタボローム分析データから選択される２個以上の定量的数値データを説明変数とし、醸造特性データを目的変数として、目的変数ごとに重回帰分析を行ない、重回帰式を求める。この重回帰式が本発明の方法で作成される予測式の候補となる。説明変数の数は特に限定されず、例えば５個以上、７個以上、又は１０個以上の定量的変数データを説明変数として用いてもよい。１つのメタボローム分析データを構成する定量的数値データの全てを説明変数として用いることも可能であるが、数個〜十数個程度の定量的数値データを説明変数として用いるのが一般的である。
【００３５】
重回帰分析の手法としては、PLS（projections to latent structures）回帰分析やOPLS（orthogonal PLS）回帰分析を好ましく用いることができる。いずれもメタボロミクスの分野で広く知られる多変量解析法であり、そのためのソフトウェアが多数市販されているので、そのようなソフトウェアを用いてこれらの重回帰分析を実施することができる。
【００３６】
重回帰分析に先立ち、適当な標準化方法にて説明変数（メタボローム分析で得られた定量的数値データ）及び目的変数（醸造特性データ）の標準化を行なう。通常、重回帰分析に使用するソフトウェアに適当な標準化ツールも搭載されているので、そのようなツールを用いて標準化を行えばよい。
【００３７】
また、重回帰分析用データセット中のメタボローム分析データは、該データに含まれる定量的数値データの全てを重回帰分析に用いても良いし、一定の基準で定量的数値データを選別抽出して重回帰分析に用いてもよい。例えば、下記実施例でも行っているように、定量的数値データが突出して大きいデータを除外したり、複数のメタボローム分析データセット間でバラつきの少ない定量的数値データを抽出したりする等して重回帰分析に供してもよい。バラつきが少ないかどうかは、例えば、各定量的数値データについて、複数のメタボローム分析用サンプル毎の定量的数値データ平均値に占める標準偏差の割合（標準偏差／平均値×100）を算出し、該割合が低いかどうか（例えば50％程度未満となるかどうか）で判断することができる。
【００３８】
メタボローム分析データは、複数セットあるうちの一部のセットを用いて重回帰分析を行ない、予測式候補を作成し、次いで、当該予測式候補の作成には使用していない別のメタボローム分析データと醸造特性データのセット、あるいは別のデータセット（検証に使用するために別の穀類サンプルを用いて別途取得した、メタボローム分析データと醸造特性データのセット）を該予測式候補に適用して、該予測式候補の交差検証を行ない、予測性能を検証することが好ましい。予測式候補の予測性能の検証では、例えば、当てはまり度や適合度を表すR2（決定係数）が高い予測式を予測性能が高い予測式として評価することができる。R2は0＜R2＜1の値をとるので、例えば、予測式の作成に使用していない別のデータセットを予測式に適用してR2値を求め、0.7≦R2、又は0.8≦R2となった予測式を予測性能が高いと評価することができる。また、予測式の予測性能は、RMSEP (Root Mean Square Error of Prediction)（個々の予測値と実測値の差の二乗の合計をサンプル数で割った値の正の平方根）の値、または、標準偏差をRMSEPで割ったRPD (Residual Predictive Deviation) の値を用いて行ってもよい。RMSEPは、値が小さい予測式を予測性能が高いと評価することができる。RPDは、値が大きい予測式を予測性能が高いと評価することができる。
【００３９】
本発明の方法で作出される予測式を穀類新品種の育種に応用する場合、予測式を用いた醸造特性の予測は、育種過程のいずれのステップで実施してもよい。育種過程初期の個体選抜のステップで醸造特性の予測による選抜を行なってもよいし、系統選抜のステップで醸造特性の予測による選抜を行なってもよい。本発明の予測式を用いれば、少量の穀類サンプルから得られるメタボローム分析データを用いて醸造特性を予測できるので、多量の穀類サンプルを得ることが困難な育種過程の早い段階においても、醸造特性予測による選抜を実施することができる。
【００４０】
醸造特性予測式を用いた穀類品種の作出方法は、具体的には、以下のようにして実施することができる。
【００４１】
まず、育成中の穀類個体集団又は穀類系統集団より、穀類サンプルを取得する。個体選抜のステップで醸造特性予測による選抜を行う場合には、育成中の穀類集団の各個体から穀類サンプルを取得する。系統選抜のステップで醸造特性予測による選抜を行う場合には、各系統から少なくとも１つの穀類サンプルを得ればよい。
【００４２】
次いで、各穀類サンプルよりメタボローム分析用サンプルを調製し、メタボローム分析データを取得する。１の穀類サンプルから１セットのメタボローム分析データを取得（すなわち、１の穀類サンプルから１のメタボローム分析用サンプルを調製）すれば十分であるが、所望により２セット以上のメタボローム分析データを取得してもよい。メタボローム分析用サンプルの調製とメタボローム分析は、使用する醸造特性予測式を作成した際に採用した方法と同じ方法で行なう。
【００４３】
次いで、取得されたメタボローム分析データを醸造特性予測式に代入し、醸造特性の予測値を算出する。この工程では、当然ながら、メタボローム分析データを構成する定量的数値データのうちで必要なデータ（予測式に採用されている化合物（メタボローム）についてのデータ）のみを用いればよい。
【００４４】
次いで、算出された予測値に基づいて醸造特性を評価し、所望の醸造特性を有すると予測された個体又は系統を、上記の穀類集団より選抜する。予測値に基づく評価と選抜は、育種の目的に応じて行えばよい。清酒原料米の育種を例に説明すると、例えば香気成分の予測を行なう場合、カプロン酸エチルを多く含む清酒の製造に適した原料米（稲）品種を育種したいときにはカプロン酸エチル生成量が多いと予測される個体ないし系統を選抜すればよく、カプロン酸エチル含量が低い清酒の製造に適した原料米（稲）品種を育種したいときにはカプロン酸エチル生成量が低いと予測される個体ないし系統を選抜すればよい。
【００４５】
醸造特性予測式を用いた育種では、複数の醸造特性に関する複数の予測式を組み合わせて用いることができる。育種の目的に応じて予測式を選択して用いればよい。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４７】
１．予測式作成の概要
メタボローム分析データを説明変数(x)、各種分析データ（酒米統一分析、麹の酵素力価、モロミ経過、一般成分分析、香気成分分析）を目的変数(y)として予測モデルを構築した。3 sets のメタボローム分析データのそれぞれに1 setの各種分析データを結合したデータセットを作成し、Data set 1, 2, 3とした。さらに、Data set 1, 2, 3 を統合したデータセットをData set allとした。モデルの構築は、SIMCA ver.13.0.3 (Umetrics, Umea, Sweden) を用いて orthogonal PLS (OPLS) 回帰分析にて行った。概要を図１に示した。OPLS回帰分析では、説明変数(x)から目的変数(y)の値を求める予測式 (例：y = a*x1 + b*x2 … + j*x10 + k) を作成することができる。実際の予測式作成は、Data set 1, 2, 3で独立に行い、作成した予測式を別のデータ（Data set 1 で予測式を作成した場合には Data set 2, 3）に適用することで交差検証と予測性能の検証を行った。
【００４８】
玄米サンプルは、一般的な酒米品種を含む５品種のそれぞれについて、圃場等が異なる複数サンプルを取得し、合計２８サンプルを使用した。
【００４９】
２．玄米抽出液のメタボローム分析データ（説明変数(x)）の取得
（方法）
１つの玄米サンプルについて、約100 mgの玄米を精秤し、2.0 mLスクリューキャップマイクロチューブに入れた。このチューブに直径5 mmのステンレスボール（株式会社相互理化学硝子製作所、cat no. 1096-04）を加えた。さらに、玄米の10倍量の50%メタノール（Milli-Q水とMethanol LC-MS CHROMASOLV(登録商標)(Cat No. 34966-2.5L)(Sigma-Aldrich Co. LLC, 米国ミズーリ州St. Louis)を1:1(v/v)で混合）を加えた後、4℃で30分間静置した。その後、4℃、3,500rpmで300sec×5の条件で Micro Smash MS-100 (株式会社トミー精工, 日本国東京)を使って試料を粉砕した。粉砕後、4℃、15,000rpmで5分間遠心し、上清を2.0mL容チューブに移した。これを4℃、15,000rpmで10分間遠心し、上清をAmicon Ultra 3K-0.5 filter (Merck KGaA, 独国Darmstadt)を用いた限外濾過に供した(4℃、15,000rpm、60分間)。ここで使用したフィルターの公称分画分子量は3 kDaであり、3 kDa以上の分子がサンプルから除去されると考えられる。
【００５０】
玄米サンプル１つにつき、独立して３回の抽出を行ない、メタボローム分析用サンプルを３サンプル調製した（玄米２８サンプル分で合計２８×３サンプルのメタボローム分析用サンプルを調製）。
【００５１】
上記で調製した２８×３のメタボローム分析用サンプルをUPLC-QTof MSに供し、メタボローム分析を行った。
＜UPLC-QTof MSの分析条件＞
ACQUITY UPLC system (日本ウォーターズ株式会社, 日本国東京) とWaters Xevo QTOF MS (日本ウォーターズ) を用いて分析を行った。LC条件とMS条件をそれぞれ次に示した。
LC 条件：カラム；ACQUITY UPLC HSS T3 Column, 2.1×150 mm 1.8 μm (日本ウォーターズ)、カラム温度；40℃、流速；0.3 mL/min、移動相；0.1% ギ酸（溶液 A）と 0.1% ギ酸-アセトニトリル（溶液B）、グラジエント；0% 溶液 B (0-5 min)、0-100% 溶液B (5-15 min)、100% 溶液B (15-20 min)、100-0% 溶液B (20-21 min)、0% 溶液 B (21-30 min)、サンプル注入量；3μL
MS 条件：イオン化；ESI positive ion mode、Desolvation gas flow；800 L/h、Desolvation temperature；450℃、Corn gas flow；50 L/h、Source temperature；140℃、Capillary voltage；3 kV、Corn voltage；15 V、Collision energy；6、MS mode；MS (m/z range 50-1,000)、MS scan数；0.2 sec
【００５２】
分析で得られた生データから、付属のソフトウェアMassLynxTM (日本ウォーターズ)のMarkerLynxTM XS(日本ウォーターズ)を使って、精密質量と保持時間（Retention time）の誤差をそれぞれ0.02 Da, 0.06 minに設定したメソッドを用いて、ピークの検出とアラインメントを行い、マーカーテーブルを作成した。この結果、3,589個のマーカーが得られた。
【００５３】
各玄米サンプルからn = 3で抽出した３つのメタボローム分析用サンプルより得たメタボローム分析データをそれぞれデータ１、データ２、データ３とし、２８の玄米サンプル由来のデータをデータ１、データ２、データ３ごとにそれぞれまとめて、3 setsのメタボローム分析データを得た。これら3 setsのメタボローム分析データに、後述するとおりに取得した２８の玄米サンプルの各種分析データ1 setを結合し、３つの重回帰分析用データセットData set 1, 2, 3を得た。Data set 1, 2, 3を統合したデータセット（すなわち、２８×３のメタボローム分析データの全てを統合し、これに２８の玄米サンプルの各種分析データを結合したデータセット）をData set allとして用いた。
【００５４】
３．各種分析データ（目的変数(y)）の取得
表１−１〜表１−３に分析項目（目的変数）を示した。
【００５５】
【表１−１】
2019070548.tif 000003
【００５６】
【表１−２】
2019070548.tif 000004
【００５７】
【表１−３】
2019070548.tif 000005
【００５８】
以下、表１−１〜表１−３に示した分析項目の分析方法を記載する。酒米統一分析については、１の玄米サンプルにつき３回の分析を行ない、その平均値をその玄米サンプルの分析値とした。それ以外の分析値は、１の玄米サンプルにつきn = 2で製麹、仕込を行ない、各麹又は仕込について２回ずつ測定を行なって４つの測定データを得て、その平均値をもって当該玄米サンプルの分析値とした。
【００５９】
＜酒米統一分析＞
酒米研究会の酒造用原料米全国統一分析法に従い、14項目（玄米水分、調整前千粒重、調整後千粒重、みかけ精米歩合、真精米歩合、無効精米歩合、砕米率、白米水分、20分吸水率、120分吸水率、蒸米吸水率、消化性 brix、粗タンパク質、カリウム）の分析を行った。
【００６０】
＜米麹酵素力価の測定＞
精米歩合70%および50%の米で作製した麹の酵素力価（AAase, GAase, APase, ACPase, α−グルコシダーゼ）を以下の方法で測定した。
【００６１】
（方法）
米麹を次の手順で作製した。玄米を精米機で精米歩合70%もしくは50%に精米した。その後、水に浸漬し、蒸した。60gの蒸米に60mgのAspergillus oryzae RIBOIS01株の分生子を播種し、温度32℃、湿度90%で18時間培養した。培養物を混ぜ返した後、温度32℃、湿度90%でさらに12時間培養した。再度培養物を混ぜ返した後、温度34℃、湿度80%で3時間培養した。その後、温度37℃、湿度70%で3時間培養し、培養物を混ぜ返した後に温度40℃、湿度70%で2時間培養した。さらに、温度42℃、湿度60%で8時間培養し、計46時間培養した。
【００６２】
5gの米麹に25mLの抽出バッファー（0.5% NaCl, 10 mM酢酸バッファー）を加え、4℃で一晩静置した。その後、濾紙（ADVANTEC(登録商標) No.5A, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo, Japan）を用いて濾過し、濾液を米麹酵素液とした（第四回改正国税庁所定分析法注解）。調製した米麹酵素液は、次に示す方法でAAase, GAase, ACPase, APase, α−グルコシダーゼ活性を測定した。
【００６３】
α-アミラーゼ(AAase):
α-アミラーゼ測定キット（キッコーマンバイオケミファ株式会社、日本国東京）を用いて測定した。米麹酵素液を抽出バッファーで50倍希釈し、キットの測定法に従って測定した。
【００６４】
グルコアミラーゼ(GAase)：
糖化力分別定量キット（キッコーマンバイオケミファ株式会社）を用いて測定した。米麹酵素液を抽出バッファーで2倍希釈し、キットの測定法に従って測定した。
【００６５】
酸性カルボキシペプチダーゼ(ACPase)：
酸性カルボキシペプチダーゼ測定キット（キッコーマンバイオケミファ株式会社）を用いて測定した。米麹酵素液を抽出バッファーで5倍希釈し、キットの測定法に従って測定した。
【００６６】
酸性プロテアーゼ(APase)：
第四回改正国税庁所定分析法注解に従った。米麹酵素液を抽出バッファーで5倍希釈して測定に用いた。
【００６７】
α−グルコシダーゼ：
糖化力分別定量キット（キッコーマンバイオケミファ株式会社）を用いて測定した。米麹酵素液をそのまま使用し、キットの測定法に従って測定した。
【００６８】
＜小仕込み試験（発酵経過）＞
精米歩合70%および50%の白米をそれぞれ用いて小仕込み試験を行ない、
・一日当たりの炭酸ガス減量の最大値
・一日当たりの炭酸ガス減量が最大値に達した日数
・炭酸ガス減量の積算値
・粕歩合
を調べた。
【００６９】
（方法）
清酒酵母K1801株を5 mLの麹エキス培地(BOME10)で30℃、一晩静置することで前培養した。200μLの前培養液を200 mLの麹エキス培地に移し、30℃、二晩静置することで本培養した。本培養液を4℃、4,140gで10分間遠心し、酵母菌体を回収した。酵母菌体は、1.0×108 cells/mLに調整し、酵母懸濁液とした。
【００７０】
続いて、仕込みを次の手順で行った。129 g(mL)滅菌水と90μLの50%乳酸を入れた450 mL容マヨネーズ瓶に白米20 g相当の米麹（20 gの白米から作製した米麹）を加え、4℃で1時間静置した。その後、1 mLの酵母懸濁液と80 gの白米（精米歩合70%又は50%）を蒸して作製した掛米を加え、よく混ぜた。モロミは、15℃で19日間インキュベートし、その間毎日重量を測定した。その後、モロミを4℃、4,140gで15分間遠心し、上清を回収した。以後、上清を製成酒として分析に用いた。原料白米に対する沈殿重量の割合を粕歩合として算出した。
【００７１】
＜製成酒の分析＞
上記の小仕込み試験で得た製成酒を分析し、以下の項目を調べた。
精米歩合70%および50%それぞれのエタノール濃度、酸度・アミノ酸度、日本酒度、香気成分（EtOAc, nPrOH, iBuOH, iAmOAc, iAmOH, EtOCap）、原エキス分
【００７２】
（方法）
エタノール濃度：
AOC-20i AUTO INJECTOR(島津製作所, 日本国京都)とGC-17A GAS CHROMATOGRAPH(島津製作所)を用いたガスクロマトグラフィーにより定量した。1.5 mL容バイアルに40μLのサンプルを取り、960μLの1%イソプロパノール（内部標準）と混合した。アルコールは、DB-624キャピラリーカラム（内径 0.53 mm、長さ 30 m、膜厚 3μm； Agilent Technologies Inc., 米国カリフォルニア州Santa Clara）で分離した。条件は以下の通り。Injection temperature, 250℃; oven temperature, 50℃; detector temperature, 250℃, carrier gas, He 6.0 mL/min。（カラム入口圧 28 kPa, スプリット比 1:40）
【００７３】
酸度・アミノ酸度：
酸度は第四回改正国税庁所定分析法注解 (pp. 20-23) に、アミノ酸度は「エタノールを使用した清酒のアミノ酸度分析方法の検討」に従って測定した。
【００７４】
日本酒度：
日本酒度は、比重 S (15/4℃)（15℃ の製成酒の 4℃ の水の密度に対する比重）を Density/Specific Gravity Meter DA-520（KYOTO ELECTRONICS MANUFACTURING CO., LTD, Kyoto, Japan）を用いて測定し、1443/S - 1443 で算出した。
【００７５】
香気成分：
揮発性香気成分 (Volatile aromatic compounds) は、7697A Headspace Sampler (Agilent Technologies) と 7890B GC system (Agilent Technologies) を用いて、T. Katou et al. Yeast 2008; 25: 799-807 と同じ方法で測定した。
【００７６】
原エキス分：
理論的エキス分（主としてブドウ糖）。醪や清酒中のエキス分とアルコール分から、それらを発酵、生成するのに必要なエキス分が発酵前の醪や清酒中にあるものとして算出したもの。清酒製造技術 (p. 247) と第四回改正国税庁所定分析法注解 (pp. 24-25) を参考に算出。
【００７７】
４．統計解析（予測式の構築）
予測式作成のための実際の作業手順を図２に示した。
【００７８】
まず、玄米メタボローム分析データを説明変数(x)（下記注釈*）、各種分析データを目的変数(y)として、SIMCA ver.13.0.3 (Umetrics, スウェーデン国Umea)を用いてOPLS回帰分析を行った。玄米メタボローム分析データのData set毎もしくは全てのData setで独立して回帰分析を行った。分析の前に、説明変数をPareto scaling（(Xi - mean) / √SD））により、また目的変数をAutoscaling（(Xi - mean) / SD）により、標準化を行った。Autoscalingは平均を0、分散を1にする標準化であり、Pareto scalingはAutoscalingよりも値の大きさを残す標準化である。
【００７９】
次に、実用的かつ精度の高い予測式を作成するために、説明変数の絞り込みを行った。モデルをS-plotで解析し、y軸の絶対値が各データセットで共通して大きい説明変数を5個ずつ計10個選択した。この10個の説明変数のみを用い、潜在変数を 1+4+0 として同様に各Data set毎にOPLS回帰分析を行った。この潜在変数は、Permutation testによりオーバーフィットにならないことを確認した。次に、別のData setもしくはData set allを各予測式に適用し、R2値が高い予測式を最適な予測式として評価した。
【００８０】
（注釈*）説明変数である玄米メタボローム分析データは、3,589個のマーカーのintensityで構成されている。このうち、1022と大きすぎるintensityを含む4つのデータを除いた3,585個を全データ(ALL)とし、統計解析に用いた。さらに、各マーカーについて、原料米サンプル毎(3 sets)の平均値に占める標準偏差の割合(stdev/average*100)を算出し、50%未満となる751個のマーカーをバラつきの少ないデータ(<50%)とし、統計解析に用いた。
【００８１】
５．予測式の評価結果
表２−１〜表２−３は、上記で作成した各予測式のR2（適合度）およびQ2（予測性）の値である。また、表３−１〜表３−９は、各予測式に各Data set (1, 2, 3, all)を適用した時のR2値と、各予測式のR2値の平均値である。表３−１〜表３−９に示した説明変数について、全データ (ALL) およびバラつきが少ないデータ (<50%) で作成した3つずつの計6個の予測式（allを除く1〜3）より、良いモデル及び優れたモデルを選択した。6つの予測式のうち、適用後のR2平均値が0.7≦R2 Avg.＜0.8のものを良いモデルとして、同じく0.8≦R2 Avg.のものを優れたモデルとして選択した。選択したモデルの実際の予測式を表４−１〜表４−４に示した。
【００８２】
以上の結果を表５にまとめた。54個の目的変数のうち、25個で優れたモデルを構築することができた（表中の「優」）。このうち、14個は全データ (All)、11個はバラつきが少ないデータ (<50%) で構築したモデルが選択された。同様に、11個の説明変数で良いモデルを構築することができた（表中の「良」）。このうち、6個は全データ (All)、5個はバラつきが少ないデータ (<50%) で構築したモデルが選択された。このことから、必ずしもバラつきが少ないデータが良い予測式を作成することができるとは言えなかった。
【００８３】
以上のことから、54個の目的変数のうち36個で原料米の特性や麹の酵素力価、モロミ経過、製成酒の特性を予測するモデルを構築することができることが示された。ここで得られた予測式は、清酒のみならず、米焼酎に対する予測式（米焼酎の原料米についての醸造特性の予測式）としてもそのまま利用することができる。
【００８４】
【表２−１】
2019070548.tif 000006
【００８５】
【表２−２】
2019070548.tif 000007
【００８６】
【表２−３】
2019070548.tif 000008
【００８７】
【表３−１】
2019070548.tif 000009
【００８８】
【表３−２】
2019070548.tif 000010
【００８９】
【表３−３】
2019070548.tif 000011
【００９０】
【表３−４】
2019070548.tif 000012
【００９１】
【表３−５】
2019070548.tif 000013
【００９２】
【表３−６】
2019070548.tif 000014
【００９３】
【表３−７】
2019070548.tif 000015
【００９４】
【表３−８】
2019070548.tif 000016
【００９５】
【表３−９】
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【００９６】
【表４−１】
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【００９７】
【表４−２】
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【００９８】
【表４−３】
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【００９９】
【表４−４】
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【０１００】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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