(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞の増殖・分化を制御し、がん、骨粗鬆症、線維症等の疾患との関連が示唆されている、Ｗｎｔシグナル伝達系の新規な阻害剤、及び該阻害剤を含有する医薬組成物の提供【解決手段】下記式（１）、（２）、（３）で表される化合物から選択される少なくとも１種を含む、Ｗｎｔシグナル伝達系阻害剤、及び該阻害剤を含有する医薬組成物。2019099531.tif 000008【選択図】図１
2019099531.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）、（２）、（３）で表される化合物から選択される少なくとも１種、または、
下記式（１）、（２）、（３）で表される化合物の薬学的に許容される塩から選択される少なくとも１種、
を含む、Ｗｎｔシグナル伝達系阻害剤。
【化１】
2019099531.tif 000007
【請求項２】
請求項１に記載のＷｎｔシグナル伝達系阻害剤を有効成分として含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、Ｗｎｔシグナル伝達系阻害剤、該阻害剤を有効成分として含む医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｗｎｔシグナル経路は、線虫やショウジョウバエから哺乳類まで種を超えて保存されており、初期発生や形態形成、細胞の増殖・分化・運動において重要な役割を担っている。本経路のリガンドタンパク質であるＷｎｔは、分子量約４０，０００の分泌性糖タンパク質で、哺乳類では１９種類のＷｎｔが同定されている。
【０００３】
通常、β−ｃａｔｅｎｉｎは、Ａｘｉｎ、ＡＰＣ、ＧＳＫ−３β等と複合体を形成し、ＧＳＫ−３βによるリン酸化を受けユビキチン−プロテアソーム系で分解される。一方、Ｗｎｔが受容体に結合すると、細胞内タンパク質Ｄｖｌが上記の複合体にシグナルを伝達し、β−ｃａｔｅｎｉｎのリン酸化・ユビキチン化が阻害される。これにより、β−ｃａｔｅｎｉｎは分解経路から逃れ、核内へ移行する。核内に移行したβ−ｃａｔｅｎｉｎは、転写因子であるＴＣＦ／ＬＥＦと結合し、下流の標的遺伝子であるこれらの遺伝子の転写が亢進されることになる。
【０００４】
Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎシグナルは、細胞の増殖・分化を制御するだけでなく、がんをはじめ、骨粗鬆症、線維症などの種々の疾患との関わりが示唆されている。従って、Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎシグナルを阻害する化合物は、これら疾患の治療薬の開発につながる。
【０００５】
Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎシグナルの伝達系を阻害する化合物として、例えば、特許文献１に記載されている式（ａ）で表される化合物が知られている。
【０００６】
【化１】
2019099531.tif 000003
【０００７】
（ここでＲ１およびＲ２は、おのおの独立して、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｂｎ、Ｔｓ、Ｍｓ、Ａｃ、Ｂｚ、ＭＯＭ、ＭＥＭ、ＳＥＭ、又はＡｌｌｏｃである。また、ＸおよびＹは、おのおの独立して、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｂｎ、ハロゲン、アルコキシ、アミノ、アシル基、又はニトロ基である。ＸおよびＹは、インドールもしくはオキシインドール骨格のベンゼン環上であれば、いずれ位置に複数結合していてもかまわない。）
【０００８】
また、Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎシグナルの伝達系を阻害するその他の化合物として、非特許文献１では式（ｂ）、非特許文献２では式（ｃ）、非特許文献３では式（ｄ）、非特許文献４では式（ｅ）、非特許文献５では式（ｆ）、非特許文献６では式（ｇ）、非特許文献７では式（ｈ）及び（ｉ）、で表す化合物が開示されている。
【０００９】
【化２】
2019099531.tif 000004
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第６０８５８８１号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｊｕｆａｎｇ  Ｓｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ  ＰＤＺ  Ｄｏｍａｉｎ”，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，４４，１５４９５−１５５０３
【非特許文献２】Ｎａｏａｋｉ  Ｆｕｊｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  Ｂ−Ｃａｔｅｎｉｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ”，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，Ｊａｎｕａｒｙ  １５，２００７，５７３−５７９
【非特許文献３】Ｄａｖｉｄ  Ｇｒａｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＤＺ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ”，  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｖｏｌ.２８４，Ｎｏ．２４，ＪＵＮＥ  １２，２００９，１６２５６−１６２６３
【非特許文献４】Ｈｏ−Ｊｉｎ  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｕｌｉｎｄａｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ＰＤＺ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ”，  Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００９，４８，６４４８−６４５２
【非特許文献５】Ｊｕｆａｎｇ  Ｓｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ  ＰＤＺ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  Ｇｕｉｄｅｄ  ｂｙ  Ｖｉｒｔｕａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ＮＭＲ  Ｓｔｕｄｉｅｓ”，  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ，２０１２；７９：３７６−３８３
【非特許文献６】Ｊｉｗｏｎ  Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ  ＰＤＺ  ｄｏｍａｉｎ  ｂｙ  ｖｉｒｔｕａｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｔｕｄｉｅｓ”，  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４，２０１６，３２５９−３２６６
【非特許文献７】Ｈｙｕｎ−Ｙｉ  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ−ＣＸＸＣ５  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｒｅ  ｎｅｗ  ｄｒｕｇ  ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｂｏｎｅ  ａｎａｂｏｌｉｃ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ  ｔｈｅｒａｐｙ”，  ＥＭＢＯ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．４，２０１６，３７５−３８７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、Ｗｎｔシグナルの伝達系を阻害する化合物の報告数が少なく、有用な医薬組成物の開発を進めるには、Ｗｎｔシグナルの伝達系を阻害する新たな化合物が求められている。
【００１３】
本開示は、上記課題を解決するためになされたもので、新規なＷｎｔシグナル伝達系阻害剤及び該阻害剤を有効成分として含む医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本開示は、以下に示す、Ｗｎｔシグナル伝達系阻害剤及び該阻害剤を有効成分として含む医薬組成物に関する。
【００１５】
［１］下記式（１）、（２）、（３）で表される化合物から選択される少なくとも１種、または、
下記式（１）、（２）、（３）で表される化合物の薬学的に許容される塩から選択される少なくとも１種、
を含む、Ｗｎｔシグナル伝達系阻害剤。
【化３】
2019099531.tif 000005
［２］上記［１］に記載のＷｎｔシグナル伝達系阻害剤を有効成分として含む医薬組成物。
【発明の効果】
【００１６】
本明細書で開示する化合物により、Ｗｎｔシグナル伝達系を阻害できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、実施例における、ＷＳＴ−８  ａｓｓａｙの結果を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例における、ＬＤＨ  ａｓｓａｙの結果を示すグラフである。
【図３】図３は図面代用写真で、ＷＳＴ−８  ａｓｓａｙ後に、位相差顕微鏡（ＩＸ７１、Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）で撮影した細胞の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に、実施形態に係るＷｎｔシグナル伝達系阻害剤（以下、単に「阻害剤」と記載することがある。）、及び、該阻害剤を有効成分として含む医薬組成物（以下、単に「医薬組成物」と記載することがある。）について詳しく説明する。
【００１９】
実施形態に係る阻害剤は、
下記式（１）、（２）、（３）で表される化合物から選択される少なくとも１種、または、
下記式（１）、（２）、（３）で表される化合物の薬学的に許容される塩から選択される少なくとも１種、
を含むことを特徴としている。
【００２０】
【化４】
2019099531.tif 000006
【００２１】
Ｗｎｔシグナル伝達系は、細胞の増殖・分化を制御するだけでなく、がんをはじめ、骨粗鬆症、線維症などの種々の疾患との関わりが示唆されている。本明細書で開示する化合物は、Ｗｎｔシグナル伝達系を阻害することから、これらの有用な医薬組成物となりうる。
【００２２】
なお、本明細書において、「薬学的に許容される塩」とは、上記化合物の有効性を有したものであり、生物学的に有害でない塩を意味する。限定されるわけではないが、例えば、上記化合物と酸又は塩基との結合により生ずる塩を意味する。薬学的に許容し得る塩は、例えば、水、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド等との、種々の溶媒和物として存在してもよい。
【００２３】
実施形態に係る阻害剤、医薬組成物は、経口投与してもよいし、注射で投与してもよい。また、経皮、静脈内、筋肉内および経直腸経路によって投与してもよい。
【００２４】
実施形態に係る阻害剤、医薬組成物の剤型としては、例えば、錠剤、丸剤、粉剤、ロゼンジ、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、溶液剤、シロップ、エアロゾル剤(固形としてまたは液体媒質中)、軟膏剤、ゼラチン軟および硬カプセル剤、座剤、滅菌注射用溶液および滅菌封入粉剤等が挙げられる。
【００２５】
また、実施形態に係る阻害剤、医薬組成物は、担体、賦型剤、希釈剤を含んでいてもよい。例えば、ラクトース、デキストロース、シュクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ガムアカシア、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、シロップ、メチルセルロース、オキシ安息香酸メチル−およびプロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油が挙げられる。更に、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、保存剤、甘味剤または着香剤を加えてもよい。また、実施形態に係る阻害剤、医薬組成物を注射により投与する場合は、注射する部位に応じて、水溶性のヒアルロン酸、ステロイド、麻酔薬、抗炎症剤等、公知の薬剤と組み合わせてもよい。
【００２６】
以下に実施例を掲げ、各実施形態を具体的に説明するが、この実施例は単にその具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は、発明の範囲を限定したり、あるいは制限するものではない。
【実施例】
【００２７】
[化合物の細胞アッセイ]
（１）化合物
化合物は、上記式（１）乃至（３）に記載の化合物を用いた。何れの化合物もナミキ商事株式会社から購入した。
【００２８】
（２）細胞の培養
細胞は、ＢＴ−２０／ＣＭＶ−Ｌｕｃ（ヒトトリプルネガティブ乳がん細胞株）を用いた。細胞は、ＪＣＲＢ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋから購入した。なお、実施例で用いた細胞は、「Ｌ  Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“ＦＺＤ７  ｈａｓ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒｉｐｌｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ”，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２０１１）３０，４４３７−４４４６」において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７の高発現が報告されている。Ｆｒｉｚｚｌｅｄは、Ｗｎｔの受容体として働き、Ｗｎｔシグナル経路を活性化する。上記の報告でＷｎｔシグナル経路の阻害にあたるＦｒｉｚｚｌｅｄの発現抑制によって細胞の増殖を抑制することが示されていることから、細胞の増殖を調べることで化合物がＷｎｔシグナル伝達系を阻害するか否か評価できる。この細胞は、１０ｖ/ｖ％ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（Ｂｉｏｓｅｒａ社製）と１ｖ/ｖ％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ｇｉｂｃｏ）を含むＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を用い、９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ社製）に細胞を播種（３．０×１０4ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）し、１日培養した。
【００２９】
（３）化合物のＷｎｔシグナル伝達系の阻害の評価
［ＷＳＴ−８  ａｓｓａｙ］
上記（２）の培地を、各化合物（１００μＭ）を含む培地に交換し、４日間培養した。なお、式（１）の化合物を含む培地には０．１９ｖ/ｖ％、式（２）および式（３）の化合物を含む培地には０．１ｖ/ｖ％のｄ６−ＤＭＳＯ（Ｍｅｒｃｋ社製）が含まれている。培養終了後、ＷＳＴ−８  ａｓｓａｙ（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８、ＤＯＪＩＮＤＯ社製）により、添加した化合物の細胞への影響を評価した。なお、ＷＳＴ−８  ａｓｓａｙは細胞数を測定するキットで、細胞数が減少した場合、化合物がＷｎｔシグナル伝達系を阻害したと評価できる。吸光度測定はプレートリーダー（ＥｎＳｐｉｒｅ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いた。
【００３０】
図１は、ＷＳＴ−８  ａｓｓａｙの結果を示すグラフである。各化合物の値は、同濃度のｄ６−ＤＭＳＯを含む培地で培養した群の値で標準化した。エラーバーは、標準偏差を示す（ｎ＝２）。図１から明らかなように、式（１）乃至式（３）で表す化合物を添加することで、細胞数の大幅な減少を確認した。したがって、式（１）乃至式（３）で表す化合物は、Ｗｎｔシグナル伝達系を阻害することで、細胞の増殖を抑制できることを確認した。
【００３１】
［ＬＤＨ  ａｓｓａｙ］
次に、各化合物（１００μＭ）を含む培地に交換後の培養期間を２日間とし、ａｓｓａｙ用試薬にＬＤＨ  ａｓｓａｙ（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ＬＤＨ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ−ＷＳＴ、ＤＯＪＩＮＤＯ社製）を用いた以外は、上記［ＷＳＴ−８  ａｓｓａｙ］と同様の手順で、化合物のＷｎｔシグナル伝達系の阻害の評価を行った。なお、ＬＤＨ  ａｓｓａｙは、細胞から培地中に放出された乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性を測定するキットである。そのため、ＬＤＨの数値が高くなった場合、化合物がＷｎｔシグナル伝達系を阻害することで、細胞が損傷したと評価できる。
【００３２】
図２は、ＬＤＨ  ａｓｓａｙの結果を示すグラフである。各化合物の値は、同濃度のｄ６−ＤＭＳＯを含む培地で培養した群の値で標準化した。エラーバーは、標準偏差を示す（ｎ＝２）。図２から明らかなように、式（１）乃至式（３）で表す化合物を添加することで、細胞が損傷することを確認した。図１及び図２に示す結果より、式（１）乃至式（３）で表す化合物は、Ｗｎｔシグナル伝達系を阻害することで、細胞の増殖を抑制し、細胞を損傷し死滅できる。
【００３３】
（４）化合物を添加後の細胞の変化
図３は、ＷＳＴ−８  ａｓｓａｙ後に、位相差顕微鏡（ＩＸ７１、Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）で撮影した細胞の写真である。図３の小さな黒点部分が、細胞の核である。図３から明らかなように、式（１）乃至式（３）で表す化合物を添加していない上段の写真は、細胞が密な状態であった。一方、式（１）乃至式（３）で表す化合物を添加した下段の写真では、細胞の死滅により核（黒点）が減少していた。また、細胞の密集度合いも低下した。以上の結果より、式（１）乃至式（３）で表す化合物は、Ｗｎｔシグナル伝達系を阻害することで、細胞を損傷し死滅できることを、細胞の変化からも確認した。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
Ｗｎｔシグナルは細胞の増殖・分化を制御するだけでなく、がんをはじめ、骨粗鬆症、線維症などの種々の疾患との関わりが示唆されている。したがって、式（１）乃至式（３）で表す化合物は、これらの治療薬となる可能性がある。
【図１】
2019099531.tif 000009
【図２】
2019099531.tif 000010
【図３】
2019099531.tif 000011