(57)【要約】【課題】キメラサイトカイン受容体を提供すること。【解決手段】本発明は、（ｉ）腫瘍分泌因子、ケモカイン、および細胞表面抗原から選択されるリガンドに結合するエキソドメイン；および（ｉｉ）サイトカイン受容体エンドドメインを含む、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
二量体化ドメイン；および
サイトカイン受容体エンドドメイン
を含む、キメラ膜貫通タンパク質。
【請求項２】
前記二量体化ドメインが、重鎖定常ドメイン（ＣＨ）および軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）の二量体化部分を含む、請求項１に記載のキメラ膜貫通タンパク質。
【請求項３】
２つのポリペプチド：
（ｉ）
（ａ）第１の二量体化ドメイン；および
（ｂ）前記サイトカイン受容体エンドドメインの第１の鎖
を含む第１のポリペプチド；ならびに
（ｉｉ）
（ａ）前記第１の二量体化ドメインと二量体化する第２の二量体化ドメイン；および
（ｂ）前記サイトカイン受容体エンドドメインの第２の鎖
を含む第２のポリペプチド
を含む、請求項１または２に記載のキメラ膜貫通タンパク質。
【請求項４】
前記第１および第２の二量体化ドメインが、自発的に、または二量体化化学誘導物質（ＣＩＤ）の存在下において、二量体化する、請求項３に記載のキメラ膜貫通タンパク質。
【請求項５】
２つのポリペプチド：
（ｉ）
（ａ）重鎖定常ドメイン（ＣＨ）
（ｂ）前記サイトカイン受容体エンドドメインの第１の鎖
を含む第１のポリペプチド；および
（ｉｉ）
（ａ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
（ｂ）前記サイトカイン受容体エンドドメインの第２の鎖
を含む第２のポリペプチド
を含む、請求項２、３または４に記載のキメラ膜貫通タンパク質。
【請求項６】
前記サイトカイン受容体エンドドメインに対する前記第１の鎖および第２の鎖が、異なり、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインのα、βおよびγ鎖から選択される、請求項５に記載のキメラ膜貫通タンパク質。
【請求項７】
前記サイトカイン受容体エンドドメインに対する前記第１の鎖および第２の鎖が、同じであり、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインのα、βおよびγ鎖から選択される、請求項５に記載のキメラ膜貫通タンパク質。
【請求項８】
前記サイトカイン受容体エンドドメインが、
（ｉ）ＩＬ−２受容体のβ鎖エンドドメイン
（ｉｉ）ＩＬ−７受容体のα鎖エンドドメイン；または
（ｉｉｉ）ＩＬ−１５受容体のα鎖エンドドメイン；および／または
（ｉｖ）共通γ鎖受容体エンドドメイン
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のキメラ膜貫通タンパク質。
【請求項９】
前記第１のポリペプチドが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および重鎖定常ドメイン（ＣＨ）を含み、前記第２のポリペプチドが、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含む、請求項５に記載のキメラ膜貫通タンパク質。
【請求項１０】
Ｆａｂエキソドメインを含む、請求項９に記載のキメラ膜貫通タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のキメラ膜貫通タンパク質を含む細胞。
【請求項１２】
キメラ抗原受容体も含む、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍関連細胞表面抗原に結合する、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれかに記載のキメラ膜貫通タンパク質をコードする核酸配列。
【請求項１５】
請求項３において定義されたような第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列および請求項３において定義されたような第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列を含む核酸構築物であって、前記核酸構築物は、構造：
Ｄｉｍ１−ＴＭ１−エンド１−ｃｏｅｘｐｒ−Ｄｉｍ２−ＴＭ２−エンド２
（ここで、
Ｄｉｍ１は、前記第１の二量体化ドメインをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、前記第１のポリペプチドの前記膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、前記第１のポリペプチドの前記エンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、両ＣＣＲの共発現を可能にする核酸配列であり、
Ｄｉｍ２は、前記第２の二量体化ドメインをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、前記第２のポリペプチドの前記膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド２は、前記第２のポリペプチドの前記エンドドメインをコードする核酸配列である）
を有する、核酸構築物。
【請求項１６】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）もコードする、請求項１５に記載の核酸構築物。
【請求項１７】
ｃｏｅｘｐｒが、自己切断性ペプチドを含む配列をコードする、請求項１５または１６に記載の核酸構築物。
【請求項１８】
相同組換えを回避するために、代替的コドンが、同一または類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域で使用される、請求項１５〜１７のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれかに記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載の、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾン。
【請求項２１】
ｉ）請求項３において定義されたような第１のポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクター；および
ｉｉ）請求項３において定義されたような第２のポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクター
を含む、キット。
【請求項２２】
キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含むベクターも含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
ｉ）請求項１〜１０のいずれかにおいて定義されたようなキメラ膜貫通タンパク質をコードする核酸配列を含むベクター；および
ｉｉ）キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含むベクター
を含む、キット。
【請求項２４】
請求項１１〜１３のいずれかに記載の細胞を作製するための方法であって、請求項１４に記載の核酸配列；請求項１５〜１８のいずれかに記載の核酸構築物；請求項１９もしくは２０に記載のベクター；または請求項２１〜２３のいずれかに記載のベクターのキットを細胞に導入する工程を含み、前記細胞が、被験体から単離された試料に由来する、方法。
【請求項２５】
請求項１１〜１３のいずれかに記載の複数の細胞を含む、医薬組成物。
【請求項２６】
疾患を処置および／または予防するための請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
以下の工程：
（ｉ）請求項１４に記載の核酸配列；請求項１５〜１８のいずれかに記載の核酸構築物；請求項１９もしくは２０に記載のベクター；または請求項２１〜２３のいずれかに記載のベクターのキットで前記細胞が形質導入またはトランスフェクションされ、
（ｉｉ）前記被験体に（ｉ）からの前記細胞が投与されること
を特徴とする、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記試料が、Ｔ細胞含有試料である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記疾患が、がんである、請求項２７または２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
疾患の処置および／または予防において使用するための、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における、請求項１１〜１３のいずれかに記載の細胞の使用。
【請求項３２】
疾患を処置および／または予防するための、請求項１１〜１３のいずれかに記載の細胞を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）、ならびにそのようなキメラサイトカイン受容体および必要に応じてキメラ抗原受容体を細胞表面に発現する細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
若干の免疫治療剤が、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーおよびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含め、がん処置での使用について記載されている。
【０００３】
キメラ抗原受容体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性をＴ細胞のエフェクター機能に結び付けるタンパク質である。キメラ抗原受容体の通常形態は、抗原認識性アミノ末端、スペーサー、Ｔ細胞生存および活性化シグナルを伝達する複合エンドドメインにすべて連結された膜貫通ドメインを有するＩ型膜貫通ドメインタンパク質の形態である。
【０００４】
これらの分子の最も一般的な形態は、シグナル伝達エンドドメインにスペーサーおよび膜貫通ドメインを介して融合された、標的抗原を認識するモノクローナル抗体から誘導された１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の融合体である。上記分子は、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答してＴ細胞の活性化をもたらす。Ｔ細胞がかかるＣＡＲを発現すると、Ｔ細胞はその標的抗原を発現する標的細胞を認識し、殺す。いくつかのＣＡＲが腫瘍関連抗原に対して開発されており、かかるＣＡＲ発現Ｔ細胞を用いる養子移入手法は、現在様々ながんの処置についての臨床試験にかけられている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前立腺がんを処置するためのＣＡＲベースのアプローチ
前立腺がんは、世界中の男性において２番目に最も一般的ながんであり、がん関連死の主な原因の第６位である。世界的には、毎年およそ１，１００，０００例の新しい症例および３００，０００の死亡数があり、すべてのがんによる死亡の４パーセントを構成する。男性の６人に１人が、生涯の間にこの疾患と診断されると推定されている。
【０００６】
前立腺がんに対する初期の処置は、手術、放射線照射もしくはホルモン療法またはそれぞれの任意の組み合わせからなり得る。ホルモン療法は、制御不能の細胞成長を助長する男性ホルモンであるテストステロンのレベルを低下させることからなる。通常、進行段階のがんのために化学療法を残しておく。
【０００７】
ホルモン療法によるテストステロンレベルの低下にもかかわらず、前立腺がんが成長すると、処置の選択肢は限定される。通常、前立腺酸性ホスファターゼ（（ＰＡＰ）抗原）を標的にした免疫応答を誘導するように設計された樹状細胞ベースの治療用がんワクチンであるがんワクチンシプロイセル−Ｔ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標））、放射性医薬品（例えば、塩化ラジウム２２３）、２次ホルモン療法（例えば、アビラテロン（ａｂｉｒａｔｅｒｏｎｅ）またはエンザルタミド（ｅｎｚａｌｕｔａｍｉｄｅ））および／または化学療法（ドセタキセルおよびカバジタキセル（ｃａｂａｚｉｔａｘｅｌ））が順にホルモン療法に追加される。これらの処置の各々は、数ヶ月間にわたってがんの成長を遅らせ、その疾患によってもたらされる症候を緩和することができるが、この疾患は、最終的にはそれらに対して耐性になる。
【０００８】
前臨床では、前立腺がんに関連する２つの抗原：前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）および前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）が、ＣＡＲ  Ｔ細胞ベースの治療によって標的にされた。
【０００９】
ＰＳＣＡ  ＣＡＲで操作されたＴ細胞で処置されたマウスは、腫瘍成長の遅延を示した（Ｈｉｌｌｅｒｄａｌら（２０１４）ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  １４：３０；およびＡｂａｔｅ−Ｄａｇａら（２０１４）２５：１００３−１０１２）。それらの細胞は、高いインビトロ細胞傷害性を示したが、インビボでは、腫瘍成長は遅れたが、腫瘍を有するマウスは治癒しなかった。
【００１０】
これは、インビボにおいて、ＣＡＲ  Ｔ細胞が、厳しい癌微小環境に打ち勝とうともがくからであり得る。特に、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、前立腺がんの腫瘍床内において生着および拡大しない可能性がある。
【００１１】
ＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性および活性は、サイトカインの投与によって、またはサイトカインを構成的に産生するＣＡＲ  Ｔ細胞によって、高まり得る。しかしながら、これらのアプローチには限界がある：サイトカインの全身投与は、有毒であり得る；サイトカインの構成的な産生は、制御されない増殖および癌化をもたらし得る（Ｎａｇａｒｋａｔｔｉら（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：７６３８−７６４２；Ｈａｓｓｕｎｅｈら（１９９７）Ｂｌｏｏｄ  ８９：６１０−６２０）。
【００１２】
ゆえに、Ｔ細胞の生着および拡大を促進して、厳しい腫瘍微小環境の影響に対抗する代替的ＣＡＲ  Ｔ細胞アプローチが必要である。
【００１３】
オンターゲットオフ腫瘍（Ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ  ｏｆｆ−ｔｕｍｏｕｒ）毒性
がんは特異性を喪失させ得るため、がんを単一抗原の存在によって効果的に説明することは比較的稀である。
【００１４】
大抵のがんは、単一の抗原に基づいて正常な組織と区別することはできない。ゆえに、かなりの「オンターゲットオフ腫瘍」毒性が生じ、それによって、正常な組織が、治療によって損傷される。例えば、リツキシマブでＢ細胞リンパ腫を処置するためにＣＤ２０を標的化する標的にするが、正常なＢ細胞コンパートメント全体が枯渇し、慢性リンパ性白血病を処置するためにＣＤ５２を標的化する標的にするが、リンパ系コンパートメント全体が枯渇し、急性骨髄性白血病を処置するためにＣＤ３３を標的化する標的にするが、骨髄コンパートメント全体が損傷される、など。
【００１５】
「オンターゲットオフ腫瘍」毒性の予測される問題は、臨床試験によって裏付けられている。例えば、ＥＲＢＢ２を標的化する標的にするアプローチは、結腸がんが肺および肝臓に転移した患者を死亡させた。ＥＲＢＢ２は、一部の患者の結腸がんにおいて過剰発現されるが、心臓および正常な脈管構造をはじめとしたいくつかの正常組織上にも発現される。
【００１６】
ゆえに、そのような「オンターゲットオフ腫瘍」毒性が減少したまたは排除された、改善されたがん治療アプローチが必要である。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
腫瘍分泌因子、ケモカインおよび細胞表面抗原から選択されるリガンドに結合するエキソドメイン；および
サイトカイン受容体エンドドメイン
を含む、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）。
(項目２)
２つのポリペプチド：
（ｉ）
（ａ）前記リガンドの第１のエピトープに結合する第１の抗原結合ドメイン
（ｂ）前記サイトカイン受容体エンドドメインの第１の鎖
を含む第１のポリペプチド；および
（ｉｉ）
（ａ）前記リガンドの第２のエピトープに結合する第２の抗原結合ドメイン
（ｂ）前記サイトカイン受容体エンドドメインの第２の鎖
を含む第２のポリペプチド
を含む、項目１に記載のキメラサイトカイン受容体。
(項目３)
前記第１および第２の抗原結合ドメインの各々が、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、項目２に記載のキメラサイトカイン受容体。
(項目４)
前記第１および第２の抗原結合ドメインの各々が、単一ドメインバインダー（ｄＡｂ）である、項目２に記載のキメラサイトカイン受容体。
(項目５)
２つのポリペプチド：
（ｉ）
（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）
（ｂ）前記サイトカイン受容体エンドドメインの第１の鎖
を含む第１のポリペプチド；および
（ｉｉ）
（ａ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
（ｂ）前記サイトカイン受容体エンドドメインの第２の鎖
を含む第２のポリペプチド
を含む、項目１に記載のキメラサイトカイン受容体。
(項目６)
前記サイトカイン受容体エンドドメインについての第１の鎖と第２の鎖が、異なり、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインのα鎖、β鎖およびγ鎖から選択される、項目５に記載のキメラサイトカイン受容体。
(項目７)
前記サイトカイン受容体エンドドメインに対する第１の鎖と第２の鎖が、同じであり、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインのα鎖、β鎖およびγ鎖から選択される、項目５に記載のキメラサイトカイン受容体。
(項目８)
前記サイトカイン受容体エンドドメインが、
（ｉ）ＩＬ−２受容体のβ鎖エンドドメイン
（ｉｉ）ＩＬ−７受容体のα鎖エンドドメイン；もしく
（ｉｉｉ）ＩＬ−１５受容体のα鎖エンドドメイン；および／または
（ｉｖ）共通γ鎖受容体エンドドメイン
を含む、前述のいずれかの項目に記載のキメラサイトカイン受容体。
(項目９)
前記リガンドが、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）およびＣＡ１２５から選択される腫瘍分泌因子である、前述のいずれかの項目に記載のキメラサイトカイン受容体。
(項目１０)
前記リガンドが、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５およびＣＣＬ２２から選択されるケモカインである、項目１〜７のいずれかに記載のキメラサイトカイン受容体。
(項目１１)
前述のいずれかの項目に記載のキメラサイトカイン受容体を含む細胞。
(項目１２)
同じリガンド上の異なるエピトープに結合する、第１のキメラサイトカイン受容体および第２のキメラサイトカイン受容体を含む、項目１１に記載の細胞。
(項目１３)
前記第１のキメラサイトカイン受容体および前記第２のサイトカイン受容体が、前記リガンドに結合したとき、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインのα／β鎖およびγ鎖を介して、組み合わされたシグナル伝達が生じるように、前記第１のキメラサイトカイン受容体が、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインのα鎖またはβ鎖を含み、前記第２のキメラサイトカイン受容体が、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインのγ鎖を含む、項目１２に記載の細胞。
(項目１４)
キメラ抗原受容体も含む、項目１１〜１３のいずれかに記載の細胞。
(項目１５)
前記キメラ抗原受容体が、腫瘍関連細胞表面抗原に結合する、項目１４に記載の細胞。
(項目１６)
前記キメラ抗原受容体が、前立腺がんに関連する細胞表面抗原に結合する、項目１５に記載の細胞。
(項目１７)
前記細胞表面抗原が、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）または前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）である、項目１６に記載の細胞。
(項目１８)
項目１〜１０のいずれかに記載のキメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）をコードする、核酸配列。
(項目１９)
第１のＣＣＲをコードする第１の核酸配列および第２のＣＣＲをコードする第２の核酸配列を含む核酸構築物であって、該核酸構築物は、構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−エンド１−ｃｏｅｘｐｒ−ＡｂＢ２−スペーサー２−ＴＭ２−エンド２
（ここで、
ＡｇＢ１は、前記第１のＣＣＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、前記第１のＣＣＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、前記第１のＣＣＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、前記第１のＣＣＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、両ＣＣＲの共発現を可能にする核酸配列であり、
ＡｇＢ２は、前記第２のＣＣＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、前記第２のＣＣＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、前記第２のＣＣＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド２は、前記第２のＣＣＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有する、核酸構築物。
(項目２０)
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）もコードする項目１９に記載の核酸構築物であって、該核酸構築物は、構造：
（ｉ）ＣＣＲＡｇＢ１−ＣＣＲスペーサー１−ＣＣＲＴＭ１−ＣＣＲエンド１−ｃｏｅｘｐｒ１−ＣＣＲＡｇＢ２−ＣＣＲスペーサー２−ＣＣＲＴＭ２−ＣＣＲエンド２−ｃｏｅｘｐｒ２−ＣＡＲＡｇＢ−ＣＡＲスペーサー−ＣＡＲＴＭ−ＣＡＲエンド；
（ｉｉ）ＣＣＲＡｇＢ１−ＣＣＲスペーサー１−ＣＣＲＴＭ１−ＣＣＲエンド１−ｃｏｅｘｐｒ１−ＣＡＲＡｇＢ−ＣＡＲスペーサー−ＣＡＲＴＭ−ＣＡＲエンド−ｃｏｅｘｐｒ２−ＣＣＲＡｇＢ２−ＣＣＲスペーサー２−ＣＣＲＴＭ２−ＣＣＲエンド２；または
（ｉｉｉ）ＣＡＲＡｇＢ−ＣＡＲスペーサー−ＣＡＲＴＭ−ＣＡＲエンド−ｃｏｅｘｐｒ１−ＣＣＲＡｇＢ１−ＣＣＲスペーサー１−ＣＣＲＴＭ１−ＣＣＲエンド１−ｃｏｅｘｐｒ２−ＣＣＲＡｇＢ２−ＣＣＲスペーサー２−ＣＣＲＴＭ２−ＣＣＲエンド２；
（ここで、
ＣＣＲＡｇＢ１は、前記第１のＣＣＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；ＣＣＲスペーサー１は、前記第１のＣＣＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＣＣＲＴＭ１は、前記第１のＣＣＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＣＲエンド１は、前記第１のＣＣＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＣＲＡｇＢ２は、前記第２のＣＣＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；ＣＣＲスペーサー２は、前記第２のＣＣＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＣＣＲＴＭ２は、前記第２のＣＣＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＣＲエンド２は、前記第２のＣＣＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
Ｃｏｅｘｐｒ１およびｃｏｅｘｐｒ２は、隣接する２つの配列の共発現を可能にする核酸配列であり；
ＣＡＲＡｇＢは、該ＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＡＲスペーサーは、該ＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＣＡＲＴＭは、該ＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＡＲエンドは、該ＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有する、項目１９に記載の核酸構築物。
(項目２１)
ｃｏｅｘｐｒが、自己切断性ペプチドを含む配列をコードする、項目１９または２０に記載の核酸構築物。
(項目２２)
相同組換えを回避するために、代替的コドンが、同一または類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域で使用される、項目１９〜２１のいずれかに記載の核酸構築物。
(項目２３)
項目１９〜２２のいずれかに記載の核酸構築物を含む、ベクター。
(項目２４)
項目２３に記載の、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾン。
(項目２５)
ｉ）項目１〜１０のいずれかにおいて定義されたような第１のＣＣＲをコードする核酸配列を含むベクター；および
ｉｉ）項目１〜１０のいずれかにおいて定義されたような第２のＣＣＲをコードする核酸配列を含むベクター
を含む、キット。
(項目２６)
キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含むベクターも含む、項目２５に記載のキット。
(項目２７)
ｉ）項目１〜１０のいずれかにおいて定義されたようなＣＣＲをコードする核酸配列を含むベクター；および
ｉｉ）キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含むベクター
を含む、キット。
(項目２８)
項目１１〜１７のいずれかに記載の細胞を作製するための方法であって、項目１８に記載の核酸配列；項目１９〜２２のいずれかに記載の核酸構築物；項目２３もしくは２４に記載のベクター；または項目２５〜２７のいずれかに記載のベクターのキットを細胞に導入する工程を含む、方法。
(項目２９)
前記細胞が、被験体から単離された試料に由来する、項目２８に記載の方法。
(項目３０)
項目１１〜１７のいずれかに記載の複数の細胞を含む、医薬組成物。
(項目３１)
疾患を処置および／または予防するための方法であって、項目３０に記載の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、方法。
(項目３２)
以下の工程：
（ｉ）被験体からの細胞含有試料の単離；
（ｉｉ）項目１８に記載の核酸配列；項目１９〜２２のいずれかに記載の核酸構築物；項目２３もしくは２４に記載のベクター；または項目２５〜２７のいずれかに記載のベクターのキットでの前記細胞の形質導入またはトランスフェクション；および
（ｉｉｉ）該被験体に（ｉｉ）からの該細胞を投与すること
を含む、項目３１に記載の方法。
(項目３３)
前記試料が、Ｔ細胞含有試料である、項目３２に記載の方法。
(項目３４)
前記疾患が、がんである、項目３２または３３に記載の方法。
(項目３５)
疾患の処置および／または予防において使用するための項目３０に記載の医薬組成物。
(項目３６)
疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における項目１１〜１７のいずれかに記載の細胞の使用。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】様々なサイトカイン受容体の構造、サイトカインを産生する細胞型およびサイトカイン受容体を発現する細胞型を要約している模式図。
【００１８】
【図２】提案されたキメラサイトカイン受容体を示している模式図。（ａ）サイトカインＩＬ２およびＩＬ７のサイトカイン受容体は、共通ガンマ鎖およびサイトカイン特異的アルファ／ベータ鎖を介してシグナル伝達する。（ｂ）キメラサイトカイン受容体の１つの実行は、サイトカインアルファ／ベータおよびガンマ鎖の外部ドメインを、ＰＳＡの異なるエピトープを認識する異なるｓｃＦｖ（または他の任意の好適なバインダー）で置換することである。（ｃ）代替的アプローチは、アルファ／ベータおよびガンマの外部ドメインをＰＳＡ特異的抗体のＶＨ／ＶＬで置換することであり、ここで、ＶＨとＶＬの両方が結合に関わり、その結果、結合によって、それらは１つになる。
【００１９】
【図３−１】凝集に基づくサイトカインシグナル伝達エンハンサー。キメラサイトカイン受容体とＣＡＲの組み合わせシステムを示している模式図。この細胞は、同じ可溶性リガンド上の異なるエピトープに結合する２つのキメラサイトカイン受容体を含む。可溶性リガンド（例えば、ＰＳＡ）の非存在下であるが細胞膜抗原（例えば、ＰＳＭＡ）の存在下では、シグナル伝達は、ＣＡＲを介して（ｔｈｏｕｇｈｔ）生じる。可溶性リガンドの存在下では、それらの２つのキメラサイトカイン受容体の凝集が生じ、サイトカインベースのシグナル増強がもたらされる。
【図３−２】凝集に基づくサイトカインシグナル伝達エンハンサー。キメラサイトカイン受容体とＣＡＲの組み合わせシステムを示している模式図。この細胞は、同じ可溶性リガンド上の異なるエピトープに結合する２つのキメラサイトカイン受容体を含む。可溶性リガンド（例えば、ＰＳＡ）の非存在下であるが細胞膜抗原（例えば、ＰＳＭＡ）の存在下では、シグナル伝達は、ＣＡＲを介して（ｔｈｏｕｇｈｔ）生じる。可溶性リガンドの存在下では、それらの２つのキメラサイトカイン受容体の凝集が生じ、サイトカインベースのシグナル増強がもたらされる。
【００２０】
【図４】図３に図示されたキメラサイトカイン受容体／ＣＡＲ組み合わせシステムに対する理論上の構築物のマップ。
【００２１】
【図５】本発明のキメラ膜貫通タンパク質に対する構造の例を図示している模式図。このキメラ膜貫通タンパク質は、二量体化ドメインおよびサイトカイン受容体エンドドメインを含む。その二量体化ドメインは、抗体型の重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含むので、示されている実施形態は、「Ｆａｂ」型の構造を有する。これらのドメイン間の安定した二量体化は、ＩＬ２受容体の共通γ鎖をＩＬ−２受容体β鎖またはＩＬ−７受容体α鎖のいずれかと一体にして、構成的なサイトカインシグナル伝達をもたらす。
【００２２】
【図６】キメラ膜貫通タンパク質によるＩＬ−２シグナル伝達。図５に示された一般構造を有する２つのキメラ膜貫通タンパク質を、ＩＬ−２シグナル伝達を誘導するそれらの能力について試験した。一方のキメラ膜貫通タンパク質は、ＩＬ２受容体エンドドメインを含み、他方は、ＩＬ−７受容体エンドドメインを含んだ。成長のためにＩＬ−２シグナル伝達に依存するマウス細胞株ＣＴＬＬ２を用いて、ＩＬ−２シグナル伝達を試験した。ポジティブコントロールとして、ＣＴＬＬ２細胞を１００ｕ／ｍＬのマウスＩＬ２とともに培養した。ＩＬ２受容体エンドドメイン（Ｆａｂ＿ＩＬ２エンド）を含むキメラ膜貫通タンパク質を発現する細胞は、ＣＴＬＬ２細胞の生存および成長を支持したのに対して、ＩＬ−７受容体を含むキメラ膜貫通タンパク質（Ｆａｂ＿ＩＬ７エンド）を発現する細胞は、支持しなかった。
【００２３】
【図７】ＰＳＡキメラサイトカイン受容体のパネルを図示している模式図。ＰＳＡを標的にしているキメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）のパネルを、異なるＰＳＡエピトープに結合する２つの抗体：５Ｄ５Ａ５および５Ｄ３Ｄ１１に由来するｓｃＦｖを用いて開発した。左上のパネル：ＩＬ２Ｒβ鎖を有する鎖上にＡ５および共通γ鎖を有する鎖上にＤ１１を有するＩＬ−２Ｒエンドドメインを有するＣＣＲ；右上のパネル：ＩＬ７Ｒα鎖を有する鎖上にＡ５および共通γ鎖を有する鎖上にＤ１１を有するＩＬ７Ｒエンドドメインを有するＣＣＲ；左下のパネル：ＩＬ２Ｒβ鎖を有する鎖上にＤ１１および共通γ鎖を有する鎖上にＡ５を有するＩＬ−２Ｒエンドドメインを有するＣＣＲ；および右下のパネル：ＩＬ７Ｒα鎖を有する鎖上にＤ１１および共通γ鎖を有する鎖上にＡ５を有するＩＬ−７Ｒエンドドメインを有するＣＣＲ。各ＣＣＲに対してネガティブコントロールも作製し、そのネガティブコントロールでは、ＩＬ２Ｒγ鎖を堅いリンカーで置換した。
【００２４】
【図８−１】ＰＳＡの存在下におけるＰＳＡキメラサイトカイン受容体を発現する細胞からのＩＬ２シグナル伝達−ＣＴＬＬ２増殖。ＣＴＬＬ２細胞に、図７に図示されたＰＳＡキメラサイトカイン受容体のいくつかを発現する構築物を形質導入した。細胞を、ＩＬ２（ポジティブコントロール）の存在下または非存在下（ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｂｓｅｎｃｅ）において、および５ｎｇ／ｍＬまたは５μｇ／ｍＬのＰＳＡの存在下または非存在下において培養した。ＣＴＬＬ２の増殖を３および７日後に評価した。ＩＬ２Ｒエンドドメインを有する抗ＰＳＡキメラサイトカイン受容体は、ＩＬ２の非存在下およびＰＳＡの存在下においてＣＴＬＬ２細胞の増殖を支持したが、ＩＬ７Ｒエンドドメインを有する受容体、または共通γ鎖の代わりに堅いリンカーを含む任意のＣＣＲは、支持しなかった。
【図８−２】ＰＳＡの存在下におけるＰＳＡキメラサイトカイン受容体を発現する細胞からのＩＬ２シグナル伝達−ＣＴＬＬ２増殖。ＣＴＬＬ２細胞に、図７に図示されたＰＳＡキメラサイトカイン受容体のいくつかを発現する構築物を形質導入した。細胞を、ＩＬ２（ポジティブコントロール）の存在下または非存在下（ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｂｓｅｎｃｅ）において、および５ｎｇ／ｍＬまたは５μｇ／ｍＬのＰＳＡの存在下または非存在下において培養した。ＣＴＬＬ２の増殖を３および７日後に評価した。ＩＬ２Ｒエンドドメインを有する抗ＰＳＡキメラサイトカイン受容体は、ＩＬ２の非存在下およびＰＳＡの存在下においてＣＴＬＬ２細胞の増殖を支持したが、ＩＬ７Ｒエンドドメインを有する受容体、または共通γ鎖の代わりに堅いリンカーを含む任意のＣＣＲは、支持しなかった。
【００２５】
【図９】ＰＳＡの存在下におけるＰＳＡキメラサイトカイン受容体を発現する細胞からのＩＬ２シグナル伝達−ＣＴＬＬ２  ＳＴＡＴ５リン酸化。ＣＴＬＬ２細胞を形質導入せずに放置した（ＷＴ）か；またはＣＴＬＬ２細胞に、ＰＳＡに対するＣＣＲを発現するベクター（Ｄ１１−ＣＤ８ＳＴＫ−ＩＬ２Ｒｇ＿Ａ５−ヒンジ−ＩＬ２Ｒｂ）または共通γ鎖の代わりに堅いリンカーを有する等価な構築物（Ｄ１１−ＣＤ８ＳＴＫ−ＲＬ＿Ａ５−ヒンジ−ＩＬ２Ｒｂ）を形質導入した。細胞を、５００μＭの過バナジン酸または５００ｎｇ／ｍＬのＰＳＡとともに１または４時間インキュベートした。次いで、ＳＴＡＴ５のＹ６９４のリン酸化を、ホスホフロー（ｐｈｏｓｐｈｏｆｌｏｗ）を用いて調査した。  本発明の態様の要旨
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明者らは、非サイトカイン結合分子の結合特異性をサイトカイン受容体のエンドドメインに移植した「キメラサイトカイン受容体」（ＣＣＲ）を開発した。そのようなＣＣＲとキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）との共発現は、ＣＡＲ  Ｔ細胞が、厳しい腫瘍微小環境に生着し、拡大するのを助ける。存在するべきＣＣＲに対するリガンドならびにＣＡＲに対するリガンドに対する要件は、別の層の選択性を追加し、オンターゲットオフ腫瘍毒性の防止に役立つ。
【００２７】
例えば、本発明者らは、ＰＳＡを検出してＩＬ２／１５またはＩＬ７シグナルをＣＡＲ
Ｔ細胞に伝達するキメラサイトカイン受容体とＣＡＲとを共発現する細胞を開発した。このように、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、前立腺がんの微小環境でのみ選択的に増殖するように刺激され、ＰＳＡの非存在下（すなわち、患者が緩解状態になった後）では、サイトカイン刺激は失われる。
【００２８】
第１の態様において、本発明は、
腫瘍分泌因子（ｔｕｍｏｕｒ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ）、ケモカインおよび細胞表面抗原から選択されるリガンドに結合するエキソドメイン；および
サイトカイン受容体エンドドメイン
を含むキメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）を提供する。
【００２９】
本発明の第１の態様の第１の実施形態において、キメラサイトカイン受容体は、２つのポリペプチド：
（ｉ）
（ａ）リガンドの第１のエピトープに結合する第１の抗原結合ドメイン
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第１の鎖
を含む第１のポリペプチド；および
（ｉｉ）
（ａ）リガンドの第２のエピトープに結合する第２の抗原結合ドメイン
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第２の鎖
を含む第２のポリペプチド
を含む。図２ｂは、そのような配置を図示している。
【００３０】
第１および第２の抗原結合ドメインの各々は、例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）または単一ドメインバインダーであり得る。
【００３１】
本発明の第１の態様の第２の実施形態において、キメラサイトカイン受容体は、２つのポリペプチド：
（ｉ）
（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第１の鎖
を含む第１のポリペプチド；および
（ｉｉ）
（ａ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第２の鎖
を含む第２のポリペプチド
を含む。
【００３２】
図２ｃは、そのような配置を図示している。
【００３３】
サイトカイン受容体エンドドメインについての第１の鎖と第２の鎖は、異なってもよく、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインのα、βおよびγ鎖から選択され得る。
【００３４】
あるいは、サイトカイン受容体エンドドメインについての第１の鎖と第２の鎖は、同じであってもよく、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインのα、βおよびγ鎖から選択され得る。
【００３５】
例えば、サイトカイン受容体エンドドメインは、
（ｉ）ＩＬ−２受容体のβ鎖エンドドメイン
（ｉｉ）ＩＬ−７受容体のα鎖エンドドメイン；
（ｉｉｉ）ＩＬ−１５受容体のα鎖エンドドメイン；または
（ｉｖ）共通γ鎖受容体エンドドメイン
を含み得る。
【００３６】
サイトカイン受容体エンドドメインは、（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）；および（ｉｖ）を含み得る。
【００３７】
リガンドは、腫瘍分泌因子、例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）およびＣＡ１２５から選択される腫瘍分泌因子であり得る。
【００３８】
リガンドは、ケモカイン、例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５およびＣＣＬ２２から選択されるケモカインから選択されるケモカインであり得る。
【００３９】
リガンドは、膜貫通タンパク質などの細胞表面分子であり得る。リガンドは、例えば、ＣＤ２２であり得る。
【００４０】
第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に記載のキメラサイトカイン受容体を含む細胞を提供する。
【００４１】
その細胞は、同じリガンド上の異なるエピトープに結合する、第１のキメラサイトカイン受容体および第２のキメラサイトカイン受容体を含み得る。
【００４２】
その細胞は、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインのα鎖またはβ鎖を含む第１のキメラサイトカイン受容体、およびＩ型サイトカイン受容体エンドドメインのγ鎖を含む第２のキメラサイトカイン受容体を含み得、その結果、第１のキメラサイトカイン受容体および第２のサイトカイン受容体がリガンドに結合したとき、α／β鎖およびγ鎖を介して、組み合わされたシグナル伝達が生じる。
【００４３】
その細胞は、キメラ抗原受容体、例えば、腫瘍関連細胞表面抗原に結合するキメラ抗原受容体も含み得る。
【００４４】
キメラ抗原受容体は、前立腺がんに関連する細胞表面抗原（例えば、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）または前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ））に結合し得る。
【００４５】
ＣＣＲが、細胞表面抗原を認識する場合、そのＣＣＲおよびＣＡＲは、同じ標的（例えば、腫瘍）細胞上に共発現された細胞表面抗原を認識し得る。例えば、Ｂ細胞悪性疾患の場合、ＣＡＲは、ＣＤ１９などの細胞表面抗原を認識し得、ＣＣＲは、標的細胞表面上に共発現された分子（例えば、ＣＤ２２）を認識することにより、生着が高まり得る。
【００４６】
第３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に記載のキメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）をコードする核酸配列を提供する。
【００４７】
第４の態様において、本発明は、第１のＣＣＲをコードする第１の核酸配列および第２のＣＣＲをコードする第２の核酸配列を含む核酸構築物を提供し、その核酸構築物は、構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−エンド１−ｃｏｅｘｐｒ−ＡｂＢ２−スペーサー２−ＴＭ２−エンド２
（ここで、
ＡｇＢ１は、第１のＣＣＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、第１のＣＣＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のＣＣＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、第１のＣＣＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、両ＣＣＲの共発現を可能にする核酸配列であり、
ＡｇＢ２は、第２のＣＣＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、第２のＣＣＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のＣＣＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド２は、第２のＣＣＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有する。
この核酸構築物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）もコードし得る。この実施形態において、核酸構築物は、構造：
（ｉ）ＣＣＲＡｇＢ１−ＣＣＲスペーサー１−ＣＣＲＴＭ１−ＣＣＲエンド１−ｃｏｅｘｐｒ１−ＣＣＲＡｇＢ２−ＣＣＲスペーサー２−ＣＣＲＴＭ２−ＣＣＲエンド２−ｃｏｅｘｐｒ２−ＣＡＲＡｇＢ−ＣＡＲスペーサー−ＣＡＲＴＭ−ＣＡＲエンド；
（ｉｉ）ＣＣＲＡｇＢ１−ＣＣＲスペーサー１−ＣＣＲＴＭ１−ＣＣＲエンド１−ｃｏｅｘｐｒ１−ＣＡＲＡｇＢ−ＣＡＲスペーサー−ＣＡＲＴＭ−ＣＡＲエンド−ｃｏｅｘｐｒ２−ＣＣＲＡｇＢ２−ＣＣＲスペーサー２−ＣＣＲＴＭ２−ＣＣＲエンド２；または
（ｉｉｉ）ＣＡＲＡｇＢ−ＣＡＲスペーサー−ＣＡＲＴＭ−ＣＡＲエンド−ｃｏｅｘｐｒ１−ＣＣＲＡｇＢ１−ＣＣＲスペーサー１−ＣＣＲＴＭ１−ＣＣＲエンド１−ｃｏｅｘｐｒ２−ＣＣＲＡｇＢ２−ＣＣＲスペーサー２−ＣＣＲＴＭ２−ＣＣＲエンド２；
（ここで、
ＣＣＲＡｇＢ１は、第１のＣＣＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＣＲスペーサー１は、第１のＣＣＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＣＣＲＴＭ１は、第１のＣＣＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＣＲエンド１は、第１のＣＣＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＣＲＡｇＢ２は、第２のＣＣＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＣＲスペーサー２は、第２のＣＣＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＣＣＲＴＭ２は、第２のＣＣＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＣＲエンド２は、第２のＣＣＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
Ｃｏｅｘｐｒ１およびｃｏｅｘｐｒ２は、隣接する２つの配列の共発現を可能にする核酸配列であり；
ＣＡＲＡｇＢは、ＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＡＲスペーサーは、ＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＣＡＲＴＭは、ＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＡＲエンドは、ＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有し得る。
【００４８】
配列ｃｏｅｘｐｒ、ｃｏｅｘｐｒ１、ｃｏｅｘｐｒ２のいずれかまたはすべてが、自己切断性ペプチドを含む配列をコードし得る。
【００４９】
相同組換えを回避するために、代替的コドンが、同一または類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域で使用され得る。
【００５０】
第４の態様において、本発明は、本発明の第４の態様に記載の核酸構築物を含むベクターを提供する。
【００５１】
そのベクターは、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾンであり得る。
【００５２】
第６の態様において、本発明は、
ｉ）本発明の第１の態様に記載の第１のＣＣＲをコードする核酸配列を含むベクター；および
ｉｉ）本発明の第２の態様に記載の第２のＣＣＲをコードする核酸配列を含むベクター
を含むキットを提供する。
【００５３】
そのキットは、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含むベクターも含み得る。
【００５４】
上記キットは、
ｉ）本発明の第１の態様に記載のＣＣＲをコードする核酸配列を含むベクター；および
ｉｉ）キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含むベクター
を含み得る。
【００５５】
第７の態様において、本発明は、本発明の第２の態様に記載の細胞を作製するための方法を提供し、その方法は、本発明の第３の態様に記載の核酸配列；本発明の第４の態様に記載の核酸構築物；本発明の第５の態様に記載のベクター；または本発明の第６の態様に記載のベクターのキットを細胞に導入する工程を含む。
【００５６】
細胞は、被験体から単離された試料由来であり得る。
【００５７】
第８の態様において、本発明の第２の態様に記載の複数の細胞を含む医薬組成物が提供される。
【００５８】
第９の態様において、疾患を処置および／または予防するための方法が提供され、その方法は、本発明の第８の態様に記載の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む。
【００５９】
上記方法は、以下の工程：
（ｉ）被験体からの細胞含有試料の単離；
（ｉｉ）本発明の第３の態様に記載の核酸配列；本発明の第４の態様に記載の核酸構築物；本発明の第５の態様に記載のベクター；または本発明の第６の態様に記載のベクターのキットでの細胞の形質導入またはトランスフェクション；および
（ｉｉｉ）その被験体に（ｉｉ）からの細胞を投与すること
を含み得る。
【００６０】
上記試料は、Ｔ細胞含有試料であり得る。
【００６１】
上記疾患は、がんであり得る。
【００６２】
疾患の処置および／または予防において使用するための本発明の第８の態様に記載の医薬組成物も提供される。
【００６３】
疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における本発明の第２の態様に記載の細胞の使用も提供される。
【００６４】
本発明のさらなる態様は、以下の番号が付けられたパラグラフに要約される：
【００６５】
１．二量体化ドメイン；および
サイトカイン受容体エンドドメイン
を含むキメラ膜貫通タンパク質。
【００６６】
２．二量体化ドメインが、重鎖定常ドメイン（ＣＨ）および軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）の二量体化部分を含む、パラグラフ１に記載のキメラ膜貫通タンパク質。
【００６７】
３．２つのポリペプチド：
（ｉ）
（ａ）第１の二量体化ドメイン；および
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第１の鎖
を含む第１のポリペプチド；および
（ｉｉ）
（ａ）第１の二量体化ドメインと二量体化する第２の二量体化ドメイン；および
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第２の鎖
を含む第２のポリペプチド
を含む、前述のいずれかのパラグラフに記載のキメラ膜貫通タンパク質。
【００６８】
４．第１および第２の二量体化ドメインが、自発的に、または二量体化化学誘導物質（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｄｕｃｅｒ  ｏｆ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）（ＣＩＤ）の存在下において、二量体化する、パラグラフ３に記載のキメラ膜貫通タンパク質。
【００６９】
５．２つのポリペプチド：
（ｉ）
（ａ）重鎖定常ドメイン（ＣＨ）
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第１の鎖
を含む第１のポリペプチド；および
（ｉｉ）
（ａ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第２の鎖
を含む第２のポリペプチド
を含む、パラグラフ２、３または４に記載のキメラ膜貫通タンパク質。
【００７０】
６．サイトカイン受容体エンドドメインに対する第１の鎖と第２の鎖が、異なり、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインのα、βおよびγ鎖から選択される、パラグラフ５に記載のキメラ膜貫通タンパク質。
【００７１】
７．サイトカイン受容体エンドドメインに対する第１の鎖と第２の鎖が、同じであり、Ｉ型サイトカイン受容体エンドドメインのα、βおよびγ鎖から選択される、パラグラフ５に記載のキメラ膜貫通タンパク質。
【００７２】
８．サイトカイン受容体エンドドメインが、
（ｉ）ＩＬ−２受容体のβ鎖エンドドメイン
（ｉｉ）ＩＬ−７受容体のα鎖エンドドメイン；または
（ｉｉｉ）ＩＬ−１５受容体のα鎖エンドドメイン；および／または
（ｉｖ）共通γ鎖受容体エンドドメイン
を含む、前述のいずれかのパラグラフに記載のキメラ膜貫通タンパク質。
【００７３】
９．第１のポリペプチドが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および重鎖定常ドメイン（ＣＨ）を含み；第２のポリペプチドが、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含む、パラグラフ５に記載のキメラ膜貫通タンパク質。
【００７４】
１０．Ｆａｂエキソドメインを含む、パラグラフ９に記載のキメラ膜貫通タンパク質。
【００７５】
１１．前述のいずれかのパラグラフに記載のキメラ膜貫通タンパク質を含む細胞。
【００７６】
１２．キメラ抗原受容体も含む、パラグラフ１１に記載の細胞。
【００７７】
１３．キメラ抗原受容体が、腫瘍関連細胞表面抗原に結合する、パラグラフ１２に記載の細胞。
【００７８】
１４．パラグラフ１〜１０のいずれかに記載のキメラ膜貫通タンパク質をコードする核酸配列。
【００７９】
１５．パラグラフ３において定義されたような第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列およびパラグラフ３において定義されたような第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列を含む核酸構築物であって、この核酸構築物は、構造：
Ｄｉｍ１−ＴＭ１−エンド１−ｃｏｅｘｐｒ−Ｄｉｍ２−ＴＭ２−エンド２
（ここで、
Ｄｉｍ１は、第１の二量体化ドメインをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のポリペプチドの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、第１のポリペプチドのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、両ＣＣＲの共発現を可能にする核酸配列であり、
Ｄｉｍ２は、第２の二量体化ドメインをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のポリペプチドの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド２は、第２のポリペプチドのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有する。
【００８０】
１６．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）もコードする、パラグラフ１５に記載の核酸構築物。
【００８１】
１７．ｃｏｅｘｐｒが、自己切断性ペプチドを含む配列をコードする、パラグラフ１５または１６に記載の核酸構築物。
【００８２】
１８．相同組換えを回避するために、代替的コドンが、同一または類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域で使用される、パラグラフ１５〜１７のいずれかに記載の核酸構築物。
【００８３】
１９．パラグラフ１５〜１８のいずれかに記載の核酸構築物を含むベクター。
【００８４】
２０．パラグラフ１９に記載の、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾン。
【００８５】
２１．
ｉ）パラグラフ３において定義されたような第１のポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクター；および
ｉｉ）パラグラフ３において定義されたような第２のポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクター
を含む、キット。
【００８６】
２２．キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含むベクターも含む、パラグラフ２１に記載のキット。
【００８７】
２３．
ｉ）パラグラフ１〜１０のいずれかにおいて定義されたようなキメラ膜貫通タンパク質（ｐｒｏｅｔｉｎ）をコードする核酸配列を含むベクター；および
ｉｉ）キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含むベクターを含む、キット。
【００８８】
２４．パラグラフ１１〜１３のいずれかに記載の細胞を作製するための方法であって、この方法は、パラグラフ１４に記載の核酸配列；パラグラフ１５〜１８のいずれかに記載の核酸構築物；パラグラフ１９もしくは２０に記載のベクター；またはパラグラフ２１〜２３のいずれかに記載のベクターのキットを細胞に導入する工程を含む、方法。
【００８９】
２５．細胞が、被験体から単離された試料に由来する、パラグラフ２４に記載の方法。
【００９０】
２６．パラグラフ１１〜１３のいずれかに記載の複数の細胞を含む、医薬組成物。
【００９１】
２７．疾患を処置および／または予防するための方法であって、この方法は、パラグラフ２６に記載の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、方法。
【００９２】
２８．以下の工程：
（ｉ）被験体からの細胞含有試料の単離；
（ｉｉ）パラグラフ１４に記載の核酸配列；パラグラフ１５〜１８のいずれかに記載の核酸構築物；パラグラフ１９もしくは２０に記載のベクター；またはパラグラフ２１〜２３のいずれかに記載のベクターのキットでの細胞の形質導入またはトランスフェクション；および
（ｉｉｉ）その被験体に（ｉｉ）からの細胞を投与すること
を含む、請求項２７に記載の方法。
【００９３】
２９．前記試料が、Ｔ細胞含有試料である、パラグラフ２８に記載の方法。
【００９４】
３０．前記疾患が、がんである、パラグラフ２８または２９に記載の方法。
【００９５】
３１．疾患の処置および／または予防において使用するための、パラグラフ２６に記載の医薬組成物。
【００９６】
３２．疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における、パラグラフ１１〜１３のいずれかに記載の細胞の使用。
詳細な説明
キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）
【００９７】
キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）は、サイトカイン受容体エンドドメインおよび異種リガンド結合エキソドメインを含む分子である。その異種エキソドメインは、エンドドメインが由来したサイトカイン受容体に対して選択的であるサイトカイン以外のリガンドに結合する。このように、異種結合特異性に移植することによって、サイトカイン受容体のリガンド特異性を変更することが可能である。
【００９８】
キメラサイトカイン受容体は、
（ｉ）リガンド結合エキソドメイン；
（ｉｉ）任意選択のスペーサー；
（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン；および
（ｉｖ）サイトカイン受容体エンドドメイン
を含む。
サイトカイン受容体およびシグナル伝達
【００９９】
多くの細胞の機能が、サイトカイン受容体スーパーファミリーのメンバーによって制御される。これらの受容体によるシグナル伝達は、これらの受容体とＪａｎｕｓキナーゼ（ＪＡＫ）との会合に依存する。Ｊａｎｕｓキナーゼは、リガンドの結合と、受容体複合体にリクルートされたシグナル伝達タンパク質のチロシンリン酸化とをつなぐ。これらには、サイトカイン応答の多様性に寄与する転写因子のファミリーであるシグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）が含まれる。
【０１００】
本発明のキメラサイトカイン受容体は、そのリガンドに結合すると、以下の細胞内シグナル伝達経路のうちの１つまたはそれを超える経路が惹起され得る：
（ｉ）ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路
（ｉｉ）ＭＡＰキナーゼ経路；および
（ｉｉｉ）ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路。
【０１０１】
ＪＡＫ−ＳＴＡＴ系は、３つの主要な構成要素：（１）受容体（２）Ｊａｎｕｓキナーゼ（ＪＡＫ）および（３）シグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）からなる。
【０１０２】
ＪＡＫは、チロシンキナーゼ活性を有し、細胞表面のサイトカイン受容体に結合する。リガンドとこの受容体との結合は、ＪＡＫの活性化を誘発する。ＪＡＫは、キナーゼ活性が高まると、受容体上のチロシン残基をリン酸化し、ホスホチロシンに結合するＳＨ２ドメインを含むタンパク質との相互作用のための部位を作り出す。これらのホスホチロシン残基に結合することができるＳＨ２ドメインを有するＳＴＡＴは、受容体にリクルートされ、それら自体が、ＪＡＫによってチロシンをリン酸化される。次いで、これらのホスホチロシンは、他のＳＴＡＴのＳＨ２ドメインに対する結合部位として作用し、それらの二量体化を媒介する。種々のＳＴＡＴが、ヘテロまたはホモ二量体を形成する。活性化されたＳＴＡＴ二量体は、細胞核に蓄積し、それらの標的遺伝子の転写を活性化する。
サイトカイン受容体エンドドメイン
【０１０３】
本発明のキメラサイトカイン受容体は、エキソドメインがそのリガンドに結合したとき、「サイトカイン型」の細胞シグナル伝達を（単独で、または別のキメラサイトカイン受容体の存在下において）引き起こすエンドドメインを含む。
【０１０４】
エンドドメインは、サイトカイン受容体エンドドメインであり得る。
【０１０５】
エンドドメインは、Ｉ型サイトカイン受容体に由来し得る。Ｉ型サイトカイン受容体は、細胞膜に隣接する細胞外の部分において、共通のアミノ酸モチーフ（ＷＳＸＷＳ）を共有する。
【０１０６】
エンドドメインは、ＩＩ型サイトカイン受容体に由来し得る。ＩＩ型サイトカイン受容体には、Ｉ型およびＩＩ型インターフェロンに結合するもの、ならびにインターロイキン−１０ファミリーのメンバー（インターロイキン−１０、インターロイキン−２０およびインターロイキン−２２）に結合するものが含まれる。
【０１０７】
Ｉ型サイトカイン受容体には、
（ｉ）インターロイキン受容体（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３およびＩＬ−２７に対する受容体）；
（ｉｉ）コロニー刺激因子受容体（例えば、エリトロポイエチン、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦに対する受容体）；および
（ｉｉｉ）ホルモン受容体／神経ペプチド受容体（例えば、ホルモン受容体およびプロラクチン受容体）
が含まれる。
【０１０８】
Ｉ型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーは、異なる鎖を含み、それらのうちのいくつかは、リガンド／サイトカイン相互作用に関わり、その他は、シグナル伝達に関わる。例えば、ＩＬ−２受容体は、α鎖、β鎖およびγ鎖を含む。
【０１０９】
ＩＬ−２受容体の共通ガンマ鎖（ＣＤ１３２としても知られる）は、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−９受容体、ＩＬ−１３受容体およびＩＬ−１５受容体の間で共有される。
ＩＬ−２
【０１１０】
ＩＬ−２は、α、βおよびγ「鎖」と称されることが多い３つの異なるタンパク質の異なる組み合わせによって生成される３つの形態を有するＩＬ−２受容体に結合する；これらのサブユニットは、他のサイトカインに対する受容体の一部でもある。ＩＬ−２Ｒのβおよびγ鎖は、Ｉ型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーである。
【０１１１】
これらの３本の受容体鎖は、様々な細胞型上に別々に異なって発現され、異なる組み合わせおよび順序で集合することにより、低親和性、中程度の親和性および高親和性のＩＬ−２受容体を生成し得る。
【０１１２】
α鎖は、低親和性でＩＬ−２に結合し、βおよびγの組み合わせは一体となって、主にメモリーＴ細胞上およびＮＫ細胞上で中程度の親和性でＩＬ−２に結合する複合体を形成し；３本すべての受容体鎖が、活性化Ｔ細胞上および制御性Ｔ細胞上で高親和性（Ｋｄ約１０〜１１Ｍ）でＩＬ−２に結合する複合体を形成する。
【０１１３】
これらの３本のＩＬ−２受容体鎖は、細胞膜にまたがり、細胞内に伸びることにより、細胞内部に生化学的シグナルを届ける。アルファ鎖は、シグナル伝達に関与せず、ベータ鎖は、チロシンホスファターゼＪＡＫ１と複合体を形成する。同様に、ガンマ鎖は、ＪＡＫ３と呼ばれる別のチロシンキナーゼと複合体を形成する。これらの酵素は、ＩＬ−２Ｒの外部ドメインに結合するＩＬ−２によって活性化される。
【０１１４】
ＩＬ−２のシグナル伝達は、初期のＴ細胞が抗原でも刺激されると、Ｔ細胞がエフェクターＴ細胞およびメモリーＴ細胞に分化するのを促進する。抗原によって選択されたＴ細胞クローンの数および機能の拡大に依存する、Ｔ細胞の免疫記憶の発生における役割を通じて、それらのＴ細胞クローンは、長期の細胞性免疫において鍵となる役割も果たす。
【０１１５】
本発明のキメラサイトカイン受容体は、ＩＬ−２受容体のβ鎖および／またはＩＬ−２受容体（すなわち共通）のγ鎖を含み得る。
【０１１６】
ＩＬ−２β鎖および共通γ鎖のエンドドメインに対するアミノ酸配列を配列番号１および２として示す。
配列番号１：ヒト共通ガンマ鎖に由来するエンドドメイン：
【化１】
2019150066.tif 000002
配列番号２：ヒトＩＬ−２Ｒβに由来するエンドドメイン：
【化２】
2019150066.tif 000003
【０１１７】
用語「〜に由来する」は、本発明のキメラサイトカイン受容体のエンドドメインが、内在性分子の野生型配列と同じ配列、またはＪＡＫ−１もしくはＪＡＫ−３と複合体を形成する能力および上で述べたシグナル伝達経路のうちの１つを活性化する能力を保持するその変異型を有することを意味する。
【０１１８】
変異型配列が、野生型配列の機能、すなわちＪＡＫ−１またはＪＡＫ−３と複合体を形成する能力、および例えば、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化する能力を保持する限り、「変異型」配列は、野生型配列（例えば、配列番号１または２）と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する。
【０１１９】
２つのポリペプチド配列間のパーセンテージ同一性は、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで自由に利用可能なＢＬＡＳＴなどのプログラムによって容易に測定され得る。
ＩＬ−７
【０１２０】
インターロイキン−７受容体は、２本の鎖：インターロイキン−７受容体−α鎖（ＣＤ１２７）および共通γ鎖受容体（ＣＤ１３２）で構成されている。この共通γ鎖受容体は、インターロイキン−２、−４、−９および−１５をはじめとした様々なサイトカインと共有される。インターロイキン−７受容体は、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞をはじめとした様々な細胞型上で発現される。
【０１２１】
インターロイキン−７受容体は、リンパ球の発達、特に、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えにおいて極めて重要な役割を果たす。ＩＬ−７Ｒは、ＳＴＡＴ５およびヒストンアセチル化によって、Ｔ細胞受容体ガンマ遺伝子を含むゲノム領域の接近可能性もコントロールする。マウスでのノックアウト研究から、アポトーシスの阻止は、Ｔリンパ球の分化および活性化におけるこのタンパク質の必須の機能であることが示唆された。
【０１２２】
本発明のキメラサイトカイン受容体は、ＩＬ−７受容体のα鎖および／もしくはＩＬ−７受容体（すなわち共通）のγ鎖、またはその変異型を含み得る。
【０１２３】
ＩＬ−７のα鎖のエンドドメインに対するアミノ酸配列を配列番号３として示す。
配列番号３−ヒトＩＬ−７Ｒαに由来するエンドドメイン：
【化３】
2019150066.tif 000004
【化４】
2019150066.tif 000005
ＩＬ−１５
【０１２４】
インターロイキン１５（ＩＬ−１５）は、ＩＬ−２と構造的類似性を有するサイトカインである。ＩＬ−２と同様に、ＩＬ−１５は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５受容体ベータ鎖（ＣＤ１２２）および共通ガンマ鎖（ガンマ−Ｃ、ＣＤ１３２）から構成される複合体に結合し、その複合体を通じてシグナル伝達する。ＩＬ−１５は、ウイルス感染後に単核食細胞（およびいくつかの他の細胞）によって分泌される。ＩＬ−１５は、ナチュラルキラー細胞の細胞増殖を誘導する。
【０１２５】
インターロイキン−１５受容体は、インターロイキン１５受容体アルファサブユニットからなり、共通のベータおよびガンマサブユニットをＩＬ−２受容体と共有する。
スペーサー
【０１２６】
本発明のキメラサイトカイン受容体は、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと接続し、抗原結合ドメインをエンドドメインと空間的に分離する、スペーサーを含み得る。フレキシブルスペーサーは、抗原結合ドメインが、抗原結合を可能にする種々の方向に向くことを可能にする。
【０１２７】
本発明の細胞が、２つまたはそれを超えるキメラサイトカイン受容体を含む場合、スペーサーは、同じであっても異なってもよい。本発明の細胞が、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む場合、そのＣＣＲおよびＣＡＲのスペーサーは、異なってもよく、例えば、異なる長さを有し得る。ＣＡＲのスペーサーは、各ＣＣＲのスペーサーより長い場合がある。
【０１２８】
スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークを含み得る。リンカーは、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークと類似の長さおよび／またはドメインスペーシング特性を有する代替的リンカー配列を二者択一的に含み得る。
【０１２９】
ヒトＩｇＧ１スペーサーは、Ｆｃ結合モチーフを除去するように変更され得る。
【０１３０】
これらのスペーサーに対するアミノ酸配列の例を下記に示す：
配列番号４（ヒトＩｇＧ１のヒンジ−ＣＨ２ＣＨ３）
【化５】
2019150066.tif 000006
配列番号５（ヒトＣＤ８ストーク）：
【化６】
2019150066.tif 000007
配列番号６（ヒトＩｇＧ１ヒンジ）：
【化７】
2019150066.tif 000008
膜貫通ドメイン
【０１３１】
膜貫通ドメインは、膜にまたがるＣＣＲの配列である。膜貫通ドメインは、疎水性アルファヘリックスを含み得る。膜貫通ドメインは、ＣＤ２８に由来し得、良好な受容体安定性をもたらす。
【０１３２】
あるいは、膜貫通ドメインは、サイトカイン受容体、例えば、エンドドメインが由来するサイトカインと同じサイトカインに由来し得る。
【０１３３】
膜貫通ドメインは、例えば、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−７ＲまたはＩＬ−１５Ｒに由来し得る。配列番号７−ヒト共通ガンマ鎖に由来する膜貫通：
【化８】
2019150066.tif 000009
配列番号８−ヒトＩＬ−２Ｒβに由来する膜貫通：
【化９】
2019150066.tif 000010
配列番号９−ヒトＩＬ−７Ｒαに由来する膜貫通：
【化１０】
2019150066.tif 000011
配列番号１０−ヒトＩＬ−１５Ｒαに由来する膜貫通：
【化１１】
2019150066.tif 000012
リガンド結合エキソドメイン
【０１３４】
リガンド結合ドメインは、抗原結合ドメインを含む。抗原結合ドメインは、ＣＣＲに対する標的リガンド、すなわち、腫瘍分泌因子またはケモカインまたは細胞表面抗原に結合する。
【０１３５】
数多くの抗原結合ドメインが、当該分野で公知であり、それらとしては、抗体、抗体模倣物およびＴ細胞受容体の抗原結合部位に基づくものが挙げられる。例えば、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）；標的抗原の天然受容体由来の結合ドメイン；標的リガンドに対して十分な親和性を有するペプチド；単一ドメインバインダー（例えば、ラクダ科動物のもの）；人工単一バインダー（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｂｉｎｄｅｒ  ｓｉｎｇｌｅ）（例えば、Ｄａｒｐｉｎ）；またはＴ細胞受容体に由来する一本鎖を含み得る。
【０１３６】
用語「リガンド」は、ＣＣＲの抗原結合ドメインによって特異的に認識および結合される実体を意味する「抗原」の同意語として使用される。
【０１３７】
リガンドが、腫瘍分泌因子である場合、抗原結合ドメインは、免疫グロブリンベースの抗原結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたは単一ドメインバインダー）を含み得る。
【０１３８】
リガンドが、ケモカインである場合、抗原結合ドメインは、そのケモカインに対する天然の受容体のケモカイン結合部分を含み得る。
リガンド
【０１３９】
本発明のＣＣＲは、リガンドに結合する。
【０１４０】
そのリガンドは、可溶性リガンド（例えば、腫瘍分泌因子またはケモカイン）であり得る。
【０１４１】
あるいは、そのリガンドは、膜結合型リガンド（例えば、細胞表面抗原）であり得る。
【０１４２】
用語「可溶性リガンド」は、細胞の一部ではないかまたは細胞に付着しておらず、細胞外空間で、例えば、目的の組織の体液中で自由に動くリガンドまたは抗原を表すために使用される。可溶性リガンドは、個体の血清、血漿または他の体液中において無細胞の状態で存在し得る。
【０１４３】
可溶性リガンドは、がんなどの特定の疾患の存在または病理に関連し得る。
【０１４４】
可溶性リガンドは、がんセクレトーム（ｃａｎｃｅｒ  ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）、すなわち腫瘍によって分泌される因子のコレクションの一部であり得、がん幹細胞、非幹細胞または周囲のストローマ由来であり得る。可溶性リガンドは、腫瘍細胞によって分泌または脱落され得る（次の項を参照のこと）。
【０１４５】
可溶性リガンドは、疾患または罹患組織に特徴的であり得る。可溶性リガンドは、疾患を有する被験体にもっぱら見られ得るか、または健康な被験体と比べて疾患を有する被験体において；もしくは健康な組織と比べて罹患組織においてより高いレベルで見られ得る。可溶性リガンドは、健康な被験体と比べて疾患を有する被験体において；または健康な組織と比べて罹患組織において、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍または１００，０００倍高いレベルで発現され得る。
【０１４６】
用語「細胞表面抗原」および「細胞表面リガンド」は、細胞表面に付着されているかまたは細胞表面上に発現されるリガンドを意味する「膜結合型抗原」および「膜結合型リガンド」の同意語として使用される。細胞表面リガンドは、例えば、膜貫通タンパク質であり得る。
【０１４７】
細胞表面リガンドが見られる細胞は、がん細胞などの標的細胞であり得る。
【０１４８】
細胞表面リガンドは、がんなどの特定の疾患の存在または病理に関連し得る。あるいは、細胞表面リガンドは、必ずしも病的状態に関連することなく、標的細胞（例えば、Ｂ細胞）の細胞型に特徴的であり得る。
【０１４９】
細胞表面リガンドが、疾患または罹患組織に特徴的である場合、その細胞表面リガンドは、疾患を有する被験体の関連する細胞上にもっぱら見られ得るか、または健康な被験体と比べて疾患を有する被験体の関連する細胞上において；もしくは健康な組織と比べて罹患組織の関連する細胞上においてより高いレベルで見られ得る。細胞表面リガンドは、健康な被験体と比べて疾患を有する被験体の細胞上において；または健康な組織と比べて罹患組織において、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍または１００，０００倍高いレベルで発現され得る。
腫瘍分泌因子
【０１５０】
ＣＣＲによって認識されるリガンドは、腫瘍によって分泌されたまたは腫瘍から脱落した可溶性リガンドであり得る。
【０１５１】
この「腫瘍分泌因子」は、例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）またはがん抗原−１２５（ＣＡ−１２５）であり得る。
【０１５２】
腫瘍分泌因子は、サイトカインではない可溶性リガンドであり得る。ゆえに、本発明のＣＣＲは、非サイトカインリガンドに対する結合特異性をサイトカイン受容体のエンドドメイン上に移植している。
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）
【０１５３】
可溶性リガンドは、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）であり得る。
【０１５４】
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は、ガンマ−セミノプロテインまたはカリクレイン−３（ＫＬＫ３）としても知られ、ヒトにおいてＫＬＫ３遺伝子によってコードされる糖タンパク質酵素である。ＰＳＡは、カリクレイン関連ペプチダーゼファミリーのメンバーであり、前立腺の上皮細胞によって分泌される。
【０１５５】
ＰＳＡは、健康な前立腺を有する男性の血清中に少量で存在するが、前立腺がんおよび他の前立腺障害を有する個体では増加している。
【０１５６】
ＰＳＡは、２３７残基の糖タンパク質であり、ＫＬＫ２によって活性化される。その生理学的役割は、精液の凝塊成分の液化であり、精子の遊離をもたらす。がんでは、ＰＳＡは、新生物の成長および転移のプロセスに関与し得る。
【０１５７】
ＰＳＡは、典型的なＨｉｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ三連構造、および他のカリクレイン関連ペプチダーゼの触媒ドメインに類似の触媒ドメインを有するキモトリプシン様セリンプロテアーゼである。ＰＳＡの結晶構造は、ｉ）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）８Ｇ８Ｆ５との複合体として、およびｉｉ）２つのｍＡｂである５Ｄ５Ａ５および５Ｄ３Ｄ１１とのサンドイッチ複合体（Ｓｔｕｒａら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１１）４１４：５３０−５４４）として、得られた。
【０１５８】
様々なモノクローナル抗体が知られており、それらとしては、Ｂａｖａｔら、Ａｖｉｃｅｎｎａ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５，７：２−７；およびＬｅｉｎｏｎｅｎ（２００４）２８９：１５７−６７に記載されているクローン２Ｇ２−Ｂ２、２Ｄ８−Ｅ８、ＩｇＧ１／Ｋが挙げられる。
【０１５９】
本発明のＣＣＲは、例えば、ＰＳＡに結合するｍＡｂ（例えば、８Ｇ８Ｆ５、５Ｄ５Ａ５または５Ｄ３Ｄ１１）由来の６つのＣＤＲまたはＶＨおよび／もしくはＶＬドメインを含み得る。
【０１６０】
ＣＣＲが、ＰＳＡ上の異なるエピトープに結合する２つの抗原結合特異性を含む場合、一方は、例えば、５Ｄ３Ｄ１１に基づき（ｂｓｅｄ）得、もう一方は、例えば、５Ｄ５Ａ５に基づき得る。
【０１６１】
５Ｄ３Ｄ１１および５Ｄ５Ａ５のＶＨおよびＶＬに対するアミノ酸配列を下記に示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）を太字で強調している。
【化１２】
2019150066.tif 000013
【化１３】
2019150066.tif 000014
【０１６２】
細胞が、２つのＣＣＲを含む場合、第１のＣＣＲの抗原結合ドメインは、５Ｄ５Ａ５由来の６つのＣＤＲを含み得、第２のＣＣＲの抗原結合ドメインは、５Ｄ３Ｄ１１由来の６つのＣＤＲを含み得る。
【０１６３】
第１のＣＣＲの抗原結合ドメインは、５Ｄ５Ａ５またはその変異型由来のＶＨおよび／またはＶＬドメインを含み得；第２のＣＣＲの抗原結合ドメインは、５Ｄ３Ｄ１１またはその変異型由来のＶＨおよび／またはＶＬドメインを含み得る。変異型のＶＨおよびＶＬドメインは、上に示した配列と少なくとも８０、９０、９５または９９％の同一性を有し得るが、但し、ＰＳＡ結合活性を保持する。
【０１６４】
ＰＳＡに結合するＣＣＲを発現する細胞は、前立腺がんの処置において有用であり得る。
がん胎児抗原（ＣＥＡ）
【０１６５】
可溶性リガンドは、ＣＥＡであり得る。
【０１６６】
がん胎児抗原（ＣＥＡ）は、細胞接着に関わる高度に近縁の一連の糖タンパク質のことを表す。ＣＥＡは、正常には、胎児発生中の胃腸組織において産生されるが、その産生は、誕生前に停止する。ゆえに、ＣＥＡは、通常、健康な成人の血液中には非常に低いレベルでしか存在しない。しかしながら、いくつかのタイプのがんにおいてその血清レベルが上昇し、これは、それを臨床検査において腫瘍マーカーとして使用できることを意味する。
【０１６７】
ＣＥＡは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型の細胞表面糖タンパク質であり、その特殊なシアロフコシル化された（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  ｓｉａｌｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）グリコフォームは、結腸癌細胞の転移性播種にとって極めて重要であり得る機能的な結腸癌Ｌ−セレクチンおよびＥ−セレクチンリガンドとして働く。免疫学的には、それらは、ＣＤ６６表面抗原分類のメンバーとして特徴付けられる。
【０１６８】
ＣＥＡおよび関連遺伝子は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するＣＥＡファミリーを構成する。ヒトにおいて、がん胎児抗原ファミリーは、２９個の遺伝子からなり、そのうち１８個は、通常、発現されている。以下は、がん胎児抗原関連細胞接着タンパク質をコードするヒト遺伝子のリストである：ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＥＡＣＡＭ１８、ＣＥＡＣＡＭ１９、ＣＥＡＣＡＭ２０、ＣＥＡＣＡＭ２１。
【０１６９】
ＣＥＡを標的にする様々な抗体が、ＷＯ２０１１／０３４６６０に記載されている。
【０１７０】
ＣＥＡに対するＣＣＲを発現する細胞は、例えば、直腸結腸がんの処置において有用であり得る。
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）
【０１７１】
可溶性リガンドは、ＶＥＧＦであり得る。
【０１７２】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、細胞によって産生される、血管発生および血管新生を刺激するシグナルタンパク質である。血管内皮成長因子は、血液循環が不十分であるときに組織への酸素供給を回復させる系の一部である。ＶＥＧＦの血清濃度は、気管支喘息および真性糖尿病において高い。ＶＥＧＦの通常の機能は、胚発生中に新しい血管を作ること、損傷後に新しい血管を作ること、運動後に筋肉を作ること、および遮断された脈管を迂回する新しい脈管（側副血行路）を作ることである。
【０１７３】
ＶＥＧＦは、過剰発現されると、疾患に寄与し得る。固形がんは、十分な血液の供給がないと、限られたサイズを超えて成長できない；ＶＥＧＦを発現し得るがんは、成長でき、転移できる。
【０１７４】
ＶＥＧＦは、シスチン−ノット成長因子の血小板由来成長因子ファミリーのサブファミリーである。それらは、血管発生（胎児の循環器系のデノボ形成）と血管新生（既存の脈管構造からの血管の成長）の両方に関わる重要なシグナル伝達タンパク質である。
【０１７５】
ＶＥＧＦファミリーは、哺乳動物において５つのメンバーを含む：ＶＥＧＦ−Ａ、胎盤成長因子（ＰＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄ。
【０１７６】
ＶＥＧＦに対する様々な抗体（例えば、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）およびラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ））が知られている。
がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）
【０１７７】
ＣＡ−１２５は、卵巣がんに関連し、卵巣がんの検出のために最も高頻度で使用されるバイオマーカーである。ＣＡ−１２５は、卵巣がんに対するマーカーとして最もよく知られているが、子宮体がん、ファロピウス管がん、肺がん、乳がんおよび消化器がんをはじめとした他のがんでも増加していることがある。
【０１７８】
ヒトＣＡ−１２５（ムチン−１６としても知られる）の配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号０７８９６６から入手可能である。
【０１７９】
いくつかのＣＡ１２５結合モノクローナル抗体が知られており、それらとしては、ＯＣ１２５およびＭ１１が挙げられる（Ｎｕｓｔａｄら、１９９６，Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．１７：１９６−３２９）。この研究では、ＣＡ１２５抗原に対する２６個のモノクローナル抗体の特異性が調べられた。ＣＡ１２５抗原は、たった２つの主要な抗原性ドメインを有することが見出され、それらの抗原性ドメインは、抗体をＯＣ１２５様（群Ａ）またはＭ１１様（群Ｂ）として分類する。
【０１８０】
本発明のキメラサイトカイン受容体は、そのような抗体由来の抗原結合ドメインを含み得る。そのようなＣＣＲを含む細胞は、例えば、卵巣がんの処置において有用であり得る。
【０１８１】
腫瘍分泌因子（または膜結合型である場合、膜貫通タンパク質）は、以下の非網羅的リストから選択され得る：
【０１８２】
ＡＬＫタンパク質の変異型をもたらすＡＬＫ遺伝子の再配列および過剰発現
アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）
ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）
ベータ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ベータ−ｈＣＧ）
変異したＢ−ＲＥＦタンパク質をもたらすＢＲＡＦ  Ｖ６００変異
Ｃ−ｋｉｔ／ＣＤ１１７
ＣＡ１５−３／ＣＡ２７．２９
ＣＡ１９−９
カルシトニン
ＣＤ２０
クロモグラニンＡ（ＣｇＡ）
サイトケラチンフラグメント２１−１
ＥＧＦＲ遺伝子変異解析
エストロゲン受容体（ＥＲ）／プロゲステロン受容体（ＰＲ）
フィブリン／フィブリノゲン
ＨＥ４
ＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子の増幅またはタンパク質の過剰発現
免疫グロブリン
ＫＲＡＳ遺伝子変異解析
乳酸デヒドロゲナーゼ
ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）
核マトリックスタンパク質２２
プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）
チログロブリン
ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）およびプラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ−１）
ケモカイン
【０１８３】
ケモカインは、走化性サイトカインである。細胞遊走は、細胞外マトリックスに埋め込まれて固定化されたケモカインの勾配によってガイドされる。ＣＸＣＬ１２のような正に帯電したケモカインは、負に帯電したＥＣＭ分子に結合する。これらの勾配は、がん細胞および免疫細胞のホーミングのための道を提供する。Ｔ細胞に対する作用は、細胞傷害性Ｔ細胞のホーミングに対して阻害性であるとみられるが、制御性Ｔ細胞は、引きつけられるとみられる。
【０１８４】
ケモカインは、およそ８〜１０キロダルトンの質量であり、３次元形状の形成にとって重要な保存された位置に４つのシステイン残基を有する。
【０１８５】
いくつかのケモカインは、炎症促進性であると考えられており、免疫応答中に誘導されて免疫系の細胞を感染部位にリクルートし得るが、その他のものは、恒常性であると考えられており、組織の維持または発生の正常なプロセスにおいて細胞の遊走の制御に関わる。
【０１８６】
ケモカインは、４つの主要なサブファミリーに分類される：ＣＸＣ、ＣＣ、ＣＸ３ＣおよびＸＣ。これらのタンパク質のすべてが、標的細胞の表面上に選択的に見られるケモカイン受容体と呼ばれるＧタンパク質結合型膜貫通受容体と相互作用することによって生物学的作用を発揮する。
【０１８７】
ケモカインの主な役割は、細胞の遊走をガイドするための化学誘引物質として作用することである。ケモカインによって引きつけられる細胞は、ケモカインの供給源に向かって高くなっていくケモカイン濃度のシグナルに従う。いくつかのケモカインは、リンパ球をリンパ節に向かわせるなどの免疫監視機構のプロセスの間に免疫系の細胞を制御するので、それらのケモカインは、これらの組織に存在する抗原提示細胞と相互作用することによって病原体の浸潤をスクリーニングし得る。他のケモカインは、炎症性であり、細菌感染、ウイルスおよび他の作用物質に応答して多種多様の細胞から放出される。それらの放出は、インターロイキン１などの炎症促進性サイトカインによって刺激されることが多い。炎症性ケモカインは、主に、白血球に対する化学誘引物質として機能し、単球、好中球、および血液由来の他のエフェクター細胞を感染部位または組織損傷部位にリクルートする。ある特定の炎症性ケモカインは、免疫応答を惹起するかまたは創傷治癒を促進するように細胞を活性化する。それらは、多くの異なる細胞型によって放出され、自然免疫系と適応免疫系の両方の細胞をガイドするように働く。
ＣＣケモカイン
【０１８８】
ＣＣケモカイン（またはβ−ケモカイン）タンパク質は、隣接した２つのシステイン（アミノ酸）をアミノ末端付近に有する。哺乳動物について報告されているこのサブグループの異なるメンバーは、少なくとも２７個あり、ＣＣケモカインリガンド（ＣＣＬ）−１から−２８と呼ばれ；ＣＣＬ１０は、ＣＣＬ９と同じである。このサブファミリーのケモカインは、通常、４つのシステインを含む（Ｃ４−ＣＣケモカイン）が、少数のＣＣケモカインが、６つのシステインを有する（Ｃ６−ＣＣケモカイン）。Ｃ６−ＣＣケモカインとしては、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２３およびＣＣＬ２８が挙げられる。ＣＣケモカインは、単球および他の細胞型（例えば、ＮＫ細胞および樹状細胞）の遊走を誘導する。
【０１８９】
ＣＣケモカインの例としては、単球が血流から離れて周囲の組織に入ることによって組織マクロファージになるように誘導する単球化学誘引物質タンパク質−１（ＭＣＰ−１またはＣＣＬ２）が挙げられる。
【０１９０】
ＣＣＬ５（またはＲＡＮＴＥＳ）は、受容体ＣＣＲ５を発現するＴ細胞、好酸球および好塩基球などの細胞を引きつける。
ＣＸＣケモカイン
【０１９１】
ＣＸＣケモカイン（またはα−ケモカイン）の２つのＮ末端システインは、この名称において「Ｘ」で表されている１つのアミノ酸によって分断されている。哺乳動物において報告されている異なるＣＸＣケモカインは１７個あり、それらは、ＣＸＣモチーフの最初のシステインの直前にグルタミン酸−ロイシン−アルギニン（または短縮してＥＬＲ）という特異的なアミノ酸配列（またはモチーフ）を有するもの（ＥＬＲ陽性）とＥＬＲモチーフを有しないもの（ＥＬＲ陰性）という２つのカテゴリーに細分される。ＥＬＲ陽性ＣＸＣケモカインは、好中球の遊走を特異的に誘導し、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２と相互作用する。
Ｃケモカイン
【０１９２】
ケモカインの第３の群は、Ｃケモカイン（またはγケモカイン）として知られており、２つのシステイン；Ｎ末端の１つのシステインおよび下流の１つのシステインしか有しないという点において他のすべてのケモカインと異なる。このサブグループに対して２つのケモカインが報告されており、ＸＣＬ１（リンホタクチン−α）およびＸＣＬ２（リンホタクチン−β）と呼ばれている。
ＣＸ３Ｃケモカイン
【０１９３】
ＣＸ３Ｃケモカインは、２つのシステインの間に３つのアミノ酸を有する。これまでに発見された唯一のＣＸ３Ｃケモカインは、フラクタルカイン（またはＣＸ３ＣＬ１）と呼ばれている。ＣＸ３Ｃケモカインは、分泌され、かつそれを発現する細胞の表面に結合され、それにより、化学誘引物質と接着分子の両方として働く。
【０１９４】
ケモカイン受容体は、白血球表面上に見られる７つの膜貫通ドメインを含むＧタンパク質共役受容体である。およそ１９個の異なるケモカイン受容体が、これまでに特徴付けられており、それらは、それらが結合するケモカインのタイプに応じて４つのファミリーに分けられる；ＣＸＣケモカインに結合するＣＸＣＲ、ＣＣケモカインに結合するＣＣＲ、唯一のＣＸ３Ｃケモカイン（ＣＸ３ＣＬ１）に結合するＣＸ３ＣＲ１、および２つのＸＣケモカイン（ＸＣＬ１およびＸＣＬ２）に結合するＸＣＲ１。ケモカイン受容体は、多くの構造的特徴を共有する；それらは、サイズが似ており（約３５０アミノ酸を有する）、短い酸性のＮ末端、３つの細胞内および３つの細胞外の親水性ループを有する７つのヘリックス膜貫通ドメイン、ならびに受容体の制御にとって重要なセリンおよびトレオニン残基を含む細胞内Ｃ末端を有する。ケモカイン受容体の最初の２つの細胞外ループはそれぞれ、これらのループの間にジスルフィド架橋の形成を可能にする保存されたシステイン残基を有する。Ｇタンパク質は、ケモカイン受容体のＣ末端と共役して、受容体の活性化の後に細胞内のシグナル伝達を可能にするのに対して、ケモカイン受容体のＮ末端ドメインは、リガンド結合の特異性を決定する。
ＣＸＣＬ１２
【０１９５】
ＣＸＣＬ１２は、リンパ球に対して強い走化性を有する。ＣＸＣＬ１２は、ＣＸＣＲ４依存性機構を通じて内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を骨髄からリクルートすることによって、血管新生において重要な役割を果たす。このＣＸＣＬ１２の機能は、ＣＸＣＬ１２を発がん、および腫瘍進行に結びつく新生血管形成における非常に重要な因子にする。ＣＸＣＬ１２は、腫瘍転移における役割も有し、受容体ＣＸＣＲ４を発現するがん細胞が、リガンドであるＣＸＣＬ１２を放出する転移標的組織に引きつけられる。
【０１９６】
ＣＸＣＬ１２に対する受容体は、ＣＸＣＲ４である。本発明のＣＣＲは、ＩＬ−２受容体などのサイトカイン受容体に由来するエンドドメインに連結された、ＣＸＣＲ４由来のＣＸＣＬ１２結合ドメインを含み得る。
【０１９７】
ＩＬ２とＣＸＣＲ４との対になった発現は、がん治療のための治療用Ｔ細胞の生着を支持し得る。多発性骨髄腫では、そのようなＣＣＲを発現している細胞は、細胞を動員し得、骨髄の環境を変化させ得る。そのような細胞は、固形腫瘍の微小環境を改変することによる固形がんの処置における用途も有する。
【０１９８】
ＣＸＣＲ４に対するアミノ酸配列は、配列番号１７として下記に示される。
【化１４】
2019150066.tif 000015
【０１９９】
ＣＸＣＲ７は、ＣＸＣＬ１２にも結合する。
ＣＣＬ２
【０２００】
ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）は、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ１）および小誘導性サイトカインＡ２とも称される。ＣＣＬ２は、組織損傷または感染によってもたらされる炎症部位に単球、メモリーＴ細胞および樹状細胞をリクルートする。
【０２０１】
ＣＣＲ２およびＣＣＲ４は、ＣＣＬ２に結合する２つの細胞表面受容体である。
【０２０２】
ＣＣＲ２は、配列番号１８として示されるアミノ酸配列を有する。
【化１５】
2019150066.tif 000016
【０２０３】
ＣＣＲ４は、配列番号１９として示されるアミノ酸配列を有する。
【化１６】
2019150066.tif 000017
【０２０４】
本発明のＣＣＲは、そのリガンド結合ドメインに、ＣＣＲ２またはＣＣＲ４のＣＣＬ２結合部位を含み得る。
細胞表面抗原
【０２０５】
リガンドは、膜貫通タンパク質などの細胞表面抗原であり得る。
【０２０６】
細胞表面抗原は、ＣＤ２２であり得る。
【０２０７】
ＣＤ２２、すなわち表面抗原分類２２は、レクチンのＳＩＧＬＥＣファミリーに属する分子である。ＣＤ２２は、成熟Ｂ細胞の表面上に見られ、それほどではないにせよ一部の未熟なＢ細胞上にも見られる。一般的に言えば、ＣＤ２２は、免疫系の過剰活性化および自己免疫疾患の発生を防ぐ制御性分子である。
【０２０８】
ＣＤ２２は、糖結合膜貫通タンパク質であり、シアル酸に特異的に結合し、Ｎ末端に免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインが位置している。Ｉｇドメインが存在することから、ＣＤ２２は免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーとなっている。ＣＤ２２は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達に対する阻害性受容体として機能する。
【０２０９】
ＣＤ２２の高発現は、非ホジキンリンパ腫および他のリンパ腫に見られる。ＣＤ２２を標的にする様々なモノクローナル抗体が知られており、それらとしては、エピラツズマブ、イノツズマブオゾガマイシン、ｍ９７１およびｍ９７２が挙げられる。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
【０２１０】
本発明の細胞は、１つまたはそれを超えるキメラ抗原受容体も含み得る。ＣＡＲは、腫瘍関連抗原に特異的であり得る。
【０２１１】
古典的ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）を細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に結び付けるキメラＩ型膜貫通タンパク質である。バインダーは、典型的にはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）から誘導された１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）であるが、抗体様抗原結合部位またはリガンドベースの抗原結合部位を含む他のフォーマットに基づくことも可能である。膜貫通ドメインは、細胞膜にタンパク質をつなぎ止め、スペーサーをエンドドメインに結び付ける。
【０２１２】
初期のＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１またはＣＤ３ζのγ鎖のどちらかの細胞内部分から誘導されたエンドドメインを有していた。したがって、これらの第一世代受容体は、免疫学的シグナル１を伝達するもので、同種標的細胞のＴ細胞による致死を誘発するのに十分ではあったが、Ｔ細胞を十分に活性化して増殖および生存をもたらすことはなかった。この限界を克服するため、複合エンドドメインが構築された：Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分とＣＤ３ζの細胞内部分の融合により、抗原認識後活性化シグナルおよび共刺激シグナルを同時に伝達することができる第二世代受容体がもたらされる。最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８の共刺激ドメインである。これは、Ｔ細胞増殖を誘発する最も強力な共刺激シグナル、すなわち免疫学的シグナル２を供給する。また、生存シグナルを伝達する密接に関連したＯＸ４０および４１ＢＢなど、ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含む一部の受容体も記載されている。活性化シグナル、増殖シグナルおよび生存シグナルを伝達することができるエンドドメインを有するさらにいっそう強力な第三世代ＣＡＲが現在記載されている。
【０２１３】
ＣＡＲコード核酸は、例えば、レトロウイルスベクターを用いてＴ細胞に移入され得る。こうして、多数の抗原特異的Ｔ細胞が、養子細胞移入のために生成され得る。ＣＡＲが標的抗原と結合したとき、これにより、活性化シグナルの、それが発現されるＴ細胞への伝達がもたらされる。すなわち、ＣＡＲは、標的抗原を発現する細胞に向けたＴ細胞の特異性および細胞傷害性を誘導する。
【０２１４】
本発明の細胞は、１つまたはそれを超えるＣＡＲを含み得る。
【０２１５】
上記ＣＡＲ（複数可）は、抗原結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメインおよびエンドドメインを含み得る。エンドドメインは、Ｔ細胞の活性化シグナルを伝達するドメインを含み得るか、またはそれと会合し得る。
抗原結合ドメイン
【０２１６】
ＣＡＲ抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原を認識するＣＡＲの一部である。
【０２１７】
数多くの抗原結合ドメインが、当該分野で公知であり、それらとしては、抗体、抗体模倣物およびＴ細胞受容体の抗原結合部位に基づくものが挙げられる。例えば、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）；標的抗原の天然リガンド；標的に対して十分な親和性を有するペプチド；単一ドメインバインダー（例えば、ラクダ科動物のもの）；人工単一バインダー（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｂｉｎｄｅｒ  ｓｉｎｇｌｅ）（例えば、Ｄａｒｐｉｎ）；またはＴ細胞受容体に由来する一本鎖を含み得る。
【０２１８】
用語「リガンド」は、ＣＡＲの抗原結合ドメインによって特異的に認識および結合される実体を意味する「抗原」の同意語として使用される。
細胞表面抗原
【０２１９】
ＣＡＲは、細胞表面抗原、すなわち、腫瘍細胞などの標的細胞の表面上に発現される膜貫通タンパク質などの実体を認識し得る。
【０２２０】
ＣＡＲは、腫瘍関連細胞表面抗原に特異的に結合し得る。
【０２２１】
様々な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が知られており、それらのうちのいくつかを表１に示す。本発明において使用される抗原結合ドメインは、この中に示されるＴＡＡに結合することができるドメインであり得る。
【表１】
2019150066.tif 000018
【０２２２】
ＣＡＲが、Ｂ細胞リンパ腫または白血病抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ１６０またはＣＤ５）を認識する場合、ＣＣＲは、ＣＤ２２などの別のＢ細胞抗原を認識し得る。
前立腺がん関連抗原
【０２２３】
ＣＡＲは、前立腺がんに関連する細胞表面抗原（例えば、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）または前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ））に特異的に結合し得る。
【０２２４】
ＰＳＣＡは、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型の細胞膜糖タンパク質である。ＰＳＣＡは、多くの前立腺がんにおいてアップレギュレートされ、膀胱および膵臓のがんでも検出される。
【０２２５】
様々な抗ＰＳＣＡ抗体が知られており、例えば、７Ｆ５（Ｍｏｒｇｅｎｒｏｔｈら（Ｐｒｏｓｔａｔｅ（２００７）６７：１１２１−１１３１）；１Ｇ８（Ｈｉｌｌｅｒｄａｌら（２０１４）ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  １４：３０）；およびＨａ１−４．１１７（Ａｂａｔｅ−Ｄａｇａら（２０１４）２５：１００３−１０１２）である。
【０２２６】
本発明のＣＣＲ発現細胞は、これらの抗体のうちの１つに基づく抗原結合ドメインを含み得る抗ＰＳＣＡ  ＣＡＲも発現し得る。
【０２２７】
ＰＳＭＡは、膜に存在する亜鉛金属酵素である。ＰＳＭＡは、ヒト前立腺において強く発現され、それは他の大抵の組織における発現よりも１００倍高い。がんにおいて、ＰＳＭＡは、発現がアップレギュレートされ、前立腺がんにおいて２番目に多くアップレギュレートされる遺伝子と呼ばれ、非がん性の前立腺よりも８〜１２倍高い。ＰＳＭＡは、ヒト前立腺および前立腺がんにおける発現に加えて、腫瘍の新生脈管構造においても高度に発現されると見出されているが、すべてのタイプの固形腫瘍（例えば、腎臓、乳房、結腸など）の正常な脈管構造では高度に発現されると見出されていない。
【０２２８】
様々な抗ＰＳＭＡ抗体が知られており、例えば、７Ｅ１１、Ｊ５９１、Ｊ４１５およびＨｙｂｒｉｔｅｃｈ  ＰＥＱ２２６．５およびＰＭ２Ｊ００４．５であり、これらの各々が、ＰＳＭＡの異なるエピトープに結合する（Ｃｈａｎｇら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：３１９２−８）。
【０２２９】
本発明のＣＣＲ発現細胞は、これらの抗体のうちの１つに基づく抗原結合ドメインを含み得る抗ＰＳＭＡ  ＣＡＲも発現し得る。
【０２３０】
例えば、ＣＣＲは、配列番号２０として示される配列を有する、Ｊ５９１に基づくｓｃＦｖを含み得る。
【化１７】
2019150066.tif 000019
ＣＡＲ膜貫通ドメイン
【０２３１】
膜貫通ドメインは、膜にまたがるＣＡＲの配列である。ＣＡＲ膜貫通ドメインは、疎水性アルファヘリックスを含み得る。膜貫通ドメインは、良好な受容体安定性をもたらすＣＤ２８に由来し得る。
【０２３２】
ＣＡＲシグナルペプチド
本明細書に記載のＣＡＲおよびＣＣＲはシグナルペプチドを含み得、その結果、それらがＴ細胞などの細胞において発現されるとき、新生タンパク質を小胞体、それに続いて細胞表面へと指向させ、そこで発現される。
【０２３３】
シグナルペプチドのコアは、単一アルファ−へリックスを形成する傾向を有する疎水性アミノ酸の長いストレッチを含み得る。シグナルペプチドは、アミノ酸の短い正に荷電したストレッチから始まり得、これが転位中におけるポリペプチドの適切なトポロジーを強化する助けとなる。シグナルペプチドの末端に、典型的にはシグナルペプチダーゼにより認識され、切断されるアミノ酸のストレッチが存在する。シグナルペプチダーゼは、転位中または転位完了後に切断して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成させ得る。次いで、遊離シグナルペプチドは、特異的プロテアーゼにより消化される。
【０２３４】
シグナルペプチドは、分子のアミノ末端に位置し得る。
【０２３５】
シグナルペプチドは、配列番号２１、２２もしくは２３に示される配列、または５、４、３、２もしくは１個のアミノ酸変異（挿入、置換または付加）を有するそれらの変異型を含み得るが、ただし、そのシグナルペプチドは、ＣＡＲの細胞表面発現を引き起こすようになおも機能する。
【化１８】
2019150066.tif 000020
【０２３６】
配列番号２１のシグナルペプチドは、小型であり高効率であり、ＴＣＲβ鎖に由来する。末端グリシンの後で約９５％の切断をもたらすことから、シグナルペプチダーゼによる効率的な除去をもたらすと予測される。
【化１９】
2019150066.tif 000021
【０２３７】
配列番号２２のシグナルペプチドは、ＩｇＧ１に由来する。
【化２０】
2019150066.tif 000022
【０２３８】
配列番号２３のシグナルペプチドは、ＣＤ８ａに由来する。
【０２３９】
ＣＡＲエンドドメイン
エンドドメインは、膜の細胞内の側に位置する古典的ＣＡＲの一部である。
【０２４０】
エンドドメインは、古典的ＣＡＲのシグナル伝達部分である。抗原結合ドメインによる抗原認識の後、個々のＣＡＲ分子クラスター、天然のＣＤ４５およびＣＤ１４８がシナプスから排除され、シグナルが細胞に伝達される。
【０２４１】
ＣＡＲエンドドメインは、細胞内のシグナル伝達ドメインであり得るか、またはそれを含み得る。代替の実施形態では、本ＣＡＲのエンドドメインは、細胞質に存在する細胞内のシグナル伝達分子と相互作用することができ、シグナル伝達をもたらし得る。
【０２４２】
上記細胞内のシグナル伝達ドメインまたは別個の細胞内のシグナル伝達分子は、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインであり得るか、またはそれを含み得る。
【０２４３】
最も一般的に使用されるシグナル伝達成分は、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３−ゼータエンドドメインのエンドドメイン成分である。これは、抗原が結合された後、活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＤ３−ゼータは、十分に適格な活性化シグナルを提供しない可能性があるので、追加の共刺激シグナル伝達が必要とされ得る。例えば、キメラＣＤ２８およびＯＸ４０は、ＣＤ３−ゼータと併用されて、増殖／生存シグナルを伝達し得るか、または３つ全部が一緒に使用され得る。
【０２４４】
ＣＡＲは、ＣＤ３−ゼータエンドドメインのみを含み得るか、ＣＤ２８もしくはＯＸ４０のエンドドメインとともにＣＤ３−ゼータエンドドメインを含み得るか、またはＣＤ２８エンドドメインならびにＯＸ４０およびＣＤ３−ゼータエンドドメインを含み得る。
【０２４５】
ＣＡＲエンドドメインは、以下のうちの１つまたはそれを超えるものを含み得る：ＩＣＯＳエンドドメイン、ＣＤ２７エンドドメイン、ＢＴＬＡエンドドメイン、ＣＤ３０エンドドメイン、ＧＩＴＲエンドドメインおよびＨＶＥＭエンドドメイン。
【０２４６】
エンドドメインは、配列番号２４〜３２に示された配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異型を含み得る。
【化２１】
2019150066.tif 000023
【化２２】
2019150066.tif 000024
【化２３】
2019150066.tif 000025
【０２４７】
変異型の配列は、配列番号２４〜３２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得るが、但し、その配列は、有効な細胞内のシグナル伝達ドメインを提供する。
核酸
【０２４８】
本発明は、本発明のＣＣＲをコードする核酸も提供する。
【０２４９】
その核酸は、構造：
ＡｇＢ−スペーサー−ＴＭ−エンド
（ここで、
ＡｇＢ１は、ＣＣＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、ＣＣＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、ＣＣＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、ＣＣＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有し得る。
核酸構築物
【０２５０】
本発明はさらに、本発明の第１の態様に関連して規定されたような第１のＣＡＲをコードする第１の核酸配列；および本発明の第１の態様に関連して規定されたような第２のＣＡＲをコードする第２の核酸配列を含む核酸構築物を提供する。
【０２５１】
核酸構築物は、以下の構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−エンド１−ｃｏｅｘｐｒ−ＡｇＢ２−スペーサー２−ＴＭ２−エンド２
（ここで、
ＡｇＢ１は、第１のＣＣＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、第１のＣＣＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のＣＣＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、第１のＣＣＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、両ＣＣＲの共発現を可能にする核酸配列であり、
ＡｇＢ２は、第２のＣＣＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、第２のＣＣＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のＣＣＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド２は、第２のＣＣＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有し得る。
【０２５２】
核酸構築物が、Ｔ細胞などの細胞において発現されるとき、それは、第１および第２のＣＣＲが細胞表面で共発現されるように切断部位で切断されるポリペプチドをコードする。
【０２５３】
第１および第２のＣＣＲは、同じ抗原上の異なるエピトープに結合し得る。
【０２５４】
第１および第２のＣＣＲは、相補的なエンドドメイン、例えば、サイトカイン受容体のαまたはβ鎖に由来するエンドドメインおよび同じサイトカイン受容体のγ鎖に由来するエンドドメインを有し得る。
【０２５５】
本発明は、本発明のＣＣＲおよびＣＡＲをコードする核酸構築物も提供する。そのような構築物は、構造：
ＣＣＲＡｇＢ−ＣＣＲスペーサー−ＣＣＲＴＭ−ＣＣＲエンド−ｃｏｅｘｐｒ−ＣＡＲＡｇＢ−ＣＡＲスペーサー−ＣＡＲＴＭ−ＣＡＲエンド
またはＣＡＲＡｇＢ−ＣＡＲスペーサー−ＣＡＲＴＭ−ＣＡＲエンド−ｃｏｅｘｐｒ−ＣＣＲＡｇＢ−ＣＣＲスペーサー−ＣＣＲＴＭ−ＣＣＲエンド
（ここで、
ＣＣＲＡｇＢは、ＣＣＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＣＲスペーサーは、ＣＣＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＣＣＲＴＭは、ＣＣＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＣＲエンドは、ＣＣＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、ＣＣＲとＣＡＲの両方の共発現を可能にする核酸配列であり、
ＣＡＲＡｇＢは、ＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＡＲスペーサーは、ＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＣＡＲＴＭは、ＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＡＲエンドは、ＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有し得る。
【０２５６】
本発明は、本発明の第１および第２のＣＣＲならびにＣＡＲをコードする核酸構築物も提供する。第１および第２のＣＣＲは、同じ抗原上の別個のエピトープに結合し得る。そのような構築物は、構造：
（ｉ）ＣＣＲＡｇＢ１−ＣＣＲスペーサー１−ＣＣＲＴＭ１−ＣＣＲエンド１−ｃｏｅｘｐｒ１−ＣＣＲＡｇＢ２−ＣＣＲスペーサー２−ＣＣＲＴＭ２−ＣＣＲエンド２−ｃｏｅｘｐｒ２−ＣＡＲＡｇＢ−ＣＡＲスペーサー−ＣＡＲＴＭ−ＣＡＲエンド；
（ｉｉ）ＣＣＲＡｇＢ１−ＣＣＲスペーサー１−ＣＣＲＴＭ１−ＣＣＲエンド１−ｃｏｅｘｐｒ１−ＣＡＲＡｇＢ−ＣＡＲスペーサー−ＣＡＲＴＭ−ＣＡＲエンド−ｃｏｅｘｐｒ２−ＣＣＲＡｇＢ２−ＣＣＲスペーサー２−ＣＣＲＴＭ２−ＣＣＲエンド２；または
（ｉｉｉ）ＣＡＲＡｇＢ−ＣＡＲスペーサー−ＣＡＲＴＭ−ＣＡＲエンド−ｃｏｅｘｐｒ１−ＣＣＲＡｇＢ１−ＣＣＲスペーサー１−ＣＣＲＴＭ１−ＣＣＲエンド１−ｃｏｅｘｐｒ２−ＣＣＲＡｇＢ２−ＣＣＲスペーサー２−ＣＣＲＴＭ２−ＣＣＲエンド２；
（ここで、
ＣＣＲＡｇＢ１は、第１のＣＣＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＣＲスペーサー１は、第１のＣＣＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＣＣＲＴＭ１は、第１のＣＣＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＣＲエンド１は、第１のＣＣＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＣＲＡｇＢ２は、第２のＣＣＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＣＲスペーサー２は、第２のＣＣＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＣＣＲＴＭ２は、第２のＣＣＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＣＲエンド２は、第２のＣＣＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
Ｃｏｅｘｐｒ１およびｃｏｅｘｐｒ２は、隣接する２つの配列の共発現を可能にする核酸配列であり；
ＣＡＲＡｇＢは、ＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＡＲスペーサーは、ＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＣＡＲＴＭは、ＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ＣＡＲエンドは、ＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有し得る。
【０２５７】
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」および「核酸」は、互いと同義であると意図されている。
【０２５８】
遺伝暗号の縮重の結果として、数多くの異なるポリヌクレオチドおよび核酸が同じポリペプチドをコードできることは、当業者によって理解される。さらに、本明細書に記載されるポリヌクレオチドが発現されるべき任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するために、当業者は、日常的な手法を用いて、本明細書に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響しないヌクレオチドの置換を行うことがあることが理解されるべきである。
【０２５９】
本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。それらは、一本鎖または二本鎖であり得る。それらは、それらの中に合成または修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドでもあり得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの修飾が当該分野で公知である。これらには、メチルホスホネート骨格およびホスホロチオエート骨格、分子の３’および／または５’末端におけるアクリジン鎖またはポリリジン鎖の付加が含まれる。本明細書中に記載されるような使用の目的において、それらのポリヌクレオチドは、当該分野において利用可能な任意の方法によって修飾され得ることが理解されるべきである。そのような修飾は、目的のポリヌクレオチドのインビボ活性を高めるためまたは寿命を延長するために行われ得る。
【０２６０】
ヌクレオチド配列に関する用語「変異型」、「ホモログ」または「誘導体」は、その配列からのまたはその配列への１つ（またはそれを超える）核酸の任意の置換、変更、修飾、置換、欠失または付加を含む。
【０２６１】
上記の構造において、「ｃｏｅｘｐｒ」は、第１のＣＡＲと第２のＣＡＲの両方の共発現を可能にする核酸配列である。それは、切断部位をコードする配列であり得、その結果、核酸構築物は、切断部位によって連結された２つまたはそれを超えるＣＣＲまたは１つのＣＣＲおよび１つのＣＡＲを生成し含む。切断部位は、自己切断性であり得、その結果、ポリペプチドが生成されると、いかなる外部の切断活性も必要とせずに、直ちに個々のペプチドに切断される。
【０２６２】
切断部位は、第１および第２のＣＣＲまたは１つのＣＣＲおよび１つのＣＡＲが分断されるようになるのを可能にする任意の配列であってよい。
【０２６３】
用語「切断」は、便宜上、本明細書中で使用されるが、切断部位は、上記ペプチドを古典的な切断以外の機構によって個々の実体に分離させ得る。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断性ペプチド（下記を参照のこと）の場合、「切断」活性を説明する様々なモデルが提案されている：宿主細胞のプロテイナーゼによるタンパク質分解、自己タンパク分解または翻訳効果（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（２００１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１）。切断部位が、タンパク質をコードする核酸配列の間に位置するとき、それらのタンパク質を別個の実体として発現させる限り、そのような「切断」の正確な機構は、本発明の目的にとって重要でない。
【０２６４】
切断部位は、フューリン切断部位であり得る。
【０２６５】
フューリンは、サブチリシン様プロタンパク質コンバターゼファミリーに属する酵素である。このファミリーのメンバーは、潜在型前駆体タンパク質をそれらの生物学的に活性な生成物にプロセシングするプロタンパク質コンバターゼである。フューリンは、前駆体タンパク質をそれらの対になった塩基性アミノ酸プロセシング部位で効率的に切断し得るカルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼである。フューリンの基質の例としては、プロ副甲状腺ホルモン、トランスフォーミング成長因子ベータ１前駆体、プロアルブミン、プロ−ベータ−セクレターゼ、膜１型マトリックスメタロプロテアーゼ、プロ神経成長因子のベータサブユニットおよびフォン・ビルブラント因子が挙げられる。フューリンは、塩基性アミノ酸標的配列（標準的には、Ａｒｇ−Ｘ−（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−Ａｒｇ’）のすぐ下流でタンパク質を切断し、ゴルジ装置において濃縮される。
【０２６６】
切断部位は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）の切断部位であり得る。
【０２６７】
ＴＥＶプロテアーゼは、高度に配列特異的なシステインプロテアーゼであり、キモトリプシン様プロテアーゼである。ＴＥＶプロテアーゼは、その標的切断部位に非常に特異的であるので、インビトロとインビボの両方において、融合タンパク質の制御された切断のために使用されることが多い。コンセンサスＴＥＶ切断部位は、ＥＮＬＹＦＱ＼Ｓである（ここで、「＼」は、切断されるペプチド結合を表す）。ヒト細胞などの哺乳動物細胞は、ＴＥＶプロテアーゼを発現しない。したがって、本核酸構築物がＴＥＶ切断部位を含み、哺乳動物細胞において発現される実施形態では、外来性ＴＥＶプロテアーゼは、哺乳動物細胞においても発現されなければならない。
【０２６８】
切断部位は、自己切断性ペプチドをコードし得る。
【０２６９】
「自己切断性ペプチド」とは、そのポリペプチドが当該タンパク質を構成し、かつ自己切断性ペプチドが生成されると、そのポリペプチドは、いかなる外部の切断活性も必要とせずに、直ちに「切断」されるか、または異なる不連続の第１および第２のポリペプチドに分離されるように機能するペプチドのことを指す。
【０２７０】
自己切断性ペプチドは、アフトウイルスまたはカルジオウイルス由来の２Ａ自己切断性ペプチドであり得る。アフトウイルスおよびカルジオウイルスの最初の２Ａ／２Ｂ切断は、それ自体のＣ末端で「切断」する２Ａによって媒介される。アフトウイルス（ａｐｔｈｏｖｉｒｕｓｅｓ）（例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびウマ鼻炎Ａウイルス）では、２Ａ領域は、約１８アミノ酸という短いセクションであり、それは、タンパク質２ＢのＮ末端残基（保存されたプロリン残基）とともに、それ自体のＣ末端での「切断」を媒介することができる自律エレメントになる（上記のようなＤｏｎｅｌｌｙら（２００１））。
【０２７１】
「２Ａ様」配列は、アフトウイルスまたはカルジオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナウイルス様」昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルスおよびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ
ｓｐｐの中の反復配列および細菌の配列（上記のようなＤｏｎｎｅｌｌｙら（２００１））において見られる。切断部位は、これらの２Ａ様配列のうちの１つ、例えば：
【化２４】
2019150066.tif 000026
【化２５】
2019150066.tif 000027
を含み得る。
【０２７２】
切断部位は、配列番号３８（ＲＡＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）として示される２Ａ様配列を含み得る。
【０２７３】
本発明は、本発明の第１の態様に記載の第１および第２のＣＣＲ、または本発明に記載の１つもしくはそれを超えるＣＣＲおよび１つもしくはそれを超えるＣＡＲをコードする１つもしくはそれを超える核酸配列を含むキットも提供する。
【０２７４】
配列番号４５および４６は、抗ＰＳＭＡ  ＣＡＲと抗ＰＳＡ  ＣＣＲとの融合物の完全なアミノ酸配列を与える。小見出しは、その配列のそれぞれ一部を表示するために与えられているが、実際には、様々なエレメントが接続されて１つの連続した配列がもたらされる。
【０２７５】
本発明の核酸構築物は、配列番号４５または４６に示されるような融合タンパク質をコードし得る。
配列番号４５−ＩＬ−２Ｒベータ鎖を有する例証的な構築物
ヒトＣＤ８ａに由来するシグナル配列：
【化２６】
2019150066.tif 000028
ｓｃＦｖ  ａＰＳＭＡ  （Ｊ５９１  Ｈ／Ｌ）
【化２７】
2019150066.tif 000029
リンカー
ＳＤＰＡ
ヒトＩｇＧ１Ｆｃスペーサー（ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ）：
【化２８】
2019150066.tif 000030
ヒトＣＤ２８に由来する膜貫通：
【化２９】
2019150066.tif 000031
ＴＣＲｚに由来するエンドドメイン：
【化３０】
2019150066.tif 000032
Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルスキャプシドタンパク質由来の２Ａペプチド：
【化３１】
2019150066.tif 000033
マウスカッパーＶＩＩＩに由来するシグナル配列：
【化３２】
2019150066.tif 000034
ｓｃＦｖ  ａＰＳＡ（５Ｄ５Ａ５  Ｈ／Ｌ）：
【化３３】
2019150066.tif 000035
リンカー：
【化３４】
2019150066.tif 000036
ヒトＣＤ８ａＳＴＫスペーサー：
【化３５】
2019150066.tif 000037
ヒト共通ガンマ鎖に由来する膜貫通：
【化３６】
2019150066.tif 000038
ヒト共通ガンマ鎖に由来するエンドドメイン：
【化３７】
2019150066.tif 000039
ウマ鼻炎Ａウイルスポリプロテイン由来の２Ａペプチド：
【化３８】
2019150066.tif 000040
マウスカッパーＶＩＩＩに由来するシグナル配列：
【化３９】
2019150066.tif 000041
ｓｃＦｖ  ａＰＳＡ（５Ｄ３Ｄ１１  Ｈ／Ｌ）：
【化４０】
2019150066.tif 000042
リンカー：
【化４１】
2019150066.tif 000043
ヒトＣＤ２８ＳＴＫスペーサー：
【化４２】
2019150066.tif 000044
ヒトＩＬ−２Ｒβに由来する膜貫通：
【化４３】
2019150066.tif 000045
ヒトＩＬ−２Ｒβに由来するエンドドメイン：
【化４４】
2019150066.tif 000046
配列番号４６−ＩＬ−７Ｒアルファ鎖を有する例証的な構築物
ヒトＣＤ８ａに由来するシグナル配列：
【化４５】
2019150066.tif 000047
ｓｃＦｖ  ａＰＳＭＡ（Ｊ５９１  Ｈ／Ｌ）
【化４６】
2019150066.tif 000048
リンカー
ＳＤＰＡ
ヒトＩｇＧ１Ｆｃスペーサー（ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ）：
【化４７】
2019150066.tif 000049
ヒトＣＤ２８に由来する膜貫通：
【化４８】
2019150066.tif 000050
ＴＣＲｚに由来するエンドドメイン：
【化４９】
2019150066.tif 000051
Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルスキャプシドタンパク質由来の２Ａペプチド：
【化５０】
2019150066.tif 000052
マウスカッパーＶＩＩＩに由来するシグナル配列：
【化５１】
2019150066.tif 000053
ｓｃＦｖ  ａＰＳＡ（５Ｄ５Ａ５  Ｈ／Ｌ）：
【化５２】
2019150066.tif 000054
リンカー：
【化５３】
2019150066.tif 000055
ヒトＣＤ８ａＳＴＫスペーサー：
【化５４】
2019150066.tif 000056
ヒト共通ガンマ鎖に由来する膜貫通：
【化５５】
2019150066.tif 000057
ヒト共通ガンマ鎖に由来するエンドドメイン：
【化５６】
2019150066.tif 000058
ウマ鼻炎Ａウイルスポリプロテイン由来の２Ａペプチド：
【化５７】
2019150066.tif 000059
マウスカッパーＶＩＩＩに由来するシグナル配列：
【化５８】
2019150066.tif 000060
ｓｃＦｖ  ａＰＳＡ（５Ｄ３Ｄ１１  Ｈ／Ｌ）：
【化５９】
2019150066.tif 000061
リンカー：
【化６０】
2019150066.tif 000062
ヒトＣＤ２８ＳＴＫスペーサー：
【化６１】
2019150066.tif 000063
ヒトＩＬ−７Ｒαに由来する膜貫通：
【化６２】
2019150066.tif 000064
ヒトＩＬ−７Ｒαに由来するエンドドメイン：
【化６３】
2019150066.tif 000065
【化６４】
2019150066.tif 000066
ベクター
【０２７６】
本発明は、本発明の第１の態様に記載の１つまたはそれより多くのＣＣＲおよび必要に応じて１つまたはそれより多くのＣＡＲをコードする１つまたはそれを超える核酸配列を含むベクターまたはベクターのキットも提供する。そのようなベクターは、本発明の第１の態様に記載のＣＣＲを発現するようにそ（れら）の核酸配列を宿主細胞に導入するために使用され得る。
【０２７７】
ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）またはトランスポゾンベースのベクターまたは合成ｍＲＮＡであり得る。
【０２７８】
ベクターは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞をトランスフェクトすることまたは形質転換することができ得る。
細胞
【０２７９】
本発明は、本発明の１つまたはそれを超えるＣＣＲおよび必要に応じて１つまたはそれを超える（ｏｎｅ  ｏｆ  ｍｏｒｅ）ＣＡＲを含む細胞を提供する。
【０２８０】
上記細胞は、本発明の核酸またはベクターを含み得る。
【０２８１】
上記細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの細胞溶解性の免疫細胞であり得る。
【０２８２】
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介性免疫において中心的役割を演じるリンパ球のタイプである。それらは、細胞表面におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）など、他のリンパ球とは区別することができる。下記で概説する通り、様々なタイプのＴ細胞がある。
【０２８３】
ヘルパーＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、形質細胞および記憶Ｂ細胞へのＢ細胞の成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む、免疫学的プロセスで他の白血球を補助する。ＴＨ細胞は、それらの表面でＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面でＭＨＣクラスＩＩ分子によりペプチド抗原と共に提示されたときに活性化される。これらの細胞は、種々のサイトカインを分泌することにより、種々のタイプの免疫応答を促進する、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨを含む、幾つかのサブタイプのうちの１つに分化し得る。
【０２８４】
細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、また移植拒絶でも関与する。ＣＴＬは、それらの表面でＣＤ８を発現する。これらの細胞は、全有核細胞の表面に存在する、ＭＨＣクラスＩに随伴する抗原に結合することにより標的を認識する。調節性Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−１０、アデノシンおよび他の分子を通じて、ＣＤ８＋細胞はアネルギー状態に不活化され得、実験的自己免疫脳脊髄炎などの自己免疫疾患を防止する。
【０２８５】
記憶Ｔ細胞は、感染の消散後長期にわたって持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、それらの同種抗原に再曝露されると、迅速に多数のエフェクターＴ細胞に拡大し、過去の感染に対する「記憶」をもつ免疫系を提供する。記憶Ｔ細胞は、３つのサブタイプ：セントラル記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ細胞）および２タイプのエフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。記憶細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。記憶Ｔ細胞は、典型的には細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
【０２８６】
以前にはサプレッサーＴ細胞として知られていた、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持に非常に重要である。それらの主たる役割は、免疫反応の終末に向けてＴ細胞媒介性免疫を制止し、胸腺での負の選択のプロセスを逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【０２８７】
ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の２つの主なクラス−天然に存在するＴｒｅｇ細胞および適応Ｔｒｅｇ細胞については記載されている。
【０２８８】
天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても知られている）は、胸腺で生じ、ＴＳＬＰで活性化された骨髄性（ＣＤ１１ｃ＋）樹状細胞および形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方と発達中のＴ細胞との間の相互作用に関連付けられている。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分
子の存在により他のＴ細胞からは区別され得る。ＦＯＸＰ３遺伝子の変異は、調節性Ｔ細胞の発達を防止し得るため、致命的な自己免疫疾患ＩＰＥＸが引き起こされ得る。
【０２８９】
適応Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても知られている）は、正常な免疫応答中に生じ得る。
【０２９０】
細胞は、ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）であり得る。ＮＫ細胞は、先天性免疫系の一部を形成する。ＮＫ細胞は、ＭＨＣ非依存的にウイルス感染細胞からの内生シグナルに対して、迅速な応答を提供する。
【０２９１】
ＮＫ細胞（自然リンパ球の群に属する）は、大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生じる共通のリンパ性前駆細胞から分化した第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃および胸腺で分化および成熟し、次いでそこから循環系に入ることが知られている。
【０２９２】
本発明のＣＣＲ発現細胞は、上記で挙げた細胞タイプのいずれでもよい。
【０２９３】
本保発明の第１の態様に記載のＴまたはＮＫ細胞は、患者自身の末梢血から（第１団）、またはドナー末梢血からの造血幹細胞移植の状況において（第２団）、または非関連ドナーからの末梢血（第３団）から生体外で作製され得る。
【０２９４】
あるいは、本発明の第１の態様によるＴまたはＮＫ細胞は、ＴまたはＮＫ細胞への誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のエキソビボでの分化から得られ得る。あるいは、溶解機能を保持し、治療薬として作用し得る不死化されたＴ細胞株が使用され得る。
【０２９５】
これらのすべての実施形態において、ＣＣＲ発現細胞は、ウイルスベクターでの形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡでのトランスフェクションを含む多くの手段のうちの１つによりそのＣＣＲまたは各々のＣＣＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することにより生成される。
【０２９６】
本発明の細胞は、被験体由来のエキソビボのＴまたはＮＫ細胞であり得る。そのＴまたはＮＫ細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料に由来し得る。ＴまたはＮＫ細胞は、本発明の第１の態様によるＣＣＲを提供する分子をコードする核酸を形質導入される前に、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処置によって、活性化および／または拡大され得る。
【０２９７】
本発明のＴまたはＮＫ細胞は、
（ｉ）被験体または上に列挙された他の起源からのＴまたはＮＫ細胞含有試料の単離；および
（ｉｉ）ＣＣＲをコードする１つまたはそれを超える核酸配列によるＴまたはＮＫ細胞の形質導入またはトランスフェクション
によって作製され得る。
【０２９８】
次いで、それらのＴまたはＮＫ細胞は、抗原結合ポリペプチドの抗原結合ドメインの発現に基づいて精製され得、例えば、選択され得る。
【０２９９】
医薬組成物
本発明はまた、本発明による複数の細胞を含む医薬組成物に関する。
【０３００】
医薬組成物は、さらに薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤を含んでいてもよい。医薬組成物は、所望により１種またはそれより多くのさらなる医薬活性ポリペプチドおよび／または化合物を含んでいてもよい。かかる製剤は、例えば、静脈内注入に好適な形態であり得る。
【０３０１】
処置方法
本発明は、疾患を処置および／または予防するための方法を提供し、その方法は、本発明の細胞（例えば、上に記載されたような医薬組成物中の本発明の細胞）を被験体に投与する工程を含む。
【０３０２】
疾患を処置するための方法は、本発明の細胞の治療的使用に関する。本明細書中において、それらの細胞は、既存の疾患に関連する少なくとも１つの症候を和らげるか、減少させるか、もしくは改善するため、および／またはその疾患の進行を減速させるか、減少させるか、もしくは阻止するために、その疾患または症状を有する被験体に投与され得る。
【０３０３】
疾患を予防するための方法は、本発明の細胞の予防的使用に関する。本明細書中において、そのような細胞は、まだ疾患にかかっていないおよび／またはいかなる疾患の症候も示していない被験体に、その疾患を予防するためもしくはその疾患の原因を弱めるため、またはその疾患に関連する少なくとも１つの症候を減少させるためもしくはその発生を予防するために、投与され得る。被験体は、その疾患の素因を有し得るか、またはその疾患を発症するリスクがあると考えられ得る。
【０３０４】
上記方法は、
（ｉ）ＴまたはＮＫ細胞含有試料を単離する工程；
（ｉｉ）そのような細胞に、本発明によって提供される核酸配列もしくはベクターを形質導入するか、またはそのような細胞を、本発明によって提供される核酸配列もしくはベクターでトランスフェクトする工程；
（ｉｉｉ）被験体に（ｉｉ）からの細胞を投与する工程
を含み得る。
【０３０５】
ＴまたはＮＫ細胞含有試料は、被験体または他の起源、例えば、上に記載されたような起源から単離され得る。ＴまたはＮＫ細胞は、被験体自身の末梢血（第一者）、またはドナー末梢血由来の造血幹細胞移植の状況（第二者）、または無関係のドナー由来の末梢血（第三者）から単離され得る。
【０３０６】
本発明は、疾患の処置および／または予防において使用するための本発明のＣＣＲ発現細胞を提供する。
【０３０７】
本発明は、疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における本発明のＣＣＲ発現細胞の使用にも関する。
【０３０８】
本発明の方法によって処置および／または予防される疾患は、がん性疾患（例えば、膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮体がん、腎臓がん（腎細胞）、白血病、肺がん、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、膵がん、前立腺がんおよび甲状腺がん）であり得る。
【０３０９】
ＣＣＲによって認識されるリガンドがＰＳＡである場合、がんは、前立腺がんであり得る。
【０３１０】
本発明の細胞は、がん細胞などの標的細胞を殺すことができ得る。標的細胞は、標的細胞の近傍に腫瘍分泌リガンドまたはケモカインリガンドが存在することを特徴とし得る。標的細胞は、標的細胞表面における腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現とともに、可溶性リガンドが存在することを特徴とし得る。
【０３１１】
本発明の細胞および医薬組成物は、上に記載された疾患の処置および／または予防において使用するためであり得る。
【０３１２】
本発明の細胞および医薬組成物は、上に記載された任意の方法において使用するためであり得る。
キメラ膜貫通タンパク質
【０３１３】
本発明は、二量体化ドメイン；およびサイトカイン受容体エンドドメインを含むキメラ膜貫通タンパク質も提供する。
【０３１４】
二量体化は、自発的に生じることがあり、その場合、キメラ膜貫通タンパク質は、構成的に活性である。あるいは、二量体化は、二量体化化学誘導物質（ＣＩＤ）の存在下においてのみ生じることがあり、その場合、膜貫通タンパク質は、ＣＩＤの存在下においてのみサイトカイン型のシグナル伝達を引き起こす。
【０３１５】
好適な二量体化ドメインおよびＣＩＤは、ＷＯ２０１５／１５０７７１（この内容は参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【０３１６】
例えば、一方の二量体化ドメインは、ＦＫ結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）のラパマイシン結合ドメインを含み得、他方は、ｍＴＯＲのＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインを含み得；ＣＩＤは、ラパマイシンまたはその誘導体であり得る。
【０３１７】
一方の二量体化ドメインは、ＦＫ結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）のＦＫ５０６（タクロリムス）結合ドメインを含み得、他方の二量体化ドメインは、シクロフィリン（ｃｙｌｃｏｐｈｉｌｉｎ）Ａのシクロスポリン結合ドメインを含み得；ＣＩＤは、ＦＫ５０６／シクロスポリン融合物またはその誘導体であり得る。
【０３１８】
一方の二量体化ドメインは、エストロゲン結合ドメイン（ＥＢＤ）を含み得、他方の二量体化ドメインは、ストレプトアビジン結合ドメインを含み得；ＣＩＤは、エストロン／ビオチン融合タンパク質またはその誘導体であり得る。
【０３１９】
一方の二量体化ドメインは、糖質コルチコイド結合ドメイン（ＧＢＤ）を含み得、他方の二量体化ドメインは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）結合ドメインを含み得；ＣＩＤは、デキサメタゾン／メトトレキサート融合タンパク質またはその誘導体であり得る。
【０３２０】
一方の二量体化ドメインは、Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）結合ドメインを含み得、他方の二量体化ドメインは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）結合ドメインを含み得；ＣＩＤは、Ｏ６−ベンジルグアニン誘導体／メトトレキサート融合タンパク質またはその誘導体であり得る。
【０３２１】
一方の二量体化ドメインは、レチノイン酸受容体ドメインを含み得、他方の二量体化ドメインは、エクジソン（ｅｃｏｄｙｓｏｎｅ）受容体ドメインを含み得；ＣＩＤは、ＲＳＬ１またはその誘導体であり得る。
【０３２２】
二量体化ドメインが、自発的にヘテロ二量体化する場合、それは、抗体の二量体化ドメインに基づき得る。特に、それは、重鎖定常ドメイン（ＣＨ）および軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）の二量体化部分を含み得る。定常ドメインの「二量体化部分」は、鎖間ジスルフィド結合を形成する配列の一部である。
【０３２３】
キメラサイトカイン受容体は、例えば、図５に模式的に図示されているように、エキソドメインとして抗体のＦａｂ部分を含み得る。
【０３２４】
キメラ膜貫通タンパク質は、２つのポリペプチド：
（ｉ）
（ａ）第１の二量体化ドメイン；および
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第１の鎖
を含む第１のポリペプチド；および
（ｉｉ）
（ａ）第１の二量体化ドメインと二量体化する第２の二量体化ドメイン；および
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第２の鎖
を含む第２のポリペプチド
を含み得る。
【０３２５】
キメラサイトカイン受容体のサイトカイン受容体エンドドメインを定義する上記の項は、本発明のキメラ膜貫通タンパク質にも当てはまる。
【０３２６】
核酸、ベクター、キット、細胞、医薬組成物および方法に関する上記の項は、本発明のキメラ膜貫通タンパク質にも当てはまる。
【０３２７】
本発明は、実施例によってさらに説明され、この実施例は、本発明を実施する際に当業者を助けるように機能すると意味されており、本発明の範囲を決して限定しないと意図されている。
【実施例】
【０３２８】
実施例１−インビトロ試験
Ｔ細胞に、ＰＳＭＡ特異的ＣＡＲを形質導入するか、またはＰＳＭＡ特異的ＣＡＲをＰＳＡ特異的ＣＣＲと共発現する構築物を形質導入する。Ｔ細胞を、ＰＳＡを分泌するかまたは分泌しないＰＳＭＡ発現標的細胞と共培養する。この共培養は、外来性ＩＬ２の存在下または非存在下で行う。この共培養は、異なるエフェクター対標的比で行う。この共培養は、反復して標的細胞でチャレンジされたＴ細胞を用いて連続的に繰り返す。Ｔ細胞の増殖および標的細胞の殺滅を測定する。このようにして、ＣＣＲがもたらすＴ細胞の増殖および生存への寄与を計測できる。さらに、連続能力を繰り返し再チャレンジする寄与能力。
実施例２−インビボ試験
【０３２９】
ＰＳＭＡを発現し、ＰＳＡを分泌し、ホタルルシフェラーゼを発現するヒト前立腺がん細胞株をＮＳＧマウスに移植する。Ｔ細胞に、ＰＳＭＡ特異的ＣＡＲを形質導入するか、またはＰＳＭＡ特異的ＣＡＲをＰＳＡ特異的ＣＣＲと共発現する構築物を形質導入する。それらのマウスにＴ細胞を投与する。腫瘍量を、生物発光イメージングを用いて連続的に計測することができ、ＣＡＲ  Ｔ細胞への応答を評価することができる。各コホート内のマウスを種々の時点で屠殺し得、巨視的計測および免疫組織化学によって腫瘍量を直接計測し得る。さらに、腫瘍床またはリンパ系組織（例えば、リンパ節、脾臓および骨髄）内におけるＴ細胞の生着／拡大が、前記組織のフローサイトメトリーによって計測される。
実施例３−構成的に活性なサイトカインシグナル伝達分子の作製および試験
【０３３０】
構成的に活性なサイトカインシグナル伝達キメラ膜貫通タンパク質を、サイトカイン受容体エンドドメインを「Ｆａｂ」型エキソドメインに連結することによって作製した（図５）。この構造は、抗体の天然の二量体化構成要素、すなわち、重鎖定常領域および軽鎖定常領域由来の二量体化ドメインを使用する。キメラ膜貫通タンパク質は、２本の鎖；エンドドメインとして抗体軽鎖κ鎖およびＩＬ２受容体共通γ鎖を含む第１のポリペプチド；ならびに抗体重鎖ＣＨ１およびＩＬ２受容体β鎖（構成的に活性なＩＬ２−シグナル伝達分子をもたらす）；またはＩＬ７受容体（構成的に活性なＩＬ７−シグナル伝達分子をもたらす）のいずれかを含むエンドドメインを含む第２のポリペプチドを有する。この研究において試験された構成的に活性なサイトカインシグナル伝達キメラ膜貫通タンパク質は、ｓｃＦｖの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んだ。これらのドメインは、二量体化が生じるために必要ではない。そのシグナルは、抗原結合と無関係であり、その構造は、等しく「無頭部（ｈｅａｄｌｅｓｓ）」であり得る（図５に示されているように）か、またはタグタンパク質などの別の実体を含み得る。
【０３３１】
これらの２つのポリペプチドをコードする核酸配列を、２Ａペプチドをコードする配列によって分断された状態でインフレームでクローニングした。
【０３３２】
ＣＴＬＬ−２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−２１４ＴＭ）は、成長のためにＩＬ−２に依存するマウス細胞傷害性Ｔリンパ球細胞である。ＩＬ−２の非存在下において、それらの細胞は、アポトーシスを起こす。ＣＴＬＬ−２細胞に、ＩＬ２受容体エンドドメインを含むキメラタンパク質を発現するベクター（Ｆａｂ＿ＩＬ２エンド）もしくはＩＬ７受容体エンドドメインを含むキメラタンパク質を発現するベクター（Ｆａｂ＿ＩＬ７エンド）を形質導入するか、または形質導入せずに放置した（ＷＴ）。ポジティブコントロールとして、３つすべてのタイプの細胞を１００Ｕ／ｍｌのマウスＩＬ２と共培養した。培養の３および７日後に細胞増殖を評価し、結果を図６に示す。
【０３３３】
形質導入されなかったＣＴＬＬ２細胞は、いずれかの構築物（Ｆａｂ＿ＩＬ２エンドまたはＦａｂ＿ＩＬ７エンド）を形質導入されたＣＴＬＬ２細胞とともに、１００Ｕ／ｍＬのマウスＩＬ２の存在下において増殖した（図６、左側のパネル）。しかしながら、外因的に加えられるＩＬ２の非存在下では、ＩＬ２Ｒエンドドメインを有する構築物（Ｆａｂ＿ＩＬ２エンド）を形質導入された細胞しか生存および増殖しなかった。これは、キメラ膜貫通受容体が、必要なＩＬ２シグナルをＣＴＬＬ２細胞に提供することを示している。
実施例４−ＰＳＡに対するキメラサイトカイン受容体の作製および試験
【０３３４】
ＰＳＡを標的にするキメラサイトカイン受容体のパネルを、異なるＰＳＡエピトープに結合する２つの抗体：５Ｄ５Ａ５および５Ｄ３Ｄ１１に由来するｓｃＦｖを用いて開発した。ＰＳＡの結晶構造は、これらの２つとのサンドイッチ複合体として得られた（上記のようなＳｔｕｒａら（２０１１））。
【０３３５】
ＣＣＲのパネルのいくつかを図示している模式図を図７に図示する。
【０３３６】
そのパネルには、以下の構築物：
Ａ５−ＣＤ８ｓｔｋ−ＩＬ２Ｒｇ＿Ｄ１１−ヒンジ−ＩＬ２Ｒｂ：共通γ鎖を有する鎖上にＡ５およびＩＬ２Ｒβ鎖を有する鎖上にＤ１１を有するＩＬ−２Ｒエンドドメインを有するＣＣＲ；
Ｄ１１−ＣＤ８ｓｔｋ−ＩＬ２Ｒｇ＿Ａ５−ヒンジ−ＩＬ２Ｒｂ：共通γ鎖を有する鎖上にＤ１１およびＩＬ２Ｒβ鎖を有する鎖上にＡ５を有するＩＬ−２Ｒエンドドメインを有するＣＣＲ；
Ｄ１１−ＣＤ８ｓｔｋ−ＲＬ＿Ａ５−ヒンジ−ＩＬ２Ｒｂ：Ｄ１１−ＣＤ８ｓｔｋ−ＩＬ２Ｒｇ＿Ａ５−ヒンジ−ＩＬ２Ｒｂと等価であるが、ＩＬ２Ｒγ鎖が堅いリンカーによって置換されている、ネガティブコントロール構築物；
Ｄ１１−ＣＤ８ｓｔｋ−ＩＬ２Ｒｇ＿Ａ５−ヒンジ−ＩＬ７Ｒａ：共通γ鎖を有する鎖上にＤ１１およびＩＬ７Ｒα鎖を有する鎖上にＡ５を有するＩＬ−７Ｒエンドドメインを有するＣＣＲ；および
Ｄ１１−ＣＤ８ｓｔｋ−ＲＬ＿Ａ５−ヒンジ−ＩＬ７Ｒａ：Ｄ１１−ＣＤ８ｓｔｋ−ＩＬ２Ｒｇ＿Ａ５−ヒンジ−ＩＬ７Ｒａと等価であるが、ＩＬ２Ｒγ鎖が堅いリンカーによって置換されているネガティブコントロール構築物
が含まれた。
【０３３７】
ＣＴＬＬ２細胞に、これらの構築物を発現するベクターを形質導入した。細胞を、ＩＬ２の存在下または非存在下（ＩＬ２の存在はポジティブコントロールとして作用する）および５ｎｇ／ｍＬもしくは５μｇ／ｍＬのＰＳＡの存在下または非存在下で、培養した。ＣＴＬＬ２細胞の増殖を３および７日後に評価し、結果を図８に示す。
【０３３８】
ＩＬ７エンドドメインを有するＣＣＲを発現するＣＴＬＬ２細胞は、ＣＴＬＬ２細胞の生存および増殖を支持しなかった（図８、最後の２つのパネル）。これらの細胞におけるマウスＩＬ−２の存在は、３日目にＣＴＬＬ２細胞の成長および増殖を支持したが、７日目までに、細胞の大部分がアポトーシスを起こした。
【０３３９】
ＩＬ２Ｒエンドドメインを有する抗ＰＳＡキメラサイトカイン受容体は、ＩＬ２の非存在下および５ｎｇ／ｍｌと５μｇ／ｍｌの両方のＰＳＡの存在下においてＣＴＬＬ２細胞の増殖を支持し（図８、最初のパネル）、５μｇ／ｍｌは、特に７日目において、より高い生存および増殖をもたらした。
【０３４０】
ＩＬ２Ｒエンドドメインを有する両方の抗ＰＳＡキメラサイトカイン受容体、すなわち、Ａ５−ＣＤ８ｓｔｋ−ＩＬ２Ｒｇ＿Ｄ１１−ヒンジ−ＩＬ２ＲｂおよびＤ１１−ＣＤ８ｓｔｋ−ＩＬ２Ｒｇ＿Ａ５−ヒンジ−ＩＬ２Ｒｂは、２つのＰＳＡ結合ドメイン：５Ｄ５Ａ５および５Ｄ３Ｄ１１の相対的なポジショニングが機能にとって重要ではないことを示唆する。
【０３４１】
共通γ鎖を堅いリンカーで置換することにより、ＣＣＲがＣＴＬＬ２細胞の生存および増殖を支持する能力が無くなった（図８、第３のパネル）。
【０３４２】
ＩＬ２シグナル伝達に対する別の読み取りとして、ＳＴＡＴ５のＹ６９４のリン酸化を、ホスホフローを用いて調査した。
【０３４３】
ＣＴＬＬ２細胞に形質導入しなかった（ＷＴ）か；ＩＬ２Ｒエンドドメインを有するＰＳＡ  ＣＣＲ構築物（Ｄ１１−ＣＤ８ＳＴＫ−ＩＬ２Ｒｇ＿Ａ５−ヒンジ−ＩＬ２Ｒｂ）を形質導入したか；またはＩＬ２Ｒγ鎖が堅いリンカーで置換された等価なネガティブコントロール構築物（Ｄ１１−ＣＤ８ＳＴＫ−ＲＬ＿Ａ５−ヒンジ−ＩＬ２Ｒｂ）を形質導入した。それらの細胞を、外因的に加えられたＩＬ−２の非存在下において一晩インキュベートした。翌日、細胞を５００μＭの過バナジン酸（ホスファターゼを阻害し、ＳＴＡＴ５のリン酸化（ｐｈｏｓｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）をもたらすポジティブコントロール）または５００ｎｇ／ｍＬのＰＳＡとともに１または４時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を固定し、透過処理し、フローサイトメトリーによって解析した。
【０３４４】
結果を図９に示す。ＰＳＡ  ＣＣＲを発現している細胞では、ＰＳＡの存在によって、ＳＴＡＴ５のリン酸化が経時的に増加した（図９、中央のパネル）。形質導入されなかったＣＴＬＬ２細胞、またはＩＬ２Ｒγ鎖が堅いリンカーで置換された等価な構築物を形質導入されたＣＴＬＬ２細胞では、そのようなリン酸化の増加は見られなかった（図９、右側のパネル）。
【０３４５】
これらの結果は、図８に示されたＣＴＬＬ２の生存／増殖データと一致し、可溶性リガンド（ここではＰＳＡ）に対するキメラサイトカイン受容体を用いることによってＴ細胞においてサイトカインシグナル伝達を誘発することができることを実証する。
【０３４６】
上記の明細書で挙げた出版物は全て、参照により本明細書に援用する。本発明の記載された方法および系の様々な修飾および変形は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者には明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態と共に記載したが、請求されている本発明は、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解するべきである。事実、分子生物学または関連分野における専門家にとって明白な、本発明を実施するために記載された方法の様々な修飾も以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。
【図１】
2019150066.tif 000067
【図２】
2019150066.tif 000068
【図３−１】
2019150066.tif 000069
【図３−２】
2019150066.tif 000070
【図４】
2019150066.tif 000071
【図５】
2019150066.tif 000072
【図６】
2019150066.tif 000073
【図７】
2019150066.tif 000074
【図８−１】
2019150066.tif 000075
【図８−２】
2019150066.tif 000076
【図９】
2019150066.tif 000077
【配列表】
2019150066000001.app
【外国語明細書】
2019150066000001.pdf