(57)【要約】【課題】ＶＬドメインを含む重鎖を発現するヒト化齧歯動物を提供すること。【解決手段】内因性非ヒト重鎖免疫グロブリン配列の改変を含み、且つ齧歯動物（例えば、マウス）において機能的なＡＤＡＭ６活性を含む、非ヒト動物、組織、細胞、および遺伝子材料が提供され、該非ヒト動物が、重鎖定常領域との関係でヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントを再配列し、軽鎖定常ドメインに融合したヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインとコグネイトである、重鎖定常ドメインに融合したヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン様分子を発現する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願図面に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと融合している免疫グロブリン重鎖定常領域を含むヒト免疫グロブリン様結合タンパク質を発現する遺伝子改変された非ヒト妊性動物の他、軽鎖定常ドメインに融合している免疫グロブリン軽鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインに融合している免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを有する結合タンパク質が提供される。機能的ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子改変されたマウス、細胞、胚、および組織が記載され、該マウス、細胞、胚、および組織は、１つまたは複数の非ヒト免疫グロブリン重鎖定常遺伝子に作動可能に連結したヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントを含む。改変は、ヒトおよび／またはヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含む。ＡＤＡＭ６機能を含むマウスは、ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性核酸配列を含むマウスを含むと記載される。内因性マウス免疫グロブリンＶＨ領域遺伝子座の遺伝子改変を含み、且つさらにＡＤＡＭ６活性を含む遺伝子改変された雄マウスは、該雄マウスに妊性を回復させるかまたは維持させる異所性核酸配列を含むマウスを含むと記載される。例示的な妊性は、野生型マウスに匹敵する妊性である。
【０００２】
内因性ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログの欠失または改変を含み、ＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログ）機能を全部または一部回復させる遺伝子改変を含む、遺伝子改変された非ヒト妊性動物が提供され、該非ヒト動物は、重鎖定常配列においてヒト免疫グロブリン軽鎖可変配列を発現する。そのような結合タンパク質を発現する細胞、それらを生成する齧歯動物（例えば、マウス）、ならびに関連した方法および組成物もまた提供される。
【０００３】
重鎖定常領域と融合した軽鎖可変領域を含む抗体を発現する、遺伝子操作された動物であって、該非ヒト動物が、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠くが、ＡＤＡＭ６機能を保持する遺伝子操作された動物が記載され、該動物には、齧歯動物（例えば、マウス）であって、該マウスが機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を生成できないようにされ、その結果として、妊性の喪失を生じる、内因性免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）領域遺伝子座の改変を含む齧歯動物（例えば、マウス）が挙げられる。複数のヒトＶＬ、ＪＬ、および必要に応じてＤＨ遺伝子セグメント、またはそれらの組み合わせによって特徴づけられる免疫グロブリンＶＨ遺伝子座を含み、且つＡＤＡＭ６機能をさらに含む、遺伝子改変されたマウスが記載され、それらには、雄マウスに妊性を回復させる異所性核酸配列を含むマウスが挙げられる。上記遺伝子改変されたマウスは、重鎖可変ドメインを欠き、その代わりに、再配列した軽鎖遺伝子セグメントを含む可変ドメインを含む抗体を発現する。
【０００４】
機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座をコードする核酸配列を含む遺伝子改変された齧歯動物（例えば、マウス）、細胞、胚、および組織が記載され、該マウス、細胞、胚、および組織は、ヒト軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖を発現する。さらに、上記マウス、細胞、胚、および組織は、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠くが、ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性核酸配列の存在によって特徴づけられるＡＤＡＭ６機能を保持する。抗原を結合するのに有用である、妊性非ヒト動物において抗体配列を作製するための方法が提供される。
【背景技術】
【０００５】
背景
過去二十年にわたって、抗体の薬学的適用は、ヒト治療薬としての使用に好適である抗体の作製の多大な研究を喚起した。ヒトへとマウス抗体を反復して投与することは、長期処置レジメンを混乱させ得る免疫原性の問題を生じさせる結果となるので、マウス抗体に基づく初期抗体治療薬は、ヒト治療薬として理想的ではなかった。マウス抗体をよりヒトらしくし、あまりマウス様にしないようなマウス抗体のヒト化に基づく解決策が開発された。その後、抗体に使用するためのヒト免疫グロブリン配列を発現するための方法が続き、これらは、主として、ファージ、細菌または酵母におけるヒト免疫グロブリンライブラリのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現に基づくものであった。最終的に、ヒト造血細胞を生着させたマウスにおいて、および内因性免疫グロブリン遺伝子座が無能化された染色体導入マウスまたはトランスジェニックマウスにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトリンパ球から有用なヒト抗体を作製する試みがなされた。
【０００６】
これらのマウスの作製のために、ランダムに組み込まれた完全ヒト導入遺伝子が、該マウスにおいて発現される免疫グロブリンレパートリーとして機能するために、内因性マウス免疫グロブリン遺伝子を無能化する必要があった。かかるマウスは、ヒト治療薬としての使用に好適なヒト抗体を作製できるが、該マウスの免疫系に関わる重大な問題を提示する。これらの問題は、いくつかの実験的ハードルをもたらす。例えば、マウスは、十分に多様な抗体レパートリーの産生を実行できず、広範なリエンジニアリングフィックス（ｒｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｉｘｅｓ）の使用を必要とし、おそらくヒト要素とマウス要素間の不適合性のため、最適以下のクローン選択過程をもたらし、および、ヒト治療薬の作製に真に有用であるために必要なヒト可変配列の大きな且つ多様な集団の信頼できない源をもたらす。
【０００７】
完全なヒト抗体導入遺伝子を含有するトランスジェニックマウスは、ヒト重鎖定常配列に結合する再配列していないヒト免疫グロブリン重鎖可変配列（Ｖ、Ｄ、およびＪ配列）およびヒト軽鎖定常配列に結合する再配列していないヒト免疫グロブリン軽鎖可変配列（ＶおよびＪ）を含有するランダムに挿入された導入遺伝子を含有する。それゆえ、上記マウスは、完全にヒトである、内因性遺伝子座以外の遺伝子座から再配列した抗体遺伝子を産生する。一般に、少なくとも一部のヒトλ配列を有するマウスも報告されているが、上記マウスは、ヒト重鎖配列およびヒトκ軽鎖配列を含有する。トランスジェニックマウスは一般に、損傷を受け、非機能的内因性免疫グロブリン遺伝子座、または内因性免疫グロブリン遺伝子座のノックアウトを有し、そのため、上記マウスは、内因性免疫グロブリン遺伝子座でヒト抗体配列を再配列することができない。かかるトランスジェニックマウスの変化は、おそらく少なくとも一部、内因性選択系内の完全なヒト抗体分子を結合させる最適以下のクローン選択過程のため、およびこのようなマウスの内因性遺伝的構成への変化による有害な影響のため、マウスにおいて十分に多様なヒト抗体レパートリーを産生するにはあまり最適ではない。
【０００８】
ヒト抗体配列を含む免疫グロブリン配列を産生するのに有用であり、且つ伝統的な抗体分子とは別に、多様性を示す、免疫グロブリン様分子の多様なレパートリーを産生するのに有用である、改善された遺伝子改変非ヒト動物を作製し、同時に、該遺伝子改変に起因する可能性がある有害な変化を低減または消去する、必要性が依然として当技術分野にある。軽鎖定常ドメインとの関係におけるヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインとコグネイトである、重鎖定常ドメインとの関係におけるヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む、有用な再配列した免疫グロブリン遺伝子を形成するように、免疫グロブリン遺伝子セグメントを再配列することができ、またはヒト軽鎖可変遺伝子セグメントの十分に多様なコレクションを含有する遺伝子座を含む変化した免疫グロブリン遺伝子座からタンパク質を生成することができる、非ヒト動物の必要性も依然としてある。免疫グロブリン様結合タンパク質を産生することができる非ヒト動物の必要性が依然としてあり、該結合タンパク質は、重鎖定常ドメインに連結したヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
免疫グロブリン遺伝子座を有する遺伝子改変非ヒト動物が提供され、該免疫グロブリン遺伝子座は、１つまたは複数の非ヒト定常領域に作動可能に連結した複数のヒト軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子セグメント、例えば、ヒトＶκおよびＪκ、またはヒトＶλおよびＪλを含み、様々な実施形態において、該遺伝子座は、内因性機能的ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする配列を欠く。上記非ヒト動物には、齧歯動物、例えば、マウスおよびラットが挙げられる。
【００１０】
ヒト軽鎖ＶκまたはＶλ遺伝子セグメント、およびヒトＪκまたはＪλ遺伝子セグメントに関わる再配列から導かれる軽鎖可変ドメインをコードする遺伝子、ならびに様々な実施形態において、追加として、ＤＨ遺伝子セグメントを再配列し、形成することができる遺伝子座が提供され、様々な実施形態において、該遺伝子座は、内因性機能的ＡＤＡＭ６遺伝子またはその機能的断片を欠く。
【００１１】
改変免疫グロブリン遺伝子座には、内因性機能的ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、且つヒト免疫グロブリン配列、例えば、ヒト（またはヒト／非ヒトキメラ）または非ヒト免疫グロブリン定常配列に作動可能に連結した（ならびに、例えば、Ｖセグメントおよび／またはＪセグメントと作動可能に連結した）ヒトＶＬセグメントを含む遺伝子座が挙げられる。複数のＶＬ遺伝子セグメント、および非ヒト動物において機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはその断片をコードする異所性ヌクレオチド配列を含む改変遺伝子座が提供される。非ヒト免疫グロブリン定常配列に作動可能に連結した、１つもしくは複数のＤＨセグメントおよび／または１つもしくは複数のＪＬもしくはＪＨセグメントと作動可能に連結した複数のＶＬ遺伝子セグメント、例えば、齧歯動物（例えば、マウスまたはラット）配列またはヒト配列を含む改変遺伝子座が提供される。そのようなヒト化遺伝子座を含む非ヒト動物もまた提供され、該非ヒト動物は、野生型妊性を示す。
【００１２】
ヒトＤおよび／またはヒトＪ遺伝子セグメントに作動可能に連結した複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を（導入遺伝子上に、または内因性非ヒト動物重鎖可変遺伝子座における挿入もしくは置き換えとして）含む非ヒト動物が提供される。様々な実施形態において、上記複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントは、上記非ヒト動物の内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座において１つもしくは複数のヒトＤおよび／または１つもしくは複数のヒトＪ遺伝子セグメントに作動可能に連結している。様々な実施形態において、上記非ヒト動物は、改変重鎖遺伝子座を含む雄非ヒト動物において機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのホモログもしくはオルソログをコードする異所性ヌクレオチド配列をさらに含む。様々な実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つのヒトＶＬセグメント、ＤＨ遺伝子セグメント、またはＪＬ遺伝子セグメントと近接している。様々な実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記非ヒト動物のゲノムにおいて非免疫グロブリン配列と近接している。１つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記改変重鎖遺伝子座と同じ染色体上にある。１つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記改変重鎖遺伝子座とは異なる染色体上にある。
【００１３】
非ヒト動物であって、すべての、または実質的すべての内因性免疫グロブリンＶＨセグメント（例えば、すべての機能的セグメント、またはほとんどすべての機能的セグメント）を欠失させるように、その免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座において改変され、且つ該非ヒト動物の内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座においてＤＨおよびＪセグメントまたはＪＬ遺伝子セグメントに作動可能に連結した複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む、非ヒト動物が提供される。そのような遺伝子座を含み、且つ内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠く非ヒト動物もまた提供される。
【００１４】
非ヒト動物においてヒト免疫グロブリン配列を生成するための方法が提供される。様々な実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、再配列され、且つ免疫グロブリン重鎖定常領域と作動可能に連結したヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖配列のレパートリー、例えば、ＶＬ、および１つもしくは複数のＤＨ、およびＪセグメント、または１つもしくは複数のＪＬセグメントに由来する。非ヒト動物、組織、および細胞においてヒト免疫グロブリン配列を生成するための方法が提供され、該ヒト免疫グロブリン配列は、対象の抗原を結合する。
【００１５】
１つの態様では、非機能的内因性齧歯動物（例えば、マウス）ＡＤＡＭ６タンパク質またはＡＤＡＭ６遺伝子を生じる改変（例えば、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子のノックアウトまたは欠失）を含む齧歯動物（例えば、マウス）を作製するための核酸構築物、細胞、胚、齧歯動物（例えば、マウス）、および方法が提供され、該齧歯動物（例えば、マウス）は、同じ種類の雄齧歯動物（例えば、マウス）において機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列を含む。１つの実施形態において、上記マウスは、齧歯動物ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする異所性ヌクレオチド配列を含む；特定の実施形態において、上記齧歯動物ＡＤＡＭ６タンパク質は、マウスＡＤＡＭ６タンパク質である。１つの実施形態において、上記マウスは、１つまたは複数の齧歯動物ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列を含み、該１つまたは複数のタンパク質は、該マウスにおいて機能的である配列番号１または配列番号２、またはその断片を含む。
【００１６】
様々な態様では、ＡＤＡＭ６活性をコードする配列は、ヒト免疫グロブリン配列と隣接する。様々な態様では、ＡＤＡＭ６活性をコードする配列は、非ヒト免疫グロブリン配列と隣接する。様々な態様では、上記配列は、上記非ヒト動物の内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座と同じ染色体上に存在する。様々な態様では、上記配列は、上記非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子座と異なる染色体上に存在する。
【００１７】
遺伝子改変された非ヒト動物は、ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログの活性を維持する改変を含み、上記改変は、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントの、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の上流への挿入を含み、且つ上記非ヒト動物はさらに、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域と同起源のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域を発現させることができる改変を含むと記載される。様々な態様では、上記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、軽鎖および重鎖の定常領域との関係において発現する。
【００１８】
様々な態様では、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントの挿入は、上記非ヒト動物のＡＤＡＭ６遺伝子の３’または下流で行われる。様々な態様では、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントの挿入は、上記非ヒト動物のＡＤＡＭ６活性が、かかる挿入を含有しない非ヒト動物と同じまたは同等なレベルにあるように、上記非ヒト動物のＡＤＡＭ６遺伝子（単数もしくは複数）が破壊されず、欠失されず、且つ／または機能的にサイレンシングされないように行われる。例示的破壊、欠失および／または機能的にサイレンシングされる改変は、上記非ヒト動物のＡＤＡＭ６遺伝子（単数または複数）によりコードされるＡＤＡＭ６タンパク質（単数または複数）の活性の低減、消去および／または喪失を生じさせる結果となる任意の改変を含む。
【００１９】
１つの態様では、内因性免疫グロブリン遺伝子座の改変を含むマウスであって、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含むマウスを作製するための、核酸構築物、細胞、胚、マウスおよび方法を提供する。１つの実施形態において、上記内因性免疫グロブリン遺伝子座は、免疫グロブリン重鎖遺伝子座であり、上記改変は、雄マウスの細胞または組織のＡＤＡＭ６活性を低減させるまたは消去する。
【００２０】
１つの態様では、マウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする異所性ヌクレオチド配列を含むマウスを提供する；マウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする内因性ヌクレオチド配列を含み、重鎖免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの遺伝子改変を含むマウスも提供する。１つの実施形態において、マウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする内因性ヌクレオチド配列は、野生型マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子と比較して、異所的な位置にある。
【００２１】
１つの態様では、内因性免疫グロブリン遺伝子座の改変を含むマウスであって、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含むマウスを作製するための方法を提供する。様々な実施形態において、上記改変は、上記内因性免疫グロブリン遺伝子座における１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントの挿入を含む。
【００２２】
１つの態様では、重鎖免疫グロブリン遺伝子座の遺伝子改変を含むマウスを作製するための方法を提供し、これらの方法の適用により、改変された重鎖免疫グロブリン遺伝子座（またはその欠失）を含む雄マウスが得られ、該雄マウスは、交配によって子孫を産生することができる。１つの実施形態において、上記雄マウスは、マウス子宮からマウス卵管を通って移行してマウス卵子を受精させることができる精子を産生できる。
【００２３】
１つの態様では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座および免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の遺伝子改変を含むマウスを作製するための方法を提供し、該重鎖遺伝子座を改変するためのこれらの方法の適用により、妊性の低減を示す雄マウスが得られ、および該マウスは、その妊性低減を全部または一部回復させる遺伝子改変を含む。様々な実施形態において、上記妊性の低減は、雄マウスの精子が、マウス子宮からマウス卵管を通って移動してマウス卵子を受精させることができないことを特徴とする。様々な実施形態において、上記妊性の低減は、ｉｎ  ｖｉｖｏ移動欠陥を示す精子を特徴とする。様々な実施形態において、上記妊性の低減を全部または一部回復させる遺伝子改変は、雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列である。
【００２４】
１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の、別の種（例えば、非マウス種）の免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座での置き換えを含む。１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、別の種（例えば、非マウス種）の免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座の内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座への挿入を含む。特定の実施形態において、上記種はヒトである。１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の全部または一部欠失を含み、該欠失は、内因性ＡＤＡＭ６機能の喪失を生じさせる結果となる。特定の実施形態において、上記内因性ＡＤＡＭ６機能の喪失は、雄マウスにおける妊性の低減に関連する。
【００２５】
１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の全部または一部の不活性化であって、内因性ＡＤＡＭ６機能の喪失を生じさせる結果とならない不活性化を含む。不活性化は、内因性非ヒト遺伝子セグメントを含む抗体の重鎖をコードするように再配列することが実質的にできない内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座を生じさせる結果となる１つまたは複数の内因性非ヒト遺伝子セグメントの置き換えまたは欠失を含み得る。不活性化は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、抗体の重鎖をコードするように再配列することができないようにする他の改変であって、内因性遺伝子セグメントの置き換えまたは欠失を含まない改変を含み得る。例示的改変は、分子技法を介した、例えば、部位特異的組み換え部位の正確な配置（例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘ技術）を使用する染色体逆位および／または転座を含む。他の例示的改変は、上記非ヒト免疫グロブリン可変遺伝子セグメントと上記非ヒト免疫グロブリン定常領域との間の作動可能な連結を無能化することを含む。
【００２６】
１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、上記非ヒト動物のゲノムに、１つまたは複数の定常領域配列（例えば、ＩｇＭおよび／またはＩｇＧ遺伝子）に作動可能に連結する別の種（例えば、非マウス種）の１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメント、および１つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメント、および必要に応じて１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメントを含有するＤＮＡ断片を挿入することを含む。１つの実施形態において、上記ＤＮＡ断片は、上記非ヒト動物のゲノムにおいて再配列を行い、重鎖定常領域に作動可能に連結した軽鎖可変ドメインをコードする配列を形成することができる。１つの実施形態において、上記種はヒトである。１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、ＡＤＡＭ６活性（例えば、コードされたタンパク質の発現および／または機能）が上記挿入を含まない非ヒト動物と同じまたは同等であるように、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントの、上記非ヒト動物の内因性ＡＤＡＭ６遺伝子の下流または３’への挿入を含む。
【００２７】
１つの態様では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の遺伝子改変を含むマウスを作製するための方法を提供し、これらの方法の適用により、改変された重鎖免疫グロブリン遺伝子座（またはその欠失）を含む雄マウスが得られ、該雄マウスは、妊性の低減を示し、そして該マウスは、その妊性低減を全部または一部回復させる遺伝子改変を含む。様々な実施形態において、上記妊性の低減は、雄マウスの精子が、マウス子宮からマウス卵管を通って移動してマウス卵子を受精させることができないことを特徴とする。様々な実施形態において、上記妊性の低減は、ｉｎ  ｖｉｖｏ移動欠陥を示す精子を特徴とする。様々な実施形態において、上記妊性の低減を全部または一部回復させる遺伝子改変は、雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列である。
【００２８】
１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座、例えば、別の種（例えば、非マウス種）の１つもしくは複数の軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子セグメント、１つもしくは複数の重鎖多様性（ＤＨ）遺伝子セグメントおよび１つもしくは複数の連結（Ｊ）遺伝子セグメント、または１つもしくは複数の軽鎖連結（ＪＬ）遺伝子セグメントで置き換えることを含む。１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、単一のオルソログ免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座ＶＬ遺伝子セグメント、少なくとも１つのＤＨ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのＪ遺伝子セグメント、または少なくとも１つのＪＬ遺伝子セグメントの、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座への挿入を含む。特定の実施形態において、上記種はヒトである。１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の全部または一部欠失を含み、該欠失は、内因性ＡＤＡＭ６機能の喪失を生じさせる結果となる。特定の実施形態において、上記内因性ＡＤＡＭ６機能の喪失は、雄マウスにおける妊性の低減に関連する。１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の全部または一部の不活性化を含み、その欠失は、内因性ＡＤＡＭ６機能の喪失を生じさせる結果とならない。不活性化は、内因性遺伝子セグメントを含む抗体の重鎖をコードするような再配列が実質的にできない内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を生じる、１つまたは複数の内因性遺伝子セグメントの置き換えまたは欠失を含み得る。不活性化は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を、抗体の重鎖をコードするように再配列することができないようにする他の改変を含んでもよく、該改変は、内因性遺伝子セグメントの置き換えまたは欠失を含まない。例示的な改変には、１つまたは複数の内因性定常領域と作動可能に連結していない重鎖遺伝子座を生じる染色体逆位および／または変化が挙げられる。
【００２９】
１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、１つまたは複数の定常領域配列（例えば、ＩｇＭ遺伝子および／またはＩｇＧ遺伝子）に作動可能に連結した別の種（例えば、非マウス種）の１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメント、１つまたは複数のＪ遺伝子セグメント、および必要に応じて１つまたは複数のＤ遺伝子セグメントを含有するＤＮＡ断片を上記マウスのゲノムへ挿入することを含む。様々な実施形態において、上記Ｊ遺伝子セグメントには、ＪＨ遺伝子セグメントまたはＪＬ遺伝子セグメントが挙げられる。１つの実施形態において、上記ＤＮＡ断片は、抗体の重鎖をコードする配列を形成するように再配列を起こすことができ、該重鎖は、再配列した、重鎖定常領域に融合したヒト軽鎖可変遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、少なくとも６個、少なくとも１６個、少なくとも３０個、または少なくとも４０個、またはそれより多くのヒトＶＬ遺伝子セグメント、および少なくとも１個または少なくとも５個のヒトＪＬ遺伝子セグメントの上記マウスのゲノムへの挿入を含む。特定の実施形態において、上記種はヒトであり、上記遺伝子セグメントはヒトκ軽鎖遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を非機能的にするような、該内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の全部または一部の欠失を含み、該欠失はさらに、内因性ＡＤＡＭ６機能の喪失を生じさせる結果となる。特定の実施形態において、内因性ＡＤＡＭ６機能の上記喪失は、雄マウスにおける妊性の低減に関連する。
【００３０】
１つの態様では、内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子からのマウスＡＤＡＭ６発現を低減させるまたは消去する改変を有する雄マウスが、内因性ＡＤＡＭ６機能の低減または消去に起因して、妊性低減（例えば、交配による子孫産生能力の高度低減）を示すまたは本質的に不妊性であるように、該改変を含み、さらに、異所性ＡＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む、マウスを提供する。１つの態様において、マウスＡＤＡＭ６発現を低減させるまたは消去する改変は、マウス免疫グロブリン遺伝子座の改変（例えば、挿入、欠失、置き換えなど）である。１つの実施形態において、上記免疫グロブリン遺伝子座は、免疫グロブリン重鎖遺伝子座である。
【００３１】
１つの実施形態において、ＡＤＡＭ６機能の低減または喪失は、マウスが、マウス子宮からマウス卵管を通って進んでマウス卵子を受精させることのできる精子を産生できないことまたは実質的に産生できないこと含む。特定の実施形態において、上記マウスの射精体積中の産生された精子細胞の少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％は、交尾後にｉｎ  ｖｉｖｏで卵管を通って進むことができず、マウス卵子を受精させることができない。
【００３２】
１つの実施形態において、ＡＤＡＭ６機能の低減または喪失は、上記マウスの精子細胞の表面でＡＤＡＭ２および／またはＡＤＡＭ３および／またはＡＤＡＭ６の複合体を形成できないことまたは実質的に形成できないことを含む。１つの実施形態において、ＡＤＡＭ６機能の喪失は、雌マウスとの交尾によってマウス卵子を受精させることが実質的にできないことを含む。
【００３３】
１つの態様において、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いているマウスであって、該マウスにＡＤＡＭ６機能性を付与するタンパク質（またはタンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列）を含むマウスを提供する。１つの実施形態において、上記マウスは雄マウスであり、上記機能性は、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いているマウスと比較して強化された妊性を含む。
【００３４】
１つの実施形態において、上記タンパク質は、上記マウスの生殖細胞系における免疫グロブリン遺伝子座内にあるゲノム配列によってコードされている。特定の実施形態において、上記免疫グロブリン遺伝子座は、重鎖遺伝子座である。もう１つの特定の実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＶＨ、少なくとも１つのヒトＤＨおよび少なくとも１つのヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。もう１つの特定の実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＶＬおよび少なくとも１つのヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む。もう１つの特定の実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＶＬ、少なくとも１つのヒトＤＨ、および少なくとも１つのヒトＪＬを含む。もう１つの特定の実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＶＬ、少なくとも１つのヒトＤＨ、および少なくとも１つのヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。もう１つの特定の実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＶＬおよび少なくとも１つのヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む。もう１つの特定の実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＶＬおよび少なくとも１つのヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。もう１つの特定の実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、６つのヒトＶκおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。もう１つの特定の実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、１６個のヒトＶκおよび５個のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。もう１つの特定の実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、３０個のヒトＶκおよび５個のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。もう１つの特定の実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、４０個のヒトＶκおよび５個のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。
【００３５】
１つの実施形態において、上記異所性タンパク質は、上記マウスの生殖細胞系における非免疫グロブリン遺伝子座内にあるゲノム配列によってコードされている。１つの実施形態において、上記非免疫グロブリン遺伝子座は、転写活性遺伝子座である。特定の実施形態において、上記転写活性遺伝子座は、ＲＯＳＡ遺伝子座である。特定の実施形態において、上記転写活性遺伝子座は、組織特異的発現と関連する。１つの実施形態において、上記組織特異的発現は、生殖組織に存在する。１つの実施形態において、上記タンパク質は、上記マウスの生殖細胞系にランダムに挿入されたゲノム配列によってコードされている。
【００３６】
１つの実施形態において、上記マウスは、ヒトまたはキメラヒト／マウスまたはキメラヒト／ラット軽鎖（例えば、ヒト可変、マウスまたはラット定常）とキメラヒト可変／マウスまたはラット定常重鎖とを含む。特定の実施形態において、上記マウスは、転写活性プロモーター、例えばＲＯＳＡ２６プロモーター、に作動可能に連結しているキメラヒト可変／ラットまたはマウス定常軽鎖遺伝子を含む導入遺伝子を含む。さらなる特定の実施形態において、上記キメラヒト／マウスまたはラット軽鎖導入遺伝子は、上記マウスの生殖細胞系内に再配列ヒト軽鎖可変領域配列を含む。
【００３７】
１つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスの生殖細胞系における免疫グロブリン遺伝子座内にある。特定の実施形態において、上記免疫グロブリン遺伝子座は、重鎖遺伝子座である。１つの実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＶＬおよび少なくとも１つのヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、少なくとも６個で、最高４０個までのヒトＶκ遺伝子セグメント、および５個のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスの生殖細胞系における非免疫グロブリン遺伝子座内にある。１つの実施形態において、上記非免疫グロブリン遺伝子座は、転写活性遺伝子座である。特定の実施形態において、上記転写活性遺伝子座は、ＲＯＳＡ２６遺伝子座である。１つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスの生殖細胞系にランダムに挿入された位置にある。
【００３８】
１つの態様では、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いているマウスであって、マウスＡＤＡＭ６機能の喪失を補う異所性ヌクレオチド配列を含むマウスを提供する。１つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスに、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を含有する対応する野生型マウスに匹敵する子孫産生能力を付与する。１つの実施形態において、上記配列は、上記マウスの精子細胞の表面でＡＤＡＭ２および／またはＡＤＡＭ３および／またはＡＤＡＭ６の複合体を形成する能力を、上記マウスに付与する。１つの実施形態において、上記配列は、上記マウスに、マウス子宮からマウス卵管を通ってマウス卵子へと進んで該卵子を受精させる能力を付与する。
【００３９】
１つの実施形態において、上記機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記マウスは、同じ年齢および系統の野生型マウスが６ヶ月の期間に産生する同腹子の数の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の数の同腹子を産生する。
【００４０】
１つの実施形態において、上記機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記マウスは、６ヶ月に期間にわたって交配させたとき、実質的に同じ期間にわたって実質的に同じ条件下で交配させた、該機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き該異所性ヌクレオチド配列を欠いている同じ年齢および同じまたは類似系統のマウスに比べて、少なくとも約１．５倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約４倍、約６倍、約７倍、約８倍または約１０以上後代を産生する。
【００４１】
１つの実施形態において、上記機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記マウスは、４または６ヶ月の交配期間中に、該機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いており該異所性ヌクレオチド配列を欠く、同じ期間交配させたマウスより、同腹子あたり平均少なくとも約２倍、３倍、４倍多い数の子を産生する。
【００４２】
１つの実施形態において、上記機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記マウスは雄マウスであり、該雄マウスは、交尾後約５〜６時間の時点で卵管から回収したとき、該機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いており該異所性ヌクレオチド配列を欠くマウスに比べて少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、１００倍、１１０倍または１２０倍以上である卵管移動を表わす精子を産生する。
【００４３】
１つの実施形態において、上記機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記マウスは、雌マウスと交尾させたとき、野生型マウスからの精子にほぼ等しい効率で約６時間以内に子宮を通過して卵管に入って卵管を通り抜けることができる精子を産生する。
【００４４】
１つの実施形態において、上記機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記マウスは、該機能的ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いており該異所性ヌクレオチド配列を欠くマウスに比べて、匹敵する期間内に約１．５倍、約２倍、約３倍または約４倍以上の同腹子を産生する。
【００４５】
１つの態様では、免疫グロブリンタンパク質をコードする非マウス核酸配列をその生殖細胞系内に含むマウスを提供し、上記非マウス免疫グロブリン配列は、マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片の挿入を含む。１つの実施形態において、上記非マウス免疫グロブリン配列は、ヒト免疫グロブリン配列を含む。１つの実施形態において、上記配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖配列を含む。１つの実施形態において、上記配列は、ヒト免疫グロブリン軽鎖配列を含む。１つの実施形態において、上記配列は、ヒト軽鎖配列と隣接したヒト重鎖配列を含む。１つの実施形態において、上記配列は、１つまたは複数のＶ遺伝子セグメント、１つまたは複数のＤ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のＪ遺伝子セグメントを含む；１つの実施形態において、上記配列は、１つまたは複数のＶ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のＪ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記１つまたは複数のＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメント、または１つまたは複数のＶおよびＪ遺伝子セグメントは、未再配列である。１つの実施形態において、上記１つまたは複数のＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメント、または１つまたは複数のＶおよびＪ遺伝子セグメントは、再配列される。１つの実施形態において、上記１つまたは複数のＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメント、または１つまたは複数のＶおよびＪ遺伝子セグメントの再配列後、上記マウスは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードする少なくとも１つの核酸配列をそのゲノム内に含む。１つの実施形態において、再配列後、上記マウスは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードする少なくとも２つの核酸配列をそのゲノム内に含む。１つの実施形態において、再配列後、上記マウスは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードする少なくとも１つの核酸配列をそのゲノム内に含む。１つの実施形態において、上記マウスは、上記ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をＢ細胞内に含む。１つの実施形態において、上記マウスは、上記ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を非Ｂ細胞内に含む。
【００４６】
１つの態様では、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域またはその機能的断片を内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座から発現するマウスであって、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性を含むマウスを提供する。１つの実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のＪＬ遺伝子セグメント、および必要に応じて、１つまたは複数のＤＨ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、少なくとも６個のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５個のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、少なくとも１６個のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５個のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、少なくとも３０個のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５個のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、少なくとも４０個のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５個のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。
【００４７】
１つの態様では、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域またはその機能的断片を内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座から発現するマウスであって、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性を含むマウスを提供する。
【００４８】
１つの実施形態において、上記雄マウスは、単一の未改変内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子またはそのオルソログもしくは（ｏｆ）ホモログもしくは機能的断片を内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座に含む。
【００４９】
１つの実施形態において、上記雄マウスは、ＡＤＡＭ６機能を付与するタンパク質をコードする異所性マウスＡＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。
【００５０】
１つの実施形態において、上記雄マウスは、内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子の場所に近いマウスゲノム内の場所（例えば、最後のＶ遺伝子セグメント配列の３’および最初のＪ遺伝子セグメントの５’）にＡＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。
【００５１】
１つの実施形態において、上記雄マウスは、内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子の場所とは異なるマウスゲノム内の場所（例えば、Ｖ遺伝子遺伝子座の最も５’のＶ遺伝子セグメント配列の５’）にＡＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。
【００５２】
１つの実施形態において、上記雄マウスは、免疫グロブリンＶ遺伝子セグメントおよび／または免疫グロブリンＪ遺伝子セグメントをコードする核酸配列の（ＡＤＡＭ６配列の転写方向に関して）上流、下流、または上流および下流に隣接するＡＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。特定の実施形態において、上記免疫グロブリンＶおよびＪ遺伝子セグメントは、ヒト遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記免疫グロブリンＶ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントは、ヒト遺伝子セグメントであり、マウスにおいて機能的なマウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする配列は、ヒトＶ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントとの間にある；１つの実施形態において、上記マウスは、２つ以上のヒトＶ遺伝子セグメントを含み、上記配列は、最も５’のヒトＶ遺伝子セグメントの５’の位置にある；１つの実施形態において、上記マウスは、２つ以上のヒトＶ遺伝子セグメントを含み、上記配列は、上記最後のＶ遺伝子セグメントと最後から二番目のＶ遺伝子セグメントとの間の位置にある；１つの実施形態において、上記マウスは、複数のヒトＶ遺伝子セグメントを含み、上記配列は、最も５’のヒトＶ遺伝子セグメントの上流の位置にある；１つの実施形態において、上記マウスは、Ｄ遺伝子セグメントをさらに含み、上記配列は、最も３’のＶ遺伝子セグメントおよび最も５’のＤ遺伝子セグメントの次に来る位置にあり、１つの実施形態において、上記配列は、Ｖ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントとの間の位置にある。
【００５３】
１つの実施形態において、上記ヒトＶ遺伝子セグメントは、軽鎖Ｖ遺伝子セグメントである。特定の実施形態において、上記軽鎖Ｖ遺伝子セグメントは、Ｖκ遺伝子セグメントである。もう１つの特定の実施形態において、上記軽鎖Ｖ遺伝子セグメントは、Ｖλ遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記Ｊ遺伝子セグメントは、ＪＨ遺伝子セグメントおよびＪＬ遺伝子セグメントから選択される。特定の実施形態において、上記ＪＬ遺伝子セグメントは、Ｊκ遺伝子セグメントである。もう１つの特定の実施形態において、上記ＪＬ遺伝子セグメントは、Ｊλ遺伝子セグメントである。
【００５４】
１つの実施形態において、上記雄マウスは、野生型雄マウスと同じまたは実質的に同じ内因性免疫グロブリン遺伝子座内の位置に配置されるＡＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。特定の実施形態において、上記内因性遺伝子座は、抗体の重鎖可変領域であって、内因性非ヒト遺伝子セグメントを含み、またはそれに由来する可変領域をコードすることができない。特定の実施形態において、上記内因性遺伝子座は、上記遺伝子座の上記重鎖遺伝子セグメントが上記雄マウスにおいて抗体の重鎖可変領域をコードできないようにした該雄マウスのゲノムの位置に置かれる。様々な実施形態において、上記雄マウスは、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントと同じ染色体上に位置するＡＤＡＭ６配列を含み、上記ＡＤＡＭ６配列は、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする。
【００５５】
１つの態様では、非機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子、または内因性ＡＤＡＭ６遺伝子の欠失をその生殖細胞系内に含む雄マウスを提供し、該マウスの精子細胞は、雌マウスの卵管を通過することができ、卵子を受精させることができる。１つの実施形態において、上記マウスは、雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片の染色体外コピーを含む。１つの実施形態において、上記マウスは、雄マウスにおいて機能的である異所性マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を含む。
【００５６】
１つの態様では、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子および内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に対する改変を含む雄マウスを提供する。１つの実施形態において、上記改変は、上記内因性ＡＤＡＭ６遺伝子または遺伝子座の下流または３’で作製される。１つの実施形態において、上記改変は、１つまたは複数の内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントによる置き換えである。１つの実施形態において、上記改変は、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントの、内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子の上流への挿入である。
【００５７】
１つの態様において、内因性ＡＤＡＭ６機能を低減させる遺伝子改変を含むマウスであって、全部もしくは一部機能的である内因性未改変対立遺伝子（例えば、ヘテロ接合体）によってあるいは雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする異所性配列からの発現によってもたらされる、少なくともいくらかのＡＤＡＭ６機能性を含むマウスを提供する。様々な実施形態において、上記ＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片は、配列番号１、配列番号２、またはそれらの組み合わせに示されたＡＤＡＭ６タンパク質をコードする核酸配列を含む。
【００５８】
１つの実施形態において、上記マウスは、機能的ＡＤＡＭ６を欠いている雄マウスと比較して、交配により子孫を産生する能力を雄マウスに付与するのに十分なＡＤＡＭ６機能を含む。１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６機能は、マウスＡＤＡＭ６またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードする異所性ヌクレオチド配列の存在によって付与される。１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６機能は、内因性免疫グロブリン遺伝子座に存在する内因性ＡＤＡＭ６遺伝子により付与され、ここで、上記マウスは、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座セグメントを含む抗体を発現することができない。雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６ホモログもしくはオルソログまたはその断片としては、十分な内因性ＡＤＡＭ６活性を欠く雄マウスにおいて観察される子孫産生能力の喪失、例えば、ＡＤＡＭ６ノックアウトマウスにおいて観察される能力の喪失を全部または一部回復させるものが挙げられる。この意味で、ＡＤＡＭ６ノックアウトマウスには、内因性遺伝子座またはその断片を含むが機能的でない、すなわち、ＡＤＡＭ６（ＡＤＡＭ６ａおよび／もしくはＡＤＡＭ６ｂ）をまったく発現しない、または野生型雄マウスの本質的に正常な子孫産生能力を支持するのに不十分であるレベルでＡＤＡＭ６（ＡＤＡＭ６ａおよび／もしくはＡＤＡＭ６ｂ）を発現するマウスが含まれる。機能の喪失は、例えば、上記遺伝子座の構造遺伝子（すなわちＡＤＡＭ６ａもしくはＡＤＡＭ６ｂコーディング領域）の改変、または上記遺伝子座の調節領域（例えば、ＡＤＡＭ６ａ遺伝子に対して５’のまたはＡＤＡＭ６ａもしくはＡＤＡＭ６ｂコーディング領域の３’の配列であって、ＡＤＡＭ６遺伝子の転写、ＡＤＡＭ６  ＲＮＡの発現またはＡＤＡＭ６タンパク質の発現を全部または一部制御する配列）の改変に起因し得る。様々な実施形態において、雄マウスにおいて機能的であるオルソログもしくはホモログまたはその断片は、雄マウスの精子（または雄マウスの射精液中の大部分の精子細胞）がマウス卵管を通過してマウス卵子を受精させることを可能にするものである。
【００５９】
１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン可変領域またはその機能的断片を発現する雄マウスは、雌マウスとの交配により子孫を産生する能力を該雄マウスに付与するのに十分なＡＤＡＭ６活性を含み、１つの実施形態において、雌マウスと交配するとき、上記雄マウスは、１つまたは２つの内因性未改変ＡＤＡＭ６対立遺伝子を有するマウスの子孫産生能力の、１つの実施形態では少なくとも２５％、１つの実施形態では少なくとも３０％、１つの実施形態では少なくとも４０％、１つの実施形態では少なくとも５０％、１つの実施形態では少なくとも６０％、１つの実施形態では少なくとも７０％、１つの実施形態では少なくとも８０％、１つの実施形態では少なくとも９０％、および１つの実施形態では該マウスの子孫産生能力とほぼ同じである、子孫産生能力を示す。
【００６０】
１つの実施形態において、雄マウスは、該雄マウスからの精子細胞が雌マウス卵巣を通り抜けることおよびマウス卵子を受精させることを可能にするために十分なＡＤＡＭ６（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）を発現する。
【００６１】
１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６機能性は、マウス染色体配列に隣接する核酸配列によって付与される（例えば、上記核酸は、マウス染色体にランダムに組み込まれている；または例えば、上記核酸を特定の場所にターゲティングすることにより、例えば部位特異的リコンビナーゼ媒介（例えば、Ｃｒｅ媒介）挿入もしくは相同組換えにより、特定の場所に配置されている）。１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６配列は上記マウスの染色体とは異なる核酸上に存在する（例えば、上記ＡＤＡＭ６配列は、エピソーム上に、すなわち染色体外に、例えば、発現構築物、ベクター、ＹＡＣ、導入染色体などに存在する）。
【００６２】
１つの態様では、内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座の改変を含む遺伝子改変マウスおよび細胞を提供し、該マウスは、免疫グロブリン軽鎖配列の少なくとも一部分、例えば、ヒト配列の少なくとも一部分を発現し、該マウスは、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性を含む。１つの実施形態において、上記改変は、上記マウスのＡＤＡＭ６活性を低減させるまたは根絶する。１つの実施形態では、上記マウスは、ＡＤＡＭ６活性をコードする両方の対立遺伝子が、不在であるように、または雄マウスにおいて正常交配を支持するように実質的に機能しないＡＤＡＭ６を発現するように、改変される。１つの実施形態において、上記マウスは、マウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする異所性核酸配列をさらに含む。１つの実施形態において、上記改変は、上記マウスのＡＤＡＭ６活性を維持し、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、抗体の重鎖をコードすることができないようにする。特定の実施形態において、上記改変は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、抗体の重鎖可変領域をコードするように再配列することができないようにする染色体逆位およびまたは（ａｎｄ  ｏｒ）転座を含む。
【００６３】
１つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含む遺伝子改変マウスおよび細胞を提供し、該改変は、該遺伝子座のＡＤＡＭ６配列から発現するＡＤＡＭ６活性を低減させるまたは消去するものであり、および該マウスは、ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を含む。様々な実施形態において、上記ＡＤＡＭ６タンパク質またはその断片は、異所性ＡＤＡＭ６配列によってコードされている。様々な実施形態において、上記ＡＤＡＭ６タンパク質またはその断片は、内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子から発現する。様々な実施形態において、上記マウスは、第一の重鎖対立遺伝子からの機能的ＡＤＡＭ６の発現を低減させるまたは消去する第一の改変を含む第一の重鎖対立遺伝子と、第二の重鎖対立遺伝子からの機能的ＡＤＡＭ６の発現を実質的に低減させないまたは消去しない第二の改変を含む第二の重鎖対立遺伝子とを含む。
【００６４】
様々な実施形態において、上記改変は、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントの、内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子の上流、または５’への挿入である。様々な実施形態において、上記改変は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に配置される上記内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を維持する。
【００６５】
１つの実施形態において、上記第二の改変は、最後のマウスＶ遺伝子グメントの（マウスＶ遺伝子セグメントの転写方向性を基準にして）３’にあり、およびマウス（またはキメラヒト／マウス）免疫グロブリン重鎖定常遺伝子またはその断片（例えば、ヒトおよび／またはマウス：ＣＨ１および／またはヒンジおよび／またはＣＨ２および／またはＣＨ３をコードする核酸配列）の（定常配列の転写方向性を基準にして）５’にある。
【００６６】
１つの実施形態において、上記改変は、第一のＡＤＡＭ６対立遺伝子をコードする第一の遺伝子座の第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子におけるものであり、および上記ＡＤＡＭ６機能は、機能的ＡＤＡＭ６をコードする第二の遺伝子座の第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子での内因性ＡＤＡＭ６の発現の結果として生じ、上記第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子は、Ｖ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントの少なくとも１つの改変を含む。特定の実施形態において、上記Ｖ、ＤおよびまたはＪ遺伝子セグメントの上記少なくとも１つの改変は、欠失、ヒトＶ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントでの置き換え、ラクダ科動物Ｖ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントでの置き換え、ヒト化またはラクダ化Ｖ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントでの置き換え、重鎖配列の軽鎖配列での置き換え、ならびにその組み合わせである。１つの実施形態において、上記少なくとも１つの改変は、上記重鎖遺伝子座における１つまたは複数の重鎖Ｖ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントの欠失ならびに１つまたは複数の軽鎖Ｖおよび／またはＪ遺伝子セグメント（例えば、ヒト軽鎖Ｖおよび／またはＪ遺伝子セグメント）での置き換えである。
【００６７】
１つの実施形態において、上記改変は、第一の遺伝子座の第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子、および第二の遺伝子座の第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子におけるものであり、上記ＡＤＡＭ６機能は、上記マウスの生殖細胞系における非免疫グロブリン遺伝子座での異所性ＡＤＡＭ６発現の結果として生ずる。特定の実施形態において、上記非免疫グロブリン遺伝子座は、ＲＯＳＡ２６遺伝子座である。特定の実施形態において、上記非免疫グロブリン遺伝子座は、生殖組織において転写活性である。
【００６８】
１つの実施形態において、上記改変は、第一の遺伝子座の第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子および第二の遺伝子座の第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子におけるものであり、上記ＡＤＡＭ６機能は、上記マウスの生殖細胞系における内因性ＡＤＡＭ６遺伝子の結果として生ずる。特定の実施形態において、上記内因性ＡＤＡＭ６遺伝子は、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントのそばに並列される。
【００６９】
１つの実施形態において、上記改変は、第一の遺伝子座の第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子および第二の遺伝子座の第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子におけるものであり、上記ＡＤＡＭ６機能は、上記第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子での異所性ＡＤＡＭ６配列の発現の結果として生ずる。１つの実施形態において、上記改変は、第一の遺伝子座の第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子および第二の遺伝子座の第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子におけるものであり、上記ＡＤＡＭ６機能または活性は、上記第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子での異所性ＡＤＡＭ６の発現の結果として生ずる。
【００７０】
１つの態様では、ＡＤＡＭ６のヘテロ接合またはホモ接合ノックアウトを含むマウスを提供する。１つの実施形態において、上記マウスは、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン配列またはラクダ科動物もしくはラクダ化ヒトもしくはマウス免疫グロブリン配列である、改変免疫グロブリン配列をさらに含む。１つの実施形態において、上記改変免疫グロブリン配列は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する。１つの実施形態において、上記改変免疫グロブリン配列は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座にヒト軽鎖可変領域配列を含む。１つの実施形態において、上記ヒト軽鎖可変領域配列は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の内因性重鎖可変配列を置き換える。１つの実施形態において、上記改変免疫グロブリン配列は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座にヒトκ軽鎖可変領域配列を含む。１つの実施形態において、上記改変免疫グロブリン配列は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座にヒトλ軽鎖可変領域配列を含む。
【００７１】
１つの態様では、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座から機能的内因性ＡＤＡＭ６を発現できないマウスを提供する。１つの実施形態において、上記マウスは、該マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６またはその機能的断片をコードする異所性核酸配列を含む。特定の実施形態において、上記異所性核酸配列は、ＡＤＡＭ６ノックアウトに関してホモ接合性である雄マウスによって示される子孫産生能力の喪失をレスキューするタンパク質をコードする。特定の実施形態において、上記異所性核酸配列は、マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする。
【００７２】
１つの態様では、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を欠いているマウスであって、該マウスにＡＤＡＭ６機能を付与する異所性核酸配列を含むマウスを提供する。１つの実施形態において、上記核酸配列は、内因性ＡＤＡＭ６配列またはその機能的断片を含む。１つの実施形態において、上記内因性ＡＤＡＭ６配列は、野生型マウスにおける最も３’側の（ｔｈｅ  ３’−ｍｏｓｔ）マウス免疫グロブリン重鎖Ｖ遺伝子セグメント（ＶＨ）と最も５’側の（ｔｈｅ  ５’−ｍｏｓｔ）マウス免疫グロブリン重鎖Ｄ遺伝子セグメント（ＤＨ）の間にあるＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂコード配列を含む。
【００７３】
１つの実施形態において、上記核酸配列は、マウスＡＤＡＭ６ａもしくはその機能的断片をコードする配列、および／またはマウスＡＤＡＭ６ｂもしくはその機能的断片をコードする配列を含み、該ＡＤＡＭ６ａおよび／もしくはＡＤＡＭ６ｂまたはその機能的断片（単数もしくは複数）は、プロモーターに作動可能に連結している。１つの実施形態において、上記プロモーターは、ヒトプロモーターである。１つの実施形態において、上記プロモーターは、マウスＡＤＡＭ６プロモーターである。特定の実施形態において、上記ＡＤＡＭ６プロモーターは、最も５’側のマウスＤＨ遺伝子セグメントに最も近い第一のＡＤＡＭ６遺伝子の第一コドンと、最も５’側のＤＨ遺伝子セグメントの組換えシグナル配列との間にある配列を含み、この場合の５’は、マウス免疫グロブリン遺伝子の転写方向に関して示される。１つの実施形態において、上記プロモーターは、ウイルスプロモーターである。特定の実施形態において、上記ウイルスプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。１つの実施形態において、上記プロモーターは、ユビキチンプロモーターである。
【００７４】
１つの実施形態において、上記プロモーターは、誘導性プロモーターである。１つの実施形態において、上記誘導性プロモーターは、非生殖組織での発現を調節する。１つの実施形態において、上記誘導性プロモーターは、生殖組織での発現を調節する。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６ａおよび／もしくはＡＤＡＭ６ｂ配列またはその機能的断片（単数もしくは複数）の発現は、生殖組織において誘導性プロモーターによって発生調節される。
【００７５】
１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはＡＤＡＭ６ｂは、配列番号１のＡＤＡＭ６ａおよび／または配列番号２の配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）のＡＤＡＭ６ｂから選択される。
【００７６】
１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６プロモーターは、配列番号３のプロモーターである。特定の実施形態において、上記ＡＤＡＭ６プロモーターは、ＡＤＡＭ６ａの第一コドンの（ＡＤＡＭ６ａの転写方向に関して）直ぐ上流の配列番号３の核酸配列であって、ＡＤＡＭ６コーディング領域の上流の配列番号３の端にわたる（ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ）核酸配列を含む。もう１つの特定の実施形態において、上記ＡＤＡＭ６プロモーターは、ＡＤＡＭ６ａの開始コドンの上流約５から約２０ヌクレオチド以内からＡＤＡＭ６ａの開始コドンの約０．５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂまたは３ｋｂ以上上流にわたる断片である。
【００７７】
１つの実施形態において、上記核酸配列は、ＡＤＡＭ６欠如のため不妊性であるまたは妊性が低いマウスの体内に配置されたとき、妊性を向上させるまたは妊性をほぼ野生型の妊性に回復させる、配列番号３またはその断片を含む。１つの実施形態において、配列番号３またはその断片は、雌マウス卵管を通過してマウス卵子を受精させることができる精子細胞を産生する能力を雄マウスに付与する。
【００７８】
１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６プロモーターは、配列番号４のプロモーターである。特定の実施形態において、上記ＡＤＡＭ６プロモーターは、ＡＤＡＭ６ａの第一コドンの（ＡＤＡＭ６ａの転写方向に関して）直ぐ上流の配列番号４の核酸配列であって、ＡＤＡＭ６コーディング領域の上流の配列番号４の端にわたる（ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ）核酸配列を含む。もう１つの特定の実施形態において、上記ＡＤＡＭ６プロモーターは、ＡＤＡＭ６ａの開始コドンの上流約５から約２０ヌクレオチド以内からＡＤＡＭ６ａの開始コドンの約０．５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂまたは３ｋｂ以上上流にわたる断片である。
【００７９】
１つの実施形態において、上記核酸配列は、ＡＤＡＭ６欠如のため不妊性であるまたは妊性が低いマウスの体内に配置されたとき、妊性を向上させるまたは妊性をほぼ野生型の妊性に回復させる、配列番号４またはその断片を含む。１つの実施形態において、配列番号４またはその断片は、雌マウス卵管を通過してマウス卵子を受精させることができる精子細胞を産生する能力を雄マウスに付与する。
【００８０】
１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６プロモーターは、配列番号５のプロモーターである。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６プロモーターは、ＡＤＡＭ６ａの第１コドンの（ＡＤＡＭ６ａの転写方向に関して）直ぐ上流の配列番号５の核酸配列を含み、ＡＤＡＭ６コーディング領域の上流の配列番号５の末端までわたる。もう１つの特定の実施形態において、上記ＡＤＡＭ６プロモーターは、ＡＤＡＭ６ａの開始コドンの上流の約５ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチド以内からＡＤＡＭ６ａの開始コドンの約０．５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂまたは３ｋｂ以上上流にわたる断片である。
【００８１】
１つの実施形態において、上記核酸配列は、ＡＤＡＭ６欠如のため不妊性であるまたは妊性が低いマウスの体内に配置されたとき、妊性を向上させるまたは妊性をほぼ野生型の妊性に回復させる、配列番号５またはその断片を含む。１つの実施形態において、配列番号５またはその断片は、雌マウス卵管を通過してマウス卵子を受精させることができる精子細胞を産生する能力を雄マウスに付与する。
【００８２】
様々な実施形態において、上記マウスにＡＤＡＭ６機能を付与する異所性核酸配列は、１つまたは複数のＡＤＡＭ６タンパク質をコードし、該１つまたは複数のＡＤＡＭ６タンパク質は、配列番号１、配列番号２、またはそれらの組み合わせを含む。
【００８３】
様々な実施形態において、上記異所性核酸配列は、配列番号３、配列番号４、および配列番号５から選択される配列を含み、該異所性核酸配列は、該異所性核酸配列によってコードされる１つまたは複数のＡＤＡＭ６タンパク質によって上記マウスにＡＤＡＭ６機能を付与する。
【００８４】
１つの実施形態において、上記核酸配列は、マウスの体内に配置され、またはマウスにおいて維持されたとき、野生型マウスと同じまたは同等の妊性のレベルを生ずる、ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードする任意の配列である。妊性の例示的レベルは、雄マウスの、雌マウス卵管を通過してマウス卵子を受精させることができる精子細胞を産生する能力により実証され得る。
【００８５】
１つの態様では、ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする内因性ヌクレオチド配列の欠失と、内因性ＶＨ遺伝子セグメントの、ヒトＶＨ遺伝子セグメントでの置き換えと、雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする異所性ヌクレオチド配列とを含むマウスを提供する。
【００８６】
１つの態様では、ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする内因性ヌクレオチド配列の欠失と、内因性ＶＨ遺伝子セグメントの、ヒトＶＬ遺伝子セグメントでの置き換えと、雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする異所性ヌクレオチド配列とを含むマウスを提供する。１つの実施形態において、上記ヒトＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記ＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖλ遺伝子セグメントである。
【００８７】
１つの実施形態において、上記マウスはさらに、ヒトＪＬ遺伝子セグメントを含み、雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする異所性ヌクレオチド配列は、ヒトＶＬ遺伝子セグメントと該ヒトＪＬ遺伝子セグメントの間に位置する。１つの実施形態において、上記マウスは、１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメント、および１つまたは複数のＶＬ遺伝子セグメントを含み、雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする異所性ヌクレオチド配列は、該１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントの上流（または５’側）に位置する。特定の実施形態において、上記ヒトＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントは、ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントである。
【００８８】
１つの実施形態において、上記マウスは、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を含む内因性免疫グロブリン遺伝子座ヌクレオチド配列の欠失を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列を含み、および上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、該１つまたは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列内にある、または該１つまたは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列に直接隣接する。
【００８９】
１つの実施形態において、上記マウスは、１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列でのすべてのまたは実質的にすべての内因性ＶＨ遺伝子セグメントの置き換えを含み、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、該１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列内にあるか、該１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列に直接隣接する。１つの実施形態において、上記マウスは、内因性ＤＨ遺伝子遺伝子座における１つまたは複数の内因性ＤＬ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒトＶＬおよび／またはヒトＪＬ遺伝子セグメントでの置き換えをさらに含む。１つの実施形態において、上記マウスは、内因性ＪＨ遺伝子遺伝子座における１つまたは複数の内因性ＪＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントでの置き換えをさらに含む。１つの実施形態において、上記マウスは、すべてのまたは実質的にすべての内因性ＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの置き換え、ならびに内因性ＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子遺伝子座における、ヒトＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントでの置き換えを含み、この場合のマウスは、マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性配列を含む。１つの実施形態において、上記マウスは、１つまたは複数のヒトＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントの、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座での挿入を含み、上記マウスは、該マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６遺伝子を含む。特定の実施形態において、上記ヒトＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントは、ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントである。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性配列は、存在するヒトＶＬ遺伝子セグメントの最も３’側の末端から二番目のＶＬ遺伝子セグメントと、存在するヒトＪＬ遺伝子セグメントの最終（ｕｌｔｉｍａｔｅ）の最も５’側のＪＬ遺伝子セグメントとの間に配置される。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性配列は、存在する上記ヒトＶＬ遺伝子セグメントの最も５’側のＶＬ遺伝子セグメントの上流（または５’側）に配置される。特定の実施形態において、上記マウスは、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントの欠失、および少なくとも４０のヒトＶＬ遺伝子セグメントでの置き換えを含み、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、ヒトＶκ４−１遺伝子セグメントかつヒトＪκ１遺伝子セグメントの上流に配置されている。特定の実施形態において、上記マウスは、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントの欠失、および少なくとも４０個のヒトＶＬ遺伝子セグメントでの置き換えを含み、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、ヒトＶκ２−４０遺伝子セグメントの上流に配置されている。
【００９０】
特定の実施形態において、上記マウスは、１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列での、すべてのまたは実質的にすべての内因性ＶＨ遺伝子セグメントの置き換えを含み、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、該１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド内にあるか、該１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチドに直接隣接する。
【００９１】
１つの実施形態において、上記ＶＬ遺伝子セグメントはＶκ遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記ＶＬ遺伝子セグメントはＶλ遺伝子セグメントである。
【００９２】
１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスのゲノム内の導入遺伝子上に存在する。１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスの染色体外に存在する。
【００９３】
１つの態様では、内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座の改変を含むマウスであって、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している再配列免疫グロブリン配列を含むＢ細胞を発現するマウスを提供し、該Ｂ細胞は、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする遺伝子をそのゲノム内（例えば、Ｂ細胞染色体上）に含む。１つの実施形態において、上記重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している再配列免疫グロブリン配列は、ヒト軽鎖Ｖ、Ｊおよび必要に応じてＤ遺伝子配列；マウス重鎖Ｖ、Ｄおよび／またはＪ配列；ヒトまたはマウス軽鎖Ｖおよび／またはＪ配列を含む。１つの実施形態において、上記重鎖定常領域遺伝子配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびその組み合わせからなる群より選択されるヒトまたはマウス重鎖配列を含む。
【００９４】
１つの実施形態では、上記ヒト軽鎖Ｖおよび／またはＪ配列は、ヒトＶκ、Ｖλ、ＪκおよびＪλ配列から選択される。
【００９５】
１つの態様では、機能的にサイレンシングされた内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むマウスを提供し、ＡＤＡＭ６機能が上記マウス内に維持され、さらに、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの挿入を含み、ここで、上記１つまたは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、ヒトＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメント、および必要に応じてヒトＤＨ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記１つまたは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、ヒトＶκ、Ｖλ、ＪκおよびＪλ遺伝子配列を含む。
【００９６】
１つの態様では、遺伝子改変マウスであって、機能的にサイレンシングされた免疫グロブリン軽鎖遺伝子を含み、１つまたは複数の内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントでの置き換えをさらに含み；機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を欠き；および雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を発現する異所性ヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変マウスを提供する。
【００９７】
１つの態様では、遺伝子改変マウスであって、機能的にサイレンシングされた免疫グロブリン軽鎖遺伝子遺伝子座を含み、１つまたは複数の内因性免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントでの置き換えをさらに含み；機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を欠き；および雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする異所性ヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変マウスを提供する。
【００９８】
１つの実施形態において、上記１つまたは複数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントは、上記異所性ヌクレオチド配列と近接している。
【００９９】
１つの態様では、機能的内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を欠き、およびマウスＡＤＡＭ６遺伝子座またはマウスＡＤＡＭ６遺伝子座もしくは配列の機能的断片をコードする異所性ヌクレオチド配列を含むマウスであって、異性のマウスと交配して、該異所性ＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を含む後代を産生することができるマウスを提供する。１つの実施形態において、上記マウスは雄である。１つの実施形態において、上記マウスは雌である。
【０１００】
１つの態様では、遺伝子改変マウスであって、内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子遺伝子座にヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含み；該内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子遺伝子座に内因性機能的ＡＤＡＭ６配列を欠き；および雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を発現する異所性ヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変マウスを提供する。
【０１０１】
１つの態様では、遺伝子改変マウスであって、内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子遺伝子座にヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントを含み；該内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座に内因性機能的ＡＤＡＭ６配列を欠き；および雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を発現する異所性ヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変マウスを提供する。
【０１０２】
１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質を発現する異所性ヌクレオチド配列は、染色体外のものである。１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質を発現する異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスのゲノム内の１つまたは複数の遺伝子座に組み込まれている。特定の実施形態において、上記１つまたは複数の遺伝子座は、免疫グロブリン遺伝子座を含む。
【０１０３】
１つの態様では、ヒトＶＬ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメント、および必要に応じてＤＨ遺伝子セグメントに由来する免疫グロブリン軽鎖配列を改変内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座から発現するマウスであって、該マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性を含むマウスを提供する。１つの実施形態において、上記ヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκおよびＶλ遺伝子セグメントから選択される。種々の実施形態において、上記Ｊ遺伝子セグメントは、ＪＨ、ＪκまたはＪλ遺伝子セグメントまたはそれらの組み合わせである。
【０１０４】
１つの実施形態において、上記マウスは、複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび複数のＪ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態では、Ｊ遺伝子セグメントはＪＬ遺伝子セグメントである。
【０１０５】
１つの態様では、免疫グロブリン軽鎖配列を改変内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座から発現するマウスであって、該重鎖が、ヒトＶＬ遺伝子セグメントおよびＪＬ遺伝子セグメントに由来し、該マウスは、該マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性を含むマウスを提供する。
【０１０６】
１つの実施形態において、上記マウスは、複数のヒトＶ遺伝子セグメント、複数のＪ遺伝子セグメント、および必要に応じて複数のＤ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記Ｄ遺伝子セグメントは、ヒトＤ遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記Ｊ遺伝子セグメントは、ヒトＪ遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記マウスは、ヒト化重鎖定常領域配列をさらに含み、該ヒト化は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびその組み合わせから選択される配列の置き換えを含む。特定の実施形態において、上記重鎖は、ヒトＶ遺伝子セグメント、ヒトＪ遺伝子セグメント、ヒトＣＨ１配列、ヒトまたはマウスヒンジ配列、マウスＣＨ２配列、およびマウスＣＨ３配列に由来する。もう１つの特定の実施形態において、上記マウスは、ヒト軽鎖定常配列をさらに含む。１つの実施形態において、上記マウスは、５’および３’が内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントに隣接するＡＤＡＭ６遺伝子を含む。特定の実施形態において、上記内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントは、抗体の重鎖可変領域をコードすることができない。特定の実施形態において、上記マウスのＡＤＡＭ６遺伝子は、野生型マウスのものと同じ位置にあり、上記マウスの内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座は、抗体の重鎖をコードするように再配列することができない。
【０１０７】
１つの実施形態において、上記複数のヒトＶ遺伝子セグメントは、（該Ｖ遺伝子セグメントの転写方向に関して）５’が、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性をコードする配列に隣接する。特定の実施形態において、上記複数のヒトＶ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ遺伝子セグメントＶκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ７−３、Ｖκ２−４、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ３−７、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ２−１０、Ｖκ３−１１、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ２−１４、Ｖκ３−１５、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ３−２０、Ｖκ６−２１、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ３−２５、Ｖκ２−２６、Ｖκ１−２７、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ３−３１、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ３−３４、Ｖκ１−３５、Ｖκ２−３６、Ｖκ１−３７、Ｖκ２−３８、Ｖκ１−３９およびＶκ２−４０を包含し、そしてヒトＶκ２−４０遺伝子セグメントは、（該ヒトＶκ２−４０遺伝子セグメントの転写方向に関して）５’が、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性をコードする配列に隣接する。特定の実施形態において、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性をコードする配列は、ヒトＶκ遺伝子セグメントに関して同じ転写方向に配置される。特定の実施形態では、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性をコードする配列は、ヒトＶκ遺伝子セグメントに関して反対の転写方向に配置される。
【０１０８】
１つの実施形態において、上記Ｖ遺伝子セグメントは、（該Ｖ遺伝子セグメントの転写方向に関して）３’が、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性をコードする配列に隣接する。
【０１０９】
１つの実施形態において、上記Ｄ遺伝子セグメントは、（該Ｄ遺伝子セグメントの転写方向に関して）５’が、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性をコードする配列に隣接する。
【０１１０】
１つの実施形態において、上記Ｊ遺伝子セグメントは、（該Ｊ遺伝子セグメントの転写方向に関して）５’が、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性をコードする配列に隣接する。
【０１１１】
１つの実施形態において、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性は、上記改変内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座の（Ｖ遺伝子セグメントの転写の方向を基準して）最も５’側のＤ遺伝子セグメントの５’および最も最も３’側のＶ遺伝子セグメントの３’にあるヌクレオチド配列の発現の結果として生ずる。
【０１１２】
１つの実施形態において、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性は、上記改変内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の（Ｖ遺伝子セグメントの転写の方向を基準して）最も５’側のJ遺伝子セグメントの５’および最も３’側のＶ遺伝子セグメントの３’に
あるヌクレオチド配列の発現の結果として生ずる。
【０１１３】
１つの実施形態において、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性は、上記改変内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における２つのヒトＶ遺伝子セグメントの間にあるヌクレオチド配列の発現の結果として生ずる。１つの実施形態において、上記２つのヒトＶ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ５−２遺伝子セグメントおよびＶκ４−１遺伝子セグメントである。
【０１１４】
１つの実施形態において、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性は、上記改変内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるヒトＶ遺伝子セグメントとヒトＪ遺伝子セグメントとの間にあるヌクレオチド配列の発現の結果として生ずる。１つの実施形態において、上記ヒトＶ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ４−１遺伝子セグメントであり、上記ヒトＪセグメントはＪκ１遺伝子セグメントである。
【０１１５】
１つの実施形態において、上記ヌクレオチド配列は、マウスＡＤＡＭ６ｂ配列またはその機能的断片、マウスＡＤＡＭ６ａ配列またはその機能的断片、およびその組み合わせから選択される配列を含む。
【０１１６】
種々の実施形態において、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性をコードする配列は、配列番号２に示されるＡＤＡＭ６ｂタンパク質および／または配列番号１に示すＡＤＡＭ６ａタンパク質をコードする。
【０１１７】
１つの実施形態において、上記２つのヒトＶ遺伝子セグメント間のヌクレオチド配列は、該ヒトＶ遺伝子セグメントに関して反対の転写方向に配置されている。特定の実施形態において、上記ヌクレオチド配列は、ＡＤＡＭ６遺伝子の転写方向に関して５’から３’へ、ＡＤＡＭ６ａ配列、続いてＡＤＡＭ６ｂ配列をコードする。１つの実施形態において。
【０１１８】
１つの実施形態において、上記ヒトＶ遺伝子セグメントと上記ヒトＪ遺伝子セグメントとの間のヌクレオチド配列は、該ヒトＶ遺伝子セグメントおよびヒトＪ遺伝子セグメントに関して反対の転写方向に配置されている。特定の実施形態において、上記ヌクレオチド配列は、ＡＤＡＭ６遺伝子の転写方向に関して５’から３’へ、ＡＤＡＭ６ａ配列、続いてＡＤＡＭ６ｂ配列をコードする。
【０１１９】
１つの実施形態において、上記マウスは、ハイブリッド免疫グロブリン配列を含み、該ハイブリッド免疫グロブリン配列は、非ヒトＡＤＡＭ６配列と近接したヒト免疫グロブリンκ軽鎖配列を含む。
【０１２０】
１つの実施形態において、上記マウスは、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座にマウス配列と近接したヒト配列を含み、該近接した配列は、少なくとも１つのヒトＶＬ遺伝子セグメント、マウスＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片、およびヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片は、上記少なくとも１つのヒトＶＬ遺伝子セグメントに直接隣接して位置する。１つの実施形態において、上記ヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片は、上記少なくとも１つのヒトＶＬ遺伝子セグメントの３’側に直接隣接し、かつヒトＪＬ遺伝子セグメントの５’側に直接隣接して位置する。特定の実施形態において、上記ヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ遺伝子セグメントであり、上記ヒトＪＬ遺伝子セグメントは、ヒトＪκ遺伝子セグメントである。
【０１２１】
１つの実施形態において、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性をコードする配列は、マウスＡＤＡＭ６配列またはその機能的断片である。
【０１２２】
１つの実施形態において、上記マウスは、内因性マウスＤＦＬ１６．１遺伝子セグメント（例えば、上記改変内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座に関してヘテロ接合性のマウスの場合）またはヒトＤＨ１−１遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記マウスによって発現する免疫グロブリン重鎖のＤ遺伝子セグメントは、内因性マウスＤＦＬ１６．１遺伝子セグメントまたはヒトＤＨ１−１遺伝子セグメントに由来する。
【０１２３】
１つの態様では、非再配列Ｂ細胞系列のＤＮＡ保有細胞内にマウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列を含むが、再配列免疫グロブリン遺伝子座を含むＢ細胞内に該マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列を含まないマウスを提供し、該マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列は、マウスＡＤＡＭ６遺伝子が野生型マウスにおいて出現する位置とは異なる、ゲノム内の位置に存在する。１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列は、再配列Ｂ細胞系列のものではないすべてのまたは実質的にすべてのＤＮＡ保有細胞に存在する；１つの実施形態において、上記核酸配列は、上記マウスの生殖細胞系細胞には存在するが、再配列Ｂ細胞の染色体には存在しない。
【０１２４】
１つの態様では、再配列免疫グロブリン遺伝子座を含むＢ細胞をはじめとするすべてのまたは実質的にすべてのＤＮＡ保有細胞内にマウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列を含むマウスを提供し、該マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列は、マウスＡＤＡＭ６遺伝子が野生型マウスにおいて出現する位置とは異なる、ゲノム内の位置に存在する。１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列は、上記再配列免疫グロブリン遺伝子座に隣接する核酸上にある。１つの実施形態において、上記再配列免疫グロブリン遺伝子座に隣接する核酸は、染色体である。１つの実施形態において、上記染色体は、野生型マウスにおいて見出される染色体であり、該染色体は、マウス免疫グロブリン遺伝子座の改変を含む。
【０１２５】
１つの態様では、ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログをそのゲノムに含むＢ細胞を含む、遺伝子改変マウスを提供する。１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログは、免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。特定の実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、抗体の重鎖をコードするように再配列することができない内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログは、免疫グロブリン遺伝子座ではない遺伝子座にある。１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６配列は、異種プロモーターによって駆動される導入遺伝子上にある。特定の実施形態において、上記異種プロモーターは、非免疫グロブリンプロモーターである。特定の実施形態において、Ｂ細胞は、ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログを発現する。
【０１２６】
１つの実施形態において、上記マウスのＢ細胞の９０％以上は、該マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはそのホモログまたはその断片をコードする遺伝子を含む。特定の実施形態において、上記マウスは雄マウスである。
【０１２７】
１つの実施形態において、上記Ｂ細胞ゲノムは、上記ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログを含む、第一の対立遺伝子および第二の対立遺伝子を含む。１つの実施形態において、上記Ｂ細胞ゲノムは、上記ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログを含む、第一の対立遺伝子を含むが第二の対立遺伝子を含まない。
【０１２８】
１つの態様では、１つまたは複数の内因性免疫グロブリン重鎖対立遺伝子での改変を含むマウスを提供し、上記改変は１つまたは複数の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子を維持する。
【０１２９】
１つの実施形態において、上記改変は、上記マウスが、少なくとも１つの重鎖対立遺伝子から再配列した内因性重鎖遺伝子セグメントを含む機能的重鎖を発現することができないようにさせ、上記少なくとも１つの内因性免疫グロブリン重鎖対立遺伝子内に配置される内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子を維持する。
【０１３０】
１つの実施形態において、上記マウスは、上記内因性免疫グロブリン重鎖対立遺伝子の少なくとも１つから再配列した内因性重鎖遺伝子セグメントを含む機能的重鎖を発現することができず、上記マウスは、内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子からＡＤＡＭ６タンパク質を発現する。特定の実施形態において、上記マウスは、２つの内因性免疫グロブリン重鎖対立遺伝子から再配列した内因性重鎖遺伝子セグメントを含む機能的重鎖を発現することができず、上記マウスは、１つまたは複数の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子からＡＤＡＭ６タンパク質を発現する。
【０１３１】
１つの実施形態において、上記マウスは、各内因性重鎖対立遺伝子から機能的重鎖を発現することができず、上記マウスは、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列の（上記マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写方向に関して）１Ｍｂｐ内、２Ｍｂｐ内、３Ｍｂｐ内、４Ｍｂｐ内、５Ｍｂｐ内、１０Ｍｂｐ内、２０Ｍｂｐ内、３０Ｍｂｐ内、４０Ｍｂｐ内、５０Ｍｂｐ内、６０Ｍｂｐ内、７０Ｍｂｐ内、８０Ｍｂｐ内、９０Ｍｂｐ内、１００Ｍｂｐ内、１１０Ｍｂｐ内、または１２０Ｍｂｐ内、または１２０超Ｍｂｐ内の上流にある機能的ＡＤＡＭ６対立遺伝子を含む。特定の実施形態において、上記機能的ＡＤＡＭ６対立遺伝子は、上記内因性重鎖遺伝子座に（例えば、遺伝子間Ｖ−Ｄ領域内、２つのＶ遺伝子セグメント間、Ｖ遺伝子セグメントとＤ遺伝子セグメントとの間、Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントとの間などに）ある。特定の実施形態において、上記機能的ＡＤＡＭ６対立遺伝子は、最後のマウスＶ遺伝子セグメントと最初のマウスＤ遺伝子セグメントとの間の９０〜１００ｋｂ遺伝子間配列内にある。もう１つの特定の実施形態において、上記内因性９０〜１００ｋｂ遺伝子間Ｖ−Ｄ配列が除去され、上記異所性ＡＤＡＭ６配列が、上記最後のＶ遺伝子セグメントと上記最初のＤ遺伝子セグメントの間に配置される。
【０１３２】
１つの態様では、１つまたは複数の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子での改変を含むマウスを提供する。
【０１３３】
１つの実施形態において、上記改変は、上記マウスが、上記１つまたは複数の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子の少なくとも１つから機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現することができないようにする。特定の実施形態において、上記マウスは、上記内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子のそれぞれから機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現することができない。
【０１３４】
１つの実施形態において、上記マウスは、各内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子から機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現することができず、上記マウスは異所性ＡＤＡＭ６配列を含む。
【０１３５】
１つの実施形態において、上記マウスは、各内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子から機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現することができず、上記マウスは、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列の（上記マウス重鎖遺伝子座の転写方向に関して）１ｋｂ内、２ｋｂ内、３ｋｂ内、４ｋｂ内、５ｋｂ内、１０ｋｂ内、２０ｋｂ内、３０ｋｂ内、４０ｋｂ内、５０ｋｂ内、６０ｋｂ内、７０ｋｂ内、８０ｋｂ内、９０ｋｂ内、１００ｋｂ内、１１０ｋｂ内、または１２０ｋｂ内、またはそれより大きなｋｂ内の上流にある異所性ＡＤＡＭ６配列を含む。特定の実施形態において、上記異所性ＡＤＡＭ６配列は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に（例えば、遺伝子間Ｖ−Ｄ領域内、２つのＶ遺伝子セグメント間、Ｖ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントとの間、Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントとの間などに）ある。特定の実施形態において、上記異所性ＡＤＡＭ６配列は、最後のマウスＶ遺伝子セグメントと最初のマウスＤ遺伝子セグメントの間の９０から１００ｋｂ遺伝子間配列内にある。もう１つの特定の実施形態では、上記内因性９０から１００ｋｂ遺伝子間Ｖ−Ｄ配列が除去され、上記異所性ＡＤＡＭ６配列が、最後のヒトＶκ遺伝子セグメントと最初のヒトＪκ遺伝子セグメントとの間に配置されている。もう１つの特定の実施形態において、上記内因性９０〜１００ｋｂ遺伝子間Ｖ−Ｄ配列が除去され、上記異所性ＡＤＡＭ６配列が、ヒトＶκ遺伝子セグメントの５’側または該セグメントの上流に配置され、該ヒトＶκ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ４−１またはＶκ２−４０遺伝子セグメントから選択される。
【０１３６】
１つの実施形態において、上記マウスは、１つまたは複数の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子から機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現することができ、上記改変は、免疫グロブリン可変ドメインをコードするヒト配列の挿入を含む。１つの実施形態において、上記ヒト配列は、再配列していない免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記ヒト配列は、Ｖ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントを含む。もう１つの特定の実施形態において、上記ヒト配列は、Ｖ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメント、およびＤ遺伝子セグメントを含む。
【０１３７】
１つの態様では、２つ以上の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子の欠失を含む、不妊性雄マウスを提供する。１つの態様では、雄性不妊形質の保有者である雌マウスであって、非機能的ＡＤＡＭ６対立遺伝子または内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子ノックアウトをその生殖細胞系に含む雌マウスを提供する。
【０１３８】
１つの態様では、抗体の重鎖をコードするように再配列することができない内因性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、およびまたは（ａｎｄ  ｏｒ）Ｊ遺伝子セグメントを含むマウスを提供し、上記マウスのＢ細胞の大部分が機能的ＡＤＡＭ６遺伝子を含む。様々な実施形態において、上記Ｂ細胞の大部分がさらに、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域の上流に、１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよびＪＬ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態では、ヒトＶＬ遺伝子セグメントおよびＪＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ遺伝子セグメントおよびＪκ遺伝子セグメントである。
【０１３９】
１つの実施形態において、上記マウスは、抗体の機能的重鎖をコードするように再配列することができないインタクトな内因性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記マウスは、少なくとも１つおよび８９以下のＶ遺伝子セグメント、少なくとも１つおよび１３以下のＤ遺伝子セグメント、少なくとも１つおよび４以下のＪ遺伝子セグメントならびにその組み合わせを含み、上記少なくとも１つおよび８９以下のＶ遺伝子セグメント、少なくとも１つおよび１３以下のＤ遺伝子セグメント、少なくとも１つおよび４以下のＪ遺伝子セグメントは、抗体の重鎖可変領域をコードするように再配列することができない。特定の実施形態において、上記マウスは、インタクトな内因性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメント内にある機能的ＡＤＡＭ６遺伝子を含む。１つの実施形態において、上記マウスは、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を含む内因性重鎖遺伝子座を含み、上記内因性重鎖遺伝子座は、８９のＶ遺伝子セグメント、１３のＤ遺伝子セグメント、および４のＪ遺伝子セグメントを含み、上記内因性重鎖遺伝子セグメントは、抗体の重鎖可変領域をコードするように再配列することができず、上記ＡＤＡＭ６遺伝子座は、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質をコードする。
【０１４０】
１つの態様では、不妊性雄マウスを作製するための方法を提供し、この方法は、ドナーＥＳ細胞の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子を非機能的にすること（または該対立遺伝子をノックアウトすること）、該ドナーＥＳ細胞を宿主胚に導入すること、代理母において該宿主胚を妊娠させること、および該ドナーＥＳ細胞に全部または一部由来する後代を該代理母に出産させることを含む。１つの実施形態において、上記方法は、後代を交配させて不妊性雄マウスを得ることをさらに含む。
【０１４１】
１つの態様では、対象となる遺伝子改変を有するマウスであって、不妊性であるマウスを作製するための方法を提供し、この方法は、（ａ）対象となる遺伝子改変をゲノム内で行う工程；（ｂ）上記ゲノムを改変して、内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子をノックアウトするか、または内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子を非機能的にする工程；および（ｃ）上記ゲノムをマウスの作製に用いる工程を含む。様々な実施形態において、上記ゲノムは、ＥＳ細胞からのものであり、または核移植実験で使用される。
【０１４２】
１つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントを欠くマウスであって、該マウスのＢ細胞の大部分がＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログを含むマウスを提供する。
【０１４３】
１つの実施形態において、上記マウスには、２つ以上のＶ遺伝子セグメント、２つ以上のＤ遺伝子セグメント、２つ以上のＪ遺伝子セグメントおよびその組み合わせから選択される内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを欠く。１つの実施形態において、上記マウスには、少なくとも１つ、かつ８９以下のＶ遺伝子セグメント、少なくとも１つ、かつ１３以下のＤ遺伝子セグメント、少なくとも１つ、かつ４以下のＪ遺伝子セグメント、およびその組み合わせから選択される免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを欠く。１つの実施形態において、上記マウスには、約３メガ塩基の上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む染色体１２由来のゲノムＤＮＡ断片を欠く。特定の実施形態において、上記マウスには、すべての機能的内因性重鎖Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントを欠く。特定の実施形態において、上記マウスには、８９のＶＨ遺伝子セグメント、１３のＤＨ遺伝子セグメントおよび４つのＪＨ遺伝子セグメントを欠く。
【０１４４】
１つの態様では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含むゲノムを生殖細胞系に有し、該免疫グロブリン重鎖遺伝子座への改変が、１つまたは複数のマウス免疫グロブリン可変領域配列の、１つまたは複数の非マウス免疫グロブリン可変領域配列での置き換えを含むものであるマウスであって、マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする核酸配列を含むマウスを提供する。１つの実施形態において、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤＨおよびＪＨ配列ならびに少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも４０、少なくとも６０または少なくとも８０のＶＨ配列は、非マウス免疫グロブリン軽鎖配列によって置き換えられている。１つの実施形態において、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤＨ、ＪＨおよびすべてのＶＨ配列は、複数の非マウス免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメント、１つまたは複数のＪＬ遺伝子セグメント、および必要に応じて１つまたは複数のＤ遺伝子セグメント配列によって置き換えられている。上記非マウス免疫グロブリン配列は、再配列していないものであってもよい。１つの実施形態において、上記非マウス免疫グロブリン配列は、非マウス種の完全な非再配列ＶＬおよびＪＬ領域を含む。１つの実施形態において、上記非マウス免疫グロブリン配列は、１つまたは複数の内因性定常領域に作動可能に連結した、上記非マウス種の完全可変領域、すなわち、一緒に結合して軽鎖可変領域をコードする配列を形成する、ＶＬ遺伝子セグメントおよびＪＬ遺伝子セグメントを含む再配列した可変領域を形成することができる。上記非マウス種は、ホモサピエンスである場合があり、上記非マウス免疫グロブリン配列は、ヒト配列である場合がある。
【０１４５】
１つの態様では、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントと近接しているＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変されたマウスが提供される。
【０１４６】
１つの実施形態において、上記マウスは、非改変の内因性ＡＤＡＭ６遺伝子配列を欠く。１つの実施形態において、上記マウスは、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子配列を欠く。
【０１４７】
１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントは、免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントは、免疫グロブリンλ軽鎖可変遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントは、免疫グロブリン重鎖定常遺伝子配列に作動可能に連結している。
【０１４８】
１つの実施形態において、上記免疫グロブリン重鎖定常遺伝子配列は、マウスまたはラットまたはヒトの重鎖遺伝子配列である。１つの実施形態において、上記重鎖定常遺伝子配列は、ＣＨ１および／またはヒンジ領域を含む。
【０１４９】
１つの実施形態において、上記マウスは、１つまたは複数の内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子配列の欠失または置き換えを含む。
【０１５０】
１つの実施形態において、上記マウスはさらに、ヒトまたはマウスまたはラットの軽鎖定常領域配列に作動可能に連結した、再配列していないヒトＶκまたは再配列していないヒトＶλ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記マウスは、複数の再配列していないヒトＶκ遺伝子セグメント（例えば、２つ以上のヒトＶκセグメント、および１つまたは複数のヒトＪκセグメント）、または複数の再配列していないヒトＶλ遺伝子セグメント（例えば、２つ以上のヒトＶλセグメント、および１つまたは複数のヒトＪλセグメント）を含む。１つの実施形態において、上記再配列していないヒトＶκまたは再配列していないヒトＶλ遺伝子セグメントは、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座で定常領域配列と作動可能に連結している。
【０１５１】
１つの実施形態において、上記マウスはさらに、内因性κ軽鎖遺伝子座および／または内因性λ軽鎖遺伝子座を非機能的にする改変を含む。１つの実施形態において、上記マウスは、内因性マウスκおよび／または内因性マウスλ軽鎖遺伝子座のノックアウトまたは欠失を含む。
【０１５２】
１つの態様では、マウス免疫グロブリン重鎖配列の、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン軽鎖配列での置き換えを含むマウス系統を維持するための方法を提供する。１つの実施形態において、上記１つまたは複数のヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、ヒト免疫グロブリンＶκおよび／またはＪκ遺伝子セグメントである。
【０１５３】
１つの実施形態において、上記マウス系統は、１つまたは複数のマウスＶＨ、ＤＨおよび／またはＪＨ遺伝子セグメントの欠失を含む。１つの実施形態において、上記マウスは、１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメント、および１つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントをさらに含む。１つの実施形態において、上記マウスは、少なくとも６、少なくとも１６、少なくとも３０、または少なくとも４０のヒトＶκ遺伝子セグメント、ならびに少なくとも５のＪκ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記ヒト軽鎖遺伝子セグメントは、定常領域遺伝子に作動可能に連結している。１つの実施形態において、上記定常領域遺伝子は、マウス定常領域遺伝子である。１つの実施形態において、上記定常領域遺伝子は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３および／もしくはＣＨ４またはその組み合わせから選択されるマウス定常領域遺伝子配列を含む。
【０１５４】
１つの実施形態において、上記方法は、上記マウス免疫グロブリン重鎖配列の置き換えに関してヘテロ接合性の雄マウスを産生する工程、および上記ヘテロ接合雄マウスを野生型雌マウスとまたはヒト重鎖配列に関してホモ接合性もしくはヘテロ接合性である雌マウスと交配させる工程を含む。１つの実施形態において、上記方法は、ヘテロ接合雄と、野生型である雌またはヒト重鎖配列に関してホモ接合性もしくはヘテロ接合性である雌とを繰り返し交配させることにより上記系統を維持する工程を含む。
【０１５５】
１つの実施形態において、上記方法は、ヒト重鎖配列に関してホモ接合性またはヘテロ接合性の雄または雌マウスから細胞を得る工程と、これらの細胞をドナー細胞として、またはこれらの細胞からの核をドナー核として利用する工程と、宿主細胞を使用してならびに／または代理母において該細胞および／もしくは核を妊娠させて遺伝子改変動物を作製するために該細胞または核を使用する工程とを含む。
【０１５６】
１つの実施形態では、重鎖遺伝子座における置き換えに関してヘテロ接合性である雄マウスのみを雌マウスに交配させる。特定の実施形態において、上記雌マウスは、置き換えられる重鎖遺伝子座に関してホモ接合性、ヘテロ接合性または野生型である。
【０１５７】
１つの実施形態において、上記マウスは、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座におけるλおよび／またはκ軽鎖可変配列の、異種免疫グロブリン軽鎖配列での置き換えをさらに含む。１つの実施形態において、上記異種免疫グロブリン軽鎖配列は、ヒト免疫グロブリンλおよび／またはκ軽鎖可変配列である。
【０１５８】
１つの実施形態において、上記マウスは、内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝子座に導入遺伝子をさらに含み、該導入遺伝子は、免疫グロブリン軽鎖定常領域配列に（非再領域配列については）作動可能に連結しているまたは（再配列の配列については）融合している、再配列または非再配列異種λまたはκ軽鎖配列（例えば、非再配列ＶＬおよび非再配列ＪＬ、または再配列ＶＪ）をコードする配列を含む。１つの実施形態において、上記異種λまたはκ軽鎖配列はヒトのものである。１つの実施形態において、上記定常領域配列は、齧歯動物、ヒトおよび非ヒト霊長類から選択される。１つの実施形態において、上記定常領域配列は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。１つの実施形態において、上記導入遺伝子は、上記軽鎖配列の発現を駆動する非免疫グロブリンプロモーターを含む。特定の実施形態において、上記プロモーターは、転写活性プロモーターである。特定の実施形態において、上記プロモーターは、ＲＯＳＡ２６プロモーターである。
【０１５９】
１つの態様では、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子の改変を含む妊性マウスが提供され、該マウスは、該マウスにＡＤＡＭ６機能を付与する異所性配列を含み、且つ該マウスは、免疫グロブリン重鎖配列をコードする核酸配列に作動可能に連結した、再配列していないヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントをその生殖細胞系内に含む。
【０１６０】
１つの態様では、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の改変を含む妊性マウスが提供され、該改変は、該ＡＤＡＭ６遺伝子座を非機能的にし、且つ該マウスは、重鎖定常配列に近接したヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン結合タンパク質を発現する。
【０１６１】
１つの実施態様において、上記免疫グロブリン結合タンパク質はさらに、軽鎖定常配列と融合したコグネイトのヒト免疫グロブリン軽鎖改変ドメインを含む。
【０１６２】
１つの実施形態において、上記重鎖定常配列および上記軽鎖定常配列は非ヒトである。
【０１６３】
１つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における１つまたは複数の免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）遺伝子セグメント、重鎖多様性（ＤＨ）遺伝子セグメント、および重鎖連結（ＪＨ）遺伝子セグメントの、１つまたは複数の軽鎖可変領域（ＶＬ）遺伝子セグメントおよび１つまたは複数の軽鎖連結領域（ＪＬ）遺伝子セグメントでの置き換えを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むマウスであって、ＡＤＡＭ６タンパク質を発現することができるマウスが提供される。
【０１６４】
一態様では、内因性重鎖遺伝子座（ＶＬＨ遺伝子座）においてＶＬ遺伝子セグメント配列を形成するための、全てのまたは実質的に全てのＶＨ遺伝子セグメント、ＤＨ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のＶＬ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のＪＬ遺伝子セグメントによる置き換えであって、該ＶＬＨ遺伝子座が、内因性ＣＨ遺伝子と組み換えられて、ＶＬ遺伝子セグメント、ＪＬ遺伝子セグメント、および内因性ＣＨ遺伝子に由来する再配列した遺伝子を形成することが可能である置き換えを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むマウスが提供される。
【０１６５】
一実施形態では、上記ＶＬセグメントが、ヒトＶＬセグメントである。一実施形態では、上記ＪＬセグメントが、ヒトＪＬセグメントである。特定の実施形態では、上記ＶＬセグメントおよびＪＬセグメントが、ヒトＶＬセグメントおよびヒトＪＬセグメントである。
【０１６６】
一実施形態では、全てのまたは実質的に全てのＶＨ遺伝子セグメント、ＤＨ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを、少なくとも６つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのＪκ遺伝子セグメントで置き換える。一実施形態では、全てのまたは実質的に全てのＶＨ遺伝子セグメント、ＤＨ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを、少なくとも１６のヒトＶκ遺伝子セグメント（ヒトＶκ）および少なくとも１つのＪκ遺伝子セグメントで置き換える。一実施形態では、全てのまたは実質的に全てのＶＨ遺伝子セグメント、ＤＨ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを、少なくとも３０のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのＪκ遺伝子セグメントで置き換える。一実施形態では、全てのまたは実質的に全てのＶＨ遺伝子セグメント、ＤＨ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントを、少なくとも４０のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのＪκ遺伝子セグメントで置き換える。一実施形態では、上記少なくとも１つのＪκ遺伝子セグメントが、２つ、３つ、４つ、または５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。
【０１６７】
一実施形態では、上記ＶＬセグメントが、ヒトＶκセグメントである。一実施形態では、上記ヒトＶκセグメントが、４−１、５−２、７−３、２−４、１−５、および１−６を含む。一実施形態では、上記ヒトＶκセグメントが、３−７、１−８、１−９、２−１０、３−１１、１−１２、１−１３、２−１４、３−１５、および１−１６を含む。一実施形態では、上記ヒトＶκセグメントが、１−１７、２−１８、２−１９、３−２０、６−２１、１−２２、１−２３、２−２４、３−２５、２−２６、１−２７、２−２８、２−２９、および２−３０を含む。一実施形態では、上記ヒトＶκセグメントが、３−３１、１−３２、１−３３、３−３４、１−３５、２−３６、１−３７、２−３８、１−３９、および２−４０を含む。
【０１６８】
一実施形態では、上記ＶＬセグメントが、ヒトＶκセグメントであり、４−１、５−２、７−３、２−４、１−５、１−６、３−７、１−８、１−９、２−１０、３−１１、１−１２、１−１３、２−１４、３−１５および１−１６を含む。一実施形態では、上記ヒトＶκセグメントが、１−１７、２−１８、２−１９、３−２０、６−２１、１−２２、１−２３、２−２４、３−２５、２−２６、１−２７、２−２８、２−２９、および２−３０をさらに含む。一実施形態では、上記ヒトＶκセグメントが、３−３１、１−３２、１−３３、３−３４、１−３５、２−３６、１−３７、２−３８、１−３９、および２−４０をさらに含む。
【０１６９】
一実施形態では、上記ＶＬセグメントが、ヒトＶλセグメントであり、ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＡの断片を含む。特定の実施形態では、上記ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＡの断片が、ｈＶλ３−２７〜ｈＶλ３−１に及ぶ。
【０１７０】
一実施形態では、上記ＶＬセグメントが、上記ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＢの断片を含む。特定の実施形態では、上記ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＢの断片が、ｈＶλ５−５２〜ｈＶλ１−４０に及ぶ。
【０１７１】
一実施形態では、上記ＶＬセグメントが、クラスターＡのゲノム断片およびクラスターＢのゲノム断片を含むヒトλ軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態では、上記ヒトλ軽鎖可変領域配列が、クラスターＡの少なくとも１つの遺伝子セグメントおよびクラスターＢの少なくとも１つの遺伝子セグメントを含む。
【０１７２】
一実施形態では、上記ＶＬセグメントが、クラスターＢの少なくとも１つの遺伝子セグメントおよびクラスターＣの少なくとも１つの遺伝子セグメントを含む。
【０１７３】
一実施形態では、上記ＶＬセグメントが、ｈＶλ３−１、ｈＶλ４−３、ｈＶλ２−８、ｈＶλ３−９、ｈＶλ３−１０、ｈＶλ２−１１、およびｈＶλ３−１２を含む。特定の実施形態では、上記ＶＬセグメントが、Ｖλ３−１２〜Ｖλ３−１にわたる上記ヒトλ軽鎖遺伝子座の隣接配列を含む。一実施形態では、上記隣接配列が、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２のｈＶλを含む。特定の実施形態では、上記ｈＶλが、３−１、４−３、２−８、３−９、３−１０、２−１１、および３−１２を包含する。特定の実施形態では、上記ｈＶλが、Ｖλ３−１２〜Ｖλ３−１にわたるヒトλ遺伝子座の隣接配列を含む。
【０１７４】
一実施形態では、上記ｈＶλが、１３〜２８またはそれより多くのｈＶλを含む。特定の実施形態では、上記ｈＶλが、２−１４、３−１６、２−１８、３−１９、３−２１、３−２２、２−２３、３−２５、および３−２７を包含する。特定の実施形態では、上記ｈＶλが、Ｖλ３−２７〜Ｖλ３−１にわたる上記ヒトλ遺伝子座の隣接配列を含む。
【０１７５】
一実施形態では、上記ＶＬセグメントが、２９〜４０のｈＶλを含む。特定の実施形態では、上記ＶＬセグメントが、Ｖλ３−２９〜Ｖλ３−１にわたる上記ヒトλ遺伝子座の隣接配列、およびＶλ５−５２〜Ｖλ１−４０にわたる上記ヒトλ遺伝子座の隣接配列を含む。特定の実施形態では、上記遺伝子改変マウスにおけるｈＶλ１−４０〜ｈＶλ３−２９における全てのまたは実質的に全ての配列が、天然では（例えば、ヒト集団では）上記ｈＶλ１−４０遺伝子セグメントの下流（３’側非翻訳部分の下流）に見出される約９５９ｂｐのヒトλ配列、制限酵素認識部位（例えば、ＰＩ−ＳｃｅＩ部位）、これに後続する、天然では上記ｈＶλ３−２９遺伝子セグメントの上流に見出される約３，４３１ｂｐのヒトλ配列から本質的になる。
【０１７６】
一実施形態では、上記Ｊκが、ヒトＪκであり、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、Ｊκ５、およびこれらの組合せからなる群から選択される。特定の実施形態では、上記Ｊκが、Ｊκ１〜Ｊκ５を含む。
【０１７７】
一実施形態では、上記ＶＬセグメントが、ヒトＶλセグメントであり、上記Ｊκ遺伝子セグメントが、１２マーのスペーサーを有するＲＳＳであって、上記Ｊκ遺伝子セグメントの上流端で近接する（ｉｓ  ｊｕｘｔａｐｏｓｅｄ）ＲＳＳを含む。一実施形態では、上記ＶＬ遺伝子セグメントが、ヒトＶλであり、上記ＶＬＨ遺伝子座が、２つ以上のＪκ遺伝子セグメントを含み、各Ｊκ遺伝子セグメントが、１２マーのスペーサーを有するＲＳＳであって、各Ｊκ遺伝子セグメントの上流端で近接するＲＳＳを含む。
【０１７８】
特定の実施形態では、上記ＶＬセグメントが、上記ヒトκ遺伝子座Ｖκ４−１〜Ｖκ２−４０にわたる隣接するヒトκ遺伝子セグメントを含み、上記ＪＬセグメントが、上記ヒトκ遺伝子座Ｊκ１〜Ｊκ５にわたる隣接するκ遺伝子セグメントを含む。
【０１７９】
上記ＶＬセグメントがＶλセグメントであり、該ＶＬセグメントとＪセグメントとの間にＤＨセグメントが存在しない一実施形態では、該ＶＬセグメントが、下流で２３マーのＲＳＳと隣接し（すなわち、その下流側で近接し）、存在する場合のＪκセグメントまたは存在する場合のＪλセグメントが、上流で１２マーのＲＳＳと隣接する（すなわち、その上流側で近接する）。
【０１８０】
上記Ｖ遺伝子セグメントがＶκ遺伝子セグメントであり、該Ｖ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントとの間にＤＨ遺伝子セグメントが存在しない一実施形態では、該Ｖκ遺伝子セグメントの各々が、その下流側で、１２マーのＲＳＳと近接し、存在する場合のＪκセグメントまたは存在する場合のＪλセグメントの各々が、その上流側で、２３マーのＲＳＳと近接する。
【０１８１】
一実施形態では、上記マウスが、ＶＬ遺伝子セグメント、ＪＬ遺伝子セグメント、および内因性ＣＨ遺伝子に由来する再配列した遺伝子を含む。一実施形態では、上記再配列した遺伝子が、体細胞変異している。一実施形態では、上記再配列した遺伝子が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くのＮ付加（Ｎ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）を含む。一実施形態では、上記ＶＬセグメントおよび上記ＪＬセグメントに由来する再配列した遺伝子において観察される上記Ｎ付加および／または上記体細胞変異が、内因性軽鎖遺伝子座において再配列する、再配列した軽鎖可変ドメイン（同じＶＬ遺伝子セグメントおよび同じＪＬ遺伝子セグメントに由来する）において観察されるＮ付加および／または体細胞変異の数の１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、または少なくとも５倍多い。一実施形態では、上記再配列した遺伝子が、対象の抗原に特異的に結合するＢ細胞であって、対象の抗原に低ナノモル濃度範囲以下のＫＤ（例えば、１０ナノモル濃度以下のＫＤ）で結合するＢ細胞に存在する。特定の実施形態では、上記ＶＬセグメント、上記ＪＬセグメント、またはこれらの両方が、ヒト遺伝子セグメントである。特定の実施形態では、上記ＶＬセグメントおよびＪＬセグメントが、ヒトκ遺伝子セグメントである。一実施形態では、上記マウスのＣＨ遺伝子が、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥから選択される。特定の実施形態では、上記マウスのＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ２Ｃ、およびＩｇＧ３から選択される。別の特定の実施形態では、上記マウスのＩｇＧが、ＩｇＧ１である。
【０１８２】
一実施形態では、上記マウスが、Ｂ細胞を含み、ここで、該Ｂ細胞が、該Ｂ細胞の染色体における遺伝子座から、４つのポリペプチド鎖から本質的になる結合タンパク質を発現し、ここで、該４つのポリペプチド鎖が、（ａ）ＶＬ領域と融合している内因性ＣＨ領域を含む、２つの同一のポリペプチドと、（ｂ）該マウスＣＨ領域と融合しており、かつ一実施形態ではヒト（例えば、ヒトκ）ＶＬ領域であるＶＬ領域に関してコグネイトであるＶＬ領域と融合している内因性ＣＬ領域を含む、２つの同一のポリペプチドとから本質的になる。一実施形態では、上記内因性ＣＨ領域と融合しているＶＬ領域が、ヒトＶＬ領域である。特定の実施形態では、上記マウスＣＨ領域と融合しているヒトＶＬ領域が、Ｖκ領域である。特定の実施形態では、上記マウスＣＨ領域と融合しているヒトＶＬ領域が、再配列したヒト生殖細胞系軽鎖ヌクレオチド配列によりコードされるＶ領域と同一である。特定の実施形態では、上記マウスＣＨ領域に融合しているヒトＶＬ領域が、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれより多くの体細胞超変異を含む。一実施形態では、上記マウスＣＨ領域に融合しているヒトＶＬ領域が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０またはそれより多くのＮ付加を含む再配列した遺伝子によりコードされる。
【０１８３】
一実施形態では、上記マウスにより発現される全てのＩｇＧ分子のうちの少なくとも５０％が、ＩｇＧアイソタイプのＣＨ領域およびＶＬ領域を含むポリペプチドを含み、ここで、該ポリペプチドの長さが、５３５、５３０、５２５、５２０、または５１５アミノ酸以下の長さである。一実施形態では、全てのＩｇＧ分子のうちの少なくとも７５％が、本段落で列挙されるポリペプチドを含む。一実施形態では、全てのＩｇＧ分子のうちの少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％が、本段落で列挙されるポリペプチドを含む。特定の実施形態では、上記マウスにより発現される全てのＩｇＧ分子が、本段落で列挙されるポリペプチドの長さ以下であるポリペプチドを含む。
【０１８４】
一実施形態では、上記マウスにより、再配列したヒトＶ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントによりコードされるが、ＤＨ遺伝子セグメントによってはコードされない可変ドメインと融合している内因性ＣＨ領域を含む第１のポリペプチド、ならびに再配列したヒトＶ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントによりコードされるが、ＤＨ遺伝子セグメントによってはコードされないＶドメインと融合している内因性ＣＬ領域を含む第２のポリペプチドを含む結合タンパク質を発現し、この結合タンパク質は、マイクロモル濃度、ナノモル濃度、またはピコモル濃度の範囲のアフィニティで抗原に特異的に結合する。一実施形態では、上記Ｊセグメントが、ヒトＪセグメント（例えば、ヒトκ遺伝子セグメント）である。一実施形態では、上記ヒトＶセグメントが、ヒトＶκセグメントである。一実施形態では、上記内因性ＣＨ領域と融合している可変ドメインが、上記内因性ＣＬ領域と融合している可変領域より多数の体細胞超変異を含み、特定の実施形態では、該内因性ＣＨ領域と融合している可変領域が、該内因性ＣＬ領域に融合しているＶ領域の約１．５、２、３、４、または５倍またはそれより大きな倍数の体細胞超変異を含み、特定の実施形態では、上記マウスＣＨ領域と融合しているＶ領域が、該マウスＣＬ領域と融合しているＶ領域より少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５またはそれより多くの体細胞超変異を含む。一実施形態では、上記マウスＣＨ領域と融合しているＶ領域が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０またはそれより多くのＮ付加を含む再配列した遺伝子によりコードされる。
【０１８５】
一実施形態では、上記マウスが、免疫グロブリン重鎖定常領域配列と融合している第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、および免疫グロブリン軽鎖定常領域と融合している第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）を含む結合タンパク質を発現し、ここで、ＶＬ１が、ＶＬ２に存在する体細胞超変異の数の約１．５〜約５倍以上の数の体細胞超変異を含む。一実施形態では、ＶＬ１における体細胞超変異の数が、ＶＬ２における数の約２〜約４倍多い。一実施形態では、ＶＬ１における体細胞超変異の数が、ＶＬ２における数の約２〜約３倍多い。一実施形態では、ＶＬ１が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０またはそれより多くのＮ付加を含む配列によりコードされる。
【０１８６】
一態様では、以下のポリペプチド：各々がＶＬ遺伝子セグメントおよびＪＬ遺伝子セグメントから本質的になる遺伝子セグメントに由来する可変ドメインと融合しているＣＨ領域から本質的になる第１の２つの同一のポリペプチド、ならびに各々がＶＬセグメントおよびＪＬセグメントから本質的になる遺伝子セグメントに由来する可変ドメインと融合しているＣＬ領域から本質的になる第２の２つの同一のポリペプチド、から本質的になる免疫グロブリンを発現する遺伝子改変マウスが提供される。
【０１８７】
特定の実施形態では、上記ＣＨ領域を有する２つの同一のポリペプチドが、マウスＣＨ領域を有する。
【０１８８】
特定の実施形態では、上記ＣＬ領域を有する２つの同一のポリペプチドが、マウスＣＬ領域を有する。
【０１８９】
一実施形態では、上記ＣＬ領域と融合している可変ドメインが、上記ＣＨ領域に融合している可変ドメインとコグネイトの可変ドメインである。
【０１９０】
一実施形態では、上記内因性ＣＨ領域と融合している可変ドメインが、上記内因性ＣＬ領域と融合している可変ドメインより多数の体細胞超変異を含み、特定の実施形態では、上記内因性ＣＨ領域と融合している可変ドメインが、該内因性ＣＬ領域と融合している可変ドメインの約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、または５倍またはそれより大きな倍数の体細胞超変異を含む。一実施形態では、上記内因性ＣＬ領域と融合している可変ドメインが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くのＮ付加を含む遺伝子によりコードされる。
【０１９１】
一実施形態では、上記Ｖセグメントおよび上記Ｊセグメントのうちの１つまたは複数が、ヒト遺伝子セグメントである。特定の実施形態では、上記Ｖセグメントおよび上記Ｊセグメントの両方が、ヒトκ遺伝子セグメントである。別の特定の実施形態では、上記Ｖセグメントおよび上記Ｊセグメントの両方が、ヒトλ遺伝子セグメントである。一実施形態では、上記Ｖセグメントおよび上記Ｊセグメントが、ヒトκ遺伝子セグメントおよびヒトλ遺伝子セグメントから独立して選択される。特定の実施形態では、上記Ｖセグメントが、Ｖκセグメントであり、上記Ｊセグメントが、Ｊλセグメントである。別の特定の実施形態では、上記Ｖセグメントが、Ｖλセグメントであり、上記Ｊセグメントが、Ｊκセグメントである。
【０１９２】
一実施形態では、上記ＣＬ領域と融合している可変ドメインおよび上記ＣＨ領域と融合している可変ドメインのうちの１つまたは複数が、ヒト可変ドメインである。特定の実施形態では、上記ヒト可変ドメインが、ヒトＶκドメインである。別の特定の実施形態では、上記ヒト可変ドメインが、Ｖλドメインである。一実施形態では、上記ヒトドメインが、ヒトＶκドメインおよびヒトＶλドメインから独立して選択される。特定の実施形態では、上記ＣＬ領域と融合しているヒト可変ドメインが、ヒトＶλドメインであり、上記ＣＨ領域と融合しているヒト可変ドメインが、ヒトＶκドメインである。別の実施形態では、上記ＣＬ領域と融合しているヒト可変ドメインが、ヒトＶκドメインであり、上記ＣＨ領域と融合しているヒト可変ドメインが、ヒトＶλドメインである。
【０１９３】
一実施形態では、上記第１の２つの同一のポリペプチドのうちのＶＬ遺伝子セグメントが、ヒトＶλセグメントおよびヒトＶκセグメントから選択される。一実施形態では、上記第２の２つの同一のポリペプチドのうちのＶＬセグメントが、ヒトＶλセグメントおよびヒトＶκセグメントから選択される。特定の実施形態では、上記第１の２つの同一のポリペプチドのうちのＶＬセグメントが、ヒトＶκセグメントであり、上記第２の２つの同一のポリペプチドのうちのＶＬセグメントが、ヒトＶκセグメントおよびヒトＶλセグメントから選択される。特定の実施形態では、上記第１の２つの同一のポリペプチドのうちのＶＬセグメントが、ヒトＶλセグメントであり、上記第２の２つの同一のポリペプチドのうちのＶＬセグメントが、ヒトＶλセグメントおよびヒトＶκセグメントから選択される。特定の実施形態では、上記第１の２つの同一のポリペプチドのうちのヒトＶＬセグメントが、ヒトＶκセグメントであり、上記第２の２つの同一のポリペプチドのうちのヒトＶＬセグメントが、ヒトＶκセグメントである。
【０１９４】
一実施形態では、上記マウスのＩｇＧが、抗原に対する反応により作製された結合タンパク質を含み、ここで、該結合タンパク質が、可変ドメインおよびＣＨ領域から本質的になるポリペプチドを含み、ここで、該可変ドメインが、再配列したＶＬセグメントおよび再配列したＪセグメントから本質的になるヌクレオチド配列によりコードされ、ここで、該結合タンパク質が、該抗原のエピトープに、マイクロモル濃度、ナノモル濃度、またはピコモル濃度の範囲のＫＤで特異的に結合する。
【０１９５】
一態様では、マウスであって、抗原に対する反応により該マウスにより作製されるＩｇＧのうちの全てまたは実質的に全てが、可変ドメインを含む重鎖を含み、ここで、該可変ドメインが、本質的にＶ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントからなる遺伝子セグメントに由来する、再配列した遺伝子によりコードされるマウスが提供される。一実施形態では、上記再配列した遺伝子が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０またはそれより多くのＮ付加を含む。
【０１９６】
一実施形態では、上記Ｖセグメントが、軽鎖のＶセグメントである。一実施形態では、上記軽鎖が、κ軽鎖およびλ軽鎖から選択される。特定の実施形態では、上記軽鎖がκ軽鎖である。特定の実施形態では、上記Ｖセグメントが、ヒトＶセグメントである。特定の実施形態では、上記Ｖセグメントが、ヒトＶκセグメントであり、上記Ｊセグメントが、ヒトＪκセグメントである。
【０１９７】
一実施形態では、上記Ｊセグメントが軽鎖のＪセグメントである。一実施形態では、上記軽鎖が、κ軽鎖およびλ軽鎖から選択される。特定の実施形態では、上記軽鎖がκ軽鎖である。特定の実施形態では、上記ＪセグメントがヒトＪセグメントである。別の実施形態では、上記Ｊセグメントが重鎖のＪセグメント（すなわち、ＪＨセグメント）である。特定の実施形態では、上記重鎖がマウス起源のものである。別の特定の実施形態では、上記重鎖がヒト起源のものである。
【０１９８】
一実施形態では、ＶセグメントおよびＪセグメントだけから作製される重鎖の可変ドメインが、体細胞変異している可変ドメインである。
【０１９９】
一実施形態では、ＶセグメントおよびＪセグメントだけから作製される重鎖の可変ドメインがマウスＣＨ領域に融合している。
【０２００】
特定の実施形態では、抗原に対する反応により上記マウスにより作製されるＩｇＧのうちの全てまたは実質的に全てが、１つ以下のヒトＶセグメントおよび１つ以下のヒトＪセグメントに由来する可変ドメインを含み、該可変ドメインが、マウスＩｇＧ定常領域に融合しており、該ＩｇＧが、マウスＣＬ領域と融合しているヒトＶＬドメインを含む軽鎖をさらに含む。特定の実施形態では、上記マウスＣＬ領域と融合しているＶＬドメインが、ヒトＶκセグメントおよびヒトＪκセグメントに由来する。特定の実施形態では、上記マウスＣＬ領域と融合しているＶＬドメインが、ヒトＶλセグメントおよびヒトＪλセグメントに由来する。
【０２０１】
一態様では、ＣＨ領域を含むポリペプチドにおける第１のＣＤＲ３およびＣＬ領域を含むポリペプチドにおける第２のＣＤＲ３を含むＩｇＧを作製するマウスであって、ここで、該第１のＣＤＲ３および該第２のＣＤＲ３の両方が、各々独立して２つ以下の遺伝子セグメントに由来し、ここで、該２つの遺伝子セグメントが、本質的にＶＬ遺伝子セグメントおよびＪＬ遺伝子セグメントからなるマウスが提供される。一実施形態では、上記ＣＨ領域を含むポリペプチドにおけるＣＤＲ３が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０またはそれより多くのＮ付加を含むＣＤＲ３のヌクレオチド配列に由来する配列を含む。
【０２０２】
一実施形態では、上記ＶＬセグメントおよび上記ＪＬセグメントが、ヒト遺伝子セグメントである。一実施形態では、上記ＶＬセグメントおよび上記ＪＬセグメントが、κ遺伝子セグメントである。一実施形態では、上記ＶＬセグメントおよび上記ＪＬセグメントが、λ遺伝子セグメントである。
【０２０３】
一態様では、ＣＨ領域を含む第１のポリペプチドにおける第１のＣＤＲ３およびＣＬ領域を含む第２のポリペプチドにおける第２のＣＤＲ３を含むＩｇＧを作製するマウスであって、ここで、該第１のＣＤＲ３および該第２のＣＤＲ３の両方が、各々アミノ酸の配列を含み、ここで、該アミノ酸のうちの７５％超がＶ遺伝子セグメントに由来するマウスが提供される。一実施形態では、上記ＣＨ領域を含むポリペプチドにおけるＣＤＲ３が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０またはそれより多くのＮ付加を含むＣＤＲ３のヌクレオチド配列に由来する配列を含む。
【０２０４】
一実施形態では、上記第１のＣＤＲ３のアミノ酸のうちの８０％超、９０％超、または９５％超、ならびに上記第２のＣＤＲ３のアミノ酸のうちの８０％超、９０％超、または９５％超が、軽鎖Ｖセグメントに由来する。
【０２０５】
一実施形態では、上記第１のＣＤＲ３のうちの２つ以下のアミノ酸が、軽鎖Ｖセグメント以外の遺伝子セグメントに由来する。一実施形態では、上記第２のＣＤＲ３のうちの２つ以下のアミノ酸が、軽鎖Ｖセグメント以外の遺伝子セグメントに由来する。特定の実施形態では、上記第１のＣＤＲ３のうちの２つ以下のアミノ酸および上記第２のＣＤＲ３のうちの２つ以下のアミノ酸が、軽鎖Ｖセグメント以外の遺伝子セグメントに由来する。一実施形態では、上記ＩｇＧのＣＤＲ３が、Ｄ遺伝子セグメントに由来するアミノ酸配列を含まない。一実施形態では、上記第１のポリペプチドのＣＤＲ３が、Ｄセグメントに由来する配列を含まない。
【０２０６】
一実施形態では、上記Ｖセグメントが、ヒトＶ遺伝子セグメントである。特定の実施形態では、上記Ｖセグメントが、ヒトＶκ遺伝子セグメントである。
【０２０７】
一実施形態では、上記第１および／または上記第２のＣＤＲ３が、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの体細胞超変異を有する。一実施形態では、上記第１のＣＤＲ３  が１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０またはそれより多くのＮ付加を含む核酸配列によりコードされる。
【０２０８】
一実施形態では、上記第１のＣＤＲ３が、ヒト軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよびヒト軽鎖Ｊ遺伝子セグメントに由来するアミノ酸から本質的になり、上記第２のＣＤＲ３が、ヒト軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよびヒト軽鎖Ｊ遺伝子セグメントに由来するアミノ酸から本質的になる。一実施形態では、上記第１のＣＤＲ３が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０またはそれより多くのＮ付加を含む核酸配列に由来する。一実施形態では、上記第１のＣＤＲ３が、２つ以下の遺伝子セグメントに由来し、ここで、該２つ以下の遺伝子セグメントが、ヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントであり、かつ、上記第２のＣＤＲ３が、２つ以下の遺伝子セグメントに由来し、ここで、該２つ以下の遺伝子セグメントが、ヒトＶκ遺伝子セグメントならびにヒトＪκセグメント、ヒトＪλセグメント、およびヒトＪＨセグメントから選択されるＪ遺伝子セグメントである。一実施形態では、上記第１のＣＤＲ３が、２つ以下の遺伝子セグメントに由来し、ここで、該２つ以下の遺伝子セグメントが、ヒトＶλセグメントならびにヒトＪκセグメント、ヒトＪλセグメント、およびヒトＪＨセグメントから選択されるＪセグメントである。
【０２０９】
一態様では、ＤＨ遺伝子セグメントに由来するアミノ酸配列を含有しないＩｇＧであって、ここで、マウスＣＬ領域と融合している第１のＶＬドメインを有する第１のポリペプチド、およびマウスＣＨ領域と融合している第２のＶＬドメインを有する第２のポリペプチドを含み、ここで、該第１のＶＬドメインおよび該第２のＶＬドメインが同一ではないＩｇＧを作製するマウスが提供される。一実施形態では、上記第１および第２のＶＬドメインが、異なるＶセグメントに由来する。別の実施形態では、上記第１および第２のＶＬドメインが、異なるＪセグメントに由来する。一実施形態では、上記第１および第２のＶＬドメインが、同一のＶセグメントおよびＪセグメントに由来し、ここで、該第２のＶＬドメインが、該第１のＶＬドメインと比較してより多数の体細胞超変異を含む。
【０２１０】
一実施形態では、上記第１および上記第２のＶＬドメインが、ヒトＶＬドメインおよびマウスＶＬドメインから独立して選択される。一実施形態では、上記第１および第２のＶＬドメインが、ＶκドメインおよびＶλドメインから独立して選択される。特定の実施形態では、上記第１のＶＬドメインが、ＶκドメインおよびＶλドメインから選択され、上記第２のＶＬドメインが、Ｖκドメインである。別の特定の実施形態では、上記Ｖκドメインが、ヒトＶκドメインである。
【０２１１】
一態様では、マウスであって、該マウスにより作製されるＩｇＧのうちの全てまたは実質的に全てが、マウスＣＬドメインと融合している第１のヒトＶＬドメインを有する軽鎖、およびマウスＣＨドメインと融合している第２のヒトＶＬドメインを有する重鎖から本質的になるマウスが提供される。
【０２１２】
一実施形態では、上記マウスＣＨドメインと融合するヒトＶＬドメインが、ヒトＶκドメインである。
【０２１３】
一実施形態では、上記第１および上記第２のヒトＶＬドメインが同一ではない。
【０２１４】
一態様では、マウスであって、ここで、該マウスにより作製される免疫グロブリンＧのうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または約１００％が、（ａ）免疫グロブリンＶＬドメインおよび免疫グロブリンＣＬ領域から本質的になる第１のポリペプチドと、（ｂ）５３５アミノ酸以下の長さの第２のポリペプチドであって、ここで、ＣＨ領域およびＤＨ遺伝子セグメントに由来する配列を欠くＶドメインから本質的になる第２のポリペプチドとの二量体から本質的になる、マウスが提供される。
【０２１５】
一実施形態では、上記第２のポリペプチドが、約４３５〜５３５アミノ酸の長さである。特定の実施形態では、上記第２のポリペプチドが、約４３５〜５３０アミノ酸の長さである。特定の実施形態では、上記第２のポリペプチドが、約４３５〜５２５アミノ酸の長さである。特定の実施形態では、上記第２のポリペプチドが、約４３５〜５２０アミノ酸の長さである。特定の実施形態では、上記第２のポリペプチドが、約４３５〜５１５アミノ酸の長さである。
【０２１６】
一実施形態では、上記マウスにより作製されるＩｇＧのうちの約９０％以上において、上記第２のポリペプチドが、約５３５アミノ酸以下の長さである。
【０２１７】
一実施形態では、上記マウスにより作製されるＩｇＧのうちの約５０％以上において、上記第２のポリペプチドが、約５３５アミノ酸以下の長さである。一実施形態では、上記マウスにより作製される免疫グロブリンＧのうちの約５０％以上において、上記第２のポリペプチドが、約５３０アミノ酸以下、５２５アミノ酸以下、５２０アミノ酸以下、５１５アミノ酸以下、５１０アミノ酸以下、５０５アミノ酸以下、５００アミノ酸以下、４９５アミノ酸以下、４９０アミノ酸以下、４８５アミノ酸以下、４８０アミノ酸以下、４７５アミノ酸以下、４７０アミノ酸以下、４６５アミノ酸以下、４６０アミノ酸以下、４５５アミノ酸以下、または４５０アミノ酸以下の長さである。一実施形態では、上記マウスにより作製されるＩｇＧのうちの約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％以上が、上記列挙される長さのＩｇＧである。特定の実施形態では、上記マウスにより作製されるＩｇＧのうちの全てまたは実質的に全てが、上記列挙される長さのＩｇＧである。
【０２１８】
一実施形態では、上記第２のポリペプチドのＶドメインが、ＶＬドメインである。特定の実施形態では、上記第２のポリペプチドのＶドメインが、ＶκドメインおよびＶλドメインから選択される。特定の実施形態では、上記第２のポリペプチドのＶドメインが、ヒトＶκドメインまたはヒトＶλドメインである。
【０２１９】
一態様では、マウスであって、その生殖細胞系におけるヌクレオチド配列から、軽鎖可変配列（例えば、Ｖ配列および／またはＪ配列）、ＤＨ配列、および重鎖定常領域を含むポリペプチドを発現するマウスが提供される。
【０２２０】
一実施形態では、上記マウスが、全てのまたは実質的に全ての機能的な内因性重鎖遺伝子座可変遺伝子セグメント（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｏｃｕｓ  ｇｅｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ）の、内因性重鎖遺伝子座における複数のヒト遺伝子セグメントによる置き換えを含む、該内因性重鎖遺伝子座に由来するポリペプチドを発現する。
【０２２１】
一実施形態では、上記ポリペプチドが、Ｖλ遺伝子セグメントまたはＶκ遺伝子セグメントに由来するＶＬ配列を含み、該ポリペプチドが、ＤＨ遺伝子セグメントに由来するＣＤＲ３を含み、該ポリペプチドが、ＪＨ遺伝子セグメントまたはＪλ遺伝子セグメントもしくはＪκ遺伝子セグメントに由来する配列を含む。
【０２２２】
一実施形態では、上記マウスは、内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座を含み、その遺伝子座は、全ての機能的なＶＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒト軽鎖Ｖλ遺伝子セグメントによる置き換えを含み、ここで、該１つまたは複数のヒトＶλセグメントの各々が、その下流側で、２３マーのスペースを置いた（２３−ｍｅｒ  ｓｐａｃｅｄ）組換えシグナル配列（ＲＳＳ）を近接させており、ここで、該Ｖλセグメントが、１２マーのスペースを置いたＲＳＳを上流および下流で近接させているヒトＤＨセグメントまたはマウスＤＨセグメントに作動可能に連結しており、該ＤＨ遺伝子セグメントが、該ＤＨ遺伝子セグメントを近接させている該１２マーのスペースを置いたＲＳＳで組み換える（ｒｅｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）のに適する、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流で近接するＪセグメントと作動可能に連結し、ここで、該Ｖセグメント、ＤＨセグメント、およびＪセグメントが、重鎖定常領域をコードする核酸配列に作動可能に連結する。
【０２２３】
一実施形態では、上記マウスは、内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座を含み、その遺伝子座は、全ての機能的なＶＨ遺伝子セグメントの、１２マーのスペースを置いた組換えシグナル配列（ＲＳＳ）と各々がその下流側で近接する１つまたは複数のヒトＶκ遺伝子セグメントによる置き換えを含み、ここで、上記Ｖセグメントが、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流および下流の両方で近接するヒトＤＨセグメントまたはマウスＤＨセグメントに作動可能に連結し、該ＤＨセグメントが、該ＤＨセグメントを近接させる該２３マーのスペースを置いたＲＳＳで組み換えるのに適する、１２マーのスペースを置いたＲＳＳと上流側で近接するＪセグメントと作動可能に連結し、ここで、該Ｖ遺伝子セグメント、ＤＨ遺伝子セグメント、および遺伝子セグメントが、重鎖定常領域をコードする核酸配列に作動可能に連結する。
【０２２４】
一実施形態では、上記重鎖定常領域が、内因性重鎖定常領域である。一実施形態では、その核酸配列が、ＣＨ１配列、ヒンジ配列、ＣＨ２配列、ＣＨ３配列、およびこれらの組合せから選択される配列をコードする。一実施形態では、上記ＣＨ１配列、ヒンジ配列、ＣＨ２配列、およびＣＨ３配列のうちの１つまたは複数が、ヒト配列である。
【０２２５】
一実施形態では、上記マウスは、内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座を含み、その遺伝子座は、全ての機能的なＶＨ遺伝子セグメントの、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと各々が下流で近接する複数のヒトＶλ遺伝子セグメントまたはヒトＶκ遺伝子セグメント、１２マーのスペースを置いたＲＳＳによって上流および下流の両方で近接させられた複数のヒトＤＨセグメント、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流および下流の両方で近接する複数のヒトＪセグメント（ＪＨセグメントまたはＪλセグメントもしくはＪκセグメント）による置き換えを含み、ここで、該遺伝子座が、ＣＨ１配列、ヒンジ配列、ＣＨ２配列、ＣＨ３配列、およびこれらの組合せから選択される内因性定常領域配列を含む。特定の実施形態では、上記マウスが、全てのまたは実質的に全ての機能的なヒトＶλセグメントまたはヒトＶκセグメント、全てのまたは実質的に全ての機能的なヒトＤＨセグメント、および全てのまたは実質的に全てのＪＨセグメントまたはＪλセグメントもしくはＪκセグメントを含む。
【０２２６】
一実施形態では、上記マウスが、（ａ）マウス配列を含む重鎖定常配列に連結したヒト軽鎖配列を含むポリペプチドと、（ｂ）ヒト軽鎖定常配列またはマウス軽鎖定常配列に連結したヒト軽鎖可変領域を含むポリペプチドとを含む抗原結合タンパク質を発現する。特定の実施形態では、上記軽鎖配列が、ヒト軽鎖配列であり、抗体をＦｃおよびＦａｂへと切断することが可能であるプロテアーゼに曝露されると、少なくとも４つの軽鎖ＣＤＲを含む完全ヒトＦａｂが形成され、ここで、該少なくとも４つの軽鎖ＣＤＲが、λ配列、κ配列、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、上記Ｆａｂが、少なくとも５つの軽鎖ＣＤＲを含む。一実施形態では、上記Ｆａｂが、６つの軽鎖ＣＤＲを含む。一実施形態では、上記Ｆａｂの少なくとも１つのＣＤＲが、ＶλセグメントまたはＶκセグメントに由来する配列を含み、該少なくとも１つのＣＤＲが、Ｄセグメントに由来する配列をさらに含む。一実施形態では、上記少なくとも１つのＣＤＲがＣＤＲ３であり、上記ＣＤＲがヒトＶκセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪκセグメントに由来する。
【０２２７】
一実施形態では、上記ポリペプチドが、ヒトＶλ遺伝子セグメントまたはヒトＶκ遺伝子セグメント、ヒトＤＨ遺伝子セグメント、およびヒトＪＨ遺伝子セグメントまたはヒトＪλ遺伝子セグメントもしくはヒトＪκ遺伝子セグメントに由来する可変領域を含む。特定の実施形態では、上記重鎖定常配列が、ヒトＣＨ１配列およびマウスＣＨ２配列およびマウスＣＨ３配列に由来する。
【０２２８】
一態様では、ヒトＪ遺伝子セグメントおよび重鎖定常領域配列に作動可能に連結した、再配列していないヒトＶκ遺伝子セグメントまたはヒトＶλ遺伝子セグメントをその生殖細胞系に含むマウスであって、ここで、重鎖定常領域と融合しているヒトＶκドメインおよび軽鎖定常ドメインと融合しているヒトＶＬドメインを含むＶＬ結合タンパク質を発現する、マウスが提供される。１つの実施形態において、上記ヒトＶＬドメインは、ヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＶλ遺伝子セグメントから選択される再配列したヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記ヒトＶＬドメインはさらに、ヒトＪκ遺伝子セグメントおよびヒトＪλ遺伝子セグメントから選択される再配列したヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む。
【０２２９】
一態様では、マウスであって、その生殖細胞系における改変された内因性重鎖遺伝子座に由来する免疫グロブリンタンパク質を発現し、ここで、該改変された内因性重鎖遺伝子座が、機能的なマウス重鎖Ｖ遺伝子セグメントを欠き、かつ該遺伝子座が、再配列していない軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよび再配列していないＪ遺伝子セグメントを含み、ここで、該再配列していない軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよび再配列していないＪ遺伝子セグメントが、重鎖定常領域配列と作動可能に連結し、ここで、該免疫グロブリンタンパク質が、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドから本質的になり、ここで、該第１のポリペプチドが、免疫グロブリン軽鎖配列および免疫グロブリン重鎖定常配列を含み、かつ、該第２のポリペプチドが、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常領域を含む、マウスが提供される。
【０２３０】
一態様では、免疫グロブリンタンパク質を発現するマウスであって、ここで、該免疫グロブリンタンパク質が、重鎖免疫グロブリン可変ドメインを欠き、該免疫グロブリンタンパク質が、軽鎖遺伝子に由来する第１の可変ドメイン、および軽鎖遺伝子に由来する第２の可変ドメインを含み、ここで、該第１の可変ドメインおよび該第２の可変ドメインが、互いに関してコグネイトであり、ここで、該第１および該第２の軽鎖可変ドメインが、同一ではなく、かつ、ここで、該第１および該第２の軽鎖可変ドメインが会合し、会合すると対象の抗原に特異的に結合する、マウスが提供される。
【０２３１】
一態様では、マウスであって、その生殖細胞系における再配列していない遺伝子セグメントから、再配列していないヒト遺伝子セグメントから本質的になる遺伝子セグメントに完全に由来する可変領域を含む免疫グロブリンタンパク質を発現し、ここで、該免疫グロブリンタンパク質が、免疫グロブリン軽鎖定常配列およびＣＨ１配列、ヒンジ配列、ＣＨ２配列、ＣＨ３配列、およびこれらの組合せからなる群から選択される免疫グロブリン重鎖定常配列を含む、マウスが提供される。
【０２３２】
一態様では、マウスであって、その生殖細胞系における再配列していない遺伝子セグメントから、可変領域を含む免疫グロブリンタンパク質を発現し、ここで、全ての可変領域の全てのＣＤＲ３が、もっぱら軽鎖Ｖ遺伝子セグメントおよび軽鎖Ｊ遺伝子セグメント（必要に応じて、１つまたは複数の体細胞超変異（例えば、１つまたは複数のＮ付加）のある）から生成する、マウスが提供される。
【０２３３】
一態様では、マウスであって、再配列していないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントに由来する、体細胞変異している免疫グロブリンタンパク質を該マウスの生殖細胞系に発現し、ここで該免疫グロブリンタンパク質が、Ｄ遺伝子セグメントに由来する配列を含むＣＤＲを欠き、ここで該免疫グロブリンタンパク質が、軽鎖定常領域と融合している軽鎖可変ドメインにおける第１のＣＤＲ３を含み、重鎖定常領域と融合している軽鎖可変ドメインにおける第２のＣＤＲ３を含み、かつ、ここで該第２のＣＤＲ３が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０またはそれより多くのＮ付加を含む、再配列した軽鎖可変領域配列に由来する、マウスが提供される。
【０２３４】
一態様では、本明細書で記載されるマウスであって、λ遺伝子座、κ遺伝子座、およびこれらの組合せから選択される、機能的にサイレンシングされた軽鎖遺伝子座を含むマウスが提供される。一実施形態では、λ遺伝子座および／またはκ遺伝子座が非機能性となるように、上記マウスが、全体的または部分的に、該λ遺伝子座および／またはκ遺伝子座の欠失を含む。
【０２３５】
一態様では、本明細書で記載される改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む細胞を含むマウス胚が提供される。一実施形態では、上記マウスが、キメラであり、上記胚の細胞のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％が、本明細書で記載される、改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む。一実施形態では、上記胚の細胞のうちの少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．８％が、本明細書で記載される、改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む。一実施形態では、上記胚が、宿主細胞およびドナーＥＳ細胞に由来する細胞を含み、ここで、該ドナーＥＳ細胞に由来する細胞が、本明細書で記載される改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む。一実施形態では、上記胚が、２細胞期、４細胞期、８細胞期、１６細胞期、３２細胞期、または６４細胞期の宿主胚、または胚盤胞であり、本明細書で記載される改変された免疫グロブリン遺伝子座を含むドナーＥＳ細胞をさらに含む。
【０２３６】
一態様では、本明細書で記載される核酸構築物を用いて作製されたマウスまたは細胞が提供される。
【０２３７】
一態様では、本明細書で記載される細胞を用いて作製されたマウスが提供される。一実施形態では、上記細胞が、マウスＥＳ細胞である。
【０２３８】
１つの態様では、本明細書に記載の遺伝子改変を含む、ＥＳ細胞、多能性細胞および人工多能性（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）細胞をはじめとする（しかしこれらに限定されない）マウス細胞およびマウス胚を提供する。ＸＸである細胞およびＸＹである細胞を提供する。本明細書に記載の改変、例えば、前核注入により細胞に導入される改変、を含有する核を含む細胞も提供する。ウイルス導入ＡＤＡＭ６遺伝子を含む細胞、胚およびマウス、例えば、該マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６遺伝子を含む形質導入構築物を含む細胞、胚およびマウスも提供する。
【０２３９】
１つの態様では、本明細書に記載のマウスに由来する細胞または組織を提供する。１つの実施形態において、上記細胞または組織は、本明細書に記載のマウスの脾臓、リンパ節または骨髄に由来する。１つの実施形態において、上記細胞はＢ細胞である。１つの実施形態において、上記細胞は、胚性幹細胞である。１つの実施形態において、上記細胞は生殖細胞である。
【０２４０】
１つの実施形態において、上記組織は、結合組織、筋組織、神経組織および上皮組織から選択される。特定の実施形態において、上記組織は生殖組織である。
【０２４１】
１つの実施形態において、本明細書に記載のマウス由来の細胞および／または組織を、１つまたは複数のｅｘ  ｖｉｖｏアッセイに使用するために単離する。様々な実施形態において、上記１つまたは複数のｅｘ  ｖｉｖｏアッセイは、物理特性、熱特性、電気特性、機械特性または光学特性、外科手術技法、異なる種類の組織の相互作用の測定、画像化技法の開発、またはそれらの組み合わせを含む。
【０２４２】
態様では、抗体を作製するための、本明細書に記載のとおりマウス由来の細胞または組織の使用を提供する。１つの態様では、ハイブリドーマまたはクアドローマを作製するための、本明細書に記載のとおりマウス由来の細胞または組織の使用を提供する。
【０２４３】
１つの態様では、非ヒト細胞は、本明細書に記載の非ヒト動物の染色体またはその断片を含む。１つの実施形態において、上記非ヒト細胞は、本明細書に記載の非ヒト動物の核を含む。１つの実施形態において、上記非ヒト細胞は、核移植の結果として上記染色体またはその断片を含む。
【０２４４】
１つの態様では、本明細書に記載のマウスに由来する核を提供する。１つの実施形態において、上記核は、Ｂ細胞ではない２倍体細胞からのものである。
【０２４５】
１つの態様では、遺伝子改変されたマウス細胞であって、再配列した内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを含む重鎖を発現することができず、且つマウスＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードする機能的ＡＤＡＭ６遺伝子を含むマウス細胞が提供される。１つの実施形態において、上記細胞はさらに、ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントの挿入を含む。特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントは、再配列するとマウス重鎖定常ドメインに融合した機能的軽鎖可変ドメインをコードするように、マウス重鎖定常領域に作動可能に連結しているＶκおよび／またはＪκ遺伝子セグメントである。
【０２４６】
１つの態様では、遺伝子改変されたマウス細胞であって、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を欠き、且つマウスＡＤＡＭ６をコードする異所性ヌクレオチド配列を含むマウス細胞が提供される。１つの実施形態において、上記細胞はさらに、内因性免疫グロブリン重鎖可変領域配列の改変を含む。特定の実施形態において、上記内因性免疫グロブリン重鎖可変領域配列の改変は、マウスＶＨ遺伝子セグメントの欠失、マウスＤＨ遺伝子セグメントの欠失、マウスＪＨ遺伝子セグメントの欠失、およびそれらの組み合わせから選択される欠失を含む。特定の実施形態において、上記マウスは、１つまたは複数のマウス免疫グロブリンＶＨ、ＤＨ、および／またはＪＨ配列の、ヒト免疫グロブリン配列での置き換えを含む。特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、ヒトＶＨ、ヒトＶＬ、ヒトＤＨ、ヒトＪＨ、ヒトＪＬ、およびそれらの組み合わせから選択される。
【０２４７】
１つの実施形態において、上記細胞は、全能性細胞、多能性細胞、または人工多能性細胞である。特定の実施形態において、上記細胞は、マウスＥＳ細胞である。
【０２４８】
１つの態様では、マウスＢ細胞であって、再配列した免疫グロブリン遺伝子を含み、該Ｂ細胞の染色体上に、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列を含むマウスＢ細胞が提供される。１つの実施形態において、上記マウスＢ細胞は、上記核酸配列の２つの対立遺伝子を含む。１つの実施形態において、上記再配列した免疫グロブリン遺伝子は、重鎖定常配列と近接した、再配列した免疫グロブリン軽鎖配列を含む。１つの実施形態において、上記軽鎖配列は、κ配列であり、１つの実施形態において、上記軽鎖配列はλ配列である。
【０２４９】
１つの実施形態において、上記核酸配列は、再配列したマウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座と近接している核酸分子（例えば、Ｂ細胞染色体）上にある。
【０２５０】
１つの実施形態において、上記核酸配列は、上記再配列したマウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座を含む核酸分子とは異なる核酸分子（例えば、Ｂ細胞染色体）上にある。
【０２５１】
１つの実施形態において、上記マウスＢ細胞は、マウスまたはヒト重鎖免疫グロブリン定常領域遺伝子に作動可能に連結した、再配列した非マウス軽鎖免疫グロブリン可変領域配列を含み、該Ｂ細胞は、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列を含む。
【０２５２】
１つの態様では、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座、および雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列を含む染色体を含む、マウス体細胞が提供される。１つの実施形態において、上記核酸配列は、上記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座と同じ染色体上にある。１つの実施形態において、上記核酸は、上記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座とは異なる染色体上にある。１つの実施形態において、上記体細胞は、上記核酸配列の単一のコピーを含む。１つの実施形態において、上記体細胞は、上記核酸配列の少なくとも２個のコピーを含む。特定の実施形態において、上記体細胞はＢ細胞である。１つの実施形態において、上記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、重鎖定常領域配列と作動可能に連結した、再配列していない免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントを含む。
【０２５３】
１つの態様では、マウス生殖細胞であって、該生殖細胞の染色体上に、マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列を含むマウス生殖細胞が提供され、該マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列は、野生型マウス生殖細胞の染色体における位置とは異なる染色体における位置にあり、該マウスがさらに、重鎖定常領域配列に作動可能に連結した、再配列していない軽鎖免疫グロブリン遺伝子セグメント（Ｖκ、および／またはＶλ、および／またはＶκとＪκ、および／またはＶλとＪλ）を含む改変を含む。１つの実施形態において、上記核酸配列は、マウス免疫グロブリン遺伝子座にある。１つの実施形態において、上記核酸配列は、マウス免疫グロブリン遺伝子座と同じ上記生殖細胞の染色体上にある。１つの実施形態において、上記核酸配列は、上記マウス免疫グロブリン遺伝子座とは異なる上記生殖細胞の染色体上にある。１つの実施形態において、上記マウス免疫グロブリン遺伝子座は、少なくとも１つのマウス免疫グロブリン配列の、少なくとも１つの非マウス免疫グロブリン配列での置き換えを含む。特定の実施形態において、上記少なくとも１つの非マウス免疫グロブリン配列は、ヒト免疫グロブリン配列である。
【０２５４】
１つの態様では、本明細書に記載のマウス由来の多能性、人工多能性、または全能性細胞が提供される。特定の実施形態において、上記細胞は、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞である。
【０２５５】
一態様では、本明細書で記載される改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む細胞が提供される。一実施形態では、上記細胞が、全能性細胞、多能性細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、およびＥＳ細胞から選択される。特定の実施形態では、上記細胞が、マウス細胞、例えば、マウスＥＳ細胞である。一実施形態では、上記細胞が、上記改変された免疫グロブリン遺伝子座についてホモ接合性である。
【０２５６】
一態様では、ヒト重鎖定常領域配列に融合した、体細胞変異させた、第１のヒトＶκ配列または第１のヒトＶλ配列を含む第１のポリペプチドをコードする核酸配列を含む細胞が提供される。
【０２５７】
一実施形態では、上記細胞は、ヒト軽鎖定常領域配列に融合した、体細胞変異させた、第２のヒトＶκ配列または第２のヒトＶλ配列を含む第２のポリペプチド鎖をさらに含む。
【０２５８】
一実施形態では、上記第１のポリペプチドの上記ヒトＶκ配列または上記ヒトＶλ配列が、上記第２のポリペプチドの上記ヒトＶκ配列または上記ヒトＶλ配列とコグネイトである。
【０２５９】
一実施形態では、上記第１のポリペプチドの上記Ｖκまたは上記Ｖλおよび上記第２のポリペプチドの上記ヒトＶκまたは上記ヒトＶλが、会合すると、対象の抗原に特異的に結合する。特定の実施形態では、上記第１のポリペプチドが、ヒトＶκから本質的になる可変ドメインを含み、上記第２のポリペプチドが、該第１のポリペプチドのヒトＶκとコグネイトであるヒトＶκからなる可変ドメインを含み、上記ヒト定常領域配列が、ＩｇＧ配列である。
【０２６０】
一実施形態では、上記細胞が、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、およびウイルス核酸配列を発現するヒト網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）から選択される。
【０２６１】
一態様では、本明細書で記載される遺伝子改変を含む染色体を含む齧歯動物（例えば、マウス）体細胞が提供される。
【０２６２】
一態様では、本明細書で記載される遺伝子改変を含む核酸配列を含む齧歯動物（例えば、マウス）生殖細胞が提供される。
【０２６３】
一態様では、本明細書で記載される齧歯動物（例えば、マウス）に由来する多能性細胞、人工多能性細胞、または全能性細胞が提供される。特定の実施形態では、上記細胞が、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞である。
【０２６４】
一態様では、齧歯動物（例えば、マウス）、細胞、または治療用タンパク質（例えば、抗体または他の抗原結合タンパク質）を製造するための、本明細書で記載される細胞の使用が提供される。１つの実施形態において、治療用タンパク質の製造のための本明細書に記載の細胞の使用が提供され、該治療用タンパク質は、ヒト可変ドメインを含む。特定の実施形態において、上記ヒト可変ドメインは、再配列したＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含む。
【０２６５】
１つの態様では、本明細書に記載のターゲティングベクター、ヌクレオチド構築物、または細胞を用いて作製される齧歯動物（例えば、マウス）が提供される。
【０２６６】
１つの態様では、齧歯動物（例えば、マウス）または細胞（例えば、マウスＥＳ細胞、マウス線維芽細胞など）の製造のための本明細書に記載のターゲティングベクターの使用が提供される。１つの実施形態において、上記ターゲティングベクターは、再配列していない免疫グロブリン遺伝子セグメントを含有するヒトゲノム断片を含む。特定の実施形態において、上記再配列していない免疫グロブリン遺伝子セグメントには、Ｖ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントが挙げられる。特定の実施形態において、上記再配列していない免疫グロブリン遺伝子セグメントには、Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、およびＪ遺伝子セグメントが挙げられる。
【０２６７】
１つの態様では、上流ホモロジーアームおよび下流ホモロジーアームを含む核酸構築物を提供し、該上流ホモロジーアームは、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列と同一または実質的に同一である配列を含み、該下流ホモロジーアームは、ヒトまたはマウス免疫グロブリン可変領域配列と同一または実質的に同一である配列を含み、マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む配列が、該上流ホモロジーアームと該下流ホモロジーアームの間に配置されている。特定に実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする配列は、野生型マウスの場合に該マウスＡＤＡＭ６が連結しているマウスプロモーターに作動可能に連結している。
【０２６８】
１つの態様では、（ａ）ヒト可変領域遺伝子セグメントヌクレオチド配列と同一または実質的に同一であるヌクレオチド配列と（ｂ）マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードするヌクレオチド配列とを含むターゲティングベクターを提供する。
【０２６９】
１つの実施形態において、上記ターゲティングベクターは、上記マウスＡＤＡＭ６をコードする配列に作動可能に連結しているプロモーターをさらに含む。特定の実施形態において、上記プロモーターは、マウスＡＤＡＭ６プロモーターである。
【０２７０】
１つの態様では、マウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を改変するためのヌクレオチド構築物であって、少なくとも１つの部位特異的リコンビナーゼ認識部位と、マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする配列とを含む構築物を提供する。
【０２７１】
一態様では、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流および下流で近接するヒトＤＨ遺伝子セグメントを含む核酸構築物が提供される。特定の実施形態では、上記核酸構築物が、ヒトＶκ遺伝子セグメントを含むヒトゲノム配列に相同なホモロジーアームを含む。一実施形態では、ターゲティング構築物は、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流および下流で各々が近接する、全てのまたは実質的に全てのヒトＤＨ遺伝子セグメントを含む。
【０２７２】
一態様では、１２マーのスペースを置いたＲＳＳと上流で近接するヒトＪκ遺伝子セグメントを含む核酸構築物が提供される。特定の実施形態では、上記核酸構築物が、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流および下流で近接するヒトゲノムＤＨ遺伝子配列に対し相同性を含有する第１のホモロジーアームを含む。一実施形態では、上記核酸構築物が、ヒトゲノムＪ遺伝子配列に対し相同性を含有するか、またはマウス重鎖定常領域配列に対し相同性を含有するか、またはマウス定常領域重鎖配列の上流のＪ−Ｃ遺伝子間配列に対し相同性を含有する第２のホモロジーアームを含む。
【０２７３】
一態様では、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと下流で近接するヒトＶλセグメント、１２マーのスペースを置いたＲＳＳと上流および下流で近接するヒトＤＨセグメント、ならびに２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流で近接するＪκセグメント、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流で近接するヒトＪλセグメント、および、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流で近接するヒトＪＨセグメントから選択されるヒトＪセグメントを含む核酸構築物が提供される。一実施形態では、上記構築物が、マウス定常領域配列、マウスＪ−Ｃ遺伝子間配列、および／またはヒトＶλ配列に対し相同性を含有するホモロジーアームを含む。
【０２７４】
一実施形態では、上記核酸構築物が、上記ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＡの断片を含むヒトλ軽鎖可変領域配列を含む。特定の実施形態では、上記ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＡの断片が、ｈＶλ３−２７〜ｈＶλ３−１に及ぶ。
【０２７５】
一実施形態では、上記核酸構築物が、上記ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＢの断片を含むヒトλ軽鎖可変領域配列を含む。特定の実施形態では、上記ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＢの断片が、ｈＶλ５−５２〜ｈＶλ１−４０に及ぶ。
【０２７６】
一実施形態では、核酸構築物が、クラスターＡのゲノム断片およびクラスターＢのゲノム断片を含むヒトλ軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態では、上記ヒトλ軽鎖可変領域配列が、クラスターＡの少なくとも１つの遺伝子セグメントおよびクラスターＢの少なくとも１つの遺伝子セグメントを含む。
【０２７７】
一実施形態では、上記ヒトλ軽鎖可変領域配列が、クラスターＢの少なくとも１つの遺伝子セグメントおよびクラスターＣの少なくとも１つの遺伝子セグメントを含む。
【０２７８】
一態様では、通常天然ではＪκセグメント、ＪＨセグメント、Ｖλセグメント、またはＶＨセグメントのいずれかと隣接して見出される、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流および下流で近接するヒトＤＨセグメントを含む核酸構築物が提供される。一実施形態では、上記核酸構築物が、ヒトＶ−Ｊ遺伝子間領域に相同であるか、またはヒトＶ遺伝子セグメントを含むヒトゲノム配列に相同な、第１のホモロジーアームを含む。一実施形態では、上記核酸構築物が、ヒト重鎖定常領域配列またはマウス重鎖定常領域配列に相同な、第２のホモロジーアームを含む。特定の実施形態では、上記ヒト重鎖定常領域配列またはマウス重鎖定常領域配列が、ＣＨ１配列、ヒンジ配列、ＣＨ２配列、ＣＨ３配列、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、上記核酸構築物が、上流で１２マーのＲＳＳと隣接するヒトＪ遺伝子セグメントを含む。一実施形態では、上記核酸構築物が、１２マーのＲＳＳと上流で隣接するＪ遺伝子セグメントに対し相同性を含有する第２のホモロジーアームを含む。一実施形態では、上記Ｊ遺伝子セグメントが、ヒトＪκセグメント、ヒトＪλセグメント、およびヒトＪＨセグメントから選択される。
【０２７９】
一態様では、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流および下流で近接するヒトＤＨセグメント、ならびに部位特異的リコンビナーゼ認識配列、例えば、Ｃｒｅタンパク質、Ｆｌｐタンパク質、またはＤｒｅタンパク質などの部位特異的リコンビナーゼにより認識される配列を含む核酸構築物が提供される。
【０２８０】
一態様では、ヒトＶλセグメントまたはヒトＶκセグメント、１２マーまたは２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流および下流で近接するＤＨセグメント、ならびに１２マーまたは２３マーのスペースを置いたＲＳＳを伴うヒトＪセグメントを含み、ここで上記１２マーまたは２３マーのスペースを置いたＲＳＳが、ヒトＪセグメントに対して（すなわち、転写方向に関して）すぐの５’側に位置する核酸構築物が提供される。一実施形態では、上記構築物が、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと３’側で近接するヒトＶλセグメント、１２マーのスペースを置いたＲＳＳと上流および下流で近接するヒトＤＨセグメント、ならびに、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと５’側で近接するヒトＪκセグメントを含む。一実施形態では、上記構築物が、１２マーのスペースを置いたＲＳＳと３’側で近接するヒトＶκ、２３マーのスペースを置いたＲＳＳと上流および下流で近接するヒトＤＨセグメント、ならびに、１２マーのスペースを置いたＲＳＳと５’側で近接するヒトＪλセグメントを含む。
【０２８１】
一態様では、ターゲティングベクターであって、（ａ）ヒトターゲティングアームおよびマウスターゲティングアームから独立して選択され、そのベクターを、内因性免疫グロブリンＶ領域遺伝子の遺伝子座または改変された免疫グロブリンＶ領域遺伝子の遺伝子座へと方向付ける、第１のターゲティングアームおよび第２のターゲティングアームと、（ｂ）（ｉ）ｈＶκ４−１〜ｈＶκ１−６およびＪκ１、（ｉｉ）ｈＶκ４−１〜ｈＶκ１−６およびＪκ１〜Ｊκ２、（ｉｉｉ）ｈＶκ４−１〜ｈＶκ１−６およびＪκ１〜Ｊκ３、（ｉｖ）ｈＶκ４−１〜ｈＶκ１−６およびＪκ１〜Ｊκ４、（ｖ）ｈＶκ４−１〜ｈＶκ１−６およびＪκ１〜Ｊκ５、（ｖｉ）ｈＶκ３−７〜ｈＶκ１−１６、（ｖｉｉ）ｈＶκ１−１７〜ｈＶκ２−３０、（ｖｉｉｉ）ｈＶκ３−３１〜ｈＶκ２−４０、および（ｉｘ）これらの組合せからなる群から選択される、ヒトＶＬ遺伝子セグメントの隣接配列、またはヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒトＪκ遺伝子セグメントの隣接配列とを含む、ターゲティングベクターが提供される。
【０２８２】
一実施形態では、上記ベクターを、内因性免疫グロブリン遺伝子座または改変された免疫グロブリン遺伝子座へと方向付けるターゲティングアームが、該内因性免疫グロブリン遺伝子座または改変された免疫グロブリン遺伝子座における配列と同一であるか、または実質的に同一である。
【０２８３】
１つの態様では、遺伝子改変マウスを作製するための方法を提供し、この方法は、該マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の（免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの転写を基準にして）上流の１つまたは複数の免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン軽鎖および／または重鎖遺伝子セグメントで置き換える工程、および該マウスの該ＡＤＡＭ６遺伝子座の（免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの転写を基準にして）下流の１つまたは複数の免疫グロブリン遺伝子セグメントを、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン重鎖または軽鎖の遺伝子セグメントで置き換える工程を含む。１つの実施形態において、上記マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の上流の１つまたは複数の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置き換える１つまたは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、Ｖ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の上流の１つまたは複数の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置き換える、上記ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、ＶおよびＤ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の下流の１つまたは複数の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置き換える、上記１つまたは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、Ｊ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の下流の１つまたは複数の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置き換える、上記１つまたは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、ＤおよびＪ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の下流の１つまたは複数の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置き換える、上記１つまたは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントを含む。
【０２８４】
１つの態様では、遺伝子改変マウスを作製するための方法を提供し、この方法は、該マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の（免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの転写を基準にして）上流の１つまたは複数の免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントで置き換える工程、および該マウスの該ＡＤＡＭ６遺伝子座の（免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの転写を基準にして）下流の１つまたは複数の免疫グロブリン遺伝子セグメントを、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン軽鎖セグメントで置き換える工程を含む。１つの実施形態において、上記マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の上流の１つまたは複数の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置き換える、上記１つまたは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、Ｖ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の上流の１つまたは複数の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置き換えるヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、ＶおよびＪ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の下流の１つまたは複数の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置き換える、上記１つまたは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、Ｊ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の下流の１つまたは複数の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置き換える、上記１つまたは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、ＶおよびＪ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の下流の１つまたは複数の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置き換える、上記１つまたは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、Ｖ遺伝子セグメントを含む。
【０２８５】
特定の実施形態では、上記Ｖ遺伝子セグメントはＶＬ遺伝子セグメントである。別の特定の実施形態では、上記Ｊ遺伝子セグメントはＪＬ遺伝子セグメントである。
【０２８６】
１つの実施形態では、上記ＡＤＡＭ６遺伝子の上流および／または下流の上記１つまたは複数の免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを多能性細胞、人工多能性細胞、または全能性細胞中で置き換えて、遺伝子改変前駆細胞を形成し；該遺伝子改変前駆細胞を宿主に導入し；そして、該遺伝子改変前駆細胞を含む該宿主を妊娠させて、該遺伝子改変前駆細胞に由来するゲノムを含むマウスを形成する。１つの実施形態において、上記宿主は胚である。特定の実施形態において、上記宿主は、マウス前桑実胚（ｐｒｅ−ｍｏｒｕｌａ）（例えば８または４細胞期）、４倍体胚、胚性細胞の集合体、または胚盤胞から選択される。
【０２８７】
１つの態様では、遺伝子改変マウスを作製する方法を提供し、この方法は、マウス免疫グロブリン遺伝子セグメントとマウスＡＤＡＭ６（または雄マウスにおいて機能的なそのオルソログもしくはホモログもしくは断片）ヌクレオチド配列とを含むマウスヌクレオチド配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む配列で置き換えて、第一のキメラ遺伝子座を形成する工程、その後、マウスＡＤＡＭ６コード配列（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする配列）を、上記ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む配列に挿入して、第二のキメラ遺伝子座を形成する工程を含む。
【０２８８】
１つの実施形態において、上記第二のキメラ遺伝子座は、ヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント（ＶＨ）を含む。１つの実施形態において、上記第二のキメラ遺伝子座は、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメント（ＶＬ）を含む。特定の実施形態において、上記第二のキメラ遺伝子座は、ヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントに作動可能に連結しているヒトＶＨ遺伝子セグメントまたはヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態では、上記第二のキメラ遺伝子座は、ヒトＪＨ遺伝子セグメントまたはヒトＪＬ遺伝子セグメントに作動可能に連結しているヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む。さらなる特定の実施形態において、上記第二のキメラ遺伝子座は、マウスＣＨ２＋ＣＨ３配列と融合するヒトＣＨ１配列、またはヒトＣＨ１およびヒトヒンジ配列を含む第三のキメラ遺伝子座に作動可能に連結している。
【０２８９】
１つの態様では、（ａ）雄マウスにおける内因性マウスＡＤＡＭ６活性の低減または消去を生じさせる結果となるマウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座の第１の改変を行う工程；および（ｂ）雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性を該マウスに付与する核酸配列を付加するように第２の改変を行う工程を含む、マウスの重鎖免疫グロブリン遺伝子座を改変するための方法が提供される。
【０２９０】
１つの実施形態において、上記第１の改変は、ヒト免疫グロブリン配列の付加、またはマウス免疫グロブリン配列のヒト免疫グロブリン配列での置き換えを含む。
【０２９１】
１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、重鎖配列である。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、軽鎖配列である。
【０２９２】
１つの実施形態において、上記第１および上記第２の改変は、単一のＥＳ細胞において行われ、該単一のＥＳ細胞は、上記マウスを作製するために宿主胚へと導入される。
【０２９３】
１つの態様では、本明細書に記載のマウスの、野生型マウスである、または遺伝子改変されている第２のマウスとの交配の後代が提供される。
【０２９４】
１つの態様では、妊性雄マウスを作製するための、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を含む異所性ヌクレオチド配列を含むマウスの使用を提供し、この使用は、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を含む上記異所性ヌクレオチド配列を含むマウスを、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を欠いているマウスと交配させること、および該異所性ＡＤＡＭ６遺伝子座もしくは配列を有する後代を産生できる雌である後代を得ること、または該異所性ＡＤＡＭ６遺伝子座もしくは配列を含む雄であって、野生型雄マウスによって示される妊性とほぼ同じである妊性を示す雄である後代を得ることを含む。
【０２９５】
１つの態様では、機能的内因性ＡＤＡＭ６配列を欠くマウスに異所性ＡＤＡＭ６配列を導入するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、本明細書に記載のマウスと、該機能的内因性ＡＤＡＭ６配列を欠くマウスとを交配させることを含む。
【０２９６】
１つの態様では、異所性ＡＤＡＭ６配列を有するマウスを作製するための、本明細書に記載のマウスからの遺伝子材料の使用を提供する。１つの実施形態において、上記使用は、本明細書に記載のマウスの細胞の核を使用する核移植を含む。１つの実施形態において、上記使用は、本明細書に記載のマウスの細胞を、該細胞に由来する動物を産生するためにクローングすることを含む。１つの実施形態において、上記使用は、上記異所性ＡＤＡＭ６配列を含むマウスを作製するためのプロセスにおける、本明細書に記載のマウスの精子または卵子の利用を含む。
【０２９７】
１つの態様では、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む妊性雄マウスを作製するための方法であって、内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座の改変を含む第一のマウス生殖細胞を、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含む第二のマウス生殖細胞で受精させる工程；受精細胞を形成する工程；上記受精細胞を胚へと発生させる工程；および代理母において上記胚を妊娠させてマウスを得る工程を含む方法を提供する。
【０２９８】
１つの実施形態において、上記受精は、雄マウスと雌マウスを交配させることによって達成される。１つの実施形態では、上記雌マウスが上記ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含む。１つの実施形態では、上記雄マウスが上記ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含む。
【０２９９】
１つの態様では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含むゲノムを有するマウスの妊性を回復させるまたは強化するための、マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログまたは対応するＡＤＡＭ６タンパク質の機能的断片をコードする核酸配列の使用を提供し、この場合の改変は、内因性ＡＤＡＭ６機能を低減させるまたは消去する。
【０３００】
１つの実施形態では、上記核酸配列を上記マウスのゲノムの異所位置に組み込む。１つの実施形態では、上記核酸配列を上記マウスのゲノムの内因性免疫グロブリン遺伝子座に組み込む。特定の実施形態において、上記内因性免疫グロブリン遺伝子座は、重鎖遺伝子座である。１つの実施形態では、上記核酸配列を上記マウスのゲノムの内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の位置に組み込む。
【０３０１】
１つの態様では、内因性重鎖遺伝子座で、マウスの１つまたは複数の免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを１つまたは複数のヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントで置き換える工程を含む、遺伝子改変されたマウスを作製するための方法が提供される。１つの実施形態において、上記置き換えは、すべての、または実質的にすべての機能的マウス免疫グロブリン重鎖セグメント（すなわち、ＶＨ、ＤＨ、およびＪＨセグメント）の、１つまたは複数の機能的ヒト軽鎖セグメント（すなわち、ＶＬおよびＪＬセグメント）での置き換えである。１つの実施形態において、上記置き換えは、すべての、または実質的にすべての機能的マウス重鎖ＶＨ、ＤＨ、およびＪＨセグメントの、すべての、または実質的にすべてのヒトＶλまたはＶκセグメントおよび少なくとも１つのＪλまたはＪκセグメントでの置き換えである。特定の実施形態において、上記置き換えは、すべての、または実質的にすべての機能的ヒトＪλまたはＪκセグメントを包含する。
【０３０２】
１つの態様では、内因性重鎖免疫グロブリン可変セグメント（ＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ）を少なくとも１つのヒトＶλまたはＶκセグメントおよび少なくとも１つのヒトＪλまたはＪκセグメントで置き換える工程を含む、マウス重鎖定常領域と融合した、ヒト免疫グロブリンＶλもしくはＶκおよび／またはＪλもしくはＪκセグメントに由来する配列を含むポリペプチドを発現するマウスを作製するための方法が提供され、該置き換えは、多能性、人工多能性、または全能性マウス細胞に存在して遺伝子改変マウス前駆細胞を形成し、該遺伝子改変マウス前駆細胞はマウス宿主へと導入され、該遺伝子改変前駆細胞を含む該マウス宿主を妊娠させて、該遺伝子改変マウス前駆細胞に由来するゲノムを含むマウスを形成する。１つの実施形態において、上記宿主は、胚である。特定の実施形態において、上記宿主は、マウス前桑実胚（例えば８または４細胞期）、４倍体胚、胚性細胞の集合体、または胚盤胞から選択される。
【０３０３】
一態様では、本明細書で記載される遺伝子改変マウスを作製するための方法であって、核移植によって本明細書で記載される改変を含有する核酸を細胞へと導入する工程と、適切な条件下で該細胞を維持して、本明細書で記載されるマウスへと発生させる工程（例えば、該細胞を培養する工程、および代理母体において該細胞を含む胚を懐胎させる工程を含めた）とを含む方法が提供される。
【０３０４】
一態様では、改変マウスを作製するための方法であって、マウスＥＳ細胞またはマウス多能性細胞もしくはマウス全能性細胞もしくはマウス人工多能性細胞を、本明細書で記載される通り、免疫グロブリン重鎖定常配列に作動可能に連結した、１つまたは複数の再配列していない免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントを包含するように改変する工程と、該ＥＳ細胞を培養する工程と、その培養ＥＳ細胞を宿主胚へと導入してキメラ胚を形成する工程と、該キメラ胚を適切な宿主マウスへと導入して改変マウスへと発生させる工程とを含む方法が提供される。一実施形態では、上記１つまたは複数の再配列していない免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントが、ヒトλ遺伝子セグメントまたはヒトκ遺伝子セグメントである。一実施形態では、上記１つまたは複数の再配列していない免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントが、ヒトＶλセグメントまたはヒトＶκセグメントおよび１つまたは複数のＪλセグメント、Ｊκセグメント、またはＪＨセグメントを含む。一実施形態では、上記重鎖定常遺伝子配列が、ＣＨ１配列、ヒンジ配列、ＣＨ２配列、ＣＨ３配列、およびこれらの組合せから選択されるヒト配列である。一実施形態では、上記１つまたは複数の再配列していない免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントにより、上記内因性重鎖遺伝子座において、全てのまたは実質的に全ての機能的な内因性重鎖可変領域遺伝子セグメントを置き換え、上記重鎖定常配列が、ＣＨ１配列、ヒンジ配列、ＣＨ２配列、およびＣＨ３配列を含むマウス配列である。
【０３０５】
一態様では、ヒトλまたはκ軽鎖可変ドメインおよびヒトまたはマウス重鎖定常領域配列を含むタンパク質を含めた、１つまたは複数のκ軽鎖および／またはλ軽鎖可変領域免疫グロブリン配列ならびに免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含むタンパク質を作製するための核酸構築物、細胞、胚、マウス、および方法が提供される。
【０３０６】
１つの態様では、本明細書に記載のマウスにおいて産生される、免疫グロブリン可変領域をコードするヌクレオチド配列が提供される。
【０３０７】
１つの態様では、本明細書に記載のマウスにおいて産生される抗体の重鎖または軽鎖可変領域アミノ酸配列が提供される。
【０３０８】
１つの態様では、本明細書に記載のマウスにおいて産生される抗体の可変領域をコードする重鎖または軽鎖可変領域ヌクレオチド配列が提供される。
【０３０９】
１つの態様では、本明細書に記載のマウスにおいて産生される抗体またはその抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ）が提供される。
【０３１０】
１つの態様では、軽鎖（すなわち、カッパ（κ）および／またはラムダ（λ））免疫グロブリン可変ドメインに由来するが、完全長重鎖免疫グロブリン可変ドメインに由来しない免疫グロブリン可変ドメインを含む結合タンパク質が記載される。遺伝子改変されたマウスを含む、結合タンパク質を作製するための方法および組成物もまた提供される。
【０３１１】
１つの態様では、本明細書に記載のマウスを対象の抗原で免疫する工程、および該マウスが該対象の抗原を特異的に結合する抗原結合タンパク質を産生することを可能にする条件下で該マウスを維持する工程を含む、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含まない抗原結合タンパク質を作製するための方法が提供される。
【０３１２】
１つの態様では、本明細書に記載のマウスを対象の抗原で免疫する工程、および該マウスが該対象の抗原を特異的に結合する抗原結合タンパク質を産生することを可能にする条件下で該マウスを維持する工程を含む、重鎖定常領域配列と近接した第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン、および軽鎖定常配列と近接している第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を作製するための方法が提供される。
【０３１３】
１つの態様では、重鎖定常領域配列と近接した免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含み、免疫グロブリン軽鎖を欠く抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、内因性κおよびλ遺伝子座のノックアウトを含む（または非機能的内因性κおよび／またはλ遺伝子座を含む）本明細書に記載のマウスを対象の抗原で免疫する工程、および該マウスが該対象の抗原を特異的に結合する抗原結合タンパク質を産生することを可能にする条件下で該マウスを維持する工程を含む、方法が提供される。
【０３１４】
１つの態様では、免疫グロブリン可変領域ヌクレオチド配列を作製するための本明細書に記載のマウスの使用が提供される。１つの実施形態において、上記可変領域ヌクレオチド配列は、再配列したＶＬ、ＤＨ、およびＪＬ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記可変領域ヌクレオチド配列は、再配列したＶＬ、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記可変領域ヌクレオチド配列は、再配列したＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記可変領域ヌクレオチド配列は、再配列したＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含む。
【０３１５】
１つの態様では、完全ヒトＦａｂまたは完全ヒトＦ（ａｂ）２を作製するための本明細書に記載のマウスの使用が提供される。１つの実施形態において、上記完全ヒトＦａｂまたは完全ヒトＦ（ａｂ）２は、再配列したＶＬ、ＤＨ、およびＪＬ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記完全ヒトＦａｂまたは完全ヒトＦ（ａｂ）２は、再配列したＶＬ、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記完全ヒトＦａｂまたは完全ヒトＦ（ａｂ）２は、再配列したＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記完全ヒトＦａｂまたは完全ヒトＦ（ａｂ）２は、再配列したＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含む。
【０３１６】
１つの態様では、完全ヒトＦａｂ（ヒト軽鎖定常領域と融合した第１のヒトＶＬ、およびヒト重鎖定常領域配列と融合した第２のヒトＶＬ）または完全ヒトＦ（ａｂ）２を作製するための本明細書に記載のマウスの使用が提供される。
【０３１７】
１つの態様では、不死化細胞系を作製するための本明細書に記載のマウスの使用が提供される。１つの実施形態において、上記不死化細胞系は、マウス定常領域核酸配列を含む核酸配列に作動可能に連結した、ヒトＶλまたはＶκドメインをコードする核酸配列を含む。１つの実施形態において、上記不死化細胞系は、ヒト可変ドメインを含む抗体を発現する。特定の実施形態において、上記ヒト可変ドメインは、軽鎖可変ドメインである。
【０３１８】
１つの態様では、ハイブリドーマまたはクアドローマを作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。１つの実施形態において、上記ハイブリドーマまたはクアドローマは、対象の抗原を結合するヒト可変ドメインを含むポリペプチドを発現する。
【０３１９】
１つの態様では、ヒト軽鎖可変領域を含有するファージライブラリーを作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。１つの実施形態において、上記軽鎖可変領域は、ヒトＶκ領域である。
【０３２０】
１つの態様では、ヒト抗原結合タンパク質を作製するための可変領域配列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、（ａ）本明細書に記載のマウスを対象の抗原で免疫すること、（ｂ）（ａ）の免疫したマウスからリンパ球を単離すること、（ｃ）上記リンパ球を１つまたは複数の標識抗体に曝露すること、（ｄ）上記対象の抗原に結合できるリンパ球を同定すること、および（ｅ）上記リンパ球からの１つまたは複数のヒト軽鎖可変領域核酸配列を増幅し、それによって可変領域配列を生成することを含む。
【０３２１】
１つの実施形態では、上記リンパ球を上記マウスの脾臓に由来する。１つの実施形態では、上記リンパ球を上記マウスのリンパ節に由来する。１つの実施形態では、上記リンパ球を上記マウスの骨髄に由来する。
【０３２２】
１つの実施形態において、上記標識抗体は、蛍光団結合体化抗体である。１つの実施形態において、１つまたは複数の上記蛍光団結合体化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧおよび／またはその組み合わせから選択される。
【０３２３】
１つの実施形態において、上記リンパ球は、Ｂ細胞である。
【０３２４】
１つの実施形態において、上記１つまたは複数の可変領域核酸配列は、軽鎖可変領域配列を含む。特定の実施形態において、上記軽鎖可変領域配列は、免疫グロブリンκ軽鎖可変領域配列である。１つの実施形態において、上記１つまたは複数の可変領域核酸配列は、λ軽鎖可変領域配列である。
【０３２５】
１つの実施形態では、ヒト抗原結合タンパク質を作製するための１つまたは複数のκ軽鎖可変領域配列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、（ａ）本明細書に記載のマウスを対象の抗原で免疫すること、（ｂ）（ａ）の免疫したマウスから脾臓を単離すること、（ｃ）上記脾臓からのＢリンパ球を１つまたは複数の標識抗体に曝露すること、（ｄ）上記対象の抗原に結合できる（ｃ）のＢリンパ球を同定すること、および（ｅ）上記Ｂリンパ球からのκ軽鎖可変領域核酸配列を増幅し、それによって該κ軽鎖可変領域配列を生成することを含む。
【０３２６】
１つの実施形態において、ヒト抗原結合タンパク質を作製するためのκ軽鎖可変領域配列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、（ａ）本明細書に記載のマウスを対象の抗原で免疫すること、（ｂ）（ａ）の免疫したマウスから１つまたは複数のリンパ節を単離すること、（ｃ）上記１つまたは複数のリンパ節からのＢリンパ球を１つまたは複数の標識抗体に曝露すること、（ｄ）上記対象の抗原に結合できる（ｃ）のＢリンパ球を同定すること、および（ｅ）上記Ｂリンパ球からのκ軽鎖可変領域核酸配列を増幅し、それによって該κ軽鎖可変領域配列を生成することを含む。
【０３２７】
１つの実施形態では、ヒト抗原結合タンパク質を作製するためのκ軽鎖可変領域配列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、（ａ）本明細書に記載のマウスを対象の抗原で免疫すること、（ｂ）（ａ）の免疫したマウスから骨髄を単離すること、（ｃ）上記骨髄からのＢリンパ球を１つまたは複数の標識抗体に曝露すること、（ｄ）上記対象の抗原に結合できる（ｃ）のＢリンパ球を同定すること、および（ｅ）上記Ｂリンパ球からのκ軽鎖可変領域核酸配列を増幅し、それによって該κ軽鎖可変領域配列を生成することを含む。様々な実施形態において、上記１つまたは複数の標識抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧおよび／またはその組み合わせから選択される。
【０３２８】
様々な実施形態では、ヒト抗原結合タンパク質を作製するためのκ軽鎖可変領域配列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、増幅κ軽鎖可変領域配列をヒト重もしくは軽鎖定常領域配列または必要に応じてヒト重鎖可変領域配列に融合させること、融合した配列を細胞において発現させること、および発現された配列を回収し、それによってヒト抗原結合タンパク質を産生させることをさらに含む。
【０３２９】
様々な実施形態において、上記ヒト重鎖定常領域は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＧから選択される。様々な特定の実施形態において、上記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４から選択される。様々な実施形態において、上記ヒト重鎖定常領域は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４またはその組み合わせを含む。様々な実施形態において、上記軽鎖定常領域は、免疫グロブリンκ定常領域である。様々な実施形態において、上記細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＤＵ１４５細胞、Ｌｎｃａｐ細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３８細胞、ＰＣ３細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、ＴＨＰ−１細胞、Ｕ８７細胞、ＳＨＳＹ５Ｙ（ヒト神経芽腫）細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、ＧＨ３細胞、ＰＣ１２細胞、ヒト網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）およびＭＣ３Ｔ３細胞から選択される。特定の実施形態において、上記細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【０３３０】
１つの態様において、対象の抗原に対して特異的なヒト軽鎖可変領域を産生させるための方法を提供し、この方法は、本明細書に記載のマウスを該抗原で免疫する工程、該抗原に対して特異的なヒト軽鎖可変領域を産生するマウスから少なくとも１つの細胞を単離する工程、該抗原に対して特異的な軽鎖可変領域を含むヒト抗原結合タンパク質を産生する少なくとも１つの細胞を産生する工程、および該ヒト抗原結合タンパク質を産生する少なくとも１つの細胞を培養する工程、および該ヒト抗原結合タンパク質を得る工程を含む。１つの実施形態では、上記ヒト軽鎖可変領域はヒトＶκ領域である。
【０３３１】
様々な実施形態において、上記抗原に対して特異的なヒト軽鎖可変領域を産生するマウスから単離される少なくとも１つの細胞は、脾細胞またはＢ細胞である。
【０３３２】
様々な実施形態において、上記抗原結合タンパク質は、抗体である。
【０３３３】
様々な実施形態において、上記対象の抗原での免疫を、タンパク質、ＤＮＡ、ＤＮＡとタンパク質の組み合わせ、または該抗原を発現する細胞を用いて行う。
【０３３４】
１つの態様では、免疫グロブリン可変領域またはその断片をコードする核酸配列を作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。１つの実施形態では、上記核酸配列を使用して、ヒト抗体またはその抗原結合断片を作製する。１つの実施形態では、上記マウスを使用して、抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ｓｃＦｖ、ビスｓｃＦｖ、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、Ｖ−ＮＡＲ、ＶＨＨ、ＶＬ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２、ＤＶＤ（すなわち、二重可変ドメイン抗原結合タンパク質）、ＳＶＤ（すなわち、単一可変ドメイン抗原結合タンパク質）または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ：ＢｉＴＥ）から選択される抗原結合タンパク質を作製する。
【０３３５】
１つの態様では、ヒト疾患または障害の処置のために、薬物（例えば、抗原結合タンパク質）を製造するための、または薬物（例えば、抗原結合タンパク質）の可変配列をコードする配列を製造するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。
【０３３６】
一態様では、第２のヒト軽鎖免疫グロブリン可変配列（ＶＬ２）とコグネイトである、第１のヒト軽鎖免疫グロブリン可変配列（ＶＬ１）をコードする核酸配列を作製するための、本明細書で記載されるマウスの使用であって、ここで、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域（ポリペプチド１）と融合している該ＶＬ１が、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域（ポリペプチド２）と融合しているＶＬ２とともに、ポリペプチド１／ポリペプチド２の二量体として発現してＶＬ１−ＶＬ２抗体を形成する。
【０３３７】
一態様では、ヒト免疫グロブリン重鎖配列と融合しているヒト免疫グロブリン軽鎖可変配列をコードする核酸配列を作製するための、本明細書で記載されるマウスの使用であって、ここで該核酸配列がヒトＶＬ−ＣＨポリペプチドをコードし、ここで該ヒトＶＬ−ＣＨポリペプチドが二量体として発現し、かつ、ここで該二量体が免疫グロブリン軽鎖の非存在下において（例えば、ヒトλ軽鎖またはヒトκ軽鎖の非存在下において）発現する。一実施形態では、そのＶＬ−ＣＨ二量体が、λ軽鎖の非存在下において、および、κ軽鎖の非存在下において、対象の抗原に特異的に結合する。
【０３３８】
一態様では、免疫グロブリン可変ドメインの全部または一部をコードする核酸配列を作製するための、本明細書で記載されるマウスの使用。一実施形態では、上記免疫グロブリン可変ドメインが、ヒトＶλドメインまたはヒトＶκドメインである。
【０３３９】
一態様では、マウス、細胞、または治療用タンパク質（例えば、抗体または他の抗原結合タンパク質）を製造するための、本明細書で記載される核酸構築物の使用が提供される。
【０３４０】
一態様では、ヒト用治療剤を製造するための細胞系を作製するための、本明細書で記載されるマウス由来の核酸配列の使用が提供される。一実施形態では、上記ヒト用治療剤が、ヒト重鎖定常配列と融合しているヒト軽鎖可変配列（例えば、ヒトＶλセグメントまたはヒトＶκセグメントに由来するヒト軽鎖可変配列）を含む結合タンパク質である。一実施形態では、上記ヒト用治療剤が、ヒトλ免疫グロブリン軽鎖またはヒトκ免疫グロブリン軽鎖である第１のポリペプチド、およびヒト重鎖定常配列と融合しているヒトＶλ可変配列またはヒトＶκ可変配列を含む第２のポリペプチドを含む。
【０３４１】
一態様では、ヒトＣＨドメインと融合させた、体細胞変異させた、ヒトＶＬドメインを含むポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物でトランスフェクトした、哺乳動物細胞を含む発現系が提供される。
【０３４２】
一実施形態では、上記発現系が、ヒトＣＬドメインと融合している免疫グロブリンＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、ここで該ヒトＣＬドメインと融合している該ＶＬドメインが、上記ヒトＣＨドメインと融合しているＶＬドメインとのコグネイト軽鎖である。
【０３４３】
一実施形態では、上記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、２９３細胞、およびウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）から選択される。
【０３４４】
一態様では、結合タンパク質を作製するための方法であって、ＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を、本明細書で記載されるマウスの細胞に由来するＣＨ領域に融合しているＶＬ領域をコードする遺伝子から得る工程と、ヒトＣＨ領域をコードする遺伝子とともにインフレームで該ＶＬ領域配列をコードするヌクレオチド配列をクローニングしてヒト結合タンパク質配列を形成し、適切な細胞において上記ヒト結合タンパク質配列を発現させる工程とを含む方法が提供される。
【０３４５】
一実施形態では、上記マウスを対象の抗原で免疫し、上記ＣＨ領域に融合しているＶＬ領域が、対象の抗原エピトープに特異的に結合する（例えば、マイクロモル濃度、ナノモル濃度、またはピコモル濃度の範囲にあるＫＤで特異的に結合する）。一実施形態では、上記ＣＨ領域に融合しているＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列を、上記マウスにおいて体細胞変異させる。
【０３４６】
一実施形態では、上記適切な細胞が、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、クァドローマ、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、およびウイルス核酸配列を発現するヒト網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）から選択される。
【０３４７】
一実施形態では、上記ＣＨ領域が、ヒトＩｇＧアイソタイプを含む。特定の実施形態では、上記ヒトＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４から選択される。別の特定の実施形態では、上記ヒトＩｇＧが、ＩｇＧ１である。別の特定の実施形態では、上記ヒトＩｇＧが、ＩｇＧ４である。別の特定の実施形態では、上記ヒトＩｇＧ４が、改変されたＩｇＧ４である。一実施形態では、上記改変されたＩｇＧ４が、ヒンジ領域における置換を含む。特定の実施形態では、上記改変されたＩｇＧ４が、野生型ヒトＩｇＧ４と比べて、ＫａｂａｔのＥＵ番号付け指標により番号付けされたアミノ酸残基２２８における置換を含む。特定の実施形態では、アミノ酸残基２２８における置換が、ＫａｂａｔのＥＵ番号付け指標により番号付けされたＳ２２８Ｐ置換である。
【０３４８】
一実施形態では、上記細胞が、上記ＣＨ領域に融合しているＶＬドメインとコグネイトである軽鎖に由来するＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、その方法が、ヒトＣκドメインまたはヒトＣλドメインに融合している該コグネイトＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を発現する工程をさらに含む。
【０３４９】
１つの態様では、二重特異性抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、本明細書に記載の第１のマウスを、第１の対象の抗原に曝露し、該第１の対象の抗原を特異的に結合する第１のヒトＶＬドメインの配列を同定する工程；本明細書に記載の第２のマウスを、第２の対象の抗原に曝露し、該第２の対象の抗原を特異的に結合する第２のヒトＶＬドメインの配列を同定する工程であって、該第１のヒトＶＬドメインは、該第２の対象の抗原を結合せず、且つ該第２のヒトＶＬドメインは、該第１の対象の抗原を結合しない、工程；ならびに該第１のヒトＶＬドメインの配列を第１の重鎖定常配列に融合させ、第１の抗原結合ポリペプチドを形成し、該第２のヒトＶＬドメインの配列を第２の重鎖定常配列に融合させ、第２の抗原結合ポリペプチドを形成する工程；ならびに二重特異性結合タンパク質において該第１の抗原結合ポリペプチドおよび該第２の抗原結合ポリペプチドを利用する工程を含む、方法が提供される。
【０３５０】
１つの実施形態において、上記抗原結合タンパク質はさらに、上記第１のヒトＶＬドメインとコグネイトであるヒトκまたはλ可変ドメインを含む第１の免疫グロブリン軽鎖、および上記第２のヒトＶＬドメインとコグネイトであるヒトκまたはλ可変ドメインを含む第２の免疫グロブリン軽鎖を含む。
【０３５１】
１つの実施形態において、上記第１の重鎖定常配列は、上記第２の重鎖定常配列と同一である。１つの実施形態において、上記第１の重鎖定常配列は、その第１の重鎖定常領域のプロテインＡへの結合性を低減または消失させる改変を含み、上記第２の重鎖定常配列は、プロテインＡを結合する。
【０３５２】
１つの実施形態において、上記第１および第２のヒトＶＬドメインは、ヒトＶκおよびヒトＪκ遺伝子セグメントに由来する配列を含む。１つの実施形態において、上記第１および第２のヒトＶＬドメインは、ヒトＶλおよびヒトＪλ遺伝子セグメントに由来する配列を含む。１つの実施形態において、上記第１および第２のヒトＶＬドメインは、ヒトＤＨ遺伝子セグメントに由来する配列を含む。１つの実施形態において、上記第１および第２のヒトＶＬドメインは、ヒトＪＨ遺伝子セグメントに由来する配列を含む。特定の実施形態において、上記第１および第２のヒトＶＬドメインは、ヒトＤＨおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントに由来する配列を含む。特定の実施形態において、上記第１および第２のヒトＶＬドメインは、ヒトＤＨおよびヒトＪκ遺伝子セグメントに由来する配列を含む。
【０３５３】
１つの実施形態において、上記第１のヒトＶＬドメインは、ヒトＶκおよびヒトＪκ遺伝子セグメントに由来する配列を含み、上記第２のヒトＶＬドメインは、ヒトＶλおよびヒトＪλ遺伝子セグメントに由来する配列を含む。１つの実施形態において、上記第１のヒトＶＬドメインは、ヒトＶλおよびヒトＪλ遺伝子セグメントに由来する配列を含み、上記第２のヒトＶＬドメインは、ヒトＶκおよびヒトＪκ遺伝子セグメントに由来する配列を含む。
【０３５４】
一態様では、本明細書で記載されるマウスにおいて作製された免疫グロブリン可変領域（ＶＲ）（例えば、ヒトＪＬ配列、またはヒトＪＨ配列、またはヒトＤＨ配列およびヒトＪＨ配列、またはヒトＤＨ配列およびヒトＪＬ配列と融合しているヒトＶＬ配列を含む）が提供される。特定の実施形態では、上記免疫グロブリンＶＲが、ＶκセグメントおよびＶλセグメントから選択される生殖細胞系のヒト遺伝子セグメントに由来し、ここで該ＶＲが該マウスに由来する再配列した配列によりコードされ、ここで該再配列した配列が体細胞超変異している。一実施形態では、上記再配列した配列が、１〜５カ所の体細胞超変異を含む。一実施形態では、上記再配列した配列が、少なくとも６、７、８、９、または１０カ所の体細胞超変異を含む。一実施形態では、上記再配列した配列が、１０カ所を超える体細胞超変異を含む。一実施形態では、上記再配列した配列を、１つまたは複数のヒト重鎖定常領域配列またはマウス重鎖定常領域配列（例えば、ヒトまたはマウスのＣＨ１配列、ヒンジ配列、ＣＨ２配列、ＣＨ３配列、およびこれらの組合せから選択される）と融合させる。
【０３５５】
一態様では、本明細書で記載されるマウスにおいて作製された結合タンパク質の免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列が提供される。一実施形態では、上記ＶＲを、１つまたは複数のヒト重鎖定常領域配列またはマウス重鎖定常領域配列（例えば、ヒトまたはマウスのＣＨ１配列、ヒンジ配列、ＣＨ２配列、ＣＨ３配列、およびこれらの組合せから選択される）と融合させる。
【０３５６】
一態様では、本明細書で記載されるマウスに由来する核酸配列によりコードされる軽鎖可変ドメインが提供される。
【０３５７】
一態様では、本明細書で記載されるマウスにおいて作製されるか、または本明細書で記載されるマウスにおいて作製された配列に由来する、抗体またはその抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ）が提供される。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
非ヒト動物であって、以下：
（ａ）１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントの、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域の上流への挿入、
（ｂ）１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントの、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の上流への挿入、および
（ｃ）ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列であって、該ＡＤＡＭ６タンパク質が異所性ＡＤＡＭ６核酸配列から発現するヌクレオチド配列を含む、
非ヒト動物。
（項目２）
前記非ヒト重鎖および／または軽鎖定常領域が、齧歯動物定常領域である、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目３）
前記軽鎖定常領域がマウスＣκである、項目１または２に記載の非ヒト動物。
（項目４）
前記非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域の上流の前記ヒトＶＬ遺伝子セグメントおよびヒトＪＬ遺伝子セグメントがヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントである、先行する項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目５）
前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の上流の前記ヒトＶＬ遺伝子セグメントおよびヒトＪＬ遺伝子セグメントがヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントである、先行する項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目６）
ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードする前記ヌクレオチド配列が、野生型非ヒトＡＤＡＭ６遺伝子座に比較して同じ場所に存在する、先行する項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目７）
ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードする前記ヌクレオチド配列が、免疫グロブリン遺伝子セグメント内に存在する、先行する項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目８）
前記免疫グロブリン遺伝子セグメントが、ヒトκ軽鎖遺伝子セグメントである、項目７に記載の非ヒト動物。
（項目９）
前記免疫グロブリン遺伝子セグメントが、前記非ヒト動物の内因性重鎖遺伝子セグメントである、項目７または８に記載の非ヒト動物。
（項目１０）
前記非ヒト動物が、該非ヒト動物において免疫グロブリンＶＬドメインを形成するように再配列することができない、内因性免疫グロブリンＶＬおよび／またはＪＬ遺伝子セグメントを含む、先行する項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目１１）
（ａ）前記非ヒト動物の内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における１つまたは複数の再配列していないヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数の再配列していないヒトＪκ遺伝子セグメント、
（ｂ）該非ヒト動物の内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座における１つまたは複数の再配列していないヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数の再配列していないヒトＪκ遺伝子セグメント
を含む遺伝子改変された非ヒト動物であって、ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片を発現することができる、非ヒト動物。
（項目１２）
項目１または１１に記載の非ヒト動物由来の細胞。
（項目１３）
前記細胞がＢ細胞である、項目１２に記載の細胞。
（項目１４）
項目１３に記載のＢ細胞から生成されたハイブリドーマ。
（項目１５）
前記非ヒト動物が齧歯動物である、項目１２に記載の細胞。
（項目１６）
前記齧歯動物がマウスおよびラットから選択される、項目１５に記載の細胞。
（項目１７）
（ａ）項目１または１１に記載の非ヒト動物を、対象の抗原に曝露させる工程と；
（ｂ）該非ヒト動物の１つまたは複数のＢリンパ球を単離する工程であって、該１つまたは複数のＢリンパ球が、対象の該抗原を結合するＶＬ結合タンパク質を発現する、工程と；
（ｃ）対象の該抗原を結合する該ＶＬ結合タンパク質のＶＬドメインをコードする核酸配列を同定する工程であって、該ＶＬ結合タンパク質が、ヒトＶκドメインおよび非ヒト軽鎖定常ドメイン、ならびにヒトＶκドメインおよび非ヒト重鎖定常ドメインを含む、工程と；
（ｄ）（ｃ）の該核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列と共に用いて、対象の該抗原を結合するヒト抗原結合タンパク質を作製する工程とを含む、対象の抗原に結合する抗原結合タンパク質を作製するための方法が提供される。
（項目１８）
前記ＶＬ結合タンパク質の非ヒト軽鎖定常領域がマウスＣκであり、且つ前記非ヒト重鎖定常領域がマウス重鎖定常領域である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記非ヒト動物がマウスである、項目１７または１８に記載の方法。
（項目２０）
非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結した１つまたは複数のヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントを含む齧歯動物であって、１つまたは複数のＡＤＡＭ６タンパク質を発現する、齧歯動物。
（項目２１）
前記１つまたは複数のヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントがヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントである、項目２０に記載の齧歯動物。
（項目２２）
前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子がマウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子である、項目２０または２１に記載の齧歯動物。
（項目２３）
前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子がＣＨ１領域および／またはヒンジ領域を含む、項目２０〜２２のいずれか１項に記載の齧歯動物。
（項目２４）
１つまたは複数の内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子配列の欠失または置き換えを含む、項目２０〜２３のいずれか１項に記載の齧歯動物。
（項目２５）
前記内因性ＶＨ遺伝子セグメント、ＤＨ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントが、再配列したＶ／Ｄ／Ｊ配列を形成するように再配列することができない、項目２０〜２４のいずれか１項に記載の齧歯動物。
（項目２６）
内因性ＡＤＡＭ６遺伝子の欠失を含み、且つ異所性マウスＡＤＡＭ６遺伝子をさらに含む、項目２０〜２５のいずれか１項に記載の齧歯動物。
（項目２７）
マウスまたはラットから選択される、項目２０〜２６のいずれか１項に記載の齧歯動物。（項目２８）
（ａ）雄齧歯動物において内因性ＡＤＡＭ６活性の低減または消失をもたらす齧歯動物重鎖免疫グロブリン遺伝子座の第１の改変を行う工程であって、該第１の改変が、１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメント、およびそれらの組み合わせから選択される遺伝子セグメントの挿入を包含する、工程；ならびに
（ｂ）雄齧歯動物において機能的であるＡＤＡＭ６活性を該齧歯動物に付与する核酸配列を該齧歯動物に付加するように第２の改変を行う工程
を含む、齧歯動物の重鎖免疫グロブリン遺伝子座を改変するための方法。
（項目２９）
前記第１の改変が、１つまたは複数のＶＬ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のＪＬ遺伝子セグメントと共に再配列することができる１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメントの挿入をさらに含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記１つまたは複数のＶＬ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントが、Ｖκ遺伝子セグメントおよびＪκ遺伝子セグメント、またはＶλ遺伝子セグメントおよびＪλ遺伝子セグメントである、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
雄齧歯動物において機能的であるＡＤＡＭ６活性を前記齧歯動物に付与する前記核酸配列が、前記１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび／または前記１つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントに近接している、項目２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記第１および前記第２の改変が、単一ＥＳ細胞において行われ、且つ該単一ＥＳ細胞が、前記齧歯動物を作製するために宿主胚へと導入される、項目２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０３５８】
【図１】図１は、マウス重鎖遺伝子座（上図）およびヒトκ軽鎖遺伝子座（下図）の概要（一定の比率ではない）を例示する。マウス重鎖遺伝子座は、約３Ｍｂの長さであり、約２００の重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメント、１３の重鎖多様性（ＤＨ）遺伝子セグメント、および４つの重鎖連結（ＪＨ）遺伝子セグメントの他、エンハンサー（Ｅｎｈ）および重鎖定常（ＣＨ）領域を含有する。上記ヒトκ軽鎖遺伝子座は、それぞれ約４４０ｋｂ〜６００ｋｂにわたる、極性が反対である遠位コンティグおよび近位コンティグへと重複する。その２つのコンティグ間には、Ｖκ遺伝子セグメントを含まないと考えられる、約８００ｋｂのＤＮＡが存在する。上記ヒトκ軽鎖遺伝子座は、約７６のＶκ遺伝子セグメント、５つのＪκ遺伝子セグメント、イントロンエンハンサー（Ｅｎｈ）、および単一の定常領域（Ｃκ）を含有する。
【０３５９】
【図２】図２は、結果として、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域に作動可能に連結したヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントを含む改変マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座を生じる、４０個のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５個のヒトＪκ遺伝子セグメントの、マウス重鎖遺伝子座へと順次挿入するための例示的なターゲティング戦略を示す。ハイグロマイシン（ｈｙｇ）選択カセットおよびネオマイシン（ｎｅｏ）選択カセットを、リコンビナーゼ認識部位（Ｒ１、Ｒ２など）と共に示す。
【０３６０】
【図３】図３は、複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび単一のヒトＪλ遺伝子セグメントの、マウス重鎖遺伝子座へと順次挿入するための例示的なターゲティング戦略を示す。ハイグロマイシン（ｈｙｇ）選択カセットおよびネオマイシン（ｎｅｏ）選択カセットを、リコンビナーゼ認識部位（Ｒ１、Ｒ２など）と共に示す。
【０３６１】
【図４】図４は、複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび４つのヒトＪλ遺伝子セグメントの、マウス重鎖遺伝子座へと順次挿入するための例示的なターゲティング戦略を示す。ハイグロマイシン（ｈｙｇ）選択カセットおよびネオマイシン（ｎｅｏ）選択カセットを、リコンビナーゼ認識部位（Ｒ１、Ｒ２など）と共に示す。
【０３６２】
【図５】図５は、ヒトＶλ遺伝子セグメント、ヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントの、マウス重鎖遺伝子座へと順次挿入するための例示的なターゲティング戦略を示す。ハイグロマイシン（ｈｙｇ）選択カセットおよびネオマイシン（ｎｅｏ）選択カセットを、リコンビナーゼ認識部位（Ｒ１、Ｒ２など）と共に示す。
【０３６３】
【図６】図６は、ヒトＶλ遺伝子セグメント、ヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントの、マウス重鎖遺伝子座へと順次挿入するための例示的なターゲティング戦略を示す。ハイグロマイシン（ｈｙｇ）選択カセットおよびネオマイシン（ｎｅｏ）選択カセットを、リコンビナーゼ認識部位（Ｒ１、Ｒ２など）と共に示す。
【０３６４】
【図７】図７は、マウス免疫グロブリン重鎖Ｖ−Ｄ遺伝子間領域からマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードするゲノム断片をクローニングするための工程、および改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座への挿入のために該ゲノム断片を改変するための操作工程（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｓｔｅｐ）を示す。
【０３６５】
【図８】図８は、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域に作動可能に連結した、ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含有する改変マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＶκ−Ｊκ遺伝子間領域への、マウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードするゲノム断片の挿入のためのターゲティング戦略を示す。
【０３６６】
【図９】図９は、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域に作動可能に連結した、ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含有する改変マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座のヒトＶκ遺伝子セグメント（すなわち、ｈＶκ２−４０）の上流（５’側）での、マウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードするゲノム断片の挿入のためのターゲティング戦略を示す。
【発明を実施するための形態】
【０３６７】
詳細な説明
本発明は、記載する特定の方法および実験条件に限定されない。かかる方法および条件は変わることがあるからである。本発明の範囲を特許請求の範囲によって定義するので、本明細書において用いる専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としたものであり、限定することを意図したものではないことを理解されたい。
【０３６８】
別様に定義しない限り、本明細書において用いるすべての用語および句は、その用語または句が用いられている文脈から相反することが明確に指摘されるまたは明確に分かる場合を除き、その用語および句が当該技術分野において獲得している意味を含む。本明細書に記載するものに類似したまたは等価の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができるが、今は特定の方法および材料を記載する。言及するすべての出版物は、参照により本明細書に援用されている。
【０３６９】
遺伝子セグメントの量を指すために用いるときの句「実質的な」または「実質的に」（例えば、「実質的にすべての」Ｖ遺伝子セグメント）は、機能的遺伝子セグメントと非機能的遺伝子セグメントの両方を含み、および様々な実施形態において、例えば、すべての遺伝子セグメントの８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上を含む；様々な実施形態において、「実質的にすべての」遺伝子セグメントは、例えば、機能的（すなわち、非偽遺伝子）遺伝子セグメントの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含む。
【０３７０】
用語「置き換え」は、ゲノム内の配列を該ゲノム配列の遺伝子座において異種配列（例えば、マウスにおけるヒト配列）で置き換えるようなやり方でＤＮＡ配列を細胞のゲノムに配置する場合のものを含む。そのようにして配置されたＤＮＡは、そのようにして配置された配列を得るために使用した源ＤＮＡの一部である１つまたは複数の調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、５’または３’非翻訳領域、適切な組換えシグナル配列など）を含み得る。例えば、様々な実施形態において、上記置き換えは、そのように置かれた（ｐｌａｃｅｄ）ＤＮＡ配列（異種配列を含む）から遺伝子産物の産生をもたらす結果となる、異種配列に代えての内因性配列の置き換えであり、該内因性配列の発現ではない；上記置き換えは、内因性ゲノム配列の、該内因性ゲノム配列によってコードされているタンパク質と類似の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列での置き換えである（例えば、上記内因性ゲノム配列は、免疫グロブリン遺伝子またはドメインをコードしており、上記ＤＮＡ断片は、一つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子またはドメインをコードする）。様々な実施形態において、内因性遺伝子またはその断片は、対応するヒト遺伝子またはその断片で置き換えられる。対応するヒト遺伝子またはその断片は、置き換えられる内因性遺伝子もしくは断片のオルソログである、置き換えられる内因性遺伝子もしくは断片のホモログである、または置き換えられる内因性遺伝子もしくは断片と構造および／もしくは機能の点で実質的に同一もしくは同じである、ヒト遺伝子または断片である。
【０３７１】
用語「連続する」は、同じ核酸分子上に存在することに対する言及を包含し、例えば、２つの核酸配列が、同じ核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）分子上に存在するが別の核酸配列によって中断されている場合、それらは「連続している」。例えば、再配列したＶ（Ｄ）Ｊ配列の最後のコドンは、定常領域配列の最初のコドンに直接続いていないが、そのＶ（Ｄ）Ｊ配列は、定常領域遺伝子配列と「連続している」。別の例では、２個のＶ遺伝子セグメント配列が、同じゲノム断片上に存在する場合、それらは「連続している」が、それらは、Ｖ領域のコドンをコードしない配列によって分かれていることがあり、例えば、それらは、制御配列、例えば、プロモーターまたは他の非コード配列によって分かれていることがある。１つの実施形態において、連続配列は、野生型ゲノムに見出されるように配置されたゲノム配列を含むゲノム断片を含む。
【０３７２】
語句「〜に由来する」は、言及されている遺伝子または遺伝子セグメント「に由来する」可変領域に関して使用されるとき、特定の再配列していない遺伝子セグメントまたはその可変ドメインを発現する遺伝子を形成するように再配列した遺伝子セグメントまでその配列をさかのぼることができること（適用可能な場合、スプライシングの差異（ｓｐｌｉｃｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ）および体細胞変異を説明する）を含む。
【０３７３】
語句「機能的」は、可変領域遺伝子セグメントまたは連結遺伝子セグメントに関して使用されるとき、発現する抗体レパートリーの使用のことを指す；例えば、ヒトでは、Ｖλ遺伝子セグメント３−１、４−３、２−８などが機能的である一方、Ｖλ遺伝子セグメント３−２、３−４、２−５などは、非機能的である。
【０３７４】
「重鎖遺伝子座」は、野生型マウスにおいて重鎖可変（ＶＨ）、重鎖多様性（ＤＨ）、重鎖連結（ＪＨ）および重鎖定常（ＣＨ）領域のＤＮＡ配列が見出される、染色体上の位置、例えば、マウス染色体上の位置を含む。
【０３７５】
「二重特異性結合タンパク質」という語句は、２つ以上のエピトープに選択的に結合することが可能である結合タンパク質を包含する。二重特異性結合タンパク質は、第１のＣＨ領域と融合している第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）および第２のＣＨ領域と融合している第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）を含む２つの異なるポリペプチドを含む。一般に、上記第１および上記第２のＣＨ領域は、同一であるか、または１つまたは複数のアミノ酸置換（例えば、本明細書で記載されるアミノ酸置換）だけ異なる。ＶＬ１およびＶＬ２は、異なるエピトープ（２つの異なる分子（例えば、抗原）に、または同じ分子（例えば、同じ抗原に）に）に特異的に結合する。二重特異性結合タンパク質が２つの異なるエピトープ（第１のエピトープおよび第２のエピトープ）に選択的に結合する場合、該第１のエピトープに対するＶＬ１のアフィニティは一般に、上記第２のエピトープに対するＶＬ１のアフィニティより、少なくとも１〜２または３または４桁小さく、ＶＬ２についてはその逆である。上記二重特異性結合タンパク質により認識されるエピトープは、同じ標的に存在する場合もあり、異なる標的に存在する場合もある（例えば、同じ抗原に存在する場合もあり、異なる抗原に存在する場合もある）。二重特異性結合タンパク質は、例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識するＶＬ１とＶＬ２とを組み合わせることにより作製することができる。例えば、上記同じ抗原の異なるエピトープを認識するＶＬ配列をコードする核酸配列は、異なるＣＨ領域をコードする核酸配列に融合させることができ、このような配列は、免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞で発現させることができ、免疫グロブリン軽鎖を発現しない細胞で発現させることもできる。典型的な二重特異性結合タンパク質は、各々が３つの軽鎖ＣＤＲと、それに続く（Ｎ末端からＣ末端へ）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを有する２つの重鎖と、抗原結合特異性は付与しないが、各重鎖と会合し得る免疫グロブリン軽鎖、または各重鎖と会合することが可能であり、ＶＬ１および／もしくはＶＬ２が結合するエピトープのうちの１つまたは複数に結合し得る免疫グロブリン軽鎖、または各重鎖と会合することが可能であり、該重鎖のうちの一方もしくは両方がエピトープのうちの一方もしくは両方に結合することを可能とするかもしくはそれ支援する免疫グロブリン軽鎖とを有する。
【０３７６】
したがって、二重特異性結合タンパク質の２つの一般的な種類は、（１）ＶＬ１−ＣＨ（二量体）、および（２）ＶＬ１−ＣＨ：軽鎖＋ＶＬ２−ＣＨ：軽鎖（その軽鎖が同じであるかまたは異なる）である。いずれの場合においても、上記ＣＨ（すなわち、上記重鎖定常領域）を、本明細書で記載される通りに示差的に改変することもでき（例えば、プロテインＡに示差的に結合するように改変される、血清半減期を延長するように改変されるなど）、同じとすることもできる。
【０３７７】
用語「細胞」は、配列を発現することに関連して使用されるとき、組み換え核酸配列を発現するのに適切な任意の細胞を含む。細胞は、原核生物および真核生物のもの（単一の細胞または複数の細胞）、細菌細胞（例えば、大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．などの菌株）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、Ｂ細胞、または細胞融合物、例えば、ハイブリドーマまたはクアドローマなどを含む。一部の実施形態において、上記細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラットまたはマウス細胞である。一部の実施形態において、上記細胞は、真核生物細胞であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ−１１  ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ８０６５、ＨＬ−６０（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、および上記細胞由来の細胞系。一部の実施形態において、上記細胞は、１つまたは複数のウイルス遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）を含む。
【０３７８】
「〜とコグネイト」の意味、例えば、第２のＶＬドメイン「〜とコグネイト」である第１のＶＬドメインの意味で用いられる場合の「コグネイト」という用語は、本発明に従うマウスにより作製される同じ結合タンパク質に由来する２つのＶＬドメイン間の関係に対する言及を包含することを意図する。例えば、本発明の実施形態に従い遺伝子改変されているマウス、例えば、ＶＨ領域、ＤＨ領域、およびＪＨ領域が、ＶＬ領域およびＪＬ領域で置き換えられた重鎖遺伝子座を有するマウスにより、第１のヒトＶＬドメインと融合している同じマウスＣＨ領域（例えば、ＩｇＧアイソタイプ）から作製された２つの同一のポリペプチド鎖、ならびに第２のヒトＶＬドメインと融合している同じマウスＣＬ領域から作製された２つの同一のポリペプチド鎖を有する抗体様結合タンパク質が作製される。上記マウスにおけるクローン選択の間、単一の抗体様結合タンパク質との関係で共に現れるように、上記第１および上記第２のヒトＶＬドメインを、クローン選択プロセスにより選択した。したがって、上記クローン選択プロセスの結果として、単一の抗体様分子において共に現れる第１および第２のＶＬドメインを、「コグネイト」と称する。これに対し、第１および第２の抗体様分子が同一の重鎖を有するのでない限り（すなわち、上記第１のヒト重鎖領域に融合しているＶＬドメインと上記第２のヒト重鎖領域に融合しているＶＬドメインとが同一でない限り）、該第１の抗体様分子において現れるＶＬドメインと該第２の抗体様分子において現れるＶＬドメインとはコグネイトではない。
【０３７９】
語句「相補性決定領域」、または用語「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン分子（例えば、抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖または重鎖の可変領域の２つのフレームワーク領域の間に典型的に（すなわち、野生型動物において）出現する生体の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を含む。ＣＤＲは、例えば、生殖細胞系配列または再配列しているもしくは再配列していない配列により、且つ例えば、ナイーブまたは成熟Ｂ細胞またはＴ細胞によりコードされることができる。一部の状況において（例えば、ＣＤＲ３において）、ＣＤＲは、連続していない（例えば、再配列していない核酸配列において）が、Ｂ細胞の核酸配列において、例えば、上記配列をスプライシングまたは結合させた結果として（例えば、重鎖ＣＤＲ３を形成するＶ−Ｄ−Ｊ組み換え）、連続する２つ以上の配列（例えば、生殖細胞系配列）によりコードされることができる。
【０３８０】
語句「遺伝子セグメント」または「セグメント」は、Ｖ（軽鎖または重鎖）またはＤもしくはＪ（軽鎖または重鎖）免疫グロブリン遺伝子セグメントの言及を含み、再配列したＶ／ＪまたはＶ／Ｄ／Ｊ配列を形成する再配列（例えば、内因性リコンビナーゼにより媒介される）に関与することができる免疫グロブリン遺伝子座（例えば、ヒトおよびマウス）での再配列していない配列を含む。別段の指示がない限り、上記Ｖ、Ｄ、およびＪセグメントは、１２／２３ルールに従ったＶ／Ｊ組み換えまたはＶ／Ｄ／Ｊ組み換えを可能にする組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）を含む。別段の指示がない限り、上記セグメントはさらに、天然の、またはその機能的等価物（例えば、Ｖセグメントプロモーター（単数または複数）およびリーダー（単数または複数））に関連する配列を含む。
【０３８１】
「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」という語句は、任意の生物に由来する免疫グロブリン重鎖定常領域配列を包含し、別段に指定されない限り、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を包含する。別段に指定されない限り、ＶＨドメインは、３つの重鎖ＣＤＲおよび４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を包含する。重鎖の断片は、ＣＤＲ、ＣＤＲおよびＦＲ、ならびにこれらの組合せを包含する。典型的な重鎖は、以下の可変ドメイン（Ｎ末端からＣ末端へ）：ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、および、必要に応じて、ＣＨ４ドメイン（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＥの場合）、ならびに膜貫通（Ｍ）ドメイン（例えば、リンパ球における膜結合免疫グロブリンの場合）から本質的になる。重鎖定常領域とは、ＦＲ４の外側から上記重鎖のＣ末端へと（Ｎ末端側からＣ末端側へと）広がる重鎖の領域である。わずかな異常（ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）、例えば、上記Ｃ末端からの１つ、２つ、３つまたは数個のアミノ酸の切断を伴う重鎖定常領域の他、配列の改変、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のアミノ酸置換を有する重鎖定常領域も、「重鎖定常領域」という語句により包含される。アミノ酸置換は、例えば（免疫グロブリン定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ定常領域についてのＥＵ付番を参照すると）、２２８位、２３３位、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２４１位、２４８位、２４９位、２５０位、２５２位、２５４位、２５５位、２５６位、２５８位、２６５位、２６７位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７６位、２７８位、２８０位、２８３位、２８５位、２８６位、２８９位、２９０位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、３０１位、３０３位、３０５位、３０７位、３０８位、３０９位、３１１位、３１２位、３１５位、３１８位、３２０位、３２２位、３２４位、３２６位、３２７位、３２８位、３２９位、３３０位、３３１位、３３２位、３３３位、３３４位、３３５位、３３７位、３３８位、３３９位、３４０位、３４２位、３４４位、３５６位、３５８位、３５９位、３６０位、３６１位、３６２位、３７３位、３７５位、３７６位、３７８位、３８０位、３８２位、３８３位、３８４位、３８６位、３８８位、３８９位、３９８位、４１４位、４１６位、４１９位、４２８位、４３０位、４３３位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位、および４３９位から選択される１つまたは複数の位置において作製することができる。
【０３８２】
限定を目的とせずに述べると、例えば、血清半減期の延長（列挙される改変（複数可）のない、同じ重鎖定常領域と比較して）を呈示させるために、重鎖定常領域を改変し、２５０位（例えば、ＥまたはＱ）、２５０位および４２８位（例えば、ＬまたはＦ）、２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位（例えば、ＳまたはＴ）、ならびに２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）における改変、または４２８位および／もしくは４３３位（例えば、Ｌ／Ｒ／ＳＩ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／もしくは４３４位（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）における改変、または２５０位および／もしくは４２８位における改変、または３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）および４３４位における改変を有することができる。別の例では、上記改変が、４２８Ｌの改変（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓの改変（例えば、Ｎ４３４Ｓ）、４２８Ｌの改変、２５９Ｉの改変（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆの改変（例えば、Ｖ３０８Ｆ）、４３３Ｋの改変（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４位（例えば、４３４Ｙ）の改変、２５２、２５４、および２５６位（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）の改変、２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）、３０７位および／もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）の改変を含み得る。
【０３８３】
「軽鎖」という語句は、任意の生物に由来する免疫グロブリン軽鎖定常（ＣＬ）領域配列を包含し、別段に指定されない限り、ヒトκ軽鎖およびヒトλ軽鎖を包含する。別段に指定されない限り、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインは、典型的に、３つの軽鎖ＣＤＲおよび４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を包含する。一般に、全長軽鎖（ＶＬ＋ＣＬ）は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を包含するＶＬドメイン、およびＣＬ領域を包含する。本発明で用い得る軽鎖（ＶＬ＋ＣＬ）は、例えば、上記結合タンパク質が選択的に結合する第１のまたは第２の（二重特異性結合タンパク質の場合）エピトープ（例えば、上記ＣＨドメインと融合しているＶＬドメインが選択的に結合するエピトープ（複数可））に選択的には結合しない軽鎖を包含する。上記ＣＨドメインと融合しているＶＬドメインが結合するエピトープ（複数可）に選択的には結合しないＶＬドメインは、既存の抗体ライブラリー（ウェットライブラリー（ｗｅｔ  ｌｉｂｒａｒｙ）またはインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ））において最も一般的に用いられる軽鎖であって、上記結合タンパク質のエピトープ結合ドメインのアフィニティおよび／または選択性には実質的に干渉しない軽鎖についてのスクリーニングにより同定され得るＶＬドメインを包含する。適切な軽鎖は、上記ＣＨ領域に融合しているＶＬ領域が特異的に結合するエピトープに結合し得る（単独でまたは該ＣＨ領域と融合しているそのコグネ
イトＶＬと組み合わせて）軽鎖を包含する。
【０３８４】
語句「マイクロモル濃度範囲（ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ  ｒａｎｇｅ）」は、１〜９９９マイクロモル濃度を意味することを意図し、語句「ナノモル濃度範囲」は、１〜９９９ナノモル濃度を意味することを意図し、語句「ピコモル濃度範囲」は、１〜９９９ピコモル濃度範囲を意味することを意図する。
【０３８５】
用語「非ヒト動物」は、任意の非ヒト動物、例えば、円口類、硬骨魚、軟骨魚類、例えば、サメおよびエイ、両生類、爬虫類、哺乳類、および鳥類を含むことを意図する。適切な非ヒト動物は哺乳類を含む。適切な哺乳類は、非ヒト霊長類、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウシ、および齧歯動物を含む。適切な非ヒト動物は、ラットおよびマウスを含む齧歯動物のファミリーから選択される。１つの実施形態において、上記非ヒト動物はマウスである。
【０３８６】
遺伝モデルとしてのマウスは、トランスジェニックおよびノックアウト技術によって大きく向上され、これらの技術により特定の遺伝子の指向性過発現または欠失の効果の研究が可能になった。あらゆるその利点にもかかわらず、上記マウスは、マウスをヒト疾患についての不完全なモデルにならしめるおよびヒト治療薬を試験するまたはそれらを作製するための不完全なプラットホームにならしめる遺伝的障害をやはり提示する。第一に、ヒト遺伝子の約９９％はマウスホモログを有する（Ｗａｔｅｒｓｔｏｎら（２００２），Ｉｎｉｔｉａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４２０，５２０−５６２）が、可能性のある治療薬は、多くの場合、所期のヒト標的のマウスオルソログと交叉反応することができない、または不適切に交叉反応する。この問題を未然に防ぐために、選択標的遺伝子を「ヒト化」することができる、すなわち、マウス遺伝子を消去して、対応するオルソロガスヒト遺伝子配列により置き換えることができる（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、同第６，５９６，５４１号および同第７，１０５，３４８号明細書；これらは参照により本明細書に援用されている）。最初、「ノックアウト・プラス・トランスジェニックヒト化（ｋｎｏｃｋｏｕｔ−ｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）」戦略によりマウス遺伝子をヒト化する努力は、上記内因性遺伝子の欠失（すなわち、ノックアウト）を保有するマウスとランダムに組み込まれたヒト導入遺伝子を保有するマウスとの交配を必要とした（例えば、Ｂｒｉｌら（２００６），Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｉｎ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｃＤＮＡ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ａｎ  Ａｒｇ（５９３）  ｔｏ  Ｃｙｓ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ９５：３４１−３４７；Ｈｏｍａｎｉｃｓら（２００６），Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｃｌａｓｓｉｃ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｍａｐｌｅ  ｓｙｒｕｐ  ｕｒｉｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＢＭＣ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  ７：３３；Ｊａｍｓａｉら（２００６）、Ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ＢＡＣ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ／ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ＨｂＥ／ｂｅｔａ−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８８（３）：３０９−１５；Ｐａｎら（２００６）、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３ｄｅｌｔａ／ｅｐｓｉｌｏｎ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ｉｎ  ｐｒｅＴ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｐｒｅＴＣＲ）ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｈｕｍａｎ  ＣＤ３ｄｅｌｔａ／ｅｐｓｉｌｏｎ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｔｈｅ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｅＴＣＲ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＣＤ３ｇａｍｍａ−  ａｎｄ  ＣＤ３ｇａｍｍａｄｅｌｔａ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４３：１７４１−１７５０参照）。しかし、これらの努力は、サイズ制限���よって妨げられた；従来のノックアウト技術は、大きなマウス遺伝子を該遺伝子の大きなヒトゲノムカウンターパートで直接置き換えるのに十分なものではなかった。該マウス遺伝子の同じまさにその遺伝子の場所で（すなわち内因性マウス遺伝子座で）ヒトカウンターパート遺伝子により内因性マウス遺伝子を直接置き換える直接相同置換の直接的なアプローチは、技術的な難しさのため、滅多に試みられない。今まで、直接置換に対する努力は手の込んだ厄介な手順を必要とし、それ故、取り扱うことができる遺伝子材料の長さおよび操作することができる精度が限定された。
【０３８７】
外因的に導入されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、マウスの前駆体Ｂ細胞内で再配列する（Ａｌｔら（１９８５）、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １：２３１−２３６）。この発見は、ヒト抗体を発現させるためにノックアウト・プラス・トランスジェニックアプローチを用いるマウスの工学的作製に活用された（Ｇｒｅｅｎら（１９９４）、Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ｆｒｏｍ  ｍｉｃｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  Ｉｇ  ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ＹＡＣｓ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ７：１３−２１；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（２００５）、Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１１１７−１１２５；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら（１９９４）Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｅ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｆｏｕｒ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（２００７）Ｆｒｏｍ  ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ，ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５：１１３４−１１４３）。内因性マウス免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖遺伝子座は、これらのマウスにおいて、各内因性遺伝子座の小さいが重大な部分の標的欠失、続いて、上に記載したようなランダムに組み込まれた大きな導入遺伝子としての、またはミニ染色体としてのヒト免疫グロブリン遺伝子遺伝子座の導入により不活性化された（Ｔｏｍｉｚｕｋａら（２０００）、Ｄｏｕｂｌｅ  ｔｒａｎｓ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｉｃ  ｍｉｃｅ：  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｈｕｍａｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｉｇ  ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｋａｐｐａ  ｌｏｃｉ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９７：７２２−７２７）。かかるマウスは、遺伝子工学の重要な前進を象徴した；それらから単離された完全ヒトモノクローナル抗体は、様々なヒト疾患の処置に有望な治療的可能性をもたらした（Ｇｉｂｓｏｎら（２００６）、Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  ｔｒｉａｌ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ、ａ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎ
ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ、Ｃｌｉｎ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ６：２９−３１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、２００７；Ｋｉｍら（２００７）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ（ＨｕＭａｘ−ＣＤ４）：ｔｗｏ  Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ  １０９（１１）：４６５５−６２；Ｌｏｎｂｅｒｇ、２００５；Ｍａｋｅｒら（２００５）、Ｔｕｍｏｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ４  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２：ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ  ｓｔｕｄｙ、Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  １２：１００５−１０１６；ＭｃＣｌｕｎｇら（２００６）、Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ  ｉｎ  ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｗｏｍｅｎ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ  ｂｏｎｅ
ｍｉｎｅｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５４，８２１−８３１）。しかし、上で論じたように、これらのマウスは、野生型マウスと比較して、損なわれたＢ細胞発生および免疫不全を示す。かかる問題は、活発な体液性応答を維持するおよびしたがって一部の抗原に対する完全ヒト抗体を産生するマウスの能力を潜在的に制限する。上記不全は、（１）ヒト免疫グロブリン導入遺伝子のランダムな導入に起因する不十分な機能性、ならびに上流および下流制御要素の欠如に起因する結果としての不正確な発現（Ｇａｒｒｅｔｔら（２００５）、Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｎｅａｒ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ３’ｅｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｇｈ  ｌｏｃｕｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｂ−Ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｏｃｃｕｐａｎｃｙ  ａｔ  ＣＴＣＦ  ｓｉｔｅｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２５：１５１１−１５２５；Ｍａｎｉｓら（２００３）、Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｂｏｕｎｄａｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３’ＩｇＨ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｇｉｏｎ、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３９：７５３−７６０；Ｐａｗｌｉｔｚｋｙら（２００６）、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ
ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ５’ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｉｇｈ  ｌｏｃｕｓ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｂｙ  ｐｒｏ−Ｂ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ＰＵ．１，  Ｐａｘ５，ａｎｄ  Ｅ２Ａ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７６I６８３９−６８５
１）；（２）Ｂ細胞の正常な成熟、増殖および生存に要求されるシグナル伝達過程を害し得る、ヒト定常ドメインと細胞表面のＢ細胞受容体シグナル伝達複合体のマウス要素の間の非効率的種間相互作用（Ｈｏｍｂａｃｈら（１９９０）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩｇＭ  ｃｌａｓｓ、Ｎａｔｕｒｅ．３４３，７６０−７６２）；および（３）親和性選択（Ｒａｏら（２００２）、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＩｇＧ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＢ  ｏｎ  ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｃｅｌｌｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９，１８５９−１８６８）および免疫グロブリン血清濃度（Ｂｒａｍｂｅｌｌら（１９６４）、Ａ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｇａｍｍａ−Ｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｎａｔｕｒｅ  ２０３：１３５２−１３５４；ＪｕｎｇｈａｎｓおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ（１９９６）、Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＩｇＧ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９３，５５１２−５５１６；Ｒａｏら、２００２；Ｈｊｅｌｍら（２００６）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６４：１７７−１８４；Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ（２００７）、Ｆｃ−ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９６，１７９−２０４）を低減させ得る、可溶性ヒト免疫グロブリンとマウスＦｃ受容体の間の非効率的種間相互作用に起因し得る。これらの不全は、内因性重および軽鎖遺伝子座におけるその天然の場所の中のマウス免疫グロブリン遺伝子座の可変領域のみのｉｎ  ｓｉｔｕヒト化によって修正することができる。これは、マウス定常領域の保持に基づきマウス環境で正常な相互作用および選択が可能であろう「逆キメラ」（すなわち、ヒトＶ：マウスＣ）抗体を作製するマウスを有効に生じさせる結果となるであろう。さらに、かかる逆キメラ抗体は、治療のために完全ヒト抗体に容易に再配列することができる。
【０３８８】
内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座における挿入または置き換えと共に、または免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子（例えば、キメラ免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子もしくは完全ヒト完全マウスなど）と共に、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における異種（例えば、別の種からの）免疫グロブリン配列による挿入または置き換えを含む遺伝子改変動物を作製することができる。上記異種免疫グロブリン配列が由来する種は多種多様であり得る。例示的な異種免疫グロブリン配列は、ヒト配列を包含する。
【０３８９】
様々な実施形態において、免疫グロブリン可変領域核酸配列、例えば、Ｖ、Ｄおよび／またはＪセグメントは、ヒトまたは非ヒト動物から得られる。Ｖ、Ｄおよび／またはＪセグメントの供給に好適な非ヒト動物としては、例えば、硬骨魚、軟骨魚、例えばサメおよびエイ、両生類、爬虫類、哺乳類、鳥類（例えば、ニワトリ）が挙げられる。非ヒト動物としては、例えば、哺乳類が挙げられる。哺乳類としては、例えば、非ヒト霊長類、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウシ（例えば、雌ウシ、ウシ、バッファロー）、シカ、ラクダ、フェレットおよび齧歯動物および非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、オランウータン、ゴリラ、マーモセット、アカゲザル、ヒヒ）が挙げられる。好適な非ヒト動物は、ラット、マウスおよびハムスターを含む齧歯動物のファミリーから選択される。１つの実施形態において、上記非ヒト動物はマウスである。この文脈から明白であるように、様々な非ヒト動物（例えば、サメ、エイ、哺乳類（例えば、ラクダ、齧歯動物、例えばマウスおよびラット））を可変ドメインまたは可変領域遺伝子セグメントの源として使用することができる。
【０３９０】
上記文脈によると、非ヒト動物は、可変配列またはセグメントと併用される定常領域配列の源としても使用される。例えば、ヒトまたは非ヒト可変配列に作動可能に連結する導入遺伝子（例えば、齧歯動物、例えばマウスもしくはラットもしくはハムスター、定常配列に作動可能に連結したヒトまたは非ヒト霊長類可変配列）において齧歯動物定常配列を使用することができる。したがって、様々な実施形態において、ヒトＶ、Ｄおよび／またはＪセグメントを齧歯動物（例えば、マウスまたはラットまたはハムスター）定常領域遺伝子配列に作動可能に連結させる。一部の実施形態では、上記ヒトＶ、Ｄおよび／またはＪセグメント（または１つまたは複数の再配列ＶＤＪもしくはＶＪ遺伝子）を、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子座ではない遺伝子座に組み込まれる導入遺伝子におけるマウス、ラットまたはハムスター定常領域遺伝子配列に作動可能に連結または融合させる。
【０３９１】
特定の実施形態では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるＶＨ、ＤＨおよびＪＨセグメントの、１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントでの置き換えを含み、該１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のＪＬセグメントが、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子に作動可能に連結しているものであるマウスを提供し、この場合のマウスは、内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝子座に導入遺伝子を含み、該導入遺伝子は、マウスまたはラットまたはヒト定常領域に作動可能に連結した非再配列または再配列ヒトＶＬおよびヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む。様々な実施形態において、上記１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントには、ヒトＶκ遺伝子セグメントまたはヒトＶλ遺伝子セグメントが挙げられる。１つの実施形態において、上記１つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントには、ヒトＪκ遺伝子セグメントまたはヒトＪλ遺伝子セグメントが挙げられる。
【０３９２】
子孫を産生する上記マウスの能力を維持しながら、マウス生殖細胞系免疫グロブリン重鎖可変遺伝子の、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子での大きなインサイチュ遺伝子置換（ｌａｒｇｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）のための方法が記載される。具体的には、上記マウス定常領域を無傷の状態のままで、マウス重鎖可変遺伝子遺伝子座の、ヒト軽鎖可変遺伝子遺伝子座での正確な置き換えが記載される。結果として、内因性定常領域との関係において免疫グロブリン様結合タンパク質を発現するマウスが創製されている。上記ヒト軽鎖可変領域は、マウス重鎖定常領域に連結して、再配列して、固有の免疫グロブリン様分子を発現するキメラヒト−マウス免疫グロブリン遺伝子座を形成する。発現した上記免疫グロブリン様分子は、「逆キメラ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｈｉｍｅｒａ）」であり、すなわち、それらは、ヒト可変領域配列およびマウス定常領域配列を含む。
【０３９３】
正確な位置、例えば、上記内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座においてさえも、マウスのゲノムにおけるヒト免疫グロブリン配列の操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）は、マウスとヒトの間の免疫グロブリン遺伝子座の多岐にわたる進化のせいで、いくらかの困難が存在する可能性がある。例えば、免疫グロブリン遺伝子座内に散在する遺伝子間配列は、マウスとヒトの間で同一ではなく、一部の状況では、機能的に等価でないこともある。マウスとヒトの間の免疫グロブリン遺伝子座におけるその相違は、特に内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の一定の部分をヒト化または操作する（ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ）とき、やはりヒト化マウスに異常を生じさせる結果となる場合がある。マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座における一部の改変は有害である。有害な改変としては、例えば、改変されたマウスの交配および子孫産生能力の喪失を挙げることができる。様々な実施形態において、マウスの上記ゲノムのヒト免疫グロブリン配列を工学的に作製することは、改変されたマウス系統に存在しないとき有害となる内因性配列を維持する方法を含む。例示的有害な作用は、改変系統の増殖不能であり、必須の遺伝子の機能の喪失、ポリペプチドを発現することの不能などを含み得る。かかる有害な作用は、上記マウスのゲノムに工学的に作製された改変に直接または間接的に関連し得る。
【０３９４】
免疫グロブリン遺伝子座が置き換えられたマウスにおいて観察される野生型に近い体液性免疫機能にもかかわらず、ランダムに組み込まれた導入遺伝子を利用する一部のアプローチでは遭遇しない、免疫グロブリンの直接置換を利用すると遭遇する他の課題がある。マウスとヒトの間の免疫グロブリン遺伝子座の遺伝子組成の相違は、免疫グロブリン遺伝子セグメントが置き換えられたマウスの繁殖にとって有益な配列の発見をもたらした。具体的には、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座内にあるマウスＡＤＡＭ遺伝子は、妊性におけるその役割のため、免疫グロブリン遺伝子座が置き換えられたマウスに最適に存在する。
【０３９５】
すべてのマウス定常鎖遺伝子および遺伝子座転写調節領域を含め、そのハイブリッド遺伝子座内で隣接マウス配列を無傷且つ機能的な状態のままにしておく一方で、上記マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座の６メガ塩基（ｍｅｇａｂａｓｅ）の可変領域（ＶＨ−ＤＨ−ＪＨ）の、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子遺伝子座（ＶＬ−ＪＬ）での正確なインサイチュ置換が実施される（図２〜図６）。野生型マウスに匹敵する様式で交配して子孫を産生する能力をマウスに付与するそのマウス配列を維持するための操作工程を実施した（図７〜図９）。具体的には、近位アームを含有する約０．５メガ塩基のヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（すなわち、４０個の機能的ヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５個のヒトＪκ遺伝子セグメント）およびマウスＡＤＡＭ６遺伝子を、キメラＢＡＣターゲティングベクターによって、マウスＥＳ細胞へ、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作テクノロジーを用いて導入した（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３、Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１：６５２−６５９参照）。
【０３９６】
マウスＡＤＡＭ６のゲノムの場所および機能
いずれかの機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現する能力を欠く雄マウスは、交配して子孫を産生する該マウスの能力の重篤な欠陥を示す。これらのマウスには、すべてのまたは実質的にすべてのマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントをヒト軽鎖可変遺伝子セグメントで置き換えることによって機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現する能力を欠く。ＡＤＡＭ６遺伝子座が、ＤＨ遺伝子セグメントの上流にあるＶＨ遺伝子セグメント遺伝子座の３’端の近位の、上記内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の領域内にあるため、このＡＤＡＭ６機能の喪失が生ずる結果となる。すべてのまたは実質的にすべての内因性重鎖可変遺伝子セグメントの、ヒト軽鎖可変遺伝子セグメントでの置き換えに関してホモ接合性であるマウスを交配させるために、それぞれが該置き換えに関してホモ接合性であり、生産的交配を待つ雄と雌を供給することは、一般に厄介なアプローチである。好結果の同腹子は、比較的稀であり、平均同腹仔のサイズは非常に小さい。その代り、上記置き換えに関してヘテロ接合性の雄を用いて、上記置き換えに関してホモ接合性の雌と交配させて、上記置き換えに対してヘテロ接合性の後代を産生し、その後、それらからホモ接合型マウスを繁殖させた。上記雄マウスの妊性の喪失についての可能性のある原因は、ホモ接合型雄マウスにおける機能的ＡＤＡＭ６タンパク質の不在であると本発明者らは決定した。
【０３９７】
様々な態様において、損傷した（すなわち、非機能的またはわずかに機能的な）ＡＤＡＭ６遺伝子を含む雄マウスは、妊性の低減または消去を示す。マウス（および他の齧歯動物）ではＡＤＡＭ６遺伝子が免疫グロブリン重鎖遺伝子座にあるため、本発明者らは、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に改変を含むマウスを繁殖させるために、または該マウスの系統を作り、維持するために、様々な改変交配または繁殖スキームを利用することを決定した。内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の置き換えに関してホモ接合性の雄マウスの低い妊性または不妊性は、マウス系統のかかる改変の維持を困難にする。様々な実施形態において、上記系統の維持は、置き換えに関してホモ接合性の雄マウスによって示される不妊問題の回避を含む。
【０３９８】
１つの態様では、本明細書に記載のマウスの系統を維持するための方法を提供する。マウスの上記系統は、異所性ＡＤＡＭ６配列を含む必要がなく、様々な実施形態において、マウスの上記系統は、ＡＤＡＭ６のノックアウト（例えば、機能的ノックアウト）に関してホモ接合性またはヘテロ接合性である。
【０３９９】
上記マウス系統は、雄マウスにおいて妊性の低減または喪失を生じさせる結果となる内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含む。１つの実施形態において、上記改変は、ＡＤＡＭ６遺伝子の調節領域および／またはコーディング領域の欠失を含む。特定の実施形態において、上記改変は、その改変を含む雄マウスの妊性を低減させるまたは消去する内因性ＡＤＡＭ６遺伝子（調節領域および／またはコーディング領域）の改変を含む；特定の実施形態において、上記改変は、その改変に関してホモ接合性である雄マウスの妊性を低減させるまたは消去する。
【０４００】
１つの実施形態において、上記マウス系統は、ＡＤＡＭ６遺伝子のノックアウト（例えば、機能的ノックアウト）または欠失に関してホモ接合性またはヘテロ接合性である。
【０４０１】
１つの実施形態では、上記改変に関してホモ接合性またはヘテロ接合性であるマウスから細胞を単離すること、および宿主胚において上記ドナー細胞を用いること、および代理母において上記宿主胚およびドナー細胞を妊娠させること、および上記遺伝子改変を含む後代を上記代理母から得ることによって、上記マウス系統を維持する。１つの実施形態において、上記ドナー細胞は、ＥＳ細胞である。１つの実施形態において、上記ドナー細胞は、多能性細胞、例えば導入多能性細胞である。
【０４０２】
１つの実施形態では、上記改変に関してホモ接合性またはヘテロ接合性であるマウスから、上記改変を含む核酸配列を単離すること、および上記核酸配列を宿主核に導入すること、および好適な動物において上記核酸配列および上記宿主核を含む細胞を妊娠させることによって、上記マウス系統を維持する。１つの実施形態では、上記核酸配列を宿主卵母細胞の胚に導入する。
【０４０３】
１つの実施形態では、上記改変に関してホモ接合性またはヘテロ接合性であるマウスから核を単離すること、および上記核を宿主細胞に導入すること、および好適な動物において上記核および宿主細胞を妊娠させて、上記改変に関してホモ接合性またはヘテロ接合性である後代を得ることによって、上記マウス系統を維持する。
【０４０４】
１つの実施形態では、上記遺伝子改変を含む雄マウスからの精液を用いる、雌マウス（野生型、上記改変に関してホモ接合性、または上記改変に関してヘテロ接合性）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）を用いることによって、上記マウス系統を維持する。１つの実施形態において、上記雄マウスは、上記遺伝子改変に関してヘテロ接合性である。１つの実施形態において、上記雄マウスは、上記遺伝子改変に関してホモ接合性である。
【０４０５】
１つの実施形態では、上記遺伝子改変に関してヘテロ接合性である雄マウスを雌マウスと交配させて、上記遺伝子改変を含む後代を得ること、上記遺伝子改変を含む雄および雌後代を同定すること、および上記遺伝子改変に関してヘテロ接合性である雄を、野生型である、上記遺伝子改変に関してホモ接合性であるまたはヘテロ接合性である雌との交配に用いて、上記遺伝子改変を含む後代を得ることによって、上記マウス系統を維持する。１つの実施形態では、上記遺伝子改変に関してヘテロ接合性の雄と、野生型雌、上記遺伝子改変に関してヘテロ接合性の雌、または上記遺伝子改変に関してホモ接合性の雌とを交配させる工程を繰り返して、上記マウス系統での上記遺伝子改変を維持する。
【０４０６】
１つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン軽鎖配列、および必要に応じて１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメントでの置き換えを含むマウス系統を維持するための方法であって、上記マウス系統を交配させて、ヘテロ接合型雄マウスを産生する工程を含み、上記ヘテロ接合性雄マウスを交配させて、上記系統において上記遺伝子改変を維持する方法を提供する。特定の実施形態において、上記系統は、ホモ接合性雄と野生型雌、または上記遺伝子改変に関してホモ接合性もしくはヘテロ接合性の雌とのいずれの交配によっても維持されない。
【０４０７】
上記ＡＤＡＭ６タンパク質は、タンパク質のＡ  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ（ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ）（ＡＤＡＭ）ファミリーのメンバーであり、タンパク質のＡＤＡＭファミリーは、大きなファミリーであり、細胞接着をはじめとする多様な機能を有する。ＡＤＡＭファミリーの一部のメンバーは、精子形成および受精に関与する。例えば、ＡＤＡＭ２は、精子−卵子相互作用に関与するタンパク質ファーティリンのサブユニットをコードする。ＡＤＡＭ３、すなわちシリテスティンは、透明帯への精子の結合に必要であるようである。ＡＤＡＭ２またはＡＤＡＭ３いずれかの不在は不妊性を生じさせる結果となる。ＡＤＡＭ２、ＡＤＡＭ３およびＡＤＡＭ６は、マウス精子細胞の表面で複合体を形成すると仮定されている。
【０４０８】
ヒトにおいては、ＤＡＭ６遺伝子は、報告によれば偽遺伝子であり、ヒトＶＨ遺伝子セグメントＶＨ１−２とＶＨ６−１との間に位置する。マウスには２つのＡＤＡＭ６遺伝子−ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ−があり、これらは、マウスＶＨ遺伝子セグメントとＤＨ遺伝子セグメントの間の遺伝子間領域において位置し、周囲の免疫グロブリン遺伝子セグメントのものとは反対の転写配向に配向する。マウスの場合、正常な受精には機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座が明らかに要求される。そこで、機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座または配列は、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座が欠けているまたは損傷を受けた内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を有する雄マウスにおいて示される受精の徹底的低減を補うまたはレスキューすることができる、ＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を指す。
【０４０９】
ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂをコードする、マウスにおける上記遺伝子間配列の位置が、内因性重鎖を改変するとき該遺伝子間配列に改変を受けやすくさせる。ＶＨ遺伝子セグメントを欠失させるもしくは置き換えるとき、またはＤＨ遺伝子セグメントを欠失させるもしくは置き換えるとき、結果として得られるマウスは重度の妊性欠損を示す確率が高い。この欠損を補償するために、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の改変に起因するＡＤＡＭ６活性の喪失を補うタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むようにマウスを改変する。様々な実施形態において、補足性ヌクレオチド配列は、妊性欠損をレスキューするマウスＡＤＡＭ６ａ、マウスＡＤＡＭ６ｂ、またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードするものである。様々な実施形態において、補償するヌクレオチド配列は、配列番号１として示される通りのマウスＡＤＡＭ６ａタンパク質をコードし、そして／または配列番号２として示される通りのマウスＡＤＭＡ６ｂタンパク質をコードする。代替として、上記内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を保存するのに適切な方法を、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座に隣接する内因性免疫グロブリン重鎖配列が、機能的内因性重鎖可変領域をコードするように再配列することができないようにしながら、使用することができる。例示的な代替方法は、内因性重鎖定常遺伝子に作動可能に連結する機能的重鎖可変領域をコードするように再配列することができないような方法で、上記内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座を配置するマウス染色体の大部分の操作を含む。様々な実施形態において、上記方法は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを含有するマウス染色体断片の逆位および／または転座を含む。
【０４１０】
妊性をレスキューする上記ヌクレオチド配列を任意の好適な位置に配置することができる。上記配列を遺伝子間領域（例えば、Ｖ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントとの間またはＶ遺伝子セグメントの上流）に配置することができ、またはゲノム内の任意の好適な位置に（すなわち、異所的に）配置することができる。１つの実施形態では、上記ヌクレオチド配列を、マウスゲノムにランダムに組み込む導入遺伝子に導入することができる。１つの実施形態では、上記配列をエピソームで、すなわちマウス染色体上ではなく別々の核酸上で、維持することができる。好適な位置としては、転写許容性または活性である位置、例えば、ＲＯＳＡ２６遺伝子座（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚら、１９９７、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９４：３７８９−３７９４）、ＢＴ−５遺伝子座（Ｍｉｃｈａｅｌら、１９９９、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．８５：３５−４７）またはＯｃｔ４遺伝子座（Ｗａｌｌａｃｅら、２０００、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：１４５５−１４６４）が挙げられる。転写活性遺伝子座へのヌクレオチド配列のターゲティングは、例えば米国特許第７，４７３，５５７号明細書に記載されており、この参考文献は参照により本明細書に援用されている。
【０４１１】
あるいは、妊性をレスキューする上記ヌクレオチド配列を誘導性プロモーターとカップリングさせて、適切な細胞および／または組織、例えば生殖組織、での最適な発現を促進することができる。例示的誘導性プロモーターとしては、物理的手段によって活性化されるプロモーター（例えば、熱ショックプロモーター）および／または化学的手段によって活性化されるプロモーター（例えば、ＩＰＴＧもしくはテトラサイクリン）が挙げられる。
【０４１２】
さらに、上記ヌクレオチド配列の発現を他の遺伝子に関連づけて、特定の発生段階または特定の組織内での発現を実現することができる。かかる発現は、上記ヌクレオチド配列を、特定の発生段階で発現する遺伝子のプロモーターと作動可能に連結させることによって実現することができる。例えば、宿主種のゲノムへと工学的に作製された１つの種からの免疫グロブリン配列を、その宿主種からのＣＤ１９遺伝子（Ｂ細胞特異的遺伝子）のプロモーター配列と作動可能に連結させる。免疫グロブリンが発現する正確な発生段階でのＢ細胞特異的発現が実現される。
【０４１３】
挿入されたヌクレオチド配列の頑強な発現を実現するためのさらにもう１つの方法は、構成的プロモーターの利用である。例示的構成的プロモーターとしては、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＥＦ１Ａ、ＰＧＫおよびＣＡＧＧが挙げられる。同様に、所望のヌクレオチド配列を選択された構成的プロモーターと作動可能に連結させ、それにより、該ヌクレオチド配列によってコードされているタンパク質（単数または複数）の高い発現レベルが得られる。
【０４１４】
用語「異所性」は、自然界で通常は遭遇しない位置への転位または配置（例えば、核酸配列の、該核酸配列が野生型マウスにおいて見出されるのと同じ位置でない位置への配置）を含むことを意図したものである。様々な実施形態において、この用語は、その対象がその正常なまたは正しい位置外にあるという意味で用いられる。例えば、「．．．をコードする異所性ヌクレオチド配列」という句は、マウスでは通常遭遇しない位置に出現するヌクレオチド配列を指す。例えば、マウスＡＤＡＭ６タンパク質（または雄マウスに対して同じまたは同様の妊性の恩恵をもたらすそのオルソログもしくはホモログもしくは断片）をコードする異所性ヌクレオチド配列の場合、該配列は、野生型マウスにおいて通常見出される位置とは異なるマウスのゲノム内の位置に配置されることがある。かかる場合、野生型マウスにおける位置とは異なるマウスのゲノム内の位置に上記配列を配置することにより、マウス配列の新規配列連結部を生み出すこととなる。マウスＡＤＡＭ６の機能的ホモログまたはオルソログは、ＡＤＡＭ６−／−マウスにおいて観察される妊性喪失（例えば、交配により子孫を産生する雄マウスの能力の喪失）のレスキューをもたらす配列である。機能的ホモログまたはオルソログは、ＡＤＡＭ６ａのアミノ酸配列に対しておよび／またはＡＤＡＭ６ｂのアミノ酸配列に対して少なくとも約８９％以上の同一性、例えば９９％以下の同一性を有するタンパク質、ならびにＡＤＡＭ６ａおよび／またはＡＤＡＭ６ｂの欠失またはノックアウトを含む遺伝子型を有するマウスの首尾よく交配する能力を補うまたはレスキューすることができるタンパク質を含む。
【０４１５】
上記異所位置は、（例えば、マウスＡＤＡＭ６配列を含有する導入遺伝子のランダム挿入の場合のように）どこでもよく、または例えば、野生型マウスにおける（例えば、改変内因性免疫グロブリン遺伝子座内だがその天然の位置の上流または下流のいずれか、例えば、改変免疫グロブリン遺伝子座内だが、異なる遺伝子セグメント間、またはマウスＶ−Ｄ遺伝子間配列内の異なる位置における）その場所に近い（しかし、正確に同じではない）位置であってもよい。異所性の配置の一例は、上記周囲の内因性重鎖遺伝子セグメントが、内因性重鎖定常領域を含有する機能的重鎖をコードするように再配列することができないようにしながら、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座内に、野生型マウスに通常見出される位置を維持することである。この例において、これは、例えば、上記可変領域遺伝子座に隣接する位置に配置された工学的に作製された部位特異的組み換え部位を使用する、上記内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を含有する上記染色体断片の逆位により、実現され得る。従って、組み換えの際に、上記内因性重鎖可変領域遺伝子座を、上記内因性重鎖定常領域遺伝子からかなり離れた距離に配置し、それにより内因性重鎖定常領域を含有する機能的重鎖をコードする再配列を防止する。機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座を維持しながら、上記内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の機能的サイレンシングを実現する他の例示的方法は、本開示および／または当技術分野において公知の方法と組み合わせて読むと、当業者であれば明らかである。上記内因性重鎖遺伝子座のかかる配置とともに、上記内因性ＡＤＡＭ６遺伝子は維持され、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、機能的にサイレンシングされる。
【０４１６】
異所性配置の別の例は、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座内への配置である。例えば、１つまたは複数の内因性ＶＨ遺伝子セグメントの、ヒトＶＬ遺伝子セグメントでの置き換えであって、内因性ＡＤＡＭ６配列を除去する置き換えを含むマウスを、マウスＡＤＡＭ６配列がヒトＶＬ遺伝子セグメントを含有する配列内に配置されるように工学的に作製することができる。結果として得られる改変は、ヒト遺伝子配列内に（異所性）マウスＡＤＡＭ６配列を生じさせることとなり、このヒト遺伝子配列内へのマウスＡＤＡＭ６配列の（異所性）配置は、ヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子の位置（すなわち、２つのＶセグメント間）に近い場合もあり、またはマウスＡＤＡＭ６配列の位置（すなわち、Ｖ−Ｄ遺伝子間領域内）に近い場合もある。マウスの生殖細胞系内のヒト遺伝子配列（例えば、免疫グロブリン軽鎖遺伝子配列）内にまたは該ヒト遺伝子配列に隣接した（異所性）マウスＡＤＡＭ６配列の連結により作られる、結果として生ずる配列連結部は、野生型マウスのゲノム内の同じまたは同様の位置と比較して新しいものになる。
【０４１７】
様々な実施形態において、ＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログを欠く非ヒト動物を提供し、この欠如が該非ヒト動物を不妊性にするか、該非ヒト動物の妊性を実質的に低減させる。様々な実施形態において、上記ＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログ欠如は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変に起因する。妊性の実質的低減は、例えば、妊性（例えば、交配頻度、同腹子あたりの子、１年あたりの同腹子、など）の約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％またはそれより多くの低減である。様々な実施形態では、非ヒト動物の雄において機能的であるマウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を上記非ヒト動物に補充し、この補充されたＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片により、妊性低減の全部または実質的部分がレスキューされる。妊性の実質的部分のレスキューは、例えば、上記非ヒト動物が、非改変（すなわち、ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログへの改変を有さない動物）重鎖遺伝子座と比較して少なくとも７０％、８０％または９０％またはそれより多い妊性を示すような妊性の回復である。
【０４１８】
様々な実施形態において、上記遺伝子改変動物（すなわち、例えば免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変に起因して、機能的ＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログを欠く動物）に付与する配列は、ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログから選択される。例えば、マウスにおけるＡＤＡＭ６機能の喪失は、１つの実施形態では、マウスＡＤＡＭ６遺伝子の付加によってレスキューされる。１つの実施形態において、マウスにおけるＡＤＡＭ６機能の喪失は、マウス、例えば齧歯動物、に対して近縁の種、例えば、異なる系統または種のマウス、任意の種のラット、齧歯動物、のオルソログまたはホモログを付加することによってレスキューされ、この場合、上記マウスのオルソログまたはホモログの付加により、ＡＤＡＭ６機能の喪失またはＡＤＡＭ６遺伝子の喪失に起因する妊性の喪失がレスキューされる。他の種からのオルソログおよびホモログは、様々な実施形態において系統発生的に関連した種から選択され、および様々な実施形態において、約８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上または９７％以上である内因性ＡＤＡＭ６（またはオルソログ）との同一性パーセントを示し、およびＡＤＡＭ６に関連したまたは（非マウスの場合は）ＡＤＡＭ６オルソログに関連した妊性喪失をレスキューする。例えば、ＡＤＡＭ６機能を欠く遺伝子改変雄ラット（例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域で置き換えられた内因性免疫グロブリン重鎖可変領域を有するラット、またはラット免疫グロブリン重鎖領域のノックアウトを有するラット）の場合、そのラットの妊性の喪失は、ラットＡＤＡＭ６の付加によって、または一部の実施形態ではラットＡＤＡＭ６のオルソログ（例えば、別のラット系統もしくは種からの、または１つの実施形態ではマウスからの、ＡＤＡＭ６オルソログ）の付加によってレスキューされる。
【０４１９】
このように、様々な実施形態において、ＡＤＡＭ６タンパク質（またはそのオルソログもしくはホモログ）をコードする核酸配列、または該核酸配列と作動可能に連結した調節領域の改変に起因して妊性を示さないまたは妊性の低減を示す遺伝子改変動物は、妊性の喪失を補うまたは回復させる核酸配列を含み、この場合、妊性の喪失を補うまたは回復させる核酸配列は、同じ種の異なる系統からのものであるか、系統発生的に類縁の種からのものである。様々な実施形態において、上記補足性核酸配列は、ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片である。様々な実施形態において、上記補足性ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、妊性の欠陥を有する遺伝子改変動物に近縁である非ヒト動物からのものである。例えば、上記遺伝子改変動物が特定の系統のマウスである場合、ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片を、別の系統のマウスから得ることができ、類縁種のマウスから得ることができる。１つの実施形態において、上記妊性の欠陥を含む遺伝子改変動物が齧歯目（ｏｒｄｅｒ  Ｒｏｄｅｎｔｉａ）のものである場合、上記ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、齧歯目の別の動物からのものである。１つの実施形態において、上記妊性の欠陥を含む遺伝子改変動物は、ネズミ亜目（ｓｕｂｏｒｄｅｒ  Ｍｙｏｍｏｒｏｐｈａ）（例えば、トビネズミ（ｊｅｒｂｏａｓ）、ジャンピングマウス（ｊｕｍｐｉｎｇ
ｍｉｃｅ）、カンガルーハムスター、ハムスター、新世界ラットおよびマウス、ハタネズミ、純種のマウスおよびラット（ｔｒｕｅ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｒａｔ）、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ、キノボリマウス、イワマウス、オジロキヌゲネズミ、マダガスカルラットおよびマウス、トゲヤマネ、デバネズミ、タケネズミ、モグラネズミ）のものであり、上記ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、齧歯目の動物、またはネズミ亜目の動物から選択される。
【０４２０】
１つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は、トビネズミ上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｄｉｐｏｄｏｉｄｅａ）からのものであり、上記ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、ネズミ上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｍｕｒｏｉｄｅａ）からのものである。１つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は、ネズミ上科からのものであり、上記ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、トビネズミ上科からのものである。
【０４２１】
１つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は齧歯動物である。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ上科から選択され、上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、ネズミ上科内の異なる種からのものである。１つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は、カンガルーハムスター科（Ｃａｌｏｍｙｓｃｉｄａｅ）（例えば、カンガルーハムスター）、キヌゲネズミ科（Ｃｒｉｃｅｔｉｄａｅ）（例えば、ハムスター、新世界ラットおよびマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（Ｍｕｒｉｄａｅ）（純種のマウスおよびラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、アシナガマウス科（Ｎｅｓｏｍｙｉｄａｅ）（キノボリマウス、イワマウス、オジロキヌゲネズミ、マダガスカルラットおよびマウス）、トゲヤマネ科（Ｐｌａｔａｃａｎｔｈｏｍｙｉｄａｅ）（例えば、トゲヤマネ）およびメクラネズミ科（例えば、デバネズミ、タケネズミおよびモグラネズミ）から選択される科からのものであり；および上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、同じ科の異なる種から選択される。特定の実施形態において、上記遺伝子改変齧歯動物は、純種のマウスまたはラット（ネズミ科）から選択され、上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、アレチネズミ、トゲマウス、またはタテガミネズミから選択される種からのものである。１つの実施形態において、上記遺伝子改変マウスは、ネズミ科のメンバーからのものであり、および上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、ネズミ科の異なる種からのものである。特定の実施形態において、上記遺伝子改変齧歯動物は、ネズミ科のマウスであり、および上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、ネズミ科のラット、アレチネズミ、トゲマウスまたはタテガミネズミからのものである。
【０４２２】
様々な実施形態において、１つの科の中の齧歯動物の１つまたは複数の齧歯動物ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログを欠く同じ科（例えば、キヌゲネズミ科（例えば、ハムスター、新世界ラットおよびマウス、ハタネズミ）；ネズミ科（例えば、純種のマウスおよびラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ））の遺伝子改変齧歯動物に妊性を回復させる。
【０４２３】
様々な実施形態において、ＡＤＡＭ６オルソログ、ホモログおよびその断片を、該オルソログ、ホモログまたは断片が、ＡＤＡＭ６活性を欠く遺伝子改変雄非ヒト動物（例えば、ＡＤＡＭ６またはそのオルソログのノックアウトを含む齧歯動物、例えばマウスまたはラット）に妊性を回復させるかどうか確認することにより、機能性について評価する。様々な実施形態において、機能性は、内因性ＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログを欠く遺伝子改変動物の精子の、遺伝子改変動物の同じ種の卵管を移動して卵子を受精させる能力と定義される。
【０４２４】
様々な態様において、マウスＡＤＡＭ６（例えば、雄マウスにおいて機能的であるそのオルソログまたはホモログまたは断片）に同様の妊性の恩恵をもたらすタンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列を含有する、内因性重鎖可変領域遺伝子座またはその部分の欠失または置き換えを含むマウスを作製することができる。上記異所性ヌクレオチド配列としては、異なるマウス系統または異なる種、例えば異なる齧歯動物種、のＡＤＡＭ６ホモログまたはオルソログ（またはその断片）であるタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、妊性の恩恵、例えば、指定された期間にわたっての同腹子数の増加、および／または同腹子あたりの子の数の増加、および／またはマウス卵管を通過してマウス卵子を受精させる雄マウスの精子細胞の能力、を付与するヌクレオチド配列が挙げられる。
【０４２５】
１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６は、マウスＡＤＡＭ６タンパク質と少なくとも８９％から９９％同一である（例えば、マウスＡＤＡＭ６ａまたはマウスＡＤＡＭ６ｂと少なくとも８９％から９９％同一である）ホモログまたはオルソログである。１つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、マウスＡＤＡＭ６ａと少なくとも８９％同一のタンパク質、マウスＡＤＡＭ６ｂと少なくとも８９％同一のタンパク質、およびその組み合わせから独立して選択される１つまたは複数のタンパク質をコードする。１つの実施形態において、上記ホモログまたはオルソログは、マウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはマウスＡＤＡＭ６ｂと同一であるまたはマウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはマウスＡＤＡＭ６ｂと約８９％以上同一であるように改変されているラット、ハムスター、マウス、またはモルモットタンパク質である。１つの実施形態において、上記ホモログまたはオルソログは、マウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはマウスＡＤＡＭ６ｂと同一であるか、マウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはマウスＡＤＡＭ６ｂと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６ａは、配列番号１またはその機能的断片を含み、上記マウスＡＤＡＭ６ｂは、配列番号２またはその機能的断片を含む。
【０４２６】
１つの態様では、（ａ）１つまたは複数のヒトＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントの、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の上流への挿入、（ｂ）１つまたは複数のヒトＶＬ、およびＪＬ遺伝子セグメントの、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域の上流への挿入、および（ｃ）ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、上記非ヒト重鎖および／または軽鎖定常領域は、齧歯動物定常領域である（例えば、マウス、ラットまたはハムスター定常領域から選択される）。１つの実施形態において、上記非ヒト軽鎖定常領域は、齧歯動物定常領域である。特定の実施形態において、上記軽鎖定常領域は、マウスＣκまたはラットＣκ領域である。特定の実施形態において、上記軽鎖定常領域は、マウスＣλまたはラットＣκ領域である。１つの実施形態において、上記ヒトＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントはＶκおよびＪκ遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記ヒトＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントはＶλおよびＪλ遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、ヒトＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントの間に存在する１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメントをさらに含む。適切な非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラットおよびハムスターを含む。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、マウスまたはラットである。
【０４２７】
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、少なくとも６個〜少なくとも４０個のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび少なくとも１個〜少なくとも５個のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、６個のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５個のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、１６個のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５個のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、３０個のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５個のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、４０個のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５個のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。様々な実施形態において、上記ヒトＪκ遺伝子セグメントは、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、Ｊκ５、およびそれらの組み合わせから選択される。
【０４２８】
１つの実施形態において、ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列は、上記非ヒト動物において異所性である。１つの実施形態において、ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片（上記非ヒト動物において機能的である）をコードするヌクレオチド配列は、野生型非ヒトＡＤＡＭ６遺伝子座と比較して同じ場所に存在する。１つの実施形態において、上記非ヒト動物はマウスであり、上記ヌクレオチド配列は、マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードし、上記非ヒト動物のゲノムの異所的な場所に存在する。１つの実施形態において、上記非ヒト動物はマウスであり、上記ヌクレオチド配列はマウスＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードし、免疫グロブリン遺伝子セグメント内に存在する。特定の実施形態において、上記免疫グロブリン遺伝子セグメントは、上記非ヒト動物の重鎖遺伝子セグメントである。特定の実施形態では、上記免疫グロブリン遺伝子セグメントは、別の種の軽鎖遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記軽鎖遺伝子セグメントは、ヒトκ軽鎖遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記マウスは、１つまたは複数の内因性の再配列していない重鎖遺伝子セグメントを含む異所性の連続配列を含み、上記ＡＤＡＭ６配列は、上記異所性の連続配列内にある。
【０４２９】
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に内因性免疫グロブリンＶＬおよび／またはＪＬ遺伝子セグメントを欠く。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、上記非ヒト動物の免疫グロブリンＶＬドメインを形成するよう再配列することができない内因性免疫グロブリンＶＬおよび／またはＪＬ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、全てまたは実質的に全ての内因性免疫グロブリンＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、１つまたは複数のヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントで置き換えられる。１つの実施形態において、全てまたは実質的に全ての内因性免疫グロブリンＶλおよびＪλ遺伝子セグメントは、全体としてまたは一部が欠失される。１つの実施形態において、全てまたは実質的に全ての内因性免疫グロブリンＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントは、上記非ヒト動物においてインタクトであり、上記非ヒト動物は、内因性免疫グロブリンＶＬおよび／またはＪＬ遺伝子セグメントと内因性免疫グロブリン軽鎖定常領域との間に挿入される１つまたは複数のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記インタクトな内因性免疫グロブリンＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントは、上記非ヒト動物において抗体のＶＬドメインを形成するように再配列することができないようにする。様々な実施形態において、上記非ヒト動物の内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座である。１つの実施形態において、上記内因性免疫グロブリンＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントは、ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントである。
【０４３０】
１つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物由来の細胞および／または組織を提供し、該細胞および／または組織は、（ａ）１つまたは複数のヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域の上流への挿入、（ｂ）１つまたは複数のヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の上流への挿入、および（ｃ）ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態において、上記非ヒト重鎖および／または軽鎖定常領域は、マウス定常領域である。１つの実施形態において、上記非ヒト重鎖および／または軽鎖定常領域はラット定常領域である。１つの実施形態において、上記非ヒト重鎖および／または軽鎖定常領域は、ハムスター定常領域である。
【０４３１】
１つの実施形態において、ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列は、上記細胞および／または組織において異所性である。１つの実施形態において、ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列は、野生型非ヒトＡＤＡＭ６遺伝子座に比較して同じ場所に存在する。１つの実施形態において、上記非ヒト細胞および／または組織はマウス由来であり、上記ヌクレオチド配列は、マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードし、異所的な場所に存在する。１つの実施形態において、上記非ヒト細胞および／または組織はマウス由来であり、上記ヌクレオチド配列は、マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードし、免疫グロブリン遺伝子セグメント内に存在する。特定の実施形態において、上記免疫グロブリン遺伝子セグメントは、重鎖遺伝子セグメントである。特定の実施形態において、上記免疫グロブリン遺伝子セグメントは、軽鎖遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、内因性重鎖遺伝子セグメントの連続配列は、上記非ヒト動物において異所的に配置され、異所的に配置された内因性重鎖遺伝子セグメントの上記連続配列は、上記マウスにおいて（例えば、雄マウスにおいて）機能的であるＡＤＡＭ６遺伝子を含む。
【０４３２】
１つの態様では、抗原結合タンパク質を作製するための、本明細書に記載の非ヒト動物の使用を提供し、該非ヒト動物は、（ａ）（ｉ）ヒトＶκドメインおよび非ヒト軽鎖定常領域を含む免疫グロブリン軽鎖および（ｉｉ）ヒトＶκドメインおよび非ヒト定常領域を含む免疫グロブリン重鎖を含む抗体および（ｂ）ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片を発現する。１つの実施形態において、上記抗原結合タンパク質はヒトである。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、齧歯動物であり、上記非ヒト定常領域は、齧歯動物定常領域である。特定の実施形態において、上記齧歯動物はマウスである。
【０４３３】
１つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物由来の非ヒト細胞または組織を提供する。１つの実施形態において、上記非ヒト細胞または組織は、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子と隣接する１つまたは複数のヒト免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒト免疫グロブリンＪκ遺伝子セグメントと、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子と隣接する１つまたは複数のヒトＶκおよび１つまたは複数のヒトＪκ遺伝子セグメントとを含み、上記細胞または組織は、ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片を発現する。１つの実施形態において、上記非ヒト軽鎖定常領域遺伝子は、マウスＣκである。
【０４３４】
１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列は、異所性である。１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列は、野生型非ヒト細胞と同じ位置にある。様々な実施形態において、上記非ヒト細胞は、マウスＢ細胞である。様々な実施形態において、上記非ヒト細胞は、胚性幹細胞である。
【０４３５】
１つの実施形態において、上記組織は、上記非ヒト動物の脾臓、骨髄またはリンパ節由来である。
【０４３６】
１つの態様では、ハイブリドーマまたはクアドローマを作製するための、本明細書に記載の非ヒト動物由来の細胞または組織の使用を提供する。
【０４３７】
１つの態様では、本明細書に記載の改変されたゲノムを含む非ヒト細胞を提供し、該非ヒト細胞は、卵母細胞、宿主胚または本明細書に記載の非ヒト動物からの細胞と、異なる非ヒト動物からの細胞との融合物である。
【０４３８】
１つの態様では、ヒト抗原結合タンパク質を作製するための、本明細書に記載の非ヒト動物由来の細胞または組織の使用を提供する。１つの実施形態において、上記ヒト抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の非ヒト動物から単離されたヒトＶκドメインを含む。
【０４３９】
１つの態様では、対象の抗原に結合する抗原結合タンパク質を作製する方法を提供し、該方法は、（ａ）対象の抗原に本明細書に記載の非ヒト動物を曝露させる工程、（ｂ）上記非ヒト動物の１つまたは複数のＢリンパ球を単離する工程（上記１つまたは複数のＢリンパ球が上記対象の抗原と結合するＶＬ結合タンパク質を発現する）、および（ｃ）対象の抗原と結合するＶＬ結合タンパク質のＶＬドメインをコードする核酸配列を同定する工程（ここで、上記ＶＬ結合タンパク質がが、ヒトＶκドメインおよび非ヒト軽鎖定常ドメインおよびヒトＶκドメインおよび非ヒト重鎖定常ドメインを含む）、ならびに（ｄ）対象となる上記抗原と結合するヒト抗原結合タンパク質を作製するために、上記（ｃ）の核酸配列とヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列とを使用する工程を含む。
【０４４０】
１つの実施形態において、上記ＶＬ結合タンパク質の上記非ヒト軽鎖定常ドメインは、マウスＣκである。１つの実施形態において、上記ＶＬ結合タンパク質の上記非ヒト重鎖鎖定常ドメインは、マウスＣγである。１つの実施形態において、上記非ヒト動物はマウスである。
【０４４１】
１つの態様では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座での改変を含む妊性雄マウスを提供し、該妊性雄マウスは、該雄マウスにおいて機能的である異所性ＡＤＡＭ６配列を含む。
【０４４２】
改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座における異所性ＡＤＡＭ６
遺伝子ターゲティングの進展、例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ）の開発により、今や、比較的大きいゲノム断片の組換えが可能である。ＢＡＣ工学は、マウスＥＳ細胞に大きな欠失および大きな挿入を施すことをできるようにした。
【０４４３】
ヒト抗体（すなわち、ヒト可変領域）を作るマウスは、ここしばらくの間に利用可能になった。これらのマウスは、ヒト治療用抗体の開発の重要な前進の代表であるが、その有用性を制限する多数の重大な異常を提示する。例えば、これらのマウスは、損なわれたＢ細胞発生を提示する。この損なわれた発生は、トランスジェニックマウスと野生型マウスの間の様々な相違に起因し得る。
【０４４４】
ヒト抗体は、成熟、増殖、またはクローン選択中の生存についてのシグナルを伝達するマウス細胞の表面のマウスプレＢ細胞受容体またはＢ細部受容体と最適に相互作用しない可能性がある。完全ヒト抗体は、マウスＦｃ受容体系と最適に相互作用しない可能性があるし、マウスは、ヒトＦｃ受容体との１対１の対応を提示しないＦｃ受容体を発現する。結局、完全ヒト抗体を作る様々なマウスは、野生型Ｂ細胞発生に要求され得るすべての真正マウス配列を含まない、例えば、下流エンハンサー要素および他の遺伝子座制御要素を含まない。
【０４４５】
完全ヒト抗体を作製するマウスは、何らかの形で無能化されている内因性免疫グロブリン遺伝子座を一般に含み、可変および定常免疫グロブリン遺伝子セグメントを含むヒト導入遺伝子が、そのマウスゲノム内のランダムな場所に導入される。内因性遺伝子座が、機能的免疫グロブリン遺伝子を形成するように遺伝子セグメントを再配列できないほど無能化されている限り、たとえＢ細胞発生が損なわれていたとしても、かかるマウスにおいて完全ヒト抗体を作製するという目的を達成することができる。
【０４４６】
ヒト導入遺伝子遺伝子座から完全ヒト抗体を作製せざるを得ないのだが、マウスにおけるヒト抗体の産生は、好ましくない過程であるようである。一部のマウスでは、この過程は、トランススイッチの機序によりキメラヒト可変／マウス定常重鎖（軽鎖ではなく）が形成される結果をもたらすには好ましいものではない。この機序により、完全ヒト抗体をコードする転写産物は、ヒトアイソタイプからマウスアイソタイプへとトランスでアイソタイプスイッチされる。完全ヒト導入遺伝子は、マウス重鎖定常領域遺伝子の非損傷コピーを保持する内因性遺伝子座から離れた場所にあるため、この過程はトランスでの過程となる。かかるマウスではトランススイッチが容易に分かるが、この現象はＢ細胞発生のレスキューにやはり不十分であり、Ｂ細胞発生は明らかに害されたままである。いずれにせよ、トランススイッチ現象は軽鎖に関して起こらないので、かかるマウスにおいてトランススイッチされた抗体は、完全ヒト軽鎖を保持する；おそらく、トランススイッチは、シスでの正常なアイソタイプスイッチに（それとは異なるにせよ）用いられる内因性遺伝子座におけるスイッチ配列に依存する。したがって、完全ヒト抗体を作製するように工学的に作製されたマウスが、マウス定常領域を有する抗体を作製するためにトランススイッチ機序を選択する場合であっても、その戦略は、正常Ｂ細胞発生のレスキューにやはり不十分である。
【０４４７】
抗体ベースのヒト治療薬の作製における主な関心事は、特定のエピトープを特異的に認識し、望ましい親和性で、通常は−常にではないが−高い親和性で、そのエピトープを結合する有用な可変ドメインを同定するために十分多様なヒト免疫グロブリン可変領域配列を作製することである。（本明細書に記載する）ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスの開発前は、マウス定常領域と共にヒト可変領域を発現するマウスが、導入遺伝子からヒト抗体を作製するマウスとの何らかの有意差を示すことになるという指摘はなかった。しかし、その仮定は間違っていた。
【０４４８】
内因性遺伝子座におけるヒト免疫グロブリン可変領域でのマウス免疫グロブリン可変領域の正確な置き換えを含有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、Ｂ細胞発生に関して野生型マウスとの驚くべき、また注目すべき類似性を提示する。驚くべき、また実にすばらしい発生の点で、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、免疫に応答して産生される可変領域が完全ヒトのものであるという１つの重要な点のみが野生型マウスと異なる、本質的に正常な野生型応答を免疫に対して提示した。
【０４４９】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、内因性遺伝子座におけるマウス免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）および免疫グロブリン軽鎖（例えば、κ軽鎖、Ｉｇκ）の生殖細胞系可変領域の、対応するヒト免疫グロブリン可変領域での正確な大規模置き換えを含有する。合計で約６メガ塩基のマウス遺伝子座が約１．５メガ塩基のヒトゲノム配列で置き換えられる。この正確な置き換えにより、結果として、ヒト可変領域とマウス定常領域を有する重および軽鎖を作製するハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスが得られる。マウスＶＨ−ＤＨ−ＪＨおよびＶκ−Ｊκセグメントの正確な置き換えは、隣接するマウス配列をインタクトなままおよび機能的なままハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座に残す。上記マウスの体液性免疫系は、野生型マウスのものと同様に機能する。Ｂ細胞発生はいずれの重要な点でも妨害されず、抗原チャレンジすると上記マウスにおいて多様性に富んだヒト可変領域が産生される。
【０４５０】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、重およびκ軽鎖についての免疫グロブリン遺伝子セグメントがヒトおよびマウスにおいて同様に再配列するので実現可能であるのだが、その遺伝子座は同じまたはほぼ同じであるというわけではない――明らかにそれらはそうではない。しかし、その遺伝子座は、すべてのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントを含有する約３００万塩基対の連続するマウス配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座からの等価の配列を基本的にカバーする約１００万塩基の連続するヒトゲノム配列で置き換えることによって重鎖可変遺伝子遺伝子座のヒト化を達成することができるほどに類似する。
【０４５１】
一部の実施形態では、一定のマウス定常領域遺伝子配列の、ヒト遺伝子配列でのさらなる置き換え（例えば、マウスＣＨ１配列の、ヒトＣＨ１での置き換え、およびマウスＣＬ配列の、ヒトＣＬ配列での置き換え）により、結果として、例えば完全ヒト抗体断片、例えば完全ヒトＦａｂの作製に好適な、ヒト可変領域および部分ヒト定常領域を有する抗体を作製するハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスが得られる。ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスは、正常な可変遺伝子セグメント再配列、正常な体細胞超変異および正常なクラススイッチを示す。これらのマウスは、野生型マウスと区別できない体液性免疫系を示し、および、マウスにヒト可変領域遺伝子セグメントの完全レパートリーを欠く場合でさえ、正常な細胞集団をすべてのＢ細胞発生段階で提示し、正常なリンパ器官構造を提示する。これらのマウスの免疫は、可変遺伝子セグメント使用頻度の広範な多様性を提示する頑強な体液性応答を生じさせる結果となる。
【０４５２】
マウス生殖細胞系可変領域遺伝子セグメントの正確な置き換えにより、部分ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスの作製が可能になる。部分ヒト免疫グロブリン遺伝子座は、再配列し、超変異し、正常にクラススイッチするため、ヒト可変領域を含むマウスでは部分ヒト免疫グロブリン遺伝子座により抗体が産生される。その可変領域をコードするヌクレオチド配列を同定し、クローニングして、選ばれた任意の配列、例えば、特定の用途に好適な任意の免疫グロブリンアイソタイプと（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ系において）融合させ、その結果、全部がヒト配列に由来する抗体または抗原結合タンパク質を得ることができる。
【０４５３】
上記マウスＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子セグメントの本質的にすべてを含む３メガ塩基までの上記マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座を、本質的にすべてのヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントをコードする２つのリピートの一方を含むヒトゲノムの０．５メガ塩基までのセグメントで正確に置き換えることにより、組換え方法によるラージスケールヒト化を用いて、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞を改変し、固有の免疫グロブリン重鎖遺伝子座を創製した。さらに、本質的にすべてのヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントをコードする２つのリピートの一方を含むヒトゲノムの二分の一メガ塩基以下のセグメントを使用して、マウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの本質的にすべてを含有するマウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の３メガ塩基セグメントを置き換えた。かかる置換免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスは、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の最も３’側のＶＨ遺伝子セグメントと最も５’側のＤＨ遺伝子セグメントの間で通常は見出されるマウスＡＤＡＭ６遺伝子座の破壊または欠失を含み得る。この領域の破壊は、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の機能性の低減または消去をもたらし得る。
【０４５４】
上記の置換遺伝子座を含み、マウスＡＤＡＭ６をコードする異所性核酸配列も含むマウスであって、本質的に正常な妊性を示すマウスを記載する。１つの実施形態において、上記異所性核酸配列は、上記改変内因性重鎖遺伝子座のヒトＶＬ遺伝子セグメントとヒトＪＬ遺伝子セグメントの間に、または最も５’側のヒトＶＬ遺伝子セグメントの上流に配置される。ＡＤＡＭ６遺伝子の転写方向は、周囲のヒトＶＬ遺伝子セグメントの転写の方向に対して逆であってもよく（図７）、または同じであってもよい（図８）。本明細書における例は、示されるヒトＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメント間に、または最も５’側のヒトトＶＬ遺伝子セグメントの上流に異所性配列を配置することによる妊性のレスキューを示すが、マウスゲノム内の任意の好適な転写許容遺伝子座への（またはさらには染色体外への）異所性配列の配置が雄マウスの妊性を同様にレスキューすると予想されることは、当業者であれば認める。様々な実施形態において、上記異所性核酸配列は、配列番号３、配列番号４、および配列番号５から選択され、該異所性核酸配列は、１つまたは複数のＡＤＡＭ６タンパク質をコードし、該１つまたは複数のＡＤＡＭ６タンパク質は、配列番号１、配列番号２、またはそれらの組み合わせを含む。
【０４５５】
マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を含む異所性配列を有する機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座を欠いているマウスを補足する現象は、非機能的なまたは最小機能的な内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を有する任意のマウスのレスキューに適用できる一般的な方法である。それ故、免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＡＤＡＭ６破壊改変を含む非常に多数のマウスを本発明の組成物および方法でレスキューすることができる。したがって、本発明は、内因性ＡＤＡＭ６機能を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座の多種多様な改変を有するマウスを含む。一部の（非限定的）例を本明細書に提供する。記載するマウスに加えて、ＡＤＡＭ６に関する組成物および方法を非常に多くの用途に、例えば、重鎖遺伝子座を多種多様な方法で改変するときに用いることができる。
【０４５６】
１つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントでの置き換えと、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＤＨ遺伝子セグメントおよびＪＨ遺伝子セグメントの、ヒトＪＬ遺伝子セグメントでの置き換えとを含むマウスであって、ＣＨ１領域および／またはヒンジ領域を欠くマウスを提供する。１つの実施形態において、上記マウスは、（ａ）ヒトＶＬ−マウスＣＨ１−マウスＣＨ２−マウスＣＨ３；（ｂ）ヒトＶＬ−マウスヒンジ−マウスＣＨ２−マウスＣＨ３；および（ｃ）ヒトＶＬ−マウスＣＨ２−マウスＣＨ３から選択される免疫グロブリン鎖の二量体である単一可変ドメイン結合タンパク質を作製する。
【０４５７】
１つの態様では、全てまたは実質的に全てのマウス免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメント（ｍＶＨ、ｍＤＨおよびｍＪＨ）の、１つまたは複数のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメント（ｈＶκおよびｈＪκ）での置き換えを有するマウスであって、全てまたは実質的に全てのマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメント（ｍＶκ、ｍＪκ）の、１つまたは複数のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメント（ｈＶκおよびｈＪκ）での置き換えをさらに含むマウスにおいて、妊性をレスキューするヌクレオチド配列をヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列内（例えば、ヒトＶκ４−１遺伝子セグメントとＪκ１遺伝子セグメントの間）に配置する。
【０４５８】
１つの態様では、機能的マウスＡＤＡＭ６遺伝子座（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）は、ヒトＶＬ遺伝子セグメントの中に、または最も５’側のヒトＶＬ遺伝子セグメントの上流に配置することができ、該ヒトＶＬ遺伝子セグメントは、内因性ＶＨ遺伝子セグメントを置き換える。１つの実施形態において、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントは除去され、１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントで置き換えられ、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、最も５’側のヒトＶＬ遺伝子セグメントの５’末端に直接隣接して配置されるか、または２つのヒトＶＬ遺伝子セグメントの間に配置される。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、挿入された上記ヒトＶＬ遺伝子セグメントの３’末端近くの２つのＶＬ遺伝子セグメントの間に配置される。特定の実施形態において、次には、ヒトＶＬ遺伝子セグメントの配列は、以下である（上記ヒトＶＬ遺伝子セグメントの転写方向に関して上流から下流へ）：ヒトＶκ５−２−マウスＡＤＡＭ６遺伝子座−ヒトＶκ４−１。特定の実施形態において、次には、ヒトＶＬ遺伝子セグメントの配列は、以下である（上記ヒトＶＬ遺伝子セグメントの転写方向に関して上流から下流へ）：マウスＡＤＡＭ６遺伝子座−ヒトＶκ２−４０であって、ここで、ヒトＶκ２−４０は、上記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座において最も５’側のヒトＶＬ遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のマウスＡＤＡＭ６ａおよびマウスＡＤＡＭ６ｂのうちの１つまたは複数の配向は、上記ヒトＶＬ遺伝子セグメントの配向と比較して、転写方向に関して反対である。１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のマウスＡＤＡＭ６ａおよびマウスＡＤＡＭ６ｂのうちの１つまたは複数の配向は、上記ヒトＶＬ遺伝子セグメントの配向と比較して、転写方向に関して同じである。
【０４５９】
１つの態様では、機能的マウスＡＤＡＭ６遺伝子座（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）は、ヒトＶＬ遺伝子セグメントとヒトＪＬ遺伝子セグメントの間（すなわち、最も３’側のヒトＶＬ遺伝子セグメントと最も５’側のヒトＪＬ遺伝子セグメントの間の遺伝子間領域内）に配置することができ、該ヒトＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントは内因性ＶＨ遺伝子セグメントを置き換えている。１つの実施形態において、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントは除去され、１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントで置き換えられ、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、最も３’側のヒトＶＬ遺伝子セグメントの３’末端に直接隣接し、且つ最も５’側のヒトＪＬ遺伝子セグメントの５’末端に直接隣接して配置される。特定の実施形態において、上記１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ遺伝子セグメントおよびＪκ遺伝子セグメントである。特定の実施形態において、次には、ヒトＶＬ遺伝子セグメントの配列は、以下である（上記ヒトＶＬ遺伝子セグメントの転写方向に関して上流から下流へ）：ヒトＶκ４−１−マウスＡＤＡＭ６遺伝子座−ヒトＪκ１。１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のマウスＡＤＡＭ６ａおよびマウスＡＤＡＭ６ｂのうちの１つまたは複数の配向は、上記ヒトＶＬ遺伝子セグメントの配向と比較して、転写方向に関して反対である。１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のマウスＡＤＡＭ６ａおよびマウスＡＤＡＭ６ｂのうちの１つまたは複数の配向は、上記ヒトＶＬ遺伝子セグメントの配向と比較して、転写方向に関して同じである。
【０４６０】
すべてのまたは実質的にすべての内因性ＶＨ遺伝子セグメントを置き換える、上記１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメント（例えば、ＶκまたはＶλセグメント）で改変されるマウスは、上に記載したように、例えばマウスＡＤＡＭ６遺伝子座もしくはその機能的断片を含む下流ホモロジーアームを有するターゲティングベクターを利用することにより、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を維持するように改変することができ、あるいは２つのヒトＶＬ遺伝子セグメント間に、またはヒトＶＬ遺伝子セグメントとＤＨ遺伝子セグメントとの間（ヒトであろうとマウスであろうと、例えば、Ｖλ＋ｍ／ｈＤＨ）もしくはＪ遺伝子セグメントとの間（ヒトであろうとマウスであろうと、例えば、Ｖκ＋ＪＨ）に位置する異所配列で損傷マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を置き換えるように改変することができる。１つの実施形態において、上記置き換えは、２つ以上のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含み、および上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座またはその機能的断片は、２つの最も３’側のＶＬ遺伝子セグメント間に配置される。そこで、特定の実施形態において、ヒトＶＬ遺伝子セグメントの構成は、以下のものである（ヒト遺伝子セグメントの転写方向に関して上流から下流に）：ヒトＶＬ３’−１−マウスＡＤＡＭ６遺伝子座−ヒトＶＬ３’。１つの実施形態において、転写方向に関して、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のマウスＡＤＡＭ６ａおよびマウスＡＤＡＭ６ｂのうちの１つまたは複数の配向は、ヒトＶＬ遺伝子セグメントの配向と比較して逆である。あるいは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、最も３’側のヒトＶＬ遺伝子セグメントと最も５’側のＪＬ遺伝子セグメントの間の遺伝子間領域に配置され得る。
【０４６１】
１つの態様では、１つまたは複数の内因性ＶＨ遺伝子セグメントの置き換えを有する、および少なくとも１つの内因性ＤＨ遺伝子セグメントを含むマウスを提供する。かかるマウスにおいて、上記内因性ＶＨ遺伝子セグメントの改変は、最も５’側のＤＨ遺伝子セグメントではなく、最も３’側のＶＨ遺伝子セグメントの１つまたは複数についての改変を含み得、この場合、上記１つまたは複数の最も３’側のＶＨ遺伝子セグメントの改変が、上記内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を破壊しないようにまたは非機能的にしないように注意する。例えば、１つの実施形態において、上記マウスは、すべてのまたは実質的にすべての内因性ＶＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントでの置き換えを含み、および上記マウスは、１つまたは複数の内因性ＤＨ遺伝子セグメントおよび機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を含む。
【０４６２】
もう１つの実施形態において、上記マウスは、最も３’側の内因性ＶＨ遺伝子セグメントの改変、および１つまたは複数の内因性ＤＨ遺伝子セグメントの改変を含み、該改変は、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座が機能的なままである程度まで該内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の完全性が維持されるように行う。一例では、かかる改変を二工程で行う：（１）上流ホモロジーアームと、機能的マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のすべてまたは部分を含む下流ホモロジーアームとを有するターゲティングベクターを利用して、最も３’側の内因性ＶＨ遺伝子セグメントを１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントで置き換える工程；（２）次に、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のすべてまたは機能的部分を含む上流ホモロジーアームを有するターゲティングベクターで内因性ＤＨ遺伝子セグメントを置き換える工程。
【０４６３】
様々な態様において、改変が内因性マウスＡＤＡＭ６の機能を破壊する場合、マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的ホモログをコードする異所性配列を含有するマウスの利用は有用である。内因性マウスＡＤＡＭ６機能を破壊する確率は、マウス免疫グロブリン遺伝子座への改変を行うとき、特に、マウス免疫グロブリン重鎖可変領域および周囲の配列を改変するときに高い。したがって、かかるマウスは、全部もしくは一部が欠失している、全部もしくは一部がヒト化されている、または全部もしくは一部が（例えば、ＶκもしくはＶλ配列で）置き換えられている免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウスを作製するときに特に有益である。下に記載するマウスに対して記載の遺伝子改変を行うための方法は当業者に公知である。
【０４６４】
マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性配列またはマウスＡＤＡＭ６タンパク質の妊性の恩恵をもたらす実質的に同一もしくは同様のタンパク質をコードする異所性配列を含有するマウスは、内因性ＡＤＡＭ６配列を破壊するかまたは欠失させるマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座への改変に関連して特に有用である。ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する抗体を発現するマウスに関連して主として記載したが、かかるマウスは、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を破壊する任意の遺伝子改変に関連して有用である。これが、マウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の改変を含有する多種多様な遺伝子改変マウスを包含することは、当業者であれば認める。これらには、例えば、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントのすべてまたは一部分の欠失または置き換えを、他の改変にかかわらず有するマウスが含まれる。非限定的な例を下に記載する。
【０４６５】
一部の態様では、マウスにおいて機能的な異所性マウス、齧歯動物または他のＡＤＡＭ６遺伝子（またはオルソログもしくはホモログもしくは断片）と１つまたは複数のヒト免疫グロブリン可変および／または定常領域遺伝子セグメントとを含む遺伝子改変マウスを提供する。様々な実施形態において、マウスにおいて機能的である他のＡＤＡＭ６遺伝子オルソログまたはホモログまたは断片は、ウシ、イヌ、霊長類、ウサギまたは他の非ヒト配列を含み得る。
【０４６６】
１つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントでの置き換えと、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＤＨ遺伝子セグメントおよびマウスＪＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントでの置き換えとを含むマウスを提供する。
【０４６７】
１つの実施形態において、上記マウスは、マウスＣＨ１ヌクレオチド配列の、ヒトＣＨ１ヌクレオチド配列での置き換えをさらに含む。１つの実施形態において、上記マウスは、マウスヒンジヌクレオチド配列の、ヒトヒンジヌクレオチド配列での置き換えをさらに含む。１つの実施形態において、上記マウスは、免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座（ＶＬおよびＪＬ）の、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座での置き換えをさらに含む。１つの実施形態において、上記マウスは、マウス免疫グロブリン軽鎖定常領域ヌクレオチド配列の、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域ヌクレオチド配列での置き換えをさらに含む。特定の実施形態において、上記ＶＬ、ＪＬおよびＣＬは、免疫グロブリンκ軽鎖配列である。特定の実施形態において、上記マウスは、ヒトヒンジおよびヒトＣＨ１配列と融合したマウスＣＨ２およびマウスＣＨ３免疫グロブリン定常領域配列を含むので、該マウス免疫グロブリン遺伝子座が再配列して、（ａ）ヒト可変領域、ヒトＣＨ１領域、ヒトヒンジ領域ならびにマウスＣＨ２およびマウスＣＨ３領域を有する重鎖と、（ｂ）ヒト可変ドメインおよびヒト定常領域を含む免疫グロブリン軽鎖をコードする遺伝子とを含む結合タンパク質をコードする遺伝子を形成する。
【０４６８】
１つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントでの置き換えと、必要に応じて、すべてのもしくは実質的にすべてのＤＨ遺伝子セグメントおよび／もしくはＪＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび／もしくはヒトＪＨ遺伝子セグメントでの置き換えと、または必要に応じて、すべてのもしくは実質的にすべてのＤＨ遺伝子セグメントおよびＪＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントでの置き換えとを含むマウスを提供する。
【０４６９】
１つの実施形態において、上記マウスは、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のＶＬ、１つまたは複数のＤＨ、および１つまたは複数のＪ遺伝子セグメント（例えば、ＪκまたはＪλ）での置き換えを含み、これらの遺伝子セグメントは、マウスヒンジ領域に作動可能に連結しており、該マウスは、転写方向に５’から３’へと、ヒトＶＬ−ヒトまたはマウスＤＨ−ヒトまたはマウスＪ−マウスヒンジ−マウスＣＨ２−マウスＣＨ３を含有する再配列免疫グロブリン鎖遺伝子を形成する。１つの実施形態において、上記Ｊ領域は、ヒトＪκ領域である。１つの実施形態において、上記Ｊ領域は、ヒトＪＨ領域である。１つの実施形態において、上記Ｊ領域は、ヒトＪλ領域である。１つの実施形態において、上記ヒトＶＬ領域は、ヒトＶλ領域およびヒトＶκ領域から選択される。
【０４７０】
特定の実施形態において、上記マウスは、マウスまたはヒト定常領域と、ヒトＶκ、ヒトＤＨおよびヒトＪκ；ヒトＶκ、ヒトＤＨおよびヒトＪＨ；ヒトＶλ、ヒトＤＨおよびヒトＪλ；ヒトＶλ、ヒトＤＨおよびヒトＪＨ；ヒトＶκ、ヒトＤＨおよびヒトＪλ；ヒトＶλ、ヒトＤＨおよびヒトＪκに由来する可変領域とを有する、単一可変ドメイン抗体を発現する。特定の実施形態では、列挙したＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメント間でのまたは列挙したＶおよびＪ遺伝子セグメント間での生産的再配列の発生が可能になるように、組換え認識配列を改変する。
【０４７１】
１つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントでの置き換えと、すべてのもしくは実質的にすべてのＤＨ遺伝子セグメントおよびＪＨ遺伝子セグメントの、ヒトＪＬ遺伝子セグメントでの置き換えとを含むマウスであって、ＣＨ１および／またはヒンジ領域を欠くマウスを提供する。
【０４７２】
１つの実施形態において、上記マウスにはＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く。１つの実施形態において、上記マウスにはヒンジ領域をコードする配列を欠く。１つの実施形態において、上記マウスにはＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域をコードする配列を欠く。
【０４７３】
特定の実施形態において、上記マウスは、マウスＣＨ３ドメインに結合しているマウスＣＨ２ドメインに融合しているヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（λまたはκ）を含む結合タンパク質を発現する。
【０４７４】
１つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントでの置き換えと、すべてのもしくは実質的にすべてのマウスＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの、ヒトＪＬ遺伝子セグメントでの置き換えとを含むマウスを提供する。
【０４７５】
１つの実施形態において、上記マウスは、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ１およびヒンジ領域、またはＣＨ１領域およびヒンジ領域およびＣＨ２領域をコードする免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列の欠失を含む。
【０４７６】
１つの実施形態において、上記マウスは、以下のものから選択されるホモ二量体を含む単一可変ドメイン結合タンパク質を作製する：（ａ）ヒトＶＬ−マウスＣＨ１−マウスＣＨ２−マウスＣＨ３；（ｂ）ヒトＶＬ−マウスヒンジ−マウスＣＨ２−マウスＣＨ３；（ｃ）ヒトＶＬ−マウスＣＨ２−マウスＣＨ３。
【０４７７】
１つの態様では、非ヒト動物であって、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、該改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座が非ヒトＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログを含む、非ヒト動物を提供する。
【０４７８】
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される齧歯動物である。
【０４７９】
１つの実施形態において、上記非ヒトＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、マウスＡＤＡＭ６配列とオルソロガスおよび／または相同性である配列であり、そのオルソログまたはホモログは、非ヒト動物において機能的である。
【０４８０】
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択され、上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、マウス、ラットおよびハムスターから選択される非ヒト動物からのものである。特定の実施形態において、上記非ヒト動物はマウスであり、上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、異なるマウス種、ラットおよびハムスターから選択される動物からのものである。特定の実施形態において、上記非ヒト動物はラットであり、上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、異なるラット種、マウスおよびハムスターから選択される齧歯動物からのものである。特定の実施形態において、上記非ヒト動物はハムスターであり、上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、異なるハムスター種、マウスおよびラットから選択される齧歯動物からのものである。
【０４８１】
特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、ネズミ亜目からのものであり、上記ＡＤＡＭ６配列は、トビネズミ上科の齧歯動物およびネズミ上科の齧歯動物から選択される動物からのものである。特定の実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ上科のマウスであり、上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、ネズミ上科のマウスまたはラットまたはハムスターからのものである。
【０４８２】
１つの実施形態において、上記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントは、１つまたは複数のヒト、キメラおよび／または齧歯動物（例えば、マウスもしくはラット）定常領域遺伝子に作動可能に連結している。１つの実施形態において、上記定常領域遺伝子はマウスである。１つの実施形態において、上記定常領域遺伝子はラットである。１つの実施形態において、上記定常領域遺伝子はハムスターである。１つの実施形態において、上記定常領域遺伝子は、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびその組み合わせから選択される配列を含む。特定の実施形態において、上記定常領域遺伝子は、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３配列を含む。１つの実施形態において、上記ヒトＶＬ遺伝子セグメントおよびヒトＪＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントである。
【０４８３】
１つの実施形態において、上記非ヒトＡＤＡＭ６配列は、ヒト免疫グロブリン軽鎖配列に隣接する。１つの実施形態において、上記非ヒトＡＤＡＭ６配列は、ヒト免疫グロブリン軽鎖配列内に位置する。特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、Ｖおよび／またはＪ遺伝子セグメントを含む。
【０４８４】
１つの実施形態において、上記非ヒトＡＤＡＭ６配列は、２つのＶ遺伝子セグメント間に位置する。１つの実施形態において、上記非ヒトＡＤＡＭ６配列は、Ｖ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントとの間に並置されている。１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６配列は、２つのＪ遺伝子セグメントの間に並置されている。
【０４８５】
１つの態様では、免疫グロブリン遺伝子座からヒトＶＬドメインと同起源のヒトＶＬドメインを発現するＢ細胞を含む遺伝子改変非ヒト動物であって、該免疫グロブリン遺伝子座から非免疫グロブリン非ヒトタンパク質を発現する遺伝子改変非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、上記非免疫グロブリン非ヒトタンパク質は、ＡＤＡＭタンパク質である。特定の実施形態において、上記ＡＤＡＭタンパク質は、ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片である。
【０４８６】
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、齧歯動物（例えば、マウスまたはラット）である。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ科のものである。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ上科のものである。特定の実施形態において、上記ネズミ上科の齧歯動物は、マウスおよびラットから選択される。
【０４８７】
１つの実施形態において、上記非免疫グロブリン非ヒトタンパク質は、齧歯動物タンパク質である。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ科のものである。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ上科のものである。特定の実施形態において、上記齧歯動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。
【０４８８】
１つの実施形態において、上記ヒトＶＬドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に直接またはリンカーによって結合する。特定の実施形態において、上記定常ドメイン配列は、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびその組み合わせから選択される配列を含む。特定の実施形態において、上記ヒトＶＬドメインは、ＶκまたはＶλドメインから選択される。
【０４８９】
種々の実施形態において、上記ヒトＶＬドメインは、ヒトＶκドメインである。
【０４９０】
１つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物であって、その生殖細胞系にヒト免疫グロブリン配列を含み、雄非ヒト動物の精子がｉｎ  ｖｉｖｏ移動欠陥を特徴とする、遺伝子改変非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、上記ｉｎ  ｖｉｖｏ移動欠陥は、上記雄非ヒト動物の精子が同じ種の雌非ヒト動物の子宮から卵管を通って移動することができないことを含む。１つの実施形態において、上記非ヒト動物には、ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を欠く。特定の実施形態において、上記ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片は、ＡＤＡＭ６ａおよび／もしくはＡＤＡＭ６ｂタンパク質またはその機能的断片を含む。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は齧歯動物である。特定の実施形態において、上記齧歯動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。
【０４９１】
１つの態様では、ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする非ヒト配列に隣接するヒト免疫グロブリン配列を含む非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は齧歯動物である。特定の実施形態において、上記齧歯動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。
【０４９２】
１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、免疫グロブリン軽鎖配列である。１つの実施形態において、上記免疫グロブリン配列は、１つまたは複数のＶＬ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、１つまたは複数のＪＬ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、１つまたは複数のＶＬ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のＪＬ遺伝子セグメントを含む。種々の実施形態において、上記ヒトＶＬ遺伝子セグメントおよびヒトＪＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ遺伝子セグメントおよびヒトＪκ遺伝子セグメントである。
【０４９３】
１つの態様では、無能化された、または欠失した内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を含む、無能化された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウスであって、ヒト抗体、またはマウス抗体、またはヒト／マウス抗体、または他のキメラ抗体を発現する核酸配列を含むマウスが提供される。１つの実施形態において、上記核酸配列は、上記マウスゲノムへランダムに組み込まれている、組み込まれた導入遺伝子に存在する。１つの実施形態において、上記核酸配列は、野生型マウスには見出されないエピソーム（例えば、染色体）にある。
【０４９４】
１つの態様では、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を含む、無能化された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウスであって、ヒト抗体、またはマウス抗体、またはヒト／マウス抗体、または他のキメラ抗体を発現する核酸配列を含むマウスが提供される。１つの実施形態において、上記核酸配列は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、１つまたは複数の内因性重鎖定常領域遺伝子から上流の位置に存在する。１つの実施形態において、上記核酸配列は、上記マウスゲノムへランダムに組み込まれている、組み込まれた導入遺伝子に存在する。１つの実施形態において、上記核酸配列は、野生型マウスには見出されないエピソーム（例えば、染色体）にある。
【０４９５】
二重特異性結合タンパク質
本明細書で記載される結合タンパク質およびそれらをコードするヌクレオチド配列は、多重特異性結合タンパク質、例えば、二重特異性結合タンパク質を作製するのに用いることができる。この態様では、ＣＨ領域と融合している第１のＶＬドメインから本質的になる第１のポリペプチドが、ＣＨ領域と融合している第２のＶＬドメインから本質的になる第２のポリペプチドと会合することができる。上記第１のＶＬドメインと上記第２のＶＬドメインとが異なるエピトープに特異的に結合する場合は、その２つのＶＬドメインを用いて二重特異性結合分子を作製することができる。上記ＣＨ領域は、同じ場合もあり、異なる場合もある。一実施形態では、例えば、上記ＣＨ領域のうちの１つが、プロテインＡに対する結合決定基を消失させるように改変され得る一方、他の重鎖定常領域は、そのように改変されない。この特定の配列は、例えば、ホモ二量体（例えば、上記第１のポリペプチドのホモ二量体または上記第２のポリペプチドのホモ二量体）の混合物からの二重特異性結合タンパク質の単離を単純化する。
【０４９６】
一態様では、本明細書で記載される方法および組成物を用いて二重特異性結合タンパク質を作製する。この態様では、ＣＨ領域に融合している第１のＶＬおよびＣＨ領域に融合している第２のＶＬの各々を、同じアイソタイプのヒトＩｇＧ配列（例えば、ヒトＩｇＧ１配列、ヒトＩｇＧ２配列、ヒトＩｇＧ３配列、またはヒトＩｇＧ４配列）とインフレームで独立してクローニングする。上記第１のＶＬは、第１のエピトープに特異的に結合し、上記第２のＶＬは、第２のエピトープに特異的に結合する。上記第１および第２のエピトープは、異なる抗原に存在する場合もあり、同じ抗原に存在する場合もある。
【０４９７】
一実施形態では、上記第１のＶＬに融合しているＣＨ領域のＩｇＧアイソタイプと上記第２のＶＬに融合しているＣＨ領域のＩｇＧアイソタイプとが同じアイソタイプであるが、１つのＩｇＧアイソタイプが少なくとも１つのアミノ酸置換を含む点で異なる。一実施形態では、上記少なくとも１つのアミノ酸置換により、該置換を保有する重鎖が、その置換を欠く重鎖と比較して、プロテインＡに結合することが不可能となるかまたは実質的に不可能となる。
【０４９８】
一実施形態では、上記第１のＣＨ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧの第１のＣＨ３ドメインを含み、上記第２のＣＨ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧの第２のＣＨ３ドメインを含み、ここで該第２のＣＨ３ドメインが、プロテインＡに対する該第２のＣＨ３ドメインの結合性を低減するかまたは消失させる改変を含む。
【０４９９】
一実施形態では、上記第２のＣＨ３ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵ指標により番号付けられた４３５Ｒ改変を含む。別の実施形態では、上記第２のＣＨ３ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵ指標により番号付けられた４３６Ｆ改変をさらに含む。
【０５００】
一実施形態では、上記第２のＣＨ３ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵ指標により番号付けられたＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉからなる群から選択される改変を含むヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインである。
【０５０１】
一実施形態では、上記第２のＣＨ３ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵ指標により番号付けられたＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉからなる群から選択される改変を含むヒトＩｇＧ２のＣＨ３ドメインである。
【０５０２】
一実施形態では、上記第２のＣＨ３ドメインが、ＫａｂａｔのＥＵ指標により番号付けられたＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉからなる群から選択される改変を含むヒトＩｇＧ４のＣＨ３ドメインである。
【０５０３】
一実施形態では、上記結合タンパク質が、１つまたは複数の本明細書で列挙される改変を有するＣＨ領域を含み、ここで該結合タンパク質の定常領域が、ヒトにおいて非免疫原性であるかまたは実質的に非免疫原性である。特定の実施形態では、上記ＣＨ領域が、ヒトにおいて免疫原性エピトープを提示しないアミノ酸配列を含む。別の特定の実施形態では、上記結合タンパク質が野生型ヒト重鎖では見出されないＣＨ領域を含み、そのＣＨ領域がＴ細胞エピトープを生成する配列を含まない。
【実施例】
【０５０４】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのようにして作製し用いるかについて記載するように提供されるものであり、本発明者らが自らの発明と考えるものの範囲を限定することを意図するものではない。別段に示されない限り、温度は摂氏で示し、圧力は大気圧または大気圧近傍である。
【０５０５】
（実施例１）
ヒト軽鎖遺伝子セグメントの重鎖遺伝子座への導入
ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら（２００３年）、「Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２１巻、６５２〜６５９頁を参照されたい）を用いて、マウスゲノムの細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーを改変するための多様なターゲティング構築物を作製した。再配列していないヒト生殖細胞系のκ軽鎖遺伝子配列の挿入（例えば、図２の上図を参照されたい）を確実にするために、マウスＢＡＣ  ＤＮＡを相同組換えにより改変して、ＶＨ遺伝子セグメント、ＤＨ遺伝子セグメント、およびＪＨ遺伝子セグメントの標的とした欠失を介してマウス内因性重鎖遺伝子座を不活化した。
【０５０６】
略述すると、リコンビナーゼを介する組換えを用いて、２回にわたる継続的なターゲティングイベントにおいて、マウス重鎖遺伝子座を欠失させた。その第１のターゲティングイベントは、上記マウス重鎖遺伝子座の５’端において、５’側から３’側への、マウス５’側ホモロジーアーム、リコンビナーゼ認識部位、ネオマイシンカセット、および３’側ホモロジーアームを含むターゲティングベクターを用いるターゲティングを包含した。上記５’側ホモロジーアームおよび３’側ホモロジーアームは、上記マウス重鎖遺伝子座の５’側配列を含有した。その第２のターゲティングイベントは、上記ＪＨ遺伝子セグメントの領域内のマウス重鎖遺伝子座の３’端において、５’側から３’側への、マウス５’側ホモロジーアーム、５’側リコンビナーゼ認識部位、第２のリコンビナーゼ認識部位、ハイグロマイシンカセット、第３のリコンビナーゼ認識部位、およびマウス３’側ホモロジーアームを含有する第２のターゲティングベクターを用いる、ターゲティングを包含した。上記５’側ホモロジーアームおよび３’側ホモロジーアームは、上記マウスＪＨ遺伝子セグメントおよび上記イントロンエンハンサーの５’および定常領域に隣接する配列を含有した。両方のターゲティングベクター（上に記載した）でターゲティングされた、改変された重鎖遺伝子座を含有する陽性ＥＳ細胞は、核型分析（ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ）により確認した。次いで、ＤＮＡを、その二重ターゲティングされたＥＳ細胞から単離し、リコンビナーゼによる処理に供し、これにより、上記第１のターゲティングベクターにおける５’側リコンビナーゼ認識部位と上記第２のターゲティングベクターにおける５’側リコンビナーゼ認識部位との間におけるマウス重鎖遺伝子座のゲノムＤＮＡの欠失が媒介され、単一のリコンビナーゼ認識部位および２つのリコンビナーゼ認識部位が隣接するハイグロマイシンカセットが残される（図２の上図）。したがって、下記で記載されるターゲティングベクターを用いて、正確な様式で順次ヒトκ生殖細胞系遺伝子セグメントを挿入するために、完全なＣＨ遺伝子を含有する、改変されたマウス重鎖遺伝子座を創製した。
【０５０７】
当技術分野において認められている標準的な分子的技法を用いて、４つの個別のターゲティングベクターを操作して、４０のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを、不活化させたマウス重鎖遺伝子座（上に記載した）へと順次挿入した（図２）。その４つのターゲティング構築物を操作するのに用いたヒトκ遺伝子セグメントは、天然では、ヒト生殖細胞系κ軽鎖遺伝子座の近位コンティグにおいて見出される（図１の下図および表１）。
【０５０８】
その最初の６つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含有する、約１１０，４９９ｂｐのヒトゲノム断片を、該ヒトＪκ５遺伝子セグメントの４３１ｂｐ下流（３’側）におけるＰＩ−ＳｃｅＩ部位を含有するように工学的に作製した（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）。別のＰＩ−ＳｃｅＩ部位を、上記マウス重鎖のイントロンエンハンサー、ＩｇＭのスイッチ領域（Ｓμ）、および上記マウス重鎖遺伝子座のＩｇＭ遺伝子を含有する、約７，８５２ｂｐのゲノム断片の５’端に工学的に作製した。その約１１０．５ｋｂのヒト断片とのライゲーションにより、このマウス断片を３’側ホモロジーアームとして用い、これにより、５’側から３’側への、上記最初の６つの連続するＶκ遺伝子セグメントおよび５つのＪκ遺伝子セグメントを含有する、約１１０．５ｋｂにわたるヒトκ軽鎖遺伝子座のゲノム配列、ＰＩ−ＳｃｅＩ部位、上記マウスイントロンエンハンサー、ＳμおよびマウスＩｇＭ定常遺伝子を含有する、約７，８５２ｂｐのマウス重鎖配列を含有する３’側連結部を創製した。上記ヒトＶκ１−６遺伝子セグメントの上流（５’側）には、上記マウス重鎖遺伝子座の５’側の配列に対応する１９，７５２ｂｐのマウスゲノムＤＮＡを含有する、マウス５’側ホモロジーアームの始点の前に、さらなる３，７１０ｂｐのヒトκ配列が存在した。上記５’側ホモロジーアームと上記ヒトκ配列の開始部との間には、３つのリコンビナーゼ認識部位が隣接するネオマイシンカセットが存在した（図２のターゲティングベクター１を参照されたい）。ヒトκ配列を最初に挿入するための最終のターゲティングベクターは、５’側から３’側への、上記重鎖遺伝子座の５’側に約２０ｋｂのマウスゲノム配列を含有する５’側ホモロジーアーム、第１のリコンビナーゼ認識部位（Ｒ１）、ネオマイシンカセット、第２のリコンビナーゼ認識部位（Ｒ２）、第３のリコンビナーゼ認識部位（Ｒ３）、上記最初の６つの連続するヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含有する、約１１０．５ｋｂのヒトゲノムκ配列、ＰＩ−ＳｃｅＩ部位、ならびに上記イントロンエンハンサー、Ｓμ、および上記マウスＩｇＭ定常遺伝子を含めた約８ｋｂのマウスゲノム配列を含有する３’側ホモロジーアームを包含した（図２のターゲティングベクター１）。このターゲティングベクターで相同組換えすることにより、組み換えられるとハイブリッド重鎖（すなわち、ヒトＶκドメインおよびマウスＣＨ領域）の形成をもたらす、内因性重鎖定常遺伝子に作動可能に連結した６つのヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含有する、改変されたマウス重鎖遺伝子座を創製した。
【表１】
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【０５０９】
１０のさらなるヒトＶκ遺伝子セグメントのハイブリッド重鎖遺伝子座への導入：１０のさらなるヒトＶκ遺伝子セグメントを、上記で記載した改変されたマウス重鎖遺伝子座へと導入するために、第２のターゲティングベクターを工学的に作製した（図２のターゲティングベクター２を参照されたい）。上記ヒトκ軽鎖遺伝子座に由来する１２の連続するヒトＶκ遺伝子セグメントを含有する、１４０，０５８ｂｐのヒトゲノム断片を、上記マウス重鎖遺伝子座の５’側にマウスゲノム配列を含有する５’側ホモロジーアームおよびヒトゲノムκ配列を含有する３’側ホモロジーアームで工学的に作製した。上記ヒトＶκ１−１６遺伝子セグメントの上流（５’側）には、ターゲティングベクター１を構築するために用いた同じ５’側ホモロジーアームである、マウス５’側ホモロジーアームの始点の前に、さらなる１０，１７０ｂｐのヒトκ配列が存在した（図２）。上記５’側ホモロジーアームと上記ヒトκ配列の開始部との間には、リコンビナーゼ認識部位が隣接するハイグロマイシンカセットが存在した。上記３’側ホモロジーアームは、ターゲティングベクター１のヒトゲノムκ配列の約１１０．５ｋｂの断片と同等の５’端に対応する、ヒトゲノムκ配列の３１，１６５ｂｐの重複を含んだ（図２）。１０のさらなるヒトＶκ遺伝子セグメントを挿入するための最終のターゲティングベクターは、５’側から３’側への、上記重鎖遺伝子座の５’側に約２０ｋｂのマウスゲノム配列を含有する５’側ホモロジーアーム、第１のリコンビナーゼ認識部位（Ｒ１）、ハイグロマイシンカセット、第２のリコンビナーゼ認識部位（Ｒ２）、およびそのうちの約３１ｋｂが、ターゲティングベクター１のヒトκ配列の５’端と重複し、このターゲティング構築物のための３’側ホモロジーアームとして働く、１２の連続するヒトＶλ遺伝子セグメントを含有する、約１４０ｋｂのヒトゲノムκ配列を包含した。このターゲティングベクターで相同組換えすることにより、組み換えられるとハイブリッド重鎖の形成をもたらす、上記マウス重鎖定常遺伝子に作動可能に連結した１６のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含有する、改変されたマウス重鎖遺伝子座を創製した。
【０５１０】
１４のさらなるヒトＶκ遺伝子セグメントのハイブリッド重鎖遺伝子座への導入：１４のさらなるヒトＶκ遺伝子セグメントを、上記で記載した改変されたマウス重鎖遺伝子座へと導入するために、第３のターゲティングベクターを工学的に作製した（図２のターゲティングベクター３）。１５の連続するヒトＶκ遺伝子セグメントを含有する、１６０，５７９ｂｐのヒトゲノム断片を、上記マウス重鎖遺伝子座の５’側にマウスゲノム配列を含有する５’側ホモロジーアームおよびヒトゲノムκ配列を含有する３’側ホモロジーアームで工学的に作製した。上記ヒトＶκ２−３０遺伝子セグメントの上流（５’側）には、上記の２つのターゲティングベクターに用いた同じ５’側ホモロジーである、マウス５’側ホモロジーアームの始点の前に、さらなる１４，６８７ｂｐのヒトκ配列が存在した（上に記載した、図２もまた参照されたい）。上記５’側ホモロジーアームと上記ヒトκ配列の開始部との間には、リコンビナーゼ認識部位が隣接するネオマイシンカセットが存在した。上記３’側ホモロジーアームは、ターゲティングベクター２のヒトゲノムκ配列の約１４０ｋｂの断片と同等の５’端に対応する、ヒトゲノムκ配列の２１，２７５ｂｐの重複を包含した（図２０）。１４のさらなるヒトＶκ遺伝子セグメントを挿入するための最終のターゲティングベクターは、５’側から３’側のへ、上記マウス重鎖遺伝子座の５’側に約２０ｋｂのマウスゲノム配列を含有する５’側ホモロジーアーム、第１のリコンビナーゼ認識部位（Ｒ１）、ネオマイシンカセット、第２のリコンビナーゼ認識部位（Ｒ２）、およびそのうちの約２１ｋｂが、ターゲティングベクター２のヒトκ配列の５’端と重複し、このターゲティング構築物のための３’側ホモロジーアームとして働く、１５のヒトＶκ遺伝子セグメントを含有する、約１６１ｋｂのヒトゲノムκ配列を包含した。このターゲティングベクターで相同組換えすることにより、組み換えられるとキメラκ重鎖の形成をもたらす、上記マウス重鎖定常遺伝子に作動可能に連結した３０のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含有する、改変されたマウス重鎖遺伝子座を創製した。
【０５１１】
１０のさらなるヒトＶκ遺伝子セグメントのハイブリッド重鎖遺伝子座への導入：１０のさらなるヒトＶκ遺伝子セグメントを、上記で記載した改変されたマウス重鎖遺伝子座へと導入するために、第４のターゲティングベクターを工学的に作製した（図２のターゲティングベクター４）。１６の連続するヒトＶκ遺伝子セグメントを含有する、９０，３９８ｂｐのヒトゲノム断片を、上記マウス重鎖遺伝子座の５’側にマウスゲノム配列を含有する５’側ホモロジーアームおよびヒトゲノムκ配列を含有する３’側ホモロジーアームで工学的に作製した。上記ヒトＶκ２−４０遺伝子セグメントの上流（５’側）には、上記のターゲティングベクターと同じ５’側ホモロジーである、マウス５’側ホモロジーアームの始点の前に、さらなる８，４８４ｂｐのヒトκ配列が存在した（上に記載した、図２）。上記５’側ホモロジーアームと上記ヒトκ配列の開始部との間には、リコンビナーゼ認識部位が隣接するハイグロマイシンカセットが存在した。上記３’側ホモロジーアームは、ターゲティングベクター３のヒトゲノムκ配列の約１６０ｋｂの断片と同等の５’端に対応する、ヒトゲノムκ配列の６１，６１５ｂｐの重複を包含した（図２）。１０のさらなるヒトＶκ遺伝子セグメントを挿入するための最終のターゲティングベクターは、５’側から３’側への、上記マウス重鎖遺伝子座の５’側に約２０ｋｂのマウスゲノム配列を含有する５’側ホモロジーアーム、第１のリコンビナーゼ認識部位（Ｒ１）、ハイグロマイシンカセット、第２のリコンビナーゼ認識部位（Ｒ２）、およびそのうちの約６２ｋｂが、ターゲティングベクター３のヒトκ配列の５’端と重複し、このターゲティング構築物のための３’側ホモロジーアームとして働く、１６のヒトＶκ遺伝子セグメントを含有する、約９０ｋｂのヒトゲノムκ配列を包含した。このターゲティングベクターで相同組換えすることにより、組み換えられるとキメラκ重鎖の形成をもたらす、上記マウス重鎖定常遺伝子に作動可能に連結した４０のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含有する、改変されたマウス重鎖遺伝子座を創製した（図２の下図）。
【０５１２】
上記で記載したのと同様の手法を用いて、マウス重鎖定常領域との関係でヒト軽鎖可変ドメイン他の組合せを構築する。さらなる軽鎖可変ドメインは、ヒトＶλ遺伝子セグメントおよびヒトＪλ遺伝子セグメントに由来し得る（図３および図４）。
【０５１３】
上記ヒトλ軽鎖遺伝子座は、１，０００ｋｂを超えて広がり、可変（Ｖ）セグメントまたは連結（Ｊ）セグメントをコードする、８０を超える遺伝子を含有する。公表された報告によれば、上記ヒトλ軽鎖遺伝子座のうちの７０のＶλ遺伝子セグメントでは、３０〜３８のいずれかの数のものが機能的な遺伝子セグメントであると考えられている。上記７０のＶλ配列は、その全てが異なるＶ遺伝子ファミリー群の異なるメンバーを含有する３つのクラスター（クラスターＡ、Ｂ、およびＣ）に整理されている。上記ヒトλ軽鎖遺伝子座内では、全ての観察されるＶλドメインの過半が、遺伝子セグメント１−４０、１−４４、２−８、２−１４、および３−２１によりコードされている。存在する７つのＪλ遺伝子セグメントのうち、４つだけが、一般に機能的なＪλ遺伝子セグメント（Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、およびＪλ７）と考えられている。一部の対立遺伝子では、第５のＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対が、偽遺伝子（Ｃλ６）であると報告されている。複数のヒトＪλ遺伝子セグメントの、本明細書で記載されるハイブリッド重鎖遺伝子座への組込みは、新規の合成により構築される。このように、生殖細胞系配置（ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）において複数のヒトＪλ遺伝子セグメントを含有するゲノム断片を、複数のヒトＶλ遺伝子セグメントで工学的に作製すると、重鎖定常領域との関係で正常なＶ−Ｊ組換えが可能となる。
【０５１４】
軽鎖可変ドメインの重鎖定常領域との結合は、非ヒト動物においてヒトＶＬ領域を有する固有のＶＬ結合タンパク質を生成させるための潜在的に豊富な多様性のある供給源を表す。マウスにおいて上記ヒトλ軽鎖遺伝子座（または上記で記載したヒトκ遺伝子座）のこの多様性を利用することにより、固有のハイブリッド重鎖の工学的作製が結果としてもたらされ、遺伝子改変動物の免疫レパートリーにとって別次元の結合タンパク質がもたらされ、治療剤の産出ための次世代のプラットフォームとしてのそれらのその後の使用がもたらされる。
【０５１５】
加えて、ヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ（またはＪκ）遺伝子セグメントを、ヒトＶκ遺伝子セグメントまたはヒトＶλ遺伝子セグメントとともに取り込ませて、組み換えられると工学的に作製された新規の可変ドメインをもたらす新規のハイブリッド遺伝子座を構築することもできる（図５および図６）。この後者の場合、通常は単一の遺伝子座に含有されない遺伝子セグメントの組合せを工学的に作製すれば、それらを単一の遺伝子座へと組み合わせるときに正常な組換えを達成し得るように、それぞれの遺伝子セグメントと関連する組換えシグナル配列（ＲＳＳ）に対する特別の注意が必要となる。例えば、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えは、組換えが生じる正確な位置において各遺伝子セグメントに隣接して見出されるヘプタマー配列およびノナマー配列として公知である保存された非コードＤＮＡ配列により誘導されることが公知である。これらの非コードＤＮＡ配列の間には、１２または２３塩基対（ｂｐ）の長さである非保存のスペーサー領域が存在する。一般に、組換えは、同じ染色体に位置する遺伝子セグメントだけで生じ、１２ｂｐのスペーサーが隣接するこれらの遺伝子セグメントは、２３ｂｐのスペーサーが隣接する遺伝子セグメントに連結し得る（すなわち１２／２３ルール）が、抗体のうちのごく一部では、２つのＤＨ遺伝子セグメント（各々に１２ｂｐのスペーサーが隣接する）の連結も観察されている。通常では適合性のスペーサーを有さない遺伝子セグメント間における組換え（例えば、ＶκとＤＨとの間における組換え、またはＤＨとＪλとの間における組換え）を可能とするには、軽鎖可変領域を含有する固有の重鎖を形成するための組換えの成功を可能とする固有のハイブリッド重鎖を構築するために所望される遺伝子セグメントと隣接する位置に、固有の適合性のスペーサーを合成する。
【０５１６】
したがって、ヒトκ軽鎖遺伝子セグメントを、内因性重鎖遺伝子座へと組み込むために、上記で概括された戦略を用いることにより、他のヒトλ軽鎖遺伝子セグメントの組合せ、ならびに特定のヒト重鎖遺伝子セグメント（例えば、ＤＨ遺伝子セグメントおよびＪＨ遺伝子セグメント）およびこれらの組合せの使用が可能となる。
【０５１７】
（実施例２）
標的とされたＥＳ細胞の同定および内因性重鎖遺伝子座にヒト軽鎖遺伝子セグメントを保有する遺伝子改変されたマウスの作製
マウスＥＳ細胞を電気穿孔して、ＶＬ結合タンパク質（すなわち、マウス重鎖定常領域に作動可能に連結したヒトκ軽鎖遺伝子セグメント）を発現するキメラマウスを生成するための、改変されたＥＳ細胞を創製するのに、上記の実施例で作製した、標的ＢＡＣ  ＤＮＡを用いる。再配列していないヒトκ軽鎖遺伝子セグメントの挿入を含有する、標的とされたＥＳ細胞は、定量的ＰＣＲアッセイであるＴＡＱＭＡＮ（登録商標）により同定される（Ｌｉｅ，Ｙ．Ｓ．およびＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．（１９９８年）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ５’
ｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９（１）：４３〜４８頁）。ヒトκ配列および関連する選択カセットの挿入、マウス重鎖配列の喪失、および、内因性重鎖遺伝子座に隣接するマウス配列の保持を検出するために、特異的なプライマーセットおよびプローブをデザインする。
【０５１８】
ヒトκ遺伝子セグメントを含有するターゲティング構築物の挿入により導入される任意の所望されない選択カセットを除去するために、上記ヒトκ軽鎖遺伝子セグメントを保有するＥＳ細胞を、リコンビナーゼを発現する構築物でトランスフェクトすることができる。必要に応じて、上記ヒトκ軽鎖遺伝子セグメントを含有する操作された重鎖遺伝子座を有するマウスは、例えば、ＥＳ細胞期に、または胚において除去されないターゲティングベクターにより導入されたいかなるＦｒｔカセットも除去するために、ＦＬＰｅディリーター（ｄｅｌｅｔｏｒ）マウス系統（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｃ．Ｉ．ら（２０００）Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｄｅｌｅｔｏｒ  ｍｉｃｅ  ｓｈｏｗ  ｔｈａｔ
ＦＬＰｅ  ｉｓ  ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２５：１３９−１４０；米国特許第６，７７４，２７９号参照）へ交配させることができる。必要に応じて、上記選択カセットは、上記マウスにおいて保持される。
【０５１９】
上記の標的としたＥＳ細胞を、ドナーＥＳ細胞として用い、上記ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法（上掲）によって８細胞期マウス胚へ導入する。マウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結したヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを有する改変重鎖遺伝子座を有するマウスを、カセット配列、該ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメント、および内因性重鎖配列の存在および／または非存在を検出した改変型の対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上掲）を用いるジェノタイピングにより同定する。
【０５２０】
仔をジェノタイピングし、免疫グロブリン重鎖レパートリーを特徴づけるために、内因性マウス免疫グロブリン重鎖定常遺伝子に作動可能に連結したヒトκ軽鎖遺伝子セグメントを含有する改変重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性の仔を選択する。
【０５２１】
（実施例３）
ＶＬ結合タンパク質を発現するマウスの増殖
ＶＬ結合タンパク質の新規の生成を創出するために、上記再配列していないヒトκ遺伝子セグメントを保有するマウスを、反対側の（ｏｐｐｏｓｉｔｅ）または標的としていない内因性重鎖対立遺伝子（すなわち、上記改変についてヘテロ接合性のマウス）の欠失を含有する別のマウスに交配させることができる。このようにすれば、得られる後代は、実施例１で記載したハイブリッド重鎖だけを発現する。交配は、当技術分野において認められている標準的な技法により実施するが、代替的には、企業、例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより実施される。改変された
重鎖遺伝子座を保有するマウス系統を、ヒト軽鎖可変ドメインを含む固有の重鎖の存在についてスクリーニングする。
【０５２２】
代替的に、上記マウス重鎖遺伝子座において、上記再配列していないヒトκ遺伝子セグメントを保有するマウスは、上記マウス軽鎖遺伝子座（κおよびλ）に１つまたは複数の欠失を含有する他のマウスに交配させることにより、最適化することができる。このようにすれば、得られる後代は、実施例１で記載した固有のヒトκ重鎖抗体だけを発現する。交配は、当技術分野において認められている標準的な技法により同様に実施するが、代替的には、企業、例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより実施される。改変重鎖遺伝子座および１つまたは複数の上記マウス軽鎖遺伝子座の欠失を保有するマウス系統を、ヒトκ軽鎖ドメインおよびマウス重鎖定常ドメインを含有する固有の重鎖の存在ならびに内因性軽鎖の非存在についてスクリーニングする。
【０５２３】
また、（上記の）改変された重鎖遺伝子座を保有するマウスを、上記内因性κ軽鎖可変遺伝子遺伝子座の、ヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座による置き換え（ＵＳ６，５９６，５４１、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス技術（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を参照されたい）を含有するマウスとも交配させる。抗原刺激に対する反応により、上記マウスが、ヒトκ軽鎖可変ドメインおよびマウス重鎖定常ドメインを含む抗体を生成するように、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍｏｕｓｅ）は、部分的に、内因性κ軽鎖可変定常領域遺伝子座に作動可能に連結する、ヒトκ軽鎖可変領域を含むゲノムを有することを包含する。上記抗体の軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡは、単離して、上記ヒト軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに作動可能に連結することができる。次いで、上記ＤＮＡを、上記抗体の完全ヒト軽鎖を発現することが可能である細胞において発現させることができる。適切な交配スケジュールでは、実施例１による、上記内因性κ軽鎖の、上記ヒトκ軽鎖遺伝子座による置き換え、および改変された重鎖遺伝子座を保有するマウスが得られる。対象の抗原で免疫して、体細胞変異したヒトＶκドメインを含有する固有のＶＬ結合タンパク質を単離することができる。
【０５２４】
（実施例４）
【０５２５】
ＡＤＡＭ遺伝子の改変重鎖遺伝子座への再操作（ｒｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）
内因性可変領域遺伝子セグメント（すなわち、ＶＤＪ）が置き換えられている、および／または欠失している改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウスは、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子の発現を欠く。特に、上記免疫グロブリン重鎖遺伝子座のそのような改変を含む雄マウスは、妊性の低減を明らかに示す。この実施例は、実施例１による改変重鎖遺伝子座を有するマウスへＡＤＡＭ６を発現する能力を再操作する（ｒｅｅｎｇｉｎｅｅｒ）ための２つの方法を明らかに示し、それにしたがって、通常の育種方法を用いて該改変マウス系統の維持を可能にする。
【０５２６】
ヒト軽鎖遺伝子セグメント内でのＡＤＡＭ６遺伝子の再操作。
ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含有する改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を、ＢＡＣ  ＤＮＡを用いる相同組換えにより、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂをコードするゲノム断片を含有するように再操作した。これは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子に近接したヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントならびにマウス重鎖定常領域を含有する最終ターゲティングベクターを生じる、マウスおよびヒト配列を含有するＢＡＣ  ＤＮＡの改変を含む一連の６工程においてＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作テクノロジー（上掲）によって達成された。
【０５２７】
５’から３’へ、固有の制限部位（Ｉ−ＣｅｕＩ）、マウスＡｄａｍ６ａおよびＡｄａｍ６ｂ遺伝子、ＩＧＣＲ１制御エレメント（Ｇｕｏら、２０１１）、免疫グロブリンＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメント、Ｅμエンハンサー、ならびにＩｇＭ定常領域遺伝子を含有するマウスＢＡＣクローン（ＶＩ１４９）を、ＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントを含有する改変重鎖遺伝子座へのＡＤＡＭ６遺伝子の再操作のための出発材料として用いた（図７）。ＶＩ１４９を、細菌相同組換え（ＢＨＲ）により改変して、上記ＢＡＣの最も遠位のＤセグメント（ＤＦＬ１６．１）の５’側の約５３ｂｐから３’末端までの、上記ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントならびに上記ＩｇＭ遺伝子の全部を欠失させた。この領域を、その５’末端に固有ＡｓｃＩ部位を含有するスペクチノマイシン耐性カセット（ｐＳＶｉ００２９）によって置き換えて、ＢＡＣクローンＶＩ４１３を生じた。
【０５２８】
追加のＢＨＲ改変を行って、マウスＡｄａｍ６ａおよびＡｄａｍ６ｂ遺伝子、ならびにＩＧＣＲ１エレメントを含有するＢＡＣクローンを創製した。固有のＩ−ＣｅｕＩ（５’）およびＡｓｃＩ（３’）制限部位を有するＦｒｔネオマイシン耐性カセット（ｐＬＭａ０２９４）で、Ａｄａｍ６ａとＡｄａｍ６ｂの間の４７１９９ｂｐを置き換えることにより、第１のＢＡＣクローンを創製した。この欠失は、Ａｄａｍ６ｂ  ＣＤＳの３’側の４７７９ｂｐからＡｄａｍ６ｂ  ＣＤＳの５’側の２９０ｂｐまでの領域にわたった。生じたＢＡＣクローンをＶＩ４２１と名付けた。同じＦｒｔカセットを、ＶＩ４１３において、Ａｄａｍ６ａとＡｄａｍ６ｂの間のＡｄａｍ６ａ  ＣＤＳの３’側の４７８２ｂｐの位置に挿入することにより第２のＢＡＣクローンを創製して、ＶＩ４２２を生じた。
【０５２９】
上記ＶＩ４２１  ＢＡＣクローンは、５’から３’へ、固有のＩ−ＣｅｕＩ部位、上記ＣＤＳの５’側の７５１ｂｐおよび３’側の４７７９ｂｐを含むＡｄａｍ６ａ、Ｆｒｔネオマイシン耐性カセット、上記ＣＤＳの５’側の２９０ｂｐおよび３’側の７３２０ｂｐを含むＡｄａｍ６ｂ、ＩＧＣＲ１、および固有のＡｓｃＩ部位を含有した（配列番号３）。
【０５３０】
上記ＶＩ４２２  ＢＡＣクローンは、５’から３’へ、固有のＩ−ＣｅｕＩ部位、上記ＣＤＳの５’側の７５１ｂｐおよび３’側の４７７９ｂｐを含むＡｄａｍ６ａ、Ｆｒｔハイグロマイシン耐性カセット、上記ＣＤＳの５’側の４７４９０ｂｐおよび３’側の７３２０ｂｐを含むＡｄａｍ６ｂ、ＩＧＣＲ１、および固有のＡｓｃＩ部位を含有した（配列番号４）。
【０５３１】
ＡＤＡＭ６遺伝子の再操作を、実施例１に記載されているように、ＶＩ４２１およびＶＩ４２２の、ターゲティングベクター１の改変型（図２）の遺伝子間領域への挿入により達成した。ターゲティングベクター１を２つのＢＨＲ工程により改変して、ＶＩ４２１およびＶＩ４２２からマウスＡＤＡＭ６断片を挿入した。第１のＢＨＲ工程について、ターゲティングベクター１からネオマイシンカセットを、ハイグロマイシンカセット（ｐＬＭａ０１００）を用いて欠失させた。生じたＢＡＣクローンをＶＩ４２５と名付け、それは、５’から３’へ、ハイグロマイシン耐性カセット、４個の最も近位のヒトＶκセグメント、２３，５５２ｂｐのＶκ−Ｊκ遺伝子間領域、および全部の５個のヒトＪκセグメントを含有し、そのヒトＪκセグメントは、マウスＥμエンハンサーおよびＩｇＭ定常領域遺伝子を含有する８ｋｂの３’マウスホモロジーアームに機能的に連結している。第２のＢＨＲについて、Ｖκ−Ｊκ遺伝子間領域内の７４０ｂｐを、固有のＩ−ＣｅｕＩおよびＡｓｃＩ制限部位が隣接したクロラムフェニコール耐性カセット（ｐＤＢａ００４９；図８）で置き換えてＶＩ４２５を改変した。その７４０ｂｐ欠失の位置は、最も近位のヒトＶκ遺伝子セグメント（Ｖκ４−１）の３’側の１６，８５８ｂｐから１７，５９７ｂｐまでであった。両方のＢＨＲから生じたＢＡＣクローンをＶＩ４２６と名付けた（図８）。
【０５３２】
ＶＩ４２１およびＶＩ４２２由来のマウスＡＤＡＭ６遺伝子を含有するＤＮＡ断片を独自に用いて、ＶＩ４２６のクロラムフェニコールカセットをＩ−ＣｅｕＩ／ＡｓｃＩ消化および適合性末端の再ライゲーション（ｒｅｌｅｇａｔｉｏｎ）によって置き換えた。図８は、それぞれＶＩ４２９およびＶＩ４２８と名付けられた、最終ターゲティングベクターを示す。実施例１に従って改変された固有の重鎖遺伝子座での組換えおよびマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードするＤＮＡ断片の挿入を可能にするように（実施例１に記載されているような；図２参照）ターゲティングベクター４で前もって改変されたＥＳ細胞へと、それぞれを用いて電気穿孔した。陽性コロニーを、ネオマイシンを用いて選択した。
【０５３３】
ヒト軽鎖遺伝子セグメントに隣接するＡＤＡＭ６の再操作
すべての上記内因性重鎖定常領域の上流に位置するヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含有する改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を、ＢＡＣ  ＤＮＡを用いる相同組換えにより、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂをコードするゲノム断片を含有するように再操作した。これは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子に近接したヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントならびにマウス重鎖定常領域を含有する最終ターゲティングベクターを生じる、マウスおよびヒト配列を含有するＢＡＣ  ＤＮＡの改変を含む一連の工程においてＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作テクノロジー（上掲）によって達成された。
【０５３４】
実施例１に従って作製されたターゲティングベクター４（図２および図９の上図を参照）を、Ｆｒｔハイグロマイシンカセットを、固有のＡｓｃＩ（５’）およびＩ−ＣｅｕＩ（３’）制限部位を含有するクロラムフェニコールカセット（ｐＬＭａ０２３１；図９）で置き換えるようにＢＨＲにより改変した。ターゲティングベクター４は、５’から３’へ、約２０ｋｂマウス遠位ＩｇＨホモロジーアーム、Ｆｒｔハイグロマイシン耐性カセット、およびヒトＶκ２−４０〜ヒトＶκ３−２５遺伝子セグメントを含有した。
【０５３５】
次に、ＶＩ４４４と名付けられたＢＡＣクローンを用いて、ＡｓｃＩ／Ｉ−ＣｅｕＩ消化および適合性末端の再ライゲーション（ｒｅｌｅｇａｔｉｏｎ）によって、ＶＩ４７７
ＢＡＣクローンのヒトＶκ遺伝子セグメントの５’側の位置にマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードするＤＮＡ断片を挿入した。上記ＶＩ４４４クローンは、５’から３’へ、固有のＩ−ＣｅｕＩ部位、上記ＣＤＳの５’側の７５１ｂｐおよび３’側の４７７９ｂｐを含むＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ｆｒｔネオマイシン耐性カセット、上記ＣＤＳの５’側の２９０ｂｐおよび３’側の１６３３ｂｐを含むＡｄａｍ６ｂ遺伝子、ならびに固有のＡｓｃＩ部位を含有した（配列番号５）。ヒトＶκ遺伝子セグメントの上流のマウスＡＤＡＭ６遺伝子の挿入のためのターゲティングベクターとして用いられた、結果として生じたＢＡＣクローンを、ＶＩ４７８と名付け、ＶＩ４２１およびＶＩ４２２とは対照的に、ＶＩ４７８においてマウスＡＤＡＭ６遺伝子は逆配向に置かれている（すなわち、ヒトＶκ遺伝子セグメントに対して同じ転写方向；図９）。上記ヒトＶκ遺伝子セグメントの遠位末端におけるマウスＡＤＡＭ６遺伝子の挿入のための最終ターゲティングベクターは、５’から３’へ、約２０ｋｂのマウス遠位ＩｇＨホモロジーアーム、固有のＡｓｃＩ部位、マウスＡｄａｍ６ｂ、Ｆｒｔネオマイシン耐性カセット、マウスＡｄａｍ６ａ、固有のＩ−ＣｅｕＩ部位、およびヒトＶκ２−４０〜ヒトＶκ３−２５遺伝子セグメントを含有した。実施例１に従って改変された固有の重鎖遺伝子座での組換えおよびマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードするＤＮＡ断片の挿入を可能にするようにターゲティングベクター４（図２）で前もって改変されたＥＳ細胞へと、このターゲティングベクターを用いて電気穿孔した。陽性コロニーを、ネオマイシンを用いて選択した。
【０５３６】
標的とされたＥＳ細胞の選択および確認
（上記の）最終ターゲティングベクターのそれぞれを用いて、マウスＥＳ細胞を電気穿孔し、ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含有する改変重鎖遺伝子座内にマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列を含む、異所性に配置されたマウスゲノム配列を含む改変ＥＳ細胞を創製した。上記改変重鎖遺伝子座内に異所性マウスゲノム断片を含有する陽性ＥＳ細胞を、ＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブを用いる定量的ＰＣＲアッセイにより同定した（ＬｉｅおよびＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ（１９９８）、上掲）。
【０５３７】
上に記載した標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）マウスの工学的作製方法（例えば、米国特許第７，６５９８，４４２号、同第７，５７６，２５９号および同第７，２９４，７５４号参照）により８細胞期マウス胚に導入した。ヒトκ軽鎖遺伝子セグメントならびにマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列を含む異所性マウスゲノム配列を含有する改変重鎖遺伝子座を保有するマウスを、該改変重鎖遺伝子座ならびにヒトκ軽鎖配列内のマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子の存在を検出する対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３）の改良法を用いる遺伝子型解析によって同定した。
【０５３８】
子を遺伝子型解析し、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列を含む異所性マウスゲノム断片を含有する改変重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性の子を、マウスＡＤＡＭ６遺伝子発現および妊性の特徴づけのために選択した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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