(57)【要約】      （修正有）【課題】サイレージ接種材料の安定性およびサイレージの好気的安定性を改善するための方法の提供。【解決手段】サイレージに、サイレージ保存有効量のラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)を含むサイレージ接種材料を添加する工程を含むサイレージを処理する方法が提供される。好気的変敗を防ぐか、または低減するのに有効であるサイレージ接種材料。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイレージ保存有効量のラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)を含むサイレージ接種材料。
【請求項２】
ラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)は、２０１３年６月２６日に提出された受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４７８４を有するラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)ＳＩＬ５１株および２０１３年６月２６日に提出された受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４７８５を有するラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)ＳＩＬ５２株のうち少なくとも１種またはそれらの遺伝的等価物である、請求項１に記載のサイレージ接種材料。
【請求項３】
サイレージに、サイレージ保存有効量のラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)を含むサイレージ接種材料を添加する工程を含む方法であって、サイレージ接種材料は、好気的変敗を防ぐかまたは低減するのに有効である、サイレージを処理するための方法。
【請求項４】
ラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)は、２０１３年６月２６日に提出された受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４７８４を有するラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)ＳＩＬ５１株および２０１３年６月２６日に提出された受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４７８５を有するラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)ＳＩＬ５２株のうち少なくとも１種またはそれらの遺伝的等価物である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
サイレージは、伝統的な草、トウモロコシ(maize)、ムラサキウマゴヤシ、しおれた草、穀草類またはサトウキビサイレージである、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
サイレージは、ベール、バッグ、バンカー、スティブサイロまたはサイロの中にある、請求項３〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
サイレージ保存有効量のラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)を含むサイレージ。
【請求項８】
ラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)は、２０１３年６月２６日に提出された受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４７８４を有するラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)ＳＩＬ５１株および２０１３年６月２６日に提出された受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４７８５を有するラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)ＳＩＬ５２株のうち少なくとも１種またはそれらの遺伝的等価物である、請求項７に記載のサイレージ。
【請求項９】
２０１３年６月２６日に提出された受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４７８４を有するラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)ＳＩＬ５１株またはそれらの遺伝的等価物の分離株。
【請求項１０】
２０１３年６月２６日に提出された受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４７８５を有するラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)ＳＩＬ５２株またはそれらの遺伝的等価物の分離株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイレージ(silage)に関する。より詳しくは、サイレージ接種材料およびサイレージの好気的安定性を増強するためにサイレージ接種材料を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイレージとは、ウシおよびヒツジのような反芻(cud-chewing)動物などの反芻動物(ruminant)に給餌される発酵した高水分飼料である。サイレージは、保存サイロ、生牧草貯蔵法（エンシレージ：ensilage）と呼ばれるプロセスにおいて、発酵され、保存される。サイレージは、草またはドクムギ、アルファルファ、フェスク、トウモロコシ（トウモロコシ(maize)）もしくはモロコシを含めた穀草類から作られることが最も多い。サイレージは、植物全体またはその一部から作られる。サイレージはまた、サトウキビを含め多数のその他の農作物から作られることもあり、これが行われる場合には、例えば、カラスムギのオートレージ、アルファルファのヘイレージなどのその他の名前が使用されることもある。カラスムギおよびエンドウマメなどの混合物が使用されることもある。
【０００３】
サイレージの製造および関連する作物栽培は、ここ数年、いくつかの異なるプロセスが規定され得る程度に発達した。これらは、(i)特に低乾燥物質、例えば、２５％未満を有する若い草のサイロ貯蔵、(ii)より高い乾燥物質、より成熟した草のサイロ貯蔵またはしおれ(wilting)によって達成される高乾燥物質であるが若い草のサイロ貯蔵および(iii)通常、約３５％の乾燥物質濃度のトウモロコシの茎葉およびトウモロコシの穂軸を含む全トウモロコシおよび４５〜５０％の乾燥物質の全穀草類、例えば、コムギ全体のサイロ貯蔵である。
【０００４】
これらのプロセスは、一般に、良好な収率をもたらすが、問題がないわけではない。特に、(ii)および(iii)の場合には、１つの大きな問題が定期的に起こる。これは、好気的変敗(spoilage)として知られる現象である。好気的変敗のプロセスは、サイロの開放時、材料が空気に曝される場合に起こり、特定の相(phase)に分けることができる。
第１に、酵母および時には酢酸菌（acetic acid bacteria）が貯蔵有機酸を吐出し(respire)始め、サイレージｐＨが上昇し、温度が上がり始める最初の相がある。最初のｐＨ上昇後、第２の相があり、この相では桿菌の活性が顕著であり温度の上昇と関連している。さらなる相は、真菌を含めた種々の微生物の活性を含む。
【０００５】
相当な含量の乾燥物質、すなわち、３０％を超えるものを含有するサイレージでは、変敗の問題は特に重大である。サイレージクランプが開けられ、サイレージが空気に曝されると、変敗は多かれ少なかれ見られる。
【０００６】
サイレージプロセスを改善するために、主に、乳酸製造の程度および速度を増大し、好気的変敗に対して保護するために、細菌接種材料などの生物学的添加物が広く使用されてきた。Ｍａｎｎらの特許文献１は、この状態を改善するための方法および組成物を提供している。特に、その少なくとも幾分かの記載は、好気的変敗プロセスが、空気の侵入に対する曝露時のクランプにおける加熱と密接に関連していると認定することに基づいている。このようなサイレージのその後の試験は、高濃度の、桿菌、酵母およびカビを含めた好熱性グラム陽性菌を示した。これは、堆肥化のものと類似している二次発酵の開始を明らかに実証する（一次発酵は、サイロ貯蔵プロセスである）。この発酵段階では、酵母およびカビが優勢である。変敗を防ぐために、死滅されるか、抑制される必要がある３つの主なカテゴリーの生物として、胞子形成細菌、酵母および真菌(fungi)があると思われる。１つのカテゴリーのみを排除することは、残りのカテゴリーの増殖につながる可能性があり、その結果、変敗は防がれない。
【０００７】
したがって、Ｍａｎｎは、少なくともまず第１に、好気的変敗を開始する微生物(特に、酵母および、サイレージの表面における真菌)を阻害する処理生物を使用することによる変敗防止を教示している。これを行うことができる生物はまた、その他の変敗微生物の発達を阻害し得、スクリーニングによって同定され得る。この必要条件を満たす種ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)の生物は、１９９６年２月１３日にNational Collection of Industrial and Marine Bacteriaに寄託された。受託番号は、４０７８８である。
【０００８】
ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)を使用する処理は、サイレージにおける変敗を低減するが、該処理は制限された程度にだけ行われる。したがって、特に、回収される乾燥物質の量を増大しながらサイレージの好気的安定性を改善するための改善サイレージ処理の必要性が残る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第６，３２６，０３７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上述した従来技術の問題に鑑み、サイレージ接種材料の安定性およびサイレージの好気的安定性を改善するための方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一態様では、サイレージを処理するための方法が提供される。該方法は、サイレージに、サイレージ保存有効量のラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)を含むサイレージ接種材料（inoculant）を添加する工程を含む。サイレージ接種材料は、好気的変敗を防ぐか、または低減するのに有効である。
【００１２】
別の態様では、サイレージ保存有効量のラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)を含むサイレージ接種材料が提供される。
【００１３】
サイレージ接種材料の一態様では、サイレージ接種材料は、担体(carrier)をさらに含む。
【００１４】
さらなる態様では、サイレージ保存有効量のラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)を含むサイレージが提供される。
【００１５】
本方法の一態様では、サイレージ接種材料およびサイレージ中の、ラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)は、２０１３年６月２６日に提出された受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４７８４を有するラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)ＳＩＬ５１株および２０１３年６月２６日に提出された受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４７８５を有するラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)ＳＩＬ５２株のうち少なくとも１種またはそれらの遺伝的等価物である。前記の株は、Lallemand SAS 19 rue des Briquettiers、31702 Blagnac Cedex、Franceによって寄託されている。
【００１６】
本方法の一態様では、サイレージ接種材料は、担体をさらに含む。
【００１７】
なおさらなる態様では、２０１３年６月２６日に提出された受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４７８４を有するラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)ＳＩＬ５１株の分離株またはその遺伝的等価物が提供される。
【００１８】
別の態様では、２０１３年６月２６日に提出された受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４７８５を有するラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)ＳＩＬ５２株の分離株またはその遺伝的等価物が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書によれば、サイロ貯蔵された飼料の好気的安定性を改善する乳酸菌を単離し、精製した。より詳しくは、ラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)が、サイレージの好気的安定性を増強することが示された。さらに、ラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)株は、サイレージに接種された場合に、良好に保存されるサイレージを製造し、該サイレージ中では、好気的変敗および加熱を伴う二次発酵の発生が低減されるか、または防がれる。
【００２０】
本発明の株は、サトウキビ（サトウキビ属(Saccharum)の種）サイレージから単離された。株の精製および単離後、分類学的研究を行い、株を同定した。それらのうち２種を、ラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)と同定し、プロトタイプ番号ＳＩＬ５１株およびＳＩＬ５２株を与えた。
【００２１】
したがって、本発明は、サイレージ接種材料およびサイレージの好気的安定性を増強するためのサイレージ接種材料の使用方法を提供する。
【００２２】
用語「サイレージ保存有効量」とは、本明細書および特許請求の範囲において、サイレージを保存するのに少なくとも十分である量を指すと理解されよう。したがって、この量は、サイレージの安定性を改善するのに少なくとも十分であり、好ましくは、回収される乾燥物質の量を増大しながらサイレージの安定性を改善するのに十分な量である。
【００２３】
用語「好気的安定性」とは、本明細書および特許請求の範囲において、周囲温度よりも２℃超上がる前にサイレージの温度が安定のままであった時間数を指すと理解される。
【００２４】
ここで、本明細書に記載される実施形態に言及する。本開示の範囲の制限は、それによって何ら意図されないということが理解される。本開示が関連する技術分野の当業者に通常起こるように、本開示は、例示される実施形態の任意の変法および改変を含み、本開示の原理のさらなる適用を含むということはさらに理解される。
【００２５】
一実施形態では、サイレージを処理する方法が提供される。該方法は、サイレージに、サイレージ保存有効量のラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)を含むサイレージ接種材料を添加する工程を含む。有効であるサイレージ接種材料は、好気的変敗を防ぐか、または低減する。
【００２６】
また、ラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)の少なくとも１種の株を含むサイレージ接種材料も提供される。より詳しくは、サイレージ接種材料は、サイレージ保存有効量のラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)種を含む。
【００２７】
上記の方法およびサイレージ接種材料の一実施形態では、ラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)の株は、２０１３年６月２６日に提出されたラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)の分離株ＣＮＣＭ  Ｉ−４７８４（ＳＩＬ５１）、２０１３年６月２６日に提出されたＣＮＣＭ  Ｉ−４７８５（ＳＩＬ５２）またはそれらの遺伝的等価物であり得る。本明細書に記載されるような飼料の好気的安定性を改善する機能活性を保持する、２０１３年６月２６日に提出された株ＣＮＣＭ  Ｉ−４７８４（ＳＩＬ５１）および２０１３年６月２６日に提出されたＣＮＣＭ  Ｉ−４７８５（ＳＩＬ５２）の突然変異体または遺伝的等価物も考慮されるということは理解される。
【００２８】
突然変異体または遺伝的等価物については、これらが誘導される方法に関わらず、重要な点は、親の種および／または株について述べられるように、それらがサイレージの好気的安定性を改善するよう機能するということである。言い換えれば、本発明は、例えば、微小な分類学上の変更のような微小変化をもたらす突然変異体を含む。
【００２９】
本発明のサイレージ接種材料は、液体または固体形態のいずれかであり得、さらなる細菌株を含み得る。本発明のサイレージ接種材料は、適した担体を含んでもよく、そのままで使用されてもよい。サイレージ接種材料は、固体形態では、固体担体を含み得る。適した担体は、水性もしくは非水性液体形態であっても、固体形態であってもよい。水性または非水性液体形態担体の例として、水、オイルおよびパラフィンが挙げられる。固体形態担体の例として、有機または無機担体、例えば、マルト−デキストリン、デンプン、炭酸カルシウム、セルロース、ホエイ、粉砕トウモロコシ穂軸および二酸化ケイ素などが挙げられる。固体組成物は、軽い粉末散布の形態で飼料に直接適用されてもよく、または、液体担体中に分配される場合には、飼料上に上手く噴霧され得る。本発明の目的上、任意のその他の適した担体が使用され得るということは理解される。
【００３０】
該阻害物質は、二次代謝産物であり得るようである。したがって、これをサイレージに使用した場合に、サイロを開くのが早過ぎると、その十分な効果が見られない場合がある。サイレージは、少なくとも３０日間、より好ましくは、少なくとも４５日間、閉じて維持されることが好ましい。最適期間は、とりわけ、サイレージ塊の大きさおよびサイロ貯蔵された材料の性質に応じて変わり得る。。
【００３１】
本発明に一致するサイロ貯蔵に適した材料とは、好気的変敗に感受性（susceptible）のものである。該材料は、通常、少なくとも２０重量％の乾燥物質を含有する。このような材料として、例えば、ライムギまたは伝統的な草、高水分トウモロコシ、トウモロコシ全植物体を含めたトウモロコシ(maize)、ムラサキウマゴヤシ、しおれた草、コムギ、マメ科植物、モロコシ、ヒマワリ、オオムギ、その他の全穀草類およびサトウキビなどのその他の農作物が挙げられる。サイレージは、ベール（好気的変敗に対して特に感受性の形態）、酸素制限バッグ、バンカー、縦型スティブサイロ、酸素制限サイロ、バッグ、パイルの中、または好気的変敗に対して感受性であり得る任意のその他の適した保存形態であり得る。一実施形態では、本発明のサイレージ接種材料は、例えば、ブタ、家禽類または反芻動物などの動物に給餌する目的の、固体であれ液体であれ、任意の適した動物飼料とともに使用してもよい。
【００３２】
以下の実施例は、本発明をさらに説明および定義するのに役立ち、決して本発明を制限しようとするものではない。
【実施例】
【００３３】
【実施例１】
【００３４】
約１２ヶ月齢である植物体から得た新鮮な切断サトウキビを用いてサイレージを製造した。サトウキビは、手作業で収穫し、実験室型チョッパー（Ｐｉｎｈｅｉｒｏ、モデル：ＰＰ−４７）を使用して切り刻んで、約３０ｍｍの長さとした。３ｋｇの切り刻んだ材料を接種材料と混合し、複数のＰＶＣプラスチックバケツ（ミニサイロ、直径１０ｃｍおよび長さ６０ｃｍ）中で適当な状態にし、これらを、ガス放出のためのブンセンバルブを有するタイトにしまった蓋で密閉した。サイロ中の材料は、約６３０±１９．９ｋｇ・ｍ−３の密度にぎっしりと詰めた。ミニサイロを室温で保存し、６１日保存した後に分析し、各サイロについて３個の複製物を調製した。
【００３５】
接種材料としてラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)ＳＩＬ３４株（Ｌ．プランタルム(plantarum)は、サイレージ接種材料としてよく使用される）ならびにラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)ＳＩＬ５１株（２０１３年６月２６日に提出されたＣＮＣＭ  Ｉ−４７８４）およびＳＩＬ５２株（２０１３年６月２６日に提出されたＣＮＣＭ  Ｉ−４７８５）を使用してサイレージを製造した。ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)およびラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)株は、サトウキビサイレージから単離され、９８％の配列同一性を有すると同定された。接種材料を何ら含まないサイレージをコントロールとして使用した。接種材料は、Ａｖｉｌａら(Effects of an indigenous and a commercial Lactobacillus buchneri strain on quality of sugar cane silage、Grass Forage Sci 6:384-394、2009)に従って培養した。最終培養後、De Man Rogosa Sharpe agar(Oxoid CM361、Basingstoke、Hampshire、England)上で細胞数を計数し、培養物の濃度を９ログ（log） ｃｆｕ・ｍｌ−１に調整した。培養物を８０ｍＬの滅菌蒸留水と混合し、６ログ（log）ｃｆｕ・ｇ−１牧草の最終濃度まで切り刻んだサトウキビの上に噴霧した。コントロールには、細菌を何ら含まない同量の水を与えた。相互汚染を避けるために、各処理のために別個の噴霧器を使用した。
【００３６】
空サイロおよび最大に満たしたサイロの重量を記録した。密閉後、サイロを室温（平均２５℃）で維持し、日光および雨から保護した。６１日のサイロ貯蔵後、最大に満たしたサイロを秤量し、その後これを開いた。乾燥物質（ＤＭ）のロスは、新鮮な飼料およびサイレージの重量およびＤＭ含量を使用して算出した。
【００３７】
ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)（ＳＩＬ３４）の接種は、その他の株およびコントロールと比較して、より低いＤＭ含量、より高いＤＭロスおよびより高い中性洗剤繊維ＮＤＦを有するサイレージをもたらした。ラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)ＳＩＬ５１株およびＳＩＬ５２株を接種されたサイレージでは、ＳＩＬ３４株およびコントロールと比較して、より低いＤＭロスが見られた（表１）。これらの同一株を用いる接種はまた、より高いＤＭ含量およびより低い中性洗剤繊維ＮＤＦを有するサイレージをもたらした。接種材料は、サイレージのｐＨ値および可溶性炭水化物含量には影響を及ぼさなかった。
【００３８】
表１  接種材料を伴わない、および種々の接種材料を伴う６１日のサイロ貯蔵でのサトウキビサイレージの化学組成
【００３９】
【表１】
2019170389.tif 000002
【００４０】
ｂ−乾燥物質含量；ｃ−新鮮物質；ｄ−中性洗剤繊維；ｅ−水溶性炭水化物；ｆ：乳酸菌。
【００４１】
１つの欄中の種々の文字を伴う平均値は、有意に異なっている（ｐ＜０．０５）。
【００４２】
分析手順
ミニサイロを開く日に、各ミニサイロから２個のサンプルを回収し、ミニサイロの内容物のすべてを均質化した。サンプルのうち一方を秤量し、５５℃でファン付きオーブン中で９６時間乾燥させた。もう一方のサンプルを使用して水抽出物を作製し、ｐＨ値を決定し、微生物集団を評価し、発酵最終生成物を検出した。
【００４３】
３０メッシュの篩を使用してＷｉｌｌｅｙ型粉砕機で乾燥サンプルを粉砕し、ラベルを付けたプラスチックポット中に保存した。サンプルを、ＤＭ含量(AOAC(1990) Official methods of analyses.15th edition. Washington, DC, USA:Association of Official Analytical Chemists)、フェノール法(Dubois M、Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F (1956) Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem 28:350-356)によって水溶性炭水化物（ＷＳＣ）、およびＨｏｌｄｅｎ(Comparison of methods of in vitro dry matter digestibility for ten 565 feeds. J Dairy Sci 82:1791-1794;1999)によって記載されるようにＡｎｋｏｍ繊維分析器(ANKOM Technology Corporation、Fairport、NY、USA)を使用して中性洗剤繊維（ＮＤＦ）について分析し、ＤＭベースで表した。
【００４４】
エタノール、１，２−プロパンジオールおよび乳酸、酢酸、プロピオン酸および酪酸のレベルを、Ｃａｒｖａｌｈｏら(Effects of propionic acid and Lactobacillus buchneri (SIL72) addition on fermentative and microbiological characteristics of sugar cane silage treated with or without calcium oxide. Grass Forage Sci doi:10.1111/j.1365-2494.2012.00863.x)に従ってＨＰＬＣによって測定した。酸、エタノールおよび１，２−プロパンジオールを、その保持時間を既知標準の保持時間と比較することによって同定した。同定した化合物の濃度を外部較正法によって決定した。ＨＰＬＣ装置（ＳｈｉｍａｄｚｕモデルＬＣ−１０Ａｉ；島津製作所、日本、東京）は、紫外検出器（ＵＶ−ＶｉｓＳＰＤ−１０Ａｉ）および屈折率検出器（ＲＩＤ  １０Ａ）からなるデュアル検出システムを備えていた。クロマトグラフィー分離には、５０℃で操作される島津製作所製のイオン排除カラム(Shim-pack SCR-101H;7.9mm×30cm)を使用した。移動相は、１００ｍＭ過塩素酸溶液からなり、０．６ｍＬ・ｍｉｎ−１の流速を有していた。酸はＵＶ吸光度（２１０ｎｍ）によって検出した。エタノールおよび１，２−プロパンジオールは、屈折率検出器を使用して同定した。ｐＨ値は、電位差計(Expandomatic Beckman SS-2)を用いて測定した。
【００４５】
表２に示されるように、ＳＩＬ５１株およびＳＩＬ５２株を接種した、最低のＤＭのロスを有するサイレージは、ＳＩＬ３４株およびコントロールよりも低いエタノール濃度を有していた。ＤＭの最大のロスを有するサイレージをもたらしたＳＩＬ３４株は、最高量の乳酸を製造した。ＳＩＬ５１株およびＳＩＬ５２株を接種したサイレージでは、ＳＩＬ３４株およびコントロールと比較して、より高い濃度の酢酸および１，２−プロパンジオールも記された。プロピオン酸レベルは同様に低く、ＳＩＬ３４株およびコントロールサイレージと一致していた。
表２  接種材料を伴わない、およびラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)接種材料を伴う６１日のサイロ貯蔵での、サトウキビサイレージの乳酸、酢酸、プロピオン酸および酪酸およびエタノールおよび１，２−プロパンジオール
【００４６】
【表２】
2019170389.tif 000003
【００４７】
微生物学的分析
新鮮飼料および、６１日インキュベートした後のサトウキビサイレージのサンプル（７０ｇ）を６３０ｍＬの０．１％滅菌ペプトン水と混合し、オービタルミキサー中、１２０ｒｐｍで２０分間撹拌した。その後、１０倍希釈物を調製して、種々の微生物群を定量した。乳酸菌（ＬＡＢ）は、嫌気性インキュベーション(AnaeroGen;Oxoid、Basingstoke、UK)後、０．１％システインＨＣｌ(Merck、Dasmstadt、Germany)および０．４％シクロヘキシミド（０．４％）（Ｓｉｇｍａ）を含有するＭＲＳ寒天(De Man Rogosa Sharpe、Difco、Detroit、MI、USA)を使用して数えた。プレートを３０℃で４８時間インキュベートした。酵母および糸状菌は、プレートを２８℃で７２時間インキュベートした後、ジクロランローズベンガルクロラムフェニコール培地(DRBC、Difco;Becton Dickinson、Sparks、MD、USA)上で数えた。すべての微生物について、３０から３００ｃｆｕの間を含有するプレートのみを数えた。
サイレージの好気的安定性の評価
９０日のサイロ貯蔵後、ミニサイロを開き、各ミニサイロから約３ｋｇの３個（triplicate）のサンプルを回収し、５ｋｇのプラスチックバケツに入れ、その好気的安定性を評価した。サイレージ塊に温度計を１０ｃｍの深さに７日間挿入した。容器は室内に維持し、２６℃（±１．５℃）で温度制御した。サイレージ温度は、８時間毎に記録した。周囲温度は、バケツに近接して置いた温度計を使用して測定した。好気的安定性は、周囲温度よりも２℃を超えて上がる前にサイレージが安定のままであった時間数と定義した。
表３  接種材料を有するサトウキビサイレージの好気的安定性
【００４８】
【表３】
2019170389.tif 000004
【００４９】
表３に示されるように、コントロールサイレージの温度は、サイロを開いた後、約２１．３時間の間安定であったが、ＳＩＬ５１株およびＳＩＬ５２株を接種したサイレージのものは、それぞれ２６．７および２１．３時間後に温度安定性を失った。最高温度に達する時間は、ＳＩＬ５１株およびＳＩＬ５２株両方において長かった。したがって、ＳＩＬ５１株およびＳＩＬ５２株は、ＳＩＬ３４株およびコントロールサイレージよりも優れた温度安定性を有するサイレージをもたらした。
【００５０】
乳酸を製造したラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)ＳＩＬ３４株を接種したサイレージは、２４時間後に温度安定性を失った。しかし、ＳＩＬ３４株は、より高い含量のエタノール、より高い酵母数およびより多いＤＭロスを有するサイレージをもたらした。ＳＩＬ５１株およびＳＩＬ５２株は、より少ない酵母集団、より低いエタノール含量およびより少ないＤＭロスなどのサイレージにとってより良好な特徴を提供した。
【実施例２】
【００５１】
トウモロコシサイレージの好気的安定性
トウモロコシサイレージを、接種材料としてラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ＮＣＩＭＢ４０７８８（Ｍａｎｎらの米国特許第６，３２６，０３７号）、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)ＳＩＬ３４株およびラクトバチルス・ヒルガンディー(Lactobacillus hilgardii)ＳＩＬ５１株（２０１３年６月２６日に提出されたＣＮＣＭ  Ｉ−４７８４）およびＳＩＬ５２株（２０１３年６月２６日に提出されたＣＮＣＭ  Ｉ−４７８５）を使用して実施例１に記載したようにマイクロサイロで製造した。接種材料を何ら伴わないサイレージをコントロールとして使用した。接種材料は実施例１に記載されるように培養した。
【００５２】
９０日のサイロ貯蔵後、ミニサイロを開き、各ミニサイロから約３ｋｇのサンプルを回収し、５ｋｇのプラスチックバケツに入れて、好気的安定性を評価した。データロガーを、サイレージ塊中、１０ｃｍの深さに７日間挿入した。周囲温度は、バケツに近接して置いたデータロガーを使用して測定した。サイレージの好気的安定性に関するデータを表４に示す。
表４  接種材料を用いたトウモロコシサイレージの好気的安定性
【００５３】
【表４】
2019170389.tif 000005
【００５４】
用量：１＝１０５ｃｆｕ／ｇ、２＝１０６ｃｆｕ／ｇ。
【００５５】
表４に示されるように、コントロールサイレージの温度は、サイロを開いた後、約４２．７時間安定であったが、ＳＩＬ５１株およびＳＩＬ５２株を接種したサイレージのものは、それぞれ、７３．０５および５３．３５時間後に温度安定性を失った。ＳＩＬ３４株を接種したサイレージは、１７．４時間安定であった。ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)ＮＣＩＭＢ４０７８８を接種したサイレージは、６０．５時間安定であった。ＳＩＬ５１株およびＳＩＬ５２株は、ＳＩＬ３４株を接種したサイレージおよびコントロールサイレージよりも優れた温度安定性を有するサイレージをもたらした。ＳＩＬ５株１およびＳＩＬ５２株はまた、ＮＣＩＭＢ  ４０７８８サイレージよりも優れた温度安定性を有するサイレージをもたらした。
【００５６】
本発明を、その特定の実施形態に関連して記載してきたが、概して、本発明の原理に従って、本発明が関連する技術分野内で公知のまたは日常的な実施内に入る本開示からのこのような逸脱を含めて、本明細書において上記で示される本質的な特徴に当てはまり得るように、また添付の特許請求の範囲に従うように、さらなる改変が可能であることおよび本明細書および特許請求の範囲は本発明の任意の変法、使用または適応を対象とするものであることは理解されよう。