(57)【要約】【課題】細胞培養特性、特に、細胞培養において細胞の増殖性が損なわれることなく、細胞活性を向上させることができる細胞培養用部材及びその製造方法を提供する。【解決手段】本発明に係る細胞培養用部材は、細胞の培養を行う容器１０を備え、該容器１０の少なくとも底面が、疎水性シリカエアロゲルを含む基材２０で形成され、前記基材２０上で細胞が培養されている状態において、該基材２０の容器内部側とは逆側の面が酸素を含む気体４０に接触している。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の培養を行う容器を備え、
該容器の少なくとも底面が、疎水性シリカエアロゲルを含む基材で形成され、
前記基材上で細胞が培養されている状態において、該基材の容器内部側とは逆側の面が酸素を含む気体に接触している、細胞培養用部材。
【請求項２】
前記疎水性シリカエアロゲルは、ケイ素原子に炭化水素基が結合した構造を有する、請求項１に記載の細胞培養用部材。
【請求項３】
前記炭化水素基がアルキル基である、請求項１又は２に記載の細胞培養用部材。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養用部材の製造方法であって、
前記疎水性シリカエアロゲルは、第１の加水分解性シラン化合物と、該第１の加水分解性シラン化合物以外である第２の加水分解性シラン化合物とを含む原料を加水分解反応することにより製造される、細胞培養用部材の製造方法。
【請求項５】
前記第１の加水分解性シラン化合物は、三官能アルコキシシランであり、
前記第２の加水分解性シラン化合物は、二官能アルコキシシランであり、
前記三官能アルコキシシラン１モルあたり、前記二官能アルコキシシランが０．００５モル以上、０．５モル以下含まれる、請求項４に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養用部材及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療に対する関心が高まるとともに、細胞培養を行うための基材に注目が集まっており、種々の細胞培養デバイスが開発されている。
【０００３】
細胞培養デバイスにおいては、基材の選定が細胞の培養特性にとって重要な一つの要素であり、基材の種類が細胞培養における細胞数の増加、細胞活性特性、細胞の分化等に大きな影響をおよぼし得るものであることが知られている。この観点から、最近では、例えば、細胞培養デバイスに組み込む基材として、三次元構造化させた材料の検討も精力的に行われている。具体的に特許文献１には、基材の表面に凹凸構造を設けた細胞培養デバイスが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−２４９５４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
近年の再生医療に対する多様化に伴い、細胞培養特性をさらに向上させることができる細胞培養デバイス又は該デバイスを組み立てるための細胞培養用部材の構築が望まれている。例えば、長期間にわたって細胞活性を維持させることができる細胞培養デバイス又は細胞培養用部材は、再生医療分野のさらなる発展の観点からも非常に有用である。
【０００６】
この観点から、本願の発明者らが詳細に検討したところ、細胞培養デバイスが備える基材（細胞培養用基材）の酸素透過性が、細胞培養特性の向上にとっての重要なファクターになることを突き止めた。具体的に、特許文献１に開示される基材を組み込んで構築した細胞培養デバイスは、基材の酸素透過性が悪いため、培地内への酸素の供給が困難となることから、細胞培養特性を向上させるには限界があった。本願発明者らが鋭意検討したところ、細胞培養特性をさらに向上させるには、培地内へ酸素を供給しやすい環境を提供できる基材を細胞培養デバイスに組み込むことが重要であることを見出した。
【０００７】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、細胞培養特性、特に、細胞培養において細胞の増殖性が損なわれることなく、細胞活性を向上させることができる細胞培養用部材及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、基材を酸素透過性の高い材料で形成し、基材を通じで酸素を培地内に供給しやすくするように細胞培養用部材を構築することにより、上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、例えば、以下の項に記載の発明を包含する。
項１
細胞の培養を行う容器を備え、
該容器の少なくとも底面が、疎水性シリカエアロゲルを含む基材で形成され、
前記基材上で細胞が培養されている状態において、該基材の容器内部側とは逆側の面が酸素を含む気体に接触している、細胞培養用部材。
項２
前記疎水性シリカエアロゲルは、ケイ素原子に炭化水素基が結合した構造を有する、項１に記載の細胞培養用部材。
項３
前記炭化水素基がアルキル基である、項１又は２に記載の細胞培養用部材。
項４
項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養用部材の製造方法であって、
前記疎水性シリカエアロゲルは、第１の加水分解性シラン化合物と、該第１の加水分解性シラン化合物以外である第２の加水分解性シラン化合物とを含む原料を加水分解反応することにより製造される、細胞培養用部材の製造方法。
項５
前記第１の加水分解性シラン化合物は、三官能アルコキシシランであり、
前記第２の加水分解性シラン化合物は、二官能アルコキシシランであり、
前記三官能アルコキシシラン１モルあたり、前記二官能アルコキシシランが０．００５モル以上、０．５モル以下含まれる、項４に記載の製造方法。
項６
少なくとも底面が、疎水性シリカエアロゲルを含む基材で形成された容器を使用し、
前記基材の容器内部側とは逆側の面が酸素を含む気体に接触した状態で、前記基材上で細胞を培養する、細胞の培養方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の細胞培養用部材は、細胞培養において細胞の増殖性が損なわれることなく、細胞活性を向上させることができ、各種の細胞培養デバイスに好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の細胞培養用部材の実施形態の一例を示す概略断面図である。
【図２】本発明の細胞培養用部材の組み立てる方法の一例を説明する概略図であり、（ａ）は、管体の斜視図、（ｂ）は基材の平面図、（ｃ）は形成された容器の斜視図、（ｄ）は形成された容器の側面図である。
【図３】試験例１−１及び１−２の細胞培養試験（培養３日後及び７日後）における細胞数変化の結果を示すグラフである。
【図４】試験例１−１及び１−２の細胞培養試験（培養３日後及び７日後）におけるアルブミン分泌活性の結果を示すグラフである。
【図５】試験例１−１及び１−２の細胞培養試験（培養３日後及び７日後）におけるＣＹＰ３Ａ４活性の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００１３】
本発明の細胞培養用部材は、細胞の培養を行う容器を備え、該容器の少なくとも底面が、疎水性シリカエアロゲルを含む基材で形成される。細胞培養用部材は、前記基材上で細胞が培養されている状態において、該基材の容器内部側とは逆側の面が酸素を含む気体に接触している。
【００１４】
前記細胞培養用部材によれば、容器底部の基材が酸素透過性の高い疎水性シリカエアロゲルを含むことから、酸素が基材を通過して培地内に到達しやすい。これにより、容器内の培養液が酸素不足の状態になることを回避しやすくなる結果、細胞培養において細胞の増殖性が損なわれることなく、細胞活性を向上させることができる。従って、本発明の細胞培養用部材は、各種の細胞培養デバイスに好適に使用することができる。
【００１５】
図１は、本発明の細胞培養用部材の実施形態の一例である。
【００１６】
図１に示す細胞培養用部材は、容器１０を備える。この容器１０は、細胞の培養で使用する培養液３０を収容できるように形成されており、容器１０内に培養液３０が含まれることで培地が形成される。
【００１７】
容器１０の少なくとも底面は、疎水性シリカエアロゲルを含む基材２０で形成されている。疎水性シリカエアロゲルの構成については後述する。
【００１８】
細胞培養用部材は、基材２０上で細胞が培養されている状態において、該基材２０の容器内部側とは逆側の面が酸素を含む気体４０に接触している。これにより、気体４０に含まれ得る酸素が、基材２０を通じて容器内部側、つまり、培養液３０に酸素が到達することができる。基材２０は、酸素透過性に優れる疎水性シリカエアロゲルを含むことから、気体４０中の酸素は容易に基材２０を通過することができ、容器内部側への酸素の供給が起こりやすい。気体４０は、例えば、空気であり、その他、酸素を含む限りはその種類は特に限定されない。
【００１９】
なお、図１において、１対の矢印により、酸素が容器１０の基材２０を通過して培養液３０に流入している様子を模式的に描写している。
【００２０】
図１の実施形態では、容器１０には、脚部１５が複数設けられており、容器１０が例えば床又は台等に載置された場合に、容器１０の下面、つまり、基材２０の裏面が気体４０と接触しやすくなる。容器１０の下面が気体４０に接触しやすくするための方法は、容器１０に脚部１５を設ける構成に限定されず、種々の方法を採用することができる。
【００２１】
図１の実施形態では、基材２０は、容器１０の底面のみに形成されているが、基材２０は、容器１０の底面のみならず、側面に形成することもできる。基材２０が容器１０の側面に形成されている場合は、側面からも酸素の供給が起こり得る。
【００２２】
図１の実施形態では、容器１０は、管体１１と、基材２０とを備え、管体１１の一端に基材２０が嵌め込まれることで形成されている。従って、基材２０の外形は、例えば、管体１１の一端の内形状（開口部の形状）に合致する形状とすることができる。
【００２３】
管体１１は、例えば、リング状、筒状、角型状等に形成される部材を挙げることができる。管体１１は、種々の材料で形成することができ、例えば、ガラス、樹脂、セラミックス等の材料で形成することができる。管体１１の開口の形状も限定されず、円形、楕円形、矩形等の種々の形状を挙げることができる。脚部１５も種々の材料で形成することができ、例えば、ガラス、樹脂、セラミックス等の材料で形成することができる。
【００２４】
容器１０は、例えば、格子状に形成された部材であってもよく、この場合は、該格子状部材内の複数のブロックが培地を形成するための空間となる。この場合にあっても、各ブロックの少なくとも底面が疎水性シリカエアロゲルを含む基材で形成される。
【００２５】
基材２０は、前記疎水性シリカエアロゲルを含む材料で形成されている。基材２０は、疎水性シリカエアロゲルのみで形成することができ、あるいは、疎水性シリカエアロゲルと、他の材料とを組み合わせて形成することができる。疎水性シリカエアロゲルの特性を十分に発揮させるという観点から、基材２０は、疎水性シリカエアロゲルのみで形成することが好ましい。
【００２６】
疎水性シリカエアロゲルの種類は、酸素透過性を有している限りは特に限定されず、例えば、公知の酸素透過性を有する疎水性シリカエアロゲルを広く適用することができる。疎水性シリカエアロゲルは、酸素を透過し、水等の水性媒体を通さないことが好ましい。
【００２７】
疎水性シリカエアロゲルは、ケイ素原子に炭化水素基が結合した構造を有することが好ましい。このような疎水性シリカエアロゲルを含む基材２０を細胞培養用部材が備える場合、細胞培養用部材は特に酸素透過性に優れるので、細胞培養において細胞活性機能を特に向上させやすい。ケイ素原子に炭化水素基が結合した構造を有する疎水性シリカエアロゲルは、酸素透過性に優れるとともに、水等の水性媒体を通しにくい材料である。
【００２８】
疎水性シリカエアロゲルは、−Ｏ−Ｓｉ−Ｏ−の繰り返し単位を基本構造として有する材料である。
【００２９】
疎水性シリカエアロゲルは、例えば、四官能アルコキシシランのみを含むアルコキシシランから製造されたシリカエアロゲルよりも疎水性が高いことを意味する。好ましくは、疎水性シリカエアロゲルは、水に溶解しないことである。
【００３０】
疎水性シリカエアロゲル中の炭素の含有量は、例えば８質量％以上であり、好ましくは８．８１質量％以上である。当該炭素の含有量が８質量％以上であれば、高い疎水性を有することができる。
【００３１】
疎水性シリカエアロゲルは、ケイ素原子に炭化水素基が結合した構造を有することが好ましい。この場合、疎水性シリカエアロゲルの疎水性がより高まるので、細胞培養用部材は、細胞活性機能をより向上させることができ、細胞活性をより失活させにくく、長期間の培養に使用することができる。
【００３２】
炭化水素基の種類は特に限定されない。炭化水素基は、飽和炭化水素基及び不飽和炭化水素基のいずれであってもよい。また、炭化水素基は、直鎖構造、分岐構造及び環状構造のいずれであってもよい。
【００３３】
炭化水素基としては、例えば、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアルケニル基、炭素数６〜２０のアリール基等を挙げることができる。さらに具体的な炭化水素基は、メチル基、エチル基、直鎖又は分岐のプロピル基、直鎖又は分岐のブチル基、フェニル基等を挙げることができる。
【００３４】
炭化水素基は、アルキル基であることが好ましい。この場合、疎水性シリカエアロゲルの酸素透過性がより高いので、細胞培養用部材は、細胞活性機能をより向上させることができ、細胞活性をより失活させにくい。また、炭化水素基がアルキル基である場合、疎水性シリカエアロゲルの構造が安定となりやすく、また、製造も容易である。特に好ましいアルキル基の炭素数は１〜３である。この場合、疎水性シリカエアロゲルの構造を制御しやすく、容易に目的の疎水性シリカエアロゲルを製造できる。
【００３５】
疎水性シリカエアロゲルの製造方法は特に限定されない。例えば、従来から公知のシリカエアロゲルの製造方法に準じて、疎水性シリカエアロゲルを製造することができる。
【００３６】
例えば、疎水性シリカエアロゲルは、第１の加水分解性シラン化合物と、該第１の加水分解性シラン化合物以外である第２の加水分解性シラン化合物とを含む原料を加水分解反応する工程を備える製造方法によって製造することができる。以下、この工程を「工程Ａ」と表記する。
【００３７】
なお、加水分解性シラン化合物とは、ケイ素原子を有し、加水分解反応が可能な化合物であることを意味し、例えば、加水分解性シラン化合物としては、アルコキシシランを挙げることができる。
【００３８】
工程Ａで使用できる第１の加水分解性シラン化合物は、三官能アルコキシシランを挙げることができる。
【００３９】
三官能アルコキシシランとしては、例えば、メチルトリメトキシシラン、メチルトリエトキシシラン、エチルトリメトキシシラン、エチルトリエトキシシラン、ｎ−プロピルトリメトキシシラン、ｎ−プロピルトリエトキシシラン、ｉ−プロピルトリメトキシシラン、ｉ−プロピルトリエトキシシラン、フェニルトリメトキシシラン、フェニルトリエトキシシラン等が挙げられる。これらは、単独で使用又は２種以上を併用できる。
【００４０】
工程Ａで使用できる第２の加水分解性シラン化合物は、二官能アルコキシシランを挙げることができる。二官能アルコキシシランとしては、例えば、ジメチルジメトキシシラン、ジメチルジエトキシシラン、ジフェニルジエトキシシラン、ジフェニルジメトキシシラン、メチルフェニルジエトキシシラン、メチルフェニルジメトキシシラン、ジエチルジエトキシシラン、ジエチルジメトキシシラン等が挙げられる。これらは、単独で使用又は２種以上を併用できる。
【００４１】
工程Ａで使用する原料には、前記第１の加水分解性シラン化合物及び前記第２の加水分解性シラン化合物以外の加水分解性シラン化合物も含むことができ、そのような加水分解性シラン化合物としては、例えば、四官能アルコキシシランを挙げることができる。
【００４２】
四官能アルコキシシランとしては、例えば、テトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン等が挙げられる。また、その他のアルコシシシランとして、ビストリメチルシリルメタン、ビストリメチルシリルエタン、ビストリメチルシリルヘキサン、ビニルトリメトキシシランなどを用いることもできる。
【００４３】
なお、アルコキシシランの部分加水分解物を第１の加水分解性シラン化合物及び第２の加水分解性シラン化合物として使用することもできる。
【００４４】
工程Ａで使用する原料には、異なる二種以上の第１の加水分解性シラン化合物が含まれていてもよい。また、工程Ａで使用する原料には、異なる二種以上の第２の加水分解性シラン化合物が含まれていてもよい。
【００４５】
工程Ａで使用する原料は、第１の加水分解性シラン化合物が三官能アルコキシシランであり、前記第２の加水分解性シラン化合物が二官能アルコキシシランである組み合わせであることが好ましい。この組み合わせにおいて、三官能アルコキシシラン１モルあたり、二官能アルコキシシランの含有量は、例えば、０．００１モル以上であり、好ましくは０．００５モル以上であり、より好ましくは０．０１モル以上であり、また、例えば、０．５モル以下であり、好ましくは０．１５モル以下である。この場合、得られる疎水性シリカエアロゲルは、酸素透過性に優れ、細胞培養において細胞活性機能をより向上させることができ、細胞活性をより失活させにくくできる。また、三官能アルコキシシラン１モルあたり、二官能アルコキシシランの含有量が上記上限及び下限である場合は、エアロゲルがより疎水性となりやすく、しかも透明性も損なわれにくい。
【００４６】
なお、工程Ａで使用する原料は、第１の加水分解性シラン化合物及び第２の加水分解性シラン化合物以外に他の材料を含むこともできる。
【００４７】
工程Ａの加水分解反応の条件は特に限定されず、例えば、公知のアルコキシシランを加水分解反応させる条件と同様の条件を採用することができる。具体的には、加水分解反応として、ゾル−ゲル法等を採用することができる。
【００４８】
ゾル−ゲル法は、第１の加水分解性シラン化合物及び第２の加水分解性シラン化合物を含む原料を溶媒の存在下で加水分解及び縮重合させ、これにより、シリカ骨格からなる湿潤状態のゲル状化合物を得る方法である。
【００４９】
ゾル−ゲル法で使用する溶媒は、特に限定されず、公知のゾル−ゲル法で使用される溶媒を選択することができる。この溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール等のアルコール、アセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン等が挙げられる。溶媒は二種以上の混合物であってもよく、また、水と有機溶媒の混合物であってもよい。
【００５０】
ゾル−ゲル法は、酸の存在下で行うこともできる。酸としては、例えば、塩酸、クエン酸、酢酸、硝酸、硫酸等が挙げられる。
【００５１】
ゾル−ゲル法は、塩基の存在下で行うこともできる。塩基としては、例えば、アンモニア、アミン化合物、ピペリジン、尿素等が挙げられる。
【００５２】
ゾル−ゲル法は、酸及び塩基の両方の存在下で行うこともできる。酸及び塩基は、例えば、水溶液で使用することができる。
【００５３】
ゾル−ゲル法は、その他、適宜の成分の存在下で行うことができる。適宜の成分としては、例えば、公知の界面活性剤、分散安定剤、粘度調整剤、ｐＨ調整剤等を挙げることができる。界面活性剤は、アニオン性、カチオン性及びノニオン性のいずれを使用することもできる。
【００５４】
ゾル−ゲル法における反応温度、反応時間も特に限定されず、例えば、公知と同様の条件とすることができる。また、ゾル−ゲル法における原料と溶媒の使用割合、任意の成分の使用量等も特に限定されず、公知のシリカエアロゲル粒子を得るための反応と同様の条件を選択することができる。
【００５５】
ゾル−ゲル法で得られたゲルは、必要に応じて熟成及び溶媒置換を行うことができる。熟成条件は特に限定されず、公知の条件と同様とすることができる。
【００５６】
溶媒置換の方法も特に限定されず、例えば、公知の方法で溶媒置換を行うことができる。溶媒置換では、例えば、ゾル−ゲル法で得られたゲル中の溶媒を、後記する超臨界乾燥が可能である溶媒に置換することが好ましい。後記の超臨界乾燥が可能である溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール；ベンゼン、トルエン等の芳香族化合物、その他、炭化水素溶媒、アミド溶媒、ケトン溶媒、エステル溶媒を挙げることができる。溶媒置換は、異なる２種以上の溶媒を使用し、それぞれの溶媒に順次置換することもできる。溶媒置換は１回のみ行うことができ、あるいは、２回以上繰り返し行うこともできる。
【００５７】
ゾル−ゲル法で得られたゲルを溶媒置換した後は、溶媒を乾燥させることにより、疎水性シリカエアロゲルが得られる。溶媒を乾燥させる方法は特に限定されず、例えば、超臨界乾燥法を採用できる。
【００５８】
超臨界乾燥法の条件は特に限定されず、公知の超臨界乾燥法を採用することができる。例えば、公知の超臨界二酸化炭素を使用した超臨界乾燥法を採用することができる。
【００５９】
超臨界乾燥を行う前に、ゾル−ゲル法で得られたゲルの粉砕処理等を行うことができる。あるいは、ゾル−ゲル法で得られたゲルの超臨界乾燥を行った後に、粉砕処理等を行うことができる。
【００６０】
以上のように、工程Ａを含み、必要に応じて、溶媒置換を行う工程及び超臨界乾燥法等による溶媒の乾燥を行う工程を備える製造方法によって疎水性シリカエアロゲルを得ることができる。
【００６１】
上記製造方法で得られた疎水性シリカエアロゲルは、例えば、バルク状、板状、膜状、スライム状、ゲル状、シート状等の形状で形成され得るので、所望の形状に疎水性シリカエアロゲルを切断加工することができる。このように得られた疎水性シリカエアロゲルを用い、必要に応じて他の材料を組み合わせることで基材２０を形成することができる。上記製造方法で得られた疎水性シリカエアロゲルを切断加工等することなく、基材２０として使用することもできる。
【００６２】
疎水性エアロゲルを切断加工する場合、例えば、レーザーを使用して疎水性エアロゲルを切断することができる。レーザーの種類は特に限定されない。例えば、レーザーによる切断時に疎水性エアロゲルの崩壊及びひび割れ等が起こりにくい点で、パルスエネルギーが０．０００１より大きく２００μＪ未満であるレーザーを使用することができる。パルスエネルギーは０．０１μＪ以上１００μＪ未満であることが好ましく、１μＪ以上５０μＪ以下であることがより好ましく、５μＪ以上４５μＪ以下であることが特に好ましい。疎水性エアロゲルを切断加工では、各種のレーザー照射装置を使用することができる。なお、レーザーの波長は特に限定されず、例えば、１００〜５０００ｎｍとすることができる。また、レーザーの繰り返し周波数も特に限定されず、例えば、０．０１〜１００００ｋＨｚとすることができる。
【００６３】
上記方法で得られた基材２０を用いて容器１０を形成する方法は特に限定されず、種々の方法で容器１０を形成することができる。
【００６４】
図２には、疎水性シリカエアロゲルを含む基材２０と、管体１１とを使用して、細胞培養用部材が備える容器１０を組み立てる方法を説明する概略図を示している。
【００６５】
容器１０は、図２（ａ）に示す管体１１と、図２（ｂ）に示す疎水性エアロゲルからなる基材２０とを準備し、図２（ｃ）及び（ｄ）に示すように管体１１の一端の開口部に基材２０を嵌め込むことで形成することができる。管体１１に基材２０を嵌め込んだときに、管体１１の内面と基材２０との間に間隙ができる場合は、適宜、シーリング剤、接着剤等で間隙を埋めることができる。管体１１に嵌め込む基材２０は、前述のようにレーザーを使用した切断加工により、管体１１の開口形状に合致する形状に形成でき、これを管体１１に嵌め込んで、容器１０の底部とすることができる。管体１１に基材２０を嵌め込んだ後、図２（ｃ）及び（ｄ）に示すように、管体１１又は基材２０に脚部１５を設けることができる。これにより、基材２０の容器１０内部とは逆側の面が空気等の気体４０と接触しやすくなる。なお、容器１０を組み立てる方法において、脚部１５が形成されている管体１１を使用することもできる。
【００６６】
細胞培養用部材を使用した細胞の培養方法は特に限定されず、例えば、公知の方法により細胞を含む培地を播種することで細胞を培養することができる。
【００６７】
細胞培養用部材を使用して細胞を培養するにあたり、必要に応じて、容器１０等を加工処理（例えば、成形処理、加熱処理、滅菌処理、表面処理等）することもできる。例えば、容器１０、特に基材２０表面を加工処理することができる。加工処理としては、例えば、基材２０表面をコラーゲン等でコーティングする処理が例示される。
【００６８】
細胞培養用部材を使用して細胞を培養する方法において、培養液の種類は特に限定されず、例えば、公知の培養液を使用して培地を形成できる。培養液には、その他、公知の成分、例えば、糖分、脂質、アミノ酸やミネラル、ビタミン等の細胞培養のための栄養成分、細胞培養の増殖因子となる成分、あるいは、ｐＨ調整剤等が含まれていてもよい。
【００６９】
細胞培養用部材を使用して細胞を培養する方法においては、基材２０の容器内部側とは逆側の面が酸素を含む気体４０に接触した状態で細胞を培養する。容器１０が脚部１５を備えている場合は、例えば、平面上に細胞培養用部材を載置することで、基材２０が酸素を含む気体４０に接触することができるので、この状態で細胞を培養することができる。
【００７０】
細胞の培養中は、基材２０が空気に接触した状態に保持することができる。あるいは、細胞の培養中は、基材２０近傍に酸素を含む気体（酸素のみでも良い）を吹き付けてもよい。いずれの場合にあっても、基材２０が酸素透過性の高い疎水性エアロゲルで形成されていることから、細胞の培養中において、酸素が基材２０を通過して培地側に供給され得る。これにより、培地内の酸素不足が防止されやすくなり、細胞培養において細胞の増殖性が損なわれることなく、細胞活性を向上させることができる
【００７１】
細胞培養用部材を使用して細胞を培養する方法において、各種の細胞を培養することができる。細胞は、幹細胞、前駆細胞、機能性細胞のいずれでもよい。ここでの機能性細胞とは、肝細胞等、分化した細胞を意味する。細胞は、一種類のみであってもよく、二種類以上でもよい。
【００７２】
本発明の細胞培養用部材は、例えば、単独で細胞培養デバイスすることができ、あるいは、他の公知の装置等と組み合わせることで細胞培養デバイスを構築することができる。また、本発明の細胞培養用部材を用いて、細胞培養用のキットを製作することもできる。このようなキットは、細胞を培養するための使用に好適である。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の態様に限定されるものではない。
【００７４】
（実施例１）
反応容器内で、界面活性剤として臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）０．８ｇと、尿素６．０ｇとを、０．０５ｍｏｌ／Ｌ酢酸水溶液２０ｇに溶解させて、３０分間撹拌し混合溶液Ａを得た。
【００７５】
一方、第１の加水分解性シラン化合物としてトリメトキシメチルシラン（ＭＴＭＳ、関東化学製試薬）９．６１ｇを、第２の加水分解性シラン化合物としてジメトキリジメチルシラン０．５２ｇを混合溶液Ａに溶解させて、３０分間撹拌することで、加水分解反応を行った。つまり、三官能アルコキシシラン１モルあたり、二官能アルコキシシランが０．０５モル含まれるようにした。その後、反応容器内を６０℃に保持し、静置することで内容物をゲル化させ、続けて９６時間静置することによりゲルを熟成させた。このゲルを反応容器ごと５倍体積量のエタノールに移し、６時間保持した後、エタノールを除去し、さらに新しいエタノールを加えて溶媒交換を行った。この溶媒交換を全３回繰り返した後、ゲルを２−プロパノールに移し、同様に２−プロパノールでの溶媒交換を６時間ごとに行った。これにより、ゲル中の溶媒が２−プロパノールで溶媒置換されたゲル化物を、反応容器内に得た。
【００７６】
このゲル化物を反応容器ごと耐圧容器に収容し、二酸化炭素を供給して、耐圧容器を４０℃、９ＭＰａとして３０分保持することで、ゲル化物内の２−プロパノールを二酸化炭素に置換した。その後、耐圧容器内を二酸化炭素の超臨界条件である８０℃、１４ＭＰａにし、超臨界乾燥を約２４時間行って、反応容器内に目的の疎水性シリカエアロゲルが形成され、これを基材として得た。
【００７７】
得られた基材を、リング状の管体の一端の開口部に嵌め込んで、細胞培養用の容器を形成し、さらに、容器の下部に複数の脚部を設けることで、細胞培養用部材を得た。基材を開口部に嵌め込むにあたっては、基材の形状を、管体の開口部の形状に合致させるように切断加工した。基材を開口部に嵌め込んだときに、管体の内面と基材との間に間隙が形成される場合は、接着剤等により、間隙を埋めるようにした。容器の幅は８ｍｍであった。なお、前記切断加工を行うにあたり、レーザー照射装置として紫外線パルスレーザー「ＨＧＬ−ＬＳＵ３ＥＡ」を使用して、基材を切断した。レーザーのパルスエネルギーは６μＪとした。
【００７８】
上記のように得られた細胞培養用部材を細胞培養デバイスとした。
【００７９】
（比較例１）
市販のティッシュカルチャープレート（ＴＣＰ；Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｌａｔｅ）を準備した。
【００８０】
（試験例１−１）
上記実施例１で得られた細胞培養用部材を空のシャーレ中に載置して、細胞を培養している状態において、容器底部の基材（疎水性エアロゲル）の下面が空気に接触する状態とした。細胞培養前の処理として、１５０℃で３時間、乾熱滅菌を行った後、２時間のＵＶ照射を行うことで滅菌処理を施した。次いで、細胞培養用部材の容器底面に設けられている基材（疎水性エアロゲル）に対し、０．３ｍｇ／ｍＬのＩ型コラーゲンを表面にコーティングした。この細胞培養用部材を用いて初代ラット肝細胞の培養試験を下記培養条件にて行った。
＜培養条件＞
・培養環境：３７℃、５体積％の二酸化炭素を含ませた空気（酸素濃度：約１９．９体積％）雰囲気下（標準的な培養条件とした）
・培地：ＨＤＭ（血清無）、
・培地量：５００μＬ／ｄｅｖｉｃｅ
・培養期間：７日間（培地交換は２，４，６日目に行った）
・細胞播種密度：１．１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｅｖｉｃｅ
ディッシュ（シャーレ）の直径は３．５ｃｍとした。
【００８１】
（試験例１−２）
実施例１で得られた細胞培養用部材の代わりに比較例１で準備したＴＣＰを用いたこと以外は試験例１−１と同様の方法で培養試験を行った。
【００８２】
図３は、試験例１−１及び１−２の細胞培養試験（培養３日後及び７日後）の結果であり、特に、細胞数変化の結果を示している。
【００８３】
この結果から、実施例１の細胞培養用部材を用いて細胞を培養した場合でも、細胞の増殖性に影響を与えないことが、ＴＣＰを使用した細胞培養との対比において明らかである。
【００８４】
図４は、試験例１−１及び１−２の細胞培養試験（培養３日後及び７日後）の結果であり、特に、アルブミン分泌活性の結果を示している。
【００８５】
アルブミン分泌活性は、培地中に分泌されたアルブミン量を酵素標識免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により定量し、単位細胞数あたりのアルブミン分泌速度に換算して計測した。細胞数の測定は、ＤＮＡ−ＤＡＰＩ（４，６−ｄｉａｍｉｎｏｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ、和光純薬工業社製）蛍光法を用いた。すなわち、一定細胞から抽出したＤＮＡとＤＮＡ−ＤＡＰＩの蛍光強度間の検量線を作製し、この関係をもとに培養した細胞の細胞数を算出した。また、この細胞数をもとに、上記の細胞当りのアルブミン分泌速度を算出した。
【００８６】
図４の結果から、疎水性エアロゲルを基材として使用して、培地に酸素を供給可能な状態で細胞培養を行った場合は、ＴＣＰを使用した細胞培養に比べて、アルブミン分泌活性が有意に向上することがわかった。特に、疎水性エアロゲルを基材として使用して、培地に酸素を供給可能な状態で細胞培養を行った場合は、細胞培養日数が経過しても、アルブミン分泌活性は、維持されるばかりか驚異的に増加するということがわかった。すなわち、アルブミン分泌活性は、ＴＣＰを使用した場合では培養３日経過後から７日後に−７８％となる一方、疎水性エアロゲル基材を使用した場合では＋６７％であった。ＴＣＰを使用した場合は、培地の酸素不足が原因で、アルブミン分泌活性が細胞培養日数の経過に伴って低下したものと考えられる。
【００８７】
図５は、試験例１−１及び１−２の細胞培養試験（培養３日後及び７日後）の結果であり、特に、ＣＹＰ３Ａ４活性の結果を示している。
【００８８】
肝細胞のＣＹＰ３Ａ４酵素活性は、Ｐ４５０−Ｇｌｏ（ｔｍ）ＣＹＰ３Ａ４  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログＮｏ．Ｖ９００１）を用いた発光法により測定した。発光基質であるＬｕｃｉｆｅｒｉｎ−ＩＰＡを含有する培養培地において、肝細胞を６０分間インキュベート（３７℃）した。その後、ルシフェリン検出試薬を添加して２０分間反応させ、産生されるルシフェリン量をルミノメーターにより測定し、その発光量をＣＹＰ３Ａ４酵素活性値とした。
【００８９】
図５の結果から、疎水性エアロゲルを基材として使用して、培地に酸素を供給可能な状態で細胞培養を行った場合は、ＴＣＰを使用した細胞培養に比べて、ＣＹＰ３Ａ４活性が有意に向上することがわかった。特に、疎水性エアロゲルを基材として使用して、培地に酸素を供給可能な状態で細胞培養を行った場合は、細胞培養日数が経過しても、ＣＹＰ３Ａ４活性は、維持されるばかりか驚異的に増加するということがわかった。すなわち、３日培養後と７日培養後のＣＹＰ３Ａ４活性を比較すると、ＴＣＰを用いた場合−５１％であるのに対し、疎水性エアロゲル基材を用いた場合では＋３５％となった。ＴＣＰを使用した場合は、培地の酸素不足が原因で、アルブミン分泌活性が細胞培養日数の経過に伴って低下したものと考えられる。
【００９０】
以上より、基材を酸素透過性の高い疎水性エアロゲルで形成し、基材を通じで酸素を培地内に供給できるように細胞培養用部材を構築することで、細胞培養特性、特に、細胞培養において細胞の増殖性が損なわれることなく、細胞活性を向上できることがわかった。
【符号の説明】
【００９１】
１０：容器
１１：管体
１５：脚部
２０：基材
３０：培養液
４０：気体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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