(57)【要約】【課題】  抗炎症性サイトカインを持続的に産生するヒト間葉系幹細胞の製造方法を提供すること。【解決手段】  サイトカインの２つ以上の組み合わせ、若しくは、単独でヒト間葉系幹細胞を刺激することにより、同ヒト間葉系幹細胞の抗炎症性サイトカインの分泌を誘導させる。刺激を与えるサイトカインが少なくともIFN-γ、TNF-α、IL-27及び／またはIL-35を含む。抗炎症性サイトカインが少なくともIL-27を含む。前記細胞刺激に用いるサイトカインを添加した培養液を用いて一定時間培養することにより、同細胞を製造する。複数のサイトカイン刺激の組み合わせにより、抗炎症性サイトカインの産生はより亢進される。【選択図】    図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗炎症性サイトカインを持続的に産生するヒト間葉系幹細胞の製造方法であって、サイトカインの２つ以上の組み合わせ、若しくは、単独でヒト間葉系幹細胞を刺激することにより、同ヒト間葉系幹細胞の抗炎症性サイトカインの分泌を誘導させるヒト間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項２】
前記細胞刺激に用いるサイトカインは、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、TNF-β、LT-β、IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、IL-27、IL-30、IL-33、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-36Ra、IL-37、IL-38、G-CSF  及び／または  GM-CSFである請求項１記載のヒト間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項３】
前記細胞刺激に用いるサイトカインを添加した培養液を用いて一定時間培養する請求項１または２記載のヒト間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項４】
前記細胞刺激に用いるサイトカインの組み合わせがIFN-γおよびTNF-αである請求項１または３記載のヒト間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項５】
前記抗炎症性サイトカインがIL-1Ra、IL-4、IL-10、IL-27,IL-35、IL-36Ra、IL-37及びIL-38のいずれかまたはこれらのうちの２以上の組み合わせである請求項１、３または４のいずれかに記載のヒト間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項６】
前記細胞刺激に用いるサイトカインを添加した培養液を用いて一定時間培養した後、前記抗炎症性サイトカインの産生をリアルタイムRT-PCR(Q-PCR)及び／またはELISA（Enzyme-linked immuno-sorbent assay）により測定し確認する請求項１〜５のいずれかに記載のヒト間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項７】
前記ヒト間葉系幹細胞は、ヒト臍帯血由来、および、臍帯、胎盤または羊膜等のヒト胎児付属物由来である請求項１〜６のいずれかに記載のヒト間葉系幹細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト間葉系幹細胞の製造方法に関し、特に、抗炎症性サイトカインを持続的に産生するヒト間葉系幹細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞が組織再生にあたり、組織損傷部位に集積し、その再生/修復に寄与するという事実から、間葉系幹細胞が抗炎症性サイトカインを含む再生誘導因子を発現することが示唆されている。その最たる機能が免疫調節であり、間葉系幹細胞の持つ免疫調節能は、慢性炎症等の難治性自己免疫疾患の症状を緩和させることが認められている。そして、次の非特許文献１では、間葉系幹細胞の免疫調節能がどのように免疫担当細胞に作用し、また、どのように疾患の症状改善に繋がるのかについて紹介されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】秋山謙太郎他  間葉系幹細胞の新しい機能  Ann Jpn Prosthodont Soc 8 : 346-353, 2016  日本補綴歯科学会誌  第124 回学術大会／シンポジウム3「幹細胞研究の現状と将来展望」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
かかる従来の実情に鑑みて、ヒト間葉系幹細胞が、これまで報告にない抗炎症性サイトカインを分泌することで、免疫調節に関与するとの仮説に立ち、抗炎症性サイトカインを持続的に産生するヒト間葉系幹細胞の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するため、本発明に係るヒト間葉系幹細胞の製造方法の特徴は、抗炎症性サイトカインを持続的に産生するものであって、サイトカインの２つ以上の組み合わせ、若しくは、単独でヒト間葉系幹細胞を刺激することにより、同ヒト間葉系幹細胞の抗炎症性サイトカインの分泌を誘導させることにある。
【０００６】
同特徴において、前記サイトカインは、前記サイトカインは、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、TNF-β、LT-β、IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、IL-27、IL-30、IL-33、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-36Ra、IL-37、IL-38、G-CSF及び／または  GM-CSFである。
【０００７】
さらに上記各特徴において、前記刺激するサイトカインを添加した培養液を用いて一定時間培養するとよい。
【０００８】
さらに上記各特徴において、前記刺激するサイトカインの組み合わせがIFN-γおよびTNF-αである。
【０００９】
一方、上記各特徴において、前記抗炎症性サイトカインは、IL-1Ra、IL-4、IL-10、IL-27,IL-35、IL-36Ra、IL-37及びIL-38のいずれかまたはこれらのうちの２以上の組み合わせである。
【００１０】
また、上記各特徴において、前記刺激するサイトカインを添加した培養液を用いて一定時間培養した後、前記抗炎症性サイトカインの産生能をリアルタイムRT-PCR(Q-PCR)及び／またはELISA（Enzyme-linked immuno-sorbent assay）により測定し確認するとよい。
【００１１】
上記各特徴において、前記ヒト間葉系幹細胞は、ヒト臍帯血由来、および、臍帯、胎盤または羊膜等のヒト胎児付属物由来である。
【００１２】
代表的な抗炎症性サイトカインであるIL-27は、IL-6/IL-12ファミリーに属するサイトカインであり、Th17分化誘導を抑制することや関節リウマチや多発性硬化症を改善させることが報告されている。間葉系幹細胞もこれら自己免疫疾患に対して同様な作用を示すことから、IL-27がヒト間葉系幹細胞によるこの免疫調節の発現に関与しているとの仮説に立ち、以下の検討を行った。
【００１３】
まず、同間葉系幹細胞に各種サイトカイン刺激を行い、IL-27のサブユニットであるIL-27p28の遺伝子発現と、培養上清に含まれるIL-27の濃度を測定した。その結果、IFN-γ、TNF-α、IL-35といったサイトカイン刺激でIL-27p28の遺伝子発現とIL-27分泌が認められた。また、IL-27刺激によってもIL27p28遺伝子発現に伴ったIL-27が分泌されたことから、同間葉系幹細胞の機能発現が持続的なIL-27産生に伴うオートクライン作用によると考えられる。さらに、IFN-γ、TNF-α単独刺激だけでなく、共刺激することで相乗的なIL-27産生増強が観察された。
【発明の効果】
【００１４】
上記本発明に係るヒト間葉系幹細胞の製造方法の特徴によれば、抗炎症性サイトカインを持続的に産生し得るに至った。
【００１５】
本発明の他の目的、構成及び効果については、以下の発明の実施の形態の項から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】サイトカイン単独刺激によるIL-27p28の遺伝子発現（未刺激を１としたときの相対値）を示すグラフである。
【図２】各種サイトカイン単独刺激によるヒト臍帯血由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれるIL-27濃度（pg/mL）を示すグラフである。
【図３】炎症性サイトカイン刺激によるIL-27p28の遺伝子発現と共刺激による増強効果（未刺激を1としたときの相対値）を示すグラフである。
【図４】炎症性サイトカイン共刺激による同間葉系幹細胞のIL-27産生亢進（pg/mL）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
次に、適宜添付図面を参照しながら、本発明をさらに詳しく説明する。
【００１８】
（使用細胞）
実験にはヒト間葉系幹細胞として、臍帯血間葉系幹細胞（UCB-MSC）、または臍帯血間葉系幹細胞の細胞株（UCB408E6E7TERT-33）を用いた。
【００１９】
（製造方法（培養方法））
それぞれの濃度（濃度は図１〜４のグラフに記入）に調製したサイトカイン（炎症性サイトカイン（IFN-γ、TNF-α）または抗炎症性サイトカイン（IL-27, IL-35））を含む培養液に細胞を懸濁、その後培養容器に播種し、一定時間（２〜３日）培養を行った。
【００２０】
（測定用細胞の回収）
上記条件にて培養後、培養上清と細胞をそれぞれ回収する。培養上清は一定時間培養後、培養液を培養容器から完全に抜き取り、遠心分離機（10,000rpm, １分）で浮遊した死細胞を除去したものを4℃で保管する。残った細胞は細胞溶解液を加えて、-80℃に保管する。
【００２１】
（遺伝子発現の測定）
抗炎症性サイトカインIL-27の構成タンパクであるIL-27p28の遺伝子発現は、回収された細胞中のmRNAを用いてリアルタイムRT-PCR(Q-PCR)により定量化した。
【００２２】
まず、RNeasy Mini Kit（キアゲン社）を用いて、細胞溶解液からRNAを抽出する。その後、PrimeScript（商標） RT reagent Kit (TaKaRa bio社)を用いてcDNAへ逆転写させる。得られたcDNAを鋳型として、PCR酵素（KAPA SYBR（登録商標） Fast qPCRキット；日本ジェネティクス社）を用いて、リアルタイムPCR（インターカレーター法によるシグナル増幅）を行った。その際、Thermal Cycler DiceＩ（登録商標） Real Time System（TaKaRa bio社）を使用した。
【００２３】
得られたIL-27p28遺伝子の蛍光シグナルはΔΔCt法により計測した。IL-27p28遺伝子発現の定量化については、同遺伝子のシグナル値に対して、ハウスキーピング遺伝子であるHPRTを内部標準と置くことで、その相対的な遺伝子発現として算出されている。
【００２４】
（抗炎症性サイトカイン濃度の測定）
同間葉系幹細胞より分泌された抗炎症性サイトカインIL-27は、ELISAにより測定した。ELSIAに使用した抗体は、Human IL-27 DuoSet（登録商標） ELISA（R&Dsystems社）である。吸光度を測定する際にマイクロプレートリーダー（バオラッド社製：iMark）を使用した。
【００２５】
（実験結果）
図１はサイトカイン単独刺激によるIL-27p28の遺伝子発現（未刺激を１としたときの相対値）を示す図である。同図（ａ）は抗炎症性サイトカインIL-27、（ｂ）は抗炎症性サイトカインIL-35、（ｃ）は炎症性サイトカインIFN-γ、（ｄ）は炎症性サイトカインTNF-αを刺激因子として得られた測定結果である。IL-27のサブユニットであるIL-27p28の遺伝子発現の上昇が、上記各サイトカイン刺激により認められる。
【００２６】
図２は、サイトカイン単独刺激による培養上清中のIL-27濃度（pg/mL）を示すグラフである。
抗炎症性サイトカインIL-35、IL-27、炎症性サイトカインIFN-γ、TNF-αそれぞれの単刺激により、抗炎症性サイトカインIL-27の濃度上昇が認められる。
【００２７】
図３は、サイトカイン共刺激によるIL-27p28遺伝子発現の増強効果（未刺激を1としたときの相対値）を示すグラフである。IFN-γ、TNF-αそれぞれの単刺激に比較して、これら共刺激により、また用量依存的にIL-27p28の遺伝子発現増強が認められる。
【００２８】
図４は、サイトカイン共刺激によるIL-27産生亢進（pg/mL）を示すグラフである。IFN-γ、TNF-αそれぞれの単刺激に比較して、共刺激によりIL-27産生の亢進が認められる。
【００２９】
上記実験例以外に表示した炎症性サイトカイン及び抗炎症性サイトカインについても、同様の傾向が期待される。
【００３０】
上記以外の遺伝子発現については次のものを確認すればよい。
IL-1Ra遺伝子：IL1RN   IL-4遺伝子：IL4  IL-10遺伝子：IL10  IL-35遺伝子：IL12p35   IL-36Ra遺伝子：IL-36RN  IL-37遺伝子：IL37  IL-38遺伝子：IL1F10
【００３１】
上記細胞の出荷時においては、前記サイトカインを添加した培養液を用いて一定時間培養した後、前記抗炎症性サイトカインの産生をリアルタイムRT-PCR(Q-PCR)及び／またはELISA（Enzyme-linked immuno-sorbent assay）により測定し確認するとよい。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明は、他家移植及び自家移植の双方に実施することができる。他家移植の場合は、臍帯血バンク、または産婦人科や産科クリニック等の病院で採取されるヒト胎児付属物を細胞の原料とする。
【００３３】
提供においては、上記製造方法により製造された間葉系幹細胞を輸血バック等にて施術する病院に搬送し、主に点滴または注射にて患者へ投与する。本発明によれば、従来の間葉系幹細胞に比べ、抗炎症サイトカインがすでに誘導されているため、投与後の即効性が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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