(57)【要約】【課題】澱粉部分分解物を基質として利用でき、かつ耐熱性を有し工業的利用に適したα-１,６-グルコシル転移活性を有する酵素、当該酵素を有効成分とするα-１,６-グルカン製造用酵素剤、および該酵素または酵素剤を用いたα-１,６-グルカンの製造方法を提供することである。【解決手段】以下の(ａ)から(ｃ)のいずれかのタンパク質である、α-１,６-グルコシル転移活性を有する酵素を提供する。(ａ) 配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；(ｂ) 配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質；(ｃ) 配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。【選択図】図８Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(ａ)から(ｃ)のいずれかのタンパク質である、α-１,６-グルコシル転移活性を有する酵素。
(ａ) 配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(ｂ) 配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質；
(ｃ) 配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
更に、α-１,４-グルコシル転移活性を有する、請求項１に記載の酵素。
【請求項３】
サーモアナエロバクター・シデロフィラス（Thermoanaerobacter siderophilus）に由来し、下記の性質を有する酵素。
(1) α-１,６-グルコシル転移活性を有する；
(2) α-１,４-グルコシル転移活性を有する；
(3) ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより測定された分子量が８０〜９０ｋＤａである；
(4) 至適ｐＨが４．０〜５．０である；
(5) 安定ｐＨ範囲が３．５〜８．５である；
(6) 至適温度が５５℃〜６０℃である；
(7) 温度安定性は６０℃以下である。
【請求項４】
(8) 基質として、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、およびデキストリンに作用する、請求項３に記載の酵素。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の酵素を含む、α-１,４-グルコシド結合および／またはα-１,６-グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類からα-１,６-グルカンを製造するための酵素剤。
【請求項６】
α-１,４-グルコシド結合および／またはα-１,６-グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類が澱粉部分分解物である、請求項５に記載の酵素剤。
【請求項７】
前記α-１,６-グルカンが、重合度２から３０を有するイソマルトオリゴ糖および／またはイソマルトメガロ糖である、請求項５または６に記載の酵素剤。
【請求項８】
α-１,４-グルコシド結合および／またはα-１,６-グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類に、請求項１から４のいずれか一項に記載の酵素または請求項５から７のいずれか一項に記載の酵素剤を作用させて、α-１,６-グルカンを得る反応工程を含む、α-１,６-グルカンの製造方法。
【請求項９】
前記反応工程の前に、以下の工程を含む、請求項８に記載の製造方法。
澱粉を加水分解して、α-１,４-グルコシド結合および／またはα-１,６-グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類を得る工程。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の方法を実施してα-１,６-グルカンを得る工程、および前記工程で得られたα-１,６-グルカンを用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。
【請求項１１】
糖受容体と糖供与体に、請求項１から４のいずれか一項に記載の酵素、および／または請求項５から７のいずれか一項に記載の酵素剤を作用させる工程を含む、配糖体の製造方法。
【請求項１２】
糖供与体がマルトオリゴ糖である、請求項１１に記載の配糖体の製造方法。
【請求項１３】
糖受容体がアルコール性水酸基を有する化合物またはフェノール性水酸基を有する化合物である、請求項１１または１２に記載の配糖体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１１から１３のいずれか一項に記載の方法を実施して配糖体を得る工程、および前記工程で得られた配糖体を用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α-１,６-グルコシル転移活性を有する酵素、および該酵素を含むα-１,６-グルカンを製造するための酵素剤に関する。本発明は、α-１,４-グルコシド結合および／またはα-１,６-グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類に上記酵素または上記酵素剤を作用させて、α-１,６-グルカンを得る工程を含む、α-１,６-グルカンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ-グルコースが主としてα-１,６結合で構成された糖質（α-１,６-グルカン）は遅消化性および持続的消化性であることが報告されている（特許文献１）。遅消化性および持続的消化性の糖質は、摂取しても血糖値の上昇が緩やかであるため、例えば血糖値の急激な上昇を避ける必要のある糖尿病患者であっても利用できる糖質として有用である。また、α-１,６-グルカンのうち、重合度（ＤＰ）１０〜５０のイソマルトメガロ糖が、腸管バリア機能の亢進作用を有することが報告されている（特許文献２）。他にも、イソマルトメガロ糖鎖（ＤＰ１０〜１００）の両末端または非還元末端のみに、α-１,４結合で構成されたアンカー糖鎖を有するアンカー型イソマルトメガロ糖が、水難溶性化合物の溶解促進作用を有することが報告されている（特許文献３）。このように、α-１,６-グルカンは食品や医療などのさまざまな分野において、有用な糖質素材として期待されている。
【０００３】
α-１,６-グルカンの酵素的な製造方法としては、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）由来デキストランスクラーゼを用いる方法（特許文献４）、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）由来デキストリンデキストラナーゼを用いる方法（特許文献５、特許文献６）、パエニバシラス属（Paenibacillus sp.）に属する５９８Ｋ株由来のデキストラングルカナーゼを用いる方法（特許文献７）が開示されている。
【０００４】
しかし、上記デキストランスクラーゼを用いる製造方法では、原料糖質であるスクロースのグルコース部分しか利用されないため、対糖デキストラン収率が５０％を超えることはないという問題があった。デキストリンデキストラナーゼとデキストラングルカナーゼは澱粉部分分解物を基質とできるものの、従来のデキストリンデキストラナーゼは４５℃まで、デキストラングルカナーゼは５０℃までしか安定的でなかった（非特許文献１および２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１６／０４７６１６
【特許文献２】特開２０１５−２０５８５６号公報
【特許文献３】特開２０１７−１１４９４３号公報
【特許文献４】特開平８−１７３１７８号公報
【特許文献５】特開２００１−２５８５８９号公報
【特許文献６】特開２００７−１８１４５２号公報
【特許文献７】特開２０１２−０９５６０６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Masayuki Suzuki, et al., J. Appl. Glycosci., 46, p469-473, 1999.
【非特許文献２】Ichinose Hitomi, et al., Appl.Microbiol Biotechnol., 101, p4115-4128, 2017.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一般に耐熱性酵素は通常の酵素に比べ物理化学的安定性に優れており、工業的規模での使用に適していると言われている。しかし、澱粉部分分解物に作用し、α-１,６-グルコシル転移活性を示す耐熱性酵素は知られていなかった。このため、工業的規模での使用に適した耐熱性を有するα-１,６-グルコシル転移活性を有する酵素が求められていた。
【０００８】
本発明の課題は、原料（基質）として澱粉部分分解物を利用し、かつ耐熱性を有し工業的規模での使用に適したα-１,６-グルコシル転移活性を有する酵素、当該酵素を有効成分とするα-１,６-グルカン製造用酵素剤、および該酵素または酵素剤を用いたα-１,６-グルカンの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、従来のα-１,６-グルコシル転移活性を有する酵素と比べて、より耐熱性を有するα-１,６-グルコシル転移活性を有する酵素を見出し、本発明を完成させるに至った。本発明はこの知見に基づくものである。
【００１０】
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］以下の(ａ)から(ｃ)のいずれかのタンパク質である、α-１,６-グルコシル転移活性を有する酵素。
(ａ) 配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(ｂ) 配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質；
(ｃ) 配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
［２］更に、α-１,４-グルコシル転移活性を有する、［１］に記載の酵素。
【００１１】
［３］サーモアナエロバクター・シデロフィラス（Thermoanaerobacter siderophilus）に由来し、下記の性質を有する酵素。
(1) α-１,６-グルコシル転移活性を有する；
(2) α-１,４-グルコシル転移活性を有する；
(3) ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより測定された分子量が８０〜９０ｋＤａである；
(4) 至適ｐＨが４．０〜５．０である；
(5) 安定ｐＨ範囲が３．５〜８．５である；
(6) 至適温度が５５℃〜６０℃である；
(7) 温度安定性は６０℃以下である。
［４］(8) 基質として、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、およびデキストリンに作用する、［３］に記載の酵素。
【００１２】
［５］［１］から［４］のいずれか一に記載の酵素を含む、α-１,４-グルコシド結合および／またはα-１,６-グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類からα-１,６-グルカンを製造するための酵素剤。
［６］α-１,４-グルコシド結合および／またはα-１,６-グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類が澱粉部分分解物である、［５］に記載の酵素剤。
【００１３】
［７］上記α-１,６-グルカンが、重合度２から３０を有するイソマルトオリゴ糖および／またはイソマルトメガロ糖である、［５］または［６］に記載の酵素剤。
［８］α-１,４-グルコシド結合および／またはα-１,６-グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類に、［１］から［４］いずれか一に記載の酵素または［５］から［７］のいずれか一に記載の酵素剤を作用させて、α-１,６-グルカンを得る反応工程を含む、α-１,６-グルカンの製造方法。
［９］上記反応工程の前に、以下の工程を含む、［８］に記載の製造方法。
澱粉を加水分解して、α-１,４-グルコシド結合および／またはα-１,６-グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類を得る工程。
［１０］［８］または［９］に記載の方法を実施してα-１,６-グルカンを得る工程、および上記工程で得られたα-１,６-グルカンを用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。
【００１４】
［１１］糖受容体と糖供与体に、［１］から［４］のいずれか一に記載の酵素、および／または［５］から［７］のいずれか一に記載の酵素剤を作用させる工程を含む、配糖体の製造方法。
［１２］糖供与体がマルトオリゴ糖である、［１１］に記載の配糖体の製造方法。
［１３］糖受容体がアルコール性水酸基を有する化合物またはフェノール性水酸基を有する化合物である、［１１］または［１２］に記載の配糖体の製造方法。
［１４］［１１］から［１３］のいずれか一に記載の方法を実施して配糖体を得る工程、および上記工程で得られた配糖体を用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、α-１,６-グルコシル転移活性を有する新規酵素を提供することができる。本発明によれば、従来のα-１,６-グルコシル転移活性を有する酵素と比較して、幅広い温度域で安定的に作用するα-１,６-グルコシル転移活性を有する酵素を用いて、α-１,６-グルカンを製造することができる。本発明によれば、原料（基質）として澱粉加水分解物を用いてα-１,６-グルカンを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】サーモアナエロバクター・シデロフィラス由来の仮想タンパク質のアミノ酸配列。下線部は、Ｎ末端側から７５３〜１５５９番目のアミノ酸である。
【図１Ｂ】サーモアナエロバクター・シデロフィラス由来の仮想タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列。下線部は、図１Ａのアミノ酸配列のＮ末端側から７５３〜１５５９番目のアミノ酸をコードする部分である。
【図１Ｃ】サーモアナエロバクター・シデロフィラス由来の仮想タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列（図１Ｂのつづき）。
【図２】サーモアナエロバクター・シデロフィラス由来の仮想タンパク質の推定的ドメイン構造。
【図３】サーモアナエロバクター・シデロフィラス由来の変異酵素△（１〜７５２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。Ｍ：分子量マーカー、Ｓ：枯草菌の菌体外上清。変異酵素△（１〜７５２）のバンドを矢印で示す。
【図４】変異酵素△（１〜７５２）の活性に対するｐＨと温度の影響。（ａ）黒丸（●）は最大酵素活性を１００％（ｐＨ４．５）としたときの、各ｐＨにおける相対活性（％）を示し、白丸（○）は各ｐＨ（ｐＨ３．０〜１１．０）で４℃２４時間保持した後の残存活性（％）を示す。（ｂ）黒丸（●）は最大酵素活性を１００％（温度６０℃）としたときの、各温度における相対活性（％）を示し、白丸（○）は各温度で１５分間保持した後の残存活性（％）を示す。
【図５】変異酵素△（１〜７５２）の反応生成物のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析。各基質は、（ａ）マルトース（Ｇ２）、（ｂ）マルトトリオース（Ｇ３）、（ｃ）マルトテトラオース（Ｇ４）、（ｄ）マルトペンタオース（Ｇ５）、（ｅ）イソマルトース（ＩＧ２）および（ｆ）イソマルトトリオース（ＩＧ３）である。各基質ごとに、上から、標準試料（ｓｔｄ）、酵素反応時間０分の試料（0 min）、３分の試料(3 min)、９分の試料(9min)、および１５分の試料(15 min)のクロマトグラムを示す。Ｇｌｃ:グルコース、Ｐａｎ：パノース、Ｂ４：６3−Ｏ−α−Ｄ−グルコシルマルトトリオース、ＩＰａｎ：イソパノース、Ｇ６：マルトヘキサオース。
【図６】変異酵素△（１〜７５２）の酵素反応生成物のＴＬＣ分析。基質は、マルトペンタオース（Ｇ５）である。シート写真の下部に記載した「ＧＡ」について、「−」はグルコアミラーゼ処理していない試料を示し、「＋」グルコアミラーゼ処理した試料を示す。「ｈ」についての数字０、１、６、２４、４８および９６は、変異酵素△（１〜７５２）と基質の反応時間を示す。
【図７Ａ】原料Ｇ６７  ｒｉｃｈシラップのＨＰＬＣ分析のクロマトグラム。クロマトグラムに記載した数字６〜８は、その数字を付したピークが重合度６〜８の糖類によるものであることを示す。
【図７Ｂ】Ｇ６７  ｒｉｃｈシラップを原料とした反応生成物のＨＰＬＣ分析。反応生成物７−１（＃１）のクロマトグラムである。クロマトグラムに記載した数字１〜１３は、その数字を付したピークが重合度１〜１３の糖類によるものであることを示す。なお、澱粉加水分解物のクロマトデータのピークから、保持時間約３０分に重合度３０の糖類が検出されることが分かっているため、重合度１４の糖類によるピーク（保持時間５２．５３７分）から保持時間３０分までのエリアを「１４〜３０」の重合度の糖類によるものとした。
【図７Ｃ】Ｇ６７  ｒｉｃｈシラップを原料とした反応生成物のＨＰＬＣ分析。反応生成物７−１（＃１）から７−５（＃５）のクロマトグラムである。添加した酵素濃度は、（＃１）６２．５、（＃２）１２５、（＃３）２５０、（＃４）５００、（＃５）１０００μＬ／ｇ−ＤＳである。＃１は、図７Ｂと同じものである。＃２から＃５のクロマトグラムでも、右端のピークから順に、重合度１、２、３などのピークであり、特に重合度１および１０の糖類によるピークに、それぞれ数字１および１０を記載して重合度を示した。
【図８Ａ】パインデックス＃１のＨＰＬＣ分析のクロマトグラム。
【図８Ｂ】パインデックス＃１を原料とした反応生成物のＨＰＬＣ分析。反応生成物８−１（＃１）のクロマトグラムである。クロマトグラムに記載した数字１〜１６は、その数字を付したピークが重合度１〜１６の糖類によるものであることを示す。なお、澱粉加水分解物のクロマトデータのピークから、保持時間約３０分に重合度３０の糖類が検出されることが分かっているため、重合度１７の糖類によるピーク（保持時間４７．７３０分）から保持時間３０分までのエリアを「１７〜３０」の重合度の糖類によるものとした。
【図８Ｃ】パインデックス＃１を原料とした反応生成物のＨＰＬＣ分析。反応生成物８−１（＃１）から８−６（＃６）のクロマトグラムである。添加した酵素の組成は、表７に示す。＃１は、図８Ｂと同じものである。＃２から＃６のクロマトグラムでも、右端のピークから順に、重合度１、２、３などのピークであり、特に重合度１および１０の糖類によるピークに、それぞれ数字１および１０を記載して重合度を示した。
【図８Ｄ】パインデックス＃１を原料とした反応生成物のデキストラナーゼ処理後のＨＰＬＣ分析。デキストラナーゼ処理後の試料＃１から＃６のクロマトグラムである。いずれのクロマトグラムでも、重合度１のピークは明らかでなく、右側の最も高いピークから順に重合度２、３、４などのピークである。特に重合度２の糖類によるピークに、数字２を記載して重合度を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に記載する本発明の説明は、代表的な実施形態や具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。なお、本明細書において「〜」を用いて表される数値範囲は「〜」の前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。また、本発明に記載される重合度（ＤＰ）は、これらグルコシド結合の種類に関係なく、構成糖であるグルコースの重合度を意味する。本発明の酵素による反応生成物の糖組成（％）は、ＨＰＬＣで検出されたピークの総面積を１００とした場合の、各糖類に対応するピークの面積比率（％）として算出したものである。
【００１８】
（酵素および酵素剤）
本発明のα-１,６-グルコシル転移活性を有する酵素は、以下の(ａ)から(ｃ)のいずれかのタンパク質である。
(ａ) 配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(ｂ) 配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質；
(ｃ) 配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００１９】
配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、好熱性細菌サーモアナエロバクター・シデロフィラス（Thermoanaerobacter siderophilus）のゲノム情報から取得した配列番号１に記載のアミノ酸配列の１〜７５２番目のアミノ酸を欠失したものであり、７５３〜１５５９番目のアミノ酸からなる。ここで、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅファミリーとアノテーションされている配列を含むものの、その具体的活性は未知の仮想タンパク質である。当該サーモアナエロバクター・シデロフィラス由来の仮想タンパク質は、Ｎ末端側から順に、ＧＨ６６触媒ドメイン、糖結合モジュールＣＢＭ３５、およびＧＨ１５触媒ドメインを含むマルチドメインタンパク質である（図２）。配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ＧＨ６６触媒ドメインを含まないが、糖結合モジュールＣＢＭ３５およびＧＨ１５触媒ドメインを含む。本発明のタンパク質は、糖結合モジュールＣＢＭ３５およびＧＨ１５触媒ドメインを含み、すなわち配列番号１に記載のアミノ酸配列の７５３〜１５１２番目のアミノ酸を含むものであることができる。Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅファミリーの活性ドメインが２つ連なった配列はあまり知られておらず、上記仮想タンパク質の実際の活性、タンパク質全体としての機能や２つの活性ドメインの相互作用は分かっていない。そのため、２つの活性ドメインの一方のみを発現させたとしても、酵素として機能するかは不明であった。
【００２０】
本発明者らは、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、α-１,６-グルコシル転移活性を有することを発見した。ここで、α-１,６-グルコシル転移活性を有する酵素とは、糖転移反応により、α-１,６-グルコシド結合を形成する反応を触媒する酵素を意味する。α-１,６-グルコシル転移活性の評価は、酵素を、マルトース、イソマルトースまたはイソマルトトリオースのいずれかを基質として反応させ、得られた反応生成物において、基質からα-１,６結合でグルコースを転移伸長した糖を検出することにより行われる。
【００２１】
本発明の酵素は、α-１,６-グルコシル転移活性のほかに、α-１,４-グルコシル転移活性を有することができる。ここで、α-１,４-グルコシル転移活性は、α-１,４-グルコシド結合を形成する糖転移反応を触媒する活性である。α-１,４-グルコシル転移活性の評価は、酵素を、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、またはマルトペンタオースのいずれかを基質として反応させ、得られた反応生成物において、基質からα-１,４結合でグルコースを転移伸長した糖を検出することにより行われる。本酵素は、α-１,４-／α-１,６-グルコシド結合加水分解活性をさらに有することができるが、α-１,４-グルコシド結合加水分解活性の発現は限定的である。ここで、α-１,４-／α-１,６-グルコシド結合加水分解活性は、それぞれα-１,４-／α-１,６-グルコシド結合を切断する加水分解反応を触媒する活性である。
【００２２】
本発明の酵素では、通常、生成物のアノマー型が基質に対して保持される（アノマー保持型）。本発明の酵素は、基質の種類や濃度、反応時間に応じて、主として発現する活性が異なる場合がある。本発明の酵素は、例えば、基質がマルトオリゴ糖（例えば、重合度３から５の糖類）である場合には、反応初期（例えば、本明細書の実施例に記載した条件では、反応時間が１５分から１時間程度）には、α-１,６-グルコシル転移活性よりも、α-１,４-グルコシル転移活性が強く発現する場合がある。本発明の酵素は、基質がマルトオリゴ糖であっても、反応時間が長くなると（例えば、本明細書の実施例に記載した条件では、反応時間が１時間以上）、α-１,６-グルコシル転移活性が主として発現する場合がある。
【００２３】
また、配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して、７０％以上、８０％以上、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα-１,６-グルコシル転移活性を示すタンパク質も本発明に係る酵素に含まれる。アミノ酸配列同一性は、比較する２本のアミノ酸配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならばギャップを導入した後、２本のアミノ酸配列間で同一であるアミノ酸残基のパーセントとして定義される。アミノ酸配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより決定することができる。
【００２４】
さらには、配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質からなり、且つα-１,６-グルコシル転移活性を有するタンパク質も本発明に係る酵素に含まれる。本明細書で言う「１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
本発明の酵素の製造方法については、後述の＜酵素の製造＞を参照されたい。
【００２５】
本発明の酵素は、サーモアナエロバクター・シデロフィラス（Thermoanaerobacter siderophilus）に由来し、下記の性質を有する酵素である。
(1) α-１,６-グルコシル転移活性を有する；
(2) α-１,４-グルコシル転移活性を有する；
(3) ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより測定された分子量が８０〜９０ｋＤａである；
(4) 至適ｐＨが４．０〜５．０である；
(5) 安定ｐＨ範囲が３．５〜８．５である；
(6) 至適温度が５５℃〜６０℃である；
(7) 温度安定性は６０℃以下ある。
【００２６】
本発明の酵素は、更に、以下の性質を有する。
(8)基質として、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、およびデキストリンに作用する。
【００２７】
本酵素が有するα-１,６-グルコシル転移活性は、本発明の酵素を、マルトース、イソマルトース、またはイソマルトトリオースのいずれかを基質として反応させ、得られた反応生成物において、基質からα-１,６結合でグルコースを転移伸長した糖を検出することにより決定される。本酵素が有するα-１,４-グルコシル転移活性は、本発明の酵素を、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、またはマルトペンタオースのいずれかを基質として反応させ、得られた反応生成物において、基質からα-１,４結合でグルコースを転移伸長した糖を検出することにより決定される。
【００２８】
本酵素はα-１,６-グルコシド結合加水分解活性を有することができる。本酵素が有するα-１,６-グルコシド結合加水分解活性は、本発明の酵素を、イソマルトテトラオース、イソマルトペンタオース、イソマルトヘキサオース、またはデキストランのいずかを基質として反応させ、グルコースを検出することにより決定される。
【００２９】
本酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定される分子量が８０〜９０ｋＤａである。なお、本明細書では、分子量は、プラスミドに組み換えて、枯草菌を宿主細胞として発現分泌させたタンパク質について表わしている。実施例２において８０〜９０ｋＤａと測定された本酵素は、Ｃ末端側にＨｉｓ-Ｔａｇ（ヒスチジン６個付加）を有し、且つ推定１７アミノ酸よりなる分泌シグナルが切断されたタンパク質である。タンパク質が菌体外に分泌される際、分泌シグナルは切断されるが、その切断部位については多少ずれる場合がある。実際の切断部位については確認していないが、シグナルペプチド予測サーバーＳｉｇｎａｌＰ４．１（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）により予測された切断部位のスコアが高いアミノ酸から数アミノ酸程度の範囲で切断されていると推測される。本発明の好ましい実施態様において、本発明の酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定される分子量が７５〜９２ｋＤａである。本発明のより好ましい実施態様において、本発明の酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定される分子量が８０〜９０ｋＤａである。
【００３０】
本発明の酵素は、温度３７℃で測定した場合、ｐＨ４．５で最大活性を示し、至適ｐＨは４．０〜５．０である。また、本酵素は、温度４℃で２４時間保持する試験において、ｐＨ３．５〜８．５で安定であった。なお、至適ｐＨおよびｐＨ安定性は、マルトース分解活性を、実施例４に示す条件で測定したものである。
【００３１】
本発明の酵素は、ｐＨ４．５で測定した場合、温度６０℃で最大活性を示し、至適温度５５℃〜６０℃である。また、本酵素は、ｐＨ４．５で１５分保持した試験において、６０℃以下で安定であった。なお、至適温度および温度安定性は、マルトース分解活性を、実施例４に示す条件で測定したものである。本酵素の至適ｐＨおよび温度並びにｐＨおよび温度安定性は、マルトースを基質としたグルコース生成量に基づき測定するマルトース分解活性を、測定したものである。本酵素では、マルトースのグルコースへの分解は、α-１,４-グルコシル転移反応、α-１,６-グルコシル転移反応、およびα-１,４-グルコシド結合加水分解反応によって起きる可能性がある。また、α-１，４グルコシル転移活性、α-１,６-グルコシル転移活性およびα-１，４-グルコシド結合加水分解活性は、おおよそ同じ触媒部位が関わっていると考えられるため、いずれも同様の反応特性（至適ｐＨおよび温度並びにｐＨおよび温度安定性）を示すと考えられるため、反応特性の評価にマルトース分解活性を用いた。
【００３２】
従来のα-１,６-グルコシル転移活性を有する酵素、例えばグルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）由来デキストリンデキストラナーゼは、ｐＨ５．２および温度３８℃で最大活性を示し、温度安定性を示すのは４５℃以下である。さらに、パエニバシラス属（Paenibacillus sp.）に属する５９８Ｋ株由来のデキストラングルカナーゼが温度安定性を示すのは５０℃以下である。このように、本発明の酵素は、従来のα-１,６-グルコシル転移活性を有する酵素と比較して、より高い耐熱性を示し、工業的規模での使用に適した安定性を有している。
【００３３】
本発明の酵素は、基質として、これらに限定されないが、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、およびデキストリンに作用することができる。
【００３４】
本発明の酵素剤は、本発明のα-１,６-グルコシル転移活性を有する酵素を含み、α-１,４-グルコシド結合および／またはα-１,６-グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類からα-１,６-グルカンを製造するための酵素剤である。すなわち、本発明の酵素剤を、酵素のα-１,６-グルコシル転移活性の発現に好適な条件下、反応液中で、α-１,４-グルコシド結合および／またはα-１,６-グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類と接触させることにより、酵素のα-１,６-グルコシル転移作用により、α-１,６結合でグルコースが転移伸長され、α-１,６-グルカンが得られる。
【００３５】
本発明の基質である、α-１,４-グルコシド結合および／またはα-１,６-グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類の例として、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖およびデキストリンを挙げることができる。本明細書において、「オリゴ糖」は、単糖分子がグルコシド結合によって２〜１０個結合した糖類を意味し、「多糖類」は、単糖分子がグルコシド結合によって、多数個、具体的には１０個より多く重合した糖類を意味する。マルトオリゴ糖は、グルコースがα-１,４結合で結合した重合度２から１０の糖類であり、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースなどがある。イソマルトオリゴ糖は、グルコースがα-１,４結合およびα-１,６結合で結合したもの、並びにグルコースがα-１,６結合のみで結合したもので、重合度２から１０の糖類であり、イソマルトース、パノース、イソマルトトリオース、イソマルトテトラオース、イソパノースなどがある。デキストリンは、澱粉を部分的に加水分解することにより得られ、α-１,４結合およびα-１,６結合でグルコースが結合された多様な重合度の糖類の混合物として得られる。一般に、デキストロース当量（ＤＥ）が１０以上２０以下の範囲をマルトデキストリン、ＤＥが１０未満をデキストリンと区別する場合があるが、本明細書で使用する場合「デキストリン」は、ＤＥの範囲にかかわらず、澱粉を低分子化したものを意味し、マルトデキストリンを含む用語として使用する。
【００３６】
本発明の酵素または酵素剤を用いてα-１,６-グルカンを生成する場合、澱粉部分分解物を原料として利用することができる。澱粉部分分解物は、主としてデキストリンであり、その一部にマルトオリゴ糖およびイソマルトオリゴ糖を含むからである。澱粉部分分解物は、澱粉を酸または酵素により加水分解し、必要に応じて分離精製することで得ることができる。
【００３７】
本発明の酵素または酵素剤を用いて生成されるα-１,６-グルカンは、グルコースを構成糖とするグルコース重合度２以上のオリゴ糖または多糖類であって、α-１,６-グルコシド結合を有するものである。すなわち、α-１,６-グルカンは、α-１,６結合のほかに、α-１,２-、α-１,３-、およびα-１,４-グルコシド結合を有していてもよい。本発明のα-１,６-グルカンの詳細については、後述する。
【００３８】
（α-１,６-グルカンの製造方法）
本発明のα-１,６-グルカンの製造方法は、α-１,４-グルコシド結合および／またはα-１,６-グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類に、本発明の酵素または酵素剤を作用させて、α-１,６-グルカンを得る反応工程を含む。すなわち、本発明の酵素または酵素剤を、酵素のα-１,６-グルコシル転移活性の発現に好適な条件下、反応液中で、α-１,４-グルコシド結合および／またはα-１,６-グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類と接触させることにより、酵素のα-１,６-グルコシル転移作用により、α-１,６結合でグルコースが転移伸長され、α-１,６-グルカンを製造することができる。
【００３９】
本発明のα-１,６-グルカンの製造方法で使用する基質であるα-１,４-グルコシド結合および／またはα-１,６-グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類の例として、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖およびデキストリンを挙げることができる。マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖およびデキストリンの説明は、前述のとおりである。マルトオリゴ糖およびイソマルトオリゴ糖は高純度の試薬レベルのものであっても、マルトオリゴ糖シラップのように純度の低いものであってもよい。本発明に使用できるマルトオリゴ糖として、これらに制限されないが、フジオリゴ♯３６０、フジオリゴ♯４５０（日本食品化工）などが挙げられる。また、本発明に使用できるイソマルトオリゴ糖として、これらに制限されないが、イソマルト５００、イソマルト９００（昭和産業）などが挙げられる。また、本発明に使用できるデキストリンとして、これらに制限されないが、パインデックス♯１、パインデックス♯２、パインデックス♯４、パインデックス♯６、パインデックス♯１００（松谷化学工業）などが挙げられる。基質濃度は、反応液中の０．１〜４０％（ｗ／ｗ）の範囲であることができるが、これに制限されない。基質濃度は高い方が、糖転移活性が高まるため、より高濃度のα-１,６-グルカンを得るという観点からは、基質濃度は高い方が好ましい。また一般的に、酵素は基質存在下で耐熱性が向上する観点からも、基質濃度は高い方が好ましい。
【００４０】
本発明のα-１,６-グルカンの製造方法は、必要に応じて、上記の反応工程の前に、澱粉を加水分解して、α-１,４-グルコシド結合および／またはα-１,６-グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類を得る工程を含むことができる。本工程では、澱粉を常法により、酸または酵素により加水分解し、必要に応じて分離精製することにより、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖およびデキストリンが得られるが、これらがα-１,４-グルコシド結合および／またはα-１,６-グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類である。本工程では、澱粉の加水分解の程度を適宜調製することができる。分解の程度は、デキストロース当量（ＤＥ）で示すことができる。本工程の澱粉の加水分解物のＤＥは、これに制限されないが、２〜７０であればよく、後の反応工程で製造することが望まれるα-１,６-グルカンの重合度に適したＤＥに調製することができる。
また、澱粉加水分解物としては、短鎖長アミロースを使用することができる。
【００４１】
本発明の製造方法では、重合度２〜３０のα-１,６-グルカンを製造することができる。重合度２〜３０のα-１,６-グルカンは、重合度２〜３０のα-１,６-グルカンを多く含む糖類の混合物として製造される。この混合物の組成は、さまざまな反応条件、例えば、基質の種類や濃度、反応時間、その他の酵素を使用するか否か、使用する場合にはその酵素の種類により、変動する。好ましい実施形態において、本発明で製造されたα-１,６-グルカンの組成は、ＤＰ３〜３０の糖類が７０％以上であり、特に８０％以上であることができる。好ましい実施形態において、本発明で製造されたα-１,６-グルカンの組成は、ＤＰ１０〜３０の糖類が３０％以上であることができ、特に４０％以上であることができ、さらには５０％以上であることができる。
【００４２】
本発明で製造することができるα-１,６-グルカンは、イソマルトオリゴ糖および／またはイソマルトメガロ糖であってもよい。イソマルトオリゴ糖は、グルコースがα-１,６結合を含む結合様式で結合した重合度２から１０の糖類であり、イソマルトメガロ糖は、グルコースがα-１,６結合を含む結合様式で結合した重合度が１０〜１００の糖類である。本発明で製造することができるα-１,６-グルカンは、特に、重合度２〜３０のイソマルトオリゴ糖および／またはイソマルトメガロ糖であることが好ましい。本発明の酵素または酵素剤を使用し、基質の種類および濃度や反応条件などを調節することにより、所望の重合度を有するイソマルトオリゴ糖および／またはイソマルトメガロ糖を製造することができる。
【００４３】
好ましい実施形態において、本発明の製造方法では、重合度１０〜３０の糖類の含有割合が高いα-１,６-グルカンを製造することができる。この場合の基質は、重合度２〜１０のマルトオリゴ糖またはイソマルトオリゴ糖が好ましく、特に重合度５〜１０のマルトオリゴ糖またはイソマルトオリゴ糖がより好ましい。好ましい別の実施形態において、本発明の製造方法では、デキストリンを基質として使用することにより、重合度１０〜３０の糖類の含有割合が高いα-１,６-グルカンを製造することができる。この場合の基質は、ＤＥ３〜３０程度のデキストリンが好ましく、ＤＥ４〜２０程度のデキストリンがより好ましい。好ましいさらに別の実施形態において、本発明の製造方法では、重合度２〜１０の糖類の含有割合が高いα-１,６-グルカンを製造することができる。
【００４４】
本発明の製造方法の反応工程では、本発明の酵素または酵素剤と、その他の酵素を併用することができる。その他の酵素は、これに制限されないが、酵素の基質となりうる澱粉部分分解物を増加させ、α-１,６結合によるグルコース転移伸長の効率とα-１,６-グルカンの収率を高めるために、本発明の酵素または酵素剤と併用することができる。
【００４５】
その他の酵素は、これに制限されないが、α-１,４-グルコシド結合および／またはα-１,６-グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類のα-１,４結合やα-１,６結合を切断するために使用することができる。特に、澱粉部分分解物の分解の程度が低い場合に、重合度が高い糖類のα-１,４結合やα-１,６結合を切断するために使用することができる。本発明は特定の理論に限定されるものではないが、澱粉部分分解物のα-１,４結合やα-１,６結合の切断により、本酵素の基質となりうる澱粉部分分解物が増加し、本酵素のα-１,６結合によるグルコース転移伸長が効率よく生じると考えられるためである。
【００４６】
その他の酵素としては、例えばα-アミラーゼ、イソアミラーゼ、および／またはプルラナーゼを挙げることができるが、これらに制限されない。本発明に用いるα-アミラーゼ、イソアミラーゼ、およびプルラナーゼの起源や調整方法などは特に限定されるものではない。α-アミラーゼは、澱粉などのα-１,４結合を切断して、多糖、オリゴ糖、マルトースに分解する酵素であり、イソアミラーゼは、澱粉などのα-１,６結合を切断する酵素であり、プルラナーゼはプルラン（α-１,４結合、α-１,４結合およびα-１,６結合の繰り返しを含む多糖類）のα-１,６結合を切断する酵素である。本発明の酵素と上記その他の酵素を併せて澱粉部分分解物に作用させることで、効率よくかつ高い収率でα-１,６-グルカンを得ることができる。
【００４７】
上記反応工程で使用する本発明の酵素、並びに併用する場合にはα-アミラーゼ、イソアミラーゼおよび／またはプルラナーゼの反応液中の各濃度(ユニット数)は、基質である澱粉部分分解物の種類（すなわち、分解の程度）や反応液中の濃度、さらには反応時間の長さ等を考慮して適宜決定することができる。また、その他の酵素を併用する場合には、本発明の酵素、α-アミラーゼ、イソアミラーゼおよびプルラナーゼの濃度比率も、基質である澱粉部分分解物の種類や各酵素の起源や性能に応じて適宜決定することができる。
【００４８】
上記反応工程の反応温度は、本発明の酵素が安定的に作用する温度域であれば、特に制限はない。α-１,６-グルカンの合成効率を高めるためには、本発明のα-１,６-グルコシル転移活性を有する酵素がより効率よく作用する温度域に、反応温度を設定することが好ましい。本発明のα-１,６-グルコシル転移活性を有する酵素はｐＨ３.５〜８.０の範囲であれば、少なくとも６０℃以下の温度で安定である。従って、本酵素を使用する反応系の温度は、例えば、３５〜６０℃といった幅広い温度域に設定することができる。工業的規模の反応系では正確な温度管理が難しい場合があるが、本酵素は、幅広い温度域で安定的に使用できる点で有利である。
【００４９】
上記反応工程は、反応温度３５〜６０℃で行うことができるが、４０〜６０℃が好ましく、５０〜６０℃がより好ましい。本発明の酵素は、高い温度安定性を示し、温度範囲５０〜６０℃においても、高い活性を示すためである。
【００５０】
また、上記反応工程の反応温度は、その他の酵素を併用する場合には、本発明の酵素、並びにα-アミラーゼ、イソアミラーゼおよび／またはプルラナーゼが安定に作用する温度域であればよい。上記のとおり、本発明の酵素は幅広い温度域で安定性を有するため、併用するその他の酵素が安定に活性化する温度を勘案して、反応系で使用するすべての酵素の活性が十分に利用できる範囲に、温度設定ができる場合が多い。
【００５１】
反応温度は、反応時間の全体を通して一定である必要はなく、反応時間の初期に併用するその他の酵素の活性を高めることが望ましい場合には、その酵素の活性が高くなる温度域に、反応初期の温度を設定し、反応時間の中期や後期には、本発明の酵素の活性が高くなる温度域に温度を設定するなど、適宜調整することができる。
【００５２】
上記反応工程の反応時間は、反応温度や基質の濃度、その他の酵素を併用する場合には使用する酵素の活性等を考慮して適宜決定できる。本発明の酵素および酵素剤は、反応初期（例えば、本明細書の実施例に記載した条件では、反応時間が１５分から１時間程度）では、α-１,６転移活性よりも、α-１,４転移活性が強く発現する場合がある。一方で、反応中期では（例えば、本明細書の実施例に記載した条件下では、反応時間が１時間以上）α-１,６転移活性が強く発現する場合がある。一方で、反応後期（例えば、本明細書の実施例に記載した条件では、反応時間が６時間以上）では、加水分解活性が強く発現する場合がある。本分野の従来技術に基づいて、α-１,６-グルカンを製造するための、好適な反応時間を適宜決定することができる。
【００５３】
上記反応工程の反応により、α-１,６-グルカンを含む水溶液が得られる。この水溶液から、エタノールなどを用いた有機溶媒による沈殿法、クロマト分画法や限外濾過膜による処理などを用いることによりα-１,６-グルカンを精製することができる。これらの方法は、単独の操作によって、またはいくつかの操作を組み合わせることにより、より効率的にα-１,６-グルカンを精製することができる。
【００５４】
本発明の食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法は、本発明のα-１,６-グルコシル転移活性を有する酵素を、α-１,４-グルコシド結合および／またはα-１,６-グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類に作用させて、α-１,６-グルカンを製造して、α-１,６-グルカンを得る工程、および上記工程で得られたα-１,６-グルカンを用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含むことができる。
【００５５】
本発明のα-１,６-グルコシル転移活性を有する酵素を、α-１,４-グルコシド結合および／またはα-１,６-グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類に作用させて、α-１,６-グルカンを製造して、α-１,６-グルカンを得る工程は、上述のα-１,６-グルカンの製造方法に基づいて実施することができる。
【００５６】
上記工程で得られたα-１,６-グルカンを用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程では、本発明のα-１,６-グルカンを原料の一つとして、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を製造すること、またはα-１,６-グルカンそのものを適当な形態（粉末、液体など）に調製し、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品として提供することができる。
【００５７】
本発明の配糖体を製造する方法は、糖受容体と糖供与体に、本発明の酵素又は酵素剤を作用させる工程を含む、配糖体の製造方法である。なお、糖受容体と糖供与体に本発明の酵素を発現する微生物を作用させてもよい。糖供与体と糖受容体を含む溶液に本酵素を作用させることにより、糖受容体にグリコシル基が少なくとも一つ転移した配糖体を作製することができる。本発明の配糖体を製造する方法は、上述のα-１,６-グルカンの製造方法に基づき反応温度やｐＨを適宜設定して実施することができる。本発明の配糖体を製造する方法では、糖受容体の性質に応じて、反応温度を調整することができる。本酵素は、幅広い温度域で安定的に使用できるため、多様な化合物の配糖体の製造に用いることができる。
【００５８】
糖供与体としては、本発明の酵素及び／又は酵素剤によりグリコシル転移する化合物であればいずれでもよい。より具体的には、マルトオリゴ糖が挙げられ、マルトースおよびマルトトリオースが好ましい。
本発明の方法で製造された配糖体は、その糖部分と糖以外の化合物の結合部位にグリコシド結合を有することができる。
【００５９】
糖受容体としては、本発明の酵素及び／又は酵素剤によりグリコシル基が転移する水酸基を有する化合物であれば、いずれでもよい。具体的には、アルコール類（例えばエタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、Ｌ−メントール、１−ブタノール、２−ブタノール）、ポリオール類（例えばグリセロール、プロピレングリコール）、ビタミン類（例えばＬ−アスコルビン酸、レチノール、イノシトール、トコフェロール）、フラボノイド類（例えばケルセチン、カテキン、ルチン、ヘスペリジン）、フェノール誘導体（例えばハイドロキノン）等を用いることができ、水酸基を有した化合物であれば特に限定されない。また、糖受容体が酸化されやすい場合は、必要に応じて還元剤を反応系に添加しておくことも有効である。
【００６０】
本発明の酵素または酵素剤で製造された配糖体は、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の原料の一つとして使用することができ、また当該配糖体そのものを食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品として提供することもできる。本発明の酵素または酵素剤で製造された配糖体は、水に溶解しやすく、室温において固形粉末として存在可能であり、さらに品質が安定であることから、飲食品、医薬品並びに化粧品等へ広く利用することができる。
【００６１】
本発明の食品の製造方法で製造される食品の例には、限定されるものではないが、各種炭水化物類（パン、麺、米飯、餅）、各種和菓子類（せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、どら焼き、ういろう、餡類、羊羹、水羊羹、錦玉、カステラ、飴玉）、各種洋菓子類（パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、ドーナツ、蒸しケーキ、プリン、ゼリー、ムース、ババロア、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディー、シロップ類）、各種氷菓（アイスクリーム、シャーベット、ジェラート、かき氷）、各種ペースト状食品（フラワーペースト、ピーナッツペースト、マーガリン、フルーツペースト）、各種飲料（果汁含有飲料、果汁ジュース、野菜ジュース、サイダー、ジンジャーエール、アイソトニック飲料、アミノ酸飲料、ゼリー飲料、コーヒー飲料、緑茶、紅茶、ウーロン茶、麦茶、乳飲料、乳酸菌飲料、ココア、ビール、発泡酒、第三のビール、ノンアルコール飲料、ビール風味飲料、リキュール、チューハイ、清酒、果実酒、蒸留酒、栄養ドリンク、健康飲料、粉末飲料）、果物・野菜加工品（ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果、漬物）、各種乳製品（チーズ、ヨーグルト、バター、練乳、粉乳）、粉末食品（粉末スープ、粉末ムース、粉末ゼリー、粉末甘味料）、栄養食、ダイエット食、スポーツ用栄養食、流動食、半固形流動食、介護食、嚥下食等が挙げられる。
【００６２】
本発明の食品の製造方法で製造される飼料および餌料の例には、限定されるものではないが、家畜、家禽、魚介類、昆虫（ミツバチ、蚕など）用飼料および餌料を挙げることができる。その形態としては、粉体、ペレット、錠剤、練り餌、カプセルなどである。
【００６３】
本発明の食品の製造方法で製造される化粧料の例には、限定されるものではないが、保湿剤および美容剤などを挙げることができる。それらの形態としては、乳液、クリームおよびエマルジョンなどである。
【００６４】
本発明の食品の製造方法で製造される医薬品の例には、限定されるものではないが、例えば抗肥満剤、血糖値上昇抑制剤などを挙げることができ、それらの形態としては、錠剤、粉剤、液剤、カプセル剤などである。
【００６５】
＜酵素の製造＞
本発明の酵素は、特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質であってもよいし、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質であってもよい。以下に、組み換えタンパク質を作製する場合について、説明する。
【００６６】
配列番号３に示されるアミノ酸配列、または配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する本発明の酵素は、遺伝子工学的手法によって調製することができる。例えば、配列番号３のアミノ酸配列をコードする遺伝子は、宿主細胞内で複製可能であるか、あるいは染色体に組み込まれかつ同遺伝子を発現可能な状態で含むＤＮＡ分子として、特に発現ベクターに挿入された形態で宿主細胞の形質転換を行い、宿主細胞を培養することで産生させることができる。このＤＮＡ分子は、配列番号３に示されるアミノ酸配列、または配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片をベクター分子に組み込むことによって得ることができる。本発明の好ましい態様によれば、このベクターはプラスミドである。本発明におけるＤＮＡ分子の作成は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌに記載の方法に準じて行なうことができる。
【００６７】
本発明において利用できるベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案しながら、ウイルス、プラスミド、コスミドベクターなどから適宜選択できる。例えば、宿主細胞が枯草菌の場合はｐＪＥＸＯＰＴ２系（特開２００９−１７８４１号公報を参照）、ｐＨＴ系のプラスミド、大腸菌の場合はλファージ系のバクテリオファージ、ｐＥＴ系、ｐＵＣ系、ｐＣｏｌｄ系、ｐＧＥＸ系のプラスミド、酵母の場合はＹＥｐ、ＹＣｐ系、ＹＩＰ系のベクター、あるいはｐＬｅｕ４、ｐＰＰＬｅｕ４、ｐＪＰＬｅｕ系（特開平４−２１８３８２号公報に記載）などが挙げられるが、これらに制限されない。このプラスミドは形質転換体を選択するためのマーカーを含んでいてもよく、該選択マーカーとしては薬剤耐性マーカーや栄養要求マーカー遺伝子を使用することができるが、これらに制限されない。
【００６８】
さらに、本発明で利用できる発現ベクターは、酵素遺伝子の発現に必要なＤＮＡ配列、例えばプロモーター、ターミネーター、リボゾーム結合部位、転写終結シグナルなどの転写調節信号、翻訳調節信号などを有することができる。該プロモーターとしては、枯草菌においてはズブチリシン、ＳＰＡＣ等のプロモーター、酵母ではアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、酸性フォスファターゼ（ＰＨＯ）、ガラクトース遺伝子（ＧＡＬ）、グリセルアルデビド３リン酸脱水素酵素遺伝子（ＧＡＰ）等のプロモーターを用いることができるが、これらに制限されない。シグナルペプチドは、培養上清からの精製が容易になるという利点があるので使用することが好ましい。また、シグナルペプチドを枯草菌や酵母由来のもの（例えば、インベルターゼシグナル、酸性フォスファターゼシグナル、λ−ファクターシグナルなど）に置き換えることができる。また、大腸菌においては、一般に慣用されるｌａｃプロモーターやＴ７プロモーターのほかに、ｃｓｐＡプロモーター等を用いて分子シャペロンを同時に発現させるなど、発現をより効率化する工夫を行うことができる
【００６９】
形質転換を行なった宿主細胞の培養は、使用する宿主細胞に関して一般的な方法を用いることができる。通常は、１〜４日程度の培養により細胞内または細胞外の培養物中に酵素が生成され蓄積される。培養条件（培地、ｐＨ、温度等）に関しては、例えば、細菌では２５〜３７℃、酵母では２５〜３０℃、真核細胞では３７℃程度が一般的である。培養条件については、遺伝子発現実験マニュアル（講談社）等を参照することができる。
【００７０】
宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の細菌、カンディダ・ウチリス（Candida utilis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）等の酵母以外に、リゾープス・ニベウス（Rhizopus niveus）、リゾープス・デルマー（Rhizopus delemar）や高等真核生物（例えばＣＨＯ細胞など）を用いることができる。枯草菌としてはパチルス（Bacillus）属に属する微生物を用いることが好ましい。パチルス属にはタンパク質を菌体外へ分泌する株（例えば、パチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）など）が存在することが知られている。またプロテアーゼを殆ど分泌しない株も知られており、このような株を宿主として用いることも好ましい。本発明においては、宿主細胞として酵母、糸状菌または細菌が好ましいが、細菌がより好ましく、特に大腸菌やパチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）が好ましい。後記する実施例に示すように、E. coli BL21とBacillus subtilits ISW1214を宿主としてこの遺伝子を発現させたところ、E. coli BL21では精製タンパク質に、Bacillus sbtilis ISW1214では培養上清に酵素活性が認められた。
【００７１】
形質転換体が産生した組み換え酵素の単離・精製は、公知の分離方法や精製方法を適当に組み合わせて行なうことができる。これらの分離・精製方法としては例えば塩沈殿、溶媒沈殿のような溶解性の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過およびＳＤＳ−ポリアクリル電気泳動のような分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法、さらに等電点電気泳動のような等電点の差を利用する方法、このほかにアフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。実施例に記載した生成方法のほかに、一般的な分離・精製法に関しては、例えば蛋白質・酵素の基礎実験法（南江堂）等を参照することができる。
【実施例】
【００７２】
以下の例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、本明細書において、特に記載しない限り、「％」、「部」等は質量基準であり、数値範囲はその端点を含むものとして記載される。また、操作手順は特に記載しない限り、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook、 Maniatis ら、Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989))に記載の方法に従った。
【００７３】
実施例１：酵素の調製
１．発現プラスミドの構築
種々の微生物について新規酵素探索を行い、サーモアナエロバクター・シデロフィラス（Thermoanaerobacter siderophilus）由来の仮想タンパク質（Accession number: WP_006569624.1）を選出し、機能解析を行った。この仮想タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）および塩基配列（配列番号２）を、それぞれ図１Ａ、およびＢ〜Ｃに示す。配列番号２に記載の塩基配列は、大腸菌での発現に最適化するために、コドン補正が行われている。
【００７４】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端から７５２番目までを欠失させたアミノ酸配列（配列番号３）からなるタンパク質を発現させるために、配列番号４に記載の塩基配列を用いて、以下の手順で、発現プラスミドを構築した。
【００７５】
目的遺伝子（配列番号４の塩基配列）を、ベクターｐＥＴ３２ｂ（Novagen、ドイツ）の両末端と相同な配列１５塩基を付加したプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件を以下に示す。ＰＣＲ増幅の反応液の総量は５０μＬであった。
５×ＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ）            １０μＬ
２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（タカラバイオ）            ２μＬ
２０μＭ  プライマー（Ts_p20283242_R）              １μＬ
２０μＭ  プライマー（T_p32_d1-752S）               １μＬ
１００ｎｇ／μＬ  テンプレート                      １μＬ
Primestar HS DNA Polymerase（タカラバイオ）     ０．２μＬ
Ｈ2Ｏ                                         ３４．８μＬ
【００７６】
使用プライマーを表１に示す。
【表１】
2019140965.tif 000003
【００７７】
ＰＣＲ増幅反応のプログラムは、まず９６℃に１分間保持した後、９６℃で１０秒間→５５℃で３０秒間→７２℃で３分間を１サイクルとして２５サイクルを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、増幅断片（２、４１８ｂｐ）に相当するバンドをゲルから切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega、 Madison、 Wisconsin、 USA)を用いて抽出し精製した。
【００７８】
Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）クローニング反応で用いる線状化プラスミドの調製のため、ｐＥＴ３２ｂを鋳型として、表２に示したプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【００７９】
【表２】
2019140965.tif 000004
【００８０】
ＰＣＲ増幅の反応液の組成は、プライマー以外は目的遺伝子の増幅に使用したものと同じであった。ＰＣＲ増幅反応のプログラムは、まず９６℃に１分間保持した後、９６℃で１０秒間→５５℃で３０秒間→７２℃で４分間を１サイクルとし２５サイクルを行った。増幅断片をエタノール沈殿により回収した後、制限酵素ＤｐｎＩにより処理してベクターＤＮＡを消化した。これをアガロースゲル電気泳動に供し、目的ＤＮＡ断片（５、９００ｂｐ）に相当するバンドを切り出し、目的遺伝子の場合と同じ手順で抽出し精製した。増幅した目的遺伝子およびベクターｐＥＴ３２ｂを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて連結した。連結反応は５０℃に２０分間保持することで行った。
【００８１】
連結反応産物を含む反応液２．５μＬとＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αのコンピテントセル５０μＬを混合し、氷上に１時間静置した後、４２℃で６０秒間ヒートショックを与え、次に氷上に３分間保持した。ＳＯＣ培地（２０ｍｇ／ｍＬのトリプトン、５ｍｇ／ｍＬの酵母エキス、８．６ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭの硫酸マグネシウム、２０ｍＭのＤ−グルコース）を９００μＬ加え、３７℃にて３０分間振盪培養した。遠心分離（６、０００×ｇ、４℃、１０分間）により菌体を回収し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１０ｍｇ／ｍＬのトリプトン、５ｍｇ／ｍＬの酵母エキス、１％のＮａＣｌ、１．５w/v％の寒天）で、３７℃にて一晩培養した。１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ液体培地（１％のトリプトン、０．５％の酵母エキス、０．５％の塩化ナトリウム）に、得られたコロニーを懸濁し、一晩振盪培養した。得られた菌体からアルカリＳＤＳ法（Birnboim and Doly、 1979）によりプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドを、変異酵素△（１〜７５２）−大腸菌発現用プラスミドとした。
【００８２】
２．組換え酵素の調製
変異酵素△（１〜７５２）−大腸菌発現用プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含む３０ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃にて一晩振盪培養した。この培養液３０ｍＬを１Ｌの同培地に植え継ぎ、濁度（６００ｎｍ）が０．５に達するまで同条件で培養した。０．１Ｍイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．１ｍＭになるように添加し、誘導培養を開始した。誘導後、培養温度を１８℃とし、２２時間振盪培養した。遠心分離（６、０００×ｇ、４℃、１０分間）を行い、菌体を回収した。これを１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波により破砕した。超音波処理をＳｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０（Branson、 Danbury、 CT）を用い、ｄｕｔｙ  ｃｙｃｌｅを５０％、ｏｕｔｐｕｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ３の条件で１分間ずつ３回行った。超音波処理１回ごとに１分間氷冷した。遠心分離（１２０００×ｇ、１０分間、４℃）を２回行い、得られた抽出液を粗酵素液とした。粗酵素液３４ｍＬを得た。予め０．５ＭのＮｉＳＯ4を用いてＮｉ2+をキレートし、０．５ＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したNi-Chelating Sepharose Fast Flowカラム（1.0 i.d. × 7 cm、5.5 mL；GE Healthcare Bioscience、 Uppsala、 Sweden）に粗酵素液を供した。非吸着タンパク質を１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）により溶出し、１５ｍＬずつ６０画分に分画した。イミダゾール直線濃度勾配（３０〜５００ｍＭ、４００ｍＬ）により吸着タンパク質を溶出し、５ｍＬずつ８０画分に分画した。活性画分８８〜１０１を回収した。回収画分を１Ｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して、４回透析した。透析膜には、ＵＣ１６−３２−１００（三光純薬、東京）を使用した。透析後の試料をＶｉｖａｓｐｉｎ２０、ＭＷＣＯ３０、０００（Sartorius、 Goettingen、 Germany）を用いて濃縮した。これを変異酵素△（１〜７５２）の精製酵素とし、４℃で保存した。
【００８３】
実施例２：枯草菌を宿主とした菌体外発現
１．発現プラスミドの構築
変異酵素△（１〜７５２）を枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で生産するための発現プラスミドを構築した。まず、実施例１で構築した△（１〜７５２）−大腸菌発現用プラスミドをテンプレートとして、センス鎖増幅についてはベクターの末端と相同な塩基配列を付加したプライマーを用いて、アンチセンス鎖増幅についてはＨｉｓ-Ｔａｇの配列の一部を付加したプライマーを用いて、目的遺伝子をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件を以下に示す。ＰＣＲ増幅の反応液の総量は５０μＬであった。
【００８４】
５×Ｐｒｉｍｅｓｔａｒ  ＧＸＬ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ）    １０μＬ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  ｍｉｘ（タカラバイオ）                    ４μＬ
１０μＭ  プライマー（ＴＳＤＤ−Ｆ）                              １μＬ
１０μＭ  プライマー（ＴＳＤＤ−Ｒ）                              １μＬ
１ｎｇ／μＬ  テンプレート                                        １μＬ
Primestar GXL DNA Polymerase（タカラバイオ）                      １μＬ
Ｈ2Ｏ                                                           ３２μＬ
【００８５】
使用プライマーを表３に示す。
【表３】
2019140965.tif 000005
【００８６】
ＰＣＲ増幅反応のプログラムは、まず９６℃に１分間保持した後、９８℃で１０秒間→６０℃で１５秒間→６８℃で３分間を１サイクルとして３０サイクルを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、増幅断片（２、４５１ｂｐ）に相当するバンドをゲルから切り出し、illustraTM GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE) を用いて抽出し精製した。
【００８７】
Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）クローニング反応で用いる線状化プラスミドの調製のため、ベクターｐＪＥＸＯＰＴ２（特開２００９−１７８４１号および特開２００９−１７８４２号参照）を本実施例に最適化するために改変したプラスミドを鋳型として、表４に示したプライマーを用いてＰＣＲを行った。センス鎖増幅についてはベクターの末端にＨｉｓ−ｔａｇの配列を付加したプライマーを用い、アンチセンス鎖増幅についてはベクターの末端から増幅するように組んだプライマーを用いた。
【００８８】
【表４】
2019140965.tif 000006
【００８９】
ＰＣＲ増幅の反応液の組成は、プライマー以外は目的遺伝子の増幅に使用したものと同じであった。ＰＣＲ増幅反応のプログラムは、まず９６℃に１分間保持した後、９８℃で１０秒間→６０℃で１５秒間→６８℃で７分間を１サイクルとし３０サイクルを行った。増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供し、目的ＤＮＡ断片（６、９００ｂｐ）に相当するバンドを切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて抽出し精製した。増幅した目的遺伝子およびベクターｐＪＥＸＯＰＴ２の増幅断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて連結した。連結反応は５０℃に１５分間保持することで行った。
【００９０】
連結反応溶液２．５μＬを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換し、この培養液からillustraTM plasmidPrep Mini Spin Kit (GE)によりプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドを変異酵素△（１〜７５２）−枯草菌発現用プラスミドとした。
【００９１】
２．組み換え酵素の調製
変異酵素△（１〜７５２）−枯草菌発現用プラスミドをプロトプラスト化した枯草菌ＩＳＷ１２１４（タカラバイオ）に導入し、７．５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含む再生寒天培地（組成：８．１％コハク酸ナトリウム、１％寒天、０．５％カザミノ酸、０．５％酵母エキス、０．１５％リン酸２水素カリウム、０．３５％リン酸水素２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム、０．０１％ウシ血清アルブミン、０．００１％メチオニン、および０．００１％ロイシン）にて３０℃で２日間培養した。得られたコロニーを前培養培地、続いて本培養培地で培養した（特開２００９−１７８４１号および特開２００９−１７８４２号に記載のとおり培養したが、培地の組成は改変したものを使用した）。遠心分離（１５、０００×ｇ、４℃、５分間）を行い、上清を０．４５μｍフィルター（メルク）で濾過したものを変異酵素△（１〜７５２）の酵素溶液とした。該酵素液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、組み換え酵素の生産を確認した。変異酵素△（１〜７５２）の理論的な分子量サイズ（約９１．５ｋＤａ）付近の８０〜９０ｋＤａに濃いバンドが見られ、培養上清中に変異酵素△（１〜７５２）が分泌されたことを確認した（図３）。
【００９２】
実施例３：活性測定
実施例１で得られた精製酵素△（１〜７５２）（本酵素１）の活性を測定するため、マルトース分解活性を測定した。
【００９３】
マルトース分解活性を、グルコース生成量に基づき測定した。グルコース量をグルコースオキシダーゼ・ペルオキシダーゼ法（Miwa et al, 1972）により定量した。酵素の希釈には、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を用いた。酵素反応液の組成（総量５０μＬ）は、以下のとおりである。
１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）        ２０μＬ
５０ｍＭマルトース                                  ２０μＬ
精製酵素△（１〜７５２）溶液                        １０μＬ
【００９４】
酵素反応液を３７℃で１０分間保持して反応させた。反応１０分経過時に、酵素反応液５０μＬと２Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）とを混合することにより反応を停止した。反応停止処理をした酵素反応液に、２０μＬのグルコース定量試薬（和光純薬工業株式会社、グルコースＣ−ＩＩ）を加えて３７℃で３０分間保持した後、吸光度（波長５０５ｎｍ）を紫外可視分光光度計JASCO V-630 BIO Spectrophotometer（日本分光、東京）を用いて測定した。濃度０〜０．５ｍＭのＤ−グルコース（ナカライテスク、京都）で作製した検量線に基づいて、酵素反応液のグルコース濃度を求めた。本実施例の条件下で、１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素量をマルトース分解活性１Ｕとした。
【００９５】
実施例４：酵素の理化学的性質（ｐＨおよび温度）
本酵素の理化学的性質については、マルトース分解活性を測定して確認した。酵素は、実施例１で得られた精製酵素△（１〜７５２）（本酵素１）を使用した。
１．至適ｐＨ
本酵素のマルトース分解活性を、ｐＨ３．０〜１１．０の緩衝液中で測定した。マルトース分解活性は、実施例３の活性測定に記載の方法に従って測定した。ただし、４０ｍＭ  Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（ＢＲ）緩衝液（ｐＨ３．０〜１１．０）を反応緩衝液として使用した。本酵素は、ｐＨ４．５で最大活性を示し、ｐＨ３．５、４．０および５．０で最大活性に対し９０％以上の活性を示し、ｐＨ４．０〜５．０において最大活性の９８％以上の活性を示した（図４ａ、黒丸）。
【００９６】
２．ｐＨ安定性
各ｐＨ（ｐＨ３．０〜１１．０）の０．１ＭのＢＲ緩衝液７５μＬと、４．０８μｇ／ｍＬの本酵素７５μＬを混合して酵素希釈液を得て、４℃で２４時間保持した。２４時間保持後の酵素希釈液を用いて、実施例３の活性測定に記載の方法に従って活性を測定した。各ｐＨの０．１ＭのＢＲ緩衝液に保持する前の活性に対して、保持後の活性（残存活性）の割合（％）を算出した。残存活性８５％以上を示すｐＨの範囲をｐＨ安定域とした場合、本酵素のｐＨ安定域は３．５〜８．５であった(図４ａ、白丸)。
【００９７】
３．至適温度
酵素反応温度を３０、３７、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５または８０℃とし、実施例３の活性測定に記載の方法に従って、酵素反応温度ごとにマルトース分解活性を測定した。本酵素は、温度６０℃で最大活性を示し、温度５５〜６０℃の範囲で最大活性の８０％以上の活性を示した（図４ｂ、黒丸）。
【００９８】
４．温度安定性
０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）２０μＬと、１０．２μｇ／ｍＬの本酵素１０μＬを混合し、３０、３７、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５または８０℃で１５分間保持した。各温度で保持後の活性を、実施例３の活性測定に記載の方法に従って測定した。各温度に保持する前の活性に対して、保持後の活性（残存活性）の割合（％）を算出した。残存活性９０％以上を示す場合、その温度で安定性を有すると判断した。本酵素は、温度６０℃以下で安定であった（図４ｂ、白丸）。
【００９９】
実施例５：酵素反応生成物のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析
ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（High performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection；パルスドアンペロメトリ検出器を用いた陰イオンクロマトグラフィ）により、変異酵素△（１〜７５２）による基質の反応生成物を分析した。基質は、マルトース（Ｇ２）、マルトトリオース（Ｇ３）、マルトテトラオース（Ｇ４）、マルトペンタオース（Ｇ５）、イソマルトース（ＩＧ２）及びイソマルトトリオース（ＩＧ３）を使用した。
【０１００】
実施例１で得られた酵素△（１〜７５２）（本酵素１）と１０ｍＭの基質と４２ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を含む１ｍＬの反応液を３７℃に保持して反応させた。反応開始後３分、６分、９分および１５分に、反応液から１８０μＬを採取した。採取した１８０μＬの反応液に、２０μＬの１ｍＭイノシトール（内部標準）を混合した後、１００℃で３分間の熱処理を行い反応停止した。各基質ごとに、３から１５分間反応させた４本の反応液２００μＬを得た。酵素の希釈には、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を用いた。反応に用いた酵素濃度は基質により異なる。酵素濃度を表５に示す。
【０１０１】
【表５】
2019140965.tif 000007
【０１０２】
各２００μＬの反応液は、アンバーライトＭＢ４（オルガノ、東京）によって脱塩し、０．４５μｍのディスポーサブルメンブレンフィルターユニット（アドバンテック、東京）を用いて濾過し、分析試料とした。１０μＬの分析試料をカラムに注入した。カラムにはＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１（0.4cm i.d. × 25 cm; Dionex）を用いた。溶離液のＮａＯＨ濃度を表５に示す。糖質分析装置（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ、Ｄｉｏｎｅｘ社製）を用いて、各基質の初期転移産物の濃度を求めた。初期転移産物の濃度として、例えば、マルトペンタオースを基質とする反応では、マルトヘキサオース濃度を標準曲線（１０〜１００μＭ）に基づき算出した。イノシトール（１００μＭ）を内部標準とし、面積補正に用いた。
【０１０３】
マルトース（Ｇ２）を基質とした場合には、本酵素により、グルコース（Ｇｌｃ）、パノース（Ｐａｎ）およびマルトトリオース（Ｇ３）が生成した（図５ａ）。α-１,６転移反応によるパノース生成速度は１０．８μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであり、α-１,４転移反応によるマルトトリオース生成速度は４．３９μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであった。α-１,６転移反応速度は、α-１,４転移反応速度の２．４６倍であった。
【０１０４】
マルトトリオース（Ｇ３）を基質とした場合には、本酵素により、グルコース（Ｇｌｃ）、マルトテトラオース（Ｇ４）および６3-Ｏ-α-Ｄ-グルコシルマルトトリオース（Ｂ４）が生成した（図５ｂ）。α-１,４転移反応によるマルトテトラオースの生成速度は９４．５μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであり、α-１,６転移反応による６3−Ｏ−α−Ｄ−グルコシルマルトトリオースの生成速度は７．２０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであった。本酵素は、基質マルトトリオース（Ｇ３）に対しては、主としてα-１,４転移反応を触媒することが分かった。α-１,４転移速度は、α-１,６転移速度の１３．１倍であった。
【０１０５】
マルトテトラオース（Ｇ４）を基質とした場合には、本酵素により、マルトトリオース（Ｇ３）とマルトペンタオース（Ｇ５）が生成した(図５ｃ)。α-１,４転移反応速度は５４．１μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであった。
【０１０６】
マルトペンタオース（Ｇ５）を基質とした場合には、本酵素により、マルトテトラオース（Ｇ４）およびマルトヘキサオース（Ｇ６）が生成した(図５ｄ)。α-１,４転移反応速度は８１．７μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであった。
【０１０７】
イソマルトース（ＩＧ２）を基質とした場合には、本酵素により、グルコース（Ｇｌｃ）、イソマルトトリオース（ＩＧ３）およびイソパノース（ＩＰａｎ）が生成した（図５ｅ）。α-１,６転移反応によるイソマルトトリオース生成速度は、３．７２μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであり、α-１,４転移反応によるイソパノース生成速度は０．３６３μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであった。α-１,６転移反応速度は、α-１,４転移反応速度の１０．２倍であった。
【０１０８】
イソマルトトリオース（ＩＧ３）を基質とした場合には、本酵素により、イソマルトース（ＩＧ２）とイソマルトテトラオース（ＩＧ４）が生成した(図５ｆ)。α-１,６転移反応によるイソマルトテトラオース生成速度は１１．１μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであった。
【０１０９】
本酵素は、反応時間１５分までの実験で、基質により、α-１,６転移反応を主に触媒する場合と、α-１,４転移反応を主に触媒する場合があることが示された。例えば、実施例５の条件において、本酵素は、１５分間程度の短い反応時間では、Ｇ３からＧ５のマルトオリゴ糖を基質とした場合、主にα-１,４転移反応を触媒するが、マルトース（Ｇ２）およびイソマルトオリゴ糖を基質とする場合には、α-１,４転移反応よりも、α-１,６転移反応を触媒することが分かった。
【０１１０】
実施例６：酵素反応の経時変化の解析
ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）により、酵素△（１〜７５２）による基質の反応生成物を経時的に分析した。
まず、実施例１で得られた酵素△（１〜７５２）（本酵素１）を、基質マルトペンタオース（Ｇ５）に作用させた。具体的には、以下の組成からなる１ｍＬの反応液を３７℃に保持して反応させた。酵素の希釈には、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を用いた。
【０１１１】
反応液の組成
３０ｍＭマルトペンタオース            ５００μＬ（終濃度１５ｍＭ）
本酵素溶液                            ４００μＬ（終濃度３６．７μｇ／ｍＬ）
１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）    １００μＬ（終濃度１０ｍＭ）
反応開始後１、６、２４、４８、９６時間に、反応液から１００μＬを採取し、１００℃で３分間の熱処理を行い反応停止した。
【０１１２】
次に、本酵素で１から９６時間の反応をさせた反応液に、等量のＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ由来グルコアミラーゼ（生化学工業）（５Ｕ／ｍＬ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解したもの）を添加し、５０℃に３０分間保持した。
【０１１３】
グルコアミラーゼ処理した反応液および未処理の反応液をＴＬＣにより分析した。ＴＬＣプレートにはシリカゲル６０Ｆ２５４アルミニウムシート（Merck、 Darmstadt、 Germany）を用いた。試料として、各反応液１μＬをＴＬＣに供した。展開溶媒にはニトロエタン：ニトロメタン：エタノール：水：１−プロパノール＝１：１：３．５：４：５．５（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）を用いて２回展開した。展開後、シートを風乾し、検出液（酢酸：硫酸：アニスアルデヒド＝１００：２：１（ｖ／ｖ／ｖ））を噴霧して、シートを加熱することで糖を検出した。図６は、スポット検出したＴＬＣシートの写真である。
【０１１４】
ＴＬＣ分析では、本酵素による反応１時間の生成物において、グルコアミラーゼにより分解されたマルトオリゴ糖Ｇ２からＧ７のスポットが複数みられたため、本酵素によりマルトオリゴ糖の不均化反応（α-１,４-グルコシル転移反応）が触媒されたと考えられる（図６）。加えて、グルコアミラーゼにより分解されないスポットが複数みられたことにより、本酵素によりα-１,６転移生成物も生じたことが確認された。
【０１１５】
本酵素による反応６時間の生成物において、グルコアミラーゼ分解によるスポットの消失は見られず、本酵素によるマルトオリゴ糖の生成は検出されなかった。重合度１０程度の反応生成物が確認されたが、ＴＬＣシートのスポットをうった位置にとどまるほどの高分子の生成は確認されなかった。この結果は、本酵素が、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）由来デキストリンデキストラナーゼとは異なることを示す特徴の一つである。
【０１１６】
本酵素による反応２４から９６時間の生成物において、グルコアミラーゼ分解によるスポットの消失は見られず、本酵素によるマルトオリゴ糖の生成は検出されなかった。グルコアミラーゼにより分解されないスポットがＩＧ２からＩＧ５のマーカースポットと同程度の展開位置に観察された。ただし、反応時間が長くなるとともに、ＩＧ３からＩＧ５に相当する長鎖生成物が分解され、グルコースの蓄積および低分子イソマルトオリゴ糖への変換がみられた（α-１,６-グルコシド結合加水分解活性）。
【０１１７】
実施例７：糖化試験１
１．方法
今回の試験用に分画調整したＧ６７  ｒｉｃｈシラップを終濃度３０％となるように超純水に溶解し、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を終濃度５０ｍＭ、およびＣａＣｌ2を終濃度３ｍＭとなるように添加した反応液を、５本用意した。各反応液に、実施例２で調製した変異酵素△（１〜７５２）を含む枯草菌の培養上清（本酵素２）を、６２．５、１２５、２５０、５００、または１０００μＬ／ｇ−ＤＳ添加し、５３℃で７２時間反応させた。
【０１１８】
Ｇ６７  ｒｉｃｈシラップおよび本酵素の反応生成物の糖組成をＨＰＬＣで分析した。分析条件はカラム：ＭＣＩ  ＧＥＬＣＫ０２ＡＳ（三菱ケミカル）、溶離液：超純水、流速：０．７ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：８０℃、検出器：示差屈折率検出器とした。反応生成物の糖組成（％）は、ＨＰＬＣで検出されたピークの総面積を１００とした場合の、各糖類に対応するピークの面積比率（％）として算出した。なお、澱粉加水分解物のクロマトデータのピークから、保持時間３０分がＤＰ３０に相当することが分かっていたため、ＤＰ１０のピーク（保持時間）から保持時間３０分までのエリア面積を、ＤＰ〜３０の面積として算出した。
【０１１９】
α-１,６結合生成を確認するため、本酵素の反応生成物に対してデキストラナーゼ処理を行った。デキストラナーゼ処理は、固形分濃度１％の試料０．５ｍＬに２００ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で２００倍希釈したデキストラナーゼＬ「アマノ」を２０μＬ添加し、５３℃に２４時間保持した。デキストラナーゼ処理後に、糖組成分析を行った。本酵素の反応生成物の糖組成と、デキストラナーゼ処理後の糖組成を比較し、デキストラナーゼ処理後のＤＰ１〜３の増加割合を算出した。ＤＰ１〜３の糖組成はカラム：Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−４２Ａ（ＢｉｏＲａｄ）、溶離液：超純水、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：７５℃、検出器：示差屈折率検出器の条件で分析した。
【０１２０】
２．結果
図７Ａ、ＢおよびＣに、Ｇ６７  ｒｉｃｈシラップ、本酵素による反応生成物のＨＰＬＣ分析のクロマトグラムを示す。表６に、Ｇ６７  ｒｉｃｈシラップおよび本酵素の反応生成物の糖組成およびデキストラナーゼ処理後のＤＰ１〜３の増加割合（％）を示す。
【０１２１】
【表６】
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【０１２２】
原料のＧ６７  ｒｉｃｈシラップは、ＤＰ６および７の糖類をそれぞれ約３３％および約３７％含み、ＤＰ３から９の糖類を約９５％含むものであった（図７Ａ）。
【０１２３】
反応生成物中のＤＰ１０〜３０の含有割合は、原料と比べ、顕著に増加している。ＤＰ１０〜３０の含有割合は、原料の４．７％が、反応生成物７−１では３７．２％に増加しており、反応生成物７−２から７−５では４６％以上となっている（表６）。
また、本酵素の添加量が多いほど、反応生成物中のＤＰ１〜２の含有割合が増加する傾向があった（表６、図７Ｃ）。
【０１２４】
一方で、反応生成物中のＤＰ３〜９の含有割合は、原料と比べ、顕著に減少していた。ＤＰ３〜９の含有割合は、原料では９５．２％であるが、最も低い反応生成物７−４では４０．９％未満に減少している（表６）。
【０１２５】
反応生成物７−１から７−５のいずれでも、デキストラナーゼ処理後の試料中のＤＰ１〜３含有割合は、処理前の反応生成物中のＤＰ１〜３含有割合に対し、いずれも＋３０％以上であった（表６）。ＤＰ１〜３含有割合の増加分は、デキストラナーゼによるα-１,６結合の加水分解により生じたものであるため、本実施例では、反応生成物中で増加したＤＰ１０〜３０は、本酵素のα-１,６転移活性により生成されたものであることを確認した。
【０１２６】
実施例８：糖化試験２
１．方法
【０１２７】
パインデックス＃１（松谷化学工業）を終濃度３０％となるように超純水に溶解し、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を終濃度５０ｍＭ、およびＣａＣｌ2を終濃度３ｍＭとなるように添加した反応液を、６本用意した。各反応液に、実施例２で調製した変異酵素△（１〜７５２）を含む枯草菌の培養上清（本酵素２）、ＧＯＤＯ−ＦＩＡ（合同酒精株式会社；イソアミラーゼ）、プルラナーゼ「アマノ」３（天野エンザイム）、およびクライスターゼＬ−１（天野エンザイム）を表７に示す条件で添加し、５３℃にて７２時間反応させた。反応物の糖組成をＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ分析条件とデキストラナーゼ処理の条件は実施例７と同様に行った。
【０１２８】
２．結果
図８Ａ、ＢおよびＣに、パインデックス＃１、本酵素による反応生成物のＨＰＬＣ分析のクロマトグラムを示す。表７に、パインデックス＃１および本酵素の反応生成物の糖組成およびデキストラナーゼ処理後のＤＰ１〜３の増加割合（％）を示す。
【０１２９】
【表７】
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原料のパインデックス＃１は、ＤＰ３１以上の糖類を約６０％含むものであった（図８Ａ）。
【０１３０】
反応生成物中のＤＰ１０〜３０の含有割合は、原料と比べ、顕著に増加していた。ＤＰ１０〜３０の含有割合は、原料の約１７％が、いずれの反応生成物でも５０％以上に増加している（表７）。反応生成物中のＤＰ１〜２およびＤＰ３〜９の含有割合も、原料と比べ、増加する傾向があった。また、実施例７と同様に、本酵素の添加量が多い方が、反応生成物中のＤＰ１〜２の含有割合が高い傾向があった。
【０１３１】
一方で、反応生成物中のＤＰ３１以上の含有割合は、原料と比べ、顕著に減少していた。ＤＰ３１以上の含有割合は、原料では約６０％あるが、いずれの反応生成物でも１０％未満に減少している（表７）。原料のパインデックス＃１に含まれていたＤＰ３１以上の糖類（デキストリン）の含有割合の低下は、加水分解酵素（ＧＯＤＯ−ＦＩＡ、プルラナーゼ「アマノ」３、およびクライスターゼＬ−１）の働きによると考えられる。
【０１３２】
反応生成物８−１から８−６のいずれでも、デキストラナーゼ処理後の試料中のＤＰ１〜３含有割合は、処理前の反応生成物中のＤＰ１〜３含有割合に対し、いずれも３５％以上増加していた（表７）。図８Ｄに示すように、デキストラナーゼ処理後の試料のクロマトグラムでは、ＤＰ４以上のピークが低くなっている。これらは、処理前の反応生成物がα-１,６結合を有するグルカンであったことを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明は、α-１,６-グルカンを使用することができる食品や医療などのさまざまな分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１３４】
配列番号１：サーモアナエロバクター・シデロフィラス由来の仮想タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２：サーモアナエロバクター・シデロフィラス由来の仮想タンパク質をコードする塩基配列
配列番号３：変異酵素△（１〜７５２）のアミノ酸配列
配列番号４：変異酵素△（１〜７５２）をコードする塩基配列
配列番号５および６：表１に記載のプライマー
配列番号７および８：表２に記載のプライマー
配列番号９および１０：表３に記載のプライマー
配列番号１１および１２：表４に記載のプライマー
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年7月17日(2018.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(ａ)から(ｃ)のいずれかのタンパク質を含む、α-1,6-グルコシル転移活性を有する酵素剤。
(ａ) 配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(ｂ) 配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、α-１,６-グルコシル転移活性を有するタンパク質；
(ｃ) 配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、α-１,６-グルコシル転移活性を有するタンパク質。
【請求項２】
更に、α-１,４-グルコシル転移活性を有する、請求項１に記載の酵素剤。
【請求項３】
前記タンパク質が、サーモアナエロバクター・シデロフィラス（Thermoanaerobacter siderophilus）に由来し、下記の性質のいずれかを有する、請求項１又は２に記載の酵素剤。
(1) 至適ｐＨが４．０〜５．０である；
(2) 安定ｐＨ範囲が３．５〜８．５である；
(3) 至適温度が５５℃〜６０℃である；
(4) 温度安定性は６０℃以下である；
(5) 基質として、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、およびデキストリンに作用する。
【請求項４】
α-１,４-グルコシド結合および／またはα-１,６-グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類からα-１,６-グルカンを製造するために用いられる、請求項１から３の何れか一項に記載の酵素剤。
【請求項５】
α-１,４-グルコシド結合および／またはα-１,６-グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類が澱粉部分分解物である、請求項４に記載の酵素剤。
【請求項６】
前記α-１,６-グルカンが、重合度２から３０を有するイソマルトオリゴ糖および／またはイソマルトメガロ糖である、請求項４または５に記載の酵素剤。
【請求項７】
α-１,４-グルコシド結合および／またはα-１,６-グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類に、請求項１から６のいずれか一項に記載の酵素剤を作用させて、α-１,６-グルカンを得る反応工程を含む、α-１,６-グルカンの製造方法。
【請求項８】
前記反応工程の前に、以下の工程を含む、請求項７に記載の製造方法。
澱粉を加水分解して、α-１,４-グルコシド結合および／またはα-１,６-グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類を得る工程。
【請求項９】
請求項７または８に記載の方法を実施してα-１,６-グルカンを得る工程、および前記工程で得られたα-１,６-グルカンを用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。
【請求項１０】
糖受容体と糖供与体に、請求項１から６のいずれか一項に記載の酵素剤を作用させる工程を含む、配糖体の製造方法。
【請求項１１】
糖供与体がマルトオリゴ糖である、請求項１０に記載の配糖体の製造方法。
【請求項１２】
糖受容体がアルコール性水酸基を有する化合物またはフェノール性水酸基を有する化合物である、請求項１０または１１に記載の配糖体の製造方法。
【請求項１３】
請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法を実施して配糖体を得る工程、および前記工程で得られた配糖体を用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。