(57)【要約】      （修正有）【課題】単離されかつ増殖したヒト臍帯血幹細胞の濃縮された集団、および、該幹細胞集団の作製方法の提供。【解決手段】ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１８４＋、ＣＤ１１７＋、ＣＤ４９ｆ＋、ＡＬＤＨ＋、ＣＤ４５ＲＡ−であり、多能性遺伝子であるＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３を発現する、単離され増殖したヒト臍帯血幹細胞の濃縮された集団、該幹細胞集団を使用して対象の血液疾患を治療する方法、及び、該幹細胞集団を用いて造血幹細胞に対する化合物の効果を決定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されかつ増殖したヒト臍帯血幹細胞の濃縮された集団であって、該幹細胞が、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１８４＋、ＣＤ１１７＋、ＣＤ４９ｆ＋、ＡＬＤＨ＋、かつＣＤ４５ＲＡ−でありかつ多能性遺伝子ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３を発現する、前記濃縮された集団。
【請求項２】
前記幹細胞の少なくとも約６０％が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性に対して陽性である、請求項１に記載の濃縮された集団。
【請求項３】
前記幹細胞が、胚性幹細胞の多能性遺伝子ｈＴＥＲＴの発現レベルにおいて上方制御を示さない、請求項１または請求項２に記載の濃縮された集団。
【請求項４】
前記幹細胞の少なくとも約９５％が、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３に対して陽性である、前記請求項のいずれか一項に記載の濃縮された集団。
【請求項５】
前記幹細胞が、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３、ＴＰＯ、ＩＬ３、及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるサイトカインと接触している、前記請求項のいずれか一項に記載の濃縮された集団。
【請求項６】
前記幹細胞が、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤と接触している、前記請求項のいずれか一項に記載の濃縮された集団。
【請求項７】
前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、ＶＰＡ、ＳＣＲ、ＬＢＨ５８９、ＴＳＡ、ＳＡＨＡ、Ｃａｙ１０４３３、及びＣａｙ１０３９８からなる群より選択される、請求項６に記載の濃縮された集団。
【請求項８】
前記幹細胞が、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤と接触していない単離されかつ増殖したヒト臍帯血幹細胞と比較して減少した、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ３、及びＨＤＡＣ５の発現を有する、請求項６または請求項７に記載の濃縮された集団。
【請求項９】
前記幹細胞の少なくとも約１８．０％±１．２％が、Ｇ２／Ｍ期にある、前記請求項のいずれか一項に記載の濃縮された集団。
【請求項１０】
前記幹細胞の少なくとも約２３．２％±１３．８％が、Ｇ０／Ｇ１期にある、前記請求項のいずれか一項に記載の濃縮された集団。
【請求項１１】
以下の工程を含む、単離されかつ増殖したヒト臍帯血幹細胞の濃縮された集団の作製方法：
単離されたヒト臍帯血幹細胞の集団を提供する工程、ならびに
単離されかつ増殖したヒト臍帯血幹細胞の濃縮された集団を作製するのに有効な条件下において、無血清培養系においてヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下にて、ヒト臍帯血幹細胞の単離された集団を処理する工程であって、該増殖したヒト臍帯血幹細胞が、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１８４＋、ＣＤ１１７＋、ＣＤ４９ｆ＋、ＡＬＤＨ＋、かつＣＤ４５ＲＡ−でありかつ多能性遺伝子ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３を発現する、工程。
【請求項１２】
前記単離されたヒト臍帯血幹細胞の集団が、前記処理を行うと約２０，２０２倍に増殖する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記処理が７日間実施される、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記増殖した幹細胞の少なくとも約８８．３％±５．９％が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性に対して陽性である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記増殖した幹細胞が、胚性幹細胞の多能性遺伝子ｈＴＥＲＴの発現レベルにおいて上方制御を示さない、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記増殖した幹細胞の少なくとも約９５％が、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３に対して陽性である、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記無血清培養系が、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３、ＴＰＯ、ＩＬ３、及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるサイトカインを更に含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、ＶＰＡ、ＳＣＲ、ＬＢＨ５８９、ＴＳＡ、ＳＡＨＡ、Ｃａｙ１０４３３、及びＣａｙ１０３９８からなる群より選択される、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記増殖した幹細胞が、前記処理前の前記単離された幹細胞と比較して減少した、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ３、及びＨＤＡＣ５の発現を有する、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記増殖した幹細胞の少なくとも約９５％が、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３に対して陽性である、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記増殖した幹細胞の少なくとも約１８．０％±１．２％が、Ｇ２／Ｍ期にある、請求項１１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記増殖した幹細胞の少なくとも約２３．２％±１３．８％が、Ｇ０／Ｇ１期にある、請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
以下の工程を含む、対象の血液疾患を治療する方法：
該対象における該血液疾患を治療するために、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離されかつ増殖したヒト臍帯血幹細胞の濃縮された集団を該対象に投与する工程。
【請求項２４】
前記投与する工程が、濃縮または精製された調製物に由来する前記幹細胞を前記対象内に移植することによって実施される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記増殖した幹細胞が、前記対象由来である、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記増殖した幹細胞の少なくとも約６０％が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性に対して陽性である、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記増殖した幹細胞が、胚性幹細胞の多能性遺伝子ｈＴＥＲＴの発現レベルにおいて全く上方制御を示さない、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記増殖した幹細胞の少なくとも約９５％が、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３に対して陽性である、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記増殖した幹細胞の少なくとも約２３％が、Ｇ２／Ｍ期にある、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記増殖した幹細胞の少なくとも約１８％が、Ｇ０／Ｇ１期にある、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
以下の工程を含む、造血幹細胞に対する化合物の効果を決定する方法：
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離されかつ増殖したヒト臍帯血幹細胞の濃縮された集団を提供する工程；
該幹細胞を、試験される化合物に接触させる工程；ならびに
該幹細胞に対する該化合物の効果を決定するために、該接触後に該幹細胞を解析する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年５月２０日出願のU.S. 61/825,354、及び２０１４年４月２４日出願のU.S. 61/983,805の利益を主張し、両方ともその内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、濃縮されかつ増殖したヒト臍帯血幹細胞、その作製方法、及び治療方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
臍帯血（「ＣＢ」）造血幹細胞（「ＨＳＣ」）は、幹細胞とその成熟細胞とを区別する多くの表現型及び機能的特性を有する（Cairo et al., "Placental and/or Umbilical Cord Blood: An Alternative Source of Hematopoietic Stem Cells for Transplantation," Blood 90:4665-4678 (1997)（非特許文献1）；Dahlberg et al., "Ex vivo Expansion of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells," Blood 117:6083-6090 (2011)（非特許文献2）；Delaney et al., "Cord Blood Graft Engineering," Biol. Blood Marrow Transplant 19(1): S74-S78 (2013)（非特許文献3）；Navarrete et al., "Cord Blood Banking: A Historical Perspective," Br. J. Haematol. 147:236-245 (2009)（非特許文献4）；Stanevsky et al., "Umbilical Cord Blood Transplantation: Pros, Cons and Beyond," Blood Rev. 23:199-204 (2009)（非特許文献5））。ＣＢ ＣＤ３４＋細胞が、より未分化であると考えられている理由は、その広範囲な増殖能、インビトロで造血コロニーを生成する高い能力、胎児ヘモグロビンを含有する赤血球細胞を形成する能力、及びこのような細胞の若干が持つ骨髄破壊的同種レシピエントを再構築する能力にある（Cairo et al., "Placental and/or Umbilical Cord Blood: An Alternative Source of Hematopoietic Stem Cells for Transplantation," Blood 90:4665-4678 (1997)（非特許文献1））。ＣＢ細胞を、血液悪性腫瘍及び遺伝性疾患に罹患した同種幹細胞レシピエントへのＨＳＣ移植片として使用することは、単一のＣＢ収集物中に存在する幹細胞数に限りがあるため、小児または若年成人レシピエントに限定されてきた（Cairo et al., "Placental and/or Umbilical Cord Blood: An Alternative Source of Hematopoietic Stem Cells for Transplantation," Blood 90:4665-4678 (1997)（非特許文献1）；Navarrete et al., "Cord Blood Banking: A Historical Perspective," Br. J. Haematol. 147:236-245 (2009)（非特許文献4）；Stanevsky et al., "Umbilical Cord Blood Transplantation: Pros, Cons and Beyond," Blood Rev. 23:199-204 (2009)（非特許文献5））。これらの制約から、成人レシピエントにおける移植失敗及び生着速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）遅延の割合が容認できないほど高い結果となった（Cairo et al., "Placental and/or Umbilical Cord Blood: An Alternative Source of Hematopoietic Stem Cells for Transplantation," Blood 90:4665-4678 (1997)（非特許文献1）；Dahlberg et al., "Ex vivo Expansion of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells," Blood 117:6083-6090 (2011)（非特許文献2）；Delaney et al., "Cord Blood Graft Engineering," Biol. Blood Marrow Transplant 19(1): S74-S78 (2013)（非特許文献3）；Navarrete et al., "Cord Blood Banking: A Historical Perspective," Br. J. Haematol. 147:236-245 (2009)（非特許文献4）；Stanevsky et al., "Umbilical Cord Blood Transplantation: Pros, Cons and Beyond," Blood Rev. 23:199-204 (2009)（非特許文献5）；Barker et al., "Combined Effect of Total Nucleated Cell Dose and HLA Match on Transplantation Outcome in 1061 Cord Blood Recipients with Hematologic Malignancies," Blood 115:1843-1849 (2010)（非特許文献6）；Delaney et al., "Strategies to Enhance Umbilical Cord Blood Stem Cell Engraftment in Adult Patients," Expert Rev. Hematol. 3:273-283 (2010)（非特許文献7））。これらの障害を克服する試みとして、２つの異なるＣＢ移植片注入、またはＣＢ ＣＤ３４＋細胞のＨＳＣ周期進行及びそれに続く分裂を促進できる様々なサイトカインの組み合わせを使用するＣＤ３４＋細胞のエクスビボでの増殖など、いくつかの異なる方法が挙げられてきた（２、６−９）。エクスビボでの幹細胞増殖におけるこれらの初期の試みでは、より多数の造血始原及び前駆細胞を産生したが、骨髄再構築細胞数は減少してしまった。ＨＳＣの大半は、イ��ビボでの細胞周期が遅い静止細胞である。（Giebel et al., "Primitive Human Hematopoietic Cells Give Rise to Differentially Specified Daughter Cells Upon their Initial Cell Division," Blood 107(5):2146-2152 (2006)（非特許文献8）；Ho et al., "The Beauty of Asymmetry: Asymmetric Divisions and Self-Renewal in the Haematopoietic System," Curr. Opin. Hematol. 14(4):330-336 (2007)（非特許文献9）；Huang et al., "Symmetry of Initial Cell Divisions Among Primitive Hematopoietic Progenitors Is Independent of Ontogenic Age and Regulatory Molecules," Blood 94(8):2595-2604 (1999)（非特許文献10）；Srour et al., "Modulation of In vitro Proliferation Kinetics and Primitive Hematopoietic Potential of Individual Human CD34+CD38-/lo Cells in G0," Blood 105(8):3109-3116 (2005)（非特許文献11））。このようなサイトカインの組み合わせの存在下で生じるＣＢ ＣＤ３４＋細胞のエクスビボ細胞周期進行及び分裂を早めることで、ＨＳＣへのコミットメントをもたらしたが、静止状態を維持したまたは細胞分裂回数の少なかったわずかな幹細胞画分に、骨髄再構築能が残されていた（１０−１３）。ごく最近では、移植可能なＣＢ ＨＳＣの数を増やすことを目的として、これらのサイトカインの組み合わせに対して、間葉系細胞フィーダー層、または固定化したｎｏｔｃｈリガンド、銅キレート剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣＩ）、オールトランスレチノイン酸、アリールハイドロカーボン受容体のアンタゴニスト、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、もしくはｃ−ＭＰＬアゴニストなどの多数の分子を添加してきた（Dahlberg et al., "Ex vivo Expansion of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells," Blood 117:6083-6090 (2011)（非特許文献2）；Delaney et al., "Strategies to Enhance Umbilical Cord Blood Stem Cell Engraftment in Adult Patients," Expert Rev. Hematol. 3:273-283 (2010)（非特許文献7）；Boitano et al., "Aryl Hydrocarbon Receptor Antagonists Promote the Expansion of Human Hematopoietic Stem Cells," Science 329:1345-1348 (2010)（非特許文献12）；De Felice et al., "Histone Deacetylase Inhibitor Valproic Acid Enhances the Cytokine-Induced Expansion of Human Hematopoietic Stem Cells," Cancer Res. 65:1505-1513 (2005)（非特許文献13）；Himburg et al., "Pleiotrophin Regulates the Expansion and Regeneration of Hematopoietic Stem Cells," Nat. Med. 16:475-482 (2010)（非特許文献14）；Milhem et al., "Modification of Hematopoietic Stem Cell Fate by 5aza 2'deoxycytidine and Trichostatin A," Blood 103:4102-4110 (2004)（非特許文献15）；Nishino et al., "Ex vivo Expansion of Human Hematopoietic Stem Cells by a Small-Molecule Agonist of c-MPL," Exp. Hematol. 37:1364-1377 e1364. (2009)（非特許文献16）；North et al., "Prostaglandin E2 Regulates Vertebrate Haematopoietic Stem Cell Homeostasis," Nature 447:1007-1011 (2007)（非特許文献17））。これらのアプローチのいくつかは、臨床試験で評価されたが、長期ではなく短期の骨髄再構築細胞が多数産生される結果となった（Dahlberg et al., "Ex vivo Expansion of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells," Blood 117:6083-6090 (2011)（非特許文献2）；de Lima et al., "Transplantation of Ex vivo Expanded Cord Blood Cells Using the Copper Chelator Tetraethylenepentamine: A Phase I/II Clinical Trial," Bone Marrow Transplant 41:771-778 (2008)（非特許文献18）；de Lima et al., "Cord-Blood Engraftment with Ex Vivo Mesenchymal-Cell Coculture," N. Engl. J. Med. 367(24):2305-2315 (2012)（非特許文献19）；Delaney et al., "Notch-Mediated Expansion of Human Cord Blood Progenitor Cells Capable of Rapid Myeloid Reconstitution," Nat. Med. 16(2):232-236 (2010)（非特許文献20））。あるいは、同種ＣＢ移植の有効性を向上させるために、ＣＢ ＣＤ３４＋細���のホーミング及び生着効率を促進する方法も進められている（Goessling et al., "Prostaglandin E2 Enhances Human Cord Blood Stem Cell Xenotransplants and Shows Long-Term Safety in Preclinical Nonhuman Primate Transplant Models," Cell Stem Cell 8(4):445-458 (2011)（非特許文献21）；Hoggatt et al., "Differential Stem and Progenitor-Cell Trafficking by Prostaglandin E2," Nature 495(7441):365-369 (2013)（非特許文献22）；O'Leary et al., "The Role of Dipeptidyl Peptidase 4 in Hematopoiesis and Transplantation," Curr. Opin. Hematol. 20(4):314-319 (2013)（非特許文献23））。
【０００４】
機能的ＣＢ ＨＳＣ数を増やす代替アプローチが提案された。このアプローチは、血清含有（ＳＣ）培地及びサイトカインの組み合わせを使用してエクスビボでＨＳＣを増殖させる先の試みが、実際はＨＳＣの遺伝的プログラムを抑制するという仮説に基づいている（Dahlberg et al., "Ex vivo Expansion of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells," Blood 117:6083-6090 (2011)（非特許文献2）；Delaney et al., "Strategies to Enhance Umbilical Cord Blood Stem Cell Engraftment in Adult Patients," Expert Rev. Hematol. 3:273-283 (2010)（非特許文献7）；Rao et al., "Concise Review: Cord Blood Banking, Transplantation and Induced Pluripotent Stem Cell: Success and Opportunities," Stem Cells 30:55-60 (2012)（非特許文献24）；Milhem et al., "Modification of Hematopoietic Stem Cell Fate by 5aza 2'deoxycytidine and Trichostatin A," Blood 103:4102-4110 (2004)（非特許文献15）；Araki et al., "Expansion of Human Umbilical Cord Blood SCID-Repopulating Cells Using Chromatin-Modifying Agents," Exp. Hematol. 34:140-149 (2006)（非特許文献25）；Araki et al., "Chromatin-Modifying Agents Permit Human Hematopoietic Stem Cells to Undergo Multiple Cell Divisions While Retaining Their Repopulating Potential," Blood 109:3570-3578 (2007)（非特許文献26）；Azuara et al., "Chromatin Signatures of Pluripotent Cell Lines," Nat. Cell Biol. 8:532-538 (2006)（非特許文献27）；Chaurasia et al., "Chromatin-Modifying Agents Promote the Ex vivo Production of Functional Human Erythroid Progenitor Cells," Blood 117:4632-4641 (2011)（非特許文献28）；Delcuve et al., "Roles of Histone Deacetylases in Epigenetic Regulation: Emerging Paradigms from Studies with Inhibitors," Clin. Epigenetics 4(1):5 (2012)（非特許文献29）；Gul et al., "Valproic Acid Increases CXCR4 Expression in Hematopoietic Stem/Progenitor Cells by Chromatin Remodeling," Stem Cells Dev. 18:831-838 (2009)（非特許文献30））。この代替方法は、ＨＳＣが対称分裂して追加の幹細胞を産生するかどうか、ＨＳＣが造血前駆細胞（ＨＰＣ）を産生すると同時に最善でもＨＳＣ数を維持する非対称分裂をするかどうか、または、ＨＳＣ数を枯渇させてより多くのＨＰＣを産生するコミットメント対称分裂をするかどうかを決定する重要な役割を、エピジェネティックなメカニズムが担うという、多くの証拠と一致する（Araki et al., "Expansion of Human Umbilical Cord Blood SCID-Repopulating Cells Using Chromatin-Modifying Agents," Exp. Hematol. 34:140-149 (2006)（非特許文献25）；Araki et al., "Chromatin-Modifying Agents Permit Human Hematopoietic Stem Cells to Undergo Multiple Cell Divisions While Retaining Their Repopulating Potential," Blood 109:3570-3578 (2007)（非特許文献26）；Asai et al., "Necdin, a p53 Target Gene, Regulates the Quiescence and Response to Genotoxic Stress of Hematopoietic Stem/Progenitor Cells," Blood 120(8):1601-1612 (2012)（非特許文献31）；Li, "Quiescence Regulators for Hematopoietic Stem Cell," Exp. Hematol. 39(5):511-520 (2011)（非特許文献32）；Will et al., "Satb1 Regulates the Self-Renewal of Hematopoietic Stem Cells by Promoting Quiescence and Repressing Differentiation Commitment," Nat. Immunol. 14(5):437-445 (2013)（非特許文献33）；Wilson et al., "Hematopoietic Stem Cells Reversibly Switch from Dormancy to Self-Renewal During Homeostasis and Repair," Cell 135(6):1118-1129 (2008)（非特許文献34））。
【０００５】
本発明は、当該技術分野におけるこれらの及びその他の足りない点を克服することに関する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Cairo et al., "Placental and/or Umbilical Cord Blood: An Alternative Source of Hematopoietic Stem Cells for Transplantation," Blood 90:4665-4678 (1997)
【非特許文献２】Dahlberg et al., "Ex vivo Expansion of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells," Blood 117:6083-6090 (2011)
【非特許文献３】Delaney et al., "Cord Blood Graft Engineering," Biol. Blood Marrow Transplant 19(1): S74-S78 (2013)
【非特許文献４】Navarrete et al., "Cord Blood Banking: A Historical Perspective," Br. J. Haematol. 147:236-245 (2009)
【非特許文献５】Stanevsky et al., "Umbilical Cord Blood Transplantation: Pros, Cons and Beyond," Blood Rev. 23:199-204 (2009)
【非特許文献６】Barker et al., "Combined Effect of Total Nucleated Cell Dose and HLA Match on Transplantation Outcome in 1061 Cord Blood Recipients with Hematologic Malignancies," Blood 115:1843-1849 (2010)
【非特許文献７】Delaney et al., "Strategies to Enhance Umbilical Cord Blood Stem Cell Engraftment in Adult Patients," Expert Rev. Hematol. 3:273-283 (2010)
【非特許文献８】Giebel et al., "Primitive Human Hematopoietic Cells Give Rise to Differentially Specified Daughter Cells Upon their Initial Cell Division," Blood 107(5):2146-2152 (2006)
【非特許文献９】Ho et al., "The Beauty of Asymmetry: Asymmetric Divisions and Self-Renewal in the Haematopoietic System," Curr. Opin. Hematol. 14(4):330-336 (2007)
【非特許文献１０】Huang et al., "Symmetry of Initial Cell Divisions Among Primitive Hematopoietic Progenitors Is Independent of Ontogenic Age and Regulatory Molecules," Blood 94(8):2595-2604 (1999)
【非特許文献１１】Srour et al., "Modulation of In vitro Proliferation Kinetics and Primitive Hematopoietic Potential of Individual Human CD34+CD38-/lo Cells in G0," Blood 105(8):3109-3116 (2005)
【非特許文献１２】Boitano et al., "Aryl Hydrocarbon Receptor Antagonists Promote the Expansion of Human Hematopoietic Stem Cells," Science 329:1345-1348 (2010)
【非特許文献１３】De Felice et al., "Histone Deacetylase Inhibitor Valproic Acid Enhances the Cytokine-Induced Expansion of Human Hematopoietic Stem Cells," Cancer Res. 65:1505-1513 (2005)
【非特許文献１４】Himburg et al., "Pleiotrophin Regulates the Expansion and Regeneration of Hematopoietic Stem Cells," Nat. Med. 16:475-482 (2010)
【非特許文献１５】Milhem et al., "Modification of Hematopoietic Stem Cell Fate by 5aza 2'deoxycytidine and Trichostatin A," Blood 103:4102-4110 (2004)
【非特許文献１６】Nishino et al., "Ex vivo Expansion of Human Hematopoietic Stem Cells by a Small-Molecule Agonist of c-MPL," Exp. Hematol. 37:1364-1377 e1364. (2009)
【非特許文献１７】North et al., "Prostaglandin E2 Regulates Vertebrate Haematopoietic Stem Cell Homeostasis," Nature 447:1007-1011 (2007)
【非特許文献１８】de Lima et al., "Transplantation of Ex vivo Expanded Cord Blood Cells Using the Copper Chelator Tetraethylenepentamine: A Phase I/II Clinical Trial," Bone Marrow Transplant 41:771-778 (2008)
【非特許文献１９】de Lima et al., "Cord-Blood Engraftment with Ex Vivo Mesenchymal-Cell Coculture," N. Engl. J. Med. 367(24):2305-2315 (2012)
【非特許文献２０】Delaney et al., "Notch-Mediated Expansion of Human Cord Blood Progenitor Cells Capable of Rapid Myeloid Reconstitution," Nat. Med. 16(2):232-236 (2010)
【非特許文献２１】Goessling et al., "Prostaglandin E2 Enhances Human Cord Blood Stem Cell Xenotransplants and Shows Long-Term Safety in Preclinical Nonhuman Primate Transplant Models," Cell Stem Cell 8(4):445-458 (2011)
【非特許文献２２】Hoggatt et al., "Differential Stem and Progenitor-Cell Trafficking by Prostaglandin E2," Nature 495(7441):365-369 (2013)
【非特許文献２３】O'Leary et al., "The Role of Dipeptidyl Peptidase 4 in Hematopoiesis and Transplantation," Curr. Opin. Hematol. 20(4):314-319 (2013)
【非特許文献２４】Rao et al., "Concise Review: Cord Blood Banking, Transplantation and Induced Pluripotent Stem Cell: Success and Opportunities," Stem Cells 30:55-60 (2012)
【非特許文献２５】Araki et al., "Expansion of Human Umbilical Cord Blood SCID-Repopulating Cells Using Chromatin-Modifying Agents," Exp. Hematol. 34:140-149 (2006)
【非特許文献２６】Araki et al., "Chromatin-Modifying Agents Permit Human Hematopoietic Stem Cells to Undergo Multiple Cell Divisions While Retaining Their Repopulating Potential," Blood 109:3570-3578 (2007)
【非特許文献２７】Azuara et al., "Chromatin Signatures of Pluripotent Cell Lines," Nat. Cell Biol. 8:532-538 (2006)
【非特許文献２８】Chaurasia et al., "Chromatin-Modifying Agents Promote the Ex vivo Production of Functional Human Erythroid Progenitor Cells," Blood 117:4632-4641 (2011)
【非特許文献２９】Delcuve et al., "Roles of Histone Deacetylases in Epigenetic Regulation: Emerging Paradigms from Studies with Inhibitors," Clin. Epigenetics 4(1):5 (2012)
【非特許文献３０】Gul et al., "Valproic Acid Increases CXCR4 Expression in Hematopoietic Stem/Progenitor Cells by Chromatin Remodeling," Stem Cells Dev. 18:831-838 (2009)
【非特許文献３１】Asai et al., "Necdin, a p53 Target Gene, Regulates the Quiescence and Response to Genotoxic Stress of Hematopoietic Stem/Progenitor Cells," Blood 120(8):1601-1612 (2012)
【非特許文献３２】Li, "Quiescence Regulators for Hematopoietic Stem Cell," Exp. Hematol. 39(5):511-520 (2011)
【非特許文献３３】Will et al., "Satb1 Regulates the Self-Renewal of Hematopoietic Stem Cells by Promoting Quiescence and Repressing Differentiation Commitment," Nat. Immunol. 14(5):437-445 (2013)
【非特許文献３４】Wilson et al., "Hematopoietic Stem Cells Reversibly Switch from Dormancy to Self-Renewal During Homeostasis and Repair," Cell 135(6):1118-1129 (2008)
【発明の概要】
【０００７】
本発明の一態様は、単離されかつ増殖したヒト臍帯血幹細胞の濃縮された集団に関する。この増殖した幹細胞は、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１８４＋、ＣＤ１１７＋、ＣＤ４９ｆ＋、ＡＬＤＨ＋、ＣＤ４５ＲＡ−、並びに多能性遺伝子ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３を発現する。
【０００８】
本発明の別の態様は、単離されかつ増殖したヒト臍帯血幹細胞の濃縮された集団の作製方法に関する。本方法は、単離されたヒト臍帯血幹細胞の集団を提供する工程、並びに、このヒト臍帯血幹細胞の単離された集団を、単離されかつ増殖したヒト臍帯血幹細胞の濃縮された集団を作製するのに有効な条件下において無血清（"ＳＦ"）培養系においてヒストンデアセチラーゼ阻害剤（"ＨＤＡＣＩ"）の存在下にて処理する工程を含む。この増殖した幹細胞は、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１８４＋、ＣＤ１１７＋、ＣＤ４９ｆ＋、ＡＬＤＨ＋、ＣＤ４５ＲＡ−、並びに多能性遺伝子ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３を発現する。
【０００９】
本発明の更なる態様は、対象の血液疾患を治療する方法に関する。本方法は、対象における血液疾患を治療するために、本発明の単離されかつ増殖したヒト臍帯血幹細胞の濃縮された集団を対象に投与する工程を含む。
【００１０】
本発明において、無血清培養条件下においてＨＤＡＣＩで処理されたＣＤ３４＋細胞は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）活性の増強、ＣＤ９０、ｃ−Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、インテグリンα６（ＣＤ４９ｆ）、及びＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）の発現増加、ただしＣＤ４５ＲＡ発現の欠如、を含む未分化な幹細胞に関連する多くの特徴を備えた追加のＣＤ３４＋細胞を産生可能であることが示された（Ｎｏｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ  Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  Ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ，"  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３（６０３９）：２１８−２２１  （２０１１））。更に、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１としても知られる）、ＮＡＮＯＧ、及び小脳のジンクフィンガータンパク質ファミリーメンバー３（ＺＩＣ３、ＨＴＸとしても知られる）を含み、ただしｈＴＥＲＴ（テロメラーゼ逆転写酵素）は除く、多数の多能性遺伝子の上方制御が、バルプロ酸（ＶＰＡ）処理と関連があった（Ａｚｕａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  "Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ，"  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ８：５３２−５３８  （２００６））。ＨＤＡＣＩで処理されたＣＤ３４＋細胞におけるＳＯＸ２、ＯＣＴ４、及びＮＡＮＯＧのノックダウンによって、ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の数が劇的に減少した。ＳＦ培養条件下でのＨＤＡＣＩを用いた処理によって、より多くの未分化細胞を産生するように、分裂するＣＢ ＣＤ３４＋細胞をプログラミングすることができ、その細胞から、放射線照射レシピエントマウス及び免疫不全二次レシピエントマウスの両方で血液悪性腫瘍または奇形腫を発症することなく再構築できたことが見出された。ＳＣＩＤ再構築細胞（ＳＲＣ）の数が、ＶＰＡ処理された細胞ではＣＢ ＣＤ３４＋初代細胞（ＰＣ）での数と比較して３６倍多かったことが、限界希釈解析により実証された。これらのデータは、幹細胞に特異的な転写因子を上方制御するエピジェネティックな方法により、分裂するＣＢ ＨＳＣの自己複製能及び多系統への分化能を維持することを示している。
[本発明1001]
単離されかつ増殖したヒト臍帯血幹細胞の濃縮された集団であって、該幹細胞が、ＣＤ34＋、ＣＤ90＋、ＣＤ184＋、ＣＤ117＋、ＣＤ49ｆ＋、ＡＬＤＨ＋、かつＣＤ45ＲＡ−でありかつ多能性遺伝子ＳＯＸ2、ＯＣＴ4、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ3を発現する、前記濃縮された集団。
[本発明1002]
前記幹細胞の少なくとも約60％が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性に対して陽性である、本発明1001の濃縮された集団。
[本発明1003]
前記幹細胞が、胚性幹細胞の多能性遺伝子ｈＴＥＲＴの発現レベルにおいて上方制御を示さない、本発明1001または本発明1002の濃縮された集団。
[本発明1004]
前記幹細胞の少なくとも約95％が、ＳＯＸ2、ＯＣＴ4、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ3に対して陽性である、前記本発明のいずれかの濃縮された集団。
[本発明1005]
前記幹細胞が、ＳＣＦ、Ｆｌｔ3、ＴＰＯ、ＩＬ3、及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるサイトカインと接触している、前記本発明のいずれかの濃縮された集団。
[本発明1006]
前記幹細胞が、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤と接触している、前記本発明のいずれかの濃縮された集団。
[本発明1007]
前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、ＶＰＡ、ＳＣＲ、ＬＢＨ589、ＴＳＡ、ＳＡＨＡ、Ｃａｙ10433、及びＣａｙ10398からなる群より選択される、本発明1006の濃縮された集団。
[本発明1008]
前記幹細胞が、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤と接触していない単離されかつ増殖したヒト臍帯血幹細胞と比較して減少した、ＨＤＡＣ1、ＨＤＡＣ3、及びＨＤＡＣ5の発現を有する、本発明1006または本発明1007の濃縮された集団。
[本発明1009]
前記幹細胞の少なくとも約18．0％±1．2％が、Ｇ2／Ｍ期にある、前記本発明のいずれかの濃縮された集団。
[本発明1010]
前記幹細胞の少なくとも約23．2％±13．8％が、Ｇ0／Ｇ1期にある、前記本発明のいずれかの濃縮された集団。
[本発明1011]
以下の工程を含む、単離されかつ増殖したヒト臍帯血幹細胞の濃縮された集団の作製方法：
単離されたヒト臍帯血幹細胞の集団を提供する工程、ならびに
単離されかつ増殖したヒト臍帯血幹細胞の濃縮された集団を作製するのに有効な条件下において、無血清培養系においてヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下にて、ヒト臍帯血幹細胞の単離された集団を処理する工程であって、該増殖したヒト臍帯血幹細胞が、ＣＤ34＋、ＣＤ90＋、ＣＤ184＋、ＣＤ117＋、ＣＤ49ｆ＋、ＡＬＤＨ＋、かつＣＤ45ＲＡ−でありかつ多能性遺伝子ＳＯＸ2、ＯＣＴ4、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ3を発現する、工程。
[本発明1012]
前記単離されたヒト臍帯血幹細胞の集団が、前記処理を行うと約20，202倍に増殖する、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記処理が7日間実施される、本発明1011または本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記増殖した幹細胞の少なくとも約88．3％±5．9％が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性に対して陽性である、本発明1011〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記増殖した幹細胞が、胚性幹細胞の多能性遺伝子ｈＴＥＲＴの発現レベルにおいて上方制御を示さない、本発明1011〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記増殖した幹細胞の少なくとも約95％が、ＳＯＸ2、ＯＣＴ4、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ3に対して陽性である、本発明1011〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記無血清培養系が、ＳＣＦ、Ｆｌｔ3、ＴＰＯ、ＩＬ3、及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるサイトカインを更に含む、本発明1011〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、ＶＰＡ、ＳＣＲ、ＬＢＨ589、ＴＳＡ、ＳＡＨＡ、Ｃａｙ10433、及びＣａｙ10398からなる群より選択される、本発明1011〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記増殖した幹細胞が、前記処理前の前記単離された幹細胞と比較して減少した、ＨＤＡＣ1、ＨＤＡＣ3、及びＨＤＡＣ5の発現を有する、本発明1011〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
前記増殖した幹細胞の少なくとも約95％が、ＳＯＸ2、ＯＣＴ4、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ3に対して陽性である、本発明1011〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記増殖した幹細胞の少なくとも約18．0％±1．2％が、Ｇ2／Ｍ期にある、本発明1011〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記増殖した幹細胞の少なくとも約23．2％±13．8％が、Ｇ0／Ｇ1期にある、本発明1011〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
以下の工程を含む、対象の血液疾患を治療する方法：
該対象における該血液疾患を治療するために、本発明1001〜1010のいずれかの単離されかつ増殖したヒト臍帯血幹細胞の濃縮された集団を該対象に投与する工程。
[本発明1024]
前記投与する工程が、濃縮または精製された調製物に由来する前記幹細胞を前記対象内に移植することによって実施される、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記増殖した幹細胞が、前記対象由来である、本発明1023または本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記増殖した幹細胞の少なくとも約60％が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性に対して陽性である、本発明1023〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
前記増殖した幹細胞が、胚性幹細胞の多能性遺伝子ｈＴＥＲＴの発現レベルにおいて全く上方制御を示さない、本発明1023〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
前記増殖した幹細胞の少なくとも約95％が、ＳＯＸ2、ＯＣＴ4、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ3に対して陽性である、本発明1023〜1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
前記増殖した幹細胞の少なくとも約23％が、Ｇ2／Ｍ期にある、本発明1023〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
前記増殖した幹細胞の少なくとも約18％が、Ｇ0／Ｇ1期にある、本発明1023〜1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
以下の工程を含む、造血幹細胞に対する化合物の効果を決定する方法：
本発明1001〜1010のいずれかの単離されかつ増殖したヒト臍帯血幹細胞の濃縮された集団を提供する工程；
該幹細胞を、試験される化合物に接触させる工程；ならびに
該幹細胞に対する該化合物の効果を決定するために、該接触後に該幹細胞を解析する工程。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｄは、ＣＢ ＣＤ３４＋細胞、ＣＢ ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞、及びＣＢ ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ１８４＋細胞のエクスビボにおける増殖に対するＨＤＡＣＩの効果を示している。図１Ａは、臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋初代細胞（ＰＣ）のエクスビボにおける増殖方法の略図である。新たに単離されたＰＣを、無血清（ＳＦ）培地または血清含有（ＳＣ）培地のいずれかにおいてサイトカインで１６時間前処理した。次いで、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣＩ）の存在下／非存在下において、追加のサイトカインを入れてまたは入れずに、前述の培養条件下で細胞を更に７日間処理した。この増殖させた細胞／再単離されたＣＤ３４＋細胞を、更なる解析に使用した。個々のＣＢＰＣを、ＳＦ培地中、バルプロ酸（ＶＰＡ）、スクリプタイド（ＳＣＲ）、またはＣＡＹ１０４３３（Ｃ４３３）の非存在下（コントロール）または存在下にて、サイトカインで７日間処理した。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｄは、ＣＢ ＣＤ３４＋細胞、ＣＢ ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞、及びＣＢ ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ１８４＋細胞のエクスビボにおける増殖に対するＨＤＡＣＩの効果を示している。ＶＰＡでは、その他のＨＤＡＣＩよりも、ＣＢ収集物当たりＣＤ３４＋細胞（＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．００５）（図１Ｂ）、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞（＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．００５）（図１Ｃ）並びにＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ１８４＋細胞（＊＊＊ｐ＝０．０００５）（図１Ｄ）の絶対数が有意に高い産生結果となった（平均±ＳＥ；図１Ｂ、図１Ｃ（ＡＮＯＶＡ  ｐ≦０．０００７）及び図１Ｄ（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１）（ｎ＝６〜７）。
【図１Ｃ】図１Ａ〜Ｄは、ＣＢ ＣＤ３４＋細胞、ＣＢ ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞、及びＣＢ ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ１８４＋細胞のエクスビボにおける増殖に対するＨＤＡＣＩの効果を示している。ＶＰＡでは、その他のＨＤＡＣＩよりも、ＣＢ収集物当たりＣＤ３４＋細胞（＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．００５）（図１Ｂ）、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞（＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．００５）（図１Ｃ）並びにＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ１８４＋細胞（＊＊＊ｐ＝０．０００５）（図１Ｄ）の絶対数が有意に高い産生結果となった（平均±ＳＥ；図１Ｂ、図１Ｃ（ＡＮＯＶＡ  ｐ≦０．０００７）及び図１Ｄ（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１）（ｎ＝６〜７）。
【図１Ｄ】図１Ａ〜Ｄは、ＣＢ ＣＤ３４＋細胞、ＣＢ ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞、及びＣＢ ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ１８４＋細胞のエクスビボにおける増殖に対するＨＤＡＣＩの効果を示している。ＶＰＡでは、その他のＨＤＡＣＩよりも、ＣＢ収集物当たりＣＤ３４＋細胞（＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．００５）（図１Ｂ）、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞（＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．００５）（図１Ｃ）並びにＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ１８４＋細胞（＊＊＊ｐ＝０．０００５）（図１Ｄ）の絶対数が有意に高い産生結果となった（平均±ＳＥ；図１Ｂ、図１Ｃ（ＡＮＯＶＡ  ｐ≦０．０００７）及び図１Ｄ（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１）（ｎ＝６〜７）。
【図２】図２Ａ〜Ｂは、ＣＢ ＣＤ３４＋細胞及びＣＢ ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞のエクスビボにおける増殖に対するＶＰＡの効果を示している。図２Ａでは、サイトカイン存在下におけるＣＢ ＣＤ３４＋細胞及びＣＢ ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の産生割合は、血清含有（ＳＣ）培養の場合よりも無血清（ＳＦ）培養の場合の方が高かった。ＳＣ培養と比較して、ＶＰＡ含有ＳＦ培養で、ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の増加倍率に有意差が観察された。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５（平均±ＳＥ；ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１）、（ｎ＝５〜７）。図２Ｂは、ＰＣ細胞、及び、ＳＦ培地中、コントロール条件下またはＶＰＡの存在下において処理されたＣＤ３４＋細胞の表現型解析を示している。ＣＤ３４、ＣＤ９０、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）、ＣＤ４９ｆ及びＣＤ４５ＲＡの発現について、各細胞集団を解析した。ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞（枠内）とＣＤ１８４、ＣＤ４９ｆ及びＣＤ４５ＲＡとの共発現が図示されている（ｎ＝４）。
【図３】図３Ａ〜Ｂは、ＣＤ３４＋細胞の遊走及びホーミングに対するＶＰＡの効果を示している。図３Ａは、ＶＰＡの非存在下（コントロール）または存在下（７日間）で産生された再単離されたＣＤ３４＋細胞の、ＳＤＦ１（１００ｎｇ／ｍＬ）により誘導された遊走の結果を示している。１６時間後及び４８時間後におけるＳＤＦ１に対して遊走した細胞数は、ＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋細胞の方が有意に高かった（平均±ＳＥ、＊ｐ＜０．０５、片側ｔ検定）、（ｎ＝４）。図３Ｂは、ＶＰＡの非存在下（コントロール）または存在下（７日間）で産生された再単離されたＣＤ３４＋細胞の、注入後１６時間及び４８時間におけるＮＳＧマウス内でのホーミングを示している（平均±ＳＥ、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊ｐ＜０．０５）。ＮＳＧマウスレシピエント（ｎ＝３５）。
【図４】図４Ａ〜Ｂは、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の細胞周期の異なる段階に対するＶＰＡの効果を示している。図４Ａは、７日間のコントロール条件下のＳＦ培養（上部パネル−２６．４％）またはＶＰＡ含有培養（下部パネル−８２．９％）後のＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞のフローサイトメトリーによる細胞周期解析を示している。対応するドットプロットは、ＢｒｄＵでパルスラベリング（２．５時間）し、７ＡＡＤで染色することにより細胞周期の異なる段階における細胞を示している（Ｇ０／Ｇ１、Ｓ及びＧ２／Ｍ）。３つの代表的な実験のうちの１つが示されている。図４Ｂは、細胞周期の異なる段階におけるＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の割合（％）を示している。ＶＰＡ含有培養において、Ｇ０／Ｇ１期（＊ｐ＜０．０５）、Ｓ期（＊Ｐ＜０．０５）、及びＧ２／Ｍ期（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）で、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞数の有意な増加が観察された（平均±ＳＤ；ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０．００２）、（ｎ＝３）。
【図５】図５Ａ〜Ｂは、サイトカインの不在下における、ＣＢ ＣＤ３４＋細胞及びＣＢ ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞のエクスビボにおける増殖に対するＶＰＡの効果を示している。図５Ａでは、ＣＢ ＣＤ３４＋初代細胞（ＰＣ）を、図１Ａに記載の通りにサイトカインで前処理し、追加のサイトカインを入れずに、ＳＦ培養条件下にて培地のみ（サイトカイン無し）またはＶＰＡのみ（サイトカイン無し）で７日間処理した。培地のみ（サイトカイン無し）及びＶＰＡのみ（サイトカイン無し）を含む培養の両方で、ＰＣと比較してＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の数が有意に高い結果となった（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１及び＊ｐ＜０．０５）（平均±ＳＥ；ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１）、（ｎ＝６）。図５Ｂでは、培地のみ（サイトカイン無し）対ＶＰＡのみ（サイトカイン無し）を含むＳＦ培養において、ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の増加倍率に有意差が観察された＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５（平均±ＳＥ；ＡＮＯＶＡ、（ｐ＜０．０００１）、（ｎ＝６）。
【図６】ＨＤＡＣタンパク質発現レベルに対するＨＤＡＣＩの効果を示している。臍帯血単核細胞（ＣＢ−ＭＮＣ）を新たに単離し、スクリプタイド（ＳＣＲ）、ＣＡＹ１０４３３（Ｃ４３３）、またはバルプロ酸（ＶＰＡ）の非存在下及び存在下にて２４時間処理した。全細胞溶解物を調製し、実施例に記載された通り、クラスＩ（１、２、及び３）、クラスＩＩａ（４及び５）、並びにクラスＩＩｂ（６）のＨＤＡＣに特異的なＨＤＡＣ ｍＡｂを使用して、ウェスタンブロットを実施した。ローディングコントロールとしてｂ−アクチンを使用した。Ｕｎは未処理の新たに単離されたＣＢ−ＭＮＣであり、Ｃはコントロールである。４つの代表的な実験のうちの１つが示されている。
【図７】図７Ａ〜Ｂは、増殖したＣＢ−ＣＤ３４＋細胞におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）機能活性を示している。図７Ａは、コントロール条件下またはＶＰＡで７日間処理された臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋初代細胞（ＰＣ）の結果を、ＡＬＤＨ活性評価用のサイトカインと共に示している。ＡＬＤＨ＋ＣＤ３４＋細胞（左列）、ＡＬＤＨ＋細胞（中央列）を含む、様々な細胞集団の等高線プロット解析。ＡＬＤＨ＋細胞（枠内）は、ＣＤ３４及びｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７）（右列）の共発現用にゲートされた。ＶＰＡ含有培養（ｐ＝０．００１）のみならず、血清含有（ＳＣ）コントロール培養（ｐ＝０．００５）と比較して無血清（ＳＦ）培養においても、より高い割合でＡＬＤＨ活性が観察された。同様に、ＡＬＤＨ＋ＣＤ３４＋細胞及びＡＬＤＨ＋ＣＤ３４＋ＣＤ１１７＋細胞の割合（％）は、ＳＣ培養と比較してＳＦ培養において有意に高かった（それぞれｐ＝０．００１及びｐ＝０．００７）。左パネルはＳＣ培養であり右パネルはＳＦ培養である。７つの代表的な実験のうちの１つが示されている。図７Ｂに示すように、ＳＣ培養と比較してＳＦ培養において、ＶＰＡの存在下にて、はるかに多数のＡＬＤＨ＋ＣＤ３４＋ＣＤ１１７＋細胞が産生された（平均±ＳＤ；＊ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．００９）、（ｎ＝３〜５）。
【図８】図８Ａ〜Ｃは、ＶＰＡにより増殖したＣＤ３４＋細胞における多能性遺伝子の転写結果を示している。図８Ａは、ＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋細胞における多能性遺伝子の発現結果を示している。ＣＤ３４＋細胞を、無血清（ＳＦ）培養及び血清含有（ＳＣ）培養においてＶＰＡの存在下又は非存在下にて処理した後、再単離した。全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。胚性幹（ＥＳ）細胞は、ＳＯＸ２／ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ転写のポジティブコントロールであり、ＣＤ３４発現のネガティブコントロールである。ＲＴ−ＰＣＲでは、ＳＦ培養条件下にてＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋細胞において偽ＯＣＴ４の発現は検出されなかった。コントロール／ＶＰＡ（ＳＦ）及びＶＰＡ（ＳＣ）／ＥＳ細胞のレーンの泳動は２つの異なるゲルにて実施し、ＯＣＴ４−偽遺伝子／本物のレーンの泳動は単一ゲルにて実施した。ＧＡＰＤＨ：ハウスキーピング遺伝子、Ｍ：５０ｂｐ ＤＮＡラダー。４つの代表的な実験のうちの１つが示されている。図８Ｂは、多能性に関する遺伝子に対するＶＰＡの効果の定量を示している。異なる条件下で培養されたＣＤ３４＋細胞を単離し、上記の通りに処理した（図８Ａ）。遺伝子（ＳＯＸ２／ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ）の相対転写レベルは、Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｑ−ＰＣＲによって計算した。コントロール培養（左パネル）及びＶＰＡ含有培養（右パネル）から再単離されたＣＤ３４＋細胞によるｍＲＮＡ発現の倍率変化は、ＰＣ中に存在する、対応する転写レベルを基準として正規化することにより計算した（平均±ＳＤ；ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．０００１）、（ｎ＝４）。図８Ｃは、ＳＦまたはＳＣ培養条件下でのＶＰＡ処理後のクロマチンリモデリング及び多能性に関する遺伝子発現の定量を示している。ＳＥＴ、ＭＹＳＴ３、ＳＭＡＲＣＡＤ１、及びＺＩＣ３遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの倍率変化を、上記の通りに計算した（平均±ＳＥ、ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．０４）、（ｎ＝３）。
【図９Ａ】図９Ａ〜Ｃは、ＶＰＡにより増殖したＣＤ３４＋細胞における多能性遺伝子の発現結果を示している。図９Ａは、コントロール条件下またはＶＰＡへの曝露後の培養から７日後に再単離されたＣＤ３４＋細胞におけるＳＯＸ２、ＯＣＴ４、及びＮＡＮＯＧ発現の代表的なフローサイトメトリー解析結果を示している。細胞を固定し、透過処理し、ＳＯＸ２／ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ ｍＡｂまたは対応するアイソタイプＩｇＧ（各パネル内の一番左側の曲線）で染色して、コントロール培養（コントロールパネル内の一番右側の曲線）及びＶＰＡ培養（ＶＰＡパネル内の一番右側の曲線）から再単離されたＣＤ３４＋細胞における細胞内タンパク質レベルを評価した。４つの代表的な実験のうちの１つが示されている。
【図９Ｂ】図９Ａ〜Ｃは、ＶＰＡにより増殖したＣＤ３４＋細胞における多能性遺伝子の発現結果を示している。図９Ｂは、多能性遺伝子発現の共焦点顕微鏡解析結果を示している：実施例に記載されている通り、ＳＦ培養においてＶＰＡで処理した後にＣＤ３４＋細胞を再単離し、アイソタイプ適合ＩｇＧ、またはＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＮＡＮＯＧ及びＺＩＣ３抗体（ＦＩＴＣ）で免疫染色した。細胞核は、ＤＡＰＩで染色した。共焦点Ｚ軸方向の単一の光学的断面（スケールバー＝１０μｍ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧ（６３倍）並びにＩｇＧ、ＺＩＣ３及び高倍率ＯＣＴ４（１２６倍）が示されている。３つの代表的な実験のうちの１つが示されている。
【図９Ｃ】図９Ａ〜Ｃは、ＶＰＡにより増殖したＣＤ３４＋細胞における多能性遺伝子の発現結果を示している。図９Ｃは、多能性遺伝子の共免疫沈降結果を示している。ＥＳ（Ｈ９）細胞及びＶＰＡで処理された細胞の子孫（Ｖ）を７日目に溶解させて、ＥＳまたはＶ細胞溶解物をＮＡＮＯＧ ｐＡｂ（または抗ＩｇＧコントロール）で免疫沈降（ＩＰ）し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画した。ＥＳ細胞及びＶＰＡで処理された細胞に由来する全タンパク質溶解物（インプット）も同じゲル内に含まれていたが、不連続であった。ウェスタンブロット解析（ＷＢ）を、ＯＣＴ４ ｐＡｂを使用して実施した。ＮＡＮＯＧ ｍＡｂを使用したＷＢも、ＥＳ及びＶ溶解物で実施した。ｂ−アクチンは、ローディングコントロールである。３つの代表的な実験のうちの１つが示されている。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜Ｅは、ｓｉＲＮＡによる多能性遺伝子のノックダウンの結果を示している。図１０Ａでは、ＣＢ ＣＤ３４＋初代細胞（ＰＣ）を無血清（ＳＦ）培養においてＶＰＡで処理した。３日後、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、及びＮＡＮＯＧ（ＳＯＮ）のプール、スクランブル（ネガティブコントロール）、並びにＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ（ポジティブコントロール）で、実施例に記載された通りに細胞をトランスフェクションした。ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＧＡＰＤＨ、及びＺＩＣ３の転写を、Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｑ−ＰＣＲで定量し、ＣＤ３４の転写物のレベルを基準として正規化した＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ≦０．００６、＊＊＊ｐ＝０．０００１（平均±ＳＥ；ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１）、（ｎ＝３）。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜Ｅは、ｓｉＲＮＡによる多能性遺伝子のノックダウンの結果を示している。図１０Ｂでは、ｓｉＲＮＡによるノックダウン後にＳＯＸ２／ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ、ＣＤ３４及びＧＡＰＤＨの発現をＲＴ−ＰＣＲにて解析した。Ｍ：ＤＮＡマーカー。胚性幹（ＥＳ）細胞は、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３のポジティブコントロールである。レーンの泳動は、同じゲル上で実施した。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜Ｅは、ｓｉＲＮＡによる多能性遺伝子のノックダウンの結果を示している。図１０Ｃでは、多能性遺伝子の発現を共焦点顕微鏡にて解析した。上部パネル：スクランブルｓｉＲＮＡ及び下部パネル：ＳＯＮ ｓｉＲＮＡは、ＶＰＡで処理した細胞におけるＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３の発現を示している。画像は、共焦点ｚ軸方向の光学的断面を表す；スケールバー＝１０μｍ（４０倍）。２つの追加実験で、類似データが得られた。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜Ｅは、ｓｉＲＮＡによる多能性遺伝子のノックダウンの結果を示している。図１０Ｄでは、トランスフェクションの７日後、ＣＤ３４＋及びＣＤ３４＋ＣＤ９０＋である細胞の割合（％）を、フローサイトメトリーを使用して解析した。このグラフは、スクランブル及びＳＯＮを含むｓｉＲＮＡでトランスフェクションした後、ＶＰＡ培養において産生されたＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の割合（％）の比較分析を表す。＊ｐ＜０．０５（平均±ＳＥ；ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．０００５）、（ｎ＝３）。
【図１０Ｅ】図１０Ａ〜Ｅは、ｓｉＲＮＡによる多能性遺伝子のノックダウンの結果を示している。図１０Ｅは、スクランブルまたはＳＯＮ ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした後、ＶＰＡ含有培養において産生されたＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の絶対数／ＣＢ収集物を計算したものを示している。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＝０．０００１（平均±ＳＥ；ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．０００８）、（ｎ＝３）。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜Ｆは、一次ＮＳＧマウスにおけるヒト細胞キメリズム解析結果を示している。ＮＳＧマウスに、初代細胞（ＰＣ）、コントロール培養物及びＶＰＡ含有培養物から再単離されたＣＤ３４＋細胞を移植した。（図１１Ａ）ヒト細胞（ＣＤ４５＋）のキメリズムの割合（％）の平均値±ＳＤをフローサイトメトリーによって測定した。（図１１Ａ）＊＊ｐ＝０．００６、＊＊＊ｐ＝０．０００８（ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０．０００１）。ＮＳＧレシピエント（ｎ＝２７）。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜Ｆは、一次ＮＳＧマウスにおけるヒト細胞キメリズム解析結果を示している。ＮＳＧマウスに、初代細胞（ＰＣ）、コントロール培養物及びＶＰＡ含有培養物から再単離されたＣＤ３４＋細胞を移植した。（図１１Ｂ）ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞のキメリズムの割合（％）の平均値±ＳＤをフローサイトメトリーによって測定した。（図１１Ｂ）＊＊ｐ＝０．００４（ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．０３）。ＮＳＧレシピエント（ｎ＝２７）。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜Ｆは、一次ＮＳＧマウスにおけるヒト細胞キメリズム解析結果を示している。ＮＳＧマウスに、初代細胞（ＰＣ）、コントロール培養物及びＶＰＡ含有培養物から再単離されたＣＤ３４＋細胞を移植した。（図１１Ｃ）ＣＤ３４＋ＣＤ１８４＋細胞のキメリズムの割合（％）の平均値±ＳＤをフローサイトメトリーによって測定した。（図１１Ｃ）＊ｐ＝０．０１、＊＊ｐ＝０．０００８（ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．０１）。ＮＳＧレシピエント（ｎ＝２７）。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜Ｆは、一次ＮＳＧマウスにおけるヒト細胞キメリズム解析結果を示している。ＮＳＧマウスに、初代細胞（ＰＣ）、コントロール培養物及びＶＰＡ含有培養物から再単離されたＣＤ３４＋細胞を移植した。（図１１Ｄ）ＣＤ３３＋細胞のキメリズムの割合（％）の平均値±ＳＤをフローサイトメトリーによって測定した。（図１１Ｄ）＊＊ｐ＝０．００３、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１）。ＮＳＧレシピエント（ｎ＝２７）。
【図１１Ｅ】図１１Ａ〜Ｆは、一次ＮＳＧマウスにおけるヒト細胞キメリズム解析結果を示している。ＮＳＧマウスに、初代細胞（ＰＣ）、コントロール培養物及びＶＰＡ含有培養物から再単離されたＣＤ３４＋細胞を移植した。（図１１Ｅ）巨核球（ＣＤ４１＋）、赤血球細胞（グリコフォリンＡ（ＧＰＡ＋））、顆粒球（ＣＤ１４＋）、Ｔ細胞（ＣＤ３＋）及びＢ細胞（ＣＤ１９＋）のキメリズムの割合（％）の平均値±ＳＤをフローサイトメトリーによって測定した。（図１１Ｅ）中央値±ＳＤ  ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１）。ＮＳＧレシピエント（ｎ＝２７）。
【図１１Ｆ】図１１Ａ〜Ｆは、一次ＮＳＧマウスにおけるヒト細胞キメリズム解析結果を示している。ＮＳＧマウスに、初代細胞（ＰＣ）、コントロール培養物及びＶＰＡ含有培養物から再単離されたＣＤ３４＋細胞を移植した。図１１Ｆでは、ＰＣ、ＶＰＡ含有または非含有のＳＦ培養条件下でサイトカインの非存在下または存在下において処理したＣＤ３４＋細胞の移植について、ヒト細胞キメリズムの割合の平均値の比較分析を行った。（図１１Ｆ）＊ｐ＜０．０５（片側ｔ検定）、＊＊ｐ≦０．００２（ＡＮＯＮＡ＜０．０００１）。ＮＳＧレシピエント（ｎ＝２７）。
【図１２】図１２Ａ〜Ｂは、二次ＮＳＧマウスにおけるヒト細胞キメリズム解析結果を示している。ＣＢ ＣＤ３４＋初代細胞（ＰＣ）または前述の様々な条件下で７日間増殖させた移植片を移植してから１３〜１４週間後、一次レシピエントマウスを犠牲死させて、２×１０６個のＢＭ細胞を二次ＮＳＧマウスへと移植した。各バーは、モノクローナル抗体染色及びフローサイトメトリー解析により測定した、二次ＮＳＧマウスの骨髄内に生じたヒトドナー細胞生着、並びに（図１２Ａ及び１２Ｂ）一次レシピエントから異なる種類の移植片を移植して１５〜１６週間後の二次ＮＳＧマウス内に生じた多系統の造血細胞の生着の割合（％）の中央値を表す。２〜３匹のマウスが、各グループに存在した。系統分化パターンには、統計上の有意差があった＊Ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、（中央値±ＳＤ、図１２Ａ及び図１２Ｂ（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１））、ＮＳＧレシピエント（ｎ＝１８）。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜Ｃは、ＣＢ ＣＤ３４＋初代細胞（ＰＣ）及びコントロール条件下で培養またはＶＰＡで処理された当量数のＣＤ３４＋細胞の子孫中に存在するＳＣＩＤ再構築細胞（ＳＲＣ）の頻度比較結果を示している。図１３Ａでは、数を増加させたＰＣ（５０、２５０、５００、２５００、及び５０００）、並びにコントロール条件下またはＶＰＡの存在下で培養した当量数の細胞で培養を始めた子孫を、それぞれＮＳＧマウスに移植した。１２〜１３週間後の、レシピエントマウスのＢＭにおけるヒトＣＤ４５＋細胞の生着割合（％）を示している。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜Ｃは、ＣＢ ＣＤ３４＋初代細胞（ＰＣ）及びコントロール条件下で培養またはＶＰＡで処理された当量数のＣＤ３４＋細胞の子孫中に存在するＳＣＩＤ再構築細胞（ＳＲＣ）の頻度比較結果を示している。図１３Ｂでは、ヒト細胞生着の証拠の有るまたは無いマウスの数を用いてポアソン統計解析を行った（表３）。このグラフは、ＰＣまたはコントロール培養物もしくはＶＰＡ含有培養物に由来する当量数のＣＤ３４＋細胞の子孫を移植後、ヒト細胞キメリズムが生じなかった（ネガティブ）マウスの割合（％）を表す。点線は、９５％信頼区間を表す。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜Ｃは、ＣＢ ＣＤ３４＋初代細胞（ＰＣ）及びコントロール条件下で培養またはＶＰＡで処理された当量数のＣＤ３４＋細胞の子孫中に存在するＳＣＩＤ再構築細胞（ＳＲＣ）の頻度比較結果を示している。図１３Ｃでは、ポアソン統計解析を使用してＳＲＣ数を計算し、ＳＲＣ／１×１０６個のＣＤ３４＋細胞の数値として表した＊＊Ｐ≦０．００２（ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．００３）、ＮＳＧマウスレシピエント（ｎ＝１１１）。
【図１４】臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋初代細胞（ＰＣ）、及び、サイトカインのない無血清（ＳＦ）培地（培地のみ）またはサイトカインのないＶＰＡのみの存在下で７日間培養したＣＤ３４＋細胞の表現型解析結果を示している。培養された細胞のＣＤ３４、ＣＤ９０、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）、ＣＤ４９ｆ及びＣＤ４５ＲＡの発現を示している。ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞とＣＤ１８４、ＣＤ４９ｆ及びＣＤ４５ＲＡとの共発現が図示されている。（ｎ＝４）
【図１５】ＨＥＫ２９３細胞におけるＨＤＡＣタンパク質レベルに対するＨＤＡＣＩの効果を示している。ＨＥＫ２９３細胞は、ＳＣＲ、Ｃ４３３、及びＶＰＡで２時間（Ｔ１）及び２４時間（Ｔ２）処理された。実施例に記載された通り、クラスＩ（１、２、及び３）、クラスＩＩａ（４及び５）並びにクラスＩＩｂ（６）のＨＤＡＣそれぞれに対してモノクローナル一次抗体（ｍＡｂ）を用いて、ウェスタンブロットで調査した。各ＨＤＡＣＩは、ＨＤＡＣ２及びＨＤＡＣ４の発現に均一に影響を与えた。β−アクチンは、ローディングコントロールとして使用した。（ｎ＝４）
【図１６】ＥＳ細胞における多能性遺伝子の共焦点顕微鏡解析結果を示している。実施例に記載された通り、ＥＳ（Ｈ９）細胞を固定し、透過処理し、ＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＮＡＮＯＧ／ＺＩＣ３抗体（ＦＩＴＣ）で染色した。細胞核は、ＤＡＰＩで染色した。ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３を含む多能性遺伝子タンパク質は、ＥＳ細胞の細胞質よりも細胞核内でより顕著であった。共焦点Ｚ軸方向の各光学的断面（スケールバー＝２５μｍ（光学ズームで６３倍））が示されている。
【図１７】図１７Ａ〜Ｇは、奇形腫形成アッセイの結果を示している。１×１０６個のＥＳ（Ｈ９）細胞またはコントロール培養物もしくはＶＰＡ含有培養物から再単離されたＣＤ３４＋細胞をマトリゲルと混合し、ＮＳＧマウスの右後肢に皮下注射した（ｎ＝９）。８週間後、マウスを犠牲死させて腫瘤を切開し、固定して、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。（図１７Ａ及び図１７Ｂ）ＥＳ（Ｈ９）細胞のみ３匹のマウスそれぞれに奇形腫を形成し（左パネル）、（図１７Ｃ）コントロール及びＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋細胞のどちらも奇形腫を形成しなかった（右パネル）。（図１７Ｄ）３つの異なる胚葉（小さい矢印−外胚葉、実線矢印−中胚葉、及び破線矢印−内胚葉）（４倍）、（図１７Ｅ）中胚葉（軟骨）（４倍）、（図１７Ｆ）着色した外胚葉（２０倍）、並びに（図１７Ｇ）内胚葉（２０倍）を示す染色断面の顕微鏡写真である。ＥＳ（Ｈ９）、コントロール及びＶＰＡを含むグループごとに、３匹のマウスを使用した（ｎ＝９マウス）。
【図１８】ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞、及びＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ１８４＋細胞の絶対数の結果を示している：ＣＢ−ＣＤ３４＋細胞をＶＰＡで７日間処理し、凍結保存前後（５週間）に表現型解析を実施した。ｎｓ＝有意ではない。（ｎ＝２）。
【図１９】図１９Ａ〜Ｃは、ＶＰＡにより増殖したＨＳＣ生成物は、表現型で定義されるすべてのクラスのＨＳＣを含むことを示している。ＶＰＡにより増殖したＣＤ３４＋細胞を、ＣＤ３４＋ＣＤ９０−ＣＤ４９ｆ−短期（Ｒ−ＳＲＣ）、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ−中期（ＩＴ−ＳＲＣ）、及びＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ＋長期（ＬＴ−ＳＲＣ）について解析した（ｎ＝３）。
【図２０】図２０Ａ〜Ｂは、ＡＬＤＨ＋ＣＤ３４＋細胞及びＡＬＤＨ−ＣＤ３４＋細胞から産生されたＢＦＵ−Ｅ＋ＣＦＵ−Ｍｉｘの絶対数に対するＨＤＡＣＩの効果を示すグラフである：以下の実施例に記載された通り、ＣＡ、ＶＰＡ、ＳＣＲ、またはＣ４３３で処理したＣＤ３４＋細胞を、Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ及びＣＤ３４モノクローナル抗体で染色し、７日目に分取した。ＳＣ培養と比較して、ＳＦ培養において各ＨＤＡＣＩの存在下で産生されたＡＬＤＨ＋ＣＤ３４＋細胞から、はるかに多数のＢＦＵ−Ｅ＋ＣＦＵ−Ｍｉｘが産生された（ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．００１）。一方、ＳＦ培養と比較して、ＳＣ培養におけるＡＬＤＨ−ＣＤ３４＋細胞から、多数のＢＦＵ−Ｅ＋ＣＦＵ−Ｍｉｘが産生された。平均±ＳＥ、ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．０１（ｎ＝３）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒト臍帯血由来の単離されかつ増殖した幹細胞の濃縮された集団、そのエクスビボにおける増殖、並びに単離されかつ増殖した幹細胞の濃縮された集団を対象に投与する工程を含む治療方法に関する。本発明にしたがって、造血幹細胞を無血清培地内及びヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下にてエクスビボで培養することにより造血幹細胞を増殖させて、特定の表現型を発現するユニークな幹細胞集団を得ることが可能である。
【００１３】
一態様によれば、本発明は、単離されかつ増殖したヒト臍帯血幹細胞の濃縮された集団に関する。この増殖した幹細胞は、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１８４＋、ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ１１７＋、ＡＬＤＨ＋であるが、ＣＤ４５ＲＡの発現はわずかであり（即ち、ＣＤ４５ＲＡ−であり）、多能性遺伝子ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３を発現する。
【００１４】
造血幹細胞は、多分化性または多能性細胞であり、全系統の血液細胞へと自身を分化させることが可能で、その多分化性または多能性を維持しながら自己再生する能力を持つ。
【００１５】
本発明の濃縮されかつ増殖した幹細胞は、ヒトから単離され、ヒト臍帯血由来である。
【００１６】
本発明の濃縮された集団の幹細胞は、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１８４＋、ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ１１７＋、かつＣＤ４５ＲＡ−である。ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１８４＋、ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ１１７＋とは、細胞表面上に（＋）ＣＤ（分化抗原群）３４、９０、１８４、４９ｆ、及び１１７抗原を発現することを意味する。これらの抗原は、造血幹細胞のマーカーである。ＣＤ４５ＲＡ−とは、細胞表面上に抗原ＣＤ４５ＲＡを発現しない（または発現がわずかである）ことを意味する。本発明の幹細胞集団は、幹細胞マーカーのＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１８４＋、ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ１１７＋、かつＣＤ４５ＲＡ−について濃縮され、多能性遺伝子ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３を発現する。
【００１７】
骨髄再構築能を有するヒト造血幹細胞の存在を試験する実験手法は、例えば、糖尿病マウス及び免疫不全マウスを交配させて得られたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを使用することにより実施することができる。このアッセイにより検出される細胞は、ＳＣＩＤ再構築細胞（ＳＲＣ）と呼ばれ、ヒト造血幹細胞に最も近いと考えられている。
【００１８】
本発明の幹細胞集団における幹細胞は、増殖した幹細胞と称され、培養後の造血幹細胞数が培養前よりも多い、言い換えれば、培養後の造血幹細胞数が、臍帯血サンプルから採取した細胞数よりも多いことを意味する。
【００１９】
一実施形態では、本発明の幹細胞の濃縮された集団は、臍帯血から単離された造血幹細胞の自己複製から得られる造血幹細胞のみを含有するかまたは主として含有する幹細胞集団である。単離された造血幹細胞から分化した造血前駆細胞、または造血幹細胞及び造血前駆細胞の両方を含有する細胞集団もまた、濃縮された集団内に存在してもよい。しかしながら、一実施形態では、濃縮された集団内の造血前駆細胞数が、造血幹細胞数よりも少ない。例えば、実験結果において、７日後のＶＰＡで処理された細胞は、主にＣＤ３４＋ＣＤ９０＋（７４．２±９．８％）細胞を含み、残りの細胞はグリコフォリン＋（１７．０±５．４％）、ＣＤ４１＋（８．９±２．０％）、ＣＤ１４＋（３．９±１．５％）であり、Ｔ細胞（ＣＤ３−  ０．２±０．３％）及びＢ細胞（ＣＤ１９−  ０．５±０．１％）は実質的に存在しなかった。増殖移植片は、細胞質に顆粒がなく顕著な核小体を有する、未分化の小さな未成熟単核細胞の均一集団から構成された。
【００２０】
一実施形態では、濃縮された集団は、細胞質に顆粒がなく顕著な核小体を有する、未分化の小さな未成熟単核細胞の均一集団を含む。
【００２１】
造血幹細胞の増殖は更に、上記表現型を有する造血幹細胞の絶対数を増加させるための造血幹細胞の分化を意味する。一実施形態では、濃縮された集団における幹細胞の少なくとも約１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、または２６％が、Ｇ２／Ｍ期にある。あるいは、濃縮された集団における幹細胞の約１８．０％±１．２％または約１７〜１９％が、Ｇ２／Ｍ期にある。別の実施形態では、濃縮された集団における幹細胞の少なくとも約４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、または３７％が、Ｇ０／Ｇ１期にある。あるいは、濃縮された集団における幹細胞の約２３．２％±１３．８％または約２０〜２６％が、Ｇ０／Ｇ１期にある。
【００２２】
本発明の濃縮された集団の幹細胞は、多能性遺伝子ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３を発現する追加特性を有する。一実施形態では、濃縮された集団における幹細胞の少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が、多能性遺伝子ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３を発現する。
【００２３】
一実施形態によれば、濃縮された幹細胞の集団の幹細胞は、胚性幹細胞の多能性遺伝子ｈＴＥＲＴの発現レベルにおいて上方制御を示さない。
【００２４】
一実施形態では、本発明の濃縮された集団における幹細胞は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性に対して陽性である。具体的には、本発明の濃縮された集団における幹細胞の少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、またはそれより多くが、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性に対して陽性である。
【００２５】
本発明の濃縮された幹細胞の集団は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３、ＴＰＯ、ＩＬ３、及びこれらのサイトカインの組み合わせからなる群より選択されるサイトカインと接触していてもよい。
【００２６】
加えて、濃縮された集団の幹細胞は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤と接触していてもよい。好適なヒストンデアセチラーゼ阻害剤としては、ＶＰＡ、ＳＣＲ、ＬＢＨ５８９、ＴＳＡ、ＳＡＨＡ、ＢＭＬ−２１０としても知られるＣａｙ１０４３３（Ｃ４３３）、及びＣａｙ１０２９８が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
本発明の濃縮されかつ増殖した集団における幹細胞は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤と接触していない単離されかつ増殖したヒト臍帯血幹細胞と比較してＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ３、及びＨＤＡＣ５の発現が減少している。
【００２８】
本発明の幹細胞が濃縮された集団には、Ｔ細胞及びＢ細胞がほぼ無い。例えば、本発明の一実施態様では、濃縮された集団は圧倒的にＣＤ３４＋ＣＤ９０＋、ＣＤ４１＋、及びＣＤ１４＋細胞を含み、Ｔ細胞及びＢ細胞は実質的に存在しない。例えば、濃縮された集団は、約６４〜８４％のＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞、約１２〜２３％のグリコフォリン（ＧＰＡ）＋細胞、約７〜１１％のＣＤ４１＋細胞、約２．５〜５．５％のＣＤ１４＋細胞、約０〜０．５％のＴ細胞（ＣＤ１９＋）、及び０．４〜０．６％のＢ細胞（ＣＤ３＋）を含んでもよい。一実施形態では、増殖した幹細胞には、Ｔ細胞及びＢ細胞がほぼ無く、限られた数の単球（ＣＤ１４）を含む。
【００２９】
一実施形態によれば、本発明の濃縮された幹細胞の集団は、以下の表現型マーカーを含む：ＨＤＡＣＩの存在下で約７日間培養後、約６４〜８４％、６５〜８３％、６６〜８２％、６７〜８１％、６８〜８０％、６９〜７９％、７０〜７８％、７１〜７７％、７２〜７６％、７３〜７５％、または７４％のＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞；約１２〜２３％、１３〜２２％、１４〜２１％、１５〜２０％、１６〜１９％、または１７〜１８％のグリコフォリン（ＧＰＡ）＋細胞；約７〜１１％、８〜１０％、または９％のＣＤ４１＋細胞；約２．５〜５．５％、３〜５％、または４％のＣＤ１４＋細胞；約０〜０．５％のＣＤ１９＋細胞；及び約０．４〜０．６％のＣＤ３＋細胞。
【００３０】
本発明の濃縮されかつ増殖した集団における幹細胞は、今後の使用のために凍結保存されてもよい。凍結保存方法は、Berz et al., "Cryopreservation of Hematopoietic Stem Cells," Am. J. Hematol. 82(6):463-472 (2007)に開示されており、その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる。
【００３１】
本発明の別の態様は、単離されかつ増殖したヒト臍帯血幹細胞の濃縮された集団の作製方法に関する。本方法は、単離されたヒト臍帯血幹細胞の集団を提供する工程、並びに単離されかつ増殖したヒト臍帯血幹細胞の濃縮された集団を作製するのに有効な条件下において、無血清培養系においてヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下にて、このヒト臍帯血幹細胞の単離された集団を処理する工程を含む。この増殖したヒト臍帯血幹細胞は、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１８４＋、ＣＤ１１７＋、ＣＤ４９ｆ＋、ＡＬＤＨ＋、ＣＤ４５ＲＡ−であり、多能性遺伝子ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３を発現する。
【００３２】
本発明のこの態様の一実施形態では、無血清培養系においてヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下にて、ヒト臍帯血幹細胞の単離された集団の処理を実施して、幹細胞の絶対数を増加させる。例えば、本方法を実施して、幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋）の絶対数を約２．０×１０４倍増加させることができる。
【００３３】
本発明の方法により得られた単離されかつ増殖した幹細胞の濃縮された集団における幹細胞は、上記の増殖しかつ濃縮された幹細胞の集団の特性を有する。
【００３４】
本発明の方法の実施において、培養系としては、ペトリ皿、フラスコ、ポリ袋、テフロン（商標）袋などの動物細胞培養に一般に使用される培養容器を挙げることができ、細胞外マトリックスまたは細胞接着分子で予めコーティングをしていても、またはしていなくてもよい。使用する場合、このようなコーティングの材料は、コラーゲンI〜XIX、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン１〜１２、ナイトジェン、テネイシン、トロンボスポンジン、フォン・ヴィレブランド因子、オステオポニン、フィブリノゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、マトリゲル、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン、キチン、キトサン、セファロース、アルギン酸ゲル、及び／もしくはハイドロゲルまたはこれらの断片であってもよい。このようなコーティング材料は、人為的に改変したアミノ酸配列を有する組換え材料であってもよい。造血幹細胞は、培地組成、ｐＨなどを機械的に制御し、高密度培養を得ることのできるバイオリアクターを使用することにより培養してもよい（Schwartz, "Rapid Medium Perfusion Rate Significantly Increases the Productivity and Longevity of Human Bone Marrow Cultures," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:6760 (1991)；Koller, "Clinical-scale Human Umbilical Cord Blood Cell Expansion In a Novel Automated Perfusion Culture System," Bone Marrow Transplant 21:653 (1998)；Koller, "Large-scale Expansion of Human Stem and Progenitor Cells from Bone Marrow Mononuclear Cells in Continuous Perfusion Cultures," Blood 82:378 (1993)を参照し、その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる）。
【００３５】
培養系が無血清である場合、様々な栄養を使用して、幹細胞の適切な培養及び増殖条件を提供してもよい。好適な栄養培地としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ'  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｈａｍ'ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ１２、ＭｃＣｏｙ'ｓ  ５Ａ培地、Ｅａｇｌｅｓ'  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ'  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｉｓｃｏｖｅ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｘ−ＶＩＶＯ  １０（Ｃａｍｂｒｅｘ社）、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（Ｃａｍｂｒｅｘ社）、ＨＰＧＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ社）、ＳｔｅｍＳｐａｎ  Ｈ３０００（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、またはＱＢＳＦ−６０（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）。
【００３６】
好適な培養培地には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、アミノ酸、ビタミン、サイトカイン、ホルモン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖などを含んでもよい。培養において、その他の化学的成分または生物学的成分を、場合に応じて、単独または組み合わせて混合してもよい。培地に添加されるこのような成分としては、インスリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コレステロール、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸、寒天、アガロース、コラーゲン、メチルセルロース、各種サイトカイン、各種成長因子などが挙げれ得る。好適なサイトカインとしては、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１４（ＩＬ−１４）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、単球コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンド（ＦＬ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＭ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、及びトロンボポエチン（ＴＰＯ）が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００３７】
特に好適なサイトカインとしては、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３、ＴＰＯ、ＩＬ−３、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００３８】
培養系に添加される好適な成長因子としては、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、マクロファージ炎症性タンパク質−１α（ＭＩＰ−１α）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、プロテアーゼネキシンＩ、プロテアーゼネキシンＩＩ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、コリン作動性分化因子（ＣＤＦ）、ケモカイン、Ｎｏｔｃｈリガンド（Ｄｅｌｔａ１など）、Ｗｎｔタンパク質、アンジオポエチン様タンパク質２、３、５または７（Ａｎｇｐｔ２、３、５または７）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、及びプレイオトロフィンが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００３９】
加えて、人為的に改変したアミノ酸配列を有する組換えサイトカインまたは成長因子が培養系に含まれてもよく、例えば、ＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６受容体複合体及びＨｙｐｅｒ  ＩＬ−６（ＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６受容体融合タンパク質）が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００４０】
一実施形態では、サイトカイン及び成長因子は、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で、培養系に添加されてもよい。
【００４１】
本発明のこの態様の方法による幹細胞の培養において、添加物または処理剤は、直接培養系に添加されてもよく、または、例えば、培養に使用される基材もしくは支持体の表面上に固定されてもよい。本方法は、使用する成分を適切な溶媒に溶解して、得られた溶液で基材または支持体をコーティングし、次いで過剰な成分を洗い落とすことにより行ってもよい。
【００４２】
特定の成分を培養系に添加する場合、最初に適切な溶媒中に溶解させて、化合物の濃度が、約１００ｎＭ〜１０ｍＭ、または約３００ｎＭ〜３００μＭ、または約１μＭ〜１００μＭ、または約３μＭ〜３０μＭとなるように、培地に添加してもよい。好適な溶媒の例としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び各種アルコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
一実施形態では、造血幹細胞は、約２５〜３９℃、または約３３〜３９℃の温度で、ＣＯ２濃度が約４〜１０ｖｏｌ％、または約４〜６ｖｏｌ％の雰囲気中にて、通常約７日間培養系において処理される。
【００４４】
本発明のこの態様の方法に従って処理された幹細胞は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例は上記に記載）の存在下で処理される。
【００４５】
本発明の方法により増殖させた造血幹細胞は、細胞移植片として使用することができる。従って、本発明の更なる態様は、対象の血液疾患を治療する方法に関する。本方法は、対象における血液疾患を治療するために、本発明の単離されかつ増殖したヒト臍帯血幹細胞の濃縮された集団を対象に投与する工程を含む。
【００４６】
造血幹細胞は、全系統の血液細胞へと分化できるので、エクスビボで血液細胞の特定の種類に分化させた後、その細胞を移植してもよい。本発明の方法により増殖させた造血幹細胞は、そのまま移植してもよく、または例えば、磁気ビーズ法もしくはセルソーティング法により、指標として細胞表面抗原を使用して濃縮した後、移植してもよい。増殖した造血幹細胞は、そのドナー（自己）または別の個体（同種）へと移植してもよい。
【００４７】
本発明の濃縮されかつ増殖した造血幹細胞は、従来の骨髄移植または臍帯血移植に代わる、造血幹細胞治療用の移植片として使用することができる。本発明の造血幹細胞の移植は、従来の骨髄移植または臍帯血移植と同じ方法で実施される。移植片は、緩衝液、抗生物質、医薬化合物、並びに濃縮されかつ増殖した造血幹細胞を含有する組成物であってもよい。
【００４８】
本発明のこの態様の方法は、対象の血液疾患を治療するために実施される。従って、本方法は、各種白血病に対する治療の他、種々の疾患の治療にも好適である。例えば、副作用として骨髄抑制を引き起こす可能性のある化学療法または放射線療法による固形癌患者の治療の場合、治療後の患者に投与すると、患者は造血障害から早期に回復することができる。従って、より強力な化学療法の使用が可能となり、治療効果が改善される。
【００４９】
本発明の治療方法は、造血幹細胞を特定の種類の血液細胞に分化させて、その細胞を患者体内に戻すことにより、患者体内における特定の種類の血液細胞不足を緩和するためにも実施されてもよい。
【００５０】
本発明の治療方法は、造血細胞の減少及び／もしくは造血不全に関連した疾患、造血細胞の増加を伴う疾患、造血機能障害を伴う疾患、免疫細胞の減少、免疫細胞の増加、自己免疫障害もしくは免疫機能障害を伴う疾患、神経損傷に関連した疾患、筋損傷を伴う疾患、並びに／または虚血性疾患を治療するために実施されてもよい。
【００５１】
本発明のこの方法に従って治療可能な疾患または障害の具体例としては、慢性肉芽腫症、重症複合免疫不全症候群、アデノシンデアミナ−ゼ（ＡＤＡ）欠損症、無ガンマグロブリン血症、Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群、Ｃｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ症候群、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）などの免疫不全症候群、Ｃ３欠損症、サラセミア、酵素欠損による溶血性貧血、及び鎌状赤血球症などの先天性貧血、ゴーシェ病及びムコ多糖症などのライソゾーム蓄積症、副腎白質ジストロフィー、各種癌及び腫瘍、特に急性または慢性白血病などの血液癌、ファンコニ症候群、再生不良性貧血、顆粒球減少症、リンパ球減少症、血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、カサバッハ・メリット症候群、悪性リンパ腫、ホジキン病、多発性骨髄腫、慢性肝疾患、腎不全、保存血または手術中の大量輸血、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、重症感染症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、混合性結合組織病、結節性多発動脈炎、橋本病、バセドウ病、重症筋無力症、インスリン依存型糖尿病、自己免疫性溶血性貧血、蛇咬症、溶血性尿毒症症候群、脾機能亢進症、出血、ベルナール・スーリエ症候群、Ｇｌａｎｚｍａｎｎ'ｓ血小板無力症、尿毒症、骨髄異形成症候群、真性多血症、赤血病、本態性血小板血症、骨髄増殖性疾患、外傷性脊髄損傷、神経損傷、神経断裂、骨格筋損傷、瘢痕、糖尿病、脳梗塞、心筋梗塞、並びに閉塞性動脈硬化症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
本発明の治療方法は、急性放射線症候群（ＡＲＳ）を含む、放射線への被曝、または過剰被爆による悪影響を緩和するために実施されてもよい。
【００５３】
本発明の治療方法による別の実施形態では、本発明の濃縮されかつ増殖した造血幹細胞は、遺伝子治療に使用される。遺伝子治療では、治療遺伝子を造血幹細胞にトランスフェクションし、得られたトランスフェクト細胞（即ち、形質転換された造血幹細胞）を患者に移植する。導入される治療遺伝子としては、治療される疾患に応じて、ホルモン、サイトカイン、受容体、酵素、ポリペプチドなどの遺伝子が挙げられ得るが、これらに限定されない。好適な治療遺伝子の具体例としては、インスリン、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、カルボキシペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、ホスホリパーゼＡ２、エステラーゼ、α１−アンチトリプシン、血液凝固因子（第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子など）、プロテインＣ、プロテインＳ、アンチトロンビン、ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ、オルニチントランスカルバノイラーゼ、ヘモグロビン、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、α−イズロニダーゼ、チトクロームＰ４５０酵素、アデノシンデアミナーゼ、ブルトンキナーゼ、補体Ｃ１〜Ｃ４、ＪＡＫ３、サイトカイン受容体共通γ鎖、毛細血管拡張性運動失調症変異（ＡＴＭ）、嚢胞性線維症（ＣＦ）、ミオシリン、胸腺液性因子、チモポイエチン、ガストリン、セレクチン、コレシストキニン、セロチニン、サブスタンスＰ、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、及び多剤耐性因子（ＭＤＲ−１）の遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
加えて、疾患遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ遺伝子は、治療遺伝子として有効であり、本発明の方法にて使用可能である。例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、デコイＲＮＡ、及びリボザイムなどである。
【００５５】
造血幹細胞に治療遺伝子を導入するには、マウス幹細胞ベクター（ＭＳＣＶ）及びモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｍｏＬＶ）などのレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、並びにレンチウイルスベクターなどの動物細胞用ベクターを含む、動物細胞への通常の遺伝子導入方法を使用してもよい（Verma, "Gene Therapy: Promises, Problems and Prospects," Nature 389:239 (1997)を参照し、その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる）。あるいは、リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法などを使用してもよい。これらの方法の内、染色体ＤＮＡに組み込むと恒久的に遺伝子発現が期待できることから、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターが、多くの場合好ましい。
【００５６】
一実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、以下の通り調製される。最初に、野生型アデノ随伴ウイルスＤＮＡの両端のＩＴＲ（末端逆位配列）間に治療遺伝子を挿入して得られたベクタープラスミド及びウイルスタンパク質を補うためのヘルパープラスミドを、細胞にトランスフェクションする。続いて、ヘルパーウイルスとしてアデノウイルスを感染させて、ＡＡＶベクターを含むウイルス粒子の産生を誘導する。アデノウイルスの代わりに、ヘルパーとして機能するアデノウイルス遺伝子を発現するプラスミドを、トランスフェクションしてもよい。次に、ウイルス粒子を造血幹細胞に感染させる。ベクターＤＮＡ中に、標的遺伝子の上流に適切なプロモーター、エンハンサー、インシュレーターなどを挿入し、遺伝子の発現を調節することが好ましい。治療遺伝子に加えて、薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子を導入すると、治療遺伝子を有する細胞の選択が容易となる。治療遺伝子は、センス遺伝子またはアンチセンス遺伝子であってもよい。
【００５７】
本発明の造血幹細胞に、本発明の治療方法にて使用する治療遺伝子をトランスフェクションする場合、この細胞は、造血幹細胞を増殖させる上記の適切な方法によって培養される。遺伝子の導入効率は、当該技術分野において標準的な方法により評価することができる。造血幹細胞に遺伝子をトランスフェクションし、得られた細胞（形質転換された造血幹細胞）を、造血幹細胞の上記増殖方法により増殖させて、得られた形質転換された造血幹細胞を、遺伝子治療の方法において対象へ投与するために使用することが可能である。
【００５８】
遺伝子治療用の移植片は、緩衝液、抗生物質、医薬品、及び形質転換された造血幹細胞を含む組成物であってもよい。
【００５９】
本発明の方法に従って、遺伝子治療により治療可能な好適な疾患としては、慢性肉芽腫症、重症複合免疫不全症候群、アデノシンデアミナ−ゼ（ＡＤＡ）欠損症、無ガンマグロブリン血症、Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群、Ｃｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ症候群、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）などの免疫不全症候群、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、サラセミア、酵素欠損による溶血性貧血、ファンコニ貧血、及び鎌状赤血球症などの先天性貧血、ゴーシェ病及びムコ多糖症などのライソゾーム蓄積症、副腎白質ジストロフィー、並びに各種癌及び腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
本発明の別の態様は、造血幹細胞に対する化合物の効果の決定方法に関する。この方法は、単離されかつ増殖したヒト臍帯血幹細胞の濃縮された集団を提供する工程であって、この幹細胞が、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１８４＋、ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ１１７＋、ＡＬＤＨ＋、ＣＤ４５ＲＡ−であり、多能性遺伝子ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３を発現する、工程、並びに、試験される化合物に幹細胞を接触させる工程を含む。次いで、化合物に接触させた後、幹細胞を解析し、幹細胞に対する化合物の効果を決定する。
【００６１】
一実施形態では、細胞表面マーカー、多能性遺伝子の発現、細胞の生存及び／もしくは分裂、並びに／または化合物に細胞への致死性があるか否かについて、幹細胞を解析する。
【実施例】
【００６２】
以下の実施例は、本発明の実施形態を例示するものであるが、決してその範囲の制限を目的とする訳ではない。
【００６３】
実施例１−臍帯血幹細胞の増殖を誘導するエピジェネティックリプログラミング
方法
ＣＢ ＣＤ３４＋細胞の単離及びそのエクスビボ培養
ＣＢ収集物は、ニューヨーク血液センター（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ）のＰｌａｃｅｎｔａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｐｒｏｇｒａｍから購入した。ＣＢ−ＭＮＣは、フィコール・ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）密度遠心分離法によって単離し、ＣＤ３４＋細胞は、先に記載した通り免疫磁性選別法により精製した（Chaurasia et al., "Chromatin-Modifying Agents Promote the Ex vivo Production of Functional Human Erythroid Progenitor Cells," Blood 117:4632-4641 (2011)，その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる）。高純度（９０％〜９８％）ＰＣ（４．０〜５．０×１０４）を、ＳＦ  Ｓｔｅｍｌｉｎｅ  II（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）培地または３０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）含有ＩＭＤＭ（Ｌｏｎｚａ社）中で、１５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌのｆｍｓ様チロシンキナーゼ受容体３（ＦＬＴ３リガンド）、１００ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン（ＴＰＯ）、及び５０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン３（ＩＬ−３）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を補充して培養し、３７℃にて５％ＣＯ２を維持した加湿インキュベーター内でインキュベートした。１６時間インキュベートした後、更に７日間、サイトカインの非存在下または持続的存在下のいずれかにて、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、ＶＰＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ＳＣＲ、及びＣＡＹ１０４３３（Ｃ４３３、ＢＭＬ−２１０とも称される）、ＣＡＹ１０３９８（ＭＤ８５としても知られる）、及びＣＡＹ１０６０３（分子式：Ｃ２２Ｈ３０Ｎ４Ｏ６）（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）を含む種々の濃度の各ＨＤＡＣＩに、細胞を曝露した（図１Ａ）。検討した細胞集団及びその集団を培養した各種条件は、表１に記載された特定の用語により示される。
【００６４】
（表１）検討した細胞集団を表すために使用される用語
2019150040.tif 000002
【００６５】
生存可能なＰＣ及び培養細胞は、トリパンブルー排除方法を使用して数えた。ＣＤ３４＋細胞または亜集団の増殖倍率は、各ＣＢ収集物中に存在すると測定したＣＤ３４＋細胞の数、及び仮に最初のＣＢ収集物中のすべてのＣＤ３４＋細胞が、記載された各種培養条件を使用して培養されていた場合に産生されていたであろうＣＤ３４＋細胞の数に基づいて計算した。
【００６６】
表現型解析
ＰＣ、またはＨＤＡＣＩの存在下または非存在下にて増殖させた培養細胞は、抗ヒトＣＤ３４ ｍＡｂまたはアイソタイプ適合コントロールｍＡｂで染色し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  II（ＢＤ社）を使用して解析した。ＣＤ３４＋細胞は、更なる表現型及び機能解析のために、先に記載した通りＣＤ３４＋細胞単離キットを使用して再単離された。すべてのｍＡｂは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社及びＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入した。コントロール培養、またはＨＤＡＣＩを加えたサイトカイン中で７日間エクスビボにおいて増殖させた細胞の表現型解析（ＣＤ３４−ＡＰＣ、ＣＤ９０−ＦＩＴＣ、ＣＤ１８４−ＰＥ、ＣＤ１１７−ＰＥ、ＣＤ４９ｆ−ＰＥ、及びＣＤ４５ＲＡ−ＰＥＣｙ７）は、先に記載した通り実施した（Chaurasia et al., "Chromatin-Modifying Agents Promote the Ex vivo Production of Functional Human Erythroid Progenitor Cells," Blood 117:4632-4641 (2011)，その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる）。
【００６７】
遊走アッセイ
ＣＢ ＣＤ３４＋細胞の遊走挙動は、直径６．５ｍｍ、５μｍ孔のＴｒａｎｓｗｅｌｌプレート（Ｃｏｓｔａｒ社）を使用して、先に記載した通り評価した（Shivtiel et al., "CD45 Regulates Homing and Engraftment of Immature Normal and Leukemic Human Cells in Transplanted Immunodeficient Mice," Exp. Hematol. 39(12):1161-1170 (2011)，その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる）。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの下層区画に、１００ｎｇ／ｍｌのストローマ細胞由来因子１（ＳＤＦ１）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を補充したＳｔｅｍＬｉｎｅ  II  ＳＦ培地を充填した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌフィルターは、３０分間３７℃にてマトリゲルでコーティングした。コントロール及びＶＰＡ含有培養物に由来する再単離されたＣＤ３４＋細胞（１×１０５）は、１００μｌのＳｔｅｍｌｉｎｅ  II培地中にて、マトリゲルコーティングしたフィルター上へプレーティングした。１６時間後及び４８時間後、下層区画へと遊走した細胞を数えて、遊走割合（％）を以下の通り計算した：（遊走した細胞数／プレーティングした細胞の総数）×１００。
【００６８】
ホーミングアッセイ
コントロール条件下またはＶＰＡでの処理後に再単離されたＣＤ３４＋細胞（５×１０５／マウス）のホーミングを、先に記載した通り実施した（Shivtiel et al., "CD45 Regulates Homing and Engraftment of Immature Normal and Leukemic Human Cells in Transplanted Immunodeficient Mice," Exp. Hematol. 39(12):1161-1170 (2011)，その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる）。レシピエントＮＳＧマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社から購入し、４時間亜致死線量の放射線を照射（３００ｃＧｙ）をして、再単離されたＣＤ３４＋細胞を尾静脈から注入した。注入後１６時間及び４８時間で、各レシピエントマウスの大腿骨２本及び脛骨２本からＢＭ細胞を採取し、ヒトＣＤ３４−ＡＰＣ ｍＡｂを使用して、ヒトＣＤ３４＋細胞の存在をフローサイトメトリーによって解析した。これらの細胞集団のホーミングは、レシピエントマウスのＢＭ中において、得られた１０６イベント当たりのＣＤ３４＋細胞数を定量化して測定した。４匹のマウスでは細胞が生着せず、実験サンプルからのバックグラウンドを差し引くために同様に解析した（その全体が参照として本明細書に組み込まれるColvin et al., "Allogeneic In vivo Stem Cell Homing,". J. Cell. Physiol. 211(2):386-391 (2007)）。コントロール条件下で培養したＣＤ３４＋細胞が８匹のＮＳＧマウスで生着し、ＶＰＡ含有培養物に由来するＣＤ３４＋細胞が１０匹のマウスで生着した。
【００６９】
ＢｒｄＵラベリングによる細胞周期解析
培養されたＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の細胞周期状態は、メーカーの取扱説明書に従ってＦＩＴＣ−ＢｒｄＵ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して評価した。ＶＰＡの存在下でコントロール条件下において７日間培養したＣＢ ＣＤ３４＋細胞を、続いて２．５時間ＢｒｄＵでパルスした。次いで、細胞を染色バッファー（３％ＦＢＳ添加ＰＢＳ）で洗浄し、ＣＤ３４−ＡＰＣ及びＣＤ９０−ＰＥ ｍＡｂで染色し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍバッファーで固定及び透過処理を行い、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファー（両方ともＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で洗浄した。透過処理後、細胞を３０μｇのＤＮＡｓｅで３０分間３７℃にて処理し、次いで、ＦＩＴＣ共役抗ＢｒｄＵ抗体及び７ＡＡＤで染色した。次いで、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋でゲートした細胞の細胞周期状態を、ＦＡＣ−ＳＣａｎｔｏ  IIフローサイトメーターでＦＡＣＳＤｉｖａソフトウエア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して記録した。
【００７０】
ＨＤＡＣに対するＨＤＡＣＩの効果
全細胞抽出物は、ＳＣＲ（８μＭ）、Ｃ４３３（８０μＭ）、及びＶＰＡ（１．２５ｍＭ）の存在下で培養した、新たに単離されたＣＢ−ＭＮＣ及びヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞から調製した。細胞タンパク質は、Ｎｏｖｅｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ｉＢｌｏｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で転写した。メンブレンを、各ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、及びβ−アクチン；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）に対するｍＡｂで調査し、メーカーの取扱説明書に従ってＨＲＰ共役二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いた化学発光系を使用して現像した。ウェスタンブロッティングの濃度解析は、ＩｍａｇｅＪソフトウエア（ＮＩＨ）で実施した。
【００７１】
ＡＬＤＨ活性に基づいた未分化細胞の単離
高いＡＬＤＨ活性は、未分化造血細胞及び癌幹細胞の特性である（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる、Hess et al., Functional Characterization of Highly Purified Human Hematopoietic Repopulating Cells Isolated According to Aldehyde Dehydrogenase Activity," Blood 104:1648-1655 (2004)；Lioznov et al., "Aldehyde Dehydrogenase Activity as a Marker for the Quality of Hematopoietic Stem Cell Transplants," Bone Marrow Transplant 35:909-914 (2005)；Storms et al., "Distinct Hematopoietic Progenitor Compartments are Delineated by the Expression of Aldehyde Dehydrogenase and CD34," Blood 106:95-102 (2005)；Aguila et al., "SALL4 is a Robust Stimulator for the Expansion of Hematopoietic Stem Cells," Blood 118:576-585 (2011)）。高ＡＬＤＨ活性で細胞集団を同定するために、Ａｌｄｅｆｌｕｏｒキット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）をメーカーの取扱説明書に従って使用した。細胞（１×１０６個／ｍｌ）をアッセイバッファー中に懸濁し、次いで細胞の半分をＡｌｄｅｆｌｕｏｒ基質（テストサンプル）に添加して、残りの半分をＤＥＡＢ阻害剤（コントロールサンプル）に添加した。テストサンプル及びコントロールサンプルは、４０分間３７℃にてインキュベートした。その後、細胞をＣＤ３４−ＡＰＣ及び／もしくはＣＤ１１７−ＰＥ ｍＡｂまたはアイソタイプ適合ＩｇＧで、更に２０分間染色した。細胞を洗浄し、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  IIフローサイトメーターによって解析した。
【００７２】
多能性遺伝子のｑＰＣＲ
全ＲＮＡは、ヒトＥＳ細胞株Ｈ９（ＷＡ０９；ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社、マディソン、ウィスコンシン州、アメリカ）、ＰＣ、ＳＦ及びＳＣ培地でのコントロール培養物またはＶＰＡ含有培養物に由来する再単離されたＣＤ３４＋細胞から、ＴＲＩｚｏｌ及びＱＩＡＧＥＮ社（ＣＡ）製ＲＮｅａｓｙキットを使用して抽出した。全ＲＮＡ（０．５〜１．０μｇ）は、ＲＮＡ  ｔｏ  ｃＤＮＡ  ＥｃｏＤｒｙ  Ｐｒｅｍｉｘキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を使用して、ｃＤＮＡへと逆転写した。プライマー配列は、表６に記載されている。ｑＰＣＲは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）及びＲｅａｌｐｌｅｘ  ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）を使用して実施した。すべての実験は３回実施し、非鋳型コントロール（ｃＤＮＡ鋳型無し）を各アッセイに含めた。ＧＡＰＤＨは、内部標準としての役割を果たした。アンプリコンは、５０ｂｐサイズ（ＤＮＡラダー）マーカーを用いて２％アガロースゲル上で泳動した。
【００７３】
（表６）ＲＴ−ＰＣＲ及びＱ−ＰＣＲ用プライマー配列
2019150040.tif 000003
＊その内容全体が本明細書に参考として組み込まれる、Redshaw & Strain, “Human haematopoietic stem cells express Oct4 pseudogenes and lack the ability to initiate Oct4 promoter-driven gene expression,” J. Negat. Results Biomed. 9:2-8 (2010)。
【００７４】
免疫蛍光染色
ＰＣ並びにコントロール培養物及びＶＰＡ含有培養物に由来する再単離された培養ＣＤ３４＋細胞は、メタノールフリーのホルムアルデヒド（２．８％）で１０分間３７℃にて固定して、少しの間氷上で冷却し、氷冷した１００％メタノールで透過処理を行った。更に、細胞を氷上で２０分間インキュベートし、インキュベーションバッファー（０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）で１０分間ブロッキングして、ＦＩＴＣ共役ｍＡｂまたはアイソタイプコントロールで１時間室温にて、ＳＯＸ２及びＯＣＴ４に対して染色した。細胞はまた、ＮＡＮＯＧに対してウサギｍＡｂ、続いてＦＩＴＣ共役抗ウサギ二次抗体でも染色し、細胞を洗浄して、フローサイトメトリーによって解析した。
【００７５】
ＰＣ並びにコントロール培養物及びＶＰＡ含有培養物に由来する再単離された細胞を、スライドガラス上に付着させ、ホルムアルデヒドで固定し、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３に対して、メーカーの取扱説明書（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）に従って抗体で染色した。ＥＳ細胞は、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３を発現するので、ポジティブコントロールとしての役割を果たした。共焦点顕微鏡解析は、ライカＴＣＳ  ＳＰ５（ウェッツラー）を使用してＺ軸方向について実施した。画像は、ＬＡＳ  ＡＦイメージングソフトウエアを用いて得た。
【００７６】
ＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４のＣｏ−ＩＰ
ＥＳ細胞及びＶＰＡで７日間処理したＣＤ３４＋細胞を、ＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ、０．１％ＮＰ４０、及び１．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に溶解させた。ＥＳ細胞またはＶＰＡで処理された細胞に由来する細胞溶解物（１．０ｍｇ）を、６μｇのＩｇＧ（コントロール）、２０μｌ（６μｇ）のＮＡＮＯＧ ｐＡｂ（カタログ  ＡＦ１９９７；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）でインキュベートして、４℃にて回転プラットフォーム上に一晩置いた。翌日、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇビーズ（５０μｌ）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を添加し、更に４時間サンプルを回転させ続けた。ビーズを溶解バッファーで３回洗浄し、煮沸して、結合タンパク質を溶出させた。ＥＳ細胞に由来する全細胞溶解物（２５μｇ）及びＶＰＡで処理された細胞に由来する全細胞溶解物（１２５μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、ＮＡＮＯＧ ｍＡｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を使用してウェスタンブロッティングによって解析した。ＩＰ実験からのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ｉＢｌｏｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して転写し、ヤギｐＡｂ抗ＯＣＴ４で免疫ブロットして、洗浄し、ＥＣＬ検出キットを使用して現像した。
【００７７】
ｓｉＲＮＡによる多能性遺伝子のサイレンシング
ＣＢ ＣＤ３４＋細胞は、ＳＦ培養条件下においてＶＰＡで処理した。ＶＰＡで処理された細胞に、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＧＡＰＤＨ、及びスクランブルｓｉＲＮＡそれぞれ、またはＳＯＸ２、ＯＣＴ４、及びＮＡＮＯＧの組み合わせであるＳｉｌｅｎｃｅｒ  Ｓｅｌｅｃｔ  ｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＣＡ）をトランスフェクションした。ＧＦＰプラスミドは、Ｎｅｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のメーカー取扱説明書に従ってトランスフェクション効率を測定するために含めた。
【００７８】
ＶＰＡ処理の７２時間後、細胞（０．５×１０６個〜１×１０６個）をＰＢＳ中で洗浄し、８μｌのＮｅｏｎ  ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｒで懸濁させた。各ｓｉＲＮＡ（２μｌ、１０〜３０ｎＭ）もしくはＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ（ＳＯＮ）の組み合わせ、またはｐｃＤＮＡ６．２／ＥｍＧＦＰプラスミド（２００ｎｇ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、メーカーの取扱説明書に従って８μｌの細胞と混合した。細胞を、電圧１，４００及びパルス幅２０ｍｓで３回パルスし、すぐにＶＰＡ添加サイトカイン補充済みの予熱した培地へと移した。細胞生存能は、トリパンブルー排除方法を使用してトランスフェクションから４８時間後に評価した。
【００７９】
加えて、スクランブルｓｉＲＮＡまたは複合ＳＯＮ ｓｉＲＮＡで処理された細胞を、ヒトＣＤ３４ ｍＡｂ及びＣＤ９０ ｍＡｂを使用して染色し、ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の割合（％）をフローサイトメトリー解析によって測定した。ＲＮＡはトランスフェクションの７日後に調製し、ｑＰＣＲは、上記の通りＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＺＩＣ３、ＣＤ３４、及びＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対して、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法を使用して実施した。相対発現レベルは、ＣＤ３４の発現を基準として正規化した。ＳＯＮ ｓｉＲＮＡによる多能性遺伝子のノックダウンに続いて、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３タンパク質の発現レベルを、上記の通り共焦点顕微鏡によって評価した。
【００８０】
エクスビボにおいて増殖させたＣＢ ＣＤ３４＋細胞のインビボ骨髄再構築能アッセイ
前述の通り、ＮＳＧマウスに、４時間３００ｃＧｙで亜致死線量の放射線を照射をして、ＰＣ（２×１０５）を注入し、サイトカインの存在下もしくは非存在下でのコントロール条件下での培養またはＶＰＡ含有培養から１週間後に再単離されたＣＤ３４＋細胞を、ＮＳＧマウスに尾静脈から注入した（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる、Milhem et al., "Modification of Hematopoietic Stem Cell Fate by 5aza 2'deoxycytidine and Trichostatin A," Blood 103:4102-4110 (2004)；Araki et al., "Expansion of Human Umbilical Cord Blood SCID-Repopulating Cells Using Chromatin-Modifying Agents," Exp. Hematol. 34:140-149 (2006)；Araki et al., "Chromatin-Modifying Agents Permit Human Hematopoietic Stem Cells to Undergo Multiple Cell Divisions While Retaining Their Repopulating Potential," Blood 109:3570-3578 (2007)）。移植後１３〜１４週間でマウスを犠牲死させた。各マウスのＢＭ細胞を、ヒトＣＤ４５−ＰＥＣｙ７またはＡＰＣ、ＣＤ３４−ＡＰＣまたはＦＩＴＣ、ＣＤ３６−ＡＰＣ、ＣＤ３３−ＰＥＣｙ７、ＣＤ１４−ＦＩＴＣ、ＣＤ１９−ＰＥ、ＣＤ４１−ＦＩＴＣ、ＣＤ７１−ＦＩＴＣ、及びグリコフォリンＡ−ＰＥ（ＧＰＡ−ＰＥ）を発現する細胞の存在について解析した。各レシピエントマウスの骨髄中に、ドナー由来ヒト造血細胞の生着を示す、少なくとも０．１％のヒトＣＤ４５＋細胞の存在が確認された（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる、Milhem et al., "Modification of Hematopoietic Stem Cell Fate by 5aza 2'deoxycytidine and Trichostatin A," Blood 103:4102-4110 (2004)；Araki et al., "Expansion of Human Umbilical Cord Blood SCID-Repopulating Cells Using Chromatin-Modifying Agents," Exp. Hematol. 34:140-149 (2006)；Araki et al., "Chromatin-Modifying Agents Permit Human Hematopoietic Stem Cells to Undergo Multiple Cell Divisions While Retaining Their Repopulating Potential," Blood 109:3570-3578 (2007)；Chaurasia et al., "Chromatin-Modifying Agents Promote the Ex vivo Production of Functional Human Erythroid Progenitor Cells," Blood 117:4632-4641 (2011)）。一次レシピエントＮＳＧマウスのＢＭ細胞（２×１０６個）を、亜致死線量の放射線を照射した二次ＮＳＧレシピエントマウスに再注入した。移植後１５〜１６週間でマウスを犠牲死させ、ＢＭ細胞をｍＡｂで染色し、上記の通りヒト細胞キメリズムの証拠をフローサイトメトリーによって解析した。
【００８１】
限界希釈解析
ＰＣ及びコントロール条件下またはＶＰＡの存在下で増殖させた当量数のＣＤ３４＋細胞の子孫におけるヒトＳＲＣの頻度を、前述の通り限界希釈解析によって解析した（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれるBoitano et al., "Aryl Hydrocarbon Receptor Antagonists Promote the Expansion of Human Hematopoietic Stem Cells," Science 329:1345-1348 (2010)）。数を増加させたＰＣ（５０、２５０、５００、２，５００、５，０００）またはＶＰＡで７日間もしくはコントロール条件下で培養した当量数のＰＣの子孫を、ＮＳＧマウスに注入した（ｎ＝１１１）。限界希釈実験の結果データを収集し、シングルヒットモデルに対してポアソン統計を適用して解析した（ｎ＝１１１）。頻度は、Ｌ−Ｃａｌｃソフトウエア（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して計算し、ウォルター・アンド・エリザ・ホール医学研究所（Ｗａｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ｅｌｉｚａ  Ｈａｌｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で入手可能なＥＬＤＡソフトウエア（ｂｉｏｉｎｆ．ｗｅｈｉ．ｅｄｕ．ａｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｅｌｄａ／）を使用してプロットした。以下の式を使用して、未反応値のｌｏｇフラクションをネガティブマウスの割合（％）に変換した：ネガティブマウスの割合（％）＝ｅ ｌｏｇフラクション。
【００８２】
奇形腫形成アッセイ
コントロール培養物もしくはＶＰＡ含有培養物から再単離されたＣＤ３４＋細胞（１×１０６個）またはほぼ同等の数のＥＳ細胞を、１００μｌのＰＢＳ中に懸濁した。これらの細胞を、等容積の氷冷マトリゲルと混合し、グループ（コントロール培養物、ＶＰＡで処理された培養物から再単離されたＣＤ３４＋細胞、及びＥＳ細胞）当たり３匹のＮＳＧマウスの右後肢へと皮下注射した。マウスの奇形腫形成を週毎に観察し、８週間後に犠牲死させた。奇形腫を切開、固定、薄切りし、Ｈ＆Ｅで染色して形態学的に調査した（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれるO'Connor et al., "Functional Assays for Human Embryonic Stem Cell Pluripotency," Methods Mol Biol. 690:67-80 (2011)）。
【００８３】
統計
結果は、各実験における様々な数値の平均±ＳＤまたは平均±ＳＥＭとして表した。統計差は、別段の指定がない限り、スチューデント両側ｔ検定を使用して評価した。テューキーの検定による対比較を併用した一元配置ＡＮＯＶＡ並びに／または等分散性のためのバートレット検定及び分散比較のためのＦ検定も使用した。０．０５以下のＰ値は、有意であると判断した。
【００８４】
研究承認
すべての動物実験は、アイカーン医科大学（Ｉｃａｈｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）の動物実験委員会（ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。少量の匿名ＣＢ単位は、ニューヨーク血液センター（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ）から購入したので、インフォームドコンセントまたは対象承認は、本研究では不要であった。
【００８５】
結果
ＣＢ ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞のエクスビボにおける増殖に対するＨＤＡＣＩ及びＳＦ培地の効果
ＨＳＣのエクスビボにおける増殖を可能にする培養条件の決定は、多数の研究の主題であった（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる、Dahlberg et al., "Ex vivo Expansion of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells," Blood 117:6083-6090 (2011);Delaney et al., "Strategies to Enhance Umbilical Cord Blood Stem Cell Engraftment in Adult Patients," Expert Rev. Hematol. 3:273-283 (2010)；Boitano et al., "Aryl Hydrocarbon Receptor Antagonists Promote the Expansion of Human Hematopoietic Stem Cells," Science 329:1345-1348 (2010)；De Felice et al., "Histone Deacetylase Inhibitor Valproic Acid Enhances the Cytokine-Induced Expansion of Human Hematopoietic Stem Cells," Cancer Res. 65:1505-1513 (2005)；Himburg et al., "Pleiotrophin Regulates the Expansion and Regeneration of Hematopoietic Stem Cells," Nat. Med. 16:475-482 (2010)；Milhem et al., "Modification of Hematopoietic Stem Cell Fate by 5aza 2'deoxycytidine and Trichostatin A," Blood 103:4102-4110 (2004)；Nishino et al., "Ex vivo Expansion of Human Hematopoietic Stem Cells by a Small-Molecule Agonist of c-MPL," Exp. Hematol. 37:1364-1377 e1364. (2009)；North et al., "Prostaglandin E2 Regulates Vertebrate Haematopoietic Stem Cell Homeostasis," Nature 447:1007-1011 (2007)）。ＳＣ培養条件並びにＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（ＤＮＭＴＩ）及びＨＤＡＣＩを用いた一連の処理を使用すると、ＣＢ ＨＳＣ数の増加が制限される可能性があると、これまでに実証されている（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる、Milhem et al., "Modification of Hematopoietic Stem Cell Fate by 5aza 2'deoxycytidine and Trichostatin A," Blood 103:4102-4110 (2004)；Araki et al., "Expansion of Human Umbilical Cord Blood SCID-Repopulating Cells Using Chromatin-Modifying Agents," Exp. Hematol. 34:140-149 (2006)；Araki et al., "Chromatin-Modifying Agents Permit Human Hematopoietic Stem Cells to Undergo Multiple Cell Divisions While Retaining Their Repopulating Potential," Blood 109:3570-3578 (2007)；Chaurasia et al., "Chromatin-Modifying Agents Promote the Ex vivo Production of Functional Human Erythroid Progenitor Cells," Blood 117:4632-4641 (2011)）。ＣＢ ＨＳＣ増殖をより促進させる培養条件を更に最適化するために、まずＣＤ３４＋細胞、次いでＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の産生を、本明細書においてはコントロール条件と称する、サイトカインを補充したＳＦ培養及びＳＣ培養において評価した。ＣＢ ＣＤ３４＋細胞を増殖させるために使用したエクスビボにおける増殖方法の略図及び検討した細胞集団を表すために使用した用語は、図１Ａ及び表１で提供される。種々のＨＤＡＣＩ（ＶＰＡ、スクリプタイド［ＳＣＲ］、トリコスタチンＡ［ＴＳＡ］、スベロイルアニリドヒドロキサム酸［ＳＡＨＡ］、ＢＭＬ−２１０としても知られるＣＡＹ１０４３３［Ｃ４３３］、ＭＤ８５としても知られるＣＡＹ１０３９８、及びＣＡＹ１０６０３［分子式：Ｃ２２Ｈ３０Ｎ４Ｏ６］）を、様々な添加量及びインキュベーション期間（５〜９日間）で、添加した。ＳＣまたはＳＦ培養条件下において、インビトロで産生させたＣＤ３４＋細胞数を増加させる、ＨＤＡＣＩの能力を評価した。検討した８つのＨＤＡＣＩの内、ＶＰＡ、ＳＣＲ、及びＣ４３３で７日間処理することが、本目的に対して最も有効であると分かった。コントロール条件（１６．２％±９．２％）と比較して、これらの剤の各々で処理すると、ほぼ同等の割合（％）のＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞（ＳＣＲ：７３．４％±１３．９％、Ｃ４３３：７０．１％±１８．４％、及びＶＰＡ：７５．２％±１０．７％）が産生された（ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０００１）。しかしながら、７日間を超えて細胞を維持すると、その割合（％）は次第に減少した。同様に、これらのＨＤＡＣＩの各々は、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞によるＣＸＣＲ４発現（ＣＤ１８４）を促進するだけでなく、ＣＢ収集物当たりのＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の産生絶対数を高め（ＡＮＯＶＡ、Ｐ≦０．０００７）（図１Ｂ及び１Ｃ）、コントロール条件と比較してＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ１８４＋細胞の産生絶対数を高める（ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０００１）（図１Ｄ）のに有効であったことが見出された。最適濃度及び半最適濃度で混ぜ合わせた場合、ＶＰＡ、ＳＣＲ、及びＣ４３３の効果は、付加的ではなかった。
【００８６】
ＣＤ３４＋細胞の増殖を促進させるＨＤＡＣＩの能力に対する血清の効果を、より詳細に調査した。ＳＦコントロール培養条件を使用すると、ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の増殖数が、ＳＣコントロール培養条件で得られた数よりも多かった（ＡＮＯＶＡ、それぞれＰ＜０．０００１）（図２Ａ）。ＳＦ条件下においてＶＰＡを添加すると、ＣＤ３４＋細胞の細胞数（２１３倍）及びＣＤ３４＋９０＋細胞の細胞数（２０，２０２倍）が、ＶＰＡを添加したＳＣ条件（ＣＤ３４＋細胞では７８倍増殖及びＣＤ３４＋９０＋細胞では８９倍増殖）と比較して劇的に増加した（ＡＮＯＶＡ、Ｐ≦０．００５）（図２Ａ）。
【００８７】
ＶＰＡにより増殖したＣＤ３４＋細胞のより詳細な表現型解析は、ＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞による白血球共通抗原のアイソフォームＣＤ４５ＲＡ及びインテグリンα６（ＣＤ４９ｆ）の発現を解析することにより調査した。ヒトＨＳＣは、ＣＤ４９ｆは発現するが、ＣＤ４５ＲＡは発現しないことが分かっていた（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれるNotta et al., "Isolation of Single Human Hematopoietic Stem Cells Capable of Long-Term Multilineage Engraftment," Science 333(6039):218-221 (2011)）。図２Ｂでは、ＶＰＡ含有培養物に由来するＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の４７．０％±４．４％がＣＤ４９ｆを発現し、同時にこれらの細胞の若干が、ＣＤ４５ＲＡ（１．９％±２．１％）を発現したことを実証した。
【００８８】
ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ１軸は、ＨＳＣホーミングに対して非常に重要なので（Gul et al., "Valproic Acid Increases CXCR4 Expression in Hematopoietic Stem/Progenitor Cells by Chromatin Remodeling," Stem Cells Dev. 18:831-838 (2009)，その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる）、ＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋細胞のＳＤＦ１に対する遊走を調査した。図３Ａに見ることができる通り、１６時間後及び４８時間後、有意に多数のＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋細胞がＳＤＦ１に対して遊走した（Ｐ＝０．０１及びＰ＝０．０３）。次に、ＶＰＡ処理後のＣＤ３４＋細胞によるＣＸＣＲ４発現の上方制御が、これら細胞のＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウス骨髄へのホーミングの増加と関連があるかどうかを調査した。図３Ｂで実証した通り、ＶＰＡ処理によって、注入後１６時間（Ｐ＜０．０００１）及び４８時間（Ｐ＝０．０１）の両方で、コントロール条件下にて培養されたＣＤ３４＋細胞と比較して、ＣＤ３４＋細胞のホーミングが増加した。次に、培養したＣＤ３４＋細胞の細胞周期状態は、コントロール培養物及びＶＰＡ含有培養物中の細胞子孫を、培養から７日目にＢｒｄＵで（２．５時間）ラベリングすることによって調査し、細胞周期の種々の段階にあるＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の比率を比較した（図４Ａ）。ＶＰＡで処理された細胞では、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の含まれる比率が、コントロール培養細胞よりもはるかに高い比率となった（７５．２％±１０．７％対１６．２％±９．２％）ことが見出された。加えて、ＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞のより多数が、コントロール培養物中（２．２％±１．０％、Ｐ＜０．０００１）の細胞よりも、Ｇ２／Ｍ内（１８．０％±１．２％）にあった。このことは、ＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞が分裂しても初期の表現型を維持し続けていることを示し、それによって、７日目でもより多数のＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞が観察されることが説明された。ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞のＧ０／Ｇ１区画もまた、コントロール培養物中（５．０％±１．４％）で見られたのと比較して、ＶＰＡ含有培養物中（２３．２％±１３．８％）にて増加しており、ＶＰＡへ曝露したＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞は、Ｇ０／Ｇ１へと戻ることが可能であることを示唆した。また、コントロール培養物に由来するＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の方が、ＶＰＡ含有培養物中よりも、培養の７日後にＳ期にある細胞の比率がより少なかった（１７．５％±１．８％対２９．４％±７．９％）（図４Ｂ）。これらのデータは、コントロール細胞は、ＶＰＡで処理された細胞よりも培養期間中の早い段階で分裂し、ＶＰＡで処理された細胞は、７日目も分裂してＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞を産生し続けたことを示唆している。ＶＰＡの効果は、継続的にサイトカインへ曝露させることに依存するかを決定するために、ＣＢ ＣＤ３４＋細胞に１６時間最初のプライミングを行い、次いで７日間ＳＦ培地のみで、またはＶＰＡは補充するが、追加のサイトカインの非存在下にてＳＦ培地内で培養した（図１Ａ）。これらの研究では、サイトカインでの最初のプライミング後、ＳＦ培地のみ（サイトカイン無し（図５Ａ））によるインキュベーション後に、ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋９０＋細胞が増殖したことが実証された。しかしながら、細胞をＶＰＡのみ（サイトカイン無し）の存在下において培養した場合、ＰＣと比較して、産生されたＣＤ３４＋細胞（Ｐ＜０．０００１）及びＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞（Ｐ＜０．０５）の絶対数は、一層高かった（図５Ａ）。しかしながら、最初に前処理をせず、次いで追加のサイトカイン無しでインキュベートした培養物中では、ＣＤ３４＋細胞増殖が同じ割合で起こらなかったことから、ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の数の増加は、少なくとも前処理のサイトカインへの曝露に依存することが示された。７日目に、培地のみ（サイトカイン無し）で培養した細胞の２１．２％±５．１％はＣＤ３４＋であり、それらの表現型はＰＣと類似していたが、ＶＰＡのみに曝露した細胞は、ＣＤ９０、ＣＤ１８４、及びＣＤ４９ｆ、ただしＣＤ４５ＲＡは除く、の劇的な上方制御を特徴とし（図１４）、ＶＰＡがエピジェネティックリプログラミングをもたらすことと一致することが分かった。ＣＢ収集物当たりのＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の数は、培地のみ（サイトカイン無し）で培養した場合に５．２倍及び１４４倍増加し、それに比較して、ＶＰＡのみ含有（サイトカイン無し）の培養物中では各々９．０倍及び４８６倍増加した（ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０００１）（図５Ｂ）。ＣＤ３４＋細胞の増殖倍率（２１３倍）及びＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の増殖倍率（２０，２０２倍）は、７日間のインキュベーション期間中、ＶＰＡ含有ＳＦ培養へのサイトカインの追加によって更に劇的に増大した（図２Ａ）。
【００８９】
ＨＤＡＣレベルに対するＨＤＡＣＩの効果
ＨＤＡＣは、多タンパク質複合体のサブユニットとして細胞内に存在し、遺伝子発現を制御する。クラスＩ ＨＤＡＣ（ＨＤＡＣ１、２、３、及び８）は、酵母の転写制御因子ＲＰＤ３に対して配列相同性を有する。しかしながら、クラスＩＩ ＨＤＡＣ（ＨＤＡＣ４、５、６、７、９、及び１０）は、酵母内で見られるデアセチラーゼＨＤＡ１と類似したドメインを共有する（その全体が参照として本明細書に組み込まれるDelcuve et al., "Roles of Histone Deacetylases in Epigenetic Regulation: Emerging Paradigms from Studies with Inhibitors," Clin. Epigenetics 4(1):5 (2012)）。クラスＩ及びＩＩ ＨＤＡＣは、転写コリプレッサーｍＳＩＮ３、ＮＣｏＲ、及びＳＭＲＴと相互作用し、それによりＨＤＡＣを転写因子へとリクルートする（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれるDelcuve et al., "Roles of Histone Deacetylases in Epigenetic Regulation: Emerging Paradigms from Studies with Inhibitors," Clin. Epigenetics 4(1):5 (2012)；Kramer et al., "The Histone Deacetylase Inhibitor Valproic Acid Selectively Induces Proteasomal Degradation of HDAC2," EMBO J. 22:3411-3420 (2003)）。ＨＤＡＣＩは、ＣＢ ＣＤ３４＋細胞におけるＨ３アセチル化を促進させることが、これまでに分かっている（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれるChaurasia et al., "Chromatin-Modifying Agents Promote the Ex vivo Production of Functional Human Erythroid Progenitor Cells," Blood 117:4632-4641 (2011)）。しかしながら、ＨＤＡＣ活性は、触媒ドメインでのこれらの阻害剤との結合によるだけでなく、ユビキチン／プロテアソーム経路を介するＨＤＡＣ分解の微調整によっても調節することができる。Ｅ２ユビキチンコンジュガーゼ（ｃｏｎｊｕｇａｓｅ）Ｕｂｃ８及びＥ３ユビキチンリガーゼＲＬＩＭの量を制限することで、ＶＰＡによる調節を受けやすいＨＤＡＣのバランスのとれた定常状態のタンパク質レベルが維持されると報告されてきた（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる、Kramer et al., "The Histone Deacetylase Inhibitor Valproic Acid Selectively Induces Proteasomal Degradation of HDAC2," EMBO J. 22:3411-3420 (2003)；Cedar et al., "Epigenetics of Haematopoietic Cell Development," Nat. Rev. Immunol. 11:478-488 (2011)；Cunliffe, "Eloquent Silence: Developmental Functions of Class I Histone Deacetylases," Curr. Opin. Genet. Dev. 18(5):404-410 (2008)）。ＨＤＡＣがＨＤＡＣＩの影響を受けることを決定するために、クラスＩ及びＩＩの両方のＨＤＡＣタンパク質レベルに対するＳＣＲ、Ｃ４３３、及びＶＰＡの効果を、ＣＢ単核細胞（ＣＢ−ＭＮＣ）及びヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞において、処理の２時間及び２４時間後に評価した。ＣＢ−ＭＮＣの処理から２時間後、ＳＣＲ、Ｃ４３３、及びＶＰＡはＨＤＡＣの発現を阻害しなかったが、処理から２４時間後、異なる割合でクラスＩ（ＨＤＡＣ１、２、及び３）、クラスＩＩａ（ＨＤＡＣ４及び５）、並びにクラスＩＩｂ（ＨＤＡＣ６）ＨＤＡＣを阻害した。ＳＣＲ及びＣ４３３は、各ＨＤＡＣに対して最も有効な阻害剤であった（図６及び表７）。
【００９０】
（表７）ウェスタンブロットの濃度解析
2019150040.tif 000004
上部パネル：ＨＤＡＣタンパク質レベルをデンシトメトリーによって評価し、ｂ−アクチンの発現を基準として正規化した。下部パネル：コントロールに対するクラスＩ及びクラスＩＩ ＨＤＡＣの下方制御割合（％）。各ＨＤＡＣＩの存在下において、ＨＤＡＣ１、３及び５が減少した。（平均±ＳＥ、ｎ＝４）
【００９１】
各ＨＤＡＣは、細胞特異的な機能において、細胞内プロセスの制御及び細胞外環境への応答に重要な役割を果たすので、特定の細胞型が、導入されたＨＤＡＣＩに反応する仕組みの予測には限界がある（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれるDelcuve et al., "Roles of Histone Deacetylases in Epigenetic Regulation: Emerging Paradigms from Studies with Inhibitors," Clin. Epigenetics 4(1):5 (2012)；Cedar et al., "Epigenetics of Haematopoietic Cell Development," Nat. Rev. Immunol. 11:478-488 (2011)；Kouzarides, "Chromatin Modifications and Their Function," Cell 128:693-705 (2007)；Oh et al., "Concise Review: Multidimensional Regulation of the Hematopoietic Stem Cell State," Stem Cells 30:82-88 (2012)）。これらＨＤＡＣＩによるＨＥＫ２９３細胞処理後のＨＤＡＣ阻害パターンは、ＣＢ−ＭＮＣのパターンとは著しく異なっており、処理の２時間後では、２４時間後と比較してより顕著であることが見出された（図１５）。ＨＤＡＣ２及びＨＤＡＣ４の下方制御は、ＨＥＫ２９３細胞に対する３種のＨＤＡＣＩ各々の効果に対して共通であったが、ＨＤＡＣ１、３、及び５の減少は、同じ剤で処理したＣＢ−ＭＮＣに対して共通であった。これらの結果は、ＳＣＲ、Ｃ４３３、及びＶＰＡは、各クラスＩ及びＩＩのＨＤＡＣＩであるが、特定のＨＤＡＣに対するその効果は、処理された細胞型に依存して変化することを示している。ＨＤＡＣ３の下方制御が、インビトロでのＨＳＣ増殖に必要不可欠であることがこれまでに分かっている（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれるElizalde et al., "Histone Deacetylase 3 Modulates the Expansion of Human Hematopoietic Stem Cells," Stem Cells Dev. 21:2581-2591 (2012)）。調査した各ＨＤＡＣＩは、ＣＢ ＣＤ３４＋細胞数を増加させることが可能であるが、ＶＰＡはＣＤ３４＋細胞増殖の促進に最も有効な化合物でありながらも、最も強力なＨＤＡＣ阻害剤ではなかった。ＶＰＡを用いて残りの実験を実施した。
【００９２】
ＶＰＡは、培養されたＣＢ ＣＤ３４＋細胞におけるＡＬＤＨ活性を変化させる
サイトカインを用いてインビトロで増殖させたＣＢ及び骨髄細胞の表現型は、必ずしも機能と関連するとは限らないので、ＡＬＤＨ活性をＨＳＣの機能マーカーとして使用した（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる、Hess et al., Functional Characterization of Highly Purified Human Hematopoietic Repopulating Cells Isolated According to Aldehyde Dehydrogenase Activity," Blood 104:1648-1655 (2004)；Lioznov et al., "Aldehyde Dehydrogenase Activity as a Marker for the Quality of Hematopoietic Stem Cell Transplants," Bone Marrow Transplant 35:909-914 (2005)；Spangrude et al., "Long-Term Repopulation of Irradiated Mice with Limiting Numbers of Purified Hematopoietic Stem Cells: In vivo Expansion of Stem Cell Phenotype but not Function," Blood 85(4):1006-1016 (1995)；Storms et al., "Distinct Hematopoietic Progenitor Compartments are Delineated by the Expression of Aldehyde Dehydrogenase and CD34," Blood 106:95-102 (2005)；Veeraputhiran et al., "Aldehyde Dehydrogenase as an Alternative to Enumeration of Total and Viable CD34(+) Cells in Autologous Hematopoietic Progenitor Cell Transplantation," Cytotherapy 13:1256-1258 (2011)）。サイトカインの存在下にて、ＳＣ培養中で培養された細胞よりも、ＳＦ培養中で培養された細胞において、より多くのＡＬＤＨ活性を有する細胞画分が観察された。更に、ＳＦ培養条件下でサイトカインを含有する培養にＶＰＡを添加すると、ＳＣ培養中で観察されたのと比較して、ＡＬＤＨ＋細胞の比率がより高くなった（図７Ａ及び表２）。
【００９３】
（表２）ＡＬＤＨ＋細胞、ＡＬＤＨ＋ＣＤ３４＋細胞、及びＡＬＤＨ＋ＣＤ３４＋ＣＤ１１７＋細胞の頻度
2019150040.tif 000005
ＰＣは、ＳＦまたはＳＣ培地内にてコントロール条件下またはＶＰＡ含有培地内で培養された。ＳＦ培養にＶＰＡを添加すると、ＳＣ培養で観察されたのと比較して、ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋ＣＤ１１７＋細胞におけるＡＬＤＨ活性の割合がより高くなった。各数値は、特定の表現型を有する細胞の割合（％）を表す。平均±ＳＥＭ。ＡＰ≦０．００７。ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０００１。ｎ＝３〜５。
ＶＰＡを添加したＳＦ培養において産生されたＡＬＤＨ＋ＣＤ３４＋ＣＤ１１７＋細胞の絶対数は、ＳＣ培養中で得られた数よりも多かった（Ｐ＝０．００９）（図７Ｂ）。
【００９４】
ＶＰＡは、多能性に関連する遺伝子の発現に影響を及ぼす
転写因子ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、及びＮＡＮＯＧは、そのプロモーターを含む標的遺伝子を共同占有し、それによって、自己複製及び多能性の維持に必要な調節及び自己調節フィードバックループの両方で協調することにより、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）の両方の運命決定を確定させる調節機能の中核を担う（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる、Boyer et al., "Core Transcriptional Regulatory Circuitry in Human Embryonic Stem Cells," Cell 122:947-956 (2005)；Loh et al., "The Oct4 and Nanog Transcription Network Regulates Pluripotency in Mouse Embryonic Stem Cells," Nat. Genet. 38(4):431-440 (2006)）。ＶＰＡ媒介ＨＳＣ増殖における、このようなマスター転写因子の役割は、コントロール条件下での培養またはＳＦ及びＳＣ培地中にてＶＰＡで処理された培養の７日後に再単離されたＣＤ３４＋細胞における、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、及びＮＡＮＯＧの発現を調査することで探求した。ＲＴ−ＰＣＲは、ＶＰＡ含有ＳＦ培養物に由来するＣＤ３４＋細胞におけるＳＯＸ２、ＯＣＴ４、及びＮＡＮＯＧ転写の発現を明らかにしたが、コントロール培養またはＶＰＡが添加されたＳＣ培養中では、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２転写がほとんど検出できなかった（図８Ａ）。定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって、これらの多能性遺伝子の発現は、ＳＣ培養中で観察されたのと比較して、ＳＦ培養中におけるＶＰＡの存在下で増加したことが実証された（ＡＮＯＶＡ、Ｐ＝０．０００１）（図８Ｂ）。成体幹細胞におけるＯＣＴ４の発現は、機能型のＯＣＴ４ではなく、実際には不活性な偽遺伝子の発現によるものであるという可能性が、他の研究者によって報告されている（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる、Redshaw et al., "Human Haematopoietic Stem Cells Express Oct4 Pseudogenes and Lack the Ability to Initiate Oct4 Promoter-Driven Gene Expression," J. Negat. Results Biomed. 9(1):2-8 (2010)；Zangrossi et al., "Oct-4 Expression in Adult Human Differentiated Cells Challenges its Role as a Pure Stem Cell Marker," Stem Cells 25:1675-1680 (2007)）。ＲＴ−ＰＣＲを使用して、１つのＯＣＴ４偽遺伝子が、ＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋細胞においては存在しなかったことが見出された（図８Ａ）。ｑＰＣＲ解析によって、２つの偽遺伝子の転写は存在しなかったことが示された。ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧとは異なり、ＥＳ細胞における別の既知の多能性マーカーであるテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれるTakahashi et al., "Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors," Cell 131:861-872 (2007)）は、ＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋細胞において増加しなかった。クロマチンリモデリングにおいて重要な役割を担うＳＥＴ、ＳＭＡＲＣＡＤ１、及びＭＹＳＴ３を含む、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、及びＮＡＮＯＧの下流標的遺伝子を、追加の多能性遺伝子ＺＩＣ３も加えて調査した（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる、Boyer et al., "Core Transcriptional Regulatory Circuitry in Human Embryonic Stem Cells," Cell 122:947-956 (2005)；Takahashi et al., "Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors," Cell 131:861-872 (2007)；Lim et al., "Zic3 is Required for Maintenance of Pluripotency in Embryonic Stem Cells," Mol. Biol. Cell 18:1348-1358 (2007)）。ＳＭＡＲＣＡＤ１、ＭＹＳＴ３、及びＺＩＣ３、た���しＳＥＴは除く、もまたＳＦ培養中のＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋細胞において劇的に増加した（ＡＮＯＶＡ、Ｐ＝０．０４）。ＺＩＣ３ ｍＲＮＡは、血清の存在下でＶＰＡを補充したコントロール培養中では検出されなかったが、ＶＰＡを補充したＳＦ培養中においてのみ増加した（図８Ｃ）。ＺＩＣ３遺伝子は、ＥＳ細胞においてＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧの標的として同定されてきた。ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＳＯＸ２の転写ネットワークと一部重なり合うＺＩＣ３は、多能性の維持に重要であり、ＮＡＮＯＧの発現を直接調節することができる（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる、Boyer et al., "Core Transcriptional Regulatory Circuitry in Human Embryonic Stem Cells," Cell 122:947-956 (2005)；Lim et al., "Zic3 is Required for Maintenance of Pluripotency in Embryonic Stem Cells," Mol. Biol. Cell 18:1348-1358 (2007)；Declercq et al., "Zic3 Enhances the Generation of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells," Stem Cells Dev. (2013)）。
【００９５】
次いで、ＣＤ３４＋細胞中でのＳＯＸ２、ＯＣＴ４、及びＮＡＮＯＧタンパク質の発現を、フローサイトメトリー解析によって調査した。ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、及びＮＡＮＯＧの発現は、ＳＣ培養中ではなく、ＳＦ培養中でＶＰＡの存在下にて最も高くなった（図９Ａ及び表３）。次いで、ＣＤ３４＋細胞中のＳＯＸ２、ＯＣＴ４、及びＮＡＮＯＧタンパク質の発現を、ｍＡｂ染色及び共焦点顕微鏡を使用して調査した（図９Ｂ及び図１６）。多能性遺伝子は、ＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋細胞中の細胞核及び細胞質の両方で増加及び局在化していたが、ＥＳ細胞中では、これらのタンパク質は、圧倒的に核内領域に局在化した。これらのタンパク質は、コントロール条件下で産生されたＣＤ３４＋細胞またはＰＣにおいては観察されなかったが、低レベルのＺＩＣ３タンパク質は、ＰＣにおいて観察された。ＯＣＴ４及びＳＯＸ２は、ＮＡＮＯＧプロモーターと結合し、その転写及び関連する遺伝子ネットワークの転写を促進させる、主な転写因子である（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる、Boyer et al., "Core Transcriptional Regulatory Circuitry in Human Embryonic Stem Cells," Cell 122:947-956 (2005)；Loh et al., "The Oct4 and Nanog Transcription Network Regulates Pluripotency in Mouse Embryonic Stem Cells," Nat. Genet. 38(4):431-440 (2006)）。ＳＣ培養ではなくＳＦ培養中にて、ＶＰＡで処理することでＮＡＮＯＧを上方制御することは、ＳＯＸ２及びＯＣＴ４間での機能的相互作用の可能性を示した（表３）。
【００９６】
（表３）多能性遺伝子の発現
2019150040.tif 000006
ＳＦ及びＳＣ培地中にて、７日間のコントロール培養物及びＶＰＡで処理された培養物から再単離されたＣＤ３４＋細胞（純度：９５％〜９９％）における、ｍＡｂ染色及びフローサイトメトリー解析によって評価したＳＯＸ２、ＯＣＴ４、及びＮＡＮＯＧの発現。各数値は、特定の多能性タンパク質を発現するＣＤ３４＋細胞の割合（％）を表す。平均±ＳＥＭ。ＡＰ＜０．０５。ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０００１。ｎ＝４。
次いで、ＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４間の物理的相互作用を、ＶＰＡで処理された細胞に由来するタンパク質のｃｏ−ＩＰによって記録した（図９Ｃ）。更に、ウェスタンブロット解析によって、ＶＰＡで処理された細胞における内因性ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの発現は、ＥＳ細胞の場合よりも多くなかったことが明らかとなった（図９Ｃ）。
【００９７】
ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の増殖に必要不可欠な多能性遺伝子
ＶＰＡで処理された培養物における多能性遺伝子の上方制御とＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の増殖との間の機能的関連性を立証するために、ＣＤ３４＋細胞に各ｓｉＲＮＡまたはＳＯＸ２、ＯＣＴ４、及びＮＡＮＯＧ（ＳＯＮ）に対するｓｉＲＮＡの複合プールのいずれかをトランスフェクションした。初めに、異なる濃度のｓｉＲＮＡを、各遺伝子について、及びコントロール培養またはＶＰＡで処理された培養中の細胞に対する遺伝子の潜在的な毒性作用について試験した。ＳＯＮ ｓｉＲＮＡで処理された細胞の形態学的外観は、スクランブルｓｉＲＮＡで処理されたのと比較して、変化はなかった。スクランブル、ＳＯＮ、及びＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後、コントロール培養及びＶＰＡ含有培養において産生された細胞の総数に、有意な減少は観察されなかった（表８）。多能性遺伝子の発現は、ｑＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＶＰＡで処理された培養物におけるｓｉＲＮＡトランスフェクション後に観察した（図１０Ａ及び１０Ｂ）。ｓｉＲＮＡによるノックダウンによって、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３転写の発現（８０％〜８４％）が著しく減少した（ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０００１）。共焦点顕微鏡及びｍＡｂ染色によっても、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、及びＮＡＮＯＧタンパク質の発現が著しく減少したことが明らかとなった。ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧ調節ネットワークの下流であるＺＩＣ３タンパク質の発現は、より少ない程度に減少した（図１０Ｃ）。ＣＤ３４＋細胞（４７．８％±４．４％対２２．８％±８．６％）及びＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞（２０．５％±６．１％対１１．７％±４．５％）（ＡＮＯＶＡ、Ｐ＝０．０００５）の割合（％）における有意な減少が、多能性遺伝子各々について特異的な各ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡと比較して、ＳＯＮ ｓｉＲＮＡでの処理後に観察された（図１０Ｄ）。更に、ＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋細胞をＳＯＮ ｓｉＲＮＡで処理した後、ＣＢ収集物当たりのＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の絶対数が、それぞれ８９．１％及び８８．７％（ＡＮＯＶＡ、Ｐ＝０．０００８）減少したことが観察された（図１０Ｅ）。
【００９８】
これらのデータは、ＶＰＡ処理が、ＳＦ培養物中のＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の産生に必要不可欠な、多能性遺伝子の以降の転写活性化を導く、培養されたＣＤ３４＋細胞のエピジェネティックなリプログラミングを引き起こすことを示している。
【００９９】
（表８）コントロール培養物及びＶＰＡで処理された培養物に対するｓｉＲＮＡトランスフェクションの効果
2019150040.tif 000007
上部パネル：コントロール培養物は、ＶＰＡ培養物について先に記載したとおりにｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の総細胞数及び割合（％）における有意差は、スクランブルｓｉＲＮＡ及びＳＯＮ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションから７２時間後では観察されなかった。（ｎ＝４）（＊ｐ≦０．５、ｎｓ）
下部パネル：ＶＰＡで処理された培養物は、方法セクションにて先に記載したとおりにスクランブルｓｉＲＮＡ及びＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の総細胞数及び割合（％）における有意差は、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡトランスフェクションから７２時間後では観察されなかった。（ｎ＝３）（＊ｐ＜０．２５、ｎｓ）
【０１００】
ＮＳＧマウスにおけるＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋細胞のインビボでの機能的挙動
ＰＣ並びにコントロール条件下並びにＶＰＡ及びサイトカインで培養されたＣＢ ＣＤ３４＋細胞の骨髄再構築能を、ＮＳＧレシピエントマウスの骨髄内での細胞生着を確認することによって評価した。すべてのレシピエントマウスにおいて、移植された移植片の種類に関係なく、ヒトＣＤ４５＋細胞及びＣＤ４５＋ＣＤ３４＋細胞が検出された。移植から１３〜１４週間後（図１１Ａ及び１１Ｂ）、ＰＣが生着したマウス内における骨髄細胞の１９．４％±４．９％がドナー由来のＣＤ４５＋細胞であり、それに比較して、コントロール培養物に由来する細胞が生着したマウス内では１３．２％±６．４％であった。一方、ＶＰＡで処理されたＣＢ ＣＤ３４＋細胞の移植では、ヒトＣＤ４５＋細胞キメリズム（３２．２％±１１．３％）及びＣＤ４５＋ＣＤ３４＋細胞（１３．０％±８．７％）の割合が、コントロール細胞で得られたのと比較して、より高い割合となった（それぞれ、Ｐ＝０．０００８及びＰ＝０．００４）（図１１Ａ及び１１Ｂ）。ＶＰＡ移植片でのＣＤ４５＋細胞キメリズムの割合もまた、ＰＣで得られた割合よりも統計上高い割合となった（Ｐ＝０．００６）。
【０１０１】
ＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋細胞が生着したマウスの骨髄内のドナー由来ＣＤ３４＋細胞では、ＰＣまたはコントロール条件下で増殖させた移植片が生着したマウスの骨髄内と比較して、ＣＤ１８４（９．９％±９．６％）と共発現した細胞数が有意に多かった（ＡＮＯＶＡ、Ｐ＝０．０１）（図１１Ｃ）。ＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋細胞移植片の、移植後に複数の造血系統に分化するパターンは、ＰＣまたはコントロール条件下で増殖させた細胞でのパターンとは明らかに異なり（ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０００１）（図１１Ｄ及び１１Ｅ）、ＶＰＡで処理された移植片が生着したマウス内に現れるＣＤ４１＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、及びグリコフォリンＡ陽性（ＧＰＡ＋）細胞の比率が高かった。
【０１０２】
次に、ＶＰＡによるＳＲＣ増殖の依存性を、その増殖中にサイトカインに曝露し続けることで評価した。図１１Ｆに見ることができる通り、サイトカインの非存在下にて培地のみ（サイトカイン無し）及びＶＰＡのみ（サイトカイン無し）で培養したＣＤ３４＋細胞の移植では、キメリズムの割合はほぼ同等であった（８．２％±５．０％対１２．５％±５．０％；Ｐ＝０．１、ＮＳ）。継続的なサイトカインへの曝露無しで産生された移植片は、複数の造血系統に属する細胞を産生する能力を保持していた（表９）。
【０１０３】
（表９）ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ｙｃｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスにおけるサイトカイン無しの無血清（ＳＦ）条件下で培養したＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋細胞のインビボでの機能的挙動
2019150040.tif 000008
２．０×１０５個のＣＢ ＣＤ３４＋初代細胞（ＰＣ）または無血清（ＳＦ）条件下にて培地のみ含有した培養（サイトカイン無し）及びＶＰＡのみ含有した培養（サイトカイン無し）から７日後に再単離されたＣＤ３４＋細胞が生着したＮＳＧマウスの骨髄解析。移植から１２〜１３週間後のヒト細胞キメリズム（ＣＤ４５＋、ＣＤ３３＋、及びＣＤ３４＋）並びにＢ細胞（ＣＤ１９＋）、顆粒球（ＣＤ１４＋）、赤血球細胞（グリコフォリンＡ（ＧＰＡ＋））及び巨核球（ＣＤ４１＋）を含む多系統の造血細胞の生着割合（％）が示されている。
（平均±ＳＥ、＊ｐ＜０．０５、（ＡＮＯＶＡ  Ｐ＜０．０００１）。ＮＳＧマウスレシピエント（ｎ＝１５））。
【０１０４】
コントロール条件下で培養した細胞の移植で得られたドナー細胞キメリズムの割合は、培地のみ（サイトカイン無し）またはＶＰＡのみ（サイトカイン無し）にて７日間サイトカインに曝露しなかった細胞で得られた割合とほぼ同等であった。しかしながら、サイトカイン＋ＶＰＡの存在下において産生された移植片の移植後に、ヒト細胞キメリズムの割合の劇的な増加が観察された（３２．３±１０．２％；ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０００１）。これらのデータは、ＰＣを１６時間だけサイトカインで前処理し、次いでサイトカインの非存在下にて培地のみまたはＶＰＡのみで培養するのであれば、ＳＲＣは存続することを示唆している。しかしながら、培養期間を通してサイトカインが存在すると、ＶＰＡの有効性を更に向上させて、ＮＳＧレシピエントにおけるヒト細胞キメリズムの割合が高くなった。
【０１０５】
増殖させた移植片の自己複製能は、一次レシピエント中に存在するドナー由来細胞を二次レシピエントに移植することで評価した。１５〜１６週間後、ＶＰＡで処理されたＣＢ ＣＤ３４＋細胞を移植した一次レシピエントに由来する骨髄細胞を移植した二次レシピエントでは、ヒトＣＤ４５＋細胞キメリズムの割合が最も高い結果となった（ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０００１）（図１２Ａ）。図１２Ｂに示すように、二次レシピエントマウス内のドナー由来細胞は複数の造血系統に属し、このパターンは、ＰＣ移植片またはコントロール条件下で増殖させた移植片が生着した一次レシピエントに由来する骨髄細胞が生着した二次レシピエント内で観察されたパターンとは異なっていた（ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０００１）。ドナー由来赤血球細胞の生着割合は、ＶＰＡで処理された移植片が生着したマウスに由来する骨髄細胞を持つ二次レシピエント内で、特に顕著であった（図１２Ｂ）（その全体が参照として本明細書に組み込まれるSauvageau et al., "In vitro and In vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells," Oncogene 23:7223-7232 (2004)）。ＶＰＡで処理された移植片が生着した骨髄細胞を持つ一次または二次レシピエントのいずれも、血液癌の証拠を発現または奇形腫を発症しなかった。奇形腫形成の可能性を更に排除するために、コントロール培養物もしくはＶＰＡ含有培養物から再単離されたＣＤ３４＋細胞またはＥＳ細胞を、それぞれＮＳＧマウスの後肢に皮下注射し、８週間後に評価した。３つの異なる胚葉由来の細胞から成る奇形腫が、ＥＳ細胞を注入した動物に限り観察された（図１７）。
【０１０６】
ＶＰＡ処理後の多能性遺伝子の上方制御の持続性を評価するために、ドナー細胞におけるこれら遺伝子の発現を、一次及び二次レシピエントＮＳＧマウスにて評価した。ｑＰＣＲを使用しても、一次及び二次レシピエントの骨髄細胞におけるＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３を含む多能性遺伝子の転写が検出されなかったことは、ＶＰＡ誘導の上方制御が一過性であったことを示した。
【０１０７】
ＶＰＡ処理で得られたＨＳＣの増殖の割合を評価するために、限界希釈解析を使用して、ＰＣ、コントロール条件下で培養された当量数のＰＣ由来の細胞、またはＶＰＡ含有培養物における、ＳＲＣ頻度を比較した。数を増加させたＰＣ（５０、２５０、５００、２，５００、及び５，０００）、またはコントロール条件下及びＶＰＡでの処理後の当量数のＰＣに由来する細胞子孫を移植した結果、移植後のヒト細胞キメリズムの割合が増加した（図１３Ａ）。ポアソン分布解析によって、ＳＲＣ頻度は、ＰＣでは１，１１５分の１（９５％ＣＩ：１／５９６〜１／２，０８７）、コントロール培養物では９，２２３分の１（９５％ＣＩ：１／３，４１９〜１／２４，８７９）、及びＶＰＡで処理された培養物では３１分の１（９５％ＣＩ：１／１４〜１／６６）であることが明らかとなった。ＰＣ、コントロール、及びＶＰＡ含有培養物の間の幹細胞頻度における全体の差は非常に有意であり（Ｐ＝９．４２×１０−２９）、ＰＣまたはコントロール培養物と比較して、ＶＰＡ培養物においてＳＲＣ数が効果的に増加することが示された（図１３Ｂ並びに表４及び５）。
【０１０８】
（表４）ＮＳＧマウスにおけるヒト細胞生着の限界希釈解析
2019150040.tif 000009
ＮＳＧマウスのＢＭ中に存在するＳＲＣの頻度一覧。ＰＣ及びコントロール条件下またはＶＰＡで７日間培養した当量数のＰＣの子孫をＮＳＧマウスに移植した。１２〜１３週間後、ヒトＣＤ４５＋細胞生着についてＢＭを解析した。
【０１０９】
１×１０６個のＰＣ及びコントロール条件下で培養した細胞では、それぞれ８９７個のＳＲＣ及び１０８個のＳＲＣが存在していたと計算された。一方、ＶＰＡ含有培養物に由来する１×１０６個の細胞では、３２，２５８個のＳＲＣが存在していたと計算された（表５）。従って、コントロール培養条件下でのＰＣのインキュベーションはＳＲＣ数を減少させたが、ＶＰＡ処理によって、ＰＣと比較してＳＲＣ数が３６倍（Ｐ≦０.００２）増加し、コントロール条件下で培養した細胞と比較してＳＲＣ数が２９９倍（Ｐ≦０.００２）増加する結果となった（図１３Ｃ）。
【０１１０】
（表５）ＳＲＣの頻度
2019150040.tif 000010
ＳＲＣの頻度は、表４で提供されたデータ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｌ−Ｃａｌｃソフトウェア及びＥＬＤＡソフトウェア）からポアソン統計を適用することで決定した。ＰＣ、コントロール、及びＶＰＡを含むグループ間での幹細胞頻度における全体の差（ＡＰ＝９．４２×１０−２９）。
【０１１１】
考察
ＨＳＣの多能性は、ＨＳＣのクロマチン構造及びエピジェネティックな可塑性が動的に維持されることによって説明することができる。クロマチン構造の変換は、主に特異的なヒストンの翻訳後修飾により制御されて、結果として得られたクロマチン構造が、許容的か抑制的かを決定する（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる、Cedar et al., "Epigenetics of Haematopoietic Cell Development," Nat. Rev. Immunol. 11:478-488 (2011)；Kouzarides, "Chromatin Modifications and Their Function," Cell 128:693-705 (2007)；Oh et al., "Concise Review: Multidimensional Regulation of the Hematopoietic Stem Cell State," Stem Cells 30:82-88 (2012)）。ＣＢ ＣＤ３４＋細胞による幹細胞機能がＳＣ培養条件及びサイトカインの組み合わせを使用したインビトロでの培養後に次第に失われることは、依然として、移植可能なＨＳＣ数のインビボでの増加に対する障壁である（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる、Giebel et al., "Primitive Human Hematopoietic Cells Give Rise to Differentially Specified Daughter Cells Upon their Initial Cell Division," Blood 107(5):2146-2152 (2006)；Ho et al., "The Beauty of Asymmetry: Asymmetric Divisions and Self-Renewal in the Haematopoietic System," Curr. Opin. Hematol. 14(4):330-336 (2007)；Huang et al., "Symmetry of Initial Cell Divisions Among Primitive Hematopoietic Progenitors Is Independent of Ontogenic Age and Regulatory Molecules," Blood 94(8):2595-2604 (1999)；Srour et al., "Modulation of In vitro Proliferation Kinetics and Primitive Hematopoietic Potential of Individual Human CD34+CD38-/lo Cells in G0," Blood 105(8):3109-3116 (2005)）。この幹細胞機能の減退は、十分に機能的なＨＳＣが、宿主内に存在する許容的環境から分離されて不利なエクスビボ環境へと配置され、それにより、自己複製能、骨髄再構築能、及び多系統分化能を含む、幹細胞の重要な機能を決定する遺伝子発現プログラムを変更するようなエピジェネティックな変化がもたらされることに起因すると考えられる。このＨＳＣ機能の喪失は、使用された培養条件に対して生じる細胞周期の急激な進行及び細胞分裂に起因している（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる、Declercq et al., "Zic3 Enhances the Generation of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells," Stem Cells Dev. (2013)；Sauvageau et al., "In vitro and In vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells," Oncogene 23:7223-7232 (2004)；Walasek et al., "Hematopoietic Stem Cell Expansion: Challenges and Opportunities," Ann. NY Acad. Sci. 1266:138-150 (2012)）。エクスビボでの幹細胞増殖における先の試みは、造血微小環境と類似させ、それによって幹細胞の機能的完全性の保持を促す環境の構築に重点を置いたことが恐らく部分的な要因となり、ある程度の成果を得てきた（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる、Dahlberg et al., "Ex vivo Expansion of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells," Blood 117:6083-6090 (2011)；Delaney et al., "Cord Blood Graft Engineering," Biol. Blood Marrow Transplant 19(1): S74-S78 (2013)；Delaney et al., "Strategies to Enhance Umbilical Cord Blood Stem Cell Engraftment in Adult Patients," Expert Rev. Hematol. 3:273-283 (2010)）。エクスビボでのこのような微小環境構築の難しさは、十分理解されており、クロマチン構造に影響を及ぼす剤を使用してＨＳＣのエピジェネティック特性を直接維持する試みである別のアプローチが取られてきた。このアプローチは、クロマチン状態の動的変化が、ヌクレオソームリモデリング、ＤＮＡメチル化、及びヒストンアセチル化によって媒介されるという理解に基づいている（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる、Cedar et al., "Epigenetics of Haematopoietic Cell Development," Nat. Rev. Immunol. 11:478-488 (2011)；Kouzarides, "Chromatin Modifications and Their Function," Cell 128:693-705 (2007)；Oh et al., "Concise Review: Multidimensional Regulation of the Hematopoietic Stem Cell State," Stem Cells 30:82-88 (2012)；Elizalde et al., "Histone Deacetylase 3 Modulates the Expansion of Human Hematopoietic Stem Cells," Stem Cells Dev. 21:2581-2591 (2012)）。このために、本研究では、細胞分裂を繰り返した後でも幹細胞の機能保持に関与する遺伝子を持つクロマチン構造の脱凝縮を図るために、いくつかのＨＤＡＣＩについて、クラスＩ及びＩＩ ＨＤＡＣの両方を阻害することが可能であるかを評価した。ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ３、及びＨＤＡＣ５タンパク質は、３種の最も活性なＨＤＡＣＩによって均一に減少し、このことは、これら３種のＨＤＡＣの組み合わせは、インビトロでの分裂後も幹細胞の機能を保持することを支持する幹細胞の運命決定において重要な役割を担うことを示唆した。
【０１１２】
ＨＤＡＣＩ処理はＨ３ヒストンアセチル化の増加をもたらすと、これまでに報告されてきた（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれるChaurasia et al., "Chromatin-Modifying Agents Promote the Ex vivo Production of Functional Human Erythroid Progenitor Cells," Blood 117:4632-4641 (2011)）、それと同時に、他の研究では、このような剤への曝露により、ＨＤＡＣへの結合及び／もしくはＤＮＡ脱メチル化の促進、並びに転写因子を関連ＤＮＡに結合させ得るヌクレオソームのスライド及び／もしくは移動、または特定のＨＤＡＣのプロテアソーム分解を引き起こすポリユビキチン化のいずれかにより、抑制的修飾が失われる結果になることが示された（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる、Cedar et al., "Epigenetics of Haematopoietic Cell Development," Nat. Rev. Immunol. 11:478-488 (2011)；Kouzarides, "Chromatin Modifications and Their Function," Cell 128:693-705 (2007)；Oh et al., "Concise Review: Multidimensional Regulation of the Hematopoietic Stem Cell State," Stem Cells 30:82-88 (2012)）。これらの相互作用によって、転写機構の形成に必要な追加のコアクチベーター及び／またはヒストン修飾酵素の動員が可能になり、転写活性化がもたらされる（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる、Cedar et al., "Epigenetics of Haematopoietic Cell Development," Nat. Rev. Immunol. 11:478-488 (2011)；Kouzarides, "Chromatin Modifications and Their Function," Cell 128:693-705 (2007)；Oh et al., "Concise Review: Multidimensional Regulation of the Hematopoietic Stem Cell State," Stem Cells 30:82-88 (2012)）。ＶＰＡは、一次及び二次ＮＳＧマウスへの細胞移植後に最大割合のヒト細胞キメリズムを生成可能な細胞の産生にて評価した、すべてのＨＤＡＣＩの内で最も有効であったことを本明細書で報告している。ＶＰＡ処理によって、ＳＲＣ頻度はＰＣでの頻度と比較して３６倍増加したが、ＨＳＣの高い増殖能及び多系統分化能特性は保持されたままであった。機能的ＨＳＣを産生する取り組みに関して、ＳＣ培養条件ではなくＳＦ培養条件の使用が重要であることが示された。ＳＦ培養条件下でのＶＰＡ処理は、ＳＣ条件下でのＶＰＡ処理よりも、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の産生数が２０，２０２倍高い結果となった。これらの結果は、血清は、機能的ＨＳＣの保持及び／または増殖に関与する調節遺伝子を阻害または抑制する因子を含むこと、並びに、血清の存在によってコミットメント及び分化に関与する遺伝子が上方制御されることを示している。これらの結果は、Ｈｉｒａｉ及び共同研究者によって報告された結果と非常に類似しており、彼らは、ｉＰＳ細胞の作製効率は、培地の組成及び形質導入した細胞をフィーダー層上に播種する濃度の変化によって、劇的に改善させることが可能であることを示した（その全体が参照として本明細書に組み込まれるHirai et al., "Efficient iPS Cell Production with the MyoD Transactivation Domain in Serum-Free Culture," PLoS One 7(3):e34149 (2012)）。ＳＦ培養条件下でのＶＰＡ処理によって、７日間のインキュベーション後に分裂中のＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞画分の多くの継続的な分裂がもたらされ、それによって、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞数の増加が説明されることも示した。これらの結果は、ＶＰＡ処理によって、７日間の培養期間を更に超えて分裂し続けるための、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の能力が保持されることを示している。しかしな��ら、この特性は、より長期間のインキュベーション後に失われ、このことは恐らく、使用した条件下におけるエクスビボでの幹細胞決定遺伝子発現プログラムの一時的な保持を表している。ＳＦ条件及びＶＰＡ処理を使用して産生させたＣＢ ＣＤ３４＋細胞の未分化な性質を、ＣＤ１８４及びインテグリンα６（ＣＤ４９ｆ）発現割合の増大、ＣＤ４５ＲＡ発現の欠如、並びにＡＬＤＨ活性割合の増加によって、更に本研究で立証した。ＣＸＣＲ４の発現増加は特に重要であり、その理由は、ＣＸＣＲ４とそのリガンドＳＤＦ１との相互作用が、幹細胞移植片の、移植されたレシピエント骨髄へのホーミングにおいて重要な役割を果たすからである（その全体が参照として本明細書に組み込まれるMotabi et al., "Advances in Stem Cell Mobilization," Blood Rev. 26(6):267-278 (2012)）。
【０１１３】
ＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋細胞における上方制御されたＣＤ１８４の機能性は、これらの細胞がコントロール培養物に由来するＣＤ３４＋細胞よりも高い割合で、インビトロでＳＤＦ１に対して遊走する能力及びＮＳＧマウス骨髄へホーミングする能力によって、本研究で立証した。従って、ＶＰＡで処理されたＣＢ ＣＤ３４＋細胞の骨髄再構築能の増大は、ＨＳＣの産生だけでなく、レシピエントマウス骨髄へのＨＳＣホーミングの促進に対する効果に起因し得る。ＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋細胞はまた、多能性関連遺伝子ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３、ただしｈＴＥＲＴは除く、の上方制御を特徴とすることが見出された。ＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋細胞のこれらの性質は、ｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞の特性であり、通常のＨＳＣとはこれまで関連がなかった。これらの多能性遺伝子（ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、及びＮＡＮＯＧ）のノックダウンは、ＶＰＡによるＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞のエクスビボでの産生を減少させるために実施した。加えて、ＳＯＮ処理後にＺＩＣ３の下方制御が観察されたのは、恐らくＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧの下流を制御することによる多能性維持への寄与の表れである（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる、Lim et al., "Zic3 is Required for Maintenance of Pluripotency in Embryonic Stem Cells," Mol. Biol. Cell 18:1348-1358 (2007)；Declercq et al., "Zic3 Enhances the Generation of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells," Stem Cells Dev. (2013)）。ＯＣＴ４がヒト腫瘍内に存在するという先行文献が、他の研究者によって研究されており、それはＯＣＴ４活性を欠くＯＣＴ４偽遺伝子に起因していた（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる、Redshaw et al., "Human Haematopoietic Stem Cells Express Oct4 Pseudogenes and Lack the Ability to Initiate Oct4 Promoter-Driven Gene Expression," J. Negat. Results Biomed. 9(1):2-8 (2010)；Zangrossi et al., "Oct-4 Expression in Adult Human Differentiated Cells Challenges its Role as a Pure Stem Cell Marker," Stem Cells 25:1675-1680 (2007)）。これら偽遺伝子の転写は、ＶＰＡで処理された細胞においては検出することができなかった。ＮＡＮＯＧとＯＣＴ４の物理的相互作用を、ＶＰＡにより増殖した細胞に由来するこれらタンパク質のｃｏ−ＩＰによって更に記録すると、ＥＳ細胞で観察された結果と類似していた。興味深いことに、Ｙｕ及び共同研究者の最近の報告によると、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２は、ヒト間葉系幹細胞におけるＣＤ４９ｆの発現を促進し、ＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋細胞を特徴付ける表現型マーカーの多くが、これら多能性遺伝子の上方制御に関連する可能性を高めている（その内容全体が、本明細書に参考として組み込まれるYu et al., "D49f Enhances Multipotency and Maintains Stemness Through the Direct Regulation of OCT4 and SOX2," Stem Cells 30(5):876-887 (2012)）。ＶＰＡで処理されたＣＢ ＣＤ３４＋細胞は不死化した細胞ではなく、ｉＰＳ及びＥＳ細胞とは明らかに異なる生物学的特性を有していた。培養において無期限に維持可能であるｉＰＳ及びＥＳ細胞とは異なり、ＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋細胞数は、培養から８日後に減少した。加えて、ＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋細胞は、ＮＳＧマウス内にＥＳ及びｉＰＳ細胞の特性である奇形腫を形成しなかった。ＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋細胞によるこれら多���性遺伝子の一時的な発現は、一次及び二次レシピエントＮＳＧマウス内で、計３０週間持続したヒト細胞における遺伝子転写の欠如によって更に立証した。これらのデータは、ＶＰＡで処理されたＣＤ３４＋細胞において誘導された、このような多能性遺伝子の一時的な発現が、恐らく細胞を不死化することなく、分裂するＣＢ ＨＳＣの機能に影響を与えることを示している。
【０１１４】
ＣＢ ＣＤ３４＋細胞の表現型を変化させるＶＰＡの能力は、造血細胞分化の階層に沿って、未分化細胞の挙動に影響を与えることが知られているサイトカインの組み合わせの添加によって劇的な影響を受けた。ＰＣは、少なくともサイトカインで１６時間前処理しない限り、ＨＳＣ数が減少した。ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞の数の増加は、これらの細胞を少なくともサイトカインで前処理し、次いで培地のみ（サイトカイン無し）またはＶＰＡのみ（サイトカイン無し）の存在下で更に７日間インキュベートした場合に限り、可能であった。しかしながら、後続の７日間の期間中にサイトカイン無しでＶＰＡに曝露された細胞のみが、ＶＰＡ及びサイトカイン含有培養において観察された細胞と類似したＨＳＣ表現型（ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ１１７＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ１８４＋ＣＤ４５ＲＡ−）を発現した。重要なのは、７日間のインキュベーション期間にわたってサイトカインをＶＰＡに添加した場合に、ＣＤ３４＋細胞の増殖割合が更に大幅に増加したことであった。驚いたことに、サイトカインの存在下及び非存在下の両方で産生されたＣＤ３４＋細胞は、ＮＳＧマウスへの細胞移植時に多系統の造血を構築する能力を保持しており、このことは、プライミング段階における短期間のサイトカイン曝露によって、限定的な増殖と、血液学的生着を生じさせるのに十分なＨＳＣ機能の維持とがもたらわれたことを示していた。これらのデータは、ＨＳＣをある程度置いたエクスビボ環境が細胞の運命を決定すること、及び表現型に関与するＨＳＣプログラムの保持は、ＳＦ培地内のＶＰＡによってエピジェネティックにリプログラミングされた結果であり、同時に、細胞数の増加はサイトカイン曝露により促進された細胞増殖の結果であることを示している。
【０１１５】
本明細書で報告された研究は、ＣＢ移植の臨床研究に対して重要な意味を持つ。本報告で概要を示したアプローチの実施には、十分なＳＲＣ数を含む利用可能な幹細胞移植片を作製し、成人でもより好ましい成果の上がる同種ＣＢ幹細胞移植を継続できる可能性がある。
【０１１６】
実施例２−ＢＦＵ−Ｅ＋ＣＦＵ−Ｍｉｘの絶対数に対するＨＤＡＣＩの効果
ＶＰＡ補充ＳＦ培養を用いて産生させた精製ＡＬＤＨ＋ＣＤ３４＋細胞では、産生したＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｍｉｘの絶対数（８．４ｘ１０７±６．７ｘ１０７／ＣＢ収集物）が、ＳＣ培養（１．４ｘ１０７±０．８８ｘ１０７）と比較して、より多かった（ＡＮＯＶＡ，ｐ＝０．００１）（図２０Ａ）。一方、ＶＰＡ補充ＳＣ培養物に由来するＡＬＤＨ−ＣＤ３４＋細胞では、産生したＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｍｉｘの数（２．７ｘ１０６±１．０ｘ１０６）が、ＳＦ培養（３．５ｘ１０５±０．７８ｘ１０５）と比較して、より多かった（ＡＮＯＶＡ，ｐ＝０．０１）（図２０Ｂ）。これらのデータは、血清が、ＡＬＤＨ＋細胞及びＡＬＤＨ−細胞の集団のインビトロでの運命に対して、特異的に影響を与えることを示している。
【０１１７】
実施例３−幹細胞表現型に対する凍結保存の効果
増殖させたＨＳＣ生成物は、移植センターへの配送前に凍結保存すると予想されるので、ＨＳＣ表現型を発現する生存可能な細胞の回復に対する凍結保存の効果を調査した。ＣＢ−ＣＤ３４＋細胞をＶＰＡで７日間処理し、細胞数を数えて、解凍前後の両方で表現型解析を実施した。凍結保存は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、グランドアイランド、ＮＹ）製Ｓｙｎｔｈ−ａ−Ｆｒｅｅｚｅを使用して実施した。
【０１１８】
Ｓｙｎｔｈ−ａ−Ｆｒｅｅｚｅは、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する合成液体凍結保存培地である。Ｓｙｎｔｈ−ａ−Ｆｒｅｅｚｅは、抗生物質、抗真菌剤、ホルモン、成長因子、血清、またはタンパク質を含まない。この培地は、ＨＥＰＥＳ及び重炭酸塩を緩衝剤としている。ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞、及びＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ１８４＋細胞の割合（％）は、凍結保存の前後で有意に変化しなかった（９０％〜９５％の細胞が生存可能のままであった）。これらのＨＳＣ表現型を発現する細胞の絶対数は、凍結保存の前後で変化しなかった（図１８）。これらのデータは、動物性タンパク質の必要なく、増殖させたＨＳＣ生成物の凍結保存の実施が可能であることを実証している。
【０１１９】
実施例４−表現型で定義されるすべてのクラスのＨＳＣを含む、ＶＰＡにより増殖したＨＳＣ生成物
ＶＰＡにより増殖したＨＳＣは多数の長期再構築細胞を含むことを示した。これらの細胞は、全能性細胞の特性である多能性遺伝子を発現するので、このような移植片には生着遅延を伴う可能性があるという妥当な懸念がある。Ｄｉｃｋ研究室では、短期並びに中間時点後及び長期間後にＮＳＧマウスにおいて再構築されるＨＳＣの階層を定義し、その表現型階層特性を同定した（その全体が参照として本明細書に組み込まれるNotta et al., "Isolation of Single Human Hematopoietic Stem Cells Capable of Long-term Multilineage Engraftment," Science 333(6039):218-221 (2011)）。短期ＳＣＩＤ再構築細胞（Ｒ−ＳＲＣ）は移植後２〜４週間でＮＳＧマウスから検出され、その表現型はＣＤ３４＋ＣＤ９０−ＣＤ４９ｆ−であり、中期ＳＲＣ（ＩＴ−ＳＲＣ）は１２〜１４週間後に再構築され、その表現型はＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ−であり、及び長期ＳＲＣ（ＬＴ−ＳＲＣ）は＞２４週間後に再構築され、その表現型はＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ＋である。これらの様々なＨＳＣクラスの分布を、ＶＰＡにより増殖したＨＳＣ生成物３つについて評価した。図１９Ａ〜Ｃに見ることができる通り、ＨＳＣのこれらのクラスは各々、ＣＢ−ＣＤ３４＋初代細胞と比較して、ＶＰＡで処理された細胞に存在する数が多かった。このことは、これらの増殖移植片が、未処理のＣＢ移植片と比較して恐らくより短期で、持続的な生着パターンをもたらし、加えて移植失敗の発生率を低下させるだろうことを示唆した。興味深いことに、ＳＦ条件下にてサイトカインのみの存在下で処理したＣＢ−ＣＤ３４＋細胞が含む、Ｒ−ＳＲＣ数が最も高い（図１９Ｃ）。この興味深い結果は、第１相試験の完了後にＶＰＡで処理された移植片の注入が、造血回復に対して短期と関連がない場合、重要であり得る。これらの結果に基づいて、Ｒ−ＳＲＣ数をより大幅に増加させることで更に短期での生着を促進させるために、ＣＤ３４＋初代細胞のごく一部をサイトカインのみの存在下で増殖し、ＶＰＡで処理された細胞生成物と混ぜ合わせることが可能となった。
【０１２０】
本明細書（付随する特許請求の範囲、要約、及び図面のすべてを含む）に記載されたすべての特徴、及び／または同様に開示されたいかなる方法もしくはプロセスのすべてのステップは、このような特徴及び／またはステップの少なくともいくつかが相互排他的な場合の組み合わせを除いて、任意の組み合わせでいかなる上記態様とも組み合わせられ得る。
【図１Ａ】
2019150040.tif 000011
【図１Ｂ】
2019150040.tif 000012
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
2019150040.tif 000041
【図１６】
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【図１７】
2019150040.tif 000043
【図１８】
2019150040.tif 000044
【図１９】
2019150040.tif 000045
【図２０】
2019150040.tif 000046
【配列表】
2019150040000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月6日(2019.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されかつ増殖したヒト造血臍帯血幹細胞の濃縮された集団であって、該造血幹細胞が、サイトカインＳＣＦ、Ｆｌｔ３リガンド、ＴＰＯ、及びＩＬ３と接触しており、該造血幹細胞が、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１８４＋、ＣＤ１１７＋、ＣＤ４９ｆ＋、ＡＬＤＨ＋、かつＣＤ４５ＲＡ−でありかつ多能性遺伝子ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３を発現し、該造血幹細胞が凍結保存されている、前記濃縮された集団。
【請求項２】
前記造血幹細胞の少なくとも６０％が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性に対して陽性である、請求項１に記載の濃縮された集団。
【請求項３】
前記造血幹細胞が、通常のヒト造血幹細胞と比較して、胚性幹細胞の多能性遺伝子ｈＴＥＲＴの発現レベルにおいて上方制御を示さない、請求項１または請求項２に記載の濃縮された集団。
【請求項４】
前記造血幹細胞の少なくとも９５％が、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３に対して陽性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の濃縮された集団。
【請求項５】
前記造血幹細胞が、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤と接触している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の濃縮された集団。
【請求項６】
前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、ＶＰＡ、ＳＣＲ、ＬＢＨ５８９、ＴＳＡ、ＳＡＨＡ、Ｃａｙ１０４３３、及びＣａｙ１０３９８からなる群より選択される、請求項５に記載の濃縮された集団。
【請求項７】
前記造血幹細胞が、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤と接触していない単離されかつ増殖したヒト造血臍帯血幹細胞と比較して減少した、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ３、及びＨＤＡＣ５の発現を有する、請求項５または請求項６に記載の濃縮された集団。
【請求項８】
前記造血幹細胞の少なくとも１８．０％±１．２％が、Ｇ２／Ｍ期にある、請求項１〜７のいずれか一項に記載の濃縮された集団。
【請求項９】
前記造血幹細胞の少なくとも２３．２％±１３．８％が、Ｇ０／Ｇ１期にある、請求項１〜８のいずれか一項に記載の濃縮された集団。
【請求項１０】
以下の工程を含む、単離されかつ増殖したヒト造血臍帯血幹細胞の濃縮された集団の作製方法：
単離されたヒト造血臍帯血幹細胞の集団を提供する工程であって、該造血幹細胞が、サイトカインＳＣＦ、Ｆｌｔ３、ＴＰＯ、及びＩＬ３と接触している、工程、
単離されかつ増殖したヒト造血臍帯血幹細胞の濃縮された集団を作製するために、無血清培養系においてヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下にて、ヒト造血臍帯血幹細胞の単離された集団を処理する工程であって、該増殖したヒト造血臍帯血幹細胞が、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１８４＋、ＣＤ１１７＋、ＣＤ４９ｆ＋、ＡＬＤＨ＋、かつＣＤ４５ＲＡ−でありかつ多能性遺伝子ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３を発現する、工程、ならびに
該造血臍帯血幹細胞を今後の使用のために凍結保存する工程。
【請求項１１】
前記単離されたヒト造血臍帯血幹細胞の集団が、前記処理を行うと２０，２０２倍に増殖する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記処理が７日間実施される、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記増殖した造血幹細胞の少なくとも８８．３％±５．９％が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性に対して陽性である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記増殖した造血幹細胞が、通常のヒト造血幹細胞と比較して、胚性幹細胞の多能性遺伝子ｈＴＥＲＴの発現レベルにおいて上方制御を示さない、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記増殖した造血幹細胞の少なくとも９５％が、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３に対して陽性である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、ＶＰＡ、ＳＣＲ、ＬＢＨ５８９、ＴＳＡ、ＳＡＨＡ、Ｃａｙ１０４３３、及びＣａｙ１０３９８からなる群より選択される、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記増殖した造血幹細胞が、前記処理前の前記単離された幹細胞と比較して減少した、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ３、及びＨＤＡＣ５の発現を有する、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記増殖した造血幹細胞の少なくとも９５％が、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３に対して陽性である、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記増殖した造血幹細胞の少なくとも１８．０％±１．２％が、Ｇ２／Ｍ期にある、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記増殖した造血幹細胞の少なくとも２３．２％±１３．８％が、Ｇ０／Ｇ１期にある、請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記処理する工程が、単一のエピジェネティックな制御因子の存在下にて実施され、該単一のエピジェネティックな制御因子がヒストンデアセチラーゼ阻害剤である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２２】
対象の血液疾患を治療するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離されかつ増殖したヒト造血臍帯血幹細胞の濃縮された集団を含む薬学的組成物であって、該対象に投与される、薬学的組成物。
【請求項２３】
前記投与する工程が、濃縮または精製された調製物に由来する前記造血幹細胞を前記対象内に移植することによって実施される、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記増殖した造血幹細胞が、前記対象由来である、請求項２２または請求項２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
前記増殖した造血幹細胞の少なくとも６０％が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性に対して陽性である、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
前記増殖した造血幹細胞が、通常のヒト造血幹細胞と比較して、胚性幹細胞の多能性遺伝子ｈＴＥＲＴの発現レベルにおいて全く上方制御を示さない、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
前記増殖した造血幹細胞の少なくとも９５％が、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びＺＩＣ３に対して陽性である、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
前記増殖した造血幹細胞の少なくとも２３％が、Ｇ２／Ｍ期にある、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
前記増殖した造血幹細胞の少なくとも１８％が、Ｇ０／Ｇ１期にある、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
以下の工程を含む、造血幹細胞に対する化合物の効果を決定する方法：
請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離されかつ増殖したヒト造血臍帯血幹細胞の濃縮された集団を提供する工程；
該造血幹細胞を、試験される化合物に接触させる工程；ならびに
該造血幹細胞に対する該化合物の効果を決定するために、該接触後に該造血幹細胞を解析する工程。