(57)【要約】      （修正有）【課題】ＭｅｔＡＰ２由来ペプチドに適した送達システムの提供。【解決手段】ペプチドを封入したリポソーム製剤であって，該ペプチドは，配列番号１〜配列番号６に記載のアミノ酸配列等を有し，かつ，該リポソームは表面が糖鎖ＮｅｕＡｃ−Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−，及び／又は，ＳＡ−Ｇａｌ−Ｇ１ｃ−で修飾されていることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドを封入したリポソームであって，該ペプチドは，配列番号１〜配列番号６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列，配列番号１〜配列番号６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列，配列番号１〜配列番号６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換，挿入，付加，又は欠失しているアミノ酸配列，及び配列番号１〜配列番号６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し，かつ，該リポソームは表面が糖鎖修飾されていることを特徴とする，リポソーム。
【請求項２】
前記ペプチドが，配列番号１〜配列番号６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するペプチドである，請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
前記ペプチドが，６０アミノ酸以下のアミノ酸からなる，請求項１又は請求項２に記載のリポソーム。
【請求項４】
前記ペプチドが，配列番号１〜配列番号６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるペプチドである，請求項１に記載のリポソーム。
【請求項５】
糖鎖修飾における糖鎖が，ＮｅｕＡｃ−Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−，及び／又は，ＳＡ−Ｇａｌ−Ｇ１ｃ−である，請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のリポソームを含有する医薬組成物。
【請求項７】
がんの治療剤，がん転移抑制剤，又はがん治療予後改善剤である，請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
がんが乳がんである，請求項７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，がんの転移を抑制するためのリポソーム製剤，及び該リポソーム製剤を利用したがん転移抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近の厚労省の統計によると、わが国のがんによる年間死亡者総数は３７万人に達し、これを日割り計算すると、毎日１０００人の同胞が癌死している勘定になる。悪性腫瘍（種々の臓器癌、肉腫、悪性リンパ腫、白血病等）の最大の特徴は転移で、転移の克服なくしてがんの制圧無しと云われる由縁であるが、あらゆる先人の努力にも拘わらず未だに、治療への大きな障壁となっている。Ｓ１００Ａ４は１０１個のアミノ酸からなる小さなＥＦハンドタイプのカルシウム結合タンパク質であり，がんの転移を促進する作用を有していることが知られている。本発明者らは，Ｓ１００Ａ４が，血管新生に関与する酵素タンパク質であるメチオニンアミノペプチダーゼ２（ＭｅｔＡＰ２）（非特許文献１）と結合し，その局在を変えることにより血管新生を促進することを報告している（非特許文献２）。また，Ｓ１００Ａ４に対するｓｉＲＮＡを用いた遺伝子ｓｉｌｅｎｃｉｎｇにより，毛細血管様管腔形成が阻害され，また腫瘍血管形成阻害を介して腫瘍増殖が阻害された（非特許文献３）。このｓｉｌｅｎｃｉｎｇ実験から明らかなようにＳ１００Ａ４は血管内皮細胞ＭＳＳ３１内では，それ単独でも血管新生にｗｏｒｋしており，腫瘍血管の増生を介して腫瘍の増殖を助けていることが示されている。Ｓ１００Ａ４の相棒として発見されたＭｅｔＡＰ２も，血管新生阻害剤Ｆｕｍａｇｉｌｌｉｎのｔａｒｇｅｔ分子と云う報告から血管新生に関与する蛋白質であると考えられている。従って両蛋白の結合コンプレックスは血管新生，腫瘍血管新生を介した腫瘍増大，転移促進にｗｏｒｋしていると考えられた。このように，Ｓ１００Ａ４とＭｅｔＡＰ２との相互作用が血管新生に関与することから，逆に当該相互作用を阻害することにより腫瘍血管形成を阻害し、更にその阻害を介した腫瘍の増殖抑制、いわゆる、がんの兵糧攻めが考えられた。
【０００３】
この目的達成のために，まず両蛋白の結合サイトを明らかにするべく，ＭｅｔＡＰ２側の結合ドメインをｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｕｌｌｄｏｗｎ法でｎａｒｒｏｗ  ｄｏｗｎし，ＭｅｔＡＰ２−（１７０−２２９）：６０ａａを得て，ＳＢＤと命名したが，本発明者らは２つの方法で両蛋白の結合コンプレックスの形成をプロックすることを考えた。一つはＳＢＤの過剰発現で，もう一つはＳＢＤのＮ端３９ａａ，ＭｅｔＡＰ２−（１７０−２０８）（ＮＢＤ）の導入である。その結果，両蛋白の結合コンプレックス形成は過剰発現との競合により解離し，代わってＳ１００Ａ／６０ａａコンプレックスがｒｅｐｌａｃｅし，ＭＳＳ３１の増殖が阻害された。一方，ＮＢＤの導入によるｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔではＭＳＳ３１細胞の血管新生阻害，ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅのＧ１−ａｒｒｅｓｔ，Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌへのＮＢＤ一回注射による腫瘍血管形成阻害，随伴する腫瘍の縮小が観察された。
【０００４】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに記載されているＭｅｔＡＰ２のＸ線Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙと照合すると，ＳＢＤ（６０ａａ）は，αＨｅｌｉｘ１−Ｌｏｏｐ−αＨｅｌｉｘ２−βＳｈｅｅｔ構造を示し，ＮＢＤ（３９ａａ）ペプチドはαＨｅｌｉｘ１−Ｌｏｏｐ−αＨｅｌｉｘ２  構造を示していることから，構造と結合活性との関連が注目された。ＣＢＤ（３８ａａ）はＳＢＤのβｓｈｅｅｔとαＨｅｌｉｘ２からなるペプチドＭｅｔＡＰ２−（１９２−２２９）であるがＳ１００Ａ４との結合能は欠落していた。構造と結合活性との相関の解析に決定的役割を演じたのはＳＰＲｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ａｓｓａｙで（非特許文献５），それによると，ＳＢＤ（＋），ＮＢＤ（＋），ＣＢＤ（−）で，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙ及びＦＲＥＴ  ａｎａｌｙｓｉｓの検証結果ともよく一致していた。Ｐ８もＰ９も、ＮＢＤのαＨｅｌｉｘ１−Ｌｏｏｐ−αＨｅｌｉｘ２の、より詳細な構造解析のために追加合成されたぺプチドで、Ｐ８はＮＢＤと同じαＨｅｌｉｘ１−Ｌｏｏｐ−αＨｅｌｉｘ２の構造をもち、ＮＢＤの両端（Ｎ端５ａａ，Ｃ端４ａａ）を９ａａ欠落した３０ａａであり、Ｐ９はＮＢＤのαＨｅｌｉｘ１の２２ａａ部分である。両者共ＳＰＲ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ａｓｓａｙでＳ１００Ａ４との結合は（−）であった。この追加ペプチドによって齎された重要な知見は、Ｐ８に関しては、１）ＮＢＤとＰ８との両Ｈｅｌｉｘ長の差の中にＳ１００Ａ４との結合に決定的に関与するａａの存在を想定させた事と、２）Ｐ９に関しては、その２２ａａと３８ａａのＣＢＤ（β−ｓｈｅｅｔ＋Ｈｅｌｉｘ２）を足すと、丁度ＳＢＤ（６０ａａ）の長さになるが、該ａｓｓａｙによるＳ１００Ａ４との結合活性は、ＳＢＤ（＋）に対して、ＣＢＤ（−）、Ｐ９（−）であった。このことは、ＳＢＤのＬｏｏｐがｃｕｔされると結合活性が消失すること、即ちＬｏｏｐの存在が活性維持に不可欠であること、とＨｅｌｉｘが単独では活性は（−）であることを示している。かくして、αＨｅｌｉｘ１−Ｌｏｏｐ−αＨｅｌｉｘ２の存在がＳ１００Ａ４との結合に必要なことが明らかとなった。
【０００５】
このように，ＮＤＢペプチドを利用したがん転移抑制への期待が高まる一方，これらのペプチドをそのまま血管内皮細胞に接触させても細胞内に取り込まれないという問題があった。種々検討した結果，本発明者らは，これまで，ＮＢＤペプチドとアテロコラーゲンとの複合体（ＮＢＤ−アテロコラーゲン複合体）を目的の血管内皮細胞に直接接触させ，又は，目的のがん組織内に直接注入することにより，ＮＤＢペプチドが血管内皮細胞に取り込まれることを報告している（非特許文献４）。当該実験において，ＮＤＢペプチドを取り込んだ血管内皮細胞に，著しい毛細血管様管腔形成阻害が観察された。また，同様にＮＢＤ−アテロコラーゲン複合体を用いてＮＤＢペプチドを導入したｄｉｒｅｃｔ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｓｓａｙ（ＤＩＶＡＡ  ａｓｓａｙ）においては，ＮＢＤはｂＦＧＦやＶＥＧＦの新規血管形成誘導能を強く阻害した。また，ＮＢＤ−アテロコラーゲン複合体を用いてＮＤＢペプチドを導入した異種移植がんモデル実験においては，ＮＢＤの単回腫瘍内投与は，腫瘍内血管形成を低下させ，腫瘍の増殖を抑制した。その際，ＮＢＤが，腫瘍細胞の増殖能に対する直接的な作用は認められなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ；２８２：１３２４−２７（１９９８）
【非特許文献２】Ｅｎｄｏ，Ｈら，ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；２７７（２９）：２６３９６−２６４０２（２００２）
【非特許文献３】Ｏｃｈｉｙａ，Ｔら，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ；１７：１７−２６（２０１４）
【非特許文献４】Ｏｃｈｉｙａ，Ｔら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；２：１５００８（２０１５）
【非特許文献５】Ｋａｔａｇｉｒｉ，Ｎら，Ｐ３１３８  ：  第７６回日本癌学会総会（２０１７）
【発明の概要】
【０００７】
このように，ＳＢＤ及びＮＢＤは血管内皮細胞に取り込まれることにより，血管形成阻害作用，及び腫瘍増殖抑制作用を有することが示されている一方，これらのペプチドはそのまま投与した場合には血管内皮細胞に取り込まれにくいという問題があった。アテロコラーゲンとペプチドとの複合体は，この問題を解決する一つの手段となりうることが示されたが，目的の血管内皮細胞に直接接触させ，又は，目的のがん組織内に直接注入する必要があり，医薬品として投与するには非常に煩雑で使いにくいという問題が残されていた。また，アテロコラーゲンを用いた場合にも血管内皮細胞への取り込み効率が十分ではないという問題もあった。
【０００８】
そこで，本発明者らは，ＳＢＤ及びＮＢＤに適した送達システムを探索すべく，種々の薬剤送達システムについて検討した。検討された送達システムとしては，例えば，ｓｉＭＰＬＥＴＭデリバリー試薬，Ｐｌａｉｎ  ＤＰＰＣ／ＣＨＯＬリポソーム，ＣＰＰ，ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ，アテロコラーゲン，及び本発明の糖鎖修飾リポソーム製剤が含まれる。このように種々の薬剤送達システムを用いて血管内皮細胞へのデリバリー効果を検討した結果，糖鎖修飾リポソーム製剤が他の送達システムと比較して圧倒的に効率よくペプチドを血管内皮細胞に送達できること（図４参照），また，がん局所投与ではなく血中全身性投与により転移抑制効果を奏することを見出し，本発明を完成させた。
【０００９】
本発明はかかる知見に基づきなされたものであり，よって，本発明は以下の発明に関する。
（１）  ペプチドを封入したリポソームであって，該ペプチドは，配列番号１〜配列番号６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列，配列番号１〜配列番号６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換，挿入，付加，又は欠失しているアミノ酸配列，及び配列番号１〜配列番号６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し，かつ，該リポソームは表面が糖鎖修飾されていることを特徴とする，リポソーム。
（２）  前記ペプチドが，配列番号１〜配列番号６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するペプチドである，（１）に記載のリポソーム。
（３）  前記ペプチドが，６０アミノ酸以下のアミノ酸からなる，（１）又は（２）に記載のリポソーム。
（４）  前記ペプチドが，配列番号１〜配列番号６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるペプチドである，（１）に記載のリポソーム。
（５）  糖鎖修飾における糖鎖が，ＮｅｕＡｃ−Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−，及び／又はＳＡ−Ｇａｌ−Ｇ１ｃ−である，（１）〜（４）のいずれか１項に記載のリポソーム。
（６）  （１）〜（５）のいずれか１項に記載のリポソームを含有する医薬組成物。
（７）  がんの治療剤，がん転移抑制剤，又はがん治療予後改善剤である，（６）に記載の医薬組成物。
（８）  がんが乳がんである，（７）に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は，ＳＢＤやＮＢＤなどのＭｅｔＡＰ２由来ペプチドに適した送達システムを提供することにより，がんの増殖抑制及び転移抑制を簡便かつ効果的に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ヒト乳がん細胞株の浸潤能に対する，ＮＢＤ（ＮＢＤとペプチド導入試薬ＢｉｏＰＯＲＴＥＲとの混合物）及びＣＢＤ（ＣＢＤとペプチド導入試薬ＢｉｏＰＯＲＴＥＲとの混合物）（コントロール）による抑制作用を示すグラフである。
【図２】動物へのヒト乳がん細胞の移植による転移抑制実験の結果を表すグラフである。ＮＢＤ封入糖鎖修飾リポソーム製剤を投与された動物では，肺への微小転移が顕著に抑制された。縦軸は肺への微小転移の数（個）を５視野の平均値として表す。
【図３】動物の肺を摘出し，外の微小転移をイメージングにより可視化した写真である。ＮＢＤ封入リポソームの投与によって，肺の微小転移が抑制された。
【図４】本発明のリポソーム以外のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）試薬による血管内皮細胞へのペプチド送達効果を検討した結果を示すグラフである。縦軸は，コントロール（ペプチドをそのまま添加）を１とした時の，各ＤＤＳ採用時のペプチドの送達量を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は，ペプチドを内包したリポソームに関する。本発明のリポソームが内包するペプチドは，配列番号１〜配列番号６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列，又は，配列番号１〜配列番号６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列への変異を含むアミノ酸配列を有する。ここで，配列番号１〜配列番号６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列への変異を含むアミノ酸配列とは，配列番号１〜配列番号６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列，配列番号１〜配列番号６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換，挿入，付加，又は欠失しているアミノ酸配列，及び配列番号１〜配列番号６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたアミノ酸配列を含む。
【００１３】
本明細書において，ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは，当業者に通常用いられるハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズすることを意味する。当業者に通常用いられるハイブリダイゼーション条件とは，例えば，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２）又は，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ等に記載の方法に従って決定することができる。例えば，当業者に通常用いられるハイブリダイゼーション条件は，６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ，０．０９Ｍ  クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ  ＮａＣｌ，０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ，その後４２℃で０．５×ＳＳＣで洗浄する条件であってもよい。また，アミノ酸配列の同一性は，例えば，ＢＬＡＳＴ，ＦＡＳＴＡ等の公知のプログラムを用いて決定することができる。また，置換，挿入，付加，又は欠失していてもよいアミノ酸の数としては，１〜１０個，１〜８個，１〜５個，１〜４個，１〜３個，１〜２個，又は１個であってもよい。
【００１４】
特に本発明者らの検討により，配列番号１に記載のアミノ酸配列（ＳＢＤ）（ＲＥＡＡＥＡＨＲＱＶＲＫＹＶＭＳＷＩＫＰＧＭＴＭＩＥＩＣＥＫＬＥＤＣＳＲＫＬＩＫＥＮＧＬＮＡＧＬＡＦＰＴＧＣＳＬＮＮＣＡ），配列番号２に記載のアミノ酸配列（ＮＢＤ）（ＲＥＡＡＥＡＨＲＱＶＲＫＹＶＭＳＷＩＫＰＧＭＴＭＩＥＩＣＥＫＬＥＤＣＳＲＫＬＩ），配列番号３に記載のアミノ酸配列（Ｐ８＋ＲＫＬＩ）（ＡＨＲＱＶＲＫＹＶＭＳＷＩＫＰＧＭＴＭＩＥＩＣＥＫＬＥＤＣＳＲＫＬＩ），配列番号４に記載のアミノ酸配列（Ｐ８＋３ａａ）（ＡＨＲＱＶＲＫＹＶＭＳＷＩＫＰＧＭＴＭＩＥＩＣＥＫＬＥＤＣＳＲＫＬ），配列番号５に記載のアミノ酸配列（Ｐ８＋２ａａ）（ＡＨＲＱＶＲＫＹＶＭＳＷＩＫＰＧＭＴＭＩＥＩＣＥＫＬＥＤＣＳＲＫ），及び配列番号６に記載のアミノ酸配列（Ｐ８＋１ａａ）（ＡＨＲＱＶＲＫＹＶＭＳＷＩＫＰＧＭＴＭＩＥＩＣＥＫＬＥＤＣＳＲ）のうち，ＡＨＲＱＶＲＫＹＶＭＳＷ（配列番号７）とＭＩＥＩＣＥＫＬＥＤＣＳＲＫＬＩ（配列番号８）がそれぞれ別のαヘリックス構造を形成すること，及びその間のＩＫＰＧＭＴ（配列番号９）がループとなって二つのαヘリックス構造を繋いでいることが明らかとなっている。配列番号１〜配列番号６に記載のアミノ酸配列における変異は，配列番号７及び／又は配列番号８に含まれるアミノ酸における変異（αヘリックス構造内の変異）と配列番号９に含まれるアミノ酸における変異（ループ構造における変異）のいずれか又は両方であってもよい。また，配列番号１〜配列番号６に記載のアミノ酸配列における変異が，配列番号７及び配列番号８に含まれるアミノ酸における変異の場合には，αヘリックス構造を維持できる変異であることが好ましく，配列番号９に含まれるアミノ酸における変異の場合には，ループ構造が維持できる変異であることが好ましい。
【００１５】
本発明のリポソームが内包するペプチドのアミノ酸の長さは，本発明の効果を奏する限り限定されるものではないが，好ましくは，６０アミノ酸以下，５０アミノ酸以下，４０アミノ酸以下，３９アミノ酸以下，又は３４アミノ酸以下とすることができる。また，本発明のリポソームが内包するペプチドのアミノ酸の長さは，本発明の効果を奏する限り限定されるものではないが，３０アミノ酸以上，３１アミノ酸以上，３２アミノ酸以上，３３アミノ酸以上，又は３４アミノ酸以上とすることができる。例えば，本発明のリポソームが内包するペプチドのアミノ酸の長さは，６０アミノ酸以下、３０アミノ酸以上とすることができ、好ましくは３９アミノ酸以下、３０アミノ酸以上である。
【００１６】
本明細書に記載のペプチドとして，好ましくは，配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ＳＢＤ），配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ＮＢＤ），配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（Ｐ８＋ＲＫＬＩ），配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（Ｐ８＋３ａａ），配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（Ｐ８＋２ａａ），及び配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（Ｐ８＋１ａａ）である。
【００１７】
本明細書において、「リポソーム」とは、内部に水性媒体を包含する脂質二重膜で形成された小胞体を意味し、脂質二重膜は単層であっても多層であってもよい。リポソームを構成する脂質は、親水基及び疎水基を備え、小胞体を構成することが可能な脂質であれば特に限定されないが、例えば、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、３β−［Ｎ−（ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、Ｎ−（トリメチルアンモニオエチル）カルバモイルコレステロール（ＴＣ−Ｃｈｏｌ）等のステロール類；ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）等のフォスファチジルエタノールアミン類；ジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）等のホスファチジルコリン類；ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）等のホスファチジルセリン類；ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）等のホスファチジン酸類等又は２以上のこれらの脂質の組み合わせを挙げることができる。
【００１８】
本発明のリポソームは表面が糖鎖修飾されている。糖鎖修飾は，血管内皮細胞への取り込みを促進する糖鎖の結合であれば特に限定されるものではないが，例えば，ＮｅｕＡｃ−Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ−（シアリルルイス  Ｘ：ｓＬｅＸ），及び／又は，ＳＡ−Ｇａｌ−Ｇ１ｃ−を挙げることができる。
【００１９】
別の態様において，本発明は前記リポソームを含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は，経口投与形態，又は注射剤，点滴，剤，点眼剤，点鼻剤，噴霧剤等の非経口投与形態で投与することができる。本発明の医薬組成物を哺乳動物等に投与する場合，錠剤，散剤，顆粒剤，シロップ剤等として経口投与してもよいし，又は，注射剤，点滴剤，点眼剤，点鼻剤，吸入剤として非経口的に投与してもよい。このような医薬組成物は，通常の薬学的に許容される担体を用いて，常法により製剤化することができる。経口用固形製剤を調製する場合は，主薬に賦形剤，更に必要に応じて，結合剤，崩壊剤，滑沢剤等を加えた後，常法により溶剤，顆粒剤，散剤，カプセル剤等とする。注射剤を調製する場合には，主薬に必要によりｐＨ調整剤，緩衝剤，安定化剤，可溶化剤等を添加し，常法により皮下又は静脈内用注射剤とすることができる。投与量は，目的の治療効果又は予防効果を発揮可能な量であれば特に制限されるものではないが，症状，年齢，性別，体重，投与形態等により異なるが，例えば成人に経口的に投与する場合には，各々通常１日のペプチド量として０．１−１０００ｍｇである。
【００２０】
好ましくは，本発明の医薬組成物はがん治療剤（がん増殖抑制剤を含む，以下同様），がん転移予防剤（がん転移抑制剤を含む，以下同様）又はがん治療予後改善剤である。本明細書において「がん」は，宿主生物にとって病原体となるような悪性形質転換を受けた細胞を意味する。原発性がん細胞（すなわち，悪性形質転換の部位の近くから得られた細胞）は，十分に確立された技術，特に組織学的検査により，非がん性細胞から容易に区別することができる。がんは，原発性がん細胞のみならず，転移がん細胞も含む。通常，固形腫瘍として現れるがんに言及する場合，「臨床的に検出可能な」腫瘍は，腫瘍塊に基づいて検出可能であり，例えば，ＣＡＴスキャン，ＭＲイメージング，Ｘ線，超音波，または触診，及び／又は患者から得られる試料中の１つ以上のがん特異的抗原の発現を検出可能な手順によって検出できる。がんとしては，これらに限定されるものではないが，肺がん，非小細胞肺がん，小細胞肺がん，非ホジキンリンパ腫，副腎皮質がん，ＡＩＤＳ関連がん，エイズ関連リンパ腫，小児小脳星細胞腫，小児大脳星細胞腫，基底細胞がん，皮膚がん（非黒色腫），胆道がん，肝外胆管がん，肝内胆管がん，膀胱がん，骨や関節のがん，骨肉腫と悪性線維組織球腫，脳がん，脳腫瘍，脳幹神経膠腫，小脳星細胞腫，神経膠腫，大脳星細胞腫／悪性神経膠腫，上衣腫，髄芽腫，テント上原始神経外胚葉性腫瘍，視経路および視床下部神経膠腫，頭頸部がん，転移性扁平上皮頸部がん，気管支腺腫／カルチノイド，カルチノイド腫瘍，神経系リンパ腫，中枢神経系のがん，中枢神経系リンパ腫，神経芽細胞腫，小児がん，Ｓｅｚｉａｒｙ症候群，頭蓋外胚細胞腫瘍，性腺外胚細胞腫瘍，肝外胆管がん，眼のがん，眼内黒色腫，網膜芽細胞腫，唾液腺がん，口腔がん，口腔空洞がん，口腔咽頭がん，口腔がん，舌のがん，食道がん，胃がん，消化管カルチノイド腫瘍，消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ），小腸がん，結腸がん，結腸直腸がん，直腸がん，肛門直腸がん，肛門がん，胚細胞腫瘍，肝細胞（肝臓）がん，ホジキンリンパ腫，喉頭がん，咽頭がん，下咽頭がん，鼻咽頭がん，副鼻腔および鼻腔がん，咽喉がん，膵島細胞腫瘍（内分泌膵臓），膵臓がん，副甲状腺がん，肝臓がん，胆嚢がん，虫垂がん，腎臓がん，尿道がん，腎盂と尿管の移行上皮がんおよび他の泌尿器のがん，扁平上皮がん，陰茎がん，精巣がん，胸腺腫，胸腺腫および胸腺がん，甲状腺がん，前立腺がん，卵巣がん，卵巣上皮がん，卵巣低悪性度腫瘍，卵巣胚細胞腫瘍，妊娠性絨毛腫瘍，乳がん，子宮がん，子宮肉腫，子宮頸がん，子宮内膜がん，子宮体がん，膣がん，外陰がん，およびウィルムス腫瘍，急性リンパ芽球性白血病，急性骨髄性白血病，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，多発性骨髄腫，慢性骨髄増殖性疾患，ヘアリー細胞白血病，原発性中枢神経系リンパ腫，慢性骨髄増殖性疾患，皮膚Ｔ細胞リンパ腫，リンパ系新生物，Ｗａｌｄｅｎｓｔｒａｍのマクログロブリン血症，髄芽腫，皮膚がん（非メラノーマ），皮膚がん（黒色腫），褐色細胞腫，メルケル細胞皮膚がん，中皮腫，悪性中皮腫，多発性内分泌腫瘍症候群，骨髄異形成症候群，骨髄異形成／骨髄増殖性疾患，松果体芽腫および下垂体腫瘍，形質細胞腫，胸膜肺芽細胞腫，網膜芽細胞腫，横紋筋肉腫，肉腫，ユーイング腫瘍のファミリー，軟組織肉腫，軟組織肉腫，菌状息肉腫，カポジ肉腫を含む。
【００２１】
がんの「転移」とは，原発性の腫瘍発生臓器とは直接接触していない臓器または他の身体部分において，原発性の腫瘍に由来して腫瘍が発生することをいう。転移には，原発性の腫瘍発生臓器とは直接接触していない臓器または他の身体部分における検出困難な量のがん細胞の存在である微小転移を含む。転移はまた，元の腫瘍部位からのがん細胞の脱離，がん細胞の身体の他の部分への移動および／または侵襲などのプロセスにおけるいくつかのステップとして定義することもできる。本発明の医薬組成物ががん転移抑制剤である場合，原発巣のがんとしては上述のいずれかのがんであってよく，また転移先の組織としては，脳，肝臓，副腎，骨，肺，及びリンパ節などが挙げられるが，これに限定されるものではない。
【００２２】
本明細書において「予後改善」とは，がん治療を受けた患者の治療後の状態（病態の経過）をよりよい状態とすることを意味し，例えば，がん再発リスクが減少すること，又は生存期間が延長することを意味してもよい。「予後改善剤」とは，当該薬剤を投与しなかった場合と比較して，当該薬剤を投与することにより，がん治療を受けた患者の治療後の状態をよりよい状態とする薬剤を意味し，例えば，がん再発リスクを減少させる薬剤，又は生存期間を延長させる薬剤ことを意味してもよい。
【００２３】
本発明は更に，前記ペプチドを内包したリポソームを含有する，がん治療（がん増殖抑制）又はがん転移予防（がん転移抑制）用又は予後改善用キットとすることができる。キットは，外箱，容器，希釈剤，濁液剤，及び／又は調製方法・投与方法に関する説明書を共に含めることができる。該キットにおいて，異なる構成成分が別々の容器中に包装され，一つのキットに含まれていてもよいし，あるいは，１種類以上の一部の構成成分（例えば，ペプチドを内包したリポソーム）のみがキットに含まれ，当該キットとは別に提供される残りの構成成分と共に使用されるように提供されていてもよい。また，好ましくは，キットの必要な構成成分は使用直前に混合される。
【００２４】
別の態様において，本発明は，がん治療剤，がん転移予防剤，又はがん治療予後改善剤を製造するための，上述のペプチドを封入したリポソームの使用を含む。また，本発明は，がんを治療するための（若しくはがんの増殖を抑制するための），がんの転移を予防（抑制）するための，又は，がん治療の予後を改善するための，上述のペプチドを封入したリポソームの使用を含む。更に，本発明は，それを必要とする患者に有効量の上述のペプチドを封入したリポソームを投与することを備える，がんの治療方法（若しくはがんの増殖抑制方法），がん転移の予防方法（抑制方法），又はがん治療後の予後を改善する方法を含む。
【実施例】
【００２５】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが，本発明はこれに限定されるものではない。なお，本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【００２６】
（実施例１）ＮＢＤ封入リポソームの調製
ＤＰＰＣ：コレステロール：ガングリオシド：ＤＣＰ：ＤＰＰＥを３０．８：３５．１：２５．１：４．４：４．５で混合し，総脂質量の１．３５倍のコール酸ナトリウムを加え，クロロホルム／メタノール（１：１（ｖ／ｖ））に溶解させた。エバポレーターで溶媒を除去し，真空乾燥させて脂質膜を得た。Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＴＡＰＳ）緩衝液を添加して脂質膜を水和した後，超音波処理してミセル懸濁液とした。ミセル懸濁液とＴＡＰＳ緩衝液に溶解したＮＢＤペプチド溶液を混合し，ＴＡＰＳ緩衝液による限外濾過にかけてペプチド内包リポソームを得た。
【００２７】
リポソーム溶液に架橋試薬ＢＳ３を加えて撹拌し，ＣＢＳ緩衝液（５０ｍＭ  炭酸水素ナトリウム／１５０ｍＭ  塩化ナトリウム，ｐＨ８．５）による限外濾過で洗浄後，Ｔｒｉｓを添加して更に撹拌し，ＴＡＰＳ緩衝液による限外濾過で洗浄した。ＮａＩＯ４を加えて撹拌後，１０ｍＭリン酸緩衝液による限外濾過で洗浄し，ＨＳＡ及びＮａＢＨ３ＣＮを添加して撹拌して，ＣＢＳ緩衝液による限外濾過で洗浄した。Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ），ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（ＤＴＳＳＰ）を加えて撹拌し，ＣＢＳ緩衝液による限外濾過で洗浄後，シリアルルイスＸ（ＳＬＸ）及びＴｒｉｓを加えて撹拌して，４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）緩衝液による限外濾過で洗浄した。０．２２μｍ濾過フィルターを用いてろ過してリポソーム溶液を得た。
【００２８】
（実施例２）ＮＢＤペプチドおよび対照となるＣＢＤペプチド（いずれもＢｉｏＰＯＲＴＥＲによるペプチド導入）の投与によるヒト乳がん細胞の浸潤能の抑制
８．０μｍポアサイズＰＥＴメンブレンのＢＤファルコン・セルカルチャー・インサートを均一なマトリゲル基底膜マトリックスでコートした，バイオコートＴＭマトリゲルＴＭ細胞浸潤チャンバー（ＣＯＩ社，コスモバイオ）に，ＮＢＤペプチド，対照となるＣＢＤペプチドでＢｉｏＰＯＲＴＥＲペプチド導入試薬により７２時間処理した転移能力の異なる２種のヒト乳がん細胞株（高転移株：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｌｕｃ−ＤＨ２ＬＮ；低転移：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｌｕｃ−Ｄ３Ｈ１）をそれぞれ５×１０４細胞数播種した。インキュベータで４８時間培養後にマトリゲルインサートの底面に浸潤した細胞をトルイジンブルー染色にて染色し，顕微鏡下でカウントした。
【００２９】
（実施例３）マウスへのヒト乳がん細胞の移植による転移抑制試験
２×１０６細胞／５０％マトリゲルのヒト乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ−Ｄ３Ｈ２ＬＮを，５０μｌ／匹で６週齢のＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤメスマウス乳房脂肪パッドへ注射することにより移植した。移植後，７日目と１４日目に，以下の容量で，ＮＢＤ封入リポソーム又はコントロールの空リポソームを尾静脈投与した。
ＮＢＤ封入リポソーム：脂質量２．９ｍｇ／ｍｌ，ペプチド量０．３７４ｍｇ／ｍｌ
空リポソーム：脂質量２．９ｍｇ／ｍｌ（脂質量がＮＢＤ封入リポソームと同じとなるよう希釈した）対照としては，空リポソームを同様に投与した。
緩衝液：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）
一匹あたりの投与量：２００μｌ（脂質量５８０μｇ，ペプチド量７４．８μｇ）
【００３０】
移植から６，１３，２０，２７，及び３４日後にｉｎ  ｖｉｖｏイメージング装置ＩＶＩＳにて，ルシフェラーゼ発光量を計測して腫瘍の大きさを測定した。また，移植から３４日後に解剖して，各臓器を摘出し，がんの微小転移を同じくルシフェラーゼ発光で計測した。肺の臓器以外に，対照リポソーム投与動物群でのルシフェラーゼ蛍光は認められなかったため，肺臓器に絞って，両群を計測，比較した。また，動物の肺を摘出し，外の微小転移をイメージングにより可視化した。動物は，各群４匹とした。
【００３１】
肺の微小転移の数を測定した結果を図２に示す。また，マウス肺における微小転移をイメージングにより可視化した結果を図３に示す。ＮＢＤ封入リポソーム製剤を投与されたマウスでは，対照の空リポソームと比較して，肺への微小転移が有意に抑制された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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