(57)【要約】【課題】ナノ粒子の作製プロセスにおける、貴金属ナノ粒子（ＰＭＮＰ）の正確なサイズを制御し、また生成された貴金属ナノコロイド（ＰＭＮＣ）がバイオコンジュゲーション反応に特異的になるように調整するためのその後の手順の際の、電解質のイオン濃度の制御し、ナノ粒子の沈殿がない安定に生じるＰＭＮＣを提供すること。【解決手段】ナノ粒子の形成は、液体中で、化学合成またはパルスレーザーアブレーションのいずれかによって達成することができる。液体におけるパルスレーザーアブレーション中に分散媒の伝導率を制御して、ナノ粒子の粒径を制御する。また、ナノ粒子の保存中、およびバイオコンジュゲーション反応を実施する直前に、伝導率を２５μＳ／ｃｍ以下の範囲に調整し、維持する。伝導率の制御は、ナノ粒子を、分散媒中の安定な非凝集コロイド懸濁液として維持するための重要なプロセスである。【選択図】図２
2019070199.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電解質を含む懸濁液中、０．０１ｎＭを超える粒子のモル濃度を有する貴金属ナノ粒子を含む
コロイド懸濁液であって、
前記貴金属ナノ粒子が、単一のピークを有する１〜１０００ｎｍの範囲のサイズ分布を有し、
前記懸濁液が、少なくとも１つの添加された既定の電解質以外に、ナノ粒子間の立体反発の原因となる該ナノ粒子の分散剤、安定剤、及び界面活性剤のいずれも含まず、
前記添加された既定の電解質が、周期表の１族のアルカリ金属及び周期表の２族のアルカリ土類金属からなる群から選択された１種の元素から形成される少なくとも１種のアニオンまたはカチオンであり、
前記懸濁液の電気伝導率は、前記既定の電解質の添加によって安定化されており、
前記規定の電解質の添加量は、前記コロイド懸濁液が、初期において２．０μＳ／ｃｍを超え、且つ２５μＳ／ｃｍ以下の範囲の初期電気伝導率を有するように選択され、
前記コロイド懸濁液の前記電気伝導率の経年による増大が１週間に１．５μＳ／ｃｍ未満であり、
前記コロイド懸濁液が保存容器に封入されており、
前記コロイド懸濁液と接触している前記保存容器の材料が、
ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、修飾ポリエチレンテレフタレートグリコールから構成される群の中から選択されたポリマーまたはプラスチックである、
コロイド懸濁液。
【請求項２】
前記コロイド懸濁液の前記初期電気伝導率が、２．０μＳ／ｃｍを超え、且つ１５μＳ／ｃｍ未満である、請求項１に記載のコロイド懸濁液。
【請求項３】
前記貴金属が、金、銀、銅、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、イリジウム、オスミウム、および前記貴金属の少なくとも１つを含む合金からなる群から選択される、請求項１に記載のコロイド懸濁液。
【請求項４】
前記貴金属ナノ粒子が、１０〜１００ｎｍの範囲の粒径を有する、請求項１に記載のコロイド懸濁液。
【請求項５】
前記電解質が、水および少なくとも１種の塩を含む、請求項１に記載のコロイド懸濁液。
【請求項６】
前記貴金属ナノ粒子の濃度が、０．１ｎＭを超える、請求項１に記載のコロイド懸濁液。
【請求項７】
前記貴金属が、周期表の１１族元素である、請求項１に記載のコロイド懸濁液。
【請求項８】
高い繰返し率のレーザーパルスが前記液体中に貴金属ナノ粒子（ＰＭＮＰ）を作製する液体パルスレーザーアブレーション（ＰＬＡＬ）法によって生成された、請求項１に記載のコロイド懸濁液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１３年１月２５日出願の米国仮出願第６１／７５６，６２２号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、貴金属ナノ粒子の水性懸濁液を生成する方法、特に生体分子を含む官能性リガンドにバイオコンジュゲーション（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）するための、金ナノ粒子の水性懸濁液を生成する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
貴金属ナノ粒子（ＰＭＮＰ）およびコロイドＰＭＮＰは、貴金属ナノコロイド（ＰＭＮＣ）とも呼ばれ、多種多様な生物学的および医学的適用におけるそれらの潜在的な使用について広く研究されている。ＰＭＮＣの適用として、造影剤、検知剤、遺伝子調節剤、標的薬物送達担体、または光応答性抗菌治療剤としてのＰＭＮＣの使用が挙げられる。これらの適用のほとんどでは、表面官能化とも呼ばれるＰＭＮＰの表面修飾が必要である。
【０００４】
過去には、ほとんどのＰＭＮＣは、イオン状態の貴金属の還元に基づくプロセス、またはリガンド分子との錯イオンの形成に基づくプロセスなどの化学合成プロセスによって生成されてきた。本来的に、化学合成では、貴金属の還元中の対となる反応の結果として形成される副生成物などの化学的副生成物が生じて、コロイド溶液の電解質にイオンが残留する。さらに、化学合成によって生成された現在市販されているＰＭＮＣは、ＰＭＮＰが凝集してコロイド溶液から沈殿するのを防止する安定化剤を含有する。安定化剤または化学的副生成物の残留イオンが存在すると、その後のバイオコンジュゲーションプロセス中にコロイド系が不安定性になるおそれがある。しかし、ナノ粒子の沈殿がない安定に生じるＰＭＮＣを得ることが、バイオ用途のためのＰＭＮＰの表面官能化にとって望ましい。
【０００５】
図１Ａは、ナノ粒子を作製するための従来技術の化学合成プロセスと、その後のバイオコンジュゲーションを示す流れ図である。示されている通り、プロセス１００は、工程１０２において化学合成法によって作製されたＰＭＮＰのコロイド溶液（すなわち、ＰＭＮＣ）から始まる。ＰＭＮＣの製造後、コロイド溶液は、その後のバイオコンジュゲーションプロセス（工程１０６）まで、キャップ付きガラス容器などの容器に一定期間保存される（工程１０４）。調製工程１０２は、市販のＰＭＮＣを購入することによって行うことができ、これらのＰＭＮＣは、通常、容器に入れて配送され、保存される。
【０００６】
リガンド交換反応は、ＰＭＮＣを含む様々な無機コロイドナノ粒子の表面を修飾するための強力な手法であることが見出されており、様々なコア材料および官能基を有する有機水溶性ナノ粒子を生成するために使用される。リガンド交換反応をＰＭＮＣに適用する最も困難な局面の１つは、実質的に完全なリガンド交換を達成すること、ならびに反応中のコロイド懸濁液の安定性を維持することである。
【０００７】
液体パルスレーザーアブレーション（ＰＬＡＬ）は、官能性ナノ粒子をバルク材料から直接合成するのに適した方法であり、完全にリガンドを含まないナノ粒子を提供することができる。共同所有の米国特許出願公開第２０１２／０２２５０２１号は、トップダウン製造方法によってＰＬＡＬ法を使用して、バルク金を標的材料として用いて、水中で安定な裸のコロイド金ナノ粒子を生成する方法を開示している。その結果から、５２０ナノメートル（ｎｍ）の金ナノコロイドの局在化表面プラズモン共鳴法の吸光度の変化をモニタすることによって特徴付けられた、チオール化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）による表面官能化中における金ナノ粒子のコロイド安定性が達成されることが実証された。
【０００８】
図１Ｂは、バイオコンジュゲーションのためのナノ粒子を作製するための、従来技術のＰＬＡＬ法を示す流れ図である。示されている通り、プロセス１０１の工程１１２では、貴金属（ＰＭ）標的材料および懸濁液が準備される。工程１１４では、ＰＭＮＰは、レーザーパルスの焦点をＰＭ標的材料に合わせることによって作製される。作製されたＰＭＮＰを懸濁液と合わせると、ＰＭＮＰを有するコロイド懸濁液が形成される。工程１１６では、コロイド懸濁液は、容器に一定期間（すなわち保存期間）保存され、次に、生体分子リガンドをＰＭＮＰと合わせるためのバイオコンジュゲーションプロセスで使用される（工程１１８）。
【０００９】
ＰＬＡＬ法におけるこのような近年の進歩にも関わらず、プロセス全体がバイオコンジュゲーション反応のためのＰＭＮＰの作製から考慮される場合、少なくとも２つの課題が残されている。１つは、ナノ粒子の作製プロセスにおける、ＰＭＮＰの正確なサイズ制御である。もう１つは、生成されたＰＭＮＣがバイオコンジュゲーション反応に特異的になるように調整するためのその後の手順の際の、電解質のイオン濃度の制御である。
【００１０】
Ｃ．Ｒｅｈｂｏｃｋら（２０１２年１０月３日に刊行されたＰｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．、「Ｓｉｚｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｌａｓｅｒ−ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ−ｆｒｅｅ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈｌｙ  ｄｉｌｕｔｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ」、ＤＯＩ：１０．１０３９／Ｃ２ＣＰ４２６４１Ｂ）は、ナノ粒径の制御プロセスを実証した。その実施形態には、ナノ秒のＰＬＡＬ手法およびサイズの制御プロセスと、高度に希釈された電解質を使用することによって、バイオコンジュゲーションのための金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）を作製することが記載されている。より具体的には、ＡｕＮＰが作製され、微量の塩を含有する水のキャリア蒸気に分散させられる。高度に希釈された電解質を用いるＰＬＡＬ法によって作製されるＡｕＮＰのサイズを制御するために、Ｃ．Ｒｅｈｂｏｃｋらは、公知の量の特定のイオンを水に導入することによって、ＡｕＮＰのサイズを制御できる可能性があることを実証した。直径１０ｎｍ以上のＡｕＮＰを生成するために、Ｃ．Ｒｅｈｂｏｃｋらは、イオン濃度が３０マイクロモル（μＭ）未満の範囲である場合には、生成されるＡｕＮＰのサイズがイオン濃度に応じて大きく変化するので、イオン濃度の正確な制御が必要であることを示している。このような低濃度範囲では、ナノ粒径に対する汚染などの、外部から導入される微量のイオンの作用はもはや無視できない。
【００１１】
誘導結合血漿質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）などの元素分析に基づく、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）およびラマン散乱法（ＲＳ）などの分子分析に基づく、電解質における個々のイオンを分析するための様々な方法がある。しかし、これらの測定のすべては、バイオコンジュゲーションのためのＰＭＮＣの能力を評価するために、バイオコンジュゲーションの前に毎回実施するにはあまりにも高価であり、時間がかかり過ぎる。
【００１２】
したがって、バイオコンジュゲーションのためのＰＭＮＣの能力を予測し、ＰＭＮＣが入れられる溶液の電解質のイオン濃度を制御することが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２／０２２５０２１号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｃ．Ｒｅｈｂｏｃｋら（２０１２年１０月３日に刊行されたＰｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．、「Ｓｉｚｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｌａｓｅｒ−ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ−ｆｒｅｅ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈｌｙ  ｄｉｌｕｔｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ」、ＤＯＩ：１０．１０３９／Ｃ２ＣＰ４２６４１Ｂ）
【非特許文献２】「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」Ｒ．Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ  ａｎｄ  Ｓ．Ｄａｔｔａ  ｆｒｏｍ  Ｎｅｗ  Ａｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、２７８〜２９１頁、（２００７年）
【非特許文献３】Ｓ．Ｊ．Ｈｕｒｓｔら、「Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ  ＤＮＡ  Ｌｏａｄｉｎｇ  ｏｎ  ａ  Ｒａｎｇｅ  ｏｆ  Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅｓ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６年、７８、８３１３〜８３１８頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
少なくとも１つの実施形態では、本発明は、電解質を含む液体中、０．０１ｎＭを超える濃度を有する貴金属ナノ粒子を含み、２５μＳ／ｃｍ以下の電気伝導率を有するコロイド懸濁液を含む。
【００１６】
少なくとも１つの実施形態では、本発明は、電気伝導率を有する液体を準備する工程と、液体の電気伝導率を２５μＳ／ｃｍ未満に調整する工程と、ナノ粒子を容器内に準備する工程と、ナノ粒子を、調整した液体と容器内で合わせて、少なくとも０．０１ｎＭのナノ粒子濃度を有するコロイド溶液を形成する工程とを含む、コロイド溶液を生成する方法を含む。
【００１７】
少なくとも１つの実施形態では、本発明は、貴金属ナノ粒子を準備する工程と、貴金属ナノ粒子を液体と合わせて、コロイド懸濁液を形成する工程と、コロイド懸濁液を精製して、コロイド溶液の総イオン濃度を２５μＳ／ｃｍ以下に低減する工程と、コロイド懸濁液の電気伝導率をモニタする工程と、必要に応じて、コロイド懸濁液の電気伝導率を２５μＳ／ｃｍ未満に調整する工程とを含む、コロイド懸濁液を生成する方法を含む。
【００１８】
少なくとも１つの実施形態では、本発明は、電気伝導率を有する液体の供給源；供給源から液体を受け取り、液体の電気伝導率を調整するように構成された、電気伝導率調整システム；入口で電気伝導率調整システムから電気伝導率が調整された液体を受け取るように構成され、出口でコロイド懸濁液を生成するように構成された容器；入口に近接して容器内に置かれた電気伝導率モニタリングデバイスを含む装置であって、電気伝導率調整システムが、電気伝導率モニタリングデバイスに応答して、液体の電気伝導率を２５μＳ／ｃｍ以下に維持するように構成されている装置を含む。
【００１９】
少なくとも１つの実施形態では、本発明は、バイオコンジュゲーションのためのコロイド懸濁液を生成する方法であって、アブレーション容器内に、貴金属を含む標的材料と、分散媒としての脱イオン水および電解質を含有する液体とを準備する工程と、１つまたは複数の伝導率モニタリングデバイスを用いて分散媒の電気伝導率をモニタし、必要に応じて、伝導率調整システムによって分散媒の電気伝導率を２５μＳ／ｃｍ以下になるように調整する工程と、レーザーパルスを標的材料に送り標的材料をアブレーションすることによって貴金属ナノ粒子を作製し、貴金属ナノ粒子のコロイド懸濁液を形成し、コロイド懸濁液が少なくとも０．０１ｎＭの貴金属ナノ粒子を含有するように調整する工程とを含む、方法を含む。
【００２０】
少なくとも１つの実施形態では、本発明は、分散媒中の貴金属ナノ粒子のコロイド懸濁液を受け取ることと、１つまたは複数の伝導率モニタリングデバイスを用いて前記コロイド懸濁液の電気伝導率をモニタし、必要に応じて、分散媒の電気伝導率を２５μＳ／ｃｍ以下になるように調整することと、前記コロイド懸濁液を生体分子と混合することによって、前記ナノ粒子を前記生体分子とをバイオコンジュゲーションし、それによって、前記生体分子の少なくとも一部を、前記貴金属ナノ粒子に付着させることとを含む、バイオコンジュゲーションの方法を含む。
【００２１】
記載の実施形態の他の態様、特徴および利点は、以下の詳細な説明、添付の特許請求の範囲および添付の図からより十分に明らかになり、これらにおける類似した参照番号は、類似または同一の要素を識別する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】バイオコンジュゲーション反応のためのナノ粒子を作製するための、従来技術の化学合成プロセスを示す従来技術の流れ図である。
【図１Ｂ】バイオコンジュゲーション反応のためのナノ粒子を作製するための、従来技術のＰＬＡＬ法を示す従来技術の流れ図である。
【図２】本発明の例示的な実施形態に係るＰＬＡＬ法を使用してバルク貴金属標的とバイオコンジュゲーションするためのＰＭＮＣを生成する、レーザーベースシステムの概略図である。
【図３】ナノ粒子の作製から、図２に示した本発明の例示的な実施形態に係るＰＬＡＬ法によるバイオコンジュゲーションまでのプロセスを示す流れ図である。
【図４】本発明の例示的な実施形態に係る市販の４つの異なる容器内で室温において保存した電解質を含有する脱イオン水における、電気伝導率の時間発展の一例を示す図である。
【図５Ａ】本発明の例示的な実施形態に係るＰＬＡＬ法によって作製した異なる伝導率の電解質におけるＡｕＮＰの粒径のプロットである。
【図５Ｂ】本発明の例示的な実施形態に係るＰＬＡＬ法によって伝導率２．７μＳ／ｃｍで作製したＡｕＮＰの粒径分布のプロットである。
【図６】本発明の例示的な実施形態に係るＰＬＡＬ法を使用してワイヤ形状の貴金属標的とバイオコンジュゲーションするためのＰＭＮＣを生成する、レーザーベースシステムの概略図である。
【図７】ナノ粒子の調製から、本発明の例示的な実施形態に係る化学的方法によるナノ粒子の合成に基づくバイオコンジュゲーションまでのプロセスを示す流れ図である。
【図８】図７に示した本発明の例示的な実施形態に係る化学的方法によって合成されたナノ粒子のための、遠心分離ベースの精製プロセス７０４を示す流れ図である。
【図９】本発明の例示的な実施形態に係る化学的方法によって合成された金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）のための、遠心分離ベースの精製プロセスを示すブロック図である。
【図１０】本発明の例示的な実施形態に係る遠心分離ベースの精製プロセスの前および後の、図９に示されている市販の化学合成されたＡｕＮＣのＵＶ−Ｖｉｓ吸光度（光学密度）のプロットである。
【図１１】本発明の例示的な実施形態に係る異なる濃度のＰＥＧ  ＭＷ２００００を含むＡｕＮＣ−ＰＣＳＮＣのＵＶ−Ｖｉｓスペクトルの発展のプロットである。
【図１２】本発明の例示的な実施形態に係るＰＬＡＬ法によって生成され、様々な電気伝導率およびレベルのｍＰＥＧ−ＳＨ  ＭＷ８５００のｍＰＥＧ−ＳＨ  ＭＷ８５００分子とコンジュゲートしたＡｕＮＣの組合せに関する実験結果を示すプロットである。
【図１３】本発明の例示的な実施形態に係るＰＬＡＬ法によって生成され、様々な電気伝導率およびレベルのｍＰＥＧ−ＳＨ  ＭＷ２００００のｍＰＥＧ−ＳＨ  ＭＷ２００００分子とコンジュゲートしたＡｕＮＣの組合せに関する実験結果を示すプロットである。
【図１４】本発明の例示的な実施形態に係る化学合成法によって生成され、様々な電気伝導率およびレベルのｍＰＥＧ−ＳＨ  ＭＷ８５００のｍＰＥＧ−ＳＨ  ＭＷ８５００分子とコンジュゲートしたＡｕＮＣの組合せに関する実験結果を示すプロットである。
【図１５】本発明の例示的な実施形態に係る化学合成法によって生成され、様々な電気伝導率およびレベルのｍＰＥＧ−ＳＨ  ＭＷ２００００のｍＰＥＧ−ＳＨ  ＭＷ２００００分子とコンジュゲートしたＡｕＮＣの組合せに関する実験結果を示すプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、例示的な実施形態を、図を参照して記載する。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「コロイド懸濁液」、「懸濁液」、「コロイド溶液」、「コロイド」および「ＰＭＮＣ」は、交換可能に使用され、ナノ粒子が分散媒に分散したコロイド系を指す。例えば、懸濁液は、金属ナノ粒子、脱イオン水および電解質を含有することができる。
【００２５】
本明細書で使用される場合、ナノ粒子が懸濁すべき媒体は、「分散媒」または簡単に「媒体」と呼ばれる。例えば、媒体は、脱イオン水および１つまたは複数の電解質を含有することができる。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「懸濁液」、「コロイド懸濁液」および「液体」は、ナノ粒子を含有していても含有していなくてもよい前述の媒体を指すために、交換可能に使用される。この３つの用語は、媒体中に粒子が存在するかしないかを特定する必要がない場合にのみ、交換可能に使用される。
【００２７】
貴金属（ＰＭ）として、金、銀、銅、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、イリジウム、オスミウム、および先に列挙した金属の少なくとも１つを含む合金が挙げられる。貴金属ナノ粒子（ＰＭＮＰ）は、貴金属微粒子または貴金属微粒子の凝集体を指す。ナノ粒子は、１ナノメートル〜１０００ナノメートルの範囲の直径を有する、ほぼ球形の形状であり得る。他のナノ粒子は、いくらか不規則な形状であってもよく、１ナノメートル〜１０００ナノメートルの範囲の平均直径を特徴とすることができ、または最長寸法１ナノメートル〜１０００ナノメートルの平均サイズを特徴とすることができる。先に列挙した貴金属、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、銅（Ｃｕ）、白金（Ｐｔ）、パラジウム（Ｐｄ）、ロジウム（Ｒｈ）、ルテニウム（Ｒｕ）、イリジウム（Ｉｒ）、およびオスミウム（Ｏｓ）の対応するナノ粒子は、これらの元素の原子記号を使用して、それぞれＡｕＮＰ、ＡｇＮＰ、ＣｕＮＰ、ＰｔＮＰ、ＰｄＮＰ、ＲｈＮＰ、ＲｕＮＰ、ＩｒＮＰ、およびＯｓＮＰと略される。貴金属ナノコロイド（ＰＭＮＣ）は、ＰＭＮＰのコロイド懸濁液を指す。それに応じて、先に列挙した貴金属、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、銅（Ｃｕ）、白金（Ｐｔ）、パラジウム（Ｐｄ）、ロジウム（Ｒｈ）、ルテニウム（Ｒｕ）、イリジウム（Ｉｒ）、およびオスミウム（Ｏｓ）のナノコロイドは、それぞれＡｕＮＣ、ＡｇＮＣ、ＣｕＮＣ、ＰｔＮＣ、ＰｄＮＣ、ＲｈＮＣ、ＲｕＮＣ、ＩｒＮＣ、およびＯｓＮＣと略される。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「表面官能化」は、官能性リガンド分子のナノ粒子の表面へのコンジュゲーションを指す。用語「バイオコンジュゲーション」は、生体分子リガンドによるナノ粒子の表面の「表面官能化」を指す。用語「生体分子リガンド」は、限定されるものではないが、少なくとも１つの生物学的に関連する官能基を有する、生物学的に活性な分子、生物学的に重要な分子、および生物学的に相溶性のある分子を含めた生物学的に関連するリガンド分子を指す。また「生体分子リガンド」は、本明細書および特許請求の範囲では、「生体分子」と略すこともできる。
【００２９】
本明細書では、用語「レーザービーム」および「パルスレーザービーム」は、交換可能に使用され、標的材料を照射するための少なくとも１つのパルスを供給する間欠的レーザー処理ビームを指し、（時間的）パルス幅、パルス持続時間、パルスエネルギー、ピーク電力、フルエンス、ビームサイズ、ビームプロファイル、スポット分布、またはスポットサイズなどのパラメータによってさらに特徴付けることができる。パルスレーザービームは、短い持続時間の爆発的パルスを含むことができる。
【００３０】
本明細書では、用語「安定な」は、生体分子がコンジュゲートしていない状態の対照試料に関する、バイオコンジュゲーション中のＵＶ−Ｖｉｓ吸光度スペクトルの変化に基づく本発明のコロイド系の安定性について定義する。Ａｕナノコロイドについては、安定性の判断基準には、以下の２つの条件の両方が満たされることが必要である。
【００３１】
ｉ）約１５〜２０ｎｍサイズのＡｕＮＰについて、典型的に約５２０ｎｍである表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の波長における光学的吸光度の変化が、対照吸光度に対してプラス／マイナス１５％以内にあること。
【００３２】
ｉｉ）（６５０ｎｍにおける吸光度）／（ＳＰＲにおける吸光度）の比＜０．２であること。
【００３３】
また、以下の詳細な説明では、一般に当技術分野で周知のいくつかの頭字語を利用する。典型的に、各頭字語が最初に出現した場合に定義を提示するが、便宜上、表１では、本願および特許請求の範囲で使用される頭字語および略語の一覧を、それらのそれぞれの定義と共に提示する。
【００３４】
【表１】
2019070199.tif 000003
【００３５】
便宜上、表２は、濃度、抵抗等の様々な単位を一覧にしたものである。
【００３６】
【表２】
2019070199.tif 000004
【００３７】
記載されている本発明の実施形態は、バイオコンジュゲーションのための貴金属ナノ粒子（ＰＭＮＰ）のコロイド懸濁液を生成する方法、およびその方法によって調製されたＰＭＮＰ懸濁液に関する。記載されている実施形態は、安定なバイオコンジュゲーションのためのコロイドＰＭＮＰを生成する２つの方法を開示している。第１の方法は、液体パルスレーザーアブレーション法（ＰＬＡＬ）であり、第２の方法は、化学合成されたナノコロイドの精製（ＰＣＳＮＣ）法である。記載されている実施形態では、ＰＭＮＰコロイド懸濁液の総イオン濃度を制御する目的で、数ある中でも、観測可能な物理的パラメータとしての電気伝導率またはその逆数である電気抵抗率を使用して、モニタ、制御または特定することを取り上げる。さらに、記載されている実施形態では、特にＰＬＡＬ法を用いて調製されたＰＭＮＣのＰＭＮＰサイズを、その後のバイオコンジュゲーションのために制御する。開示されているＰＬＡＬ法によるＰＭＮＣの製造は、ＰＭＮＰの作製のためにＰＬＡＬ法を実施する前またはその実施中に分散媒の伝導率をモニタすることを含み、また、所定のサイズのＰＭＮＰに伝導率の調整が必要な場合には、分散媒の伝導率を調整することを含む。その後同様に、伝導率は、プロセス管理限界以内に維持されるようにモニタし、制御することができ、したがって伝導率は、バイオコンジュゲーションが実施される時点またはそれに近い時点で、所望の範囲内になる。
【００３８】
ＰＭＮＰのコロイド懸濁液を作製するＰＬＡＬ法は、ＰＭＮＰが分散する分散媒の総イオン濃度を制御することによって、コロイド懸濁液の電気伝導率を調整し、作製されたＰＭＮＰの粒径を、特に約１０ｎｍ以上のサイズ範囲に調整する工程を含む。またＰＬＡＬ法は、ＰＭＮＰのサイズの変動を低減するために、サイズを改良する工程を含む。２つの工程を組み合わせることによって、通常の正規対数統計分布に類似のＰＭＮＰサイズ分布、ならびに第２のピーク、ショルダー、ウィング等の異常がない、十分に制御された狭いピークおよび平坦なテールが得られる。
【００３９】
また、ＰＭＮＰのコロイド懸濁液を作製する化学的方法は、ＰＭＮＰが分散する分散媒の総イオン濃度を制御することによって、コロイド懸濁液の電気伝導率を調整し、それによって、作製されたＰＭＮＰの粒径を、特に約１０ｎｍ以上のサイズ範囲に調整する工程を含む。
【００４０】
水中でイオン濃度を変化させる要因として、総イオン濃度に影響を及ぼす保存条件、例えば容器材料、および電解質を調製するために使用される電解質または脱イオン水の保存温度が挙げられる。他の要因として、溶存ガスの存在が挙げられる。
【００４１】
ＰＭＮＰの分散媒における、外部から導入されたイオンの効果を研究する。イオン濃度は、コロイド懸濁液の電気伝導率を測定することによって決定することができる。市販の異なる容器内で室温において保存した脱イオン水におけるコロイド懸濁液の電気伝導率の時間発展は、特に長い保存期間にわたって保存されたＰＭＮＣについて、著しく大きい変動を示す。
【００４２】
記載されている実施形態では、電気伝導率のモニタリングおよび調整は、ＰＭＮＰの作製時、保存期間中、バイオコンジュゲーション時もしくはそれに近い時間、または任意の適切な組合せにおいて実施することができる。このようなモニタリングまたは調整は、ＰＬＡＬ法または化学的方法を用いて実施される。電気伝導率のモニタリングおよび調整は、バイオコンジュゲーションにとって重要であるだけでなく、ＰＭＮＰが分散すべき分散媒中で実施されるとき、またはＰＬＡＬ配置でレーザーを用いる照射の前に、ＰＬＡＬ法によって生成されたＰＭＮＰの質も安定にする。
【００４３】
ＰＬＡＬによるＰＭＮＣの作製
図２は、本発明の例示的な実施形態に従ってＰＬＡＬ法を使用して、貴金属のバルク標的を使用してバイオコンジュゲーションするためのＰＭＮＣを生成するレーザーベースシステムの概略図である。示されている通り、ＰＬＡＬシステム２００は、レーザービーム２０２、レンズ２０４、ガイド機構２０６、バルク標的２０８、標的ホルダー２１０、懸濁液２１２、容器２１４、撹拌子２１６、作製されたＰＭＮＰ２１８、光学窓２２０、Ｏリング封止２２２、移動ステージ２２４、入口２２６、出口２２８、伝導率調整システム２３０、伝導率モニタリングデバイス２３２、伝導率モニタリングデバイス２３４、制御装置２３６、それぞれの伝導率モニタリングデバイス２３２および２３４からのフィードバックデータ２３８および２４０、ＰＭＮＣ容器２４４における収集および保存の前の懸濁液２１２の領域としてのコロイド懸濁液２４２を含む。
【００４４】
レーザービーム２０２は、パルスレーザー源（示さず）によって送られ、レンズ２０４によって焦点を合わされ、ガイド機構２０６によって誘導されて、標的２０８を照射することができる。
【００４５】
パルスレーザー源の出力波長は、中赤外から近赤外線範囲まで（例えば、約２０００ｎｍ〜７８０ｎｍ）、可視範囲まで（例えば、７００ｎｍ〜４００ｎｍ）または紫外範囲まで（例えば、３９５ｎｍ〜２６６ｎｍ）であり得る。
【００４６】
レーザービーム２０２は、好ましくは１ｋＨｚ〜１００ＭＨｚ、１０ｋＨｚ〜１ＭＨｚ、１００ｋＨｚ〜１０ＭＨｚ、または１００ｋＨｚ〜１ＭＨｚのパルス繰返し率を提供する。少なくとも１つの実施形態では、１００ＫＨｚ〜約１０ＭＨｚの範囲の高い繰返し率のパルスを利用して、ＰＭＮＰを作製することができる。
【００４７】
レーザービーム２０２は、１０ナノジュール（ｎＪ）〜２ミリジュール（ｍＪ）、より好ましくは５０ｎＪ〜３００マイクロジュール（ｎＪ）、または０．１〜１００μＪのパルスエネルギーを供給することができる。
【００４８】
レーザービーム２０２は、１０フェムト秒（ｆｓ）〜１００ナノ秒（ｎｓ）、１０ｆｓ〜１０ｎｓ、または３０ｆｓ〜１０ピコ秒（ｐｓ）の持続時間を有するパルスを供給することができる。
【００４９】
例えば１００ｆｓ未満の極度に短いパルス持続時間によって、望ましくない熱効果が低減されるが、パルス持続時間が数十フェムト秒に近い場合、または液体層が無視できない厚さである場合、液体（例えば、懸濁液２１２）における屈折率の波長分散に起因して、パルス持続時間の時間的広幅化が著しく大きくなる。このような分散は、技術の１つまたは組合せを使用して相殺することができる。分散補償のための追加の光学部品を光路に挿入すると、パルスの分散を相殺することができる。分散補償のための光学部品として、一対の光学的回折格子および一対の体積ブラッグ格子が挙げられるが、これらに限定されない。反対符号の分散を有する材料を挿入すると、パルスの分散を相殺することができる。限定されるものではないが、光ファイバ、フォトニック結晶ファイバ、フォトニックバンドギャップファイバ、非線形光ファイバ、およびファイバブラッグ格子を含む光導波路も、パルス持続時間の広幅化効果を相殺することができる。
【００５０】
例示的な一実施形態では、レーザービーム２０２を生じるパルスレーザー源は、１０４５ｎｍで操作され、１００ｋＨｚ〜約５ＭＨｚの調整可能なパルス繰返し率を有する市販の超高速ファイバレーザーであり得る。例えば、ＩＭＲＡ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．から利用可能なＤ−１０００超高速ファイバレーザーは、ＰＬＡＬシステム２００においてレーザーパルス源として利用することができる。Ｄ−１０００ＩＭＲＡ超高速ファイバレーザーは、パルス当たり最大１０μＪのパルスエネルギー、および１００ｋＨｚの繰返し率において７００フェムト秒（ｆｓ）未満のパルス幅を有するレーザーパルスを生じることができる。
【００５１】
レンズ２０４は、単焦点レンズであり、ｆ−シータレンズであってもよい。ガイド機構２０６は、２次元レーザー走査システムであってもよい。例えば、ガイド機構２０６は、ｆ−シータレンズ（すなわち、レンズ２０４）を備えたＸ−Ｙ検流計走査装置であってもよい。
【００５２】
例示的な一実施形態では、ガイド機構２０６のレーザー走査配置は、ポストオブジェクティブ走査システムとして構成される。他の適切な走査配置およびビーム／標的位置調節機構は、走査速度、位置決め精度、および他の変数に基づいて、ガイド機構２０６に合わせて設計を選択して、利用することができる。
【００５３】
別の例示的な実施形態では、ガイド機構２０６は、標的２０８の表面上でのレーザービーム２０２の高速走査または他の動作に合わせて構成された振動鏡であってもよい。振動鏡の振動周波数は、好ましくは１０Ｈｚ以上であり、角度振幅は１ｍｒａｄ以上であり、したがって、表面上の走査速度は、０．０１ｍ／ｓ以上になる。振動鏡は、圧電駆動型（ｐｉｅｚｏ−ｄｒｉｖｅｎ）鏡、検流計鏡、またはビーム動作に適した他の装置であってもよい。先に説明した通り、２個以上の鏡を使用して、対物レンズの像平面における２次元動作を達成することができる。好ましくは、像平面および標的２０８の標的表面は、完全に平行であり、より好ましくは、標的２０８へのレーザービーム２０２の入射角は、像平面におけるスポット位置とは独立に一定角である。別のレンズまたはレンズシステムを実行して、光路に沿ってレーザービーム２０２の焦点位置を調整することもできる。レンズ２０４は、ガイド機構２０６の前または後に置くことができる。
【００５４】
市販の貴金属標的として受け取ることができる標的２０８は、標的ホルダー２１０に搭載することができる。標的２０８は、平坦表面を有するバルク貴金属であってもよい。標的２０８および標的ホルダー２１０は、容器２１４内の懸濁液２１２の表面下数ミリメートル、好ましくは数ミリメートルから好ましくは１ｃｍ未満まで沈められる。
【００５５】
いくつかの実行では、成型工程または成形工程、例えば切断、圧縮、機械加工および後形成プロセスを、標的２０８のバルク貴金属に適用して、標的２０８の表面を平坦にすることができる。平坦表面を研磨してもよい。
【００５６】
代替の一実施形態では、標的２０８は、懸濁液２１２に完全に沈んでいなくてもよい。標的２０８の一部が懸濁液２１２と接触している限り、ＰＬＡＬ法によるレーザーアブレーションは、標的２０８および懸濁液２１２の界面で行うことができる。
【００５７】
標的ホルダー２１０は、ガラスなどの、光学的に耐久性がある化学的に不活性な材料から製造されていてもよいが、標的２０８が適所に安定して保持される限り、必ずしもそのような材料から製造されていなくてもよい。
【００５８】
懸濁液２１２は、水、メタノール、エタノール、アセトン、または電解質を含有する別の有機液体を含むことができ、ＰＭＮＣを作製するための分散媒として作用する。
【００５９】
懸濁液２１２は、電解質が溶解している脱イオン水または蒸留水であってもよく、懸濁液２１２の伝導率は、作製されたＰＭＮＰ２１８に必要なサイズに従って、２５μＳ／ｃｍ以下、１μＳ／ｃｍ〜１０μＳ／ｃｍ、または１．５μＳ／ｃｍ〜８μＳ／ｃｍの値に調整される。
【００６０】
溶解した電解質は、以下の少なくとも１種の元素を用いて形成されたアニオンおよびカチオンを含む、クエン酸塩などの有機塩、無機塩および錯イオン塩であり得る。
ａ）アルカリ金属（すなわち、周期表の１族元素）、例えばＮａおよびＫ、
ｂ）アルカリ土類金属（すなわち、周期表の２族元素）、例えばＭｇおよびＣａ、
ｃ）プニクトゲン（すなわち、周期表の１５族元素）、例えばＮおよびＰ、
ｄ）カルコゲン（すなわち、周期表の１６族元素）、例えばＯおよびＳ、
ｅ）ハロゲン（すなわち、周期表の１７族元素）、例えばＣＩ、ＢｒおよびＩ。
【００６１】
ＰＬＡＬシステム２００は、液体循環システム（示さず）を含む。懸濁液２１２の流れは、液体循環システムによって入口２２６から容器２１４に導入され、出口２２８へと流れる。好ましくは、懸濁液２１２は、１ｍｌ／ｓ以上の速度、より好ましくは１０ｍｌ／ｓ以上の速度で流れる。ここで、懸濁液２１２の流れ、標的２０８上のレーザービーム２０２の動作、またはこれらの両方を使用して、レーザー照射領域における蓄熱を制御することができる。
【００６２】
懸濁液２１２の液体層の厚さは、レーザービーム２０２のごくわずかな線形および非線形吸光度によって決定される。したがって、レーザービーム２０２の波長は、中赤外から近赤外範囲まで（例えば、約２０００ｎｍ〜７８０ｎｍ）、可視範囲まで（例えば、７００ｎｍ〜４００ｎｍ）または紫外範囲まで（例えば、３９５ｎｍ〜２６６ｎｍ）である。
【００６３】
作製されたＰＭＮＰ２１８がコロイド懸濁液の形態で存在する懸濁液２１２の一部は、図２に示されている領域２４２として例示される。コロイド懸濁液２４２は、容器２４４に収集され、保存される。循環システムでは、コロイド懸濁液２４２は、懸濁液２１２が出口２２８から入口２２６に移動するまでの任意の適切な位置にあり得る。
【００６４】
容器２１４は、光学窓２２０によって被覆される。Ｏリング封止２２２は、懸濁液２１２が漏出するのを防止するために、光学窓２２０と容器２１４の間に置かれる。容器２１４は、移動ステージ２２４上に固定されており、このステージは、示されている通り、容器２１４および懸濁液２１２の並進運動を生じる。容器２１４は、入口２２６および出口２２８を有しており、懸濁液２１２は、容器２１４を介して入口２２６から出口２２８まで流れ、それによって、作製されたＰＭＮＰ２１８は、運び出され、ＰＭＮＣ容器２４４に収集され、保存される。様々な実行において、懸濁液２１２の流れは、標的２０８の剥離された材料とガラス窓２２０の間の間隙を充填して、レーザーアブレーション中に生じた任意の気泡が光学窓２２０上に留らないようにするのに十分な程度急速であるべきである。
【００６５】
撹拌子２１６は、懸濁液２１２の流れを生じ、作製されたＰＭＮＰ２１８がレーザー照射領域に残留するのを防止する一助になる。また、懸濁液２１２の流れは、レーザー焦点体積を冷却する。
【００６６】
作製されたＰＭＮＰ２１８は、約１〜１０００ｎｍの範囲の粒径を有する。図５Ｂに示されているデータは、２．７μＳ／ｃｍで安定化した伝導率を有する懸濁媒体において、ＰＬＡＬ法によって作製されたＡｕＮＰの粒径分布を示している。ナノ粒子の大部分は、１０〜１００ｎｍのサイズを有していたことが分かる。
【００６７】
光学窓２２０は、容器２１４の一番上に置かれ、したがって、標的２０８とガラス窓２２０の間の間隙は、流れる懸濁液２１２で充填される。液体流は、作製されたＰＭＮＰ２１８を懸濁液２１２に均一に分布させることができる。容器２１４の一番上に光学窓２２０が存在しない場合、流れる懸濁液２１２の上面は、流れている間に上下することがあり、アブレーション標的２０８の上の懸濁液２１２の厚さに変動をもたらすおそれがある。これによって、レーザービーム２０２の光路が変化し、作製されたＰＭＮＰ２１８のより広範なサイズ分布を生じる場合がある。したがって、記載されている本発明の実施形態では、流れている懸濁液２１２の上の光学窓２２０は、アブレーション標的２０８の上に一定の深度の懸濁液２１２を維持するように導入される。さらに、循環システムがない場合、例えば図２に示されているレーザービーム２０２、移動ステージ２２４に対して垂直の、横振動の動作ＡＡ−ＢＢによって、懸濁液２１２が、標的２０８上のアブレーションスポットを横断して局所的に流れるおそれもある。
【００６８】
Ｏリング封止２２２は、容器を封止するために、容器２１４と光学窓２２０の間に置かれる。
【００６９】
移動ステージ２２４は、好ましくは、数Ｈｚの振動周波数、例えば約０．００１〜１００Ｈｚの範囲の振動周波数、および数ミリメートルの振幅を有する。また、振とう機（示さず）を使用して、液体循環を生じさせることができ、振とう機の循環動作によって、懸濁液２１２の循環動作も引き起こされる。光学窓２２０は、移動ステージ２２４または振とう機を使用するのに必須ではないと考えられる。しかし、光学窓２２０を使用しない場合、移動ステージ２２４または振とう機の使用により、標的２０８の上の液体層の厚さが均一でなくなり、作製されたＰＭＮＰ２１８のサイズ分布がより広範になるおそれがある。
【００７０】
容器２１４の入口２２６および出口２２８は、容器に、ある一定の距離で、例えばＰＭＮＰが作製されない領域に入口２２６が位置し、ＰＭＮＰが作製される領域に出口２２８が位置するように、容器の反対側に設置される。
【００７１】
伝導率調整システム２３０は、容器２１４の入口２２６近くの上流位置に置かれ、制御装置２３６によって制御される。伝導率モニタリングデバイス２３２は、伝導率調整システム２３０の前に、懸濁液２１２の上流伝導率をモニタするために使用される。伝導率モニタリングデバイス２３４は、ＰＭＮＰ２１８を作製する前に、容器２１４における懸濁液２１２の伝導率をモニタするために使用される。制御装置２３６は、伝導率モニタリングデバイス２３２および２３４から、それぞれフィードバックデータ２３８および２４０を受け取り、伝導率調整システム２３０を制御し、それによって、ＰＬＡＬによってＰＭＮＰ２１８を作製する直前に、懸濁液２１２において必要な伝導率を安定にすることができる。特定の実施形態では、懸濁液２１２と、ＰＭＮＣ容器２４４内に抽出されたコロイド懸濁液の両方の電気伝導率が、測定されるべきである。懸濁液とコロイド懸濁液のそれぞれの伝導率は、それぞれの所定の範囲内にあるべきである。好ましくは、コロイド懸濁液の伝導率は、２５μＳ／ｃｍ以下であり、懸濁液の伝導率は、好ましくは２０μＳ／ｃｍ未満の範囲である。電気伝導率の調整は、電気伝導率が所望の範囲未満である場合には、十分な量の電解質溶液を、液体またはコロイド懸濁液に添加することを含む。電気伝導率が所望の範囲を超える場合には、電気伝導率の調整は、十分な量の水または高度に希釈された電解質を、液体またはコロイド懸濁液に添加することを含む。図２に示されているシステムでは、システム２００は、伝導率調整システム２３０に接続されている、電解質溶液および高度に希釈された電解質溶液または水の供給口を含むことができるが、これらの供給口は、図を明確にするために示されていない。制御装置２３６の指示の下にある伝導率調整システム２３０は、適切な溶液を懸濁液２１２に添加して、伝導率を所望の範囲内に維持する。フィードバックデータ２３８および２４０により、適切な調整が確実になされる。較正工程では、図５Ａに示されているデータなどの、分散媒の伝導率と、粒径の制御に関して得られた粒径の相関データを使用することができる。コロイド懸濁液については、少なくとも２種類の伝導率データが有用であると提案できる。一方は、生成されたＰＭＮＣが保存されるべき容器における、伝導率増大の時間発展である。データが得られたら、ＰＭＮＣの寿命期間を推定することができる。もう１つの有用なタイプの伝導率データは、コンジュゲーションされる選択された生体分子のバイオコンジュゲーションに最適な範囲に関するデータである。較正データに従って伝導率を調整すると、バイオコンジュゲーションプロセスによって、プロセス中のコロイドの不安定性を誘発する危険性を最小限に抑えることができる。伝導率を調整する工程は、手動、半自動または自動プロセスであり得る。
【００７２】
伝導率モニタリングデバイス２３２、２３４は、市販の電気伝導率計測器または抵抗率計測器、例えば、市販の水伝導率計測器または水抵抗率計測器であってもよい。いくつかの実施形態では、伝導率モニタリングデバイス２３２、２３４のために使用される市販の電気伝導率計測器には、約１μＳ／ｃｍ〜５μＳ／ｃｍであるかまたはそれより良好な、伝導率の最小限の検出可能な変化が必要である。
【００７３】
当技術分野で周知の通り、抵抗率は、伝導率の逆数であり、伝導率モニタリングデバイス２３２、２３４では、１μＳ／ｃｍ〜５μＳ／ｃｍの範囲の伝導率は、１ＭΩｃｍ〜０．２ＭΩｃｍの範囲の抵抗率に変換される。抵抗率と伝導率の変換関係式は、抵抗率ＭΩｃｍ＝１／（伝導率μＳ／ｃｍ）である。以下、これらの等価パラメータは、伝導率（μＳ／ｃｍ）に統合される。いくつかの例示的な実施形態では、伝導率測定の分解能は、約１μＳ／ｃｍであるかまたはそれより良好である。
【００７４】
図３は、ナノ粒子の作製から、図２に示した本発明の例示的な実施形態に係るＰＬＡＬ法によるバイオコンジュゲーションまでのプロセスを示す流れ図である。示されている通り、ＰＬＡＬプロセス３００は、観測可能な物理的なパラメータとしての、懸濁液における電解質の電気伝導率または抵抗率を使用して、作製されたＰＭＮＰのサイズを正確に制御することを含む。ＰＬＡＬ法によって作製されたＰＭＮＣは、ＰＭＮＰを作製する前またはその作製中に、電解質の電気伝導率をモニタし、調整するプロセスを含む。伝導率のモニタリングまたは調整またはその両方は、ＰＭＮＰの作製後、バイオコンジュゲーション実施の時点に近い時点まで、またはその実施中に行うことができる。ＰＬＡＬ法は、ＰＭＮＰのサイズを正確に制御する方法を提供することができる。
【００７５】
示されている通り、工程３０２では、貴金属の標的２０８は、アブレーション標的のために受け取られ、またはそうでなければアブレーション標的のために準備される。例示的な一実施形態では、標的２０８は、容器２１４の一番上に取り外し可能な光学窓２２０を有する容器２１４内に位置する、バルク金標的を含む。工程３０２では、ＰＭＮＰが分散すべき媒体としての懸濁液２１２も準備される。標的２０８は、懸濁液２１２の表面下数ミリメートルから好ましくは１ｃｍ未満までの距離に沈んでいる。懸濁液２１２は、レーザービーム２０２の波長に対して透明な任意の液体であり得る。懸濁液２１２は、ナノ粒子が分散するための分散媒として作用する。ナノ粒子は、分散媒中にほぼ均一に分布することができる。懸濁液２１２として、水、メタノール、エタノール、アセトン、または電解質を含有する別の有機液体を挙げることができる。
【００７６】
一実施形態では、懸濁液２１２は、伝導率が２５μＳ／ｃｍ未満、好ましくは１μＳ／ｃｍ〜１０μＳ／ｃｍの範囲である、電解質を有する脱イオン水である。したがって、ＰＬＡＬシステム２００では、懸濁液２１２中、その場でＰＭＮＣを作製することができる。次に、形成されたＰＭＮＣは、懸濁液２１２に安定に懸濁し、したがって、コロイド金懸濁液を安定な状態で維持するための分散剤、安定剤、界面活性剤または他の材料は必要ない。ここで、懸濁液２１２のイオン濃度は、懸濁液２１２における電解質の量および電解質の希釈または濃度の係数に従って、予め推定することができる。
【００７７】
工程３０４では、ＰＭＮＰ２１８の作製前または作製中の懸濁液２１２の電気伝導率は、伝導率モニタリングデバイス２３２、２３４によってモニタされる。また、懸濁液２１２の電気伝導率は、ＰＭＮＰ２１８の所定のサイズに伝導率の調整が必要である場合には、伝導率調整システム２３０によって調整される。
【００７８】
前述の通り、水の総イオン濃度は、生成のための容器材料の表面、環境または保存、および大気への曝露などの外部の要因によって、必要な低濃度範囲が変化しやすくなる可能性がある。水は、容器に接触した後、最初に推定された懸濁液２１２のイオン量に加えて、さらなるイオンを含有する場合があり、それによって、高度に希釈された電解質中でＰＬＡＬ法を使用して作製されたＰＭＮＰ２１８のサイズが、大きな影響を受けるおそれがある。実際、水または電解質が任意の外部の接触を回避することは困難である。しかし、記載されている本発明の実施形態では、高度に希釈された電解質における総イオン濃度の不確実性は、レーザービーム２０２を標的２０８に照射する前に、高度に希釈された電解質の電気伝導率を測定することによって解決することができる。伝導率モニタリングデバイス２３２、２３４は、記載されている実施形態では、高度に希釈された電解質の電気伝導率または抵抗率を測定するために用いられる。例えば、伝導率モニタリングデバイス２３２は、高度に希釈された電解質が容器２１４内に入る前に、高度に希釈された電解質の電気伝導率または抵抗率を測定するために、入口２２６に置かれる。伝導率モニタリングデバイス２３４は、高度に希釈された電解質の電気伝導率または抵抗率を測定するために、容器２１４内の、ＰＭＮＰが作製されない入口２２６近くに置かれる。
【００７９】
Ｃ．Ｒｅｈｂｏｃｋらの図４Ａから、水または電解質における外部から導入されたイオンの作用は、イオン濃度が３０μＭ未満の範囲である場合、もはや無視できないことが知られている。したがって、イオン濃度が３０μＭ未満の範囲である場合、作製されたＡｕＮＰの粒径は変化する。
【００８０】
一般に、電解質の伝導率は、固体が塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）であると推定して、水に溶解した全固体（ＴＤＳ）に変換される。この変換により、１μＳ／ｃｍの伝導率は、ＮａＣｌ約０．６ｍｇ／水１ｋｇに相当し、これは約１０μＭのモル濃度である。変換を考慮に入れると、作製されたＡｕＮＰのサイズが、イオン濃度によって大きく変わる濃度未満である３０μＭのイオン濃度は、約３μＳ／ｃｍの伝導率に相当する。特に、イオン濃度１０μＭ以下では、Ｃ．Ｒｅｈｂｏｃｋらによれば、約１５ｎｍを超えるＡｕＮＰを生成する必要がある。先の通りに算出すると、１０μＭのＮａＣｌを導入することによって、電気伝導率が約１μＳ／ｃｍ増大する。それに比例して、１μＭのＮａＣｌを導入すると、伝導率の増大は、わずか０．１μＳ／ｃｍである。理論的に、極度に精製した水の電気伝導率は、２５℃で０．０５５μＳ／ｃｍまで低下し得ると予測された。しかし実際、大気中室温で保存され平衡化された脱イオン水の典型的な電気伝導率は、０．５μＳ／ｃｍ〜１．５μＳ／ｃｍの範囲であると認識されている。結果として、例えば、高度に希釈された電解質を、保存容器からアブレーション容器２１４に移し、その後コロイド懸濁液を保存するだけで、分散媒の初期イオン量が変わることがある。図４は、本発明の例示的な実施形態に係る市販の４つの異なる容器内で室温において保存した電解質を含有する脱イオン水における、電気伝導率の時間発展の一例を示す図である。容器は、３つの異なる透明なホウケイ酸ガラス瓶Ａ、ＢおよびＣ、ならびに透明なポリカーボネート瓶Ｄである。脱イオン水の初期電気伝導率は、水道水の場合には約１μＳ／ｃｍである。図４に示されている通り、脱イオン水の電気伝導率は、保存すると経時的に増大する。特にガラス瓶に入れると、第１週における電気伝導率の増大は、１．３μＳ／ｃｍ以上になる。第１週が経過した後に増大率は低減するが、電気伝導率は、２００日後も１３μＳ／ｃｍまで増大し続ける。データは、プラスチック瓶で保存すると、経時的な伝導率の増大が最も緩慢であり、最も小さいことを示している。したがって好ましくは、作製されたＰＭＮＣと接触する、図２に示されている容器２４４の材料は、ポリマーまたはプラスチック、例えばポリカーボネート、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、修飾ポリエチレンテレフタレートグリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）、またはポリスチレンである。このような容器材料を使用して、分散媒およびＰＭＮＣの電気伝導率をさらに安定にすべきである。
【００８１】
伝導率の調整工程３０４は、その場でまたは実験施設内で実施することができる。実験施設内で実施する場合の電気伝導率の制御に関して、外部のイオン源への懸濁液２１２のさらなる曝露が最小限に抑えられる場合、ナノ粒子の作製工程の直前に制御を実施することが望ましい場合がある。その場で実施する場合、例示的な一実施形態では、図２に示されているＰＬＡＬシステム２００には、伝導率モニタリングデバイス２３４を備えることができる。
【００８２】
懸濁液２１２の電気伝導率を増大するために、ＫＣ１およびＮａＯＨなどの先に列挙した電解質の溶液を、懸濁液２１２に添加してもよい。懸濁液２１２の電気伝導率を低減するために、電気伝導率が数μＳ／ｃｍ以下である微量の電解質を含有している可能性がある脱イオン水または蒸留水を、懸濁液２１２に添加してもよい。その場で実施する場合、例示的な一実施形態では、図２に示されているＰＬＡＬシステム２００は、上流位置に、制御装置２３６によって制御される伝導率調整システム２３０を有することができる。伝導率調整システム２３０の前に、別の伝導率モニタリングデバイス２３２を使用して、懸濁液２１２の上流電気伝導率をモニタすることができる。制御装置２３６は、伝導率モニタリングデバイス２３２および２３４からのフィードバックデータ２３８および２４０の一方または両方を受け取ると、ＰＬＡＬによるＰＭＮＰの作製が行われる前に懸濁液２１２において必要な伝導率が安定化されるように、伝導率調整システム２３０を制御する。
【００８３】
例示的な一実施形態では、システムは、伝導率調整の自動制御に合わせて構成することができる。第１の液体からの流れの制御は、伝導率を増大するように制御され、第２の液体からの流れの制御は、伝導率を低減するように制御され得る。制御装置２３６は、電気伝導率をモニタするためのプログラムを含み、較正情報に基づいて電気伝導率を調整するコンピュータ（示さず）に接続されていてもよい。代替の例示的な実施形態では、半自動またはコンピュータ支援の制御を実行することができる。
【００８４】
工程３０６では、ＰＭＮＰ２１８は、レーザービーム２０２を標的２０８に照射することによって作製される。作製されたＰＭＮＰ２１８を懸濁液２１２と合わせて、ＰＭＮＣ懸濁液２４２を形成する。
【００８５】
作製されたＰＭＮＰ２１８がコロイド懸濁液の形態で存在する懸濁液２１２の一部は、図２に示されている領域２４２として例示されている。コロイド懸濁液２４２は、工程３０６の成果として、容器２４４に収集され、保存される。コロイド懸濁液２４２の収集は、工程３０６の後または最中に行うことができる。循環システムでは、コロイド懸濁液２４２は、懸濁液２１２が入口２２６から出口２２８に移動するまでの任意の適切な位置にあり得る。
【００８６】
工程３０８では、作製されたＰＭＮＰまたはＰＭＮＣのサイズ分布が改良される。図５Ａは、本発明の例示的な実施形態に係るＰＬＡＬ法によって作製した異なる伝導率の電解質におけるＡｕＮＰの粒径のプロットである。分析のための超遠心分離法、例えばルイジアナ州プレイリービルのＣＰＳ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．製のＣＰＳ  Ｄｉｓｋ  ＣｅｎｔｒｉｆｕｇｅＤＣ２４０００  ＵＨＲを適用して、ＡｕＮＰのサイズを測定する。プロットしたサイズは、重量分布に基づいて測定された粒径のピークサイズである。示されている通り、粒径は、イオン濃度が低くなるにつれて大きくなる。しかし、３５ｎｍ以上の粒径のＡｕＮＰを生成することが可能であり、電解質の電気伝導率が適切に安定化される場合、好ましい粒径は、約１０ｎｍ〜約３０ｎｍの範囲である。Ｃ．Ｒｅｈｂｏｃｋらは、電気伝導率がおそらく少なくとも０．５μＳ／ｃｍ未満である場合に、１μＭのＮａＣｌ溶液において約３２ｎｍの最大サイズが生成されると報告した。しかし本発明は、図５Ａに示されている通り、１．５μＳ／ｃｍの伝導率を有する電解質溶液において、３２ｎｍのＡｕＮＰが生成され得ることを示す。結果として、電解質溶液に過剰量のイオンが存在することは、公知の量のＮａＣｌから推定された伝導率よりもはるかに高い電解質溶液の伝導率を生じることが示唆される。このことは、総イオン濃度が伝導率によって適切に推定される場合、イオン濃度および粒径に関するＲｅｈｂｏｃｋらの教示とは正反対である。
【００８７】
伝導率が安定化された電解質におけるＰＬＡＬ法によって、正確に制御されたサイズピークを有するサイズ（例えばナノ粒径）分布が生成されるが、サイズ分布は、まだ第２のピークまたはショルダー構造を含有している場合がある。望ましくないサイズのＰＭＮＰを有するこれらの粒子を除去するために、例えば、遠心分離をＰＭＮＣに適用することができる。より大きいサイズのＰＭＮＰを除去するためには、遠心分離処理されたＰＭＮＣから上清部分を得ることができる。多くのＰＭＮＰが、遠心管の底部近くに沈殿する。このようなＰＭＮＰの収集物は、ペレットと呼ばれる。より小さいサイズのＰＭＮＰを除去するためには、遠心分離処理されたＰＭＮＣからペレット部分を抽出することができ、次に、電解質溶液または脱イオン水を添加することによって再分散させることができる。
【００８８】
工程３１０では、作製されたＰＭＮＣは、バイオコンジュゲーションの前に、適切な保存条件下で保存容器に保存される。本発明に従ってＰＬＡＬ法によって作製されたＰＭＮＣは、２０μＳ／ｃｍ未満、ほとんどの場合には１μＳ／ｃｍ〜１０μＳ／ｃｍの範囲の電気伝導率を有する。しかし図４に示されている通り、脱イオン水単独の伝導率でも、水を保存容器に保存すると経時的に増大し続ける。したがって、作製されたＰＭＮＣに接触する保存容器（例えば、図２に示されている容器２４４）の材料は、好ましくは、ポリマーまたはプラスチック、例えばポリカーボネート、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、修飾ポリエチレンテレフタレートグリコール、またはポリスチレンである。
【００８９】
溶存ガスは、得られたコロイド懸濁液の伝導率に影響を及ぼす場合があり、したがって容器は、不活性ガス、例えば窒素または希ガス、例えばヘリウム、ネオン、アルゴンまたはクリプトン雰囲気下でパージし、封止することができる。
【００９０】
保存温度に関して、ＰＭＮＣは、好ましくは４０℃未満、好ましくは２５℃未満、より好ましくは１５℃未満、例えば冷蔵庫等で４℃の温度に維持される。
【００９１】
保存環境に関して、日光への曝露は、回避するべきである。好ましくは、ＰＭＮＣを入れた容器は、暗所に維持され、または暗色もしくは琥珀色の容器が使用される。
【００９２】
工程３１２では、保存されたＰＭＮＣ懸濁液の伝導率がモニタされ、調整される。バイオコンジュゲーションプロセスは、イオン濃度に対して非常に感度が高いため、ＰＭＮＣの製造に合わせて特に調整された電解質は、その後のバイオコンジュゲーションプロセスに対して効果を有する場合がある。さらに、保存容器材料からのイオンの浸出、保存条件、および保存温度も、得られたバイオコンジュゲーションのコロイド安定性に影響を及ぼすことがある。したがって、イオン伝導率は、保存容器での保存中、伝導率の実質的な変動を回避するのに十分頻繁にモニタされ、調整されることが好ましい。例えば、図４は、任意の必要な調整周期の時間枠を決定するために利用できる情報を提供している。保存期間中、伝導率は、好ましい上限である２５μＳ／ｃｍを超える場合がある。したがって、伝導率を、管理限界としての所定の範囲内、好ましくは２５μＳ／ｃｍ未満に維持するようにモニタし、調整することが望ましい。同様にこの手法では、バイオコンジュゲーション反応が実施される時点またはそれに近い時点で、任意の調整を容易に行うことができる。
【００９３】
以下に記載の通り、特に８５００を超える分子量を有する生体分子を用いる安定な制御可能なバイオコンジュゲーションのために、作製されたＰＭＮＣの伝導率は、限界の２５μＳ／ｃｍ未満に維持される必要がある。伝導率を、ＰＭＮＣの作製後約４カ月にわたって２５μＳ／ｃｍ未満に維持するために、伝導率の増大率は、１週間当たり１．５μＳ／ｃｍ以下、好ましくは１週間当たり１μＳ／ｃｍ以下、より好ましくは１週間当たり０．５μＳ／ｃｍ以下である必要がある。したがって、コロイド懸濁液の電気伝導率は、好ましくは２５μＳ／ｃｍ未満であり、約１μＳ／ｃｍ〜２２μＳ／ｃｍ、または約１．５μＳ／ｃｍ〜１５μＳ／ｃの範囲であり得る。伝導率の変化に関して、保存容器に保存されたコロイド懸濁液の電気伝導率の増大は、好ましくは１週間当たり１．５μＳ／ｃｍ未満、より好ましくは１週間当たり１μＳ／ｃｍ未満、またはさらにより好ましくは１週間当たり０．５μＳ／ｃｍ未満である。
【００９４】
工程３１４では、１５００を超える分子量を有する生体分子を用いるバイオコンジュゲーションを実施することができる。
【００９５】
プロセス３００の工程は、コロイド懸濁液が連続的に生成される連続プロセスであってもよい。プロセス３００の工程は、相互に作用しない（ｎｏｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ）工程がすべて一度に実施されるバッチプロセスであってもよい。
【００９６】
ＰＬＡＬ法の代替の一実施形態では、バルク標的材料は、図６に模式的に示されている通り、外部から液体に供給されるワイヤ形状の貴金属であり得る。示されている通り、レーザーベースシステム６００は、レーザービーム６０２、レンズ６０４、ガイド機構６０６、アブレーションのためのワイヤバルク標的６０８、懸濁液６１２、容器６１４、撹拌子６１６、作製されたＰＭＮＰ６１８、光学窓６２０、Ｏリング封止６２２、入口６２６、出口６２８、伝導率調整システム６３０、伝導率モニタリングデバイス６３２、６３４、および制御装置６３６を含む。図２の実施形態と図６の実施形態の差異は、バルク標的２０８が、ワイヤ形状のバルク標的６０８によって置きかえられ得るということである。ワイヤバルク標的６０８は、容器６１４に供給することができ、それによって、ワイヤバルク標的６０８のヘッドが、レーザービーム６０２の焦点体積内に維持される。したがって、レーザーベースシステム６００は、移動ステージを含まない。例示的な一実施形態では、アブレーションのためのワイヤバルク標的６０８は、一本の金ワイヤである。
【００９７】
化学的方法によるＰＭＮＣの作製
図７は、ナノ粒子の調製から、本発明の例示的な実施形態に係る化学的方法によるナノ粒子の合成に基づくバイオコンジュゲーションまでのプロセスを示す流れ図である。本明細書では、化学的方法は、化学合成されたナノコロイドの精製（ＰＣＳＮＣ）法を指す。
【００９８】
ＰＣＳＮＣプロセス７００は、図１Ａに示されている通り、工程７０２における公知の化学合成法によって、ＰＭＮＰまたはコロイド溶液（例えばＰＭＮＣ）を調製することから開始される。化学合成されたＰＭＮＣは、還元反応の残りの副生成物およびコロイド系を安定にするために使用される添加剤などの多量の電解質イオンを含有しているので、精製プロセスの後、工程７０４においてコロイド溶液の総イオン濃度を低減する。例示的な精製プロセスとして、遠心分離、透析、電気透析法、または限外濾過が挙げられるが、これらに限定されない。遠心分離に基づく精製プロセスを、以下に説明する。他の３つのプロセスは、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」Ｒ．Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ  ａｎｄ  Ｓ．Ｄａｔｔａ  ｆｒｏｍ  Ｎｅｗ  Ａｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、２７８〜２９１頁、（２００７年）に詳説されている。
【００９９】
図８は、図７の本発明の例示的な実施形態に係る遠心分離ベースの精製プロセス７０４を示す流れ図である。工程７０４２では、化学合成法によって調製されたＰＭＮＣ溶液は、遠心管に入れられる。次に、ＰＭＮＣ溶液は、遠心分離デバイス内で遠心分離処理される。適切な遠心分離条件、例えば２０分間で約８０００Ｇを選択することによって、ＰＭＮＰのほとんどは遠心管の底部に沈殿し、それを収集したら、先に説明した通り粒子の凝集なしに再分散することができる。工程７０４４では、コロイド溶液の電解質イオンの総量は、遠心分離処理されたＰＭＮＣ溶液の上清を除去することによって低減される。工程７０４６では、脱イオン水などの高度に希釈された電解質溶液を、遠心分離処理されたＰＭＮＣ溶液の沈殿物に添加し、溶液のＰＭＮＰの密度を、最初に調製したＰＭＮＣの密度に近い密度にする。最後に、沈殿したＰＭＮＰを、工程７０４８で溶液をボルテックスして再分散させる。脱イオン水によって希釈を行う場合、全手順による電解質の希釈率は、工程７０４８後の溶液の総体積と、工程７０４４で上清を除去した後に残る部分の体積の比によって、ほぼ定義される。例えば、脱イオン水０．９ｍｌが、工程７０４６で残りの溶液沈殿物０．１ｍｌに添加される場合、電解質は１０倍希釈される。
【０１００】
希釈率に応じて、遠心分離の全手順は、工程７０４８の後に、調製されたコロイド溶液として得られたＰＭＮＣで開始して反復することができ、それによって、図７の伝導率の調整およびモニタリング工程７０８で、必要な伝導率が得られる。
【０１０１】
図７に戻ると、精製プロセス７０４は、伝導率の調整工程７０８の一部であってもよいが、伝導率の微調整は、伝導率の値を低減するために精製プロセス７０４について既に列挙した方法（例えば、透析法、電気透析法、限外濾過法等）によって、または伝導率の値を増大するために電解質を添加することによって実施することができる。
【０１０２】
一般に、精製プロセス７０４は、コロイド溶液の伝導率を低減するが、伝導率の増大が必要な場合には、工程７０６中に、微量の電解質、例えばＮａＣｌおよびＫＣｌまたはそれらの電解質溶液をコロイド懸濁液に添加することによって行うことができる。
【０１０３】
例示的な一実施形態では、ＰＭＮＣは、金ナノコロイド（すなわち、ＡｕＮＣ）である。以下、図９に示されている通り、化学合成されたＡｕＮＣに遠心分離法を適用する、精製プロセス８００の例示的な実施形態を説明する。図９は、本発明の例示的な実施形態に係る化学的方法によって合成された金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）のための、遠心分離ベースの精製プロセスを示すブロック図である。
【０１０４】
図９の精製プロセス８００は、工程８０２でＡｕＮＣを準備することによって開始される。ＡｕＮＣは、カリフォルニア州レディングのＴｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．から市販されている、クエン酸塩還元法によって合成されるＡｕＮＣ溶液であってもよい。ＡｕＮＰの平均粒径は、２０．１ｎｍである。波長５２０ｎｍにおける光学密度は、１．０４である。塩化金の濃度は、０．０１％である。１ミリリットル（ｍｌ）当たりの粒子の数は、７．００×１０１１である。粒子のモル濃度は、１．１６×１０−９Ｍ（１．１６ｎＭ）である。１ｍｌ当たりの金の質量は、５６．６ｍｇである。元のＡｕＮＣ溶液で測定された伝導率（σ）は、３２７μＳ／ｃｍである。工程８０４では、合計３６ｍｌのＡｕＮＣ溶液を分割し、２４本の１．５ｍｌの遠心管に等量で移し、それを８０００Ｇで２０分間かけて遠心分離処理する。次に、遠心分離処理されたＡｕＮＣ溶液の上清１．４ｍｌを、各遠心管から除去する（工程８０６）。工程８０８では、各管は、伝導率約１μＳ／ｃｍを有する脱イオン水１．４ｍｌで再充填される。工程８１０では、すべての管をボルテックスミキサーに入れて、遠心分離処理されたＡｕＮＣ溶液の沈殿物を脱イオン水と混合し、それによって、電解質レベルが低下したＡｕＮＣの再分散コロイド溶液を生成する。
【０１０５】
次に、工程８０４から工程８１０への手順を２回反復する。最後に、２４本の管中の溶液のすべてをまとめて収集し、キャップ付きプラスチック瓶に保存する。精製プロセス８００の後、ＡｕＮＣ溶液は、２．５μＳ／ｃｍの伝導率を有しており、この伝導率は、初期伝導率３２７μＳ／ｃｍよりもはるかに低い。
【０１０６】
図１０は、本発明の例示的な実施形態に係る遠心分離ベースの精製プロセスの前および後の、図９に示されている市販の化学合成されたＡｕＮＣのＵＶ−Ｖｉｓ吸光度（光学密度）のプロットである。示されている通り、精製後に５２０ｎｍにおいて光学密度０．９６が得られたが、これは、収率９２．３％に相当する。１ｍｌ当たりの粒子の推定数は、６．４６×１０１１である。粒子のモル濃度は、１．０７×１０−９（１．０７ｎＭ）である。
【０１０７】
図７に戻ると、工程７０６でＰＭＮＣ懸濁液を保存容器に保存する。ここで、「保存」工程７０６は、図３に示されている通り、ＰＬＡＬ法によって作製されたＰＭＮＣの保存工程３１０に類似している。作製後約４カ月の保存期間にわたってＰＭＮＣ懸濁液の伝導率を２５μＳ／ｃｍ未満に維持するために、伝導率の増大率は、１週間当たり１．５μＳ／ｃｍ以下、好ましくは１週間当たり１μＳ／ｃｍ以下、より好ましくは１週間当たり０．５μＳ／ｃｍ以下である必要がある。
【０１０８】
製造されたＰＭＮＣ溶液と接触する保存容器の材料は、ＰＬＡＬ法によって作製されたＰＭＮＣの保存と同様に、好ましくは、ポリマーまたはプラスチック、例えばポリカーボネート、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、修飾ポリエチレンテレフタレートグリコールおよびポリスチレンである。
【０１０９】
ＰＭＮＣの保存温度は、少なくとも４０℃未満、好ましくは２５℃未満、最も好ましくは１０℃未満であるべきであり、例えば冷蔵庫で４℃に維持されるべきである。
【０１１０】
ＰＭＮＣの保存環境は、ＰＭＮＣが日光に曝露されるのを回避するべきである。好ましくは、ＰＭＮＣを入れた容器は、暗所に維持され、または容器は、ＰＭＮＣを外部光から遮断する。
【０１１１】
さらに保存容器は、得られたコロイド懸濁液の伝導率に対する溶存ガスの影響を最小限に抑えるために、不活性ガス、例えば窒素または希ガス、例えばヘリウム、ネオン、アルゴンまたはクリプトン雰囲気下でパージし、封止することができる。
【０１１２】
工程７０８では、保存されたコロイド懸濁液の伝導率は、モニタされ、調整される。ここで「モニタリングおよび調整」工程７０８は、図３に示される通り、ＰＬＡＬ法によって調製されたＰＭＮＣのモニタリングおよび調整工程３１２と同じである。
【０１１３】
工程７１０では、２００を超える分子量を有する生体分子を用いるバイオコンジュゲーションを実施することができる。ここで「バイオコンジュゲーション」工程７１０は、図３に示される通り、ＰＬＡＬ法によって調製されたＰＭＮＣのバイオコンジュゲーション工程３１２と同じである。
【０１１４】
以下に記載の通り、特に８５００以上の分子量を有する生体分子を用いる安定な制御可能なバイオコンジュゲーションのために、作製されたＰＭＮＣの伝導率は、２５μＳ／ｃｍ未満に維持されるべきである。
【０１１５】
バイオコンジュゲーションの実施例および実験結果
バイオコンジュゲーションは、ＰＭＮＰのコロイド懸濁液を、様々な化学官能基を含有する標的分子または生体分子と一緒に利用することによって実施され、その官能基の適切な特徴は、金ナノ粒子の表面に対する高親和性である。このような官能基の例として、チオール、アミンおよびホスフィンが挙げられる。ＰＭＮＰを含有する溶液および標的分子を混合し、標的分子がＰＭＮＰと結合するのに十分長い時間、適切な環境に静置する。反応プロセスは、例えば米国特許出願公開第２０１２／０２２５０２１号に記載の、動的光散乱によって測定される、ＰＭＮＰへの標的分子の結合が生じるときの粒径変化に従ってモニタすることができる。例えば、以下に説明する通り、室温に少なくとも２４時間置くことによって、特定の分子が、ＡｕＮＰの表面上にコンジュゲートされるのに十分長い時間を設けることができる。本発明の効果の少なくとも１つは、ＰＭＮＰの表面が一部官能化されると、バイオコンジュゲーションプロセス中のコロイドが安定性になることに見出された。バイオコンジュゲーションの有用な一例は、以下ＰＥＧ化と呼ばれるチオール化ＰＥＧとのコンジュゲーションである。ＰＭＮＰ、特にＡｕＮＰの形成、ならびにナノ粒子の表面修飾および／または官能化に関するいくつかの態様は、共同所有の米国特許出願公開第２０１２／０２２５０２１号（‘０２１）に開示されている。‘０２１に説明されている通り、金ナノ粒子の表面官能化に使用される分子の中でも、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはより具体的にはチオール化ポリエチレングリコール（ＳＨ−ＰＥＧ）は、広く使用されている、より重要な化学種の１つである。本明細書の他所で説明されている通り、多くの他のリガンドを使用して、一般にアプタマーに連結したチオール官能基における結合を介して、アプタマーを含む本発明のコロイド金調製物を官能化することができる。ＰＥＧは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−の繰返し単位からなる直鎖ポリマーである。分子量に応じて、同じ分子構造が、ポリ（エチレンオキシド）またはポリオキシエチレンとも呼ばれる。このポリマーは、多くの有機溶媒および水への可溶性が非常に高い。ＰＥＧ鎖は、ＡｕＮＰの表面上にコンジュゲートした後、エントロピーを最大限にするために、コイルに折り畳まれ、または対応する分子量のタンパク質よりもはるかに大きい直径を有する、マッシュルームのような立体配置に屈曲する傾向が高い。ＰＥＧによる金ナノ粒子の表面修飾は、しばしば「ＰＥＧ化（ＰＥＧｌａｔｉｏｎ）」と呼ばれ、本明細書および特許請求の範囲では、金ナノ粒子へのＰＥＧの結合は、ＰＥＧ化と呼ばれる。ＡｕＮＰ表面上のＰＥＧの層は、相互作用する金ナノ粒子間に立体障害をもたらすことによって、水性環境における金ナノ粒子を安定にする一助になり得るので、ペグ化金ナノ粒子は、高い塩濃度で、はるかにより安定である。さらに、ＰＥＧのエチレングリコール官能基は、水分子と十分に相互作用することが知られており、したがって、ＰＥＧ分子が金ナノ粒子の表面上にコンジュゲートする場合、ＰＥＧ鎖間の空間は、水分子を引き付けて、金ナノ粒子の周囲に水分子の親水性層を作り出すことができる。これにより、「粘性」が低い不活性な親水性表面が得られ、それによって、ペグ化金ナノ粒子が、それらの対象となる標的化部位に到達する前に、強化された透過および保持機構に基づく受動的標的化、または標的化部分を活用し、それらの所期の機能を果たす能動的標的化を介して、全身血液循環からヒト細網内皮系（ＲＥＳ）によって認識され、排除されるのが防止される。またＰＥＧ鎖は、本発明に従って調製されたペグ化ＡｕＮＰに、他の標的化機能またはシグナル伝達機能を付加するための反応性部位を提供する。これらの反応性部位は、検出機能およびシグナル伝達機能のための蛍光マーカーに結合するために使用することができる。現在、ＰＥＧ化は、金ナノ粒子の安定性および可溶性を強化し、循環時間を延長し、非特異的結合を最小限に抑え、対象となる部位への特異的標的化を改善するための非常に有効な手段になっているので、本発明に従って調製されたＡｕＮＰのＳＨ−ＰＥＧへのコンジュゲーションを、ＰＭＮＰの表面修飾の一例として、以下に開示する。
【０１１６】
しかし、コロイド懸濁液の不安定性を誘発することなくバイオコンジュゲーションを実施するためには、過剰量の標的分子が必要である。‘０２１に開示されているＰＥＧ化の場合、分子の総量が、ナノ粒子の利用可能な表面が分子によって占有される単層を形成するのに必要な量よりも少ないと、コロイド系が不安定になり、ナノ粒子の凝集もしくは沈殿、または容器の表面上へのナノ粒子の沈着が生じるおそれがある。ＡｕＮＰおよびＡｇＮＰなどの、可視光波長領域において表面プラズモン共鳴を有するＰＭＮＰの場合、凝集、沈殿または沈着が理由となり、コロイド溶液の光学的吸光度の低下または比色変化によって、不安定性の誘発が観測され得る。以下、本発明に従ってＰＬＡＬ法およびＰＣＳＮＣ法によって調製された２つのタイプのＡｕＮＣを使用して、効果を実証する。
【０１１７】
安定性試験では、約２０ｎｍのナノ粒径ピークを有する２つのタイプのＡｕＮＣであるＡｕＮＣ−ＰＬＡＬおよびＡｕＮＣ−ＰＣＳＮＣを、本発明に従って、それぞれＰＬＡＬ法およびＰＣＳＮＣ法によって調製した。ＡｕＮＣ−ＰＬＡＬおよびＡｕＮＣ−ＰＣＳＮＣの初期伝導率は、それぞれ２．３３μＳ／ｃｍおよび２．５４μＳ／ｃｍであった。ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルのサイズピーク吸光度は、ＡｕＮＣ−ＰＬＡＬでは５２０ｎｍにおいて１．００であり、ＡｕＮＣ−ＰＣＳＮＣでは５２０ｎｍにおいて０．９６であった。ＡｕＮＣ−ＰＬＡＬおよびＡｕＮＣ−ＰＣＳＮＣにおける推定モル粒子濃度は、それぞれ１．１１×１０−９（１．１１ｎＭ）および１．０７×１０−９（１．０７ｎＭ）であった。ＰＭＮＰのバイオコンジュゲーションの様々な実施形態では、コロイド懸濁液中のＰＭＮＰの濃度は、０．０１ｎＭ超または０．１ｎＭ超から１００ｎＭまでであってもよく、この値は、コロイド安定性に関する最大値であり、コロイド系においてＰＭＮＰが近接していることを示す。
【０１１８】
バイオコンジュゲーションプロセスに対する伝導率の著しく大きい影響を示す目的で、２種のＡｕＮＣのそれぞれを６つの試料に分割し、脱イオン水および２．５ｍＭのＮａＣｌ溶液の混合物を添加することによって、６つの試料の伝導率を調整して、６つの異なる値を得た。ここで脱イオン水は、１μＳ／ｃｍの伝導率を有し、ＮａＣｌ溶液は、３２０μＳ／ｃｍの伝導率を有する。
【０１１９】
ＰＥＧ化プロセスの前の最終的な伝導率を、表３に列挙する。
【０１２０】
【表３】
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【０１２１】
先に列挙した２４の試料のそれぞれを、０（対照）、２０ｎＭ、４０ｎＭおよび６０ｎＭの異なるチオール化ＰＥＧ濃度について、体積０．９ｍｌの４つの試料にさらに分割した。
【０１２２】
生体分子として、アラバマ州アラブのＬａｙｓａｎ  Ｂｉｏ製の、分子量（ＭＷ）８５００および２００００を有する２つのタイプのチオール化ＰＥＧ（ＳＨ−ＰＥＧ）を、さらなる精製なしに使用し、異なる濃度のＰＥＧを含むチオール化ＰＥＧ溶液０．１ｍｌを、ＡｕＮＣ試料に添加することによってＰＥＧ化を実施し、対照の０、２０ｎＭ、４０ｎＭおよび６０ｎＭのＰＥＧ濃度を有する総体積１ｍｌの混合溶液を得た。ＰＭＮＰのバイオコンジュゲーションの様々な実施形態では、官能性リガンド分子は、２００超または８５００超から約１，０００，０００までの分子量を有することができる。１，０００，０００の値は、抗体がＰＭＮＰに付着することを表す。
【０１２３】
ＰＥＧ濃度０（対照）、２０ｎＭ、４０ｎＭおよび６０ｎＭを有するＡｕＮＣ−ＰＬＡＬ試料の混合溶液における、チオール化ＰＥＧ分子の数とＡｕＮＰの数の最終的な比は、それぞれ０、２０：１、４０：１および６０：１であった。ＰＥＧ濃度０（対照）、２０ｎＭ、４０ｎＭおよび６０ｎＭを有するＡｕＮＣ−ＰＣＳＮＣ試料では、最終的な比は、それぞれ０、１９：１、３９：１および５８：１であった。
【０１２４】
ＰＥＧ化では、コロイド不安定性の痕跡は、ＰＥＧ分子の数とＡｕＮＰの数の比が１００未満：１になる場合に最も顕著になるので、０〜６０ｎＭの範囲のＰＥＧ濃度を選択した。
【０１２５】
混合した後、各溶液を、およそ２５℃の室温で少なくとも２４時間静置して、ＰＥＧ分子がＡｕ−チオール結合を介してＡｕＮＰの表面上にコンジュゲートするのに十分長い時間を設けた後、ＰＥＧ化の影響下でのＡｕナノ粒子のコロイド安定性の特徴を決定した。
【０１２６】
ＰＥＧ化の影響下でのコロイド安定性を、ＡｕＮＰの約５２０ｎｍの非常に強い局在化表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が存在することにより適切な技術であるとみなされているＵＶ−ＶＩＳ吸光分光を測定することによって評価した。ＰＥＧ化の影響下でのＡｕＮＰの凝集、沈殿または沈着は、約５２０ｎｍにおける吸光度の低下または約６５０ｎｍにおける吸光度の増大に反映される。
【０１２７】
図１１は、本発明の例示的な実施形態に係る異なる濃度のＰＥＧ  ＭＷ２００００を含むＡｕＮＣ−ＰＣＳＮＣのＵＶ−Ｖｉｓスペクトルのプロットである。示されている通り、異なる濃度のＰＥＧ  ＭＷ２００００を含むＡｕＮＣ−ＰＣＳＮＣについて、試料番号６のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルは、誘発されたコロイド不安定性の痕跡がスペクトルにおいてどのように認識され得るかを例示するために示される。
【０１２８】
ＰＥＧ  ＭＷ２００００分子を添加すると、６５０ｎｍにおける吸光度が増大すると共に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の波長約５２０ｎｍにおける吸光度が低下する。ＡｕＮＣでは、約６５０ｎｍにおける吸光度の増大は、コロイド不安定性の痕跡の１つであるＡｕＮＰの凝集に起因する。６５０ｎｍにおける吸光度とＳＰＲにおける吸光度の比が０．２に近い場合、誘発された不安定性は、コロイド溶液の変色によって視覚的に認識され得る。根本的な操作機構を理解するのに、本発明の実施形態を実施する必要はないが、コロイド系の安定化機構が、ナノ粒子上の表面電荷に起因して生じる電気的二重層の反発に基づくものから、ＰＥＧなどのリガンド分子とコンジュゲートすることによって達成される、立体反発に基づくものに変わる場合に、コロイド不安定性が時々誘発されることが見出された。反発機構の移行中、２つの異なる安定化機構のいずれもコロイド安定性を維持するのに十分でない、不安定領域が存在すると思われる。例えば、約１５〜２０ｎｍのサイズを有するＡｕＮＰによるＰＥＧ化では、この不安定領域は、ＰＥＧ分子の数とＡｕＮＰの数の比が、１００：１未満である場合に見出される。
【０１２９】
コロイド不安定性は、状況に応じて容器表面上にナノ粒子が沈殿し、またはナノ粒子が沈着して、コロイド溶液の吸光度が低減することと認識され得る。コロイド系の安定性は、伝導率の範囲に関連する。伝導率の範囲を定量的に特定するＡｕＮＣの安定性には、先の、誘発されたコロイド不安定性、すなわちナノ粒子の凝集、ナノ粒子の沈殿、および容器表面上へのナノ粒子の沈着の３つの痕跡が考慮に入れられる。ＰＥＧ濃度および伝導率と相関する、６５０ｎｍにおける吸光度とＳＰＲにおける吸光度の比を、２つのタイプのＡｕＮＣと２種類のＰＥＧ分子のすべての組合せについて図１２〜１５にまとめる。図１２および１３は、それぞれＰＥＧ  ＭＷ８５００およびＰＥＧ  ＭＷ２００００を含むＡｕＮＣ−ＰＬＡＬに関するものである。図１４および１５は、それぞれＰＥＧ  ＭＷ８５００およびＰＥＧ  ＭＷ２００００を含むＡｕＮＣ−ＰＣＳＮＣに関するものである。
【０１３０】
図１２は、本発明の例示的な実施形態に従って、ＰＬＡＬ法によって生成され、ｍＰＥＧ−ＳＨ  ＭＷ８５００分子とコンジュゲートしたＡｕＮＣの組合せに関する実験結果を示すプロットである。図１３は、本発明の例示的な実施形態に従って、ＰＬＡＬ法によって生成され、ｍＰＥＧ−ＳＨ  ＭＷ２００００分子とコンジュゲートしたＡｕＮＣの組合せに関する実験結果を示すプロットである。図１４は、本発明の例示的な実施形態に従って、化学合成法によって生成され、ｍＰＥＧ−ＳＨ  ＭＷ８５００分子とコンジュゲートしたＡｕＮＣの組合せに関する実験結果を示すプロットである。図１５は、本発明の例示的な実施形態に従って、化学合成法によって生成され、ｍＰＥＧ−ＳＨ  ＭＷ２００００分子とコンジュゲートしたＡｕＮＣの組合せに関する実験結果を示すプロットである。
【０１３１】
Ａｕナノコロイドでは、安定性の判断基準には、以下の２つの条件の両方が満たされることが必要である。
【０１３２】
ｉ）約１５〜２０ｎｍサイズのＡｕＮＰについて、典型的に約５２０ｎｍである表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の波長における光学的吸光度の変化が、対照吸光度に対してプラス／マイナス１５％以内にあること。
【０１３３】
ｉｉ）（６５０ｎｍにおける吸光度）／（ＳＰＲにおける吸光度）の比＜０．２であること。
【０１３４】
バイオコンジュゲーションに関して調査したすべての試料について、第１の要件ｉ）が満たされ、それによって、コロイド安定性の範囲が第２の要件ｉｉ）によって決定される。図１２〜図１５から、安定性の第２の要件が、ＰＥＧ  ＭＷ８５００に関するすべての測定点において満たされることが分かる。あらゆる場合、６５０ｎｍにおける吸光度とＳＰＲにおける吸光度の比は、０．２未満である。ＰＥＧ２００００を使用する試料について、ＰＥＧ  ＭＷ２００００では約２５μＳ／ｃｍの閾値伝導率であり、この値未満では、６５０ｎｍにおける吸光度とＳＰＲにおける吸光度の比は、ＡｕＮＣ−ＰＬＡＬまたはＡｕＮＣ−ＰＣＳＮＣに関わらず、すなわちＡｕＮＣの生成方法に関わらず、０．２未満に抑えられる。また、ＡｕＮＣが低い伝導率を有するほど、バイオコンジュゲーションプロセス中に安定であることが分かる。
【０１３５】
実験データから得た先の結果は、単に実証する目的で示されているが、バイオコンジュゲーションは、懸濁液の総イオン濃度に対して非常に感度が高く、コロイド溶液の伝導率をモニタし、調整することによって総イオン濃度を最適化することが有益であることが見出される。例えば、ＰＥＧの場合、生体分子が８５００を超える分子量を有するならば、より低い伝導率によって安定なバイオコンジュゲーションが得られることが予期される。
【０１３６】
本明細書に記載のデータでは、ＭＷ２００００分子のチオール化ＰＥＧまたはＭＷ８５００分子のチオール化ＰＥＧを使用したが、これらは単に例示目的で選択したものである。本発明は、チオール化ＰＥＧ分子と併用することに限定されない。本発明は、バイオコンジュゲーションに安定なコロイド金ナノ粒子を生成するので、チオール、ジスルフィド、ホスフィン、アミン、アジド、メチルまたはカルボキシル基などの、ＡｕＮＰ表面に結合できる基を有するどんなリガンドを使用することもできる。またこれによって、アプタマーおよび他の希少なまたは高価なリガンドの結合に使用するのに非常に魅力的な、本発明に従って調製されるコロイド金ナノ粒子が生成される。アプタマーは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）または当技術分野で公知のアミノ酸配列であり得る。また、本発明のコロイド金は、抗体、酵素、タンパク質、ペプチド、および希少なまたは高価な他のレポーターまたはリガンド材料に結合するために使用することができる。リガンドは、ＡｕＮＰにコンジュゲートすることができる基を有する、またはその基に結合している任意の蛍光性マーカーを含むことができる。さらに、異なる官能基および１つまたは複数の腕および２００〜１，０００，０００の範囲の分子量を有する、モノ官能性、ホモ官能性、およびヘテロ官能性ＰＥＧを含むあらゆる種類のＰＥＧ分子を、表面修飾反応に使用することもできる。ヘテロ官能性ＰＥＧを使用する場合、官能基、例えばカルボキシル基ＣＯＯＨおよびアミン基ＮＨ２を、他のリガンド上の他の官能基と結合するために使用することができた。本発明では、ＡｕＮＰおよび他のＰＭＮＰに付加される他の官能基について、広範な可能性が開かれる。使用できるＰＥＧ以外のポリマーの例として、炭化水素、ポリアクリルアミド、ポリデシルメタクリレート、ポリメタクリレート、ポリスチレン、デンドリマー分子、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、および他の有機鎖分子が挙げられる。先に列挙したポリマーの少なくとも１つを含むコポリマーも、範囲に含まれる。バイオコンジュゲーション中の安定性に関して、２５μＳ／ｃｍ未満などのより低い伝導率が有益であるが、いくつかのバイオコンジュゲーション反応では、異なる理由により、２５μＳ／ｃｍを超えるより高い伝導率が必要になる場合がある。例えば、Ｓ．Ｊ．Ｈｕｒｓｔら、「Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ  ＤＮＡ  Ｌｏａｄｉｎｇ  ｏｎ  ａ  Ｒａｎｇｅ  ｏｆ  Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅｓ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６年、７８、８３１３〜８３１８頁は、表面へのＤＮＡ負荷を強化するＮａＣｌの能力を利用することにより、ＡｕＮＣにおける塩濃度を増大して、ＡｕＮＰへのＤＮＡ負荷を最大限することを提示した。ＰＭＮＣの好ましい伝導率は、２５μＳ／ｃｍ未満であるにも関わらず、本発明の特定の実施形態では、ＰＭＮＣとＤＮＡなどの生体分子の混合前または混合中に、２５μＳ／ｃｍを超える伝導率の増大は、バイオコンジュゲーション反応の一部として有益となり得る。バイオコンジュゲ���ション中に安定性が維持される限り、特に、例えば最小量の生体分子とコンジュゲートすることによって達成され得る、コロイドが安定になるのに十分な安定化機構をナノ粒子が得た場合、伝導率は可能な限り高くてもよい。
【０１３７】
本発明の別の効果は、伝導率が十分に制御され、その増大が抑制されることにより、コロイドが長期間安定であるということである。初期電解質濃度は、調製したときに非常に低いとしても、関連するイオンが容器の表面から生じ続けるので、コロイド系は、保存中に経時的に不安定になる。図４に示されている通り、外部から導入された電解質の量の時間発展は、伝導率をモニタすることによって推定することができ、したがって、予め決定することができる。
【０１３８】
本発明の特定の態様、利点および新規な特徴は、本発明を概説する目的で本明細書に記載されている。しかし、このような利点は、必ずしもすべてが任意の特定の実施形態に従って達成され得るわけではないと理解される。したがって本発明は、本明細書に教示されまたは示唆され得る通り、１つまたは複数の利点を達成する方式で、必ずしも他の利点を達成することなく具現化または実施され得る。
【０１３９】
本明細書では、特定の実施形態のみを具体的に記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく数々の改変をそれらの実施形態に加え得ることが明らかになろう。さらに、記載されている実施形態は、互いに排他的ではなく、所望の設計目的を達成するために、例示的な一実施形態に関連して記載された要素、成分、材料または工程を、適切な方法で他の実施形態と組み合わせてもよいし、または他の実施形態から排除してもよい。
【０１４０】
用語「または」は、排他的な「または」ではなく、包括的な「または」を意味するものとする。すなわち、別段特定されない限り、または文脈から明らかでない限り、「ＸはＡまたはＢを用いる」とは、自然に存在するあらゆるすべての順序のいずれかを意味するものとする。すなわち、ＸがＡを用いる場合、ＸがＢを用いる場合、またはＸがＡおよびＢの両方を用いる場合、「ＸはＡまたはＢを用いる」は、これらの場合のいずれかを満たす。さらに、本願および添付の特許請求の範囲で使用される冠詞「ａ」および「ａｎ」は、別段特定されない限り、または文脈から単数形を対象とすることが明らかでない限り、一般に「１つまたは複数」を意味すると解釈されるべきである。
【０１４１】
さらに頭字語は、単に、本明細書および特許請求の範囲をさらに読み易くするために使用される。これらの頭字語は、使用されている用語の普遍性を減じるものではなく、特許請求の範囲を本明細書に記載の実施形態に限定すると解釈されるべきではないことに留意されたい。
【０１４２】
記載されている実施形態の性質を説明するために記載し、例示された部分の詳細、材料および配置に、以下の特許請求の範囲に記載の範囲から逸脱することなく様々な変更を加え得ることを、当業者はさらに理解されよう。
【０１４３】
さらなる実施例および実施形態
本発明は、以下の実施例の１つまたは複数に関し得る。
【０１４４】
１．電解質を含む液体中、０．０１ｎＭを超える濃度を有する貴金属ナノ粒子
を含み、
２５μＳ／ｃｍ以下の電気伝導率を有する、コロイド懸濁液。
【０１４５】
２．前記コロイド懸濁液の電気伝導率が、１．５μＳ／ｃｍを超え、１５μＳ／ｃｍ未満である、実施例１のコロイド懸濁液。
【０１４６】
３．前記コロイド懸濁液が保存容器に封入されており、前記コロイド懸濁液と接触している前記保存容器の材料が、ポリマーまたはプラスチックである、実施例１のコロイド懸濁液。
【０１４７】
４．前記ポリマーまたは前記プラスチックが、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、修飾ポリエチレンテレフタレートグリコール、およびポリスチレンである、実施例３のコロイド懸濁液。
【０１４８】
５．前記保存容器内の前記コロイド懸濁液の前記電気伝導率の増大が、１週間に１．５μＳ／ｃｍ未満である、実施例３のコロイド懸濁液。
【０１４９】
６．前記貴金属が、金、銀、銅、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、イリジウム、オスミウム、および前記貴金属の少なくとも１つを含む合金からなる群から選択される、実施例１のコロイド懸濁液。
【０１５０】
７．前記貴金属ナノ粒子が、約１〜１０００ｎｍの範囲の粒径を有する、実施例１のコロイド懸濁液。
【０１５１】
８．前記電解質が、水および少なくとも１種の塩を含む、実施例１のコロイド懸濁液。
【０１５２】
９．前記塩が、周期表の１族元素、周期表の２族元素、周期表の１５族元素、周期表の１６族元素、および周期表の１７族元素からなる群から選択される少なくとも１種の元素を含む、実施例８のコロイド懸濁液。
【０１５３】
１０．前記貴金属ナノ粒子の濃度が、０．１ｎＭを超える、実施例１のコロイド懸濁液。
【０１５４】
１１．電気伝導率を有する液体を準備する工程と、
前記液体の前記電気伝導率を所望の範囲内に調整する工程と、
ナノ粒子を容器内に準備する工程と、
前記ナノ粒子を、調整した前記液体と容器内で合わせて、少なくとも０．０１ｎＭのナノ粒子濃度を有するコロイド溶液を形成する工程と
を含む、コロイド溶液を生成する方法。
【０１５５】
１２．前記ナノ粒子を準備する工程が、
調整した前記液体を、内部に標的を入れた容器に移す工程と、
標的にレーザー光パルスを照射して、ナノ粒子を形成する工程と
を含む、実施例１１の方法。
【０１５６】
１３．前記液体の前記電気伝導率を調整する工程が、
前記電気伝導率が前記所望の範囲未満である場合には、電解質溶液を前記液体に添加する工程と、
前記電気伝導率が前記所望の範囲を超える場合には、水または高度に希釈された電解質を前記液体に添加する工程と
を含む、実施例１１の方法。
【０１５７】
１４．前記所望の範囲が、およそ１μＳ／ｃｍ〜およそ２５μＳ／ｃｍである、実施例１１の方法。
【０１５８】
１５．前記所望の範囲が、１μＳ／ｃｍ〜１０μＳ／ｃｍである、実施例１１の方法。
【０１５９】
１６．前記方法の工程が、連続プロセスである、実施例１１の方法。
【０１６０】
１７．前記方法の工程が、バッチプロセスである、実施例１１の方法。
【０１６１】
１８．コロイド懸濁液における貴金属ナノ粒子のサイズ分布を改良する工程をさらに含む、実施例１１の方法。
【０１６２】
１９．前記サイズ分布を改良する工程が、遠心分離によって実施される、実施例１８の方法。
【０１６３】
２０．コロイド懸濁液を保存容器内に保存する工程をさらに含む、実施例１１の方法。
【０１６４】
２１．保存された前記コロイド懸濁液の電気伝導率をモニタし、必要に応じて、電気伝導率が所望の範囲未満である場合には、電解質溶液を前記液体に添加し、前記電気伝導率が前記所望の範囲を超える場合には、水または高度に希釈された電解質を前記液体に添加する工程をさらに含む、実施例２０の方法。
【０１６５】
２２．前記標的が、バルク貴金属標的である、実施例１２の方法。
【０１６６】
２３．前記バルク貴金属標的の材料の少なくとも一部を、前記液体と接触させる、実施例２２の方法。
【０１６７】
２４．前記標的が、ワイヤ形状の貴金属標的である、実施例１２の方法。
【０１６８】
２５．前記ワイヤ形状の貴金属標的の材料の少なくとも一部を、前記液体と接触させる、実施例２４の方法。
【０１６９】
２６．貴金属ナノ粒子が、約１〜１０００ｎｍの範囲の粒径を有する、実施例１２の方法。
【０１７０】
２７．前記レーザー光パルスが、１ｋＨｚ〜１００ＭＨｚの範囲の繰返し率を有する、実施例１２の方法。
【０１７１】
２８．前記レーザー光パルスが、１０ｎＪ〜２ｍＪの範囲のパルスエネルギーを有する、実施例１２の方法。
【０１７２】
２９．前記レーザー光パルスが、紫外、可視または近赤外波長の波長中心を有する、実施例１２の方法。
【０１７３】
３０．前記レーザー光パルスが、１０ｆｓ〜１００ｎｓの範囲のパルス持続時間を有する、実施例１２の方法。
【０１７４】
３１．貴金属ナノ粒子を準備する工程と、
前記貴金属ナノ粒子を液体と合わせて、コロイド懸濁液を形成する工程と、
前記コロイド懸濁液を精製して、コロイド溶液の総イオン濃度を低減する工程と、
前記コロイド懸濁液の電気伝導率をモニタする工程と、
必要に応じて、前記コロイド懸濁液の前記電気伝導率を、所望の範囲内に調整する工程と
を含む、コロイド懸濁液を生成する方法。
【０１７５】
３２．前記コロイド懸濁液を精製する工程が、
前記コロイド懸濁液を遠心分離処理する工程と、
遠心分離処理された前記コロイド懸濁液の上清を除去して、電解質イオンの総量を低減する工程と、
高度に希釈された電解質溶液を、遠心分離処理された前記コロイド懸濁液の沈殿物に添加する工程と、
遠心分離処理されたコロイド前記懸濁液の沈殿物を、高度に希釈された電解質溶液と混合する工程と
を含む、実施例３１の方法。
【０１７６】
３３．混合する工程が、遠心分離処理された前記コロイド懸濁液を、高度に希釈された前記電解質溶液と共にボルテックスする工程を含む、実施例３２の方法。
【０１７７】
３４．前記コロイド懸濁液を保存容器に保存する工程をさらに含む、実施例３１の方法。
【０１７８】
３５．保存された前記コロイド懸濁液の電気伝導率をモニタし、必要に応じて、電気伝導率が所望の範囲未満である場合には、電解質溶液を液体に添加し、前記電気伝導率が前記所望の範囲を超える場合には、水または高度に希釈された電解質を前記液体に添加する工程をさらに含む、実施例３４の方法。
【０１７９】
３６．前記コロイド懸濁液を使用してバイオコンジュゲーションする工程をさらに含む、実施例３１の方法。
【０１８０】
３７．前記液体の前記電気伝導率を調整する工程が、
前記電気伝導率が所望の範囲未満である場合には、電解質溶液を前記液体に添加する工程と、
前記電気伝導率が前記所望の範囲を超える場合には、高度に希釈された電解質溶液または水を前記液体に添加する工程と
を含む、実施例３１の方法。
【０１８１】
３８．前記所望の範囲が、およそ１μＳ／ｃｍ〜およそ２５μＳ／ｃｍである、実施例３１の方法。
【０１８２】
３９．前記所望の範囲が、１μＳ／ｃｍ〜１０μＳ／ｃｍである、実施例３１の方法。
【０１８３】
４０．前記貴金属ナノ粒子が、約１〜１０００ｎｍの範囲の粒径を有する、実施例３４の方法。
【０１８４】
４１．電気伝導率を有する液体の供給源と、
前記供給源から前記液体を受け取り、前記液体の電気伝導率を調整するように構成された、電気伝導率調整システムと、
入口で前記電気伝導率調整システムから前記電気伝導率が調整された前記液体を受け取るように構成され、出口でコロイド懸濁液を生成するように構成された容器と、
入口に近接して前記容器内に置かれた電気伝導率モニタリングデバイスと
を含む装置であって、
前記電気伝導率調整システムが、前記電気伝導率モニタリングデバイスに応答して、前記液体の前記電気伝導率を所望の範囲内に維持するように構成されている、装置。
【０１８５】
４２．ナノ粒子の供給源をさらに含む装置であって、
前記容器が、ナノ粒子を受け取るように構成されており、前記ナノ粒子が、前記液体と合わさるとコロイド懸濁液を形成する、実施例４１の装置。
【０１８６】
４３．貴金属標的を受け取るように構成された、前記容器内に配置されたホルダーと、
標的に向けられたレーザー光パルスを生じるように構成されたレーザーシステムと
をさらに含む装置であって、
前記レーザー光パルスが、標的に当たるとナノ粒子を生成し、前記ナノ粒子が、前記液体と合わさるとコロイド懸濁液を形成する、実施例４１の装置。
【０１８７】
４４．前記貴金属標的が、平坦表面を有するバルク貴金属標的である、実施例４３のシステム。
【０１８８】
４５．前記バルク貴金属標的および前記ホルダーの両方が、前記液体の表面下に沈むように構成されている、実施例４４のシステム。
【０１８９】
４６．前記電気伝導率調整システムが、
前記液体の供給源と、前記電気伝導率調整システムの間に設置された、追加の電気伝導率モニタリングデバイスを含み、
前記追加の電気伝導率モニタリングデバイスにさらに応答する、実施例４１の装置。
【０１９０】
４７．前記容器が、並進運動を生じる移動ステージに取り付けられている、実施例４１のシステム。
【０１９１】
４８．前記容器内に配置された貴金属ワイヤと、
前記貴金属ワイヤに向けられたレーザー光パルスを生じるように構成されたレーザーシステムと
をさらに含むシステムであって、
前記貴金属ワイヤのヘッドが、前記レーザー光パルスの焦点体積内に維持され、
前記レーザー光パルスが、前記貴金属ワイヤに当たるとナノ粒子を生成し、前記ナノ粒子が、前記液体と合わさるとコロイド懸濁液を形成する、実施例４１のシステム。
【０１９２】
４９．前記レーザー光パルスの焦点を合わせるように構成されたレンズをさらに含む、実施例４３または４８のシステム。
【０１９３】
５０．前記レンズが、ｆ−シータレンズである、実施例４９のシステム。
【０１９４】
５１．前記レーザー光パルスを前記貴金属標的上に誘導するように構成されたガイド機構をさらに含む、実施例４３または４８のシステム。
【０１９５】
５２．前記ガイド機構が、１０Ｈｚ以上の振動周波数、および１ｍｒａｄ以上の角度振幅を有し、０．０１ｍ／ｓ以上の標的表面上のレーザービーム走査速度をもたらすように構成された振動鏡である、実施例５１のシステム。
【０１９６】
５３．前記振動鏡が、圧電駆動型鏡である、実施例５２のシステム。
【０１９７】
５４．前記振動鏡が、検流計鏡である、実施例５２のシステム。
【０１９８】
５５．前記電気伝導率モニタリングデバイスに近接して、前記容器内に配置された撹拌子をさらに含む、実施例４３または４８のシステム。
【０１９９】
５６．発生した前記レーザー光パルスが、１ｋＨｚ〜１００ＭＨｚの範囲の繰返し率を有する、実施例４３または４８のシステム。
【０２００】
５７．発生した前記レーザー光パルスが、１０ｎＪ〜２ｍＪの範囲のパルスエネルギーを有する、実施例４３または４８のシステム。
【０２０１】
５８．発生した前記レーザー光パルスが、紫外、可視または近赤外波長の波長中心を有する、実施例４３または４８のシステム。
【０２０２】
５９．発生した前記レーザー光パルスが、１０ｆｓ〜１００ｎｓの範囲のパルス持続時間を有する、実施例４３または４８のシステム。
【０２０３】
６０．前記貴金属ナノ粒子が、約１〜１０００ｎｍの範囲の粒径を有する、実施例４３または４８のシステム。
【０２０４】
６１．前記液体が、電解質を含む、実施例４３または４８のシステム。
【０２０５】
６２．前記電解質が、少なくとも１種の塩を含む、実施例６１のシステム。
【０２０６】
６３．前記塩が、周期表の１族元素、周期表の２族元素、周期表の１５族元素、周期表の１６族元素、および周期表の１７族元素からなる群から選択される少なくとも１種の元素を含む、実施例６２のシステム。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2019070199.tif 000017
【図１１】
2019070199.tif 000018
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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