(57)【要約】      （修正有）【課題】間葉系幹細胞から、比較的容易に脂肪に由来するエネルギーを燃焼させ、熱に変換する性質を有する、ＵＣＰ１発現細胞及び該細胞の培養方法の提供。【解決手段】間葉系幹細胞（２Ｓ）、線維芽細胞、脂肪組織を、一般的な培地（１−１）にＮ−シクロプロピル−５−（２−チエニル）−３−イソキサゾールカルボキシアミド（ＩＳＸ９）を添加した培地で培養することで得られるＵＣＰ１発現細胞。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−シクロプロピル−５−（２−チエニル）−３−イソキサゾールカルボキシアミドを添加した培地により培養することを特徴とするＵＣＰ１発現細胞の培養方法。
【請求項２】
前記培地は，血清培地或いは無血清培地である請求項１のＵＣＰ１発現細胞の培養方法。
【請求項３】
前記培地は，血清培地或いは無血清培地に対して，チアゾリジン系の薬剤，環状アデノシン１リン酸経路を活性化する薬剤，インドメタシン，インスリン，トリヨードサイロニン，又は，糖質コルチコイドを添加した培地である請求項１のＵＣＰ１発現細胞の培養方法。
【請求項４】
ＵＣＰ１発現細胞は脂肪由来の間葉系幹細胞から培養された請求項１〜３の何れか１項のＵＣＰ１発現細胞の培養方法。
【請求項５】
ＵＣＰ１発現細胞は線維芽細胞から培養された請求項１，２の何れかのＵＣＰ１発現細胞の培養方法。
【請求項６】
ＵＣＰ１発現細胞は脂肪組織から培養された請求項１，２の何れかのＵＣＰ１発現細胞の培養方法。
【請求項７】
培地にＮ−シクロプロピル−５−（２−チエニル）−３−イソキサゾールカルボキシアミドを添加して培養されたことを特徴とするＵＣＰ１発現細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，ＵＣＰ１発現細胞の培養技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪細胞には，エネルギーの蓄積に関わる白色脂肪細胞と，エネルギー消費に関わる褐色脂肪細胞があることが知られている。また，褐色脂肪細胞と同様に，エネルギー消費に関わるベージュ細胞という細胞も知られている。これらの細胞（褐色脂肪細胞及び／又はベージュ細胞：ＵＣＰ１発現細胞）は，たんぱく質「ＵＣＰ１」を発現するという特徴を有している。たんぱく質ＵＣＰ１は脂肪に由来するエネルギーを燃焼させ，熱に変換する性質を有する。自力で暖を取ることが出来ない新生児は多くの褐色脂肪を持つが，成長するにつれ褐色脂肪は減少する。
ここで，成人の体内にＵＣＰ１発現細胞が存在すれば，エネルギーが多く消費され，肥満及び肥満に伴うメタボリックシンドロームが改善することが期待されている。
【０００３】
成人の体内にＵＣＰ１発現細胞を存在させるために，各種幹細胞をＵＣＰ１発現細胞に分化誘導した後，移植する手法が考えられる。
公知技術としてｉＰＳ細胞から褐色脂肪細胞を誘導する技術が提案されている。しかし，未分化のｉＰＳ細胞は奇形腫（腫瘍）を生じる恐れがあり，未分化のｉＰＳ細胞を完全に除去する技術は現時点では確立していない。そのため，ｉＰＳ細胞を移植する手法は安全面で問題がある。
【０００４】
ここで，間葉系幹細胞は白色脂肪，骨，軟骨等に分化することが知られている。そして間葉系幹細胞は，移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の治療薬として静脈内に投与されており，歯茎内への移植の実績が多々存在する。そのため，間葉系幹細胞の投与或いは移植は，安全面で問題がないと考えられている。そのため，間葉系幹細胞から比較的容易に大量のＵＣＰ１発現細胞を培養することが出来れば，肥満及び肥満に伴うメタボリックシンドロームに対して画期的な治療を行うことが可能である。
しかし，現状では間葉系幹細胞から比較的容易に大量のＵＣＰ１発現細胞を培養する技術は提案されていない。
また，間葉系幹細胞以外の組織或いは細胞を培養してＵＣＰ１発現細胞を得ることも可能であるが，その様なＵＣＰＩ発現細胞を比較的容易且つ大量に培養する技術も未だに提案されていない。
【０００５】
その他の従来技術として，生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で熱発生性脂肪細胞を増加させる作用剤が提案されているが（特許文献１参照），係る従来技術は生体外部で熱発生性脂肪細胞を培養することを意図してはいない。
また，線維芽細胞を薬剤で処理してたんぱく質ＵＣＰ１の発現を誘導できることが報告されているが（非特許文献１参照），一般的な脂肪分化誘導培地に対して４種類の薬剤を添加するという煩雑な操作を必要とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１７−２０６５６５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔａｋｅｄａ  Ｙ，  Ｈａｒａｄａ  Ｙ，  Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  Ｔ  ＆  Ｄａｉ  Ｐ．  Ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｔｏ  ｂｒｏｗｎ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．  Ｓｃｉ．  Ｒｅｐ．  ７，  ４３０４（２０１７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上述した従来技術の問題点に鑑みて提案されたものであり，間葉系幹細胞或いはその他の細胞（或いは組織）から比較的容易に大量のＵＣＰ１発現細胞を培養することが出来るＵＣＰ１発現細胞の培養方法の提供を目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のＵＣＰ１発現細胞の培養方法は，Ｎ−シクロプロピル−５−（２−チエニル）−３−イソキサゾールカルボキシアミド（ＩＳＸ９）を添加した培地により培養することを特徴としている。
また本発明のＵＣＰ１発現細胞は，培地（１−１，１−２）にＮ−シクロプロピル−５−（２−チエニル）−３−イソキサゾールカルボキシアミド（ＩＳＸ９）を添加して培養されたことを特徴としている。
ここで，ＩＳＸ９における「（２−チエニル）」なる文言は，イソキサゾールに結合している炭素（Ｃ）から数えて２番目がＳ（硫黄）になっているチエニル基を意味している。
【００１０】
本発明において，前記培地（１−１，１−２）は，血清培地或いは無血清培地が好ましい。
また本発明において，前記培地（１−１）は，血清培地或いは無血清培地に対して，チアゾリジン系の薬剤（ロシグリタゾン等），環状アデノシン１リン酸（ｃＡＭＰ）経路を活性化する薬剤（フォルスコリン，３−イソブチル−１−メチルキサンチン等），インドメタシン，インスリン，トリヨードサイロニン，又は，糖質コルチコイドを添加した培地であるのが好ましい。
さらに，前記ＵＣＰ１発現細胞は脂肪由来の間葉系幹細胞であるのが好ましい。
そして，ＵＣＰ１発現細胞は線維芽細胞から培養されるのが好ましい。
或いは，ＵＣＰ１発現細胞は脂肪組織から培養されるのが好ましい。
【００１１】
本発明の実施に際して，チアゾリジン系の薬剤（ロシグリタゾン等）を添加した血清培地或いは無血清培地（１−１）で間葉系幹細胞（２Ｓ）を培養し，その後，当該培地（１−１）にＮ−シクロプロピル−５−（２−チエニル）−３−イソキサゾールカルボキシアミドを添加してさらに培養を続けることが出来る。
【発明の効果】
【００１２】
上述の構成を具備する本発明によれば，培地（１−１）に脂肪滴が形成され，脂肪分化培地による脂肪分化誘導が好適に行われる。
そして，形成された脂肪滴を有する細胞（脂肪細胞）において，たんぱく質ＵＣＰ１（脱共役たんぱく質の一つのパターン）の遺伝子発現が確認されるので，形成された脂肪細胞はＵＣＰ１発現細胞である。
すなわち本発明によれば，生体外で幹細胞からＵＣＰ１発現細胞を簡単に培養することが出来る。
【００１３】
ここで，培養に用いられる培地（１−１）は一般的な脂肪誘導培地であり，添加されるのはＮ−シクロプロピル−５−（２−チエニル）−３−イソキサゾールカルボキシアミド（ＩＳＸ９）のみであるため，複雑な操作或いは処理を必要とせず，簡易にＵＣＰ１発現細胞を培養することが出来る。
そして，生体外で簡易にＵＣＰ１発現細胞を培養出来る本発明によれば，大量のＵＣＰ１発現細胞を培養することが可能であり，培養されたＵＣＰ１発現細胞を移植することにより，安全且つ効果的に，肥満及び肥満に伴うメタボリックシンドロームに対して治療することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の第１実施形態を示す説明図である。
【図２】本発明の第１実施形態における手順を示すフローチャートである。
【図３】実験例１の結果を示す図である。
【図４】実験例２の結果を示す図である。
【図５】本発明の第２実施形態を示す説明図である。
【図６】本発明の第２実施形態における手順を示すフローチャートである。
【図７】実験例３の結果を示す図である。
【図８】実験例４の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
最初に図１，図２を参照して，本発明の第１実施形態について説明する。
本発明の第１実施形態に係る培養方法の概要を示す図１において，培養容器３には一般的な脂肪誘導培地１−１が充填されており，当該培地で被験者Ｍから採取した細胞２（例えば脂肪細胞）を処理設備１０で処理して得た脂肪由来の幹細胞２Ｓが培養される。ここで，幹細胞２Ｓは脂肪由来の間葉系幹細胞に限定される訳ではなく，臍帯由来の間葉系幹細胞，歯髄由来の間葉系幹細胞，骨髄由来の間葉系幹細胞，羊膜由来の間葉系幹細胞，胎盤由来の間葉系幹細胞であっても良い。
一般的な脂肪誘導培地１−１は，血清培地或いは無血清培地に対して，チアゾリジン系の薬剤（ロシグリタゾン等），環状アデノシン１リン酸（ｃＡＭＰ）経路を活性化する薬剤（フォルスコリン，３−イソブチル−１−メチルキサンチン等），インドメタシン，インスリン，トリヨードサイロニン，又は，糖質コルチコイドの何れかを添加した培地を採用することが出来る。
【００１６】
図示の実施形態において，脂肪誘導培地１−１で間葉系幹細胞２Ｓを培養する工程で，薬剤Ｎ−シクロプロピル−５−（２−チエニル）−３−イソキサゾールカルボキシアミド（ＩＳＸ９）を添加する。上述した様に，ＩＳＸ９における「（２−チエニル）」なる文言は，イソキサゾールに結合しているＣ（炭素）から数えて２番目がＳ（硫黄）になっているチエニル基を意味している。
培養した間葉系幹細胞２Ｓにおいて脂肪滴を有する細胞（脂肪細胞）が生成されたか否か，すなわち，培養されたのが脂肪細胞に分化した細胞であるか否かを確認するため，例えば顕微鏡４が使用される。もちろん，顕微鏡以外の手段であって，脂肪への分化を確認する機能を有する機器であれば，顕微鏡４に代えて使用することができる。
【００１７】
第１実施形態において，間葉系幹細胞を培養して分化した脂肪細胞がＵＣＰ１発現細胞であるか否かは，脱共役たんぱく質の一つのパターンであるＵＣＰ１の遺伝子発現の有無で判定する。そして，たんぱく質ＵＣＰ１の発現の有無を確認する手法として，定量ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いている。図１において，符号ＰＣＲは，定量ＰＣＲ法を実施する設備を示す。
定量ＰＣＲ法の前処理として，脂肪細胞よりＲＮＡ（リボ核酸）を抽出し，逆転写反応（すなわち，ＲＮＡからｃＤＮＡの合成）を行ってｃＤＮＡ（ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ）の調製を行う。得られたｃＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行い，たんぱく質ＵＣＰ１の発現量を測定する。
上述した様に，たんぱく質ＵＣＰ１はＵＣＰ１発現細胞にのみ存在し，白色脂肪細胞には存在しない。そしてＵＣＰ１発現細胞は，たんぱく質ＵＣＰ１の作用によって脂肪を燃焼させ，高効率で熱に変換する（エネルギーを消費する）。
定量ＰＣＲ法による確認の結果，間葉系幹細胞を培養して形成された脂肪滴を有する細胞（脂肪細胞）において，ＵＣＰ１の遺伝子発現が確認されれば，形成された脂肪細胞はＵＣＰ１発現細胞であることが確認できる。
なお，定量ＰＣＲ法を実施する設備に代えて，ウエスタンブロット法を実施する設備，或いは免疫染色法を実施する設備を用いても良い。
【００１８】
次に，主として図２を参照して，第１実施形態で間葉系幹細胞を培養してたんぱく質ＵＣＰ１の遺伝子発現を確認する手順について説明する。
図２において，ステップＳ１では，培養容器３に一般的な脂肪誘導培地１−１を充填する。そしてステップＳ２に進む。
ステップＳ２では，一般的な脂肪誘導培地１−１が充填された培養容器３に，脂肪由来の間葉系幹細胞２Ｓを供給する。この幹細胞２Ｓは，処理設備１０において，被験者から採取した脂肪細胞２に公知の処理を施すことにより得られる。図示の実施形態では，幹細胞２Ｓは脂肪由来の間葉系幹細胞であるが，上述した様にその他の幹細胞であっても良い。
【００１９】
ステップＳ３では，前記培地１−１で間葉系幹細胞２Ｓを培養する。培養する際に，培地１−１に，薬剤ＩＳＸ９（Ｎ−シクロプロピル−５−（２−チエニル）−３−イソキサゾールカルボキシアミド）を添加する。
ステップ３における培養期間と薬剤ＩＳＸ９を添加する時期については，例えば，培地１−１で間葉系幹細胞２Ｓを１週間培養する。そして薬剤ＩＳＸ９を添加して，添加後，さらに１週間培養する。ここで，培養期間（例えば，薬剤ＩＳＸ９添加前の１週間と，添加後の１週間），薬剤ＩＳＸ９の添加時期は，培養実験等によりケース・バイ・ケースで決定することが出来る。
【００２０】
ステップＳ４では，上述した培養期間の経過後（例えば，薬剤ＩＳＸ９を添加後，１週間培養した後）に，培養した間葉系幹細胞２Ｓに脂肪滴が形成されか否か，すなわち，培養された幹細胞が脂肪細胞に分化したか否かを確認する。幹細胞が脂肪細胞に分化したか否かを確認するのは，例えば顕微鏡４を使用して行うことが出来る。図示の実施形態では，培養した間葉系幹細胞２Ｓの顕微鏡写真を解析して，脂肪滴の有無を確認している。
ここで，ステップＳ４で脂肪滴が確認されても，当該脂肪細胞がＵＣＰ１発現細胞であるか，或いは，白色脂肪細胞であるかを確認する必要がある。そのため，ステップＳ５においては，培養した間葉系幹細胞２Ｓに形成された脂肪滴が，脱共役たんぱく質の一つのパターンであるＵＣＰ１の遺伝子を発現しているか否かを確認している。ＵＣＰ１の遺伝子が発現していれば，分化した脂肪細胞はＵＣＰ１発現細胞であることが確認出来る。
なお，ＵＣＰ１の遺伝子が発現したか否かは，定量ＰＣＲ法により判断される。
【００２１】
ここで，ステップＳ３で培養中に薬剤ＩＳＸ９を添加することにより，ＵＣＰ１の遺伝子の発現が促進される。
薬剤ＩＳＸ９の添加時期については，培地（例えば一般的な脂肪分化誘導培地）の組成により，脂肪由来の間葉系幹細胞２Ｓを一般的な脂肪分化誘導培地１−１を充填した培養容器３に供給する以前の段階で，一般的な脂肪分化誘導培地１−１に薬剤ＩＳＸ９を添加しても，たんぱく質ＵＣＰ１を発現させることが可能である。
換言すれば，ステップＳ１の一般的な脂肪分化誘導培地１−１の充填と同時に薬剤ＩＳＸ９を添加しても，たんぱく質ＵＣＰ１を発現させることが可能である。そして，培養容器３に一般的な脂肪分化誘導培地１−１を充填した（ステップＳ１）後，脂肪由来の間葉系幹細胞２Ｓを供給する（ステップＳ２）以前の段階で薬剤ＩＳＸ９を添加しても，たんぱく質ＵＣＰ１を発現させることが可能である。さらにステップＳ２で脂肪由来の間葉系幹細胞２Ｓを供給する際に薬剤ＩＳＸ９を添加しても，たんぱく質ＵＣＰ１の遺伝子を発現させることが可能である。
【００２２】
次に，図１，図２の実施形態であって，被験者Ｍから採取した脂肪細胞２から得た脂肪由来の間葉系幹細胞２Ｓを培養する実験例について説明する。
［実験例１］
２つの培養容器３のそれぞれに，後述する組成の一般的な脂肪分化誘導培地１−１（血清を含む血清培地）を充填した。そして，被験者Ｍから採取した脂肪細胞２を処理設備１０で処理して得た幹細胞２Ｓを培養した。そして，当該幹細胞２Ｓにより試料１，試料２を作成した。
試料１では，間葉系幹細胞２Ｓを１週間培養し，一般的な脂肪分化誘導培地１−１に薬剤ＩＳＸ９を添加して，さらに１週間培養を行った。一方，試料２では，間葉系幹細胞２Ｓを１週間培養し，その後，当該一般的な脂肪分化誘導培地１−１に薬剤ＩＳＸ９を添加せずに，さらに１週間培養を行った。
培養後，試料１，試料２の双方において，脂肪滴を有する細胞（脂肪細胞）が確認された。すなわち，試料１，試料２の双方において，間葉系幹細胞２Ｓは脂肪細胞に分化したことが確認できた。
試料１，試料２の双方において確認された脂肪滴を有する細胞（脂肪細胞）よりＲＮＡ（リボ核酸）を抽出し，逆転写反応を行ってＲＮＡからｃＤＮＡを合成し，ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ）を調製した。得られたｃＤＮＡを用いて定量ＰＣＲ法を行い，試料１，試料２の脂肪細胞からＵＣＰ１の遺伝子発現量を測定した。
【００２３】
試料１，試料２の顕微鏡写真から脂肪滴を有する細胞（脂肪細胞）の形成が明確に確認され，脂肪分化培地１−１による脂肪分化誘導は良好に行われたことが分かった。
定量ＰＣＲ法の結果を図３に示すが，ＵＣＰ１の遺伝子発現は薬剤ＩＳＸ９を添加した試料１のみで確認され，薬剤ＩＳＸ９を添加しない試料２ではたんぱく質ＵＣＰ１の遺伝子発現は確認されなかった。なお，図３で，縦軸の「Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｑｕａｎｔｉｔｙ」はたんぱく質ＵＣＰ１の遺伝子発現量を示すパラメータであり，試料１（ＩＳＸ９を添加した試料）におけるたんぱく質ＵＣＰ１の遺伝子発現量を１とする相対的な数値である。
図３では明示されていないが，実験例１において，脂肪分化誘導培地１−１に間葉系幹細胞２Ｓを供給する以前の段階で薬剤ＩＳＸ９を添加した場合，及び，脂肪分化誘導培地１−１に間葉系幹細胞２Ｓを供給するのと同時に薬剤ＩＳＸ９を脂肪分化誘導培地１−１に添加した場合についても，たんぱく質ＵＣＰ１の遺伝子発現が確認出来た。
実験例１で使用した一般的な脂肪分化誘導培地１−１の組成を，以下で示す。
ＤＭＥＭ‐ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ                  ５００ｍｌ
デキサメサゾン                                      １μＭ
インドメタシン                                      ５０μＭ
インスリン                                          ０．０１ｍｇ／ｍｌ
３‐イソブチル‐メチルキサンチン                    ０．５ｍＭ
ＦＢＳ（ウシ胎児血清）                              １０％
【００２４】
［実験例２］
２つの培養容器３のそれぞれに，市販されている無血清培地（ロンザジャパン株式会社製の商品名「ＭＳＣＧＢ−ＣＤ」）に対して，チアゾリジン系の薬剤であるロシグリタゾンを５μＭ添加したものを一般的な脂肪誘導培地１−１として充填した。
その後，それぞれに被験者Ｍから採取した脂肪細胞２を処理設備１０で処理して得た幹細胞２Ｓを培養した。そして，当該幹細胞２Ｓにより試料３，試料４を作成した。
試料３では，間葉系幹細胞２Ｓを１週間培養し，その後，一般的な脂肪分化誘導培地１−１に薬剤ＩＳＸ９を添加して，間葉系幹細胞２Ｓをさらに１週間培養した。一方，試料４では，間葉系幹細胞２Ｓを１週間培養し，その後，薬剤ＩＳＸ９を添加することなく，間葉系幹細胞２Ｓをさらに１週間培養を行った。
培養後，試料３，試料４の双方において，脂肪滴を有する細胞（脂肪細胞）が確認された。すなわち，試料３，試料４の双方において，間葉系幹細胞２Ｓは脂肪細胞に分化したことが確認できた。
試料３，試料４の双方において確認された脂肪滴を有する細胞（脂肪細胞）よりＲＮＡ（リボ核酸）を抽出し，逆転写反応を行ってＲＮＡからｃＤＮＡを合成し，ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ）を調製した。得られたｃＤＮＡを用いて定量ＰＣＲ法を行い，試料３，試料４の脂肪細胞からＵＣＰ１の遺伝子発現量を測定した。
【００２５】
試料３，試料４の顕微鏡写真から脂肪滴を有する細胞（脂肪細胞）の形成が明確に確認され，脂肪分化培地１−１による脂肪分化誘導は良好に行われたことが分かった。
定量ＰＣＲ法の結果を図４に示すが，たんぱく質ＵＣＰ１の遺伝子発現は，薬剤ＩＳＸ９を添加した試料３のみで確認され，薬剤ＩＳＸ９を添加しない試料４ではＵＣＰ１の遺伝子発現は確認されなかった。
【００２６】
実験結果が図示されてはいないが，発明者による実験では，脂肪由来の間葉系幹細胞のみならず，臍帯由来の間葉系幹細胞，歯髄由来の間葉系幹細胞，骨髄由来の間葉系幹細胞，羊膜由来の間葉系幹細胞，胎盤由来の間葉系幹細胞についても，図３，図４で示すのと同様に，たんぱく質ＵＣＰ１の遺伝子発現は，薬剤ＩＳＸ９を添加した試料のみで確認され，薬剤ＩＳＸ９を添加しない試料ではＵＣＰ１の遺伝子発現は確認されなかった。
【００２７】
図１〜図４の実施形態においては，被験者Ｍから例えば脂肪細胞２を採取して，処理設備１０で処理して幹細胞２Ｓを得た。そして，当該幹細胞２Ｓを培養して，ＵＣＰ１発現細胞を得ている。
発明者は，幹細胞以外の細胞，例えば線維芽細胞，或いは脂肪組織を被験者から採取し，処理設備１０により幹細胞を得ることなく，ＵＣＰ１発現細胞を大量に培養出来ることを確認している。
被験者から線維芽細胞或いは脂肪組織を採取し，ＵＣＰ１発現細胞を培養する実施形態について，図５，図６を参照して説明する。
【００２８】
図５において，培養容器３には一般的な培地１−２（例えば無血清培地或いは血清培地）が充填されており，当該培地で被験者Ｍから採取した組織２０（例えば線維芽細胞或いは脂肪組織）を培養する。ここで，組織２０は線維芽細胞、脂肪組織に限定される訳ではなく、その他の組織或いは細胞，例えば臍帯，歯髄，骨髄，羊膜，胎盤，その他であっても良い。培地１−２にはＩＳＸ９が添加されている。
図５では明示されていないが，培養された組織或いは細胞がＵＣＰ１を発現しているか否か（ＵＣＰ１細胞であるか否か）は，第１実施形態と同様に，ＵＣＰ１の遺伝子発現の有無を，定量ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いて行う。定量ＰＣＲ法の前処理として，培養された細胞よりＲＮＡ（リボ核酸）を抽出し，逆転写反応（すなわち，ＲＮＡからｃＤＮＡの合成）を行ってｃＤＮＡ（ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ）の調製を行い，得られたｃＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行い，たんぱく質ＵＣＰ１の発現量を測定することは，図１，図２で説明したのと同様である。
そして第１実施形態と同様に，定量ＰＣＲ法を実施する設備に代えて，ウエスタンブロット法を実施する設備，或いは免疫染色法を実施する設備を用いても良い。
【００２９】
次に，主として図６を参照して，第２実施形態でＵＣＰ１発現細胞培養の手順を説明する。
図６において，ステップＳ１１では，培養容器３に一般的な培地１−２を充填し、培地１−２に薬剤ＩＳＸ９を添加する。そしてステップＳ１２に進む。
ステップＳ１２では，被験者Ｍから採取した組織（或いは細胞）２０を供給して，培養する。ここで，薬剤ＩＳＸ９は組織２０の培養時に培地に添加しても良い。例えば、組織２０を１週間培養し、それからＩＳＸ９を添加し，さらに１週間培養する。
ステップＳ１２に続くステップＳ１３では，培養された細胞２０がＵＣＰ１発現細胞であるか否かを，定量ＰＣＲ法により確認する。
【００３０】
次に，図５，図６の実施形態において，被験者Ｍから採取した細胞２０を用いた実験例３，実験例４について説明する。
［実験例３］
２つの培養容器３（図５参照）のそれぞれに，一般的な培地１−２（血清を含む血清培地）を充填した。そして，被験者から採取した表皮由来の線維芽細胞を培養容器３に供給して，試料５，試料６を作成した。
試料５では，表皮由来線維芽細胞を１週間培養し，その後，当該一般的な脂肪分化誘導培地１−１に薬剤ＩＳＸ９を添加して，さらに１週間培養を行った。一方，試料６では，表皮由来線維芽細胞を１週間培養し，その後，当該一般的な脂肪分化誘導培地１−１に薬剤ＩＳＸ９を添加せず，さらに１週間培養を行った。
培養後，試料５，試料６の双方の細胞（脂肪細胞）よりｃＤＮＡを調製し，得られたｃＤＮＡを用いて定量ＰＣＲ法を行い，試料５，試料６の脂肪細胞からＵＣＰ１の遺伝子発現量を測定した。
【００３１】
試料５，試料６について，定量ＰＣＲ法の結果を図７に示すが，ＵＣＰ１の遺伝子発現は薬剤ＩＳＸ９を添加した試料５で強く誘導され，薬剤ＩＳＸ９を添加しない試料６ではたんぱく質ＵＣＰ１の遺伝子発現は僅かに確認されるのみであった。
なお，実験例３，４と同様に，実験例５において，培地１−２に表皮由来線維芽細胞を供給する以前の段階で薬剤ＩＳＸ９を添加した場合と，培地１−１に表皮由来線維芽細胞を供給するのと同時に薬剤ＩＳＸ９を脂肪分化誘導培地１−１に添加した場合についても，たんぱく質ＵＣＰ１の遺伝子発現が確認出来た。
【００３２】
［実験例４］
２つの培養容器３（図５参照）のそれぞれに，実験例１で用いられた培地と同様な組成を有する一般的な脂肪分化誘導培地（血清を含む血清培地）を充填した。そして，被験者から採取した脂肪組織（間葉系幹細胞を取り出す処理を行っていない脂肪細胞）を培養容器３に供給して，試料７，試料８を作成した。
試料７では，脂肪組織を１週間培養し，その後，培地に薬剤ＩＳＸ９を添加して，さらに１週間培養を行った。一方，試料８では，脂肪組織を１週間培養し，その後，培地に薬剤ＩＳＸ９を添加することなく，脂肪組織をさらに１週間培養を行った。
【００３３】
培養後，試料７，試料８の双方からｃＤＮＡを調製し，定量ＰＣＲ法により，試料７，試料８の脂肪組織からＵＣＰ１の遺伝子発現量を測定した。
定量ＰＣＲ法の結果を図８に示すが，たんぱく質ＵＣＰ１の遺伝子発現は，薬剤ＩＳＸ９を添加した試料７で強く誘導され，薬剤ＩＳＸ９を添加しない試料８ではＵＣＰ１の遺伝子発現は僅かに確認されるのみであった。
実験例４においても、培地に脂肪組織を供給する以前の段階で薬剤ＩＳＸ９を添加した場合と，培地に脂肪組織を供給するのと同時に薬剤ＩＳＸ９を添加した場合についても，たんぱく質ＵＣＰ１の遺伝子発現が確認出来た。
【００３４】
図示の実施形態によれば，一般的な培地１−１，１−２に被験者Ｍから採取して処理した間葉系幹細胞２Ｓ，或いは被験者Ｍから採取された線維芽細胞，脂肪組織を供給し，薬剤ＩＳＸ９（Ｎ−シクロプロピル−５−（２−チエニル）−３−イソキサゾールカルボキシアミド）のみを添加して培養することにより，複雑な操作或いは処理を必要とせず，簡易にＵＣＰ１発現細胞を培養することが出来る。
そして，生体外で簡易にＵＣＰ１発現細胞を培養出来るので，大量のＵＣＰ１発現細胞を培養することが可能であり，培養されたＵＣＰ１発現細胞を移植することにより，安全且つ効果的に，肥満及び肥満に伴うメタボリックシンドローム，その他の疾病に対して効果的に治療することが可能となることが期待される。
【００３５】
図示の実施形態はあくまでも例示であり，本発明の技術的範囲を限定する趣旨の記述ではないことを付記する。
【符号の説明】
【００３６】
１−１，１−２・・・一般的な脂肪誘導培地
２０・・・脂肪組織
２Ｓ・・・間葉系幹細胞
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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