(57)【要約】【課題】短時間かつ低コストで蛋白質の生産性を大幅に向上した微生物取得することが可能な方法を提供する。【解決手段】ゲルマイクロドロップ法により分画された細胞が生産する蛋白質に対し、低分子の蛍光化合物で標識し、検出を行う。これにより、バックグラウンドを減少させて微量なシグナルの検出を可能とする。その結果、蛋白質の初期生産性が低い細胞であっても、生産性に応じた細胞ソーティングが可能となる。また、培養中に死んだ細胞を除去することにより、外来遺伝子にコードされた蛋白質の生産性をより高めることが可能となる。【選択図】図１
2019140973.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来遺伝子にコードされた蛋白質を生産する細胞を選択する方法であって、
細胞内の核酸に変異を導入し、
変異が導入された細胞を網目構造を有する固体あるいは網目構造を有する膜で作製されたマイクロドロップに包埋して分画し、
分画された細胞を培養し、
外来遺伝子にコードされた蛋白質を標識して細胞を選択する方法。
【請求項２】
網目構造を有する固体あるいは網目構造を有する膜がゲルで構成される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ゲルがアガロースゲルである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
外来遺伝子にコードされた蛋白質が、標識化部位としてさらに第１のタグを有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
第１のタグがＨａｌｏタグ、ＴｅｔＣｙｓタグ、ＡＣＰタグ、ＭＰＣタグ、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、Ｔｒｘタグからなる群から選択されるタグである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
外来遺伝子にコードされた蛋白質が、細胞を捕捉するための第２のタグをさらに有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
第２のタグがヘマグルチニンタグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、ｍｙｃタグ、ＶＳタグ、Ｓタグ、Ｅタグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＨＳＶタグ、ＣＢＤタグ、ＣＢＰタグからなる群から選択されるタグである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞内の核酸への変異の導入が、紫外線照射、ＥＭＳなどの変異原性化合物の添加、変異ポリメラーゼによる誤った塩基の導入、またはＤＮＡ断片の染色体へのランダムな挿入により行われる、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
細胞の分画が、ゲルマイクロドロップ法により行われる、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ゲルマイクロドロップ法に用いられるゲルがアガロースゲルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
標識が、蛍光標識化合物により行われる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
蛍光標識化合物が、Ｈａｌｏ−タグ基質、ＴｅｔＣｙｓタグ基質、ＡＣＰタグ、ＭＰＣタグ、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグからなる群から選択される蛍光標識化合物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞の選択が、ソーティング法により行われる、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
２回以上のソーティングを行う、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
外来遺伝子にコードされた蛋白質の生産量、及び／または、細胞の分画と培養により形成されたコロニーの大きさに基づいて細胞の選択を行う、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ゲルマイクロドロップを散乱光をエリアスケーリングファクターで補正することにより、細胞を含むゲルマイクロドロップの選択を行う、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
培養中に死んだ細胞を除去する方法であって、検出用と異なる波長を有する色素による染色によって死んだ細胞を特異的に染色することにより、死んだ細胞を含むゲルマイクロドロップをソーティング時に除去する、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
細胞が、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌からなる群から選択される細胞である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
変異が導入される細胞内の核酸が、ＤＮＡ、及び／または、ＲＮＡである、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
外来遺伝子にコードされた蛋白質が抗体または酵素である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
抗体が、マウス抗体、マウス−ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体からなる群から選択される抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
抗体が、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、Ｍｉｎｉｂｏｄｙ、Ｄｉａｂｏｄｙ、Ｔｒｉａｂｏｄｙ、Ｔｅｔｒａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖからなる群から選択される抗体である、請求項２０または２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異株を高速に選択する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
培養困難な微生物などを取得するため、試料中に存在する微生物をゲルマイクロドロップ中に含有させ、このゲルマイクロドロップを培養し、フローサイトメトリー法で分離する方法（ゲルマイクロドロップ（Gel Microdrop (GMD)）・フローサイトメトリー法）が知られている（非特許文献１）。この方法では一般に、ゲルマイクロドロップ１個あたり１つの細胞が取り込まれるようにするという手法が採られている。
【０００３】
また、蛍光基質を用いることにより、アガロースビーズ中でマイクロコロニーを形成した大腸菌や酵母のβ−ガラクトシダーゼの活性をフローサイトメトリー法により測定する方法が知られている（非特許文献２）。この文献は、β−ガラクトシダーゼ活性の高い大腸菌や酵母をゲルマイクロドロップ・フローサイトメトリー法により分離できることを示している。
【０００４】
非特許文献３では、ゲルマイクロドロップ・フローサイトメトリー法により、抗生物質を分泌する大腸菌を分離する手法が紹介されている。この文献では、遺伝子ライブラリーを有する大腸菌を、黄色ブドウ球菌と共にゲルマイクロドロップに含有させ、黄色ブドウ球菌が死滅したゲルマイクロドロップを回収するという手法が採られている。
【０００５】
非特許文献４〜６では、ＣＨＯ(Chinese hamster ovary)細胞などの動物細胞を用いた、ゲルマイクロドロップ・フローサイトメトリー法による、抗体やサイトカインなどの蛋白質の分泌生産能力が異なる細胞の分離方法が紹介されている。非特許文献４は、コピー数の増加によって生産性が有意に増加した脊椎動物細胞株のスクリーニングを、非特許文献５は、抗体を生産するCHO細胞株においてコピー数の減少によって生じる低生産株の検出と分離を、非特許文献６は、細胞外からの刺激によって生産性を獲得したサイトカイン生産細胞株の検出について記載されている。
【０００６】
しかしながら上記の文献では、微生物が分泌生産する蛋白質（抗体を含む）に関し、その生産性が変化した細胞を分離する技術は報告されてはいなかった。
【０００７】
なお、ゲルマイクロドロップ法とマイクロ流体法の比較が記載されている非特許文献７では、ゲルマイクロドロップ法では培養時に培地交換が可能であること、ゲル溶解酵素により細胞を回収できることなど、ゲルマイクロドロップ法の利点が紹介されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】日本農芸化学会誌、Vol.77, No.2, p154-157, 2003
【非特許文献２】APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Dec. 1990, p3861-3866.
【非特許文献３】Biotechnol Bioeng. 2014 Feb; 111(2):232-243.
【非特許文献４】Trends Biotechnol. 2007 Sep;25(9):425-32.
【非特許文献５】Cytotechnology 34: 27-37, 2000
【非特許文献６】Cytokine 27 (2004) 120-128.
【非特許文献７】NPG Asia Materials (2014) 6, e133.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、蛋白質の初期生産性が低い細胞であっても、その生産性に応じた選択が可能な方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、ゲルマイクロドロップ法により分画された細胞が生産する蛋白質に対し、低分子の蛍光化合物で標識し、検出を行った。これにより、バックグラウンドを減少させて微量なシグナルの検出を可能とした。また、微生物細胞の増殖などによって生じる多様な分子種の正確な判別、培養中に生じる一部の死んだ細胞から生じる高い強度の検出シグナルを有する擬陽性GMDの除去を可能とした。その結果、蛋白質の初期生産性が低く、培養生産中に増殖や細胞死が生じる微生物細胞であっても、生産性に応じた細胞の選択が可能となることを見出した。
【００１１】
また本発明者は、低分子抗体などを生産する酵母などの微生物を包埋したGMDを作製し、生産性が向上した変異株の取得に関して多数の基礎的な実験を繰り返した結果、多数の基本的な問題が存在することを見いだした。即ち、（１）微生物は初期状態での生産性は一般的に分泌生産に分化した動物細胞に比較して生産性が低く検出が難しいこと、（２）微生物の場合には細胞の生育が早いことからマイクロコロニーを形成するが、培養条件を制御してもマイクロコロニーの肥大化などによってGMDの破壊が生じるため、細胞が包埋されたGMD以外に、遊離した細胞、破壊されGMDの断片、遊離した細胞と破壊されたGMDの断片との混合物など、多様な粒子が混在することになり、これらの中から細胞が包埋されたGMDの正確な選別が難しいこと、（３）マイクロコロニー中に生じた死細胞の細胞内に蓄積された蛋白質から生じる高い強度のシグナルによって擬陽性が生じること、などが精度の高い高生産株の分離を著しく困難にしている。これらのことは特に、高い生産性の向上や高生産株のさらなる生産性の向上株の取得など、実用的に重要な局面において特に顕著となる。本発明は、これらの全てを克服し、十分に生産性が向上した実用的あるいはそれに近い株を親株とした場合であっても、蛋白質の分泌生産性がさらに向上した微生物株の取得を実現する方法を提供する。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（２２）に関する。
（１）外来遺伝子にコードされた蛋白質を生産する細胞を選択する方法であって、細胞内の核酸に変異を導入し、変異が導入された細胞を網目構造を有する固体あるいは網目構造を有する膜で作製されたマイクロドロップに包埋して分画し、分画された細胞を培養し、
外来遺伝子にコードされた蛋白質を標識して細胞を選択する方法。
（２）網目構造を有する固体あるいは網目構造を有する膜がゲルで構成される（１）に記載の方法。
（３）ゲルがアガロースゲルである（２）に記載の方法。
（４）外来遺伝子にコードされた蛋白質が、標識化部位としてさらに第１のタグを有する、（１）から（３）のいずれか一項に記載の方法。
（５）第１のタグがＨａｌｏタグ、ＴｅｔＣｙｓタグ、ＡＣＰタグ、ＭＰＣタグ、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、Ｔｒｘタグからなる群から選択されるタグである、（４）に記載の方法。
（６）外来遺伝子にコードされた蛋白質が、細胞を捕捉するための第２のタグをさらに有する、（１）から（５）のいずれか一項に記載の方法。
（７）第２のタグがヘマグルチニンタグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、ｍｙｃタグ、ＶＳタグ、Ｓタグ、Ｅタグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＨＳＶタグ、ＣＢＤタグ、ＣＢＰタグからなる群から選択されるタグである、（６）に記載の方法。
（８）細胞内の核酸への変異の導入が、紫外線照射、ＥＭＳなどの変異原性化合物の添加、変異ポリメラーゼによる誤った塩基の導入、またはＤＮＡ断片の染色体へのランダムな挿入により行われる、（１）から（７）のいずれか一項に記載の方法。
（９）細胞の分画が、ゲルマイクロドロップ法により行われる、（１）から（８）のいずれか一項に記載の方法。
（１０）ゲルマイクロドロップ法に用いられるゲルがアガロースゲルである、（９）に記載の方法。
（１１）標識が、蛍光標識化合物により行われる、（１）から（１０）のいずれか一項に記載の方法。
（１２）蛍光標識化合物が、Ｈａｌｏ−タグ基質、ＴｅｔＣｙｓタグ基質、ＡＣＰタグ、ＭＰＣタグ、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグからなる群から選択される蛍光標識化合物である、（１１）に記載の方法。
（１３）細胞の選択が、ソーティング法により行われる、（１）から（１２）のいずれか一項に記載の方法。
（１４）２回以上のソーティングを行う、（１３）に記載の方法。
（１５）外来遺伝子にコードされた蛋白質の生産量、及び／または、細胞の分画と培養により形成されたコロニーの大きさに基づいて細胞の選択を行う、（１）から（１４）のいずれか一項に記載の方法。
（１６）ゲルマイクロドロップを散乱光をエリアスケーリングファクターで補正することにより、細胞を含むゲルマイクロドロップの選択を行う、（１３）から（１５）のいずれか一項に記載の方法。
（１７）培養中に死んだ細胞を除去する方法であって、検出用と異なる波長を有する色素による染色によって死んだ細胞を特異的に染色することにより、死んだ細胞を含むゲルマイクロドロップをソーティング時に除去する、（１３）から（１５）のいずれか一項に記載の方法。
（１８）細胞が、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌からなる群から選択される細胞である、（１）から（１７）のいずれか一項に記載の方法。
（１９）変異が導入される細胞内の核酸が、ＤＮＡ、及び／または、ＲＮＡである、（１）から（１８）のいずれか一項に記載の方法。
（２０）外来遺伝子にコードされた蛋白質が抗体または酵素である、（１）から（１９）のいずれか一項に記載の方法。
（２１）抗体が、マウス抗体、マウス−ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体からなる群から選択される抗体である、（２０）に記載の方法。
（２２）抗体が、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、Ｍｉｎｉｂｏｄｙ、Ｄｉａｂｏｄｙ、Ｔｒｉａｂｏｄｙ、Ｔｅｔｒａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖからなる群から選択される抗体である、（２０）または（２１）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、蛋白質の初期生産性が低く、培養生産中に増殖や細胞死が生じる微生物細胞であっても、その生産性に応じた選択が可能な方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】GMDによるscFv高生産株の取得を示した図である。
【図２】GMDを用いて獲得された変異株の生産性の比較を示した図である。
【図３】ピキア酵母の生産性向上を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の一実施形態について詳細に説明する。本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、本発明の効果を阻害しない範囲で適宜変更を加えて実施することができる。
【００１６】
［蛋白質］
本発明において蛋白質とは、アミノ酸が２残基以上ペプチド結合で結合された物質のことをいい、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドも本発明の蛋白質に含まれる。また、糖蛋白質などの各種修飾蛋白質も、本発明の蛋白質に含まれる。蛋白質の修飾の例として、糖鎖付加、脂質付加、アセチル化、アシル化、アルキル化、アミド化、ビオチニル化、ホルミル化などが挙げられる。なお、天然に存在するアミノ酸だけではなく、非天然型のアミノ酸を含有する蛋白質も本発明の蛋白質に含まれる。
【００１７】
本発明において細胞により生産される蛋白質としては、分泌蛋白質が好ましい。分泌蛋白質の例として、抗体、菌体外酵素、サイトカイン、ペプチドホルモンなどが挙げられる。
【００１８】
抗体としては、マウス抗体、マウス−ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などが挙げられる。
また抗体の例として、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどが挙げられる。中でも、ＩｇＧが好ましい。ＩｇＧの例として、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などが挙げられる。中でも、ＩｇＧ１が好ましい。
抗体には、抗体の一部、すなわち抗体断片や、抗体の一部を含む蛋白質も含まれる。そのような例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、Ｍｉｎｉｂｏｄｙ、Ｄｉａｂｏｄｙ、Ｔｒｉａｂｏｄｙ、Ｔｅｔｒａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖなどが挙げられる。
【００１９】
また本発明における菌体外酵素としては、グルコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼなどが挙げられる。
【００２０】
サイトカインとしては、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、造血因子、細胞増殖因子、細胞障害因子、アディポカイン、神経栄養因子などが挙げられる。
インターロイキンとしては、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７などの各種インターロイキンやそのサブユニットが挙げられる。
インターフェロンとしては、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−δ、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−λ、ＩＦＮ−τ、ＩＦＮ−ζなどの各種インターフェロンが挙げられる。
ケモカインとしては、ＣＣＬ１〜ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１〜ＣＸＣＬ１７、ＸＣＬ１〜ＸＣＬ２、ＣＸ３ＣＬ１などの各種ケモカインが挙げられる。
造血因子としては、ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯなどが挙げられる。
細胞増殖因子としては、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＴＧＦなどが挙げられる。
細胞障害因子としては、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βなどが挙げられる。
アディポカインとしては、レプチンなどが挙げられる。
神経栄養因子としては、ＮＧＦなどが挙げられる。
【００２１】
また本発明におけるサイトカインには、サイトカインの一部、すなわちサイトカインの断片や、サイトカインの一部を含む蛋白質も含まれる。
【００２２】
ペプチドホルモンとしては、ソマトスタチン、バソプッレッシン、オキシトシン、エンドルフィン、カルシトニン、パラトルモン、インヒビン、アクチビン、リラキシン、グルカゴン、インスリン、レニン、ガストリン、グレリン、コレシストキニン、セレクチン、モチリン、アディポネクチン、コレシストキニン、成長ホルモンなどが挙げられる。
【００２３】
また本発明におけるペプチドホルモンには、ペプチドホルモンの一部、すなわちペプチドホルモンの断片や、ペプチドホルモンの一部を含む蛋白質も含まれる。
【００２４】
その他、本発明における分泌蛋白質の例として、ｔＰＡ、ｕＰＡ、血液凝固第ＶＩＩＩ因子などの血液凝固因子も挙げられる。
【００２５】
本発明における血液凝固因子には、血液凝固因子の一部、すなわち血液凝固因子の断片や、血液凝固因子の一部を含む蛋白質も含まれる。また、グルコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼなどの菌体外酵素も挙げられる。
【００２６】
［細胞］
本発明において細胞とは、蛋白質を生産することが可能な細胞であれば、いかなる細胞をも意味する。本発明において蛋白質を生産する細胞として、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌などを例示することができる。中でも、酵母、大腸菌、枯草菌が好ましい。
【００２７】
酵母としては、サッカロミセス酵母、ピキア酵母、シゾサッカロミセス酵母、カンジダ酵母、トルロプシス酵母、ジゴサッカロミセス酵母、ヤロウィア酵母、ハンセヌラ酵母、クルイウェロミセス酵母、デバリオミセス酵母、ゲオトリクム酵母、ウィッケルハミア酵母、フェロミセス酵母、スポロボロマイセス酵母などが挙げられる。中でも、サッカロミセス酵母、ピキア酵母、シゾサッカロミセス酵母が好ましく、サッカロミセス酵母、ピキア酵母がより好ましく、サッカロミセス酵母がさらに好ましい。
【００２８】
大腸菌としては、遺伝子操作でよく利用されている、Ｋ−１２株あるいはＢ株由来の株が好ましい。Ｋ−１２株由来の株としては、ＢＢ４、ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ、Ｃ６００、ＣＪ２３６、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＨＳＴ０２、ＪＭ１０９、XL1-Blueなどが、Ｂ株由来の株としてはＢＬ２１、Rosetta-gami B、Turnerなどが挙げられる。
【００２９】
枯草菌としては、バチルス・ズブチリスが好ましく、中でも代表的な実験室株である１６８株が好ましい。
糸状菌としては、アスペルギルスオリゼ、アスペルギルスニガーなどが好ましい。いずれの場合にも、形態形成によって菌体部分がGMD外に出てこないようにするために、培養時間を短くするなどの調整を行う。
【００３０】
［細胞内の核酸への変異の導入］
細胞内の核酸へ変異を導入する方法として、紫外線を照射する方法、α線、β線、γ線などの放射線を照射する方法、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）などの化学物質により変異を誘発する方法、変異型DNAポリメラーゼを保持する微生物による複製時のヌクレオチドの取り込みの誤りを利用した方法、ＤＮＡ断片の染色体へのランダムな挿入などが挙げられる。これらの方法により、細胞内のＤＮＡ及び／またはＲＮＡに変異を導入することができる。本発明において細胞内の核酸へ変異を導入する方法としては、紫外線を照射する方法（紫外線照射法）が簡便で好ましい。
【００３１】
［細胞の分画］
本発明において細胞の分画は、網目構造を有する固体あるいは網目構造を有する膜で作製されたゲルマイクロドロップを用いて行う。後の細胞を培養する過程における培地交換が容易であること、及び細胞を選択する過程における迅速性・経済性・簡便性における観点で高い優位性を有する。
ゲルマイクロドロップの作製は、アガロースゲルを用いることが好ましい。この場合、アガロースを含有する培地などの水溶液によって限界希釈された細胞懸濁液を用いてエマルジョンを作製し、温度を下げることによって、1個のマイクロドロップ内に1個の細胞を有する多数のゲルマイクロドロップを作製することができる。
【００３２】
［細胞の培養］
本発明において細胞の培養は、細胞の種類に応じた通常の条件により行うことができる。例えば細胞として酵母を用いた場合、後述する実施例において記載された培養条件が好ましく選択される。
【００３３】
［分泌された蛋白質の捕獲］
細胞から分泌された蛋白質は、前記の網目構造により、物理的固定あるいは拡散速度の低減によってマイクロドロップ内に捕捉される。また、この網目構造に、分泌された蛋白質と相互作用する機能を付加することにより、捕捉効率および捕捉容量を向上させることができる。例えば、ストレプトアビジンを含有するアガロースと、後述する第２のタグに対するビオチン化抗体を用い、第２のタグを介して、分泌された蛋白質をゲルマイクロドロップに捕捉することも可能である。前記ビオチン化抗体の代替として、抗体とProtein Aのように生産させるタンパク質に直接的に結合するタンパク質をビオチン化して使用することができる。また、低分子化合物に結合する抗体やタンパク質の場合には、該低分子化合物にリンカーなどを介してビオチンを結合させた化合物を用いることができる。
【００３４】
［細胞の選択］
本発明において細胞の選択は、フローサイトメトリー法により行われることが好ましい。特に細胞の分画においてゲルマイクロドロップ法を用いた場合、ゲルマイクロドロップ法を用いなかった場合と比較して非常に迅速・簡便にフローサイトメトリー法を行うことができる。またその場合、使用する試薬や器具などにかかる費用を大幅に削減できることから、経済性にも極めて優れている。
【００３５】
細胞の分画にゲルマイクロドロップ法を用い、細胞の選択をフローサイトメトリー法により行う場合、まず、ゲルマイクロドロップ中に存在しないフリーの状態の細胞から、ゲルマイクロドロップを分離することが好ましい。次に、細胞による蛋白質の生産の有無を指標に、細胞を含有しているゲルマイクロドロップを分離し、細胞を含有していないゲルマイクロドロップを除去することが好ましい。そして、細胞の分画とその後の培養により形成されたコロニーの大きさに基づいて、ゲルマイクロドロップを分離することが好ましい。この分離されたゲルマイクロドロップのそれぞれについて、細胞による蛋白質の生産量が高い画分を選択することが好ましい。この選択されたゲルマイクロドロップのクローニング操作を行い、ＥＬＩＳＡなどの手法により、細胞による蛋白質の生産量の検討を行うことが好ましい。
【００３６】
また、細胞の分画にゲルマイクロドロップ法を用い、細胞の選択をフローサイトメトリー法により行う場合、細胞の分画、細胞の培養、細胞の選択の一連の操作を２回以上、好ましくは３回行うこともできる。この一連の操作を２回以上繰り返すことにより、細胞による蛋白質の生産量が高い画分の選択が容易となる。
なお、細胞の分画、細胞の培養、細胞の選択の一連の操作ではなく、細胞の培養と選択、もしくは細胞の選択を２回以上、好ましくは３回行うこともできる。
【００３７】
また、培養中に死んだ細胞を除去する方法であって、検出用と異なる波長を有する色素による染色によって死んだ細胞を特異的に染色することにより、死んだ細胞を含むゲルマイクロドロップをソーティング時に除去することにより、外来遺伝子にコードされた蛋白質の生産性をより高めることも可能である。
なお、死細胞の特異的な染色には、ヨウ化プロピディウム（PI）、エチジウムブロミド（EB）、アクリジンオレンジ（AO）、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）、トリパンブルー、FITC標識アネキシンV、7-アミノ-アクチノマイシン D（7-AAD）などを用いることができる。
【００３８】
［エリアスケーリングファクター］
本発明の細胞の分画においてゲルマイクロドロップ法を用い、細胞の選択をフローサイトメトリー法により行う場合、フローサイトメトリーを行う際、細胞の大きさをエリアスケーリングファクターで補正することが可能である。フローサイトメトリーで検出されるシグナルは、シグナル強度の積分値であるため、細胞が大きくなると同じシグナル強度であっても、測定される総シグナル量は大きくなる。これを補正するのが、エリアスケーリングファクターである。
【００３９】
［蛋白質の標識化部位］
本発明において標識化部位とは、標識物質を直接または間接的に結合させる部位のことをいう。分泌生産する蛋白質が、化合物や他の蛋白質など分子に対して特異的な結合能を有する場合には、これらを蛍光標識した分子を用いることにより、直接的に標識物質を蛋白質に結合させることができる。また、間接的に標識物質を蛋白質に結合させる場合、第１のタグを介して標識物質を蛋白質に結合させることが好ましい。第１のタグとしては、Ｈａｌｏタグ、ＴｅｔＣｙｓタグ、ＡＣＰタグ、ＭＰＣタグ、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、Ｔｒｘタグからなる群から選択されるタグであることが好ましい。
【００４０】
［蛋白質の標識］
本発明において蛋白質の標識は、蛋白質の標識化部位に応じて一般的な標識方法を選択することが可能である。標識物質としては、蛍光標識化合物を用いることが好ましい。第１のタグを介して標識物質を蛋白質に結合させる場合、蛍光標識化合物としては、Ｈａｌｏ−タグ基質、ＴｅｔＣｙｓタグ基質、ＡＣＰタグ基質、ＭＰＣタグ基質、ＳＮＡＰタグ基質、ＣＬＩＰタグ基質、ＧＳＴタグ基質、ＭＢＰタグ基質、Ｔｒｘタグ基質からなる群から選択される低分子の蛍光標識化合物であることが好ましい。
【００４１】
また、上記のような低分子の蛍光標識化合物を用いて検出を行った場合、後の細胞を選択する過程において、バックグラウンドを減少させて微量なシグナルの検出が可能となる。その結果、蛋白質の初期生産性が低い細胞であっても、生産性に応じた細胞の選択が可能となる。
【００４２】
［細胞の捕捉］
前述したように、本発明の細胞を分画する過程においてゲルマイクロドロップ法を用い、かつゲルがストレプトアビジンを含有する場合、第２のタグに対するビオチン化抗体を用い、細胞により生産される蛋白質の第２のタグを介して、細胞を捕捉することも可能である。第２のタグとしては、ヘマグルチニンタグ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、ｍｙｃタグ、ＶＳタグ、Ｓタグ、Ｅタグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＨＳＶタグ、ＣＢＤタグ、ＣＢＰタグからなる群から選択されるタグであることが好ましい。
【実施例】
【００４３】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００４４】
［ゲルマイクロドロップ(GMD)の作成］
（材料）
・1×PBS（酵母の種類に応じたSD培地を２％加えておく。）
・100 mLのmedium瓶に70mLのmineral oil (SIGMA-ALDRICH 330779-1L) と0.7 mLのSpan80(SIGMA-ALDRICH S6760-250 mL)を添加し、撹拌子を入れてオートクレーブする。→（A）、（B）
・内圧式マイクロユニット(MN-20 SPGテクノ製)のモジュールにSPG膜（孔径15 μm 疎水性）をセットし、アルミホイルにくるみオートクレーブする。（SPG膜の内径はそれぞれで微妙に異なるので、SPG膜がo-リングに密着していることを良く確認する。密着が不足している際にはo-リングを最適なものに交換する。P4リングが最適と思われる。）
・1Lのガラスビーカーに精製水300 mLを入れてオートクレーブし、放冷後に温度制御付マグネチックスターラー（EYELA RCH-20L）で40℃に保温する（C）。
・Streptavidinを1 mg/mlとなるように溶解し、フィルター滅菌しておく。
・100 μm セルストレーナー
【００４５】
（注釈）
１．分散相10 mL中の理論上のGMD数は3.7×108個となる（平均φ45 μmと仮定）。酵母を1.85×107 cells/mLとなるように調整し、2.5% Agarose液と4:1になるように混合すると、GMDに対する酵母数は1/10となる。
２．好条件培養下での酵母の分裂周期は2時間である。このため、例えば30℃,16時間の培養で、single cellから分裂する細胞数は1×28＝256個となるため、温度を適切に設定することでGMD内の細胞数が増えすぎないようにコントロールしなければならない。
【００４６】
実施例1（anti-His-tag scFvを生産するサッカロミセス酵母の生産性向上）
αF-FLAG-HL(His-tag)-HA-Halo の場合
αF：サッカロミセス酵母のαファクターのシグナル配列およびプレプロ配列
FLAG：FLAG-tag
HL：anti-His-tag 抗体のH鎖、L鎖の可変領域をリンカーを介してこの順に接続したscFv
HA：HA-tag
Halo：Halo-tag
＊低温誘導性のHSP12プロモーターの下流に上記の遺伝子を接続し、さらにその下流にCYC1ターミネータを接続して、2ミクロンの複製起点を有するプラスミドでURA3をマーカーとしてYPH500に形質転換した。この形質転換体を用いた実験の詳細を以下に示した。
【００４７】
＜方法＞
１．内圧式マイクロユニットを安全キャビネット内に設置し15分以上UV殺菌する。
２．mineral oil（A）を（C）内で、40℃の水浴で保温する。
３．CelBioGel Encapsulation Matrixを70℃のヒートブロックで10分加温し、溶解する。（時々、転倒混和する、チューブのラベルを剥がしてから加温すると内部が見えやすい。1 sampleにつき2本（1 mL）用意する。）その後40℃で保温する。
４．18〜20時間（酵母の種類に応じて時間を調整する。）、前培養した酵母液を血球計算盤でカウントし、細胞数を1.85×107 cells/mLとなるように調整し、氷冷しておく。（酵母回収時の条件 1500 rpm 5 min）希釈懸濁後に細胞数を血球計算盤で再カウントする。この時、細胞がほぐれているかどうかもチェックする。その後氷冷しておく。（メスピペットの先端にイエローチップを付け、やわらかく吸引と押し出しを反復することにより、凝集した細胞を分散させる。
５．モジュールを内圧式マイクロユニットにセッティングし、SPG膜を（A）に浸す。
【００４８】
６．タンクに（B）10 mLを加え、窒素圧を3kPaに調整してタンク内のオイルを押し出す。圧はこのままの状態として供給バルブを閉じる。
７．1 mL のCelBioGel Encapsulation Matrixに酵母液250 μLを加え、よく混合し、分散相タンクに注入する。
８．オイルをスターラーで撹拌（450 rmp）しながら、供給バルブを開けGMDを作成する。この時ガス圧は2〜3 kPaとし、膜表面の色が変わったら0 kPaとする。（SPG膜のロットによりガス圧は変わる。溶出圧については経験的な感覚が大きい。）
９．水浴の温度設定は、放出開始時35℃で5 min → 30℃で15 min〜20 minへ途中で変更し、できるだけ酵母にダメージがかからないようにする。
１０．作成されたGMDを氷水中で、450 rpmで撹拌しながら15 min〜30 min程氷冷し、Agaroseを固化させる。
【００４９】
１１．50 mLファルコンチューブ２本に回収して、600×g、5 min、20℃で遠心する。
１２．オイルをデカンテーションにより捨て、30mLの1×PBSを加え、400×g、3 min、20℃で遠心する。（1×PBSを加えた際に、ピペッティングにより軽く壁面のオイルを落としておく。）
１３．上清を5〜7ml程度までピペットで除き、丁寧にピペッティングによりオイルに包まれた沈殿を懸濁させ、新しい15 mLファルコンチューブ１本にまとめる。
１４．400×g、3 min、20℃で遠心し、上清を除く。
１５．10 mlの1×PBSに懸濁し、400×g、1 min、20℃で遠心し、上清を除く。（これを3回程繰り返し、オイルを完全に除く）
【００５０】
１６．（必要があれば、70 μmのBDファルコンセルストレーナーでサイズの大きなGMDを取り除く。）
１７．GMDを4.0 ｍLの1×PBSに懸濁する。
１８．0.3 ｍLのGMDを残しunstained GMD controlとする。
１９．GMDとは別チューブに、滅菌済み Streptavidin 80μLを、4mLの1×PBSに懸濁し、これをGMDに加える。ローテーターでゆっくりと10分間、室温で撹拌する。
２０．400×g、1 min、20℃で遠心しGMDを回収し、上清を除く。
【００５１】
２１．10 mlの1×PBSに懸濁し、400×g、1 min、20℃で遠心し、上清を除く。（この洗浄作業を3回程繰り返す）
２２．GMDを4.3 mLの1×PBSに再懸濁する。
２３．0.3 ｍLのGMDを残し、negative GMD controlとする。
２４．GMDとは別チューブに、30 μLのビオチン化抗体を、2mLの1×PBSに懸濁し、これをGMD溶液に加える。ローテーターでゆっくりと10分間、室温で撹拌する。
２５．400×g、1 min、20℃で遠心しGMDを回収し、上清を除く。
【００５２】
２６．10 mlの1×PBSに懸濁し、400×g、1 min、20℃で遠心し、上清を除く。（この洗浄作業を3回程繰り返す）
２７．50 mL培養チューブにGMDと10 mLの培地を加え、75 rpm 24℃で10時間振盪培養する。（培養時間は目的の都度調製する）
２８．培養後GMDを400×g、1 min、20℃で遠心して回収し、上清を除く。
２９．10 mlの1×PBSに懸濁し、400×g、1 min、20℃で遠心し、上清を除く。（この洗浄作業を2回程繰り返す）
３０．染色作業が無い場合は1〜2 mlの1×PBSに懸濁し、15 mlファルコンチューブに移し、FACSで分析又は分取に供する。（氷上に保管）染色作業に進む場合はその染色に用いる基質に応じた手順（３１．）へ進む。基質をGMDに加える際には、必ずbufferに懸濁してからGMDに加える。直接GMDに加えることはしない。
【００５３】
３１．上清を除いたGMDに準備した基質溶液を加え、各基質に応じたincubationを行う。→下記参照
３２．incubation後、400×g、1 min、20℃で遠心して回収し、上清を除く。
３３．適当な量の1×PBSに懸濁し、400×g、1 min、20℃で遠心し、上清を除く。（この洗浄作業を2〜3回程繰り返す）
３４．1〜2 mlの1×PBSに懸濁し、15 mlファルコンチューブに移し、FACSで分析又は分取に供する。（氷上に保管）
【００５４】
＜GMDに使用時の、各基質とincubate時間について＞
・Halo Tag基質
diAcFAM Ligand ・ Alexa Fluor 488 Ligand ・ Alexa Fluor 660 Ligand
→ 1 mlのPBSに対して、1 μl
（→ GMD 1ml作製時、2〜3 mlのPBSに懸濁している）
Incubation: 30℃、15分、ヒートブロック（遮光）
【００５５】
・Cell Vue → Diluent C 1 ml に対して、Claret Dye 4 μl
Incubate: 室温、5分、ローテーター（遮光）
→ FBS 2 ml加える
→ 室温、2分、ローテーター（遮光）
【００５６】
・CFDA → 培養後GMD回収後、生理的食塩水を洗浄・懸濁に用いる。
1 mlの生理的食塩水に対して、10 μl（使用前に室温に30分以上出しておく。）
Incubation: 30℃、30分、ヒートブロック（遮光）
【００５７】
・CTC → 1 mlのPBSに対して、stock solution 20μlとEnhancing reagent A 1 μl
Incubation: 30℃、30分、ヒートブロック（遮光）
【００５８】
・FlAsH → 1 mlのPBSに対して、2 μl
Incubation: 30℃、15分、ヒートブロック（遮光）
【００５９】
・Calcein Deep Red Acetate → 1 mlのPBSに対して、stock solution 1μl
Incubation: 室温、1時間、ローテーター（遮光）
【００６０】
・Mito tracker FM → stock solution (1 mM)をPBSで100 nMにして使用する。
Incubation: 30℃、1時間、ヒートブロック（遮光）
【００６１】
・ACP Tag基質 → 1mlのPBSに対して、下記の試薬を入れる。
・CoA 488（1/200） 5 μl
・MgCl2（1/100） 10 μl
・SFP Synthase（1/40） 25 μl
・5% BSA（1/10） 100 μl
Incubation: 30℃、1時間、ローテーター（遮光）
【００６２】
上記のanti-His-tag scFvを生産するサッカロミセス酵母の形質転換体を培養して、生存率が約10%になるようにUV照射を行った。この変異株集団を上記に従ってFACSを用いて分離し、得られた変異株を包埋するGMDを一昼夜培養してプレートに撒いた。得られたコロニーを培養してELISAで測定した（図1）。こうして得られた変異株を親株と比較したところ、anti-His-tag scFvの生産性が親株に比較して10〜20倍に向上した株が得られた（図2）。
【００６３】
実施例2（Tandem scFvを生産するピキア酵母の生産性向上）
抗CD3抗体、および抗EGFR抗体の可変領域からなるscFvをリンカーを介して接続してTandem scFvとした。これを既知の高分泌化変異を有するαファクターのプレプロ配列の下流に接続し、更に上流にピキア酵母のGAP遺伝子のプロモーター（Pgap）を下流にピキア酵母のAOX遺伝子のターミネーター（Taox）を接続して、G418遺伝子をマーカーとするプラスミドに接続して大腸菌で増幅し、ピキア酵母（Pichia pastoris CBS7435株）に形質転換して染色体上に組み込んだ。こうして得られたTandem scFv生産性ピキア酵母（#254C）を用いて実施例1と同様にGMDを作製し、FACSを用いて分離したところ、約8倍に生産性が向上した株（P9-27）が得られた（図3）。
【図１】
2019140973.tif 000003
【図２】
2019140973.tif 000004
【図３】
2019140973.tif 000005