(57)【要約】【課題】安全性が高く、かつ広範囲の細胞に対して効率よく遺伝子を導入できるｉＰＳ細胞の作製方法を提供する。【解決手段】ｉＰＳ細胞の作製方法は、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたＭ遺伝子および１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたＨ遺伝子を含み、Ｆ遺伝子を欠損している、第１の分節されたゲノムと第２の分節されたゲノムとに分節された麻疹ウイルス由来のゲノムを有するウイルスベクターを細胞に感染させる感染工程を含み、第１の分節されたゲノムは、第１のリーダー配列、Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、第１のトレーラー配列および少なくとも１つのリプログラム因子をコードする遺伝子を含み、第２の分節されたゲノムは、第２のリーダー配列、Ｈ遺伝子、Ｌ遺伝子、第２のトレーラー配列および少なくとも１つのリプログラム因子をコードする遺伝子を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたＭタンパク質をコードする遺伝子および１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたＨタンパク質をコードする遺伝子を含み、Ｆタンパク質をコードする遺伝子を欠損している、第１の分節されたゲノムと第２の分節されたゲノムとに分節された麻疹ウイルス由来のゲノムを有するウイルスベクターを細胞に感染させる感染工程を含み、
前記第１の分節されたゲノムは、
第１のリーダー配列、Ｎタンパク質をコードする遺伝子、Ｐタンパク質をコードする遺伝子、前記Ｍタンパク質をコードする遺伝子、第１のトレーラー配列および少なくとも１つのリプログラム因子をコードする遺伝子を含み、
前記第２の分節されたゲノムは、
第２のリーダー配列、前記Ｈタンパク質をコードする遺伝子、Ｌタンパク質をコードする遺伝子、第２のトレーラー配列および少なくとも１つのリプログラム因子をコードする遺伝子を含む、
ｉＰＳ細胞の作製方法。
【請求項２】
前記細胞は、
血液細胞である、
請求項１に記載のｉＰＳ細胞の作製方法。
【請求項３】
前記血液細胞は、
造血幹細胞である、
請求項２に記載のｉＰＳ細胞の作製方法。
【請求項４】
前記血液細胞は、
ナイーブＴ細胞、幹細胞様記憶Ｔ細胞または未分化Ｂ細胞である、
請求項２に記載のｉＰＳ細胞の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｉＰＳ細胞の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
採取および投与における侵襲性が低いため、血液細胞は再生医療などの治療用細胞として、最も臨床応用されている。特に造血幹細胞および造血前駆細胞は、過去約３０年にわたって造血器を中心とした悪性腫瘍の治療法に用いられ、現在も一般治療法に用いられている。これらに加えて、リンパ球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞および樹状細胞などの血液細胞は、悪性腫瘍細胞に対する免疫細胞療法として臨床試験が進められてきている。
【０００３】
さらに近年、遺伝子を改変した血液細胞を用いた遺伝子治療に関して、重症先天性疾患または悪性腫瘍に対して臨床試験が進められてきている。特にＴ細胞受容体あるいはキメラ抗原受容体遺伝子を導入した遺伝子改変Ｔ細胞療法は、悪性腫瘍に対する顕著な治療効果が期待できる新規治療法として注目されている。
【０００４】
現在、Ｔ細胞への遺伝子導入には、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターが使用されている。しかし、レンチウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターの場合、ゲノムＤＮＡへの挿入によるゲノム毒性が問題である。
【０００５】
これに対し、ゲノムＤＮＡへの挿入の可能性が低い遺伝子導入法として、アデノウイルスベクターを使用する方法、さらには、ｍＲＮＡおよびプラスミドなどを用いる非ウイルス系ベクターを使用する方法が知られている。しかし、アデノウイルスベクターおよび非ウイルス系ベクターでは、導入効率が極めて低く、使用できる細胞種が限られている。
【０００６】
ゲノムＤＮＡへの挿入の可能性が低い遺伝子導入法として、センダイウイルスベクターも知られている。例えば、特許文献１には、Ｆ遺伝子を欠損させて、２次的な感染性ウイルス粒子を放出しないように改変したセンダイウイルスベクターが開示されている。また、特許文献２には、細胞のリプログラミングに関する遺伝子を搭載したセンダイウイルスベクターが開示されている。
【０００７】
センダイウイルスと同じパラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）に属する麻疹ウイルスは、免疫細胞および上皮細胞に極めて高い感染力を保持したウイルスである。特許文献３には、複数に分節されたゲノムを保持し、少なくとも１つの分節ゲノムが宿主内で発現可能な外来遺伝子を含む麻疹ウイルスが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第３６０２０５８号公報
【特許文献２】国際公開第２０１０／００８０５４号
【特許文献３】国際公開第２００７／００７９２１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
Ｔ細胞に遺伝子を導入する場合、上記特許文献１および特許文献２に開示されたセンダイウイルスベクターでは、センダイウイルスベクターの作製が比較的困難なうえ、センダイウイルスが残存しやすく、取り除くのが困難であるという不都合がある。また、センダイウイルスの本来の宿主ではないヒトに対して、センダイウイルスベクターがどのような影響を及ぼすのか知見が少なく、安全性の面で実際の臨床利用には躊躇せざるを得ない。
【００１０】
また、アデノウイルスベクターと同様に、上記特許文献１および特許文献２に開示されたセンダイウイルスベクターならびに上記特許文献３に開示された麻疹ウイルスでは、遺伝子の導入効率を上げるため、遺伝子導入に先立ちＴ細胞を刺激して活性化させる必要がある。このため、Ｔ細胞の活性化によるＴ細胞の分化が誘起されることが懸念され、ナイーブＴ細胞および未分化Ｂ細胞などへの遺伝子導入が困難である。
【００１１】
上記のように従来のウイルスベクターでは、ヒトへの使用における安全性が十分に担保されておらず、効率よく遺伝子を導入できる細胞が限定されている。
【００１２】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、安全性が高く、かつ広範囲の細胞に対して効率よく遺伝子を導入できるｉＰＳ細胞の作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明に係るｉＰＳ細胞の作製方法は、
１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたＭタンパク質をコードする遺伝子および１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたＨタンパク質をコードする遺伝子を含み、Ｆタンパク質をコードする遺伝子を欠損している、第１の分節されたゲノムと第２の分節されたゲノムとに分節された麻疹ウイルス由来のゲノムを有するウイルスベクターを細胞に感染させる感染工程を含み、
前記第１の分節されたゲノムは、
第１のリーダー配列、Ｎタンパク質をコードする遺伝子、Ｐタンパク質をコードする遺伝子、前記Ｍタンパク質をコードする遺伝子、第１のトレーラー配列および少なくとも１つのリプログラム因子をコードする遺伝子を含み、
前記第２の分節されたゲノムは、
第２のリーダー配列、前記Ｈタンパク質をコードする遺伝子、Ｌタンパク質をコードする遺伝子、第２のトレーラー配列および少なくとも１つのリプログラム因子をコードする遺伝子を含む。
【００１４】
この場合、前記細胞は、
血液細胞である、
こととしてもよい。
【００１５】
また、前記血液細胞は、
造血幹細胞である、
こととしてもよい。
【００１６】
また、前記血液細胞は、
ナイーブＴ細胞、幹細胞様記憶Ｔ細胞または未分化Ｂ細胞である、
こととしてもよい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、安全性が高く、かつ広範囲の細胞に対して効率よく遺伝子を導入できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】６遺伝子を搭載した非伝播型の麻疹ウイルスベクターの分節されたゲノムの構成を示す図である。
【図２】図１に示す麻疹ウイルスベクタープラスミドの構成を示す図である。
【図３】麻疹ウイルスベクターを導入したＢＪ細胞および活性化Ｔ細胞の蛍光画像を示す図である。
【図４】麻疹ウイルスベクターに搭載した遺伝子の発現解析の結果を示す図である。
【図５】麻疹ウイルスベクターおよびセンダイウイルスベクターの各血球系細胞への導入効率を示す図である。
【図６】麻疹ウイルスベクターおよびセンダイウイルスベクターの臍帯血由来Ｔ細胞への導入効率を示す図である。
【図７】麻疹ウイルスベクターとセンダイウイルスベクターの末梢血由来Ｔ細胞の各分画への導入効率を示す図である。
【図８】ＢＪ細胞より樹立した多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）のコロニーの位相差図および蛍光画像を示す図である。
【図９】Ｔ細胞より樹立したｉＰＳ細胞の初代コロニーの位相差図および蛍光画像を示す図である。
【図１０】ＢＪ細胞由来ｉＰＳ細胞の未分化マーカーの発現を示す図である。
【図１１】ＲＴ−ＰＣＲ法による未分化マーカーおよびウイルス由来遺伝子の発現解析の結果を示す図である。
【図１２】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける三胚葉系分化誘導解析の結果を示す図である。
【図１３】奇形腫形成試験による三胚葉系分化能の解析結果を示す図である。
【図１４】ＢＪ細胞由来ｉＰＳ細胞の核型解析の結果を示す図である。
【図１５】基底状態のｉＰＳ細胞の形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明に係る実施の形態について説明する。
（実施の形態１）
まず、実施の形態１について詳細に説明する。本実施の形態に係るウイルスベクターは、パラミクソウイルス科に属するウイルス由来のゲノムを含む。
【００２０】
パラミクソウイルス科に属するウイルス（以下、単に「ウイルス」ともいう）は、（−）鎖ＲＮＡゲノムを有するＲＮＡウイルスである。ウイルスとしては、麻疹ウイルス（Measles virus）、センダイウイルス（Sendai virus）、ニューカッスル病ウイルス（Newcastle disease virus）、おたふくかぜウイルス（Mumps virus）、１型パラインフルエンザウイルス（Parainfluenza virus 1）、２型パラインフルエンザウイルス（Parainfluenza virus 2）、３型パラインフルエンザウイルス（Parainfluenza virus 3）、５型パラインフルエンザウイルス（Parainfluenza virus 5、Simian virus 5）、メタニューモウイルス（Metapneumo virus）、ＲＳウイルス（Respiratorysyncytial virus）、牛疫ウイルス（Rinderpest virus）、およびジステンパーウイルス（Distemper virus）が挙げられる。上記パラミクソウイルス科に属するウイルスは、好適には、麻疹ウイルスである。
【００２１】
パラミクソウイルス科に属するウイルスのゲノムは、非分節の一本鎖ＲＮＡで、３’末端にリーダー配列（Ｌｅ）と、５’末端にトレーラー配列（Ｔｒ）と、を有する。リーダー配列とトレーラー配列との間には、ウイルスを構成する機能性タンパク質をコードする各種遺伝子が配置されている。リーダー配列はプロモーター活性を有する。トレーラー配列はアンチゲノムの場合にプロモーター活性を有する。
【００２２】
機能性タンパク質をコードする主な遺伝子は、Ｎタンパク質をコードする遺伝子（Ｎ遺伝子）、Ｐタンパク質をコードする遺伝子（Ｐ遺伝子）、Ｍタンパク質をコードする遺伝子（Ｍ遺伝子）、Ｆタンパク質をコードする遺伝子（Ｆ遺伝子）、Ｈタンパク質をコードする遺伝子（Ｈ遺伝子）ならびにＬタンパク質をコードする遺伝子（Ｌ遺伝子）である。ゲノムにおける６つの遺伝子各々の両末端には、転写開始配列および転写終結配列という転写の制御配列がある。
【００２３】
Ｎタンパク質は、ウイルスのゲノムに対して５’末端から順に整然と並んで結合し、ゲノムＲＮＡを包装する。Ｐタンパク質は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの小サブユニットとして機能し、ウイルスのゲノムの転写複製に関与する。なお、Ｐ遺伝子からは、ＲＮＡ編集（RNA editing）機構などによりＶタンパク質およびＣタンパク質などのアクセサリータンパク質が合成されることがある。Ｌタンパク質は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの大サブユニットとして機能し、Ｐタンパク質とともにウイルスのゲノムの転写複製に関与する。
【００２４】
Ｍタンパク質は、ウイルス粒子の構造を内側から支えるマトリックスタンパク質である。Ｆタンパク質は、細胞融合に関与しており、ウイルスに病原性をもたらす。Ｈタンパク質は、ウイルス受容体結合タンパク質である。Ｈタンパク質は、野生型のウイルスが感染のための受容体としてのＳＬＡＭ（Signaling lymphocyte activation module）またはＮｅｃｔｉｎ４に結合する。ＳＬＡＭおよびＮｅｃｔｉｎ４は、限られた細胞種のみで発現しているため、ウイルスの宿主域を限定している。
【００２５】
パラミクソウイルス科に属するウイルス由来のゲノムとは、上記機能性タンパク質をコードする遺伝子を有しており、感染細胞において増幅され得るゲノムを意味する。
【００２６】
本実施の形態に係るウイルスベクターに含まれる上記ゲノムでは、Ｈ遺伝子およびＦタンパク質の両方が改変されている。Ｈ遺伝子の改変は、例えば、Ｈ遺伝子の欠損である。Ｈ遺伝子を欠損させることで、Ｈタンパク質の発現を消失させることができる。また、Ｈ遺伝子の改変は、Ｈタンパク質の１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加される変異であってもよい。
【００２７】
より具体的には、Ｈ遺伝子の改変は、例えば、Ｈタンパク質の３９０番目のアスパラギンのイソロイシンへの置換（Ｎ３９０Ｉ）、４１６番目のアスパラギンのアスパラギン酸への置換（Ｎ４１６Ｄ）、４４６番目のトレオニンのセリンへの置換（Ｔ４４６Ｓ）、４８１番目のアスパラギンのチロシンへの置換（Ｎ４８１Ｙ）および４９２番目のグルタミン酸のグリシンへの置換（Ｅ４９２Ｇ）である。これらの置換によって、Ｈタンパク質は、ＳＬＡＭおよびＮｅｃｔｉｎ４に加え、ほぼすべての細胞において発現が認められるmembrane co-factor protein（ＣＤ４６）に結合できる。
【００２８】
Ｈ遺伝子を改変することで、野生型のＨタンパク質に対して、Ｈタンパク質の構造または機能を変化させることができる。上述のようにＨタンパク質はウイルス受容体結合タンパク質であるため、当該ウイルスベクターは、Ｈ遺伝子の改変によって、ＳＬＡＭおよびＮｅｃｔｉｎ４以外の分子を受容体として利用できる。すなわち、Ｈ遺伝子を改変することで、ウイルスベクターの感染できる細胞種を増加させることができる。
【００２９】
Ｆ遺伝子の改変は、例えば、Ｆ遺伝子の欠損である。Ｆ遺伝子を欠損させることで、Ｆタンパク質の発現を消失させることができる。例えば、麻疹ウイルスのゲノムを用いた場合、Ｆタンパク質を欠損させたウイルスベクターは、特殊な細胞株（Ｖｅｒｏ／ＳＬＡＭ／Ｆ細胞）を除く他の細胞内で病原性をもったウイルスを産生できない。このため、上記特殊な細胞株に感染させない限り、当該ウイルスベクターの伝播性を消失させることができる。
【００３０】
Ｆ遺伝子の改変は、Ｆタンパク質の１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加される変異であってもよい。当該変異によって、野生型のＦタンパク質に対して、Ｆタンパク質の構造または機能を変化させればよい。
【００３１】
また、上記ゲノムにおけるＭタンパク質をコードする遺伝子が、Ｍタンパク質の１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加される変異を有してもよい。変異の例として、Ｍタンパク質の６４番目のプロリンのセリンへの置換（Ｐ６４Ｓ）および８９番目のグルタミン酸のグリシンへの置換（Ｅ８９Ｇ）が挙げられる。Ｍタンパク質はウイルス粒子の構造を内側から支えるマトリックスタンパク質であるため、Ｍタンパク質に変異を導入することで、ウイルス粒子形成能を向上させ、さらに細胞融合能を低下させることができる。
【００３２】
本実施の形態に係るウイルスベクターに含まれる上記ゲノムは、外来遺伝子を有する。このため、当該ウイルスベクターは、外来遺伝子を発現させることができる。外来遺伝子は、限定されないが、例えば、ウイルス、細菌および寄生虫などの病原性を惹起する各種タンパク質をコードする遺伝子、各種サイトカインをコードする遺伝子、各種ペプチドホルモンをコードする遺伝子、および細胞のリプログラミング因子をコードする遺伝子などが挙げられる。また、外来遺伝子として、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）またはＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescent Protein）をコードする遺伝子などのレポーター遺伝子を挿入してもよい。
【００３３】
外来遺伝子の数は、特に限定されないが、好適には２〜６個である。具体的に例示される外来遺伝子として、リプログラミング因子であるＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２およびＫＬＦ４などが挙げられる。もちろんその他のリプログラミング因子であるＬ−ＭＹＣおよびＰＩＮ１などが外来遺伝子としてゲノムにさらに挿入されてもよい。
【００３４】
上記機能性タンパク質をコードする遺伝子および外来遺伝子のゲノムにおける配置は、リーダー配列とトレーラー配列との間であれば特に限定されない。ゲノムにおける上記機能性タンパク質をコードする遺伝子の相互の位置関係は、野生型のウイルスのゲノムにおける並び順などの位置とは無関係に、任意に決定することができる。
【００３５】
本実施の形態に係るウイルスベクターに含まれる上記ゲノムは、複数に分節されてもよい。分節とは、ゲノムＲＮＡが、複数本のＲＮＡに断片化されることを意味する。つまり、複数に分節されたゲノムは、１つのゲノムとして機能する一組のＲＮＡ群である。分節されたゲノムの本数は、限定されないが、最大で６本であることが好ましく、特に好ましくは２本である。
【００３６】
この場合、分節されたゲノム各々は、リーダー配列とトレーラー配列とを有する。好ましくは、分節されたゲノム各々の一端にリーダー配列が配置され、他端にトレーラー配列が配置される。この場合、分節された各ゲノムのリーダー配列とトレーラー配列との間に、上記の機能性タンパク質をコードする遺伝子のいずれか、および外来遺伝子が配置される。
【００３７】
機能性タンパク質をコードする遺伝子および外来遺伝子は、複数に分節されたゲノムの１本に挿入されてもよいし、２本以上に挿入されてもよい。複数個の外来遺伝子を発現させる場合は、複数に分節されたゲノムの１本に、複数個の外来遺伝子のすべてが挿入されてもよいし、あるいは、複数に分節されたゲノムの２本以上に、それぞれ１個以上の外来遺伝子が挿入されることで、全体として複数個の外来遺伝子が挿入されてもよい。複数に分節されたゲノムの１本に複数個の外来遺伝子が挿入される場合、その個数は、上記機能性タンパク質をコードする遺伝子の発現効率が著しく低下しない範囲内であれば限定はされない。
【００３８】
複数に分節されたゲノムにおける外来遺伝子の配置は、特に限定されない。例えば、麻疹ウイルスのゲノムを２本に分節し、Ｆ遺伝子を欠損させて、リプログラミング因子を外来遺伝子として挿入した場合、第１の分節されたゲノムには、３’末端から５’末端に向かって、リーダー配列、ＯＣＴ３／４、Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子、改変されたＭ遺伝子、ＳＯＸ２、トレーラー配列の順に配置され、第２の分節されたゲノムには、３’末端から５’末端に向かって、リーダー配列、ＫＬＦ４、改変されたＨ遺伝子、Ｌ遺伝子、トレーラー配列の順に配置される。外来遺伝子としてＬ−ＭＹＣおよびＰＩＮ１をさらに挿入する場合、好適には、ＳＯＸ２とトレーラー配列との間にＬ−ＭＹＣを、Ｈ遺伝子とＬ遺伝子との間にＰＩＮ１を挿入すればよい。
【００３９】
Ｈ遺伝子、Ｆ遺伝子およびＭ遺伝子を除く上記機能性タンパク質をコードする遺伝子は、野生型ウイルスのゲノムに含まれる各遺伝子の塩基配列と完全に同一でなくとも、転写および複製における活性が野生型の活性と同等かそれ以上であれば、変異が導入されたものであってもよい。機能性タンパク質をコードする遺伝子は、例えば、転写および複製における活性が天然型の各タンパク質と同等またはそれ以上であれば、１もしくは数個、例えば１〜１５個、好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなるタンパク質をコードする塩基配列であってもよい。当該変異型のタンパク質と天然型のタンパク質とのアミノ酸配列の相同性は、例えば、９０〜１００％であることが好ましいが、転写および複製における活性が、保持されていれば、アミノ酸の相同性は、例えば、４０〜９０％であってもよい。
【００４０】
上記のリプログラミング因子をコードする遺伝子およびＥＧＦＰをコードする遺伝子を外来遺伝子として有する分節されたゲノムの好適な例を図１に示す。２本の当該分節されたゲノムでは、Ｈタンパク質にＮ３９０Ｉ、Ｎ４１６Ｄ、Ｔ４４６Ｓ、Ｎ４８１ＹおよびＥ４９２Ｇの変異が加わるようにＨ遺伝子が改変され（Ｈ８）、さらにＦ遺伝子が欠損している。また、Ｍタンパク質にＰ６４ＳおよびＥ８９Ｇの変異が加わるようにＭ遺伝子が改変されている（Ｍ６４８９）。なお、Ｐ遺伝子はＰ／Ｖ／Ｃとして示されている。
【００４１】
当該ウイルスベクターは、細胞感染能および伝播力を有している。細胞感染能とは、宿主となる細胞への接着能および膜融合能を保持することで、細胞内にウイルス内部のゲノムなどを導入し得る能力である。また、伝播力とは、細胞内に導入されたゲノムを複製し、感染性粒子またはそれに準ずる複合体を形成して、当該ゲノムを別の細胞に伝播し得る能力である。
【００４２】
本実施の形態に係るウイルスベクターは、公知のウイルスベクターの作製方法で作製できる。例えば、当該ウイルスベクターは、ウイルスのゲノムゲノムに対応するｃＤＮＡを用いて、あるいは、ウイルスのゲノムを用いて、ウイルス粒子の再構成を行うことにより、作製することができる。ここで、ウイルス粒子の再構成とは、ウイルスのゲノムを人工的に作製し、試験管内または細胞内において、もとのウイルスまたは組換えウイルスを作製することを意味する。
【００４３】
いずれの方法においても、通常は、ウイルスからゲノムを単離し、逆転写反応などによりゲノムのｃＤＮＡを作製する。続いて、ゲノムを分節する場合は、公知の遺伝子組み換え技術および核酸増幅法などにより、当該ｃＤＮＡを複数のｃＤＮＡに断片化したうえで、外来遺伝子の挿入などの操作を施す。断片化の方法は、ゲノムから作製したｃＤＮＡの塩基配列などに基づいて結果的に複数のｃＤＮＡ断片が調製される方法であればよく、限定はされない。
【００４４】
ゲノムから作製したｃＤＮＡの塩基配列に基づく調製方法としては、例えば、ゲノムから作製したｃＤＮＡ中の所定の領域を鋳型としてＰＣＲ法などで増幅断片を得る方法が挙げられる。所定の領域は、発現させるゲノムの構造を考慮して適宜設定することができ、限定はされない。所定の領域は、ウイルスの機能性タンパク質をコードする各遺伝子断片をそれぞれ個別に増幅できるように設定することが好ましい。このように領域を設定した場合は、得られた各遺伝子の増幅断片を、所望の種類、個数、並び順（位置）で結合させることで、ｃＤＮＡ断片を調製することができる。
【００４５】
分節されたゲノムに外来遺伝子を挿入するには、別途調製した外来遺伝子を含むＤＮＡ断片を、上述の分節化したｃＤＮＡ中に、公知の遺伝子組み換え技術を用いて挿入すればよい。図１に示すＮ遺伝子を含む第１の分節されたゲノムに対応するｃＤＮＡの塩基配列およびＨ遺伝子を含む第２の分節されたゲノムに対応するｃＤＮＡの塩基配列は、それぞれ配列番号１および配列番号２に示される。
【００４６】
ウイルス粒子の再構成には、調製されたｃＤＮＡ断片を含むＤＮＡ、好ましくはプラスミドＤＮＡ、または、ｃＤＮＡを予めｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写したＲＮＡを用いればよい。
【００４７】
一般に、パラミクソウイルス科に属するウイルスのゲノムまたはそのアンチゲノムを裸のＲＮＡのまま宿主細胞内に導入しても、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの鋳型とはならない。鋳型となるには、当該ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成反応の初期段階において、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質およびＬタンパク質が存在し、これらタンパク質とゲノムＲＮＡとの複合体（ＲＮＰ複合体）の形成が必要である。そのため、ウイルスベクターを再構成するには、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質およびＬタンパク質を併せて発現させるか、あるいは、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質およびＬタンパク質を発現し得る宿主を用いることが望ましい。これに加え、上記ウイルスベクターに含まれるＲＮＡのＦ遺伝子を欠損させた場合は、Ｆタンパク質も発現し得る宿主を用いるのが好ましい。
【００４８】
上記ウイルスベクターは、例えば、ウイルスのＮタンパク質、Ｐタンパク質およびＬタンパク質を発現する宿主内に、上記ゲノムまたはそのｃＲＮＡを導入することで作製できる。また、ウイルスのＮタンパク質、Ｐタンパク質およびＬタンパク質を発現する宿主内に、上記ゲノムまたはそのｃＲＮＡの鋳型となるｃＤＮＡを含むＤＮＡと、当該ＤＮＡの転写ユニットと、を導入してもよい。この他、宿主内に、上記ゲノムまたはそのｃＲＮＡの鋳型となるｃＤＮＡを含むＤＮＡと、ウイルスのＮ遺伝子を含むＤＮＡと、ウイルスのＰ遺伝子を含むＤＮＡと、ウイルスのＬ遺伝子を含むＤＮＡと、これらＤＮＡの転写ユニットと、を導入してもよい。
【００４９】
上記宿主が発現するＮタンパク質、Ｐタンパク質およびＬタンパク質としては、これらの天然型のタンパク質の活性と同等またはそれ以上であれば、完全に同一のものでなくてもよく、例えば、１もしくは数個、例えば１〜１５個、好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなるタンパク質であってもよいし、あるいは、他のウイルス由来またはアミノ酸配列が大きく異なる全く別のタンパク質であってもよい。
【００５０】
上記宿主は、上記機能性タンパク質および外来遺伝子が発現し得る細胞であれば、特に限定はされず、例えば、培養された哺乳動物または鳥類の細胞、鶏卵などが挙げられる。具体的に、培養細胞としては、例えば、ＢＨＫ−Ｔ７／９細胞、ＣＨＯ、２９３細胞、Ｂ９５ａ、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞、ＬＬＣＭＫ２、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＣＶ−１、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、Ｐ１９、Ｆ９、ＰＣｌＺ、ＢＡＦ３、Ｊｕｒｋａｔ、ヒトＰＢＭＣＮ、ＭＴ−４、Ｍｏｌｔ−４、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｌ９２９、Ｖｅｒｏ／ｈＳＬＡＭ、ＣＨＯ／ｈＳＬＡＭ、Ａ５４９／ｈＳＬＡＭ、ＨｅＬａ／ｈＳＬＡＭ、２９３Ｔ、ＢＨＫおよびニワトリ胚繊維芽細胞などを用いることができる。また、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などの昆虫細胞を用いることもできる。
【００５１】
上記転写ユニットとしては、例えば、所定のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルス、所定のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＤＮＡなどが好ましい。
【００５２】
また、上記製造方法で得られるウイルスベクターは、他の細胞との共培養などにより選択的かつ効率的に増殖させることができる。例えば、麻疹ウイルスを用いたウイルスベクターの場合、上記製造方法で得られた再構成したウイルスベクターを含む培養細胞を、あらかじめ培養しておいたＶｅｒｏ／ＳＬＡＭ／Ｆ細胞上に播き、共培養することにより、ウイルスベクターが感染および増殖したＶｅｒｏ／ＳＬＡＭ／Ｆ細胞の巨細胞を得ることができる。
【００５３】
より具体的には、例えば、麻疹ウイルスベクターを作製する場合、図１に示す分節されたゲノムに対応する２つのプラスミドを、必要に応じて機能性タンパク質をコードする遺伝子を含む他のプラスミドとともに、適切な細胞に導入すればよい。その後、細胞を回収し、Ｖｅｒｏ／ＳＬＡＭ／Ｆ細胞上へ播種し、出現した巨細胞を採取すれば、麻疹ウイルスベクターを取得できる。麻疹ウイルスベクターを、新たなＶｅｒｏ／ＳＬＡＭ／Ｆ細胞に感染させ、増幅させてから麻疹ウイルスベクターを放出させてもよい。この場合、遠心分離によってウイルスを含む上清をウイルス液として回収できる。
【００５４】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るウイルスベクターは、Ｈ遺伝子が改変されているため、多様な細胞種に感染でき、すなわち宿主域を拡げることができる。また、当該ウイルスベクターは、Ｆ遺伝子が改変されているため、細胞感染能をもつウイルスの産生を防ぐことができ、伝播性を消失させることで安全性を向上させることができる。また、上記ウイルスベクターは、複製過程のすべてが細胞質内で行われ、ＤＮＡ合成を伴わないため、ゲノム毒性の懸念がなく、極めて安全性が高い。
【００５５】
なお、本実施の形態に係るウイルスベクターに含まれるゲノムは、複数に分節されてもよいこととした。こうすることで、複数の外来遺伝子またはサイズの大きい遺伝子を搭載することができる。また、分節されたゲノム各々は、リーダー配列とトレーラー配列とを有してもよいこととした。パラミクソウイルス科に属するウイルスでは、下流（５’側）の遺伝子ほど発現が低くなる特徴的な遺伝子発現のパターンが知られているが、分節されたゲノム各々がリーダー配列とトレーラー配列とを有することで、分節されたゲノム各々にポリメラーゼが作用することができ、各遺伝子の発現量を高めることができる。また、宿主において複数の外来遺伝子を同時に発現させることができる。さらに、ゲノムを２本に分節することで、タンパク質の発現効率を高く維持するのに好適なゲノムのサイズになる。もちろん分節されていない１本のゲノムでも同様な機能を発揮できる。
【００５６】
なお、本実施の形態では、分節されたゲノム上のＭタンパク質をコードする遺伝子が、Ｍタンパク質の１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加される変異を有してもよいこととした。こうすることで、当該ウイルスベクターの細胞に対する遺伝子導入効率および安全性をさらに高めることができる。
【００５７】
また、本実施の形態では、ウイルスが麻疹ウイルスであってもよいこととした。麻疹ウイルスは、免疫細胞に対する強い指向性を有するため、上記ウイルスベクターによれば、Ｂ細胞、Ｔ細胞および顆粒球に対しても高効率に遺伝子導入が可能である。さらに、上記ウイルスベクターは、下記実施例に示すように、活性化していないナイーブＴ細胞、セントラル記憶Ｔ細胞、エフェクター記憶Ｔ細胞およびＢ細胞さらには造血幹細胞を含む血液細胞にも極めて高効率に遺伝子導入が可能である。また、麻疹ウイルスは、本来ヒトを宿主とするので、ヒトへの影響に関する知見が蓄積されているため、安全面に配慮しながら適切に使用することができる。
【００５８】
なお、本実施の形態では、外来遺伝子の例として、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２およびＫＬＦ４を挙げた。本実施の形態に係るウイルスベクターのゲノムとして麻疹ウイルスのゲノムを用いた場合、リプログラミング因子をコードする遺伝子を搭載した当該ウイルスベクターによって、従来法では、作製が非常に困難な基底状態のｉＰＳ細胞を作製することができる。
【００５９】
なお、本実施の形態に係るウイルスベクターに含まれるＲＮＡは、ウイルスが本来有するゲノムと同様に（−）鎖ＲＮＡの他に、必要に応じて、（＋）鎖ＲＮＡであってもよい。
【００６０】
別の実施の形態では、上記ウイルスベクターに含まれるゲノムの作製に好適なコンストラクトが提供される。該コンストラクトは、パラミクソウイルス科に属するウイルス由来の、３’末端にリーダー配列が、５’末端にトレーラー配列がそれぞれ配置された複数に分節されたゲノムの鋳型となる核酸を含み、当該分節されたゲノムにおけるＨタンパク質をコードする遺伝子およびＦタンパク質をコードする遺伝子の両方が改変されている。
【００６１】
上記核酸は、上述の分節された各ゲノムに基づいて作製されたｃＤＮＡまたはｃＲＮＡであってもよい。例えば、当該核酸は、分節された各ゲノムに対応する複数のｃＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡであってもよい。
【００６２】
例えば、麻疹ウイルスのゲノムを２本に分節し、Ｆ遺伝子を欠損させた場合、上記コンストラクトは、３’末端から５’末端に向かって、リーダー配列、Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子およびトレーラー配列の順に配置されたゲノムに対応するｃＤＮＡと、３’末端から５’末端に向かって、リーダー配列、Ｈ遺伝子、Ｌ遺伝子およびトレーラー配列の順に配置されたゲノムに対応するｃＤＮＡを含む。
【００６３】
当該コンストラクトは、従来の遺伝子工学における遺伝子組み換え技術を用いて、容易に外来遺伝子を挿入することができる。当該コンストラクトを上記のようにウイルス粒子の再構成に用いることで、上記分節された各ゲノムを含むウイルスベクターが効率よく作製できる。
【００６４】
当該コンストラクトは、従来の形質転換または形質感染技術を介して原核細胞または真核細胞に導入され得る。例えば、当該発現コンストラクトをプラスミドの形態で各種細胞に導入することができる。
【００６５】
なお、上記コンストラクトが含む核酸は、パラミクソウイルス科に属するウイルスのゲノム由来の、３’末端にリーダー配列が、５’末端にトレーラー配列がそれぞれ配置された複数に分節されたゲノムのｃＲＮＡであってもよい。また、上記コンストラクトは、パラミクソウイルス科に属するウイルス由来の、３’末端にリーダー配列が、５’末端にトレーラー配列が配置されたゲノムの鋳型となる核酸を含み、当該ゲノムにおけるＨタンパク質をコードする遺伝子およびＦタンパク質をコードする遺伝子の両方が改変されていてもよい。
【００６６】
（実施の形態２）
次に、実施の形態２について説明する。本実施の形態に係る細胞は、上記実施の形態１に係るウイルスベクターによって外来遺伝子が導入されたものである。
【００６７】
ウイルスベクターは、公知の方法で細胞に感染させることができる。例えば、細胞を含む培養液にウイルスベクターを添加し、室温において１，２００×ｇで４５分間、遠心すればよい。この他、ウイルスベクターを細胞に感染させる方法として、電気穿孔法、リポフェクション法、ヒートショック法、ＰＥＧ法、リン酸カルシウム法およびＤＥＡＥデキストラン法などの各種ウイルスを細胞に感染させる方法が挙げられる。
【００６８】
細胞は、特に限定されないが、ヒトの体細胞、線維芽細胞、血液細胞の他、サルの体細胞などである。細胞としては、Ｂ細胞、活性化した、または活性化していないＴ細胞、顆粒球、造血幹細胞を含む血液細胞などが好適である。特に好適な細胞は、ナイーブＴ細胞、幹細胞様記憶Ｔ細胞または未分化Ｂ細胞である。細胞に外来遺伝子を導入する際の当該ウイルスベクターの力価は、とくに限定されないが、ＭＯＩ（multiplicity of infection）が１〜１００、好ましくは３〜２０、より好ましくは５〜１０である。
【００６９】
少なくともＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２およびＫＬＦ４を外来遺伝子として含む上記ウイルスベクターで外来遺伝子を導入された細胞は、未分化マーカーを発現し、三胚葉系分化能を有するｉＰＳ細胞に誘導される。上記ウイルスベクターで遺伝子を導入することで、基底状態のｉＰＳ細胞も誘導できる。
【００７０】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る細胞は、上記ウイルスベクターによって遺伝子が導入されるので、所望の複数の外来遺伝子を、同時に長期にわたって発現することができる。また、遺伝子導入の対象としてナイーブＴ細胞、幹細胞様記憶Ｔ細胞または未分化Ｂ細胞、さらには造血幹細胞を選択できるため、本実施の形態に係る細胞は、遺伝子を改変した血液細胞を用いた遺伝子治療、特に遺伝子改変Ｔ細胞療法に極めて有用である。
【００７１】
また、当該細胞は、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２およびＫＬＦ４を含む上記ウイルスベクターで外来遺伝子を導入され、基底状態のｉＰＳ細胞に誘導される。基底状態のｉＰＳ細胞は、増殖効率がより高く、単細胞で播種しても増殖できるため、大量作製と容易な保存が可能になる。また、基底状態であるため、広範囲の細胞種に分化させることができる。
【００７２】
なお、本実施の形態に係る細胞の用途は、外来遺伝子に応じて様々である。細胞に導入する外来遺伝子をＴ細胞受容体遺伝子またはキメラ抗原受容体遺伝子とすることで、悪性腫瘍に対するＴ細胞療法に利用できる。また、外来遺伝子としてＴ細胞にＺｎフィンガーヌクレアーゼなどを導入してＣＣＲ５遺伝子を破壊（遺伝子編集）することで、ＨＩＶ／ＡＩＤＳに対する治療に利用できる。アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）などの酵素欠損症の患者の細胞に酵素をコードする遺伝子を導入することで、酵素欠損症の治療も可能である。
【００７３】
なお、別の実施の形態では、ｉＰＳ細胞の作製方法が提供される。当該ｉＰＳ細胞の作製方法は、上記実施の形態２に係るウイルスベクターを細胞に感染させる感染工程を含む。該細胞は、血液細胞であってもよく、活性化（刺激）していない免疫細胞、好適にはナイーブＴ細胞である。当該ｉＰＳ細胞の作製方法は、基底状態のｉＰＳ細胞の作製方法を包含する。
【実施例】
【００７４】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００７５】
（細胞培養）
下記実施例における細胞培養は以下のように行った。マウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ細胞）、Ｖｅｒｏ／ＳＬＡＭ細胞、線維芽細胞株であるＢＪ細胞は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（ナカライテスク社製）に１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を含有させた培養液で培養した。Ｖｅｒｏ／ＳＬＡＭ／Ｆ細胞は、ＤＭＥＭに０．５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（ナカライテスク社製）およびＦＢＳを７．５％で含有させた培養液で培養した。
【００７６】
ＢＨＫ−Ｔ７／９細胞はα改変ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  ｅａｇｌｅ（α−ＭＥＭ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に、６００μｇ／ｍＬのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ（ナカライテスク社製）および１０％ＦＢＳを含有させた培養液で培養した。健常人の末梢血由来血液細胞は、ＲＰＭＩ１６４０（ナカライテスク社製）に１０％ＦＢＳを含有させた培養液で培養した。臍帯血由来または健常人由来Ｔ細胞は、ＲＰＭＩ１６４０に１０％ＦＢＳを含有させた培養液、該培養液に１７５  ＩＵ／ｍＬのヒト組み換えＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）をさらに添加した培養液、またはＫＢＭ５０２培養液（コージンバイオ社製）で培養した。臍帯血由来造血幹細胞は、Ｓｔｅｍｓｐａｎ培養液（ＶＥＲＩＴＡＳ社製）に、ヒト組み換えＳＣＦ、ヒト組み換えＦｌｔ−３Ｌおよびヒト組み換えＴＰＯ（すべてＰｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を添加した培養液で培養した。
【００７７】
すべてのｐｒｉｍｅｄ型のｉＰＳ細胞は、ヒトＥＳ細胞維持培養液でＭＥＦ細胞上において培養した。ヒトＥＳ細胞維持培養液の組成は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ナカライテスク社製）に、２０％ＫＳＲ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｅｉｓ社製）、２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｓｉｇｍａ社製）、２ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ナカライテスク社製）、１％  ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ナカライテスク社製）、４ｎｇ／ｍＬ  ｂａｓｉｃ  ＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）である。
【００７８】
基底状態のｉＰＳ細胞は、混合培養液でＭＥＦ細胞上において培養した。当該混合培養液の組成は、ＤＭＥＭ  ／Ｆ１２に、２０％  ＫＳＲ、２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、２ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１％  ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、１μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１（Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）、１μＭ  ＰＤ０３２５９０１（Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）、１，０００  ｕｎｉｔｓ／ｍＬのヒト組み換えＬＩＦ（ナカライテスク社製）である。
【００７９】
（実施例１：非伝播型遺伝子改変麻疹ウイルスベクターの構築）
非伝播型遺伝子改変麻疹ウイルスベクターは、麻疹ウイルスを構成する機能性タンパク質をコードする遺伝子を含む２つのプラスミド（ＭＶ−ＨＬ−Ｋ−Ｐｉｎ１−ＥＧＦＰおよびＭＶ−ＮＰＭ−ＯＳＭ）と、ウイルス合成を助ける４つのプラスミド（ｐＣＩＴＥ−ＩＣ−Ｎ、ｐＣＩＴＥ−ＩＣ−ＰΔＣ、ｐＣＩＴＥｋｏ−９３０１Ｂ−Ｌ、ｐＣＡ７−ＩＣ−Ｆ）とを、以下のように、パッケージ細胞としてＢＨＫ−Ｔ７／９細胞にＳＬＡＭ遺伝子および麻疹ウイルスのＦ遺伝子を導入したＶｅｒｏ／ＳＬＡＭ／Ｆ細胞と共培養することにより産生した。外来遺伝子として、ｉＰＳ細胞の作製に使用されるＯＣＴ３／４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、Ｌ−ＭＹＣ遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子およびＰＩＮ１遺伝子と、レポーター遺伝子としてＥＧＦＰ遺伝子を挿入した。
【００８０】
まず、Ｈタンパク質にＮ３９０Ｉ、Ｎ４１６Ｄ、Ｎ４８１Ｙ、Ｅ４９２Ｇの変異、およびＭタンパク質にＰ６４Ｓ、Ｅ８９Ｋの変異が挿入されるように、麻疹ウイルス株ＭＶ−ＩＣ３２３−ＥＧＦＰにおける野生型のＨ遺伝子およびＭ遺伝子を、遺伝子組換えにて改変した。
【００８１】
続いて、図２に示すように、ＭＶ−ＮＰＭ−ＯＳＭプラスミドは、上記変異を挿入したＭＶ−ＩＣ３２３−ＥＧＦＰのＥＧＦＰ遺伝子をＯＣＴ３／４遺伝子に、Ｆ遺伝子をＳＯＸ２遺伝子に、Ｈ遺伝子およびＬ遺伝子をＬ−ＭＹＣ遺伝子に組み換えることにより作製した。一方、ＭＶ−ＨＬ−Ｋ−Ｐｉｎ１−ＥＧＦＰプラスミドは、上記変異を挿入したＭＶ−ＩＣ３２３−ＥＧＦＰのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子およびＦ遺伝子をＫＬＦ４遺伝子に組み換え、Ｌ遺伝子とＨ遺伝子との間にＰＩＮ１遺伝子を挿入することで作製した。
【００８２】
ＭＶ−ＮＰＭ−ＯＳＭプラスミドおよびＭＶ−ＨＬ−Ｋ−Ｐｉｎ１−ＥＧＦＰプラスミドと、４つのプラスミド（ｐＣＡＧ−Ｔ７−ＩＣ−Ｆ、ｐＣＩＴＥ−ＩＣ−Ｎ、ｐＣＩＴＥ−ＩＣ−ＰΔＣ、ｐＣＩＴＥ−ｋｏ−９３０１Ｂ−Ｌ）とを用いて、ＢＨＫ−Ｔ７／９細胞に遺伝子導入した。２日後に細胞をディッシュより回収し、Ｖｅｒｏ／ＳＬＡＭ／Ｆ細胞上へ播種し、２日後に巨細胞を採取し、麻疹ウイルスベクターを回収した。回収した麻疹ウイルスベクターを、新たなＶｅｒｏ／ＳＬＡＭ／Ｆ細胞に感染させ、増幅後、細胞を回収した。回収した細胞をＤＭＥＭに再懸濁し、凍結融解を繰り返すことによって、細胞内から培養液に麻疹ウイルスベクター（ＭＶＶ）を放出させた。その後、遠心分離によって上清のみをウイルス液として回収し、分注後、−８０℃で保存した。力価はＶｅｒｏ／ＳＬＡＭ細胞に当該ウイルス液を添加し、２日後に、フローサイトメトリー法でＧＦＰ陽性細胞の割合を解析し、決定した。
【００８３】
（実施例２：非伝播型遺伝子改変麻疹ウイルスベクターの評価）
実施例１で作製したＭＶＶを活性化Ｔ細胞あるいはＢＪ細胞を用いて評価した。活性化Ｔ細胞は、健常人由来末梢血をＫＢＭ５０２培養液中でＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｃｄ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、５日間刺激することで作製した。より詳細には、５×１０４個の各細胞を１２ウェルプレートに播種し、力価に応じた量のウイルス液を添加した。次に、遠心法（室温、１，２００×ｇ、４５分）にて遺伝子導入後、ＰＢＳで一度洗浄し、培養液を交換した。２日後、フローサイトメトリー法にて活性化Ｔ細胞のＧＦＰ陽性細胞における５つの遺伝子（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ−ＭＹＣおよびＰＩＮ１の発現を解析した。また、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）  Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＤ社製）を用いて外来遺伝子由来のタンパク質の発現を解析した。使用した抗体は、抗ＯＣＴ３／４抗体、抗ＳＯＸ２抗体、抗ＫＬＦ４抗体（以上すべてＳａｎｔａ  ｃｒｕｚ社製）、抗ＭＹＣ抗体および抗ＰＩＮ１抗体（以上すべてＲ＆Ｄ社製）である。
【００８４】
（結果）
図３は、ＢＪ細胞および活性化Ｔ細胞の蛍光画像を示す。両細胞ともに蛍光が認められた。したがって、ＭＶＶは、ＢＪ細胞および活性化Ｔ細胞に遺伝子を導入することが確認できた。
【００８５】
図４は、活性化Ｔ細胞のＧＦＰ発現を解析した結果を示す。ＭＶＶを用いて、活性化Ｔ細胞に遺伝子導入し、導入後３日目での、ＧＦＰ陽性細胞における上記５つの遺伝子の発現を解析した。この結果より、ＥＧＦＰ遺伝子に加え、５つの遺伝子すべてが同時に発現していることが確認できた。
【００８６】
（実施例３：非伝播型遺伝子改変麻疹ウイルスベクターによる遺伝子導入とその解析）
同意を得た健常人より末梢血または臍帯血を１０ｍＬ程度採取し、リンパ球分離液（ナカライテスク社製）を用いて単核球を分離した。同時に、ＮＨ４Ｃｌ、ＫＨＣＯ３およびＥＤＴＡ（すべてナカライテスク社製）で調製した溶血剤で１ｍｌ程度の末梢血または臍帯血を溶血した。これらの方法で回収した血液細胞に、遠心法（室温、１，２００×ｇ、４５分）でＭＶＶを用いて遺伝子導入を行った（ＭＯＩ＝５）。遺伝子導入後、ＰＢＳ（−）（ＰＢＳタブレット（タカラバイオ社製）を純水で溶解し、オートクレーブ滅菌を実施して調製）で洗浄後、培養液を交換した。２日後、細胞を回収しフローサイトメトリー法でＧＦＰの発現を指標に各血球系譜の遺伝子導入率および各細胞系譜における麻疹ウイルス受容体の発現を解析した。
【００８７】
比較対照群として、ＧＦＰ遺伝子を搭載したセンダイウイルスベクター（ＳｅＶ）（ＰｌａｓｍＥｘ（登録商標）−ＡＧ；医学生物学研究所より入手）に対して、ＭＶＶと同様の方法で遺伝子導入を行った。各血球系譜の解析に使用した抗体は、単球系：ＡＰＣ−Ｃｙ７標識抗ＣＤ１４抗体（Ｂｉｏ  ｌｅｇｅｎｄ社製）、ＰＥ標識抗ＣＤ１１ｂ抗体（ＢＤ社製）、好中球系：ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５標識抗Ｃｄ１５抗体（Ｂｉｏ  ｌｅｇｅｎｄ社製）、Ｂ細胞系：ＡＰＣ−Ｃｙ７標識抗ＣＤ１９抗体（Ｂｉｏ  ｌｅｇｅｎｄ社製）、Ｔ細胞系：ＡＰＣ標識抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏ  ｌｅｇｅｎｄ社製）、ＡＰＣ−Ｃｙ７標識抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏ  ｌｅｇｅｎｄ社製）、ＰＥ−Ｃｙ７標識抗ＣＤ８抗体（Ｂｉｏ  ｌｅｇｅｎｄ社製）、ＡＰＣ標識抗ＣＤ４５ＲＡ（Ｂｉｏ  ｌｅｇｅｎｄ社製）、ＰＥ標識抗ＣＤ１９７抗体（Ｂｉｏ  ｌｅｇｅｎｄ社製）、ＮＫ細胞：ＰＥ−Ｃｙ７標識抗ＣＤ５６抗体（Ｂｉｏ  ｌｅｇｅｎｄ社製）である。使用したウイルス受容体に対する抗体は、ＰＥ標識抗ＣＤ４６抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＰＥ標識抗ＣＤ１５０抗体（Ｂｉｏ  ｌｅｇｅｎｄ社製）、およびＰＥ標識抗Ｎｅｃｔｉｎ４抗体（Ｒ＆Ｄ社製）である。なお、単球はＣＤ１４＋かつＣＤ１１ｂ＋と定義した。Ｂ細胞はＣＤ１９＋かつＣＤ３−と定義した。Ｔ細胞はＣＤ３＋かつＣＤ１９−と定義した。好中球はＣＤ１５＋と定義した。ＮＫ細胞はＣＤ３−かつＣＤ１９−かつＣＤ５６＋と定義した。
【００８８】
（結果）
図５は、末梢血由来の各血球系細胞のＧＦＰ陽性率を示す。単球においては両ベクターともに高い遺伝子導入率を認めたが、Ｂ細胞、Ｔ細胞および好中球においてＭＶＶは、ＳｅＶと比較し高い遺伝子導入効率を認めた。
【００８９】
図６は、臍帯血由来の活性化していないＴ細胞のＧＦＰ陽性率を示す。ＳｅＶは、ＭＯＩ＝１０でも遺伝子が導入されなかったのに対して、ＭＶＶは、ＭＯＩ＝５で高い遺伝子導入効率を示した。
【００９０】
Ｔ細胞をＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７（ＣＤ１９７）にて分画し、各分画における遺伝子導入効率を検討した。図７に示すように、抗原に暴露される前のナイーブＴ細胞および幹細胞様記憶Ｔ細胞分画（ＣＤ４５ＲＡ  ｈｉｇｈかつＣＤ１９７  ｈｉｇｈ）、および抗原の再暴露によって増殖するセントラル記憶Ｔ細胞分画（ＣＤ４５ＲＡ  ｌｏｗかつＣＤ１９７  ｈｉｇｈ）およびエフェクター記憶Ｔ細胞分画（ＣＤ４５ＲＡ  ｌｏｗかつＣＤ１９７  ｌｏｗ）において、ＭＶＶによる高効率な遺伝子導入が確認できた。一方、ＣＤ８＋細胞の結果から、エフェクターＴ細胞分画（ＣＤ４５ＲＡ  ｈｉｇｈかつＣＤ１９７  ｌｏｗ）では、ＭＶＶによる遺伝子導入の効率化は確認されなかった。
【００９１】
上記結果により、センダイウイルスベクターを含む従来法では遺伝子導入が困難であったナイーブＴ細胞および幹細胞様記憶Ｔ細胞に対して、ＭＶＶによる高効率な遺伝子導入が可能であることを示している。したがって、本実施例に係るＭＶＶは、遺伝子改変Ｔ細胞を用いる遺伝子治療、特に遺伝子改変Ｔ細胞療法において革新的な治療用ベクターとなる可能性を強く示唆した。また、ＭＶＶは、初代培養Ｂ細胞に対しても高効率に遺伝子を導入できた。
【００９２】
（実施例４：非伝播型遺伝子改変麻疹ウイルスベクターを用いたｉＰＳ細胞の樹立）
ＢＪ細胞にＭＶＶを用いて遠心法（室温、１，２００×ｇ、４５分）で遺伝子導入を行い（ＭＯＩ＝５）、ＰＢＳで洗浄後培養液交換を行った。遺伝子導入後７日目に、ＢＪ細胞をＭＥＦ細胞上に播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内にて一日培養し、翌日、培地をヒトＥＳ細胞維持培養液に交換した。その後１日おきに培養液を交換しながら３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内にて培養し、遺伝子導入後２７日目にヒトＥＳ細胞様のコロニーを分取した（図８参照）。
【００９３】
また、健常人の末梢血由来単核球をＫＢＭ５０２培養液中においてＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｃｄ３／ＣＤ２８を用いて刺激し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。培養後５日目に細胞を回収し、ＭＶＶを用いてリプログラミング因子を遠心法（室温、１，２００×ｇ、４５分）で遺伝子導入し、細胞を翌日ＭＥＦ細胞上に播種し３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。培養開始後２０日目にＥＳ細胞様のコロニー（図９参照）を回収し、新鮮なＭＥＦ細胞上に播種した。
【００９４】
ＢＪ細胞から樹立した上記ｉＰＳ細胞に対して免疫抗体染色法およびＲＴ−ＰＣＲ法を実施し、未分化マーカーの発現を確認した。免疫抗体染色法はヒトｉＰＳ細胞を４％パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝溶液（ナカライテスク社製）を用いて４℃で、３０分間固定し、０．１％トリトンＸ−１００（ナカライテスク社製）で処理後、５％スキムミルク（ナカライテスク社製）でブロッキングした。一次抗体として抗ＮＡＮＯＧ抗体（Ｒ＆Ｄ社製）、抗ＯＣＴ３／４抗体、抗ＳＳＥＡ−４抗体、抗Ｔｒａ−１−６０抗体および抗Ｔｒａ−１−８１抗体（すべてＳａｎｔａ  ｃｒｕｚ社製）を用いて４℃で一晩、二次抗体（ａｎｔｉ−ｇｏａｔ  ＩｎＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））で、室温３０分間で染色を行った。アルカリフォスファターゼ染色には、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐａｔａｓｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いた。
【００９５】
ＲＴ−ＰＣＲ法では、ＢＪ細胞から樹立した上記ｉＰＳ細胞よりＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ社製）を用いて抽出し、相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて合成した。その後、Ｔａｋａｒａ  ＥｘＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて増幅反応を行い、１．５％アガロースゲル（ナカライテスク社製）を用いて電気泳動を行った。ＲＴ−ＰＣＲ法で用いたプライマーの塩基配列は、Ｅｎｄｏ  ＯＣＴ３／４に対して配列番号３および配列番号４、Ｅｎｄｏ  ＳＯＸ２に対して配列番号５および配列番号６、Ｅｎｄｏ  ＫＬＦ４に対して配列番号７および配列番号８、Ｅｎｄｏ  ＭＹＣに対して配列番号９および配列番号１０、ＮＡＮＯＧに対して配列番号１１および配列番号１２、ＴＥＲＴに対して配列番号１３および配列番号１４、ＤＮＭＴ３Ｂに対して配列番号１５および配列番号１６、ＭＶ−Ｎ  ｐｒｏｔｅｉｎに対して配列番号１７および配列番号１８、ＭＶ−Ｌ  ｐｒｏｔｅｉｎに対して配列番号１９および配列番号２０、ならびにβ−ＡＣＴＩＮに対して配列番号２１および配列番号２２である。
【００９６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ胚様体形成法による三胚葉系分化誘導を検討した。ＢＪ細胞から樹立した上記ｉＰＳ細胞をＭＥＦよりＥＳ細胞解離液（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ＩＶ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、０．２５％トリプシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）およびＫＳＲの混合液）を用いて解離し、ヒトＥＳ細胞維持培養液中に再懸濁し、非接着性の６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内にて培養した。翌日、浮遊細胞を回収し、ｂａｓｉｃ  ＦＧＦを添加していないヒトＥＳ細胞維持培養液中に再懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。培養開始１４日目に細胞を回収し、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ混合液（ナカライテスク社製）を用いて細胞を解離させ、０．１％ゼラチン溶液（ナカライテスク社製）を用いてコーティングしたディッシュに播種し、７日間３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。
【００９７】
免疫抗体染色法を用いてＢＪ細胞から樹立した上記ｉＰＳ細胞の三胚葉系分化を確認した。使用した抗体は、抗ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ抗体（Ｒ＆Ｄ社製）、抗ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社製）および抗ｎｅｓｔｉｎ抗体（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社製）を用いた。
【００９８】
ＢＪ細胞から樹立した上記ｉＰＳ細胞に関して奇形腫形成試験を行った。１×１０６個のｉＰＳ細胞を免疫不全マウス（実験動物中央研究所より入手）の精巣内に注入し、９〜１３週後、奇形腫を取り出した。その後、２０％ホルマリン（和光純薬工業社製）で奇形腫組織を固定し、ヘマトキシリン−イオジン染色を行った。また、ＢＪ細胞から樹立した上記ｉＰＳ細胞の核型解析を行った（Ｃｈｒｏｍｏｃｅｎｔｅｒ社）。
【００９９】
（結果）
図１０に示すように、未分化の細胞で発現するアルカリフォスファターゼ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ３／４、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１の発現をｉＰＳ細胞で確認した。ＲＴ−ＰＣＲ法の結果を図１１に示す。ｉＰＳ細胞の各サンプルでは、遺伝子導入したＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＬ−ＭＹＣの発現が確認された。また、未分化マーカーであるＮＡＮＯＧ、ＴＥＲＴおよびＤＮＭＴ３Ｂの発現も確認された。なお、麻疹ウイルス由来のＮタンパク質およびＬタンパク質の発現は見られなかった。さらに、上記ｉＰＳ細胞の三胚葉系分化を確認した（図１２参照）。
【０１００】
奇形腫形成試験の結果、図１３に示すように、三胚葉系分化能が確認された。このことから、ＢＪ細胞から樹立した上記ｉＰＳ細胞の多分化能が示された。当該ｉＰＳ細胞は、図１４に示すように、４６本の染色体を有し、核型が正常であった。
【０１０１】
（実施例５：基底状態（ｇｒｏｕｎｄ  ｓｔａｔｅ）のｉＰＳ細胞の樹立と分化誘導および解析）
理化学研究所より入手した臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞を解凍し、ＳｔｅｍｓｐａｎにＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌを添加した培養液を用いて３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内にて培養した。翌日、ＭＶＶを用いて遠心法（室温、１，２００×ｇ、４５分）で遺伝子導入を行い、上記培養液で２日間培養した。３日目においてＭＥＦ細胞上に播種し、４日目に培養液をヒトＥＳ細胞維持培養液に交換した。その後、１日おきに培養液を交換しながら３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内にて培養を継続した。遺伝子導入後１４日目において出現したコロニー（図１５参照）を採取し、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ混合溶液で単細胞に解離し、ＭＥＦ細胞上に播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内にて培養した。
【０１０２】
（結果）
図１５に示すように、基底状態のｉＰＳ細胞を樹立できた。基底状態のｉＰＳ細胞は、４日おきに０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ混合溶液を用いて単細胞まで解離させ継代したところ、Ｙ−２７６３２を使用せずに１０継代以上でもコロニー形態を維持できた。また、培養液をヒトＥＳ細胞維持培養液に交換し、ＭＥＦ細胞の播種濃度を薄くすることでヒトＥＳ細胞様コロニーの出現も確認できた。
【０１０３】
本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態および変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、この発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内およびそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、この発明の範囲内とみなされる。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明は、血液細胞への遺伝子導入のためのウイルスベクターおよびコンストラクトに好適である。このため、本発明は、免疫療法、特にＴ細胞療法への応用が期待される。また、本発明は、多能性幹細胞の作製にも好適であるため、分化誘導により得られる組織細胞を用いた再生医療に加え、難病疾患患者由来の細胞から樹立したｉＰＳ細胞を用いた疾患解析および創薬研究などに応用できる。さらには血液細胞を対象としたゲノム編集技術への応用も可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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