(57)【要約】      （修正有）【課題】膵β細胞におけるアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（アポＣＩＩＩ）の局所産生と肥満との関連に基づき、糖尿病の発症を制限および／または糖尿病を治療するための方法において使用する組成物の提供。【解決手段】式Ａ−Ｂの化合物を含む組成物であって、ここでＡは膵β細胞標的化部分であり、ＢはアポＣＩＩＩ、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、Ｓｒｃキナーゼ、および／またはβ１インテグリンの発現および／または活性の阻害剤である組成物。アポＣＩＩＩ阻害剤が、抗アポＣＩＩＩ抗体、及び抗アポＣＩＩＩアプタマーからなる群から選択される組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
効果的な量で必要とする対象者に投与することによって糖尿病を治療または発症を制限するための方法において使用するための組成物であって、式Ａ−Ｂの化合物を含み、Ａは膵β細胞標的化部分であり、Ｂはアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（アポＣＩＩＩ）の発現の阻害剤であり、
アポＣＩＩＩ阻害剤が、抗アポＣＩＩＩ抗体、及び抗アポＣＩＩＩアプタマーからなる群から選択される、組成物。
【請求項２】
膵β細胞特異的標的化部分がディジョージ症候群責任領域遺伝子２（ＤＧＣＲ２）、ゴルジブレフェルジンＡ耐性グアニンヌクレオチド交換因子１（ＧＢＦ１）、オーファンＧタンパク質結合受容体ＧＰＲ４４（ＧＰＲ４４）、セルピンＢ１０（ＰＩ−１０）、ＦＸＹＤ領域含有イオントランスポーターレギュレータ２（ＦＸＹＤ２）、テトラスパニン−７（ＴＳＰＡＮ７）、ギャップ結合タンパク質，デルタ２，３６ｋＤａ（ＧＪＤ２）、溶質キャリアファミリー１８（小胞モノアミン），メンバー２（ＳＬＣ１８Ａ２）、プロキネチシン受容体１（ＰＲＯＫＲ１）、グルタミン酸受容体，代謝型５（ＧＲＭ５）、ニューロペプチドＹ受容体Ｙ２（ＮＰＹ２Ｒ）、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）、および膜貫通タンパク質２７（ＴＭＥＭ２７）からなる群から選択されるタンパク質と選択的に結合する部分を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
膵β細胞特異的標的化部分が抗体またはアプタマーを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
膵β細胞特異的標的化部分がグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、膵ペプチド（ＰＰ）、エキセンジン−４、ナフチルアラニン、およびナフチルアラニン誘導体からなる群から選択される部分を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
アポＣＩＩＩ阻害剤が、抗アポＣＩＩＩ抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
対象者がコントロールと比べてアポＣＩＩＩを過剰発現する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
糖尿病を治療するためのものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
糖尿病の発症を制限するためのものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
対象者が１型糖尿病を有するまたは発症するリスクがある、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
対象者が２型糖尿病を有するまたは発症するリスクがある、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
対象者が２型糖尿病を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
式Ａ−Ｂの化合物を含む組成物であって、ここでＡは膵β細胞標的化部分であり、Ｂはアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（アポＣＩＩＩ）の発現の阻害剤であり、
アポＣＩＩＩ阻害剤が、抗アポＣＩＩＩ抗体、及び抗アポＣＩＩＩアプタマーからなる群から選択される、上記組成物。
【請求項１３】
膵β細胞特異的標的化部分がディジョージ症候群責任領域遺伝子２（ＤＧＣＲ２）、ゴルジブレフェルジンＡ耐性グアニンヌクレオチド交換因子１（ＧＢＦ１）、オーファンＧタンパク質結合受容体ＧＰＲ４４（ＧＰＲ４４）、セルピンＢ１０（ＰＩ−１０）、ＦＸＹＤ領域含有イオントランスポーターレギュレータ２（ＦＸＹＤ２）、テトラスパニン−７（ＴＳＰＡＮ７）、ギャップ結合タンパク質、デルタ２、３６ｋＤａ（ＧＪＤ２）、溶質キャリアファミリー１８（小胞モノアミン）、メンバー２（ＳＬＣ１８Ａ２）、プロキネチシン受容体１（ＰＲＯＫＲ１）、グルタミン酸受容体，代謝型５（ＧＲＭ５）、ニューロペプチドＹ受容体Ｙ２（ＮＰＹ２Ｒ）、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）、および膜貫通タンパク質２７（ＴＭＥＭ２７）からなる群から選択されるタンパク質と選択的に結合する部分を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
膵β細胞特異的標的化部分が抗体またはアプタマーを含む、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項１５】
膵β細胞特異的標的化部分がグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、膵ペプチド（ＰＰ）、エキセンジン−４、ナフチルアラニン、およびナフチルアラニン誘導体からなる群から選択される部分を含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
アポＣＩＩＩ阻害剤が、抗アポＣＩＩＩ抗体である、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
組成物は式Ａ−Ｂ−Ｃからなる化合物を含むものであり、ここでＣが組成物の細胞内移行を可能にする化合物部分である、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
Ｃが細胞透過性ペプチドである、請求項１７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連案件の相互参照
本出願は、２０１３年３月１３日出願した米国特許仮出願第６１／７７９５０８号の優先権を主張し、その全体が参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
国際糖尿病連合（ＩＤＦ）は、糖尿病を有する人々の数が２０１１年に３億６６００万人であり、この数は２０３０年までに５億５０００万人に増加し得ると推定している。患者の大多数は２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）を有する。肥満、インスリン耐性、およびＴ２ＤＭの発症には関連があるが、詳細な基本的メカニズムは依然として分かっておらず、この極めて重要な問題を最終的に検討できる可能性がある治療標的を特定することが最優先となる。
【０００３】
Ｔ２ＤＭにおけるインスリン耐性に関わる従来の標的組織は筋肉、肝臓、および脂肪である。これらの末梢組織はインスリンに対する効果的な反応によってグルコース恒常性を維持し、インスリンがその受容体および下流のシグナルカスケードを活性化できないとグルコース処理に障害を生じる。さらにインスリンは膵β細胞上のその受容体を刺激して、それによりインスリン生合成および分泌の正のフィードバックループに直接的に寄与する。
【０００４】
アポリポタンパク質ＣＩＩＩ（アポＣＩＩＩ）は主に肝臓、それより少ないが小腸で合成されるリポタンパク質である。アポＣＩＩＩはアポＢリポタンパク質および高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）に存在し、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）を阻害することによってこれらの代謝を調節する。アポＣＩＩＩの発現は、インスリン欠如およびインスリン耐性によって増加し、高血糖がアポＣＩＩＩ転写を誘発することも認められている。循環トリグリセリドの高量のピークでは、アポＣＩＩＩ過剰発現マウスは高脂肪食誘発性糖尿病により罹り易くなる。ヒトでは高い循環アポＣＩＩＩ量はインスリン耐性と関連する。さらに、１型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）を有する患者は血清アポＣＩＩＩの量が高いことが認められた。これは電位依存性Ｃａ２＋チャンネルの高い活性、細胞質遊離Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）およびアポトーシスの増加を生じ、影響はアポＣＩＩＩの低下によってブロッキングされた。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書に開示される発明は、糖尿病を治療または発症を制限するための方法を提供し、式Ａ−Ｂの化合物を含む組成物を効果的な量でこの方法を必要とする対象者に投与することを含み、ここでＡは膵β細胞標的化部分であり、Ｂはアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（アポＣＩＩＩ）、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、Ｓｒｃキナーゼ、および／またはβ１インテグリンの発現および／または活性の阻害剤である。
【０００６】
他の態様では、式Ａ−Ｂの組成物が提供され、ここでＡは膵β細胞標的化部分であり、Ｂはアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（アポＣＩＩＩ）、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、Ｓｒｃキナーゼ、またはβ１インテグリンの阻害剤である。さらなる態様では、組成物は式Ａ−Ｂ−Ｃからなるものであり、ここでＣは組成物の細胞内移行を可能にする化合物である。
【０００７】
種々の実施形態では、アポＣＩＩＩ阻害剤は抗アポＣＩＩＩ抗体、抗アポＣＩＩＩアプタマー、アポＣＩＩＩ小干渉ＲＮＡ，アポＣＩＩＩ内部セグメント化小干渉ＲＮＡ、アポＣＩＩＩ短ヘアピンＲＮＡ、アポＣＩＩＩマイクロＲＮＡ、およびアポＣＩＩＩアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。
【０００８】
種々の実施形態では、ＰＫＡまたはＳｒｃキナーゼ阻害剤は、ＰＰ１アナログ、ＰＰ２、アデノシン３’，５’−環状モノホスホロチオアート−Ｒ、アデノシン３’，５’−環状モノホスホロチオアートＨ−７、アデノシン３’，５’−環状モノホスホロチオアートＨ−８、アデノシン３’，５’−環状モノホスホロチオアートＨ−９、およびアデノシン３’，５’−環状モノホスホロチオアートＨ−８９からなる群から選択される。
【０００９】
種々の実施形態では、β１インテグリン阻害剤は抗β１インテグリン抗体、抗β１インテグリンアプタマー、β１インテグリン小干渉ＲＮＡ、β１インテグリン内部セグメント化小干渉ＲＮＡ、β１インテグリン短ヘアピンＲＮＡ、β１インテグリンマイクロＲＮＡ、およびβ１インテグリンアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。
【００１０】
種々の実施形態では、膵β細胞特異的標的化部分には、ディジョージ症候群責任領域遺伝子２（ＤＧＣＲ２）、ゴルジブレフェルジンＡ耐性グアニンヌクレオチド交換因子１（ＧＢＦ１）、オーファンＧタンパク質結合受容体ＧＰＲ４４（ＧＰＲ４４）、セルピンＢ１０（ＰＩ−１０）、ＦＸＹＤ領域含有イオントランスポーターレギュレータ２（ＦＸＹＤ２）、テトラスパニン−７（ＴＳＰＡＮ７）、ギャップ結合タンパク質、デルタ２，３６ｋＤａ（ＧＪＤ２）、溶質キャリアファミリー１８（小胞モノアミン)、メンバー２（ＳＬＣ１８Ａ２）、プロキネチシン受容体１（ＰＲＯＫＲ１）、グルタミン酸受容体，代謝型５（ＧＲＭ５）、ニューロペプチドＹ受容体Ｙ２（ＮＰＹ２Ｒ）、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）、および膜貫通タンパク質２７（ＴＭＥＭ２７）からなる群から選択されるタンパク質と選択的に結合する部分が含まれる。さらなる実施形態では、膵β細胞特異的標的化部分には、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、膵ペプチド（ＰＰ）、エキセンジン−４、ナフチルアラニン、およびナフチルアラニン誘導体からなる群から選択される部分が含まれる。
【００１１】
本発明の特定の実施形態は、後述するいくつかの実施形態および請求項のより詳細な説明によって明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１ａ】時間にともなうoｂ／oｂ膵島における高血糖の悪化およびインスリンシグナル化の低下を示す。ｏｂ／ｏｂおよび同等齢のｏｂ／ｌｅａｎマウス（ｎ＝８〜１１）を４、８、および１２週齢で測定した（ａ）平均体重、（ｂ）非空腹時血糖量、および（ｃ）非空腹時血漿インスリン量。（ｄ）４、８、および１２週齢における肥満と痩身コントロール間の膵島遺伝子発現変化。ｍＲＮＡ量はリアルタイムｑＰＣＲによって測定し、β−アクチンで基準化した。ｏｂ／ｏｂマウスの発現量を、１．０に設定したｏｂ／ｌｅａｎの発現量と比較した。ｏｂ／ｌｅａｎ遺伝子発現は期間中に有意な変化はなかった（ｎ＝４〜９）。データは平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）で示した。＊ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定またはＡＮＯＶＡ（ターキーの事後分析）による。
【図１ｂ】時間にともなうoｂ／oｂ膵島における高血糖の悪化およびインスリンシグナル化の低下を示す。ｏｂ／ｏｂおよび同等齢のｏｂ／ｌｅａｎマウス（ｎ＝８〜１１）を４、８、および１２週齢で測定した（ａ）平均体重、（ｂ）非空腹時血糖量、および（ｃ）非空腹時血漿インスリン量。（ｄ）４、８、および１２週齢における肥満と痩身コントロール間の膵島遺伝子発現変化。ｍＲＮＡ量はリアルタイムｑＰＣＲによって測定し、β−アクチンで基準化した。ｏｂ／ｏｂマウスの発現量を、１．０に設定したｏｂ／ｌｅａｎの発現量と比較した。ｏｂ／ｌｅａｎ遺伝子発現は期間中に有意な変化はなかった（ｎ＝４〜９）。データは平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）で示した。＊ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定またはＡＮＯＶＡ（ターキーの事後分析）による。
【図１ｃ】時間にともなうoｂ／oｂ膵島における高血糖の悪化およびインスリンシグナル化の低下を示す。ｏｂ／ｏｂおよび同等齢のｏｂ／ｌｅａｎマウス（ｎ＝８〜１１）を４、８、および１２週齢で測定した（ａ）平均体重、（ｂ）非空腹時血糖量、および（ｃ）非空腹時血漿インスリン量。（ｄ）４、８、および１２週齢における肥満と痩身コントロール間の膵島遺伝子発現変化。ｍＲＮＡ量はリアルタイムｑＰＣＲによって測定し、β−アクチンで基準化した。ｏｂ／ｏｂマウスの発現量を、１．０に設定したｏｂ／ｌｅａｎの発現量と比較した。ｏｂ／ｌｅａｎ遺伝子発現は期間中に有意な変化はなかった（ｎ＝４〜９）。データは平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）で示した。＊ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定またはＡＮＯＶＡ（ターキーの事後分析）による。
【図１ｄ】時間にともなうoｂ／oｂ膵島における高血糖の悪化およびインスリンシグナル化の低下を示す。ｏｂ／ｏｂおよび同等齢のｏｂ／ｌｅａｎマウス（ｎ＝８〜１１）を４、８、および１２週齢で測定した（ａ）平均体重、（ｂ）非空腹時血糖量、および（ｃ）非空腹時血漿インスリン量。（ｄ）４、８、および１２週齢における肥満と痩身コントロール間の膵島遺伝子発現変化。ｍＲＮＡ量はリアルタイムｑＰＣＲによって測定し、β−アクチンで基準化した。ｏｂ／ｏｂマウスの発現量を、１．０に設定したｏｂ／ｌｅａｎの発現量と比較した。ｏｂ／ｌｅａｎ遺伝子発現は期間中に有意な変化はなかった（ｎ＝４〜９）。データは平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）で示した。＊ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定またはＡＮＯＶＡ（ターキーの事後分析）による。
【図２ａ】時間にともなうｏｂ／ｏｂ膵島におけるインスリンシグナル化カスケードの変化を示す。（ａ）マウスから４、８、および１２週齢で調製されたｏｂ／ｏｂ膵島溶解物をリン酸化−Ａｋｔ、全Ａｋｔ、リン酸化ＦｏｘＯ１、およびγ−チューブリンに特異的な抗体で検出したウェスタンブロット分析。バンドはデンシトメトリーによって定量した。全ＦｏｘＯ１イムノブロットはノイズ比に対してシグナルが弱いため、ＦｏｘＯ１のｍＲＮＡ量を代わりに測定した（ｎ＝３〜４）。
【図２ｂ】時間にともなうｏｂ／ｏｂ膵島におけるインスリンシグナル化カスケードの変化を示す。（ｂ）４、８、および１２週齢における肥満と痩身コントロール間の膵島遺伝子発現変化。ｍＲＮＡ量はリアルタイムｑＰＣＲによって測定し、β−アクチンで基準化した（ｎ＝４〜８）。
【図２ｃ】時間にともなうｏｂ／ｏｂ膵島におけるインスリンシグナル化カスケードの変化を示す。（ｃ）各デンシトメトリー定量とともに添加コントロールとしてポンソーＳで染色した血清アポＣＩＩＩのウェスタンブロット（ｎ＝３）。データは平均±ＳＥＭで示した。＊ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ（ターキーの事後分析）による。
【図３ａ】アポＣＩＩＩを発現することが知られている組織から得るアポＣＩＩＩの相対的発現を示す。（ａ）ｏｂ／ｌｅａｎおよびｏｂ／ｏｂの両方における４、８、および１２週齢でのアポＣＩＩＩの肝臓発現を比較して対比した（ｎ＝５〜７）。
【図３ｂ】アポＣＩＩＩを発現することが知られている組織から得るアポＣＩＩＩの相対的発現を示す。（ｂ）ｏｂ／ｌｅａｎおよびｏｂ／ｏｂの両方における４、８、および１２週齢でのアポＣＩＩＩの小腸発現を比較して対比した（ｎ＝５〜６）。ｍＲＮＡ量はリアルタイムｑＰＣＲによって測定し、β−アクチンで基準化した。使用したイントロン−スパニング（エクソン３および４）リアルタイムｑＰＣＲプライマーは、膵島溶解物から得るアポＣＩＩＩ発現を測定するために使用したものと全く同一だった。データは平均±ＳＥＭで示した。
【図４ａ】げっ歯類およびヒト膵島におけるアポＣＩＩＩの発現を示す。（ａ）ｏｂ／ｌｅａｎマウスにおけるアポＣＩＩＩの組織特異的発現。特異的イントロン−スパニングプライマーをリアルタイムｑＰＣＲによるアポＣＩＩＩ発現の測定に使用した。挿入図は異なる組織におけるアポＣＩＩＩの全コード領域の代表的な増幅を示す（ｎ＝４〜６）。
【図４ｂ】げっ歯類およびヒト膵島におけるアポＣＩＩＩの発現を示す。（ｂ）分類した初代ラットβ細胞におけるアポＣＩＩＩ発現。解離したラット膵島から得る単一細胞をそれらの区別可能な自発蛍光に従って分類した。ついで細胞をリアルタイムｑＰＣＲによる発現分析のために溶解した。分類した細胞における異なる膵島ホルモンの高濃度化が、分類法による純度を示す。（ｎ＝４）。
【図４ｃ】げっ歯類およびヒト膵島におけるアポＣＩＩＩの発現を示す。（ｃ）ヒトアポＣＩＩＩエピトープを認識する抗体を用いた、分離したヒト膵島におけるアポＣＩＩＩ局在。コントロールとして、使用する前にアポＩＩＩ抗体を組換えアポＣＩＩＩとプレインキュベーションしてブロッキングした。陰性コントロールでは、第二抗体のみを加えた（ｎ＝３〜６）。データは平均±ＳＥＭで示した。
【図５ａ】異なるアポＣＩＩＩアイソフォームの相対的発現を示す。（ａ）ＥＮＳＥＭＢＬによって決定されたアポＣＩＩＩの２つのアイソフォーム間の差を示す図（転写物ＩＤを表示）。両アイソフォームは似たような数数のエクソンおよび全く同じコード配列（黒色バー）を有する。これらはエクソン１に相当する５’非翻訳領域（ＵＴＲ）でのみ異なり、アイソフォーム２はアイソフォーム１と比べて長い５’ＵＴＲ（灰色バー）を有している。またアイソフォーム２はエクソン４に短い３’ＵＴＲを有している。従って、異なるイントロンスパニングリアルタイムｑＰＣＲプライマーを使用し、エクソン１の異なる配列に基づいてアイソフォーム１とアイソフォーム２の両方の相対量を測定した。提示する異なるプライマーを試験して同一のプライミング効率を有することが示された。
【図５ｂ】異なるアポＣＩＩＩアイソフォームの相対的発現を示す。（ｂ）膵島溶解物における２種類の異なるアポＩＩＩアイソフォームの相対的発現（ｎ＝３）。
【図５ｃ】異なるアポＣＩＩＩアイソフォームの相対的発現を示す。（ｃ）肝臓溶解物における２種類の異なるアポＩＩＩアイソフォームの相対的発現（ｎ＝３）。データは平均±ＳＥＭで示した。
【図６ａ】Ｍｉｎ６細胞におけるマウスＭｙｃ−アポＣＩＩＩの過剰発現およびＣａ２＋流入へのその影響を示す。（ａ）培地と細胞の両方をトランスフェクションした２４時間後に収集した。Ｃ−Ｍｙｃ抗体を免疫沈降のために使用し、得られる結合タンパク質をｃ−ｍｙｓおよびアポＣＩＩＩ抗体の両方で検出した。アポＣＩＩＩがアポＣＩＩＩトランスフェクション細胞培養培地で検出されるが、溶解物およびコントロールトランスフェクション細胞培養培地のどちらにも検出されない。
【図６ｂ】Ｍｉｎ６細胞におけるマウスＭｙｃ−アポＣＩＩＩの過剰発現およびＣａ２＋流入へのその影響を示す。（ｂ）マウスアポＣＩＩＩコード配列をシグナルペプチドの直ぐ後にｃ−ｍｙｃ配列でタグ化してＭｉｎ６細胞で発現させた。コントロールとして、同一プロモーター下でｄｓ−ｔｏｍａｔｏ構築体を使用した。トランスフェクションしたＭｉｎ６細胞におけるｃ−ＭｙｃおよびＣ−ペプチド染色の代表的な最大強度投影画像。
【図６ｃ】Ｍｉｎ６細胞におけるマウスＭｙｃ−アポＣＩＩＩの過剰発現およびＣａ２＋流入へのその影響を示す。（ｃ）Ｍｙｃ−アポＣＩＩＩおよびコントロールでトランスフェクションした両方のＭｉｎ６細胞にＦｕｒａ−２を添加して、２５ｍＭ  ＫＣｌを用いた膜の脱分極で［Ｃａ２＋］ｉを測定した（ｎ＝４）。データは平均±ＳＥＭで示した。＊＊＜０．０１、スチューデントのｔ検定による。
【図７ａ】１２週齢のｏｂ／ｏｂ膵島におけるアポＣＩＩＩノックダウンの効果を示す。（ａ）分離した膵島を直接的に溶解（ｏｂ／ｏｂ）、またはアポＣＩＩＩ特異的（ＡＳ）／不活性（Ｓｃｒ）なアンチセンスオリゴヌクレオチドに１８時間暴露した。アポＣＩＩＩ発現をリアルタイムｑＰＣＲによって測定して、培養した膵島におけるアポＣＩＩＩノックダウンの効果を判断した（ｎ＝４）。
【図７ｂ】１２週齢のｏｂ／ｏｂ膵島におけるアポＣＩＩＩノックダウンの効果を示す。（ｂ）活性または不活性いずれかのアポＣＩＩＩアンチセンスに暴露したｏｂ／ｏｂおよびｏｂ／ｌｅａｎ膵島にＦｕｒａ−２を加えて１１ｍＭグルコースに暴露して、グルコース刺激されたＣａ２＋流入を測定した（ｎ＝４〜１１）。
【図７ｃ】１２週齢のｏｂ／ｏｂ膵島におけるアポＣＩＩＩノックダウンの効果を示す。（ｃ）２５ｍＭ  ＫＣｌを使用して脱分極およびそれに続くＣａ２＋流入を誘発した（ｎ＝９〜１０）。
【図７ｄ】１２週齢のｏｂ／ｏｂ膵島におけるアポＣＩＩＩノックダウンの効果を示す。（ｄ）４、８、および１２週齢の動物から分離したｏｂ／ｏｂ膵島におけるカスパーゼ３／７活性。（ｎ＝４）。
【図７ｅ】１２週齢のｏｂ／ｏｂ膵島におけるアポＣＩＩＩノックダウンの効果を示す。（ｅ）Ｃａ２＋−チャンネル阻害剤ベラパミルと一昼夜インキュベーションした（左のカラム）、またはアポＣＩＩＩアンチセンスに暴露した（右のカラム）１２週齢ｏｂ／ｏｂマウスから得るβ細胞におけるカスパーゼ活性の低下（ｎ＝４）。データは平均±ＳＥＭで示した。＊ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定またはＡＮＯＶＡ（ターキーの事後分析）による。
【００１３】
本発明の詳細な説明。
【００１４】
引用されているすべての参考文献は、本明細書ではこれら全体で参考として組み込まれる。本出願では、特別に記載がない限り、利用される技術は次に示すようないくつかのよく知られた参考文献のいずれかに認めることができる。Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook， et al.， 1989， Cold Spring Harbor Laboratory Press)， Gene Expression Technology (Methods in Enzymology， Vol. 185， edited by D. Goeddel， 1991.  Academic Press， San Diego， CA)， “Guide to Protein Purification” in Methods in Enzymology (M.P. Deutshcer， ed.， (1990) Academic Press， Inc.); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis， et al. 1990. Academic Press， San Diego， CA)， Culture of Animal Cells:  A Manual of Basic Technique， 2nd Ed. (R.I. Freshney. 1987.  Liss， Inc. New York， NY)， Gene Transfer and Expression Protocols， pp. 109-128， ed. E.J. Murray， The Humana Press Inc.， Clifton， N.J.)， and the Ambion 1998 Catalog (Ambion， Austin， TX). 
【００１５】
本明細書で使用されるとき、単数形（「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」）は、別段の明確な指示がない限り、複数形の指示対象を含む。本明細書で使用される「および」（ａｎｄ）は、別段の明確な指示がない限り、「または」（ｏｒ）と交換可能なものとして使用される。
【００１６】
本発明のあらゆる態様のすべての実施形態は、別段の明確な指示がない限り、組み合わせて使用することができる。
【００１７】
第一の態様では、本発明は式Ａ−Ｂの組成物が提供され、ここでＡは膵β細胞標的化部分であり、Ｂはアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（アポＣＩＩＩ）、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、Ｓｒｃキナーゼ、またはβ１インテグリンの阻害剤である。さらなる態様では、組成物は式Ａ−Ｂ−Ｃからなるものであり、ここでＣは組成物の細胞内移行を可能にする化合物である。
【００１８】
本発明者は、驚くべきことに、肥満は膵β細胞におけるアポＣＩＩＩの局所産生と関連することを発見している。本明細書に示す実施例は、インスリン耐性によってβ細胞中のインスリンシグナル化が低下しているｏｂ／ｏｂマウスから得る膵島で、アポＣＩＩＩが局所的に発現されて増加していることを実証する。これらの膵島はβ細胞を９０％超含み、アポＣＩＩＩ発現のほとんどはインスリン分泌性β細胞から生じる。このため、本発明の組成物は、例えば、糖尿病を治療または発症を制限するために使用できる。
【００１９】
本明細書での使用において、アポＣＩＩＩ、ＰＫＡ、Ｓｒｃキナーゼ、および／またはβ１インテグリンの発現および／または活性の「阻害剤」は、アポＣＩＩＩ、ＰＫＡ、Ｓｒｃキナーゼ、および／またはβ１インテグリンＤＮＡのＲＮＡへの転写を低下する化合物、アポＣＩＩＩ、ＰＫＡ、Ｓｒｃキナーゼ、および／またはβ１インテグリンＲＮＡのタンパク質への翻訳を低下する化合物、ならびにアポＣＩＩＩ、ＰＫＡ、Ｓｒｃキナーゼ、および／またはβ１インテグリンタンパク質の機能を低下する化合物を含む。これらの阻害は、アポＣＩＩＩ、ＰＫＡ、Ｓｒｃキナーゼ、および／またはβ１インテグリンの発現および／または活性を低下させて、細胞内カルシウム濃度の増加能を低下させるような完全な阻害または部分的な阻害であり得る。当該阻害剤はアポＣＩＩＩ、ＰＫＡ、Ｓｒｃキナーゼ、および／またはβ１インテグリンと結合する抗体、アポＣＩＩＩ、ＰＫＡ、Ｓｒｃキナーゼ、および／またはβ１インテグリン活性を干渉できるアパタマー、アポＣＩＩＩ、ＰＫＡ、Ｓｒｃキナーゼ、および／またはβ１インテグリンタンパク質、ＤＮＡ、またはｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、アポＣＩＩＩ、ＰＫＡ、Ｓｒｃキナーゼ、および／またはβ１インテグリンタンパク質、ＤＮＡ、またはｍＲＮＡに対する小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または内部セグメント化小干渉ＲＮＡ（ｓｉｓｉＲＮＡ）、ならびにアポＣＩＩＩ、ＰＫＡ、Ｓｒｃキナーゼ、および／またはβ１インテグリン活性を干渉できる他の化学的または生物学的化合物からなる群から選択される。
【００２０】
種々の実施形態では、アポＣＩＩＩ阻害剤は抗アポＣＩＩＩ抗体、抗アポＣＩＩＩアプタマー、アポＣＩＩＩ小干渉ＲＮＡ，アポＣＩＩＩ内部セグメント化小干渉ＲＮＡ、アポＣＩＩＩ短ヘアピンＲＮＡ、アポＣＩＩＩマイクロＲＮＡ、およびアポＣＩＩＩアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。
【００２１】
種々の実施形態では、ＰＫＡまたはＳｒｃキナーゼ阻害剤は、ＰＰ１アナログ、ＰＰ２、アデノシン３’，５’−環状モノホスホロチオアート−Ｒ、アデノシン３’，５’−環状モノホスホロチオアートＨ−７、アデノシン３’，５’−環状モノホスホロチオアートＨ−８、アデノシン３’，５’−環状モノホスホロチオアートＨ−９、およびアデノシン３’，５’−環状モノホスホロチオアートＨ−８９からなる群から選択される。
【００２２】
種々の実施形態では、β１インテグリン阻害剤は抗β１インテグリン抗体、抗β１インテグリンアプタマー、β１インテグリン小干渉ＲＮＡ、β１インテグリン内部セグメント化小干渉ＲＮＡ、β１インテグリン短ヘアピンＲＮＡ、β１インテグリンマイクロＲＮＡ、およびβ１インテグリンアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。
【００２３】
本組成物の膵β細胞標的化部分は、この方法を必要とする対象者への投与によって本組成物を膵β細胞に標的化することができる。いくつかの実施形態では、膵β標的化部分は、膵β細胞と優先的および／または特異的に結合する抗体、受容体、受容体リガンド、および類似物質を含むことができる。１つ以上の標的化部分を阻害剤と結合させて、組成物を膵β細胞に標的化できる組成物を得ることができる。種々の実施形態では、標的化部分は、限定されないが、膵β細胞と優先的に結合するペプチド、膵β細胞と結合する抗体、および膵β細胞と結合する受容体リガンドを含む。
【００２４】
一つの実施形態では、膵β細胞特異的標的化部分は膵β細胞と優先的に結合する１種類以上のペプチドまたは他の結合部分を含み、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１  ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：  ７３）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、膵ペプチド（ＰＰＹ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、エキセンジン−４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ナフチルアラニン、およびナフチルアラニン誘導体からなる群から選択される（配列を表１に示す）。
【００２５】
他の実施形態では、膵β細胞特異的標的化部分は、ディジョージ症候群責任領域遺伝子２（ＤＧＣＲ２  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ゴルジブレフェルジンＡ耐性グアニンヌクレオチド交換因子１（ＧＢＦ１  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、オーファンＧタンパク質結合受容体ＧＰＲ４４（ＧＰＲ４４  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、セルピンＢ１０（ＰＩ−１０  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＦＸＹＤ領域含有イオントランスポーターレギュレータ２（ＦＸＹＤ２  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、テトラスパニン−７（ＴＳＰＡＮ７  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、ギャップ結合タンパク質、デルタ２，３６ｋＤａ（ＧＪＤ２  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、溶質キャリアファミリー１８（小胞モノアミン），メンバー２（ＳＬＣ１８Ａ２  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、プロキネチシン受容体１（ＰＲＯＫＲ１  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、グルタミン酸受容体、代謝型５（ＧＲＭ５  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、ニューロペプチドＹ受容体Ｙ２（ＮＰＹ２Ｒ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、および膜貫通タンパク質２７（ＴＭＥＭ２７  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）からなる群から選択される膵β細胞タンパク質と選択的に結合する部分を含む。
【表１】
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【００２６】
標的化部分が抗体を含むとき、当該抗体はポリクローナルまたはモノクローナルとすることができる。抗体は、抗体のヒト化、全長ヒト型、またはネズミ型とすることができる。当該抗体は、Harlow and Lane， Antibodies; A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor， N.Y.，(1988)に記載されたような、よく知られた方法によって作製できる。いくつかの実施形態では、付加アミノ酸残基を抗体または抗体フラグメントのＮ端またはＣ端に加えることができる。標的化部分がアプタマーを含む場合、当該アプタマーは特定の標的分子と結合するオリゴ核酸またはペプチド分子とすることができる。アプタマーの結合特性を構築および決定する方法は、従来技術でよく知られており、アプタマーはランダムライブラリーから分離できる、または既に特定されたペプチドとすることができる。
【００２７】
膵β細胞標的化部分と阻害剤の結合は、膵β細胞標的化部分および阻害剤がそれぞれの活性を維持さえすれば、２つの分子を結合するいかなる化学反応によって実施できる。一つの実施形態では、β細胞標的化部分および阻害剤はともにポリペプチドを含み、組成物は組換え融合タンパク質を含む。別の実施形態では、β細胞標的化部分および阻害剤はポリヌクレオチドを含み、組成物は組換え核酸を含む。他の実施形態では、膵β細胞標的化部分と阻害剤の間の結合は、例えば共有結合、アフィニティー結合、インターカレーション、配位結合、および錯体形成などの多くの化学的メカニズムを含むことができる。共有結合は、既存の側鎖の直接的な縮合、あるいは外部架橋分子の組込みによって達成できる。多くの二価または多価結合剤が、抗体などのタンパク質分子を他の分子と結合するのに便利である。例えば、結合剤の代表的な例として、限定されないが、チオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン、およびヘキサメチレンジアミンなどの有機化合物とすることができる。
【００２８】
別の実施形態では、組成物は一般式Ａ−Ｂ−Ｃからなるものであり、ここでＣは組成物の細胞内移行を可能にする化合物である。一つの実施形態では、組成物の細胞内移行を可能にする化合物は細胞透過性ペプチドを含むことができる。他の実施形態では、組成物の細胞内移行を可能にする化合物は、非ペプチド性細胞透過性化合物を含むことができる。細胞透過性ペプチドまたは非ペプチド性細胞透過性化合物は、組成物の標的化部分によって標的にされた膵β細胞への組成物の取り込みを促進する。細胞透過性化合物は、本明細書に記載されている各成分の活性を維持する適切な技術によって組成物の成分Ａ−Ｂと結合できる。一つの実施形態では、Ａ−Ｂ−Ｃのそれぞれはポリペプチドであり、組成物は融合タンパク質を含む。
【００２９】
細胞透過性ペプチドの例には、限定されないが、ＲＲＡＳＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、ＬＲＲＡＳＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、ＷＬＲＲＡＳＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、ＲＲＡＴＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、ＬＲＲＡＴＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、ＷＬＲＲＡＴＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、ＲＲＡＹＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、ＬＲＲＡＹＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、ＷＬＲＲＡＹＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、ＲＲＡＤＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、ＬＲＲＡＤＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）、ＷＬＲＲＡＤＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）、ＲＲＡＥＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）、ＬＲＲＡＥＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）、ＷＬＲＲＡＥＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）、ＲＲＡＳＡＰＲＲＡＳＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、ＬＲＲＡＳＡＰＬＲＲＡＳＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、ＷＬＲＲＡＳＡＰＷＬＲＲＡＳＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、ＲＲＡＴＡＰＲＲＡＴＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、ＬＲＲＡＴＡＰＬＲＲＡＴＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ＷＬＲＲＡＴＡＰＷＬＲＲＡＴＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ＲＲＡＹＡＰＲＲＡＹＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ＬＲＲＡＹＡＰＬＲＲＡＹＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ４２）、ＷＬＲＲＡＹＡＰＷＬＲＲＡＹＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ＲＲＡＤＡＰＲＲＡＤＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ＬＲＲＡＤＡＰＬＲＲＡＤＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ＷＬＲＲＡＤＡＰＷＬＲＲＡＤＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ＲＲＡＥＡＰＲＲＡＥＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ＬＲＲＡＥＡＰＬＲＲＡＥＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、ＷＬＲＲＡＥＡＰＷＬＲＲＡＥＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ＡＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＬＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）、ＰＬＳＳＩＳＲＩＧＤＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）、ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）、ＶＴＶＬＡＬＧＡＬＡＧＶＧＶＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）、ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＬＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）、ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）、ＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）、ＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＡＡＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）、ＡＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、ＫＡＦＡＡＬＡＡＲＬＹＲＫＡＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）、ＫＡＦＡＫＬＡＡＱＬＹＲＫＡＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）、ＡＧＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ  Ｉ��  ＮＯ：６８）、およびＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ６９）が含まれる。
【００３０】
組成物の個別成分は当業者に知られている適切な方法によって調製できる。組成物を製剤化した時点で、溶液、懸濁液、ゲル、エマルション、固形、あるいは脱水または凍結乾燥した粉末として無菌バイアルに保存できる。当該製剤は使用時の剤型、または投与前に再構成を必要とする剤型（例、凍結乾燥）のいずれかで保存できる。
【００３１】
第二の態様では、本発明はプロモーターと操作によって連結された、本発明のいずれかの実施形態または実施形態の組合せの融合タンパク質をコードする分離された核酸または組換え核酸を提供する。従って、いくつかの実施形態では、融合タンパク質は本発明の組成物のペプチド成分Ａ−Ｂ（および任意にＣ）のいずれかの実施形態または実施形態の組合せを含む。他の実施形態では、本発明の組成物の成分Ａ−Ｂはそれぞれポリヌクレオチドであり、そのため分離された核酸は本発明の組換え核酸組成物をコードする。分離された核酸配列はコードされたタンパク質の発現および／または精製を促進するために使用する、限定されないが、ポリＡ配列、改変コザック配列、ならびにエピトープタグ、移行シグナル、分泌シグナル、核局在シグナル、および細胞膜局在シグナルをコードする配列を含む追加配列を含むことができる。用語「操作によって連結された」は、本明細書ではフランキング配列の配置を意味するために使用され、このように記載されたフランキング配列はその通常の機能を実施するように構成または組み立てられる。従って、コード配列に操作によって連結されたフランキング配列はコード配列の複製、転写、および／または翻訳に影響することができる。例えば、コード配列は、プロモーターがこのコード配列の転写を指示できるとき、プロモーターと操作によって連結される。フランキング配列は、それが正しく機能できる限り、コード配列と連続させる必要はない。従って、例えば、介在する翻訳されないが転写される配列がプロモーター配列とコード配列の間に存在することができ、それでもプロモーター配列はコード配列と「操作によって連結された」と考えられる。
【００３２】
第三の態様では、本発明は、本発明の分離された核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。用語「ベクター」は本明細書で使用されるとき、コード情報をホスト細胞に伝達するために使用される分子（例、核酸、プラスミド、またはウイルス）を意味するために使用される。用語「ベクター」には、連結された別の核酸を輸送できる核酸分子が含まれる。ベクターの一つのタイプは「プラスミド」であり、追加ＤＮＡセグメントが挿入される環状二本鎖ＤＮＡ分子をいう。ベクターの別のタイプはウイルスベクターであり、追加ＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに挿入される。ある種のベクターは、導入されたホスト細胞で自己複製できる（例、複製の細菌起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例、非エピソーム哺乳動物ベクター）はホスト細胞への導入の際にホスト細胞のゲノムに統合され、これによってホストゲノムとともに複製される。さらにある種のベクターは操作によって連結された遺伝子の発現を指示できる。このようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（または簡単に「発現ベクター」）として言及される。全般的に、組換えＤＮＡ技術で利用される発現ベクターはしばしばプラスミド型である。用語「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクター型であるため、本明細書では区別されずに使用されることがある。しかし本発明は、同等な機能をはたす、ウイルスベクター（例、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス）などの他の型の発現ベクターを含むことが意図されている。
【００３３】
第四の態様では、本発明は、本発明のいずれかの実施形態または実施形態の組合せの発現ベクターを含む組換えホスト細胞を提供する。用語「組換えホスト細胞」（または「ホスト細胞」）は本明細書で使用されるとき、組換え発現ベクターが導入された細胞を意味する。組換えホスト細胞またはホスト細胞は、特定の対象細胞だけではなく、このような細胞の子孫も意味することが意図されている。ある種の改変は変異または環境影響によって続く世代に生じる可能性があるため、このような子孫は実際には親細胞と同一でない可能性があるが、このような細胞はそれでも本明細書で使用される用語「ホスト細胞」の範囲に含まれる。広範な様々なホスト細胞発現系が本発明の抗体様結合タンパク質を発現するために使用でき、細菌、酵母、バキュロウイルス、および哺乳動物発現系（ならびにファージ提示発現系）が含まれる。適切な細菌発現系の例はｐＵＣ１９である。抗体様結合タンパク質を組換えによって発現するため、抗体様結合タンパク質のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡフラグメントを有する１つ以上の組換え発現ベクターでホスト細胞を形質転換またはトランスフェクションして、ポリペプチド鎖をホスト細胞で発現させ、好ましくはホスト細胞が培養される培地中に分泌させ、この培地から抗体様結合タンパク質を回収することができる。
【００３４】
用語「形質転換」は本明細書で使用されるとき、細胞の遺伝子特性における変化を意味し、細胞が新規ＤＮＡを含むように改変されているときに細胞は形質転換されている。例えば、細胞はその本来の状態から遺伝的に改変されるときに細胞は形質転換される。形質転換後、形質転換ＤＮＡは細胞の染色体への物理的な統合によって細胞のＤＮＡと再結合できる、または複製されずにエピソームエレメントとして一時的に維持される、またはプラスミドとして独立して複製できる。ＤＮＡが細胞分裂によって複製される場合、細胞は安定的に形質転換されていると考えられる。用語「トランスフェクション」は本明細書で使用されるとき、細胞による外来または外因性ＤＮＡの取り込みを意味し、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されている場合に細胞は「トランスフェクション」されている。多くのトランスフェクション技術が従来技術としてよく知られている。これらの技術は１種類以上の外因性ＤＮＡ分子を適切なホスト細胞に導入するために使用できる。
【００３５】
第五の態様では、本発明は糖尿病を治療または発症を制限する方法を提供し、式Ａ−Ｂの化合物を含む組成物を効果的な量でこの方法を必要する対象者に投与することが含まれ、ここでＡは膵β細胞標的化部分であり、Ｂはアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（アポＣＩＩＩ）、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、Ｓｃｒキナーゼ、および／またβ１インテグリンの発現および／または活性の阻害剤である。従って、本明細書に開示される組成物のいずれかの実施形態または実施形態の組合せを本発明で使用できる。
【００３６】
種々の実施形態では、アポＣＩＩＩ阻害剤は抗アポＣＩＩＩ抗体、抗アポＣＩＩＩアプタマー、アポＣＩＩＩ小干渉ＲＮＡ，アポＣＩＩＩ内部セグメント化小干渉ＲＮＡ、アポＣＩＩＩ短ヘアピンＲＮＡ、アポＣＩＩＩマイクロＲＮＡ、およびアポＣＩＩＩアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。
【００３７】
種々の実施形態では、ＰＫＡまたはＳｒｃキナーゼ阻害剤は、ＰＰ１アナログ、ＰＰ２、アデノシン３’，５’−環状モノホスホロチオアート−Ｒ、アデノシン３’，５’−環状モノホスホロチオアートＨ−７、アデノシン３’，５’−環状モノホスホロチオアートＨ−８、アデノシン３’，５’−環状モノホスホロチオアートＨ−９、およびアデノシン３’，５’−環状モノホスホロチオアートＨ−８９からなる群から選択される。
【００３８】
種々の実施形態では、β１インテグリン阻害剤は抗β１インテグリン抗体、抗β１インテグリンアプタマー、β１インテグリン小干渉ＲＮＡ、β１インテグリン内部セグメント化小干渉ＲＮＡ、β１インテグリン短ヘアピンＲＮＡ、β１インテグリンマイクロＲＮＡ、およびβインテグリンアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。
【００３９】
種々の実施形態では、膵β細胞特異的標的化部分には、ディジョージ症候群責任領域遺伝子２（ＤＧＣＲ２）、ゴルジブレフェルジンＡ耐性グアニジンヌクレオチド交換因子１（ＧＢＦ１）、オーファンＧタンパク質結合受容体ＧＰＲ４４（ＧＰＲ４４）、セルピンＢ１０（ＰＩ−１０）、ＦＸＹＤ領域含有イオントランスポーターレギュレータ２（ＦＸＹＤ２）、テトラスパニン−７（ＴＳＰＡＮ７）、ギャップ結合タンパク質，デルタ２，３６ｋＤａ（ＧＪＤ２）、溶質キャリアファミリー１８（小胞モノアミン)、メンバー２（ＳＬＣ１８Ａ２）、プロキネチシン受容体１（ＰＲＯＫＲ１）、グルタミン酸受容体，代謝型５（ＧＲＭ５）、ニューロペプチドＹ受容体Ｙ２（ＮＰＹ２Ｒ）、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）、および膜貫通タンパク質２７（ＴＭＥＭ２７）からなる群から選択されるタンパク質と選択的に結合する部分が含まれる。さらなる実施形態では、膵β細胞特異的標的化部分には、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、膵ペプチド（ＰＰ）、エキセンジン−４、ナフチルアラニン、およびナフチルアラニン誘導体からなる群から選択される部分が含まれる。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、「膵β細胞」は膵β膵島細胞を含むいずれかの細胞ポピュレーションである。当該膵β膵島細胞ポピュレーションは、膵臓、分離されたランゲルハンス膵島（「膵島」）、および分離された膵β膵島細胞を含む。
【００４１】
一つの実施形態では、本方法は糖尿病を治療するためのものである。この実施形態では、対象者は１型または２型糖尿病と診断されている。本明細書で使用されるとき、「糖尿病」は膵臓によるインスリンの産生が不十分または産生がなく、高血糖量になることによって特徴付けられる。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、「糖尿病を治療する」は、（ａ）糖尿病または糖尿病合併症の重篤度を低下する、（ｂ）糖尿病合併症の発症を制限または防止する、（ｃ）糖尿病合併症または糖尿病の特徴的な症状の悪化を阻害する、（ｄ）再発糖尿病合併症または糖尿病の特徴的な症状を制限または防止する、（ｅ）過去に症状を示した患者における糖尿病合併症または糖尿病の特徴的な症状の再発を制限または防止する、のうちの１つ以上を達成することを意味する。
【００４３】
本発明の方法によって治療できる糖尿病の特徴的な症状には、限定されないが、高血糖量、インスリン産生低下、インスリン耐性、タンパク尿、および糸球体クリアランス低下が含まれる。本発明の方法によって治療できる糖尿病合併症には、限定されないが、神経における合併症（糖尿病性神経障害）および平滑筋細胞異常調節と関連した合併症（限定されないが、勃起不全、膀胱機能不全、ならびに限定されないが、アテローム性硬化症、脳卒中、および末梢血管疾患を含む血管合併症を含む）が含まれる。
【００４４】
別の実施形態では、本方法は糖尿病の発症を制限するためのものである。この態様では、対象者は１型または２型糖尿病のリスクがあり、有益性は糖尿病および／または糖尿病合併症の発症を制限することである。糖尿病を発症するリスクのある対象者を治療でき、限定されないが、代謝症候群、糖尿病の既知の遺伝子リスク因子、糖尿病の家族歴、および肥満の１つ以上を有する対象者が含まれる。
【００４５】
さらなる実施形態では、糖尿病および／または糖尿病合併症を治療または発症を制限するための方法は、さらにアポＣＩＩＩをコントロールと比べて過剰発現することが特定されているこれらの個人を治療することを含む。アポＣＩＩＩ発現の増加は糖尿病合併症の発症に先行し、従ってこの実施形態では本発明の方法を用いた治療に適した患者を早期に検出できる。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、「過剰発現」はアポＣＩＩＩ発現がコントロールを超える量である。適切なコントロールを使用でき、糖尿病を有さないことが分かっている対象者から得るアポＣＩＩＩ発現量、または同様な患者サンプルのポピュレーションから得るアポＣＩＩＩの過去に測定されて基準化された発現量が含まれる。コントロールと比較して増加したアポＣＩＩＩの量は「過剰発現」と考えられ、種々の実施形態では、過剰発現はコントロールと比べて少なくとも１０％、２０％、５０％、１００％、２００％、またはこれ以上増加したアポＣＩＩＩ発現を含む。好ましい実施形態では、アポＣＩＩＩ発現は血液または血清サンプル中で検出される。一つの実施形態では、血清中のアポＣＩＩＩの量を評価するため、Ｍｏｎｔａｇｅ  Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｄｅｐｌｅｔｅ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）またはＡｌｂｕＳｏｒｂ（商標）（Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｇｒｏｕｐ）の使用によるなど、標準的な技術を用いて血清サンプルからアルブミンを取り除く。ついで収集した血清サンプルを一昼夜凍結乾燥させてｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８で処理することができる。溶出したタンパク質を凍結乾燥させてから１００μＬの０．１％ＴＦＡに溶解し、ＡＣＥ  Ｃ１８  １０×０．２１ｃｍカラム２０〜６０％にかけ、アポＣＩＩＩが溶出する曲線下面積を求めることができる。アポＣＩＩＩは、限定されないが、ＭＡＬＤＩ質量分析を含む適切な技術を用いて特定できる。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、用語「対象者」または「患者」は治療が望まれる対象を意味し、ヒト、畜牛、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、昆虫、ウマ、ニワトリなどが含まれる。最も好ましくは、対象者はヒトである。
【００４８】
治療剤は、従来の非毒性の医薬品として許容可能な基剤、補助剤、および賦形剤を含む投与単位剤型で、限定されないが、経口、局所、非経口、鼻腔内、肺、または結腸を含む適切な経路によって投与できる。非経口という用語は、本明細書で使用されるとき、経皮、皮下、血管内（例、静脈内）、筋肉内、または髄腔内の注射または点滴技術、および類似法を含む。さらに本発明の化合物および医薬品として許容可能な基剤を含む医薬組成物が提供される。治療剤は、１種類以上の非毒性の医薬品として許容可能な基剤および／または希釈剤および／または補助剤、ならびに必要に応じて他の活性成分とともに存在することができる。治療剤は例えば錠剤、トローチ、ドロップ、水性または油性懸濁液、分散可能な粉末または顆粒、エマルション、硬質または軟質カプセル、あるいはシロップまたはエリキシルなどの経口使用に適した剤型にすることができる。
【００４９】
別の実施形態では、組成物はまた、膜、スポンジ、または本発明の組成物が吸収またはカプセル化される他の適切な材料の埋め込みを介して局所投与することができる。埋め込みデバイスを使用する場合、デバイスは膵臓の中、または膵臓の隣に埋め込むことができ、目的の分子は拡散、持続放出ボーラス、ナノ−コンテナ、または継続投与によって送達できる。
【００５０】
投与量の範囲は、化合物の選択、投与経路、剤型の性質、対象者の状態の性質、および担当医師の判断に依存する。例えば、経口投与は静脈内注射による投与よりも高い投与量を必要とすることが予測される。これらの投与量の変化は、従来技術で十分理解されている最適化のための標準的な経験的方法を用いて調整できる。
【００５１】
許容可能な組成材料は、好ましくは適用される投与量および濃度で受容者に非毒性である。治療用組成物は、組成物の例えばｐＨ、浸透圧、粘性、透明度、色調、等張性、香気、無菌性、安定性、溶解速度、放出速度、吸着、または浸透を変更、維持、または持続するための製剤材料を含むことができる。適切な製剤材料には、限定されないが、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンなど）、抗菌剤、抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウムなど）、緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸など）、増量剤（マンニトールまたはグリシンなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＴＤＡ）など）、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）、充填剤、モノサッカライド、ジサッカライド、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンなど）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）、着色剤、香料と希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素など）、溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールなど）、糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）、懸濁化剤、界面活性剤または保湿剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０やポリソルベート８０などのポリソルベート、トライトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、またはチロキサポールなど）、安定性増強剤（スクロースまたはソルビトールなど）、張度増強剤（ハロゲン化アルカリ金属−好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム−またはマンニトールソルビトールなど）、送達賦形剤、希釈剤、添加剤、および／または医薬補助剤（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（１８ｔｈ  Ｅｄ．，  Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）、および同書の後続版を参照、目的に応じて参考文献によって本明細書に組み込まれている）が含まれる。
【００５２】
本治療組成物は、例えば意図した投与経路、送達方式、および所望の投与量に依存して、当業者によって判断される。当該組成物は、抗体様結合タンパク質の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボ消失速度に影響する可能性がある。
【００５３】
実施例
材料および方法
【００５４】
動物。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグランドである同等齢のｏｂ／ｏｂ（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）およびｏｂ／ｌｅａｎ（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐ＋）をＫａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｔ，  Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，  Ｓｗｅｄｅｎの繁殖コロニーから得た。実験で使用するマウスをジェノタイピングした。すべての実験を４〜１２週齢のマウスで実施した。マウスは温度および湿度管理された部屋で、１２時間の明暗サイクル、定期的な食餌、および不断給水によって飼育した。動物の管理および実験はＫａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｔの動物実験倫理委員会に従って実施した。
【００５５】
細胞培養。３５〜４２継代のＭＩＮ６−ｍ９細胞を、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、１０％ＦＣＳ、および７５μＭβ−メルカプトエタノールを添加した１１．１ｍＭグルコース含有ＤＭＥＭによって、５％ＣＯ２および３７℃で培養した。ＭＩＮ６細胞を、ｔｄＴｏｍａｔｏを含むコントロール発現構築体またはｃ−Ｍｙｃタグ化マウスアポＣＩＩＩ構築体でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いて２４時間トランスフェクションした。すべての実験はトランスフェクションした４８時間後に実施した。
【００５６】
代謝試験。非空腹時グルコースをグルコースメーター（Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｋ（商標）  Ａｄｖａｎｔａｇｅ，Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＵＳＡ）で測定し、血清インスリンをインスリン用ＡｒｃＤｉａ（商標）２光子蛍光励起マイクロ粒子蛍光分析（ＴＰＸ）アッセイ（ＡｒｃＤｉａ  Ｇｒｏｕｐ，Ｆｉｎｌａｎｄ）で測定した。
【００５７】
膵島分離。動物を頸椎脱臼によって安楽死させ、膵臓を０．２％ＢＳＡおよび２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液を添加したハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｗｅｄｅｎ）緩衝液に１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼを含有する３ｍＬでかん流した。その後、膵臓を摘出して３７℃で２０分間消化した。膵島を採取して、直ちにｍＲＮＡ／タンパク質分析に使用するか、または１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、ならびに１００Ｕ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬのそれぞれペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地で一昼夜培養した。
【００５８】
膵島の単一細胞への分散。分離した膵島をＣａ２＋およびＭｇ２＋無添加のＨＢＳＳで洗浄し、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ中のＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｙｔｏｔｅｃｈ，Ｄｅｎｍａｒｋ）とともにインキュベーションして単一細胞に分散させた。細胞はペトリ皿で膵島用として同一培地中で浮遊状態にした。
【００５９】
ＲＮＡ分離および定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。全ＲＮＡを分類した細胞または分離した膵島からＲＮＡｅａｓｙ（商標）  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて分離した。つまり、細胞を最初にＲＬＴ溶解緩衝液を用いて、ついでスピンＱｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ（商標）溶解によって溶解した。肝臓および腸のＲＮＡ分離では、組織／細胞破壊をハンドヘルドのローター−ステーター式ホモジナイザーによってＲＬＴ溶解緩衝液中で最初に実施し、ついで１０００×ｇで遠心分離を５分間実施した。続いて上清をＱｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ（商標）カラムに移して完全に溶解させてから、ＲＮＡｅａｓｙ（商標）  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を適用した。溶解物はすべてＲＮＡｅａｓｙ（商標）スピンカラムに加え、その後のＲＮＡ分離およびカラム上のＤＮアーゼ処理を製造業者の推奨に従って実施した。全ＲＮＡはＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）によって３７℃で逆転写した。すべての遺伝子の発現は、ＡＢＩ７９００ＨＴ装置上でＲＯＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＵＳＡ）を加えたＴａｑ（商標）  ＳＹＢＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって測定した。β−アクチンを内因性コントロールとして、９５℃、１０分間の１サイクル、ついで９５℃、３０秒間および６０℃、１分間の二段階の４０サイクルで使用した。すべての場合において、特に記載がない限り、遺伝子特異的イントロンスパニングプライマーを使用し、ＰＣＲ融解曲線は特異的単一増幅産物に相当する単一ピークを生じた。
【００６０】
ウェスタンブロッティング。膵島および細胞はＰＢＳで洗浄してＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリス，ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸Ｎａ、０．１％ＳＤＳ、ＥＤＴＡ−フリープロテアーゼ阻害剤カクテル，１μｇ／ｍＬペプスタインおよびロイペプチン）で溶解した。溶解物を注射針（０．３３ｘ１３ｍｍ／２９Ｇｘ１／２）に５回通した後、４℃でローテーターによって３０分間インキュベーションした。ホモジネートを１０，０００×ｇで１０分間スパニングして上清中のタンパク質の量をＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ）によって測定した。等量のタンパク質（２５〜５０μｇ）を、ＭＥＳ緩衝系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＵＳＡ）を用いた４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルで分離した。続いてタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに電子移動させた。リン酸化特異的抗体の場合、メンブレンは各抗体で検出し、ついで剥がして各全タンパク質量を認識する抗体で再検出した。ウサギ抗ＦｏｘＯ１、ウサギ抗ホスホ−ＦｏｘＯ１、ウサギ抗Ａｋｔ、およびウサギ抗ホスホ−Ａｋｔ抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＵＳＡ）から購入した。さらに使用した抗体はウサギ抗アポＣＩＩＩ抗体（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ，ＵＳＡ）、モルモットｃ−ペプチド（Ａｂｃａｍ，ＵＫ）、マウス抗ｃＭｙｃ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＵＳＡ）、およびマウス抗チューブリン（Ａｂｃａｍ，ＵＫ）だった。免疫反応性はＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＳＡ）を用いたホースラディッシュペルオキダーゼ共役体化第二抗体によって検出した。
【００６１】
免疫細胞化学。ＭＩＮ６細胞におけるＭｙｃ−タグ化アポＣＩＩＩを可視化するため、トランスフェクション後の細胞をガラスカバースリップ上で培養後、３０分間３％ＰＦＡ固定した。引き続き細胞を１０％ヤギ血清ブロッキング緩衝液中で、ｃ−Ｍｙｃ（マウスモノクローナル，Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ，ＵＳＡ）およびＣ−ペプチド（ウサギポリクローナル，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ＵＳＡ）に特異的な抗体と静かに振とうしながら４℃で一昼夜インキュベーションした。細胞をブロッキング緩衝液中でＡｌｅｘａ４８８抗マウス（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ，ＵＳＡ）およびＡｌｅｘａ５４６抗ウサギ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ＵＳＡ）と１時間インキュベーションした後、洗浄し、ＤＡＰＩを加えたＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ（商標）封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，ＵＳＡ）を用いて固定化した。ヒト膵島は４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、ＰＢＳで洗浄して２０％スクロース／ＰＢＳで４℃、一昼夜インキュベーションした。その後これらをＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）  ＯＣＴ（商標）（Ｓａｋｕｒａ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で包理して低温切片化（１０μｍ）した。切片を０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳで１５分間透過処理し、３％Ｈ２Ｏ２ブロックで１０分間処理してＰＢＳで洗浄し、続いて１０％ヤギ血清でブロッキングした。免疫組織化学染色をヤギ抗ヒトアポＣＩＩＩ（１：１００，Ａｃａｄｅｍｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，ＵＳＡ）を用いて４℃で一昼夜インキュベーションして実施し、ついでＡｌｅｘａ（商標）  Ｆｌｏｕｒ４８８−標識ウサギ抗ヤギ（１：１０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と室温で３０分間インキュベーションした。対比染色をＤＡＰＩ（１：１０００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で実施した。前述の方法に従い、ヤギ抗ヒトアポＣＩＩＩのブロッキングも、アポＣＩＩＩタンパク質（免疫用ペプチド）で４℃一昼夜前処理したヤギ抗ヒトアポＣＩＩＩを用いて、コントロールとして実施した。 
【００６２】
［Ｃａ２＋］ｉの測定。［Ｃａ２＋］ｉの変化をＲＰＭＩ１６４０培地中で０．０７ｍｇ／ｍＬアポＣＩＩＩアンチセンスまたは不活性コントロール（Ｉｓｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＵＳＡ）と１６時間のインキュベーションした後の膵島について記録した。膵島かん流実験に使用した基礎培地は、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、５．９ｍＭ  ＫＣｌ、２．６ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含み、３ｍＭグルコース、１１ｍＭグルコース、または２５ｍＭ  ＫＣｌが添加された０．１％ＢＳＡを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）だった。膵島は２μＭフラ−２アセトキシメチルエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＵＳＡ）を加えたＰｕｒａｍａｔｒｉｘ（商標）  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＵＳＡ）を用いてカバースリップに結合させ、２波長励起蛍光法用のＳｐｅｘ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ  ｓｙｓｔｅｍに連結された倒立落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，  Ａｘｉｏｖｅｒｔ（商標）  １３５）に装着した。３４０ｎｍおよび３８０ｎｍの２励起波長による発光を使用して蛍光比３４０／３８０を計算し、［Ｃａ２＋］ｉにおける変化を反映させた。２つのモノクロメータの光強度の出力における変動の可能性を補正するため、各実験には３６０／３６０比の測定も含めた。すべての実験は相当する３６０／３６０比によってすべての蛍光比を割って基準化した。
【００６３】
カスパーゼ測定。カスパーゼ３／７の活性は、ＳｅｎｓｏＬｙｔｅ（商標）  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｒｈ１１０  Ｃａｓｐａｓｅ  ３／７  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ＡｎａＣｈｅｍ，ＵＳＡ）に変更を加えて使用して、製造業者の取扱説明書に従って測定した。つまり、膵島または細胞を収集し、溶解緩衝液（ＡｎａＣｈｅｍ，ＵＳＡ）を用いて溶解し、タンパク質をＢＣＡ法によって定量した。１０μｇのタンパク質をブラック３８４ウェルプレートに加え、Ｒｈ１１０カスパーゼ３／７基質を含むアッセイ緩衝液（ＡｎａＣｈｅｍ，ＵＳＡ）を適切な量加え、満たした。プレートを暗所で２４℃、１時間インキュベーションした。Ｅｘ／Ｅｍ＝４９０／５２０ｎｍでの蛍光強度を計測して相対的なカスパーゼ活性を測定した。
【００６４】
ＲＮＡ分析。５’−ＲＡＣＥをｏｂ／ｏｂ膵島（１．５μｇＲＮＡ）を用いて、Ａｍｂｉｏｎ  ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ（商標）  ＲＡＣＥ−ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ  ｋｉｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）によって実施した。ＰＣＲは製造業者の取扱説明書に従って実施した。プラチナＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）をＲＡＣＥ−ＰＣＲに使用した。アポＣＩＩＩ−アウター用のプライマー配列（第一増幅）：５’ＧＧＡＧＧＧＧＴＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＧＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）；アポＣＩＩＩ−インナー（ネスティド増幅）：５’ＴＣＴＧＡＡＧＴＧＡＴＴＧＴＣＣＡＴＣＣＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）。第一ＰＣＲ（アウターＰＣＲ）のアリコートをその後のネスティドＰＣＲ（インナーＰＣＲ）に使用した。増幅したｃＤＮＡをゲル精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）にサブクローニングし、Ｍ１３リバースおよびＭ１３フォワードプライマーでシークエンシングした。
【００６５】
統計的分析。試験は少なくとも３回繰り返した。個別実験では、使用した動物数（ｎ）は各図に括弧で含めた。結果はすべて平均±ＳＥＭ（エラーバーで表示）として表示される。統計的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ（商標）  Ｐｒｉｓｍ  ５またはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００７のいずれかで実施した。スチューデントのｔ検定または一元配置ＡＮＯＶＡ（ターキーの事後分析）を必要に応じて使用した。Ｐ値＜０．０５は統計的に有意であると考えられた。
【００６６】
実施例１。ｏｂ／ｏｂ膵島におけるインスリンシグナル化。
【００６７】
９０％を超えるβ細胞からなるｏｂ／ｏｂマウス膵島におけるインスリンシグナル化の変化を測定するため、４、８、および１２週齢のこれらのマウスにおける体重、非空腹時血糖、およびインスリン濃度などのパラメーターを測定して表現型の変化を追跡した。４週齢以降から定期的にジェノタイピングした同等齢のｏｂ／ｌｅａｎマウスをコントロールとして使用した。ｏｂ／ｏｂマウスは１４週齢まで高血糖が増加する既知の一過性高血糖モデルであるため、試験は最初の１２週齢までに限定し、体重および非空腹時血糖量の両方が４〜１２週齢まで漸進的に増加することが認められた（図１ａおよび図１ｂ）。しかしｏｂ／ｏｂマウスの非空腹時インスリン量はコントロールマウスよりも高いまま維持された（図１ｃ）。
【００６８】
長期の高インスリン血症では、β細胞特異的インスリン受容体ノックアウトマウス（βＩＲＫＯ）およびβ細胞特異的ＰＩ３Ｋサブユニットｐ８５ノックアウトマウス（βＰｉｋ３ｒ１）で認められるのと同様に、膵島でのインスリンシグナル化の量に支障が来されている可能性がある。膵島インスリンシグナル化の下流に含まれることが知られているいくつかの遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定した。ｇｃｋ、ｉｒｓ１、ｉｒｓ２、ｖａｍｐ２、ｓｎａｐ２５、およびｒａｂ２７ａの発現はインスリン受容体（ＩＲ）活性化ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）活性によって制御されることが示された。すべての遺伝子は１２週齢ｏｂ／ｏｂ膵島で下方調節された（図１ｄ）。このことは、１２週齢ｏｂ／ｏｂ膵島において同等齢のｏｂ／ｌｅａｎ同腹子と比べてＰＩ３Ｋ活性の有意な低下が認められた以前の発見と一致する。
【００６９】
実施例２。ｏｂ／ｏｂ膵島におけるＦｏｘＯ１−調節された遺伝子発現の時間に伴う漸進的変化。
【００７０】
インスリンが遺伝子発現における変化を誘発する方法の１つは、Ａｋｔのリン酸化カスケードおよびその下流の標的フォークヘッド転写因子ＦｏｘＯ１によってである。Ａｋｔのインスリン仲介された活性化は、その核除外および転写活性の欠如によってＦｏｘＯ１のリン酸化を引き起こす。このシグナル化カスケードはインスリン耐性または損傷／傷害のいずれかの際にβ細胞機能および増殖を維持する上で極めて重要であることが認められている。ｏｂ／ｏｂ膵島におけるホスホ−Ａｋｔおよびホスホ−ＦｏｘＯ１の量を４、８、および１２週齢で測定した。１２週齢のｏｂ／ｏｂ膵島では、４週齢の膵島と比べてホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）およびホスホ−ＦｏｘＯ１（Ｓｅｒ２５６）に有意な低下があった（図２ａ）。これらの膵島中の全Ａｋｔタンパク質の量は時間にともなう有意差がなかった。ＦｏｘＯ１のメッセンジャーＲＮＡ量を測定し、試験したすべての週齢群に有意差が認められなかった。さらにｉｒｓ１、ｉｒｓ２、ｖａｍｐ２、およびｒａｂ２７ａはＦｏｘＯ１によって抑制されることが示唆されており、ホスホ−ＦｏｘＯ１の低下はｏｂ／ｏｂ膵島遺伝子発現における変化を裏付ける。
【００７１】
ＦｏｘＯ１のインスリン受容体仲介抑制は、肝細胞における炭水化物と脂肪代謝の間のバランスの維持に極めて重要である。インスリン耐性肝細胞におけるＦｏｘＯ１リン酸化の低下、およびそれに続く活性化は、アポＣＩＩＩ、循環トリグリセリドのモジュレーター、主要な糖新生酵素であるグルコース−６−ホスファターゼ、およびリポタンパク質組立てに含まれるミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質であるｍｔｔｐ１の発現を促進する。同様なメカニズムがホスホ−ＦｏｘＯ１の量の低下を有するｏｂ／ｏｂ膵島で生じるかどうか調査するため、ＦｏｘＯ１標的遺伝子であるアポＣＩＩＩ、ｇ６ｐｃ２（膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ）およびｍｔｔｐ１のｍＲＮＡ発現量を測定した。ｏｂ／ｏｂ膵島において３種の遺伝子すべてで時間にともなうｍＲＮＡ発現の有意な増加があった（図２ｂ）。それとともに、これらのデータは膵島レベルでのインスリン耐性がＦｏｘＯ１によって正または負に調節される遺伝子発現における変化を引き起こすことを示唆する。これらの中で、アポＣＩＩＩ発現はβ細胞機能を妨害することが認められている新規膵島因子として突出している。ｇ６ｐｃ２はＴ２ＤＭゲノムワイド関連（ＧＷＡ）解析で変異体として当初は特定されたが、その機能はＴ２ＤＭのリスク増加に翻訳されるとは思われなかった。
【００７２】
ｏｂ／ｏｂマウスでは試験した週齢群で肝臓および腸アポＣＩＩＩ発現に有意差はなかった（図３）。ｏｂ／ｏｂマウスにおけるアポＣＩＩＩの全身量も試験し、驚くべきことに、アポＣＩＩＩイムノブロットがｏｂ／ｏｂマウスの血清アポＣＩＩＩ量の４週齢から１２週齢での増加を示したということが発見された（図１ｃ）。肝アポＣＩＩＩは循環アポＣＩＩＩの大部分を占めており、循環アポＣＩＩＩの高量は、ＶＬＤＬ粒子の産生増加よりもむしろトリグリセリド−リッチ（ＶＬＤＬ）残余の細胞取り込み低下の結果である可能性があった。
【００７３】
実施例３．アポＣＩＩＩはｏｂ／ｏｂマウスおよびヒト膵島の両方で検出される。
【００７４】
膵島におけるアポＣＩＩＩの存在は、以前は観察されていないが、このリポタンパク質がβ細胞機能不全およびＴ１ＤＭの両方に含まれることが分かったため興味深い。膵島のみのプロテオーム特性がアポＣＩＩＩの存在を示した。しかしこれは膵島の微小血管に存在する全身循環アポＣＩＩＩ、またはここに示すように、膵島自体でのアポＣＩＩＩの局所産生によるいずれかの結果であり得る。比較すると、ｏｂ／ｌｅａｎ膵島におけるアポＣＩＩＩの発現は肝臓と比べて約３０００倍低い（図４ａ）。アポＣＩＩＩを発現する他の既知器官である小腸は肝臓と比べて１０倍低いが、膵島アポＣＩＩＩ発現と比べて３００倍高い発現を有する。それにもかかわらず、１２週齢ｏｂ／ｏｂ膵島に認められるアポＣＩＩＩ  ｍＲＮＡの３倍の増加は、膵島内に強いオートクリン／パラクリン効果を与えている可能性がある（図２ｂ）。１２週齢ｏｂ／ｏｂマウスの膵島におけるアポＣＩＩＩ転写物の５’ＲＡＣＥは、異なる５’−非翻訳領域および１００％同一なコード領域を有する２つの転写物の存在を裏付けた（図５）。主な膵島アポＣＩＩＩ転写物は肝臓で発現される転写物と同一であり、同じプロモーターが肝臓および膵島細胞におけるアポＣＩＩＩ転写を調節していることを示唆する。
【００７５】
膵島内のアポＣＩＩＩの起源を測定した。ｏｂ／ｏｂ膵島の内分泌部分は約９０％がβ細胞からなり、この細胞型がアポＣＩＩＩ発現のための主要な候補となる。このことを試験するため、ラットβ細胞を全膵島細胞環境から分類するのに本来は最適化されたフローサイトメトリープロトコールを使用した。分類したβ細胞のその後の特徴評価によって、インスリンの高発現、ソマトスタチンの低発現、およびグルカゴンと膵ポリペプチドが検出されないことが示された（図４ｂ）。アポＣＩＩＩの発現はβ細胞が豊富なポピュレーションで、インスリンよりは低いものの同様に高く、アポＣＩＩＩが膵β細胞で発現されることが示唆された（図４ｂ）。ヒトアポＣＩＩＩ抗体を用いた免疫蛍光染色によって、糖尿病歴のない男性３名および女性２名のドナー５名から得たヒト膵島調製物におけるアポＣＩＩＩの存在が示された（図４ｃ）。従ってこれらのデータは、膵島におけるアポＣＩＩＩの局所産生がげっ歯類からヒトに保存されていることを実証する。
【００７６】
実施例４。アポＣＩＩＩ過剰発現がＭＩＮ６細胞における［Ｃａ２＋］ｉを増加する。
【００７７】
外因的に加えたヒトアポＣＩＩＩは、ラットインスリン分泌性細胞ラインＲＩＮｍ５ＦおよびＩＮＳ−１Ｅ、ならびに初代マウスβ細胞におけるアポトーシスを誘発する。従って、アポＣＩＩＩの局所産生が同様にマウスβ細胞機能およびアポトーシスに影響したかどうかを測定することが重要だった。マウス肝切片および溶解物におけるアポＣＩＩＩを認識する抗体の能力によって妨害されるため、ｃ−Ｍｙｃタグ化マウスアポＣＩＩＩ構築体をβ細胞内のＭｙｃ−アポＣＩＩＩの局在を測定するために使用した。Ｍｙｃ−アポＣＩＩＩはＭｙｃ−アポＣＩＩＩトランスフェクション細胞の培地に２４時間培養後に検出でき、合成されたアポＣＩＩＩが細胞外培地に放出されることが示された（図６ａ）。Ｍｙｃ−アポＣＩＩＩとインスリンＣ−ペプチドの間の共局在はトランスフェクション細胞に検出できず、（図６ｂ）、アポＣＩＩＩはβ細胞から連続して放出されるが、インスリンとは共放出されないことが示唆された。Ｍｙｃ−アポＣＩＩＩまたはｔｄＴｏｍａｔｏ（コントロールベクター）のいずれかでトランスフェクションされたＭＩＮ６細胞にフラ−２ＡＭを加えて４８時間後にＫＣｌ刺激での［Ｃａ２＋］ｉに対するマウスアポＣＩＩＩの効果を測定した。ＫＣｌ暴露後の［Ｃａ２＋］ｉの増加がコントロールトランスフェクション細胞に比べてＭｙｃ−アポCＩＩＩを発現するＭＩＮ６細胞で観察された（図６ｃ）。これは外因的に加えたヒトアポＣＩＩＩのラットインスリノーマ細胞および初代β細胞に対する以前の効果と一致しており、ヒトアポＣＩＩＩとマウスアポＣＩＩＩが６０％のアミノ酸同一性しか有していないにも関わらず、機能が保存されていることを示した。トランスフェクション効率は約５０％だったが、脱分極で［Ｃａ２＋］ｉの高い増加が同一培養皿における非トランスフェクション細胞で認められ、その量はコントロールトランスフェクション細胞からの量を超えた。このことは、非トランスフェクション細胞が近傍のＭｙｃ−アポＣＩＩＩ発現細胞から培地に放出されるアポＣＩＩＩによって影響されたことを示唆する。
【００７８】
実施例５。内因性膵島アポＣＩＩＩの低下は改善された［Ｃａ２＋］ｉハンドリングおよびアポトーシス低下を生じる。
【００７９】
１２週齢ｏｂ／ｏｂマウスから得る膵島内の内因性アポＣＩＩＩ発現の増加の効果を調査するため、アポＣＩＩＩに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび不活性コントロールを用いたノックダウン実験を実施した。アンチセンスヌクレオチドに１８時間暴露された膵島におけるアポＣＩＩＩの発現は、コントロール膵島と比べて２０％だった（図７ａ）。膵島におけるアポＣＩＩＩの全体的な発現は、新たに分離された膵島におけるアポＣＩＩＩのｍＲＮＡ量と比べて、培養後１８時間だけで約５０％に低下し、人工的な環境が膵島培養と関連したことが示唆された。ついで膵島にフラ−２ＡＭを加えて、高グルコースおよびＫＣｌの両暴露後の［Ｃａ２＋］ｉに対するアポＣＩＩＩの効果を測定した。ｏｂ／ｏｂ膵島は［Ｃａ２＋］ｉのピーク値が有意に高く、ｏｂ／ｌｅａｎ膵島と比べて高グルコース濃度に対して反応性が強かった（図７ｂ）。１２週齢ｏｂ／ｏｂ膵島におけるアポＣＩＩＩのノックダウンでは、高グルコースおよびＫＣｌの両方の刺激で［Ｃａ２＋］ｉのピーク値が低下した（図７ｂ、７ｃ）。
【００８０】
内因性アポＣＩＩＩの低下がｏｂ／ｏｂ膵島におけるアポトーシスに影響するかどうか測定した。ｏｂ／ｏｂ膵島は大規模なβ細胞増殖を有する過形成であるが、これらの膵島におけるアポトーシスの存在は排除しない。従ってアポトーシスのレベルは４、８、および１２週齢（ホスホ−ＦｏｘＯ１低下）のｏｂ／ｏｂマウスの新たに分離した膵島でカスパーゼ３／７の活性を計測して測定した。ｏｂ／ｏｂ膵島におけるアポトーシスは、４週齢の膵島と比べて１２週齢のｏｂ／ｏｂ膵島で有意に高かった（図７ｄ）。アポＣＩＩＩ量が最も高い１２週齢ｏｂ／ｏｂ膵島における内因性アポＣＩＩＩの低下は、スクランブルアンチセンスで処理した膵島と比べて、アポトーシスの測定としてのカスパーゼ３／７活性を３１％まで低下させた（図７ｅ）。過去の結果は、アポＣＩＩＩが電位依存性Ｃａ２＋チャンネルの活性を増加することを示している。β細胞をＣａ２＋チャンネルブロッカーであるベラパミルに暴露するとカスパーゼ活性が１５％低下し（図７ｅ）、ｏｂ／ｏｂ膵島内のアポＣＩＩＩのＦｏｘＯ１誘発発現の増加が非平衡化［Ｃａ２＋］ｉおよびβ細胞アポトーシスの増加を引き起こすことが示唆される。
【００８１】
これらの結果は、肥満が膵β細胞中のアポＣＩＩＩの局所産生と関連しており、アポＣＩＩＩ量の増加がインスリン耐性、［Ｃａ２＋］ｉの増加、およびβ細胞アポトーシスを引き起こすことを示し、従ってアポＣＩＩＩの局所的な膵島産生がＴ２ＤＭのインスリン耐性状態におけるβ細胞アポトーシスを仲介する新規因子として特定される。効果は可逆的であり、内因性β細胞アポＣＩＩＩの低下が［Ｃａ２＋］ｉを正常化してβ細胞生存を改善する。従って局所的に増加したアポＣＩＩＩはβ細胞の機能および生存を妨害でき、Ｔ２ＤＭ表現型の発症に影響を有する。結果は、インスリンシグナル化の低下を有するｏｂ／ｏｂマウスから得る膵島でアポＣＩＩＩが局所的に発現されて増加することを実証する。これらの膵島はβ細胞を９０％超含み、アポＣＩＩＩ発現のほとんどはインスリン分泌性β細胞由来である。アポＣＩＩＩは細胞質遊離Ｃａ２＋濃度、およびアポＣＩＩＩを低下または電位依存性Ｃａ２＋チャンネルをブロッキングすることによって無効にすることができたβ細胞アポトーシスを誘発した。このことがアポＣＩＩＩを、Ｔ２ＤＭにおいてβ細胞インスリン耐性をβ細胞量の低下と関連づける主要な対象にさせる。その結果として、β細胞アポＣＩＩＩ発現の阻害はβ細胞の機能および生存を維持する新しいメカニズムを構成する。
【００８２】
要約すると、β細胞におけるインスリンシグナル化はアポＣＩＩＩ発現を低く維持するために不可欠である。インスリンシグナル化が膵島レベルで損なわれた場合、ＦｏｘＯ１の核への移動が遺伝子発現における変化を誘発し、アポＣＩＩＩ転写の促進が他の変化とともに含まれる。アポＣＩＩＩの局所産生における増加が続いて［Ｃａ２＋］ｉの増加を引き起こし、今度はβ細胞アポトーシスの増加を生じる。従って、膵島レベルでインスリン耐性を防止することはβ細胞の量を維持するために、特にβ細胞が漸進的に失われるＴ２ＤＭの後期において、極めて重要である。膵島アポＣＩＩＩはβ細胞アポトーシスの促進において中心的存在であり、アポＣＩＩＩの局所的β細胞産生の低下はＴ２ＤＭにおける新規の治療剤を提供できる。
【００８３】
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【００８４】
本願は以下の発明をも包含する。
［１］
糖尿病を治療または発症を制限するための方法であって、式Ａ−Ｂの化合物を含む組成物を効果的な量でこの方法を必要とする対象者に投与することを含み、Ａは膵β細胞標的化部分であり、Ｂはアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（アポCＩＩＩ）、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、Ｓｒｃキナーゼ、および／またはβ１インテグリンの阻害剤である、方法。
［２］
膵β細胞特異的標的化部分がディジョージ症候群責任領域遺伝子２（ＤＧＣＲ２）、ゴルジブレフェルジンＡ耐性グアニンヌクレオチド交換因子１（ＧＢＦ１）、オーファンＧタンパク質結合受容体ＧＰＲ４４（ＧＰＲ４４）、セルピンＢ１０（ＰＩ−１０）、ＦＸＹＤ領域含有イオントランスポーターレギュレータ２（ＦＸＹＤ２）、テトラスパニン−７（ＴＳＰＡＮ７）、ギャップ結合タンパク質，デルタ２，３６ｋＤａ（ＧＪＤ２）、溶質キャリアファミリー１８（小胞モノアミン)，メンバー２（ＳＬＣ１８Ａ２）、プロキネチシン受容体１（ＰＲＯＫＲ１）、グルタミン酸受容体，代謝型５（ＧＲＭ５）、ニューロペプチドＹ受容体Ｙ２（ＮＰＹ２Ｒ）、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）、および膜貫通タンパク質２７（ＴＭＥＭ２７）からなる群から選択されるタンパク質と選択的に結合する部分を含む、［１］に記載の方法。
［３］
膵β細胞特異的標的化部分が抗体またはアプタマーを含む、［１］または［２］に記載の方法。
［４］
膵β細胞特異的標的化部分がグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、膵ペプチド（ＰＰ）、エキセンジン−４、ナフチルアラニン、およびナフチルアラニン誘導体からなる群から選択される部分を含む、［１］に記載の方法。
［５］
阻害剤がアポＣＩＩＩ阻害剤を含む、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］
アポＣＩＩＩ阻害剤が抗アポＣＩＩＩ抗体、抗アポＣＩＩＩアプタマー、アポＣＩＩＩ小干渉ＲＮＡ，アポＣＩＩＩ内部セグメント化小干渉ＲＮＡ、アポＣＩＩＩ短ヘアピンＲＮＡ、アポＣＩＩＩマイクロＲＮＡ、およびアポＣＩＩＩアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、［５］に記載の方法。
［７］
阻害剤がＰＫＡまたはＳｒｃキナーゼ阻害剤を含む、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］
ＰＫＡまたはＳｒｃキナーゼ阻害剤がＰＰ１アナログ、ＰＰ２、アデノシン３’，５’−環状モノホスホロチオアート−Ｒ、アデノシン３’，５’−環状モノホスホロチオアートＨ−７、アデノシン３’，５’−環状モノホスホロチオアートＨ−８、アデノシン３’，５’−環状モノホスホロチオアートＨ−９、およびアデノシン３’，５’−環状モノホスホロチオアートＨ−８９からなる群から選択される、［７］に記載の方法。
［９］
阻害剤がβ１インテグリン阻害剤を含む、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］
β１インテグリン阻害剤が抗β１インテグリン抗体、抗β１インテグリンアプタマー、β１インテグリン小干渉ＲＮＡ、β１インテグリン内部セグメント化小干渉ＲＮＡ、β１インテグリン短ヘアピンＲＮＡ、β１インテグリンマイクロＲＮＡ、およびβインテグリンアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、［８］に記載の方法。
［１１］
方法がコントロールと比べてアポＣＩＩＩを過剰発現する対象者に組成物を投与することを含む、［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］
方法が糖尿病を治療するためのものである、［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［１３］
方法が糖尿病の発症を制限するためのものである、［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［１４］
対象者が１型糖尿病を有するまたは発症するリスクがある、［１］〜［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］
対象者が２型糖尿病を有するまたは発症するリスクがある、［１］〜［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１６］
対象者が２型糖尿病を有する、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の方法。
［１７］
式Ａ−Ｂの組成物であって、ここでＡは膵β細胞標的化部分であり、Ｂはアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（アポＣＩＩＩ）、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、Ｓｒｃキナーゼ、またはβ１インテグリンの阻害剤である、上記組成物。
［１８］
膵β細胞特異的標的化部分がディジョージ症候群責任領域遺伝子２（ＤＧＣＲ２）、ゴルジブレフェルジンＡ耐性グアニンヌクレオチド交換因子１（ＧＢＦ１）、オーファンＧタンパク質結合受容体ＧＰＲ４４（ＧＰＲ４４）、セルピンＢ１０（ＰＩ−１０）、ＦＸＹＤ領域含有イオントランスポーターレギュレータ２（ＦＸＹＤ２）、テトラスパニン−７（ＴＳＰＡＮ７）、ギャップ結合タンパク質、デルタ２、３６ｋＤａ（ＧＪＤ２）、溶質キャリアファミリー１８（小胞モノアミン)、メンバー２（ＳＬＣ１８Ａ２）、プロキネチシン受容体１（ＰＲＯＫＲ１）、グルタミン酸受容体，代謝型５（ＧＲＭ５）、ニューロペプチドＹ受容体Ｙ２（ＮＰＹ２Ｒ）、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）、および膜貫通タンパク質２７（ＴＭＥＭ２７）からなる群から選択されるタンパク質と選択的に結合する部分を含む、［１７］に記載の組成物。
［１９］
膵β細胞特異的標的化部分が抗体またはアプタマーを含む、［１７］または［１８］に記載の組成物。
［２０］
膵β細胞特異的標的化部分がグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、膵ペプチド（ＰＰ）、エキセンジン−４、ナフチルアラニン、およびナフチルアラニン誘導体からなる群から選択される部分を含む、［１７］〜［１９］のいずれか一項に記載の組成物。
［２１］
阻害剤がアポＣＩＩＩ阻害剤を含む、［１７］〜［２０］のいずれか一項に記載の組成物。
［２２］
阻害剤が抗アポＣＩＩＩ抗体、抗アポＣＩＩＩアプタマー、アポＣＩＩＩ小干渉ＲＮＡ，アポＣＩＩＩ内部セグメント化小干渉ＲＮＡ、アポＣＩＩＩ短ヘアピンＲＮＡ、アポＣＩＩＩマイクロＲＮＡ、およびアポＣＩＩＩアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、［２１］に記載の組成物。
［２３］
阻害剤がＰＫＡまたはＳｒｃ阻害剤を含む、［１７］〜［２２］のいずれか一項に記載の組成物。
［２４］
阻害剤がＰＰ１アナログ、ＰＰ２、アデノシン３’，５’−環状モノホスホロチオアート−Ｒ、アデノシン３’，５’−環状モノホスホロチオアートＨ−７、アデノシン３’，５’−環状モノホスホロチオアートＨ−８、アデノシン３’，５’−環状モノホスホロチオアートＨ−９、およびアデノシン３’，５’−環状モノホスホロチオアートＨ−８９からなる群から選択される、［２３］に記載の組成物。
［２５］
阻害剤がβ１インテグリン阻害剤を含む、［１７］〜［２４］のいずれか一項に記載の組成物。
［２６］
阻害剤が抗β１インテグリン抗体、抗β１インテグリンアプタマー、β１インテグリン小干渉ＲＮＡ、β１インテグリン内部セグメント化小干渉ＲＮＡ、β１インテグリン短ヘアピンＲＮＡ、β１インテグリンマイクロＲＮＡ、およびβ１インテグリンアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、［２５］に記載の組成物。
［２７］
組成物は式Ａ−Ｂ−Ｃからなるものであり、ここでＣが組成物の細胞内移行を可能にする化合物である、［１７］〜［２６］のいずれか一項に記載の組成物。
［２８］
Ｃが細胞透過性ペプチドである、［２７］に記載の組成物。
［２９］
組成物が融合タンパク質を含む、［１７］〜［２８］のいずれか一項に記載の組成物。
［３０］
組成物が組換え核酸を含む、［１７］〜［２８］のいずれか一項に記載の組成物。
［３１］
［２９］の融合タンパク質をコードする分離された核酸、または［３０］の組換え核酸であって、プロモーターと操作によって連結された核酸。
［３２］
［３１］の分離された核酸を含む、組換え発現ベクター。
［３３］
［３２］の発現ベクターを含む、分離された組換えホスト細胞。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
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【配列表】
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