(57)【要約】      （修正有）【課題】アスタキサンチン又はその前駆体又は誘導体を宿主細胞で効率よく大量に生産するためのアプローチの提供。【解決手段】４つの遺伝子カセットを含む組換えポリヌクレオチド配列、ベクター、宿主細胞及びアスタキサンチンを生産する方法。組換えポリヌクレオチド配列は、より高いレベルのアスタキサンチン前駆体を、より短い代謝経路を介して提供するように設計され、それにより所望の立体異性体の形態及び／又はエステル化形態を有するより高いレベルの最終産物（例えば、アスタキサンチン）を達成する。【選択図】図１７ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスタキサンチン、その前駆体又は誘導体を生産する方法であって、
（１）組換えポリヌクレオチド配列を宿主細胞に導入すること；及び
（２）前記宿主細胞をグルコース、ガラクトース、グリセロール、及び脂肪酸からなる群より選択される材料を含む培地中で培養することを含み、
前記組換えポリヌクレオチド配列が、
第１のプロモーターと、前記第１のプロモーターに作動可能に連結されゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼをコードする第１の核酸配列とを含む、第１の遺伝子カセット；
第２のプロモーターと、前記第２のプロモーターに作動可能に連結され３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼをコードする第２の核酸配列とを含む、第２の遺伝子カセット；
第３のプロモーターと、前記第３のプロモーターに作動可能に連結されフィトエンデサチュラーゼをコードする第３の核酸配列とを含む、第３の遺伝子カセット；及び
第４のプロモーターと、前記第４のプロモーターに作動可能に連結されフィトエンシンターゼ及びリコペンシクラーゼの各機能を有する二機能性酵素をコードする第４の核酸配列とを含む、第４の遺伝子カセットを含み、
前記組換えポリヌクレオチド配列の各遺伝子カセットの３'末端が、その下流の隣接遺伝子カセットの５'末端に相同である、方法。
【請求項２】
前記培地が０．５〜４０％グリセロールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地が０．００１％〜５％脂肪酸をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記脂肪酸がオクタン酸である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アスタキサンチンが、３Ｓ，  ３Ｓ'−アスタキサンチン又は３Ｒ，  ３Ｒ'−アスタキサンチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
アスタキサンチンの前記前駆体が、ゲラニルゲラニルピロリン酸、フェニコキサンチン、リコペン、エキネノン、カンタキサンチン、フィトエン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、又はβ−カロチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アスタキサンチンの前記誘導体が、アスタキサンチンモノエステル又はアスタキサンチンジエステルである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の、第２の、第３の、及び第４の核酸配列が、配列番号１、２、３、及び４の配列をそれぞれ含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記組換えポリヌクレオチド配列が、
第５のプロモーターと、前記第５のプロモーターに作動可能に連結されβ−カロチンヒドロキシラーゼをコードする第５の核酸配列とを含む、第５の遺伝子カセット；及び
第６のプロモーターと、前記第６のプロモーターに作動可能に連結されβ−カロチンケトラーゼをコードする第６の核酸配列とを含む、第６の遺伝子カセット
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第５の核酸配列が、配列番号５、６、又は７のいずれかの配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第６の核酸配列が、配列番号８の配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１〜第６のプロモーターが、ＳｃＧａｐＤＨプロモーター、ＫｌＧａｐＤＨプロモーター、ＳｃＰＧＫプロモーター、ＫｌＰＧＫプロモーター、ＫｌＡＤＨＩプロモーター、ＳｃＡＤＨＩプロモーター、ＫｌＡＤＨ４プロモーター、ＳｃＡＤＨ４プロモーター、ＫｌＬａｃ４プロモーター及びＩＣＬプロモーターからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１〜第６のプロモーターが互いに異なる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組換えポリヌクレオチド配列が、
第７のプロモーターと、前記第７のプロモーターに作動可能に連結されＰ４５０レダクターゼをコードする第７の核酸配列とを含む、第７の遺伝子カセット；及び
第８のプロモーターと、前記第８のプロモーターに作動可能に連結されβ−カロチンオキシゲナーゼをコードする第８の核酸配列とを含む、第８の遺伝子カセット
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第７の核酸配列が配列番号９の配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第８の核酸配列が配列番号１０の配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の、第２の、第３の、第４の、第７の、及び第８のプロモーターのそれぞれが、ＳｃＧａｐＤＨプロモーター、ＫｌＧａｐＤＨプロモーター、ＳｃＰＧＫプロモーター、ＫｌＰＧＫプロモーター、ＫｌＡＤＨＩプロモーター、ＳｃＡＤＨＩプロモーター、ＫｌＡＤＨ４プロモーター、ＳｃＡＤＨ４プロモーター、ＫｌＬａｃ４プロモーター及びＩＣＬプロモーターからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の、第２の、第３の、第４の、第７の、及び第８のプロモーターが互いに異なる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記組換えポリヌクレオチド配列が、マーカープロモーターと、前記マーカープロモーターに作動可能に連結されたマーカー遺伝子とを含む、マーカー遺伝子カセットをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
アスタキサンチン、その前駆体又は誘導体を宿主細胞で生産するための組換えポリヌクレオチド配列であって、
第１のプロモーターと、前記第１のプロモーターに作動可能に連結されゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼをコードする第１の核酸配列とを含む、第１の遺伝子カセット；
第２のプロモーターと、前記第２のプロモーターに作動可能に連結され３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼをコードする第２の核酸配列とを含む、第２の遺伝子カセット；
第３のプロモーターと、前記第３のプロモーターに作動可能に連結されフィトエンデサチュラーゼをコードする第３の核酸配列とを含む、第３の遺伝子カセット；及び
第４のプロモーターと、前記第４のプロモーターに作動可能に連結されフィトエンシンターゼ及びリコペンシクラーゼの各機能を有する二機能性酵素をコードする第４の核酸配列とを含む、第４の遺伝子カセットを含み、
前記組換えポリヌクレオチド配列の各遺伝子カセットの３'末端が、その下流の隣接遺伝子カセットの５'末端に相同である、組換えポリヌクレオチド配列。
【請求項２１】
前記アスタキサンチンが３Ｓ，  ３Ｓ'−アスタキサンチン又は３Ｒ，  ３Ｒ'−アスタキサンチンである、請求項２０に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
【請求項２２】
アスタキサンチンの前記前駆体が、ゲラニルゲラニルピロリン酸、フェニコキサンチン、リコペン、エキネノン、カンタキサンチン、フィトエン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、又はβ−カロチンである、請求項２０に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
【請求項２３】
アスタキサンチンの前記誘導体が、アスタキサンチンモノエステル又はアスタキサンチンジエステルである、請求項２０に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
【請求項２４】
前記第１の、第２の、第３の、及び第４の核酸配列が、配列番号：１、２、３、及び４の配列をそれぞれ含む、請求項２０に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
【請求項２５】
第５のプロモーターと、前記第５のプロモーターに作動可能に連結されβ−カロチンヒドロキシラーゼをコードする第５の核酸配列とを含む、第５の遺伝子カセット；及び
第６のプロモーターと、前記第６のプロモーターに作動可能に連結されβ−カロチンケトラーゼをコードする第６の核酸配列とを含む、第６の遺伝子カセット
をさらに含む、請求項２０に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
【請求項２６】
前記第５の核酸配列が、配列番号５、６、又は７のいずれかの配列を含み、前記第６の核酸配列が、配列番号８の配列を含む、請求項２５に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
【請求項２７】
前記第１〜第６のプロモーターのそれぞれが、ＳｃＧａｐＤＨプロモーター、ＫｌＧａｐＤＨプロモーター、ＳｃＰＧＫプロモーター、ＫｌＰＧＫプロモーター、ＫｌＡＤＨＩプロモーター、ＳｃＡＤＨＩプロモーター、ＫｌＡＤＨ４プロモーター、ＳｃＡＤＨ４プロモーター、ＫｌＬａｃ４プロモーター及びＩＣＬプロモーターからなる群より選択される、請求項２５に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
【請求項２８】
前記第１〜第６のプロモーターが互いに異なる、請求項２７に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
【請求項２９】
第７のプロモーターと、前記第７のプロモーターに作動可能に連結されＰ４５０レダクターゼをコードする第７の核酸配列とを含む、第７の遺伝子カセット；及び
第８のプロモーターと、前記第８のプロモーターに作動可能に連結されβ−カロチンオキシゲナーゼをコードする第８の核酸配列とを含む、第８の遺伝子カセット
をさらに含む、請求項２０に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
【請求項３０】
前記第７の核酸配列が、配列番号９の配列を含み、前記第８の核酸配列が、配列番号１０の配列を含む、請求項２９に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
【請求項３１】
前記第１の、第２の、第３の、第４の、第７の、及び第８のプロモーターのそれぞれが、ＳｃＧａｐＤＨプロモーター、ＫｌＧａｐＤＨプロモーター、ＳｃＰＧＫプロモーター、ＫｌＰＧＫプロモーター、ＫｌＡＤＨＩプロモーター、ＳｃＡＤＨＩプロモーター、ＫｌＡＤＨ４プロモーター、ＳｃＡＤＨ４プロモーター、ＫｌＬａｃ４プロモーター及びＩＣＬプロモーターからなる群より選択される、請求項２９に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
【請求項３２】
前記第１の、第２の、第３の、第４の、第７の、及び第８のプロモーターが互いに異なる、請求項３１に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
【請求項３３】
マーカープロモーターと、前記マーカープロモーターに作動可能に連結されたマーカー遺伝子とを含む、マーカー遺伝子カセットをさらに含む、請求項２０に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
【請求項３４】
ストレスに対する宿主細胞の耐性を向上させる方法であって、請求項１の組換えポリヌクレオチド配列を前記宿主細胞に導入することを含む、方法。
【請求項３５】
宿主細胞に対する前記ストレスが、エタノール、ブタノール、ＵＶ暴露、フルフラール、又は薬物前駆体に暴露されることにより引き起こされる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記薬物前駆体が１０−デアセチルバッカチンＩＩＩである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１の、第２の、第３の及び第４の核酸配列が、配列番号１、２、３、及び４の配列をそれぞれ含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記組換えポリヌクレオチド配列が、
第５のプロモーターと、前記第５のプロモーターに作動可能に連結されβ−カロチンヒドロキシラーゼをコードする第５の核酸配列とを含む、第５の遺伝子カセット；及び
第６のプロモーターと、前記第６のプロモーターに作動可能に連結されβ−カロチンケトラーゼをコードする第６の核酸配列とを含む、第６の遺伝子カセット
をさらに含む、請求項３４に記載の方法、
【請求項３９】
前記組換えポリヌクレオチド配列の前記第５の核酸配列が、配列番号５、６、又は７のいずれかの配列を含み、前記組換えポリヌクレオチド配列の前記第６の核酸配列が、配列番号８の配列を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１〜第６のプロモーターのそれぞれが、ＳｃＧａｐＤＨプロモーター、ＫｌＧａｐＤＨプロモーター、ＳｃＰＧＫプロモーター、ＫｌＰＧＫプロモーター、ＫｌＡＤＨＩプロモーター、ＳｃＡＤＨＩプロモーター、ＫｌＡＤＨ４プロモーター、ＳｃＡＤＨ４プロモーター、ＫｌＬａｃ４プロモーター及びＩＣＬプロモーターからなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１〜第６のプロモーターが互いに異なる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記組換えポリヌクレオチド配列が、
第７のプロモーターと、前記第７のプロモーターに作動可能に連結されＰ４５０レダクターゼをコードする第７の核酸配列とを含む、第７の遺伝子カセット；及び
第８のプロモーターと、前記第８のプロモーターに作動可能に連結されβ−カロチンオキシゲナーゼをコードする第８の核酸配列とを含む、第８の遺伝子カセット
をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
前記組換えポリヌクレオチド配列の前記第７の核酸配列が、配列番号９の配列を含み、前記組換えポリヌクレオチド配列の前記第８の核酸配列が、配列番号１０の配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１の、第２の、第３の、第４の、第７の、及び第８のプロモーターのそれぞれが、ＳｃＧａｐＤＨプロモーター、ＫｌＧａｐＤＨプロモーター、ＳｃＰＧＫプロモーター、ＫｌＰＧＫプロモーター、ＫｌＡＤＨＩプロモーター、ＳｃＡＤＨＩプロモーター、ＫｌＡＤＨ４プロモーター、ＳｃＡＤＨ４プロモーター、ＫｌＬａｃ４プロモーター及びＩＣＬプロモーターからなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１の、第２の、第３の、第４の、第７の、及び第８のプロモーターが互いに異なる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記組換えポリヌクレオチド配列が、マーカープロモーターと、前記マーカープロモーターに作動可能に連結されたマーカー遺伝子とを含む、マーカー遺伝子カセットをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４７】
エタノール又はバッカチンＩＩＩの生産における宿主細胞の生産性を向上させる方法であって、請求項１の組換えポリヌクレオチド配列を前記宿主細胞に導入することを含む、方法。
【請求項４８】
前記第１の、第２の、第３の及び第４の核酸配列が、配列番号１、２、３、及び４の配列をそれぞれ含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記組換えポリヌクレオチド配列が、
第５のプロモーターと、前記第５のプロモーターに作動可能に連結されβ−カロチンヒドロキシラーゼをコードする第５の核酸配列とを含む、第５の遺伝子カセット；及び
第６のプロモーターと、前記第６のプロモーターに作動可能に連結されβ−カロチンケトラーゼをコードする第６の核酸配列とを含む、第６の遺伝子カセット
をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記組換えポリヌクレオチド配列の前記第５の核酸配列が、配列番号５、６、又は７のいずれかの配列を含み、前記組換えポリヌクレオチド配列の前記第６の核酸配列が、配列番号８の配列を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記第１〜第６のプロモーターのそれぞれが、ＳｃＧａｐＤＨプロモーター、ＫｌＧａｐＤＨプロモーター、ＳｃＰＧＫプロモーター、ＫｌＰＧＫプロモーター、ＫｌＡＤＨＩプロモーター、ＳｃＡＤＨＩプロモーター、ＫｌＡＤＨ４プロモーター、ＳｃＡＤＨ４プロモーター、ＫｌＬａｃ４プロモーター及びＩＣＬプロモーターからなる群より選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記第１〜第６のプロモーターが互いに異なる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記組換えポリヌクレオチド配列が、
第７のプロモーターと、前記第７のプロモーターに作動可能に連結されＰ４５０レダクターゼをコードする第７の核酸配列とを含む、第７の遺伝子カセット；及び
第８のプロモーターと、前記第８のプロモーターに作動可能に連結されβ−カロチンオキシゲナーゼをコードする第８の核酸配列とを含む、第８の遺伝子カセット
をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
前記組換えポリヌクレオチド配列の前記第７の核酸配列が、配列番号９の配列を含み、前記組換えポリヌクレオチド配列の前記第８の核酸配列が、配列番号１０の配列を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記第１の、第２の、第３の、第４の、第７の、及び第８のプロモーターのそれぞれが、ＳｃＧａｐＤＨプロモーター、ＫｌＧａｐＤＨプロモーター、ＳｃＰＧＫプロモーター、ＫｌＰＧＫプロモーター、ＫｌＡＤＨＩプロモーター、ＳｃＡＤＨＩプロモーター、ＫｌＡＤＨ４プロモーター、ＳｃＡＤＨ４プロモーター、ＫｌＬａｃ４プロモーター及びＩＣＬプロモーターからなる群より選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記第１の、第２の、第３の、第４の、第７の、及び第８のプロモーターが互いに異なる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記組換えポリヌクレオチド配列が、マーカープロモーターと、前記マーカープロモーターに作動可能に連結されたマーカー遺伝子とを含む、マーカー遺伝子カセットをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．本発明の分野
【０００２】
本開示はアスタキサンチンの生合成に関する。より具体的には、開示の発明はアスタキサンチン又はその前駆体又は誘導体の生合成に関する。
【０００３】
２．関連技術の説明
【０００４】
カロテノイドは、過度の光の下で光酸化損傷から光合成器官を保護する集光色素である。ビタミンＡの前駆体であり、抗酸化物質として機能し得るカロテノイドは、ヒトにおいて、免疫系を刺激することができ、がんを含む幅広いヒト疾患に対して保護を提供することができる。自然界には、アスタキサンチン、リコペン、β−カロチン、エキネノン、カンタキサンチン、及びゼアキサンチンを含む、多くの種類のカロテノイドが存在する。赤色カロテノイドであるアスタキサンチンは、他のカロテノイドよりも高い抗酸化活性を有するため、水産養殖、医薬、化粧品、及び食品業界における使用に大きな商業的可能性を有している。
【０００５】
アスタキサンチン（３，３'−ジヒドロキシ−β−カロチン−４，４'−ジオン）（図１）は、いくつかの鳥、甲殻類、及びサケに特徴的な着色を付与するカロテノイド色素である。酸化バランスの混乱は、リウマチ性関節炎、心臓病、パーキンソン病、アルツハイマー病、がん、及び脳卒中に寄与する可能性があると考えられる。このスーパー抗酸化物質カロテノイドは、抗酸化能がビタミンＥよりも５００倍超であり、他のカロテノイドよりも１０倍強い。アスタキサンチンが、がん、慢性炎症性疾患、メタボリックシンドローム、糖尿病、糖尿病性腎症、心臓血管疾患、胃腸疾患、肝疾患、神経変性疾患、眼疾患、皮膚疾患、運動誘発性疲労、男性不妊症、ＨｇＣｌ２誘発性急性腎不全、免疫サポート、及びアテローム性動脈硬化症のリスクの減少などの、様々な疾患の予防及び治療における健康促進効果を有することを多くの研究が示している。
【０００６】
アスタキサンチンは、カロテノイド市場で最も売れている製品の一つである。化学合成から作られたアスタキサンチンは、市場の主要なシェアを有しており、その商業的利用は主に、サケ及びマスの養殖用の飼料添加物としての利用である。合成アスタキサンチンは、石油化学製品を用いて生産される。合成及び天然アスタキサンチンは本質的に同じ化学式を有するが、分子特性が異なり、この分子特性の違いが天然アスタキサンチンの安全で効果的な抗酸化物質特性を提供する。さらに、化学的に合成されたアスタキサンチンは、以下の三つの理由について、製薬市場において適法でない。
【０００７】
第一に、幾何異性体の型は、合成アスタキサンチンの吸収に影響を与える。Ｚ型配置（シス異性体）を有する化学合成アスタキサンチンは動物により吸収されないため、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）はそれを禁止している（表１）。比較すると、天然アスタキサンチンにおける配置は、９８％がＥ型配置（トランス異性体）である（表１）。
【０００８】
【表１】
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【０００９】
第二に、様々なアスタキサンチン異性体は、分子上の２つのヒドロキシル基の配置に基いて特徴づけられている。各分子がＣ−３及びＣ−３'に２つのキラル中心を有するため、アスタキサンチンは、２つの鏡像異性体（３Ｒ，  ３'Ｒ及び３Ｓ，  ３'Ｓ）及びメソ型（３Ｒ，  ３'Ｓ）（図１）を含む、配置異性体を有し得る。３Ｓ，  ３'Ｓ立体異性体は、３Ｒ，  ３'Ｒ立体異性体よりも高い抗酸化活性を有するが、３Ｒ，  ３'Ｓメソ型については抗酸化活性は見出されていない。合成アスタキサンチンは、（３Ｓ，  ３'Ｓ）、（３Ｒ，  ３'Ｓ）、及び（３Ｒ，  ３'Ｒ）異性体のおよそ１：２：１の比の混合物であるが、３Ｓ，  ３'Ｓ立体異性体は、藻類中に見出される主な形態である（表１）。
【００１０】
第三に、その遊離形態の合成アスタキサンチンは、特に酸化の影響を受けやすい。実際、天然のアスタキサンチンは、タンパク質にコンジュゲートされているか、又は１又は２の脂肪酸でエステル化されてモノエステル及びジエステルの形態を形成しており、これらのエステル化された分子はまた、人体により容易に吸収される。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓなどの藻類から生産された天然アスタキサンチンは、合成アスタキサンチンよりもはるかに強力なフリーラジカルスカベンジャー及び抗酸化物質であることが示されている。合成産物は、魚飼料の一部としてのみ使用することができる。
【００１１】
アスタキサンチンは、その拡大する医療上の可能性のために、潜在的な機能性食品及び医薬成分であると考えられており、養殖産業において飼料及び食用色素としてますます使用されている。天然アスタキサンチン、特に３Ｓ，  ３'Ｓ立体異性体エステル化アスタキサンチンは、合成産物よりも有利であるため、アスタキサンチンを生成するのに適した宿主においてカロテノイド経路を確立することは、科学的及び産業的に興味深い。カロテノイド生合成経路が研究されてきたが（図２ａ及び２ｂ）、理想のアスタキサンチン（３Ｓ，  ３'Ｓ立体異性体エステル化アスタキサンチン）を生産するための細胞工場の原理を実証することは簡単ではない。サケ、エビ、緑藻、植物、Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ、改変微生物などの多くの宿主は、アスタキサンチン及びその誘導体の様々な異性体を細胞内に蓄積することが報告されている。しかしながら、それらの全ては、アスタキサンチン生成に様々な制約を有し、その制約とは例えば、冷水魚及びエビにおいては低濃度、全ての植物系においては予期せぬケトレーション、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓにおいては最終産物の低い抗酸化活性、及び緑藻の培養においては巨大な土地と長い培養時間である。さらに、誘導アプローチ又は変異誘発による改善を介してさえも、特定のカロテノイド最終産物の生産及びそれらの比を制御することは難しい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
前述を考慮すると、アスタキサンチンの生合成に対する新規なアプローチが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
以下は、本開示の簡略化した概要を提示する。この概要は、本開示の広範な概説ではなく、本発明の重要な／決定的な要素を特定するものでも、本発明の範囲を示すものでもない。その唯一の目的は、後に提示されるより詳細な説明の前置きとして、本明細書に開示されるいくつかの概念を簡略化した形で提示することである。
【００１４】
本発明の具体的な目的は、アスタキサンチン、その前駆体又は誘導体の生合成における使用のための、組換えポリヌクレオチド配列、ベクター、宿主細胞及び方法を提供することである。アスタキサンチン及び／又はその前駆体又は誘導体の抗酸化能に基づき、本発明はまた、ストレスに対する宿主細胞の耐性を向上させる方法、及びエタノール又はバッカチンＩＩＩの生産における宿主の生産性を向上させる方法を提供する。
【００１５】
一つの態様において、本開示は、アスタキサンチン、その前駆体又は誘導体を宿主細胞で生産するための組換えポリヌクレオチド配列に関する。この組換えポリヌクレオチド配列は、４つの遺伝子カセットを含む：（１）ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ＧＧＰＰシンターゼ）をコードする第１の核酸配列に作動可能に連結された第１のプロモーターを含む、第１の遺伝子カセット；（２）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）をコードする第２の核酸配列に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む、第２の遺伝子カセット；（３）フィトエンデサチュラーゼをコードする第３の核酸配列に作動可能に連結された第３のプロモーターを含む、第３の遺伝子カセット；及び（４）フィトエンシンターゼ及びリコペンシクラーゼの機能を有する二機能性酵素（以下、フィトエンシンターゼ／リコペンシクラーゼ）をコードする第４の核酸配列に作動可能に連結された第４のプロモーターを含む、第４の遺伝子カセット。組換えポリヌクレオチド配列の各遺伝子カセットの３'末端は、その下流の隣接遺伝子カセットの５'末端に相同である。
【００１６】
本開示の一実施形態によれば、第１の核酸配列は、配列番号１の配列を含むｃｒｔＥ遺伝子であり、第２の核酸配列は、配列番号２の配列を含むＨＭＧ１遺伝子であり、第３の核酸配列は、配列番号３の配列を含むｃｒｔＩ遺伝子であり、第４の核酸配列は、配列番号４の配列を含むｃｒｔＹＢ遺伝子である。
【００１７】
本開示のある実施形態によれば、アスタキサンチンは３Ｓ，  ３Ｓ'−アスタキサンチンである。本開示の他の実施形態によれば、アスタキサンチンは３Ｒ，  ３Ｒ'−アスタキサンチンである。
【００１８】
一実施形態によれば、アスタキサンチンの前駆体は、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）、フェニコキサンチン、リコペン、エキネノン、カンタキサンチン、フィトエン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、又はβ−カロチンである。別の実施形態によれば、アスタキサンチンの誘導体は、アスタキサンチンモノエステル又はアスタキサンチンジエステルである。
【００１９】
本開示のいくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチド配列は６つの遺伝子カセットを含み、この６つの遺伝子カセットとは、（１）ＧＧＰＰシンターゼをコードする第１の核酸配列に作動可能に連結された第１のプロモーターを含む、第１の遺伝子カセット；（２）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードする第２の核酸配列に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む、第２の遺伝子カセット；（３）フィトエンデサチュラーゼをコードする第３の核酸配列に作動可能に連結された第３のプロモーターを含む、第３の遺伝子カセット；（４）フィトエンシンターゼ／リコペンシクラーゼをコードする第４の核酸配列に作動可能に連結された第４のプロモーターを含む、第４の遺伝子カセット；（５）β−カロチンヒドロキシラーゼをコードする第５の核酸配列に作動可能に連結された第５のプロモーターを含む、第５の遺伝子カセット；及び（６）β−カロチンケトラーゼをコードする第６の核酸配列に作動可能に連結された第６のプロモーターを含む、第６の遺伝子カセット、である。組換えポリヌクレオチド配列の各遺伝子カセットの３'末端は、その下流の隣接遺伝子カセットの５'末端に相同である。
【００２０】
本開示の一実施形態によれば、第５の核酸配列は、配列番号５、６、又は７のいずれかの配列を含むｃｈＹｂ遺伝子であり、第６の核酸配列は、配列番号８の配列を含むｂｋｔ遺伝子である。
【００２１】
本開示の実施形態によれば、第１〜第６のプロモーターのそれぞれは、ＳｃＧａｐＤＨプロモーター、ＫｌＧａｐＤＨプロモーター、ＳｃＰＧＫプロモーター、ＫｌＰＧＫプロモーター、ＫｌＡＤＨＩプロモーター、ＳｃＡＤＨＩプロモーター、ＫｌＡＤＨ４プロモーター、ＳｃＡＤＨ４プロモーター、ＫｌＬａｃ４プロモーター及びＩＣＬプロモーターからなる群より選択される。好ましくは、第１〜第６のプロモーターは互いに異なる。
【００２２】
本開示の他の実施態様において、組換えポリヌクレオチド配列は６つの遺伝子カセットを含み、この６つの遺伝子カセットとは、（１）ＧＧＰＰシンターゼをコードする第１の核酸配列に作動可能に連結された第１のプロモーターを含む、第１の遺伝子カセット；（２）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードする第２の核酸配列に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む、第２の遺伝子カセット；（３）フィトエンデサチュラーゼをコードする第３の核酸配列に作動可能に連結された第３のプロモーターを含む、第３の遺伝子カセット；（４）フィトエンシンターゼ／リコペンシクラーゼをコードする第４の核酸配列に作動可能に連結された第４のプロモーターを含む、第４の遺伝子カセット；（５）Ｐ４５０レダクターゼをコードする第７の核酸配列に作動可能に連結された第７のプロモーターを含む、第７の遺伝子カセット；及び（６）β−カロチンオキシゲナーゼをコードする第８の核酸配列に作動可能に連結された第８のプロモーターを含む、第８の遺伝子カセット、である。組換えポリヌクレオチド配列の各遺伝子カセットの３'末端は、その下流の隣接遺伝子カセットの５'末端に相同である。
【００２３】
本開示の一実施形態によれば、第７の核酸配列は、配列番号９の配列を含むｃｒｔＲ遺伝子であり、第８の核酸配列は、配列番号１０の配列を含むｃｒｔＳ遺伝子である。
【００２４】
本開示の別の実施形態によれば、第１の、第２の、第３の、第４の、第７の、及び第８のプロモーターのそれぞれは、ＳｃＧａｐＤＨプロモーター、ＫｌＧａｐＤＨプロモーター、ＳｃＰＧＫプロモーター、ＫｌＰＧＫプロモーター、ＫｌＡＤＨＩプロモーター、ＳｃＡＤＨＩプロモーター、ＫｌＡＤＨ４プロモーター、ＳｃＡＤＨ４プロモーター、ＫｌＬａｃ４プロモーター及びＩＣＬプロモーターからなる群より選択される。好ましくは、プロモーターは互いに異なる。
【００２５】
本開示のある実施形態において、組換えポリヌクレオチド配列は、マーカー遺伝子に作動可能に連結されたマーカープロモーターを含む、マーカー遺伝子カセットをさらに含む。
【００２６】
本開示の第２の態様は、アスタキサンチン、その前駆体又は誘導体を宿主細胞で生産するための組換えベクターに関する。ベクターは、本開示の上述の態様／実施形態に係る組換えポリヌクレオチド配列、及び組換えポリヌクレオチド配列を発現するためにそれに動作可能に連結された制御配列を含む。
【００２７】
本開示の第３の態様は、アスタキサンチン、その前駆体又は誘導体を、上で論じた本開示の態様／実施形態に係る組換えポリヌクレオチド配列又はベクターを含む宿主細胞で生産するための、宿主細胞に関する。宿主細胞に含まれる様々な組換えポリヌクレオチド配列又はベクターについて、生産されるアスタキサンチンは３Ｓ，  ３Ｓ'−アスタキサンチン又は３Ｒ，  ３Ｒ'−アスタキサンチンであり得る。アスタキサンチンの前駆体は、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）、フェニコキサンチン、リコペン、エキネノン、カンタキサンチン、フィトエン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、又はβ−カロチンであり得る。アスタキサンチンの誘導体は、アスタキサンチンモノエステル又はアスタキサンチンジエステルであり得る。
【００２８】
任意選択の実施形態において、宿主細胞は、真核細胞又は原核細胞である。
【００２９】
第４の態様において、本開示はアスタキサンチン、その前駆体又は誘導体を生産する方法に関する。さらなる実施形態によれば、この方法は、上述の態様／実施形態に係る宿主細胞を培地中で培養するステップを含み、ここで、培地は、アスタキサンチン又はその前駆体又は誘導体を生産するために、グルコース、ガラクトース、グリセロール、及び脂肪酸からなる群より選択される材料を含む培地であってよい。一つの具体的な実施形態において、培地は０．５〜４０％グリセロールを含む。別の具体的な実施形態において、培地は、オクタン酸などの０．００１〜５％脂肪酸を含む。
【００３０】
本開示の第５の態様は、ストレスに対する宿主細胞の耐性を向上させる方法に関する。この方法は、本組換えポリヌクレオチド配列及び／又はベクターを宿主細胞に導入することを含む。一実施形態によれば、宿主に対するストレスは、エタノール、ブタノール、ＵＶ暴露、フルフラール、又は１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ（１０ＤＢ）などの薬物前駆体に暴露されることにより引き起こされる。
【００３１】
さらなる態様において、本開示は、本組換えポリヌクレオチド配列及び／又はベクターを宿主細胞に導入することを含む、エタノール又はバッカチンＩＩＩの生産における宿主細胞の生産性を向上させる方法に関する。
【００３２】
本開示の付随する特徴及び利点の多くは、添付図面と関連して考慮される以下の詳細な説明を参照してよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
本説明は、添付の図面に照らして、以下の詳細な説明からよりよく理解されるであろう。
【００３４】
【図１】図１は、３Ｓ，  ３'Ｓアスタキサンチン（一番上のパネル）、３Ｒ，  ３'Ｒアスタキサンチン（中央のパネル）、及び３Ｒ，  ３'Ｓアスタキサンチン（一番下のパネル）の化学構造をそれぞれ示す図面である。
【００３５】
【図２】図２ａ及び２ｂは、カロテノイド生合成経路を示す模式図である。
【００３６】
【図３】図３ａ及び３ｂは、３Ｓ，  ３'Ｓアスタキサンチンのデザイナー生合成経路を示す模式図である。
【００３７】
【図４ａ】図４ａは、本開示の一例にしたがう、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの保存領域を示す配列アライメントデータであり、触媒ドメイン１〜６が下線でマークされており、７２０８はＫｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓに由来するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを表し、Ｐ１２６８３はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを表し、ＡＣＮ４０４７６はＰｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓに由来するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを表し、ＸＰ＿００１２１１３２３はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓに由来するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを表し、ＡＢＹ８４８４８はＧａｎｏｄｅｒｍａ  ｌｕｃｉｄｕｍに由来するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを表す。
【００３８】
【図４ｂ】図４ｂは、本開示の一例にしたがう、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの触媒ドメイン１〜６内の保存残基を示す模式図であり、保存残基が下線でハイライトされている。
【００３９】
【図５ａ】図５ａは、本開示の別の例にしたがう、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）シンターゼの保存領域を示す配列アライメントデータであり、触媒ドメイン１〜２が下線でマークされており、ＡＡＹ３３９２１はＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓに由来するＧＧＰＰシンターゼを表し、ＮＰ＿６２４５２１はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒに由来するＧＧＰＰシンターゼを表し、ＢＡＢ９９５６５はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに由来するＧＧＰＰシンターゼを表し、ＺＰ＿０００５６７５２はＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａに由来するＧＧＰＰシンターゼを表し、ＮＰ＿６９６５８７はＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍに由来するＧＧＰＰシンターゼを表す。
【００４０】
【図５ｂ】図５ｂは、本開示の別の例にしたがう、ＧＧＰＰシンターゼの触媒ドメイン１〜２内の保存残基を示す模式図であり、保存残基が下線でハイライトされている。
【００４１】
【図６】図６は、本開示の一例にしたがう、３つの遺伝子カセットを含む組換えポリヌクレオチド配列（ｃｒｔＥ−Ｋａｎ−ｔＨＭＧ１と略する）を含む遺伝子改変株Ｘｄ３．０を示す模式図である。
【００４２】
【図７ａ】図７ａは、本開示の一例にしたがう、リコペンシクラーゼドメインの保存領域を示す配列アライメントデータであり、触媒ドメイン１〜２が下線でマークされており、ＣＡＢ５１９４９はＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓに由来するリコペンシクラーゼを表し、ＸＰ＿７６２４３４はＵｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ  ５２１に由来するリコペンシクラーゼを表し、ＮＰ＿３４４２２３はＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  Ｐ２に由来するリコペンシクラーゼを表し、ＹＰ＿０２４３１２はＰｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｔｏｒｒｉｄｕｓ  ＤＳＭ  ９７９０に由来するリコペンシクラーゼを表す。
【００４３】
【図７ｂ】図７ｂは、本開示の一例にしたがう、リコペンシクラーゼドメインの触媒ドメイン１〜２内の保存残基を示す模式図であり、保存残基が下線でハイライトされている。
【００４４】
【図７ｃ】図７ｃは、本開示の一例にしたがう、トランス−イソプレニル二リン酸シンターゼの保存領域を示す配列アライメントデータであり、触媒ドメイン１〜２が下線でマークされており、ＣＡＢ５１９４９はＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓに由来するトランス−イソプレニル二リン酸シンターゼを表し、ＮＰ＿２７９６９３はＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＮＲＣ−１に由来するトランス−イソプレニル二リン酸シンターゼを表し、ＮＰ＿６８１８８７はＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１に由来するトランス−イソプレニル二リン酸シンターゼを表し、ＺＰ＿０００８９８７８はＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉに由来するトランス−イソプレニル二リン酸シンターゼを表す。
【００４５】
【図７ｄ】図７ｄは、本開示の一例にしたがう、トランス−イソプレニル二リン酸シンターゼの触媒ドメイン１〜２内の保存残基を示す模式図であり、保存残基が下線でハイライトされている。
【００４６】
【図８ａ】図８ａは、本開示の別の例にしたがう、フィトエンデサチュラーゼの保存領域を示す配列アライメントデータであり、ＮＡＤ（Ｐ）結合ロスマン様ドメインが下線でマークされており、ＡＡＯ５３２５７はＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓｅｎｅ  ｄｅｓａｔｕｒａに由来するフィトエンデサチュラーゼを表し、ＣＡＥ０７４１６はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＷＨ  ８１０２に由来するフィトエンデサチュラーゼを表し、ＢＡＡ１０７９８はＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ６８０３に由来するフィトエンデサチュラーゼを表し、ＢＡＢ７３７６３はＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７１２０に由来するフィトエンデサチュラーゼを表し、ＡＡＬ９１３６６はＳｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍに由来するフィトエンデサチュラーゼを表す。
【００４７】
【図８ｂ】図８ｂは、本開示の別の例にしたがう、フィトエンデサチュラーゼのＮＡＤ（Ｐ）結合ロスマン様ドメイン内の保存残基を示す模式図であり、保存残基が下線でハイライトされている。
【００４８】
【図９】図９は、本開示の一例にしたがう、５つの遺伝子カセットを含む組換えポリヌクレオチド配列（ｃｒｔＩ−ｃｒｔＥ−Ｋａｎ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１と略する）を含む遺伝子改変株Ｘｄ５．０を示す模式図である。
【００４９】
【図１０ａ】図１０ａ及び１０ｂは、本開示の別の例にしたがう、β−カロチンオキシゲナーゼの保存領域を示す配列アライメントデータであり、触媒ドメイン１〜３が下線でマークされており、ＡＡＹ３３９２１はＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓに由来するβ−カロチンオキシゲナーゼを表し、Ｑ０８４７７はＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓに由来するβ−カロチンオキシゲナーゼを表し、Ｐ３３２７４はＲａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓに由来するβ−カロチンオキシゲナーゼを表し、Ｐ１１７０７はＯｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓに由来するβ−カロチンオキシゲナーゼを表し、Ｐ３３２７０はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒに由来するβ−カロチンオキシゲナーゼを表す。
【図１０ｂ】図１０ａ及び１０ｂは、本開示の別の例にしたがう、β−カロチンオキシゲナーゼの保存領域を示す配列アライメントデータであり、触媒ドメイン１〜３が下線でマークされており、ＡＡＹ３３９２１はＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓに由来するβ−カロチンオキシゲナーゼを表し、Ｑ０８４７７はＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓに由来するβ−カロチンオキシゲナーゼを表し、Ｐ３３２７４はＲａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓに由来するβ−カロチンオキシゲナーゼを表し、Ｐ１１７０７はＯｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓに由来するβ−カロチンオキシゲナーゼを表し、Ｐ３３２７０はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒに由来するβ−カロチンオキシゲナーゼを表す。
【００５０】
【図１０ｃ】図１０ｃは、本開示の別の例にしたがう、β−カロチンオキシゲナーゼの触媒ドメイン１〜３内の保存残基を示す模式図であり、保存残基が下線でハイライトされている。
【００５１】
【図１１ａ】図１１ａ及び１１ｂは、本開示の一例にしたがう、Ｐ４５０レダクターゼの保存領域を示す配列アライメントデータであり、フラボドキシンドメインとＮＡＤＰＨチトクロームｐ４５０レダクターゼドメインが下線でそれぞれマークされており、ＡＣＩ４３０９７はＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓに由来するＰ４５０レダクターゼを表し、Ｑ００１４１はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒに由来するＰ４５０レダクターゼを表し、ＮＰ＿５９６０４６はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅに由来するＰ４５０レダクターゼを表し、ＸＰ＿００１７３１４９４はＭａｌａｓｓｅｚｉａ  ｇｌｏｂｏｓａ  ＣＢＳ  ７９６６に由来するＰ４５０レダクターゼを表し、ＸＰ＿７６２４２０はＵｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ  ５２１に由来するＰ４５０レダクターゼを表す。
【図１１ｂ】図１１ａ及び１１ｂは、本開示の一例にしたがう、Ｐ４５０レダクターゼの保存領域を示す配列アライメントデータであり、フラボドキシンドメインとＮＡＤＰＨチトクロームｐ４５０レダクターゼドメインが下線でそれぞれマークされており、ＡＣＩ４３０９７はＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓに由来するＰ４５０レダクターゼを表し、Ｑ００１４１はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒに由来するＰ４５０レダクターゼを表し、ＮＰ＿５９６０４６はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅに由来するＰ４５０レダクターゼを表し、ＸＰ＿００１７３１４９４はＭａｌａｓｓｅｚｉａ  ｇｌｏｂｏｓａ  ＣＢＳ  ７９６６に由来するＰ４５０レダクターゼを表し、ＸＰ＿７６２４２０はＵｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ  ５２１に由来するＰ４５０レダクターゼを表す。
【００５２】
【図１１ｃ】図１１ｃは、本開示の一例にしたがう、Ｐ４５０レダクターゼのフラボドキシンドメイン１〜４内の保存残基を示す模式図であり、保存残基が下線でハイライトされている。
【００５３】
【図１１ｄ】図１１ｄは、本開示の一例にしたがう、ＮＡＤＰＨチトクロームｐ４５０レダクターゼドメイン１〜５内の保存残基を示す模式図であり、保存残基が下線でハイライトされている。
【００５４】
【図１２】図１２は、本開示の一例にしたがう、７つの遺伝子カセットを含む組換えポリヌクレオチド配列（ｃｒｔＩ−ｃｒｔＲ−ｃｒｔＥ−Ｋａｎ−ｃｒｔＳ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１と略する）を含む遺伝子改変株Ｘｄ７−３を示す模式図である。
【００５５】
【図１３ａ】図１３ａは、本開示の別の例にしたがう、特定の株の寒天プレート培養の表現型をそれぞれ示す写真であり、全ての株が１０世代継代で選択された。
【００５６】
【図１３ｂ】図１３ｂは、本開示の別の例にしたがう、組換えポリヌクレオチド配列を構築するのに用いられるスキームを示す模式図である。
【００５７】
【図１３ｃ】図１３ｃは、本開示の一例にしたがう、特定の株から抽出され、続いてコロニーＰＣＲアッセイにより増幅されたＤＮＡ断片をそれぞれ示す、ゲル電気泳動の写真である。
【００５８】
【図１４ａ】図１４ａは、本開示の別の例にしたがう、β−カロチンケトラーゼの保存領域を示す配列アライメントデータであり、触媒ドメイン１〜４が下線でマークされており、ＸＰ＿００１６９８６９９はＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉに由来するβ−カロチンケトラーゼを表し、ＢＡＢ７４８８８はＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７１２０に由来するβ−カロチンケトラーゼを表し、ＮＰ＿９２４６７４はＧｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓ  ＰＣＣ  ７４２１に由来するβ−カロチンケトラーゼを表し、ＡＢＢ２５９３８はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＣＣ９９０２に由来するβ−カロチンケトラーゼを表し、ＣＡＥ０７８８３はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＷＨ  ８１０２に由来するβ−カロチンケトラーゼを表す。
【００５９】
【図１４ｂ】図１４ｂは、本開示の別の例にしたがう、β−カロチンケトラーゼの触媒ドメイン１〜４内の保存残基を示す模式図であり、保存残基が下線でハイライトされている。
【００６０】
【図１５ａ】図１５ａは、本開示の一例にしたがう、β−カロチンヒドロキシラーゼの保存領域を示す配列アライメントデータであり、触媒ドメイン１〜２が赤い長方形の境界によりアウトライン化されており、ＸＰ＿００１６９８６９８はＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉに由来するβ−カロチンヒドロキシラーゼを表し、ＡＢＳ５０２３７はＣｈｒｏｍｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓに由来するβ−カロチンヒドロキシラーゼを表し、Ｑ９ＳＰＫ６はＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓに由来するβ−カロチンヒドロキシラーゼを表す。
【００６１】
【図１５ｂ】図１５ｂは、本開示の一例にしたがう、β−カロチンヒドロキシラーゼの触媒ドメイン１〜２内の保存残基を示す模式図であり、保存残基が赤色でハイライトされている。
【００６２】
【図１６ａ】図１６ａは、本開示の一例にしたがう、７つの遺伝子カセットを含む組換えポリヌクレオチド配列（すなわち、ｃｒｔＩ−ｃｒｔＥ−ＣｒＣｈＹｂ−Ｋａｎ−ＣｒＢＫＴ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１）を含む遺伝子改変株Ｃｒ１を示す模式図である。
【００６３】
【図１６ｂ】図１６ｂは、本開示の別の例にしたがう、７つの遺伝子カセットを含む組換えポリヌクレオチド配列（すなわち、ｃｒｔＩ−ｃｒｔＥ−ＨｐＣｈＹｂ−Ｋａｎ−ＣｒＢＫＴ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１）を含む遺伝子改変株Ｈｐ９を示す模式図である。
【００６４】
【図１６ｃ】図１６ｃは、本開示のさらに別の例にしたがう、７つの遺伝子カセットを含む組換えポリヌクレオチド配列（すなわち、ｃｒｔＩ−ｃｒｔＥ−ＣｚＣｈＹｂ−Ｋａｎ−ＣｒＢＫＴ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１）を含む遺伝子改変株Ｃｚ５を示す模式図である。
【００６５】
【図１７ａ】図１７ａは、本開示の一例にしたがう、特定の株を含有するブロスをそれぞれ示す写真である。
【００６６】
【図１７ｂ】図１７ｂは、本開示の別の例にしたがう、特定の株を含有するブロスをそれぞれ示す写真である。
【００６７】
【図１７ｃ】図１７ｃは、本開示の一例にしたがう、特定の株の増殖曲線を示す折れ線グラフである。
【００６８】
【図１７ｄ】図１７ｄは、本開示の一例にしたがう、分光光度法アッセイにより測定される全カロテノイドのフルスペクトルＵＶ／Ｖを示す折れ線グラフである。
【００６９】
【図１８】図１８ａ及び１８ｂは、本開示の別の例にしたがう、ＨＰＬＣ分光測定アッセイによりＵＶ４５０ｎｍ下で測定される特定の株の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）結果を示し、１は遊離形態のカンタキサンチンを示し、６は遊離形態のβ−カロチンを示し、２、３、４、５、７、及び８は未知のピークを示す。
【００７０】
【図１９ａ】図１９ａは、本開示の一例にしたがう、特定の株のコロニーをそれぞれ示す写真である。
【００７１】
【図１９ｂ】図１９ｂは、本開示の一例にしたがう、様々な温度下の、特定の株を含有するブロスをそれぞれ示す写真である。
【００７２】
【図１９ｃ】図１９ｃは、本開示の一例にしたがう、遺伝子発現を示すヒストグラムである。
【００７３】
【図２０】図２０ａ及び２０ｂは、本開示の一例にしたがう、ＨＰＬＣ分光測定アッセイによりＵＶ４５０ｎｍ下で測定される特定の株のＨＰＬＣ結果を示す。
【００７４】
【図２１ａ】図２１ａは、本開示の別の例にしたがう、特定の株及び成分を含有するブロスを示す写真である。
【００７５】
【図２１ｂ】図２１ｂは、本開示の別の例にしたがう、ＣＡ６−ＩＴＳ株及び特定の成分を含有するブロスを示す写真である。
【００７６】
【図２２】図２２は、本開示の一例にしたがう、ケン化処理を伴うＵＶ４６０ｎｍ下での液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）分析を示す。
【００７７】
【図２３ａ】図２３ａは、本開示の一例にしたがう、特定の株のフリーラジカル消去率を示すヒストグラムであり、この比率はＡＢＴＳ基質を用いる抗酸化能力アッセイにより測定される。
【００７８】
【図２３ｂ】図２３ｂは、本開示の一例にしたがう、Ｔｒｏｌｏｘ等価抗酸化能力（ＴＥＡＣ）アッセイの結果を示すヒストグラムである。
【００７９】
【図２４ａ】図２４ａは、本開示の一例にしたがう、８つの遺伝子カセットを含む組換えポリヌクレオチド配列を示す模式図である。
【００８０】
【図２４ｂ】図２４ｂは、本開示の一例にしたがう、７つの遺伝子カセットを含むＣＡ６−ＩＴＳ株の内部転写スペーサー（ＩＴＳ）領域を示す模式図である。
【００８１】
【図２４ｃ】図２４ｃは、本開示の例にしたがう、特定の株からそれぞれ抽出され、続いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により分析される、特定の遺伝子の相対的遺伝子発現を示すヒストグラムである。
【００８２】
【図２４ｄ】図２４ｄは、本開示の別の例にしたがう、本組換えポリヌクレオチド配列を含むハイコピー数プラスミドＲＳ４２６を示す模式図である。
【００８３】
【図２４ｅ】図２４ｅは、本開示の一例にしたがう、電気泳動の結果を示す写真である。
【００８４】
【図２４ｆ】図２４ｆは、本開示の一例にしたがう、ＣＡ６−ＩＴＳ株により生産されたアスタキサンチンのＨＰＬＣデータを示す。
【００８５】
【図２５】図２５ａ及び２５ｂは、本開示の別の例にしたがう、特定の株及び成分を含有するブロスを示す写真である。
【００８６】
【図２６ａ】図２６ａは、本開示の一例にしたがう、ＬＣ  ＭＳ／ＭＳ分析によりＵＶ４６０ｎｍ下で測定された超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）の結果を示す。
【００８７】
【図２６ｂ】図２６ｂは、本開示の別の例にしたがう、ＬＣ  ＭＳ／ＭＳ分析によりＵＶ４６０ｎｍで分析されたＭＳ／ＭＳの結果を示す。
【００８８】
【図２７】図２７は、本開示の一例にしたがう、（ａ）ＵＶ暴露、（ｂ）フルフラール、（ｃ）エタノール、及び（ｄ）イソブタノールでそれぞれ処理された野生型及びＣｚ３０株のコロニーを呈する写真である。
【００８９】
【図２８ａ】図２８ａは、本開示の別の例にしたがう、様々なエタノール濃度でそれぞれ処理された野生型及びＣｚ３０株の細胞密度を示すヒストグラムである。
【００９０】
【図２８ｂ】図２８ｂは、本開示の別の例にしたがう、２０％ガラクトースを含有するＹＰＧ培地中で培養された野生型及びＣｚ３０株の細胞密度及びエタノール生産を示すデータであり、左のｙ軸は細胞密度を表し、右のｙ軸はエタノール生産を表し、ｘ軸は時間次元を表す。
【００９１】
【図２９ａ】図２９ａは、本開示の一例にしたがう、特定の濃度のエタノール中に溶解した特定の濃度の１０デアセチルバッカチンＩＩＩ（１０ＤＢ）でそれぞれ処理した、野生型及びＣｚ３０株のコロニーを呈する写真である。
【００９２】
【図２９ｂ】図２９ｂは、本開示の一例にしたがう、特定の濃度の１０ＤＢでそれぞれ処理した野生型及びＣｚ３０株の細胞密度を示すヒストグラムである。
【００９３】
【図３０】図３０は、（ａ）４％エタノール中に溶解した０．８ｍＭ  １０ＤＢ、及び（ｂ）６％エタノール中に溶解した１．２ｍＭ  １０ＤＢでそれぞれ処理した、野生型及びＣｚ３０株の増殖曲線を示す折れ線グラフである。
【００９４】
【図３１】図３１は、特定の株における１０ＤＢの生物変換を示す写真である。
【００９５】
一般的な慣行にしたがい、記載された様々な特徴／要素は原寸に比例して描かれておらず、代わりに本発明に関連する特定の特徴／要素を最良に示すように描かれている。
【発明を実施するための形態】
【００９６】
発明の詳細な説明
添付の図面に関連する以下の詳細な説明は、本例の説明として意図されており、本例を構築又は利用できる唯一の形態を表すことを意図するものではない。この説明は、本例の機能及び本例を構築し作動させるための一連のステップを示す。しかしながら、同一又は同等の機能及び一連のステップは、様々な例により達成され得る。
【００９７】
便宜上、明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲において用いられるいくつかの用語をここに集める。本明細書において他に定義されない限り、本開示で用いられる科学技術用語は、当業者により一般的に理解され用いられる意味を有するものとする。
【００９８】
文脈によって他に必要とされない限り、単数形の用語は、その複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。具体的には、本明細書中及び請求項において用いられるように、単数形「ａ」及び「ａｎ」は、文脈が他に明確に示さない限り、複数の参照を含む。
【００９９】
本発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータが近似値であることにもかかわらず、特定の実施例に示される数値は、可能な限り正確に報告されている。しかしながら、あらゆる数値は、それぞれの試験測定において見出される標準偏差から必然的に生じる、ある一定の誤差を本質的に含む。また、本明細書で使用する「約」という用語は、一般的に、所与の値又は範囲の１０％、５％、１％、又は０．５％以内を意味する。代わりに、用語「約」は、当業者によって考慮される場合、許容可能な平均の標準誤差内であることを意味する。作動例／実施例以外において、又は他に明確に指定しない限り、本明細書中に開示される、材料の量、継続時間、温度、作動条件、量の比などについての、数値範囲、量、値及びパーセンテージの全ては、全ての場合において、用語「約」により修飾されているものとして理解されるものとする。したがって、特に断りのない限り、本開示及び添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、必要に応じて変化し得る近似値である。最低限でも、各数値パラメータは、報告された有効数字の数に照らして、通常の丸め技術を適用することによって、少なくとも解釈されるべきである。
【０１００】
本明細書で用いられる、用語「制御配列」は、それらが動作可能に連結されたコード配列の発現に影響を及ぼすのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。このような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なる。原核生物において、制御配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、及びターミネーターを含む。真核生物において、制御配列は一般に、プロモーター、ターミネーター及びエンハンサー又はサイレンサーを含む。用語「制御配列」は、最低限、コード配列の発現にその存在が必要な全ての成分を含むことが意図され、追加の有利な成分を含むこともでき、特定の遺伝子が、いつ、どれくらい、どこで発現するかを決定する。ある実施形態において、用語「制御配列」は、特定のプロモーター以外の調節成分を含む。
【０１０１】
本明細書における「プロモーター」への言及は、細胞、組織又は器官における核酸配列の発現を、付与、活性化、又は増強する、合成又は融合の分子又は誘導体を説明する。
【０１０２】
「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、互換的に用いることができ、本開示にしたがい、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ又は前記ＤＮＡの転写産物（例えば、ＲＮＡ分子）のいずれかを意味するものと理解される。本開示が、天然環境又は天然状態のゲノムポリ核酸配列に関するものではないこともまた、理解されるべきである。本発明の核酸、ポリヌクレオチド、又は核酸配列は、イオン交換クロマトグラフィー、分子サイズ排除クロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない分離方法によって、又は増幅、サブストラクティブハイブリダイゼーション、クローニング、サブクローニング又は化学合成、又はこれらの遺伝子工学的方法の組み合わせなどの遺伝子工学的方法によって、単離、精製（又は部分的に精製）することができる。
【０１０３】
本明細書で用いられる用語「配列相同性」は、特定の比較ウインドウにわたり最大一致のためにアライメントさせたときの、２以上の核酸又はアミノ酸配列の間の配列関係を指す。「相同性」のパーセンテージは、比較ウインドウにわたる２つの最適にアライメントされた配列を比較することにより決定される。２つの配列の「最適なアライメント」のために、比較ウインドウ中の配列の一部は、付加又は欠失を含まない参照配列と比較したときに、ギャップ（例えば、欠失又は付加）を含んでよいことが理解されるだろう。アライメントの後、一致した位置（すなわち、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両方の配列に出現する位置）の数を決定し、次いで比較ウインドウ中の位置の総数で除される。次いで、この結果を１００で乗じ、配列又はアミノ酸相同性のパーセンテージを計算する。いくつかの実施形態において、２つの配列は、ヌクレオチド又はアミノ酸の総数が同じである。アライメントされた配列は、熟練した職人が精通しているＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡを含む任意の方法によって分析することができる。
【０１０４】
上で議論したように、アスタキサンチン生合成のための現在の技術は、多くの制限を有し、化学合成と経済的に競合することができない。他方、多くのアスタキサンチンが化学合成により安く生産されているが、この生産プロセスは高い環境汚染を引き起こす。そしてその産物は人体に容易に貯蔵されることも容易に吸収されることもできず、食品及び医薬市場によく受け入れられていない。上記に鑑み、本発明は、アスタキサンチン又はその前駆体又は誘導体を宿主細胞で効率よく大量に生産するためのアプローチ（図３ａ及び３ｂ）を提供することを目的とする。従来の方法（例えば、改変微生物による生産）及び化学合成と比較すると、本アプローチは４つの利点により特徴づけられる。４つの利点とは、（１）より高い前駆体の合成、（２）より短い代謝経路、（３）最終産物の正確な構造、及び（４）エステル形態の保護である。
【０１０５】
具体的には、本開示は、アスタキサンチンの生合成を調節するいくつかのポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド配列；本組換えポリヌクレオチド配列を含むベクター；本組換えポリヌクレオチド配列及び／又はベクターを含む宿主細胞；及びその結果、前記宿主細胞を用いて、アスタキサンチン、その前駆体又は誘導体を生合成する方法を提供する。このように生産されたアスタキサンチン及び／又はその前駆体又は誘導体の抗酸化能に基づき、本開示はまた、ストレスに対する宿主細胞の耐性を向上させる方法、及びエタノール又はバッカチンＩＩＩなどの薬物前駆体の生産における宿主細胞の生産性を向上させる方法を提供する。
【０１０６】
このように生産されたアスタキサンチンは、３Ｓ，  ３Ｓ'−アスタキサンチン又は３Ｒ，  ３Ｒ'−アスタキサンチンであり得る。アスタキサンチンの前駆体は、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）、フェニコキサンチン、リコペン、エキネノン、カンタキサンチン、フィトエン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、又はβ−カロチンであり得る。アスタキサンチンの誘導体は、アスタキサンチンモノエステル又はアスタキサンチンジエステルであり得る。
【０１０７】
１．  組換えポリヌクレオチド配列
【０１０８】
本開示の第１の態様は、プロモーターに基づく遺伝子アセンブリ及び同時過剰発現（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｂａｓｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ＰＧＡＳＯ）技術（Ｃｈａｎｇら．、２０１２）によって構築される、組換えポリヌクレオチド配列に関する。ＰＧＡＳＯ技術は、個々のプロモーターを有する遺伝子カセットの組換えアセンブリについて、重複するポリヌクレオチドを用いるクローニング戦略であり、その結果、複数の遺伝子カセットを細胞のゲノムに予め指定された順序で挿入することができる。簡潔には、各遺伝子カセットは、２つの部分：（１）５'末端でプロモーター配列に連結された遺伝子配列、及び（２）隣接するカセットの５'末端と同一の、遺伝子カセットの３'末端の配列、を含む。第１の遺伝子カセットについてのプロモーター配列の５'末端の部分及び第２の遺伝子カセットの３'末端の部分は、部位特異的挿入を容易にするために、宿主ゲノム中の所定の位置に相同である。好ましくは、各遺伝子カセット中のプロモーター配列は互いに異なる。しかしながら、遺伝子カセットの３'末端の配列は、隣接する下流の遺伝子カセット中のプロモーター配列の一部に相同であるべきである。遺伝子カセットが細胞に導入されると、それらは予め指定された順序で、重複するプロモーター配列のペアの間での相同組換えを介して結合し、それにより、最初のプロモーター配列及び最後の遺伝子カセットの３'末端での相同組換えを介して、ゲノム中に挿入される。
【０１０９】
以下の組換えポリヌクレオチド配列は全て、ＰＧＡＳＯ技術の概念に基づいて構築される。
【０１１０】
１．１  ２つの遺伝子カセットを含む組換えポリヌクレオチド配列
【０１１１】
本開示の一実施形態によれば、本組換えポリヌクレオチド配列は２つの遺伝子カセットを含む。第１の遺伝子カセットは第１のプロモーターにより駆動される第１の核酸配列を含み、ここで第１の核酸配列は、ゲラニルピロリン酸（ＦＰＰ）からのＧＧＰＰの形成を触媒する酵素である、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）シンターゼをコードする。第２の遺伝子カセットは、第２のプロモーターにより駆動される第２の核酸配列を含み、ここで、第２の核酸配列は、アセチル−ＣｏＡからのメバロン酸の形成を触媒する、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼをコードする。ＰＧＡＳＯ技術の戦略に基づき、１つの遺伝子カセットの３'末端は、その下流の別の遺伝子カセットの５'末端に相同である。それ故に、２つの遺伝子カセットが宿主細胞に導入されると、それらは組み立てられて組換えポリヌクレオチド配列を構築する。
【０１１２】
例えば、本開示の一つの実施形態において、第１の遺伝子カセットの３'末端の配列は、第２のプロモーターの一部に相同である。構築された組換えポリヌクレオチド配列は、構造的に、２つの遺伝子カセット、すなわち、第１の及び第２の遺伝子カセットを、５'末端から３'末端の方向の順で含む。
【０１１３】
任意選択的に、組換えポリヌクレオチド配列は、マーカープロモーターと、マーカープロモーターに作動可能に連結されたマーカー遺伝子とを含む、マーカーカセットをさらに含んでよい。別の実施形態によれば、第１の遺伝子カセットの３'末端の配列は、マーカープロモーターの一部に相同であるが、マーカーカセットの３'末端の配列は、第２のプロモーターの一部に相同である。それ故に、相同組換えの後、マーカーカセットは第１の遺伝子カセットと第２の遺伝子カセットとの間に位置する。
【０１１４】
ＧＧＰＰシンターゼを生産するために、第１の核酸配列は、ｃｒｔＥ遺伝子又はその断片であり、これはＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ、又はＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍのｃｒｔＥ遺伝子に由来することができる。一つの具体的な実施形態において、第１の核酸配列は、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓのｃｒｔＥ遺伝子の触媒ドメインに由来し、配列番号１の配列を含む。
【０１１５】
ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを生産するために、第２の核酸配列は、ＨＭＧ１遺伝子又はその断片であり、これは、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、又はＧａｎｏｄｅｒｍａ  ｌｕｃｉｄｕｍのＨＭＧ１遺伝子に由来することができる。一つの実施形態において、第２の核酸配列は、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓのＨＭＧ１遺伝子の触媒ドメインに由来する。酵母において、トランケート型ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ｔＨＭＧ１）が、フィードバック阻害を減少させ、それ故に下流のＧＧＰＰの蓄積を向上させることが知られている。したがって、一つの具体的な例において、第２の核酸配列はｔＨＭＧ１であり、配列番号２の配列を含む。
【０１１６】
マーカー遺伝子としては、スクリーニングマーカー遺伝子（例えば、蛍光遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、及びＬａｃＺ遺伝子）又は選択マーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）が可能である。本開示の一実施形態によれば、マーカー遺伝子は、宿主にカナマイシン／ジェネティシン（Ｇ４１８）／ネオマイシン耐性を付与するＫａｎＭＸマーカー遺伝子、又はオーレオバシジンＡ（ＡｂＡ）耐性を付与するＡＵＲ１−Ｃ遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子である。
【０１１７】
第１の核酸配列／遺伝子、第２の核酸配列／遺伝子、及びマーカー核酸配列／遺伝子の発現をそれぞれ駆動するのに用いることのできる適切なプロモーターの例としては、ＳｃＧａｐＤＨプロモーター、ＫｌＧａｐＤＨプロモーター、ＳｃＰＧＫプロモーター、ＫｌＰＧＫプロモーター、ＫｌＡＤＨＩプロモーター、ＳｃＡＤＨＩプロモーター、ＫｌＡＤＨ４プロモーター、ＳｃＡＤＨ４プロモーター、ＫｌＬａｃ４プロモーター及びＩＣＬプロモーターがあるが、これらに限定されない。好ましくは、組換えポリヌクレオチド配列中のそれぞれの核酸配列又は遺伝子カセットは、互いに異なるプロモーターによって駆動される。一つの実施形態において、第１のプロモーターはＫｌＬａｃ４プロモーター、第２のプロモーターはＳｃＡＤＨＩプロモーター、マーカープロモーターはＫｌＧａｐＤＨプロモーターである。
【０１１８】
１．２  ４つの遺伝子カセットを含む組換えポリヌクレオチド配列
【０１１９】
本開示の別の実施形態によれば、本組換えポリヌクレオチド配列は４つの遺伝子カセットを含む。具体的には、セクション１．１で上述の、ＧＧＰＰシンターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをそれぞれ発現する第１の及び第２の遺伝子カセットに加えて、組換えポリヌクレオチド配列は第３の及び第４の遺伝子カセットをさらに含んでよい。第３の遺伝子カセットは、第３のプロモーターにより駆動される第３の核酸配列を含み、ここで第３の核酸配列は、ｃｉｓ−フィトエンからのリコペンの形成を触媒する酵素である、フィトエンデサチュラーゼをコードする。第４の遺伝子カセットは、第４のプロモーターにより駆動される第４の核酸配列を含み、ここで第４の核酸配列は、フィトエンシンターゼ及びリコペンシクラーゼの各機能を保持する二機能性酵素（以下、フィトエンシンターゼ／リコペンシクラーゼ）をコードし、これらフィトエンシンターゼ及びリコペンシクラーゼの両方の酵素はリコペンからβ−カロチンへの変換の触媒において役割を果たす。
【０１２０】
本明細書に記載の４つの遺伝子カセットは、ＰＧＡＳＯ技術の戦略にしたがって組み立てられる。すなわち、各遺伝子カセットの３'末端は、その下流の隣接遺伝子カセットの５'末端に相同である。例えば、本開示の一つの実施形態において、第３の遺伝子カセットの３'末端の配列は、第１のプロモーターの一部に相同であり；第１の遺伝子カセットの３'末端の配列は、第４のプロモーターの一部に相同であり；第４の遺伝子カセットの３'末端の配列は、第２のプロモーターの一部に相同である。４つの遺伝子カセットはインビボで自然発生的に組み立てられ、第３の遺伝子カセット、第１の遺伝子カセット、第４の遺伝子カセット、及び第２の遺伝子カセットを、５'末端から３'末端の方向の順で含む、組換えポリヌクレオチド配列を生じるだろう。
【０１２１】
任意選択的に、組換えポリヌクレオチド配列は、マーカープロモーターと、マーカープロモーターに作動可能に連結されたマーカー遺伝子とを含む、マーカーカセットをさらに含んでよい。マーカーカセットを含む組換えポリヌクレオチド配列は、ＰＧＡＳＯ方法を用いることにより同様のやり方で構築される。したがって、その詳細な説明は、簡潔のために省略している。本開示の一実施形態によれば、マーカーカセットは、第１の遺伝子カセットと第４の遺伝子カセットとの間に位置する。
【０１２２】
フィトエンデサチュラーゼを生産するために、第３の核酸配列はｃｒｔＩ遺伝子又はその断片であり、これはＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓｅｎｅ  ｄｅｓａｔｕｒａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＷＨ  ８１０２、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ６８０３、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７１２０、又はＳｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍに由来することができる。一つの具体的な実施形態において、第３の核酸配列は、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓのｃｒｔＩ遺伝子の触媒ドメインに由来し、配列番号３の配列を含む。
【０１２３】
フィトエンシンターゼ及びリコペンシクラーゼの各機能を有する二機能性酵素を構築するために、第４の核酸配列は、ｃｒｔＹＢ遺伝子又はその断片を含むように構築され、この配列は、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ  ５２１、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ又はＰｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｔｏｒｒｉｄｕｓに由来することができる。一つの具体的な実施形態において、第４の核酸配列は、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓのｃｒｔＹＢ遺伝子の触媒ドメインに由来し、配列番号４の配列を含む。
【０１２４】
マーカー遺伝子は、スクリーニングマーカー遺伝子又は選択マーカー遺伝子が可能である。本開示の一実施形態によれば、マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子ＫａｎＭＸである。
【０１２５】
第１の核酸配列／遺伝子、第２の核酸配列／遺伝子、第３の核酸配列／遺伝子、第４の核酸配列／遺伝子、及びマーカー核酸配列／遺伝子の発現をそれぞれ駆動するのに用いることのできる適切なプロモーターの例としては、ＳｃＧａｐＤＨプロモーター、ＫｌＧａｐＤＨプロモーター、ＳｃＰＧＫプロモーター、ＫｌＰＧＫプロモーター、ＫｌＡＤＨＩプロモーター、ＳｃＡＤＨＩプロモーター、ＫｌＡＤＨ４プロモーター、ＳｃＡＤＨ４プロモーター、ＫｌＬａｃ４プロモーター及びＩＣＬプロモーターがあるが、これらに限定されない。好ましくは、組換えポリヌクレオチド配列中のそれぞれの核酸配列は、異なるプロモーターにより駆動される。一つの実施形態において、第１のプロモーターはＳｃＰＧＫプロモーター、第２のプロモーターはＳｃＡＤＨＩプロモーター、第３のプロモーターはＫｌＬａｃ４プロモーター、第４のプロモーターはＫｌＡＤＨＩプロモーター、マーカープロモーターはＫｌＧａｐＤＨプロモーターである。
【０１２６】
１．３  ３Ｓ，  ３Ｓ'−アスタキサンチンを発現するための６つの遺伝子カセットを含む組換えポリヌクレオチド配列
【０１２７】
本開示の別の実施形態によれば、３Ｓ，  ３Ｓ'−アスタキサンチンを生産する目的で、組換えポリヌクレオチド配列は６つの遺伝子カセットを含む。具体的には、セクション１．２で上述のように、ＧＧＰＰシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、及びフィトエンシンターゼ／リコペンシクラーゼをそれぞれ発現する、第１の〜第４の遺伝子カセットに加えて、組換えポリヌクレオチド配列は、β−カロチンヒドロキシラーゼ及びβ−カロチンケトラーゼをそれぞれ発現する追加の２つの遺伝子カセットをさらに含んでよい。β−カロチンヒドロキシラーゼとβ−カロチンケトラーゼの両方が、３Ｓ，  ３Ｓ'−アスタキサンチンへのβ−カロチンの変換に必要である。より具体的には、第５の遺伝子カセットは第５のプロモーターにより駆動される第５の核酸配列を含み、ここで第５の核酸配列はβ−カロチンヒドロキシラーゼをコードする。第６の遺伝子カセットは第６のプロモーターにより駆動する第６の核酸配列を含み、ここで第６の核酸配列はβ−カロチンケトラーゼをコードする。
【０１２８】
同様に、６つの遺伝子カセットを含む組換えポリヌクレオチド配列もまた、ＰＧＡＳＯ技術の戦略に基づき構築され、ここで各遺伝子カセットの３'末端は、その下流の隣接遺伝子カセットの５'末端に相同である。例えば、一つの具体的な例において、第３の遺伝子カセットの３'末端の配列は、第１のプロモーターの一部に相同であり；第１の遺伝子カセットの３'末端の配列は、第５のプロモーターの一部に相同であり；第５の遺伝子カセットの３'末端の配列は、第６のプロモーターの一部に相同であり；第６の遺伝子カセットの３'末端の配列は、第４のプロモーターの一部に相同であり；第４の遺伝子カセットの３'末端の配列は、第２のプロモーターの一部に相同である。宿主細胞に一旦導入されると、６つの遺伝子カセットは自然発生的に組み立てられ、第３の遺伝子カセット、第１の遺伝子カセット、第５の遺伝子カセット、第６の遺伝子カセット、第４の遺伝子カセット、及び第２の遺伝子カセットを、５'末端から３'末端の方向の順で含む、組換えポリヌクレオチド配列を生じるだろう。
【０１２９】
さらに任意選択的に、組換えポリヌクレオチド配列は、マーカープロモーターにより駆動されるマーカー遺伝子を含む、マーカー遺伝子カセットをさらに含んでよい。本実施形態において、構築されたマーカーカセットは、第５の遺伝子カセットと第６の遺伝子カセットとの間に位置する。
【０１３０】
β−カロチンヒドロキシラーゼを生産するために、第５の核酸配列は、ｃｈＹｂ遺伝子又はその断片を含むように構築され、この配列は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、又はＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓに由来することができる。一つの実施形態において、第５の核酸配列はＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのｃｈＹｂ遺伝子の触媒ドメインに由来し、配列番号５の配列を含む。別の実施形態において、第５の核酸配列はＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓのｃｈＹｂ遺伝子の触媒ドメインに由来し、配列番号６の配列を含む。さらに別の実施形態において、第５の核酸配列はＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓのｃｈＹｂ遺伝子の触媒ドメインに由来し、配列番号７の配列を含む。
【０１３１】
β−カロチンケトラーゼを生産するために、第６の核酸配列は、ｂｋｔ遺伝子又はその断片を含むように構築され、この配列は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７１２０、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓ  ＰＣＣ  ７４２１、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＣＣ９９０２、又はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＷＨ  ８１０２に由来することができる。一つの具体的な実施形態において、第６の核酸配列はＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのｂｋｔ遺伝子の触媒ドメインに由来し、配列番号８の配列を含む。
【０１３２】
マーカー遺伝子は、上述のスクリーニングマーカー遺伝子又は選択マーカー遺伝子が可能である。本開示の一実施形態によれば、マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子ＫａｎＭＸである。
【０１３３】
第１〜第６の核酸配列及びマーカー遺伝子の発現をそれぞれ駆動するのに用いることのできる適切なプロモーターの例としては、ＳｃＧａｐＤＨプロモーター、ＫｌＧａｐＤＨプロモーター、ＳｃＰＧＫプロモーター、ＫｌＰＧＫプロモーター、ＫｌＡＤＨＩプロモーター、ＳｃＡＤＨＩプロモーター、ＫｌＡＤＨ４プロモーター、ＳｃＡＤＨ４プロモーター、ＫｌＬａｃ４プロモーター及びＩＣＬプロモーターがあるが、これらに限定されない。好ましくは、組換えポリヌクレオチド配列中のそれぞれの核酸配列は、互いに異なるプロモーターによって駆動される。一つの実施形態において、第１のプロモーターはＳｃＧａｐＤＨプロモーター、第２のプロモーターはＳｃＡＤＨＩプロモーター、第３のプロモーターはＫｌＬａｃ４プロモーター、第４のプロモーターはＫｌＡＤＨＩプロモーター、第５のプロモーターはＳｃＰＧＫプロモーター、第６のプロモーターはＫｌＰＧＫプロモーター、及びマーカープロモーターはＫｌＧａｐＤＨプロモーターである。
【０１３４】
１．４  ３Ｒ，  ３Ｒ'−アスタキサンチンを発現するための６つの遺伝子カセットを含む組換えポリヌクレオチド配列
【０１３５】
本発明はまた、３Ｒ，  ３Ｒ'−アスタキサンチンを宿主細胞で大量に生産するように設計された組換えポリヌクレオチド配列を提供する。本開示のいくつかの実施形態によれば、３Ｒ，  ３Ｒ'−アスタキサンチンの生産のための組換えポリヌクレオチド配列は、６つの遺伝子カセットを含み、ここで、最初の４つの遺伝子カセットは、セクション１．２で上述のように、ＧＧＰＰシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、及びフィトエンシンターゼ／リコペンシクラーゼをそれぞれ発現し、一方で最後の２つの遺伝子カセット（以下、第７の遺伝子カセット及び第８の遺伝子カセット）は、β−カロチンからの３Ｒ，  ３Ｒ'−アスタキサンチンの形成の触媒において役割を果たすことが知られている、Ｐ４５０レダクターゼ及びβ−カロチンオキシゲナーゼをそれぞれ発現する。具体的には、第７の遺伝子カセットは第７のプロモーターにより駆動される第７の核酸配列を含み、ここで第７の核酸配列はＰ４５０レダクターゼをコードする。第８の遺伝子カセットは第８のプロモーターにより駆動される第８の核酸配列を含み、ここで第８の核酸配列はβ−カロチンオキシゲナーゼをコードする。
【０１３６】
同様に、３Ｒ，  ３Ｒ'−アスタキサンチンを生産するための組換えポリヌクレオチド配列は、ＰＧＡＳＯ戦略の概念にしたがって構築され、ここで、各遺伝子カセットの３'末端は、その下流の隣接遺伝子カセットの５'末端に相同である。例えば、一実施形態によれば、第３の遺伝子カセットの３'末端の配列は、第７のプロモーターの一部に相同であり；第７の遺伝子カセットの３'末端の配列は、第１のプロモーターの一部に相同であり；第１の遺伝子カセットの３'末端の配列は、第８のプロモーターの一部に相同であり；第８の遺伝子カセットの３'末端の配列は、第４のプロモーターの一部に相同であり；第４の遺伝子カセットの３'末端の配列は、第２のプロモーターの一部に相同である。遺伝子カセットの間の相同な配列がインビボでの相同組換えをもたらすため、７つの遺伝子カセットは組み立てられ、第３の遺伝子カセット、第７の遺伝子カセット、第１の遺伝子カセット、第８の遺伝子カセット、第４の遺伝子カセット、及び第２の遺伝子カセットを、５'末端から３'末端の方向の順で含む、組換えポリヌクレオチド配列を生じるだろう。
【０１３７】
任意選択的に、３Ｒ，  ３Ｒ'−アスタキサンチンの生産のための組換えポリヌクレオチド配列は、マーカープロモーターにより駆動されるマーカー遺伝子を含む、マーカー遺伝子カセットをさらに含んでよい。一つの好ましい実施形態において、マーカーカセットは、第１の遺伝子カセットと第８の遺伝子カセットとの間に位置する。
【０１３８】
Ｐ４５０レダクターゼを生産するために、第７の核酸配列はｃｒｔＲ遺伝子又はその断片を含むように構築され、この配列はＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａｇｌｏｂｏｓａ  ＣＢＳ７９６６、又はＵｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ  ５２１に由来することができる。一つの具体的な実施形態において、第７の核酸配列はＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓに由来し、配列番号９の配列を含む。
【０１３９】
β−カロチンオキシゲナーゼを生産するために、第８の核酸配列はｃｒｔＳ遺伝子又はその断片を含むように構築され、この配列はＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ、又はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒに由来することができる。一つの実施形態において、第８の核酸配列はＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓに由来し、配列番号１０の配列を含む。
【０１４０】
マーカー遺伝子は、スクリーニングマーカー遺伝子又は選択マーカー遺伝子が可能である。本開示の一実施形態によれば、マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子ＫａｎＭＸである。
【０１４１】
第１の核酸配列／遺伝子、第２の核酸配列／遺伝子、第３の核酸配列／遺伝子、第４の核酸配列／遺伝子、第７の核酸配列／遺伝子、第８の核酸配列／遺伝子、及びマーカー核酸配列／遺伝子の発現をそれぞれ駆動するのに用いることのできる、適切なプロモーターの例としては、ＳｃＧａｐＤＨプロモーター、ＫｌＧａｐＤＨプロモーター、ＳｃＰＧＫプロモーター、ＫｌＰＧＫプロモーター、ＫｌＡＤＨＩプロモーター、ＳｃＡＤＨＩプロモーター、ＫｌＡＤＨ４プロモーター、ＳｃＡＤＨ４プロモーター、ＫｌＬａｃ４プロモーター及びＩＣＬプロモーターがあるが、これらに限定されない。好ましくは、組換えポリヌクレオチド配列中のそれぞれの核酸配列は、互いに異なるプロモーターによって駆動される。一つの実施形態において、第１のプロモーターはＳｃＰＧＫプロモーター、第２のプロモーターはＳｃＡＤＨＩプロモーター、第３のプロモーターはＫｌＬａｃ４プロモーター、第４のプロモーターはＫｌＡＤＨＩプロモーター、第７のプロモーターはＳｃＧａｐＤＨプロモーター、第８のプロモーターはＫｌＰＧＫプロモーター、マーカープロモーターはＫｌＧａｐＤＨプロモーターである。上に列挙した全てのプロモーターは、全ての環境において活性のある構成的酵母プロモーターであり、酵母細胞における遺伝子発現を効率よく駆動することができる。
【０１４２】
本開示のいくつかの実施形態によれば、セクション１．１〜１．４において言及したプロモーターのそれぞれ（すなわち、第１のプロモーター、第２のプロモーター、第３のプロモーター、第４のプロモーター、第５のプロモーター、第６のプロモーター、第７のプロモーター、第８のプロモーター、及びマーカープロモーター）は、特定のヌクレオチド配列を含む。一つの具体的な例において、ＫｌＬａｃ４プロモーターは配列番号６３のヌクレオチド配列を含み；ＳｃＧａｐＤＨプロモーターは配列番号６４のヌクレオチド配列を含み；ＳｃＰＧＫプロモーターは配列番号６５のヌクレオチド配列を含み；ＫｌＧａｐＤＨプロモーターは配列番号６６のヌクレオチド配列を含み；ＫｌＰＧＫプロモーターは配列番号６７のヌクレオチド配列を含み；ＫｌＡＤＨＩプロモーターは配列番号６８のヌクレオチド配列を含み；ＳｃＡＤＨＩプロモーターは配列番号６９のヌクレオチド配列を含む。
【０１４３】
理解されるように、セクション１．１〜１．４に記載される各遺伝子カセット（すなわち、第１の遺伝子カセット、第２の遺伝子カセット、第３の遺伝子カセット、第４の遺伝子カセット、第５の遺伝子カセット、第６の遺伝子カセット、第７の遺伝子カセット、第８の遺伝子カセット、及びマーカー遺伝子カセット）の発現を駆動させるのに用いられるプロモーターのそれぞれは、遺伝子カセットが原核宿主細胞（例えば、細菌宿主細胞）又は他の真核宿主細胞（例えば、哺乳類細胞）において効率よく発現できるように、酵母とは異なる種において遺伝子発現を駆動させる他の構成的プロモーターにより置き換えることができる。原核宿主細胞において遺伝子発現を駆動させるのに用いることのできる適切なプロモーターとしては、Ｔ３プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター（ｔｒｐ及びｌａｃプロモーターのハイブリッド）、ｌａｃ由来プロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐｒｏＵプロモーター、ｃｓｔ−１プロモーター、ｔａｔＡプロモーター、ｃａｄＡプロモーター、ｎａｒプロモーター、ｃｓｐＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ラムノースプロモーター、及びｐｈｏＡプロモーターがあるが、これらに限定されない。哺乳類細胞において遺伝子発現を駆動させるのに適切なプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーター、ウイルスの内部プロモーター、ユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、伸長因子−１アルファ（ＥＦ−１アルファ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーターからなる群より選択してよい。
【０１４４】
ＰＧＡＳＯ技術に加えて、セクション１．１〜１．４に記載される遺伝子カセット（すなわち、第１の遺伝子カセット、第２の遺伝子カセット、第３の遺伝子カセット、第４の遺伝子カセット、第５の遺伝子カセット、第６の遺伝子カセット、第７の遺伝子カセット、第８の遺伝子カセット、及びマーカー遺伝子カセット）は、好ましい産物（すなわち、３Ｓ，  ３Ｓ'−アスタキサンチン又は３Ｒ，  ３Ｒ'−アスタキサンチン）が生産される限り、適切な制限酵素、及びＧａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニングシステムなどの、熟練した職人に知られる他の適切な方法により組み立てることができる。
【０１４５】
もし異なる構築戦略が用いられた場合、セクション１．１〜１．４に記載される遺伝子カセット（すなわち、第１の遺伝子カセット、第２の遺伝子カセット、第３の遺伝子カセット、第４の遺伝子カセット、第５の遺伝子カセット、第６の遺伝子カセット、第７の遺伝子カセット、第８の遺伝子カセット、及びマーカー遺伝子カセット）は、異なる配列及び／又は順序で組み立てることができる。したがって、組み立てられた産物は、組換えアセンブリに異なる重複する／相同なポリヌクレオチドを用いることにより、その中に含まれる遺伝子カセットの配列について本組換えポリヌクレオチド配列と異なっていてよい。代わりに、異なる制限酵素を用いて所望の遺伝子カセットを生成させてもよい。それ故に、本遺伝子カセットを含む異なるアセンブリ配列のポリヌクレオチド配列もまた、本開示の範囲内である。
【０１４６】
組み立てられた組換えポリヌクレオチド配列の順序は、実験又は臨床研究で一般的に用いられる任意の方法により確認及び分析することができる。例えば、順序は、遺伝子配列決定、制限酵素消化、又はロングＰＣＲアッセイにより分析することができる。本開示の一実施形態によれば、組換えポリヌクレオチド配列の順序は、ロングＰＣＲアッセイにより分析される。一般に、ロングＰＣＲアッセイは、極めて長いＰＣＲ産物（最大４０ｋｂ  ＤＮＡ）を増幅するために用いられる技術であり、これは取扱説明書にしたがって市販のキットにより実施することができる。
【０１４７】
２．  本組換えポリヌクレオチド配列を含むベクター
【０１４８】
本開示の第２の態様は、本開示の上述の態様／実施形態に係る組換えポリヌクレオチド配列と、前記組換えポリヌクレオチド配列に動作可能に連結された制御配列とを含む、ベクターに関する。
【０１４９】
制御配列は、様々なタイプの宿主細胞での組換えポリヌクレオチド配列の発現を容易にする目的で存在する。したがって、制御配列は、様々な要素（例えば、プロモーター、リボソーム結合部位／ＲＢＳ、エンハンサー／サイレンサー、及びターミネーター）をその中に含んでよい。例えば、酵母細胞において発現させるために、制御配列は、酵母ゲノムにおける複製の起点を含む自律複製配列（ＡＲＳ）を含むだろう。ここで、ＡＲＳは、プラスミド安定性に対するそれらの影響の順に名付けられた、４つの領域（Ａ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３）を含む。Ａ−ドメインは高度に保存されており、任意の突然変異は複製の起点の機能を無効にする。Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３領域における突然変異は、複製の起点の機能を弱めるが、妨げないだろう。一般に、酵母細胞におけるベクター複製の開始のための、制御配列の複製起点は、複製タンパク質を採用する必須のＤＮＡ配列（すなわち、ＡＲＳコンセンサス配列、ＡＣＳ）から成る。
【０１５０】
原核宿主細胞において発現させるために、制御配列は、複製起点（ｏｒｉ）、及びオペロンを含んでよい。典型的には、複製起点としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）のゲノムに由来するｏｒｉＣ、又はｐＢＲ３２２（Ｅ．  ｃｏｌｉのプラスミド）に由来し２つの突然変異を含むｐＵＣが可能である。オペロンは、プロモーターの発現を調節するのに用いられ、適切なオペロンの例としてはｌａｃオペロン、ｔｒｐオペロン、及びＴｎ１０由来テトラサイクリン耐性（Ｔｅｔ）オペロンがあるが、これらに限定されない。
【０１５１】
哺乳類細胞において発現させるために、制御配列は、複製起点、及びエンハンサー／サイレンサーを含んでよい。ベクターの複製を哺乳類細胞において開始させるための複製起点としては、ＳＶ４０ウイルスのゲノムに由来するＳＶ４０起点、又は哺乳類細胞のゲノムに由来するｏｒｉＣが可能である。エンハンサーは、一般にシス作用性の、それが調節する遺伝子の上流又は下流に位置する、ＤＮＡの短い（５０〜１５００ｂｐ）領域であり、遺伝子の転写を活性化するタンパク質（アクチベーター）に結合できる。一方、サイレンサーは、それが調節する遺伝子の上流又は下流に位置するＤＮＡ配列であり、遺伝子の転写を抑制する転写因子（リプレッサー）に結合することができる。
【０１５２】
本組換えポリヌクレオチド配列は、熟練した職人に知られる任意の方法により制御配列に動作可能に連結することができる。例えば、連結は、適切な制限酵素、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニングシステム、又は相同組換えにより実施することができる。本開示の一実施形態によれば、本組換えポリヌクレオチド配列は、相同組換えにより制御配列に動作可能に連結される。具体的には、本組換えポリヌクレオチド配列は、酵母細胞内へ制御配列と共に同時形質転換され、ここで組換えポリヌクレオチド配列の５'末端及び３'末端は、制御配列内のマーカー遺伝子の３'末端及び５'末端にそれぞれに相同である。それ故に、組換えポリヌクレオチド配列に含まれる遺伝子カセットは、制御配列内にインビボで自然発生的に組み立てることができる。一つの具体的な実施形態において、制御配列はプラスミドｐＲＳ４２６であり、マーカー遺伝子はＵＲＡ３遺伝子である。
【０１５３】
本開示の一実施形態によれば、制御配列はハイコピー数プラスミドベクターである。それ故に、相同組換えの後、本組換えポリヌクレオチド配列は酵母細胞で高度に発現できる。
【０１５４】
３．  本組換えポリヌクレオチド配列を発現するための宿主細胞
【０１５５】
本開示の第３の態様は、組換えポリヌクレオチド配列を発現するために用いられ、それによりアスタキサンチン、その前駆体及び／又は誘導体を生産する宿主細胞に関する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、セクション１．１、１．２、１．３、又は１．４の組換えポリヌクレオチド配列を含む、セクション２のベクターで遺伝子導入される。
【０１５６】
このように生産されたアスタキサンチンは、３Ｓ，  ３Ｓ'−アスタキサンチン又は３Ｒ，  ３Ｒ'−アスタキサンチンであってよい。アスタキサンチンの前駆体は、ゲラニルゲラニルピロリン酸、フェニコキサンチン、リコペン、エキネノン、カンタキサンチン、フィトエン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、又はβ−カロチンであってよい。アスタキサンチンの誘導体は、アスタキサンチンモノエステル又はアスタキサンチンジエステルであってよい。
【０１５７】
本組換えポリヌクレオチド配列及び／又はベクターは、熟練した職人に知られる方法により宿主細胞へ導入することができる。具体的には、関連分野で一般的に用いられる、外来性ＤＮＡ及び／又はベクターを原核宿主細胞（例えば、細菌宿主細胞）へ導入するための方法としては、化学的処理（二価カチオンを含有する溶液中で宿主細胞をインキュベートし、次いで熱処理を行うなど）、及びエレクトロポレーション（細胞膜に穴を開ける電場で宿主細胞を短く処理するなど）がある。
【０１５８】
外来性ＤＮＡ及び／又はベクターを酵母細胞に導入するために、以下の処理のいずれかを用いてよい。この処理としては、酵素処理（宿主細胞を酵素で処理して細胞壁を分解する）、化学的処理（宿主細胞をアルカリカチオンに暴露する）、エレクトロポレーション、及びガラスビーズ撹拌があるが、これらに限定されない。本開示の一実施形態によれば、本組換えポリヌクレオチド配列及び／又はベクターは、エレクトロポレーションを介して酵母細胞に導入される。
【０１５９】
外来性ＤＮＡ及び／又はベクターを真核宿主細胞（例えば、哺乳類細胞）へ導入することに関しては、化学物質（リン酸カルシウム、高度に分岐した有機化合物／デンドリマー、リポソーム、及びカチオン性ポリマーなど）、エレクトロポレーション、細胞スクイージング（細胞膜を穏やかに絞る）、ソノポレーション（高強度超音波により細胞膜の細孔形成を誘導する）、光学的遺伝子導入（高度に集束したレーザーにより細胞膜に微小孔を作製する）、インパルフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）（ナノ繊維の表面に結合したＤＮＡが細胞に挿入される）、遺伝子銃（不活性固体のナノ粒子にＤＮＡが結合し、次いで標的細胞の核に直接「ショット」される）、マグネトフェクション／磁石補助下遺伝子導入（標的細胞にＤＮＡを送達するために磁力を用いる）、及び／又はウイルス法／ウイルス形質導入（標的細胞にＤＮＡを送達するキャリアとしてウイルスを用いる）により、宿主細胞を処理してよい。
【０１６０】
したがって、アスタキサンチン、その前駆体及び／又は誘導体を発現するのに適切な宿主細胞としては、原核（例えば、細菌細胞）、又は真核（例えば、酵母細胞及び哺乳類細胞）が可能である。本開示の好ましい一実施形態によれば、宿主細胞は酵母細胞である。
【０１６１】
いくつかの実施形態によれば、宿主細胞は、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｌｅｃａｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｄｅｋｋｅｒａ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ、Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ、Ｌａｃｈａｎｃｅａ、Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｚｙｇｏｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｌａｃｈａｎｃｅａ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｓｐｏｒｅｎｄｏｎｅｍａ、Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｇｕｅｈｏｍｙｃｅｓ、Ｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＢｒａｃｈＹｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｏｃｕｒｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ、Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｈａｆｎｉａ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、及びＺｙｍｏｍｏｎａｓ細胞からなる群より選択される酵母細胞である。一つの具体的な実施形態において、宿主細胞はＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓである。
【０１６２】
本開示の一実施形態によれば、アスタキサンチン、その前駆体及び／又は誘導体を効率よく生産するために、宿主細胞は、セクション１及び２において上述の本遺伝子カセット／組換えポリヌクレオチド配列／ベクターの１以上のコピーを含んでよい。
【０１６３】
培養宿主細胞からのタンパク質の大量生産に一般的に用いられる発酵プロセスの間に毒性中間体産物が生じるため、本組換えポリヌクレオチド配列／ベクターにより生産されたアスタキサンチン／アスタキサンチン前駆体／アスタキサンチン誘導体は、発酵プロセスの間、毒性中間体による損傷から宿主細胞を保護してよい。
【０１６４】
本開示の実施形態によれば、このように生産されたアスタキサンチン、その前駆体、及び／又は誘導体は、宿主細胞をストレス耐性にする抗酸化活性を呈する。ストレスは、エタノール、ブタノール、ＵＶ暴露、フルフラール、及び／又は抗がん剤の前駆体に宿主細胞を暴露することにより引き起こすことができる。一つの具体的な例において、宿主細胞は、抗がん剤パクリタキセルを生じる、抗がん剤の前駆体、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ（１０ＤＢ）に耐性である。異なるストレスに対する宿主細胞の耐性は、実験の目的に応じ、様々な方法で評価することができる。例えば、耐性は、コロニー数、細胞増殖、細胞密度、又は遺伝子発現の測定により評価することができる。
【０１６５】
４．  アスタキサンチン、その前駆体、又は誘導体を生産する方法
【０１６６】
本開示の第４の態様は、アスタキサンチン、その前駆体及び／又は誘導体を生産する方法に関する。この方法は、セクション３に記載の宿主細胞を、グルコース、ガラクトース、グリセロール、脂肪酸、及び／又はそれらの組み合わせからなる群より選択される材料を含む培地（例えば、酵母エキス−ペプトン−グリセロール（ＹＰＧ）培地）中で培養することを含む。一つの実施形態において、培地はグリセロールを含む。別の実施形態において、培地はグルコースを含む。さらに別の実施形態において、培地はガラクトースを含む。またさらに別の実施形態において、培地はオクタン酸などの脂肪酸を含む。
【０１６７】
宿主細胞内での遺伝子カセットの発現を誘導するのに十分な、グルコース、ガラクトース、又はグリセロールの濃度は、約０．５〜４０％（質量濃度、ｗ／ｗ）である。すなわち、この濃度は、０．５質量％、０．６質量％、０．７質量％、０．８質量％、０．９質量％、１質量％、２質量％、３質量％、４質量％、５質量％、６質量％、７質量％、８質量％、９質量％、１０質量％、１１質量％、１２質量％、１３質量％、１４質量％、１５質量％、１６質量％、１７質量％、１８質量％、１９質量％、２０質量％、２１質量％、２２質量％、２３質量％、２４質量％、２５質量％、２６質量％、２７質量％、２８質量％、２９質量％、３０質量％、３０質量％、３１質量％、３２質量％、３３質量％、３４質量％、３５質量％、３６質量％、３７質量％、３８質量％、３９質量％、又は４０質量％が可能である。一方、宿主細胞内での遺伝子カセットの発現を誘導するのに十分な、脂肪酸の濃度は、約０．００１％〜５％（質量濃度、ｗ／ｗ）である。すなわち、この濃度は、０．００１質量％、０．００２質量％、０．００３質量％、０．００４質量％、０．００５質量％、０．００６質量％、０．００７質量％、０．００８質量％、０．００９質量％、０．０１質量％、０．０２質量％、０．０３質量％、０．０４質量％、０．０５質量％、０．０６質量％、０．０７質量％、０．０８質量％、０．０９質量％、０．１質量％、０．２質量％、０．３質量％、０．４質量％、０．５質量％、０．６質量％、０．７質量％、０．８質量％、０．９質量％、１質量％、２質量％、３質量％、４質量％、又は５質量％が可能である。
【０１６８】
好ましくは、宿主細胞内での遺伝子カセットの発現を誘導するのに用いられるグルコース、ガラクトース、又はグリセロールの濃度は、約５〜３０％である。一方、宿主細胞内での遺伝子カセットの発現を誘導するのに用いられる脂肪酸の濃度は、約０．００５〜０．５％である。
【０１６９】
本開示のいくつかの実施形態によれば、培地は、グルコース、ガラクトース、グリセロール、及び脂肪酸からなる群より選択される１つの成分を含む。一つの実施形態において、培地は２０％グルコースを含む。別の実施形態において、培地は２０％ガラクトースを含む。さらに別の実施形態において、培地は０．０１〜０．１％脂肪酸を含む。一つの好ましい実施形態において、培地は１０〜２０％グリセロールを含む。
【０１７０】
理解されるように、宿主細胞内での遺伝子カセットの発現を効率よく誘導するために、培地は、グルコース、ガラクトース、グリセロール、及び脂肪酸からなる群より選択される少なくとも２つの成分を含んでよい。
【０１７１】
本開示の実施形態によれば、宿主細胞がアスタキサンチンを生産するのに適切な温度は、約１８℃〜４２℃の範囲である。例えば、この温度は、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、又は４２℃が可能である。一つの実施形態において、温度は３０℃である。別の実施形態において、温度は３７℃である。一つの好ましい例によれば、温度は２５℃である。
【０１７２】
宿主での本組換えポリヌクレオチド配列／ベクターの発現は、本技術分野において知られる様々な方法により評価することができる。例えば、発現は、本宿主を含むコロニー及び／又はブロスの色の直接可視化及び／又は写真撮影により、検出することができる。又は、発現は、細胞増殖の測定、細胞密度の測定、遺伝子発現の測定、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析、又は液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）分析により分析することができる。
【０１７３】
本開示のいくつかの実施形態によれば、本方法は、このように生産されたアスタキサンチン、その前駆体及び／又は誘導体を、直接宿主細胞又は培地から単離するステップをさらに含む。一つの実施形態において、アスタキサンチンは、自己溶解（酵母細胞をトルエン／水酸化アンモニウムと混合し、続いて混合物を室温で２４〜４８時間インキュベートする）、ホモジナイゼーション（ホモジナイザー、フレンチプレス、又はＭａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｉｎホモジナイザーの使用による）、ガラスビーズボルテックス（ガラスビーズでの撹拌によって、酵母細胞を破壊する）、酵素的溶解（ザイモラーゼ又はリチカーゼによる細胞壁の消化）、凍結及び粉砕（液体窒素中で細胞を直接凍結し、乳鉢と乳棒で凍結細胞を粉末に粉砕する）、及び化学的処理（宿主細胞をＳＤＳ、及び／又はアセトンで処理することによるものなど）などによって、酵母細胞から発現タンパク質を抽出することにより、宿主細胞から直接単離される。本開示の一実施形態によれば、アスタキサンチンは、宿主細胞をアセトンで処理することにより、酵母細胞から抽出される。別の実施形態によれば、アスタキサンチンは、凍結乾燥し、続いてメタノール処理することにより、宿主細胞から抽出される。
【０１７４】
本開示のいくつかの実施形態によれば、このように生産されたアスタキサンチンは、３Ｓ，  ３Ｓ'−アスタキサンチン又は３Ｒ，  ３Ｒ'−アスタキサンチンである。
【０１７５】
一実施形態によれば、本方法の産物はアスタキサンチンの前駆体であり、これはＧＧＰＰ、フェニコキサンチン、リコペン、エキネノン、カンタキサンチン、β−クリプトキサンチン、ゼアキサンチン、フィトエン、又はβ−カロチンであってよい。
【０１７６】
他の実施形態によれば、本方法の産物はアスタキサンチンの誘導体であり、これはアスタキサンチンモノエステル又はアスタキサンチンジエステルであってよい。
【０１７７】
本開示の実施形態によれば、このように生産されたアスタキサンチン及び／又はその前駆体又は誘導体は抗酸化活性を有し、抗酸化物質として用いることができる。抗酸化活性は、当業者に知られる任意のインビトロ及び／又はインビボ法により評価することができる。例えば、インビトロ抗酸化活性を評価するのに適切な方法としては、１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（α，α−ジフェニル−β−ピクリルヒドラジル；ＤＰＰＨ）消去活性、過酸化水素消去（Ｈ２Ｏ２）アッセイ、一酸化窒素消去活性、ペルオキシナイトライトラジカル消去活性、Ｔｒｏｌｏｘ等価抗酸化能力（ＴＥＡＣ）法／ＡＢＴＳラジカルカチオン脱色アッセイ、全ラジカル補足抗酸化パラメーター（ＴＲＡＰ）法、第二鉄還元−抗酸化力（ＦＲＡＰ）アッセイ、スーパーオキシドラジカル消去活性（ＳＯＤ）、ヒドロキシルラジカル消去活性、ヒドロキシルラジカル回避能（ＨＯＲＡＣ）法、酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）法、還元力法（ＲＰ）、ホスホモリブデン法、チオシアン酸第二鉄（ＦＴＣ）法、チオバルビツール酸（ＴＢＡ）法、ＤＭＰＤ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン二塩酸塩）法、β−カロチンリノール酸法／共役ジエンアッセイ、キサンチンオキシダーゼ法、第二銅イオン還元抗酸化能力（ＣＵＰＲＡＣ）法、又は金属キレート化活性が可能である。インビボ抗酸化活性を決定する方法としては、血漿の第二鉄還元能力、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）推定、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＳＨＰｘ）推定、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）法、カタラーゼ（ＣＡＴ）、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性（ＧＧＴ）アッセイ、グルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）アッセイ、脂質過酸化（ＬＰＯ）アッセイ、及びＬＤＬアッセイがあるが、これらに限定されない。本開示の一実施形態によれば、生産されたアスタキサンチン、又はその前駆体又は誘導体の抗酸化活性を測定するために、Ｔｒｏｌｏｘ等価抗酸化能力（ＴＥＡＣ）法／ＡＢＴＳラジカルカチオン脱色アッセイが用いられる。
【０１７８】
以下の実施例は、本発明の特定の態様を解明し、本発明を実施する上で当業者を助けるために提供される。これらの実施例は決して本発明の範囲をなんら限定するものではない。さらなる詳述なしに、当業者は本明細書の記載に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。本明細書に引用される全ての刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１７９】
材料及び方法
【０１８０】
遺伝子合成
【０１８１】
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのｂｋｔ遺伝子、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのｃｈＹｂ遺伝子（すなわち、ＣｒＣｈＹｂ遺伝子）、Ｃｈｒｏｍｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓのｃｈＹｂ遺伝子（すなわち、ＣｚＣｈＹｂ遺伝子）、及びＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓのｃｈＹｂ遺伝子（すなわち、ＨｐＣｈＹｂ遺伝子）を、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）遺伝子合成（ＧＥＮＥＡＲＴ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によりそれぞれ合成した。全ての合成遺伝子配列を、宿主であるＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓのコドン使用頻度に基いて、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）プロセスによる多重パラメーター遺伝子最適化に供した。
【０１８２】
したがって、合成ｂｋｔ遺伝子は配列番号８のアミノ酸配列を有し、合成ＣｒＣｈＹｂ遺伝子は配列番号５のアミノ酸配列を有し、合成ＣｚＣｈＹｂ遺伝子は配列番号６のアミノ酸配列を有し、合成ＨｐＣｈＹｂ遺伝子は配列番号７のアミノ酸配列を有した。
【０１８３】
遺伝子クローニング
【０１８４】
ｃｒｔＥ遺伝子、トランケート型ＨＭＧ１遺伝子（ｔＨＭＧ１遺伝子）、ｃｒｔＩ遺伝子、ｃｒｔＹＢ遺伝子、ｃｒｔＲ遺伝子、及びｃｒｔＳ遺伝子を、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓからＰＣＲによりそれぞれ増幅した。各遺伝子をクローニングするのに用いられるプライマー及び各クローニング遺伝子の配列識別番号（配列番号）を表２に列挙した。
【０１８５】
【表２】
2019150047.tif 000004
【０１８６】
ＫｌＬａｃ４プロモーターを、配列番号７０、７１、７２、及び７３のプライマーによりＰＣＲで増幅した。増幅したＫｌＬａｃ４プロモーターは、配列番号６３のヌクレオチド配列を有した。ＳｃＧａｐＤＨプロモーターを、配列番号７４、７５、７６、及び７７のプライマーによりＰＣＲで増幅した。増幅したＳｃＧａｐＤＨプロモーターは、配列番号６４のヌクレオチド配列を有した。ＳｃＰＧＫプロモーターを、配列番号８２、８３、８４、及び８５のプライマーによりＰＣＲで増幅した。増幅したＳｃＰＧＫプロモーターは、配列番号６５のヌクレオチド配列を有した。ＫｌＧａｐＤＨプロモーターを、配列番号８６、８７、８８、及び８９のプライマーによりＰＣＲで増幅した。増幅したＫｌＧａｐＤＨプロモーターは、配列番号６６のヌクレオチド配列を有した。ＫｌＰＧＫプロモーターを、配列番号９０、９１、９２、及び９３のプライマーによりＰＣＲで増幅した。増幅したＫｌＰＧＫプロモーターは、配列番号６７のヌクレオチド配列を有した。ＫｌＡＤＨＩプロモーターを、配列番号９４、９５、９６、及び９７のプライマーによりＰＣＲで増幅した。増幅したＫｌＡＤＨＩプロモーターは、配列番号６８のヌクレオチド配列を有した。ＳｃＡＤＨＩプロモーターを、配列番号７８、７９、８０、及び８１のプライマーによりＰＣＲで増幅した。増幅したＳｃＡＤＨＩプロモーターは、配列番号６９のヌクレオチド配列を有した。
【０１８７】
組換えポリヌクレオチド配列の以下の構築を容易にするために、増幅したプロモーターを、制限酵素ＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩにより、プラスミドｐＵＣ１８プラスミドへそれぞれクローニングした。
【０１８８】
遺伝子カセットアセンブリ
【０１８９】
境界上に重複する５５ｂｐの領域を含む連続遺伝子カセットを組換え遺伝子アセンブリに用いた。遺伝子カセットを、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑシステムの使用による融合ＰＣＲにより組み立てた。反応混合物は、０．２ｍＭの各プライマー（それぞれ以下に記載）、０．２５ｍＭの各デオキシヌクレオシド三リン酸、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む１ｘＰＣＲバッファー、２μＬのＤＮＡ及び２．５ＵのＥｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含んだ。ＰＣＲ反応は、９４℃で１分間、続いて５８℃〜５３℃のアニーリング温度で１分間、及び７２℃で最適化された時間、１０サイクル行った。
【０１９０】
最適な条件のための酵母培養
【０１９１】
カロテノイド生産に最適な条件を見つけるために、改変酵母を、ＹＰＧ培地（１％ＢａｃｔｏＤｉｆｃｏ−酵母エキス、２％ＢａｃｔｏＤｉｆｃｏ−ペプトン、２％Ｍｅｒｃｋ−Ｄ（＋）−ガラクトース）中で、それぞれ２５℃、３０℃、及び３７℃で３日間培養した。細胞増殖のための炭素源の利用を試験するために、改変酵母を、２０％グルコース、２０％ガラクトース、又は２０％グリセロールを添加したＹＰＧ培地中で培養した。
【０１９２】
酵母の形質転換及びクローンスクリーニング
【０１９３】
酵母細胞を、５ｍｌのＹＰＧ培地（１％ＢａｃｔｏＤｉｆｃｏ−酵母エキス、２％ＢａｃｔｏＤｉｆｃｏ−ペプトン、２％Ｍｅｒｃｋ−Ｄ（＋）−グルコース）中で、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で１６時間インキュベートした。外来性遺伝子である遺伝子カセットを酵母細胞で発現させるために、遺伝子カセットを、Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ（Ｋ．  ｌａｃｔｉｓタンパク質発現キット、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）へ同時形質転換した。遺伝子カセットをＨｉＦｉ−ＰＣＲ（高忠実度酵素であるＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＭＡＸ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａＫａＲａを用いたポリメラーゼ連鎖反応）により増幅し、１ステップで細胞に導入すると、それらは、予め指定された順序で、重複するプロモーター配列のペアの間での相同組換えにより結合した。次いでそれらを、最初の遺伝子カセットのプロモーター配列及び最後の遺伝子カセットの３'末端での相同組換えによりゲノムへ挿入した。Ｇ４１８耐性（ＫａｎＭＸ）に必須のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を、クローンスクリーニングのマーカー遺伝子として用いた。各断片を等モル比で含む１０μｌ容積の標的ＤＮＡ断片を、４０μｌのコンピテント細胞と混合した。アルミニウムキュベット（２ｍｍ）を備えるＢｉｏＲａｄシステム（ＧｅｎｅＰｌｕｓｅｒＸｃｅｌｌ  ＴＭ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて、エレクトロポレーションを実施した（１．０ｋＶ、４００Ω、及び２５μＦキャパシタンス）。Ｇ４１８（２００μｇ／ｍｌ）を含むＹＰＧプレート（１％ＢａｃｔｏＤｉｆｃｏ−酵母エキス、２％ＢａｃｔｏＤｉｆｃｏ−ペプトン、及び２％Ｍｅｒｃｋ−ガラクトース）上に細胞を広げた。
【０１９４】
各断片の存在を確認するために、単離した各コロニーをＱｕｃｉｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ抽出溶液（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）中で消化し、酵母細胞壁を取り除いた。遺伝子特異的チェックプライマー（配列番号２３〜３６）を有するこれらの遺伝子カセットの順序をチェックするのに、ロングＰＣＲ法（ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ  ＭＡＸ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ＴａＫａＲａ）を用いた。そして、ハイスループットコロニースクリーニングを、自動電気泳動分析システム（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ＡｎａｌｙｚｅｒＴＭ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により達成した。
【０１９５】
逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ
【０１９６】
ゲノムＤＮＡを、ＤＮＡ単離キットＩＩＩ（ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩＩ、Ｒｏｃｈｅ）を用いて酵母細胞から精製した。鋳型ｍＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔｓ  （Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）を用いて酵母細胞から精製した。ｃＤＮＡ合成を、逆転写キット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）  ＩＩ  ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施した。リアルタイムｑＰＣＲ分析を、同じ株におけるこれらのプロモーターの駆動力をチェックするために用いることができ、これらのプロモーター間の相対的転写プロファイルは、様々な培養温度下で確立される。各遺伝子の相対的定量は、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｓｅｔ（ＵＰＬＳ、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＷ  ４８０  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｍａｓｔｅｒ、Ｒｏｃｈｅ）により、特異的プライマー対（アンプリコンサイズは１００〜１５０ｂｐ）を用い、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０、Ｒｏｃｈｅ）で、製造業者のプロトコルにしたがい、実施した。ＲＴ−ＰＣＴアッセイで遺伝子発現を分析するのに用いたプライマーを表３に列挙した。
【０１９７】
【表３】
2019150047.tif 000005
【０１９８】
抗酸化能力アッセイ
【０１９９】
２，２'−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）は、食品の抗酸化能力を測定するために、食品産業及び農業研究者により頻繁に使用されている。このアッセイにおいて、ＡＢＴＳは、過硫酸ナトリウムの添加により、ラジカルカチオンに変換される。このラジカルカチオンは青色であり、７３４ｎｍの光を吸収する。ＡＢＴＳラジカルカチオンは、ほとんどの抗酸化物質に対して反応性である。この反応の間に、青色のＡＢＴＳラジカルカチオンは、その無色の中性形態に戻る。この反応は、分光光度法でモニターすることができる。このアッセイは、しばしばＴｒｏｌｏｘ等価抗酸化能力（ＴＥＡＣ）アッセイと呼ばれる。試験した様々な抗酸化物質の反応性を、ビタミンＥの水溶性アナログであるＴｒｏｌｏｘの反応性と比較する。機能確認のために、細胞の抗酸化能力アッセイをＡＢＴＳ基質反応で行った。ＹＰＧ培地中２５℃７２時間の培養の後、細胞を凍結乾燥し、分析のために、細胞中の色素をメタノールにより抽出した。
【０２００】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析
【０２０１】
３日間培養した細胞を回収し、脱イオン水で洗浄した。細胞ペレットを凍結乾燥機で凍結乾燥した。逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析のために、カロテノイドを乾燥した細胞からアセトンで抽出した。分析を行うために、ＰＵ−２０８９クォータナリポンプ及び８７０−ＵＶインテリジェントＵＶ−ＶＩＳ検出器を含む、Ｊａｓｃｏ  ＨＰＬＣ機器を用いた。ＨＰＬＣ分離及び量子化を、Ｎｏｍｕｒａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０−ＵＧ  Ｃｏｌｕｍｎ（３μｍ、ＩＤ４．６ｍｍｘＬ２５０ｍｍ−ＵＧ１７３４６２５０Ｗ）で、メタノール／ＭＴＢＥ／水（８１：１５：４）及びメタノール／ＭＴＢＥ／水（７：９０：３）を移動層として用いて行った。使用した流速は１ｍｌ／ｍｉｎであり、クロマトグラムは４６０ｎｍで記録した。
【０２０２】
エタノール生産アッセイ
【０２０３】
エタノールの生産は、炎イオン化検出器（ＦＩＤ）及びステンレス鋼カラム（８０／１２０  Ｃａｒｂｏｐａｃｋ  Ｂ／６．６％  Ｃａｒｂｏｗａｘ、２ｍ  ｘ  ２ｍｍ）を備えるガスクロマトグラフィー（Ｓｈｉｍａｚｄｕ、ＧＣ−１４、Ｊａｐａｎ）によって、窒素を移動ガスとして用いて分析した。運転条件は、４℃毎分の傾斜率で８０℃から１５０℃までのカラムの加熱、１８０℃の注入温度、及び２５０℃の検出温度を含んだ。各発酵実験及びその後の分析を３回繰り返した。
【０２０４】
例１  組換えポリヌクレオチド配列の構築
【０２０５】
１．１  ｃｒｔＥ−Ｋａｎ−ｔＨＭＧ１
【０２０６】
ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）は、多くの生物において、カロテノイド、ジベレリン、トコフェロール、クロロフィル、テルペン及びテルペノイドなどの医薬化合物の生合成に重要な前駆体である。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ１遺伝子によりコードされる）及びＧＧＰＰシンターゼ（ｃｒｔＥ遺伝子によりコードされる）は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ経路における２つの重要な中間体である。トランケート型ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ｔＨＭＧ１）を発現させることにより、酵母においてフィードバック阻害が減少し、それ故に下流のＧＧＰＰ蓄積を向上させることができることが示されている。したがって、組換えポリヌクレオチド配列ｃｒｔＥ−Ｋａｎ−ｔＨＭＧ１は、ｃｒｔＥ遺伝子及びＨＭＧ１遺伝子を含むように構築した。Ｇ４１８耐性（Ｋａｎ）に必須のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を、クローンスクリーニングのためのマーカー遺伝子として用いた。
【０２０７】
異なる宿主細胞に由来するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ及びＧＧＰＰシンターゼのアミノ酸配列をＢＬＡＳＴ分析により分析した（図４ａ及び５ａ）。機能ドメインの予測されるアミノ酸配列に基づいて（図４ｂ及び５ｂ）、発現宿主に最適化されたコドン使用頻度で遺伝子をクローニング又は合成し、次いで、各プロモーターを有するデザイナー遺伝子カセットとして構築した。
【０２０８】
実際には、最初に、配列番号１１及び１２のプライマーによるＰＣＲにより増幅したｃｒｔＥ遺伝子を、プラスミドｐＵＣ１８中に、制限酵素ＡｇｅＩ及びＮｃｏＩにより、ＫｌＬａｃ４プロモーターと組み立て、次いで配列番号２３及び２４のプライマーによるＰＣＲにより増幅してＫｌＬａｃ４−ｃｒｔＥ遺伝子カセットを作製した。配列番号９４及び９５のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅したＫａｎ遺伝子を、プラスミドｐＵＣ１８中に、制限酵素ＡｇｅＩ及びＮｃｏＩにより、ＫｌＧａｐＤＨプロモーターと組み立て、次いで配列番号２５及び２６のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅し、ＫｌＧａｐＤＨ−Ｋａｎ遺伝子カセットを作製した。ここで、配列番号２５のヌクレオチド配列は配列番号２４のヌクレオチド配列に部分的に相補的であり（すなわち、ＡＧＴＡＴＧＧＴＡＡＣＧＡＣＣＧＴＡＣＡＧＧＣＡＡ  対  ＴＴＧＣＣＴＧＴＡＣＧＧＴＣＧＴＴＡＣＣＡＴＡＣＴ）、それ故に、ＫｌＧａｐＤＨ−Ｋａｎ遺伝子カセットの５'末端はＫｌＬａｃ４−ｃｒｔＥ遺伝子カセットの３'末端に相同であった。配列番号１３及び１４のプライマーによるＰＣＲにより増幅したｔＨＭＧ１遺伝子を、プラスミドｐＵＣ１８中に、制限酵素ＡｇｅＩ及びＮｃｏＩにより、ＳｃＡＤＨＩプロモーターと組み立て、次いで配列番号２７及び２８のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅し、ＳｃＡＤＨＩ−ｔＨＭＧ１遺伝子カセットを作製した。ここで、配列番号２７のヌクレオチド配列は配列番号２６のヌクレオチド配列に部分的に相補的であり（すなわち、ＧＴＧＴＡＣＡＡＴＡＴＧＧＡＣＴＴＣＣＴＣＴＴＴＴＣ  対  ＧＡＡＡＡＧＡＧＧＡＡＧＴＣＣＡＴＡＴＴＧＴＡＣＡＣ）、したがって、ＳｃＡＤＨＩ−ｔＨＭＧ１遺伝子カセットの５'末端はＫｌＧａｐＤＨ−Ｋａｎ遺伝子カセットの３'末端に相同であった。
【０２０９】
ＫｌＬａｃ４−ｃｒｔＥ遺伝子カセットとＫｌＧａｐＤＨ−Ｋａｎ遺伝子カセットとの間の相同な配列、及びＫｌＧａｐＤＨ−Ｋａｎ遺伝子カセットとＳｃＡＤＨＩ−ｔＨＭＧ１遺伝子カセットとの間の相同な配列に基いて、３つの遺伝子カセットをＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓへ同時形質転換すると、それらは自然発生的に組み立てられ、組換えポリヌクレオチド配列ｃｒｔＥ−Ｋａｎ−ｔＨＭＧ１を生じた（図６及び表４に要約されるように）。組換えポリヌクレオチド配列ｃｒｔＥ−Ｋａｎ−ｔＨＭＧ１を含む改変株をＸｄ３．０と命名した。
【０２１０】
【表４】
2019150047.tif 000006
【０２１１】
１．２  ｃｒｔＩ−ｃｒｔＥ−Ｋａｎ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１
【０２１２】
β−カロチンは、最もよく知られたプロビタミンＡカロテノイドであり、赤血球形成性プロトポルフィリン症などの様々な疾患を治療するために使用されてきた。それはまた、閉経前の女性の乳がんのリスクと加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）のリスクを軽減するためにも使用されてきた。β−カロチンは下流のカロテノイドの生産のための重要な中流前駆体であり、ｃｒｔＹ（フィトエンシンターゼ）遺伝子、ｃｒｔＩ（フィトエンデサチュラーゼ）遺伝子及びｃｒｔＢ（リコペンシクラーゼ）はβ−カロチン生合成経路において重要な媒介物である。したがって、ｃｒｔＩ遺伝子、ｃｒｔＥ遺伝子、ｃｒｔＹＢ遺伝子（フィトエンシンターゼ及びリコペンシクラーゼの二機能性酵素をコードする）、ｔＨＭＧ１遺伝子、及びＫａｎマーカー遺伝子を含む、組換えポリヌクレオチド配列ｃｒｔＩ−ｃｒｔＥ−Ｋａｎ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１を、例１．２において構築した。
【０２１３】
リコペンシクラーゼドメイン、トランス−イソプレニル二リン酸シンターゼ、及びＮＡＤ（Ｐ）結合ロスマン様ドメインのアミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴ分析によりそれぞれ分析した（図７ａ、７ｃ及び８ａ）。機能ドメインの予測されたアミノ酸配列に基づいて（図７ｂ、７ｄ及び８ｂ）、発現宿主に最適化されたコドン使用頻度で遺伝子をクローニング又は合成し、次いで、個々のプロモーターを有するデザイナー遺伝子カセットを構築した。
【０２１４】
例１．１で説明したのと同様の戦略で、最初に、配列番号１５及び１６のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅したｃｒｔＩ遺伝子を、ｐＵＣ１８中に、制限酵素ＡｇｅＩ及びＮｃｏＩにより、ＫｌＬａｃ４プロモーターと組み立て、次いで配列番号２３及び２９のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅してＫｌＬａｃ４−ｃｒｔＩ遺伝子カセットを作製した。配列番号１１及び１２のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅したｃｒｔＥ遺伝子を、ｐＵＣ１８中に、制限酵素ＡｇｅＩ及びＮｃｏＩにより、ＳｃＰＧＫプロモーターと組み立て、次いで配列番号３０及び２４のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅してＳｃＰＧＫ−ｃｒｔＥ遺伝子カセットを作製した。配列番号９４及び９５のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅したＫａｎ遺伝子を、ｐＵＣ１８中に、制限酵素ＡｇｅＩ及びＮｃｏＩにより、ＫｌＧａｐＤＨプロモーターと組み立て、次いで配列番号２５及び３１のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅してＫｌＧａｐＤＨ−Ｋａｎ遺伝子カセットを作製した。配列番号１７及び１８のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅したｃｒｔＹＢ遺伝子を、ｐＵＣ１８中に、制限酵素ＡｇｅＩ及びＮｃｏＩにより、ＫｌＡＤＨＩプロモーターと組み立て、次いで配列番号３２及び２６のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅し、ＫｌＡＤＨＩ−ｃｒｔＹＢ遺伝子カセットを作製した。配列番号１３及び１４のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅したｔＨＭＧ１遺伝子を、ｐＵＣ１８中に、制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩにより、ＳｃＡＤＨＩプロモーターと組み立て、次いで配列番号２７及び２８のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅してＳｃＡＤＨＩ−ｔＨＭＧ１遺伝子カセットを作製した。
【０２１５】
それぞれの遺伝子カセットの間の相同な配列で、５つの遺伝子カセットをＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓへ同時形質転換すると、それらは自然発生的に組み立てられ、組換えポリヌクレオチド配列ｃｒｔＩ−ｃｒｔＥ−Ｋａｎ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１を生じた（図９及び表５に要約されるように）。組換えポリヌクレオチド配列ｃｒｔＩ−ｃｒｔＥ−Ｋａｎ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１を含む改変株をＸｄ５．０と命名した。
【０２１６】
【表５】
2019150047.tif 000007
【０２１７】
１．３  ｃｒｔＩ−ｃｒｔＲ−ｃｒｔＥ−Ｋａｎ−ｃｒｔＳ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１
【０２１８】
β−カロチン中間体をアスタキサンチンに変換するために、２つの下流のアスタキサンチンシンターゼ遺伝子、ｃｒｔＳ（β−カロチンオキシゲナーゼ）及びｃｒｔＲ（Ｐ４５０レダクターゼ）をＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ宿主に導入した。例１．３において、ｃｒｔＩ遺伝子、ｃｒｔＲ遺伝子、ｃｒｔＥ遺伝子、ｃｒｔＳ遺伝子、ｃｒｔＹＢ遺伝子（フィトエンシンターゼ及びリコペンシクラーゼの各機能を有する二機能性酵素をコードする）、ｔＨＭＧ１遺伝子、及びＫａｎマーカー遺伝子を含む組換えポリヌクレオチド配列ｃｒｔＩ−ｃｒｔＲ−ｃｒｔＥ−Ｋａｎ−ｃｒｔＳ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１を構築した。
【０２１９】
β−カロチンオキシゲナーゼ及びＰ４５０レダクターゼの保存ドメイン領域を触媒ドメインとして決定した（図１０ａ及び１１ａ）。さらに、各保存ドメインの保存残基もまた分析した（図１０ｂ、１１ｂ、及び１１ｃ）。組換えポリヌクレオチド配列ｃｒｔＩ−ｃｒｔＲ−ｃｒｔＥ−Ｋａｎ−ｃｒｔＳ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１を構築するのに用いたコドンは、分析結果に基づいた。同様のＰＧＡＳＯ構築戦略で、配列番号１５及び１６のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅したｃｒｔＩ遺伝子を、ｐＵＣ１８中に、制限酵素ＡｇｅＩ及びＮｃｏＩにより、ＫｌＬａｃ４プロモーターと組み立て、次いで配列番号２３及び３３のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅してＫｌＬａｃ４−ｃｒｔＩ遺伝子カセットを作製した。配列番号１９及び２０のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅したｃｒｔＲ遺伝子を、ｐＵＣ１８中に、制限酵素ＳｆｉＩ及びＮｃｏＩにより、ＳｃＧａｐＤＨプロモーターと組み立て、次いで配列番号３４及び２９のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅してＳｃＧａｐＤＨ−ｃｒｔＲ遺伝子カセットを作製した。配列番号１１及び１２のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅したｃｒｔＥ遺伝子を、ｐＵＣ１８中に、制限酵素ＡｇｅＩ及びＮｃｏＩにより、ＳｃＰＧＫプロモーターと組み立て、次いで配列番号３０及び２４のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅してＳｃＰＧＫ−ｃｒｔＥ遺伝子カセットを作製した。配列番号９８及び９９のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅したＫａｎ遺伝子を、ｐＵＣ１８中に、制限酵素ＡｇｅＩ及びＮｃｏＩにより、ＫｌＧａｐＤＨプロモーターと組み立て、次いで配列番号２５及び３５のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅してＫｌＧａｐＤＨ−Ｋａｎ遺伝子カセットを作製した。配列番号２１及び２２のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅したｃｒｔＳ遺伝子を、ｐＵＣ１８中に、制限酵素ＡｇｅＩ及びＮｃｏＩにより、ＫｌＰＧＫプロモーターと組み立て、次いで配列番号３６及び３１のプライマーを用いるタンパク質ＰＣＲにより増幅してＫｌＰＧＫ−ｃｒｔＳ遺伝子カセットを作製した。配列番号１７及び１８のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅したｃｒｔＹＢ遺伝子を、ｐＵＣ１８中に、制限酵素ＡｇｅＩ及びＮｏｔＩにより、ＫｌＡＤＨＩプロモーターと組み立て、次いで配列番号３２及び２６のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅してＫｌＡＤＨＩ−ｃｒｔＹＢ遺伝子カセットを作製した。配列番号１３及び１４のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅したｔＨＭＧ１遺伝子を、ｐＵＣ１８中に、制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩにより、ＳｃＡＤＨＩプロモーターと組み立て、次いで配列番号２７及び２８のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅してＳｃＡＤＨＩ−ｔＨＭＧ１遺伝子カセットを作製した。
【０２２０】
７つの遺伝子カセットをＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓへ同時形質転換すると、遺伝子カセット間の相同な配列に基づき、それらは自然発生的に組み立てられ、組換えポリヌクレオチド配列ｃｒｔＩ−ｃｒｔＲ−ｃｒｔＥ−Ｋａｎ−ｃｒｔＳ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１を生じた（図１２及び表６に要約されるように）。組換えポリヌクレオチド配列ｃｒｔＩ−ｃｒｔＲ−ｃｒｔＥ−Ｋａｎ−ｃｒｔＳ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１を含む改変株をＸｄ７−３と命名した。
【０２２１】
【表６】
2019150047.tif 000008
【０２２２】
この改変株Ｘｄ７−３は、赤色カロテノイド、３Ｒ，  ３'Ｒアスタキサンチン立体異性体を生産することができるはずである。しかしながら、Ｘｄ７−３は、黄色カロテノイド（β−カロチン及びゼアキサンチン）蓄積による細胞色変化を呈した（図１３ａ及び表７）。Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ由来のβ−カロチンオキシゲナーゼ及びＰ４５０レダクターゼの酵素効率が十分でない、又は／及びＳｃＰＧａｐＤＨのプロモーター強度が低すぎる可能性がある、と推測される。
【０２２３】
【表７】
2019150047.tif 000009
【０２２４】
１．４  ｃｒｔＩ−ｃｒｔＥ−ＣｈＹｂ−Ｋａｎ−ＣｒＢＫＴ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１
【０２２５】
３Ｓ，  ３'Ｓアスタキサンチン立体異性体を生産する目的で、２つの追加のアスタキサンチンシンターゼ遺伝子、ｂｋｔ（β−カロチンケトラーゼをコードする）及びｃｈＹｂ（β−カロチンヒドロキシラーゼをコードする）をＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓに導入した。
【０２２６】
組換えポリヌクレオチド配列ｃｒｔＩ−ｃｒｔＥ−ＣｈＹｂ−Ｋａｎ−ＣｒＢＫＴ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１を構築するために、最初にβ−カロチンケトラーゼの保存領域のアミノ酸配列を分析した（図１４ａ）。ここで、各保存領域の保存残基を図１４ｂに図示した。分析結果に基づき、発現宿主に最適なコドン使用頻度で、遺伝子をクローニング又は合成し、次いでＫｌＰＧＫプロモーターを有するデザイナー遺伝子カセットとして構築した。
【０２２７】
さらに、アスタキサンチン生合成経路における他の重要な酵素遺伝子を選択するために、３つの異なる藻類である、Ｃ．  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ（ＣｒＣｈＹｂ）、Ｃｈ．  ｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（ＣＺＣｈＹｂ）、及びＨ．  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ（ＨｐＣｈＹｂ）からもｃｈＹｂ遺伝子をクローニングし、ＳｃＰＧＫプロモーターを有するデザイナー遺伝子カセットを構築するのに用いた。上述のように、保存ドメイン領域を決定した（図１５）。この遺伝子を、宿主における発現のための最適なコドン使用頻度で、クローニング又は合成した。
【０２２８】
組換えポリヌクレオチド配列ｃｒｔＩ−ｃｒｔＥ−ＣｈＹｂ−Ｋａｎ−ＣｒＢＫＴ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１を、ｃｒｔＥ−Ｋａｎ−ｔＨＭＧ１又はｃｒｔＩ−ｃｒｔＥ−Ｋａｎ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１を構築するのと同様の方法により構築した。ここで、ＣｈＹｂ遺伝子としては、ＣｒＣｈＹｂ遺伝子、ＣｚＣｈＹｂ遺伝子、又はＨｐＣｈＹｂ遺伝子が可能である。簡潔に述べると、増幅したｃｒｔＩ遺伝子断片を、ｐＵＣ１８中に、制限酵素ＡｇｅＩ及びＮｃｏＩにより、ＫｌＬａｃ４プロモーターと組み立て、次いで配列番号２３及び３３のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅してＫｌＬａｃ４−ｃｒｔＩ遺伝子カセットを作製した。増幅したｃｒｔＥ遺伝子断片を、ｐＵＣ１８中に、制限酵素ＡｇｅＩ及びＮｃｏＩにより、ＳｃＧａｐＤＨプロモーターと組み立て、次いで配列番号３４及び２９のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅してＳｃＧａｐＤＨ−ｃｒｔＥ遺伝子カセットを作製した。ＣｈＹｂ遺伝子（すなわち、ＣｒＣｈＹｂ遺伝子、ＣｚＣｈＹｂ遺伝子、又はＨｐＣｈＹｂ遺伝子）を、ｐＵＣ１８中に、制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩにより、ＳｃＰＧＫプロモーターと組み立て、次いで配列番号３０及び２４のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅してＳｃＰＧＫ−ＣｈＹｂ遺伝子カセットを作製した。Ｋａｎ遺伝子を、ｐＵＣ１８中に、制限酵素ＡｇｅＩ及びＮｃｏＩにより、ＫｌＧａｐＤＨプロモーターと組み立て、次いで配列番号２５及び３５のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅してＫｌＧａｐＤＨ−Ｋａｎ遺伝子カセットを作製した。ＢＫＴ遺伝子を、ｐＵＣ１８中に、制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩにより、ＫｌＰＧＫプロモーターと組み立て、次いで配列番号３６及び３１のプライマーを用いるタンパク質ＰＣＲにより増幅してＫｌＰＧＫ−ＢＫＴ遺伝子カセットを作製した。ｃｒｔＹＢ遺伝子を、ｐＵＣ１８中に、制限酵素ＡｇｅＩ及びＮｏｔＩにより、ＫｌＡＤＨＩプロモーターと組み立て、次いで配列番号３２及び２６のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅してＫｌＡＤＨＩ−ｃｒｔＹＢ遺伝子カセットを作製した。ｔＨＭＧ１遺伝子を、ｐＵＣ１８中に、制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ制限酵素部位により、ＳｃＡＤＨＩプロモーターと組み立て、次いで配列番号２７及び２８のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅してＳｃＡＤＨＩ−ｔＨＭＧ１遺伝子カセットを作製した。
【０２２９】
同様の概念で、各遺伝子カセット間の相同な配列は、組換えポリヌクレオチド配列ｃｒｔＩ−ｃｒｔＥ−ＣｈＹｂ−Ｋａｎ−ＣｒＢＫＴ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１を生産するために、宿主細胞Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓにおいて７つの遺伝子カセットの相同組換えを生じた。ここでＣｈＹｂとしてはＣｒＣｈＹｂ、ＨｐＣｈＹｂ、又はＣｚＣｈＹｂが可能である（図１６及び表８に要約されるように）。
【０２３０】
【表８】
2019150047.tif 000010
【０２３１】
生産された組換えポリヌクレオチド配列（すなわち、ｃｒｔＩ−ｃｒｔＥ−ＣｒＣｈＹｂ−Ｋａｎ−ＣｒＢＫＴ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１、ｃｒｔＩ−ｃｒｔＥ−ＨｐＣｈＹｂ−Ｋａｎ−ＣｒＢＫＴ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１、及びｃｒｔＩ−ｃｒｔＥ−ＣｚＣｈＹｂ−Ｋａｎ−ＣｒＢＫＴ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１）をＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓゲノムにそれぞれ導入した（図１６）。組換えポリヌクレオチド配列ｃｒｔＩ−ｃｒｔＥ−ＨｐＣｈＹｂ−Ｋａｎ−ＣｒＢＫＴ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１を含む改変株をＨｐ９と命名した。組換えポリヌクレオチド配列ｃｒｔＩ−ｃｒｔＥ−ＣｒＣｈＹｂ−Ｋａｎ−ＣｒＢＫＴ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１を含む改変株をＣｒ１と命名した。組換えポリヌクレオチド配列ｃｒｔＩ−ｃｒｔＥ−ＣｚＣｈＹｂ−Ｋａｎ−ＣｒＢＫＴ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１を含む改変株をＣｚ５と命名した。
【０２３２】
例２  例１．４の組換えポリヌクレオチド配列を含む改変株の特徴付け
【０２３３】
例１．４において構築された改変株Ｃｒ１、Ｃｚ５、及びＨｐ９の特徴を例２において調べた。最初に、遺伝子カセットの発現及びカロテノイドの生産性を例２．１において確認し、宿主細胞がカロテノイドを発現するのに最適な条件を例２．２において決定した。
【０２３４】
２．１  例１．４の組換えポリヌクレオチド配列の発現
【０２３５】
１０世代の継代の後、安定なクローン、Ｃｒ１、Ｃｚ５、及びＨｐ９を選択した。図１３ａ及び表７のデータによれば、ＨｐＣｈＹｂはＣｒＣｈＹｂ及びＣＺＣｈＹｂよりも強力なβ−カロチンヒドロキシラーゼ活性を有する可能性がある。各クローンにおけるこれらの遺伝子カセットの順序を確認するために、ロングＰＣＲ方法（ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ  ＭＡＸ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ＴａＫａＲａ）及び電気泳動分析を用いた。データは、これらの安定なクローンのそれぞれが、修正された順序で、設計された遺伝子カセットを有することを示した（図１３ｂ及び１３ｃ）。
【０２３６】
５０ｍｌバッチの発酵培養を用い、最適な培養条件においてこれらの改変株を比較した。３日間の培養の後、増殖曲線データは、Ｈｐ９及びＣｚ５株が、ＷＴ株、Ｃｒ１株、及びＸｄ７−３株のいずれよりも、わずかに速く増殖したことを示した（図１７ｃ）。これらの株、特にＨｐ９は、培養された培地の色が、コントロールのクリーム色から、赤色又は濃いオレンジ色へ、顕著に変化した（図１７ａ及び１７ｂ）。
【０２３７】
細胞中のカロテノイドを定量するために、アセトンを用いてこれらの色素を酵母培養物から抽出した。フルスペクトルＵＶ／Ｖ分光光度法を用いてカロテノイドの総量を推定した。ここで、β−カロチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、及びゼアキサンチンを含む、遊離形態の純粋なカロテノイド化合物を、４つの標準として用いた。分析結果に基づくと、全てのカロテノイド化合物は４００ｎｍ〜５３０ｎｍの吸収スペクトルを有していた（データは示さず）。ＷＴ株以外の、これらの改変株の全て（Ｘｄ７−３、Ｃｒ１、Ｃｚ５、及びＨｐ９）から抽出されたカロテノイドもまた、４００ｎｍ〜５３０ｎｍの吸収スペクトルを有していた（図１７ｄ）。
【０２３８】
このように生産されたカロテノイドの組成を分析するためにＨＰＬＣを使用した。遊離形態のカロテノイド化合物のそれぞれは、それらの各リテンションタイムによって分離することができた。例えば、アスタキサンチンは７．８分で、ゼアキサンチンは９．７分で、カンタキサンチンは１２．８分で、β−カロチンは３２分で、分離することができる。標準曲線から補間することによりβ−カロチンの濃度を定量したところ、Ｘｄ７−３、Ｃｒ１、Ｃｚ５及びＨｐ９株を含む各改変株は、それぞれ２４４．７、５９．６、９３．９及び２２４．４μｇ／ｇのβ−カロチンを蓄積することができると推定された。このデータはまた、Ｈｐ９株が、Ｃｒ１株よりも３．８倍速くβ−カロチンを生産することができることを示した。さらに、ＷＴ株及びＸｄ７−３株以外の、藻類のｂｋｔ及びｃｈｙｂ遺伝子を有する全ての改変株が、同様にカンタキサンチンを細胞内に蓄積することができた。ここで、約１８．４、１２．８、及び３９．８μｇ／ｇのカンタキサンチンが、Ｃｒ１、Ｃｚ５、及びＨｐ９株にそれぞれ見出された（表７）。データはまた、Ｈｐ９株が、Ｃｚ５株よりも３．１倍速くカンタキサンチンを生産することができることを示した。
【０２３９】
藻類β−カロチンヒドロキシラーゼ遺伝子である、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のＣｒｃｈｙｂ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓ由来のＣｚｃｈｙｂ、又はＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ由来のＨｐｃｈｙｂ、及び６つの他のカロテノイド−合成経路遺伝子を、酵母宿主Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓのゲノムに共に組み込んだ。これらの３つの藻類遺伝子のそれぞれは、Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ由来の真菌遺伝子よりも、β−カロチンを下流のカロテノイドに変換する高い効率を示した。さらに、Ｈｐｃｈｙｂを有する株は、Ｃｒｃｈｙｂ又はＣｚｃｈｙｂを組み込んだ株よりも高いカロテノイド生産性を示した。このことは、ＨｐｃｈｙｂがＣｒｃｈｙｂ及びＣｚｃｈｙｂよりも効率的であることを示唆している。まとめると、これらの結果は、β−カロチンヒドロキシラーゼがカロテノイドの生合成に重要な役割を果たすことを示唆している。
【０２４０】
さらに、ＵＶ４５０ｎｍ下でのＨＰＬＣ分光測定アッセイによれば（図１８ａ及び１８ｂ）、本例の各改変株は、遊離形態のカンタキサンチンのピーク（ピーク１）、遊離形態のβ−カロチンのピーク（ピーク６）、及びいくつかの未知のピーク（ピーク２、３、４、５、７、及び８）を示した。それ故に、これらの改変株は、ゼアキサンチン、３Ｓ，  ３'Ｓアスタキサンチン立体異性体などのカロテノイド及びそれらの誘導体、及び／又はそれらのエステル化誘導体を生産することができるはずである。
【０２４１】
２．２  例１．４の組換えポリヌクレオチド配列の最適な発現条件の特徴付け
【０２４２】
本例において、カロテノイド及びそれらの誘導体を、例１．４において確立した改変株によって発現するための最適な条件を決定した。ここで、最適な温度を例２．２．１において評価し、最適な培養培地を例２．２．２において確認した。
【０２４３】
２．２．１  最適な温度
【０２４４】
本ベクターのカロテノイド生産性を向上させるために、ベクターのもう１つのコピーをＣｚ５株に組み込み、生じた株をＣｚ３０株と命名した。Ｃｚ５株と比較すると、Ｃｚ３０株はより強い赤色変化を生じた（図１９ａ）。
【０２４５】
カロテノイド生産に最適な条件を評価するために、Ｃｚ５及びＣｚ３０を、２５℃、３０℃、及び３７℃で、ＹＰＧ培地中で別々に培養した。３日間の培養の後、２５℃又は３０℃で培養したブロス（Ｃｚ５又はＣｚ３０を含んだ）は赤色であったが、３７℃で培養したブロス（Ｃｚ５又はＣｚ３０を含んだ）は白色のままであった（図１９ｂ）。加えて、２日間培養した後、Ｃｚ３０のみが２５℃で顕著な色変化を呈した。データは、２５℃がカロテノイド生産に最適な温度であること、及びＣｚ３０がＣｚ５よりも高い生産性を有することを示した。
【０２４６】
Ｃｚ５株と比べてＣｚ３０株が顕著に強い赤色変化を呈したため、Ｃｚ３０の遺伝子発現プロファイルを様々な培養温度下で試験した。全てのサンプルを４８時間培養した後に採取し、リアルタイムＰＣＲアッセイのためにｍＲＮＡを各サンプルから抽出した。図１９ｃに示されたデータのように、調査した全ての条件において、全ての形質転換された遺伝子の発現レベルは、Ｃｚ３０において、Ｃｚ５よりもはるかに高かった。このデータは、Ｃｚ３０がより多くのカロテノイドを生産し、より強い赤色を呈したという観察と一致した。さらに、この結果はまた、全ての形質転換された遺伝子の発現レベルが、３０℃において、２５℃又は３７℃よりも高いことを示した。２５℃が最も強い赤色を生じたため、このデータは、２５℃が酵素反応に最適な条件であることを示した（図１９ｃ）。
【０２４７】
フィトエンデサチュラーゼ（ｃｒｔＩによりコードされる）及びβ−カロチンケトラーゼ（ＢＫＴによりコードされる）が、３Ｓ，  ３'Ｓ−アスタキサンチンの生産に極めて重要な酵素であるため、２つのより強いプロモーター、すなわち、ｐＬａｃ４及びｐＫｌＰＧＫを用いてこれらの２つの遺伝子を駆動させた。したがって、ＣｒｔＩ及びＣｒＢＫＴ遺伝子の発現レベルが、他の遺伝子のものよりも高くなるだろうということが予期された（図１９ｃ）。
【０２４８】
ＨＰＬＣ分光測定アッセイは、改変Ｃｚ３０株がより高い量のβ−カロチン、カンタキサンチン、及びエステル化アスタキサンチン誘導体（すなわち、モノエステルカロテノイド及びジエステルカロテノイド）を経路において蓄積することをさらに確認した（図２０ａ及び２０ｂ）。
【０２４９】
したがって、このデータは、Ｃｚ５株と比較して、Ｃｚ３０株がより高いカロテノイドの生産性を有することを示した。さらに、このデータはまた、２５℃がカロテノイド生産に最適な温度であることを示した。
【０２５０】
２．２．２  最適な培養培地
【０２５１】
細胞増殖のための炭素源を調べるために、野生型Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ（ＷＴ）及び改変株Ｃｚ３０を、２０％グルコース、２０％ガラクトース、又は２０％グリセロールを添加したＹＰＧ培地中で別々に培養した。２５℃２日間の培養の後、ＷＴ細胞のブロスは白色であったが、Ｃｚ３０のブロスは、黄色（グルコース）、オレンジ色（ガラクトース）、又は赤色（グリセロール）を呈した（図２１ａ）。これらのデータは、Ｃｚ３０が、培養培地に添加した成分（すなわち、グルコース、ガラクトース、又はグリセロール）に応じて、異なる組み合わせのカロテノイドを細胞中に生産及び蓄積することを示した。異なる炭素源間の細胞色の違いは、細胞中に異なる濃度のカロテノイドが蓄積したことにより生じた可能性があるか、あるいは、黄色カロテノイド（β−カロチン及びゼアキサンチン）及びピンクがかった赤色カロテノイド（カンタキサンチン、アスタキサンチン、及び他のエステル化アスタキサンチン誘導体）などの、異なるタイプのカロテノイドの合成に起因する可能性がある（図２１ａ）。しかしながら、５日間の培養の後、２０％グリセロールを添加した場合を除き、宿主細胞の変色が観察された。
【０２５２】
グリセロールと共に培養した全ての改変Ｃｚ５及びＣｚ３０サンプルを、４８時間及び７２時間の培養の後に採取し、リアルタイムＰＣＲアッセイのためにそれらのｍＲＮＡを抽出した。カンタキサンチン生産のためにデザインされた遺伝子カセットから予期されるように、２５℃、３０℃又は３７℃４８時間で、ＣｚＢＫＴ遺伝子の発現レベルは、ＨｐＣＨＹＢの発現レベルよりも高いことが見出された（表９）。さらに、カンタキサンチンのアスタキサンチンへの変換のための、ＨｐＣＨＹＢ遺伝子の発現レベルは、７２時間で、ＣｚＢＫＴ遺伝子のものよりも高かった（表９）。
【０２５３】
【表９】
2019150047.tif 000011
【０２５４】
ＬＣ分光測定アッセイの結果に基づくと、２０％グリセロールの存在下で培養したＣｚ３０は、２０％ガラクトースの存在下で培養したものよりも高い量のβ−カロチン及びカンタキサンチンを蓄積した（表１０）。ケン化処理の後、ＬＣ／ＭＳ分析を用いて、生産された化合物を同定した。このデータは、このように生産されたカロテノイドが、β−カロチン、カンタキサンチン、及びアスタキサンチンを含むことを示した（図２２）。
【０２５５】
【表１０】
2019150047.tif 000012
【０２５６】
興味深いことに、バイオディーゼル産業の副産物であるグリセロール中で培養したＣｚ３０細胞は、他の炭素源中で培養したものに比べて顕著な赤色変化を呈した。このことは、グリーン産業の発展のための、Ｃｚ３０の潜在的利用を示唆している。さらに、グリセロール代謝とカロテノイドのエステル化との間の関係は今なお明らかではないが、Ｃｚ３０のブロスは、２０％グリセロール中での５日間の培養の後で赤色のままであった。
【０２５７】
カロテノイドをＷＴ及びＣｚ３０株から抽出し、このように生産されたカロテノイドの抗酸化能力を、ＡＢＴＳ基質反応を用いることにより決定した。ＹＰＧ培地中２５℃７２時間の培養の後、宿主細胞を凍結乾燥し、細胞中の色素をメタノールにより抽出した。Ｃｚ３０の抽出物は、ＷＴ（５２．３％）よりも高いフリーラジカル消去能力（７２．１％）を呈した（図２３ａ）。このデータは、ＷＴもまた抗酸化能力を有しはするが、Ｃｚ３０により生産されたカロテノイドによって、Ｔｒｏｌｏｘ等価抗酸化能力（ＴＥＡＣ）アッセイにおいて、約２０％のフリーラジカル消去能力がもたらされること、及びその能力が、１グラムの細胞乾燥重量あたり１．９５ｍｇのＴｒｏｌｏｘ（ビタミンＥの水溶性アナログ）と等価であることを示した（図２３ｂ）。
【０２５８】
上述のデータは、２０％グリセロールを含有する培地がカロテノイドの生産に最適な環境を提供することを示した。さらに、これらの結果はまた、生産されたカロテノイドが抗酸化能を有することを示した。
【０２５９】
例３  アスタキサンチン生産の向上
【０２６０】
β−カロチンケトラーゼ及びβ−カロチンヒドロキシラーゼが、アスタキサンチン生産経路における２つの重要な調節された酵素であるため、アスタキサンチン合成遺伝子カセット（すなわち、ｃｒｔＩ−ｃｒｔＥ−ＨｐＣｈＹｂ−Ｋａｎ−ＨｐＣｈＹｂ−ＣｒＢＫＴ−ｃｒｔＹＢ−ｔＨＭＧ１）を追加のＣｈＹｂ遺伝子カセットと共に宿主ゲノムへ組み込み、ＣＡ６株を作製した（図２４ａ）。培養後の形質転換体は、培養されたブロスにおいて顕著な赤色変化を生じた。
【０２６１】
アスタキサンチン生産に重要な酵素のコピー数を増加させる目的で、アスタキサンチンシンターゼ遺伝子、ｂｋｔ（β−カロチンケトラーゼをコードする）及びｃｈＹｂ（β−カロチンヒドロキシラーゼをコードする）をＣＡ６株のｒＤＮＡの内部転写スペーサー（ＩＴＳ）領域にさらに組み込み、このように作成された株をＣＡ６−ＩＴＳと命名した。この遺伝子カセットはａｕｒ−ＨｐＣｈＹｂ−ＣｒＢＫＴ及びプロモーターを含んでいた（図２４ｂ）。ＨｐＣｈＹｂ及びＣｒＢＫＴ遺伝子の発現レベルは、重要な酵素のコピー数が増加するのに比例して増加した（図２４ｃ）。
【０２６２】
細胞増殖の炭素源を調べるために、１０％グリセロールを添加した又は添加しないＹＰＧ培地中で改変株ＣＡ６−ＩＴＳを培養した。２５℃２日間の培養の後、１０％グリセロールを添加したＹＰＧ培地中で培養したＣＡ６−ＩＴＳ株は、グリセロールを添加しないＹＰＧ培地中で培養したものに比べてより強い赤色変化を明らかに生じた（図２１ｂ）。表１１のデータは、１０％グリセロールがＣＡ６−ＩＴＳ株におけるアスタキサンチン生産を誘導するのに十分であることをさらに示した。
【０２６３】
【表１１】
2019150047.tif 000013
【０２６４】
さらに、アスタキサンチン合成遺伝子カセットをハイコピー発現プラスミドＲＳ４２６と共にＣＡ６−プラスミド株へ導入した（図２４ｄ）。遺伝子カセットは、インビボでプラスミドと自然発生的に組み立てられ、この形質転換体はオレンジ〜赤色のコロニーを生じることができた。プラスミドの高いコピー数により、宿主細胞は、高い量のタンパク質を発現し、より効率よく前駆体をアスタキサンチンへ変換する潜在力を有する。
【０２６５】
ＨＰＬＣ分光測定アッセイの結果に基づくと、改変ＣＡ６−ＩＴＳ株は、それぞれ７．７６、９．９、１２．２５、及び３１．４０分のリテンションタイムにある、遊離形態のアスタキサンチン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、β−カロチンを生産することができる（図２４ｅ）。アスタキサンチン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、β−カロチンの収量は、それぞれ約１９．４８、２１．７、４．４０、及び５０１．５７μｇ／ｇである（表１２）。このデータは、β−カロチンヒドロキシラーゼをコードするｃｈＹｂのコピー数を増加させることにより、カロテノイドの生産性を向上させることができるということを明らかにした。
【０２６６】
【表１２】
2019150047.tif 000014
【０２６７】
このように、本例の２つの改変株、ＣＡ６及びＣＡ６−ＩＴＳは、アスタキサンチン前駆体をアスタキサンチンに効率よく変換することができる。さらに、関連する遺伝子発現の高いコピー数は、アスタキサンチン生産に極めて重要である。
【０２６８】
例４  新規の組み合わせの、モノエステル又はジエステルの形態を有する天然カロテノイドの生産
【０２６９】
遊離アスタキサンチンの極性端部は、動物（例えば、ヒト）によって、非極性カロテノイドよりもよく吸収されることができるが、酸化を特に受けやすい。アスタキサンチンは、脂肪酸−エステルとして自然界、例えば緑藻類などに広く存在し、１つ又は２つの脂肪酸とモノエステル及びジエステルの形態を形成しており、これらのエステル化分子はより安定性である。コレステロールエステラーゼはエステル化アスタキサンチンを加水分解する有力な候補である。この加水分解物は続いてミセルに組み込まれ、アスタキサンチンは腸細胞により吸収されることができる。
【０２７０】
この例において、改変株中のカロテノイドエステル及びそれらの幾何異性体を同定した。クラブトリー陰性酵母、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓを、その高い増殖速度及び高い細胞量産能力、並びにヒドロキシ基を様々な長さの脂肪酸とのモノエステル又はジエステル、例えばオクタン酸−エチルエステル、酢酸−２−フェニルエチルエステル、及びデカン酸−エチルエステルなど、に変換する潜在力のために、宿主細胞として選んだ。
【０２７１】
藻類由来の天然アスタキサンチンは通常、そのヒドロキシ基の末端に結合した脂肪酸と組み合わっており、このことによりエステル化アスタキサンチンがもたらされる。このエステル化アスタキサンチンは、合成に見られる非エステル化形態のアスタキサンチン、及び「遊離」アスタキサンチンと呼ばれる細菌生産アスタキサンチンよりも、より安定性及びより生物活性であることが示されている。モノエステル又はジエステル化アスタキサンチンを生成するために、脂肪酸（０．０１％又は０．１％オクタン酸）を、培養されたＣＡ６−ＩＴＳ株に、ガラクトース誘導と一緒に又は後に添加した。オクタン酸をガラクトース誘導と同時に添加すると、細胞色は赤色に変わりはじめた（図２５ａ及び２５ｂ）。
【０２７２】
このジエステル中の新規の組み合わせの飽和脂肪酸の可能性を、質量分析法アッセイ（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）から収集したデータを用いて試験した。さらに、ＬＣ  ＭＳ／ＭＳ分析を用いて、このように生産された化合物の構造を確認した。このデータは、このように生産されたカロテノイドが、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、β−クリプトキサンチン、エステル化アドニキサンチン、リコペン、フィトエン、β−カロチン、及びエステル化アスタキサンチンを含むことを示した（図２６ａ及び２６ｂ）。
【０２７３】
例５  組換えポリヌクレオチド配列を含んだ改変株の特徴づけ
【０２７４】
カロテノイド化合物が２つの環構造を有し、この２つの環構造がカロテノイド化合物の２つの末端に又はその近くにそれぞれ位置するため、それらの環構造は細胞の内部又は外部の一重項及び三重項酸素分子を無効にすることができる。それはまた、Ｃｚ３０が、ＵＶ損傷、溶媒ストレス、及び／又は反応性酸素種（ＲＯＳ）の効果に対抗するのを助ける可能性がある。さらに、カロテノイド生産酵母は、増殖する細胞の脂質過酸化が低減することに起因して、環境ストレスに対しより耐性である可能性がある。したがって、本開示に記載の改変株は、他の付加価値のある代謝物質を生産し、生産性を向上するために用いることができる。
【０２７５】
５．１  ストレスに対する宿主の耐性の程度の強化
【０２７６】
図２３のデータは、Ｃｚ３０の細胞抽出物が野生型（ＷＴ）コントロールと比較して抗酸化活性を示すことを明らかにした。この例において、Ｃｚ３０の抗ストレス能力を、ＵＶ、フルフラール、エタノール、又はイソブタノール処理により、さらに確認した。
【０２７７】
ＷＴ及びＣｚ３０を別々に、ＵＶに５、１０、又は２０分間暴露し、ＹＰＧプレートに一連の希釈率で接種し、４８時間培養した。ＵＶ光に２０分間暴露した後では、いくつかのＣｚ３０コロニーのみが、ＹＰＧプレート上で増殖できた（図２７ａ）。この観察は、Ｃｚ３０のカロテノイド産物がＵＶ損傷を低減でき、その結果ＷＴよりも速い細胞増殖がもたらされることを示唆した。
【０２７８】
バイオリファイナリーの用途のために、植物バイオマスは地球上で最も豊富な再生可能資源の一つであり、持続可能な社会の発展に不可欠な構成要素であると考えられている。植物からの再生可能な生物学的資源は、バイオ燃料、バイオケミカル、バイオ潤滑剤、及び生分解性材料などのバイオ製品に変換することができる。植物バイオマスに含まれる糖を利用するために、酸加水分解、水蒸気爆発、アンモニア繊維膨張、オルガノソルブ、亜硫酸前処理、アルカリ湿式酸化、オゾン前処理、及び酵素処理を含む、多くの利用可能な処理技術が、リグノセルロースの破壊のために用いられる。リグノセルロースの酸及び水蒸気前処理の間に生じる毒素は、ヘミセルロース及びセルロースから生じるフルフラール及びヒドロキシメチルフルフラール、リグニンから生じるアルコール及びアルデヒド、及びバイオリアクターから生じる重金属など、幅広い物質にわたる。したがって、試験した第２のストレス因子はフルフラール処理であった。図２７ｂにおいて、Ｃｚ３０株は１００ｍＭフルフラールの処理に耐えることができた一方で、ＷＴ株は８０ｍＭフルフラールでの処理にしか耐えることができなかった。
【０２７９】
エタノール及びブタノール処理について、ＷＴ及びＣｚ３０株をさらに試験した。細胞ペレットを採取し、０、４、８又は１２％エタノールに２４時間；又は０、０．５、１又は２％イソブタノールに２４時間暴露した。次いで、ＹＰＧプレートに一連の希釈率で接種し、４８時間培養した。１２％エタノール（図２７ｃ）又は２％イソブタノール（図２７ｄ）で２４時間処理した後では、いくつかのＣｚ３０コロニーのみがＹＰＧプレート上で増殖できた。このように、中に組み込まれたカロテノイド経路によってもたらされたＣｚ３０株の抗酸化能力が、エタノール及びブタノールに対するＣｚ３０株の耐性を同様に向上させる。
【０２８０】
全てのこれらのデータは、カロテノイドの抗酸化活性が、ＵＶ、フルフラール、エタノール、及びイソブタノール暴露を含む、様々な環境ストレスの損傷から宿主細胞（すなわち、Ｃｚ３０）を保護することができることを示した。
【０２８１】
５．２  発酵プロセス中の宿主のエタノール耐性及び／又は生産性の程度の強化
【０２８２】
発酵プロセスにおいて、エタノールなどのいくつかの最終産物の蓄積は、宿主にとって非常に有毒となり、それにより生産プロセスにボトルネックを生じる可能性がある。反応性酸素種（ＲＯＳ）の増加は、細胞外ストレスに対する細胞の応答であり、この細胞外ストレス下では、フリーラジカルが脂質過酸化により膜を直接攻撃する可能性がある。細胞膜は、細胞が外部ストレスに順応できるようにする重要な障壁であり、有機溶媒に非常に影響されやすい成分の一つでもある。
【０２８３】
野生型（ＷＴ）及び改変株Ｃｚ３０を、様々な濃度のエタノールを添加したＹＰＧ培地中でのエタノール耐性試験に供した（図２８ａ）。０％エタノール試験において、細胞増殖速度はＷＴ株とＣｚ３０株との間で同等であった。２、４、又は６％エタノール試験において、ＷＴの細胞増殖はエタノールにより顕著に抑制されたが、Ｃｚ３０の増殖は弱く影響された。すなわち、示された濃度のエタノールの存在下での２４時間の培養の後、ＷＴと比較して、Ｃｚ３０はより高い細胞密度を示した（図２８ａ）。この観察は、Ｃｚ３０のカロテノイド産物が溶媒損傷を低減することができ、その結果ＷＴよりも速い細胞増殖がもたらされることを示唆した。
【０２８４】
エタノール生産性を試験するために、ＷＴ及びＣｚ３０株を２０％ガラクトースを添加したＹＰＧ培地中で培養した。７２時間後、Ｃｚ３０はＷＴ（２．５％）より多くのエタノール（３．５％）を生産した（図２８ｂ）。このように、Ｃｚ３０のカロテノイド産物は抗酸化作用を明らかに付与した。
【０２８５】
このデータは、生産性を向上させながらも、カロテノイドが、発酵プロセス中にエタノールの損傷から宿主を保護することができることを示した。
【０２８６】
５．３  宿主の毒素耐性及び生産性の強化
【０２８７】
二次代謝産物の収量は、本質的にその前駆体未満である。十分な量の化合物を得るためには、半合成が、中間体を最終生成物又はアナログに化学的に変換する確実な方法を提供する。しかしながら、化学的プロセスはしばしば、面倒な操作及び有機汚染を招く。二次代謝産物及びそれらの前駆体の両方が、宿主に対し非常に有毒である可能性があり、このことが、より経済的に、それらの生産のボトルネックを生じる。
【０２８８】
バッカチンＩＩＩは、パクリタキセル半合成のための、医療産業における非常に重要な前駆体である。さらに、バッカチンＩＩＩの前駆体化合物である１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ（１０ＤＢ）は、一般的な観賞用イチイ（Ｔａｘｕｓ  ｂａｃｃａｔａ）の針葉抽出物に多く産出され、より安価な前駆体であり、かつ環境に優しい源と考えられてきた。さらに、エタノールは、それらの前駆体及び／又は最終産物を溶解及び抽出するための非常に重要な溶媒である。
【０２８９】
この例において、Ｃｚ３０の抗毒素効力を、エタノールに溶解した１０−デアセチルバッカチンＩＩＩの処理により分析した。野生型（ＷＴ）及びＣｚ３０の細胞ペレットを別々に採取し、０、４、８又は１２％エタノールに溶解した０、０．８、１．６又は３．２ｍＭの１０−デアセチルバッカチンＩＩＩに暴露した。２４時間後、細胞をＹＰＧプレートに一連の希釈率で接種し、さらに４８時間培養した。図２９ａは、１２％エタノール中３．２ｍＭの１０−デアセチルバッカチンＩＩＩでの前処理の後、Ｃｚ３０コロニーがＹＰＧプレート上でＷＴよりもよく増殖したことを示した。さらに、改変酵母を、様々な初期濃度の１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ及び／又はエタノールを含むＹＰＧ培地中での１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ耐性試験にも供した（図２９ｂ）。このデータは、Ｃｚ３０が、０．４〜１．２ｍＭの１０−デアセチルバッカチンＩＩＩを含有する培地において、ＷＴよりもよく増殖することを明らかにした。４％エタノールを含む０．８ｍＭの１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ又は６％エタノールを含む１．２ｍＭの１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ中での培養の効果は、４％エタノール又は６％エタノール中での培養よりも高い程度の損傷を示した（図２９ｂ）。これらの結果は、４％エタノールを含む０．８ｍＭの１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ（図３０ａ）及び６％エタノールを含む１．２ｍＭの１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ（図３０ｂ）下での、改変酵母の増殖曲線アッセイにより確認された。
【０２９０】
これらのデータは、カロテノイドが、生物医学薬物の前駆体（例えば、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ）の損傷から宿主細胞を保護することができることを示した。さらに、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩからのバッカチンＩＩＩ生物変換の試験は、改変株により達成された（図３１）。このデータは、より高い濃度のカロテノイドを含有するＹＤ８株が、他の株と比較して、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩからより多くのバッカチンＩＩＩ生物変換をすることができることを示した（表１３）。これらの結果は、カロテノイドを含有する株が、その生物変換の能力を向上させることができることを示した。
【０２９１】
【表１３】
2019150047.tif 000015
【０２９２】
要するに、本開示は様々な組換えポリヌクレオチド配列を提供し、その全てはカロテノイドをインビボで生産するのに用いることができる。高い生産能力に基づいて、本開示はまた、互いに異なる組換えポリヌクレオチド配列を含むいくつかの改変株を確立した。さらに、本組換えポリヌクレオチド／改変株の発現に最適な条件を明らかにした。この条件下で、生産性を大幅に強化することができ、このことにより科学的及び産業的用途のためにアスタキサンチンを生合成する手段が提供される。本組換えポリヌクレオチド配列により発現される産物は、環境ストレス、発酵産物、又は生物医学薬物の前駆体により引き起こされる様々な損傷から改変細胞を保護するだろう。そしてこのことが改変細胞を費用対効果の高いバイオファイナリーにしている。
【０２９３】
実施形態の上記の説明は例として与えられているに過ぎず、様々な変更が当業者によってなされ得ることが理解されるべきである。上記の明細書、実施例、及びデータは、本発明の典型的な実施形態の構造及び使用の完全な説明を提供する。本発明の様々な実施形態を、ある程度特定して、又は１以上の個別の実施形態を参照して、上に説明してきたが、当業者は、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、開示の実施形態に多数の変更を行うことができるであろう。
【図１】
2019150047.tif 000016
【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
2019150047.tif 000021
【図４ｂ】
2019150047.tif 000022
【図５ａ】
2019150047.tif 000023
【図５ｂ】
2019150047.tif 000024
【図６】
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【図７ａ】
2019150047.tif 000026
【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図８ａ】
2019150047.tif 000030
【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０ａ】
2019150047.tif 000033
【図１０ｂ】
2019150047.tif 000034
【図１０ｃ】
2019150047.tif 000035
【図１１ａ】
2019150047.tif 000036
【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
2019150047.tif 000039
【図１２】
2019150047.tif 000040
【図１３ａ】
2019150047.tif 000041
【図１３ｂ】
2019150047.tif 000042
【図１３ｃ】
2019150047.tif 000043
【図１４ａ】
2019150047.tif 000044
【図１４ｂ】
2019150047.tif 000045
【図１５ａ】
2019150047.tif 000046
【図１５ｂ】
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【図１６ａ】
2019150047.tif 000048
【図１６ｂ】
2019150047.tif 000049
【図１６ｃ】
2019150047.tif 000050
【図１７ａ】
2019150047.tif 000051
【図１７ｂ】
2019150047.tif 000052
【図１７ｃ】
2019150047.tif 000053
【図１７ｄ】
2019150047.tif 000054
【図１８ａ】
2019150047.tif 000055
【図１８ｂ】
2019150047.tif 000056
【図１９ａ】
2019150047.tif 000057
【図１９ｂ】
2019150047.tif 000058
【図１９ｃ】
2019150047.tif 000059
【図２０ａ】
2019150047.tif 000060
【図２０ｂ】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図２２】
2019150047.tif 000064
【図２３ａ】
2019150047.tif 000065
【図２３ｂ】
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【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
2019150047.tif 000068
【図２４ｃ】
2019150047.tif 000069
【図２４ｄ】
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【図２４ｅ】
2019150047.tif 000071
【図２４ｆ】
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【図２５ａ】
2019150047.tif 000073
【図２５ｂ】
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【図２６ａ】
2019150047.tif 000075
【図２６ｂ】
2019150047.tif 000076
【図２７ａ】
2019150047.tif 000077
【図２７ｂ】
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【図２７ｃ】
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【図２７ｄ】
2019150047.tif 000080
【図２８ａ】
2019150047.tif 000081
【図２８ｂ】
2019150047.tif 000082
【図２９ａ】
2019150047.tif 000083
【図２９ｂ】
2019150047.tif 000084
【図３０ａ】
2019150047.tif 000085
【図３０ｂ】
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【図３１】
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【配列表】
2019150047000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月16日(2019.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスタキサンチン、その前駆体又は誘導体を宿主細胞で生産するための組換えポリヌクレオチド配列であって、
第１のプロモーターと、前記第１のプロモーターに作動可能に連結されゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼをコードする第１の核酸配列とを含む、第１の遺伝子カセット；
第２のプロモーターと、前記第２のプロモーターに作動可能に連結され３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼをコードする第２の核酸配列とを含む、第２の遺伝子カセット；
第３のプロモーターと、前記第３のプロモーターに作動可能に連結されフィトエンデサチュラーゼをコードする第３の核酸配列とを含む、第３の遺伝子カセット；及び
第４のプロモーターと、前記第４のプロモーターに作動可能に連結されフィトエンシンターゼ及びリコペンシクラーゼの各機能を有する二機能性酵素をコードする第４の核酸配列とを含む、第４の遺伝子カセットを含み、
前記組換えポリヌクレオチド配列の各遺伝子カセットの３'末端が、その下流の隣接遺伝子カセットの５'末端に相同であり、
前記第１の、第２の、第３の、及び第４の核酸配列が、配列番号：１、２、３、及び４の配列をそれぞれ含む、組換えポリヌクレオチド配列。
【請求項２】
前記アスタキサンチンが３Ｓ，  ３Ｓ'−アスタキサンチン又は３Ｒ，  ３Ｒ'−アスタキサンチンであり、
アスタキサンチンの前記前駆体が、ゲラニルゲラニルピロリン酸、フェニコキサンチン、リコペン、エキネノン、カンタキサンチン、フィトエン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、又はβ−カロチンであり、
アスタキサンチンの前記誘導体が、アスタキサンチンモノエステル又はアスタキサンチンジエステルである、
請求項１に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
【請求項３】
第５のプロモーターと、前記第５のプロモーターに作動可能に連結されβ−カロチンヒドロキシラーゼをコードする第５の核酸配列とを含む、第５の遺伝子カセット；及び
第６のプロモーターと、前記第６のプロモーターに作動可能に連結されβ−カロチンケトラーゼをコードする第６の核酸配列とを含む、第６の遺伝子カセット
をさらに含む、請求項１に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
【請求項４】
前記第５の核酸配列が、配列番号５、６、又は７のいずれかの配列を含み、前記第６の核酸配列が、配列番号８の配列を含む、請求項３に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
【請求項５】
前記第１〜第６のプロモーターが互いに異なる、請求項４に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
【請求項６】
第７のプロモーターと、前記第７のプロモーターに作動可能に連結されＰ４５０レダクターゼをコードする第７の核酸配列とを含む、第７の遺伝子カセット；及び
第８のプロモーターと、前記第８のプロモーターに作動可能に連結されβ−カロチンオキシゲナーゼをコードする第８の核酸配列とを含む、第８の遺伝子カセット
をさらに含む、請求項１に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
【請求項７】
前記第７の核酸配列が、配列番号９の配列を含み、前記第８の核酸配列が、配列番号１０の配列を含む、請求項６に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
【請求項８】
前記第１の、第２の、第３の、第４の、第７の、及び第８のプロモーターが互いに異なる、請求項７に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
【請求項９】
アスタキサンチン、その前駆体又は誘導体を生産する方法であって、
（１）請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド配列を宿主細胞に導入すること；及び
（２）前記宿主細胞をグルコース、ガラクトース、グリセロール、及び脂肪酸からなる群より選択される材料を含む培地中で培養すること
を含む、方法。
【請求項１０】
前記培地が０．５〜４０％グリセロールを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記培地が０．００１％〜５％脂肪酸をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ストレスに対する宿主細胞の耐性を向上させる方法であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド配列を前記宿主細胞に導入することを含む、方法。
【請求項１３】
宿主細胞に対する前記ストレスが、エタノール、ブタノール、ＵＶ暴露、フルフラール、又は薬物前駆体に暴露されることにより引き起こされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬物前駆体が１０−デアセチルバッカチンＩＩＩである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
エタノール又はバッカチンＩＩＩの生産における宿主細胞の生産性を向上させる方法であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド配列を前記宿主細胞に導入することを含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
【図１５ａ】図１５ａは、本開示の一例にしたがう、β−カロチンヒドロキシラーゼの保存領域を示す配列アライメントデータであり、触媒ドメイン１〜２が下線によりアウトライン化されており、ＸＰ＿００１６９８６９８はＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉに由来するβ−カロチンヒドロキシラーゼを表し、ＡＢＳ５０２３７はＣｈｒｏｍｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓに由来するβ−カロチンヒドロキシラーゼを表し、Ｑ９ＳＰＫ６はＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓに由来するβ−カロチンヒドロキシラーゼを表す。ここで、ＸＰ＿００１６９８６９８の触媒ドメイン１〜２は、配列番号１０２及び１０５のアミノ酸配列をそれぞれ有し、ＡＢＳ５０２３７の触媒ドメイン１〜２は、配列番号１０３及び１０６のアミノ酸配列をそれぞれ有し、Ｑ９ＳＰＫ６の触媒ドメイン１〜２は、配列番号１０４及び１０７のアミノ酸配列をそれぞれ有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
【図１５ｂ】図１５ｂは、本開示の一例にしたがう、β−カロチンヒドロキシラーゼの触媒ドメイン１〜２内の保存残基を示す模式図であり、この触媒ドメイン１〜２は、配列番号１００及び１０１のアミノ酸配列をそれぞれ有し、保存残基が下線でハイライトされている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2019150047000001.app
【外国語明細書】
2019150047000001.pdf