(57)【要約】      （修正有）【課題】高温耐久性に優れるキシラナーゼ、その利用、及びキシラナーゼのスクリーニング方法の提供。【解決手段】キシラナーゼ候補について、（ａ）所定温度にて２時間保存したとき、２５℃で２時間保存したときのキシラナーゼ活性の半分の活性となるときの当該所定温度、及び（ｂ）５０℃で保存したときのキシラナーゼ活性の半減期の少なくともいずれかについて評価する工程、を備えることで、スクリーニングして、高温耐久性に優れるキシラナーゼを取得する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシラナーゼであって、
配列番号１で表されるアミノ酸配列に対してアライメントしたとき、その６位、４６位、４７位、５５位、８０位、９４位、９９位、１２５位及び１６４位からなる群から選択される１個又は２個以上の位置に相当する位置に変異を有する、キシラナーゼ。
【請求項２】
前記変異は、
６位相当位置では、Ｅ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｍ及びＱのいずれかであり、
４６位相当位置では、Ｉであり、
４７位相当位置では、Ｃ及びＡのいずれかであり、
５５位相当位置では、Ｓ、Ｄ及びＥのいずれかであり、
８０位相当位置では、Ｍ、Ａ及びＩのいずれかであり、
９４位相当位置では、Ｈ、Ｃ、Ｙ及びＡのいずれかであり、
９９位相当位置では、Ｇ及びＡのいずかであり、
１２５位相当位置では、Ａ及びＳのいずれかであり、
１６４位相当位置では、Ｍである、請求項１に記載のキシラナーゼ。
【請求項３】
前記変異は、
６位相当位置では、Ｅ、Ｉ、Ｖ及びＳのいずれかであり、
４６位相当位置では、Ｉであり、
４７位相当位置では、Ｃ及びＡのいずれかであり、
５５位相当位置では、Ｓであり、
８０位相当位置では、Ｍ、Ａ及びＩのいずれかであり、
９４位相当位置では、Ｈ、Ｃ及びＹのいずれかであり、
９９位相当位置では、Ｇ及びＡのいずかであり、
１２５位相当位置では、Ａであり、
１６４位相当位置では、Ｍである、請求項２に記載のキシラナーゼ。
【請求項４】
さらに、配列番号１で表されるアミノ酸配列に対してアライメントしたとき、その３７位、５６位、７１位、１１９位、１２０位、１３７位、１４０位、１５４位及び１６１位からなる群から選択される１個又は２個以上の位置に相当する位置に変異を有する、請求項１〜３のいずれかに記載のキシラナーゼ。
【請求項５】
前記変異は、
３７位相当位置では、Ｉであり、
５６位相当位置では、Ｔであり、
７１位相当位置では、Ａであり、
１１９位相当位置では、Ｖ及びＣのいずれかであり、
１２０位相当位置では、Ｋ及びＡのいずれかであり、
１３７位相当位置では、Ｗ、Ａ、Ｌ及びＶのいずれかであり、
１４０位相当位置では、Ｉであり、
１５４位相相当位置では、Ａであり、
１６１位相当位置では、Ａ及びＥのいずれかである、請求項４に記載のキシラナーゼ。
【請求項６】
４位置以上に変異を備える、請求項１〜５のいずれかに記載のキシラナーゼ。
【請求項７】
前記キシラナーゼは、５０℃におけるキシラナーゼ活性の半減期が３０時間以上である、請求項１〜６のいずれかにキシラナーゼ。
【請求項８】
前記キシラナーゼは、５０℃におけるキシラナーゼ活性の半減期が１００時間以上である、請求項１〜７のいずれかに記載のキシラナーゼ。
【請求項９】
前記キシラナーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有する、請求項１〜８のいずれかに記載のキシラナーゼ。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のキシラナーゼのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリヌクレオチドを、備える発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載のキシラナーゼを発現する、形質転換体。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれかに記載のキシラナーゼを用いてキシランを分解する工程を備える、キシランの分解方法。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれかに記載のキシラナーゼを用いてキシランを分解する工程と、
前記キシランを有用物質に変換する工程と、
を備える、有用物質の生産方法。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれかに記載のキシラナーゼを含む、組成物。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれかに記載のキシラナーゼを生産する形質転換体を含む、組成物。
【請求項１７】
キシラナーゼのスクリーニング方法であって、
配列番号１で表されるアミノ酸配列に対してアライメントしたとき、その６位、３７位、４６位、４７位、５５位、５６位、７１位、８０位、９４位、９９位、１１９位、１２０位、１２５位、１３７位、１４０位、１５４位、１６１位及び１６４位からなる群から選択される１個又は２個以上の位置に相当する位置に変異を有する、キシラナーゼ候補を準備する工程と、
前記キシラナーゼ候補について、
（ａ）所定温度にて２時間保存したとき、２５℃で２時間保存したときのキシラナーゼ活性の半分の活性となるときの当該所定温度、及び
（ｂ）５０℃で保存したときのキシラナーゼ活性の半減期
の少なくともいずれかについて評価する工程、
を備える、方法。
【請求項１８】
前記評価工程は、５０℃で保存したときのキシラナーゼ活性の半減期が３０時間以上であるキシラナーゼをスクリーニングする工程である、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、キシラナーゼ及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘミセルロースを含むバイオマスの有効利用は、バイオマスの効率的利用のためには重要な課題である。ヘミセルロースを分解するキシラナーゼについては種々の改変体や新規キシラナーゼが提供されている（特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１６−４９０３５号公報
【特許文献２】特開２０１７−３５００１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者の検討によれば、ヘミセルロースを含むバイオマスは、例えば、約５０℃で数日間連続処理を行うことが効率的な場合がある。また、本発明者によれば、これまで提供されているキシラナーゼでは、最適温度は高温化されているが、高温での耐久性についてはほとんど検討されておらず、また、その機能も備えているわけではない。
【０００５】
本明細書は、高温耐久性を備えるキシラナーゼ及びその利用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、キシラナーゼの改変体ライブラリを構築し、スクリーニングを行い、高温耐久性の発揮のために有用な変異を特定できた。本明細書は、こうした知見に基づき以下の手段を提供する。
【０００７】
（１）キシラナーゼであって、
配列番号１で表されるアミノ酸配列に対してアライメントしたとき、その６位、４６位、４７位、５５位、８０位、９４位、９９位、１２５位及び１６４位からなる群から選択される１個又は２個以上の位置に相当する位置に変異を有する、キシラナーゼ。
（２）前記変異は、
６位相当位置では、Ｅ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｍ及びＱのいずれかであり、
４６位相当位置では、Ｉであり、
４７位相当位置では、Ｃ及びＡのいずれかであり、
５５位相当位置では、Ｓ、Ｄ及びＥのいずれかであり、
８０位相当位置では、Ｍ、Ａ及びＩのいずれかであり、
９４位相当位置では、Ｈ、Ｃ、Ｙ及びＡのいずれかであり、
９９位相当位置では、Ｇ及びＡのいずかであり、
１２５位相当位置では、Ａ及びＳのいずれかであり、
１６４位相当位置では、Ｍである、（１）に記載のキシラナーゼ。
（３）前記変異は、
６位相当位置では、Ｅ、Ｉ、Ｖ及びＳのいずれかであり、
４６位相当位置では、Ｉであり、
４７位相当位置では、Ｃ及びＡのいずれかであり、
５５位相当位置では、Ｓであり、
８０位相当位置では、Ｍ、Ａ及びＩのいずれかであり、
９４位相当位置では、Ｈ、Ｃ及びＹのいずれかであり、
９９位相当位置では、Ｇ及びＡのいずかであり、
１２５位相当位置では、Ａであり、
１６４位相当位置では、Ｍである、（２）に記載のキシラナーゼ。
（４）さらに、配列番号１で表されるアミノ酸配列に対してアライメントしたとき、その３７位、５６位、７１位、１１９位、１２０位、１３７位、１４０位、１５４位及び１６１位からなる群から選択される１個又は２個以上の位置に相当する位置に変異を有する、（１）〜（３）のいずれかに記載のキシラナーゼ。
（５）前記変異は、
３７位相当位置では、Ｉであり、
５６位相当位置では、Ｔであり、
７１位相当位置では、Ａであり、
１１９位相当位置では、Ｖ及びＣのいずれかであり、
１２０位相当位置では、Ｋ及びＡのいずれかであり、
１３７位相当位置では、Ｗ、Ａ、Ｌ及びＶのいずれかであり、
１４０位相当位置では、Ｉであり、
１５４位相相当位置では、Ａであり、
１６１位相当位置では、Ａ及びＥのいずれかである、（４）に記載のキシラナーゼ。
（６）４位置以上に変異を備える、（１）〜（５）のいずれかに記載のキシラナーゼ。
（７）前記キシラナーゼは、５０℃におけるキシラナーゼ活性の半減期が３０時間以上である、（１）〜（６）のいずれかに記載のキシラナーゼ。
（８）前記キシラナーゼは、５０℃におけるキシラナーゼ活性の半減期が１００時間以上である、（１）〜（７）のいずれかに記載のキシラナーゼ。
（９）前記キシラナーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有する、（１）から（８）のいずれかに記載のキシラナーゼ。
（１０）（１）〜（９）のいずれかに記載のキシラナーゼのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
（１１）（１０）に記載のポリヌクレオチドを、備える発現ベクター。
（１２）（１）〜（９）のいずれかに記載のキシラナーゼを発現する、形質転換体。
（１３）（１）〜（９）のいずれかに記載のキシラナーゼを用いてキシランを分解する工程を備える、キシランの分解方法。
（１４）（１）〜（９）のいずれかに記載のキシラナーゼを用いてキシランを分解する工程と、
前記キシランを有用物質に変換する工程と、
を備える、有用物質の生産方法。
（１５）（１）〜（９）のいずれかに記載のキシラナーゼを含む、組成物。
（１６）（１）〜（９）のいずれかに記載のキシラナーゼを生産する形質転換体を含む、組成物。
（１７）キシラナーゼのスクリーニング方法であって、
配列番号１で表されるアミノ酸配列に対してアライメントしたとき、その６位、３７位、４６位、４７位、５５位、５６位、７１位、８０位、９４位、９９位、１１９位、１２０位、１２５位、１３７位、１４０位、１５４位、１６１位及び１６４位からなる群から選択される１個又は２個以上の位置に相当する位置に変異を有する、キシラナーゼ候補を準備する工程と、
前記キシラナーゼ候補について、
（ａ）所定温度にて２時間保存したとき、２５℃で２時間保存したときのキシラナーゼ活性の半分の活性となるときの当該所定温度、及び
（ｂ）５０℃で保存したときのキシラナーゼ活性の半減期
の少なくともいずれかについて評価する工程、
を備える、方法。
（１８）前記評価工程は、５０℃で保存したときのキシラナーゼ活性の半減期が３０時間以上であるキシラナーゼをスクリーニングする工程である、（１７）に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】単一の変異を有する改変体の耐熱温度の上昇（Δ耐熱温度）を示す図である。
【図２】単一の変異を有する改変体の一部についての耐熱温度の上昇（Δ耐熱温度）を示す図である。
【図３】相加変異体のΔ耐熱温度を示す図である。
【図４】相加変異体のΔ耐熱温度の相加予測値と実験値の比較結果を示す図である。
【図５Ａ】ＧＨＦ１１に属する８１個のキシラナーゼの一部のアミノ酸配列のアライメント結果を示す図である。
【図５Ｂ】ＧＨＦ１１に属する８１個のキシラナーゼの他の一部のアミノ酸配列のアライメント結果を示す図である。番号は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢの登録番号を表す。
【図５Ｃ】ＧＨＦ１１に属する８１個のキシラナーゼの他の一部のアミノ酸配列のアライメント結果を示す図である。番号は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢの登録番号を表す。
【図５Ｄ】ＧＨＦ１１に属する８１個のキシラナーゼの他の一部のアミノ酸配列のアライメント結果を示す図である。番号は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢの登録番号を表す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書の開示は、キシラナーゼ及びその利用に関する。
【００１０】
本発明者は、バイオマス処理を実用的及び／又は効率的に行うために従来にない観点である高温耐久性の観点からTrichoderma reesei由来のキシラナーゼを探索した。本発明者は、高温耐久性のための変異部位について取得するほか、これらの変異の相加効果を確認した。
【００１１】
なお、本明細書において、「キシラナーゼ」とは、エンド−１，４−β−キシラナーゼであり、ＥＣ番等３．２．１．８の酵素をいう。キシラナーゼは、キシランをキシロースに分解する酵素である。キシランは、植物細胞の細胞壁に存在するヘミセルロースの主成分である。以下、本明細書に開示されるキシラナーゼ及びその利用について、詳細に説明する。
【００１２】
（キシラナーゼ）
本明細書に開示されるキシラナーゼ（以下、本キシラナーゼともいう。）は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるキシラナーゼのアミノ酸配列に対してアライメントしたとき、所定の部位において変異が導入されたキシラナーゼとして規定できる。
【００１３】
ここで、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるキシラナーゼは、Trichoderma reesei由来のキシラナーゼであって、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢの登録番号Ｐ３６２１７で特定されるキシラナーゼの成熟タンパク質（登録番号P３６２１７で規定されるアミノ酸配列（配列番号３）の第３４位〜第２２３位、１９０アミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなり、シグナルペプチド（同第１位〜第１９位）（配列番号４）及びプロペプチド（同第２０位〜第３３位）（配列番号５）を除いたもの）である。（以下、このキシラナーゼを、第１のキシラナーゼという。第１のキシラナーゼは、Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｆａｍｉｌｙ（ｈｔｔｐ:：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ−Ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ．ｈｔｍｌ）の１１に分類される。本明細書において、特に断りのない限り、アミノ酸配列における位置は、当該１９０アミノ酸残基からなる第１のキシラナーゼのアミノ酸配列における位置として表すものとする。なお、第１のキシラナーゼの第１０位〜１８８位（登録番号P３６２１７で規定されるアミノ酸配列の第４３位〜２２１位に相当し、配列番号２で表される。）が触媒ドメインである。
【００１４】
（耐熱温度）
本キシラナーゼは、第１のキシラナーゼより、耐熱温度が高いことが好ましい。本キシラナーゼの耐熱温度は、例えば、Δ耐熱温度（℃）として評価することができる。本明細書において、Δ耐熱温度は、第１のキシラナーゼの耐熱温度（℃）に対する本キシラナーゼの耐熱温度（℃）の差分温度（℃）である。例えば、ある保存温度で２時間保存したときの活性が、２５℃で２時間保存後の活性の半分の活性となるときの当該保存温度を、キシラナーゼの耐熱温度とすることができる。
【００１５】
より具体的には、例えば、キシラナーゼを、２５℃、４８℃及び５２℃でそれぞれ２時間保存後、所定の方法で活性を測定する。これにより、保存温度を横軸とし、キシラナーゼ活性を縦軸とするとき、活性の減少曲線を得ることができる。この活性減少曲線において、２５℃で２時間保存時の活性の半分となる活性に対応する補助線が活性減少曲線と交差する点の保存温度を、耐熱温度（℃）とすることができる。こうして得られた本キシラナーゼの耐熱温度から第１のキシラナーゼの耐熱温度を引いた値をΔ耐熱温度とする。Δ耐熱温度は、具体的には、後述する実施例に記載される条件を採用して測定することができる。
【００１６】
本キシラナーゼは、例えば、Δ耐熱温度が１℃以上である。また例えば、Δ耐熱温度が１．５℃以上であり、また例えば、２℃以上であり、また例えば、３℃以上であり、また例えば４℃以上であり、また例えば５℃以上である。Δ耐熱温度の上昇により、例えば、５０℃でのキシラナーゼ活性の半減期が増大する。特に、本キシラナーゼの活性半減期の観点からは、Δ耐熱温度が４℃以上、好ましくは、５℃以上、より好ましくは６℃以上、さらに好ましくは７℃以上、なお好ましくは８℃以上、一層好ましくは９℃以上である。また、上限も特に限定するものではないが、例えば、活性半減期の観点からは、１２℃以下であり、また例えば、１１℃以下であり、また例えば、１０℃以下である。
【００１７】
（活性半減期）
本キシラナーゼは、例えば、所定の保存温度で保存したときの、キシラナーゼ活性の半減期が、第１のキシラナーゼよりも長いことが好ましい。本明細書においてキシラナーゼの活性半減期とは、キシラナーゼをある温度で保存したときの残存活性が半分となる時間（ｈｒ）である。本キシラナーゼの活性半減期は、例えば、ヘミセルロースを含むバイオマスを分解するときの温度である５０℃を保存温度として、評価することができる。
【００１８】
より具体的な保存条件及びキシラナーゼ活性は、後述する実施例に開示される方法を採用することができる。なお、保存温度としては、５０℃に限定するものではなく、例えば、５０℃以上６５℃以下の範囲において所定の温度を設定することができる。例えば、５５℃における残存活性であってもよいし、６０℃における残存活性でもよい。また、６５℃における残存活性であってもよい。
【００１９】
第１のキシラナーゼは、５０℃における半減期は、約３時間であるが、本キシラナーゼは、例えば、５０℃における半減期は、３０時間以上であり、また例えば、同４０時間以上であり、また例えば５０時間以上であり、また例えば６０時間以上であり、また例えば７０時間以上であり、また例えば８０時間以上であり、また例えば９０時間以上であり、また例えば１００時間以上である。さらにまた、例えば、１２０時間以上であり、また例えば、１４０時間以上であり、また例えば、１６０時間以上であり、また例えば、１８０時間以上であり、また例えば２００時間以上であり、また例えば、２２０時間以上であり、また例えば、２４０時間以上である。５０℃における半減期が１００時間以上であれば、ヘミセルロースを含むバイオマスの分解（糖化）のための処理時間（６０〜２００時間程度）において、概ね活性を維持することができ、効率的にバイオマスを分解することができる。
【００２０】
Δ耐熱温度が４℃以上の本キシラナーゼは、同時に、５０℃における活性半減期も、３０時間以上、より好ましくは４０時間以上、さらに好ましくは５０時間以上、なお好ましくは６０時間以上であることが多く、典型的には８０時間以上である。また、Δ耐熱温度が６℃以上、好ましくは同７℃以上、より好ましくは同８℃以上の本キシラナーゼは、同時に、５０℃における活性半減期が１００時間以上、より好ましくは１２０時間以上、さらに好ましくは１４０時間以上、なお好ましくは１６０時間、一層好ましくは１８０時間以上であることが多い。
【００２１】
（変異）
本キシラナーゼが有する変異の変異は、第１のキシラナーゼを基準として規定されている。これらの変異は、第１のキシラナーゼに対して、種々の改変を試みることで、高温耐久性に貢献する変異を特定したことによって得られたからである。一方、本明細書において開示する変異は、第１のキシラナーゼのアミノ酸配列にのみ適用されるものではなく、他のキシラナーゼにも適用されるものである。すなわち、第１のキシラナーゼは、ＧＨＦ１１に分類されるものであって、ＧＨＦ１１に属する他のキシラナーゼは、類似のアミノ酸配列と立体構造を備えている。これらのことから、当業者であれば、少なくともＧＨ１１ファミリーに属するキシラナーゼに対して本明細書に開示される変異を適用することで本キシラナーゼを得ることができることが理解される。
【００２２】
本キシラナーゼは、第１のキシラナーゼに対して人為的に変異を導入したもののほか、本明細書に開示される変異を本来的に備えている天然由来のキシラナーゼも包含される。
【００２３】
本キシラナーゼが有しうる変異位置は、配列番号１で表されるアミノ酸配列に対してアライメントしたとき、その６位、３７位、４６位、４７位、５５位、５６位、７１位、８０位、９４位、９９位、１１９位、１２０位、１２５位、１３７位、１４０位、１５４位、１６１位及び１６４位からなる群から選択される１個又は２個以上の位置に相当する位置である。本キシラナーゼにおけるかかる変異位置は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と本キシラナーゼのアミノ酸配列（すなわち、変異部位を有するキシラナーゼである。）とを、ＢＬＡＳＴ（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）やＰｆａｍ（http://pfam.xfam.org/）などの公知のアミノ酸配列アラインメントプログラムを用いて、例えば、デフォルトのパラメータでアラインメントさせることにより特定することができる。
【００２４】
これらの変異位置は、いずれも、Δ耐熱温度（℃）が、プラスになりうることが確認されている位置である。以下に、各変異位置における可能性ある置換アミノ酸残基を示す。この置換アミノ酸残基は、第１のキシラナーゼにおける以下の位置において本来的なアミノ酸残基以外の残りの１９種類のアミノ酸に置換した、単一変異体の飽和遺伝子ライブラリの評価に基づいて得られている。なお、（）内は、第１のキシラナーゼ（１位〜１９０位））における位置である。
【００２５】
変異位置における置換アミノ酸残基中、＊印のあるアミノ酸残基は、Δ耐熱温度が約１℃以上となった変異である。
【００２６】
グリシン（６位）：グルタミン酸＊、イソロイシン、バリン、セリン、システイン、メチオニン、グルタミン
バリン（３７位）：イソロイシン
バリン（４６位）：イソロイシン＊
グリシン（４７位）：システイン＊、アラニン＊
トレオニン（５５位）：セリン＊、アスパラギン酸、グルタミン酸
リジン（５６位）：トレオニン
アスパラギン（７１位）：アラニン
セリン（８０位）：メチオニン＊、アラニン＊、イソロイシン、
グリシン（９４位）：ヒスチジン＊、システイン＊、アラニン、チロシン
セリン（９９位）：グリシン＊、アラニン
アルギニン（１１９位）：バリン、システイン
トレオニン（１２０位）：リジン、アラニン
グルタミン（１２５位）：アラニン＊、セリン
チロシン（１３７位）：トリプトファン、アラニン、ロイシン、バリン
バリン（１４０位）：イソロイシン
アスパラギン（１５４位）：アラニン
グルタミン（１６１位）：アラニン、グルタミン酸
ロイシン（１６４位）：メチオニン
【００２７】
Δ耐熱温度が約１℃以上であるという観点から、６位（６Ｅ）、４６位（４６Ｉ）、４７位（４７Ｃ、４７Ａ）、５５位（５５Ｓ）、８０位（８０Ｍ、８０Ａ）、９４位（９４Ｈ、９４Ｃ）、９９位（９９Ｇ）、１２５位（１２５Ａ）及び１６４位（１６４Ｍ）は有用な変異位置及び変異である。また、Δ耐熱温度が約１．５℃以上である変異は、６Ｅ、４７Ｃ、４７Ａ、５５Ｓ、８０Ｍ、８０Ａ、９４Ｈ、９９Ｇ、１２５Ａである。また、同約２．０℃以上である変異は、４７Ｃ、８０Ｍ、９９Ｇである。さらに、同２．５℃以上である変異は、４７Ｃ、９９Ｇである。さらにまた、同３．０℃以上である変異は、４７Ｃである。
【００２８】
また、有効なΔ耐熱温度を得るのに貢献した変異が複数個存在しているという観点から、好ましい変異位置としては、６位、４７位、５５位、９０位、９４位、９９位、１１９位、１２０位、１２５位、１３７位、１６１位が挙げられる。なかでも、６位、５５位、８０位、９４位、１３７位が挙げられる。
【００２９】
また、例えば、Δ耐熱温度の上昇及び例えば５０℃での活性半減期の増大に貢献する変異位置は、４７位である。変異としては、４７Ｃである。また、同様に、９９位も有用な変異位置である。変異としては、９９Ｇである。さらに、８０位も有用な変異である。変異としては、８０Ｍ又は８０Ａである。また、１２５位も有用な変異位置である。変異としては、１２５Ａである。さらにまた、５５位も有用な変異位置である。変異としては、５５Ｓである。
【００３０】
かかる変異位置は、これらに加えて、１２０位である。変異としては、１２０Ｋである。また、９４位も有用な変異位置である。変異としては、９４Ｃ、９４Ｈである。また、１６４位も有用な変異位置である。変異としては、１６４Ｍでる。
【００３１】
また、かかる変異位置は、これらに加えて、６位である。変異としては６Ｅである。また、７１位も有用な変異位置である。変異としては、７１Ａである。また、１３７位も有用な変異位置である。変異としては１３７Ｗである。
【００３２】
さらにまた、かかる変異位置は、これらに加えて、４６位である。変異としては、４６Ｉである。また、４７位も有用な変異位置である。変異としては、４７Ａである。
【００３３】
本キシラナーゼは、こうした変異位置における変異を１個又は２個以上備えることができる。本キシラナーゼは、２個以上の変異の組合せ（相加）によって、それぞれの変異に基づくΔ耐熱温度を相加した又は相加以上のΔ耐熱温度（℃）を得ることができる。本発明者が見出した変異は、それぞれ独立してΔ耐熱温度（℃）及び／又は活性半減期に貢献しているからである。
【００３４】
２個以上の変異を組み合わせる場合、特に限定するものではないが、３個以上の変異を組み合わせることが好ましく、より好ましくは４個以上である。４個以上の変異を組合せると、３個以下の場合に比べて大きくΔ耐熱温度が向上する。さらに好ましくは、５個以上である。また、変異の個数は、８個以下程度であることが好ましい。変異個数が多いと、Δ耐熱温度は相加される傾向にあるが、例えば、５０℃における活性半減期が変化しなくなるからである。好ましくは、７個以下であり、より好ましくは６個以下である。典型的には、４個以上７個以下、また、５個以上６個以下程度が、Δ耐熱温度の向上と５０℃等における半減期の増大の観点から好適である。
【００３５】
本キシラナーゼのキシラナーゼ活性の最適温度は、特に限定するものではないが、５０℃以上６５℃以下であることが好ましい。この範囲であると、高温での活性と耐久性とを両立することができる。最適温度は、また例えば、５５℃以上６５℃以下である。なお、最適温度及びキシラナーゼ活性は、後述する実施例に開示される方法によって評価し規定することができる。
【００３６】
本キシラナーゼが有する２個以上の変異の組合せは、既述の変異から選択して適宜決定することができるが、なかでも、既述のΔ耐熱温度及び活性半減期の観点から選択することができる。また例えば、本キシラナーゼは、以下に開示される変異から選択される、例えば、２個以上１０個以下、また例えば、３個以上９個以下、また例えば、４個以上８個以下、また例えば５個以上７個以下、また例えば５個以上５個以下の変異を適宜選択して組み合わせることができる。以下に、本キシラナーゼにおける個々の変異と好適な範囲の組み合わせを例示的に列挙する。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
本キシラナーゼは、第１のキシラナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）と８０％以上の同一性及び／又は類似性を有することが好ましい。また例えば、同８５％以上あり、また例えば、同９０％以上であり、また例えば、９５％以上であり、また例えば９６％以上であり、また例えば９７％以上であり、また例えば９８％以上であり、また例えば９９％以上であり、また例えば９９．５％以上である。また例えば、本キシラナーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列とは同一性が１００％未満である。
【００３９】
本明細書において同一性又は類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarity と称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))を利用し決定することができる。BLASTのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
【００４０】
本キシラナーゼは、後述する特定変異位置において変異を有することができるが、当該変異による効果を損なわない限り、当該特定変異位置以外において置換、欠失等の変異を有していてもよい。すなわち、こうした追加の変異は、第１のキシラナーゼのアミノ酸配列における触媒ドメイン（第１０位〜第１８８位）以外の部位などとすることができる。こうした変異として、アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のカッコ内のグループ内での置換が挙げられる。例えば、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。
【００４１】
当業者は、本明細書に開示される本キシラナーゼの変異位置及び好適な置換例に基づいて、種々の相加体を作製、その評価を行い、意図した高温耐久性を有するキシラナーゼを得ることができる。
【００４２】
また、当業者は、本明細書に開示される本キシラナーゼに対して、例えば、第１のキシラナーゼが有するシグナルペプチドやプロペプチドのいずれか又は双方の領域をそのＮ末端側に付加したり、あるいは、これらと同様の機能を有するペプチドを適宜付加して本キシラナーゼの生産等のために好適なタンパク質とすることができる。
【００４３】
本キシラナーゼは、例えば、第１のキシラナーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（配列番号６）（GenBank:EU532196）を、慣用の突然変異誘発法、部位特異的変異法、エラープローンＰＣＲを用いた分子進化的手法等によって改変することによって改変ＤＮＡを取得し、当該改変ＤＮＡ等に基づいて取得することができる。改変ＤＮＡを取得する手法としては、Kunkel法又は Gapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法が挙げられ、例えば、商業的に入手可能な種々の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットを用いて変異が導入される。
【００４４】
例えば、本キシラナーゼは、こうして得られた改変ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物によって真核細胞等の適当な宿主を形質転換し、この形質転換細胞を、当業者に公知の通常の方法に従って培養し、当該培養細胞または培地から本キシラナーゼを回収することによって得ることができる。培養細胞から、当該細胞の破砕後、遠心分離等の分離操作により可溶性画分を得、この画分からポリペプチドを回収することができる。例えば、本キシラナーゼは、慣用の精製技術を組み合わせて単離することができる。そのような技術には、硫安分画、有機溶媒処理、遠心分離、限外濾過、各種クロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー等）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、電気泳動等が包含される。
【００４５】
そのほか、当業者であれば、Molecular Cloning（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning :a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview, NY (1989)）等を参照することにより、例えば、配列番号１又は６等の公知配列に基づいて、各種態様のＤＮＡを取得し、当該ＤＮＡを利用して本キシラナーゼを得ることができる。
【００４６】
本キシラナーゼは、ヘミセルロースを含むバイオマスのセルラーゼ複合体又はセルラーゼを発現する形質転換体による分解（糖化）及び分解・エタノール等の有用物質の発酵生産等における実用的温度である５０℃において、従来に比して高い耐久性を備えることができる。したがって、本キシラナーゼは、バイオマスからの有用物質生産に有用である。
【００４７】
また、本キシラナーゼは、バイオマスからの有用物質の生産以外にも有用である。キシラナーゼは、パルプの漂白、サイレージの消化性向上、食品添加物として用いるほか、種々の食品分野での用途がある。工業的用途や保存安定性の観点からは、高温耐久性は重要な要素である。本キシラナーゼは、食品自体への用途及び食品製造への用途においても有用である。
【００４８】
本キシラナーゼは、用途に応じて、精製された又は未精製のタンパク質として用いられるほか、後述するように、本キシラナーゼを、細胞内発現する、表層呈示する又は分泌発現する形質転換体などの微生物の形態を採ることもできる。本キシラナーゼをタンパク質として用いるとき、本キシラナーゼのほか、他のセルラーゼや添加剤を含む組成物として構成されていてもよい。また、本キシラナーゼを、微生物形態として用いるとき、他のセルラーゼを同時発現する形質点間体として構成されていてもよい。
【００４９】
（ポリヌクレオチド）
本明細書に開示されるポリヌクレオチド（以下、単に、本ポリヌクレオチドともいう。）は、本キシラナーゼのアミノ酸配列をコードすることができる。かかるポリヌクレオチドは、種々の形態を採ることができるが、当該アミノ酸配列のコード領域は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり、典型的にはＤＮＡである。
【００５０】
本ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片のほか、プラスミド、ベクター等の形質転換等に適した公知の形態を採ることができる。
【００５１】
本ポリヌクレオチドは、本キシラナーゼを得るためのＤＮＡとして得ることができるほか、例えば、配列番号１又は６等の配列に基づいて設計したプライマーを用いて、ヘミセルロース分解性生物等から抽出したＤＮＡ、各種ｃＤＮＡライブラリ又はゲノムＤＮＡライブラリ等由来の核酸を鋳型としたＰＣＲ増幅を行うことにより、核酸断片として得ることができる。また、上記ライブラリ等由来の核酸を鋳型とし、キシラナーゼ遺伝子の一部であるＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸断片として得ることができる。あるいは化学合成法等の当技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成してもよい。
【００５２】
（発現ベクター）
本明細書に開示される発現ベクター（以下、本ベクターともいう。）は、本ポリヌクレオチドを備えることができる。本ベクターは、宿主細胞において本キシラナーゼを発現させることを目的とするものである。発現ベクターは、形質転換しようとする細胞の種類や目的等に応じて種々の形態を採ることができる。本ベクターの一例としては、例えば、本タンパク質を工業的に生産する微生物を得るためのベクター、本タンパク質を細胞表層呈示ないし分泌発現し、必要に応じてエタノールなどの有用物質を発酵により生産する微生物を得るためのベクターなどが挙げられる。当業者であれば、このようなベクターを本願出願時の周知技術に基づいて容易に構築することができる。
【００５３】
以下、本キシラナーゼでバイオマスを分解する微生物をえるためのベクターの要素等について説明する。
【００５４】
本ベクターは、適切なプロモーター、ターミネーターのほか、マーカーやその他の要素を備えることができる。こうしたベクター要素は、形質転換しようとする宿主細胞や、本キシラナーゼの発現形態に応じて適宜選択される。
【００５５】
本ベクターが形質転換しようとする宿主細胞としては、特に限定するものではないが、原核細胞や真核細胞とすることができる。原核細胞としては、例えば、Escherichia coliなどの大腸菌などが挙げられる。また、真核細胞としては、物質生産等を考慮すると、麹菌などのカビや酵母が挙げられる。麹菌としては、アスペルギルス・アキュリータス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus orizae）等のアスペルギルス属が挙げられる。また、酵母としては、公知の各種酵母を利用できるが、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属の酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス属の酵母、キャンディダ・シェハーテ（Candida shehatae）等のキャンディダ属の酵母、ピキア・スティピティス（Pichia stipitis）等のピキア属の酵母、ハンセヌラ（Hansenula）属の酵母、クロッケラ属（Klocckera）の酵母、スワニオマイセス属（Schwanniomyces）の酵母及びヤロイア属（Yarrowia）の酵母、トリコスポロン（Trichosporon）属の酵母、ブレタノマイセス（Brettanomyces）属の酵母、パチソレン（Pachysolen）属の酵母、ヤマダジマ（Yamadazyma）属の酵母、クルイベロマイセス・マーキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）等のクルイベロマイセス属の酵母、イサトケンキア・オリエンタリス（Issatchenkia orientalis）等のイサトケンキア属の酵母が挙げられる。なかでも、工業的利用性等の観点からサッカロマイセス属酵母が好ましい。なかでも、サッカロマイセス・セレビジエが好ましい。
【００５６】
本ベクターに適用するプロモーターは、宿主で作動し、かつ意図した発現態様を実現できるものであればよい。また、プロモーターは、誘導的であっても構成的であってもよい。例えば、酵母における構成的プロモーターとしては、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ１）プロモーター、ヒスチジン栄養性機能遺伝子（ＨＩＳ３）プロモーター、チトクロームｂｃ１コンプレックス（ＣＹＣ１）プロモーター及び高浸透圧応答7遺伝子（ＨＯＲ７）プロモーター及びこれらの改変体が挙げられる。
【００５７】
本ベクターに適用するターミネーターも、宿主で作動し、かつ意図した発現態様を実現できるものであればよい。さらに、本ベクターは、エンハンサー、複製開始点（ori）、マーカー等も併せて備えることができる。
【００５８】
本ベクターは、宿主細胞の染色体外において保持されていてもよいが、好ましくは染色体上に保持されるように構成される。
【００５９】
なお、こうした発現ベクターの作製、組換え体宿主としての酵母等の取り扱いに必要な一般的な操作は、当業者間で通常行われているものであり、たとえば、T．Maniatis，J. Sambrookらの実験書（Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1982,1989、2001)等を適宜参照することにより当業者であれば実施することができる。
【００６０】
（形質転換体）
本明細書に開示される形質転換体（以下、単に、本形質転換体ともいう。）は、本キシラナーゼを発現することができる。本形質転換体は、本キシラナーゼを発現することができるため、本キシラナーゼの工業的な生産のほか、本形質転換体をバイオマス等の分解や糖化発酵に用いることができる。
【００６１】
本形質転換体は、既述の本ベクターを宿主に導入することにより得ることができる。宿主への導入方法としては、従来公知の各種方法、例えば、リン酸カルシウム法、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法または他の方法が挙げられる。このような手法は、上記した実験書等に記載される。ベクターを導入した微生物につき、マーカー遺伝子を用いた選抜及び活性発現による選抜により本形質転換体を得ることができる。
【００６２】
本形質転換体は、キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）を発現していることが好ましい。すなわち、キシロースをキシルロースに変換する能力が付与されていることが好ましい。ＸＩ活性が付与されていることにより、ペントースリン酸経路を介してキシロースを炭素源として増殖でき、発酵することができる。
【００６３】
本形質転換体が真核細胞であるとき、本キシラナーゼをコードするＤＮＡを、染色体外に保持してもよいしが、好ましくは染色体上に保持されている。また、高いキシロース分解能を発揮させるために例えば、複数コピー保持していることが好ましい。
【００６４】
本形質転換体は、そのほか、セルラーゼや他のヘミセルラーゼを細胞表層あるいは細胞外に分泌発現するものであってもよい。例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼなどの各種セルラーゼのほか、他のヘミセルラーゼ等のその他のバイオマス分解酵素も挙げられる。こうしたタンパク質を発現させることで、リグノセルロースに由来するリグニン以外の糖類を効果的に利用できるようになる。また、本明細書に開示される形質転換体は、このほか、必要に応じて外来遺伝子の導入、内在性遺伝子の破壊などの遺伝子工学的な改変がなされたものであってもよい。
【００６５】
こうした酵素をコードする遺伝子は、酵母等の真核細胞において内因性であってもよいし、外因性であってもよい。また、公知のこれらの酵素をコードする遺伝子を適宜利用できる。遺伝子としては、解糖系を増強できるものである限り、由来を問わないで利用できる。すなわち、遺伝子は、宿主となる酵母以外の他の種の酵母、他の属の酵母に由来するものであってもよいし、動物、植物、真菌（カビ等）、細菌などいずれ酵母以外の生物に由来するものであってもよい。こうした遺伝子に関する情報は、当業者であれば、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information；http://www.ncbi.nlm.nih.gov）等のＨＰにアクセスすることにより適宜入手できる。なお、遺伝子としては、ゲノムＤＮＡのほか、ｃＤＮＡ等であってもよい。
【００６６】
（キシランの分解方法及びキシロースの生産方法）
本明細書に開示されるキシランの分解方法（以下、単に、本分解方法ともいう。）は、本キシラナーゼを用いてキシランを分解する工程を備えることができる。本分解方法によれば、キシランを分解するのにあたり高い分解温度、例えば、５０℃程度、を設定することができる。また、本分解方法によれば、当該高い分解温度を設定した場合でも、新たにキシラナーゼを追加しなくてもよく、一挙にキシランを分解することができて、有利である。本分解方法は、キシランの分解産物であるキシロースの生産方法としても実施することができる。
【００６７】
本分解方法によれば、炭素源としてキシランを含んでいれば、それを有効利用できる。キシランを含む炭素源としては、一般に、植物又はその一部であり、一般的なバイオマス資源のほか、コーヒ滓やテンサイなどの圧搾滓等の食品廃棄物などが挙げられる。
【００６８】
キシランを、キシラナーゼで分解することで、分解産物としてキシロースを得ることができる。キシランは、アラビノキシラン、グルクロノキシランなどの多糖の総称であり、キシロースを構成単糖としている。キシランは、天然には、ヘミセルロースの一成分を構成しており、リグノセルロースなどのバイオマス等に存在している。
【００６９】
本分解方法は、精製又は未精製のタンパク質として本キシラナーゼを用いてキシランを分解する工程とすることもできるし、本キシラナーゼを細胞外にて発現する本形質転換体を用いてキシランを分解する工程としてもよい。タンパク質として本キシラナーゼを用いることは、食品工業分野において有用である場合があり、本形質転換体を用いることが、バイオマス資源の利用や糖化発酵の観点から有用である場合がある。
【００７０】
タンパク質として本キシラナーゼを用いる場合、本キシラナーゼでキシランを直接分解する。この場合の条件は、本キシラナーゼのΔ耐熱温度や活性半減期を考慮して、分解温度や時間等を適宜設定することができる。典型的には、４５℃以上６５℃以下で数時間から数十時間程度とすることができる。
【００７１】
また、本形質転換体が発現するキシラナーゼを用いてキシランを分解する工程では、キシランを細胞外発現する微生物をキシランに添加し、当該微生物の発酵に適した培養条件で培養する培養工程を実施することで、キシランを分解できる。培養条件は、微生物の種類に応じて適宜設定することができるが、典型的には、静置培養、振とう培養または通気攪拌培養等を用いることができ、通気条件は、嫌気条件下、微好気条件下及び好気条件等、適宜選択することができ、培養温度も、特に限定しないが、２５℃〜５５℃等の範囲とすることができる。また、培養時間も必要に応じて設定されるが、数時間〜１５０時間程度とすることができる。また、ｐＨの調整は、無機あるいは有機酸、アルカリ溶液等を用いて行うことができる。培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。
【００７２】
なお、培養工程では、炭素源として、グルコースを含むことができる。グルコースは、微生物が代謝できる炭素源であるからである。また、形質転換体がセルロース分解能を有する場合には、炭素源として、培地中にセルロース又はその部分分解物を含んでいてもよいし、炭素源として、ヘミセルロースを含むリグノセルロースなどのバイオマスを用いてもよい。かかる本形質転換体は、キシランを本キシラナーゼが分解することでリグノセルロース構造体を緩ませて効率的にセルロースを分解できるほか、セルロースを分解したグルコースを炭素源として代謝増殖できる。このため、本キシラナーゼの発現量を増大させやすく、効率的なキシランの分解が可能となる。さらに、炭素源としてヘミセルロースを含むリグノセルロースなどのバイオマスをかかる本形質転換体で分解することで、本形質転換体による糖化同時発酵も実施でき、本形質転換体による有用物質の生産も可能となる。
【００７３】
培養工程では、形質転換体の宿主に一般的に適用される培養条件を適宜選択して用いることができる。典型的には、発酵のための培養は、静置培養、振とう培養または通気攪拌培養等を用いることができる。通気条件は、嫌気条件下、微好気条件下及び好気条件等、適宜選択することができる。培養温度も、特に限定しないが、２５℃〜５５℃等の範囲とすることができる。また、培養時間も必要に応じて設定されるが、数時間〜１５０時間程度とすることができる。また、ｐＨの調整は、無機あるいは有機酸、アルカリ溶液等を用いて行うことができる。培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。
【００７４】
（有用物質の生産方法）
本明細書に開示される有用物質の生産方法（以下、単に、本生産方法ともいう。）は、本キシラナーゼを用いてキシランを分解する工程と、前記工程で得られたキシロースを有用物質に変換する工程と、を備えることができる。本生産方法によれば、キシランを効率的に分解し、それにより得られたキシロースを有用物質に変換することで、キシロース由来の各種有用物質を得ることができる。
【００７５】
本生産方法で生産しようとする有用物質は、特に限定するものではないが、例えば、キシロースを酵素で代謝して得られるキシルロースなどの五炭糖のほか、これらを五炭糖のみまた同時に六炭糖を利用して微生物が生産するエタノール、乳酸、酢酸、１，３−プロパン−ジオール、プロパノール、ブタノール、コハク酸、エチレン及びグリセロールが挙げられる。グルコースなどの六単糖やキシルロースなどの五炭糖を酸触媒の存在下で脱水して得られる、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、これらの化合物に由来するフルフリルアルコール、テトラヒドロフラン、フランジカルボン酸並びにキシロースの還元によって得られるキシリトール等が挙げられる。
【００７６】
本生産方法における分解工程は、キシランの分解工程と同様の態様で実施できる。また、本生産方法における変換工程は、分解工程で得たキシロースを、さらなる酵素処理、工業的処理、微生物による発酵処理などを実施して有用物質に変換する工程であるキシロースから各種有用物質を得るための方法は、本願出願時において当業者において周知であり、当業者であれば、目的の有用物質の種類に応じて、本生産方法を利用し、また、適宜工程を追加することができる。
【００７７】
本生産方法では、特に限定するものではないが、キシランの分解工程において、本形質転換体を用いることが好適である。本形質転換体のキシロース資化能力により及び／又は他に炭素源を用いることにより、分解工程及び変換工程を同時に実施でき、本形質転換体が有する代謝能力によって生産可能なものを有用物質として生産できる。この場合、本形質転換体が酵母の場合、グルコースからの代謝系の１種又は２種以上の酵素を遺伝子組換えにより置換、追加等して本来の代謝物でない化合物を有用物質として生産できる。この場合、具体的には、エタノールなどの低級アルコール、乳酸、酢酸などの有機酸の他、１，３−プロパン−ジオール、プロパノール、ブタノール、コハク酸、エチレン及びグリセロールのほか、イソプレノド合成経路の追加によるテルペノイド系のファルネソール、ゲラニルゲラニオール、スクアレン、さらには、ファインケミカル（コエンザイムＱ１０、ビタミン及びその原料等）、解糖系の改変によるグリセリン、プラスチック・化成品原料などが挙げられる。酵母は、アルコール発酵能が高いため、本形質転換体は、キシランのほか、セルロースを含むバイオマスを炭素源とした培地に用いてエタノールを効率的に生産することができる。また、アルコール発酵能力が高い酵母は、その解糖系を改変して他の有機酸等の有用物質を生産する場合にも、当該有用物質の生産能力も高い。
【００７８】
こうした培養工程などの変換工程の実施により、用いた本発明の形質転換体が有している有用物質生産能力に応じて有用物質が生産される。例えば、本発明の形質転換体がエタノール生産能力を有している場合には、エタノールであり、乳酸を生産可能に改変されている場合には、乳酸等となる。発酵終了後、培養液から有用物質含有画分を回収する工程、さらにこれを精製又は濃縮する工程を実施することもできる。回収工程や精製等の工程は有用物質の種類等に応じて適宜選択される。
【００７９】
（スクリーニング方法）
本明細書に開示されるキシラナーゼのスクリーニング方法（以下、本スクリーニング方法ともいう。）は、配列番号１で表されるアミノ酸配列に対してアライメントしたとき、その６位、３７位、４６位、４７位、５５位、５６位、７１位、８０位、９４位、９９位、１１９位、１２０位、１２５位、１３７位、１４０位、１５４位、１６１位及び１６４位からなる群から選択される１個又は２個以上の位置に相当する位置に変異を有する、キシラナーゼ候補を準備する工程と、前記キシラナーゼ候補について、（ａ）所定温度にて２時間保存したとき、２５℃で２時間保存したときのキシラナーゼ活性の半分の活性となるときの当該所定温度、及び（ｂ）５０℃で保存したときのキシラナーゼ活性の半減期の少なくともいずれかについて評価する工程と、を備えることができる。上記変異位置は、単一変異体において良好なΔ耐熱温度を備えることがわかっている。したがって、これらの変異位置における変異を組み合わせることで、高温耐久性に優れる本キシラナーゼを効率的にスクリーニングすることができる。
【００８０】
本スクリーニング方法は、上記した（ａ）及び（ｂ）のいずれかの評価を実施すればよい。必要に応じて適宜選択してもよいし、双方を行ってもよい。上記（ａ）の評価は、一次スクリーニングに有効である。
【００８１】
本スクリーニング方法において、評価工程は、５０℃で保存したときのキシラナーゼ活性の半減期が３０時間以上であるキシラナーゼをスクリーニングする工程とすることができる。かかる半減期を有するキシラナーゼであれば、キシランの分解工程に有用である。
【００８２】
スクリーニング候補に適用する変異位置、変異位置における変異の態様、変異の個数等は、既に説明した本キシラナーゼにおける各種態様を適用することができる。また、スクリーニング候補の取得も、本キシラナーゼの取得と同様の態様で実施できる。なお、本スクリーニング方法においては、無細胞タンパク質合成系によってスクリーニング候補を取得すると効率的なスクリーニングが可能となる。
【００８３】
本スクリーニング方法では、上記した変異位置のほか、追加の変異を備えたスクリーニング候補を用いてもよい。
【実施例】
【００８４】
以下、本明細書の開示をより具体的に説明するために具体例としての実施例を記載する。以下の実施例は、本明細書の開示を説明するためのものであって、その範囲を原知恵するものではない。
【実施例１】
【００８５】
（各種変異体の合成）
キシラナーゼ（以下、ＸＹＮ）はTrichoderma reesei由来UniProtKBの登録番号P36217(XYN2_HYPJR)、Glycoside Hydrolase Family（http://www.cazy.org/Glycoside-Hydrolases.html）の１１に分類されるものを用いた。成熟キシラナーゼの全長アミノ酸配列の１９０残基のうち野生型の配列がアラニンである７残基を除いた１８３残基を、２ステップＰＣＲによる変異導入法を用いて、それぞれアラニンに置換した変異遺伝子ライブラリを構築した。１ｓｔ  ＰＣＲでは、野生型のＸＹＮ遺伝子の５’末端に付加したＴ７プロモーターとｒｂｓのフォワードプライマー（Ｔ７ｐ）と変異導入部位のリバースプライマー（ｒｐ）、変異導入部位のフォワードプライマー（ｆｐ）とＸＹＮ遺伝子の３’末端に付加したＴ７ターミネータ（転写終了領域）のリバースプライマー（Ｔ７ｔ）を用いて、２断片を増幅した。２ｎｄＰＣＲでは、Ｔ７ｐとＴ７ｔプライマーを用いて全長配列を増幅した。
【００８６】
天然型および各変異体の２ｎｄ ＰＣＲ産物を鋳型にして、大腸菌由来無細胞タンパク質合成系によりＸＹＮを合成し、変異タンパク質ライブラリを９６穴ＰＣＲプレート上に構築した。無細胞タンパク質合成は、ＰＣＲ産物２．５μｌに、転写翻訳反応液（Ｓ３０大腸菌抽出液、５６．４ｍＭＴｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，ｐＨ７．４、１．２ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭＧＴＰ、１ｍＭＣＴＰ、１ｍＭＵＴＰ、４０ｍＭクレアチンフォスフェート、０．７ｍＭ２０アミノ酸ミックス、４．１％（ｗ／ｗ）ポリエチレングリコール６０００、３５μｇ／ｍｌフォリン酸、０．２ｍｇ／ｍｌ大腸菌ｔＲＮＡ、３６ｍＭ酢酸アンモニウム、０．１５ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム、１００ｍＭ酢酸カリウム、１０μｇ／ｍｌリファンピシン、７．７μｇ／ｍｌＴ７ＲＮＡポリメラーゼ）１２．５μｌを添加し、２６℃で３時間保温して行った。
【００８７】
無細胞タンパク質合成産物１μｌを、２５ｍＭクエン酸Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５）２９μｌに加え、２５℃のほか、４８〜５２℃の間において１℃の間隔をおいた温度でそれぞれ２時間保温した。その後、基質であるＡＸＢ溶液３０μｌを添加した後に、４０℃で１５分間保温し、ＸＹＮと基質を反応させた。ＡＸＢ溶液は、ＡＺＯ−ＸＹＬＡＮ（ＢＩＲＣＨＷＯＯＤ由来、Ｍｅｇａｚｙｍｅ製）１ｇを滅菌水１００ｍｌに溶解したものを用いた。酵素反応液にエタノール１４０μｌを加えて撹拌し、室温で５分間放置し反応を停止した。プレート遠心機で３０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清１００μｌを、９６穴アッセイプレートに入れ、プレートリーダー（モレキュラーデバイス製ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸＰＬＵＳ３８４）を用いて、青色の吸収を５９０ｎｍで測定した。
【００８８】
上記のように、２５℃で２時間、４８℃〜５２℃で２時間保温した各変異体において、２５℃で２時間保温後の活性を１とする残存活性が１／２となる温度を、耐熱温度と定義した。すなわち、残存活性が０．５となる近傍の２点の温度における残存活性をｙ軸とし当該温度をｘ軸としてプロットして線形近似式を求め、当該式にＹ＝０．５を挿入したときのｘを耐熱温度（℃）とした。なお、耐熱温度が４８〜５２℃の範囲に含まれない場合には、想定される耐熱温度近傍で同様に活性を測定し、プロットして線形近似式を求めて耐熱温度を得た。耐熱性は、各変異体の耐熱温度から野生型の耐熱温度を差し引いた温度差（Δ耐熱温度）をとることで評価した。
【００８９】
上記結果の上位の変異部位を中心に次の変異導入候補として４５か所を選出した。変異導入候補のアミノ酸残基を、野生型のアミノ酸とアラニンを除いた残りの１８種類のアミノ酸に置換した飽和変異遺伝子ライブラリを構築した。上記と同様に２ステップＰＣＲにより変異導入し、無細胞合成系により酵素を合成した。
【実施例２】
【００９０】
（シングル変異の耐熱性）
アラニンに置換したライブラリ及び４５カ所の飽和変異ライブラリの合計１０１０変異体の耐熱性を評価した。結果を図１に示す。また、そのうちのΔ耐熱温度が正である４０カ所のシングル変異体を抽出した結果を図２に示す。
【００９１】
図１に示すように、１０１０個の変異体のうち、Δ耐熱温度が正となった変異体は、ごくわずかであった。ほとんどの変異体は、Δ耐熱温度が負となり、親キシラナーゼよりも耐熱性が低下していた。また、図２に示すように、Δ耐熱温度が約１℃以上ある変異体は、１１個であった。また、配列番号１における６位、４７位、５５位、８０位、９４位、９９位、１１９位、１２０位、１２５位、１３７位、１６１位については、２種類以上のアミノ酸で効果が出ており、耐熱性に大きく寄与する部位であると考えられた。なお、上記４０カ所の変異位置は、１９種類すべてのアミノ酸に置換し評価した結果、耐熱性を示したものである。
【実施例３】
【００９２】
（相加変異体の耐熱性評価）
実施例２で確認できた各変異位置において効果が高い変異については、２１種類の相加変異体を実施例１に準じて作製し、実施例１と同様にしてΔ耐熱温度を評価した。相加変異体が有する変異を以下の表に示し、Δ耐熱温度を評価した結果を図３に示す。
【００９３】
【表２】
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【００９４】
図３に示すように、変異を相加することにより耐熱温度は一挙に向上し、２〜３個の変異を相加することで、Δ耐熱温度は４℃を超え、さらに、５〜８個の変異を相加することで、Δ耐熱温度は、約８℃以上となり、７種類の変異体でΔ耐熱温度が１０℃以上となった。
【００９５】
これらの相加変異体につき、シングル変異でのΔ耐熱温度を加算した相加予測値と、相加変異体の実際の実験によるΔ耐熱温度を比較した結果を図４に示す。図４に示すように、相加予測値と実測値との間には相関があり、変異を相加するにつれて耐熱性が向上することがわかった。
【実施例４】
【００９６】
（相加変異体の活性半減期の評価）
実施例３で作製した相加変異体を用いて、５０℃下での半減期を評価した。なお、キシラナーゼ活性の評価については、温度を５０℃とする以外は、実施例１と同様に行った。
【００９７】
【表３】
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【００９８】
上記表に示すように、野生型では５０℃で2時間放置後の残存活性は約８０％に低下し、５０℃で保温時の残存活性の半減期は、野生型では３．１時間であった。５種類以上の変異を相加した変異体では、半減期は１２０時間以上であり、最も半減期の長いｍｕｔＲ８９ｂでは２６３時間であった。ｍｕｔＲ８９ｂの野生型の半減期を１とした相対比は８４倍であった。
【実施例５】
【００９９】
（酵母による相加変異体の分泌発現と耐熱性評価）
野生型および相加変異体Ｒ８９のキシラナーゼコード領域をＰＣＲで増幅し、シングルコピーの酵母分泌発現ベクターであるｐＡＵＲＧＡＰＳＳＲＧにサブクローニングした。ｐＡＵＲＧＡＰＳＳＲＧ  はＴＤＨ３プロモーター下流に、分泌シグナルを持ち菌体外に酵素を分泌する事が可能である。本ベクターを酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＪ５４６５株）に形質転換し、ＳＤ−ＵＲＡ寒天培地（ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ１．７ｇ、カザミノ酸５ｇ、アミノ酸ｍｉｘ、グルコース２０ｇ、寒天２０ｇ、脱イオン水１０００ｍｌ、ｐＨ６．０）で３０℃、３日間培養した。生育したコロニーをＳＤ−ＵＲＡ液体培地（ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ １．７ｇ、カザミノ酸５ｇ、−ＵＲＡアミノ酸ｍｉｘ０．７７ｇ、グルコース２０ｇ、脱イオン水１０００ｍｌ、ｐＨ６．０）２ｍｌに植菌し、３０℃、２４時間培養した菌液を前培養液とした。１００μｌの前培養液を２ｍｌのＳＤ−ＵＲＡ液体培地へ植菌し、３０℃、２４時間本培養を行った。遠心分離により得られた培養上清を粗酵素液として用いた。
【０１００】
粗酵素液３０μｌに基質であるＡＸＢ溶液３０μｌを添加し、実施例１と同様にして活性を測定し、粗酵素液のΔ耐熱温度を、無細胞タンパク質合成産物の耐熱温度評価時と同様の方法で調べた。その結果、酵母に分泌生産させた相加変異体Ｒ８９のΔ耐熱温度は９．７℃であり、大腸菌由来無細胞合成系産物を用いた場合の１０．１℃とほぼ同等であった。このことから、形質転換体が原核生物であっても真核生物であるかにかかわらず、安定して、Δ耐熱温度に優れるキシラナーゼを取得できることがわかった。
【実施例６】
【０１０１】
（GH11のキシラナーゼのアライメント）
Pham ID; Glyco_hydro_11 (PF00457)に登録されているＧＨＦ１１のキシラナーゼの８１配列を以下の方法でアライメントした。アライメント結果を図５Ａ〜図５Ｄに示す。なお、図５中、Ｐ３６２１７は、Trichoderma reesei由来のキシラナーゼであって、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢの登録番号Ｐ３６２１７を表し、その他の番号もＵｎｉＰｒｏｔＫＢを表す。
http://pfam.xfam.org/family/PF00457#tabview=tab3
Alignment types：seed（the curated alignment from which the HMM for the family is built
Selex format
【０１０２】
その結果、登録番号P36217(XYN2_HYPJR)のアミノ酸配列の６位、３７位、４６位、４７位、５５位、５６位、７１位、８０位、９４位、９９位、１１９位、１２０位、１２５位、１３７位、１４０位、１５４位、１６１位及び１６４位は、８１種のキシラナーゼにおいても、類似のアミノ酸残基を有しており、また、１７４種のキシラナーゼは、基準としたキシラナーゼの触媒ドメインである第１０位〜第１８８位（配列番号２）に対して３７％〜９４％の同一性と７７％〜１００％の類似性を有していた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【配列表】
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