(57)【要約】【課題】人工角膜の脱落や感染症等の発生を抑制することが可能であり、かつ、十分な強度及び光学特性を得ることが可能な人工角膜を提供する。また、異常の発生を抑制することが可能であり、かつ、十分な強度及び光学特性を得ることが可能な人工角膜を製造するための人工角膜の製造方法を提供する。【解決手段】貫通孔が形成された不織布と、貫通孔を覆うように配置されている水性高分子ゲルとを備える人工角膜。また、貫通孔が形成された不織布を準備する不織布準備工程と、貫通孔を覆うように水性高分子ゲルを配置するゲル配置工程とを含む人工角膜の製造方法。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
貫通孔が形成された不織布と、
前記貫通孔を覆うように配置されている水性高分子ゲルとを備えることを特徴とする人工角膜。
【請求項２】
貫通孔が形成された不織布を準備する不織布準備工程と、
前記貫通孔を覆うように水性高分子ゲルを配置するゲル配置工程とを含むことを特徴とする人工角膜の製造方法。
【請求項３】
前記不織布を構成する繊維は、ナノファイバーであることを特徴とする請求項２に記載の人工角膜の製造方法。
【請求項４】
前記不織布を構成する繊維は、ポリビニルアルコール系ナノファイバーであることを特徴とする請求項３に記載の人工角膜の製造方法。
【請求項５】
前記不織布は、ポリビニルアルコール−ヒドロキシエチルセルロース−グラファイト複合ナノファイバーからなることを特徴とする請求項４に記載の人工角膜の製造方法。
【請求項６】
前記不織布は、ポリビニルアルコール及びヒドロキシエチルセルロースの混合溶液にグラファイトを分散させた紡糸溶液を原料としてエレクトロスピニング法により形成されたものであることを特徴とする請求項５に記載の人工角膜の製造方法。
【請求項７】
前記不織布にハイドロキシアパタイトが付着していることを特徴とする請求項２〜６のいずれかに記載の人工角膜の製造方法。
【請求項８】
前記不織布準備工程では、前記不織布を塩化カルシウム水溶液に浸漬し、その後、前記不織布をｐＨ１０以上に調整したリン酸水素二ナトリウム水溶液に浸漬するサイクルを一回又は複数回実施することにより前記不織布に前記ハイドロキシアパタイトを付着させることを特徴とする請求項７に記載の人工角膜の製造方法。
【請求項９】
前記水性高分子ゲルは、ポリビニルアルコール系の水性高分子ゲルであることを特徴とする請求項２〜８のいずれかに記載の人工角膜の製造方法。
【請求項１０】
前記ゲル配置工程では、凍結融解法により前記不織布に前記水性高分子ゲルを配置することを特徴とする請求項９に記載の人工角膜の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工角膜及び人工角膜の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
角膜は目（眼球）を構成する組織の１つであり、厚さ０．５ｍｍ〜０．７ｍｍ程度の、透明な膜である。濁りが生じる等、角膜に何らかの障害が出ることを角膜疾患といい、角膜疾患は世界で３番目に多い失明原因とされている。現在、世界中でおよそ１０００万人が角膜疾患により失明していると推定されている。
【０００３】
角膜疾患の治療方法としては、角膜移植が広く知られている。しかし、角膜移植は他人の生体組織を患者に移植するものであるため、拒絶反応や感染症が発生する懸念がある。また、角膜の提供者数が不足しているという問題もある。
そこで、生体から採取した角膜ではなく人工角膜を用いることが検討されている。
【０００４】
初期の人工角膜は、ほぼ全体が緻密な透明無機材料（ガラス等）や透明樹脂（ポリメチルメタアクリレート等）からなるものが多かった（例えば、特許文献１参照。）。しかし、このような人工角膜は、生体組織との接着性が悪い、眼球に力学的なストレスを与える等といった問題があり、人工角膜の脱落や感染症等の異常が発生しやすいことから、少なくとも長期間の使用に耐えうるものではなかった。
【０００５】
近年、上記のような事情から、コラーゲン等の生体適合性が高い軟物質や繊維質物質（例えば、不織布）からなる人工角膜が研究されている（例えば、特許文献２参照。）。このような人工角膜は、移植後に細胞となじみやすい、酸素や栄養素を通過させることができる等の利点があることから、異常（人工角膜の脱落や感染症等）の発生を抑制することが可能な人工角膜とすることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭６３−９９８６０号公報
【特許文献２】特開２００８−４３４１９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、軟物質からなる人工角膜には、十分な強度を得ることは難しいという問題がある。また、繊維質物質からなる人工角膜には、十分な光学特性（高い透明性、適切な屈折率、低い散乱性等）が得られない場合があるという問題がある。
【０００８】
そこで、本発明は上記問題を解決するためになされたものであり、異常（人工角膜の脱落や感染症等）の発生を抑制することが可能であり、かつ、十分な強度及び光学特性を得ることが可能な人工角膜を提供することを目的とする。また、異常の発生を抑制することが可能であり、かつ、十分な強度及び光学特性を得ることが可能な人工角膜を製造するための人工角膜の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
［１］本発明の人工角膜は、貫通孔が形成された不織布と、前記貫通孔を覆うように配置されている水性高分子ゲルとを備えることを特徴とする。
【００１０】
［２］本発明の人工角膜の製造方法は、貫通孔が形成された不織布を準備する不織布準備工程と、前記貫通孔を覆うように水性高分子ゲルを配置するゲル配置工程とを含むことを特徴とする。
【００１１】
［３］本発明の人工角膜の製造方法においては、前記不織布を構成する繊維は、ナノファイバーであることが好ましい。
【００１２】
［４］本発明の人工角膜の製造方法においては、前記不織布を構成する繊維は、ポリビニルアルコール系ナノファイバーであることが好ましい。
【００１３】
［５］本発明の人工角膜の製造方法においては、前記不織布は、ポリビニルアルコール−ヒドロキシエチルセルロース−グラファイト複合ナノファイバーからなることが好ましい。
【００１４】
［６］本発明の人工角膜の製造方法においては、前記不織布は、ポリビニルアルコール及びヒドロキシエチルセルロースの混合溶液にグラファイトを分散させた紡糸溶液を原料としてエレクトロスピニング法により形成されたものであることが好ましい。
【００１５】
［７］本発明の人工角膜の製造方法においては、前記不織布にハイドロキシアパタイトが付着していることが好ましい。
【００１６】
［８］本発明の人工角膜の製造方法においては、前記不織布準備工程では、前記不織布を塩化カルシウム水溶液に浸漬し、その後、前記不織布をｐＨ１０以上に調整したリン酸水素二ナトリウム水溶液に浸漬するサイクルを一回又は複数回実施することにより前記不織布に前記ハイドロキシアパタイトを付着させることが好ましい。
【００１７】
［９］本発明の人工角膜の製造方法においては、前記水性高分子ゲルは、ポリビニルアルコール系の水性高分子ゲルであることが好ましい。
【００１８】
［１０］本発明の人工角膜の製造方法においては、前記ゲル配置工程では、凍結融解法により前記不織布に前記水性高分子ゲルを配置することが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の人工角膜によれば、不織布を備えるため、細胞とのなじみやすさ及び酸素や栄養素の通過性に加えて強度を確保することが可能となる。また、本発明の人工角膜によれば、不織布に貫通孔が形成され、当該貫通孔を覆うように水性高分子ゲルが配置されているため、人工角膜を通過する光が不織布による影響を受けないようにすることが可能となる。このため、本発明の人工角膜は、異常の発生を抑制することが可能であり、かつ、十分な強度及び光学特性を得ることが可能な人工角膜となる。
【００２０】
本発明の人工角膜の製造方法によれば、貫通孔が形成された不織布を準備する不織布準備工程と、貫通孔を覆うように水性高分子ゲルを配置するゲル配置工程とを含むため、異常の発生を抑制することが可能であり、かつ、十分な強度及び光学特性を得ることが可能な人工角膜を製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】実施形態に係る人工角膜１を説明するために示す図である。
【図２】実施形態に係る人工角膜の製造方法のフローチャートである。
【図３】実施例に係る人工角膜Ｓ０〜Ｓ３における不織布及びナノスケールのハイドロキシアパタイト（ｎＨＡ）の全反射測定法によるフーリエ変換赤外分光スペクトル（ＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトル）を示すグラフである。
【図４】実施例に係る人工角膜Ｓ０〜Ｓ３における不織布、グラファイト（ＧＲ）及びｎＨＡのＸ線回折（ＸＲＤ）パターンを示すグラフである。
【図５】実施例に係る人工角膜Ｓ０〜Ｓ３における不織布及びｎＨＡの高分解能ＸＲＤパターンを示すグラフである。
【図６】実施例に係る人工角膜Ｓ０〜Ｓ３における不織布の電界放出型走査型電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）画像である。
【図７】実施例に係る人工角膜Ｓ０〜Ｓ３における不織布を構成する繊維の繊維径の分布を示すグラフである。
【図８】実施例に係る人工角膜Ｓ０〜Ｓ３及びｎＨＡの高分解能ＦＥ−ＳＥＭ画像である。
【図９】実施例に係る人工角膜Ｓ０〜Ｓ３の不織布及びポリビニルアルコール（ＰＶＡ）ハイドロゲルの含水率を示す棒グラフである。
【図１０】実施例に係る人工角膜Ｓ０〜Ｓ３の不織布及びＰＶＡハイドロゲルの水接触角に関する実験の様子を示す図である。
【図１１】図１１は、実施例に係る人工角膜Ｓ０〜Ｓ３の不織布及びＰＶＡハイドロゲルのひずみ−応力曲線を示すグラフである。
【図１２】実施例における細胞毒性試験の結果を示す顕微鏡写真である。
【図１３】実施例における細胞毒性試験の結果を示す顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明に係る人工角膜及び人工角膜の製造方法について実施形態に基づいて説明する。なお、実施形態の中で説明されている諸要素及びその組み合わせの全てが本発明の解決手段に必須であるとは限らない。
【００２３】
１．実施形態に係る人工角膜１
図１は、実施形態に係る人工角膜１を説明するために示す図である。図１（ａ）は人工角膜１の平面図であり、図１（ｂ）は図１（ａ）のＡ−Ａ断面図である。
まず、実施形態１に係る人工角膜１について説明する。
【００２４】
実施形態に係る人工角膜１は、図１に示すように、貫通孔１２が形成された不織布１０と、貫通孔１２を覆うように配置されている水性高分子ゲル２０とを備える。
人工角膜１の大きさは、使用目的（移植対象）に応じて適宜設定することができる。一般的には、移植先の角膜の厚さ（ヒト（成人）であれば、上記したように厚さ０．５ｍｍ〜０．７ｍｍ程度）に合わせることが好ましい。
【００２５】
不織布１０は平面視したときに円形の外形形状を有し、当該円形の中心部に貫通孔１２が形成されている。
不織布１０は、水性高分子ゲル２０の足場材であるということもできる。
【００２６】
不織布１０を構成する繊維は、本発明の効果を損ねない限り、任意の繊維径を有するものを用いることができ、任意の材料からなるものを用いることができる。
不織布１０を構成する繊維は、ナノファイバーであることが好ましい。
ナノファイバーとは、ナノオーダーの繊維径（例えば、３０００ｎｍ以下の繊維径。好ましくは、１０００ｎｍ以下の平均繊維径。）を有する繊維である。ナノファイバーは、マイクロオーダー以上の繊維径を有する通常の繊維とは異なる性質（例えば、極めて大きい比表面積）を有し、様々な分野で活用されている。この場合、ナノファイバーの繊維径は５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲内にあることが好ましい。
【００２７】
また、不織布１０を構成する繊維は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）系ナノファイバーであることが一層好ましい。
ポリビニルアルコール系ナノファイバーとは、主な成分（重量比で３０％以上の成分）としてポリビニルアルコールを原料とする成分を含有するナノファイバーのことをいう。
【００２８】
なお、ポリビニルアルコールは水溶性のポリマーであるため、不織布の原料としてポリビニルアルコール系のポリマーを用いる場合には、基本的には不溶化処理（例えば、グルタルアルデヒド（ＧＡ）、熱、ＵＶ等を用いた架橋処理）を行う必要がある。ポリビニルアルコールに関する不溶化処理の必要性や具体的方法については周知の事項であるため、以下の記載においては、不溶化処理については特に記載しないこともある。
【００２９】
実施形態においては、不織布１０は、ポリビニルアルコール−ヒドロキシエチルセルロース−グラファイト（ＰＶＡ−ＨＥＣ−ＧＲ）複合ナノファイバーからなる。
ポリビニルアルコール−ヒドロキシエチルセルロース−グラファイト複合ナノファイバーとは、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）とヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）とが混合された原料からなるナノファイバーの繊維間にグラファイト（ＧＲ）が分散されたもののことをいう。なお、グラファイトはナノスケールのものである必要はなく、例えば、最長部の長さが２０μｍ以下のものを用いることができる。
【００３０】
もちろん、本発明には、上記したものの他に、キトサン、ゼラチン‐ＰＶＡ、セルロース、ポリ‐Ｌ‐乳酸といった生体適合性が高い物質を原料とするナノファイバーからなる不織布を用いることもできる。
【００３１】
実施形態においては、不織布１０にハイドロキシアパタイトが付着している。ハイドロキシアパタイトの付着は、物理的なものであってもよいし、化学的なものであってもよい。
【００３２】
水性高分子ゲル２０は、貫通孔１２を覆うように配置されている。水性高分子ゲル２０は、「貫通孔１２を埋めるように配置されている」と表現することもできるし、「貫通孔１２内に配置されている」と表現することもできる。
【００３３】
水性高分子ゲル２０は、ポリビニルアルコール系の水性高分子ゲルである。
水性高分子ゲルとは、ポリマーによる三次元的な網目状構造内に水を保持しているゲル（ハイドロゲル）のことをいう。ポリビニルアルコール系の水性高分子ゲルとは、ポリビニルアルコールを原料とする成分を主な成分として有する水性高分子ゲルのことをいう。
ポリビニルアルコール系の水性高分子ゲルとしては、ポリマー全体が完全加水分解のポリビニルアルコールからなるポリビニルアルコールハイドロゲル（ＰＶＡハイドロゲル）を好適に用いることができる。
もちろん、本発明には、水性高分子ゲルとして、ポリヒドロキシエチルメタアクリレート、ポリビニルピロリドン、シリコーンハイドロゲル等を用いることもできる。
【００３４】
２．実施形態に係る人工角膜の製造方法
図２は、実施形態に係る人工角膜の製造方法のフローチャートである。
次に、実施形態に係る人工角膜の製造方法について説明する。
【００３５】
実施形態に係る人工角膜の製造方法は、図２に示すように、不織布準備工程Ｓ１０と、ゲル配置工程Ｓ２０とを含む。
【００３６】
不織布準備工程Ｓ１０は、貫通孔１２が形成された不織布１０を準備する工程である。不織布準備工程Ｓ１０は、エレクトロスピニング工程Ｓ１２及びハイドロキシアパタイト付着工程Ｓ１４とを含む。
【００３７】
不織布準備工程Ｓ１０で準備する不織布１０を構成する繊維は、ナノファイバーであることが好ましく、ポリビニルアルコール系ナノファイバーであることが一層好ましい。
実施形態においては、不織布１０は、ポリビニルアルコール−ヒドロキシエチルセルロース−グラファイト（ＰＶＡ−ＨＥＣ−ＧＲ）複合ナノファイバーからなる。
当該不織布１０は、エレクトロスピニング工程Ｓ１２により準備することができる。
【００３８】
エレクトロスピニング工程Ｓ１２は、エレクトロスピニング（電界紡糸）法によりナノファイバーを形成し、当該ナノファイバーで構成された不織布１０を得る工程である。
エレクトロスピニング工程Ｓ１２では、ポリビニルアルコール及びヒドロキシエチルセルロースの混合溶液にグラファイトを分散させた紡糸溶液を原料としてエレクトロスピニング法により不織布１０（複合ナノファイバー）を形成する。エレクトロスピニング法による不織布（複合ナノファイバー）の製造条件は後述する実施例で例示するが、製造条件はこれに限定されるものではなく、適切な範囲で変更することができる。
【００３９】
不織布準備工程Ｓ１０で準備する不織布１０には、ハイドロキシアパタイトが付着している。当該不織布１０は、ハイドロキシアパタイト付着工程Ｓ１４により準備することができる。
【００４０】
ハイドロキシアパタイト付着工程Ｓ１４は、不織布１０を塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）水溶液に浸漬し、その後、不織布１０をｐＨ１０以上に調整したリン酸水素二ナトリウム水溶液（Ｎａ２ＨＰＯ４）に浸漬するサイクルを一回又は複数回実施することにより不織布１０にハイドロキシアパタイトを付着させる工程である。
上記の方法では、ナノスケールのハイドロキシアパタイトを合成しつつ不織布１０に付着させていくことになる。この場合、不織布１０を構成する繊維におけるヒドロキシ基がカルシウムイオンと化学的に結合するため、ハイドロキシアパタイトの付着力を高くすることが可能となる。
不織布にハイドロキシアパタイトを付着させる工程は上記に限定されるものではなく、他の工程（方法）により不織布にハイドロキシアパタイトを付着させてもよい。
【００４１】
なお、不織布準備工程Ｓ１０で準備する不織布１０には貫通孔１２が形成されているが、貫通孔１２の形成はゲル配置工程Ｓ２０に入る前のどこかで行えばよい。貫通孔１２は、例えば、切削や打ち抜きにより形成することができる。また、不織布１０を最初から貫通孔１２を含む形で形成してもよい。これは、不織布１０の外周形状についても同様である。
【００４２】
ゲル配置工程Ｓ２０は、貫通孔１２を覆うように水性高分子ゲル２０を配置する工程である。
水性高分子ゲル２０は、ポリビニルアルコール系の水性高分子ゲルである。ポリビニルアルコール系の水性高分子ゲルとしては、ポリビニルアルコールハイドロゲルを好適に用いることができる。
ゲル配置工程Ｓ２０では、凍結融解法により不織布１０に水性高分子ゲル２０を配置（固定）する。凍結融解法は広く知られている技術であるため、詳細な説明は省略する。
なお、不織布１０に水性高分子ゲル２０を配置する工程は上記に限定されるものではなく、他の工程（方法）により不織布１０に水性高分子ゲル２０を配置（固定）してもよい。
【００４３】
３．実施形態に係る人工角膜１及び人工角膜の製造方法の効果
以下、実施形態に係る人工角膜１及び人工角膜の製造方法の効果について説明する。
【００４４】
実施形態に係る人工角膜１によれば、不織布１０を備えるため、細胞とのなじみやすさ及び酸素や栄養素の通過性に加えて強度を確保することが可能となる。また、実施形態に係る人工角膜１によれば、不織布１０に貫通孔が形成され、当該貫通孔１２を覆うように水性高分子ゲル２０が配置されているため、人工角膜１を通過する光が不織布１０による影響を受けないようにすることが可能となる。このため、実施形態１に係る人工角膜１は、異常の発生を抑制することが可能であり、かつ、十分な強度及び光学特性を得ることが可能な人工角膜となる。
【００４５】
実施形態に係る人工角膜の製造方法によれば、貫通孔１２が形成された不織布１０を準備する不織布準備工程Ｓ１０と、貫通孔１２を覆うように水性高分子ゲル２０を配置するゲル配置工程Ｓ２０とを含むため、異常の発生を抑制することが可能であり、かつ、十分な強度及び光学特性を得ることが可能な人工角膜１を製造することが可能となる。
【００４６】
また、実施形態に係る人工角膜の製造方法によれば、不織布１０を構成する繊維は、ナノファイバーであるため、不織布１０の強度及び比表面積を十分に大きくすることが可能となり、製造する人工角膜１の患部への定着性を十分に高くすることが可能となる。
【００４７】
また、実施形態に係る人工角膜の製造方法によれば、不織布１０を構成する繊維は、ポリビニルアルコール系ナノファイバーであるため、生体適合性が高くかつナノファイバー化に適した材料であるポリビニルアルコールを主な材料として用いることから、製造する人工角膜１の不織布１０の患部への定着性を一層高くすることが可能となる。
【００４８】
また、実施形態に係る人工角膜の製造方法によれば、不織布１０は、ポリビニルアルコール−ヒドロキシエチルセルロース−グラファイト複合ナノファイバーからなるため、製造する人工角膜において、ヒドロキシエチルセルロースを加えることでナノファイバーの引っ張り強さを高めて不織布の強度を一層向上させることが可能となり、かつ、グラファイトにより人工角膜に定着した生組織（細胞）の活性を高くする（血管新生等を促進する）ことが可能となる。
【００４９】
また、実施形態に係る人工角膜の製造方法によれば、不織布１０は、ポリビニルアルコール及びヒドロキシエチルセルロースの混合溶液にグラファイトを分散させた紡糸溶液を原料としてエレクトロスピニング法により形成されたものであるため、繊維径のばらつきやグラファイトの凝集が十分に少ない不織布１０を形成することが可能となる。
【００５０】
また、実施形態に係る人工角膜の製造方法によれば、不織布１０にハイドロキシアパタイトが付着しているため、不織布１０上に定着した生組織（細胞）の活性を高くして人工角膜と眼球との一体化を促進することが可能となる。
【００５１】
また、実施形態に係る人工角膜の製造方法によれば、不織布準備工程Ｓ１０では、不織布１０を塩化カルシウム水溶液に浸漬し、その後、不織布１０をｐＨ１０以上に調整したリン酸水素二ナトリウム水溶液に浸漬するサイクルを一回又は複数回実施することにより不織布１０にハイドロキシアパタイトを付着させるため、不織布１０とハイドロキシアパタイトとの間の付着力を高くすることが可能となり、かつ、サイクルの回数を変更することでハイドロキシアパタイトの量を容易に調節することが可能となる。
【００５２】
また、実施形態に係る人工角膜の製造方法によれば、水性高分子ゲル２０は、ポリビニルアルコール系の水性高分子ゲルであるため、良好な光学特性を有するポリビニルアルコール系の水性高分子ゲルを用いることで、製造する人工角膜１において一層良好な光学特性を得ることが可能となる。
【００５３】
また、実施形態に係る人工角膜の製造方法によれば、ゲル配置工程Ｓ２０では、凍結融解法により不織布１０に水性高分子ゲル２０を配置するため、簡便な方法で不織布１０と水性高分子ゲル２０とを固定することが可能となる。
【００５４】
［実施例］
実施例においては、本発明の人工角膜を本発明の人工角膜の製造方法により実際に製造し、観察や実験を行った。
【００５５】
１．実施例で用いた試薬・装置等
まず、実施例で用いた試薬や装置等について説明する。
【００５６】
実施例に係る人工角膜の製造方法では、分析用グレードの試薬を用いた。水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ。純度９７．０％）、アセトン、エタノール（９９．５）、１０倍リン酸干渉食塩水（ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ。ｐＨ７．４）及び濃塩酸（ＨＣｌ。３５．０〜３７．０％）は、和光純薬工業株式会社を通じて購入したものを用いた。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グラファイト粉末（ＧＲ。＜２０μｍ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ。Ｍｗ：８５，０００−１２４，０００、加水分解度：８７〜８９％及び完全けん化）、２−ヒドロキシメチルセルロース（ＨＥＣ。平均Ｍｗ：９０，０００）及びリン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）は、シグマアルドリッチを通じて購入したものを用いた。グルタルアルデヒド（ＧＡ。５０％水溶液）及び塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）は、米国のＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社を通じて購入したものを用いた。
【００５７】
人工角膜に関する細胞毒性試験においても、分析用グレードの試薬等を用いた。ダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ−１２混合培地（（ＤＭＥＭ）／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２  ｍｅｄｉｕｍ）は、シグマアルドリッチを通じて購入したものを用いた。仔ウシ血清（ＮＢＣＳ）、インスリン−トランスフェリン−セレニウム混合試薬（ＩＴＳ）及び上皮成長因子（ＥＧＦ。ヒト組換え体。）は、サーモフィッシャー・サイエンティフィックのＧｉｂｃｏブランドのものを購入して用いた。塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）は、Ａｊａｘ  Ｆｉｎｅｃｈｅｍ社を通じて購入したものを用いた。
２４ウェル細胞培養プレートは、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社のものを使用した。
ヒト角膜上皮（ＨＣＥ）細胞は、Ｓｃｈｅｐｅｎｓ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＩｌｅｎｅ  Ｇｉｐｓｏｎ博士から譲渡されたものを用いた。
【００５８】
電界紡糸における電源装置としては、松定プレシジョン株式会社のＨａｒ−１００＊１２を用いた。
ＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルの測定には、英国のＳｍｉｔｈｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ社のＤｕｒａＳａｍｐｌＩＲ  ＩＩを用いた。測定は室温で行った。
Ｘ線回折パターン（ＸＲＤパターン）の測定には、株式会社リガクのＲｏｔａｆｌｅｘ  ＲＴＰ３００を用いた。測定には、Ｃｕ  ｋα線を用いた。管電圧及び管電流は、それぞれ５０ｋＶ及び２００ｍＡとした。
【００５９】
電界放出型走査型電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）画像の取得には、日立製作所のＳ−５０００を用いた。サンプルを７０℃で乾燥させて金でコーティングしてから、サンプルの画像取得を行った。
繊維径を算出するための画像分析ソフトとしては、Ｉｍａｇｅ  Ｊを用いた。
水接触角（ＷＣＡ）の測定には、協和界面科学株式会社のＣＡ−Ｄ型水接触角計を用いた。
【００６０】
不織布等の物理的特性の測定には、株式会社エー・アンド・デイのテンシロン万能材料試験機  ＲＴＣ１２５０Ａを用いた。クロスヘッド速度は１ｍｍ／ｍｉｎとした。測定はＡＳＴＭ  Ｄ６３８  プラスチック引張試験方法に沿って行い、サンプルとしてダンベル型に整形したものを用いた。温度は室温とした。サンプルのゲージ長は１００ｍｍとし、１倍リン酸干渉食塩水に１５分浸漬してから試験を行った。
細胞の様子は、オリンパス株式会社の倒立顕微鏡を用いて観察した。
【００６１】
２．実施例に係る人工角膜の製造方法
次に、実施例に係る人工角膜の製造方法について説明する。
実施例に係る人工角膜の製造方法は、基本的には実施形態に係る人工角膜の製造方法と同様であり、不織布準備工程とゲル配置工程とを含む。
【００６２】
（１）不織布準備工程
（１−１）エレクトロスピニング工程
まず、加水分解度が８７％〜８９％のポリビニルアルコール（以下、ＰＶＡと記載する。）を脱イオン水に加え、８０℃で４時間攪拌し、１１ｗｔ％ＰＶＡ水溶液を作製した。これとは別に、ヒドロキシエチルセルロース（以下、ＨＥＣと記載する）を脱イオン水に加え、５０℃で６時間攪拌し、５％（ｖ／ｖ）ＨＥＣ水溶液も作製した。
【００６３】
その後、体積比がグラファイト（以下、ＧＲと記載する。）：ＨＥＣ水溶液＝０．１：１０となるようにＧＲをＨＥＣ水溶液に加えて２時間攪拌し、ＨＥＣ／ＧＲ水溶液を作製した。次に、体積比がＨＥＣ／ＧＲ水溶液：ＰＶＡ水溶液＝１：９となるようにＨＥＣ／ＧＲ水溶液をＰＶＡ水溶液と混合し、室温で１時間攪拌して紡糸溶液を作製した。作製した紡糸溶液に対して超音波処理を行い、気泡を除去した。
【００６４】
次に、電源装置と、キャピラリーチップを取り付けた２０ｍＬプラスチックシリンジと、電源装置の陽極とキャピラリーチップとを接続する銅線と、電源装置の陰極と接続された金属製のコレクターとを備えるエレクトロスピニング装置を準備し、エレクトロスピニングを行った。チップ−コレクター間の距離は１５ｃｍとし、印加電圧は１２ｋＶとした。エレクトロスピニング中においては、紡糸溶液の流量を１ｍＬ／ｈとした。
なお、上記したようなエレクトロスピニング装置やエレクトロスピニング装置を構成する構成要素は広く知られているものであるため、詳細な説明は省略する。
【００６５】
次に、エレクトロスピニングにより得た不織布を４ｃｍ２程度の大きさに切り出し、直径９０ｍｍのペトリ皿に置いた。グルタルアルデヒド（ＧＡ）２ｇ、エタノール２ｇ及び塩酸０．１ｇを５０ｍＬ丸底フラスコに準備し、アセトンを加えて５０ｍＬの不溶化用溶液を作製した。当該不溶化溶液に不織布を浸し、常温で６時間静置した。その後不織布を、３７℃の脱イオン水で洗浄した。洗浄はシェーカーインキュベーター中で行い、洗浄時間は２日とした。洗浄中は、１２時間ごとに脱イオン水を新しいものと交換した。
その後、不織布を、直径８ｍｍの円形形状となるように切断した。その後、不織布を３７℃で４８時間乾燥させた。
【００６６】
（１−２）ハイドロキシアパタイト付着工程
次に、不織布を、シェーカーインキュベーター中にセットした０．０５Ｍ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）水溶液２５ｍＬに入れ、３７℃で１２時間保温した。１２時間後、塩化カルシウム水溶液を０．０３Ｍリン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）水溶液２５ｍＬと交換し、２Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液でｐＨを１１に調整した。この状態で、３７℃で１２時間保温した。
実施例については、ナノサイズのハイドロキシアパタイト（以下、ｎＨＡと記載する。）を付着させる量による影響を観察するために、上記サイクルの繰り返し数を１回〜３回とした不織布を準備した。また、ハイドロキシアパタイト付着工程を行わなかった不織布も準備した。
その後、不織布を脱イオン水で１５分洗浄し、３７℃で乾燥させた。ゲル配置工程前に、不織布の中央に直径３ｍｍの貫通孔を形成した。
【００６７】
（２）ゲル配置工程
ＰＶＡ（完全加水分解）１５ｇを８０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）水溶液７５ｇに加え、８０℃で４時間攪拌することで水性高分子ゲルのもととなる１５ｗｔ％ＰＶＡ溶液を作製した。
次に、１５ｗｔ％ＰＶＡ溶液に不織布を浸漬し、凍結融解法により水性高分子ゲルを配置した。凍結融解法は、１５ｗｔ％ＰＶＡ溶液及び不織布を、−２０℃の環境に１２時間置く工程と、室温の環境に１２時間置く工程とを５回繰り返すことにより実施した。
その後、水性高分子ゲルを配置した不織布をシェーカーインキュベーター中にセットした水の中に入れ、１２時間ごとに水を取り替えながら３７℃で２日間洗浄し、ジメチルスルホキシドを除去した。
このようにして、実施例に係る人工角膜を製造した。
【００６８】
３．実施例に係る人工角膜の物性等
以下、実施例に係る人工角膜の物性等を観察及び測定した結果を説明する。
なお、以下の説明では、ｎＨＡが付着していない不織布を用いて製造した人工角膜を人工角膜Ｓ０、ｎＨＡを付着させるサイクルを１回実施した不織布を用いて製造した人工角膜を人工角膜Ｓ１、ｎＨＡを付着させるサイクルを２回実施した不織布を用いて製造した人工角膜を人工角膜Ｓ２、ｎＨＡを付着させるサイクルを３回実施した不織布を用いて製造した人工角膜を人工角膜Ｓ３とする。図面においても、Ｓ０〜Ｓ３の符号を用いる。
【００６９】
図３は、実施例に係る人工角膜Ｓ０〜Ｓ３における不織布及びｎＨＡのＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルを示すグラフである。図３のグラフの横軸は波長（単位：ｃｍ−１）を表し、縦軸は吸光度を表す。なお、各スペクトルは比較しやすいように縦に並べてあるため、縦軸の吸光度は各スペクトルの絶対的な吸光度を表すものではない。
図４は、実施例に係る人工角膜Ｓ０〜Ｓ３における不織布、ＧＲ及びｎＨＡのＸＲＤパターンを示すグラフである。図４のグラフの横軸は２θを表し、縦軸は強度（任意単位）を表す。
図５は、実施例に係る人工角膜Ｓ０〜Ｓ３における不織布及びｎＨＡの高分解能ＸＲＤパターンを示すグラフである。図５のグラフの横軸は２θを表し、縦軸は強度（任意単位）を表す。
【００７０】
図６は、実施例に係る人工角膜Ｓ０〜Ｓ３における不織布のＦＥ−ＳＥＭ画像である。図６（ａ）は人工角膜Ｓ０の不織布のＦＥ−ＳＥＭ画像であり、図６（ｂ）は人工角膜Ｓ１の不織布のＦＥ−ＳＥＭ画像であり、図６（ｃ）は人工角膜Ｓ２の不織布のＦＥ−ＳＥＭ画像であり、図６（ｄ）は人工角膜Ｓ３の不織布のＦＥ−ＳＥＭ画像である。
図７は、実施例に係る人工角膜Ｓ０〜Ｓ３における不織布を構成する繊維の繊維径の分布を示すグラフである。図７（ａ）は人工角膜Ｓ０の不織布の繊維径の分布を示すグラフであり、図７（ｂ）は人工角膜Ｓ１の不織布の繊維径の分布を示すグラフであり、図７（ｃ）は人工角膜Ｓ２の不織布の繊維径の分布を示すグラフであり、図７（ｄ）は人工角膜Ｓ３の不織布の繊維径の分布を示すグラフである。図７に示すグラフの縦軸は本数（単位：本）を表す。
図８は、実施例に係る人工角膜Ｓ０〜Ｓ３及びｎＨＡの高分解能ＦＥ−ＳＥＭ画像である。図８（ａ）は人工角膜Ｓ０の不織布のＦＥ−ＳＥＭ画像であり、図８（ｂ）は人工角膜Ｓ１の不織布のＦＥ−ＳＥＭ画像であり、図８（ｃ）は人工角膜Ｓ２の不織布のＦＥ−ＳＥＭ画像であり、図８（ｄ）は人工角膜Ｓ３の不織布のＦＥ−ＳＥＭ画像であり、図８（ｅ）はｎＨＡのＦＥ−ＳＥＭ画像であり、図８（ｆ）は人工角膜Ｓ０の貫通孔の辺縁部付近を示すＦＥ−ＳＥＭ画像である。
【００７１】
図９は、実施例に係る人工角膜Ｓ０〜Ｓ３の不織布及びＰＶＡハイドロゲルの含水率を示す棒グラフである。図９の棒グラフの縦軸は含水率（単位：％）を表す。
図１０は、実施例に係る人工角膜Ｓ０〜Ｓ３の不織布及びＰＶＡハイドロゲルの水接触角に関する実験の様子を示す図である。図１０（ａ）は水接触角の数値を示す棒グラフであり、図１０（ｂ）〜図１０（ｆ）は各サンプルの測定時の写真である。
図１１は、実施例に係る人工角膜Ｓ０〜Ｓ３の不織布及びＰＶＡハイドロゲルのひずみ−応力曲線を示すグラフである。図１１のグラフの横軸はひずみ（単位：％）を表し、縦軸は応力（単位：ＭＰａ）を表す。なお、図１１のグラフにおいては、人工角膜Ｓ０〜Ｓ３の不織布に関する測定結果がほぼ同じ傾向となり分離して示すことが困難であるため、人工角膜Ｓ０〜Ｓ３の不織布に関するグラフをまとめて「Ｓ０−Ｓ３」と表示している。
【００７２】
まず、実施例に係る人工角膜Ｓ０〜Ｓ３における不織布及びｎＨＡについて、ＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルを測定した（図３参照。）。
人工角膜Ｓ０〜Ｓ３における不織布においては、ＯＨやＣＨ２に関連する３３８２ｃｍ−１及び２９３１ｃｍ−１のバンド、ＣＯＯＨやＣ＝Ｃ結合に関連する１７２６ｃｍ−１及び１４２７ｃｍ−１のピーク、Ｃ−Ｏ結合に関連する１２４２ｃｍ−１及び１１１６ｃｍ−１のピーク等、基本的なピーク等が確認できた。
【００７３】
また、ｎＨＡについても、ＯＨの対称伸縮に起因する３３８２ｃｍ−１のバンド、炭酸アパタイトに関連する１４２７ｃｍ−１のピーク、Ｐ−Ｏ結合の曲げ振動及び伸縮振動に起因する１０２０ｃｍ−１のバンド、Ｐ−Ｏ結合の対称伸縮に起因する１０２０ｃｍ−１のバンド、リン酸イオン（ＰＯ４３−）の対称伸縮に起因する９６２ｃｍ−１のピーク、リン酸イオン（ＰＯ４３−）の非対称伸縮に起因する８７３ｃｍ−１のバンド等、基本的なピーク等が確認できた。
【００７４】
さらに、ｎＨＡを付着させるサイクルを多く行ったものほど、ｎＨＡの増加によりＰ−Ｏ結合の対称伸縮に起因する１０２０ｃｍ−１のピークが大きくなり、カルシウムイオンの影響によりＯＨに関連する３３８２ｃｍ−１のバンドが小さくなる等の傾向が見られた。
つまり、ｎＨＡの付着が成功していることや、ｎＨＡを付着させるサイクルの回数によりｎＨＡの付着量を制御できることが確認できた。
【００７５】
次に、人工角膜Ｓ０〜Ｓ３における不織布、ＧＲ及びｎＨＡについて、ＸＲＤパターンを測定した（図４参照。）。また、人工角膜Ｓ０〜Ｓ３における不織布及びｎＨＡについて、３５°〜５５°の範囲内で高分解能ＸＲＤパターンを測定した（図５参照。）。
その結果、ＧＲ及びｎＨＡに特徴的なピーク形状と人工角膜Ｓ０〜Ｓ３のピーク形状との比較（特に、ｎＨＡに関連する特徴的なピークである４７°、４９．７°及び５３．４°のピークの強度。図５参照。）から、ｎＨＡを付着させるサイクルの回数によりｎＨＡの付着量を制御できることが確認できた。
【００７６】
次に、人工角膜Ｓ０〜Ｓ３における不織布のＦＥ−ＳＥＭ画像を取得し、観察を行った（図６及び図７参照。）。
全体的には、スムーズな形状のナノファイバーが製造できていることが確認できた。また、ナノファイバーの繊維径は１５３ｎｍ〜５４３ｎｍであり、これはｎＨＡを付着させるサイクルの回数には依存していないことが確認できた。ナノファイバーのうち７０％は繊維径が３００ｎｍ〜４００ｎｍの範囲内にあり、全体としての平均繊維径は３５９ｎｍであった。ＦＥ−ＳＥＭ画像からはＧＲの凝集は確認できなかった。また、特に人工角膜Ｓ３においては、他のサンプルと比較してｎＨＡ（針状の物質が凝集しているもの）が増加していることが確認できた。
【００７７】
次に、人工角膜Ｓ０〜Ｓ３及びｎＨＡの高分解能ＦＥ−ＳＥＭ画像を取得し、観察を行った（図８参照。）。その結果、人工角膜Ｓ１では針状の構造のｎＨＡが凝集しはじめていることが観察でき（図８（ｂ）参照。）、人工角膜Ｓ２及び人工角膜Ｓ３ではｎＨＡがさらに増えていることが確認できた（図８（ｃ）及び図８（ｄ）参照。）。また、ｎＨＡの高分解能ＦＥ−ＳＥＭ画像からは、針状のｎＨＡが凝集して平均直径５２ｎｍの凝集体を形成していることが確認でき、これは人工角膜Ｓ１〜Ｓ３でも同様であることが確認できた。
また、人工角膜の貫通孔の辺縁部付近にはギャップ等が見られず、人工角膜においては不織布と水性高分子ゲル（ＰＶＡハイドロゲル）とがしっかり固定できていることが確認できた（図８（ｆ）参照。）。なお、図８（ｆ）に示したのは人工角膜Ｓ０に関するＦＥ−ＳＥＭ画像であるが、他の人工角膜Ｓ１〜Ｓ３においても同様の結果が確認できた。人工角膜の貫通孔の辺縁部付近においては、水性高分子ゲルが不織布内部に数μｍ〜数十μｍ程度（実施例においては２０μｍ程度）染み込むように入り込んでいるため、不織布‐辺縁部‐水性高分子ゲルが滑らかに連続するようになると考えられる。
【００７８】
次に、実施例に係る人工角膜Ｓ０〜Ｓ３の不織布及びＰＶＡハイドロゲルの含水率を測定した（図９参照。）。含水率は、水を十分に吸収させた状態のサンプルの重量と、よく乾燥させた状態のサンプルの重量とを測定することにより算出した。ＰＶＡハイドロゲルの含水率は７９．５％であり、これはヒトの生体角膜の含水率の数値（約７８％）と近い数値となっていることが確認できた。また、人工角膜Ｓ０〜Ｓ３不織布の含水率は８３．８％〜８８．３％の範囲にあることが確認できた。不織布においては、ｎＨＡの量が増えると水分を吸収できる容積がわずかに減り、吸水率が減少する傾向があることが確認できた。
【００７９】
次に、実施例に係る人工角膜Ｓ０〜Ｓ３の不織布及びＰＶＡハイドロゲルの水接触角を測定した（図１０参照。）。その結果、人工角膜Ｓ０〜Ｓ３の不織布の方がＰＶＡハイドロゲルよりも水接触角が大きいという結果が得られた。
【００８０】
次に、実施例に係る人工角膜Ｓ０〜Ｓ３の不織布及びＰＶＡハイドロゲルのひずみ−応力曲線を測定して物性を調べた（図１１参照。）。
その結果、予期した通り、人工角膜Ｓ０〜Ｓ３の不織布は、ＰＶＡハイドロゲルと比較して、弾性が低く、引っ張り強さが大きいことが確認できた。具体的には、ＰＶＡハイドロゲルの引っ張り強さは２．２９ＭＰａであったのに対して、人工角膜Ｓ０の引っ張り強さは６．３２ＭＰａであり、人工角膜Ｓ１の引っ張り強さは７．４８ＭＰａであり、人工角膜Ｓ２の引っ張り強さは７．２７ＭＰａであり、人工角膜Ｓ３の引っ張り強さは８．６９ＭＰａであった。なお、上記結果を見ると、ｎＨＡの量が増えると不織布の引っ張り強さも大きくなる傾向があるように思われる。
【００８１】
４．角膜細胞に対する細胞毒性試験
図１２及び図１３は、実施例における細胞毒性試験の結果を示す顕微鏡写真である。図１２（ａ）はネガティブコントロールについての結果を示す写真であり、図１２（ｂ）はポジティブコントロールについての結果を示す写真であり、図１２（ｃ）はＰＶＡハイドロゲルについての結果を示す写真である。また、図１３（ａ）は人工角膜Ｓ０の不織布についての結果を示す写真であり、図１３（ｂ）は人工角膜Ｓ１の不織布についての結果を示す写真であり、図１３（ｃ）は人工角膜Ｓ２の不織布についての結果を示す写真であり、図１３（ｄ）は人工角膜Ｓ３の不織布についての結果を示す写真である。
【００８２】
次に、実施例に係る人工角膜Ｓ０〜Ｓ３の不織布及びＰＶＡハイドロゲルのヒト角膜上皮（ＨＣＥ）細胞に対する細胞毒性に関する試験を行った。
ヒト角膜上皮細胞を培養するための培地としては、１０％仔ウシ血清（ＮＢＣＳ）、１．０５ｍＭ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、０．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、２ｍｇ／ｍＬ上皮成長因子（ＥＧＦ。ヒト組換え体。）及び１％インスリン−トランスフェリン−セレニウム混合試薬（ＩＴＳ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ−１２混合培地（（ＤＭＥＭ）／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２  ｍｅｄｉｕｍ）を用いた。
ＨＣＥ細胞の培養には２４ウェル細胞培養プレートを用い、８０％コンフルエントとなるまで行った。
【００８３】
その後、細胞層上にサンプルを直接配置し、新鮮培地で２４時間培養を行った。培養後、トリパンブルーで死んだ細胞を染色し、顕微鏡で観察を行った。細胞毒性は、ＩＳＯ１０９９３ガイドラインに沿って行った。
なお、ネガティブコントロールのサンプルとしては、Ｓｉｌａｓｔｉｃ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｇｒａｄｅ  ｔｕｂｉｎｇ（シリコーンエラストマー製のチューブ、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ社製。）を用いた。また、ポジティブコントロールのサンプルとしては、無菌手術用ラテックス手袋（オーストラリアのＡｎｓｅｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ社製）を用いた。
【００８４】
その結果、ポジティブコントロールでは細胞が全滅したのに対して、ネガティブコントロールではわずかな細胞死しか発生しなかった。当該細胞死も、サンプルを配置したときの物理的損傷に起因するものであると考えられる。実施例に係る人工角膜Ｓ０〜Ｓ３の不織布及びＰＶＡハイドロゲルについては、細胞死の割合はネガティブコントロールと近い結果となったことから、これらについて、ヒト角膜上皮細胞に対する細胞毒性はないことが確認できた。
【００８５】
５．結論
以上の試験例により、本発明の人工角膜の製造方法により本発明の人工角膜が製造可能であることが確認できた。
【００８６】
以上、本発明を上記の実施形態及び実施例に基づいて説明したが、本発明は上記の実施形態及び実施例に限定されるものではない。その趣旨を逸脱しない範囲において種々の様態において実施することが可能である。
例えば、上記実施形態及び各実験例において記載した構成等は例示又は具体例であり、本発明の効果を損なわない範囲において変更することが可能である。
【符号の説明】
【００８７】
１…人工角膜、１０…不織布、１２…貫通孔、２０…水性高分子ゲル
【図１】
2019170618.tif 000003
【図２】
2019170618.tif 000004
【図３】
2019170618.tif 000005
【図４】
2019170618.tif 000006
【図５】
2019170618.tif 000007
【図６】
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【図７】
2019170618.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2019170618.tif 000013
【図１２】
2019170618.tif 000014
【図１３】
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