(57)【要約】      （修正有）【課題】マイクロRNAの1以上の標的遺伝子の発現をモジュレートするための手段の提供。【解決手段】マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれるヌクレオチド配列によりコードされるマイクロペプチド及び遺伝子発現をモジュレートするためのその使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
- a) マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれる12〜303ヌクレオチド長のオープンリーディングフレームを検出する工程と、
- b)・前記オープンリーディングフレームのものと同一のヌクレオチド配列又はその縮重配列によってコードされ、前記マイクロRNAの一次転写産物の転写とは独立して当該細胞中に存在するペプチドの存在下における、前記マイクロRNAを発現する特定の真核細胞における前記マイクロRNAの蓄積と、
・前記ペプチドの非存在下における、前記マイクロRNAを発現する前記特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞における前記マイクロRNAの蓄積と、を比較する工程とを含み、
前記ペプチド非存在下における前記マイクロRNAの蓄積からの、前記ペプチド存在下における前記マイクロRNAの蓄積のモジュレーションが、前記オープンリーディングフレームによりコードされるマイクロペプチドの存在を示す、マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれるヌクレオチド配列によりコードされるマイクロペプチド(miPEP)を検出及び同定する方法によって得られたヌクレオチド配列によってコードされるmiPEP。
【請求項２】
マイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列中に含まれる12〜303ヌクレオチドのオープンリーディングフレームによってコードされる３〜100アミノ酸、好ましくは４〜40アミノ酸のmiPEPであって、
前記miPEPは、真核細胞における前記マイクロRNAの蓄積をモジュレートすることができ、
前記ヌクレオチド配列は、前記マイクロRNAの一次転写産物の5'部分又は3'部分、好ましくは5'部分に含まれ、
前記miPEPによるマイクロRNAのモジュレーションは、miPEPの存在下における細胞と非存在下における細胞とのマイクロRNA量の変化を観察することによって証明される、miPEP。
【請求項３】
前記miPEPが、
-  配列番号１〜配列番号104及び配列番号355、
-  配列番号375〜配列番号386、又は
-  配列番号424
からなるペプチドの群から選択される請求項１又は２に記載のmiPEP。
【請求項４】
特に
-  配列番号105〜配列番号208及び配列番号356、
-  配列番号387〜配列番号399、又は
-  配列番号425
からなる核酸の群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のmiPEPをコードする核酸分子。
【請求項５】
特定の真核細胞における遺伝子の発現をモジュレートするための、少なくとも：
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載のmiPEP、
- 前記miPEPをコードする核酸、又は
- 前記核酸を含むベクター
の使用であって、
前記特定の真核細胞は、その一次転写産物が前記少なくとも1つのmiPEPをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含み、その蓄積が前記少なくとも1つのmiPEPによってモジュレートされるマイクロRNAを発現することができ、
前記遺伝子の発現は、前記マイクロRNAによって調節され、
前記miPEPは、特に：
- 配列番号１〜配列番号104及び配列番号355、
- 配列番号375〜配列番号386、又は
- 配列番号424、
特に：
配列番号59、配列番号24、配列番号43、配列番号76、配列番号77、配列番号14、配列番号63及び配列番号424
からなるペプチドの群から選択され、
前記核酸は、特に：
- 配列番号105〜配列番号208及び配列番号356、
- 配列番号387〜配列番号399、又は
- 配列番号425、
特に：
配列番号163、配列番号128、配列番号147、配列番号180、配列番号181、配列番号118、配列番号425及び配列番号167
からなる核酸の群から選択され、
前記マイクロRNAが、特に：
- 配列番号282〜配列番号354及び配列番号358、
- 配列番号412〜配列番号423、又は
- 配列番号427、
特に：
配列番号319、配列番号297、配列番号305、配列番号331、配列番号291、配列番号322及び配列番号427
からなる核酸の群から選択される、使用。
【請求項６】
ヒト又は動物用薬剤として用いるための、少なくとも：
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載のmiPEP、
- 前記miPEPをコードする核酸、又は
- 前記核酸を含むベクター
を含む組成物。
【請求項７】
真核細胞におけるmiPEPの蓄積工程を行うことを含み、
前記miPEPは：
- ３〜100アミノ酸、好ましくは４〜20アミノ酸のサイズ、及び
- 前記遺伝子の発現を調節するマイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列によってコードされるものと同一のペプチド配列を有し、
- 前記マイクロRNA蓄積をモジュレートすることができ、
前記真核細胞における前記miPEPの蓄積は、前記miPEPの蓄積がない前記遺伝子の発現と比較して、前記遺伝子の発現のモジュレーションを誘導し、
当該方法は、ヒトの身体又は動物の身体の外科的処置又は治療的処置のためにも、人間の遺伝的同一性の改変のためにも用いられない、真核植物細胞又は真核動物細胞、特にヒト細胞においてマイクロRNAにより調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法。
【請求項８】
植物の成長及び/又は発達を促進するための、
特に植物の生理学的パラメータ、特にバイオマス、葉の表面積、開花、果実のサイズ、植物種子の産生及び/又は選択をモジュレートするための、
特に植物の単為結実若しくは雌雄同体を制御するための、又は
特に植物種子の生理学的パラメータ、特に発芽、根系の根張り及び水分ストレス耐性を改変するための、又は
-植物病害の予防又は治療のための、
特に感染性疾患への耐性を促進するための
植物用薬剤としての、少なくとも：
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載のmiPEP、
- 前記miPEPをコードする核酸、又は
- 前記核酸を含むベクター
を含む組成物の使用。
【請求項９】
植物を根絶するか、又はその成長を遅らせるための除草剤としての、少なくとも：
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載のmiPEP、
- 前記miPEPをコードする核酸、又は
- 前記核酸を含むベクター
を含む組成物の使用。
【請求項１０】
特に植物又は当該植物に接触している支持体に適用することによって、植物に有害であるか又はそのように分類されがちな生物を根絶するための害虫駆除剤、特に昆虫綱動物駆除剤、クモ綱動物駆除剤、軟体動物門動物駆除剤又はネズミ目動物駆除剤としての、少なくとも：
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載のmiPEP、
- 前記miPEPをコードする核酸、又は
- 前記核酸を含むベクター
を含む組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロペプチド（マイクロRNAによりコードされるペプチド又は「miPEP」）及び遺伝子発現をモジュレートするためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロRNA(miRNA)は、標的mRNAを分解することによって、又はその翻訳を阻害することによって、転写後レベルで標的遺伝子の発現を制御する、成熟後に約21ヌクレオチド長の小さなノンコーディングRNAである。miRNAは、植物及び動物において生じる。
標的遺伝子は、多くの場合、発達過程において重要な遺伝子である。例えば、それらは、転写因子又はプロテアソームタンパク質をコードする。
【０００３】
miRNAの発現調節は殆ど理解されていないが、殆どのコーディング遺伝子と同様、調節にはRNAポリメラーゼIIが関与することが特に知られている：この酵素は「pri-miRNA」と呼ばれる一次転写産物を産生し、その後、これは特にDicer型酵素を含むタンパク質複合体によって成熟される。この成熟は、まず、miRNA及びその相補配列のmiRNA*を含むステムループ二次構造を有する「pre-miRNA」と呼ばれるmiRNA前駆体の形成をもたらす。次に、前駆体が成熟してmiRNA及びmiRNA*を含むより短い二本鎖RNAの形成をもたらす。その後、miRNAは、RISC複合体に引き渡され、これが標的遺伝子のmRNAを切断するか、又はその翻訳を阻害する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
更に、マイクロRNAの一次転写産物におけるイントロンの存在が、成熟マイクロRNAの発現を増大させることが示されている（Schwabら, EMBO Rep., 14(7): 615-21, 2013）。しかしながら、実験が困難なために、マイクロRNAの一次転写産物又はpri-miRNAはあまり研究されてこなかった。
【０００５】
真核生物の遺伝子の約50%は、コーディング配列上流の5'UTR領域（5'非翻訳領域）内に小さなオープンリーディングフレームを有する。これら小さなオープンリーディングフレーム（又は「uORF」、上流ORFの略）は、当該uORFにコードされるペプチドによって、主にシスに作用して、mRNAに対するリボソームの固定及び速度をモジュレートすることにより、また未知のメカニズムによりトランスにも作用して、翻訳調節因子の役割を果たし得る（Combierら, Gene Dev, 22: 1549-1559, 2008）。定義によれば、uORFは、コーディング遺伝子の上流に存在する。
【０００６】
近年、長鎖遺伝子間ノンコーディングRNA（lincRNA）中にも小さなORFが発見されているが、その推定上の機能(もし存在するならば)は、未知である（Ingoliaら, Cell, 147(4): 789-802, 2011; Guttman及びRinn, Nature, 482(7385): 339-46, 2012）。
【０００７】
しかしながら、ノンコーディングマイクロRNA中における、ペプチドをコードするORFの存在については、まだ何の報告例もない。今日まで、マイクロRNA及び、ひいてはその一次転写産物は、それらの具体的な作用機序に基づき、ペプチドを産生しないノンコーディング調節性RNAとして常に考えられてきた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の１つの態様は、マイクロRNAの発現をモジュレートすることができるペプチドを提供することである。
本発明の別の態様は、マイクロRNAの1以上の標的遺伝子の発現をモジュレートするための手段を提供することである。
本発明は、マイクロRNAにより標的化される遺伝子の発現を、当該マイクロRNA以外の手段によって、より簡便に、より効果的に制御することを可能にするという利点を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】HAM1及びHAM2遺伝子の発現（A）又はM. トランカツラにおける側根数（B）に対するMtmiR171b（メディカゴ  トランカツラで同定されたmiR171b）の過剰発現の効果を示す。
【図２】M. トランカツラにおけるMtmiR171bの発現並びにHAM1及びHAM2遺伝子の発現（A）又は側根数（B）に対するMtmiPEP171b1の過剰発現の効果を示す。
【図３】M. トランカツラにおけるMtmiR171bの発現、HAM1及びHAM2遺伝子の発現（A）並びに側根数（B）に対するMtmiPEP171b1の効果を示す。
【図４】M. トランカツラにおけるpre-MtmiR171b (A)及びMtmiR171b（B）の発現に対するMtmiPEP171b1の効果を示す。
【図５】M. トランカツラにおける種々のマイクロRNA前駆体の発現に対するMtmiPEP171b1の過剰発現の効果(A)及びMtmiPEP171b1の効果(B)を示す。
【図６】モデル植物ニコチアナ  ベンサミアナにおいて示された、MtmiR171bの発現に対するMtmiPEP171b1の翻訳の効果を示す。
【図７】モデル植物ニコチアナ  ベンサミアナにおいて示された、pre-MtmiR171bの発現に対するMtmiPEP171b1の過剰発現の効果を示す。
【図８】モデル植物ニコチアナ  ベンサミアナにおいて示された、pre-MtmiR171bの発現に対するMtmiPEP171b1の効果を示す。
【図９】モデル植物ニコチアナ  ベンサミアナにおいて示された、pri-miR171b (A)、pre-MtmiR171b (B)及びMtmiR171b (C)の発現に対するMtmiPEP171b1の効果を示す。
【図１０】MtmiPEP171b1を発現するために改変されたタバコ葉細胞におけるMtmiPEP171b1の局在を示す。
【図１１】モデル植物タバコにおいて示された、AtmiR165aの発現に対する（アラビドプシス  タリアナにおいて同定された）AtmiPEP165aの発現の効果(A)及びAtmiR319aに対する（アラビドプシス  タリアナにおいて同定された）AtmiPEP319a2の発現の効果(B)を示す。
【図１２】アラビドプシス  タリアナの根の成長に対するAtmiPEP165a処置の効果を示す。
【図１３】ドロソフィラにおいて同定されたmiPEP8の配列の保存を示す。
【図１４】ドロソフィラ種におけるmiPEP8の質量（kDa）及び等電点（pI）の変化を示す。
【図１５】miPEPの機能に対する配列付加の効果を示す。
【図１６】メディカゴ  トランカツラの根系におけるMtmiPEP171b1の発現を示す。
【図１７】ドロソフィラ  メラノガスター細胞におけるDmmiPEP8の発現を示す。
【図１８】D. メラノガスター細胞におけるDmmiR8蓄積に対するDmmiPEP8の影響を示す。
【図１９】ホモ  サピエンス細胞におけるHsmiR155蓄積に対するHsmiPEP155の効果を示す。
【図２０】モデル植物ニコチアナ  ベンサミアナにおいて示された、MtmiR171bの発現に対するMtmiPEP171b1の翻訳の効果を示す。
【図２１】モデル植物ニコチアナ  ベンサミアナにおいて示された、MtmiR171bの発現に対するMtmiPEP171b1の過剰発現の効果を示す。
【図２２】AtmiR165aの蓄積及びその標的遺伝子（PHAVOLUTA: PHV、PHABOLUSA: PHB及びREVOLUTA: REV）の蓄積に対するAtmiPEP165aの効果を示す。
【図２３】A. タリアナにおけるAtmiR164aの発現に対するAtmiPEP164aを用いる処置の効果を示す。
【図２４】アラビドプシス  タリアナの成長に対するAtmiPEP164aを用いる処置の効果を示す。
【図２５】A. タリアナにおけるAtmiR165aの発現に対するAtmiPEP165aを用いる処置の効果を示す。
【図２６】A. タリアナにおけるAtmiR319aの発現に対するAtmiPEP319a1の過剰発現の効果を示す。
【図２７】アラビドプシス  タリアナの成長に対するAtmiPEP319aを用いる処置の効果を示す。
【図２８】免疫染色を示す。
【図２９】A. タリアナにおけるAtmiR160bの発現に対するAtmiPEP160b1の過剰発現の効果を示す。
【図３０】AtmiR164aの発現に対するAtmiPEP164a1の効果を示す。
【図３１】A. タリアナにおけるAtmiR319aの発現に対するAtmiPEP319a1の過剰発現の効果を示す。
【図３２】M. トランカツラにおけるMtmiR169dの発現に対するMtmiPEP169dの効果を示す。
【図３３】M. トランカツラにおけるMtmiR171eの発現に対するMtmiPEP171eの過剰発現の効果を示す。
【図３４】野生型M. トランカツラ種植物におけるMtmiPEP171b1の局在を示す。
【図３５】野生型A. タリアナ種植物におけるAtmiPEP165aの存在を示す。
【図３６】A. タリアナにおけるAtmiPEP165aの作用を示す。
【図３７】M. トランカツラにおける側根数に対するpri-miR171bの効果を示す。
【図３８】ドロソフィラ  メラノガスター細胞におけるDmmiPEP8翻訳の可能性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
よって、本発明は、
- a)  マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれる12〜303ヌクレオチド長のオープンリーディングフレームを検出する工程と、
- b)  ・上記オープンリーディングフレームのものと同一のヌクレオチド配列又はその縮重配列によってコードされ、上記マイクロRNAの一次転写産物の転写とは独立して当該細胞中に存在するペプチドの存在下における、上記マイクロRNAを発現する特定の真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、
・  上記ペプチドの非存在下における、上記マイクロRNAを発現する上記特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、を比較する工程とを含み、
上記ペプチドの非存在下における上記マイクロRNAの蓄積からの、上記ペプチドの存在下における上記マイクロRNAの蓄積のモジュレーションが、上記オープンリーディングフレームによりコードされるマイクロペプチドの存在を示す、
マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれるヌクレオチド配列によりコードされるマイクロペプチド（miPEP）を検出及び同定する方法に関する。
【００１１】
本発明は、特に、
- a)  マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれる15〜303ヌクレオチド長のオープンリーディングフレームを検出する工程と、
- b)  ・上記オープンリーディングフレームのものと同一のヌクレオチド配列又はその縮重配列によりコードされ、上記マイクロRNAの一次転写産物の転写とは独立して当該細胞中に存在するペプチドの存在下における、上記マイクロRNAを発現する特定の真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、
・  上記ペプチドの非存在下における、上記マイクロRNAを発現する上記特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、を比較する工程とを含み、
上記ペプチド非存在下における上記マイクロRNAの蓄積からの、上記ペプチド存在下における上記マイクロRNAの蓄積のモジュレーションが、上記オープンリーディングフレームによりコードされるマイクロペプチドの存在を示す、マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれるヌクレオチド配列によりコードされるマイクロペプチド（miPEP）を検出及び同定する方法に関する。
【００１２】
本発明は、特に、
a)  マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれる15〜303ヌクレオチド長又は12ヌクレオチド長のオープンリーディングフレームを検出する工程と、
b)  ・上記オープンリーディングフレームのものと同一のヌクレオチド配列又はその縮重配列によりコードされ、上記マイクロRNAの一次転写産物の転写とは独立して当該細胞中に存在するペプチドの存在下における、上記マイクロRNAを発現する特定の真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、
・  上記ペプチドの非存在下における、上記マイクロRNAを発現する上記特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、を比較する工程とを含み、
上記ペプチド非存在下における上記マイクロRNAの蓄積からの、上記ペプチド存在下における上記マイクロRNAの蓄積のモジュレーションが、上記オープンリーディングフレームによりコードされるマイクロペプチドの存在を示す、マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれるヌクレオチド配列によりコードされるマイクロペプチド（miPEP）を検出及び同定する方法に関する。
【００１３】
本発明は、特に、
- a)  マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれる12ヌクレオチド長のオープンリーディングフレームを検出する工程と、
- b)  ・上記オープンリーディングフレームのものと同一のヌクレオチド配列又はその縮重配列によりコードされ、上記マイクロRNAの一次転写産物の転写とは独立して当該細胞中に存在するペプチドの存在下における、上記マイクロRNAを発現する特定の真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、
・  上記ペプチドの非存在下における、上記マイクロRNAを発現する上記特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、を比較する工程とを含み、
上記ペプチド非存在下における上記マイクロRNAの蓄積からの、上記ペプチド存在下における上記マイクロRNAの蓄積のモジュレーションが、上記オープンリーディングフレームによりコードされるマイクロペプチドの存在を示す、マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれるヌクレオチド配列によりコードされるマイクロペプチド（miPEP）を検出及び同定する方法に関する。
【００１４】
したがって、第1の工程において、マイクロペプチドの検出及び同定方法は、マイクロRNAの一次転写産物中の、ペプチドをコードする可能性のあるオープンリーディングフレームの存在を検出することからなる。
第2の工程に関しては、マイクロRNA蓄積に対する上記ペプチドの効果を探ることによって、上記ペプチドを特徴決定すること、すなわち上記ペプチドが細胞内で実際に産生されたペプチドに相当するか否かを決定することを可能にする。
【００１５】
マイクロRNA蓄積に対するペプチドの効果を示すために、マイクロRNAを発現する第1の細胞に大量のペプチドを導入する。次いで、この第1の細胞におけるマイクロRNA蓄積を測定し、第1の細胞と同一であるが上記ペプチドを含まない第2の細胞におけるマイクロRNA蓄積と比較する。
【００１６】
よって、ペプチド存在下の細胞とペプチド非存在下の細胞とのマイクロRNA量の変化を観察することにより、（i）当該マイクロRNAの一次転写産物によりコードされるペプチドが存在すること、（ii）当該ペプチドの配列が、当該マイクロRNAの一次転写産物で同定されるオープンリーディングフレームによりコードされること、及び（iii）当該ペプチドが、当該マイクロRNA蓄積に対して効果を有すること、が示される。
【００１７】
したがって、本発明は、一方ではマイクロRNAの一次転写産物上に、マイクロペプチドをコードできるオープンリーディングフレームが存在することを観察し、他方では上記マイクロペプチドが上記マイクロRNA蓄積をモジュレートできることを観察したという本発明者らによる予測されなかった２つの観察結果に基づいている。
【００１８】
特に、本発明は、
- a)  マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれる15〜303ヌクレオチド長のオープンリーディングフレームを検出する工程と、
- b)  ・上記オープンリーディングフレームのものと同一のヌクレオチド配列又はその縮重配列によりコードされ、上記マイクロRNAの一次転写産物の転写とは独立して当該細胞中に存在するペプチドの存在下における、上記マイクロRNAの一次転写産物を発現する特定の真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、
・  上記ペプチドの非存在下における、上記マイクロRNAの一次転写産物を発現する上記特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、を比較する工程とを含み、
上記ペプチド非存在下における上記マイクロRNAの蓄積からの、上記ペプチド存在下における上記マイクロRNAの蓄積のモジュレーションが、上記オープンリーディングフレームによりコードされるマイクロペプチドの存在を示す、マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれるヌクレオチド配列によりコードされるマイクロペプチド（miPEP）を検出及び同定する方法に関する。
【００１９】
特に、本発明は、
- a)  マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれる15〜303ヌクレオチド長又は12ヌクレオチド長のオープンリーディングフレームを検出する工程と、
- b)  ・上記オープンリーディングフレームのものと同一のヌクレオチド配列又はその縮重配列によりコードされ、上記マイクロRNAの一次転写産物の転写とは独立して当該細胞中に存在するペプチドの存在下における、上記マイクロRNAの一次転写産物を発現する特定の真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、
・  上記ペプチドの非存在下における、上記マイクロRNAの一次転写産物を発現する上記特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞におけるマイクロRNA蓄積と、を比較する工程とを含み、
上記ペプチド非存在下における上記マイクロRNAの蓄積からの、上記ペプチド存在下における上記マイクロRNAの蓄積のモジュレーションが、上記オープンリーディングフレームによりコードされるマイクロペプチドの存在を示す、マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれるヌクレオチド配列によりコードされるマイクロペプチド（miPEP）を検出及び同定する方法に関する。
【００２０】
特に、本発明は、
- a)  マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれる12ヌクレオチド長のオープンリーディングフレームを検出する工程と、
- b)  ・上記オープンリーディングフレームのものと同一のヌクレオチド配列又はその縮重配列によりコードされ、上記マイクロRNAの一次転写産物の転写とは独立して当該細胞中に存在するペプチドの存在下における、上記マイクロRNAの一次転写産物を発現する特定の真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、
・  上記ペプチドの非存在下における、上記マイクロRNAの一次転写産物を発現する上記特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、を比較する工程とを含み、
上記ペプチド非存在下における上記マイクロRNAの蓄積からの、上記ペプチド存在下における上記マイクロRNAの蓄積のモジュレーションが、上記オープンリーディングフレームによりコードされるマイクロペプチドの存在を示す、マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれるヌクレオチド配列によりコードされるマイクロペプチド（miPEP）を検出及び同定する方法に関する。
【００２１】
本発明において、用語「マイクロRNA」、「ノンコーディングマイクロRNA」及び「miRNA」は、同義であり、互換可能に用いられ得る。それらは、翻訳されず、ペプチド又はタンパク質をもたらさない約21ヌクレオチドのRNAの小分子と定義される。
しかしながら、この成熟型において、マイクロRNAは、例えばRISC複合体によって、転写後機構により特定の遺伝子を調節する機能を果たす。
【００２２】
マイクロRNAの一次転写産物又は「pri-miRNA」は、DNA分子の転写から直接得られるRNA分子に相当する。一般に、この一次転写産物は、例えばRNAの特定の構造又はスプライシング現象によるRNAの特定部分の切断に関連付けられる1以上の転写後修飾を受け、マイクロRNAの前駆体又は「pre-miRNA」をもたらし、次いでマイクロRNAの成熟型又は「miRNA」をもたらす。
【００２３】
用語「マイクロペプチド」及び「miPEP」（マイクロRNAによりコードされるペプチド）は、同義であり、互換可能に用いられ得る。それらは、マイクロRNAの一次転写産物上に存在するオープンリーディングフレームによってコードされ、当該マイクロRNAの蓄積をモジュレートできるペプチドと定義される。
本発明で意味するところのマイクロペプチドは、「マイクロ」がペプチドのサイズに対応するものでないことから、必ずしも、小さなペプチドであると解されるべきではない。
【００２４】
本発明によれば、miPEPは、転写モジュレータ、特に転写活性因子と考えることもできる。このような転写モジュレータは、転写レベルで作用して、pri-miRNA、pre-miRNA及びmiRNAの蓄積をモジュレートすることができる。
【００２５】
遺伝子コードの縮重を考慮すれば、同一のマイクロペプチドは、複数のヌクレオチド配列によってコードされ得る。この種のヌクレオチド配列は、少なくとも１つのヌクレオチドで互いに異なるが同一のペプチドをコードし、「縮重配列」と呼ばれる。
【００２６】
用語「オープンリーディングフレーム」又は「ORF」は、同義であり、互換可能に用いられ得る。それらは、ペプチド又はタンパク質をコードする可能性のあるDNA又はRNA分子中のヌクレオチド配列に相当する：オープンリーディングフレームは、開始コドン（一般にメチオニンをコードする開始コドン）から始まり、一連のコドン（アミノ酸をコードする各々のコドン）が続き、終止コドン（翻訳されない終止コドン）で終わる。
本発明においては、ORFは、それがマイクロRNAの一次転写産物上に存在するとき、特に「miORF」と呼ばれ得る。
【００２７】
特定の本発明において定義されるmiORFは、12〜303ヌクレオチドのサイズを有し得、3〜100アミノ酸のペプチドをコードし得る。
特に、本発明で定義するmiORFは、15〜303ヌクレオチドのサイズを有し得る。アミノ酸は3ヌクレオチドのコドンによりコードされるので、15〜303ヌクレオチドのmiORFは、4〜100アミノ酸のmiPEPをコードする。
特に、miORFは、15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 47, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 138, 141, 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 261, 264, 267, 270, 273, 276, 279, 282, 285, 288, 291, 294, 297, 300又は303ヌクレオチドのサイズを有し、4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99又は100アミノ酸のサイズを有するmiPEPをそれぞれコードする。
【００２８】
本発明において、「蓄積」とは、細胞内における分子、例えばマイクロRNA又はマイクロペプチドの産生量を意味する。
よって、細胞内の分子蓄積の「モジュレーション」は、細胞内に存在する当該分子の量の変化に相当する。
更に、miPEPの効果は、miRNA蓄積のモジュレーションだけでなく、対応するpri-miRNA又はpre-miRNA蓄積のモジュレーションによっても観察することができる。
【００２９】
１つの実施形態では、本発明は、マイクロRNA蓄積のモジュレーションが当該マイクロRNA蓄積の増大又は減少、特に増大である、上記で定義したmiPEPの検出及び同定方法に関する。
「蓄積の減少」は、細胞内における分子の量の減少に相当する。
反対に、「蓄積の増大」は、細胞内における分子の量の増大に相当する。
有利な実施形態では、本発明は、マイクロRNA蓄積のモジュレーションが当該マイクロRNA蓄積の増大である、上記で定義したmiPEPの検出及び同定方法に関する。
【００３０】
１つの実施形態では、本発明は、細胞内におけるペプチドの存在が、
-  当該ペプチドをコードする核酸の当該細胞内への導入、又は
-  当該ペプチドの当該細胞内への導入
に起因する、上記で定義したmiPEPの検出及び同定方法に関する。
【００３１】
miPEPを特徴決定するためには、当該細胞内に試験対象のペプチドが存在する、マイクロRNAを発現する細胞のモデルを得る必要がある。そのために、細胞とペプチドとを接触させることによって、又はペプチドをコードする核酸を細胞内に導入し、その後当該細胞内で核酸がペプチドに翻訳されることによって、ペプチドを細胞内に導入することができる。
【００３２】
１つの実施形態では、工程a）におけるオープンリーディングフレームが、マイクロRNAの一次転写産物の5'部分又は3'部分、好ましくは5'部分に含まれる、上記で定義したmiPEPの検出及び同定方法に関する。
マイクロRNAの一次転写産物の5'部分又は3'部分は、マイクロRNAの成熟中に切断されるRNA分子の末端部分に相当する。
【００３３】
１つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、野生型植物細胞中に存在する、上記で定義したmiPEPの検出及び同定方法に関する。
本発明において、野生型植物細胞は、ヒトにより遺伝子操作されていない植物細胞に相当する。
【００３４】
１つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、野生型動物細胞、特に野生型ヒト細胞又は野生型ドロソフィラ属(Drosophila)動物細胞中に存在する、上記で定義したmiPEPの検出及び同定方法に関する。
本発明において、野生型動物細胞は、ヒトにより遺伝子操作されていない動物細胞、特にヒト細胞に相当する。
【００３５】
１つの実施形態では、本発明は、工程bにおいて用いられる特定の真核細胞及び当該特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞が、アラビドプシス  タリアナ（Arabidopsis thaliana）などのアブラナ科植物、グリシン  マクス（Glycine max、ダイズ）、メディカゴ  トランカツラ(Medicago truncatula)及びメディカゴ  サティバ(Medicago sativa) (アルファルファ)などのマメ科植物、又はニコチアナ  ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana、タバコ）、ソラナム  ツベロサム（Solanum tuberosum、ジャガイモ）、ソラナム  リコパーシカム（Solanum lycopersicum、トマト）若しくはソラナム  メロンゲナ（Solanum melongena、ナス）などのナス科植物の植物細胞である、上記で定義したmiPEPの検出及び同定方法に関する。
【００３６】
１つの実施形態では、本発明は、工程bにおいて用いられる特定の真核細胞及び当該特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞が、植物細胞、好ましくはメディカゴ  トランカツラ細胞、ニコチアナ  ベンサミアナ細胞又はアラビドプシス  タリアナ細胞である、上記で定義したmiPEPの検出及び同定方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、工程bにおいて用いられる特定の真核細胞及び当該特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞が、動物細胞、好ましくはヒト細胞又はドロソフィラ属動物細胞である、上記で定義したmiPEPの検出及び同定方法に関する。
【００３７】
上記で定義したマイクロペプチドの検出及び同定方法では、マイクロRNAに対するペプチドの潜在的効果を示すことができるように、マイクロRNAの一次転写産物上の、ペプチドをコードできるORFを同定した後に、上記マイクロRNA及び上記ペプチドを有する細胞モデルを得る必要がある。
【００３８】
したがって、２つの選択肢が考えられる：
-  miORFが同定された細胞モデルと、miRNAに対するペプチドの効果が示された細胞モデルとが同一であるか、又は
-  miORFが同定された細胞モデルと、miRNAに対するペプチドの効果が示された細胞モデルとが異なる。
【００３９】
第１の選択肢では、ペプチドの効果を観察するために用いられる細胞モデルは、マイクロRNAの一次転写産物が単離された細胞モデルと同一である。この細胞モデルでは、特定の真核細胞は、マイクロRNAを天然に含んでおり、これら細胞内には、試験対象のペプチドのみ導入する必要がある。この文脈において、マイクロRNAは、それが細胞内に天然に存在するために、「内因性のもの」と称される。しかし、内因性マイクロRNAのその他のコピーを、例えば内因性マイクロRNAをコードするベクターを細胞内に導入することによって、細胞に添加してもよい。
【００４０】
第２の選択肢では、ペプチドの効果を観察するために用いられる細胞モデルは、マイクロRNAの一次転写産物が単離された細胞モデルとは異なる。この細胞モデルでは、特定の真核細胞は、マイクロRNAも試験対象のペプチドも含まない。したがって、これら２つの要素をこれら細胞内に導入する必要がある。この文脈において、マイクロRNAは、それが細胞内に天然に存在しないために、「外因性のもの」と称される。
【００４１】
１つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、工程b）において用いられる真核細胞において、及び工程b）において用いられる特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞において、内因性のものである、上記で定義したmiPEPの検出及び同定方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、工程b）において用いられる、上記マイクロRNAの発現を可能にするベクターを含む真核細胞において、及び工程b）において用いられる、特定の真核細胞と同じタイプの、上記マイクロRNAの発現を可能にするベクターを含む真核細胞において、外因性のものである、上記miPEPの検出及び同定方法に関する。
【００４２】
１つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAの蓄積が、定量RT-PCR又はノザンブロットを用いて測定される、上記で定義したmiPEPの検出及び同定方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAの蓄積が、DNAチップ又はRNAチップを用いて測定される、上記で定義したmiPEPの検出及び同定方法に関する。
マイクロRNAの蓄積は、特定の核酸分子のアッセイのための分子生物学的手法を用いて測定してもよい。
【００４３】
また、別の態様では、本発明は、
- a)  マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれる15〜303ヌクレオチド長のオープンリーディングフレームを検出する工程と、
- b)  ・上記オープンリーディングフレームのものと同一のヌクレオチド配列又はその縮重配列によりコードされ、上記マイクロRNAの一次転写産物の転写とは独立して当該細胞中に存在するペプチドの存在下における、上記マイクロRNAを発現する特定の真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、
・  上記ペプチドの非存在下における、上記マイクロRNAを発現する上記特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、を比較する工程とを含み、
上記ペプチドの非存在下における上記マイクロRNAの蓄積からの、上記ペプチドの存在下における上記マイクロRNAの蓄積のモジュレーションが、その一次転写産物がマイクロペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むマイクロRNAの存在を示す、その一次転写産物の配列がmiPEPをコードするヌクレオチド配列を含むマイクロRNAを検出及び同定する方法に関する。
【００４４】
特に、本発明は、
- a)  マイクロRNAの一次転写産物の配列中に含まれる15〜303ヌクレオチド長のオープンリーディングフレームを検出する工程と、
- b)  ・上記オープンリーディングフレームのものと同一のヌクレオチド配列又はその縮重配列によりコードされ、上記マイクロRNAの一次転写産物の転写とは独立して当該細胞中に存在するペプチドの存在下における、上記マイクロRNAの一次転写産物を発現する特定の真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、
・  上記ペプチドの非存在下における、上記マイクロRNAの一次転写産物を発現する上記特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞における上記マイクロRNAの蓄積と、を比較する工程とを含み、
上記ペプチドの非存在下における上記マイクロRNAの蓄積からの、上記ペプチドの存在下における上記マイクロRNAの蓄積のモジュレーションが、その一次転写産物がマイクロペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むマイクロRNAの存在を示す、その一次転写産物の配列がmiPEPをコードするヌクレオチド配列を含むマイクロRNAを検出及び同定する方法に関する。
【００４５】
１つの実施形態では、本発明は、マイクロRNA蓄積のモジュレーションが、マイクロRNA蓄積の増大又は減少、特に増大である、上記で定義したマイクロRNAの検出及び同定方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、細胞内におけるペプチドの存在が、
-  当該ペプチドをコードする核酸の当該細胞内への導入、又は
-  当該ペプチドの当該細胞内への導入
に起因する、上記で定義したマイクロRNAの検出及び同定方法に関する。
【００４６】
１つの実施形態では、本発明は、工程a）におけるオープンリーディングフレームが、マイクロRNAの一次転写産物の5'部分又は3'部分、好ましくは5'部分に含まれる、上記で定義したマイクロRNAの検出及び同定方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、野生型植物細胞中に存在する、上記で定義したマイクロRNAの検出及び同定方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、野生型動物細胞、特に野生型ヒト細胞中に存在する、上記で定義したマイクロRNAの検出及び同定方法に関する。
【００４７】
１つの実施形態では、本発明は、工程b）において用いられる真核細胞及び特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞が、植物細胞、好ましくはメディカゴ  トランカツラ細胞である、上記で定義したマイクロRNAの検出及び同定方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、工程b）において用いられる真核細胞及び特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞が、動物細胞、好ましくはドロソフィラ属動物細胞である、上記で定義したマイクロRNAの検出及び同定方法に関する。
【００４８】
１つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、工程b）において用いられる真核細胞において、及び工程b）において用いられる、特定の真核細胞と同じタイプの真核細胞において、内因性のものである、上記で定義したマイクロRNAの検出及び同定方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、工程b）において用いられる、マイクロRNAの発現を可能にするベクターを含む真核細胞において、及び工程b）において用いられる、特定の真核細胞と同じタイプの、マイクロRNAの発現を可能にするベクターを含む真核細胞において、外因性のものである、上記で定義したマイクロRNAの検出及び同定方法に関する。
【００４９】
１つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAの蓄積が、定量RT-PCR又はノザンブロットを用いて測定される、上記で定義したマイクロRNAの検出及び同定方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAの蓄積が、DNAチップ又はRNAチップを用いて測定される、上記で定義したマイクロRNAの検出及び同定方法に関する。
【００５０】
別の態様では、本発明は、上記で定義した方法を実施することによって得られるmiPEPに関する。
より具体的には、本発明は、上記で定義した方法を実施することによって得られるヌクレオチド配列によってコードされるmiPEPに関する。言い換えれば、本発明は、上記で定義した方法を実施することによって検出及び同定されるヌクレオチド配列によってコードされるmiPEPに関する。
【００５１】
また、本発明の別の態様は、マイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列によってコードされ、真核細胞におけるマイクロRNA蓄積をモジュレートできる、3〜100アミノ酸、特に4〜100アミノ酸、特に4〜60アミノ酸、好ましくは4〜40アミノ酸のmiPEPに関する。
また、本発明の別の態様は、マイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列によってコードされ、真核細胞におけるマイクロRNA蓄積をモジュレートできる、4〜100アミノ酸又は3アミノ酸のmiPEPに関する。
また、本発明の別の態様は、マイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列によってコードされ、真核細胞におけるマイクロRNA蓄積をモジュレートできる、3アミノ酸のmiPEPに関する。
【００５２】
特に、本発明において定義されるmiPEPは、15〜303ヌクレオチドのmiORFによってコードされ、4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99又は100アミノ酸、特に5, 8, 10, 18, 19, 23, 37, 50又は59アミノ酸のサイズを有する。
特に、本発明のmiPEPは、4〜10アミノ酸、4〜20アミノ酸、4〜30アミノ酸、4〜40アミノ酸、4〜50アミノ酸、4〜60アミノ酸、4〜70アミノ酸、4〜80アミノ酸、4〜90アミノ酸又は4〜100アミノ酸の範囲のサイズを有する。
【００５３】
更に、マイクロRNAの一次転写産物について複数のmiORFが同定され得、このことはマイクロRNAの一次転写産物が複数のmiPEPをコードする可能性があることを示していることに留意すべきである。
また、miPEPの効果は、一般的に、１つのマイクロRNA、すなわち当該miPEPをコードする一次転写産物に由来するマイクロRNAに特異的であることに留意すべきである。
【００５４】
miPEPによるマイクロRNAのモジュレーションは、miPEPの存在下及び非存在下における細胞間のマイクロRNA量の変化を観察することで証明され得る。
【００５５】
１つの実施形態では、本発明は、ヌクレオチド配列がマイクロRNAの一次転写産物の5'部分又は3'部分、好ましくは5'部分に含まれる、上記で定義したmiPEPに関する。
１つの実施形態では、本発明は、ヌクレオチド配列がマイクロRNAの一次転写産物上に存在する第1のオープンリーディングフレームに相当する、上記で定義したmiPEPに関する。
１つの実施形態では、本発明は、塩基性の、好ましくは8より高い等電点を有する、上記で定義したmiPEPに関する。
１つの実施形態では、本発明は、酸性の等電点を有する、上記で定義したmiPEPに関する。
【００５６】
１つの実施形態では、本発明は、配列番号1〜配列番号104、配列番号375〜配列番号386及び配列番号355からなるペプチドの群から選択される、上記で定義したmiPEPに関する（表1）。
１つの実施形態では、本発明は、
-  配列番号1〜配列番号104及び配列番号355、
-  配列番号375〜配列番号386、又は
-  配列番号424
からなるペプチドの群から選択される、上記で定義したmiPEPに関する。
１つの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列MVTからなる、上記で定義したmiPEPに関する。
【００５７】
別の態様では、本発明は、上記で定義したmiPEPをコードする核酸分子に関する。
１つの実施形態では、本発明は、配列番号105〜配列番号208、配列番号387〜配列番号399及び配列番号356からなる核酸の群から選択される、上記で定義した核酸分子に関する（表2）。
１つの実施形態では、本発明は、
-  配列番号105〜配列番号208及び配列番号356、
-  配列番号387〜配列番号399、又は
-  配列番号425
からなる核酸の群から選択される、上記で定義した核酸分子に関する。
【００５８】
特定の実施形態では、本発明は、miR171b（配列番号319）の一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列（配列番号163）によってコードされ、真核細胞において上記miR171bの蓄積をモジュレートできる、MtmiPEP171b1（配列番号59）に関する。
特定の実施形態では、本発明は、miR164a（配列番号297）の一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列（配列番号128）によってコードされ、真核細胞において上記miR164aの蓄積をモジュレートできる、AtmiPEP164a1（配列番号24）に関する。
【００５９】
特定の実施形態では、本発明は、miR165a（配列番号305）の一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列（配列番号147）によってコードされ、真核細胞において上記miR165aの蓄積をモジュレートできる、AtmiPEP165a（配列番号43）に関する。
特定の実施形態では、本発明は、miR319a（配列番号331）の一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列（配列番号180）によってコードされ、真核細胞において上記miR319aの蓄積をモジュレートできる、AtmiPEP319a1（配列番号76）に関する。
【００６０】
特定の実施形態では、本発明は、miR319a（配列番号331）の一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列（配列番号181）によってコードされ、真核細胞において上記miR319aの蓄積をモジュレートできる、AtmiPEP319a2（配列番号77）に関する。
特定の実施形態では、本発明は、miR160b（配列番号291）の一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列（配列番号118）によってコードされ、真核細胞において上記miR160bの蓄積をモジュレートできる、AtmiPEP160b1（配列番号14）に関する。
【００６１】
特定の実施形態では、本発明は、miR169d（配列番号427）の一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列（配列番号425）によってコードされ、真核細胞において上記miR169dの蓄積をモジュレートできる、MtmiPEP169d（配列番号424）に関する。
特定の実施形態では、本発明は、miR171e（配列番号322）の一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列（配列番号167）によってコードされ、真核細胞において上記miR171eの蓄積をモジュレートできるMtmiPEP171e（配列番号63）に関する。
【００６２】
特定の実施形態では、本発明は、miR1（配列番号353）の一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列（配列番号206）によってコードされ、真核細胞において上記miR1の蓄積をモジュレートできる、DmmiPEP1a（配列番号102）に関する。
特定の実施形態では、本発明は、miR1（配列番号353）の一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列（配列番号207）によってコードされ、真核細胞において上記miR1の蓄積をモジュレートできる、DmmiPEP1b（配列番号103）に関する。
【００６３】
特定の実施形態では、本発明は、miR8（配列番号354）の一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列（配列番号208）によってコードされ、真核細胞において上記miR8の蓄積をモジュレートできる、DmmiPEP8（配列番号104）に関する。
特定の実施形態では、本発明は、miR155（配列番号358）の一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列（配列番号356）によってコードされ、真核細胞において上記miR155の蓄積をモジュレートできる、HsmiPEP155（配列番号355）に関する。
【００６４】
別の態様では、本発明は、特に植物又はヒトなどの動物に天然に存在するmiPEPのものと同一の配列を含むか又は当該配列からなる、単離されたペプチド、又は単離精製されたペプチド、又は合成ペプチド、又は組換えペプチドに関する。
別の態様では、本発明は、上記で定義した少なくとも1つの核酸分子を含むベクターに関する。
【００６５】
また、別の態様では、本発明は、その一次転写産物が少なくとも1つのmiPEPをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含み、その蓄積が上記少なくとも1つのmiPEPによってモジュレートされるマイクロRNAを発現することができる特定の真核細胞において、当該マイクロRNAによりその発現が調節される少なくとも1つの遺伝子の発現をモジュレートするための、少なくとも、
-  上記で定義したmiPEP、
-  上記miPEPをコードする核酸、又は
-  上記核酸を含むベクター
の使用に関する。
【００６６】
また、別の態様では、本発明は、その一次転写産物が少なくとも1つのmiPEPをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含み、その蓄積が上記少なくとも1つのmiPEPによってモジュレートされるマイクロRNAを発現することができる特定の真核細胞において、当該マイクロRNAによりその発現が調節される少なくとも1つの遺伝子の発現をモジュレートするための、少なくとも、
-  マイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列によってコードされ、真核細胞において当該マイクロRNAの蓄積をモジュレートできる、4〜100アミノ酸、好ましくは4〜40アミノ酸のmiPEP、
-  上記miPEPをコードする核酸、又は
-  上記核酸を含むベクター
の使用に関する。
【００６７】
また、別の態様では、本発明は、その一次転写産物が少なくとも1つのmiPEPをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含み、その蓄積が上記少なくとも1つのmiPEPによってモジュレートされるマイクロRNAを発現することができる特定の真核細胞において、当該マイクロRNAによりその発現が調節される少なくとも1つの遺伝子の発現をモジュレートするための、少なくとも、
-  マイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列によってコードされ、真核細胞において当該マイクロRNAの蓄積をモジュレートできる、4〜100アミノ酸又は3アミノ酸のmiPEP、
-  上記miPEPをコードする核酸、又は
-  上記核酸を含むベクター
の使用に関する。
【００６８】
また、別の態様では、本発明は、その一次転写産物が少なくとも1つのmiPEPをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を含み、その蓄積が上記少なくとも1つのmiPEPによってモジュレートされるマイクロRNAを発現することができる特定の真核細胞において、当該マイクロRNAによりその発現が調節される少なくとも1つの遺伝子の発現をモジュレートするための、少なくとも、
-  マイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列によってコードされ、真核細胞において当該マイクロRNAの蓄積をモジュレートできる、3アミノ酸のmiPEP、
-  上記miPEPをコードする核酸、又は
-  上記核酸を含むベクター
の使用に関する。
【００６９】
本発明は、miPEPを用いて当該マイクロRNA蓄積をモジュレートすることによって、同一のマイクロRNAの1以上の標的遺伝子の発現をモジュレートすることができるという本発明者らによる驚くべき観察結果に基づく。
【００７０】
１つの実施形態では、本発明は、特定の真核細胞が植物細胞である、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、特定の真核細胞が、アラビドプシス  タリアナなどのアブラナ科植物、グリシン  マクス（ダイズ）、メディカゴ  トランカツラ及びメディカゴ  サティバ(アルファルファ)などのマメ科植物、ニコチアナ  ベンサミアナ（タバコ）、ソラナム  ツベロサム（ジャガイモ）、ソラナム  リコパーシカム（トマト）又はソラナム  メロンゲナ（ナス）などのナス科植物の植物細胞である、上記で定義した使用に関する。
【００７１】
１つの実施形態では、本発明は、特定の真核細胞が、動物細胞、特にヒト細胞である、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、特定の真核細胞が、動物細胞、特にヒト細胞であり、miPEPが、ヒトの身体又は動物の身体の外科的処置又は治療的処置のためにも、人間の遺伝的同一性の改変のためにも用いられない、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、特定の真核細胞が動物細胞であり、miPEPがヒトの身体又は動物の身体の外科的処置又は治療的処置に用いられる、上記で定義した使用に関する。
【００７２】
１つの実施形態では、本発明は、マイクロRNA及び遺伝子が、特定の真核細胞において内因性のものである、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、マイクロRNA及び遺伝子が、特定の真核細胞において外因性のものであり、当該特定の真核細胞が当該マイクロRNA及び遺伝子の発現を可能にする少なくとも1つのベクターを含む、上記で定義した使用に関する。
【００７３】
本発明では、「内因性」及び「外因性」との表現は、種間の配列保存性に鑑みて、異なる種のマイクロRNA及び/又は遺伝子を区別するために用いられる。
よって、用語「内因性」とは、マイクロRNA及び/又は遺伝子が、懸案の細胞において天然に存在し得ることを示す。しかしながら、内因性マイクロRNA及び/又は内因性遺伝子のその他のコピーを、例えばクローニングによって、当該懸案の細胞に人工的に添加してもよい。
反対に、用語「外因性」とは、マイクロRNA及び/又は遺伝子が、懸案の細胞において天然に存在し得ないことを示す。それは、別のタイプの細胞又は別の種の生体において同定されるマイクロRNA及び/又は遺伝子である；したがって、このマイクロRNA及び/又は遺伝子は、必ず当該懸案の細胞に人工的に導入される。
したがって、本発明において、遺伝的に形質転換された細胞は、配列が類似している可能性のあるマイクロRNA及び/又は遺伝子の２つの群（一方は内因性のもので、他方は外因性のもの）を含み得る。
【００７４】
１つの実施形態では、本発明は、miRNAの一次転写産物及び遺伝子が、マイクロRNAの一次転写産物の発現を可能にする少なくとも1つのベクターを含む特定の真核細胞において外因性のものである、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miRNAの一次転写産物が、人工的に細胞内に導入されるベクターによってコードされる、上記で定義した使用に関する。
【００７５】
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、配列番号1〜配列番号104、配列番号375〜配列番号386及び配列番号355からなるペプチドの群から選択される、上記で定義した使用に関する（表1）。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、
-  配列番号1〜配列番号104及び配列番号355、
-  配列番号375〜配列番号386、又は
-  配列番号424
からなるペプチドの群から選択される、上記で定義した使用に関する。
【００７６】
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、MtmiPEP171b1 (配列番号59)、AtmiPEP164a1 (配列番号24)、AtmiPEP165a (配列番号43)、AtmiPEP319a1 (配列番号76)及びAtmiPEP319a2 (配列番号77)から選択される、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、MtmiPEP171b1 (配列番号59) 、AtmiPEP164a1 (配列番号24) 、AtmiPEP165a (配列番号43) 、AtmiPEP319a1 (配列番号76) 、AtmiPEP319a2 (配列番号77) 、AtmiPEP160b1 (配列番号14) 、MtmiPEP171e (配列番号63)及びMtmiPEP169d (配列番号424)から選択される、上記で定義した使用に関する。１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、DmmiPEP1a (配列番号102) 、DmmiPEP1b (配列番号103)及びDmmiPEP8 (配列番号104)から選択される、上記で定義した使用に関する。
【００７７】
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、HsmiPEP155a (配列番号355)である、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、核酸が、配列番号105〜配列番号208及び配列番号356からなる核酸の群から選択される、上記で定義した使用に関する（表2）。
１つの実施形態では、本発明は、核酸が、
-  配列番号105〜配列番号208及び配列番号356、
-  配列番号387〜配列番号399、又は
-  配列番号425
からなる核酸の群から選択される、上記で定義した使用に関する。
【００７８】
１つの実施形態では、本発明は、核酸が、miORF171b (配列番号163)、miORF164a1 (配列番号128)、miORF165a (配列番号147)、miORF319a1 (配列番号180)及びmiORF319a2 (配列番号181)から選択される、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、核酸が、miORF171b (配列番号163)、miORF164a1 (配列番号128)、miORF165a (配列番号147)、miORF319a1 (配列番号180)、miORF319a2 (配列番号181)、miORF160b1 (配列番号118)、miORF169d (配列番号425)及びmiORF171e (配列番号167)から選択される、上記で定義した使用に関する。
【００７９】
１つの実施形態では、本発明は、核酸が、miORF1a (配列番号206)、miORF1b (配列番号207)及びmiORF8 (配列番号208)から選択される、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、核酸が、miORF155 (配列番号356)から選択される、上記で定義した使用に関する。
【００８０】
１つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、配列番号282〜配列番号354及び配列番号358からなる核酸の群から選択される、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、
-  配列番号282〜配列番号354及び配列番号358、
-  配列番号412〜配列番号423、又は
-  配列番号427
からなる核酸の群から選択される、上記で定義した使用に関する。
【００８１】
１つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、miR171b (配列番号319)、miR165a (配列番号305)及びmiR319a (配列番号331)から選択される、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、miR171b (配列番号319)、miR164a (配列番号297)、miR165a (配列番号305)、miR319a (配列番号331)、miR160b (配列番号291)、miR171e (配列番号322)及びmiR169d (配列番号427)から選択される、上記で定義した使用に関する。
【００８２】
１つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、miR1a (配列番号353)及びmiR8 (配列番号354)から選択される、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが、miR155 (配列番号358)から選択される、上記で定義した使用に関する。
【００８３】
別の態様では、本発明は、特に、
-3〜100アミノ酸、好ましくは4〜20アミノ酸のサイズを有し、
-当該遺伝子の発現を調節するマイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列によってコードされるものと同一のペプチド配列を有し、
-上記マイクロRNAの蓄積をモジュレートすることができる
miPEPの、真核細胞内における蓄積工程を行うことを含み、
上記真核細胞内における上記miPEPの蓄積が、上記miPEPの蓄積がない上記遺伝子の発現に対して、上記遺伝子の発現のモジュレーションを誘導する、真核細胞におけるマイクロRNAによって調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
【００８４】
別の態様では、本発明は、特に、
-4〜100アミノ酸又は3アミノ酸のサイズを有し、
-当該遺伝子の発現を調節するマイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列によってコードされるものと同一のペプチド配列を有し、
-上記マイクロRNAの蓄積をモジュレートすることができる
miPEPの、真核細胞内における蓄積工程を行うことを含み、
上記真核細胞内における上記miPEPの蓄積が、上記miPEPの蓄積がない上記遺伝子の発現に対して、上記遺伝子の発現のモジュレーションを誘導する、真核細胞におけるマイクロRNAによって調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
【００８５】
別の態様では、本発明は、特に、
-3アミノ酸のサイズを有し、
-当該遺伝子の発現を調節するマイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列によってコードされるものと同一のペプチド配列を有し、
-上記マイクロRNAの蓄積をモジュレートすることができる
miPEPの、真核細胞内における蓄積工程を行うことを含み、
上記真核細胞内における上記miPEPの蓄積が、上記miPEPの蓄積がない上記遺伝子の発現に対して、上記遺伝子の発現のモジュレーションを誘導する、真核細胞におけるマイクロRNAによって調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
【００８６】
特に、本発明は、
-4〜100アミノ酸、好ましくは4〜20アミノ酸のサイズを有し、
-当該遺伝子の発現を調節するマイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチド配列によってコードされるものと同一のペプチド配列を有し、
-上記マイクロRNAの蓄積をモジュレートすることができる
miPEPの、真核細胞内における蓄積工程を行うことを含み、
上記真核細胞内における上記miPEPの蓄積が、上記miPEPの蓄積がない上記遺伝子の発現に対して、上記遺伝子の発現のモジュレーションを誘導する、真核細胞におけるマイクロRNAによって調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
【００８７】
１つの実施形態では、本発明は、細胞内におけるmiPEPの蓄積が、
-  当該miPEPをコードする核酸の当該細胞内への導入、又は
-  当該miPEPの当該細胞内への導入
に起因する、上記で定義した遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
【００８８】
１つの実施形態では、本発明は、真核細胞が、植物細胞である、上記で定義した遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、真核細胞が、動物細胞、特にヒト細胞である、上記で定義した遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
【００８９】
１つの実施形態では、本発明は、真核細胞が、動物細胞、特にヒト細胞であり、ヒトの身体又は動物の身体の外科的処置又は治療的処置のためにも、人間の遺伝的同一性の改変のためにも用いられない、上記で定義した遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、マイクロRNA及び遺伝子が、真核細胞において内因性のものである、上記で定義した遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、マイクロRNA及び遺伝子が、当該マイクロRNA及び遺伝子の発現を可能にする少なくとも1つのベクターを含む真核細胞において外因性のものである、上記で定義した遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
【００９０】
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、配列番号1〜配列番号104、配列番号375〜配列番号386及び配列番号355からなるペプチドの群から選択される、上記で定義した遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、
-  配列番号1〜配列番号104及び配列番号355、
-  配列番号375〜配列番号386、又は
-  配列番号424
からなるペプチドの群から選択される、上記で定義した遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
【００９１】
特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるMtmiPEP171b1 (配列番号59)の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるMtmiPEP171b1の蓄積は、MtmiPEP171b1の蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導する、
真核細胞におけるmiR171b (配列番号319)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
【００９２】
特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるMtmiPEP171b1 (配列番号59)の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるMtmiPEP171b1の蓄積は、MtmiPEP171b1の蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導し、
上記遺伝子が、HAM1（アクセッション番号MtGI9- TC114268）及びHAM2（アクセッション番号MtGI9- TC120850）（メディカゴ  トランカツラ遺伝子発現アトラス(Medicago truncatula Gene Expression Atlas)「MtGEA」データベースでのアクセッション番号）から選択される、
真核細胞におけるmiR171b (配列番号319)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
【００９３】
特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるAtmiPEP165a1 (配列番号24)の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるAtmiPEP164a1の蓄積は、AtmiPEP164a1の蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導する、
真核細胞におけるmiR164a (配列番号297)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
【００９４】
特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるAtmiPEP165a (配列番号43)の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるAtmiPEP165aの蓄積は、AtmiPEP165aの蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導する、
真核細胞におけるmiR165a (配列番号305)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
【００９５】
特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるAtmiPEP319a1 (配列番号76)の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるAtmiPEP319a1の蓄積は、AtmiPEP319a1の蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導する、
真核細胞におけるmiR319a (配列番号331)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
【００９６】
特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるAtmiPEP319a2 (配列番号77)の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるAtmiPEP319a2の蓄積は、AtmiPEP319a2の蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導する、
真核細胞におけるmiR319a (配列番号331)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
【００９７】
特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるAtmiPEP160b1 (配列番号14)の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるAtmiPEP160b1の蓄積は、AtmiPEP160b1の蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導する、
真核細胞におけるmiR160b (配列番号291)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
【００９８】
特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるMtmiPEP169d (配列番号424)の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるMtmiPEP169dの蓄積は、MtmiPEP169dの蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導する、
真核細胞におけるmiR169d (配列番号427)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
【００９９】
特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるMtmiPEP171e (配列番号 63)の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるMtmiPEP171eの蓄積は、MtmiPEP171eの蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導する、
真核細胞におけるmiR171e (配列番号322)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
【０１００】
特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるDmmiPEP1a (配列番号102)の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるDmmiPEP1aの蓄積は、DmmiPEP1aの蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導する、
真核細胞におけるmiR1 (配列番号353)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
【０１０１】
特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるDmmiPEP1b（配列番号103）の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるDmmiPEP1bの蓄積は、DmmiPEP1bの蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導する、
真核細胞におけるmiR1 (配列番号353)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
【０１０２】
特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるDmmiPEP8 (配列番号104)の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるDmmiPEP8の蓄積は、DmmiPEP8の蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導する、
真核細胞におけるmiR8 (配列番号354)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
【０１０３】
特定の実施形態では、本発明は、
真核細胞におけるhsmiPEP155 (配列番号355)の蓄積工程を行うことを含み、
真核細胞におけるhsmiPEP155の蓄積は、hsmiPEP155の蓄積がない遺伝子の発現に対して、遺伝子発現のモジュレーションを誘導する、
真核細胞におけるmiR155 (配列番号358)により調節される遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。
【０１０４】
別の態様では、本発明は、ペプチドが、miPEPをコードするヌクレオチド配列を有するマイクロRNAの一次転写産物の転写とは独立して真核細胞内に存在する、上記で定義したmiPEPと同一のペプチドを含む改変真核細胞に関する。
【０１０５】
本発明において、用語「改変真核細胞」とは、真核細胞が、ペプチドとして、又はmiPEPをコードするベクターとして、の如何を問わず、細胞内に人工的に導入されたmiPEPを含むことを意味する。
細胞内に人工的に導入されたmiPEPに加えて、本発明の改変真核細胞は、miPEPをコードするmiORFに対応する少なくとも1つの核酸も含む。
細胞内に人工的に導入されたmiPEP及びmiORFに加えて、本発明の改変真核細胞は、その一次転写産物がmiORFを含む少なくとも1つのmiRNAも含む。
【０１０６】
１つの実施形態では、本発明は、マイクロRNAが内因性のものである、上記で定義した改変真核細胞に関する。
別の実施形態では、本発明は、マイクロRNAが外因性のものであり、改変真核細胞がマイクロRNAの発現を可能にするベクターを含む、上記で定義した改変真核細胞に関する。
【０１０７】
１つの実施形態では、本発明は、植物細胞である上記で定義した改変真核細胞に関する。
１つの実施形態では、本発明は、植物細胞が、メディカゴ  トランカツラ又はアラビドプシス  タリアナの細胞であり、ペプチドが、
-  配列番号１〜配列番号101、
-  配列番号375〜配列番号386、又は
-  配列番号424
からなるペプチドの群から選択される、上記で定義した改変真核細胞に関する。
【０１０８】
１つの実施形態では、本発明は、植物細胞が、メディカゴ  トランカツラ又はアラビドプシス  タリアナの細胞であり、ペプチドが、配列番号43、配列番号59及び配列番号77からなる群から選択される、上記で定義した改変真核細胞に関する。
１つの実施形態では、本発明は、植物細胞が、メディカゴ  トランカツラ又はアラビドプシス  タリアナの細胞であり、ペプチドが、配列番号59、配列番号24、配列番号43、配列番号76、配列番号77、配列番号14、配列番号424及び配列番号63からなる群から選択される、上記で定義した改変真核細胞に関する。
【０１０９】
１つの実施形態では、本発明は、動物細胞である上記で定義した改変真核細胞に関する。
１つの実施形態では、本発明は、動物細胞がドロソフィラ属動物細胞であり、ペプチドが、配列番号102、配列番号103及び配列番号104からなるペプチドの群から選択される、上記で定義した改変真核細胞に関する。
１つの実施形態では、本発明は、動物細胞がヒト細胞であり、ペプチドが、配列番号355からなる、上記で定義した改変真核細胞に関する。
【０１１０】
別の態様では、本発明は、上記で定義した少なくとも1つの改変真核細胞を含む植物に関する。
また、別の態様では、本発明は、上記で定義した少なくとも1つの改変真核細胞を含む非ヒト動物に関する。
【０１１１】
別の態様では、本発明は、少なくとも、
-  上記で定義したmiPEP、
-  上記miPEPをコードする核酸、又は
-  上記核酸を含むベクター
を含む組成物に関する。
【０１１２】
別の態様では、本発明は、
-  配列番号1〜配列番号101、
-  配列番号375〜配列番号386、又は
-  配列番号424
からなる群から選択される少なくとも1つのmiPEPを含む組成物に関する。
【０１１３】
別の態様では、本発明は、少なくとも、
-  上記で定義したmiPEP、
-  上記miPEPをコードする核酸、又は
-  上記核酸を含むベクター
を含む害虫駆除用組成物に関する。
【０１１４】
別の態様では、本発明は、少なくとも、
-  上記で定義したmiPEP、
-  上記miPEPをコードする核酸、又は
-  上記核酸を含むベクター
を含む植物用薬剤組成物(composition phytopharmaceutique)に関する。
【０１１５】
別の態様では、本発明は、少なくとも、
-  上記で定義したmiPEP、
-  上記miPEPをコードする核酸、又は
-  上記核酸を含むベクター
を含むエリシター組成物(composition elicitrice)に関する。
【０１１６】
「エリシター組成物」とは、優れた共生能、又は熱ストレス、水分ストレス若しくは化学的ストレスのそれらの性質の如何を問わず種々のストレスに対する優れた耐性を植物に付与することができる組成物を指す。
この目的のために、本発明は、植物の成長（成長阻害、又は反対に、成長促進）及び生理的機能（より優れた菌根形成能、より優れた根粒形成能、種々のストレスに対してのより優れた耐性）に作用する組成物にも関する。
特に、本発明は、植物の成長を促進させるための組成物に関する。
【０１１７】
別の態様では、本発明は、少なくとも、
-  上記で定義したmiPEP、
-  上記miPEPをコードする核酸、又は
-  上記核酸を含むベクター
を含む除草用組成物に関する。
【０１１８】
別の態様では、本発明は、少なくとも、
-  上記で定義したmiPEP、
-  上記miPEPをコードする核酸、又は
-  上記核酸を含むベクター
を含む昆虫綱動物駆除用組成物に関する。
【０１１９】
別の態様では、本発明は、好ましくは配列番号24からなるmiPEP164aを活性成分として含む組成物、特に植物衛生用組成物(composition phytosanitaire)に関する。
別の態様では、本発明は、好ましくは配列番号76からなるmiPEP319aを活性成分として含む組成物、特に植物衛生用組成物に関する。
【０１２０】
別の態様では、本発明は、好ましくは配列番号59からなるmiPEP171bを活性成分として含む組成物、特に植物衛生用組成物に関する。
別の態様では、本発明は、好ましくは配列番号43からなるmiPEP165aを活性成分として含む組成物、特に植物衛生用組成物に関する。
【０１２１】
別の態様では、本発明は、好ましくは配列番号77からなるmiPEP319a2を活性成分として含む組成物、特に植物衛生用組成物に関する。
別の態様では、本発明は、好ましくは配列番号14からなるmiPEP160b1を活性成分として含む組成物、特に植物衛生用組成物に関する。
【０１２２】
別の態様では、本発明は、好ましくは配列番号424からなるmiPEP169dを活性成分として含む組成物、特に植物衛生用組成物に関する。
別の態様では、本発明は、好ましくは配列番号63からなるmiPEP171eを活性成分として含む組成物、特に植物衛生用組成物に関する。miPEPの溶解特性は、特に、それらのアミノ酸組成によって決まる。親水性のmiPEPは、水などの水性溶液中に溶解し、容器詰めすることができる。疎水性のmiPEPは、有機溶媒などの溶媒中に溶解し、容器詰めすることができる。
【０１２３】
miPEPを用いる植物の処置について、有機溶媒は、少量では植物に非毒性の溶媒である。すなわち、それらは、植物の発達に対して有害な効果を有しない。限定されないが、有機溶媒は、アセトニトリル及び酢酸から選択することができる。
【０１２４】
また、miPEPは、例えばアセトニトリルと酢酸との混合物のような有機溶媒混合物中に溶解し、容器詰めすることができる。特に、miPEPは、50％アセトニトリル、10％酢酸及び40％水(体積/体積/体積)を含む溶液中に溶解することができる。
好ましくは、miPEP164a及びmiPEP165aは水に溶解し、miPEP171b及びmiPEP319aは50％アセトニトリル、10％酢酸及び40％水(体積/体積/体積)を含む溶液に溶解する。
【０１２５】
限定されないが、上記で定義した組成物、害虫駆除用組成物、植物用薬剤組成物、除草用組成物及び昆虫綱動物駆除用組成物は、10-9 M〜10-4 MのmiPEP、特に10-9 M、10-8 M、10-7 M、10-6 M、10-5 M又は10-4 MのmiPEPを含み得る。
想定される適用に依存して、より高濃度又はより低濃度の組成物が提供されてもよい。例えば、miPEPを散布によって植物に適用しなければならない場合には、10-1 M〜10-3 MのmiPEP、特に10-1 M、10-2 M又は10-3 MのmiPEPを含む組成物が想定され得る。
【０１２６】
別の態様では、本発明は、植物を根絶するか、又はその成長を遅延させるための除草剤としての、好ましくは植物の種又は属に特異的な除草剤としての上記で定義した組成物の使用に関する。
【０１２７】
別の態様では、本発明は、
-植物の成長及び/又は発達を促進するための、
特に植物の生理的パラメータ、特にバイオマス、葉の表面積、開花、果実のサイズ、植物種子の産生及び/又は選択をモジュレートするための、
特に単為結実又は雌雄同体を制御するための、又は
植物種子の生理的パラメータ、特に発芽、根系の根張り及び水分ストレス耐性を改変するための、又は
-植物病害の予防又は治療のための、
特に感染性疾患への耐性を促進するための、
植物用薬剤としての上記で定義した組成物の使用に関する。
【０１２８】
別の態様では、本発明は、植物の生理的パラメータ、特にバイオマス、葉の表面積又は果実のサイズをモジュレートするための、上記で定義した組成物の使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、果実のサイズを大きくすることを目的として果樹をまばらにするための、上記で定義した組成物の使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、植物の単為結実又は雌雄同体を制御するために用いられる、植物種子の産生及び/又は選択のための上記で定義した組成物の使用に関する。
【０１２９】
１つの実施形態では、本発明は、葉又は根を介して植物に投与される、上記で定義した組成物の使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、植物種子の産生及び/又は選択のための、上記で定義した組成物の使用に関する。
【０１３０】
１つの実施形態では、本発明は、植物種子の生理的パラメータ、特に根系の根張り、発芽及び水分ストレス耐性を改変するために用いられる、上記で定義した組成物の使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、植物種子のコーティング又はフィルムコーティングによって適用される、上記で定義した組成物の使用に関する。
【０１３１】
別の態様では、本発明は、植物に有害な生物又はそのように分類され得る生物を根絶するための害虫駆除剤、特に昆虫綱動物駆除剤、クモ綱動物駆除剤、軟体動物門動物駆除剤又はネズミ目動物駆除剤としての、上記で定義した組成物の使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、昆虫綱動物駆除剤としての、上記で定義した組成物の使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、昆虫綱動物の害虫を根絶するための、上記で定義した組成物の使用に関する。
【０１３２】
１つの実施形態では、本発明は、有害なものとして分類される動物種又はそのように分類されがちな動物種、特にネズミ科動物、特にラットを根絶するための、上記で定義した組成物の使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、特に植物又は当該植物に接している支持体に適用することによって、植物に有害であるか又はそのように分類されがちな生物を根絶するための害虫駆除剤、特に昆虫綱動物駆除剤、クモ綱動物駆除剤、軟体動物門動物駆除剤又はネズミ目動物駆除剤としての、上記で定義した組成物の使用に関する。
【０１３３】
別の態様では、本発明は、昆虫綱動物の害虫から植物を保護するために当該植物に適用される、上記で定義した組成物の使用に関する。
別の態様では、本発明は、植物の成長を促進させるためのペプチドの使用であって、
上記ペプチドは、上記植物に導入されており、
上記ペプチドは、上記植物において天然に存在するmiPEPのものと同一の配列を含むか又は当該配列からなるアミノ酸配列を有し、
上記植物において天然に存在する上記miPEPは、その配列がmiRNAの一次転写産物上に位置するオープンリーディングフレームによってコードされる4〜100アミノ酸のペプチドであり、
上記miPEPは、上記植物における上記miRNAの蓄積をモジュレートすることができ、
上記miRNAは、植物の生長部分又は繁殖部分、特に根、茎、葉又は花の発達に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現を調節する、使用に関する。
【０１３４】
驚くべきことに、本発明者らは、その配列が、miRNAの一次転写産物によってコードされるmiPEPのものと同一の配列を含むか又は当該配列からなるペプチドを用いて、植物の成長を促進することができることを見出した。
【０１３５】
本発明において、用語「植物」とは、一般に、発達の段階に拘りなく植物の全体又は部分（種又は若芽(jeune pousse)の形態の植物を含む）、植物の1以上の器官（例えば葉、根、茎、花）、植物の1以上の細胞又は植物細胞のクラスタをいう。
本発明において、用語「成長」とは、時間を経ての、植物の全体又は部分の発達をいう。よって、植物の成長は、植物の特定の部分、細胞又は器官、例えば葉、根、茎又は花について観察可能な発達のパラメータをモニタリングすることによって、測定及び定量され得る。
【０１３６】
限定されないが、植物の成長を測定及び定量するためのパラメータは、特に、
-葉のサイズ、表面積、体積、質量及び数、
-花のサイズ及び数、
-茎（又は穂）のサイズ、
-根の長さ及び数、
-発芽(germination)の早さ
-つぼみ形成(bourgeonnement)の早さ
-開花誘導（又は開花期への移行）の早さ、又は
-細胞数
であり得る。
マメ科植物の場合、植物の成長は、根の根粒形成率又は根粒のサイズ及び数にも関連付けられ得る。
【０１３７】
更に、本発明において、表現「植物の成長の促進」又は「植物の成長の改善」とは、
-  発達の加速化（例えば、参照用植物に対しての、所定の時点における植物の葉のサイズの巨大化等）、
-  発達の増大（例えば、参照用植物では達成できない植物の葉のサイズの巨大化等）、
又は
-  植物の発達における加速化及び増大
のいずれかを示す。
【０１３８】
miPEPは植物において天然に存在するペプチドなので、本発明による使用は、園芸又は農業における慣用の化学的方法と比較して環境に優しいという利点を有することに着目することが重要である。
【０１３９】
また、本発明は、植物の成長を促進するための、当該植物に導入されるmiPEPの使用であって、
上記導入されるmiPEPは、上記植物において天然に存在するmiPEPのものと同一の配列を含むか又は当該配列からなるペプチドであり、
上記天然に存在するmiPEPは、その配列が、miRNAの一次転写産物の5'に位置するオープンリーディングフレームによってコードされる4〜100アミノ酸のペプチドであり、
上記miPEPは、上記植物における上記miRNAの蓄積をモジュレートすることができ、
上記miRNAは、植物の生長部分又は繁殖部分、特に根、茎、葉又は花の発達に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現を調節し、
上記導入されるmiPEP量及び天然に存在するmiPEP量の総和は、天然に存在するmiPEP量よりも厳密に大きい、使用に関する。
【０１４０】
本発明において、表現「導入されるmiPEP」は、「植物において天然に存在するmiPEP」とは反対に、植物に人工的に導入されるmiPEPをいう。したがって、植物へのmiPEPの導入は、自然な現象ではなく、交雑にも選択にも相当しない技術的な工程である。
導入されるmiPEPは、植物の外部で産生されたペプチド（例えば、単離及び/又は精製されたペプチド、合成ペプチド又は組換えペプチド）又はmiPEPをコードする核酸の植物への非自然的導入後の植物において産生されたペプチドのいずれかであり得る。
【０１４１】
miPEPが導入されていない植物は、天然に存在するmiPEP量に相当するmiPEP基底量を有する。miPEPのものと同一の配列を含むか又は当該配列からなるmiPEPの使用は、その一次転写産物がmiPEPをコードする配列を含むmiRNAの蓄積をモジュレートするmiPEPの総量の増大をもたらす。
更に、導入されるmiPEPは、植物において存在し、その導入は、その安定性に対する影響を有しない。
【０１４２】
１つの実施形態では、本発明は、植物の生長部分又は繁殖部分の発達に関与する遺伝子が、NAC1 (アクセッション番号AT1G56010.1)、NAC4 (アクセッション番号AT5G07680.1)、NAC5 (アクセッション番号AT5G61430.1)、CUC1 (アクセッション番号AT3G15170.1)、CUC2 (アクセッション番号AT5G53950.1)、TCP3 (アクセッション番号AT1G53230.1)及びTCP4 (アクセッション番号AT3G15030.1) (アラビドプシス情報資源「TAIR」(The Arabidopsis Information Resource)データベースによるアクセッション番号)からなる群から選択される、上記で定義した使用に関する。
【０１４３】
特に、本発明は、植物の生長部分又は繁殖部分の発達に関与する遺伝子が、NAC1、NAC4、NAC5、CUC1及びCUC2からなる群から選択される、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、植物の生長部分又は繁殖部分の発達に関与する遺伝子が、TCP3及びTCP4からなる群から選択される、上記で定義した使用に関する。
【０１４４】
１つの実施形態では、本発明は、miRNAが、miR164a及びmiR319aから選択される、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miRNAが、miR164a、miR319a、miR171b、miR165a、miR160b、miR169d及びmiR171eから選択される、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、AtmiPEP164a1、AtmiPEP319a1、AtmiPEP319a2、MtmiPEP171b1、AtmiPEP165a1、AtmiPEP160b1、MtmiPEP169d、MtmiPEP171eから選択される、上記で定義した使用に関する。
【０１４５】
特に、本発明は、miR164aが、配列番号297からなるヌクレオチド配列を有する、上記で定義した使用に関する。
特に、本発明は、miR164aが、配列番号297のヌクレオチド配列と少なくとも80％の同一性、好ましくは少なくとも90％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、AtmiPEP164a1であり、特にAtmiPEP164a1が、配列番号24からなるアミノ酸配列を有する上記で定義した使用に関する。
【０１４６】
特に、本発明は、miR319aが、配列番号331からなるヌクレオチド配列を有する、上記で定義した使用に関する。
特に、本発明は、miR319aが、配列番号331のヌクレオチド配列と少なくとも80％の同一性、好ましくは少なくとも90％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、AtmiPEP319a1であり、特にAtmiPEP319a1が、配列番号76からなるアミノ酸配列を有する、上記で定義した使用に関する。
【０１４７】
１つの実施形態では、本発明は、植物が、アラビドプシス  タリアナなどのアブラナ科植物、グリシン  マクス（ダイズ）、メディカゴ  トランカツラ及びメディカゴ  サティバ (アルファルファ)などのマメ科植物又はニコチアナ  ベンサミアナ（タバコ）、ソラナム  ツベロサム（ジャガイモ）、ソラナム  リコパーシカム（トマト）若しくはソラナム  メロンゲナ（ナス）などのナス科植物である、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、植物が、アブラナ科植物である、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、植物が、アラビドプシス  タリアナである、上記で定義した使用に関する。
【０１４８】
１つの実施形態では、本発明は、アラビドプシス  タリアナ種植物の成長を促進するための上記で定義した使用であって、
AtmiPEP164a1は、アラビドプシス  タリアナ種植物に導入され、
AtmiPEP164a1は、アラビドプシス  タリアナ種植物において天然に存在するものでもあり、
導入されるAtmiPEP164a1は、その配列が天然に存在するAtmiPEP164a1のものと同一の配列を含むか又は当該配列からなるペプチドであり、
天然に存在するAtmiPEP164a1の配列は、miR164aの一次転写産物の5'に位置するオープンリーディングフレームによってコードされ、
miR164aは、アラビドプシス  タリアナの生長部分又は繁殖部分の発達に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現を制御し、
導入されるAtmiPEP164a1量及び天然に存在するAtmiPEP164a1量の総和は、アラビドプシス  タリアナ種植物において天然に存在するAtmiPEP164a1量よりも厳密に大きい、使用に関する。
【０１４９】
１つの実施形態では、本発明は、アラビドプシス  タリアナ種植物の成長を促進させるための、上記で定義した使用であって、
AtmiPEP319a1は、アラビドプシス  タリアナ種植物に導入され、
AtmiPEP319a1は、アラビドプシス  タリアナ種植物において天然に存在するものでもあり、
導入されるAtmiPEP319a1は、その配列が天然に存在するAtmiPEP319a1のものと同一の配列を含むか又は当該配列からなるペプチドに導入され、
天然に存在するAtmiPEP319a1の配列は、miR319aの一次転写産物の5'に位置するオープンリーディングフレームによってコードされ、
miR319aは、アラビドプシス  タリアナの生長部分又は繁殖部分の発達に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現を制御し、
導入されるAtmiPEP319a1量及び天然に存在するAtmiPEP319a1量の総和は、アラビドプシス  タリアナ種植物において天然に存在するAtmiPEP319a1量よりも厳密に大きい、使用に関する。
【０１５０】
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、好ましくは散水、噴霧又は肥料、堆肥、培養土又は不活性な支持体を添加することによって、外部から植物に導入される、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、散水及び噴霧することによって導入される、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、散水及び肥料を添加することによって導入される、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、噴霧及び肥料を添加することによって導入される、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、散水、噴霧及び肥料を添加することによって導入される、上記で定義した使用に関する。
【０１５１】
事実、本発明者らは、植物において、対応するmiRNAの蓄積をモジュレートするために、miPEPを含む組成物を植物に直接適用できることを予期せぬことに見出した。このことは、miPEPが、植物によって捕捉されることを示す。
１つの実施形態では、本発明は、植物が、10-9 M〜10-4 MのmiPEPを含む組成物、特に10-9 M、10-8 M、10-7 M、10-6 M、10-5 M又は10-4 MのmiPEPを含む組成物を用いて処置される、上記で定義した使用に関する。
好ましくは、植物に散水又は噴霧することによって適用するために、組成物は、10-8 M〜10-5 Mの濃度を有する。
加えて、より高濃度又はより低濃度の組成物が、miPEPを用いての植物の処置のために想定され得る。限定されないが、例えば、導入される外因性miPEPを散布によって植物に適用する場合には、10-1 M〜10-3 M、特に10-2 MのmiPEPを含む、より高濃度の組成物が用いられ得る。
【０１５２】
１つの実施形態では、本発明は、miPEPをコードする核酸によりmiPEPが植物に導入され、上記核酸が植物に導入される、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物における茎サイズが、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物における茎サイズと比較して増大される、上記で定義した使用に関する。
【０１５３】
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物における葉の数が、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物における葉の数と比較して増大される、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物における葉のサイズが、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物における葉のサイズと比較して増大される、上記で定義した使用に関する。
【０１５４】
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物における根の数が、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物における根の数と比較して増大される、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物における根の長さが、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物における根の長さと比較して増大される、上記で定義した使用に関する。
【０１５５】
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物における根粒形成率が、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物における根粒形成率と比較して増大される、上記で定義した使用に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物における根粒数が、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物における根粒数と比較して増大される、上記で定義した使用に関する。
【０１５６】
miPEPが導入されている植物における成長を測定及び定量するためのパラメータ（例えば茎サイズ、葉の数及びサイズ、根の数及び長さ、根の根粒形成率又は根粒数）の増大は、好ましくは、同一条件下で育ったがmiPEPが何も導入されていない同齢の同じ植物（すなわち、同種及び/又は変種の植物）との比較によって証明される。
【０１５７】
別の態様では、本発明は、植物において天然に存在するものでもあるmiPEPを当該植物に導入する工程を含む、植物の成長を促進するための方法であって、
導入されるmiPEPは、その配列が、天然に存在するmiPEPのものと同一の配列を含むか又は当該配列からなる4〜100アミノ酸のペプチドであり、
天然に存在するmiPEPの配列は、miRNAの一次転写産物の5'に位置するオープンリーディングフレームによってコードされ、
miPEPは、miRNAの蓄積をモジュレートすることができ、
miRNAは、植物の生長部分又は繁殖部分、特に根、茎、葉又は花の発達に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現を調節し、
導入されるmiPEP量及び天然に存在するmiPEP量の総和が、天然に存在するmiPEPの量よりも厳密に大きい、方法に関する。
【０１５８】
１つの実施形態では、本発明は、植物の生長部分又は繁殖部分の発達に関与する遺伝子が、NAC1 (アクセッション番号AT1G56010.1)、NAC4 (アクセッション番号AT5G07680.1)、NAC5 (アクセッション番号AT5G61430.1)、CUC1 (アクセッション番号AT3G15170.1)、CUC2 (アクセッション番号AT5G53950.1)、TCP3 (アクセッション番号AT1G53230.1)及びTCP4 (アクセッション番号AT3G15030.1)からなる群から選択される、上記で定義した方法に関する。
特に、本発明は、植物の生長部分又は繁殖部分の発達に関与する遺伝子が、NAC1、NAC4、NAC5、CUC1及びCUC2からなる群から選択される、上記で定義した方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、植物の生長部分又は繁殖部分の発達に関与する遺伝子が、TCP3及びTCP4からなる群から選択される、上記で定義した方法に関する。
【０１５９】
１つの実施形態では、本発明は、miRNAが、miR164a、miR319a、miR171b、miR165a、miR160b、miR169d及びmiR171eから選択される、上記で定義した方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、AtmiPEP164a1、AtmiPEP319a1、AtmiPEP319a2、MtmiPEP171b1、AtmiPEP165a1、AtmiPEP160b1、MtmiPEP169d、MtmiPEP171eから選択される、上記で定義した方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miRNAがmiR164aであり、特にmiR164aが配列番号297からなるヌクレオチド配列を有する、上記で定義した方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPがAtmiPEP164a1であり、特にAtmiPEP164a1が配列番号24からなるアミノ酸配列を有する、上記で定義した方法に関する。
【０１６０】
１つの実施形態では、本発明は、miRNAがmiR319aであり、特にmiR319aが配列番号331からなるヌクレオチド配列を有する、上記で定義した方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPがAtmiPEP319a1であり、特にAtmiPEP319a1が配列番号76からなるアミノ酸配列を有する、上記で定義した方法に関する。
【０１６１】
１つの実施形態では、本発明は、植物が、アラビドプシス  タリアナなどのアブラナ科植物、グリシン  マクス（ダイズ）、メディカゴ  トランカツラ及びメディカゴ  サティバ (アルファルファ)などのマメ科植物又はニコチアナ  ベンサミアナ（タバコ）、ソラナム  ツベロサム（ジャガイモ）、ソラナム  リコパーシカム（トマト）若しくはソラナム  メロンゲナ（ナス）などのナス科植物である、上記で定義した方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、植物がアブラナ科植物である、上記で定義した方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、植物がアラビドプシス  タリアナである、上記で定義した方法に関する。
【０１６２】
１つの実施形態では、本発明は、アラビドプシス  タリアナ種植物の成長を促進するための、上記で定義した方法であって、
AtmiPEP164a1は、アラビドプシス  タリアナ種植物に導入され、
AtmiPEP164a1は、アラビドプシス  タリアナ種植物において天然に存在するものでもあり、
導入されるAtmiPEP164a1は、その配列がmiR164aの一次転写産物の5'に位置するオープンリーディングフレームによってコードされる4〜100アミノ酸のペプチドである天然に存在するAtmiPEP164a1のものと同一の配列を含むか又は当該配列からなるペプチドであり、
AtmiPEP164a1は、アラビドプシス  タリアナの生長部分又は繁殖部分の発達に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現を調節するmiR164a蓄積を増大させることができ、
導入されるAtmiPEP164a1量及び天然に存在するAtmiPEP164a1量の総和は、天然に存在するAtmiPEP164a1量よりも厳密に大きい、方法に関する。
【０１６３】
１つの実施形態では、本発明は、アラビドプシス  タリアナ種植物の成長を促進するための、上記で定義した方法であって、
AtmiPEP319a1は、アラビドプシス  タリアナ種植物に導入され、
AtmiPEP319a1は、アラビドプシス  タリアナ種植物において天然に存在するものでもあり、
導入されるAtmiPEP319a1は、その配列がmiR319aの一次転写産物の5'に位置するオープンリーディングフレームによってコードされる4〜100アミノ酸のペプチドである天然に存在するAtmiPEP319a1のものと同一の配列を含むか又は当該配列からなるペプチドであり、
AtmiPEP319a1は、アラビドプシス  タリアナの生長部分又は繁殖部分の発達に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現を調節するmiR319aの蓄積を増大させることができ、
導入されるAtmiPEP319a1量及び天然に存在するAtmiPEP319a1量の総和は、天然に存在するAtmiPEP319a1量よりも厳密に大きい、方法に関する。
【０１６４】
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、好ましくは肥料、堆肥、培養土又は不活性な支持体を散水、噴霧又は添加することによって、外部から植物に導入される、上記で定義した方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、10-9 M〜10-4 MのmiPEPを含む組成物、特に10-9、10-8、10-7、10-6、10-5又は10-4 MのmiPEPを含む組成物の形態で植物に投与される、上記で定義した方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、当該miPEPをコードする核酸により植物に導入され、上記の核酸が植物に導入される、上記で定義した方法に関する。
【０１６５】
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の茎サイズが、miPEPが何も導入されていないか又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の茎サイズと比べて増大される、上記で定義した方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の葉の数が、miPEPが何も導入されていないか又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の葉の数と比べて増大される、上記で定義した方法に関する。
【０１６６】
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の葉のサイズが、miPEPが何も導入されていないか又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の葉のサイズと比べて増大される、上記で定義した方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の根の数が、miPEPが何も導入されていないか又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の根の数と比べて増大される、上記で定義した方法に関する。
【０１６７】
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の根の長さが、miPEPが何も導入されていないか又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の根の長さと比べて増大される、上記で定義した方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の根粒形成率が、miPEPが何も導入されていないか又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の根粒形成率と比べて増大される、上記で定義した方法に関する。
【０１６８】
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の根粒数が、miPEPが何も導入されていないか又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の根粒数と比べて増大される、上記で定義した方法に関する。
別の態様では、本発明は、植物の成長を促進するための上記で定義した使用又は方法に従ってmiPEPが導入されている植物に関する。
【０１６９】
別の態様では、本発明は、
a)miPEPの発現を可能にする条件下で、植物に、又は植物の少なくとも1つの細胞に、4〜100アミノ酸のmiPEPをコードする核酸を導入する工程であって、
上記miPEPは、上記植物において天然に存在するものでもあり、
上記天然に存在するmiPEPは、その配列がmiRNAの一次転写産物の5'に位置するオープンリーディングフレームによってコードされるペプチドであり、
上記miPEPは、植物における上記miRNAの蓄積をモジュレートすることができ、
上記miRNAは、植物の生長部分又は繁殖部分、特に根、茎、葉又は花の発達に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現を調節する、工程と、
b)トランスジェニック植物の取得を可能にする条件下で、工程a)において得られた植物又は植物の少なくとも1つの細胞を培養する工程と
を含む、トランスジェニック植物を製造する方法に関する。
【０１７０】
別の態様では、本発明は、
a)miPEPの発現を可能にする条件下で、植物に、又は植物の少なくとも1つの細胞に、4〜100アミノ酸又は3アミノ酸のmiPEPをコードする核酸を導入する工程であって、
上記miPEPは、上記植物において天然に存在するものでもあり、
上記天然に存在するmiPEPは、その配列がmiRNAの一次転写産物の5'に位置するオープンリーディングフレームによってコードされるペプチドであり、
上記miPEPは、植物における上記miRNAの蓄積をモジュレートすることができ、
上記miRNAは、植物の生長部分又は繁殖部分、特に根、茎、葉又は花の発達に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現を調節する、工程と、
b)トランスジェニック植物の取得を可能にする条件下で、工程a)において得られた植物又は植物の少なくとも1つの細胞を培養する工程と
を含む、トランスジェニック植物を製造する方法に関する。
【０１７１】
別の態様では、本発明は、
a)miPEPの発現を可能にする条件下で、植物に、又は植物の少なくとも1つの細胞に、3アミノ酸のmiPEPをコードする核酸を導入する工程であって、
上記miPEPは、上記植物において天然に存在するものでもあり、
上記天然に存在するmiPEPは、その配列がmiRNAの一次転写産物の5’に位置するオープンリーディングフレームによってコードされるペプチドであり、
上記miPEPは、植物における上記miRNAの蓄積をモジュレートすることができ、
上記miRNAは、植物の生長部分又は繁殖部分、特に根、茎、葉又は花の発達に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現を調節する、工程と、
b)トランスジェニック植物の取得を可能にする条件下で、工程a)において得られた植物又は植物の少なくとも1つの細胞を培養する工程と
を含む、トランスジェニック植物を製造する方法に関する。
【０１７２】
１つの実施形態では、本発明は、核酸が導入されていない同一の植物と比較して、工程b)において得られたトランスジェニック植物の成長が改善されている、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、植物に導入される核酸によってコードされるmiPEPの発現が、核酸が導入されていない同一の植物と比較して、成長の改善をもたらす、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
【０１７３】
１つの実施形態では、本発明は、工程a)が、核酸を含むベクター、好ましくはプラスミドを用いて行われる、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、工程a)の核酸の発現が、強力なプロモータ、好ましくは強力な構成性プロモータ、例えば35Sプロモータの制御下に置かれている、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
【０１７４】
１つの実施形態では、本発明は、植物の生長部分又は繁殖部分の発達に関与する遺伝子が、NAC1 (アクセッション番号 AT1G56010.1)、NAC4 (アクセッション番号AT5G07680.1)、NAC5 (アクセッション番号AT5G61430.1)、CUC1 (アクセッション番号AT3G15170.1)、CUC2 (アクセッション番号AT5G53950.1)、TCP3 (アクセッション番号AT1G53230.1)及びTCP4 (アクセッション番号AT3G15030.1)からなる群から選択される、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
【０１７５】
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、配列番号1〜配列番号101及び配列番号375〜配列番号386からなる群から選択される配列を含むか又は当該配列からなるアミノ酸配列を有する、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、
-  配列番号1〜配列番号101、
-  配列番号375〜配列番号386、又は
-  配列番号424
からなる群から選択される配列を含むか又は当該配列からなるアミノ酸配列を有する、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
【０１７６】
１つの実施形態では、本発明は、miRNAがmiR164aであり、特にmiR164aが配列番号297からなるヌクレオチド配列を有する、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPがAtmiPEP164a1であり、特にAtmiPEP164a1が配列番号24からなるアミノ酸配列を有する、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
【０１７７】
１つの実施形態では、本発明は、miRNAがmiR319aであり、特にmiR319aが配列番号331からなるヌクレオチド配列を有する、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPがAtmiPEP319a1であり、特にAtmiPEP319a1が配列番号76からなるアミノ酸配列を有する、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
【０１７８】
１つの実施形態では、本発明は、工程a)において導入される核酸が、配列番号128及び配列番号180から選択されるヌクレオチド配列を含む、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
【０１７９】
１つの実施形態では、本発明は、植物が、アラビドプシス  タリアナなどのアブラナ科植物、グリシン  マクス（ダイズ）、メディカゴ  トランカツラ及びメディカゴ  サティバ(アルファルファ)などのマメ科植物又はニコチアナ  ベンサミアナ（タバコ）、ソラナム  ツベロサム（ジャガイモ）、ソラナム  リコパーシカム（トマト）若しくはソラナム  メロンゲナ（ナス）などのナス科植物である、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、トランスジェニック植物がアブラナ科植物である、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、トランスジェニック植物がアラビドプシス  タリアナである、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
【０１８０】
１つの実施形態では、本発明は、
a)AtmiPEP164a1の発現を可能にする条件下において、配列番号24のアミノ酸配列からなるAtmiPEP164a1をコードする配列番号128のヌクレオチド配列を含む核酸を、アラビドプシス  タリアナ種植物に、又はアラビドプシス  タリアナ種植物の少なくとも1つの細胞に導入する工程であって、
上記AtmiPEP164a1は、上記のアラビドプシス  タリアナ種植物において天然に存在するものでもあり、
上記天然に存在するmiPEPは、その配列がmiR164aの一次転写産物の5'に位置するオープンリーディングフレームによってコードされるペプチドであり、
上記AtmiPEP164a1は、上記miR164の蓄積をモジュレートすることができ、
上記miR164aは、アラビドプシス  タリアナの生長部分又は繁殖部分の発達に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現を制御する、工程と、
b)トランスジェニックアラビドプシス  タリアナ種植物の取得を可能にする条件下で、工程a)において得られた植物又は植物の少なくとも1つの細胞を培養する工程と
を含む、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
【０１８１】
１つの実施形態では、本発明は、
a)AtmiPEP319a1の発現を可能にする条件下において、配列番号76のアミノ酸配列からなるAtmiPEP319a1をコードする配列番号180のヌクレオチド配列を含む核酸を、アラビドプシス  タリアナ種植物に、又はアラビドプシス  タリアナ種植物の少なくとも1つの細胞に導入する工程であって、
上記AtmiPEP319a1は、上記のアラビドプシス  タリアナ種植物において天然に存在するものでもあり、
上記天然に存在するmiPEPは、その配列がmiR319aの一次転写産物の5’に位置するオープンリーディングフレームによってコードされるペプチドであり、
上記AtmiPEP319a1は、上記miR319の蓄積をモジュレートすることができ、
上記miR319aは、アラビドプシス  タリアナの生長部分又は繁殖部分の発達に関与する
少なくとも1つの遺伝子の発現を調節する、工程と、
b)トランスジェニックアラビドプシス  タリアナ種植物の取得を可能にする条件下で、工程a)において得られた植物又は植物の少なくとも1つの細胞を培養する工程と
を含む、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
【０１８２】
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、当該miPEPをコードする核酸により植物に導入され、上記の核酸が植物に導入される、上記で定義した製造方法に関する。
【０１８３】
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の茎サイズが、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の茎サイズと比べて増大される、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の葉の数が、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の葉の数と比べて増大される、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
【０１８４】
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の葉のサイズが、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の葉のサイズと比べて増大される、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の根の数が、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の根の数と比べて増大される、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
【０１８５】
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の根の長さが、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の根の長さと比べて増大される、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の根粒形成率が、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の根粒形成率と比べて増大される、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
【０１８６】
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが導入されている植物の根粒数が、miPEPが何も導入されていないか、又は上記のmiPEPが導入されていない同齢の同じ植物の根粒数と比べて増大される、上記で定義したトランスジェニック植物の製造方法に関する。
【０１８７】
また、１つの態様では、本発明は、上記で定義した製造方法によって得られるトランスジェニック植物に関する。
別の態様では、本発明は、miPEPをコードするベクターを含むトランスジェニック植物であって、
上記miPEPは、上記の植物において天然に存在するものでもあり、
上記天然に存在するmiPEPは、その配列がmiRNAの一次転写産物の5'部分に位置するオープンリーディングフレームによってコードされるペプチドであり、
上記miPEPは、植物における上記miRNAの蓄積をモジュレートすることができ、
上記miRNAは、少なくとも1つの遺伝子の発現を調節し、
植物に導入されるベクターによってコードされる上記miPEPの発現は、核酸が導入されていない同一の植物と比べて上記遺伝子の発現のモジュレーションをもたらす、トランスジェニック植物に関する。
【０１８８】
１つの実施形態では、本発明は、遺伝子が、植物の生長部分又は繁殖部分、特に根、茎、葉又は花の発達に関与し、植物に導入された核酸によってコードされるmiPEPの発現が、核酸が導入されていない同一の植物と比較して当該トランスジェニック植物の成長の改善をもたらす、上記で定義したトランスジェニック植物に関する。
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、
-  配列番号1〜配列番号101、
-  配列番号375〜配列番号386、又は
-  配列番号424
からなる群から選択される、上記で定義したトランスジェニック植物に関する。
【０１８９】
別の態様では、本発明は、ベクターを含むトランスジェニック植物であって、
上記ベクターは、miRNAの一次転写産物の発現を可能にする核酸を含み、
上記miRNAの一次転写産物は、miPEPをコードするオープンリーディングフレームを含み、
上記miPEPは、植物におけるmiRNAの蓄積をモジュレートすることができ、
上記miRNAは、植物において少なくとも1つの遺伝子の発現を調節し、
植物に導入されるベクターによりコードされるmiPEPの発現は、核酸が導入されていない同一の植物と比べて、上記遺伝子の発現のモジュレーションをもたらす、トランスジェニック植物に関する。
【０１９０】
１つの実施形態では、本発明は、核酸が内因性のものである、上記で定義したトランスジェニック植物に関する。
核酸が内因性のものである場合、少なくとも1コピーの核酸は、植物に導入されるベクターとは独立して、当該植物内において既に天然に存在している。
【０１９１】
１つの実施形態では、本発明は、核酸が外因性のものである、上記で定義したトランスジェニック植物に関する。
核酸が外因性のものである場合、既に植物内において天然に存在する当該核酸のコピーはない。
１つの実施形態では、本発明は、遺伝子が、植物の生長部分又は繁殖部分、特に根、茎、葉又は花の発達に関与し、植物に導入される核酸によってコードされるmiPEPの発現は、核酸が導入されていない同一の植物と比較して当該トランスジェニック植物の成長の改善をもたらす、上記で定義したトランスジェニック植物に関する。
【０１９２】
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、
-  配列番号1〜配列番号101、
-  配列番号375〜配列番号386、又は
-  配列番号424
からなる群から選択される、上記で定義したトランスジェニック植物に関する。
【０１９３】
別の態様では、本発明は、植物種子の所定量と、その配列が当該植物において天然に存在するmiPEPのものと同一の配列を含むか又は当該配列からなるペプチドの所定量とを組み合わせて含む組成物に関する。
【０１９４】
１つの実施形態では、本発明は、miPEPが、
-  配列番号1〜配列番号101、
-  配列番号375〜配列番号386、又は
-  配列番号424
からなる群から選択される、上記で定義した組成物に関する。
【０１９５】
１つの実施形態では、本発明は、植物、特にA. タリアナの種子の所定量と、その配列がAtmiPEP164a1のものと同一の配列を含むか又は当該配列からなるペプチドの所定量とを組み合わせて含む組成物に関する。
１つの実施形態では、本発明は、植物、特にA. タリアナの種子の所定量と、その配列がAtmiPEP319a1のものと同一の配列を含むか又は当該配列からなるペプチドの所定量とを組み合わせて含む組成物に関する。
１つの実施形態では、本発明は、植物、特にM. トランカツラの種子の所定量と、その配列がMtmiPEP171bのものと同一の配列を含むか又は当該配列からなるペプチドの所定量とを組み合わせて含む組成物に関する。
【０１９６】
１つの実施形態では、本発明は、コーティング種子を形成するように製剤化された、上記で定義した組成物に関する。
コーティングは、アグリ-食品産業において慣用の方法によって行うことができ、溶媒又は土壌、例えばバインダ又は粘土中で分解可能な材料を用いて達成することができる。
【０１９７】
本発明によれば、コーティングは、例えばmiPEPの組成物又はmiPEPと組み合わせた種子の組成物に特定の性質を付与するために用いることができる。
１つの実施形態では、本発明は、MtmiPEP171bを含むコーティング種子を形成するように製剤化された、上記で定義した組成物に関する。
１つの実施形態では、本発明は、AtmiPEP164a1を含むコーティング種子を形成するように製剤化された、上記で定義した組成物に関する。
１つの実施形態では、本発明は、AtmiPEP319a1を含むコーティング種子を形成するように製剤化された、上記で定義した組成物に関する。
【０１９８】
別の態様では、本発明は、少なくとも、
-  上記で定義したmiPEP、
-  上記miPEPをコードする核酸、又は
-  上記核酸を含むベクター
と、医薬的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
【０１９９】
別の態様では、本発明は、少なくとも、
-  上記で定義したmiPEP、
-  上記miPEPをコードする核酸、又は
-  上記核酸を含むベクター
を含む、特にヒト又は動物用の医薬として用いるための組成物に関する。
本発明の組成物の使用は、ヒトの医療及び獣類の医療において適用可能である。
【０２００】
別の態様では、本発明は、少なくとも、
-  上記で定義したmiPEP、
-  上記miPEPをコードする核酸、又は
-  上記核酸を含むベクター
を含む、患者の遺伝子の発現の脱調節に関連付けられる疾患の予防及び/又は治療に用いるための組成物であって、
上記遺伝子の発現は、その蓄積が上記miPEPによってモジュレートされるマイクロRNAによって調節される、組成物に関する。
【０２０１】
１つの実施形態では、本発明は、疾患が、がん、糖尿病、肥満、感染性疾患及び神経変性疾患から選択される、上記で定義した組成物に関する。
１つの実施形態では、本発明は、疾患が、がん、糖尿病、肥満、感染性疾患、神経変性疾患、循環器疾患(maladies cardiovasculaires)及び自己免疫疾患から選択される、上記で定義した組成物に関する。
１つの実施形態では、本発明は、疾患が、がん、糖尿病、肥満、感染性疾患、神経変性疾患、循環器疾患及び自己免疫疾患から選択される、上記で定義した組成物に関する。
１つの実施形態では、本発明は、疾患が、循環器疾患及び自己免疫疾患から選択される、上記で定義した組成物に関する。
【０２０２】
別の態様では、本発明は、少なくとも、
-  上記で定義したmiPEP、
-  上記miPEPをコードする核酸、又は
-  上記核酸を含むベクター
を含む、動物又はヒトの寄生生物感染の予防及び/又は治療に用いるための組成物であって、
上記寄生生物は、その蓄積が上記miPEPによってモジュレートされるマイクロRNAによって、その発現が調節される遺伝子を有する、組成物に関する。
【０２０３】
別の態様では、本発明は、医薬として用いるための、真核細胞におけるマイクロRNAの
蓄積をモジュレートすることができ、マイクロRNAの一次転写産物に含まれるヌクレオチ
ド配列によってコードされる4〜100アミノ酸又は3アミノ酸のmiPEPに関する。
【０２０４】
別の態様では、本発明は、miPEPを特異的に認識する抗体に関する。
特に、本発明は、AtmiPEP165aを特異的に認識する抗体に関する。
特に、本発明は、MtmiPEP171bを特異的に認識する抗体に関する。
特に、本発明は、AtmiPEP164a1を特異的に認識する抗体に関する。
特に、本発明は、AtmiPEP319a1を特異的に認識する抗体に関する。
【０２０５】
このような抗体は、当業者に公知の方法によって、例えば、動物による免疫反応及び抗体産生を惹起するために非ヒト動物にmiPEPを注入することによって、取得することができる。
【０２０６】
別の態様では、本発明は、miPEPを特異的に認識する抗体を用いて、植物からの生物試料を標識する工程を含む、miPEPの免疫染色方法(un procede d'immunolocalisation)に関する。
特に、本発明は、AtmiPEP165aを特異的に認識する抗体を用いるAtmiPEP165aの免疫染色方法に関する。
特に、本発明は、MtmiPEP171bを特異的に認識する抗体を用いるMtmiPEP171bの免疫染色方法に関する。
特に、本発明は、AtmiPEP164a1を特異的に認識する抗体を用いるAtmiPEP164a1の免疫染色方法に関する。
特に、本発明は、AtmiPEP319a1を特異的に認識する抗体を用いるMtmiPEP319a1の免疫染色方法に関する。
【０２０７】
別の態様では、本発明は、医薬として用いるための、本発明のmiPEPを特異的に認識する抗体に関する。
別の態様では、本発明は、本発明のmiPEPを特異的に認識する抗体と、医薬的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
【０２０８】
別の態様では、本発明は、その配列が、上記で定義したmiPEPのものと同一の配列を含むか又は当該配列からなる組換えペプチドをコードする発現ベクターで生体を形質転換する工程を含む、組換えペプチドを製造する方法に関する。
１つの実施形態では、生体は、細菌、酵母、(酵母以外の）菌類、動物細胞、植物及び動物を含む群から選択される。
１つの実施形態では、生体は、エシェリシア  コリ(Escherichia coli)である。
【０２０９】
特に、本発明は、
-組換えペプチドをコードする核酸を、タグ、例えばGSTをコードする核酸に結合させる工程と、
-組換えペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターをE. コリ細菌に導入する工程と、-発現ベクターを含むE. コリ細菌をLB培地中で、好ましくは0.2〜0.4のODまで培養する工程と、
-好ましくは4〜5時間、IPTGで組換えペプチドの産生を誘導する工程と、
-E. コリ細菌を遠心分離して溶菌する工程と、
-上清を濾過する工程と、
-グルタチオンセファロースアフィニティカラムで組換えペプチドを精製する工程と、
-必要に応じて、プロテアーゼを用いてGSTを切断する工程と
を含む、上記で定義した組換えペプチドを製造する方法に関する。
【０２１０】
miPEP、miORF、miRNA及びmiRNAの一次転写産物の全ての配列を表1、2、3、4、5及び6に示す。
表7は、pri-miR171bの種々の領域のDNA配列についての多型解析を表す（ハプロタイプは、他のハプロタイプと少なくとも1つのアミノ酸が異なるときに定義される）。
【表１−１】
2019170379.tif 000002
【表１−２】
2019170379.tif 000003
【表１−３】
2019170379.tif 000004
【表１−４】
2019170379.tif 000005
【表１−５】
2019170379.tif 000006
【表１−６】
2019170379.tif 000007
【表１−７】
2019170379.tif 000008
【表１−８】
2019170379.tif 000009
【表１−９】
2019170379.tif 000010
【表２−１】
2019170379.tif 000011
【表２−２】
2019170379.tif 000012
【表２−３】
2019170379.tif 000013
【表２−４】
2019170379.tif 000014
【表２−５】
2019170379.tif 000015
【表２−６】
2019170379.tif 000016
【表２−７】
2019170379.tif 000017
【表２−８】
2019170379.tif 000018
【表３−１】
2019170379.tif 000019
【表３−２】
2019170379.tif 000020
【表３−３】
2019170379.tif 000021
【表３−４】
2019170379.tif 000022
【表３−５】
2019170379.tif 000023
【表３−６】
2019170379.tif 000024
【表３−７】
2019170379.tif 000025
【表３−８】
2019170379.tif 000026
【表３−９】
2019170379.tif 000027
【表３−１０】
2019170379.tif 000028
【表３−１１】
2019170379.tif 000029
【表３−１２】
2019170379.tif 000030
【表３−１３】
2019170379.tif 000031
【表３−１４】
2019170379.tif 000032
【表３−１５】
2019170379.tif 000033
【表３−１６】
2019170379.tif 000034
【表３−１７】
2019170379.tif 000035
【表３−１８】
2019170379.tif 000036
【表３−１９】
2019170379.tif 000037
【表３−２０】
2019170379.tif 000038
【表３−２１】
2019170379.tif 000039
【表３−２２】
2019170379.tif 000040
【表３−２３】
2019170379.tif 000041
【表３−２４】
2019170379.tif 000042
【表３−２５】
2019170379.tif 000043
【表３−２６】
2019170379.tif 000044
【表３−２７】
2019170379.tif 000045
【表４−１】
2019170379.tif 000046
【表４−２】
2019170379.tif 000047
【表４−３】
2019170379.tif 000048
【表４−４】
2019170379.tif 000049
【表４−５】
2019170379.tif 000050
【表５】
2019170379.tif 000051
【表６】
2019170379.tif 000052
【表７】
2019170379.tif 000053
【０２１１】
以下の図及び実施例は本発明をより詳細に説明するが、その範囲を限定するものではない。
【０２１２】
図1．HAM1及びHAM2遺伝子の発現（A）又はM. トランカツラにおける側根数（B）に対するMtmiR171b（メディカゴ  トランカツラで同定されたmiR171b）の過剰発現の効果
(A) Y軸は、コントロール植物（白色カラム）又はMtmiR171bを過剰発現する植物（黒色カラム）におけるMtmiR171b（左カラム）、HAM1（中央カラム）又はHAM2 （右カラム）の相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝10）に相当する。MtmiR171bの過剰発現は、HAM1及びHAM2遺伝子の発現減少を誘導する。
(B) Y軸は、コントロール植物（白色カラム）又はMtmiR171bを過剰発現する植物（黒色カラム）において観察された側根の平均数を示す。エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝100）に相当する。MtmiR171bの過剰発現は、側根数の減少をもたらす。
【０２１３】
図2 ．M. トランカツラにおけるMtmiR171bの発現並びにHAM1及びHAM2遺伝子の発現（A）又は側根数（B）に対するMtmiPEP171b1の過剰発現の効果
(A) Y軸は、コントロール植物（白色カラム）又はMtmiPEP171b1を過剰発現する植物（黒色カラム）におけるMtmiPEP171b1 (左側のグラフ)、miR171b (右側のグラフ、左カラム)、又はHAM1 (アクセッション番号MtGI9- TC114268) (右側のグラフ、中央カラム)又はHAM2 (アクセッション番号MtGI9- TC120850) (右側のグラフ、右カラム)の相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝10）に相当する。MtmiPEP171b1の過剰発現は、MtmiR171bの蓄積増大並びにHAM1及びHAM2遺伝子の発現減少を誘導する。
(B) Y軸は、コントロール植物（白色カラム）又はMtmiPEP171b1を過剰発現する植物（黒色カラム）において観察された側根の平均数を示す。エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝100）に相当する。MtmiPEP171b1の過剰発現は、側根数の減少をもたらす。
【０２１４】
図3 ．M. トランカツラにおけるMtmiR171bの発現、HAM1及びHAM2遺伝子の発現（A）並びに側根数（B）に対するMtmiPEP171b1の効果
(A) Y軸は、コントロール植物（白色カラム）又は１日１回、5日間の散水によって0.01 μM (明灰色カラム)、0.1 μM (暗灰色カラム)又は1 μM (黒色カラム)のMtmiPEP171b1で処置した植物におけるMtmiR171b(左カラム)、HAM1(中央カラム)又はHAM2(右カラム)の相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝10）に相当する。種々の濃度のMtmiPEP171b1の適用は、MtmiR171bの蓄積増大並びにHAM1及びHAM2遺伝子の発現減少を誘導する。
(B) Y軸は、コントロール植物（白色カラム）又は１日１回、5日間の散水によって0.1μMのMtmiPEP171b1で処置した植物（黒色カラム）において観察された側根の平均数を示す。エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝100）に相当する。0.1 μMのMtmiPEP171b1の適用は、側根数の減少をもたらす。
(C) Y軸は、コントロール植物（白色カラム）或いは１日１回、5日間の散水によって0.01 μM (灰色カラム)、0.1 μM (暗灰色カラム)若しくは1 μM(黒色カラム)のMtmiPEP171b1又はそのアミノ酸組成がmiPEP171bと同一であるがその配列が異なる0.01μMのスクランブルペプチド（LIVSHLYSEKFDCMRKILRI、配列番号428）（明灰色カラム）で処置した植物におけるMtmiR171b（左カラム）、HAM1（中央カラム）又はHAM2（右カラム）の相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝10）に相当する。
【０２１５】
図4 ．M. トランカツラにおけるpre-MtmiR171b (A)及びMtmiR171b（B）の発現に対するMtmiPEP171b1の効果
Y軸は、コントロール植物（左カラム）又は１日１回、5日間の散水によって0.01 μM、0.1 μM又は1 μMのMtmiPEP171b1で処置した植物(右カラム)のマイクロRNAの種々の形態にある前駆体の相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝200）に相当する。種々の濃度のMtmiPEP171b1の適用は、pre-MtmiR171b (A)及びMtmiR171b (B)の蓄積増大をもたらす。
【０２１６】
図5．M. トランカツラにおける種々のマイクロRNA前駆体の発現に対するMtmiPEP171b1の過剰発現の効果(A)及びMtmiPEP171b1の効果(B)
Y軸は、MtmiPEP171b1を過剰発現する植物におけるマイクロRNA前駆体の発現と、コントロールの根における当該前駆体の発現との比（A）又はMtmiPEP171b1 (0.1 μM)で処置された植物におけるマイクロRNA前駆体の発現と、コントロールの根における当該前駆体の発現との比（B）を示す。試験された種々のマイクロRNA前駆体をx軸の左から右に示す。
すなわち、pre-MtmiR171b (配列番号246) 、pre-MtmiR169 (配列番号359)、pre-MtmiR169a (配列番号360)、pre-MtmiR171a (配列番号361)、pre-MtmiR171h (配列番号362)、pre-MtmiR393a (配列番号363)、pre-MtmiR393b (配列番号364)、pre-MtmiR396a (配列番号365)及びpre-MtmiR396b (配列番号366)である。エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝10）に相当する。MtmiPEP171b1は、MtmiR171b蓄積に対してのみ効果をもたらし、その他のmiRNAに対しては効果をもたらさないことが注目される。
【０２１７】
図6．モデル植物ニコチアナ  ベンサミアナにおいて示された、MtmiR171bの発現に対するMtmiPEP171b1の翻訳の効果
Y軸は、pri-MtmiR171b（白色カラム）又はATGコドンがATTで置き換えられた変異型pri-MtmiR171b（黒色カラム）を発現させるために形質転換されたタバコ植物におけるMtmiR171bの相対的発現を示す。したがって、変異型pri-MtmiR171bは、MtmiPEP171b1を産生することができない。エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝30）に相当する。MtmiPEP171b1が翻訳されないことにより、miR171b蓄積が著しく低減することが注目される。
【０２１８】
図7．モデル植物ニコチアナ  ベンサミアナにおいて示された、pre-MtmiR171bの発現に対するMtmiPEP171b1の過剰発現の効果
Y軸は、MtmiR171b(左カラム)、MtmiR171b及びMtmiPEP171b1(中央カラム)、又は、MtmiR171b及び開始コドンATGがATTで置き換えられた変異型MtmiORF171b（右カラム）を発現させるために形質転換されたタバコ植物におけるpre-MtmiR171bの相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝30）に相当する。MtmiPEP171b1の発現はMtmiR171bの発現を増大させるが、この効果はMtmiORF171bからMtmiPEP171b1への翻訳に依存することが注目される。
【０２１９】
図8．モデル植物ニコチアナ  ベンサミアナにおいて示された、pre-MtmiR171bの発現に対するMtmiPEP171b1の効果
Y軸は、MtmiPEP171b1（0.1μM）がサンプリングの12時間前及び30分前に2回噴霧されたか（右カラム）又は噴霧されなかった（左カラム）、MtmiR171bを発現させるために形質転換されたタバコ植物におけるMtmiR171bの相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝6）に相当する。噴霧によって適用されるペプチドMtmiPEP171b1は、MtmiR171bの蓄積増大を誘導する。
【０２２０】
図9．モデル植物ニコチアナ  ベンサミアナにおいて示された、pri-miR171b (A)、pre-MtmiR171b (B)及びMtmiR171b (C)の発現に対するMtmiPEP171b1の効果
Y軸は、MtmiR171bを発現するために改変されたタバコ植物(左カラム)、又はMtmiR171bを発現し、MtmiPEP171b1を過剰発現するために改変されたタバコ植物(右カラム、図9A)、又は0.1μMのmiPEP171b1で処置されたタバコ植物(図9B及びC)における種々の形態にあるマイクロRNA前駆体の相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝30）に相当する。MtmiPEP171b1の過剰発現又はmiPEP171b1の適用は、pri-MtmiR171b (A)、pre-MtmiR171b (B)及びMtmiR171b (C)の蓄積を増大させる。
【０２２１】
図10．MtmiPEP171b1を発現するために改変されたタバコ葉細胞におけるMtmiPEP171b1の局在
写真は、GFPタンパク質のみ（左パネル）又はMtmiPEP171b1に融合したGFPタンパク質（右パネル）を発現させるために改変されたタバコ葉細胞を示す。これらの観察結果は、MtmiPEP171b1が核にある小体(petits corps nucleaires)に局在することを示す。
【０２２２】
図11．モデル植物タバコにおいて示された、AtmiR165aの発現に対する（アラビドプシス  タリアナにおいて同定された）AtmiPEP165aの発現の効果(A)及びAtmiR319aに対する（アラビドプシス  タリアナにおいて同定された）AtmiPEP319a2の発現の効果(B)
(A) Y軸は、AtmiR165a(左カラム)又はAtmiR165a及びAtmiPEP165a(右カラム)を発現するために改変されたタバコ植物におけるAtmiR165aの相対的発現を示す。
(B) Y軸は、AtmiR319a(左カラム)又はAtmiR319a及びAtmiPEP319a(右カラム)を発現するために改変されたタバコ植物におけるAtmiR319aの相対的発現を示す。
エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝30）に相当する。
いずれの場合においても、miORFの発現、したがってmiPEPの産生は、pre-miRNAの蓄積増大をもたらすことが注目される。
【０２２３】
図12．アラビドプシス  タリアナの根の成長に対するAtmiPEP165a処置の効果
写真は、同齢の2つの植物を示す：コントロール植物（左側の植物）及びAtmiPEP165aで処置された植物（右側の植物）。AtmiPEP165aでの処置は、アラビドプシス  タリアナにおいて根の成長が大きく加速されるという表現型をもたらす。このグラフは、漸増用量のAtmiPEP165aを用いる処置に応答してのpre-miR165の発現を示す。
【０２２４】
図13．ドロソフィラにおいて同定されたmiPEP8の配列の保存
miPEP8の配列(配列番号104)は、12匹の種々のドロソフィラ種のmiORF8の配列(配列番号208)から推測し、アライメントした。ヒストグラムは、分析した12種におけるmiORF8配列間の各アミノ酸の保存を示す。
【０２２５】
図14．ドロソフィラ種におけるmiPEP8の質量（kDa）及び等電点（pI）の変化(evolution)
左側のY軸は、miPEP8のサイズ（kD）を示す。右側のY軸は、miPEPの等電点を示す。X軸は、miPEPの由来、すなわちドロソフィラ種を示す。それらのサイズの有意な変化(３倍以上)にも拘らず、miPEPの電荷は、試験された12種では依然として強い塩基性（>9.8）であることが注目される。
【０２２６】
図15．miPEPの機能に対する配列付加の効果
miPEP171bを過剰発現させるためにタバコの葉を形質転換した。これらのグラフは、配列（タグHis、HA又はGFP）の付加がmiPEPの機能を変更しないことを示す。Y軸は、MtmiR171b（左カラム）を発現させるために、MtmiR171b及びタグタンパク質が付加されたか又は付加されていないMtmiPEP171b1（右カラム）を発現させるために形質転換されたタバコ植物におけるpre-MtmiR171bの相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝6）に相当する。MtmiPEP171b1の発現がMtmiR171bの発現を増大させるが、この効果はタグの存在とは独立していることが注目される。
【０２２７】
図16．メディカゴ  トランカツラの根系におけるMtmiPEP171b1の発現
GUSタンパク質（青色）と、miR17bのプロモータ（A、E）、miPEP171b1のATG（B、F）、全miPEP171b1（C、G）又はATG2（miPEPの後の前駆体に位置する2番目のATG）（D、H）との融合物を発現させるために、メディカゴ  トランカツラの根を形質転換した。根の先端（A）及び側根（E）においてmiRNAが発現していることが明らかである。転写物融合体（B、F）及び翻訳物融合体（C、G）は、同一の組織においてmiPEP171bの発現を示すが、次のATGは活性ではない（D、H）。
【０２２８】
図17．ドロソフィラ  メラノガスター細胞におけるDmmiPEP8の発現
DmmiPEP8（OE miPEP8）又はその翻訳開始コドンが変異したmiPEP8（OE miPEP8 mut）を過剰発現させるために、ドロソフィラ  メラノガスター細胞をトランスフェクトした。Y軸は、pre-miR8の相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差（独立した実験回数＝6）に相当する。DmmiPEP8の発現がDmmiR8の発現を増大させ、この効果はmRNAの翻訳に関連付けられることが注目される。
【０２２９】
図18．D. メラノガスター細胞におけるDmmiR8蓄積に対するDmmiPEP8の影響
野生型DmmiR8（OE miR8）又はその翻訳開始コドンが変異したDmmiR8（OE miR8 miPEP8 mut）を過剰発現させるために、ドロソフィラ  メラノガスター細胞をトランスフェクトした。Y軸は、pre-miR8の相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差（独立した実験回数＝2）に相当する。DmmiPEP8の存在がDmmiR8の発現を増大させることが注目される。
【０２３０】
図19．ホモ  サピエンス細胞におけるHsmiR155蓄積に対するHsmiPEP155の効果
HsmiPEP155（OE miPEP155）を過剰発現させるために、ホモ  サピエンスのHeLa細胞をトランスフェクトした。Y軸は、pre-miR155の相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差（独立した実験回数＝2）に相当する。HsmiPEP155の発現はHsmiR155の発現を増大させることが注目される。
【０２３１】
図20．モデル植物ニコチアナ  ベンサミアナにおいて示された、MtmiR171bの発現に対するMtmiPEP171b1の翻訳の効果
Y軸は、pri-miR171b（左カラム）、miORF171bが欠失したpri-miR171b（中央カラム）又はATGコドンがATTで置き換えられた変異型pri-miR171b（右カラム）を発現させるために形質転換されたタバコ植物においてMtmiR171bの相対的発現を示す。したがって、変異型pri-miR171bは、miPEP171b1を産生することができない。エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝30）に相当する。miPEP171b1の翻訳がされないことにより、miR171b蓄積は著しく低減することが注目される。
【０２３２】
図21．モデル植物ニコチアナ  ベンサミアナにおいて示された、MtmiR171bの発現に対するMtmiPEP171b1の過剰発現の効果
Y軸は、miPEP171bの発現を可能にするベクターと、第2の空ベクター（白色カラム）、MtmiPEP171bの発現を可能にするベクター（左の黒色カラム）、MtmiPEP171bをコードするORFのATGコドンがATTで置き換えられたベクター（中央の黒色カラム）又は翻訳されるペプチドのアミノ酸配列を改変することなくORFのヌクレオチド配列を変異させたベクター（縮重ORFによってコードされるmiPEP、右の黒色カラム）のいずれかとで形質転換されたタバコ植物におけるMtmiR171bの相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝30）に相当する。MtmiPEP171b1の発現がMtmiR171bの発現を増大させ、この効果がMtmiORF171bからMtmiPEP171b1への翻訳に依存することが注目される。
【０２３３】
図22．AtmiR165aの蓄積及びその標的遺伝子（PHAVOLUTA: PHV、PHABOLUSA: PHB及びREVOLUTA: REV）の蓄積に対するAtmiPEP165aの効果
Y軸は、水（コントロール）又は種々の濃度（0.01 μM、0.1 μM、1 μM又は10 μM）のAtmiPEP165aで処置されたアラビドプシス  タリアナの根におけるAtmiR165a、PHV、PHB及びREVの相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝10）に相当する。
より高濃度のAtmiPEP165aを用いての植物の処置は、AtmiR165a蓄積の用量依存的な効果と、AtmiPEP165a量に応じたその標的遺伝子の負の調節とを示す。
【０２３４】
図23．A. タリアナにおけるAtmiR164aの発現に対するAtmiPEP164aを用いる処置の効果
写真は、水（コントロール、左側の写真）又はAtmiPEP164aのものと同一の配列を有する0.1μMの合成ペプチド水溶液（0.1μMのmiPEP164a）を用いて処置した根におけるAtmiR164a蓄積のノザンブロット分析の結果を示す。RNA U6は、AtmiR164a量の定量を可能にするローディングコントロールとして用いる。
この実験を独立して4回繰り返したところ、類似の結果が得られた。
0.1 μMの miPEP164aを用いてのA. タリアナの芽の処置は、miR164aの蓄積増大をもたらす。
【０２３５】
図24．アラビドプシス  タリアナの成長に対するAtmiPEP164aを用いる処置の効果
写真は、3週間成長後の2つの植物（上面及び側面）を示す：水で散水したコントロール植物（A）及びAtmiPEP164aに相当する合成ペプチドの組成物(0.1 μM)で散水した植物（B）。AtmiPEP164aをアラビドプシス  タリアナ種植物に散水することにより植物の成長が著しく良くなる。
【０２３６】
図25．A. タリアナにおけるAtmiR165aの発現に対するAtmiPEP165aを用いる処置の効果
写真は、水（コントロール、左側の写真）又はAtmiPEP165aのものと同一の配列を有する合成ペプチドの0.1 μM水溶液（0.1μMのmiPEP165a）で処置された根におけるAtmiR165a蓄積のノザンブロット分析の結果を示す。RNA U6は、AtmiR165a量の定量を可能にするローディングコントロールとして用いる。
この実験を独立して4回繰り返したところ、類似の結果が得られた。
0.1μMの miPEP165aを用いてのA. タリアナの芽の処置は、miR165aの蓄積増大をもたらす。
【０２３７】
図26．A. タリアナにおけるAtmiR319aの発現に対するAtmiPEP319a1の過剰発現の効果
Y軸は、コントロール植物（左カラム）又はAtmiPEP319a1を過剰発現する植物（右カラム）におけるAtmiR319aの相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝10）に相当する。AtmiPEP319a1の過剰発現は、AtmiR319aの蓄積増大を誘導する。
【０２３８】
図27．アラビドプシス  タリアナの成長に対するAtmiPEP319aを用いる処置の効果
写真は、3週間成長後の2つの植物（上面及び側面）を示す：水で散水したコントロール植物（A）、及びAtmiPEP319a1に相当する合成ペプチド0.1 μMの組成物で散水された植物（B）。AtmiPEP319a1をアラビドプシス  タリアナ種植物に散水することにより植物の成長が著しく良くなる。
【０２３９】
図28．免疫染色
GUSタンパク質（青色）と、miPEP171bのATG (PromiR171b-ATG1:GUS)又はATG2 (miPEPの後の前駆体に位置する2番目のATG) (PromiR171b-ATG2:GUS)との融合物を発現させるために、メディカゴ  トランカツラの根を形質転換した。また、抗miPEP171b抗体（miPEP171b）を用いて標識した。M. トランカツラの根におけるmiPEP171bの免疫染色は、側根の開始部分におけるmiPEP171bの存在を明らかにし、このことは、マイクロRNAと、対応するmiPEPとの共局在を示している。
【０２４０】
図29．A. タリアナにおけるAtmiR160bの発現に対するAtmiPEP160b1の過剰発現の効果
Y軸は、コントロール植物（左カラム）又はAtmiPEP160b1を過剰発現する植物（右カラム）におけるAtmiR160bの相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝10）に相当する。AtmiPEP160b1の過剰発現は、AtmiR160bの相対的発現の増大を誘導する。
【０２４１】
図30．AtmiR164aの発現に対するAtmiPEP164a1の効果
Y軸は、コントロール植物（左カラム）又は0.1μMのAtmiPEP164a1を１日１回散水した植物（右カラム）におけるAtmiR164aの相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝10）に相当する。
AtmiPEP164a1の添加は、AtmiR164aの相対的発現の増大を誘導する。
【０２４２】
図31．A. タリアナにおけるAtmiR319aの発現に対するAtmiPEP319a1の過剰発現の効果
Y軸は、コントロール植物（左カラム）又はAtmiPEP319a1を過剰発現する植物（右カラム）におけるAtmiR319aの相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝10）に相当する。
AtmiPEP319a1の過剰発現は、AtmiR319aの相対的発現の増大を誘導する。
【０２４３】
図32．M. トランカツラにおけるMtmiR169dの発現に対するMtmiPEP169dの効果
Y軸は、コントロール植物（左カラム）又は0.1 μMのMtmiPEP169dを１日１回散水した植物（右カラム）におけるMtmiR169dの相対的発現を示す。
エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝10）に相当する。
MtmiPEP169dの添加は、MtmiR169dの相対的発現の増大を誘導する。
【０２４４】
図33．M. トランカツラにおけるMtmiR171eの発現に対するMtmiPEP171eの過剰発現の効果
Y軸は、コントロール植物（左カラム）又はMtmiPEP171eを過剰発現する植物（右カラム）におけるMtmiR171eの相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝10）に相当する。
MtmiPEP171eの過剰発現は、MtmiR171eの相対的発現の増大を誘導する。
【０２４５】
図34．野生型M. トランカツラ種植物におけるMtmiPEP171b1の局在
MtmiPEP171b1に特異的な抗体を用いる免疫ブロッティングにより、様々な量（1、0.5又は0.1 nmol）の合成ペプチドMtmiPEP171b1及びM. トランカツラの根の全抽出物を分析した。
MtmiPEP171b1は、M. トランカツラの根において天然に産生される。
【０２４６】
図35．野生型A. タリアナ種植物におけるAtmiPEP165aの存在
上側の写真は、野生型A. タリアナCol-0の若苗(左側)及びAtmiPEP165aを過剰発現するA. タリアナの若苗(右側)におけるAtmiPEP165a量のウェスタンブロット分析に相当する。
下側の写真は、野生型A. タリアナCol-0の若苗(左側)及びAtmiPEP165aを過剰発現するA. タリアナの若苗(右側)におけるコントロールタンパク質（チューブリン）量のウェスタンブロット分析に相当する。AtmiPEP165aは、A. タリアナにおいて天然に産生され、AtmiPEP165aを過剰発現する植物において、より大量に存在する。
【０２４７】
図36．A. タリアナにおけるAtmiPEP165aの作用
(A) Y軸は、コントロールの根（左カラム）又は10 μMのAtmiPEP165aを１日１回散水した根（右カラム）におけるpri-miR165aの相対的発現を示す。エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝10）に相当する。
AtmiPEP165aの添加は、AtmiR165aの相対的発現の増大を誘導する。
(B) Y軸は、コルジセピン（RNA合成阻害剤）の存在下における、コントロールの根（灰色の曲線）又は10 μMのAtmiPEP165aを１日１回散水した根（黒色の曲線）におけるpri-miR165aの相対的発現を示す。X軸は、コルジセピンで処置した時間を示す。
AtmiPEP165aの添加は、pri-miR165aのより良好な安定性を誘導しない。
(C) Y軸は、野生型植物（Col-0）又はRNAポリメラーゼIIの第2のラージサブユニット(la seconde grande sous-unite)の劣性対立遺伝子(un allele faible)が変異した植物（nrpb2-3）におけるpri-miR165aの相対的発現を示す。X軸は、植物が水で散水されたか、又は10 μMのAtmiPEP165aで散水されたかを示す。
野生型植物とは異なり、変異した植物は、AtmiPEP165aに応答してAtmiR165aを蓄積することができない。
【０２４８】
図37．M. トランカツラにおける側根数に対するpri-miR171bの効果
Y軸は、コントロール植物（白色カラム）又はpri-miR171bを過剰発現する植物（黒色カラム）において観察された側根の平均数を示す。エラーバーは、平均の標準誤差（個体数＝100）に相当する。
pri-miR171bの過剰発現は、側根数の減少を誘導する。
【０２４９】
図38．ドロソフィラ  メラノガスター細胞におけるDmmiPEP8翻訳の可能性
DmmiPEP8 (miPEP8::GFP)又はその開始コドンが変異したDmmiPEPmt（miPEP8 mt::GFP）を発現するように、いくつかのドロソフィラ  メラノガスター細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションのコントロールとして、モエシン-RFPタンパク質を産生するプラスミド（下側の写真）を、DmmiPEP8をコードするプラスミド(左側の写真)及びDmmiPEP8 mtをコードするプラスミド(右側の写真)と共にコトランスフェクトした。DmmiPEP8配列の開始コドンは、GFPの合成を可能にするので機能的である一方（左上の写真）、ATG変異を有する構築物はGFPを殆ど産生しない（右上の写真）ことが観察される。
よって、これらの結果は、miPEPのORFが機能的であることを示唆する。
【実施例】
【０２５０】
A:  植物におけるmiPEPの分析
実施例1‐モデル植物メディカゴ  トランカツラにおける特徴決定
a)  MtmiPEP171b1（メディカゴ  トランカツラにおいて同定されたmiPEP171b1）の同定及び特徴決定
マイクロRNAであるMtmiR171bは、根の分裂組織領域において発現する。このマイクロRNAの過剰発現は、特に、HAM1遺伝子（アクセッション番号MtGI9- TC114268）及びHAM2遺伝子（アクセッション番号MtGI9- TC120850）の発現減少（図1A）並びに側根数の減少（図1B）をもたらす。また、pri-miR171bの過剰発現は、側根数の減少を誘導する（図37）。
【０２５１】
MtmiR171bの一次転写産物の配列を、RACE-PCR法を用いて決定した。一次転写産物の配列解析により、完全に予想されていなかったいくつかの小さなオープンリーディングフレーム（sORF）の存在を同定することが可能となった。これらのsORFを、miORF（「マイクロRNA ORF」の略）と称した。これらのmiORFは、約4〜100アミノ酸の短鎖ペプチドをコードしている可能性がある。これらのmiORFと著しい相同性を有するものはデータベースでは見つからなかった。
【０２５２】
MtmiR171bの過剰発現において既に観察されたように、MtmiORF171bと称される第1のmiORFの過剰発現は、MtmiR171bの蓄積増大と、HAM1遺伝子及びHAM2遺伝子の発現減少（図2A参照）並びに側根数の減少（図2B）をもたらす。
【０２５３】
MtmiORF171bが実際にペプチドの産生をもたらすか否か、及び上記で観察された調節性機能が実際に当該ペプチドによるものなのか否かを決定するために、その配列がMtmiORF171bによってコードされる可能性のあるものと同一である合成ペプチドをメディカゴ  トランカツラの根に適用した。このペプチドの適用は、MtmiORF171bの過剰発現について上記で既に観察された表現型、すなわちMtmiR171bの蓄積増大、HAM1遺伝子及びHAM2遺伝子の発現減少(図3A参照)、及び側根数の減少(図3B)をもたらす。
【０２５４】
これらの実験結果は、MtmiORF171bが、MtmiR171bの蓄積、及びMtmiR171bの標的遺伝子：HAM1及びHAM2の発現をモジュレートできるペプチドをコードすることを示す。当該ペプチドは、MtmiPEP171b1と称される（マイクロRNAによりコードされるペプチドに相当する「miPEP」）。
更に、MtPEP171b1は、MtmiR171bの蓄積増大（図4A）及びpre-MtmiR171bの蓄積増大（図4B）をもたらす。
【０２５５】
b)   miPEP171b1の特異性
メディカゴ  トランカツラの種々のマイクロRNA前駆体（MtmiR171b 配列番号319、MtmiR169 配列番号367、MtmiR169a 配列番号368、MtmiR171a 配列番号369、MtmiR171h 配列番号370、MtmiR393a 配列番号371、MtmiR393b 配列番号372、MtmiR396a 配列番号373及びMtmiR396b 配列番号374）の発現を測定し、コントロール植物及びMtmiPEP171b1をコードするMtmiORF171bを過剰発現する植物（図5A）、又はコントロール植物及びMtmiPEP171b1を含む栽培用培地で成長させた植物（図5B）と比較した。
得られた結果は、MtmiPEP171b1がMtmiR171bの蓄積増大をもたらすに過ぎず、その他のmiRNAの蓄積増大はもたらさないことを示す。このことは、miPEPが、それが由来するマイクロRNAに対してのみ効果を有することを示す。
【０２５６】
c)   miPEP171b1の局在
更に、M. トランカツラの根におけるmiPEP171b1の免疫局在は、側根の開始部分におけるmiPEP171b1の存在を明らかにしており、マイクロRNAと、対応するmiPEPとの共局在を示す（図28及び34）。
【０２５７】
実施例1B‐MtmiPEP169d
MtmiPEP169dに関して、このmiPEPの過剰発現は、MtmiR169dの蓄積を誘導することがM. トランカツラにおいてインビボで示された（図32）。
【０２５８】
実施例1C‐MtmiPEP171e
MtmiPEP171eに関して、このmiPEPの過剰発現は、MtmiR171eの蓄積を誘導することがM. トランカツラにおいてインビボで示された（図33）。
【０２５９】
実施例2 ‐モデル植物タバコにおける特徴決定
a)  タバコにおけるメカニズムの保存
マイクロRNAの調節メカニズムがその他の植物種において保存されているか否かを決定するために、種々の細胞モデルにおいて、MtmiPEP171b1によるMtmiR171bの調節を試験した。このために、MtmiR171b及びMtmiPEP171b1をタバコの葉に導入した。
【０２６０】
MtmiPEP171b1を産生できる野生型pri-miRNA又はMtmiPEP171b1を産生できない（MtmiORF171bの開始コドンATGがATTで置き換えられた）変異型pri-miRNAであるメディカゴ  トランカツラMtmiR171bを発現させるために形質転換されたタバコの葉におけるMtmiR171b蓄積を測定した（図6及び図20）。MtmiPEP171b1が翻訳されないことにより、MtmiR171bの蓄積は、著しく低減する。
【０２６１】
メディカゴ  トランカツラのMtmiR171bのみ（コントロール）を発現させるか、又はそれに加えてメディカゴ  トランカツラの野生型MtmiORF171b(35SmiPEP171b1 ATG)を発現させるか若しくは開始コドンATGがATTで置き換えられた変異型MtmiORF17b（35SmiPEP171b1 ATT）を発現させるために形質転換されたタバコの葉におけるpre-MtmiR171bの蓄積を測定した（図7及び図21）。MtmiORF171bの発現は、pre-miR171bの蓄積増大をもたらし、このpre-miR171bの蓄積は、MtmiORF171bからマイクロペプチドへの翻訳に依存する。
【０２６２】
更に、サンプリング12時間前(１回目)及びサンプリング30分前(２回目)に噴霧することによりMtmiPEP171b1 (0.1μM)で処置されていないか又は処置されたメディカゴ  トランカツラのMtmiR171bを発現させるために形質転換されたタバコの葉において、MtmiPEP171b1は、葉に噴霧することによってペプチドの形態で直接用いてもよいことが観察された(図８)。
【０２６３】
更に、MtmiPEP171b1が、MtmiR171bの蓄積増大（図9A）及びpre-MtmiR171bの蓄積増大（図9B）をもたらすが、pri-MtmiR171bの蓄積は減少させること（図9C）が（メディカゴ   トランカツラと同様に）タバコにおいて観察された。
まとめると、これらの結果は、マイクロRNAの調節メカニズムと、miPEPの制御下におけるそれらの標的遺伝子の調節メカニズムが種において保存されていることを示す。
【０２６４】
b)   MtmiPEP171b1の細胞内局在
蛍光タンパク質（GFP）と融合したメディカゴ  トランカツラMtmiPEP171b1を過剰発現させるために、タバコの葉を形質転換した（図10）。得られた結果は、miPEPが核にある小体に局在することを示す。
【０２６５】
c)  データベースからのmiPEPの同定
70のmiRNAの一次転写産物中にオープンリーディングフレームの存在について植物ゲノムデータベースを検索し、miPEPをコードすることが可能な101のmiORFを同定した。
現在、アラビドプシス  タリアナにおいて同定されたAtmiPEP165a及びAtmiPEP319a2が既に特徴決定されている。モデル植物であるタバコにおいて行った実験により、AtmiORF165a又はAtmiORF319aの過剰発現が、AtmiR165a又はAtmiR319aの蓄積をそれぞれ増大させることを示すことができた（図11）。
miR165aは、Revoluta、Phavoluta及びPhabulosaのような転写因子を調節する。miR319は、TCPファミリーの遺伝子を調節する。
【０２６６】
実施例3‐モデル植物アラビドプシス  タリアナにおける特徴決定
実施例3A‐AtmiPEP165a
AtmiPEP165aに関して、AtmiPEP165aを用いての処置は、根の成長が大きく加速されるという表現型をもたらすことがアラビドプシス  タリアナにおいてインビボで示された（図12）。
更に、より高濃度のmiPEP165aを用いての植物の処置は、miR165a蓄積に対する用量依存的な効果、及びmiPEP165a量に応じてのその標的遺伝子(PHAVOLUTA: PHV、PHABOLUSA: PHB及びREVOLUTA: REV)の負の調節を示す（図22）。
【０２６７】
実施例3B‐AtmiPEP164a
AtmiPEP164aに関して、これを合成し、当該合成ペプチドで処置されたA. タリアナの根におけるmiR164aの蓄積増大を調べるために用いた。
ノザンブロット分析は、ペプチドmiPEP164aを用いての植物の処置が、miR164aの蓄積増大をもたらすことを示す（図23）。
同様の結果がqRT-PCRによって得られた（図30）。
また、AtmiPEP164aを用いての植物の処置が、植物の成長を著しく増大することが、アラビドプシス  タリアナにおいてインビボで示された（図24）。
【０２６８】
実施例3C‐AtmiPEP165a
AtmiPEP165aに関して、これを合成し、当該合成ペプチドで処置されたA. タリアナの根におけるmiR165aの蓄積増大を調べるために用いた。
ノザンブロット分析は、ペプチドmiPEP165aを用いての植物の処置が、miR165aの蓄積増大をもたらすことを示す（図25）。
更に、それら自身のmiRNA蓄積に対するmiPEPの作用機序を決定するために、野生型植物及びmiPEP165aを過剰発現するように形質転換された植物において、pri-miR165aの発現を分析した（図35）。
【０２６９】
pri-miR165aの過剰発現は、miPEP165aを過剰発現する植物において亢進する（図36A）。
RNA合成阻害剤であるコルジセピンの存在下においては、野生型植物及び形質転換された植物におけるpri-miR165a量は同一であり（図36B）、このことは、miPEP165aがRNA安定化因子として機能するのではなく、むしろpri-miR165aの転写活性化因子として機能することを示す。
更に、野生型植物（Col-0植物）及びRNAポリメラーゼIIの第2のラージサブユニットの劣性対立遺伝子を有する変異型植物（nrpb2-3植物）において、pri-miR165aの発現を分析した。得られた結果は、変異型植物が、野生型植物とは異なり、miPEP165aに応答してのpri-miR165蓄積の増大を示さないことを示す。miPEPは、転写調節因子として機能するようである。
【０２７０】
実施例3D‐AtmiPEP319a1
AtmiPEP319a1に関して、これも合成し、当該合成ペプチドで処置されたA. タリアナの根におけるmiR319aの蓄積増大を調べるために用いた。
qRT-PCRによる分析は、AtmiPEP319a1の過剰発現が、miR319aの蓄積増大をもたらすことを示す（図26及び31）。
また、AtmiPEP319a1を用いての植物の処置は、植物の成長を著しく増大することが、アラビドプシス  タリアナにおいてインビボで示された（図27）。
【０２７１】
実施例3E‐AtmiPEP160b1
AtmiPEP160b1に関して、このmiPEPの過剰発現が、AtmiR160b蓄積を誘導することが、A.タリアナにおいてインビボで示された（図29）。
【０２７２】
材料及び方法
生物材料
M. トランカツラの種子の表面を滅菌し、暗中4℃で5日間アガープレート上で発芽させた。次いで、7.5 μMホスフェートを含む窒素非含有Fahraeus培地で満たされた12 cm四角プレート上で若芽を成長させた（Lauresserguesら, Plant J., 72(3): 512-22, 2012）。毎日、側根を数えた。ポットの中で、少量のリンを含有するLong Ashton改変培地を植物に１日置きに散水した（Balzergueら, Journal of Experimental Botany, (62)1049-1060, 2011）。
【０２７３】
Eurogentec又はSmartox-Biotechによりペプチドを合成した。MtmiPEP171b1を、40% 水/50% アセトニトリル/10% 酢酸(v/v/v)の溶液中に再懸濁し、その他のペプチドを水中に再懸濁した。
種々の濃度(0.01、0.1、1 μM)のペプチド溶液を用いて、当該ペプチドを噴霧することにより、サンプリング12時間前(１回目)及びサンプリング30分前(２回目)に、葉に散水した。
【０２７４】
マイクロRNAの逆転写
3倍容量のエタノールを用いて行ったRNA沈澱を除き、製造業者の取扱説明書に従って、Tri-Reagent (MRC)試薬を用いてRNAを抽出した。RNAの逆転写は、特異的なステム-ループプライマーRTprimer171bと、高分子量のRNAの逆転写を行うための六量体とを併用して行った。
簡潔には、ステム-ループライマーMIR171b（0.2 μM）、六量体（500 ng）、RTバッファー（1X）、SuperScript逆転写酵素(SSIII)（1ユニット）、dNTP（各0.2 mM）及びDTT（0.8 mM）に1μgのRNAを添加し、25 μlの最終反応混合物とした。逆転写を行うために、パルス逆転写反応を行った（16℃で2分間、42℃で1分間及び50℃で1秒のサイクルを40回繰り返し、その後85℃で5分間の逆転写の最終的な不活性化）。
【０２７５】
定量RT-PCR分析(qRT-PCR)
RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）抽出キットを用いて、M. トランカツラの根又はタバコの葉からトータルRNAを抽出した。500 ngのトータルRNAについて、SuperScript II逆転写酵素(Invitrogen)を用いて逆転写を行った。この手法をそれぞれ２回繰り返して、３回の繰り返し(n=3)を行った。各実験を2〜3回繰り返した。Lauresserguesら（Plant J., 72(3): 512-22, 2012）に記載の方法により、LightCycler 480 System thermocycler (Roche Diagnostics)を用いて、qPCRによる増幅を行った。
【０２７６】
統計解析
遺伝子の相対的発現及び側根産生の平均値は、Student検定又はKruskal-Wallis検定を用いて解析した。エラーバーは、SEM（平均の標準誤差）を表す。アスタリスクは、有意差を示す（p<0.05）。
【０２７７】
プラスミド構築物
Pfuポリメラーゼ（Promega）を用いて、興味あるDNAフラグメントを増幅した。Combierら（Genes & Dev, 22: 1549-1559, 2008）に記載される方法によって、強力な構成性プロモータ35Sの制御下における過剰発現のためにXhoI及びNotI酵素を用いてDNAフラグメントをpPEX-DsREDプラスミドに、レポーター遺伝子についてはKpnI-NcoI酵素を用いてpPEX GUSプラスミドに、クローニングした。
miPEP165a及びmiPEP319aについては、Combierら（Genes & Dev, 22: 1549-1559, 2008）に記載される方法により、対応するmiORFをpBIN19にクローニングした。
【０２７８】
植物の形質転換
アグロバクテリウム  リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)で形質転換された根を有する合成植物は、Boisson-Dernierら（Mol Plant-Microbe Interact, 18: 1269-1276, 2005）に記載される方法によって取得した。双眼蛍光拡大鏡を用いてのDsRED観察により、形質転換された根を確認し、選択した。コントロールの根は、pPEX-DsREDベクターを含まないA.リゾゲネスで形質転換された根に相当する。タバコの葉の形質転換は、Combierら（Genes & Dev, 22: 1549-1559, 2008）に記載される方法によって行った。
【０２７９】
ノザンブロット分析
Lauresserguesら. Plant J, 72(3): 512-22, 2012に記載されるプロトコルに従って、ノザンブロット分析を行った。
生物試料は、0.1MのNaCl、2%のSDS、50mMのTris-HCl (pH 9)、10mMのEDTA (pH 8)及び20mMのメルカプトエタノールを含むバッファー中でホモジナイズし、フェノール/クロロホルム混合物を用いてRNAを2回抽出し、エタノールで沈澱させた。
PAGE15%ゲルにRNAをロードし、ナイロンメンブレン（HybondNX, Amersham）に転写した。RNA U6又はmiR164aを検出するために、その端が標識された放射性オリゴヌクレオチドプローブを用いてRNAをハイブリダイズした。
ハイブリダイゼーションは55℃で行った。ハイブリダイゼーションシグナルは、ホスホイメージャー（Fuji）を用いて定量し、RNA U6の特異的プローブのシグナルを用いて正規化した。
【０２８０】
RNAの安定性
各条件について、MS固体培地上で垂直式栽培された２週齢の植物を、1mlのMS液体培地を含む6ウェルプレートに移した。1mMのmiPEPと共に16時間インキュベーション後、植物を100μg/mlのコルジセピン又は（コントロールとしての）水で処置し、種々の時点で回収し、RNAを抽出及び定量した。各実験をそれぞれ3回行った。
【０２８１】
組織化学的標識
GUS標識は、Combierら（Genes & Dev, 22: 1549-1559, 2008）に記載される方法により行った。試料を顕微鏡（axiozoom）で観察した。
【０２８２】
免疫染色
50mMホスフェートバッファー(pH7.2)中の４％ホルマリン(v/v)中で、メディカゴ組織の根又は胚を2時間固定し、水中の（融点の低い）アガロースLMP 5%に包埋する。薄い切片（100μm）を取得し、Pbi（免疫用ホスフェートバッファー）、2% Tween及び1%ウシ血清アルブミン（PbiT-BSA）中において2時間ブロッキングされたテフロンコートスライド上のPbi中に置き、その後BSA-PbiT中に希釈された一次抗体を用いて4℃で一晩（12 h）標識した。切片をPBiTで洗浄し、PbiT-BSA中に希釈された二次抗体と共に、周囲温度で2時間インキュベートした。その後、Pbi中で30分間スライドを洗浄し、Citifluor (封入剤)に封入した。一次抗体及び希釈率は、以下のとおりであった：1716a (1:500, v/v)。二次抗体は、Alexa Fluor 633蛍光プローブ（Molecular Probes）とカップリングしたヤギ抗ウサギIgG抗体であり、1:1000（v/v）の希釈率で用いた。
【０２８３】
ウェスタンブロッティング
タンパク質の全抽出物は、Combierら（Genes & Dev, 22: 1549-1559, 2008）に記載される方法を用いて調製し、SDS-PAGEで分離した。泳動は、ホスフェートバッファーを用いて、4℃、15Vで一晩行い、その後グルタルアルデヒド0.2%（v/v）溶液中でメンブレンを室温で45分間インキュベートした。一次抗体は、1:1000（v/v）の希釈率で用い、HRP-コンジュゲートヤギ抗ウサギIgG抗体を二次抗体として1:40000（v/v）の希釈率で用いた。
【０２８４】
【表８−１】
2019170379.tif 000054
【表８−２】
2019170379.tif 000055
【表８−３】
2019170379.tif 000056
【０２８５】
B: 動物におけるmiPEPの分析
実施例4‐ドロソフィラにおけるmiPEP候補の同定
a)  miPEP候補の同定
モデル動物ドロソフィラ  メラノガスターにおけるRACE-PCRにより行った最初の試験は、胚形成中に発現されるmiRNA、miR1及びmiR8の存在を示す。
植物と同様に、試験された2つのmiRNAのそれぞれにおいてmiORFを同定した。例えば、昆虫における成長調節の役割を担うことが知られるmiR8は、miPEP8をコードする可能性のあるmiORFを有する。
（ドロソフィラ  メラノガスターで同定される）DmmiR1については、DmmiPEP1a及びDmmiPEP1bをコードする可能性のある2つのDmmiORFを有する。
【０２８６】
系統発生学的解析は、解析した12のドロソフィラ種におけるmiORFの存在についての進化的保存、すなわち6千万年以上前のそれらの分岐からの進化的保存を示す（図13）。
【０２８７】
更に、ドロソフィラにおいて同定されたmiPEPは、植物のmiPEPといくつかの類似点を有する。それらの一次配列、したがってそれらのサイズが種において急速に変化するならば、サイズの低減がみられると共に（32〜104AA）、全体的に塩基性の電荷（9.5〜12のpHi）についての強い保存がみられる（図14）。
【０２８８】
したがって、まとめると、これらの結果は、広範な真核生物種にわたって、マイクロRNAの一次転写産物によってコードされる調節性miPEPが存在することを示す。発見されたこれらのペプチドは、植物及び動物の両方において、多様な基本的生物機能を調節し得る未解明の天然分子が存在することを表す。
【０２８９】
b)  miPEPの発現
（配列番号494の配列からの）DmmiPEP8又は（配列番号495の配列からの）その開始コドンが変異したDmmiPEP mtを過剰発現するようにドロソフィラ  メラノガスター細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションコントロールとして、モエシン-RFP産生プラスミドを、DmmiPEP8をコードするプラスミド及びDmmiPEP8 mtをコードするプラスミドと共にコトランスフェクトした。DmmiPEP8配列の開始コドンは、GFPによって示されるmiPEP::GFP融合タンパク質の合成を可能にするので、機能的である一方、ATGが変異した構築物は、GFPを殆ど産生しないことが観察される。
これらの結果は、miPEPのORFが機能的であることを示唆する（図38）。
【０２９０】
材料及び方法
ドロソフィラ  メラノガスター細胞
S2細胞は、T75フラスコ中の1%ペニシリン100 U/mL、ストレプトアビジン100mg/mL（Sigma）及び10％補体除去(decomplemente)胎児ウシ血清を含む12 mLのSchneider培地（GIBCO）中で（56℃で30分間）培養する。
一過的トランスフェクションは、FuGENE(登録商標) HDトランスフェクションキット（Roche）を用いて、推奨に従って行う。慣用の方法では、6ウェルプレート（培地3ml/ウェル）に予め播種された150万のS2細胞を、250 ngのトータルプラスミドDNAでトランスフェクトする。100μlのOPTIMEM（GIBCO）中で、DNAをFugene（3 μl）と接触させる。20分後、形成されたトランスフェクション試薬を、培養培地中で細胞と接触させる。トランスフェクションの66 h後、細胞のRNAを抽出する。
【０２９１】
DmmiPEP8フラグメント及び変異DmmiPEP8フラグメントのクローニング
pUASプラスミド中のGFPとインフレームでクローニングされるように(pour etre clones en phase avec la GFP dans un plasmide pUAS)、DmmiPEP8（配列番号494）の配列及び開始コドンが変異したDmmiPEP8（配列番号495）の配列に対応するDNAフラグメントを増幅した。DmmiPEP8::GFP又はその変異型DmmiPEP8 mt::GFPをコードするプラスミド、アクチンプロモータの制御下で産生されるGAL4転写因子によってそれらの過剰発現を可能にするpACT-GAL4、及び同様にアクチンプロモータの制御下においてトランスフェクションコントロールとして用いられるモエシン-RFPタンパク質をコードする発現ベクターの混合物（1/1/1の比率、全量300 ng）を用いて、SE昆虫細胞をコトランスフェクトした。トランスフェクションの48h後、ホルムアルデヒド4%（W/V）を最終培地に添加することによって、細胞を10分間固定する。次いで、PBS1Xを用いて細胞を2回洗浄し、顕微鏡（Leica SPE）で観察するためにスライドにコーティングする。
【０２９２】
【表９】
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【０２９３】
C:ヒトにおけるmiPEPの特徴決定
実施例5‐HsmiPEP155の特徴決定
興味あるDNAフラグメント（HsmiPEP155及び変異miPEP）を合成するか、又は特異的なプライマーを用いてPCRによって増幅し、酵素XhoI及びNotIを用いて、強力な構成性プロモータによってその発現が制御されるGAL4転写因子によってそれらの過剰発現を可能にするpUASプラスミドにクローニングした。
【０２９４】
HeLa細胞のゲノムDNAに対するPCR増幅又はL428ヒト細胞のトータルRNAに対するRT-PCRのいずれかによって、種々の構築物を産生した。増幅したPCRフラグメントをHindIII/EcoRI制限酵素で消化し、次いでpcDNA3.1ベクターにクローニングする。エシェリシア  コリDH5α株をエレクトロポレートし、次いで固体培地（2YT+アガー+アンピシリン）で培養する。次いで種々のクローンからプラスミドDNAを調製し、確認のためにシーケンスする。次いで、QIAfilter Plasmid Midi kit (QIAGEN)を用いて構築物を調製し、−20℃で保存する。
【０２９５】
HeLa細胞（樹立腫瘍株、ATCC CCL-2.2）を、6ウェルプレート中の完全培地［(DMEM (1x) + Glutamax + ピルビン酸を含まない4.5g/Lグルコース + 1x ペニシリン/ストレプトマイシン + 1 mM Na-ピルベート + 10% ウシ血清］中で培養し、37℃、5%CO2のインキュベータ中に置く。
【０２９６】
50%コンフルエンスのときに細胞をトランスフェクトする。実験開始の際、抗生物質を含む完全培地を、抗生物質を含まない完全培地に置き替える。
【０２９７】
各ウェルについて、混合物A［250 μlのOptimem (+Glutamax) (Gibco) + 2μgのDNA］及び混合物B［250 μlのOptimem + 4 μlのLipofectamine 2000 (Invitrogen)］を調製し、周囲温度で5分間放置する。次いで混合物Bを混合物Aに滴下して混合し、周囲温度で25分間インキュベーショトする。次いで、混合物をウェルに滴下する。4〜5時間後、培地を、抗生物質を含む完全培地に置き替える。トランスフェクションの48時間後、細胞を停止させる(les cellules sont arretees)。培地をアスピレートし、廃棄する;細胞をPBS 1Xでリンスする。次いで、細胞を−20℃で保存するか、又はトータルRNAを直接抽出することが可能である。
【０２９８】
各ウェルについて、細胞に1mlのTri-Reagent(Euromedex)を置くことによって、RNAを抽出する。Tri-reagentをアスピレートし、戻すことを数回行い、細胞を適正に溶解させ、それを1.5 mlチューブに移す。0.2 mlの水-飽和クロロホルムを添加する。それをボルテックスにより混合し、次いで周囲温度で2〜3分間放置する。それを15300 rpmで、4℃で5分間遠心分離する。周囲温度で10分間インキュベートし、15300 rpmで4℃、15分間遠心分離し、0.5mlのイソプロパノールから水相を沈降させる。上清を廃棄し、1 mlの70%エタノールでペレットをリンスし、15300 rpmで4℃、5分間遠心分離する。上清を再び廃棄し、ペレットを数分間風乾する。
【０２９９】
残留している可能性のあるゲノムDNAを可能な限り除去するために、RNAをDNaseで処理する。このために、170μlの超純水、20μlのDNaseバッファー10x及び10μlのRQ1 RNaseフリーDNaseにペレットを再懸濁し、37℃で30分間維持する。次いで、37℃で20分間にわたって、20μlのSDS10%及び5μlのプロテイナーゼK（20 mg/ml）を添加する。
225μlのフェノール/H2O/クロロホルム混合物を用いて最後のフェノール抽出を行い、15300 rpm、4℃で5分間遠心分離する。
【０３００】
次いで、20μlの3M酢酸ナトリウム及び600μlの100%エタノールから、−80℃で20分間、水相を沈降させる。次いで、これを15300rpm、4℃で15分間遠心分離する。上清を廃棄する。1mlの70%エタノールでペレットをリンスし、15300rpm、4℃で5分間遠心分離し、上清を再び廃棄し、ペレットを数分間風乾させる。
次いで、15〜20μlの超純水にペレットを溶解させ、RNAをアッセイする。
【０３０１】
次いで、15%アクリルアミドゲル［アクリルアミド/40%ビス-アクリルアミド溶液、比率19:1］、TBE 1x中の7M尿素を用いてのノザンブロットにより10〜15μgのトータルRNAを分析する。泳動は、ゲルを予め温めた後、泳動バッファーとしてのTBE1x中400Vで行う。次いで、転写タンク中で1V及び4℃で2時間、RNAをBiodyne Plus 0.45μmナイロンメンブレンに電気的に転写する。転写の終わりに、0.124 J/cm2のUVでメンブレンを照射する。次いで、ハイブリダイゼーションオーブン中50℃で1時間、5xSSPEバッファー、1xデンハルト液、1% SDS及び150μg/mlの酵母tRNA中でメンブレンをプレハイブリダイズさせる。次いで、γ-32P-ATP (0.5〜1.106 cpm/mlのハイブリダイゼーションバッファー)で5'を標識されたヌクレオチドプローブを添加し、50℃で一晩ハイブリダイズさせる。次いで、0.1xSSPE/0.1%SDS中周囲温度でメンブレンを2回洗浄し、BioMax HEスクリーン(Kodak)及びBioMax MSフィルム(Kodak)を含むオートラジオグラフィーカセットに曝し、−80℃で24〜48時間、マイクロRNAを検出する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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