(57)【要約】      （修正有）【課題】糖類をタガトースへと酵素的に転換することにより、タガトースを製造する方法の提供。【解決手段】タガトースを製造する方法であって、フルクトース６−リン酸エピメラーゼ等のエピメラーゼによって触媒されてフルクトース６−リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース６−リン酸（Ｔ６Ｐ）へ変換するステップ；及びタガトース６−リン酸ホスファターゼ等のホスファターゼによって触媒されて、生成された該Ｔ６Ｐをタガトースへ変換するステップを含む、方法。【選択図】図１
2019150026.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タガトースを製造する方法であって、
エピメラーゼによって触媒されてフルクトース６−リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース６−リン酸（Ｔ６Ｐ）へ変換すること；及び
ホスファターゼによって触媒されて、生成された該Ｔ６Ｐをタガトースへ変換すること
を含む、方法。
【請求項２】
グルコース６−リン酸（Ｇ６Ｐ）を前記Ｆ６Ｐに変換するステップを更に含み、該ステップがホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
グルコース１−リン酸（Ｇ１Ｐ）を前記Ｇ６Ｐに変換するステップを更に含み、該ステップがフォスフォグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
糖類を前記Ｇ１Ｐに変換するステップを更に含み、該ステップが少なくとも１つの酵素によって触媒され、該糖類が、デンプン又はその誘導体、セルロース又はその誘導体及びスクロースからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの酵素が、α−グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）、マルトースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、及びセルロースホスホリラーゼからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記糖類が、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトース、及びグルコースからなる群から選択されるデンプン又はその誘導体である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
デンプンをデンプン誘導体へ変換するステップを更に含み、該デンプン誘導体がデンプンの酵素的加水分解又はデンプンの酸加水分解によって製造される、請求項４又は請求項６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
４−グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）が前記方法へ添加される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記デンプン誘導体が、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、α−アミラーゼ、又はその組み合わせによって触媒されるデンプンの酵素的加水分解によって、製造される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
フルクトースを前記Ｆ６Ｐへ変換するステップであって、少なくとも１つの酵素によって触媒される、ステップ；及び
随意に、スクロースを該フルクトースへ変換するステップであって、少なくとも１つの酵素によって触媒される、ステップ
を、更に含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
グルコースを前記Ｇ６Ｐへ変換するステップであって、少なくとも１つの酵素によって触媒される、ステップ、及び
随意に、スクロースを該グルコースへ変換するステップであって、少なくとも１つの酵素によって触媒される、ステップ
を、更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記エピメラーゼがフルクトース６−リン酸エピメラーゼである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記フルクトース６−リン酸エピメラーゼが、配列番号：１、３、５、７、９又は１０と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記フルクトース６−リン酸エピメラーゼが、配列番号：２、４、６、８又は１１と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ホスファターゼがタガトース６−リン酸ホスファターゼである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記タガトース６−リン酸ホスファターゼが、配列番号：１２、１４又は１６と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記タガトース６−リン酸ホスファターゼが、配列番号：１３、１５又は１７と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法のステップが、約４０℃〜約７０℃の範囲の温度で、約５．０〜約８．０の範囲のｐＨで、及び／又は約８時間〜約４８時間の間遂行される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法のステップが、１つのバイオリアクター又は連続してアレンジされた複数のバイオリアクターにおいて遂行される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法のステップが、ＡＴＰ不含、ＮＡＤ（Ｈ）不含で、約０ｍＭ〜約１５０ｍＭのリン酸塩濃度で遂行され、リン酸塩がリサイクルされ、及び／又は前記方法の少なくとも１つのステップがエネルギー的に有利な化学反応を包含する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法によって製造されるタガトース。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１０月２日に出願された米国特許出願第６２／２３６，２２６号の優先権を主張し、該出願は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は糖Ｄ−タガトースの製造に関する。より具体的には、本発明は、糖類（ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）（例えば多糖、オリゴ糖、二糖、スクロース、Ｄ−グルコース、及びＤ−フルクトース）をＤ−タガトースへと酵素的に転換することによって、Ｄ−タガトースを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｄ−タガトース（以降、タガトース）は、スクロースの甘味の９２％を有するがカロリーはたった３８％である、低カロリーの天然甘味料である。それは、果物、カカオ、及び乳製品中に少量でのみ存在する、天然に存在する単糖ヘキソースである。タガトースは２００３年にＦｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）によって食品添加物として承認され、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）と指定された。しかしながら、タガトースの高い売値に起因して、甘味料としての使用は限定されている。タガトースは非常に多くの健康上の利益を誇り、それらは、非齲蝕原性であること；低カロリーであること；３という非常に低い血糖インデックスを有すること；グルコースの血糖インデックスを２０％減弱させること；平均血糖レベルを低下できること；高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールを上昇させることによって、心血管性疾患、卒中、及び他の血管疾患の予防を支援すること；並びに、検証されたプレバイオティックス及び抗酸化物質であること、である。Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｇａｔｏｓｅ，ａ  Ｎｅｗ  Ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｄｒｕｇ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｏｂｅｓ．Ｍｅｔａｂ．１０（２）：１０９−３４（２００８）。それゆえ、タガトースは、明らかに医薬産業、生物工学産業、学術産業、食品産業、飲料産業、食物サプリメント産業、及び食品雑貨産業における様々な適用を有する。
【０００４】
現在、タガトースは、ラクターゼ又は酸加水分解によってラクトースを加水分解してＤ−グルコース及びＤ−ガラクトースを形成することを介して、優先的に生成される（ＷＯ２０１１１５０５５６、ＣＮ１０３０２５８９４、ＵＳ５００２６１２、ＵＳ６０５７１３５、及びＵＳ８８０２８４３）。次いでＤ−ガラクトースは、アルカリ性条件下で水酸化カルシウムによって化学的に、又はｐＨ中性条件下でＬ−アラビノースイソメラーゼによって酵素的に、のいずれかで、Ｄ−タガトースへ異性化される。最終産物は濾過及びイオン交換クロマトグラフィーの組み合わせによって単離される。この製造する方法は複数のタンク又はバイオリアクター中で遂行される。全体として、この方法は、他の糖（例えばＤ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、及び非加水分解ラクトース）の費用のかかる分離及び低産物収率のために悩ましい。微生物細胞発酵経由のいくつかの方法は開発されているが、どれも、費用のかかる原料（例えばガラクチトール及びＤ−プシコース）、低産物収率、及び費用のかかる分離への依存性に起因して、実践的な代替物であるとは証明されていない。
【０００５】
該方法のうちの少なくとも１つのステップがエネルギー的に有利な化学反応を包含する、高収率のタガトース生成のための費用効率の高い合成経路を開発する必要性がある。さらに、１つのタンク又はバイオリアクター中で方法のステップを遂行できる、タガトース生成方法のための必要性がある。リン酸塩をリサイクルでき、及び／又は該方法がリン酸塩源としてのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の使用を要求しない、比較的低濃度のリン酸塩で遂行できるタガトース生成の方法のための必要性もある。反応ステップのうちの任意のものにおいて費用のかかるニコチン酸アミドアデノシンジヌクレオチド（ＮＡＤ（Ｈ））コエンザイムの使用を要求しない、タガトース生成経路のための必要性もある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書において記載される発明は、タガトースを製造する方法に関する。様々な態様において、本方法は、エピメラーゼによって触媒されてフルクトース６−リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース６−リン酸（Ｔ６Ｐ）へ変換すること；及び、ホスファターゼによって触媒されてＴ６Ｐをタガトースへ変換すること、を包含する。本発明は、本明細書において記載される方法のうちの任意のものによって製造されたタガトースにも関する。
【０００７】
本発明のいくつかの態様において、タガトースを製造する方法は、グルコース６−リン酸（Ｇ６Ｐ）をＦ６Ｐへ変換するステップも包含し、このステップはホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される。他の態様において、タガトース合成のための方法は、グルコース１−リン酸（Ｇ１Ｐ）をＧ６Ｐへ変換するステップも包含し、この変換ステップはホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される。
【０００８】
様々な態様において、タガトースを製造する方法は、少なくとも１つの酵素によって触媒されて糖類をＧ１Ｐへ変換すること；ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒されてＧ１ＰをＧ６Ｐへ変換すること；ホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒されてＧ６ＰをＦ６Ｐへ変換すること；エピメラーゼによって触媒されてＦ６Ｐをタガトース６−リン酸（Ｔ６Ｐ）へ変換すること；及び、ホスファターゼによって触媒されて、生成されたＴ６Ｐをタガトースへ変換すること、を包含することができる。
【０００９】
本方法のうちの任意のものにおいて使用される糖類は、デンプン又はその誘導体、セルロース又はその誘導体、及びスクロースからなる群から選択され得る。デンプン又はその誘導体は、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトース、又はグルコースであり得る。本発明のいくつかの態様において、タガトースを製造する方法は、デンプンの酵素的加水分解又は酸加水分解によってデンプンをデンプン誘導体へ変換することを包含する。他の態様において、デンプン誘導体は、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、α−アミラーゼ、又はこれらの酵素の２つ以上の組み合わせによって触媒される、デンプンの酵素的加水分解によって製造され得る。タガトースを製造する方法は、ある特定の態様において、４−グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を添加することも包含することができる。
【００１０】
様々な態様において、タガトースを製造する方法は、少なくとも１つの酵素によって触媒されてフルクトースをＦ６Ｐへ変換すること；エピメラーゼによって触媒されてＦ６Ｐをタガトース６−リン酸（Ｔ６Ｐ）へ変換すること；及び、ホスファターゼによって触媒されて、生成されたＴ６Ｐをタガトースへ変換すること、を包含することができる。他の実施形態において、タガトース生成方法は、少なくとも１つの酵素によって触媒されてスクロースをフルクトースへ変換すること；少なくとも１つの酵素によって触媒されてフルクトースをＦ６Ｐへ変換すること；エピメラーゼによって触媒されてＦ６Ｐをタガトース６−リン酸（Ｔ６Ｐ）へ変換すること；及び、ホスファターゼによって触媒されて、生成されたＴ６Ｐをタガトースへ変換すること、を包含する。
【００１１】
本発明の他の態様において、タガトースを製造する方法において使用されるＧ６Ｐは、少なくとも１つの酵素によって触媒されてグルコースをＧ６Ｐへ変換すること、によって生成され得る。そして、少なくとも１つの酵素によって触媒されてスクロースをグルコースへ変換すること、によってグルコースは生成され得る。
【００１２】
本発明のいくつかの態様において、Ｆ６ＰをＴ６Ｐへ変換するのに使用されるエピメラーゼは、フルクトース６−リン酸エピメラーゼである。フルクトース６−リン酸エピメラーゼは、配列番号：１、３、５、７、９又は１０と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされ得る。様々な態様において、フルクトース６−リン酸エピメラーゼは、配列番号：２、４、６、８又は１１と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１３】
本発明の様々な態様において、Ｔ６Ｐをタガトースへ変換するのに使用されるホスファターゼは、タガトース６−リン酸ホスファターゼである。タガトース６−リン酸ホスファターゼは、配列番号：１２、１４又は１６と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされ得る。本発明のいくつかの態様において、タガトース６−リン酸ホスファターゼは、配列番号：１３、１５又は１７と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１４】
様々な態様において、本発明の方法は、約４０℃〜約７０℃の範囲の温度で、約５．０〜約８．０の範囲のｐＨで、及び／又は約８時間〜約４８時間の間遂行される。いくつかの態様において、タガトースを製造する方法のステップは１つのバイオリアクター中で遂行される。他の態様において、ステップは連続してアレンジされた複数のバイオリアクター中で遂行される。
【００１５】
本発明の他の態様において、タガトースを製造する方法のステップは、ＡＴＰ不含、ＮＡＤ（Ｈ）不含で、約０ｍＭ〜約１５０ｍＭのリン酸塩濃度で遂行され、リン酸塩はリサイクルされ、及び／又は本方法のうちの少なくとも１つのステップはエネルギー的に有利な化学反応を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
これらの図面は、本発明の実施形態のうちのいくつかの特定の態様を例示し、本発明の限定又は規定に使用されるべきではない。
【００１７】
【図１】フルクトース６−リン酸を、タガトース６−リン酸及び次いでＤ−タガトース（タガトース）へ変換する酵素経路を図示する概略図解である。
【００１８】
【図２】デンプン又はその誘導産物をタガトースへ変換する酵素経路を図示する概略図解である。以下の略語が使用される。αＧＰ、α−グルカンホスホリラーゼ又はデンプンホスホリラーゼ；ＰＧＭ、ホスホグルコムターゼ；ＰＧＩ、ホスホグルコイソメラーゼ；Ｆ６ＰＥ、フルクトース６−リン酸エピメラーゼ；Ｔ６ＰＰ、タガトース６−リン酸ホスファターゼ；ＩＡ、イソアミラーゼ；ＰＡ、プルラナーゼ；ＭＰ、マルトースホスホリラーゼ；ＰＰＧＫ、ポリリン酸グルコキナーゼ。
【００１９】
【図３】セルロース又はその誘導産物をタガトースへ変換する酵素経路を示す。ＣＤＰ、セロデキストリンホスホリラーゼ；ＣＢＰ、セロビオースホスホリラーゼ；ＰＰＧＫ、ポリリン酸グルコキナーゼ；ＰＧＭ、ホスホグルコムターゼ；ＰＧＩ、ホスホグルコイソメラーゼ；Ｆ６ＰＥ、フルクトース６−リン酸エピメラーゼ；Ｔ６ＰＰ、タガトース６−リン酸ホスファターゼ。
【００２０】
【図４】フルクトースをタガトースへ変換する酵素経路を図示する概略図解である。ＰＰＦＫ、ポリリン酸フルクトキナーゼ；Ｆ６ＰＥ、フルクトース６−リン酸エピメラーゼ；Ｔ６ＰＰ、タガトース６−リン酸ホスファターゼ。
【００２１】
【図５】グルコースをタガトースへ変換する酵素経路を図示する概略図解である。ＰＰＧＫ、ポリリン酸グルコキナーゼ；ＰＧＩ、ホスホグルコイソメラーゼ；Ｆ６ＰＥ、フルクトース６−リン酸エピメラーゼ；Ｔ６ＰＰ、タガトース６−リン酸ホスファターゼ。
【００２２】
【図６】スクロース又はその誘導産物をタガトースへ変換する酵素経路を示す。ＳＰ、スクロースホスホリラーゼ；ＰＰＦＫ、ポリリン酸フルクトキナーゼ；ＰＧＭ、ホスホグルコムターゼ；ＰＧＩ、ホスホグルコイソメラーゼ；Ｆ６ＰＥ、フルクトース６−リン酸エピメラーゼ；Ｔ６ＰＰ、タガトース６−リン酸ホスファターゼ。
【００２３】
【図７】タガトースへのグルコース１−リン酸の変換のための生成ギブスエネルギーに基づく中間体の間の反応ギブスエネルギーを示す。
【発明の詳細な説明】
【００２４】
本発明は、産物分離費用及びタガトース生成費用を大幅に減少させる一方で、高い産物収率を備えたタガトースの合成のための酵素経路又は方法を提供する。
【００２５】
本発明は、タガトースを製造する方法であって、エピメラーゼによって触媒されてフルクトース６−リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース６−リン酸（Ｔ６Ｐ）へ変換すること、及び、ホスファターゼ（例えばタガトース６−リン酸ホスファターゼ、Ｔ６ＰＰ）によって触媒されて、生成されたＴ６Ｐをタガトースへ変換すること、を包含する、該方法に関する。この方法は、図１中に概論的に示される。ある特定の実施形態において、Ｆ６ＰのＴ６Ｐへの変換を触媒するエピメラーゼは、フルクトース６−リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）である。
【００２６】
Ｆ６ＰをＴ６Ｐへ変換するエピメラーゼは本発明の方法において使用され得る。本発明のいくつかの態様において、Ｆ６ＰをＴ６Ｐへ変換する方法における使用のために好適なエピメラーゼは、配列番号：２、４、６、８又は１１（以下に示される）のアミノ酸配列へ、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性の程度を有するアミノ酸配列を含む。好適なエピメラーゼは、配列番号：１、３、５、７、９又は１０（以下に示される）のヌクレオチド配列へ、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性の程度を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
【００２７】
本発明は、配列番号：２、４、６、８又は１１のアミノ酸配列へ、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性の程度を有するアミノ酸配列を含むエピメラーゼにも関する。他の態様において、本発明は、配列番号：１、３、５、７、９又は１０のヌクレオチド配列へ、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性の程度を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるエピメラーゼに関する。
【００２８】
Ｔ６Ｐをタガトース（Ｄ−タガトース）へ変換するホスファターゼは本発明の方法において使用され得る。本発明のいくつかの態様において、Ｔ６Ｐをタガトース（Ｄ−タガトース）へ変換するのに使用され得るホスファターゼは、配列番号：１２、１４又は１６（以下に示される）のアミノ酸配列へ、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性の程度を有するアミノ酸配列を含む。タガトースホスファターゼは、配列番号：１３、１５又は１７（以下に示される）のヌクレオチド配列へ、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性の程度を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
【００２９】
本発明は、Ｔ６Ｐをタガトース（Ｄ−タガトース）へ変換し、配列番号：１２、１４又は１６のアミノ酸配列へ、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性の程度を有するアミノ酸配列を含むホスファターゼにも関する。様々な態様において、本発明は、Ｔ６Ｐをタガトース（Ｄ−タガトース）へ変換し、配列番号：１３、１５又は１７のヌクレオチド配列へ、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、及びさらに最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性の程度を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるホスファターゼに関する。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本発明に記載のタガトースを製造する方法は、グルコース６−リン酸（Ｇ６Ｐ）をＦ６Ｐへ酵素的に転換するステップも包含し、このステップはホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される。他の実施形態において、タガトースを製造する方法はグルコース１−リン酸（Ｇ１Ｐ）をＧ６Ｐに変換するステップを追加で包含し、このステップがホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される。なお更なる実施形態において、タガトース生成方法は、少なくとも１つの酵素によって触媒されて糖類をＧ１Ｐへ変換するステップも包含する。
【００３１】
したがって、本発明に従ってタガトースを製造する方法は、例えば、以下の、（ｉ）１つ又は複数の酵素を使用して、糖類をグルコース１−リン酸（Ｇ１Ｐ）へ変換するステップと；（ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ、ＥＣ５．４．２．２）を使用して、Ｇ１ＰをＧ６Ｐへ変換するステップと；（ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ、ＥＣ５．３．１．９）を使用して、Ｇ６ＰをＦ６Ｐへ変換するステップと；（ｉｖ）フルクトース６−リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）によって、Ｆ６ＰをＴ６Ｐへ変換するステップと、（ｖ）タガトース６−リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）によって、Ｔ６Ｐをタガトースに変換するステップとを包含することができる。糖類がデンプンである方法の例は図２中に示される。
【００３２】
典型的には、開示される方法において使用される酵素単位の比は、１：１：１：１：１（αＧＰ：ＰＧＭ：ＰＧＩ：Ｆ６ＰＥ：Ｔ６ＰＰ）である。産物収率の最適化のために、これらの比は任意の数の組み合わせで調整され得る。例えば、３：１：１：１：１の比を使用してリン酸化中間体の濃度を最大化することができ、それは下流の反応の活性増加をもたらすだろう。反対に、１：１：１：１：３の比を使用してαＧＰのためのリン酸塩のロバストな供給を維持することができ、それはα−１，４−グリコシド結合のより効率的な加リン酸分解性切断をもたらすだろう。例えば３：１：１：１：３の酵素の比を使用して、反応速度を更に増加させることができる。したがって、酵素比（以下に議論される他の随意の酵素が含まれる）を変動させて、タガトース生成の効率を増加させることができる。例えば、特定の酵素は、他の酵素の量と比べて、約２×、３×、４×、５×などの量で存在し得る。
【００３３】
本方法の重要な利点のうちの１つは、１つのバイオリアクター又は反応容器中で方法のステップを遂行できるということである。あるいは、ステップは、連続してアレンジされる複数のバイオリアクター又は反応容器中でも遂行できる。
【００３４】
特にすべての方法のステップが単一のバイオリアクター又は反応容器中で遂行される場合に、Ｔ６ＰのＴ６ＰＰ脱リン酸化によって生成されたリン酸イオンは、次いで糖類をＧ１Ｐへ変換する方法のステップにおいてリサイクルすることができる。開示される方法においてリン酸塩をリサイクルする能力は、リン酸塩の非化学量論的な量が使用されることを可能にし、それは反応リン酸塩濃度を低く維持する。これは全体的な経路及び方法の全体的な速度に影響するが、個別の酵素の活性を限定せず、タガトースを得る方法の全体的効率を可能にする。
【００３５】
例えば、反応リン酸塩濃度は、約０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ〜約５０ｍＭ、又はより好ましくは約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲であり得る。例えば、反応リン酸塩濃度は、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、又は約５５ｍＭであり得る。
【００３６】
したがって、低いリン酸塩濃度は、低い全リン酸塩及びしたがってリン酸塩除去費用の低下に起因して、生成費用の減少をもたらす。それは、高濃度の遊離リン酸塩によるＴ６ＰＰの阻害も防止し、リン酸塩汚染についての可能性も減少させる。
【００３７】
さらに、本明細書において開示される方法は、リン酸塩源として添加されるＡＴＰなしに（すなわちＡＴＰ不含）遂行できる。この方法は、ＮＡＤ（Ｈ）も添加する必要なしに（すなわちＮＡＤ（Ｈ）不含）遂行できる。他の利点には、タガトースを作製するための開示される方法のうちの少なくとも１つのステップがエネルギー的に有利な化学反応を包含するという事実も含まれる（図７）。
【００３８】
糖類をＧ１Ｐへ変換するのに使用される酵素の例には、α−グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ、ＥＣ２．４．１．１）、マルトースホスホリラーゼ（ＭＰ、ＥＣ２．４．１．８）、セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ、ＥＣ２．４．１．４９）、セロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ、ＥＣ２．４．１．２０）、セルロースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ、ＥＣ２．４．１．７）、及びその組み合わせが含まれる。酵素又は酵素の組み合わせの選択は、本方法において使用される糖類に依存する。
【００３９】
Ｇ１Ｐの生成のために使用される糖類は、多糖、オリゴ糖、及び／又は二糖であり得る。例えば、糖類は、デンプン、１つ若しくは複数のデンプンの誘導体、セルロース、１つ若しくは複数のセルロースの誘導体、スクロース、１つ若しくは複数のスクロースの誘導体、又はその組み合わせであり得る。
【００４０】
デンプンは天然で最も広く使用されるエネルギー貯蔵化合物であり、植物種子中で多くは保存される。天然のデンプンは、直線状アミロース及び分岐状アミロペクチンを含有する。デンプン誘導体の例には、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトース、フルクトース、及びグルコースが含まれる。セルロース誘導体の例には、前処理されたバイオマス、再生された非晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、フルクトース、及びグルコースが含まれる。スクロース誘導体には、フルクトース及びグルコースが含まれる。
【００４１】
デンプン誘導体は、デンプンの酵素的加水分解によって、又はデンプンの酸加水分解によって製造され得る。具体的には、デンプンの酵素的加水分解は、α−１，６−グルコシド結合を加水分解する、イソアミラーゼ（ＩＡ、ＥＣ．３．２．１．６８）；α−１，６−グルコシド結合を加水分解する、プルラナーゼ（ＰＡ、ＥＣ．３．２．１．４１）；短いマルトオリゴ糖のグリコシル転移を触媒してより長いマルトオリゴ糖を与える、４−α−グルカノトランスフェラーゼ（４ＧＴ、ＥＣ．２．４．１．２５）；又はα−１，４−グルコシド結合を切断する、α−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１）によって、触媒又は促進され得る。
【００４２】
さらに、セルロースの誘導体は、セルラーゼ混合物によって触媒されるセルロースの酵素的加水分解によって、酸によって、又はバイオマスの前処理によって、製造され得る。
【００４３】
ある特定の実施形態において、糖類をＧ１Ｐへ変換するのに使用される酵素はαＧＰを含有する。このステップにおいて、糖類がデンプンを含む場合に、Ｇ１ＰはαＧＰによってデンプンから生成され；糖類が可溶性デンプン、アミロデキストリン又はマルトデキストリンを含有する場合に、Ｇ１ＰはαＧＰによって可溶性デンプン、アミロデキストリン又はマルトデキストリンから生成される。
【００４４】
糖類がマルトースを含み、酵素がマルトースホスホリラーゼを含有する場合に、Ｇ１Ｐはマルトースホスホリラーゼによってマルトースから生成される。糖類がスクロースを含み、酵素がスクロースホスホリラーゼを含有するならば、Ｇ１Ｐはスクロースホスホリラーゼによってスクロースから生成される。
【００４５】
さらに別の実施形態において、糖類がセロビオースを含み、酵素がセロビオースホスホリラーゼを含有する場合に、Ｇ１Ｐはセロビオースホスホリラーゼによってセロビオースから生成される。
【００４６】
追加の実施形態において、糖類がセロデキストリンを含有し、酵素がセロデキストリンホスホリラーゼを含む場合に、Ｇ１Ｐはセロデキストリンホスホリラーゼによってセロデキストリンから生成される。
【００４７】
糖類をＧ１Ｐへ変換する代替の実施形態において、糖類がセルロースを含み、酵素がセルロースホスホリラーゼを含有する場合に、Ｇ１Ｐはセルロースホスホリラーゼによってセルロースから生成される。
【００４８】
本発明によれば、タガトースはフルクトースからも生成することができる。該方法の例は図４中で示される。例えば、この方法は、ポリリン酸フルクトキナーゼ（ＰＰＦＫ）によって触媒されてフルクトース及びポリリン酸塩からＦ６Ｐを生成すること；Ｆ６ＰＥによって触媒されてＦ６ＰをＴ６Ｐへ変換すること；及び、Ｔ６ＰＰによって触媒されてＴ６Ｐをタガトースへ変換すること、を包含する。フルクトースは、例えばスクロースの酵素的変換によって生成することができる。
【００４９】
他の実施形態において、タガトースはスクロースから生成することができる。かかる方法の例は図６中で示される。この方法は、以下の酵素的ステップ：スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）によって触媒されてスクロース及び遊離リン酸塩からＧ１Ｐを生成するステップ；ＰＧＭによって触媒されてＧ１ＰをＧ６Ｐへ変換するステップ；ＰＧＩによって触媒されてＧ６ＰをＦ６Ｐへ変換するステップ；Ｆ６ＰＥによって触媒されてＦ６ＰをＴ６Ｐへ変換するステップ；及び、Ｔ６ＰＰによって触媒されてＴ６Ｐをタガトースへ変換するステップ、が含まれるインビトロの合成経路を提供する。
【００５０】
Ｔ６Ｐがタガトースへ変換される場合に生成されるリン酸イオンは、次いでスクロースをＧ１Ｐへ変換するステップにおいてリサイクルすることができる。加えて、図６中で示されるように、ＰＰＦＫ及びポリリン酸塩を使用して、ＳＰによるスクロースの加リン酸分解性切断によって生成されたフルクトースから、Ｆ６Ｐを生成することによって、タガトース収率を増加させることができる。
【００５１】
いくつかの実施形態において、タガトースを製造する方法には、酵素的加水分解又は酸加水分解によって多糖及びオリゴ糖からグルコースを生成するステップ、少なくとも１つの酵素によって触媒されてグルコースをＧ６Ｐへ変換するステップ、酵素的加水分解又は酸加水分解によって多糖及びオリゴ糖からフルクトースを生成するステップ、少なくとも１つの酵素によって触媒されてフルクトースをＧ６Ｐへ変換するステップ、が含まれる。多糖及びオリゴ糖の例は上で列挙される。
【００５２】
他の実施形態において、Ｇ６Ｐは、ポリリン酸グルコキナーゼによってグルコース及びポリリン酸ナトリウムから生成される。
【００５３】
本開示は、糖類（デンプン中の多糖及びオリゴ糖、セルロース、スクロース、及びそれらの誘導産物等）をタガトースに変換する方法を提供する。ある特定の実施形態において、人工的な（非天然の）ＡＴＰ不含酵素経路は、無細胞酵素混液を使用して、デンプン、セルロース、スクロース、及びそれらの誘導産物をタガトースへ変換するために提供される。
【００５４】
上で示されるように、いくつかの酵素を使用してデンプンを加水分解し、Ｇ１Ｐ収率を増加させることができる。かかる酵素には、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、及びα−アミラーゼが含まれる。トウモロコシデンプンは、αＧＰ作用を妨害する多くの分岐を含有する。イソアミラーゼを使用してデンプンを脱分岐させることができ、直線状アミロデキストリンをもたらす。イソアミラーゼ前処理デンプンは、最終産物中でより高いＦ６Ｐ濃度をもたらし得る。イソアミラーゼ及びプルラナーゼはα−１，６−グリコシド結合を切断し、それはα−グルカンホスホリラーゼによるデンプンのより完全な分解を可能にする。α−アミラーゼはα−１，４−グリコシド結合を切断し、したがって、α−アミラーゼは、タガトースへのより迅速な変換のためにデンプンを断片へ分解するのに使用される。
【００５５】
図２中で示されるように、マルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）を使用して、分解産物マルトースをＧ１Ｐ及びグルコースへと加リン酸分解的に切断することによって、タガトース収率を増加させることができる。あるいは、４−グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を使用して、分解産物のグルコース、マルトース及びマルトトリオースをより長いマルトオリゴ糖へとリサイクルし；それをαＧＰによって加リン酸分解的に切断してＧ１Ｐを与えることによって、タガトース収率を増加させることができる。
【００５６】
加えて、セルロースは最も多量にある生物資源であり、植物細胞壁の主要な構成要素である。非食料品のリグノセルロース系バイオマスは、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンに加えて、他の微量成分を含有する。純粋なセルロース（アビセル（微結晶性セルロース）、再生された非晶性セルロース、細菌セルロース、フィルターペーパーなどが含まれる）は、処理のシリーズによって製造され得る。部分的に加水分解されたセルロース系基質には、重合度が７を超える非水溶性セロデキストリン、３〜６の重合度を備えた水溶性セロデキストリン、セロビオース、グルコース、及びフルクトースが含まれる。
【００５７】
ある特定の実施形態において、セルロース及びその誘導産物はステップのシリーズを介してタガトースへ変換され得る。かかる方法の例は図３中で示される。この方法は、セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）によって触媒されてそれぞれセロデキストリン及びセロビオース並びに遊離リン酸塩からＧ１Ｐを生成するステップ；ＰＧＭによって触媒されてＧ１ＰをＧ６Ｐへ変換するステップ；ＰＧＩによって触媒されてＧ６ＰをＦ６Ｐへ変換するステップ；Ｆ６ＰＥによって触媒されてＦ６ＰをＴ６Ｐへ変換するステップ；及び、Ｔ６ＰＰによって触媒されてＴ６Ｐをタガトースへ変換するステップ、を包含するインビトロの合成経路を提供する。この方法において、リン酸イオンは、セロデキストリン及びセロビオースをＧ１Ｐへ変換するステップによってリサイクルすることができる。
【００５８】
いくつかの酵素を使用して、固体セルロースを水溶性セロデキストリン及びセロビオースへ加水分解することができる。かかる酵素にはエンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼが含まれるが、β−グルコシダーゼ（セロビアーゼ）は含まれない。
【００５９】
セルロースの加水分解及びＧ１Ｐ生成の前に、セルロース及びバイオマスを前処理して、それらの反応性を増加させ、セルロース鎖の重合度を減少させることができる。セルロース及びバイオマスの前処理方法には、希酸前処理、セルロース溶媒ベースのリグノセルロース分画、アンモニア繊維爆砕、アンモニア水浸漬、イオン液体処理、及び濃酸（塩酸、硫酸、リン酸及びそれらの組み合わせが含まれる）の使用による部分的加水分解が含まれる。
【００６０】
いくつかの実施形態において、図３中で示されるように、ポリリン酸塩及びポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）を本方法へ添加することができ、したがって、分解産物グルコースのＧ６Ｐへのリン酸化によってタガトースの収率を増加させる。
【００６１】
他の実施形態において、タガトースはグルコースから生成することができる。かかる方法の例は図５中で示される。この方法は、ポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）によって触媒されてグルコース及びポリリン酸塩からＧ６Ｐを生成するステップ；ＰＧＩによって触媒されてＧ６ＰをＦ６Ｐへ変換するステップ；Ｆ６ＰＥによって触媒されてＦ６ＰをＴ６Ｐへ変換するステップ；及び、Ｔ６ＰＰによって触媒されてＴ６Ｐをタガトースへ変換するステップ、を包含する。
【００６２】
当技術分野において公知の任意の好適な生理的バッファーを、本発明の方法において使用することができる（ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、ＭＯＰＳ、ＤＩＰＳＯ、トリズマなど等）。すべての実施形態について、反応バッファーは５．０〜８．０の範囲のｐＨを有することができる。より好ましくは、反応バッファーのｐＨは約６．０〜約７．３の範囲であり得る。例えば、反応バッファーｐＨは、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２又は７．３であり得る。
【００６３】
反応バッファーは、重要な金属カチオンも含有することができる。金属イオンの例にはＭｇ２＋及びＺｎ２＋が含まれる。
【００６４】
本方法のステップが遂行される反応温度は３７〜８５℃の範囲であり得る。より好ましくは、ステップは約４０℃〜約７０℃の範囲の温度で遂行することができる。温度は、例えば約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃又は約６０℃であり得る。好ましくは、反応温度は約５０℃である。
【００６５】
開示される方法の反応時間は必要に応じて調整することができ、約８時間〜約４８時間の範囲であり得る。例えば、反応時間は、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間、約２４時間、約２６時間、約２８時間、約３０時間、約３２時間、約３４時間、約３６時間、約３８時間、約４０時間、約４２時間、約４４時間、約４６時間、又は約４８時間であり得るより好ましくは、反応時間は約２４時間である。
【００６６】
本発明に記載の方法は、反応全体について非常に有利な平衡定数に起因して高収率を達成することができる。例えば、図７は、グルコース１−リン酸のタガトースへの変換のための生成ギブスエネルギーに基づく中間体の間の反応ギブスエネルギーを示す。反応ギブスエネルギーはhttp://equilibrator.weizmann.ac.il/を使用して得られた。理論的には、出発材料が完全に中間体に変換されるならば、最大９９％の収率を達成することができる。
【００６７】
本発明の方法は低コストの出発材料を使用し、原料及び産物分離と関連する費用の減少によって生成費用を低減させる。デンプン、セルロース、スクロース及びそれらの誘導体は、例えばラクトースよりも低い費用の原料である。タガトースがラクトースから生成される場合に、グルコース、ガラクトース及びタガトースはクロマトグラフィーによって分離され、それはより高い生成費用を引き起こす。
【００６８】
さらに、Ｔ６Ｐを本発明に記載のタガトースへ変換するステップは、原料にかかわらず、不可逆的ホスファターゼ反応である。したがって、タガトースは、後続の産物分離費用を効果的に最小限にしながら非常に高収率で生成される。
【００６９】
細胞ベースの製造方法とは対照的に、本発明は、タガトースの細胞不含製造を包含し、細胞膜（それは多くの場合細胞の中へ及び細胞から外への基質／産物の輸送を減速させる）の排除に起因する比較的高い反応速度を有する。それは、栄養に富む発酵培地／細胞内代謝物のない最終産物も有する。
【実施例】
【００７０】
材料及び方法
化学物質
【００７１】
トウモロコシデンプン、可溶性デンプン、マルトデキストリン、マルトース、グルコース、フィルターペーパーが含まれるすべての化学物質は、特に断りのない限り、試薬グレード以上のものであり、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）又はＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、米国）から購入した。制限酵素、Ｔ４リガーゼ、及びＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ（ＭＡ）及び米国）から購入した。オリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ、米国）又はＥｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、米国）のいずれかによって合成された。Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ９  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｃｅｌｌｏｄｅｘｔｒｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  ｏｎ  ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１；９２：５５１−５６０．中で記載されるように、酵素精製において使用される、再生された非晶性セルロースを、アビセルＰＨ１０５（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、米国）からの溶解及び再生を介して製造した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｓｉｇ１０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）をＤＮＡ操作のための宿主細胞として使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）を組換えタンパク質発現のための宿主細胞として使用した。１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン又は５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンのいずれかを含むＺＹＭ−５０５２培地を、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞増殖及び組換えタンパク質発現のために使用した。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉからのセルラーゼ（カタログ番号：Ｃ２７３０）及びプルラナーゼ（カタログ番号：Ｐ１０６７）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）から購入し、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ、ＮＣ、米国）によって製造されたものであった。マルトースホスホリラーゼ（カタログ番号：Ｍ８２８４）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【００７２】
組換え酵素の生成及び精製
【００７３】
タンパク質発現プラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン又は５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンのいずれかを含有する１００ｍＬのＺＹＭ−５０５２培地を備えた１Ｌのエルレンマイヤーフラスコ中でインキュベーションした。細胞を、２２０ｒｐｍでの回転式振盪により３７℃で１６〜２４時間増殖させた。細胞を１２℃で遠心分離によって採取し、５０ｍＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）（加熱沈殿及びセルロース結合モジュール）、又は３００ｍＭのＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含有する２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）（Ｎｉ精製）のいずれかにより１回洗浄した。細胞ペレットを同じバッファー中で再懸濁し、超音波処理によって溶解した（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ  Ｍｏｄｅｌ  ５００；５秒パルスオン及び１０秒オフ、５０％の振幅で全体で２１分間）。遠心分離後に、上清中の標的タンパク質を精製した。
【００７４】
３つのアプローチを使用して、様々な組換えタンパク質を精製した。Ｈｉｓタグ付加タンパク質をＰｒｏｆｉｎｉｔｙ  ＩＭＡＣ  Ｎｉ−Ｃｈａｒｇｅｄ  Ｒｅｓｉｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、米国）によって精製した。セルロース結合モジュール（ＣＢＭ）及び自己切断インテインを含有する融合タンパク質を、大きな表面積の再生された非晶性セルロース上での高親和性吸着を介して精製した。７０〜９５℃で５〜３０分間の加熱沈殿を使用して超耐熱性酵素を精製した。組換えタンパク質の純度を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって検討した。
【００７５】
使用される酵素及びそれらの活性アッセイ
【００７６】
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａからのα−グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｇ４ＦＥＨ８）を使用した。１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＤＴＴ及び３０ｍＭのマルトデキストリンを含有する５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）中で５０℃で、活性をアッセイした。Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２濃縮器（１０，０００分子量カットオフ）（Ｖｉｖａｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＭＡ、米国）による酵素の濾過によって、反応を停止した。グルコース１−リン酸（Ｇ１Ｐ）を、２５Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼを補足したグルコースヘキソキナーゼ／Ｇ６ＰＤＨアッセイキット（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＧＡＨＫ２０−１ＫＴ）を使用して測定した。単位（Ｕ）はμｍｏｌ／分として記述される。
【００７７】
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓからのホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ６８ＢＪ６）を使用した。５ｍＭのＭｇＣｌ２及び５ｍＭのＧ１Ｐを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．２）中で５０℃で、活性を測定した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２濃縮器（１０，０００分子量カットオフ）による酵素の濾過によって、反応を停止した。産物グルコース６−リン酸（Ｇ６Ｐ）を、ヘキソキナーゼ／Ｇ６ＰＤＨアッセイキット（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号ＧＡＨＫ２０−１ＫＴ））を使用して決定した。
【００７８】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍからのホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ａ３ＤＢＸ９）及びＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＰＧＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ５ＳＬＬ６）の異なる２つの源を使用した。５ｍＭのＭｇＣｌ２及び１０ｍＭのＧ６Ｐを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．２）中で５０℃で、活性を測定した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２濃縮器（１０，０００分子量カットオフ）による酵素の濾過によって、反応を停止した。産物（フルクトース６−リン酸（Ｆ６Ｐ））を、フルクトース６−リン酸キナーゼ（Ｆ６ＰＫ）／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＫ）／乳酸脱水素酵素（ＬＤ）共役酵素アッセイ（そこで３４０ｎｍでの吸光度の減少はＦ６Ｐの生成を指摘する）を使用して決定した。この２００μＬ反応物は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＧ６Ｐ、１．５ｍＭのＡＴＰ、１．５ｍＭのホスホエノールピルビン酸、２００μＭのＮＡＤＨ、０．１ＵのＰＧＩ、５ＵのＰＫ、及び５ＵのＬＤを含んでいた。
【００７９】
Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍからのフルクトース６−リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｂ５ＹＢＤ７）を使用した。５ｍＭのＭｇＣｌ２及び１０ｍＭのＦ６Ｐを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．２）中で５０℃で、活性を測定した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２濃縮器（１０，０００分子量カットオフ）による酵素の濾過によって、反応を停止した。産物（タガトース６−リン酸（Ｔ６Ｐ））を、タガトース６−リン酸ホスファターゼを使用し遊離リン酸塩放出を検出して決定した。遊離リン酸塩放出を検出するために、０．１Ｍの酢酸亜鉛及び２ｍＭのモリブデン酸アンモニウム（ｐＨ５）を含有する５００μＬの溶液を、５０μＬの反応物へ添加した。これを混合し、１２５μＬの５％のアスコルビン酸（ｐＨ５）が後続した。この溶液を混合し、次いで３０℃で２０分間インキュベーションした。８５０ｎｍでの吸光度を読み取って、遊離リン酸塩放出を決定した。
【００８０】
Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  ＵＮＩ−１からの好熱性Ｆ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ：Ｅ８Ｎ０Ｎ６）
【００８１】
ヌクレオチド配列（配列番号：１）
【００８２】
ＡＴＧＴＴＣＧＧＣＴＣＧＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＣＧＣＡＧＡＡＡＣＡＧＧＧＣＡＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＡＴＣＣＣＡＴＣＣＡＴＴＴＧＴＴＣＧＧＣＡＣＡＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＡＴＣＴＴＧＣＣＣＧＣＣＧＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＴＣＧＡＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＡＴＣＡＧＧＴＣＡＡＣＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＧＴＡＣＡＧＣＧＧＣＡＴＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＧＡＴＴＴＴＧＴＣＣＧＣＴＴＴＣＴＧＣＧＣＧＡＡＡＴＴＣＴＧＧＡＡＣＧＧＧＡＡＧＧＴＡＴＴＣＣＣＣＣＧＣＡＡＣＡＧＧＴＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＧＧＧＧＡＴＣＡＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＴＡＣＣＣＣＴＧＧＣＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＴＧＣＣＧＡＡＡＣＣＧＣＣＡＴＡＧＣＡＣＡＡＧＣＧＣＴＧＧＡＡＡＴＧＧＴＧＣＧＧＧＣＡＴＡＣＧＴＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＴＡＣＡＣＣＡＡＡＡＴＴＣＡＴＣＴＧＧＡＣＧＣＴＴＣＣＡＴＧＣＣＣＴＧＣＧＣＣＧＡＴＧＡＣＧＡＣＣＣＣＧＡＧＣＧＴＣＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＡＧＣＧＣＡＴＡＧＣＣＣＧＡＣＧＧＧＣＧＧＣＧＣＡＧＴＴＧＴＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＡＡＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＣＧＧＴＴＣＡＧＣＣＧＧＴＧＴＡＣＧＴＡＡＴＴＧＧＣＡＧＴＧＡＧＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＧＣＧＣＡＧＧＧＴＣＡＧＧＡＧＧＣＡＡＧＡＣＴＴＣＡＣＧＴＣＡＣＣＡＣＴＣＣＧＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＡＡＧＣＣＧＣＧＣＴＧＧＡＴＧＣＣＴＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＣＴＴＴＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＴＴＧＡＣＴＣＣＣＧＴＴＴＧＧＧＡＧＣＧＧＧＴＣＡＴＴＧＣＧＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＧＧＧＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＣＧＴＧＧＡＣＡＧＣＡＴＴＣＡＣＧＣＣＴＡＴＣＡＧＣＧＣＧＡＡＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＧＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＴＣＡＴＣＧＡＧＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＧＴＡＴＧＡＡＧＣＣＣＡＣＴＣＧＡＣＣＧＡＴＴＡＣＣＡＧＡＣＣＣＧＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＣＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＣＣＡＣＴＴＴＴＣＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＧＴＴＧＧＴＣＣＧＧＣＡＣＴＡＡＣＣＴＴＴＧＣＣＴＡＣＣＧＣＧＡＡＧＣＣＧＴＧＴＴＣＧＣＣＣＴＧＧＡＡＣＡＣＡＴＣＧＡＡＣＧＧＧＡＡＡＴＡＴＴＧＧＧＣＡＧＧＣＡＧＧＡＴＡＴＧＣＣＴＣＴＣＴＣＣＣＧＣＣＴＧＡＧＴＧＡＡＧＴＣＣＴＣＧＡＣＧＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＣＧＡＴＣＣＡＣＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＧＧＡＴＡＣＴＴＴＧＣＣＧＧＣＧＣＴＣＣＣＧＣＣＧＡＡＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＴＡＣＡＧＴＴＴＣＡＧＣＧＡＣＣＧＣＡＴＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＡＧＧＡＡＧＣＣＧＴＧＣＧＧＡＧＡＣＴＧＣＴＣＧＣＣＡＡＣＣＴＧＡＴＣＧＡＡＡＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＡＧＴＴＴＧＣＴＣＡＧＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＣＣＧＣＧＣＧＡＧＴＡＴＧＡＧＡＴＧＧＴＧＣＧＣＧＣＧＧＧＧＧＡＡＡＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＧＣＡＧＧＡＣＣＴＧＡＴＴＣＧＧＧＣＡＣＡＴＡＴＣＣＡＧＣＡＣＡＣＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＴＡＣＧＣＴＧＣＧＧＣＧＴＧＣＧＧＧＴＡＡ
【００８３】
アミノ酸配列（配列番号：２）
【００８４】
ＭＦＧＳＰＡＰＬＬＤＭＶＴＡＱＫＱＧＭＡＲＧＩＰＳＩＣＳＡＨＰＶＶＬＳＡＡＣＨＬＡＲＲＳＧＡＰＬＬＩＥＴＴＣＮＱＶＮＨＱＧＧＹＳＧＭＴＰＡＤＦＶＲＦＬＲＥＩＬＥＲＥＧＩＰＰＱＱＶＩＬＧＧＤＨＬＧＰＹＰＷＲＫＥＰＡＥＴＡＩＡＱＡＬＥＭＶＲＡＹＶＱＡＧＹＴＫＩＨＬＤＡＳＭＰＣＡＤＤＤＰＥＲＰＬＰＬＥＲＩＡＲＲＡＡＱＬＣＡＡＡＥＡＡＡＧＡＶＱＰＶＹＶＩＧＳＥＶＰＰＰＧＧＡＱＧＱＥＡＲＬＨＶＴＴＰＱＥＡＱＡＡＬＤＡＦＲＥＡＦＬＱＡＧＬＴＰＶＷＥＲＶＩＡＬＶＶＱＰＧＶＥＦＧＶＤＳＩＨＡＹＱＲＥＡＡＲＰＬＫＴＦＩＥＧＶＰＧＭＶＹＥＡＨＳＴＤＹＱＴＲＡＳＬＲＡＬＶＥＤＨＦＳＩＬＫＶＧＰＡＬＴＦＡＹＲＥＡＶＦＡＬＥＨＩＥＲＥＩＬＧＲＱＤＭＰＬＳＲＬＳＥＶＬＤＥＶＭＬＮＤＰＲＨＷＱＧＹＦＡＧＡＰＡＥＱＡＬＡＲＲＹＳＦＳＤＲＩＲＹＹＷＨＨＰＡＡＱＥＡＶＲＲＬＬＡＮＬＩＥＴＰＰＰＬＳＬＬＳＱＹＬＰＲＥＹＥＭＶＲＡＧＥＩＳＳＨＰＱＤＬＩＲＡＨＩＱＨＴＬＥＤＹＡＡＡＣＧ
【００８５】
Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｋｒｏｎｏｔｓｋｙｅｎｓｉｓからの好熱性Ｆ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ：Ｅ４ＳＥＨ３）
【００８６】
ヌクレオチド配列（配列番号：３）
【００８７】
ＡＴＧＡＧＴＣＣＴＣＡＡＡＡＴＣＣＡＴＴＧＡＴＴＧＧＴＴＴＡＴＴＴＡＡＧＡＡＴＡＧＡＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＴＡＡＧＧＧＴＡＴＴＡＴＴＴＣＡＧＴＴＴＧＴＴＣＴＴＣＡＡＡＴＧＡＡＡＴＡＧＴＣＴＴＡＧＡＡＧＣＡＧＴＴＴＴＡＡＡＡＡＧＡＡＴＧＡＡＡＧＡＴＡＣＡＡＡＣＣＴＡＣＣＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＣＧＡＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＴＣＡＡＴＴＴＧＧＣＧＧＧＴＡＴＴＣＴＧＧＧＴＴＧＡＣＡＣＣＧＴＣＴＣＡＧＴＴＣＡＡＡＧＡＡＣＧＡＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＴＴＧＣＴＣＡＡＡＡＡＧＴＴＧＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＴＡＡＴＴＣＴＴＧＧＴＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＴＴＧＧＡＣＣＡＴＴＴＧＴＧＴＧＧＣＧＴＧＡＣＣＡＧＧＡＡＣＣＡＧＡＡＡＴＴＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＡＴＧＣＴＡＡＧＣＡＡＡＴＧＡＴＡＡＡＡＧＡＡＴＡＣＡＴＡＡＡＡＧＣＡＧＧＴＴＴＴＡＣＣＡＡＡＡＴＴＣＡＣＡＴＣＧＡＣＡＣＧＡＧＴＡＴＧＣＣＴＴＴＡＡＡＡＧＧＧＧＡＧＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＡＴＧＡＴＧＡＡＡＴＡＡＴＴＧＣＴＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＴＧＣＴＣＴＧＣＡＧＧＡＴＴＧＣＧＧＡＧＧＡＧＴＧＴＴＴＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＴＡＴＡＡＡＣＡＡＴＣＣＣＴＡＴＡＴＴＡＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＴＴＡＴＧＴＧＡＴＡＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＣＧＧＣＧＧＡＧＡＧＴＣＴＴＣＴＡＴＴＴＧＴＣＡＡＡＣＡＡＴＴＡＣＴＡＣＴＡＡＡＧＡＴＧＡＡＴＴＡＧＡＡＡＧＡＡＧＴＴＴＡＧＡＡＴＡＴＴＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＧＣＡＴＧＴＡＴＴＣＧＡＴＴＡＴＧＴＡＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧＴＴＧＣＡＡＡＴＴＴＴＧＧＡＧＴＴＧＡＡＴＴＴＧＧＧＡＧＣＧＡＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＧＡＴＴＴＴＧＡＴＡＴＧＧＡＡＡＡＡＧＴＡＡＡＧＣＣＧＣＴＡＡＡＡＧＡＡＣＴＴＴＴＧＧＣＡＡＡＧＴＡＣＡＡＴＡＴＡＧＴＡＴＴＴＧＡＡＧＧＣＣＡＴＴＣＴＡＣＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＴＴＡＡＡＡＡＧＡＡＴＧＧＴＣＧＡＡＴＧＴＧＧＴＡＴＴＧＣＡＡＴＴＴＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＣＴＡＡＣＡＴＴＴＡＣＡＴＴＧＣＧＣＧＡＡＧＣＧＴＴＡＧＴＡＧＣＡＣＴＴＡＧＴＣＡＴＡＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＴＴＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＡＣＴＧＴＣＡＡＧＡＴＴＴＡＧＡＧＡＡＧＴＴＴＴＡＴＴＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＣＴＡＡＣＡＴＧＣＡＡＡＧＡＴＣＡＣＴＧＧＡＧＴＡＡＡＴＡＴＴＴＴＧＡＴＧＡＧＡＡＴＧＡＴＡＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＴＣＡＡＡＧＣＴＣＣＴＡＴＡＴＡＧＣＴＡＴＣＴＴＧＡＣＡＧＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＴＡＴＴＴＴＧＡＡＡＡＣＧＡＧＡＧＴＧＴＧＡＡＡＡＧＴＧＣＴＧＴＴＴＡＴＴＣＴＣＴＴＡＴＴＧＧＡＡＡＴＴＴＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＣＴＴＧＴＡＡＧＴＣＡＧＴＡＴＴＴＴＣＣＴＴＣＴＣＡＧＴＡＣＣＡＡＡＡＧＡＴＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＡＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＧＧＴＧＣＴＧＣＣＧＡＣＣＴＡＡＴＡＴＴＧＧＡＴＡＡＡＡＴＡＧＧＧＧＡＡＧＴＣＡＴＴＧＡＣＣＡＴＴＡＴＧＴＴＴＡＴＧＣＧＧＴＡＡＡＡＧＡＡＴＡＡ
【００８８】
アミノ酸配列（配列番号：４）
【００８９】
ＭＳＰＱＮＰＬＩＧＬＦＫＮＲＥＫＥＦＫＧＩＩＳＶＣＳＳＮＥＩＶＬＥＡＶＬＫＲＭＫＤＴＮＬＰＩＩＩＥＡＴＡＮＱＶＮＱＦＧＧＹＳＧＬＴＰＳＱＦＫＥＲＶＩＫＩＡＱＫＶＤＦＰＬＥＲＩＩＬＧＧＤＨＬＧＰＦＶＷＲＤＱＥＰＥＩＡＭＥＹＡＫＱＭＩＫＥＹＩＫＡＧＦＴＫＩＨＩＤＴＳＭＰＬＫＧＥＮＳＩＤＤＥＩＩＡＫＲＴＡＶＬＣＲＩＡＥＥＣＦＥＫＩＳＩＮＮＰＹＩＴＲＰＶＹＶＩＧＡＤＶＰＰＰＧＧＥＳＳＩＣＱＴＩＴＴＫＤＥＬＥＲＳＬＥＹＦＫＥＡＦＫＫＥＧＩＥＨＶＦＤＹＶＶＡＶＶＡＮＦＧＶＥＦＧＳＤＥＩＶＤＦＤＭＥＫＶＫＰＬＫＥＬＬＡＫＹＮＩＶＦＥＧＨＳＴＤＹＱＴＫＥＮＬＫＲＭＶＥＣＧＩＡＩＬＫＶＧＰＡＬＴＦＴＬＲＥＡＬＶＡＬＳＨＩＥＥＥＩＹＳＮＥＫＥＫＬＳＲＦＲＥＶＬＬＮＴＭＬＴＣＫＤＨＷＳＫＹＦＤＥＮＤＫＬＩＫＳＫＬＬＹＳＹＬＤＲＷＲＹＹＦＥＮＥＳＶＫＳＡＶＹＳＬＩＧＮＬＥＮＶＫＩＰＰＷＬＶＳＱＹＦＰＳＱＹＱＫＭＲＫＫＤＬＫＮＧＡＡＤＬＩＬＤＫＩＧＥＶＩＤＨＹＶＹＡＶＫＥ
【００９０】
Ｃａｌｄｉｌｉｎｅａ  ａｅｒｏｐｈｉｌａからの好熱性Ｆ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ：Ｉ０Ｉ５０７）
【００９１】
ヌクレオチド配列（配列番号：５）
【００９２】
ＡＴＧＴＣＡＡＣＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＡＴＣＡＴＴＴＴＧＣＧＡＣＴＧＡＴＣＧＡＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＣＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＣＣＡＴＣＴＣＡＣＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＴＣＴＧＴＣＣＣＡＡＣＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＣＴＧＧＡＧＧＣＡＧＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＴＧＣＣＡＣＡＣＧＣＣＧＡＴＧＣＴＣＴＴＣＧＣＴＧＣＣＡＣＧＣＴＣＡＡＴＣＡＡＧＴＣＧＡＴＣＧＣＧＡＣＧＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＧＧＴＴＧＧＡＣＧＣＣＴＧＣＧＣＡＡＴＴＣＧＴＣＧＣＣＧＡＧＡＴＧＣＧＴＣＧＣＴＡＴＧＣＣＧＴＣＣＧＣＴＡＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＣＣＧＣＴＣＴＡＴＣＣＴＴＧＣＣＴＧＧＡＴＣＡＣＧＧＣＧＧＧＣＣＧＴＧＧＣＴＣＡＡＡＧＡＴＣＧＣＣＡＴＧＣＡＣＡＧＧＡＡＡＡＧＣＴＡＣＣＧＣＴＣＧＡＣＣＡＧＧＣＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＣＴＣＡＣＣＧＣＣＴＧＴＣＴＧＧＡＧＧＣＣＧＧＣＴＡＣＧＣＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＴＣＧＡＣＣＣＣＡＣＧＧＴＣＧＡＴＣＧＣＡＣＧＣＴＣＣＣＧＣＣＣＧＧＡＧＡＡＧＣＧＣＣＧＣＴＣＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＡＧＣＧＣＡＣＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＡＣＡＴＧＣＣＧＡＡＣＡＧＧＡＧＣＧＡＣＡＧＣＧＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＣＧＧＣＧＧＴＣＧＣＣＴＡＴＧＡＡＧＴＣＧＧＣＡＣＣＧＡＡＧＡＡＧＴＡＣＡＴＧＧＣＧＧＧＣＴＧＧＴＧＡＡＴＴＴＣＧＡＣＡＡＴＴＴＴＧＴＣＧＣＣＴＴＣＴＴＧＧＡＴＴＴＧＣＴＣＡＡＧＧＣＡＡＧＧＣＴＴＧＡＡＣＡＡＣＧＴＧＣＣＣＴＧＡＴＧＣＡＣＧＣＣＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＴＣＧＴＧＧＴＧＧＣＧＣＡＧＧＴＣＧＧＣＡＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＴＡＣＡＡＣＧＴＡＴＴＴＴＧＡＣＣＣＣＡＧＴＧＣＧＧＣＧＣＡＡＣＧＧＣＴＧＡＣＴＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＧＣＣＣＴＡＣＣＧＧＴＧＣＡＣＴＧＴＴＧＡＡＧＧＧＧＣＡＣＴＡＣＡＣＣＧＡＣＴＧＧＧＴＣＧＡＡＡＡＴＣＣＣＧＣＣＧＡＣＴＡＴＣＣＧＡＧＧＧＴＡＧＧＣＡＴＧＧＧＡＧＧＣＧＣＣＡＡＣＧＴＴＧＧＴＣＣＡＧＡＧＴＴＴＡＣＧＧＣＧＧＣＣＧＡＧＴＴＣＧＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧＣＴＧＧＡＡＣＧＧＣＧＧＧＡＡＣＡＡＣＧＧＣＴＧＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＧＧＡＡＡＴＴＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＴＧＴＴＴＴＴＴＧＧＣＴＧＣＡＣＴＧＧＡＡＧＡＧＧＣＡＧＴＡＧＴＣＧＣＴＴＣＡＧＡＴＣＧＴＴＧＧＣＧＧＡＡＧＴＧＧＣＴＣＣＡＧＣＣＣＧＡＴＧＡＧＡＴＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＴＴＴＧＣＡＧＡＡＴＴＡＡＣＧＣＣＣＧＣＡＣＧＣＣＧＧＣＧＣＴＧＧＣＴＣＧＴＧＣＡＧＡＣＣＧＧＧＧＣＡＣＧＣＴＡＣＧＴＣＴＧＧＡＣＴＧＣＧＣＣＧＡＡＡＧＴＴＡＴＣＧＣＣＧＣＡＣＧＣＧＡＡＣＡＧＣＴＣＴＡＴＧＣＧＣＡＣＣＴＣＴＣＣＣＴＴＧＴＧＣＡＧＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＡＴＧＣＣＴＡＣＧＴＧＧＴＡＧＡＧＴＣＡＧＴＣＧＣＣＣＧＧＴＣＡＡＴＣＧＡＧＣＧＣＴＡＴＡＴＣＧＡＴＧＣＣＴＴＣＡＡＣＴＴＡＴＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＴＡＣＡＴＴＧＣＴＴＧＧＡＴＧＡ
【００９３】
アミノ酸配列（配列番号：６）
【００９４】
ＭＳＴＬＲＨＩＩＬＲＬＩＥＬＲＥＲＥＱＩＨＬＴＬＬＡＶＣＰＮＳＡＡＶＬＥＡＡＶＫＶＡＡＲＣＨＴＰＭＬＦＡＡＴＬＮＱＶＤＲＤＧＧＹＴＧＷＴＰＡＱＦＶＡＥＭＲＲＹＡＶＲＹＧＣＴＴＰＬＹＰＣＬＤＨＧＧＰＷＬＫＤＲＨＡＱＥＫＬＰＬＤＱＡＭＨＥＶＫＬＳＬＴＡＣＬＥＡＧＹＡＬＬＨＩＤＰＴＶＤＲＴＬＰＰＧＥＡＰＬＶＰＩＶＶＥＲＴＶＥＬＩＥＨＡＥＱＥＲＱＲＬＮＬＰＡＶＡＹＥＶＧＴＥＥＶＨＧＧＬＶＮＦＤＮＦＶＡＦＬＤＬＬＫＡＲＬＥＱＲＡＬＭＨＡＷＰＡＦＶＶＡＱＶＧＴＤＬＨＴＴＹＦＤＰＳＡＡＱＲＬＴＥＩＶＲＰＴＧＡＬＬＫＧＨＹＴＤＷＶＥＮＰＡＤＹＰＲＶＧＭＧＧＡＮＶＧＰＥＦＴＡＡＥＦＥＡＬＥＡＬＥＲＲＥＱＲＬＣＡＮＲＫＬＱＰＡＣＦＬＡＡＬＥＥＡＶＶＡＳＤＲＷＲＫＷＬＱＰＤＥＩＧＫＰＦＡＥＬＴＰＡＲＲＲＷＬＶＱＴＧＡＲＹＶＷＴＡＰＫＶＩＡＡＲＥＱＬＹＡＨＬＳＬＶＱＡＤＰＨＡＹＶＶＥＳＶＡＲＳＩＥＲＹＩＤＡＦＮＬＹＤＡＡＴＬＬＧ
【００９５】
Ｃａｌｄｉｔｈｒｉｘ  ａｂｙｓｓｉからの好熱性Ｆ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ：Ｈ１ＸＲＧ１）
【００９６】
ヌクレオチド配列（配列番号：７）
【００９７】
ＡＴＧＡＧＴＣＴＧＣＡＴＣＣＴＴＴＡＡＡＴＡＡＡＴＴＡＡＴＣＧＡＧＣＧＡＣＡＣＡＡＡＡＡＡＧＧＡＡＣＧＣＣＧＧＴＣＧＧＴＡＴＴＴＡＴＴＣＣＧＴＣＴＧＴＴＣＧＧＣＣＡＡＴＣＣＣＴＴＴＧＴＴＴＴＧＡＡＡＧＣＧＧＣＣＡＴＧＣＴＡＣＡＧＧＣＧＣＡＡＡＡＧＧＡＴＣＡＧＴＣＴＴＴＧＣＴＡＣＴＴＡＴＴＧＡＧＧＣＣＡＣＴＴＣＣＡＡＣＣＡＧＧＴＡＧＡＴＣＡＡＴＴＣＧＧＣＧＧＴＴＡＣＡＣＣＧＧＣＡＴＧＣＧＧＣＣＣＧＡＡＧＡＴＴＴＴＡＡＡＡＣＡＡＴＧＡＣＧＣＴＴＧＡＡＣＴＧＧＣＡＧＣＣＧＡＡＡＡＣＡＡＴＴＡＣＧＡＴＣＣＡＣＡＧＧＧＡＴＴＡＡＴＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＣＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＣＡＡＣＣＧＣＴＧＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＡＧＣＧＣＣＴＣＣＣＧＧＧＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＡＧＡＴＴＧＣＣＧＣＴＴＡＴＧＴＴＡＡＡＧＣＣＧＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＣＣＡＣＴＴＡＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＴＴＧＣＡＡＡＡＣＧＡＴＧＣＣＡＣＡＧＡＴＴＣＣＧＣＣＧＧＣＣＧＣＣＴＴＣＣＡＧＴＣＧＡＡＡＣＡＡＴＣＧＣＴＣＡＡＣＧＴＡＣＣＧＣＡＧＡＡＴＴＡＴＧＣＧＣＣＧＴＧＧＣＣＧＡＡＣＡＡＡＣＴＴＡＣＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＣＣＡＡＣＴＣＴＴＴＣＣＧＣＣＧＣＣＴＧＴＴＴＡＣＡＴＴＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＧＣＧＣＡＡＧＡＡＧＣＧＣＴＧＡＡＣＣＡＧＡＴＣＣＡＴＡＴＴＡＣＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＧＡＧＧＴＴＣＡＡＣＡＧＡＣＣＡＴＴＧＡＴＣＡＣＧＴＧＣＧＧＣＧＧＧＣＣＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＡＣＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＣＴＴＡＣＧＡＡＡＧＡＧＴＴＴＧＣＧＣＣＧＴＴＧＴＣＧＴＧＣＡＧＣＣＡＧＧＣＧＴＴＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＡＴＣＡＡＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＡＡＴＡＣＧＣＴＣＣＣＧＡＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＣＴＴＡＡＡＡＧＡＴＴＴＴＡＴＴＧＡＡＡＧＣＣＡＴＴＣＧＣＡＧＣＴＧＧＴＴＴＡＴＧＡＡＧＣＧＣＡＣＴＣＴＡＣＴＧＡＴＴＡＣＣＡＧＡＣＣＧＣＡＣＣＴＣＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＧＡＴＧＧＴＡＡＡＡＧＡＴＣＡＣＴＴＴＧＣＣＡＴＴＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧＧＧＣＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＣＴＴＴＧＣＣＣＴＧＣＧＣＧＡＡＧＣＣＡＴＴＴＴＴＧＣＴＣＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＣＴＴＴＴＧＣＣＡＴＴＧＣＡＣＡＧＡＧＣＧＣＴＣＡＡＡＣＣＴＴＣＴＧＣＣＡＴＴＣＴＧＧＡＡＡＣＧＣＴＧＧＡＣＣＡＡＡＣＧＡＴＧＧＡＣＡＡＡＡＡＣＣＣＴＧＣＴＴＡＣＴＧＧＣＡＡＡＡＧＣＡＴＴＡＣＧＧＣＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＡＡＧＡＡＧＴＡＣＧＣＴＴＴＧＣＧＣＡＧＣＧＧＴＴＴＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＣＣＧＣＡＴＴＣＧＴＴＡＣＴＡＣＴＧＧＣＣＧＴＴＴＣＣＡＡＡＧＧＴＴＣＡＡＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＧＣＣＡＡＴＴＧＣＴＡＡＡＡＡＡＣＴＴＧＣＡＡＣＡＡＡＴＴＴＣＣＡＴＴＣＣＴＣＴＡＡＣＴＴＴＧＧＴＡＡＧＣＣＡＧＴＴＣＡＴＧＣＣＡＧＡＧＧＡＡＴＡＣＣＡＡＣＧＴＡＴＴＣＧＣＣＡＡＧＧＡＡＣＧＴＴＡＡＣＣＡＡＣＧＡＴＣＣＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＣＡＡＡＡＴＴＣＡＡＡＧＣＧＴＡＴＴＡＡＡＧＣＡＡＴＡＣＧＣＧＧＡＧＧＣＧＡＣＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＡＡＣＴＣＴＴＴＧＡＣＡＴＴＣＡＣＧＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡＡＴＴＣＡＴＴＡＧＣＡＡＴＧＧＡＧＣＧＡＣＴＡＴＧＡ
【００９８】
アミノ酸配列（配列番号：８）
【００９９】
ＭＳＬＨＰＬＮＫＬＩＥＲＨＫＫＧＴＰＶＧＩＹＳＶＣＳＡＮＰＦＶＬＫＡＡＭＬＱＡＱＫＤＱＳＬＬＬＩＥＡＴＳＮＱＶＤＱＦＧＧＹＴＧＭＲＰＥＤＦＫＴＭＴＬＥＬＡＡＥＮＮＹＤＰＱＧＬＩＬＧＧＤＨＬＧＰＮＲＷＴＫＬＳＡＳＲＡＭＤＹＡＲＥＱＩＡＡＹＶＫＡＧＦＳＫＩＨＬＤＡＴＭＰＬＱＮＤＡＴＤＳＡＧＲＬＰＶＥＴＩＡＱＲＴＡＥＬＣＡＶＡＥＱＴＹＲＱＳＤＱＬＦＰＰＰＶＹＩＶＧＳＤＶＰＩＰＧＧＡＱＥＡＬＮＱＩＨＩＴＥＶＫＥＶＱＱＴＩＤＨＶＲＲＡＦＥＫＮＧＬＥＡＡＹＥＲＶＣＡＶＶＶＱＰＧＶＥＦＡＤＱＩＶＦＥＹＡＰＤＲＡＡＡＬＫＤＦＩＥＳＨＳＱＬＶＹＥＡＨＳＴＤＹＱＴＡＰＬＬＲＱＭＶＫＤＨＦＡＩＬＫＶＧＰＡＬＴＦＡＬＲＥＡＩＦＡＬＡＦＭＥＫＥＬＬＰＬＨＲＡＬＫＰＳＡＩＬＥＴＬＤＱＴＭＤＫＮＰＡＹＷＱＫＨＹＧＧＴＫＥＥＶＲＦＡＱＲＦＳＬＳＤＲＩＲＹＹＷＰＦＰＫＶＱＫＡＬＲＱＬＬＫＮＬＱＱＩＳＩＰＬＴＬＶＳＱＦＭＰＥＥＹＱＲＩＲＱＧＴＬＴＮＤＰＱＡＬＩＬＮＫＩＱＳＶＬＫＱＹＡＥＡＴＱＩＱＮＳＬＴＦＴＱＮＱＮＳＬＡＭＥＲＬ
【０１００】
Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍからの好熱性Ｆ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ：Ｂ５ＹＢＤ７）
【０１０１】
ヌクレオチド配列（配列番号：９）
【０１０２】
ＡＴＧＴＧＧＣＴＴＡＧＴＡＡＡＧＡＴＴＡＴＴＴＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＧＴＴＴＡＴＴＣＴＡＴＡＴＧＴＡＧＣＴＣＴＡＡＴＣＣＡＴＡＴＧＴＧＡＴＴＧＡＧＧＣＡＡＧＴＧＴＴＧＡＡＴＴＴＧＣＴＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧＡＴＴＡＴＡＴＴＴＴＡＡＴＴＧＡＧＧＣＧＡＣＡＣＣＴＣＡＴＣＡＧＡＴＡＡＡＣＣＡＧＴＴＴＧＧＴＧＧＡＴＡＴＴＣＡＧＧＴＡＴＧＡＣＴＣＣＣＧＡＡＧＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＣＴＴＴＧＴＡＡＴＧＧＧＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＡＧＧＧＴＧＡＴＴＣＴＴＧＧＡＧＧＧＧＡＣＣＡＴＴＴＡＧＧＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＴＧＧＣＡＡＧＡＴＧＡＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＡＡＴＧＡＡＡＡＡＧＧＣＡＡＡＡＧＡＣＣＴＴＡＴＡＡＧＧＧＣＣＴＴＴＧＴＧＧＡＧＡＧＴＧＧＴＴＡＴＡＡＧＡＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＧＡＴＴＧＴＡＧＴＡＴＧＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＡＴＧＡＴＣＣＴＧＴＡＧＴＧＣＴＣＴＣＴＣＣＣＧＡＧＡＡＧＡＴＡＧＣＡＧＡＡＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧＡＡＣＴＴＣＴＴＧＡＧＧＴＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＡＡＡＧＴＡＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧＣＣＴＧＴＧＴＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＡＡＣＴＧＡＴＧＴＡＣＣＧＧＴＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＴＡＴＴＡＣＣＴＣＡＧＴＧＧＡＧＧＡＴＴＴＴＡＧＡＧＴＡＧＣＡＡＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＴＴＴＧＡＧＧＡＴＧＴＴＣＣＡＡＧＧＡＴＡＴＧＧＧＡＴＡＧＧＡＴＡＡＴＴＧＧＴＴＴＴＧＴＡＡＴＡＡＴＧＣＴＴＧＧＴＡＴＡＧＧＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＴＴＴＧＡＧＴＡＴＧＡＣＡＧＧＡＴＴＡＡＧＧＴＧＡＧＡＡＡＡＡＴＴＴＴＡＧＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＧＡＡＧＧＴＣＡＣＴＣＴＡＣＴＧＡＣＴＡＴＣＡＧＡＣＡＡＡＡＣＧＴＧＣＡＴＴＧＡＧＡＧＡＴＡＴＧＧＴＡＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＴＡＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＧＧＴＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＴＴＡＡＣＡＧＣＡＡＧＴＴＴＴＡＧＡＡＧＧＧＧＡＧＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＡＧＴＡＧＣＡＴＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＣＴＴＡＴＡＴＣＧＧＡＡＧＡＴＡＡＡＡＧＧＴＣＴＡＡＴＡＴＴＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＴＧＣＴＴＧＡＧＡＣＴＡＴＧＴＴＡＡＡＡＧＡＴＧＡＴＡＡＡＴＡＴＴＧＧＡＧＡＡＡＧＴＡＴＴＡＴＡＡＧＧＡＴＴＣＡＧＡＡＡＧＡＴＴＡＧＡＡＴＴＡＧＡＴＡＴＴＴＧＧＴＡＣＡＡＣＴＴＡＣＴＴＧＡＴＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＴＴＡＴＴＧＧＧＡＡＴＡＴＡＡＡＧＡＧＡＴＡＡＡＡＡＴＡＧＣＴＴＴＡＡＡＴＡＧＧＣＴＴＴＴＴＧＡＡＡＡＴＴＴＴＴＣＧＧＡＡＧＧＧＧＴＴＧＡＴＡＴＴＡＧＡＴＡＣＡＴＣＴＡＴＣＡＡＴＡＴＴＴＴＴＡＴＧＡＴＴＣＧＴＡＴＴＴＴＡＡＡＧＴＡＡＧＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＴＡＡＧＡＡＡＴＧＡＴＣＣＡＡＧＧＧＡＧＣＴＡＡＴＡＡＡＧＡＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＧＡＡＧＧＴＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣＴＡＴＣＡＣＴＡＴＧＣＴＧＴＡＡＡＣＴＴＡＴＡＡ
【０１０３】
コドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号：１０）
【０１０４】
ＡＴＧＴＧＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＣＴＧＣＧＴＡＡＧＡＡＧＧＧＣＧＴＴＴＡＣＡＧＣＡＴＴＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＣＧＴＡＴＧＴＴＡＴＴＧＡＡＧＣＧＡＧＣＧＴＧＧＡＧＴＴＣＧＣＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＣＧＡＴＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＴＴＧＡＡＧＣＧＡＣＣＣＣＧＣＡＣＣＡＧＡＴＣＡＡＣＣＡＡＴＴＴＧＧＴＧＧＣＴＡＴＡＧＣＧＧＣＡＴＧＡＣＣＣＣＧＧＡＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＡＣＴＴＴＧＴＴＡＴＧＧＧＣＡＴＣＡＴＴＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＧＴＡＴＣＧＡＧＧＡＡＧＡＣＣＧＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＧＡＴＣＡＣＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＴＧＣＣＧＴＧＧＣＡＧＧＡＴＧＡＧＣＣＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＣＧＡＴＧＡＡＧＡＡＡＧＣＧＡＡＡＧＡＣＣＴＧＡＴＣＣＧＴＧＣＧＴＴＣＧＴＴＧＡＡＡＧＣＧＧＴＴＡＣＡＡＧＡＡＡＡＴＴＣＡＣＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＧＣＡＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＣＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＡＧＣＣＣＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＧＣＧＧＡＡＣＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＴＴＧＣＧＧＡＧＧＡＡＡＣＣＧＣＧＣＧＴＡＡＡＴＡＣＡＡＣＴＴＴＣＡＡＣＣＧＧＴＧＴＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＡＣＣＧＡＴＧＴＴＣＣＧＧＴＴＧＣＧＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＧＴＡＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧＧＡＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＧＣＧＡＴＴＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＴＡＣＴＴＴＧＡＡＧＡＣＧＴＴＣＣＧＣＧＴＡＴＴＴＧＧＧＡＴＣＧＴＡＴＣＡＴＴＧＧＴＴＴＣＧＴＧＡＴＣＡＴＧＣＴＧＧＧＣＡＴＴＧＧＴＴＴＣＡＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＧＴＧＴＴＴＧＡＡＴＡＴＧＡＴＣＧＴＡＴＣＡＡＡＧＴＧＣＧＴＡＡＡＡＴＴＣＴＧＧＡＡＧＡＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＣＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＡＴＣＡＧＡＣＣＡＡＧＣＧＴＧＣＧＣＴＧＣＧＴＧＡＣＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＣＧＴＴＣＧＴＡＴＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＧＧＴＣＣＧＧＣＧＣＴＧＡＣＣＧＣＧＡＧＣＴＴＣＣＧＴＣＧＴＧＧＴＧＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＡＡＣＴＧＡＴＴＡＧＣＧＡＧＧＡＴＡＡＡＣＧＴＡＧＣＡＡＣＡＴＴＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡＣＧＡＴＡＡＡＴＡＣＴＧＧＣＧＴＡＡＧＴＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＣＡＧＣＧＡＧＣＧＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧＧＴＡＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＣＧＴＡＴＴＣＧＴＴＡＣＴＡＣＴＧＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧＡＴＴＧＣＧＣＴＧＡＡＣＣＧＴＣＴＧＴＴＣＧＡＧＡＡＣＴＴＴＡＧＣＧＡＡＧＧＣＧＴＴＧＡＴＡＴＣＣＧＴＴＡＣＡＴＣＴＡＣＣＡＡＴＡＣＴＴＣＴＡＣＧＡＣＡＧＣＴＡＣＴＴＣＡＡＡＧＴＧＣＧＴＧＡＧＧＧＴＡＡＡＡＴＣＣＧＴＡＡＣＧＡＣＣＣＧＣＧＴＧＡＡＣＴＧＡＴＴＡＡＧＡＡＣＧＡＧＡＴＴＡＡＧＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＣＴＡＣＣＡＴＴＡＴＧＣＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＴＡＡ
【０１０５】
アミノ酸配列（配列番号：１１）
【０１０６】
ＭＷＬＳＫＤＹＬＲＫＫＧＶＹＳＩＣＳＳＮＰＹＶＩＥＡＳＶＥＦＡＫＥＫＮＤＹＩＬＩＥＡＴＰＨＱＩＮＱＦＧＧＹＳＧＭＴＰＥＤＦＫＮＦＶＭＧＩＩＫＥＫＧＩＥＥＤＲＶＩＬＧＧＤＨＬＧＰＬＰＷＱＤＥＰＳＳＳＡＭＫＫＡＫＤＬＩＲＡＦＶＥＳＧＹＫＫＩＨＬＤＣＳＭＳＬＳＤＤＰＶＶＬＳＰＥＫＩＡＥＲＥＲＥＬＬＥＶＡＥＥＴＡＲＫＹＮＦＱＰＶＹＶＶＧＴＤＶＰＶＡＧＧＧＥＥＥＧＩＴＳＶＥＤＦＲＶＡＩＳＳＬＫＫＹＦＥＤＶＰＲＩＷＤＲＩＩＧＦＶＩＭＬＧＩＧＦＮＹＥＫＶＦＥＹＤＲＩＫＶＲＫＩＬＥＥＶＫＫＥＮＬＦＶＥＧＨＳＴＤＹＱＴＫＲＡＬＲＤＭＶＥＤＧＶＲＩＬＫＶＧＰＡＬＴＡＳＦＲＲＧＶＦＬＬＳＳＩＥＤＥＬＩＳＥＤＫＲＳＮＩＫＫＶＶＬＥＴＭＬＫＤＤＫＹＷＲＫＹＹＫＤＳＥＲＬＥＬＤＩＷＹＮＬＬＤＲＩＲＹＹＷＥＹＫＥＩＫＩＡＬＮＲＬＦＥＮＦＳＥＧＶＤＩＲＹＩＹＱＹＦＹＤＳＹＦＫＶＲＥＧＫＩＲＮＤＰＲＥＬＩＫＮＥＩＫＫＶＬＥＤＹＨＹＡＶＮＬ
【０１０７】
Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｇｉｄｉｓからのタガトース６−リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｏ２９８０５）を使用した。５ｍＭのＭｇＣｌ２及び１０ｍＭのＴ６Ｐを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．２）中で５０℃で、活性を測定した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２濃縮器（１０，０００分子量カットオフ）による酵素の濾過によって、反応を停止した。Ｆ６ＰＥについて記載されるような遊離リン酸塩放出の検出によって、タガトース生成を決定した。
【０１０８】
Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓからの好熱性Ｔ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ：Ｏ２９８０５）
【０１０９】
ヌクレオチド配列（配列番号：１２）
【０１１０】
ＡＴＧＴＴＣＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＣＣＡＴＣＧＣＡＧＴＴＧＡＣＡＴＡＧＡＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＡＣＣＧＡＣＡＧＡＡＡＧＡＧＧＧＣＴＣＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＧＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＣＣＧＣＡＡＧＧＴＡＡＡＡＡＴＴＣＣＣＧＴＧＡＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＴＡＴＣＴＴＧＴＴＴＴＧＣＧＡＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＴＧＡＴＴＧＧＡＧＴＣＴＣＡＧＡＣＧＴＧＧＴＡＡＴＣＴＧＣＧＡＧＡＡＴＧＧＧＧＧＣＧＴＧＧＴＧＡＧＧＴＴＣＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＧＧＧＡＧＧＡＴＡＴＴＧＴＴＴＴＡＧＧＡＧＡＴＡＡＡＧＡＧＡＡＡＴＧＣＧＴＴＧＡＧＧＣＴＧＴＧＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＡＡＡＣＡＣＴＡＴＧＡＧＧＴＴＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＡＡＴＡＣＡＧＧＡＡＧＴＣＧＧＡＡＧＴＧＴＧＣＡＴＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＴＣＡＡＣＧＡＧＧＣＧＡＧＡＡＡＧＣＴＣＡＴＴＧＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＧＧＴＴＡＡＧＣＴＴＧＴＧＧＡＴＴＣＡＧＧＣＴＴＴＧＣＣＴＡＣＣＡＣＡＴＴＡＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＴＧＴＴＡＧＣＡＡＧＧＧＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＧＴＴＣＧＴＴＧＣＣＧＡＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＴＴＣＡＧＣＧＧＡＧＴＴＴＧＣＡＧＴＴＡＴＣＧＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡＧＡＡＣＧＡＣＡＴＡＧＡＣＡＴＧＴＴＣＡＧＡＧＴＴＧＣＴＧＧＡＴＴＣＧＧＡＡＴＴＧＣＴＧＴＴＧＣＣＡＡＴＧＣＣＧＡＴＧＡＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＡＴＧＣＴＧＡＴＴＴＡＧＴＴＡＣＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＡＣＧＧＣＧＡＧＧＧＧＧＴＴＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＣＴＧＧＧＡＴＴＧＴＴＧＣＧＧＴＧＡ
【０１１１】
アミノ酸配列（配列番号：１３）
【０１１２】
ＭＦＫＰＫＡＩＡＶＤＩＤＧＴＬＴＤＲＫＲＡＬＮＣＲＡＶＥＡＬＲＫＶＫＩＰＶＩＬＡＴＧＮＩＳＣＦＡＲＡＡＡＫＬＩＧＶＳＤＶＶＩＣＥＮＧＧＶＶＲＦＥＹＤＧＥＤＩＶＬＧＤＫＥＫＣＶＥＡＶＲＶＬＥＫＨＹＥＶＥＬＬＤＦＥＹＲＫＳＥＶＣＭＲＲＳＦＤＩＮＥＡＲＫＬＩＥＧＭＧＶＫＬＶＤＳＧＦＡＹＨＩＭＤＡＤＶＳＫＧＫＡＬＫＦＶＡＥＲＬＧＩＳＳＡＥＦＡＶＩＧＤＳＥＮＤＩＤＭＦＲＶＡＧＦＧＩＡＶＡＮＡＤＥＲＬＫＥＹＡＤＬＶＴＰＳＰＤＧＥＧＶＶＥＡＬＱＦＬＧＬＬＲ
【０１１３】
Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｓからのＴ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｄ２ＲＨＶ２＿ＡＲＣＰＡ）
【０１１４】
ヌクレオチド配列（配列番号：１４）
【０１１５】
ＧＴＧＴＴＣＡＡＧＧＣＴＴＴＧＧＴＡＧＴＴＧＡＴＡＴＡＧＡＣＧＧＡＡＣＴＴＴＧＡＣＧＧＡＴＡＡＧＡＡＧＡＧＧＧＣＡＡＴＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＴＣＧＡＡＧＣＡＣＴＴＡＧＡＡＡＡＣＴＡＡＡＧＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＴＣＴＴＧＧＣＡＡＣＣＧＧＡＡＡＣＡＴＴＴＣＡＴＧＣＴＴＴＧＣＡＡＧＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＡＡＧＡＴＴＡＴＡＧＧＴＧＴＴＴＣＣＧＡＴＡＴＴＧＴＡＡＴＡＧＣＴＧＡＧＡＡＣＧＧＡＧＧＴＧＴＴＧＴＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＴＡＣＧＡＣＧＧＡＧＡＧＧＡＣＡＴＡＧＴＴＣＴＧＧＧＧＧＡＴＡＧＡＡＧＴＡＡＡＴＧＣＴＴＡＡＧＡＧＣＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＣＴＴＡＧＡＡＡＡＣＧＣＴＴＣＡＡＡＧＴＡＧＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＣＡＡＣＧＡＡＴＡＴＡＧＧＡＡＧＴＣＴＧＡＧＧＴＣＴＧＣＡＴＧＡＧＧＡＧＧＡＡＣＴＴＣＣＣＴＡＴＡＧＡＧＧＡＡＧＣＴＡＧＡＡＡＧＡＴＡＣＴＧＣＣＡＡＡＡＧＡＴＧＴＴＡＧＡＡＴＡＧＴＣＧＡＴＡＣＡＧＧＣＴＴＣＧＣＡＴＡＣＣＡＣＡＴＡＡＴＣＧＡＴＧＣＡＡＡＴＧＴＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧＡＡＧＧＣＴＴＴＧＡＴＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴＴＧＧＡＣＧＴＴＡＡＧＧＡＴＴＴＣＡＴＴＧＣＧＡＴＡＧＧＴＧＡＴＴＣＣＧＡＡＡＡＣＧＡＣＡＴＴＧＡＡＡＴＧＴＴＧＧＡＡＧＴＴＧＣＡＧＧＴＴＴＴＧＧＣＧＴＴＧＣＡＧＴＴＧＣＧＡＡＴＧＣＧＧＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧＧＴＡＧＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＡＣＡＴＣＧＡＡＧＣＣＴＡＡＴＧＧＡＧＡＣＧＧＡＧＴＴＧＴＣＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＧＴＴＣＴＴＧＧＧＡＣＴＣＡＴＴＴＡＧ
【０１１６】
アミノ酸配列（配列番号：１５）
【０１１７】
ＭＦＫＡＬＶＶＤＩＤＧＴＬＴＤＫＫＲＡＩＮＣＲＡＶＥＡＬＲＫＬＫＩＰＶＶＬＡＴＧＮＩＳＣＦＡＲＡＶＡＫＩＩＧＶＳＤＩＶＩＡＥＮＧＧＶＶＲＦＳＹＤＧＥＤＩＶＬＧＤＲＳＫＣＬＲＡＬＥＴＬＲＫＲＦＫＶＥＬＬＤＮＥＹＲＫＳＥＶＣＭＲＲＮＦＰＩＥＥＡＲＫＩＬＰＫＤＶＲＩＶＤＴＧＦＡＹＨＩＩＤＡＮＶＳＫＧＫＡＬＭＦＩＡＤＫＬＧＬＤＶＫＤＦＩＡＩＧＤＳＥＮＤＩＥＭＬＥＶＡＧＦＧＶＡＶＡＮＡＤＥＫＬＫＥＶＡＤＬＶＴＳＫＰＮＧＤＧＶＶＥＡＬＥＦＬＧＬＩ
【０１１８】
Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｖｅｎｅｆｉｃｕｓからのＴ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｆ２ＫＭＫ２＿ＡＲＣＶＳ）
【０１１９】
ヌクレオチド配列（配列番号：１６）
【０１２０】
ＡＴＧＣＴＣＣＧＴＣＣＡＡＡＧＧＧＴＣＴＣＧＣＣＡＴＴＧＡＣＡＴＣＧＡＣＧＧＡＡＣＣＡＴＡＡＣＡＴＡＣＡＧＧＡＡＴＣＧＡＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＧＴＡＡＧＧＣＣＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＴＡＡＡＡＡＴＣＣＣＴＧＴＡＧＴＴＣＴＴＧＣＡＡＣＴＧＧＣＡＡＣＡＴＡＴＣＣＴＧＴＴＴＣＧＣＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴＡＴＡＧＧＣＧＴＣＴＣＡＧＡＣＡＴＴＧＴＴＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＡＴＧＧＡＧＧＴＡＴＴＧＴＴＣＧＡＴＴＣＡＧＣＴＡＣＧＡＴＧＧＣＧＡＣＧＡＣＡＴＡＧＴＧＣＴＴＧＧＧＧＡＣＡＴＡＡＧＣＡＡＡＴＧＣＣＴＴＡＡＡＧＣＧＧＣＴＧＡＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＧＡＧＴＡＣＴＴＴＧＡＡＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＴＡＣＡＧＧＡＡＧＴＣＧＧＡＧＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＧＣＡＧＡＡＡＣＴＴＴＣＣＴＡＴＴＧＡＡＧＡＧＧＣＧＡＧＧＡＡＡＡＴＴＣＴＴＣＡＣＧＡＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴＧＡＴＧＴＴＡＡＡＡＴＣＧＴＣＧＡＴＴＣＡＧＧＴＴＴＴＧＣＧＴＡＣＣＡＣＡＴＡＡＴＧＧＡＴＧＣＧＡＡＧＧＴＣＡＧＣＡＡＡＧＧＡＡＧＧＧＣＴＣＴＴＧＡＧＴＡＣＡＴＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＣＴＴＧＧＴＡＴＡＡＧＴＣＣＧＡＡＧＧＡＧＴＴＣＧＣＴＧＣＡＡＴＴＧＧＴＧＡＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＧＡＣＡＴＡＧＡＣＣＴＧＡＴＴＡＡＧＧＣＴＧＣＣＧＧＣＣＴＣＧＧＴＡＴＴＧＣＣＧＴＴＧＧＡＧＡＴＧＣＴＧＡＣＴＴＡＡＡＧＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＡＧＧＣＣＧＡＣＧＴＧＧＴＡＧＴＣＴＣＧＡＡＧＡＡＧＡＡＴＧＧＣＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＴＴＧＡＡＧＣＡＣＴＴＧＡＧＣＴＴＣＴＧＧＧＣＴＴＡＡＴＴＴＡＡ
【０１２１】
アミノ酸配列（配列番号：１７）
【０１２２】
ＭＬＲＰＫＧＬＡＩＤＩＤＧＴＩＴＹＲＮＲＳＬＮＣＫＡＶＥＡＬＲＫＶＫＩＰＶＶＬＡＴＧＮＩＳＣＦＡＲＴＡＡＫＬＩＧＶＳＤＩＶＩＣＥＮＧＧＩＶＲＦＳＹＤＧＤＤＩＶＬＧＤＩＳＫＣＬＫＡＡＥＩＬＫＥＹＦＥＩＥＦＬＤＡＥＹＲＫＳＥＶＣＬＲＲＮＦＰＩＥＥＡＲＫＩＬＨＤＡＫＬＤＶＫＩＶＤＳＧＦＡＹＨＩＭＤＡＫＶＳＫＧＲＡＬＥＹＩＡＤＥＬＧＩＳＰＫＥＦＡＡＩＧＤＳＥＮＤＩＤＬＩＫＡＡＧＬＧＩＡＶＧＤＡＤＬＫＬＫＭＥＡＤＶＶＶＳＫＫＮＧＤＧＶＶＥＡＬＥＬＬＧＬＩ
【０１２３】
Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍからの組換えのセロデキストリンホスホリラーゼ及びセロビオースホスホリラーゼは、Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｈｉｇｈ−ｙｉｅｌｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  ｗａｔｅｒ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｃｋｔａｉｌｓ．ＣｈｅｍＳｕｓＣｈｅｍ  ２００９；２：１４９−１５２中で記載される。記載されるように、それらの活性をアッセイした。
【０１２４】
Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ  ＹＸからの組換えポリリン酸グルコキナーゼは、Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ  ＹＸ：ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ＡＴＰ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２；９３：１１０９−１１１７中で記載される。記載されるように、その活性をアッセイした。
【０１２５】
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉからの組換えイソアミラーゼは、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｏｕｂｌｉｎｇ  ｐｏｗｅｒ  ｏｕｔｐｕｔ  ｏｆ  ｓｔａｒｃｈ  ｂｉｏｂａｔｔｅｒｙ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍｏｓｔ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ｉｓｏａｍｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ａｒｃｈａｅｏｎ  Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２０１５；５：１３１８４中で記載される。記載されるように、その活性をアッセイした。
【０１２６】
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓからの組換え４−α−グルカノルトランスフェラーゼ（ｇｌｕｃａｎｏｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）は、Ｊｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．４−α−Ｇｌｕｃａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ａｒｃｈａｅｏｎ  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  Ｌｉｔｏｒａｌｉｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７；２４８：１７１−１７８中で記載される。記載されるように、その活性を測定した。
【０１２７】
Ｃａｌｄｉｔｈｒｉｘ  ａｂｙｓｓｉからのスクロースホスホリラーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｈ１ＸＴ５０）を使用した。１０ｍＭのスクロース及び１２ｍＭの有機リン酸塩を含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）中で、その活性を測定した。グルコース１−リン酸（Ｇ１Ｐ）を、２５Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼを補足したグルコースヘキソキナーゼ／Ｇ６ＰＤＨアッセイキットを使用して、α−グルカンホスホリラーゼでのように測定した。
【０１２８】
各々の実施例中で以下に使用される酵素単位を増加又は減少させて、所望に応じて反応時間を調整することができる。例えば、もし２４時間ではなく８時間で実施例９を遂行したければ、酵素の単位は約３倍増加されるであるだろう。反対に、もし２４時間ではなく４８時間で実施例９を遂行したければ、酵素単位は約２倍減少されるであるだろう。これらの例は、一定の生成性を維持しながら反応時間を増加又は減少させるのに、どのように酵素単位の量を使用できるかを示す。
【０１２９】
例１
【０１３０】
デンプンからのフルクトース６−リン酸の酵素的生合成の技術的実行可能性を検証するために、３つの酵素を組換えにより発現させ、それらは、Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａからのα−グルカンホスホリラーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｇ４ＦＥＨ８）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓからのホスホグルコムターゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ６８ＢＪ６）及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍからのｐｈｏｓｐｈｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ａ３ＤＢＸ９）である。組換えタンパク質をＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）中で過剰に発現させ、上記のように精製した。
【０１３１】
１０ｇ／Ｌの可溶性デンプン、５０ｍＭのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＺｎＣｌ２、０．０１ＵのαＧＰ、０．０１ＵのＰＧＭ、及び０．０１ＵのＰＧＩを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を、５０℃で２４時間インキュベーションした。Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２濃縮器（１０，０００分子量カットオフ）による酵素の濾過によって、反応を停止した。産物（フルクトース６−リン酸（Ｆ６Ｐ））を、上記のように、フルクトース６−リン酸キナーゼ（Ｆ６ＰＫ）／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＫ）／乳酸脱水素酵素（ＬＤ）共役酵素アッセイ（そこで３４０ｎｍでの吸光度の減少はＦ６Ｐの生成を指摘する）を使用して決定した。２４時間後のＦ６Ｐの最終濃度は３．６ｇ／Ｌであった。
【０１３２】
例２
【０１３３】
実施例１と同じ試験（反応温度以外は）を４０〜８０℃で実行した。４０時間の反応の後に、１０ｇ／Ｌの可溶性デンプンが、４０℃で０．９ｇ／ＬのＦ６Ｐ及び８０℃で３．６ｇ／ＬのＦ６Ｐを生成したことが見出された。これらの結果から、酵素のこのセットについて反応温度を増加させることはＦ６Ｐ収率を増加させることが示唆されるが、あまりにも高い温度はある程度の酵素活性を損ない得る。
【０１３４】
例３
【０１３５】
８０℃で、およそ１：１：１のαＧＰ：ＰＧＭ：ＰＧＩの酵素比は速いＦ６Ｐ生成をもたらすことが見出された。反応時間が十分に長かったならば、酵素比は最終的なＦ６Ｐ濃度に大きく影響を及ぼさなかったことが指摘された。しかしながら、酵素比は、反応速度、及びシステムにおいて使用される酵素の合計の費用に影響する。
【０１３６】
例４
【０１３７】
１０ｇ／Ｌのマルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＺｎＣｌ２、０．０１ＵのαＧＰ、０．０１ＵのＰＧＭ、及び０．０１ＵのＰＧＩを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を、５０℃で２４時間インキュベーションした。Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２濃縮器（１０，０００分子量カットオフ）による酵素の濾過によって、反応を停止した。産物（フルクトース６−リン酸（Ｆ６Ｐ））を、上記のように、フルクトース６−リン酸キナーゼ（Ｆ６ＰＫ）／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＫ）／乳酸脱水素酵素（ＬＤ）共役酵素アッセイ（そこで３４０ｎｍでの吸光度の減少はＦ６Ｐの生成を指摘する）を使用して決定した。２４時間後のＦ６Ｐの最終濃度は３．６ｇ／Ｌであった。
【０１３８】
例５
【０１３９】
アビセルからのＦ６Ｐ生成について試験するために、Ｓｉｇｍａセルラーゼを使用して５０℃でセルロースを加水分解した。市販のセルラーゼからβ−グルコシダーゼを除去するために、１０ろ紙分解活性（ｆｉｌｔｅｒ  ｐａｐｅｒ  ｕｎｉｔ）／ｍＬのセルラーゼを、氷水浴で１０ｇ／Ｌのアビセルへ１０分間混合した。４℃での遠心分離の後に、β−グルコシダーゼを含有する上清をデカントした。エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼを含有するセルラーゼと結合したアビセルを、加水分解のためにクエン酸バッファー（ｐＨ４．８）中で５０℃で３日間再懸濁した。セルロース加水分解物を、１０ｍＭのリン酸塩、５ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．５ｍＭのＺｎＣｌ２を含有する１００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．２）中の、５Ｕ／ｍＬのセロデキストリンホスホリラーゼ、５Ｕ／Ｌのセロビオースホスホリラーゼ、５Ｕ／ｍＬのαＧＰ、５Ｕ／ｍＬのＰＧＭ及び５Ｕ／ｍＬのＰＧＩと混合した。反応を７２時間６０℃で遂行し、高濃度のＦ６Ｐが見出された（グルコースは少量及びセロビオースはない）。上記の共役酵素アッセイを使用してＦ６Ｐを検出した。ヘキソキナーゼ／Ｇ６ＰＤＨアッセイキットを上記のように使用してグルコースを検出した。
【０１４０】
例６
【０１４１】
アビセルからのＦ６Ｐ収率を増加させるために、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｓｗｅｌｌｉｎｇ  ｔｏ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｂｙ  ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ    ２００６；７：６４４−６４８中で記載されるように、アビセルを濃リン酸により前処理して非晶性セルロース（ＲＡＣ）を生成した。市販のセルラーゼからβ−グルコシダーゼを除去するために、１０ろ紙分解活性／ｍＬのセルラーゼを、１０ｇ／ＬのＲＡＣと氷水浴で５分間混合した。４℃での遠心分離の後に、β−グルコシダーゼを含有する上清をデカントした。エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼを含有するセルラーゼと結合したＲＡＣを、加水分解のためにクエン酸バッファー（ｐＨ４．８）中で５０℃で１２時間再懸濁した。ＲＡＣ加水分解物を、１０ｍＭのリン酸塩、５ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．５ｍＭのＺｎＣｌ２を含有する１００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．２）中の、５Ｕ／ｍＬのセロデキストリンホスホリラーゼ、５Ｕ／Ｌのセロビオースホスホリラーゼ、５Ｕ／ｍＬのαＧＰ、５Ｕ／ｍＬのＰＧＭ及び５Ｕ／ｍＬのＰＧＩと混合した。反応を６０℃で７２時間遂行した。グルコースをＦ６Ｐへ変換するために酵素が添加されなかったので、高濃度のＦ６Ｐ及びグルコースが回収された。上記の共役酵素アッセイを使用してＦ６Ｐを検出した。ヘキソキナーゼ／Ｇ６ＰＤＨアッセイキットを上記のように使用してグルコースを検出した。
【０１４２】
例７
【０１４３】
ＲＡＣからのＦ６Ｐ収率を更に増加させるために、ポリリン酸グルコキナーゼ及びポリリン酸塩を添加した。市販のセルラーゼからβ−グルコシダーゼを除去するために、１０ろ紙分解活性／ｍＬのセルラーゼを、１０ｇ／ＬのＲＡＣと氷水浴で５分間混合した。４℃での遠心分離の後に、β−グルコシダーゼを含有する上清をデカントした。エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼを含有するセルラーゼと結合したＲＡＣを、５０℃での加水分解のためにクエン酸バッファー（ｐＨ４．８）中で再懸濁し、加水分解のためにクエン酸バッファー（ｐＨ４．８）中で５０℃で１２時間インキュベーションした。ＲＡＣ加水分解物を、５０ｍＭのポリリン酸塩、１０ｍＭのリン酸塩、５ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．５ｍＭのＺｎＣｌ２を含有する１００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．２）中の、５Ｕ／ｍＬのポリリン酸グルコキナーゼ、５Ｕ／ｍＬのセロデキストリンホスホリラーゼ、５Ｕ／Ｌのセロビオースホスホリラーゼ、５Ｕ／ｍＬのαＧＰ、５Ｕ／ｍＬのＰＧＭ及び５Ｕ／ｍＬのＰＧＩと混合した。反応を５０℃で７２時間遂行した。Ｆ６Ｐは高濃度で見出され、ここでは存在するグルコースは少量のみであった。上記の共役酵素アッセイを使用してＦ６Ｐを検出した。ヘキソキナーゼ／Ｇ６ＰＤＨアッセイキットを上記のように使用してグルコースを検出した。
【０１４４】
例８
【０１４５】
Ｆ６Ｐからのタガトース生成を検証するために、２ｇ／ＬのＦ６Ｐを、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．２）中の、１Ｕ／ｍｌのフルクトース６−リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）及び１Ｕ／ｍｌのタガトース６−リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）と混合した。反応物を５０℃で１６時間インキュベーションした。Ｆ６Ｐのタガトースへの１００％の変換を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｈｉ−Ｐｌｅｘ  Ｈ−カラム及び屈折率検出器を使用して、ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ）によって観察する。サンプルは、０．６ｍＬ／分で５ｍＭのＨ２ＳＯ４中で流した。
【０１４６】
例９
【０１４７】
マルトデキストリンからのタガトースの生成を検証するために、２０ｇ／Ｌのマルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、及び０．０５ＵのＴ６ＰＰを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を、５０℃で２４時間インキュベーションした。Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２濃縮器（１０，０００分子量カットオフ）による酵素の濾過によって、反応を停止した。タガトースを、屈折率検出器と共にＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣ及びＡｇｉｌｅｎｔ  Ｈｉ−Ｐｌｅｘ  Ｈ−カラムを使用して、検出及び定量化した。移動相は５ｍＭのＨ２ＳＯ４であり、０．６ｍＬ／分で流した。９．２ｇ／Ｌのタガトースの収率を得た。これは、酵素（イソアミラーゼ又は４−グルカントランスフェラーゼ等）なしのマルトデキストリン分解の制限に起因する理論収率の９２％と一致する。タガトースの様々な濃度のスタンダードを使用して、この収率を定量化した。
【０１４８】
例１０
２００ｇ／Ｌのマルトデキストリン、１０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．１ｇ／Ｌのイソアミラーゼを含有する反応混合物を、８０℃で２４時間インキュベーションした。これを使用して、２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、及び０．０５ＵのＴ６ＰＰを含有する０．２０ｍＬの別の反応混合物を生成し、５０℃で２４時間インキュベーションした。実施例９中のように、タガトースの生成を定量化した。タガトースの収率は、イソアミラーゼによるマルトデキストリンの前処理により１６ｇ／Ｌへ増加した。
【０１４９】
例１１
【０１５０】
マルトデキストリンからのタガトース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕの４−グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を実施例９中で記載される反応へ添加した。
【０１５１】
２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン（実施例９を参照）、５０ｍＭのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＴ６ＰＰ、及び０．０５Ｕの４ＧＴを含有する０．２ｍＬの反応混合物を、５０℃で２４時間インキュベーションした。実施例９中のように、タガトースの生成を定量化した。タガトースの収率は、ＩＡ処理マルトデキストリンへの４ＧＴの添加により１７．７ｇ／Ｌへ増加した。これは理論収率の８８．５％と一致する。
【０１５２】
例１２
【０１５３】
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の濃度範囲を決定するために、５０ｇ／Ｌのマルトデキストリン；６．２５ｍＭ、１２．５ｍＭ、２５ｍＭ、３７．５ｍＭ又は５０ｍＭのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）；５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ＵのａＧＰ；０．１ＵのＰＧＭ；０．１ＵのＰＧＩ；０．１ＵのＦ６ＰＥ；及び０．１ＵのＴ６ＰＰを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を５０℃で６時間インキュベーションした。短い継続時間は完了に到達しなかったことを保証し、したがって、効率における差を明確に見出すことができた。実施例９中のように、タガトースの生成を定量化した。６．２５ｍＭ、１２．５ｍＭ、２５ｍＭ、３７．５ｍＭ又は５０ｍＭのいずれかのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）を含む反応について、それぞれ、４．５ｇ／Ｌ、５．１ｇ／Ｌ、５．６ｇ／Ｌ、４．８ｇ／Ｌ又は４．９ｇ／Ｌのタガトースの収率が得られた（表１）。これらの結果は、２５ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．２）の濃度がこれらの特定の反応条件のために理想的であることを指摘する。ｐＨ７．２での６．２５ｍＭのＰＢＳの使用でさえ、リン酸塩リサイクルに起因する有意なターンオーバーをもたらすことに注目することが重要である。これは、開示されるリン酸塩リサイクル方法が、工業レベルの体積あたりの生産性（例えば２００〜３００ｇ／Ｌのマルトデキストリン）ででさえ、低いリン酸塩レベルを維持できることを示す。
【０１５４】
【表１】
2019150026.tif 000003
【０１５５】
例１３
【０１５６】
カスケード反応のｐＨ領域を決定するために、５０ｇ／Ｌのマルトデキストリン；５０ｍＭのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２又は７．３）；５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．０２ＵのαＧＰ；０．０２ＵのＰＧＭ；０．０２ＵのＰＧＩ；０．０２ＵのＦ６ＰＥ；及び０．０２ＵのＴ６ＰＰを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を５０℃で１６時間インキュベーションした。完了に到達しなかったことを保証するために単位を低下させ、したがって、効率における差を明確に見出すことができた。実施例８中のように、タガトースの生成を定量化した。ｐＨ６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２又は７．３の５０ｍＭのリン酸緩衝食塩水を含む反応について、それぞれ、４．０ｇ／Ｌ、４．１ｇ／Ｌ、４．２ｇ／Ｌ、４．１ｇ／Ｌ、４．４ｇ／Ｌ、４．１ｇ／Ｌ、３．８ｇ／Ｌ又は４．０のｇ／Ｌタガトースの収率が得られた（表２）。これらの結果は、このシステムは幅広いｐＨ領域を通して作動するが、６．８のｐＨがこれらの特定の反応条件のために理想的であることを指摘する。
【０１５７】
【表２】
2019150026.tif 000004
【０１５８】
例１４
【０１５９】
スケールアップを調査するために、５０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン（実施例９を参照）、５０ｍＭのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ＵのαＧＰ、１０ＵのＰＧＭ、１０ＵのＰＧＩ、１０ＵのＦ６ＰＥ、及び１０ＵのＴ６ＰＰを含有する２０ｍＬの反応混合物を、５０℃で２４時間インキュベーションした。実施例８中のように、タガトースの生成を定量化した。タガトースの収率は、２０ｍＬのスケール及び５０ｇ／Ｌのマルトデキストリンで３７．６ｇ／Ｌであった。これは理論収率の７５％と一致する。これらの結果は、より大きな反応容積へのスケールアップが収率の有意な損失をもたらさないことを指摘する。
【０１６０】
例１５
【０１６１】
マルトデキストリンからのタガトース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕのマルトースホスホリラーゼを実施例９中で記載される反応へ添加する。
【０１６２】
例１６
【０１６３】
マルトデキストリンからのタガトース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕのポリリン酸グルコキナーゼ及び７５ｍＭのポリリン酸塩を実施例９中で記載される反応へ添加する。
【０１６４】
例１７
【０１６５】
フルクトースからタガトースを生成するために、１０ｇ／Ｌのフルクトース、５０ｍＭのＴｒｉｓバッファー（ｐＨ７．０）、７５ｍＭのポリリン酸塩、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのフルクトースポリリン酸キナーゼ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、及び０．０５ＵのＴ６ＰＰを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を、５０℃で２４時間インキュベーションする。実施例９中のように、タガトースの生成を定量化する。
【０１６６】
例１８
【０１６７】
グルコースからタガトースを生成するために、１０ｇ／Ｌのグルコース、５０ｍＭのＴｒｉｓバッファー（ｐＨ７．０）、７５ｍＭのポリリン酸塩、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのグルコースポリリン酸キナーゼ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、及び０．０５ＵのＴ６ＰＰを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を、５０℃で２４時間インキュベーションする。実施例９中のように、タガトースの生成を定量化する。
【０１６８】
例１９
【０１６９】
スクロースからタガトースを生成するために、１０ｇ／Ｌのスクロース、５０ｍＭのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのスクロースホスホリラーゼ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、及び０．０５ＵのＴ６ＰＰを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を、５０℃で２４時間インキュベーションする。実施例９中のように、タガトースの生成を定量化する。
【０１７０】
例２０
【０１７１】
スクロースからのタガトースの収率を更に増加させるために、７５ｍＭのポリリン酸塩及び０．０５のポリリン酸フルクトキナーゼを実施例１５における反応混合物へ添加する。実施例９中のように、タガトースの生成を定量化する。
【図１】
2019150026.tif 000005
【図２】
2019150026.tif 000006
【図３】
2019150026.tif 000007
【図４】
2019150026.tif 000008
【図５】
2019150026.tif 000009
【図６】
2019150026.tif 000010
【図７】
2019150026.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月24日(2019.4.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タガトースを製造する方法であって、
エピメラーゼによって触媒されてフルクトース６−リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース６−リン酸（Ｔ６Ｐ）へ変換するステップ；及び
ホスファターゼによって触媒されて、生成された該Ｔ６Ｐをタガトースへ変換するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
グルコース６−リン酸（Ｇ６Ｐ）を前記Ｆ６Ｐに変換するステップを更に含み、該ステップがホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
グルコース１−リン酸（Ｇ１Ｐ）を前記Ｇ６Ｐに変換するステップを更に含み、該ステップがフォスフォグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
糖類を前記Ｇ１Ｐに変換するステップを更に含み、該ステップが少なくとも１つの酵素によって触媒され、該糖類が、デンプン又はその誘導体、セルロース又はその誘導体及びスクロースからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの酵素が、α−グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）、マルトースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、及びセルロースホスホリラーゼからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記糖類が、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトース、及びグルコースからなる群から選択されるデンプン又はその誘導体である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
デンプンをデンプン誘導体へ変換するステップを更に含み、該デンプン誘導体がデンプンの酵素的加水分解又はデンプンの酸加水分解によって製造される、請求項４又は請求項６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
４−グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）が添加される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記デンプン誘導体が、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、α−アミラーゼ、又はその組み合わせによって触媒されるデンプンの酵素的加水分解によって、製造される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
フルクトースを前記Ｆ６Ｐへ変換するステップであって、少なくとも１つの酵素によって触媒される、ステップ
を、更に含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
スクロースを該フルクトースへ変換するステップであって、少なくとも１つの酵素によって触媒される、ステップ
を、更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
グルコースを前記Ｇ６Ｐへ変換するステップであって、少なくとも１つの酵素によって触媒される、ステップ
を、更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
スクロースを該グルコースへ変換するステップであって、少なくとも１つの酵素によって触媒される、ステップ
を、更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記エピメラーゼがフルクトース６−リン酸エピメラーゼである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記フルクトース６−リン酸エピメラーゼが、配列番号：１、３、５、７、９又は１０と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記フルクトース６−リン酸エピメラーゼが、配列番号：２、４、６、８又は１１と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ホスファターゼがタガトース６−リン酸ホスファターゼである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記タガトース６−リン酸ホスファターゼが、配列番号：１２、１４又は１６と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記タガトース６−リン酸ホスファターゼが、配列番号：１３、１５又は１７と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法で規定する全てのステップが、４０℃〜７０℃の範囲の温度で、５．０〜８．０の範囲のｐＨで、及び／又は８時間〜４８時間の間遂行される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法で規定する全てのステップが、１つのバイオリアクター又は連続してアレンジされた複数のバイオリアクターにおいて遂行される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法で規定する全てのステップが、ＡＴＰ不含、ＮＡＤ（Ｈ）不含で、０ｍＭを超え約１５０ｍＭまでのリン酸塩濃度で遂行され、リン酸塩がリサイクルされ、及び／又は前記方法の少なくとも１つのステップがエネルギー的に有利な化学反応を包含する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法で規定する全てのステップが１つのバイオリアクターにおいて遂行される、請求項２２に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明の他の態様において、タガトースを製造する方法のステップは、ＡＴＰ不含、ＮＡＤ（Ｈ）不含で、約０ｍＭ〜約１５０ｍＭのリン酸塩濃度で遂行され、リン酸塩はリサイクルされ、及び／又は本方法のうちの少なくとも１つのステップはエネルギー的に有利な化学反応を包含する。
他の記載との重複もあるが、本発明を以下に示す。
［発明１］
タガトースを製造する方法であって、
エピメラーゼによって触媒されてフルクトース６−リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース６−リン酸（Ｔ６Ｐ）へ変換すること；及び
ホスファターゼによって触媒されて、生成された該Ｔ６Ｐをタガトースへ変換すること
を含む、方法。
［発明２］
グルコース６−リン酸（Ｇ６Ｐ）を前記Ｆ６Ｐに変換するステップを更に含み、該ステップがホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される、発明１に記載の方法。
［発明３］
グルコース１−リン酸（Ｇ１Ｐ）を前記Ｇ６Ｐに変換するステップを更に含み、該ステップがフォスフォグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、発明２に記載の方法。
［発明４］
糖類を前記Ｇ１Ｐに変換するステップを更に含み、該ステップが少なくとも１つの酵素によって触媒され、該糖類が、デンプン又はその誘導体、セルロース又はその誘導体及びスクロースからなる群から選択される、発明３に記載の方法。
［発明５］
少なくとも１つの酵素が、α−グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）、マルトースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、及びセルロースホスホリラーゼからなる群から選択される、発明４に記載の方法。
［発明６］
前記糖類が、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトース、及びグルコースからなる群から選択されるデンプン又はその誘導体である、発明４に記載の方法。
［発明７］
デンプンをデンプン誘導体へ変換するステップを更に含み、該デンプン誘導体がデンプンの酵素的加水分解又はデンプンの酸加水分解によって製造される、発明４又は発明６のいずれか一項に記載の方法。
［発明８］
４−グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）が前記方法へ添加される、発明６に記載の方法。
［発明９］
前記デンプン誘導体が、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、α−アミラーゼ、又はその組み合わせによって触媒されるデンプンの酵素的加水分解によって、製造される、発明７に記載の方法。
［発明１０］
フルクトースを前記Ｆ６Ｐへ変換するステップであって、少なくとも１つの酵素によって触媒される、ステップ；及び
随意に、スクロースを該フルクトースへ変換するステップであって、少なくとも１つの酵素によって触媒される、ステップ
を、更に含む、発明1に記載の方法。
［発明１１］
グルコースを前記Ｇ６Ｐへ変換するステップであって、少なくとも１つの酵素によって触媒される、ステップ、及び
随意に、スクロースを該グルコースへ変換するステップであって、少なくとも１つの酵素によって触媒される、ステップ
を、更に含む、発明２に記載の方法。
［発明１２］
前記エピメラーゼがフルクトース６−リン酸エピメラーゼである、発明１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
［発明１３］
前記フルクトース６−リン酸エピメラーゼが、配列番号：１、３、５、７、９又は１０と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、発明１２に記載の方法。
［発明１４］
前記フルクトース６−リン酸エピメラーゼが、配列番号：２、４、６、８又は１１と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、発明１２に記載の方法。
［発明１５］
前記ホスファターゼがタガトース６−リン酸ホスファターゼである、発明１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
［発明１６］
前記タガトース６−リン酸ホスファターゼが、配列番号：１２、１４又は１６と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、発明１５に記載の方法。
［発明１７］
前記タガトース６−リン酸ホスファターゼが、配列番号：１３、１５又は１７と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、発明１５に記載の方法。
［発明１８］
前記方法のステップが、約４０℃〜約７０℃の範囲の温度で、約５．０〜約８．０の範囲のｐＨで、及び／又は約８時間〜約４８時間の間遂行される、発明１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
［発明１９］
前記方法のステップが、１つのバイオリアクター又は連続してアレンジされた複数のバイオリアクターにおいて遂行される、発明１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
［発明２０］
前記方法のステップが、ＡＴＰ不含、ＮＡＤ（Ｈ）不含で、約０ｍＭ〜約１５０ｍＭのリン酸塩濃度で遂行され、リン酸塩がリサイクルされ、及び／又は前記方法の少なくとも１つのステップがエネルギー的に有利な化学反応を包含する、発明１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
［発明２１］
発明１〜２０のいずれか一項に記載の方法によって製造されるタガトース。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
加えて、セルロースは最も多量にある生物資源であり、植物細胞壁の主要な構成要素である。非食料品のリグノセルロース系バイオマスは、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンに加えて、他の微量成分を含有する。純粋なセルロース（アビセル（商標）（微結晶性セルロース）、再生された非晶性セルロース、細菌セルロース、フィルターペーパーなどが含まれる）は、処理のシリーズによって製造され得る。部分的に加水分解されたセルロース系基質には、重合度が７を超える非水溶性セロデキストリン、３〜６の重合度を備えた水溶性セロデキストリン、セロビオース、グルコース、及びフルクトースが含まれる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
トウモロコシデンプン、可溶性デンプン、マルトデキストリン、マルトース、グルコース、フィルターペーパーが含まれるすべての化学物質は、特に断りのない限り、試薬グレード以上のものであり、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）又はＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、米国）から購入した。制限酵素、Ｔ４リガーゼ、及びＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ（ＭＡ）及び米国）から購入した。オリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ、米国）又はＥｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、米国）のいずれかによって合成された。Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ９  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ｃｅｌｌｏｄｅｘｔｒｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  ｏｎ  ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１；９２：５５１−５６０．中で記載されるように、酵素精製において使用される、再生された非晶性セルロースを、アビセル（商標）ＰＨ１０５（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、米国）からの溶解及び再生を介して製造した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｓｉｇ１０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）をＤＮＡ操作のための宿主細胞として使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）を組換えタンパク質発現のための宿主細胞として使用した。１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン又は５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンのいずれかを含むＺＹＭ−５０５２培地を、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞増殖及び組換えタンパク質発現のために使用した。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉからのセルラーゼ（カタログ番号：Ｃ２７３０）及びプルラナーゼ（カタログ番号：Ｐ１０６７）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）から購入し、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ、ＮＣ、米国）によって製造されたものであった。マルトースホスホリラーゼ（カタログ番号：Ｍ８２８４）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
アビセル（商標）からのＦ６Ｐ生成について試験するために、Ｓｉｇｍａセルラーゼを使用して５０℃でセルロースを加水分解した。市販のセルラーゼからβ−グルコシダーゼを除去するために、１０ろ紙分解活性（ｆｉｌｔｅｒ  ｐａｐｅｒ  ｕｎｉｔ）／ｍＬのセルラーゼを、氷水浴で１０ｇ／Ｌのアビセル（商標）へ１０分間混合した。４℃での遠心分離の後に、β−グルコシダーゼを含有する上清をデカントした。エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼを含有するセルラーゼと結合したアビセル（商標）を、加水分解のためにクエン酸バッファー（ｐＨ４．８）中で５０℃で３日間再懸濁した。セルロース加水分解物を、１０ｍＭのリン酸塩、５ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．５ｍＭのＺｎＣｌ２を含有する１００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．２）中の、５Ｕ／ｍＬのセロデキストリンホスホリラーゼ、５Ｕ／Ｌのセロビオースホスホリラーゼ、５Ｕ／ｍＬのαＧＰ、５Ｕ／ｍＬのＰＧＭ及び５Ｕ／ｍＬのＰＧＩと混合した。反応を７２時間６０℃で遂行し、高濃度のＦ６Ｐが見出された（グルコースは少量及びセロビオースはない）。上記の共役酵素アッセイを使用してＦ６Ｐを検出した。ヘキソキナーゼ／Ｇ６ＰＤＨアッセイキットを上記のように使用してグルコースを検出した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】
アビセル（商標）からのＦ６Ｐ収率を増加させるために、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｓｗｅｌｌｉｎｇ  ｔｏ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｂｙ  ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ    ２００６；７：６４４−６４８中で記載されるように、アビセル（商標）を濃リン酸により前処理して非晶性セルロース（ＲＡＣ）を生成した。市販のセルラーゼからβ−グルコシダーゼを除去するために、１０ろ紙分解活性／ｍＬのセルラーゼを、１０ｇ／ＬのＲＡＣと氷水浴で５分間混合した。４℃での遠心分離の後に、β−グルコシダーゼを含有する上清をデカントした。エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼを含有するセルラーゼと結合したＲＡＣを、加水分解のためにクエン酸バッファー（ｐＨ４．８）中で５０℃で１２時間再懸濁した。ＲＡＣ加水分解物を、１０ｍＭのリン酸塩、５ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．５ｍＭのＺｎＣｌ２を含有する１００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．２）中の、５Ｕ／ｍＬのセロデキストリンホスホリラーゼ、５Ｕ／Ｌのセロビオースホスホリラーゼ、５Ｕ／ｍＬのαＧＰ、５Ｕ／ｍＬのＰＧＭ及び５Ｕ／ｍＬのＰＧＩと混合した。反応を６０℃で７２時間遂行した。グルコースをＦ６Ｐへ変換するために酵素が添加されなかったので、高濃度のＦ６Ｐ及びグルコースが回収された。上記の共役酵素アッセイを使用してＦ６Ｐを検出した。ヘキソキナーゼ／Ｇ６ＰＤＨアッセイキットを上記のように使用してグルコースを検出した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2019150026.tif 000012
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2019150026.tif 000013
【外国語明細書】
2019150026000001.pdf