(57)【要約】【課題】  被検体中に存在する１種類又は複数種類の菌株を同定する方法を提供し、必要に応じて当該生菌数も測定できる方法を提供すること。【解決手段】  １種類又は複数種類の乳酸菌及び/またはビフィズス菌を含む菌株を含む被検体中のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の生菌数を測定する方法であり、下記工程を含む生菌数測定方法。（１）前記被検体を希釈した液を用いて培地上又は培地中に複数のコロニーを形成させた後に、形成されたコロニーのなかから全部又は一部のコロニーを選択する工程、（２）選択されたコロニー由来のDNAを鋳型として、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチドを用いて増幅核酸を得る工程、（３）の前記工程で得られた増幅核酸及び前記被検体を希釈したときの希釈倍率に基づき、前記被検体中に含まれる前記ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の割合及び生菌数を測定する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種類又は複数種類の乳酸菌及び/またはビフィズス菌を含む被検体中のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の生菌数を測定する方法であり、下記工程を含む方法。
（１）前記被検体を希釈した液を用いて培地上又は培地中に複数のコロニーを形成させた後に、形成されたコロニーのなかから全部又は一部のコロニーを選択する工程、
（２）選択されたコロニー由来のDNAを鋳型として、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチドを用いてビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１由来の増幅核酸を得る工程、
（３）前記工程にて得られた増幅核酸及び前記被検体を希釈したときの希釈倍率に基づき、前記被検体中に含まれる前記ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の割合及び生菌数を測定する工程。
【請求項２】
前記（１）のコロニー選択工程において、前記被検体を各希釈倍率に希釈して複数の希釈液を作製し、それぞれの希釈液を各培地上に又は培地中に接種してコロニーを形成させた後に、そのなかから所定数のコロニーが形成された培地を選択する、請求項１に記載の生菌数測定方法。
【請求項３】
ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０
２６２１を含む組成物の製造方法であり、前記請求項１または２に記載の測定方法を用いて、被検体となる組成物中のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の生菌数を測定する工程、前記生菌数に基づいて目的生菌数になるように組成物中のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の配合量を調整して設計する工程を含み、前記各菌株の配合量の設計に基づき、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１を含む組成物を得る、前記組成物の製造方法。
【請求項４】
１種類又は複数種類の乳酸菌及び/またはビフィズス菌を含む被検体中のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１を同定する方法であり、下記工程を含む同定方法。
（１）前記被検体を希釈した液を用いて培地上に又は培地中に複数のコロニーを形成させ、このなかから全部又は一部のコロニーを選択する工程、
（２）前記選択された各コロニー由来のＤＮＡを鋳型として配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチドを用いてビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１由来の増幅核酸を得る工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、１種類又は複数種類の乳酸菌及び/又はビフィズス菌を含む被検体中のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の生菌数を測定する方法、及び当該生菌数測定方法を用いる組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
製品中に添加されている有用菌の生菌数を個別に表示することは、消費者にとって製品の情報量が多く表示されている観点から、有益なことであると考えられている。また、国によっては、製品中に添加されている有用菌について、菌株ごとに生菌数を表示することが、義務化されている又は推奨されている。
また、製品中に含まれているグラム陽性菌及びグラム陰性菌を含む菌株の生菌数を測定することができれば、コンタミネーション等を確認でき、製品の品質を向上させることができる。また、製品中の生菌数を正確に把握できることは、製品製造時や製品保管時等の製品の品質を管理する上でも重要である。
【０００３】
近年の健康志向によって、ビフィズス菌及び乳酸菌は腸内に有用な菌株として一般的に認識されるようになり、ビフィズス菌及び乳酸菌はヒトにおける健康保健効果を期待して種々の食品や健康食品に添加されている。このようなビフィズス菌及び乳酸菌等の、ヒトに良い影響を与える有用菌（善玉菌ともいう）、又は、それらを含む製品や飲食品は、プロバイオティクスと一般的に呼ばれている。
また、ビフィズス菌及び乳酸菌であっても、その効能は、使用する菌株に依存することが多い。このため、効能目的に応じて、有用菌のなかから期待する効能が発現できる菌株を１種類又は複数種類選択し添加されたプロバイオティクス製品（例えば、菌末、飲食品や飼料等）が製造され、多く市販されている（非特許文献１の表１参照）。
【０００４】
上述のように有用菌の表示の義務化や推奨等の観点から、ビフィズス菌及び乳酸菌を含む製品について、製造直後、流通後又は保管時における製品中の生菌数を測定する方法が検討されている。
【０００５】
生菌数を測定する方法として、例えば、ビフィズス菌のみが生育する培地を用いる方法、好気培養により乳酸菌のみを培養する方法等が知られている。
【０００６】
より具体的には、例えば、寒天培地を用いた培養法による生菌数測定方法のうち、ビフィズス菌及び／又は乳酸菌を含む検体から、ビフィズス菌のみを検出する寒天培地としては、ＴＯＳ  ＭＵＰ寒天培地、ＭＧＬＰ寒天培地等が利用されている（非特許文献２及び３）。
【０００７】
同様に、ビフィズス菌及び／又は乳酸菌を含む検体から、乳酸菌のみを検出する寒天培地としては、ビフィズス菌が酸素を含む大気中では生育できないことを利用し、ＭＲＳ寒天培地、ＢＣＰ寒天培地を用いた好気培養により、乳酸菌のみを生育させる方法が広く知られている。
また、ビフィズス菌又は乳酸菌を複数種類含む製品中の各菌株及びその生菌数を測定する方法としては、ＢＬ寒天培地に無菌脱繊血液を加えた培地上に塗抹し、嫌気培養により培地上に生育させて形成したコロニーの形態（色、形状等）、又はグラム染色法による菌の形態などから判定する方法がある（非特許文献３）。
【０００８】
また、商業的に利用されるビフィズス菌の中で、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベを選択的に生育させる培地も開発されている（特許文献１及び２）。
【０００９】
また、近年、菌株同定の手段としては、特異的PCRが用いられており、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ブレーベ FERM BP-11175（Bifidobacterium breve FERM BP-11175）の菌株同定法が知られている。（特許文献３及び特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／１１８７６５
【特許文献２】ＷＯ２０１１／１１８７６４
【特許文献３】特開２０１７−２１６９７９
【特許文献４】特開２０１７−２１６９８０
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】光岡知足著「ビフィズス菌の研究」、財団法人日本ビフィズス菌センター、１９９４年、第２８２−２８３頁
【非特許文献２】Milk Products - Enumeration of presumptive bifidobacteria - Colony count technique at 37 ℃ ISO29981/IDF220 2010年発刊
【非特許文献３】「はっ酵乳・乳酸菌飲料中のビフィズス菌の菌数測定法」、社団法人全国はっ酵乳乳酸菌飲料協会  ビフィズス菌検査法検討委員会、２０００年３月第１−１３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、上記の従来技術のうち、ＢＬ寒天培地やＲＣＭ寒天培地にコロニーを生育した場合でも、ビフィズス菌・乳酸菌の菌株が同じ場合には、異なる菌株であっても似たようなコロニー形状になる場合が多く、菌株ごとの生菌数を簡便に正確に測定することは不可能であった。
【００１３】
そこで、本技術は、被検体中に存在する１種類又は複数種類の乳酸菌及び/又はビフィズス菌をより簡便に同定する方法を提供し、必要に応じて当該生菌数もより正確に測定できる方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上述のように、従来の生菌数測定方法は、被検体中に複数種類の菌株が含まれている場合、特殊な培地を用いて特定の種類の菌株に限定してこの菌株の生菌数のみを測定する考え方であった。しかし、本技術では、従来とは逆に、特殊な培地を用いるのではなく汎用的な培地を用いてビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムを同時に測定する考え方である。
従来の生菌数の測定方法では、特殊な培地、すなわち特殊な成分を使用した場合、特殊な成分によって菌株の種類ごとに生育状況に差が生じ、場合によっては熟練者の観察結果が必要になるので、菌株割合及び生菌数の正確さに欠ける。このため、特定の菌株に限定する考え方を採用している従来の方法は、被検体中の菌株割合及び各生菌数を正確に測定しているとはいえない。
しかしながら、本技術の生菌数測定方法によれば、汎用的な培地を用いることができ、かつ被検体中に存在するビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１を同定することができ、また熟練者の観察結果も不要になるので、より正確に簡便に菌株割合及び各生菌数を測定することができる。
このようにして、本発明者らは、以下の本発明を完成させた。
[１]
１種類又は複数種類の乳酸菌及び/またはビフィズス菌を含む被検体中のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の生菌数を測定する方法であり、下記工程を含む方法。
（１）前記被検体を希釈した液を用いて培地上又は培地中に複数のコロニーを形成させた後に、形成されたコロニーのなかから全部又は一部のコロニーを選択する工程、
（２）選択されたコロニー由来のDNAを鋳型として、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチドを用いてビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１由来の増幅核酸を得る工程、
（３）前記工程にて得られた増幅核酸及び前記被検体を希釈したときの希釈倍率に基づき、前記被検体中に含まれる前記ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の割合及び生菌数を測定する工程。
[２]
前記（１）のコロニー選択工程において、前記被検体を各希釈倍率に希釈して複数の希釈液を作製し、それぞれの希釈液を各培地上に又は培地中に接種してコロニーを形成させた後に、そのなかから所定数のコロニーが形成された培地を選択する（１）に記載の生菌数測定方法。
[３]
ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１を含む組成物の製造方法であり、
（１）または（２）に記載の測定方法を用いて、被検体となる組成物中のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の生菌数を測定する工程、前記生菌数に基づいて、目的生菌数になるように組成物中のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の配合量を調整して設計する工程を含み、
前記各菌株の配合量の設計に基づき、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１を含む組成物を得る、前記組成物の製造方法。
[４]
１種類又は複数種類の乳酸菌及び/またはビフィズス菌を含む被検体中のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１を同定する方法であり、下記工程を含む同定方法。
（１）前記被検体を希釈した液を用いて培地上に又は培地中に複数のコロニーを形成させ、このなかから全部又は一部のコロニーを選択する工程、
（２）前記選択された各コロニー由来のＤＮＡを鋳型として配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチドを用いてビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１由来の増幅核酸を得る工程。  
【発明の効果】
【００１５】
本技術によれば、被検体中に存在する１種類又は複数種類の中からビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１を同定する方法を提供し、必要に応じて当該生菌数も測定できる方法を提供することができる。
なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本技術中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
【００１７】
＜１．本技術の生菌数の測定方法＞
本技術の１種類又は複数種類の乳酸菌及び/又はビフィズス菌を含む被検体中のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の生菌数を測定する方法であり、下記工程を含む方法である。
（１）前記被検体を希釈した液を用いて培地上又は培地中に複数のコロニーを形成させた後に、形成されたコロニーのなかから全部又は一部のコロニーを選択する工程、
（２）選択されたコロニー由来のDNAを鋳型として配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチドを用いてビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１由来の増幅核酸を得る工程、
（３）前記工程で得られた増幅核酸及び前記被検体を希釈したときの希釈倍率に基づき、前記被検体中に含まれる前記ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の割合及び生菌数を測定する工程。
【００１８】
〔被検体〕
本技術に用いる被検体は、１種類又は複数種類の菌株（被検菌）を含むものであれば特に限定されないが、乳酸菌、ビフィズス菌の生菌体が含まれているものが望ましい。例えば、飲食品（例えば、発酵乳、菌末、菓子、飲料、健康食品、機能性食品、機能性表示食品、特定保健用食品、育児用粉乳等）、医薬品、家畜用飼料等の製品、前記製品に対して粉砕、希釈液による希釈等の処理を施した製品等が挙げられる。品質管理の必要性の観点から、生菌数の調製がされている製品が好ましく、例えば、飲食品又は医薬品が好ましい。
【００１９】
本技術の生菌数測定方法が適用されうる、食品、健康食品等の製品は、菌株を含む製品であれば特に限定されないが、例えば、有用菌である乳酸菌及び／又はビフィズス菌が配合される食品、健康食品等が挙げられる。当該有用菌が含まれる製品として、より具体的な例を挙げれば、乳児用粉乳、幼児用粉乳、発酵乳、乳成分を含む又は乳成分を含まない飲料や食品、菌末、チョコレート、タブレット、カプセル、サシェット等が挙げられる。
【００２０】
〔被検体中の菌株〕
被検体中に含まれる菌株は、乳酸菌及び/又はビフィズス菌であればいずれでもよいが、本技術は製品中の生菌数を測定し表示する等に利用できる観点から、有用菌の菌株であることが好ましい。当該有用菌は、市販の製品に含まれる有用菌株、微生物保存機関でカルチャー・コレクションとして保存されている有用菌株、ブタペスト条約に基づく国際寄託機関で受託菌株として保存されている有用菌株、将来見出される有用菌株等が挙げられる。本発明においては、被検体中に少なくともビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム（Bifidobacterium longum subsp.longum）ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１が含まれており、さらに1種類以上の乳酸菌及び/又はビフィズス菌が含まれていることが好ましい。
【００２１】
本技術における前記ビフィズス菌は特に限定されないが、好適にはビフィドバクテリウム属の細菌である。当該ビフィズス菌として、より具体的な例を挙げれば、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス（Bifidobacterium longum subsp. infantis）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・アニマリス（Bifidobacterium animalis subsp. animalis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティス（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）等が挙げられる。このうち好ましい例として、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス（Bifidobacterium longum subsp. infantis）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（（Bifidobacteium bifidum）等が挙げられる。
【００２２】
本技術における前記乳酸菌は特に限定されないが、好適にはラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属の細菌である。当該乳酸菌として、より具体的な例を挙げれば、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス  サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ジェンセニ（Lactobacillus jensenii、ラクトバチルス・ジョンソニ（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ラクトバチルス  ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus  helveticus）、ラクトコッカス・サブスピーシーズ．ラクティス（Lactococcus lactis subsp. Lactis）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（Lactococcus lactis subsp. Cremoris）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）等が挙げられる。
このうち好ましい例として、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）等が挙げられる。
【００２３】
本技術では、前記ビフィズス菌及び／又は前記乳酸菌は、上述のような有用菌に該当するものが好ましい。また、本技術は、前記ビフィズス菌及び／又は前記乳酸菌の群から選ばれる１種又は２種以上について適用することが可能である。
【００２４】
本技術における前記ビフィズス菌及び／又は乳酸菌の菌株うち、［１］ビフィドバクテリウム・インファンティス NITE BP-02623（Bifidobacterium infantis M-63）、［２］ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP-02622（Bifidobacterium breve M-16V）、［３］ビフィドバクテリウム・ブレーベ FERM BP-11175（Bifidobacterium breve FERM BP-11175）、［４］Lactobacillus acidophilus NITE BP−01695、［５］Lactobacillus gasseri BP-01669、［６］Lactobacillus rhamnosus LCS-742からなる群から選ばれる１種又は２種以上が、有用菌株として製品に使用されている観点から、好適である。
【００２５】
［１］ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム ＮＩＴＥ ＢＰ−０２６２１（Bifidobacterium longum BB536）は、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に、２０１８年１月２６日にＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の受託番号で、ブダペスト条約に基づく国際寄託がなされたものである。また、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１（ＢＢ５３６）菌株と同一の菌株であるビフィドバクテリウム・ロンガム  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９菌株は、米国の保存機関であるAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）（米国、２０１１０  バージニア州  マナサス  ユニバーシティ・ブルバード  １０８０１）に、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９の受託番号で寄託されている。
［２］ビフィドバクテリウム・インファンティス  NITE BP-02623（Bifidobacterium infantis M-63）は、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に、２０１８年１月２６日にＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２３の受託番号で、ブダペスト条約に基づく国際寄託がなされたものである。ビフィドバクテリウム・インファンティスＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２３（Ｍ−６３）と同一の菌株であるビフィドバクテリウム・インファンティス  ＢＣＣＭ  ＬＭＧ２３７２８は、ベルギーの保存機関であるBelgian Coordinated Collections of Microorganisms（ＢＣＣＭ）（ベルギー、Ｂ−１０００  ブリュッセル  シアンス通り（ウェーテンスカップ通り）８）に、ＢＣＣＭ  ＬＭＧ２３７２８の受託番号で寄託されている。
［３］ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP-02622（Ｍ−１６Ｖ）は、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に、２０１８年１月２６日にＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２２の受託番号で、ブダペスト条約に基づく国際寄託がなされたものである。
［４］ビフィドバクテリウム・ブレーベ FERM BP-11175は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、平成２１年８月２５日付けで受託番号FERM BP-11175にて、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
［５］Lactobacillus acidophilus NITE BP−01695は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、平成２５年８月２３日付けで受託番号FERM BP-01695にて、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
［６］Lactobacillus gasseri BP-01669は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に、２０１３年７月２９日に、受託番号：NITE BP-01669にて、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
［７］Lactobacillus rhamnosus LCS-742は、森永乳業株式会社よりLactobacillus rhamnosus LCS-742として、販売されている（例えば、特表2009-522280参照）。
【００２６】
なお、前記菌株を培養する場合、従来、培養法による微生物の生菌数の測定に用いられている公知の培養法が利用できる。前記培養法としては固体培養法（寒天培地にて培養を行う培養法）が挙げられる。
固体培養法として具体的には、混釈法、平板塗抹法、スパイラル法等が挙げられる。混釈法は、試験試料（検体、又は検体を希釈液で希釈した希釈物）を、加温溶解した寒天培地と混和し、冷却固形化して培養する方法である。平板塗抹法は、試験試料を、寒天培地上に塗抹して培養する方法である。スパイラル法は、試験試料を、機器等を使用して濃度勾配を付けて培地上にプレーティングする方法である。
本技術において、培地上でコロニーを形成させる場合、平板塗抹法又はスパイラル法を用いればよく、また、培地中でコロニーを形成させる場合、混釈法を用いればよい。このうち、平板塗抹法及び混釈法が好ましい。
【００２７】
本技術の生菌数測定方法における、（１）前記被検体を希釈した液を用いて培地上又は培地中に複数のコロニーを形成させ、このなかから全部又は一部のコロニーを選択する工程、（２）前記選択された各コロニー由来のDNAを鋳型として配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチドを用いてビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１由来の増幅核酸を得る工程（３）前記増幅核酸数及び前記被検体を希釈したときの希釈倍率に基づき、前記被検体中に含まれるビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の生菌数及び割合を判定する工程について以下に説明する。
【００２８】
〔（１）コロニー選択工程〕
本技術におけるコロニー選択工程は、前記被検体を希釈した液を用いて培地上に又は培地中に複数のコロニーを形成させた後に、形成されたコロニーのなかから全部又は一部のコロニーを選択する工程である。
当該コロニー選択工程には、被検体を液体にて希釈する希釈工程、被検体に含まれる菌株（以下、「被検菌」ともいう）を培地上に又は培地中に培養して各菌株のコロニーを形成するコロニー形成工程、形成された全コロニー数の全部又は一部のなかから選択されたコロニー数をカウントするカウント工程が、少なくとも含まれることが望ましい。
【００２９】
本技術のコロニー選択工程において、前記被検体を希釈した液を用いることが好適である。本技術において、前記被検体を液体に溶解又は懸濁させて、前記被検菌を含む混合溶液を作成する。この混合溶液は、培地に直接塗布するための希釈液として用いてもよいし、希釈用の原液として用いてもよい。この混合溶液又はこれをさらに希釈した混合溶液を、本技術において前記被検体を希釈した液として用いればよい。
【００３０】
本技術において、懸濁や希釈等の目的で被検体に使用する液体は、目的とする又は想定される被検菌（具体的には乳酸菌又はビフィズス菌）の培養又は観察に通常用いられているものであれば、特に限定されず、被検菌の浸透圧に影響がでない液体が好ましい。
本技術において、被検菌がビフィズス菌及び／又は乳酸菌の場合、培養又は観察に用いられている液体として、例えば、０．８５％生理食塩水、０．１％ペプトン加生理食塩水、光岡バッファー、バッファードペプトンウォーター、1/4強度リンゲル溶液等が挙げられる。
【００３１】
本技術では、前記被検体を希釈することが、培地上で又は培地中でコロニー同士が接触していないコロニーを選択しやすいので好ましい。培地上において又は培地中において、コロニー同士が接触しないことは、釣菌のためのコロニーとして選択し易い観点及びコロニー数をカウントし易い観点から、望ましい。本技術では、被検体中の菌株が適切な濃度になるように液体にて希釈することがより望ましい。このようにして被検体を適切な希釈倍率に希釈した液を用いて、培地上に又は培地中に適切な数及びサイズのコロニーを形成させることが、増幅核酸を得る工程でのサンプル数を確保しつつ、かつ釣菌コロニーを選択し易くなることで生菌数測定の精度が向上する観点から、望ましい。
【００３２】
上述の希釈倍率が適切であるかどうかは、培養後の培地上に又は培地中に形成されるコロニー数及びその状態（サイズや形状等）が適切であるかによって、判断してもよい。この場合、希釈倍率が異なる複数の希釈液を作製する；それぞれの希釈倍率に希釈された液を用いてそれぞれの培地上又は培地中に接種する；接種後、それぞれの培地を培養してコロニーを形成させる；コロニー形成後に、複数の培地のなかから所定数のコロニーが形成された培地を選択する。この選択の判断は、各培地のコロニー観察にて行えばよい。そして、作製された複数の希釈液のなかから、適切な濃度（言い換えると、適切な希釈倍率）を選択することができる。希釈倍率が適切と判断するときのコロニー数の目安は、１シャーレ（直径８〜１２ｃｍ）内に３０〜３００個である。
【００３３】
本技術のコロニー選択工程において、前記希釈液を用いて接種し、接種後に培地上に又は培地中に培養することによって、培地上に又は培地中に複数のコロニーを形成させることが、好適である。
【００３４】
本技術で用いる培地は、目的とする又は想定される被検菌が生育可能な培地成分を含むものを用いれば、特に限定されず、汎用的な培地を用いればよい。
前記培地を固形とする成分として、細菌培養に使用できるものであれば特に限定されないが、例えば、寒天、ジェランガム、ゼラチン等が挙げられ、このうち寒天が好ましい。例えば、寒天は、通常固化できる濃度であれば特に配合量は限定されないが、一般的には最終的に得られる培地中の濃度が１．５質量％程度（１．３〜１．８質量％）となるように配合されている。
【００３５】
従来の生菌数測定方法では、複数種類の様々なビフィズス菌及び又は乳酸菌が含まれている被検体を培地上又は培地中で培養し、培養後に培地上又は培地中で目的とする菌株が目視等により判別できるように培地組成が調整されていた。しかし、本技術では、むしろ従来の考えとは逆となる目的菌株のみの専用培地ではなく、目的とする菌株が生育可能な一般的な基礎培地成分（汎用的な培地組成ともいう）を用いることが好適である。本技術は、汎用的な培地での培養が可能であることから、培地組成による、菌株割合及び生菌数への影響が少ないことを、有利な点とする。
【００３６】
前記基礎培地成分としては、特に限定はされないが、例えば、酵母エキス、肉エキス、ペプトン等の窒素源；塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム等のナトリウム塩、Ｌ−システイン塩酸塩、リン酸塩、金属塩類（例えば、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン等の硫酸塩）等の塩類；糖類（例えば、グルコース、ラクトース、オリゴ糖、スクロース、デンプン等）；が挙げられる。
【００３７】
前記培地は、被検菌がビフィズス菌及び／又は乳酸菌の場合、ビフィズス菌及び／又は乳酸菌用の生育培地が好適であり、一般的なビフィズス菌及び／又は乳酸菌用の基礎培地を用いればよい。ビフィズス菌及び／乳酸菌培養用の生育培地成分として、使用可能な酵母エキス、肉エキス、ペプトンとして、それぞれ、通常、微生物の培養のために用いられるものが利用できる。酵母エキスは、酵母を原料として自己消化酵素などによって適度に分解された栄養源であり、具体的には、Yeast Extract（ＢＤ社製）等を例示することができる。肉エキスは、肉の浸出液から得られる栄養源であり、ペプトンに備わっていないミネラル、リン酸、エネルギー源等の必須な要素を付与することにより、ペプトンの栄養素の特性を補完する栄養源である。具体的には、'LAB-MEMCO' powder（ＯＸＯＩＤ社製）等を例示することができる。ペプトンは、牛乳カゼイン、獣肉、大豆タンパク質等をタンパク質分解酵素又は酸で部分的に加水分解したものである。具体的には、BactoTM peptone（ＢＤ社製）等を例示することができる。
培地１０００ｍＬ中、酵母エキスの含有量は、１．８〜４．２ｇ／１０００ｍＬが好ましい。より好ましくは２．７〜４．２ｇ／１０００ｍＬである。
培地１０００ｍＬ中、肉エキスの含有量は、６．０〜１４．０ｇ／１０００ｍＬが好ましい。より好ましくは９．０〜１４．０ｇ／１０００ｍＬである。
培地１０００ｍＬ中、ペプトンの含有量は、６．０〜１４．０ｇ／１０００ｍＬが好ましい。より好ましくは９．０〜１４．０ｇ／１０００ｍＬである。
上記酵母エキス、肉エキス、ペプトンそれぞれの含有量（ｇ／１０００ｍＬ）は、培地１０００ｍＬ中に含まれる固形分量（ｇ）を示す。
【００３８】
ビフィズス菌及び／乳酸菌培養用の培地成分は、浸透圧の観点から、前記塩類を含むことが好ましい。前記塩類としては、ナトリウム塩が好ましく、塩化ナトリウム、及び酢酸ナトリウムが特に好ましい。培地中、前記塩類の含有量は、培地１０００ｍＬ中、５〜１５ｇ／１０００ｍＬが好ましい。ビフィズス菌及び／乳酸菌培養用の基礎培地成分は、浸透圧及び生育の観点から、前記糖類を含むことが好ましい。前記糖類として、グルコース、スクロース、ラフィノースからなる群から選択される１種又は２種以上が好ましい。
培地中、前記糖類の含有量は、培地１０００ｍＬ中、１０〜４０ｇ／１０００ｍＬが好ましい。
【００３９】
本技術の培地は、必要に応じて、本技術の効果を損なわない範囲で、上記以外の他の成分を含有してもよく、前記他の成分としては、特に限定されず、一般的に培地に添加されている成分を含有できる。
また、本技術の培地の作製方法は、特に限定されず、公知の方法を利用して作製することができる。例えば、基礎培地成分を含む培地成分を、滅菌処理（オートクレーブ１２１℃１５分間）後、滅菌シャーレ等の滅菌容器に流し込み固化させればよい。また、市販品の生培地（シャーレに分注済みの培地）を購入してもよい。
【００４０】
被検菌としてビフィズス菌及び／又は乳酸菌を目的又は想定する場合、ビフィズス菌及び／又は乳酸菌の観察用又は生菌数測定用に使用可能な寒天培地を用いることが好ましい。
ビフィズス菌の寒天培地として、例えば、ＲＣＭ寒天培地、ＢＬ寒天培地、ＴＯＳ寒天培地、ＴＯＳ  ＭＵＰ寒天培地、ＭＧＬＰ寒天培地、ＭＲＳ寒天培地、ＭＲＳＣ寒天培地等、ＧＡＭ寒天培地等が挙げられる。
乳酸菌の寒天培地として、例えば、ＢＣＰ寒天培地、ＭＲＳ寒天培地、Ｍ１７寒天培地等が挙げられる。
【００４１】
また、接種方法としては、寒天培地の表面に菌を接種する塗抹法でも、シャーレに菌懸濁液を添加し、直後に加温溶解した寒天培地を流し込む混釈法のどちらであってもよい。
また、各培地の培地組成に合わせた培養条件にて培養を行えばよく、被検菌としてビフィズス菌を想定する場合、嫌気培養で行うのが好ましく、乳酸菌を想定する場合、嫌気培養もしくは好気培養が好ましいが、３７℃で１〜３日間培養で行うことが好ましい。
【００４２】
本技術における培養後の培地上又は培地中の適切なコロニー数とは、少なくとも２以上の複数のコロニーの数であるのが好ましい。
本明細書におけるカウントするコロニーの形態として、目視できる大きさの円形状が好ましく、より具体的には直径０．７ｍｍ以上が好ましく、コロニーのサンプル数を多くしつつコロニー同士を接触させないようにするため、より好ましくは０．７〜３ｍｍ程度、さらに好ましくは１〜２ｍｍ程度の円形である。
本技術における培地上に又は培地中における適切なコロニー数は、隣接するコロニーが接触することなく、略円形を保つコロニーが培地上又は培地中の選定エリアに２以上で多く存在することが好ましい。
本技術において、前記被検体を各希釈倍率に希釈した液を用いて、それぞれの培地上に又は培地中に接種してコロニーを形成させる。そのなかから適切なコロニーが形成された培地を、次の同定工程のサンプルとして用いることが好適である。
培養後の培地上に又は培地中における適切なコロニー数として、３０〜３００個／１シャーレ（直径９ｃｍの場合）が好ましい。より好ましくは５０〜２５０個／ｃｍ2である。コロニー数を増やすために直径が大きいシャーレを使用してもよい。
【００４３】
本技術のコロニー選択工程において、培地上に又は培地中に存在する全てのコロニーを選択しこの数をカウントしてもよく、また、コロニー観察にて良好なコロニー形成がされている一部のエリアを選択し、この選択されたエリア内のコロニーをカウントしてもよい。一定エリア内のコロニー数をカウントする場合には、当該エリアを１シャーレ（直径９ｃｍ）全体に換算することで、培地上に又は培地中に存在する全てのコロニー数とすることができる。前記カウントされるコロニー数は、少なくとも１０個以上が好ましく、より好ましくは３０個以上、さらに好ましくは１００個以上３００個以下である。
【００４４】
本技術において、培地上又は培地中の全てのコロニーをカウントすることは、被検体中のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の生菌数及び生菌株割合の算出精度を高める観点から好ましい。また、本技術において、培地上又は培地中における一部のエリア内のコロニーをカウントすることは、コロニー数が数百個等と多い場合や一部のエリアでコロニー同士が重なっていた場合等でも再度培養又は再度希釈倍率設定を行わなくてもよいので、作業効率の観点から好ましい。
【００４５】
培養後に培地上又は培地中のコロニー数及びその状態に基づいたコロニー選択は、目視でも可能であるが、本技術であれば高度な経験によるコロニー形態の判定をしなくともよいので、カメラ（ＣＣＤ等）を用いてコロニー数を画像解析にて計測することも可能である。画像解析等を利用することで、コロニー判定を自動化できると共に、被検体中の生菌数算出を自動化できる観点で有利である。
【００４６】
〔（２）増幅核酸を得る工程〕
本技術の菌株同定工程は、前記各コロニー由来のDNAを鋳型として配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチドを用いてビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の増幅核酸を得る工程、である。
【００４７】
本技術におけるサンプル調製工程（前処理工程）は、上述した培地上に又は培地中に存在する全部又は一部の選択されたコロニーごとに、釣菌を行い、PCR増幅用のプレートにそれぞれ溶解する。これにより、上述で選択された全部又は一部のコロニー数が、増幅核酸サンプル数になる。例えば、選択したコロニー数５０個の場合増幅サンプル数は５０個となる。
なお、釣菌は、先端の尖った棒状（楊枝等）のもので、コロニー釣菌に使用後、廃棄するか、滅菌処理して再利用してもよい。一旦コロニーからDNAを抽出した後に、各増幅サンプルとしてウェルプレートあるいはエッペンに移植してもよい。
【００４８】
本技術において、増幅核酸とは、試料中の核酸のうち増幅したい核酸（標的核酸）を、当該標的核酸の塩基配列の相補性を利用して増幅することをいう。核酸増幅方法の具体例として、例えばＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＮＡＳＢＡ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、及び３ＳＲなどが挙げられるがこれらに限定されない。本技術において、核酸増幅は好ましくはＰＣＲを用いることが好ましい。
【００４９】
本技術において、ＰＣＲは、一般的に行われているＰＣＲと同様の方法により行われてよい。典型的には、ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ、プライマー、及びＤＮＡポリメラーゼ、並びにその他の必要成分を含む反応液を用意し、変性工程、アニーリング工程、及び伸長反応工程に各々適した温度で当該反応液を所定時間保温するという一連の工程を２０〜４０サイクル繰り返すことにより行われる。各工程における温度や保温時間並びにサイクル数は当業者により適宜定められる。
【００５０】
ＰＣＲの反応条件は、使用する酵素や装置等に応じて当業者により適宜設定される。具体的には、例えば９５℃３分間加温後、変性工程：９０〜９８℃で１０〜４０秒、アニーリング工程：５０〜６５℃で２０〜４０秒、及び伸長反応工程：７０〜７５℃で２０〜４０秒の一連の工程を２０〜４０サイクル繰返し、最後に７２℃で１０分間加熱する反応条件が挙げられる。鋳型ＤＮＡとプライマーの量比は、１０２〜１０８コピーの染色体ＤＮＡに対しプライマー０．２〜２μｍｏｌであることが好ましい。
【００５１】
ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲに用いることができるものであれば特に制限されない。
ＤＮＡポリメラーゼとしては例えば、市販入手可能なＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）、Ｔａｋａｒａ  Ｔａｑ、及びＴａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ）などのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、並びに、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ
社）及びＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）などのＤＮＡポリメラーゼを挙げることができるがこれらに限定されない。上記ＰＣＲにおいて用いられるＤＮＡポリメラーゼは、これらの酵素と緩衝液とからなる組成物であってもよい。
【００５２】
本技術の核酸増幅用プライマーを用いて増幅される核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり、
特には染色体ＤＮＡ又はその断片でありうる。増幅される核酸は、前記コロニーから染色体を抽出したものでもよいし、釣菌により得られたコロニー由来の核酸断片もありうる。細菌からの核酸の抽出は、当業者に既知の方法により行われてよい。例えば、ＱＩＡＧＥＮ社のＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  ＫｉｔやＱＩＡａｍｐＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、日本バイオラッド社のインスタジーンマトリックス（ＩｎｓｔａＧｅｎｅ  Ｍａｔｒｉｘ）などの市販のＤＮＡ抽出キットを使用することができる。また、Ｍｕｒｍｕｒの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３  ｐ２０８−２１８（１９６１））やベンジルクロライド法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２１  ｐ５２７９−５２８０（１９９３））などにより細胞からＤＮＡを抽出し、さらにはリボヌクレアーゼによりＲＮＡを除去することによっても、ＤＮＡを抽出することができる。核酸の抽出に際しては、ＰＣＲ阻害物質を除去する物質、例えば牛血清アルブミン等を加えることが好ましい。ＤＮＡの抽出法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ″，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒに従い取得することが出来る。  
【００５３】
本技術の核酸増幅用プライマーを用いてビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの核酸断片が、４６１ｂｐの増幅産物が得られる。そのため、得られた増幅産物がビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム由来であることを確認するために、増幅核酸数を決定するために増幅産物の長さが決定されてもよい。増幅産物の長さの決定は、当業者により適宜行われてよく、例えばアガロースゲル電気泳動により行われる。増幅核酸を決定する工程はアガロースゲル電気泳動で行われる。アガロースゲル電気泳動で目的の大きさの増幅産物が得られていた場合は、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１由来の増幅核酸が得られたと判別する。
【００５４】
〔（３）ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの割合及び生菌数の判定工程〕
本技術のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の割合及び生菌数の判定工程は、前記増幅核酸数及び前記組成物を希釈したときの希釈倍率に基づき、前記被検体中に含まれるビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の割合及び生菌数を判定する工程である。
本技術において、前記増幅核酸数と前記被検体を希釈したときの希釈倍率とに基づき、前記被検体中に含まれる前記菌株割合及び生菌数を判定することができる。
より具体的には、本技術では、「ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１のコロニー数×被検体の希釈倍率」に基づき、被検体中に含まれる各菌株割合及び各生菌数を（ＣＦＵ／ｇ）にて算出することが好適である。
本技術で使用される「生菌数の単位」は、被検体１ｇもしくは１ｍＬの希釈液を用いて培地上又は培地中のコロニー数に基づき、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の生菌数を求めているので、「ＣＦＵ（colony  forming  unit；コロニー形成単位）／製品１ｇもしくは１ｍＬ」で表されることが好ましい。
さらに、本技術では、汎用的な培地組成を使用しているため、製品中に含まれる１種類又は複数種類の菌株全てを生育させやすいので、「各菌株のコロニー数／全てのコロニー数」に基づき各ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム割合を算出させた場合の分母の「全てのコロニー数」がより正確であることから、正確な生菌数及び菌株割合を得やすい利点がある。
【００５５】
製品１ｇを液体懸濁して希釈液を作成した場合；
全生菌数（ＣＦＵ／製品１ｇ）＝希釈倍率×［希釈液１ｍＬ／塗布量ｍＬ］×培地上に又は培地中に形成されたコロニー数。
ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の生菌数（ＣＦＵ／製品１ｇ）＝希釈倍率×［希釈液１ｍＬ／塗布量ｍＬ］×ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１のコロニー数。
ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１割合（％）＝ＰＣＲにて同定されたビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１のコロニー数／全コロニー数（又は培地上に又は培地中に形成された全コロニー数）×１００
培地上又は培地中の全面積は、１シャーレ（直径９ｃｍの場合）の全面積とするのが好ましい。なお、培地上又は培地中の一部エリアを抜き取りこのエリア内の全コロニーを増幅断片を得られたサンプルとした場合、このエリアの全コロニー数から培地上又は培地中の全面積の全コロニー数を算出してもよい。
【００５６】
また、本技術において、同定できなかった菌株（コロニー）は、生菌数及び菌株割合を算出する際の各グループ中のサンプル数及び選択されたコロニー数から排除することにより簡便でかつ正確な各菌株の生菌数及び菌株割合を測定することができる。
【００５７】
＜２．本技術の１種類又は複数種類の菌株を含む組成物の製造方法＞
本技術は、別の側面として、上記＜１．本技術の生菌数の測定方法＞を用いて、１種類又は複数種類のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１を含む組成物の製造法を提供することも可能である。なお、上記＜１．本技術の生菌数の測定方法＞と共通する構成についてはその説明を省略する。
本技術の組成物の製造方法の「組成物」は、特に限定されず、本技術の被検体に使用可能な組成物であればよく、製品であってもよく試作品であってもよい。例えば、飲食品組成物、医薬品組成物、飼料組成物等の何れでも良いが、上記＜１．本技術の生菌数の測定方法＞にて説明した製品が好適である。
【００５８】
ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１を含む組成物の製造方法であり、前記測定方法を用いて、被検体となる組成物中のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の生菌数を測定する工程、前記測定された組成物中のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の生菌数に基づいて、目的生菌数になるように組成物中のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の配合量を調整して設計する工程を含み、前記各菌株の配合量の設計に基づき、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１を含む組成物を得る、前記組成物の製造方法である。
【００５９】
本技術の組成物の製造方法における前記（１）の生菌数測定工程は、上記＜１．本技術の生菌数の測定方法＞と共通する構成について、その説明を省略する。
本技術の組成物の製造方法において、被検体となる組成物は、１種類又は複数種類であり、複数の場合には、同一ロット、製造時期が同時期、製造原材料が同一であるものが好ましい。目的生菌数とは、１種類又は複数種類でもよい。また、目的生菌数とは、特に限定されず、製造者の任意によって設定することができ、製造時に組成物に配合する生菌数である。例えば、目的生菌数として、製造時に基準として設定された生菌数；製造直後の生菌数マイナス製造保管時の生菌数に基づき生菌数の減少分を補充するように補正された生菌数等が挙げられる。
【００６０】
組成物には、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１を含む１種類又は複数種類の菌株が含まれているが、経時的変化によって、この組成物中の１種類の菌株又は複数種類の各菌株の生存率等が変化してくる。このため、菌株を含む組成物の品質管理では、長期間保存したときにこの変化を想定して各菌株の配合量及び菌株割合を調整する対策も必要となっている。本技術では、このような菌株の配合量及び配合割合の調整をより正確に行うことができる。
【００６１】
また、菌株を通常長期間保存すると菌株の生育力も低下しやすいので、特殊な成分を使用して生菌数を測定する方法ではその特殊な成分の影響によって真の生存率よりもより低い生存率を算出しやすく、正確さに欠けるリスクがある。しかしながら、本技術では、汎用的な培地を使用できるので、そのリスクを低減することができる。
【００６２】
また、本技術では、保管による組成物中の各菌株の生菌数及び菌株割合の変化をモニタリングし正確に把握することもできる。そして、本技術では、このモニタリング結果を製造プロセスにフィードバックし、製造プロセスにおける組成物中の各菌株の生菌数及び菌株割合を調整（増量又は減量）することによって、一定期間保存後の組成物中における目的とする生菌数及び菌株割合にすることができる。
【００６３】
本技術の方法とその結果及び／又は当該結果と組成物の製造方法を、装置のＣＰＵ等を含む制御部、及び記憶媒体（ＵＳＢメモリ、ＨＤＤ、ＣＤ、ネットワークサーバ等）等を備えるハードウエア資源にプログラムとして格納し、制御部によって実現させることも可能である。
また、本技術は、本技術の方法及び／又は当該結果と組成物の製造方法として、コンピュータを機能させるためのプログラムとすることも可能である。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例に基づいて本技術を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本技術の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
【００６５】
［実施例１］
試験試料としてビヒダスヨーグルトプレーン加糖４ポットを用いる。なお、この生菌末をそれぞれ生理食塩水を希釈液として１０5倍に正確に段階希釈し、塗抹法にてRCM寒天培地（ＯＸＯＩＤ社製）に接種し、嫌気培養により37℃にて48時間培養した。
得られた２０コロニー釣菌し、加熱処理後に遠心処理した上清液を分離菌DNA sample A-Tとする。一方、ネガティブコントロールとしてDNAを含まない滅菌水を用いてPCR増幅を行う。すべてのサンプルに対し、配列番号１、２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、PCR増幅を行った。
【００６６】
上記A-Tに相当するWell-Plateサンプルに対し、アガロースゲル電気泳動を行った結果、分離菌A-Tはいずれも約461bp付近にバンドが認められ、ネガティブコントロールではバンドが認められなかった。
よって、１０5倍希釈し20個のコロニーが得られたすべてがビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ ＢＰ−０２６２１であることがわかり、１０5の希釈乗率を計算し、サンプル中には２．０×１０6ｇのビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム  ＮＩＴＥ ＢＰ−０２６２１が含まれることが分かった。
【００６７】
さらに、６ヶ月保管した混合物について、同様にして、各菌株割合及び各菌株の生菌数を測定する。この結果により、製造時の各菌株の生菌数マイナス６ヶ月保管したときの各菌株の生菌数に基づき、再び混合物を製造する際に、各菌株の減量した分について製造する際に各菌株を増量する。
SEQUENCE LISTING
<110>  Morinaga milk industry co., ltd.
<120>  Method for identifing Genus of Bifidobacterium
<130>  P00002006
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<170>  PatentIn version 3.5
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gaacagggtg tgctgagtga  
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<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
agcgagaa gatcatcgaa