(57)【要約】【課題】運動ニューロンに関する状態の処置のためのＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストの提供。【解決手段】本発明は、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを投与することによって、運動ニューロンの生存および軸索成長に関する疾患、障害または傷害（筋萎縮性側索硬化症を含む）を処置する方法を提供する。運動ニューロンの生存を促進するための例示的な方法であって、前記運動ニューロンと、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを含む有効量の組成物とを接触させることを含み、このＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストが、（ｉ）可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド；（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片；（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチド；（ｉｖ）ＬＩＮＧＯ−２アプタマー；および（ｖ）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストのうちの２つ以上の組み合わせからなる群より選択される方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
運動ニューロンは、筋肉機能を制御するニューロンである。それらは中枢神経系に位置し、筋肉を制御するために中枢神経系の外側に伸びる軸索を有する。通常、脳に位置する上位運動ニューロンは、脊髄に位置する下位運動ニューロンにシグナルを送り、下位運動ニューロンが筋活動を指令する。当然のことながら、筋肉は、呼吸、嚥下、会話および歩行を含む多くの活動に重要である。したがって、運動ニューロンの損傷または運動ニューロン機能の低下には壊滅的な臨床効果がある場合があり、運動ニューロンに関連する多数の症状が同定されている。
【０００２】
このような症状としては、限定されないが、以下の疾患、障害および傷害が挙げられる：筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）、Ｘ連鎖球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ；ケニー病）、進行性球麻痺、偽性球麻痺、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ポリオ後症候群（ＰＰＳ）、ハンチントン病、本態性振戦（ＥＴ）、運動ニューロン疾患、麻痺およびパーキンソン病。ＡＬＳは、これらの疾患の代表的なものの１つであり、毎年、１００，０００人に１〜２人がＡＬＳを発症している。ＡＬＳは、上位運動ニューロンおよび下位運動ニューロンの両方の破壊に関連する急速進行性疾患であり、随意筋運動の喪失をもたらす。
【０００３】
損傷ニューロンに関連するある特定のナトリウムチャネルｔｈｙａｔを遮断するリルゾールの使用を含むいくつかの疾患修飾処置が、ＡＬＳおよび他の運動ニューロン関連疾患に利用可能である。このような処置は疾患進行を遅らせ得るが、現在のところ、運動ニューロン疾患の治療法はない。したがって、運動ニューロンの軸索の再生を促進し、および／または運動ニューロンの生存を促進する治療が、不十分な運動ニューロン機能に関連する疾患を有する患者にとって非常に必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の簡単な概要
ＬＩＮＧＯ−２（ＦＬＪ３１８１０、ロイシンリッチリピートおよび免疫グロブリン様ドメイン含有ｎｏｇｏ受容体相互作用タンパク質２、ＬＥＲＮ３、ロイシンリッチリピート神経タンパク質３、ロイシンリッチリピート神経タンパク質６Ｃ、ＬＲＲＮ６Ｃ、ＰＲＯ３１９９３またはＵＮＱ９２３４）は、皮質ニューロンおよび後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンで発現しており、運動ニューロンの生存および運動ニューロンの軸索長を負に調節する。ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、インビボおよびインビトロの両方で運動ニューロンの生存および成長を促進するのに使用することができる。例えば、抗体、その抗原結合断片およびその誘導体は、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストとして使用することができる。可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド、およびＬＩＮＧＯ−２領域に対応するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する核酸もＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストとして使用することができる。したがって、運動ニューロンとＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストとを接触させることによって、運動ニューロンの生存および運動ニューロンの軸索成長を促進するための方法が本明細書で提供される。
【０００５】
本発明のある特定の実施形態は、以下のものを包含する（各実施形態は、大文字「Ｅ」の後の数字によって示される）：
【０００６】
Ｅ１）Ｃ０９抗体と同じＬＩＮＧＯ−２エピトープに特異的に結合することができる、単離された結合分子。
【０００７】
Ｅ２）Ｃ０９抗体がＬＩＮＧＯ−２に結合するのを競合的に阻害する、Ｅ１に記載の単離された結合分子。
【０００８】
Ｅ３）Ｃ０９抗体の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、単離された結合分子。
【０００９】
Ｅ４）抗体またはその抗原結合断片を含む、Ｅ１〜Ｅ３のいずれか一項に記載の結合分子。
【００１０】
Ｅ５）Ｃ０９の可変重ドメイン（ＶＨ）ＣＤＲ１〜３を含み、１つ以上のＶＨ  ＣＤＲが３個以下の単一アミノ酸置換を有する、Ｅ１〜Ｅ４のいずれか一項に記載の結合分子。
【００１１】
Ｅ６）Ｃ０９のＶＨ  ＣＤＲ１〜３を含む、Ｅ５に記載の結合分子。
【００１２】
Ｅ７）Ｃ０９の可変軽ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲ１〜３を含み、１つ以上のＶＬ  ＣＤＲが３個以下の単一アミノ酸置換を有する、Ｅ１〜Ｅ６のいずれか一項に記載の結合分子。
【００１３】
Ｅ８）Ｃ０９のＶＬ  ＣＤＲ１〜３を含む、Ｅ７に記載の結合分子。
【００１４】
Ｅ９）Ｃ０９のＶＨ  ＣＤＲ１〜３およびＶＬ  ＣＤＲ１〜３を含む、Ｅ１〜Ｅ４のいずれか一項に記載の結合分子。
【００１５】
Ｅ１０）該ＶＨが、Ｃ０９のＶＨと少なくとも８５％、９０％または９５％同一のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、Ｅ１〜Ｅ９のいずれか一項に記載の結合分子。
【００１６】
Ｅ１１）該ＶＨが、Ｃ０９のＶＨと同一のアミノ酸配列を含む、Ｅ１０に記載の結合分子。
【００１７】
Ｅ１２）Ｃ０９のＶＬと少なくとも８５％、９０％または９５％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、Ｅ１〜Ｅ１１のいずれか一項に記載の結合分子。
【００１８】
Ｅ１３）該ＶＬが、Ｃ０９のＶＬと同一のアミノ酸配列を含む、Ｅ１２に記載の結合分子。
【００１９】
Ｅ１４）Ｃ０９のＶＨおよびＶＬと少なくとも８５％、９０％または９５％同一のアミノ酸配列を含むＶＨおよびＶＬを含む、Ｅ１〜Ｅ１３のいずれか一項に記載の結合分子。
【００２０】
Ｅ１５）該ＶＨおよびＶＬが、Ｃ０９のＶＨおよびＶＬと同一のアミノ酸配列を含む、Ｅ１４に記載の結合分子。
【００２１】
Ｅ１６）ＬＩＮＧＯ−２のＬＲＲドメインに結合する、Ｅ１〜Ｅ１５のいずれか一項に記載の結合分子。
【００２２】
Ｅ１７）ＬＩＮＧＯ−２のＬＲＲ７〜ＬＲＲ１２におけるエピトープに結合する、Ｅ１６に記載の結合分子。
【００２３】
Ｅ１８）配列番号２のアミノ酸２０２〜３４３におけるエピトープに結合する、Ｅ１６に記載の結合分子。
【００２４】
Ｅ１９）配列番号２のアミノ酸２８〜４０８または配列番号２のアミノ酸４１０〜５００のＬＩＮＧＯ−２領域に結合する、Ｅ１〜Ｅ１８のいずれか一項に記載の結合分子。
【００２５】
Ｅ２０）ヒト、ラットおよびマウスＬＩＮＧＯ−２に結合する、Ｅ１〜Ｅ１９のいずれか一項に記載の結合分子。
【００２６】
Ｅ２１）ヒトおよびラットＬＩＮＧＯ−２に結合する、Ｅ１〜Ｅ１９のいずれか一項に記載の結合分子。
【００２７】
Ｅ２２）ヒトおよびマウスＬＩＮＧＯ−２に結合する、Ｅ１〜Ｅ１９のいずれか一項に記載の結合分子。
【００２８】
Ｅ２３）ヒトＬＩＮＧＯ−２に結合する、Ｅ１〜Ｅ１９のいずれか一項に記載の結合分子。
【００２９】
Ｅ２４）運動ニューロンの生存を促進する、Ｅ１〜Ｅ２３のいずれか一項に記載の結合分子。
【００３０】
Ｅ２５）運動ニューロンの軸索成長を促進する、Ｅ１〜Ｅ２４のいずれか一項に記載の結合分子。
【００３１】
Ｅ２６）オリゴデンドロサイト分化を促進する、Ｅ１〜Ｅ２５のいずれか一項に記載の結合分子。
【００３２】
Ｅ２７）髄鞘形成を促進する、Ｅ１〜Ｅ２６のいずれか一項に記載の結合分子。
【００３３】
Ｅ２８）ＡＫＴリン酸化を促進する、Ｅ１〜Ｅ２７のいずれか一項に記載の結合分子。
【００３４】
Ｅ２９）ヒト抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体を含む、Ｅ１〜Ｅ２８のいずれか一項に記載の結合分子。
【００３５】
Ｅ３０）天然に存在する抗体、ｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディまたは一本鎖抗体を含む、Ｅ１〜Ｅ２８のいずれか一項に記載の結合分子。
【００３６】
Ｅ３１）モノクローナル抗体を含む、Ｅ１〜Ｅ２８のいずれか一項に記載の結合分子。
【００３７】
Ｅ３２）該ＶＨが、Ｃ０９のＶＨ  ＣＤＲ１〜３を含むＶＨをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【００３８】
Ｅ３３）該ＶＨが、Ｃ０９のＶＨと少なくとも８５％、９０％もしくは９５％同一であるかまたはこれと同一のアミノ酸配列を含むＶＨをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【００３９】
Ｅ３４）該ＶＬが、Ｃ０９のＶＬ  ＣＤＲ１〜３を含むＶＬをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【００４０】
Ｅ３５）該ＶＬが、Ｃ０９のＶＬと少なくとも８５％、９０％もしくは９５％同一であるかまたはこれと同一のアミノ酸配列を含むＶＬをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【００４１】
Ｅ３６）前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、ＬＩＮＧＯ−２に特異的に結合することができる、Ｅ３２〜Ｅ３５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【００４２】
Ｅ３７）該抗体またはその抗原結合断片が、Ｃ０９抗体と同じエピトープに特異的に結合する、Ｅ３６に記載のポリヌクレオチド。
【００４３】
Ｅ３８）前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、ＬＩＮＧＯ−２のＬＲＲドメインに結合することができる、Ｅ３２〜Ｅ３７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【００４４】
Ｅ３９）前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、ＬＩＮＧＯ−２のＬＲＲ７〜ＬＲＲ１２におけるエピトープに結合することができる、Ｅ３２〜Ｅ３７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【００４５】
Ｅ４０）前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２のアミノ酸２８〜４０８または配列番号２のアミノ酸４１０〜５００のＬＩＮＧＯ−２領域に結合することができる、Ｅ３２〜Ｅ３７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【００４６】
Ｅ４１）前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、ＬＩＮＧＯ−２のアミノ酸２０２〜３４３におけるエピトープに結合することができる、Ｅ３２〜Ｅ３７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【００４７】
Ｅ４２）前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、ヒト、ラットおよびマウスＬＩＮＧＯ−２に結合することができる、Ｅ３２〜Ｅ４１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【００４８】
Ｅ４３）前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、ヒトおよびラットＬＩＮＧＯ−２に結合することができる、Ｅ３２〜Ｅ４１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【００４９】
Ｅ４４）前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、ヒトおよびマウスＬＩＮＧＯ−２に結合することができる、Ｅ３２〜Ｅ４１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【００５０】
Ｅ４５）前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、ヒトＬＩＮＧＯ−２に結合することができる、Ｅ３２〜Ｅ４１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【００５１】
Ｅ４６）前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、運動ニューロンの生存を促進することができる、Ｅ３２〜Ｅ４５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【００５２】
Ｅ４７）前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、運動ニューロンの軸索成長を促進することができる、Ｅ３２〜Ｅ４５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【００５３】
Ｅ４８）Ｅ１〜Ｅ３１のいずれか一項に記載の結合分子をコードする、ポリヌクレオチド。
【００５４】
Ｅ４９）Ｅ３２〜Ｅ４８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【００５５】
Ｅ５０）ＶＨをコードする核酸を含むポリヌクレオチドと、ＶＬをコードする核酸を含むポリヌクレオチドとを含む組成物であって、該ＶＨおよび該ＶＬが、Ｃ０９のＶＨおよびＶＬと少なくとも８５％、９０％もしくは９５％同一であるかまたはこれらと同一のアミノ酸配列を含む、組成物。
【００５６】
Ｅ５１）ＶＨをコードする核酸を含むポリヌクレオチドと、ＶＬをコードする核酸を含むポリヌクレオチドとを含む組成物であって、該ＶＨ  ＣＤＲ１〜３および該ＶＬ  ＣＤＲ１〜３が、Ｃ０９のＶＨ  ＣＤＲ１〜３およびＶＬ  ＣＤＲ１〜３である、組成物。
【００５７】
Ｅ５２）ＶＨをコードする核酸を含む該ポリヌクレオチドと、ＶＬをコードする核酸を含む該ポリヌクレオチドとが同じベクターの中にある、Ｅ５０またはＥ５１に記載の組成物。
【００５８】
Ｅ５３）ＶＨをコードする核酸を含む該ポリヌクレオチドと、ＶＬをコードする核酸を含む該ポリヌクレオチドとが異なるベクターの中にある、Ｅ５０またはＥ５１に記載の組成物。
【００５９】
Ｅ５４）前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、ＬＩＮＧＯ−２に特異的に結合することができる、Ｅ５０〜Ｅ５３のいずれか一項に記載の組成物。
【００６０】
Ｅ５５）該抗体またはその抗原結合断片が、Ｃ０９抗体と同じエピトープに特異的に結合することができる、Ｅ５４に記載の組成物。
【００６１】
Ｅ５６）前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、ＬＩＮＧＯ−２のＬＲＲドメインに結合することができる、Ｅ５０〜Ｅ５５のいずれか一項に記載の組成物。
【００６２】
Ｅ５７）前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、ＬＩＮＧＯ−２のＬＲＲ２〜ＬＲＲ７におけるエピトープに結合することができる、Ｅ５０〜Ｅ５５のいずれか一項に記載の組成物。
【００６３】
Ｅ５８）前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２のアミノ酸２８〜４０８または配列番号２のアミノ酸４１０〜５００のＬＩＮＧＯ−２領域に結合することができる、Ｅ５０〜Ｅ５５のいずれか一項に記載の組成物。
【００６４】
Ｅ５９）前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、ＬＩＮＧＯ−２のアミノ酸２０２〜３４３におけるエピトープに結合することができる、Ｅ５０〜Ｅ５５のいずれか一項に記載の組成物。
【００６５】
Ｅ６０）前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、ヒト、ラットおよびマウスＬＩＮＧＯ−２に結合することができる、Ｅ５０〜Ｅ５９のいずれか一項に記載の組成物。
【００６６】
Ｅ６１）前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、ヒトおよびラットＬＩＮＧＯ−２に結合することができる、Ｅ５０〜Ｅ５９のいずれか一項に記載の組成物。
【００６７】
Ｅ６２）前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、ヒトおよびマウスＬＩＮＧＯ−２に結合することができる、Ｅ５０〜Ｅ５９のいずれか一項に記載の組成物。
【００６８】
Ｅ６３）前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、ヒトＬＩＮＧＯ−２に結合することができる、Ｅ５０〜Ｅ５９のいずれか一項に記載の組成物。
【００６９】
Ｅ６４）前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、運動ニューロンの生存を促進することができる、Ｅ５０〜Ｅ６３のいずれか一項に記載の組成物。
【００７０】
Ｅ６５）前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、運動ニューロンの軸索成長を促進することができる、Ｅ５０〜Ｅ６３のいずれか一項に記載の組成物。
【００７１】
Ｅ６６）Ｅ３２〜Ｅ４７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド。
【００７２】
Ｅ６７）ＶＨポリペプチドと、ＶＬポリペプチドとを含む組成物であって、該ＶＨおよび該ＶＬが、Ｃ０９のＶＨおよびＶＬと少なくとも８５％、９０％もしくは９５％同一であるかまたはこれらと同一のアミノ酸配列を含む、組成物。
【００７３】
Ｅ６８）ＶＨポリペプチドと、ＶＬポリペプチドとを含む組成物であって、該ＶＨ  ＣＤＲ１〜３および該ＶＬ  ＣＤＲ１〜３が、Ｃ０９のＶＨ  ＣＤＲ１〜３およびＶＬ  ＣＤＲ１〜３である、組成物。
【００７４】
Ｅ６９）前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、ＬＩＮＧＯ−２に特異的に結合することができる、Ｅ６７またはＥ６８に記載の組成物。
【００７５】
Ｅ７０）該抗体またはその抗原結合断片が、Ｃ０９抗体と同じエピトープに特異的に結合することができる、Ｅ６９に記載の組成物。
【００７６】
Ｅ７１）前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、ＬＩＮＧＯ−２のＬＲＲドメインに結合することができる、Ｅ６７〜Ｅ７０のいずれか一項に記載の組成物。
【００７７】
Ｅ７２）前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、ＬＩＮＧＯ−２のＬＲＲ７〜ＬＲＲ１２におけるエピトープに結合することができる、Ｅ６７〜Ｅ７０のいずれか一項に記載の組成物。
【００７８】
Ｅ７３）前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２のアミノ酸２８〜４０８または配列番号２のアミノ酸４１０〜５００のＬＩＮＧＯ−２領域に結合することができる、Ｅ６７〜Ｅ７０のいずれか一項に記載の組成物。
【００７９】
Ｅ７４）前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、ＬＩＮＧＯ−２のアミノ酸２０２〜３４３におけるエピトープに結合することができる、Ｅ６７〜Ｅ７０のいずれか一項に記載の組成物。
【００８０】
Ｅ７５）前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、ヒト、ラットおよびマウスＬＩＮＧＯ−２に結合することができる、Ｅ６７〜Ｅ７４のいずれか一項に記載の組成物。
【００８１】
Ｅ７６）前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、ヒトおよびラットＬＩＮＧＯ−２に結合することができる、Ｅ６７〜Ｅ７４のいずれか一項に記載の組成物。
【００８２】
Ｅ７７）前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、ヒトおよびマウスＬＩＮＧＯ−２に結合することができる、Ｅ６７〜Ｅ７４のいずれか一項に記載の組成物。
【００８３】
Ｅ７８）前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、ヒトＬＩＮＧＯ−２に結合することができる、Ｅ６７〜Ｅ７４のいずれか一項に記載の組成物。
【００８４】
Ｅ７９）前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、運動ニューロンの生存を促進することができる、Ｅ６７〜Ｅ７８のいずれか一項に記載の組成物。
【００８５】
Ｅ８０）前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、運動ニューロンの軸索成長を促進することができる、Ｅ６７〜Ｅ７８のいずれか一項に記載の組成物。
【００８６】
Ｅ８１）Ｅ３２〜Ｅ４８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、Ｅ４９に記載のベクター、Ｅ５０〜Ｅ６５もしくはＥ６７〜Ｅ８０のいずれか一項に記載の組成物、またはＥ６６に記載のポリペプチドを含む、宿主細胞。
【００８７】
Ｅ８２）抗ＬＩＮＧＯ−２結合分子を生産する方法であって、Ｅ８１に記載の宿主細胞を培養すること、および前記結合分子を回収することを含む、方法。
【００８８】
Ｅ８３）Ｅ８２に記載の方法によって生産される、抗ＬＩＮＧＯ−２結合分子。
【００８９】
Ｅ８４）試料におけるＬＩＮＧＯ−２発現を検出するための方法であって、（ａ）前記試料と、Ｅ１〜Ｅ３１またはＥ８３のいずれか一項に記載の結合分子とを接触させること、および（ｂ）前記試料における前記結合分子の結合を検出することを含む、方法。
【００９０】
Ｅ８５）（ａ）Ｅ１〜Ｅ３１もしくはＥ８３のいずれか一項に記載の結合分子、Ｅ３２〜Ｅ４８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、Ｅ４９に記載のベクター、Ｅ５０〜Ｅ６５もしくはＥ６７〜Ｅ８０のいずれか一項に記載の組成物、Ｅ６６に記載のポリペプチド、またはＥ８１に記載の宿主細胞、および（ｂ）担体を含む、医薬組成物。
【００９１】
Ｅ８６）配列番号２のポリペプチドまたはその変異体の可溶性断片をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸であって、前記ポリペプチドが運動ニューロンの生存を促進することができる、単離された核酸。
【００９２】
Ｅ８７）配列番号２のポリペプチドまたはその変異体の可溶性断片をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸であって、前記ポリペプチドが運動ニューロンの軸索成長の阻害の低減の生存を促進することができる、単離された核酸。
【００９３】
Ｅ８８）配列番号２のアミノ酸１〜５００からなる群より選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、Ｅ８６またはＥ８７に記載の核酸。
【００９４】
Ｅ８９）該ポリペプチドが、前記参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、Ｅ８８に記載の核酸。
【００９５】
Ｅ９０）該ポリペプチドが、前記参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、Ｅ８８に記載の核酸。
【００９６】
Ｅ９１）前記ポリペプチドに融合された異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、Ｅ８６〜Ｅ９０のいずれか一項に記載の核酸。
【００９７】
Ｅ９２）前記異種ポリペプチドが、免疫グロブリン、血清アルブミン、標的化ポリペプチド、レポーターポリペプチド、精製促進ポリペプチド、前記ポリペプチドのいずれかの断片、および前記ポリペプチドまたは断片の２つ以上の組み合わせからなる群より選択される、Ｅ９１に記載の核酸。
【００９８】
Ｅ９３）前記異種ポリペプチドが、免疫グロブリンＦｃ、ヒト血清アルブミンまたはその断片、ヒスチジンタグ、および運動ニューロン糖タンパク質またはその断片からなる群より選択される、Ｅ９２に記載の核酸。
【００９９】
Ｅ９４）薬学的に許容され得る担体と、Ｅ８６〜Ｅ９３のいずれか一項に記載の核酸とを含む、組成物。
【０１００】
Ｅ９５）Ｅ８６〜Ｅ９３のいずれか一項に記載の核酸を含む、ベクター。
【０１０１】
Ｅ９６）前記核酸が発現制御配列に作動可能に連結されている、Ｅ９５に記載のベクター。
【０１０２】
Ｅ９７）前記ベクターがウイルスベクターである、Ｅ９６に記載のベクター。
【０１０３】
Ｅ９８）前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタインバーウイルスベクター、パポーバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターからなる群より選択される、Ｅ９７に記載のベクター。
【０１０４】
Ｅ９９）Ｅ８６〜Ｅ９３のいずれか一項に記載の核酸、またはＥ９５〜Ｅ９８のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【０１０５】
Ｅ１００）前記ポリペプチドを発現する、Ｅ９９に記載の宿主細胞。
【０１０６】
Ｅ１０１）Ｅ８６〜Ｅ９３のいずれか一項に記載の核酸によってコードされる、単離されたポリペプチド。
【０１０７】
Ｅ１０２）合成的に生産される、Ｅ１０１に記載のポリペプチド。
【０１０８】
Ｅ１０３）ポリマーにコンジュゲートされている、Ｅ１０１またはＥ１０２に記載のポリペプチド。
【０１０９】
Ｅ１０４）前記ポリマーが、ポリアルキレングリコール、糖ポリマーおよびポリペプチドからなる群より選択される、Ｅ１０３に記載のポリペプチド。
【０１１０】
Ｅ１０５）前記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、Ｅ１０４に記載のポリペプチド。
【０１１１】
Ｅ１０６）１個、２個、３個または４個のポリマーにコンジュゲートされている、Ｅ１０３〜Ｅ１０５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【０１１２】
Ｅ１０７）該ポリマーの総分子量が２０，０００Ｄａ〜４０，０００Ｄａである、Ｅ１０６に記載のポリペプチド。
【０１１３】
Ｅ１０８）Ｅ１０１またはＥ１０２に記載のポリペプチドに特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片であって、運動ニューロンの生存を促進することができる、抗体またはその抗原結合断片。
【０１１４】
Ｅ１０９）Ｅ１０１またはＥ１０２に記載のポリペプチドに特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片であって、運動ニューロンの軸索成長の阻害を低減することができる、抗体またはその抗原結合断片。
【０１１５】
Ｅ１１０）Ｅ１０１またはＥ１０２に記載のポリペプチドに特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片であって、オリゴデンドロサイト分化を促進することができる、抗体またはその抗原結合断片。
【０１１６】
Ｅ１１１）Ｅ１０１またはＥ１０２に記載のポリペプチドに特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片であって、髄鞘形成を促進することができる、抗体またはその抗原結合断片。
【０１１７】
Ｅ１１２）Ｅ１０１またはＥ１０２に記載のポリペプチドに特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片であって、ＡＫＴリン酸化を促進することができる、抗体またはその抗原結合断片。
【０１１８】
Ｅ１１３）Ｅ１０１またはＥ１０２に記載のポリペプチドに特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片であって、ＬＩＮＧＯ−２のＬＲＲドメインに対する、抗体またはその抗原結合断片。
【０１１９】
Ｅ１１４）Ｅ１０１またはＥ１０２に記載のポリペプチドに特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号２のアミノ酸２０２〜３４３におけるエピトープに対する、抗体またはその抗原結合断片。
【０１２０】
Ｅ１１５）Ｅ１０１またはＥ１０２に記載のポリペプチドに特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号２のアミノ酸２８〜４０８または配列番号２のアミノ酸４１０〜５００のＬＩＮＧＯ−２領域に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
【０１２１】
Ｅ１１６）Ｅ１０１またはＥ１０２に記載のポリペプチドに特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片であって、ＬＩＮＧＯ−２のＬＲＲＮＴまたはＬＲＲＣＴドメインに結合する、抗体またはその抗原結合断片。
【０１２２】
Ｅ１１７）Ｅ１０１またはＥ１０２に記載のポリペプチドに特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片であって、ＬＩＮＧＯ−２の免疫グロブリンドメインに結合する、抗体またはその抗原結合断片。
【０１２３】
Ｅ１１８）薬学的に許容され得る担体、Ｅ１０２〜Ｅ１０７のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、組成物。
【０１２４】
Ｅ１１９）薬学的に許容され得る担体、Ｅ９９またはＥ１００に記載の宿主細胞を含む、組成物。
【０１２５】
Ｅ１２０）運動ニューロンの生存を促進するための方法であって、前記運動ニューロンと、（ｉ）可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド；（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片；（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチド；（ｉｖ）ＬＩＮＧＯ−２アプタマー；および（ｖ）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストの２つ以上の組み合わせからなる群より選択されるＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを含む有効量の組成物とを接触させることを含む、方法。
【０１２６】
Ｅ１２１）運動ニューロンの軸索成長を促進するための方法であって、前記運動ニューロンと、（ｉ）可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド；（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片；（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチド；（ｉｖ）ＬＩＮＧＯ−２アプタマー；および（ｖ）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストの２つ以上の組み合わせからなる群より選択されるＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを含む組成物とを接触させることを含む、方法。
【０１２７】
Ｅ１２２）哺乳動物における運動ニューロンの生存を促進するための方法であって、（ｉ）可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド；（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片；（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチド；（ｉｖ）ＬＩＮＧＯ−２アプタマー；および（ｖ）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストの２つ以上の組み合わせからなる群より選択されるＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを含む有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法。
【０１２８】
Ｅ１２３）哺乳動物における運動ニューロンの軸索成長を促進するための方法であって、（ｉ）可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド；（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片；（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチド；（ｉｖ）ＬＩＮＧＯ−２アプタマー；および（ｖ）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストの２つ以上の組み合わせからなる群より選択されるＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを含む有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法。
【０１２９】
Ｅ１２４）哺乳動物における運動ニューロンの生存に関連する疾患、障害または傷害を処置するための方法であって、（ｉ）可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド；（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片；（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチド；（ｉｖ）ＬＩＮＧＯ−２アプタマー；および（ｖ）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストの２つ以上の組み合わせからなる群より選択されるＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを含む治療有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法。
【０１３０】
Ｅ１２５）哺乳動物における運動ニューロンの軸索成長に関連する疾患、障害または傷害を処置するための方法であって、（ｉ）可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド；（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片；（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチド；（ｉｖ）ＬＩＮＧＯ−２アプタマー；および（ｖ）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストの２つ以上の組み合わせからなる群より選択されるＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを含む治療有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法。
【０１３１】
Ｅ１２６）哺乳動物におけるオリゴデンドロサイトの死または分化の欠如に関連する疾患、障害または傷害を処置するための方法であって、（ｉ）可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド；（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片；（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチド；（ｉｖ）ＬＩＮＧＯ−２アプタマー；および（ｖ）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストの２つ以上の組み合わせからなる群より選択されるＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを含む治療有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法。
【０１３２】
Ｅ１２７）哺乳動物における脱髄（ｄｅｍｙｌｉｎａｔｉｏｎ）に関連する疾患、障害または傷害を処置するための方法であって、（ｉ）可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド；（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片；（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチド；（ｉｖ）ＬＩＮＧＯ−２アプタマー；および（ｖ）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストの２つ以上の組み合わせからなる群より選択されるＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを含む治療有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法。
【０１３３】
Ｅ１２８）哺乳動物における髄鞘形成不全に関連する疾患、障害または傷害を処置するための方法であって、（ｉ）可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド；（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片；（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチド；（ｉｖ）ＬＩＮＧＯ−２アプタマー；および（ｖ）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストの２つ以上の組み合わせからなる群より選択されるＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを含む治療有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法。
【０１３４】
Ｅ１２９）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストが可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドである、Ｅ１２０〜Ｅ１２８のいずれか一項に記載の方法。
【０１３５】
Ｅ１３０）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストが、Ｅ１０２〜Ｅ１０７のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、Ｅ１２９に記載の方法。
【０１３６】
Ｅ１３１）前記可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドが、（ｉ）ＬＩＮＧＯ−２のＩｇドメインまたはその断片、変異体もしくは誘導体、（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２のＬＲＲドメインまたはその断片、変異体もしくは誘導体、および（ｉｉｉ）前記ＬＩＮＧＯ−２ドメインまたはその断片、変異体もしくは誘導体の組み合わせからなる群より選択されるＬＩＮＧＯ−２領域を含む、Ｅ１２９に記載の方法。
【０１３７】
Ｅ１３２）前記可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドが、（ｉ）ＬＩＮＧＯ−２の膜貫通ドメインまたはその断片、変異体もしくは誘導体、（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２の細胞内ドメインまたはその断片、変異体もしくは誘導体、および（ｉｉｉ）前記ＬＩＮＧＯ−２ドメインまたはその断片、変異体もしくは誘導体の組み合わせからなる群より選択されるＬＩＮＧＯ−２領域を欠く、Ｅ１３０またはＥ１３１に記載の方法。
【０１３８】
Ｅ１３３）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストがＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片である、Ｅ１２０〜Ｅ１２８のいずれか一項に記載の方法。
【０１３９】
Ｅ１３４）前記ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片が、Ｅ１〜Ｅ２８およびＥ８０のいずれか一項に記載の結合分子である、Ｅ１３３に記載の方法。
【０１４０】
Ｅ１３５）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストがＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチドを含む、Ｅ１２０〜Ｅ１２８のいずれか一項に記載の方法。
【０１４１】
Ｅ１３６）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチドが、（ｉ）アンチセンスポリヌクレオチド；（ｉｉ）リボザイム；（ｉｉｉ）低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；および（ｉｖ）低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）からなる群より選択される、Ｅ１３５に記載の方法。
【０１４２】
Ｅ１３７）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストがＬＩＮＧＯ−２アプタマーを含む、Ｅ１２０〜Ｅ１２８のいずれか一項に記載の方法。
【０１４３】
Ｅ１３８）前記哺乳動物が、運動ニューロンに関する疾患、障害または傷害と診断されたものである、Ｅ１２２〜Ｅ１２７のいずれか一項に記載の方法。
【０１４４】
Ｅ１３９）前記疾患、障害または傷害が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）、Ｘ連鎖球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ；ケニー病）、進行性球麻痺、偽性球麻痺、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ポリオ後症候群（ＰＰＳ）、ハンチントン病、本態性振戦（ＥＴ）、運動ニューロン疾患、麻痺およびパーキンソン病からなる群より選択される、Ｅ１２４、Ｅ１２５またはＥ１３８のいずれか一項に記載の方法。
【０１４５】
Ｅ１４０）前記疾患、障害または傷害が筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）（ＡＬＳ）である、Ｅ１３９に記載の方法。
【０１４６】
Ｅ１４１）ボーラス注射または慢性注入によって、前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを投与する、Ｅ１２０〜Ｅ１４０のいずれか一項に記載の方法。
【０１４７】
Ｅ１４２）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを中枢神経系に直接投与する、Ｅ１２０〜Ｅ１４０のいずれか一項に記載の方法。
【０１４８】
Ｅ１４３）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを全身投与する、Ｅ１２０〜Ｅ１４０のいずれか一項に記載の方法。
【０１４９】
Ｅ１４４）（ａ）発現制御配列への作動可能な連結により前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドで前記運動ニューロンをトランスフェクトすること、および（ｂ）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを発現させることを含む、Ｅ１２０またはＥ１２１に記載の方法。
【０１５０】
Ｅ１４５）（ａ）発現制御配列への作動可能な連結により前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを前記哺乳動物に投与すること、および（ｂ）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを発現させることを含む、Ｅ１２２〜Ｅ１４３のいずれか一項に記載の方法。
【０１５１】
Ｅ１４６）発現ベクターとして前記ポリヌクレオチドを投与する、Ｅ１４５に記載の方法。
【０１５２】
Ｅ１４６）前記発現ベクターがウイルスベクターである、Ｅ１４５に記載の方法。
【０１５３】
Ｅ１４７）該ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、パポーバウイルスベクターおよびポックスウイルスベクターからなる群より選択される、Ｅ１４６に記載の方法。
【０１５４】
Ｅ１４８）前記投与が、（ａ）前記ポリヌクレオチドを含む培養宿主細胞であって、前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを発現する培養宿主細胞を提供すること；および（ｂ）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストが前記哺乳動物で発現されるように、前記培養宿主細胞を前記哺乳動物に導入することを含む、Ｅ１４５〜Ｅ１４７のいずれか一項に記載の方法。
【０１５５】
Ｅ１４９）前記培養宿主細胞が、処置するべき哺乳動物に由来する、Ｅ１４８に記載の方法。
【０１５６】
Ｅ１５０）局所投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与および皮下投与からなる群より選択される経路によって、前記ベクターを投与する、Ｅ１４６〜Ｅ１４９のいずれか一項に記載の方法。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ＬＩＮＧＯ−２に特異的に結合することができる単離された抗体またはその抗原結合断片であって、運動ニューロンの生存を促進することができる、単離された抗体またはその抗原結合断片。
（項目２）
配列番号２のポリペプチドまたはその変異体の可溶性断片をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸であって、前記ポリペプチドが運動ニューロンの生存を促進することができる、単離された核酸。
（項目３）
配列番号２のポリペプチドまたはその変異体の可溶性断片をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸であって、前記ポリペプチドが運動ニューロンの軸索成長の阻害の低減の生存を促進することができる、単離された核酸。
（項目４）
配列番号２のアミノ酸１〜５００からなる群より選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、項目２または３に記載の核酸。
（項目５）
該ポリペプチドが、前記参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、項目３に記載の核酸。
（項目６）
該ポリペプチドが、前記参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、項目４に記載の核酸。
（項目７）
前記ポリペプチドに融合された異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目２〜６のいずれか一項に記載の核酸。
（項目８）
前記異種ポリペプチドが、免疫グロブリン、血清アルブミン、標的化ポリペプチド、レポーターポリペプチド、精製促進ポリペプチド、前記ポリペプチドのいずれかの断片、および前記ポリペプチドまたは断片の２つ以上の組み合わせからなる群より選択される、項目７に記載の核酸。
（項目９）
前記異種ポリペプチドが、免疫グロブリンＦｃ、ヒト血清アルブミンまたはその断片、ヒスチジンタグ、および運動ニューロン糖タンパク質またはその断片からなる群より選択される、項目８に記載の核酸。
（項目１０）
薬学的に許容され得る担体と、項目２〜９のいずれか一項に記載の核酸とを含む、組成物。
（項目１１）
項目２〜９のいずれか一項に記載の核酸を含む、ベクター。
（項目１２）
前記核酸が発現制御配列に作動可能に連結されている、項目１１に記載のベクター。
（項目１３）
前記ベクターがウイルスベクターである、項目１２に記載のベクター。
（項目１４）
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタインバーウイルスベクター、パポーバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターからなる群より選択される、項目１３に記載のベクター。
（項目１５）
項目２〜９のいずれか一項に記載の核酸、または項目１１〜１４のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目１６）
前記ポリペプチドを発現する、項目１５に記載の宿主細胞。
（項目１７）
項目２〜９のいずれか一項に記載の核酸によってコードされる、単離されたポリペプチド。
（項目１８）
合成的に生産される、項目１７に記載のポリペプチド。
（項目１９）
ポリマーにコンジュゲートされている、項目１７または１８に記載のポリペプチド。
（項目２０）
前記ポリマーが、ポリアルキレングリコール、糖ポリマーおよびポリペプチドからなる群より選択される、項目１９に記載のポリペプチド。
（項目２１）
前記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、項目２０に記載のポリペプチド。
（項目２２）
１個、２個、３個または４個のポリマーにコンジュゲートされている、項目１９〜２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目２３）
該ポリマーの総分子量が２０，０００Ｄａ〜４０，０００Ｄａである、項目２２に記載のポリペプチド。
（項目２４）
項目１７または１８に記載のポリペプチドに特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片であって、運動ニューロンの生存を促進することができる、抗体または抗体結合断片。
（項目２５）
項目１７または１８に記載のポリペプチドに特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片であって、運動ニューロンの軸索成長の阻害を低減することができる、抗体または抗体結合断片。
（項目２６）
薬学的に許容され得る担体、項目１７〜２３のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、組成物。
（項目２７）
薬学的に許容され得る担体、項目１５または１６に記載の宿主細胞を含む、組成物。
（項目２８）
運動ニューロンの生存を促進するための方法であって、前記運動ニューロンと、
（ｉ）可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド；
（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片；
（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチド；
（ｉｖ）ＬＩＮＧＯ−２アプタマー；および
（ｖ）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストののうちの２つ以上の組み合わせ
からなる群より選択されるＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを含む有効量の組成物とを接触させることを含む、方法。
（項目２９）
運動ニューロンの軸索成長を促進するための方法であって、前記運動ニューロンと、
（ｉ）可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド；
（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片；
（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチド；
（ｉｖ）ＬＩＮＧＯ−２アプタマー；および
（ｖ）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストの２つ以上の組み合わせ
からなる群より選択されるＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを含む組成物とを接触させることを含む、方法。
（項目３０）
哺乳動物における運動ニューロンの生存を促進するための方法であって、
（ｉ）可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド；
（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片；
（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチド；
（ｉｖ）ＬＩＮＧＯ−２アプタマー；および
（ｖ）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストのうちの２つ以上の組み合わせ
からなる群より選択されるＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを含む有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法。
（項目３１）
哺乳動物における運動ニューロンの軸索成長を促進するための方法であって、
（ｉ）可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド；
（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片；
（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチド；
（ｉｖ）ＬＩＮＧＯ−２アプタマー；および
（ｖ）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストのうちの２つ以上の組み合わせ
からなる群より選択されるＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを含む有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法。
（項目３２）
哺乳動物における運動ニューロンの生存に関連する疾患、障害または傷害を処置するための方法であって、
（ｉ）可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド；
（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片；
（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチド；
（ｉｖ）ＬＩＮＧＯ−２アプタマー；および
（ｖ）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストのうちの２つ以上の組み合わせ
からなる群より選択されるＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを含む治療有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法。
（項目３３）
哺乳動物における運動ニューロンの軸索成長に関連する疾患、障害または傷害を処置するための方法であって、
（ｉ）可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド；
（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片；
（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチド；
（ｉｖ）ＬＩＮＧＯ−２アプタマー；および
（ｖ）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストのうちの２つ以上の組み合わせ
からなる群より選択されるＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを含む治療有効量の組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法。
（項目３４）
前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストが可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドである、項目２８〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストが、項目１７〜２３のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドが、
（ｉ）ＬＩＮＧＯ−２のＩｇドメインまたはその断片、変異体もしくは誘導体、
（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２のＬＲＲドメインまたはその断片、変異体もしくは誘導体、および
（ｉｉｉ）前記ＬＩＮＧＯ−２ドメインまたはその断片、変異体もしくは誘導体の組み合わせ
からなる群より選択されるＬＩＮＧＯ−２領域を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドが、
（ｉ）ＬＩＮＧＯ−２の膜貫通ドメインまたはその断片、変異体もしくは誘導体、
（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−２の細胞内ドメインまたはその断片、変異体もしくは誘導体、および
（ｉｉｉ）前記ＬＩＮＧＯ−２ドメインまたはその断片、変異体もしくは誘導体の組み合わせ
からなる群より選択されるＬＩＮＧＯ−２領域を欠く、項目３５または項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストがＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片である、項目２８〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片が、項目１に記載の抗体またはその抗原結合断片である、項目１１９に記載の方法。
（項目４０）
前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストがＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチドを含む、項目２８〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチドが、
（ｉ）アンチセンスポリヌクレオチド；
（ｉｉ）リボザイム；
（ｉｉｉ）低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；および
（ｉｖ）低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）
からなる群より選択される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストがＬＩＮＧＯ−２アプタマーを含む、項目２８〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記哺乳動物が、運動ニューロンに関する疾患、障害または傷害と診断されたものである、項目３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記疾患、障害または傷害が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）、Ｘ連鎖球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ；ケニー病）、進行性球麻痺、偽性球麻痺、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ポリオ後症候群（ＰＰＳ）、ハンチントン病、本態性振戦（ＥＴ）、運動ニューロン疾患、麻痺およびパーキンソン病からなる群より選択される、項目３２、３３および４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記疾患、障害または傷害が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
ボーラス注射または慢性注入によって、前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを投与する、項目２８〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを中枢神経系に直接投与する、項目２８〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを全身投与する、項目２８〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
（ａ）発現制御配列への作動可能な連結により前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドで前記運動ニューロンをトランスフェクトすること、および（ｂ）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを発現させることを含む、項目２８または２９に記載の方法。
（項目５０）
（ａ）発現制御配列への作動可能な連結により前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを前記哺乳動物に投与すること、および（ｂ）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを発現させることを含む、項目３０〜４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
発現ベクターとして前記ポリヌクレオチドを投与する、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記発現ベクターがウイルスベクターである、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
該ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、パポーバウイルスベクターおよびポックスウイルスベクターからなる群より選択される、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記投与が、（ａ）前記ポリヌクレオチドを含む培養宿主細胞であって、前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを発現する培養宿主細胞を提供すること；および（ｂ）前記ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストが前記哺乳動物で発現されるように、前記培養宿主細胞を前記哺乳動物に導入することを含む、項目５０〜５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記培養宿主細胞が、処置するべき哺乳動物に由来する、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
局所投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与および皮下投与からなる群より選択される経路によって、前記ベクターを投与する、項目５１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】ラット組織のＱ−ＰＣＲ。ＬＩＮＧＯ−２は、成体ラット脳組織で高発現している。Ｑ−ＰＣＲによって、ＬＩＮＧＯ−２のｍＲＮＡ発現の定量を行った。
【０１５８】
【図２】Ｐ６マウス組織のＱ−ＰＣＲ。ＬＩＮＧＯ−２は、生後６日（Ｐ６）マウス脳および脊髄組織で高発現している。Ｑ−ＰＣＲによって、ＬＩＮＧＯ−２のｍＲＮＡ発現の定量を行った。
【０１５９】
【図３】ラット神経細胞集団のＱ−ＰＣＲ。ＬＩＮＧＯ−２は、皮質ニューロンおよび後根神経節（ＤＲＧ）で高発現している。Ｑ−ＰＣＲによって、ＬＩＮＧＯ−２のｍＲＮＡ発現の定量を行った。
【０１６０】
【図４】ＬＩＮＧＯ−２−Ｆｃおよび抗ＬＩＮＧＯ−２抗体は、運動ニューロンの生存を促進する。ヒト運動ニューロンを亜ヒ酸ナトリウムで３０分間処理し、ヒトＩｇＧ（対照）、可溶性ＬＩＮＧＯ−２−Ｆｃまたは抗ＬＩＮＧＯ−２抗体Ｃ０９  Ｆａｂのいずれかの存在下で回復させた。インキュベーション後、抗βＩＩＩチューブリンおよび抗神経フィラメントによる免疫細胞化学によって、運動ニューロンを染色した。
【０１６１】
【図５】ＬＩＮＧＯ−２−Ｆｃは、運動ニューロンの軸索成長を促進する。Ｎｙｃｏｄｅｎｚ勾配遠心分離によって、胎生期１６日（Ｅ１６）ラット脊髄由来の運動ニューロンを単離した。単離した運動ニューロンを亜ヒ酸ナトリウムで３０分間処理し、ヒトＩｇＧまたは可溶性ＬＩＮＧＯ−２−Ｆｃのいずれかの存在下で回復させた。インキュベーション後、抗神経フィラメントによる免疫細胞化学によって、運動ニューロンを染色した。
【０１６２】
【図６】ＬＩＮＧＯ−２発現レベルは、ＳＯＤＧ９３Ａマウスでアップレギュレートしている。インサイチューハイブリダイゼーションを使用して、６５日齢の野生型およびＳＯＤＧ９３ＡマウスにおけるＬＩＮＧＯ−２  ＲＮＡレベルを測定した。各種マウス由来の前角領域におけるＬＩＮＧＯ−２陽性細胞の数を計数した。グラフは、ＬＩＮＧＯ−２陽性細胞の数（左）およびＬＩＮＧＯ−２陽性細胞の割合（右）を示す。
【０１６３】
【図７】抗ＬＩＮＧＯ−２抗体は、ＡＫＴリン酸化をアップレギュレートする。対照試料、および抗ＬＩＮＧＯ−２抗体Ｃ０９または対照抗体で処理した試料において、ウエスタンブロットによってＡＫＴリン酸化のレベルを測定した。
【０１６４】
【図８】抗ＬＩＮＧＯ−２抗体は、オリゴデンドロサイト分化を促進する。対照試料、および１、３または１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ＬＩＮＧＯ−２抗体Ｃ０９で処理した試料において、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）およびミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のレベルを測定した。
【発明を実施するための形態】
【０１６５】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されているのと同一の意味を有する。矛盾する場合は、該定義を含む本出願が優先される。文脈によって別段の必要がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および他の参考文献は、個々の各刊行物または特許出願が、参照により組み込まれるものとして具体的および個別に示されるかのように、あらゆる目的のためにそれら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６６】
本明細書に記載されるものに類似または同等の方法および材料を、本発明の実践または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。材料、方法、および実施例は単なる例証であり、限定することを意図しない。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるだろう。
【０１６７】
本発明をさらに定義するために、以下の用語および定義を提供する。
【０１６８】
用語「１つ（ａまたはａｎ）の」実体は、その実体の１つ以上を指すことに留意するべきである。例えば、「１つの免疫グロブリン分子」は、１つ以上の免疫グロブリン分子を表すと理解するべきである。したがって、用語「１つ（ａまたはａｎ）」、「１つ以上の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」および「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」は、本明細書で互換的に使用することができる。
【０１６９】
用語「ポリヌクレオチド」は、単数の核酸および複数の核酸を包含することを意図し、単離された核酸分子または構築物、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、在来型のホスホジエステル結合または非在来型の結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるアミド結合）を含み得る。用語「核酸」は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１つ以上の核酸セグメント、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドは、その天然の環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えば、抗ＬＩＮＧＯ−２結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片をコードする組換えポリヌクレオチドであって、ベクターに含まれる組換えポリヌクレオチドは、単離されたとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞中に維持されている組換えポリヌクレオチドまたは（部分的または実質的に）精製されたポリヌクレオチドの溶液が挙げられる。単離されたＲＮＡ分子としては、ポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写産物が挙げられる。単離されたポリヌクレオチドまたは核酸としてはさらに、合成的に生産されたこのような分子が挙げられる。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位または転写ターミネーターなどの調節要素であり得るか、またはこれを含み得る。ポリヌクレオチドは、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖またはより典型的には二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得る。加えて、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成され得る。ポリヌクレオチドはまた、１つ以上の修飾塩基、または安定性もしくは他の理由により修飾されたＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含有し得る。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化塩基および異常塩基、例えばイノシンが挙げられる。様々な修飾をＤＮＡおよびＲＮＡに行うことができる。したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態を包含する。
【０１７０】
本明細書で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないがコード領域の一部とみなすことができ、しかし、任意のフランキング配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどは、コード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域は、単一のポリヌクレオチド構築物、例えば単一のベクター上に、または別々のポリヌクレオチド構築物、例えば別々の（異なる）ベクター上に存在できる。さらに、任意のベクターは単一のコード領域を含有し得るか、または２つ以上のコード領域を含み得、例えば、単一のベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードし得る。さらに、ベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、抗ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニスト、例えば抗体またはその断片、変異体もしくは誘導体をコードする核酸に融合されているかまたは融合されていない異種コード領域をコードし得る。異種コード領域としては、限定されないが、分泌シグナルペプチドまたは異種機能性ドメインなどの特殊な要素またはモチーフが挙げられる。
【０１７１】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、１つ以上のコード領域に作動可能に結合されたプロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳制御要素を含み得る。作動可能な結合は、遺伝子産物の発現を調節配列の影響または制御下に置くように、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコード領域が１つ以上の調節配列に結合する場合である。２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域およびそれに結合したプロモーター）は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、および２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、発現調節配列が遺伝子産物の発現を指令する能力を妨害しないかまたはＤＮＡ鋳型が転写される能力を妨害しない場合、「作動可能に結合」している。したがって、プロモーター領域は、プロモーターが核酸の転写をもたらすことができる場合、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合している。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指令する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーター以外の他の転写制御要素、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサーおよび転写終結シグナルは、ポリヌクレオチドに作動可能に結合して、細胞特異的転写を指令することができる。適切なプロモーターおよび他の転写制御領域は、本明細書に開示される。
【０１７２】
様々な転写制御領域が当業者に公知である。これらとしては、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば限定されないが、サイトメガロウイルス（イントロンＡを伴う最初期プロモーター）、サルウイルス４０（初期プロモーター）およびレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメントが挙げられる。他の転写制御領域としては、脊椎動物遺伝子由来のもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβグロビン、ならびに真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列が挙げられる。さらなる適切な転写制御領域としては、組織特異的プロモーターおよびエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）が挙げられる。
【０１７３】
同様に、様々な翻訳制御要素が当業者に公知である。これらとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始および終結コドン、ならびにピコルナウイルス由来の要素（特に、配列内リボソーム進入部位またはＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも称される）が挙げられる。
【０１７４】
他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。
【０１７５】
ポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指令する分泌またはシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域に結合され得る。シグナルの仮説によると、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、成長中のタンパク質鎖が粗面小胞体を通って輸送され始めると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者であれば、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、一般に、ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有し、これが完全または「全長」ポリペプチドから切断されて分泌または「成熟」形態のポリペプチドを生成することを理解している。ある特定の実施形態では、天然シグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖シグナルペプチド、または作動可能に結合されたポリペプチドの分泌を指令する能力を保持するその配列の機能的誘導体を使用する。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチドまたはその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換することができる。
【０１７６】
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」を包含することを意図し、アミド結合（ペプチド結合としても公知である）によって直鎖状に連結されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の任意の１つ以上の鎖を指し、特定の長さの産物を指さない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２つ以上のアミノ酸の１つ以上の鎖を指すのに使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義の中に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりにまたは互換的に使用することができる。用語「ポリペプチド」はまた、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断または天然に存在しないアミノ酸による修飾を含むポリペプチドの発現後修飾の産物を指すこと意図する。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来し得るか、または組換え技術によって生産することができるが、指定の核酸配列から翻訳される必要はない。化学合成を含む任意の方法でそれを作製することができる。
【０１７７】
ポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１，０００以上または２，０００以上のアミノ酸のサイズのものであり得る。ポリペプチドは、規定の三次元構造を有し得るが、このような構造を有する必要はない。規定の三次元構造を有するポリペプチドはフォールディングされたと称され、規定の三次元構造を有さず多数の異なる立体構造を採用することができるポリペプチドは、フォールディングされていないと称される。本明細書で使用される場合、用語「糖タンパク質」は、少なくとも１つの炭水化物部分（これは、アミノ酸残基、例えばセリン残基またはアスパラギン残基の酸素含有または窒素含有側鎖を介してタンパク質に結合する）にカップリングしたタンパク質を指す。
【０１７８】
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、変異体もしくは誘導体は、その自然環境にないポリペプチドを意図する。特定のレベルの精製は必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然または自然の環境から取り出すことができる。宿主細胞中で発現された組換え生産ポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドと同様に、単離されたとみなされる。
【０１７９】
ポリペプチドは、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によって互いに結合したアミノ酸、すなわちペプチドアイソスターから構成され得、遺伝子によってコードされる２０種のアミノ酸以外のアミノ酸（例えば、天然に存在しないアミノ酸）を含有し得る。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングなどの自然過程または当技術分野で周知の化学修飾技術のいずれかによって、修飾することができる。
【０１８０】
用語「断片」、「変異体」、「誘導体」および「類似体」は、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストについて言及する場合、運動ニューロンの生存を促進する任意のアンタゴニスト分子を含む。これらの用語はまた、運動ニューロンの軸索成長を促進する任意のアンタゴニスト分子を含む。可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドは、ＬＩＮＧＯ−２のタンパク質分解断片、欠失断片、特に、動物に送達されるとより容易に作用部位に達する断片を含み得る。ポリペプチド断片は、線形および三次元エピトープを含む、天然ポリペプチドの抗原性または免疫原性エピトープを含むポリペプチドの任意の部分をさらに含む。可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドは、変異体ＬＩＮＧＯ−２領域（上記断片を含む）、およびさらにはアミノ酸置換、欠損、または挿入により改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み得る。変異体は、対立遺伝子変異体などの天然に存在するものであり得る。「対立遺伝子変異体」は、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占有する別の形態の遺伝子を意図する。Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５）。天然に存在しない変異体は、当技術分野で公知の突然変異誘発技術を使用して生産することができる。可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠損、または付加を含み得る。ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストはまた、誘導体分子を含み得る。例えば、可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドは、天然のポリペプチドに見られないさらなる機能を示すように改変されたＬＩＮＧＯ−２領域を含み得る。例としては、融合タンパク質およびタンパク質コンジュゲートが挙げられる。
【０１８１】
保存的置換としては、以下の群内での置換が挙げられる：バリン、アラニン、およびグリシン；ロイシン、バリン、およびイソロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリン、システイン、およびスレオニン；リシンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。非極性疎水性アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正電荷（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが挙げられる。負電荷（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。上記の極性、塩基性、または酸性基の１つのメンバーの、同じ群の別のメンバーによる任意の置換は、保存的置換とみなされ得る。
【０１８２】
非保存的置換としては、（ｉ）陽性電荷側鎖を有する残基（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ）が陰性電荷残基（例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）の代わりとなるもの、もしくはこれによって置換されるもの、（ｉｉ）親水性残基（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）が疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ）の代わりとなるもの、もしくはこれによって置換されるもの、（ｉｉｉ）システインもしくはプロリンが任意の他の残基の代わりとなるもの、もしくはこれによって置換されるもの、または（ｉｖ）巨大な疎水性または芳香族側鎖を有する残基（例えば、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、またはＴｒｐ）がより小さな側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ）を有するかもしくは側鎖を有しない（例えば、Ｇｌｙ）ものの代わりとなるもの、もしくはこれによって置換されるものが挙げられる。
【０１８３】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の用語「配列同一性パーセント」は、比較領域にわたって配列が共有する同一のマッチ位置の数であって、２つの配列の最適なアライメントのために導入しなければならない付加または欠失（すなわち、ギャップ）を考慮したものを指す。マッチ位置は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が標的および参照配列の両方に現れる任意の位置である。標的配列中に現れるギャップは、ヌクレオチドまたはアミノ酸ではないため計数されない。同様に、参照配列由来のヌクレオチドまたはアミノ酸でなく標的配列のヌクレオチドまたはアミノ酸が計数されるため、参照配列中に現れるギャップは計数されない。
【０１８４】
配列同一性の割合は、同一のアミノ酸残基または核酸塩基が両配列に存在する位置の数を決定してマッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較領域中の位置の総数で割り、その結果に１００を乗じて配列同一性の割合を求めることによって計算される。２つの配列間の配列の比較および配列同一性パーセントの決定は、オンライン使用およびダウンロードの両方について容易に入手可能なソフトウェアを使用して達成することができる。適切なソフトウェアプログラムは、タンパク質およびヌクレオチド配列の両方のアライメントについて、様々な供給源から入手可能である。配列同一性パーセントを決定するための１つの適切なプログラムはｂｌ２ｓｅｑであり、これは、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能なプログラムのＢＬＡＳＴパッケージソフトの一部である。ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して２つの配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するのに使用され、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するのに使用される。他の適切なプログラムは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒであり、これは、バイオインフォマティクスプログラムのＥＭＢＯＳＳパッケージソフトの一部であり、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＥＢＩ）、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａからも入手可能である。
【０１８５】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列とアライメントする単一ポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列内の異なる領域は、それら自体の配列同一性パーセントをそれぞれ有し得る。配列同一性パーセント値は、小数第２位で四捨五入されることに留意するべきである。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、および８０．１４は切り捨てて８０．１に四捨五入され、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、および８０．１９は切り上げて８０．２に四捨五入される。長さ値は常に整数であることにも留意するべきである。
【０１８６】
当業者であれば、配列同一性パーセントの計算のための配列アライメントの作成は、専ら一次配列データによって行われる配列−配列のバイナリ比較に限定されないことを認識するであろう。配列アライメントは、複数の配列アライメントから得られ得る。複数の配列アライメントを作成するための１つの適切なプログラムはＣｌｕｓｔａｌＷ２であり、ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇから入手可能である。別の適切なプログラムはＭＵＳＣＬＥであり、ｗｗｗ．ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｍｕｓｃｌｅ／から入手可能である。あるいは、ＣｌｕｓｔａｌＷ２およびＭＵＳＣＬＥは、例えば、ＥＢＩから入手可能である。
【０１８７】
配列アライメントは、配列データを異種源からのデータ、例えば、構造データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能データ（例えば、突然変異の位置）、または系統発生学的データと統合することによって作成することができるとも認識されよう。異種データを統合して複数の配列アライメントを作成するための適切なプログラムはＴ−Ｃｏｆｆｅｅであり、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇから入手可能であり、あるいは例えばＥＢＩから入手可能である。配列同一性パーセントを計算するのに使用される最終アライメントは、自動または手動のいずれかでキュレートすることができるとも認識されよう。
【０１８８】
用語「断片」、「変異体」、「誘導体」および「類似体」は、抗ＬＩＮＧＯ−２抗体または抗体ポリペプチドについて言及する場合、対応する抗体または抗体ポリペプチドの抗原結合特性の少なくとも一部を保持する任意のポリペプチドを含む。ポリペプチドの断片としては、本明細書の他の場所で論じる特異的抗体断片に加えて、タンパク質分解断片および欠失断片が挙げられる。別段の明記がない限り、本明細書で使用される場合、抗体に関する「その断片」は、免疫特異的断片、すなわち抗原特異的断片を指す。抗ＬＩＮＧＯ−２抗体および抗体ポリペプチドの変異体としては、上記断片、およびさらにはアミノ酸置換、欠失または挿入により改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。変異体は、天然に存在するものかまたは天然に存在しないものであり得る。変異体ポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。変異体ポリペプチドは、本明細書では「ポリペプチド類似体」とも称され得る。本明細書で使用される場合、抗ＬＩＮＧＯ−２抗体または抗体ポリペプチドの「誘導体」は、官能性側基の反応によって化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有する主題ポリペプチドを指す。「誘導体」として、２０種の標準アミノ酸の１つ以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドも挙げられる。例えば、４−ヒドロキシプロリンは、プロリンの代わりとなり得る；５−ヒドロキシリシンは、リシンの代わりとなり得る；３−メチルヒスチジンは、ヒスチジンの代わりとなり得る；ホモセリンは、セリンの代わりとなり得る；オルニチンは、リシンの代わりとなり得る；。抗ＬＩＮＧＯ−２抗体および抗体ポリペプチドの誘導体は、参照抗体または抗体ポリペプチドに見られないさらなる特徴を示すように改変されたポリペプチドを含み得る。
【０１８９】
「ポリペプチド断片」は、ポリペプチドの短いアミノ酸配列を指す。タンパク質断片は、「独立したもの」であり得るか、または該断片が領域の一部を形成するより大きいポリペプチド内に含まれ得る。ポリペプチド断片の代表的な例としては、例えば、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約６０アミノ酸、約７０アミノ酸、約８０アミノ酸、約９０アミノ酸、約１００アミノ酸、約２００アミノ酸、約３００アミノ酸、約４００アミノ酸、約５００アミノ酸、約６００アミノ酸および約１，０００アミノ酸長を含む断片が挙げられる。
【０１９０】
「結合分子」または「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。一実施形態では、結合分子は、ＬＩＮＧＯ−２、例えば全長ＬＩＮＧＯ−２または成熟ＬＩＮＧＯ−２に特異的に結合する。別の実施形態では、結合分子は、抗体またはその抗原結合断片である。
【０１９１】
抗ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片、変異体および誘導体が、本明細書に記載される。天然に存在する抗体などのフルサイズ抗体についての具体的な言及がない限り、用語「抗ＬＩＮＧＯ−２抗体」は、フルサイズ抗体およびこのような抗体の抗原結合断片、変異体、類似体または誘導体、例えば、天然に存在する抗体もしくは免疫グロブリン分子もしくは人工抗体分子、または抗体分子と同様に抗原に結合する断片を包含する。
【０１９２】
ある特定の実施形態では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。あるいは、例えば、飽和突然変異誘発によってコード配列の全部または一部に沿って突然変異をランダムに導入することができ、得られた突然変異体を生物学的活性についてスクリーニングして、活性（例えば、ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド、例えばヒト、霊長類、マウスまたはヒト、霊長類およびマウスの任意の組み合わせのＬＩＮＧＯ−２に結合する能力）を保持する突然変異体を同定することができる。「ヒト」または「完全ヒト」抗体のこのような変異体（またはその誘導体）は、「最適化された」または「抗原結合について最適化された」ヒトまたは完全ヒト抗体とも称され、抗原に対する改善された親和性を有する抗体を含む。
【０１９３】
一実施形態では、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、「抗体」もしくは「免疫グロブリン」分子またはその抗原結合断片、例えば、天然に存在する抗体もしくは免疫グロブリン分子もしくは人工抗体分子、または抗体分子と同様に抗原に結合する断片である。用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、本明細書で互換的に使用される。抗体または免疫グロブリンは、少なくとも重鎖の可変ドメインを含み、通常は少なくとも重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系の基本的な免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）を参照のこと。
【０１９４】
天然に存在する抗体において、各抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗体が水性環境でその三次元配置を取ると、特異的に配置されて抗原結合ドメインを形成するアミノ酸の短い非連続配列である。抗原結合ドメインにおけるアミノ酸の残りは、「フレームワーク」領域と称され、分子間の可変性をほとんど示さない。フレームワーク領域は主としてβシート立体構造を取り、ＣＤＲは、βシート構造を接続し、いくつかの場合ではβシート構造の一部を形成するループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性相互作用によってＣＤＲを正しい方向に配置する骨格を形成するように作用する。配置されたＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに対する表面相補性を規定する。この相補的な表面は、抗体のその同族エピトープに対する非共有結合を促進する。それぞれＣＤＲおよびフレームワーク領域を含むアミノ酸は正確に定義されているため、当業者であれば、任意の所定の重鎖または軽鎖可変領域を容易に同定することができる（”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｋａｂａｔ，Ｅら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ
Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）；およびＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）（これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【０１９５】
当技術分野で使用および／または承認されている用語の定義が２つ以上ある場合、本明細書で使用される用語の定義は、反対の明示がない限り、すべてのこのような意味を含むと意図される。具体例は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる非連続な抗原結合部位を説明するための用語「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の使用である。この特定の領域は、Ｋａｂａｔら、（１９８３）Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”およびＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）によって記載されおり、ここで、これらの定義は、互いに比較した場合にアミノ酸残基についてオーバーラップまたはサブセットを含む。それでもなお、抗体またはその変異体のＣＤＲを指すためにいずれかの定義を適用することは、本明細書で定義および使用される用語の範囲内であると意図される。上で引用した各参考文献によって定義した場合のＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表１に示す。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列およびサイズに応じて変化し得る。当業者であれば、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むかをルーチンに決定することができる。
【表１】
2019150055.tif 000002
【０１９６】
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列についての番号付けシステムを定義した。当業者であれば、配列それ自体以外のいかなる実験データにも依存することなく、この「Ｋａｂａｔ番号付け」システムを任意の可変ドメイン配列に一義的に割り当てることができる。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，”Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）に記載されている番号付けシステムを指す。別段の明記がない限り、ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体における特定のアミノ酸残基位置の番号付けについての言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う。
【０１９７】
一実施形態では、抗原結合分子は、参照抗体分子の少なくとも１つの重鎖または軽鎖ＣＤＲを含む。別の実施形態では、抗原結合分子は、１つ以上の参照抗体分子由来の少なくとも２つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、抗原結合分子は、１つ以上の参照抗体分子由来の少なくとも３つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、抗原結合分子は、１つ以上の参照抗体分子由来の少なくとも４つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、抗原結合分子は、１つ以上の参照抗体分子由来の少なくとも５つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、抗原結合分子は、１つ以上の参照抗体分子由来の少なくとも６つのＣＤＲを含む。ある特定の実施形態では、参照抗体分子はＣ０９である。主題抗原結合分子に含まれ得る少なくとも１つのＣＤＲを含む例示的な抗体分子は当技術分野で公知であり、例示的な分子が本明細書に記載される。
【０１９８】
天然に存在する抗体などのフルサイズ抗体についての具体的な言及がない限り、用語「抗ＬＩＮＧＯ−２抗体」は、フルサイズ抗体およびこのような抗体の抗原結合断片、変異体、類似体または誘導体、例えば、天然に存在する抗体もしくは免疫グロブリン分子もしくは人工抗体分子、または抗体分子と同様に抗原に結合する断片を包含する。
【０１９９】
抗体またはその抗原結合断片としては、限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異的、ヒト、ヒト化、霊長類化、またはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスフィルド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生される断片、ならびに抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示される結合分子に対する抗Ｉｄ抗体を含む）が挙げられる。ＳｃＦｖ分子は当技術分野で公知であり、例えば米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。免疫グロブリンまたは抗体分子は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスの免疫グロブリン分子であり得る。
【０２００】
一本鎖抗体を含む抗体断片は可変領域を単独で、またはヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの全部または一部と組み合わせて含み得る。可変領域と、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせも含む抗原結合断片も本明細書で提供される。抗体またはその抗原結合断片は、トリおよび哺乳動物を含む任意の動物起源由来のものであり得る。ある特定の実施形態では、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリの抗体である。別の実施形態では、可変領域は、（例えば、サメ由来の）コンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）起源であり得る。
【０２０１】
本明細書で使用される場合、用語「重鎖部分」は、免疫グロブリン重鎖由来のアミノ酸配列を含む。重鎖部分を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中央および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそれらの変異体もしくは断片の少なくとも１つを含む。例えば、結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインと、ヒンジドメインの少なくとも一部と、ＣＨ２ドメインとを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメインとを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインと、ヒンジドメインの少なくとも一部と、ＣＨ３ドメインとを含むポリペプチド鎖、またはＣＨ１ドメインと、ヒンジドメインの少なくとも一部と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含むポリペプチド鎖を含み得る。別の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、結合ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠き得る。上記のように、当業者であれば、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）は、天然に存在する免疫グロブリン分子由来のアミノ酸配列において異なるように修飾され得ることを理解するであろう。結合ポリペプチドの重鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子由来のＣＨ１ドメインと、ＩｇＧ３分子由来のヒンジ領域とを含み得る。別の例では、重鎖部分は、部分的にＩｇＧ１分子由来であり、部分的にＩｇＧ３分子由来のヒンジ領域を含み得る。別の例では、重鎖部分は、部分的にＩｇＧ１分子由来であり、部分的にＩｇＧ４分子由来のキメラヒンジを含み得る。
【０２０２】
本明細書で使用される場合、用語「軽鎖部分」は、免疫グロブリンの軽鎖由来のアミノ酸配列を含む。典型的には、軽鎖部分は、ＶＬまたはＣＬドメインの少なくとも１つを含む。
【０２０３】
本明細書に開示される抗ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、抗原のエピトープまたは一部、例えば、それらが認識または特異的に結合する本明細書に開示される標的ポリペプチド（例えば、全長または成熟ＬＩＮＧＯ−２）の点で記載または特定され得る。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的ポリペプチドの一部は、「エピトープ」または「抗原決定基」である。標的ポリペプチドは単一のエピトープを含み得るが、典型的には少なくとも２つのエピトープを含み、抗原のサイズ、立体構造および種類に応じて任意の数のエピトープを含み得る。さらに、標的ポリペプチド上の「エピトープ」は、非ポリペプチド要素であり得るかまたはこれを含み得、例えばエピトープは、炭水化物側鎖を含み得ることに留意するべきである。
【０２０４】
抗体に対するペプチドまたはポリペプチドエピトープの最小サイズは、約４〜５アミノ酸であると考えられる。ペプチドまたはポリペプチドエピトープは、少なくとも７、少なくとも９、または少なくとも約１５〜約３０のアミノ酸を含有し得る。ＣＤＲは、三次形態の抗原性ペプチドまたはポリペプチドを認識することができるので、エピトープを含むアミノ酸は連続的である必要はなく、いくつかの場合では同じペプチド鎖上にさえなくてもよい。抗ＬＩＮＧＯ−２抗体が認識するペプチドまたはポリペプチドエピトープは、ＬＩＮＧＯ−２の連続的または非連続的な少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５または約１５〜約３０アミノ酸の配列を含有し得る。
【０２０５】
「特異的に結合する」は、一般に、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合し、該結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間のいくらかの相補性を伴うことを意味する。この定義によれば、抗体は、それが無関係なランダムエピトープに結合するよりも容易にその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合する場合に、エピトープに「特異的に結合する」といわれる。用語「特異性」は、本明細書では、ある特定の抗体がある特定のエピトープに結合する相対的親和性を述べるのに使用される。例えば、抗体「Ａ」は、所定のエピトープに対する特異性が抗体「Ｂ」よりも高いとみなされ得るか、または抗体「Ａ」は、それが関連エピトープ「Ｄ」に対して有するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合するといわれ得る。
【０２０６】
「優先的に結合する」は、抗体が、それが関連、類似、相同または相似エピトープに結合するよりも容易にエピトープに特異的に結合することを意味する。したがって、所定のエピトープに「優先的に結合する」抗体は、このような抗体が関連エピトープと交差反応し得るとしても、関連エピトープよりもそのエピトープに結合する可能性が高い。
【０２０７】
非限定的な例として、抗体は、第２のエピトープに対するその抗体の解離定数（ＫＤ）よりも小さいＫＤで第１のエピトープに結合する場合、前記第１のエピトープに優先的に結合するとみなされ得る。別の非限定的な例では、抗体は、第２のエピトープに対するその抗体のＫＤよりも少なくとも１桁小さい親和性で第１のエピトープに結合する場合、第１の抗原に優先的に結合するとみなされ得る。別の非限定的な例では、抗体は、第２のエピトープに対するその抗体のＫＤよりも少なくとも２桁小さい親和性で第１のエピトープに結合する場合、第１のエピトープに優先的に結合するとみなされ得る。
【０２０８】
別の非限定的な例では、抗体は、第２のエピトープに対するその抗体のｏｆｆ速度（ｋ（ｏｆｆ））よりも小さいｋ（ｏｆｆ）で第１のエピトープに結合する場合、第１のエピトープに優先的に結合するとみなされ得る。別の非限定的な例では、抗体は、第２のエピトープに対するその抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも１桁小さい親和性で第１のエピトープに結合する場合、第１のエピトープに優先的に結合するとみなされ得る。別の非限定的な例では、抗体は、第２のエピトープに対するその抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも２桁小さい親和性で第１のエピトープに結合する場合、第１のエピトープに優先的に結合するとみなされ得る。本明細書に開示される抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、５×１０−２秒−１以下、１０−２秒−１、５×ｌ０−３秒−１またはｌ０−３秒−１のｏｆｆ速度（ｋ（ｏｆｆ））で、本明細書に開示される標的ポリペプチド（例えば、ＬＩＮＧＯ−２、例えばヒト、霊長類、マウスまたはヒト、霊長類およびマウスの任意の組み合わせのＬＩＮＧＯ−２）またはその断片もしくは変異体に結合するといわれ得る。抗体は、５×１０−４秒−１以下、１０−４秒−１、５×１０−５秒−１または１０−５秒−１、５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１または１０−７秒−１のｏｆｆ速度（ｋ（ｏｆｆ））で、本明細書に開示される標的ポリペプチド（例えば、ＬＩＮＧＯ−２、例えばヒト、霊長類、マウスまたはヒト、霊長類およびマウスの任意の組み合わせのＬＩＮＧＯ−２）またはその断片もしくは変異体に結合するといわれ得る。
【０２０９】
本明細書に開示される抗体または抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、１０３Ｍ−１秒−１以上、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０４Ｍ−１秒−１または５×１０４Ｍ−１秒−１のｏｎ速度（ｋ（ｏｎ））で、本明細書に開示される標的ポリペプチド（例えば、ＬＩＮＧＯ−２、例えばヒト、霊長類、マウスまたはヒト、霊長類およびマウスの任意の組み合わせのＬＩＮＧＯ−２）またはその断片もしくは変異体に結合するといわれ得る。抗体は、１０５Ｍ−１秒−１以上、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１または５×１０６Ｍ−１秒−１または１０７Ｍ−１秒−１のｏｎ速度（ｋ（ｏｎ））で、本明細書に開示される標的ポリペプチド（例えば、ＬＩＮＧＯ−２、例えばヒト、霊長類、マウスまたはヒト、霊長類およびマウスの任意の組み合わせのＬＩＮＧＯ−２）またはその断片もしくは変異体に結合し得る。
【０２１０】
抗体は、それがエピトープに対する参照抗体の結合をある程度遮断する程度にそのエピトープに優先的に結合する場合、所定のエピトープに対する参照抗体の結合を競合的に阻害するといわれる。競合阻害は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば競合ＥＬＩＳＡアッセイによって決定することができる。抗体は、所定のエピトープに対する参照抗体の結合を、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％または少なくとも５０％競合的に阻害するといわれ得る。
【０２１１】
本明細書で使用される場合、用語「親和性」は、個々のエピトープと免疫グロブリン分子のＣＤＲとの結合強度の尺度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．）ｐａｇｅｓ  ２７−２８を参照のこと。本明細書で使用される場合、用語「アビディティ」は、免疫グロブリン集団と抗原との間の複合体の全体的な安定性、すなわち、免疫グロブリン混合物と抗原との機能的な結合強度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗの２９〜３４頁を参照のこと。アビディティは、特定のエピトープを有する集団における個々の免疫グロブリン分子の親和性、ならびにさらには免疫グロブリンおよび抗原の価数の両方に関係する。例えば、二価モノクローナル抗体と、高度に反復しているエピトープ構造を有する抗原、例えばポリマーとの間の相互作用は、アビディティが高いものの１つである。
【０２１２】
抗ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体はまた、それらの交差反応性の点で記載または特定され得る。本明細書で使用される場合、用語「交差反応性」は、第１の抗原に対して特異的な抗体が第２の抗原と反応する能力；２つの異なる抗原性物質間の関係性の尺度を指す。したがって、抗体は、その形成を誘導したエピトープ以外のエピトープに抗体が結合する場合に交差反応性である。交差反応性エピトープは、一般に、誘導エピトープと同じ相補性構造特徴の多くを含有し、いくつかの場合では、実際には元のものよりもよく適合し得る。
【０２１３】
例えば、ある特定の抗体は、非同一の関連エピトープ、例えば（当技術分野で公知の本明細書に記載される方法を使用して計算した場合に）参照エピトープと少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％および少なくとも５０％の同一性を有するエピトープに結合するというある程度の交差反応性を有する。抗体は、それが（当技術分野で公知の本明細書に記載される方法を使用して計算した場合に）参照エピトープと９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性を有するエピトープに結合しない場合、交差反応性をほとんどまたは全く有しないといわれ得る。抗体は、それがある特定のエピトープのいかなる他の類似体、オルソログまたはホモログにも結合しない場合、そのエピトープに対して「高度に特異的」であるとみなされ得る。
【０２１４】
前記のように、様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元構造が周知である。本明細書で使用される場合、用語「ＶＨドメイン」は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、用語「ＣＨ１ドメイン」は、免疫グロブリン重鎖の最初（最もアミノ末端側）の定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインはＶＨドメインに隣接し、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端側である。
【０２１５】
本明細書で使用される場合、用語「ＣＨ２ドメイン」は、従来の番号付けスキームを使用して、抗体の例えば約残基２４４〜残基３６０（残基２４４〜３６０、Ｋａｂａｔ番号付けシステム；および残基２３１〜３４０、ＥＵ番号付けシステム；Ｋａｂａｔ  ＥＡらを参照のこと）に及ぶ重鎖分子の一部を含む。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対形成しない点で独特である。むしろ、２つのＮ連結分岐炭水化物鎖が、インタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に介在する。ＣＨ３ドメインはＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインからＣ末端に及び、約１０８個の残基を含むことも十分に立証されている。
【０２１６】
本明細書で使用される場合、用語「ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを連結する重鎖分子の一部を含む。このヒンジ領域は約２５個の残基を含み、フレキシブルであるので、２つのＮ末端抗原結合領域が独立して動くことを可能にする。ヒンジ領域は、３つの別個のドメイン：上部、中央および下部ヒンジドメインに細分化することができる（Ｒｏｕｘら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３（１９９８））。
【０２１７】
本明細書で使用される場合、用語「ジスルフィド結合」は、２つの硫黄原子間に形成される共有結合を含む。アミノ酸システインは、第２のチオール基とジスルフィド結合または架橋を形成することができるチオール基を含む。最も多く天然に存在するＩｇＧ分子では、ＣＨ１およびＣＬ領域はジスルフィド結合によって連結され、２つの重鎖は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムを使用すれば２３９および２４２に対応する位置（２２６位または２２９位、ＥＵ番号付けシステム）で２つのジスルフィド結合によって連結される。
【０２１８】
本明細書で使用される場合、用語「キメラ抗体」は、免疫反応性領域または部位が第１の種から得られるかまたはこれに由来し、定常領域（これはインタクトなものでもよいし、部分的なものでもよいし、または本発明にしたがって改変されたものでもよい）が第２の種から得られる任意の抗体を含む。ある特定の実施形態では、標的結合領域または部位は非ヒト供給源（例えば、マウスまたは霊長類）に由来し、定常領域はヒトのものである。
【０２１９】
本明細書で使用される場合、「ヒト」または「完全ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、下記のようにおよび例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載されているように、ヒト免疫グロブリンライブラリーからまたは１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックな動物であって、内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を含む。「ヒト」または「完全ヒト」抗体はまた、少なくとも重鎖の可変ドメインまたは少なくとも重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む抗体であって、該可変ドメインがヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列を有する抗体を含む。「ヒト」または「完全ヒト」抗体はまた、本明細書に記載される抗体分子（例えば、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる上記「ヒト」または「完全ヒト」抗体を含み、この抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体に免疫特異的に結合する。
【０２２０】
限定されないが、アミノ酸置換をもたらす部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発を含む当業者に公知の標準的技術を使用して、ヒト抗ＬＩＮＧＯ−２抗体をコードするヌクレオチド配列に変異を導入することができる。変異体（誘導体を含む）は、参照ＶＨ領域、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２またはＶＬＣＤＲ３に対して５０個未満のアミノ酸置換、４０個未満のアミノ酸置換、３０個未満のアミノ酸置換、２５個未満のアミノ酸置換、２０個未満のアミノ酸置換、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、５個未満のアミノ酸置換、４個未満のアミノ酸置換、３個未満のアミノ酸置換または２個未満のアミノ酸置換をコードする。一実施形態では、抗体のＣＤＲに存在する１つ以上のシステイン残基は、異なるアミノ酸残基に変更される。
【０２２１】
本明細書で使用される場合、用語「人工抗体」は、特異性が公知の抗体の１つ以上のＣＤＲを少なくとも部分的に置換することによって、必要な場合にはフレームワーク領域を部分的に置換し配列を変更することによって、重鎖もしくは軽鎖またはその両方の可変ドメインを変化させた抗体を指す。ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスまたはさらにサブクラスの抗体に由来するものでもよいが、ＣＤＲは、異なるクラスの抗体および／または異なる種由来の抗体に由来するものであると想定される。特異性が公知の非ヒト抗体由来の１つ以上の「ドナー」ＣＤＲをヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域に移植した人工抗体は、本明細書では「ヒト化抗体」と称される。ある特定の実施形態では、ある可変ドメインの抗原結合能を別のものに移すために、ＣＤＲのすべてをドナー可変領域由来の完全ＣＤＲで置換する必要はない。むしろ、標的結合部位の活性を維持するのに必要な残基を移植すれば十分であり得る。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，６９３，７６２号および米国特許第６，１８０，３７０号に記載されている説明を考慮すると、ルーチンな実験を行うことによって、または試行錯誤の試験によって機能的な人工抗体またはヒト化抗体を得ることは、十分に当業者の能力の範囲内であろう。
【０２２２】
ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはその両方の可変ドメイン中のフレームワーク領域は、ヒト起源の残基のみを含み得ることがさらに認識され、この場合、ヒト化抗体のこれらのフレームワーク領域は、「完全ヒトフレームワーク領域」と称される。あるいは、必要に応じて、ＬＩＮＧＯ−２抗原に対する適切な結合を維持するかまたはＬＩＮＧＯ−２抗原に対する結合を増強するために、ドナー可変ドメインのフレームワーク領域の１つ以上の残基を、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはその両方の可変ドメインのヒトフレームワーク領域の対応する位置内で操作することができる。したがって、このように操作したヒトフレームワーク領域は、ヒトおよびドナーフレームワーク残基の混合物を含み、本明細書では「部分的ヒトフレームワーク領域」と称される。
【０２２３】
例えば、抗ＬＩＮＧＯ−２抗体のヒト化は、基本的にはＷｉｎｔｅｒおよび共同研究者（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法にしたがって、齧歯類もしくは突然変異齧歯類抗ＬＩＮＧＯ−２  ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することによって行うことができる。米国特許第５，２２５，５３９号；米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第５，６９３，７６１号；米国特許第５，６９３，７６２号；米国特許第５，８５９，２０５号（参照により本明細書に組み込まれる）も参照のこと。得られたヒト化抗ＬＩＮＧＯ−２抗体は、ヒト化抗体の重鎖および／または軽鎖の可変ドメインの完全ヒトフレームワーク領域内に、少なくとも１つの齧歯類または突然変異齧歯類ＣＤＲを含み得る。いくつかの場合では、ヒト化抗ＬＩＮＧＯ−２抗体の１つ以上の可変ドメインのフレームワーク領域内の残基は、対応する非ヒト（例えば、齧歯類）残基で置換され（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第５，６９３，７６１号；米国特許第５，６９３，７６２号；および米国特許第６，１８０，３７０号を参照のこと）、この場合、得られたヒト化抗ＬＩＮＧＯ−２抗体は、重鎖および／または軽鎖の可変ドメイン内に部分的ヒトフレームワーク領域を含み得る。
【０２２４】
さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見られない残基を含み得る。抗体性能をさらに改良するために（例えば、所望の親和性を得るために）、これらの改変が行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここで、すべてまたは実質的にすべてのＣＤＲは、非ヒトヒト免疫グロブリンのものに対応し、すべてのまたは実質的にすべてのフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含むであろう。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；ａｎｄ  Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。したがって、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に少ないものが非ヒト種由来の対応する配列で置換された抗体を含み得る。実際上、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基および可能であればいくつかのフレームワーク残基が齧歯類抗体の類似部位由来の残基で置換されたヒト抗体である。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第５，６９３，７６１号；米国特許第５，６９３，７６２号；米国特許第５，８５９，２０５号を参照のこと。米国特許第６，１８０，３７０号および国際公開第０１／２７１６０号も参照のこと（ここでは、ヒト化抗体および所定の抗原に対する改善された親和性を有するヒト化抗体を生産するための技術が開示されている）。
【０２２５】
本明細書で使用される場合、用語「連結された」、「融合された」または「融合」は、互換的に使用される。これらの用語は、化学的コンジュゲーションまたは組換え手段を含む手段によって、２つ以上の要素または成分を結合することを指す。「インフレーム融合」は、元のＯＲＦの正しいリーディングフレームを維持するように、２つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を結合して連続するより長いＯＲＦを形成することを指す。したがって、得られた組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメント（これらのセグメントは、自然では、通常はそのように結合されていない）を含有する単一タンパク質である。したがって、リーディングフレームは融合セグメント全体を通して連続的にされるが、例えば、インフレームリンカー配列によってこのセグメントを物理的または空間的に分けることができる。
【０２２６】
ポリペプチドとの関連において、「直鎖状配列」または「配列」は、ポリペプチドがアミノ末端からカルボキシル末端方向に線形のアミノ酸であって、配列中で互いに隣接する残基がポリペプチドの一次構造において連続的であるアミノ酸である。
【０２２７】
用語「発現」は、本明細書で使用される場合、遺伝子が生化学的物質、例えばＲＮＡまたはポリペプチドを生成するプロセスを指す。このプロセスは、限定されないが、遺伝子ノックダウンならびに一過性発現および安定的発現の両方を含む、細胞内における遺伝子の機能的存在の任意の発現を含む。これには、限定されないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または任意の他のＲＮＡ産物への遺伝子の転写、およびポリペプチドへのこのようなｍＲＮＡの翻訳が挙げられる。所望の最終産物が生化学的物質である場合、発現は、その生化学的物質および任意の前駆体の創出を含む。遺伝子の発現は「遺伝子産物」を生成する。本明細書で使用される場合、遺伝子産物は、核酸、例えば遺伝子の転写によって生成されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写産物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載される遺伝子産物は、転写後修飾、例えばポリアデニル化を有する核酸、または翻訳後修飾、例えばメチル化、グリコシル化、脂質付加、他のタンパク質サブユニットとの結合、タンパク質分解切断などを有するポリペプチドをさらに含む。
【０２２８】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、必要な投与量および時間において、所望の治療結果を達成するのに有効な量を指す。治療結果は、例えば、症候の緩和、生存の延長、運動性の改善などであり得る。治療結果は「治癒」である必要はない。
【０２２９】
本明細書で使用される場合、「予防有効量」は、必要な投与量および時間において、所望の予防結果を達成するのに有効な量を指す。典型的には、予防用量は、疾患前または疾患の初期段階において被験体に使用されるため、予防有効量は治療有効量よりも少ないであろう。
【０２３０】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」または「処置」は、その目的が、自己免疫性症状の進行などの望ましくない生理的変化または障害を防止または遅延（減少）することである治療的処置および予防的または防止的措置の両方を指す。有益なまたは所望の臨床的結果としては、限定されないが、検出可能または検出不可能かにかかわらず、症候の緩和、疾患程度の減少、疾患状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善もしくは一次的緩和および寛解（部分的または完全にかかわらず）が挙げられる。「処置」はまた、処置を受けない場合に予想される生存と比較して延長された生存を意味し得る。処置を必要とするものとしては、症状もしくは障害を既に有するもの、および症状もしくは障害を有する傾向にあるもの、または症状もしくは障害を予防しようとするものが挙げられる。
【０２３１】
「被験体」、「個体」、「動物」、「患者」、または「哺乳動物」は、診断、予後、または治療が望まれる任意の被験体、特に哺乳動物被験体を意味する。哺乳動物被験体としては、限定されないが、ヒト、家畜、農場動物、動物園動物、競技用動物、愛玩動物、例えばモルモット、ウサギ、ラットおよびマウス、霊長類、例えばサル、オランウータンおよびチンパンジー、イヌ科動物、例えばイヌおよびオオカミ、ネコ科動物、例えばネコ、ライオンおよびトラ、ウマ科動物、例えばウマ、ロバおよびシマウマ、食用動物、例えばウシ、ブタおよびヒツジ、有蹄動物、例えばシカおよびキリン、クマなどが挙げられる。ある特定の実施形態では、哺乳動物はヒト被験体である。
【０２３２】
本明細書で使用される場合、「ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストの投与によって利益を受け得る被験体」および「処置を必要とする動物」などの語句は、例えば、抗ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドの検出に（例えば、診断手順に）使用されるＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストの投与から、および／または抗ＬＩＮＧＯ−２抗体などのＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストによる処置（すなわち、ＡＬＳなどの疾患の一時的緩和または予防）から利益を受け得る被験体（例えば、哺乳動物被験体）を含む。
【０２３３】
用語「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現のサイレンシングまたは減少を指す。それは、動物および植物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングの過程であり、サイレンシングされる遺伝子の配列とその二本鎖領域が相同であるｓｉＲＮＡによって開始される。遺伝子は、生物に対して内因性もしくは外因性のものでもよいし、染色体に組み込まれて存在するものでもよいし、またはゲノムに組み込まれないトランスフェクションベクター中に存在するものでもよい。遺伝子の発現は、完全または部分的に阻害される。ＲＮＡｉはまた、標的ＲＮＡの機能を阻害すると考えられ得る；標的ＲＮＡの機能は、完全または部分的であり得る。
【０２３４】
ＩＩ．ＬＩＮＧＯ−２
ＬＩＮＧＯ−２は、皮質ニューロンおよび後根神経節（ＤＲＧ）で発現しており、運動ニューロンの生存および運動ニューロンの軸索成長を負に調節する。
【０２３５】
天然に存在するヒトＬＩＮＧＯ−２は、６０６アミノ酸のポリペプチドである。ヒトＬＩＮＧＯ−２  ｍＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＮＭ＿１５２５７０として報告されている：
【化１】
2019150055.tif 000003
【０２３６】
（配列番号１のヌクレオチド６５１〜２４７１によってコードされる）ヒトＬＩＮＧＯ−２のポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＮＰ＿６８９７８３として報告されている：
【化２】
2019150055.tif 000004
マウスＬＩＮＧＯ−２  ｍＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＮＭ＿１７５５１６．４として報告されている：
【化３】
2019150055.tif 000005
マウスＬＩＮＧＯ−２のポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＮＰ＿７８０７２５として報告されている：
【化４】
2019150055.tif 000006
ラットＬＩＮＧＯ−２  ｍＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＮＭ＿００１１０７９２６．１として報告されている：
【化５】
2019150055.tif 000007
ラットＬＩＮＧＯ−２のポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＮＰ＿００１１０１３９６として報告されている：
【化６】
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【０２３７】
天然に存在するヒトＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド（ＦＬＪ３１８１０、ロイシンリッチリピートおよび免疫グロブリン様ドメイン含有ｎｏｇｏ受容体相互作用タンパク質２、ＬＥＲＮ３、ロイシンリッチリピート神経タンパク質３、ロイシンリッチリピート神経タンパク質６Ｃ、ＬＲＲＮ６Ｃ、ＰＲＯ３１９９３またはＵＮＱ９２３４としても公知である）は、６０６アミノ酸の約６８Ｋｄａのタンパク質である（配列番号２）。ＬＩＮＧＯ−２は、少なくとも３つの他のヒトパラログ（ＬＩＮＧＯ−１、ＬＩＮＧＯ−３およびＬＩＮＧＯ−４）を含有するＬＩＮＧＯタンパク質ファミリーのメンバーである。Ｍｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２８（２００４）を参照のこと。ヒトＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドは、（Ｎ末端キャップ（ＬＲＲＮＴ）およびＣ末端キャップ（ＬＲＲＣＴ）を含む）ロイシンリッチリピートのストレッチを含有する。ＬＩＮＧＯ−２はまた、Ｉｇドメイン、膜貫通領域および細胞内ドメインを含有する。加えて、天然に存在するＬＩＮＧＯ−２タンパク質は、タンパク質のＮ末端にシグナル配列を含有する。当業者であれば認識するように、本明細書で報告されるＬＩＮＧＯ−２の様々なドメインの長さは概算である。表２には、配列番号２のアミノ酸配列に基づいて、ＬＩＮＧＯ−２ドメインの近似境界が記載されている。
【表２】
2019150055.tif 000009
【０２３８】
ＬＩＮＧＯ−２の組織分布は、ラットおよびマウスで研究されている。定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によって決定した場合、成体ラットＬＩＮＧＯ−２の発現は、中枢神経系に局在している。Ｐ６（生後６日目）マウスでは、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によって決定した場合、ＬＩＮＧＯ−２の発現は、皮質ニューロンおよび後根神経節に局在している（図１および２を参照のこと）。
【０２３９】
ＩＩＩ．ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストの使用方法
本明細書で実証されているように、ＬＩＮＧＯ−１およびＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドは約６０．７％のアミノ酸配列同一性を共有するが、これらのポリペプチドの拮抗作用は細胞に対して異なる効果を生じる。より具体的には、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは再髄鞘形成を促進しないが、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストは再髄鞘形成を促進する。加えて、ＬＩＮＧＯ−１およびＬＩＮＧＯ−２の発現パターンは異なる。特に、ＬＩＮＧＯ−２発現は脳よりも脊髄で高いが、ＬＩＮＧＯ−１発現は脊髄よりも脳で高い。
【０２４０】
このような疾患を患っている動物における運動ニューロンの生存または運動ニューロンの軸索成長に関連する疾患、障害または傷害（例えば、筋萎縮性側索硬化症）を処置するための方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、有効量のＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを動物に投与することを含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる。ある特定の実施形態では、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチド、ＬＩＮＧＯ−２アプタマーおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０２４１】
（哺乳動物またはインビトロにおける）運動ニューロンの生存または運動ニューロンの軸索成長を促進するための方法であって、該運動ニューロンと、有効量のＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストとを接触させることを含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる方法が本明細書でさらに提供される。運動ニューロンが哺乳動物（ｍａｎｍｍａｌ）内にある場合、この量は治療有効量であり得る。ある特定の実施形態では、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチド、ＬＩＮＧＯ−２アプタマーおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０２４２】
本明細書に開示される処置方法に使用するべきＬＩＮＧＯ−２アンタゴニスト、例えば、可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−２抗体、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチドまたはＬＩＮＧＯ−２アプタマーを調製し、ＬＩＮＧＯ−２が軸索成長またはニューロンの生存を負に調節する能力を停止、軽減、抑制または阻害する治療剤として使用することができる。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、特定の種類の運動ニューロンの軸索成長を促進することができる。例えば、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、上位運動ニューロンまたは下位運動ニューロンの軸索成長を促進することができる。ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、アルファ運動ニューロンまたはガンマ運動ニューロンの軸索成長を促進することができる。ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、体性運動ニューロン、特殊な内臓運動ニューロン（鰓運動ニューロン）または一般の内臓運動ニューロン（内臓運動ニューロン）の軸索成長を促進することができる。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、特定の種類の運動ニューロンの生存を促進することができる。例えば、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、上位運動ニューロンまたは下位運動ニューロンの生存を促進することができる。ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、アルファ運動ニューロンまたはガンマ運動ニューロンの生存を促進することができる。ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、体性運動ニューロン、特殊な内臓運動ニューロン（鰓運動ニューロン）または一般の内臓運動ニューロン（内臓運動ニューロン）の生存をすることもできる。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、オリゴデンドロサイト分化を促進することができる。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、ＡＫＴリン酸化を促進することができる。いくつかの実施形態では、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、ＤＲＧ細胞におけるＡＫＴリン酸化を促進することができる。
【０２４７】
さらなる実施形態は、運動ニューロンの生存を誘導して、運動ニューロンの破壊を伴う疾患、障害または傷害を処置する方法であって、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを哺乳動物（場合により、該疾患、障害または傷害の部位またはその近く）に、運動ニューロンの軸索伸長の阻害を軽減するのに十分な量で投与することを含む方法を含む。
【０２４８】
例えば、可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチドまたはＬＩＮＧＯ−２アプタマーを患者に直接投与することによって、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを投与することができる。あるいは、特定のＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを産生する発現ベクターを介して、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを投与することができる。ある特定の実施形態では、（１）ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを発現する核酸（例えば、ベクター）で移植可能な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすること；および（２）該形質転換宿主細胞を哺乳動物に移植することを含む処置方法において、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを投与する。いくつかの実施形態では、宿主細胞を疾患、障害または傷害の部位に移植（ｉｍｐｌａｔｅｄ）することができる。いくつかの実施形態では、移植可能な宿主細胞を哺乳動物から取り出し、一時的に培養し、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストをコードする単離された核酸で形質転換またはトランスフェクトし、それを取り出した同じ哺乳動物に再移植する。細胞をそれが移植される同じ部位から取り出すことができるが、これが必須ではない。エクスビボ遺伝子治療としても公知のこのような実施形態は、一定期間にわたるＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストの連続供給を提供することができる。
【０２４９】
本明細書で提供される方法によって処置または改善することができる疾患または障害としては、運動ニューロンの生存に関連する疾患、障害または傷害が挙げられる。このような疾患としては、限定されないが、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）、Ｘ連鎖球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ；ケニー病）、進行性球麻痺、偽性球麻痺、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ポリオ後症候群（ＰＰＳ）、ハンチントン病、本態性振戦（ＥＴ）、運動ニューロン疾患、麻痺、パーキンソン病、および他の運動機能関連疾患が挙げられる。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストの投与は、運動ニューロン機能の低下に関連する特定の症候を低減または予防するのに十分である。例えば、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、筋萎縮、筋力低下、線維束性攣縮、原線維形成（ｆｉｂｒｉｌｌｉａｔｉｏｎ）、低血圧、反射低下、衰弱、緊張亢進、反射亢進、クローヌス、麻痺（例えば、四肢麻痺、対麻痺または単麻痺）、痙縮、バビンスキーテスト、安静時振戦、アテトーシス、舞踏病、バリスムス、遅発性ジスキネジー、硬症（ｒｉｄｉｇｉｔｙ）、ジストニア、運動失調、ジスメトリア、拮抗運動反復不全、眼振、運動開始遅延、動作緩慢または他の運動障害を改善、安定化または予防することができる。
【０２５１】
ＩＶ．可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド
ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドは、可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドの断片、変異体またはその誘導体を含む。上記表２には、ヒトＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドの様々なドメインが記載されている。他種のＬＩＮＧＯ−２のポリペプチド、例えばマウスＬＩＮＧＯ−２（配列番号４）について、類似のドメイン構造を推定することができる。可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドは、典型的にはＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドの膜貫通ドメインを欠き、場合によりＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドの細胞質ドメインを欠く。例えば、ある特定の可溶性ヒトＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドは、ヒトＬＩＮＧＯ−２の膜貫通ドメインを含む配列番号２のアミノ酸５４６〜５６６を欠く。加えて、ある特定の可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドは、ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドのＬＲＲドメインおよびＩｇドメインを含む。
【０２５２】
変異体ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドはまた、対応する野生型ポリペプチドと配列が異なり得る。特に、ＬＩＮＧＯ−２の生物学的活性を大きく損なうことなく、ある特定のアミノ酸置換をＬＩＮＧＯ−２配列に導入することができる。例示的な実施形態では、変異体ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸置換を含有し、ならびに／または配列番号２のアミノ酸２８〜４０８および配列番号２のアミノ酸２８〜５００もしくは同等のＬＩＮＧＯ−２ホモログ断片（例えば、配列番号４または配列番号６）からなる群より選択される参照アミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含む。任意の所定のＬＩＮＧＯ−２断片と配列が異なる変異体ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸置換（保存的または非保存的）、１つ以上の欠失および／または１つ以上の挿入を含み得る。ある特定の実施形態では、可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドは、例えば、哺乳動物における運動ニューロンの生存または運動ニューロンの軸索成長を促進する。
【０２５３】
可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４または配列番号６の少なくとも６、例えば１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、１００アミノ酸またはそれ以上の断片を含み得る。加えて、可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドは、少なくとも１個、例えば５個、１０個、１５個または２０個の保存的アミノ酸置換を含み得る。配列番号２または配列番号４の参照ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一の可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドの対応する断片も企図される。ある特定の実施形態では、可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドは、例えば、哺乳動物における運動ニューロンの生存を促進するか、または運動ニューロンの軸索成長を促進する。
【０２５４】
「ＬＩＮＧＯ−２参照アミノ酸配列」または「参照アミノ酸配列」は、いかなるアミノ酸置換も導入されていない特定の配列を意味する。当業者であれば理解するように、置換がない場合、「単離されたポリペプチド」は、参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。
【０２５５】
さらなるＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドとしては、以下を含むか、以下から本質的になるか、または以下からなる、ヒトＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド断片が挙げられるがこれらに限定されない：配列番号２のアミノ酸１〜５７；配列番号２のアミノ酸１〜７９；配列番号２のアミノ酸１〜１０３；配列番号２のアミノ酸１〜１２７；配列番号２のアミノ酸１〜１５１；配列番号２のアミノ酸１〜１７５；配列番号２のアミノ酸１〜１９９；配列番号２のアミノ酸１〜２２３；配列番号２のアミノ酸１〜２４７；配列番号２のアミノ酸１〜２７１；配列番号２のアミノ酸１〜２９５；配列番号２のアミノ酸１〜３１９；配列番号２のアミノ酸１〜３４３；配列番号２のアミノ酸１〜４０８；配列番号２のアミノ酸１〜５００；配列番号２のアミノ酸１〜５４５；配列番号２のアミノ酸  アミノ酸２８〜５７；配列番号２のアミノ酸２８〜７９；配列番号２のアミノ酸２８〜１０３；配列番号２のアミノ酸２８〜１２７；配列番号２のアミノ酸２８〜１５１；配列番号２のアミノ酸２８〜１７５；配列番号２のアミノ酸２８〜１９９；配列番号２のアミノ酸２８〜２２３；配列番号２のアミノ酸２８〜２４７；配列番号２のアミノ酸２８〜２７１；配列番号２のアミノ酸２８〜２９５；配列番号２のアミノ酸２８〜３１９；配列番号２のアミノ酸２８〜３４３；配列番号２のアミノ酸２８〜４０８；配列番号２のアミノ酸２８〜５００；配列番号２のアミノ酸２８〜５４５；配列番号２のアミノ酸５８〜７９；配列番号２のアミノ酸５８〜１０３；配列番号２のアミノ酸５８〜１２７；配列番号２のアミノ酸５８〜１５１；配列番号２のアミノ酸５８〜１７５；配列番号２のアミノ酸５８〜１９９；配列番号２のアミノ酸５８〜２２３；配列番号２のアミノ酸５８〜２４７；配列番号２のアミノ酸５８〜２７１；配列番号２のアミノ酸５８〜２９５；配列番号２のアミノ酸５８〜３１９；配列番号２のアミノ酸５８〜３４３；配列番号２のアミノ酸５８〜４０８；配列番号２のアミノ酸５８〜５００；配列番号２のアミノ酸５８〜５４５；配列番号２のアミノ酸８２〜１０３；配列番号２のアミノ酸８２〜１２７；配列番号２のアミノ酸８２〜１５１；配列番号２のアミノ酸８２〜１７５；配列番号２のアミノ酸８２〜１９９；配列番号２のアミノ酸８２〜２２３；配列番号２のアミノ酸８２〜２４７；配列番号２のアミノ酸８２〜２７１；配列番号２のアミノ酸８２〜２９５；配列番号２のアミノ酸８２〜３１９；配列番号２のアミノ酸８２〜３４３；配列番号２のアミノ酸８２〜４０８；配列番号２のアミノ酸８２〜５００；配列番号２のアミノ酸８２〜５４５；配列番号２のアミノ酸１０６〜１２７；配列番号２のアミノ酸１０６〜１５１；配列番号２のアミノ酸１０６〜１７５；配列番号２のアミノ酸１０６〜１９９；配列番号２のアミノ酸１０６〜２２３；配列番号２のアミノ酸１０６〜２４７；配列番号２のアミノ酸１０６〜２７１；配列番号２のアミノ酸１０６〜２９５；配列番号２のアミノ酸１０６〜３１９；配列番号２のアミノ酸１０６〜３４３；配列番号２のアミノ酸１０６〜４０８；配列番号２のアミノ酸１０６〜５００；配列番号２のアミノ酸１０６〜５４５；配列番号２のアミノ酸１３０〜１５１；配列番号２の���ミノ酸１３０〜１７５；配列番号２のアミノ酸１３０〜１９９；配列番号２のアミノ酸１３０〜２２３；配列番号２のアミノ酸１３０〜２４７；配列番号２のアミノ酸１３０〜２７１；配列番号２のアミノ酸１３０〜２９５；配列番号２のアミノ酸１３０〜３１９；配列番号２のアミノ酸１３０〜３４３；配列番号２のアミノ酸１３０〜４０８；配列番号２のアミノ酸１３０〜５００；配列番号２のアミノ酸１３０〜５４５；配列番号２のアミノ酸１５４〜１７５；配列番号２のアミノ酸１５４〜１９９；配列番号２のアミノ酸１５４〜２２３；配列番号２のアミノ酸１５４〜２４７；配列番号２のアミノ酸１５４〜２７１；配列番号２のアミノ酸１５４〜２９５；配列番号２のアミノ酸１５４〜３１９；配列番号２のアミノ酸１５４〜３４３；配列番号２のアミノ酸１５４〜４０８；配列番号２のアミノ酸１５４〜５００；配列番号２のアミノ酸１５４〜５４５；配列番号２のアミノ酸１７８〜１９９；配列番号２のアミノ酸１７８〜２２３；配列番号２のアミノ酸１７８〜２４７；配列番号２のアミノ酸１７８〜２７１；配列番号２のアミノ酸１７８〜２９５；配列番号２のアミノ酸１７８〜３１９；配列番号２のアミノ酸１７８〜３４３；配列番号２のアミノ酸１７８〜４０８；配列番号２のアミノ酸１７８〜５００；配列番号２のアミノ酸１７８〜５４５；配列番号２のアミノ酸２０２〜２２３；配列番号２のアミノ酸２０２〜２４７；配列番号２のアミノ酸２０２〜２７１；配列番号２のアミノ酸２０２〜２９５；配列番号２のアミノ酸２０２〜３１９；配列番号２のアミノ酸２０２〜３４３；配列番号２のアミノ酸２０２〜４０８；配列番号２のアミノ酸２０２〜５００；配列番号２のアミノ酸２０２〜５４５；配列番号２のアミノ酸２２６〜２４７；配列番号２のアミノ酸２２６〜２７１；配列番号２のアミノ酸２２６〜２９５；配列番号２のアミノ酸２２６〜３１９；配列番号２のアミノ酸２２６〜３４３；配列番号２のアミノ酸２２６〜４０８；配列番号２のアミノ酸２２６〜５００；配列番号２のアミノ酸２２６〜５４５；配列番号２のアミノ酸２５０〜２７１；配列番号２のアミノ酸２５０〜２９５；配列番号２のアミノ酸２５０〜３１９；配列番号２のアミノ酸２５０〜３４３；配列番号２のアミノ酸２５０〜４０８；配列番号２のアミノ酸２５０〜５００；配列番号２のアミノ酸２５０〜５４５；配列番号２のアミノ酸２７４〜２９５；配列番号２のアミノ酸２７４〜３１９；配列番号２のアミノ酸２７４〜３４３；配列番号２のアミノ酸２７４〜４０８；配列番号２のアミノ酸２７４〜５００；配列番号２のアミノ酸２７４〜５４５；配列番号２のアミノ酸２９８〜３１９；配列番号２のアミノ酸２９８〜３４３；配列番号２のアミノ酸２９８〜４０８；配列番号２のアミノ酸２９８〜５００；配列番号２のアミノ酸２９８〜５４５；配列番号２のアミノ酸３２２〜３４３；配列番号２のアミノ酸３２２〜４０８；配列番号２のアミノ酸３２２〜５００；配列番号２のアミノ酸３２２〜５４５；配列番号２のアミノ酸３５５〜４０８；配列番号２のアミノ酸３５５〜５００；配列番号２のアミノ酸３５５〜５４５；配列番号２のアミノ酸４１０〜５００；配列番号２のアミノ酸４１０〜５４５；または���のようなポリペプチドの断片、変異体もしくは誘導体。
ある特定の実施形態では、可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドは、例えば、哺乳動物における運動ニューロンの生存を促進し、および／または運動ニューロンの軸索成長を促進する。
【０２５６】
当業者であれば十分に理解するように、例えば、ＬＩＮＧＯ−２ドメイン領域の別の予測に基づいて、上記のものなどのＬＩＮＧＯ−２断片は、長さがいずれかの末端で例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸だけ異なり得る（より長いかまたはより短い）。本明細書に記載される配列番号２、配列番号４、配列番号６またはそれらの断片と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一の対応する可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド断片も企図される。
【０２５７】
可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドは、２つ以上の可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドの任意の組み合わせを含み得る。したがって、ホモ二量体またはヘテロ二量体のいずれかである可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド二量体が企図される。本明細書に記載される２つ以上の可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドを直接接続することもできるし、または適切なペプチドリンカーを介して接続することもできる。このようなペプチドリンカーは、本明細書の他の場所に記載される。
【０２５８】
加えて、上記断片のいずれかは、Ｎ末端に分泌シグナルペプチド、例えば配列番号２のアミノ酸の１〜２７をさらに含み得る。本明細書の別の場所に記載されるものなどの他の分泌シグナルペプチドを使用することもできる。
【０２５９】
可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドは、環状であり得る。可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドの環化は、直鎖状ペプチドの配座自由度を減少させ、より構造的に制約された分子をもたらす。多くのペプチド環化方法が当技術分野で公知である。例えば、ペプチドのＮ末端およびＣ末端アミノ酸残基間のアミド結合の形成による「骨格−骨格」環化。「骨格−骨格」環化方法としては、２つのω−チオアミノ酸残基（例えば、システイン、ホモシステイン）間のジスルフィド架橋の形成が挙げられる。ある特定の可溶性ＬＩＮＧＯ−２ペプチドは、ペプチドのＮ末端およびＣ末端上に修飾を含んで環状ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドを形成する。このような修飾としては、限定されないが、システイン残基、アセチル化システイン残基、ＮＨ２ポリペプチドおよびビオチンを有するシステイン残基が挙げられる。他のペプチド環化方法は、Ｌｉ＆Ｒｏｌｌｅｒ．Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３：３２５−３４１（２００２）（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０２６０】
Ｖ．抗体およびその抗原結合断片
ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストとしてはまた、ＬＩＮＧＯ−２活性のアンタゴニスト、例えば抗体Ｃ０９であるＬＩＮＧＯ−２特異的抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体が挙げられる。例えば、運動ニューロンで発現されているＬＩＮＧＯ−２に対するある特定のＬＩＮＧＯ−２抗体の結合は、運動ニューロンの生存の阻害を遮断するか、または運動ニューロンの軸索成長の阻害を遮断する。ある特定の実施形態では、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニスト抗体は、例えば、哺乳動物における運動ニューロンの生存を促進するか、または運動ニューロンの軸索成長を促進する。
【０２６１】
ある特定の実施形態では、結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体、例えば、抗体Ｃ０９はＬＩＮＧＯ−２に結合し、運動ニューロンの生存を促進するか、または運動ニューロンの軸索成長を促進する。
【０２６２】
ある特定の実施形態では、抗ＬＩＮＧＯ−２抗体は、ヒト、ラット、マウスまたはヒト、ラットおよびマウスの任意の組み合わせのＬＩＮＧＯ−２に結合する。
Ａ．抗ＬＩＮＧＯ−２抗体ポリペプチド
【０２６３】
抗体Ｃ０９と同じＬＩＮＧＯ−２エピトープに特異的に結合することができる単離された結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体も提供される。別の実施形態では、単離された結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、Ｃ０９のＶＨおよびＶＬを含む抗体と同じＬＩＮＧＯ−２エピトープに特異的に結合することができる。別の実施形態では、単離された結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、Ｃ０９のＶＨまたはＶＬを含む抗体と同じＬＩＮＧＯ−２エピトープに特異的に結合することができる。
【０２６４】
別の実施形態では、単離された結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、ＬＩＮＧＯ−２に特異的に結合し、抗体Ｃ０９がＬＩＮＧＯ−２（例えば、ヒト、ラット、マウスまたはヒト、ラットおよびマウスの任意の組み合わせのＬＩＮＧＯ−２）に特異的に結合するのを競合的に阻害することができる。別の実施形態では、単離された結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、ＬＩＮＧＯ−２に特異的に結合し、Ｃ０９のＶＨおよびＶＬを含む抗体がＬＩＮＧＯ−２（例えば、ヒト、ラット、マウスまたはヒト、ラットおよびマウスの任意の組み合わせのＬＩＮＧＯ−２）に特異的に結合するのを競合的に阻害することができる。別の実施形態では、単離された結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、ＬＩＮＧＯ−２に特異的に結合し、Ｃ０９のＶＨまたはＶＬを含む抗体、例えばヒト、ラット、マウスまたはヒト、ラットおよびマウスの任意の組み合わせのＬＩＮＧＯ−２を競合的に阻害することができる。
【０２６５】
ある特定の実施形態では、結合分子は、参照抗ＬＩＮＧＯ−２抗体分子のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態では、結合分子は、参照抗体と少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。ある特定の実施形態では、参照抗体はＣ０９である。
【０２６６】
別の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、ＶＨドメインのＣＤＲの少なくとも１つが、配列番号７、８または９（表３を参照のこと）のＶＨアミノ酸配列由来ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなり、ここで、該コードされるＶＨドメインを含む抗体またはその抗原結合断片は、ＬＩＮＧＯ−２に特異的または優先的に結合することができる。さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、運動ニューロンの生存を促進するか、または運動ニューロンの軸索成長を促進する。
【表３】
2019150055.tif 000010
【０２６７】
別の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、ＶＨドメインのＣＤＲの少なくとも１つが、それぞれ配列番号７、８または９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２または３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなり、ここで、該コードされるＶＨドメインを含む抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、ＬＩＮＧＯ−２に特異的または優先的に結合することができる。さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、運動ニューロンの生存を促進するか、または運動ニューロンの軸索成長を促進する。
【０２６８】
別の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、ＶＨドメインのＣＤＲの少なくとも１つが、１個、２個、３個、４個または５個の保存的アミノ酸置換を除いて、それぞれ配列番号７、８または９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２または３と同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなり、ここで、該コードされるＶＨドメインを含む抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、ＬＩＮＧＯ−２に特異的または優先的に結合することができる。さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、運動ニューロンの生存を促進するか、または運動ニューロンの軸索成長を促進する。
【０２６９】
別の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、配列番号１０（表４を参照のこと）のＶＨアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含むか、これから本質的になるか、またはこれからなり、ここで、該コードされるＶＨドメインを含む抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、ＬＩＮＧＯ−２に特異的または優先的に結合することができる。さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、運動ニューロンの生存を促進するか、または運動ニューロンの軸索成長を促進する。
【表４】
2019150055.tif 000011
【０２７０】
別の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、ＶＬドメインのＣＤＲの少なくとも１つが、配列番号１１、１２または１３（表５を参照のこと）のＶＬアミノ酸配列由来ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなり、ここで、該コードされるＶＬドメインを含む抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、ＬＩＮＧＯ−２に特異的または優先的に結合することができる。さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、運動ニューロンの生存を促進するか、または運動ニューロンの軸索成長を促進する。
【表５】
2019150055.tif 000012
【０２７１】
別の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、ＶＬドメインのＣＤＲの少なくとも１つが、それぞれ配列番号１１、１２または１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２または３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなり、ここで、該コードされるＶＬドメインを含む抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、ＬＩＮＧＯ−２に特異的または優先的に結合することができる。さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、運動ニューロンの生存を促進するか、または運動ニューロンの軸索成長を促進する。
【０２７２】
別の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、ＶＬドメインのＣＤＲの少なくとも１つが、１個、２個、３個、４個または５個の保存的アミノ酸置換を除いて、それぞれ配列番号１１、１２または１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２または３と同一のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなり、ここで、該コードされるＶＬドメインを含む抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、ＬＩＮＧＯ−２に特異的または優先的に結合することができる。さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、運動ニューロンの生存を促進するか、または運動ニューロンの軸索成長を促進する。
【０２７３】
さらなる実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、配列番号１４（表６を参照のこと）のＶＬアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含むか、これから本質的になるか、またはこれからなり、ここで、該コードされるＶＬドメインを含む抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、ＬＩＮＧＯ−２に特異的または優先的に結合することができる。さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、運動ニューロンの生存を阻害し促進するか、または運動ニューロンの軸索成長を促進する。
【表６】
2019150055.tif 000013
【０２７４】
ある特定のアンタゴニスト抗体は、特定のＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド断片またはドメイン、例えば、本明細書に記載されるＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド、断片、変異体または誘導体に特異的または優先的に結合することができる。
【０２７５】
抗ＬＩＮＧＯ−２抗体の適切な生物学的に活性な変異体も有用である。このような変異体は、親抗ＬＩＮＧＯ−２抗体の所望の結合特性を保持しているであろう。抗体変異体を作製するための方法は、当技術分野で一般に利用可能である。
【０２７６】
ＬＩＮＧＯ−２に特異的に結合することができ、所望の活性を保持することができるポリペプチドの正確な化学構造は、いくつかの因子に依存する。イオン化可能なアミノ基およびカルボキシル基が分子中に存在するので、特定のポリペプチドは、酸性もしくは塩基性の塩としてまたは中性の形態で得ることができる。適切な環境条件に置かれた場合にそれらの生物学的活性を保持するすべてのこのような調製物は、本明細書で使用される抗ＬＩＮＧＯ−２抗体の定義に含まれる。さらに、ポリペプチドの一次アミノ酸配列は、糖部分（グリコシル化）を使用して誘導体化によって、または脂質、リン酸塩、アセチル基などの他の補助分子によって増強され得る。これは、糖とのコンジュゲーションによっても増強され得る。このような増強のある特定の態様は、産生宿主の翻訳後プロセシングシステムによって達成される；他のこのような改変は、インビトロで導入し得る。いずれの場合でも、このような改変は、抗ＬＩＮＧＯ−２抗体の所望の特性が損なわれない限り、本明細書で使用される抗ＬＩＮＧＯ−２抗体の定義に含まれる。このような改変は、様々なアッセイにおいて、ポリペプチドの活性を増強または減少させることによって、活性に対して定量的または定性的な影響を及ぼし得ると予想される。さらに、酸化、還元または他の誘導体化によって鎖中の個々のアミノ酸残基を改変することもできるし、ポリペプチドを切断して活性を保持する断片を得ることもできる。所望の特性（例えば、ＬＩＮＧＯ−２に対する結合特異性、結合親和性および関連活性、例えば、運動ニューロンの死を阻害する能力、および運動ニューロンの軸索成長を促進する能力）を損なわないこのような変化は、本明細書で使用される目的の抗ＬＩＮＧＯ−２抗体の定義からポリペプチド配列を除外するものではない。
【０２７７】
この技術は、ポリペプチド変異体の調製および使用に関して実質的なガイダンスを提供する。抗ＬＩＮＧＯ−２結合分子の変異体、例えば抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体の調製において、当業者であれば、天然タンパク質のヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対するどの改変が、医薬組成物の治療活性成分として使用するのに適切な変異体をもたらすかを容易に決定することができる。
【０２７８】
抗体分子のフレームワーク領域のみまたはＣＤＲ領域のみに突然変異を導入することが可能である。導入された突然変異は、サイレントまたは中立ミスセンス突然変異であり得る（すなわち、抗原に結合する抗体の能力に対して全くまたはほとんど影響を及ぼさない）。これらの種類の突然変異は、コドン使用を最適化するために、またはハイブリドーマの抗体産生を改善するのに有用であり得る。あるいは、非中立ミスセンス突然変異は、抗体の抗原結合能を変化させ得る。ほとんどのサイレントおよび中立ミスセンス突然変異の位置はフレームワーク領域内にあることが多く、ほとんどの非中立ミスセンス突然変異の位置はＣＤＲ内にあることが多いが、これは絶対条件ではない。当業者であれば、抗原結合活性の変化がないかまたは結合活性の変化がある（例えば、抗原結合活性の改善または抗体特異性の変化）などの所望の特性を有する突然変異体分子を設計および試験することができる。突然変異誘発の後に、コードされるタンパク質をルーチンに発現させ、コードされるタンパク質の機能的および／または生物学的な活性（例えば、ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープに免疫特異的に結合する能力）を、本明細書に記載される技術を使用して、または当技術分野で公知の技術をルーチンに改変することによって決定することができる。
【０２７９】
ある特定の実施形態では、抗ＬＩＮＧＯ−２抗体は、少なくとも１つの最適化相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。「最適化ＣＤＲ」は、ＣＤＲを改変し、最適化ＣＤＲを含む抗ＬＩＮＧＯ−２抗体に付与された持続もしくは改善された結合親和性および／または抗ＬＩＮＧＯ−２活性に基づいて最適化配列を選択することを意図する。「抗ＬＩＮＧＯ−２活性」は、例えば、ＬＩＮＧＯ−２に関連する以下の活性、例えば、運動ニューロンのＬＩＮＧＯ−２依存性運動ニューロン細胞死、運動ニューロンの軸索成長のＬＩＮＧＯ−２依存性阻害、またはＬＩＮＧＯ−２に関連する任意の他の活性の１つ以上を調節する活性を含み得る。抗ＬＩＮＧＯ−２活性はまた、ＬＩＮＧＯ−２発現に関連する疾患、限定されないが、ある特定の種類の運動ニューロン関連疾患（ｒｅａｌｔｅｄ  ｄｉｓｅａｅｓ）、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病および本態性振戦（ＥＴ）の発生率または重症度の低下に起因し得る。改変は、抗ＬＩＮＧＯ−２抗体がＬＩＮＧＯ−２抗原に対する特異性を保持し、改善された結合親和性および／または改善された抗ＬＩＮＧＯ−２活性を有するように、ＣＤＲ内のアミノ酸残基を置換することを含み得る。
Ｂ．抗ＬＩＮＧＯ−２抗体をコードするポリヌクレオチド
【０２８０】
本発明の抗ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をコードする核酸分子も本明細書で提供される。
【０２８１】
一実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、ＶＨドメインのＣＤＲの少なくとも１つが、配列番号１８（表４を参照のこと）から選択されるＶＨコード配列のＶＨＣＤＲ１、２または３ポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または同一の核酸配列によってコードされる免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）をコードする核酸を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、運動ニューロンの生存および／または運動ニューロンの軸索成長を促進する抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をコードする。
【０２８２】
他の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、ＶＨドメインのＣＤＲの少なくとも１つの配列が、（ａ）配列番号７に記載されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ１配列；（ｂ）配列番号８に記載されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ２配列；および（ｃ）配列番号９に記載されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ３配列からなる群より選択される免疫グロブリンＶＨドメインをコードする核酸を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、運動ニューロンの生存および／または運動ニューロンの軸索成長を促進する抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をコードする。
【０２８３】
さらなる実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１０を含む参照ＶＨドメインポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を有するＶＨドメインをコードする核酸を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなり、ここで、該コードされるＶＨドメインを含む抗ＬＩＮＧＯ−２抗体は、ＬＩＮＧＯ−２に特異的または優先的に結合する。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、運動ニューロンの生存および／または運動ニューロンの軸索成長を促進する抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をコードする。
【０２８４】
一実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、ＶＬドメインのＣＤＲの少なくとも１つが、配列番号２２（表６を参照のこと）から選択されるＶＬコード配列のＶＬＣＤＲ１、２または３ポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または同一の核酸配列によってコードされる免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）をコードする核酸を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、運動ニューロンの生存および／または運動ニューロンの軸索成長を促進する抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をコードする。
【０２８５】
他の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、ＶＬドメインのＣＤＲの少なくとも１つの配列が、（ａ）配列番号１１に記載されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ１配列；（ｂ）配列番号１２に記載されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ２配列；および（ｃ）配列番号１３に記載されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ３配列からなる群より選択される免疫グロブリンＶＬドメインをコードする核酸を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、運動ニューロンの生存および／または運動ニューロンの軸索成長を促進する抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をコードする。
【０２８６】
さらなる実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１４を含む参照ＶＬドメインポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を有するＶＬドメインをコードする核酸を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなり、ここで、該コードされるＶＬドメインを含む抗ＬＩＮＧＯ−２抗体は、ＬＩＮＧＯ−２に特異的または優先的に結合する。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、運動ニューロンの生存および／または運動ニューロンの軸索成長を促進する抗体または抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をコードする。
【０２８７】
上記ポリヌクレオチドはいずれも、例えば、コードされるポリペプチドの分泌を指令するシグナルペプチド、本明細書に記載される抗体定常領域または本明細書に記載される他の異種ポリペプチドをコードするさらなる核酸をさらに含み得る。また、上記ポリヌクレオチドの１つ以上を含む組成物が本明細書で提供される。
【０２８８】
一実施形態では、組成物は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含み、ここで、前記第１のポリヌクレオチドは本明細書に記載されるＶＨドメインをコードし、前記第２のポリヌクレオチドは本明細書に記載されるＶＬドメインをコードする。具体的には、配列番号１８に記載されているＶＨドメインコードポリヌクレオチドと、ＶＬドメインコードポリヌクレオチド、例えば、配列番号２２に記載されているＶＬドメインをコードするポリヌクレオチドとを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる組成物が提供される。配列番号７、配列番号８および配列番号９をコードする核酸配列を含むＶＨドメインコードポリヌクレオチドと、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３をコードする核酸配列を含むＶＬドメインコードポリヌクレオチドとを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる組成物も提供される。
【０２８９】
他の場所で記載されるように、ポリヌクレオチドの断片も提供される。加えて、本明細書に記載される融合ポリポリペプチド、Ｆａｂ断片および他の誘導体をコードするポリヌクレオチドも企図される。
【０２９０】
ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の方法によって生産または製造することができる。例えば、抗体のヌクレオチド配列が公知である場合、（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２（１９９４）に記載されるように）抗体をコードするポリヌクレオチドを化学合成オリゴヌクレオチドからアセンブルすることができ、これは、簡潔に言えば、抗体をコードする配列の部分を含有するオーバーラップオリゴヌクレオチドを合成し、これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングおよびライゲーションし、次いで、ライゲーションしたオリゴヌクレオチドをＰＣＲによって増幅することを含む。
【０２９１】
あるいは、抗ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源由来の核酸から作製することができる。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンが入手可能ではないが、抗体分子の配列が公知である場合、抗体をコードする核酸は、化学合成することができるか、または適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体もしくは他の抗ＬＩＮＧＯ−２抗体を発現する任意の組織または細胞、例えば抗体を発現する選択されたハイブリドーマ細胞から作製されたｃＤＮＡライブラリーもしくはこれから単離された核酸、例えばポリＡ＋ＲＮＡ）から、配列の３’および５’端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用してＰＣＲ増幅によって、または特定の遺伝子配列に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用してクローニングし、例えば抗体もしくは他の抗ＬＩＮＧＯ−２抗体をコードするｃＤＮＡライブラリー由来のｃＤＮＡクローンを同定することによって得ることができる。次いで、ＰＣＲによって作製した増幅核酸を、当技術分野で周知の任意の方法を使用して複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。
【０２９２】
抗ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、ヌクレオチド配列の操作のための当技術分野で周知の方法、例えば組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲなどを使用してそのヌクレオチド配列を操作して（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）およびＡｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ）（これらは両方とも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている技術を参照のこと）、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製する（例えばアミノ酸置換、欠失および／または挿入を創出する）ことができる。
【０２９３】
抗ＬＩＮＧＯ−２結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成され得る。例えば、抗ＬＩＮＧＯ−２抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖またはより典型的には二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得る。加えて、抗ＬＩＮＧＯ−２結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成され得る。抗ＬＩＮＧＯ−２結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドはまた、１つ以上の修飾塩基、または安定性もしくは他の理由により修飾されたＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含有し得る。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化塩基および異常塩基、例えばイノシンが挙げられる。様々な修飾をＤＮＡおよびＲＮＡに行うことができる；したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態を包含する。
【０２９４】
１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失がコードされるタンパク質に導入されるように、１つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を免疫グロブリンのヌクレオチド配列に導入することによって、免疫グロブリン由来のポリペプチド（例えば、免疫グロブリン重鎖部分または軽鎖部分）の非天然変異体をコードする単離されたポリヌクレオチドを形成することができる。部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの標準的技術によって、突然変異を導入することができる。１つ以上の非必須アミノ酸残基において、保存的アミノ酸置換を行うことができる。
Ｃ．抗ＬＩＮＧＯ−２抗体の特徴
【０２９５】
他の実施形態では、結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、ＬＩＮＧＯ−２の少なくとも１つのエピトープであって、配列番号２または配列番号４の少なくとも約４〜５アミノ酸、配列番号２または配列番号４の少なくとも７、少なくとも９または少なくとも約１５〜約３０アミノ酸を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなるエピトープに特異的または優先的に結合する。記載される配列番号２または配列番号４の所定のエピトープのアミノ酸は連続的または直鎖状であり得るが、これが必須ではない。ある特定の実施形態では、ＬＩＮＧＯ−２の少なくとも１つのエピトープは、細胞表面上にまたは例えばＩｇＧ  Ｆｃ領域に融合された可溶性断片として発現されるＬＩＮＧＯ−２の細胞外ドメインによって形成される非直鎖状エピトープを含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる。したがって、ある特定の実施形態では、ＬＩＮＧＯ−２の少なくとも１つのエピトープは、配列番号２または配列番号４の連続的または非連続的な少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、約１５〜約３０または少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００アミノ酸を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる。ここで、非連続的アミノ酸は、タンパク質フォールディングによってエピトープを形成する。
【０２９６】
他の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、ＬＩＮＧＯ−２の少なくとも１つのエピトープであって、上記配列番号２または配列番号４の連続的または非連続的な１、２、３、４、５、６アミノ酸またはそれ以上に加えて、タンパク質を改変するさらなるポリペプチドを含むか、これから本質的になるか、またはこれからなるエピトープに特異的または優先的に結合する（例えば、ＬＩＮＧＯ−２抗体が、それが非改変型のタンパク質に結合するよりも高い親和性で改変標的タンパク質に結合するように、炭水化物ポリペプチドを含むことができる）。あるいは、ＬＩＮＧＯ−２抗体は、非改変型の標的タンパク質には全く結合しない。
【０２９７】
他の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、ＬＩＮＧＯ−２のＬＲＲドメインに結合する。
【０２９８】
さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、配列番号２のアミノ酸２８〜４０８、配列番号２のアミノ酸５８〜３４３、配列番号２のアミノ酸８２〜３４３、配列番号２のアミノ酸１０６〜３４３、配列番号２のアミノ酸１３０〜３４３、配列番号２のアミノ酸１５４〜３４３、配列番号２のアミノ酸１７８〜３４３、配列番号２のアミノ酸２０２〜３４３、配列番号２のアミノ酸２２６〜３４３、または配列番号２のアミノ酸２５０〜３４３におけるエピトープに結合する。
【０２９９】
さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、配列番号２のアミノ酸２０２〜２２３、配列番号２のアミノ酸２０２〜２４７、配列番号２のアミノ酸２０２〜２７１、配列番号２のアミノ酸２０２〜２９５、配列番号２のアミノ酸２０２〜３１９、または配列番号２のアミノ酸２０２〜３４３におけるエピトープに結合する。
【０３００】
さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、配列番号２のアミノ酸２２６〜２４７、配列番号２のアミノ酸２２６〜２７１、配列番号２のアミノ酸２２６〜２９５、配列番号２のアミノ酸２２６〜３１９、または配列番号２のアミノ酸２２６〜３４３におけるエピトープに結合する。
【０３０１】
さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、配列番号２のアミノ酸２５０〜２７１、配列番号２のアミノ酸２５０〜２９５、配列番号２のアミノ酸２５０〜３１９、または配列番号２のアミノ酸２５０〜３４３におけるエピトープに結合する。
【０３０２】
さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、配列番号２のアミノ酸２７４〜２９５、配列番号２のアミノ酸２７４〜３１９、または配列番号２のアミノ酸２７４〜３４３におけるエピトープに結合する。
【０３０３】
さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、配列番号２のアミノ酸２９８〜３１９、または配列番号２のアミノ酸２９８〜３４３におけるエピトープに結合する。
【０３０４】
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、上記ＬＩＮＧＯ−２または断片もしくは変異体の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する（すなわち、それが無関係なまたはランダムエピトープに結合するよりも容易にこのようなエピトープに結合する）か；上記ＬＩＮＧＯ−２または断片もしくは変異体の少なくとも１つのエピトープに優先的に結合する（すなわち、それが関連、類似、相同または相似エピトープに結合するよりも容易にこのようなエピトープに結合する）か；上記ＬＩＮＧＯ−２または断片もしくは変異体のある特定のエピトープにそれ自体が特異的または優先的に結合する参照抗体の結合を競合的に阻害するか；または、約５×１０−２Ｍ未満、約１０−２Ｍ、約５×１０−３Ｍ、約１０−３Ｍ、約５×１０−４Ｍ、約１０−４Ｍ、約５×１０−５Ｍ、約１０−５Ｍ、約５×１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ、約５×１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ、約５×１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ、約５×１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ、約５×１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ、約５×１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ、約５×１０−１２Ｍ、約１０−１２Ｍ、約５×１０−１３Ｍ、約１０−１３Ｍ、約５×１０−１４Ｍ、約１０−１４Ｍ、約５×１０−１５Ｍまたは約１０−１５Ｍの解離定数ＫＤを特徴とする親和性で、上記ＬＩＮＧＯ−２または断片もしくは変異体の少なくとも１つのエピトープに結合する。特定の態様では、抗体またはその断片は、マウスＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドまたはその断片と比べて、ヒトＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドまたはその断片に優先的に結合する。
【０３０５】
抗体結合解離定数との関連で使用される場合、用語「約」は、抗体親和性を測定するのに利用される方法に特有のある程度の変動を許容する。例えば、使用される器具類の精度レベル、測定される試料の数に基づく標準誤差、および丸め誤差に依存して、用語「約１０−２Ｍ」は、例えば０．０５Ｍ〜０．００５Ｍを含み得る。
【０３０６】
具体的な実施形態では、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、５×１０−２秒−１以下、１０−２秒−１、５×ｌ０−３秒−１または１０−３秒−１のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））で、ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体に結合する。あるいは、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、５×１０−４秒−１以下、１０−４秒−１、５×１０−５秒−１または１０−５秒−１５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１または１０−７秒−１のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））で、ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体に結合する。
【０３０７】
他の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、１０３Ｍ−１秒−１以上、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０４Ｍ−１秒−１または５×１０４Ｍ−１秒−１のオン速度（ｋ（ｏｎ））で、ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体に結合する。あるいは、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、１０５Ｍ−１秒−１以上、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１または５×１０６Ｍ−１秒−１または１０７Ｍ−１秒−１のオン速度（ｋ（ｏｎ））で、ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体に結合する。
【０３０８】
ある特定のＬＩＮＧＯ−２アンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片では、定常領域ドメインの１つ以上の少なくとも一部が欠損しているか、または所望の生化学的特徴、例えばほぼ同一の免疫原性の非改変全抗体と比較したエフェクタ機能の低下、非共有結合的に二量体化する能力、腫瘍部位に局在化する能力の改善、血清半減期の減少または血清半減期の増加を提供するように別様に改変されている。例えば、ある特定の抗体は、免疫グロブリン重鎖に類似のポリペプチド鎖を含むが、１つ以上の重鎖ドメインの少なくとも一部を欠くドメイン欠損抗体である。例えば、ある特定の抗体では、修飾抗体の定常領域の１つのドメイン全体が欠損しており、例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部が欠損している。
【０３０９】
ある特定のＬＩＮＧＯ−２アンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片では、当技術分野で公知の技術を使用して、エフェクタ機能を低下するようにＦｃ部分を突然変異することができる。例えば、定常領域の修飾を使用して、ジスフィルド結合またはオリゴ糖部分を修飾し、抗原特異性または抗体の柔軟性の改善によって局在性の増強を可能にし得る。修飾の結果として生じる生理学的プロファイル、バイオアベイラビリティ、および他の生化学的効果は、過度の実験を伴わずに、周知の免疫学的技術を使用して容易に測定および定量することができる。
【０３１０】
ある特定の実施形態では、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片は、処置される動物、例えばヒトにおいて有害な免疫反応を引き起こさない。一実施形態では、当技術分野で認められている技術を使用して、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片を修飾して、それらの免疫原性を低下させることができる。例えば、抗体をヒト化、霊長類化、脱免疫化することもできるし、またはキメラ抗体を作製することもできる。これらの種類の抗体は、親抗体の抗原結合特性を保持または実質的に保持するが、ヒトでは免疫原性が低い非ヒト抗体、典型的にはマウスまたは霊長類抗体に由来する。これは、（ａ）非ヒト可変ドメイン全体をヒト定常領域に移植してキメラ抗体を作製すること；（ｂ）重要なフレームワーク残基の保持の有無にかかわらず、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ以上の少なくとも一部をヒトフレームワークおよび定常領域に移植すること；または、（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってヒト様区分でそれらを「クロークキングする」ことを含む様々な方法によって達成することができる。このような方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１６９−２１７（１９９４）、ならびに米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，６９３，７６２号および米国特許第６，１９０，３７０号（これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０３１１】
改変型の抗体またはその抗原結合断片は、当技術分野で公知の技術を使用して全前駆体または親抗体から作製することができる。例示的な技術は、本明細書でより詳細に論じられる。
【０３１２】
ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片は、当技術分野で公知の技術を使用して作製または製造することができる。ある特定の実施形態では、抗体分子またはその断片は「組換え生産」される（すなわち、組換えＤＮＡ技術を使用して生産される）。抗体分子またはその断片を作製するための例示的な技術は、本明細書でより詳細に論じられる。
【０３１３】
ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニスト抗体またはその断片は、ポリクローナル抗体の作製、または例えばハイブリドーマもしくはファージディスプレイによるモノクローナル抗体の調製（ｐｒｅｐｒａｔｉｏｎ）を含む当技術分野で公知の任意の適切な方法によって作製することができる。
【０３１４】
抗体分子を発現させるために、様々な宿主−発現ベクター系を利用することができる。２つの発現ベクター（重鎖由来のポリペプチドをコードする第１のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第２のベクター）で宿主細胞をコトランスフェクトすることができる。２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの同等の発現を可能にする同一の選択可能なマーカーを含有し得る。あるいは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一ベクターを使用することができる。このような状況では、有利には、過剰な毒性遊離重鎖を回避するために、軽鎖を重鎖の前に配置する（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１９７（１９８０））。重鎖由来のポリペプチドおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする単一ベクターで宿主細胞をトランスフェクトすることもできる。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。
【０３１５】
１つ以上の発現ベクターを従来の技術によって宿主細胞に導入し、次いで、トランスフェクトした細胞を従来の技術によって培養して抗体を産生させる。したがって、抗体またはその重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドであって、異種プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含有する宿主細胞が提供される。二重鎖抗体を発現するためのある特定の実施形態では、免疫グロブリン分子全体を発現させるために、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターを宿主細胞において同時発現させることができる。
【０３１６】
抗体が組換え発現されたら、当技術分野で公知の任意の免疫グロブリン分子精製法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、特にプロテインＡ後の特定の抗原に対するアフィニティ、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差示的溶解性によって、または任意の他の標準的なタンパク質精製技術によって、それを精製することができる。あるいは、抗体の親和性を増加させるための方法が米国特許出願公開第２００２／０１２３０５７号Ａ１に開示されている。
【０３１７】
一実施形態では、結合分子または抗原結合分子は、１つ以上のドメインが部分的または全体的に欠損している合成定常領域を含む（「ドメイン欠損抗体」）。ある特定の実施形態では、適合性修飾抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が除去されているドメイン欠損構築物または変異体（ΔＣＨ２構築物）を含む。他の実施形態について、可変領域の動作の柔軟性および自由度を提供するために、短い連結ペプチドを欠損ドメインの代わりとすることができる。当業者であれば、抗体の異化率に対するＣＨ２ドメインの調節特性のために、このような構築物がある特定の状況下では望ましい場合があることを認識するであろう。ドメイン欠損構築物は、ＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコードするベクター（例えば、Ｂｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）を使用して得ることができる（例えば、国際公開第０２／０６０９５５号Ａ２および国際公開第０２／０９６９４８号Ａ２を参照のこと）。ＣＨ２ドメインを欠損させ、ドメイン欠損ＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターを提供するように、この例示的なベクターを操作した。
【０３１８】
本明細書に記載される抗体分子（例えば、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる抗体の使用であって、前記抗体またはその断片がＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドに免疫特異的に結合する使用も本明細書に提供される。
【０３１９】
ＶＩ．ポリペプチドおよび抗体コンジュゲートおよび融合体
異種ポリペプチドに融合されてＬＩＮＧＯ−２融合タンパク質を形成するＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド（例えば、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリペプチド）も本明細書で提供される。異種ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｔｉｄｅｓ）に融合された抗ＬＩＮＧＯ−２抗体も提供される（ｐｒｏｖｉｅｄ）。様々な目的、例えば、血清半減期の増加、バイオアベイラビリティの改善、特定の器官または組織型に対するインビボ標的化、組換え発現効率の改善、宿主細胞分泌の改善、精製容易性およびより高いアビディティを達成するために、ＬＩＮＧＯ−２融合タンパク質および抗体融合体を使用することができる。達成するべき目的に応じて、異種ポリペプチドは、不活性または生物学的に活性であり得る。また、ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドもしくは抗体に安定的に融合されるか、またはインビトロもしくはインビボで切断可能であるようにそれを選択することができる。異なる目的を達成するための異種部分は、当技術分野で公知である。
【０３２０】
ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニスト融合ポリペプチドまたは抗体の発現の代案として、選択された異種ポリペプチドを予め形成し、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリペプチドまたは抗体に化学的にコンジュゲートすることができる。ほとんどの場合、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリペプチドまたは抗体に融合またはコンジュゲートするかにかかわらず、選択された異種ポリペプチドは同様に機能するであろう。したがって、異種アミノ酸配列についての以下の議論では、特に断りのない限り、融合タンパク質の形態で、または化学的なコンジュゲートとして、異種配列をＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリペプチドまたは抗体に結合することができると理解するべきである。
【０３２１】
いくつかの方法は、Ｉｇ重鎖定常領域のＦｃ領域（すなわち、Ｃ末端部分）に融合されたＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドを用いる。一実施形態では、可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドは、ヒンジおよびＦｃ領域に融合される。ＬＩＮＧＯ−２−Ｆｃ融合体の潜在的な利点としては、溶解性、インビボ安定性、および多価性、例えば二量体化が挙げられる。使用されるＦｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＧ  Ｆｃ領域であり得る（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）。あるいは、ＩｇＥまたはＩｇＭ  Ｆｃ領域であり得る（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４）。例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域などのＩｇＧ  Ｆｃ領域も使用することができる。Ｆｃ融合体をコードするＤＮＡを構築および発現するための材料および方法は当技術分野で公知であり、過度の実験を伴わずに、ＬＩＮＧＯ−２融合体を得るために適用することができる。いくつかの方法は、Ｃａｐｏｎらの米国特許第５，４２８，１３０号および米国特許第第５，５６５，３３５号に記載されているものなどのＬＩＮＧＯ−２融合タンパク質を用いる。
【０３２２】
完全にインタクトな野生型Ｆｃ領域は、Ｆｃ融合タンパク質に不要なまたは望まれない場合があるエフェクタ機能を示す。したがって、融合タンパク質中のＦｃ領域から、ある特定の結合部位を削除することができる。例えば、軽鎖との同時発現は不要であるため、重鎖結合タンパク質の結合部位Ｂｉｐ（Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔら、１９８７，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ８：１１１−１１４）を、この部位が効率的な分泌を妨げないようにＩｇＥのＦｃ領域のＣＨ２ドメインから削除する。同様に、免疫グロブリンの軽鎖に対する結合に関与するＦｃ領域に存在するシステイン残基を、これらのシステイン残基がＦｃ領域の適切なフォールディングを妨げないように削除することもできるし、または別のアミノ酸で置換することもできる。ＩｇＭに存在するものなどの膜貫通ドメイン配列も削除することができる。
【０３２３】
ある特定の実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を使用する。あるいは、免疫グロブリンγの他のサブクラス（γ−２、γ−３、およびγ−４）のＦｃ領域を分泌カセットに使用することができる。免疫グロブリンγ−１のＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、ヒンジ領域の少なくとも一部と、ＣＨ２領域と、ＣＨ３領域とを含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンγ−１のＦｃ領域は、ヒンジ領域の一部とＣＨ３領域とを含むがＣＨ２領域を含まないＣＨ２欠損Ｆｃである。ＣＨ２欠損Ｆｃは、Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  １：４７（１９９０）によって記載されている。いくつかの実施形態では、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭの１つのＦｃ領域を使用する。
【０３２４】
ＬＩＮＧＯ−２−Ｆｃ融合タンパク質は、いくつかの異なる構造で構築することができる。一構造では、可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドのＣ末端は、ＦｃヒンジポリペプチドのＮ末端に直接融合される。わずかに異なる構造では、可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドのＮ末端とＦｃポリペプチドのＣ末端との間において、短いポリペプチド、例えば、２〜１０アミノ酸を融合体に組み込む。このようなリンカーは、いくつかの状況において生物学的活性を改善し得る立体構造の柔軟性を提供する。ヒンジ領域の十分な部分がＦｃポリペプチド中に保持される場合、ＬＩＮＧＯ−２−Ｆｃ融合体は二量体化して二価分子を形成する。単量体Ｆｃ融合体の相同集団は、単一特異性二価二量体をもたらすであろう。それぞれ異なる特異性を有する２つの単量体Ｆｃ融合体の混合物は、二重特異性二価二量体をもたらすであろう。
【０３２５】
ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドおよび抗ＬＩＮＧＯ−２抗体ポリペプチド抗体は、異種ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端にさらに組換え融合され得る。例えば、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリペプチドまたは抗体は、検出アッセイで標識として有用な分子、およびエフェクタ分子、例えば異種ポリペプチド、薬剤、放射性核種、または毒素に組換え融合またはコンジュゲートされ得る。例えば、国際公開第９２／０８４９５号；国際公開第９１／１４４３８号；国際公開第８９／１２６２４号；米国特許第５，３１４，９９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照のこと。
【０３２６】
ＬＩＮＧＯ−２の機能を阻害するＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリペプチドまたは抗体融合体を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる融合タンパク質も提供される。ある特定の実施形態では、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリペプチドまたは抗体が融合された異種ポリペプチドは、機能的に有用であるか、またはＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリペプチドもしくは抗体を標的とするのに有用である。ある特定の実施形態では、ＬＲＲドメイン、Ｉｇドメインもしくは細胞外ドメイン全体（配列番号２のアミノ酸２８〜５４５に対応する）を含む可溶性ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリペプチド、例えばＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド、または本明細書に記載される任意の他のＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド断片、変異体もしくは誘導体は、異種ポリペプチドポリペプチドに融合されて、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニスト融合ポリペプチドを形成する。シグナル配列は、小胞体膜を通るタンパク質輸送を開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。免疫融合を構築するのに有用なシグナル配列としては、抗体軽鎖シグナル配列、例えば、抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１２５：１９１−２０２（１９８９））、抗体重鎖シグナル配列、例えば、ＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８６：５７７４（１９８０））が挙げられる。あるいは、他のシグナル配列を使用することができる。例えば、Ｗａｔｓｏｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：５１４５（１９８４）を参照のこと。シグナルペプチドは、通常、シグナルペプチダーゼによって小胞体内腔で切断する。この結果、Ｆｃ領域および可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドを含有する免疫融合タンパク質が分泌される。
【０３２７】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列は、融合タンパク質とＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドとの間のタンパク質分解切断部位をコードする。切断部位は、コードされる融合タンパク質のタンパク質分解切断を提供し、これにより、融合ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）を標的タンパク質から分離する。
【０３２８】
ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリペプチドまたは抗体がＬＩＮＧＯ−２の生物学的機能を阻害するのを共有結合が妨げないように、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリペプチドおよび抗体は、すなわち、任意の種類の分子の共有結合によって修飾される誘導体を含む。例えば、限定されないが、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリペプチドおよび抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、ホスフィル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質に対する結合などによって修飾され得る。多数の化学修飾のいずれも、限定されないが、特定の化学分解、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む公知の技術によって行われ得る。加えて、誘導体は、１つ以上の非古典的なアミノ酸を含有し得る。
【０３２９】
いくつかの実施形態は、１つ以上のポリマーがＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドまたは抗体にコンジュゲート（共有結合）された可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドまたはＬＩＮＧＯ−２抗体に関する。このようなコンジュゲーションに適切なポリマーの例としては、ポリペプチド（上記）、糖ポリマー、およびポリアルキレングリコール鎖が挙げられる。典型的には、以下のもの：溶解性、安定性、またはバイオアベイラビリティの１つ以上を改善する目的で、ポリマーを可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドまたはＬＩＮＧＯ−２抗体にコンジュゲートするが、必ずしもそうではない。
【０３３０】
ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリペプチドまたは抗体に対するコンジュゲーションに一般に使用されるポリマーのクラスは、ポリアルキレングリコールである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、最も頻繁に使用される。ＰＥＧ部分、例えば、１個、２個、３個、４個、または５個のＰＥＧポリマーを各ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリペプチドまたは抗体にコンジュゲートして、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリペプチドまたは抗体単独と比較して、血清半減期を増加させることができる。ＰＥＧ部分は非抗原性であり、本質的には生物学的に不活性である。ＰＥＧ部分は、分岐状または非分岐状であり得る。
【０３３１】
ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリペプチドまたは抗体に付着されたＰＥＧ部分の数、および個々のＰＥＧ鎖の分子量は変化し得る。一般に、ポリマーの分子量が高いほど、ポリペプチドに付着されたポリマー鎖が少ない。通常、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリペプチドまたは抗体に付着された総ポリマー質量は、２０ｋＤａ〜４０ｋＤａである。したがって、１本のポリマー鎖を付着する場合、その鎖の分子量は、一般に２０〜４０ｋＤａである。２本の鎖を付着する場合、各鎖の分子量は、一般に１０〜２０ｋＤａである。３本の鎖を付着する場合、分子量は、一般に７〜１４ｋＤａである。
【０３３２】
ポリペプチド上の任意の適切な露出反応基を通して、ポリマー、例えばＰＥＧをＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリペプチドまたは抗体に連結することができる。露出反応基は、例えば、内部リシン残基のＮ末端アミノ基もしくはエプシロンアミノ基、またはその両方であり得る。活性化ポリマーは、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリペプチドまたは抗体上の任意の遊離アミノ基において反応および共有結合することができる。ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリペプチドまたは抗体の遊離カルボキシル基、適切に活性されたカルボニル基、ヒドロキシル、グアニジル、イミダゾール、酸化カーボハイドレート部分、およびメルカプト基も（利用可能な場合には）、ポリマー付着用の反応基として使用することができる。
【０３３３】
コンジュゲーション反応では、典型的には、１モルのポリペプチド当たり約１．０〜約１０モルの活性ポリマーが、ポリペプチド濃度に応じて用いられる。通常、選択された比率は、反応の最大化と、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリペプチドまたは抗体の所望の薬理学的活性を障害し得る（多くの場合には非特異性な）副作用の最小化との間のバランスを表す。ある特定の実施形態では、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリペプチドまたは抗体の（例えば、本明細書に記載されるか、または当技術分野で公知のアッセイのいずれかで実証した場合の）生物学的活性の少なくとも５０％が保持される。さらなる実施形態では、ほぼ１００％が保持される。
【０３３４】
ＶＩＩ．ＬＩＮＧＯ−２ポリヌクレオチドアンタゴニスト
ポリヌクレオチドはまた、ＬＩＮＧＯ−２機能をアンタゴナイズするのに使用することができる。したがって、ＬＩＮＧＯ−２ポリヌクレオチドアンタゴニストは、運動ニューロンの生存を促進し、および／または運動ニューロンの軸索成長を促進することができる。具体的な実施形態は、運動ニューロン関連障害を処置する方法であって、ＬＩＮＧＯ−２をコードするポリヌクレオチドに特異的に結合することができる核酸分子を含む有効量のＬＩＮＧＯ−２ポリヌクレオチドアンタゴニストを投与することを含む方法を含む。ＬＩＮＧＯ−２ポリヌクレオチドアンタゴニストは、ＬＩＮＧＯ−２の発現を抑制することができる（ノックダウン）。ある特定の実施形態では、ＬＩＮＧＯ−２ポリヌクレオチドアンタゴニストは、例えば、哺乳動物における運動ニューロンの生存および／または運動ニューロンの軸索成長を促進する。ＬＩＮＧＯ−２ポリヌクレオチドアンタゴニストとしては、限定されないが、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびＲＮＡｉが挙げられる。典型的には、このような結合分子を動物に別個に投与するが（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）を参照のこと）、宿主細胞によって取り込まれてインビボで発現されるポリヌクレオチドから、このような結合分子をインビボで発現させることもできる。Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）も参照のこと。
【０３３５】
ＲＮＡｉを媒介する分子（限定されないが、ｓｉＲＮＡを含む）は、化学合成（Ｈｏｈｊｏｈ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５２１：１９５−１９９，２００２）、ｄｓＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：９９４２−９９４７，２００２）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写（Ｄｏｎｚｅｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：ｅ４６，２００２；Ｙｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：６０４７−６０５２，２００２）、およびＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＩＩＩなどのヌクレアーゼを使用した二本鎖ＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：９９４２−９９４７，２００２）によって、インビトロで生産することができる。
【０３３６】
ｓｉＲＮＡ分子はまた、２つのオリゴヌクレオチドを互いにアニーリングすることによって形成することができ、典型的には、二本鎖および一本鎖部分の両方を含む以下の一般構造を有する：
【化７】
2019150055.tif 000014
【０３３７】
式中、Ｎ、Ｘ、およびＹはヌクレオチドであり、ＸはＹに水素結合し、「：」は２つの塩基間の水素結合を示し、ｘは１〜約１００の値を有する自然数であり、ｍおよびｎは独立して０〜約１００の値を有する全整数である。いくつかの実施形態では、Ｎ、Ｘ、およびＹは独立して、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴまたはＵである。特に、合成ｓｉＲＮＡ（たとえば、２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングの産物）の場合、天然に存在しない塩基およびヌクレオチドが存在し得る。二本鎖の中央区分は「コア」と称され、測定単位として塩基対（ｂｐ）を有する；一本鎖部分は、測定単位としてヌクレオチド（ｎｔ）を有するオーバーハングである。示されているオーバーハングは３’オーバーハングであるが、５’オーバーハングを有する分子も企図される。オーバーハングを有しないｓｉＲＮＡ分子（すなわち、ｍ＝０およびｎ＝０）、およびコアの片側にはオーバーハングを有するが、他方の側には有しないもの（例えば、ｍ＝０およびｎ≧１、またはその逆もまた同様）も企図される。
【０３３８】
Ｐａｄｄｉｓｏｎら、（Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．１６：９４８−９５８，２００２）は、ＲＮＡｉを生じさせる手段としてヘアピン状にフォールディングした低分子ＲＮＡ分子を使用した。したがって、このような短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子もまた、本明細書で提供される方法において有利に使用される。機能的ｓｈＲＮＡのステムおよびループの長さは多様であり、ステムの長さは約２５〜約３０ｎｔのいずれかの範囲であり得、ループの大きさは、サイレンシング活性に影響を及ぼさない約４〜約２５ｎｔの範囲であり得る。いかなる理論にも束縛されるものではないが、これらのｓｈＲＮＡはＤＩＣＥＲ
ＲＮａｓｅのｄｓＲＮＡ産物に似ており、いずれの事象においても、特定の遺伝子の発現の阻害について同じ能力を有すると考えられている。
【０３３９】
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡは、レンチウイルスベクター（例えば、ｐＬＬ３．７）から発現される。
【０３４０】
アンチセンス技術を使用して、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって、または三重らせん形成によって、遺伝子発現を制御することができる。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）で論じられている。三重らせん形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３００（１９９１）で論じられている。該方法は、ポリヌクレオチドの相補的ＤＮＡまたはＲＮＡに対する結合に基づくものである。
【０３４１】
例えば、ＬＩＮＧＯ−２をコードするポリヌクレオチドの５’コード部分を使用して、長さが約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計することができる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを転写に関与する遺伝子領域に対して相補的になるように設計し、それにより、標的タンパク質の転写および産生を阻止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子の標的ポリペプチドへの翻訳を遮断する。
【０３４２】
アンチセンス分子の絶対的な相補性は必要ではない。ＬＩＮＧＯ−２をコードするＲＮＡの少なくとも一部に対に対して相補的な配列は、ＲＮＡとハイブリダイズして安定的な二重鎖または三重鎖を形成するのに十分な相補性を有する配列を意味する。ハイブリダイズ能は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存するであろう。一般に、ハイブリダイズする核酸が大きいほど、それが含有し得る塩基ミスマッチが多くなるが、安定的な二重鎖（または場合により三重鎖）を依然として形成する。当業者であれば、ハイブリダイズした複合体の融点を決定するために、標準的技術を使用することによって許容可能なミスマッチの程度を確認することができる。
【０３４３】
メッセンジャーＲＮＡの５’末端、例えば、ＡＵＧ開始コドンまでを含む５’非翻訳配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドが、翻訳の阻害に最も効率的に機能するはずである。しかしながら、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に対して相補的な配列も、ｍＲＮＡの翻訳の阻害に有効であることが示されている。一般に、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３３−３３５（１９９４）を参照のこと。したがって、５’または３’のいずれかの非翻訳非コード領域に対して相補的なオリゴヌクレオチドを、ＬＩＮＧＯ−２の翻訳を阻害するアンチセンスアプローチにおいて使用することができる。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に対して相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補体を含むはずである。ｍＲＮＡコード領域に対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、効率の低い翻訳の阻害因子であるが、使用することができる。アンチセンス核酸は、典型的には少なくとも６ヌクレオチド長、例えば、約６〜約５０ヌクレオチド長である。具体的な態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０３４４】
本明細書に開示される治療方法に使用するためのポリヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは改変型であり得、一本鎖または二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子、ハイブリダイゼーションなどの安定性を改善するために、塩基性ポリペプチド、糖ポリペプチド、またはリン酸骨格において修飾され得る。オリゴヌクレオチドは、ペプチドなどの他の付随基（ａｐｐｅｎｄｅｄ  ｇｒｏｕｐ）（例えば、インビボで宿主細胞受容体を標的とするためのもの）、または細胞膜を通過する輸送を促進する薬剤、（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２（１９８７））；１９８８年１２月１５日公開の国際公開第８８／０９８１０号を参照のこと）、または血液脳関門（例えば、１９８８年４月２５日公開の国際公開第８９／１０１３４号を参照のこと）、ハイブリダイゼーション誘導性の切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６（１９８８）を参照のこと）、または挿入剤（例えば、Ｚｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９（１９８８）を参照のこと）を含み得る。この目的のために、別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘導性の架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘導性の切断剤などに、オリゴヌクレオチドをコンジュゲートすることができる。
【０３４５】
ポリヌクレオチド組成物は、触媒性ＲＮＡ、またはリボザイムをさらに含む（例えば、１９９０年１０月４日公開の国際公開第９０／１１３６４号；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１２２２−１２２５（１９９０）を参照のこと）。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する隣接領域によって決定付けられる位置でｍＲＮＡを切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが以下の２塩基の配列５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および生産は当技術分野で周知であり、Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１（１９８８）により詳細に記載されている。ある特定の実施形態では、すなわち、効率を高めて非機能的ｍＲＮＡ転写産物の細胞内蓄積を最小限に抑えるために、リボザイムは、切断可能な認識部位が標的ｍＲＮＡの５’末端近傍に位置するように操作される。
【０３４６】
アンチセンスアプローチと同様に、リボザイムは、（例えば、改善された安定性、標的化などについての）修飾オリゴヌクレオチドから構成され得、インビボでＬＩＮＧＯ−２を発現する細胞に送達することができる。リボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、ＤＮＡをコードするアンチセンスの導入について上に記載したのと同じように細胞に導入することができる。１つの送達方法は、トランスフェクトした細胞が、内因性ＬＩＮＧＯ−２のメッセージを破壊し、翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生するように、例えばｐｏｌ  ＩＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩプロモーターなどの強力な構成的または誘導性プロモーターの制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使用することを含む。アンチセンス分子とは異なり、リボザイムは触媒性であるため、より低い細胞内濃度が効率に必要とされる。
【０３４７】
ＶＩＩＩ．ＬＩＮＧＯ−２アプタマーアンタゴニスト
別の実施形態では、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、アプタマーである。アプタマーは、独特の配列を有し、所望の標的（例えば、ポリペプチド）に対して特異的に結合する特性を有し、所定の標的の特異的リガンドであるヌクレオチドまたはポリペプチドであり得る。ヌクレオチドアプタマーとしては、ＬＩＮＧＯ−２に結合する二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＲＮＡ分子が挙げられる。ある特定の実施形態では、ＬＩＮＧＯ−２アプタマーアンタゴニストは、例えば、哺乳動物における運動ニューロンの生存および／または運動ニューロンの軸索成長を促進する。
【０３４８】
核酸アプタマーは、当技術分野で公知の方法を使用して、例えば試験管内進化（ＳＥＬＥＸ）法によって選択される。ＳＥＬＥＸは、例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、米国特許第５，５８０，７３７号、米国特許第５，５６７，５８８号、米国特許第５，７０７，７９６号、米国特許第５，７６３，１７７号、米国特許第６，０１１，５７７号および米国特許第６，６９９，８４３号（これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、標的分子に高特異的に結合する核酸分子のインビトロ進化方法である。アプタマーを同定するための別のスクリーニング方法が、米国特許第５，２７０，１６３号に記載されている（これも参照により本明細書に組み込まれる）。ＳＥＬＥＸ法は、様々な二次元および三次元構造を形成する核酸の能力、ならびにモノマーまたはポリマーにかかわらず、他の核酸分子およびポリペプチドを含む、事実上任意の化合物とのリガンドとして作用する（特異的結合対を形成する）、ヌクレオチドモノマー内で利用可能な化学的多様性に基づくものである。任意の大きさまたは組成の分子が、標的として役立ち得る。
【０３４９】
ＬＩＮＧＯ−２のタンパク質構造を使用して、ＬＩＮＧＯ−２に作用するアプタマーついてのＳＥＬＥＸ法を使用したスクリーニングによって、ＬＩＮＧＯ−２媒介過程を阻害するアプタマーの同定が可能になるであろう。
【０３５０】
ポリペプチドアプタマーは、ＬＩＮＧＯ−２に結合しそれによりその作用を遮断する能力について選択されたランダムペプチドである。ポリペプチドアプタマーは、両端でタンパク質骨格に付着した短い可変ペプチドドメインを含み得る。この二重の構造的制約が、ペプチドアプタマーの結合親和性を、抗体に匹敵するレベル（ナノモル範囲）まで大きく高める。例えば、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ  Ｆら、（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ７８（８）：４２６−４３０を参照のこと。短い可変ペプチドの長さは、典型的には約１０〜２０アミノ酸であり、骨格は、優れた溶解性および緻密特性を有する任意のタンパク質であり得る。骨格タンパク質の非限定的な一例は、細菌タンパク質であるチオレドキシン−Ａである。例えば、Ｃｏｈｅｎ  ＢＡら、（１９９８）ＰＮＡＳ  ９５（２４）：１４２７２−１４２７７を参照のこと。
【０３５１】
ポリペプチドアプタマーは、タンパク質機能の主要な阻害因子として作用するペプチドまたは低分子ポリペプチドである。ペプチドアプタマーは、標的タンパク質に特異的に結合し、その機能的能力を遮断する（Ｋｏｌｏｎｉｎら、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１４，２６６−１４，２７１）。当技術分野で公知の様々な技術によって、標的タンパク質に対して高い親和性および特異性で結合するペプチドアプタマーを単離することができる。ペプチドアプタマーは、酵母ツーハイブリッドスクリーニング（Ｘｕ，Ｃ．Ｗら、（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１２，４７３−１２，４７８）、またはリボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓら、（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：４９３７−４９４２）によって、ランダムペプチドライブラリーから単離することができる。また、それらは、ファージライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒら、（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１−２０）、または化学的に作製されたペプチドライブラリーから単離することもできる。加えて、ポリペプチドアプタマーは、リガンド調節ペプチドアプタマー（ＬｉＲＰＡ）の選択を使用して選択することができる。例えば、Ｂｉｎｋｏｗｓｋｉ  ＢＦら、（２００５）Ｃｈｅｍ＆Ｂｉｏｌ  １２（７）：８４７−８５５（これは、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。ペプチドアプタマーを合成する手段が困難であるために、それらの使用はポリヌクレオチドアプタマーよりも複雑であるが、これらは無制限の化学的多様性を有する。ポリヌクレオチドアプタマーは、４つのヌクレオチド塩基のみを利用するために限定的であるが、ペプチドアプタマーはかなり幅広いレパートリーを有する（すなわち、２０種のアミノ酸）。
【０３５２】
他のポリペプチドについて本明細書のあらゆる場所で記載されているように、ペプチドアプタマーは修飾され得る（例えば、ポリマーにコンジュゲートされ得るか、またはタンパク質に融合され得る）。
【０３５３】
ＩＸ．ベクターおよび宿主細胞
宿主発現系は、目的のコード配列を生産し、続いて精製することができるビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされると、インサイチューでＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリペプチドまたは抗体を発現することができる細胞も表す。これらとしては、限定されないが、抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの微生物、抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）、抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））に感染した、または抗体コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系、あるいは哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモータ）もしくは哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）由来のプロモーターを含有する組換え発現構築物を宿す哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が挙げられる。例えば、組換え抗体分子全体を発現するためのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなどの細菌細胞または真核細胞が、組換え抗体分子の発現に使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞を、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要な中間初期遺伝子プロモーター要素などのベクターと併せたものは、有効な抗体発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２（１９９０））。
【０３５４】
ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニスト、例えば、可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−２抗体、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチド、またはＬＩＮＧＯ−２アプタマーをコードする核酸を含むベクターを使用して、アンタゴニストを生産することができる。このような核酸が作動可能に連結されるベクターおよび発現制御配列の選択は、所望の機能特性、例えば、タンパク質発現、および形質転換される宿主細胞に依存する。
【０３５５】
作動可能に連結されたコード配列の発現の調節に有用な発現制御要素は、当技術分野で公知である。例としては、限定されないが、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、および他の調節要素が挙げられる。誘導性プロモーターを使用する場合、例えば、宿主細胞培地における栄養状態の変化または温度の変化によって、それを制御することができる。
【０３５６】
一実施形態では、ＮＥＯＳＰＬＡ（米国特許第６，１５９，７３０号）と称されるＢｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．の特許発現ベクターを使用することができる。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモータ／エンハンサー、マウスβグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエクソン１およびエクソン２、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、およびリーダー配列を含有する。このベクターは、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトすると高レベルの発現をもたらすことが見出されており、続いてＧ４１８含有培地で選択し、メトトレキサート増幅する。当然のことながら、細胞中で発現を引き起こすことができる任意の発現ベクターを使用することができる。適切なベクターの例としては、限定されないが、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、およびｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）、およびプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）が挙げられる。さらなる細胞発現ベクターが当技術分野で公知であり、市販されている。典型的には、このようなベクターは、所望のＤＮＡセグメントを挿入するための便利な制限部位を含有する。例示的なベクターとしては、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１、ｐｍｌ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ３１２５５）、レトロウイルス発現ベクターｐＭＩＧおよびｐＬＬ３．７、アデノウイルスシャトルベクターｐＤＣ３１５、ＡＡＶベクター、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９（ＢｉｏＲａｄ）、ｐＰＬおよびｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。他の例示的なベクター系は、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示されている。
【０３５７】
Ｘ．遺伝子治療
運動ニューロンの生存および／または運動ニューロンの軸索成長を促進することが治療上有益な神経系疾患、障害または傷害を処置するための遺伝子治療法を使用して、例えば、ヒト患者などの哺乳動物において、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストをインビボで生産することができる。これは、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストをコードする適切な核酸であって、適切な発現制御配列に作動可能に連結された核酸を投与することを含む。一般に、これらの配列が、ウイルスベクターに組み込まれる。このような遺伝子治療に適切なウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタインバール（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ）ウイルスベクター、パポーバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターは、複製不全ウイルスベクターであり得る。そのＥ１遺伝子またはＥ３遺伝子に欠損を有するアデノウイルスベクターが、典型的に使用される。アデノウイルスベクターを使用する場合、ベクターは、通常、選択可能なマーカー遺伝子を有しない。
【０３５８】
ＸＩ．医薬組成物
ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、ヒトを含む哺乳動物に投与するための医薬組成物に製剤化することができる。医薬組成物は、例えば、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の一部グリセリド混合物、水、硫酸プロタミンなどの塩、または電解質、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂などを含む、薬学的に許容され得る担体を含む。
【０３５９】
組成物は、任意の適切な方法によって、例えば、非経口的、脳室内、経口的、吸入スプレーによって、局所的、経直腸的、経鼻腔的、頬側、経膣的、または埋込型容器を介して投与され得る。本明細書で使用される場合、用語「非経口的」は、皮下、経静脈、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、肝内、髄板内、および頭蓋内注射または注入技術を含む。前述のように、本明細書で提供される方法で使用されるＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、神経系で作用して運動ニューロンの生存および／または運動ニューロンの軸索成長を促進する。したがって、ある特定の方法では、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、それらが血液脳関門を通過するように投与される。この通過は、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニスト分子自体が本来有する物理化学特性、医薬製剤中の他の構成要素、または血液脳関門を破るための針、カニューレ、または手術器具などの機械的装置の使用に起因し得る。ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストが本質的に血液脳関門を通過しない分子（例えば、通過を促進するポリペプチドとの融合体）である場合、適切な投与経路は、例えば髄腔内または頭蓋内である。ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストが本質的に血液脳関門を通過する分子である場合、投与経路は、以下に記載される様々な経路の１つ以上によるものであり得る。
【０３６０】
本明細書で提供される方法で使用される組成物の無菌注入形態は、水性または油性の懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤、および懸濁剤を使用して、当技術分野で公知の技術にしたがって製剤化され得る。また、無菌注入調製物は、非毒性の非経口的に許容され得る希釈剤または溶媒の無菌注入溶液または懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール懸濁液であり得る。用いることができる許容され得るビヒクルおよび溶媒には、水、リンガー溶液、および等浸透圧の塩化ナトリウム溶液がある。加えて、無菌の固定油が、溶媒または懸濁培地として従来用いられている。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無菌性固定油を用いることができる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、オリーブオイルまたはキャスターオイルなどの薬学的に許容され得る油と同様に、特にそれらのポリオキシエチル化版での注入剤の調製に有用である。また、これらの油溶液または懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤または分散剤、例えばカルボキシメチルセルロース、または乳化剤および懸濁液を含む薬学的に許容され得る剤形の製剤で一般に使用される類似の分散剤も含有し得る。また、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ、および他の乳化剤などの他の一般に使用される界面活性剤、または薬学的に許容され得る固体、液体もしくは他の剤形の製造に一般に使用されるバイオアベイラビリティエンハンサーを製剤化の目的で使用することもできる。
【０３６１】
非経口製剤を単回ボーラス投与、注入または負荷ボーラス投与した後に維持用量とすることができる。これらの組成物は、特定の一定間隔または変動間隔、例えば、１日１回、または「必要に応じて」投与され得る。
【０３６２】
ある特定の医薬組成物は、例えば、カプセル、錠剤、水性懸濁液、または溶液を含む、許容され得る剤形で経口投与され得る。ある特定の医薬組成物はまた、鼻エアロゾルまたは吸入によって投与され得る。このような組成物は、生理食塩水溶液として、ベンジルアルコールもしくは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを増強するための吸収促進剤ならびに／または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を使用して調製され得る。
【０３６３】
担体材料と組み合わせて単一剤形を産生することができるＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストの量は、処置される宿主、使用されるアンタゴニストの種類、および特定の投与様式に応じて変化するであろう。組成物は、単回投与、複数回投与、または確立された期間にわたって注入で投与され得る。また、投与量計画は、最適な所望の反応（例えば、治療または予防反応）を提供するように調整することもできる。
【０３６４】
本明細書で提供される方法は、「治療有効量」または「予防有効量」のＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを使用する。このような治療有効量または予防有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重などの要因にしたがって変化し得る。また、治療有効量または予防有効量は、治療上有益な効果が任意の毒性または有害な影響を上回る量である。
【０３６５】
任意の特定患者に対する具体的な投与量および処置計画は、使用される特定のＬＩＮＧＯ−２アンタゴニスト、患者の年齢、体重、一般な健康状態、性別、および食事、投与時間、排出率、薬物の組み合わせ、および処置される特定の疾患の重度を含む様々な要因に依存するであろう。医療従事者によるこのような要因の判断は、当技術分野における通常技術の範囲内である。この量はまた、処置されるべき個々の患者、投与経路、製剤の種類、使用される化合物の特徴、疾患の重度、および所望の効果に依存するであろう。使用量は、当技術分野で周知の薬理学的および薬物動態学的原理によって決定することができる。
【０３６６】
ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、神経系に直接投与することもできるし、大脳心室内もしくは髄腔内投与することもできるし、または全身投与することもできる。投与用組成物は、１日に体重１ｋｇ当たり０．００１〜１０ｍｇの投与量のＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストが投与されるように製剤化することができる。いくつかの実施形態では、投与量は、１日に体重１ｋｇ当たり０．０１〜１．０ｍｇである。いくつかの実施形態では、投与量は、１日に体重１ｋｇ当たり０．００１〜０．５ｍｇである。
【０３６７】
ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニスト抗体を使用する処置の場合、投与量は、宿主の体重１ｋｇ当たり、例えば、約０．０００１〜１００ｍｇ、より普通には０．０１〜５ｍｇ（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇなど）の範囲であり得る。例えば、投与量は、体重１ｋｇ当たり１ｍｇ、または体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ、あるいは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、例えば少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。上記範囲の中間にある用量も有用である。このような投与量を、毎日、１日おき、１週間に１回、または実験分析によって決定された任意の他のスケジュールにしたがって、被験体に投与することができる。例示的な処置は、長期間、例えば少なくとも６カ月をかけて、複数回投与での投与を含む。さらなる例示的な処置計画は、２週間毎に１回、または１カ月に１回、あるいは３〜６カ月毎に１回の投与を含む。例示的な投与量スケジュールとしては、連日１〜１０ｍｇ／ｋｇもしくは１５ｍｇ／ｋｇ、１日おきに３０ｍｇ／ｋｇ、または１週間に１回６０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、この場合、投与される各抗体の投与量は、示した範囲内に含まれる。
【０３６８】
ある特定の実施形態では、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストポリヌクレオチドをコードする核酸分子を用いて被験体を処置することができる。核酸の用量は、患者当たり約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、または３０〜３００μｇのＤＮＡの範囲である。感染性ウイルスベクターの用量は、１用量当たり１０〜１００ビリオンまたはそれ以上で変化する。
【０３６９】
また、補足的な活性化合物を、組成物に組み込むこともできる。例えば、可溶性ＬＩＮＧＯ−２ポリペプチドまたは融合タンパク質を、１つ以上のさらなる治療剤と共製剤化および／または同時投与することができる。
【０３７０】
ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを選択した標的組織に送達するのに適切な任意の送達方法、例えば、水溶液のボーラス注射または制御放出系の埋め込みを使用することができる。制御放出インプラントの使用は、反復注射の必要性を低減する。
【０３７１】
本明細書の方法に使用されるＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、脳に直接注入することができる。化合物を脳に直接注入するための様々なインプラントが公知であり、神経障害を患っているヒト患者に治療化合物を送達するのに有効である。これらとしては、ポンプ、定位固定的に埋め込まれた一時的間質カテーテル、永久頭蓋内カテーテルインプラント、および手術的に埋め込まれた生体分解性インプラントを使用した脳への長期注入が挙げられる。例えば、Ｇｉｌｌら、上記；Ｓｃｈａｒｆｅｎら、”Ｈｉｇｈ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｏｄｉｎｅ−１２５  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｆｏｒ  Ｇｌｉｏｍａｓ，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．２４（４）：５８３−５９１（１９９２）；Ｇａｓｐａｒら、”Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ
１２５Ｉ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．４３（５）：９７７−９８２（１９９９）；ｃｈａｐｔｅｒ  ６６，ｐａｇｅｓ  ５７７−５８０，Ｂｅｌｌｅｚｚａら、”Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ，”ｉｎ  Ｇｉｌｄｅｎｂｅｒｇら、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９９８）；およびＢｒｅｍら、”Ｔｈｅ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ
ＢＣＮＵ−Ｌｏａｄｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅｗｌｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ：Ｐｈａｓｅ  Ｉ  Ｔｒｉａｌ，”Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２６：１１１−２３（１９９５）を参照のこと。
【０３７２】
また、組成物は、化合物に対する適切な送達または支持システムとして機能する、生体適合担体材料に分散したＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストも含み得る。持続放出担体の適切な例としては、座薬またはカプセルなどの造形品形態の半透性ポリマーマトリックスが挙げられる。埋込型または微小カプセル持続放出マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，３１９号、欧州特許第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ
２２：５４７−５６（１９８５））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、またはポリ−Ｄ−（−）−３ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）が挙げられる。
【０３７３】
いくつかの実施形態では、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、脳の適切な領域に直接注入することによって、患者に投与される。例えば、Ｇｉｌｌら、”Ｄｉｒｅｃｔ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９：５８９−９５（２００３）を参照のこと。代替技術が利用可能であり、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを投与するのに適用することができる。例えば、カテーテルまたはインプラントの定位固定配置は、Ｒｉｅｃｈｅｒｔ−Ｍｕｎｄｉｎｇｅｒユニット、およびＺＤ（Ｚａｍｏｒａｎｏ−Ｄｕｊｏｖｎｙ）多目的ローカライズユニットを使用して達成することができる。２ｍｍスライス厚の１２０ｍｌのオムニパーク、３５０ｍｇヨウ素／ｍｌを注入した造影コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンは、三次元の多平面処置計画を可能にし得る（ＳＴＰ，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。この機器は、明確な標的確認のためにＣＴおよびＭＲＩ標的情報を重ね合わせる磁気共鳴映像法研究に基づいて計画することを可能にする。
【０３７４】
ＧＥ  ＣＴスキャナ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）と併用するために改良したＬｅｋｓｅｌｌ定位固定システム（Ｄｏｗｎｓ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＧＡ）、ならびにＢｒｏｗｎ−Ｒｏｂｅｒｔｓ−Ｗｅｌｌｓ（ＢＲＷ）定位固定システム（Ｒａｄｉｏｎｉｃｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）をこの目的に使用することができる。したがって、埋め込みの朝に、ＢＲＷ定位固定フレームのアニュラベースリングを患者の頭蓋骨に取り付けることができる。連続ＣＴ断面を、底板に留めたグラファイトロッドローカライザフレームを用いて、（標的組織）領域を通して、３ｍｍ間隔で取得することができる。コンピュータ化処置計画プログラムは、グラファイトロッド画像のＣＴ座標を使用して、ＶＡＸ１１／７８０コンピュータ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｙｎａｒｄ，Ｍａｓｓ）上で実行し、ＣＴスペースとＢＲＷスペースとの間をマッピングすることができる。
【０３７５】
本明細書に記載される運動ニューロン関連障害の処置方法は、典型的には、ヒトにおける使用前に、所望の治療または予防活性についてインビトロで試験され、次いで、許容され得る動物モデルにおいてインビボで試験される。トランスジェニック動物を含む適切な動物モデルは、当業者に周知である。例えば、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストの生存効果を実証するためのインビトロアッセイが本明細書に記載される。運動ニューロンの生存および運動ニューロンの軸索成長に対するＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストの効果は、実施例に記載されているように、インビトロで試験することができる。最後に、インビボ試験は、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストを発現するトランスジェニックマウスを作ることによって、または本明細書に記載されるようにＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストをマウスまたはラットモデルに投与することによって実施することができる。
【実施例】
【０３７６】
実施例１：ＬＩＮＧＯ−２は、中枢神経系で特異的に発現している
以下の方法による定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）アッセイによって、ラットおよびマウス組織におけるＬＩＮＧＯ−２発現を評価した。ラットＲＮＡはＣｌｏｎｔｅｃｈから購入し、マウスＲＮＡはＰ６マウス組織から調製した。製造業者の説明書を使用してＡｂｓｏｌｕｔｅｌｙ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、ｍＲＮＡを抽出した。組織特異的な第１鎖ｃＤＮＡをｍＲＮＡから合成し、ＬＩＮＧＯ−２  ｍＲＮＡレベルを定量するために、（ｉ）フォワードプライマー５’−ＡＣＣＴＴＧＴＡＴＡＣＣＴＧＡＣＣＣＡＣＣＴＴＡＡ−３’（配列番号２３）、（ｉｉ）リバースプライマー５’−ＡＧＡＧＡＡＣＡＴＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＡＴＡＧＴＧ−３’（ラット）（配列番号２４）または５’−ＡＧＡＧＡＡＣＡＴＧＣＣＡＧＣＴＴＣＡＡＴＡＧＴＧ−３’（マウス）（配列番号２５）および（ｉｉｉ）ＭＧＢプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）５’−ＣＣＴＣＴＣＣＴＡＣＡＡＴＣＣＣ−３’（配列番号２６）を使用してＴａｑｍａｎ  ＲＴ−ＰＣＲに供した（基本的にはＭｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ７：２２１−２２８（２００４）に記載されているように実施した）。ｍＲＮＡレベルを定量するために、ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｘ３０００Ｐ）を使用した。
【０３７７】
最初に、組織におけるＬＩＮＧＯ−２  ｍＲＮＡレベルを、同じ組織におけるβ−アクチンｍＲＮＡレベルに対して標準化することによって、相対的なＬＩＮＧＯ−２発現レベルを決定した。プライマーセットＲｎ００６７８６９＿ｍ１（ラット）またはＭｎ００６０７９３９（マウス）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、β−アクチンｍＲＮＡレベルを並行して定量した。次いで、各組織における標準化したＬＩＮＧＯ−２  ｍＲＮＡレベルを、ラットのユニバーサルセットおよびマウスの肺組織における標準化した発現レベル（これらは両方とも１の値とした）と比較することによって、相対的なＬＩＮＧＯ−２  ｍＲＮＡレベルを決定した。ラットの相対的なＬＩＮＧＯ−２発現レベルを図１に示し、Ｐ６マウス組織のものを図２に示す。ラットでは、ＬＩＮＧＯ−２は、脳で最も強く発現していた。胸腺、胃、肝臓、結腸、心臓、胎盤、腎臓、脾臓、乳房および肺における発現レベルは、バックグラウンドよりも低いかまたは検出不可能であった。Ｐ６マウス組織では、ＬＩＮＧＯ−２は、脳および脊髄で最も強く発現していた。特に、脊髄の発現レベルは、脳の発現レベルよりも高かった。これは、脳における発現が脊髄における発現よりも高いというＬＩＮＧＯ−１について観察されたものとは反対である。心臓、腎臓、肝臓、脾臓、腸、肺、皮膚および胃におけるＬＩＮＧＯ−２発現は、バックグラウンドよりも低いかまたは検出不可能であった。
【０３７８】
実施例２：ＬＩＮＧＯ−２は、皮質およびＤＲＧニューロンで高発現している
以下の方法による定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）アッセイによって、ラット神経細胞におけるＬＩＮＧＯ−２発現を評価した。ラット神経細胞集団からＲＮＡを取得し、製造業者の説明書を使用してＡｂｓｏｌｕｔｅｌｙ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、ｍＲＮＡを抽出した。第１鎖ｃＤＮＡをＲＮＡから合成し、ＬＩＮＧＯ−２  ｍＲＮＡレベルを定量するために、実施例１に記載されているように配列番号２３〜２６のプライマーを使用してＴａｑｍａｎ  ＲＴ−ＰＣＲに供した（基本的にはＭｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ７：２２１−２２８（２００４）に記載されているように実施した）。ｍＲＮＡレベルを定量するために、ＴａｑＭａｎ
Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｘ３０００Ｐ）を使用した。
【０３７９】
最初に、神経細胞集団におけるＬＩＮＧＯ−２  ｍＲＮＡレベルを、同じ神経細胞集団におけるアクチンｍＲＮＡレベルに対して標準化することによって、相対的なＬＩＮＧＯ−２発現レベルを決定した。次いで、各組織における標準化したＬＩＮＧＯ−２  ｍＲＮＡレベルを、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）における標準化した発現レベル（これを１の値とした）と比較することによって、相対的なＬＩＮＧＯ−２  ｍＲＮＡレベルを決定した。相対的なＬＩＮＧＯ−２発現レベルを図３に示す。ＬＩＮＧＯ−２は、皮質および後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンで最も強く発現していた。星状細胞における発現は検出可能であったが、皮質およびＤＲＧニューロンと比べて低かった。ミクログリア細胞では、レベルが最も低かった。
【０３８０】
実施例３：ＬＩＮＧＯ−２−Ｆｃ融合タンパク質の構築および精製
ヒトＬＩＮＧＯ−２の細胞外部分（残基１〜５００）をヒトＩｇＧ１のヒンジおよびＦｃ領域に融合して、構築物を作製した。可溶性ＬＩＮＧＯ−２：Ｆｃタンパク質の配列を以下に示す：
【化８】
2019150055.tif 000015
【０３８１】
実施例４：ＬＩＮＧＯ−２特異的モノクローナル抗体の生産
３．５×１０１０個のユニークなクローンを含有するヒトナイーブファージミドＦａｂライブラリーをスクリーニングすることによって、ＬＩＮＧＯ−２に特異的に結合する抗ＬＩＮＧＯ−２抗体を作製した（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５  Ｍａｒ；２３（３）：３４４−８．）。前述のように選択を実施し、抗体Ｃ０９を同定した／Ｃ０９の配列を表３〜６に示す。結合実験は、Ｃ０９抗体がＬＩＮＧＯ−２に結合するが、ＬＩＮＧＯ−１に結合しないことを実証している。加えて、Ｃ０９抗体は、ＬＩＮＧＯ−２のＬＲＲ７〜ＬＲＲ１２を含有するが、ＬＩＮＧＯ−２のＬＲＲ１〜ＬＲＲ６を欠くＬＩＮＧＯ構築物に結合する。
【０３８２】
実施例５：可溶性ＬＩＮＧＯ−２または抗ＬＩＮＧＯ−２抗体によるＬＩＮＧＯ−２の遮断は、ヒト運動ニューロンの生存を促進する
９６ウェルプレートにおいて、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳｃ）由来のヒト運動ニューロン（Ｌｏｎｚａ）を０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡでトリプシン処理し、ＭｏｔｏｒＢｌａｓｔ培地（Ｌｏｎｚａ）中、５×１０４個／ウェルの密度で４チャンバースライド上にリプレートした。５％ＣＯ２を含む加湿空気中で、細胞を３７℃で一晩インキュベートした。
【０３８３】
細胞を０．５ｍＭ亜ヒ酸ナトリウムで３０分間処理した。亜ヒ酸ナトリウムは、細胞死を誘導する酸化的傷害を提供する。細胞を３回洗浄し、次いで、５０μｇ／ｍＬの可溶性ＬＩＮＧＯ−２−Ｆｃ、１０μｇ／ｍＬの抗ＬＩＮＧＯ−２  Ｃ０９  Ｆａｂまたは対照ｈＩｇＧのいずれかを含有する新鮮ＭｏｔｏｒＢｌａｓｔ培地を細胞に追加した。５％ＣＯ２を含む加湿空気中で、培養物を３７℃で２４時間インキュベートし、次いで、４％パラホルムアルデヒドで固定した。
【０３８４】
抗βＩＩＩチューブリン（Ｃｏｖａｎｃｅ）および抗神経フィラメント（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、細胞に対して免疫細胞化学を実施して、運動ニューロンを染色した（図４）。
【０３８５】
図４に示されているように、亜ヒ酸ナトリウムによる処理により、運動ニューロンの数が減少した。しかしながら、可溶性ＬＩＮＧＯ−２−Ｆｃおよび抗ＬＩＮＧＯ−２  Ｃ０９  Ｆａｂの両方が、亜ヒ酸ナトリウム誘導性の運動ニューロン死を軽減した。
【０３８６】
実施例６：可溶性ＬＩＮＧＯ−２によるＬＩＮＧＯ−２の遮断は、運動ニューロンの軸索成長を促進する
Ｎｙｃｏｄｅｎｚ勾配遠心分離を使用して、胎生期１６日（Ｅ１６）ラット脊髄から運動ニューロンを単離した。Ｅ１６ラット胚由来の脊髄を解剖し、０．０２５％トリプシン中、３７℃で４０分間インキュベートした。１容量のＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ
Ｆ−１２  Ｈａｍ（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）および０．００４％ＤＮａｓｅに対して３容量のダルベッコ改変イーグル培地を含有する培地とトリプシン溶液を交換した。脊髄細胞を５分間インキュベートし、次いで、細胞懸濁液が均質になるまで穏やかに粉砕することによって分離した。得られた脊髄懸濁液を４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）クッション上に重層し、この溶液を１００×ｇ、４℃で遠心分離することによって細胞ペレットを回収した。０．００４％ＤＮａｓｅを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に細胞ペレットを再懸濁し、８．０１％、７．６６％および７．０５％のＮｙｃｏｄｅｎｚ勾配上に重層した。勾配を５００×ｇで遠心分離した。培地および７．０５％溶液の界面にある白色の混濁物質が運動ニューロンであると確認し、回収した。
【０３８７】
運動ニューロン成長培地（２％Ｂ２７および０．５ｍＭグルタミンを補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地と、０．４μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン、５μｇ／ｍＬのインスリンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（３：１）とが１：１の比）中、１０μｇ／ｍＬのポリ−Ｄリシンおよび１０μｇ／ｍＬのラミニン（ｌａｍｉｎｉ）でコーティングした４チャンバースライド上に、細胞５×１０４個／ウェルの密度で、回収した運動ニューロンをプレートした。得られた培地に、１０ｎｇ／ｍＬのニューロトロフィン−３、１０ｎｇ／ｍＬの脳由来神経栄養因子、１０ｎｇ／ｍＬのグリア細胞株由来神経栄養因子、１０ｎｇ／ｍＬの毛様体神経栄養因子および抗生物質を補充した。５％ＣＯ２を含む加湿空気中で、細胞を３７℃で一晩インキュベートし、次いで、０．５ｍＭ亜ヒ酸ナトリウムで３０分間処理した。細胞を３回洗浄し、次いで、５０μｇ／ｍＬの可溶性ＬＩＮＧＯ−２−Ｆｃまたは対照ｈＩｇＧのいずれかを含有する新鮮運動ニューロン成長培地を追加した。５％ＣＯ２を含む加湿空気中で、培養物を３７℃で２４時間インキュベートし、次いで、４％パラホルムアルデヒドで固定した。
【０３８８】
抗神経フィラメント（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、細胞に対して免疫細胞化学を実施して、運動ニューロンを染色した（図５）。各ニューロンの最も長い神経突起を軸索とみなし、Ｏｐｅｎｌａｂソフトウェアを使用して軸索長を測定した。図５に見られるように、亜ヒ酸ナトリウムによって細胞を処理した後、可溶性ＬＩＮＧＯ−２は、ニューロンの軸索成長をｈＩｇＧ対照で処理した細胞と比較して約２０％促進した。
【０３８９】
実施例７：ＬＩＮＧＯ−２発現レベルは、ＳＯＤＧ９３Ａマウスでアップレギュレートしている
突然変異体銅／亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）ＤＮＡ（例えば、ＳＯＤＧ３９Ａ）を有するトランスジェニック動物は、ヒト筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）（ＡＬＳ）患者に似た麻痺性運動ニューロン疾患を発症するので、ＡＬＳモデルとして一般に使用されている。Ｎａｒａｉら、Ｎｅｕｒｏｌ．Ｉｎｔ．１：ｅ１６（２００９）。
【０３９０】
６５日齢のＳＯＤＧ９３Ａマウスまたは年齢適合対照野生型マウスをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で灌流し、脊髄を解剖した。脊髄を４％パラホルムアルデヒドで固定し、脊髄の胸部をクリオスタット切片用の最適切削温度（Ｏ．Ｃ．Ｔ．）化合物に包埋した。ジゴキシゲニン標識ＬＩＮＧＯ−２アンチセンスＲＮＡプローブ５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＡＧＡＡＧＣＣＣＴＴＴＣＣＣＡＴＣＴ−３（配列番号２８）およびジゴキシゲニン標識センスＲＮＡプローブ５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＡＧＡＡＧＣＣＣＴＴＴＣＣＣＡＴＣＴ−３’（配列番号２９）で凍結切片をプローブした。
【０３９１】
次いで、製造業者の説明書にしたがってチラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）＋蛍光抗ジゴキシゲニンコンジュゲート抗体キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、切片を染色した。
【０３９２】
定量分析を実施し、各スライドの前角領域におけるＬＩＮＧＯ−２陽性細胞の数を、Ｏｐｅｎｌａｂソフトウェアによって２０倍で計数した。ＳＯＤＧ３９Ａマウスおよび野生型マウスの両方について、３匹の動物を分析した。図６に見られるように、インサイチューハイブリダイゼーションによって測定した場合、ＬＩＮＧＯ−２発現レベルは、６５日齢のＳＯＤＧ３９Ａマウス由来の脊髄の前角でアップレギュレートしていた。ＳＯＤＧ３９Ａマウスでは、野生型対照マウスと比較して、ＬＩＮＧＯ−２陽性細胞の数が２倍増加しており、染色強度がより強かった。
【０３９３】
実施例８：ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、ＡＬＳにおける運動ニューロンの成長および生存を促進する
ヒトＳＯＤＧ９３Ａを発現するトランスジェニックマウスおよび年齢適合対照をＰＢＳ（ビヒクル対照）、対照抗体または抗ＬＩＮＧＯ−２抗体（例えば、Ｃ０９）で処置する。週１回の腹腔内注射によって、処置を提供する。８４〜９０日齢にマウスを屠殺し、筋肉量および組織学について評価する（例えば、運動ニューロンの生存を評価する）。疾患進行（例えば、左右の横臥位（ｌａｔｅｒａｌ  ｒｅｃｕｍｂａｎｃｙ）から直立する能力および握力）について、他のマウスをさらなる時間（例えば、約１３４日間）モニタリングする。
【０３９４】
実施例９：ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、ＡＫＴリン酸化をアップレギュレートする
等濃度の抗ＬＩＮＧＯ−２抗体（Ｃ０９）または対照抗体の存在下で、運動ニューロンをインキュベートした。細胞溶解物を回収し、ウエスタン分析によってリン酸化ＡＫＴタンパク質のレベルをアッセイした。β−アクチンのレベルも対照として測定した。図７に示されているように、抗ＬＩＮＧＯ−２抗体は、ＡＫＴリン酸化を増加させた。
【０３９５】
実施例１０：ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストは、オリゴデンドロサイト分化を促進する
漸増量のＣ０９抗体でオリゴデンドロサイト前駆細胞を処理し、ウエスタンブロッティングによってミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）およびミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）タンパク質について試験することによって、抗ＬＩＮＧＯ−２抗体の役割をインビトロで調査した。図８に示されているように、Ｃ０９抗体による処理は、ＭＡＧおよびＭＢＰレベルを用量依存的に増加させた。ＭＰＢは、成熟オリゴデンドロサイトのマーカーである。したがって、これらのデータは、ＬＩＮＧＯ−２アンタゴニストがオリゴデンドロサイト分化を促進することを示している。
【図１】
2019150055.tif 000016
【図２】
2019150055.tif 000017
【図３】
2019150055.tif 000018
【図４】
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【図５】
2019150055.tif 000020
【図６】
2019150055.tif 000021
【図７】
2019150055.tif 000022
【図８】
2019150055.tif 000023
【配列表】
2019150055000001.app
【外国語明細書】
2019150055000001.pdf