(57)【要約】【課題】ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦ−β遺伝子、又は、ＳＭＡＤ２／３遺伝子を標的とする二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）組成物、並びに、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦ−β、又は、ＳＭＡＤ２／３の発現を阻害するために該ｄｓＲＮＡ組成物を使用する方法の提供。【解決手段】ＣＯＬ１Ａ１、ＴＦＧβ、又は、ＳＭＡＤ２／３の発現を阻害するためのｄｓＲＮＡであって、前記ｄｓＲＮＡがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、特定のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、特定の配列に対応するアンチセンスヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む、前記ｄｓＲＮＡ。【選択図】図１３
2019150075.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＯＬ１Ａ１の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、
（i）前記センス鎖が配列番号29のヌクレオチド配列からなり、かつ前記アンチセンス鎖が配列番号30のヌクレオチド配列からなるか、
（ii）前記センス鎖が配列番号33のヌクレオチド配列からなり、かつ前記アンチセンス鎖が配列番号34のヌクレオチド配列からなるか、
（iii）前記センス鎖が配列番号41のヌクレオチド配列からなり、かつ前記アンチセンス鎖が配列番号42のヌクレオチド配列からなるか、
（iv）前記センス鎖が配列番号45のヌクレオチド配列からなり、かつ前記アンチセンス鎖が配列番号46のヌクレオチド配列からなるか、
（v）前記センス鎖が配列番号47のヌクレオチド配列からなり、かつ前記アンチセンス鎖が配列番号48のヌクレオチド配列からなるか、または
（vi）前記センス鎖が配列番号55のヌクレオチド配列からなり、かつ前記アンチセンス鎖が配列番号56のヌクレオチド配列からなる、
前記ｄｓＲＮＡ。
【請求項２】
少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３】
前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、２'−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５'−チオリン酸エステル基含有ヌクレオチド、コレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合した末端ヌクレオチド、２'−デオキシ−２'−フルオロ修飾ヌクレオチド、２'−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２'−アミノ修飾ヌクレオチド、２'−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダートおよび非天然塩基含有ヌクレオチドからなる群より選択される、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４】
リガンドをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項５】
前記リガンドが前記ｄｓＲＮＡの前記センス鎖の３'末端と複合体化されている、請求項４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡを含有する、細胞。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡを含む、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
【請求項８】
脂質製剤をさらに含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記脂質製剤がＳＮＡＬＰまたはＸＴＣ製剤である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
インビトロで細胞内のＣＯＬ１Ａ１発現を阻害する方法であって、
（ａ）  請求項１〜５のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡを前記細胞に導入する工程、および、
（ｂ）  工程（ａ）で作製された細胞を、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物が分解されるのに十分な時間にわたり維持し、それによって前記細胞内のＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現を阻害する工程
を含む、前記方法。
【請求項１１】
前記細胞が肝星細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＯＬ１Ａ１発現が少なくとも３０％阻害される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
肝線維症を治療するための請求項７〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、そのような治療を必要とする対象に投与される、前記医薬組成物。
【請求項１４】
前記対象の体重に対して０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの濃度で前記ｄｓＲＮＡが投与される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
肝線維症の治療に使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡまたは請求項７〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡをコードするベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１８】
肝線維症を特徴とする慢性肝疾患を治療するための請求項７〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、そのような治療を必要とする対象に投与される、前記医薬組成物。
【請求項１９】
肝線維症を特徴とする慢性肝疾患の治療に使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡまたは請求項７〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１０年１０月２９日に出願された米国特許仮出願第６１／４０８，２７１号、２０１０年８月６日に出願された米国特許仮出願第６１／３７１，４８１号、および２０１０年６月２日に出願された米国特許仮出願第６１／３５０，８２９号の利益を主張するものである。これらの各出願の内容の全体は、参照により本明細書に組み入れられたものとする。
【０００２】
配列表
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出してある配列表を含み、これによりその全体を参照して組み入れたものとする。２０１１年６月２日に作成された前記ＡＳＣＩＩ複製物は５１０５８ＰＣＴ．ｔｘｔという名称であり、８６４，１１０バイトのサイズである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、肝臓におけるコラーゲン１Ａ１（ＣＯＬ１Ａ１）遺伝子、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ）遺伝子ならびにＳＭＡＤホモログ２および３（ＳＭＡＤ２／３）遺伝子の発現の阻害、および肝線維症の抑制に関連する。特に、肝星細胞での遺伝子発現の阻害を目的とする。
【背景技術】
【０００４】
米国では、慢性肝疾患は疾患関連死の１２番目の主因であり、毎年およそ２８，０００人の人々が慢性肝疾患で落命する。米国とヨーロッパでは、肝硬変は肝胆疾患および消化器疾患の間で最も一般的な新生物によらない死因である。また、米国の都市部の男性の４番目の主な死因はアルコール性肝疾患である。慢性肝疾患は、肝線維症および肝硬変に至る肝臓細胞の進行性の破壊と再生のプロセスを特徴とする。
【０００５】
肝線維症は肝臓が損傷を受けた時に起こるプロセスである。そのような損傷は、ウイルスの活動（例えば、慢性Ｂ型肝炎または慢性Ｃ型肝炎）または他の肝臓感染症（例えば、寄生生物、細菌）、化学物質への曝露（例えば、医薬、レクリエーショナルドラッグ、過度のアルコール、汚染物質への曝露）、自己免疫性プロセス（例えば、自己免疫性肝炎）、代謝系疾患（例えば、脂質貯蔵障害、グリコーゲン貯蔵障害、コレステロール貯蔵障害または金属貯蔵障害）、または癌増殖（原発性または続発性肝臓癌）の結果であり得る。肝線維症の原因の主要な細胞種は、循環系よりビタミンＡを摂取し、それを貯蔵する常在性類洞周囲細胞である肝星細胞（ＨＳＣ）である。
【０００６】
肝臓では線維症は、ネクローシス、虚脱および瘢痕形成の結果であるばかりか、損傷を受けた間充織細胞が様々な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を合成することによりマトリックスの合成と分解が混乱した結果でもある。肝線維症は、細胞外物質の分泌の増加と分解の減少の漸進的なプロセスである。肝臓細胞への損傷によってそのプロセスが始まると信じられている。傷害の後のネクローシス死肝臓細胞の存在が、マトリックス産生細胞を刺激するサイトカインを含むメディエーターを分泌する炎症細胞の反応を誘起する。特に、肝臓細胞への損傷により、肝臓の類洞を裏打ちするマクロファージであるクッパー細胞から複数の細胞性因子が活性化され、そして、分泌されることになる。これらの因子は、損傷を受けた肝臓細胞、血小板および肝臓類洞内皮細胞によって分泌される細胞性因子と共に、ＨＳＣの活性化因子になる。活性化されると、ＨＳＣは増殖性で線維形成性であり、且つ、収縮性の筋線維芽細胞に分化し、そして、ＨＳＣは自己分泌とパラ分泌を介して増殖して大量のＥＣＭ物質を合成し、その物質は徐々に蓄積して肝臓に線維状の塊を形成する。筋線維芽細胞はプロコラーゲンを分泌し、その末端ドメインがプロコラーゲンペプチドによって切断された後にそれは不溶性のコラーゲンとして蓄積して線維症の原因となる。コラーゲン特異的シャペロンであるヒートショックプロテイン４７（ＨＳＰ４７）が小胞体内でのプロコラーゲンの正確な三重らせん形成を確実にすることでコラーゲンの分泌を促進する。そして、ＨＳＰ４７はプロコラーゲン合成の翻訳調節にも関係があるとされている。
【０００７】
ＥＣＭ物質の区分は次のとおりである：コラーゲン類（タイプＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ）、グリコプロテイン（ラミニン、フィブロネクチン、エンタクチン、アンジュリンおよびエラスチン）およびプロテオグリカン類（コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸およびヘパリン）。これらのＥＣＭ物質は細胞表面受容体、および増殖因子類、コラーゲン類、フィブロネクチン、ラミニン等のような巨大分子と相互作用する。線維芽細胞、好中球およびマクロファージにより産生される分解酵素によりＥＣＭマトリックスを分解する肝臓の能力を圧倒する反復性で持続性の傷害の後に線維症が発生する。肝臓中で増えた過剰なＥＣＭ物質により、肝臓の構造が乱れ、門脈高血圧症となる。そして、それにより硬変として知られる肝臓循環系の不可逆的で有害な再構成が引き起こされる可能性がある。硬変は、線維性瘢痕組織および再生結節による肝臓組織の置換を特徴とする。これらの再生結節は、損傷を受けた組織が再生を試みたプロセスの結果であり、そして、これにより肝機能が喪失することになる。したがって、線維症は肝臓損傷の徴候であり、且つ、進行性肝硬変による肝不全の主要な原因である。線維症は様々な慢性肝疾患で共通して発生するので、肝線維症の治療および／または予防は非常に重要である。
【発明の概要】
【０００８】
細胞または哺乳類においてコラーゲン１Ａ１（ＣＯＬ１Ａ１）遺伝子、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ）遺伝子ならびに／またはＳＭＡＤホモログ２および３（ＳＭＡＤ２／３）遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）介在性切断をもたらす組成物および方法が本明細書において記載される。これに限定されないが、慢性肝疾患を含む肝臓細胞への損傷の結果として生じるＣＯＬ１Ａ１遺伝子の過剰発現を原因とする肝線維症の治療および／また予防用の組成物および方法もまた記載されている。肝線維症はウイルスまたは他の感染症、自己免疫疾患、胆管閉塞、代謝性疾患、過度の飲酒、原発性胆汁性肝硬変、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、化学物質への曝露、および中でも癌の結果である。
【０００９】
慢性肝疾患および肝線維症を治療および／または予防する組成物および方法の実施形態は、慢性的な肝臓障害条件下で生じる損傷を含む肝臓損傷の間に過剰に産生され、そして、線維症の原因となる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）物質のうちの少なくとも１つが減少する可能性がある場合、肝臓での線維症が、予防されなくても、少なくとも低減する可能性があるという前提に少なくとも部分的には基づいている。その組成物と方法は、関連するＥＣＭ遺伝子とまた線維症プロセス中のＥＣＭ物質の主要な生産者である肝星細胞（ＨＳＣ）の活性化に関与するシグナル伝達分子、例えば、ＴＧＦ−βおよびＳＭＡＤ２／３の遺伝子発現のＲＮＡ干渉に基づく。
【００１０】
本明細書において用いられる場合、用語「ｉＲＮＡ」は、その用語が本明細書において定義されるようにＲＮＡを含有し、そして、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路によるＲＮＡ転写物の標的切断を仲介する因子を意味する。１つの実施形態では、本明細書に記載されるようなｉＲＮＡは細胞または哺乳類においてＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現を阻害する。
【００１１】
本明細書において取り上げられる前記組成物に含まれるｉＲＮＡは、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子またはＳＭＡＤ２／３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である、３０ヌクレオチド以下、一般的には１９〜２４ヌクレオチドの長さの領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を持つｄｓＲＮＡを包含する。
【００１２】
１つの実施形態では、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現を阻害するためのｉＲＮＡは、互いに相補的な少なくとも２つの配列を含む。そのｉＲＮＡは、第１配列を有するセンス鎖と第２配列を有するアンチセンス鎖を含む。そのアンチセンス鎖は、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβまたはＳＭＡＤ２／３をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして、その相補領域は３０ヌクレオチド以下および少なくとも１５ヌクレオチドの長さである。一般的に、前記ｉＲＮＡは１９〜２４ヌクレオチド、例えば、１９〜２１ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、前記ｉＲＮＡは約１５から約２５ヌクレオチドまでの長さであり、別の実施形態では、前記ｉＲＮＡは約２５から約３０ヌクレオチドまでの長さである。ＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβおよび／またはＳＭＡＤ２／３を発現する細胞と接触すると、本明細書に記載されるような方法で測定法されたときのように、前記ｉＲＮＡはＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現をそれぞれ少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％または少なくとも４０％またはそれ以上阻害する。１つの実施形態では、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）中にＣＯＬ１Ａ１  ｉＲＮＡ、ＴＧＦβ  ｉＲＮＡまたはＳＭＡＤ２／３  ｉＲＮＡが製剤される。
【００１３】
１つの実施形態では、本明細書において取り上げられるｉＲＮＡは、表３〜７のセンス配列からなる群より選択されるｄｓＲＮＡの第１配列と表３〜７のアンチセンス配列からなる群より選択される第２配列を含む。本明細書において取り上げられる前記ｉＲＮＡ分子は、天然ヌクレオチドを含むことができ、または、これらに限定されないが、２'−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５'−チオリン酸エステル基含有ヌクレオチドおよびコレステリル誘導体に結合した末端ヌクレオチドを含む少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むことができる。あるいは、前記修飾ヌクレオチドは、２'−デオキシ−２'−フルオロ修飾ヌクレオチド、２'−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２'−アミノ−修飾ヌクレオチド、２'−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラミデートおよび非天然塩基含有ヌクレオチドからなる群より選択されることができる。一般に、そのような修飾配列は、表３〜７のセンス配列からなる群より選択されるｉＲＮＡの第１配列と表３〜７の対応するアンチセンス配列からなる群より選択される第２配列に基づくであろう。
【００１４】
１つの実施形態では、本明細書に記載されるようなｉＲＮＡはＣＯＬ１Ａ１  ＲＮＡ転写物を標的とし、別の実施形態では、ＴＧＦβ  ＲＮＡ転写物を標的とする。さらに別の実施形態では、前記ｉＲＮＡはＳＭＡＤ２転写物を標的とする。さらに別の実施形態では、前記ｉＲＮＡはＳＭＡＤ３転写物を標的とする。
【００１５】
本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、前記ｉＲＮＡは、配列番号５３（４１１００−ｂ１Ｄ）と配列番号５４（４１１０１−ｂ１Ｄ）のＲＮＡ配列ペア（ＡＤ−２１３４９−ｂ１）、配列番号６９（４２８６１）と配列番号７０（４２８６２）のＲＮＡ配列ペア（ＡＤ−２２１３８）、配列番号９１（４２８８３）と配列番号９２（４２８８４）のＲＮＡ配列ペア（ＡＤ−２２１４９）、または、配列番号１４０（４０３２２−ｂ１）と配列番号１４１（４０３２３−ｂ１）のＲＮＡ配列ペア（ＡＤ−２０９１６−ｂ１）を含むｄｓＲＮＡである。
【００１６】
１つの実施形態では、本発明において取り上げられるｉＲＮＡは、ＣＯＬ１Ａ１  ＲＮＡ転写物、ＴＧＦβ  ＲＮＡ転写物またはＳＭＡＤ２／３  ＲＮＡ転写物の５'または３'非翻訳領域のような非コード領域を標的にする。
【００１７】
１つの態様では、本発明の実施形態は、本発明において取り上げられるｉＲＮＡのうちの少なくとも１つを含む細胞を提供する。その細胞は、一般的に、ヒト細胞などの哺乳類細胞である。１つの好ましい実施形態では、前記細胞は肝臓細胞である。より好ましい実施形態では、前記細胞はＨＳＣである。
【００１８】
別の態様では、本発明の実施形態は、生物、好ましくはヒト対象において、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供する。その組成物は、典型的には本明細書において記載されるｉＲＮＡの１つ以上と薬学的に許容可能な担体または送達用媒体を含む。１つの実施形態では、前記組成物は、これに限定されないが、慢性肝疾患を含む肝疾患の治療に用いられる。１つの実施形態では、前記組成物は、肝線維症の治療に用いられる。いくつかの実施形態では、肝疾患または肝線維症はウイルスまたは他の感染症、自己免疫疾患、胆管閉塞、代謝性疾患、過度の飲酒、原発性胆汁性肝硬変、ＮＡＳＨ、化学物質への曝露または癌の結果である。
【００１９】
別の実施形態では、前記医薬組成物は、本明細書において記載される投与計画、例えば、４週間に１回以下、３週間に１回以下、２週間に１回以下、または１週間に１回以下の計画での投与用に製剤される。別の実施形態では、対象、例えば、慢性肝疾患または慢性肝疾患症状を有する対象の残りの寿命を含む１か月以上の間、例えば、１か月、２か月、３か月または６か月、または１年または５年または１０年またはそれ以上の間、前記医薬組成物の投与を維持することができる。
【００２０】
別の実施形態では、本明細書において記載される特徴とされるｉＲＮＡを含有する組成物、例えば、ＣＯＬ１Ａ１を標的とするｄｓＲＮＡは、肝疾患または肝線維症の遠因、例えば、ウイルスまたは他の感染症、自己免疫疾患、胆管閉塞、代謝性疾患、過度の飲酒、原発性胆汁性肝硬変、ＮＡＳＨ、化学物質への曝露および癌を治療すると知られている薬剤などの非ｉＲＮＡ治療薬と共に投与される。別の実施形態では、本明細書において記載される特徴とされるｉＲＮＡを含有する組成物、例えば、ＣＯＬ１Ａ１を標的とするｄｓＲＮＡは、抗Ｃ型肝炎ウイルス剤療法などの非ｉＲＮＡ療法と共に投与される。例えば、本発明において取り上げられるｉＲＮＡはＣ型肝炎ウイルスの感染の治療のためにインターフェロンαと共に投与されることができる。
【００２１】
別の実施形態では、患者にＣＯＬ１Ａ１  ｉＲＮＡ、ＴＧＦβ  ｉＲＮＡおよび／またはＳＭＡＤ２／３  ｉＲＮＡを投与し、その後、その患者に非ｉＲＮＡ薬剤または非ｉＲＮＡ療法を施す（逆もまた成り立つ）。別の実施形態では、ＣＯＬ１Ａ１  ｉＲＮＡ、ＴＧＦβ  ｉＲＮＡおよび／またはＳＭＡＤ２／３  ｉＲＮＡと非ｉＲＮＡ治療薬または非ｉＲＮＡ療法を同時に施す。１つの実施形態では、前記治療薬は、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス感染症の治療用インターフェロンαである。別の実施形態では、１つより多いｉＲＮＡの組合せを患者に投与する。例えば、ＣＯＬ１Ａ１  ｉＲＮＡとＴＧＦβ  ｉＲＮＡの組合せ、ＣＯＬ１Ａ１  ｉＲＮＡとＳＭＡＤ２／３  ｉＲＮＡの組合せまたはＣＯＬ１Ａ１  ｉＲＮＡ、ＴＧＦβ  ｉＲＮＡおよびＳＭＡＤ２／３  ｉＲＮＡの組合せ。
【００２２】
別の態様では、次の工程を実行することによりＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現を阻害する方法が本明細書において提供される：
（ａ）  互いに相補的な少なくとも２つの配列を含む二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を細胞に導入する工程。そのｄｓＲＮＡは第１配列を有するセンス鎖と第２配列を有するアンチセンス鎖を持ち、そのアンチセンス鎖はＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβおよび／またはＳＭＡＤ２／３をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的であって、３０ヌクレオチド以下、すなわち、１５〜３０ヌクレオチドの長さであり、一般的に１９〜２４ヌクレオチドの長さである相補領域を持ち、そして、そのｄｓＲＮＡは、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβおよび／またはＳＭＡＤ２／３を発現する細胞と接触するとＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現をそれぞれ少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％またはそれ以上阻害する。そして、
（ｂ）  工程（ａ）で作製された細胞を、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子またはＳＭＡＤ２／３遺伝子のｍＲＮＡ転写物が分解されるのに十分な時間にわたり維持し、それによって細胞内のＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現をそれぞれ阻害する工程。
【００２３】
別の実施形態では、前記方法は標的遺伝子の発現を肝臓細胞で、好ましくは肝星細胞で阻害するためのものである。
【００２４】
他の態様では、部分的にはＣＯＬ１Ａ１の過剰発現が介在する肝疾患または肝線維症を治療する、予防する、反転させる、または、管理する方法が本明細書において提供される。１つの実施形態では、その方法は、そのような治療、予防、反転または管理を必要とする患者に治療上有効量または予防上有効量の本明細書において取り上げられるｉＲＮＡの１つ以上を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、前記患者は、ウイルスまたは他の感染症、自己免疫疾患、胆管閉塞、代謝性疾患、過度の飲酒、原発性胆汁性肝硬変、ＮＡＳＨ、化学物質への曝露または癌を原因とする慢性肝疾患を有する。別の実施形態では、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβまたはＳＭＡＤ２／３を標的とするｉＲＮＡの投与により、患者において高血清アルブミンおよび／または黄疸などの肝疾患または肝線維症の少なくとも１つの症状の重症度が緩和される、または、除去される。
【００２５】
１つの態様では、本発明は細胞中でＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現を阻害するためのベクターを提供する。１つの実施形態では、そのベクターは、本明細書に記載されるようなｉＲＮＡの１つの少なくとも一方の鎖をコードするヌクレオチド配列に機能するように結合された少なくとも１つの調節性配列を含む。
【００２６】
別の態様では、本発明は、細胞中でＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現を阻害するためのベクターを含有する細胞を提供する。そのベクターは、本明細書に記載されるようなｉＲＮＡのうちの１つの少なくとも一方の鎖をコードするヌクレオチド配列に機能するように結合された調節性配列を含む。
【００２７】
さらに別の態様では、本発明は、肝臓で細胞外にコラーゲンを過剰に沈着することになるシグナル伝達経路に関与する第２の遺伝子を標的とする第２のｉＲＮＡと組み合わせてＣＯＬ１Ａ１  ｉＲＮＡを含有する組成物を提供する。例えば、その第２の遺伝子はＴＧＦβ、ＳＭＡＤ２またはＳＭＡＤ３をコードする遺伝子であり得る。
【００２８】
[本発明1001]
ＣＯＬ1Ａ1の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号53のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号54の対応するアンチセンスヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、前記ｄｓＲＮＡ。
[本発明1002]
ＣＯＬ1Ａ1の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＣＯＬ1Ａ1  ＲＮＡ転写物と相補的な領域を含み、かつ、表3または表6に列挙されたアンチセンス配列のうちの1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、前記ｄｓＲＮＡ。
[本発明1003]
ＴＦＧβの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号69のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号70の対応するアンチセンスヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、前記ｄｓＲＮＡ。
[本発明1004]
ＴＦＧβの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号91のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号92の対応するアンチセンスヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、前記ｄｓＲＮＡ。
[本発明1005]
ＴＧＦβの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＴＧＦβ  ＲＮＡ転写物と相補的な領域を含み、かつ、表4または表7に列挙されたアンチセンス配列のうちの1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、前記ｄｓＲＮＡ。
[本発明1006]
ＳＭＡＤ2／3の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号140のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号141の対応するアンチセンスヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、前記ｄｓＲＮＡ。
[本発明1007]
ＳＭＡＤ2／3の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＳＭＡＤ2／3  ＲＮＡ転写物と相補的な領域を含み、かつ、表5に列挙されたアンチセンス配列のうちの1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、前記ｄｓＲＮＡ。
[本発明1008]
少なくとも1個の修飾ヌクレオチドを含む、本発明1001〜1007のいずれかのｄｓＲＮＡ。
[本発明1009]
前記修飾ヌクレオチドの少なくとも1つが、2'−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、5'−チオリン酸エステル基含有ヌクレオチド、コレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合した末端ヌクレオチド、2'−デオキシ−2'−フルオロ修飾ヌクレオチド、2'−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2'−アミノ修飾ヌクレオチド、2'−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダートおよび非天然塩基含有ヌクレオチドからなる群より選択される、本発明1008のｄｓＲＮＡ。
[本発明1010]
前記相補領域が少なくとも17ヌクレオチド長である、本発明1002、1005、および1007のいずれかのｄｓＲＮＡ。
[本発明1011]
前記相補領域が19〜21ヌクレオチド長である、本発明1002、1005、および1007のいずれかのｄｓＲＮＡ。
[本発明1012]
それぞれの鎖が30ヌクレオチド以下の長さである、本発明1001〜1011のいずれかのｄｓＲＮＡ。
[本発明1013]
少なくとも一方の鎖が、少なくとも1ヌクレオチドの3'オーバーハングを含む、本発明1001〜1012のいずれかのｄｓＲＮＡ。
[本発明1014]
リガンドをさらに含む、本発明1001〜1013のいずれかのｄｓＲＮＡ。
[本発明1015]
前記リガンドが前記ｄｓＲＮＡの前記センス鎖の3'末端と複合体化されている、本発明1014のｄｓＲＮＡ。
[本発明1016]
前記相補領域が表3または表6のアンチセンス配列のうちの1つからなる、本発明1002のｄｓＲＮＡ。
[本発明1017]
表3または表6から選択されるセンス鎖配列からなるセンス鎖と、表3または表6から選択されるアンチセンス配列からなるアンチセンス鎖とを含む、本発明1002のｄｓＲＮＡ。
[本発明1018]
前記相補領域が表4または表7のアンチセンス配列の1つからなる、本発明1005のｄｓＲＮＡ。
[本発明1019]
表4または表7から選択されるセンス鎖配列からなるセンス鎖と、表4または表7から選択されるアンチセンス配列からなるアンチセンス鎖とを含む、本発明1005のｄｓＲＮＡ。
[本発明1020]
前記相補領域が表5のアンチセンス配列の1つからなる、本発明1007のｄｓＲＮＡ。
[本発明1021]
表5から選択されるセンス鎖配列からなるセンス鎖と、表5から選択されるアンチセンス配列からなるアンチセンス鎖とを含む、本発明1007のｄｓＲＮＡ。
[本発明1022]
本発明1001〜1007のいずれかのｄｓＲＮＡを含有する、細胞。
[本発明1023]
本発明1001または1002のｄｓＲＮＡを含む、ＣＯＬ1Ａ1遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
[本発明1024]
本発明1003、1004または1005のｄｓＲＮＡを含む、ＴＧＦβ遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
[本発明1025]
本発明1006または1007のｄｓＲＮＡを含む、ＳＭＡＤ2／3遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
[本発明1026]
脂質製剤をさらに含む、本発明1023〜1025のいずれかの医薬組成物。
[本発明1027]
前記脂質製剤がＳＮＡＬＰまたはＸＴＣ製剤である、本発明1026の医薬組成物。
[本発明1028]
細胞内のＣＯＬ1Ａ1発現を阻害する方法であって、
ａ．  本発明1001〜1007のいずれかのｄｓＲＮＡを前記細胞に導入する工程、および、
ｂ．  工程（ａ）で作製された細胞を、ＣＯＬ1Ａ1遺伝子のｍＲＮＡ転写物が分解されるのに十分な時間にわたり維持し、それによって前記細胞内のＣＯＬ1Ａ1遺伝子の発現を阻害する工程
を含む、前記方法。
[本発明1029]
前記細胞が肝星細胞である、本発明1028の方法。
[本発明1030]
ＣＯＬ1Ａ1発現が少なくとも30％阻害される、本発明1028または1029の方法。
[本発明1031]
肝線維症を治療する方法であって、そのような治療を必要とするヒトに、治療上有効量の本発明1001〜1007のいずれかのｄｓＲＮＡまたは本発明1030〜1034のいずれかの医薬組成物を投与する工程を含む、前記方法。
[本発明1032]
前記対象の体重に対して0．01ｍｇ／ｋｇ〜5ｍｇ／ｋｇの濃度で前記ｄｓＲＮＡが投与される、本発明1040の方法。
[本発明1033]
肝線維症の治療に使用するための、本発明1001〜1007のいずれかのｄｓＲＮＡまたは本発明1023〜1027のいずれかの医薬組成物。
[本発明1034]
ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の鎖をコードするベクターであって、前記ｄｓＲＮＡが、ＣＯＬ1Ａ1をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的な領域を含み、30塩基対以下の長さであり、かつ切断のために前記ｍＲＮＡを標的とする、前記ベクター。
[本発明1035]
ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の鎖をコードするベクターであって、前記ｄｓＲＮＡが、ＴＧＦβをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的な領域を含み、30塩基対以下の長さであり、かつ切断のために前記ｍＲＮＡを標的とする、前記ベクター。
[本発明1036]
ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の鎖をコードするベクターであって、前記ｄｓＲＮＡが、ＳＭＡＤ2／3をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的な領域を含み、30塩基対以下の長さであり、かつ切断のために前記ｍＲＮＡを標的とする、前記ベクター。
[本発明1037]
前記相補領域が19〜21ヌクレオチド長である、本発明1034〜1036のいずれかのベクター。
[本発明1038]
本発明1034〜1037のいずれかのベクターを含む、細胞。
[本発明1039]
肝線維症を特徴とする慢性肝疾患を治療する方法であって、そのような治療を必要とするヒトに、治療上有効量の本発明1001〜1007のいずれかのｄｓＲＮＡまたは本発明1023〜1027のいずれかの医薬組成物を投与する工程を含む、前記方法。
[本発明1040]
肝線維症を特徴とする慢性肝疾患の治療に使用するための、本発明1001〜1007のいずれかのｄｓＲＮＡまたは本発明1023〜1027のいずれかの医薬組成物。
本発明の様々な実施形態の詳細は、以下の記述に表される。本発明のその他の特色、目的および利点が本明細書と添付の図面から、および添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞での単一用量のコラーゲン１Ａ１  ｓｉＲＮＡのインビトロでの効果を示す図である。ｓｉＲＮＡ  ＡＤ−２１３４９（配列番号５３および配列番号５４）はＣＯＬ１Ａ１  ｍＲＮＡの産生について約６５ｐＭのＩＣ５０を有する。
【図２】図２は、ｓｉＣＯＬ１Ａ１  ＡＤ２１３４９（配列番号５３および配列番号５４）のＡＦ０９およびＡＦ１２ベースの送達が評価されるＣＣｌ４マウスモデルの処理計画を示す図である。
【図３】図３は、ｓｉＣＯＬ１Ａ１  ＡＤ２１３４９（配列番号５３および配列番号５４）のＡＦ０９およびＡＦ１２ベースの送達を用いるＣＣｌ４マウスモデルでのＣＯＬ１Ａ１ノックダウンの効果を示す図である。
【図４】図４は、ｓｉＣＯＬ１Ａ１  ＡＤ２１３４９（配列番号５３および配列番号５４）のＡＦ０９およびＡＦ１２ベースの送達の用量反応が評価されるＣＣｌ４マウスモデルの処理計画を示す図である。
【図５】図５は、ｓｉＣＯＬ１Ａ１  ＡＤ２１３４９（配列番号５３および配列番号５４）のＡＦ１２ベースの送達を用いるＣＣｌ４マウスモデルでのＣＯＬ１Ａ１ノックダウンの用量依存的効果を示す図である。
【図６】図６は、ｓｉＣＯＬ１Ａ１  ＡＤ２１３４９（配列番号５３および配列番号５４）のＡＦ１１ベースの送達が評価されるＣＣｌ４マウスモデルの処理計画を示す図である。
【図７】図７は、ｓｉＣＯＬ１Ａ１  ＡＤ２１３４９（配列番号５３および配列番号５４）のＡＦ１１ベースの送達を用いるＣＣｌ４マウスモデルでのＣＯＬ１Ａ１ノックダウンの効果を示す図である。
【図８】図８は、ｓｉＡＣＴＡ２のＡＦ１２ベースの送達を用いるＣＣｌ４マウスモデルでのＡＣＴＡ２ノックダウンの効果を示す図である。
【図９】図９は、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞での単一用量のＴＧＦβ  ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）のインビトロでの効果を示す図である。ＴＧＦβ  ｓｉＲＮＡであるＡＤ２２１４９（配列番号９１および配列番号９２）とＡＤ２２１３８（配列番号６９および配列番号７０）はＴＧＦβの発現についてそれぞれ約２０ｐＭと約７０ｐＭのＩＣ５０を有する。
【図１０】図１０は、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞での単一用量のＳＭＡＤ２  ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）のインビトロでの効果を示す図である。ｓｉＲＮＡ  ＡＤ−２０９１６（配列番号１４０および配列番号１４１）はＳＭＡＤ２の発現について約７５ｐＭのＩＣ５０を有する。
【図１１】図１１は、ｓｉＳＭＡＤ２  ＡＤ−２０９１６（配列番号１４０および配列番号１４１）の脂質ナノ粒子ベースの送達を用いるＣＣｌ４マウスモデルでのＳＭＡＤ２ノックダウンの効果を示す図である。
【図１２】図１２は、ｓｉＳＭＡＤ２  ＡＤ−２０９１６（配列番号１４０および配列番号１４１）の脂質ナノ粒子ベースの送達を用いるＣＣｌ４マウスモデルでのＣＯＬ１Ａ１の発現へのＳＭＡＤ２ノックダウンの効果を示す図である。ＳＭＡＤ２／３  ｓｉＲＮＡによりＣｏｌ１ａ１レベルが減少し（Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡ注入動物の約５０〜６０％）、そして、線維症の発生においてＳＭＡＤ類がＴＧＦβシグナル伝達に関与していることをそのデータは示している。
【図１３】図１３は、ｓｉＣＯＬ１Ａ１の脂質ナノ粒子ベース製剤を用いる慢性肝臓傷害モデルでのＣＯＬ１Ａ１ノックダウンの効果を示す図である。
【図１４】図１４は、ｓｉＡＣＴＡ２のＡＦ１２ベースの送達を用いるＣＣｌ４マウスモデルで平滑筋αアクチン（α−ＳＭＡ）を有する星細胞への送達の効果を示す図である。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｃは、Ｃｏｌ１ａ１のノックダウンにＲＮＡｉが介在することを示す図である。図１５Ａは、５'ＲＡＣＥ試験の計画を示す図である。図１５Ｂは、動物が脂質ナノ粒子−ｓｉＣｏｌ１ａ１製剤を注入され、２４時間後に殺処理されたことを示す図である。図１５Ｃは、ネステッドＰＣＲのＤＮＡバンドを表すアガロースゲルを示す図である。
【図１６】図１６は、ｓｉＣＯＬ１Ａ１  ＡＤ２１３４９（配列番号５３および配列番号５４）のＡＦ１２ベースの送達を用いる胆管結紮マウスモデルでのＣＯＬ１Ａ１ノックダウンの実験計画と効果を示す図である。
【図１７】図１７は、胆管結紮動物での相対的なＣｏｌ１ａ１発現を示す図である。
【図１８】図１８は、ｓｉＣＯＬ１Ａ１  ＡＤ２１３４９（配列番号５３および配列番号５４）を用いる胆管結紮マウスモデルでのＣＯＬ１Ａ１ノックダウンの効果を示す図である。
【図１９】図１９は、ｓｉＣＯＬ１Ａ１  ＡＤ２１３４９（配列番号５３および配列番号５４）を用いる肝臓傷害性ＴＡＡマウスモデルでのＣＯＬ１Ａ１ノックダウンの実験計画と効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の詳細な説明
本明細書において記載される態様および実施形態は、これに限定されないが、慢性肝疾患に関係がある肝線維症を含む肝疾患および肝線維症の治療および／または予防のための組成物と方法に関連する。その実施形態は、肝臓の損傷中に過剰に産生され、そして、線維症の原因となる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）物質のうちの少なくとも１つが減少する可能性がある場合、肝臓の線維症が、予防されなくても、少なくとも低減する可能性があるという前提を利用している。本明細書において記載される組成物と方法は、関連するＥＣＭ遺伝子とまた線維形成のプロセス中に肝星細胞（ＨＳＣ）の活性化に関与するシグナル伝達分子、例えばＴＧＦ−βおよびＳＭＡＤ２／３の遺伝子発現のＲＮＡ干渉に基づく。
【００３１】
二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）がＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるよく保存された調節機構で遺伝子発現を妨げることが示されている。国際公開第ＷＯ９９／３２６１９号（Ｆｉｒｅら）は、エレガンス線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）で遺伝子の発現を阻害するために少なくとも２５ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡを使用することを開示した。植物（例えば、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅらの国際公開第ＷＯ９９／５３０５０号、およびＨｅｉｆｅｔｚらの国際公開第ＷＯ９９／６１６３１号を参照のこと)、ショウジョウバエ（例えば、Yang, D., et al., Curr. Biol. (2000) 10:1191-1200を参照のこと）、および哺乳類（Ｌｉｍｍｅｒの国際公開第ＷＯ００／４４８９５号、およびＫｒｅｕｔｚｅｒらの独国特許第１０１  ００  ５８６．５号を参照のこと）を含む他の生物でもｄｓＲＮＡは標的ＲＮＡを分解することが示されている。この天然の機構は、今では遺伝子の異常な、または、望まれない調節を原因とする疾患を治療するための新しい種類の医薬の開発の焦点となっている。
【００３２】
慢性肝疾患症状の間に肝臓での線維症の原因となる１つのそのようなＥＣＭ成分はコラーゲン１Ａ１（ＣＯＬ１Ａ１）である。本発明者らは、本明細書において記載されるように、インビボでのＨＳＣへのｓｉＲＮＡの脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）介在性送達が、四塩化炭素（ＣＣｌ４）誘発性マウス肝臓傷害モデルのＨＳＣにおけるＣＯＬ１Ａ１発現をかなり低減させたことを示す（図２〜３）。ＣＣｌ４処理の後に、カチオン性脂質Ｃ１２−２００（PNAS,2010,107(2):1864）を含むＬＮＰ中に製剤されたｓｉＲＮＡを静脈内注射により投与した。ＨＳＣ特異的な標的であるＣＯＬ１Ａ１の発現のサイレンシングにより、ＨＳＣへの効果的なｓｉＲＮＡ送達が実証された。ＣＯＬ１Ａ１ノックダウンはおよそ０．１ｍｇ／ｋｇのＩＣ５０を有すると共に用量依存的であった（図４〜５）。本発明者らは、さらに驚くべきことに、複数回（６回）の肝臓損傷を３９日の期間にわたって受けた慢性肝疾患のマウスモデルにおいて、本明細書において記載されるＣＯＬ１Ａ１  ｓｉＲＮＡ製剤を用いてＣＯＬ１Ａ１発現の効果的で著しい減少が達成されることもできることを示した（図１３）。
【００３３】
線維形成のプロセス中にＨＳＣの活性化に関与するシグナル伝達分子には、ＴＧＦ−βとＳＭＡＤ２／３が含まれるがこれらに限定されない。ＴＧＦ−βとＳＭＡＤ２／３を特異的に標的とするｓｉＲＮＡのＬＮＰ介在性送達がＴＧＦ−βとＳＭＡＤ２／３のインビトロでの発現を著しく低減させることを本発明者らは示す（図９〜１０）。肝臓でＳＭＡＤ２／３を特異的に標的とするｓｉＲＮＡのＬＮＰ介在性送達が、四塩化炭素（ＣＣｌ４）誘発性マウス肝臓傷害モデルでのＳＭＡＤ２／３とＣＯＬ１Ａ１の発現を著しく低減させることを本発明者らはさらに示す（図１１〜１２）。
【００３４】
線維症は、慢性肝疾患を含む多くの慢性器官不全疾患に共通の病理上の特色である。傷害の後にネクローシス死細胞が、マトリックス産生細胞を刺激するサイトカインのようなメディエーターを分泌する炎症細胞の反応を誘起する。基本的に、損傷を受けた肝臓細胞は物質（例えば、コラーゲン類）を細胞外のマトリックスに分泌するＨＳＣを活性化する。ＥＣＭでの不適切なコラーゲンの沈着が線維症の特徴であり、それは発病過程の後期で生じる。線維症を止めることで肝臓の機能を安定化することができ、移植までの時間を延期し、または生存期間の延長をもたらす。
【００３５】
線維症の生物学は非常によく理解されている。ＨＳＣは肝線維症の発病において中心的な役割を果たし、慢性肝疾患において「静止した状態の」ＨＳＣから線維形成性筋線維芽細胞に分化転換する。それはＴＧＦ−β駆動型プロセスであり、ＳＭＡＤ２とＳＭＡＤ３がＴＧＦβシグナル伝達の中間物として機能する。ＴＧＦ−βは直接的に、および、間接的に作用するが、それはこのプロセスの重要なメディエーターである。肝線維症の治療および／または予防の１つの方法は、ＨＳＣの増殖を抑制すること、および／または、ＨＳＣのアポトーシスを促進することである。別の方法は、ＨＳＣがコラーゲンのようなＥＣＭ成分を産生し、肝臓細胞のＥＣＭに分泌して線維性の塊を形成することを阻害することである。ＣＯＬ１Ａ１は、通常、肝臓に非常に低いレベルで存在するが、肝臓への損傷の後に活性化されたＨＳＣによって発現が上昇し、そして、産生される。ＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβ、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３などのＴＧＦβシグナル伝達中間物ならびにＣＯＬ１Ａ１の過剰発現に寄与するその他のタンパク質／因子の発現をＲＮＡｉで阻害することが、病因に無関係に肝線維症の治療に妥当であり得る。
【００３６】
したがって、本明細書において記載される態様および実施形態は、細胞または哺乳類においてＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現を阻害するための、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子をそれぞれ標的とするｉＲＮＡとそれらを用いる方法を含む。ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現を阻害することにより肝線維症を治療および／または予防するための組成物および方法もまた本明細書において提供される。ｉＲＮＡはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるプロセスによるｍＲＮＡの配列特異的な分解を目的とする。
【００３７】
前記態様の１つの実施形態では、ＣＯＬ１Ａ１の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号５３のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号５４のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む前記二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）が、本明細書において提供される。
【００３８】
前記態様の別の実施形態では、ＴＧＦβの発現を阻害するためのｄｓＲＮＡであって、前記ｄｓＲＮＡがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号６９のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号７０のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む前記ｄｓＲＮＡが、本明細書において提供される。
【００３９】
前記態様の別の実施形態では、ＴＧＦβの発現を阻害するためのｄｓＲＮＡであって、前記ｄｓＲＮＡがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号９１のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号９２のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む前記ｄｓＲＮＡが、本明細書において提供される。
【００４０】
前記態様の別の実施形態では、ＳＭＡＤ２／３の発現を阻害するためのｄｓＲＮＡであって、前記ｄｓＲＮＡがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号１４０のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号１４１のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む前記ｄｓＲＮＡが、本明細書において提供される。
【００４１】
本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、前記ｉＲＮＡは、配列番号５３（４１１００−ｂ１Ｄ）と配列番号５４（４１１０１−ｂ１Ｄ）のＲＮＡ配列ペア（ＡＤ−２１３４９−ｂ１）、配列番号６９（４２８６１）と配列番号７０（４２８６２）のＲＮＡ配列ペア（ＡＤ−２２１３８）、配列番号９１（４２８８３）と配列番号９２（４２８８４）のＲＮＡ配列ペア（ＡＤ−２２１４９）および／または配列番号１４０（４０３２２−ｂ１）と配列番号１４１（４０３２３−ｂ１）のＲＮＡ配列ペア（ＡＤ−２０９１６−ｂ１）を含むｄｓＲＮＡである。
【００４２】
いくつかの実施形態では、前記ｉＲＮＡの配列は、表３〜７に見出される配列識別子によって特定される配列を含む。表３〜７はセンス鎖と対応するアンチセンス鎖の配列識別子（配列番号）を含む。表３の各列（配列番号１〜配列番号６２）は、本明細書において記載される組成物と方法で用いられるＣＯＬ１Ａ１を標的とする２つの別々のｉＲＮＡ、すなわち、センス鎖（配列番号１〜配列番号６２のうちの奇数番号の配列識別子）と対応するアンチセンス鎖（配列番号１〜配列番号６２のうちの偶数番号の配列識別子）の２つの別々のペアを特定する。同様に、表４の各列（配列番号６３〜配列番号１３０）は、本明細書において記載される組成物と方法で用いられるＴＧＦ−βを標的とする２つの別々のｉＲＮＡ、すなわち、センス鎖（配列番号６３〜配列番号１３０のうちの奇数番号の配列識別子）と対応するアンチセンス鎖（配列番号６３〜配列番号１３０のうちの偶数番号の配列識別子）の２つの別々のペアを特定する。表５の各列（配列番号１３２〜配列番号１６７）は、本明細書において記載される組成物と方法で用いられるＳＭＡＤ２／３を標的とする２つの別々のｉＲＮＡ、すなわち、センス鎖（配列番号１３２〜配列番号１６７のうちの奇数番号の配列識別子）と対応するアンチセンス鎖（配列番号１３２〜配列番号１６７のうちの偶数番号の配列識別子）の２つの別々のペアを特定する。表６の各列（配列番号１８５〜配列番号２７９２）は、本明細書において記載される組成物と方法で用いられるＣＯＬ１Ａ１を標的とする２つの別々のｉＲＮＡ、すなわち、センス鎖（配列番号１８５〜配列番号２７９２のうちの奇数番号の配列識別子）と対応するアンチセンス鎖（配列番号１８５〜配列番号２７９２のうちの偶数番号の配列識別子）の２つの別々のペアを特定する。表７の各列（配列番号２７９３〜配列番号２８６０）は、本明細書において記載される組成物と方法で用いられるＳＭＡＤ２／３を標的とする２つの別々のｉＲＮＡ、すなわち、センス鎖（配列番号２７９３〜配列番号２８６０のうちの奇数番号の配列識別子）と対応するアンチセンス鎖（配列番号２７９３〜配列番号２８６０のうちの偶数番号の配列識別子）の２つの別々のペアを特定する。したがって、いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは表３〜７に記載され、そして、本明細書において提供される配列識別子（配列番号）によって特定されるようなＲＮＡ配列ペア（「センス鎖と対応するアンチセンス鎖の二重鎖」）または「センス鎖と対応するアンチセンス鎖」を含むｄｓＲＮＡである。
【００４３】
本明細書において取り上げられる組成物のｉＲＮＡは、３０ヌクレオチド以下の長さの、すなわち、１５〜３０ヌクレオチドの長さの、一般的には１９〜２４ヌクレオチドの長さの領域であって、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。これらのｉＲＮＡの使用により、肝臓でのＣＯＬ１Ａ１の発現または過剰発現に関係する線維形成のプロセスに関連があるとされる遺伝子のｍＲＮＡを標的とした分解が可能になる。特に非常に低用量のＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβおよび／またはＳＭＡＤ２／３のｉＲＮＡが特異的に、および、効率的にＲＮＡｉを仲介することができ、それぞれ、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現を著しく阻害することになる。細胞ベースの試験およびインビボモデル系を用いて、本発明者らは、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβおよび／またはＳＭＡＤ２／３を標的とするｉＲＮＡが特異的に、および、効率的にＲＮＡｉを仲介することができ、各遺伝子の発現を著しく阻害することになることを示している。本発明者らはまた驚くことに、反復性肝臓傷害または慢性肝臓傷害の条件でのＣＯＬ１Ａ１発現の著しい低減を仲介するために、ＣＯＬ１Ａ１を標的とするｉＲＮＡを用いることができることを発見している。また、本発明者らは、間接的にＣＯＬ１Ａ１の発現を阻害することになるＳＭＡＤ２／３の発現の阻害をＳＭＡＤ２／３のＲＮＡｉが仲介することを示す。したがって、これらのｉＲＮＡを含む方法と組成物は、直接的な、または、間接的なＣＯＬ１Ａ１生産の下方調節による肝疾患および／または肝線維症の治療および／または予防に有用である。以下の詳細な説明は、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現を阻害するためのｉＲＮＡを含む組成物の製造法および使用法ならびにＣＯＬ１Ａ１の発現または過剰発現を原因とする肝線維症を特徴とする肝疾患を治療および／または予防し、可能であれば反転させる組成物および方法を開示する。
【００４４】
本明細書において取り上げられる組成物の実施形態はまた、３０ヌクレオチド以下の長さであり、一般的には１９〜２４ヌクレオチドの長さであり、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子またはＳＭＡＤ２／３遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的な領域を有するアンチセンス鎖を持つｉＲＮＡを含む。
【００４５】
本明細書において取り上げられる医薬組成物の実施形態は、３０ヌクレオチド以下の長さであり、一般的には１９〜２４ヌクレオチドの長さであり、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的な領域を有するアンチセンス鎖を持つｉＲＮＡを薬学的に許容可能な担体と共に含む。
【００４６】
したがって、いくつかの態様において、ＣＯＬ１Ａ１  ｉＲＮＡ、ＴＧＦβ  ｉＲＮＡおよび／またはＳＭＡＤ２／３  ｉＲＮＡおよび薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子、ＳＭＡＤ２遺伝子および／またはＳＭＡＤ３遺伝子の発現を阻害する前記組成物の使用方法、ならびにＣＯＬ１Ａ１遺伝子の過剰発現を原因とする肝線維症を治療および／または予防し、可能であれば反転させるために前記医薬組成物を使用する方法が本発明において取り上げられる。
【００４７】
１つの実施形態では、前記医薬組成物は１つより多いｉＲＮＡタイプ、すなわち、１つより多い遺伝子標的を標的とするｉＲＮＡを含む。例えば、前記医薬組成物はＣＯＬ１Ａ１  ｉＲＮＡとＴＧＦβ  ｉＲＮＡの組合せ、ＣＯＬ１Ａ１  ｉＲＮＡとＳＭＡＤ２／３  ｉＲＮＡの組合せ、またはＣＯＬ１Ａ１  ｉＲＮＡ、ＴＧＦβ  ｉＲＮＡおよびＳＭＡＤ２／３  ｉＲＮＡの組合せを含む。
【００４８】
１つの実施形態では、ビタミンＡ結合リポソームを用いて前記ｉＲＮＡを送達する。肝臓中のＨＳＣは循環系からビタミンＡを取り込み、そして、それを貯蔵する。ビタミンＡ結合リポソームは、ｉＲＮＡがビタミンＡ捕捉性ＨＳＣを特異的に標的とするように機能する。
【００４９】
１つの実施形態では、本明細書において記載されるｉＲＮＡの送達用の前記脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤は、ＬＮＰカプセル化ｉＲＮＡがビタミンＡ捕捉性ＨＳＣを標的とするようにビタミンＡと結合させられる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本明細書において記載される前記医薬組成物および／または治療法は、コラーゲン特異的シャペロンであるヒートショックプロテイン４７（ＨＳＰ４７）を標的とする追加のｉＲＮＡをさらに含む。Ｓａｔｏ，  Ｙ．ら（2008, Nature Biotechnology, 26:431-442）は、ｓｉＲＮＡ含有ビタミンＡ結合リポソームによるＨＳＰ４７の発現阻害が、致死量のジメチルニトロソアミンで処理されたラットにおいてほぼ完全に肝線維症を解決し、そして、生存期間を延長させることを示した。
【００５１】
Ｉ．  定義
便宜上、本明細書、実施例および添付の請求項で使用されるある用語および言い回しの意味が以下に提供される。本明細書の他の部分での用語の使用法とこの節で提供されるその定義の間に明らかな食い違いがある場合、この節での定義が勝るものとする。
【００５２】
本明細書において用いられる場合、用語「慢性肝疾患」または「慢性肝疾患状態」は、肝臓が長期間にわたって反復性損傷および／または傷害を受け、結果として線維症および硬変に至る肝臓実質の進行性の破壊と再生のプロセスに入っている病気を意味する。慢性肝疾患は、これらに限定されないが、ウイルス性の原因（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ））、毒性物質および／または薬品の反復使用（例えば、アルコール性肝疾患、アミオダロン、メトトレキサート、ニトロフラントイン）、代謝性／遺伝性の原因／症状（例えば、非アルコール性脂肪肝疾患、血色素症、ウィルソン病）および自己免疫疾患（例えば、自己免疫性慢性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎）を含む様々な病因のうちのどんなものの結果としても生じることができ、または、どんなものとも関係がある。肝疾患または肝疾患状態は、本明細書において用いられる場合、その状態が少なくとも１か月間持続する、または、継続するとき、「慢性」であるとみられるが、いくつかの好ましい実施形態では、「慢性」を１２週間以上の期間として定義することができる（例えば、対象の残りの生存期間など）。
【００５３】
本明細書において用いられる場合、用語「線維症」は、器官または組織の通常の成分として、というよりはむしろ修復性プロセスまたは反応性プロセスとしての線維性組織の形成を意味する。線維症は、任意の特定の組織での線維芽細胞の蓄積と正常な沈着を超過するコラーゲンの沈着を特徴とする。線維症は、炎症、刺激状態または傷治癒の結果として生じる。本明細書において用いられる場合、「線維芽細胞の蓄積およびコラーゲンの沈着」と同じ意味で用語「線維症」を用いる。線維芽細胞は結合組織の細胞であり、全身の結合組織に分散している。線維芽細胞は、Ｉ型および／またはＩＩＩ型コラーゲンを含有する軟質ＥＣＭを分泌する。組織に対する傷害への反応で、近くの線維芽細胞がその傷に移動し、増殖し、そして、大量のコラーゲン性細胞外マトリックスを産生する。コラーゲンは、細胞外マトリックスおよび結合組織、軟骨および骨の主な成分であるグリシンとプロリンに富む線維性タンパク質である。コラーゲン分子は、α鎖と呼ばれる鎖の３重らせん構造であり、ロープ様のらせん状に互いに巻き付けられている。コラーゲンにはいくつかの形態または型が存在し、これらのうちで最も一般的なＩ型は皮膚、腱および骨に見られ、そしてＩＩＩ型は皮膚、血管および内臓器官に見られる。
【００５４】
本明細書において用いられる場合、用語「線維形成のプロセス」は、線維形成中の線維性組織の一時的、および、進行性の沈着を意味する。
【００５５】
本明細書において用いられる場合、用語「肝線維症」は、肝臓に存在する、および／または、肝臓に生じる線維症を意味する。用語「肝線維症（ｈｅｐａｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）」および「肝線維症（ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）」は互換的に用いられる。
【００５６】
本明細書において用いられる場合、用語「硬変」は、肝臓が機能性肝臓細胞の喪失を経た肝線維症の後期を意味する。正常な肝臓組織が線維性組織と置換され、その結果、正常な肝臓構造が広範囲に変形する。密集した線維組織が取り巻く再生結節が主な特徴である。線維症瘢痕組織の異常増殖が肝臓の本来の機能を抑制する。硬変は通常、非可逆的であると考えられる。
【００５７】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」および「Ｕ」は各々一般的にそれぞれグアニン、シトシン、アデニン、チミジンおよびウラシルを塩基として含有するヌクレオチドを表す。しかしながら、用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」はまた、以下にさらに詳細を記すように、修飾ヌクレオチドまたは代用置換部分（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｍｏｉｅｔｙ）を意味し得ることが理解されるであろう。当業者は、そのような置換部分を担持するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変えることなく、グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルを他の部分と置換できることに気付くであろう。例えば、これに限定されないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシンまたはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対形成することができる。それ故に、ウラシル、グアニンまたはアデニンを含有するヌクレオチドは、本明細書において取り上げられるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含有するヌクレオチドと置換されることができる。別の例では、オリゴヌクレオチド内のどの位置にあるアデニンおよびシトシンもそれぞれグアニンおよびウラシルと置換して標的ｍＲＮＡとＧ−Ｕウォッブル塩基対を形成することができる。そのような置換部分を含有する配列は本明細書において記載される組成物および方法に適切である。
【００５８】
本明細書において用いられる場合、用語「ｉＲＮＡ」は、その用語が本明細書において定義されるようにＲＮＡを含み、そして、ＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路による標的切断に介在する因子を意味する。１つの実施形態では、本明細書に記載されるようなｉＲＮＡは細胞内でのＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現を阻害する。
【００５９】
本明細書において用いられる場合、「標的配列」は、第１次転写産物のＲＮＡプロセッシングによる産物であるメッセンジャー（ｍＲＮＡ）を含む、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子、ＳＭＡＤ２遺伝子またはＳＭＡＤ３遺伝子の転写中に形成されたｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続部分を意味する。その配列の標的部分は少なくとも、その部分での、または、その近くでのｉＲＮＡ指向性切断の基質として働くために十分な長さであろう。例えば、標的配列は一般的に長さが９〜３６ヌクレオチドまで、例えば、１５〜３０ヌクレオチドであり、その間の部分範囲を含むであろう。非限定的な例として、標的配列は１５〜３０ヌクレオチド、１５〜２６ヌクレオチド、１５〜２３ヌクレオチド、１５〜２２ヌクレオチド、１５〜２１ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、１５〜１９ヌクレオチド、１５〜１８ヌクレオチド、１５〜１７ヌクレオチド、１８〜３０ヌクレオチド、１８〜２６ヌクレオチド、１８〜２３ヌクレオチド、１８〜２２ヌクレオチド、１８〜２１ヌクレオチド、１８〜２０ヌクレオチド、１９〜３０ヌクレオチド、１９〜２６ヌクレオチド、１９〜２３ヌクレオチド、１９〜２２ヌクレオチド、１９〜２１ヌクレオチド、１９〜２０ヌクレオチド、２０〜３０ヌクレオチド、２０〜２６ヌクレオチド、２０〜２５ヌクレオチド、２０〜２４ヌクレオチド、２０〜２３ヌクレオチド、２０〜２２ヌクレオチド、２０〜２１ヌクレオチド、２１〜３０ヌクレオチド、２１〜２６ヌクレオチド、２１〜２５ヌクレオチド、２１〜２４ヌクレオチド、２１〜２３ヌクレオチドまたは２１〜２２ヌクレオチドまでであり得る。
【００６０】
本明細書において用いられる場合、用語「配列を含む鎖」は、標準ヌクレオチド命名法を用いて言及される配列により記載されるヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドを意味する。
【００６１】
本明細書において用いられる場合、他に指示されない限り、用語「相補的である」は、第２ヌクレオチド配列に対する関係で第１ヌクレオチド配列について記述するために用いられるとき、当業者によって理解されるように、第１ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが一定の条件で第２ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして二重鎖構造を形成する能力に当てはまる。そのような条件は、例えば、ストリンジェントな条件である可能性があり、そこでストリンジェントな条件は、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｏＣまたは７０℃で１２〜１６時間とそれに続く洗浄を含み得る。生物内で遭遇し得るような生理学的に妥当な条件などの他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な適用に合わせて、２つの配列の相補性を試験するために最も適切な一組の条件を決定することができるであろう。
【００６２】
ｉＲＮＡ内の相補的配列、例えば、本明細書に記載されるようなｄｓＲＮＡ内の相補的配列は、第１ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドへの一方または両方のヌクレオチド配列の全長にわたる塩基対形成を含む。そのような配列は、本明細書において互いに対して「完全に相補的である」と言及されることができる。しかしながら、本明細書において第１配列が第２配列に対して「実質的に相補的である」と言及される場合、その２つの配列は完全に相補的であり得る、または、それらの配列の最終的な適用、例えば、ＲＩＳＣ経路による遺伝子発現の阻害に最も妥当な条件でハイブリダイズする能力を保持しながら、３０塩基対（ｂｐ）までの二重鎖にハイブリダイゼーションすると、それらは１つ以上だが、一般的には５つ以下、４つ以下、３つ以下または２つ以下のミスマッチ塩基対を形成することができる。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションして、１つ以上の一本鎖オーバーハングを形成するように設計されている場合、そのようなオーバーハングは、相補性の判定の点でミスマッチとみなされないものとする。例えば、２１ヌクレオチドの長さの１つのオリゴヌクレオチドと２３ヌクレオチドの長さの別のオリゴヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡであって、長い方のオリゴヌクレオチドが短い方のオリゴヌクレオチドと完全に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡを本明細書において記載される目的にとって「完全に相補的である」とさらに言及することができる。
【００６３】
「相補的」配列は、本明細書において使用される場合、非天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドのハイブリダイズする能力についての上記の要件が満たされている限り、非ワトソン‐クリック塩基対ならびに／または非天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を含むことができ、または、それらから完全に形成されることができる。そのような非ワトソン‐クリック塩基対には、Ｇ：Ｕウォッブル塩基対合またはフーグスティーン型塩基対合が含まれるがこれらに限定されない。
【００６４】
本明細書では、用語「相補的である」、「完全に相補的である」および「実質的に相補的である」を、それらが使用されている文脈から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の間、または、ｉＲＮＡ薬剤のアンチセンス鎖と標的配列の間の塩基マッチングに関して使用することができる。
【００６５】
本明細書において用いられる場合、ｍＲＮＡの「少なくとも一部と実質的に相補的である」ポリヌクレオチドは、目的のｍＲＮＡ（例えば、ＣＯＬ１Ａ１をコードするｍＲＮＡ）の連続部分に実質的に相補的であるポリヌクレオチドを意味する。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列がＣＯＬ１Ａ１をコードするｍＲＮＡの非中断部分と実質的に相補的である場合、ＣＯＬ１Ａ１  ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。
【００６６】
用語「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は、本明細書において用いられる場合、標的ＲＮＡに対して「センス」方向と「アンチセンス」方向を有すると言及すされるであろう２本の逆平行であり実質的に相補的である核酸鎖を含むハイブリダイズした二重鎖領域を持つＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子複合体を包含するｉＲＮＡを意味する。その二重鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を通した所望の標的ＲＮＡの特異的分解を可能にする任意の長さの二重鎖領域であり得るが、それは、典型的には、９塩基対から３６塩基対（ｂｐ）、例えば、１５〜３０ｂｐの長さの範囲にあるであろう。９ｂｐと３６ｂｐの間の二重鎖を考慮すると、その二重鎖は、この範囲での任意の長さ、例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６であることができ、そして、その範囲の中の任意の部分範囲、これらに限定されないが、１５〜３０ｂｐ、１５〜２６ｂｐ、１５〜２３ｂｐ、１５〜２２ｂｐ、１５〜２１ｂｐ、１５〜２０ｂｐ、１５〜１９ｂｐ、１５〜１８ｂｐ、１５〜１７ｂｐ、１８〜３０ｂｐ、１８〜２６ｂｐ、１８〜２３ｂｐ、１８〜２２ｂｐ、１８〜２１ｂｐ、１８〜２０ｂｐ、１９〜３０ｂｐ、１９〜２６ｂｐ、１９〜２３ｂｐ、１９〜２２ｂｐ、１９〜２１ｂｐ、１９〜２０ｂｐ、２０〜３０ｂｐ、２０〜２６ｂｐ、２０〜２５ｂｐ、２０〜２４ｂｐ、２０〜２３ｂｐ、２０〜２２ｂｐ、２０〜２１ｂｐ、２１〜３０ｂｐ、２１〜２６ｂｐ、２１〜２５ｂｐ、２１〜２４ｂｐ、２１〜２３ｂｐまたは２１〜２２ｂｐの間の部分範囲内の任意の長さであることができる。Ｄｉｃｅｒおよび類似の酵素によるプロセッシングによって細胞中に生成されたｄｓＲＮＡは一般に１９〜２２ｂｐの長さである。ｄｓＤＮＡの二重鎖領域の一方の鎖は、標的ＲＮＡの領域と実質的に相補的な配列を含む。その二重鎖構造を形成する２本の鎖は、少なくとも１つの自己相補領域を有する１つのＲＮＡ分子に由来する可能性があり、または、２つ以上の別々のＲＮＡ分子から形成される可能性がある。前記二重鎖領域が１つの分子の２本の鎖から形成される場合、その分子は、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３'末端とそれの他方の鎖の５'末端の間が（本明細書において「ヘアピンループ」と称される）ヌクレオチドの一本鎖によって分けられた二重鎖領域を持つ可能性がある。そのヘアピンループは少なくとも１個の未対合のヌクレオチドを含むことができ、いくつかの実施形態では、そのヘアピンループは少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも２３個またはそれ以上の未対合のヌクレオチドを含むことができる。ｄｓＲＮＡの２つの実質的に相補的である鎖が別々のＲＮＡ分子からなる場合、それらの分子は必ずというわけではないが、共有結合で結合することができる。前記の２本の鎖がヘアピンループ以外の手段により共有結合で結合される場合、その結合構造は「リンカー」と称される。上記のようなｄｓＲＮＡを指すために、用語「ｓｉＲＮＡ」もまた���明細書において用いられる。
【００６７】
用語「ＲＮＡ分子」または「リボ核酸分子」は、自然で発現される、または、自然に見いだされるＲＮＡ分子だけでなく、本明細書に記載されるような、または、当技術分野において公知であるような１個以上のリボヌクレオチド／リボヌクレオシド類似体または誘導体を含むＲＮＡの類似体および誘導体を包含するということを当業者は認識するであろう。厳密に言うと、「リボヌクレオシド」はヌクレオシド塩基とリボース糖を含み、そして、「リボヌクレオチド」は１つ、２つ、または３つのリン酸部分を有するリボヌクレオシドである。しかしながら、用語「リボヌクレオシド」と「リボヌクレオチド」は、本明細書において用いられる場合、同義であるとみなされ得る。ヌクレオ塩基構造またはリボース‐リン酸骨格構造において、例えば、以下で本明細書に記載されるように、ＲＮＡを修飾することができる。しかしながら、リボヌクレオシド類似体または誘導体を含む分子は二重鎖を形成する能力を保持しなければならない。非限定的な例として、ＲＮＡ分子は、２'−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシド、５'チオリン酸エステル基を含むヌクレオシド、コレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合した末端ヌクレオチド、ロックドヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、２'−デオキシ−２'−フルオロ修飾ヌクレオシド、２'−アミノ−修飾ヌクレオシド、２'−アルキル修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ホスホラミデートまたは非天然塩基含有ヌクレオシドまたはそれらの任意の組合せが含まれるがこれらに限定されない少なくとも１個の修飾リボヌクレオシドを含むこともできる。あるいは、ＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子の全長まで少なくとも２個の修飾リボヌクレオシド、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個またはそれ以上の修飾リボヌクレオシドを含むことができる。ＲＮＡ分子中のそのような複数の修飾リボヌクレオシドの各々について修飾が同じである必要はない。１つの実施形態では、本明細書において記載される方法および組成物で使用することが考えられる修飾ＲＮＡは、要求される二重鎖構造を形成する能力を持ち、ＲＩＳＣ経路による標的ＲＮＡの特異的分解を可能にする、または、仲介するペプチド核酸（ＰＮＡ）である。
【００６８】
１つの態様では、修飾リボヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドを含む。そのような例では、ｉＲＮＡ薬剤は、例えば、デオキシヌクレオシドオーバーハング、またはｄｓＲＮＡの二本鎖部分内の１個以上のデオキシヌクレオシドを含む１個以上のデオキシヌクレオシドを含むことができる。しかしながら、どんな場合にも二本鎖ＤＮＡ分子は用語「ｉＲＮＡ」によって包含されないことは自明である。
【００６９】
１つの態様では、ＲＮＡ干渉薬剤は、標的ＲＮＡの切断を指向するために標的ＲＮＡ配列と相互作用する一本鎖ＲＮＡを含む。理論にとらわれたくないが、植物および無脊椎動物細胞に導入された長鎖二本鎖ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒとして知られるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡに分解される(Sharp et al., Genes Dev. 2001, 15:485)。ＩＩＩ型リボヌクレアーゼ様酵素であるＤｉｃｅｒは、２塩基の３'オーバーハングを特徴とする１９〜２３塩基対の短干渉ＲＮＡにｄｓＲＮＡを加工する(Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363)。ｓｉＲＮＡは次にＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、そこで１つ以上のヘリケースがｓｉＲＮＡ二重鎖を巻き戻し、相補的なアンチセンス鎖が標的認識を先導することを可能にする(Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309)。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ中の１つ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断してサイレンシングを誘導する(Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188)。したがって、１つの態様において、本発明は、標的遺伝子のサイレンシングをもたらすＲＩＳＣ複合体の形成を促進する一本鎖ＲＮＡに関連する。
【００７０】
本明細書において用いられる場合、用語「ヌクレオチドオーバーハング」は、ｉＲＮＡの二重鎖構造、例えば、ｄｓＲＮＡからはみ出る少なくとも１個の未対合のヌクレオチドを意味する。例えば、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３'末端が他方の鎖の５'末端を超えて伸びている、またはその逆のとき、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。ｄｓＲＮＡは少なくとも１ヌクレオチドのオーバーハングを含むことができ、あるいは、そのオーバーハングは少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチドまたはそれ以上を含むことができる。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／デオキシヌクレオシドを含むヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含むことができ、または、それらからなることができる。前記オーバーハングは、センス鎖上、アンチセンス鎖上、または、それらの任意の組合せであり得る。また、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖かセンス鎖のどちらかの５'末端、３'末端または両端に存在することができる。
【００７１】
１つの実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３'末端および／または５'末端に１〜１０ヌクレオチドのオーバーハングを持つ。１つの実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、３'末端および／または５'末端に１〜１０ヌクレオチドのオーバーハングを持つ。別の実施形態では、オーバーハング中の１個以上のヌクレオチドがヌクレオシドチオリン酸と置換される。
【００７２】
用語「平滑の」または「平滑末端の」は、ｄｓＲＮＡに関して本明細書において用いられる場合、ｄｓＲＮＡの所望の末端に未対合のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が存在しないこと、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。ｄｓＲＮＡの一端または両端が平滑であり得る。ｄｓＲＮＡの両端が平滑である場合、そのｄｓＲＮＡは平滑末端型であると言われる。明確にすると、「平滑末端型」ｄｓＲＮＡは、両端が平滑である、すなわち、その分子のどちらの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないｄｓＲＮＡである。そのような分子は、最も多くの場合、その全長にわたって二本鎖であるであろう。
【００７３】
用語「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」は、標的配列に実質的に相補的な領域を含むｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡの鎖を意味する。本明細書において用いられる場合、用語「相補領域」は、本明細書において定義されるような配列、例えば標的配列と実質的に相補的なアンチセンス鎖の領域を意味する。相補領域が標的配列と完全には相補的ではない場合、その分子の内部領域または末端領域にミスマッチが存在し得る。一般に、大半の許容されるミスマッチは末端領域、例えば、５'末端および／または３'末端の５、４、３または２ヌクレオチド内に存在する。
【００７４】
用語「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」は、本明細書において用いられる場合、その用語が本明細書において定義されるようにアンチセンス鎖の領域と実質的に相補的である領域を含むｉＲＮＡの鎖を意味する。
【００７５】
本明細書において用いられる場合、１つの実施形態では、用語「ＳＮＡＬＰ」は、安定核酸脂質粒子を意味する。ＳＮＡＬＰは、ｉＲＮＡまたはｉＲＮＡが転写されるプラスミドのような核酸を含む低減した水性内部をコートする脂質小胞を意味する。ＳＮＡＬＰは、例えば、米国特許出願公開第２００６０２４００９３号、第２００７０１３５３７２号、および国際公開第ＷＯ２００９０８２８１７号に記載される。「ＳＮＡＬＰ」製剤の例は本明細書のどこかに記載される。
【００７６】
「細胞に導入する」は、ｉＲＮＡに言及する際、当業者によって理解されるように、細胞への取り込みもしくは吸収を促進すること、またはもたらすことを意味する。ｉＲＮＡの吸収または取り込みは、独力の拡散性プロセスまたは能動的細胞性プロセスを通して、または、補助薬剤または装置によって起こり得る。この用語の意味はインビトロの細胞に限定されない。ｉＲＮＡを生物の部分である「細胞に導入する」こともできる。そのような例では、細胞への導入は生物への送達を含むであろう。例えば、インビボ送達のために、ｉＲＮＡを組織部位に注入する、または、全身投与することができる。インビボ送達は、米国特許第５，０３２，４０１号および米国特許第５，６０７，６７７号、および米国出願公開第２００５／０２８１７８１号に記載されるもののようなβグルカン送達システムによるものでもあり得る。これによりそれらの文献の全体を参照して組み入れる。細胞へのインビトロ導入は、電気穿孔法およびリポフェクションなどの当技術分野において公知の方法を含む。さらなる方法は本明細書において以下に記載される、または、当技術分野において公知である。
【００７７】
本明細書において用いられる場合、「〜の発現を阻害する」という句は、本明細書に記載されるようなｉＲＮＡ組成物で処理された細胞でのＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現の、未処理の細胞でのＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβまたはＳＭＡＤ２／３の発現と比較した少なくとも部分的な「低減」を意味する。
【００７８】
用語「サイレンスする」、「〜の発現を阻害する」、「〜の発現を下方調節する」、「〜の発現を抑制する」などは、それらがＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子について言及する限りにおいて、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現の少なくとも部分的な阻害であって、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子を転写し、そして、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現が阻害されるように処理されている第１細胞もしくは細胞群から単離され得る、または、そのような細胞もしくは細胞群で検出され得るＣＯＬ１Ａ１  ｍＲＮＡ、ＴＧＦβ  ｍＲＮＡおよび／またはＳＭＡＤ２／３  ｍＲＮＡの、第１細胞もしくは細胞群と実質的に同一であるがそのように処理されていない第２細胞もしくは細胞群（対照細胞）と比較して低減した量によってそれぞれ明らかとなるような阻害を本明細書において意味する。阻害の程度は通常、次式で表される：
2019150075.tif 000003
。
【００７９】
あるいは、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現と機能的に関連しているパラメータ、例えば、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子またはＳＭＡＤ２／３遺伝子によりそれぞれコードされるタンパク質の量の、またはサイトカイン生産の喪失もしくは減少などの一定の表現型を示す細胞の数の低下という表現で阻害の程度が表され得る。原則としては、恒常的に、または、ゲノム工学的にのどちらかでＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβおよび／またはＳＭＡＤ２／３を発現する任意の細胞において、そして、任意の適切な測定法によりＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子のサイレンシングが判定されることができる。しかしながら、所与のｉＲＮＡがＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現をある程度阻害するかどうか、および、それによって所与のｉＲＮＡが本発明に包含されるかどうか決定するために基準が必要なとき、以下の実施例で提供される測定法がそのような基準として機能するものとする。
【００８０】
例えば、ある例では、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現は本明細書において取り上げられるｉＲＮＡの投与によって少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％抑制される。いくつかの実施形態では、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子は本明細書において取り上げられるｉＲＮＡの投与によって少なくとも約６０％、７０％または８０％抑制される。いくつかの実施形態では、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子は本明細書に記載されるようなｉＲＮＡの投与によって少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または以上抑制される。
【００８１】
ＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβおよび／またはＳＭＡＤ２／３の発現に関連して本明細書において用いられる場合、用語「治療する」、「治療」などは、ＣＯＬ１Ａ１の過剰発現が介在する肝線維症の除去または緩和を意味する。いくつかの実施形態では、用語「治療する」、「治療」などは、肝線維症に関係する少なくとも１つの症状を除去すること、もしくは緩和すること、または、線維形成のプロセスを遅延させること、もしくは反転させることを意味する。
【００８２】
肝機能または肝線維症バイオマーカーまたは肝線維症症状に関連して、「低減する」は、そのようなレベルの統計的に有意な減少を意味する。その減少は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％またはそれ以上の減少である可能性があり、そして好ましくは、肝臓不全、慢性肝疾患、肝線維症または硬変が無い個人について正常な範囲内であるとして許容されるレベルまで下がっている。
【００８３】
本明細書において用いられる場合、「治療上有効量」および「予防上有効量」という句は、ＣＯＬ１Ａ１の過剰発現が介在する肝線維症の治療、予防または管理における治療上の利益をもたらす量を意味する。治療上有効な特定の量は通常の医療従事者によって容易に決定されることができ、そして、それは例えば、患者の病歴および年齢、肝疾患または肝線維症の病期、ならびにＣＯＬ１Ａ１の過剰発現を間接的に阻害する他の薬剤ならびに慢性肝臓傷害および線維症に至る遠因を治療する他の薬剤の投与などの当技術分野において公知の因子に依存して変化する可能性がある。
【００８４】
本明細書において用いられる場合、「医薬組成物」は薬学的有効量のｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書において用いられる場合、「薬学的有効量」、「治療上有効量」または単に「有効量」は、意図した薬学的な、治療上の、または予防上の結果をもたらすのに有効なｉＲＮＡのその量に当てはまる。例えば、ある疾病または疾患に関係する測定可能なパラメータが少なくとも１０％減少するとき所与の臨床治療が有効であると考えられている場合、その疾病または疾患の治療用の薬品の治療上有効量は、そのパラメータで少なくとも１０％の減少をもたらすために必要な量である。例えば、治療上有効量のＣＯＬ１Ａ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡはＣＯＬ１Ａ１タンパク質のレベルを少なくとも１０％減少することができる。
【００８５】
用語「薬学的に許容可能な担体」は治療薬の投与用の担体を意味する。そのような担体には、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。その用語は細胞培養培地を特に排除している。経口投与される薬品について、薬学的に許容可能な担体には、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味剤、着香剤、着色剤および保存剤などの薬学的に許容可能な賦形剤が含まれるがこれらに限定されない。適切な不活性希釈剤には炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、および乳糖が含まれるが、一方、コーンスターチおよびアルギン酸は適切な崩壊剤である。結合剤はデンプンおよびゼラチンを含むことができるが、一方、滑沢剤は、存在する場合、一般的には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであろう。所望により、胃腸管での吸収を遅らせるために錠剤をモノステアリン酸グリセリルなどの物質でコートすることができる。薬品の製剤に含まれる薬剤は本明細書において以下に記載される。
【００８６】
本明細書において用いられる場合、線維症を「予防する」医薬は、統計標本において、未処理対照試料と比較して処理試料で線維症の発生を低減させ、または、未処理対照試料と比較してその疾患または病気の１つ以上の症状の発生を遅らせる、または、重症度を低減させる組成物である。
【００８７】
「感染」は、本明細書において用いられる場合、宿主内で複製する外来生物または外来因子の宿主における存在に起因し得る疾患または病気を意味する。感染は、典型的には感染性生物または因子による正常な粘膜性隔壁または他の組織の隔壁への侵入を含む。感染症を有する対象は、その対象の体内に存在する客観的に測定可能な感染生成物または因子を有する対象である。
【００８８】
本明細書において用いられる場合、「対象」は哺乳類、例えば、イヌ、ウマ、ネコおよび他の非ヒト霊長類である。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【００８９】
本明細書において用いられる場合、「ＸＸ」が数である用語「ＬＮＰＸＸ」は、本明細書において「ＡＦＸＸ」とも称される。例えば、ＬＮＰ０９はＡＦ０９とも称され、そして、ＬＮＰ１２はＡＦ１２としても知られ、そのようにも称される。
【００９０】
本明細書において用いられる場合、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、本発明に必須であって、さらに、必須にせよ、必須でないにせよ非特定の要素を包含しやすい組成物、方法およびそれらのそれぞれの成分に関して用いられる。
【００９１】
本明細書において用いられる場合、用語「〜から基本的になる」は、所与の実施形態に必要な要素に当てはまる。その用語により、本発明のその実施形態の基本的、および、新規の、または、機能上の特徴に実質的に影響しない要素が存在することが可能になる。
【００９２】
用語「〜からなる」は、実施形態のその記述に列挙されていないどんな要素をも排除する、本明細書に記載されるような組成物、方法およびその個々の要素に当てはまる。
【００９３】
ＩＩ．  二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）
ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡ薬剤が本明細書において記載される。１つの実施形態では、そのｉＲＮＡ薬剤は細胞または哺乳類、例えば肝線維症を特徴とする肝疾患を有するヒトにおいてＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現をそれぞれ阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子であって、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現で形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的な相補領域を有するアンチセンス鎖を含むｄｓＲＮＡであって、そして、その相補領域は３０ヌクレオチド以下の長さであり、一般的に１９〜２４ヌクレオチドの長さであるｄｓＲＮＡであって、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子またはＳＭＡＤ２／３遺伝子をそれぞれ発現している細胞と接触すると、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現をそれぞれ、例えば、ＰＣＲまたは分枝状ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ベースの方法で測定すると、または、ウェスタンブロットなどのタンパク質ベースの方法で測定すると少なくとも１０％阻害するｄｓＲＮＡを含む。ｂＤＮＡまたはＴａｑＭａｎ測定法などによりＣＯＬ１Ａ１  ｍＲＮＡレベルを測定することで、または、例えば、ウェスタンブロッティングまたは流動細胞分析技術を用いた免疫蛍光分析などによりタンパク質レベルを測定することでＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、一次肝細胞、ＨｅｐＧ２細胞、一次培養ＨＳＣなどの培養細胞での、または、対象由来の生物学的試料でのＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現を分析することができる。
【００９４】
ｄｓＲＮＡは、そのｄｓＲＮＡが使用されるであろう条件でハイブリダイズして二重鎖構造を形成するほど相補的な２本のＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列に実質的に相補的であり、一般的に完全に相補的な相補領域を含む。その標的配列は、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現中に形成されたｍＲＮＡの配列に由来することができる。他方の鎖（センス鎖）はアンチセンス鎖と、その２本の鎖が適切な条件で混合されるとハイブリダイズして二重鎖構造を形成するように、相補的な領域を含む。一般的に、その二重鎖構造は１５塩基対と３０塩基対の間の長さを含み、より一般的には１８塩基対と２５塩基対の間の長さを含み、さらにより一般的には１９塩基対と２４塩基対の間の長さを含み、および最も一般的には１９塩基対と２１塩基対の間の長さを含む。同様に、前記標的配列に対しての相補領域は１５ヌクレオチドと３０ヌクレオチドの間の長さを含み、より一般的には１８ヌクレオチドと２５ヌクレオチドの間の長さを含み、さらにより一般的には１９ヌクレオチドと２４ヌクレオチドの間の長さを含み、および最も一般的には１９ヌクレオチドと２１ヌクレオチドの間の長さを含む。いくつかの実施形態では、前記ｄｓＲＮＡは１５ヌクレオチドと２０ヌクレオチドの間の長さを含み、別の実施形態では、前記ｄｓＲＮＡは２５ヌクレオチドと３０ヌクレオチドの間の長さを含む。当業者が認識するように、切断の標的とされるＲＮＡの標的領域は、大変頻繁により大きいＲＮＡ分子の部分であり、頻繁にはｍＲＮＡ分子の部分であるであろう。妥当である場合、ｍＲＮＡ標的の「一部」は、ＲＮＡｉ指向性切断（すなわち、ＲＩＳＣ経路を通じた切断）の基質であるために十分な長さのｍＲＮＡ標的の連続配列である。９ｂｐほどの二重鎖を有するｄｓＲＮＡは、いくつかの状況では、ＲＮＡｉ指向性ＲＮＡ切断に介在することができる。最も頻繁には、標的は少なくとも１５ヌクレオチドの長さ、好ましくは１５〜３０ヌクレオチドの長さであるであろう。
【００９５】
当業者はまた、前記二重鎖領域、例えば９〜３６ｂｐの、例えば、１５〜３０ｂｐの二重鎖領域はｄｓＲＮＡの主な機能部分であることも理解するであろう。したがって、１つの実施形態では、所望のＲＮＡを切断のために標的とする、例えば１５〜３０ｂｐの機能性二重鎖に加工される限り、３０ｂｐ以上の二重鎖領域を持つＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子複合体はｄｓＲＮＡである。したがって、当業者は、１つの実施形態では、それで、ｍｉＲＮＡはｄｓＲＮＡであることを認識するであろう。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは天然のｍｉＲＮＡではない。別の実施形態では、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβおよび／またはＳＭＡＤ２／３の発現を標的とするのに有用なｉＲＮＡ薬剤はより大きいｄｓＲＮＡの切断により目的の細胞で生成されることはない。
【００９６】
本明細書に記載されるようなｄｓＲＮＡは１つ以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含むことができる。そのｄｓＲＮＡを、以下でさらに論じるような当技術分野において公知の標準的な方法、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃから市販されているような自動化ＤＮＡ合成機を使用して合成することができる。
【００９７】
１つの実施形態では、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子はヒトＣＯＬ１Ａ１遺伝子である。別の実施形態では、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子はマウスまたはラットのＣＯＬ１Ａ１遺伝子である。１つの実施形態では、ｉＲＮＡはヒトならびに／またはマウスおよびラットのＣＯＬ１Ａ１配列と交差反応する。特定の実施形態では、第１配列は表３と表６由来のセンス配列を含むｄｓＲＮＡのセンス鎖であり、第２配列は表３と表６の対応するアンチセンス配列からなる群より選択される。表３と表６に提供される標的配列中のどこかを標的とする別のｄｓＲＮＡ薬剤をその標的配列と隣接するＣＯＬ１Ａ１配列を用いて容易に決定することができる。
【００９８】
１つの実施形態では、ＴＧＦβ遺伝子はヒトＴＧＦβ遺伝子である。別の実施形態では、ＴＧＦβ遺伝子はマウスまたはラットのＴＧＦβ遺伝子である。特定の実施形態では、第１配列は表４と表７由来のセンス配列を含むｄｓＲＮＡのセンス鎖であり、第２配列は表４と表７の対応するアンチセンス配列からなる群より選択される。表４と表７に提供される標的配列のどこかを標的とする別のｄｓＲＮＡ薬剤をその標的配列と隣接するＴＧＦβ配列を用いて容易に決定することができる。１つの実施形態では、ｉＲＮＡはヒトならびに／またはマウスおよびラットのＴＧＦβ配列と交差反応する。
【００９９】
１つの実施形態では、ＳＭＡＤ２／３遺伝子はヒトＳＭＡＤ２／３遺伝子である。別の実施形態では、ＳＭＡＤ２／３遺伝子はマウスまたはラットのＳＭＡＤ２／３遺伝子である。特定の実施形態では、第１配列は表５由来のセンス配列を含むｄｓＲＮＡのセンス鎖であり、第２配列は表５の対応するアンチセンス配列からなる群より選択される。表５に提供される標的配列のどこかを標的とする別のｄｓＲＮＡ薬剤をその標的配列と隣接するＳＭＡＤ２／３配列を用いて容易に決定することができる。１つの実施形態では、ｉＲＮＡはヒトならびに／またはマウスおよびラットのＳＭＡＤ２／３配列と交差反応する。
【０１００】
１つの態様では、ｄｓＲＮＡは少なくとも２つのヌクレオチド配列、すなわち、センス配列およびアンチセンス配列を含み、それによってセンス鎖は表３〜７に提供される配列からなる群より選択され、そのセンス鎖の対応するアンチセンス鎖は表３〜７より選択されるであろう。この態様では、２つの配列の一方はその２つの配列の他方と相補的であり、その配列の一方がＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβおよび／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現で生成されたｍＲＮＡ配列と実質的に相補的である。したがってこの態様では、ｄｓＲＮＡは、１つのオリゴヌクレオチドが表３〜７中のセンス鎖として記載され、第２のオリゴヌクレオチドが表３〜７由来のセンス鎖の対応するアンチセンス鎖として記載される２つのオリゴヌクレオチドを含むであろう。本明細書のどこかに記載され、そして、当技術分野において公知であるように、ｄｓＲＮＡの補的な配列は、別々のオリゴヌクレオチド上にあるのではなく１つの核酸分子の自己相補領域として含まれることもできる。
【０１０１】
当業者は、２０塩基対と２３塩基対の間の、しかし具体的には２１塩基対の二重鎖構造を有するｄｓＲＮＡがＲＮＡ干渉の誘導に特に効果的なものとして認められていることを(Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888)よく知っている。しかしながら、他の人達は、より短い、または、より長いＲＮＡ二重鎖構造が同様に効果的であり得ることを見つけている。上記の実施形態では、表３〜７に提供される配列識別子で特定されるオリゴヌクレオチド配列の特質から、本明細書において記載されるｄｓＲＮＡは最小で２１ｎｔの長さを持つ少なくとも１本の鎖を含むことができる。一端または両端でほんのわずかのヌクレオチドを欠く表３〜７の配列のうちの１つを有するより短い二重鎖が上記のｄｓＲＮＡと比較して同様に効果的であり得ることを合理的に予想することができる。それ故に、表３〜７の配列のうちの１つに由来する、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の連続したヌクレオチドの部分配列を有するｄｓＲＮＡであって、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現を５、１０、１５、２０、２５または３０％阻害以下まで阻害するそれらの能力が完全配列を含むｄｓＲＮＡと異なるｄｓＲＮＡが本発明に従って考えられる。
【０１０２】
さらに、表３〜７に提供されるＲＮＡは、ＲＩＳＣ介在性切断を受けやすいＣＯＬ１Ａ１転写物、ＴＧＦβ転写物および／またはＳＭＡＤ２／３転写物中の部位を同定する。したがって、本発明は、そのような配列の１つの内部に標的を定めるｉＲＮＡをさらに取り上げる。本明細書において用いられる場合、ｉＲＮＡがＲＮＡ転写物の特定の部位内のどこにおいてもその転写物の切断を促進する場合、そのｉＲＮＡはその特定の部位内に標的を定めると言われる。そのようなｉＲＮＡは、それぞれＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の中の選択された配列に隣接する領域から抽出された追加のヌクレオチド配列に結合した、表３〜７に提供される配列の１つに由来する少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを全般的に含むであろう。
【０１０３】
標的配列は一般的には１５〜３０ヌクレオチドの長さであるが、この範囲にある特定の配列の、任意の所与の標的ＲＮＡの切断を指向することについての適合性には様々な違いがある。本明細書において提示される様々なソフトウェアパッケージおよびガイドラインが任意の所与の遺伝子標的に最適な標的配列を同定するためのガイダンスを提供するが、標的配列として機能し得るサイズ範囲にある配列を同定するために所与のサイズ（非限定的な例として、２１ヌクレオチド）の「ウィンドウ」または「マスク」が標的ＲＮＡ配列上に字義通りに、または、（例えば、インシリコを含む）比ゆ的に設置される経験則による方法もとることができる。配列「ウィンドウ」を最初の標的配列の位置の１ヌクレオチド上流に、または、下流に漸次動かすことにより、次に可能性がある標的配列を同定することができ、ついに選択された任意の所与の標的サイズについて可能な配列の完全なセットが特定される。最適に機能する配列を同定するためのこのプロセスにより、同定された配列の組織的な合成および（本明細書に記載されるような、または、当技術分野において公知であるような測定法を用いる）試験と組み合わされて、ｉＲＮＡ薬剤に標的とされると、標的遺伝子の発現の最も好ましい阻害を仲介するＲＮＡ配列が同定されることが可能となる。したがって、例えば、表３〜７中の配列識別子により特定される配列は効果的な標的配列を表すが、同等の、または、さらに好ましい阻害特性を有する配列を同定するために、所与の配列の１ヌクレオチド上流または下流に漸次「ウィンドウを歩かせる」ことにより阻害効果のさらなる最適化を達成できると考えられる。
【０１０４】
また、例えば、表３〜７中の配列識別子によって特定される任意の配列について、組織的にヌクレオチドを付加するか除去するかのどちらかによってより長い、または、より短い配列を生成し、そして、それらの配列および標的ＲＮＡの位置からその上流または下流により長い、または、より短いサイズのウィンドウを歩かせることにより生成した配列を試験することによりさらなる最適化が達成され得るであろうと考えられる。また、この方法を新しい候補標的を作成することに結び付け、当技術分野において公知であるような、または、本明細書に記載されるような阻害測定法でそれらの標的配列に基づきｉＲＮＡの有効性を試験することにより、阻害効率がさらに改善することになり得る。さらになお、そのような最適化された配列を、その分子を発現阻害剤としてさらに最適化するために（例えば、血清中安定性または循環半減期の増加、熱安定性の増加、経膜送達の向上、特定の場所または細胞種へのターゲティング、サイレンシング経路の酵素との相互作用の増加、エンドソームからの放出の増加など）、例えば、本明細書に記載されるような、または、当技術分野において公知であるような修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングの付加またはオーバーハングの変更、または、当技術分野において公知であるような、および／もしくは、本明細書で論じられるようなその他の修飾により調整することができる。
【０１０５】
本明細書に記載されるようなｉＲＮＡは標的配列に対する１つ以上のミスマッチを含有することができる。１つの実施形態では、本明細書に記載されるようなｉＲＮＡは３つ以下のミスマッチを含有する。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含有する場合、相補領域の中央にミスマッチ区域が位置しないことが好ましい。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含有する場合、相補領域の５'末端または３'末端のどちらかから最後の５ヌクレオチド以内にミスマッチが制限されることが好ましい。例えば、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の領域に相補的な２３ヌクレオチドｉＲＮＡ薬剤のＲＮＡ鎖について、そのＲＮＡ鎖は一般的に中央の１３ヌクレオチド内にどんなミスマッチをも含有しない。標的配列に対するミスマッチを含有するｉＲＮＡがＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子のそれぞれの発現阻害に効果的であるかどうか判定するために、本明細書において記載される方法、または当技術分野において公知の方法を用いることができる。ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現阻害におけるミスマッチを有するｉＲＮＡの有効性を考慮することは、特にＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の中の特定の相補領域が集団内で多型性の配列変化を有すると知られている場合、重要である。
【０１０６】
１つの実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも一端は、１〜４ヌクレオチドの、一般的には１または２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有する。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、その平滑末端型の相対物と比較して予想外に優れた阻害特性を持つ。さらに別の実施形態では、ｉＲＮＡのＲＮＡは、例えば、ｄｓＲＮＡは、安定性またはその他の有益な特質を向上するために化学的に修飾される。本発明において取り上げられる核酸は、"Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載されるもののような当技術分野においてよく確立されている方法によって合成および／または修飾されることがでる。この文献をこれにより参照して本明細書に組み入れる。修飾には、例えば、（ａ）末端修飾、例えば、５'末端修飾（リン酸化、複合体化、逆結合など）、３'末端修飾（複合体化、ＤＮＡヌクレオチド、逆結合など）、（ｂ）塩基修飾、例えば、安定化塩基、不安定化塩基、または広範囲のレパートリーの相手と塩基対合する塩基との置換、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）または複合体化塩基、（ｃ）糖修飾（例えば、２'位または４'位での）または糖の置換、ならびに（ｄ）ホスホジエステル結合の修飾または置換を含む骨格修飾が含まれる。本明細書において記載される実施形態において有用なＲＮＡ化合物の具体例には、修飾された骨格を含む、または、天然のヌクレオシド間結合を含まないＲＮＡが含まれるがこれらに限定されない。修飾された骨格を有するＲＮＡには、中でも、骨格中にリン原子を有さないものが含まれる。本明細書の目的のために、そして、当技術分野においてときどき参照されるように、ヌクレオシド間骨格にリン原子を有さない修飾ＲＮＡはオリゴヌクレオシドであると考えることもできる。特定の実施形態では、修飾ＲＮＡはヌクレオシド間骨格にリン原子を有するであろう。
【０１０７】
修飾ＲＮＡ骨格には、例えば、チオリン酸エステル、キラルチオリン酸エステル、ジチオリン酸エステル、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３'−アルキレンホスホン酸エステルおよびキラルホスホン酸エステルを含むメチルホスホン酸エステルおよび他のアルキルホスホン酸エステル、ホスフィン酸エステル、３'−アミノアミド亜リン酸エステルおよびアミノアルキルアミド亜リン酸エステルを含むアミド亜リン酸エステル、チオノアミド亜リン酸エステル、チオノアルキルホスホン酸エステル、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の３'−５'結合を有するボラノリン酸エステル、これらの２'−５'結合類似体、およびヌクレオシド単位の隣接対が３'−５'から５'−３'に、または、２'−５'から５'−２'に結合している逆極性を有するもの）が含まれる。様々な塩、混合塩、および遊離酸形態もまた含まれる。
【０１０８】
上記のリン原子含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９５号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３１６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、第５，６２５，０５０号、第６，０２８，１８８号、第６，１２４，４４５号、第６，１６０，１０９号、第６，１６９，１７０号、第６，１７２，２０９号、第６，２３９，２６５号、第６，２７７，６０３号、第６，３２６，１９９号、第６，３４６，６１４号、第６，４４４，４２３号、第６，５３１，５９０号、第６，５３４，６３９号、第６，６０８，０３５号、第６，６８３，１６７号、第６，８５８，７１５号、第６，８６７，２９４号、第６，８７８，８０５号、第７，０１５，３１５号、第７，０４１，８１６号、第７，２７３，９３３号、第７，３２１，０２９号および米国再発行特許第３９４６４号が含まれるがこれらに限定されず、それらの文献の各々を参照して本明細書に組み入れる。
【０１０９】
その中にリン原子を含まない修飾ＲＮＡ骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子性もしくは複素環式ヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらには、（部分的にはヌクレオシドの糖部分から形成される）モルホリノ結合、シロキサン骨格、スルフィド、スルフオキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファミン酸エステル骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホン酸エステルおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素部分を有する他のものを持つものが含まれる。
【０１１０】
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号および第５，６７７，４３９号が含まれるがこれらに限定されず、それらの文献の各々を参照して本明細書に組み入れる。
【０１１１】
他の実施形態では、適切なＲＮＡ模倣物をｉＲＮＡに使用することが考えられており、そのｉＲＮＡではヌクレオチド単位の糖とヌクレオシド間結合の両方、すなわち、骨格が新しい基によって置換される。適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために塩基単位が維持される。１つのそのようなオリゴマー化合物であって、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているＲＮＡ模倣物はペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物では、ＲＮＡの糖骨格がアミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換される。ヌクレオ塩基は維持され、そして、その骨格のアミド部分のアザ窒素原子と直接的に、または、間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号および第５，７１９，２６２号が含まれるがこれらに限定されず、それらの文献の各々を参照して本明細書に組み入れる。ＰＮＡ化合物についてのさらなる教示を、例えば、Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500中に見出すことができる。
【０１１２】
本発明において取り上げられるいくつかの実施形態は、チオリン酸エステル骨格を有するＲＮＡおよびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシド、および特に先に参照した米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる］−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［式中、本来のホスホジエステル骨格は−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表される］、および先に参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を含む。いくつかの実施形態では、本明細書において取り上げられるＲＮＡは、先に参照した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有する。
【０１１３】
修飾ＲＮＡはまた、１つ以上の置換糖部分を含有することもできる。ｉＲＮＡ、例えば、本明細書において取り上げられるｄｓＲＮＡは２'位に次のＯＨ基、Ｆ基、Ｏ−アルキル基、Ｓ−アルキル基もしくはＮ−アルキル基、Ｏ−アルケニル基、Ｓ−アルケニル基もしくはＮ−アルケニル基、Ｏ−アルキニル基、Ｓ−アルキニル基もしくはＮ−アルキニル基、またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル基のうちの１つを含むことができ、アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基は炭素数１〜１０の置換もしくは非置換アルキル基または炭素数２〜１０の置換もしくは非置換アルケニル基または置換もしくは非置換アルキニル基であり得る。例示的で適切な修飾には、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が含まれ、式中、ｎとｍは１から約１０である。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは２'位に次のうちの１つを含む：炭素数１〜１０の低級アルキル基、置換低級アルキル基、アルカリル基、アラルキル基、Ｏ−アルカリル基またはＯ−アラルキル基、ＳＨ基、ＳＣＨ３基、ＯＣＮ基、Ｃｌ基、Ｂｒ基、ＣＮ基、ＣＦ３基、ＯＣＦ３基、ＳＯＣＨ３基、ＳＯ２ＣＨ３基、ＯＮＯ２基、ＮＯ２基、Ｎ３基、ＮＨ２基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロシクロアルカリル基、アミノアルキルアミノ基、ポリアルキルアミノ基、置換シリル基、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入物質、ｉＲＮＡの薬物動態特性を向上するための基、またはｉＲＮＡの薬力学的特性を向上するための基、および類似の特性を有する他の置換物。いくつかの実施形態では、その修飾には、２'-メトキシエトキシ基（２'−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ基３、２'−Ｏ−（２−メトキシエチル）基または２'−ＭＯＥ基としても知られる）（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504）、すなわち、アルコキシ−アルコキシ基が含まれる。別の例示的な修飾は２'−ジメチルアミノオキシエトキシ基、すなわち、２'−ＤＭＡＯＥ基としても知られ、本明細書において以下の実施例に記載されるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基であり、（２'−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルエトキシエチル基または２'−ＤＭＡＥＯＥ基としてまた当技術分野において公知である）２'−ジメチルアミノエトキシエトキシ基、すなわち、本明細書において以下の実施例にもまた記載される２'−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２基である。
【０１１４】
その他の修飾には、２'−メトキシ基（２'−ＯＣＨ３）、２'−アミノプロポキシ基（２'−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２'−フルオロ基（２'−Ｆ）が含まれる。ｉＲＮＡのＲＮＡのその他の位置に、特に３'末端ヌクレオチドの糖の３'位、または２−５結合ｄｓＲＮＡ中に、および５'末端ヌクレオチドの５'位に類似の修飾がなされることもできる。ｉＲＮＡは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖模倣物を有することもできる。そのような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号および第５，７００，９２０号が含まれるがこれらに限定されず、それらのうちのあるものが本願によって共通して認知され、それらの文献の各々を参照して本明細書に組み入れる。
【０１１５】
ｉＲＮＡは、（当技術分野においては単純に「塩基」としばしば称される）ヌクレオ塩基の修飾または置換を含むこともできる。本明細書において用いられる場合、「未修飾の」または「天然の」ヌクレオ塩基はプリン塩基のアデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾ヌクレオ塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２‐チオウラシル、２−チオチミンおよび２‐チオシトシン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピルウラシルおよび５−プロピルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４‐チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオールアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７‐メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−ダアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどの合成ヌクレオ塩基および天然ヌクレオ塩基が含まれる。さらなるヌクレオ塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008において開示されるもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990において開示されるもの、 Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613によって開示されるもの、およびSanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993によって開示されるものが含まれる。これらのヌクレオ塩基のうちのあるものは、本発明において取り上げられるオリゴマー化合物の結合親和性を増加させることに特に有用である。これらは５−置換ピリミジン類、６−アザピリミジン類ならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含むＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン類を含む。５−メチルシトシン置換が核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されており(Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）、さらに特に２'−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされるとき５−メチルシトシン置換は例示的な塩基置換である。
【０１１６】
上述の修飾ヌクレオ塩基ならびに他の修飾ヌクレオ塩基のいくつかの調製を教示する代表的な米国特許には、上述の米国特許第３，６８７，８０８号ならびに米国特許第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、第５，６８１，９４１号、第６，０１５，８８６号、第６，１４７，２００号、第６，１６６，１９７号、第６，２２２，０２５号、第６，２３５，８８７号、第６，３８０，３６８号、第６，５２８，６４０号、第６，６３９，０６２号、第６，６１７，４３８号、第７，０４５，６１０号、第７，４２７，６７２号および第７，４９５，０８８号が含まれるがこれらに限定されず、それらの文献の各々を参照して本明細書に組み入れ、そして、米国特許第５，７５０，６９２号もまた参照して本明細書に組み入れる。
【０１１７】
１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）を含むようにｉＲＮＡのＲＮＡを修飾することもできる。ロックド核酸は、リボース部分が２'位と４'位の炭素原子を連結する特別な架橋を含む修飾リボース部分を有するヌクレオチドである。この構造はリボースを３'末端立体構造に効率的に「ロック」する。ｓｉＲＮＡへのロックド核酸の付加が血清中のｓｉＲＮＡの安定性を向上させ、そして、オフターゲット効果を低減させることが示されている(Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447、 Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843、 Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193)。
【０１１８】
ロックド核酸ヌクレオチドの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第６，２６８，４９０号、第６，６７０，４６１号、第６，７９４，４９９号、第６，９９８，４８４号、第７，０５３，２０７号、第７，０８４，１２５号および第７，３９９，８４５号が含まれるがこれらに限定されず、それらの文献の各々を参照してその全体を本明細書に組み入れる。
【０１１９】
本発明において取り上げられるｉＲＮＡのＲＮＡの別の修飾は、ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取込を向上させる１つ以上のリガンド、部分または複合物のＲＮＡへの化学的結合を含む。そのような部分には、コレステロール部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556）、コール酸（Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060）、例えば、ベリル−Ｓ−トリチルチオールなどのチオエーテル（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309、Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538）、例えば、ドデカンジオール残基またはウンデシル残基などの脂肪族鎖（Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118、Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330、Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54）、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたは１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホン酸トリエチルアンモニウムなどのリン脂質（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654、 Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783）、ポリアミン鎖またはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237）、またはオクタデシルアミン部分もしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937）などの脂質部分が含まれるがこれらに限定されない。
【０１２０】
１つの実施形態では、リガンドが、それが組み込まれるｉＲＮＡ薬剤の分布、ターゲティングまたは持続時間を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドが選択された標的、例えば、分子、細胞または細胞種、細胞区画もしくは器官区画、組織、器官または身体の領域などの区画への、例えば、そのようなリガンドを欠く種と比較して向上した親和性をもたらす。好ましいリガンドは二重鎖核酸の二重鎖対合に関与しないであろう。
【０１２１】
リガンドには、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポプロテイン（ＬＤＬ）またはグロブリン）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）、または脂質などの天然物質が含まれ得る。リガンドはまた組換え分子または、合成ポリアミノ酸などの合成高分子のような合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例には、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ-アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物共重合体、ポリ（Ｌ−ラクチド−グリコリード）共重合体、ジビニルエーテル−マレイン酸無水物共重合体、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファゼンであるポリアミノ酸が含まれる。ポリアミンの例には、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣性ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの４級塩またはαラセンペプチドが含まれる。
【０１２２】
リガンドはまた、ターゲティング基、例えば、細胞または組織ターゲティング薬剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、腎臓細胞などの特定の細胞種に結合する抗体を含むことができる。ターゲティング基はチロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホン酸エステル、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチンまたはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣物であり得る。
【０１２３】
リガンドの他の例には、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラーレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合物（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合物、テトラアザマクロサイクルのＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰまたはＡＰが含まれる。
【０１２４】
リガンドはタンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、共リガンドに特異的な親和性を有する分子、または抗体、例えば、肝星細胞のような特定の細胞種に結合する抗体であり得る。リガンドにはまた、ホルモンおよびホルモン受容体が含まれ得る。それらにはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、または多価フコースなどの非ペプチド種も含まれ得る。リガンドは、例えば、リポポリサッカリド、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子またはＴＧＦβ受容体であり得る。
【０１２５】
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することにより、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメントおよび／または中間径フィラメントを破壊することにより細胞へのｉＲＮＡ薬剤の取り込みを増加させることができる薬品などの物質であり得る。その薬品は、例えば、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシンまたはミオセルビンであり得る。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなｉＲＮＡに結合するリガンドは薬物動態（ＰＫ）修飾因子として作用する。本明細書において用いられる場合、「ＰＫ修飾因子」は、薬物動態修飾因子を意味する。ＰＫ修飾因子には、脂質親和体、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが含まれる。例示的なＰＫ修飾因子には、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが含まれるがこれらに限定されない。多数のチオリン酸エステル結合を含むオリゴヌクレオチドもまた血清タンパク質に結合することが知られており、したがって、短いオリゴヌクレオチド、例えば、骨格中に複数のチオリン酸エステル結合を含む約５塩基、１０塩基、１５塩基または２０塩基のオリゴヌクレオチドがまたリガンドとして（例えばＰＫ修飾因子リガンドとして）本発明に従う。さらに、血清成分（例えば、血清タンパク質）に結合するアプタマーもまた、本明細書において記載される実施形態でのＰＫ修飾リガンドとしての使用に適切である。
【０１２７】
脂質複合体
１つの実施形態では、リガンドまたは複合物は脂質または脂質ベースの分子である。そのような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。ＨＳＡ結合リガンドが複合体の標的組織、例えば、身体の非腎臓標的組織への分布を可能とする。例えば、標的組織は肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。ＨＳＡに結合できる他の分子もまたリガンドとして使用することができる。例えば、ネプロキシンまたはスピリンを使用することができる。脂質または脂質ベースのリガンドは、（ａ）複合体の分解への耐性を増大することができ、（ｂ）標的細胞または細胞膜へのターゲティングまたは輸送を向上することができ、および／または（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＡＳへの結合を調節するために用いられ得る。
【０１２８】
調節する、例えば、複合体の標的組織への結合を制御するために脂質ベースのリガンドを使用することができる。例えば、ＨＳＡに強力に結合する脂質または脂質ベースのリガンドほど腎臓にターゲットされる可能性が少なく、したがって、身体から除去される可能性が少なくなるであろう。複合体が腎臓を標的とするためにＨＳＡにあまり強力に結合しない脂質または脂質ベースのリガンドを使用することができる。
【０１２９】
好ましい実施形態では、前記脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。複合体が、好ましくは、非腎臓組織に分布されるように、それが十分な親和性でＨＳＡに結合することが好ましい。しかしながら、ＨＳＡリガンド間結合が反転されることができないほど親和性が強くないことが好ましい。
【０１３０】
別の好ましい実施形態では、複合体が、好ましくは、腎臓に分布するように、前記脂質ベースのリガンドはＨＳＡに弱く結合するか、全く結合しない。腎臓細胞にターゲットする他の部分もまた、脂質ベースのリガンドの代わりに、または、それに加えて使用することができる。
【０１３１】
別の態様では、前記リガンドは部分、例えば、増殖細胞などの標的細胞によって取り込まれるビタミンである。これらは、例えば、悪性または非悪性タイプの、例えば癌細胞の望まない細胞増殖を特徴とする疾患の治療に特に有用である。ビタミンの例には、ビタミンＡ、ＥおよびＫが含まれる。ビタミンの他の例には、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールまたは肝臓中のＨＳＣのような標的細胞によって取り込まれる他のビタミンもしくは栄養物が含まれる。ＨＳＡおよび低密度リポプロテイン（ＬＤＬ）もまた含まれる。
【０１３２】
細胞透過性ペプチドおよび薬剤
別の態様では、前記リガンドは細胞透過性薬剤であり、好ましくはらせん状細胞透過性薬剤である。好ましくは、その薬剤は両親媒性である。例示的な薬剤は、ＴＡＴまたはアンテナペディアなどのペプチドである。前記薬剤がペプチドである場合、それは修飾されている可能性があり、ペプチジル模倣物、逆転異性体、非ペプチドまたは偽ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸の使用を含む。前記らせん状薬剤は好ましくはαらせん状薬剤であり、それは好ましくは親油性相および疎油性相を持つ。
【０１３３】
前記リガンドはペプチドまたはペプチド模倣物であり得る。ペプチド模倣物（オリゴペプチド模倣物とも称される）は天然ペプチドに類似する明確な三次元構造に折り畳まれることができる分子である。ペプチドおよびペプチド模倣物のｉＲＮＡ薬剤への結合が、細胞認識および吸収の向上などによりｉＲＮＡの薬物動態分布に影響する可能性がある。前記ペプチドまたはペプチド模倣物部分は約５〜５０アミノ酸、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸の長さであり得る。
【０１３４】
ペプチドまたはペプチド模倣物は、例えば、細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチドまたは（例えば、主として、チロシン、トリプトファンまたはフェニルアラニンからなる）疎水性ペプチドでありうる。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。別の変形例では、前記ペプチド部分は疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含むことができる。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドはＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号１６８）のアミノ酸配列を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１６９））はまたターゲティング部分でもあり得る。前記ペプチド部分は細胞膜を越えてペプチド、オリゴヌクレオチドおよびタンパク質を含む大極性分子を運ぶことができる「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶのＴａｔタンパク質由来の配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１７０））およびショウジョウバエのアンテナペディアタンパク質由来の配列（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１７１））が送達ペプチドとして機能することができることが明らかになっている。ファージディスプレイライブラリーまたは１ビーズ−１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリー(Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991)から同定されたペプチドのように、ペプチドまたはペプチド模倣物はＤＮＡのランダム配列によりコードされることができる。細胞ターゲティング用途のために組み込まれたモノマー単位を介してｄｓＲＮＡ薬剤に繋がれるペプチドまたはペプチド模倣物は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチドまたはＲＧＤ模倣物である。ペプチド部分は約５アミノ酸から約４０アミノ酸までの範囲の長さであり得る。ペプチド部分は、例えば、安定性を増大させるために、または、立体構造特性を方向付けるために構造上の修飾を有することができる。以下に記載される構造上の修飾のいずれも利用することができる。
【０１３５】
内皮腫瘍細胞または乳腺癌腫瘍細胞などの腫瘍細胞を標的とするためにＲＧＤペプチド部分を使用することができる(Zitzmann et al., Cancer Res., 62:5139-43, 2002)。ＲＧＤペプチドは、肺、腎臓、脾臓または肝臓を含む他の様々な組織の腫瘍へのｄｓＲＮＡ薬剤のターゲティングを容易にすることができる(Aoki et al., Cancer Gene Therapy  8:783-787, 2001)。好ましくは、ＲＧＤペプチドは腎臓へのｉＲＮＡ薬剤のターゲティングを容易にするであろう。前記ＲＧＤペプチドは線状または環状であることができ、修飾、例えば、グリコシル化またはメチル化されて特定の組織へのターゲティングを容易にすることができる。例えば、グリコシル化ＲＧＤペプチドは、αｖβ３を発現する腫瘍細胞へｉＲＮＡ薬剤を送達することができる(Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001)。
【０１３６】
増殖細胞に濃縮されるマーカーを標的にするペプチドを使用することができ、例えば、ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣物は、癌細胞、特にαｖβ３インテグリンを提示する細胞を標的とすることができる。したがって、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤ含有環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸を含むＲＧＤペプチドならびに合成ＲＧＤ模倣物を使用することができるであろう。ＲＧＤに加えて、αｖβ３インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することができる。一般的に、細胞増殖と血管新生を制御するために、そのようなリガンドを使用することができる。
【０１３７】
「細胞透過性ペプチド」は、細胞、例えば、細菌細胞もしくは真菌細胞などの微生物細胞またはヒト細胞などの哺乳類細胞を透過することができる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えば、αらせん状線状ペプチド（例えば、ＬＬ−３７またはセロピンＰ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−ディフェンシン、β−ディフェンシンまたはバクテネシン）、または、ただ１つのもしくは２つの優勢なアミノ酸を含有するペプチド（例えば、ＰＲ−３９またはインドリシジン）であり得る。細胞透過性ペプチドはまた核移行シグナル（ＮＬＳ）を含むこともできる。例えば、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ−１のｇｐ４１とＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳの融合ペプチドドメインに由来するＭＰＧ（Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003）などの二連両親媒性ペプチドであり得る。
【０１３８】
炭水化物複合物
いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは炭水化物複合物をさらに含む。炭水化物複合物は、本明細書に記載されるように、核酸のインビボ送達に好都合であり、ならびに組成物はインビボでの治療上の使用に適切である。本明細書において用いられる場合、「炭水化物」は、少なくとも６炭素原子を各炭素原子に結合する酸素、窒素もしくはイオウ原子とともに有する１つ以上の（線状、分枝状または環状であり得る）単糖単位からなる炭水化物それ自体か少なくとも６炭素原子を各炭素原子に結合する酸素、窒素もしくはイオウ原子とともに有する１つ以上の（線状、分枝状または環状であり得る）単糖単位からなる炭水化物部分をその一部として持つ化合物のどちらかである化合物を意味する。代表的な炭水化物には、糖（単糖、二糖、三糖および約４〜９単糖単位を含有するオリゴ糖）ならびにデンプン、グリコーゲン、セルロースおよびポリサッカリドガムなどのポリサッカリドが含まれる。具体的な単糖には炭素数５の糖および上記の（このましくは炭素数５〜８の）糖が含まれ、二糖および三糖には（好ましくは炭素数５〜８の）単糖単位を有する糖が含まれる。
【０１３９】
１つの実施形態では、前記炭水化物複合物は、
2019150075.tif 000004
2019150075.tif 000005
2019150075.tif 000006
2019150075.tif 000007
2019150075.tif 000008
からなる群、すなわち、式ＩＩ〜式ＸＸＩＩより選択される。
【０１４０】
本明細書において記載される実施形態で使用される別の代表的な炭水化物複合物には、ＸかＹの一方がオリゴヌクレオチドであり、他方は水素である、
2019150075.tif 000009
が含まれるがこれに限定されない。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、前記炭水化物複合物は、これらに限定されないが、ＰＫ修飾因子、エンドソーム分解性リガンドおよび細胞透過性ペプチドなどの他のリガンドをさらに含む。
【０１４２】
リンカー
いくつかの実施形態では、切断可能または切断不可能であり得る様々なリンカーを用いて本明細書において記載される複合物をｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに結合することができる。
【０１４３】
用語「リンカー」または「結合基」は、化合物の２つの部分を結合する有機部分を意味する。リンカーは、典型的には、直接結合または酸素もしくはイオウなどの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位または、これらに限定されないが、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリールであって、式中、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換複素環が１つ以上のメチレンの中に挿入されるか１つ以上のメチレンがＯ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換複素環で終わりになるものなどの原子鎖を含み、式中、Ｒ８は水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である。１つの実施形態では、前記リンカーは１〜２４原子の間であり、好ましくは４〜２４原子の間であり、好ましくは６〜１８原子の間であり、より好ましくは８〜１８原子の間であり、最も好ましくは８〜１６原子の間である。
【０１４４】
切断可能な結合基は、細胞外では十分に安定だが、標的細胞に入ると切断されて、そのリンカーが一つにまとめている２つの部分を放出する。好ましい実施形態では、対象の血液中または（例えば、血液または血清中に見られる条件を模倣するために、または、代表するために選択され得る）第２基準条件よりも標的細胞中または（例えば、細胞内条件を模倣するために、または、代表するために選択され得る）第１条件で前記の切断可能な結合基が少なくとも１０倍以上、好ましくは少なくとも１００倍速く切断される。
【０１４５】
切断可能な結合基は切断因子、例えば、ｐＨ、酸化還元電位または分解性分子の存在に敏感である。一般的に、切断因子は血清または血液中よりも細胞内に広く存在し、または高いレベルもしくは活性で見つかる。そのような分解性因子の例には、例えば、細胞中に存在し、酸化還元で切断可能な結合基を還元により分解することができる酸化還元酵素またはメルカプタンなどの還元剤を含む酸化還元剤であって特定の基質のために選択される、または、基質特異性が無い酸化還元剤、エステラーゼ、酸性環境を作り出すことができる、例えば、ｐＨが５以下になるエンドソームまたは薬剤、一般的な酸、（基質特異的であり得る）ペプチダーゼおよびホスファターゼとして作用することにより酸で切断可能な結合基を加水分解または分解することができる酵素が含まれる。
【０１４６】
ジスルフィド結合などの切断可能な結合基はｐＨに敏感であり得る。ヒト血清のｐＨは７．４であり、一方、平均細胞内ｐＨはわずかに低く、約７．１〜７．３の範囲である。エンドソームはより酸性のｐＨを持ち、５．５〜６．０の範囲であり、リソソームは約５．０のさらにより酸性のｐＨを持つ。いくつかのリンカーは好ましいｐＨで切断される切断可能な結合基を持ち、それによってリガンドからカチオン性脂質を細胞内で放出し、または細胞の所望の区画に放出するであろう。
【０１４７】
リンカーは、特定の酵素により切断される切断可能な結合基を含むことができる。リンカーに組み込まれる切断可能な結合基の種類は、標的とされる細胞に依ることができる。例えば、エステル基を含むリンカーを介してカチオン性脂質に肝臓ターゲティングリガンドを連結することができる。肝臓細胞はエステラーゼに富み、したがってそのリンカーはエステラーゼに富んでいない細胞種よりも肝臓細胞でより効率的に切断されるであろう。エステラーゼに富む他の細胞種は肺、腎皮質および精巣の細胞を含む。
【０１４８】
肝臓細胞および滑膜細胞などのペプチダーゼに富む細胞種を標的とするとき、ペプチド結合を含むリンカーを使用することができる。
【０１４９】
一般的に、切断可能な結合基候補の適合性を、分解性因子（または条件）のその結合基候補を切断する能力を試験することで評価することができる。血液中での、または、他の非標的組織と接触するときの切断可能な結合基候補の切断耐性能力をまた試験することも望ましいであろう。したがって、第１条件が標的細胞での切断を示すために選択され、第２条件が他の組織または生物学的液体、例えば、血液もしくは血清での切断を示すために選択される場合、第１条件と第２条件の間での切断に対する相対的感受性を測定することができる。無細胞系、細胞、培養細胞、培養器官もしくは組織、または動物の全身でその評価を行うことができる。無細胞条件または培養条件で最初の評価を行い、動物の全身でのさらなる評価により確認を行うことが有益であり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液または血清（または、細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件）と比較して、細胞中で（または、細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件で）少なくとも２、４、１０または１００倍速く切断される。
【０１５０】
酸化還元で切断可能な結合基
切断可能な結合基の１つの分類は、還元または酸化されて切断される酸化還元で切断可能な結合基である。還元により切断可能な結合基の例は、ジスルフィド結合基（−Ｓ−Ｓ−）である。切断可能な結合基候補が適切な「還元により切断可能な結合基」であるかどうか決定するために、または、例えば、特定のｉＲＮＡ部分および特定のターゲティング剤との使用に適切であるかどうか決定するために、本明細書において記載される方法に頼ることができる。例えば、標的細胞などの細胞で観察されるであろう切断速度を模倣する当技術分野において公知の試薬を使用して、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、または他の還元剤と保温することにより候補を評価することができる。血液または血清の条件を模倣するように選択されている条件で候補を評価することもできる。好ましい実施形態では、血液では候補化合物が多くとも１０％切断される。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液（または、細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件）と比較して、細胞中で（または、細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件で）少なくとも２、４、１０または１００倍速く分解される。候補化合物の切断速度を、細胞内媒体を模倣するように選択された条件での標準的な酵素反応速度測定法を用いて決定することができ、そして、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較することができる。
【０１５１】
リン酸エステルベースの切断可能な結合基
リン酸エステルベースの切断可能な結合基は、リン酸エステル基を分解する、または、加水分解する因子により切断される。細胞中でリン酸エステル基を切断する因子の例は細胞中のホスファターゼなどの酵素である。リン酸エステルベースの結合基の例は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−である。上記のものと類似する方法を用いて、これらの候補を評価することができる。
【０１５２】
酸で切断可能な結合基
酸で切断可能な結合基は、酸性条件で切断される結合基である。好ましい実施形態では、酸で切断可能な結合基は、約６．５以下（例えば、約６．０、５．５、５．０またはそれ以下）のｐＨを持つ酸性環境中で、または、一般的な酸として作用することができる酵素のような因子により切断される。細胞中では、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低ｐＨオルガネラが酸で切断可能な結合基に切断環境を提供することができる。酸で切断可能な結合基の例には、ヒドラゾン、エステルおよびアミノ酸のエステルが含まれるがこれらに限定されない。酸切断基は、一般式−Ｃ＝ＮＮ−、Ｃ（Ｏ）Ｏまたは−ＯＣ（Ｏ）を有することができる。好ましい実施形態は、前記エステル（アルコキシ基）の酸素に結合する炭素がアリール基であるとき、ジメチルペンチル基またはｔ−ブチル基などの置換アルキル基または第３級アルキル基である。上記のものと類似する方法を用いて、これらの候補を評価することができる。
【０１５３】
エステルベースの結合基
エステルベースの切断可能な結合基は、細胞中のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素により切断される。エステルベースの切断可能な結合基の例には、アルキレン基、アルケニレン基およびアルキニレン基のエステルが含まれるがこれらに限定されない。エステルの切断可能な結合基は、一般式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−を有する。上記のものと類似する方法を用いて、これらの候補を評価することができる。
【０１５４】
ペプチドベースの結合基
ペプチドベースの切断可能な結合基は、細胞中のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素により切断される。ペプチドベースの切断可能な結合基は、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドを産生するためにアミノ酸間で形成されるペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能基はアミド基（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）を含まない。アミド基は任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキネレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、ペプチドおよびタンパク質を産生するためにアミノ酸間で形成される特別な種類のアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般的に、ペプチドおよびタンパク質を産生するアミノ酸間で形成されるペプチド結合（すなわち、アミド結合）に限定され、アミド官能基全体を含んでいるわけではない。ペプチドベースの切断可能な結合基は、一般式-ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）−（配列番号８７６）を有し、式中、ＲＡとＲＢは２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。上記のものと類似する方法を用いて、これらの候補を評価することができる。
【０１５５】
リンカーを有する代表的な炭水化物複合物には、ＸかＹの一方がオリゴヌクレオチドであり、他方は水素である、
2019150075.tif 000010
2019150075.tif 000011
が含まれるがこれらに限定されない。
【０１５６】
ＲＮＡ複合体の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第４，８２８，９７９号、第４，９４８，８８２号、第５，２１８，１０５号、第５，５２５，４６５号、第５，５４１，３１３号、第５，５４５，７３０号、第５，５５２，５３８号、第５，５７８，７１７号、第５，５８０，７３１号、第５，５９１，５８４号、第５，１０９，１２４号、第５，１１８，８０２号、第５，１３８，０４５号、第５，４１４，０７７号、第５，４８６，６０３号、第５，５１２，４３９号、第５，５７８，７１８号、第５，６０８，０４６号、第４，５８７，０４４号、第４，６０５，７３５号、第４，６６７，０２５号、第４，７６２，７７９号、第４，７８９，７３７号、第４，８２４，９４１号、第４，８３５，２６３号、第４，８７６，３３５号、第４，９０４，５８２号、第４，９５８，０１３号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，２４５，０２２号、第５，２５４，４６９号、第５，２５８，５０６号、第５，２６２，５３６号、第５，２７２，２５０号、第５，２９２，８７３号、第５，３１７，０９８号、第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号、第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号、第５，５１０，４７５号、第５，５１２，６６７号、第５，５１４，７８５号、第５，５６５，５５２号、第５，５６７，８１０号、第５，５７４，１４２号、第５，５８５，４８１号、第５，５８７，３７１号、第５，５９５，７２６号、第５，５９７，６９６号、第５，５９９，９２３号、第５，５９９，９２８号および第５，６８８，９４１号、第６，２９４，６６４号、第６，３２０，０１７号、第６，５７６，７５２号、第６，７８３，９３１号、第６，９００，２９７号、第７，０３７，６４６号が含まれるがこれらに限定されず、それらの文献の各々を参照して本明細書に組み入れる。
【０１５７】
所与の化合物中の全ての位置が均一に修飾される必要はなく、そして、実際には、前述の修飾のうちの１つよりも多くのものが１つの化合物中に、またはｉＲＮＡ内のたった１つのヌクレオシドに組み込まれ得る。本発明はまた、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物を含む。「キメラ」ｉＲＮＡ化合物または「キメラ体」は、本発明との関連では、ｉＲＮＡ化合物、好ましくはｄｓＲＮＡであり、それは、それぞれが少なくとも１つのモノマー単位、すなわち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合ヌクレオチドからなる２つ以上の化学的に別個の領域を含む。これらのｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ分解に対する向上した耐性、向上した細胞取込および／または標的核酸への向上した結合親和性をそのｉＲＮＡにもたらすように修飾されている少なくとも１つの領域を含有することが典型的である。前記ｉＲＮＡのその他の領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質として機能することができる。例として、ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮａｓｅＨの活性化によりＲＮＡ標的が切断され、それにより遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害の効率を大いに向上する。結果として、キメラｄｓＲＮＡを使用すると、同じ標的領域にハイブリダイズするチオリン酸エステル結合型デオキシｄｓＲＮＡと比較して、より短いｉＲＮＡで匹敵できる結果をしばしば得ることができる。当技術分野において公知のゲル電気泳動および必要に応じて関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によりＲＮＡ標的の切断を日常的に検出することができる。
【０１５８】
ある例では、非リガンド基によりｉＲＮＡのＲＮＡを修飾することができる。多数の非リガンド分子がｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取込を向上させるためにｉＲＮＡと複合体化されており、そして、そのような複合体化を実施するための方法が科学文献において利用可能である。そのような非リガンド部分には、コレステロール（Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61、 Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306、 Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール残基もしくはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111、 Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327、 Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくは１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホン酸トリエチルアンモニウム（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651、 Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777）、ポリアミン鎖もしくはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229）、またはオクタデシルアミン部分もしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923）などの脂質部分が含まれている。そのようなＲＮＡ複合体の調製を教示する代表的な米国特許は先に記載されている。典型的な複合体化プロトコルは配列の１つ以上の位置にアミノリンカーを担持するＲＮＡの合成を含む。次に、適切なカップリング試薬または活性化試薬を使用して、複合体化される分子とそのアミノ基を反応させる。溶液相において、固形支持体になお結合しているＲＮＡを用いるかＲＮＡを切断した後に複合体化反応を実行することができる。典型的には、ＲＮＡ複合体のＨＰＬＣによる精製により、純粋な複合体がもたらされる。
【０１５９】
ｉＲＮＡの送達
多数の異なる方法で、それを必要とする対象へのｉＲＮＡの送達を達成することができる。ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物を対象に投与することにより、インビボ送達を直接的に実行することができる。あるいは、ｉＲＮＡをコードしそのｉＲＮＡの発現を指向する１つ以上のベクターを投与することにより、送達を間接的に実行することができる。これらの変形例を以下でさらに論じる。
【０１６０】
直接的な送達
一般的に、核酸分子の任意の送達方法をｉＲＮＡとの使用のために適合させることができる（例えば、Akhtar S. and Julian RL.,1992, Trends Cell. Biol. 2(5):139-144 および国際公開第ＷＯ９４／０２５９５号を参照のこと。それら文献の全体を参照して本明細書に組み入れる）。しかしながら、分子をインビボでうまく送達するために考慮する重要な３つの因子が存在する：（ａ）送達される分子の生物学的安定性、（２）非特異的効果の予防、および（３）標的組織での送達された分子の蓄積。例えば、組織（非限定的な例としては腫瘍）への直接注入もしくは移植などの局所投与により、または、製剤を局所的に投与することにより、ｉＲＮＡの非特異的効果を最小化することができる。治療部位への局所投与が薬剤の局所濃度を最大化し、別の方法ではその薬剤により害を受ける可能性がある全身組織、または、その薬剤を分解することができる全身組織への薬剤の曝露を限定し、そして、より少ない総投与量のｉＲＮＡ分子が投与されることを可能とする。いくつかの研究で、ｉＲＮＡが局所的に投与されるときの遺伝子産物の成功したノックダウンが示されている。例えば、カニクイザルでの硝子体内注入（Tolentino, MJ., et al (2004) Retina 24:132-138）とマウスでの網膜下注入（Reich, SJ., et al (2003) Mol. Vis. 9:210-216）によるＶＥＧＦ  ｄｓＲＮＡの眼内送達が両方とも加齢黄斑変性の実験モデルにおける血管新生を妨げることが示された。さらに、マウスでのｄｓＲＮＡの直接腫瘍内注入が腫瘍体積を減少させ（Pille, J., et al (2005) Mol. Ther.11:267-274）、そして、腫瘍担持マウスの生存時間を延長することができる（Kim, WJ., et al (2006) Mol. Ther. 14:343-350、 Li, S., et al (2007) Mol. Ther. 15:515-523）。ＲＮＡ干渉は、直接注入によるＣＮＳへの局所送達について成功を示しており（Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49、 Tan, PH., et al (2005) Gene Ther. 12:59-66、 Makimura, H., et al (2002) BMC Neurosci. 3:18、 Shishkina, GT., et al (2004) Neuroscience 129:521-528、 Thakker, ER., et al (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275、 Akaneya,Y., et al (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602）、鼻腔内投与による肺への局所送達について成功を示している（Howard, KA., et al (2006) Mol. Ther. 14:476-484、 Zhang, X., et al (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684、 Bitko, V., et al (2005) Nat. Med. 11:50-55）。疾患の治療用にｉＲＮＡを全身投与するために、ＲＮＡを修飾することができ、または、代わりに薬物送達システムを用いて送達することができる。両方の方法が、インビボでのエンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの急速な分解を防ぐように作用する。ＲＮＡまたは医薬担体の修飾もｉＲＮＡ組成物の標的組織へのターゲティングを可能にすることができ、そして、望まないオフターゲット効果を避けることができる。コレステロールなどの親油性基への化学的複合体化によりｉＲＮＡ分子を修飾し、細胞取込を向上させ、そして分解を防ぐことができる。例えば、親油性コレステロール部分と複合体化されたＡｐｏＢ指向性ｉＲＮＡをマウスに全身注入し、肝臓と空腸の両方でａｐｏＢ  ｍＲＮＡをノックダウンすることとなった（Soutschek,J.,et al (2004) Nature 432:173-178）。アプタマーへのｉＲＮＡの複合体化が前立腺癌のマウスモデルでの腫瘍増殖を抑制し、そして、腫瘍退縮に介在することが示されている（McNamara, JO., et al (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015）。他の実施形態では、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソームまたはカチオン性送達システムなどの薬物送達システムを使用してｉＲＮＡを送達することができる。正に荷電したカチオン性送達システムは（負に荷電した）ｉＲＮＡ分子の結合を促進し、そしてまた、負に荷電した細胞膜での相互作用を増強して細胞によるｉＲＮＡの効率的な取込を可能とする。カチオン性脂質、デンドリマーまたはポリマーはｉＲＮＡと結合させられることができるか、ｉＲＮＡを包むベシクルまたはミセルを形成するように導入されることができるかのどちらかである（例えば、Kim SH., et al (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116を参照のこと）。ベシクルまたはミセルの形成が全身投与される時のｉＲＮＡの分解をさらに防ぐ。カチオン性ｉＲＮＡ複合体の作製法および投与法は十分に当業者の能力の範囲内である（例えば、Sorensen, DR., et al (2003) J. Mol. Biol 327:761-766、 Verma, UN., et al (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300、Arnold, AS et al (2007) J. Hypertens. 25:197-205を参照のこと。それらの文献の全体を参照して本明細書に組み入れる。）。ｉＲＮＡの全身送達に有用な薬物送達システムのいくつかの非限定的な例には、ＤＯＴＡＰ（Sorensen, DR., et al (2003),上記、 Verma, UN., et al (2003),上記）、オリゴフェクタミン、「固形核酸脂質粒子」（Zimmermann, TS., et al (2006) Nature 441:111-114）、カルジオリピン（Chien, PY., et al (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328、 Pal, A., et al (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091）、ポリエチレンイミン（Bonnet ME., et al (2008) Pharm. Res. 印刷前の８月１６日付電子出版、 Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659）、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド（Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487）、およびポリアミドアミン（Tomalia, DA., et al (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67、 Yoo, H., et al (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804）が含まれる。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは全身投与のためにシクロデキストリンと複合体を形成する。ｉＲＮＡとシクロデキストリンの投与方法と医薬組成物は米国特許第７，４２７，６０５号に見つけることができ、その文献の全体を参照して本明細書に組み入れる。
【０１６１】
ベクターにコードされるｄｓＲＮＡ
別の態様では、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位からＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子を標的とするｉＲＮＡを発現することができる（例えば、Couture, A, et al., TIG.,1996, 12:5-10、 Skillern, A., et al., 国際公開第ＷＯ００／２２１１３号、 Conrad, 国際公開第ＷＯ００／２２１１４号およびConrad, 米国特許第６，０５４，２９９号を参照のこと）。発現は、使用された特定のコンストラクトおよび標的組織または細胞種に応じて一時的でも（数時間から数週間の単位）持続性でも（数週間から数か月またはそれ以上）あり得る。組み込み型ベクターまたは非組み込み型ベクターでありうる線状コンストラクト、環状プラスミドまたはウイルスベクターとしてこれらの導入遺伝子を導入することができる。染色体外プラスミドとして遺伝されることを可能にするように、導入遺伝子を構築することもできる（Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92:1292）。
【０１６２】
発現ベクター上のプロモーターからｉＲＮＡの１つの鎖または個々の鎖を転写することができる。２つの別々の鎖が、例えば、ｄｓＲＮＡを生成するように発現されることになっている場合、２つの別々の発現ベクターを（例えば、形質移入または感染により）標的細胞に共導入することができる。あるいは、ｄｓＲＮＡの各々個々の鎖が、同じ発現プラスミドに局在している複数のプロモーターによって転写されることができる。１つの実施形態では、ｄｓＲＮＡがステムループ構造を持つようにリンカーポリヌクレオチド配列により連結される逆方向反復ポリヌクレオチドとしてｄｓＲＮＡが発現される。
【０１６３】
ｉＲＮＡ発現ベクターは一般的にＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。本明細書に記載されるようなｉＲＮＡの発現用組換えコンストラクトを作製するために、真核細胞に適合性がある発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞に適合性がある発現ベクターを使用することができる。真核細胞発現ベクターは当技術分野において周知であり、多数の商業上の供給元から入手可能である。典型的には、そのようなベクターは、所望の核酸断片の挿入に便利な制限部位を含んで提供される。ｉＲＮＡ発現ベクターの送達は、例えば、静脈内投与または筋肉内投与による、患者から生体外に移植された標的細胞に投与して、その後、患者に再導入することによる、または、所望の標的細胞への導入を可能にする他のあらゆる手段による全身性の送達であり得る。
【０１６４】
カチオン性脂質担体（例えば、オリゴフェクタミン）または非カチオン性脂質ベース担体（例えば、トランジット−ＴＫＯ（商標））との複合体として標的細胞にｉＲＮＡ発現プラスミドを形質移入することができる。本発明は、標的ＲＮＡの様々な領域を標的とするｉＲＮＡ介在性ノックダウンのために１週間以上の期間にわたり、複数回、脂質形質移入することも考えている。様々な公知の方法を用いて、ベクターの宿主への成功する導入をモニターすることができる。例えば、一時的な形質移入を、グリーンフルオレッセントプロテイン（ＧＦＰ）などの蛍光マーカーのようなレポーターを用いて示すことができる。特定の環境因子（例えば、抗生物質および薬品）への耐性、例えば、ハイグロマイシンＢ耐性を形質移入細胞にもたらすマーカーを用いて生体外での細胞の安定的な形質移入を確実にすることができる。
【０１６５】
本明細書において記載される方法および組成物とともに利用することができるウイルスベクターシステムには、（ａ）アデノウイルスベクター、（ｂ）レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウィルスなどを含むがこれらに限定されないレトロウイルスベクター、（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター、（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター、（ｅ）ＳＶ４０ベクター、（ｆ）ポリオーマウイルスベクター、（ｇ）パピローマウイルスベクター、（ｈ）ピコルナウイルスベクター、（ｉ）オルソポックスなどのポックスウイルスベクター、例えば、ワクシニアウイルスベクターまたは鳥ポックス、例えば、カナリアポックスもしくは家禽ポックス、および（ｊ）ヘルパー依存性または新世代アデノウイルスが含まれるがこれらに限定されない。複製欠損ウイルスもまた好都合であり得る。様々なベクターが細胞のゲノムに組み込まれる、または、組み込まれないであろう。コンストラクトは、必要に応じて、形質移入のためのウイルス性配列を含むことができる。あるいは、ＥＰＶベクターおよびＥＢＶベクターなどのエピソームによる複製が可能であるベクターにコンストラクトを組み込むことができる。ｉＲＮＡの組換え発現用のコンストラクトは、標的細胞におけるｉＲＮＡの発現を確実なものとするために、一般的に調節性配列、例えば、プロモーター、エンハンサーなどを必要とするであろう。ベクターとコンストラクトについて考慮する他の態様は以下でさらに論じられる。
【０１６６】
ｉＲＮＡの送達に有用なベクターは、所望の標的細胞または組織でのｉＲＮＡの発現に十分な調節性配列（プロモーター、エンハンサーなど）を含むであろう。恒常性発現または制御性／誘導性発現のどちらかをもたらすように調節性配列を選択することができる。
【０１６７】
例えば、ある生理学的調節因子、例えば、循環グルコースレベルまたはホルモンに感受性である誘導性調節性配列を用いることにより(Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24）、ｉＲＮＡの発現を正確に調節することができる。細胞または哺乳類でのｄｓＲＮＡの発現制御に適切なそのような誘導性発現システムには、例えば、エクダイソンによる、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、２量体化の化学誘導剤およびイソプロピル−β−Ｄ１-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による調節が含まれる。当業者であればｉＲＮＡ導入遺伝子を使用する意図に基づいて適切な調節性／プロモーター配列を選ぶことができるであろう。
【０１６８】
特定の実施形態では、ｉＲＮＡをコードする核酸配列を含有するウイルスベクターを用いることができる。例えば、レトロウイルスベクターを用いることができる(Miller et al., Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正確なパッケージと宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要な構成要素を含有している。核酸の患者への送達を促進する１つ以上のベクターにｉＲＮＡをコードする核酸配列をクローンする。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細は、例えば、Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994)に見出すことができ、その文献は造血性幹細胞を化学療法に対してより耐性とするためにその幹細胞にｍｄｒ１遺伝子を送達するレトロウイルスベクターの使用について記載している。遺伝子治療でのレトロウイルスベクターの使用を説明する他の文献は、Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994)、 Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994)、 Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993)および Grossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993)である。使用が考えられているレンチウイルスベクターには、例えば、米国特許第６，１４３，５２０号、第５，６６５，５５７号および第５，９８１，２７６号に記載されるＨＩＶベースのベクターが含まれており、それらの文献を参照して本明細書に組み入れる。
【０１６９】
ｉＲＮＡの送達での使用にアデノウイルスも考えられている。アデノウイルスは、例えば、気道上皮への遺伝子の送達に特に魅力的な媒体である。アデノウイルスは自然界では気道上皮に感染し、そこでそれらは軽い病気を引き起こす。アデノウイルスベースの送達システムの他の標的は肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスは非増殖細胞に感染できる利点がある。Kozarsky and Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993）はアデノウイルスベースの遺伝子治療の概説を提供する。Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994）は、アカゲザルの気道上皮へ遺伝子を移入するアデノウイルスベクターの使用について説明する。遺伝子治療でのアデノウイルスの使用の他の例を、Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991)、 Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992)、 Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993)、国際公開第ＷＯ９４／１２６４９号、およびWang, et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995）に見つけることができる。本発明において取り上げられるｉＲＮＡの発現に適切なＡＶベクター、組換えＡＶベクターの構築方法および標的細胞へのベクターの送達方法は、Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010に記載される。
【０１７０】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用も考えられている(Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993）、米国特許第５，４３６，１４６号）。１つの実施形態では、Ｕ６  ＲＮＡプロモーターかＨ１  ＲＮＡプロモーターのどちらか、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを有する組換えＡＡＶベクターから２つの別々の、相補的な一本鎖ＲＮＡ分子としてｉＲＮＡを発現することができる。本発明において取り上げられるｄｓＲＮＡの発現に適切なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターの構築方法および標的細へのベクターの送達方法が、Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532、 Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826、米国特許第５，２５２，４７９号、米国特許第５，１３９，９４１号、国際特許出願第ＷＯ９４／１３７８８号、および国際特許出願第ＷＯ９３／２４６４１号に記載され、それらの文献の全開示を参照して本明細書に組み入れる。
【０１７１】
別の好ましいウイルスベクターは、ワクシニアウイルスなどのポックスウイルス、例えば、アンカラ修飾ウイルス（ＭＶＡ）またはＮＹＶＡＣなどの弱毒化ワクシニア、家禽ポックスまたはカナリアポックスなどの鳥ポックスである。
【０１７２】
必要に応じて、他のウイルス由来のエンベロープタンパク質もしくは他の表面抗原でベクターをシュードタイプすることにより、または、異なるウイルスのキャプシドタンパク質と置換することにより、ウイルスベクターの指向性を改変することができる。例えば、レンチウイルスベクターを水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、モコラウイルスなどに由来する表面タンパク質でシュードタイプすることができる。異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するようにベクターを改変することにより、ＡＡＶベクターが異なる細胞を標的とするようにさせることができる。例えば、Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801を参照のこと。その文献の全開示を参照して本明細書に組み入れる。
【０１７３】
ベクターの医薬製剤は、許容可能な希釈剤中にベクターを含むことができ、または、遺伝子送達用媒体が包埋されている遅放性マトリックスを含むことができる。あるいは、完全な遺伝子送達ベクター、例えば、レトロウイルスベクターを組換え細胞からそのままの形状で産生することができる場合、その医薬製剤は、その遺伝子送達システムを産生する１つ以上の細胞を含むことができる。
【０１７４】
ＩＩＩ．  ｉＲＮＡ含有医薬組成物
１つの実施形態では、ｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体を含有する医薬組成物が本明細書において提供される。ｉＲＮＡ含有医薬組成物はＣＯＬ１Ａ１遺伝子の過剰発現に関連する肝線維症の治療に有用である。送達モードに基づいてそのような医薬組成物を製剤する。一例は、静脈内（ＩＶ）送達などの非経口送達による全身性投与用に製剤される組成物である。別の例は、例えば連続ポンプ点滴での脳への点滴などによる脳柔組織への直接送達用に製剤される組成物である。
【０１７５】
本明細書において取り上げられる医薬組成物は、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与される。一般的に、ｉＲＮＡの適切な用量は、１日に受容者の体重１キログラムあたり０．０１〜２００．０ミリグラムの範囲にあり、概して、１日に体重１キログラムあたり１〜５０ｍｇの範囲にあるであろう。例えば、１回の投与あたり０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇの用量でｄｓＲＮＡを投与することができる。１日に１回前記医薬組成物を投与することができ、または、１日を通して適切な投与間隔で２、３またはそれ以上の分割用量としてｉＲＮＡを投与することができ、または、制御放出製剤により連続点滴もしくは連続送達を用いて前記ｉＲＮＡを投与することさえできる。その場合、各分割用量に含まれるｉＲＮＡは、総１日投与量を達成するように対応して少なくなければならない。数日にわたる送達のために、例えば、数日の期間にわたってｉＲＮＡの持続性放出をもたらす従来の持続性放出製剤を用いて単位投与量を調合することもできる。持続性放出製剤は当技術分野において周知であり、例えば、本発明の薬剤について用いることができるであろう特定の部位への薬剤の送達に特に有用である。この実施形態では、前記単位投与量は１日用量の対応する倍数を含む。
【０１７６】
その後の用量が３日以下、４日以下もしくは５日以下の投与間隔で、または、１週間以下、２週間以下、３週間以下もしくは４週間以下の投与間隔で投与されるほど、単一用量のＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβおよび／またはＳＭＡＤ２／３のレベルへの効果が長期にわたることができる。
【０１７７】
当業者は、対象を効果的に治療するために必要とされる投与量とタイミングが、その対象の疾病または疾患の重症度、以前の治療、一般的な健康状態および／または年齢、ならびに他の存在する疾病を含むがこれらに限定されない一定の要因によって影響されることを認識するであろう。さらに、治療上有効量の組成物を用いる対象の治療には、一回の治療または一連の治療が含まれる可能性がある。本明細書のどこかに記載されるように、従来の方法論を用いて、または、適切な動物モデルを使用するインビボ試験に基づいて、本発明に包含される個々のｉＲＮＡの効果的な投与量およびインビボ半減期を推定することができる。
【０１７８】
様々な原因の肝線維症の研究用に、例えば、四塩化炭素（ＣＣｌ４）処理マウス、ジアメチルニトロサミン処理マウスおよびチオアセタミド処理マウスのような多数のマウスモデルが利用可能である。ｉＲＮＡのインビボ試験ならびに治療上有効量の決定にそのようなモデルを使用することができる。
【０１７９】
本発明はまた、本発明において取り上げられるｉＲＮＡ化合物を含む医薬組成物と製剤を包含する。局所処置が望ましいのか、または、全身処置が望ましいのかに応じて、および、治療される領域に応じて多数の方法で本発明の医薬組成物を投与することができる。投与は、局所（例えば、経皮パッチによる）投与、例えば、噴霧器によるものを含む、粉剤もしくはエアロゾル剤の吸入もしくは吹送による肺性投与、気管支内投与、鼻腔内投与、表皮性および経皮性投与、経口投与または非経口投与であり得る。非経口投与には、静脈内注射もしくは点滴、動脈内注射もしくは点滴、皮下注射もしくは点滴、腹腔内注射もしくは点滴、または筋肉内注射もしくは点滴、例えば、移植した装置による真皮下投与、または、例えば、実質内投与、髄腔内投与もしくは脳室内投与による頭蓋内投与が含まれる。
【０１８０】
肝臓（例えば、肝臓のＨＳＣ）などの特定の組織を標的とするように、ｉＲＮＡを送達することができる。
【０１８１】
局所投与用の医薬組成物と製剤には、経皮パッチ、軟膏、外用水薬、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、座剤、スプレー剤、液剤および粉剤が含まれ得る。従来の医薬担体、水性基剤、粉体基剤、または油性基剤、増粘剤などが必要である、または、望ましい可能性がある。コーティング付きコンドーム、グローブなども有用である可能性がある。適切な局所投与用製剤には、本発明において取り上げられるｉＲＮＡが脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤などの局所送達剤と混合されているものが含まれる。適切な脂質とリポソームには、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロリホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が含まれる。本発明において取り上げられるｉＲＮＡはリポソーム内にカプセル化されることができ、または、リポソーム、特にカチオン性リポソームとの複合体を形成することができる。あるいは、ｉＲＮＡは脂質、特にカチオン性脂質との複合体になることができる。適切な脂肪酸とエステルには、アラキドン酸、オレイン酸、エイコン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸エステル、トリカプリン酸エステル、モノオレイン、ジラウリン、１−モノカプリン酸グリセリル、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリンまたはＣ１−２０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリステートＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリドまたはそれらの薬学的に許容可能な塩が含まれるがこれらに限定されない。局所投与用製剤については米国特許第６，７４７，０１４号に詳細が記載され、その文献を参照して本明細書に組み入れる。
【０１８２】
リポソーム性製剤
薬品の製剤に研究され、そして、使用されてきている、多くの組織化界面活性剤構造体がマイクロエマルジョンの他に存在する。これらには、モノレイヤー、ミセル、バイレイヤーおよびベシクルが含まれる。リポソームなどのベシクルは、薬物送達の観点からそれらが提供するそれらの特異性と作用期間のために、関心を非常に引きつけている。本発明で用いられる場合、用語「リポソーム」は球状の１つのバイレイヤーまたは複数のバイレイヤーに整えられた両親媒性脂質からなるベシクルを意味する。
【０１８３】
リポソームは、親油性物質と水性内部から形成される膜を有する単層または多重膜のベシクルである。水性部分は送達される組成物を含む。カチオン性リポソームは、細胞壁と融合することができるという利点を持っている。非カチオン性リポソームは同程度に効率よく細胞壁と融合することはできないが、インビボでマクロファージによって取り込まれる。
【０１８４】
哺乳類の無傷な皮膚を通過するために、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下で、各々５０ｎｍ未満の直径を有する一連の微細な孔を通過していかなくてはならない。したがって、とても変形しやすく、そのような微細な孔を通過していくことができるリポソームを使用することが好ましい。
【０１８５】
リポソームのさらなる利点には、天然リン脂質から得られるリポソームは生物適合性であり、および、生分解性である、リポソームは広範囲の水溶性薬品および脂質溶解性薬品を取り込むことができる、リポソームはその内部区画中にカプセル化された薬品を代謝と分解から守ることができることが挙げられる（Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245）。リポソーム製剤の調製における重要な考慮事項は、脂質表面電荷、ベシクルのサイズおよびリポソームの水性内部の容積である。
【０１８６】
リポソームは、有効成分の作用部位への転移と送達に有用である。リポソーム膜は生物学的膜に構造的に類似しているので、組織にリポソームが適用されると、そのリポソームは細胞膜と融合し始め、リポソームと細胞の融合が進むにつれ、活性薬剤が作用することができるその細胞へリポソームの内容物が移される。
【０１８７】
リポソーム性製剤は、多くの薬品の送達モードとして、精力的な研究の中心であり続けている。局所投与について、リポソームは他の製剤に勝って、いくつかの利点を提供するという証拠が増えてきている。そのような利点には、投与された薬品の全身性高吸収に関連する副作用の低減、投与された薬品の所望の標的での蓄積の増加、および、親水性および疎水性の両方の広範囲の薬品を皮膚に投与する能力が挙げられる。
【０１８８】
高分子量ＤＮＡを含む薬剤を皮膚に送達するリポソームの能力が、いくつかの報告により詳述されている。鎮痛剤、抗体、ホルモンおよび高分子量ＤＮＡを含む化合物が皮膚に投与されてきている。適用の大半は、表皮上部のターゲティングという結果になっている。
【０１８９】
リポソームは２つの広範な分類に分けられる。カチオン性リポソームは、負に荷電したＤＮＡ分子と相互作用して安定的な複合体を形成する正に荷電したリポソームである。正に荷電したＤＮＡ／リポソーム複合体は負に荷電した細胞表面に結合し、そして、エンドソームの内部に取り入れられる。エンドソーム内の酸性ｐＨのため、リポソームが破裂し、その内容物をその細胞の細胞質に放出する（Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985）。
【０１９０】
ｐＨ感受性の、または、負に荷電したリポソームは、ＤＮＡと複合体化するというよりもむしろＤＮＡを封入する。ＤＮＡとその脂質は同じように帯電しているので、複合体形成よりもむしろ反発が起こる。にもかかわらず、これらのリポソームの水性内部に封入されるＤＮＡもある。培養中の細胞単層にチミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを送達するためにｐＨ感受性リポソームを用いている。その外来性遺伝子の発現がその標的細胞で検出された（Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274）。
【０１９１】
１つの主要な種類のリポソーム性組成物には、天然ホスファチジルコリン以外のリン脂質が含まれる。例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から中性のリポソーム組成物を形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は一般的にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、一方、アニオン性融合性リポソームは主にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別の種類のリポソーム性組成物は、例えば、大豆ＰＣおよび卵ＰＣなどのホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別の種類はリン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
【０１９２】
いくつかの研究によりリポソーム性薬品製剤の皮膚への局所性送達が評価されている。インターフェロン含有リポソームのモルモットの皮膚への適用により、ヘルペスによる皮膚のただれが減少する結果になったが、他の手段による（例えば、液剤としての、または、乳剤としての）インターフェロンの送達は効果的ではなかった（Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410）。また、その他の研究によって、水性システムを用いるインターフェロンの投与に対するリポソーム性製剤の一部として投与されたインターフェロンの有効性が試験され、そして、水性投与よりもリポソーム性製剤が優れていると結論された（du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265）。
【０１９３】
非イオン性リポソームシステム、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含むシステムも、薬品の皮膚への送達でのそれらの利便性を判定するために検討されている。シクロスポリン−Ａをマウスの皮膚の真皮に送達するために、Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム性製剤を使用した。そのような非イオン性リポソームシステムは皮膚の様々な層へのサイクロスポリンＡの送置の促進に効果的であることが結果により示された（Hu et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4(6):466）。
【０１９４】
リポソームはまた「立体安定化」リポソームを含み、その用語は、本明細書において用いられる場合、リポソームに組み入れられると、そのような特別な脂質を欠くリポソームと比較して循環存続期間を向上することになる１つ以上の特別な脂質を含むリポソームを意味する。立体安定化リポソームの例は、リポソームのベシクル形成脂質部分の一部が（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１などの１つ以上の糖脂質を含む、または、（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つ以上の親水性高分子で誘導体化されているものである。任意の特定の理論に縛られることを望むものではないが、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリンまたはＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体安定化リポソームについては、これらの立体安定化リポソームの循環半減期の向上は細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞への取り込みの減少に起因することが当技術分野において考えられている（Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765）。
【０１９５】
１つ以上の糖脂質を含む様々なリポソームが当技術分野において公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64）は、リポソームの血液半減期を向上させるモノシアロガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシドおよびホスファチジルイノシトールの能力を報告した。これらの発見はＧａｂｉｚｏｎらによって（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949）に詳しく説明された。両方ともＡｌｌｅｎらに属する米国特許第４，８３７，０２８号および国際公開第ＷＯ８８／０４９２４号は、（１）スフィンゴミエリンおよび（２）ガングリオシドＧＭ１または硫酸ガラクトセレブロシドエステルを含むリポソームを開示する。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示する。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは国際公開第ＷＯ９７／１３４９９号に開示される（Ｌｉｍら）。
【０１９６】
１つ以上の親水性高分子で誘導体化された脂質を含む多数のリポソームおよびそれらの調製方法は当技術分野において公知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778）は、ＰＥＧ部分を含有する非イオン性界面活性剤２Ｃ１２１５Ｇを含むリポソームについて説明した。Ｉｌｌｕｍら（FEBS Lett., 1984, 167, 79）は、ポリスチレン粒子の高分子性グリコールでの親水性コーティングが血液半減期を非常に向上させることを特に言及した。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボキシル基の結合により修飾された合成リン脂質がＳｅａｒｓにより記載されている（米国特許第４，４２６，３３０号および第４，５３４，８９９号）。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（FEBS Lett., 1990, 268, 235）は、ＰＥＧまたはＰＥＧステアレートで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが血液循環半減期を非常に増加させることを説明した。Ｂｌｕｍｅら（Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91）は、そのような観察を他のＰＥＧ−誘導体化リン脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧの組合せから形成されるＤＳＰＥ−ＰＥＧに拡張した。その外部表面に共有結合で結合したＰＥＧ部分を有するリポソームが欧州特許第ＥＰ  ０  ４４５  １３１  Ｂ１号およびＦｉｓｈｅｒに属する国際公開第ＷＯ９０／０４３８４号に記載されている。１〜２０モルパーセントのＰＥＧ誘導体化ＰＥを含有するリポソーム組成物およびその使用方法は、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許第５，０１３，５５６号および第５，３５６，６３３号）とＭａｒｔｉｎら（米国特許第５，２１３，８０４号および欧州特許第ＥＰ  ０  ４９６  ８１３  Ｂ１号）によって説明されている。多数の他の脂質−高分子複合体を含むリポソームは国際公開第ＷＯ９１／０５５４５号および米国特許第５，２２５，２１２号（両方ともＭａｒｔｉｎらに属する）および国際公開第ＷＯ９４／２００７３号（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）に開示されている。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームは国際公開第ＷＯ９６／１０３９１号（Ｃｈｏｉら）に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉら）および米国特許第５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａら）は、その表面で機能部分によりさらに誘導体化され得るＰＥＧ含有リポソームについて記載する。
【０１９７】
多数の核酸を含むリポソームが当技術分野において公知である。Ｔｈｉｅｒｒｙらに属する国際公開第ＷＯ９６／４００６２号は、リポソーム中に高分子量の核酸をカプセル化する方法を開示する。Ｔａｇａｗａらに属する米国特許第５，２６４，２２１号はタンパク質結合リポソームを開示し、そのようなリポソームの内容物はｄｓＲＮＡを含むことができると強く主張する。Ｒａｈｍａｎらに属する米国特許第５，６６５，７１０号は、リポソーム中にオリゴデオキシヌクレオチドをカプセル化するある方法について記載している。Ｌｏｖｅらに属する国際公開第ＷＯ９７／０４７８７号は、ｒａｆ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含むリポソームを開示する。
【０１９８】
トランスファーソームはさらに別の種類のリポソームであり、そして、薬物送達用媒体の魅力的な候補である非常に変形しやすい脂質凝集物である。トランスファーソームは、非常に変形しやすいのでそれ自体よりも小さい孔を容易に通り抜けることが可能な脂質液滴と説明され得る。トランスファーソームはそれが使用される環境に適応することができ、例えば、それらは自己最適化性であり（皮膚の孔の形状に適応する）、自己修復性であり、断片化することなくそれらの標的に到着することが多く、そして、多くの場合、自己負荷性である。トランスファーソームを作製するために表面エッジ活性化剤、たいていは界面活性剤を標準的なリポソーム性組成物に添加することができる。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚に送達するために使用されてきている。血清アルブミンのトランスファーソーム介在性送達は血清アルブミン含有液剤の皮下注入と同程度に効果的であることが示されている。
【０１９９】
（マイクロエマルジョンを含む）乳剤およびリポソームなどの製剤での広範な応用が界面活性剤に認められる。天然および合成の多種多様な界面活性剤の特性を分類し、そして、等級づけする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基（「ヘッド」としても知られる）の性質が、製剤に使用される様々な界面活性剤を分類するための最も有用な手段を提供する（Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285）。
【０２００】
界面活性剤分子がイオン化されていない場合、それは非イオン性界面活性剤として分類される。医薬品および化粧品での広範な応用が非イオン性界面活性剤に認められ、そして、非イオン性界面活性剤は広範なｐＨ値にわたって使用することができる。一般的に、それらのＨＬＢ値はその構造に応じて２から約１８までの範囲である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、ショ糖エステルおよびエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが含まれる。脂肪族アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールおよびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルもまたこの種類に含まれる。ポリオキシエチレン系界面活性剤は非イオン性界面活性剤類の中で最も普及しているメンバーである。
【０２０１】
界面活性剤分子が水に溶解または分散しているとき負電荷を持つ場合、その界面活性剤は陰イオン性と分類される。陰イオン性界面活性剤には、石鹸などのカルボキシレート、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、アルキル硫酸エステルおよびエトキシル化アルキル硫酸エステルなどの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレートおよびスルホサクシネートなどのスルホネート、ならびにホスフェートが含まれる。陰イオン性界面活性剤類の最も重要なメンバーはアルキル硫酸エステルと石鹸である。
【０２０２】
界面活性剤分子が水に溶解または分散しているとき正電荷を持つ場合、その界面活性剤は陽イオン性と分類される。陽イオン性界面活性剤には、第４級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが含まれる。第４級アンモニウム塩はこの種類で最も使用されるメンバーである。
【０２０３】
界面活性剤分子が正電荷か負電荷のどちらかを持つ能力を有する場合、その界面活性剤は両性と分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタインおよびホスファチドが含まれる。
【０２０４】
薬品、製剤および乳剤中での界面活性剤の使用が概説されている（Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285）。
【０２０５】
核酸脂質粒子
１つの実施形態では、例えば、ＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰまたは他の核酸脂質粒子を形成する脂質製剤中に本発明において取り上げられるＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβおよびＳＭＡＤ２／３のｄｓＲＮＡを完全にカプセル化する。本明細書において用いられる場合、用語「ＳＮＡＬＰ」は、ＳＰＬＰを含む安定な核酸脂質粒子を意味する。本明細書において用いられる場合、用語「ＳＰＬＰ」は、脂質小胞内にカプセル化されたプラスミドＤＮＡを含む核酸脂質粒子を意味する。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは典型的にはカチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を防ぐ脂質（例えば、ＰＥＧ−脂質複合体）を含む。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは静脈内（ｉ．ｖ．）注入後の循環存続期間の延長を示し、そして、遠位部分（例えば、投与部位から物理的に離れている部位）に蓄積するので、それらは全身性適用に極めて有用である。ＳＰＬＰには、国際公開第ＷＯ００／０３６８３号に記載されるカプセル化濃縮化剤−核酸複合体を含む「ｐＳＰＬＰ」が包含される。本発明の粒子は典型的には約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０ｎｍ〜約９０ｎｍの平均直径を有し、そして、実質的に非毒性である。さらに、核酸は、本発明の核酸脂質粒子中に存在するとき、水性溶液中でヌクレアーゼによる分解に対して耐性である。核酸脂質粒子およびその調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号、第５，９８１，５０１号、第６，５３４，４８４号、第６，５８６，４１０号、第６，８１５，４３２号、および国際公開第ＷＯ９６／４０９６４号に開示される。
【０２０６】
１つの実施形態では、脂質対薬品比（質量／質量比）（例えば、脂質対ｄｓＲＮＡ比）は約１：１から約５０：１まで、約１：１から約２５：１まで、約３：１から約１５：１まで、約４：１から約１０：１まで、約５：１から約９：１まで、または約６：１〜約９：１の範囲にあるであろう。
【０２０７】
前記カチオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、または３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、またはそれらの類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１'−（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチルアザンジイル）ジドデカン−２−オール（ＴｅｃｈＧ１）、またはそれらの混合物であり得る。前記カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％から約５０ｍｏｌ％まで、または、約４０ｍｏｌ％を構成することができる。
【０２０８】
別の実施形態では、脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製するために化合物２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランを使用することができる。２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランの合成は、２００８年１０月２３日に提出された米国仮特許出願第６１／１０７，９９８号に記載され、その文献を参照して本明細書に組み入れる。
【０２０９】
１つの実施形態では、前記脂質−ｓｉＲＮＡ粒子は、６３．０±２０ｎｍの粒子サイズと０．０２７のｓｉＲＮＡ／脂質比で２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランを４０％、ＤＳＰＣを１０％、コレステロールを４０％、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧを１０％（モルパーセント）含む。
【０２１０】
前記非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−ｌ−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１-トランスＰＥ、１-ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロールまたはそれらの混合物を含むがこれらに限定されないアニオン性脂質または中性脂質であり得る。前記非カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％から約９０ｍｏｌ％まで、約１０ｍｏｌ％、またはコレステロールが含まれている場合は約５８ｍｏｌ％であり得る。
【０２１１】
粒子の凝集を抑制する複合体化脂質は、例えば、これらに限定されないが、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、またはそれらの混合物を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質であり得る。ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体は、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ］８）であり得る。粒子の凝集を抑制する複合体化脂質は、粒子中に存在する全脂質の０ｍｏｌ％から約２０ｍｏｌ％まで、または、約２ｍｏｌ％であり得る。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、前記核酸脂質粒子は、例えば、粒子中に存在する全脂質の約１０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％または約４８ｍｏｌ％の比率でコレステロールをさらに含む。
【０２１３】
ＬＮＰ０１
１つの実施形態では、脂質ｄｓＲＮＡナノ粒子（すなわち、ＬＮＰ０１粒子）を調製するために脂質様物質ＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ１４８７）（２００８年３月２６日に提出された米国特許出願第１２／０５６，２３０号を参照のこと。その文献を参照して本明細書に組み入れる。）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＰＥＧ−セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を使用することができる。エタノール中の各々の原液を次のように調製することができる：ＮＤ９８，１３３ｍｇ／ｍｌ、コレステロール，２５ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ−セラミドＣ１６，１００ｍｇ／ｍｌ。次にＮＤ９８、コレステロールおよびＰＥＧ−セラミドＣ１６原液を例えば４２：４８：１０のモル比で混合することができる。混合された脂質溶液を（例えば、ｐＨ５の酢酸ナトリウム中の）ｄｓＲＮＡ水性溶液と、最終エタノール濃度が約３５〜４５％であり、そして、最終酢酸ナトリウム濃度が約１００〜３００ｍＭであるように混合することができる。脂質−ｄｓＲＮＡナノ粒子は典型的には混合すると自然に形成する。所望の粒子サイズ分布に応じて、その結果のナノ粒子混合物を、例えばＬｉｐｅｘ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）などのサーモバレル型押出成形機を使用することにより（例えば、１００ｎｍカットオフ性の）ポリカーボネート膜から押し出すことができる。いくつかの場合では押出工程を省略することができる。エタノールの除去およびそれと同時の緩衝液交換を、例えば、透析濾過または接線流濾過により達成することができる。緩衝液を約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３または約ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と交換することができる。
2019150075.tif 000012
【０２１４】
ＬＮＰ０１製剤は、例えば、国際公開第ＷＯ２００８／０４２９７３号に記載され、これによりその文献を参照して組み入れる。
【０２１５】
脂質−ｄｓＲＮＡ製剤のさらなる例は次の通りである。
2019150075.tif 000013
2019150075.tif 000014
2019150075.tif 000015
2019150075.tif 000016
ＤＳＰＣ：ジステアロイルホスファチジルコリン
ＤＰＰＣ：ジパルミトイルホスファチジルコリン
ＰＥＧ−ＤＭＧ：ＰＥＧ−ジジミリストイルグリセロール（Ｃ１４−ＰＥＧまたはＰＥＧ−Ｃ１４）（平均分子量２，０００のＰＥＧ）
ＰＥＧ−ＤＳＧ：ＰＥＧ−ジスチリルグリセロール（Ｃ１８−ＰＥＧまたはＰＥＧ−Ｃ１８）（平均分子量２，０００のＰＥＧ）
ＰＥＧ−ｃＤＭＡ：ＰＥＧ−カルバモイル−１，２−ジミリスチルオキシプロピルアミン（平均分子量２，０００のＰＥＧ）
【０２１６】
ＳＮＡＬＰ（１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））含有製剤は２００９年４月１５日に提出された国際公開第ＷＯ２００９／１２７０６０号に記載され、これによりその文献を参照して組み入れる。
【０２１７】
ＸＴＣ含有製剤は、例えば、２００９年１月２９日に提出された米国仮特許出願第６１／１４８，３６６号、２００９年３月２日に提出された米国仮特許出願第６１／１５６，８５１号、２００９年６月１０日に提出された米国仮特許出願第号、２００９年７月２４日に提出された米国仮特許出願第６１／２２８，３７３号、２００９年９月３日に提出された米国仮特許出願第６１／２３９，６８６号、および２０１０年１月２９日に提出された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２２６１４号に記載され、これによりそれらの文献を参照して組み入れる。
【０２１８】
ＭＣ３含有製剤は、例えば、２００９年９月２２日に提出された米国仮特許出願第６１／２４４，８３４号、２００９年６月１０日に提出された米国仮特許出願第６１／１８５，８００号、および２０１０年６月１０日に提出された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／２８２２４号に記載され、これによりそれらの文献を参照して組み入れる。
【０２１９】
ＡＬＮＹ−１００含有製剤は、例えば、２００９年１１月１０日に提出された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／６３９３３号に記載され、これによりその文献を参照して組み入れる。
【０２２０】
Ｃ１２−２００含有製剤は、２００９年５月５日に提出された米国仮特許出願第６１／１７５，７７０号および２０１０年５月５日に提出された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／３３７７７号に記載され、これによりそれらの文献を参照して組み入れる。
【０２２１】
カチオン性脂質の合成
本発明の核酸脂質粒子で使用される化合物のいずれも、例えばカチオン性脂質などは実施例においてより詳細に記載される方法を含む公知の有機合成技術により調製されることができる。他に指示されない限り、全ての置換基は以下に定義される通りである。
【０２２２】
「アルキル基」は、１から２４個の炭素原子を含む直鎖状または分枝状、非環状または環状の飽和脂肪族炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖アルキル基にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基などが含まれ、一方、飽和分枝状アルキル基にはイソプロピル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソペンチル基などが含まれる。代表的な飽和環状アルキル基にはシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが含まれ、一方、不飽和環状アルキルにはシクロペンテニル基およびシクロヘキセニル基などが含まれる。
【０２２３】
「アルケニル基」は、隣接する炭素原子の間に少なくとも１つの二重結合を含有する先に定義したようなアルキル基を意味する。アルケニル基はｃｉｓ異性体とｔｒａｎｓ異性体の両方を含む。代表的な直鎖アルケニル基および分枝状アルケニル基にはエチレニル基、プロピレニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、イソブチレニル基、１−ペンテニル基、２−ペンテニル基、３−メチル−１−ブテニル基，２−メチル−２−ブテニル基、２，３−ジメチル−２−ブテニル基などが含まれる。
【０２２４】
「アルキニル基」は、隣接する炭素原子の間に少なくとも１つの三重結合をさらに含有する先に定義したような任意のアルキル基またはアルケニル基を意味する。代表的な直鎖アルキニル基および分枝状アルキニル基にはアセチレニル基、プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、１−ペンチニル基、２−ペンチニル基、３−メチル−１ブチニル基などが含まれる。
【０２２５】
「アシル基」は、結合部位の炭素が以下に定義するようにオキソ基で置換されている任意のアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基を意味する。例えば、−Ｃ（＝Ｏ）アルキル基、−Ｃ（＝Ｏ）アルケニル基および−Ｃ（＝Ｏ）アルキニル基がアシル基である。
【０２２６】
「複素環基」は、飽和、不飽和または芳香族のどれかであり、そして、窒素、酸素およびイオウから独立して選択される１個からまたは２個のヘテロ原子を含む５〜７員の単環式複素環、または７〜１０員の二環式複素環であって、前記窒素およびイオウヘテロ原子が所望により酸化されている可能性があり、そして、前記窒素ヘテロ原子が所望により４級化されているものを意味し、上記複素環のいずれかがベンゼン環に融合している二環式リングを含む。任意のヘテロ原子または炭素原子を介して前記複素環基を結合することができる。複素環基には以下に定義するようなヘテロアリール基が含まれる。複素環基には、モルホルニル基、ピロリジノニル基、ピロリジニル基、ピペリジニル基、ピペリズィニル基、ヒダントイニル基、バレロラクタミル基、オキシラニル基、オキセタニル基、テトラヒドロフラニル基、テトラヒドロピラニル基、テトラヒドロピリジニル基、テトラヒドロピリミジル基、テトラヒドロチオフェニル基、テトラヒドロチオピラニル基、テトラヒドロピリミジニル基、テトラヒドロチオフェニル基、テトラヒドロチオピラニル基などが含まれる。
【０２２７】
用語「置換されていてもよいアルキル基」、「置換されていてもよいアルケニル基」、「置換されていてもよいアルキニル基」、「置換されていてもよいアシル基」および「置換されていてもよい複素環基」は、置換されると、少なくとも１個の水素原子が置換基で置換されることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合、２個の水素原子が置換される。この点では、置換基には、オキソ基、ハロゲン、複素環基、−ＣＮ、−ＯＲＸ、−ＮＲＸＲＹ、−ＮＲＸＣ（＝Ｏ）ＲＹ、−Ｃ（＝Ｏ）ＲＸ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲＸ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＸＲＹ、−ＳＯｎＲＸおよび−ＳＯｎＮＲＸＲＹが含まれ、式中、ｎは０、１または２であり、ＲＸとＲＹは同じであるか異なり、そして独立して水素、アルキル基または複素環基であり、そして前記アルキル置換基および複素環置換基の各々がオキソ基、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル基、−ＯＲＸ、複素環基、−ＮＲＸＲＹ、−ＮＲＸＣ（＝Ｏ）ＲＹ、−Ｃ（＝Ｏ）ＲＸ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲＸ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＸＲＹ、−ＳＯｎＲＸおよび−ＳＯｎＮＲＸＲＹのうちの１つ以上でさらに置換され得る。
【０２２８】
「ハロゲン」はフルオロ基、クロロ基、ブロモ基およびヨード基を意味する。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は保護基の使用を必要とする可能性がある。保護基方法論は当業者に周知である（例えば、Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. et al., Wiley-Interscience, New York City, 1999を参照のこと）。簡単に述べると、本発明の範囲内の保護基は、機能基の望まない反応性を低減する、または、除去する任意の基である。ある反応中に機能基にその活性を隠すために保護基を付加することができ、次に元の機能基を表に出すために保護基を除去することができる。いくつかの実施形態では、「アルコール保護基」が使用される。「アルコール保護基」は、アルコール機能基の望まない反応性を低減させる、または、除去する任意の基である。当技術分野において周知の技術を用いて保護基を付加し、そして、除去することができる。
【０２３０】
式Ａの合成
いくつかの実施形態では、式Ａ
2019150075.tif 000017
であって、式中、Ｒ１とＲ２は独立してアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基であり、各々が置換されていてもよく、そしてＲ３とＲ４は独立して低級アルキル基であるか所望により結合させられて置換複素環を形成するものであるカチオン性脂質を使用して本発明の核酸脂質粒子を製剤する。いくつかの実施形態では、前記カチオン性脂質はＸＴＣ（２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン）である。一般的に、他に指示されない限り全ての置換基が先に定義したとおりである次の反応計画１または２により上記の式Ａの脂質が作製され得る。
計画１
2019150075.tif 000018
計画１に従って、Ｒ１とＲ２は独立してアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基であり、各々が置換されていてもよく、そしてＲ３とＲ４は独立して低級アルキル基であるか所望により結合させられて置換複素環を形成する脂質Ａを調製することができる。ケトン１および臭化物２は購入可能であり、または、当業者に公知の方法に従ってそれらを調製することができる。１と２の反応がケタール３を産生する。ケタール３のアミン４での処理が式Ａの脂質を産生する。Ｘがハロゲンイオン、水酸化物イオン、リン酸イオン、硫酸イオンなどから選択される陰イオン性対イオンである式５の有機塩を用いて式Ａの脂質を対応するアンモニウム塩に変換することができる。
計画２
2019150075.tif 000019
【０２３１】
あるいは、計画２に従って、ケトン１出発物質を調製することができる。グリニャール試薬６とシアン化物７は購入可能であり、または、当業者に公知の方法に従ってそれらを調製することができる。６と７の反応がケトン１を産生する。式Ａの対応する脂質へのケトン１の変換は計画１において説明される通りである。
【０２３２】
ＭＣ３の合成
ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ（すなわち、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート）の調製は次の通りであった。ジクロロメタン（５ｍＬ）中の（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−オール（０．５３ｇ）、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ酪酸塩酸塩（０．５１ｇ）、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．６１ｇ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．５３ｇ）の溶液を室温で一晩撹拌した。前記溶液を希塩酸で洗浄し、次に希炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機画分を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、そして、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。１〜５％メタノール／ジクロロメタン溶出濃度勾配を用いてシリカゲルカラム（２０ｇ）に残留物を通した。精製産物を含む画分を混合し、そして、溶媒を除去し、無色の油分（０．５４ｇ）が産生した。
【０２３３】
ＡＬＮＹ−１００の合成
次の計画３を用いてケタール５１９［ＡＬＮＹ−１００］の合成が実行された。
2019150075.tif 000020
【０２３４】
５１５の合成
２つ口丸底フラスコ（ＲＢＦ）（１Ｌ）内の２００ｍｌの無水ＴＨＦ中のＬｉＡｌＨ４（３．７４ｇ，０．０９８５２ｍｏｌ）の撹拌懸濁液に７０ｍＬのＴＨＦ中の５１４（１０ｇ，０．０４９２６ｍｏｌ）の溶液を０℃窒素雰囲気下でゆっくりと加えた。添加を完了した後に、反応混合物を室温まで温め、次に、加熱して４時間還流した。反応の進行はＴＬＣによりモニターした。反応の完了の後（ＴＬＣによる）、混合物を０℃までに冷却し、そして、飽和Ｎａ２ＳＯ４溶液を注意深く加えて反応の抑制を行った。反応混合物を室温で４時間撹拌し、そして、濾過した。残留物をＴＨＦでよく洗浄した。濾過液と洗液を混合し、そして、４００ｍＬのジオキサンと２６ｍＬの濃塩酸で希釈し、そして、室温で２０分間撹拌した。真空下で揮発性成分を取り除いて５１５の塩酸塩を白色の固形物として供給した。収量：７．１２ｇ 1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 9.34 (broad, 2H), 5.68 (s, 2H), 3.74 (m, 1H), 2.66-2.60 (m, 2H), 2.50-2.45 (m, 5H).
【０２３５】
５１６の合成
２５０ｍＬの２つ口ＲＢＦ内の１００ｍＬの乾燥ＤＣＭ中の化合物５１５の撹拌溶液に、トリエチルアミン（３７．２ｍＬ，０．２６６９ｍｏｌ）を加え、そして、窒素雰囲気下で０℃まで冷却した。５０ｍＬの乾燥ＤＣＭ中のＮ−（ベンジルオキシ−カルボニルオキシ）−スクシンイミド（２０ｇ，０．０８００７ｍｏｌ）をゆっくりと添加した後に反応混合物が室温まで温まるにまかせた。反応の完了の後（２〜３時間、ＴＬＣによる）、混合物を１ＮのＨＣｌ溶液（１ｘ１００ｍＬ）と飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１ｘ５０ｍＬ）で続けて洗浄した。次に有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、そして、溶媒を蒸発乾燥させて粗製物質が生じ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーでそれを精製して粘着性の塊として５１６を得た。収量：１１ｇ（８９％）。1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ = 7.36-7.27(m, 5H), 5.69 (s, 2H), 5.12 (s, 2H), 4.96 (br., 1H) 2.74 (s, 3H), 2.60(m, 2H), 2.30-2.25(m, 2H). LC-MS [M+H] -232.3 (96.94%).
【０２３６】
５１７Ａおよび５１７Ｂの合成
シクロペンテン５１６（５ｇ，０．０２１６４ｍｏｌ）を５００ｍＬの１つ口ＲＢＦ内の２２０ｍＬのアセトンと水（１０：１）の溶液に溶解し、そして、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド（７．６ｇ，０．０６４９２ｍｏｌ）と続けて４．２ｍＬのｔｅｒｔ−ブタノール中のＯｓＯ４の７．６％溶液（０．２７５ｇ，０．００１０８ｍｏｌ）を室温でそれに添加した。反応の完了後（約３ｈ）、固形のＮａ２ＳＯ３を添加して混合物の反応を抑制し、そして、その結果生じる混合物を室温で１．５時間撹拌した。ＤＣＭ（３００ｍＬ）で反応混合物を希釈し、そして、水（２ｘ１００ｍＬ）と続けて飽和ＮａＨＣＯ３（１ｘ５０ｍＬ）溶液、水（１ｘ３０ｍＬ）そして最後に塩水（１ｘ５０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、そして、真空で溶媒を除去した。粗物質のシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製によりジアステレオマーの混合物が供給され、それらは分取ＨＰＬＣにより分離された。収量：−６ｇ粗物質
【０２３７】
５１７Ａのピーク１（白色の固形物）, 5.13 g (96%). 1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 7.39-7.31(m, 5H), 5.04(s, 2H), 4.78-4.73 (m, 1H), 4.48-4.47(d, 2H), 3.94-3.93(m, 2H), 2.71(s, 3H), 1.72- 1.67(m, 4H). LC-MS - [M+H]-266.3, [M+NH4 +]-283.5 present, HPLC-97.86%. 立体化学はＸ線により確認された。
【０２３８】
５１８の合成
化合物５０５の合成について記載されるものと類似の方法を用いて化合物５１８（１．２ｇ，４１％）が無色の油分として得られた。1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ= 7.35-7.33(m, 4H), 7.30-7.27(m, 1H), 5.37-5.27(m, 8H), 5.12(s, 2H), 4.75(m,1H), 4.58-4.57(m,2H), 2.78-2.74(m,7H), 2.06-2.00(m,8H), 1.96-1.91(m, 2H), 1.62(m, 4H), 1.48(m, 2H), 1.37-1.25(br m, 36H), 0.87(m, 6H). HPLC-98.65%.
【０２３９】
化合物５１９の合成の一般的方法
ヘキサン（１５ｍＬ）中の化合物５１８（１等量）の溶液をＴＨＦ中のＬＡＨの氷冷溶液（１Ｍ，２等量）に滴下して加えた。添加を完了した後に混合物を４０℃で０．５時間にわたって加熱し、次に氷浴で再度冷却した。混合物を飽和Ｎａ２ＳＯ４水溶液で注意深く加水分解し、次にセライトに通して濾過し、そして油分に還元した。カラムクロマトグラフィーにより純粋な５１９（１．３ｇ，６８％）がもたらされ、それを無色の油分として得た。13C NMR □ = 130.2, 130.1 (x2), 127.9 (x3), 112.3, 79.3, 64.4, 44.7, 38.3, 35.4, 31.5, 29.9 (x2), 29.7, 29.6 (x2), 29.5 (x3), 29.3 (x2), 27.2 (x3), 25.6, 24.5, 23.3, 226, 14.1; エレクトロスプレーMS (+ve): C44H80NO2 (M + H)+の分子量、計算値：６５４．６、実測値：６５４．６．
【０２４０】
標準的な方法か押出しが無い方法のどちらかにより調製された製剤は同じ方法で特徴づけられ得る。例えば、製剤は典型的には目視検査により特徴づけられる。それらは、凝集物または沈殿物が無いやや白っぽい半透明の溶液であるであろう。脂質−ナノ粒子の粒子サイズと粒子サイズ分布は、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ、米国）を用いる光散乱により測定され得る。粒子は約２０〜３００ｎｍ、例えば、４０〜１００ｎｍのサイズであるであろう。粒子サイズ分布は単峰式であるであろう。製剤中の全ｄｓＲＮＡ濃度ならびに封入画分が色素排除試験法を用いて推定される。製剤化ｄｓＲＮＡの試料を製剤崩壊界面活性剤、例えば、０．５％トリトン−Ｘ１００の存在下、または、非存在下でリボグリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）などのＲＮＡ結合色素と保温することができる。界面活性剤を含有する試料からのシグナルにより検量線と比較して製剤中の全ｄｓＲＮＡを測定することができる。全ｄｓＲＮＡ含量から（界面活性剤の非存在下でのシグナルにより測定される）「遊離の」ｄｓＲＮＡ含量を引き算することで封入画分が決定される。封入ｄｓＲＮＡのパーセントは典型的には＞８５％である。ＳＮＡＬＰ製剤では、粒子サイズは少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍおよび少なくとも１２０ｎｍである。適切な範囲は典型的には少なくとも約５０ｎｍ〜少なくとも約１１０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、または少なくとも約８０ｎｍ〜少なくとも約９０ｎｍである。
【０２４１】
経口投与用組成物および製剤には粉剤または顆粒剤、微粒子剤、ナノ粒子剤、水または非水性媒体中の懸濁剤または液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ、錠剤またはミニ錠剤が含まれる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が望ましい可能性がある。いくつかの実施形態では、経口製剤は、１つ以上の浸透促進界面活性剤とキレート剤と共に本発明において取り上げられるｄｓＲＮＡを投与するものである。適切な界面活性剤には脂肪酸および／またはそれらのエステルもしくは塩、胆汁酸および／またはその塩が含まれる。適切な胆汁酸／塩には、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウムおよびムグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが含まれる。適切な脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチル酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、１−モノカプリン酸グリセリル、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリンまたはモノグリセリド、ジグリセリドまたはそれらの薬学的に許容可能な塩（例えば、ナトリウム塩）が含まれる。いくつかの実施形態では、浸透促進剤の組合せ、例えば、胆汁酸／塩と組合せて脂肪酸／塩を用いる。１つの例示的な組合せはラウリン酸のナトリウム塩、カプリン酸およびＵＤＣＡである。さらなる浸透促進剤にはポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが含まれる。スプレー乾燥粒子を含む顆粒形態で本発明において取り上げられるｄｓＲＮＡｓを経口送達することができ、または、ミクロもしくはナノ粒子を形成するように複合化されて経口送達することができる。ｄｓＲＮＡ複合体化剤には、ポリ−アミノ酸、ポリイミン、ポリアクリレート、ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート、カチオン化ゼラチン、カチオン化アルブミン、カチオン化デンプン、カチオン化アクリレート、カチオン化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびカチオン化デンプン、ポリアルキルシアノアクリレート、ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、ＤＥＡＥ誘導体化ポルラン、ＤＥＡＥ誘導体化セルロースおよびＤＥＡＥ誘導体化デンプンが含まれる。適切な複合体化剤には、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシナオアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−グリコール酸）共重合体（ＰＬＧＡ））、アルジネートおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。ｄｓＲＮＡの経口製剤とそれらの調製は米国特許第６，８８７，９０６号、米国特許出願公開第２００３００２７７８０号、および米国特許第６，７４７，０１４号に詳細が記載され、それらの文献の各々を参照して本明細書に組み入れる。
【０２４２】
非経口投与、実質内（脳への）投与、髄腔内投与、脳室内投与または肝臓内投与のための組成物と製剤は、緩衝液、希釈剤、ならびに、これらに限定されないが、浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容可能な担体または賦形剤などの他の適切な添加剤を含むことも可能である無菌水性溶液を含むことができる。
【０２４３】
本発明の医薬組成物は、液剤、乳剤およびリポソーム含有製剤を含むがこれらに限定されない。これらの組成物は、既製液体、自己乳化固形物および自己乳化半固形物を含むがこれらに限定されない様々な構成要素から作製され得る。肝臓癌腫などの肝臓疾患を治療するとき肝臓を標的とする製剤が特に好ましい。
【０２４４】
単位剤形で都合よく提供され得る本発明の医薬製剤は、製薬産業において周知の従来の技術に従って調製され得る。そのような技術は有効成分を医薬担体または賦形剤と混合させる工程を含む。一般的に、有効成分を液体担体または細分化固形担体またはその両方と均一かつ十分に混合し、次に必要に応じて産物を成形することにより前記製剤が調製される。
【０２４５】
本発明の組成物は、これらに限定されないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、軟質ゲル剤、座剤および浣腸剤などの多くのあり得る剤形のいずれかに製剤され得る。本発明の組成物は、水性媒体、非水性媒体または混合媒体中の懸濁剤として製剤され得る。水性懸濁剤は、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む懸濁剤の粘度を増加させる物質をさらに含有することができる。前記懸濁剤は安定化剤を含有することもできる。
【０２４６】
その他の製剤
乳剤
本発明の組成物は乳剤として調製および製剤され得る。典型的には乳剤は、通常、直径が０．１μｍを超える液滴の形状で１つの液体が別の液体に分散する不均一系である（例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY、 Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199、 Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245、Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335、 Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301を参照のこと）。乳剤は、多くの場合、緊密に混合され、そして、互いに分散した２つの非混和性液体を含む二相系である。一般的に、乳剤は油中水型（ｗ／ｏ）か水中油型（ｏ／ｗ）のどちらかであり得る。水相が小さい液滴に細かく分割され、大容量の油相中に分散されるとき、その結果生じる組成物は油中水型（ｗ／ｏ）乳剤と呼ばれる。あるいは、油相が小さい液滴に細かく分割され、大容量の水相中に分散されるとき、その結果生じる組成物は水中油型（ｏ／ｗ）乳剤と呼ばれる。乳剤は分散層に加えてその他の成分、および、水相、油相またはそれ自体別の相に存在し得る活性薬物を含有することができる。乳化剤、安定化剤、色素および抗酸化剤などの医薬賦形剤も必要に応じて乳剤中に存在し得る。医薬乳剤はまた、例えば、油中水中油型（ｏ／ｗ／ｏ）乳剤および水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）乳剤の場合のように、２つよりも多い相からなる多重乳剤でもあり得る。そのような複合型製剤は、単純な二相型乳剤が提供しないいくらかの利点を多くの場合提供する。ｏ／ｗ乳剤の個々の油滴が小さい水滴を取り囲む多重乳剤は、ｗ／ｏ／ｗ乳剤を構成する。同様に、油の連続相中で安定化された水の小球の中に取り囲まれた油滴の系はｏ／ｗ／ｏ乳剤を提供する。
【０２４７】
乳剤は、熱力学的安定性がほとんどないこと、または、全くないことを特徴とする。多くの場合、乳剤の分散相または不連続相は外相または連続相によく分散され、そして、乳化剤または製剤の粘度によりこの形態で維持される。乳剤のどちらかの相は、乳剤様の軟膏ベースおよびクリーム剤の場合のように、半固形物または固形物であり得る。乳剤を安定化する他の手段は、乳剤のどちらかの相に取り込まれ得る乳化剤の使用を必要とする。乳化剤は、合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、および細分散化固形物の４つの区分に大きく分類され得る（例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199を参照のこと）。
【０２４８】
表面活性剤としても知られる合成界面活性剤は、乳剤の製剤に広範な応用性を見出しており、そして、文献中に概説されている（例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199を参照のこと）。界面活性剤は典型的には両親媒性であり、そして、親水性部分および疎水性部分を含む。界面活性剤の疎水性に対する親水性の割合は親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と名付けられており、そして、製剤の調製において界面活性剤を分類し、そして、選択するのに有用な手段である。界面活性剤は、親水性基の性状に基づいて様々な種類、非イオン性、陰イオン性、カチオン性および両性に分類され得る（例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY、 Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285を参照のこと）。
【０２４９】
乳液製剤に用いられる天然乳化剤には、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチンおよびアラビアゴムが含まれる。吸収基剤は、無水ラノリンおよび親水性ワセリンのように、親水性を有するので、水を吸収してｗ／ｏ乳剤を形成し、しかしそれでも、その半固形物の硬度を保持する。細分化された固形物もまた、特に界面活性剤と組み合わせて、および、粘性調合物中において良好な乳化剤として使用されている。これらには、重金属水酸化物などの極性無機固形物、ベントナイト、アタパルファイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸ナトリウムおよびコロイド状計算アルミニウムマグネシウムのような非膨潤粘土、顔料ならびに炭素またはトリステアリン酸グリセリルなどの非極性固形物が含まれる。
【０２５０】
多様な非乳化材料も乳液製剤に含まれ、そして、乳剤の特性に寄与する。これらには、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪族アルコール、脂肪エステル、保湿剤、親水性コロイド、保存剤および抗酸化剤が含まれる（Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335、Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199）。
【０２５１】
親水性コロイドまたはヒドロコロイドには、ポリサッカリド（例えば、アラビアゴム、寒天、アルギン酸、カラギナン、グアーガム、カラヤガムおよびトラガカント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）および合成高分子（例えば、カルボマー、セルロースエーテルおよびカルボキシビニル高分子）などの天然ガム類および合成高分子が含まれる。これらは水中で分散し、または、膨潤し、分散相の液滴の周囲に強力な界面薄膜を形成することにより、そして、外相の粘度を増大させることにより乳剤を安定化させるコロイド溶液を形成する。
【０２５２】
乳剤は多くの場合、微生物の増殖を容易に援助できる炭水化物、タンパク質、ステロールおよびホスファチドなどの多数の成分を含有するため、これらの製剤は多くの場合、保存剤を組み入れる。乳液製剤に含まれる一般的に使用される保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第４級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルおよびホウ酸が含まれる。製剤の劣化を防ぐために抗酸化剤もまた通常乳液製剤に添加される。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、アルキルガレート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどのフリーラジカル捕捉剤、またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤、ならびにクエン酸、酒石酸およびレシチンなどの抗酸化剤協力剤であり得る。
【０２５３】
皮膚科的経路、経口経路および非経口経路による乳液製剤の適用ならびにそれらの製造方法は文献に概説されている（例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY、 Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199を参照のこと）。製剤の容易性ならびに吸収および生物学的利用能の観点からの有効性のため経口送達用の乳液製剤は非常に広範に用いられてきている（例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245、 Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199を参照のこと）。鉱油ベースの下剤、油溶性ビタミンおよび高脂質栄養調製品は、ｏ／ｗ乳剤として通常経口投与される物質のうちに含まれる。
【０２５４】
本発明の１つの実施形態では、ｉＲＮＡと核酸の組成物はマイクロエマルジョンとして製剤される。マイクロエマルジョンは、単一の光学的に等方性であり、熱力学的に安定な溶液である水、油または両親媒性の系として定義され得る（例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY、 Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245を参照のこと）。典型的にはマイクロエマルジョンは、まず、油を界面活性剤水溶液に分散し、次に、概して中間鎖長アルコールである十分な量の第四の成分を加えて透明な系を形成することにより調製される系である。したがって、マイクロエマルジョンはまた、表面活性分子の界面薄膜により安定化される２つの非混和性溶液の熱力学的に安定で光学等方的に透明な分散物として説明されている（Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215）。マイクロエマルジョンは通常、油、水、界面活性剤、共界面活性剤および電解質を含む３〜５種の成分の組合せにより調製される。マイクロエマルジョンが油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）であるかは、使用する油と界面活性剤の特性、および、界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的充填状態に依存する（Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271）。
【０２５５】
相ダイアグラムを用いる現象論的方法は広く研究されており、そして、マイクロエマルジョンの製剤方法についての包括的な知識を当業者に提供している(例えば、 Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY、 Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245、Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335を参照のこと）。従来の乳剤と比較して、マイクロエマルジョンは自然に形成される熱力学的に安定な液滴の製剤の中で非水溶性薬品を可溶化するという利点をもたらす。
【０２５６】
マイクロエマルジョンの調製に使用される界面活性剤には、これらに限定されないが、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレエート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）がそれらのみか共界面活性剤と組み合わせて含まれる。共界面活性剤は、通常、エタノール、１−プロパノールおよび１−ブタノールなどの短鎖アルコールであるが、界面活性剤薄膜を貫通し、結果として界面活性剤分子の間に生成したボイドスペースのために乱れた薄膜を形成することにより界面流動性を高めるように働く。しかしながら、共界面活性剤を使用することなくマイクロエマルジョンを調製することが可能であり、そして、非アルコール含有自己乳化性マイクロエマルジョン系は当技術分野において公知である。水相は典型的には水、薬品の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコールおよびエチレングリコールの誘導体であり得るが、これらに限定されない。油相には、Ｃａｐｔｅｘ３００、Ｃａｐｔｅｘ３５５、Ｃａｐｍｕｌ  ＭＣＭ、脂肪酸エステル、（炭素数８〜１２の）中間鎖モノ、ジ、およびトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪族アルコール、ポリグリコール化グリセリド、炭素数８〜１０の飽和ポリグリコール化グリセリド、植物性油ならびにシリコン油などの物質が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０２５７】
マイクロエマルジョンは薬品の可溶化と薬品の吸収の向上の観点から特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルジョン（ｏ／ｗとｗ／ｏの両方）が、ペプチドを含む薬品の経口生物学的利用能を向上すると主張されている（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号、第７，０６３，８６０号、第７，０７０，８０２号、第７，１５７，０９９号、Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390、 Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205を参照のこと）。マイクロエマルジョンは、薬品可溶化の向上、酵素的加水分解からの薬品の保護、薄膜流動性と透過性の界面活性剤誘導変化による薬品吸収の向上の可能性、調製の容易性、固形剤形よりも優れた経口投与の容易性、臨床的有効性の向上および毒性の減少という利点をもたらす（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号、第７，０６３，８６０号、第７，０７０，８０２号、第７，１５７，０９９号、Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385、 Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143を参照のこと）。多くの場合、マイクロエマルジョンは、それらの成分が外界温度で集まると、自然に形成することができる。これは、熱不安定性薬品、ペプチド、またはｉＲＮＡを製剤するときに特に有利であり得る。マイクロエマルジョンはまた、美容用途および医薬用途の両方で活性成分の経皮送達に有効である。本発明のマイクロエマルジョン組成物および製剤は、胃腸管からのｉＲＮＡと核酸の全身性吸収の増大を促進し、ならびに、ｉＲＮＡと核酸の局所細胞性取込を向上することが期待される。
【０２５８】
本発明のマイクロエマルジョンはまた、製剤の特性を改善し、そして、本発明のｉＲＮＡと核酸の吸収を向上させるために、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ３）、ラブラソールおよび浸透促進剤などのその他の成分および添加剤を含むことができる。本発明のマイクロエマルジョンに使用される浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤からなる５つの大きい区分の１つに属するように分類され得る（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92）。これらの区分の各々は先に論じられている。
【０２５９】
浸透促進剤
１つの実施形態では、本発明は、動物の皮膚への核酸、特にｉＲＮＡの効率的な送達をもたらすために様々な浸透促進剤を用いる。大半の薬品が溶液中にイオン化形態と非イオン化形態の両方の形態で存在する。しかしながら、通常、脂質可溶性薬品または親油性薬品だけが容易に細胞膜を通過する。通過される予定の膜が浸透促進剤で処理された場合、非親油性薬品でさえ細胞膜を通過することが明らかになっている。非親油性薬品の細胞膜を越えた拡散の補助に加えて、浸透促進剤はまた親油性薬品の透過性を向上する。
【０２６０】
浸透促進剤は、５つの大きい区分、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤の１つに属するように分類され得る（例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002、 Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92を参照のこと）。浸透促進剤の上述した分類の各々は以下でさらに詳細に論じられている。
【０２６１】
界面活性剤：
本発明との関連では、界面活性剤（または、「表面活性剤」）は、水性溶液に溶解すると、その溶液の表面張力を、または、その水性溶液と別の液体との間の界面間張力を低減させ、結果として、粘膜によるｉＲＮＡの吸収を増大させることになる化学的実体である。胆汁塩と脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（例えば、Malmsten, M. Surfactant s and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002、 Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92を参照のこと）、および、ＦＣ−４３などのパーフルオロ化合物乳剤が含まれる。Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252）。
【０２６２】
脂肪酸：
浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸とその誘導体には、例えば、オレイン酸、ラウリル酸、カプリン酸（ｎ−デカノイン酸）、ミリスチル酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらの炭素数１〜２０のアルキル（例えば、メチル、イソプロピルおよびｔ−ブチル）エステル、およびそれらのモノ−およびジ−グリセリド（すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリスチレート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど）が含まれる（例えば、Touitou, E., et al.  Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006、 Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92、 Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654を参照のこと）。
【０２６３】
胆汁塩
胆汁の生理学的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が含まれる（例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002、 Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935を参照のこと）。様々な天然胆汁塩およびそれらの合成誘導体が浸透促進剤として作用する。したがって、用語「胆汁塩」には、胆汁の天然成分のいずれもが、ならびに、それらの合成誘導体のいずれもが含まれる。適切な胆汁塩には、例えば、コール酸（または、その薬学的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が含まれる（例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002、 Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92、 Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783、 Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33、 Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25、 Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583を参照のこと）。
【０２６４】
キレート剤
本発明との関連で使用されるようなキレート剤は、溶液から金属イオンをそれと錯体を形成することにより除去し、結果として、粘膜によるｉＲＮＡの吸収を増大させることになる化合物として定義され得る。本発明における浸透促進剤としてのその使用に関して、大半の特徴が明らかになったＤＮＡヌクレアーゼは触媒作用に二価の金属イオンを必要とし、したがって、キレート剤により阻害されるので、キレート剤はＤＮａｓｅ阻害剤として働きもするという追加の利点を追加する（Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339）。適切なキレート剤には、エチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチレートおよびホモバニレート）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９およびβ‐ジケトン（エナミン）のＮ−アミノアシル誘導体が含まれるが、これらに限定されない（例えば、Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006、 Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92、 Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51を参照のこと）。
【０２６５】
非キレート非界面活性剤
本明細書において用いられる場合、非キレート非界面活性剤浸透促進化合物は、キレート剤または界面活性剤として示される活性は有意ではないが、にもかかわらず消化管粘膜を通してｉＲＮＡの吸収を増大させる化合物として定義され得る（例えば、Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33を参照のこと）。この種類の浸透促進剤には、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−アルカノン誘導および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92）、およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非ステロイド系抗炎症剤(Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626）が含まれる。
【０２６６】
本発明の医薬組成物および他の組成物に、ｉＲＮＡの細胞レベルでの取込を向上させる薬剤を付加することもできる。例えば、リポフェクチンなどのカチオン性脂質（Ｊｕｎｉｃｈｉら、米国特許第５，７０５，１８８号）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリシンなどのポリカチオン性分子（Ｌｏｌｌｏら、国際公開第ＷＯ９７／３０７３１号）もｄｓＲＮＡの細胞取込を向上させることが知られている。市販の形質移入試薬の例には数ある中でも、例えば、リポフェクタミン（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、リポフェクタミン２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、２９３フェクチン（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、セルフェクチン（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、リポフェクタミン（商標）２０００ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、リポフェクタミン（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、オリゴフェクタミン（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、オプチフェクト（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧｅｎｅＱ２形質移入試薬（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ、スイス）、ＤＯＴＡＰリポソーマル形質移入試薬（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ、スイス）、ＤＯＳＰＥＲリポソーマル形質移入試薬（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ、スイス）またはＦｕｇｅｎｅ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ、スイス）、トランスフェクタム（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）形質移入試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）、Ｔｆｘ（商標）−２０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）、Ｔｆｘ（商標）−５０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（ＯＺ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、フランス）、ＴｒａｎｓＰａｓｓa  Ｄ１形質移入試薬（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、マサチューセッツ州、米国）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州、米国）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎ形質移入試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州、米国）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲ形質移入試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州、米国）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ形質移入試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇ��、カリフォルニア州、米国）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ２形質移入試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州、米国）、サイトフェクチン形質移入試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州、米国）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲ形質移入試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州、米国）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）形質移入試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州、米国）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ、Ｔａｕｎｔｏｎ、マサチューセッツ州、米国）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ、Ｔａｕｎｔｏｎ、マサチューセッツ州、米国）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、カリフォルニア州、米国）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、カリフォルニア州、米国）、またはＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、カリフォルニア州、米国）が挙げられる。
【０２６７】
投与された核酸の浸透を向上させるために、エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール類、２−ピロールなどのピロール類、アゾン類、ならびにリモネンおよびメントールなどのテルペン類を含む他の薬剤を利用することができる。
【０２６８】
担体
本発明のある組成物はまた製剤中に担体化合物を組み入れる。本明細書において用いられる場合、「担体化合物」または「担体」は、不活性である（すなわち、それ自体は生物学的活性を持たない）が、例えば、生物学的に活性がある核酸を分解することにより、または、循環系からのそれの除去を促進することにより生物学的活性を持つ核酸の生物学的利用能を低減させるインビボプロセスにより核酸として認識される核酸、またはその類似体を意味することができる。核酸と担体化合物の共投与、典型的には後者の物質が過剰な共投与は、肝臓、腎臓または他の循環外貯蔵場所で回収される核酸の量を、おそらくは担体化合物と核酸の間での共通の受容体をめぐる競合のために実質的に減少させる結果になり得る。例えば、部分的にチオリン酸エステルを有するｄｓＲＮＡがポリイノシン酸、デキストラン硫酸、ポリシチジン酸または４−アセタミド−４'イソチオシアノ−スチルベン−２，２'−ジスルホン酸と共投与されるとその肝臓組織での回収が低減する可能性がある（Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121、 Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183）。
【０２６９】
賦形剤
担体化合物と対照的に、「医薬担体」または「賦形剤」は、１つ以上の核酸を動物に送達するための薬学的に許容可能な溶媒、懸濁剤または他のあらゆる薬学的に不活性な媒体である。賦形剤は液体または固体であることができ、そして、計画された投与方式を念頭に、核酸および所与の医薬組成物の他の成分と組み合わされたとき、所望の容積、硬度などを提供するように選択される。典型的な医薬担体には、結合剤（例えば、トウモロコシαデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、充填剤（例えば、乳糖および他の糖、ミクロクリスタリンセルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、硬化植物性油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）、崩壊剤（例えば、デンプン、グリコール酸デンプンナトリウムなど）および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２７０】
本発明の組成物を製剤するために、核酸と有害に反応することがない非腸管外投与に適切な薬学的に許容可能な有機賦形剤または無機賦形剤もまた使用することができる。適切な薬学的に許容可能な担体には水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０２７１】
核酸の局所投与用の製剤は無菌および非無菌の水性溶液、アルコールなどの一般的な溶媒中の非水性溶液、または液体もしくは固体油系基剤中の核酸の溶液を含むことができる。前記溶液はまた緩衝液、希釈剤および他の適切な添加剤を含有することもできる。核酸と有害に反応することがない非腸管外投与に適切な薬学的に許容可能な有機賦形剤または無機賦形剤を使用することができる。
【０２７２】
適切な薬学的に許容可能な賦形剤には水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０２７３】
他の成分
本発明の組成物は、当技術分野で確立されている使用レベルで医薬組成物中に従来見られる他の補助成分をさらに含有することができる。したがって、例えば、前記組成物はその他の適合性を有する薬学的に活性がある物質、例えば、痒み止め薬、収斂薬、局所麻酔薬または抗炎症薬のような物質を含有することができ、または、前記組成物を様々な剤形に物理的に製剤するのに有用な、色素、着香剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定化剤などのその他の物質を含有することができる。しかしながら、そのような物質は、添加されると、本発明の組成物の生物学的活性を過度に干渉しない必要がある。製剤は無菌化されることができ、そして、所望により、製剤の核酸と有害に相互作用しない、例えば、滑沢剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩、緩衝液、着色剤、着香剤、および／または芳香物質などの補助剤と混合されることができる。
【０２７４】
水性懸濁液は、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランを含むその懸濁液の粘性を増大させる物質を含有することができる。前記懸濁液はまた安定化剤を含有することができる。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、本発明において取り上げられる医薬組成物は（ａ）１つ以上のｉＲＮＡ化合物および（ｂ）非ＲＮＡｉ機構により機能する１つ以上の他の薬剤を含む。そのような他の薬剤の例には、１つ以上の組換えサイトカイン（例えば、ＩＬ６、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ）、ＰＰＡＲγリガンドおよびコルチコステロイド類が含まれるが、これらに限定されない。基本的に、他の非ＲＮＡｉ薬剤は肝線維症の遠因を標的とし、および／または、病気の症状の緩和を目的とする。肝線維症の遠因の治療法は当技術分野において公知である。そのような治療法と治療計画のいくつかが表２に示されている。
【０２７６】
培養細胞または実験動物での標準的な製薬的方法、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％までの致死用量）とＥＤ５０（集団の５０％での治療上有効用量）を決定するための方法により、そのような化合物の毒性と治療有効性を決定することができる。毒性と治療効果の間の用量比は治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表現され得る。高治療指数を示す化合物が好ましい。
【０２７７】
ヒトでの使用のためのある範囲の投与量を製剤することに培養細胞試験と動物実験から得られたデータを用いることができる。本明細書において取り上げられる組成物の投与量は、ほとんど、または、全く毒性がないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。用いる剤形と利用する投与経路に応じて投与量はこの範囲で変化し得る。本発明において取り上げられる方法で使用される任意の化合物について、治療上有効な用量は、最初、培養細胞試験から推定され得る。培養細胞で決定されるようなＩＣ５０（すなわち、症状の最大抑制の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む化合物の、または、適切であるときは、標的配列のポリペプチド産物のある循環血漿中濃度範囲を達成する（例えば、前記ポリペプチドの濃度の減少を達成する）用量を動物モデルにより製剤することができる。ヒトで有用な用量をさらに正確に決定するためにそのような情報を用いることができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
【０２７８】
それらの投与に加えて、先に議論したように、本明細書において取り上げられるｉＲＮＡは、ＣＯＬ１Ａ１の過剰発現により媒介される肝線維症の治療に有効な他の公知の薬剤と組み合わせて投与されることができる。どのような事象であれ、臨床医は、当技術分野において公知の、または、本明細書において記載される有効性の標準的な測定法を用いて観察された結果を基にｉＲＮＡ投与の量とタイミングを調節することができる。
【０２７９】
ＩＶ．  ｉＲＮＡ標的遺伝子：ＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβおよびＳＭＡＤ２／３
ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）コラーゲンＩ型α１（ＣＯＬ１Ａ１）はコラーゲンα−１（Ｉ）鎖、α−１Ｉ型コラーゲン、プロ−α−１コラーゲン１型、コラーゲンα１鎖Ｉ型、皮膚、腱および骨コラーゲンα−１鎖、ＯＩ４およびＣＯＬ１Ａ１としても知られる。
【０２８０】
ＣＯＬ１Ａ１遺伝子は、その３重らせんが２つのα１鎖と１つのα２鎖を含むＩ型コラーゲンのプロ−α１鎖をコードする。Ｉ型コラーゲンは大半の結合組織に見出される線維形成性コラーゲンであり、骨、角膜および腱に豊富である。この遺伝子の変異はＩ〜ＩＶ型骨形成不全症、ＶＩＩＡ型エーラス・ダンロス症候群、古典型エーラス・ダンロス症候群、カフィー病および特発性骨粗鬆症に付随する。この遺伝子と血小板由来成長因子βの遺伝子が局在する１７番染色体と２２番染色体の相互転座が、その成長因子の未制御性発現の結果として生じる隆起性皮膚線維肉腫と呼ばれる特定の種類の皮膚腫瘍に付随する。交互のポリアデニル化シグナルの使用の結果として生じる２つの転写物がこの遺伝子で同定されている。ヒトＣＯＬ１Ａ１遺伝子はチンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、ラットおよびゼブラフィッシュで保存されている。
【０２８１】
ヒトＣＯＬ１Ａ１  ｍＲＮＡのＧＥＮＢＡＮＫ（商標）登録番号はＮＭ＿００００８８．３であり、そして、その配列は配列番号１７２として本明細書において提供される。
【０２８２】
マウスＣＯＬ１Ａ１  ｍＲＮＡのＧＥＮＢＡＮＫ（商標）登録番号はＮＭ＿００７７４２．３であり、そして、その配列は配列番号１７３として本明細書において提供される。
【０２８３】
ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）はまたＴＧＦ−β−１、ＴＧＦ−β１タンパク質、潜在関連ペプチド、ＣＥＤ、ＬＡＰ、ＤＰＤ１、ＴＧＦｂおよびＴＧＦβとしても知られる。この遺伝子は、多くの細胞種で増殖、分化、接着、移動および他の機能を調節する多機能性ペプチドであるサイトカインのトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）ファミリーのメンバーをコードする。多くの細胞がＴＧＦβ受容体を持ち、そして、そのタンパク質は多くの他の成長因子を正に、および、負に調節する。その分泌されたタンパク質は潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）と成熟型ＴＧＦβ１ペプチドに切断され、そして、ＴＧＦβ１ホモ二量体、ＬＡＰホモ二量体および潜在型ＴＧＦβ１結合タンパク質からなる潜在型かＴＧＦβ１ホモ二量体からなる活性型のどちらかの型で見いだされる。前記成熟型ペプチドはまた、他のＴＧＦβファミリーメンバーとヘテロ二量体を形成することもできる。ヒトＴＧＦβ１遺伝子はチンパンジー、イヌ、マウス、ラットおよびゼブラフィッシュで保存されている。
【０２８４】
ヒトＴＧＦβ１  ｍＲＮＡのＧＥＮＢＡＮＫ（商標）登録番号は１．ＮＭ＿０００６６０．４であり、そして、その配列は配列番号１７４として本明細書において提供される。
【０２８５】
マウスＴＧＦβ１  ｍＲＮＡのＧｅｎｂａｎｋ（商標）登録番号は１．ＮＭ＿０１１５７７．１、ＧＩ：６７５５７７４であり、そして、その配列は配列番号１７５として本明細書において提供される。
【０２８６】
ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ＳＭＡＤファミリーメンバー２（ＳＭＡＤ２）はまた「マザーズ・アゲインスト・デカペンタプレジック・ホモログ２」、ＭＡＤホモログ２、Ｍａｄタンパク質ホモログ、Ｍａｄ関連タンパク質２、マザー・アゲインストＤＰＰホモログ２、マザーズ・アゲインストＤＰＰホモログ２、ＳｍａおよびＭａｄ関連タンパク質２、ＪＶ１８、ＭＡＤＨ２、ＭＡＤＲ２、ＪＶ１８−１、ｈＭＡＤ−２、ｈＳＭＡＤ２、ＭＧＣ２２１３９、ＭＧＣ３４４４０、およびＳＭＡＤ２としても知られる。ＳＭＡＤタンパク質は複数の伝達経路に介在するシグナル伝達因子および転写修飾因子である。ＳＭＡＤ２は、その受容体活性化用ＳＭＡＤアンカー（ＳＡＲＡ）タンパク質との相互作用を介してＴＧＦ−β受容体にリクルートされる。ＴＧＦ−βシグナルに反応して、ＳＭＡＤ２はＴＧＦ−β受容体によりリン酸化される。そのリン酸化がこのタンパク質のＳＡＲＡとの解離を誘導し、そして、ファミリーメンバーＳＭＡＤ４との結合を誘導する。ＳＭＡＤ４との結合はこのタンパク質の細胞核への移行に重要であり、細胞核ではそれは標的プロモーターに結合し、そして、他の補助因子と転写抑制複合体を形成する。ＳＭＡＤ２はまた、アクチビンＩ型受容体キナーゼによりリン酸化されることもでき、そして、アクチビンからのシグナルを仲介する。また、同じタンパク質をコードするスプライス型転写異型体が観察されている。ヒトＳＭＡＤ２遺伝子はチンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ニワトリおよびゼブラフィッシュで保存されている。
【０２８７】
ヒトＳＭＡＤ２転写物には３つの既知の異性体が存在する。これらの３つのヒトＳＭＡＤ２  ｍＲＮＡのＧＥＮＢＡＮＫ（商標）登録番号はＮＭ＿００１００３６５２．２、ＮＭ＿００１１３５９３７．１およびＮＭ＿００５９０１．４であり、そして、その配列はそれぞれ配列番号１７６、配列番号１７７および配列番号１７８として本明細書において提供される。
【０２８８】
マウスＳＭＡＤ２には１つの既知の転写物が存在する。マウスＳＭＡＤ２  ｍＲＮＡのＧＥＮＢＡＮＫ（商標）登録番号はＮＭ＿０１０７５４．４であり、そして、その配列は配列番号１７９として本明細書において提供される。
【０２８９】
ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ＳＭＡＤファミリーメンバー３（ＳＭＡＤ３）はまた、「マザーズ・アゲインスト・デカペンタプレジック・ホモログ３」、ＭＡＤＨ３、ｈＭＡＤ−３、ｈＳＭＡＤ３、ＭＡＤホモログ３、ｍａｄタンパク質ホモログ、マザーズ・アゲインストＤＰＰホモログ３、ＳＭＡおよびＭＡＤ関連タンパク質３、ｍａｄホモログＪＶ１５−２、ＨＳＰＣ１９３、ＨｓＴ１７４３６、ＭＧＣ６０３９６、ＤＫＦＺｐ５８６Ｎ０７２１、およびＤＫＦＺｐ６８６Ｊ１０１８６としても知られる。
【０２９０】
この遺伝子によりコードされるタンパク質は、ショウジョウバエの遺伝子「マザーズ・アゲインスト・デカペンタプレジック」（Ｍａｄ）およびエレガンス線虫（Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ）の遺伝子Ｓｍａの遺伝子産物に類似するタンパク質のファミリーであるＳＭＡＤに属する。ＳＭＡＤ３はトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βのシグナルを仲介し、したがって、細胞増殖、アポトーシスおよび分化などの複数の細胞プロセスを調節する。ＳＭＡＤ３は、トランスフォーミング増殖因子−βにより活性化される転写修飾因子として機能し、そして、発癌の調節に役割を果たすと考えられている。ヒトＳＭＡＤ３遺伝子はチンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ニワトリ、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエおよびカで保存されている。
【０２９１】
ＳＭＡＤ３転写物には少なくとも４つの異性体が存在する。４つのヒトＳＭＡＤ３  ｍＲＮＡのＧＥＮＢＡＮＫ（商標）登録番号はＮＭ＿００１１４５１０２．１、ＮＭ＿００１１４５１０３．１、ＮＭ＿００１１４５１０４．１およびＮＭ＿００５９０２．３であり、そして、その配列はそれぞれ、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２および配列番号１８３として本明細書において提供される。
【０２９２】
マウスＳＭＡＤ３には１つの既知の転写物が存在する。マウスＳＭＡＤ３  ｍＲＮＡのＧＥＮＢＡＮＫ（商標）登録番号はＮＭ＿０１６７６９．４であり、そして、その配列は配列番号１８４として本明細書において提供される。
【０２９３】
Ｖ．  肝臓、肝疾患、線維症および硬変
線維症は、炎症、刺激状態、または傷治癒の結果として器官または部分で異常な量の線維性結合組織を形成することを特徴とする。線維性疾患には、全身性硬化症（ＳＳｃ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、肝硬変、腎性全身性線維症（ＮＳＦ）、塵肺症（金属粒子または鉱物粒子の吸入を原因とする慢性呼吸器疾患）、筋膜炎、硬化性粘液水腫、後腹膜線維症、肺線維症、肝線維症、慢性移植片対宿主病および慢性同種移植片拒絶反応および嚢胞性線維症が含まれるがこれらに限定されず、線維性疾患は様々な組織でのコラーゲンおよび他の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の異常で過剰な沈着を特徴とする。活動性線維症はまたリウマチ性関節炎、ループス、自己免疫疾患、ライム病、喘息、特発性肺線維症、慢性肺線維症、子宮線維症および卵巣線維症において生じる可能性もある。それらの病因はきわめて多様であるが、活性化表現型を示すＥＣＭ産生線維芽細胞の患部組織での存在が全ての線維性疾患に典型的である。線維芽細胞の活性化は、Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンならびにフィブロネクチンをコードする遺伝子の転写活性の著しい上昇、平滑筋αアクチン（α−ＳＭＡ）の発現の開始、およびＥＣＭ分解活性の低下を特徴とする。活性化線維芽細胞は、α−ＳＭＡを含有するストレスファイバーの発現の結果として生じる収縮性特性を示し、そして、それらの線維症促進性活性化は、インビトロでの複数回の継代培養の間に保存される一組の複雑な分子的および生化学的変化の一部である。
【０２９４】
身体では、肝臓は最も複雑であり、そして、代謝的に活発な器官であり、そして、それは５００を超える生命維持に必要な機能を実行する。それはまた、身体中の主要な解毒器官でもある。肝臓は、肝臓から老廃物を運び去ることに役立つ血液中の大半の化学物質のレベルを調節し、そして、胆汁を分泌する。胃および小腸を離れる全ての血液が肝臓を通過する。肝臓はこの血液を処理し、そして、栄養と他の成分を身体の残りの部分が使用するために利用可能な形状に分解する。重要な機能のいくつかは次の通りである：（１）感染に対する免疫をもたらす、（２）身体において重要なタンパク質の大半、およびまた全ての体脂肪に保持されるコレステロールおよびリポプロテインを産生する、（３）血液から大半の化学物質、薬物およびアルコールを除去する、（４）小腸に胆汁を排出する。胆汁は脂肪の消化に必須であり、そしてまた身体の老廃物を運搬するために働く、（５）生命維持に重要なタンパク質を産生することにより血液の凝固を調節する、そして（６）余分な糖（グルコース）を飢餓時に使用することができるデンプン（グリコーゲン）の形状に変換して貯蔵する。さらに、肝臓は莫大な予備機能能力を有する。たとえ肝臓の７０％が除去されても、全ての肝機能が正常なままでいる。肝臓はまた、その大部分が除去された後にそれ自身を再生できる身体で唯一の器官でもある。
【０２９５】
潜在的な急性または慢性肝疾患状態を原因とする炎症、刺激状態、または傷治癒の結果として異常な量の線維性結合組織が産生されるとき、肝線維症が生じる。肝炎は、結果として、肝臓細胞が損傷および破壊される肝臓の炎症である。肝炎は急性であり、すなわち、急性肝疾患であり、または、慢性であり、すなわち、慢性肝疾患である可能性がある。急性肝炎から完全に回復していない患者は、肝臓がより多くの損傷と炎症を保持し続けるので、慢性肝炎を発生させる可能性がある。症状が３か月〜６か月よりも長く続く場合、肝炎は慢性であるとみなされる。慢性肝疾患状態での炎症／刺激状態／傷治癒は、ウイルス（例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型またはＧ型肝炎ウイルス）または他の感染症（赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種）、トリヒナ回虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）、中国肝吸虫、肝臓ジストマ（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）および住血吸虫属の吸虫）、自己免疫性肝炎、胆道閉鎖、先天性疾患、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）および原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）による胆管閉塞または胆道疾患、代謝性疾患（例えば、鉄過剰の血色素症、銅過剰のウィルソン病）、過度の飲酒に起因する脂肪蓄積または多くの場合、糖尿病および肥満と関係がある特発性非ＮＡＳＨ、ならびにアセトアミノフェン、パラセタモール、ドライクリーニング用化学物質およびいくつかの野生のキノコなどの薬物の過剰服用などの毒性化学物質への曝露、ならびに肝臓癌に起因する可能性がある。肝臓腫瘍を発生する患者のおよそ９０％が硬変を患う。肝臓癌の種類には、肝細胞癌、線維層板幹細胞癌、続発性肝臓癌および胆管細胞癌（胆管腫瘍）が含まれる。肝線維症の他の原因には、肝臓からの血液流出の閉塞（すなわち、バット・キアリ症候群）、クリグラー・ナジャール症候群、ジルベール症候群、デュビン・ジョンソン症候群、高ビリルビン血症、心臓および血管障害、α１−アンチトリプシン欠損、高血液ガラクトースレベル、出生時の高血液チロシンレベル、グリコーゲン貯蔵病、糖尿病および栄養不良が含まれる。
【０２９６】
急性肝炎と共に慢性肝疾患および肝線維症への進行を開始するプロセスが始まる。急性肝炎が解決しない場合、慢性肝炎が生じ、そして、線維症と、ある場合では、硬変を特徴とする慢性肝疾患への段階を整える。例として、アルコールの過剰消費を原因とするアルコール誘導性肝疾患は脂肪肝（ステージＩ）と共に始まる。脂肪肝は肝臓細胞内での脂肪の過剰蓄積である。これは最も一般的なアルコール誘導性肝臓疾患である。肝臓が肥大し、右側の上腹部の不快感の原因となる。ステージＩＩでは、肝臓の急性炎症であるアルコール性肝炎が生じ、個々の肝臓細胞の破壊と瘢痕化が伴う。症状には、発熱、黄疸、白血球数の増加、肥大化した柔らかい肝臓、および皮膚でのくも状静脈が含まれ得る。ステージＩＩＩは、正常肝臓組織の破壊を特徴とするアルコール性硬変であり、非機能性瘢痕組織を残す。症状には、（吐血に至る）門脈高血圧症、脾臓肥大、腹水、（凝固不良に起因する）過剰出血、腎臓不全、意識障害または肝臓癌に加えてアルコール性肝炎の症状が含まれ得る。
【０２９７】
肝硬変は、正常組織の線維組織による置換と機能性肝臓細胞の喪失を特徴とする肝臓の慢性疾患である。肝硬変の全般的な構造は密集した線維組織に囲まれた再生結節である。線維症瘢痕組織の過剰増殖が、肝臓が適切に機能することを妨げる。肝線維症は通常、硬変になり、そして、正常肝臓構造を広範に変形することになる肝線維症の後期である。硬変の原因は線維症の原因と同じである。硬変は通常、不可逆的であるとみなされる。この不可逆的な肝臓の瘢痕形成は、命にかかわる可能性がある。進行したステージでは、肝臓の８０〜９０％が損傷を受け、そして、瘢痕組織によって置換される可能性がある。硬変の症状は、重症度に応じて様々である。軽い硬変はどのような症状も示すことが全くできない。肝硬変の最初期の症状には、疲労、無気力、黄色の眼と尿（軽い黄疸）、脚のむくみ、ひどい痒みおよび貧血（低ヘモグロビン）などの一般的な症状が含まれ得る。さらに進行したステージでは、患者は、吐血、重篤な感染症を発生させる可能性がある腹部の水（腹水）に起因する腹部膨満、精神機能低下と昏睡、ひどい黄疸および腎臓障害などの命にかかわる合併症を有する可能性がある。さらに、患者は、両方とも正常な血液凝固に必須である肝臓タンパク質のプロトロンビンと血小板について、プロトロンビンが低レベルであり、そして、血小板数が少ないことを原因として出血傾向を有する可能性がある。
【０２９８】
当業者に公知の医療手法により肝臓の線維症と硬変を評価し、そして、診断することができる。その医療手法には、特異的な臨床検査、肝機能検査、肝臓生検、ドップラー超音波検査、ＣＴおよび／またはＭＲ画像検査および（胆管のＸ線による）胆管造影検査が含まれるがこれらに限定されない。
【０２９９】
特異的な臨床検査、肝臓および機能検査には、多くの場合、肝臓が適切に機能しているかどうか決定することができる一連の血液検査を含む非侵襲性診断手法が含まれる。これらの検査はまた急性肝臓疾患と慢性肝臓疾患を区別することができ、そして、肝炎と胆汁鬱滞を区別することができる。最も一般的に実行される血液検査には、（１）血清ビリルビン検査―ビリルビンレベルの上昇は多くの場合、胆汁流の妨害または肝臓による胆汁の加工における欠損を示す―ビリルビンは肝臓により産生され、胆汁中に排出される、（２）血清アルブミン検査―正常レベルより下のアルブミンは多くの慢性肝臓疾患と関係がある、（３）血清アルカリホスファターゼ検査―胆汁中に見出される酵素であるアルカリホスファターゼのレベルの上昇は、たいてい、胆汁流の妨害、肝臓傷害またはある種の癌を示す、（４）血清アミノトランスフェラーゼ（トランスアミナーゼ）―この酵素は損傷肝臓細胞から放出される、（５）プロトロンビン時間（ＰＴＴ）検査―この検査は血液が凝固するのにかかる時間を測定する。血液凝固はビタミンＫと肝臓により作製されるタンパク質を必要とする。肝臓細胞損傷と胆汁流妨害が両方とも適切な血液凝固を妨げる可能性がある、（７）アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）検査―この酵素は損傷肝臓細胞から放出される、（８）アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）検査―この酵素は損傷を受けた肝臓細胞、心臓細胞、筋肉細胞または脳細胞から放出される、（９）ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ検査―この酵素は肝臓、膵臓および腎臓で産生され、そして、これらの器官が傷害を受けると血液に放出される、（１０）乳酸脱水酵素検査―この酵素は、肝臓、心臓、肺または能などの器官が傷害を受けると放出される、（１１）５−ヌクレオチダーゼ検査―この酵素は、胆管閉塞または胆汁流の妨害のために肝臓が傷害を受けると、放出される、（１２）α−フェトタンパク質検査―このタンパク質は胎児の肝臓と精巣により産生され、成人になって肝炎を経験すると肝炎または癌の徴候である、（１３）ミトコンドリア抗体検査―これらの抗体の存在は原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎およびある種の他の自己免疫疾患の徴候である可能性がある。いくつかの実施形態では、肝線維症および／または硬変を評価し、そして、診断するために線維症のバイオマーカーを用いる。肝線維症のバイオマーカーは当技術分野において公知であり、例えば、表９を参照のこと。検査結果は正常である可能性があり、または、硬変またはアルコール症の合併症に起因する非特異的な異常を検出する可能性がある。ＡＬＴとＡＳＴレベルは多くの場合、中程度に上昇する。アルカリホスファターゼとγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）は多くの場合正常であり、レベルの上昇は胆汁鬱滞または胆管閉塞を示す。ビリルビンはたいてい正常であるが、硬変が進行すると、特に、原発性胆汁性肝硬変では増加する（以下を参照のこと）。血清アルブミンの減少とＰＴの延長は、通常は終末期の事象である肝臓内合成不全を直接的に反映する。栄養不良のとき、アルブミンもまた低レベルであり得る。硬変と大半の肝臓疾患において血清グロブリンが炎症性成分と共に増加する。貧��は高赤血球分布幅と共に一般的であり、そして、通常、正球性である。貧血は、多くの場合、多因子性であり、慢性消化管出血から小球性貧血であり、葉酸栄養欠損または（特に、過度の飲酒での）溶血および脾臓機能亢進から大球性貧血である。全血球計算（ＣＢＣ）によりまた白血球減少症、血小板減少症または汎血球減少症を検出することができる。
【０３００】
肝線維症および硬変の正確な診断、または、任意の共存する肝疾患の除外、肝疾患の重症度の病期分類と等級分類、治療決定、患者と医療提供者の再確信のために、そして、将来の疾患進行を判断する基準として、肝臓生検が現在では至適基準とみなされている。診断生検は、肝臓と胆管を冒す多数の疾患の診断において非常に重要で有用な検査である。大半の場合では、これにより非常に具体的な診断を確立することが可能になり、そしてまた、病気の病期分類と等級分類を可能にする。病期分類と等級分類のいくつかの尺度が当技術分野において公知であり、例えば、表８（F. Grunhage and F. Lammert, Chapter 20: Assessment of heptic fibrosis in chronic viral hepatitis, in Hepatology: a clinical textbook. Eds. Mauss, Berg, Rockstroh, Sarrazin and Wedemeyer, 2nd ed. 2010）およびＣｈｉｌｄ−Ｔｕｒｃｏｔｔｅ−Ｐｕｇｈスコアリングシステム（メルク医学マニュアル）を参照のこと。肝臓を冒す疾患のために患者が受けている治療の有効性を医師がモニターすることにモニター用肝臓生検が役に立ち得る。（皮膚を通過した針による）経皮性肝臓生検、（血管を通した）経頸静脈性肝臓生検、（腹部小切開による）腹腔鏡下肝臓生検、細針吸引肝臓生検および開放手術肝臓生検などの多種多様な肝臓生検が存在する。組織学的検査のために検査室に送るため、その手技の間に肝臓組織の小片を取り出す。
【０３０１】
診断と肝線維症の病期分類のための他の非侵襲性手法もまた用いられる。例えば、肝線維症マーカーは、α−２−マクログロブリン（ａ−ＭＡ）、トランスフェリン、アポリポプロテインＡ１、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ラミニン、Ｎ−末端プロコラーゲンＩＩＩ（ＰＩＩＩＮＰ）、７ＳコラーゲンＩＶ（７Ｓ−ＩＶ）、全ビリルビン、間接ビリルビン、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ＡＳＴ／ＡＬＴ、ｇ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アルブミン、アルブミン／グロブリン、血液尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（Ｃｒ）、トリグリセリド、コレステロール、ならびに高密度リポプロテインおよび低密度リポプロテインである。Ｌｕｎ−ＧｅｎＬｕらは（World J. Gastroenterologgy, 2003, 9(11):2574-2578）、至適標準の肝臓生検の実行を必要とせずに肝線維症の病期と等級を決定するために、慢性肝疾患を有する２００人の患者の２０を超える非侵襲性パラメータを測定し、そして、非侵襲性パラメータのレベルにより判定されるような炎症活性をこれらの患者に由来する継続的な肝臓生検の線維症と関係づけようと試みた。病理学的な診断では、ステージ１とステージ２は、軽い線維症を示し、ステージ３とステージ４は重症の線維症を示した。Ｌｕｎ−ＧｅｎＬｕらは、肝線維症と炎症活性の間に緊密な相関が存在することを発見した。ＡＳＴ、ＧＧＴ、アルブミン、アルブミン／グロブリン、ＡＬＰ、ＡＦＰ、ヒアルロン酸、Ｎ−末端プロコラーゲンＩＩＩ（ＰＩＩＩＮＰ）、ＩＶ型コラーゲン（ＣｏｌＩＶ）、メタロプロテイナーゼ−１（ＴＩＭＰ−１）の組織インヒビター、α−２−マクログロブリン、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、ドップラー超音波検査、ＣＴおよび／またはＭＲ画像検査のいくつかのパラメータの全てで炎症活性の程度と関連があった。ＧＧＴ、アルブミン、アルブミン／グロブリン、ＡＬＰ、ＡＦＰ、ヒアルロン酸、ＣｏｌＩＶ、ＴＩＭＰ−１、α−２−マクログロブリン、トランスフォーミング増殖因子−β１（ＴＧＦｂ１）、ＮＫ、ドップラー超音波検査、ＣＴおよび／またはＭＲ画像検査のいくつかのパラメータの全てで線維症の病期分類と関連があった。炎症と初期の線維症でＴＧＦβとＴＩＭＰ−１のレベルがさらに著しく増加することが明らかになった。このことは、それらが肝臓の炎症と線維症の変化を反映する可能性があることを示している。ＧＧＴ、アルブミン、アルブミン／グロブリン、ＡＬＰ、ＡＦＰ、ＨＡ、７Ｓ−ＩＶおよびα２−ＭＡには肝線維症と正の相関があった。この研究では、有意な診断値を持つことが知られているＰＩＩＩＮＰ、ラミニン、トランスフェリンおよびアポプロテインＡ１は確かめられなかった。
【０３０２】
肝疾患とその結果の肝線維症の治療には、肝臓での炎症と刺激状態の主な原因を治療すること、および炎症を制御することが含まれるがこれらに限定されない（表２を参照のこと）。本明細書において記載されるｄｓＲＮＡ介在性方法に加えて、治療はまた、次のうちの１つ／それ以上を含むことができる。抗ウイルス薬剤―肝疾患または肝線維症がＢ型肝炎またはＣ型肝炎により引き起こされるとき、注射可能な抗ウイルス薬インターフェロンαにより肝臓の炎症を止めることができる。さらに、Ｂ型肝炎では、ラミブジンまたはアデフォビルなどの経口抗ウイルス薬を使用することが可能であり、一方、Ｃ型肝炎では、リバビリンを使用することができる。コルチコステロイド類―自己免疫疾患を原因とする慢性肝疾患を治療するためにコルチコステロイド類を使用することができる。しかしながら、炎症が抑制されるときでも、肝臓の瘢痕形成が続き得る可能性がある。ある薬品の中断―ある薬品によって慢性肝炎が引き起こされるとき、それらの薬品を中断することは通常どのような症状をも取り除く。アルコールの中断―これはアルコール誘導性慢性肝疾患での回復に必須であるが、それはまたＣ型肝炎および肝臓の他の慢性疾患でも非常に当を得ている。他の治療法の例には、表２に開示されるものが含まれる。さらに、肝線維症の治療、予防および／または管理のために、Ｑｉｎｇｇａｎカプセル、イチョウ葉、Ｒｕａｎｇａｎ、サルビア、ミシマサイコおよび白シャクヤクなどの伝統的な漢方薬を前記治療法および組成物と組み合わせて用いることができる。
【０３０３】
ＶＩ．  ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現阻害法
１つの態様では、細胞内のＣＯＬ１Ａ１の発現を阻害する方法であって、（ａ）前記細胞内のＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子またはＳＭＡＤ２／３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを前記細胞に導入する工程、および（ｂ）工程（ａ）で作製された細胞を、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子またはＳＭＡＤ２／３遺伝子それぞれのｍＲＮＡ転写物が分解されるのに十分な時間にわたり維持する工程を含む方法が、本明細書において提供される。ｄｓＲＮＡがＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３の遺伝子の発現を標的とする実施形態では、細胞を刺激してＣＯＬ１Ａ１を過剰発現させるＴＧＦβからのシグナル伝達を低減することにより、その細胞でのＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現が間接的に阻害される。その阻害はＣＯＬ１Ａ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解によるものではない。遺伝子発現の減少は当技術分野において公知のどんな方法によっても、および、本明細書において記載される方法、例えば、定量ＲＴ−ＰＣＲによって評価され得る。
【０３０４】
１つの実施形態では、細胞は哺乳類細胞であり、好ましくはヒト細胞である。別の実施形態では、細胞は哺乳類肝臓細胞である。好ましい実施形態では、細胞はＨＳＣである。
【０３０５】
１つの実施形態では、細胞に１つより多いｄｓＲＮＡが導入される。１つの実施形態では、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡが細胞に導入される、すなわち、ｄｓＲＮＡの組合せが細胞に導入され、そして、１つより多い遺伝子が標的とされる。例えば、ＣＯＬ１Ａ１  ｉＲＮＡとＴＧＦβ  ｉＲＮＡの組合せ、ＣＯＬ１Ａ１  ｉＲＮＡとＳＭＡＤ２／３  ｉＲＮＡの組合せ、またはＣＯＬ１Ａ１  ｉＲＮＡ、ＴＧＦβ  ｉＲＮＡおよびＳＭＡＤ２／３  ｉＲＮＡの組合せ。
【０３０６】
１つの実施形態では、ｄｓＲＮＡが、好ましくは、リポソーム中の、例えば、当技術分野において公知のおよび／または本明細書において記載されるＬＮＰ製剤化リポソーム中のｄｓＲＮＡが細胞に導入される。１つの実施形態では、ＨＳＣなどの特異的な細胞を標的とするためにＬＮＰが製剤される。例えば、ＬＮＰカプセル化ｄｓＲＮＡがビタミンＡ捕捉性ＨＳＣを標的とするように、ＬＮＰ製剤化リポソームをビタミンＡと結合させることができる。
【０３０７】
１つの実施形態では、ＣＯＬ１Ａ１の発現が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％までも阻害される。ＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現もまたｄｓＲＮＡによって阻害される実施形態では、ＣＯＬ１Ａ１の発現の減少に加えて、それらのそれぞれの発現は少なくとも３０％阻害される。
【０３０８】
１つの態様では、哺乳類のＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現を阻害する方法であって、（ａ）前記哺乳類の細胞内のＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子またはＳＭＡＤ２／３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含む組成物を前記哺乳類に投与する工程、および（ｂ）工程（ａ）の哺乳類を、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子またはＳＭＡＤ２／３遺伝子それぞれのｍＲＮＡ転写物が分解されるのに十分な時間にわたり維持し、それによって前記細胞内のＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現を阻害する工程を含む方法が本明細書において提供される。ｄｓＲＮＡがＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現を標的とする実施形態では、細胞を刺激してＣＯＬ１Ａ１を過剰発現させるＴＧＦβからのシグナル伝達を低減させることにより、細胞でのＣＯＬ１Ａ１の発現が間接的に阻害される。その阻害はＣＯＬ１Ａ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解によるものではない。遺伝子発現の減少は当技術分野において公知のどんな方法によっても、および、本明細書において記載される方法、例えば、定量ＲＴ−ＰＣＲによって評価され得る。１つの実施形態では、吸引肝臓生検試料は、標的遺伝子の発現の減少をモニターするための組織材料として働く。
【０３０９】
１つの実施形態では、前記方法は、例えば、長期間、例えば、２、３、４日またはそれ以上、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間またはそれ以上の間、標的ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現が減少するように本明細書において取り上げられる組成物を哺乳類に投与する工程を含む。
【０３１０】
好ましくは、本明細書において取り上げられる方法および組成物に有用なｉＲＮＡは標的ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子、またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の（一次、またはプロセッシングを受けた）ＲＮＡを特異的に標的とする。ｉＲＮＡを用いてこれらの遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法を、本明細書のどこかに記載されているように調製し、および、実行することができる。
【０３１１】
本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、１つより多いｉＲＮＡが哺乳類に投与され、そして、哺乳類中で１つより多い遺伝子が標的とされるように、本明細書において取り上げられる方法および組成物は１つより多いｉＲＮＡを含む。例えば、ＣＯＬ１Ａ１  ｉＲＮＡとＴＧＦβ  ｉＲＮＡの組合せ、ＣＯＬ１Ａ１  ｉＲＮＡとＳＭＡＤ２／３  ｉＲＮＡの組合せ、またはＣＯＬ１Ａ１  ｉＲＮＡ、ＴＧＦβ  ｉＲＮＡおよびＳＭＡＤ２／３  ｉＲＮＡの組合せ。
【０３１２】
したがって、本明細書において記載される態様のいくつかの実施形態では、本明細書において記載される方法および組成物は、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子およびＴＧＦβ遺伝子を標的とするｉＲＮＡを含む。これらの方法では、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子およびＴＧＦβ遺伝子の両方の発現が阻害される。別の実施形態では、本明細書において記載される方法および組成物は、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子およびＳＭＡＤ２／３遺伝子を標的とするｉＲＮＡを含む。これらの方法では、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子およびＳＭＡＤ２／３遺伝子の両方の発現が阻害される。さらに別の実施形態では、本明細書において記載される方法および組成物は、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子およびＳＭＡＤ２／３遺伝子を標的とするｉＲＮＡを含む。これらの方法では、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＳＭＡＤ２／３遺伝子およびＴＧＦβ遺伝子の全て３つの発現が阻害される。
【０３１３】
本明細書において記載される態様の１つの実施形態では、前記方法は、治療される予定の哺乳類のＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子またはＳＭＡＤ２／３遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含むｉＲＮＡを含有する組成物を投与する工程を含む。治療される予定の生物がヒトなどの哺乳類であるとき、経口経路、腹腔内経路、または、頭蓋内投与（例えば、脳室内投与、実質内投与および髄腔内投与）、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経気道（エアロゾル投与）、経鼻投与、経直腸投与、および局所（バッカル投与および舌下投与を含む）投与を含む非経口経路を包含するがこれらに限定されない当技術分野において公知のどんな手段によっても前記組成物を投与することができる。ある実施形態では、静脈内点滴または注入により前記組成物が投与される。
【０３１４】
ＶＩＩ．  ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の過剰発現を特徴とする肝疾患および肝線維症の治療法
本発明の態様および実施形態は、特に、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現を標的とするｉＲＮＡとＣＯＬ１Ａ１介在性肝線維症の治療用の少なくとも１つのｉＲＮＡを含有する組成物の使用に関連する。本発明の実施形態はまた、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現を促進する伝達経路中の分子、例えば、ＴＦＧβおよびＳＭＡＤ２／３を標的とするｉＲＮＡの使用に関連する。例えば、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡを含有する組成物を肝線維症の治療および／もしくは予防のために使用し、または、ＴＧＦβ遺伝子および／もしくはＳＭＡＤ２／３遺伝子を標的とするｉＲＮＡを含有する組成物を肝線維症の治療および／もしくは予防のために使用する。
【０３１５】
１つの実施形態では、そのような治療を必要とする対象で肝線維症を治療する、および／または、予防する方法であって、治療上有効量のＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子またはＳＭＡＤ２／３遺伝子を標的とするｉＲＮＡをその対象に投与する工程を含む方法が本明細書において提供される。
【０３１６】
１つの実施形態では、肝線維症を治療する、および／または、予防する方法は、（ａ）哺乳類の細胞内のＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子またはＳＭＡＤ２／３遺伝子を標的とするｉＲＮＡを含む組成物を対象に投与する工程、および（ｂ）工程（ａ）の対象を、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子またはＳＭＡＤ２／３遺伝子それぞれのｍＲＮＡ転写物が分解されるのに十分な時間にわたり維持し、それによって前記細胞内のＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現を阻害する、または、低減させる工程を含む。ｉＲＮＡがＴＧＦβ遺伝子および／またはＳＭＡＤ２／３遺伝子の発現を標的とする実施形態では、細胞を刺激してＣＯＬ１Ａ１を過剰発現させるＴＧＦβからのシグナル伝達を低減させることにより、細胞でのＣＯＬ１Ａ１の発現を間接的に減少させる。ＣＯＬ１Ａ１の発現の減少はＣＯＬ１Ａ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解によるものではない。遺伝子発現の減少は当技術分野において公知のどんな方法によっても、および、本明細書において記載される方法、例えば、定量ＲＴ−ＰＣＲによって評価され得る。１つの実施形態では、吸引肝臓生検試料は、標的遺伝子の発現の減少をモニターするための組織材料として働く。
【０３１７】
１つの実施形態では、肝線維症は、ウイルスまたは他の感染症、自己免疫疾患、胆管閉塞、代謝性疾患、過度の飲酒、原発性胆汁性肝硬変、ＮＡＳＨ、化学物質への曝露または癌の結果である。他の実施形態では、肝線維症は本明細書において記載される他の示されたことの結果である。
【０３１８】
１つの実施形態では、１つより多いｄｓＲＮＡが対象に投与され、そして、その結果として、１つより多い遺伝子が標的とされる。例えば、ＣＯＬ１Ａ１  ｉＲＮＡとＴＧＦβ  ｉＲＮＡの組合せ、ＣＯＬ１Ａ１  ｉＲＮＡとＳＭＡＤ２／３  ｉＲＮＡの組合せ、またはＣＯＬ１Ａ１  ｉＲＮＡ、ＴＧＦβ  ｉＲＮＡおよびＳＭＡＤ２／３  ｉＲＮＡの組合せ。
【０３１９】
１つの実施形態では、本明細書において記載される肝線維症を治療する、および／または、予防する方法はＣＯＬ１Ａ１遺伝子およびＴＧＦβ遺伝子を標的とするｉＲＮＡを含む。この実施形態では、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子とＴＧＦβ遺伝子の両方の発現が阻害される。別の実施形態では、本明細書において記載される肝線維症を治療する、および／または、予防する方法はＣＯＬ１Ａ１遺伝子およびＳＭＡＤ２／３遺伝子を標的とするｉＲＮＡを含む。この実施形態では、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子とＳＭＡＤ２／３遺伝子の両方の発現が阻害される。さらに別の実施形態では、本明細書において記載される肝線維症を治療する、および／または、予防する方法はＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子およびＳＭＡＤ２／３遺伝子を標的とするｉＲＮＡを含む。この実施形態では、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＳＭＡＤ２／３遺伝子およびＴＧＦβ遺伝子の全て３つの発現が阻害される。
【０３２０】
１つの実施形態では、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＴＧＦβ遺伝子およびＳＭＡＤ２／３遺伝子を標的とするｉＲＮＡが投与される。
【０３２１】
１つの実施形態では、対象の体重に対して０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの濃度でｉＲＮＡが投与される。
【０３２２】
１つの実施形態では、前記方法は、例えば、慢性肝疾患または肝線維症の治療および／または予防のために、他の医薬および／または他の治療法と組み合わせて、例えば、公知の医薬および／または公知の治療法、例えば、慢性肝疾患または肝線維症の遠因の治療に現在用いられているものと共にｉＲＮＡまたはその医薬組成物を用いることにさらに関連する。例えば、生物学的化学療法および放射線治療などの１つ以上のその他の抗肝癌治療と併せてｉＲＮＡまたはその医薬組成物を投与することもできる。したがって、治療には、例えば、化学療法（例えば、クロラムブチル、プレドニゾン、プレドニゾロン、ビンクリスチン、シタラビン、クロファラビン、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、デシタビン、ＭＤＲ１阻害剤）、リツキシマブ、インターフェロン−α、アントラサイクリン系薬品（ダウノルビシンまたはイダルビシンなど）、Ｌ−アスパラギナーゼ、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ブレオマイシン、フルダラビン、エトポシド、ペントスタチンまたはクラドリビン）、骨髄移植、幹細胞移植、抗代謝物薬品（メトトレキサートおよび６‐メルカプトプリン）またはそれらの任意の組合せが含まれ得る。
【０３２３】
化学療法は癌細胞を破壊することができる薬品を用いる癌の治療である。現在の使用法では、用語「化学療法」は、標的型治療法と対照的に、急速に分裂する細胞に全般的に影響する細胞毒性薬品を通常意味する。化学療法薬品は可能な様々な方法で細胞分裂を妨害し、例えば、ＤＮＡの複製または新しく形成された染色体の分配を妨害する。正常な細胞は全般的にＤＮＡ損傷を修復できるが、多くの癌細胞がＤＮＡ損傷を修復できないことからある程度の特異性が生じる可能性があるが、化学療法の大半の種類は全ての急速に分裂する細胞を標的とし、そして、癌細胞に特異的ではない。大半の化学療法計画は組合せて施される。例示的な化学療法剤には、５−ＦＵ増強剤、９−ＡＣ、ＡＧ２０３７、ＡＧ３３４０、アグリカナーゼ阻害剤、アミノグルテチミド、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アスパラギナーゼ、アザシチジン、バチマスタット（ＢＢ９４）、ＢＡＹ１２−９５６６、ＢＣＨ−４５５６、ビス−ナフタルイミド、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスタイン（Ｃａｒｍｕｓｔａｉｎｅ）＋ポリフェプロザン、ｃｄｋ４／ｃｄｋ２阻害剤、クロラムブシル、ＣＩ−９９４、シスプラチン、クラドリビン、ＣＳ−６８２、シタラビンＨＣｌ、Ｄ２１６３、Ｄアクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、ＤｅｐｏＣｙｔ、デキシフォサミド（Ｄｅｘｉｆｏｓａｍｉｄｅ）、ドセタキセル、ドラスタイン（Ｄｏｌａｓｔａｉｎ）、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、ＤＸ８９５１ｆ、Ｅ７０７０、ＥＧＦＲ、エピルビシン、エリスロポエチン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エトポシド（ＶＰ１６−２１３）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＦＫ３１７、フラボピリドール、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、フラジリン（Ｆｒａｇｙｌｉｎｅ）、ゲムシタビン、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、ヒドロキシウレア（ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターロイキン−２、イリノテカン、ＩＳＩ６４１、クレスチン、レモナールＤＰ２２０２、ロイプロリド酢酸（ＬＨＲＨ放出因子類似体）、レバミゾール、ＬｉＧＬＡ（γ−リノレン酸リチウム）、ロジンシーズ、ロメテキソール（Ｌｏｍｅｔｅｘｏｌ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、マリミスタット（Ｍａｒｉｍｉｓｔａｔ）、メクロレタミンＨＣｌ（ナイトロジェンマスタード）、メゲストロール酢酸、メグラミン（Ｍｅｇｌａｍｉｎｅ）ＧＬＡ、メルカプトプリン、メスナ、ミトグアゾン（メチル−ＧＡＧ、メチルグリオキサールビス−グアニルヒドラゾン、ＭＧＢＧ）、ミトタン（ｏ．ｐ'−ＤＤＤ）、ミトキサントロン、ミトキサントロンＨＣｌ、ＭＭＩ２７０、ＭＭＰ、ＭＴＡ／ＬＹ２３１５１４、オクトレオチド、ＯＤＮ６９８、ＯＫ−４３２、経口プラチナ、経口タキソイド、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ．ＲＴＭ．）、ＰＡＲＰ阻害剤、ＰＤ１８３８０５、ペントスタチン（２'デオキシコホルマイシン）、ＰＫＣ４１２、プリカマイシン、プロカルバジンＨＣｌ、ＰＳＣ８３３、ラリトレキセド（Ｒａｌｉｔｒｅｘｅｄ）、ＲＡＳファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＲＡＳガン遺伝子阻害���、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン、スラミン、クエン酸タモキシフェン、タキサン類似体、テモゾロミド、テニポシド（ＶＭ−２６）、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、チロシンキナーゼ、ＵＦＴ（テガフール／ウラシル）、バルルビシン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンデシン、ＶＸ−７１０、ＶＸ−８５３、ＹＭ１１６、ＺＤ０１０１、ＺＤ０４７３／Ａｎｏｒｍｅｄ、ＺＤ１８３９、ＺＤ９３３１が含まれるが、これらに限定されない。
【０３２４】
肝線維症の治療または肝線維症の緩和の有効性は、例えば、肝線維症マーカーα−２−マクログロブリン（ａ−ＭＡ）、トランスフェリン、アポリポプロテインＡ１、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ラミニン、Ｎ−末端プロコラーゲンＩＩＩ（ＰＩＩＩＮＰ）、７ＳコラーゲンＩＶ（７Ｓ−ＩＶ）、全ビリルビン、間接ビリルビン、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ＡＳＴ／ＡＬＴ、ｇ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アルブミン、アルブミン／グロブリン、血液尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（Ｃｒ）、トリグリセリド、コレステロール、高密度リポプロテインおよび低密度リポプロテインの定期的なモニターおよび肝臓吸引生検により評価され得る。治療の前（初期測定値）、および、その後、治療計画中（後期測定値）に肝線維症マーカーを測定することができ、および／または、肝臓吸引生検を実行することができる。後期測定値の初期測定値との比較により、医師にその治療が有効であるかどうかの指標が提供される。そのようなパラメータのうちのいずれか１つ、または、パラメータの任意の組合せを測定することにより治療または予防の有効性をモニターすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。ＣＯＬ１Ａ１を標的とするｉＲＮＡまたはその医薬組成物の投与との関連では、肝線維症症状「に対して効果的である」とは、臨床的に適切な方法での投与が患者のうちの少なくとも統計的に有意な部分に、症状の改善、回復、疾患の負荷の減少、腫瘍体積または腫瘍細胞数の減少、寿命の延長、生活の質の改善などの有益な効果、または、肝線維症および関連する病因の治療に詳しい医師によって良いものとして一般に認められる他の効果をもたらすということを指す。
【０３２５】
肝線維症状態の１つ以上のパラメータマーカーに統計的に有意な改善が存在するとき、または、そうでなければ予期されるであろう症状の悪化または発生が起こらなかったことにより、治療効果または予防効果は明白である。例として、測定可能な疾患パラメータでの少なくとも１０％の望ましい変化、および好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上の望ましい変化が有効な治療の指標であり得る。例えば、血清中の肝臓酵素活性のレベルの低下または血清アルブミンの増加がアルブミンを合成する肝臓の能力の改善を示す。当技術分野において公知であるような肝線維症の実験動物モデル、例えば、本明細書において記載されるマウスモデルを用いて所与のｉＲＮＡ薬品またはその薬品の製剤の有効性を判定することもできる。実験動物モデルを用いるとき、マーカー、症状、または組織学的に検討される細胞外コラーゲンに統計的に有意な低減が観察されると、治療の有効性が証明される。
【０３２６】
ウイルスと寄生生物による感染症が炎症と肝線維症の原因となる可能性がある。いくつかの例は、ヘパドナウイルス科（Ａ型およびＢ型肝炎ウイルス）、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルスおよび未分類のウイルス（例えば、海綿状脳症の病因因子、（Ｂ型肝炎ウイルスの不完全付随体であると考えられている）デルタ肝炎の因子、非Ａ型非Ｂ型肝炎の因子（経腸的に伝播する＝クラス１、非経口的に伝播する＝クラス２（すなわち、Ｃ型肝炎）、ノルウォークウイルスおよび関連ウイルス、ならびにアストロウイルス）である。例示的な寄生生物には、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属の種）（熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．  ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐ．  ｏｖａｌｅ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ．  ｖｉｖａｘ））、線虫トリヒナ（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）、吸虫肝臓ジストマ（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ）、ビルハルツ住血吸虫（Ｓ．  ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ）および日本住血吸虫（Ｓ．  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）およびそれらの任意の組合せが含まれるがこれらに限定されない。
【０３２７】
他の実施形態では、抗ウイルス医薬または抗ウイルス薬剤と組み合わせてＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβおよび／またはＳＭＡＤ２／３を標的とするｉＲＮＡの投与が実行される。本明細書において記載される方法に有用な抗ウイルス薬剤の例には、免疫グロブリン、アマンタジン、インターフェロン、ヌクレオシド類似体およびプロテアーゼ阻害剤が含まれるがこれらに限定されない。抗ウイルス薬剤の具体的な例には、アセマンナン、アシクロビル、アシクロビルナトリウム、アデフォビル、アロブジン、アルビルセプトスドトックス、塩酸アマンタジン、アラノチン、アリルドン、メシル酸アテビルジン、アブリジン、シドフォビル、シパムフィリン、塩酸シタラビン、メシル酸デラビルジン、デスシクロビル、ジダノシン、ジソキサリル、エドクスジン、エンビラデン、エンビロキシム、ファムシクロビル、塩酸ファモチン、フィアシタビン、フィアルリジン、ホサリラート、ホスカメットナトリウム、ホスホネットナトリウム、ガンシクロビル、ガンシクロビルナトリウム、イドキシウリジン、ケトキサール、ラミブジン、ロブカビル、塩酸メモチン、メチサゾン、ネビラピン、ペンシクロビル、ピロダビル、リバビリン、塩酸リマンタジン、メシル酸サクイナビル、塩酸ソマンタジン、ソリブジン、スタトロン、スタブジン、塩酸チロロン、トリフルリジン、塩酸バラシクロビル、ビダラビン、リン酸ビダラビン、リン酸ビダラビンナトリウム、ビロキシム、ザルシタビン、ジドブジンおよびジンビロキシムが含まれるが、これらに限定されない。
【０３２８】
さらなる実施形態では、ＣＯＬ１Ａ、ＴＧＦβおよび／またはＳＭＡＤ２／３を標的とするｉＲＮＡの投与が抗寄生生物医薬または抗寄生生物薬剤と組み合わせて施される。「抗寄生生物医薬」は、感染性生物を殺すかその成長または機能を抑制する薬剤を意味する。殺寄生生物剤とも称される抗寄生生物医薬の本明細書において記載される方法に有用な例には、アルベンダゾール、アムホテリシンＢ、ベンズニダゾール、ビチオノール、塩酸クロロキン、リン酸クロロキン、クリンダマイシン、デヒドロエメチン、ジエチルカルバマジン、ジロキサニドフロエート、ドキシサイクリン、エフロミチン（ｅｆｌｏｍｉｔｈｉｎｅ）、フラゾリダオン（ｆｕｒａｚｏｌｉｄａｏｎｅ）、グルココルチコイド類、ハロファントリン、ヨードキノール、イベルメクチン、メベンダゾール、メフロキン、アンチモン酸メグルミン、メラルソプロール、メトリフォネート、メトロニダゾール、ニクロサミド、ニフルチモクス、オキサムニキン、パロモマイシン、イセチオン酸ペンタミジン、ピペラジン、プランジカンテル、リン酸プリマキン、プログアニル、パモ酸ピランテル、ピリメタンミン−スルホンアミド、ピリメタンミン−スルファドキシン、キナクリンＨＣｌ、硫酸キニン、グルコン酸キニジン、スピラマイシン、スチボグルコン酸ナトリウム（グルコン酸ナトリウムアンチモン）、スラミン、テトラサイクリン、チアベンダゾール、チミダゾール（ｔｉｍｉｄａｚｏｌｅ）、トリメトプリム−スルファメトキサゾールおよびトリパルサミドが含まれるが、これらに限定されず、これらのうちのいくつかは単体で使用される、または、他と組み合わせて使用される。
【０３２９】
同じ組成物中にｉＲＮＡと追加の治療薬を組み合わせて、例えば、非経口的に投与することができ、または、追加の治療薬を別個の組成物の部分として、もしくは、本明細書において記載される別の方法により投与することができる。
【０３３０】
１つの実施形態では、肝疾患または肝線維症の遠因、例えば、ウイルスまたは他の感染症、自己免疫疾患、胆管閉塞、代謝性疾患、過度の飲酒、原発性胆汁性肝硬変、ＮＡＳＨ、化学物質への曝露および肝臓癌を治療すると知られている薬剤などの非ｉＲＮＡ治療薬と共にｉＲＮＡを投与する。非ｉＲＮＡ治療薬のいくつかの例が表２に示されている。別の実施形態では、本明細書において記載される特徴とされるｉＲＮＡ、例えば、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβおよび／またはＳＭＡＤ２／３を標的とするｄｓＲＮＡは抗Ｃ型肝炎ウイルス薬剤などの非ｉＲＮＡ治療薬と共に投与される。例えば、Ｃ型肝炎ウイルスの感染症の治療のためにインターフェロンαと共に本明細書において取り上げられるｉＲＮＡを投与することができる。
【０３３１】
１つの実施形態では、ｉＲＮＡはＣＯＬ１Ａ１  ｉＲＮＡであり、そして、肝臓で細胞外にコラーゲンを過剰に沈着させることになる伝達経路に関与する第２の遺伝子を標的とする第２のｉＲＮＡと組み合わせてそのｉＲＮＡを投与する。例えば、その第２の遺伝子はＴＧＦβ、ＳＭＡＤ２またはＳＭＡＤ３をコードする遺伝子であり得る。
【０３３２】
１つの実施形態では、ｉＲＮＡはＣＯＬ１Ａ１  ｉＲＮＡ、ＴＧＦβ  ｉＲＮＡまたはＳＭＡＤ２／３  ｉＲＮＡであり、活性化ＨＳＣにより産生されるプロコラーゲンの成熟に関与する第２の遺伝子であるコラーゲン特異的シャペロンのＨＳＰ４７を標的とする第２のｉＲＮＡと組み合わせてそのｉＲＮＡを投与する。
【０３３３】
患者に０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇまたは２．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡなどの治療用量のｉＲＮＡを投与することができる。ある期間の時間、例えば、５分、１０分、１５分、２０分または２５分の期間にわたってｉＲＮＡを静脈内点滴により投与することができる。例えば、定期的に、例えば１か月、２か月、３か月、４か月またはそれ以上の間に隔週で（すなわち、二週間ごとに）投与を繰り返す。最初の治療計画の後、より低い頻度で治療をほどこすことができる。例えば、３か月の間に隔週で投与した後に、６か月間、または、１年間またはそれ以上の間、１か月に１回投与を繰り返すことができる。ｉＲＮＡの投与により、ＣＯＬ１Ａ１のレベルが、例えば、患者の細胞、組織、例えば、肝臓組織または他の区画において少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％またはそれ以上減少することができる。
【０３３４】
完全用量のｉＲＮＡを投与する前に、輸液反応を起こす用量の５％用量などのより少ない用量を患者に投与し、アレルギー反応などの悪性効果、または、脂質レベルもしくは血圧の上昇について患者をモニターすることができる。別の例では、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−α）レベルの上昇などの望まない免疫刺激性効果について患者をモニターすることができる。
【０３３５】
ＣＯＬ１Ａ１の発現への阻害的効果のため、本発明による組成物またはそれより調製された医薬組成物は、不可逆的な肝臓損傷が防がれ得るという点で、生活の質を向上させることができ、そして、生存時間を延長させることができる。 
【０３３６】
他に定義されていない限り、本明細書において使用されている全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により共通して理解されるものと同じ意味を持つ。本発明において取り上げられるｉＲＮＡと方法の実施または試験に、本明細書において記載されるものと類似または同等の方法および材料を用いることができるが、適切な方法と材料が以下に記載される。本明細書において言及される全ての特許公開、特許申請、特許、および他の参照文献の全体を参照して本明細書に組み入れる。矛盾がある場合は、定義を含み本明細書が優先する。さらに、材料、方法および実施例は例示だけを目的とし、限定を意図するものではない。
【実施例】
【０３３７】
実施例１：干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）合成
試薬の供給元
本明細書において試薬の供給元が具体的に教示されていない場合、分子生物学での適用に標準的な品質／純度の分子生物学用試薬の任意の供給会社からそのような試薬を得ることができる。
【０３３８】
オリゴヌクレオチド合成
申請者らは、本明細書において記載されるｉＲＮＡ分子を生成するためにいくつかの異なる方法を用いている。本実施例は、使用している１つの方法を記述するものである。当業者は、本明細書において記載されるようなｉＲＮＡを調製するために当技術分野において公知の任意の方法を用いることができる。
【０３３９】
ＡＫＴＡオリゴパイロットシンセサイザー上でオリゴヌクレオチドを合成する。市販されている多孔質ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）固形支持体（ｄＴ−ＣＰＧ、５００Å、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）および標準的な保護基を有するＲＮＡホスホラミダイトである５'−Ｏ−ジメトキシトリチルＮ６−ベンゾイル−２'−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２'−ｔ−ブチルジメチルシリル−シチジン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−−イソブトリル−２'−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイトおよび５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−２'−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共にオリゴヌクレオチド合成のために使用した。（Ｐｒｏｍｅｇａ）から２'−Ｆホスホラミダイト、５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２'−フルオロ−シチジン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホラミダイトおよび５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−２'−フルオロ−ウリジン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホラミダイトを購入している。グアノシンを除く全てのホスホラミダイトをアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中に０．２Ｍの濃度で使用し、１０％ＴＨＦ／ＡＮＣ（体積／体積）中に０．２Ｍの濃度でグアノシンを使用する。１６分のカップリング／リサイクル時間を用いる。活性化剤は５−エチルチオテトラゾール（０．７５Ｍ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）であり、ＰＯ−酸化にはヨウ素／水／ピリジンを使用し、ＰＳ−酸化には２，６−ルチジン／ＡＣＮ（１：１  体積／体積）中のＰＡＤＳ（２％）を使用する。
【０３４０】
３'−リガンド複合体化鎖を、対応するリガンドを含有する固形支持体を使用して合成する。例えば、ヒドロキシプロリノール−コレステロールホスホラミダイトから配列中へのコレステロール単位の導入を実行する。６−アミノヘキサン酸エステル結合を介してコレステロールをｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリノールに連結してヒドロキシプロリノール−コレステロール部分を得る。５'末端をＣｙ−３およびＣｙ−５．５（蛍光団）で標識したｉＲＮＡを、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社より購入する対応するＱｕａｓａｒ−５７０（Ｃｙ−３）ホスホラミダイトから合成する。保護化リガンド−ホスホラミダイト構成単位を適切に使用することにより５'末端および／または内部位置へのリガンドの複合体化を達成する。５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール活性化剤の存在下での固形支持体結合オリゴヌクレオチドへの無水ＣＨ３ＣＮ中の０．１Ｍホスホラミダイト溶液の１５分に延長したカップリング。（１）で報告されるような標準的なヨウ素‐水法を用いて、または、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド／アセトニトリル／水（１０：８７：３）での処理によりヌクレオチド間亜リン酸エステルのリン酸エステルへの酸化を行い、１０分の酸化待機時間がオリゴヌクレオチドを複合体化する。ＤＤＴＴ（ＡＭ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓより購入）、ＰＡＤＳおよび／またはＢｅａｕｃａｇｅ試薬などのイオウ転移試薬を用いることにより亜リン酸エステルをチオリン酸エステルへ酸化してチオリン酸エステルを導入する。コレステロールホスホラミダイトを自作で合成し、ジクロロメタン中に０．１Ｍの濃度で使用する。コレステロールホスホラミダイト用のカップリング時間は１６分である。
【０３４１】
脱保護Ｉ（ヌクレオ塩基脱保護）
合成の完了後、１００ｍＬのガラスボトル（ＶＷＲ）に前記支持体を移す。８０ｍＬのエタノールアンモニア混合液［アンモニア：エタノール（３：１）］を５５℃で６．５時間用いて塩基とリン酸エステル基を同時脱保護することにより、オリゴヌクレオチドを支持体から切り離す。ボトルを氷上で一時的に冷却し、次に前記エタノールアンモニア混合液を濾過して新しい２５０ｍＬのボトルに移す。１部４０ｍＬのエタノール／水（１：１  体積／体積）で２回、前記多孔質ガラス（ＣＰＧ）を洗浄する。前記混合液の体積を次にロータリーエバポレーターにより約３０ｍＬに減少させる。次に、前記混合液をドライアイス上で凍結し、真空乾燥機を用いて真空で乾燥させる。
【０３４２】
脱保護ＩＩ（２'−ＴＢＤＭＳ基の除去）
２６ｍＬのトリエチルアミン、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（ＴＥＡ・３ＨＦ）またはピリジン−ＨＦおよびＤＭＳＯ（３：４：６）に前記乾燥残留物を再懸濁し、２'位のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を取り除くために６０℃で９０分間加熱する。次に、５０ｍＬの２０ｍＭ酢酸ナトリウムを用いて反応を抑制し、ｐＨを６．５に調整する。精製までオリゴヌクレオチドを冷凍庫に貯蔵する。
【０３４３】
分析
精製の前に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりオリゴヌクレオチドを分析する。緩衝液とカラムの選択は、配列および／または複合体化されたリガンドの性質に依る。
【０３４４】
ＨＰＬＣ精製
逆相分取ＨＰＬＣによりリガンド複合体化オリゴヌクレオチドを精製する。自分で充填したＴＳＫゲルカラムでの陰イオン交換ＨＰＬＣにより複合体化しなかったオリゴヌクレオチドを精製する。緩衝液は、１０％ＣＨ３ＣＮ中の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）（緩衝液Ａ）と１０％ＣＨ３ＣＮ、１Ｍ  ＮａＢｒ中の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）である。全長のオリゴヌクレオチドを含む画分をプールし、脱塩し、そして、凍結乾燥する。およそ０．１５の分光密度（ＯＤ）の脱塩化オリゴヌクレオチドを１５０μＬまで水に希釈し、次に、ＣＧＥおよびＬＣ／ＭＳ分析のための特別なバイアルにピペットで分注する。次に化合物をＬＣ−ＥＳＭＳとＣＧＥにより分析する。
【０３４５】
ｉＲＮＡ調製
ｉＲＮＡの一般的な調製には、１ｘＰＢＳ中で等モル量のセンス鎖とアンチセンス鎖を９５℃で５分間加熱し、そして、室温までゆっくりと冷やす。二重鎖が完全体であることをＨＰＬＣ分析により確認する。
【０３４６】
標準的な命名法を用いて核酸配列を以下に表記し、表１の略語を特に以下に表す。
【０３４７】
（表１）核酸配列表記に用いられるヌクレオチドモノマーの略語。オリゴヌクレオチド内にこれらのモノマーが存在するとき、それらは相互に５'−３'ホスホジエステル結合により結合していると理解されるであろう。
2019150075.tif 000021
【０３４８】
実施例２：ＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβ、ＳＭＡＤ２／３  ｓｉＲＮＡの設計および合成
転写物
ヒトコラーゲン１Ａ１分子（ＣＯＬ１Ａ１）、ヒトトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ）、ＳＭＡＤファミリーメンバー２および３をコードする遺伝子、ならびにマウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）およびラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）由来のオルソロガスな配列を標的とするｓｉＲＮＡを特定するためにオリゴヌクレオチドの設計を行った。その設計の過程でヒトＣＯＬ１Ａ１  ｍＲＮＡ  ＮＭ＿００００８８．３（配列番号１７２）、マウスＣＯＬ１Ａ１  ｍＲＮＡ  ＮＭ＿００７７４２．３（配列番号１７３）、ヒトＴＧＦβ  ｍＲＮＡ  ＮＭ＿０００６６０．４（配列番号１７４）、マウスＴＧＦβ  ｍＲＮＡ  ＮＭ＿０１１５７７．１（配列番号１７５）、４つのヒトＳＭＡＤ３  ｍＲＮＡ  ＮＭ＿００１１４５１０２．１（配列番号１８０）、ＮＭ＿００１１４５１０３．１（配列番号１８１）、ＮＭ＿００１１４５１０４．１（配列番号１８２）、およびＮＭ＿００５９０２．３（配列番号１８３）、マウスＳＭＡＤ３  ｍＲＮＡ  ＮＭ＿０１６７６９．４（配列番号１８４）を用い、３つのヒトＳＭＡＤ２  ｍＲＮＡはＮＭ＿００１００３６５２．２（配列番号１７６）、ＮＭ＿００１１３５９３７．１（配列番号１７７）、およびＮＭ＿００５９０１．４（配列番号１７８）であり、ならびにマウスＳＭＡＤ２ｍＲＮＡはＮＭ＿０１０７５４．４である。ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｓｅｑコレクションから全ての配列を得た。
【０３４９】
２セットのオリゴを設計した。ヒトＣＯＬ１Ａ１に１００％同一であるがマウスまたはラットでは１００％未満同一であるヒト特異的オリゴセット、および、ヒト、非ヒト霊長類、マウスのＣＯＬ１Ａ１転写物および両方のラットＣＯＬ１Ａ１転写物に１００％同一である第２ｓｉＲＮＡセット。マウスＳＭＡＤ２（ＮＭ＿０１０７５４）とマウスＳＭＡＤ３（ＮＭ＿０１６７６９）に対して１００％の同一性を有するオリゴのセットを設計した。ＴＧＦβについては、ヒト配列とマウス配列に対して１００％の同一性を有するオリゴのセットを設計した。
【０３５０】
ｓｉＲＮＡの設計と特異性予測
１９塩基長のオリゴセットの特異性を各配列から予測した。ＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβおよびＳＭＡＤ２／３のｓｉＲＮＡを、それらそれぞれのヒト、またはマウスおよびラットの（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｓｅｑセット内でＮＭ＿ｒｅｃｏｒｄおよびＸＭ＿ｒｅｃｏｒｄとして定義される）トランスクリプトームに対するＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いる包括的な検索に使用した。次に、アラインメントをパースし、そして、ｓｉＲＮＡと任意の潜在的な「オフターゲット」転写物の間のミスマッチの位置と数に基づいてスコアを生成するために「ｏｆｆｔａｒｇｅｔＦａｓｔａ．ｐｙ」という名称のＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用した。ｓｉＲＮＡの「シード」領域での、その分子の５'末端から２〜９の位置での差異を強調するために、オフターゲットスコアに荷重がかけてある。次のようにオフターゲットスコアを計算する。オリゴと転写物の間のミスマッチにペナルティーが与えられる。オリゴの位置２〜９中のシード領域での１つのミスマッチに２．８のペナルティーが与えられ、推定上の切断部位１０および１１でのミスマッチに１．２のペナルティーが与えられ、および、他の全てのミスマッチに１のペナルティーが与えられる。次に、ミスマッチペナルティーを合計して各オリゴ‐転写物対についてのオフターゲットスコアを計算する。次に、全てのオリゴ‐転写物対由来の最小のオフターゲットスコアを決定し、そして、その後のオリゴの分別に用いる。計算されたスコアに従って、特異性でｓｉＲＮＡの両鎖を分類した。３より高いスコアは非常に特異的であるとみなされ、３に等しいスコアは特異的であるとみなされ、そして、２．２と２．８の間のスコアは適度に特異的であるとみなされる。どのオリゴを合成するか選択するときに、我々はアンチセンス鎖のオフターゲットスコアによって高いものから低いものまで分類し、そして、最も良い（オフターゲットスコアが最も低い）オリゴ対を選んだ。
【０３５１】
ＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβおよびＳＭＡＤ２／３のＲＮＡ配列の合成
ＭｅｒＭａｄｅ１９２シンセサイザーでＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβおよびＳＭＡＤ２／３のｉＲＮＡ配列を１μｍｏｌの規模で合成した。
【０３５２】
以下に詳述するように、配列表中の全ての配列について「エンドライト」化学を適用した。
●  センス鎖中の全てのピリミジン類（シトシンおよびウリジン）が２'−Ｏ−メチル塩基（２'Ｏ−メチルＣおよび２'−Ｏ−メチルＵ）を含んだ。
●  アンチセンス鎖では、リボＡヌクレオシドに（５'位の方向に）隣接するピリミジン類はそれらに対応する２−Ｏ−メチルヌクレオシドで置き換えられた。
●  センス配列およびアンチセンス配列の両方の３'末端に２塩基のｄＴｓｄＴ伸長部が導入された。
●  ＭｅｒＭａｄｅ１９２合成ソフトウェアでのローディングに適合するように配列ファイルをテキストファイルに変換した。
【０３５３】
合成、切断および脱保護
ホスホラミダイト化学を用いる固形物支持型オリゴヌクレオチド合成をＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβおよびＳＭＡＤ２／３のＲＮＡ配列の合成に用いた。
【０３５４】
９６ウェルプレート中で上記の配列の合成を１ｕｍの規模で実行した。０．１Ｍの濃度で前記アミダイト溶液を調製し、そして、（アセトニトリル中に０．６Ｍの濃度の）エチルチオテトラゾールを活性化剤として用いた。
【０３５５】
第１工程でメチルアミンを用い、そして、第２工程でフッ化物試薬を用いて合成した配列を９６ウェルプレート中で切断し、そして、脱保護化した。アセトン：エタノール（８０：２０）混合液を用いて粗製の配列を沈殿させ、そして、０．０２Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液中に沈殿物を再懸濁した。各配列の試料をＬＣ−ＭＳで分析して同一性を確認し、紫外線で分析して定量し、そして、選択した試料セットをイオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィーにより分析して純度を測定した。
【０３５６】
精製および脱塩
Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑカラムを使用するＡＫＴＡエクスプローラー精製システムでＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβおよびＳＭＡＤ２／３のＲＮＡ配列を精製した。精製中にカラム温度を６５℃に維持した。９６ウェル（１．８ｍＬのディープウェル）プレートにおいて試料注入および回収を実行した。全長の配列に相当する１つのピークを溶離液中に回収した。ＡＫＴＡピューリファイアーを使用してＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムで精製された配列を脱塩した。脱塩したＣＯＬ１Ａ１配列、ＴＧＦβ配列およびＳＭＡＤ２／３配列を（Ａ２６０での紫外線測定により）濃度および（イオン交換ＨＰＬＣにより）純度について分析した。次に、一本鎖をアニーリングさせた。
【０３５７】
実施例３：ＮＩＨ３Ｔ３細胞でのＣＯＬ１Ａ１  ｓｉＲＮＡのインビトロスクリーニング
細胞培養および形質移入
トリプシン処理によりプレートから剥がす前に、５％のＣＯ２濃度の大気中、３７℃、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標））でＮＩＨ３Ｔ３細胞を集密近くまで増殖させた。９６ウェルプレートに１ウェルあたり１０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと０．２μｌのリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州、カタログ番号１３７７８−１５０）と共に１ウェルあたり５μｌのｓｉＲＮＡ二重鎖に５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭを加えてリバーストランスフェクションを実行し、室温で１５分間保温した。前記形質移入ミックスに細胞を加え、そして、ＲＮＡ精製の前に２４時間培養した。複数のＣＯＬ１Ａ１二重鎖の各々を用いる単一用量スクリーンについて、１０ｎＭの最終二重鎖濃度で実験を実行した。１０ｎＭの単一用量スクリーンで強いサイレンシングを示す１０個の二重鎖のサブセットを、段階希釈を用いて１０ｎＭから１０ｆＭまでの濃度範囲にわたって試験して、それらのＩＣ５０を決定した。選択したＡＤ２１３４９（配列番号５３および配列番号５４）は６５ｐＭのＩＣ５０を有する。試験されたｓｉＲＮＡはげっ歯類、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）およびヒトと交差反応した（図１を参照のこと）。
【０３５８】
ＭａｇＭＡＸ−９６全ＲＮＡ単離キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｏｒｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州、製品番号：ＡＭ１８３０）を用いる全ＲＮＡ単離
細胞を回収し、そして、１４０μｌの溶解／結合溶液中に溶解し、次にＥｐｐｅｎｄｏｒｆのサーモミキサーを用いて８５０ｒｐｍで１分間混合した（その過程を通して混合速度は同じであった）。２０マイクロリッターの磁気ビーズおよび溶解／結合促進混合液を細胞溶解物に加え、そして、５分間混合した。磁気スタンドを使用して磁気ビーズを捕捉し、そして、ビーズをかき乱すことなく上清を除去した。上清を除去した後に磁気ビーズを（イソプロパノールを添加した）洗浄溶液１で洗浄し、そして、１分間混合した。再びビーズを捕捉し、そして、上清を除去した。次に、ビーズを１５０μｌの（エタノールを添加した）洗浄溶液２で洗浄し、捕捉し、そして、上清を除去した。次に５０μｌのＤＮａｓｅ混合液（ＭａｇＭａｘターボＤＮａｓｅ緩衝液およびＴｕｒｂｏ  ＤＮａｓｅ）をビーズに加え、そして、それらを１０〜１５分間混合した。混合した後に１００μｌのＲＮＡ再結合溶液を加え、そして、３分間混合した。上清を除去し、そして、磁気ビーズを１５０μｌの洗浄溶液２で再び洗浄し、そして、１分間混合し、そして、上清を完全に除去した。磁気ビーズを２分間混合して乾燥させた後にＲＮＡを５０μｌの水に溶出した。
【０３５９】
ＡＢＩ高能力ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州、カタログ番号４３６８８１３）を使用するｃＤＮＡ合成
一反応当たり２μｌの１０×緩衝液、０．８μｌの２５×ｄＮＴＰ混合物、２μｌのランダムプライマー、１μｌの逆転写酵素、１μｌのＲＮａｓｅ阻害剤および３．２μｌの水のマスターミックスを１０μｌの全ＲＮＡに加えた。ＭＪ  ＲｅｓｅａｒｃｈまたはＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｃ−１０００もしくはＳ−１０００サーマルサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）を使用して次の工程でｃＤＮＡを生成した：２５℃１０分、３７℃１２０分、８５℃５秒、４℃で保持。
【０３６０】
リアルタイムＰＣＲ
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０用３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４７２９７４００１）に１ウェルあたり合計で１０μｌの中に０．５μｌのＧＡＰＤＨ用ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３２６３１７Ｅ）、０．５μｌのＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβまたはＳＭＡＤ２／３用ＴａｑＭａｎプローブおよび５μｌのＲｏｃｈｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４８８７３０１００１）を含むマスターミックスに２μｌのｃＤＮＡを加えた。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０リアルタイムＰＣＲマシーン（Ｒｏｃｈｅ）でリアルタイムＰＣＲを行った。少なくとも２回の独立した形質移入で各二重鎖を試験した。各形質移入をｑＰＣＲで２回試験した。
【０３６１】
ΔΔＣｔ方法を用いてリアルタイムデータを解析した。ＧＡＰＤＨの発現に対して各試料を正規化し、そして、非ターゲティング二重鎖のＡＤ−１９５５で形質移入された細胞に対してノックダウンを評価した。ＸＬｆｉｔソフトウェア中の４パラメータフィットモデルを用いてＩＣ５０を明らかにした。図１に示されるように、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞中での単一用量のコラーゲン１Ａ１  ｓｉＲＮＡの効果をインビトロで検討した。ｓｉＲＮＡ  ＡＤ−２１３４９（配列番号５３および配列番号５４）はＣＯＬ１Ａ１  ｍＲＮＡの産生について約６５ｐＭのＩＣ５０を有する。
【０３６２】
実施例４：四塩化炭素（ＣＣｌ４）誘導マウス肝線維症モデル
一般的に、肝臓傷害は多くの要因、例えば、四塩化炭素（ＣＣｌ４）、ジアメチルニトロザミンおよびチオアセトアミドなどの毒性化学物質、例えば、異種血清に対するインビボでの免疫反応および住血吸虫やウイルスなどの病原体に起因する損傷、胆管線維症に至る総胆管の結紮、ならびに過度の飲酒により引き起こされ得る。エタノール飼料で飼育されたヒヒおよびラットのツカモト／フレンチモデルがアルコール性肝臓傷害動物モデルの例である。
【０３６３】
本明細書における実験マウスモデルの使用は、化学物質ＣＣｌ４で肝臓傷害が誘導されるものである。このマウスモデルはよく研究されている肝線維症の化学誘導モデルである。ＣＣｌ４処理マウスで観察される肝臓の病理変化には、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ活性の上昇と共にネクローシス、炎症および線維症が含まれる。いくつかのマイクロアレイでの研究により、肝臓での長期の線維性変化とよく相関するプロコラーゲンタイプ１Ａ（Jiang Y., et al., 2004, Toxicol. Sci., 79:404-410）などの肝臓線維形成に関与する遺伝子のＣＣｌ４誘導性上方調節が示された。第１日と第８日にミネラルオイル（ＭＯ）中に１．７５ｍｌ／ｋｇの濃度のＣＣｌ４を用いてＢａｌｂ／ｃ動物に経口強制投与が施された。ＣＣｌ４の最初の投与から２４時間後に血清中肝臓酵素レベルを測定した。第１０日または第１１日に前記動物を殺処理し、シリウスレッドで肝臓の組織像を染色して細胞外コラーゲンのレベルを測定した。
【０３６４】
ＣＣｌ４の初回投与の２４以内に２つの肝機能バイオマーカー酵素であるアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）が上昇したように、コラーゲンの発現レベルが著しく上昇した。
【０３６５】
同様に、ＣＣｌ４処理マウスの肝臓は、対照ミネラルオイル処理動物と比較して、シリウスレッド染色による細胞外コラーゲンの染色の増大を示した。
【０３６６】
実施例５：ＣＣｌ４マウスモデルでのＣＯＬ１Ａ１  ｓｉＲＮＡのインビボ試験
ＣＣｌ４マウスモデルでのＣＯＬ１Ａ１ノックダウン用ｓｉＣＯＬ１Ａ１のＡＦ０９およびＡＦ１２ベースの送達を評価するために、第１日および第８日に経口強制投与により（２回）１．７５ｍｌ／ｋｇの最終用量でＣＣｌ４を用いてＢａｌｂ／ｃ動物に肝臓傷害を誘導した。対照動物にはミネラルオイルだけが与えられた。その後、第９日にＡＦ０９およびＡＦ１２製剤化ｓｉＲＮＡを前記マウスに静脈内注入し、次に、第１１日のｓｉＲＮＡ注入後約４０時間で前記マウスを殺処理した。使用した対照ｓｉＲＮＡはｓｉＬＵＣ（ＡＤ１９５５）であった。ｓｉＣＯＬ１Ａ１（ＡＤ２１３４９）（配列番号５３および配列番号５４）とｓｉＬＵＣ（ＡＤ１９５５）の両方の投与量は３ｍｇ／ｋｇであった。Ｔａｑｍａｎ−定量ＰＣＲを用いて肝臓でのＣＯＬ１Ａ１およびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを分析した。１条件１群あたり合計で１０〜１５匹の動物を用いた。ＣＯＬ１Ａ１  ｍＲＮＡのレベルをＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルのそれに対して正規化した。
【０３６７】
図２はＣＣｌ４／ｓｉＲＮＡ処理計画を示し、そして、図３は得られた結果を要約する。ＡＦ０９およびＡＦ１２製剤化ｓｉＣＯＬ１Ａ１（ＡＤ２１３４９）（配列番号５３および配列番号５４）の両方が、対照ｓｉＬＵＣ  ｓｉＲＮＡと比較してＣＣｌ４処理マウスでＣＯＬ１Ａ１  ｍＲＮＡレベルのレベルを著しく減少させた。さらに、３ｍｇ／ＫｇではＡＦ１２−２１３４９（配列番号５３および配列番号５４）を用いるＣＯＬ１Ａ１ノックダウンがＡＦ０９−２１３４９よりも優れていた。
【０３６８】
ＣＣｌ４処理マウスモデルでのＡＦ１２ベースの送達によるｓｉＣＯＬ１Ａ１の用量反応を評価するために、第１日および第８日に経口強制投与により（２回）１．７５ｍｌ／ｋｇの最終用量でＣＣｌ４を用いてＢａｌｂ／ｃ動物に肝臓傷害を誘導した。対照動物にはミネラルオイルだけが与えられた。第９日にＡＦ１２製剤化ｓｉＲＮＡを様々な投与量で前記マウスに静脈内注入し、次に、第１１日のｓｉＲＮＡ注入後約４０時間で前記マウスを殺処理した。使用した対照ｓｉＲＮＡはＡＦ１２＿ＬＵＣ（ＡＤ１９５５）であった。ＡＦ１２＿ＣＯＬ１Ａ１（ＡＤ２１３４９）（配列番号５３および配列番号５４）とｓｉＬＵＣ（ＡＤ１９５５）の両方の投与量は、０．１ｍｇ／ｋｇから３ｍｇ／ｋｇまでの範囲であった。Ｔａｑｍａｎ−定量ＰＣＲを用いて肝臓でのＣＯＬ１Ａ１およびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを分析した。１投与量１群あたり合計で１０匹の動物を用い、ミネラルオイル対照群に５匹の動物を用いた。ＣＯＬ１Ａ１  ｍＲＮＡのレベルをＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルのそれに対して正規化した。
【０３６９】
図４はＣＣｌ４／ｓｉＲＮＡ処理計画での用量反応を示し、そして、図５は得られた結果を要約する。３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇの投与量でのＡＦ１２＿ＣＯＬ１Ａ１（ＡＤ２１３４９）（配列番号５３および配列番号５４）製剤が、対照ｓｉＬＵＣ  ｓｉＲＮＡと比較してＣＣｌ４処理マウスでＣＯＬ１Ａ１  ｍＲＮＡレベルのレベルを著しく減少させた。ＡＦ１２−ＡＤ２１３４９（配列番号５３および配列番号５４）を用いるＣＯＬ１Ａ１ノックダウンについて、ＥＤ５０は約０．１ｍｇ／ｋｇであった。データはＡＦ１２＿Ｌｕｃに対して正規化された。
【０３７０】
マウスモデルでのｓｉＣＯＬ１Ａ１のＡＦ１１ベースの送達を評価するために、第１日および第７日に経口強制投与により（２回）１．７５ｍｌ／ｋｇの最終用量でＣＣｌ４を用いてＢａｌｂ／ｃ動物に肝臓傷害を誘導した。対照動物にはミネラルオイルだけが与えられた。第８日にＡＦ１１製剤化ｓｉＲＮＡを様々な投与量で前記マウスに静脈内注入し、次に、第１０日のｓｉＲＮＡ注入後約４０時間で前記マウスを殺処理した。使用した対照ｓｉＲＮＡはｓｉＬＵＣ（ＡＤ１９５５）であった。ＣＯＬ１Ａ１（ＡＤ２１３４９）（配列番号５３および配列番号５４）とｓｉＬＵＣ（ＡＤ１９５５）の両方の投与量は３ｍｇ／ｋｇであった。Ｔａｑｍａｎ−定量ＰＣＲを用いて肝臓でのＣＯＬ１Ａ１およびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを分析した。１投与量１群あたり合計で１０匹の動物を用い、ミネラルオイル対照群に５匹の動物を用いた。ＣＯＬ１Ａ１  ｍＲＮＡのレベルをＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルのそれに対して正規化した。
【０３７１】
図６はＣＣｌ４／ＡＦ１１−ｓｉＲＮＡ処理計画を示し、そして、図７は得られた結果を要約する。３ｍｇ／ｋｇの投与量でのＡＦ１１＿ＣＯＬ１Ａ１（ＡＤ２１３４９）（配列番号５３および配列番号５４）製剤が、対照ｓｉＬＵＣ  ｓｉＲＮＡと比較してＣＣｌ４処理マウスでＣＯＬ１Ａ１  ｍＲＮＡレベルのレベルを著しく減少させた。ＡＦ１１−ＡＤ２１３４９製剤を用いておよそ６５％のＣＯＬ１Ａ１  ｍＲＮＡノックダウンが達成された。データはＡＦ１２＿Ｌｕｃに対して正規化された。
【０３７２】
肝星細胞（ＨＳＣ）は肝線維症中の異常なマトリックス沈着の主要な原因である。これらの細胞は、慢性肝疾患の両方で「静止した状態の」ＨＳＣから「活性化された」線維形成性筋線維芽細胞への分化転換を経る。その分化転換は、細胞増殖、平滑筋αアクチン（α−ＳＭＡ）の発現を有する形態変化および細胞外マトリックスタンパク質、原線維性コルゲンの沈着を特徴とする（Friedman et al., 1992, Hepatology, 15:234-243; Friedman, 2000, J. Biol. Chem., 275:2247-2250）。Ｕｅｍｕｒａ  Ｍ．ら（2005, Mol. Biol. Cell, 16:4214-4224）は、一次ラットＨＳＣでのＳＭＡＤ３の過剰発現と一次ラットＨＳＣのＴＧＦβでの処理が接着斑とα-ＳＭＡ組織を増加させることを示した。このことは、ＴＧＦβが、ＳＭＡＤ３を介してシグナルを伝達して、「活性化」ＨＳＣまたは筋線維芽細胞の形態学的な、および機能上の成熟に重要な役割を果たしていることを示している。
【０３７３】
ＡＦベースの（すなわち、ＡＦ０９、ＡＦ１１、ＡＦ１２ベースの製剤）送達方法がＣＣｌ４処理マウス中の「活性化」ＨＳＣまたは筋線維芽細胞にｓｉＲＮＡをまさに送達したことを確認するために、「活性化」ＨＳＣで過剰発現されてもいるα−ＳＭＡのノックダウンを、ＡＦ０９＿ＡＣＴＡ２を使用して判定した。α−ＳＭＡは活性化筋線維芽細胞および血管平滑筋細胞に存在するが肝細胞には存在しないので、α−ＳＭＡを標的として選択した。図８は、ＣＣｌ４処理マウスの肝臓細胞でのＡＣＴＡ２の発現ノックダウンを示した。このデータにより、ＣＣｌ４処理マウス中のＨＳＣへのＡＦ０９−ＡＣＴＡ２の送達が確認された。
【０３７４】
実施例６：ＮＩＨ３Ｔ３細胞でのＴＧＦβ  ｓｉＲＮＡのインビトロスクリーニング
ＮＩＨ３Ｔ３細胞を増殖させ、培養し、そして、用いたｓｉＲＮＡがトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ）遺伝子を標的としたこと以外は実施例３に記載されるようにｓｉＲＮＡで処理した。複数のＴＧＦβ二重鎖の各々を用いる単一用量スクリーンについて、１０ｎＭの最終二重鎖濃度で実験を実行した（図９）。
【０３７５】
１０ｎＭの単一用量スクリーンで強いサイレンシングを示す１０個の二重鎖のサブセットを、段階希釈を用いて１０ｎＭから１０ｆＭまでの濃度範囲にわたって試験して、それらのＩＣ５０を決定した。選択したｓｉＲＮＡであるＡＤ２２１４９（配列番号９１および配列番号９２）およびＡＤ２２１３８（配列番号６９および配列番号７０）はＴＧＦβのｍＲＮＡにそれぞれ約２０ｐＭおよび約７０ｐＭのＩＣ５０を有する。試験されたｓｉＲＮＡはげっ歯類、ＮＨＰおよびヒトと交差反応した。
【０３７６】
実施例７：ＮＩＨ３Ｔ３細胞でのＳＭＡＤ２  ｓｉＲＮＡのインビトロスクリーニング
ＮＩＨ３Ｔ３細胞を増殖させ、培養し、そして、用いたｓｉＲＮＡがＳＭＡＤファミリーメンバー２および３（ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３）遺伝子を標的としたこと以外は実施例３に記載されるようにｓｉＲＮＡで処理した。複数のＳＭＡＤ２／３二重鎖の各々を用いる単一用量スクリーンについて、１０ｎＭの最終二重鎖濃度で実験を実行した（図１０）。 
【０３７７】
１０ｎＭの単一用量スクリーンで強いサイレンシングを示す１０個の二重鎖のサブセットを、段階希釈を用いて１０ｎＭから１０ｆＭまでの濃度範囲にわたって試験して、それらのＩＣ５０を決定した。選択したｓｉＲＮＡであるＡＤ−２０９１６（配列番号１４０および配列番号１４１）はＳＭＡＤ２のｍＲＮＡに約７５ｐＭのＩＣ５０を有する。
【０３７８】
実施例８：ＣＣｌ４マウスモデルでのＳＭＡＤ２  ｓｉＲＮＡのインビボ試験
ＳＭＡＤは線維症発生でのＴＧＦβシグナル伝達に関与しているので、ＳＭＡＤの発現をノックダウンすると肝臓傷害マウスモデルでのＣＯＬ１Ａ１の発現が影響を受けるかどうか検討した。ＣＣｌ４マウスモデルでのＳＭＡＤ２ノックダウン用ｓｉＳＭＡＤ２  ＡＤ−２０９１６（配列番号１４０および配列番号１４１）のＬＮＰベースの送達を評価するために、第０日に経口強制投与により（２回）１．７５ｍｌ／ｋｇの用量でＣＣｌ４を用いてＢａｌｂ／ｃ動物に肝臓傷害を誘導した。対照動物にはミネラルオイルだけが与えられた。第２日にＬＮＰ製剤化ｓｉＲＮＡを前記マウスに静脈内注入し、次に、ＣＣｌ４誘導後第４日に前記マウスを殺処理した。対照ｓｉＲＮＡはｓｉＬＵＣ（ＡＤ１９５５）であった。ｓｉＳＭＡＤ２／３  ＡＤ−２０９１６（配列番号１４０および配列番号１４１）とｓｉＬＵＣ（ＡＤ１９５５）の両方の投与量は３ｍｇ／ｋｇであった。Ｔａｑｍａｎ−定量ＰＣＲを用いて肝臓でのＳＭＡＤ２およびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを分析した。１条件１群あたり合計で１０匹の動物を用いた。ＳＭＡＤ２  ｍＲＮＡのレベルをＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルのそれに対して正規化した。
【０３７９】
図１１は得られた結果を要約する。ｓｉＳＭＡＤ２／３  ＡＤ−２０９１６（配列番号１４０および配列番号１４１）は対照ｓｉＬＵＣ  ｓｉＲＮＡと比較してＣＣｌ４処理マウスでＳＭＡＤ２／３  ｍＲＮＡレベルのレベルを著しく減少させた。ＳＭＡＤ２発現の減少はおよそ８０％であった。
【０３８０】
ＣＣｌ４マウスモデルでのＳＭＡＤ２ノックダウン用ｓｉＳＭＡＤ２  ＡＤ−２０９１６（配列番号１４０および配列番号１４１）のＬＮＰベースの送達とＣＯＬ１Ａ１の発現へのその効果を評価するために、第０日に経口強制投与により（２回）１．７５ｍｌ／ｋｇの用量でＣＣｌ４を用いてＢａｌｂ／ｃ動物に肝臓傷害を誘導した。対照動物にはミネラルオイルだけが与えられた。第２日にＬＮＰ製剤化ｓｉＲＮＡを前記マウスに静脈内注入し、次に、ＣＣｌ４誘導後第４日に前記マウスを殺処理した。対照ｓｉＲＮＡはｓｉＬＵＣ（ＡＤ１９５５）であった。ｓｉＳＭＡＤ２／３  ＡＤ−２０９１６（配列番号１４０および配列番号１４１）とｓｉＬＵＣ（ＡＤ１９５５）の両方の投与量は３ｍｇ／ｋｇであった。Ｔａｑｍａｎ−定量ＰＣＲを用いて肝臓でのＳＭＡＤ２、ＣＯＬ１Ａ１およびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを分析した。１条件１群あたり合計で１０匹の動物を用いた。ＳＭＡＤ２  ｍＲＮＡのレベルをＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルのそれに対して正規化した。
【０３８１】
図１２は得られた結果を要約する。ｓｉＳＭＡＤ２  ＡＤ−２０９１６のＬＮＰベースの送達を用いるＳＭＡＤ２のノックダウンにより、ＣＣｌ４処理マウスでのＣＯＬ１Ａ１の発現が減少した。Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡ注入動物に対して、その減少は約５０〜６０％であった。
【０３８２】
実施例９：慢性肝疾患のマウスモデルでのＣＯＬ１Ａ１  ｓｉＲＮＡ性阻害のインビボでの実証
肝臓に対する反復性損傷により慢性肝疾患が引き起こされ、その結果、最終的には肝線維症および硬変になる肝臓破壊および肝臓退縮の進行性のプロセスに入る。肝臓に対するそのような反復性損傷の条件でＣＯＬ１Ａ１の効果的な阻害が仲介され得るかどうか、および、そのような状況でそのような処理が線維症の低減に効果的であるかどうか評価するために、複数回の損傷を含む慢性肝臓傷害のマウスモデルを確立し、そして、ＣＯＬ１Ａ１のノックダウン用のＣＯＬ１Ａ１に対するｓｉＲＮＡの反復投与の効果を測定した。この慢性肝臓傷害のマウスモデルでは、第１日、第８日、第１５日、第２２日、第２９日および第３６日に経口強制投与により１．７５ｍｌ／ｋｇの最終用量でＣＣｌ４を用いてＢａｌｂ／ｃ動物に肝臓傷害を誘導した。これらの同じ日に対照動物にはミネラルオイルだけが与えられた。第２３日、第２７日、第３０日、第３３日および第３７日にＡＦ０９およびＡＦ１２製剤化ＣＯＬ１Ａ１  ｓｉＲＮＡを前記マウスに静脈注入し、次に、最後のｓｉＲＮＡ注入後の約４０〜４８時間で、すなわち、第３９日で前記マウスを殺処理した。使用した対照ｓｉＲＮＡはｓｉＬＵＣ（ＡＤ１９５５）であった。ｓｉＣＯＬ１Ａ１（ＡＤ２１３４９）（配列番号５３および配列番号５４）とｓｉＬＵＣ（ＡＤ１９５５）の両方の投与量は１ｍｇ／ｋｇであった。Ｔａｑｍａｎ−定量ＰＣＲを用いて肝臓でのＣＯＬ１Ａ１およびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを分析した。１条件１群あたり合計で１０匹の動物を用いた。ＣＯＬ１Ａ１  ｍＲＮＡのレベルをＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルのそれに対して正規化した。
【０３８３】
図１３は得られた結果を要約する。驚くことに、ｓｉＣＯＬ１Ａ１（ＡＤ２１３４９）（配列番号５３および配列番号５４）のＣ１２ベースの送達を用いるＣＯＬ１Ａ１のノックダウンにより、３９日の期間にわたって複数回の肝臓損傷（６回）を受けたマウスでＣＯＬ１Ａ１の発現が著しく、および、予期せず減少した。Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡ注入動物に対して、その減少は約９５％であった。
【０３８４】
実施例１０：慢性肝疾患のマウスモデル（ＣＣｌ４モデル、ＴＡＡモデルおよび胆管結紮モデル）でのＣＯＬ１Ａ１  ｓｉＲＮＡ性阻害のインビボでの実証
ＣＣｌ４モデルでは、肝臓損傷が中心静脈周辺領域のみへ非常に集中することになり、したがって、ＣＣｌ４モデルは肝臓の中心静脈周辺領域への肝臓損傷の良いモデルである。
【０３８５】
ＴＡＡモデルでは、一様な肝臓損傷（すなわち、中心静脈周辺性および門脈周囲性肝臓損傷）となる。ＴＡＡモデルはＣＣｌ４モデルよりも時間がかかり、したがって、ＴＡＡモデルはヒト集団に発生する肝臓傷害をより厳密に模倣していると考えられる。
【０３８６】
胆管の結紮またはカニューレ挿入が胆管結紮モデルに介在する。このモデルは胆管周辺領域をもたらし、そして、このモデルはヒトでの胆管線維症の良いモデルである。他の２つのモデルと対照的に、胆管結紮モデルでは、結果として継続性および進行性傷害、すなわち慢性肝疾患になる。
【０３８７】
図１６は、胆管結紮マウスモデルでのｓｉＣＯＬ１Ａ１  ＡＤ２１３４９（配列番号５３および配列番号５４）のＡＦ１２ベースの送達を用いるＣＯＬ１Ａ１ノックダウンの実験計画および効果を示す。
【０３８８】
図１７は胆管結紮動物での相対的なＣｏｌ１ａ１発現を示す。
【０３８９】
図１８は、胆管結紮マウスモデルでのｓｉＣＯＬ１Ａ１  ＡＤ２１３４９（配列番号５３および配列番号５４）を用いるＣＯＬ１Ａ１ノックダウンの効果を示す。
【０３９０】
図１９は、肝臓傷害のＴＡＡマウスモデルでのｓｉＣＯＬ１Ａ１  ＡＤ２１３４９（配列番号５３および配列番号５４）を用いるＣＯＬ１Ａ１ノックダウンの実験計画および効果を示す。
【０３９１】
（表２）治療することにより線維形成が低減することができる基礎疾患の例
2019150075.tif 000022
【０３９２】
（表３）ＣＯＬ１Ａ１  ｓｉＲＮＡ二重鎖
2019150075.tif 000023
【０３９３】
（表４）ＴＧＦ−β  ｓｉＲＮＡ二重鎖
2019150075.tif 000024
【０３９４】
（表５）ＳＭＡＤ２／３  ｓｉＲＮＡ二重鎖
2019150075.tif 000025
【０３９５】
（表６）マウスＣｏｌ１ａ１転写物ＮＭ＿００７７４２．３（配列番号１７３）と交差反応するヒトＣＯＬ１Ａ１転写物ＮＭ＿００００８８．３（配列番号１７２）に基づいて設計されたヒトＣＯＬ１Ａ１  ｉＲＮＡ配列
2019150075.tif 000026
2019150075.tif 000027
2019150075.tif 000028
2019150075.tif 000029
2019150075.tif 000030
2019150075.tif 000031
2019150075.tif 000032
2019150075.tif 000033
2019150075.tif 000034
2019150075.tif 000035
2019150075.tif 000036
2019150075.tif 000037
2019150075.tif 000038
2019150075.tif 000039
2019150075.tif 000040
2019150075.tif 000041
2019150075.tif 000042
2019150075.tif 000043
2019150075.tif 000044
2019150075.tif 000045
2019150075.tif 000046
2019150075.tif 000047
2019150075.tif 000048
2019150075.tif 000049
2019150075.tif 000050
2019150075.tif 000051
【０３９６】
（表７）トランスフォーミング増殖因子β  ｉＲＮＡ配列
2019150075.tif 000052
【０３９７】
（表８）一般的に用いられる肝線維症の病期分類スコア
2019150075.tif 000053
【０３９８】
Batts KP, Ludwig J. Chronic hepatitis. An update on terminology and reporting. Am J Surg Pathol 1995,19(12):1409-17.
Desmet VJ, Gerber M, Hoofnagle JH, Manns M, Scheuer PJ. Classification of chronic hepatitis: diagnosis, grading and staging. Hepatology 1994, 19(6):1513-20.
Ishak K, Baptista A, Bianchi L, Callea F, De Groote J, Gudat F, et al. Histological grading and staging of chronic hepatitis. J Hepatol 1995, 22(6):696-9.
Knodell RG, Ishak KG, Black WC, Chen TS, Craig R, Kaplowitz N, Kiernan TW, Wollman J. Formulation and application of a numerical scoring system for assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis. Hepatology 1981, 1(5):431-5.
Schirmacher P, Fleig WE, Dienes HP. (Biopsy diagnosis of chronic hepatitis). Z Gastroenterol 2004, 42(2):175-85.
【０３９９】
（表９）肝臓の一般的なマーカー
2019150075.tif 000054
【図１】
2019150075.tif 000055
【図２】
2019150075.tif 000056
【図３】
2019150075.tif 000057
【図４】
2019150075.tif 000058
【図５】
2019150075.tif 000059
【図６】
2019150075.tif 000060
【図７】
2019150075.tif 000061
【図８】
2019150075.tif 000062
【図９】
2019150075.tif 000063
【図１０】
2019150075.tif 000064
【図１１】
2019150075.tif 000065
【図１２】
2019150075.tif 000066
【図１３】
2019150075.tif 000067
【図１４】
2019150075.tif 000068
【図１５】
2019150075.tif 000069
【図１６】
2019150075.tif 000070
【図１７】
2019150075.tif 000071
【図１８】
2019150075.tif 000072
【図１９】
2019150075.tif 000073
【配列表】
2019150075000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年7月18日(2019.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＧＦβの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号63、65、69、75、77、85、91、93、99、および105のうちの一つを含み、前記アンチセンス鎖が、それぞれ、配列番号64、66、70、76、78、86、92、94、100、および106のうちの一つを含む、前記ｄｓＲＮＡ。
【請求項２】
ＳＭＡＤ２／３の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＳＭＡＤ２／３  ＲＮＡ転写物と相補的な領域を含み、かつ、表５に列挙されたアンチセンス配列のうちの１つと３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む、前記ｄｓＲＮＡ。
【請求項３】
少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４】
前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、２'−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５'−チオリン酸エステル基含有ヌクレオチド、コレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合した末端ヌクレオチド、２'−デオキシ−２'−フルオロ修飾ヌクレオチド、２'−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２'−アミノ修飾ヌクレオチド、２'−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダートおよび非天然塩基含有ヌクレオチドからなる群より選択される、請求項３に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項５】
それぞれの鎖が３０ヌクレオチド以下の長さである、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項６】
少なくとも一方の鎖が、少なくとも１ヌクレオチドの３'オーバーハングを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項７】
リガンドをさらに含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項８】
前記リガンドが前記ｄｓＲＮＡの前記センス鎖の３'末端と複合体化されている、請求項７に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項９】
請求項１に記載のｄｓＲＮＡを含有する、細胞。
【請求項１０】
請求項１に記載のｄｓＲＮＡを含む、ＴＧＦβ遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載のｄｓＲＮＡを含む、脂質製剤。
【請求項１２】
ＳＮＡＬＰまたはＸＴＣ製剤である、請求項１１に記載の脂質製剤。
【請求項１３】
細胞内のＴＧＦβ発現を阻害する方法であって、
ａ．  請求項１に記載のｄｓＲＮＡを前記細胞に導入する工程、および、
ｂ．  工程（ａ）で作製された細胞を、ＴＧＦβ遺伝子のｍＲＮＡ転写物が分解されるのに十分な時間にわたり維持し、それによって前記細胞内のＴＧＦβ遺伝子の発現を阻害する工程
を含む、前記方法。
【請求項１４】
肝線維症を治療するための、請求項１に記載のｄｓＲＮＡを含む医薬組成物。
【請求項１５】
配列番号63、65、69、75、77、85、91、93、99、および105のうちの一つを含むセンス鎖と、配列番号64、66、70、76、78、86、92、94、100、および106のうちの一つをそれぞれ含むアンチセンス鎖とを含むｄｓＲＮＡをコードするベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１７】
前記センス鎖が配列番号69のヌクレオチド配列を含み、かつ前記アンチセンス鎖が配列番号70のヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１８】
前記センス鎖が配列番号91のヌクレオチド配列を含み、かつ前記アンチセンス鎖が配列番号92のヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載のｄｓＲＮＡ。