(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｏ−ホスホセリン（O-phosphoserine、OPS）の排出能を有するポリペプチドの活性が強化された微生物及び前記微生物を用いてＯ−ホスホセリン、システインまたはシステイン誘導体を生産する方法。【解決手段】Ｏ−ホスホセリン（ＯＰＳ）排出活性を示し、特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドの活性が強化された、Ｏ−ホスホセリン生産微生物を培地で培養する段階、及びＯ−ホスホセリン生産微生物またはその培地からＯ−ホスホセリンを分離する段階を含む、Ｏ−ホスホセリンの生産方法。また、Ｏ−ホスホセリン生産微生物が大腸菌であり、生産されたＯ−ホスホセリンまたはこれを含む培地を硫化物と反応させる段階を含む、システインまたはその誘導体の生産方法。【選択図】図１
2019150038.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または２のアミノ酸配列を有するＯ−ホスホセリン（O-phosphoserine、OPS）の排出活性を示すポリペプチドの活性が内在的活性に比べて強化された、Ｏ−ホスホセリン生産微生物。
【請求項２】
前記微生物は、さらにホスホセリンホスファターゼ（phosphoserine phosphatase、SerB）の活性が内在的活性に比べて弱化されたものである、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
前記微生物は、さらにホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（phosphoglycerate dehydrogenase、SerA）またはホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（phosphoserine aminotransferase、SerC）の活性が内在的活性に比べて強化されたものである、請求項１に記載の微生物。
【請求項４】
前記Ｏ−ホスホセリン生産微生物が大腸菌である、請求項１に記載の微生物。
【請求項５】
Ｏ−ホスホセリン（ＯＰＳ）排出活性を示し、配列番号１または２のアミノ酸配列を有するポリペプチドの活性が強化された、Ｏ−ホスホセリン生産微生物を培地で培養する段階、及び
前記Ｏ−ホスホセリン生産微生物またはその培地からＯ−ホスホセリンを分離する段階を含む、Ｏ−ホスホセリンの生産方法。
【請求項６】
前記Ｏ−ホスホセリン生産微生物は、さらにホスホセリンホスファターゼ（phosphoserine phosphatase、SerB）の活性が内在的活性に比べて弱化されたものである、請求項５
に記載の生産方法。
【請求項７】
前記Ｏ−ホスホセリン生産微生物は、さらにホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（phosphoglycerate dehydrogenase、SerA）またはホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（phosphoserine aminotransferase、SerC）の活性が内在的活性に比べて強化されたものである、請求項５に記載の生産方法。
【請求項８】
前記Ｏ−ホスホセリン生産微生物が大腸菌である、請求項５に記載の生産方法。
【請求項９】
ａ）請求項１〜４のいずれか一項の微生物を培地で培養してＯ−ホスホセリン（ＯＰＳ）を生産する段階、及びｂ）Ｏ−ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（O-Phosphoserine sulfhydrylase、OPSS）またはこれを発現する微生物の存在下で、前記ａ）段階で生産され
たＯ−ホスホセリンまたはこれを含む培地を硫化物と反応させる段階を含む、システインまたはその誘導体の生産方法。
【請求項１０】
前記硫化物が、Ｎａ２Ｓ、ＮａＳＨ、（ＮＨ４）２Ｓ、Ｈ２Ｓ及びＮａ２Ｓ２Ｏ３からなる群から選択される１つ以上である、請求項９に記載のシステインまたはその誘導体の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｏ−ホスホセリンを生産する微生物及び前記微生物を用いてＯ−ホスホセリン、システインまたはシステイン誘導体を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−システインは、あらゆる生物体の硫黄代謝において重要なアミノ酸であり、毛髪のケラチンなど生体内のタンパク質、グルタチオン、ビオチン、メチオニン及びその他の硫黄を含有した代謝産物の合成に使用されるだけでなく、コエンザイムＡ生合成の前駆物質として使用される。
【０００３】
微生物を用いてＬ−システインを生産する方法としては、１）微生物を用いてＤ、Ｌ−ＡＴＣを生物学的に転換する方法、２）大腸菌を用いたＬ−システインを生産する直接発酵方法が知られている（特許文献１、非特許文献１）。３）また、微生物を用いてＯ−ホスホセリン（O-phosphoserine、以下「ＯＰＳ」）を発酵生産した後、Ｏ−ホスホセリン
スルフヒドリラーゼ（O-phosphoserine sulfhydrylase、以下「ＯＰＳＳ」）の触媒作用
の下で、硫化物と反応してＬ−システインに転換させた方法が公知となっている（特許文献２）。
【０００４】
ここで、前記３）の方法を用いて高収率のシステインを生産するためには、前駆体であるＯＰＳを過量生産しなければならない。そこで、本発明者らはＯＰＳ生産菌株で生産されたＯＰＳを細胞外に円滑に排出させることができる適切な排出因子を究明するために鋭意努力した。
【０００５】
このような背景の下、本発明者らはＯＰＳ排出能を有するＹｈｈＳ及びＭｄｔＤの両ポリペプチドを新たに解明し、ＯＰＳ生産微生物で前記ポリペプチドの活性を強化させる場合、ＯＰＳを効果的に排出させることを確認し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】欧州登録特許ＥＰ０８８５９６２Ｂ
【特許文献２】韓国登録特許第１０−１３８１０４８号公報
【特許文献３】報韓国公開特許第１０−２０１２−００４１１１５号公報
【特許文献４】韓国登録特許第１０−０６２００９２号公報
【特許文献５】欧州特許ＥＰ０９４３６８７Ｂ
【特許文献６】米国公開公報第２０１２−０１９００８１号公報
【特許文献７】韓国登録特許第１０−１２０８２６７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Wada M and Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006
【非特許文献２】Sambrook et al., 1989, infra
【非特許文献３】Ahmed Zahoor,Computation and structural biotechnology journal, vol 3, 2012
【非特許文献４】Wendisch VF et al., Curr Opin Microbiol. 2006 Jun;9(3):268-74
【非特許文献５】Peters-Wendisch P et al., Appl Environ Microbiol. 2005 Nov;71(11):7139-44
【非特許文献６】Grant GA et al., J. Biol. Chem., 39: 5357-5361, 1999
【非特許文献７】Grant GA et al., Biochem., 39: 7316-7319, 2000
【非特許文献８】Grant GA et al., J. Biol. Chem., 276: 17844-17850, 2001
【非特許文献９】Peters-Wendisch P et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 60: 437-441, 2002
【非特許文献１０】Mino K and Ishikawa K, FEBSletters, 551: 133-138, 2003
【非特許文献１１】Burns KE et al., J. Am. Chem. Soc., 127: 11602-11603, 2005
【非特許文献１２】van der Rest et al. 1999
【非特許文献１３】Pao SS et al., Microbiol Mol Biol Rev. 62(1);1-34. 1998
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の一つの目的は、ＯＰＳ排出活性を示すポリペプチドの活性が内在的活性に比べて強化された、ＯＰＳ生産微生物を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の一つの目的は、前記ＯＰＳ生産微生物を培地で培養する段階及び前記微生物またはその培地からＯＰＳを分離する段階を含む、ＯＰＳの生産方法を提供することにある。
【００１０】
本発明のもう一つの目的は、前記ポリペプチドのＯＰＳ生産または排出用途を提供することにある。
【００１１】
本発明のもう一つの目的は、ａ）ＯＰＳ排出活性を示す前記ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて強化された、ＯＰＳ生産微生物を培地で培養してＯＰＳを生産する段階、及びｂ）ＯＰＳスルフヒドリラーゼまたはこれを発現する微生物の存在下で、前記ａ）段階で生産されたＯＰＳまたはこれを含む培地を硫化物と反応させる段階を含む、システインまたはその誘導体の生産方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の配列番号１または２のアミノ酸配列を有する新規なポリペプチドは、優れたＯＰＳ排出能を有するため、これをＯＰＳ生産微生物に適用する場合、ＯＰＳを高効率で生産することができ、Ｌ−システイン合成などに便利に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＹｈｈＳ及びＭｄｔＤタンパク質の機能を強化させた本発明の組換え微生物の培養液から排出されたＯＰＳをすべて除去した後、細胞内部のＯＰＳをＨＰＬＣ（high performance liquid chromatography）を用いて測定した結果をグラフで示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の一態様は、配列番号１または２のアミノ酸配列を有する、ＯＰＳ排出活性を示すポリペプチドの活性が内在的活性に比べて強化された、ＯＰＳ生産微生物を提供する。
【００１５】
本発明において、用語、「Ｏ−ホスホセリン（O-phosphoserine、以下「ＯＰＳ」）」
とは、セリン及びリン酸（phosphoric acid）のエステル化合物であり、種々のタンパク
質の構成要素である。特に、前記ＯＰＳはＬ−システインの前駆体であり、ＯＰＳスルフヒドリラーゼ（OPS sulfhydrylase、OPSS）の触媒作用の下で、硫化物と反応してシステ
インに変換することができる（特許文献２）。
【００１６】
本発明において、用語、「ＯＰＳ排出活性を示すポリペプチド」とは、細胞内のＯＰＳを細胞外に排出する活性を有する膜タンパク質を意味し、具体的には、大腸菌由来の膜タンパク質であることができる。過量のＯＰＳが存在する条件で生育の低下が解除される大腸菌から膜タンパク質２種が同定された。このように究明されたＯＰＳ排出能を有する膜タンパク質は、具体的には、配列番号１のアミノ酸配列を有するＹｈｈＳ  ＭＦＳ（major facilitator superfamily）トランスポーター、及び配列番号２のアミノ酸配列を有す
るＹｅｇＢ  ＭＦＳトランスポーターである。前記ＹｅｇＢ  ＭＦＳトランスポーターは、本発明においてＭｄｔＤと混用して使用することができる。前記タンパク質のＯＰＳ排出活性は知られておらず、本発明で最初に究明された。
【００１７】
また、前記ポリペプチドは、配列番号１または２で表されたアミノ酸配列であることができ、前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上の相同性を示すアミノ酸配列として、実質的に前記ポリペプチドと同一または相当するＯＰＳ排出能を示す膜タンパク質であれば制限なく含まれる。また、このような相同性を有する配列として実質的にＯＰＳ排出能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたポリペプチド変異体も本発明の範囲内に含まれるのは自明である。
【００１８】
また、前記Ｏ−ホスホセリン（O-phosphoserine、OPS）の排出活性能を有するポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、前記配列番号１または２で表されたアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。前記ポリヌクレオチドは、コドンの縮退性（degeneracy）、または前記ポリペプチドを発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮し、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に多様な変形が行われることができる。前記ポリヌクレオチド配列は、例えば、配列番号３または４のポリヌクレオチド配列を有することができ、これと相同性が８０％、具体的には９０％以上の塩基配列を有することができる。しかし、これに限定されない。
【００１９】
本発明において、用語、「相同性」とは、与えられたポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列と一致する程度を意味し、パーセンテージで表示することができる。本明細書において、与えられたポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列と同一または類似する活性を有するその相同性配列が「％相同性」で示される。例えば、スコア（score）
、同一性（identity）及び類似度（similarity）などのパラメータ（parameter）を計算
する標準ソフトウェア、具体的にはＢＬＡＳＴ  ２．０を利用したり、定義された厳格な条件の下でサザンハイブリダイゼイション実験により配列を比較して確認することができ、定義される適切な混成化条件は、当業者によく知られている方法で決定することができる（例えば、非特許文献２参照）。
【００２０】
本発明の一具体例では、ＯＰＳ生産能を有する微生物において、前記ＹｈｈＳタンパク質（配列番号１）またはＭｄｔＤタンパク質（配列番号２）の活性を強化させる場合、陽性対照群であるＲｈｔＢタンパク質（特許文献３）、または比較群としてＭＦＳトランスポーターであるＥｍｒＤまたはＹｃａＤを強化させた菌株に比べて優れたＯＰＳ排出活性を有することを確認した。前記「ＲｈｔＢ」はホモセリン／ホモセリンラクトンを排出する膜タンパク質であり、遺伝子ｒｈｔＢでコードされる。ＯＰＳ生産菌株において前記ＲｈｔＢの活性を強化させた場合、ＯＰＳ排出能が増加することを確認されたため（特許文献２）、これを陽性対照群として使用した。ＯＰＳ生産菌株において前記ＲｈｔＢタンパク質と本発明によるＹｈｈＳタンパク質及びＭｄｔＤタンパク質の活性をそれぞれ強化させたとき、本発明によるＹｈｈＳタンパク質及びＭｄｔＤタンパク質は、前記ＲｈｔＢタンパク質と比較しても優れたＯＰＳ排出能を示した。また、用語「ＥｍｒＤ」及び用語「ＹｃａＤ」は、大腸菌のＭＦＳトランスポータータンパク質であり、それぞれｅｍｒＤ及びｙｃａＤ遺伝子でコードされる。前記ＥｍｒＤ及びＹｃａＤはＹｈｈＳ及びＭｄｔＤタ
ンパク質のようにＭＦＳトランスポーターに属するタンパク質であり、ＭＦＳトランスポーターに属する他のタンパク質もＯＰＳ排出能を示すことができるかを確認するために比較群として使用した。その結果、ＥｍｒＤ及びＹｃａＤタンパク質は、ＹｈｈＳ及びＭｄｔＤタンパク質とは異なり、ＯＰＳ排出能を示さないことを確認した。
【００２１】
一方、本発明のポリペプチドは、ＯＰＳ排出活性を有するため、ＯＰＳ生産能を有する微生物において前記ポリペプチドの活性を内在的活性に比べて強化させる場合、ＯＰＳを効果的に生産することができる。
【００２２】
本発明において、用語、「ＯＰＳ生産」とは、ＯＰＳを菌株内で作り出すだけでなく、細胞内のＯＰＳを細胞外、例えば、培地に排出することも含む概念であり、具体的にはＯＰＳを細胞内から外に排出することを意味する。
【００２３】
本発明において、用語、「内在的活性」とは、本来微生物が天然の状態、即ち、非変異状態で示すポリペプチドの活性状態を意味する。「内在的活性に比べて強化」とは、本来微生物が天然の状態で示すポリペプチドの活性と比較したとき、その活性が増加したことを意味し、特定のポリペプチドの活性を有さない微生物にポリペプチドの活性を付与することも含む概念である。
【００２４】
前記「活性の強化」とは、特にこれに限定されないが、ポリペプチド自体の活性が増大され、本来の機能以上の効果を導出することを含むだけでなく、内在的遺伝子活性の増加、内部または外部要因から内在的遺伝子増幅、外部からの遺伝子導入、プロモーターの交換または変形及び突然変異による酵素活性の増加などによりその活性が増加することを含む。具体的には、前記ポリペプチドをコードする遺伝子の細胞内コピー数の増加、前記ポリペプチドをコードする遺伝子発現調節配列を変形する方法、前記ポリペプチドの活性が増加するように突然変異された遺伝子で染色体上の前記ポリペプチドをコードする遺伝子を代替する方法及び前記ポリペプチドの活性が強化されるように、前記ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子に変異を導入させる方法等により行われることができ、前記記載の方法に制限されるものではない。このような活性を強化させる方法は、本明細書内の他のポリペプチドの活性強化時にも同様に参照することができる。
【００２５】
前記において遺伝子のコピー数の増加は、特にこれに限定されないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われるか、または宿主細胞内の染色体に挿入されることにより行われることができる。具体的には、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主と無関係に複製され、機能することができるベクターが宿主細胞内に導入されるものであり得る。または、前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することができるベクターが宿主細胞の染色体内に導入されるものであり得る。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組換えにより行われることができる。本発明のベクターは、相同組換えを起こして染色体内に挿入されることができるため、前記染色体への挿入如何を確認するための選別マーカー（selection marker）をさらに含むことができる。選別マーカーは、ベクターに形質転換された細胞を選別、即ち、目的のポリヌクレオチドの挿入如何を確認するためのものであり、薬剤耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能表現型を付与するマーカーが使用されることができ、これに限定されるものではない。選択剤（selective agent）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみ生存するか、または
他の表現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。
【００２６】
前記ベクターは、適合した宿主内で目的タンパク質を発現させることができるように、適合した発現調節配列に作動可能に連結された、前記目的タンパク質をコードするポリヌ
クレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物であり得る。前記発現調節配列は、転写を開始することができるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合したｍＲＮＡリボゾーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含む。ベクターは、適当な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノムそのものに統合することができる。
【００２７】
本発明で使用されるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界において知られている任意のベクターを利用することができる。通常使用されるベクターの例としては、天然の状態または組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージを挙げることができる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＭＢＬ３、λＭＢＬ４、λＩＸＩＩ、λＡＳＨＩＩ、λＡＰＩＩ、λｔ１０、λｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用することができ、プラスミドベクターとしてｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを使用することができる。
【００２８】
本発明において、用語「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内に発現することができさえすれば、宿主細胞の染色体に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらすべてを含む。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現することができるものであれば、如何なる形態で導入されても関係ない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自体的に発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細
胞に導入されることができ、これに限定されるものではない。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボゾーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含むことができる。前記発現カセットは、自体複製が可能な発現ベクターの形態であることができる。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであり得る。
【００２９】
また、前記において、用語「動作可能に連結」されたこととは、本発明の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。
【００３０】
次に、ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を変形することは、特にこれらに限定されないが、前記発現調節配列の活性を強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組み合わせで配列上の変化を誘導して実行したり、さらに強い活性を有する核酸配列と交換することにより行うことができる。前記発現調節配列は、特にこれに限定されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボゾーム結合部位をコードする配列、転写及び解読の終結を調節する配列などを含むことができる。
【００３１】
前記ポリヌクレオチドの発現単位の上流には、本来のプロモーターの代わりに強力なプロモーターが連結することができ、これに限定されるものではない。公知となった強力なプロモーターの例には、ｃｊ１プロモーター（特許文献４）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター及びｔｅｔプロモーターが含まれることができる。
【００３２】
また、染色体上のポリヌクレオチド配列の変形は、特にこれに限定されないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性をさらに強化させるように核酸配列を欠失、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行うか、またはさらに強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列と交換することにより行うことができる。
【００３３】
このようなタンパク質活性の導入及び増進は、相応するタンパク質の活性または濃度が野生型タンパク質や初期の微生物菌株における活性または濃度を基準として、一般に、少なくとも１％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％または５００％、最大１０００％または２０００％まで増加されることであり得るが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
本発明において、用語「ＯＰＳ生産微生物」とは、ＯＰＳを生物内で生産することができる原核または真核微生物菌株であり、具体的には遺伝的操作によりＯＰＳを蓄積することができる微生物を意味する。
【００３５】
本発明の一具体例として、前記微生物は、配列番号１または２のポリペプチドの活性が増強される場合、ＯＰＳを排出することができる微生物であれば、特にその種類は限定されず、原核細胞または真核細胞の両方が可能であるか、具体的には原核細胞であり得る。例えば、エシェリキア（Escherichia）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、プロビデンシア（Providencia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、及びブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物菌株が含まれることができ、具体的にはエシェリキア属微生物、その例として大腸菌が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特に、前記エシェリキア属またはコリネバクテリウム属微生物の場合、Ｌ−セリンの生合成経路の酵素であるＳｅｒＡ、ＳｅｒＣ及びＳｅｒＢを利用して、ＯＰＳ及びＬ−セリンを生産することができる（非特許文献３〜５）。
【００３６】
また、前記ＯＰＳ生産微生物は、さらに、内在的ホスホセリンホスファターゼ（phosphoserine phosphatase、SerB）の活性が内在的活性に比べて弱化されたものであり得る。
【００３７】
前記ＳｅｒＢは、ＯＰＳをＬ−セリン（L-serine）に転換させる活性を有するため、前記ＳｅｒＢ活性が弱化されるように変異された微生物は、ＯＰＳを蓄積する機能を有し、ＯＰＳの生産に有用に使用することができる。前記ＳｅｒＢは、配列番号１７または１８で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり得るが、これに限定されるものではない。また、ＳｅｒＢの活性を示す限り、前記アミノ酸配列と８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、より具体的には９９％以上の同一のアミノ酸配列を含むことができるが、これに制限されない。
【００３８】
また、前記ＳｅｒＢをコードするポリヌクレオチド配列は、前記配列番号１７または１８で表されたアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列を有することができる。前記ポリヌクレオチドは、コドンの縮退性または前記ポリペプチドを発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮し、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に多様な変形が行われることができる。前記ポリヌクレオチド配列は、例えば、配列番号１９または２０のポリヌクレオチド配列を有することができ、これと相同性が８０％、具体的には９０％以上である塩基配列を有することができる。しかし、これに限定されない。
【００３９】
本発明において、用語「内在的活性に比べて弱化」とは、本来微生物が天然の状態で有しているタンパク質の活性と比較したとき、その活性が減少したことを意味し、活性が除
去された場合も含む。
【００４０】
前記弱化は、前記タンパク質をコードする遺伝子の変異などによりタンパク質自体の活性が本来の微生物が有しているタンパク質の活性に比べて減少または除去された場合と、これをコードする遺伝子の発現阻害または翻訳（translation）阻害などにより細胞内に
おいて全体的なタンパク質活性の程度が天然型菌株に比べて低い場合、前記遺伝子の発現が全く行われない場合、及び発現されても活性がない場合も含む概念である。
【００４１】
このようなタンパク質活性の弱化は、当該分野においてよく知られている多様な方法で達成することができる。前記方法の例として、前記タンパク質の活性が除去された場合を含め、前記酵素の活性が減少するように突然変異された遺伝子で染色体上の前記タンパク質をコードする遺伝子を代替する方法；前記タンパク質をコードする遺伝子の発現調節配列を変形する方法；前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の全体または一部を欠失させる方法；前記染色体上の遺伝子の転写体に相補的に結合して前記ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入する方法；前記タンパク質をコードする遺伝子のＳＤ配列の前段にＳＤ配列と相補的な配列を人為的に付加して２次構造を形成させてリボゾーム（ribosome）の付着が不可能にする方法及び該当配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写されるようにプロモーターを付加するＲＴＥ（Reverse transcription engineering）方法な
どがあり、これらの組み合わせでも達成することができるが、前記の例により特に制限されるものではない。
【００４２】
具体的には、タンパク質をコードする遺伝子の一部または全体を欠失する方法は、細菌内に染色体挿入用ベクターを利用して染色体内の内在的目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、一部の核酸配列が欠失されたポリヌクレオチドまたはマーカー遺伝子で交換することにより行うことができる。その一例として、相同組換えにより遺伝子を欠失させる方法を使用することができる。また、前記において「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類によって異なるが、具体的には１〜３００個、好ましくは１〜１００個、さらに好ましくは１〜５０個であり得るが、特にこれに制限されるものではない。
【００４３】
また、発現調節配列を変形する方法は、前記発現調節配列の活性がさらに弱化されるように核酸配列を欠失、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行うか、さらに弱い活性を有する核酸配列と交換することにより行うことができる。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレーター配列、リボゾーム結合部位をコードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列を含む。
【００４４】
また、染色体上の遺伝子配列を変形する方法は、前記タンパク質の活性をさらに弱化されるように遺伝子配列を欠失、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組み合わせで配列上の変化を誘導して行うか、さらに弱い活性を有するように改良された遺伝子配列または活性がないように改良された遺伝子配列と交換することにより行うことができる。
【００４５】
また、前記ＯＰＳを生産する微生物は、さらにホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（phosphoglycerate dehydrogenase、SerA）またはホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（phosphoserine aminotransferase、SerC）の活性が内在的活性に比べて強化されたものであり得る。
【００４６】
前記ＳｅｒＡは、３−ホスホグリセリン酸（3-phosphoglycerate）を３−ホスホヒドロキシピルビン酸（3-phospho-hydroxypyruvate）に転換する活性を有するタンパク質であ
り、前記ＳｅｒＡは野生型またはセリンに対するフィードバックが解除された変異体が使
用されることができる。また、前記ＳｅｒＣは３−ホスホヒドロキシピルビン酸をＯＰＳに転換する活性を有するタンパク質である。したがって、前記ＳｅｒＡまたは／及びＳｅｒＣの活性が強化された微生物は、ＯＰＳ生産菌株として有用に使用されることができる。
【００４７】
前記ＳｅｒＡは、これに限定されないが、配列番号２１〜２６からなる群から選択されたアミノ酸配列を有することができる。前記配列番号２１は、野生型ＳｅｒＡの配列であり、配列番号２２〜２６は、セリンに対するフィードバックが解除された変異体の配列である。また、ＳｅｒＡの野生型またはセリンに対するフィードバックが解除された変異体の活性を示す限り、前記アミノ酸配列と８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９９％以上が同一のアミノ酸配列を含むことができるが、これに限定されない。前記フィードバックが解除された変異体は、前記ＳｅｒＡをコードする遺伝子に挿入、置換などの方法により変異を導入し、セリンまたはグリシンによるフィードバック阻害からその活性を維持するか、または強化された場合を意味し、前記フィードバックが解除された変異体は、既によく知られている（非特許文献６〜９及び特許文献５）。
【００４８】
また、前記ＳｅｒＡの野生型またはセリンに対するフィードバックが解除された変異体をコードするポリヌクレオチド配列は、前記配列番号２１〜２６で表されたいずれか一つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を有することができるが、これに限定されない。前記ポリヌクレオチドは、コドンの縮退性により、または前記ポリペプチドを発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮し、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に多様な変形が行われることができる。前記ポリヌクレオチド配列は、例えば、配列番号２７〜３２で表されたいずれか一つのポリヌクレオチド配列を有することができ、これと相同性が８０％、具体的には９０％以上である塩基配列を有することができる。しかし、これに限定されない。
【００４９】
前記ＳｅｒＣは、例えば、配列番号３３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり得るが、これに限定されるものではない。また、ＳｅｒＣの活性を示す限り、前記のアミノ酸配列と８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９９％以上が同一のアミノ酸配列を含むことができるが、これに制限されない。
【００５０】
また、前記ＳｅｒＣをコードするポリヌクレオチド配列は、前記配列番号３３に表されたアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列を有することができる。前記ポリヌクレオチドは、コドンの縮退性、または前記ポリペプチドを発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮し、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に多様な変形が行われることができる。前記ポリヌクレオチド配列は、例えば、配列番号３４のポリヌクレオチド配列を有することができ、これと相同性が８０％、具体的には９０％以上である塩基配列を有することができる。しかし、これに限定されない。
【００５１】
また、前記微生物は、さらにＯＰＳの細胞内への流入または分解能力を減少させた微生物であることができる。
【００５２】
前記のようなＯＰＳ生産微生物に関する内容は、前記で記述された内容以外にも、特許文献２または特許文献５などに開示された内容が本発明の参考資料として使用されることができる。
【００５３】
本発明の他の一態様は、ＯＰＳ排出活性を示し、かつ配列番号１または２のアミノ酸配列を有するポリペプチドの活性が強化された、ＯＰＳ生産微生物を培地で培養する段階、
及び前記Ｏ−ホスホセリン生産微生物またはその培地からＯ−ホスホセリンを分離する段階を含む、ＯＰＳの生産方法を提供する。
【００５４】
本発明において、用語「培養」とは、前記微生物を適当に調節された環境条件で生育させることを意味する。本発明の培養過程は、当業界において知られている適当な培地と培養条件に応じて行われることができる。このような培養過程は選択された菌株に応じて当業者が容易に調整して使用することができる。具体的には、前記培養は、回分式、連続式及び流加式であることができるが、これに限定されるものではない。
【００５５】
前記ＳｅｒＢ活性が内在的活性に比べて弱化された遺伝子組換え微生物の培養は、前記微生物のセリン要求性が誘導され、培地にグリシンまたはセリンがさらに含まれることができる。グリシンは、精製されたグリシン、グリシンを含むイースト抽出物、トリプトンの形態で提供されることができ、培養液に含まれる濃度は、通常、０．１〜１０ｇ／Ｌ、具体的には０．５〜３ｇ／Ｌであることができる。また、セリンは、精製されたセリン、セリンを含有するイースト抽出物、トリプトンなどの形態で提供されることができ、培養液に含まれる濃度は、通常、０．１〜５ｇ／Ｌ、具体的には０．１〜１ｇ／Ｌであることができる。
【００５６】
前記培地に含まれる炭素源は、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、澱粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油などのようなオイル及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれることができ、これらの物質は個別にまたは混合物として使用されることができる。しかし、これに限定されるものではない。前記培地に含まれる窒素源として、ペプトン、イースト抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、及び大豆、小麦のような有機窒素源及び尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源が含まれることができ、前記窒素源は、単独または組み合わせで使用することができる。しかし、これに限定されるものではない。前記培地に含まれるリン源として、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、及び対応するナトリウム−含有塩が含まれることができるが、これに限定されるものではない。また、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含むことができる。それ以外に、アミノ酸、ビタミン、及び適切な前駆体などが含まれることができる。前記培地または前駆体は、培養物に回分式または連続式で添加されることができるが、これに限定されるものではない。
【００５７】
培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化合物を培養物に適切な方法で添加し、培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中には脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して気泡の生成を抑制することができる。また、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有ガスを注入したり、嫌気及び微好気状態を維持するために気体の注入なしに、あるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入することができる。培養物の温度は、通常２７℃〜３７℃、具体的には３０℃〜３５℃であることができる。培養期間は、所望の有用物質の生産量が得られるまで継続することができ、具体的には１０〜１００時間であることができる。
【００５８】
本発明は、前記培養段階で生産されたＯＰＳをさらに分離及び精製することができ、その方法は、培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式培養方法などに応じて当該分野において公知となった適切な方法を用いて培地から目的とするＯＰＳを回収することができ、これに限定されない。
【００５９】
本発明の他の一態様として、前記配列番号１または２のアミノ酸配列を有するポリペプチドのＯＰＳ生産または排出用途を提供する。
【００６０】
本発明の他の一態様として、ａ）前記配列番号１または２のアミノ酸配列を有する、ＯＰＳ排出活性を示すポリペプチドの活性が内在的活性に比べて強化された、ＯＰＳ生産微生物を培地で培養してＯＰＳを生産する段階；及びｂ）ＯＰＳスルフヒドリラーゼ（O-phosphoserine sulfhydrylase、OPSS）またはこれを発現する微生物の存在下、前記ａ）段
階で製造されたＯＰＳまたはこれを含む培地を硫化物と反応させる段階を含む、システインまたはその誘導体の製造方法を提供する。
【００６１】
本発明において、用語「ＯＰＳスルフヒドリラーゼ（O-phosphoserine sulfhydrylase
、OPSS）」とは、ＯＰＳにチオール基（thiol、group、ＳＨ基）を提供し、前記ＯＰＳをシステインに転換する反応を触媒するポリペプチドを意味する。前記酵素は、アエロパイラム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）、マイコバクテリウム・チュバキュローシス（Mycobacterium tuberculosis）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatics）、トリコモナス・バギナリス（Trichomonas vaginalis）（非特許文献１０及び
非特許文献１１）で初めて明らかになった。また、前記ＯＰＳＳは、野生型ＯＰＳＳタンパク質だけでなく、前記ＯＰＳＳをコードするポリヌクレオチド配列中、一部の配列が欠失、置換または付加された配列であり、野生型ＯＰＳＳタンパク質の生物学的活性と同等またはそれ以上の活性を示す変異体タンパク質も含め、例えば、特許文献２及び特許文献７で開示されたＯＰＳＳタンパク質及びその変異体タンパク質もすべて含まれる。
【００６２】
前記硫化物は、当該技術分野において通常使用される固形だけではなく、ｐＨ、圧力、溶解度の差異により液体または気体の形態で提供され、スルフィド（sulfide、Ｓ２−）
、チオ硫酸塩（thiosulfate、Ｓ２Ｏ３２−）などの形態でチオール基（thiol group、ＳＨ基）に転換することができるすべての硫化物であれば、利用可能である。具体的には、チオール基をＯＰＳに提供するＮａ２Ｓ、ＮａＳＨ、Ｈ２Ｓ、（ＮＨ４）２Ｓ及びＮａ２Ｓ２Ｏ３を用いることができる。前記反応は、一つのＯＰＳ反応基に１つのチオール基を提供して１つのシステインあるいはシステイン誘導体を製造する反応であり、前記反応時、硫化物の添加量はＯＰＳモル濃度の０．１〜３倍であることができ、具体的には、１〜２倍であることができる。
【００６３】
また、本発明では、さらに前記段階ｂ）の反応段階を通じて生産されたシステインを分離及び精製する段階を含む。この時、当該分野において公知となった適合した反応を用いて反応液から、目的とするシステインを分離及び精製して回収することができる。
【００６４】
また、本発明の特徴は、配列番号１または２で表されるポリペプチドの活性をＯＰＳ生産微生物で強化させてＯＰＳを高収率で生産し、生産されたＯＰＳをＯＰＳＳと反応させてシステインを効果的に生産することであり、製造されたシステインは、また、当業界において公知となった化学的合成反応を通じてシステインの水素原子、または特定の原子団を変形させることにより多様なシステイン誘導体で生産することができる。
【００６５】
本発明において、用語「誘導体」とは、任意の化合物の一部を化学的に変化させて得られる類似化合物であり、通常の化合物中、水素原子、または特定の原子団が、他の原子または原子団により置換された化合物を意味する。
本発明において、用語「システイン誘導体」とは、システインの水素原子、または特定の原子団が、他の原子または原子団により置換された化合物を意味する。その例として、システインのアミン基（−ＮＨ２）の窒素原子またはチオール基（−ＳＨ）の硫黄原子に他の原子または原子団が付着された形態であることができ、その例としてＮＡＣ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）、ＳＣＭＣ（Ｓ−Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉ
ｎｅ）、ＢＯＣ−ＣＹＳ（ＭＥ）−ＯＨ、（Ｒ）−Ｓ−（２−アミノ−２−カルボキシエチル）−Ｌ−ホモシステイン、(Ｒ)−２−アミノ−３−スルホプロピオン酸、Ｄ−２−アミノ−４−（エチルチオ）酪酸、３−スルフィノ−Ｌ−アラニン、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｂｏｃ−ｍｅｔｈｙｌ）−ＯＨ、セレノ−Ｌ−システイン、Ｓ−（２−チアゾリル）−Ｌ−システイン、Ｓ−（２−チエニル）−Ｌ−システイン、Ｓ−（４−トレイル）−Ｌ−システインなどがあるが、これらに限定されない。システインは、アセチル化剤（acetylation agent）と反応してＮＡＣ（Ｎ−アセチルシステイン）で容易に合成することができ、
塩基性条件下では、ハロ酢酸（haloacetic acid）と反応させることによりＳＣＭＣ（S-Carboxymetylcysteine）で合成することができる。前記システイン誘導体は、主に医薬品
原料であり、鎮咳薬、咳抑制薬、気管支炎、気管支喘息と咽頭炎などの治療剤として使用される。
【実施例】
【００６６】
以下、本発明を実施例により、より詳しく説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例により制限されるものではない。
【００６７】
実施例１：ＹｈｈＳ  ＭＦＳトランスポーター及びＹｅｇＢ  ＭＦＳトランスポーターの同定
ＯＰＳの排出に関与する大腸菌の膜タンパク質を同定するために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２＿Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）のゲノムＤＮＡライブラリを用いてスクリーニングを行った。
【００６８】
ＯＰＳにより大腸菌の生育が低下する条件をセットアップ（set up）するためにＯＰＳを生産するベース菌株を作製した。スクリーニングベース菌株は、大腸菌野生型菌株であるＷ３１１０において内在的ホスホセリンホスファターゼ（phosphoserine phosphatase
、SerB）の活性が弱化されるように変異させた組換え微生物であり、ＫＣＣＭ１１２１２Ｐ（「ＣＡ０７−００１２」とも命名、特許文献２及び特許文献５）と命名した菌株である。
【００６９】
ＯＰＳ生産菌株であるＫＣＣＭ１１２１２ＰをＯＰＳを含む培地で培養させて、生育の低下(growth inhibition)を示す最適スクリーニング条件を確立した。Ｗ３１１０ゲノム
ライブラリプラスミドをＣＡ０７−００１２電気穿孔法で形質転換させ（非特許文献１２）、過量のＯＰＳが添加された培地条件で生育の低下が解除されるコロニーを選別した。選別されたコロニーからプラスミドを獲得してシーケンス技法を利用して塩基配列を分析した。このことから、過量のＯＰＳ添加条件で生育の低下を解除させるのに関与する大腸菌の膜タンパク質の２種を同定した。
【００７０】
前記２種の大腸菌の膜タンパク質は、ＹｈｈＳ  ＭＦＳ（ｍａｊｏｒ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）トランスポーター（配列番号１のアミノ酸配列、及び配列番号３の塩基配列）及びＹｅｇＢ  ＭＦＳトランスポーター（配列番号２のアミノ酸配列、及び配列番号４の塩基配列）をそれぞれコードするｙｈｈＳ及びｍｄｔＤで確認された（非特許文献１３）。
【００７１】
実施例２：ｙｈｈＳ  及びｍｄｔＤ過発現ベクター製作
ＯＰＳによる生育の低下を解除させるのに関与するＹｈｈＳ  ＭＦＳトランスポーター及びＹｅｇＢ  ＭＦＳトランスポーターをＯＰＳ生産菌株でそれぞれ強化した場合、ＯＰＳ排出能が向上するかを確認するために、それぞれ遺伝子の過発現ベクターを製作しようとした。また、ホモセリン及びホモセリンラクトントランスポーターであるＲｈｔＢをＯＰＳ生産菌株で強化した場合、ＯＰＳ濃度が上昇することを確認したため（特許文献２）
、これを陽性対照群(positive control)として用いた。そして、ＹｈｈＳ及びＭｄｔＤと同様に、ＭＦＳ（major facilitator superfamily）に属する大腸菌膜タンパク質マルチ
薬物放出トランスポーター（multidrug efflux transporter ）ＥｍｒＤ及びＹｃａＤ  
ＭＦＳトランスポーターを共に評価した。ＹｈｈＳ  ＭＦＳトランスポーターをコードする遺伝子ｙｈｈＳ（配列番号３、Accession Numbers:b3473）及びＹｅｇＢ  ＭＦＳトラ
ンスポーターをコードする遺伝子ｍｄｔＤ（配列番号４、Accession Numbers:b2077）断
片は、Ｗ３１１０ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを通じて獲得した。
【００７２】
それぞれの膜タンパク質遺伝子に対する過発現ベクターを作製するために使用したプライマー配列は下記表１に表記した通りである。
【００７３】
【表１】
2019150038.tif 000003
【００７４】
ｙｈｈＳ  ＰＣＲは、配列番号５及び６のプライマーを、ｍｄｔＤ  ＰＣＲは、配列番号７及び８を用いた。この時、使用したプライマーは、米国国立衛生研究所ジーンバンク（NIH GeneBank）に登録されているＫ１２  Ｗ３１１０の遺伝子（GenBank accession number AP 003471）及び周辺塩基配列に関する情報に基づいて作製した。
【００７５】
ｒｈｔＢ、ｅｍｒＤ及びｙｃａＤ遺伝子に対するＰＣＲも前記表１に開示されたそれぞれのプライマー対を用いて該当遺伝子断片を増幅した。  
【００７６】
増幅された各遺伝子の断片は、制限酵素であるＥｃｏＲＶ及びＨｉｎｄIIIを処理し、
ｐＣＬ１９２０ベクター（GenBank No AB236930）に大腸菌のｒｈｔＢ遺伝子のプロモー
ター（ＰｒｈｔＢ）が挿入されているｐＣＬ−ＰｒｈｔＢ−ベクターのＥｃｏＲＶ及びＨｉｎｄIII制限酵素部位にそれぞれクローニングして、ｐＣＬ−ＰｒｈｔＢ−ｒｈｔＢ、
ｐＣＬ−ＰｒｈｔＢ−ｙｈｈＳ、ｐＣＬ−ＰｒｈｔＢ−ｍｄｔＤ、ｐＣＬ−ＰｒｈｔＢ−ｅｍｒＤ、ｐＣＬ−ＰｒｈｔＢ−ｙｃａＤを作製した。
【００７７】
実施例３：ＹｈｈＳ  ＭＦＳトランスポーター及びＹｅｇＢ  ＭＦＳトランスポーターの強化菌株製作、及びＯＰＳ生産能の評価
＜実施例３−１：ＣＡ０７−００１２を利用したＹｈｈＳ  ＭＦＳトランスポーター及びＹｅｇＢ  ＭＦＳトランスポーター強化菌株製作、及びＯＰＳ生産能の評価＞
実施例２で製作された５種のプラスミドをそれぞれＯＰＳ生産株であるＣＡ０７−００１２に導入した菌株を作製し、ＯＰＳの生産能を評価した。
【００７８】
それぞれの菌株をＬＢ固体培地に塗抹した後、３３℃の培養器で一晩培養した。前記培養した菌株を表２の２５ｍＬの力価培地に接種した後、これを３４．５℃、２００ｒｐｍの培養器で４０時間培養して、その結果を表３に示した。
【００７９】
【表２】
2019150038.tif 000004
【００８０】
【表３】
2019150038.tif 000005
【００８１】
前記表３で示されたように、大腸菌由来のＣＡ０７−００１２菌株に大腸菌膜タンパク質の遺伝子をさらに導入した場合のうち、ＲｈｔＢ、ＹｈｈＳ及びＭｄｔＤ強化株でＯＰＳの生産量がＣＡ０７−００１２に比べて増加した結果を示した。特に、本発明のＹｈｈＳ強化株及びＭｄｔＤ強化株の場合は、ＯＰＳ濃度が１５０％以上に上昇することを確認した。一方、比較群であるＥｍｒＤ強化株及びＹｃａＤ強化株の場合には、ＯＰＳの生産量を増加させない結果を示した。
【００８２】
前記ＣＡ０７−００１２／ｐＣＬ−ＰｒｈｔＢ−ｙｈｈＳと命名された菌株を大腸菌ＣＡ０７−０２６６（Escherichia coli CA07-0266）と命名し、これをブダペスト条約の下の国際寄託機関である韓国微生物保存センターに２０１３年１２月９日付けで寄託し、寄託番号ＫＣＣＭ１１４９５Ｐが与えられた。
【００８３】
また、前記ＣＡ０７−００１２／ｐＣＬ−ＰｒｈｔＢ−ｍｄｔＤを大腸菌ＣＡ０７−０２６７（Escherichia coli CA07-0267）と命名し、これをブダペスト条約の下の国際寄託機関である韓国微生物保存センターに２０１３年１２月９日付けで寄託して寄託番号ＫＣＣＭ１１４９６Ｐが与えられた。
【００８４】
＜実施例３−２：ＳｅｒＡ及びＳｅｒＣ強化菌株を用いたＹｈｈＳ  ＭＦＳトランスポーター及びＹｅｇＢ  ＭＦＳトランスポーターの強化菌株製作及びＯＰＳ生産能の評価＞
また、ＯＰＳ生合成経路であるＳｅｒＡ（３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、D-3-phosphoglycerate dehydrogenase）及びＳｅｒＣ（３−ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、3-phosphoserine aminotransferase）の活性を強化させることによりＯＰＳ生産能が増加されたＯＰＳ生産菌株であるＣＡ０７−００２２／ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）−（ＲＢＳ）ｓｅｒＣ（特許文献３）を用いて前記大腸菌の膜タンパク質遺伝子の効果を把握しようとし、その結果を下記の表４に示した。
【００８５】
【表４】
2019150038.tif 000006
【００８６】
前記表４で見られるように、大腸菌由来のＣＡ０７−００１２菌株よりＯＰＳ生産能の向上したＣＡ０７−００２２／ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊Ｇ３３６Ｖ）−（ＲＢＳ）ｓｅｒＣに、大腸菌の膜タンパク質遺伝子をさらに導入した菌株のうち、本発明のＹｈｈＳ及びＭｄｔＤ強化株、及び陽性対照群であるＲｈｔＢ強化株の場合、ＯＰＳの生産量が対照群に比べて増加することを再度確認することができた。特に、本発明のＹｈｈＳ及びＭｄｔＤ強化株の場合、前記表３の結果と同様に、ＯＰＳ濃度が１４５％以上上昇する結果を示した。一方、比較群であるＥｒｍＤ強化群及びＹｃａＤ強化群の場合は、対照群に比べてＯＰＳ生産量が減少した結果を示した。
【００８７】
＜実施例３−３：プロモーター強度によるＹｈｈＳ  ＭＦＳトランスポーター及びＹｅ
ｇＢ  ＭＦＳトランスポーターの強化菌株製作、及びＯＰＳ生産能の評価＞
また、ＯＰＳ濃度が対照群に比べて上昇した膜タンパク質ＹｈｈＳ及びＭｄｔＤにおいてプロモーター強度を強化した時、排出能が向上するかどうかを確認するために、ＣＡ０７−００２２／ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）−（ＲＢＳ）ｓｅｒＣにＹｈｈＳ及びＭｄｔＤ遺伝子をさらに導入した。この時、ｒｈｔＢプロモーター（ＰｒｈｔＢ）より強いｔｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）を使用した。
【００８８】
遺伝子ＹｈｈＳ及びｍｄｔＤ断片は、ｐＣＬ−ＰｒｈｔＢ−ｇｅｎｅをＥｃｏＲＶとＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ｐＣＬ１９２０ベクターにｔｒｃプロモーターが挿入されているｐＣＬ−Ｐｔｒｃ−ＧＦＰベクターのＥｃｏＲＶとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素の部位にそれぞれクローニングし、ｐＣＬ−Ｐｔｒｃ−ｙｈｈＳ及びｐＣＬ−Ｐｔｒｃ−ｍｄｔＤを作製した。その後、各プラスミドを鋳型として、配列番号１５及び配列番号１６のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理してｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊Ｇ３３６Ｖ）−（ＲＢＳ）ｓｅｒＣのＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素の部位にクローニングした。
【００８９】
【表５】
2019150038.tif 000007
【００９０】
その結果、前記表５で見られるように、プロモーターを強化して大腸菌膜タンパク質の発現を増加させた場合、対照群に比べて収率が１５０％以上に増加することを確認することができ、ｒｈｔＢプロモーターを使用したときよりも、１２０％以上の収率が増加することを確認した。
【００９１】
＜実施例３−４：染色体上のプロモーター強度によるＹｈｈＳ  ＭＦＳトランスポーター及びＹｅｇＢ  ＭＦＳトランスポーターの強化菌株製作、及びＯＰＳ生産能の評価＞
また、染色体上でＹｈｈＳ及びＭｄｔＤのプロモーターをより強力なプロモーターで変えた場合、排出能が向上するかを確認するために自己プロモーターをｃｊ１プロモーター（特許文献４）で置換された菌株を製作し、Ｏ−ホスホセリンの生産能を評価した。Ｃｊ１プロモーターを大腸菌の染色体に導入する方法は、一般的に用いられる下記方法で製作した。染色体にＹｈｈＳ及びＭｄｔＤがプロモーターを置換するために製作した組換えベクターをＯＰＳ生産菌株であるＣＡ０７−００２２／ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）−（ＲＢＳ）ｓｅｒＣ（特許文献２）に形質転換させて、親菌株が有している自己プロモーター配列と前記ベクター上のプロモーター配列とを相同組換えを通じて置換させることにより、染色体内にｃｊ１プロモーター配列を挿入させた。
【００９２】
それぞれの菌株をＬＢ固体培地に塗抹した後、３３℃の培養器で一晩培養した菌株を、前記表２の２５ｍＬの力価培地に接種した後、これを３４．５℃、２００ｒｐｍの培養器で４０時間培養し、その結果を下記表６に示した。
【００９３】
【表６】
2019150038.tif 000008
【００９４】
前記表６で示されたように、染色体上で各膜タンパク質の発現を増加させた場合、対照群に比べて収率が最大１３０％増加することを確認した。
【００９５】
実施例４：ＹｈｈＳ  ＭＦＳトランスポーター及びＹｅｇＢ  ＭＦＳトランスポーターのＯＰＳ排出機能の確認
実施例３においてＯＰＳ生産が確認された前記フラスコサンプル中、膜タンパク質を強化させていない陰性対照群（negative control）であるＣＡ０７−００２２／ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）−（ＲＢＳ）ｓｅｒＣ、ＹｈｈＳ及びＭｄｔＤタンパク質を強化させたサンプルＣＡ０７−００２２／ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）−（ＲＢＳ）ｓｅｒＣ−Ｐｔｒｃ−ｙｈｈＳ及びＣＡ０７−００２２／ｐＣＬ−Ｐｒｍｆ−ｓｅｒＡ＊（Ｇ３３６Ｖ）−（ＲＢＳ）ｓｅｒＣ−Ｐｔｒｃ−ｍｄｔＤを用いて培地内に排出されたＯＰＳをすべて除去した後、細胞のみを収集し細胞を破砕した。その後、細胞内のＯＰＳ濃度をＨＰＬＣ（high performance liquid chromatography）機器を用いて測定して、その結果を図１に示した。
【００９６】
その結果、図１で示されたように、本発明のＹｈｈＳ及びＭｄｔＤ強化株の場合、対照群に比べて細胞内のＯＰＳ濃度が３０〜４０％まで減少することを確認し、ＹｈｈＳ及びＭｄｔＤタンパク質はＯＰＳを細胞外に排出する役割をしていることを確認した。これにより、ＹｈｈＳ及びＭｄｔＤタンパク質を強化する場合、細胞内部のＯＰＳを円滑に排出することにより、ＯＰＳ生産能を向上させると判断された。
【００９７】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されることがあることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【００９８】
2019150038.tif 000009
【００９９】
2019150038.tif 000010
【図１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年5月24日(2019.5.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｏ−ホスホセリン（O-phosphoserine、OPS）を生産するための、配列番号１または２のアミノ酸配列を有するＯ−ホスホセリンの排出活性を示すポリペプチドの活性が内在的活性に比べて強化された微生物の使用。
【請求項２】
前記微生物が、さらにホスホセリンホスファターゼ（phosphoserine phosphatase、SerB）の活性が内在的活性に比べて弱化されたものである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記微生物が、さらにホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（phosphoglycerate dehydrogenase、SerA）またはホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（phosphoserine aminotransferase、SerC）の活性が内在的活性に比べて強化されたものである、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記微生物が、エシェリキア属、エルウィニア属、セラチア属、プロビデンシア属、コリネバクテリウム属、又はブレビバクテリウム属に属する微生物である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記微生物が大腸菌である、請求項１に記載の使用。
【外国語明細書】
2019150038000001.pdf
2019150038000002.pdf
2019150038000003.pdf
2019150038000004.pdf