(57)【要約】【課題】被験物質が抗癌剤の候補となり得るか否かの評価方法や抗癌剤の候補となり得る被験物質のスクリーニング方法等を提供する。【解決手段】正常細胞を用いた、被験物質が抗癌剤の候補となり得るか否かの評価方法であって、  該被験物質の下記式（１）で定義される増殖期選択的阻害指数（ＲＲＤ値）が大きい程、より抗癌剤の候補となり得ると評価することを特徴とする評価方法。  ＲＲＤ値＝［静止期の正常細胞のＩＣ５０］／［増殖期の正常細胞のＩＣ５０］  （１）【選択図】図６
2019150073.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常細胞を用いた、被験物質が抗癌剤の候補となり得るか否かの評価方法であって、
該被験物質の下記式（１）で定義される増殖期選択的阻害指数（ＲＲＤ値）が大きい程、より抗癌剤の候補となり得ると評価することを特徴とする評価方法。
ＲＲＤ値＝［静止期の正常細胞のＩＣ５０］／［増殖期の正常細胞のＩＣ５０］  （１）
【請求項２】
上記ＲＲＤ値が１０以上のときに抗癌剤の候補となり得ると評価する請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の評価方法を用いて被験物質が抗癌剤の候補となり得るか否かの評価ができるようになっている評価キットであって、
上記正常細胞、該正常細胞のための容器、及び、静止期と増殖期を調製し分ける培地を含むことを特徴とする評価キット。
【請求項４】
更に、ＭＴＴアッセイに使用する器具、及び、細胞に付着させる色素を含む請求項３に記載の評価キット。
【請求項５】
請求項１又は請求項２に記載の評価方法を用いて抗癌剤の候補となり得る被験物質をスクリーニングすることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項６】
請求項５に記載のスクリーニング方法に用いるものであって、
上記正常細胞、該正常細胞のための容器、及び、静止期と増殖期を調製し分ける培地を含むことを特徴とする抗癌剤のスクリーニング用キット。
【請求項７】
更に、ＭＴＴアッセイに使用する器具、及び、細胞に付着させる色素を含む請求項６に記載の抗癌剤のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験物質が抗癌剤の候補となり得るか否かの評価方法、抗癌剤の候補となり得る被験物質のスクリーニング方法、抗癌剤の候補となり得るか否かの評価ができる評価キット、抗癌剤のスクリーニング用キット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗癌剤の開発においては、癌細胞に対する細胞傷害効果に比べて、正常細胞に対する傷害効果が小さい薬剤が探索されることが一般的である。しかしながら、そのようにして得られたほとんどの化合物は前臨床試験の段階で開発棄却されるのが現実である。そのため、より高次の開発過程に進む化合物の絶対数が少なく、治療効果を有する抗癌剤（制癌剤）の開発は遅れている。
【０００３】
発生が終止的段階に到達した個体における正常細胞の多くは、増殖が停止した静止期の状態にある。それに対して、癌細胞は細胞分裂の制御に関する因子の遺伝子変異により増殖の停止ができなくなり、継続的な増殖期の状態にある。実際に、臨床において制癌剤としての治療の有効性が確立されている薬剤は、例外なく正常細胞に対して毒性を示し、臨床上の使用にあたっては、専門的見地からの厳重な注意が必要であるとされている。したがって、正常細胞に対する毒性があるからといって、制癌剤としての有効性が期待できないとは結論できないことは、一般に受け入れられている。
【０００４】
最近、抗癌剤の開発は、癌細胞がもつ特有の機構や分子種に着目した分子標的薬を中心になされている（非特許文献１及び２）。しかし、そのような化合物のほとんどは癌細胞に対して特異的な増殖阻害効果を示さないという問題があった。一方、従来行われていた細胞増殖能の阻害剤を制癌剤として利用するという方法は、癌細胞の増殖抑制には効果があるが、副作用が強いという問題があった。そのため、制癌剤として臨床応用を試みられている化合物の種類は限られているのが現状である。
【０００５】
したがって、増殖期の細胞に対して選択的な細胞傷害効果をもつ化合物をスクリーニングする方法等の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】La Porta CA: Cellular targets for anticancer strategies. Current drug targets 2004, 5(4):347-355.
【非特許文献２】Tsai CJ, Nussinov R: The molecular basis of targeting protein kinases in cancer therapeutics. Semin Cancer Biol 2013, 23(4):235-242.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、被験物質が抗癌剤の候補となり得るか否かの評価方法や、抗癌剤の候補となり得る被験物質のスクリーニング方法等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、静止期の正常細胞のＩＣ５０及び増殖期の正常細胞のＩＣ５０を求めることによって、増殖期の細胞に対して選択的な細胞傷害効果をもつ化合物をスクリーニングでき、上記のようにスクリーニングされた化合物が抗癌剤の候補となり得るか否かの評価方法として有用であることを見出して本発明をするに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、正常細胞を用いた、被験物質が抗癌剤の候補となり得るか否かの評価方法であって、
該被験物質の下記式（１）で定義される増殖期選択的阻害指数（ＲＲＤ値）が大きい程、より抗癌剤の候補となり得ると評価することを特徴とする評価方法を提供するものである。
ＲＲＤ値＝［静止期の正常細胞のＩＣ５０］／［増殖期の正常細胞のＩＣ５０］  （１）
【００１０】
また、本発明は、上記評価方法を用いて抗癌剤の候補となり得る被験物質をスクリーニングすることを特徴とするスクリーニング方法を提供するものである。
【００１１】
また、本発明は、上記評価方法を用いて被験物質が抗癌剤の候補となり得るか否かの評価ができるようになっているものであることを特徴とする評価キットを提供するものである。
【００１２】
また、本発明は、上記スクリーニング方法に用いるものであることを特徴とする抗癌剤のスクリーニング用キットを提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、前記問題点や前記課題を解決し、静止期の正常細胞に対して細胞傷害作用を示さないが、増殖期の細胞に対して強い細胞傷害効果を示す被験物質を、抗癌剤の候補となり得ると評価し、抗癌剤の候補となり得る被験物質をスクリーニングすることができる。
また、このようにスクリーニングされた被験物質は、静止期の正常細胞には傷害を及ぼし難いので、その後の治療試験（治験）でも有利であり、臨床現場で有効性を示す抗癌剤の候補となり得る。
【００１４】
また、本発明の評価方法等は、コスト的に有利であり、簡便かつ効率的な手段によって、抗癌剤の候補となり得る物質をスクリーニングすることができる。
【００１５】
本発明の評価方法やスクリーニング方法等を用いて、実際に、今まで抗癌剤として知られていなかった化合物（タプシガルギン）を、新たに抗癌剤の候補となり得る物質として見出した。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＨＥＬ細胞を用いたＭＴＴアッセイの手順を示した模式図である。
【図２】２種類の被験物質について、濃度を振った時のＨＥＬ細胞の生細胞の存在割合を示す図である。（Ａ、Ｂ）増殖期（Ａ）及び静止期（Ｂ）のＨＥＬ細胞に対するパクリタキセルの細胞毒性の差を示すグラフ、（Ｃ、Ｄ）増殖期（Ｃ）及び静止期（Ｄ）のＨＥＬ細胞に対するＤＭＳＯの細胞毒性の差を示すグラフ
【図３】増殖期特異的に阻害する化合物の探索スキームを示した模式図である。
【図４】分裂停止薬剤によるパクリタキセルの細胞傷害効果の抑制を示した図である。
【図５】分裂停止薬剤によるＤＭＳＯの細胞傷害効果の抑制を示した図である。
【図６】腹水癌モデルマウスに対するタプシガルギンの抗癌作用を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明について説明するが、本発明は、以下の具体的態様に限定されるものではなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。
【００１８】
＜評価方法＞
本発明の評価方法は、正常細胞を用いた、被験物質が抗癌剤の候補となり得るか否かの評価方法であって、
該被験物質の下記式（１）で定義される増殖期選択的阻害指数（ＲＲＤ値）が大きい程、より抗癌剤の候補となり得ると評価することを特徴とする。
ＲＲＤ値＝［静止期の正常細胞のＩＣ５０］／［増殖期の正常細胞のＩＣ５０］  （１）
【００１９】
本明細書において、「増殖期（分裂期）」とは、細胞が増殖（分裂）状態であることをいい、「静止期」とは、細胞の増殖（分裂）が停止している状態をいう。
【００２０】
本明細書において、「正常細胞」とは、「腫瘍細胞（癌細胞）由来の培養細胞ではない細胞」のことをいう。
該正常細胞は、増殖期と静止期の細胞を何れも簡単な操作で得ることができる細胞であることが好ましく、ヒト胎児肺線維芽細胞（Human Embryonic Lung fibroblast、以下「ＨＥＬ細胞」と略記する場合がある）であることがより好ましい。
ＨＥＬ細胞を低濃度血清条件下で培養すると、接触阻害効果が誘導される細胞シートを形成し、増殖が停止した静止期の状態の細胞を容易に維持させることができる。そのため、本発明においては、限定はされないが、「正常細胞」としてＨＥＬ細胞を使用することがより好ましい。静止期の状態にあるＨＥＬ細胞の調製法の例について図１の右側に図示した。
【００２１】
被験物質としては特に限定されず、単独の物質であってもよく、２種以上の物質からなる混合物であってもよい。また、天然由来の物質であってもよく、人工合成物でもよい。
具体的には、例えば、被験物質として、アミノ酸；ジペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド等のペプチド；タンパク質；抗体；ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸；飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸等の脂質；単糖、二糖、オリゴ糖、多糖等の糖；有機化合物；無機化合物；これらの組み合わせ；等が挙げられる。
【００２２】
本明細書において、「抗癌剤」とは、癌細胞に直接的又は間接的に作用することによって、癌細胞の増殖や機能を抑制し又は死滅させる剤をいい、「制癌剤」も含まれる。
【００２３】
本明細書において、増殖期選択的阻害指数（ratio between resting phase IC50 and dividing phase IC50、以下「ＲＲＤ値」と略記する場合がある）は、下記式（１）で定義される。
ＲＲＤ値＝［静止期の正常細胞のＩＣ５０］／［増殖期の正常細胞のＩＣ５０］  （１）
【００２４】
上記式（１）中、「ＩＣ５０（50% Inhibition Concentration）」とは、「５０％細胞増殖阻害濃度」のことをいい、細胞の５０％が死滅する被験物質の濃度を示す。ＩＣ５０は、例えば、実施例に記載の方法により求めることができる。
【００２５】
上記ＲＲＤ値が大きい程、抗癌剤となり得る可能性が高い。ＲＲＤ値が１０以上であることが好ましく、１００以上であることがより好ましく、３００以上であることが特に好ましく、７５０以上であることが更に好ましい。下限が上記であると、抗癌剤の候補となり得る被験物質のスクリーニングの精度が上がる。
【００２６】
＜スクリーニング方法＞
本発明のスクリーニング方法は、上記評価方法を用いて抗癌剤の候補となり得る被験物質をスクリーニングすることを特徴とする。
【００２７】
本発明のスクリーニング方法は、必要に応じてその他の工程を含んでいてもよい。
【００２８】
本発明のスクリーニング方法によって、コスト的に有利に、簡便かつ効率的な手段によって、抗癌剤の候補となり得る物質のスクリーニングが可能である。
該スクリーニング方法で得られた物質は、初期のスクリーニングの段階から静止期の正常細胞には傷害を及ぼし難いものを選択しているので、臨床現場において有効性を示す物質である可能性が極めて高い。
【００２９】
＜評価キット＞
本発明の評価キットは、上記評価方法を用いて被験物質が抗癌剤の候補となり得るか否かの評価ができるようになっているものであることを特徴とする。
【００３０】
例えば、本発明の評価キットには、ＨＥＬ細胞等の正常細胞を含むものであってもよい。また、該正常細胞のための容器、培地等を含むことが好ましい。
また、ＭＴＴアッセイに使用する器具、細胞に付着させる色素等を含めた「装置と化合物」；濃度の異なるＦＢＳ等の静止期と増殖期を調製し分ける培地；等を含むことが好ましい。
【００３１】
＜スクリーニング用キット＞
本発明のスクリーニング用キットは、上記スクリーニング方法に用いるものであることを特徴とする。
【００３２】
例えば、本発明のスクリーニング用キットには、正常細胞を含むものであってもよい。該正常細胞のための容器や培地等を含むものであってもよい。
また、上記評価キットに含まれるものと同様のものが挙げられる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例及び試験例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等の具体的範囲に限定されるものではない。
また、特に記載がない限り、「％」は「質量％」を意味する。
【００３４】
［細胞及び試薬］
ＨＥＬ細胞は、東京大学医科学研究所  感染・免疫部門  ウイルス病態制御分野  川口寧教授より分与してもらった。マウス乳癌細胞ＦＭ３Ａは、学習院大学大学院自然科学研究科生命科学専攻  花岡文雄教授より分与してもらった。
３２４種類の化合物を含む標準阻害剤キットは、化学療法基盤支援活動（Screening Committee of Anticancer Drugs）矢守隆夫班長より供与された。
パクリタキセル、ドデタキセル、タプシガルギン、シスプラチン及びカンプトテシンは、和光純薬工業株式会社より購入した。
増殖阻害薬（シクロヘキシミド、ロバスタチン、サイトカラシンＤ、ＳＢ２２５００２、ボルテゾミブ、ラディシコール）、分裂停止薬剤（細胞分裂同調薬；アフィディコリン、ヒドロキシ尿素、ノコダゾール）、及び、Dulbecco's Modified Eagle's Medium（ＤＭＥＭ、細胞培養試薬）は、ナカライテスク社から、ウシ胎児血清（Fetal bovine serum、ＦＢＳ）は、HyClone社（Logan, UT）から、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液は、Sigma-Aldrich社（St. Louis, MO, USA）からそれぞれ購入した。
【００３５】
［ＨＥＬ細胞を用いたin vitro細胞傷害性解析］
各種化合物のＨＥＬ細胞への傷害性は、ＭＴＴアッセイにより評価した（図１）。
１０％牛血清含有ＤＭＥＭを用いて継代培養されたＨＥＬ細胞を４×１０３個／ウェルで９６ウェルマイクロプレートに播種し、増殖期の状態にあるＨＥＬ細胞として調製した。一晩培養後、各種化合物を含有させた培地に置換して２日間培養した。Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromideを添加して４時間培養後、付着細胞内の色素を可溶化させた。一晩培養後、波長５９５ｎｍにおける吸光度を測定して生細胞の存在割合とした。
【００３６】
一方、継代培養されたＨＥＬ細胞を４×１０４個／ウェルで９６ウェルマイクロプレートに播種し、一晩培養して単層の細胞シートを形成させた。培地を１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに置換して７日間培養し、静止期の状態にあるＨＥＬ細胞として調製した。各種化合物を含有させた培地に置換して２日間培養した。以下、上記の方法と同様にＭＴＴアッセイを実施した。
【００３７】
標準阻害剤ライブラリーを用いた解析では、各種化合物を２μＭ及び０．０２μＭの濃度で添加した２つの条件で、増殖期条件の細胞と静止期条件の細胞に対する細胞傷害性を検討した。また、化合物濃度２μＭの条件における細胞傷害率が４０％以上で、かつ静止期条件の細胞と比べて増殖期条件の細胞に対する細胞傷害率が３倍以上となった化合物を選択した。
【００３８】
［腹水癌モデルマウスを用いたin vivo解析］
in vitro条件下で培養したＦＭ３Ａ細胞をＰＢＳに懸濁し、１×１０６個／マウスの細胞をＣ３Ｈ／Ｈｅ−ＪＪマウス（雌、５週齢）に対して腹腔内投与した。翌日から、タプシガルギンを５６ｍｇ／ｋｇの投与量又はＰＢＳを腹腔内に毎日投与した。検体の生死を毎日観察し、それぞれの群の生存期間を決定した。
【００３９】
［統計学的解析］
本研究における全ての実験は、少なくとも２回以上実施された。数値データは、平均±標準誤差（mean ± standard error of the mean（ＳＥＭ））で表示した。有意差はStudent's t-testを用いて評価した。
【００４０】
実施例１
［増殖期の正常細胞に特異的な細胞毒性化合物の探索系の確立］
まず、増殖期の正常細胞には作用するが、静止期の正常細胞には作用しない細胞毒性化合物を探索する方法の確立を試みた。ＨＥＬ細胞（ヒト胎児肺線維芽細胞）は、添加する血清の濃度を変えることにより、容易に増殖期と静止期の両方の細胞を得ることができる。また、低血清濃度の条件下でコンフルエント（confluent）となったＨＥＬ細胞は、増殖を停止し、その状態で安定した生存率を維持することができる。
そこで、このＨＥＬ細胞を用いた増殖期特異的な細胞毒性化合物のスクリーニング方法を構築した。該スクリーニング方法で使用したＭＴＴアッセイ（MTT assay）の手順を示す模式図を図１に示す。そして、該スクリーニング方法を用いて、本発明者らが有する、様々な細胞内タンパク質を標的とした阻害剤と既存の抗癌剤から構成されるライブラリー（全３２５化合物）の中から、増殖期のＨＥＬ細胞に対して細胞傷害効果を有する化合物を探索した。
【００４１】
表１及び２は、各化合物を２μＭ及び０．０２μＭの濃度で添加したときの、ＭＴＴアッセイによる、増殖期条件の細胞と静止期条件の細胞に対する細胞傷害性を検討した結果である。
表１及び２中の数値（阻害率）はＭＴＴアッセイで測定した吸光度を用いて、以下の計算式によって求めた。
阻害率（％）＝｛１−（被験物質を加えた試料の吸光度）／（溶媒（コントロール）を加えた試料の吸光度）｝×１００
阻害率が高い程、細胞傷害効果が高いことを示す。
【００４２】
【表１】
2019150073.tif 000003
【００４３】
【表２】
2019150073.tif 000004
【００４４】
４４種類の化合物が２μＭ以下で増殖期のＨＥＬ細胞に対して細胞傷害効果を示すことが判明した（表１及び２）。
【００４５】
次に４４種類の化合物の１つであるパクリタキセル（paclitaxel）を、in vitro下で増殖期条件又は静止期条件となるように調製したＨＥＬ細胞に対して２日間作用させた。
結果を図２Ａ及びＢに示す。図中、＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１であることを示す。
増殖期のＨＥＬ細胞に対しては、０．００１μＭで細胞傷害効果を示したが、静止期のＨＥＬ細胞に対しては、１０μＭ添加においても細胞傷害効果を示さなかった。
【００４６】
一方、有機溶媒であり細胞傷害物質であるＤＭＳＯ（Dimethyl sulfoxide）（５％）を、in vitro下で増殖期条件又は静止期条件となるように調製したＨＥＬ細胞に対して２日間作用させた。
結果を図２Ｃ及びＤに示す。図中、＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１であることを示す。
増殖期と静止期の何れにおいても、細胞傷害効果が認められた。
【００４７】
次に上記４４種類の化合物について、増殖期のＨＥＬ細胞に対するＩＣ５０と定常期（静止期）のＨＥＬ細胞に対するＩＣ５０を算出した。更に、静止期の細胞に対するＩＣ５０と増殖期の細胞に対するＩＣ５０の比（静止期細胞のＩＣ５０／増殖期細胞のＩＣ５０）を増殖期選択的阻害指数（ＲＲＤ値）として算出した。
【００４８】
結果を図３及び表３に示す。
表３中、ＩＣ５０はＭＴＴアッセイの結果から、溶媒（ＤＭＳＯ）のみを加えたときの吸光度と比較して、吸光度が半分になる化合物の濃度を示す。
【００４９】
【表３】
2019150073.tif 000005
【００５０】
薬物の細胞傷害効果が増殖期特異的であるとする基準として、その毒性化合物の静止期の細胞に対するＩＣ５０と増殖期の細胞に対するＩＣ５０の比を採用し、以下、この値を増殖期選択的阻害指数（ＲＲＤ値）と呼ぶことにする。一般に、化合物のＲＲＤ値は、１以上となるが、この値が高いほど増殖期特異的な毒性化合物であると考えられ、上記ライブラリー中の化合物について、ＲＲＤ値が１０以上であるものは８種類であった（図３、表３）。
【００５１】
なかでも、ドデタキセル（docetaxel）、パクリタキセル（paclitaxel）、及びタプシガルギン（thapsigargin）は、ＲＲＤ値がそれぞれ６０００、２０００（以上）、７５０と高い値を示した（表３）。一方、有機溶媒であるＤＭＳＯについては、増殖期と静止期でＩＣ５０値は一致しており、ＲＲＤ値は１であった（表３）。また、ＲＲＤ値は化合物によって数千倍以上の違いがあることが判明した。
【００５２】
実施例２
［パクリタキセルの分裂期のＨＥＬ細胞における細胞増殖抑制作用に対する細胞分裂停止薬の効果］
ＲＲＤ値が大きい化合物は、静止期の細胞には毒性を示さず、増殖期の細胞に選択的に傷害を起こすと考えられる。すなわち、それらの薬剤の毒性効果の発現には、細胞が分裂状態であることが必要であると考えられる。そのような化合物は、薬物で分裂を停止させた細胞に対する傷害作用が低下すると予想される。そこで、ＲＲＤ値が２０００倍（以上）であったパクリタキセルについて、細胞増殖抑制作用が細胞増殖阻害剤存在下では低下するか否かを検討した。
【００５３】
アフィディコリン（Aphidicolin）、ヒドロキシ尿素（Hydroxyurea）、ノコダゾール（Nocodazol）は、それぞれＤＮＡポリメラーゼα、ヌクレオチドデヒドロゲナーゼ、及びチューブリンの重合を阻害し、培養細胞の増殖を阻害することが既に知られている。これらの化合物を、in vitro下で増殖期条件のＨＥＬ細胞にそれぞれ作用させ、細胞分裂を静止させた状態とし、パクリタキセルの細胞毒性効果をＭＴＴアッセイにより検討した。パクリタキセルは各種化合物と共に２日間作用させた。
【００５４】
結果を図４及び表４に示す。図４中、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１であることを示す。
パクリタキセルの添加による細胞毒性作用は、いずれの分裂停止薬剤によっても抑制されることがわかった。したがって、少なくともパクリタキセルについては、細胞が分裂状態にあることが、その細胞傷害効果を発揮するのに必要であることがわかった。
また、ＤＭＳＯについても検討した結果、ＤＭＳＯの細胞毒性作用は、分裂停止薬剤の処理によって抑制されなかった（図５）。すなわち、ＤＭＳＯの毒性は、細胞が分裂状態にあることを必要としないことがわかった。
【００５５】
【表４】
2019150073.tif 000006
【００５６】
実施例３
［タプシガルギンの制癌効果］
個体を形成するほとんどの細胞は、静止期にあると考えられている。したがって、ＲＲＤ値が高い薬剤は、これらの静止期の体細胞に対しては毒性を示さず、制癌剤としての効果が期待されると考えられる。実際、ＲＲＤ値が６０００倍、及び２０００倍（以上）であるドデタキセル（docetaxel）とパクリタキセル（paclitaxel）は、臨床において制癌剤として使用されている。そこで我々は、本評価系においてＲＲＤ値が７５０と高い値を示したタプシガルギン（thapsigargin）が胆癌マウスの系で制癌作用を示すかを検討した。
【００５７】
ＦＭ３Ａ細胞を腹腔内移植したマウスに対してタプシガルギン又はＰＢＳを毎日投与して生存を観察した。in vitro条件下で培養したＦＭ３Ａ細胞をＰＢＳに懸濁し、１×１０６個／マウスの細胞をＣ３Ｈ／Ｈｅ−ＪＪマウス（雌、５週齢）に対して腹腔内投与した。翌日から、タプシガルギンを５４ｍｇ／ｋｇの投与量又はＰＢＳを腹腔内に毎日投与し、マウスの生死を毎日観察した。
【００５８】
結果を図６に示す。ＦＭ３Ａ細胞のin vivo腹水癌モデルマウスに対してタプシガルギンを連続投与するとＰＢＳを投与したマウスに比べて有意に生存期間が延長することがわかった。
【００５９】
［実施例のまとめ］
本研究では、正常細胞であるＨＥＬ細胞を用いて、増殖期の細胞に対して強い細胞傷害効果を有するが、静止期の細胞に対する毒性は低い化合物を探索する系を確立した。さらに、本発明者らが保有する化合物ライブラリーから、増殖期の細胞に対して低濃度で細胞傷害効果を有する化合物を複数見出した。更に、増殖期の細胞に対して選択的な細胞傷害効果をもつタプシガルギンは、腹水癌マウスに対して延命効果を導くことを示した。
【００６０】
本発明では、生体内の多くの正常細胞が静止期にあることに着目し、静止期の細胞に対するＩＣ５０と増殖期の細胞に対するＩＣ５０の比（静止期ＩＣ５０／増殖期ＩＣ５０）をＲＲＤ値として定義し、この値が大きい化合物を選別する方法を確立した。実際に、本発明者らが所有する化合物ライブラリーを探索したところ、抗癌剤として臨床応用されているドデタキセルとパクリタキセルが増殖期細胞に対して強い細胞傷害性を有し、大きなＲＲＤ値を示すことを明らかにした。
【００６１】
更に、これまでに抗癌剤としては臨床応用されていない複数の化合物が、増殖期細胞に対して細胞傷害効果を有することを示した。特にＲＲＤ値が高い化合物としてタプシガルギンを同定した。
タプシガルギンはThapsia garganicaから単離された化合物であり、sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase（ＳＥＲＣＡ）という一連の酵素群の阻害剤として利用されている（Lytton J, Westlin M, Hanley MR: Thapsigargin inhibits the sarcoplasmic or endoplasmic reticulum Ca-ATPase family of calcium pumps. J Biol Chem 1991, 266(26):17067-17071）。
タプシガルギンは、in vitro条件下で癌細胞に対して小胞体（ＥＲ）ストレスの誘導を介した細胞毒性を示すこと、また、タプシガルギンのようなＥＲストレス誘導剤は、多剤耐性の性質を有する癌細胞に対して細胞傷害効果を引き起こす能力を有することが既に報告されている。
【００６２】
本実施例では、タプシガルギンが腹水癌マウスモデルに対して延命効果を誘導することを示した。この結果は、ＲＲＤ値が大きい化合物は、抗癌剤としての利用可能性があることを示唆した。よって、本発明の評価方法等は、臨床において、抗癌剤となる化合物のシーズを発見する上で有用であると期待される。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明である評価方法やスクリーニング方法を用いることによって、臨床現場で有効性を示す抗癌剤の候補となり得る化合物のスクリーニング等が可能となり、医薬品業界等に広く利用されるものである。
【図１】
2019150073.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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