(57)【要約】【課題】正常細胞とＮＡＰＲＴが発現している腫瘍細胞の混合細胞集団において、ＮＡＰＲＴ発現腫瘍細胞に対して正常細胞の割合を増やすための方法、及び抗腫瘍剤の処方を補助する方法を提供することを目的とする。【解決手段】  正常細胞とＮＡＰＲＴが発現している腫瘍細胞の混合細胞集団に対し、ＮＡＭＰＴ阻害剤、ＮＡＰＲＴ阻害剤に加えて、ＮＭＮを投与すると、腫瘍細胞に対して正常細胞の割合を増やすことができる。ＮＡＰＲＴが発現している腫瘍を有する哺乳動物個体に対し、ＮＡＭＰＴ阻害剤、ＮＡＰＲＴ阻害剤に加えて、ＮＭＮを投与すると、正常細胞に対する増殖抑制などの副作用を減らすことができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式を有する化合物を有効成分して含有するニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤。
【化１】
2019137638.tif 000018
【請求項２】
請求項１に記載のＮＡＭＰＴ阻害剤を有効成分して含有する抗腫瘍剤。
【請求項３】
ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）の発現が実質的にない腫瘍に対する薬剤である、請求項３に記載の抗腫瘍剤。
【請求項４】
ＮＡＭＰＴ阻害剤以外の抗腫瘍剤と共投与される、請求項３に記載の抗腫瘍剤。
【請求項５】
前記ＮＡＭＰＴ阻害剤以外の抗腫瘍剤との合剤である、請求項４に記載の抗腫瘍剤。
【請求項６】
前記ＮＡＭＰＴ阻害剤以外の抗腫瘍剤が、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）阻害剤である、請求項４または５に記載の抗腫瘍剤。
【請求項７】
ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）が発現している腫瘍に対する薬剤である、請求項６に記載の抗腫瘍剤。
【請求項８】
ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）と共投与される、請求項６または７に記載の抗腫瘍剤。
【請求項９】
ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）との合剤である、請求項９に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１０】
下記式を有する化合物のＮＡＭＰＴ阻害活性を測定する、測定方法。
【化２】
2019137638.tif 000019
（式中、Ｒは、水素、置換されていてもよい炭素原子１〜１２個を有する直鎖又は分枝鎖アルキル基、置換されていてもよい炭素原子３〜６個を有するシクロアルキル基、置換されていてもよい炭素原子２〜６個と二重結合１又は２個を有するアルケニル基、置換されていてもよい炭素原子２〜６個と三重結合１又は２個を有するアルキニル基、置換されていてもよいアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルコキシ基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボニル基、ホルミル基、オキシカルボニル基、カルボキシ基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボキシレート基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルアミド基、アミノカルボニル基、アミノ基、シアノ基、ジアゾ基、ニトロ基、チオ基、スルホキシル基、及びスルホニル基から成る群から独立して選択され、前記アリール基は、炭素環式アリール基又は複素環式アリール基であり、ここで、前記炭素環式アリールは原子６〜２０個を含み、前記複素環式アリールは炭素原子２〜２０個と、窒素、酸素及び硫黄から成る群より選ばれるヘテロ原子１〜５個を含む３〜８員環のアザシクロアルキル基を形成する。置換基における水素原子は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２ハロアルキル基、芳香族炭化水素基または芳香族複素環基等によって置換されている。）
【請求項１１】
ＮＡＭＰＴ阻害剤のスクリーニング方法であって、
請求項１０に記載の化合物の複数種類に対してＮＡＭＰＴ阻害活性を測定する工程と、
ＮＡＭＰＴ阻害活性が得られた化合物をＮＡＭＰＴ阻害剤とする工程と、
を含むスクリーニング方法。
【請求項１２】
ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）阻害剤と共投与される、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤。
【請求項１３】
さらにニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）と共投与される、請求項１２に記載のＮＡＭＰＴ阻害剤。
【請求項１４】
ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤と共投与される、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）阻害剤。
【請求項１５】
さらにニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）と共投与される、請求項１５に記載のＮＡＰＲＴ阻害剤。
【請求項１６】
ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤とニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）阻害剤とを有効成分として含有する、抗腫瘍剤。
【請求項１７】
さらにニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）を含有する、請求項１６に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１８】
ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）阻害剤のスクリーニング方法であって、
ニコチン酸を含有する細胞培養用培地中で、ＮＡＰＲＴを発現している腫瘍細胞に対して、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤に加えてＮＡＰＲＴ阻害剤の候補となる化合物を投与する工程と、
前記腫瘍細胞の増殖及び／又は生死を調べる
工程と、
を含むスクリーニング方法。
【請求項１９】
前記ニコチン酸の濃度が、１．０μＭ以上である、請求項１９のスクリーニング方法。
【請求項２０】
前記ニコチン酸の濃度が、３．０μＭ以上である、請求項１９のスクリーニング方法。
【請求項２１】
前記培地が、エタノールアミンを含有する、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２２】
前記エタノールアミンの濃度が、１０．０μＭ以上である、請求項２２のスクリーニング方法。
【請求項２３】
前記エタノールアミンの濃度が、１００．０μＭ以上である、請求項２１のスクリーニング方法。
【請求項２４】
６−アミノニコチン酸を有効成分して含有するニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）阻害剤。
【請求項２５】
６−アミノニコチン酸を有効成分して含有する抗腫瘍剤。
【請求項２６】
ＮＡＰＲＴ阻害剤以外の抗腫瘍剤と共投与される、請求項２５に記載の抗腫瘍剤。
【請求項２７】
前記ＮＡＰＲＴ阻害剤以外の抗腫瘍剤との合剤である、請求項２６に記載の抗腫瘍剤。
【請求項２８】
前記ＮＡＰＲＴ阻害剤以外の抗腫瘍剤が、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤である、請求項２６または２７に記載の抗腫瘍剤。
【請求項２９】
ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）と共投与される、請求項２８に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３０】
ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）との合剤である、請求項２９に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３１】
ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）が発現している腫瘍に対する薬剤である、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３２】
下記式を有する化合物のＮＡＰＲＴ阻害活性を測定する、測定方法。
［化］
2019137638.tif 000020
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、独立して、水素、置換されていてもよい炭素原子１〜１２個を有する直鎖又は分枝鎖アルキル基、置換されていてもよい炭素原子３〜６個を有するシクロアルキル基、置換されていてもよい炭素原子２〜６個と二重結合１又は２個を有するアルケニル基、置換されていてもよい炭素原子２〜６個と三重結合１又は２個を有するアルキニル基、置換されていてもよいアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルコキシ基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボニル基、ホルミル基、オキシカルボニル基、カルボキシ基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボキシレート基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルアミド基、アミノカルボニル基、アミノ基、シアノ基、ジアゾ基、ニトロ基、チオ基、スルホキシル基、及びスルホニル基から成る群から独立して選択され、前記アリール基は、炭素環式アリール基又は複素環式アリール基であり、ここで、前記炭素環式アリールは原子６〜２０個を含み、前記複素環式アリールは炭素原子２〜２０個と、窒素、酸素及び硫黄から成る群より選ばれるヘテロ原子１〜５個を含む３〜８員環のアザシクロアルキル基を形成する。置換基における水素原子は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２ハロアルキル基、芳香族炭化水素基または芳香族複素環基等によって置換されている。）
【請求項３３】
ＮＡＰＲＴ阻害剤のスクリーニング方法であって、
請求項３２に記載の化合物の複数種類に対してＮＡＰＲＴ阻害活性を測定する工程と、
ＮＡＰＲＴ阻害活性が得られた化合物をＮＡＰＲＴ阻害剤とする工程と、
を含むスクリーニング方法。
【請求項３４】
１．０μＭ以上のニコチン酸及び１０．０μＭ以上のエタノールアミンを含有する細胞培養用培地。
【請求項３５】
３．０μＭ以上のニコチン酸及び１００．０μＭ以上のエタノールアミンを含有する細胞培養用培地。
【請求項３６】
請求項１８〜２３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法に用いるための培地である、請求項３４または３５に記載の培地。
【請求項３７】
in vitroにおいて、正常細胞とニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）を発現している腫瘍細胞との混合細胞集団において、腫瘍細胞に対して正常細胞の割合を増やすための方法であって、
前記腫瘍細胞に、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）阻害剤、ＮＡＭＰＴ阻害剤、及びニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）を投与する工程、を含む方法。
【請求項３８】
腫瘍を有する哺乳類個体に対して投与する抗腫瘍剤の処方を補助する方法であって、
前記腫瘍患者の生検検体における腫瘍細胞がニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）を発現しているかどうか調べる工程と、
前記腫瘍細胞におけるＮＡＰＲＴの発現レベルが所定レベル以下の場合、前記薬剤として、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤を選択し、前記発現レベルが前記所定レベルより高い場合、前記薬剤として、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）阻害剤、ＮＡＭＰＴ阻害剤、及びニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）を選択することを提示する工程と、
を含む方法。
【請求項３９】
正常細胞とニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）が発現している腫瘍細胞の混合細胞集団に対し、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）類縁体が腫瘍細胞に対して正常細胞の割合を増やすかどうかを調べる方法であって、
ＮＡＭＰＴ阻害剤、ＮＡＰＲＴ阻害剤、及び前記ＮＭＮ類縁体を前記正常細胞と前記腫瘍細胞に投与する工程、および、
前記正常細胞と前記腫瘍細胞各々の増殖及び／又は生死をしらべる工程と、
を含み、
前記ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）類縁体が以下の構造式である方法。
【化２】
2019137638.tif 000021
（式中、Ｒ１は、水素またはリン酸基であり、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素または炭素数３〜２４のアシル基から選択される基である。）
【請求項４０】
正常細胞とニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）が発現している腫瘍細胞の混合細胞集団に対し、腫瘍細胞に対して正常細胞の割合を増やす薬剤のスクリーニング方法であって、
ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）阻害剤、及びニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）類縁体を前記正常細胞と前記腫瘍細胞に投与する工程、および、
前記正常細胞と前記腫瘍細胞各々の増殖及び／又は生死をしらべる工程と、
を含む方法であって、
前記ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）類縁体が以下の構造式である、
【化２】
2019137638.tif 000022
（式中、Ｒ１は、水素またはリン酸基であり、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素または炭素数３〜２４のアシル基から選択される基である。）
方法。
【請求項４１】
前記正常細胞と前記腫瘍細胞が培養細胞であって、
請求項３７、３９〜４０のいずれか１項に記載の方法がニコチン酸を含有する培地中で行われる、方法。
【請求項４２】
前記ニコチン酸の濃度が、１．０μＭ以上である、請求項４１の方法。
【請求項４３】
前記ニコチン酸の濃度が、３．０μＭ以上である、請求項４１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤およびそれを含有する抗腫瘍剤、新規ＮＡＭＰＴ阻害剤のスクリーニング方法、新規ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）阻害剤およびそれを含有する抗腫瘍剤、新規ＮＡＰＲＴ阻害剤のスクリーニング方法、腫瘍細胞に対して正常細胞の割合を増やすための方法、並びに抗腫瘍剤の処方を補助する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）は、生体内のエネルギー代謝系に関与する重要な補酵素である。細胞内ＮＡＤ＋合成について、哺乳動物では、図１に示すように、トリプトファン（Ｔｒｐ）を材料としてキノリン酸（ＱＡ）を経るｄｅ  ｎｏｖｏ合成経路とニコチンアミド（ＮＡＭ）、ニコチン酸（ＮＡ）及びニコチンアミドリボシド（ＮＲ）を材料とする３つのサルベージ（salvage）経路の、合計４つの合成経路が知られている。
【０００３】
腫瘍細胞は、これらの経路のうち、主としてニコチンアミドを利用することが見出されており、正常な細胞で利用されるニコチン酸やトリプトファンは、利用され得ないか、または少なくとも細胞の生存に十分な程度までは利用され得ないと考えられている（例えば特許文献１参照）。したがって、ニコチンアミドをニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）に変換する酵素ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）は、腫瘍特異的薬物を選択するための標的分子となっている。例えば、ＦＫ８６６／ＡＰＯ８６６（例えば、非特許文献１参照）、ＣＨＳ８２８／ＧＭＸ１７７８およびそのプロドラッグＥＢ１６２７／ＧＭＸ１７７７（例えば、非特許文献２参照）などのＮＡＭＰＴ阻害剤は、抗腫瘍剤として知られている。これらのＮＡＭＰＴ阻害剤によってＮＡＤ＋濃度を低下させると、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの酵素活性が低下することによってがん細胞が依存する解糖系が抑制され、抗腫瘍作用が生じる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／００６９８８
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｈａｓｍａｎｎ ａｎｄ Ｓｃｈｅｍａｉｎｄａ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６３（２１）：７４６３-７４４２
【非特許文献２】Ｈｊａｒｎａａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９；５７５１-５７５７；Ｂｉｎｄｅｒｕｐ，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ １５：２４９１-２４９４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤およびそれを含有する抗腫瘍剤、新規ＮＡＭＰＴ阻害剤のスクリーニング方法、新規ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）阻害剤およびそれを含有する抗腫瘍剤、新規ＮＡＰＲＴ阻害剤のスクリーニング方法、腫瘍細胞に対して正常細胞の割合を増やすための方法、並びに抗腫瘍剤の処方を補助する方法、を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述したように、腫瘍細胞は、主としてニコチンアミドを利用し、正常な細胞で利用されるニコチン酸やトリプトファンは、利用され得ないか、または少なくとも細胞の生存に十分な程度までは利用され得ないと考えられていた。しかしながら、本願発明者らは、新規ＮＡＭＰＴ阻害剤を求めてスクリーニングし、腫瘍細胞に対する効果を確かめる中で、腫瘍細胞を培養する際、ニコチン酸を含有した培地でＮＡＭＰＴ阻害剤を添加しても、抗腫瘍作用が見られない場合があることを見出した。この発見から、本願発明者らは、（１）ＮＡＤ＋の材料としてニコチン酸を利用できる腫瘍細胞があること（２）そのような腫瘍細胞では、ＮＡＭＰＴ阻害剤とともにＮＡＰＲＴ阻害剤を投与しないと、抗腫瘍作用が生じないこと（３）ＮＡ欠乏による抗腫瘍効果を観察するアッセイ系では、細胞培養用培地にＮＡが必要であること、などを明らかにし、本判明の完成に至った。本発明の主な実施態様は以下のとおりである。
【０００８】
（１）本発明の一実施態様は、下記式を有する化合物を有効成分して含有するニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤である。
【０００９】
【化１】
2019137638.tif 000002
【００１０】
（２）本発明の一実施態様は、上記ＮＡＭＰＴ阻害剤を有効成分して含有する抗腫瘍剤である。この抗腫瘍剤が、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）の発現が実質的にない腫瘍に対する薬剤であってもよい。
【００１１】
また、この抗腫瘍剤が、ＮＡＭＰＴ阻害剤以外の抗腫瘍剤と共投与されてもよく、この場合、ＮＡＭＰＴ阻害剤以外の抗腫瘍剤との合剤であってもよい。また、ＮＡＭＰＴ阻害剤以外の抗腫瘍剤が、ＮＡＰＲＴ阻害剤であってもよい。
【００１２】
ＮＡＰＲＴ阻害剤と共投与される上記抗腫瘍剤は、ＮＡＰＲＴが発現している腫瘍に対する薬剤であってもよい。また、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）と共投与されてもよく、この場合、ＮＭＮとの合剤であってもよい。
【００１３】
（３）本発明の一実施態様は、下記式を有する化合物のＮＡＭＰＴ阻害活性を測定する、測定方法である。
【００１４】
【化２】
2019137638.tif 000003
（式中、Ｒは、水素、置換されていてもよい炭素原子１〜１２個を有する直鎖又は分枝鎖アルキル基、置換されていてもよい炭素原子３〜６個を有するシクロアルキル基、置換されていてもよい炭素原子２〜６個と二重結合１又は２個を有するアルケニル基、置換されていてもよい炭素原子２〜６個と三重結合１又は２個を有するアルキニル基、置換されていてもよいアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルコキシ基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボニル基、ホルミル基、オキシカルボニル基、カルボキシ基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボキシレート基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルアミド基、アミノカルボニル基、アミノ基、シアノ基、ジアゾ基、ニトロ基、チオ基、スルホキシル基、及びスルホニル基から成る群から独立して選択され、前記アリール基は、炭素環式アリール基又は複素環式アリール基であり、ここで、前記炭素環式アリールは原子６〜２０個を含み、前記複素環式アリールは炭素原子２〜２０個と、窒素、酸素及び硫黄から成る群より選ばれるヘテロ原子１〜５個を含む３〜８員環のアザシクロアルキル基を形成する。置換基における水素原子は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２ハロアルキル基、芳香族炭化水素基または芳香族複素環基等によって置換されている。）
【００１５】
本発明の他の実施態様は、複数種類の上記化合物のＮＡＭＰＴ阻害活性を測定する工程と、ＮＡＭＰＴ阻害活性が得られた化合物をＮＡＭＰＴ阻害剤とする工程と、を含むＮＡＭＰＴ阻害剤のスクリーニング方法である。
【００１６】
（４）本発明の一実施態様は、ＮＡＰＲＴ阻害剤と共投与される、ＮＡＭＰＴ阻害剤である。さらにＮＭＮと共投与されてもよい。
【００１７】
（５）本発明の一実施態様は、ＮＡＭＰＴ阻害剤と共投与される、ＮＡＰＲＴ阻害剤である。さらにＮＭＮと共投与されてもよい。
【００１８】
（６）本発明の一実施態様は、ＮＡＭＰＴ阻害剤とＮＡＰＲＴ阻害剤とを有効成分として含有する、抗腫瘍剤である。さらにＮＭＮを含有してもよい。
【００１９】
（７）本発明の一実施態様は、ニコチン酸を含有する細胞培養用培地中で、ＮＡＰＲＴを発現している腫瘍細胞に対してＮＡＭＰＴ阻害剤に加えてＮＡＰＲＴ阻害剤の候補となる化合物を投与する工程と、前記腫瘍細胞の増殖及び／又は生死を調べる工程と、を含む、ＮＡＰＲＴ阻害剤のスクリーニング方法である。ニコチン酸の濃度が、１．０μＭ以上または３．０μＭ以上であってもよい。培地が、エタノールアミンを含有してもよく、エタノールアミンの濃度が、１０．０μＭ以上または１００．０μＭ以上であってもよい。
【００２０】
（８）本発明の一実施態様は、６−アミノニコチン酸を有効成分して含有するＮＡＰＲＴ阻害剤である。
【００２１】
（９）本発明の一実施態様は、６−アミノニコチン酸を有効成分して含有する抗腫瘍剤である。ＮＡＰＲＴ阻害剤以外の抗腫瘍剤と共投与されてもよく、この場合、ＮＡＰＲＴ阻害剤以外の抗腫瘍剤との合剤であってもよい。ＮＡＰＲＴ阻害剤以外の抗腫瘍剤が、ＮＡＭＰＴ阻害剤であってもよい。
【００２２】
ＮＡＰＲＴ阻害剤以外の抗腫瘍剤と共投与される抗腫瘍剤が、さらにＮＭＮと共投与されてもよく、この場合、ＮＭＮとの合剤であってもよい。
【００２３】
この抗腫瘍剤は、ＮＡＰＲＴが発現している腫瘍に対する薬剤であってもよい。
【００２４】
（１０）本発明の一実施態様は、下記式を有する化合物のＮＡＰＲＴ阻害活性を測定する、測定方法である。
【００２５】
【化３】
2019137638.tif 000004
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、独立して、水素、置換されていてもよい炭素原子１〜１２個を有する直鎖又は分枝鎖アルキル基、置換されていてもよい炭素原子３〜６個を有するシクロアルキル基、置換されていてもよい炭素原子２〜６個と二重結合１又は２個を有するアルケニル基、置換されていてもよい炭素原子２〜６個と三重結合１又は２個を有するアルキニル基、置換されていてもよいアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルコキシ基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボニル基、ホルミル基、オキシカルボニル基、カルボキシ基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボキシレート基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルアミド基、アミノカルボニル基、アミノ基、シアノ基、ジアゾ基、ニトロ基、チオ基、スルホキシル基、及びスルホニル基から成る群から独立して選択され、前記アリール基は、炭素環式アリール基又は複素環式アリール基であり、ここで、前記炭素環式アリールは原子６〜２０個を含み、前記複素環式アリールは炭素原子２〜２０個と、窒素、酸素及び硫黄から成る群より選ばれるヘテロ原子１〜５個を含む３〜８員環のアザシクロアルキル基を形成する。置換基における水素原子は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２ハロアルキル基、芳香族炭化水素基または芳香族複素環基等によって置換されている。）
本発明の他の実施態様は、複数種類の上記化合物のＮＡＰＲＴ阻害活性を測定する工程と、ＮＡＰＲＴ阻害活性が得られた化合物をＮＡＰＲＴ阻害剤とする工程と、を含むＮＡＰＲＴ阻害剤のスクリーニング方法である。
【００２６】
（１１）本発明の一実施態様は、１．０μＭ以上のニコチン酸及び１０．０μＭ以上のエタノールアミンを含有する細胞培養用培地である。３．０μＭ以上のニコチン酸及び１００．０μＭ以上のエタノールアミンを含有してもよい。（７）に記載のスクリーニング方法に用いるための培地であってもよい。
【００２７】
（１２）本発明の一実施態様は、in vitroにおいて、正常細胞とＮＡＰＲＴを発現している腫瘍細胞との混合細胞集団において、腫瘍細胞に対して正常細胞の割合を増やすための方法であって、腫瘍細胞に、ＮＡＰＲＴ阻害剤、ＮＡＭＰＴ阻害剤、及びＮＭＮを投与する工程、を含む方法である。
【００２８】
（１３）本発明の一実施態様は、腫瘍を有する哺乳類個体に対して投与する抗腫瘍剤の処方を補助する方法であって、腫瘍患者の生検検体における腫瘍細胞がＮＡＰＲＴを発現しているかどうか調べる工程と、腫瘍細胞におけるＮＡＰＲＴの発現レベルが所定レベル以下の場合、薬剤としてＮＡＭＰＴ阻害剤を選択し、発現レベルが所定レベルより高い場合、薬剤としてＮＡＰＲＴ阻害剤、ＮＡＭＰＴ阻害剤、及びＮＭＮを選択することを提示する工程と、を含む方法である。
【００２９】
（１４）本発明の一実施態様は、ＮＭＮ類縁体が正常細胞とＮＡＰＲＴが発現している腫瘍細胞の混合細胞集団に対し、腫瘍細胞に対して正常細胞の割合を増やすかどうかを調べる方法であって、ＮＡＭＰＴ阻害剤、ＮＡＰＲＴ阻害剤、及びＮＭＮ類縁体を正常細胞と腫瘍細胞各々に投与する工程、および、正常細胞と腫瘍細胞各々の増殖及び／又は生死をしらべる工程と、を含み、ＮＭＮ類縁体が以下の構造式である方法である。
【００３０】
【化４】
2019137638.tif 000005
（式中、Ｒ１は、水素またはリン酸基であり、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素または炭素数３〜２４のアシル基から選択される基である。）
【００３１】
本発明の他の実施態様は正常細胞とＮＡＰＲＴが発現している腫瘍細胞の混合細胞集団に対し、腫瘍細胞に対して正常細胞の割合を増やす薬剤のスクリーニング方法であって、ＮＡＭＰＴ阻害剤、ＮＡＰＲＴ阻害剤、及びＮＭＮ類縁体を正常細胞と前記腫瘍細胞各々に投与する工程、および、正常細胞と前記腫瘍細胞各々の増殖及び／又は生死をしらべる工程と、を含む方法であって、ＮＭＮ類縁体が以下の構造式である、
【００３２】
【化５】
2019137638.tif 000006
（式中、Ｒ１は、水素またはリン酸基であり、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素または炭素数３〜２４のアシル基から選択される基である。）
方法である。
【００３３】
正常細胞と腫瘍細胞が培養細胞であって、これらの方法がニコチン酸を含有する培地中で行われてもよく、ニコチン酸の濃度が、１．０μＭ以上または３．０μＭ以上であってもよい。
【発明の効果】
【００３４】
本発明によって、新規ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤およびそれを含有する抗腫瘍剤、新規ＮＡＭＰＴ阻害剤のスクリーニング方法、新規ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）阻害剤およびそれを含有する抗腫瘍剤、新規ＮＡＰＲＴ阻害剤のスクリーニング方法、選択的に前記腫瘍細胞を殺す方法、並びに最適薬剤の選択方法選択を補助する方法、を提供できるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ＮＡＤ＋の前駆体とその生体内代謝経路を示した図である。
【図２】本発明の実施例で用いられた、ＴＬＭ１１８〜ＴＬＭ１２１の構造である。
【図３】本発明の一実施例において、ＴＬＭ１１８処理群及びＦＫ８６６処理群の腫瘍担持マウスでは、腫瘍体積の増大が抑制されたことを示すグラフである。
【図４】本発明の一実施例において、腫瘍細胞又は正常細胞を、３種のＮＡＤ＋前駆体ＮＡ，ＱＡ，またはＮＲとＦＫ８６６をそれぞれＦＫ８６６の濃度を変えて併用処理し、細胞生存率の変化を測定したグラフである。
【図５】本発明の一実施例において、図４のデータの細胞生存率の代わりに、増殖抑制からの回復率を算出して表したグラフである。
【図６】本発明の一実施例において、ＮＡＰＲＴが機能している腫瘍細胞における、ＮＡＭＰＴ阻害剤とＮＡＰＲＴ阻害剤の併用による細胞増殖抑制効果を調べたグラフである。
【図７】本発明の一実施例において、ＮＡＰＲＴを発現している腫瘍細胞株では、ＮＭＮの同時使用によって、ＮＡＭＰＴ阻害剤とＮＡＰＲＴ阻害剤とによる細胞増殖抑制が抑圧され、増殖が回復することを示す図である。
【図８】本発明の一実施例において、培養液中のエタノールアミンが細胞増殖増強作用を有することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００３７】
（１）ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤
本発明の一実施形態であるＮＡＭＰＴ阻害剤は、下記一般式を有する化合物を有効成分として含有する。
【００３８】
【化６】
2019137638.tif 000007
特に、図２に示すＴＬＭ１１８〜１２１が好ましい。
【００３９】
これらのＮＡＭＰＴ阻害剤は抗腫瘍剤として利用できる。腫瘍の種類は特に限定されないが、乳癌、前立腺癌、肺癌、胃癌、結腸・盲腸・直腸等の大腸癌、十二指腸・空腸・回腸等の小腸癌、十二指腸癌、子宮体癌、子宮頚癌、皮膚癌、扁平上皮癌、膀胱癌、膵癌、肝癌、腎癌、精巣癌、卵巣癌、舌癌、食道癌、咽頭癌、喉頭癌、口腔癌、胆嚢癌、頚癌、甲状腺癌、骨癌、脳腫瘍、グリオーマ、中皮腫、肉腫、骨肉腫、線維腫、脂肪腫、粘液腫、軟骨腫、骨腫、血管腫、黒色腫、筋腫、神経腫、神経膠腫、筋肉腫、線維肉腫、乳頭腫、腺腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫などが例示できる。
【００４０】
これらのＮＡＭＰＴ阻害剤を単独で投与する場合、特にニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）阻害剤と共投与しない場合、治療対象の腫瘍は、ＮＡＰＲＴの発現が正常細胞より低いか、実質的に発現がない腫瘍であることが好ましい。この場合の比較の対象である正常細胞は、腫瘍と同じ組織由来であることが好ましい。
【００４１】
投与方法は特に限定されず、全身投与または局所投与のいずれでもよく、経口投与、非経口投与のいずれであってもよい。非経口投与としては、静脈内投与、動脈内投与、皮下、皮内、筋肉内への投与、腫瘍内への投与などを例示できる。投与量は特に限定されず、投与方法、腫瘍の種類、患者の条件（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）などに応じて適宜選択される。
【００４２】
これらのＮＡＭＰＴ阻害剤は、他の抗腫瘍剤と共投与してもよい。ＮＡＭＰＴ阻害剤と他の抗腫瘍剤とは、それぞれの単剤として投与してもよく、合剤として投与してもよい。他の抗腫瘍剤の投与量も特に限定されず、ＮＡＭＰＴ阻害剤と相加的または相乗的効果が得られるように、投与方法、腫瘍の種類、患者の条件（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）などに応じて適宜決定される。なお、本明細書において、共投与とは、それぞれの有効な効果の少なくとも一部が重複するように投与することであって、時間的には前後して投与しても、投与方法が異なっていてもよい。
【００４３】
ＮＡＭＰＴ阻害剤と共投与される抗腫瘍剤は、特に限定されないが、ＮＡＭＰＴ阻害剤以外の抗腫瘍剤であることが好ましく、ＮＡＰＲＴ阻害剤であることが好ましい。ＮＡＰＲＴ阻害剤と共投与する場合、治療対象の腫瘍は、ＮＡＰＲＴの発現があるものが好ましい。
【００４４】
ＮＡＭＰＴ阻害剤及びＮＡＰＲＴ阻害剤を共投与する場合、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）をさらに共投与することが好ましい。それによって、主に正常細胞に対して増殖を回復させることができるため、正常細胞に対するＮＡＰＲＴ阻害剤による副作用を抑制することができる。ＮＭＮと、ＮＡＭＰＴ阻害剤またはＮＡＰＲＴ阻害剤は、それぞれの単剤として投与してもよく、合剤として投与してもよい。ＮＭＮの投与量も特に限定されず、正常細胞に対するＮＡＰＲＴ阻害剤による副作用を抑制する効果が得られるように、投与方法、腫瘍の種類、患者の条件（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）などに応じて適宜決定される。
【００４５】
なお、ＴＬＭ１１８〜１２１は、以下のようにして合成できる。
【００４６】
【化７】
2019137638.tif 000008
【００４７】
まず、上記化合物１を公知の方法で合成する（Helvetica Chimica Acta, 2012, vol.95, p.34-42）。次に、化合物１、1H-pyrrolo[3,2-c]pyridine-2-carboxylic acid、及びＨＡＴＵのＤＭＦ溶液をＤＩＥＡに徐々に添加した後、アルゴン中、室温で、スターラーで混合する。得られた混合溶液から、カラムクロマトグラフィーで上記化合物ＴＬＭ１１８を精製する。ＴＬＭ１１９〜１２１や（２）に後述するＴＬＭ１１８類縁体は、上記化合物１を合成する際に用いるＰｈＣＯＣｌの代わりに、フェニル基があらかじめ修飾されたＰｈＣＯＣｌを用いることによって合成することができる。
【００４８】
（２）リード化合物を用いた新規ＮＡＭＰＴ阻害剤のスクリーニング方法
本発明の一実施形態は、下記式を有する化合物のＮＡＭＰＴ阻害活性を測定する、測定方法である。
【００４９】
【化８】
2019137638.tif 000009
（式中、Ｒは、水素、置換されていてもよい炭素原子１〜１２個を有する直鎖又は分枝鎖アルキル基、置換されていてもよい炭素原子３〜６個を有するシクロアルキル基、置換されていてもよい炭素原子２〜６個と二重結合１又は２個を有するアルケニル基、置換されていてもよい炭素原子２〜６個と三重結合１又は２個を有するアルキニル基、置換されていてもよいアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルコキシ基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボニル基、ホルミル基、オキシカルボニル基、カルボキシ基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボキシレート基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルアミド基、アミノカルボニル基、アミノ基、シアノ基、ジアゾ基、ニトロ基、チオ基、スルホキシル基、及びスルホニル基から成る群から独立して選択され、前記アリール基は、炭素環式アリール基又は複素環式アリール基であり、ここで、前記炭素環式アリールは原子６〜２０個を含み、前記複素環式アリールは炭素原子２〜２０個と、窒素、酸素及び硫黄から成る群より選ばれるヘテロ原子１〜５個を含む３〜８員環のアザシクロアルキル基を形成する。置換基における水素原子は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２ハロアルキル基、芳香族炭化水素基または芳香族複素環基等によって置換されている。）
本発明の他の実施形態は、ＮＡＭＰＴ阻害剤のスクリーニング方法であって、下記式を有する複数種類の化合物のＮＡＭＰＴ阻害活性を測定する工程と、
【００５０】
【化９】
2019137638.tif 000010
（式中、Ｒは、水素、置換されていてもよい炭素原子１〜１２個を有する直鎖又は分枝鎖アルキル基、置換されていてもよい炭素原子３〜６個を有するシクロアルキル基、置換されていてもよい炭素原子２〜６個と二重結合１又は２個を有するアルケニル基、置換されていてもよい炭素原子２〜６個と三重結合１又は２個を有するアルキニル基、置換されていてもよいアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルコキシ基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボニル基、ホルミル基、オキシカルボニル基、カルボキシ基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボキシレート基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルアミド基、アミノカルボニル基、アミノ基、シアノ基、ジアゾ基、ニトロ基、チオ基、スルホキシル基、及びスルホニル基から成る群から独立して選択され、前記アリール基は、炭素環式アリール基又は複素環式アリール基であり、ここで、前記炭素環式アリールは原子６〜２０個を含み、前記複素環式アリールは炭素原子２〜２０個と、窒素、酸素及び硫黄から成る群より選ばれるヘテロ原子１〜５個を含む３〜８員環のアザシクロアルキル基を形成する。置換基における水素原子は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２ハロアルキル基、芳香族炭化水素基または芳香族複素環基等によって置換されている。）ＮＡＭＰＴ阻害活性が得られた化合物をＮＡＭＰＴ阻害剤とする工程と、を含むスクリーニング方法である。
【００５１】
ここで、ＮＡＭＰＴ阻害活性を測定する具体的な測定方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、組換えＮＡＭＰＴタンパク質を作製し、ＮＡＭＰＴ反応系に０．０１〜１０μＭの上記化合物を加えた場合のＮＡＭＰＴ活性を測定し、化合物を加えない場合のＮＡＭＰＴ活性と比較することによって、上記化合物のＮＡＭＰＴ阻害活性を測定することができる。簡便に行うため、CycLex NAMPT Colorimetric Assay Kitなどの市販品を用いてもよい。
【００５２】
このようにＮＡＭＰＴ阻害活性を測定する際、上記化合物を用いることによって、ＴＬＭ１１８よりＮＡＭＰＴ阻害活性の強い化合物を得ることができる可能性が高くなる。
【００５３】
（３）ＮＡＰＲＴ阻害剤とＮＡＭＰＴ阻害剤の共投与
本願発明者らは、ＮＡＤ＋の材料としてニコチン酸を利用できる腫瘍細胞があることを見出した。このことから、ＮＡＰＲＴ阻害剤とＮＡＭＰＴ阻害剤を共投与することで、より広範囲の腫瘍に対し、抗腫瘍剤として使用できるようになる。腫瘍の種類は特に限定されず、（１）に例示したものでもよい。
【００５４】
ＮＡＰＲＴ阻害剤とＮＡＭＰＴ阻害剤を共投与する場合、治療対象の腫瘍は、ＮＡＰＲＴが発現している腫瘍であることが好ましく、特に、ＮＡＤ＋についてＮＡＰＲＴの活性だけで腫瘍細胞の生存が維持できるレベルになるように、ＮＡＰＲＴが発現していることが好ましい。
【００５５】
本発明の一実施形態は、ＮＡＰＲＴ阻害剤と共投与されるＮＡＭＰＴ阻害剤、またはＮＡＭＰＴ阻害剤と共投与されるＮＡＰＲＴ阻害剤、である。これらは単剤であっても合剤であってもよい。単剤の場合、両者の投与方法は同じであっても異なっていてもよい。各阻害剤の投与量は、これらが相乗効果を得られるように、投与方法、腫瘍の種類、患者の条件（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）などに応じて適宜決定される。
【００５６】
ＮＡＭＰＴ阻害剤は、（１）に上述した化合物であっても、公知のものであってもよい。例えば、ＡＳ１６０４４９８、ＡＳ２３３４９９０、ＡＳ２２９２４２７（以上、アステラス製薬化合物ライブラリー）、ＧＭＸ１７７８、ＳＴＦ−１１８８０４、Ｐ７Ｃ３（以上、セレック社）、ＣＨＳ８２８などを例示できる。
【００５７】
ＮＡＰＲＴ阻害剤は、（５）に後述する化合物であっても、公知のものであってもよい。例えば、２−ヒドロキシニコチン酸などを例示できる。
【００５８】
ＮＡＭＰＴ阻害剤及びＮＡＰＲＴ阻害剤を共投与する場合、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）をさらに共投与することが好ましい。それによって、正常細胞に対するＮＡＰＲＴ阻害剤による副作用を抑制することができる。ＮＭＮと、ＮＡＭＰＴ阻害剤及びＮＡＰＲＴ阻害剤は、それぞれを単剤として投与してもよく、いずれか２つもしくは３つを合剤として投与してもよい。ＮＭＮの投与量も特に限定されず、正常細胞に対するＮＡＰＲＴ阻害剤による副作用を抑制する効果が得られるように、投与方法、腫瘍の種類、患者の条件（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）などに応じて適宜決定される。
【００５９】
（４）培養細胞を用いた新規ＮＡＰＲＴ阻害剤のスクリーニング方法
本発明の一実施形態にかかるＮＡＰＲＴ阻害剤のスクリーニング方法は、ニコチン酸およびＮＡＭＰＴ阻害剤に加え、ＮＡＰＲＴ阻害剤の候補となる化合物を含有する細胞培養用培地中で、ＮＡＰＲＴを発現している腫瘍細胞を培養する工程と、腫瘍細胞の増殖及び／又は生死を調べる工程と、を含む。
【００６０】
細胞培養用培地は特に限定されないが、培養細胞に適しているものであればよく、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＲＰＭＩ、またはそれらの混合培地が例示できる。細胞培養用培地に含有しているニコチン酸の濃度は特に限定されないが、細胞がＮＡＭＰＴ阻害剤の存在下で生存できる濃度であることが好ましく、例えば、０．５μＭ以上であることが好ましく、１．０μＭ以上であることがより好ましく、３．０μＭ以上であることがさらに好ましく、１０．０μＭ以上であることがさらに好ましい。また、５００．０μＭ以下であることが好ましく、３００．０μＭ以下であることがより好ましく、１００．０μＭ以下であることがさらに好ましい。この細胞培養用培地が、さらにエタノールアミンを含有することが好ましく、それによって細胞増殖能が向上する。培地中のエタノールアミンの濃度は特に限定されないが、１０．０μＭ以上であることが好ましく、３０．０μＭ以上であることがより好ましく、１００．０μＭ以上であることがさらに好ましい。また、５．０ｍＭ以下であることが好ましく、３．０ｍＭ以下であることがより好ましく、１．０ｍＭ以下であることがさらに好ましい。
【００６１】
ＮＡＰＲＴを発現している腫瘍細胞は特に限定されないが、ＮＡとＮＡＭＰＴ阻害剤の存在下で生存できるレベルでＮＡＰＲＴを発現していることが好ましい。腫瘍の種類は特に限定されず、（１）に例示したものでもよい。
【００６２】
ＮＡＭＰＴ阻害剤は特に限定されず、（３）に述べたものから適宜選択すればよい。その濃度も、技術常識から容易に設定でき、例えば、ＮＡＰＲＴを発現していない腫瘍細胞に対して、増殖しないか、または細胞死を起こさせる最低濃度以上であり、細胞（正常細胞が好ましいが、それに限定されない）に対して非特異的に細胞死を起こさせる最低濃度未満であることが好ましい。具体的には、複数のＮＡＰＲＴを発現していない腫瘍細胞に対して、増殖しないか、または細胞死を起こさせる最低濃度を測定し、もっとも高い最低濃度以上とする、及び複数の正常細胞に対して、増殖しないか、または細胞死を起こさせる最低濃度を測定し、もっとも低い最低濃度以下とするなどとすることによって、ＮＡＭＰＴ阻害剤の濃度を決めることができる。具体的には、０．１〜１０００ｎＭが好ましく、１〜１００ｎＭがより好ましい。
【００６３】
ＮＡＰＲＴ阻害剤の候補となる化合物の濃度も、技術常識から容易に設定でき、例えば、０．１〜１０００μＭが好ましく、１〜１００μＭがより好ましい。
【００６４】
腫瘍細胞の増殖及び／又は生死を調べる方法は特に限定されず、公知の技術を用いることができる。例えば、候補となる化合物の処理の前後で、生細胞数を数えればよい。生細胞数は、血球計算板を用いて数えることもできるし、死細胞が混在しているような場合は、WST-8やトリパンブルーで染色することによって、生細胞と死細胞を染め分けて測定することもできる。
【００６５】
候補となる化合物を含有する培地で培養した細胞の増殖抑制または細胞死によって、所定時間後に、当該化合物を含有しない培地で培養したコントロールの細胞より細胞数が減少した場合に、その化合物をＮＡＰＲＴ阻害剤と特定し、所定時間後でもコントロールの細胞と細胞数の変化がない場合に、その化合物をＮＡＰＲＴ阻害剤ではないと特定する。
【００６６】
候補となる化合物は、特に限定されないが、以下の一般式を有する化合物であることが好ましい。
【００６７】
【化１０】
2019137638.tif 000011
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、独立して、水素、置換されていてもよい炭素原子１〜１２個を有する直鎖又は分枝鎖アルキル基、置換されていてもよい炭素原子３〜６個を有するシクロアルキル基、置換されていてもよい炭素原子２〜６個と二重結合１又は２個を有するアルケニル基、置換されていてもよい炭素原子２〜６個と三重結合１又は２個を有するアルキニル基、置換されていてもよいアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルコキシ基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボニル基、ホルミル基、オキシカルボニル基、カルボキシ基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボキシレート基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルアミド基、アミノカルボニル基、アミノ基、シアノ基、ジアゾ基、ニトロ基、チオ基、スルホキシル基、及びスルホニル基から成る群から独立して選択され、前記アリール基は、炭素環式アリール基又は複素環式アリール基であり、ここで、前記炭素環式アリールは原子６〜２０個を含み、前記複素環式アリールは炭素原子２〜２０個と、窒素、酸素及び硫黄から成る群より選ばれるヘテロ原子１〜５個を含む３〜８員環のアザシクロアルキル基を形成する。置換基における水素原子は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２ハロアルキル基、芳香族炭化水素基または芳香族複素環基等によって置換されている。）
【００６８】
（５）ＮＡＰＲＴ阻害剤
本発明の一実施形態であるＮＡＰＲＴ阻害剤は、下記一般式を有する化合物を有効成分として含有する。
【００６９】
【化１３】
2019137638.tif 000012
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、独立して水素、ハロゲン、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３ハロアルキルからなる群より選択される。）
特に、以下の６−アミノニコチン酸が好ましい。
【００７０】
【化１４】
2019137638.tif 000013
【００７１】
これらのＮＡＰＲＴ阻害剤は抗腫瘍剤として利用できる。腫瘍の種類は特に限定されず、（１）に例示したものでもよい。
【００７２】
これらのＮＡＰＲＴ阻害剤を単独で投与する場合、特にＮＡＭＰＴ阻害剤と共投与しない場合、治療対象の腫瘍は、ＮＡＭＰＴの発現が正常細胞より低いか、実質的に発現がない腫瘍であることが好ましい。この場合の正常細胞は、腫瘍と同じ組織由来であることが好ましい。
【００７３】
投与方法は特に限定されず、全身投与または局所投与のいずれでもよく、経口投与、非経口投与のいずれであってもよい。非経口投与としては、静脈内投与、動脈内投与、皮下、皮内、筋肉内への投与、腫瘍内への投与などを例示できる。投与量は特に限定されず、投与方法、腫瘍の種類、患者の条件（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）などに応じて適宜選択される。
【００７４】
これらのＮＡＰＲＴ阻害剤は、他の抗腫瘍剤と共投与してもよい。ＮＡＰＲＴ阻害剤と他の抗腫瘍剤とは、それぞれの単剤として投与してもよく、合剤として投与してもよい。他の抗腫瘍剤の投与量も特に限定されず、ＮＡＭＰＴ阻害剤と相加的または相乗的効果が得られるように、投与方法、腫瘍の種類、患者の条件（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）などに応じて適宜決定される。
【００７５】
他の抗腫瘍剤は、特に限定されないが、ＮＡＰＲＴ阻害剤以外の抗腫瘍剤であることが好ましく、ＮＡＭＰＴ阻害剤であることが好ましい。この場合、治療対象の腫瘍は、ＮＡＭＰＴの発現があるものが好ましい。
【００７６】
ＮＡＭＰＴ阻害剤及びＮＡＰＲＴ阻害剤を共投与する場合、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）をさらに共投与することが好ましい。それによって、正常細胞に対するＮＡＰＲＴ阻害剤による副作用を抑制することができる。ＮＭＮと、ＮＡＭＰＴ阻害剤またはＮＡＰＲＴ阻害剤は、それぞれの単剤として投与してもよく、合剤として投与してもよい。ＮＭＮの投与量も特に限定されず、正常細胞に対するＮＡＰＲＴ阻害剤による副作用を抑制する効果が得られるように、投与方法、腫瘍の種類、患者の条件（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）などに応じて適宜決定される。
【００７７】
（６）リード化合物を用いた新規ＮＡＰＲＴ阻害剤のスクリーニング方法
本発明の一実施形態は、下記式を有する化合物のＮＡＰＲＴ阻害活性を測定する、測定方法である。
【００７８】
【化１１】
2019137638.tif 000014
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、独立して、水素、置換されていてもよい炭素原子１〜１２個を有する直鎖又は分枝鎖アルキル基、置換されていてもよい炭素原子３〜６個を有するシクロアルキル基、置換されていてもよい炭素原子２〜６個と二重結合１又は２個を有するアルケニル基、置換されていてもよい炭素原子２〜６個と三重結合１又は２個を有するアルキニル基、置換されていてもよいアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルコキシ基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボニル基、ホルミル基、オキシカルボニル基、カルボキシ基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボキシレート基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルアミド基、アミノカルボニル基、アミノ基、シアノ基、ジアゾ基、ニトロ基、チオ基、スルホキシル基、及びスルホニル基から成る群から独立して選択され、前記アリール基は、炭素環式アリール基又は複素環式アリール基であり、ここで、前記炭素環式アリールは原子６〜２０個を含み、前記複素環式アリールは炭素原子２〜２０個と、窒素、酸素及び硫黄から成る群より選ばれるヘテロ原子１〜５個を含む３〜８員環のアザシクロアルキル基を形成する。置換基における水素原子は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２ハロアルキル基、芳香族炭化水素基または芳香族複素環基等によって置換されている。）
【００７９】
本発明の他の実施形態は、下記式を有する複数種類の化合物のＮＡＰＲＴ阻害活性を測定する工程と、
【化１２】
2019137638.tif 000015
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、独立して、水素、置換されていてもよい炭素原子１〜１２個を有する直鎖又は分枝鎖アルキル基、置換されていてもよい炭素原子３〜６個を有するシクロアルキル基、置換されていてもよい炭素原子２〜６個と二重結合１又は２個を有するアルケニル基、置換されていてもよい炭素原子２〜６個と三重結合１又は２個を有するアルキニル基、置換されていてもよいアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルコキシ基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボニル基、ホルミル基、オキシカルボニル基、カルボキシ基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボキシレート基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルアミド基、アミノカルボニル基、アミノ基、シアノ基、ジアゾ基、ニトロ基、チオ基、スルホキシル基、及びスルホニル基から成る群から独立して選択され、前記アリール基は、炭素環式アリール基又は複素環式アリール基であり、ここで、前記炭素環式アリールは原子６〜２０個を含み、前記複素環式アリールは炭素原子２〜２０個と、窒素、酸素及び硫黄から成る群より選ばれるヘテロ原子１〜５個を含む３〜８員環のアザシクロアルキル基を形成する。置換基における水素原子は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２ハロアルキル基、芳香族炭化水素基または芳香族複素環基等によって置換されている。）
ＮＡＰＲＴ阻害活性が得られた化合物をＮＡＰＲＴ阻害剤とする工程と、を含むＮＡＰＲＴ阻害剤のスクリーニング方法である。
【００８０】
ここで、ＮＡＰＲＴ阻害活性を測定する具体的な測定方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、組換えＮＡＰＲＴタンパク質を作製し、ＮＡＰＲＴ反応系に０．０１〜１０μＭの上記化合物を加えた場合のＮＡＰＲＴ活性を測定し、化合物を加えない場合のＮＡＰＲＴ活性と比較することによって、上記化合物のＮＡＰＲＴ阻害活性を測定することができる。
【００８１】
このように上記化合物を用いてＮＡＰＲＴ阻害活性を測定することによって、ＮＡＰＲＴ阻害活性を有する化合物を得ることができる可能性が高くなる。
【００８２】
（７）腫瘍細胞に対して正常細胞の割合を増やすための方法、および抗腫瘍剤の選択を補助する方法
本発明の一実施態様は、in vitroにおいて、正常細胞とＮＡＰＲＴを発現している腫瘍細胞との混合細胞集団において、腫瘍細胞に対して正常細胞の割合を増やすための方法であって、腫瘍細胞に、ＮＡＰＲＴ阻害剤、ＮＡＭＰＴ阻害剤、及びＮＭＮを投与する工程、を含む方法である。薬剤、特にＮＭＮの濃度を最適化することによって腫瘍細胞に特異的に増殖抑制及び／又は細胞死の効果を及ぼすことができる。一方、ＮＡＰＲＴの発現レベルが所定レベル以下の場合、ＮＡＭＰＴ阻害剤を選択し、ＮＡＰＲＴ阻害剤及びＮＭＮは選択しなくてもよい。
【００８３】
混合細胞集団とは、細胞レベルで混在していてもよく、腫瘍細胞集団と正常細胞集団が同じ培養系の中に存在していてもよい。培地は、ニコチン酸を含有した、（４）で記載した培地を使用することが好ましい。
【００８４】
本発明の他の実施形態は、腫瘍を有する哺乳類個体に対して投与する抗腫瘍剤の選択を補助する方法であって、腫瘍細胞がＮＡＰＲＴを発現しているかどうか調べ、発現レベルが所定レベルより高い場合、薬剤として、ＮＡＰＲＴ阻害剤、ＮＡＭＰＴ阻害剤、及びＮＭＮを選択することを提示する方法である。それによって、正常細胞に対する副作用を少なくし、腫瘍に対して増殖抑制及び／又は細胞死のより大きな効果を及ぼす薬剤の選択を補助することができる。一方、ＮＡＰＲＴの発現レベルが所定レベル以下の場合、ＮＡＭＰＴ阻害剤を選択し、ＮＡＰＲＴ阻害剤及びＮＭＮは選択しないことを提示しなくてもよい。
【００８５】
腫瘍細胞がＮＡＰＲＴを発現しているかどうか調べる方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、in vitroの場合、腫瘍特異的抗体と用いたＦＡＣＳなどで腫瘍細胞だけを濃縮してサンプルとすることができる。in vivoでは、生検サンプルを用いることができ、生検サンプルにおいて、例えばＲＮＡレベルではＲＴ−ＰＣＲなど、タンパクレベルでは抗体染色などを用いて発現レベルを調べることができる。間接的ではあるが、腫瘍細胞を培養し、ＮＡＭＰＴ阻害剤を投与しても残存し、ＮＡＰＲＴ阻害剤とＮＡＭＰＴ阻害剤を共投与すると増殖抑制及び／又は細胞死が生じることを観察することで、ＮＡＰＲＴを発現していると判断してもよい。
【００８６】
ここで、所定レベルとは、ＮＡＭＰＴ阻害剤を投与した時にＮＡＰＲＴを用いてＮＡＤ＋を合成することによって残存できる最小の発現量以上であり、ＮＡＰＲＴ阻害剤によって、特異的に阻害されて増殖抑制及び／又は細胞死が生じる最大の発現量以下の範囲にある。
【００８７】
なお、用いるＮＡＭＰＴ阻害剤やＮＡＭＰＴ阻害剤は、上述の選択肢から選ぶことができる。
【００８８】
（８）ＮＭＮ類縁体
上述のように、ＮＭＮは、ＮＡＰＲＴ阻害剤とＮＡＭＰＴ阻害剤とを共投与する際に正常細胞への副作用を少なくし、腫瘍細胞の損傷を特異的にする効果がある。
【００８９】
本発明の一実施形態は、正常細胞とＮＡＰＲＴが発現している腫瘍細胞に対し、選択的に腫瘍細胞の増殖抑制及び／又は細胞死が生じるかどうかを調べる方法であって、ＮＡＭＰＴ阻害剤、ＮＡＰＲＴ阻害剤、及び以下の一般式を有するＮＭＮまたはその類縁体を、in vitroで正常細胞と腫瘍細胞に投与する工程、および、正常細胞と腫瘍細胞の増殖及び／又は生死をしらべる工程と、を含む方法である。
【００９０】
［化］
2019137638.tif 000016
（式中、Ｒ１は、水素またはリン酸基であり、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素または炭素数３〜２４のアシル基から選択される基である。）
【００９１】
アシル基のカルボニル炭素に結合している炭化水素基は、炭素数２〜２３の直鎖状または分岐鎖状の、飽和または不飽和の炭化水素基となる。
【００９２】
Ｒ１およびＲ２における前記アシル基の炭素数は、３〜１８であることが好ましく、３〜１２であることがより好ましく、３〜６であることが特に好ましい。前記アシル基のカルボニル炭素に結合している炭化水素基の炭素数は、２〜２９であり、３〜２３であることが好ましく、４〜１９であることがより好ましく、５〜１５であることが特に好ましい。
【００９３】
本発明の他の実施形態は、ＮＡＰＲＴ阻害剤とＮＡＭＰＴ阻害剤に共投与する薬剤のスクリーニング方法であって、ＮＡＰＲＴ阻害剤、ＮＡＭＰＴ阻害剤、及び候補となる上記一般式のＮＭＮ類縁体を、in vitroで正常細胞とＮＡＰＲＴが発現している腫瘍細胞に投与する工程、および、それらの細胞の増殖及び／又は生死をしらべる工程と、を含む。
【００９４】
いずれの方法においても、正常細胞と腫瘍細胞は、混合していても、別々の集合体であってもよい。混合していても、例えば、腫瘍細胞特異的なマーカーを同時に使うことによって、選択的に腫瘍細胞の増殖抑制及び／又は細胞死が生じるかどうかを調べることができる。
【００９５】
培地は、ニコチン酸を含有した、（４）で記載した培地を使用することが好ましい。培地に含有させるＮＡＰＲＴ阻害剤とＮＡＭＰＴ阻害剤は特に限定されず、（３）に例示したものでもよい。ＮＡＰＲＴを発現している腫瘍細胞は特に限定されないが、ＮＡＭＰＴ阻害剤の存在下で生存できるレベルでＮＡＰＲＴを発現していることが好ましい。腫瘍の種類は特に限定されず、（１）に例示したものでもよい。
【００９６】
細胞の増殖及び／又は生死を調べる方法は特に限定されず、公知の技術を用いることができる。例えば、候補となる化合物の処理の前後で、生細胞数を数えればよい。生細胞数は、血球計算板を用いて数えることもできるし、死細胞が混在しているような場合は、WST-8やトリパンブルーで染色することによって、生細胞と死細胞を染め分けて測定することもできる。
【００９７】
スクリーニング方法においては、候補となるＮＭＮ類縁体を含有する培地で培養した細胞の増殖抑制または細胞死によって、所定時間後に、腫瘍細胞について、そのＮＭＮ類縁体を含有しない培地で培養したコントロールの腫瘍細胞より細胞数が減少し、正常細胞について、そのＮＭＮ類縁体を含有しない培地で培養したコントロールの正常細胞と細胞数がほぼ変わらない場合に、その化合物をＮＡＰＲＴ阻害剤と特定し、所定時間後でもコントロールの細胞と細胞数の変化がない場合に、その化合物をＮＡＰＲＴ阻害剤とＮＡＭＰＴ阻害剤に共投与する薬剤とする。このスクリーニング方法によって、選択的に腫瘍細胞の増殖抑制及び／又は細胞死を生じさせることのできる薬剤の組み合わせを選択することができる。
【００９８】
このように上記化合物を用いて正常細胞と腫瘍細胞の増殖及び／又は生死をしらべることによって、選択的に腫瘍細胞の増殖抑制及び／又は細胞死を生じさせることのできる薬剤を容易に得ることができるようになる。
【実施例】
【００９９】
（１）ＴＬＭ１１８の合成
ＴＬＭ１１８は、以下のようにして合成した。
【０１００】
2019137638.tif 000017
【０１０１】
まず、上記化合物１を公知の方法で合成する（Helvetica Chimica Acta, 2012, vol.95, p.34-42）。次に、化合物１（７２ｍｇ，０．２４６ｍｍｏｌ，１ｅｑ．）、1H-pyrrolo[3,2-c]pyridine-2-carboxylic acid （４１ｍｇ，０．２４６ｍｍｏｌ，１ｅｑ．）、及びＨＡＴＵ（９４ｍｇ，０．２４６ｍｍｏｌ，１ｅｑ．）のＤＭＦ溶液をＤＩＥＡ（６４μＬ，０．３６９ｍｍｏｌ，１．５ｅｑ．）に徐々に転嫁した後、アルゴン中、室温で１２時間、スターラーで混合した。得られた混合溶液を真空で濃縮した。その後、シリカゲル（１０％メタノール―９０％ＤＣＭ）カラムクロマトグラフィーで精製し、３０ｍｇの上記化合物ＴＬＭ１１８が得られた（収率３０％）。
【０１０２】
1H NMR (500 MHz; CD3OD): δ8.86 (s, 1H), 8.20 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 7.47-7.42 (m, 4H), 7.37-7.35 (m, 2H), 4.59 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 3.68 (d, J = 10 Hz, 1H), 3.40 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.06 (t, J = 10 Hz, 1H), 2.82 (t, J = 10 Hz, 1H), 1.84 (d, J = 10 Hz, 1H), 1.67-1.59 (m, 5H), 1.47-1.33 (m, 5H).
13C NMR (500 MHz; CD3OD): 
δ163.0, 145.5, 141.8, 141.6, 137.4, 130.9, 129.7, 126.3, 108.8, 103.3, 79.5, 43.7, 40.6, 37.14, 37.09, 33.9, 33.1, 30.7, 25.0
【０１０３】
（２）ＴＬＭ１１８及びその類縁体のＮＡＭＰＴ阻害活性
本実施例では、ＴＬＭ１１８がＮＡＭＰＴ阻害活性を有することを示す。
【０１０４】
具体的には、ＴＬＭ１１８について、Cyclex NAMPT Colorimetric Assay Kit (Cyclex)を用いて、０．０３〜１０μＭの範囲でＮＡＭＰＴ阻害活性を測定し、ＩＣ５０を算出した。コントロールとして、従来からよく知られているＮＡＭＰＴ阻害化合物であるＦＫ８６６を用いた。
【０１０５】
その結果、ＦＫ８６６及びＴＬＭ１１８は濃度依存的にＮＡＭＰＴ活性を阻害し、ＩＣ５０は、それぞれ、０．６２及び０．１９μＭであった。
【０１０６】
このように、ＴＬＭ１１８は、ＦＫ８６６に比較して、強力なＮＡＭＰＴ阻害活性を有する。
【０１０７】
（３）ＴＬＭ１１８及びその類縁体の細胞増殖抑制効果（in vitro）
本実施例では、培養ヒト腫瘍細胞を用いて、図２に示すＴＬＭ１１８〜１２１の化合物が細胞増殖抑制活性を有することを示す。
【０１０８】
ヒト膵臓腺癌細胞株ＰＡＮＣ１、ヒト大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６、非小胞性肺がん細胞株ＮＣＩ-Ｈ５２２、急性白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔは、American Type Collection （ＡＴＣＣ）から購入した。培地として、ＰＡＮＣ１細胞及びＨＣＴ１１６細胞は、Ｄ−ＭＥＭ（High-glucose）(Wako, Cat #043-30085)を、ＮＣＩ-Ｈ５２２及びＪｕｒｋａｔは、ＲＰＭＩ−１６４０を用いた。それぞれの培地に、１０％ＦＢＳ（Biosera, Cat # FB-1061/500）及びペニシリン／ストレプトマイシン(Wako, Cat #168-23191)を追加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。
【０１０９】
まず、９６ウエルのディッシュにＰＡＮＣ１を２０００個／ウエルで、ＨＣＴ１１６及びＮＣＩ-Ｈ５２２は１０００個／ウエルの濃度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１６〜２４時間培養した後、ＴＬＭ１１８〜１２１を０．１ｎＭ〜３０μＭの範囲で培地に添加した。その後７２時間さらに培養し、ＷＳＴ-８試薬を添加して細胞生存率を測定した。
【０１１０】
その結果、ＦＫ８６６、ＴＬＭ１１８〜１２１は、濃度依存的に腫瘍細胞の増殖を阻害し、ＥＣ５０は、それぞれ、５．０μＭ、２６ｎＭ，２４ｎＭ、２０ｎＭ、１８ｎＭであった。
【０１１１】
次に、ＦＫ８６６及びＴＬＭ１１８については、コロニー・フォーミング・アッセイを行って腫瘍細胞の増殖阻害活性を確認した。ＰＡＮＣ１細胞を６ウエルのディッシュに４００個／２ｍＬ／ウエルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１６〜２４時間培養した後、薬剤処理を行った。薬剤処理後１０日間培養を行い、細胞を４％中性緩衝ホルマリン溶液で固定、０．１％（ｗ／ｖ）クリスタルバイオレットで染色した。洗浄、風乾後、コロニー数を計測してコロニー形成能を算出した。
【０１１２】
その結果、ＦＫ８６６及びＴＬＭ１１８は、コロニー・フォーミング・アッセイにおいても、濃度依存的に腫瘍細胞の増殖を阻害し、ＥＣ５０は、それぞれ、１８、５．４ｎＭであった。
【０１１３】
このように、ＴＬＭ１１８及びその類縁体である化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）は、ＦＫ８６６に比較して、強力な腫瘍細胞の増殖阻害活性を有する。
【０１１４】
（４）ＴＬＭ１１８の制がん効果（in vivo）
本実施例では、担がんモデルマウスを用いて、ＴＬＭ１１８が抗腫瘍活性を有することを示す。
【０１１５】
免疫不全ヌードマウスであるBALB/cAJcl-nu/nu (日本クレア)を搬入後１週間順化し、ＰＡＮＣ１細胞を１×１０６個／１００μＬ／個体で移植することで担癌マウスを作出した。その後、腫瘍体積が約３５ｃｍ３に成長した時（実験開始時とする）、ＴＬＭ１１８を１日２回４日間連続で投与した。以後、２８日目まで、週に２回、腫瘍体積と体重を測定した。
【０１１６】
その結果、図３に示すように、化合物非投与（ＮＴ）群、ＴＬＭ１１８処理群、ＦＫ８６６処理群のいずれにおいても、マウスの体重減少は見られなかった（図３Ａ）。一方、腫瘍体積はＮＴ群で実験開始時の２．５倍まで増大したのに対し、ＴＬＭ１１８処理群、ＦＫ８６６処理群では腫瘍体積の増大が見られなかった（図３Ｂ）。
【０１１７】
このように、in vivoにおいても、ＴＬＭ１１８は、ＦＫ８６６と少なくとも同じレベルの抗腫瘍効果を示す。
【０１１８】
（５）腫瘍細胞におけるＮＡＤ＋生合成経路
本実施例では、ヒト腫瘍細胞の中で、ＮＡＰＲＴが機能している腫瘍細胞があることを示す。
【０１１９】
腫瘍細胞のモデルとして、ヒト肺腺がん細胞株ＮＣＩ-Ｈ５２２及びヒト大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６を、正常細胞のモデルとして、ヒト網膜上皮由来細胞株ＡＲＰＥ-１９を、ＡＴＣＣから購入した。培地として、ＮＣＩ-Ｈ５２２細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０(Wako, Cat #189-02025)、ＨＣＴ１１６細胞は、Ｄ−ＭＥＭ（High-glucose）(Wako, Cat #043-30085)、ＡＲＰＥ-１９細胞は、Ｄ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２(Wako, Cat #042-30555)を用いた。それぞれの培地に、１０％ＦＢＳ (Biosera, Cat # FB-1061/500)及びペニシリン／ストレプトマイシン (Wako, Cat #168-23191)を追加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。３〜４日おきに継代培養を行った。
【０１２０】
これらの細胞に、濃度を段階的に希釈した３種のＮＡＤ＋前駆体ＮＡ，ＱＡ，ＮＲとＦＫ８６６（ＮＣＩ-Ｈ５２２：８ｎＭ、ＨＣＴ１１６：２６．５ｎＭ、ＡＲＰＥ-１９：５８ｎＭ）をそれぞれ併用処理し、細胞生存率をＷＳＴアッセイを用いて評価した（図４）。ＷＳＴアッセイは（２）と同様に行った。また、その時の回復率を（対照群-ＦＫ８６６と各前駆体添加群）／（対照群-ＦＫ８６６単剤処理した群）×１００（％）として求めた（図５）。斜線で示した領域は、生体内に存在していると考えられている濃度領域であり、ＮＡ：１０μＭ、ＱＡ：＜３μＭ、ＮＲ：３μＭである。
【０１２１】
その結果、図４及び図５に示すように、ＮＡＭＰＴ阻害剤ＦＫ８６６の存在下で、ＮＡを添加した場合、ＮＣＩ-Ｈ５２２では増殖が回復しないのに対し、ＨＣＴ１１６、ＡＲＰＥ-１９では、１μＭの添加では増殖がほぼ回復した。ＱＡでは、いずれも増殖がほとんど回復しなかった。ＮＲは、いずれの細胞の場合も、ＮＲの濃度依存的に増殖が回復し、生体内での濃度と比べてはるかに高濃度で添加することで、ようやく増殖が回復した。
【０１２２】
なお、ＮＣＩ-Ｈ５２２では、ＮＡＭＰＴ阻害剤ＦＫ８６６でＮＡＤ＋濃度が低下し、ＮＡ添加によってもＮＡＤ＋濃度は低下したままであるのに対し、ＨＣＴ１１６、ＡＲＰＥ-１９では、ＮＡＭＰＴ阻害剤ＦＫ８６６でＮＡＤ＋濃度が低下するが、ＮＡ添加によって増殖が回復するとともに、ＮＡＤ＋濃度も回復する。
【０１２３】
このように、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成経路とＮＡＭ、ＮＡ及びＮＲを材料とする３つのサルベージ経路のうち、ＮＣＩ-Ｈ５２２では、ＮＡＭＰＴが発現し、ＮＡＭを材料とするサルベージ経路が主に機能し、ＨＣＴ１１６、ＡＲＰＥ-１９では、ＮＡＭＰＴ及びＮＡＰＲＴが発現し、ＮＡＭ及びＮＡを材料とするサルベージ経路が主に機能している。
【０１２４】
（６）ＮＡＰＲＴが機能している腫瘍細胞における、ＮＡＭＰＴ阻害剤とＮＡＰＲＴ阻害剤の併用による細胞増殖抑制効果
本実施例では、ＮＡＰＲＴが機能している腫瘍細胞において、ＮＡ存在下でも、ＮＡＭＰＴ阻害剤とＮＡＰＲＴ阻害剤を併用すれば細胞増殖を抑制できることを示す。
【０１２５】
ＨＣＴ１１６、ＡＲＰＥ-１９をＦＫ８６６（２６．５nM）、ＮＡ（３μM）、２-ＨＮＡ（１ｍM）の様々な組み合わせで処理し、その際の細胞生存率をＷＳＴアッセイで評価した。ＷＳＴアッセイは（２）と同様に行った。
【０１２６】
その結果、図６に示すように、ＨＣＴ１１６、ＡＲＰＥ-１９では、ＮＡの存在下で、ＮＡＭＰＴ阻害剤であるＦＫ８６６は細胞増殖抑制効果を失うが、ＮＡＰＲＴ阻害剤である２-ＨＮＡを追加すると、細胞増殖抑制効果が生じた。
【０１２７】
このように、ＮＡＰＲＴが機能している細胞では、ＮＡＭ及びＮＡを材料とするサルベージ経路を両方阻害することによって、細胞増殖を抑制することができる。
【０１２８】
（７）ＮＭＮの併用による、ＮＡＭＰＴ阻害剤とＮＡＰＲＴ阻害剤とによる細胞増殖抑制の抑圧
本実施例では、ＮＡＭＰＴ阻害剤とＮＡＰＲＴ阻害剤とＮＭＮを併用すれば、ＮＡＭＰＴ阻害剤とＮＡＰＲＴ阻害剤とによる細胞増殖抑制が抑圧され、増殖が回復するが、正常細胞のほうが腫瘍細胞より、回復率が高いことを示す。
【０１２９】
ＮＡＰＲＴを発現していない腫瘍細胞株（ＮＣＩ−Ｈ５５２、ＮＣＩ−Ｈ４６０（ＮＡＭＰＴ−）、Ａ−５４９、ＰＣ３、ＭＩＡＰａＣａ−２、ＨＴ１０８０、Ｔ９８Ｇ、Ｕ２５１．Ｇ３６１、ＷＭ−２６６−４）、ＮＡＰＲＴを発現している腫瘍細胞株（８７５、Ｌｕ１３９、ＨＣＴ−１１６、Ｃｏｌｏ２０５、Ｕ−８７ＭＧ、ＳＫＯＶ３、ＰＡＮＣ−１）及び正常細胞株（ＡＲＰＥ−１０、Ｗ１３８、ＭＲＣ５、ＴＩＧ−１２０、正常ヒト上皮性ケラチノサイト）をＮＡ（３μＭ）＋ＦＫ８６６（２６．５ｎＭ）、ＮＡ（３μＭ）＋ＦＫ８６６（２６．５ｎＭ）＋２−ＨＮＡ（１ｍＭ）、またはＮＡ（３μＭ）＋ＦＫ８６６（２６．５ｎＭ）＋２−ＨＮＡ（１ｍＭ）＋１〜１００μＭのＮＭＮで処理し、その際の細胞生存率をＷＳＴアッセイで評価した。ＷＳＴアッセイは（２）と同様に行った。その結果に対し、ＥＣ５０（ｎＭ）を算出した。
【０１３０】
図７に示したように、ＮＡ＋ＦＫ８６６（上段）では、ＮＡＰＲＴを発現していない腫瘍細胞株の細胞生存率は低く、ＮＡＰＲＴを発現している腫瘍細胞株及び正常細胞株では細胞生存率は高かった。ＮＡ＋ＦＫ８６６＋２−ＨＮＡ（中段）では、ＮＡＰＲＴを発現している腫瘍細胞株及び正常細胞株でも細胞生存率は低くなった。ところが、それにＮＭＮを加えると（下段）、いずれの細胞ともにＮＭＮの濃度依存的に細胞生存率は回復するが、正常細胞のほうがはるかに回復の度合いが強かった。
【０１３１】
このように、ＮＭＮは、ＮＡＭＰＴ阻害剤とＮＡＰＲＴ阻害剤の併用による細胞増殖抑制を抑圧する活性があり、特に正常細胞でその効果は高い。従って、３つの薬剤の併用剤をＮＡＰＲＴを発現している腫瘍を有する哺乳類個体に投与した時、副作用がより少ない抗腫瘍剤となる。
【０１３２】
（８）培地中のエタノールアミンの効果
Lympholyte（登録商標） リンパ球分離溶液（コスモ・バイオ株式会社）を用いて、ヒト末梢血から、リンパ球を回収した。インスリン、トランスフェリン、ヒトアルブミンを含有する市販の無血清リンパ球培養培地を用い、０〜５００μＭのエタノールアミンを添加して、５％ＣＯ２，３７℃の条件で培養し、９６時間、１２０時間、１４４時間後に細胞数を計測したところ、図８に示すように、細胞培養液中にエタノールアミンを添加することにより、細胞の増殖が増強された。
【０１３３】
このように、エタノールアミンを含有する細胞培養培地を用いることにより、細胞増殖速度を増強することができる。
【図１】
2019137638.tif 000023
【図２】
2019137638.tif 000024
【図３】
2019137638.tif 000025
【図４】
2019137638.tif 000026
【図５】
2019137638.tif 000027
【図６】
2019137638.tif 000028
【図７】
2019137638.tif 000029
【図８】
2019137638.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】平成30年5月1日(2018.5.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式を有する化合物を有効成分して含有するニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤。
【化１】
2019137638.tif 000031
【請求項２】
請求項１に記載のＮＡＭＰＴ阻害剤を有効成分して含有する抗腫瘍剤。
【請求項３】
ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）の発現が実質的にない腫瘍に対する薬剤である、請求項３に記載の抗腫瘍剤。
【請求項４】
ＮＡＭＰＴ阻害剤以外の抗腫瘍剤と共投与される、請求項３に記載の抗腫瘍剤。
【請求項５】
前記ＮＡＭＰＴ阻害剤以外の抗腫瘍剤との合剤である、請求項４に記載の抗腫瘍剤。
【請求項６】
前記ＮＡＭＰＴ阻害剤以外の抗腫瘍剤が、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）阻害剤である、請求項４または５に記載の抗腫瘍剤。
【請求項７】
ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）が発現している腫瘍に対する薬剤である、請求項６に記載の抗腫瘍剤。
【請求項８】
ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）と共投与される、請求項６または７に記載の抗腫瘍剤。
【請求項９】
ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）との合剤である、請求項９に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１０】
下記式を有する化合物のＮＡＭＰＴ阻害活性を測定する、測定方法。
【化２】
2019137638.tif 000032
（式中、Ｒは、水素、置換されていてもよい炭素原子１〜１２個を有する直鎖又は分枝鎖アルキル基、置換されていてもよい炭素原子３〜６個を有するシクロアルキル基、置換されていてもよい炭素原子２〜６個と二重結合１又は２個を有するアルケニル基、置換されていてもよい炭素原子２〜６個と三重結合１又は２個を有するアルキニル基、置換されていてもよいアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルコキシ基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボニル基、ホルミル基、オキシカルボニル基、カルボキシ基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボキシレート基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルアミド基、アミノカルボニル基、アミノ基、シアノ基、ジアゾ基、ニトロ基、チオ基、スルホキシル基、及びスルホニル基から成る群から独立して選択され、前記アリール基は、炭素環式アリール基又は複素環式アリール基であり、ここで、前記炭素環式アリールは原子６〜２０個を含み、前記複素環式アリールは炭素原子２〜２０個と、窒素、酸素及び硫黄から成る群より選ばれるヘテロ原子１〜５個を含む３〜８員環のアザシクロアルキル基を形成する。置換基における水素原子は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２ハロアルキル基、芳香族炭化水素基または芳香族複素環基等によって置換されている。）
【請求項１１】
ＮＡＭＰＴ阻害剤のスクリーニング方法であって、
請求項１０に記載の化合物の複数種類に対してＮＡＭＰＴ阻害活性を測定する工程と、
ＮＡＭＰＴ阻害活性が得られた化合物をＮＡＭＰＴ阻害剤とする工程と、
を含むスクリーニング方法。
【請求項１２】
ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）阻害剤と共投与される、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤。
【請求項１３】
さらにニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）と共投与される、請求項１２に記載のＮＡＭＰＴ阻害剤。
【請求項１４】
ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤と共投与される、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）阻害剤。
【請求項１５】
さらにニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）と共投与される、請求項１５に記載のＮＡＰＲＴ阻害剤。
【請求項１６】
ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤とニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）阻害剤とを有効成分として含有する、抗腫瘍剤。
【請求項１７】
さらにニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）を含有する、請求項１６に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１８】
ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）阻害剤のスクリーニング方法であって、
ニコチン酸を含有する細胞培養用培地中で、ＮＡＰＲＴを発現している腫瘍細胞に対して、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤に加えてＮＡＰＲＴ阻害剤の候補となる化合物を投与する工程と、
前記腫瘍細胞の増殖及び／又は生死を調べる
工程と、
を含むスクリーニング方法。
【請求項１９】
前記ニコチン酸の濃度が、１．０μＭ以上である、請求項１９のスクリーニング方法。
【請求項２０】
前記ニコチン酸の濃度が、３．０μＭ以上である、請求項１９のスクリーニング方法。
【請求項２１】
前記培地が、エタノールアミンを含有する、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２２】
前記エタノールアミンの濃度が、１０．０μＭ以上である、請求項２２のスクリーニング方法。
【請求項２３】
前記エタノールアミンの濃度が、１００．０μＭ以上である、請求項２１のスクリーニング方法。
【請求項２４】
６−アミノニコチン酸を有効成分して含有するニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）阻害剤。
【請求項２５】
６−アミノニコチン酸を有効成分して含有する抗腫瘍剤。
【請求項２６】
ＮＡＰＲＴ阻害剤以外の抗腫瘍剤と共投与される、請求項２５に記載の抗腫瘍剤。
【請求項２７】
前記ＮＡＰＲＴ阻害剤以外の抗腫瘍剤との合剤である、請求項２６に記載の抗腫瘍剤。
【請求項２８】
前記ＮＡＰＲＴ阻害剤以外の抗腫瘍剤が、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤である、請求項２６または２７に記載の抗腫瘍剤。
【請求項２９】
ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）と共投与される、請求項２８に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３０】
ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）との合剤である、請求項２９に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３１】
ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）が発現している腫瘍に対する薬剤である、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３２】
下記式を有する化合物のＮＡＰＲＴ阻害活性を測定する、測定方法。
【化３】
2019137638.tif 000033
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、独立して、水素、置換されていてもよい炭素原子１〜１２個を有する直鎖又は分枝鎖アルキル基、置換されていてもよい炭素原子３〜６個を有するシクロアルキル基、置換されていてもよい炭素原子２〜６個と二重結合１又は２個を有するアルケニル基、置換されていてもよい炭素原子２〜６個と三重結合１又は２個を有するアルキニル基、置換されていてもよいアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルコキシ基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボニル基、ホルミル基、オキシカルボニル基、カルボキシ基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルカルボキシレート基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキルアミド基、アミノカルボニル基、アミノ基、シアノ基、ジアゾ基、ニトロ基、チオ基、スルホキシル基、及びスルホニル基から成る群から独立して選択され、前記アリール基は、炭素環式アリール基又は複素環式アリール基であり、ここで、前記炭素環式アリールは原子６〜２０個を含み、前記複素環式アリールは炭素原子２〜２０個と、窒素、酸素及び硫黄から成る群より選ばれるヘテロ原子１〜５個を含む３〜８員環のアザシクロアルキル基を形成する。置換基における水素原子は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２ハロアルキル基、芳香族炭化水素基または芳香族複素環基等によって置換されている。）
【請求項３３】
ＮＡＰＲＴ阻害剤のスクリーニング方法であって、
請求項３２に記載の化合物の複数種類に対してＮＡＰＲＴ阻害活性を測定する工程と、
ＮＡＰＲＴ阻害活性が得られた化合物をＮＡＰＲＴ阻害剤とする工程と、
を含むスクリーニング方法。
【請求項３４】
１．０μＭ以上のニコチン酸及び１０．０μＭ以上のエタノールアミンを含有する細胞培養用培地。
【請求項３５】
３．０μＭ以上のニコチン酸及び１００．０μＭ以上のエタノールアミンを含有する細胞培養用培地。
【請求項３６】
請求項１８〜２３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法に用いるための培地である、請求項３４または３５に記載の培地。
【請求項３７】
in vitroにおいて、正常細胞とニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）を発現している腫瘍細胞との混合細胞集団において、腫瘍細胞に対して正常細胞の割合を増やすための方法であって、
前記腫瘍細胞に、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）阻害剤、ＮＡＭＰＴ阻害剤、及びニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）を投与する工程、を含む方法。
【請求項３８】
腫瘍を有する哺乳類個体に対して投与する抗腫瘍剤の処方を補助する方法であって、
前記腫瘍患者の生検検体における腫瘍細胞がニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）を発現しているかどうか調べる工程と、
前記腫瘍細胞におけるＮＡＰＲＴの発現レベルが所定レベル以下の場合、前記薬剤として、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤を選択し、前記発現レベルが前記所定レベルより高い場合、前記薬剤として、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）阻害剤、ＮＡＭＰＴ阻害剤、及びニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）を選択することを提示する工程と、
を含む方法。
【請求項３９】
正常細胞とニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）が発現している腫瘍細胞の混合細胞集団に対し、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）類縁体が腫瘍細胞に対して正常細胞の割合を増やすかどうかを調べる方法であって、
ＮＡＭＰＴ阻害剤、ＮＡＰＲＴ阻害剤、及び前記ＮＭＮ類縁体を前記正常細胞と前記腫瘍細胞に投与する工程、および、
前記正常細胞と前記腫瘍細胞各々の増殖及び／又は生死をしらべる工程と、
を含み、
前記ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）類縁体が以下の構造式である方法。
【化４】
2019137638.tif 000034
（式中、Ｒ１は、水素またはリン酸基であり、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素または炭素数３〜２４のアシル基から選択される基である。）
【請求項４０】
正常細胞とニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）が発現している腫瘍細胞の混合細胞集団に対し、腫瘍細胞に対して正常細胞の割合を増やす薬剤のスクリーニング方法であって、
ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）阻害剤、及びニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）類縁体を前記正常細胞と前記腫瘍細胞に投与する工程、および、
前記正常細胞と前記腫瘍細胞各々の増殖及び／又は生死をしらべる工程と、
を含む方法であって、
前記ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）類縁体が以下の構造式である、
【化５】
2019137638.tif 000035
（式中、Ｒ１は、水素またはリン酸基であり、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素または炭素数３〜２４のアシル基から選択される基である。）
方法。
【請求項４１】
前記正常細胞と前記腫瘍細胞が培養細胞であって、
請求項３７、３９〜４０のいずれか１項に記載の方法がニコチン酸を含有する培地中で行われる、方法。
【請求項４２】
前記ニコチン酸の濃度が、１．０μＭ以上である、請求項４１の方法。
【請求項４３】
前記ニコチン酸の濃度が、３．０μＭ以上である、請求項４１の方法。