(57)【要約】      （修正有）【課題】加水分解に対する安定性を向上させたニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体とその製造方法の提供。【解決手段】式［Ｉ］で表されるニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体又はその薬理学的に許容される塩。2019137625.tif 000006（式中、Ｒ１は水素原子又はグリコシル基を示し、Ｒ１のうちの少なくとも１つはグリコシル基を示す）。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式［Ｉ］で表されるニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体、又はその薬理学的に許容される塩。
【化１】
2019137625.tif 000005
（式中、Ｒ１は水素原子又はグリコシル基を示し、Ｒ１のうちの少なくとも１つはグリコシル基を示す。）
【請求項２】
グリコシル基が、グルコシル基である請求項１に記載のニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体。
【請求項３】
ニコチンアミドモノヌクレオチドと糖供与体とを含有する溶液に酵素を作用させる工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載のニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体、又はその薬理学的に許容される塩の製造方法。
【請求項４】
請求項１に記載のニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体、又はその薬理学的に許容される塩を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体とその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニコチンアミドモノヌクレオチド（化学式：Ｃ１１Ｈ１５Ｎ２Ｏ８Ｐ）は、人間を含む多くの生物の体内で作られる、下記の構造式［化１］で表される化合物である。一般にＮＭＮ（Nicotinamide mononucleotide）と呼ばれており、補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の生合成に関与する中間代謝物として知られている。ＮＡＤは、さまざまな脱水素酵素の補酵素として機能し、細胞内のエネルギー代謝において重要な役割を果たしている。酸化型（ＮＡＤ＋）及び還元型（ＮＡＤＨ）の２つの状態を取り、これら各状態の酸化・還元を通じて各種の酵素反応に関与している。
【０００３】
【化１】
2019137625.tif 000002
【０００４】
ニコチンアミドモノヌクレオチドは、生体内では、肝臓組織によるＮＡＤ代謝経路、すなわち、キヌレニン経路を経てキノリン酸からＮＡＤの合成に関与する経路において産生されている。この点について、図１を参照して具体的に説明する。図１はビタミンＢ３として知られるナイアシン（ニコチンアミドとニコチン酸の総称）に関与する代謝経路を示す説明図である。食事から摂取したニコチン酸は肝臓に取り込まれ、ニコチンアミドに変換され、ニコチンアミドは血流を介して全身に供給される。各細胞は血液中からニコチンアミドを取り込み、ＮＡＤ、ＮＡＤＰに変換して利用する。ニコチンアミドはトリプトファンからも生合成される。
【０００５】
図１に示すように、生体内においては、トリプトファンを出発物質とした場合、トリプトファンはトリプトファン代謝経路であるキヌレニン経路を経てキノリン酸（ＱＡ）に変換され、さらにニコチン酸モノヌクレオチド（ＮａＭＮ）となる。他方、ニコチン酸（Ｎａ）を出発物質とした場合、ニコチン酸は直接ＮａＭＮに変換される。ＮａＭＮはその後、ニコチン酸アデニンジヌクレオチド（ＮａＡＤ）を経て、ＮＡＤサイクルによってＮＡＤ、ニコチンアミド（ＮａＭ）、ニコチンアミドモノヌクレオチドと相互に変換される。ニコチンアミド（ＮａＭ）は、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）によってニコチンアミドモノヌクレオチドに変換され、次いでニコチンアミドモノヌクレオチドがニコチンアミドモノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）により変換されてＮＡＤが生成される。なお、ＮＡＤ中間代謝産物であるニコチンアミドリボシド（ＮＲ）からもニコチンアミドモノヌクレオチドが産生される。
【０００６】
近年、ニコチンアミドモノヌクレオチドは、細胞内のエネルギー代謝に不可欠なＮＡＤの中間代謝物としての役割だけでなく、老化を抑える役割を持つサーチュイン遺伝子を活性化する機能を有することが知られるようになり、例えば、マウスにニコチンアミドモノヌクレオチドを投与する実験において、老化に伴う代謝の機能低下等が改善されることが次第に明らかにされつつある。このような状況を受けて、現在、ニコチンアミドモノヌクレオチドは、その生理的意義や創薬標的としての可能性について非常に注目を集めており、そうした方面の研究が盛んに進められている。
【０００７】
ニコチンアミドモノヌクレオチドの生理的意義、特に老化関連疾患における生理的意義に関する報告の例を挙げると、例えば、高脂肪食負荷誘導性糖尿病マウス、老化糖尿病マウスに対し、ニコチンアミドモノヌクレオチドを腹腔内投与したところ、ＮＡＤ＋の合成系において、サーチュイン１が触媒する反応速度が上昇し、耐糖能異常、インシュリン抵抗性、脂質異常症を改善することが報告されている（非特許文献１）。
【０００８】
その他の例としては、老年マウス（２２月齢）に対し、ニコチンアミドモノヌクレオチドを腹腔内投与（７日間）したところ、加齢に伴う骨格筋のミトコンドリア機能不全を回復させ、骨格筋萎縮や炎症のマーカー、インシュリンシグナル伝達、グルコース取り込みを改善することが報告されている（非特許文献２）。
【０００９】
また、野生型若年マウス（６月齢）に対し、ニコチンアミドモノヌクレオチドを経口投与（１２か月間）したところ、老化に伴う海馬の神経幹細胞の減少が抑制され、新生神経が増加傾向にあることが報告されている（非特許文献３）。
【００１０】
以上のように、ニコチンアミドモノヌクレオチドは、ＮＡＤの中間代謝物としての役割以外に、サーチュインを活性化することによる、さまざまな生理的意義、特に老化関連疾患における生理的意義が明らかにされつつある。このような状況から、ニコチンアミドモノヌクレオチドについての研究が活発に行われるようになっており、そのため、研究者がニコチンアミドモノヌクレオチドを研究中に取り扱う場面が増加している。
【００１１】
しかしながら、ニコチンアミドモノヌクレオチドは、水分、特に熱水に溶けやすく、水溶液中のような条件下でなくても、周囲の大気中に含まれる湿気によって加水分解を起こす可能性がある。この加水分解は、主としてニコチンアミドモノヌクレオチドのリボース部分とニコチンアミド部分間のグリコシド結合における不安定性に由来していると考えられるが、いずれにせよ、このような不安定性は、ニコチンアミドモノヌクレオチドの生理的意義の損失を招いたり、その測定において不正確な分析結果を生じたりする原因になるため好ましくない。そのため、ニコチンアミドモノヌクレオチドを保存する場合や、医薬品や食品等の製品に配合する場合には加水分解が起こらないよう、水分や湿気に特に注意する必要がある。
【００１２】
また、生体がニコチンアミドモノヌクレオチドを摂取した場合、細胞内にニコチンアミドモノヌクレオチドが吸収される際又は吸収された後に、生体内に数多く存在する加水分解酸素の攻撃を受けることにより、ニコチンアミドモノヌクレオチドが加水分解されて、その作用効果が早い段階で失われる可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Yoshino, J., Mills, K.F., Yoon, M.J., & Imai, S.(2011) Cell Metab., 14, 528-536
【非特許文献２】Gomes, A.P., L., Ling, A.J., Moslehi, J.J., Montgomery, M.K., Rajiman, L., White, J.P., Teodoro, J.S., Wrann, C.D., Hubbard, B.P., Mercken, E.M., Palmeira, C.M., de Cabo, R., Rolo, A.P., Turner, N., Bell, E.L., & Sinclair, D.A.(2013) Cell, 155, 1624-1638
【非特許文献３】Stein, L.R. & Imai, S.(2014) EMBO J., 33, 1321-1340
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
以上のように、ニコチンアミドモノヌクレオチドは、その画期的な生理的意義についての研究が活発化しているものの、加水分解に対する安定性が低いため、水分や湿気の多い環境には置かないようにするなど、品質管理の点で特に注意する必要がある。また、ニコチンアミドモノヌクレオチドは、生体内に存在する加水分解酸素の作用を受けるのを遅延化させて、ニコチンアミドモノヌクレオチドの作用の持続性の向上を図ることが望まれる。そこで、生体内でニコチンアミドモノヌクレオチドと同様の生理的機能を発揮するニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体であって、ニコチンアミドモノヌクレオチドに比べて加水分解に対する安定性を向上させて、作用の持続化を図ったニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、鋭意研究した結果、ニコチンアミドモノヌクレオチドのリボース部分の２位、３位の水酸基、及びリン酸部分の水酸基の全部又は一部にグリコシル基を導入することにより、ニコチンアミドモノヌクレオチドの加水分解に対する安定性が向上して、作用の持続化が達成され、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下に示すものである。
［１］式［Ｉ］で表されるニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体又はその薬理学的に許容される塩。
【００１６】
【化２】
2019137625.tif 000003
（式中、Ｒ１は水素原子又はグリコシル基を示し、Ｒ１のうちの少なくとも１つはグリコシル基を示す。）。
［２］グリコシル基が、グルコシル基である［１］に記載のニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体。
［３］ニコチンアミドモノヌクレオチドと糖供与体とを含有する溶液に酵素を作用させる工程を含むことを特徴とする、［１］に記載のニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体、又はその薬理学的に許容される塩の製造方法。
［４］［１］に記載のニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体、又はその薬理学的に許容される塩を含む組成物。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体は、ニコチンアミドモノヌクレオチドに比べて、水分や湿気に強く、加水分解に対して安定であり、また、摂取した場合に生体内のグリコシダーゼによって徐々に分解された後にニコチンアミドモノヌクレオチド本来の生理的機能を発揮するため、ニコチンアミドモノヌクレオチドの作用の持続化を図ることができる。さらに、前記ニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体は、それ自体、その化学的、生理学的性質をニコチンアミドモノヌクレオチドと比較することにより、ニコチンアミドモノヌクレオチドの生物学的機能や、生理活性発現の機構に関する情報を得ることを目的として利用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ナイアシン（ニコチンアミドとニコチン酸の総称）に関与する代謝経路を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
前述したように、本発明は、以下の式［Ｉ］で表されるニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体、又はその薬理学的に許容される塩である。生体内でニコチンアミドモノヌクレオチドは補酵素であるＮＡＤに変換されるが、一般的には、ＮＡＤのようなヌクレオチド構造を有する補酵素においてニコチンアミド部分の修飾は酵素分子に対する認識機能を低下させて触媒反応に直接的な影響を及ぼし、多くの場合、その影響は好ましくない方向に作用するといわれる。本発明は、そのような影響が危惧されるニコチンアミド部分の修飾を行うことなく、ニコチンアミドモノヌクレオチドのリボース部分の２位、３位の水酸基、及びリン酸部分の水酸基の全部又は一部にグリコシル基を導入することに成功したものである。
【００２０】
【化３】
2019137625.tif 000004
【００２１】
式中、Ｒ１は水素原子又はグリコシル基を示し、Ｒ１のうちの少なくとも１つはグリコシル基を示す。該グリコシル基は、単糖又はオリゴ糖の糖残基であり、具体的には、単糖又はオリゴ糖のヘミアセタール性水酸基を除去して結合位置とした、糖の部分構造である。前記単糖としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、ラムノース等、前記オリゴ糖としては、マルトース、スクロース、ラクトース、マルトオリゴ糖（マルトトリオース、マルトテトラオース等）等が挙げられる。したがって、前記グリコシル基には、例えば、グルコシル基、ガラクトシル基、フルクトシル基、ラムノシル基、マルトシル基、スクロシル基、ラクトシル基、マルトオリゴシル基（マルトトリオシル基、マルトテトラオシル基等）等が含まれる。また、前記グリコシル基には、これらの基の任意の組み合わせ、例えば、１，２結合、１，３結合、１，４結合又は１，６結合で結合した基が含まれる。前記グリコシル基としては、製造の容易さの点からは、グルコシル基、マルトシル基、マルトオリゴシル基が望ましく、特にグルコシル基が望ましい。
【００２２】
前記薬理学的に許容される塩としては、薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等を挙げることができる。具体的には、薬理学的に許容される酸付加塩として、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、ホウ酸等の無機酸塩、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、酒石酸、安息香酸等のカルボン酸塩、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等のスルホン酸塩、グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸塩等を挙げることができる。また、薬理学的に許容される金属塩として、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム、亜鉛等の金属塩等を挙げることができる。また、薬理学的に許容されるアンモニウム塩として、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等を挙げることができる。また、薬理学的に許容される有機アミン付加塩として、トリエチルアミン、ピペリジン、モルホリン、トルイジン等を挙げることができる。また、薬理学的に許容されるアミノ酸付加塩として、グルタミン酸、リジン、グリシン、アラニン等の付加塩等を挙げることができる。
【００２３】
本発明のニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体、又はその薬理学的に許容される塩の製造方法に制限はなく、有機化学的方法、酵素化学的方法等やこれらの方法を適宜組み合わせてもよい。一般的には、位置並びに立体選択的に糖鎖を導入することが可能であり、しかも簡便かつ効率的に製造することが可能であるという点からは、ニコチンアミドモノヌクレオチドと糖供与体とを含有する溶液に酵素を作用させる酵素化学的方法により生成させるのが好ましい。そこで、以下では、ニコチンアミドモノヌクレオチドと糖供与体とを含有する溶液に酵素を作用させてニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体、又はその薬理学的に許容される塩を製造する本発明の製造方法について詳細に説明する。
【００２４】
ニコチンアミドモノヌクレオチドには光学異性体としてα体、β体の２種類が存在しているが、本発明の製造方法ではβ体が使用される。ニコチンアミドモノヌクレオチドは、例えば、ニコチンアミドとリボースからニコチンアミドリボシドを合成し（Bioorg. Med. Chem. Lett., 12, 1135-1137 (2002) 参照）、次いで、リボース部分の５位水酸基のリン酸化する（Chem. Comm., 1999, 729-730参照）ことにより得ることができる。具体的には、例えば、まず、ニコチンアミドとＬ−リボーステトラアセテートとを、無水アセトニトリルに溶解し、窒素気流下、トリメチルシリルトリフルオロスルホン酸を過剰量添加後、室温にて撹拌し、メタノールを添加して反応を停止させた上記反応液を、活性炭を充填したカラムに付し、蒸留水で洗浄後、メタノールで溶出して生成物を回収する。次いで、この生成物のＬ−リボース部分の５位水酸基のリン酸化反応を行うために、上記生成物をトリメトキシリン酸に溶解し、氷冷下、オキシ塩化リンを滴下し、窒素気流下で撹拌し、水酸化ナトリウム水溶液を添加して中和させ、反応を停止させた上記反応液に、冷アセトニトリル−エーテル溶液を添加する。その後、下層（水相）を陰イオン交換樹脂に通して反応物を回収し、さらに陽イオン交換樹脂で精製することにより、純度の高いニコチンアミドモノヌクレオチドを回収することができる。また、ニコチンアミドモノヌクレオチドは市販されており、それらの市販品を購入して使用することができる。
【００２５】
本発明の製造方法で用いる糖供与体は、同時に用いる酵素によってニコチンアミドモノヌクレオチドから前記式Ｉで表されるニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体を生成できるものであればよい。ニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体の生成を容易にするためには、利用する酵素に適した糖供与体が選ばれる。
【００２６】
前記糖供与体の例としては、マルトース、マルトオリゴ糖（マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオース等）、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン部分加水分解物（アミロース等）、液化デンプン、糊化デンプン、溶性デンプン、糖ヌクレオチド（ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ガラクトース、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−フコース等）等が挙げられる。糖ヌクレオチドは公知の方法によって得ることができる。
【００２７】
本発明の製造方法で用いる酵素は、ニコチンアミドモノヌクレオチドと前記糖供与体とを含有する溶液に作用させるとき、ニコチンアミドモノヌクレオチドを分解せずに、ニコチンアミドモノヌクレオチドのリボース部分の２位、３位の水酸基、及びリン酸部分の水酸基の全部又は一部にグリコシル基を転移して前記ニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体を生成するものであればよい。このような酵素としては、大きく糖転移酵素と糖加水分解酵素とがある。該糖転移酵素としては、グルコースの転移反応を触媒するグルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトースの転移反応を触媒するガラクトシルトランスフェラーゼ、マンノースの転移反応を触媒するマンノシルトランスフェラーゼ、フコースの転移反応を触媒するフコシルトランスフェラーゼ等が例示される。これらの糖転移酵素を用いる場合には、それぞれ順に前記糖供与体として、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ガラクトース、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−フコース等の糖ヌクレオチドが利用される。
【００２８】
一方、前記糖加水分解酵素は、本来、生体内で糖鎖間結合を加水分解する酵素であるが、糖受容体となるニコチンアミドモノヌクレオチドの濃度を高めることで、糖供与体の糖をニコチンアミドモノヌクレオチドに転移させて、前記ニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体を形成することができる。該糖加水分解酵素としては、糖のα−１，４ーグルコシド結合を加水分解する反応を触媒する酵素であるα−グルコシダーゼ、グリコシド結合を加水分解してデンプン中のアミロースやアミロペクチンを、グルコースやマルトース、オリゴ糖に変換する酵素であるα−アミラーゼ等を用いることができる。これらを用いる場合は、糖供与体として、マルトース、マルトオリゴ糖（マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオース等）、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン部分加水分解物（アミロース等）、液化デンプン、糊化デンプン、溶性デンプンが利用される。
【００２９】
α−アミラーゼを用いて前記ニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体を生成させる場合は、一般に、α−グルコシダーゼを用いた場合よりも、グルコシル基の結合数の大きいものを生成させることができる。グルコシル基の結合数の大きい生成物は、必要に応じて、グルコアミラーゼ等を用いて部分加水分解し、グルコシル基の結合数を低減させることができる。
【００３０】
前記α−グルコシダーゼは、例えば、マウスの腎臓、ラットの腸粘膜、イヌ、ブタの小腸等動物由来の酵素、コメ種子、トウモロコシ種子等植物由来の酵素、ムコール（Mucor）属、ペニシリウム（Penicillium）属等に属するカビ、サッカロミセス（Saccharomyces）属等に属する酵母等の微生物を栄養培地で培養して得られる酵素を適宜選択できる。
【００３１】
前記α−アミラーゼは、例えば、バチルス（Bacillus）属等に属する細菌培養物由来の酵素を適宜選択できる。
【００３２】
前述した糖転移酵素は、前記ニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体を生成できる限り、必ずしも精製して使用する必要はないが、必要ならば、公知の各種方法で精製して使用してもよい。また、市販の糖転移酵素を利用することもできる。使用する酵素量と反応時間とは、密接な関係があり、反応時間や経済性等を考慮して適宜酵素量が決定される。
【００３３】
前記糖転移酵素をニコチンアミドモノヌクレオチドと前記糖供与体とを含有する溶液に作用させる場合、ニコチンアミドモノヌクレオチドの濃度は、通常、１質量／容積％以上、望ましくは、２〜３０質量／容積％含有していればよい。一方、前記糖化合物の濃度は、ニコチンアミドモノヌクレオチドに対して、通常、０．５〜３０倍の範囲が好適である。
【００３４】
本発明の製造方法は、ニコチンアミドモノヌクレオチドと前記糖供与体とを含有する溶液に前記糖転移酵素を加え、通常、該糖転移酵素が充分作用する条件、通常、ｐＨ３〜９、温度３０〜８０℃の範囲から選ばれる条件に維持して行う。
前記溶液としては、使用する酵素の至適ｐＨ等を考慮して、通常、各種の水性溶媒や緩衝液（トリス塩酸、リン酸、酢酸等）の中から適宜選べばよい。
【００３５】
以上述べた製造方法により、本発明のニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体、又はその薬理学的に許容される塩の含有溶液が得られる。この溶液には、一般に、前記ニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体だけでなく、未反応のニコチンアミドモノヌクレオチドや前記糖供与体等が含まれる。精製されたニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体を製造する場合には、ニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体と未反応のニコチンアミドモノヌクレオチド、前記糖供与体等からなる夾雑物との分子量、親和性等の違いを利用する分離手段、例えば、膜分離、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の方法で分離精製すれば、高純度のニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体を得ることができる。
【００３６】
前記製造方法により得られたニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体含有溶液は、そのままニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体含有製品としてもよいが、通常は、前記溶液を加熱等することによって酵素を失活させた後、ろ過、濃縮、乾燥、粉末化して粉末状のニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体含有製品とする。なお、該製品において、食品や医薬品等に含有される成分を適宜添加することができる。前記ニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体含有製品（組成物）において、ニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体の含有量については使用目的、使用対象、使用頻度等に基づいて適宜決定すればよいが、経済性や効果を考慮すると、全組成物の０．０００１〜４０質量％程度が例示される。こうして得られたニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体含有組成物は、ニコチンアミドモノヌクレオチドと同様の生理的機能等を期待して利用するほか、ニコチンアミドモノヌクレオチドの生化学的評価等を行う際にも利用することができる。
【図１】
2019137625.tif 000007