(57)【要約】【課題】動物組織からプラズマローゲンを効率的に抽出することができる方法を提供すること。【解決手段】動物組織をプロテアーゼで処理する酵素処理工程と、プロテアーゼで処理した動物組織をエタノールを含む抽出液で抽出する抽出工程とを有するプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法である。【選択図】図４
2019140919.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物組織をプロテアーゼで処理する酵素処理工程と、
前記プロテアーゼで処理した動物組織を、エタノールを含む抽出液で抽出する抽出工程と、
を有することを特徴とするプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
【請求項２】
動物組織が、ホタテ類の食用部位であることを特徴とする請求項１記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
【請求項３】
動物組織が、ホヤの食用部位であることを特徴とする請求項１記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
【請求項４】
動物組織が、鳥類の食用部位であることを特徴とする請求項１記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
【請求項５】
プロテアーゼが、糸状菌由来のプロテアーゼであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
【請求項６】
プロテアーゼが、麹菌由来のプロテアーゼであることを特徴とする請求項５記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
【請求項７】
プロテアーゼが、中性プロテアーゼであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物組織から多量のプラズマローゲンを含む機能性素材を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リン脂質は、生体膜の構成成分として重要であるが、中でもエーテルリン脂質であるプラズマローゲンは、哺乳動物の生体膜のリン脂質の約１８％を占めている。このプラズマローゲンは、特に、脳神経、心筋、骨格筋、白血球、精子に多いことが知られている。
【０００３】
プラズマローゲンは、ドコサヘキサエン酸やアラキドン酸などの多価不飽和脂肪酸と多く結合しているため、これらの多価不飽和脂肪酸から産生するプロスタグランヂンやロイコトリエンなどの細胞間シグナルの２次メッセンジャーの貯留所となっているだけでなく、細胞融合、イオン移送など重要な働きをしている。
さらに、プラズマローゲンのビニルエーテル結合（アルケニル結合）が、特に酸化ストレスに敏感であるため細胞の抗酸化の機能も果たしている。
【０００４】
また、プラズマローゲンは、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、統合失調症などの脳神経病、糖尿病などのメタボリックシンドロームや、種々の感染症や免疫異常の治療および改善の効果において効果があるといわれている。
【０００５】
従来より、このようなプラズマローゲンを動物組織から抽出する試みがなされている（特許文献１及び２）。例えば、特許文献１においては、レイヤーのムネ肉に対してエタノールを抽出溶媒として抽出処理し、抽出液を回収する方法が提案されている。
【０００６】
また、特許文献２においては、動物組織に対して、エタノール抽出処理を行い、エタノール抽出物を得、エタノール抽出物をホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）で処理し、ジアシル型グリセロリン脂質を加水分解し、さらに水溶性ケトン系溶剤で処理し、不溶部を回収し、不溶部を、脂肪族炭化水素溶剤と水溶性ケトン溶剤との混合有機溶剤、及び水で溶媒分配し、混合有機溶剤部を回収する方法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第５４８３８４６号公報
【特許文献２】特許第５４８９４３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のように、有用なプラズマローゲンを動物組織から得ようとする試みはされているものの、必ずしも効率よくプラズマローゲンを得ることができているとはいえない。
【０００９】
本発明の課題は、動物組織からプラズマローゲンを効率的に得ることができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、動物組織からプラズマローゲンを効率的に抽出すべく鋭意検討した結果、動物組織をプロテアーゼにより処理した後、エタノールで抽出することにより、多量のプラズマローゲンを抽出できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下のとおりのものである。
［１］動物組織をプロテアーゼで処理する酵素処理工程と、前記プロテアーゼで処理した動物組織を、エタノールを含む抽出液で抽出する抽出工程とを有することを特徴とするプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
［２］動物組織が、ホタテ類の食用部位であることを特徴とする［１］記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
［３］動物組織が、ホヤの食用部位であることを特徴とする［１］記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
［４］動物組織が、鳥類の食用部位であることを特徴とする［１］記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
［５］プロテアーゼが、糸状菌由来のプロテアーゼであることを特徴とする［１］〜［４］のいずれか記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
［６］プロテアーゼが、麹菌由来のプロテアーゼであることを特徴とする［５］記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
［７］プロテアーゼが、中性プロテアーゼであることを特徴とする［１］〜［６］のいずれか記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、動物組織からプラズマローゲンを効率的に抽出することができ、多量のプラズマローゲンを含む機能性素材を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例で用いた各素材に対する酵素別の総脂質重量を比較した図である。
【図２】実施例におけるリン脂質の分析条件を示す図である。
【図３】実施例で用いた各素材に対する酵素別の、リン脂質の分析条件におけるプラズマローゲンの割合を比較した図である。
【図４】実施例で用いた各素材に対する酵素別のプラズマローゲンの増加割合を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法は、動物組織をプロテアーゼで処理する酵素処理工程と、プロテアーゼで処理した動物組織を、エタノールを含む抽出液で抽出する抽出工程とを有することを特徴とする。本発明の製造方法においては、酵素処理工程及び抽出工程の前後に他の工程を有していてもよい。
【００１５】
［酵素処理工程］
酵素処理工程は、動物組織をプロテアーゼで処理する工程である。
動物組織としては、プラズマローゲンを含む動物組織であれば特に制限されるものではなく、ホタテ類、ホヤ、ナマコ、アワビ、サケ、サンマ、カツオ等の水産動物や鳥類の食用部位（可食部位）を挙げることができ、これらの中でも、ホタテ類、ホヤ、鳥類の食用部位が好ましい。
【００１６】
本発明におけるホタテ類は、イタヤガイ科に属する食用の二枚貝をいい、例えば、Mizuhopecten属、Pecten属に属するものを挙げることができる。具体的には、日本で採取されるホタテガイ（学名：Mizuhopecten yessoensis）や、ヨーロッパで採取されるヨーロッパホタテ（学名：Pecten maximus（Linnaeus））等を挙げることができる。食用部位としては、貝柱、ひも等を挙げることができる。
【００１７】
本発明におけるホヤは、マボヤ科に属する食用の脊索動物をいい、マボヤ属、アカボヤ属に属するものを挙げることができる。具体的には、マボヤ（学名：Halocynthia roretzi）や、アカボヤ（学名：Halocynthia aurantium）等を挙げることができる。食用部位としては、身の部分（筋膜体）を挙げることができる。
【００１８】
本発明における鳥類は、食用の鳥類であれば特に制限されるものではなく、例えば、鶏、烏骨鶏、鴨等を挙げることができる。食用部位としては、プラズマローゲンを豊富に含むムネ肉が好ましい。
【００１９】
これらの動物組織は、切断物であってもよいが、より効率的にプラズマローゲンを抽出できることから、粉砕物を用いることが好ましい。
【００２０】
酵素処理に用いるプロテアーゼとしては、Aspergillus属、 Rhizopus属等の糸状菌由来のプロテアーゼや、Bacillus属等の細菌由来のプロテアーゼや、パパイヤ、パイナップル等の植物から抽出されたプロテアーゼを挙げることができ、市販のプロテアーゼ剤を用いることができる。これらの中でも、糸状菌由来のプロテアーゼが好ましく、麹菌由来のプロテアーゼが特に好ましい。また、プラズマローゲンは酸性、塩基性では不安定であることから、中性プロテアーゼが好ましい。
【００２１】
プロテアーゼの使用量としては、例えば、動物組織１００ｇに対して、０．１〜１０．０ｇ程度であることが好ましく、０．２〜８．０ｇ程度であることがより好ましく、０．３〜５．０ｇ程度であることがさらに好ましい。
【００２２】
［抽出工程］
抽出工程においては、プロテアーゼで処理した動物組織を、エタノールを含む抽出液で抽出する。
【００２３】
抽出工程で用いるエタノールを含む抽出液としては、含水エタノールであってもよく、エタノールと他の有機溶媒との混合物であってもよい。エタノール濃度としては、５０質量％以上であることが好ましく、８０質量％以上であることがより好ましく、９５質量％以上であることが好ましく、実質的に１００質量％であることが好ましい。
【００２４】
エタノールの使用量としては、例えば、動物組織１００ｇに対して、１００〜３０００ｍＬ程度であることが好ましく、２００〜２０００ｍＬ程度であることがより好ましく、２５０〜１０００ｍＬ程度であることがさらに好ましい。なお、エタノールを用いた抽出は複数回行ってもよい。
【００２５】
抽出処理を行った後、固形分を除去して抽出液を回収し、必要に応じて乾燥固化することにより、本発明のプラズマローゲンを含有した機能性素材を得ることができる。なお、この抽出物に対して、プラズマローゲンの濃度を高める濃縮処理を施してもよい。
【００２６】
本発明の製造方法により得られる機能性素材中に含まれるプラズマローゲンの量としては、０．００１〜１００ｍｇ／ｇ（wet重量換算）であることが好ましく、０．１〜１０ｍｇ／ｇであることがより好ましい。
【００２７】
本発明のプラズマローゲンを含有した機能性素材は、食品、化粧品、医薬品等に含有させて用いることができる。食品としては、一般食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、サプリメント等を挙げることができる。本発明の機能性素材を含有する食品は、アトピー性皮膚炎の改善、認知症の予防又は改善、高血糖化の抑制、血中コレステロールの降下、脂質の代謝促進、抗疲労、血中アルブミン量の維持、肝機能の回復、運動時の筋肉の低下の抑制等に有効である。化粧品としては、乳液、クリーム、ローション、オイル、パック、洗顔料、クレンジング、ボディ洗浄料等を挙げることができる。本発明の機能性素材を含有する化粧品は、皺の改善や美白を目的とした皮膚老化防止に有効である。
【００２８】
食品、化粧品等の形態は特に制限されるものではなく、例えば、錠状、カプセル状、粉末状、顆粒状、液状、粒状、棒状、板状、ブロック状、固形状、丸状、ペースト状、クリーム状、カプレット状、ゲル状、チュアブル状、スティック状等を挙げることができる。
【実施例１】
【００２９】
次の手順により、各素材（ホタテ類の食用部位・鳥類の食用部位・ホヤの食用部位）からプラズマローゲンを含む組成物を抽出し、分析を行った。具体的に、ホタテ類の食用部位としては、ホタテガイ（学名：Mizuhopecten yessoensis）のひもを用いた。鳥類の食用部位としては、鶏の胸肉を用いた。ホヤの食用部位としては、マボヤ（学名：Halocynthia roretzi）の身（筋膜体）を用いた。
【００３０】
１．素材（ホタテ・鶏胸肉・ホヤ）５０ｇを解凍し、ハサミで細かく切った。
２．次の試験溶液を準備した。
ａ）０．１Ｍクエン酸溶液（ｐＨ４．５）５０ｍＬのみ
ｂ）０．１Ｍクエン酸溶液（ｐＨ４．５）５０ｍＬ＋コクラーゼ（登録商標）・Ｐ顆粒（三菱ケミカルフーズ株式会社製）０．２５ｇ
ｃ）１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）５０ｍＬ＋プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ（天野エンザイム株式会社製）０．２５ｇ
ｄ）１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）５０ｍＬ＋プロチンＳＤ−ＮＹ１０（天野エンザイム株式会社製）１．２５ｇ
【００３１】
３．素材と上記ａ）〜ｄ）の各試験溶液とを混合し、ブレンダー（WARING社製HGBSS）で粉砕した（１０秒×３回）。
４．５０℃で６０分間反応させた（約１５分おきにガラス棒で攪拌した）。
５．エタノール２５０ｍＬを加え、ブレンダーに入れ粉砕した（１０秒×２回）。
６．３０分放置した（約５分ごとにガラス棒で１０回転攪拌した）。
７．吸引ろ過し、ろ液を回収した。
【００３２】
８．ろ液を１ｍＬスピッツ管に取り、リン脂質の分析に用いた。
９．残りのろ液をエバポレーターで乾固させ、総脂質重量を測定した。
【００３３】
各分析結果を以下に示す。
（１）総脂質重量
１）上記ａ）〜ｄ）の試験溶液を用いた抽出物の総脂質重量を表１及び図１に示す。
【００３４】
【表１】
2019140919.tif 000003
【００３５】
（２）リン脂質の分析
１）上記ａ）〜ｄ）の試験溶液を用いた抽出物のリン脂質の分析条件（図２参照）における各成分の割合（ＨＰＬＣの面積値から算出）を表２に示す。
【００３６】
【表２】
2019140919.tif 000004
【００３７】
pl-PE：エタノラミンプラズマローゲン
PE：ホスファチジルエタノラミン
pl-PC：コリンプラズマローゲン
PC：ホスファチジルコリン
CAEP：セラミドアミノエチルホスホン酸
SM：スフィンゴミエリン
PS：ホスファチジルセリン
PI：ホスファチジルイノシトール
LPC：リゾホスファチジルコリン
【００３８】
２）リン脂質の分析条件におけるプラズマローゲン（pl-PE＋pl-PC）の割合を表３及び図３に示す。
【００３９】
【表３】
2019140919.tif 000005
【００４０】
（３）プロテアーゼ処理によるプラズマローゲン（pl-PE＋pl-PC）の増加率
上記（１）で求めた総脂質量に、上記（２）２）で求めたプラズマローゲン（pl-PE＋pl-PC）の割合をかけた数値を算出し、「ａ）プロテアーゼなし」を基準（１．０）として、プラズマローゲン（pl-PE＋pl-PC）の量を比較した。その結果を表４及び図４に示す。
なお、総脂質全体に占めるリン脂質の割合は、プロテアーゼ処理を施してもほぼ変化はなかった。
【００４１】
【表４】
2019140919.tif 000006
【００４２】
表４に示すように、プロテアーゼ処理を施すことにより、プラズマローゲンの抽出量が飛躍的に増加することがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の製法により製造されるプラズマローゲンを含む機能性素材は、食品や化粧品に用いることができることから、産業上有用である。
【図１】
2019140919.tif 000007
【図２】
2019140919.tif 000008
【図３】
2019140919.tif 000009
【図４】
2019140919.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成30年6月14日(2018.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物組織を中性プロテアーゼで処理する酵素処理工程と、
前記中性プロテアーゼで処理した動物組織を、エタノールを含む抽出液で抽出する抽出工程と、
を有することを特徴とするプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
【請求項２】
動物組織が、ホタテ類の食用部位であることを特徴とする請求項１記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
【請求項３】
動物組織が、ホヤの食用部位であることを特徴とする請求項１記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
【請求項４】
動物組織が、鳥類の食用部位であることを特徴とする請求項１記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
【請求項５】
プロテアーゼが、糸状菌由来のプロテアーゼであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
【請求項６】
プロテアーゼが、麹菌由来のプロテアーゼであることを特徴とする請求項５記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
【手続補正書】
【提出日】平成31年1月28日(2019.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホタテ類、ホヤ及び鳥類から選ばれる動物の組織を中性プロテアーゼで処理する酵素処理工程と、
前記中性プロテアーゼで処理した動物組織を、エタノールを含む抽出液で抽出する抽出工程と、
を有することを特徴とするプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法（ただし、中性プロテアーゼで処理すると同時又は処理の後に脂質分解酵素で処理するものを除く。）。
【請求項２】
動物組織が、ホタテ類の食用部位であることを特徴とする請求項１記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
【請求項３】
動物組織が、ホヤの食用部位であることを特徴とする請求項１記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
【請求項４】
動物組織が、鳥類の食用部位であることを特徴とする請求項１記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
【請求項５】
プロテアーゼが、糸状菌由来のプロテアーゼであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
【請求項６】
プロテアーゼが、麹菌由来のプロテアーゼであることを特徴とする請求項５記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月28日(2019.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホタテ類及びホヤから選ばれる動物の組織を中性プロテアーゼで処理する酵素処理工程と、
前記中性プロテアーゼで処理した動物組織を、エタノールを含む抽出液で抽出する抽出工程と、
を有することを特徴とするプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法（ただし、中性プロテアーゼで処理すると同時又は処理の後に脂質分解酵素で処理するものを除く。）。
【請求項２】
動物組織が、ホタテ類の食用部位であることを特徴とする請求項１記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
【請求項３】
動物組織が、ホヤの食用部位であることを特徴とする請求項１記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
【請求項４】
プロテアーゼが、糸状菌由来のプロテアーゼであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。
【請求項５】
プロテアーゼが、麹菌由来のプロテアーゼであることを特徴とする請求項４記載のプラズマローゲンを含む機能性素材の製造方法。