(57)【要約】【課題】新規なスクアレン消費酵素のスクリーニング方法及びスクアレン−ホペン環化酵素を提供する。【解決手段】スクアレン消費酵素遺伝子を、スクアレンを経由して合成される色素合成可能な細胞に導入し、該色素合成量の増加又は低下を指標とする、スクアレン消費酵素及び／又はその変異体のスクリーニング方法を完成し、さらに該方法により変異型スクアレン−ホペン環化酵素を得ることができた。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列における４２位、６１位、６９位、７１位、９０位、１０７位、１１７位、１２０位、１２４位、１２８位、１２９位、１３１位、１３６位、１４２位、１４５位、１５３位、１５７位、１５９位、１７１位、１８１位、１８７位、１９５位、２０３位、２０７位、２０８位、２１１位、２１４位、２１９位、２３６位、２５１位、２５５位、２５７位、２５９位、２６５位、２７１位、２８５位、２９８位、３３２位、３３５位、３４８位、３５４位、３５７位、３５９位、３６５位、３７８位、３９０位、４２４位、４３７位、４３９位、４４０位、４７８位、４９７位、５０３位、５１４位、５２５位、５７４位、６０４位、及び６２３位からなる群より選択される少なくとも１つの部位にアミノ酸置換を有することを特徴とする、変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその誘導体。
【請求項２】
前記変異型スクアレン−ホペン環化酵素は、野生型スクアレン−ホペン環化酵素と比較して、ホペン合成量が高いことを特徴とする、請求項１に記載の変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその誘導体。
【請求項３】
前記のアミノ酸配列番号１の部位で示されるアミノ酸置換は、以下の群より選択される少なくとも１以上からなる請求項１又は２に記載の変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその誘導体、
M42V、Ｍ42Ｔ、Ｍ61Ｖ、L69S、E71D、T90M、Ｅ107Ｋ、I117Ｖ、Q120R、Ｅ124Ｇ、F129L、Ｖ128L、Ｖ128Ｍ、R131Q、L136Ｐ、W142R、V145A、Ｍ153L、Ｋ157Ｅ、Ｍ159I、Ｒ171Ｑ、Ｍ181Ｖ、M181R、Ｍ181Ｔ、F187L、Ｙ195Ａ、Ｖ203Ｇ、R207W、Ｒ208Ｈ、Ｋ211Ｒ、K211Ｍ、Ｇ214Ｃ、D219G、F236S、F236L、Ｄ251Ｈ、Ｄ255Ｇ、S257N、G259S、Ｗ265Ｃ、Ａ271Ｖ、Ｋ285Ｅ、Ｄ298Ｅ、Ｒ332Ｃ、Ｋ335Ｒ、P348S、Ｋ354Ｍ、Ｎ357Ｙ、Ｋ359Ｍ、F365L、Ｔ378Ａ、L390S、Ｎ424Ｄ、F437L、Ｅ439Ｇ、Ｖ440L、Ｅ478Ｇ、T497S 、A503Ｖ、P514S、Ｑ525Ｒ、Ａ574Ｔ、Ｄ604Ｇ及びＲ623L。
【請求項４】
前記アミノ酸置換は、以下のいずれから選択される１以上からなる請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその誘導体、
M181V、V128L、L136P、N424D、V440L。
【請求項５】
前記アミノ酸置換は、以下の（１）〜（２４）のいずれから選択される１からなる請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその誘導体、
（１）R131Q、M159I、F437L
（２）F129L、F236L、P514S、R623L
（３）G259S、K335R、F437L、Q525R、A574T
（４）V128L
（５）L136P
（６）F236S、A503V、D604G
（７）V145A、E478G
（８）I117V、Q120R、R171Q、D251H
（９）V440L
（１０）M153L、E439G
（１１）E71D、Y195A、D219G、A271V、T378A
（１２）W142R、K211R、K359M
（１３）R208H、S257N、W265C
（１４）M42V、V203G
（１５）M181T、T497S
（１６）M42T、M61V、L69S、K157E、D255G、K285E
（１７）N424D
（１８）T90M、E124G、P348S
（１９）E107K、M181R、K354M、L390S
（２０）G214C、D298E
（２１）M181V
（２２）R207W、K211M
（２３）V128M、F187L、及び、
（２４）R332C、N357Y、F365L。
【請求項６】
配列番号１で示されるアミノ酸配列において、R131Q、M159I及びF437Lのアミノ酸置換を有することを特徴とする、変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその誘導体。
【請求項７】
以下の（１）〜（７）のいずれか１である遺伝子からなる変異型スクアレン−ホペン環化酵素遺伝子、
（１）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子、
（２）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（３）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（４）配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、
（５）配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（６）配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAにおいて、1〜50個の塩基配列が置換、欠損、挿入及び／又は付加しているDNAからなる遺伝子、及び、
（７）配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAと相同性が90%以上のDNAからなる遺伝子。
【請求項８】
以下の（１）〜（３）のいずれか１であるアミノ酸配列からなる変異型スクアレン−ホペン環化酵素、
（１）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列、
（２）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性を有するアミノ酸配列、及び、
（３）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性を有するアミノ酸配列。
【請求項９】
スクアレン消費酵素遺伝子を、スクアレンを経由して合成される色素合成可能な細胞に導入し、該色素合成量の増加又は低下を指標とする、スクアレン消費酵素及び／又はその変異体のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記色素合成量の低下が、色素合成に関与する又は競合する酵素の基質がスクアレン消費酵素により消費されることによる色素合成量の低下である、請求項９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記細胞が大腸菌又は酵母である、請求項９又は１０に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記細胞がスクアレンを経由して合成される色素合成に関与する若しくは競合する遺伝子又はその変異体により形質転換された細胞である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
スクアレン消費酵素がスクアレン−ホペン環化酵素であり、スクアレンを経由して合成される色素合成に関与する遺伝子がスクアレン不飽和化酵素（CrtN）遺伝子である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
スクアレン消費酵素がスクアレン不飽和化酵素であり、スクアレンを経由して合成される色素合成に競合する遺伝子がスクアレン−ホペン環化酵素遺伝子である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スクアレン消費酵素のスクリーニング方法及びスクアレン−ホペン環化酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
スクアレンは、Ｃ３０の直鎖状炭化水素であり、化粧品原料、食油、燃料として注目されている。さらに、スクアレンを前駆体として生合成されるトリテルペン類も注目されている。
しかし、これらのスクアレンを起点とする有価化合物の合成活性をスクリーニングする系の開発が不十分であった。そのため、生合成経路の解明は限定的である。当然であるが、生合成経路が解明されていないので、スクアレンを起点とする有価化合物の生合成の試みもほとんどされていない状況である。
【０００３】
スクアレン環化酵素である精製されたAlicyclobacillus由来のスクアレン／ホベンサイクラーゼに有機合成された人工基質を与えると、非天然のC35テルペン骨格が得られることが知られている(非特許文献１：Ａｂｅ，ＪAＣＳ，124，14514(2002):Hoshino，Ｃｈｅｍ Ｅｕｒ;Ｊ．１５，2091(2009))。このような新規機能の候補が無数に存在するが、それらの組織的な探索、あるいはそれらの特異性の改変は、スクリーニング系の不在により極めて困難であった。
【０００４】
スクアレン−ホペン環化酵素の変異型酵素（D377C、D377N、Y420H、Y420W等）を用いることによって、スクアレンから、単環性トリテルペンである３−デオキシアキレオールＡを得る方法が知られている｛非特許文献２： Biosci. Biotechnol. Biochem., (1999) Vol.63, pp. 2189-2198、非特許文献３：Biosci. Biotechnol. Biochem., (2001) Vol.65, pp.2233-2242、非特許文献４：Biosci. Biotechnol. Biochem., (2002) Vol.66, pp.1660-1670）｝。
しかし、本発明の変異型スクアレン−ホペン環化酵素と前記変異型酵素と比較した場合、アミノ酸置換が明らかに異なる。
【０００５】
本発明者らは、「テルペン合成酵素変異体をコードする遺伝子であって、酵素活性及び／又はその発現が野生型酵素と比較して増強されたテルペン合成酵素変異体をコードする遺伝子を導入した細胞に、被検遺伝子を導入して培養し、細胞に導入した被検遺伝子のうち生存した細胞に導入した被検遺伝子を選択することを含む、テルペン合成酵素の遺伝子及び／又はその変異体のスクリーニング方法（参照：特許文献１）」を開示している。
しかし、前記スクリーニング方法は、本発明のスクアレン消費酵素及び／又はその変異体のスクリーニング方法とは原理が異なる。
【０００６】
本発明者らは、「被検遺伝子を色素合成可能な細胞に導入し、色素合成量の低下を検出することを特徴とする、テルペン合成酵素の遺伝子及び／又はその変異体のスクリーニング方法（参照：特許文献２）」を開示している。
しかし、前記スクリーニング方法は、本発明のスクアレン消費酵素及び／又はその変異体のスクリーニング方法とはスクリーニングの対象が異なる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2011-125334号公報
【特許文献２】特開2014-223038号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｂｅ，ＪAＣＳ，124，14514(2002):Hoshino，Ｃｈｅｍ Ｅｕｒ;Ｊ．１５，2091(2009)
【非特許文献２】Biosci.Biotechnol. Biochem., (1999) Vol.63, pp. 2189-2198
【非特許文献３】Biosci.Biotechnol. Biochem., (2001) Vol.65, pp.2233-2242
【非特許文献４】Biosci. Biotechnol.Biochem., (2002) Vol.66, pp.1660-1670
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、新規なスクアレン消費酵素のスクリーニング方法及びスクアレン−ホペン環化酵素を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは鋭意検討した結果、スクアレン消費酵素遺伝子を、スクアレンを経由して合成される色素合成可能な細胞に導入し、該色素合成量の増加又は低下を指標とする、スクアレン消費酵素及び／又はその変異体のスクリーニング方法を完成し、さらに該方法により変異型スクアレン−ホペン環化酵素を得ることができて、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．配列番号１で示されるアミノ酸配列における４２位、６１位、６９位、７１位、９０位、１０７位、１１７位、１２０位、１２４位、１２８位、１２９位、１３１位、１３６位、１４２位、１４５位、１５３位、１５７位、１５９位、１７１位、１８１位、１８７位、１９５位、２０３位、２０７位、２０８位、２１１位、２１４位、２１９位、２３６位、２５１位、２５５位、２５７位、２５９位、２６５位、２７１位、２８５位、２９８位、３３２位、３３５位、３４８位、３５４位、３５７位、３５９位、３６５位、３７８位、３９０位、４２４位、４３７位、４３９位、４４０位、４７８位、４９７位、５０３位、５１４位、５２５位、５７４位、６０４位、及び６２３位からなる群より選択される少なくとも１つの部位にアミノ酸置換を有することを特徴とする、変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその誘導体。
２．前記変異型スクアレン−ホペン環化酵素は、野生型スクアレン−ホペン環化酵素と比較して、ホペン合成量が高いことを特徴とする、前項１に記載の変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその誘導体。
３．前記のアミノ酸配列番号１の部位で示されるアミノ酸置換は、以下の群より選択される少なくとも１以上からなる前項１又は２に記載の変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその誘導体、
M42V、Ｍ42Ｔ、Ｍ61Ｖ、L69S、E71D、T90M、Ｅ107Ｋ、I117Ｖ、Q120R、Ｅ124Ｇ、F129L、Ｖ128L、Ｖ128Ｍ、R131Q、L136Ｐ、W142Ｒ、V145A、Ｍ153L、Ｋ157Ｅ、Ｍ159I、Ｒ171Ｑ、Ｍ181Ｖ、M181R、Ｍ181Ｔ、F187L、Ｙ195Ａ、Ｖ203Ｇ、R207W、Ｒ208Ｈ、Ｋ211Ｒ、K211Ｍ、Ｇ214Ｃ、D219G、F236S、F236L、Ｄ251Ｈ、Ｄ255Ｇ、S257N、G259S、Ｗ265Ｃ、Ａ271Ｖ、Ｋ285Ｅ、Ｄ298Ｅ、Ｒ332Ｃ、Ｋ335Ｒ、P348S、Ｋ354Ｍ、Ｎ357Ｙ、Ｋ359Ｍ、F365L、Ｔ378Ａ、L390S、Ｎ424Ｄ、F437L、Ｅ439Ｇ、Ｖ440L、Ｅ478Ｇ、T497S 、A503Ｖ、P514S、Ｑ525Ｒ、Ａ574Ｔ、Ｄ604Ｇ及びＲ623L。
４．前記アミノ酸置換は、以下のいずれから選択される１以上からなる前項１〜３のいずれか１項に記載の変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその誘導体、
M181V、V128L、L136P、N424D、V440L。
５．前記アミノ酸置換は、以下の（１）〜（２４）のいずれから選択される１からなる前項１〜３のいずれか１項に記載の変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその誘導体、
（１）R131Q、M159I、F437L
（２）F129L、F236L、P514S、R623L
（３）G259S、K335R、F437L、Q525R、A574T
（４）V128L
（５）L136P
（６）F236S、A503V、D604G
（７）V145A、E478G
（８）I117V、Q120R、R171Q、D251H
（９）V440L
（１０）M153L、E439G
（１１）E71D、Y195A、D219G、A271V、T378A
（１２）W142R、K211R、K359M
（１３）R208H、S257N、W265C
（１４）M42V、V203G
（１５）M181T、T497S
（１６）M42T、M61V、L69S、K157E、D255G、K285E
（１７）N424D
（１８）T90M、E124G、P348S
（１９）E107K、M181R、K354M、L390S
（２０）G214C、D298E
（２１）M181V
（２２）R207W、K211M
（２３）V128M、F187L、及び、
（２４）R332C、N357Y、F365L。
６．配列番号１で示されるアミノ酸配列において、R131Q、M159I及びF437Lのアミノ酸置換を有することを特徴とする、変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその誘導体。
７．以下の（１）〜（７）のいずれか１である遺伝子からなる変異型スクアレン−ホペン環化酵素遺伝子、
（１）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子、
（２）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（３）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（４）配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、
（５）配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（６）配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAにおいて、1〜50個の塩基配列が置換、欠損、挿入及び／又は付加しているDNAからなる遺伝子、及び、
（７）配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAと相同性が90%以上のDNAからなる遺伝子。
８．以下の（１）〜（３）のいずれか１であるアミノ酸配列からなる変異型スクアレン−ホペン環化酵素、
（１）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列、
（２）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性を有するアミノ酸配列、及び、
（３）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性を有するアミノ酸配列。
９．スクアレン消費酵素遺伝子を、スクアレンを経由して合成される色素合成可能な細胞に導入し、該色素合成量の増加又は低下を指標とする、スクアレン消費酵素及び／又はその変異体のスクリーニング方法。
１０．前記色素合成量の低下が、色素合成に関与する又は競合する酵素の基質がスクアレン消費酵素により消費されることによる色素合成量の低下である、前項９に記載のスクリーニング方法。
１１．前記細胞が大腸菌又は酵母である、前項９又は１０に記載のスクリーニング方法。
１２．前記細胞がスクアレンを経由して合成される色素合成に関与する若しくは競合する遺伝子又はその変異体により形質転換された細胞である、前項９〜１１のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
１３．スクアレン消費酵素がスクアレン−ホペン環化酵素であり、スクアレンを経由して合成される色素合成に関与する遺伝子がスクアレン不飽和化酵素（CrtN）遺伝子である、前項９〜１２のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
１４．スクアレン消費酵素がスクアレン不飽和化酵素であり、スクアレンを経由して合成される色素合成に競合する遺伝子がスクアレン−ホペン環化酵素遺伝子である、前項９〜１２のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、野生型スクアレン−ホペン環化酵素と比較してホペン合成量が高い変異型スクアレン−ホペン環化酵素並びに該酵素のスクリーニング方法を提供することができた。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１のＳＨＣ（スクアレン−ホペン環化酵素）ライブラリの作製の概要。
【図２】ｐＪ２１１−ｐｌａｃ−ＳＨＣｗｔ（ｐＪ２１１−ｌａｃＰ／Ｏ−ＳＨＣ）のマップを示す。
【図３】実施例２の植菌後３７℃で４４時間静置培養したプレートの観察結果。
【図４】ｐＵＣ−ｈＳＱＳ−ＣｒｔＮｏｐｔ１０，０００（ｐＵＣ−ｌａｃＰ／Ｏ−ｈＳＱＳ−ＣｒｔＮ）のマップを示す。
【図５】実施例３のＳＨＣライブラリのスクアレン消費スクリーニングの観察結果。Ｍｎ２＋：０Ｍ  ｌｉｂは０Ｍライブラリの観察結果を示す。ＳＨＣｗｔはｐＪ２１１−ＳＨＣｗｔの観察結果を示す。ＳＨＣｄｅａｄはｐＪ２１１−ＳＨＣｄｅａｄの観察結果を示す。矢印は、「色が薄くなっているコロニー（スクアレン消費活性が向上しているスクアレンーホペン環化酵素変異体が発現しているコロニー）」を示す。
【図６】実施例４のＳＨＣ変異体の生産物解析の結果。野生型の合成量を１としたときの合成量で合成量順にソーティングした。
【図７】実施例４のＳＨＣ変異体のアミノ酸変異マッピングの結果。横軸はＳＨＣの６３１アミノ酸のアミノ酸配列を示す。縦軸は各変異体（又は野生型）を示す。図中の濃い縦長の四角はアミノ酸変異を示す。シノニマス変異は表示していない。丸で囲んだ箇所は単独で活性が上がった変異を示す。横軸を指す矢印は複数の変異体に見られた変異を示す。縦軸を指す矢印は活性向上に寄与していると考えられる変異を特定していない変異体を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、「変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその変異体」、並びに、「スクアレン消費酵素及び／又はその変異体のスクリーニング方法」に関する。
【００１５】
（変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその誘導体）
本発明の変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその誘導体は、野生型スクアレン−ホペン環化酵素と比較して、アミノ酸又は塩基が１以上異なる酵素を意味する。
野生型スクアレン−ホペン環化酵素は、Alicyclobacillus属、Zymomonas属、Bradyrhizobium属、Methylococcus属等の細菌で産出され、スクアレンを閉環して、５環性のホペン又はホパノールを生成する酵素として知られている。
特に、本発明の変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその誘導体は、野生型スクアレン−ホペン環化酵素と比較して、ホペン合成量が高い（合成活性が高い）ことを特徴とする。
また、本発明の誘導体とは、変異型スクアレン−ホペン環化酵素の保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、若しくはアセチル化誘導体を対象とする。
なお、保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、若しくはアセチル化誘導体は、自体公知の方法で得ることができる。
【００１６】
本発明の変異型スクアレン−ホペン環化酵素は、Alicyclobacillus acidocaldarius由来のスクアレン−ホペン環化酵素（配列番号１）と比較して、アミノ酸配列に以下で示される置換を有する。
４２位、６１位、６９位、７１位、９０位、１０７位、１１７位、１２０位、１２４位、１２８位、１２９位、１３１位、１３６位、１４２位、１４５位、１５３位、１５７位、１５９位、１７１位、１８１位、１８７位、１９５位、２０３位、２０７位、２０８位、２１１位、２１４位、２１９位、２３６位、２５１位、２５５位、２５７位、２５９位、２６５位、２７１位、２８５位、２９８位、３３２位、３３５位、３４８位、３５４位、３５７位、３５９位、３６５位、３７８位、３９０位、４２４位、４３７位、４３９位、４４０位、４７８位、４９７位、５０３位、５１４位、５２５位、５７４位、６０４位、及び／又は６２３位。
また、本発明の変異型スクアレン−ホペン環化酵素は、Alicyclobacillus acidocaldarius由来のスクアレン−ホペン環化酵素（配列番号１）と比較して、アミノ酸配列に以下で示される置換を有する。
M42V、Ｍ42Ｔ、Ｍ61Ｖ、L69S、E71D、T90M、Ｅ107Ｋ、I117Ｖ、Q120R、Ｅ124Ｇ、F129L、Ｖ128L、Ｖ128Ｍ、R131Q、L136Ｐ、W142Ｒ、V145A、Ｍ153L、Ｋ157Ｅ、Ｍ159I、Ｒ171Ｑ、Ｍ181Ｖ、M181R、Ｍ181Ｔ、F187L、Ｙ195Ａ、Ｖ203Ｇ、R207W、Ｒ208Ｈ、Ｋ211Ｒ、K211Ｍ、Ｇ214Ｃ、D219G、F236S、F236L、Ｄ251Ｈ、Ｄ255Ｇ、S257N、G259S、Ｗ265Ｃ、Ａ271Ｖ、Ｋ285Ｅ、Ｄ298Ｅ、Ｒ332Ｃ、Ｋ335Ｒ、P348S、Ｋ354Ｍ、Ｎ357Ｙ、Ｋ359Ｍ、F365L、Ｔ378Ａ、L390S、Ｎ424Ｄ、F437L、Ｅ439Ｇ、Ｖ440L、Ｅ478Ｇ、T497S 、A503Ｖ、P514S、Ｑ525Ｒ、Ａ574Ｔ、Ｄ604Ｇ及び／又はＲ623L。
【００１７】
本発明の変異型スクアレン−ホペン環化酵素は、Alicyclobacillus acidocaldarius由来のスクアレン−ホペン環化酵素（配列番号１）と比較して、アミノ酸配列に以下の（１）〜（２４）のいずれか１で示される置換を有する。
（１）R131Q、M159I、F437L（配列番号２、配列番号５）
（２）F129L、F236L、P514S、R623L（配列番号３、配列番号６）
（３）G259S、K335R、F437L、Q525R、A574T（配列番号４、配列番号７）
（４）V128L
（５）L136P
（６）F236S、A503V、D604G
（７）V145A、E478G
（８）I117V、Q120R、R171Q、D251H
（９）V440L
（１０）M153L、E439G
（１１）E71D、Y195A、D219G、A271V、T378A
（１２）W142R、K211R、K359M
（１３）R208H、S257N、W265C
（１４）M42V、V203G
（１５）M181T、T497S
（１６）M42T、M61V、L69S、K157E、D255G、K285E
（１７）N424D
（１８）T90M、E124G、P348S
（１９）E107K、M181R、K354M、L390S
（２０）G214C、D298E
（２１）M181V
（２２）R207W、K211M
（２３）V128M、F187L
（２４）R332C、N357Y、F365L
【００１８】
本発明の変異型スクアレン−ホペン環化酵素は、Alicyclobacillus acidocaldarius由来のスクアレン−ホペン環化酵素（配列番号１）と比較して、以下のいずれから１以上のアミノ酸置換を有することにより、野生型スクアレン−ホペン環化酵素と比較して、ホペン合成量が高いことを下記の実施例で確認している。
M181V、V128L、L136P、N424D及びV440L。
【００１９】
ホペン合成量（ホペン合成活性）が高いとは、Alicyclobacillus acidocaldarius由来の野生型スクアレン−ホペン環化酵素（配列番号１）と比較して、1.1倍以上、1.5倍以上、2.0倍以上、3.0倍以上、約4.0倍（以上）、約5.0倍（以上）、約6.0倍（以上）、約7.0倍（以上）、約8.0倍（以上）、約9.0倍（以上）、約10倍（以上）、約11倍（以上）、約12倍（以上）、約13倍（以上）、約14倍（以上）、約15倍（以上）、約16倍（以上）、約17倍（以上）、約18倍（以上）、約19倍（以上）、約20倍（以上）、約21倍（以上）、約22倍（以上）、約23倍（以上）、約24倍（以上）、約25倍（以上）、約26倍（以上）、約27倍（以上）、約28倍（以上）、約29倍（以上）、約30倍（以上）、約31倍（以上）、約35倍（以上）、約40倍（以上）のホペン合成量を例示することができる。
【００２０】
（変異型スクアレン−ホペン環化酵素遺伝子）
本発明の変異型スクアレン−ホペン環化酵素遺伝子は、（１）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子、（２）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸、好ましくは1〜15個、より好ましくは1〜10個、最も好ましくは1〜5個が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、（３）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、（４）配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、（５）配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、（６）配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAにおいて、1〜50個の塩基配列が置換、欠損、挿入及び／又は付加しているDNAからなる遺伝子、（７）配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAと90%以上の相同性を有するDNAからなる遺伝子を、含む。
上記（１）の遺伝子は、本発明のスクアレン消費酵素及び／又はその変異体のスクリーニング方法から得られたスクアレン−ホペン環化酵素をコードする遺伝子である。該スクアレン−ホペン環化酵素は、スクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性を持つ。
上記（２）の遺伝子は、本発明の変異型スクアレン−ホペン環化酵素に対して酵素活性を失わせない程度の変異を導入したポリペプチドをコードする遺伝子である。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982）などを挙げることができる。変異したアミノ酸の数は、通常は、20アミノ酸以内であり、好ましくは10アミノ酸以内であり、更に好ましくは５アミノ酸以内であり、最も好ましくは3アミノ酸である。変異を導入したポリペプチドが酵素活性を保持しているかどうかは、例えば、変異を導入したポリペプチドをコードする遺伝子を大腸菌等に導入し、発現させ、その大腸菌等がスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成することができるかどうか調べることによりわかる。特に、本実施例により、Alicyclobacillus acidocaldarius由来のスクアレン−ホペン環化酵素のアミノ酸配列において、酵素活性に重要なアミノ酸の位置であるM181、V128、L136、N424及びV440を特定している。これらのアミノ酸の位置・部位に変異が導入されると酵素活性が失われる可能性が高いので、変異はこれらのアミノ酸以外のアミノ酸に導入されることが好ましい。
上記（３）の遺伝子に関し、「配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性と実質的同等の活性」とは、その活性程度が、配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列のスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性と比較して強くても弱くてもよい。例えば、0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1.0倍、1.1倍、1.2倍、1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍の活性を例示することができる。
また、相同性は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center forBiological Information）等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算することができる。
上記（５）の遺伝子は、DNA同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる遺伝子である。この遺伝子における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、5×SSC、1％SDSを含む緩衝液中の37℃でのハイブリダイゼーション及び1×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による37℃での洗浄処理といった条件であり、好ましくは、5×SSC、1％SDSを含む緩衝液中の42℃でのハイブリダイゼーション及び0.5×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による42℃での洗浄処理といった条件であり、更に好ましくは、5×SSC、1％SDSを含む緩衝液中の65℃でのハイブリダイゼーション及び0.2×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による65℃での洗浄処理といった条件である。ハイブリダイゼーションを利用することにより得られたDNAが、活性を有するポリペプチドをコードするかどうかは、例えば、そのDNAを大腸菌等に導入し、発現させ、その大腸菌等がスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成することができるかどうか調べることによりわかる。ハイブリダイゼーションにより得られるDNAは、上記（４）の遺伝子（配列番号５〜７のいずれか１）と通常、高い相同性を有する。高い相同性とは、90％以上の相同性、好ましくは95％以上の相同性、更に好ましくは98％以上の相同性を指す。
上記（６）の遺伝子は、配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAにおいて、1〜50個、好ましくは1〜30個、より好ましくは1〜20個、特に好ましくは1〜10個、最も好ましくは1〜5個の塩基配列が置換、欠損、挿入及び／又は付加しているDNAからなる遺伝子である。
上記（７）の遺伝子は、配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAと90%以上、好ましくは93％以上、より好ましくは95％以上、最も好ましくは98％以上の相同性を有するDNAからなる遺伝子を、含む。
【００２１】
（変異型スクアレン−ホペン環化酵素）
本発明の変異型スクアレン−ホペン環化酵素は、（１）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列、（２）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列において、1〜20個、好ましくは1〜15個、より好ましくは1〜10個、最も好ましくは1〜5個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性を有するアミノ酸配列、（３）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性を有するアミノ酸配列を、含む。
なお、ペプチドの変異の導入において、当該ペプチドの基本的な性質（物性、機能、生理活性又は免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸及び芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。
【００２２】
（本発明のスクリーニング方法）
本発明のスクアレン消費酵素のスクリーニング方法は、スクアレン消費酵素の探索を行うため、基質から色素を合成することができる細胞にスクアレン消費酵素遺伝子を導入し発現させて、基質の消費をスクアレン消費酵素と競合する酵素と競合させ、色素合成量の増減を検出することによる、スクアレン消費酵素遺伝子のスクリーニング方法に関する。
さらに、本発明は、スクアレン消費酵素遺伝子ライブラリ（特に、ランダム変異を導入したスクアレン消費酵素遺伝子ライブラリ）を色素合成可能な細胞に導入し、色素合成量の増減を検出することによる、野生型スクアレン消費酵素と比較して活性の高い変異型スクアレン消費酵素遺伝子のスクリーニング方法に関する。
【００２３】
（スクアレン消費酵素）
本発明での「スクアレン消費酵素」とは、スクアレンの消費に関与する酵素（複数の酵素群も含む）である。特に、スクアレン消費酵素は、スクアレンを直接又は間接的に色素に転換する作用を有すれば特に限定されない。
例えば、スクアレン−ホペン環化酵素、スクアレン不飽和化酵素、CrtNb（4, 4'-diapolycopene oxidase）、スクアレンエポキシダーゼ、アンブレイン合成酵素、スクアレン水素化酵素及びスクアレン飽和化酵素等を例示することができる。
また、本発明での「スクアレン消費酵素遺伝子」とは、スクアレン消費酵素をコードする遺伝子である。「その変異体」とは、スクアレン消費酵素遺伝子のＤＮＡがその一部のヌクレオチドの置換、欠失、付加などにより変異した遺伝子の概念である。自然界で生じた変異でもよいし、人工的になされた変異でもよい。
変異は、発現酵素の酵素活性、発現量又は安定性が高くなる変異が好ましい。また基質特異性を高めるような変異も好ましい。特に、酵素活性を高める変異が好ましい。
変異体のライブラリを作成し、そのライブラリから、その宿主において酵素活性、発現量又は安定性が高い変異体を本発明の方法により、スクリーニングできる。
本発明における「スクアレンを経由して合成される色素合成可能な細胞へ導入されるスクアレン消費酵素遺伝子」とは、スクアレン消費酵素遺伝子若しくはその変異体を含むと考えられる遺伝子又は遺伝子群である。天然の細胞から抽出した遺伝子、作製したライブラリの遺伝子、化学合成遺伝子、ＰＣＲ増幅遺伝子など由来は問わない。本発明のスクリーニング方法は、発現する酵素の基質消費能を指標とするため、未同定の遺伝子をスクリーニングすることができる。
スクアレン消費酵素遺伝子又はその変異体の、スクアレンを経由して合成される色素合成可能な細胞への導入は、遺伝子組み換え技術で用いられている常法によることができる。例えば、ベクターにスクリーニング対象の遺伝子を組み込み、細胞を形質転換する等である。
【００２４】
（スクアレン消費酵素と競合する酵素）
本発明での「スクアレン消費酵素と競合する酵素」とは、基質の消費をスクアレン消費酵素と競合する特性を有する。
例えば、下記の表１に記載の酵素を例示することができる。
【００２５】
（色素合成に関与又は競合する酵素の基質）
本発明での「色素合成に関与又は競合する酵素の基質」とは、スクアレンだけでなく、スクアレンの前駆物質や、スクアレン派生物質であるジアポニューロスポレン、ジアポリコペン等も対象とする。
【００２６】
（本発明のスクリーニング方法での組合せ）
本発明のスクリーニング方法では、下記の表１に記載の組合せを例示することができるが、特に限定されない。
【００２７】
【表１】
2019170350.tif 000002
【００２８】
例えば、色素合成に関与又は競合する酵素の基質がスクアレンであり、スクアレン消費酵素がスクアレン−ホペン環化酵素であり、スクアレン消費酵素と競合する酵素がスクアレン不飽和化酵素の時、スクアレン消費酵素の活性が高い場合にはジアポニューロスポレン（黄色）の合成量が低下し（ホペン（無色）の合成量が増加し）、スクアレン消費酵素の活性が低い場合にはジアポニューロスポレン（黄色）の合成量が上昇する（ホペン（無色）の合成量が低下する）。
例えば、色素合成に関与又は競合する酵素の基質がスクアレンであり、スクアレン消費酵素がスクアレン不飽和化酵素であり、スクアレン消費酵素と競合する酵素がスクアレン−ホペン環化酵素の時、スクアレン消費酵素の活性が高い場合にはジアポニューロスポレン（黄色）の合成量が上昇し（ホペン（無色）の合成量が低下する）、スクアレン消費酵素の活性が低い場合にはジアポニューロスポレン（黄色）の合成量が減少する（ホペン（無色）の合成量が増加する）。
例えば、色素合成に関与又は競合する酵素の基質がスクアレンであり、スクアレン消費酵素がスクアレン−ホペン環化酵素であり、スクアレン消費酵素と競合する酵素がスクアレン不飽和化酵素CrtN及びCrtNb（4, 4'-diapolycopene oxidase）のオペロンの時、スクアレン消費酵素の活性が高い場合には赤色色素であるジアポリコペンジアールの合成量が低下し（ホペンの合成量が増加し）、スクアレン消費酵素の活性が低い場合には赤色色素であるジアポリコペンジアールの合成量が増加する（ホペンの合成量が低下する）。
例えば、色素合成に関与又は競合する酵素の基質がスクアレンであり、スクアレン消費酵素がスクアレンエポキシダーゼであり、スクアレン消費酵素と競合する酵素がスクアレン不飽和化酵素の時、スクアレン消費酵素の活性が高い場合にはジアポニューロスポレン（黄色）の合成量が低下する。
例えば、色素合成に関与又は競合する酵素の基質がスクアレンであり、スクアレン消費酵素がアンブレイン合成酵素であり、スクアレン消費酵素と競合する酵素がスクアレン不飽和化酵素の時、スクアレン消費酵素の活性が高い場合にはジアポニューロスポレン（黄色）の合成量が低下する。
例えば、色素合成に関与又は競合する酵素の基質がスクアレンであり、スクアレン消費酵素がスクアレン水素化酵素（スクアレン飽和化酵素）であり、スクアレン消費酵素と競合する酵素がスクアレン不飽和化酵素の時、スクアレン消費酵素の活性が高い場合にはジアポニューロスポレン（黄色）の合成量が低下する。
【００２９】
（スクアレンを経由して合成される色素合成可能な細胞）
本発明での「スクアレンを経由して合成される色素合成可能な細胞」は、上記の酵素により色素を生合成することができる細胞であれば制限されない。天然の細胞でも、遺伝子組み換えにより形質転換されている細胞でもよい。遺伝子組み換え細胞は、遺伝子組み換えの操作に簡便な細胞である、大腸菌、枯草菌、酵母などが挙げられる。
本発明で用いる好ましい色素合成可能な細胞は、色素合成に関与する酵素遺伝子若しくはその変異体、及び／又は、色素合成に競合する酵素遺伝子若しくはその変異体により形質転換されている細胞である。また、さらにイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（idi）遺伝子により、Idiを細胞に導入し、イソプレノイド経路を強化した細胞が好ましい。
本発明で用いる色素合成可能な細胞は、必要に応じて、ジアポフィトエン合成酵素（CrtM）遺伝子若しくはその変異体、及び／又はデヒドロスクアレン不飽和化酵素（CrtN）遺伝子若しくはその変異体を形質転換された細胞でも良い。その色素合成可能細胞は、C15PPを基質として、ジアポニューロスポレン（黄色）ジアポリコペン(赤色)等を生成し、細胞が黄色や赤色等になる。CrtM遺伝子とCrtN遺伝子又はそれらの変異体は、同一のベクターに組み込まれていてもよいし、別のベクターに組み込まれていてもよい。
また、本発明で用いる色素合成可能な細胞は、必要に応じて、CrtM遺伝子若しくはその変異体、及び／又はCrtN遺伝子若しくはその変異体に加えさらにゲラニル二リン酸合成酵素（GPS）遺伝子又はその変異体により形質転換された細胞でも良い。その色素合成可能な細胞は、C10PPを基質として、ジアポニューロスポレン（黄色）ジアポリコペン(赤色)等を生成し、細胞が黄色や赤色等になる。CrtM遺伝子、CrtN遺伝子及びGPS遺伝子又はそれらの変異体は、同一のベクターに組み込まれていてもよいし、別のベクターに組み込まれていてもよい。
また、本発明で用いる色素合成可能な細胞は、必要に応じて、フィトエン合成酵素（CrtB）遺伝子若しくはその変異体、及び／又はフィトエン脱水素酵素（CrtI）遺伝子若しくはその変異体により形質転換された細胞でも良い。その色素合成可能細胞は、C20PPを基質として、リコペン（赤色）等を生成し、細胞がピンク色等になる。CrtB遺伝子及びCrtI遺伝子又はそれらの変異体は、同一のベクターに組み込まれていてもよいし、別のベクターに組み込まれていてもよい。
また、本発明で用いる色素合成可能な細胞は、必要に応じて、CrtB遺伝子若しくはその変異体、及び／又はCrtI遺伝子若しくはその変異体に加えさらにゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（CrtE）遺伝子又はその変異体により形質転換された細胞でも良い。その色素合成可能細胞は、C20PPを基質として、リコペン（赤色）等を生成し、細胞がピンク色等になる。特にC20PPを合成しない宿主（例えば大腸菌）にはCrtE遺伝子の導入が必要になる。CrtB遺伝子、CrtI遺伝子及びCrtE遺伝子又はそれらの変異体は、同一のベクターに組み込まれていてもよいし、別のベクターに組み込まれていてもよい。
【００３０】
（色素合成量の増加又は低下）
本発明での「色素合成量の増加又は低下」は、細胞における色素生合成の量が増加又は低下し、細胞中の色素量が増加又は減少することである。スクアレン消費酵素とスクアレン消費酵素と競合する酵素が基質の消費を競合することにより、色素合成量が増加又は低下する。すなわち、本発明のスクリーニング方法では、スクアレン消費酵素遺伝子を導入した色素合成可能な細胞における色素合成量を、スクアレン消費酵素遺伝子を導入していない色素合成可能な細胞における色素合成量と比較し、色素合成量が増加又は低下した細胞を選択し、その細胞に導入された該遺伝子をスクアレン消費酵素遺伝子であると決定する。
【００３１】
色素合成量の増加若しくは低下を検出する方法、又は色素合成量の増加若しくは低下を測定する方法は、視認により実施できる。また、各種測定機器、マイクロプレートリーダー、分光光度計、測色光度計などの各種測定機器により検出できる。
本発明のスクリーニング方法を用いれば、細胞を破壊することなく、スクアレン消費酵素の活性を検出又は測定することができる。具体的には、視認によるときは、細胞のコロニーをプレート上に作成し、コロニー色を観察する。視認によるものであれば、0.3-1.5 mm、特に0.5-1.0 mm直径のコロニーを形成させ、目視により探索する。
スループットをあげる必要があるときは、低倍率拡大鏡などを用い、より小さなコロニーを密集させる手法を用いることができる。また、画像解析ソフトウエアを用いることによって、コロニー色の強弱を定量化し、コロニーピッカーを用いてスクリーニング全般を半自動化することもできる。
【００３２】
（色素合成可能細胞の製造方法）
色素合成可能細胞は、常法により製造することができる。例えば、各遺伝子を、購入又はＰＣＲなどにより常法により調製し、その遺伝子を宿主に適する発現ベクターに常法により組み込み、目的のベクターを選択し、そのベクターにより宿主細胞を常法により形質転換することにより得られる。
用いる宿主細胞は、制限されないが、培養時間の短縮やクローニングの容易さを考えれば、大腸菌、枯草菌、酵母などが好ましい。特に大腸菌、酵母が好ましく、好適な大腸菌としては、Escherichia coli XL1-Blueのようなクローニング株、HB101やBL21などの発現株に加え、テルペン前駆体の合成量が豊富な遺伝子ノックアウト株、たとえばJW1750 ΔgdhA (glutamate dehydrogenase欠損)、JW0110 ΔaceE(pyruvate dehydrogenase欠損)（Baba,T. et al.; Mol Syst Biol 2, 2006 0008 (2006)）等が挙げられ、好適な酵母としては、標準的な発芽酵母、INVSc1(invitrogen)、YPH499(stratagene)等が挙げられる。
好適なベクターは、特に制限はなく、一般に用いられているベクターでよい。例えば、宿主が大腸菌であるときは、pUC18、pACYC184、などに由来するものが挙げられ、宿主が枯草菌であるときはpUB110、pE194、pC194、pHY300PLK DNAなどが、宿主が酵母であるときは、pRS303、YEp213、TOp2609等が挙げられる。
【００３３】
（スクアレン消費酵素遺伝子又はその変異体のスクリーニング用キット）
本発明のスクアレン消費酵素遺伝子又はその変異体のスクリーニング用キットは、色素合成可能細胞を含むものであり得る。色素合成可能細胞は、冷凍保存してバイアル内に封入したものが好適である。あるいは、本発明に係るキットは、所望の細胞を色素合成可能細胞に形質転換するための色素合成酵素遺伝子発現ベクターを構成要素として含むものであり得る。
さらに、上記本発明に係るキットは、被検遺伝子用の発現ベクター、クローニング酵素セット、メタゲノムソース、あるいは配列データベースをもとに作製された（候補）遺伝子ライブラリ、マイクロプレート、イソプレノイド経路（テルペン上流経路）の強化された菌株、培地や添加剤などのスクリーニングに有用な物質や器具（画像スキャナや測色光度計、色見本、コロニーピッカー）などをキットの構成要素として加えることができる。
【００３４】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
（ＳＨＣライブラリの作製）
以下の通り、スクアレン消費酵素であるスクアレン・ホペンサイクラーゼ（スクアレン−ホペン環化酵素）の遺伝子全域にｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲを施してランダム変異を導入し、ＳＨＣライブラリ（ｐＪ２１１  −ｐｌａｃ−［ＳＨＣ］ｌｉｂ）を作製した。概要を図１に示す。
【００３６】
（ランダム変異導入）
（１）テンプレートとしてｐＪ２１１−ｐｌａｃ−ＳＨＣｗｔ（図２）からＰＣＲ増幅したＳＨＣｗｔ（５ｎｇ）、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５−ｕｎｉｔｓ、ＮＥＢ）、プライマー（ｐＪ２１１−ＳＨＣＦ：5'-TTTTGAATTCTCGGGAGGTACATATGGCTGAGCAGTTGGTGGA-3'：配列番号８及びｐＪ２１１−ＳＨＣＲ：5'-TTTTACTAGTTTACCTGCGCTCGATGGCTT-3'：配列番号９）、ＭｎＣｌ２（０、１０又は２０μＭ）、ｄＮＴＰ（各２ｍＭ）、５％ＤＭＳＯ及び超純水（残部）を混合し総量５０μＬとした。
（２）９４℃５秒、続いて（９４℃１５秒−５７℃１５秒−６８℃２分）×２５サイクル、最後に６８℃５分のサイクルでＰＣＲを行い、ＭｎＣｌ２濃度０μＭ、１０μＭ及び２０μＭにおいて得られたＰＣＲ産物をそれぞれプラスミドライブラリ化に用いるインサートとした。
（３）ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、ＰＣＲ産物のシングルバンドの所見より増幅効率を確認した。
その結果、ＰＣＲ増幅収量は、ＭｎＣｌ２が０μＭの場合５μｇ、ＭｎＣｌ２が１０μＭの場合５μｇ、及びＭｎＣｌ２が２０μＭの場合３μｇであり、増幅効率はそれぞれ１０００倍、１０００倍、及び６００倍であったことを確認した。
【００３７】
（プラスミドライブラリ化）
（１）ｐＪ２１１−ｐｌａｃ−ＳＨＣｗｔをテンプレートとしてＱ５ポリメラーゼ（ＮＥＢ）でベクター部分を増幅した。
（２）前記ベクター部分及び前記インサートをＥｃｏＲＩ／Ｓｐｅｌで切断し、ライゲーションした。
（３）ＢＷ２５１１３エレクトロポレーション用コンピテントセルに形質転換し、ライブラリを回収し、ＭｎＣｌ２濃度０μＭ、１０μＭ及び２０μＭ（０μＭライブラリ、１０μＭライブラリ及び２０μＭライブラリ）におけるライブラリサイズを確認した。
結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
2019170350.tif 000003
【実施例２】
【００３９】
（ＳＨＣライブラリのスクアレン消費酵素スクリーニングのためのＣｒｔＮの選択）
実施例３のＳＨＣライブラリを使用したスクアレン消費酵素スクリーニングで使用するスクアレンを経由して合成される色素合成に関与する酵素であるＣｒｔＮを選択するため、ｐＵＣ-ｈＳＱＳＣｒｔＮｏｐｔ、大腸菌に最適化していないｐＵＣ−ｈＳＱＳ−ＣｒｔＮ及びＣｒｔＮを合成しないｐＵＣ-ｈＳＱＳを用いて評価した。
【００４０】
（手順）
（１）大腸菌コドンに最適化されたＣｒｔＮ（ＣｒｔＮｏｐｔ）について、翻訳開始配列を３通りに変え、それぞれ開始効率を高（ＣｒｔＮｏｐｔ１００，０００）・中（ＣｒｔＮｏｐｔ１０，０００）・低（ＣｒｔＮｏｐｔ５００）に設計し、３種類のｐＵＣ−ｈＳＱＳ−ＣｒｔＮｏｐｔを作製した。
（２）作製したｐＵＣ-ｈＳＱＳＣｒｔＮｏｐｔ、大腸菌に最適化していないｐＵＣ−ｈＳＱＳ−ＣｒｔＮ及びＣｒｔＮを合成しないｐＵＣ-ｈＳＱＳをｐＪ２１１−Φ、ｐＪ２１１−ＳＨＣｗｔ、ｐＪ２１１−ＳＨＣｄｅａｄ、ｐＪ２１１−ＳＨＣＥ４５Ｄ、ｐＪ２１１−ＳＨＣＦ４３７Ｌと共にＸＬ１Ｂに導入し、ニトロセルロース膜上に植菌した。３７℃で４８時間静置培養した後、コロニーの色を観察した。
【００４１】
（結果）
結果を図３に示す。
植菌後３７℃で４４時間静置培養したプレートを観察した結果、ＣｒｔＮの種類によらず、色の濃さはｐＪ２１１−Φ≒ｐＪ２１１−ＳＨＣｄｅａｄ＞ｐＪ２１１−ＳＨＣｗｔ＞ｐＪ２１１−ＳＨＣＥ４５Ｄ＞ｐＪ２１１−ＳＨＣＦ４３７Ｌとなった。
なお、ＳＨＣＥ４５Ｄは野生型よりも低温活性型、ΦはSHCを発現しない型、ＳＨＣｄｅａｄはスクアレン―ホペン環化酵素の活性がない型（D376R）、ＳＨＣＦ４３７ＬはＳＨＣＥ４５Ｄよりもさらに低温活性型を意味する。
よって、ｐＵＣ−ｈＳＱＳ−ＣｒｔＮｏｐｔ１０，０００（図４）、ｐＵＣ−ｈＳＱＳ−ＣｒｔＮｏｐｔ１，０００、ｐＵＣ−ｈＳＱＳ−ＣｒｔＮｏｐｔ５００及びｐＵＣ−ｈＳＱＳ−ＣｒｔＮの全てについて、ＳＨＣ活性（スクアレン消費活性）のスクリーニングに適していた。
次に、植菌後３７℃で４８時間静置培養したプレートを観察した結果、ＣｒｔＮｏｐｔ５００では、ｐＪ２１１−ＳＨＣｗｔの方が低温適応型（大腸菌内活性が高いと思われる）として知られるｐＪ２１１−ＳＨＣＥ４５Ｄよりも色素蓄積量の違いが明確であった。すなわち、ＣｒｔＮｏｐｔ５００株は野生型よりも高い活性を見分けるのに適していることが確認できた。
また、ＣｒｔＮｏｐｔ１０，０００では、ｐＪ２１１−ＳＨＣｗｔ及びｐＪ２１１−ＳＨＣＥ４５Ｄの色素蓄積量は同程度であった。すなわち、ｐＪ２１１−ＳＨＣＥ４５Ｄよりもさらに強い活性の探索に適していることが確認できた。
【実施例３】
【００４２】
（ＳＨＣライブラリのスクアレン消費スクリーニング）
ｐＵＣ−ｈＳＱＳ−ＣｒｔＮｏｐｔ１０，０００を用いて、実施例１で作製したＳＨＣライブラリのＳＨＣ活性について、大腸菌コロニーの色から判断するスクアレン消費スクリーニングを行い、活性が上がったＳＨＣ変異体を探索した。
【００４３】
（手順）
（１）ｐＵＣ−ｈＳＱＳ−ＣｒｔＮｏｐｔ１０，０００を導入したＸＬ１Ｂｌｕｅのケミカルコンピテントセルに、実施例１で作製したＳＨＣライブラリ（０μＭライブラリ、１０μＭライブラリ及び２０μＭライブラリ）、ｐＪ２１１−ＳＨＣｗｔ又はｐＪ２１１−ＳＨＣｄｅａｄを形質転換し、ＬＢ固体培地｛カルベニシリン及びカナマイシン含有（Ｃａｒｂ．Ｋａｎ．）｝に敷いたＮＣ膜上に植菌した。
（２）プレートを３７℃で３８時間静置培養した後、室温に取り出し、さらに１０時間静置培養し、コロニーの様子を観察した。
（３）ｐＪ２１１−ＳＨＣｗｔよりも特に色が薄いコロニーをピックし、２ ｍＬ  ＬＢ  液体培地（Ｃａｒｂ．Ｋａｎ．）を分注した４８穴ディープウェルで一晩培養した後、プラスミドを回収した。
【００４４】
（結果）
結果を図５に示す。
各ライブラリ中に、ｐＪ２１１−ＳＨＣｗｔよりも色が薄いコロニーが多く見つかった（図５）。その中でも特に色が薄いコロニーをピックして回収した。詳細を下記表３に示す。ミニプレップ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、ＳＨＣの正しいサイズにバンドが検出されたＳＨＣ変異体は合計２８個であった。
【００４５】
【表３】
2019170350.tif 000004
【実施例４】
【００４６】
（ＳＨＣ変異体のアミノ酸変異マッピング）
実施例３で取得した２８個のＳＨＣ変異体のうち、２４個について配列解析し、公知の方法により、アミノ酸一次配列上へのＳＨＣ変異体のアミノ酸変異マッピングを行った。
【００４７】
（ＳＨＣ変異体の生産物解析）
配列解析したＳＨＣ変異体についてｈＳＱＳと共発現して生産物解析を行った。方法は以下の通りである。
（手順）
（１）ＸＬ１ＢｌｕｅをｐＵＣ−ｈＳＱＳ並びにｐＪ２１１−ＳＨＣｗｔ若しくは上記で配列解析したＳＨＣ変異体（ｐＪ２１１−ＳＨＣｍｕｔａｎｔｓ）で共形質転換しコロニーを形成させた。
（２）コロニーをピックしてＬＢ液体培地（Ｃａｒｂ．Ｋａｎ．）培地で３７°Ｃ、１６時間培養した。
（３）培養液を５０ｍＬフラスコに分注したＴＢ（Ｃａｒｂ．Ｋａｎ．）培地１０ｍＬに１／１００量（１００μＬ）植菌し３７°Ｃで４８時間培養した。
（４）各サンプル培養液１０ｍＬを遠心（３７５０ｒｐｍ、４℃、１５分）により集菌し、生理食塩水で洗浄し、ペレットにアセトン１０ｍＬを加えて脂溶性画分を抽出した。
（５）脂溶性画分をｌｍＬヘキサンで抽出し、ＭｇＳＯ４を加え水分を除去した。このうちヘキサン７００μＬを分取し、ＴＦＨ：ＭｅＯＨ＝６：４の溶媒７０μＬに濃縮した。
（６）得られたサンプルのうち５μＬを用いてＨＰＬＣ−ＭＳによる解析を行った。固定相にはＳｈｉｍｐａｃｋカラム（１５０×２ｍｍ）、移動相にはメタノールを用い、流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎとした。検出にはフォトダイオードアレイ検出器及び質量分析器（イオン化：ＡＰＣＩ）を用いた。生産物量はＭＳのＳＩＭモードの４１１．４ｍＺｚのイオンで得られたクロマトグラムのピーク面積から、スクアレン標品を用いて作製した検量線を用いて算出した。
【００４８】
（結果）
アミノ酸変異マッピングと生産物解析の結果を併せた結果を図７及び表４に示す。
生産物解析の結果を図６に示す。
今回解析したＳＨＣ変異体は、全て細胞あたりのホペン合成量が野生型よりも増えていた。最も高い変異体は２９倍も多くなっていた（図６のサンプルＮｏ．１０−２）。
単独で活性を上げる変異が５個あり、複数の変異体に見られた変異箇所が６個あった（表４のＶ１２８及びＭ１８１はどちらにも当てはまる）。これらを組み合わせることによって、さらに活性の高い変異体が得られる。
【００４９】
【表４】
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表４中、ホペン合成量：細胞あたりのホペン合成量で、SHCwt=1としたときの相対量。wtはN=3、変異体はN=1で分析。アミノ酸変異：網掛けはシノニマス変異、下線は複数の変異体で変異が起こっていた箇所。太字は単独変異で活性が上がる変異。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、野生型スクアレン−ホペン環化酵素と比較してホペン合成量が高い変異型スクアレン−ホペン環化酵素並びに該酵素のスクリーニング方法を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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