(57)【要約】【課題】親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを含むブロックコポリマー、及び上記ブロックコポリマーから形成される、治療適用および診断適用のためのpH感受性ミセル組成物の提供。【解決手段】親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを含むブロックコポリマーであって、該親水性ポリマーセグメントが、ポリ(エチレンオキシド)（PEO）、ポリ(メタクリレートホスファチジルコリン)（MPC）、およびポリビニルピロリドン（PVP）から選択されるポリマーを含み、該疎水性ポリマーセグメントを含む、ブロックコポリマー及び、上記ブロックコポリマーから形成される、治療適用および診断適用のためのpH感受性ミセル組成物及び組成物を用いて、該個体において腫瘍を画像化する方法、初期エンドソーム活性を画像化する方法、後期エンドソーム活性もしくはリソソーム活性を、画像化する方法。【選択図】図１Ｃ
2019070160.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを含み、かつ標識部分を含んでもよいブロックコポリマーであって、
該親水性ポリマーセグメントが、ポリ(エチレンオキシド)（PEO）、ポリ(メタクリレートホスファチジルコリン)（MPC）、およびポリビニルピロリドン（PVP）からなる群より選択されるポリマーを含み、
該疎水性ポリマーセグメントが以下を含む、
ブロックコポリマー：
2019070160.tif 000032
式中、
R'は-Hまたは-CH3であり、
Rは-NR1R2であり、ここでR1およびR2はアルキル基であり、R1およびR2は同じであるかまたは異なり、R1およびR2は一緒になって5〜16個の炭素を有し、R1およびR2は連結して環を形成してもよく、
nは1〜約10であり、
xは合計で約20〜約200である。
【請求項２】
前記親水性ポリマーセグメントがPEOを含む、請求項1記載のブロックコポリマー。
【請求項３】
nが1〜4である、請求項1または2記載のブロックコポリマー。
【請求項４】
nが2である、請求項1または2記載のブロックコポリマー。
【請求項５】
R'が-CH3である、請求項1〜4のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項６】
R'が-Hである、請求項1〜4のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項７】
xが合計で約40〜約100である、請求項1〜6のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項８】
xが合計で約50〜約100である、請求項1〜6のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項９】
xが合計で約40〜約70である、請求項1〜6のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項１０】
xが合計で約60〜約80である、請求項1〜6のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項１１】
xが合計で約70である、請求項1〜6のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項１２】
R1およびR2がそれぞれ直鎖アルキルまたは分枝アルキルである、請求項1〜11のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項１３】
R1およびR2が連結して環を形成する、請求項1〜11のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項１４】
R1およびR2が同じである、請求項1〜13のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項１５】
R1およびR2が異なる、請求項1〜13のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項１６】
R1およびR2がそれぞれ3〜8個の炭素を有する、請求項1〜15のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項１７】
R1およびR2が一緒になって、5〜10個の炭素を有する環を形成する、請求項13記載のブロックコポリマー。
【請求項１８】
R1およびR2がプロピルである、請求項1〜11のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項１９】
プロピルがイソプロピルである、請求項18記載のブロックコポリマー。
【請求項２０】
R1およびR2がブチルである、請求項1〜11のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項２１】
ブチルがn-ブチルである、請求項20記載のブロックコポリマー。
【請求項２２】
R1およびR2が一緒になって-(CH2)5-である、請求項1〜11のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項２３】
R1およびR2が一緒になって-(CH2)6-である、請求項1〜11のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項２４】
式Iの化合物を含む、請求項1〜24のいずれか一項記載のブロックコポリマー：
2019070160.tif 000033
式中、
Lは標識部分であり、
yは0〜約6であり、
R''は-Hまたは-CH3であり、
mは1〜約10であり、
zは、前記PEOのサイズが約2kD〜約20kDとなるようなものであり、
R'''は任意の適切な部分であり、かつ
構造の一部分
2019070160.tif 000034
は、任意の順に配置されてもよい。
【請求項２５】
R''が-CH3である、請求項24記載のブロックコポリマー。
【請求項２６】
R''が-Hである、請求項24記載のブロックコポリマー。
【請求項２７】
mが1〜4である、請求項24〜26のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項２８】
mが2である、請求項24〜26のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項２９】
前記PEOのサイズが約2kD〜約10kDである、請求項24〜28のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項３０】
前記PEOのサイズが約4kD〜約6kDである、請求項24〜28のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項３１】
前記PEOのサイズが約5kDである、請求項24〜28のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項３２】
zが約114である、請求項24〜28のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項３３】
yが0である、請求項24〜32のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項３４】
yが1〜6である、請求項24〜32のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項３５】
yが約3である、請求項24〜32のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項３６】
Lが蛍光標識である、請求項24〜35のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項３７】
前記蛍光標識がテトラメチルローダミン（TMR）である、請求項36記載のブロックコポリマー。
【請求項３８】
Lが近赤外（NIR）標識である、請求項24〜35のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項３９】
前記NIR標識がシパート(cypate)である、請求項38記載のブロックコポリマー。
【請求項４０】
前記NIR標識がシパート類似体である、請求項38記載のブロックコポリマー。
【請求項４１】
pH感受性ミセルを形成する、請求項1〜40のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項４２】
請求項41記載のブロックコポリマーを含むpH感受性ミセルを含む、組成物。
【請求項４３】
前記ミセルが約10〜約200nmのサイズを有する、請求項42記載の組成物。
【請求項４４】
前記ミセルが約20〜約100nmのサイズを有する、請求項42記載の組成物。
【請求項４５】
前記ミセルが約30〜約50nmのサイズを有する、請求項42記載の組成物。
【請求項４６】
前記ミセルが約1pH単位未満のpH転移範囲を有する、請求項42〜45のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４７】
前記ミセルが約0.5pH単位未満のpH転移範囲を有する、請求項42〜45のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４８】
前記ミセルが約0.25pH単位未満のpH転移範囲を有する、請求項42〜45のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４９】
前記ミセルが約5〜約8のpH転移値を有する、請求項42〜48のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５０】
前記ミセルが約5〜約6のpH転移値を有する、請求項42〜48のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５１】
前記ミセルが約6〜約7のpH転移値を有する、請求項42〜48のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５２】
前記ミセルが約7〜約8のpH転移値を有する、請求項42〜48のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５３】
前記ミセルが約6.3〜約6.9のpH転移値を有する、請求項42〜48のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５４】
前記ミセルが約5.0〜約6.2のpH転移値を有する、請求項42〜48のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５５】
前記ミセルが約5.9〜約6.2のpH転移値を有する、請求項42〜48のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５６】
前記ミセルが約5.0〜約5.5のpH転移値を有する、請求項42〜48のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５７】
前記ミセルがさらに標的指向部分を含む、請求項42〜56のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５８】
前記標的指向部分がVEGFR2に結合する、請求項57記載の組成物。
【請求項５９】
前記標的指向部分がRAFL-1 mAbのFab'断片である、請求項58記載の組成物。
【請求項６０】
前記標的指向部分がαvβ3インテグリンに結合する、請求項57記載の組成物。
【請求項６１】
前記標的指向部分がcRGDfKである、請求項60記載の組成物。
【請求項６２】
前記標的指向部分が血管新生バイオマーカーに結合する、請求項57記載の組成物。
【請求項６３】
前記血管新生バイオマーカーがVEGF-VEGFR複合体またはエンドグリンである、請求項62記載の組成物。
【請求項６４】
前記ミセル内に封入された薬物をさらに含む、請求項42〜63のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６５】
前記薬物が疎水性である、請求項64記載の組成物。
【請求項６６】
前記薬物が約2〜約8のlog pを有する、請求項64記載の組成物。
【請求項６７】
前記薬物が化学療法剤である、請求項64〜66のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６８】
前記薬物がドキソルビシンである、請求項64記載の組成物。
【請求項６９】
前記薬物がβ-ラパコンである、請求項64記載の組成物。
【請求項７０】
前記薬物がパクリタキセルである、請求項64記載の組成物。
【請求項７１】
それを必要としている個体において癌を治療するための方法であって、
請求項67〜70のいずれか一項記載の組成物の有効量を投与する段階
を含む、方法。
【請求項７２】
前記癌が固形腫瘍を含む、請求項71記載の方法。
【請求項７３】
個体において腫瘍を画像化するための方法であって、
(a）前記ブロックコポリマーが標識部分を含む、請求項42〜63のいずれか一項記載の組成物を該個体に投与する段階、および
(b）該ブロックコポリマーのその解離型における分布を調べる段階
を含む、方法。
【請求項７４】
前記個体において腫瘍を診断するために用いられる、請求項73記載の方法。
【請求項７５】
前記個体において腫瘍をモニターするために用いられる、請求項73記載の方法。
【請求項７６】
薬物の初期エンドソームへの送達のための方法であって、
前記ミセルが約5.9〜約6.5のpH転移値を有する、請求項64〜70のいずれか一項記載の組成物をそれを必要としている個体に投与する段階
を含む、方法。
【請求項７９】
薬物の後期エンドソームまたはリソソームへの送達のための方法であって、
前記ミセルが約5.0〜約5.5のpH転移値を有する、請求項64〜70のいずれか一項記載の組成物をそれを必要としている個体に投与する段階
を含む、方法。
【請求項８０】
前記薬物がリソソーム蓄積症薬である、請求項79記載の方法。
【請求項８１】
個体において初期エンドソーム活性を画像化するための方法であって、
(a）前記ブロックコポリマーが標識部分を含み、かつ前記ミセルが約5.9〜約6.5のpH転移値を有する、請求項42〜63のいずれか一項記載の組成物を個体に投与する段階、および
(b）該ブロックコポリマーのその解離型における分布を調べる段階
を含む、方法。
【請求項８２】
個体において後期エンドソーム活性またはリソソーム活性を画像化するための方法であって、
(a）前記ブロックコポリマーが標識部分を含み、かつ前記ミセルが約5.0〜約5.5のpH転移値を有する、請求項42〜63のいずれか一項記載の組成物を該個体に投与する段階、および
(b）該ブロックコポリマーのその解離型における分布を調べる段階
を含む、方法。
【請求項８３】
式
2019070160.tif 000035
の化合物。
【請求項８４】
式
2019070160.tif 000036
の化合物。
【請求項８５】
式
2019070160.tif 000037
の化合物。
【請求項８６】
請求項83記載の化合物のポリマー。
【請求項８７】
請求項84記載の化合物のポリマー。
【請求項８８】
請求項85記載の化合物のポリマー。
【請求項８９】
R'''が重合反応によって生じる末端基である、請求項24〜41のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項９０】
R'''がBrである、請求項89記載のブロックコポリマー。
【請求項９１】
R'''がチオラートである、請求項89記載のブロックコポリマー。
【請求項９２】
R'''がチオエステルである、請求項89記載のブロックコポリマー。
【請求項９３】
構造の一部分
2019070160.tif 000038
が、無作為化されている、請求項24〜41または89〜93のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2011年3月31日提出の米国特許仮出願第61/470,441号、2011年4月1日提出の同第61/471,054号、および2010年9月22日提出の同第61/385,422号の35 U.S.C. §119(e)の下での恩典を主張し、これらそれぞれの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府支援による研究または開発に関する言明
本発明は、米国立衛生研究所によって授与された助成金番号R01CA129011、R01CA102792およびR21EB005394の下で政府支援によって行った。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
多機能ナノ粒子は、バイオセンサー、診断用ナノプローブおよび標的指向薬物送達システムなどの広い範囲の適用において注目されている。これらの取り組みは、様々な生理組織における薬物送達の正確な時空的制御により、診断および治療において生物学的特異性を改善し、副作用を軽減する必要性によっておおいに後押しされてきた。この目標を達成するために、刺激応答性ナノプラットフォームを開発するための取り組みがなされてきた。送達効率を正確に目標に定めるために活用されてきた環境刺激には、pH、温度、酵素発現、酸化還元反応および光誘導が含まれる。これらの活性化シグナルの中でも、pHトリガーは、以下の2つの型のpH差に基づく、最も広く研究された刺激の1つである：（a）病的（例えば、腫瘍）組織対正常組織、および（b）酸性細胞内区画。
【０００４】
例えば、腫瘍細胞外微小環境の異常な酸性（pHe約6.5）のために、いくつかのpHe応答性ナノシステムが腫瘍画像化の感度または治療の有効性を高めると報告されている。しかし、酸性環境における加水分解によって薬物を放出するポリマーミセル組成物にとっては、薬物の放出のために数日を要することもある。この間に、体はミセルを排出または分解することもある。
【０００５】
酸性エンドソーム/リソソーム区画を標的とするために、ペイロードバイオアベイラビリティを改善するための、pH切断可能なリンカーを有するナノベクターが研究されている。さらに、薬物の有効性を高めるために、pH誘導性電荷変換によるいくつかのスマートナノベクターが設計されている。これらの進歩にもかかわらず、生細胞におけるナノ粒子の特異的輸送および活性化ならびにエンドサイトーシス中の異なるエンドサイトーシスオルガネラとのそれらの相互作用は十分に理解されていない。エンドサイトーシスシステムは、内部に取り入れられたカーゴの選別、加工および分解において異なる役割を有する一連の区画からなる。pH感受性ナノ粒子による異なるエンドサイトーシス区画の選択的標的指向は、ナノ粒子の滞留時間が短いこと（数分未満）およびこれらの区画におけるpH差が小さいこと（例えば、初期エンドソームとリソソームとの間のpH単位＜1）により、特に困難である。
【０００６】
血管新生、すなわち新しい血管の形成は、発生および創傷修復などの正常な生理的プロセスにおいて必須の役割を果たす。病的血管新生は、腫瘍ならびに一連の非新生物疾患（例えば、糖尿病性網膜症、子宮内膜症）において起こる。癌において、既存の脈管網からの新しい血管の形成は、持続的な腫瘍成長および栄養と代謝老廃物との交換のために必要である。発癌の腫瘍微小環境モデルにおいて、血管新生は虚血バリアを克服するための最後の重要な段階である。血管新生表現型の獲得は、急速な腫瘍拡大、ならびに局所侵襲および癌転移の促進を引き起こす。
【０００７】
腫瘍血管新生は、一連の血管新生因子によって調整される複雑な生体プロセスである。最初に、ストレスを受けた腫瘍細胞（例えば、低酸素下）は、隣接する宿主血管からの静止状態の血管内皮を刺激して新しい毛細血管を発芽させる、成長因子およびケモカイン（例えば、VEGF-A）を分泌する。これらの成長因子は血管上のインテグリン（例えば、αvβ3、αvβ5）の発現を活性化または上方制御し、これらは、新しい血管発芽の生成における内皮細胞の移動および生存を促進する。腫瘍血管新生のメカニズムの理解によって、様々な抗血管新生薬の急速な開発が推進された。ベバシズマブ（Avastin(登録商標)、Genentech）は、血管新生内皮細胞で過剰発現されるVEGFR1およびVEGFR2受容体へのVEGF結合およびそれらを通じてのシグナル伝達を阻害する、ヒト化抗VEGF抗体である。これは結腸直腸癌、非小細胞肺癌、および乳癌の治療のために細胞毒性化学療法との組み合わせで臨床認可されている。スニチニブ（Sutent(登録商標)、Pfizer）およびソラフェニブ（Nexavar(登録商標)、Bayer Pharm. Corp.）は、VEGF受容体を含む複数の受容体チロシンキナーゼの小分子阻害剤である。これらは腎細胞癌、GI間質性腫瘍（スニチニブ）、および切除不能の肝臓癌（ソラフェニブ）の治療のためにFDAによって認可されている。様々な他の標的指向剤が現在、後期臨床試験中である（例えば、αvβ3インテグリンを標的とするビタキシン（Vitaxin）およびシレンジタイドは、転移性黒色腫および前立腺癌の治療のための第II/III相臨床試験中である）。
【０００８】
血管新生画像化は、癌の早期検出、ならびに多くの新しい分子標的抗血管新生療法の治療後評価のために、かなり有望である。2つの主な戦略、すなわち機能的画像化および標的指向画像化が、血管新生画像化において現在用いられている。機能的画像化戦略は、固形腫瘍の血流、腫瘍血液量および血管透過性を評価する。これらの画像化技術にはドップラー超音波、動的コントラスト増強CTまたはMRIが含まれる。これらの主な利点は、抗血管新生薬の有効性をモニターするために容易に適合させることができ、すでに臨床で実行されていることである。主な欠点は、これらの方法が腫瘍血管新生にあまり特異的ではないことである。最近、標的指向画像化戦略は、集中的に研究されており、腫瘍内の内皮の状態をより正確に特徴決定するという利点を有する可能性がある。鍵となる血管新生標的の中には、VEGFおよびその受容体、インテグリン（例えば、αvβ3およびαvβ5）、およびマトリックスメタロプロテアーゼがある。PET、MRI、光学画像法、超音波などの様々な画像化様式が調査されており、その成功度合いは異なる。
【０００９】
癌分子画像化適用のために、高いコントラスト感度および特異性を達成することは、いまだにてごわい難題である。現在、ほとんどの通常の画像化プローブはコントラストプローブの常時オンデザインを用いており、コントラスト感度は、画像化ペイロードの組織蓄積の差から生じる。所期のバイオマーカーの低い組織濃度、シグナル出力を高めるための増幅戦略の欠如、および高いバックグラウンドシグナルは、いくつかの主要な制限因子である。小分子量放射性トレーサー（例えば、64Cu標識cRGD）に対し、検出感度は非常に高い（例えば、＜10-12M）が、コントラスト感度は、標的受容体に対する比較的低い結合親和性および標的組織における画像化ペイロードの不十分な蓄積によって制限される。モノクローナル抗体（mAb）は、様々な癌細胞表面マーカーに対する非常に高い親和性および特異性を示した。しかし、放射性標識または蛍光標識したmAbは、クリアランス時間が遅く、血中で高いバックグラウンドシグナルが持続するため、分子画像化適用においては制限される。多くの通常の造影剤において、コントラスト感度は、一方では癌バイオマーカーの比較的低い組織濃度によって、他方では常時オンナノプローブからの高い非特異的バックグラウンドシグナルによって、本質的に制限される。
【００１０】
必要とされるのは、治療適用および診断適用のための改善されたpH応答性ミセル組成物、特に以下の1つまたは複数を有する組成物である：高い画像化および/または薬物ペイロード、長い血液循環時間、高いコントラスト感度および特異性、標的部位での迅速な薬物送達、ならびに特定の狭いpH範囲内での応答性（例えば、腫瘍または特定のオルガネラの標的指向のため）。
【発明の概要】
【００１１】
本発明の1つの局面は、親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを含み、標識部分を含んでもよいブロックコポリマーであって、該親水性ポリマーセグメントが、ポリ(エチレンオキシド)（PEO）、ポリ(メタクリレートホスファチジルコリン)（MPC）、およびポリビニルピロリドン（PVP）からなる群より選択されるポリマーを含み、該疎水性ポリマーセグメントが以下を含む、ブロックコポリマーである：
2019070160.tif 000003
式中、R'は-Hまたは-CH3であり、Rは-NR1R2であり、ここでR1およびR2はアルキル基であり、R1およびR2は同じであるかまたは異なり、R1およびR2は合わせて5〜16個の炭素を有し、R1およびR2は連結して環を形成してもよく、nは1〜約10であり、xは合計で約20〜約200である。いくつかの態様において、親水性ポリマーセグメントはPEOを含む。いくつかの態様において、nは1〜4である。いくつかの態様において、nは2である。いくつかの態様において、R'は-CH3である。いくつかの態様において、R'は-Hである。いくつかの態様において、xは合計で約40〜約100である。いくつかの態様において、xは合計で約50〜約100である。いくつかの態様において、xは合計で約40〜約70である。いくつかの態様において、xは合計で約60〜約80である。いくつかの態様において、xは合計で約70である。いくつかの態様において、R1およびR2はそれぞれ直鎖または分枝アルキルである。いくつかの態様において、R1およびR2は連結して環を形成する。いくつかの態様において、R1およびR2は同じである。いくつかの態様において、R1およびR2は異なる。いくつかの態様において、R1およびR2はそれぞれ3〜8個の炭素を有する。いくつかの態様において、R1およびR2は一緒になって、5〜10個の炭素を有する環を形成する。いくつかの態様において、R1およびR2はプロピルである。いくつかの態様において、プロピルはイソプロピルである。いくつかの態様において、R1およびR2はブチルである。いくつかの態様において、ブチルはn-ブチルである。いくつかの態様において、R1およびR2は一緒になって-(CH2)5-である。いくつかの態様において、R1およびR2は一緒になって-(CH2)6-である。いくつかの態様において、ブロックコポリマーは式Iの化合物を含む：
2019070160.tif 000004
式中、Lは標識部分であり、yは0〜約6であり、R''は-Hまたは-CH3であり、mは1〜約10であり、zは、PEOのサイズが約2kD〜約20kDとなるようなものであり、R'''は任意の適切な部分であり、かつ構造の一部分
2019070160.tif 000005
は、任意の順に配置されてもよい。いくつかの態様において、R''は-CH3である。いくつかの態様において、R''は-Hである。いくつかの態様において、mは1〜4である。いくつかの態様において、mは2である。いくつかの態様において、PEOのサイズは約2kD〜約10kDである。いくつかの態様において、PEOのサイズは約4kD〜約6kDである。いくつかの態様において、PEOのサイズは約5kDである。いくつかの態様において、zは約114である。いくつかの態様において、yは0である。いくつかの態様において、yは1〜6である。いくつかの態様において、yは約3である。いくつかの態様において、Lは蛍光標識である。いくつかの態様において、蛍光標識はテトラメチルローダミン（TMR）である。いくつかの態様において、Lは近赤外（NIR）標識である。いくつかの態様において、NIR標識はシパート(cypate)である。いくつかの態様において、NIR標識はシパート類似体である。いくつかの態様において、R'''は重合反応によって生じる末端基である。いくつかの態様において、R'''はBrである。いくつかの態様において、R'''はチオラートである。いくつかの態様において、R'''はチオエステルである。いくつかの態様において、構造の一部分
2019070160.tif 000006
は、無作為化されている。いくつかの態様において、ブロックコポリマーはpH感受性ミセルを形成する。
【００１２】
本発明の別の局面は、本明細書に記載のブロックコポリマーを含むpH感受性ミセルを含む、組成物である。pH感受性ミセルを作製する際に、本明細書に記載の任意のブロックコポリマーを用いうることが理解されるべきである。いくつかの態様において、ミセルは約10〜約200nmのサイズを有する。いくつかの態様において、ミセルは約20〜約100nmのサイズを有する。いくつかの態様において、ミセルは約30〜約50nmのサイズを有する。いくつかの態様において、ミセルは約1pH単位未満のpH転移範囲を有する。いくつかの態様において、ミセルは約0.5pH単位未満のpH転移範囲を有する。いくつかの態様において、ミセルは約0.25pH単位未満のpH転移範囲を有する。いくつかの態様において、ミセルは約5〜約8のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約5〜約6のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約6〜約7のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約7〜約8のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約6.3〜約6.9のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約5.0〜約6.2のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約5.9〜約6.2のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約5.0〜約5.5のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルはさらに標的指向部分を含む。いくつかの態様において、標的指向部分はVEGFR2に結合する。いくつかの態様において、標的指向部分はRAFL-1 mAbのFab'断片である。いくつかの態様において、標的指向部分はαvβ3インテグリンに結合する。いくつかの態様において、標的指向部分はcRGDfKである。いくつかの態様において、標的指向部分は血管新生バイオマーカーに結合する。いくつかの態様において、血管新生バイオマーカーはVEGF-VEGFR複合体またはエンドグリンである。いくつかの態様において、組成物はミセル内に封入された薬物をさらに含む。いくつかの態様において、薬物は疎水性である。いくつかの態様において、薬物は約2〜約8のlog pを有する。いくつかの態様において、薬物は化学療法剤である。いくつかの態様において、薬物はドキソルビシンである。いくつかの態様において、薬物はβ-ラパコンである。いくつかの態様において、薬物はパクリタキセルである。
【００１３】
本発明の別の局面は、それを必要としている個体において癌を治療するための方法であって、本明細書に記載の化学療法剤を含むpH感受性ミセル組成物の有効量を投与する段階を含む、方法である。いくつかの態様において、癌は固形腫瘍を含む。
【００１４】
本発明の別の局面は、個体において腫瘍を画像化するための方法であって、(a）ブロックコポリマーが標識部分を含む、本明細書に記載のpH感受性ミセル組成物を個体に投与する段階、および(b）該ブロックコポリマーのその解離型における分布を調べる段階を含む、方法である。いくつかの態様において、該方法を用いて個体において腫瘍を診断する。いくつかの態様において、該方法を用いて個体において腫瘍をモニターする。
【００１５】
本発明の別の局面は、薬物の初期エンドソームへの送達のための方法であって、pH感受性ミセルが約5.9〜約6.5のpH転移値を有する、本明細書に記載の薬物を含む組成物をそれを必要としている個体に投与する段階を含む、方法である。
【００１６】
本発明の別の局面は、薬物の後期エンドソームまたはリソソームへの送達のための方法であって、ミセルが約5.0〜約5.5のpH転移値を有する、本明細書に記載の薬物を含むpH感受性ミセル組成物をそれを必要としている個体に投与する段階を含む、方法である。いくつかの態様において、薬物はリソソーム蓄積症薬である。
【００１７】
本発明の別の局面は、個体において初期エンドソーム活性を画像化するための方法であって、(a）ブロックコポリマーが標識部分を含み、かつミセルが約5.9〜約6.5のpH転移値を有する、本明細書に記載のpH感受性ミセル組成物を該個体に投与する段階、および(b）該ブロックコポリマーのその解離型における分布を調べる段階を含む、方法である。
【００１８】
本発明の別の局面は、個体において後期エンドソーム活性またはリソソーム活性を画像化するための方法であって、(a）ブロックコポリマーが標識部分を含み、かつミセルが約5.0〜約5.5のpH転移値を有する、本明細書に記載のpH感受性ミセル組成物を個人に投与する段階、および(b）該ブロックコポリマーのその解離型における分布を調べる段階を含む、方法である。
【００１９】
本発明の別の局面は、式
2019070160.tif 000007
の化合物である。
【００２０】
本発明の別の局面は、化合物C6A-MAのポリマーである。
【００２１】
本発明の別の局面は、式
2019070160.tif 000008
の化合物である。
【００２２】
本発明の別の局面は、化合物C7A-MAのポリマーである。
【００２３】
本発明の別の局面は、式
2019070160.tif 000009
の化合物である。
【００２４】
本発明の別の局面は、化合物DBA-MAのポリマーである。
[本発明1001]
親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを含み、かつ標識部分を含んでもよいブロックコポリマーであって、
該親水性ポリマーセグメントが、ポリ(エチレンオキシド)（PEO）、ポリ(メタクリレートホスファチジルコリン)（MPC）、およびポリビニルピロリドン（PVP）からなる群より選択されるポリマーを含み、
該疎水性ポリマーセグメントが以下を含む、
ブロックコポリマー：
2019070160.tif 000010
式中、
R'は-Hまたは-CH3であり、
Rは-NR1R2であり、ここでR1およびR2はアルキル基であり、R1およびR2は同じであるかまたは異なり、R1およびR2は一緒になって5〜16個の炭素を有し、R1およびR2は連結して環を形成してもよく、
nは1〜約10であり、
xは合計で約20〜約200である。
[本発明1002]
前記親水性ポリマーセグメントがPEOを含む、本発明1001のブロックコポリマー。
[本発明1003]
nが1〜4である、本発明1001または1002のブロックコポリマー。
[本発明1004]
nが2である、本発明1001または1002のブロックコポリマー。
[本発明1005]
R'が-CH3である、本発明1001〜1004のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1006]
R'が-Hである、本発明1001〜1004のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1007]
xが合計で約40〜約100である、本発明1001〜1006のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1008]
xが合計で約50〜約100である、本発明1001〜1006のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1009]
xが合計で約40〜約70である、本発明1001〜1006のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1010]
xが合計で約60〜約80である、本発明1001〜1006のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1011]
xが合計で約70である、本発明1001〜1006のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1012]
R1およびR2がそれぞれ直鎖アルキルまたは分枝アルキルである、本発明1001〜1011のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1013]
R1およびR2が連結して環を形成する、本発明1001〜1011のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1014]
R1およびR2が同じである、本発明1001〜1013のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1015]
R1およびR2が異なる、本発明1001〜1013のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1016]
R1およびR2がそれぞれ3〜8個の炭素を有する、本発明1001〜1015のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1017]
R1およびR2が一緒になって、5〜10個の炭素を有する環を形成する、本発明1013のブロックコポリマー。
[本発明1018]
R1およびR2がプロピルである、本発明1001〜1011のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1019]
プロピルがイソプロピルである、本発明1018のブロックコポリマー。
[本発明1020]
R1およびR2がブチルである、本発明1001〜1011のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1021]
ブチルがn-ブチルである、本発明1020のブロックコポリマー。
[本発明1022]
R1およびR2が一緒になって-(CH2)5-である、本発明1001〜1011のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1023]
R1およびR2が一緒になって-(CH2)6-である、本発明1001〜1011のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1024]
式Iの化合物を含む、本発明1001〜1024のいずれかのブロックコポリマー：
2019070160.tif 000011
式中、
Lは標識部分であり、
yは0〜約6であり、
R''は-Hまたは-CH3であり、
mは1〜約10であり、
zは、前記PEOのサイズが約2kD〜約20kDとなるようなものであり、
R'''は任意の適切な部分であり、かつ
構造の一部分
2019070160.tif 000012
は、任意の順に配置されてもよい。
[本発明1025]
R''が-CH3である、本発明1024のブロックコポリマー。
[本発明1026]
R''が-Hである、本発明1024のブロックコポリマー。
[本発明1027]
mが1〜4である、本発明1024〜1026のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1028]
mが2である、本発明1024〜1026のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1029]
前記PEOのサイズが約2kD〜約10kDである、本発明1024〜1028のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1030]
前記PEOのサイズが約4kD〜約6kDである、本発明1024〜1028のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1031]
前記PEOのサイズが約5kDである、本発明1024〜1028のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1032]
zが約114である、本発明1024〜1028のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1033]
yが0である、本発明1024〜1032のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1034]
yが1〜6である、本発明1024〜1032のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1035]
yが約3である、本発明1024〜1032のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1036]
Lが蛍光標識である、本発明1024〜1035のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1037]
前記蛍光標識がテトラメチルローダミン（TMR）である、本発明1036のブロックコポリマー。
[本発明1038]
Lが近赤外（NIR）標識である、本発明1024〜1035のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1039]
前記NIR標識がシパート(cypate)である、本発明1038のブロックコポリマー。
[本発明1040]
前記NIR標識がシパート類似体である、本発明1038のブロックコポリマー。
[本発明1041]
pH感受性ミセルを形成する、本発明1001〜1040のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1042]
本発明1041のブロックコポリマーを含むpH感受性ミセルを含む、組成物。
[本発明1043]
前記ミセルが約10〜約200nmのサイズを有する、本発明1042の組成物。
[本発明1044]
前記ミセルが約20〜約100nmのサイズを有する、本発明1042の組成物。
[本発明1045]
前記ミセルが約30〜約50nmのサイズを有する、本発明1042の組成物。
[本発明1046]
前記ミセルが約1pH単位未満のpH転移範囲を有する、本発明1042〜1045のいずれかの組成物。
[本発明1047]
前記ミセルが約0.5pH単位未満のpH転移範囲を有する、本発明1042〜1045のいずれかの組成物。
[本発明1048]
前記ミセルが約0.25pH単位未満のpH転移範囲を有する、本発明1042〜1045のいずれかの組成物。
[本発明1049]
前記ミセルが約5〜約8のpH転移値を有する、本発明1042〜1048のいずれかの組成物。
[本発明1050]
前記ミセルが約5〜約6のpH転移値を有する、本発明1042〜1048のいずれかの組成物。
[本発明1051]
前記ミセルが約6〜約7のpH転移値を有する、本発明1042〜1048のいずれかの組成物。
[本発明1052]
前記ミセルが約7〜約8のpH転移値を有する、本発明1042〜1048のいずれかの組成物。
[本発明1053]
前記ミセルが約6.3〜約6.9のpH転移値を有する、本発明1042〜1048のいずれかの組成物。
[本発明1054]
前記ミセルが約5.0〜約6.2のpH転移値を有する、本発明1042〜1048のいずれかの組成物。
[本発明1055]
前記ミセルが約5.9〜約6.2のpH転移値を有する、本発明1042〜1048のいずれかの組成物。
[本発明1056]
前記ミセルが約5.0〜約5.5のpH転移値を有する、本発明1042〜1048のいずれかの組成物。
[本発明1057]
前記ミセルがさらに標的指向部分を含む、本発明1042〜1056のいずれかの組成物。
[本発明1058]
前記標的指向部分がVEGFR2に結合する、本発明1057の組成物。
[本発明1059]
前記標的指向部分がRAFL-1 mAbのFab'断片である、本発明1058の組成物。
[本発明1060]
前記標的指向部分がαvβ3インテグリンに結合する、本発明1057の組成物。
[本発明1061]
前記標的指向部分がcRGDfKである、本発明1060の組成物。
[本発明1062]
前記標的指向部分が血管新生バイオマーカーに結合する、本発明1057の組成物。
[本発明1063]
前記血管新生バイオマーカーがVEGF-VEGFR複合体またはエンドグリンである、本発明1062の組成物。
[本発明1064]
前記ミセル内に封入された薬物をさらに含む、本発明1042〜1063のいずれかの組成物。
[本発明1065]
前記薬物が疎水性である、本発明1064の組成物。
[本発明1066]
前記薬物が約2〜約8のlog pを有する、本発明1064の組成物。
[本発明1067]
前記薬物が化学療法剤である、本発明1064〜1066のいずれかの組成物。
[本発明1068]
前記薬物がドキソルビシンである、本発明1064の組成物。
[本発明1069]
前記薬物がβ-ラパコンである、本発明1064の組成物。
[本発明1070]
前記薬物がパクリタキセルである、本発明1064の組成物。
[本発明1071]
それを必要としている個体において癌を治療するための方法であって、
本発明1067〜1070のいずれかの組成物の有効量を投与する段階
を含む、方法。
[本発明1072]
前記癌が固形腫瘍を含む、本発明1071の方法。
[本発明1073]
個体において腫瘍を画像化するための方法であって、
(a）前記ブロックコポリマーが標識部分を含む、本発明1042〜1063のいずれかの組成物を該個体に投与する段階、および
(b）該ブロックコポリマーのその解離型における分布を調べる段階
を含む、方法。
[本発明1074]
前記個体において腫瘍を診断するために用いられる、本発明1073の方法。
[本発明1075]
前記個体において腫瘍をモニターするために用いられる、本発明1073の方法。
[本発明1076]
薬物の初期エンドソームへの送達のための方法であって、
前記ミセルが約5.9〜約6.5のpH転移値を有する、本発明1064〜1070のいずれかの組成物をそれを必要としている個体に投与する段階
を含む、方法。
[本発明1079]
薬物の後期エンドソームまたはリソソームへの送達のための方法であって、
前記ミセルが約5.0〜約5.5のpH転移値を有する、本発明1064〜1070のいずれかの組成物をそれを必要としている個体に投与する段階
を含む、方法。
[本発明1080]
前記薬物がリソソーム蓄積症薬である、本発明1079の方法。
[本発明1081]
個体において初期エンドソーム活性を画像化するための方法であって、
(a）前記ブロックコポリマーが標識部分を含み、かつ前記ミセルが約5.9〜約6.5のpH転移値を有する、本発明1042〜1063のいずれかの組成物を個体に投与する段階、および
(b）該ブロックコポリマーのその解離型における分布を調べる段階
を含む、方法。
[本発明1082]
個体において後期エンドソーム活性またはリソソーム活性を画像化するための方法であって、
(a）前記ブロックコポリマーが標識部分を含み、かつ前記ミセルが約5.0〜約5.5のpH転移値を有する、本発明1042〜1063のいずれかの組成物を該個体に投与する段階、および
(b）該ブロックコポリマーのその解離型における分布を調べる段階
を含む、方法。
[本発明1083]
式
2019070160.tif 000013
の化合物。
[本発明1084]
式
2019070160.tif 000014
の化合物。
[本発明1085]
式
2019070160.tif 000015
の化合物。
[本発明1086]
本発明1083の化合物のポリマー。
[本発明1087]
本発明1084の化合物のポリマー。
[本発明1088]
本発明1085の化合物のポリマー。
[本発明1089]
R'''が重合反応によって生じる末端基である、本発明1024〜1041のいずれかのブロックコポリマー。
[本発明1090]
R'''がBrである、本発明1089のブロックコポリマー。
[本発明1091]
R'''がチオラートである、本発明1089のブロックコポリマー。
[本発明1092]
R'''がチオエステルである、本発明1089のブロックコポリマー。
[本発明1093]
構造の一部分
2019070160.tif 000016
が、無作為化されている、本発明1024〜1041または1089〜1093のいずれかのブロックコポリマー。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】本発明のブロックコポリマーの例を示す。
【図１Ｂ】本発明のブロックコポリマーの例を示す。
【図１Ｃ】蛍光標識（例としてTMRを用いる）を含むミセルの例の設計原理を図示する。高pHでは、ミセル集合はホモFRETおよび光誘導性電子伝達（PET）メカニズムによる蛍光消光を引き起こす。低pHでは、ミセルの分解が発光の劇的な増大をもたらす。高pHでは、疎水性ポリマーセグメントのアミン基はプロトン化されない。低pHでは、疎水性ポリマーセグメントのアミン基はプロトン化される。
【図２】図2Aは、原子移動ラジカル重合（ATRP）法による合成PEO-b-PRコポリマーの例を示す。図2Bは、PEO-b-(PR-r-TMR)ナノプローブの合成の例を示す。
【図３】図3Aは、pHAMナノプローブ3、4、6、7の正規化蛍光強度をpHの関数として示す。pH応答（ΔpH10〜90％）は＜0.25pH単位で、Fmax/Fminは最大55倍であった図3Bは、4.9でのpH活性化後のナノプローブ4（pHt＝5.4）のストップトフロー蛍光測定を示す。蛍光回復時間（τ1/2）は3.7msであった。
【図４Ａ】2つの代表的PEO-b-PRブロックコポリマー、5および7、ならびにそれらの対応するモノマーのpH滴定曲線を示す。
【図４Ｂ】2つの代表的PEO-b-PRブロックコポリマー、5および7の、3級アミンの異なるイオン化状態での、重水素化1H NMRスペクトルを示す。
【図４Ｃ】水溶液中のPEO-b-PRブロックコポリマー7の透過電子顕微鏡検査（TEM）を示し、そのpKa（6.7）よりも高いpH7.4でのミセル形成およびpH5.5での完全なミセル解離を示している。ミセルの平均直径は45nmであった。
【図５】図5Aおよび5Bは、H2009細胞および培地における酸性化後のpHAMナノ粒子の活性化の定量を示す。図5Aは、H2009細胞および培地中の3の経時的シグナル対ノイズ比（SNR）を示す。図5Bは、HCl添加前および後のH2009細胞および培地の間のSNRの比較を示す。大きい差異（60分のSNR細胞/SNR培地＝31）がHCl添加前に観察され、HCl後にはこの傾向は逆転した（SNR細胞/SNR培地＝0.74）。P値はスチューデンツt検定を用いて算出した。
【図６】図6Aは、共焦点画像解析を用いた、経時的なナノプローブ3のpHAM活性化についての細胞内位置（初期エンドソーム（Rab5a）および後期エンドソーム/リソソーム（Lamp1））の試験を示す。図6Bは、共焦点画像解析を用いた、経時的なナノプローブ4のpHAM活性化についての細胞内位置（初期エンドソーム（Rab5a）および後期エンドソーム/リソソーム（Lamp1））の試験を示す。図6Cおよび6Dは、2つのナノプローブ3の細胞内取り込みおよび活性化の異なるプロセスを示す。
【図７】様々なpH環境における異なる時点のPEO-b-PC6Aミセルからのドキソルビシンの放出を示す。
【図８】NIR-pHAMの開発のためのNIR-NHSエステルおよびPEO-b-(PR-r-NIR)コポリマーの合成を図示する。
【図９】マレイミド末端PEG-b-PRコポリマーの合成を図示する。
【図１０】図10Aは、cRGDコード化pHAMナノプローブ、cRAD-pHAM、遊離cRGDブロック（各群についてN＞10）および細胞培養用培地でそれぞれ異なるように処理したHUVEC細胞の蛍光強度を示す。図10Bは、cRGD-pHAMで処理したHUVEC細胞のcRAD-pHAMおよびdRGDブロック対照に対するコントラスト対ノイズ比（CNR）を示す。
【図１１】A549腫瘍を有するマウスにおけるcRGDコード化pHAM（標的指向ミセル）およびcRGDなしのpHAM（非標的指向ミセル）のインビボ薬物動態試験を示す。
【図１２】血管化腫瘍における血管新生バイオマーカー（例えば、VEGFR2、αvβ3）の画像化のためのpH活性化可能（pHAM）ナノプローブの例を示す。これらのナノプローブは、血液循環の間「サイレント」（またはオフ状態）のままであるが、血管新生腫瘍内皮細胞において受容体仲介エンドサイトーシス後のpH活性化によりオンになりうる。
【図１３】酸性細胞内オルガネラ（すなわち、エンドソーム/リソソーム）内の血管標的指向pHAMのための細胞内活性化メカニズムの例を示す。
【図１４】図14Aおよび14Bは、0.1mg/mlの濃度を有する4つの異なるPEG-b-PRコポリマーからのpH依存性ミセル化挙動（pHの関数としての（14A）正規化光散乱強度および（14B）ピレンI1/I3発光比）を示す。
【図１５】本発明のミセルなどのより大きい高分子による腫瘍への薬物送達の選択的標的指向を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は、ブロックコポリマー、ならびに1つまたは複数の該ブロックコポリマーを含むミセル組成物を提供し、該ミセル組成物は、癌、心血管疾患、炎症、自食作用関連疾患、もしくはリソソーム蓄積症の治療などの1つもしくは複数の治療適用および/もしくは診断適用、腫瘍画像化、ならびに/または初期エンドソーム、後期エンドソームおよびリソソームなどの細胞内オルガネラの画像化において有用である。本発明は、そのような治療適用および診断適用におけるミセル組成物を使用する方法をさらに提供する。
【００２７】
本発明のブロックコポリマーは、親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを含み、疎水性ポリマーセグメントはpH感受性を与えるためのイオン化可能アミン基を含む。ブロックコポリマーは、これらのイオン化可能ブロックコポリマーの超分子自己集合に基づき、pH活性化可能ミセル（pHAM）ナノ粒子を形成する（例えば、図1C参照）。例えば、図1Cは、本発明のミセルの非限定的な例の設計原理を図示する。高pHでは、ブロックコポリマーが集合してミセルとなるが、低pHでは、疎水性ポリマーセグメントのアミン基のイオン化がミセルの解離を引き起こす。理論に縛られたくはないが、ミセル形成およびその熱力学的安定性は疎水性セグメントと親水性セグメントとの間のデリケートな平衡によって推進される。イオン化可能な基は異なるpH値で調整可能な親水性/疎水性ブロックとして作用し得、これはミセルの動的自己集合に直接影響しうる。理論に縛られたくはないが、ミセル化は疎水性ポリマーセグメントのアミンのイオン化転移を鋭敏化して、迅速で超高感度なpH応答を与えうる。腫瘍などの様々な環境（例えば、腫瘍の細胞外環境）内での、または初期もしくは後期エンドソームもしくはリソソームなどの特定のエンドサイトーシス区画内での選択的活性化を達成するために、異なるブロックコポリマーを選択して、生理的範囲内の異なる転移pH値を有するミセルを提供しうる。
【００２８】
治療適用のために、薬物をミセルの内部に組み込んでもよい。特定のpH条件（例えば、腫瘍およびエンドサイトーシス区画内にある酸性pH）は、ミセルの急速なプロトン化および解離を引き起こしてユニマーとし、それにより薬物を放出しうる。いくつかの態様において、ミセルは、生理的pH（pH7.4）で安定な薬物封入を提供するが、酸性環境では急速に薬物を放出しうる。本発明のミセルは、治療適用において以下などの1つまたは複数の利点を提供しうる：（1）以前のミセル組成物での数時間または数日間に対し、特定のpH環境（例えば、酸性環境）下での短時間以内（例えば、数分以内）のミセルの解離（および薬物の迅速な放出）；（2）薬物の高いパーセンテージの封入；（3）薬物の有効性を増強し、正常細胞への毒性を減少しうる、所望の部位（例えば、腫瘍またはリソソーム）への薬物送達の選択的標的指向（例えば、図15参照）；（4）長い血液循環時間；（5）特定の狭いpH範囲内での応答性（例えば、特定のオルガネラの標的指向のため）、および（6）画像化シグナルが治療有効性に対する予測因子でありうる、画像誘導療法。
【００２９】
診断適用のために、標識部分をブロックコポリマーに結合してもよい。いくつかの態様において、pHがミセル形成に有利である場合、標識（例えば、蛍光標識）はミセル内に隔離され、隔離によって標識シグナルの低下が起こる（例えば、蛍光消光により、例えば、図1C参照）。特定のpH条件（例えば、腫瘍およびエンドサイトーシス区画内にある酸性pH）は、ユニマーへのミセルの急速なプロトン化および解離を引き起こして、それにより標識を曝露し、標識シグナルを増大（例えば、蛍光発光を増大）させうる。本発明のミセルは、診断適用において以下などの1つまたは複数の利点を提供しうる：（1）以前のミセル組成物での数時間または数日間に対し、特定のpH環境（例えば、酸性環境）下での短時間以内（例えば、数分以内）のミセルの解離（および標識シグナルの迅速な増大）；（2）画像化ペイロードの増大；（3）所望の部位（例えば、腫瘍または特定のエンドサイトーシス区画）への標識の選択的標的指向；（4）長い血液循環時間；（5）特定の狭いpH範囲内での応答性（例えば、特定のオルガネラの標的指向のため）；および（6）高いコントラスト感度および特異性。例えば、ミセルは正常な生理的条件（例えば、血液循環）下ではサイレント（またはオフ状態）のままで、バックグラウンドシグナルは最低限であるが、ミセルがインビボでそれらの所期の分子標的（例えば、細胞外腫瘍環境または細胞オルガネラ）に到達する場合には、画像化シグナルは大幅に増強されうる。非限定的な例として、血管新生バイオマーカー（例えば、αvβ3）への特異的標的指向後に、ミセルナノプローブは受容体仲介エンドサイトーシス後のエンドソーム/リソソーム内のpH活性化によりオンになりうる。図12は、血管化腫瘍における血管新生バイオマーカー（例えば、VEGFR2、αvβ3）の画像化のためのpH活性化可能（pHAM）ナノプローブの例を示す。これらのナノプローブは、血液循環中は「サイレント」（またはオフ状態）のままであるが、血管新生腫瘍内皮細胞において受容体仲介エンドサイトーシス後のpH活性化によりオンになりうる。図13は、酸性細胞内オルガネラ（すなわち、エンドソーム/リソソーム）内の血管標的指向pHAMのための細胞内活性化メカニズムを図示する。
【００３０】
定義
本明細書において用いられる「アルキル」は、例えば、1つまたは複数の追加の飽和炭化水素部分で置換されていてもよい、直鎖、分枝鎖、または環式（縮合したおよびスピロ二環式および多環式を含む）飽和炭化水素部分を含む、任意の飽和炭化水素部分を指す。
【００３１】
本明細書において用いられる「pH感受性ミセル」、「pH活性化可能ミセル」および「pH活性化可能ミセル（pHAM）ナノ粒子」は、1つまたは複数のブロックコポリマーを含むミセルを指すように本明細書において交換可能に用いられ、pHに応じて（例えば、特定のpHよりも上または下で）解離する。非限定的な例として、特定のpHで、ブロックコポリマーは実質的にミセル型である。pHが変化する（例えば、低下する）につれて、ミセルは解離し始め、pHがさらに変化する（例えば、さらに低下する）につれて、ブロックコポリマーは実質的に解離（非ミセル）型で存在する。
【００３２】
「ナノプローブ」は、画像化標識部分を含むpH感受性ミセルを示すように本明細書において用いられる。
【００３３】
本明細書において用いられる「pH転移範囲」は、ミセルが解離するpH範囲を指す。いくつかの態様において、pH転移範囲はpH応答の鋭敏度である。pH応答の鋭敏度を求める一例を以下の実施例2に記載する。簡単に言うと、ブロックコポリマーがミセル型である場合にミセル内に隔離される（蛍光消光）蛍光標識を含むブロックコポリマーについて、pHに対する蛍光強度を測定する（例えば、図1C参照）。pHが変化する（例えば、低下する）につれて、ミセルは解離して、蛍光標識を曝露し、蛍光発光を引き起こす。pHに対する正規化蛍光強度（NFI）曲線は、ミセルのpH応答特性の定量的評価を可能にする。NFIを[F-Fmin]/[Fmax-Fmin]の比として算出し、ここでFは任意の所与のpHでのミセルの蛍光強度であり、FmaxおよびFminはそれぞれオン/オフ状態での最大および最小蛍光強度である。pH応答の鋭敏度はΔpH10〜90％であり、NFI値が10％から90％まで変動するpH範囲である。標識なしのコポリマーに対して、動的光散乱（DLS）または外部フルオロフォア（例えば、ピレン）を用いてpH依存性ミセル化挙動を特徴決定することができる。例えば、図14Aは、pHの関数としての、0.1mg/mL濃度でのいくつかのPEO-b-PRコポリマーの正規化光散乱強度を示す。異なるpH値では、溶液中でユニマーからミセルナノ粒子が形成されたことにより、光散乱強度の劇的な増大が観察された。得られたミセルの流体力学的直径は40〜50nmと測定された。光散乱データは、ピレン発光（λex＝339nm）のI1/I3比（それぞれ372〜374および382〜384nm）を調べることによりさらに裏付けられた（図14B）。I1/I3比はピレン環境の極性を反映し、ここでミセルコア中のピレンの分配はI1/I3値の低下を引き起こす。
【００３４】
本明細書において用いられる「pH転移値」（pHt）は、ミセルの半分が解離するpHを指す。pH転移値を求める一例を以下の実施例2に記載する。簡単に言うと、ブロックコポリマーがミセル型である場合にミセル内に隔離される（蛍光消光）蛍光標識を含むブロックコポリマーについて、pH値は測定された蛍光発光が0.5×(Fmax＋Fmin)であるpHであり、ここでFmaxおよびFminはそれぞれオン/オフ状態での最大および最小蛍光強度である。標識なしのコポリマーに対して、動的光散乱（DLS）または外部フルオロフォア（例えば、ピレン）を用いてpH依存性ミセル化挙動を特徴決定することができる。例えば、図14Aは、pHの関数としての、0.1mg/mL濃度でのいくつかのPEO-b-PRコポリマーの正規化光散乱強度を示す。異なるpH値では、溶液中でユニマーからミセルナノ粒子が形成されたことにより、光散乱強度の劇的な増大が観察された。得られたミセルの流体力学的直径は40〜50nmと測定された。光散乱データは、ピレン発光（λex＝339nm）のI1/I3比（それぞれ372〜374および382〜384nm）を調べることによりさらに裏付けられた（図14B）。I1/I3比はピレン環境の極性を反映し、ここでミセルコア中のピレンの分配はI1/I3値の低下を引き起こす。光散乱およびピレン実験からはいずれも同様のpH転移値が得られた。pHt値はPEO-b-PDBA、PEO-b-PDPA、PEO-b-PC7A、PEO-b-PC6Aについてそれぞれ5.0、6.2、7.0、および7.2であった。
【００３５】
本明細書において用いられる「治療」なる用語は、治療中の疾患または障害（例えば、癌）の臨床病理の自然な経過を変えるよう設計された臨床介入を意味する。望ましい治療の効果には、例えば、疾患状態を改善もしくは寛解すること、障害の進行を遅延もしくは逆転させること、緩解、または予後改善が含まれる。
【００３６】
本明細書において用いられる「有効量」なる用語は、所望の治療、予防、または診断の結果を達成するのに必要な用量および期間において有効な量を意味する。有効量は1回または複数回の投与で提供することができる。
【００３７】
本明細書において用いられる「個体」は、ヒト、霊長類、実験動物（例えば、ラット、マウスなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタなど）、ペット（例えば、イヌ、ネコなど）、および競技動物（例えば、ウマなど）を含む、動物、好ましくは哺乳動物を指す。いくつかの態様において、個体はヒトである。
【００３８】
本明細書における「約〜」という値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーター自体に対する態様も含む（かつ記載する）。
【００３９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる、単数形「1つ（a）」、「1つ（an）」、および「その（the）」は、文脈が明らかにそうではないと示さないかぎり、複数の言及を含む。
【００４０】
本明細書に記載の本発明のすべての局面および態様は、局面および態様「を含む」、「からなる」、および「から基本的になる」ことを含むことが理解される。列挙した要素「から基本的になる」方法または組成物は、明記された段階または材料ならびに方法および組成物の基本的および新規特徴に著しく影響をおよぼさないものだけを含むことが理解されるべきである。
【００４１】
本明細書に記載の任意の組成物を、文脈が明らかにそうではないと示さないかぎり、本明細書に記載の任意の方法において用いうることが理解されるべきである。
【００４２】
ブロックコポリマー化合物
親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを含み、かつ標識部分をさらに含んでいてもよい新規ブロックコポリマーであって、該親水性ポリマーセグメントが、ポリ(エチレンオキシド)（PEO）、ポリ(メタクリレートホスファチジルコリン)（MPC）、およびポリビニルピロリドン（PVP）からなる群より選択されるポリマーを含み、該疎水性ポリマーセグメントが以下を含む、ブロックコポリマーを本明細書において提供する：
2019070160.tif 000017
式中、R'は-Hまたは-CH3であり、Rは-NR1R2であり、ここでR1およびR2はアルキル基であり、R1およびR2は同じあるかまたは異なり、R1およびR2は合わせて5〜16個の炭素を有し、R1およびR2は連結して環を形成してもよく、nは1〜約10であり、xは合計で約20〜約200である。例えば、xは連続セグメントとして約20〜約200であってもよく（すなわち、約20〜約200モノマー単位の連続セグメント）、または他の部分（例えば、標識を含む部分）が、例えば、以下により詳細に記載するとおり、モノマー単位の間に散在していてもよい。
【００４３】
本発明のブロックコポリマーは、例えば、式Iの化合物を含む：
2019070160.tif 000018
式中、Lは標識部分であり、yは0〜約6であり、R''は-Hまたは-CH3であり、mは1〜約10であり、zは、PEOのサイズが約2kD〜約20kDとなるようなものであり、x、n、R、およびR'は上記で定義される通りであり、R'''は任意の適切な部分であり、かつ構造の一部分
2019070160.tif 000019
は、任意の順に配置されてもよい。
【００４４】
いくつかの態様において、R'''は重合反応によって生じる末端基である。例えば、原子移動ラジカル重合（ATRP）を用いる場合、R'''は-Brでありうる。図1A、2A、2B、8および9における化学構造は重合反応によって生じる末端基として-Brを含みうることが理解されるべきである。例えば、可逆的付加開裂連鎖移動（RAFT）を用いる場合、R'''はチオラートまたはチオエステルなどの硫黄含有基でありうる。いくつかの態様において、R'''は-Brである。いくつかの態様において、R'''はチオラートである。いくつかの態様において、R'''はチオエステルである。末端基は、重合後に適切な部分によってさらに修飾してもよい。
【００４５】
いくつかの態様において、構造の一部分
2019070160.tif 000020
は、無作為化されており、すなわち、
2019070160.tif 000021
であり、
式中、rはR含有部分およびL含有部分の無作為の順序を示す（すなわち、R含有部分およびL含有部分は無作為に散在する）。
【００４６】
いくつかの態様において、構造の一部分
2019070160.tif 000022
は、連続的に配置される。例えば、R含有部分は1つのブロックとして存在し、L含有部分はR含有部分の前または後のいずれかに1つのブロックとして存在してもよい。他の配置も用いてもよい。
【００４７】
親水性ポリマーセグメント
いくつかの態様において、親水性ポリマーセグメントはポリ(エチレンオキシド)（PEO）を含む。いくつかの態様において、親水性ポリマーセグメントはポリ(メタクリレートホスファチジルコリン)（MPC）を含む。いくつかの態様において、親水性ポリマーセグメントはポリビニルピロリドン（PVP）を含む。一般に、親水性ポリマーセグメントのPEO、MPC、またはPVPポリマーのサイズは約2kD〜約20kDである。いくつかの態様において、ポリマーのサイズは約2kD〜約10kDである。いくつかの態様において、ポリマーのサイズは約2kD〜約5kDである。いくつかの態様において、ポリマーのサイズは約3kD〜約8kDである。いくつかの態様において、ポリマーのサイズは約4kD〜約6kDである。いくつかの態様において、ポリマーのサイズは約5kDである。いくつかの態様において、ポリマーは約100〜約130モノマー単位を有する。いくつかの態様において、ポリマーは約110〜約120モノマー単位を有する。いくつかの態様において、ポリマーは約114モノマー単位を有する。いくつかの態様において、ポリマーの多分散指数（PDI）は約1.2未満である。いくつかの態様において、ポリマーの多分散指数（PDI）は約1.1未満である。
【００４８】
適切なPEO、MPC、およびPVPポリマーは購入しても（例えば、PEOポリマーはAldrich Sigmaから購入してもよい）、または当技術分野において公知の方法によって合成してもよい。いくつかの態様において、親水性ポリマーは、疎水性モノマーを重合してブロックコポリマーを生成するための開始剤として用いることもできる。
【００４９】
例えば、MPCポリマー（例えば、分布の狭いMPCポリマー）を、2-ブロモ-2-メチルプロパン酸エチル（Sigma Aldrich）などの市販の小分子開始剤を用いて、原子移動ラジカル重合（ATRP）により調製することができる。これらの得られたMPCポリマーを高分子ATRP開始剤として用い、他のモノマーとさらに共重合してMPC-b-PDPAなどのブロックコポリマーを生成することができる。PEO-b-PRブロックコポリマーを、原子移動ラジカル重合（ATRP）または可逆的付加開裂連鎖移動（RAFT）法を用いて合成することができる（例えば、Australian Journal of Chemistry Volume: 58 Issue: 6 Pages: 379-410 (2005)；Progress in Polymer Science Volume: 32 Issue: 1 Pages: 93-146 (2007)参照。ATRPまたはRAFTは、狭い多分散性（＜1.1）を有するPEO-b-PRコポリマーを生成しうるリビング重合を可能にする。異なるメタクリレートまたはアクリレートモノマーを用いて、異なるpH感受性を有するPRセグメントを生成することができる。
【００５０】
疎水性ポリマーセグメント
疎水性ポリマーセグメントは以下を含む：
2019070160.tif 000023
式中、R'は-Hまたは-CH3であり、Rは-NR1R2であり、ここでR1およびR2はアルキル基であり、R1およびR2は同じあるかまたは異なり、R1およびR2は合わせて5〜16個の炭素を有し、R1およびR2は連結して環を形成してもよく、nは1〜約10であり、xは合計で約20〜約200である。
【００５１】
いくつかの態様において、nは1〜4である。いくつかの態様において、nは2である。様々な態様において、nは1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である。
【００５２】
いくつかの態様において、R'は-CH3である。いくつかの態様において、R'は-Hである。
【００５３】
いくつかの態様において、xは合計で約40〜約100である。いくつかの態様において、xは合計で約50〜約100である。いくつかの態様において、xは合計で約40〜約70である。いくつかの態様において、xは合計で約60〜約80である。いくつかの態様において、xは合計で約70である。
【００５４】
いくつかの態様において、R1およびR2は合わせて5〜14個の炭素を有する。いくつかの態様において、R1およびR2は合わせて5〜12個の炭素を有する。いくつかの態様において、R1およびR2は合わせて5〜10個の炭素を有する。いくつかの態様において、R1およびR2は合わせて5〜8個の炭素を有する。いくつかの態様において、R1およびR2は合わせて6〜12個の炭素を有する。いくつかの態様において、R1およびR2は合わせて6〜10個の炭素を有する。いくつかの態様において、R1およびR2は合わせて6〜8個の炭素を有する。様々な態様において、R1およびR2は合わせて5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、または16個の炭素を有する。いくつかの態様において、R1およびR2はそれぞれ3〜8個の炭素を有する。いくつかの態様において、R1および/またはR2は3個の炭素を含む。いくつかの態様において、R1および/またはR2は4個の炭素を含む。いくつかの態様において、R1および/またはR2は5個の炭素を含む。いくつかの態様において、R1および/またはR2は6個の炭素を含む。いくつかの態様において、R1および/またはR2は7個の炭素を含む。いくつかの態様において、R1および/またはR2は8個の炭素を含む。いくつかの態様において、R1およびR2は同じである。いくつかの態様において、R1およびR2は異なる。いくつかの態様において、R1およびR2はそれぞれ独立して直鎖または分枝アルキルである。いくつかの態様において、R1およびR2はそれぞれ直鎖アルキルである。いくつかの態様において、R1およびR2はそれぞれ分枝アルキルである。R1およびR2に適したアルキル基には、例えば、n-、イソ-、sec-、tert-、ネオ-などの、各アルキル基の様々な可能な骨格異性体を含む、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、およびペンタデシルが含まれ、但し、Rにおける炭素の総数が5〜16である。いくつかの態様において、R1およびR2はプロピルである。いくつかの態様において、プロピルはイソプロピルである。いくつかの態様において、プロピルはn-プロピルである。いくつかの態様において、R1およびR2はブチルである。いくつかの態様において、ブチルはn-ブチルである。いくつかの態様において、ブチルはイソブチルである。いくつかの態様において、ブチルはsec-ブチルである。いくつかの態様において、ブチルはt-ブチルである。いくつかの態様において、R1およびR2は連結して環を形成する。環は、1つまたは複数のアルキル基で置換されていてもよく、但し、Rにおける炭素の総数が5〜16である。いくつかの態様において、R1およびR2は一緒になって、5〜10個の炭素を有する環を形成する。いくつかの態様において、R1およびR2は一緒になって、5〜8個の炭素を有する環を形成する。いくつかの態様において、R1およびR2は一緒になって、5〜7個の炭素を有する環を形成する。いくつかの態様において、R1およびR2は一緒になって-(CH2)5-である。いくつかの態様において、R1およびR2は一緒になって-(CH2)6-である。
【００５５】
疎水性ポリマーセグメントを、例えば、原子移動ラジカル重合（ATRP）または可逆的付加開裂連鎖移動（RAFT）によって合成してもよい。疎水性ポリマーセグメントのATRP合成の例は実施例1において見いだしうる。いくつかの態様において、疎水性ポリマーセグメントの多分散指数（PDI）は約1.2未満である。いくつかの態様において、疎水性ポリマーセグメントの多分散指数（PDI）は約1.1未満である。
【００５６】
標識部分
ブロックコポリマーは、1つまたは複数の標識部分（例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれ以上）を含んでいてもよい。いくつかの態様において、標識は蛍光標識である。いくつかの態様において、蛍光標識はテトラメチルローダミン（TMR）である。いくつかの態様において、標識は近赤外（NIR）標識である。いくつかの態様において、NIR標識はシパートまたはシパート類似体である。
【００５７】
ブロックコポリマーが式Iの化合物である場合、いくつかの態様において、R''は-CH3である。いくつかの態様において、R''は-Hである。いくつかの態様において、mは1〜4である。いくつかの態様において、mは2である。様々な態様において、mは1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である。いくつかの態様において、yは0である。いくつかの態様において、yは1〜6である。様々な態様において、yは1、2、3、4、5、または6である。いくつかの態様において、yは3である。
【００５８】
標識部分は、コポリマーに、直接またはリンカー部分を通じて結合してもよい。当技術分野において公知の方法を用いて、標識部分を、例えば、疎水性ポリマーに結合してもよい。結合の例は、例えば、以下の実施例1および5において見いだしうる。
【００５９】
本発明のミセルは有利に高い画像化ペイロードを有しうる。様々な態様において、ミセルはミセル1つあたり少なくとも約500個の色素、少なくとも約1000個、少なくとも約1500個、少なくとも約2000個、少なくとも約2400個、少なくとも約3000個の色素を有する。これに比べて、数が多いほど色素消光を引き起こし、結合エピトープを改変しうるため、典型的な免疫蛍光結合体は1分子あたり4つの蛍光体を有する。
【００６０】
特定の使用法のために、異なる標識が好ましい場合もある。例えば、テトラメチルローダミンを、例えば、共焦点画像解析におけるインビトロ細胞試験のために用いてもよいが、インビボでの動物画像解析試験のためには、NIR色素が組織透過を高めうる。
【００６１】
例示的なブロックコポリマー
本発明のブロックコポリマーの非限定的な例には、以下の実施例に記載のものが含まれる。式Iのブロックコポリマーの非限定的な例を表Aに示す。
【００６２】
（表Ａ）例示的なブロックコポリマー
2019070160.tif 000024
【００６３】
表Aにおいて、構造の一部分
2019070160.tif 000025
は、無作為化されており、すなわち、
2019070160.tif 000026
である。
【００６４】
本明細書に記載の化合物に関して、重合反応はポリマー長の特定の変動性を招きうること、および特定のポリマー内のモノマー単位の数を示す本明細書に記載の数（例えば、x、y、z）はモノマー単位の平均数を示しうることが理解されるべきである。いくつかの態様において、本明細書の記載のポリマーセグメント（例えば、疎水性ポリマーセグメント、親水性ポリマーセグメント）は約1.2未満の多分散指数（PDI）を有する。いくつかの態様において、ポリマーセグメントの多分散指数（PDI）は約1.1未満である。いくつかの態様において、ブロックコポリマーの多分散指数（PDI）は約1.2未満である。いくつかの態様において、ブロックコポリマーの多分散指数（PDI）は約1.1未満である。
【００６５】
ミセル組成物
本明細書に記載の1つまたは複数のブロックコポリマー（例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上）を用いて、pH感受性ミセルを形成してもよい。いくつかの態様において、組成物は1つの型のミセルを含む。いくつかの態様において、2つまたはそれ以上（例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上）の異なる型のミセルを組み合わせて、混合ミセル組成物を形成してもよい。
【００６６】
本発明のpH感受性ミセル組成物は、pH応答が非常に広い（すなわち、2pH単位）他のpH感受性組成物とは対照的に、有利に狭いpH転移範囲を有する。いくつかの態様において、ミセルは約1pH単位未満のpH転移範囲を有する。様々な態様において、ミセルは約0.9pH単位未満、約0.8pH単位未満、約0.7pH単位未満、約0.6pH単位未満、約0.5pH単位未満、約0.4pH単位未満、約0.3pH単位未満、約0.2pH単位未満、約0.1pH単位未満のpH転移範囲を有する。いくつかの態様において、ミセルは約0.5pH単位未満のpH転移範囲を有する。いくつかの態様において、ミセルは約0.25pH単位未満のpH転移範囲を有する。
【００６７】
ミセルが蛍光標識を含む場合、pHAMの狭いpH応答特性は蛍光生成の効率を改善し得る。理論に縛られたくはないが、pHAMのpH応答はブロックコポリマーの協同的中和およびミセル化の結果、ホモFRETおよびPETメカニズム両方から起こりうる（例えば、図1C参照）。小分子pH感受性色素またはPETに基づくミセル（活性化には2pH単位が必要）に比べて、pHAMからの鋭敏化されたpH応答は、腫瘍微小環境（pHe＝6.5〜6.9）または細胞内オルガネラ（5.0〜6.2）におけるpHのわずかな変化で蛍光体の完全なターンオンをもたらしうる。
【００６８】
ミセルは、特定の細胞または微小環境を標的とするために、生理的範囲内の異なるpH転移値を有しうる。いくつかの態様において、ミセルは約5〜約8のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約5〜約6のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約6〜約7のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約7〜約8のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約6.3〜約6.9（例えば、腫瘍微小環境）のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約5.0〜約6.2（例えば、細胞内オルガネラ）のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約5.9〜約6.2（例えば、初期エンドソーム）のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約5.0〜約5.5（例えば、後期エンドソームまたはリソソーム）のpH転移値を有する。実施例に記載するとおり、ナノプローブ4、3、7および6はそれぞれ5.4、6.3、6.8および7.2の蛍光転移pH値を有する。
【００６９】
本発明の標識ミセルは、有利に大きいシグナル応答（例えば、オンおよびオフ状態の間のシグナルのより大きい差）を有しうる。例えば、蛍光標識を用いる場合、FmaxとFminの比（RF＝Fmax/Fmin）を用いてオン/オフ状態の間の蛍光応答を定量することができる。実施例に示すとおり、10〜55倍の範囲のRF値を有するナノプローブを作製し（表3）、ナノプローブの大きい蛍光応答を示した。様々な態様において、標識ミセルは、少なくとも約10種、少なくとも約20種、少なくとも約30種、少なくとも約40種、少なくとも約50種、少なくとも約60種のシグナル応答を有する。
【００７０】
理論に縛られたくはないが、癌療法におけるミセルの使用は、部分的にはミセルのサイズにより、抗腫瘍効果を増強し、正常組織への毒性を減少しうる。特定の化学療法剤（例えば、ドキソルビシン）などの小分子は、正常および腫瘍組織の両方に入ることができるが、非標的指向ミセルナノ粒子は漏出性の腫瘍脈管構造を優先的に通過しうる（例えば、図15参照）。いくつかの態様において、ミセルは約10〜約200nmのサイズを有する。いくつかの態様において、ミセルは約20〜約100nmのサイズを有する。いくつかの態様において、ミセルは約30〜約50nmのサイズを有する。
【００７１】
ブロックコポリマーからミセルを生成する方法の例は、以下の実施例において見いだしうる。例えば、ブロックコポリマーをまず有機溶媒（例えば、THF）に溶解し、任意に超音波処理下で、水溶液に加えてもよく、ここでコポリマーは溶液中で自己集合してミセルを形成する。
【００７２】
いくつかの態様において、ミセルは薬物をさらに含む。いくつかの態様において、ミセルは標識部分をさらに含む。いくつかの態様において、ミセルは標的指向部分をさらに含む。いくつかの態様において、ミセルは薬物および標識部分をさらに含む。いくつかの態様において、ミセルは薬物および標的指向部分をさらに含む。いくつかの態様において、ミセルは標的指向部分および標識部分をさらに含む。いくつかの態様において、ミセルは薬物、標的指向部分、および標識部分をさらに含む。
【００７３】
標的指向部分
治療適用または診断適用において、ミセルは標的指向部分をさらに含んでいてもよい。例えば、標的指向部分は、血管新生バイオマーカーなどの癌細胞表面マーカーを標的とし得る。例えば、診断適用において、標的指向ナノプローブは腫瘍の診断および/または分子標的抗血管新生療法の有効性評価のために有用であり得、ここで治療標的（例えば、VEGFR2、αvβ3）の発現レベルは特異的に測定されることができる。
【００７４】
いくつかの態様において、標的指向部分は血管新生バイオマーカーに結合する。いくつかの態様において、血管新生バイオマーカーはVEGF-VEGFR複合体またはエンドグリンである。いくつかの態様において、標的指向部分はVEGFR2に結合する。いくつかの態様において、標的指向部分はRAFL-1 mAbのFab'断片である。いくつかの態様において、標的指向部分はαvβ3インテグリンに結合する。いくつかの態様において、標的指向部分はcRGDfKである。
【００７５】
標的指向部分を、当技術分野において公知の方法によってブロックコポリマー（例えば、親水性ポリマーセグメント）に結合してもよい。結合の例は以下の実施例において見いだしうる。
【００７６】
薬物封入
ミセルは、ミセル内に封入された薬物をさらに含んでいてもよい。ミセルの内部は疎水性であるため、疎水性薬物はミセル内により容易に封入されうる。いくつかの態様において、薬物は疎水性であり、低い水溶性を有する。いくつかの態様において、薬物は約2〜約8のlog pを有する。いくつかの態様において、薬物は化学療法剤である。いくつかの態様において、薬物はドキソルビシンである。いくつかの態様において、薬物はβ-ラパコンである。いくつかの態様において、薬物はパクリタキセルである。
【００７７】
溶媒蒸発などの当技術分野において公知の方法を用いて、薬物をミセルに組み込んでもよい。薬物組み込みの例は、例えば、以下の実施例4において見いだしうる。簡単に言うと、例えば、まず薬物およびブロックコポリマーを有機溶液中に溶解することにより、薬物をミセルに封入してもよい。この溶液を、任意に超音波処理下で水溶液に加えることにより、ミセル封入薬物を得てもよい。
【００７８】
治療法および診断法
薬物を含むミセルを用いて、例えば、癌、心血管疾患、炎症、自食作用関連疾患、もしくはリソソーム蓄積症、または他の疾患を治療してもよく、ここで薬物は限局的なpH差（例えば、生理的pH（7.4）とは異なるpH）により適切な部位に送達されうる。治療法のためのミセルは、標識部分（例えば、治療の画像解析を助けるため）および/または標的指向部分（例えば、特定の細胞表面マーカーを標的とするため、またはエンドサイトーシス送達のためにミセルを標的とするため）をさらに含んでいてもよい。いくつかの態様において、治療する障害は癌である。いくつかの態様において、癌は固形腫瘍を含む。ミセルが標的指向部分を含む態様において、非固形癌を治療してもよい。いくつかの態様において、治療する障害はリソソーム蓄積症である。いくつかの態様において、ミセルは約6.3〜約7.2（例えば、腫瘍微小環境への送達のため）のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約5.0〜約6.5（例えば、細胞内オルガネラへの送達のため）のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約6.2または6.2超（例えば、初期エンドソームへの送達のため）のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約5.5（例えば、後期エンドソームまたはリソソームへの送達のため）のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約6.3〜約6.9のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約5.0〜約6.2のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約5.9〜約6.2のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約5.0〜約5.5のpH転移値を有する。実施例に記載するとおり、ナノプローブ4、3、7および6はそれぞれ5.4、6.3、6.8および7.2の蛍光転移pH値を有する。いくつかの態様において、より高いpHt（例えば、7.2、6.8）を有する非標的指向pHAMを用いて、薬物を腫瘍に送達してもよい。いくつかの態様において、より低いpHt（例えば、5.4、6.3）を有する標的指向pHAMを用いて、薬物をエンドサイトーシス区画に送達してもよい。
【００７９】
標識部分を含むミセルを、画像化適用、例えば、腫瘍またはエンドサイトーシス区画を画像化する際に用いてもよい。診断法のためのミセルは、標的指向部分（例えば、特定の細胞表面マーカーを標的とするため、またはエンドサイトーシス送達のためにミセルを標的とするため）をさらに含んでいてもよい。いくつかの態様において、この方法を用いて個体の腫瘍を診断する。いくつかの態様において、この方法を用いて個体の腫瘍をモニターし、例えば、治療の効果をモニターする。いくつかの態様において、ミセルを用いて初期エンドソーム活性を画像化する。いくつかの態様において、ミセルを用いて後期エンドソーム活性を画像化する。いくつかの態様において、ミセルを用いてリソソーム活性を画像化する。いくつかの態様において、ミセルは約6.3〜約7.2（例えば、腫瘍微小環境への送達のため）のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約5.0〜約6.5（例えば、細胞内オルガネラへの送達のため）のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約6.2または6.2超（例えば、初期エンドソームへの送達のため）のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約5.5（例えば、後期エンドソームまたはリソソームへの送達のため）のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約6.3〜約6.9（例えば、腫瘍微小環境を画像化するため）のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約5.0〜約6.2（例えば、細胞内オルガネラを画像化するため）のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約5.9〜約6.2（例えば、初期エンドソームを画像化するため）のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約5.0〜約5.5（例えば、後期エンドソームまたはリソソームを画像化するため）のpH転移値を有する。実施例に記載するとおり、ナノプローブ4、3、7および6はそれぞれ5.4、6.3、6.8および7.2の蛍光転移pH値を有する。いくつかの態様において、より高いpHt（例えば、7.2、6.8）を有する非標的指向pHAMを、腫瘍を画像化するために用いてもよい。いくつかの態様において、より低いpHt（例えば、5.4、6.3）を有する標的指向pHAMを、エンドサイトーシスの区画を画像化するために、またはエンドサイトーシスによる取り込みを介して腫瘍を画像化するために用いてもよい。
【００８０】
本発明の組成物において複数の型の標識を用いてもよい。例えば、異なるNIR蛍光体（例えば、特有の励起/発光波長を有する）を用いて、異なるバイオマーカーのための一連の多色ナノプローブを生成してもよい。これにより、いくつかの分子標的（例えば、VEGFR2およびαvβ3）の同時画像化を可能にする多色ナノプローブ群を作製し、これは血管新生腫瘍脈管構造の画像化有効性をさらに改善しうる。
【００８１】
本発明は、ミセルと薬学的に許容される担体とを含む組成物をさらに提供する。そのような組成物を、例えば、注射（例えば、静脈内注射）または注入などの任意の適切な方法によって、個体に投与してもよい。投与は局所でも全身でもよい。
【００８２】
以下の実施例は例示のために提供するにすぎず、いかなる様式でも本発明の範囲を限定する意図はない。理解を明白にするための例証および実例として、前述の発明をいくらか詳細に記載してきたが、当業者であれば本発明の教示に照らし、添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなくそれに対して特定の変更および改変を行いうることが容易に明らかになるであろう。
【００８３】
本明細書において引用するすべての出版物、特許出願、および特許は、それぞれ個別の出版物、特許出願、および特許が具体的かつ個別に参照により本明細書に組み入れられると示されたかのごとく、参照により本明細書に組み入れられる。特に、本明細書において引用するすべての出版物は、本発明と関連して用いうる組成物および方法を記載および開示するために、特に参照により本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００８４】
特に記載がないかぎり、温度は摂氏度で、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。
【００８５】
実施例1：調整可能でpH活性化可能なミセル（pHAM）ナノ粒子の合成
I. メタクリレートモノマーの合成
2-(テトラメチレンイミノ)エタノール（C5A）、2-(ペンタメチレンイミノ)エタノール（C6A）およびN,N,N',N'',N''-ペンタメチルジエチレントリアミン（PMDETA）はSigma-Aldrichから購入した。2-(ヘキサメチレンイミノ)エタノール（C7A）および2-(ジブチルアミノ)エタノール（DBA）はそれぞれAlfa Aesar CompanyおよびTCI America Inc.から購入した。NHS-テトラメチルローダミン（NHS-TMR）はInvitrogen Companyから購入した。モノマーの2-(ジメチルアミノ)エチルメタクリレート（DMA-MA）、2-(ジエチルアミノ)エチルメタクリレート（DEA-MA）、2-(ジイソプロピルアミノ)エチルメタクリレート（DPA-MA）および2-アミノエチルメタクリレート（AMA）はPolyscience Companyから購入した。AMAはイソプロパノールおよび酢酸エチル（3：7）で2回再結晶した。PEGマクロ開始剤、MeO-PEG114-Brは、臭化2-ブロモ-2-メチルプロパノイルおよびMeO-PEG114-OHから、文献中の手順に従って調製した（Bronstein et al., J. Phys. Chem. B, 2005, 109:18786-18798）。他の溶媒および試薬は、Sigma-AldrichまたはFisher Scientific Inc.から受け取ったままで用いた。
【００８６】
すべての新しいメタクリレートモノマー（C5A-MA、C6A-MA、C7A-MA、DBA-MA）は、類似の方法によって合成した。2-(ペンタメチレンイミノ)エチルメタクリレート（C6A-MA）の合成を代表的手順として記載する。まず、2-(ペンタメチレンイミノ)エタノール（12.9g、0.1mol）、トリエチルアミン（10.1g、0.1mol）、および阻害剤ヒドロキノン（0.11g、0.001mol）を100mLテトラヒドロフラン（THF）に溶解し、次いで塩化メタクリロイル（10.4g、0.1mol）を三頚フラスコ中に滴加した。溶液をTHF中で2時間還流した。反応後、溶液をろ過して沈澱したトリエチルアミン-HCl塩を除去し、THF溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。得られた残渣を無色液体として減圧蒸留した（0.05mmHgで83〜87℃）。合成後、モノマーを1H NMRで特徴決定した。すべてのNMRスペクトルはCDCl3中テトラメチルシラン（TMS）を内部標準としてVarian 500MHz 1H NMR分光計で得た。モノマーの特徴決定および収率は以下のとおりで表1に示す。
【００８７】
（表１）メタクリレートモノマーの特徴決定および収率
2019070160.tif 000027
【００８８】
II. PEO-b-PRおよびPEO-b-(PR-r-TMR)ブロックコポリマーの合成
異なる三級アミン含有セグメント（PR）とポリ(エチレンオキシド)（PEO）セグメントとを有する2つの系列のブロックコポリマー（PEO-b-PR（y=0）およびPEO-b-PR-r-TMR、図1A）を、原子移動ラジカル重合（ATRP；Tsarevsky and Matyjaszewski, Chem. Rev. 2007, 107:2270-2299；Ma et al., Macromolecules 2003, 36:3475-3484）により作製した。直鎖ジアルキル系列において（図1B参照、R基1、2、3、および4）、鎖長はメチル基からブチル基まで変動し；環状系列において（図1B参照、R基5、6および7）、環サイズは5員環から7員環まで変動した。
【００８９】
pH非感受性色素、テトラメチルローダミン（TMR；Albertazzi et al. Am. Chem. Soc. 2010, 132:18158-18167）をモデル蛍光体として用い、pHAMナノ粒子のpH応答特性を調べるための画像化ビーコンとしてPRブロックに結合した。以下により詳細に記載するとおり、より高いpHでは、中性PRセグメントは協同的に自己集合してミセルの疎水性コアとなり、これはTMR分子間のフェルスター共鳴エネルギー移動（ホモFRET）および三級アミンからTMRへの光誘導電子移動（PeT）のメカニズムを通じて蛍光体の凝集および蛍光シグナルの消光を引き起こす（Kobayashi et al., Chem. Rev. 2010, 110:2620-2640；Uchiyama et al., Chem. Int. Ed. 2008, 47:4667-4669；Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd ed., Springer, New York City, 2006, pp. 443-475；Diaz-Fernandez et al., Chem. Eur. J. 2006, 12:921-930）。より低いpHでは、PRセグメントはプロトン化されて正に荷電し、ミセルの分解ならびにTMRの距離の増大およびPeTの減少による蛍光発光の劇的な増大につながる（図1C））。
【００９０】
PEO-b-PRコポリマー（図2A）をまず原子移動ラジカル重合（ATRP）法によって合成した。色素を含まないコポリマーを、ポリマーの特徴決定ならびにpKaおよび臨界ミセル濃度の測定に用いた（表2および3）。手順を例示するための例としてPEO-b-PDPAを用いる。まず、DPA-MA（1.06g、5mmol）、PMDETA（21μL、0.1mmol）、およびMeO-PEG114-Br（0.5g、0.1mmol）を重合チューブに加えた。次いで、2-プロパノール（2mL）およびDMF（2mL）の混合物を加えて、モノマーおよび開始剤を溶解した。凍結-ポンプ-解凍を3サイクル行って酸素を除去した後、CuBr（14mg、0.1mmol）を反応チューブに窒素雰囲気下で加え、チューブを減圧下で密封した。重合を40℃で8時間行った。重合後、反応混合物を10mL THFで希釈し、Al2O3カラムを通過させて、触媒を除去した。THF溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。残渣を蒸留水中で透析し、凍結乾燥して、白色粉末を得た。得られたPEO-b-PRコポリマーを1H 500MHz NMR、ゲル浸透クロマトグラフィ（Viscotech GPCmax、Polymer Labs によるPLgel 5μm MIXED-Dカラム、溶離剤としてTHF、1mL/分）により特徴決定した。表2に各コポリマーの収率、分子量（MnおよびMw）および多分散指数（PDI）を示す。PEO-b-PDPA（標識部分なし）はブロックコポリマー（3）を指し、PEO-b-PDBA（標識部分なし）はブロックコポリマー（4）を示し、PEO-b-PC6A（標識部分なし）はブロックコポリマー（6）を指し、およびPEO-b-PC7A（標識部分なし）はブロックコポリマー（7）を指す。
【００９１】
（表２）PEO-b-PRジブロックコポリマーの特徴決定
2019070160.tif 000028
a数平均（Mn）、重量平均分子量（Mw）および多分散指数（PDI＝Mw/Mn）は、溶離剤としてTHFを用いたGPCにより求めた。b 1H NMRにより求めた。
【００９２】
TMR色素を導入するため、コポリマー合成においてAMAを用いた（図2B）。PEO-b-(PR-r-AMA)コポリマーの合成は前述の手順に従った。AMAモノマーの開始剤への供給比を制御することにより（比＝3）、3つの一級アミノ基を各ポリマー鎖に導入した。これらのPEO-b-(PR-r-AMA)コポリマーについて、類似の収率および分子量が得られた。TMR結合のために、PEO-b-(PR-r-AMA)（50mg）をまず2mL DMFに溶解した。次いで、NHS-TMRエステル（一級アミノ基のモル量に対して1.5当量）を加えた。反応混合物を室温で2日間撹拌した。コポリマーを調製用ゲル浸透クロマトグラフィ（VarianによるPLgel Prep 10μm 10E3A 300×25mmカラム、溶離剤としてTHF、5mL/分）で精製して、遊離色素分子を除去した。生成したPEO-b-(PR-r-TMR)コポリマーを凍結乾燥し、保存のために-20℃で維持した。TMR含有コポリマーにおいて、PRブロックの繰り返し単位の数は70であった。
【００９３】
III. ミセルナノ粒子の調製
以前に発表された溶媒蒸発法によってミセルを調製した（Nasongkla et al., Nano. Lett. 2006, 6:2427-2430）。PEO-b-(PDPA-r-TMR)の例において、24mgのコポリマーをまず1mL THFに溶解し、次いで4mL蒸留水に超音波処理下で滴加した。THFを空気流下で4時間蒸発させた。次いで、蒸留水を加え、保存溶液としてポリマー濃度を4mg/mLに調節した。ミセル形成後、ナノ粒子を透過電子顕微鏡検査（TEM、JEOL 1200 EXモデル）によりミセルのサイズおよび形態について、動的光散乱（DLS、Malvern MicroVモデル、He-Neレーザー、λ＝632nm）により流体力学的直径（Dh）について特徴決定した。
【００９４】
実施例2：調整可能でpH活性化可能なミセルナノ粒子の特徴決定
合成したミセルナノ粒子を特徴決定して、生理的範囲（5.0〜7.4）でのpH応答ならびにそれらの一時的応答の両方について、それらのpH応答特性を示した。
【００９５】
I. 蛍光特徴決定
本試験では、結合したTMR蛍光体を画像化ビーコンとして用いて、pHAMナノ粒子のpH応答特性を調べた。試験したpH範囲（4.5〜8.0）でミセルまたは蛍光体の消光がPDMAブロックの強い親水性によって観察されない、(ポリエチレンオキシド)-b-ポリ((ジメチル-アミノ)エチルメタクリレート)（PEO-b-PDMA、（1）を「常時オン」対照として用いた。まず、pHAMナノプローブ（3、4、6、7）のおよびPEO-b-(PDMA-r-TMR)の蛍光発光スペクトルを、Hitachi蛍光光度計（F-7500モデル）で得た。各コポリマーについて、試料をはじめにMilliQ水中、6mg/mLの濃度で調製した。次いで、保存溶液を異なるpH値を有する0.2Mクエン酸-リン酸緩衝液で希釈した。最終ポリマー濃度を0.1mg/mLに制御した。ナノプローブを545nmで励起し、560〜700nmで発光スペクトルを収集した。発光および励起スリットはいずれも5nmであった。
【００９６】
蛍光寿命測定のために、PEO-b-(PDPA-r-TMR)（3）およびPEO-b-(PDBA-r-TMR)（4）（いずれも0.1mg/mL）からの、TMRの蛍光減衰を測定した。ナノプローブ3（pHt＝6.3）について、寿命をリン酸ナトリウム/クエン酸緩衝液中、pH＝7.4および5.5（それぞれpHtよりも上および下）で測定した。同様に、ナノプローブ4（pHt＝5.4）について、寿命をpH＝7.4および4.9で測定した。両方の実験において、遊離TMR色素（0.005mg/mL）も対照として測定した。これらの試験は、色素レーザー（GL 302）におよびストロボスコープ検出器に接続した窒素レーザー（GL-3300）からなるLaserStrobe蛍光寿命測定器（Photon Technology International, Inc., Birmingham, NJ）で実施した。C-540A（Exciton, Inc., Dayton, OH）色素溶液を用いて540nmの励起波長を生じた。減衰曲線を570nmの波長で分析した。発光モノクロメータースリットは4nmであった。すべての測定を室温で行った。IRF（機器の応答関数）を、グリコーゲンの溶液からの散乱光を測定することにより求めた。蛍光強度減衰データを、PTI機器と共に供給されたソフトウェアを用いて、一重指数関数的減衰関数によって解析した。
【００９７】
異なるpH値での一連のナノプローブ溶液の蛍光画像は、各ナノプローブについて鋭敏な蛍光転移を示し、pHAMナノプローブの調整可能な超pH応答性を示している。
【００９８】
pHに対する正規化蛍光強度（NFI）曲線（図3A）は、pHAMナノプローブのpH応答特性の定量的評価を可能にした。NFIは[F−Fmin]/[Fmax−Fmin]の比として算出し、ここで、Fは任意の所与のpHでのナノプローブの蛍光強度であり、FmaxおよびFminはそれぞれオン/オフ状態での最大および最小蛍光強度であった。図3Aに示すとおり、580nmでの発光強度を用いて異なるpHAMナノプローブの超pH応答を定量した。pH応答の鋭敏度を定量するために、すべてのpHAMナノプローブについて、ΔpH10〜90％、すなわちNFI値が10％〜90％まで変動するpH範囲を評価した。鋭敏値はナノプローブ4、6、3および7でそれぞれ0.21、0.23、0.24、および0.20 pH単位であった。
【００９９】
ΔpH10〜90％の小さい値は、プロトン濃度の＜2倍の変化を表す（すなわち、[H+]10％/[H+]90％＝10ΔpH10〜90％）ため、顕著なpH感受性を示す。これと比べて、小分子色素（Urano, et al., Nat. Med. 2009, 15:104-109）では、同じ程度の発光変化に対する鋭敏値は約2 pH単位（[H+]における100倍）で、ヘンダーソン-ハッセルバルヒの式に一致している（Atkins and De Paula, Physical Chemistry, Oxford University Press, 2009）。pHの鋭敏度に加えて、オン/オフ状態の間の蛍光応答を定量するために、FmaxおよびFminの比（RF＝Fmax/Fmin）も測定した。RFの値は10〜55倍の範囲であり（表3）、ナノプローブの大きい蛍光応答を示している。ミセルにおける発光強度低下に一致して、データはTMRの励起状態（例えば、ミセル中のナノプローブ3では0.44ns（pH＝7.4）は、pH7.4での遊離色素（1.97ns）またはpH5.5での分解ユニマー（1.84ns）よりもはるかに短い寿命を有することを示した。
【０１００】
（表３）PEO-b-(PR-r-TMR)ナノプローブの特徴決定
2019070160.tif 000029
apH滴定実験により求めた。bpH7.4におけるピレンプローブのI1/I3比により求めた。c1mg/mLのコポリマー濃度およびpH＝7.4におけるDLSにより求めた。dローダミン蛍光発光強度により求めた。e20μLの5mg/mLポリマー溶液を80μLのリン酸緩衝液（pH5.5）と混合することによるストップトフロー測定により求めた。f4の低いpHt値（5.4）を説明するために、pH＝4.9の緩衝液を用いた。
【０１０１】
要約すると、pH活性化可能なミセルナノ粒子は、生理的範囲（pH5.0〜7.4）における調整可能性および超高感度pH応答、オン/オフ状態の間の発光強度の大幅な増大（最大55倍）を示し、かつ活性化のために＜0.25のpHしか必要としない。
【０１０２】
II. pH一時的応答
本試験は、合成したpH活性化可能なミセルナノ粒子における蛍光活性化を測定するために、ストップトフロー測定を用いた。pHAMナノプローブのストップトフロー測定は、Bio-Logic SFM-3機器を用いて行った。すべての実験は、室温でリン酸ナトリウム/クエン酸緩衝液中の異なるpHで行った。モノクロメーターを540nmでの励起のために用い、570nmロングパスで蛍光強度を記録した。実験をBioKine 16 V 3.03ソフトウェアで制御し、推定不感時間1.5msを有した。
【０１０３】
ストップトフロー実験により、蛍光活性化は非常に速く、ほとんどのナノプローブは低pHでは5ms以内に完全に活性化される（例えば、4のτ1/2＝3.7ms、図3B）ことが示された。超高感度pH応答は、ナノプローブ4、3、7および6でのみ観察された。蛍光転移pH値（pHt、F＝0.5×(Fmax＋Fmin)のpH）は、ナノプローブ4、3、7および6についてそれぞれ5.4、6.3、6.8および7.2であった（図3A）。他のコポリマーはいかなるpH応答も示さなかった（例えば、1）か、または広いpH応答のみ（例えば、2、5、データは示していない）のいずれかであった。
【０１０４】
要約すると、ストップトフロー実験により、pH活性化可能なミセルナノ粒子は5ms未満の範囲の迅速な一時的応答を有することが示された。
【０１０５】
III. コポリマーおよび成分モノマーのpH滴定曲線およびその後の1H NMRスペクトル解析
理論に縛られたくはないが、疎水性ミセル化がpHAMの超pH応答性の推進力であり、協同的応答を達成するにはPRセグメントにおける疎水性についての臨界閾値が必要と考えられる。この仮説を試験するために、2つの代表的ブロックコポリマー、5および7、ならびにそれらの対応するモノマーのpH滴定曲線を比較した（図4A）。
【０１０６】
典型的な手順において、PEO-b-PRコポリマーまたはその対応するモノマーをまず0.1N HClに溶解し、最終濃度5〜10mg/mLとした。少量（50〜100μL増分）の0.1N NaOH溶液を撹拌下に加えることにより、pH滴定を行った。2〜11までの範囲のpH増大をNaOHの全添加量（VNaOH）の関数としてモニターした。pH値を、微小電極を備えたMettler Toledo pH計を用いて測定した。図4Aは、環状PEO-b-PRコポリマー（5および7）および対応するモノマーの代表的滴定曲線を示す。各試料について、滴定曲線における2つの当量点の中央のpHとしてpKa値を算出した。すべてのPEO-b-PRコポリマーおよび対応するモノマーのpKa値を表3に示した。
【０１０７】
両方のモノマーは、加えたNaOHの量の範囲で広いpH応答を有するイオン化可能な小分子のように挙動した。コポリマー5は同様の広いpH応答を示した。これに対して、コポリマー7は劇的に鋭敏化されたpH転移を示し、大幅に増大した緩衝能力を示した。三級アミンの異なるイオン化状態（[R3NH+]/[R3N]0）での5および7の重水素化1H NMRは、仮説をさらに支持している（図4B）。PEOセグメントはそのピーク強度を変化させず、内部標準として用いた。イオン化状態全体にわたり、5のPRセグメントのプロトン共鳴ピークは容易に可視化されたが、ピーク強度はより高いpHでピーク幅の広幅化に伴って低下し、コポリマーのバルク凝集挙動を反映していた。7について、コポリマーの中性状態（すなわち、0％）は、高度に緻密なミセルコアの形成により、PRセグメントにおける完全に抑えられた共鳴ピークを導いた。水溶液中の7の透過電子顕微鏡検査（TEM）は、そのpKa（6.7）よりも高いpH7.4でミセルの形成、およびpH5.5で完全なミセル分解を示した（図4C）。これと比べて、いずれのpHでも5からミセルは形成されなかった（データは示していない）。
【０１０８】
要約すると、これらのデータは、疎水性ミセル化は、観察された7のアンモニウム基の協同的脱プロトン化挙動の主な推進力であることを示唆していた。
【０１０９】
IV. PEO-b-PRジブロックコポリマーの臨界ミセル濃度（CMC)の測定
各PEO-b-PRコポリマーのCMCを0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液中、pH7.4で測定した。まず、コポリマー保存溶液（3mg/mL）を同じ緩衝液中で異なる濃度に希釈した。各溶液において、5μLのピレンのTHF溶液（2×10-4mol/L）を2mLのポリマー溶液に加えて、5×10-7mol/Lの最終ピレン濃度を得た。蛍光スペクトルをHitachi蛍光計（F-7500モデル）で、励起波長339nmならびに励起および発光スリットそれぞれ10.0nmおよび1.0nmを用いて記録した。I1およびI3値を、それぞれ約372および382nmの最大発光強度として測定した。I1/I3比を異なるpH値でのポリマー濃度の関数としてプロットした。I1/I3比はピレン環境の極性を反映し、ここで疎水性ミセルコアへのピレンの分配はI1/I3値の低下につながる（Kalyanasundaram et al., J. Am. Chem. Soc. 1977, 99:2039-2044；Winnik, Chem. Rev. 1993, 93:587-614）。CMC値を、溶液中でミセルが形成される臨界ポリマー濃度として測定した。TMR干渉を避けるために、TMR結合していないPEO-b-PRコポリマーをこれらの試験で用いた。pH7.4でのCMC値を表3に示した。
【０１１０】
実施例3：細胞内pHAM（TMRナノプローブ）活性化の部位およびメカニズム
I. ヒト肺癌細胞における共焦点レーザー走査型顕微鏡検査
pHAMの細胞内活性化を調べるために、ヒトH2009肺癌細胞中のナノプローブ3を共焦点レーザー走査型顕微鏡検査により検査し、H2009細胞中のpHAMナノプローブの活性化を相対蛍光強度により定量した（図5）。
【０１１１】
H2009細胞を、5％ウシ胎仔血清（FBS）、100 IU/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシンを補ったRPMI 1640培地（Invitrogen、CA）中、37℃、5％CO2雰囲気下で培養した。細胞内輸送および同時局在試験のために、Organelle Lights(商標) Endosomes-GFPおよびLysosomes-GFP BacMam 1.0キット（Molecular Probes、OR）を、それぞれRab5a（初期エンドソームマーカー）およびLamp1（後期エンドソーム/リソソームマーカー）標識のために用いて、H2009細胞にバキュロウイルスを形質移入した。次いで、細胞をさらなる解析のために成長培地中で培養した。ミセル取り込みおよび細胞内活性化の共焦点画像解析試験のために、H2009細胞を2mLの完全RPMI培地中でガラス底皿（MatTek、MA）に播種し、ポリマー濃度0.2mg/mL、pH7.4でナノプローブ3と共にインキュベートした。共焦点画像をミセル添加後0、15、30、45、および60分で捕捉した。60分のインキュベーション後、0.1N HCl溶液（250μL）を培地に加えて培地をpH5.0まで酸性化し、細胞をただちに画像化した。画像をImage-Jソフトウェアを用いて解析した。5回の独立した測定値を平均±標準偏差として提示した。同時局在実験のために、Rab5a-GFPまたはLamp1-GFPを発現している形質移入細胞を2mLのフェノールレッドを含まない完全RPMI培地中でガラス底皿に播種した。24時間の細胞成長後、PBS（pH7.4）中の0.4mgのナノプローブ3または4（5mg/mLコポリマー溶液）を培地に加えて、最終ポリマー濃度0.2mg/mLとした。画像を指定の時点で、100×対物レンズを備えたNikon ECLIPSE TE2000-E共焦点顕微鏡により捕捉した。GFPおよびTMRをそれぞれ488および543nmで励起した。GFPおよびTMRの発光波長はそれぞれ515および595nmであった。
【０１１２】
pHAMナノプローブは、中性pHでは「サイレント」であるため、これらを培地に直接適用し、その内部移行の動力学を培地を除去する必要なしにモニターした。ナノプローブの添加直後、H2009細胞も培地も観察可能な蛍光シグナルは示さなかった。15分の時点で、細胞内に断続的な蛍光の点が現れた。蛍光点の数は経時的に増加した。H2009細胞のシグナル対ノイズ比（SNR細胞、バックグラウンドノイズとして0時間の蛍光強度を用いる）により、経時的なナノプローブ取り込み増大および活性化のさらなる定量が可能となった。60分の時点で、培地（SNR培地＝69.3±9.1、P＜0.001）に比べてSNR細胞の31倍の増大（2.14±0.17×103）が観察され、ここでナノプローブの大部分はまだ存在していた（図5A）。次いで、0.1N HCl溶液を加えて培地をpH5.0まで酸性化し、培地バックグラウンドの蛍光強度のかなりの増大がみられた。蛍光コントラストの逆の傾向が見られ、ここでSNR細胞はSNR培地の74％（P＜0.05）であった（図5B）。
【０１１３】
これらのデータは、pHAMナノプローブが潜在的に常時オンナノプローブ（HCl添加後の場合のように）に比べて癌細胞のコントラスト感受性を劇的に増大させうることを示していた。
【０１１４】
II. ヒト肺癌細胞のエンドサイトーシスオルガネラにおけるpHAMの活性化
異なるエンドサイトーシスオルガネラがpHAMを選択的に活性化しうるかどうかをさらに調べるために、H2009細胞に初期エンドソームおよび後期エンドソーム/リソソームにおけるそれぞれ緑色蛍光タンパク質（GFP）融合Rab5aおよびLamp Iバイオマーカーを形質移入した。
【０１１５】
H2009細胞を2mLの完全RPMI培地中でガラス底皿（MatTek、MA）に播種し、ポリマー濃度0.2mg/mL、pH7.4でナノプローブ3と共にインキュベートした。共焦点画像をミセル添加後0、15、30、45、および60分で捕捉した。60分のインキュベーション後、0.1N HCl溶液（250μL）を培地に加えて培地をpH5.0まで酸性化し、細胞をただちに画像化した。画像をImage-Jソフトウェアを用いて解析した。5回の独立した測定値を平均±標準偏差として提示した。同時局在実験のために、Rab5a-GFPまたはLamp1-GFPを発現している形質移入細胞を2mLのフェノールレッドを含まない完全RPMI培地中でガラス底皿に播種した。24時間の細胞成長後、PBS（pH7.4）中の0.4mgのナノプローブ3または4（5mg/mLコポリマー溶液）を培地に加えて、最終ポリマー濃度0.2mg/mLとした。画像を指定の時点で、100×対物レンズを備えたNikon ECLIPSE TE2000-E共焦点顕微鏡により捕捉した。GFPおよびTMRをそれぞれ488および543nmで励起した。GFPおよびTMRの発光波長はそれぞれ515および595nmであった。バフィロマイシンA1によるリソソームの酸性化の阻害に関するならびにナノプローブ3および4の細胞内活性化に対するその効果に関する実験のために、Lamp1-GFPを発現している形質移入H2009細胞を2mLのフェノールレッドを含まない完全RPMI1640培地中でガラス底皿に播種した。24時間の細胞成長後、培地を、バフィロマイシンA1（最終濃度＝1μM）を含む新鮮培地で置き換え、細胞を37℃で1時間インキュベートした。次いで、PBS（pH7.4）中の0.4mgのナノプローブ3または4を培地に加えて、最終ポリマー濃度0.2mg/mLとした。37℃で1時間インキュベートした後、細胞を100×対物レンズを備えたNikon ECLIPSE TE2000-E共焦点顕微鏡により画像化した。GFPおよびTMRをそれぞれ488および543nmで励起した。GFPおよびTMRの発光波長はそれぞれ515および595nmであった。画像捕捉後、培地を新鮮培地で置き換えた。細胞を37℃で5時間インキュベートし、続いて共焦点顕微鏡分析を行った。
【０１１６】
2つのpHAMナノプローブ（3および4、それぞれのpHtは6.3および5.4）をH2009細胞と共にインキュベートし、共焦点画像解析を用いてpHAM活性化の細胞内位置を調べた。20個またはそれ以上の同時局在化ドット（すなわち、初期エンドソーム内またはリソソーム内の活性化pHAM）を有するH2009細胞（N＝30〜50）を陽性として特定し、パーセンテージを定量した（図6Aおよび6B）。ナノプローブ3について、30分の時点で80％の細胞が初期エンドソームとの同時局在において陽性であったが、後期エンドソーム/リソソームと同時局在していたのは12％にすぎなかった。経時的に、初期エンドソームとの活性化3の同時局在は減少したが、後期エンドソーム/リソソームとの活性化3の同時局在は増大した（図6A）。これに対して、ナノプローブ4（PHt＝5.4）は活性化のための細胞内位置の異なるパターンを示した。すべての時点で、初期エンドソーム同時局在が見られた陽性細胞は10％未満であった。代わりに、ほとんどすべての活性化ナノプローブ4は後期エンドソーム/リソソームと同時局在していた（図6B）。図6Cおよび図6Dは、2つのナノプローブの細胞内取り込みおよび活性化の異なるプロセスを示す。ナノプローブ3は、より高い小胞pH（5.9〜6.2）で初期エンドソーム内で速やかに活性化され得（Casey et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010, 11:50-61；Modi et al., Nat. Nanotech. 2009, 4:325-330）、活性化は、ナノプローブが後期エンドソーム/リソソームへと移動するにつれて持続する。対照的に、ナノプローブ4は、より低い小胞pH（5.0〜5.5）でほとんど後期エンドソーム/リソソーム内でのみ活性化される（Casey et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010, 11:50-61；Modi et al., Nat. Nanotech. 2009, 4:325-330）。同様の結果がヒトSLK腫瘍内皮細胞でも見られた（データは示していない）。
【０１１７】
これらのデータは、pHAMナノ粒子によって異なるエンドサイトーシスオルガネラ内の小胞pHの小さい差を標的とすることの実現可能性を示している。
【０１１８】
pHAMの細胞内活性化メカニズムを検証するために、H2009細胞をバフィロマイシンA1と共に1時間インキュベートし、次いでナノプローブ3を加えた。バフィロマイシンは、原形質膜を越えるプロトンポンピングと、細胞内オルガネラ（例えば、リソソーム）の酸性化とを担う、液胞型H+-ATPアーゼ（V-ATPアーゼ；Gagliardi et al., Curr. Med. Chem. 1999, 6:1197-1212）の特異的阻害剤である。データは、バフィロマイシンA1存在下で、TMR蛍光の非存在によって示されるとおり、ナノプローブ3は活性化されなかった。培地中のバフィロマイシンA1および3の除去後、TMR蛍光のlamp 1-GFP標識リソソームとの同時局在により3の活性化が現れた。同様の結果がH2009細胞においてナノプローブ4でも見られた。
【０１１９】
これらの実験は、合成ナノ粒子が、pH7.4の培地中では「サイレント」であるが、細胞への取り込み後に活性化されうることを示していた。さらに、6.3および5.4のpH転移を有するナノ粒子は、初期エンドソーム（pH5.9〜6.2）およびリソソーム（5.0〜5.5）などの、異なるエンドサイトーシス区画において選択的に活性化されうる。これらのデータは、pHAMナノ粒子によって異なるエンドサイトーシスオルガネラ内の小胞pHの小さい差を標的とすることの実現可能性を示している。
【０１２０】
実施例4：化学療法剤のpHAMナノ粒子への封入
本試験は、pHAMナノ粒子が高いパーセンテージの化学療法剤を封入し、その後、腫瘍細胞で観察されるものと同様の酸性環境に曝露されると速やかに放出しうることを示そうとするものであった。
【０１２１】
I. ドキソルビシンのミセルへの封入
PEO-b-PC6Aを前述のとおりに合成した（実施例1（IおよびII）参照）。ドキソルビシンのミセルへの封入を、まずドキソルビシンおよびPEO-b-PC6Aを水および塩酸に溶解することによって達成した。次いで、この溶液を0.1M pH9緩衝液に、超音波処理下で滴加した。
【０１２２】
この方法を用いることにより、10パーセントの理論ローディングのうち、5〜6パーセントの間のドキソルビシンローディングパーセンテージが得られた。ドキソルビシン封入ミセルをクロロホルムに溶解し、次いでUV吸光度を測定することにより、薬物ローディングを算出した。
【０１２３】
II. 酸性環境への曝露後のドキソルビシンの放出
ドキソルビシン放出実験を、様々なpH環境でドキソルビシンをローディングしたミセルの異なる時点での蛍光強度を測定することにより行った。最初に、キュベット中で125μLのドキソルビシンローディングミセルを175μLの水と混合し、初期蛍光スペクトルを取った。次いで、10〜20μLの5M pH緩衝液をキュベットに加えて、経時的ドキソルビシン放出を測定した。薬物濃度を、水中およびpH緩衝液中の遊離ドキソルビシンの蛍光較正曲線に基づいて算出した。低濃度（＜0.025mg/mL）では、蛍光強度と濃度は直接比例する。より高濃度では蛍光消光が起こる。
【０１２４】
放出試験は、ドキソルビシンはpH5.0では迅速にミセルから放出されること、およびpH7.4ではミセルは比較的安定であることを示している。pH5.0では、ミセルは最初の2時間でドキソルビシンを迅速に放出し、その後、この放出は非常に遅い。pH7.4では、ドキソルビシンは数時間後にミセルからゆっくり放出されるが、薬物の大部分は封入されたままである（図7）。低濃度（＜0.025mg/mL）では、蛍光強度と濃度は直接比例する。より高濃度では蛍光消光が起こる。
【０１２５】
本試験は、ポリマーミセルが高いパーセンテージのドキソルビシン（約6％）を封入しうること、および酸性条件でプロトン化されるポリマーが、低pH値で加水分解を受けるポリマーよりもはるかに速く解離しうることを示した。放出試験は、ミセルがpH5.0ではドキソルビシンを迅速に放出し得、薬物の大部分が最初の2時間で放出されることを示した。
【０１２６】
III. パクリタキセルのミセルへの封入
パクリタキセルをローディングしたミセルを、以前に発表された手順に従って調製した。簡単に言うと、20mgのMeO-PEO5k-PDPA25kおよび2mgのパクリタキセルを1mLのTHFに溶解した。次いで、混合物を10mLのMilli-Q水に超音波処理下で急速に加えた。混合物を微小限外ろ過装置を用いて6回超限外ろ過し、THFを除去した。得られたミセル溶液を室温で4時間放置し、0.45μmのセルロース膜を通してろ過し、ミセル溶液中のいかなる沈澱も除去した。ポリマーミセル中のパクリタキセルローディング含有量を、アセトニトリル中のミセルの分解によって求めた。パクリタキセル濃度を、34％アセトニトリルおよび66％水からなる移動相で逆相C18カラム（5μm、4.6×250mm）を用い、227nm、流速1mL/分でのHPLCによって求めた。MeO-PEO5k-PDPA25kミセル中のパクリタキセル含有量は8.3±0.6％であった。
【０１２７】
実施例5：腫瘍血管新生画像化のためのシパートを含むpHAM-NIR蛍光体の生成
I. NIR-pHAMの合成
シパート-NHSエステル（NIR色素）を、発表された手順に従って合成した（図8； Lopalco, et al., Org. Biomol. Chem., 2009, 7:856-859；Ye et al., Bioconjug. Chem, 2007, 19:225-234）。図8は、NIR-NHSおよびPEO-b-(PR-r-NIR)コポリマーの代表的合成スキームを示す。1,2-ジクロロベンゼン中、110℃での、1,2,2-トリメチル-1H-ベンズ[e]インドール（A）の3-ブロモプロパン酸との反応により、Bを得た。Bをマロンアルデヒドビス(フェニルイミン)1塩酸塩（n＝1）またはグルタコンアルデヒドジアニル1塩酸塩（n＝2）とさらに反応させて、対応するNIR蛍光体（C）を得た。Cを無水DMF中、O-(N-スクシンイミジル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（TSTU）およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）で処理して、NIR-NHSエステルを得た。最後に、NIR-NHSの一級アミノ基を有するブロックコポリマーへの結合により、PEO-b-(PR-r-NIR)を合成した。シパート含有コポリマーにおいて、PRブロックにおける繰り返し単位の数は70であった。合成後、ポリマーをゲル浸透クロマトグラフィ、1H NMR、および蛍光分光法によって完全に特徴決定した。異なる励起/発光波長（例えば、n＝1の場合λex/λem＝678/704nm；n＝2の場合λex/λem＝781/808nm）を有する有用な類似体を続いて生成した。
【０１２８】
II. NIR-pHAM蛍光体の最適化
TMR-pHAMにおける予備的試験は、PRの長さおよびTMRの数が超pH応答に影響をおよぼしうることを示している。十分なPR長は協同的ミセル化を提供し得、pH応答、すなわちΔpH10〜90％に直接影響をおよぼす。TMR密度は蛍光応答を制御し得る。例えば、y＝3においてTMRナノプローブ3に対して55の最適Fmax/Fminが得られ、オン状態で観察可能な分子内蛍光消光は見られなかった。これと比べて、y＝1では、10のFmax/Fminしか得られなかった（データは示していない）。
【０１２９】
NIR-pHAM開発のために、PR長（70）を維持してポリマー鎖あたりの最適NIR密度を調べる。異なる蛍光体（すなわち、シパートとTMR）は異なるホモFRETおよびPET消光効果を有すると予想され、これは最適なpHAM組成物に影響をおよぼしうる。ホモFRETおよびPETからの寄与を定量するために、NIR結合ポリマーをNIRなしポリマーと混合し、NIR結合ポリマーのモル比を系統的に変動させる。ミセルあたり1つのNIR色素に対する消光係数の外挿により、PET寄与の定量が可能となる。次いで、PRセグメント上のシパート密度（例えば、y＝1、3、6）を系統的に増大させる。消光効率を測定し、r6（rはミセルコアにおける色素対の間の距離である）に反比例するホモFRETモデルと相関させる（Lakowicz (ed.), Principles of Fluorescence Spectroscopy, Edn. 3rd, 443-475 (Springer, New York City; 2006）。
【０１３０】
次いで、pH転移がそれぞれ5.4、6.3、6.8および7.2の調整可能なNIR-pHAM（すなわち、TMRがNIR色素で置き換えられているナノプローブ3、4、6、7）ナノプローブ群を合成する。異なる色素（例えば、シパート）を用いると、pHtのわずかな変動が生じうる。NIR-pHAM合成の後、pHおよび蛍光応答（例えば、前述のpHt、ΔpH10〜90％、Fmax/Fmin）、物品サイズ（TEMおよびDLS）、臨界ミセル濃度および蛍光寿命を測定する。
【０１３１】
実施例6：血管を標的とするcRGDfK-pHAMの開発
本試験は、pH感受性ポリマーミセルナノ粒子に腫瘍の脈管構造を標的とさせるためのcRGDfK-pHAMの開発を示す。小ペプチドリガンドcRGDfK（cRGD）は、血管新生腫瘍内皮細胞において過剰発現されるαvβ3インテグリン（CD61）を特異的に標的とする。
【０１３２】
チオール-マレイミド化学をpHAM表面上のリガンド結合のために用いた（図9）。MAL-PEO-b-PRをPEO-b-(PR-r-NIR)と、MAL-PEO-b-PRのモル比10モル％で混合した。ミセル形成後、cRGD-SHペプチドをチオール-マレイミド連結によって結合した。ペプチド結合を、1H NMRによりマレイミド基（6.7ppm）の消失、およびcRGDfK上のD-Pheからの芳香族基（7.0〜7.5ppm）の生成によってモニターした。アミノ酸分析をさらに用いて、pHAMナノプローブの表面上のペプチド密度を定量した（Khemtong, et al., Cancer Res., 2009, 69:1651-1658）。TEMおよびDLSを用いて粒子のサイズおよび形態におけるリガンド機能付与を調べ、蛍光分光光度法を用いてpHAMのpH応答蛍光特性を検証した。レーザー走査型共焦点顕微鏡検査は標的指向pHAMの細胞取り込みおよび細胞内活性化の動力学を調べるための主なツールであった。
【０１３３】
ヒト臍血管内皮細胞（HUVEC）をこれらの試験において用いた。この細胞株は、血管新生内皮細胞のインビトロでの細胞培養モデルとして十分に認められ、αvβ3インテグリンがHUVEC細胞上で過剰発現される（Ellis et al., J. Vase. Res., 2003, 40:234-243；Vag et al., Contrast Media Mol. Imaging, 2009, 4:192-198）。図10は、HUVEC細胞におけるcRGDコード化PEG-b-(PDPA-r-NIR)pHAM（pH転移＝6.3）のコントラスト特異性を示す。cRGD/cRADの表面密度を20モル％で制御した。αvβ3特異性を調べるために、cRADコード化pHAMおよび遊離cRGDブロック＋cRGDコード化pHAMを対照として用いた。HUVEC細胞をEGM培地中で培養した後、異なるpHAM試料（ポリマー濃度：0.2mg/mL）を3時間インキュベートした。cRGDブロック対照において、20モル過剰量の遊離cRGDペプチドは、cRGD-pHAMと同時インキュベートされて、αvβ3結合に対して競合した。pHAMは、培地のpHでサイレントであるため、HUVEC細胞内でのpHAMの活性化を、培地を除去する必要なしで直接画像化することができる。
【０１３４】
データから、細胞のインキュベーション後、cRGD-pHAMがHUVEC細胞内で蛍光強度の劇的な増大を示すことが判明した。これと比べて、cRAD-pHAMおよびcRGDブロック対照は蛍光シグナルをほとんど示さなかった。異なるHUVEC細胞のROI分析は、cRGD-pHAM、cRAD-pHAM、およびcRGDブロック対照の平均蛍光強度はそれぞれ15.2±3.5、1.4±0.2、1.5±0.2であることを示した（図10A）。ほぼ同等のROIサイズの培地バックグラウンドの蛍光は0.56±0.09であった。異なるpHAM状態のコントラスト対ノイズ比（CNR＝(FIpHAM−FI培地)/FI培地、式中、FIpHAMおよびFI培地はそれぞれpHAM試料および培地の蛍光強度である）を算出するために、培地をバックグラウンドノイズとして用いた。cRGD-pHAM、cRAD-pHAM、およびcRGDブロック対照のCNR値はそれぞれ26.1±6.2、1.5±0.4、および1.6±0.4であった（図10B）。cRGD-pHAMのCNRにおける＞10倍の増大が2つの対照で観察されたことは注目に値し、αvβ3特異的標的指向を示している（P＜0.01）。特に、このコントラストは、細胞培養用培地中、高濃度（0.2mg/mL）の「サイレント」pHAMナノプローブ存在下で観察された。
【０１３５】
実施例7：腫瘍を有するマウスにおいてインビボで特有の血管新生バイオマーカー画像化における標的指向pHAMの特異性および有効性の評価
I. 腫瘍脈管構造におけるpHAM活性化
TMRは短い励起/発光波長（λex＝540nm、λem＝580nm）を有するため、これらの試験はcRGDコード化TMR結合pHAMナノ粒子を用いて、腫瘍脈管構造におけるpHAM活性化を示した。
【０１３６】
A549腫瘍異種移植片を有する無胸腺ヌードマウス（100〜200mm3、各群n＝3）をこれらの試験において用いた。cRGDおよびcRADコード化PEG-b-(PDPA-r-TMR)pHAMナノプローブを表面密度20モル％で用いた。ナノプローブを14μmol TMR/kgの用量で尾静脈から注射し、動物をpHAM注射の3時間後に屠殺した。様々な器官を摘出し、ペトリ皿に入れ、IVIS Spectrumにより画像化した。
【０１３７】
cRADコード化およびcRGDコード化TMR-pHAMからの、外植した器官および腫瘍組織のTMRシグナルを、Maestro蛍光画像化装置により、同じ画像化条件で直接観察することができる。TMRは組織透過が限られているにもかかわらず、cRGDコード化pHAMからの腫瘍は明らかに、cRADコード化pHAMからのものよりも、ならびに隣接する筋組織よりも高い蛍光強度を示した。両方の群で、血液の滴はいかなる蛍光シグナルも示さず、血中のpHAMの所期のバックグラウンド抑制効果を示していた。一方、肝臓は両方のpHAM製剤を取り込む主な器官であると考えられ、ナノサイズの粒子のRESクリアランスと一致していた（Moghimi, et al., Pharmacol. Rev., 2001, 53:283-318）。
【０１３８】
エクスビボ画像化後、腫瘍組織を凍結し、8μmで切断した。腫瘍組織の共焦点画像解析は、cRGD-pHAM処理した腫瘍において、cRAD-pHAM対照よりも顕著な蛍光強度の増大を示した。pHAM活性化の部位を検証するために、腫瘍切片をまずPECAM（CD31）に対するラット一次抗マウスmAbで染色し、続いて洗浄し、Delight 488結合抗ラット二次抗体で染色した。重ね合わせ画像は、pHAM活性化の大部分は脈管構造染色と同時局在していたことを示し、腫瘍脈管構造における活性な標的指向およびcRGDコード化pHAMの活性化を示している。本試験は、腫瘍を有するマウスにおいて、cRGDコード化pHAMによって特定の血管新生バイオマーカー（すなわち、αvβ3）を標的とすることの実現可能性を示している。TMR色素の短い組織透過を克服するために、NIR-pHAMナノプローブ（例えば、シパート、n＝2の場合、λex/λem＝781/808nm）を、さらなるインビボでの動物試験のために用いてもよい。
【０１３９】
II. 最適なpHt値を有する標的指向NIR-pHAMナノプローブの評価
血管新生バイオマーカーの画像化特異性に対するpHtの影響を調べる。この一連の試験において、cRGDコード化NIR-pHAMをモデルシステムとして、およびcRADコード化NIR-pHAMを対照として用いる。NIR結合PEG-b-PDBA（pHt＝5.4）、PEG-b-PDPA（6.3）、またはPEO-b-PC7A（6.8）ナノプローブを評価する。より大きいpHt値（例えば、6.8）を有するcRGD-pHAMナノプローブは、初期段階のエンドソーム内でより速い蛍光応答をもたらしうる。しかし、これは、腫瘍微小環境における酸性pHなどの、他の非αvβ3関連メカニズムによって、より「活性化」されやすいと考えられる。逆もまた同じで、より低いpHt値（例えば、5.4）を有するcRGD-pHAMは、αvβ3仲介性エンドサイトーシスによって、より特異的に「オン」となり得るが；血管新生内皮細胞においてそれらが活性化されるにはより長い時間がかかると考えられる。
【０１４０】
この一連の実験において、本発明者らは、異なるpHtを有するcRGDおよびcRADコード化NIR-pHAMを、A549腫瘍を有するマウスの尾静脈から注射する。腫瘍および他の器官の蛍光強度を経時的に記録して、pHAM活性化の動力学を調べる。Living Image 4.0ソフトウェアを用いて、マウス解剖学的構造に重ね合わせた3Dボリューム画像を表示する。腫瘍組織について、蛍光強度を経時的にプロットして、cRGDコード化NIR-pHAMに飽和動力学が存在するかどうか（受容体飽和から予想されるとおり）を調べる。飽和動力学が観察される場合には、受容体飽和を可能にする最小用量としての最適pHAM用量を求める。次いで、この用量をその後の試験で用いて、他の器官（例えば、肝臓）における非特異的取り込みを最小限に抑える。次いで、cRGDコード化対cRADコード化NIR-pHAMについて、周囲の筋組織に対する腫瘍のCNRを算出し、αvβ3仲介性エンドサイトーシスによる標的特異的コントラストを調べるために比較する。異なるpHt値を有するNIR-pHAMについて、異なるNIR-pHAM設計全てにわたる標的指向（すなわち、cRGDコード化）群と非標的指向（すなわち、cRADコード化）群との間のCNRを比較する。これらの結果は、腫瘍微小環境におけるステルスpHAM（PEO表面）活性化におけるデータと相関している。本試験のこの結果により、インビボで特定の血管新生バイオマーカーを画像化するために、NIR-pHAMの最適なpHt設計が選択される。
【０１４１】
cRGDコード化NIR-pHAM（NIR結合PEG-b-PDPA（pHt＝6.3））をモデルシステムとして、および非標的指向NIR-pHAMを対照として用いた。NIR結合PEG-b-PDPAは、以下のとおりの式Iの構造を有した。
2019070160.tif 000030
標的指向NIR結合PEG-b-PDPAはcRGDの表面密度10モル％を有した。
【０１４２】
cRGDコード化および非標的指向NIR結合PEG-b-PDPAを、A549肺腫瘍を有する無胸腺ヌードマウスの尾静脈から静脈内注射した。インビボNIR蛍光強度を注射後3時間記録した。比較群において、cRGDfKペプチドのブロッキング用量をcRGDコード化NIR結合PEG-b-PDPA投与の30分前に注射した。
【０１４３】
cRGDコード化NIR結合PEG-b-PDPAからの腫瘍は明らかに、非標的指向NIR結合PEG-b-PDPAよりもまたはcRGDブロッキング群からのものよりも高い蛍光強度を示した。
【０１４４】
III. cRGDコード化pHAMの薬物動態試験
本試験は、A549腫瘍を有するマウスにおける、cRGDコード化pHAM（標的指向ミセル）およびcRGDなしのpHAM（非標的指向ミセル）の血中循環時間を示した。
【０１４５】
雌無胸腺ヌードマウス（20〜25g）の右側腹部にヒト非小細胞肺癌A549細胞（5×106細胞/マウス）を皮下接種した。腫瘍を200〜300mm3に到達させた後、ミセルを注射した。PK試験のために、cRGDなしのpHAMまたは10％cRGDコード化PEG-b-(PDPA-r-TMR)pHAMを20mg/kgミセルの用量で尾静脈から注射した。血液を静脈内注射の2分、3、6、12、24および48間後に採取した。1,000rpmで10分間の遠心沈降により血漿をRBCから分離した。血漿をさらなる分析のために4℃で保存した。ポリマーを血漿から酸性メタノール（0.1M HCl：MeOH、3：7、v/v）で抽出し、励起および発光波長それぞれ545および580nmを用いて蛍光計で検出した。
【０１４６】
cRGDコード化pHAMおよびcRGDなしのpHAMはいずれも長い血中循環時間を示した。cRGDコード化pHAMおよびcRGDなしのpHAMの血中半減期はそれぞれ10.0および9.5時間であった（図11）。
【０１４７】
IV. いくつかの腫瘍異種移植片モデルにおいてαvβ3インテグリンおよびVEGFR2を画像化する際のNIR-pHAMナノプラットフォームの普遍性の試験
最適pHtを有するNIR-pHAM製剤をこれらの試験において用いる。VEGFR2標的指向ナノプローブのために、本発明者らはNIR-pHAM結合のためのRAFL-1 mAbのFabR2'-SH断片を精製する。非特異的Fab'-SHも対照ラットIgGから調製する。Fab'-SHをチオール-マレイミド化学によりNIR-pHAM表面に結合する。RAFL-1-NIRイミノ結合体を常時オン対照として用いる。αvβ3標的指向NIR-pHAMのために、小分子色素結合体としてのcRGD-NIRも合成する。これらの常時オンプローブは標的とする部位で高い血中シグナルおよび限られた画像化ペイロード増大を有し、これらは対応するNIR-pHAMナノプローブに比べて有意に低いコントラスト感受性を有する。
【０１４８】
標的指向ナノプローブを、雌ヌードマウスの乳房パッドにおける正所性MDA-MB-231乳房腫瘍モデル（Ran et al., Neoplasia, 2003, 5:297-307）nu/nuマウスにおける正所性MiaPaca-2膵臓腫瘍モデル（Korpanty et al., Cancer Res., 2007, 13:323-330）における他のより臨床的に関連する腫瘍モデルにおいて調べる。両方の腫瘍モデルは高いレベルの血管新生バイオマーカー（例えば、VEGFR2、αvβ3、エンドグリン）を発現する。これらの腫瘍モデルにおけるNIR-pHAMナノプローブの画像化特異性および有効性を評価し、結果を組織切片におけるこれらの血管新生バイオマーカーの免疫組織化学によって確認する。
【０１４９】
実施例8. 酸性腫瘍における非標的指向NIR-pHAMの活性化の評価
細胞外pHは腫瘍微小環境および代謝を試験するための重要な生理的パラメーターになってきている。（Cardone et al., Nature Rev. Cancer, 2005, 5:786-795；Gerweck and Seetharaman, Cancer Res. 1996, 56:1194-1198；Helmlinger et al., Nature Medicine, 1997, 3:177-182）。好気性解糖（ワールブルク効果としても知られる）、すなわち酸素存在下でのグルコースの乳酸への変換が、癌で特有に観察される。正常な細胞内pH（約7.2）を維持するために、癌細胞はいくつかの輸送システム（例えば、Na+/H+交換、液胞型H+ ATPアーゼ（V-ATPアーゼ）、Na+/HCO3-交換）を用いて、内部細胞からプロトンを搬出する。これは、ECM分解および血管形成の促進を通じて癌侵入をさらに助長する、微小環境アシドーシスを引き起こす。
【０１５０】
pHAM活性化を試験する前に、腫瘍のマップをまず、インビボで組織pHを画像化するためのMRI緩和時間測定法を用いて測定する（Garcia-Martin et al., Magn. Reason. Med., 2006, 55:309-315；Raghunand et al., Magn. Reason. Med., 2003, 49:249-257）。MRIによる測定後、腫瘍微小環境における非標的指向NIR-pHAMの活性化を評価する。pHAMのサイズが小さいため（直径40〜50nm）、これらは漏出性腫瘍微小脈管構造を通じて腫瘍間質に蓄積する。典型的な実験において、NIR-pHAMナノプローブを尾静脈から注射する。経時的な3D活性化マップおよび動的コントラストをＩVIS Spectrumで測定する。製造者によって提供されるLiving Image (4.0)ソフトウェアを用いてNIR-pHAMナノプローブの空間的および時間的活性化を分析する。さらに、定量的3D蛍光（FLIT4）ツールセットを用いて、光学画像をMRIからのマップと共に記録する。次いで、腫瘍のマップによるpHAM活性化のパターンを比較する。NIR-pHAM活性化特性を検査し、異なるpH転移（すなわち、5.4、6.3、6.8、7.2）を有するナノプローブについて比較する。
【０１５１】
実験は以下を示す：（1）腫瘍微小環境pHとNIR-pHAM活性化との間のそれぞれ密接に相関するpHeおよびpHtの関係；（2）高pH転移（すなわち、6.8または7.2）を有するNIR-pHAMについて、試験したpHAMナノプローブの超pH応答（すなわち、オフ/オン転移のための＜0.25pH単位）のため、これらは酸性腫瘍に対する高感度画像化プローブであり、腫瘍薬物送達のために有用であること；および（3）低pH転移（すなわち、5.4または6.3）を有するNIR-pHAMについて、酸性腫瘍微小環境によるそれらの活性化の欠如により、血管新生バイオマーカーに対する画像化特異性が得られること。
【０１５２】
PEG-PC7A-Cy5.5ナノプローブを試験した。用いたPEG-PC7A-Cy5.5の構造は以下のとおりの式Iの構造を有した。
2019070160.tif 000031
PEG-PC7A-Cy5.5ナノプローブ（pHt＝6.7）を、A549肺腫瘍を有する無胸腺ヌードマウスの尾静脈から静脈内注射した（25mg/kg）。比較群において、α−シアノ-4-ヒドロキシシンナメート、すなわちモノカルボキシレートトランスフェラーゼ1（MCT1）阻害剤をナノプローブ投与の24時間前に注射した。非標的指向PEG-PC7A-Cy5.5ナノプローブからの腫瘍は明らかに、MCT1阻害剤群からのものよりも高い蛍光強度を示した。
【０１５３】
実施例9：VEGFR2を標的とするpHAMの開発
本試験は、内皮細胞の表面上のVEGFR2受容体を特異的に標的指向するためのFabR2'機能付与ミセルの開発を示す。VEGFR2は血管新生腫瘍内皮細胞において過剰発現されるため、RAFL-1 mAbのFab'断片をVEGFR2受容体に対する特異的標的指向のために用いる。RAFL-1 mAbはVEGFR2に高い親和性（15pM）および特異性で結合し（Ran et al., Neoplasia, 2003, 5:297-307）、表面機能付与のためのRAFL-1のFabR2'-SH断片の精製後、FabR2'機能付与リポソームは対照リポソームに比べてマウス内皮細胞における細胞取り込みの＞30倍の増大を示した（Marconescu, PhD. Thesis, UT Southwestern Medical Center, Dallas, 2008）。全mAbに比べて、FabR2'-SHはより小さい標的指向部位（50対150kD）を導入する利点、およびpHAM表面上の結合エピトープの優れた提示（すなわち、全mAbの無作為の配向の代わりにfacing solution）を有する。
【０１５４】
pHAM表面でのリガンド結合のためにチオール-マレイミド化学を用いる。MAL-PEO-b-PRをPEO-b-(PR-r-NIR)と異なるモル比（例えば、20モル％のMAL-PEO-b-PR）で混合する。各pHAMコポリマーについて、次いでその対応するマレイミド末端コポリマーを合成する（図8）。ミセル形成後、FabR2'-SHペプチドをチオール-マレイミド連結によって結合する。アミノ酸分析をさらに用いて、pHAMナノプローブの表面上のペプチド密度を定量する（Khemtong, et al., Cancer Res., 2009, 69:1651-1658）。TEMおよびDLSを用いて粒子のサイズおよび形態におけるリガンド機能付与を調べ、蛍光分光光度法を用いてpHAMのpH応答蛍光特性を検証する。レーザー走査型共焦点顕微鏡検査は、標的指向pHAMの細胞取り込みおよび細胞内活性化の動力学を調べるための主なツールである。
【図１Ａ】
2019070160.tif 000039
【図１Ｂ】
2019070160.tif 000040
【図１Ｃ】
2019070160.tif 000041
【図２】
2019070160.tif 000042
【図３】
2019070160.tif 000043
【図４Ａ】
2019070160.tif 000044
【図４Ｂ】
2019070160.tif 000045
【図４Ｃ】
2019070160.tif 000046
【図５】
2019070160.tif 000047
【図６】
2019070160.tif 000048
【図７】
2019070160.tif 000049
【図８】
2019070160.tif 000050
【図９】
2019070160.tif 000051
【図１０】
2019070160.tif 000052
【図１１】
2019070160.tif 000053
【図１２】
2019070160.tif 000054
【図１３】
2019070160.tif 000055
【図１４】
2019070160.tif 000056
【図１５】
2019070160.tif 000057
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月18日(2019.2.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを含む、ブロックコポリマーであって、
該親水性ポリマーセグメントが、ポリ(エチレンオキシド)（PEO）、ポリ(メタクリレートホスファチジルコリン)（MPC）、およびポリビニルピロリドン（PVP）からなる群より選択されるポリマーを含み、該親水性ポリマーは、100〜130モノマー単位を含み、
該疎水性ポリマーセグメントが以下を含む、
ブロックコポリマー：
2019070160.tif 000058
式中、
R'は-Hまたは-CH3であり、
Rは-NR1R2であり、ここでR1およびR2はアルキル基であり、R1およびR2は同じであるかまたは異なり、R1およびR2は一緒になって5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、または16個の炭素原子を有するか、あるいはR1およびR2は連結して総数5〜16個の炭素原子を含む環を形成し、
nは1〜約10であり、
xは合計で約20〜約200である。
【請求項２】
nが1〜4である、請求項1記載のブロックコポリマー。
【請求項３】
xが合計で約40〜約100である、請求項1または2記載のブロックコポリマー。
【請求項４】
R1およびR2がそれぞれ直鎖アルキルまたは分枝アルキルである、請求項1〜3のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項５】
R1およびR2が連結して環を形成する、請求項1〜3のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項６】
R1およびR2が同じである、請求項1〜5のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項７】
R1およびR2が異なる、請求項1〜5のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項８】
R1およびR2がそれぞれ3〜8個の炭素を有する、請求項1〜7のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項９】
R1およびR2がエチル、プロピル、またはブチルである、請求項1〜3のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項１０】
R1およびR2が一緒になって-(CH2)5-または-(CH2)6-である、請求項1〜3のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項１１】
pH感受性ミセルを形成する、請求項1〜10のいずれか一項記載のブロックコポリマー。
【請求項１２】
請求項1〜11のいずれか一項記載のブロックコポリマーを含むpH感受性ミセルを含む、組成物。
【請求項１３】
前記ミセルが約10〜約200nmのサイズを有する、請求項12記載の組成物。
【請求項１４】
前記ミセル内に封入された薬物をさらに含む、請求項12または13記載の組成物。
【請求項１５】
前記薬物が化学療法剤である、請求項14記載の組成物。
【請求項１６】
前記薬物がドキソルビシン、β-ラパコン、またはパクリタキセルである、請求項15記載の組成物。
【請求項１７】
個体において癌を治療するための、請求項12〜16のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１８】
前記癌が固形腫瘍を含む、請求項17記載の組成物。
【請求項１９】
薬物の初期エンドソームへの送達のための、請求項12〜16のいずれか一項記載の組成物であって、前記ミセルが約5.9〜約6.5のpH転移値を有する、組成物。
【請求項２０】
薬物の後期エンドソームまたはリソソームへの送達のための、請求項12〜16のいずれか一項記載の組成物であって、前記ミセルが約5.0〜約5.5のpH転移値を有する、組成物。