(57)【要約】      （修正有）【課題】霊芝の抽出物に由来するアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害剤、これを利用した食品および医薬品、ならびに該ＡＣＥ阻害剤の製造方法の提供。【解決手段】霊芝(Ganoderma lingzhi)から有機溶媒を主成分とする溶媒で抽出することにより得られる成分を有効成分として含むアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害剤、このＡＣＥ阻害剤を含む食品および医薬品。【選択図】図１
2019150046.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
霊芝(Ganoderma lingzhi)から有機溶媒を含有する溶媒(有機系溶媒)で抽出することにより得られるトリペノイド類を有効成分として含むことを特徴とするＡＣＥ阻害剤。
【請求項２】
前記トリペノイド類が、
（２）ガノデリックアシッドＮ(Ganoderic acid N)、（８）ガノデリックアシッドＡ（Ganoderic acid A）、（９）ガノデリックアシッドＡＭ１（Ganoderic acid AM1）、（１０）ガノデリックアシッドＢ（Ganoderic acid B）、（２３）ガノデリックアシッドＣ１（Ganoderic acid C1）、（２４）ガノデリックアシッドＣ２（Ganoderic acid C2）、（２５）ガノデリックアシッドＣ６（Ganoderic acid C6）、（２６）ガノデリックアシッドＨ（Ganoderic acid H）、（２７）ガノデリックアシッドＫ（Ganoderic acid K）、（２８）ガノデリックアシッドＴＲ（Ganoderic acid TR）、（２９）ガノデリン酸Ａ（Ganoderenic acid A）、（３０）ガノデリン酸Ｃ（Ganoderenic acid C）、（３１）ガノデリン酸Ｄ（Ganoderenic acid D）、（３２）ガノデリン酸Ｆ（Ganoderenic acid F）、（３３）ガノデリン酸Ｈ（Ganoderenic acid H）、からなる群から選択された１種または２種以上の化合物であることを特徴とする、請求項１に記載のＡＣＥ阻害剤。
【請求項３】
（２）ガノデリックアシッドＮ(Ganoderic acid N)、（８）ガノデリックアシッドＡ（Ganoderic acid A）、（９）ガノデリックアシッドＡＭ１（Ganoderic acid AM1）、（１０）ガノデリックアシッドＢ（Ganoderic acid B）、（２３）ガノデリックアシッドＣ１（Ganoderic acid C1）、（２４）ガノデリックアシッドＣ２（Ganoderic acid C2）、（２５）ガノデリックアシッドＣ６（Ganoderic acid C6）、（２６）ガノデリックアシッドＨ（Ganoderic acid H）、（２７）ガノデリックアシッドＫ（Ganoderic acid K）、（２８）ガノデリックアシッドＴＲ（Ganoderic acid TR）、（２９）ガノデリン酸Ａ（Ganoderenic acid A）、（３０）ガノデリン酸Ｃ（Ganoderenic acid C）、（３１）ガノデリン酸Ｄ（Ganoderenic acid D）、（３２）ガノデリン酸Ｆ（Ganoderenic acid F）、（３３）ガノデリン酸Ｈ（Ganoderenic acid H）からなる群から選択された１種または２種以上のトリテルペノイド類を含むＡＣＥ阻害剤。
【請求項４】
前記抽出用の溶媒が、クロロホルム、アルコールまたは含水アルコールであることを特徴とする請求項１〜２のいずれか一項に記載のＡＣＥ阻害剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＣＥ阻害剤を有効成分とする、ＡＣＥに関連する疾患の予防あるいは軽減のための食品(健康補助食品)、化粧料、研究試薬または医薬品。
【請求項６】
前記疾患が、高血圧症、高血圧により引き起こされる動脈硬化に起因する動脈硬化症、脳梗塞（ラグナ梗塞、アテローム血栓性梗塞、脳塞栓）、脳出血、くも膜下出血、心肥大、狭心症、心筋梗塞、腎障害である請求項５に記載の食品(健康補助食品)、研究試薬または医薬品。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＣＥ阻害剤を有効成分とする、苦味料。
【請求項８】
霊芝(Ganoderma lingzhi)から、有機溶媒を含有する溶媒(有機系溶媒)を用いて、ＡＣＥ阻害作用を有する成分を抽出処理する工程を含むことを特徴とする、ＡＣＥ阻害剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、霊芝(Ganoderma lingzhi)、特にその子実体の抽出物を含有するＡＣＥ阻害剤、該ＡＣＥ阻害剤を含む食品および薬剤、並びにそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンギオテンシン変換酵素（ACE）を阻害することは、高血圧の治療として最も主要な治療法の一つである（非特許文献１）、毒蛇の毒にＡＣＥを阻害するペプチドが発見されてから、高血圧症の治療薬に用いる薬の開発に多大な労力がかけられてきた。アンギオテンシンに関する薬市場では、現在、アンギオテンシンＩのＡＣＥによる切断部位を模したカプトプリル等のペプチド類似薬物が多数存在し、市場を独占している。しかしながら、現在利用可能な薬物には薬物の使用に起因する副作用があるため、天然由来のＡＣＥ阻害活性を有する、新規化合物の探索が依然として望まれている。
【０００３】
霊芝の子実体（キノコ）は、真菌に属し、東アジアの国々で最も知られている栄養補助食品であり、健康増進する目的で用いられてきた歴史があり、心疾患の治療および長寿命促進の効能を有していると信じられてきた。この真菌の一般的な学名は、「Ganoderma lucidum(Curtis)P.Karst」である。しかしながら、CaOら（非特許文献２）による最近の形態学および分子系統学の解析によれば、東アジアで商業的に栽培された霊芝は、もともと欧州由来であると説明される正統の「Ganoderma lucidum」から派生した種類とは異なる種類であると報告している。CaOは、東アジアに広がっているその霊芝について「Ganoderma lingzhi Sheng H.Wu, Y.Cao & Y.C. Dai」という名称を提案した。
【０００４】
霊芝は、高血圧治療薬を含む日本および中国の伝統的な種々の薬の中で、その医学的価値ゆえに貴重とされてきた(非特許文献３)。霊芝の粉末が高血圧ラットに対して血圧低下作用を有することが報告されている（非特許文献４）。さらに、ガノデルマ属のキノコの熱水抽出物でもって６ヶ月の間、高血圧患者の治療を行ったところ、高血圧患者の症状が改善されたことも報告されている（非特許文献５）。
【０００５】
もしも、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を阻害できる物質（ＡＣＥ阻害剤）が新たに見出され、アンギオテンシンIからIIへの変換を抑制でき、血圧上昇を抑えることができ、高血圧の疾患治療薬の多様化に寄与することができる。このような事情から、様々なアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤が望まれている。
【０００６】
本発明者らは、霊芝（Ganoderma lingzhi）について、いくつかの新規トリテルペノイドの単離を報告している（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Smith, R. E. T.; Ashiya, M. Nat. Rev. Drug Discov. 2007, 6, 597-8.
【非特許文献２】Cao, Y.; Wu, S.-H.; Dai, Y.-C. Fungal Divers. 2012, 56, 49-62.
【非特許文献３】Wasser, S. In Encyclopedia of Dietary Supplements; 2005; pp. 603-622.
【非特許文献４】Kabir, Y.; Kimura, S.; Tamura, T. Dietary effect of Ganoderma lucidum mushroom on blood pressure and lipid levels in spontaneously hypertensive rats(SHR).J. Nutr. Sci. Vitaminol. (Tokyo).1988,34, 433-438.
【非特許文献５】Katsuo Kanmatsuse, Nagao Kajiwara, Kyoko Hayashi, Shyuji Shimogaichi, Itaru Fukibara, Hideo Ishikawa, T. T. Studies on Ganoderma lucidum. I. Efficacy against Hypertension and Side Effects.Yakugaku Yasshi1985,105, 942-947.
【非特許文献６】Fatmawati, S.; Shimizu, K.; Kondo, R. Fitoterapia 2010, 81, 1033-6.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、様々な抽出方法で霊芝、特に子実体から異なる方法で抽出した抽出物や抽出物に含まれるトリペノイド類についてアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害活性について鋭意研究していたところ、ＡＣＥ阻害活性を有するトリペノイド類が多数存在することなどを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
したがって、本発明は、上記霊芝の抽出物に由来する、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害活性を有するＡＣＥ阻害剤、これを利用した食品、化粧料および医薬品、ならびに該ＡＣＥ阻害剤の製造方法の提供をすることを目的とする。さらには、例えばアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の効率的な阻害に必要な化学構造の特定に資する研究試薬の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明により、以下のＡＣＥ阻害剤等が提供される。
［１］  霊芝(Ganoderma lingzhi)から有機溶媒を含有する溶媒(有機系溶媒)で抽出することにより得られるトリペノイド類を有効成分として含むことを特徴とするＡＣＥ阻害剤。
【００１１】
［２］  前記トリペノイド類が、
（２）ガノデリックアシッドＮ(Ganoderic acid N)、
（８）ガノデリックアシッドＡ（Ganoderic acid A）、
（９）ガノデリックアシッドＡＭ１（Ganoderic acid AM1）、
（１０）ガノデリックアシッドＢ（Ganoderic acid B）、
（２３）ガノデリックアシッドＣ１（Ganoderic acid C1）、
（２４）ガノデリックアシッドＣ２（Ganoderic acid C2）、
（２５）ガノデリックアシッドＣ６（Ganoderic acid C6）、
（２６）ガノデリックアシッドＨ（Ganoderic acid H）、
（２７）ガノデリックアシッドＫ（Ganoderic acid K）、
（２８）ガノデリックアシッドＴＲ（Ganoderic acid TR）、
（２９）ガノデリン酸Ａ（Ganoderenic acid A）、
（３０）ガノデリン酸Ｃ（Ganoderenic acid C）、
（３１）ガノデリン酸Ｄ（Ganoderenic acid D）、
（３２）ガノデリン酸Ｆ（Ganoderenic acid F）、
（３３）ガノデリン酸Ｈ（Ganoderenic acid H）、からなる群から選択された１種または２種以上の化合物であることを特徴とする、［１］に記載のＡＣＥ阻害剤（なお、附番（２）、（８）〜（１０）、（２３）〜（３３）は本発明の説明の便宜上付与した。）。
【００１２】
［３］  （２）ガノデリックアシッドＮ(Ganoderic acid N)、（８）ガノデリックアシッドＡ（Ganoderic acid A）、（９）ガノデリックアシッドＡＭ１（Ganoderic acid AM1）、（１０）ガノデリックアシッドＢ（Ganoderic acid B）、（２３）ガノデリックアシッドＣ１（Ganoderic acid C1）、（２４）ガノデリックアシッドＣ２（Ganoderic acid C2）、（２５）ガノデリックアシッドＣ６（Ganoderic acid C6）、（２６）ガノデリックアシッドＨ（Ganoderic acid H）、（２７）ガノデリックアシッドＫ（Ganoderic acid K）、（２８）ガノデリックアシッドＴＲ（Ganoderic acid TR）、（２９）ガノデリン酸Ａ（Ganoderenic acid A）、（３０）ガノデリン酸Ｃ（Ganoderenic acid C）、（３１）ガノデリン酸Ｄ（Ganoderenic acid D）、（３２）ガノデリン酸Ｆ（Ganoderenic acid F）、（３３）ガノデリン酸Ｈ（Ganoderenic acid H）、からなる群から選択された１種または２種以上のトリテルペノイド類を含むＡＣＥ阻害剤。
【００１３】
［４］  前記抽出用の溶媒が、クロロホルム、アルコールまたは含水アルコールであることを特徴とする［１］〜［２］のいずれかに記載のＡＣＥ阻害剤。
【００１４】
［５］  ［１］〜［４］のいずれかに記載のＡＣＥ阻害剤を有効成分とする、ＡＣＥに関連する疾患の予防あるいは軽減のための食品(健康補助食品)、化粧料、研究試薬または医薬品。
【００１５】
［６］  前記疾患が、高血圧症、高血圧により引き起こされる動脈硬化に起因する動脈硬化症、脳梗塞（ラグナ梗塞、アテローム血栓性梗塞、脳塞栓）、脳出血、くも膜下出血、心肥大、狭心症、心筋梗塞、腎障害である［５］に記載の食品(健康補助食品)、研究試薬または医薬品。
【００１６】
［７］  ［１］〜［４］のいずれかに記載のＡＣＥ阻害剤を有効成分とする、苦味料。
【００１７】
［８］  霊芝(Ganoderma lingzhi)から、有機溶媒を含有する溶媒(有機系溶媒)を用いて、ＡＣＥ阻害作用を有する成分を抽出処理する工程を含むことを特徴とする、ＡＣＥ阻害剤の製造方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、霊芝由来の有効成分を含有し、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を阻害して高血圧症およびこれに関連する疾患の治療に有用なＡＣＥ阻害剤、これを利用した食品、化粧料および医薬品、ならびに該ＡＣＥ阻害剤の効率的な製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、霊芝（Ganoderma lingzhi）由来のトリテルペノイドのＡＣＥ阻害活性に重要な官能基を説明する図である。
【図２】図２（Ａ）は、タンパク質であるアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）と、この酵素の阻害剤として公知のカプトプリル（オレンジ色）とが結合した複合体において、ＡＣＥ由来のタンパク質部分がとる立体構造に対し、さらにガノデリックアシッドＡ（白色＋薄茶色）をドッキングさせるシミュレーションを行った結果のイメージを示す。図２（Ｂ）は、図２（Ａ）においてアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）にカプトプリルを結合させる代わりに、ＡＣＥ阻害剤として公知のリシノプリル（オレンジ色）を結合させた以外は、図２（Ａ）と同様にして複合体を作成し、ガノデリックアシッドＡをドッキングシミュレーションした場合の結果のイメージを示す。図２（Ｃ）は、図２（Ａ）において、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）にカプトプリルを結合させる代わりに、ＡＣＥ阻害剤として公知のエナラプリル（オレンジ色）を結合させた以外は、図２（Ａ）と同様にして複合体を作成し、ガノデリックアシッドＡをドッキングシミュレーションした場合の結果のイメージを示す。この図２（Ａ）〜（Ｃ）から、ガノデリックアシッドＡがＡＣＥの上記公知の化合物(阻害剤)との結合部位のポケットからはみ出ていることがわかる。なお、オレンジ色の化合物の分子は、公知の薬剤（図２（A)ではカプトプリル（オレンジ色）、図２（B)ではリシノプリル（オレンジ色）、図２（C)ではエナラプリル（オレンジ色））を示し、白球部分を有する化合物の分子はガノデリックアシッドＡを示す。また、複数のスポット（緑色）はＡＣＥの活性部位(active site)を示す。
【図３】図３は、本発明に係るトリテルペノイド等のＡＣＥ阻害剤について、同人堂化学研究所社製「ＡＣＥkit-WST」のＡＣＥ活性測定原理を利用して上記ＡＣＥ阻害剤の阻害能を測定する原理を示した図である。
【図４】図４は、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）によりアンギオテンシンＩをアンギオテンシンＩＩに変換する反応系に、異なる濃度のガノデリックアシッドＡ(ACE阻害剤)を添加した場合に起こる酵素反応について、Ｘ軸に阻害剤濃度［Ｉ］（μｇ／ｍＬ）を取り、Ｙ軸に１／ＡＣＥ酵素反応速度ｖ（分(minute)／abs．）を取って、基質（３ＨＢ−ＧＧＧ）の濃度別にＤｉｘｏｎのプロットをしたグラフである。図４のDixonプロットのグラフの形状から、ガノデリックアシッドＡは不拮抗阻害と非競合的阻害との混合の阻害様式（混合型非拮抗阻害）でＡＣＥを阻害していることが分かる。このことから、ガノデリックアシッドＡはＡＣＥの活性部位とは別の部位に働いて酵素の働きを下げることが分かる。ガノデリックアシッドＡは、従来ＡＣＥ阻害剤として知られるカプトプリル等との結合部位が異なるため、(活性部位を奪い合わず、ＡＣＥ阻害剤として)併用可能であることが分かる。
【図５】図５は、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）によりアンギオテンシンＩをアンギオテンシンＩＩに変換する反応系に、異なる濃度のガノデリックアシッドＣ２(ACE阻害剤)を添加した場合に起こる酵素反応について、Ｘ軸に阻害剤濃度［Ｉ］（μｇ／ｍＬ）を取り、Ｙ軸にＡＣＥ反応速度の逆数（１／ｖ（[分(minute)／abs.]）)を取って、基質（３ＨＢ−ＧＧＧ）の濃度別にＤｉｘｏｎのプロットをしたグラフである。この図５では、基質濃度を変化させた場合に、その直線と横軸との交点（−１／Ｋｉ）が一定であることから、ガノデリックアシッドＣ２は、ＡＣＥを非競合的阻害（Non-Competitive inhibition）することが理解できる。すなわち、ガノデリックアシッドＣ２は、ＡＣＥの基質であるアンギオテンシンＩとの間でＡＣＥ活性部位を奪い合わない（競合的阻害ではなく）。このことから、ガノデリックアシッドＣ２はＡＣＥの活性部位とは別の部位に働いて酵素の働きを下げることが分かり、従来ＡＣＥ阻害剤として知られるカプトプリル等と併用可能であることが分かる。また、霊芝由来の成分を必須成分とする、本発明に係るＡＣＥ阻害剤は、古来より和漢薬として利用され、また、米国ＦＤＡ認可も下りている霊芝由来の成分を有効成分として含有しており、その安全性も高いと考えられる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明に係るアンギオテンシン変換酵素（Ａngiotensin converting Enzyme;ACE）の阻害剤は、霊芝(Ganoderma lingzhi)から、有機溶媒を含む溶媒(有機系溶媒)で抽出することにより得られる成分を有効成分として含む。なお、該成分は、前記霊芝から有機系溶媒による抽出を経て調製された成分に限らず、人工的に合成した同一の成分であってもよい。
以下、ＡＣＥ阻害剤とその製法、このＡＣＥ阻害剤に含まれる霊芝トリペノイド化合物とその物性、効果、用途等について説明する。
【００２１】
《ＡＣＥ阻害剤》
（抽出）
抽出素材としての霊芝(Ganoderma lingzhi)は、採取した霊芝をそのまま原料として用いてもよいが、抽出効率等の点からは、好ましくは採取した天然物(霊芝)を乾燥、破砕等の加工処理に供して調製したものを挙げることができる。抽出素材を粉砕する場合、ロール式粉砕機、フードプロセッサー、ボールミル粉砕機、ハンマー式粉砕機等による粉砕が例示できる。
【００２２】
抽出用の有機系溶媒は、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の活性を阻害する作用を有する霊芝中のトリペノイド類等の成分を効率よく抽出する観点から、該溶媒として有機溶媒を１０％以上含有する溶媒が好ましく、有機溶媒を５０％以上含有する溶媒（有機系溶媒）がさらに好ましい。なお、有機系溶媒中に含まれる有機溶媒の量は、溶媒全量に対して、通常１０％以上、さらには３０〜７０％程度であることが望ましい。
【００２３】
該有機系溶媒の例としては、ハロゲン化アルキル（例：クロロホルム等）、アルコール類（例：メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等、Ｃ１〜１０程度の1価の脂肪族アルコール、あるいはエチレングリコールやグリセリンなどの多価アルコール）、炭化水素（例：ｎ−ヘキサンなど、Ｃ１〜１０程度の脂肪族炭化水素）、エーテル（例：ジメチルエーテル、エチルメチルエーテル、ジエチルエーテル等の式「Ｒ1−Ｏ−Ｒ2(Ｒ1,Ｒ2はＣ１〜５程度のアルキル基）」で示される鎖状エーテル；フラン、ジベンゾフラン、テトラヒドロフラン等の脂肪族又は芳香族系の環状エーテル；エステル（例：酢酸エチル等、1価〜多価カルボン酸のＣ１〜５程度のアルキルエステル）の有機溶媒；又は水とこれらの有機溶媒との混合物を挙げることができる。
【００２４】
特に、アルコール類としてメタノール、エタノール、イソプロピルアルコールが好ましいが、抽出成分中に残存しても人体に悪影響が少ない観点からエタノールまたは含水エタノール（含水アルコール）が特に好ましい。含水エタノールとしては、例えば、エタノール濃度が５〜９９.５％の含水エタノールを用いることができる。
【００２５】
抽出処理は、特に制限されないが、例えば、山野より採取した天然物や人工栽培の霊芝を、必要に応じて乾燥または粉砕した後、上記抽出溶媒に浸漬し放置することにより所望の成分を抽出する浸漬法（冷浸法、温浸法）、及びソックスレー抽出器を用いた加熱還流によるソックスレー抽出法等の公知の抽出法を適用することができる。このように抽出された抽出液は、必要に応じて、溶媒を蒸発させて濃縮または乾固してもよく、固体又はその粉末の形態として調製することができる。
【００２６】
抽出温度は、用いられる抽出用溶媒が凍結・固化しない限り、特に制限はなく、有機系溶媒抽出などでは、例えば０℃〜１００℃である。また、抽出時間は、所望の成分（前記トリペノイド類）を抽出できれば特に制限はなく例えば１時間〜３日間である。抽出処理の圧力は特に制限はなく、例えば常圧〜４気圧である。
【００２７】
また、抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相分取液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）などの各種クロマトグラフィーに供して分画操作を繰り返し、抽出成分の含有量及び純度を高めてもよい。
【００２８】
（抽出成分）  霊芝(Ganoderma lingzhi)から、上記有機系溶媒で抽出することにより得られる成分(霊芝有機系溶媒抽出物)として下記トリペノイド類（１）〜（３３）が含まれる。なお、以下の説明では、トリペノイド（２）、（８）〜（１０）、（２３）〜（３３）をまとめて「トリペノイド（２）等」「トリペノイド類（２）等」「ＡＣＥ阻害剤（２）等」ともいう。化合物（１）〜（３３）をまとめて「化合物（１）等」という。
【００２９】
これらのトリテルペノイド（２）等が抽出物に含まれていることは、例えばＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ（島津製作所「ＬＣＭＳ−２０２０」）等を用いたＬＣＭＳ分析(液体クロマトグラフ質量分析)により確認することができる。
【００３０】
本発明者らは、これらのトリペノイド類（１）〜（３３）（化合物（１１）を除く、以下同様。）について、活性の高低はあるものの、アンギオテンシン変換酵素の阻害活性を有することを見出している。したがって、本発明に係るアンギオテンシン変換酵素の阻害剤（ＡＣＥ阻害剤）には、トリペノイド類の化合物（１）〜（３３）からなる群から選択された１種または２種以上を含み、ＡＣＥ阻害活性の観点から、より好ましくは下記に列挙する化合物（２）、（８）〜（１０）、（２３）〜（３３）からなる群から選択された１種または２種以上を含むものが挙げられる。これらの化合物（１）〜（３３）それ自体は、霊芝由来の化合物として市販(販売会社：Chemfaces社（武漢市、湖北省、中国）およびPhytochemicals社（LLC,ニュージャージー州、アメリカ合衆国）など)されているため、これを購入して用いてもよい。なお、ガノデリックアシッドＤ(Ganoderic acid D；化合物（１１））については、アンギオテンシン変換酵素の阻害活性を有する可能性がある。
【００３１】
【化１】
2019150046.tif 000003
（１）ガノデリックアシッドＺ(Ganoderic acid Z)、
【００３２】
【化２】
2019150046.tif 000004
（２）ガノデリックアシッドＮ(Ganoderic acid N)、
【００３３】
【化３】
2019150046.tif 000005
（３）ガノデリックアシッドＳ（Ganoderic acid S）
【００３４】
【化４】
2019150046.tif 000006
（４）ガノデリックアシッドＥ（Ganoderic acid E）
【００３５】
【化５】
2019150046.tif 000007
（５）ガノデリックアシッドＳＺ（Ganoderic acid SZ）、
【００３６】
【化６】
2019150046.tif 000008
（６）ガノデリックアシッドＬＭ２（Ganoderic acid LM2）
【００３７】
【化７】
2019150046.tif 000009
（７）ガノデリックアシッドＤＭ（Ganoderic acid ＤＭ）
【００３８】
【化８】
2019150046.tif 000010
（８）ガノデリックアシッドＡ（Ganoderic acid A）
【００３９】
【化９】
2019150046.tif 000011
（９）ガノデリックアシッドＡＭ１（Ganoderic acid AM1）
【００４０】
【化１０】
2019150046.tif 000012
（１０）ガノデリックアシッドＢ（Ganoderic acid B）
【００４１】
【化１１】
2019150046.tif 000013
（１１）ガノデリックアシッドＤ（Ganoderic acid D）
【００４２】
【化１２】
2019150046.tif 000014
（１２）ガノデリックアシッドＹ（Ganoderic acid Y）
【００４３】
【化１３】
2019150046.tif 000015
（１３）ガノデリックアシッドＴＮ（Ganoderic acid TN）
【００４４】
【化１４】
2019150046.tif 000016
（１４）ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（Ganoderic acid T-Q）
【００４５】
【化１５】
2019150046.tif 000017
（１５）ガノルシド酸Ａ（Ganolucidic acid A）
【００４６】
【化１６】
2019150046.tif 000018
（１６）ガノデルマノントリオール（Ganodermanontriol）
【００４７】
【化１７】
2019150046.tif 000019
（１７）ガノデルマノンジオール（Ganodermanondiol）
【００４８】
【化１８】
2019150046.tif 000020
（１８）ガノデロールＡ（Ganoderol A）
【００４９】
【化１９】
2019150046.tif 000021
（１９）ガノデロールＢ（Ganoderol B）
【００５０】
【化２０】
2019150046.tif 000022
（２０）ガノデリオールＦ（Ganoderiol F）
【００５１】
【化２１】
2019150046.tif 000023
（２１）ルシアルデヒドＡ（Lucialdehyde A）
【００５２】
【化２２】
2019150046.tif 000024
（２２）ルシアルデヒドＢ（Lucialdehyde B）
【００５３】
【化２３】
2019150046.tif 000025
（２３）ガノデリックアシッドＣ１（Ganoderic acid C1）
【００５４】
【化２４】
2019150046.tif 000026
（２４）ガノデリックアシッドＣ２（Ganoderic acid C2）
【００５５】
【化２５】
2019150046.tif 000027
（２５）ガノデリックアシッドＣ６（Ganoderic acid C6）
【００５６】
【化２６】
2019150046.tif 000028
（２６）ガノデリックアシッドＨ（Ganoderic acid H）
【００５７】
【化２７】
2019150046.tif 000029
（２７）ガノデリックアシッドＫ（Ganoderic acid K）
【００５８】
【化２８】
2019150046.tif 000030
（２８）ガノデリックアシッドＴＲ（Ganoderic acid TR）
【００５９】
【化２９】
2019150046.tif 000031
（２９）ガノデリン酸Ａ（Ganoderenic acid A）
【００６０】
【化３０】
2019150046.tif 000032
（３０）ガノデリン酸Ｃ（Ganoderenic acid C）
【００６１】
【化３１】
2019150046.tif 000033
（３１）ガノデリン酸Ｄ（Ganoderenic acid D）
【００６２】
【化３２】
2019150046.tif 000034
（３２）ガノデリン酸Ｆ（Ganoderenic acid F）
【００６３】
【化３３】
2019150046.tif 000035
（３３）ガノデリン酸Ｈ（Ganoderenic acid H）
【００６４】
（塩、エステル）
本発明においては、抽出した化合物（１）〜（３３）をアルコールと反応させてエステル化したり、または塩基と反応させて塩を形成しても良い。これら化合物（１）等のエステルとして、メチルエステル等、炭素数１〜１１を有する直鎖または分岐状のアルキルエステルを挙げることができる。これら化合物（１）等の塩としては、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩；アンモニウム塩等を挙げることができる。
【００６５】
（成分濃度）
当該ＡＣＥ阻害剤に含まれる有効成分（化合物（１）等のいずれか１種または２種以上の合計）の濃度は、ＡＣＥに対して結合し、ＡＣＥ活性を阻害する作用を発揮することを限度として特に制限されず、例えば、１０〜５００μｇ／ｍＬとなるように、ＡＣＥ阻害剤１００重量％中、剤型、用法、用量に合わせて０．１〜１００重量％の範囲から適宜設定することができる。
【００６６】
（ＡＣＥ阻害剤の評価）
従来、カプトプリル、リシノプリル、エナラプリラート（エナラプリル）等のＡＣＥ阻害剤が存在するが、カプトプリルは下記化学構造（Ａ１）、リシノプリルは下記化学構造（Ａ２）、エナラプリラート（エナラプリル）は下記化学構造（Ａ３）を有する。また、アンギオテンシンＩは下記化学構造（Ａ４）を有する。
【００６７】
【化３４】
2019150046.tif 000036
【００６８】
【化３５】
2019150046.tif 000037
【００６９】
【化３６】
2019150046.tif 000038
（アンギオテンシンＩ）
【００７０】
【化３７】
2019150046.tif 000039
【００７１】
上述した従来公知のＡＣＥ阻害剤であるカプトプリル、リシノプリル、エナラプリラート（エナラプリル）は、本発明に係るＡＣＥ阻害剤の有効成分である、上記化合物（２）等より強力なＡＣＥ阻害作用を有している。また、ヘビ毒から見つかったペプチドのうち-Phe-Ala-Proといった配列がＡＣＥの基質になることを考えると、上記公知の阻害剤については少なくともプロリン：
【００７２】
【化３８】
2019150046.tif 000040
のアミン部位（ピロリジン部位）がＡＣＥに認識されていると考えられ、実際に基質結合部位にプロリンが結合する。このプロリンの環状アミン部位は、ＡＣＥの本来の基質であるアンギオテンシンＩに存在するが、上述したステロイド骨格をベースとするトリテルペノイド類（化合物（１）〜（３３））にはピロリジン部位は存在しない。したがって、化合物（２）等はＡＣＥの基質と異なるふるまいをしてＡＣＥを阻害することが分かり、少なくとも拮抗阻害の様式ではないと考えられる。
【００７３】
また、上記化合物（１）〜（３３）は、ステロイド骨格を基本骨格とする分子であり、分子サイズが公知のアンギオテンシン変換酵素の阻害剤に比べて大きく、構造活性相関解析（Streucute-activity relationship analysis；ＳＡＲ）のドッキングスコアがプラスであること（後述）から、アンギオテンシン変換酵素の結合ポケットに入り込む際に衝突を起こしていると考えられる。なお、ドッキングスコアとは、ある化合物を酵素等の結合部位や活性中心にあるポケットにドッキングさせるシミュレーションを行った場合に、両分子間での衝突エネルギーを示すものであり、ドッキングスコアにより両分子の衝突の有無の判定が可能である。また、後述するように、ガノデリックアシッドＡについては非競合的阻害(Non-competitive inhibition)と不拮抗阻害(Uncomptitive inhibition)との混合型の様式を示し、ガノデリックアシッドＣ２については非競合的阻害(Non-competitive inhibition)を示した（図４，図５参照）。
【００７４】
これらの事実から、化合物（１）〜（３３）のトリテルペノイド類は、カプトプリル等の公知のアンギオテンシン変換酵素の阻害剤とは異なり、活性部位とは異なるＡＣＥの部位に結合してＡＣＥの活性を阻害する非拮抗阻害（Non-competitive inhibition）か、ＡＣＥ−基質の複合体に対して結合してＡＣＥを阻害する不拮抗阻害（Uncomptitive inhibition）か、またはそれらの混合型の阻害をすると考えられる。
【００７５】
このことから、上記化合物（１）〜（３３）は、上述の公知のカプトプリル、リシノプリル、エナラプリラート（エナラプリル）等がＡＣＥと既に結合している状態であってもＡＣＥを阻害する効果を発揮する点で非常に有用である。また、本発明のＡＣＥ阻害剤であるトリテルペノイド類が非拮抗阻害または非競合的阻害によりＡＣＥを阻害することから、本発明に係るＡＣＥ阻害剤は、カプトプリル等のアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害剤と併用できる可能性があり、この点でも有用である。
【００７６】
また、化合物（１）〜（３３）は、エナラプリル等と異なる機構でＡＣＥを阻害する可能性が高く、化合物（１）〜（３３）とＡＣＥとの結合や該結合によるＡＣＥ阻害の機構を解明するための研究試薬としても非常に有用である。
【００７７】
また、ＡＣＥは周知のようにブラジキニンを代謝するキニナーゼIIでもあるため、ＡＣＥ活性が阻害されるとブラジキニンが蓄積して空咳の原因となる。しかし、霊芝について、これまでの服用経験から副作用（空咳等）が知られてもいないし報告もないことから、霊芝由来のトリテルペノイド類（化合物）についても副作用は生じにくいと考えられる。また、霊芝由来のトリテルペノイド類がＡＣＥの活性を非拮抗阻害（Non-competitive inhibition）または非競合的阻害（Non-competitive inhibition）することから、ＡＣＥの活性部位が塞がれずアンギオテンシンＩからIIへの変換が緩やかに行われる。したがって、本発明に係るACE阻害薬の使用によってブラジキニンが気道などにおいて蓄積しにくく，空咳などの副作用を惹起しにくくなると考えられる。
【００７８】
さらに、霊芝（Ganoderma lingzhi）由来のトリテルペノイド類の化合物（２）等は、上記公知のＡＣＥ阻害剤のもつ高血圧抑制効果よりは弱いものの、上述したカプトプリル等の合成薬剤に比べて入手しやすく安価なＡＣＥ阻害剤である。また、安全性については、古来よりこれら成分を含む霊芝の熱湯抽出物は漢方薬として用いられ、ＦＤＡ等でも認可されており、安全性の点でも有利であるなどという利点もある。
【００７９】
（阻害率）
以下、本発明に係るＡＣＥ阻害剤の阻害率について説明する。上述したようにトリテルペノイドの化合物（２）等は、従来公知で有名なカプトプリル等のＡＣＥ阻害剤による拮抗阻害とは異なり、不拮抗阻害、非競合的阻害またはこれらの混合型の阻害によりＡＣＥを阻害する。したがって、トリテルペノイドの化合物（２）等を有効成分とする本発明に係るＡＣＥ阻害剤は、従来公知のカプトプリル等のＡＣＥ阻害剤による拮抗阻害の阻害率と異なり、不拮抗阻害、非競合的阻害またはこれらの混合型の阻害における阻害率という位置付けとなる。
【００８０】
（阻害率の測定方法）
本発明に係るＡＣＥ阻害剤のＡＣＥ阻害率は、従来公知の方法、例えば、ドージンニュース（http://www.dojindo.co.jp/letterj/124/commercial/04.html）等に記載の方法により測定することができる。
【００８１】
一般にＡＣＥの阻害率はＡＣＥ活性を測定する方法を利用して調べることができる。具体的には、ＡＣＥ阻害剤が全く存在しない条件下と所定量存在する条件下でそれぞれＡＣＥ活性を測定した後、ＡＣＥ阻害剤の添加により低下したＡＣＥ活性の量を本来のＡＣＥ活性の量に対する割合として表すことで、該割合を阻害率（％）として得ることができる。
【００８２】
ＡＣＥ活性の測定方法自体については、例えば、アンジオテンシン変換酵素と合成基質（Ｈippuryl-His-Leu）とを含む反応液に、合成基質（Ｈippuryl-His-Leu）からＡＣＥの作用により切り出されてくる馬尿酸を酢酸エチルで溶媒抽出後、濃縮乾固し、再溶解して２２８ｎｍの吸光度を測定し、該吸光度からＡＣＥ活性を算出する方法を用いてもよい。
【００８３】
この方法を用いる場合、阻害剤が存在しない反応系の例として、１ｍＭ基質（Ｈippuryl-His-Leu）、３００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．３）を挙げることができる。また、阻害剤が存在する反応系の例として、上記反応系にさらに０．１〜１０００μＭの本発明に係るＡＣＥ阻害剤（トリテルペノイド類（２）等を含む薬剤）や公知のＡＣＥ阻害剤を加えた反応系を挙げることができる。各反応系で測定したＡＣＥ活性の値からＡＣＥ阻害率を算出することができる。
【００８４】
しかしながら、このＡＣＥ阻害率の測定方法は、有機溶媒である酢酸エチルを用いる上に、操作が煩雑であり測定誤差も生じやすい方法であることから、他の方法を用いてもよい。
【００８５】
例えば、「ＡＣＥ kit−ＷＳＴ」（同人堂化学研究所社）を用いた測定方法を例示することができる（図３参照）。この方法は、図３に示すように、３−ヒドロキシブチリル−グリシル−グリシル−グリシン（３ＨＢ−ＧＧＧ；３−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ−ｇｌｙｃｙｌ−ｇｌｙｃｙｌ−ｇｌｙｃｉｎｅ）をＡＣＥの基質として用いる方法であり、３ＨＢ−ＧＧＧは、ＡＣＥの存在下でグリシルグリシン（ＧＧ）と３−ヒドロキシブチリルグリシン（3-Hydroxybutyrylglycine(3HB-G)）とに分解される。次に、この３−ヒドロキシブチリルグリシン（３ＨＢ−Ｇ）は、アミノシクラーゼにより３−ヒドロキシ酪酸（3-Hydroxybutyric acid；３ＨＢ）とグリシン（Ｇ）とに分解される。さらに、この３−ヒドロキシ酪酸（3-Hydroxybutyric acid；３ＨＢ）は、3-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（D-3-Hydroxybutyrate dehydrogenase）によりアセト酢酸（Acetoacetic acid；AA)に変換される。この変換の際にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）が産生される。この産生されるＮＡＤＨにより、酸化還元する化合物（mediator）を還元し、この化合物により指示薬を発色させて、発色体の波長光を吸光度計により測定し、ＡＣＥ阻害率を算出する。この算出は、サンプル(ＡＣＥ阻害剤)で処理したウェル（As）の吸光度と、ＡＣＥ阻害剤を全く含まない反応液（ポジティブコントロール）の吸光度（Ac）と、ＡＣＥを含まないブランクのウェル（Ab）の吸光度とを比較することにより、阻害率を下記に示した式（I）で算出することができる。
阻害率（％）＝［（Ac−As）／（Ac−Ab）］×１００・・・（I）
【００８６】
［測定手順の具体例］
ＡＣＥ阻害活性の測定手順の具体例として、以下の１'）〜８'）が挙げられる。
１'）霊芝（Ganoderma lingzhi）由来のトリテルペノイド（化合物（１）等）を０μｇ／ｍＬで含むサンプル溶液Ｄ１、６２．５μｇ／ｍＬで含むサンプル溶液Ｄ２、１２５μｇ／ｍＬで含むサンプル溶液Ｄ３、２５０μｇ／ｍＬで含むサンプル溶液Ｄ４をそれぞれ調製する。このサンプル溶液Ｄ１〜Ｄ４を９６ウェルプレートの第１〜４番目のウェルにそれぞれ２０μＬ加える。また、第５番目と第６番目の各ウェルに純水を２０μＬ入れる（blank1,blank2)。さらに第１〜６番目のウェルにそれぞれ１２０μＬの純水を加える。
【００８７】
２'）上記第１〜５番目の各ウェルに対して、８５μＬの基質溶液〔１２．５ｍＭ Hippuryl-His-Leu(シグマ製)、100mMホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）、１ＭＮａＣｌ〕を加える。この混合液を室温で５分〜１０分間静置する。１５μLの水／エタノール混合液を前記混合液に添加し、エタノールの終濃度を全てのウェルで５％とする。
３'）blank2用の第６番目のウェルに純水を１００μＬ加える。
４'）第１〜６番目の各ウェルに１０μＬの０．３Ｕ／ｍＬのＡＣＥ（ウサギ肺由来、シグマ製）、５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）を加える。
５'）３７℃で６０分間インキュベート（静置）する。
６'）２５０μＬの１Ｎ塩酸を加えて反応を停止する。
７'）１．５ｍＬの酢酸エチルを加えて攪拌し、遠心分離後、１ｍＬの酢酸エチル層を遠心濃縮乾固し、１ｍＬの超純水に溶解して、２２８ｎｍの吸光度を測定する。ＡＣＥ阻害率は、次式で表される。
８'）ＡＣＥ阻害活性値（阻害率％）を下記式により求める.
（ＡＣＥ阻害活性値（阻害率〔％〕））＝〔（Abs.blank1−Abs.sample）／（Abs.blank1−Abs. blank2）×１００〔％〕
【００８８】
（ＩＣ50）
ＡＣＥ阻害活性は、ＡＣＥの阻害剤が全く存在しない場合に最終産物として生成される発色体の量を１００％とした場合に、該発色体の量を５０％とするのに必要なＡＣＥ阻害剤の量(すなわち、ＩＣ50)として評価することができる。
【００８９】
例えば、上述したＡＣＥ阻害活性の測定において、同一のＡＣＥ阻害剤について終濃度の異なるサンプル（ＡＣＥ阻害剤）を複数用意（例；１０００μｇ／ｍＬ、７５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬ、６２．５μｇ／ｍＬのＡＣＥ阻害剤（トリテルペノイド等）を用意）してそれぞれＡＣＥ阻害率を測定し、これらのサンプル（ＡＣＥ阻害剤）の濃度とＡＣＥ阻害率との関係から近似曲線を得ることでＡＣＥの活性を５０％阻害する濃度(ＩＣ50)を算出することができる。
【００９０】
以下のように、不拮抗阻害または非競合的阻害によるＡＣＥの阻害率（ＩＣ50）の観点から、ＡＣＥ阻害剤として特に好ましいものは、下記式（ａ）および(ｂ)中、附番（２）、（８）〜（１０）、（２３）〜（３３）に示すように、第１のグループ（ａ）：
【００９１】
【化３９】
2019150046.tif 000041
【００９２】
【表１】
2019150046.tif 000042
に含まれるものを中心として、第２のグループ（ｂ）に含まれるもの：
【００９３】
【化４０】
2019150046.tif 000043
【００９４】
【表２】
2019150046.tif 000044
が挙げられる。
【００９５】
第１のグループ（ａ）に含まれ、本発明に係るＡＣＥ阻害剤の有効成分として特に有用なものとしては、（２）ガノデリックアシッドＮ(Ganoderic acid N)、（８）ガノデリックアシッドＡ（Ganoderic acid A）、（９）ガノデリックアシッドＡＭ１（Ganoderic acid AM1）、（１０）ガノデリックアシッドＢ（Ganoderic acid B）、（２３）ガノデリックアシッドＣ１（Ganoderic acid C1）、（２４）ガノデリックアシッドＣ２（Ganoderic acid C2）、（２５）ガノデリックアシッドＣ６（Ganoderic acid C6）、（２６）ガノデリックアシッドＨ（Ganoderic acid H）、（２７）ガノデリックアシッドＫ（Ganoderic acid K）、（２９）ガノデリン酸Ａ（Ganoderenic acid A）、（３０）ガノデリン酸Ｃ（Ganoderenic acid C）、（３１）ガノデリン酸Ｄ（Ganoderenic acid D）、（３２）ガノデリン酸Ｆ（Ganoderenic acid F）、（３３）ガノデリン酸Ｈ（Ganoderenic acid H）がＡＣＥ阻害剤としての効果が特に優れている点で好ましい。
【００９６】
また第２のグループ（ｂ）に含まれるものとしては、（２８）ガノデリックアシッドＴＲ（Ganoderic acid TR）がＡＣＥ阻害剤としての効果が特に優れている点で好ましい。  したがって、本発明に係るＡＣＥ阻害剤として、好ましくは、化合物（２）,（８）〜（１０）、（２３）〜（３３）のいずれか１種または２種以上を含有するものが挙げられる。本発明に係るＡＣＥ阻害剤として、さらに好ましくは、ＩＣ50が２００μｇ／ｍＬ未満となる化合物（８）、（９）、（２４）、（２８）および（２９）のいずれか１種または２種以上を含有するものが挙げられる。
【００９７】
なお、第３のグループ（ｃ）に含まれるもの：
【００９８】
【化４１】
2019150046.tif 000045
【００９９】
【表３】
2019150046.tif 000046
は、上記の通りである。
【０１００】
（第１のグループ(a)）
霊芝由来のトリテルペノイド類としては、上記式（ａ）、（ｂ）の他に（ｃ）で示すようなＡＣＥ阻害活性に影響を与える特定の構造を有しているか否かにより、上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含めた３つのグループに分けることができる。
【０１０１】
式（ａ）に示すように、第１のグループ（ａ）は、テトラサイクリック環の第８番目と第９番目の炭素の間に二重結合（Δ9,8）を有し、分岐鎖がカルボキシル基を有するものである。ＡＣＥ阻害活性が高い（ＩＣ50≦５００μｇ／ｍＬ、好ましくは１００μｇ／ｍＬ≦ＩＣ50≦５００μｇ／ｍＬ）のトリテルペノイド類のほとんどがこの第１のグループ（ａ）に属する。
【０１０２】
（第２グループ）
上記式（ｂ）に示すように、第２のグループ（ｂ）は、テトラサイクリック環の第７番目と第８番目の炭素、および第９番目と第１１番目の炭素の間に二重結合（Δ7,8、Δ9,11）を有し、分岐鎖がカルボキシル基を有するものである。ＡＣＥ阻害活性が高い（ＩＣ50≦５００μｇ／ｍＬ、好ましくは１００μｇ／ｍＬ≦ＩＣ50≦５００μｇ／ｍＬ、より好ましくは１６８μｇ／ｍＬ≦ＩＣ50≦５００μｇ／ｍＬ）、ごく一部のトリテルペノイド類（例：（２８）ガノデリックアシッドＴＲ（Ganoderic acid TR））がこの第２のグループに属する。
【０１０３】
（第３グループ）
上記式（ｃ）に示すように、第３のグループ（ｃ）は、テトラサイクリック環の第７番目と第８番目の炭素、および第９番目と第１１番目の炭素の間に二重結合（Δ7,8、Δ9,11）を有し、分岐鎖がカルボキシル基を有しないものである。ＡＣＥ阻害活性がそれほど高くない（ＩＣ50＞５００μｇ／ｍＬの）トリテルペノイド類の殆どがこの第３のグループ（ｃ）に属する。第３グループについては、第１，２グループとは異なり、骨格構造中にカルボキシル基を有していないことから、高いＡＣＥ阻害活性（１００μｇ／ｍＬ≦ＩＣ50≦５００μｇ／ｍＬ）を有するためには、少なくとも骨格構造中にカルボキシル基が必要と考えられる。
【０１０４】
（ドッキングシミュレーション）
本発明者らは、ＡＣＥと、上記式（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で示され霊芝中に含まれる化合物とのドッキングシミュレーションを「CLC Drug Discovery Workbench」（CLC Bio, Aarhus, Denmark社製）により行った。
【０１０５】
この結果、各化合物とアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）とのドッキングスコアと、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の活性部位を構成する半径１３オングストロームの球状空間に化合物（１）〜（３３）をドッキングさせた場合に衝突があるか否かを示すドッキングスコアが、ほぼ全てのトリテルペノイドにおいてプラスとなることを見出した（上記表１〜表３参照）。なお、ドッキングスコアは、０を超えて数値の値が高いほど、ＡＣＥの活性中心に阻害剤の分子が入り込めずにＡＣＥとの衝突が生じていることを意味する。
【０１０６】
したがって、上述したように、化合物（１）〜（３３）を有効成分とする本発明に係るＡＣＥ阻害剤が、公知のＡＣＥ阻害剤（カプトプリル等）とはその作用機構・部位が異なり、不拮抗的阻害（Uncompetitive inhibition）または非競争的阻害（Non-competitive inhibition）によりＡＣＥを阻害していることを示している。ドッキングスコアは、ＡＣＥ阻害剤が不拮抗的阻害（Uncompetitive inhibition）または非競争的阻害（Non-competitive inhibition）によりＡＣＥを阻害している指標となる。
【０１０７】
（ＡＣＥ阻害剤の細胞送達）
アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）は、生理的には,肺の血管内皮細胞によって産生・放出され、血圧調節に関与している酵素である。したがって、この肺の血管内皮細胞に特異的にＡＣＥ阻害剤を送達することができれば、より効率的にＡＣＥ阻害を引き起こすことができる。例えば、ＣＤ３１等は細胞表面に存在するタンパク質で、血管内皮細胞であることを示す細胞マーカーであるので、これを利用して本発明に係るＡＣＥ阻害剤を血管内皮細胞に特異的に送達してもよい。
【０１０８】
具体的には、上記化合物（１）〜（３３）の少なくともいずれか１種、好ましくは化合物（２）、（８）〜（１０）、（２３）〜（３３）の少なくともいずれか１種に対する抗体(Ａ)を作製し、抗原であるＣＤ３１の抗体(Ｂ)を作製し、各化合物（２）等と上記抗体との複合体（以下「抗体薬物複合体」という）を形成し、これを本発明に係るＡＣＥ阻害剤を含むＤＤＳ製剤（ドラッグデリバリーシステムを利用して特定の細胞にのみ所定の薬剤を送達するように構成した薬剤）として用いる例が考えられる。上記抗体をポリマー化してターゲットに対する結合力を上げても良い。
【０１０９】
ここで、抗体（Ａ）は、各化合物（２）等を特異的に保持する機能、抗体（Ｂ）は、特定の細胞（血管上皮細胞等）のみに発現している特定のタンパク質（ＣＤ３１）に特異的に結合する機能を有し、抗体（Ａ），（Ｂ）の複合体は、これら双方の機能を有するため、化合物（２）等を特定の細胞（腫瘍細胞等）に特異的に送達させることができる。
【０１１０】
この場合、各化合物（２）等と上記抗体との間は、選択的に切断可能なリンカー（例えば特定のプロテアーゼで選択的に切断可能なタンパク質配列を含むシアトルジェネティクス社等のリンカーなど）で連結される。この抗体薬物複合体は血中では安定であるので、ＣＤ３１抗原が発現した血管上皮細胞に選択的に作用し、血管上皮細胞内に取り込まれた後、該細胞由来のタンパク質分解酵素によりリンカーが切断されて各化合物（２）等を放出させることができる。その結果、各化合物（２）等が特定の細胞に送達されて、該細胞（血管上皮細胞等）において特異的にＡＣＥの阻害を起こすこととなる。
【０１１１】
《ＡＣＥ阻害剤の用途》
本発明に係るＡＣＥ阻害剤は、食品（サプリメント、食品添加物等）、化粧料（ミスト等）、医薬品、研究試薬等として用いることができる。これらは、上記の有機溶媒系抽出物、好ましくはトリペノイド化合物（１）〜（３３）のいずれか１種または２種以上、より好ましくは化合物（２）等のいずれか１種または２種以上を含有しているものである。
【０１１２】
〔食品〕
本発明に係る食品は、霊芝の溶媒（例:クロロホルム,エタノール）抽出物に高濃度で含まれるＡＣＥ阻害剤としての上記有機溶媒系抽出物、好ましくは有効成分の化合物（１）〜（３３）のいずれか１種または２種以上、より好ましくは化合物（２）等のいずれか１種または２種以上を含有するものである。
【０１１３】
ＡＣＥにより生成されるアンギオテンシンＩＩは、心臓の収縮力を高め、細動脈を収縮させることで血圧を上昇させる。したがって、本発明に係るＡＣＥ阻害剤を下記所定量含む食品によれば、血圧上昇を抑えることができる。これにより、高血圧により引き起こされる動脈硬化に起因する各種の疾患（動脈硬化症、脳梗塞（ラグナ梗塞、アテローム血栓性梗塞、脳塞栓）、脳出血、くも膜下出血、心肥大、狭心症、心筋梗塞、腎障害など）の治療、予防、進行抑制あるいは軽減させることができる。
【０１１４】
カプトプリル等の公知のＡＣＥ阻害剤は競合的阻害の様式でＡＣＥを阻害するが、本発明に係るＡＣＥ阻害剤は不拮抗阻害または非競合的阻害、或いはこれらの混合型の様式でＡＣＥを阻害することから、例えば、本発明に係るＡＣＥ阻害剤を食品に添加して摂取しつつ、上述した公知のＡＣＥ阻害剤も併服することができるという優れた利点を有する。
【０１１５】
（食品中のトリテルペノイド濃度）
公知のＡＣＥ阻害剤のうち、例えばカプトプリル（分子量：２１７．２９ｇ／ｍol）のＩＣ50値は２３ｎＭ（約５μｇ／Ｌ）である。そのため、カプトプリル等は非常に強力なＡＣＥ阻害活性を示す。これに対して、トリテルペノイド類によりＡＣＥを阻害する場合、そのＩＣ50値は約２００μＭ（約１００ｍｇ／Ｌ）〜９５０μＭ（５００ｍｇ／Ｌ）の範囲であり、カプトプリル等と比較してＡＣＥ阻害効果が緩やかである。このことから、上述したトリテルペノイド類を食品添加物やサプリメントに血圧降下作用の有効成分として含有させる場合に成分量を安全な濃度範囲で調節しやすく、食品添加物等としてＡＣＥ阻害効果を安全に得やすい観点から好ましい。また、カプトプリルが０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日で経口投与される例があることを考慮すると、同等の作用を得るためには、例えばトリテルペノイド（例；ガノデリックアシッドＡ）を約２ｍｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ体重／日で経口投与することが考えられるが、それより低濃度、例えば０．１ｍｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度範囲となるように調節して、食品（１日の食量分）に添加することで高血圧の予防、軽減等の効果を得るようにしてもよい。
【０１１６】
本発明に係る食品の剤型として、霊芝から上記有機系溶媒で抽出した抽出物、より好ましくは化合物（１）〜（３３）のうちのいずれか１種または２種以上、特に好ましくは（２）等のうちのいずれか１種または２種以上をそのまま食品として調製したものを挙げることができ、また、前記食品の形態として、他の食品に添加したもの、あるいは、カプセル、錠剤等、食品または健康食品に通常用いられる任意の形態を挙げることができる。具体的には、上記化合物（１）〜（３３）のいずれか１種または２種以上を含む、ゼリー（スティック状）やドリンク剤とする例が挙げられる。
【０１１７】
本発明に係るＡＣＥ阻害剤を食品中に配合してヒトやその他動物が経口摂取（経口投与）する場合には、食品中にＡＣＥ阻害剤と共に適宜添加可能な成分として、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料などを挙げることができる。その場合、本発明に係るＡＣＥ阻害剤を食品およびこれら任意成分と混合し、用途に応じて、その剤型を粉末、顆粒、錠剤等の形に成形することができる。さらには、ＡＣＥ阻害剤を食品原料中に混合して食品を調製し、機能性食品として製品化することができる。
【０１１８】
本発明に係る食品では、上記有機系溶媒抽出物、好ましくは化合物（１）〜（３３）のいずれか１種または２種以上、より好ましくは化合物（２）等のいずれか１種または２種以上の合計が、血中濃度で０．１〜１００μＭとなるように製造し、本発明に係るＡＣＥ阻害剤入り食品を摂取することが好ましい。例えば、成人（体重６０ｋｇ）に対して、化合物（２）等のいずれか１種以上または２種以上の上記抽出物を１ｍｇ〜１０００ｍg／日の態様で摂取する例が挙げられる。例えば、上記ドリンク剤の場合、上記有機溶媒系抽出物を１００〜３００ｍｇ／３０ｃｃで含有するドリンク剤が挙げられる。
【０１１９】
ここで、カプトプリルをヒトに投与する場合、血中濃度が１．７２ｎｍｏｌ／ｍＬ（カプトプリルのＩＣ50の約１／１３倍）となるように投与していることから、これに倣って、化合物（２）等の何れか１種または２種以上の食品中の合計の含有量を調節しても良く、この場合、化合物（２）等の中で最もＡＣＥ阻害能が高いガノデリックアシッドＡを基準にして調節することが望ましい。具体的には、化合物（２）等の血中濃度がガノデリックアシッドＡのＩＣ50値の１／１３０倍（１．５４μＭ、０．７７μｇ／ｍＬ）以上〜該ＩＣ50の１／１３倍（１５．４μＭ、７．７μｇ／ｍＬ）以下となるように化合物（２）等のいずれか１種以上を食品中の合計量を調節する例が挙げられる。
【０１２０】
（サプリメント）
本発明に係るＡＣＥ阻害剤はサプリメントに用いることができる。サプリメントとする場合は、例えば、好ましくは化合物（１）〜（３３）のいずれか１種または２種以上、より好ましくは化合物（２）等のいずれか１種または２種以上を原料とするか、または霊芝から上記有機系溶媒で抽出した抽出物を原料とし、公知の賦形剤を用いて常法により顆粒状・粉末状・ゲル状・カプセル状・ペースト状または錠剤にしたものをサプリメントとして用いることができる。このうち、ペースト状にする場合、本発明に係るＡＣＥ阻害剤をサイクロデキストリンに内包させても良い。また、上記原料には、他のトリテルペノイドを任意に含有してもよい。
【０１２１】
サプリメント中の有機系溶媒抽出物の含有量、霊芝由来のトリペノイドである化合物（１）〜（３３）のいずれか１種または２種以上の含有量、あるいは化合物（２）等のいずれか１種または２種以上の合計の含有量は特に制限はないが、霊芝１００ｇ中には２００ｍｇ程度ガノデリン酸が含まれ、通常１回の摂取で霊芝２５〜３０ｇを用いることから、一般的には１回の摂取でガノデリン酸を５０ｍｇ〜６０ｍｇを体内に取り込んでいると考えられる。そのため、この１回の摂取量を基準にしてサプリメント中の化合物（２）等の何れか１種以上の合計量を調節してもよい。また、この合計量は上記食品と同様に調節してもよい。この場合、サプリメント中の化合物（２）等の何れか１種以上の合計量を、血中濃度がガノデリックアシッドＡのＩＣ50の１／１３０倍（１．５４μＭ、０．７７μｇ／ｍＬ）〜ＩＣ50の１／１３倍（１５．４μＭ、７．７μｇ／ｍＬ）以下となるように含有させてサプリメント（１回分）とする例が挙げられる。
【０１２２】
本発明に係る上記サプリメントによれば、上記効能（ＡＣＥ阻害に基づく高血圧により引き起こされる動脈硬化に起因する各種の疾患（動脈硬化症、脳梗塞（ラグナ梗塞、アテローム血栓性梗塞、脳塞栓）、脳出血、くも膜下出血、心肥大、狭心症、心筋梗塞、腎障害など）の予防や軽減を期待することができる。
【０１２３】
（食品添加物）
有機系溶媒抽出物、化合物（１）〜（３３）、あるいは化合物（２）等は、強い苦味を呈することから、食品添加物（苦味料）として苦味が許容される清涼飲料水、酒精飲料等に用いることができる。有機系溶媒抽出物、化合物（１）〜（３３）、あるいは化合物（２）等は、基本的にセスキテルペン等の公知の苦味料と同様に取り扱うことが可能である。逆に、これらの苦味を抑えて用いることも可能であり、その場合は、苦味マスキング剤（花王「ベネコート  ＢＭＩ−４０」等）により苦味をマスキングすることができる。
【０１２４】
有機系溶媒抽出物、化合物（１）〜（３３）、あるいは化合物（２）等を上記食品添加物として用いる場合、食品添加物として安全性の点で許可されている、一価アルコール(エタノールなど)、多価アルコール（例：エチレングリコール、グリセリンなど）、動植物油(例：グリセリンのモノ、ジ、トリ-脂肪酸エステルに代表される多価アルコールの脂肪酸エステル等)などの公知の溶媒、公知の界面活性剤または公知の乳化剤｛例：シュガーエステル、ソルビタン脂肪酸エステル（ソルビタンエステル),プロピレングリコール脂肪酸エステル(PGエステル)、レシチン）｝などを用いて、有機系溶媒抽出物、化合物（１）〜（３３）、あるいは化合物（２）等を水溶性または油溶性にして用いてもよく、水・天然ガム質および多糖類などの高分子物質とともに常用の溶剤または乳化剤を用いて乳化して用いてもよい。この処理により水溶性または油溶性とした有機系溶媒抽出物、化合物（１）〜（３３）、あるいは化合物（２）等を油性食品（マヨネーズ等）、水性食品（清涼飲料等）に含めても良い。食品添加物中の有機系溶媒抽出物、化合物（１）〜（３３）のいずれか１種または２種、あるいは化合物（２）等のいずれか１種または２種以上の合計の含有量は特に制限はないが、上述したサプリメントの濃度と同じ範囲に設定することができる。
【０１２５】
〔研究試薬〕
化合物（１）〜（３３）は、その化学構造の相違によりＡＣＥ阻害活性や阻害の仕方（不拮抗的阻害（Uncompetitive inhibition）か非競合的阻害（Non-competitive Inhibition））が相違するため、各化合物（１）〜（３３）はそれぞれアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）との結合の態様及びアンギオテンシン変換酵素の活性発現機構（各化合物（１）〜（３３）がＡＣＥに結合した後のＡＣＥのコンフォーメーション（立体配座））がそれぞれの化合物間で異なると考えられる。しかしながら、その詳細は現在不明である。したがって、ＡＣＥ阻害活性の程度が異なる各化合物（１）〜（３３）、特にＡＣＥ阻害活性の高い化合物（２）等を、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の活性阻害の機構を解明するための研究試薬として用いることができる。また、これら化合物（１）〜（３３）のＡＣＥに対する結合態様の解析に基づいて、さらに高活性のＡＣＥ活性阻害剤を開発することも可能であり、このための研究試薬としても用いることができる。
【０１２６】
研究試薬としての使用例としては、例えば、各化合物（１）〜（３３）、各化合物（２）等のみ、または、該化合物および基質の疑似物（ＡＣＥの基質の類似物で消化されない化合物）を用いる例が挙げられるが、具体的には、これらの化合物を個別にアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）に結合させ、該結合の状態で結晶化を行い、該結晶を用いてＸ線結晶構造解析を行うことによりＡＣＥのコンフォメーションの変化を解析する例や、さらに、演算機上（In silico）で、各化合物（２）等のみ、または、前記基質の疑似物および化合物（２）等をアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）に結合させるドッキングシミュレーションを行い、ＡＣＥのコンフォメーションの変化を演算し、実際に行った実験結果と比較する例を挙げることができる。
【実施例】
【０１２７】
本発明者らは、ACE阻害活性に影響を与え、霊芝の血圧降下作用に寄与するラノスタン型のトリテルペノイドの構造的特徴を特定すべく、アンギオテンシン転換酵素阻害アッセイと、トリテルペノイドのアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害性能を予測するドッキングソフトウェアによりシミュレーション実験等を行った。
【０１２８】
［試験例１］
試験例１では、以下のようにアンギオテンシン転換酵素の阻害アッセイを行った。
（材料と方法）
霊芝(Ganoderma lingzhi)由来の３２種類のトリテルペノイド（純度＞９８％）（化合物（１）〜（３３））は、Chemfaces社（武漢市、湖北省、中国）およびPhytochemicals社（LLC,ニュージャージー州、アメリカ合衆国）から購入した。全てのトリテルペノイドは、さらなる精製をすることなく使用した。ACEテストキット「ACEキットWSTA５０２」は、同仁化学研究所（熊本、日本）から購入した。ドッキングソフトウェア「CLC Drug Discovery」は、CLCバイオ社（オーフス、デンマーク）から購入した。
【０１２９】
（ＡＣＥ阻害アッセイ）
「ACEキットWSTA５０２」（同仁同化学研究所社）と９６ウェルプレートとを用いて、前記キットの製品説明書の手順に従い、若干の変更を加えて阻害活性アッセイを行った。
【０１３０】
具体的には、以下の手順１）〜９）に従って、各化合物のＡＣＥの阻害率を算出した。１）霊芝（Ganoderma lingzhi）由来のトリテルペノイド（化合物（２））を、０μｇ／ｍＬで含むサンプル溶液Ｃ１、６２．５μｇ／ｍＬで含むサンプル溶液Ｃ２、１２５μｇ／ｍＬで含むサンプル溶液Ｃ３、２５０μｇ／ｍＬで含むサンプル溶液Ｃ４をそれぞれ調製した。このサンプル溶液Ｃ１〜Ｃ４を９６ウェルプレートの第１〜４番目のウェルにそれぞれ２０μＬ加えた。また、第５番目と第６番目の各ウェルに純水を２０μＬ入れた（blank1,blank2)。
【０１３１】
２）上記第１〜５番目の各ウェルに対して、前記キットに同梱のSubstrate bufferを１７μＬ加えた。混合液を室温で５分〜１０分間静置した。３μLの水／エタノール混合液を前記混合液に添加し、エタノールの終濃度を全てのウェルで５％とした。
３）９６ウェルのプレートのblank2用の第６番目のウェルに純水を２０μＬ加えた。
４）第１〜６番目のウェルにEnzyme working solution ２０μＬずつ加えた。なお、Enzyme working solutionを加えるとすぐに3-Hyderoxybutyric acid(3HB)の生成が始まるため、ウェル間のタイムラグをできるだけ少なくするためにマルチチャンネルのピペットを使った。
５）３７℃で６０分間インキュベート（静置）した。
６）各ウェルにIndicator working solutionを２００μＬずつ加えた。
７）室温で１０分間インキュベートした。
８）プレートリーダーで各ウェルの反応溶液の４５０ｎｍの吸光度を測定した。
９）ＡＣＥ阻害活性値（阻害率％）を下記式により求めた.
（ＡＣＥ阻害活性値（阻害率〔％〕））＝〔（Abs.blank1−Abs.sample）／（Abs.blank1−Abs. blank2）×１００〔％〕
【０１３２】
なお、上記化合物（２）以外の化合物（１）、（３）〜（３３）(ガノデリックアシッドＤ（化合物（１１））を除く)についても同様にＡＣＥ阻害活性値（阻害率〔％〕）を測定・算出した。
【０１３３】
(ＩＣ50の測定)
上記の通りに化合物（１）〜（３３）(ガノデリックアシッドＤ（化合物（１１））を除く。以下、同様。)のそれぞれについて５段階の濃度別に測定・算出した阻害率（％）の値を「用量−反応曲線」のグラフとしてプロットした（横軸：各化合物の濃度、縦軸：ＡＣＥ阻害率〔％〕）（不図示）。この「用量−反応曲線」のグラフからＩＣ50を算出した（表４〜６）。すなわち、阻害剤が全く存在しない条件下におけるＡＣＥの活性を１００％（阻害率＝０〔％〕）とした場合に、ＡＣＥの活性が５０％（阻害率＝５０〔％〕）となる上記化合物の濃度〔μＭ〕をＩＣ50として算出した。なお、阻害率（％）の測定・算出は３回行った（ｎ＝３）。
【０１３４】
［試験例２］
（分子モデリング）
各化合物（トリテルペノイド）（１）〜（３３）の化学構造の３Ｄモデルをソフトウェア「MarvinSketch」（ChemAxon社,ブダペスト、ハンガリー）により作成し、これをアンギオテンシン変換酵素の活性部位を含む半径１３オングストローム（Å）の球状空間内にドッキングさせるドッキングシミュレーションを行った。なお、このドッキングシミュレーションは、ソフトウェア「CLC Drug Discovery Workbench」（CLC Bio, Aarhus, Denmark社製）により行った。
【０１３５】
上記化合物（１）〜（３３）として、Ganoderic acid Z (1), Ganoderic acid N (2), Ganoderic acid S (3), Ganoderic acid E (4), Ganoderic acid SZ (5), Ganoderic acid LM2 (6), Ganoderic acid DM (7), Ganoderic acid A (8), Ganoderic acid AM1 (9), Ganoderic acid B (10), Ganoderic acid Y (12), Ganoderic acid TN (13), Ganoderic acid T-Q (14), Ganolucidic acid A (15), Ganodermanontriol (16), Ganodermanondiol (17), Ganoderol A (18), Ganoderol B (19), Ganoderiol F (20), Lucialdehyde A (21), Lucialdehyde B (22), Ganoderic acid C1 (23), Ganoderic acid C2 (24), Ganoderic acid C6 (25), Ganoderic acid H (26), Ganoderic acid K (27), Ganoderic acid TR (28), Ganoderenic acid A (29), Ganoderenic acid C (30), Ganoderenic acid D (31), Ganoderenic acid F (32), Ganoderenic acid H (33)を用いた。
【０１３６】
図２（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、ＡＣＥ阻害剤（化合物（１）〜（３３）等）をドッキングさせる対象として上記ドッキングシミュレーションに使用したタンパク質（ＡＣＥ）の立体構造は３種類存在し、図２（Ａ）は、ＡＣＥ阻害剤のカプトプリルと結合した状態のアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の立体構造、図２（Ｂ）は、リシノプリルと結合した状態のアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の立体構造、図２（Ｃ）は、エナラプリラート（エナラプリル）と結合した状態のアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の立体構造である。
【０１３７】
（結果・考察）
上記ドッキングシミュレーションの結果、ほぼ全ての場合で化合物がＡＣＥに衝突していることを示すプラスのドッキングスコアとなった（上記表１〜表３）。上記ドッキングスコアがプラスであることから、化合物（１）〜（３３）が、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の上記結合部位の中に上手く入り込んでおらず、各化合物（１）〜（３３）とアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）との間に何らかの物理衝突があることを示す。この結果は、霊芝由来のトリテルペノイド（化合物）（１）〜（３３）がＡＣＥの結合部位のポケットに入り込むには分子サイズが大き過ぎることを示している。
【０１３８】
［試験例３］
アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の活性部位のポケットに化合物（１）〜（３３）が入り込むには分子サイズが大き過ぎるという上記推論を明らかにするために、本発明者らは、ガノデリックアシッドA（ACEに対する阻害活性が最も高い化合物）の３Ｄモデルを利用して、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の前記ポケットの中において、ガノデリックアシッドＡの分子がとると予想される配置を調べた。すなわち、ＡＣＥの活性部位と各化合物（１）〜（３３）とのエネルギー（Docking Score(kcal/mol)）が最小となる位置を特定した。この結果を図２および表１〜表３に示す。
【０１３９】
（結果）
アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）と、公知のＡＣＥ阻害剤として知られている「カプトプリル」、「リシノプリル」または「エナラプリル（エナラプリラート）」との各複合体に由来する蛋白質の立体形状（３つ）をそれぞれターゲットとして利用した。
【０１４０】
図２にはドッキングシミュレーションの結果（阻害剤がガノデリックアシッドＡの場合の結果）を示されている。なお、図２は、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の活性部位のポケットに対して、ガノデリックアシッドAを配置させた結果と、カプトプリル等を配置させた結果とを同時に示している。また、図２は、左側から右側に向かって順に、（Ａ）カプトプリルと結合したアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の蛋白質の構造（活性部位周辺）、（Ｂ）リシノプリルと結合したアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の蛋白質の構造（活性部位周辺）、（Ｃ）エナラプリル（エナラプリラート）と結合したアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の蛋白質の構造（活性部位周辺）を示している。
【０１４１】
図２（Ａ）〜（Ｃ）に示されているように、霊芝（Ganoderma lingzhi）由来のトリテルペノイド(化合物（１）〜（３３）)の構造は、実際上、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の活性部位のポケットの中に入り込むには大き過ぎており、それに対して、公知のＡＣＥ阻害剤（カプロプリル等）は、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の活性中心のポケットによくフィットしている。
【０１４２】
各トリテルペノイド（化合物（１）〜（３３））の化学構造のいずれかの部位がアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）のタンパク質と衝突しており、活性部位のポケットの中からはみ出ている。そして、このことが理由でドッキングスコアがプラスとなったと考えられる。
【０１４３】
［試験例４］
（ACE阻害活性の測定）
霊芝（Ganoderma lingzhi）由来の３３のランタノイド（化合物（１）〜（３３））がアンギオテンシン変換酵素（ACE）の阻害試験に供された。２つのアルデヒド、５つのアルコール、および２６のランタノイド誘導体が存在するが、構造活性相関解析（Streucute-activity relationship analysis）を可能とするために、それらの化合物（ランタノイド）を、テトラサイクリック環部分およびそれらの環に結合している分岐鎖に基づいてグループ分けした。
【０１４４】
（第１グループ）
第１のグループは、テトラサイクリック環に二重結合（ΔC8,9）を含み、カルボキシル基に分岐を有している化合物である。
【０１４５】
【化４２】
2019150046.tif 000047
【０１４６】
【表４】
2019150046.tif 000048
【０１４７】
（第２グループ）
第２のグループは、テトラサイクリック環に２つの二重結合（ΔC7,8，Δ9,11）を含み、カルボキシル基に分岐を有している化合物である。
【０１４８】
【化４３】
2019150046.tif 000049
【０１４９】
【表５】
2019150046.tif 000050
【０１５０】
（第３のグループ）
第３のグループは、第２のグループのサイクリック環と似ているものを有しているが、化合物の分岐鎖がカルボキシル基末端を有していないものである。
【０１５１】
【化４４】
2019150046.tif 000051
【０１５２】
【表６】
2019150046.tif 000052
【０１５３】
（結果・考察）
霊芝由来の、調べた化合物（１）〜（３３）の中で、１５個の化合物（２）、（８）〜（１０）、（２３）〜（３３）がエタノールの終濃度５％における測定可能なＩＣ50値を示した。すなわち、霊芝(Ganoderma lingzhi)由来の一部のトリペノイドについては、特に優れたＡＣＥ阻害能が確認された。これらの化合物（１）〜（３３）のうち、ＩＣ50の範囲が１００．１〜４９９．５の範囲であるところの最も高いＡＣＥ阻害活性を有するものは、ガノデリックアシッドＡであった（表４〜表６を対比して参照）。ＩＣ50値を測定可能なグループの中で最も低いＡＣＥ阻害活性を示したものは、ガノデリックアシッドNであった（表４〜表６を対比して参照）。ＩＣ50値の測定可能な化合物の殆どは、第１のグループ(式（ａ）)であり、これらの化合物と第２のグループ(式（ｂ）)に属するたった１つの化合物（ガノデリックアシッドTR（２８））が、IC50値＝１６８．１μｇ／ｍLという、かなり高いＡＣＥ阻害活性を示した。
【０１５４】
残りの第２のグループの化合物（(式（ｂ）中、表５の第2行目以下)および第３のグループ（式（ｃ）、表６）の全ての化合物はわずかな阻害活性しか示さなかった（ＩＣ50＞５００μｇ／ｍＬとして示している。なお、５００μｇ／ｍＬはトリテルペノイドの水に対して溶解しうる限界濃度である。）
【０１５５】
【化４５】
2019150046.tif 000053
【０１５６】
上記表４〜表６に示した結果から、上記化学構造の分岐鎖にあるカルボキシル基（−COOH基）がトリテルペノイドのACE阻害活性に影響する重要な因子の一つであると考えられる。前記カルボキシル基（−COOH基）を有していないものは、測定可能な阻害活性を示さなかった。しかしながら、上記カルボキシル基の存在だけではＡＣＥ阻害活性の発現には十分ではなく、上記化学構造のテトラサイクリック環のある特定の箇所（特に、上記Ｒ５）に−C＝O基または−OH基が存在することも必要である。また、第８番目と第９番目の炭素間に二重結合がある場合、ＡＣＥ阻害活性を促進する。
【０１５７】
ところで、トリテルペノイドの化学構造中に炭素C24,25の二重結合が存在すると、トリテルペノイドのＡＣＥ阻害活性を低減させる。
ガノデリックアシッドAおよびガノデリン酸Aは、C20,22の箇所の二重結合のみが異なっているが、これらの化合物は阻害活性の低減が少なく、ＩＣ50についてみれば、「１００．１μｇ／ｍＬ」→「１２５．９μｇ／ｍL」に変化する程度である。これに対して、ガノデリックアシッドC１とガノデリックアシッドLM２とは、C24,25の箇所にある二重結合のみが異なっているが、ＩＣ50の変動は、「３８３．６μｇ／ｍＬ」→「＞５００μｇ／ｍL」と鋭い低減を示した。
【０１５８】
上述した要因に加えて、上記化学構造のテトラサイクリック環の中にある二重結合もまた阻害活性の発現に寄与していると考えらえる。ガノデリックアシッドTRを除いて、２つの二重結合をC7,8およびC9,11に有する他の構造は、ＡＣＥ阻害活性を殆ど示さず、それらの化合物のIC50の値は得られなかった。
【０１５９】
［試験例５］
各化合物（１）〜（３３）がいずれの阻害様式によってアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を阻害しているか調べるために、試験例１で使用したACEテストキット「ACEキットWSTA５０２」等を用いて下記阻害様式のそれぞれに含まれるパラメータ値を実測する試験を行い、Ｄｉｘｏｎプロットによる阻害様式の判定を行った。
《競合的阻害》
【０１６０】
【化４６】
2019150046.tif 000054
《非競合的阻害》
【０１６１】
【化４７】
2019150046.tif 000055
《不拮抗阻害》
【０１６２】
【化４８】
2019150046.tif 000056
（上記式において、E：アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）、S：基質、ES 酵素・基質複合体、I：阻害剤(トリテルペノイド)、EI：酵素・阻害剤複合体、P：生成物、[S]：基質初濃度、[S]：遊離の基質濃度、Ks：反応速度定数、Km：ミカエリス定数、Vmax：最大反応速度、Ki：阻害定数（EIの解離定数））
試験例１で用いたキットを使用して、阻害剤（化合物（１）〜（３３））存在下でのＡＣＥ活性の測定（ＡＣＥの酵素反応速度ｖの測定、等）を行った。
【０１６３】
（準備）
使用した上記キットのＡＣＥ基質溶液の容量（１０μＬ、１５μＬ、２０μＬ、２５μＬ）とし、ＡＣＥ基質溶液のそれぞれに対して、所定の濃度でトリテルペノイド（ガノリックアシッドＡ、ガノデリックアシッドＣ２）およびＡＣＥを含む溶液２０μＬをそれぞれ混合した後、最終的なサンプルの容量を６０μＬに調整した。
【０１６４】
なお、上記ＡＣＥ基質の終濃度は、順に、１２．５ｍＭ、１８．６ｍＭ、２４．７ｍＭ、３０．９ｍＭとした。また、各トリテルペノイド類の反応系の終濃度をそれぞれ６２．５μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬおよび２５０μｇ／ｍＬとした（下記表７参照）。
【０１６５】
【表７】
2019150046.tif 000057
【０１６６】
【表８】
2019150046.tif 000058
「1/V」については、生成物（実施例で用いた図３のkitの発色体（color））を定量するための吸光度（Abs.(450nmの吸光度)）１を増加させるために要する時間（分）として表している。
【０１６７】
（手順）
（１）上述した各サンプル（ガノデリックアシッドＡ，Ｃ２等の各化合物を阻害剤として含むサンプル溶液）について、試験例１で述べたように行いＡＣＥ活性を測定して吸光度を得た。なお、６０分間のインキュベーション（静置）により、ＡＣＥによるアンギオテンシンを変換する反応が収束していると考えられる。
【０１６８】
(２）トリテルペノイド類（各化合物）を含まない反応液の酵素反応速度ｖ（吸光度(abs.)/分）は、(i)のＡＣＥ活性測定で得たコントロールの吸光度(Abs.(450nm))を６０(分)で割ることで算出した。
【０１６９】
（３）トリテルペノイドを含む反応液の酵素反応速度ｖ（吸光度(abs.)/分）は、(i)のＡＣＥ活性測定で得たサンプルの吸光度(Abs.(450nm))を６０(分)で割ることで算出した。
【０１７０】
（４）１／ｖをトリテルペノイド類の濃度に対してプロット（Dixonプロット）した。  図４にガノデリックアシッドＡを阻害剤として用いた場合の結果（Dixonプロット、縦軸：１/v（分/abs.(450nm))）、横軸［Ｉ］（μｇ／ｍＬ））を示す。
図５にガノデリックアシッドＣ２を阻害剤として用いた場合の結果（Dixonプロット、縦軸：1/v(min/abs.)、横軸［Ｉ］（μｇ／ｍＬ）)を示す。
【０１７１】
（結論）
（ガノデリックアシッドＡ）
図４は、横軸に阻害剤としてのガノデリックアシッドＡの濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸にＡＣＥ酵素の反応速度ｖ（abs. / 分）の逆数を取ったものである。
【０１７２】
図４のDixonプロットのグラフから、ガノデリックアシッドＡは不拮抗阻害と非競合的阻害との混合の阻害様式（混合型非拮抗阻害）でＡＣＥを阻害していることが分かる。つまり、したがって、ガノデリックアシッドＡは、ＡＣＥに対して不拮抗阻害の様式でＡＣＥを阻害していると考えられる。すなわち、ガノデリックアシッドＡは、ＡＣＥの活性部位とは別の部位に働いて酵素の働きを下げることが分かる。従来ＡＣＥ阻害剤として知られるカプトプリル等と併用可能であることが分かる。
【０１７３】
（ガノデリックアシッドＣ２）
図５は、横軸に阻害剤としてのガノデリックアシッドＣ２の濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸にＡＣＥ酵素の反応速度（分／abs.）を取ったものである。
【０１７４】
図５のグラフから、ガノデリックアシッドＣ２のＡＣＥに対する阻害様式は、非競合的阻害（Uncompetitive inhibition）であることが理解できる。すなわち、ガノデリックアシッドＣ２は、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の基質であるアンギオテンシンＩとの間でＡＣＥ活性部位を奪い合わずに、ＡＣＥの活性部位とは別の部位に働いて酵素の働きを下げることが分かり、従来ＡＣＥ阻害剤として知られるカプトプリル等と併用可能であることが分かる。
【０１７５】
（総論）
本発明によれば、霊芝（Ganoderma lingzhi）由来のトリテルペノイドがACEに対して緩やかな阻害活性を示すことが実証された。また、構造活性相関解析（Streucute-activity relationship analysis）により活性に影響を与える重要な部位が明らかとなった。分子モデリングの解析により、トリテルペノイドの阻害活性が競合阻害ではない代わりに、不拮抗阻害または非競合的阻害であり、従来のＡＣＥ阻害剤(例：カプトプリル、リシノプリル、エナラプリル)と併用でき、その結果としての相乗効果が期待できる。
【０１７６】
以上、本発明に係るＡＣＥ阻害剤について、実施例および各試験例に基づいて詳細に説明してきたが、本発明は上記実施例等に限定されず、本発明の要旨を逸脱しないかぎり、設計変更は許容される。
【図１】
2019150046.tif 000059
【図２】
2019150046.tif 000060
【図３】
2019150046.tif 000061
【図４】
2019150046.tif 000062
【図５】
2019150046.tif 000063
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月12日(2019.6.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示される基本骨格構造を有するトリペノイド類を含むことを特徴とする、ＡＣＥ阻害剤。
【化１】
2019150046.tif 000064
[ここでＲ１は＝Ｏまたは−ＯＨ、Ｒ２は＝−Ｈ、＝Ｏまたは−ＯＨ、Ｒ３は＝−Ｈ、または＝Ｏ、Ｒ４は＝−Ｈまたは−ＯＨ、Ｒ５は＝Ｏまたは−ＯＨを示す]
【請求項２】
前記トリペノイド類は、ガノデリックアシッドＡ、ガノデリックアシッドＣ２、ガノデリックアシッドＡＭ１、およびガノデリン酸Ａから選択される少なくとも１種のトリペノイド類である、請求項１に記載のＡＣＥ阻害剤。
【請求項３】
前記トリペノイド類は、ガノデリックアシッドＡおよびガノデリックアシッドＣ２から選択される少なくとも一種である、請求項１または２に記載のＡＣＥ阻害剤。
【請求項４】
下記式（２）で示される基本骨格構造を有するトリペノイド類を含むことを特徴とする、ＡＣＥ阻害剤。
【化２】
2019150046.tif 000065
[ここでＲ１は−ＯＨまたは＝Ｏ、Ｒ５は−ＯＨまたは＝Ｏを示す]
【請求項５】
前記トリペノイド類がガノデリックアシッドＴＲである、請求項４に記載のＡＣＥ阻害剤。
【請求項６】
前記トリペノイド類と、ＡＣＥとの構造活性相関解析によるドッキングスコア（Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）がプラスの値である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＡＣＥ阻害剤。
【請求項７】
前記トリペノイド類は、Ｄｉｘｏｎプロットによる阻害様式、およびＡＣＥの酵素反応速度が式（３）に示される数式で示されるか、または式（３）に示される数式および式（４）に示される数式との混合で示される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＡＣＥ阻害剤。
【化３】
2019150046.tif 000066
【化４】
2019150046.tif 000067
[ここで、Eはアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）、Ｓは基質、ＥＳは酵素・基質複合体、Ｉは阻害剤（トリテルペノイド）、ＥＩは酵素・阻害剤複合体、Ｐは生成物、［Ｓ］は基質初濃度、［Ｓ］は遊離の基質濃度、Ｋｓは反応速度定数、Ｋｍはミカエリス定数、Ｖｍａｘは最大反応速度、Ｋｉは阻害定数（ＥＩの解離定数）を示す］
【請求項８】
前記トリペノイド類が９８％を超える純度で含まれる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＡＣＥ阻害剤。
【請求項９】
前記ＡＣＥ阻害剤は、ガノデリックアシッドＨまたはガノデリックアシッドＫを含まない、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＡＣＥ阻害剤。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のＡＣＥ阻害剤を有効成分とする、ＡＣＥに関連する疾患の予防あるいは軽減のための食品(健康補助食品)、化粧料または医薬品。
【請求項１１】
前記疾患が、高血圧症、高血圧により引き起こされる動脈硬化に起因する動脈硬化症、脳梗塞（ラグナ梗塞、アテローム血栓性梗塞、脳塞栓）、脳出血、くも膜下出血、心肥大、狭心症、心筋梗塞、腎障害である請求項１０に記載の食品(健康補助食品)または医薬品。