(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｔリンパ球などの免疫細胞の培養または増殖方法の提供。【解決手段】免疫細胞集団の増殖を誘導するための方法であって、該免疫細胞の増殖を引き起こすように、該免疫細胞を、該免疫細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体のリガンド、及び該免疫細胞上の共刺激性分子のリガンドと接触させることを含み、ここで、該リガンドは組成物内部に含まれ、該組成物は液相又は多構成相を含み、かつ該リガンドは該組成物の表面上に固定化されていない、前記方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫細胞集団の増殖を誘導するための方法であって、該免疫細胞の増殖を引き起こすよ
うに、該免疫細胞を、該免疫細胞上のT細胞受容体（TCR）/CD3複合体のリガンド、及び該
免疫細胞上の共刺激性分子のリガンドと接触させることを含み、ここで、該リガンドは組
成物内部に含まれ、該組成物は液相又は多構成相を含み、かつ該リガンドは該組成物の表
面上に固定化されていない、前記方法。
【請求項２】
前記組成物が、ヒドロゲル、アルブミン、又は疎水性分子を含む、請求項1記載の方法
。
【請求項３】
前記組成物が、ビーズの形態をとる、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が、実質的に球状である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記TCR/CD3複合体の前記リガンドが、高分子ポリペプチド結合剤である、請求項1記載
の方法。
【請求項６】
前記リガンドが、CD3に対する抗体（抗-CD3）である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が、ポリクローナルである、請求項6記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、モノクローナルである、請求項6記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が、OKT3若しくはG19-4、又はそれらのCD3結合部分であるモノクローナル抗体
である、請求項6記載の方法。
【請求項１０】
前記共刺激性分子のリガンドが、CD28のリガンドである、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
前記共刺激性分子のリガンドが、CD28に対する高分子ポリペプチド結合剤である、請求
項1記載の方法。
【請求項１２】
前記共刺激性分子のリガンドが、CD28に対する抗体（抗-CD28）である、請求項1記載の
方法。
【請求項１３】
前記抗体が、ポリクローナルである、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が、モノクローナルである、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
前記共刺激性分子のリガンドが、CD9に対する抗体である、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体がポリクローナルである、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体が、モノクローナルである、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体が、ES5.2D8である、請求項15記載の方法。
【請求項１９】
前記共刺激性分子のリガンドが、B7-1若しくはB7-2、又はそれらのCD28結合断片である
、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物が、ヒドロゲルを含む、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
前記ヒドロゲルが、自己集合性ヒドロゲルである、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
前記ヒドロゲルが、ポリグルタメート鎖及びビタミンEを含む、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
前記リガンドが、前記ヒドロゲルの網状組織中に含まれる、請求項20〜22のいずれか一
項記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物が、油、脂質、又はフッ化炭素を含み、該油、脂質、又はフッ化炭素が液体
である、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
前記油、脂質、又はフッ化炭素が前記組成物中にナノメートル大、又はマイクロメート
ル大の小滴の形態で存在する、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
前記リガンドが前記微細小滴の表面上の前記組成物中に存在する、請求項24記載の方法
。
【請求項２７】
前記リガンドが抗-CD3及び抗-CD28である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物がアルブミンを含む、請求項1記載の方法。
【請求項２９】
前記アルブミンが液体疎水性分子と複合体を形成する、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
前記疎水性分子が油、脂質、又はフッ化炭素である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
前記アルブミンが前記疎水性分子の小滴の表面上に存在する、請求項29又は30記載の方
法。
【請求項３２】
前記アルブミン及び前記リガンドが、前記疎水性分子の小滴の表面上に存在する、請求
項29又は30記載の方法。
【請求項３３】
前記アルブミンが、本来のものとは異なるアルブミンである、請求項28〜32のいずれか
一項記載の方法。
【請求項３４】
前記アルブミンが変性している、請求項28〜32のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
前記リガンドのうちの少なくとも1つが疎水性分子にコンジュゲートされている、請求
項1記載の方法。
【請求項３６】
前記CD3のリガンドが、疎水性分子にコンジュゲートされている、請求項1記載の方法。
【請求項３７】
前記共刺激性分子のリガンドが、疎水性分子にコンジュゲートされている、請求項1記
載の方法。
【請求項３８】
前記リガンドが、CD28のリガンドである、請求項1記載の方法。
【請求項３９】
各前記リガンドがそれぞれ疎水性分子にコンジュゲートされている、請求項1記載の方
法。
【請求項４０】
前記リガンドが抗-CD28及び抗-CD3である、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
前記リガンドが抗-CD3及び、B7-1又はB7-2のうちの1つである、請求項39記載の方法。
【請求項４２】
前記組成物が疎水性分子を含み、前記リガンドのいずれも該疎水性分子とコンジュゲー
トされていない、請求項1記載の方法。
【請求項４３】
前記組成物が疎水性分子を含み、前記リガンドが抗-CD28及び抗-CD3であり、該抗-CD28
又は該抗-CD3のいずれも、該疎水性分子とコンジュゲートされていない、請求項39記載の
方法。
【請求項４４】
前記組成物が疎水性分子を含み、前記リガンドが抗-CD3及び、B7-1又はB7-2のうちの1
つであり、かつ該抗-CD3又は該B7-1若しくはB7-2のうちの1つのいずれも、該疎水性分子
とコンジュゲートされていない、請求項39記載の方法。
【請求項４５】
前記疎水性分子が水溶液中で自己集積し、ミセルを形成する、請求項35〜44のいずれか
一項記載の方法。
【請求項４６】
前記疎水性分子が脂質である、請求項35〜44のいずれか一項記載の方法。
【請求項４７】
前記疎水性分子が、脂肪鎖である、請求項35〜44のいずれか一項記載の方法。
【請求項４８】
前記疎水性分子がフッ化炭素である、請求項35〜44のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
前記アルブミンが、ヒト血清アルブミンである、請求項2〜48のいずれか一項記載の方
法。
【請求項５０】
前記免疫細胞が、T細胞である、請求項1〜49のいずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
前記T細胞がCD4＋ T細胞である、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
前記T細胞がCD8＋ T細胞である、請求項50記載の方法。
【請求項５３】
前記T細胞が、Treg細胞である、請求項50記載の方法。
【請求項５４】
前記免疫細胞が、約100倍〜約100,000倍増殖する、請求項1〜53のいずれか一項記載の
方法。
【請求項５５】
前記組成物が、主として2℃〜44℃で水性媒体と混和しない液相系又は多相系を含む、
請求項1〜54のいずれか一項記載の方法。
【請求項５６】
前記組成物が均質化に際し、2℃〜44℃で水性媒体とのコロイド又はエマルションとし
て存在する、請求項1記載の方法。
【請求項５７】
前記免疫細胞をインターロイキン-2（IL-2）と接触させることをさらに含む、請求項1
〜56のいずれか一項記載の方法。
【請求項５８】
前記免疫細胞をホルボールエステルと接触させることをさらに含む、請求項1〜57のい
ずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は2013年6月24日に出願された米国仮特許出願第61/838,685号に対する優先権を主
張し、その開示は、その全てが参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
(1. 分野)
本明細書に提供されるのは、細胞培養の分野における方法、具体的には免疫細胞、例え
ばTリンパ球の培養及び増殖の分野における方法である。
【背景技術】
【０００３】
（2. 背景）
Tリンパ球（T細胞）は多くの方法で培養し、増殖させることができる。T細胞を増殖さ
せるための一般に行われている方法の1つでは、T細胞上の主たるシグナル伝達部分に対す
る抗体、例えば抗-CD3抗体を、T細胞上の共刺激性部分に対する抗体、例えばCD28に対す
る抗体と組み合わせて利用する。ここで、両抗体は固体表面、例えばビーズ又は培養シャ
ーレ表面に固定化される。しかし、当該技術分野では、免疫細胞を増殖させるための他の
方法が需要されている。本開示はそのような他の方法を提供する。
【発明の概要】
【０００４】
（3. 概要）
本明細書に提供されるのは、少なくとも1つの主刺激性リガンド（本明細書では、主リ
ガンドとも呼ぶこととする）及び少なくとも1つの共刺激性分子のリガンド（本明細書で
は、共刺激性リガンドとも呼ぶこととする）を用いて、免疫細胞、例えばT細胞の集団を
増殖させるための方法である。
【０００５】
一態様において、本明細書に提供されるのは、免疫細胞の集団の増殖を誘導するための
方法であって、免疫細胞の増殖を引き起こすように、該免疫細胞を主リガンド、例えば該
免疫細胞上のT細胞受容体（TCR）/CD3複合体のリガンド、及び該免疫細胞上の共刺激性リ
ガンドと接触させることを含み、ここで、該リガンドは組成物中に含まれ、該組成物は液
相又は多構成相を含み、かつ該リガンドは該組成物の表面上に固定化されていない、前記
方法である。特定の実施態様において、組成物はポリマー、ヒドロゲル、アルブミン、及
び/又は疎水性分子を含む。特定の実施態様において、組成物はビーズの形態をとり、例
えば実質的に球状である。組成物はアジュバントなどではない（例えば、アルミニウム塩
、水酸化リン灰石（calcium phosphate hydroxide）、ベリリウム、油（例えば、鉱油又
はパラフィン油）それ自体、界面活性剤それ自体、スクアレン、チメロサール（エチル水
銀）、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバントではない）。
【０００６】
特定の実施態様において、主リガンド、例えば該TCR/CD3複合体のリガンドは、高分子
ポリペプチド結合剤である。具体的な実施態様において、リガンドはCD3に対する抗体（
抗-CD3）である。抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよい。抗体はハイブリド
ーマクローン由来のものでよく、非ヒト抗体のヒト化形態でもよい。具体的な実施態様に
おいて、モノクローナル抗体はOKT3（ムロノマブ-CD3）又はG19-4、又はそれらのCD3-結
合部分である。また、結合剤は、ミモトープとすることもできる。
【０００７】
特定の実施態様において、共刺激性リガンドは、CD28のリガンドである。特定の実施態
様において、共刺激性リガンドはCD28に対する高分子ポリペプチド結合剤である。共刺激
性リガンドは、例えば、CD28に対する抗体（抗-CD28）とすることができる。特定の実施
態様において、共刺激性リガンドはB7-1若しくはB7-2、又はそれらのCD28結合断片である
。共刺激性リガンドは、例えば、CD137に対する抗体（抗-CD137）とすることができる。
別の実施態様において、共刺激性リガンドはCD9に対する抗体（抗-CD9）である。具体的
な実施態様において、抗-CD9抗体はES5.2D8である。抗体はポリクローナルでもモノクロ
ーナルでもよい。抗体はハイブリドーマクローン由来のものでよく、非ヒト抗体のヒト化
形態でもよい。
【０００８】
本明細書に提示されるいずれかの実施態様の具体的な実施態様において、主リガンド及
び共刺激性リガンドは、それぞれ抗-CD3及び抗-CD28であり、例えば、該TCR/CD3複合体の
リガンドは抗-CD3であり、該免疫細胞上の共刺激性分子のリガンドは、抗-CD28である。
本明細書に提示されるいずれかの実施態様の具体的な実施態様において、リガンドは抗-C
D3及び抗-CD137（抗-4-1BB）であり、例えば、該TCR/CD3複合体のリガンドは抗-CD3であ
り、該免疫細胞上の共刺激性分子のリガンドは、抗-CD137である。
【０００９】
特定の実施態様において、組成物はヒドロゲルを含む。ヒドロゲルは自己集合性ヒドロ
ゲル、例えば、ポリグルタメート鎖及びビタミンEを含むヒドロゲルとすることができる
。具体的な実施態様において、該リガンドの1つ又は両方は、該ヒドロゲルの網状組織中
に含まれる。
【００１０】
具体的な他の実施態様において、組成物は油、脂質又はフッ化炭素を含み、ここで、該
油、脂質又はフッ化炭素は液体であり、例えば、水溶液中で液体として存在する。具体的
な実施態様において、該油、脂質、又はフッ化炭素はナノメートル、又はマイクロメート
ル大の小滴の形態で組成物中に存在する。具体的な実施態様において、該リガンドは該微
小液滴及びミセルの内部、又はそれらの表面上の該組成物中に存在する。
【００１１】
特定の実施態様において、リガンドを含む組成物は、アルブミンを含む。具体的な実施
態様において、アルブミンは液体疎水性分子、例えば油、脂質、又はフッ化炭素と複合体
を形成する。具体的な実施態様において、該アルブミンの一部、又はその実質的に全ては
、該疎水性分子の小滴の表面上に存在する。より具体的な実施態様において、該アルブミ
ン及び該リガンドの一部、又はそれらの実質的に全ては、該疎水性分子の小滴の表面上に
存在する。具体的な実施態様において、アルブミンは本来のものとは異なるアルブミンで
あり、例えば該アルブミンは血清中に存在するアルブミンの構造以外の構造を有する。よ
り具体的な実施態様において、該アルブミンは変性している。
【００１２】
該方法の別の実施態様において、該主リガンド及び/又は共刺激性リガンドのうちの少
なくとも1つ、又は両方は、疎水性分子にコンジュゲートされている。具体的な実施態様
において、主リガンド、例えば、CD3リガンドは、疎水性分子にコンジュゲートされてい
る。別の具体的な実施態様において、共刺激性リガンドは疎水性分子にコンジュゲートさ
れている。より具体的な実施態様において、共刺激性リガンドはCD28のリガンドである。
より具体的な実施態様において、該共刺激性リガンド及び主リガンドは、それぞれ抗-CD2
8及び抗-CD3であり、該リガンドの両方は、疎水性分子にコンジュゲートされている。別
のより具体的な実施態様において、疎水性分子にそれぞれコンジュゲートされている該リ
ガンドは抗-CD3及び、B7-1又はB7-2のうちの1つである。
【００１３】
該方法の別の実施態様において、該主リガンド及び/又は共刺激性リガンドの少なくと
も1つ、又は両方は、リンカー分子を介して疎水性分子にコンジュゲートされる。具体的
な実施態様において、主リガンド、例えばCD3リガンドは、抗-CD3特異的な抗体を介して
、疎水性分子にコンジュゲートされている。より具体的な実施態様において、共刺激性リ
ガンドはCD28のリガンドであり、リンカーは抗-CD3-特異的抗体である。
【００１４】
他の実施態様において、該組成物は疎水性分子を含み、ここで、該主リガンド又は共刺
激性リガンドのいずれも、該疎水性分子にコンジュゲートされていない。例えば、具体的
な実施態様において、該組成物は疎水性分子を含み、該リガンドは抗-CD28及び抗-CD3で
あり、かつ該抗-CD28又は該抗-CD3のいずれも該疎水性分子にコンジュゲートされていな
い。別の具体的な実施態様において、該組成物は疎水性分子を含み、ここで、該リガンド
は抗-CD3及び、B7-1又はB7-2のうちの1つであり、かつ該抗-CD3又は該B7-1若しくはB7-2
のうちの1つはいずれも、該疎水性分子にコンジュゲートされていない。
【００１５】
上記実施態様のいずれにおいても、該疎水性分子は水溶液中で自己集積し、ミセルを形
成する。様々な実施態様において、該疎水性分子は脂質、脂肪鎖、又はフッ化炭素（例え
ば、パーフルオロカーボン）である。
【００１６】
主リガンド及び/又は共刺激性リガンドのいずれか又は両方が、アルブミンと複合体を
形成する実施態様において、該アルブミンはヒト血清アルブミンとすることができる。
【００１７】
本明細書に提供される方法のいずれかの実施態様の具体的な実施態様において、組成物
は2℃〜44℃で概して水性媒体に不混和性である液相系又は多相系を含む。具体的な実施
態様において、均質化に際し、2℃〜44℃で水性媒体とのコロイド又はエマルションとし
て前記組成物が存在する。
【００１８】
本明細書のいずれかの実施態様の特定の具体的な実施態様において、該免疫細胞は、T
細胞であり、例えば限定されない例として、CD4＋ T細胞、CD8＋ T細胞、又はTreg細胞が
挙げられる。特定の具体的な実施態様において、T細胞は、CD45RO−、CD45RA＋、CCR7＋
、CD62L＋、IL-2Rβ−、かつCD95−である。特定の他の具体的な実施態様において、T細
胞は、CD45RO−、CD45RA＋、CCR7＋、CD62L＋、IL-2Rβ＋、かつCD95＋である。特定の他
の具体的な実施態様において、T細胞は、CD45RO＋、CD45RA−、CCR7＋、CD62L＋、IL-2R
β＋、かつCD95＋である。特定の他の具体的な実施態様において、T細胞は、CD45RO＋、C
D45RA−、CCR7−、CD62L−、IL-2Rβ＋、かつCD95＋である。特定の他の具体的な実施態
様において、T細胞は、CD45RO＋、CD45RA＋、CCR7−、CD62L−、IL-2Rβ＋、かつCD95＋
である。特定の具体的な実施態様において、T細胞は、CD3＋、CD8＋、CD27＋、CD28＋、C
D45RO−、CD45RA＋、CCR7＋、CD62L＋、IL-2Rβ＋、IL-7R＋、かつCD95−である。他の具
体的な実施態様において、T細胞はCCR7、CXCR4、及びL-セレクチンのうちの1以上を発現
する。他の具体的な実施態様において、T細胞はCCR7及びL-セレクチンを発現しない。他
の具体的な実施態様において、T細胞はCCR9＋、α4β7＋、CCR7＋、かつL-セレクチン低
発現若しくはL-セレクチン−のいずれかである。他の具体的な実施態様において、T細胞
は、CCD4＋、CCD10＋、LFA-1＋、及びα4β1＋である。具体的な実施態様において、T細
胞は、セントラルメモリーT細胞であるか、又は約20％、25％、 30％、35％、40％、45％
、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、又は95％のT細胞がセント
ラルメモリーT細胞である。別の具体的な実施態様において、T細胞は、セントラルメモリ
ーステムT細胞（Central Memory stem T cells）であるか、又は約20％、25％、30％、35
％、40％, 45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、又は 95％
のT細胞がセントラルメモリーステムT細胞である。特定の実施態様において、T細胞を培
養中TWS119と接触させた。他の実施態様において、T細胞を培養中外因のIL-2、IL-7、IL-
21、及び/又はIL-15と接触させた。本明細書に記載されるいずれの実施態様においても、
免疫細胞をさらにホルボールエステル、例えば12-O-テトラデカノイルホルボール-13-ア
セタート（TPA；ホルボール-12-ミリスタート-13-アセタート（PMA）とも呼ばれる）と接
触させる。
【００１９】
本明細書に提供される方法のいずれかの実施態様の具体的な実施態様において、免疫細
胞は約100倍〜約100,000倍まで増殖する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（4. 詳細な説明）
本明細書に提供されるのは、免疫細胞上の主たるシグナル伝達タンパク質のリガンド（
主リガンド）及び共刺激性ドメインのリガンド（共刺激性リガンド）を用いて免疫細胞、
例えばTリンパ球（T細胞）を増殖させるための方法であり、ここで、リガンドは、両方と
も表面、例えば固体表面上に固定化されてはいない。
【００２１】
従って、本明細書に提供されるのは、免疫細胞集団の増殖を誘導する方法であって、該
免疫細胞の増殖を引き起こすように、免疫細胞を該免疫細胞上の主たるシグナル伝達ドメ
イン又はタンパク質のリガンド（主リガンド）、及び該免疫細胞上の共刺激性ドメインの
リガンド（共刺激性リガンド）と接触させることを含み、ここで、該リガンドは組成物中
に含まれ、該組成物はアジュバントではない液相又は多構成相を含み、かつ該リガンドは
該組成物の表面上に固定化されていない、前記方法である。本明細書で使用される「リガ
ンド」は、任意の高分子を指し、例えば、例として免疫細胞の主たるシグナル伝達ドメイ
ン若しくはタンパク質又は免疫細胞上の共刺激性ドメインに結合することができるタンパ
ク質又はその一部分であり、例えば、抗体又はその結合部分、受容体又はその結合部分、
又はそのような生体分子の人工の、若しくは天然に生じた変形体を含む。
【００２２】
主たるシグナル伝達ドメインは、例えば、T細胞受容体（TCR）/CD3複合体の一部である
タンパク質、例えば、CD3γ、CD3δ、若しくはCD3ε又はそれらの機能性部分とすること
ができる。特定の実施態様において、該TCR/CD3複合体のリガンドは、高分子ポリペプチ
ド結合剤である。具体的な実施態様において、リガンドは、CD3に対する抗体（抗-CD3）
、例えば、抗-CD3γ、抗-CD3δ、又は抗-CD3εである。抗体は、ポリクローナルでもモノ
クローナルでもよい。抗体はハイブリドーマクローン由来のものでよく、非ヒト抗体のヒ
ト化形態でもよい。具体的な実施態様において、モノクローナル抗体はOKT3若しくはG19-
4又はそれらのCD3-結合部分である。
【００２３】
また、主たるシグナル伝達ドメインを、CD2とすることもできる。この場合、リガンド
は、例えばCD2に対する抗体とすることができる。
【００２４】
特定の実施態様において、共刺激性リガンドは、CD28のリガンドである。特定の実施態様
において、共刺激性リガンドは、CD28に対する高分子ポリペプチド結合剤である。共刺激
性リガンドは、例えば、CD28に対する抗体（抗-CD28）とすることができる。そのような
抗体は、例えば、モノクローナル抗体9.3又はEX5.3D10（ATCC寄託番号HB11373）とするこ
とができる。特定の実施態様において、共刺激性リガンドは、B7-1若しくはB7-2、又はそ
れらのCD28結合断片である。共刺激性リガンドは、例えば、CD137に対する抗体（抗-CD13
7）とすることができる。該共刺激性分子のリガンドは、例えば4-1BBに対する抗体（抗-4
-1BB）とすることができる。別の実施態様において、共刺激性リガンドは、CD9に対する
抗体（抗-CD9）である。具体的な実施態様において、抗-CD9抗体は、ES5.2D8である。抗
体は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよい。抗体はハイブリドーマクローン由来
のものでよく、非ヒト抗体のヒト化形態でもよい。別の実施態様において、共刺激性リガ
ンドは、CD2に対する抗体（抗-CD27）である。別の実施態様において、共刺激性リガンド
はICOSに対する抗体（抗-ICOS）である。別の実施態様において、共刺激性リガンドは、C
D40Lに対する抗体（抗-CD40L）である。別の実施態様において、共刺激性リガンドはOX40
に対する抗体（抗-OX40）である。
【００２５】
本明細書に提示されるいずれかの実施態様の具体的な実施態様において、リガンドは抗
-CD3及び抗-CD28であり、例えば、該TCR/CD3複合体のリガンドは、抗-CD3であり、該免疫
細胞上の共刺激性分子のリガンドは抗-CD28である。本明細書に提示されたいずれかの実
施態様の具体的な実施態様において、リガンドは抗-CD3及び抗-CD137（抗-4-1BB）であり
、例えば該TCR/CD3複合体のリガンドは、抗-CD3であり、該免疫細胞上の共刺激性分子の
リガンドは、抗-CD137である。
【００２６】
特定の実施態様において、本明細書に提供されるのは、免疫細胞集団の増殖を誘導する
ための方法であって、免疫細胞を、活性剤Zap70、akt、wav-1、及びジアシルグリセロー
ル（DAG）を含む組成物と接触させることを含み、ここで、該組成物がアジュバントでは
ない液相又は多構成相を含む、前記方法である。具体的な実施態様において、該活性剤は
、表面、例えば、該組成物の表面上に固定化されていない。他の具体的な実施態様におい
て、1以上の、又は全ての該活性剤は表面、例えば該組成物の表面上に固定化されている
。
【００２７】
主リガンド及び共刺激性リガンドのいずれか又は両方を含む組成物は、リガンドが免疫
細胞の一部により感知されることができ、免疫細胞の増殖を引き起こすように、少なくと
もリガンドの一部に適応した任意の形態とすることができる。特定の実施態様において、
組成物は免疫細胞上の主たるシグナル伝達ドメインに対するリガンドを含み、ここで、少
なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、6
5％、70％、75％、80％、85％、90％、又は95％のリガンドが、免疫細胞上の該主たるシ
グナル伝達ドメインに結合することができ、例えばフローサイトメトリーにおいて、例え
ば抗-イディオタイプ抗体、又は蛍光物質標識リガンドを用いて測定可能となるように配
置する。特定の実施態様において、組成物は免疫細胞上の共刺激性分子に対するリガンド
を含み、ここで、少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、5
0％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、又は95％のリガンドが、免疫
細胞上の該共刺激性分子に結合することができ、例えばフローサイトメトリーにおいて、
例えば抗-イディオタイプ抗体、又は蛍光物質標識リガンドを用いて測定可能となるよう
に配置する。特定の実施態様において、組成物はビーズの形態をとり、例えば、実質的に
球状である。特定の実施態様において、組成物は主たるシグナル伝達ドメイン及び共刺激
性分子に対するリガンドを含み、ここで、両リガンドは、該組成物の全体にわたって無作
為に分布する。他の実施態様において、組成物は主たるシグナル伝達ドメイン及び共刺激
性分子に対するリガンドを含み、ここで、両リガンドは、組成物の表面、例えば、疎水性
/親水性界面に流体として存在する。
【００２８】
（4.1. リガンド及びポリマーを含む組成物）
主リガンド及び共刺激性リガンドを含む組成物は、例えば主リガンド及び共刺激性リガ
ンドを一緒にしてミセル中に保持する結合剤として作用するポリマーをさらに含むことが
できる。そのようなポリマーは、例えば、両親媒性ポリマー又はヒドロゲルとすることが
できる。
【００２９】
特定の実施態様において、組成物はヒドロゲルを含む。細胞培養に適した任意のヒドロ
ゲルを使用することができる。好ましい実施態様において、組成物は自己集合性ヒドロゲ
ルを含む。本明細書に提供される方法において使用することができる自己集合性ヒドロゲ
ルは、例えば、L-又はD-オリゴラクテート鎖で修飾された架橋デキストランミクロスフェ
アを含む（例えば、van Tommeらの文献「オリゴラクテートで継ぎ枝したデキストランミ
クロスフェアの自己集合による巨視的なヒドロゲル（Macroscopic hydrogels by self-as
sembly of oligolactate-grafted dextran microspheres）」Biomacromolecules 9(1):15
8-165 （2008）を参照されたい）；リガンドをヒドロゲルに加えることは、リガンドを含
む溶液にミクロスフェアを混合することにより達成できる。また、ミクロスフェアは例え
ば、ポリビニルアルコール（PVA）及びポリ（ビニルピロリドン）（PVP）も含むことがで
きる。
【００３０】
任意の自己集合性ヒドロゲルが使用できるのに対し、好ましい実施態様はポリグルタメ
ート鎖及びビタミンE部分を含む両親媒性ポリマー、例えばFlamel Technologies社（Vene
ssieux、France）製MEDUSA（登録商標）ヒドロゲルの使用を組み込んでいる。組成物は、
リガンドを含むヒドロゲルのミクロスフェアが形成されるように、水和ヒドロゲルと第一
及び第二のリガンドとを合わせることにより形成される。使用できる他の両親媒性ポリマ
ーは、例えば、親水性部分としてポリエチレングリコール並びに疎水性部分としてセチル
トリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）及びナトリウムパーフルオロヘキサナート（FC
(5)又はFC(7)）鎖の組み合わせ（Kangらの文献、Biomacromolecules 4(2):360-365（2003
）を参照されたい；ポリ(2-アクリルアニドヘキサデシルスルホン酸（PAMC18S）；親水性
部分としてのポリエチレングリコール並びに疎水性部分としてのデサミノチロシル-チロ
シンエチルエステル（DTE）及びデサミノチロシル-チロシン（DT）の組み合わせ（Kahnら
の文献、J. Funct. Biomater. 3(4):745-759（2012）を参照されたい）を含む両親媒性ポ
リマーを含む。
【００３１】
（4.2. リガンド及び疎水性化合物を含む組成物）
特定の実施態様において、組成物は疎水性化合物、例えば、疎水性部分又は疎水性液体
を含む。組成物は疎水性化合物及びリガンドを含むことができ、ここで、リガンドは疎水
性化合物と共有結合的に結合してはいない。組成物は疎水性化合物及びリガンドを含むこ
とができ、ここで、1つ又は両方のリガンドは、それぞれ疎水性化合物と共有結合的に結
合している。
【００３２】
疎水性液体は、乳化すると、リガンドを含むのに適したミセルを自然に形成する。ミセ
ルを形成するのに適した疎水性化合物には、油、又は液体フッ化炭素、例えばパーフルオ
ロオクチルブロミド、パーフルブロンなどが挙げられる。好ましい実施態様において、疎
水性化合物はリガンドを変性させるようには作用しない。
【００３３】
特定の実施態様において、1つ又は両方のリガンドが、疎水性部分に共有結合により結合
し、融合タンパク質又は免疫コンジュゲートを形成することができ；複数のそのような融
合タンパク質又は免疫コンジュゲートは、疎水性部分が水溶液中で自己集積するときに自
然にミセルを形成することができる。抗体のようなリガンドは、例えば、例としてポリエ
チレングリコール（PEG）及びジアシル脂質を含む疎水性化合物に結合することができる
。具体的な実施態様において、ジアシル脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（PE）
である。具体的な実施態様において、PEG-PEはp-ニトロフェニルカルボニル（pNP）リン
カーを介してリガンドにコンジュゲートされ、例えばpNP-PEG-PE-リガンドコンジュゲー
トを与える。pNP-PEG-PE-リガンド免疫コンジュゲートを含む免疫ミセルは、遊離NH2基を
含むリガンドから、リガンドをpH8.0〜9.5でpNP-PEG-PEと混合することにより生産するこ
とができる；Torchlinらの文献「免疫ミセル：溶解性の低い薬物のための標的化された医
薬担体（Immunomicelles: Targeted pharmaceutical carriers for poorly soluble drug
s）」PNAS 100(10):6039-6044（2003）を参照されたい。
【００３４】
（4.3. リガンド及びアルブミンを含む組成物）
特定の実施態様において、組成物はアルブミン、例えばヒト血清アルブミンを含む。ア
ルブミンは本来のアルブミン（例えば、変性していないアルブミン）としてもよいし、変
性したアルブミンとしてもよい。変性したアルブミンは本来のアルブミンから、例えば本
来のアルブミンに機械的剪断力をかけることにより、例えば超音波処理により、又は本来
のアルブミンを含む溶液をジェットスプレー又は類似の装置に通すことにより、生産する
ことができる。
【００３５】
アルブミン及びリガンドを例えば溶液中で、例えば撹拌することにより、激しくかき混
ぜることにより、ボルテックスにかけることにより、又は2つの溶液を完全に合わせる他
の方法により、互いに混合することができる。
【００３６】
アルブミンをリガンドと合わせる前に、まず疎水性化合物と合わせることができる。好
ましくは、疎水性化合物をミクロスフェアの内側に、かつアルブミンをミクロスフェアの
外側に有する疎水性化合物のミクロスフェアの形成を引き起こすような方法で、アルブメ
ン（albumen）及び疎水性化合物を合わせる。そのようなアルブメンで被覆したミクロス
フェアを生産するための方法が、例えば国際特許出願PCT/US2012/037137号及び米国特許
第5,498,421号に記載されており、これらの開示はその全てが参照により本明細書に組み
込まれている。一実施態様において、アルブミンはまず疎水性化合物、例えば、油、例え
ば、ダイズ油と複合体を形成するが、この複合体形成は、1×体積の1％〜5％のアルブミ
ン水溶液を、1×〜4×体積の油で覆い、温度を10℃〜45℃、例えば20℃にし、30秒超音波
処理することによって行われる。別の実施態様において、アルブミンはまず疎水性化合物
、例えば液体フッ化炭素、例えばパーフルオロオクチルブロミドと複合体を形成するが、
この複合体形成は、1×体積の1％〜5％のアルブミン水溶液を、1×〜4×体積のフッ化炭
素で覆い、温度を10℃〜45℃、例えば20℃にし、30秒超音波処理することによって行われ
る。各々の場合で、生じたエマルションを生理食塩水溶液で希釈することができる。
【００３７】
一度そのようなミクロスフェアが生産されたら、撹拌し、激しくかき混ぜ、又はボルテ
ックスにかけることにより、リガンドとミクロスフェアとの複合体を形成させることがで
きる。リガンド/アルブミン複合体の大きさは、アルブミン/疎水性化合物ミクロスフェア
との複合体形成に使用するリガンド量を変化させることにより変更することができる。リ
ガンドは、例えば、約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、
8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、又は15.0 mg/mLに、約20％足し引きした量で
使用することができる。特定の実施態様において、集積体の中で、アルブミンと複合体を
形成したリガンド、又はアルブミン/疎水性化合物ミクロスフェアは、それぞれの標的に
結合する能力を維持する。
【００３８】
（4.4. Tリンパ球）
本明細書のいずれかの実施態様の好ましい実施態様において、本明細書に提供される方
法に従って増殖させる免疫細胞は、T細胞（Tリンパ球とも称する）である。限定されない
例において、T細胞はCD4＋ T細胞、CD8＋ T細胞、又はTreg細胞である。T細胞はT細胞前
駆細胞からのT細胞の発達の系譜に沿って、任意の段階で使用することができる。
【００３９】
本明細書に記載された方法において使用するためのT細胞は、対象から取得することが
でき、又は存在するT細胞の培養物から取得することができる。対象から取得されるT細胞
は、例えば、哺乳類、例えばヒト、イヌ、ネコ、齧歯類、及びそのトランスジェニック種
から得ることができる。T細胞は、例えば、末梢血、胎盤血、臍帯血、骨髄、リンパ節組
織、脾臓組織、腫瘍などから得ることができる。末梢血からの細胞は、例えば白血球フェ
レーシスにより分離することができる。T細胞は、任意に赤血球を溶解し、末梢血白血球
を単球から、例えば、PERCOLL（商標）勾配を通じて遠心分離することにより、末梢血白
血球から得ることができる。CD28＋、CD4＋、CD8＋、CD28RA＋、かつCD28RO＋ T細胞など
の特定のT細胞の亜集団、又は後に記載するいずれかの他のT細胞集団は、ポジティブ及び
/又はネガティブセレクション技術により白血球から単離することができる。ポジティブ
又はネガティブセレクションのいずれかについての好ましい方法は、ポジティブに選択さ
れることとなる、又はネガティブに選択されることとなる細胞上に存在する細胞表面マー
カーに方向づけられた1以上のモノクローナル抗体を利用し、負の磁気的免疫接着を介し
て細胞を選別することである。ポジティブセレクション又はネガティブセレクションのい
ずれかのための抗体の適切な組み合わせは、当業者には明らかである。
【００４０】
T細胞はT細胞の培養に適切な条件下で、例えば動物血清（例えば牛胎仔血清）及び抗生
物質（例えば、ペニシリンストレプトマイシン）を含む、増殖及び生存能に不可欠な因子
を含み得る適切な培地（例えば、最少必須培地又はRPMI培地1640）を含む条件下で培養す
ることができる。T細胞は典型的には、増殖を支えるのに必要な条件下、例えば適切な温
度（例えば、37℃）及び雰囲気（例えば、5％CO2が添加された空気）の下で維持される。
【００４１】
本明細書に提供される方法を用いて培養し、増殖させるT細胞は、例えば、CD45RO−、C
D45RA＋、CCR7＋、CD62L＋、IL-2Rβ−、かつCD95−とすることができる。細胞集団は、
本明細書に提供される方法に従って培養し、増殖させることができ、少なくとも20％、25
％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％
、又は95％の該集団中の細胞が、CD45RO−、CD45RA＋、CCR7＋、CD62L＋、IL-2Rβ−、か
つCD95− T細胞である。
【００４２】
特定の他の具体的な実施態様において、T細胞はCD45RO−、CD45RA＋、CCR7＋、CD62L＋
、IL-2Rβ＋、かつCD95＋である。細胞集団を本明細書に提供される方法に従って培養し
、増殖させることができ、ここで、少なくとも20％、25％、30％、35％、40％、45％、50
％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、又は95％の該集団中の細胞は、
CD45RO−、CD45RA＋、CCR7＋、CD62L＋、IL-2Rβ＋、かつCD95＋ T細胞である。
【００４３】
特定の他の具体的な実施態様において、T細胞はCD45RO＋、CD45RA−、CCR7＋、CD62L＋
、IL-2Rβ＋、かつCD95＋である。細胞集団を本明細書に提供される方法に従って培養し
、増殖させることができ、ここで、少なくとも20％、25％、30％、35％、40％、45％、50
％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、又は95％の該集団中の細胞は、
CD45RO＋、CD45RA−、CCR7＋、CD62L＋、IL-2Rβ＋、かつCD95＋ T細胞である。
【００４４】
特定の他の具体的な実施態様において、T細胞はCD45RO＋、CD45RA−、CCR7−、CD62L−
、IL-2Rβ＋、かつCD95＋である。細胞集団を本明細書に提供される方法に従って培養し
、増殖させることができ、ここで、少なくとも20％、25％、30％、35％、40％、45％、50
％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、又は95％の該集団中の細胞は、
CD45RO＋、CD45RA−、CCR7−、CD62L−、IL-2Rβ＋、かつCD95＋ T細胞である。
【００４５】
特定の他の具体的な実施態様において、T細胞はCD45RO＋、CD45RA＋、CCR7−、CD62L−
、IL-2Rβ＋、かつCD95＋である。細胞集団を本明細書に提供される方法に従って培養し
、増殖させることができ、ここで、少なくとも20％、25％、30％、35％、40％、45％、50
％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、又は95％の該集団中の細胞は、
CD45RO＋、CD45RA＋、CCR7−、CD62L−、IL-2Rβ＋、かつCD95＋ T細胞である。
【００４６】
特定の具体的な実施態様において、T細胞はCD3＋、CD8＋、CD27＋、CD28＋、CD45RO−
、CD45RA＋、CCR7＋、CD62L＋、IL-2Rβ＋、IL-7R＋、かつCD95−である。細胞集団を本
明細書に提供される方法に従って培養し、増殖させることができ、ここで、少なくとも20
％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％
、90％、又は95％の該集団中の細胞は、CD3＋、CD8＋、CD27＋、CD28＋、CD45RO−、CD45
RA＋、CCR7＋、CD62L＋、IL-2Rβ＋、IL-7R＋、かつCD95− T細胞である。他の具体的な
実施態様において、T細胞はCCR7、CXCR4、及びL-セレクチンのうちの1以上を発現する。
【００４７】
他の具体的な実施態様において、T細胞はCCR7及びL-セレクチンを発現していない。細
胞集団を本明細書に提供される方法に従って培養し、増殖させることができ、ここで、少
なくとも20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、
80％、85％、90％、又は95％の該集団中の細胞は、CCR7及びL-セレクチンを発現していな
い。
【００４８】
他の具体的な実施態様において、T細胞はCCR9＋、α4β7＋、CCR7＋、かつL-セレクチ
ン低発現 又はL-セレクチン−のいずれかである。細胞集団を本明細書に提供される方法
に従って培養し、増殖させることができ、ここで、少なくとも20％、25％、30％、35％、
40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、又は95％の該集
団中の細胞は、CCR9＋、α4β7＋、CCR7＋、かつL-セレクチン低発現又はL-セレクチン−
のいずれかのT細胞である。
【００４９】
他の具体的な実施態様において、T細胞はCCD4＋、CCD10＋、LFA-1＋、かつα4β1＋で
ある。細胞集団を本明細書に提供される方法に従って培養し、増殖させることができ、こ
こで、少なくとも20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％
、75％、80％、85％、90％、又は95％の該集団中の細胞は、CCD4＋、CCD10＋、LFA-1＋、
かつα4β1＋のT細胞である。
【００５０】
具体的な実施態様において、T細胞はセントラルメモリーT細胞であるか、又は約20％、
25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90
％、若しくは95％のT細胞がセントラルメモリーT細胞である。別の具体的な実施態様にお
いて、T細胞はセントラルメモリーステムT細胞であるか、又は約20％、25％、30％、35％
、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、若しくは95％
のT細胞がセントラルメモリーステムT細胞である。
【００５１】
特定の実施態様において、T細胞を、本明細書に提供される方法に従う培養の間の少な
くとも一部の期間、又は全期間にわたってグリコーゲンシンターゼキナーゼ-3β（GSK3β
）の阻害剤と接触させた。具体的な実施態様において、GSK3βの阻害剤はTWS119である。
【００５２】
他の実施態様において、T細胞を本明細書に提供される方法に従う培養における増殖の
間の少なくとも一部の期間、又は全期間にわたって外因性IL-2、IL-7、IL-21、及び/又は
IL-15と接触させた。すなわち、本明細書に記載される免疫細胞、例えばT細胞を増殖させ
るための方法の特定の実施態様において、該方法は、増殖の間の少なくとも一部の期間、
又は全期間にわたって免疫細胞を外因性のIL-2、IL-7、IL-21、及び/又はIL-15と接触さ
せることを含む。
【００５３】
本明細書に記載される任意の実施態様において、本明細書に提供される方法に従う培養
の間の少なくとも一部の期間、又は全期間にわたって、免疫細胞をT細胞増殖の非特異的
刺激因子、例えばホルボールエステル、例えば12-O-テトラデカノイルホルボール-13-ア
セタート（TPA；ホルボール-12-ミリスタート-13-アセタート（PMA）とも称する）にさら
に接触させる。
【００５４】
本明細書に記載される任意の実施態様において、主たるシグナル伝達リガンド及び共刺
激性リガンドを用いて免疫細胞を増殖させると、該免疫細胞を約107個〜約108個、約108
個〜約109個、約109個〜1010個、約1010個〜約1011個、約1011個〜約1012個又は約1012個
〜約1013個含む細胞集団を生じる。
【００５５】
（4.5. T細胞の増殖）
T細胞及び先に記載したリガンド含有組成物は、例えばT細胞の培養に適した容器の培養
シャーレ中で互いに接触するように配置することができる。組成物がミクロスフェアの形
態で存在する実施態様において、T細胞のミクロスフェアに対する比率は、10:1〜1:10,00
00の内のいずれの比でもよく、例えば限定はしない例は、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50
、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800
、1:900、1:1000、又は1:10,000である。T細胞の増殖は、例えば1日、2日、3日、4日、5
日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19
日、20日、21日、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日、29日、若しくは30日、又
はそれ以上の日数続行することができる。増殖の程度は例えば細胞計数計、フローサイト
メトリーなどを用いて細胞試料を数えることにより、増殖の間、1以上の時点で分析する
ことができる。増殖速度は、コールターカウンターを用いるなどして、例えばT細胞の大
きさを調べたり、又は体積を測定したりすることによって決定することができる。休止中
のT細胞は、約6.8ミクロンの平均径を有する。最初の活性化及び刺激に続き、刺激性リガ
ンドの存在下でT細胞の平均径は第4日目までに12ミクロンを超えるまでに増加することが
期待され、およそ第6日目までに減少を始める。
【００５６】
最初の活性化及び刺激に続いて、T細胞集団の刺激を長期的に維持するために、曝露期
間の後、リガンド含有組成物、例えばマイクロキャリアからT細胞を分離することができ
、活性化刺激（例えば、抗-CD3抗体）からT細胞を分離することができる。ここで、培養
期間の間中、T細胞及び共刺激性リガンドの間の接触は維持される。T細胞の増殖速度は定
期的に（例えば、毎日）、先に記載の通りに、例えばコールターカウンターを用いてT細
胞の大きさを調べる、又は体積を測定することによってモニタリングすることができる；
平均細胞径がおよそ8ミクロンまで低下した後、T細胞を再び活性化し、再び刺激してさら
なる増殖を誘導することができる。あるいは、T細胞の増殖速度及びT細胞の再刺激のため
の時間は、活性化されたT細胞上に誘導される細胞表面分子、例えばB7-1、B7-2の存在を
検定することによりモニタリングすることができ；最初の又は先の刺激後の発現水準、又
は刺激されていない細胞における発現水準と比較したB7-1の発現水準の低下は、再刺激の
ための時間を示し得る。あるいは、T細胞の増殖速度及びT細胞の再刺激のための時間は、
栄養消費量、例えばグルコース消費量を検定することによりモニタリングすることができ
る。
【００５７】
CD4＋又はCD8＋ T細胞集団の長期刺激による誘導は、T細胞を主リガンド及び共刺激性
リガンド、例えば抗-CD3抗体及び抗-CD28抗体又はモノクローナル抗体ES5.2D8で1回以上
再活性化及び再刺激し、CD4＋又はCD8＋細胞集団の数を元のT細胞集団の約10倍〜約1000
倍まで増加させることにより達成することができる。主リガンド及び/又は共刺激性リガ
ンドのうちの1つ又は両方の存在下、又は不存在下で、当該技術分野で認識された方法に
従ってT細胞の培養を達成することができる。T細胞は血清を含まない培地、又は例えばヒ
ト血清、ウシ胎仔血清、仔ウシ血清などを含む培地中で培養することができる。T細胞を
培養する、例えば増殖させるための培地は、1以上のサイトカイン、例えばインターロイ
キン-s（IL-2）、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、及び/又はIL-21を含むことができる。その
ようなサイトカインは、培養中に1回、又は例えば1日、2日、3日、4日、若しくは5日おき
に加えることができる。
【００５８】
（4.6. 抗体）
主リガンド又は共刺激性リガンドのいずれか又は両方を、抗体とすることができる。抗
体は商業的取得源、例えば米国培養細胞系統保存機関、ABCAM（登録商標）社などから入
手することができる。また、抗体は標準的な技術により生産することもできる。本明細書
に提供される免疫細胞を増殖させるための方法において有用な抗体は、少なくとも2つの
エピトープ結合部位を有する例えばIgG、IgM、IgE、IgA、若しくはIgD、又はそれらの人
為的な変形体のいずれのクラスでもよい。
【００５９】
抗体は免疫原を用いて生産することができ、任意にキャリヤに連結したコンジュゲート
として提示され、典型的には免疫する動物に応じて、免疫投与量当たり約10 μg〜約500 
mgであり、好ましくは投与量当たり約50 μg〜約50 mgである。また、免疫調製物は希釈
剤の一部としてアジュバント、例えばフロイントアジュバント（CFA）、不完全フロイン
トアジュバント（IFA）、又はミョウバンを含むこともできる。そのようなアジュバント
は当該技術分野で周知であり、商業的に複数の取得源から入手可能である。
【００６０】
免疫原は、例えば本来のタンパク質（例えば、本来のCd3、本来のCD28、本来のCD137な
ど）又はそのような本来のタンパク質に基づいた合成ペプチドを含むことができる。可溶
性及び膜結合形態の両方のタンパク質又はペプチド断片が、免疫原としての使用に適して
いる。また、精製タンパク質は免疫原性又は可溶性を高めるために脂質又は糖類のような
非タンパク質性物質で共有結合的に、又は非共有結合的に修飾することもできる。全タン
パク質を免疫原として使用するために細胞性取得源から精製することもできる。ペプチド
を免疫原として使用することとなる場合、本来のタンパク質の配列、及びその免疫原部位
の配列は、例えばGenBank又はSwissProt公共配列データベース中で容易に入手できる。
【００６１】
精製タンパク質又はペプチド、例えばCD28タンパク質又はそのペプチド断片は、動物に
おいて免疫原性を示すキャリヤ、例えば、アルブミン、血清タンパク質（例えばグロブリ
ン及びリポタンパク質）、ポリアミノ酸、ウシ胎仔血清、ウサギ血清アルブミン、チログ
ロブリン、スカシ貝ヘモシアニン、卵オボアルブミン、及びウシγ-グロブリンにコンジ
ュゲートすることができる。当業者に公知の化学架橋剤を、そのようなコンジュゲート形
成に使用することができ、例えば、スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキ
サン-1-カルボキシラート（SMCC）、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（MBS）；N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート（SIAB
）、スクシンイミジル4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート（SMPB）、1-エチル-3-(3-ジ
メチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（EDC）；4-スクシンイミジル-オキシカル
ボニル-a-メチル-a-(2-ピリジルジチオ)-トルン（4-succinimidyl-oxycarbonyl-a-methyl
-a-(2-pyridyldithio)-tolune）（SMPT）、N-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プ
ロピオネート（SPDP）、スクシンイミジル6-[3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート]ヘキ
サノエート（LC-SPDP）などがある。
【００６２】
主リガンド又は共刺激性リガンドのいずれか又は両方に対する抗体は、ポリクローナル
抗体とすることができ、又はこれを含むことができる。ポリクローナル抗体は一般に、例
えばLindsten, T.らの文献（1993）J. Immunol. 151:3489-3499に記載された通りに、及
び他の公知の技術により、タンパク質の細胞外ドメイン及びアジュバントなどの適切な免
疫原を複数回皮下（sc）又は腹腔内（ip）注射することにより、動物体内で産生させるこ
とができる。
【００６３】
主リガンド又は共刺激性リガンドのいずれか又は両方に対する抗体は、モノクローナル抗
体とすることができ、又はこれを含むことができる。モノクローナル抗体は、例えばKohl
er及びMilsteinの文献（1975、Nature 256:495-497）に最初に記載されたハイブリドーマ
技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozborらの文献（1983）Immunol Today 4:72）、E
BV-ハイブリドーマ技術（Coleらの文献（1985）、「モノクローナル抗体及び癌治療（Mon
oclonal Antibodies and Cancer Therapy）」、Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96）、トリ
オーマ技術、又はファージディスプレイ技術（Marksらの文献、(1992) J. Biol Chem 160
07-16010）により作製される。また、本発明のモノクローナル抗体組成物は、組換えDNA
技術という当業者には周知の他の方法によっても生産することができる。組換えDNA技術
には、例えば特定の抗原特異性を有する抗体断片を同定し、単離するために開発され、モ
ノクローナル抗体の生産に利用できる「コンビナトリアル抗体ディスプレイ」法がある。
コンビナトリアルディスプレイ法は当該技術分野で公知である。例えば、Sastryらの文献
（1989）PNAS 86:5728；Huseらの文献（1989）Science 246:1275；及びOrlandiらの文献(
1989) PNAS86:3833を参照されたい。
【実施例】
【００６４】
（5. 実施例）
（5.1. 実施例1：抗-CD3と抗-CD28及びヒドロゲルを用いたT細胞の増殖）
T細胞を250 mLの対象の末梢血から得る。リンパ球画分を白血球フェレーシスにより取
得し、画分中の赤血球を溶解する。磁気ビーズにコンジュゲートされた、Beckman-Coulte
r社又はLifeSpan BioSciences社から入手した抗体を用いてCD4＋、CD45RA＋、かつCD62L
＋である細胞のポジティブセレクションを行い続いて、得られた細胞集団において磁気ビ
ーズにコンジュゲートされたLifeSpan BioSciences社から入手したCD45RO、IL-2Rβ、及
びCD95に対する抗体を用いてネガティブセレクションを行うことにより、T細胞集団を取
得する。CD45RO−、CD45RA＋、CCR7＋、CD62L＋、IL-2Rβ−、かつCD95−であるT細胞集
団を得る。
【００６５】
両方ともABCAM（登録商標）社から入手したCD3及びCD28に方向づけられた抗体を、それ
ぞれ主リガンド及び共刺激性リガンドとして選択する。これら抗体を溶液中、約100〜約5
00 μmのミクロスフェアを生産する条件下で、ポリグルタメート鎖及びビタミンEを含む
自己集合性ヒドロゲルであるMEDUSA（登録商標）ヒドロゲルと合わせる。抗体及びヒドロ
ゲルの相対量を慣例的に変化させることにより、大きさを修正することができる。
【００６６】
1×107個のT細胞を、ヒドロゲル/リガンドミクロスフェア存在下、細胞：ミクロスフェ
アの比率を約1:10として培養する。培養は28日間続けられ、7日ごとに随意に細胞計数を
行う。この手順により1×1010〜1×1011個の活性化T細胞を生じることが期待される。
【００６７】
（5.2. 抗-CD3と抗-CD28及び油とアルブミンを用いたT細胞の増殖）
抗-CD3及び抗-CD28抗体をリガンドとして選択し、実施例1に記載の通りにT細胞を作製
する。
【００６８】
1×体積の5％アルブミン水溶液を2×体積の油で覆い、水浴中アルブミン/油の温度を20
℃にする。アルブミン溶液及び油を30秒間超音波処理し、乳化させる。続いて、エマルシ
ョンを生理的に許容し得る生理食塩水溶液で1:5に希釈する。
【００６９】
10 mlの培養培地中の1×107個のT細胞を、リガンドを約1:1 v:vで含むエマルションの
存在下培養する。培養を28日間続行し、7日ごとに随意に細胞計数を行う。この手順によ
り1×1010〜1×1011個の活性化T細胞を生じることが期待される。
【００７０】
（5.3. 抗-CD3と抗-CD28及びパーフルオロカーボンとアルブミンを用いたT細胞の増殖）
抗-CD3及び抗-CD28抗体をリガンドとして選択し、実施例1に記載の通りにT細胞を作製
する。
【００７１】
1×体積の5％アルブミン水溶液を2×体積のパーフルオロオクチルブロミドで覆い、水
浴中アルブミン溶液/パーフルオロオクチルブロミドの温度を20℃にする。続いて、アル
ブミン溶液及びパーフルオロオクチルブロミドを30秒間超音波処理し、乳化させる。続い
て、エマルションを生理的に許容し得る生理食塩水溶液で1:5に希釈する。
【００７２】
10 mlの培養培地中の1×107個のT細胞を、リガンドを約1:1 v:vで含むエマルションの
存在下培養する。培養を28日間続行し、7日ごとに随意に細胞計数を行う。この手順によ
り1×1010〜1×1011個の活性化T細胞を生じることが期待される。
【００７３】
（5.4. 抗-CD3と抗-CD28及びパーフルオロカーボンを用いたT細胞の増殖）
抗-CD3及び抗-CD28抗体をリガンドとして選択し、実施例1に記載の通りにT細胞を作製
する。1×体積の抗-CD3及び抗-CD28抗体の両方を含む水溶液を、2×体積のパーフルオロ
オクチルブロミドで覆い、水浴中アルブミン溶液/パーフルオロオクチルブロミドの温度
を20℃にする。続いて、アルブミン溶液及びパーフルオロオクチルブロミドを30秒間超音
波処理し、乳化させる。続いて、エマルションを生理的に許容し得る生理食塩水溶液で1:
5に希釈する。
【００７４】
10 mlの培養培地中の1×107個のT細胞を、リガンドを約1:1 v:vで含むエマルションの
存在下培養する。培養を28日間続行し、7日ごとに随意に細胞計数を行う。この手順によ
り1×1010〜1×1011個の活性化T細胞を生じることが期待される。
【００７５】
（5.5. 抗-CD3及び抗-CD28並びに油を用いたT細胞の増殖）
抗-CD3及び抗-CD28抗体をリガンドとして選択し、実施例1に記載の通りにT細胞を作製
する。1×体積の抗-CD3及び抗-CD28抗体の両方を含む水溶液を、2×体積のダイズ油で覆
い、水浴中アルブミン溶液/パーフルオロオクチルブロミドの温度を20℃にする。続いて
、アルブミン溶液及び油を30秒間超音波処理し、乳化させる。続いて、エマルションを生
理的に許容し得る生理食塩水溶液で1:5に希釈する。
【００７６】
10 mlの培養培地中の1×107個のT細胞を、リガンドを約1:1 v:vで含むエマルションの
存在下培養する。培養を28日間続行し、7日ごとに随意に細胞計数を行う。この手順によ
り1×1010〜1×1011個の活性化T細胞を生じることが期待される。
本明細書に引用される全ての刊行物及び特許出願は、参照により本明細書に組み込まれ
る。理解を明確にする目的で例示及び例証することによりいく分の詳細を先に記載したが
、本明細書の教示に照らせば、添付する特許請求の範囲の精神又は範囲を逸脱することな
くある程度の変化及び修飾を加えることができることが、当業者にはすぐに明らかとなる
であろう。
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月13日(2019.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に実質的に記載された、新規な物、方法及び製造方法。
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月13日(2019.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
10 mlの培養培地中の1×107個のT細胞を、リガンドを約1:1 v:vで含むエマルションの存在下培養する。培養を28日間続行し、7日ごとに随意に細胞計数を行う。この手順により1×1010〜1×1011個の活性化T細胞を生じることが期待される。
本明細書に引用される全ての刊行物及び特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。理解を明確にする目的で例示及び例証することによりいく分の詳細を先に記載したが、本明細書の教示に照らせば、添付する特許請求の範囲の精神又は範囲を逸脱することなくある程度の変化及び修飾を加えることができることが、当業者にはすぐに明らかとなるであろう。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
免疫細胞集団の増殖を誘導するための方法であって、該免疫細胞の増殖を引き起こすように、該免疫細胞を、該免疫細胞上のT細胞受容体（TCR）/CD3複合体のリガンド、及び該免疫細胞上の共刺激性分子のリガンドと接触させることを含み、ここで、該リガンドは組成物内部に含まれ、該組成物は液相又は多構成相を含み、かつ該リガンドは該組成物の表面上に固定化されていない、前記方法。
（構成２）
前記組成物が、ヒドロゲル、アルブミン、又は疎水性分子を含む、構成1記載の方法。
（構成３）
前記組成物が、ビーズの形態をとる、構成1記載の方法。
（構成４）
前記組成物が、実質的に球状である、構成1記載の方法。
（構成５）
前記TCR/CD3複合体の前記リガンドが、高分子ポリペプチド結合剤である、構成1記載の方法。
（構成６）
前記リガンドが、CD3に対する抗体（抗-CD3）である、構成5記載の方法。
（構成７）
前記抗体が、ポリクローナルである、構成6記載の方法。
（構成８）
前記抗体が、モノクローナルである、構成6記載の方法。
（構成９）
前記抗体が、OKT3若しくはG19-4、又はそれらのCD3結合部分であるモノクローナル抗体である、構成6記載の方法。
（構成１０）
前記共刺激性分子のリガンドが、CD28のリガンドである、構成1記載の方法。
（構成１１）
前記共刺激性分子のリガンドが、CD28に対する高分子ポリペプチド結合剤である、構成1記載の方法。
（構成１２）
前記共刺激性分子のリガンドが、CD28に対する抗体（抗-CD28）である、構成1記載の方法。
（構成１３）
前記抗体が、ポリクローナルである、構成12記載の方法。
（構成１４）
前記抗体が、モノクローナルである、構成12記載の方法。
（構成１５）
前記共刺激性分子のリガンドが、CD9に対する抗体である、構成1記載の方法。
（構成１６）
前記抗体がポリクローナルである、構成15記載の方法。
（構成１７）
前記抗体が、モノクローナルである、構成15記載の方法。
（構成１８）
前記抗体が、ES5.2D8である、構成15記載の方法。
（構成１９）
前記共刺激性分子のリガンドが、B7-1若しくはB7-2、又はそれらのCD28結合断片である、構成1記載の方法。
（構成２０）
前記組成物が、ヒドロゲルを含む、構成1記載の方法。
（構成２１）
前記ヒドロゲルが、自己集合性ヒドロゲルである、構成20記載の方法。
（構成２２）
前記ヒドロゲルが、ポリグルタメート鎖及びビタミンEを含む、構成20記載の方法。
（構成２３）
前記リガンドが、前記ヒドロゲルの網状組織中に含まれる、構成20〜22のいずれか一項記載の方法。
（構成２４）
前記組成物が、油、脂質、又はフッ化炭素を含み、該油、脂質、又はフッ化炭素が液体である、構成1記載の方法。
（構成２５）
前記油、脂質、又はフッ化炭素が前記組成物中にナノメートル大、又はマイクロメートル大の小滴の形態で存在する、構成24記載の方法。
（構成２６）
前記リガンドが前記微細小滴の表面上の前記組成物中に存在する、構成24記載の方法。
（構成２７）
前記リガンドが抗-CD3及び抗-CD28である、構成26記載の方法。
（構成２８）
前記組成物がアルブミンを含む、構成1記載の方法。
（構成２９）
前記アルブミンが液体疎水性分子と複合体を形成する、構成28記載の方法。
（構成３０）
前記疎水性分子が油、脂質、又はフッ化炭素である、構成29記載の方法。
（構成３１）
前記アルブミンが前記疎水性分子の小滴の表面上に存在する、構成29又は30記載の方法。
（構成３２）
前記アルブミン及び前記リガンドが、前記疎水性分子の小滴の表面上に存在する、請求項29又は30記載の方法。
（構成３３）
前記アルブミンが、本来のものとは異なるアルブミンである、構成28〜32のいずれか一項記載の方法。
（構成３４）
前記アルブミンが変性している、構成28〜32のいずれか一項記載の方法。
（構成３５）
前記リガンドのうちの少なくとも1つが疎水性分子にコンジュゲートされている、請求項1記載の方法。
（構成３６）
前記CD3のリガンドが、疎水性分子にコンジュゲートされている、構成1記載の方法。
（構成３７）
前記共刺激性分子のリガンドが、疎水性分子にコンジュゲートされている、構成1記載の方法。
（構成３８）
前記リガンドが、CD28のリガンドである、構成1記載の方法。
（構成３９）
各前記リガンドがそれぞれ疎水性分子にコンジュゲートされている、構成1記載の方法。
（構成４０）
前記リガンドが抗-CD28及び抗-CD3である、構成39記載の方法。
（構成４１）
前記リガンドが抗-CD3及び、B7-1又はB7-2のうちの1つである、構成39記載の方法。
（構成４２）
前記組成物が疎水性分子を含み、前記リガンドのいずれも該疎水性分子とコンジュゲートされていない、構成1記載の方法。
（構成４３）
前記組成物が疎水性分子を含み、前記リガンドが抗-CD28及び抗-CD3であり、該抗-CD28又は該抗-CD3のいずれも、該疎水性分子とコンジュゲートされていない、構成39記載の方法。
（構成４４）
前記組成物が疎水性分子を含み、前記リガンドが抗-CD3及び、B7-1又はB7-2のうちの1つであり、かつ該抗-CD3又は該B7-1若しくはB7-2のうちの1つのいずれも、該疎水性分子とコンジュゲートされていない、構成39記載の方法。
（構成４５）
前記疎水性分子が水溶液中で自己集積し、ミセルを形成する、構成35〜44のいずれか一項記載の方法。
（構成４６）
前記疎水性分子が脂質である、構成35〜44のいずれか一項記載の方法。
（構成４７）
前記疎水性分子が、脂肪鎖である、構成35〜44のいずれか一項記載の方法。
（構成４８）
前記疎水性分子がフッ化炭素である、構成35〜44のいずれか一項記載の方法。
（構成４９）
前記アルブミンが、ヒト血清アルブミンである、構成2〜48のいずれか一項記載の方法。
（構成５０）
前記免疫細胞が、T細胞である、構成1〜49のいずれか一項記載の方法。
（構成５１）
前記T細胞がCD4＋ T細胞である、構成50記載の方法。
（構成５２）
前記T細胞がCD8＋ T細胞である、構成50記載の方法。
（構成５３）
前記T細胞が、Treg細胞である、構成50記載の方法。
（構成５４）
前記免疫細胞が、約100倍〜約100,000倍増殖する、構成1〜53のいずれか一項記載の方法。
（構成５５）
前記組成物が、主として2℃〜44℃で水性媒体と混和しない液相系又は多相系を含む、構成1〜54のいずれか一項記載の方法。
（構成５６）
前記組成物が均質化に際し、2℃〜44℃で水性媒体とのコロイド又はエマルションとして存在する、構成1記載の方法。
（構成５７）
前記免疫細胞をインターロイキン-2（IL-2）と接触させることをさらに含む、構成1〜56のいずれか一項記載の方法。
（構成５８）
前記免疫細胞をホルボールエステルと接触させることをさらに含む、構成1〜57のいずれか一項記載の方法。
【外国語明細書】
2019150049000001.pdf