(57)【要約】      （修正有）【課題】１，４−ジオキサン分解菌の検出・定量を、高精度で行うことのできるプライマーセットを提供することを課題とする。【解決手段】特定の塩基配列を含むプライマーセット、及び、プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、遺伝子増幅が生じたか否かによりｍｍｏＣ遺伝子を有する微生物が存在していたか否かを判定する１，４−ジオキサン分解菌の検出方法、並びにｍｍｏＣ遺伝子の増幅量から、ｍｍｏＣ遺伝子を有する微生物の定量を行う１，４−ジオキサン分解菌の定量方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１に記載の塩基配列を含むプライマーと、配列番号：２に記載の塩基配列を含むプライマーとからなるプライマーセット。
【請求項２】
配列番号：３に記載の塩基配列を含むプライマーと、配列番号：４に記載の塩基配列を含むプライマーとからなるプライマーセット。
【請求項３】
請求項１または２に記載のプライマーセットを用いたＰＣＲを行い、遺伝子増幅が生じたか否かによりｍｍｏＣ遺伝子を有する微生物が存在していたか否かを判定する１，４−ジオキサン分解菌の検出方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載のプライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲで得られたｍｍｏＣ遺伝子の増幅量から、ｍｍｏＣ遺伝子を有する微生物の定量を行うことを特徴とする１，４−ジオキサン分解菌の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲという。）に用いるプライマーセットと、このプライマーセットを利用して１，４−ジオキサン分解菌を検出、定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，４−ジオキサンは、下記式（１）で表される環状エーテルである。１，４−ジオキサンは、水や有機溶媒との相溶性に優れており、主に有機合成の反応溶剤として使用されている。
【０００３】
【化１】
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【０００４】
２０１０年度の日本国における１，４−ジオキサンの製造・輸入量は、約４５００ｔ／年であり、約３００ｔ／年が環境中へ放出されたと推測される。１，４−ジオキサンは、水溶性であるため、水環境中へ放出されると広域に拡散してしまう。また、揮発性、固体への吸着性、光分解性、加水分解性、生分解性がいずれも低いため、水中からの除去が困難である。１，４−ジオキサンは急性毒性及び慢性毒性を有する上、発がん性も指摘されていることから、１，４−ジオキサンによる水環境の汚染は、人や動植物に悪影響を及ぼすことが懸念されている。そのため、日本国では、水道水質基準（０．０５ｍｇ／Ｌ以下）、環境基準（０．０５ｍｇ／Ｌ以下）及び排水基準（０．５ｍｇ／Ｌ以下）により、１，４−ジオキサンの規制がなされている。
【０００５】
従来の活性汚泥法や活性炭吸着法等の処理方法では、水中から１，４−ジオキサンを十分に除去することができない。過酸化水素を添加してのオゾン処理（Ｏ３／Ｈ２Ｏ２）、紫外線照射下でのオゾン処理（Ｏ３／ＵＶ）、放射線や超音波照射下でのオゾン処理等、複数の物理化学的な酸化方法を併用する促進酸化法においてのみ、１，４−ジオキサン処理の有効性が確認されている。しかし、促進酸化法はイニシャルコストおよびランニングコストが高いことから普及に至っていない。また、非特許文献１では、１，４−ジオキサン以外の有機物が存在すると、促進酸化法による１，４−ジオキサンの処理効率が低下すると報告されている。
【０００６】
低コストかつ安定的に１，４−ジオキサンを含む水を処理する方法が求められており、特許文献１、非特許文献２では、１，４−ジオキサン分解菌による生物処理が提案されている。生物処理は、１，４−ジオキサン分解菌を、曝気槽、土壌、地下水等へ投入し、これらに含まれる１，４−ジオキサンを分解する方法である。しかし、１，４−ジオキサン分解菌の菌体量は日々変動する。１，４−ジオキサン分解菌が減少すると処理能力が低下するため、１，４−ジオキサン分解菌の菌体量を把握し、菌体量が少なければ追加する必要がある。
【０００７】
ここで、非特許文献３、４には、１，４−ジオキサン分解菌が有するＴＨＦモノオキシゲナーゼが１，４−ジオキサンの分解に関与していることが報告されている。
本発明者らは、分解菌が有する１，４−ジオキサン分解に関与する遺伝子のなかで、ＴＨＦモノオキシゲナーゼを構成するタンパク質の一つであるＭｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＭｍｏＢ／ＤｍｐＭをコードするｔｈｍＣ遺伝子により、分解菌を検出、定量することができることを報告している（特許文献２）。
【０００８】
ここで、ＴＨＦモノオキシゲナーゼは、多様な炭化水素類の初発酸化を担っている可溶性鉄（ＩＩ）モノオキシゲナーゼ（ＳＤＩＭＯ）の一種に分類されており、ＳＤＩＭＯには他にメタン／プロパンモノオキシゲナーゼ等が含まれている（非特許文献５）。
そして、ｔｈｍ遺伝子群を有さない１，４−ジオキサン分解菌の存在が確認されており、これらｔｈｍ遺伝子群を有さない１，４−ジオキサン分解菌が有する分解遺伝子は特定されていない。そのため、ｔｈｍ遺伝子群を有していない分解菌の検出、定量方法が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００８−３０６９３９号公報
【特許文献２】特開２０１７−６０６９号公報
【００１０】
【非特許文献１】K. KOSAKA, H. YAMADA, S. MATSUI, and K. SHISHIDA: The effects of the co-existing compounds on the decomposition of micropollutants using the ozone/hydrogen peroxide process. Water Sci. Technol., 42, pp.353-361, 2000.
【非特許文献２】清和成、池道彦：１，４−ジオキサン分解菌を用いた汚染地下水の生物処理・浄化技術の可能性，用水と廃水，Vol.53, No.7, 2011.
【非特許文献３】H. MASUDA, K. McCLAY, R. J. STEFFAN, and G. J. ZYLSTRA: Biodegradation of tetrahydrofuran and 1,4-dioxane by soluble diiron monooxygenase in Pseudonocardia sp. strain ENV478. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 22(5), pp. 312-316, 2012.
【非特許文献４】A. GROSTERN, C. M. SALES, W.-Q. ZHUANG, O. ERBILGIN, and L. ALVAREZ-COHEN: Glyoxylate metabolism is a key feature of the metabolic degradation of 1,4-dioxane by Pseudonocardia dioxanivorans strain CB1190. Appl. Environ. Microbiol., 78(9), pp. 3298-3308, 2012.
【非特許文献５】N. V. COLEMAN, N. B. BUI, and A. J. HOLMES:  Soluble di-iron monooxygenase gene diversity in soils, sediments and ethene enrichments. Environ. Microbiol., 8(7), pp. 1228-1239, 2006.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
１，４−ジオキサン分解菌の検出・定量を、高精度で行うことのできるプライマーセットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
１．配列番号：１に記載の塩基配列を含むプライマーと、配列番号：２に記載の塩基配列を含むプライマーとからなるプライマーセット。
２．配列番号：３に記載の塩基配列を含むプライマーと、配列番号：４に記載の塩基配列を含むプライマーとからなるプライマーセット。
３．１．または２．に記載のプライマーセットを用いたＰＣＲを行い、遺伝子増幅が生じたか否かによりｍｍｏＣ遺伝子を有する微生物が存在していたか否かを判定する１，４−ジオキサン分解菌の検出方法。
４．１．または２．に記載のプライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲで得られたｍｍｏＣ遺伝子の増幅量から、ｍｍｏＣ遺伝子を有する微生物の定量を行うことを特徴とする１，４−ジオキサン分解菌の定量方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のプライマーセットにより、１，４−ジオキサン分解菌が有する１，４−ジオキサン分解に関与する遺伝子である、ＳＤＩＭＯの一種であるＭｅｔｈａｎｅ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｃをコードすると推定されるｍｍｏＣ遺伝子を特異的に増幅することができる。
ｍｍｏＣ遺伝子が増幅されることで、１，４−ジオキサン分解菌が存在しているかを判定することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法でのＣｔ値から、サンプル中に存在する１，４−ジオキサン分解菌の菌体量を、精度よく推定することができる。１，４−ジオキサン分解菌の菌体量を迅速に精度よく定量することができるため、菌体量が少なければ、すぐに１，４−ジオキサン分解菌を追加することができ、１，４−ジオキサンの処理能力を安定して維持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実験２におけるＰＣＲプライマーセット候補１の増幅結果を示す図。
【図２】実験２におけるＰＣＲプライマーセット候補３の増幅結果を示す図。
【図３】実験３におけるＰＣＲプライマーセット候補１を用いたリアルタイムＰＣＲのＤＮＡ濃度（−ｌｏｇ希釈倍率）とＣｑ値との関係を示す図。
【図４】実験３におけるＰＣＲプライマーセット候補３を用いたリアルタイムＰＣＲのＤＮＡ濃度（−ｌｏｇ希釈倍率）とＣｑ値との関係を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１，４−ジオキサン分解菌（以下、分解菌という。）は自然界に存在しており、１，４−ジオキサンで汚染された汚泥等を、炭素源として１，４−ジオキサンのみを含む培地で培養することでスクリーニングすることができる。分解菌は、これまで１０数種の存在が報告されているが、本発明者らが保有しているＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｄ６、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｄ１１は、ｔｈｍ遺伝子群を有していない。なお、以下では各菌をそれぞれＤ６株、Ｄ１１株という。
【００１６】
本発明者らは、ｔｈｍ遺伝子群を有さない分解菌が有する１，４−ジオキサン分解に関与すると推定される遺伝子のなかで、Ｍｅｔｈａｎｅ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｃをコードすると推定されるｍｍｏＣ遺伝子により、ｔｈｍ遺伝子群を有さない分解菌を検出、定量することができることを見出した。
具体的には、フォワードプライマーとして配列番号１に示す塩基配列（５’−ＣＣＡＣＡＣＧＧＴＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＣ−３’）を含むプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２に示す塩基配列（５’−ＧＣＡＣＡＧＧＴＡＧＧＣＧＴＣＡＴＡＧＡＧ−３’）を含むプライマーとからなるプライマーセット、または、フォワードプライマーとして配列番号３に示す塩基配列（５’−ＧＧＣＡＧＣＧＴＣＣＴＴＡＣＡＴＣＡＡＧ−３’）を含むプライマーと、リバースプライマーとして配列番号４に示す塩基配列（５’−ＴＧＡＡＣＡＴＣＣＣＣＣＡＣＴＧＡＡＡＣ−３’）を含むプライマーとからなるプライマーセットを用いたＰＣＲにより、ｍｍｏＣ遺伝子を増幅することができ、１，４−ジオキサン分解菌を検出することができる。
【００１７】
ＰＣＲ法としては、ＭＰＮ−ＰＣＲ法、競合的ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法のいずれを用いてもよいが、迅速に高精度な結果が得られることから、リアルタイムＰＣＲ法が好ましい。リアルタイムＰＣＲ法は、増幅産物を蛍光によって検出する。検出方法としては、蛍光を発する色素をインターカレートするインターカレーター法や蛍光色素を結合させる蛍光プローブ法等を特に制限することなく利用することができる。
すなわち、ｍｍｏＣ遺伝子が増幅・検出されることにより、サンプル中に、ｍｍｏＣ遺伝子を有する微生物である１，４−ジオキサン分解菌が存在しているかを判定することができる。
【００１８】
ここで、リアルタイムＰＣＲ法は、ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅量をリアルタイムでモニタリングして解析する手法である。リアルタイムＰＣＲ法により、サンプルに含まれる特定の塩基配列を有するＤＮＡの濃度の定量分析を行うことができる。
リアルタイムＰＣＲ法により、特定のＤＮＡが増幅され、蛍光検出可能な量に達すると、急激な蛍光強度の増加が観察される。このときのサイクル数をＴｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ（以下、Ｃｔ値という。）という。ＰＣＲ法では１サイクルごとにＤＮＡが２倍となり、ＤＮＡは指数関数的に増幅する。サンプル中に含まれる当初ＤＮＡ量が多いほど、少ないサイクル数で蛍光検出可能な量に達するため、Ｃｔ値は小さくなる。
Ｃｔ値と当初ＤＮＡ量の常用対数との間には直線関係があり、これを基に検量線を作成することができる。すなわち、異なるＤＮＡ濃度を有する複数個のサンプルのリアルタイムＰＣＲ法でＣｔ値を測定し、Ｃｔ値を縦軸に、ＰＣＲ開始前の当初ＤＮＡ量を横軸にプロットすることで、検量線を作成できる。この検量線は、試料のＤＮＡ濃度とＣｔ値との関係を表し、濃度未知のサンプルのＣｔ値をリアルタイムＰＣＲ法により測定することで、サンプルに含まれるＤＮＡ量を決定することができる。
すなわち、定量されたｍｍｏＣ遺伝子量と１，４−ジオキサン分解菌の菌体量との間には直線関係があるため、リアルタイムＰＣＲ法で定量された、ｍｍｏＣ遺伝子量から、サンプル中の１，４−ジオキサン分解菌の菌体量を推定することができる。
【００１９】
分解菌は、食物連鎖でより上位に位置する生物に捕食されたり、増殖したりするため、菌体量は日々変動する。分解菌による１，４−ジオキサンの浄化処理において、その処理能力は菌体量に比例し、菌体量が減少すると処理能力が低下してしまう。リアルタイムＰＣＲ法で、ｍｍｏＣ遺伝子のＣｔ値を観測することで、分解菌の菌体量を迅速に、かつ高精度で定量することができるため、菌体量が１，４−ジオキサン処理に必要な量よりも少ないときには、１，４−ジオキサン分解菌を追加することで、処理能力を増大することができる。
次に、本発明を実施例に基づいて、さらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２０】
「実験１：プライマーの設計」
Ｄ６株、Ｄ１１株について、ドラフトゲノムデータが取得されている。総塩基配列は、Ｄ６株が７．４Ｍｂｐ、Ｄ１１株が８．６Ｍｂｐである。Ｒａｐｉｄ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  Ｓｕｂｓｙｓｔｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（ＲＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｒａｓｔ．ｎｍｐｄｒ．ｏｒｇ／）を用いて遺伝子推定を行い、ＳＤＩＭＯ遺伝子を探索した結果、Ｄ６株、Ｄ１１株は、ＳＤＩＭＯに分類される可溶性メタンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子群を有していたが、ＴＨＦ／１，４−ジオキサンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子群を有していなかった。可溶性メタンモノオキシゲナーゼは、ＴＨＦ／１，４−ジオキサンモノオキシゲナーゼとは塩基・アミノ酸配列が大きく異なっていることから、Ｄ６株、Ｄ１１株は、ｔｈｍＣ遺伝子をターゲットとするモニタリング手法が適用できなかったと推察される。
【００２１】
一方、可溶性メタンモノオキシゲナーゼが、Ｄ６株、Ｄ１１株による１，４−ジオキサン分解に関与しているものと推察されることから、可溶性メタンモノオキシゲナーゼ遺伝子の塩基配列を対象として、Ｐｒｉｍｅｒ３プログラム（T. KORESSAAR, M. REMM: Bioinformatics, 23, 10, 1289-1291 (2007) “Enhancements and modifications of primer design program Primer3”、A. UNTERGASSER, I. CUTCUTACHE, T. KORESSAAR, J. YE, B.C. FAIRCLOTH, M. REMM, S.G. ROZEN: Nucleic Acids Res. 40, 15, e115 (2012) “Primer3 - new capabilities and interfaces”）を用いてリアルタイムＰＣＲプライマー候補を抽出した。次に、Ｐｒｉｍｅｒ−Ｂｌａｓｔプログラム（J. YE, G. COULOURIS, I. ZARETSKAYA, I. CUTCUTACHE, S. ROZEN, T.L. MADDEN: BMC Bioinformatics, 13, 134 (2012) “Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction”）を用いて、プライマー候補の配列とＧｅｎＢａｎｋ登録配列との相同性を検索し、特異性の高いＰＣＲプライマーセット候補を設計した。
設計したＰＣＲプライマーセット候補を、下記表１に示す。なお、ＰＣＲプライマーセット候補１〜３は、両菌株に共通であり、候補４はＤ６株のみ、候補５はＤ１１株のみの配列から抽出された。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
「実験２：プライマーの選定」
Ｄ６株、Ｄ１１株と、ｔｈｍＣ遺伝子を有する１，４−ジオキサン資化菌であるＰｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐ．Ｄ１７、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐ．Ｎ２３、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｄｉｏｘａｎｉｖｏｒａｎｓ  ＣＢ１１９０、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ａｅｔｈｅｒｉｖｏｒａｎｓ  ＪＣＭ１４３４３、ＴＨＦを一次基質とする１，４−ジオキサン共代謝菌であるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ  Ｔ１、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ  Ｔ５、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ａｃａｃｉａｅ  ＪＣＭ１６７０７、ＴＨＦは分解可能であるが１，４−ジオキサンを分解しないＰｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｏｘｙｄａｎｓ  ＪＣＭ３３９２、１，４−ジオキサンもＴＨＦも分解しないＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ＪＣＭ１３１１、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ  ＪＣＭ３２０５を用いて、設計した各ＰＣＲプライマーセット候補を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、特異性の検証を行った。ＰＣＲは、下記表２に示す条件で行った。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
ＰＣＲプライマーセット候補２、４、５は、標的以外の１，４−ジオキサン資化菌あるいは１，４−ジオキサン共代謝菌において非特異的な増幅が観察され、標的とするｔｈｍ遺伝子群を有さない分解菌であるＤ６株、Ｄ１１株の特異的検出には適さなかった。
【００２６】
ＰＣＲプライマーセット候補１、３は、非特異的な増幅はなく、予想された長さの増幅産物のみが検出された。ＰＣＲ増幅結果を図１、２、表３に示す。
【００２７】
【表３】
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【００２８】
ＰＣＲプライマーセット候補１は、供試菌株の中で、Ｄ６株、Ｄ１１株でのみ増幅産物が検出され、他の菌株では非特異的なものを含め、増幅産物が確認されなかった。このことから、本プライマーセット１は本来の標的である２菌株に非常に特異性の高いプライマーセットであると考えられた。
ＰＣＲプライマーセット候補３は、Ｄ６株、Ｄ１１株以外に、１，４−ジオキサン資化菌であるＲ．ａｅｔｈｅｒｉｖｏｒａｎｓ  ＪＣＭ１４３４３においても１６５ｂｐ辺りに増幅産物が確認された。Ｒ．ａｅｔｈｅｒｉｖｏｒａｎｓ  ＪＣＭ１４３４３はプロパンモノオキシゲナーゼ（ＰＭＯ）／ＭＭＯに属するＳＤＩＭＯを保有するため、増幅産物が得られることは妥当な結果と考えられる。
【００２９】
「実験３：リアルタイムＰＣＲ」
ＰＣＲプライマーセット候補１、３の、リアルタイムＰＣＲへの適用性を検討した。
ＰＣＲプライマーセット候補１、３を用いてＤ６株とＤ１１株のゲノムＤＮＡから得た増幅産物をプラスミドｐＴＡＣ−１に挿入してクローン化し、抽出した挿入プラスミドより希釈列を作成し、実験２と同じＰＣＲ条件でリアルタイムＰＣＲを実施した。いずれの組み合わせにおいても、ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ解析では各々１つのピークが検出され、増幅終了後のサンプルをアガロースゲル電気泳動に供した結果からも、特異的な増幅が行われていることが確認された。また、各々についてＤＮＡ濃度（−ｌｏｇ希釈倍率）とＣｑ値との関係を調べた結果、図３、４に示す通り、直線性が確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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