(57)【要約】【課題】標的核酸における塩基多型を簡便かつ迅速に検出すること。【解決手段】標的核酸における一塩基多型の検出方法は、（ａ）標的核酸に対して、野生型用プライマーセット及び変異型用プライマーセットを用いて核酸増幅反応を行い、増幅産物を取得する増幅工程、及び（ｂ）標的核酸中の塩基多型を検出する工程を含む。野生型用プライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に第１のタグ配列が取り付けられ、他方に標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられている。変異型用プライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に第２のタグ配列が取り付けられ、他方に標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられている。上記検出する工程は、上記タグ配列と、固相担体に保持された、上記タグ配列とハイブリダイズし得る核酸配列を有するプローブとをハイブリダイズさせて得られるハイブリダイズ産物を、標識物質又は標識物質導入材料を用いて検出することを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸における一塩基多型の検出方法であって、
（ａ）前記標的核酸に対して、野生型用プライマーセット及び変異型用プライマーセットを用いて核酸増幅反応を行い、増幅産物を取得する増幅工程、及び
（ｂ）前記標的核酸中の塩基多型を検出する工程
を含み、
前記野生型用プライマーセット及び前記変異型用プライマーセットの各々は順方向プライマー及び逆方向プライマーを備え、
野生型用プライマーセットの順方向プライマーが、標的核酸と同一の配列を有するか、又は、５’末端から３’末端までの箇所に標的核酸の塩基とは異なる塩基を少なくとも一つ有するが他の箇所は標的核酸と同一の配列を有する場合、
野生型用プライマーセットの順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基は野生型の塩基であり、
変異型用プライマーセットの順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基は変異型の塩基であり、かつ
変異型用プライマーセットの順方向プライマーは、標的核酸の塩基多型部位に変異型の塩基を有するが他の箇所は標的核酸と同一の配列を有するか、又は標的核酸の塩基多型部位に変異型の塩基を有し、かつ５’末端から３’末端までの箇所に標的核酸の塩基とは異なる塩基を少なくとも一つ有するが他の箇所は標的核酸と同一の配列を有し；
野生型用プライマーセットの順方向プライマーが、標的核酸と相補的な配列を有するか、又は、５’末端から３’末端までの箇所に標的核酸の塩基とは相補的でない塩基を少なくとも一つ有するが他の箇所は標的核酸と相補的な配列を有する場合、
野生型用プライマーセットの順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基は野生型の塩基に相補的な塩基であり、
変異型用プライマーセットの順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基は変異型の塩基に相補的な塩基であり、かつ
変異型用プライマーセットの順方向プライマーは、標的核酸の塩基多型部位に変異型の塩基を有するが他の箇所は標的核酸と相補的な配列を有するか、又は標的核酸の塩基多型部位に変異型の塩基を有し、かつ５’末端から３’末端までの箇所に標的核酸の塩基とは相補的でない塩基を少なくとも一つ有するが他の箇所は標的核酸と相補的な配列を有し；  前記野生型用プライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に第１のタグ配列が取り付けられ、他方に標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられており、
前記変異型用プライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に第１のタグ配列とは配列が異なる第２のタグ配列が取り付けられ、他方に標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられており、
前記検出する工程は、前記タグ配列と、固相担体に保持された、前記タグ配列とハイブリダイズし得る核酸配列を有するプローブとをハイブリダイズさせて得られるハイブリダイズ産物を、前記標識物質又は標識物質導入材料を用いて検出することを含む、方法。
【請求項２】
前記標的核酸が少なくとも２つの一塩基多型を有し、
前記野生型用プライマーセット及び前記変異型用プライマーセットの各々が、前記標的核酸の第１の塩基多型部位を含む前記標的核酸の核酸配列の部分を増幅させる第１組のプライマーセットと、前記標的核酸の第２の塩基多型部位を含む前記標的核酸の核酸配列の部分を増幅させる第２組のプライマーセットとを含み、
前記野生型用プライマーセット及び前記変異型用プライマーセットの前記第１組のプライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に第１のタグ配列が取り付けられ、他方に標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられており、
前記野生型用プライマーセット及び前記変異型用プライマーセットの前記第２組のプライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に第２のタグ配列が取り付けられ、他方に前記標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられており、
前記検出する工程は、前記第１タグ配列及び前記第２タグ配列と、固相担体に保持された、前記第１タグ配列及び前記第２タグ配列のそれぞれとハイブリダイズし得る核酸配列を有する第１プローブ及び第２プローブとをハイブリダイズさせて得られるハイブリダイズ産物を、前記標識物質又は標識物質導入材料を用いて検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅工程が一つの反応容器中で行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記固相担体が長尺状の多孔質材料であり、前記プローブは一つの固相担体上に、各プローブが間隔を空けた状態で、固相担体の長手方向に対して交差する方向に略直線状に保持される請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記核酸増幅反応がＰＣＲ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＬＡＭＰ、ＲＣＡ及びＲＰＡよりなる群から選択されたいずれかの方法であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記標的核酸がG6PD遺伝子の核酸である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記変異型用のプライマーセットの順方向プライマーが、rs1050828又はrs1050829を含む１５〜５０塩基長のオリゴヌクレオチドからなる請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
標的核酸における一塩基多型を検出するためのキットであって、
標的核酸を増幅するための野生型用プライマーセット及び変異型用プライマーセットと、
プローブを保持する固相担体と
を含み、
前記野生型用プライマーセット及び前記変異型用プライマーセットの各々は順方向プライマー及び逆方向プライマーを備え、
野生型用プライマーセットの順方向プライマーが、標的核酸と同一の配列を有するか、又は、５’末端から３’末端までの箇所に標的核酸の塩基とは異なる塩基を少なくとも一つ有するが他の箇所は標的核酸と同一の配列を有する場合、
野生型用プライマーセットの順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基は野生型の塩基であり、
変異型用プライマーセットの順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基は変異型の塩基であり、かつ
変異型用プライマーセットの順方向プライマーは、標的核酸の塩基多型部位に変異型の塩基を有するが他の箇所は標的核酸と同一の配列を有するか、又は標的核酸の塩基多型部位に変異型の塩基を有し、かつ５’末端から３’末端までの箇所に標的核酸の塩基とは異なる塩基を少なくとも一つ有するが他の箇所は標的核酸と同一の配列を有し；
野生型用プライマーセットの順方向プライマーが、標的核酸と相補的な配列を有するか、又は、５’末端から３’末端までの箇所に標的核酸の塩基とは相補的でない塩基を少なくとも一つ有するが他の箇所は標的核酸と相補的な配列を有する場合、
野生型用プライマーセットの順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基は野生型の塩基に相補的な塩基であり、
変異型用プライマーセットの順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基は変異型の塩基に相補的な塩基であり、かつ
変異型用プライマーセットの順方向プライマーは、標的核酸の塩基多型部位に変異型の塩基を有するが他の箇所は標的核酸と相補的な配列を有するか、又は標的核酸の塩基多型部位に変異型の塩基を有し、かつ５’末端から３’末端までの箇所に標的核酸の塩基とは相補的でない塩基を少なくとも一つ有するが他の箇所は標的核酸と相補的な配列を有し；  前記野生型用プライマーセット及び前記変異型用プライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方にタグ配列が取り付けられ、他方に標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられており、
前記プローブは前記タグ配列とハイブリダイズし得る核酸配列を有する、キット。
【請求項９】
前記標的核酸が少なくとも２つの一塩基多型を有し、
前記野生型用プライマーセット及び前記変異型用プライマーセットの各々が、前記標的核酸の第１の塩基多型部位を含む前記標的核酸の核酸配列の部分を増幅させる第１組のプライマーセットと、前記標的核酸の第２の塩基多型部位を含む前記標的核酸の核酸配列の部分を増幅させる第２組のプライマーセットとを含み、
前記野生型用プライマーセット及び前記変異型用プライマーセットの前記第１組のプライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に第１のタグ配列が取り付けられ、他方に標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられており、
前記野生型用プライマーセット及び前記変異型用プライマーセットの前記第２組のプライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に第２のタグ配列が取り付けられ、他方に前記標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられており、  
前記プローブは、前記第１タグ配列及び前記第２タグ配列のそれぞれとハイブリダイズし得る核酸配列を有する第１プローブ及び第２プローブを含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記固相担体が長尺状の多孔質材料であり、前記プローブは一つの固相担体上に、各プローブが間隔を空けた状態で、固相担体の長手方向に対して交差する方向に略直線状に保持される請求項８又は９に記載のキット。
【請求項１１】
ＤＮＡポリメラーゼ及び４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含む請求項８〜１０のいずれかに記載のキット。
【請求項１２】
前記標的核酸がG6PD遺伝子の核酸である請求項８〜１１のいずれかに記載のキット。
【請求項１３】
前記変異型用のプライマーセットの順方向プライマーが、rs1050828又はrs1050829を含む１５〜５０塩基長のオリゴヌクレオチドからなる請求項８〜１２のいずれかに記載のキット。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸における塩基多型の検出方法及び標的核酸における塩基多型の検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品の効果及び副作用の個人差の原因の一つとして、薬物代謝酵素又はトランスポーターの遺伝子の塩基多型が知られている。さらに、塩基多型は多数の疾患の遺伝マーカーとしての働きもする。このため、遺伝子の塩基多型の解析は臨床的に重要である。
【０００３】
例えば、G6PD（グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ）はペントースリン酸経路の律速酵素であり、細胞内にNADPHを供給する重要な酵素である。NADPHは酸化型グルタチオンを還元し、還元型グルタチオンにするために必須の補酵素である。生体内において、還元型グルタチオンは活性酸素を除去するために利用され、細胞を酸化的ストレスから防御している。プリマキンがCYP2D6により代謝活性化されたときに生じる活性酸素種は、マラリア原虫に強い酸化ストレスを与えて効果を示す一方、ヒトの細胞にも障害を与える。赤血球はNADPHをペントースリン酸経路からのみ得ているため、G6PDの機能に異常がある場合、酸化ストレスにより細胞膜障害を受けやすくなる。
【０００４】
G6PD欠損症はX染色体伴性劣性遺伝の疾患であり、世界で4億人が罹患していると推定されている。G6PD欠損症患者の多くは、普段の生活において何ら徴候を示さないが、食事、薬剤、感染などによって酸化ストレスが生じると、重篤な溶血性貧血を引き起こすことがある。一方、G6PD欠損症の患者において、G6PD機能の低下した赤血球の寿命は短いため、マラリア原虫が赤血球内で十分に成熟できず、マラリア抵抗性を示すことが報告されている。
【０００５】
プリマキンは、熱帯熱マラリアに対する抗生殖母体効果及び三日熱マラリアと卵形マラリアに対する肝細胞内休眠体を殺滅する薬剤であるが、G6PD欠損症の患者が服用した場合、溶血性貧血が起こり死に至る場合もある。肝細胞内休眠体の根治療法には、プリマキンの長期投与が必要であることから、G6PD欠損症の患者に対する安全性が問題となる。したがって、G6PD欠損症の診断に基づきプリマキン投与の可否を判断することは、プリマキンによる副作用を回避する上で極めて重要である。G6PD酵素活性の評価には、蛍光スポット法やホルマザン法が広く用いられている。近年では、臨床現場における即時検査のためのRDTsが開発されてきている。しかしながら、これらのG6PD酵素活性測定法は、酵素機能が高度に低下している患者は感度良く検出できるものの、中程度に低下している場合の感度は高くない。また、酵素活性が低下するアレルをヘテロ接合体で有する女性ではX染色体の不活性化であるライオニゼーションが生じるため、ヘテロ接合体の患者を検出するためには分子遺伝的手法が適していると考えられる。
【０００６】
G6PD遺伝子はX染色体Xp28に存在し、13箇所のエキソンから構成されている。G6PD遺伝子にはこれまで200以上のバリアントが報告されており、多様な酵素活性を示す。ただし、マラリア流行地であるアフリカでは、集団にアミノ酸置換を伴う主要な一塩基多型が2種類（202G>A; V86M及び376A>G; N126D）同定されている。また、G6PDの酵素機能とプリマキンによる副作用の程度には関連性が報告されていることから、G6PDの遺伝子多型からプリマキンの副作用を予測することが可能であると考えられる。
【０００７】
現在、国内承認されているファーマコゲノミクス検査薬に、インベーダー法を利用したUGT1A1アッセイキットとDNAチップを利用したアンプリチップCYP450があるが、これらはPCR後の塩基多型の検出に高額な機器を必要とする。
【０００８】
また、特許文献１には塩基多型の検出方法が開示されているが、野生型核酸の配列を有するプライマーと、塩基多型に対応する変異型核酸の配列を有するプライマーと、これらのプライマーと対になるリバースプライマーとを準備してＰＣＲを行うが、ＰＣＲ産物をゲル電気泳動に供しなければならず、塩基多型の検出までに時間がかかる。さらに、特許文献１に記載された検出方法では、一つの特定の塩基多型を含む染色体又はその断片の増幅を、その塩基多型を増幅させる一組のプライマーを用いて一つの反応液中で行う必要があり、複数の塩基多型を検出したい場合には塩基多型ごとに異なる反応液中で染色体又はその断片を増幅しなければならず、多大な時間と労力を要する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】WO01/042498
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、標的核酸における一塩基多型を簡便かつ迅速に検出することができる標的核酸における一塩基多型の検出方法及び検出用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、かかる課題を解決すべく、標的核酸を増幅するためのプライマーセットの一方にタグ配列を取り付け、他方に標識物質又は標識物質導入材料を取り付け、固相担体にかかるタグ配列とハイブリダイズし得る核酸配列を有するプローブを取りつける構成を採用した。このような構成により、標的核酸の増幅後に、電気泳動を行わなくとも、固相担体上に増幅産物を結合させ、検出された増幅産物のバンドから標的核酸における一塩基多型を目視で簡便かつ迅速に検出できることを見出した。
【００１２】
本発明の以下の態様が提供される。
【００１３】
項１．標的核酸における一塩基多型の検出方法であって、
（ａ）前記標的核酸に対して、野生型用プライマーセット及び変異型用プライマーセットを用いて核酸増幅反応を行い、増幅産物を取得する増幅工程、及び
（ｂ）前記標的核酸中の塩基多型を検出する工程
を含み、
前記野生型用プライマーセット及び前記変異型用プライマーセットの各々は順方向プライマー及び逆方向プライマーを備え、
野生型用プライマーセットの順方向プライマーが、標的核酸と同一の配列を有するか、又は、５’末端から３’末端までの箇所に標的核酸の塩基とは異なる塩基を少なくとも一つ有するが他の箇所は標的核酸と同一の配列を有する場合、
野生型用プライマーセットの順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基は野生型の塩基であり、
変異型用プライマーセットの順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基は変異型の塩基であり、かつ
変異型用プライマーセットの順方向プライマーは、標的核酸の塩基多型部位に変異型の塩基を有するが他の箇所は標的核酸と同一の配列を有するか、又は標的核酸の塩基多型部位に変異型の塩基を有し、かつ５’末端から３’末端までの箇所に標的核酸の塩基とは異なる塩基を少なくとも一つ有するが他の箇所は標的核酸と同一の配列を有し；
野生型用プライマーセットの順方向プライマーが、標的核酸と相補的な配列を有するか、又は、５’末端から３’末端までの箇所に標的核酸の塩基とは相補的でない塩基を少なくとも一つ有するが他の箇所は標的核酸と相補的な配列を有する場合、
野生型用プライマーセットの順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基は野生型の塩基に相補的な塩基であり、
変異型用プライマーセットの順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基は変異型の塩基に相補的な塩基であり、かつ
変異型用プライマーセットの順方向プライマーは、標的核酸の塩基多型部位に変異型の塩基を有するが他の箇所は標的核酸と相補的な配列を有するか、又は標的核酸の塩基多型部位に変異型の塩基を有し、かつ５’末端から３’末端までの箇所に標的核酸の塩基とは相補的でない塩基を少なくとも一つ有するが他の箇所は標的核酸と相補的な配列を有し；  前記野生型用プライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に第１のタグ配列が取り付けられ、他方に標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられており、
前記変異型用プライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に第１のタグ配列とは配列が異なる第２のタグ配列が取り付けられ、他方に標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられており、
前記検出する工程は、前記タグ配列と、固相担体に保持された、前記タグ配列とハイブリダイズし得る核酸配列を有するプローブとをハイブリダイズさせて得られるハイブリダイズ産物を、前記標識物質又は標識物質導入材料を用いて検出することを含む、方法。
【００１４】
項２．前記標的核酸が少なくとも２つの一塩基多型を有し、
前記野生型用プライマーセット及び前記変異型用プライマーセットの各々が、前記標的核酸の第１の塩基多型部位を含む前記標的核酸の核酸配列の部分を増幅させる第１組のプライマーセットと、前記標的核酸の第２の塩基多型部位を含む前記標的核酸の核酸配列の部分を増幅させる第２組のプライマーセットとを含み、
前記野生型用プライマーセット及び前記変異型用プライマーセットの前記第１組のプライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に第１のタグ配列が取り付けられ、他方に標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられており、
前記野生型用プライマーセット及び前記変異型用プライマーセットの前記第２組のプライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に第２のタグ配列が取り付けられ、他方に前記標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられており、
前記検出する工程は、前記第１タグ配列及び前記第２タグ配列と、固相担体に保持された、前記第１タグ配列及び前記第２タグ配列のそれぞれとハイブリダイズし得る核酸配列を有する第１プローブ及び第２プローブとをハイブリダイズさせて得られるハイブリダイズ産物を、前記標識物質又は標識物質導入材料を用いて検出することを含む、項１に記載の方法。
【００１５】
項３．前記増幅工程が一つの反応容器中で行われる、項１又は２に記載の方法。
【００１６】
項４．前記固相担体が長尺状の多孔質材料であり、前記プローブは一つの固相担体上に、各プローブが間隔を空けた状態で、固相担体の長手方向に対して交差する方向に略直線状に保持される項１〜３のいずれかに記載の方法。
【００１７】
項５．前記核酸増幅反応がＰＣＲ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＬＡＭＰ、ＲＣＡ及びＲＰＡよりなる群から選択されたいずれかの方法であることを特徴とする項１〜４のいずれかに記載の方法。
【００１８】
項６．前記標的核酸がG6PD遺伝子の核酸である項１〜５のいずれかに記載の方法。
【００１９】
項７．前記変異型用のプライマーセットの順方向プライマーが、rs1050828又はrs1050829を含む１５〜５０塩基長のオリゴヌクレオチドからなる項１〜６のいずれかに記載の方法。
【００２０】
項８．標的核酸における一塩基多型を検出するためのキットであって、
標的核酸を増幅するための野生型用プライマーセット及び変異型用プライマーセットと、
プローブを保持する固相担体と
を含み、
前記野生型用プライマーセット及び前記変異型用プライマーセットの各々は順方向プライマー及び逆方向プライマーを備え、
野生型用プライマーセットの順方向プライマーが、標的核酸と同一の配列を有するか、又は、５’末端から３’末端までの箇所に標的核酸の塩基とは異なる塩基を少なくとも一つ有するが他の箇所は標的核酸と同一の配列を有する場合、
野生型用プライマーセットの順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基は野生型の塩基であり、
変異型用プライマーセットの順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基は変異型の塩基であり、かつ
変異型用プライマーセットの順方向プライマーは、標的核酸の塩基多型部位に変異型の塩基を有するが他の箇所は標的核酸と同一の配列を有するか、又は標的核酸の塩基多型部位に変異型の塩基を有し、かつ５’末端から３’末端までの箇所に標的核酸の塩基とは異なる塩基を少なくとも一つ有するが他の箇所は標的核酸と同一の配列を有し；
野生型用プライマーセットの順方向プライマーが、標的核酸と相補的な配列を有するか、又は、５’末端から３’末端までの箇所に標的核酸の塩基とは相補的でない塩基を少なくとも一つ有するが他の箇所は標的核酸と相補的な配列を有する場合、
野生型用プライマーセットの順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基は野生型の塩基に相補的な塩基であり、
変異型用プライマーセットの順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基は変異型の塩基に相補的な塩基であり、かつ
変異型用プライマーセットの順方向プライマーは、標的核酸の塩基多型部位に変異型の塩基を有するが他の箇所は標的核酸と相補的な配列を有するか、又は標的核酸の塩基多型部位に変異型の塩基を有し、かつ５’末端から３’末端までの箇所に標的核酸の塩基とは相補的でない塩基を少なくとも一つ有するが他の箇所は標的核酸と相補的な配列を有し；  前記野生型用プライマーセット及び前記変異型用プライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方にタグ配列が取り付けられ、他方に標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられており、
前記プローブは前記タグ配列とハイブリダイズし得る核酸配列を有する、キット。
【００２１】
項９．前記標的核酸が少なくとも２つの一塩基多型を有し、
前記野生型用プライマーセット及び前記変異型用プライマーセットの各々が、前記標的核酸の第１の塩基多型部位を含む前記標的核酸の核酸配列の部分を増幅させる第１組のプライマーセットと、前記標的核酸の第２の塩基多型部位を含む前記標的核酸の核酸配列の部分を増幅させる第２組のプライマーセットとを含み、
前記野生型用プライマーセット及び前記変異型用プライマーセットの前記第１組のプライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に第１のタグ配列が取り付けられ、他方に標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられており、
前記野生型用プライマーセット及び前記変異型用プライマーセットの前記第２組のプライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に第２のタグ配列が取り付けられ、他方に前記標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられており、  
前記プローブは、前記第１タグ配列及び前記第２タグ配列のそれぞれとハイブリダイズし得る核酸配列を有する第１プローブ及び第２プローブを含む、項８に記載のキット。
【００２２】
項１０．前記固相担体が長尺状の多孔質材料であり、前記プローブは一つの固相担体上に、各プローブが間隔を空けた状態で、固相担体の長手方向に対して交差する方向に略直線状に保持される項８又は９に記載のキット。
【００２３】
項１１．ＤＮＡポリメラーゼ及び４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含む項８〜１０のいずれかに記載のキット。
【００２４】
項１２．前記標的核酸がG6PD遺伝子の核酸である項８〜１１のいずれかに記載のキット。
【００２５】
項１３．前記変異型用のプライマーセットの順方向プライマーが、rs1050828又はrs1050829を含む１５〜５０塩基長のオリゴヌクレオチドからなる項８〜１２のいずれかに記載のキット。  
【発明の効果】
【００２６】
本発明の検出方法及び検出用キットによれば、野生型用プライマーセット及び変異型用プライマーセットを用いた標的核酸の増幅反応後に、固相担体上で標的核酸中の塩基多型の有無を簡便かつ迅速に検出することができる。固相担体上の特定位置で塩基多型を検出できるため、精度も正確である。また、試料中に複数の塩基多型が存在する場合には、一つの固相担体上で複数の塩基多型の有無を同時に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】一塩基多型の検出を検出するためのプライマーセットの構成を示す模式図。（Ａ）野生型用プライマーセット。（Ｂ）変異型用プライマーセット。
【図２】固相担体のプローブと、図１のプライマーセットとの関係を示す模式図。
【図３】一塩基多型の検出方法の概要を説明する略図。
【図４】（Ａ）核酸検出用デバイスの一実施形態の平面図、（Ｂ）側面図。
【図５】プライマーセットを用いたＰＣＲの略図。
【図６】核酸クロマトグラフィーによる室温でのＰＣＲ産物の展開後のストリップにおけるバンドの検出を示す写真。wt：野生型、het：ヘテロ接合体、mt：変異型ホモ接合体。Negative Control：ヒトゲノムDNAを含まない反応サンプル。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の好ましい実施形態について説明する。
【００２９】
本明細書において「標的核酸」とは、検出しようとする塩基多型部位を含む核酸を意味する。標的核酸の由来は特に限定されず、各種生物材料（個体又はその組織、器官等の個体の一部のほか、排せつ物、体液等）のほか、人工的な核酸を含む人工材料が挙げられる。標的核酸の例としては、遺伝病を含む各種疾患、薬物代謝、生活習慣病に関連する遺伝子が挙げられる。例えば、高血圧との関連性が高いACE遺伝子、糖尿病との関連性が高いPPARγ遺伝子、抗マラリア剤プリマキン（登録商標）との関連性が高いグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）遺伝子等が挙げられる。
【００３０】
本明細書において「塩基多型」とは、標的核酸中のある部位において個体間で２種以上の塩基が存在することを指し、一方を野生型、それとは異なる塩基を有するものを変異型という。「塩基多型部位」とは、野生型と変異型が存在している塩基多型の位置をいう。
【００３１】
本発明の第一態様によれば、標的核酸における一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）の検出方法であって、（ａ）上記標的核酸に対して、野生型用プライマーのセット（以後、野生型用プライマーセットと称する）及び変異型用プライマーのセット（以後、変異型用プライマーセットと称する）を用いて核酸増幅反応を行い、増幅産物を取得する増幅工程、及び（ｂ）上記標的核酸中の塩基多型を検出する工程を含む方法が提供される。
【００３２】
野生型用プライマーセット及び変異型用プライマーセットの各々は順方向プライマー及び逆方向プライマーを備え、野生型用プライマーセット及び変異型用プライマーセットの各々の順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基が、標的核酸の塩基多型部位の塩基に対応する。
【００３３】
野生型用プライマーセットの順方向プライマーが標的核酸と同一の配列を有する場合、野生型用プライマーセットの順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基は塩基多型の野生型の塩基であり、変異型用プライマーセットの順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基は変異型の塩基多型である。ただし、野生型用プライマーセットの順方向プライマーは、５’末端から３’末端までの箇所に、該順方向プライマーがハイブリダイズする標的核酸の塩基とは相補的でない塩基（ミスマッチ塩基）を少なくとも一つ有するように設計してもよい。
【００３４】
変異型用プライマーセットの順方向プライマーも、５’末端から３’末端までの箇所に、該順方向プライマーがハイブリダイズする標的核酸の塩基とは相補的でない塩基（ミスマッチ塩基）を少なくとも一つ有するように設計してもよい。ミスマッチ塩基の数は、好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下、さらに好ましくは１個とする。
【００３５】
野生型用プライマーセットの順方向プライマーが標的核酸と相補的な配列を有する場合、野生型用プライマーセットの順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基は野生型の塩基多型に相補的な塩基であり、変異型用プライマーセットの順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基は変異型の塩基多型に相補的な変異である。ただし、野生型用プライマーセットの順方向プライマーは、５’末端から３’末端までの箇所に、該順方向プライマーがハイブリダイズする標的核酸の塩基とは相補的でない塩基（ミスマッチ塩基）を少なくとも一つ有するように設計してもよい。
【００３６】
変異型用プライマーセットの順方向プライマーも、５’末端から３’末端までの箇所に、該順方向プライマーがハイブリダイズする標的核酸の塩基とは相補的でない塩基（ミスマッチ塩基）を少なくとも一つ有するように設計してもよい。ミスマッチ塩基の数は、好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下、さらに好ましくは１個とする。
【００３７】
野生型用プライマーセットの逆方向プライマーは、野生型用プライマーセットの順方向プライマーと共に使用されて塩基多型部位を含む標的核酸の野生型の核酸配列を増幅するのに十分な塩基配列を有していればよく、そのような逆方向プライマーの設計は当業者には周知である。例えば、野生型用プライマーセットの順方向プライマーを、標的核酸のセンス鎖を鋳型として５’末端から３’末端方向へ作成した場合、野生型用プライマーセットの逆方向プライマーは標的核酸のアンチセンス鎖を鋳型として５’末端から３’末端方向へ作成される。
【００３８】
変異型用プライマーセットの逆方向プライマーは、変異型プライマーセットの順方向プライマーと共に使用されて塩基多型部位を含む標的核酸の変異型の核酸配列を増幅するのに十分な塩基配列を有していればよく、そのような逆方向プライマーの設計は当業者には周知である。例えば、変異型用プライマーセットの順方向プライマーを、標的核酸のセンス鎖を鋳型として５’末端から３’末端方向へ作成した場合、変異型用プライマーセットの逆方向プライマーは標的核酸のアンチセンス鎖を鋳型として５’末端から３’末端方向へ作成される。
【００３９】
野生型用プライマーセットの逆方向プライマーと変異型用プライマーセットの逆方向プライマーは同じヌクレオチド配列のプライマーとしても、異なるヌクレオチド配列のプライマーとしてもよいが、プライマー設計の簡便さの点で野生型用プライマーセットの逆方向プライマーと変異型用プライマーセットの逆方向プライマーは同じとすることが好ましい。
【００４０】
野生型用プライマーの順方向プライマー及び逆方向プライマー並びに変異型用プライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの長さは限定されないが、上記変異型用のプライマーセットの順方向プライマーが１５〜５０塩基長のオリゴヌクレオチドからなることが好ましく、１８〜４０塩基長のオリゴヌクレオチドからなることがより好ましく、１８〜３０塩基長のオリゴヌクレオチドからなることがさらに好ましい。
【００４１】
野生型用プライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に、スペーサー配列を介して又は介さずに、第１のタグ配列が取り付けられ、他方に標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられている。
【００４２】
また、変異型用プライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に、スペーサー配列を介して又は介さずに、第１のタグ配列とは配列が異なる第２のタグ配列が取り付けられ、他方に標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられている。
【００４３】
タグ配列は、標的核酸の配列とは無関係にタグ間のクロスリアクションを排除した設計がなされた配列である。第１のタグ配列及び第２のタグ配列を設けることで、複数の核酸配列の多型の有無を同時に検出するときのクロスリアクションが効果的に防止される。各タグ配列は、好ましくは１５塩基以上５０塩基以下、より好ましくは２０塩基以上２５塩基以下である。そのようなタグ配列は核酸検出の分野において周知である。タグ配列の導入の詳細については、例えばＷＯ２０１３／０３９２２８号を参照されたい。タグ配列を有するＤＮＡは製造業者から入手可能である。
【００４４】
スペーサーは、プライマーとタグ配列の間に挿入される、ポリメラーゼ反応阻害領域からなる遺伝子非発現部分である。スペーサーを設けることで、その位置でＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止させることが可能である。スペーサーとしては、核酸誘導体を含むこともできるし、非核酸誘導体を含むこともできる。核酸誘導体としては、Ｌ型核酸、３-ｄｅｏｘｙ-２-ｈｙｄｒｏｘｙ-ｄＮ、修飾塩基核酸、損傷塩基核酸、リン酸結合部位修飾核酸、ＲＮＡ、２’-ＯＭｅ-Ｎ、及び、それらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。非核酸誘導体としては、炭素鎖（Ｃｎ）、ペグ鎖（（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）、ジスルフィド含有鎖（ＣｎＳＳＣｎ）、及びジチオールフォスフォロアミダイトからなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。
【００４５】
標識物質は、目視（肉眼で）で検出可能な発光又は発色を提示する発光物質又は発色物質であることが好ましい。このような標識物質としては、各種染料、各種顔料、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム化合物、オレフィン、エノールエーテル、エナミン、アリールビニルエーテル、ジオキセン、アリールイミダゾール、ルシゲニン、ルシフェリン及びエクリオンを包含する化学発光物質が挙げられる。さらに、金コロイド若しくはゾル又は銀コロイド若しくはゾルを包含するコロイド若しくはゾル、金属粒子、無機粒子等が挙げられる。
【００４６】
標識物質は、その一部に粒子を有していてもよい。標識物質の一部を構成する粒子の平均粒子径は、特に限定しないが、例えば、２０ｎｍ以上２０μｍ以下、好ましくは０．１μｍ以上１０μｍ以下、特に好ましくは０．１μｍ以上５μｍ以下、さらに好ましくは０．１５μｍ以上２μｍ以下である。また、固相担体の孔径によって適宜調整される。
【００４７】
好ましくは粒子は水溶液に懸濁でき、そして水不溶性ポリマー材料からなる粒子である。例えばポリエチレン、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリル酸ポリマー、メタクリル酸ポリマー、アクリロニトリルポリマー、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン、ポリビニルアセテート−アクリレート、ポリビニルピロリドン又は塩化ビニル−アクリレートが挙げられる。それらの表面上に活性基、例えばカルボキシル、アミノ又はアルデヒド基を任意選択で有するラテックス粒子も挙げられる。
【００４８】
標識物質導入材料は、標識物質と結合するための材料であり、標識物質の標的核酸への導入を可能にする。標識物質導入材料としては、抗原抗体反応における抗体や、アビジン（ストレプトアビジン）−ビオチンシステムにおけるビオチン、抗ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）システムにおけるジゴキシゲニン、又は抗ＦＩＴＣ−ＦＩＴＣシステムにおけるＦＩＴＣ等に代表されるハプテン類などが挙げられる。
【００４９】
標的核酸とのハイブリダイゼーション工程において、あるいはこの工程に先立って、あるいはこの工程後に、増幅産物に取り付けられた標識物質導入材料と、標識物質導入材料と結合する部位を備える標識物質とが結合して、増幅産物の検出を可能にする。
【００５０】
図１Ａ，Ｂに、一塩基多型の検出を検出するためのプライマーセットの構成の一例を示す。図１Ａは野生型用プライマーセットであり、図１Ｂは変異型用プライマーセットである。なお、図１Ａ，Ｂのプライマーセットは一塩基多型の検出を検出する原理を示すために例示したにすぎず、本願発明のプライマーセットの核酸配列をこれに限定するものではない。
【００５１】
図１Ａにおいて、野生型用プライマーセットのうちの順方向プライマー（１）の３’末端から１番目が標的核酸（４）の核酸配列の塩基多型部位の塩基に対応し、野生型用プライマーの順方向プライマー（１）は塩基多型部位において標的核酸（４）の野生型の塩基（アデニン）に相補的な塩基（チミン）を有する。野生型用プライマーの順方向プライマー（１）の５’末端にはスペーサー配列（２）を介してタグ配列としてのＤＮＡタグ１（３）を備えている。野生型用プライマーセットのうちの逆方向プライマー（５）は５’末端には標識物質又は標識物質導入材料（６）が取り付けられている。
【００５２】
図１Ｂにおいて、変異型用プライマーセットのうちの順方向プライマー（７）の３’末端から１番目が標的核酸（４）の核酸配列の塩基多型部位の塩基に対応し、変異型用プライマーの順方向プライマー（７）は塩基多型部位において標的核酸の変異型の塩基（グアニン）に相補的な塩基（シトシン）を有する。変異型用プライマーの順方向プライマー（７）の５’末端にはスペーサー配列（８）を介してタグ配列としてのＤＮＡタグ２（９）を備えている。変異型用プライマーセットのうちの逆方向プライマー（１０）は５’末端には標識物質又は標識物質導入材料（１１）が取り付けられている。
【００５３】
この例で、標的核酸（４）の塩基多型部位の塩基は野生型の塩基（アデニン）であるため、図１Ａ及び図１Ｂの各々のプライマーセットを用いて核酸増幅反応により標的核酸（４）を増幅すると、図１Ａの野生型用プライマーセットを用いた場合は、標的核酸を鋳型とした伸長反応が進行するが、図１Ｂの変異型用プライマーセットを用いた場合は伸長反応が停止する。このように、野生型用プライマーセット及び変異型用プライマーセットは、塩基多型部位が野生型である核酸配列と、塩基多型部位が変異型である核酸配列とを、それぞれ特異的に増幅するように設計されている。
【００５４】
固相担体は、野生型用プライマーセットの順方向プライマーのタグ配列に特異的にハイブリダイズし得る核酸配列を有する第１のプローブと、変異型プライマーセットの順方向プライマーのタグ配列に特異的にハイブリダイズし得る核酸配列を有する、第１プローブとは配列が異なる第２のプローブとを備えている。
【００５５】
固相担体に取り付けられるプローブの長さは、特に限定されないが、各標的核酸に対する特異性とハイブリダイゼーション効率を確保するため、１５塩基以上５０塩基以下であることが好ましい。
【００５６】
固相担体は、セルロース、ニトロセルロース、ナイロン（商標）、ポリエーテルスルホン、ポリフッ化ビニリデン等の当該技術分野で周知の多孔質材料から形成される。多孔質材料はオリゴヌクレオチドからなるプローブを保持するのに有利である。固相担体はストリップ状又はシート状に形成されることが好ましい。なお、ストリップとは長尺状の部材で、長手方向の寸法がそれに対して垂直な幅方向の寸法よりも大きく、厚み方向の寸法が幅方向の寸法よりも小さい部材をさす。シートとは、平板状の部材をさす。
【００５７】
図２に、固相担体をストリップに具現化した例を符号（１２）で示す。例えば野生型用プライマーセット及び変異型プライマーセットとして図１Ａ，Ｂに示したプライマーセットを使用する場合、固相担体１２には、ＤＮＡタグ１（３）と特異的にハイブリダイズし得る核酸配列を有する第１のプローブ（１３）と、ＤＮＡタグ２（９）と特異的にハイブリダイズし得る核酸配列を有する、第１プローブ（１３）とは異なる第２プローブ（１４）とがバンド状に取り付けられる。標的核酸（４）の塩基多型部分が野生型である場合、野生型用プライマーセットを用いた核酸増幅反応が進行するため、第１のプローブ（１３）が固相担体（１２）に保持された位置で、ＤＮＡタグ１（３）と第１プローブ（１３）とを特異的にハイブリダイズさせて得られるハイブリダイズ産物を、標識物質又は標識物質導入材料（６）を用いて検出することができるが、第２のプローブ（１４）が固相担体（１２）に保持された位置では、ＤＮＡタグ２（９）と第２プローブ（１４）とを特異的にハイブリダイズさせて得られるハイブリダイズ産物は検出することができない。
【００５８】
本発明の第一態様の検出方法において、核酸増幅反応は、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法、ＬＣＲ（ligase chain reaction）法、ＳＤＡ（strand displacement amplification）法、ＬＡＭＰ（loop-mediated amplification）法、ＲＣＡ（rolling circle amplification）法及びＲＰＡ法（recombinase polymerase amplification）よりなる群から選択されたいずれの方法であってもよく、簡便さ及び検出感度の点でＰＣＲ法が好ましい。
【００５９】
増幅工程は、標的核酸に野生型用プライマーセット及び変異型用プライマーセット、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、及びＤＮＡポリメラーゼの存在下で、標的核酸の核酸配列を鋳型とするオリゴヌクレオチドを変性、アニーリング、及び伸長させ、核酸配列の相補鎖を指数関数的に合成（増幅）させる反応を含む。
【００６０】
増幅工程におけるＰＣＲの条件は、目的の核酸配列を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されず、例えば、ＰＣＲ反応に用いる鋳型としての核酸配列としての２本鎖ＤＮＡ量は０ ．１ｎｇ以上が好ましく、１〜５０ｎｇがより好ましい。また、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９２〜９８℃で１０〜６０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５５〜７０℃で１０〜６０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を７１〜７５℃で５〜１２０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを２０〜４０サイクル行う。サイクル反応の前に初期変性反応を行うことが好ましい。ＰＣＲにおける初期変性反応条件について、変性温度は９２〜９８℃が好ましく、変性時間は３０秒〜１０分が好ましい。
【００６１】
上記検出する工程は、上記タグ配列と、固相担体に保持された、上記タグ配列とハイブリダイズし得る核酸配列を有するプローブとをハイブリダイズさせて得られるハイブリダイズ産物を、上記標識物質又は標識物質導入材料を用いて検出することを含む。
【００６２】
図３に示すように、標的核酸の核酸配列の増幅を例えばＰＣＲ法で行う場合、（ａ）生物材料より抽出したＤＮＡ（ａ）と、野生型核酸の配列を有するプライマーと、塩基多型に対応する変異型核酸の配列を有するプライマーと、ＰＣＲに必要なＤＮＡポリメラーゼ等の酵素（ｂ）等を混合し、エッペンドルフチューブ等の一つの反応容器中でＰＣＲを行う（ｃ）。次に、ＰＣＲ増幅産物に標識物質又は標識物質導入材料を結合させる（ｄ）。標識物質が、ラテックス粒子等のように目視で検出可能な発光又は発色を提示する場合、この時点で反応容器中の反応液の発光又は発色を確認することができる。次に、固相担体（ここではストリップを図示）の先端を、反応容器内に入れ、増幅された標的核酸を含む反応液に浸漬させることで反応液を固相担体に展開する（ｅ）。反応液は、固相担体を構成する多孔質材料内に毛細管現象により展開される。
【００６３】
ここで、展開される反応液は、固相担体１２中での標的核酸の展開を容易にするように、展開媒体を含むことが好ましい。展開媒体は、特に限定されないが、例えば、水、水と相溶する有機溶媒、又は水と１種又は２種以上の前記有機溶媒の混液が挙げられる。水と相溶する有機溶媒としては、例えば、炭素数１〜４程度の低級アルコール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類、アセトン等が挙げられる。展開媒体は、好ましくは水を主体とする。
【００６４】
展開媒体は、ｐＨを調整するための緩衝成分を含むことができる。緩衝成分のｐＨは、意図するｐＨにもよるが、通常は６．０以上８．０以下の範囲である。より好ましくは７．０以上８．０以下である。こうしたｐＨを得るための成分は、例えば、酢酸と酢酸ナトリウム（酢酸緩衝液）、クエン酸とクエン酸ナトリウム（クエン酸緩衝液）、リン酸とリン酸ナトリウム（リン酸緩衝液）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等が挙げられる。なお、展開媒体として、増幅反応液をそのまま採用してもよい。また、増幅反応液に対して、界面活性剤や適当な塩等の追加の成分や溶媒を加えたりすることで、組成や濃度の調整をして展開媒体として使用してもよい。展開時間は特に限定されず、固相担体１２の形態や形状、展開媒体の性質に応じて適宜設定される。
【００６５】
反応液が、プローブが保持された位置に到達すると、プローブを固定化したラインの発色により、複数の標的核酸における塩基多型を識別し、その有無を検出することができる（ｆ）。
【００６６】
本発明の第一態様の標的核酸における一塩基多型の検出方法の効果は以下の効果を奏する。
【００６７】
本発明の第一態様の検出方法によれば、核酸増幅に用いる野生型用プライマーセットのプライマー及び変異型プライマーセットのプライマーをすべて一つの反応液中に混合して、一つの反応容器中でマルチプレックスで核酸を増幅し、そのまま標的核酸中の塩基多型の有無を検出することができる。このため、２時間以内、特には１時間以内で迅速に塩基多型の有無を検出又は識別することができる。
【００６８】
従来技術では核酸多型の検出に、野生型用プライマーセットのプライマーを用いた核酸増幅反応と変異型プライマーセットのプライマーを用いた核酸増幅反応を分けたり、核酸増幅後にゲル電気泳動に供したりする必要があった。本発明の第一態様の検出方法によれば、１回の核酸増幅反応で一塩基多型を検出できるため、操作が簡便である。
【００６９】
また、核酸増幅の増幅産物を一つの固相担体上に展開することで、１つの固相担体上で塩基多型の有無を目視で確認することができる。
【００７０】
本発明の第一態様の検出方法は、常温でも行うことができる。また、高額な蛍光検出機器も必要ないため、簡便かつ低コストである。
【００７１】
本発明の第二態様は、本発明の第一態様の一塩基多型の検出方法において、標的核酸が複数、つまり少なくとも２つの一塩基多型を有する。
【００７２】
第二態様の塩基多型の検出方法では、野生型用プライマーセット及び上記変異型用プライマーセットの各々が、標的核酸の第１の塩基多型部位を含む標的核酸の核酸配列の部分を増幅させる第１組のプライマーセットと、標的核酸の第２の塩基多型部位を含む標的核酸の核酸配列の部分を増幅させる第２組のプライマーセットとを含む。
【００７３】
野生型用プライマーセットの第１組のプライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に、スペーサー配列を介して又は介さずに、第１のタグ配列が取り付けられ、他方に標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられている。
【００７４】
野生型用プライマーセットの第２組のプライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に、スペーサー配列を介して又は介さずに、第２のタグ配列が取り付けられ、他方に上記標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられている。
【００７５】
変異型用プライマーセットの第１組のプライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に、スペーサー配列を介して又は介さずに、第３のタグ配列が取り付けられ、他方に標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられている。
【００７６】
変異型用プライマーセットの第２組のプライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に、スペーサー配列を介して又は介さずに、第４のタグ配列が取り付けられ、他方に上記標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられている。
【００７７】
第１のタグ配列、第２のタグ配列、第３のタグ配列、及び第４のタグ配列はそれぞれ配列が異なっており、クロスリアクションを排除した設計がなされている。
【００７８】
検出する工程は、第１のタグ配列、第２のタグ配列、第３のタグ配列、及び第４のタグ配列と、固相担体に保持された、第１のタグ配列、第２のタグ配列、第３のタグ配列、及び第４のタグ配列のそれぞれとハイブリダイズし得る核酸配列を有する第１プローブ、第２プローブ、第３プローブ、及び第４プローブとをハイブリダイズさせて得られるハイブリダイズ産物を、上記標識物質又は標識物質導入材料を用いて検出することを含む。
【００７９】
タグ配列、スペーサー、核酸増幅反応、ＰＣＲ条件、標識物質、及び標識物質導入材料に関しては本発明の第一態様の検出方法に関して説明した通りである。
【００８０】
複数の塩基多型は、同じ遺伝子中に存在してもよいし、異なる遺伝子中に存在してもよい。異なる遺伝子中に塩基多型が存在する場合、第１の塩基多型部位を含む標的核酸である第１の遺伝子中の核酸配列の部分を第１組のプライマーセット（野生型用プライマーセットの第１組のプライマーセット及び変異型用プライマーセットの第１組のプライマーセット）で増幅させ、第２の塩基多型部位を含む標的核酸である第２の遺伝子中の核酸配列の部分を第２組のプライマーセット（野生型用プライマーセットの第２組のプライマーセット及び変異型用プライマーセットの第２組のプライマーセット）で増幅させる。
【００８１】
本発明の第二態様の標的核酸における一塩基多型の検出方法は、第一態様の検出方法の効果に加えて、以下の効果を奏する。
【００８２】
本発明の第二態様の検出方法では、標的核酸中の塩基多型が複数であっても、複数の塩基多型の有無を、核酸増幅に用いる野生型用プライマーセットのプライマー及び変異型プライマーセットのプライマーをすべて一つの反応液中に混合して、一つの反応容器中でマルチプレックスで核酸を増幅し、そのまま検出することができる。このため、２時間以内、特には１時間以内で迅速に塩基多型の有無を検出又は識別することができる。
【００８３】
本発明の第二態様の検出方法では、最大で６種類の塩基多型の同時検出が可能である。つまり、本発明の第二態様の検出方法では、２種類の塩基多型、３種類の塩基多型、４種類の塩基多型、５種類の塩基多型、又は６種類の塩基多型の同時検出が可能である。このため、塩基多型の数が増えても、迅速に塩基多型の有無を検出又は識別することができる。また、検出する塩基多型を複数とすることで、疾患の診断等、より高い精度が要求される用途に第二態様の検出方法を使用することができる。
【００８４】
本発明の第三態様によれば、標的核酸における一塩基多型を検出するためのキットが提供される。キットは、標的核酸を増幅するための野生型用プライマーセット及び変異型用プライマーセットと、固相担体とを含む。
【００８５】
野生型用プライマーセット及び変異型用プライマーセットの各々は順方向プライマー及び逆方向プライマーを備えている。
【００８６】
野生型用プライマーセット及び変異型用プライマーセットの各々の順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基が、標的核酸の塩基多型部位の塩基に対応する。
【００８７】
野生型用プライマーセットの順方向プライマーが、標的核酸と同一の配列を有するか、又は、５’末端から３’末端までの箇所に標的核酸の塩基とは異なる塩基（ミスマッチ塩基）を少なくとも一つ有するが他の箇所は標的核酸と同一の配列を有する場合、野生型用プライマーセットの順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基は塩基多型の野生型の塩基であり、変異型用プライマーセットの順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基は変異型の塩基多型である。
【００８８】
変異型用プライマーセットの順方向プライマーも、標的核酸の塩基多型部位に変異型の塩基を有するが他の箇所は標的核酸と同一の配列を有するか、又は標的核酸の塩基多型部位に変異型の塩基を有し、かつ５’末端から３’末端までの箇所に標的核酸の塩基とは異なる塩基を少なくとも一つ有するが他の箇所は標的核酸と同一の配列を有するように設計し得る。
【００８９】
野生型用プライマーセットの順方向プライマーが、標的核酸と相補的な配列を有するか、又は、５’末端から３’末端までの箇所に標的核酸の塩基と相補的でない塩基（ミスマッチ塩基）を少なくとも一つ有するが他の箇所は標的核酸と相補的な配列を有する場合、    野生型用プライマーセットの順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基は野生型の塩基に相補的な塩基であり、変異型用プライマーセットの順方向プライマーの３’末端から１番目又は２番目の塩基は変異型の塩基に相補的な塩基である。
【００９０】
変異型用プライマーセットの順方向プライマーも、標的核酸の塩基多型部位に変異型の塩基を有するが他の箇所は標的核酸と相補的な配列を有するか、又は標的核酸の塩基多型部位に変異型の塩基を有し、かつ５’末端から３’末端までの箇所に標的核酸の塩基とは相補的でない塩基を少なくとも一つ有するが他の箇所は標的核酸と相補的な配列を有するように設計し得る。
【００９１】
野生型用プライマーセットの順方向プライマー及び変異型用プライマーセットの順方向プライマーは、ミスマッチ塩基を少なくとも一つ有するように設計してもよい。ミスマッチ塩基の数は、好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下、さらに好ましくは１個とする。
【００９２】
野生型用プライマーセットの逆方向プライマーは、野生型用プライマーセットの順方向プライマーと共に使用されて塩基多型部位を含む標的核酸の野生型の核酸配列を増幅するのに十分な塩基配列を有していればよく、そのような逆方向プライマーの設計は当業者には周知である。
【００９３】
変異型用プライマーセットの逆方向プライマーは、変異型プライマーセットの順方向プライマーと共に使用されて塩基多型部位を含む標的核酸の変異型の核酸配列を増幅するのに十分な塩基配列を有していればよく、そのような逆方向プライマーの設計は当業者には周知である。
野生型用プライマーセットの逆方向プライマーと変異型用プライマーセットの逆方向プライマーは同じヌクレオチド配列のプライマーとしても、異なるヌクレオチド配列のプライマーとしてもよいが、プライマー設計の簡便さの点で野生型用プライマーセットの逆方向プライマーと変異型用プライマーセットの逆方向プライマーは同じとすることが好ましい。
【００９４】
野生型用プライマーの順方向プライマー及び逆方向プライマー並びに変異型用プライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの長さは限定されないが、上記変異型用のプライマーセットの順方向プライマーが１５〜５０塩基長のオリゴヌクレオチドからなることが好ましく、１８〜４０塩基長のオリゴヌクレオチドからなることがより好ましく、１８〜３０塩基長のオリゴヌクレオチドからなることがさらに好ましい。
【００９５】
野生型用プライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に、スペーサー配列を介して又は介さずに、第１のタグ配列が取り付けられ、他方に標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられている。
【００９６】
また、変異型用プライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に、スペーサー配列を介して又は介さずに、第１のタグ配列とは配列が異なる第２のタグ配列が取り付けられ、他方に標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられている。
【００９７】
固相担体は、第１のタグ配列と特異的にハイブリダイズし得る核酸配列を有する第１のプローブと、第２のタグ配列と特異的にハイブリダイズし得る核酸配列を有する、第１プローブとは異なる第２プローブとを保持している。
【００９８】
標的核酸の塩基多型部分が野生型である場合、野生型用プライマーセットを用いた核酸増幅反応が進行するため、第１のプローブが固相担体に保持された位置で、第１のタグ配列と第１プローブとを特異的にハイブリダイズさせて得られるハイブリダイズ産物を、標識物質又は標識物質導入材料を用いて検出することができる。標的核酸の塩基多型部分が変異型である場合、変異型用プライマーセットを用いた核酸増幅反応が進行するため、第２のプローブが固相担体に保持された位置で、第２のタグ配列と第２プローブとを特異的にハイブリダイズさせて得られるハイブリダイズ産物を、標識物質又は標識物質導入材料を用いて検出することができる。
【００９９】
野生型用プライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの構成、変異型プライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの構成、タグ配列、スペーサー、標識物質、及び標識物質導入材料に関しては本発明の第一態様の検出方法に関して説明した通りである。
【０１００】
本発明の第三態様のキットは、ＤＮＡポリメラーゼをさらに備えることができる。ＤＮＡポリメラーゼは野生型用プライマーセット及び変異型プライマーセットによる標的核酸の標的核酸を鋳型としたＤＮＡ合成に使用される。
【０１０１】
ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であればいずれでもよい。当該ポリメラーゼとしては、Bst DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Bca(exo-)DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Vent (Exo-)DNAポリメラーゼ（Vent DNAポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、DeepVent (Exo-)DNAポリメラーゼ（DeepVent DNAポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、KOD DNAポリメラーゼなどが挙げられる。  本発明の第三態様のキットは、ｄＮＴＰをさらに備えることができる。ｄＮＴＰは野生型用プライマーセット及び変異型プライマーセットによる標的核酸の標的核酸を鋳型としたＤＮＡ合成のＤＮＡの構成材料として使用される。ｄＮＴＰとしては、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰが挙げられる。
【０１０２】
本発明の第三態様のキットは、核酸増幅反応に使用するための反応緩衝液をさらに備えることができる。
【０１０３】
反応緩衝液としては、トリス緩衝液、ＥＤＴＡ緩衝液、及びトリス−ＥＤＴＡ緩衝液等が挙げられる。
【０１０４】
核酸増幅反応は、ＰＣＲ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法、ＲＣＡ法及びＲＰＡ法よりなる群から選択されたいずれの方法であってもよく、簡便さ及び検出感度の点でＰＣＲ法が好ましい。
【０１０５】
増幅反応におけるＰＣＲの条件は、目的の核酸配列を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されず、例えば、ＰＣＲ反応に用いる鋳型としての核酸配列としての２本鎖ＤＮＡ量は０ ．１ｎｇ以上が好ましく、１〜５０ｎｇがより好ましい。また、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９２〜９８℃で１０〜６０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５５〜７０℃で１０〜６０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を７１〜７５℃で５〜１２０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを２０〜４０サイクル行う。サイクル反応の前に初期変性反応を行うことが好ましい。ＰＣＲにおける初期変性反応条件について、変性温度は９２〜９８℃が好ましく、変性時間は３０秒〜１０分が好ましい。
【０１０６】
塩基多型の検出は、タグ配列と、固相担体に保持された、タグ配列とハイブリダイズし得る核酸配列を有するプローブとをハイブリダイズさせて得られるハイブリダイズ産物を、標識物質又は標識物質導入材料を用いて検出することができる。
【０１０７】
本発明の第三態様のキットは以下の効果を奏する。
【０１０８】
本発明の第三態様のキットによれば、核酸増幅に用いる野生型用プライマーセットのプライマー及び変異型プライマーセットのプライマーをすべて一つの反応液中に混合して、マルチプレックスで核酸を増幅し、そのまま標的核酸中の塩基多型の有無を検出することができる。このため、１又は複数の塩基多型を簡便かつ迅速に検出することができる。
【０１０９】
本発明の第三態様の検出キットによれば、１回の核酸増幅反応で一塩基多型を検出できるため、操作が簡便である。
【０１１０】
また、核酸増幅の増幅産物を一つの固相担体上に展開することで、１つの固相担体上で塩基多型の有無を目視で確認することができる。
【０１１１】
本発明の第三態様の検出キットは、常温でも行うことができる。また、高額な蛍光検出機器も必要ないため、簡便かつ低コストである。
【０１１２】
本発明の第四態様は、本発明の第三態様の一塩基多型を検出するためのキットにおいて、標的核酸が複数、つまり少なくとも２つの一塩基多型を有する。
【０１１３】
第四態様の塩基多型を検出するためのキットでは、野生型用プライマーセット及び上記変異型用プライマーセットの各々が、標的核酸の第１の塩基多型部位を含む標的核酸の核酸配列の部分を増幅させる第１組のプライマーセットと、標的核酸の第２の塩基多型部位を含む標的核酸の核酸配列の部分を増幅させる第２組のプライマーセットとを含む。
【０１１４】
野生型用プライマーセットの第１組のプライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に、スペーサー配列を介して又は介さずに、第１のタグ配列が取り付けられ、他方に標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられている。
【０１１５】
野生型用プライマーセットの第２組のプライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に、スペーサー配列を介して又は介さずに、第２のタグ配列が取り付けられ、他方に上記標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられている。
【０１１６】
変異型用プライマーセットの第１組のプライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に、スペーサー配列を介して又は介さずに、第３のタグ配列が取り付けられ、他方に標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられている。
【０１１７】
変異型用プライマーセットの第２組のプライマーセットの順方向プライマー及び逆方向プライマーの一方に、スペーサー配列を介して又は介さずに、第４のタグ配列が取り付けられ、他方に上記標識物質又は標識物質導入材料が取り付けられている。
【０１１８】
第１のタグ配列、第２のタグ配列、第３のタグ配列、及び第４のタグ配列はそれぞれ配列が異なっており、クロスリアクションを排除した設計がなされている。
【０１１９】
検出する工程は、第１のタグ配列、第２のタグ配列、第３のタグ配列、及び第４のタグ配列と、固相担体に保持された、第１のタグ配列、第２のタグ配列、第３のタグ配列、及び第４のタグ配列のそれぞれとハイブリダイズし得る核酸配列を有する第１プローブ、第２プローブ、第３プローブ、及び第４プローブとをハイブリダイズさせて得られるハイブリダイズ産物を、上記標識物質又は標識物質導入材料を用いて検出することを含む。
【０１２０】
タグ配列、スペーサー、標識物質、標識物質導入材料、核酸増幅反応、及びＰＣＲ条件に関しては本発明の第三態様の検出キットに関して説明した通りである。
【０１２１】
本発明の第四態様の検出キットは、第三態様の検出方法の効果に加えて、以下の効果を奏する。
【０１２２】
複数の塩基多型は、同じ遺伝子中に存在してもよいし、異なる遺伝子中に存在してもよい。異なる遺伝子中に塩基多型が存在する場合、第１の塩基多型部位を含む標的核酸である第１の遺伝子中の核酸配列の部分を第１組のプライマーセット（野生型用プライマーセットの第１組のプライマーセット及び変異型用プライマーセットの第１組のプライマーセット）で増幅させ、第２の塩基多型部位を含む標的核酸である第２の遺伝子中の核酸配列の部分を第２組のプライマーセット（野生型用プライマーセットの第２組のプライマーセット及び変異型用プライマーセットの第２組のプライマーセット）で増幅させる。
【０１２３】
本発明の第四態様の標的核酸における一塩基多型の検出キットは、第三態様の検出キットの効果に加えて、以下の効果を奏する。
【０１２４】
本発明の第四態様の検出キットでは、標的核酸中の塩基多型が複数であっても、複数の塩基多型の有無を、核酸増幅に用いる野生型用プライマーセットのプライマー及び変異型プライマーセットのプライマーをすべて一つの反応液中に混合して、一つの反応容器中でマルチプレックスで核酸を増幅し、そのまま検出することができる。このため、２時間以内、特には１時間以内で迅速に塩基多型の有無を検出又は識別することができる。
【０１２５】
本発明の第四態様の検出方法では、２種類の塩基多型、３種類の塩基多型、４種類の塩基多型、５種類の塩基多型、又は６種類の塩基多型の同時検出が可能である。このため、塩基多型の数が増えても、迅速に塩基多型の有無を検出又は識別することができる。また、検出する塩基多型を複数とすることで、疾患の診断等、より高い精度が要求される用途に第四態様の検出キットを使用することができる。
【０１２６】
上記の第一態様及び第二態様の塩基多型の検出方法並びに第三態様及び第四態様の塩基多型の検出キットにおいて、固相担体は、該固相担体を組み込んだ核酸検出用デバイスとして具現化されてもよい。
【０１２７】
図４（Ａ）は核酸検出用デバイスの一実施形態の平面図であり、図４（Ｂ）は同核酸検出用デバイスの側面図である。
【０１２８】
一実施形態の核酸検出用デバイス１は、固相担体１２を備えている。核酸検出用デバイス１は、任意選択で固相担体１２を支持するバッキング部材１５を備えてもよく、さらに任意選択で、固相担体１２と外部環境との間の気体の流通を妨げ、固相担体１２に保持されたプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション反応環境の気密性を維持するための被覆部材１６を備えてもよい。被覆部材１６は固相担体１２の表面を被覆する透明フィルムであり、透明フィルムを構成する素材は、固相担体表面の気密性を維持し、展開液の蒸発を妨げるものであればとくに限定されないが、例えばポリエチレンテレフタレートを挙げることができる。被覆部材１６を設けることにより、核酸クロマトグラフィーにおける非特異的シグナル（非特異的ハイブリダイゼーション）の発生を簡便に抑制でき、標的核酸の塩基多型をより高感度に検出することができる。
【０１２９】
図４（Ａ），（Ｂ）において、領域１８ａ，１８ｂ，１８ｃ，１８ｄ，１８ｅは、固相担体１２におけるプローブの固定位置であり、対応する標的核酸の増幅産物ごとに対応して、固相担体１２の先端部（図面下側）から一定程度離れた位置に、ライン状に互いに平行に離間して固定される。領域１８ｅは通常フローコントロールラインとする。
【０１３０】
例えばある一つの遺伝子中の２つの異なる位置に塩基多型がある場合、領域１８ａで第１の塩基多型部位における野生型塩基を検出し、領域１８ｂで第１の塩基多型部位における野生型塩基を検出し、領域１８ｃで第２の塩基多型部位における野生型塩基を検出し、領域１８ｄで第２の塩基多型部位における野生型塩基を検出するように対応させることができる。代わりに、４つの領域１８ａ，１８ｂ，１８ｃ，１８ｄをこれとは異なる順序で第１の塩基多型部位における野生型塩基、第１の塩基多型部位における変異型塩基、第２の塩基多型部位における野生型塩基、第２の塩基多型部位における変異型塩基のいずれかと対応させることもできる。
【０１３１】
プローブの固相担体１２への固定化方法は特に限定されず、その３’末端で固相担体１０に結合されていてもよいし、５’末端で結合されていてもよい。例えば、ニトロセルロース等を固相担体１２に使用する場合、プローブを固相担体１２にインクジェット方式でプリントした後、ＵＶ照射などにより固着性を高める。この方法の場合、プローブはＵＶの届く固相担体１２表面のみに固定化される。
【０１３２】
固相担体１２上には標的核酸の増幅産物に対応するプローブ領域を容易に特定できるように、１つ又は複数の位置マーカー１９ａ，１９ｂ，１９ｃ，１９ｄ，１９ｅを配置してもよい。位置マーカー１９ａ，１９ｂ，１９ｃ，１９ｄ，１９ｅの存在により、目視検出の場合であっても、簡便に標的核酸の特定位置における塩基多型の存在又は不存在を検出することができる。
【０１３３】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【０１３４】
１．試料の収集
標準DNAとして、マラリア感染が疑われたケニア人被検者から採取した血液由来の52の精製済みDNAを使用した。
２．マルチプレックスＰＣＲ
グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）遺伝子は、２種類の塩基多型（rs1050828及びrs1050829）を有することが知られている。rs1050828はG202Aとも称され、野生型では202G（グアニン）、変異型では202A(アラニン）となる。rs1050829はA376Gとも称され、野生型では376A(アラニン）、変異型では376G（グアニン）である。
【０１３５】
表１に、G6PD遺伝子中の２つの塩基多型の検出のためのマルチプレックスＰＣＲで用いたオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列を示す。
【０１３６】
F-1_202_Fw_Wt（配列番号１）がrs1050828の野生型に対応する順方向プライマーであり、F-2_202_Fw_Vr（配列番号２）がrs1050828の変異型に対応する順方向プライマーであり、Bio_202_Rv（配列番号３）がrs1050828の２つの順方向プライマーに対する共通の逆方向プライマーである。
【０１３７】
F-3_376_Fw_Wtがrs1050829（配列番号４）の野生型に対応する順方向プライマーであり、F-4_376_Fw_Vrが（配列番号５）rs1050829の変異型に対応する順方向プライマーであり、Bio_376_Rv（配列番号６）がrs1050829の２つの順方向プライマーに対する共通の逆方向プライマーである。
【０１３８】
G6PD遺伝子を表１に示すプライマーによりアレル特異的に増幅した。表２に、PCRに使用した試薬及びプライマーの量を示す。PCR 0.2 ml チューブバンド  セパレート8連  ナチュラル（Greiner Bio-One）に入れ、PCRに供した。
【０１３９】
各PCRプライマーは、G6PDの遺伝子配列に続き、スペーサー（3つのカーボン連結）、DNAタグ配列を連結した。図５に示すように、配列番号１，２，４，５の塩基配列からなる順方向プライマーの５’末端にはそれぞれＤＮＡタグ１，２，３，４を付け、それらの各々と対をなす配列番号３，６の塩基配列からなる逆方向プライマーの５’末端にはビオチンを付加した。
【０１４０】
DNAタグ付きプライマー及びビオチン付加プライマーはTBA株式会社で合成した。
【０１４１】
【表１】
2019170322.tif 000002
【０１４２】
【表２】
2019170322.tif 000003
【０１４３】
表３に、ＰＣＲ条件を示す。T100  サーマルサイクラー（Bio-Rad）を使用した。ステップ１として、95°C、3分の変性を1回行い、ステップ２として、変性95℃，30秒、アニーリング 68°C，30秒、伸長72℃，30秒を30サイクルで増幅を行った。
【０１４４】
【表３】
2019170322.tif 000004
【０１４５】
３．核酸検出デバイスを用いた核酸クロマトグラフィー
図５に示すように、核酸クロマトグラフィーストリップには、ＤＮＡタグ１，２，３，４に相補的なＤＮＡ鎖（タグ１相補鎖、タグ２相補鎖、タグ３相補鎖、タグ４相補鎖）を、ストリップの長手方向に対して交差する方向に略直線状にプリントしておいた。このような構成にすることで、例えば順方向プライマー  F-1_202_Fw_Wt（配列番号１）と逆方向プライマー  Bio_202_Rv（配列番号３）により増幅されたＤＮＡがある場合には、ＤＮＡタグ１に相補的なＤＮＡが取り付けられたラインがナノラテックス粒子により青色に呈色して観察される。ＤＮＡタグ２，３，４についても同様である。
【０１４６】
上記のマルチプレックスＰＣＲで得られたＰＣＲ産物を、核酸クロマトグラフィー用の展開液に加えてハイブリダイズ用溶液を調製し（表４）、核酸クロマトグラフィーストリップ（C-PAS8 (2 mm)（TBA株式会社）の下端を当該溶液に浸漬し、ＰＣＲ産物を室温にて核酸クロマトグラフィーストリップに展開した。
【０１４７】
【表４】
2019170322.tif 000005
【０１４８】
４．結果
図６に5検体の塩基多型の検出結果を示す。一番左のストリップは202G(野生型)かつ376A（野生型）、左から二番目のストリップは202G(野生型)かつ376がヘテロ接合体、左から三番目のストリップは202G(野生型)かつ376G（変異型）、左から四番目のストリップは202及び376ともにヘテロ接合体、左から五番目のストリップは202A(変異型)かつ376G（変異型）であることが分かる。一番右のストリップは被験者の標的核酸を含まない反応液を展開した陰性対照である。驚くべきことに、プライマーの３’末端を標的核酸の塩基多型部位に対応させても、好感度にG6PD中の２つの遺伝子多型の各々の野生型及び変異型を明確に識別することができた。
【０１４９】
２つの塩基多型が変異型であるヒトでは、抗マラリア剤のプリマキン（登録商標）の副作用が出ることが知られている。プリマキン（登録商標、サノフィ株式会社製）の用量は成人で１日１回30mg、小児で0.5mg/kg（最大で１日１回30mg）とされているが、左から五番目のストリップのように、塩基多型の検出結果に基づいて２つの塩基多型が変異型であると判定された被験者では、プリマキン（登録商標）を上記の用量よりも低用量で投与する等の処置をとることができる。
【０１５０】
ヒト臨床検体52サンプルを用いて、従来法であるサンガー法による従来の遺伝子多型検出法との一致率（Concordance rate）を評価したところ、52個のサンプル全てにおいて、本願実施例の塩基多型の検出法と、従来法とによる遺伝子多型検出の一致率は100%であった（データ非図示）。
【０１５１】
本実施例では、G6PD中の２種類の塩基多型部位を特異的にＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物を核酸クロマトグラフィーストリップに展開することで、検出されたバンドの位置から各塩基多型の有無を識別した。また、核酸クロマトグラフィーにより、ＰＣＲ後の検出を約１０分とする迅速化が可能となった。加えて、結果がストリップ上で青色ラインとして可視化されるため、バンドの位置を肉眼で容易に識別又は診断することが可能となった。
【０１５２】
本願実施例の塩基多型の検出法によれば、従来法に匹敵する高い精度で、一回のPCRで極めて迅速に複数の塩基多型を検出することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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