(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトＣＤ４０（ｈＣＤ４０）活性を中和し、ＣＤ４０活性が有害である障害に罹患しているヒト被験体において、ＣＤ４０を検出するため、及びＣＤ４０活性を阻害するために有用である、アゴニスト活性を実質的に有さないアンタゴニストヒト化抗体及びその抗原結合部分の提供。【解決手段】特定の配列のトポグラフィー的領域Ｃｙｓ６２−Ｐｈｅ６７、Ｇｌｎ７９−Ｃｙｓ８３、Ａｒｇ９０−Ｔｈｒ９９及びＴｈｒ２４−Ｃｙｓ３７によって定義されるヒトＣＤ４０のエピトープと結合する、単離されたアンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のトポグラフィー的領域Ｃｙｓ６２−Ｐｈｅ６７、Ｇｌｎ７９−Ｃｙｓ８３、Ａｒｇ９０−Ｔｈｒ９９およびＴｈｒ２４−Ｃｙｓ３７によって定義されるヒトＣＤ４０のエピトープと結合する、単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
アンタゴニスト抗体である、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３】
配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域および配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４】
配列番号１１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を含む重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５】
配列番号４２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を含む重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項６】
配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を含む重鎖可変領域および配列番号２１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項７】
ＩｇＧアイソタイプである、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８】
ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプである、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項９】
ジャーカット細胞レポーターアッセイにおいて少なくとも５０ｎＭのＩＣ５０を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１０】
配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域および／または配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１１】
軽鎖可変領域が、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、重鎖可変領域が、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、請求項１０に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１２】
重鎖可変領域が、配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２をさらに含む、請求項１０または１１に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３】
軽鎖可変領域が、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２をさらに含む、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１４】
重鎖可変領域が、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１をさらに含む、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１５】
軽鎖可変領域が、配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１をさらに含む、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１６】
配列番号６、４２および８のＣＤＲセットを含む重鎖可変領域ならびに配列番号２１、１１および１２のＣＤＲセットを含む軽鎖可変領域を含む、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１７】
ヒト化抗体である、請求項１０から１６のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１８】
ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む、請求項１７に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１９】
ヒトアクセプターフレームワークが、配列番号８２−１０６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２０】
ヒトアクセプターフレームワークが、少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、フレームワークのアミノ酸配列が、ヒトアクセプターフレームワークの配列と少なくとも６５％同一であり、ヒトアクセプターフレームワークと同一のアミノ酸残基を少なくとも７０個含む、請求項１８に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２１】
ヒトアクセプターフレームワークが、重要な残基における少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、重要な残基が、
ＣＤＲに隣接している残基；
グリコシル化部位残基；
稀な残基；
ヒトＣＤ４０と相互作用できる残基；
ＣＤＲと相互作用できる残基；
標準的残基；
重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の接触残基；
バーニアゾーン内の残基；ならびに
Ｃｈｏｔｈｉａによって定義される可変重鎖ＣＤＲ１とＫａｂａｔによって定義される第１の重鎖フレームワークとの間で重複する領域内の残基
からなる群から選択される、請求項１８に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２２】
重要な残基が、４８Ｈ、４９Ｈおよび３６Ｌからなる群から選択される、請求項２１に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２３】
重要な残基置換が、可変重鎖領域内にあり、Ｖ４８ＩまたはＳ４９Ａである、請求項２２に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２４】
重要な残基置換が、可変軽鎖領域内にあり、Ｙ３６Ｆである、請求項２２または２３に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２５】
配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１０から２４のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２６】
配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１０から２５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２７】
アゴニスト活性を実質的に有さない、請求項１から２６のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２８】
ＣＤ４０の、ＣＤ４０Ｌとの結合またはｓＣＤ４０Ｌとの結合を阻害する、請求項１から２７のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２９】
カニクイザルＣＤ４０と結合する、請求項１から２８のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３０】
ＣＤ４０の生物学的機能を調節することができる、請求項１から２９のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３１】
ＣＤ４０を中和することができる、請求項１から３０のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３２】
ＮＦ−κＢ活性化を阻害する、請求項１から３１のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３３】
表面プラズモン共鳴によって測定される場合、少なくとも約１０２Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０３Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０４Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１；および少なくとも約１０６Ｍ−１ｓ−１からなる群から選択される、ＣＤ４０との結合速度定数（Ｋｏｎ）を有する、請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３４】
最大で約１０−７Ｍ；最大で約１０−８Ｍ；最大で約１０−９Ｍ；最大で約１０−１０Ｍ；最大で約１０−１１Ｍ；最大で約１０−１２Ｍ；および最大で１０−１３Ｍからなる群から選択されるＣＤ４０との解離定数（ＫＤ）を有する、請求項１から３３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３５】
ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＡ定常ドメインまたはヒトＩｇＥ定常ドメインの重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項１から６および請求項９から３４のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３６】
重鎖免疫グロブリン定常領域ドメインが、ヒトＩｇＧ１定常ドメインである、請求項３５に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３７】
ヒトＩｇＧ１定常ドメインが、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３８】
ヒトＩｇカッパ定常ドメインまたはヒトＩｇラムダ定常ドメインを含む軽鎖免疫グロブリン定常ドメインをさらに含む、請求項１から３７のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３９】
ヒトＩｇカッパ定常ドメインが配列番号４のアミノ酸配列を含むかまたはヒトＩｇラムダ定常ドメインが配列番号８１のアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４０】
請求項１から３９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分と競合する、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４１】
配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号４２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４２】
配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４３】
配列番号４１に記載のアミノ酸配列もしくは配列番号４１に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む重鎖および／または配列番号４０に記載のアミノ酸配列もしくは配列番号４０に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖を含む、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４４】
重鎖が配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖が配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４３に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４５】
配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗ＣＤ４０抗体。
【請求項４６】
請求項１から４５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分および医薬として許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項４７】
請求項１から４５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分およびポリソルベートを含む、医薬組成物。
【請求項４８】
ポリソルベートがポリソルベート８０である、請求項４７に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
ヒスチジンバッファーを含む、請求項４６から４８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
ポリオールを含む、請求項４６から４８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
ポリオールが、マンニトール、ソルビトール、トレハロースまたはスクロースからなる群から選択される、請求項４６から４８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
約４から約８のｐＨを有する、請求項４６から５１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
約５から約７のｐＨを有する、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
凍結乾燥されたものである、請求項４６から５３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
請求項１から４５のいずれか一項に記載のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体アミノ酸配列をコードする、単離された核酸。
【請求項５６】
請求項５５に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項５７】
ｐｃＤＮＡ、ｐＴＴ、ｐＴＴ３、ｐＥＦＢＯＳ、ｐＢＶ、ｐＪＶおよびｐＢＪからなる群から選択される、請求項５６に記載のベクター。
【請求項５８】
請求項５６または５７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項５９】
原核細胞または真核細胞である、請求項５８に記載の宿主細胞。
【請求項６０】
真核細胞が、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞または昆虫細胞である、請求項５９に記載の宿主細胞。
【請求項６１】
哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞である、請求項６０に記載の宿主細胞。
【請求項６２】
抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分を産生する方法であって、請求項５８から６１のいずれか一項に記載の宿主細胞を、培養培地中、抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分が産生されるのに十分な条件下で培養するステップを含む、方法。
【請求項６３】
請求項６２に記載の方法によって産生された、抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分。
【請求項６４】
ヒトＣＤ４０活性を低下させる方法であって、ヒトＣＤ４０を、請求項１から４５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分と接触させ、その結果、ヒトＣＤ４０活性が低下するステップを含む、方法。
【請求項６５】
インビトロ方法である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
ＣＤ４０が有害である障害を有するヒト被験体を治療するための方法であって、被験体に請求項１から４５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分を有効量で投与することを含む、方法。
【請求項６７】
ＣＤ４０活性が有害である障害を有するヒト被験体におけるヒトＣＤ４０活性を低下させる方法であって、ヒト被験体に請求項１から４５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分を投与し、その結果、ヒト被験体におけるヒトＣＤ４０活性が低下するステップを含む、方法。
【請求項６８】
抗体またはその抗原結合部分を、被験体に第２の薬剤を投与する前に、それと同時にまたはその後に投与する、請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項６９】
第２の薬剤が、ヒトＩＬ−１２；ＰＧＥ２；ＬＰＡ；ＮＧＦ；ＣＧＲＰ；ＳｕｂＰ；ＲＡＧＥ；ヒスタミン；ヒスタミン受容体遮断薬；ブラジキニン；ＩＬ−１アルファ；ＩＬ−１ベータ；ＶＥＧＦ；ＰＬＧＦ；メトトレキサート；コルチコステロイド、グルココルチコイド受容体モジュレーター；シクロスポリン、ラパマイシン、ＦＫ５０６、非ステロイド性抗炎症剤、吸入されたステロイド；ベータ−アゴニスト；短時間作用性もしくは長時間作用性ベータ−アゴニスト；ロイコトリエンもしくはロイコトリエン受容体のアンタゴニスト；ＡＤＶＡＩＲ；ＩｇＥ阻害剤；抗ＩｇＥ抗体；ＸＯＬＡＩＲ；ホスホジエステラーゼ阻害剤；ＰＤＥ４阻害剤；キサンチン；抗コリン薬；肥満細胞安定化剤；クロモリン；ＩＬ−４阻害剤；ＩＬ−５阻害剤；エオタキシン／ＣＣＲ３阻害剤  ヒスタミンもしくはＨ１、Ｈ２、Ｈ３およびＨ４を含めたヒスタミン受容体のアンタゴニスト；プロスタグランジンＤもしくはその受容体ＤＰ１およびＣＲＴＨ２のアンタゴニスト；ＴＮＦアンタゴニスト；ＴＮＦ受容体の可溶性断片；ＥＮＢＲＥＬ；ＴＮＦ酵素アンタゴニスト；ＴＮＦ変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤；ムスカリン受容体アンタゴニスト；ＴＧＦ−ベータアンタゴニスト；インターフェロンガンマ；ピルフェニドン；化学療法剤、メトトレキサート；レフルノミド；シロリムス（ラパマイシン）もしくはその類似体、ＣＣＩ−７７９；ＣＯＸ２もしくはｃＰＬＡ２阻害剤；ＮＳＡＩＤ；免疫調節物質；ｐ３８阻害剤；ＴＰＬ−２、ＭＫ−２およびＮＦｋＢ阻害剤；ブデソニド；上皮増殖因子；コルチコステロイド；シクロスポリン；スルファサラジン；アミノサリチル酸；６−メルカプトプリン；アザチオプリン；メトロニダゾール；リポキシゲナーゼ阻害薬；メサラミン；オルサラジン；バルサラジド；抗酸化剤；トロンボキサン阻害剤；ＩＬ−１受容体アンタゴニスト；抗ＩＬ−１ベータ抗体；抗ＩＬ−６抗体；増殖因子；エラスターゼ阻害剤；ピリジニル−イミダゾール化合物；ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦもしくはＰＤＧＦに対する抗体もしくはアゴニスト；ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ９０もしくはそれらのリガンドに対する抗体；ＦＫ５０６；ラパマイシン；ミコフェノール酸モフェチル；イブプロフェン；プレドニゾロン；ホスホジエステラーゼ阻害剤；アデノシンアゴニスト；抗血栓剤；補体阻害剤；アドレナリン作動薬；ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８もしくはＭＡＰキナーゼ阻害剤；ＩＬ−１β変換酵素阻害剤；ＴＮＦ−α．ｑｕａｄｒａｔｕｒｅ．変換酵素阻害剤；Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤；メタロプロテイナーゼ阻害剤；６−メルカプトプリン；アンジオテンシン変換酵素阻害剤；可溶性サイトカイン受容体；可溶性ｐ５５  ＴＮＦ受容体；可溶性ｐ７５  ＴＮＦ受容体；ｓＩＬ−１ＲＩ；ｓＩＬ−１ＲＩＩ；ｓＩＬ−６Ｒ；抗炎症性サイトカイン；ＩＬ−４；ＩＬ−１０；ＩＬ−１１；またはＴＧＦ−βと結合することができる抗体またはその断片からなる群から選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
障害が、呼吸器疾患；喘息；アレルギー性喘息および非アレルギー性喘息；感染に起因する喘息；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）への感染に起因する喘息；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；気道炎症を伴う状態；好酸球増加症；線維症および過剰粘液産生；嚢胞性線維症；肺線維症；アトピー性障害；アトピー性皮膚炎；蕁麻疹；湿疹；アレルギー性鼻炎；アレルギー性胃腸炎；皮膚の炎症性状態および／または自己免疫性状態；胃腸器官の炎症性状態および／または自己免疫性状態；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；潰瘍性大腸炎；クローン病；肝臓の炎症性状態および／または自己免疫性状態；肝硬変；肝線維症；Ｂ型肝炎ウイルスおよび／またはＣ型肝炎ウイルスによって引き起こされる肝線維症；強皮症；腫瘍またはがん；肝細胞癌；神経膠芽腫；リンパ腫；ホジキンリンパ腫；ウイルス感染；細菌感染；寄生虫感染症；ＨＴＬＶ−１感染；防御１型免疫応答の発現の抑制およびワクチン接種中の防御１型免疫応答の発現の抑制からなる群から選択される、請求項６６から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
障害が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円板状ループス、ループス腎炎、サルコイドーシス、ならびに、若年性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、ライター症候群、強直性脊椎炎および痛風性関節炎を含むがこれらに限定されない炎症性関節炎、臓器または組織移植片の拒絶反応、超急性、急性もしくは慢性の拒絶反応および／または移植片対宿主病、多発性硬化症、高ＩｇＥ症候群、結節性多発性動脈炎、原発性胆汁性肝硬変、炎症性腸疾患、クローン病、セリアック病（グルテン過敏性腸症）、自己免疫性肝炎、悪性貧血、自己免疫性溶血性貧血、乾癬、強皮症、重症筋無力症、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性甲状腺炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、免疫複合体病、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、多発性筋炎および皮膚筋炎、寒冷グロブリン血症、血栓溶解、心筋症、尋常性天疱瘡、間質性肺線維症、サルコイドーシス、１型糖尿病および２型糖尿病、１型、２型、３型および４型遅延型過敏症、アレルギーまたはアレルギー性障害、治療用タンパク質に対する望ましくない／意図されたものではない免疫応答、喘息、チャーグ・ストラウス症候群（アレルギー性肉芽腫症）、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎および刺激性接触皮膚炎、化膿性汗腺炎、ぶどう膜炎、蕁麻疹、ＩｇＥ依存性アレルギー、アテローム性動脈硬化症、血管炎、特発性炎症性筋疾患、溶血性疾患、アルツハイマー病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、シェーグレン症候群および乾癬のような自己免疫性疾患または炎症性疾患からなる群から選択される、請求項６６から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
抗体またはその抗原結合断片が、非経口様式、皮下様式、筋肉内様式、静脈内様式、関節内様式、気管支内様式、腹腔内様式、嚢内様式、軟骨内様式、腔内様式、腔内様式、小脳内様式、脳室内様式、結腸内様式、頸管内様式、胃内様式、肝内様式、心筋内様式、骨内様式、骨盤内様式、心膜内様式、腹腔内様式、胸膜内様式、前立腺内様式、肺内様式、直腸内様式、腎臓内様式、網膜内様式、脊髄内様式、滑液内様式、胸腔内様式、子宮内様式、膀胱内様式、ボーラス様式、膣様式、直腸様式、頬側様式、舌下様式、鼻腔内様式および経皮様式からなる群から選択される少なくとも１つの様式によって投与される、請求項６６から７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
試験試料中のＣＤ４０またはその断片の存在をイムノアッセイによって決定する方法であって、イムノアッセイが、試験試料を請求項１から４５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗体またはその抗原結合部分および少なくとも１つの検出可能な標識と接触させることを含む、方法。
【請求項７４】
（ｉ）試験試料を少なくとも１つの抗体またはその抗原結合部分と接触させるステップであって、抗体またはその抗原結合部分がＣＤ４０またはその断片上のエピトープと結合して第１の複合体を形成するステップ、（ｉｉ）複合体を少なくとも１つの検出可能な標識と接触させるステップであって、検出可能な標識が、第１の複合体上のエピトープまたは抗体もしくはその抗原結合部分が結合していないＣＤ４０もしくはその断片上のエピトープと結合して第２の複合体を形成するステップ、および（ｉｉｉ）第２の複合体中の検出可能な標識によって生成されるシグナルに基づいて試験試料中のＣＤ４０またはその断片の存在を検出するステップであって、ＣＤ４０またはその断片の存在が、検出可能な標識によって生成されるシグナルと直接相関するステップとをさらに含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
（ｉ）試験試料を少なくとも１つの抗体またはその抗原結合部分と接触させるステップであって、抗体またはその抗原結合部分がＣＤ４０またはその断片上のエピトープと結合して第１の複合体を形成するステップ、（ｉｉ）複合体を少なくとも１つの検出可能な標識と接触させるステップであって、検出可能な標識がＣＤ４０またはその断片と抗体またはその抗原結合部分との結合について競合して第２の複合体を形成するステップ、および（ｉｉｉ）第２の複合体中の検出可能な標識によって生成されるシグナルに基づいて試験試料中のＣＤ４０またはその断片の存在を検出するステップであって、ＣＤ４０またはその断片の存在が、検出可能な標識によって生成されるシグナルと間接的に相関するステップをさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本明細書によりその内容全体が本明細書に参照により組み込まれる、２０１５年５月２９日に出願された米国仮出願第６２／１６８，４２５号の優先権を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、その全体が本明細書に参照により組み込まれる、配列表を含有する。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１６年５月１２日に作成され、名称は１１７８１３−１０４２０＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは９１，０１９バイトである。
【０００３】
本発明は、ＣＤ４０（ＣＤ４０）抗体およびその抗原結合部分ならびに種々の疾患の予防および／または治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
ＣＤ４０は、Ｂ細胞発生、リンパ球活性化および抗原提示細胞（ＡＰＣ）機能において重要な役割を果たす腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーメンバーである。臓器特異的自己免疫疾患ならびに全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のような全身性自己免疫では、上皮、白血球および血管内皮におけるＣＤ４０発現が上昇する。ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０シグナル伝達経路の破壊により、クローン病のような慢性炎症性疾患の患者において、ＩＬ−２３およびＴＮＦのような炎症促進サイトカインの産生が減少し、Ｔヘルパー細胞の分化および機能が低下し、また、マクロファージの活性化が阻害される。ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの相互作用により、体液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方が誘導される。ＣＤ４０は、このリガンド−受容体対を調節して、Ｂ細胞および樹状細胞（ＤＣ）を含めたその他の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化する。
【０００５】
ＣＤ４０は、広範囲の造血細胞型（リンパ球、単球、樹状細胞）および非造血細胞型（上皮、内皮、線維芽細胞）において発現する、４８ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質（ｖａｎ  Ｋｏｏｔｅｎ、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．２０００年１月；６７（１）：２−１７頁）である。ＣＤ４０Ｌは、主に活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞および血小板において発現する。ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ生物学の理解の大部分は、ＡＰＣ（樹状細胞（ＤＣ）またはＢ細胞のいずれかにおけるＣＤ４０発現）とＣＤ４０Ｌ発現Ｔ細胞との間の相互作用によってもたらされる。休止状態のＢ細胞では、ＣＤ４０Ｌとの会合により、Ｂ細胞活性化、増殖およびメモリーＢ細胞発生が駆動される（Ｋｅｈｒｙ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６年４月１日；１５６（７）：２３４５−８頁）。ＣＤ４０シグナル伝達は、免疫グロブリンクラススイッチおよび胚中心形成にも必要である。Ｂ細胞生物学におけるＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌシグナル伝達経路の重要性は、胚中心を欠き、Ｔ依存性抗体応答が抑制されるＣＤ４０欠損マウスまたはＣＤ４０Ｌ欠損マウスにおいて明らかである。しかし、Ｔ非依存性ＩｇＧ応答はＣＤ４０−／−マウスにおいてインタクトなままであり、これにより、これらのマウスにおいて欠如しているのが細胞間相互作用であることが示唆される。ＣＤ４０欠損マウスは、Ｔ細胞区画にも欠損を有する。樹状細胞上のＣＤ４０を通じたシグナル伝達により、ＭＨＣクラスＩＩならびにＣＤ８０およびＣＤ８６のような種々の共刺激分子が上方制御され、ＤＣの成熟化が促進される。成熟ＤＣにより、ＩＬ−２およびＩＬ−１２のようなサイトカインの産生を通じてＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化および生存が刺激される。ＣＤ４０Ｌ−／−マウスにおいてＴ依存性体液性応答が損なわれる主要な原因は、非効率的なＴ細胞初回刺激であると思われる（Ｇｒｅｗａｌ、Ｎａｔｕｒｅ．１９９５年１２月７日；３７８（６５５７）：６１７−２０頁）。Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群を有するヒトにおいて、同様のＢ細胞表現型が見られ得る。これらの患者は、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌシグナル伝達を抑止する、ＣＤ４０Ｌ遺伝子座における突然変異に起因して、原発性免疫不全症に罹患している。これらの個体では、ＩｇＭレベルが上昇しており、また、ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＥを産生することができず、その結果、日和見感染症のリスクが上昇する（Ａｄｒｉａｎａ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８年５月；２８、補遺１：Ｓ６２−６頁）。
【０００６】
ＣＤ４０シグナル伝達経路は、休止状態またはナイーブのリンパ球およびＡＰＣの、活性化／成熟表現型への変換の中核をなす。Ｔ細胞初回刺激およびＢ細胞活性化はＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌシグナル伝達の不在下で起こり得るが、この経路は、ロバストな適応免疫応答の生成に必要である。ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの会合の結果、ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）がＣＤ４０の細胞質ドメインに動員される（Ｂｉｓｈｏｐ、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．２００７；５９７：１３１−５１頁）。種々のＴＲＡＦタンパク質のリン酸化の結果として、標準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ＮＦｋＢ経路と非標準的（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ＮＦｋＢ経路の両方が活性化される。さらに、ＪＡＫ３とＣＤ４０細胞質尾部の会合の結果として、ＳＴＡＴ５活性化がもたらされ、それにより、ＤＣの成熟化ならびにＴＮＦおよびＩＦＮγ産生が誘導される。ＴＲＡＦ６依存性ＰＩ３Ｋ活性化はＤＣにおける重大な生存シグナルであり、一方、ＴＲＡＦ２／ＴＲＡＦ６は、ＮＦｋＢ活性化およびＣＤ８０発現の上方制御において重複する機能を有する（Ｈｏｓｔａｇｅｒ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３年１１月１４日；２７８（４６）：４５３８２−９０頁）。ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ５およびＴＲＡＦ６は全て、ＣＤ４０シグナル伝達によって媒介される免疫グロブリンクラススイッチにおいて重要な役割を果たすことが示されている（Ｌｅｏ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９９年２月１６日；９６（４）：１４２１−１４２６頁）。
【０００７】
ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌシグナル伝達経路は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、多発性硬化症、関節リウマチおよびシェーグレン症候群を含めた多くの自己免疫疾患の病理発生に関係づけられている（ＬａｗおよびＧｒｅｗａｌ、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．２００９；６４７：８−３６頁）。腎臓、腸および関節を含めた、慢性自己免疫による損傷を受けた組織におけるマクロファージ、内皮、上皮およびＢ細胞において、ＣＤ４０発現が上昇する（Ｂｏｒｃｈｅｒｄｉｎｇ、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２０１０年４月；１７６（４）：１８１６−２７頁、；Ｓａｗａｄａ−Ｈａｓｅ、Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０００年６月；９５（６）：１５１６−２３頁）。ＳＬＥ、ＩＢＤおよびシェーグレン症候群に罹患している患者では、炎症負荷と一致して、可溶性ＣＤ４０Ｌが上昇する。
【０００８】
慢性小腸炎におけるＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ経路に関する最古の証拠の一部は、抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂにより齧歯類が実験的大腸炎から保護される前臨床モデルから得られたものである（ｄｅ  Ｊｏｎｇ、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２０００年９月；１１９（３）：７１５−２３頁；Ｌｉｕ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ｊｕｎ  １；１６４（１１）：６００５−１４頁；Ｓｔｕｂｅｒ、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９６年２月１日、１８３（２）：６９３−８頁）。疾患活動性スコアの減少は、消化管における炎症促進性サイトカイン産生の減少および慢性的な体重減少からの保護に関連付けられた。ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌが遺伝的に欠損した動物において同様の結果が観察された（ｄｅ  Ｊｏｎｇ、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２０００年９月；１１９（３）：７１５−２３頁）。それでも疾患の発症後にマウスを抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂで処置することが疾患活動性を低下させるのに有効であり、これにより、この経路が慢性炎症性疾患の維持のために重大であることが示唆される。さらに、ＣＤ４０アゴニスト抗体は、リンパ球を欠くマウスにおいて小腸炎を駆動するのに十分である（Ｕｈｌｉｇ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００６年８月；２５（２）：３０９−１８頁）。ＣＤ４０  ｓｉＲＮＡを使用したごく最近のデータによっても、大腸炎におけるＣＤ４０シグナル伝達の重要な役割が指摘されている（Ａｒｒａｎｚ、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１３年２月１０日；１６５（３）：１６３−７２頁）。クローン病では、固有層単球および上皮は高レベルのＣＤ４０を発現し、ＣＤ４０＋単球は末梢血に濃縮される。さらに、ＣＤ４０遺伝子座の多型が、ＩＢＤへの易罹患性に関連付けられている。抗ＴＮＦ抗体を用いて治療されたクローン病患者において、転写プロファイリングにより、適切な薬物治療応答を有する患者ではＣＤ４０  ｍＲＮＡレベルが低下することが示された。しかし、ＴＮＦ阻害剤に対する反応が不十分な患者ではＣＤ４０  ｍＲＮＡレベルは変化せず、これにより、これらの患者における炎症がＣＤ４０依存性ＴＮＦ非依存性経路により促進される可能性があることが示唆される。試験により、ＣＤ４０媒介性シグナル伝達の阻害がＩＢＤならびにその他の自己免疫疾患の病理発生において重要であることが示唆される。したがって、クローン病のような慢性炎症性疾患および障害を治療するために、治療目的で使用することができるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体およびその抗原結合部分が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ｖａｎ  Ｋｏｏｔｅｎ、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．２０００年１月；６７（１）：２−１７頁
【非特許文献２】Ｋｅｈｒｙ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６年４月１日；１５６（７）：２３４５−８頁
【非特許文献３】Ｇｒｅｗａｌ、Ｎａｔｕｒｅ．１９９５年１２月７日；３７８（６５５７）：６１７−２０頁
【非特許文献４】Ａｄｒｉａｎａ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８年５月；２８、補遺１：Ｓ６２−６頁
【非特許文献５】Ｂｉｓｈｏｐ、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．２００７；５９７：１３１−５１頁
【非特許文献６】Ｈｏｓｔａｇｅｒ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３年１１月１４日；２７８（４６）：４５３８２−９０頁
【非特許文献７】Ｌｅｏ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９９年２月１６日；９６（４）：１４２１−１４２６頁
【非特許文献８】ＬａｗおよびＧｒｅｗａｌ、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．２００９；６４７：８−３６頁
【非特許文献９】Ｂｏｒｃｈｅｒｄｉｎｇ、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２０１０年４月；１７６（４）：１８１６−２７頁
【非特許文献１０】Ｓａｗａｄａ−Ｈａｓｅ、Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０００年６月；９５（６）：１５１６−２３頁
【非特許文献１１】ｄｅ  Ｊｏｎｇ、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２０００年９月；１１９（３）：７１５−２３頁
【非特許文献１２】Ｌｉｕ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ｊｕｎ  １；１６４（１１）：６００５−１４頁
【非特許文献１３】Ｓｔｕｂｅｒ、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９６年２月１日、１８３（２）：６９３−８頁
【非特許文献１４】Ｕｈｌｉｇ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００６年８月；２５（２）：３０９−１８頁
【非特許文献１５】Ａｒｒａｎｚ、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１３年２月１０日；１６５（３）：１６３−７２頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分に関する。本発明の抗体として、それだけには限らないが、ヒトＣＤ４０と結合することができ、アゴニスト活性を実質的に有さないアンタゴニストヒト化抗体およびその抗原結合部分が挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第１の態様では、本発明は、配列番号１のトポグラフィー的（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃ）領域Ｃｙｓ６２−Ｐｈｅ６７、Ｇｌｎ７９−Ｃｙｓ８３、Ａｒｇ９０−Ｔｈｒ９９およびＴｈｒ２４−Ｃｙｓ３７によって定義されるヒトＣＤ４０のエピトープと結合する、単離された抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。一実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、アンタゴニスト抗体である。一実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、アゴニスト活性を実質的に有さないアンタゴニスト抗体である。
【００１２】
別の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域および配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、配列番号１１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を含む重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を含む軽鎖可変領域を含む。別のさらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、配列番号４２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を含む重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を含む重鎖可変領域および配列番号２１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を含む軽鎖可変領域を含む。
【００１３】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＩｇＧアイソタイプである。さらなる関連する実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプである。
【００１４】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ジャーカット細胞レポーターアッセイにおいて少なくとも５０ｎＭのＩＣ５０を有する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域および／または配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。一実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分の軽鎖可変領域は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、重鎖可変領域は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分の重鎖可変領域は、配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２をさらに含む。別のさらなる実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分の軽鎖可変領域は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２をさらに含む。別の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分の重鎖可変領域は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１をさらに含む。別のさらなる実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分の軽鎖可変領域は、配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１をさらに含む。
【００１６】
別の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、配列番号６、４２および８のＣＤＲセットを含む重鎖可変領域ならびに配列番号２１、１１および１２のＣＤＲセットを含む軽鎖可変領域を含む。
【００１７】
一実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、ヒト化されたものである。さらなる実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む。さらなる関連する実施形態では、ヒトアクセプターフレームワークは、配列番号８２−１０６から選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ヒトアクセプターフレームワークは、少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、フレームワークのアミノ酸配列は、前記ヒトアクセプターフレームワークの配列と少なくとも６５％同一であり、前記ヒトアクセプターフレームワークと同一であるアミノ酸残基を少なくとも７０個含む。さらなる実施形態では、ヒトアクセプターフレームワークは、重要な残基に少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、前記重要な残基が、以下から選択される：
ＣＤＲに隣接する残基；
グリコシル化部位残基；
希な残基；
ヒトＣＤ４０と相互作用できる残基；
ＣＤＲと相互作用できる残基；
標準的残基；
重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の接触残基；
バーニアゾーン（Ｖｅｒｎｉｅｒ  ｚｏｎｅ）内の残基；および
Ｃｈｏｔｈｉａによって定義される可変重鎖ＣＤＲ１とＫａｂａｔによって定義される第１の重鎖フレームワークとの間で重複する領域内の残基。
【００１８】
さらなる関連する実施形態では、重要な残基は、４８Ｈ、４９Ｈおよび３６Ｌから選択される。一実施形態では、重要な残基置換は、可変重鎖領域におけるものであり、Ｖ４８ＩまたはＳ４９Ａである。別の実施形態では、重要な残基置換は、可変軽鎖領域におけるものであり、Ｙ３６Ｆである。
【００１９】
一実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２０】
一実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、アゴニスト活性を実質的に有さない。別の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤ４０のＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）との結合または可溶性ＣＤ４０リガンド（ｓＣＤ４０Ｌ）との結合を阻害する。別のさらなる実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、カニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＤ４０と結合する。一実施形態では、抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＣＤ４０およびカニクイザルＣＤ４０を結合するが、ラットＣＤ４０、ウサギＣＤ４０またはマウスＣＤ４０を結合しない。
【００２１】
別の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤ４０の生物学的機能を調節することができる。さらなる実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤ４０を中和することができる。さらに別のさらなる実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、ＮＦ−κＢ活性化を阻害する。
【００２２】
一実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴によって測定される、少なくとも約１０２Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０３Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０４Ｍ−１ｓ−１；少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１；および少なくとも約１０６Ｍ−１ｓ−１から選択される、ＣＤ４０との結合速度定数（Ｋｏｎ）を有する。
別の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、最大で約１０−７Ｍ；最大で約１０−８Ｍ；最大で約１０−９Ｍ；最大で約１０−１０Ｍ；最大で約１０−１１Ｍ；最大で約１０−１２Ｍ；および最大で１０−１３Ｍからなる群から選択される、ＣＤ４０との解離定数（ＫＤ）を有する。
【００２３】
別の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＡ定常ドメインまたはヒトＩｇＥ定常ドメインの重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。関連する実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分の重鎖免疫グロブリン定常領域ドメインは、ヒトＩｇＧ１定常ドメインである。さらなる関連する実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分のヒトＩｇＧ１定常ドメインは、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【００２４】
別の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＩｇカッパ定常ドメインまたはヒトＩｇラムダ定常ドメインを含む軽鎖免疫グロブリン定常ドメインをさらに含む。関連する実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分のヒトＩｇカッパ定常ドメインが配列番号４のアミノ酸配列を含むか、またはヒトＩｇラムダ定常ドメインが配列番号８１のアミノ酸配列を含む。
【００２５】
本発明は、特定の実施形態では、本明細書に記載の態様および実施形態のいずれかに記載されている抗体またはその抗原結合部分と競合するアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分も特徴とする。
【００２６】
別の態様では、本発明は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号４２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含むアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
【００２７】
別の態様では、本発明は、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含むアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。別の態様では、本発明は、配列番号２８に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび／または配列番号２０に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含むアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。
【００２８】
別の態様では、本発明は、配列番号４１に記載のアミノ酸配列もしくは配列番号４１に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む重鎖および／または配列番号４０に記載のアミノ酸配列もしくは配列番号４０に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖を含むアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。一実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分の重鎖は、配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含み、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分の軽鎖は、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む。
【００２９】
別の態様では、本発明は、配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗ＣＤ４０抗体を特徴とする。
【００３０】
一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合部分は、組換え抗体またはその抗原結合部分である。
【００３１】
本発明は、特定の実施形態では、本明細書に記載の態様および実施形態のいずれかに記載されている抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分および医薬として許容される担体を含む医薬組成物も特徴とする。
【００３２】
本発明は、その他の特定の実施形態では、本明細書に記載の態様および実施形態のいずれかに記載されている抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分およびポリソルベートを含む医薬組成物も特徴とする。さらなる関連する実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート８０である。
【００３３】
別の実施形態では、医薬組成物は、ヒスチジンバッファーを含む。
【００３４】
別のさらなる実施形態では、医薬組成物は、ポリオールを含む。関連する実施形態では、ポリオールは、マンニトール、ソルビトール、トレハロースまたはスクロースから選択される。
【００３５】
別の実施形態では、医薬組成物は、約４から約８のｐＨを有する。関連する実施形態では、医薬組成物は、約５から約７のｐＨを有する。
【００３６】
別の実施形態では、医薬組成物は凍結乾燥されたものである。
【００３７】
本発明は、その他の実施形態では、本明細書に記載の態様および実施形態のいずれか１つのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体アミノ酸配列をコードする単離された核酸も特徴とする。さらなる実施形態では、本発明は、単離された核酸を含むベクターを特徴とする。関連する実施形態では、ベクターは、ｐｃＤＮＡベクター、ｐＴＴベクター、ｐＴＴ３ベクター、ｐＥＦＢＯＳベクター、ｐＢＶベクター、ｐＪＶベクターおよびｐＢＪベクターから選択される。
【００３８】
別の実施形態では、宿主細胞は、ベクターを含む。関連する実施形態では、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である。さらなる実施形態では、真核細胞は、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞または昆虫細胞である。別のさらなる実施形態では、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞である。
【００３９】
本発明は、特定の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分を産生する方法であって、本明細書に記載の態様および実施形態のいずれか１つの宿主細胞を、培養培地中、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分が産生されるのに十分な条件下で培養するステップを含む方法も特徴とする。さらなる実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分を当該方法によって産生する。
【００４０】
本発明は、その他の実施形態では、ヒトＣＤ４０活性を低下させる方法であって、ヒトＣＤ４０を本明細書に記載の態様および実施形態のいずれか１つの抗体またはその抗原結合部分と接触させ、その結果、ヒトＣＤ４０活性が低下するステップを含む方法も特徴とする。さらなる実施形態では、この方法は、インビトロ方法である。
【００４１】
本発明は、その他の特定の実施形態では、ＣＤ４０が有害である障害を有するヒト被験体を治療するための方法であって、被験体に本明細書に記載の態様および実施形態のいずれか１つの抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分を有効量で投与するステップを含む方法も特徴とする。
【００４２】
本発明は、その他の実施形態では、ＣＤ４０活性が有害である障害を有するヒト被験体におけるヒトＣＤ４０活性を低下させる方法であって、ヒト被験体に本明細書に記載の態様および実施形態のいずれか１つの抗体またはその抗原結合部分を投与し、その結果、ヒト被験体におけるヒトＣＤ４０活性が低下するステップを含む方法も特徴とする。
【００４３】
さらなる実施形態では、被験体に第２の薬剤を投与する前に、それと同時にまたはその後に、抗体またはその抗原結合部分を投与する。さらなる関連する実施形態では、第２の薬剤は、ヒトＩＬ−１２；ＰＧＥ２；ＬＰＡ；ＮＧＦ；ＣＧＲＰ；ＳｕｂＰ；ＲＡＧＥ；ヒスタミン；ヒスタミン受容体遮断薬；ブラジキニン；ＩＬ−１アルファ；ＩＬ−１ベータ；ＶＥＧＦ；ＰＬＧＦ；メトトレキサート；コルチコステロイド、グルココルチコイド受容体モジュレーター；シクロスポリン、ラパマイシン、ＦＫ５０６、非ステロイド性抗炎症剤、吸入されたステロイド；ベータ−アゴニスト；短時間作用性もしくは長時間作用性ベータ−アゴニスト；ロイコトリエンもしくはロイコトリエン受容体のアンタゴニスト；ＡＤＶＡＩＲ；ＩｇＥ阻害剤；抗ＩｇＥ抗体；ＸＯＬＡＩＲ；ホスホジエステラーゼ阻害剤；ＰＤＥ４阻害剤；キサンチン；抗コリン薬；肥満細胞−安定化剤；クロモリン；ＩＬ−４阻害剤；ＩＬ−５阻害剤；エオタキシン／ＣＣＲ３阻害剤  ヒスタミンもしくはＨ１、Ｈ２、Ｈ３およびＨ４を含めたヒスタミン受容体のアンタゴニスト；プロスタグランジンＤもしくはその受容体ＤＰ１およびＣＲＴＨ２のアンタゴニスト；ＴＮＦアンタゴニスト；ＴＮＦ受容体の可溶性断片；ＥＮＢＲＥＬ；ＴＮＦ酵素アンタゴニスト；ＴＮＦ変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤；ムスカリン受容体アンタゴニスト；ＴＧＦ−ベータアンタゴニスト；インターフェロンガンマ；ピルフェニドン；化学療法剤、メトトレキサート；レフルノミド；シロリムス（ラパマイシン）もしくはその類似体、ＣＣＩ−７７９；ＣＯＸ２もしくはｃＰＬＡ２阻害剤；ＮＳＡＩＤ；免疫調節物質；ｐ３８阻害剤；ＴＰＬ−２、ＭＫ−２およびＮＦｋＢ阻害剤；ブデソニド；上皮増殖因子；コルチコステロイド；シクロスポリン；スルファサラジン；アミノサリチル酸；６−メルカプトプリン；アザチオプリン；メトロニダゾール；リポキシゲナーゼ阻害薬；メサラミン；オルサラジン；バルサラジド；抗酸化剤；トロンボキサン阻害剤；ＩＬ−１受容体アンタゴニスト；抗ＩＬ−１ベータ抗体；抗ＩＬ−６抗体；増殖因子；エラスターゼ阻害剤；ピリジニル−イミダゾール化合物；ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦもしくはＰＤＧＦに対する抗体もしくはアゴニスト；ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ９０もしくはそれらのリガンドに対する抗体；ＦＫ５０６；ラパマイシン；ミコフェノール酸モフェチル；イブプロフェン；プレドニゾロン；ホスホジエステラーゼ阻害剤；アデノシンアゴニスト；抗血栓剤；補体阻害剤；アドレナリン作動薬；ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８もしくはＭＡＰキナーゼ阻害剤；ＩＬ−１β変換酵素阻害剤；ＴＮＦ−α．ｑｕａｄｒａｔｕｒｅ．変換酵素阻害剤；Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤；メタロプロテイナーゼ阻害剤；６−メルカプトプリン；アンジオテンシン変換酵素阻害剤；可溶性サイトカイン受容体；可溶性ｐ５５  ＴＮＦ受容体；可溶性ｐ７５  ＴＮＦ受容体；ｓＩＬ−１ＲＩ；ｓＩＬ−１ＲＩＩ；ｓＩＬ−６Ｒ；抗炎症性サイトカイン；ＩＬ−４；ＩＬ−１０；ＩＬ−１１；またはＴＧＦ−βと結合することができる抗体またはその断片から選択される。
【００４４】
さらなる実施形態では、障害は、呼吸器疾患；喘息；アレルギー性喘息および非アレルギー性喘息；感染に起因する喘息；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）への感染に起因する喘息；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；気道炎症を伴う状態；好酸球増加症；線維症および過剰粘液産生；嚢胞性線維症；肺線維症；アトピー性障害；アトピー性皮膚炎；蕁麻疹；湿疹；アレルギー性鼻炎；アレルギー性胃腸炎；皮膚の炎症性状態および／または自己免疫性状態；胃腸器官の炎症性状態および／または自己免疫性状態；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；潰瘍性大腸炎；クローン病；肝臓の炎症性状態および／または自己免疫性状態；肝硬変；肝線維症；Ｂ型肝炎ウイルスおよび／またはＣ型肝炎ウイルスによって引き起こされる肝線維症；強皮症；腫瘍またはがん；肝細胞癌；神経膠芽腫；リンパ腫；ホジキンリンパ腫；ウイルス感染；細菌感染；寄生虫感染症；ＨＴＬＶ−１感染；防御１型免疫応答の発現の抑制およびワクチン接種中の防御１型免疫応答の発現の抑制から選択される。
【００４５】
別のさらなる実施形態では、障害は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円板状ループス、ループス腎炎、サルコイドーシス、ならびに、若年性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、ライター症候群、強直性脊椎炎および痛風性関節炎を含むがこれらに限定されない炎症性関節炎、臓器または組織移植片の拒絶反応、超急性、急性もしくは慢性の拒絶反応および／または移植片対宿主病、多発性硬化症、高ＩｇＥ症候群、結節性多発性動脈炎、原発性胆汁性肝硬変、炎症性腸疾患、クローン病、セリアック病（グルテン過敏性腸症）、自己免疫性肝炎、悪性貧血、自己免疫性溶血性貧血、乾癬、強皮症、重症筋無力症、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性甲状腺炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、免疫複合体病、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、多発性筋炎および皮膚筋炎、寒冷グロブリン血症、血栓溶解、心筋症、尋常性天疱瘡、間質性肺線維症、サルコイドーシス、１型糖尿病および２型糖尿病、１型、２型、３型および４型遅延型過敏症、アレルギーまたはアレルギー性障害、治療用タンパク質に対する望ましくない／意図されたものではない免疫応答、喘息、チャーグ・ストラウス症候群（アレルギー性肉芽腫症）、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎および刺激性接触皮膚炎、蕁麻疹、ＩｇＥ依存性アレルギー、アテローム性動脈硬化症、血管炎、特発性炎症性筋疾患、溶血性疾患、アルツハイマー病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、シェーグレン症候群ならびに乾癬のような自己免疫性疾患または炎症性疾患から選択される。
【００４６】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を治療するために使用される。
【００４７】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、潰瘍性大腸炎を治療するために使用される。
【００４８】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、クローン病を治療するために使用される。
【００４９】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を治療するために使用される。
【００５０】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、サルコイドーシスを治療するために使用される。
【００５１】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、若年性関節炎を治療するために使用される。
【００５２】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、関節リウマチを治療するために使用される。
【００５３】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、乾癬性関節炎を治療するために使用される。
【００５４】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、強直性脊椎炎を治療するために使用される。
【００５５】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、化膿性汗腺炎を治療するために使用される。
【００５６】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、ぶどう膜炎を治療するために使用される。
【００５７】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、シェーグレン症候群を治療するために使用される。
【００５８】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、乾癬を治療するために使用される。
【００５９】
別のさらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、非経口様式、皮下様式、筋肉内様式、静脈内様式、関節内様式、気管支内様式、腹腔内様式、嚢内様式、軟骨内様式、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ）様式、腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）様式、小脳内様式、脳室内様式、結腸内様式、頸管内様式、胃内様式、肝内様式、心筋内様式、骨内（ｉｎｔｒａｏｓｔｅａｌ）様式、骨盤内様式、心膜内様式、腹腔内様式、胸膜内様式、前立腺内様式、肺内様式、直腸内様式、腎臓内様式、網膜内様式、脊髄内様式、滑液内様式、胸腔内様式、子宮内様式、膀胱内様式、ボーラス様式、膣様式、直腸様式、頬側様式、舌下様式、鼻腔内様式および経皮様式から選択される少なくとも１つの様式によって投与される。
【００６０】
本発明は、その他の特定の実施形態では、試験試料中のＣＤ４０またはその断片の存在をイムノアッセイによって決定する方法であって、イムノアッセイが、試験試料を本明細書に記載の態様および実施形態のいずれかの少なくとも１つの抗体またはその抗原結合部分ならびに少なくとも１つの検出可能な標識と接触させることを含む方法も特徴とする。さらなる実施形態では、方法は、（ｉ）試験試料を少なくとも１つの抗体またはその抗原結合部分と接触させるステップであって、抗体またはその抗原結合部分がＣＤ４０またはその断片上のエピトープと結合して第１の複合体を形成するステップ、（ｉｉ）複合体を少なくとも１つの検出可能な標識と接触させるステップであって、検出可能な標識が第１の複合体上のエピトープまたは抗体もしくはその抗原結合部分が結合していないＣＤ４０もしくはその断片上のエピトープと結合して第２の複合体を形成するステップ、および（ｉｉｉ）第２の複合体中の検出可能な標識によって生成されるシグナルに基づいて試験試料中のＣＤ４０またはその断片の存在を検出するステップであって、ＣＤ４０またはその断片の存在が、検出可能な標識によって生成されるシグナルと直接相関するステップを、さらに含む。さらなる関連する実施形態では、方法は、（ｉ）試験試料を少なくとも１つの抗体またはその抗原結合部分と接触させるステップであって、抗体またはその抗原結合部分がＣＤ４０またはその断片上のエピトープと結合して第１の複合体を形成するステップ、（ｉｉ）複合体を少なくとも１つの検出可能な標識と接触させるステップであって、抗体またはその抗原結合部分との結合について、検出可能な標識がＣＤ４０またはその断片と競合して、第２の複合体を形成するステップ、および（ｉｉｉ）第２の複合体中の検出可能な標識によって生成されるシグナルに基づいて試験試料中のＣＤ４０またはその断片の存在を検出するステップであって、ＣＤ４０またはその断片の存在が、検出可能な標識によって生成されるシグナルと間接的に相関するステップを、さらに含む。
【００６１】
一実施形態では、本発明は、結合領域、例えば、本明細書に記載のＣＤＲを含むＤＶＤ−Ｉｇを提供する。一実施形態では、本発明のＤＶＤ−Ｉｇは、４つのポリペプチド鎖を含み、２つのポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎ（式中、ＶＤ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは重鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであるが、ただし、ＣＨ１ではなく、Ｘ２は、Ｆｃ領域である）を含み、２つのポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎ（式中、ＶＤ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであるが、ただし、ＣＨ１ではなく、Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、ｎは０または１である）を含み；前記結合タンパク質の前記４つのポリペプチド鎖は、４つの機能的な抗原結合部位を形成する。一実施形態では、ＤＶＤの第１（および／または第２）の重鎖は、配列番号６、４２および８に記載のＣＤＲセットを含む。一実施形態では、第１（および／または第２）の軽鎖可変領域は、配列番号２１、１１および１２に記載のＣＤＲセットを含む。一実施形態では、本発明のＤＶＤ−Ｉｇは、単一特異性であり、ｈｕＣＤ４０と結合する。別の実施形態では、本発明のＤＶＤ−Ｉｇは、多重特異性であり、ＣＤ４０および第２の分子標的に結合する。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１Ａ】キメラ抗体（抗体１（Ａｂ１））対アゴニスト対照ならびに公知のアンタゴニスト抗体（４Ｄ１１（Ａｓｔｅｌｌａｓ）およびＢｉｂ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））のアンタゴニスト活性を示すグラフである。
【図１Ｂ】図１Ａと同じアゴニストおよびアンタゴニスト対照を使用したアゴニストアッセイにおける、同じキメラ抗体Ａｂ１の活性を示すグラフである。
【図２Ａ】ヒト化抗体Ａｂ１０１のアゴニスト活性を抗体４Ｄ１１、抗体ＢＩｂ、ＩｇＧ抗体（対照）およびアゴニスト対照抗体（２１４１）と比較して示すグラフである。
【図２Ｂ】ヒト化抗体Ａｂ１０１のアンタゴニスト活性を抗体４Ｄ１１、抗体ＢＩｂ、ＩｇＧ抗体（対照）およびアゴニスト対照抗体（２１４１）と比較して示すグラフである。
【図３Ａ】ヒト化抗体Ａｂ１０１のインビボ試験からの結果を示すグラフである。ヒトＰＢＭＣをＩｇ対照、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合物またはＡｂ１０１抗体と組み合わせて受けたｈｕｓｃｉｄマウスにおけるＩｇＧ産生を示すグラフである。
【図３Ｂ】ヒト化抗体Ａｂ１０１のインビボ試験からの結果を示すグラフである。図３Ａと同じ薬剤を投与した同じマウスモデルにおけるＢ細胞生存を示すグラフである。
【図４Ａ】抗ヒトＣＤ４０マウス抗体アンタゴニストとアラインメントコンセンサス配列のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。抗体３（Ａｂ３）（配列番号４８）、Ａｂ１（配列番号９）および抗体２（Ａｂ２）（配列番号７６）の可変軽鎖と可変軽鎖コンセンサス配列（配列番号１１６）の配列アラインメントを示す。
【図４Ｂ】抗ヒトＣＤ４０マウス抗体アンタゴニストとアラインメントコンセンサス配列のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。Ａｂ３（配列番号４４）、Ａｂ１（配列番号５）およびＡｂ２（配列番号７５）の可変重鎖と可変重鎖コンセンサス配列（配列番号１１７）の配列アラインメントを示す。
【図５Ａ】実施例７に記載の単球活性化アッセイにおける、ヒトＣＤ４０に対するＡｂ１０２の代表的な中和力（アンタゴニスト活性）を示すグラフである。単球活性化は、各アッセイ内のＴＮＦ濃度の上昇と一致する。
【図５Ｂ】実施例７に記載の単球活性化アッセイにおける、ヒトＣＤ４０に対するＡｂ１０２の代表的なアゴニスト活性を示すグラフである。単球活性化は、各アッセイ内のＴＮＦ濃度の上昇と一致する。
【図６】抗体１３８（Ａｂ１３８）の予防的投与に伴う内視鏡検査スコアの用量反応性阻害を示すグラフである。抗体１３８を、１５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇの用量で試験した。ＩｇＧ陰性対照を使用した。抗ｐ４０ＩＬ−１２／２３による処置を陽性対照として使用した。疾患は、動物に移入されたＣＤ４５Ｒｂｈｉ細胞によって媒介される。ＲＢｌｏｗは陰性対照群を指す。ＣＤ４５ＲＢｌｏｗ細胞は疾患を媒介しない。
【図７】抗体１３８（Ａｂ１３８）の投与を用いた、結腸内のＩＢＡ１＋マクロファージを決定するための免疫組織化学的分析の結果を示すグラフである。結腸切片の組織学的分析により、マクロファージの減少（炎症の一般的な測定基準）が示された。ＩｇＧ陰性対照を使用した。抗ｐ４０ＩＬ−１２／２３による処置を陽性対照として使用した。
【図８】大腸炎のＴ細胞移入モデルにおける、最後の投薬の９６時間後（Ｃｔｒｏｕｇｈと同等）の循環抗体１３８（Ａｂ１３８）の血清中レベルを示すグラフである。血清中レベルは用量反応性であることが示された。抗ｐ４０ＩＬ−１２／２３による処置を陽性対照として使用した。０．５ｍｇ／ｋｇ群の動物１匹のみが、測定可能なレベルのＡｂ１３８を有した。
【図９Ａ】大腸炎マウスモデルにおける、抗体１３８の投与後の内視鏡検査結果を示すグラフである。抗体１３８（Ａｂ１３８）による処置を細胞注射の３週間後、内視鏡的疾患の確認後に開始し、ＭＥＤＡＩ合計スコアの用量反応性阻害が認められた。最高用量（１５ｍｇ／ｋｇ）で統計的有意性に達した（図９Ａ）。
【図９Ｂ】抗体１３８の投与後の組織学的検査結果を示すグラフである。骨髄炎の測定基準としての結腸内のＩＢＡ１＋マクロファージの組織学的分析が図９Ｂに示されている。
【図１０】ビヒクルのみで処置した対照動物（実線）と比較して、Ａｂ１０２（破線）では、抗ＫＬＨ  ＩｇＭおよび抗ＫＬＨ  ＩｇＧが抑制されることを示す結果を示すグラフである。カニクイザル（２匹／性別／群）にＡｂ１０２を０ｍｇ／ｋｇ（ビヒクルのみ）または１０ｍｇ／ｋｇの投与量で５週間にわたって皮下（ＳＣ）投与した。８日目にキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を全ての動物に投与した。ＫＬＨ投与に対して（ＫＬＨ日数）−１１日目、−７日目、０日目、４日目、７日目、１０日目、１４日目および２１日目に各動物から血清試料を採取した。
【図１１Ａ】ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおいて、抗ＣＤ４０抗体１３８による処置によりタンパク尿が予防されることを示すグラフである。マウスに、１５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、１．５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回または１５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に１回、投薬した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ビヒクル単独での投与を対照として使用した。タンパク尿をパーセント尿中タンパク質＜３００ｍｇ／ｄＬとして決定した。
【図１１Ｂ】抗ＣＤ４０抗体１３８による処置により、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスの生存が延長されることを示す結果を示すグラフである。動物に、１５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、１．５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回または１５ｍｇ／ｋｇ抗体を１週間に１回、投薬した。ビヒクル単独での投与を対照として使用した。パーセント生存を経時的に示した。
【図１２Ａ】抗ＣＤ４０抗体１３８による処置により、腎炎の発生が予防されることを示す結果を示すグラフである。図１２Ａは、１５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、１．５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回または１５ｍｇ／ｋｇ抗体を１週間に１回、投薬されたマウスにおける、２９日目および６３日目の、糸球体疾患に対する抗体１３８の効果を示す。ＰＢＳビヒクル単独での投与を対照として使用した。糸球体疾患を０−４の尺度で評価した。糸球体疾患の重症度は加齢ＭＲＬマウスで悪化したことから、抗体１３８の糸球体疾患の最小化に関する有効性は５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇで維持された。血管周囲の炎症を以下の基準に基づいて尺度０−４にスコア化した：０−少数の希なリンパ球まで；１−少数のリンパ球が緩い凝集体を形成している；２−リンパ球がばらばらの小さな凝集体を形成している；３−リンパ球の分極した凝集体が隣接する静脈の内腔内に隆起しているが、弓状動脈を完全に包囲できていない；４−リンパ球凝集体が弓状動脈の外膜を完全に包囲し、その中に広がっている。
【図１２Ｂ】抗ＣＤ４０抗体による処置により、腎炎の発生が予防されることを示す結果を示すグラフである。図１２Ｂは、１５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、１．５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回または１５ｍｇ／ｋｇ抗体を１週間に１回、投薬されたマウスにおける、２９日目および６３日目の、腎臓血管周囲（ＰＶ）炎に対する抗体１３８の効果を示す結果を示す。ＰＢＳビヒクル単独での投与を対照として使用した。抗ＣＤ４０抗体は、５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇで、２９日目および６３日目において、腎臓における血管周囲（ＰＶ）浸潤を低減するのに有効であった。
【図１２Ｃ】抗ＣＤ４０抗体１３８による処置により、腎炎の発生が予防されることを示すグラフである。図１２Ｃは、１５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、１．５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回または１５ｍｇ／ｋｇ抗体を１週間に１回、投薬されたマウスにおける、２９日目および６０日目の、尿細管間質性炎（ＴＩ）に対する抗体１３８の効果を示す。ＰＢＳビヒクル単独での投与を対照として使用した。ＴＩは、疾患の初期に低減した。
【図１３Ａ】抗ＣＤ４０抗体１３８による処置により、唾液腺炎が予防されることを示すグラフである。図１３Ａは、１５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、１．５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回または１５ｍｇ／ｋｇ抗体を１週間に１回、投薬されたマウスにおける、２９日目および６０日目の、唾液腺炎に対する抗体１３８の効果を示す。ＰＢＳビヒクル単独での投与を対照として使用した。管周囲炎を以下の基準に基づいて尺度０−４にスコア化した：０−少数の希な白血球まで；１−少数の白血球が緩い凝集体を形成している；２−白血球がばらばらの小さな凝集体を形成している；３−管を完全に包囲する白血球の分極した凝集体；４−白血球凝集体が唾液腺の腺実質内に広がっている。
【図１３Ｂ】抗ＣＤ４０抗体１３８による処置により、関節の炎症が予防されることを示すグラフである。図１３Ｂは、１５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、１．５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回または１５ｍｇ／ｋｇ抗体を１週間に１回、投薬されたマウスにおける、２９日目および６０日目の、関節の炎症に対する抗体１３８の効果を示す。ＰＢＳビヒクル単独での投与を対照として使用した。マウス当たり２本の足のそれぞれについて、関節の炎症を以下の基準に基づいて０−４の尺度にスコア化した：０−炎症なし；１−関節腔内に少数の白血球；２−関節腔内にいくつもの白血球、軽度の滑液増殖を伴う；３−白血球により関節腔が膨張しており、中程度の滑液増殖を伴う；４−白血球および滑液増殖が全ての関節腔内に広がり、合体しており、顕著な骨浸食および／または増殖が伴う。スコアを合算すると、マウス当たり可能性のある総スコアは８である。
【図１４】抗ＣＤ４０抗体１３８により、脾臓において濾胞型ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ）および胚中心（ＧＣ）Ｂ細胞の増大が予防される（フローサイトメトリーによって決定される）ことを示す４つのグラフ（ｉ−ｉｖ）のパネルである。マウスに、１５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、１．５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回または１５ｍｇ／ｋｇ抗体を１週間に１回、投薬した。ＰＢＳビヒクル単独での投与を対照として使用した。パネル（ｉ）は、２９日目における脾臓内のＴｆｈ細胞の数を示す。パネル（ｉｉ）は、６３日目における脾臓内のＴｆｈ細胞の数を示す。パネル（ｉｉｉ）は、２９日目における脾臓内のＧＣ  Ｂ細胞の数を示す。パネル（ｉｖ）は、６３日目における脾臓内のＧＣ  Ｂ細胞の数を示す。
【図１５Ａ】抗ＣＤ４０抗体１３８による処置により、２９日目において、総循環ＩｇＧレベルの上昇が予防されることを示すグラフである。マウスに、１５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、１．５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回および１５ｍｇ／ｋｇ抗体を１週間に１回、投薬した。ＰＢＳビヒクル単独での投与を対照として使用した。
【図１５Ｂ】抗ＣＤ４０抗体１３８による処置により、６３日目において、総循環ＩｇＧレベルの上昇が予防されることを示すグラフである。マウスに、１５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、１．５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回および１５ｍｇ／ｋｇ抗体を１週間に１回、投薬した。ＰＢＳビヒクル単独での投与を対照として使用した。
【図１６Ａ】２９日目における、抗二本鎖ＤＮＡ（抗ｄｓＤＮＡ）力価に対する抗ＣＤ４０抗体１３８による処置の効果を示すグラフである。マウスに、１５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、１．５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回または１５ｍｇ／ｋｇ抗体を１週間に１回、投薬した。ＰＢＳビヒクル単独での投与を対照として使用した。２９日目に、抗ｄｓＤＮＡ力価を決定した。
【図１６Ｂ】６３日目における、抗二本鎖ＤＮＡ（抗ｄｓＤＮＡ）力価に対する抗ＣＤ４０抗体１３８による処置を示すグラフである。マウスに、１５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、１．５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回または１５ｍｇ／ｋｇ抗体を１週間に１回、投薬した。ＰＢＳビヒクル単独での投与を対照として使用した。６３日目に、抗ｄｓＤＮＡ力価を決定した。
【図１７Ａ】抗ＣＤ４０抗体１３８の予防的投薬により、タンパク尿が予防されることを示すグラフである。マウスにおいて２６週齢時に予防的処置を開始し、タンパク尿のマウスは試験から除外した。マウスに、１５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、１．５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回または１５ｍｇ／ｋｇ抗体を１週間に１回、投薬した。ＰＢＳビヒクル単独での投与を対照として使用した。タンパク尿を、パーセント尿中タンパク質＜３００ｍｇ／ｄＬとして決定した。
【図１７Ｂ】ＳＬＥマウスモデルを使用して、抗ＣＤ４０抗体１３８の予防的投薬により生存が延長されることを示すグラフである。マウスにおいて、２６週齢時に予防的処置を開始し、タンパク尿のマウスは試験から除外した。マウスに、１５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回、１．５ｍｇ／ｋｇの抗体を１週間に２回または１５ｍｇ／ｋｇ抗体を１週間に１回、投薬した。ＰＢＳビヒクル単独での投与を対照として使用した。３６週齢にわたってパーセント生存を評価した。
【図１８Ａ】抗体１３８を１５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、１週間に２回の用量で用いて処置されたマウスでは、尿中タンパク質のグレード（ｍｇ／ｄＬ相当）によって示される通り、経時的に低タンパク尿が発生したことを示すグラフである。ビヒクルＰＢＳの投与、ＩＰ、１週間に２回を対照として使用した。プレドニゾロンを１０ｍｇ／ｋｇの用量で経口的に（ＰＯ）、１日１回（ＳＩＤ）与えた。ビヒクルＰＢＳ無処置対照マウスとプレドニゾロンで処置されたマウスのいずれでも低タンパク尿は発生しなかった。タンパク尿の閾値は、３００ｍｇ／ｄＬで示される。
【図１８Ｂ】抗体１３８を１５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、１週間に２回の用量で用いて処置されたマウスにおける、タンパク尿からの回復率を示すグラフである。パーセント正常尿中タンパク質によって決定されるタンパク尿からの回復率に基づいて、タンパク尿からの回復までの平均時間は、２３±７日であった。ビヒクルＰＢＳの投与、ＩＰ、１週間に２回を対照として使用した。プレドニゾロンを１０ｍｇ／ｋｇの用量で経口的に（ＰＯ）、１日１回（ＳＩＤ）与えた。
【図１８Ｃ】パーセント生存によって示される通り、抗ＣＤ４０抗体１３８を１５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、１週間に２回の用量で用いて処置されたマウスの生存が有意に延長されることを示すグラフである。ビヒクルＰＢＳの投与、ＩＰ、１週間に２回を対照として使用した。プレドニゾロンを経口的に（ＰＯ）１日１回（ＳＩＤ）与えた。
【図１９Ａ】抗体１３８を１５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、１週間に２回、１．５ｍｇ／ｋｇ  １週間に２回、１５ｍｇ／ｋｇ  １週間に１回の用量で用いた予防的処置により、唾液の産生が保護されることを示すグラフである。ビヒクルＰＢＳを対照として使用した。プレドニゾロンを１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。疾患を有さない若年マウスである７週齢のＮＺＢＷＦ−１マウスにおける唾液の産生をさらなる比較として使用した。唾液の量（ｍｇ）を決定した。抗ＣＤ４０で処置されたマウスによる唾液の産生は、比較的に均一であった。
【図１９Ｂ】抗ＣＤ４０抗体１３８を１５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、１週間に２回、１．５ｍｇ／ｋｇ  １週間に２回、１５ｍｇ／ｋｇ  １週間に１回の用量で用いた予防的処置により、唾液体積が保護されることを示すグラフである。ビヒクルＰＢＳを対照として使用した。プレドニゾロンを１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。唾液体積／体重（ｍｇ／ｇｍ）を決定した。抗ＣＤ４０抗体で処置されたマウスによる唾液の産生は、無処置対照マウスにおけるものよりも有意に多かった。
【図２０Ａ】抗ＣＤ４０抗体１３８を１５ｍｇ／ｋｇの用量で用いた治療的処置により、唾液の産生が保護されることを示すグラフである。プレドニゾロンを１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。１１週齢のマウスにおける唾液の産生をさらなる比較として使用した。唾液の量（ｍｇ）を決定した。
【図２０Ｂ】抗ＣＤ４０抗体１３８を１５ｍｇ／ｋｇの用量で用いた治療的処置により、唾液の産生が保護されることを示すグラフである。プレドニゾロンを１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。１１週齢のマウスにおける唾液の産生をさらなる比較として使用した。唾液体積／体重（ｍｇ／ｇｍ）を決定した。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
本発明は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分およびその使用に関する。本発明の種々の態様は、抗体および抗体断片およびその医薬組成物ならびにそのような抗体および断片を作製するための核酸、組換え発現ベクターおよび宿主細胞に関する。インビトロまたはインビボのいずれかにおいて、ヒトＣＤ４０を検出するため、ヒトＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ活性を阻害するため；および慢性炎症性疾患およびクローン病のような疾患または障害を予防または治療するための、本発明の抗体の使用方法も本発明に包含される。
【００６４】
本明細書において別段の定義のない限り、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有する。用語の意味および範囲は、明確でなければならないが、任意の潜在的に曖昧な事象では、本明細書において提供される定義は、あらゆる辞書の定義または付帯的な定義よりも優先される。さらに、文脈によって別段に必要とされない限り、単数の用語は、複数を含むものとし、複数の用語は、単数を含むものとする。本出願では、「または」の使用は、別段の記述のない限り、「および／または」を意味する。さらに、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などのその他の形態の使用は、限定的ではない。また、「要素」または「成分」などの用語は、別段の記述のない限り、１つのユニットを含む要素および成分ならびに２以上のサブユニットを含む要素および成分の両方を包含する。
【００６５】
一般に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法ならびにその技術は、当技術分野で周知のものであり、当技術分野でよく使用されるものである。本発明の方法および技術は、別段の指示のない限り、一般に、当技術分野で周知の従来法に従って、また、本明細書を通じて引用されて論じられる種々の一般的な参考文献およびより特定の参考文献に記載されるように、実施される。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、当技術分野で一般に遂行されるように、または本明細書に記載されるように実施される。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学ならびに医薬品化学および製薬化学に関連して使用される命名法ならびにその実験室手順および技術は、当技術分野で周知のものであり、当技術分野でよく使用されるものである。標準技術は、化学合成、化学分析、医薬品、製剤および送達ならびに患者の治療のために使用されている。
【００６６】
本発明がより容易に理解され得るように、選択用語が以下に定義される。
【００６７】
用語「ポリペプチド」とは、本明細書で使用される場合、アミノ酸の任意のポリマー鎖を指す。用語「ペプチド」および「タンパク質」は、用語ポリペプチドと同義的に使用され、アミノ酸のポリマー鎖も指す。用語「ポリペプチド」は、天然または人工のタンパク質、タンパク質断片およびタンパク質配列のポリペプチド類似体を包含する。ポリペプチドは単量体であってもポリマーであってもよい。
【００６８】
用語「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」は、その起源または供給源に基づいて、その天然状態でそれに付随する天然に会合している成分と会合していないタンパク質またはポリペプチドであり、実質的に、同一種に由来するその他のタンパク質を含まず、異なる種に由来する細胞によって発現されるか、または天然には生じない。したがって、化学的に合成されたポリペプチドまたはそれが天然に生じる細胞とは異なる細胞系において合成されたポリペプチドは、その天然に会合している成分から「単離」される。タンパク質はまた、当技術分野で周知のタンパク質精製技術を使用する単離によって天然に会合している成分を実質的に含まないようにされ得る。単離されたポリペプチドの例は、単離された抗体またはその抗原結合部分である。
【００６９】
用語「回収すること」とは、本明細書で使用される場合、例えば、当技術分野で周知のタンパク質精製技術を使用する単離によって、ポリペプチドなどの化学種を、天然に会合している成分を実質的に含まないようにするプロセスを指す。
【００７０】
「ヒトＣＤ４０」および「ヒトＣＤ４０野生型」という用語（本明細書では、ｈＣＤ４０、ｈＣＤ４０ｗｔと省略される）は、本明細書で使用される場合、Ｉ型膜貫通タンパク質を指す。一実施形態では、用語ヒトＣＤ４０は、標準の組換え発現方法によって調製され得る組換えヒトＣＤ４０（ｒｈＣＤ４０）を包含することが意図されている。表１には、当技術分野で公知であるヒトＣＤ４０のアミノ酸配列（すなわち、配列番号１）およびその細胞外ドメインのアミノ酸配列（すなわち、配列番号１０７）が提供される。
【００７１】
【表１】
2019150024.tif 000002
【００７２】
「生物活性」とは、本明細書で使用される場合、ＣＤ４０受容体の全ての固有の生物学的特性を指す。ＣＤ４０の生物学的特性として、それだけには限らないが、ＣＤ４０Ｌとの結合；Ｂ細胞発生への関与；リンパ球活性化への関与；抗原提示細胞機能への関与；樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞の活性の調節；マクロファージおよび樹状細胞における炎症性サイトカインの産生の誘導；抗原提示の上方制御；Ｔ細胞刺激の上方制御；およびＢ細胞における免疫グロブリンクラススイッチの促進が挙げられる。
【００７３】
用語「特異的結合」または「特異的に結合すること」は、本明細書で使用される場合、抗体、タンパク質またはペプチドの、第２の化学種との相互作用に関連して、相互作用が、化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存していること、例えば、抗体が、タンパク質一般とではなく、特定のタンパク質構造を認識し、結合することを意味する。抗体が、エピトープ「Ａ」に対して特異的である場合には、標識された「Ａ」および抗体を含有する反応物中のエピトープＡ（または遊離の、標識されていないＡ）を含有する分子の存在は、抗体と結合している標識されたＡの量を低減する。
【００７４】
「アゴニスト」という用語は、本明細書で使用される場合、目的の分子、例えばＣＤ４０と接触させた場合に、アゴニストの不在下で観察された活性または機能の規模と比較して、分子の特定の活性または機能の規模の増大を引き起こすモジュレーターを指す。
【００７５】
用語「アンタゴニスト」または「阻害剤」は、本明細書で使用される場合、目的の分子と接触させた場合に、アンタゴニストの不在下で観察された活性または機能の規模と比較して、分子の特定の活性または機能の規模の減少を引き起こすモジュレーターを指す。目的の特定のアンタゴニストとして、ヒトＣＤ４０（ｈＣＤ４０）の生物活性または免疫学的活性を遮断または調節するものが挙げられる。ｈＣＤ４０のアンタゴニスト抗体は、例えば、ＣＤ４０Ｌと一緒に培養される（またはそれに曝露される）初代ヒトＢ細胞（Ｂ細胞をＣＤ４０Ｌ発現ヒトＴ細胞と一緒に培養するなど）のＣＤ８６による上方制御を阻害し得る。一実施形態では、アゴニスト活性を実質的に有さないアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、実施例７に記載のアゴニスト単球アッセイのようなアゴニストアッセイにおいて陰性対照に相当するまたは陰性対照から１標準偏差以内の活性のレベルを有すると定義される。
【００７６】
本発明の抗体またはその抗原結合部分は、抗体またはその抗原結合部分の不在下でのＣＤ４０活性または機能と比較して、ＣＤ４０活性または機能の低下を引き起こすアンタゴニスト抗体またはその抗原結合部分である。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、アゴニスト活性を実質的に有さない、すなわち、抗体またはその抗原結合部分は、抗体またはその抗原結合部分の不在下でのＣＤ４０活性または機能と比較して、ＣＤ４０活性または機能の規模の増加を引き起こさない。アゴニスト活性およびアンタゴニスト活性は、当技術分野で公知の方法を使用して、例えば、ＮＦｋＢ媒介性アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と連結したヒトＣＤ４０を発現するＣＤ４０発現レポーター細胞株またはＢ細胞アッセイを使用して評価することもできる。さらに、一実施形態では、アゴニスト活性およびアンタゴニスト活性は、実施例７に記載のインビトロ単球アゴニストアッセイおよびインビトロ単球アンタゴニストアッセイを使用して評価され得る。
【００７７】
「ＣＤ４０Ｌとの結合を阻害する」という用語は、ＣＤ４０とそのリガンドであるＣＤ４０Ｌとの結合を妨げる抗体またはその抗原結合断片の能力を指す。そのようなＣＤ４０Ｌとの結合の阻害の結果、ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌとの結合によって媒介される生物活性が低下または消滅する。
【００７８】
用語「抗体」とは、本明細書で使用される場合、４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖、および２つの軽（Ｌ）鎖からなる任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子またはＩｇ分子の本質的なエピトープ結合特徴を保持する、その任意の機能的断片、突然変異体、変異体または誘導体を広く指す。このような突然変異体、変異体または誘導体抗体形式は、当技術分野で公知である。その限定されない実施形態は以下に論じられている。
【００７９】
全長抗体では、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＨＣＶＲまたはＶＨと略される）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において、ＬＣＶＲまたはＶＬと略される）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散財している、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細かく分けることができる。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。免疫グロブリン分子は、任意の種類のもの（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。
【００８０】
抗体の「抗原結合部分」もしくは「抗原結合断片」（または単に「抗体部分」もしくは「抗体断片」）という用語は、本明細書で使用される場合、抗原（例えば、ｈＣＤ４０）に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原−結合機能は、全長抗体の断片によって実施され得るということがわかっている。このような抗体実施形態はまた、２種以上の異なる抗原と特異的に結合する、二特異性、二重特異性または多重特異性形式であり得る。抗体の「抗原結合部分」もしくは「抗原結合断片」という用語の範囲内に包含される結合断片の例として、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）単一の可変ドメインを含むｄＡｂ断片（参照により本明細書に組み込むＷａｒｄら、（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６頁、Ｗｉｎｔｅｒら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９０／０５１４４  Ａ１）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を使用し、ＶＬおよびＶＨ領域対が一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）としても知られる；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６頁；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３頁参照のこと）として製造されることを可能にする合成リンカーによって結合され得る。このような一本鎖抗体もまた、抗体の用語「抗原結合部分」もしくは「抗原結合断片」内に包含されるものとする。ダイアボディーなどの一本鎖抗体のその他の形態も包含される。ダイアボディーは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによって、ドメインが別の鎖の相補的ドメインと対形成するようにし、２つの抗原結合部位を作製する、二価の、二特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ、Ｐ．ら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８頁；  Ｐｏｌｊａｋ、Ｒ．Ｊ．ら（１９９４年）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３頁参照のこと）。このような抗体結合部分は、当技術分野で公知である（ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００１年）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．７９０頁（ＩＳＢＮ  ３−５４０−４１３５４−５））。
【００８１】
用語「抗体構築物」は、本明細書で使用される場合、リンカーポリペプチドまたは免疫グロブリン定常ドメインと連結した本発明の抗原結合部分を１つ以上含むポリペプチドを指す。リンカーポリペプチドは、ペプチド結合によって結合した２つ以上のアミノ酸残基を含み、１つ以上の抗原結合部分を連結するために使用される。このようなリンカーポリペプチドは、当技術分野で周知である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ、Ｐ．ら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８頁；Ｐｏｌｊａｋ、Ｒ．Ｊ．ら（１９９４年）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３頁参照のこと）。免疫グロブリン定常ドメインとは、重鎖または軽鎖定常ドメインを指す。ヒトＩｇＧ重鎖定常ドメインおよびヒトＩｇＧ軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列は、当技術分野で公知であり、表２に表されている。
【００８２】
【表２】
2019150024.tif 000003
【００８３】
さらに、抗体またはその抗原結合部分は、抗体または抗体部分と１つ以上のその他のタンパク質またはペプチドとの共有結合または非共有結合によって形成された、より大きな免疫接着分子の一部であり得る。このような免疫接着分子の例として、四量体ｓｃＦｖ分子を製造するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、Ｓ．Ｍ．ら（１９９５年）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３−１０１頁）ならびに二価のビオチン化ｓｃＦｖ分子を製造するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、Ｓ．Ｍ．ら（１９９４年）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３１：１０４７−１０５８頁）が挙げられる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分は、それぞれ全抗体のパパインまたはペプシン消化などの従来技術を使用して、全抗体から調製され得る。さらに、抗体、抗体部分および免疫接着分子は、本明細書に記載の標準の組換えＤＮＡ技法を使用して得られ得る。
【００８４】
「単離された抗体」とは、本明細書で使用される場合、異なる抗原特異性を有するその他の抗体を実質的に含まない抗体を指すものとする（例えば、ｈＣＤ４０と特異的に結合する単離された抗体は、ｈＣＤ４０以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ｈＣＤ４０と特異的に結合する単離された抗体は、その他の種に由来するＣＤ４０分子などのその他の抗原に対して交差反応性を有し得る。さらに、単離された抗体は、その他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。
【００８５】
用語「キメラ抗体」とは、ある種に由来する重鎖および軽鎖可変領域配列ならびに別の種に由来する定常領域配列を含む抗体、例えば、ヒト定常領域と連結しているマウス重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体を指す。
【００８６】
用語「ＣＤＲグラフト化抗体」とは、１つの種に由来するが、ＶＨおよび／またはＶＬの１つ以上のＣＤＲ領域の配列が、別の種のＣＤＲ配列で置換されている重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体、例えば、１つ以上のマウスＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）がヒトＣＤＲ配列で置換されている、マウス重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体を指す。
【００８７】
用語「Ｋａｂａｔ番号付け」、「Ｋａｂａｔ定義」および「Ｋａｂａｔ標識」は、本明細書において同義的に使用される。当技術分野で認識されるこれらの用語は、抗体の重鎖および軽鎖可変領域中のその他のアミノ酸残基よりも可変（すなわち、超可変）であるアミノ酸残基またはその抗原結合部分を番号付けるシステムを指す（Ｋａｂａｔら（１９７１年）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ、Ｓｃｉ．  １９０：３８２−３９１頁およびＫａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ第９１−３２４２）。重鎖可変領域について、超可変領域は、ＣＤＲ１のアミノ酸位置３１−３５、ＣＤＲ２のアミノ酸位置５０−６５およびＣＤＲ３のアミノ酸位置９５−１０２の範囲である。軽鎖可変領域については、超可変領域は、ＣＤＲ１のアミノ酸位置２４−３４、ＣＤＲ２のアミノ酸位置５０−５６およびＣＤＲ３のアミノ酸位置８９−９７の範囲である。
【００８８】
本明細書で使用される場合、用語「アクセプター」および「アクセプター抗体」とは、フレームワーク領域のうちの１つ以上のアミノ酸配列の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または１００％を提供するまたはコードする抗体または核酸配列を指す。いくつかの実施形態では、用語「アクセプター」とは、定常領域（複数可）を提供するまたはコードする抗体アミノ酸配列または核酸配列を指す。さらに別の実施形態では、用語「アクセプター」とは、フレームワーク領域のうちの１つ以上および定常領域（複数可）を提供するまたはコードする抗体アミノ酸配列または核酸配列を指す。特定の実施形態では、用語「アクセプター」とは、１つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または１００％を提供するまたはコードするヒト抗体アミノ酸または核酸配列を指す。この実施形態と一致して、アクセプターは、ヒト抗体の１つ以上の特定の位置では生じない少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個または少なくとも１０個のアミノ酸残基を含有し得る。アクセプターフレームワーク領域および／またはアクセプター定常領域（複数可）は、例えば、生殖系列抗体遺伝子、成熟抗体遺伝子、機能性抗体（例えば、当技術分野で周知の抗体、開発中の抗体または市販の抗体）に由来するまたはそれらから得られる。
【００８９】
本明細書で使用される場合、用語「ＣＤＲ」とは、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域のそれぞれに３つのＣＤＲがあり、これらは可変領域のそれぞれについてＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される。用語「ＣＤＲセット」とは、本明細書で使用される場合、抗原と結合することができる単一の可変領域内に存在する３つのＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なるシステムに従って異なる定義がなされている。Ｋａｂａｔにより記載されているシステム（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７年）および（１９９１年））は、抗体の任意の可変領域に適用可能な明白な残基の番号付けシステムを提供するだけでなく、３つのＣＤＲを定義する正確な残基境界も提供する。これらのＣＤＲは、ＫａｂａｔＣＤＲと称することができる。Ｃｈｏｔｈｉａおよび共同研究者（Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７頁（１９８７年）およびＣｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３頁（１９８９年））は、ＫａｂａｔＣＤＲ内の特定の下位部分が、アミノ酸配列のレベルで大きな多様性を有するにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格コンホメーションをとることを見出した。これらの下位部分は、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３またはＨ１、Ｈ２およびＨ３と示され、ここで、「Ｌ」および「Ｈ」は、それぞれ軽鎖領域および重鎖領域を示す。これらの領域はＣｈｏｔｈｉａＣＤＲと称することができ、ＫａｂａｔＣＤＲと重複する境界を有する。ＫａｂａｔＣＤＲと重複するＣＤＲを定義するその他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３−１３９頁（１９９５年））およびＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６２（５）：７３２−４５頁（１９９６年））によって記載されている。さらにその他のＣＤＲ境界定義は、上記のシステムの１つを厳密に辿らない場合もあり、それらは、特定の残基または残基の群または全ＣＤＲでさえ、抗原結合に大幅に影響を与えないという予測または実験的知見を踏まえて、短くされる場合も、長くされる場合もあるが、それでも、ＫａｂａｔＣＤＲと重複する。本発明で使用される方法では、これらのシステムのいずれに従って定義されるＣＤＲでも利用することができるが、好ましい実施形態では、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａによって定義されるＣＤＲを使用する。
【００９０】
本明細書で使用される場合、用語「標準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）」残基とは、Ｃｈｏｔｈｉａら（どちらも参照により本明細書に組み込むＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９０７頁（１９８７年）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９（１９９２年））によって定義される特定の標準的なＣＤＲ構造を定義する、ＣＤＲまたはフレームワーク内の残基を指す。Ｃｈｏｔｈｉａらによると、多くの抗体のＣＤＲの重要な部分は、アミノ酸配列のレベルで大きな多様性があるにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格コンホメーションを有する。各標準構造は、ループを形成するアミノ酸残基の連続セグメントの１セットのペプチド骨格ねじれ角を主に規定する。
【００９１】
本明細書で使用される場合、用語「ドナー」および「ドナー抗体」とは、１つ以上のＣＤＲを提供する抗体を指す。好ましい実施形態では、ドナー抗体は、フレームワーク領域が得られるまたはそれに由来する抗体とは異なる種に由来する抗体である。ヒト化抗体との関連で、用語「ドナー抗体」とは、１つ以上のＣＤＲを提供する非ヒト抗体を指す。
【００９２】
本明細書で使用される場合、用語「フレームワーク」または「フレームワーク配列」とは、ＣＤＲを引いた可変領域の残りの配列を指す。ＣＤＲ配列の正確な定義は、種々のシステムによって決定され得るので、フレームワーク配列の意味は、対応する種々の解釈を受ける。また、６つのＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３ならびに重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３）により、軽鎖および重鎖上のフレームワーク領域が各鎖上の４つの小領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）に分けられ、ＣＤＲ１がＦＲ１とＦＲ２との間に位置し、ＣＤＲ２がＦＲ２とＦＲ３との間に位置し、ＣＤＲ３がＦＲ３とＦＲ４との間に位置する。特定の小領域をＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４として特定せずに、その他により称されるフレームワーク領域とは、単一の天然に存在する免疫グロブリン鎖の可変領域内の組み合わされたＦＲを表す。本明細書で使用される場合、１つのＦＲは、４つの小領域のうちの１つを表し、複数のＦＲは、フレームワーク領域を構成する４つの小領域のうちの２つ以上を表す。
【００９３】
ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列は、当技術分野で公知である。本発明の一実施形態では、ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列は、表３および表４に記載される配列から選択される。
【００９４】
【表３】
2019150024.tif 000004
【００９５】
【表４】
2019150024.tif 000005
【００９６】
本明細書において、用語「生殖系列抗体遺伝子」または「遺伝子断片」とは、特定の免疫グロブリンの発現のための遺伝子再配列および突然変異につながる成熟プロセスを受けていない、非リンパ系細胞によってコードされる免疫グロブリン配列を指す（例えば、Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２２（３）：１８３−２００頁（２００２年）；Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓら、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．  ４８４：１３−３０頁（２００１年）参照のこと）。本発明の種々の実施形態によって提供される利点の１つは、生殖系列抗体遺伝子は、成熟抗体遺伝子よりも、種において個体の特徴を示す必須アミノ酸配列構造を保存する可能性が高く、したがって、その種において治療上使用される場合に外来供給源に由来すると認識される可能性が低いという認識に基づく。
【００９７】
本明細書において、用語「重要な」残基とは、抗体、特に、ヒト化抗体の結合特異性および／または親和性に対してより影響を与える可変領域内の特定の残基を指す。重要な残基として、ＣＤＲに隣接している残基、潜在的なグリコシル化部位（Ｎ−またはＯ−グリコシル化部位のいずれかであり得る）、稀な残基、抗原と相互作用できる残基、ＣＤＲと相互作用できる残基、標準的残基、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の接触残基、バーニアゾーン内の残基および可変重鎖ＣＤＲ１のＣｈｏｔｈｉａ定義と第１の重鎖フレームワークのＫａｂａｔ定義との間で重複する領域中の残基のうち１種以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
本明細書で使用される場合、用語「ヒト化抗体」は、目的の抗原（例えば、ヒトＣＤ４０）と免疫特異的に結合し、ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク（ＦＲ）領域および非ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体またはその変異体、誘導体、類似体または断片である。本明細書において、ＣＤＲに関連して、用語「実質的に」とは、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲを指す。ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のものに対応し、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つの、通常、２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）のすべてを実質的に含む。好ましくは、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、通常、ヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、軽鎖と重鎖の少なくとも可変ドメインとの両方を含有する。抗体はまた、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４領域を含み得る。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖のみを含有する。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖のみを含有する。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、軽鎖および／またはヒト化重鎖のヒト化可変ドメインのみを含有する。
【００９９】
ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを始めとする免疫グロブリンの任意のクラス、ならびに制限するものではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を始めとする任意のアイソタイプから選択され得る。ヒト化抗体は、２以上のクラスまたはアイソタイプ由来の配列を含んでもよく、特定の定常ドメインは、当技術分野で周知の技術を使用して、所望のエフェクター機能を最適化するよう選択され得る。
【０１００】
ヒト化抗体のフレームワークおよびＣＤＲ領域は、親配列と正確に対応する必要はなく、例えば、ドナー抗体ＣＤＲまたはコンセンサスフレームワークは、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、挿入および／または欠失によって突然変異され、その結果、その部位でのＣＤＲまたはフレームワーク残基が、ドナー抗体またはコンセンサスフレームワークのいずれかと対応しなくてもよい。しかし、好ましい実施形態では、このような突然変異は、大規模なものではない。普通、ヒト化抗体残基の少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％は、親のＦＲおよびＣＤＲ配列のものと対応する。本明細書において、用語「コンセンサスフレームワーク」とは、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域を指す。本明細書において、用語「コンセンサス免疫グロブリン配列」とは、関連免疫グロブリン配列のファミリーにおいて最も頻繁に生じるアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列を指す（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ、Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ  １９８７年参照のこと）。免疫グロブリンのファミリーでは、コンセンサス配列中の各位置は、ファミリーにおいてその位置で最も頻繁に生じるアミノ酸によって占められている。２個のアミノ酸が等しく頻繁に生じる場合には、いずれかがコンセンサス配列中に含まれ得る。
【０１０１】
本明細書において、「バーニア（Ｖｅｒｎｉｅｒ）」ゾーンとは、ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ、（参照により本明細書に組み込む、１９９２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２２４：４８７−４９９頁）によって記載される、ＣＤＲ構造を調整し、抗原に対する適合度を微調整し得るフレームワーク残基のサブセットを指す。バーニアゾーン残基は、ＣＤＲの根底をなす層を形成し、ＣＤＲの構造および抗体の親和性に対して影響を及ぼし得る。
【０１０２】
用語「多価結合タンパク質」は、本明細書では、２種以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質を示すために使用される。多価結合タンパク質は、３つ以上の抗原結合部位を有するように操作されていることが好ましく、一般に、天然に存在しない抗体である。用語「多重特異性結合タンパク質」とは、２つ以上の関連する標的または関連しない標的と結合することができる結合タンパク質を指す。
【０１０３】
本明細書において互換的に使用される用語「二重可変ドメイン」または「ＤＶＤ」もしくは「ＤＶＤ−Ｉｇ」とは、２種以上の抗原結合部位を含み、四価または多価の結合タンパク質である、抗原結合タンパク質である。このようなＤＶＤは、単一特異性、すなわち、１種の抗原と結合することができるものであってもよく、多重特異性、すなわち、２種以上の抗原と結合することができるものであってもよい。２つの重鎖ＤＶＤポリペプチドおよび２つの軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含むＤＶＤ結合タンパク質はＤＶＤ  Ｉｇと称される。ＤＶＤ  Ｉｇの半分はそれぞれ、重鎖ＤＶＤポリペプチドおよび軽鎖ＤＶＤポリペプチドならびに２つの抗原結合部位を含む。各結合部位は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、抗原結合部位あたり、抗原結合に関与する合計６つのＣＤＲを有する。一実施形態では、本明細書に記載のＣＤＲ（例えば、配列番号６、４２および８（重鎖）ならびに２１、１１および１２（軽鎖））が抗ＣＤ４０  ＤＶＤに使用される。ＤＶＤ−Ｉｇ構造の例は、当技術分野で公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込む、米国特許第７，６１２，１８１号に記載されている。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、用語「中和（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ）」とは、抗体またはその抗原結合部分がサイトカイン受容体と特異的に結合すると、サイトカイン受容体の生物活性が中和されることを指す。中和抗体またはその抗原結合部分は、ｈＣＤ４０と結合することによってｈＣＤ４０の生物活性の阻害をもたらす中和抗体であることが好ましい。好ましくは、中和抗体またはその抗原結合部分は、ｈＣＤ４０に結合し、ｈＣＤ４０の生物活性を少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％またはそれ以上低減する。中和抗体またはその抗原結合部分によるｈＣＤ４０の生物活性の阻害は、当技術分野で周知のｈＣＤ４０生物活性の１つ以上の指標を測定することによって評価され得る。
【０１０５】
用語「活性」は、抗原に対する抗体、例えばｈＣＤ４０抗原と結合する抗ｈＣＤ４０抗体の結合特異性／親和性および／または、抗体、例えば、ｈＣＤ４０との結合によりｈＣＤ４０の生物活性（例えばＣＤ４０Ｌとの結合；Ｂ細胞発生への関与；リンパ球活性化への関与；抗原提示細胞機能への関与；樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞の活性の調節；マクロファージおよび樹状細胞における炎症性サイトカインの産生の誘導；抗原提示の上方制御；Ｔ細胞刺激の上方制御；およびＢ細胞における免疫グロブリンクラススイッチの促進）を阻害する抗ｈＣＤ４０抗体の中和力のような活性を含む。
【０１０６】
本発明の抗ＣＤ４０抗体の活性を評価するための例示的なアッセイとして、本明細書に記載のインビトロアッセイおよびインビボアッセイが挙げられる。詳細には、アッセイは、抗ＣＤ４０抗体がアゴニスト抗体であるかアンタゴニスト抗体であるかを決定するために使用され得る。
【０１０７】
例えば、ヒトＣＤ４０との結合およびＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用の阻害は、ヒトＣＤ４０発現細胞株を使用して、ＦＡＣＳ分析によってアッセイされ得る。アンタゴニスト活性およびアゴニスト活性は、ＮＦｋＢ媒介性アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と連結したヒトＣＤ４０を発現するＣＤ４０発現レポーター細胞株を使用して評価され得る。シグナルがＣＤ４０を通じて受け取られると、ＮＦｋＢ活性化によりＡＰの分泌が導かれ、それを比色定量基質によって測定する。例示的なアンタゴニストアッセイとして、ＣＤ４０レポーター株を、ＣＤ４０Ｌを発現するジャーカット細胞株と一緒に（生理的リガンド相互作用をもたらすため）または可溶性ＣＤ４０Ｌと一緒に培養することができ、抗ＣＤ４０抗体のＮＦｋＢシグナルを遮断する能力を評価することができる。例示的なアゴニストアッセイとして、ヒトＣＤ４０レポーター細胞株を抗ＣＤ４０抗体で処理し、ＮＦｋＢシグナルを上記の通り測定することができる。
【０１０８】
あるいは、ＣＤ４０アンタゴニスト抗体を添加する前に低用量の抗ＩｇＭおよび抗ＩＬ４を用いてＢ細胞を活性化する、Ｂ細胞アゴニストアッセイが利用され得る。Ｂ細胞活性化の増強はＣＤ８６の上方制御として測定され得、今度はそれにより、アゴニスト活性が示される。同様に、初代ヒトＢ細胞をＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用によってＢ細胞活性化およびＣＤ８６発現の上方制御を導くＣＤ４０Ｌ発現ヒトＴ細胞株と一緒に培養する、Ｂ細胞アンタゴニストアッセイが利用され得る。初代ヒトＢ細胞のＣＤ８６上方制御の阻害により、アンタゴニスト活性が示される。
【０１０９】
用語「エピトープ」は、抗体またはその抗原結合部分に特異的に結合することができる任意のポリペプチド決定基を含む。特定の実施形態では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面基群（ｓｕｒｆａｃｅ  ｇｒｏｕｐｉｎｇｓ）を含み、特定の実施形態では、特定の３次元構造的特徴および／または特定の荷電特徴を有し得る。種々の実施形態では、エピトープは、抗原、すなわちＣＤ４０の一次構造の直線的または連続的なエピトープ、すなわち、アミノ酸の直線的配列であり得る。あるいは、その他の実施形態では、エピトープは、抗原がその二次構造を仮定する場合、特定の３次元形状を有する立体構造エピトープであり得る。例えば、立体構造エピトープは、抗原の非直線的、すなわち非連続的なアミノ酸を含み得る。
【０１１０】
特定の実施形態では、エピトープは抗体またはその抗原結合部分によって結合される抗原の領域である。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、タンパク質および／または高分子の複合混合物中のその標的抗原を優先的に認識する場合に、抗原と特異的に結合するといえる。
【０１１１】
用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むものとする。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特に、ＣＤＲ３中に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダム突然変異誘発および部位特異的突然変異誘発によって誘発されるか、またはインビボ体細胞突然変異によって誘発される突然変異）を含み得る。しかし、用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含まないものとする。
【０１１２】
用語「組換えヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、組換え手段によって調製、発現、作製もしくは単離されたすべてのヒト抗体、例えば宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体（以下の節ＩＩＣにさらに記載されている）、組換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．Ｒ．、（１９９７年）ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ．１５：６２−７０頁；Ａｚｚａｚｙ  Ｈ．およびＨｉｇｈｓｍｉｔｈ  Ｗ．Ｅ．、（２００２年）Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：４２５−４４５頁；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ  Ｊ．Ｖ．およびＬａｒｒｉｃｋ  Ｊ．Ｗ．（２００２年）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：１２８−１４５頁；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．およびＣｈａｍｅｓ  Ｐ．（２０００年）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１−３７８頁）、ヒト免疫グロブリン遺伝子にとってトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ら（１９９２年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５頁；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ  Ｓ−Ａ．およびＧｒｅｅｎ  Ｌ．Ｌ．（２００２年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５９３−５９７頁；Ｌｉｔｔｌｅ  Ｍ．ら（２０００年）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１：３６４−３７０頁を参照のこと）またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列のその他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意のその他の手段によって調製、発現、作製もしくは単離された抗体などを含むものとする。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する。しかし、特定の実施形態では、このような組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてのトランスジェニックの動物が使用される場合には、インビボ体細胞突然変異誘発）に付され、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、それと関連している一方で、インビボにおけるヒト抗体生殖系列レパートリー内には天然に存在しなくともよい配列である。一実施形態では、例えば、それだけには限らないが、Ｊｅｒｍｕｔｕｓら、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ２００５／００７６９９  Ａ２号に記載されているものなどのヒトＩｇファージライブラリーを使用することなどの、当技術分野で周知の技法を使用して作製され得る、ヒトＣＤ４０と結合することができる完全ヒト抗体が提供される。
【０１１３】
本明細書において、用語「表面プラズモン共鳴」とは、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によってリアルタイム生体特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。さらなる説明のためには、Ｊｏｎｓｓｏｎ、Ｕ．ら（１９９３年）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．  ５１：１９−２６頁；Ｊｏｎｓｓｏｎ、Ｕ．ら（１９９１年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７頁；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ、Ｂ．ら（１９９５年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．  ８：１２５−１３１頁；およびＪｏｈｎｎｓｏｎ、Ｂ．ら（１９９１年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８：２６８−２７７頁参照のこと。
【０１１４】
用語「ｋｏｎ」とは、本明細書で使用される場合、当技術分野で公知の、抗体／抗原複合体を形成するための、抗体の抗原との会合の結合速度定数を指すものとする。
【０１１５】
用語「ｋｏｆｆ」とは、本明細書で使用される場合、当技術分野で公知の、抗体／抗原複合体からの抗体の解離についての解離速度定を指すものとする。
【０１１６】
用語「ＫＤ」は、本明細書で使用される場合、当技術分野で公知の、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を指すものとする。
【０１１７】
用語「標識された抗体」とは、本明細書で使用される場合、抗体またはその抗原結合部分の同定をもたらす標識が組み込まれた抗体を指す。好ましくは、標識は、例えば、放射標識されたアミノ酸の組み込みまたは印をつけたアビジン（例えば、蛍光マーカーまたは光学的方法もしくは比色法によって検出され得る酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出され得るビオチニル部分のポリペプチドとの結合によって、検出可能なマーカーである。ポリペプチドのための標識の例として、それだけには限らないが、以下が挙げられる：放射性同位元素または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、または１５３Ｓｍ）；蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドホスホール）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；化学発光マーカー；ビオチニル基；二次レポーター（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認識される所定のポリペプチドエピトープ；および、ガドリニウムキレートなどの磁性物質。
【０１１８】
本明細書において、用語「結晶」、および「結晶化された」とは、結晶の形態で存在する抗体またはその抗原結合部分を指す。結晶は、物質の固体状態の１種の形態であり、非晶質固体状態または液晶状態などのその他の形態とは異なる。結晶は、原子、イオン、分子（例えば、抗体などのタンパク質）または分子集合体（例えば、抗原／抗体複合体）の、規則正しい、反復する３次元の配置からなる。これらの３次元配置は、この分野で十分に理解されている特定の数学的関係に従って配列される。結晶中で反復される基本単位またはビルディングブロックは、非対称単位と呼ばれる。所与の、十分に定義された結晶学的対称と一致する配列中の非対称単位の反復は、結晶の「単位格子」を提供する。３次元すべてにおける規則正しい並進による単位格子の反復は結晶を提供する。Ｇｉｅｇｅ，Ｒ．およびＤｕｃｒｕｉｘ，Ａ．Ｂａｒｒｅｔｔ、Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第２版、２０１−１６頁、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９年）を参照のこと。
【０１１９】
用語「ポリヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれかまたはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾された形態の２つ以上のヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は、ＤＮＡの一本鎖および二本鎖形態を含むが、二本鎖ＤＮＡであることが好ましい。
【０１２０】
用語「単離されたポリヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、その起源によって、ポリヌクレオチド（例えば、ゲノムのポリヌクレオチド、ｃＤＮＡのポリヌクレオチド、または合成起源のポリヌクレオチド、またはそれらのいくつかの組合せ）を意味するものとし、「単離されたポリヌクレオチド」は、「単離されたポリヌクレオチド」が天然に存在する場合にともに存在するポリヌクレオチドのすべてまたは一部と会合しておらず；天然には連結していないポリヌクレオチドと作動可能に連結され；またはより長い配列の一部として天然には生じない。
【０１２１】
用語「ベクター」とは、本明細書で使用される場合、それが連結している別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すものとする。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは、その中にさらなるＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、これは、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲーションされ得るものである。特定のベクターは、それらが導入されている宿主細胞において自己複製できる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。その他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノム内に組み込まれ得、それにより、宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、特定のベクターは、それが作動可能に連結した遺伝子の発現を導くことができる。このようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技法において有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが、ベクターの最も一般的に使用される形態であるので、互換的に使用され得る。しかし、本発明は、同等の機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などの発現ベクターのこのようなその他の形態を含むものとする。
【０１２２】
用語「作動可能に連結された」とは、記載された成分が、それらがその意図される方法で機能するのを可能にする関係にある近位を指す。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が、制御配列に適合する条件下で達成されるような方法でライゲーションされる。「作動可能に連結された」配列は、目的の遺伝子と連続している発現制御配列およびトランスで作用するすなわち目的の遺伝子からある距離をおいて制御する発現制御配列の両方を含む。本明細書において、用語「発現制御配列」とは、それらがライゲーションされているコード配列の発現およびプロセシングを達成するために必須であるポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列として、適当な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；および望ましい場合には、タンパク質分泌を増強する配列が挙げられる。このような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なり；原核生物では、このような制御配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列を含み；真核生物では、一般に、このような制御配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、その存在が、発現およびプロセシングにとって不可欠である成分を含むものとし、また、その存在が有利であるさらなる成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含み得る。本発明のタンパク質構築物は、発現カセット、ベクター、組換え宿主細胞ならびに組換えポリタンパク質および単一のオープンリーディングフレーム由来のタンパク質前駆体の組換え発現およびタンパク質分解プロセシングのための方法（例えば、参照により本明細書に組み込むＷＯ２００７／０１４１６２）を含めた、当技術分野で公知の発現ベクターおよび宿主細胞を使用して発現させ、精製することができる。
【０１２３】
本明細書において定義される「形質転換」とは、それによって外因性ＤＮＡが宿主細胞に入る任意のプロセスを指す。形質転換は、当技術分野で周知の種々の方法を使用して自然条件または人工条件下で起こり得る。形質転換は、原核細胞または真核細胞の宿主細胞中に外来核酸配列を挿入するための任意の公知の方法に依存し得る。方法は、形質転換されている宿主細胞に基づいて選択され、それだけには限らないが、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポフェクションおよび微粒子銃を挙げることができる。このような「形質転換された」細胞は、挿入されたＤＮＡが、自己複製プラスミドとして、または宿主染色体の一部としてのいずれかで複製できる安定に形質転換された細胞を含む。それらはまた、挿入されたＤＮＡまたはＲＮＡを限られた期間にわたり一時的に発現する細胞を含む。
【０１２４】
用語「組換え宿主細胞」（または簡単に「宿主細胞」）とは、本明細書で使用される場合、外因性ＤＮＡが導入されている細胞を指すものとする。このような用語は、特定の目的の細胞だけでなく、このような細胞の後代も指すことが意図されていることが理解されるべきである。突然変異または環境の影響のいずれかによって後継の世代では特定の修飾が起こり得るので、このような後代は、実際は、親細胞と同一でない場合もあるが、本明細書において、依然として用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。好ましくは、宿主細胞は、生物界のいずれかから選択される原核細胞および真核細胞を含む。好ましい真核細胞は、原生生物、真菌、植物および動物細胞を含む。最も好ましくは、宿主細胞として、それだけには限らないが、原核生物細胞株大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）；哺乳動物細胞株ＣＨＯ、ＨＥＫ  ２９３およびＣＯＳ；昆虫細胞株Ｓｆ９；および真菌細胞サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。
【０１２５】
標準技術が、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成および組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために使用され得る。酵素反応および精製技術は、製造業者の使用説明書に従って、または当技術分野で通常行われるように、または本明細書に記載されるように実施され得る。前述の技術および手順は、概して、当技術分野で周知の従来の方法に従って、本明細書を通じて引用され論じられる種々の一般的参考文献およびより特定の参考文献に記載されるように、実施され得る。例えば、いかなる目的に関しても参照により本明細書に組み込む、Ｓａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年））を参照のこと。
【０１２６】
「トランスジェニック生物」は、当技術分野で公知のようにそして本明細書で使用される場合、導入遺伝子を含有する細胞を有する生物を指し、ここで、生物（または生物の先祖）に導入された導入遺伝子は、この生物では天然に発現されないポリペプチドを発現する。「導入遺伝子」は、トランスジェニック生物が発生する細胞のゲノム中に安定に、作動可能に組み込まれ、トランスジェニック生物の１種以上の細胞種または組織においてコードされた遺伝子産物の発現を指示するＤＮＡ構築物である。
【０１２７】
用語「調節する（ｒｅｇｕｌａｔｅ）」および「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」は、本明細書において、同義的に使用され、目的の分子の活性（例えば、ｈＣＤ４０の生物活性）における変化または変更を指す。調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）は、目的の分子の特定の活性または機能の規模の増大または減少であり得る。分子の例示的活性および機能として、それだけには限らないが、結合特徴、酵素活性、細胞受容体活性化およびシグナル変換が挙げられる。
【０１２８】
同様に、本明細書において、用語「モジュレーター」とは、目的の分子の活性または機能（例えば、ｈＣＤ４０の生物活性）を変化または変更できる化合物である。例えば、モジュレーターは、モジュレーターの不在下で観察された活性または機能の規模と比較して、分子の特定の活性または機能の規模の増大または減少を引き起こし得る。特定の実施形態では、モジュレーターは、分子の少なくとも１種の活性または機能の規模を減少させる阻害剤である。例示的阻害剤として、それだけには限らないが、タンパク質、ペプチド、抗体、ペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｉｅｓ）、炭水化物または小さい有機分子が挙げられる。ペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｉｅｓ）は、例えば、ＷＯ０１／８３５２５に記載されている。
【０１２９】
本明細書において、用語「有効量」とは、障害もしくは１種以上のその症状の重篤度および／もしくは期間を低減もしくは寛解させる、障害の前進を防止する、障害の退縮を引き起こす、障害と関連している１種以上の症状の再発、発現、発症もしくは進行を防止する、障害を検出する、または別の治療（例えば、予防薬または治療薬）の予防的効果または治療的効果（複数可）を増強もしくは改善するのに十分である治療の量を指す。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、用語「非応答者」とは、ＴＮＦα阻害剤を用いた治療後のそれらの臨床疾患の状態に改善が見られないまたは改善が限られているまたは不十分である（例えば、ＣＤＡＩスコアの低減がない、コルチコステロイドの使用の低減がない）、ＩＢＤ（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎）を有する被験体を指すために使用される。一実施形態では、ＴＮＦ非応答者とは、ＴＮＦα阻害剤を用いた治療後のクローン病活動指数（ＣＤＡＩ）スコアの１００点以上の低減が実現できない、ＩＢＤを有する被験体である。一実施形態では、非応答者とは、ＴＮＦα阻害剤を用いた治療後の特定の時間枠内でクローン病活動指数（ＣＤＡＩ）スコアの１００点以上の低減が実現できない、ＩＢＤを有する被験体である。
【０１３１】
Ｉ．ヒトＣＤ４０（ｈＣＤ４０）と結合する抗体
本発明の一態様は、ヒトＣＤ４０（ｈＣＤ４０）を含めたＣＤ４０と結合するアンタゴニストヒト化抗体またはその抗原結合部分を提供する。本発明のその他の実施形態は、ＣＤ４０と結合するマウスモノクローナル抗体またはその抗原結合部分ならびに本明細書に記載の抗ＣＤ４０マウス抗体の可変領域を含むキメラ抗体を含む。本発明の抗体は、有意なアゴニスト活性を有さないアンタゴニスト抗ＣＤ４０（例えば、抗ヒトＣＤ４０）抗体であることが好ましい。
【０１３２】
１．抗体１（Ａｂ１）に由来するヒト化抗ｈＣＤ４０アンタゴニスト抗体
本発明は、少なくとも一部において、アンタゴニスト特性を有し、特定の実施形態では実質的なアゴニスト活性を有さないヒト化抗ＣＤ４０抗体の同定に基づく。
【０１３３】
実施例１に記載の通り、３種のアンタゴニスト抗ｈＣＤ４０マウス抗体、すなわち、Ａｂ１（配列番号９に記載のＶＬ配列および配列番号５に記載のＶＨ配列）、Ａｂ２（配列番号７６に記載のＶＬ配列および配列番号７５に記載のＶＨ配列）およびＡｂ３（配列番号４８に記載のＶＬ配列および配列番号４４に記載のＶＨ配列）が同定された。
【０１３４】
コンセンサスＣＤＲ配列をマウスアンタゴニスト抗体Ａｂ１、Ａｂ２およびＡｂ３のＣＤＲアミノ酸配列のアラインメントに基づいて決定した。ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域についてのコンセンサスアミノ酸配列はそれぞれ配列番号７８、７９および８０に記載されており、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列についてのコンセンサスアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１０８、１０９および１１０に記載されている。全ての配列が以下の表５および図４にも記載されている。
【０１３５】
【表５】
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【０１３６】
重鎖ＣＤＲ１ドメインのコンセンサスアミノ酸配列は、配列番号７８（Ｇ（Ｆ／Ｙ）ＴＦ（Ｓ／Ｔ）（Ｄ／Ｓ）Ｙ（Ｇ／Ｔ）Ｍ（Ｎ／Ｈ））として記載されている。可変重鎖ＣＤＲ２ドメインのコンセンサスアミノ酸配列は、配列番号７９（ＹＩ（Ｓ／Ｎ）（Ｓ／Ｐ）（Ｇ／Ｓ）（Ｒ／Ｓ）（Ｄ／Ｓ／Ｇ）（Ｎ／Ｙ）（Ｉ／Ｐ）（Ｙ／Ｎ）Ｙ（Ａ／Ｎ）（Ｄ／Ｑ）（Ｔ／Ｋ）（Ｖ／Ｆ）Ｋ（Ｇ／Ｄ））として記載されている。可変重鎖ＣＤＲ３ドメインのコンセンサスアミノ酸配列は配列番号８０（（Ｓ／Ｗ）（Ｗ／Ｇ）（Ｇ／Ｙ）（Ｙ／Ｓ）ＦＤＶ）に記載されている。
【０１３７】
可変軽鎖ＣＤＲ１ドメインのコンセンサスアミノ酸配列は、配列番号１０８（（Ｋ／Ｒ）ＳＳ（Ｑ／Ｋ）ＳＬＬ（Ｎ／Ｈ）Ｓ（Ｇ／−）Ｎ（Ｑ／Ｇ）（Ｋ／Ｎ）（Ｎ／Ｔ）ＹＬ（Ｔ／Ｙ））として記載されている。可変軽鎖ＣＤＲ２ドメインのコンセンサスアミノ酸配列は、配列番号１０９（（Ｗ／Ｒ）（Ａ／Ｍ）ＳＴ（Ｒ／Ｌ）（Ｅ／Ａ）Ｓ）として記載されている。可変軽鎖ＣＤＲ３ドメインのコンセンサスアミノ酸配列は、配列番号１１０（（Ｑ／Ｍ）（Ｎ／Ｑ）（Ｄ／Ｈ）（Ｙ／Ｌ）（Ｔ／Ｅ）ＹＰＬＴ）として記載されている。
【０１３８】
一実施形態では、本発明は、配列番号１０８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、配列番号１１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む可変軽鎖３を含み、配列番号７８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号７９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、配列番号８０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む可変重鎖を含む、抗ＣＤ４０アンタゴニスト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【０１３９】
マウス抗体Ａｂ１、Ａｂ２およびＡｂ３の同定後、抗体Ａｂ１およびＡｂ３をヒト化のために選択した（下記の実施例２に記載）。表１１および１２に、それぞれヒト化Ａｂ１およびＡｂ３のＣＤＲ領域、ＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列を提供する。詳細には、９種の異なるヒト化抗体をＡｂ３に基づいて作製した（以下の実施例２および表１２を参照のこと）。以下を含めた、Ａｂ１に基づく４種の異なるヒト化抗体も作製した：
Ａ）ｈｕＡｂ１  ＶＨ．１／ＶＬ．１（配列番号１３として記載されているＶＨアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号６、７および８として記載されているＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；ならびに配列番号１４として記載されているＶＬアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号１０、１１および１２として記載されているＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列）；
Ｂ）ｈｕＡｂ１  ＶＨ．１Ａ／ＶＬ．１（配列番号１５として記載されているＶＨアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号６、７および８として記載されているＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；ならびに配列番号１４として記載されているＶＬアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号１０、１１および１２として記載されているＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列）；
Ｃ）ｈｕＡｂ１  ＶＨ．１／ＶＬ．１Ａ（配列番号１３として記載されているＶＨアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号６、７および８として記載されているＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；ならびに配列番号１６として記載されているＶＬアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号１０、１１および１２として記載されているＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列）；ならびに
Ｄ）ｈｕＡｂ１  ＶＨ．１Ａ／ＶＬ．１Ａ（配列番号１５として記載されているＶＨアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号６、７および８として記載されているＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列；配列番号１６として記載されているＶＬアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号１０、１１および１２として記載されているＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列）。
【０１４０】
Ａｂ１のヒト化型を、軽鎖ＣＤＲ１内の潜在的な脱アミド部位が除去されるようにさらに改変した。６種の変異ｈｕＡｂ１抗体を分析し、これらの抗体のうち４種がＣＤ４０のアンタゴニストであると同定された。６種の抗体は、本明細書ではＡｂ１ｖ１、Ａｂ１ｖ２、Ａｂ１ｖ３、Ａｂ１ｖ４、Ａｂ１ｖ５およびＡｂ１ｖ６と称される（ＣＤＲおよび可変配列が以下の表１３に提供されている）。６種のヒト化Ａｂ１種の変異体のうち、ｈｕＡｂ１ｖ１が特に優れたアンタゴニスト活性を有するものとして選択された。ｈｕＡｂ１ｖ１の重鎖可変配列は、それぞれ配列番号６、７および８に記載されているＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を有する配列番号１５に提供される。ｈｕＡｂ１ｖ１の軽鎖可変配列は、それぞれ配列番号２１、１１および１２に記載されているＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を有する配列番号２０で提供される。
【０１４１】
抗体ｈｕＡｂ１ｖ１の重鎖ＣＤＲ２をさらに突然変異誘発し、その結果１７種の変異体がもたらされた（下記の実施例４に記載）。これらのｈｕＡｂ１ｖ１重鎖ＣＤＲ２の変異体は、本明細書ではｈｕＡｂ１ｖ１ＣＤＲ２ｖ１からｈｕＡｂ１ｖ１ＣＤＲ２ｖ１７と称される。ｈｕＡｂ１ｖ１ＣＤＲ２ｖ１からｈｕＡｂ１ｖ１ＣＤＲ２ｖ１７の重鎖の配列は表１６に提供され、ここで、ＶＨ  ｈｕＡｂ１ｖ１ＣＤＲ２ｖ７がＣＤ４０に対して特に優れたアンタゴニスト活性を有するクローンとして選択され、残りはアゴニスト活性を比較的有さなかった。ｈｕＡｂ１ｖ１ＣＤＲ２ｖ７の重鎖可変配列は、それぞれ配列番号６、４２および８に記載されているＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を有する配列番号２８に提供される。
【０１４２】
ｈｕＡｂ１ｖ１ＣＤＲ２ｖ７  ＶＨ（それぞれ配列番号６、４２および８に記載されているＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を有する配列番号２８のＶＨ）およびｈｕＡｂ１ｖ１  ＶＬ（それぞれ配列番号２１、１１および１２に記載されているＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を有する配列番号２０のＶＬ）の選択後、可変領域を２種の異なるＩｇＧバックグラウンドにクローニングし、その結果、２種の抗ＣＤ４０アンタゴニスト抗体、すなわち、Ａｂ１０１およびＡｂ１０２がもたらされた。表６（および表１９）に、これらのＩｇＧ抗体に関する本発明の特定の実施形態の全長の重鎖配列および軽鎖配列を提供する。表６では、定常領域に下線が引かれており、ＣＤＲドメインが太字になっている。
【０１４３】
【表６】
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【０１４４】
したがって、一実施形態では、本発明は、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号３９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含むアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（Ａｂ１０１）に関する。代替の実施形態では、本発明は、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号４１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含むアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（Ａｂ１０２）に関する。
【０１４５】
したがって、本発明は、アンタゴニスト活性を有するマウス抗ＣＤ４０抗体、キメラ抗ＣＤ４０抗体およびヒト化抗ＣＤ４０抗体を包含する。特定の実施形態では、本発明は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域および／または配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含むアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分を提供する。特定の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。一実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、配列番号４１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖；および配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。別の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、配列番号３９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖；および配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０１４６】
表５、６、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８および１９に記載のアミノ酸配列（可変またはＣＤＲ）を有する抗体が本発明に包含される。したがって、一態様では、本発明は、（ａ）配列番号１０、１７、１９または２１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を有するアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分に関する。その代わりにまたはそれと組み合わせて、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号７または４２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む。
【０１４７】
特定の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、（ａ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；ならびに（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有する。
【０１４８】
別の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、（ａ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；ならびに（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有する。
【０１４９】
別の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、（ａ）配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；ならびに（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有する。
【０１５０】
別の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、（ａ）配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；ならびに（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有する。
【０１５１】
別の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、（ａ）配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；ならびに（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有する。
【０１５２】
別の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、（ａ）配列番号１０８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１０９に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号１１０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；ならびに（ａ）配列番号７８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号７９に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号８０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有する。
【０１５３】
本発明のさらに別の態様では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、配列番号５、１３、１５もしくは２２−３８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および／または配列番号９、１４、１６、１８、２０もしくは４３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１５４】
特定の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１５５】
別の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４、１６もしくは１８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１５６】
別の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４、１６、１８、２０もしくは４３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１５７】
別の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１５８】
本明細書に記載の抗体、特に抗体Ａｂ１０２は、ＣＤ４０に対してアンタゴニスト活性を有し、実質的なアゴニスト活性は伴わない。したがって、抗体Ａｂ１０２およびＡｂ１０１によって認識されるエピトープと結合する抗体が本発明に包含される。特定の実施形態では、本発明は、単離された抗体またはその抗原結合部分であって、前記抗体またはその抗原結合断片が、ヒトＣＤ４０と結合した結果、配列番号１のトポグラフィー的領域Ｃｙｓ６２−Ｐｈｅ６７、Ｇｌｎ７９−Ｃｙｓ８３、Ａｒｇ９０−Ｔｈｒ９９およびＴｈｒ２４−Ｃｙｓ３７によって定義されるエピトープと結合したＣＤ４０が、前記抗体またはその抗原結合断片によりＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）との結合を阻害される、単離された抗体またはその抗原結合部分を包含する。別の態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸残基Ｃｙｓ６２−Ｐｈｅ６７（Ｃｙｓ６２、Ｇｌｙ６３、Ｇｌｕ６４、Ｓｅｒ６５、Ｇｌｕ６６、Ｐｈｅ６７）、Ｇｌｎ７９−Ｃｙｓ８３（Ｇｌｎ７９、Ｈｉｓ８０、Ｌｙｓ８１、Ｔｙｒ８２、Ｃｙｓ８３）、Ａｒｇ９０−Ｔｈｒ９９（Ａｒｇ９０、Ｖａｌ９１、Ｇｌｎ９２、Ｇｌｎ９３、Ｌｙｓ９４、Ｇｌｙ９５、Ｔｈｒ９６、Ｓｅｒ９７、Ｇｌｕ９８およびＴｈｒ９９）およびＴｈｒ２４−Ｃｙｓ３７（Ｔｈｒ２４、Ａｌａ２５、Ｃｙｓ２６、Ａｒｇ２７、Ｇｌｕ２８、Ｌｙｓ２９、Ｇｌｎ３０、Ｔｙｒ３１、Ｌｅｕ３２、Ｉｌｅ３３、Ａｓｎ３４、Ｓｅｒ３５、Ｇｌｎ３６、Ｃｙｓ３７）のうちの３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、または全てを含むヒトＣＤ４０のエピトープと結合するヒトＣＤ４０と結合することができる抗体またはその抗原結合断片に関する。
【０１５９】
別の実施形態では、本発明は、ＣＤ４０に対するアンタゴニスト活性を有する重鎖ＣＤＲ２領域を提供する。具体的には、ＶＨ  ＣＤＲ２アミノ酸配列ＹＩＳＳＧＲＸＮＩＹＹＡＤＴＶＫＧ（配列番号１１２）の残基５５（残基Ｘ）が、残基Ｓ５５を有する親ＣＤＲ２配列と比較した抗体のアンタゴニスト活性の増大において役割を果たすと同定された。ＨＣ  ＣＤＲ２の５５位の残基Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＭｅｔにより、５５位のその他のアミノ酸と比較して低いレベルのアンタゴニスト活性がもたらされる。一実施形態では、本発明は、配列番号１１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を含む重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を含む軽鎖可変領域を含むアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分を提供する。抗体可変重鎖および軽鎖に関して配列番号１１１と組み合わせることができるＣＤＲ１およびＣＤＲ３ドメインアミノ酸配列は、例えば表１３および１８を含め、全体にわたって記載されている。
【０１６０】
さらなる実施形態では、本発明は、アンタゴニスト／アゴニストスイッチと同定された残基を有する軽鎖ＣＤＲ１領域を提供する。以下の実施例３に記載の通り、残基「Ｓ」におけるＶＬ  ＣＤＲ１領域ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ（配列番号１０）の「ＮＳ」モチーフの修飾により、アンタゴニスト抗体のアゴニスト抗体へのスイッチがもたらされ得る。したがって、一実施形態では、本発明は、配列番号１１３（ＫＳＳＱＳＬＬＮＸＧＮＱＫＮＹＬＴ；Ｘはアミノ酸残基Ｐｒｏではない）を含むＣＤＲ１  ＶＬ領域を有するアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を包含する。
【０１６１】
用語「競合抗体」とは、本明細書では、同じ分子または安定であるが非共有結合により連結した超分子実体、好ましくは同じ分子、すなわちＣＤ４０を標的とする任意の数の抗体であって、少なくとも１つが、好ましくはその他の抗体のこの標的エピトープ（上記）への接近を立体的に妨害することによって、または標的実体におけるその他の抗体に対する標的の親和性を低下させるコンホメーションを誘導および／または安定化することによって、より好ましくは、その他の抗体の標的エピトープに十分に近い、それと重複していている、またはそれと同一である、最も好ましくはそれと重複しているまたは同一である、特にそれと同一であるエピトープと結合することによりその他の抗体の標的エピトープへの接近を直接遮断することによって別の測定可能な結合を特異的に低下させることができる抗体を指す。本明細書では、２つのエピトープは、それらの化学構造、好ましくはそれらのアミノ酸配列の一部を共有している場合、「重複している」といわれ、それらの化学構造、好ましくはそれらのアミノ酸配列が同一である場合、「同一である」といわれる。
【０１６２】
特定の実施形態では、競合抗体またはその抗原結合部分は、本明細書で提示されている抗体のいずれかと競合する抗体またはその抗原結合部分である。一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の抗体（例えばＡｂ１０１またはＡｂ１０２）と競合し得、残基Ｃｙｓ６２−Ｐｈｅ６７、Ｇｌｎ７９−Ｃｙｓ８３、Ａｒｇ９０−Ｔｈｒ９９およびＴｈｒ２４−Ｃｙｓ３７を含めたヒトＣＤ４０のトポグラフィー的（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌ）エピトープと結合する競合抗体を提供する。
【０１６３】
特定の実施形態では、アゴニスト抗体は、（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ａ）配列番号７４に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１６４】
その他の特定の実施形態では、アゴニスト抗体は、（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ａ）配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１６５】
さらなる実施形態では、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、配列番号１５もしくは１３に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および／または配列番号７７もしくは４３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１６６】
２．抗体３（Ａｂ３）に由来するヒト化抗ＣＤ４０抗体
マウスＡｂ３の重鎖および軽鎖のヒト化型のアミノ酸配列を以下の表１１に提供する。したがって、本発明は、さらに、抗体３（Ａｂ３）由来の可変配列および／またはＣＤＲ配列を含む抗体を特徴とする。
【０１６７】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号５１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；ならびに（ａ）配列番号４５に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号４６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号４７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むヒト化抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【０１６８】
したがって、一態様では、本発明は、（ａ）配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号５１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を有するアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分に関する。その代わりにまたはそれと組み合わせて、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、（ａ）配列番号４５に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号４６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号４７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む。
【０１６９】
本発明のさらに別の態様では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、配列番号４４、５２、５４もしくは５５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および／または配列番号４８、５３、５６もしくは５７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１７０】
特定の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１７１】
別の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、配列番号５２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号５３、５６もしくは５７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１７２】
別の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号５３、５６もしくは５７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１７３】
別の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号５３、５６もしくは５７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１７４】
３．抗ＣＤ４０キメラ抗体
キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体およびヒト免疫グロブリン定常領域に由来する可変領域を有する抗体などの抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体を製造する方法は、当技術分野で公知である。例えば、その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２頁（１９８５年）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４頁（１９８６年）；Ｇｉｌｌｉｅｓら（１９８９年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２頁；米国特許第５，８０７，７１５号；同４，８１６，５６７号および同４，８１６，３９７号参照のこと。さらに、適当な生物活性のヒト抗体分子に由来する遺伝子と一緒に、適当な抗原特異性のマウス抗体分子から遺伝子をスプライシングすることによって「キメラ抗体」を製造するために開発された技術が使用され得る。例えば、そのそれぞれが参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ８１：８５１−８５５頁；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４年、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８頁；Ｔａｋｅｄａら、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４頁参照のこと。
【０１７５】
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；ならびに（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有するアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分に関する。特定の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、配列番号７６に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号７５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する。
【０１７６】
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号５１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；ならびに（ａ）配列番号４５に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号４６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号４７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有するアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分に関する。特定の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、配列番号４８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する。
【０１７７】
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；ならびに（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；（ｂ）配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有するアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分に関する。特定の実施形態では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する。
【０１７８】
前述の単離された抗ＣＤ４０抗体ＣＤＲ配列により、本発明に従って単離されたＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分の新規ファミリーが確立され、それらとして、表５、１１−１３および１５−１８に列挙されているＣＤＲ配列を含む抗体が含まれる。ｈＣＤ４０に関して好ましいＣＤ４０結合および／または中和活性を有する本発明のＣＤＲを作製するためおよび選択するために、それだけには限らないが、本明細書に具体的に記載されているものを含めた、本発明の抗体を作製し、これらの抗体のＣＤ４０結合および／または中和特性を評価するための、当技術分野で公知の標準の方法が使用され得る。
【０１７９】
４．本発明の抗体の特徴付け
本発明の抗ＣＤ４０抗体はアンタゴニスト抗体であり、例えば当技術分野で公知であり、本明細書に記載されているいくつかのインビトロおよびインビボアッセイのいずれか１つによって評価して、ＣＤ４０活性を低下させるまたは中和する高い能力を示し得る。特定の実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体はアンタゴニストであり、アゴニスト活性を実質的に有さない。アンタゴニスト活性およびアゴニスト活性は、本明細書に記載のものを含めた当技術分野で公知のアッセイによって決定することができる。例えば、ヒトＣＤ４０との結合およびＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用の阻害は、ヒトＣＤ４０発現細胞株を使用してＦＡＣＳ分析によってアッセイされ得る。
【０１８０】
一実施形態では、抗ＣＤ４０抗体のＣＤ４０アンタゴニストまたはアゴニスト活性は、レポーター細胞株を使用して決定される。例えば、アンタゴニスト活性およびアゴニスト活性は、ＮＦｋＢ媒介性アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と連結したヒトＣＤ４０を発現するＣＤ４０発現レポーター細胞株を使用して評価され得る。シグナルがＣＤ４０を通じて受け取られると、ＮＦｋＢ活性化によりＡＰの分泌が導かれ、それを比色定量基質によって測定する。例示的なアンタゴニストアッセイとして、ＣＤ４０レポーター株を、ＣＤ４０Ｌを発現するジャーカット細胞株と一緒に（生理的リガンド相互作用をもたらすため）または可溶性ＣＤ４０Ｌと一緒に培養することができ、そこで、抗ＣＤ４０抗体のＮＦｋＢシグナルを遮断する能力（標準の方法によって決定されるように、ＡＰのわずかな存在から非存在まで）を評価することができる。例示的なアゴニストアッセイとして、ヒトＣＤ４０レポーター細胞株を抗ＣＤ４０抗体で処理し、上記の通りＮＦｋＢシグナルを測定することができる（陰性対照を上回るＡＰの存在と考えられる）。ＣＤ４０レポーター細胞株の例は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＣＤ４０Ｌ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）であり、これは、ＣＤ４０Ｌの生理活性を、ＣＤ４０刺激後のＮＦ−κＢ活性化の際の胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の分泌によって測定するのに役立つ。ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用は、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用してＳＥＡＰのレベルを評価することによってモニタリングされ得る。
【０１８１】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０アンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片は、アンタゴニスト可溶性ＣＤ４０Ｌレポーターアッセイによって決定される、０．４ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０アンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片は、ジャーカット細胞株におけるアンタゴニストＣＤ４０レポーターアッセイによって決定される、５１ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０アンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片は、ジャーカット細胞株におけるアンタゴニストＣＤ４０レポーターアッセイによって決定される、３．４ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０アンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片は、ジャーカット細胞株におけるアンタゴニストＣＤ４０レポーターアッセイによって決定される、０．９ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。
【０１８２】
一実施形態では、抗ＣＤ４０抗体のＣＤ４０アンタゴニストまたはアゴニスト活性は、Ｂ細胞アゴニストアッセイを使用して決定される。例えば、ＣＤ４０アンタゴニスト抗体を添加する前に低用量の抗ＩｇＭおよびＩＬ４を用いてＢ細胞を活性化する、Ｂ細胞アゴニストアッセイが利用され得る。Ｂ細胞活性化の増強はＣＤ８６の上方制御として測定され得、今度はそれにより、アゴニスト活性が示される。同様に、初代ヒトＢ細胞をＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用によってＢ細胞活性化およびＣＤ８６発現の上方制御を導くＣＤ４０Ｌ発現ヒトＴ細胞株と一緒に培養する、Ｂ細胞アンタゴニストアッセイが利用され得る。初代ヒトＢ細胞のＣＤ８６上方制御の阻害により、アンタゴニスト活性が示される。
【０１８３】
一実施形態では、抗ＣＤ４０抗体のＣＤ４０アンタゴニストまたはアゴニスト活性は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＡＤＣＣ）媒介性アッセイを使用して決定される。アンタゴニスト活性およびアゴニスト活性は、ＡＤＣＣを媒介する抗体の能力によって評価され得る。アンタゴニストＣＤ４０抗体はＡＤＣＣの有効なメディエーターであり、一方、アゴニスト抗体はＡＤＣＣ活性を有さない。抗体依存性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＡＤＣＣ）は、これらの表面上に発現するＦｃ受容体を介して抗体の定常領域と結合することによって標的細胞を認識するマクロファージ、ＮＫ細胞、好中球細胞などの活性化によって誘導される細胞傷害性の一種を指す。補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）とは、抗体の抗原との結合によって起こる補体系の活性化によって誘導される細胞傷害性の一種を指す。ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性の低下とは、例えばハイブリドーマ４Ｄ１１（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７５８）によって産生されるモノクローナル抗体のような対照抗ＣＤ４０アンタゴニスト抗体と比較したこれらの活性の低下を意味する。その全体を参照により本明細書に組み込むＥＰ１７０７６２７Ｂ１には、ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性を決定するためのアッセイが記載されている。
【０１８４】
さらに、固定化された抗ＣＤ４０  Ａｂを用いて刺激した樹状細胞（ＤＣ）の生物活性が、アゴニスト活性をアッセイするために使用され得る。ＤＣは、非リンパ系組織内のＡｇを拾い上げ、これらを二次リンパ器官に運搬して、危険シグナルおよび救済シグナルのような成熟化刺激に応答してＴ細胞を初回刺激することができる最も強力な抗原提示細胞であると考えられている。対照的に、活性化を伴わないＤＣによるＡｇの提示では、同起源のＴＣＲを有するエフェクターＴ細胞の排除または二次リンパ組織における調節性Ｔ細胞の誘導がもたらされる。したがって、末梢組織における未成熟ＤＣに対する成熟化シグナルの存在または非存在は、適応免疫応答または寛容のいずれかを誘導するスイッチとして作用する。ＤＣ成熟化のための主要なＣＤ４＋Ｔ細胞救済シグナルは、ＤＣ上に発現したＣＤ４０と活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ４０リガンド（Ｌ）との間の相互作用によってもたらされる。したがって、ＣＤ４０刺激により、ＣＣＲ７の発現が上方制御されることによってＤＣの二次リンパ組織への遊走が誘導される。Ｗａｔａｎａｂｅら、２００３年、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ；１７１：５８２８−５８３６頁には、アゴニスト活性およびアンタゴニスト活性を決定するために、抗ＣＤ４０抗体がＤＣを活性化することができるかどうかを決定するために使用され得るアッセイが記載されている。そのような例示的なアッセイとして、固定化された抗ＣＤ４０  Ａｂを用いて刺激されたＢＭ−ＤＣ上のＭＨＣクラスＩ／ＩＩ  Ａｇおよび共刺激分子の発現、固定化された抗ＣＤ４０  Ａｂを用いて刺激されたＢＭ−ＤＣのインビボ遊走活性、固定化された抗ＣＤ４０  Ａｂを用いて刺激されたＢＭ−ＤＣのインビトロ遊走活性およびＣＣＲ７発現の、決定が挙げられる。
【０１８５】
一実施形態では、抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分のアゴニスト活性は、下記の実施例７に記載されたアッセイのようなインビトロ単球活性化アッセイを使用して決定される。インビトロ単球活性化アッセイは、単球を抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分に曝露させ、そこで、抗体またはその抗原結合部分がＣＤ４０の活性化因子（アゴニスト）であれば、ＴＮＦ産生の増加がもたらされる。実施例７に記載の通り、インビトロ単球活性化アッセイを使用すると、アゴニスト活性を実質的に有さないアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分では、ＴＮＦの産生はもたらされないまたは最小である。
【０１８６】
一実施形態では、アゴニスト活性を実質的に有さないアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分は、インビトロＣＤ４０アゴニストアッセイ、例えば、実施例７に記載のアゴニスト単球アッセイにおいて陰性対照の１標準偏差以内に入る活性を有する。
【０１８７】
アゴニストアッセイは、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み込むＵＳ５７８６４５６、ＵＳ２０１１／０２４３９３２およびＥＰ１７０７６２７Ｂ１にさらに記載されている。抗体機能を試験するためのアンタゴニストアッセイは、そのそれぞれを参照により本明細書に組み込むＵＳ７３６１３４５、ＵＳ２０１１／０２４３９３２およびＥＰ１７０７６２７Ｂ１にさらに記載されている。
【０１８８】
好ましい実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＣＤ４０と結合し、ここで、抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＣＤ４０から、表面プラズモン共鳴によって決定した場合に約０．１ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数で解離するまたはヒトＣＤ４０活性を、約１×１０−６Ｍ以下のＩＣ５０で阻害する。あるいは、抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＣＤ４０から、表面プラズモン共鳴によって決定した場合に約１×１０−２ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数で解離し得るまたはヒトＣＤ４０活性を約１×１０−７Ｍ以下のＩＣ５０で阻害し得る。あるいは、抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＣＤ４０から、表面プラズモン共鳴によって決定した場合に約１×１０−３ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数で解離し得るまたはヒトＣＤ４０活性を約１×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０で阻害し得る。あるいは、抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＣＤ４０から、表面プラズモン共鳴によって決定した場合に約１×１０−４ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数で解離し得るまたはＣＤ４０活性を約１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０で阻害し得る。あるいは、抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＣＤ４０から、表面プラズモン共鳴によって決定した場合に約１×１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数で解離し得るまたはＣＤ４０を約１×１０−１０Ｍ以下のＩＣ５０で阻害し得る。あるいは、抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＣＤ４０から、表面プラズモン共鳴によって決定した場合に約１×１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度定数で解離し得るまたはＣＤ４０活性を約１×１０−１１Ｍ以下のＩＣ５０で阻害し得る。
【０１８９】
抗体を以下の実施例に記載の通りヒト化した。フレームワーク復帰突然変異を、可変ドメインの新規合成によってまたは変異原性オリゴヌクレオチドプライマーおよびポリメラーゼ連鎖反応によってまたはＣＤＲグラフトのそれぞれについて復帰突然変異およびその他の突然変異の種々の組合せの両方を可能にすることによってＣＤＲグラフト化抗体配列に導入した。機能的特徴付けのためにマウスモノクローナルＣＤ４０抗体のヒト化可変領域をＩｇＧ発現ベクターにクローニングした。
【０１９０】
特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域などの重鎖定常領域を含む。好ましくは、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１重鎖定常領域またはＩｇＧ４重鎖定常領域である。さらに、抗体は、軽鎖定常領域、κ軽鎖定常領域またはλ軽鎖定常領域のいずれかを含み得る。好ましくは、抗体は、κ軽鎖定常領域を含む。または、抗体部分は、例えば、Ｆａｂ断片または一本鎖Ｆｖ断片であり得る。
【０１９１】
５．抗ＣＤ４０ヒト化抗体の作製
上記の通り、ヒト化抗体は、非ヒト種に由来する１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を有する所望の抗原と結合する非ヒト種抗体に由来する抗体分子である。既知ヒトＩｇ配列は、例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ−／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｐｕｂｌｉｃ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｐｅｄｒｏ−／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｍｇｅｎ．ｕｎｉｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ＳＤ／ＩＴ／ＩＴ．ｈｔｍｌ；ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−／ＣＨ０５／ｋｕｂｙ０５．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｌｉｂｒａｒｙ．ｔｈｉｎｋｑｕｅｓｔ．ｏｒｇ／１２４２９／Ｉｍｍｕｎｅ／Ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｈｈｍｉ．ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／１９９６／ｖｌａｂ／；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．−ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃ７／ｍｉｋｅｉｍａｇｅｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／；ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ−／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ．ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ．ｃｏｍ／；ｐａｔｈｂｏｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｈｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏ−ｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｈｃｌ／；ｗｗｗ．ｐｅｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐａ／３４０９１３−／３４０９１３．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／；ｗｗｗ．ｍ．ｅｈｉｍｅｕ．ａｃｊｐ／．ａｂｏｕｔ．ｙａｓｕｈｉｔｏ−／Ｅｌｉｓａ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ／ｔａｂｌｅ．ａｓｐ；ｗｗｗ．ｉｃｎｅｔ．ｕｋ／ａｘｐ／ｆａｃｓ／ｄａｖｉｅｓ／ｌｉｎ−ｋｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ−／．ａｂｏｕｔ．ｆｃｃｌ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｓａｃ−ｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅｓ＿ｇｅｏ．ｈｔｍｌ；ａｘｉｍｔｌ．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／．ａｂｏｕｔ．ｒｅｋ／ＡＥＰ−Ｓｔａｒｔ．ｈｔｍｌ；ｂａｓｅｒｖ．ｕｃｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／．ａｂｏｕｔ．ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓｌ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｒｅｃａｂ．ｕｎｉ−ｈｄ．ｄｅ／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／；ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／−ｖｉｒ／Ｖ＿ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌ；ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４／；ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍａｒｔｉｎ／ａｂｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ａｎｔｉ−ｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ／；ａｂｇｅｎ．ｃｖｍ．ｔａｍｕ．ｅｄｕ／ｌａｂ／ｗｗｗａｂｇｅｎ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／．ａｂｏｕｔ．ｈｏｎｅｇｇｅｒ／ＡＨＯ−ｓｅｍｉｎａｒ／Ｓｌｉｄｅ０１．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｕｂｃｇ０７ｓ／；ｗｗｗ．ｎｉｍｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ＣＣ／ｃｃａｅｗｇ／ｃｃａｅｗｇ．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃ７／ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ＿ａｉｍ．−ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉ．ｍｉｓｓｏｕｒｉ．ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｉｏｃ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｆｍｏｌｉｎａ／Ｗｅｂｐａｇｅｓ−／Ｐｅｐｔ／ｓｐｏｔｔｅｃｈ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｊｅｒｉｎｉ．ｄｅ／ｆｒｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｐａｔｅｎｔｓ．ｉｂｍ．ｃｏｍ／ｉｂｍ．ｈｔｍｌ、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐｔ．  Ｈｅａｌｔｈ  （１９８３年）に開示されており、これらは、参照により本明細書に各々、全文が組み込まれる、。免疫原性を低減するまたは結合、親和性、結合速度、解離速度、アビディティー、特異性、半減期もしくは当技術分野で公知の任意のその他の適した特徴を低減、増強もしくは改変するために、このような移入された配列が使用され得る。
【０１９２】
ヒトフレームワーク領域中のフレームワーク残基は、抗原結合を変更、好ましくは、改善するためにＣＤＲドナー抗体に由来する対応する残基で置換され得る。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって、例えば、抗原結合にとって重要であるフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリングおよび特定の位置の通常のフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される（例えば、参照によってその全文が本明細書に組み込まれる、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３頁（１９８８年）参照のこと）。３次元免疫グロブリンモデルは一般に利用異可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列のあり得る３次元立体構造を例示し、示すコンピュータプログラムが利用可能である。これらのディスプレイの観察によって、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のあり得る役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンのその抗原と結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、ＦＲ残基は、標的抗原（複数可）に対する親和性の増大などの所望の抗体特徴が達成されるようにコンセンサス配列および移入配列から選択され、組み合わされ得る。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接に、最も実質的に関与する。抗体は、それだけには限らないが、それに列挙される参考文献を含め、参照によって各々全文が組み込まれる、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２頁（１９８６年）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４頁（１９８８年）、Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５１：２２９６頁（１９９３年）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１頁（１９８７年）、Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８９：４２８５頁（１９９２年）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５１：２６２３頁（１９９３年）、Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２８（４／５）：４８９−４９８頁（１９９１年）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４頁（１９９４年）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３頁（１９９４年）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０９９６７、ＰＣＴ／：ＵＳ９８／１６２８０、ＵＳ９６／１８９７８、ＵＳ９１／０９６３０、ＵＳ９１／０５９３９、ＵＳ９４／０１２３４、ＧＢ８９／０１３３４、ＧＢ９１／０１１３４、ＧＢ９２／０１７５５；ＷＯ９０／１４４４３、ＷＯ９０／１４４２４、ＷＯ９０／１４４３０、ＥＰ２２９，２４６、ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６、ＥＰ２３９，４００、米国特許第５，５６５，３３２号，同５，７２３，３２３号，同５，９７６，８６２号，同５，８２４，５１４号，同５，８１７，４８３号，同５８１４４７６号、同５７６３１９２号、同５７２３３２３号、同５７６６８８６号、同５，７１４，３５２号、同６，２０４，０２３号、同６，１８０，３７０号、同５，６９３，７６２号、同５，５３０，１０���号、同５，５８５，０８９号、同５，２２５，５３９号；同４，８１６，５６７号に記載されるものなど当技術分野で公知の種々の技術を使用してヒト化され得る。
【０１９３】
抗ＣＤ４０ヒト化抗体の例は上の節１および２および下記の実施例に提供されている。
【０１９４】
ＩＩ．抗体の産生および抗体産生細胞株
本発明の抗体は、当技術分野で公知のいくつかの技術のうちいずれかによって作製され得る。
【０１９５】
１．ハイブリドーマ技術を使用する抗ＣＤ４０モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマの使用、組換えおよびファージディスプレイ技術またはそれらの組合せを含めた、当技術分野で公知のさまざまな技術を使用して調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で公知のものおよび例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版  １９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１年）（この参考文献は、その全文が参照により組み込まれる）に教示されるものを始めとするハイブリドーマ技術を使用して製造され得る。本明細書において、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって製造される抗体に制限されないということも留意されたい。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物クローン、原核生物クローンまたはファージクローンを含めた単一クローンに由来する抗体を指すのであって、製造される方法を指すのではない。
【０１９６】
ハイブリドーマ技術を使用して特異的抗体を製造し、スクリーニングする方法は、慣用的なものであり、当技術分野で周知である。一実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体を作製する方法ならびに本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することを含む方法によって製造された抗体を提供し、これでは、好ましくは、ハイブリドーマが、本発明の抗原を用いて免疫処置されたマウスから単離された脾細胞を、骨髄腫細胞と融合すること、次いで、融合から得られたハイブリドーマを、本発明のポリペプチドと結合できる抗体を分泌するハイブリドーマクローンについてスクリーニングすることによって作製される（実施例１を参照のこと）。手短には、マウスは、ＣＤ４０抗原を用いて免疫処置され得る。好ましい一実施形態では、ＣＤ４０抗原は、免疫応答を刺激するようアジュバントとともに投与される。このようなアジュバントとして、完全または不完全フロイントアジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）が挙げられる。このようなアジュバントは、ポリペプチドを局所沈着に隔離することによって、ポリペプチドが迅速分散することから保護し得るか、またはこのようなアジュバントは、宿主を、マクロファージおよび免疫系のその他の成分にとって走化性である因子を分泌するよう刺激する物質を含有し得る。好ましくは、ポリペプチドが投与される場合には、免疫処置スケジュールは、数週間にわたって広がっているポリペプチドの２回以上の投与を含む。
【０１９７】
ＣＤ４０抗原を用いて動物を免疫処置した後、抗体および／または抗体を製造する細胞が動物から得られ得る。抗ＣＤ４０抗体を含有する血清が、動物を出血させることまたは屠殺することによって動物から得られる。動物から得られた血清が使用され得、免疫グロブリン画分が血清から得られ得るまたは抗ＣＤ４０抗体が血清から精製され得る。この方法で得られた血清または免疫グロブリンは、ポリクローナルであり、したがって、不均一な特性のアレイを有する。
【０１９８】
免疫応答が検出されると、例えば、抗原ＣＤ４０に対して特異的な抗体を、マウス血清において検出し、マウス脾臓を回収し、脾細胞を単離する。次いで、周知の技術によって脾細胞を任意の適した骨髄腫細胞、例えば、ＡＴＣＣから入手可能である細胞株ＳＰ２０から得た細胞に融合する。ハイブリドーマを選択し、限界希釈によってクローニングする。次いで、ハイブリドーマクローンを、ＣＤ４０と結合できる抗体を分泌する細胞について当技術分野で公知の方法によってアッセイする。一般に、高レベルの抗体を含有する腹水を、陽性ハイブリドーマクローンを用いてマウスを免疫処置することによって作製できる。
【０１９９】
別の実施形態では、抗体を産生する不死化されたハイブリドーマは、免疫処置された動物から調製され得る。免疫処置後、当技術分野で周知であるように、動物を屠殺し、脾臓Ｂ細胞を不死化された骨髄腫細胞と融合する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前掲参照のこと。好ましい一実施形態では、骨髄腫細胞は、免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない（非分泌細胞株）。融合し、抗生物質選択した後、ハイブリドーマを、ＣＤ４０またはその部分またはＣＤ４０を発現する細胞を使用してスクリーニングする。好ましい実施形態では、最初のスクリーニングを、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、好ましくはＥＬＩＳＡを使用して実施する。ＥＬＩＳＡスクリーニングの例は、参照により本明細書に組み込む、ＷＯ００／３７５０４に提供されている。
【０２００】
抗ＣＤ４０抗体を産生するハイブリドーマを選択し、クローニングし、以下にさらに論じられる、ロバストなハイブリドーマ増殖、高い抗体産生および望ましい抗体特徴を含めた望ましい特徴についてさらにスクリーニングする。ハイブリドーマは、培養され、同系動物における免疫系を欠く動物（例えば、ヌードマウス）においてインビボで、または細胞培養においてインビトロで、拡大され得る。ハイブリドーマを選択、クローニングおよび拡大する方法は、当業者に周知である。
【０２０１】
好ましい一実施形態では、ハイブリドーマは、上記されるマウスハイブリドーマである。別の好ましい実施形態では、ハイブリドーマは、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシまたはウマなどの非ヒト、非マウス種において産生される。別の実施形態では、ハイブリドーマは、ヒトハイブリドーマであり、これでは、ヒト非分泌性骨髄腫が、抗ＣＤ４０抗体を発現するヒト細胞と融合される。
【０２０２】
特異的エピトープを認識する抗体断片は、公知の技術によって作製され得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を製造する）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を製造する）などの酵素を使用する免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断によって製造され得る。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨＩドメインを含有する。
【０２０３】
２．ＳＬＡＭを使用する抗ＣＤ４０モノクローナル抗体
本発明の別の態様では、組換え抗体は、米国特許第５，６２７，０５２号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０２５５１およびＢａｂｃｏｃｋ、Ｊ．Ｓ．ら（１９９６年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８４３−７８４８頁）に記載される、選択されたリンパ球抗体法（ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｅｔｈｏｄ）（ＳＬＡＭ）と当技術分野で呼ばれる手順を使用して、単一の、単離されたリンパ球から作製される。この方法では、第１節に記載される、目的の抗体を分泌する単一細胞、例えば、免疫処置された動物のいずれか１種から得られたリンパ球が、抗原特異的溶血プラークアッセイを使用してスクリーニングされる。ここでは、抗原ＣＤ４０、ＣＤ４０のサブユニットまたはその断片が、ビオチンなどのリンカーを使用してヒツジ赤血球にカップリングされ、ＣＤ４０に対して特異性を有する抗体を分泌する単一の細胞を同定するために使用される。目的の抗体を分泌する細胞を同定した後、重鎖および軽鎖可変領域ｃＤＮＡが逆転写酵素ＰＣＲによって細胞からレスキューされ、次いで、これらの可変領域が、ＣＯＳまたはＣＨＯ細胞などの哺乳動物宿主細胞において、適当な免疫グロブリン定常領域（例えば、ヒト定常領域）との関連で発現され得る。インビボで選択されたリンパ球から得られた増幅された免疫グロブリン配列を用いてトランスフェクトされた宿主細胞は、例えば、トランスフェクトされた細胞をパニングし、ＣＤ４０に対する抗体を発現する細胞を単離することによって、インビトロでさらなる分析および選択を受け得る。増幅された免疫グロブリン配列は、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／２９１３１およびＰＣＴ公開番号ＷＯ００／５６７７２に記載されているインビトロ親和性成熟法などによってインビトロでさらに操作され得る。
【０２０４】
３．トランスジェニック動物を使用する抗ＣＤ４０モノクローナル抗体
本発明の別の実施形態では、抗体を、ＣＤ４０抗原を用いてヒト免疫グロブリン遺伝子座の一部またはすべてを含む非ヒト動物を免疫処置することによって産生する。好ましい一実施形態では、非ヒト動物は、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウス（ヒト免疫グロブリン遺伝子座の大きな断片を含みかつマウス抗体産生に欠陥のある、操作されたマウス株）である。例えば、Ｇｒｅｅｎら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１頁（１９９４年）および米国特許第５，９１６，７７１号、同５，９３９，５９８号、同５，９８５，６１５号、同５，９９８，２０９号、同６，０７５，１８１号、同６，０９１，００１号、同６，１１４，５９８号、および同６，１３０，３６４号参照のこと。１９９１年７月２５日に発行されたＷＯ９１／１０７４１、１９９４年２月３日に発行されたＷＯ９４／０２６０２、どちらも１９９６年１０月３１日に発行されたＷＯ９６／３４０９６およびＷＯ９６／３３７３５、１９９８年４月２３日に発行されたＷＯ９８／１６６５４、１９９８年６月１１日に発行されたＷＯ９８／２４８９３、１９９８年１１月１２日に発行されたＷＯ９８／５０４３３、１９９９年９月１０日に発行されたＷＯ９９／４５０３１、１９９９年１０月２１日に発行されたＷＯ９９／５３０４９、２０００年２月２４日に発行されたＷＯ００／０９５６０、および２０００年６月２９日に発行されたＷＯ００／３７５０４も参照のこと。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウスは、完全ヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒトＭａｂを作製する。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウスは、ヒト重鎖遺伝子座およびｘ軽鎖遺伝子座のメガベースサイズの、生殖系列立体配置ＹＡＣ断片の導入によってヒト抗体レパートリーのおよそ８０％を含有する。その開示内容を参照により本明細書に組み込む、Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６頁（１９９７年）、ＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  １８８：４８３−４９５頁（１９９８年）参照のこと。
【０２０５】
４．組換え抗体ライブラリーを使用する抗ＣＤ４０モノクローナル抗体
本発明の抗体を作製するためにインビトロ法も使用され得、ここで、所望の結合特異性を有する抗体を同定するために、抗体ライブラリーがスクリーニングされる。このような組換え抗体ライブラリーをスクリーニングする方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｌａｎｄｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１８６１９；Ｄｏｗｅｒら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１７２７１；Ｗｉｎｔｅｒら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２０７９１；Ｍａｒｋｌａｎｄら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１５６７９；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０１０４７；Ｇａｒｒａｒｄら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０９６９０；Ｆｕｃｈｓら（１９９１年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２頁；Ｈａｙら（１９９２年）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、３：８１−８５頁；Ｈｕｓｅら（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１頁；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらＮａｔｕｒｅ（１９９０年）  ３４８：５５２−５５４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３年）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４頁；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９−８９６頁；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８頁；Ｇｒａｍら（１９９２年）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０頁；Ｇａｒｒａｄら（１９９１年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７頁；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１年）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７頁；ならびにＢａｒｂａｓら（１９９１年）  ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２頁、米国特許出願公開第２００３０１８６３７４号、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／２９１３１に記載される方法が挙げられ、各々の開示内容を参照により本明細書に組み込む。
【０２０６】
組換え抗体ライブラリーは、ＣＤ４０または細胞外ドメインなどのＣＤ４０の一部を用いて免疫処置した被験体に由来するものであり得る。または、組換え抗体ライブラリーは、ヒトＣＤ４０を用いて免疫処置されていないヒト被験体から得たヒト抗体ライブラリーなど、ナイーブな被験体すなわち、ＣＤ４０を用いて免疫処置されていないものに由来し得る。本発明の抗体は、ヒトＣＤ４０を含むペプチドを用いて組換え抗体ライブラリーをスクリーニングし、それによってＣＤ４０を認識する抗体を選択することによって選択される。このようなスクリーニングおよび選択を実施する方法は、前述の段落における参考文献に記載されるなど、当技術分野で周知である。特定のＫｏｆｆ速度定数でヒトＣＤ４０から解離するものなど、ｈＣＤ４０に対して特定の結合親和性を有する本発明の抗体を選択するために、表面プラズモン共鳴の当技術分野で公知の方法が使用されて、所望のＫｏｆｆ速度定数を有する抗体が選択され得る。特定のＩＣ５０を有するものなど、ｈＣＤ４０に対して特定の中和活性を有する本発明の抗体を選択するために、ｈＣＤ４０活性の阻害を評価するための当技術分野で公知の標準法が使用され得る。
【０２０７】
一態様では、本発明は、ヒトＣＤ４０と結合する単離された抗体またはその抗原結合部分に関する。好ましくは、抗体は、中和抗体である。種々の実施形態では、抗体は、組換え抗体またはモノクローナル抗体である。
【０２０８】
例えば、本発明の抗体はまた、当技術分野で公知の種々のファージディスプレイ法を使用して作製され得る。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子の表面にディスプレイされる。特に、このようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインをディスプレイするために利用され得る。目的の抗原と結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば、標識された抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕獲された抗原を使用して選択または同定され得る。これらの方法において使用されるファージは、通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換えによって融合された、Ｆａｂ、Ｆｖまたはジスルフィドによって安定化されたＦｖ抗体ドメインを有するファージから発現されるｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む糸状ファージである。本発明の抗体を作製するために使用され得るファージディスプレイ法の例として、それぞれを参照によりその全体を本明細書に組み込む、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０頁（１９９５年）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６頁（１９９５年）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４：９５２−９５８頁（１９９４年）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ  １８７  ９−１８頁（１９９７年）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０頁（１９９４年）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；および米国特許第５，６９８，４２６号；同５，２２３，４０９号；同５，４０３，４８４号；同５，５８０，７１７号；同５，４２７，９０８号；同５，７５０，７５３号；同５，８２１，０４７号；同５，５７１，６９８号；同５，４２７，９０８号；同５，５１６，６３７号；同５，７８０，２２５号；同５，６５８，７２７号；同５，７３３，７４３号；および同５，９６９，１０８号に開示されるものが挙げられる。
【０２０９】
上記の参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージから抗体コーディング領域が単離され、ヒト抗体または任意のその他の所望の抗原結合断片を含む全抗体を作製するために使用され、例えば、以下に詳細に記載される哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含めた任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片を組換え製造するための技術も、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９頁（１９９２年）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４頁（１９９５年）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３頁（１９８８年）（前記文献を、参照によりその全体を本明細書に組み込む）に開示されるものなど、当技術分野で公知の方法を使用して使用され得る。一本鎖Ｆｖおよび抗体を製造するために使用され得る技術の例として、米国特許第４，９４６，７７８号および同５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８頁（１９９１年）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９頁（１９９３年）；およびＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４１頁（１９８８年）に記載されるものが挙げられる。
【０２１０】
ファージディスプレイによる組換え抗体ライブラリーのスクリーニングの代替として、大きなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための当技術分野で公知のその他の方法論が、本発明の二重特異性抗体の同定に適用され得る。代替発現系の１つの種類として、ＳｚｏｓｔａｋおよびＲｏｂｅｒｔｓによるＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／３１７００に、ならびにＲｏｂｅｒｔｓ、Ｒ．Ｗ．およびＳｚｏｓｔａｋ、Ｊ．Ｗ．（１９９７年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１２２９７−１２３０２頁に記載される、組換え抗体ライブラリーが、ＲＮＡ−タンパク質融合物として発現されるものがある。この系では、ピューロマイシン（ペプチジルアクセプター抗生物質）を３’末端に保持する合成ｍＲＮＡのインビトロ翻訳によって、ｍＲＮＡとそれがコードするペプチドまたはタンパク質との間の共有結合融合物が作製される。したがって、特異的ｍＲＮＡは、コードされたペプチドまたはタンパク質、例えば、抗体またはその部分の特性、例えば、抗体またはその部分の二重特異性抗原との結合に基づいて、ｍＲＮＡの複雑な混合物（例えば、コンビナトリアルライブラリー）から濃縮され得る。このようなライブラリーのスクリーニングから回収される抗体またはその部分をコードする核酸配列は、上記の組換え手段によって（例えば、哺乳動物宿主細胞において）発現され得、さらに、突然変異が最初に選択された配列（複数可）中に導入されているｍＲＮＡ−ペプチド融合物の、スクリーニングのさらなるラウンドによって、または上記の組換え抗体のインビトロでの親和性成熟のためのその他の方法によってのいずれかで、さらなる親和性成熟に付され得る。
【０２１１】
別のアプローチでは、本発明の抗体はまた、当技術分野で公知の酵母ディスプレイ法を使用して作製され得る。酵母ディスプレイ法では、抗体ドメインを酵母細胞壁に繋ぎ止め、それらを酵母の表面上にディスプレイするために遺伝学的方法が使用される。特に、このような酵母は、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインをディスプレイするために利用され得る。本発明の抗体を作製するために使用され得る酵母ディスプレイ法の例として、参照により本明細書に組み込むＷｉｔｔｒｕｐら（米国特許第６，６９９，６５８号）に開示されるものが挙げられる。
【０２１２】
５．組換えＣＤ４０抗体の製造
本発明の抗体は、当技術分野で公知のいくつかの技術のいずれかによって製造され得る。例えば、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクター（複数可）が、標準技術によって宿主細胞中にトランスフェクトされている宿主細胞からの発現。用語「トランスフェクション」の種々の形態は、外因性ＤＮＡを原核生物または真核生物の宿主細胞に導入するためによく使用されるさまざまな技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含するものとする。原核生物または真核生物の宿主細胞のいずれかにおいて、本発明の抗体を発現することが可能であるが、真核細胞における抗体の発現が好ましく、哺乳動物宿主細胞においてが最も好ましいが、これは、このような真核細胞（特に、哺乳動物細胞）は、原核細胞よりも、適切に折り畳まれた免疫学的に活性な抗体を組み立て、分泌する可能性が高いためである。
【０２１３】
本発明の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳動物宿主細胞として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、Ｒ．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎおよびＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２年）  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １５９：６０１−６２１頁に記載されたＤＨＦＲ選択マーカーとともに使用される、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ（１９８０年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０頁に記載されたｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現、より好ましくは、宿主細胞が増殖される培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって製造される。抗体は、標準タンパク質精製法を使用して培養培地から回収され得る。
【０２１４】
宿主細胞はまた、機能的抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ分子を製造するために使用され得る。上記の手順に対する変法は、本発明の範囲内にあるということは理解されよう。例えば、本発明の抗体の軽鎖および／または重鎖のいずれかの機能的断片をコードするＤＮＡを用いて、宿主細胞をトランスフェクトすることが望ましいものであり得る。組換えＤＮＡ技術はまた、目的の抗原との結合にとって必須ではない、軽鎖および重鎖のいずれかまたは両方をコードするＤＮＡの一部またはすべてを除去するためにも使用され得る。このような末端切断型ＤＮＡ分子から発現された分子もまた、本発明の抗体によって包含される。さらに、標準化学的架橋法によって本発明の抗体を第２の抗体に架橋することによって、一方の重鎖および一方の軽鎖が本発明の抗体でありもう一方の重鎖および軽鎖が対象の抗原以外の抗原に対して特異的である二機能性抗体も製造され得る。
【０２１５】
本発明の抗体またはその抗原結合部分を組換え発現するための好ましい系では、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターが、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションによってｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入される。組換え発現ベクター内では、抗体重鎖および軽鎖遺伝子は、各々、この遺伝子の高レベルの転写を駆動するためにＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントに作動可能に連結されている。組換え発現ベクターはまた、メトトレキサート選択／増幅を使用してベクターでトランスフェクトされているＣＨＯ細胞の選択を可能にするＤＨＦＲ遺伝子を保持する。選択された形質転換体宿主細胞は、抗体重鎖および軽鎖の発現を可能にするよう培養され、無傷の抗体が培養培地から回収される。組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培養培地から抗体を回収するために、標準分子生物学技術が使用される。さらに、本発明は、本発明の宿主細胞を、本発明の組換え抗体が合成されるまで適した培養培地中で培養することによって、本発明の組換え抗体を合成する方法を提供する。この方法は、培養培地から組換え抗体を単離することをさらに含み得る。
【０２１６】
本発明の別の実施形態は、グリコシル化抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここでは、抗体またはその抗原結合部分は、１個以上の炭水化物残基を含む。新生インビボタンパク質製造は、翻訳後修飾として知られるさらなるプロセシングを受け得る。特に、糖（グリコシル）残基が、酵素的に添加され得る（グリコシル化として知られるプロセス）。共有結合によって連結しているオリゴ糖側鎖を有する得られたタンパク質は、グリコシル化タンパク質または糖タンパク質として知られる。抗体は、Ｆｃドメインならびに可変ドメイン中に１個以上の炭水化物残基を有する糖タンパク質である。Ｆｃドメイン中の炭水化物残基は、Ｆｃドメインのエフェクター機能に対して重要な効果を有するが、抗体の抗原結合または半減期に対しては最小の効果しか有さない（Ｒ．Ｊｅｆｆｅｒｉｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．  ２１（２００５年）、１１−１６頁）。対照的に、可変ドメインのグリコシル化は、抗体の抗原結合活性に対して効果を有し得る。可変ドメイン中のグリコシル化は、おそらくは立体障害のために、抗体結合親和性に対して負の効果を有するか（Ｃｏ、Ｍ．Ｓ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３年）  ３０：１３６１−１３６７頁）、または抗原に対する親和性の増大をもたらし得る（Ｗａｌｌｉｃｋ、Ｓ．Ｃ．ら．、Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８８年）  １６８：１０９９−１１０９頁；Ｗｒｉｇｈｔ、Ａ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９１年）  １０：２７１７−２７２３頁）。
【０２１７】
本発明の一態様は、抗体またはその抗原結合部分のＯ−またはＮ−結合型グリコシル化部位が突然変異されているグリコシル化部位突然変異体の作製を対象とする。当業者ならば、標準的な周知の技術を使用してこのような突然変異体を作製できる。生物活性を保持するが、結合活性が増大または低下しているグリコシル化部位突然変異体が、本発明の別の目的である。
【０２１８】
さらに別の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合部分のグリコシル化が修飾される。例えば、脱グリコシル化抗体が作製され得る（すなわち、抗体がグリコシル化を欠く）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増大させるよう変更され得る。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つ以上の部位を変更することによって達成され得る。例えば、１つ以上の可変領域グリコシル化部位の除去によりその部位でのグリコシル化を起こさせない、１つ以上のアミノ酸置換がなされ得る。このような脱グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増大させ得る。このようなアプローチは、このそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込む、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００３０１６４６６Ａ２および米国特許第５，７１４，３５０号および同第６，３５０，８６１号にさらに詳細に記載されている。
【０２１９】
さらに、またはあるいは、フコシル残基の量が低減されている低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体または二分するＧｌｃＮＡｃ構造が増大している抗体などの、変更された種類のグリコシル化を有する本発明の修飾された抗体が作製され得る。このように変更されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能を高めると実証されている。このような炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化機構が変更された宿主細胞において抗体を発現させることによって達成され得る。グリコシル化機構が変更された細胞は、当技術分野で記載されており、本発明の組換え抗体を発現させ、それによって、グリコシル化が変更された抗体を製造する宿主細胞として使用され得る。例えば、このそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込む、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら（２００２年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０頁；Ｕｍａｎａら（１９９９年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１頁ならびに欧州特許第ＥＰ  １，１７６，１９５号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／０３５８３５；ＷＯ９９／５４３４２８０を参照のこと。
【０２２０】
タンパク質グリコシル化は、目的のタンパク質のアミノ酸配列ならびにタンパク質が発現される宿主細胞に応じて変わる。種々の生物が、種々のグリコシル化酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ）を産生し、入手可能な種々の基質（ヌクレオチド糖）を有し得る。このような要因のために、タンパク質グリコシル化パターンおよびグリコシル残基の組成物は、特定のタンパク質が発現される宿主系に応じて異なり得る。本発明において有用なグリコシル残基として、それだけには限らないが、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、ｎ−アセチルグルコサミンおよびシアル酸が挙げられる。好ましくは、グリコシル化抗体またはその抗原結合部分は、グリコシル化パターンがヒトであるようなグリコシル残基を含む。
【０２２１】
異なるタンパク質グリコシル化が、異なるタンパク質特徴をもたらし得ることは、当業者にとって公知である。例えば、酵母などの微生物宿主において製造され、酵母内在性経路を利用してグリコシル化された治療用タンパク質の有効性は、ＣＨＯ細胞株などの哺乳動物細胞において発現された同一タンパク質のものと比較して、低減され得る。このような糖タンパク質はまた、ヒトにおいて免疫原性である場合があり、投与後のインビボ半減期の減少を示し得る。ヒトおよびその他の動物における特定の受容体は、特異的なグリコシル残基を認識し、血流からのタンパク質の迅速なクリアランスを促進し得る。その他の有害作用として、タンパク質フォールディング、溶解度、プロテアーゼに対する感受性、輸送、運搬、区画化、分泌、その他のタンパク質または因子による認識、抗原性またはアレルゲン性における変化が挙げられる。したがって、臨床医は、特定の組成およびグリコシル化のパターン、例えば、ヒト細胞においてまたは意図される対象動物の種特異的細胞において産生されるものと同一のまたは少なくとも同様のグリコシル化組成およびパターンを有する治療用タンパク質を好み得る。
【０２２２】
宿主細胞のものとは異なるグリコシル化タンパク質を発現することは、異種グリコシル化酵素を発現するよう宿主細胞を遺伝的に修飾することによって達成され得る。臨床医は、当技術分野で公知の技術を使用して、ヒトタンパク質グリコシル化を示す抗体またはその抗原結合部分を作製し得る。例えば、酵母株は、天然に存在しないグリコシル化酵素を発現するよう遺伝的に修飾されており、その結果、これらの酵母株において産生されたグリコシル化されたタンパク質（糖タンパク質）は、動物細胞、特に、ヒト細胞のものと同一であるタンパク質グリコシル化を示す（米国特許公開第２００４００１８５９０号および同２００２０１３７１３４号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００５１００５８４  Ａ２）。
【０２２３】
本発明はまた、抗体またはその抗原結合部分に加えて、このような本発明の抗体またはその抗原結合部分に特異的な抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体を対象とする。抗Ｉｄ抗体とは、一般に、別の抗体の抗原結合領域と関連している独特の決定基を認識する抗体である。抗Ｉｄは、抗体またはその抗原結合部分またはそのＣＤＲ含有領域を用いて動物を免疫処理することによって調製され得る。免疫処理された動物は、免疫化抗体のイディオタイプの決定基を認識し、それに応じて抗Ｉｄ抗体を産生する。抗Ｉｄ抗体はまた、さらに別の動物において免疫応答を誘発する「免疫原」として使用され得、いわゆる抗抗Ｉｄ抗体を産生する。
【０２２４】
さらに、目的のタンパク質は、種々のグリコシル化酵素を発現するよう遺伝子操作された結果、ライブラリーのメンバー宿主細胞が、変異体グリコシル化パターンを有する目的のタンパク質を産生する、宿主細胞のライブラリーを使用して発現され得るということは当業者によって理解されよう。次いで、臨床医は、特定の新規グリコシル化パターンを有する目的のタンパク質を選択および単離し得る。好ましくは、特に選択された新規グリコシル化パターンを有するタンパク質は、生物学的特性の改善または変更を示す。
【０２２５】
ＩＩＩ．アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の使用
本発明の抗ヒトＣＤ４０抗体またはその一部の、ヒトＣＤ４０と結合する能力を考慮すると、これらは、酵素連結免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または組織の免疫組織化学的検査などの従来のイムノアッセイを使用してヒトＣＤ４０（例えば、血清または血漿などの生体試料中の）を検出するために使用され得る。本発明は、生体試料中のヒトＣＤ４０を検出するための方法であって、生体試料を本発明の抗体または抗体部分と接触させ、ヒトＣＤ４０と結合した抗体（または抗体部分）または結合していない抗体（または抗体部分）のいずれかを検出して、それにより、生体試料中のヒトＣＤ４０を検出することを含む方法を提供する。抗体は、結合した抗体または結合していない抗体の検出を容易にするために検出可能な物質を用いて直接または間接的に標識される。適した検出可能な物質として、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質が挙げられる。適した酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適した補欠分子族複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適した蛍光物質の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例として、ルミノールが挙げられ；適した放射性物質の例として、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏまたは１５３Ｓｍが挙げられる。
【０２２６】
抗体を標識する代わりに、ヒトＣＤ４０は、生体液中で、検出可能な物質で標識されたｒｈＣＤ４０標準物質および標識されていない抗ヒトＣＤ４０Ｒ抗体を利用する競合イムノアッセイによってアッセイされ得る。このアッセイでは、生体試料、標識されたｒｈＣＤ４０標準物質および抗ヒトＣＤ４０抗体を組み合わせ、標識されていない抗体と結合した標識されたｒｈＣＤ４０標準物質の量が決定される。生体試料中のヒトＣＤ４０の量は、抗ＣＤ４０抗体と結合した標識されたｒｈＣＤ４０標準物質の量に反比例する。同様に、ヒトＣＤ４０は、生体液中で、検出可能な物質で標識されたｒｈＣＤ４０標準物質および標識されていない抗ヒトＣＤ４０抗体を利用する競合イムノアッセイによってもアッセイされ得る。
【０２２７】
本発明の抗体および抗体部分は、インビトロおよびインビボの両方で、ヒトＣＤ４０活性を中和できることが好ましい。したがって、本発明のこのような抗体および抗体部分は、例えば、ｈＣＤ４０を含有する細胞培養物において、本発明の抗体が交差反応するＣＤ４０を有する、ヒト被験体において、またはその他の哺乳動物被験体においてｈＣＤ４０活性を阻害するために使用され得る。一実施形態では、本発明は、ｈＣＤ４０を、本発明の抗体または抗体部分と接触させ、その結果、ｈＣＤ４０活性が阻害されることを含む、ｈＣＤ４０活性を阻害する方法を提供する。例えば、ｈＣＤ４０を含有する、または含有すると疑われる細胞培養では、培養物においてｈＣＤ４０活性を阻害するために、本発明の抗体または抗体部分が培養培地に添加され得る。
【０２２８】
別の実施形態では、本発明は、被験体において、ｈＣＤ４０活性を低下させる方法を提供し、これは、ＣＤ４０活性が有害である疾患または障害を患っている被験体において有利である。本発明は、このような疾患または障害を患っている被験体においてＣＤ４０活性を低下させる方法を提供し、この方法は、被験体に、本発明の抗体または抗体部分を投与し、その結果、被験体におけるＣＤ４０活性が低下されることを含む。好ましくは、ＣＤ４０は、ヒトＣＤ４０であり、被験体は、ヒト被験体である。または、被験体は、本発明の抗体が結合できるＣＤ４０を発現する哺乳動物であり得る。さらに、被験体は、ＣＤ４０が導入されている（例えば、ＣＤ４０の投与によってまたはＣＤ４０導入遺伝子の発現によって）哺乳動物であり得る。本発明の抗体は、治療目的でヒト被験体に投与され得る。さらに、本発明の抗体は、獣医学的目的で、またはヒト疾患の動物モデルとして、抗体が結合できるＣＤ４０を発現する非ヒト哺乳動物に投与され得る。後者に関して、このような動物モデルは、本発明の抗体の治療効力を評価するのに有用であり得る（例えば、投与量のおよび投与の経時的推移の試験）。
【０２２９】
本明細書において、用語「ＣＤ４０活性が有害である障害」とは、疾患および他の障害を含むものとし、ここで、この障害は、それを患っている被験体におけるＣＤ４０活性の存在が、この障害の病態生理を担うこともしくはこの障害の悪化に寄与する一因であることがわかっているかまたはその疑いがある障害である。したがって、ＣＤ４０活性が有害である障害とは、ＣＤ４０活性の低下が、症状および／または障害の進行を軽減すると期待される障害である。このような障害は、障害を患っている被験体の体液におけるＣＤ４０濃度の増大（例えば、被験体の血清、血漿、滑液などにおける、ＣＤ４０濃度の増大）によって証明され得、これは、例えば上記の抗ＣＤ４０抗体を使用して、検出され得る。本発明の抗体およびその変異体、またはその抗原結合断片を用いて治療され得る障害の非限定的な例として、本発明の抗体の医薬組成物に関する下の節おいて考察されている障害が挙げられる。例えば、適した障害として、それだけには限らないが、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円板状ループス、ループス腎炎、サルコイドーシス、若年性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、ライター症候群、強直性脊椎炎、痛風性関節炎、臓器または組織移植片の拒絶反応、移植片対宿主病、多発性硬化症、高ＩｇＥ症候群、結節性多発性動脈炎、原発性胆汁性肝硬変、炎症性腸疾患、クローン病、セリアック病（グルテン過敏性腸症）、自己免疫性肝炎、悪性貧血、自己免疫性溶血性貧血、乾癬、強皮症、重症筋無力症、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性甲状腺炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、免疫複合体病、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、多発性筋炎および皮膚筋炎、寒冷グロブリン血症、血栓溶解、心筋症、尋常性天疱瘡、間質性肺線維症、サルコイドーシス、１型糖尿病および２型糖尿病、１型、２型、３型および４型遅延型過敏症、アレルギーまたはアレルギー性障害、喘息、チャーグ・ストラウス症候群（アレルギー性肉芽腫症）、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎および刺激性接触皮膚炎、蕁麻疹、ＩｇＥ依存性アレルギー、アテローム性動脈硬化症、血管炎、特発性炎症性筋疾患、溶血性疾患、アルツハイマー病および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチーが挙げられる。特定の実施形態では、疾患または障害は、慢性炎症性障害である。特定の実施形態では、ＣＤ４０活性が有害である障害は、それだけには限らないが、クローン病または潰瘍性大腸炎を含めた炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。
【０２３０】
その他の実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体または抗原結合部分は、それだけには限らないが、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、化膿性汗腺炎、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、乾癬、強直性脊椎炎およびクローン病を含めた、ＴＮＦα活性が有害である障害を、治療するために使用される。一実施形態では、ＴＮＦα活性が有害である障害は、ぶどう膜炎である。
【０２３１】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を有するヒト被験体を治療するために使用される。
【０２３２】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、潰瘍性大腸炎を治療するために使用される。
【０２３３】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、クローン病を治療するために使用される。
【０２３４】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を治療するために使用される。
【０２３５】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、サルコイドーシスを治療するために使用される。
【０２３６】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、若年性関節炎を有するヒト被験体を治療するために使用される。
【０２３７】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、関節リウマチを治療するために使用される。
【０２３８】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、乾癬性関節炎を治療するために使用される。
【０２３９】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、強直性脊椎炎を有するヒト被験体を治療するために使用される。
【０２４０】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、化膿性汗腺炎を治療するために使用される。
【０２４１】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、ぶどう膜炎を治療するために使用される。
【０２４２】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、シェーグレン症候群を治療するために使用される。
【０２４３】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、乾癬を治療するために使用される。
【０２４４】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、アトピー性皮膚炎を治療するために使用される。
【０２４５】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、強皮症を治療するために使用される。
【０２４６】
本発明の抗ＣＤ４０  ｍＡｂｓは、自然免疫応答および適応免疫応答の両方におけるＣＤ４０の中心的な役割に起因して、生物学的にナイーブな患者および抗ＴＮＦ不適応答者集団のどちらの治療に関しても治療可能性を有する。本発明は、消化管における慢性炎症を維持する、ＴＮＦおよびＩＬ−２３産生ならびに接着／共刺激分子発現のようなＣＤ４０シグナル伝達抑制分子経路を、阻害することができる治療を、提供する。抗ＴＮＦで治療されたクローン病患者の発現プロファイリングに基づいて、抗ＣＤ４０を用いた治療は、抗ＴＮＦ応答者集団を越えて、より広範な区分のクローン病患者の治療に広がる治療可能性を有し得る。特定の実施形態では、本発明は、抗ＴＮＦ療法に応答できないＩＢＤ患者の下位集団を治療する方法を提供する。そのようなＩＢＤ患者は、クローン病または潰瘍性大腸炎を有し得、例えば、それだけには限らないが、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴルまたはゴリムマブのようなＴＮＦα阻害剤を用いた治療に対して応答できなかったまたは応答が限られていた患者である。本明細書に記載の抗ＣＤ４０アンタゴニスト抗体は、クローン病または潰瘍性大腸炎を有するＴＮＦ非応答者の治療に使用され得る。特定の実施形態では、本発明は、治療患者、例えば、中程度から重度に活動性のクローン病を有し、抗ＴＮＦ非応答者である成体患者を治療する方法を包含する。
【０２４７】
本発明の抗体またはその抗原結合部分は、このような疾患を治療するために単独で、または組み合わせて使用され得る。本発明の抗体またはその抗原結合部分は、単独でまたはさらなる薬剤、例えば、治療薬と組み合わせて使用される場合があり、前記のさらなる薬剤は、その意図される目的のために当業者によって選択されるということは理解されなくてはならない。例えば、さらなる薬剤は、本発明の抗体によって治療されている疾患または状態を治療するのに有用であると技術分野で認識されている治療薬であり得る。さらなる薬剤はまた、治療用組成物に有益な性質を付与する薬剤、例えば、組成物の粘性に影響を及ぼす薬剤であり得る。本発明内に含まれる組合せは、その意図される目的にとって有用な組合せであるということは理解されなければならない。以下に示された薬剤は例示目的であって、制限であるとは意図されない。本発明の一部である組合せは、本発明の抗体および以下の一覧から選択される少なくとも１種のさらなる薬剤であり得る。組合せはまた、形成された組成物がその意図される機能を遂行し得るようなものであれば、２種以上のさらなる薬剤、例えば、２種または３種のさらなる薬剤を含み得る。
【０２４８】
併用療法は、１種以上のさらなる治療薬、例えば、本明細書にさらに記載されている１種以上のサイトカインおよび増殖因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症薬（例えば、全身性抗炎症薬）、抗線維化薬、代謝阻害剤、酵素阻害剤および／または細胞毒性剤または細胞増殖抑制薬剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、免疫調節性薬剤、遺伝子療法のためのベクター、アルキル化剤、抗血管新生剤、代謝拮抗薬、ホウ素含有薬剤、化学保護剤、ホルモン、抗ホルモン剤、コルチコステロイド、光活性治療薬、オリゴヌクレオチド、放射性核種薬剤、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、または放射線増感剤と一緒に製剤化され、および／またはそれと同時投与される１種以上のＣＤ４０アンタゴニスト、例えば抗ＣＤ４０抗体またはその断片を含み得る。
【０２４９】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を治療するために第２の薬剤と組み合わせて使用される。特定の実施形態では、第２の薬剤は、メサラミン、バルサラジド、アザチオプリン、６−ＭＰ、メトトレキサート、インフリキシマブ、セルトリズマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、ナタリズマブ、ベドリズマブ、ウステキヌマブまたはこれらの組合せである。
【０２５０】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、ＳＬＥを治療するために第２の薬剤と組み合わせて使用され、第２の薬剤は、ニトロペースト（ｎｉｔｒｏｐａｓｔｅ）／ニトログリセリン、ニフェジピン、シルデナフィル、タダラフィルまたはこれらの組合せである。
【０２５１】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、ＳＬＥを治療するために第２の薬剤と組み合わせて使用され、第２の薬剤は、コルチコステロイド、内在性ステロイド産生物質、ＮＳＡＩＤ、抗炎症剤、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、免疫抑制剤、抗凝固薬またはこれらの組合せである。
【０２５２】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、ＳＬＥを治療するために、コルチコステロイドと組み合わせて使用される。使用することができるコルチコステロイドの例として、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾンまたはこれらの組合せが挙げられる。
【０２５３】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、ＳＬＥを治療するために、内在性ステロイド産生をもたらす薬剤、例えばコルチコトロピン（Ａｃｔｈａｒ）と組み合わせて使用される。
【０２５４】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、ＳＬＥを治療するために、局所または注射療法と組み合わせて使用される。そのような療法の例として、それだけには限らないが、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、ピメクロリムスクリーム、タクロリムス軟膏、イミキモドまたはこれらの組合せが挙げられる。
【０２５５】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、ＳＬＥを治療するために非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）と組み合わせて使用される。併用療法において使用することができるＮＳＡＩＤの例として、それだけには限らないが、インドメタシン、ナブメトン、セレコキシブ、イブプロフェン、ナプロキセン、ジクロフェナクまたはこれらの組合せが挙げられる。
【０２５６】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、ＳＬＥを治療するために抗炎症薬と組み合わせて使用される。さらなる実施形態では、抗炎症薬は、アセトアミノフェンおよび／またはサリチル酸塩である。
【０２５７】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、ＳＬＥを治療するために疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）と組み合わせて使用される。ＤＭＡＲＤの例として、それだけには限らないが、ヒドロキシクロロキン（Ｐｌａｑｕｅｎｉｌ）、クロロキン、メトトレキサート（Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ）、レフルノミド（Ａｒａｖａ）、スルファサラジンまたはこれらの組合せが挙げられる。
【０２５８】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、ベリムマブ（Ｂｅｎｌｙｓｔａ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）、静脈内Ｉｇまたはこれらの組合せと組み合わせて使用される。
【０２５９】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、ＳＬＥを治療するために免疫抑制剤と組み合わせて使用される。免疫抑制剤の例として、それだけには限らないが、アザチオプリン（Ｉｍｕｒａｎ）、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ）、シクロスポリン、タクロリムスおよびミコフェノール酸が挙げられる。
【０２６０】
一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分、例えばＡｂ１０２は、ＳＬＥを治療するために抗凝固剤と組み合わせて使用される。抗凝固剤の例として、それだけには限らないが、アスピリン、ヘパリン、ワルファリンおよびエノキサパリン（Ｌｏｖｅｎｏｘ）が挙げられる。
【０２６１】
１種以上のＣＤ４０アンタゴニスト、例えば、抗ＣＤ４０抗体またはその断片と同時投与されるかおよび／または共に製剤化され得る好ましいさらなる治療剤のさらなる例。そのような組合せは、本明細書に記載のＣＤ４０関連障害を治療するために使用され得る。１種以上の抗ＣＤ４０抗体またはその断片と同時投与され得、および／または一緒に製剤化され得る治療薬のさらなる例として、とりわけ、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、ＴＮＦ受容体、例えば、ｐ５５またはｐ７５ヒトＴＮＦ受容体またはその誘導体、例えば、７５ｋＤ  ＴＮＦＲ−ＩｇＧ（７５ｋＤ  ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質、ＥＮＢＲＥＬ）の可溶性断片）；ＴＮＦ酵素アンタゴニスト、例えば、ＴＮＦ変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤；ムスカリン性受容体アンタゴニスト；ＴＧＦ−ベータアンタゴニスト；インターフェロンガンマ；ピルフェニドン；化学療法剤、例えば、メトトレキセート、レフルノミド、またはシロリムス（ラパマイシン）またはその類似体、例えばＣＣＩ−７７９；ＣＯＸ２およびｃＰＬＡ２阻害剤；非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；免疫調節物質；ｐ３８阻害剤、ＴＰＬ−２、ＭＫ−２およびＮＦｋＢ阻害剤のうちの１つ以上が挙げられる。
【０２６２】
その他の好ましい組合せは、サイトカイン抑制性抗炎症薬（複数可）（ＣＳＡＩＤ）；その他のヒトサイトカインまたは増殖因子、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−３１、インターフェロン、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦおよびエンドセリン−１、ならびにこれらのサイトカインおよび増殖因子の受容体に対する抗体またはアンタゴニストである。本発明の抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ９０、ＣＴＬＡなどの細胞表面分子またはＣＤ１５４（ｇｐ３９またはＣＤ４０Ｌ）を始めとするそのリガンドに対する抗体と組み合わせられ得る。
【０２６３】
治療薬の好ましい組合せは、炎症カスケードにおける異なる点で干渉し得る；好ましい例として、キメラ、ヒト化またはヒトＴＮＦ抗体のようなＴＮＦアンタゴニスト、アダリムマブ、（ＨＵＭＩＲＡ；Ｄ２Ｅ７；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／２９１３１）、ＣＡ２（レミケード）、ＣＤＰ５７１および可溶性ｐ５５またはｐ７５ＴＮＦ受容体、その誘導体（ｐ７５ＴＮＦＲ１ｇＧ（エンブレル（ＥＮＢＲＥＬ）またはｐ５５ＴＮＦＲ１ｇＧ（レネルセプト）およびまたＴＮＦ変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤が挙げられる。同様に、ＩＬ−１阻害剤（インターロイキン−１−変換酵素阻害剤、ＩＬ−１ＲＡなど）が同じ理由で有効であり得る。その他の好ましい組合せとして、インターロイキン４が挙げられる。
【０２６４】
投与計画は、最適な所望の反応（例えば、治療反応または予防反応）を提供するよう調整され得る。例えば、単回ボーラスが投与される場合も、いくつかの分割用量が経時的に投与される場合も、または治療状況の危急によって、用量が比例的に減少または増加される場合もある。投与の容易さおよび投与量の均一性のために、非経口組成物を単位投与形で製剤することは特に有利である。本明細書において、単位投与形とは、治療される哺乳動物被験体のための単位投与量として適合している、物理的に別個の単位を指し；各単位は、必要な医薬担体と共に、所望の治療効果を生じるよう算出された所定の量の活性化合物を含有する。本発明の単位投与形の仕様は、（ａ）活性化合物の独特の特徴および達成される特定の治療効果または予防効果および（ｂ）個体における感受性の扱いについてのこのような活性化合物の配合の技術分野に固有の制限によって決定され、それらに直接的に依存する。
【０２６５】
投与量の値は、軽減される状態の種類および重篤度に応じて変わり得るということは留意されたい。任意の特定の被験体にとっての特定の投与計画は、個体の必要性および組成物を投与し組成物の投与を監督している人の専門的判断に従って経時的に調整されなければならないということ、および本明細書に示される投与量範囲は、単に例示的なものであって、特許請求される組成物の範囲または実施を制限しようとするものではないということは、さらに理解されなくてはならない。
【０２６６】
別の態様では、本出願は、被験体における、ＣＤ４０活性が有害である障害を治療する（例えば、治癒する、抑制する、寛解させる、発症を遅延させるもしくは予防するまたは再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｒ  ｒｅｌａｐｓｅ）を予防する）または予防する方法を特徴とする。方法は、被験体にＣＤ４０結合剤（特にアンタゴニスト）、例えば本明細書に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその断片を、ＣＤ４０に関連する障害を治療または予防するために十分な量で投与するステップを含む。ＣＤ４０アンタゴニスト、例えば抗ＣＤ４０抗体またはその断片は、被験体に単独でまたは本明細書に記載のその他の治療モダリティと組み合わせて投与され得る。
【０２６７】
別の態様では、本出願は、試料中のＣＤ４０の存在をインビトロ（例えば、血清、血漿、組織、生検などの生体試料）で検出するための方法を提供する。本主題の方法は、障害、例えば炎症性障害を診断するために使用され得る。方法は、（ｉ）試料または対照試料を本明細書に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその断片と接触させるステップと、（ｉｉ）抗ＣＤ４０抗体またはその断片と試料または対照試料との間の複合体の形成を検出するステップであって、試料中の複合体の形成に対照試料と比較して統計的に有意な変化があることにより、試料中のＣＤ４０の存在が示されるステップとを含む。
【０２６８】
さらに別の態様では、本出願は、ＣＤ４０の存在をインビボで検出するための方法を提供する（例えば、被験体におけるインビボ画像診断）。本主題の方法は、障害、例えばＣＤ４０に関連する障害を診断するために使用され得る。方法は、（ｉ）本明細書に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその断片を、抗体または断片とＣＤ４０との結合が可能になる条件下で被験体または対照の被験体に投与するステップと、（ｉｉ）抗体または断片とＣＤ４０との間の複合体の形成を検出するステップであって、被験体における複合体の形成に対照被験体と比較して統計的に有意な変化があることにより、ＣＤ４０の存在が示されるステップとを含む。
【０２６９】
抗体エフェクター機能を変更するためのＦｃ部分中のアミノ酸残基の置換は、当技術分野で公知である（Ｗｉｎｔｅｒら、米国特許第５，６４８，２６０号；同５６２４８２１号）。抗体のＦｃ部分は、いくつかの重要なエフェクター機能、例えば、サイトカイン誘導、ＡＤＣＣ、食作用、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）ならびに抗体および抗原抗体複合体の半減期／クリアランス速度を媒介する。いくつかの場合には、これらのエフェクター機能は、治療用抗体にとって望ましいものであるが、別の場合には、治療目的によって、不必要またはさらに有害であることもある。特定のヒトＩｇＧアイソタイプ、特に、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、それぞれ、ＦｃγＲｓおよび補体Ｃ１ｑとの結合によって、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを媒介する。新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、抗体の循環半減期を決定する重要な成分である。さらに別の実施形態では、抗体のエフェクター機能が変更されるよう抗体の定常領域、例えば、抗体のＦｃ領域において少なくとも１個のアミノ酸残基が置換される。
【０２７０】
一実施形態は、本発明の抗体または抗体部分が、誘導体化されるかまたは１つ以上の機能的分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）に連結されている、標識された抗体またはその抗原結合部分を提供する。例えば、本発明の標識された抗体またはその抗原結合部分は、別の分子（例えば、ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグ）との抗体または抗体部分の会合を媒介し得る１つ以上のその他の分子実体（例えば、別の抗体（例えば、二特異性抗体またはダイアボディー）、検出可能な薬剤、医薬品、タンパク質もしくはペプチド）および／または細胞傷害性薬剤もしくは治療用薬剤（有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、免疫調節剤、遺伝子療法用ベクター、アルキル化剤、抗血管新生剤、代謝拮抗薬、ホウ素含有薬剤（ｂｏｒｏｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、化学保護剤、ホルモン、抗ホルモン剤、コルチコステロイド、光活性治療薬、オリゴヌクレオチド、放射性核種薬剤、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、放射線増感剤およびこれらの組合せからなる群から選択される）と、本発明の抗体または抗体部分を（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合による会合またはその他によって）機能的に連結することによって、誘導体化され得る。
【０２７１】
用いることにより本発明の抗体または抗体部分が誘導体化され得る有用な検出可能な薬剤として、蛍光化合物が挙げられる。例示的蛍光検出可能薬剤として、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリンなどが挙げられる。抗体はまた、検出可能な酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどを用いて誘導体化され得る。抗体が検出可能な酵素で誘導体化される場合には、検出可能な反応生成物を生じるために酵素が用いるさらなる試薬を加えることによって、検出される。例えば、検出可能な薬剤である西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合には、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加が、検出可能である、着色された反応生成物をもたらす。抗体はまた、ビオチンで誘導体化され、アビジンまたはストレプトアビジン結合の間接的測定によって検出され得る。
【０２７２】
本発明の別の実施形態は、結晶化抗体またはその抗原結合部分を提供する。好ましくは、本発明は、本明細書に開示される、全抗ＣＤ４０抗体およびその断片の結晶ならびにこのような結晶を含む製剤および組成物に関する。一実施形態では、結晶化抗体またはその抗原結合部分は、抗体またはその抗原結合部分の可溶性対応物よりも、インビボで長い半減期を有する。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、結晶化後に生物活性を保持する。
【０２７３】
本発明の結晶化抗体またはその抗原結合部分は、当技術分野で公知の、参照により本明細書に組み込むＷＯ０２０７２６３６に開示される方法に従って製造され得る。
【０２７４】
ＩＶ．医薬組成物
本発明はまた、本発明の抗体またはその抗原結合部分と、医薬上許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【０２７５】
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体または抗体部分の「治療上有効な量」または「予防上有効な量」を含み得る。「治療上有効な量」とは、必要な投薬回数及び期間において、所望の治療結果を達成するために有効な量を指す。抗体または抗体部分の治療上有効な量は、当業者によって決定され得、個体の病状、年齢、性別および体重ならびに個体における抗体または抗体部分の所望の反応を誘発する能力などの要因に従って変わり得る。治療上有効な量はまた、抗体または抗体部分の任意の毒性または有害な作用を治療上有益な作用が凌ぐものである。「予防上有効な量」とは、必要な投薬回数及び期間において、所望の予防結果を達成するために有効な量を指す。通常、予防上の用量は、被験体において疾患に先立って、または疾患の初期段階で使用されるので、予防上有効な量は、治療上有効な量よりも少ないものとなる。
【０２７６】
本発明の抗体を含む医薬組成物は、それだけには限らないが、障害の診断、検出またはモニタリングにおいて；障害またはその１つ以上の症状の予防、治療、管理または寛解において、および／または研究において使用される。特定の実施形態では、組成物は、本発明の１種以上の抗体を含む。別の実施形態では、ＣＤ４０活性が有害である障害を治療するために、医薬組成物は、本発明の１種以上の抗体および本発明の抗体以外の１種以上の予防薬または治療薬を含む。好ましくは、障害またはその１種以上の症状の予防、治療、管理または寛解のために有用であるとわかっている、またはそれにおいて使用されていた、または現在使用されている予防薬または治療薬。これらの実施形態に一致して、組成物は、担体、希釈液または賦形剤をさらに含み得る。
【０２７７】
本発明の抗体または抗体部分は、被験体に投与するのに適した医薬組成物中に組み込まれ得る。通常、医薬組成物は、本発明の抗体または抗体部分および医薬として許容される担体を含む。本明細書において、「医薬として許容される担体」としては、生理学的に適合される、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。医薬として許容される担体の例として、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどならびにそれらの組合せのうち１種以上が挙げられる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコールまたは塩化ナトリウムを含むことが好ましい。医薬として許容される担体は、抗体または抗体部分の使用期限または有効性を延長もしくは増強する、湿潤剤または乳化剤、保存料またはバッファーなどの微量の補助物質をさらに含み得る。
【０２７８】
種々の送達系が公知であり、本発明の１種以上の抗体または本発明の１種以上の抗体の組合せおよび障害または１種以上のその症状を予防、管理、治療または寛解するのに有用な予防薬または治療薬を投与するために使用され得、例えば、リポソームにおけるカプセル封入、微粒子、マイクロカプセル、抗体または抗体断片を発現できる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６２：４４２９−４４３２頁（１９８７年））、レトロウイルスまたはその他のベクターの一部としての核酸の構築物などである。本発明の予防薬または治療薬を投与する方法として、それだけには限らないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内の、腹腔内、静脈内および皮下）、硬膜外投与、腫瘍内投与および粘膜投与（例えば、鼻腔内および経口経路）が挙げられる。さらに、肺の投与は、例えば、吸入器または噴霧器およびエアロゾル化剤を有する製剤の使用によって使用され得る。例えば、参照によりその全文が本明細書に各々、組み込まれる、米国特許第６，０１９，９６８号、同５，９８５，３２０号、同５，９８５，３０９号、同５，９３４，２７２号、同５，８７４，０６４号、同５，８５５，９１３号、同５，２９０，５４０号、および同４，８８０，０７８号；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６およびＷＯ９９／６６９０３を参照のこと。一実施形態では、本発明の抗体、併用療法または本発明の組成物は、Ａｌｋｅｒｍｅｓ  ＡＩＲ肺薬物送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）を使用して投与される。特定の実施形態では、本発明の予防薬または治療薬は、筋肉内に、静脈内に、腫瘍内に、経口によって、鼻腔内に、肺にまたは皮下に投与される。予防薬または治療薬は、任意の従来経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸管粘膜など）を通る吸収を介して投与され得、またその他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は、全身であっても局所であってもよい。
【０２７９】
特定の実施形態では、本発明の予防薬または治療薬を、治療を必要とする領域に局所的に投与することが望ましいものであり得；これは、例えば、制限するものではないが、局所注入として、注射によって、またはインプラントによって達成され得、前記インプラントは、サイラスティックメンブラン、ポリマー、線維性マトリックス（例えば、ＴＩＳＳＵＥＬ）またはコラーゲンマトリックスなどのメンブランおよびマトリックスを含めた多孔性または非多孔性材料である。一実施形態では、有効量の、本発明の１種以上の抗体であるアンタゴニストが、障害またはその症状を予防、治療、管理および／または寛解させるために被験体に罹患領域に局所的に投与される。別の実施形態では、有効量の本発明の１種以上の抗体が、有効量の本発明の抗体以外の１種以上の治療（例えば、１種以上の予防薬または治療薬）と組み合わせて、障害またはその１種以上の症状を予防、治療、管理および／または寛解させるために被験体の罹患領域に局所的に投与される。
【０２８０】
別の実施形態では、本発明の予防薬または治療薬は、制御放出または持続放出系で送達され得る。一実施形態では、制御放出または持続放出を達成するためにポンプが使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ、上記；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７年、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．  １４：２０頁；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０年、Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７頁；Ｓａｕｄｅｋら、１９８９年、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．  ３２１：５７４頁を参照のこと）。別の実施形態では、ポリマー材料は、本発明の治療の制御放出または持続放出を実現するために使用され得る（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．（１９７４年）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ、Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４年）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ、１９８３年、Ｊ．、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照のこと；  Ｌｅｖｙら、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇら、１９８９年、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄら、１９８９年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７  １：１０５）；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５、９１６，５９７；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９９／１５１５４号；およびＰＣＴ公開番号第ＷＯ９９／２０２５３号も参照のこと。持続放出製剤において使用されるポリマーの例として、それだけには限らないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）およびポリオルトエステルが挙げられる。好ましい一実施形態では、持続放出製剤において使用されるポリマーは、不活性であり、漏出性の不純物を含まず、保存に対して安定であり、無菌であり、生分解性である。さらに別の実施形態は、制御放出または持続放出系は、予防標的または治療標的に近接して配置され得、したがって、全身用量の画分のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、Ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、上記、２巻、１１５−１３８頁（１９８４年）参照のこと）。
【０２８１】
制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒによる概説（１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：１５２７−１５３３頁）において論じられている。本発明の１種以上の治療薬を含む持続放出製剤を作製するために当業者に公知の任意の技法が使用され得る。例えば、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込む、米国特許第４，５２６、９３８号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０５５４８、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／２０６９８、Ｎｉｎｇら、１９９６年、「Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｈｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｇｅｌ」、Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ＆Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、３９：１７９−１８９頁、Ｓｏｎｇら、１９９５年、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｌｕｎｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｌｏｎｇ−Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ」、ＰＤＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５０：３７２−３９７頁、Ｃｌｅｅｋら、１９９７年、「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ｂＦＧＦ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：８５３−８５４頁およびＬａｍら、１９９７年、「Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｌｏｃａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：７５９−７６０頁を参照のこと。
【０２８２】
特定の実施形態では、本発明の組成物が、予防薬または治療薬をコードする核酸である場合には、そのコードされる予防薬または治療薬の発現を促進するために、適当な核酸発現ベクターの一部として構築することおよび細胞内に入るようにそれを投与することによって、例えば、レトロウイルスベクターを使用することによって（米国特許第４，９８０，２８６号参照のこと）、または直接注射によって、または微粒子銃を使用することによって（例えば、ａ  ｇｅｎｅ  ｇｕｎ；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、ＤｕＰｏｎｔ）、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクト剤を用いてコーティングすることによって、または核に入ると知られているホメオボックス様ペプチドと関連して投与することによって（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８６４−１８６８頁参照のこと）、核酸はインビボで投与され得る。または、核酸は、相同組換えによる発現のために細胞内に導入され、宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得る。
【０２８３】
本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路と適合するよう製剤される。投与経路の例として、それだけには限らないが、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下）、経口、鼻腔内（例えば、吸入）、経皮（例えば、局所）、経粘膜および直腸投与が挙げられる。特定の実施形態では、組成物は、ヒトへの静脈内、皮下、筋肉内、経口、鼻腔内または局所投与に適している医薬組成物として、常法に従って製剤される。通常、静脈内投与用の組成物は、滅菌等張性水性バッファー中の溶液である。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤および注射の部位での疼痛を和らげるためリグノカムン（ｌｉｇｎｏｃａｍｎｅ）などの局所麻酔薬も含み得る。
【０２８４】
本発明の組成物が、局所的に投与される場合には、組成物は、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアゾール、溶液、エマルジョンの形態または当業者に周知のその他の形態で製剤され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（１９９５年）参照のこと。噴霧できない局所投与形には、局所適用に適合する担体または１種以上の賦形剤を含み、好ましくは、水より大きい動粘性係数を有する、粘性から半固体または固体形態が、通常使用される。適した製剤として、制限するものではなく、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、散剤、リニメント剤、軟膏（ｓａｌｖｅｓ）などが挙げられ、これらは、必要に応じて、滅菌されるか、または例えば浸透圧などの種々の特性に影響を及ぼすために補助剤（例えば、保存料、安定化剤、湿潤剤、バッファーまたは塩）と混合される。その他の適した局所投与形として、好ましくは、固体または液体不活性担体と組み合わせた有効成分が、加圧された揮発性物質（例えば、ガス状噴射剤、例えば、ｆｒｅｏｎ）との混合物中にまたはスクイーズボトル中にパッケージされている噴霧性エアゾール製剤が挙げられる。必要に応じて、保湿剤または保水剤も、医薬組成物および投与形に添加され得る。このようなさらなる成分の例は、当技術分野で周知である。
【０２８５】
本発明の方法が、組成物の鼻腔内投与を含む場合には、組成物は、エアゾール形態、スプレー、ミストまたは滴剤の形態で製剤され得る。特に、本発明に従って使用するための予防薬または治療薬は、適した噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の適したガス）を使用して、加圧パックまたは噴霧器からエアゾールスプレーの体裁という形態で簡便に送達され得る。加圧エアゾールの場合には、投与単位は、定量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適した散剤基剤の散剤ミックスを含有する、吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ）または吸入器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）において使用するためのカプセル剤およびカートリッジ（例えば、ゼラチンからなる）が製剤され得る。
【０２８６】
本発明の方法が、経口投与を含む場合には、組成物は、錠剤、カプセル剤、カシェ剤、ジェルキャップ、溶液、懸濁液などの形態で経口的に製剤され得る。錠剤またはカプセル剤は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えば、ラクトース、微晶質セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸ナトリウムデンプン）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの医薬として許容される賦形剤を用い、従来の手段によって調製され得る。錠剤は、当技術分野で周知の方法によってコーティングされてもよい。経口投与のための液体製剤は、それだけには限らないが、溶液、シロップ剤または懸濁液の形態をとり得る、またはそれらは使用前に水もしくはその他の適した媒体で構成するための乾燥製剤として調製され得る。このような液体製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアガム）；非水性媒体（例えば、アーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコールまたは精留植物油）；および保存料（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの医薬として許容される添加剤を用い、従来の手段によって調製され得る。製剤はまた、適宜、バッファー塩、矯味剤、着色剤および甘味剤も含有し得る。経口投与用製剤は、予防薬または治療薬（複数可）の徐放、制御放出または持続放出のために適宜製剤され得る。
【０２８７】
本発明の方法は、例えば、エアロゾル化剤を用いて製剤された組成物の吸入器または噴霧器の使用による肺の投与を含み得る。例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０１９，９６８号、同５，９８５，３２０号、同５，９８５，３０９号、同５，９３４，２７２号、同５，８７４，０６４号、同５，８５５，９１３号、同５，２９０，５４０号および同４，８８０，０７８号；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６およびＷＯ９９／６６９０３参照のこと。特定の実施形態では、本発明の抗体、併用療法および／または本発明の組成物は、Ａｌｋｅｒｍｅｓ  ＡＩＲ肺薬剤送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）を使用して投与される。
【０２８８】
本発明の方法は、注射による（例えば、ボーラス注射または連続注入による）非経口投与用に製剤された組成物の投与を含み得る。注射用製剤は、防腐剤を加えた単位投与形で（例えば、アンプル中で、または複数用量容器中で）提示され得る。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの形態をとり得、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの処方剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔｓ）を含有し得る。または、有効成分は、使用前に適した媒体（例えば、滅菌発熱物質不含水）を用いて構成するための散剤形態であり得る。
【０２８９】
本発明の方法は、デポー製剤として製剤された組成物の投与をさらに含み得る。このような長時間作用型製剤は、移植（例えば、皮下に、または筋肉内に）によって、または筋肉注射によって投与され得る。したがって、例えば、組成物は、適したポリマー物質または疎水性物質を用いて（例えば、許容されるオイル中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂を用いて、または難溶性誘導体として（例えば、難溶性塩として）製剤され得る。
【０２９０】
本発明の方法は、中性のまたは塩の形態として製剤された組成物の投与を包含する。医薬として許容される塩として、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるものなどの陰イオンを用いて形成されるもの、ならびにナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの陽イオンを用いて形成されるものが挙げられる。
【０２９１】
一般に、組成物の成分は、別個に、または単位投与形中に一緒に混合されて、例えば、活性薬剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密閉された容器中の無水凍結乾燥散剤または無水濃縮物として供給される。投与様式が注入である場合には、組成物は、滅菌医薬等級水または生理食塩水を含有する注入ビンを用いて分配され得る。投与様式が注射によってである場合には、滅菌注射水または生理食塩水のアンプルは、成分が投与に先立って混合され得るように提供され得る。
【０２９２】
特に、本発明はまた、本発明の予防薬または治療薬または医薬組成物のうち１種以上が、薬剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密閉された容器中にパッケージングされることを提供する。一実施形態では、本発明の予防薬または治療薬または医薬組成物のうち１種以上が、密閉された容器中の無水滅菌凍結乾燥散剤または無水濃縮物として供給され、（例えば、水または生理食塩水を用いて）被験体に投与するための適当な濃度に再構成され得る。好ましくは、本発明の予防薬または治療薬または医薬組成物のうち１種以上は、少なくとも５ｍｇ、より好ましくは、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも７５ｍｇまたは少なくとも１００ｍｇの単位投与量で密閉された容器中の無水滅菌凍結乾燥散剤として供給される。本発明の凍結乾燥予防薬または治療薬または医薬組成物は、その元の容器中で、２℃から８℃の間で保存されなくてはならず、本発明の予防薬または治療薬または医薬組成物は、再構成された後、１週間以内に、好ましくは、５日以内に、７２時間以内に、４８時間以内に、２４時間以内に、１２時間以内に、６時間以内に、５時間以内に、３時間以内にまたは１時間以内に投与されなくてはならない。代替の実施形態では、本発明の予防薬または治療薬または医薬組成物のうち１種以上が、薬剤の量および濃度を示す密閉された容器中の液体形態で供給される。投与される組成物の液体形態は、密閉された容器中で、少なくとも０．２５ｍｇ／ｍｌ供給されることが好ましく、より好ましくは、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２．５ｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも１００ｍｇ／ｍｌである。液体形態は、その元の容器中で、２℃から８℃の間で保存されなくてはならない。
【０２９３】
本発明の抗体および抗体部分は、非経口投与に適した医薬組成物中に組み込まれ得る。好ましくは、抗体または抗体部分は、０．１−２５０ｍｇ／ｍｌの抗体を含有する注射用溶液として調製される。注射用溶液は、フリントまたはアンバーバイアル、アンプルまたは薬剤充填済みシリンジ中の液体または凍結乾燥投与形のいずれかからなり得る。バッファーは、ｐＨ５．０から７．０（最適には、ｐＨ６．０）のＬ−ヒスチジン（１−５０ｍＭ）、最適には、５−１０ｍＭであり得る。その他の適したバッファーとして、それだけには限らないが、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムが挙げられる。溶液の毒性を改変するために、塩化ナトリウムが、０−３００ｍＭ（最適には、液体投与形には１５０ｍＭ）の濃度で使用され得る。凍結乾燥投与形には、凍結保護物質、主に０−１０％スクロース（最適には、０．５−１．０％）が含まれ得る。その他の適した凍結保護物質として、トレハロースおよびラクトースが挙げられる。凍結乾燥投与形には、充填剤、主に、１−１０％マンニトール（最適には、２−４％）も含まれ得る。液体および凍結乾燥投与形の両方において、安定化剤、主に、１−５０ｍＭ  Ｌ−メチオニン（最適には、５−１０ｍＭ）も使用され得る。その他の適した充填剤として、グリシン、アルギニンが挙げられ、０−０．０５％ポリソルベート−８０（最適には、０．００５−０．０１％）として含まれ得る。さらなる界面活性剤として、それだけには限らないが、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性剤が挙げられる。非経口投与用の注射用溶液として調製された本発明の抗体および抗体部分を含む医薬組成物は、アジュバントとして有用である薬剤、例えば、吸収を増大させるよう使用されるものまたは治療用タンパク質（例えば、抗体）の分散物をさらに含み得る。特に有用なアジュバントとして、ＨＹＬＥＮＥＸ（組換えヒトヒアルロニダーゼ）などのヒアルロニダーゼがある。注射用溶液におけるヒアルロニダーゼの添加は、非経口投与、特に、皮下投与後のヒトバイオアベイラビリティを改善する。また、より少ない疼痛および不快感、ならびに最小の注射部位反応の発生率しか伴わずに、より大きな注射部位容積（すなわち、１ｍｌ超）を可能にする。（参照により本明細書に組み込むＷＯ２００４０７８１４０、ＵＳ２００６１０４９６８を参照のこと）。
【０２９４】
一実施形態では、本発明は、本発明の抗体、例えば抗体Ａｂ１０２、ヒスチジン、およびポリソルベート、例えばポリソルベート８０を含む医薬組成物を包含する。一実施形態では、本発明は、配列番号４１のアミノ酸を含む重鎖および配列番号４０のアミノ酸を含む軽鎖を含む抗体、ヒスチジン、およびポリソルベート、例えばポリソルベート８０を含む医薬組成物を包含する。特定の実施形態では、医薬組成物は凍結乾燥されたものである。
【０２９５】
本発明の組成物は、種々の形態であり得る。これらとして、例えば、液体溶液（例えば、注射用溶液および注入用溶液）、分散物または懸濁液、錠剤、丸剤、散剤、リポソームおよび坐剤などの液体、半固体および固体投与形が挙げられる。好ましい形態は、意図される投与様式および治療適用に応じて変わる。通常好ましい組成物は、その他の抗体を用いるヒトの受動免疫処置に使用されるものと類似の組成物などの注射用溶液または注入用溶液の形態である。好ましい投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好ましい一実施形態では、抗体は、静脈内注入または注射によって投与される。別の好ましい実施形態では、抗体は、筋肉内注射または皮下注射によって投与される。
【０２９６】
治療用組成物は、通常、無菌で、製造および保存の条件下で安定でなくてはならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散物、リポソームまたは高い薬物濃度に適したその他の秩序構造として製剤され得る。滅菌注射用溶液は、適当な溶媒中の必要な量で活性化合物（すなわち、抗体または抗体部分）を、必要に応じて上記で列挙された成分のうち１種またはそれらの組合せとともに組み込むこと、続いて、濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散物は、活性化合物を、基本分散媒および上記で列挙されたもののうち必要なその他の成分を含有する滅菌媒体に組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌凍結乾燥散剤の場合には、好ましい調製方法は、真空乾燥ならびに有効成分および先に滅菌濾過したその溶液に由来する任意のさらなる所望の成分の散剤が得られる噴霧乾燥である。溶液の適切な流動度は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散物の場合には必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持され得る。注射用組成物の長期吸収は、組成物中に、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによってもたらされ得る。
【０２９７】
多くの治療適用にとって、好ましい投与経路／様式は、皮下注射、静脈内注射または注入であるが、本発明の抗体および抗体部分は、当技術分野で公知の種々の方法によって投与され得る。投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて変わるということは、当業者ならば理解されよう。特定の実施形態では、活性化合物は、化合物を迅速放出から保護する担体を用い、例えば、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含めた制御放出製剤として調製され得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーは使用され得る。このような製剤を調製するための多数の方法が、特許権が取られているか、当業者には一般的に知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８年を参照のこと。
【０２９８】
特定の実施形態では、本発明の抗体または抗体部分は、例えば、不活性希釈液または吸収可能食用担体とともに経口投与され得る。化合物（および必要に応じて、その他の成分）はまた、ハードまたはソフトシェルゼラチンカプセル剤中に封入されても、錠剤に打錠されても、または被験体の食事に直接組み込まれてもよい。経口治療投与には、化合物は、賦形剤とともに組み込まれ、摂取可能な錠剤、頬側錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウェハースなどの形態で使用され得る。本発明の化合物を、非経口投与以外によって投与するには、化合物をその不活化を防ぐ物質によってコーティングするまたは化合物をその不活化を防ぐ物質と同時投与する必要があり得る。
【０２９９】
その他の実施形態では、本発明の抗体または抗体部分は、ポリマーに基づく種とコンジュゲートされ得、その結果、前記ポリマーに基づく種により、前記本発明の抗体または抗体部分に十分なサイズが付与され得、その結果、前記本発明の抗体または抗体部分に、透過性および蓄積の増強効果（ＥＰＲ効果）の利益がもたらされる（ＰＣＴ公開番号第ＷＯ２００６／０４２１４６Ａ２号および米国特許公開第２００４／００２８６８７Ａ１号、同第２００９／０２８５７５７Ａ１号および同第２０１１／０２１７３６３Ａ１号および米国特許第７，６９５，７１９号も参照のこと。（これらそれぞれの全体があらゆる目的について参照により本明細書に組み込む））。
【０３００】
補足の活性化合物もまた、組成物中に組み込まれ得る。特定の実施形態では、本発明の抗体または抗体部分は、ＣＤ４０活性が有害である障害を治療するために有用である１種以上のさらなる治療薬と共に製剤および／または同時投与される。例えば、本発明の抗ｈＣＤ４０抗体または抗体部分は、その他の標的と結合する１種以上のさらなる抗体（例えば、のサイトカインと結合する抗体または細胞表面分子と結合する抗体）と共に製剤および／または同時投与され得る。さらに、本発明の１種以上の抗体は、前述の治療薬のうち２種以上と組み合わせて使用され得る。このような併用療法は、より低い用量の投与される治療薬を利用することが有利であり得、したがって、種々の単剤療法と関連している潜在的な毒性または合併症を避けながら利用することが有利であり得る。
【０３０１】
特定の実施形態では、ＣＤ４０に対する抗体またはその断片は、当技術分野で公知の半減期延長媒体と連結される。このような媒体として、それだけには限らないが、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコールおよびデキストランが挙げられる。このような媒体は、例えば、いかなる目的に対しても参照により本明細書に組み込む、米国出願公開第０９／４２８０８２号および公開されたＰＣＴ出願番号ＷＯ９９／２５０４４に記載されている。
【０３０２】
特定の実施形態では、本発明の抗体または本発明の別の予防薬または治療薬をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列が、遺伝子療法によって、障害またはその１種以上の症状を治療、予防、管理または寛解させるために投与される。遺伝子療法とは、発現された核酸または発現可能な核酸を被験体に投与することによって実施される治療を指す。本発明のこの実施形態では、核酸はそのコードされた抗体または予防効果もしくは治療効果を媒介する本発明の予防薬もしくは治療薬を生成する。
【０３０３】
当技術分野で入手可能な遺伝子療法のための方法のいずれかも、本発明に従って使用され得る。遺伝子療法の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら、１９９３年、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５頁；ＷｕおよびＷｕ、１９９１年、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５頁；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、１９９３年、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ３２：５７３−５９６頁；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２頁（１９９３年）；およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ、１９９３年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６２：１９１−２１７頁；５月、１９９３年、ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５頁を参照のこと。使用され得る組換えＤＮＡ技術の当技術分野でよく知られている方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３年）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０年）に記載されている。遺伝子療法の種々の方法の詳細な説明は、参照により本明細書に組み込む、米国公開第２００５００４２６６４  Ａ１号に提供されている。
【０３０４】
本明細書に記載された本発明の方法のその他の適した改変および適合は、明らかであり、本発明の範囲または本明細書に記載された実施形態から逸脱することなく、適した等価物を使用して行われ得るということは、当業者には容易に明らかとなる。ここで、本発明を詳細に記載したが、これは、単に例示目的で含まれるのであって、本発明を制限するものではないことが、以下の実施例を参照することによってより明確に理解される。
【実施例】
【０３０５】
［実施例１］：アンタゴニスト抗ヒトＣＤ４０（ｈＣＤ４０）モノクローナル抗体
ＣＤ４０特異的アンタゴニスト抗体を同定するために、ハイブリドーマ技術を使用してマウスモノクローナル抗ＣＤ４０抗体を単離した。
【０３０６】
手短には、マウスを、ヒトＣＤ４０抗原およびアジュバントを用いて免疫処置した。抗原を数週間にわたって数回投与することを含む免疫処置後、各免疫処置された動物由来の血清を採取した。次いで、血清を、標準のＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーアッセイを使用して試験して、ＣＤ４０を検出することができる抗体を有する血清を同定した。結合アッセイに基づいてマウス血清中のＣＤ４０特異的抗体の存在が検出されたら、マウス脾臓を回収し、抗体産生細胞を標準の技法に従って単離した。次いで、脾細胞を公知の技法によって融合して抗体産生骨髄腫細胞を形成した。融合後、ハイブリドーマをＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーによってスクリーニングしてＣＤ４０遮断および中和特性を有する種々の抗体を決定した。
【０３０７】
スクリーニング後、大多数の抗体はアゴニスト活性を有すると同定されたが、マウスモノクローナル抗体のうちの３種（Ａｂ１、Ａｂ２およびＡｂ３）は、ＣＤ４０に対してアンタゴニスト活性を有し、実質的なアゴニスト活性を伴わないと同定された。これらの３種のマウス抗体の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を以下の表７−９に記載する。可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）内のＣＤＲが太字で示されている（それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）。
【０３０８】
【表７】
2019150024.tif 000008
【０３０９】
【表８】
2019150024.tif 000009
【０３１０】
【表９】
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2019150024.tif 000011
【０３１１】
３種の抗ＣＤ４０アンタゴニストマウスモノクローナル抗体（Ａｂ１、Ａｂ２およびＡｂ３）に由来するＣＤＲ領域のコンセンサス配列が同定され、それが上の表５に提供されている。３種のマウス抗体の可変領域アミノ酸配列のアラインメントは、図４Ａ（軽鎖）および４Ｂ（重鎖）においても提供される。
【０３１２】
３種の抗体のマウス重鎖可変領域および軽鎖可変領域（ＶＨおよびＶＬ）を、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用してクローニングした。これらのＶＨ領域およびＶＬ領域（上の表７−９に記載）をその後、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域を含むベクターにクローニングし、次いで、哺乳動物宿主細胞においてキメラ抗体として発現させた。次いで、これらのヒトキメラ抗体（ヒト定常およびマウス可変領域）を、インビトロアッセイを使用して特徴付けて、これらがそれぞれアンタゴニストおよび／またはアゴニスト効果を有するかどうかを決定した。
【０３１３】
ＦＡＣＳ分析を使用して、３種のキメラ抗ＣＤ４０抗体がヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞上に発現したｈｕＣＤ４０またはカニクイザルＣＤ４０のいずれかと結合することができるかどうかを決定した。３種のキメラ抗体のそれぞれが、ＨＥＫ細胞上に発現したヒトＣＤ４０に結合することができたが、カニクイザルＣＤ４０を認識したのはキメラ抗体のうち２種だけであり、キメラ抗体３（ｃｈＡｂ３）はカニクイザルＣＤ４０に結合しなかった。ＦＡＣＳ結合試験の結果が表１０に要約されている。
【０３１４】
ＦＡＣＳ分析を使用して、３種のキメラ抗体が可溶性ＣＤ４０リガンド（ｓＣＤ４０Ｌ）とＣＤ４０の結合を阻害することができるかどうかも決定した。ＣＤ４０発現ＨＥＫ細胞を使用して、ＩＣ５０値を測定した。表１０に記載の通り、キメラ抗体のそれぞれがＣＤ４０とそのリガンドの結合を遮断することができた。
【０３１５】
結合アッセイに加えて、アンタゴニスト活性およびアゴニスト活性を、ＮＦｋＢ媒介性アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と連結したヒトＣＤ４０を発現するＣＤ４０発現レポーター細胞株を使用して測定した。ＣＤ４０発現レポーター細胞株アッセイでは、シグナルがＣＤ４０を通じて受け取られることでＮＦｋＢ活性化により導かれるＡＰの分泌を、比色定量基質によって測定する。アンタゴニスト活性を決定するために、ＣＤ４０レポーター細胞株（ＨＥＫ）を、ＣＤ４０Ｌを発現するジャーカット細胞株（生理的リガンド相互作用をもたらす）または可溶性ＣＤ４０Ｌ（例えば、表１０において参照されるＨｉｓ−ＣＤ４０Ｌ）のいずれかと一緒に培養した。抗ＣＤ４０抗体のＮＦｋＢシグナルを遮断する能力を測定した。アゴニスト活性を測定するために、ヒトＣＤ４０レポーター細胞株を、抗ＣＤ４０抗体を用いて直接処理し、ＮＦｋＢシグナルを測定した。３種のキメラ抗体についての代表的なＣＤ４０アンタゴニストおよびアゴニストアッセイのデータが表１０ならびに図１Ａおよび１Ｂに要約されている。
【０３１６】
【表１０】
2019150024.tif 000012
【０３１７】
表１０および図１に記載の通り、抗ＣＤ４０キメラ抗体は、アンタゴニスト活性を示し、検出可能なアゴニスト活性はなかった。上記の実験からの結果に基づいて、抗ＣＤ４０アンタゴニスト抗体Ａｂ１およびＡｂ３に由来する重鎖可変領域および軽鎖可変領域をヒト化のために選択した。
【０３１８】
［実施例２］：アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体Ａｂ１およびＡｂ３のヒト化
アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体Ａｂ１のヒト化
ヒト化抗体をＡｂ１の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ配列に基づいて作製した。詳細には、ヒト生殖系列配列を、Ａｂ１のＶＨ鎖およびＶＬ鎖のＣＤＲドメインが異なるヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列にグラフト化された、ＣＤＲグラフト化されたヒト化Ａｂ１抗体を構築するために選択した。モノクローナル抗体Ａｂ１のＶＨ配列およびＶＬ配列を用いたアラインメントに基づいて、以下のヒト配列をアクセプターとして選択した：
１．重鎖アクセプター配列を構築するためのＩＧＨＶ３−２１＊０１およびＩＧＨＪ６＊０１
２．重鎖を構築するための代替アクセプターとしてのＩＧＨＶ３−４８＊０１およびＩＧＨＪ６＊０１
３．軽鎖アクセプター配列を構築するためのＩＧＫＶ４−１＊０１およびＩＧＫＪ２＊０１
４．軽鎖を構築するための代替アクセプターとしてのＩＧＫＶ２−４０＊０１およびＩＧＫＪ２＊０１
次いで、ＣＤＲグラフト化抗体を、Ａｂ１の対応するＶＨ  ＣＤＲおよびＶＬ  ＣＤＲを上の１−４に記載されているアクセプター配列にグラフト化することによって調製した。
【０３１９】
フレームワーク復帰突然変異（複数可）を有するヒト化抗体を作製するために、フレームワーク突然変異を同定し、ＣＤＲグラフト化抗体に導入した。これらの突然変異を、復帰突然変異（複数可）を有する可変ドメインの新規合成およびポリメラーゼ連鎖反応における変異原性オリゴヌクレオチドプライマーを含む、標準の技法を使用して導入した。以下の通りＣＤＲグラフト化抗体（抗体Ａｂ１のＣＤＲを含有する）のそれぞれについて逆突然変異およびその他の突然変異の種々の組合せを構築した。（注：下記の突然変異についての残基番号は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに基づく。）
ＣＤＲグラフト化抗体の重鎖については、以下のバーニアおよびＶＨ／ＶＬ界面残基のうちの１つ以上を復帰突然変異させた：Ｖ４８Ｉおよび／またはＳ４９Ａ。
【０３２０】
ＣＤＲグラフト化抗体の軽鎖については、以下のバーニアおよびＶＨ／ＶＬ界面残基を復帰突然変異させた：Ｙ３６Ｆ。
【０３２１】
マウスモノクローナルＡｂ１に由来するヒト化抗体の可変領域の説明が以下に提供される：
・ヒト化Ａｂ１（ｈｕＡｂ１  ＶＨ．１）は、ＩＧＨＶ３−２１＊０１およびＩＧＨＪ６＊０１フレームワーク配列を含有するＣＤＲグラフト化Ａｂ１  ＶＨである；
・ヒト化Ａｂ１ＶＨ．１ａ（ｈｕＡｂ１  ＶＨ．１Ａ）は、以下の２つのフレームワーク復帰突然変異：Ｖ４８Ｉ、Ｓ４９Ａを有するｈｕＡｂ１  ＶＨ．１のアミノ酸配列を含むヒト化重鎖である；
・ヒト化Ａｂ１ＶＬ．１（ｈｕＡｂ１  ＶＬ．１）は、ＩＧＫＶ４−１＊０１およびＩＧＫＪ２＊０１フレームワーク配列を含有するＣＤＲグラフト化Ａｂ１  ＶＬである；ならびに
・ヒト化Ａｂ１ＶＬ．１ａ（ｈｕＡｂ１  ＶＬ．１Ａ）は、ｈｕＡｂ１  ＶＬ．１に基づくヒト化軽鎖であり、１つの提唱されたフレームワーク復帰突然変異：Ｙ３６Ｆを含有する。
【０３２２】
注：ＩＧＨＶ３−２１＿ＩＧＨＪ６は、ＩＧＨＶ３−２１＊０１およびＩＧＨＪ６＊０１に対応する可変配列を含む抗体を指す。
【０３２３】
次いで、ヒト化可変領域を、以下の重鎖可変領域と軽鎖可変領域との組合せに基づく４種の異なるヒト化抗体の機能的特徴付けのために、ＩｇＧ発現ベクターにクローニングした：
Ａ．ｈｕＡｂ１  ＶＨ．１／ＶＬ．１
Ｂ．ｈｕＡｂ１  ＶＨ．１Ａ／ＶＬ．１
Ｃ．ｈｕＡｂ１  ＶＨ．１／ＶＬ．１Ａ
Ｄ．ｈｕＡｂ１  ＶＨ．１Ａ／ＶＬ．１Ａ
前述のヒト化抗体の可変領域およびＣＤＲアミノ酸配列は、以下の表１１に記載されている。
【０３２４】
【表１１】
2019150024.tif 000013
2019150024.tif 000014
2019150024.tif 000015
【０３２５】
上記の通り、Ａｂ１のＶＨ領域およびＶＬ領域のヒト化型のＣＤＲは、マウスＡｂ１抗体と同一であった。
【０３２６】
アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体３（Ａｂ３）のヒト化
ヒト化抗体を、Ａｂ３の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ配列に基づいても作製した。ヒト生殖系列配列を、Ａｂ３のＶＨ鎖およびＶＬ鎖のＣＤＲドメインが異なるヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列にグラフト化された、ＣＤＲグラフト化されたヒト化Ａｂ３抗体を構築するために選択した。モノクローナル抗体Ａｂ３のＶＨ配列およびＶＬ配列を用いたアラインメントに基づいて、以下のヒト配列をアクセプターとして選択した：
１．重鎖アクセプター配列を構築するためのＩＧＨＶ３−６９＊０６およびＩＧＨＪ６＊０１
２．重鎖を構築するための代替アクセプターとしてのＩＧＨＶ１−１８＊０１およびＩＧＨＪ６＊０１
３．軽鎖アクセプター配列を構築するためのＩＧＫＶ２−２９＊０２およびＩＧＫＪ２＊０１
４．軽鎖を構築するための代替アクセプターとしてのＩＧＫＶ２−２８＊０１およびＩＧＫＪ２＊０１
ＣＤＲグラフト化抗体を、Ａｂ３の対応するＶＨ  ＣＤＲおよびＶＬ  ＣＤＲを上の１−４に記載されているアクセプター配列にグラフト化することによって調製した。
【０３２７】
フレームワーク復帰突然変異（複数可）を有するヒト化抗体を作製するために、いくつものフレームワーク突然変異を同定し、ＣＤＲグラフト化抗体に導入した。これらの突然変異を、復帰突然変異（複数可）を有する可変ドメインの新規合成およびポリメラーゼ連鎖反応における変異原性オリゴヌクレオチドプライマーを含む、標準の技法を使用して導入した。逆突然変異を含む突然変異の種々の組合せをＣＤＲグラフト化抗体（抗体Ａｂ３のＣＤＲを含有する）のそれぞれについて構築した。（注：下記の突然変異についての残基番号はＫａｂａｔ番号付けシステムに基づく。）
重鎖Ａｂ３については、以下のバーニアおよびＶＨ／ＶＬ界面残基のうちの１つ以上を復帰突然変異させた：Ｍ４８Ｉ、Ｖ６７Ａ、Ｉ６９Ｌ。さらに、Ｑ１Ｅの変化を検討した。Ｑ１Ｅ突然変異を、ピログルタミン酸形成を防止するために導入した。
【０３２８】
軽鎖Ａｂ３については、以下のバーニアおよびＶＨ／ＶＬ界面残基のうちの１つ以上を復帰突然変異させた：Ｙ３６Ｆ、Ｌ４６Ｙ。
【０３２９】
マウスモノクローナルＡｂ３に由来するヒト化抗体の可変領域の説明が下に記載されている：
・ｈｕＡｂ３ＶＨ．１ｚは、ＩＧＨＶ１−６９＊０６およびＩＧＨＪ６＊０１フレームワーク配列を含有するＣＤＲグラフト化されたヒト化Ａｂ３  ＶＨである。
【０３３０】
・ｈｕＡｂ３ＶＨ．１は、ピログルタミン酸形成を防止するためのＱ１Ｅ変化を有するｈｕＡｂ３ＶＨ．１ｚに基づく
・ｈｕＡｂ３ＶＨ．１Ａは、ｈｕＡｂ３ＶＨ．１に基づくヒト化設計であり、３つのさらなるフレームワーク復帰突然変異：Ｍ４８Ｉ、Ｖ６７Ａ、Ｉ６９Ｌを含有する。
【０３３１】
・ｈｕＡｂ３ＶＨ．１ｂは、ｈｕＡｂ３ＶＨ．１とｈｕＡｂ３ＶＨ．１Ａとの間の中間の設計であり、１つの提唱されたフレームワーク復帰突然変異：Ｉ６９Ｌを含有する。
【０３３２】
・ｈｕＡｂ３ＶＬ．１は、ＩＧＫＶ２−２８＊０１およびＩＧＫＪ２＊０１フレームワーク配列を含有するＣＤＲグラフト化されたヒト化Ａｂ３  ＶＬである。
【０３３３】
・ｈｕＡｂ３ＶＬ．１Ａは、ｈｕＡｂ３ＶＬ．１に基づくヒト化設計であり、２つのフレームワーク復帰突然変異：Ｙ３６Ｆ、Ｌ４６Ｙを含有する。
【０３３４】
・ｈｕＡｂ３ＶＬ．１Ｂは、ｈｕＡｂ３ＶＬ．１とｈｕＡｂ３ＶＬ．１Ａとの間の中間の設計である。これは、１つの提唱されたフレームワーク復帰突然変異：Ｌ４６Ｙを含有する。
【０３３５】
＊ＩＧＨＶ１−６９＿ＩＧＨＪ６は、ＩＧＨＶ１−６９＊０６およびＩＧＨＪ６＊０１生殖系列配列で構成されることにも注意されたい。
【０３３６】
次いで、ヒト化可変領域を、以下の重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組合せに基づく９種の異なるヒト化抗体の機能的特徴付けのために、ＩｇＧ発現ベクターにクローニングした：
Ａ．ｈｕＡｂ３ＶＨ．１／ＶＬ．１
Ｂ．ｈｕＡｂ３ＶＨ．１Ｂ／ＶＬ．１
Ｃ．ｈｕＡｂ３ＶＨ．１Ａ／ＶＬ．１
Ｄ．ｈｕＡｂ３ＶＨ．１／ＶＬ．１Ａ
Ｅ．ｈｕＡｂ３ＶＨ．１Ｂ／ＶＬ．１Ａ
Ｆ．ｈｕＡｂ３ＶＨ．１Ａ／ＶＬ．１Ａ
Ｇ．ｈｕＡｂ３ＶＨ．１／ＶＬ．１Ｂ
Ｈ．ｈｕＡｂ３ＶＨ．１Ｂ／ＶＬ．１Ｂ
Ｉ．ｈｕＡｂ３ＶＨ．１Ａ／ＶＬ．１Ｂ
前述のヒト化抗体の可変領域およびＣＤＲアミノ酸配列は、以下の表１２に記載されている。
【０３３７】
【表１２】
2019150024.tif 000016
2019150024.tif 000017
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2019150024.tif 000019
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【０３３８】
上記の通り、Ａｂ３のＶＨ領域およびＶＬ領域のヒト化型のＣＤＲはマウスＡｂ３抗体と同一であった。
【０３３９】
Ａｂ３はカニクイザルＣＤ４０と結合しなかったので（実施例１を参照のこと）、Ａｂ１のヒト化型をさらなる分析ために選択した。
【０３４０】
［実施例３］：ヒト化Ａｂ１抗体のＶＬ  ＣＤＲ１の改変
上記のヒト化Ａｂ１  ＶＨおよびＶＬ抗体配列の調査により、軽鎖のＣＤＲ１において露出している潜在的な脱アミド配列モチーフ（「ＮＳ」モチーフ）が同定された。同定された「ＮＳ」モチーフ部位は、脱アミドおよび加水分解を導く可能性があり、スクシンイミド中間体およびアスパルチルＡＳＰまたはイソＡＳＰをもたらす可能性がある。したがって、配列モチーフを操作してヒト化Ａｂ１  ＶＬ  ＣＤＲ１配列からなくした。「ＮＳ」モチーフの除去により、改善された抗体製造が可能になる。
【０３４１】
ヒト化Ａｂ１のさらなる操作により、６種の異なる抗体がもたらされた。注目すべきことに、４種はアンタゴニスト活性を保持したが、２種はアゴニスト抗体になった（ｈｕＡｂ１ｖ４およびｈｕＡｂ１ｖ３）。表１４に示されている通り、ｈｕＡｂ１ｖ４およびｈｕＡｂ１ｖ３は、ｈｕＣＤ４０レポーターアッセイによって決定される、アゴニスト活性を示したが、Ｊｕｒｋａｔ／レポーターアッセイにおいて決定される、アンタゴニスト活性は示さなかった。変異ヒト化Ａｂ１抗体（ｈｕＡｂ１ｖ１からｈｕＡｂ１ｖ６まで）のＶＨアミノ酸配列およびＶＬアミノ酸配列ならびにＣＤＲが下の表１３に記載されている。
【０３４２】
【表１３】
2019150024.tif 000021
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【０３４３】
ＶＬ  ＣＤＲ１における「ＮＳ」モチーフの改変に加えて、上の表１３に記載されている変異ｈｕＡｂ１ｖ２およびｈｕＡｂ１ｖ３は、これらのＶＨドメインにさらなるフレームワーク突然変異を有する。
【０３４４】
以下の表１４は、変異体結合、アゴニスト活性およびアンタゴニスト活性の要約を提供する。アッセイの説明は、上の実施例２において見出すことができる。以下の表１４において、ＶＬ  ＣＤＲ１内の突然変異させた「ＮＳ」モチーフに下線が引かれている。表１４に記載の通り、抗体ｈｕＡｂ１ｖ４（ＶＬ  ＣＤＲ１ドメインに「Ｐ」突然変異を含有する）およびｈｕＡｂ１ｖ３（ＶＬ  ＣＤＲ１ドメインに「Ｌ」突然変異を含有し、ＶＨ領域内にフレームワーク突然変異を含有する）は、アンタゴニスト活性を有する親抗体に由来するにもかかわらず、アゴニスト活性を示した。
【０３４５】
【表１４】
2019150024.tif 000024
【０３４６】
ヒト化抗ＣＤ４０抗体ｈｕＡｂ１ｖ１を、さらなる試験および改善のために選択した。
【０３４７】
［実施例４］：抗ＣＤ４０抗体ｈｕＡｂ１ｖ１のＨＣ  ＣＤＲ２の操作
実施例３に記載の変異体から、抗体ｈｕＡｂ１ｖ１をさらなる分析のために選択した。この抗体の効力をさらに改善するために、ＨＣ  ＣＤＲ２ドメイン内に突然変異を含有するｈｕＡｂ１ｖ１重鎖（ＨＣ）の変異体を製造した。１７種のさらなる変異体を作製した（名称ｈｕＡｂ１ｖ１ＣＤＲ２ｖ１からｈｕＡｂ１ｖ１ＣＤＲ２ｖ１７）。変異体ＨＣ領域を、アゴニスト活性およびアンタゴニスト活性を決定するための活性試験のためにｈｕＡｂ１ｖ１  ＬＣ（配列番号２０）と対合させた。１７種の変異体重鎖を作製し、インビトロ活性試験から、一般に、変異体が、ｈｕＡｂ１ｖ１と比較して、それらのアンタゴニスト活性および多様な効力を保持することが示された。表１５は、抗体変異体はアンタゴニスト活性を維持したが、各変異体の効力は変動したことを示す。
【０３４８】
【表１５】
2019150024.tif 000025
【０３４９】
全てのｈｕＡｂ１ｖ１  ＨＣ変異体は、下の表１６に記載されている通り、Ｓ５５位において突然変異させたものである（５５位に下線が引かれている）。
【０３５０】
【表１６】
2019150024.tif 000026
2019150024.tif 000027
【０３５１】
以下の表１７は、上記のｈｕＡｂ１ｖ１変異体の、Ｓ５５残基（太字／下線が引かれている）を操作した後のＨＣ  ＣＤＲ２領域の比較を提供する。ｈｕＡｂ１ｖ１のＶＨ  ＣＤＲ２領域は、配列番号１５のアミノ酸残基５０−６６に対応する。
【０３５２】
【表１７】
2019150024.tif 000028
【０３５３】
重鎖可変領域ｈｕＡｂ１ｖ１ＣＤＲ２ｖ７は、製造され、上の表１５−１７に記載されているその他の変異体と比較して特に有利な性質を有するので、これを選択した。特に、ｈｕＡｂ１ｖ１ＣＤＲ２ｖ７は、ＨＣ  ＣＤＲ２にＳ５５Ｇと同定される突然変異を有する。詳細には、抗体ｈｕＡｂ１ｖ１のＶＬ（配列番号２０；表１３参照）およびＶＨ  ｈｕＡｂ１ｖ１ＣＤＲ２ｖ７を含有する抗体が、抗体ｈｕＡｂ１ｖ１と比較して２０倍増大したアンタゴニスト活性を有することが決定された。
【０３５４】
ｈｕＡｂｖ１のＶＬおよびｈｕＡｂ１ｖ１ＣＤＲ２ｖ７のＶＨを、２種の異なるヒトＩｇＧ１定常領域に関して発現させた。１つのＩｇＧ１定常領域は、そのエフェクター機能が低下したので選択し（ｈＣｇ１、ｚ、非Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡまたはＬＡＬＡ）、その他のＩｇＧ１定常領域は、そのエフェクター機能が低下しかつＦｃＲｎ結合を増強する突然変異のセットを有したので選択した（ｈＣｇ１、ｚ、非Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ−Ｔ２５０Ｑ、Ｍ４２８ＬまたはＬＡＬＡ−ＱＬ）。以下の表１８および１９は、抗ヒトＣＤ４０抗体Ａｂ１０１（ＶＬ  ｈｕＡｂｖ１／ＶＨ  ｈｕＡｂ１ｖ１ＣＤＲ２ｖ７／ｈＣｇ１／ｋ−ＬＡＬＡ）およびＡｂ１０２（ＶＬ  ｈｕＡｂｖ１／ＶＨ  ｈｕＡｂ１ｖ１ＣＤＲ２ｖ７／ｈＣｇ１／ｋ−ＬＡＬＡ−ＱＬ）の重鎖および軽鎖についてのアミノ酸配列情報を提供する。各ＶＨ配列またはＶＬ配列の個々のＣＤＲのアミノ酸残基が太字で示されている。表１９では定常領域に下線が引かれている。
【０３５５】
【表１８】
2019150024.tif 000029
2019150024.tif 000030
【０３５６】
【表１９】
2019150024.tif 000031
2019150024.tif 000032
【０３５７】
［実施例５］：ヒト化アンタゴニスト抗ｈＣＤ４０抗体Ａｂ１０１およびＡｂ１０２の機能的特徴付け
インビトロ分析
ヒト化抗ＣＤ４０抗体Ａｂ１０１およびＡｂ１０２はどちらも、実施例１に記載のレポーターアッセイの所見と同様のアンタゴニスト活性を示した。残留するアゴニスト活性は、潜在的なリスクに関連するので、Ｂ細胞アゴニストアッセイを展開した。このアッセイでは、抗体をヒトＢ細胞におけるＣＤ８６上方制御の阻害について評価する。ヒトＢ細胞は、ＣＤ４０を構成的に発現し、ＣＤ４０を通じたシグナル伝達により、細胞表面上のＣＤ８６の上方制御によって測定される、Ｂ細胞の活性化が導かれる。Ｂ細胞を、低用量の抗ＩｇＭおよび抗ＩＬ４を用いて活性化し、ＣＤ４０アンタゴニスト抗体を添加した。Ｂ細胞活性化の増強をＣＤ８６の上方制御として測定し、これは、アゴニストＣＤ４０の存在下では観察されたがアンタゴニストＣＤ４０  Ａｂの存在下では観察されず、これにより、インビトロにおけるリード候補のアゴニスト活性が検出不可能であることが示唆される。アンタゴニスト活性を測定するために、初代ヒトＢ細胞を、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用によってＢ細胞活性化およびＣＤ８６発現の上方制御を導くＣＤ４０Ｌ発現ヒトＴ細胞株と一緒に培養した。アンタゴニストＣＤ４０の、初代ヒトＢ細胞のＣＤ８６上方制御を阻害する能力を測定し、それにより、図２Ｂに示されている通り、抗ＣＤ４０抗体Ａｂ１０１の強力なアンタゴニスト活性が示された。図２Ａは、抗体Ａｂ１０１がアゴニスト活性を有さないことを示す。特に、図２Ｂに記載の通り、アンタゴニスト抗体ＢＩｂ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）が４．２１３のＩＣ５０値を有し、アゴニスト抗体ＡＤ１１（Ａｓｔｅｌｌａｓ）が０．１９０６のＩＣ５０値を有したのと比較して、抗体Ａｂ１０１は、１．３３７のＩＣ５０値を有した。したがって、抗体Ａｂ１０１（および可変領域が同一であることを考慮してＡｂ１０２）は、ＣＤ４０の強力なアンタゴニストであり、実質的なインビトロアゴニスト活性は示さない。
【０３５８】
インビボ分析
抗体Ａｂ１０１のインビボ活性を試験するために、ヒト抗体作製およびＢ細胞生存のモデルを確立した。手短には、健康なドナーから単離されたヒトＰＢＭＣを免疫無防備状態のｓｃｉｄマウスに移入したところ、１４日後に、マウス抗原に応答したヒトＩｇＧの産生が測定可能であった。さらに、これらのマウス由来の脾細胞のＦＡＣＳ分析により、ヒトＢ細胞の生着および生存が示された。抗原特異的応答を、破傷風トキソイド（ＴｅｔＴｏｘ）ワクチンを用いた攻撃を含め、抗ＴｅｔＴｏｘ特異的ＩｇＧを測定することによって測定した（Ｎａｉｔｏ、２０００年；Ｊｅｕｒｉｓｓｅｎ、２００４年）。
【０３５９】
これらのｈｕｓｃｉｄマウスを抗ヒトＣＤ４０（Ａｂ１０１、５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）の週に１回の投薬で処置することにより、ヒトＩｇＧ産生（図３Ａ）およびＢ細胞生存（図３Ｂ）の＞８５％阻害がもたらされ、これにより、抗体がインビボにおいて活性であることが明白に実証される。詳細には、図３Ａは、抗体Ａｂ１０１が、Ｉｇ対照と比較してＩｇＧ産生を阻害することができたことを示し、図３Ｂは、上記のｈｕｓｃｉｄモデルにおける抗体Ａｂ１０１の投与により、Ｂ細胞生存が阻害されたことを示す。
【０３６０】
［実施例６］：Ｆａｂ  Ａｂ１０２のエピトープ分析
Ｆａｂ  Ａｂ１０２を使用して、Ｆａｂ  Ａｂ１０１が結合するエピトープを決定するために結晶学的試験を実施した。上記の通り、抗体Ａｂ１０１とＡｂ１０２のＶＨ配列およびＶＬ配列は同じであり、したがって、以下の結晶構造試験におけるＦａｂ  Ａｂ１０２の使用は、抗体Ａｂ１０１およびＡｂ１０２の両方の結合特徴を表す。
【０３６１】
Ａｂ１０２  Ｆａｂ単独についておよびＡｂ１０１  ＦａｂとＣＤ４０抗原との複合体について結晶構造を決定した。結晶を得、ＩＭＣＡ−ＣＡＴ  １７ＩＤ  ｂｅａｍｌｉｎｅでデータを収集した。Ａｂ１０２  Ｆａｂの結晶構造は１．７４Åの分解能まで解析され、Ａｂ１０２  Ｆａｂ／ＣＤ４０複合体構造は２．８４Åの分解能まで解析された。結晶構造により、Ａｂ１０２  Ｆａｂの３Ｄ立体構造エピトープの同定がもたらされた。
【０３６２】
Ａｂ１０２  Ｆａｂの３Ｄ立体構造エピトープの同定
Ａｂ１０２  ＦａｂとＣＤ４０との間の接触には、界面を安定化する重要な水素結合および疎水性相互作用の両方を伴う。分子接触の一覧（４．０Åの下で測定）を、ＣＣＰ４  ｓｕｉｔｅ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒａｍｓ中のプログラムＮＣＯＮＴを使用して作成した。２つの別々の結晶学的ＣＤ４０単量体と対応する結合したＡｂ１０２  Ｆａｂの軽鎖および重鎖との間の接触を測定した。Ａｂ１０２  Ｆａｂと結晶学的ＣＤ４０二量体（結晶の接触によって作製された二量体）との間にさらなる接触が観察された。この情報に基づいて、Ａｂ１０２  Ｆａｂ結合に関するエピトープは、ＣＤ４０のＣｙｓ６２−Ｐｈｅ６７、Ｇｌｎ７９−Ｃｙｓ８３、Ａｒｇ９０−Ｔｈｒ９９、Ｔｈｒ２４−Ｃｙｓ３７によって定義されるトポグラフィー的領域で構成される。
【０３６３】
材料および方法
ＣＤ４０抗原の調製および精製：
ヒトＣＤ４０細胞外ドメイン（アミノ酸１−１９３）をコードするＤＮＡ配列およびその後にインフレームで続くＣ末端Ｔｅｖプロテアーゼ切断部位およびヘキサヒスチジンタグ（配列番号１１５）を、ｐＨｙｂＥベクターにクローニングした。プラスミドを、トランスフェクション試薬ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ）をＰＥＩ：ＤＮＡ比４：１で使用し、ＨＥＫ２９３  ６ｅ細胞（ＭＲＬ）に１ｍｌ当たり細胞１×１０６個でトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間の時点で、トランスフェクトされた細胞培養物にトリプトン−Ｎ１を供給した（０．５％まで）。トランスフェクション後７日目に、トランスフェクトされた細胞培養を、遠心分離し、その後、０．２ｕのＰＥＳフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を通して濾過することによって清澄化した。清澄化された培地を、１０ｋＤａの膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたＫｖｉｃｋ  ＴＦＦシステムを使用してバッファーをＰＢＳ、ｐＨ７．４に換え、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で平衡化されたＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）５ｍｌにローディングした。カラムをＰＢＳ、ｐＨ７．４中２５ｍｍのイミダゾールで洗浄し、結合したタンパク質をＰＢＳ、ｐＨ７．４中２５０ｍＭのイミダゾールを用いて溶出した。溶出したタンパク質を、１０ｋＤａの分子量カットオフを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心濾過デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮し、平衡化およびランにＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いた２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＳＥＣによってさらに精製した。ＣＤ４０を含有する画分をプールし、濃度を２８０ｎｍにおける吸光度によって測定し、試料をＳＥＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析によって分析した。［ＣＤ４０（ｈ）（２１−１９３）］−Ｔｅｖ−Ｈｉｓ６（配列番号１１５として開示されている「Ｈｉｓ６」）を一定分量にして−８０℃で貯蔵した。
【０３６４】
ＣＤ４０  Ａｂ１０２  Ｆａｂ断片の調製および精製：
ＣＤ４０  Ａｂ１０２のＦａｂ断片を、以下に詳述されている通り、親ｍＡｂのパパイン切断によって調製した。パパインを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４バッファー中５０ｍＭのシステインを用いて活性化した。ＰＢＳ、ｐＨ７．４バッファー中ｍＡｂ  ＣＤ４０  Ａｂ１０２  ［ｈｕ  ＩｇＧ１／ｋ］ＬＡＬＡ  ＱＬとパパインをパパイン対ｍＡｂの重量比１：１００で混合し、３７℃で１時間インキュベートした。５ｍＭのヨードアセトアミドを用いて反応をクエンチした。混合物を１０ｍｌのＭａｂ  ＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ  ｒｅｓｉｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、Ｆａｂ断片をフロースルーとして採取した。Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−１５  Ｂｉｏｍａｘ  １０ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）遠心分離デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してフロースルーを濃縮した。濃縮された混合物を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５バッファー中に予め平衡化した２．６ｃｍ×６０ｃｍのＳｅｐｈａｃｒｙｌ  ２００  ＨｉＰｒｅｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。Ｆａｂ断片を含有する画分（２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収によってモニタリングされる）をプールし、−８０℃で凍結させた。試料純度を分析用ＳＥＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析によって評価した。
【０３６５】
ＣＤ４０／ＣＤ４０  Ａｂ１０２  Ｆａｂ複合体調製物：
組換えヒトＣＤ４０を哺乳動物発現系において発現させ、その後、当技術分野で周知の技法を使用して精製した。組換えヒトＣＤ４０およびＣＤ４０  Ａｂ１０２  Ｆａｂタンパク質を１．１：１のモル比で混合し、４℃で４時間インキュベートした。複合体試料を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５バッファーで予め平衡化した２．６ｃｍ×６０ｃｍのＳｅｐｈａｃｒｙｌ  ２００  ＨｉＰｒｅｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に毎分１ｍｌでローディングした。複合体を含有する画分（２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収によってモニタリングされる）をプールし、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−１５  Ｂｉｏｍａｘ  １０ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）遠心分離デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して１８ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。試料純度を分析用ＳＥＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。
【０３６６】
Ａｂ１０２  Ｆａｂ結晶化：
Ｆａｂを単独で、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５中２２．５ｍｇ／ｍｌで供給した。結晶を２３℃で蒸気拡散法によって成長させた。リザーバーは、２５％（ｗ／ｖ）ＰＭＭＥ５５０、０．１ＭのＭＥＳ、ｐＨ６．５、０．０１Ｍの硫酸亜鉛を含有した。ドロップを、等体積のタンパク質およびリザーバー溶液を添加することによって作製した。結晶は厚い柱として成長し、これを、リザーバー溶液を使用し、１０％（ｖ／ｖ）プロピレングリコールを添加して凍結保護した。結晶を回収し、凍結溶液に入れて振り、液体窒素中で直接凍結冷却した。１．７４Åまでの回析データを、Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｒｇｏｎｎｅ  ＩＬ）、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅにおいて、１７ＩＤ  ｂｅａｍｌｉｎｅ、１００Ｋで気体窒素の下で採取した。
【０３６７】
Ａｂ１０２  ＦａｂとＣＤ４０抗原の複合体の結晶化：
Ｆａｂ複合体を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５中１８ｍｇ／ｍｌで供給した。使用した抗原構築物は、［ＣＤ４０（ｈ）（２１−１９３）］−ＴＥＶ−６Ｈｉｓ（配列番号１１５として開示されている「Ｈｉｓ６」）であった。結晶を２３℃で蒸気拡散法によって成長させた。リザーバーは、２Ｍの硫酸アンモニウム、０．１Ｍのリン酸クエン酸、ｐＨ４．２を含有した。等体積のタンパク質およびリザーバー溶液を添加することによってドロップを作製した。結晶は細い棒として成長し、これを、２．５Ｍの硫酸リチウムを使用して凍結保護した。結晶を回収し、凍結溶液に入れて振り、液体窒素中で直接凍結冷却した。２．８４Åまでの回析データを、Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｒｇｏｎｎｅ  ＩＬ）、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅにおいて、１７ＩＤ  ｂｅａｍｌｉｎｅ、１００Ｋで気体窒素の下で採取した。
【０３６８】
Ａｂ１０２  ＦａｂおよびＡｂ１０２  ＦａｂとＣＤ４０の複合体の構造決定
両方の結晶構造についての回析データを、Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｈａｓｉｎｇ  ＬｔｄからのプログラムａｕｔｏＰＲＯＣを使用して処理した。
【０３６９】
Ａｂ１０２  Ｆａｂデータセットを、以下の単位格子の寸法：ａ＝６４．６５、ｂ＝１３０．４、ｃ＝１３２．６を有する空間群Ｃ２２２１で処理した。最も可能性の高い分子置換の解を、プログラムＰＨＡＳＥＲを使用し、以前に報告されたＦａｂ検索モデル（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｅｎｔｒｙ  ３Ｑ０Ｓ）を使用して決定した。１つのＦａｂ分子についての座標が分子置換の解に基づいて作製された。得られた溶液の予備精密化を、ＲＥＦＭＡＣおよびプログラムＢＵＳＴＥＲを使用して行った。反復的なタンパク質モデル構築を、プログラムＣＯＯＴならびに２Ｆｏ−ＦｃおよびＦｏ−Ｆｃ電子密度マップの調査を使用して行った。精密化を、ＢＵＳＴＥＲを使用した水分子の付加で終えた。最終的な精密化の統計値により、Ｒｆｒｅｅ／Ｒｗｏｒｋ値が０．２３／０．１９であることが報告された。
【０３７０】
Ａｂ１０２  ＦａｂとＣＤ４０との複合体のデータセットを、以下の単位格子の寸法：ａ＝１７３．３、ｂ＝７６．０、ｃ＝１２６．１を有する空間群Ｐ２１２１２で処理した。最も可能性の高い分子置換の解を、プログラムＰＨＡＳＥＲを使用し、上で報告した予め解を得られてたＡｂ１０２  Ｆａｂを使用して決定した。分子置換の解に基づいて、２つのＦａｂ分子についての座標が見出された。得られた溶液の予備精密化を、ＲＥＦＭＡＣおよびプログラムＢＵＳＴＥＲを使用して行った。ＣＤ４０についてのモデルを、プログラムＣＯＯＴならびに２Ｆｏ−ＦｃおよびＦｏ−Ｆｃ電子密度マップの調査を使用して手動で構築した。精密化を、ＢＵＳＴＥＲを使用した水分子の付加で終えた。最終的な精密化の統計値により、Ｒｆｒｅｅ／Ｒｗｏｒｋ値が０．２５／０．２０であることが報告された。
【０３７１】
［実施例７］：単球活性化アッセイにおけるＡｂ１０２の中和力およびアゴニスト活性
本実施例では、以下の方法を使用し、インビトロにおけるＡｂ１０２のアンタゴニスト活性およびアゴニスト活性を調査した。
【０３７２】
アンタゴニストアッセイ：Ａｂ１０２の、ＣＤ４０媒介性単球活性化を遮断する能力をアンタゴニストアッセイにおいて評価した。精製された単球を、１μｇ／ｍＬのＭＥＧＡＣＤ４０Ｌ（Ｅｎｚｏ）と、８０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦおよび８０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγの存在下、２×１０６個／ｍＬの濃度で混合した。９６ウェルＵ底組織培養（ＴＣ）プレートにウェル当たり５０μＬを添加した。試験された材料の希釈物を培養培地中に調製し、希釈物５０μＬをドナーから得られたヒト単球に添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２日間培養した後、上清を、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）イムノアッセイプラットフォームを使用したサイトカイン（ＴＮＦ）分析のために回収した。
【０３７３】
アゴニストアッセイ：Ａｂ１０２の、ＣＤ４０を通じて単球活性化を誘導する能力を評価した。ＭＥＧＡＣＤ４０Ｌ（Ｅｎｚｏ）を単球活性化についての陽性対照として使用した。精製されたヒト単球を、培養培地中、８０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦおよび８０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγの存在下、２×１０６個／ｍＬまで希釈し、９６ウェルＵ底ＴＣプレートに５０μＬ／ウェルを添加した。試験された材料の希釈物を培養培地中に調製し、希釈物５０μＬを単球に添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２日間培養した後、上清を、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）イムノアッセイプラットフォームを使用したサイトカイン（ＴＮＦ）分析のために回収した。
【０３７４】
骨髄細胞は、クローン病の病理発生において重要な役割を果たすので、上記の単球に基づくアッセイを展開してＡｂ１０２の機能活性を評価した。ＣＤ４０シグナル伝達により単球の活性化、およびそれにより、ＴＮＦのような炎症性サイトカインの産生が誘導される。Ａｂ１０２についての代表的な単球アンタゴニストおよびアゴニストアッセイがそれぞれ図５Ａおよび５Ｂに示されている。図５Ａに示されている通り、Ａｂ１０２により、ＴＮＦの発現が濃度依存的に遮断された。アゴニストアッセイ形式では、可溶性ＣＤ４０Ｌにより、単球からのＴＮＦの産生が１．９ｎＭのＥＣ５０で誘導されたが、Ａｂ１０２では、２００ｎＭの濃度まででＴＮＦ産生は誘導されなかった。図５Ｂに記載の通り、ＴＮＦのＡｂ１０２レベルは陰性対照（関連しないＩｇＧ）のものと同様であり、これにより、検出可能なＴＮＦ産生がわずかであるまたは存在しないことが示される。３者の異なるドナーから、以下の表２０に示されているＩＣ５０値を有する一貫する結果が得られた。
【０３７５】
【表２０】
2019150024.tif 000033
【０３７６】
つまり、上記のアンタゴニストアッセイおよびアゴニストアッセイの両方においてＡｂ１０２を試験した結果から、Ａｂ１０２が、測定可能なアゴニスト活性を有さない、アゴニスト活性を実質的に有さないアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体であることが示された。
【０３７７】
［実施例８］：Ａｂ１０２の交差反応性
Ａｂ１０２の、種々の種に由来するＣＤ４０との交差反応性を試験した。標準の技法を使用して、Ａｌｅｘａ６４７で標識されたＡｂ１０２では、Ｂ細胞の表面上のヒトＣＤ４０とカニクイザルＣＤ４０のどちらに対しても同様の結合速度論が実証され、以下の表２１に示されている通り、ＥＣ５０値はヒト細胞に対しては０．８９±０．１７ｎＭであり、カニクイザル細胞に対しては１．４±０．１５ｎＭであった。Ａｂ１０２のマウスＣＤ４０、ラットＣＤ４０およびウサギＣＤ４０との結合は、３０μｇ／ｍＬ（２００ｎＭ）までの濃度では検出することができなかった。
【０３７８】
【表２１】
2019150024.tif 000034
【０３７９】
つまり、標準の結合アッセイを使用して、Ａｂ１０２は、ヒトＣＤ４０およびカニクイザルＣＤ４０には結合したが、マウスＣＤ４０、ラットＣＤ４０またはウサギＣＤ４０との検出可能な結合は示されなかった。
【０３８０】
［実施例９］：Ｔ細胞移入大腸炎を治療するための、マウス抗ＣＤ４０抗体１３８の使用
以下の方法をインビボ試験において使用して、マウス抗ＣＤ４０抗体（抗体１３８）の大腸炎を治療する能力を決定した。抗マウスＣＤ４０抗体１３８は、Ａｂ１０２と同様の特徴を有し、例えば、抗体１３８は、Ａｂ１０２と同じく実質的なアゴニスト活性を有さないアンタゴニスト抗体である。したがって、抗体１３８は、実施例９のマウスモデルにおけるＡｂ１０２活性を表すものである。以下にインビボ大腸炎のＴ細胞移入モデルを記載する。
【０３８１】
ナイーブＴ細胞の単離および注射
０日目に、ｂａｌｂ／ｃマウスから脾臓を採取し、氷上の４％ウシ胎仔血清（完全培地）を補充したＲＰＭＩ培地に入れた。単一細胞懸濁液を機械的破壊によって得、１００μｍの細胞濾過器を通過させて、４％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ培地（完全培地）に入れた。細胞を遠心分離（４℃、１２５０ｒｐｍで１０分）によって採取し、Ｒｏｂｏｓｅｐ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁させた。細胞濃度を、Ｍｏｘｉ  Ｍｉｎｉ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｏｒｆｌｏ）を使用して測定し、Ｒｏｂｏｓｅｐバッファー中１ｍＬ当たり細胞１×１０８個に調整した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、負の選択磁気ビーズキット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造業者の指示に従って単離した。細胞をＦＡＣＳによってさらに精製して、それぞれ細胞のなかで最も鮮やかな４２％および最もくすんだ１２％として採取された、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈの集団およびＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｌｏｗの集団を得た。細胞を計数し、１ｍｌ当たり細胞１×１０６個に調整し、０．５ｍＬ（細胞１×１０５個）をＳＣＩＤマウスの腹腔内（ＩＰ）に注射した。
【０３８２】
処置
次いで、マウス抗ＣＤ４０抗体１３８を、細胞注射時（予防的処置）または疾患が内視鏡検査によって確認された後（治療的処置）に開始して、ＰＢＳ中様々な用量で１週間に２回、ＳＣＩＤマウス（上記）にＩＰ投与した。さらに、いくつもの対照群を含めた。群は、１）抗体９５１（関連しないＩｇＧ）、ＰＢＳ中１５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、１週間に２回、または２）抗体１３８（ＣＤ４０Ｌを遮断する抗体）、ＩＰ、ＰＢＳ中、１週間に２回のいずれかを受けた。さらに、Ｔ細胞移入（ＴＣＴ）試験において、抗ｐ４０（ＩＬ−１２／２３）抗体または抗ＴＮＦモノクローナル抗体のいずれかを臨床的に意義のある対照比較物として投与した。
【０３８３】
内視鏡検査
マウスへの細胞注射後の種々の時点で、疾患を結腸内視鏡検査によって評価した。イソフルランを用いた麻酔後、柔軟な強制飼養針を肛門にゆっくりと挿入し、ＰＢＳ  ３００μＬをゆっくりと注入して糞便ペレットを除去した。動物を麻酔から回復させ、歩き回らせて、残りのペレットすべてが通過するのを容易にした（およそ５分）。マウスを再度イソフルランで麻酔し、内視鏡検査プローブ（Ｋａｒｌ  Ｓｔｏｒｚ）を肛門に深さ３ｃｍまで挿入した。写真画像を肛門縁から３ｃｍ、２ｃｍおよび１ｃｍの所で捕捉した。画像を後で以下の表２２に詳述されている尺度を使用してスコア化した。３つの距離のそれぞれにおける各パラメータについてのスコアを合わせて、表２２に示されているＭｕｒｉｎｅ  Ｅｎｄｏｓｃｏｐｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ（ＭＥＤＡＩ）合計スコアをもたらした。ＭＥＤＡＩ合計スコアを使用して得ることができる最大スコアは２４であった。
【０３８４】
治療的投薬の場合では、細胞注射の３週間後の内視鏡検査スコアリングを使用して疾患を確認し、動物を処置に関して群分けした。
【０３８５】
【表２２】
2019150024.tif 000035
【０３８６】
組織学的検査
ＧＩ試料をカセット中に分節を伸ばした全結腸の方向に入れ、それにより結腸全体の長さの分析を可能にし、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）のために処理した。ブロックを５ミクロンに切片作製し、ガラススライドに載せた後、免疫組織化学的検査を実施して、抗ＩＢＡ１抗体を使用してカルシウムイオン結合アダプター分子１（ＩＢＡ１）を検出した（カタログ番号０１９−１９７４１；Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）。ＩＢＡ１マーカーを使用して組織切片中のマクロファージを同定した。スライドをメチルグリーンで対比染色し、脱水し、カバーガラスに載せた。
【０３８７】
次いで、スライドを、Ｖｅｃｔｒａイメージングシステムによって４×でスキャンし、４×低拡大モザイク画像を再調査した後、２０×で画像化する領域を選択した。
【０３８８】
次いで、Ｖｅｃｔｒａイメージングで再スキャンしたスライドおよび捕捉し選択した２０×高拡大高分解能画像を、ｉｎＦｏｒｍソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）における画像解析アルゴリズムに供した。使用されたｉｎＦｏｒｍアルゴリズムセットは、３つのアルゴリズムを有する：バックグラウンド／無関係の染色を排除するための、スペクトルにより画像処理されファイルでのＩＢＡ１およびＣＤ３についての染色の第１の閾値。その後のアルゴリズムにより、組織は対象とする組織（固有層、上皮、筋、粘膜下組織およびバックグラウンド）に分割され、第１のアルゴリズムから作成されるＲＧＢ画像でＣＤ３またはＩＢＡ１が定量化される。
【０３８９】
ＩｎＦｏｒｍデータをテキストファイルにエクスポートし、それを、組織分割データまたは細胞分割データのいずれかについての単一のデータファイルに統合した。
【０３９０】
急性モデルにおけるアンタゴニスト活性の検証に基づいて、慢性大腸炎のモデルを使用して概念実証を確立した。ナイーブＴ細胞を免疫無防備状態の宿主（ＳＣＩＤマウス）に移入した後の大腸炎の遮断の影響を試験するために３つの試験を行った。単一用量レベルを予防的処置様式および治療的処置様式の両方で調査し、一方、完全な用量反応を予防的様式で検査した。
【０３９１】
細胞移入時に投与されたマウス抗ＣＤ４０抗体１３８の用量反応
予防的に投与されたマウス抗ＣＤ４０抗体１３８の用量反応を、大腸炎のＴ細胞移入モデルを使用して決定した。種々の用量（０．５ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇ）を含む処置を細胞移入時に開始した。１．５ｍｇ／ｋｇまで下げた用量により、ＭＥＤＡＩ合計スコアの最大の阻害がもたらされたが、０．５ｍｇ／ｋｇでは有意な効果はなかった。マウス抗ＣＤ４０抗体１３８の活性は、陽性対照として使用された抗ｐ４０ＩＬ−１２／２３による処置の標準用量と同等であった。結腸切片の組織学的分析により、マクロファージの減少（炎症の一般的な測定基準）が示され、これは、図６および図７に記載の通り、疾患の内視鏡的評価とよく相関するものであった。詳細には、図６には、３９日目（最終スコア）における、マウス抗ＣＤ４０抗体１３８の予防的投与に伴う内視鏡検査スコアの用量反応阻害が記載されている。図６において、ＲＢｌｏｗは陰性対照群を指す。ＣＤ４５ＲＢｌｏｗ細胞は疾患を媒介しない。この大腸炎のモデルでは、疾患は、動物に移入されたＣＤ４５ＲＢｈｉ細胞によって媒介される。図７には、マウスの結腸内のＩＢＡ１＋マクロファージの数（組織学的に決定されたもの）が示されており、０．５ｍｇ／ｋｇを超える用量においてマクロファージのレベルがより低く、ｐ４０陽性対照よりも低いことが記載されている。
【０３９２】
循環マウス抗ＣＤ４０抗体１３８のレベルを最後の投薬の９６時間後に測定し（Ｃｔｒｏｕｇｈと同等である）、図８に記載の通り、用量反応性であることが示された。最低用量レベル（０．５ｍｇ／ｋｇ）では、この群の動物１匹を除く全てで定量化の下限（ＬＬＯＱ）を下回る濃度がもたらされた。
【０３９３】
細胞移入の３週間後に投与されたマウス抗ＣＤ４０抗体１３８の用量反応
マウス抗ＣＤ４０抗体１３８による処置を細胞注射の３週間後、内視鏡的疾患の確認後に開始したところ、ＭＥＤＡＩ合計スコアの用量反応性阻害が観察され、最高用量（１５ｍｇ／ｋｇ）では統計的有意性に達した（図９Ａ）。図９Ｂに記載の通り、骨髄炎の測定基準としての結腸内のＩＢＡ１＋マクロファージの組織学的分析により、同様の結果がもたらされた。最後の投薬の７２時間後に測定された抗体１３８の平均血清中濃度は、１５ｍｇ／ｋｇを受けた動物では１９１．９μｇ／ｍｌであった。
【０３９４】
［実施例１０］：カニクイザルにおけるＴ細胞依存性抗体応答
Ｔ細胞依存性抗体応答（ＴＤＡＲ）アッセイをカニクイザルにおいて行った。２匹／性別／群にＡｂ１０２を０ｍｇ／ｋｇ（ビヒクルのみ）または１０ｍｇ／ｋｇ投与量で５週間にわたって皮下（ＳＣ）投与した。８日目に、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を全ての動物に投与した。ＫＬＨ投与に対して−１１日目、−７日目、０日目、４日目、７日目、１０日目、１４日目および２１日目に、各動物から血清試料を採取した。全ての動物を、最後の予定された血液採取が完了した後に試験設備動物コロニーに戻した（図１０）。
【０３９５】
図１０に示されている通り、Ａｂ１０２により、抗ＫＬＨ  ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体Ｔ細胞依存性抗体応答のどちらも、ビヒクルのみで処置された動物と比較して抑制されることが見出された。
【０３９６】
この試験における所見は、原型外来タンパク質の非経口投与後のＣＤ４０依存性ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体産生の薬理的抑制と一致した。結果から、Ａｂ１０２の使用が、自己抗体の産生が疾患の一部であるループスの治療と関連性があり得ることが示唆された。これらの所見から、カニクイザルの、前臨床的毒性学試験のための適切な種としての生物学的関連性も支持される。さらに、試験により、カニクイザルＣＤ４０との交差反応性が実証され、ＣＤ４０を必要とすることが分かっている機構（Ｔ依存性抗体応答）におけるＡｂ１０２のインビボ活性が示された。
【０３９７】
［実施例１１］：全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を治療するための、マウス抗ＣＤ４０抗体１３８の使用
マウス抗ＣＤ４０抗体１３８のアンタゴニスト活性が上記の急性モデルおよび大腸炎のモデル（実施例９を参照のこと）において示されたので、このマウス抗ＣＤ４０抗体の有効性を全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のマウスモデルにおいて調査した。２種のＳＬＥモデルを使用した：ＭＲＬ／ｌｐｒおよびＮＺＢ／Ｗ−Ｆ１（ＴｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓおよびＫｏｎｏ．１９９９年、Ｍｕｒｉｎｅ  ｌｕｐｕｓ  ｍｏｄｅｌｓ：ｇｅｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｉｎ  Ｌａｈｉｔａ  Ｒ．Ｇ．編、Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｌｕｐｕｓ  Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ、第３版、１４５頁に記載されている）。ＭＲＬ／ｌｐｒマウスおよびＮＺＢ／Ｗ−Ｆ１マウスにおいて抗ＣＤ４０による処置の有効性を評価する理論的根拠は２つある。第１に、これらのモデルは、ＳＬＥの顕在化が異なる。ＮＺＢ／Ｗ−Ｆ１マウスではループス腎炎および唾液腺炎を自然発症するが、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスでは、腎炎および唾液腺炎に加えて関節および皮膚での徴候を発症する（Ａｎｄｒｅｗｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４８：１１９８−１２１５頁、１９７８年）。患者はＳＬＥの顕在化が異なるので、両方のモデルを使用することにより、大多数のＳＬＥ患者における潜在的有効性を評価することが可能になる。第２に、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスおよびＮＺＢ／Ｗ−Ｆ１マウスでは、これらの疾患の遺伝学的基礎が異なり（Ｐｅｒｒｙら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１１年、Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ２７１６９４）、したがって、モデル間にまたがる有効性により、遺伝的に均一ではないヒトに置き換える際の信頼度が増す。
【０３９８】
１１．１．ＳＬＥのＭＲＬ／ｌｐｒモデル
有効性を決定するために、マウスに、マウス抗ＣＤ４０抗体１３８を、１０週齢で開始して、以下の表２３に示されている用量で、腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によって投与した。本試験では、ＰＢＳ注射を陰性対照として使用し、プレドニゾロンを陽性対照として使用した。
【０３９９】
【表２３】
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【０４００】
タンパク尿を週に１回Ａｌｂｕｓｔｉｘ（尿中タンパク質を検査するために使用される尿試験紙の商標）によってモニタリングした。図１１Ａに示されている通り、≧３００ｍｇ／ｄＬと定義される高タンパク尿は治療開始直後に発症し始めた。図１１Ａに記載の通り、６３日目の試験完了までに、無処置ＰＢＳ対照マウスおよび１．５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ４０抗体を用いて処置されたマウスの５０−６０％で高タンパク尿が発症した。対照的に、その他の処置群のほぼ全てのマウスでは、試験全体を通して低タンパク尿が維持された。１５ｍｇ／ｋｇで１週間当たり１回の処置群は、ＰＢＳ対照とは有意に異なった。生存もモニタリングし、図１１Ｂに示されている通り、１５ｍｇ／ｋｇを１週間当たり１回および５ｍｇ／ｋｇを１週間当たり２回の投薬により、無処置ＰＢＳ対照動物と比較して生存が有意に延長されることが見出された。多くのマウスが、腎炎が発症する前にＦａｓｌｐｒ突然変異によって引き起こされるリンパ節腫脹によって窮迫が引き起こされたことにより、安楽死を受けたことに留意するべきである。したがって、観察された生存の減少は、腎炎だけに帰するものではない可能性がある。それにもかかわらず、これらのデータから、抗ＣＤ４０抗体により、用量依存的に、ループスになりやすいＭＲＬ／ｌｐｒマウスのタンパク尿が予防され、生存が延長することが示される。
【０４０１】
ＳＬＥの治療に関する抗ＣＤ４０抗体の有効性について、種々の処置群からのマウスの腎臓、唾液腺および足首関節に由来するヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色で染色されたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片においても評価した。対照無処置ＰＢＳマウスにおける全ての試験器官における疾患の重症度が９週間の試験にわたって、ＭＲＬマウスが開始時の１０週齢から終了時の１９週齢まで加齢するにしたがい、増大した。
【０４０２】
腎臓では、図１２Ａに示されている通り、抗ＣＤ４０抗体による処置は、１５ｍｇ／ｋｇで投与した場合に、治療の２９日目および６３日目の両方において、糸球体疾患の低減において効果的であった。糸球体疾患の重症度は加齢ＭＲＬマウスで悪化したことから、抗ＣＤ４０抗体による処置の糸球体疾患の最小化に関する有効性は５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇで維持された。１５ｍｇ／ｋｇ用量で週に１回与えられた抗ＣＤ４０抗体は、週に２回の投薬と同様に有効であった。５ｍｇ／ｋｇの用量で週に２回与えられた抗ＣＤ４０抗体もほぼ同じ効果を有した。図１２Ｂに示されている通り、５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇの用量で与えられた抗ＣＤ４０抗体は、２９日目および６３日目において、腎臓における血管周囲の（ＰＶ）浸潤を低減させるのに有効であり、図１２Ｃに示されている通り、疾患の初期に尿細管間質性（ＴＩ）が低減する傾向があった。
【０４０３】
唾液腺では、１．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇの用量で与えられた抗ＣＤ４０抗体が２９日目において唾液腺炎の低減に効果的であり、１５ｍｇ／ｋｇでは、療法の６３日目に有効性が維持されていた（図１３Ａ）。無処置マウスでは、２９日後に唾液腺浸潤は有意には変化しなかった。
【０４０４】
足根関節組織では、１．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇの用量で投与された抗ＣＤ４０抗体が２９日目に関節周囲の炎症の低減に効果的であり、１５ｍｇ／ｋｇでは、療法の６３日目に有効性が維持されていた（図１３Ｂ）。関節では、炎症は１９週齢のマウスにおいて１０週齢のマウスと比較して低減する傾向があった。それにもかかわらず、抗ＣＤ４０抗体による処置により、１５ｍｇ／ｋｇで、療法の６３日目には炎症がほぼゼロにまで有意に低減された。
【０４０５】
胚中心（ＧＣ）形成には、ＧＣ  Ｂ細胞上のＣＤ４０と濾胞型ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ）上のＣＤ４０Ｌの会合を通じたＢ細胞およびＴ細胞相互作用が必要である。ＧＣは、形質細胞およびメモリーＢ細胞が生成し、また、親和性成熟およびＩｇクラススイッチが起こる、解剖学的構造である。ＧＣは、ＳＬＥにおける高親和性および病原性自己抗体の発生に欠かせないものである。
【０４０６】
マウス抗ＣＤ４０抗体１３８により、Ｂ細胞およびＴ細胞相互作用が不安定化し、ＧＣ形成が妨げられる。ＧＣ形成が妨げられる程度を評価するために、脾臓内のＧＣ  Ｂ細胞およびＴｆｈ細胞の数をフローサイトメトリーによって決定した（図１４）。Ｔｆｈ細胞数は、用量にかかわらず、抗ＣＤ４０抗体１３８で処置されたマウスの全てで、２９日目において対照よりも有意に少なかった。試験された用量の中で、５ｍｇ／ｋｇ用量群では、６３日目において対照と比較して有意に少ないままであった（図１４、パネル（ｉ）および（ｉｉ）を参照されたい）。ＧＣ  Ｂ細胞も、全ての抗ＣＤ４０抗体用量で２９日目において対照よりも少なく、抗ＣＤ４０抗体を５ｍｇ／ｋｇの用量で受けたマウスおよび１５ｍｇ／ｋｇの用量で受けたマウスでは６３日目においても少ないままであった。しかし、これらの無処置対照からの差異は統計的に有意ではなかった。この結果にもかかわらず、全ての用量群においてデータが治療効果に向かう全体的な傾向があった。さらに、これらの実験では、マウス抗ＣＤ４０抗体によるアゴニスト活性はわずかであるかまたはないことが実証された。
【０４０７】
マウスＳＬＥおよびヒトＳＬＥでは、自己反応性抗体のレベルに加えて循環総ＩｇＧレベルも経時的に上昇する。したがって、抗ＣＤ４０抗体１３８の抗体産生に対する効果を評価するために、総循環ＩｇＭおよびＩｇＧレベルを調査した。さらに、一般的なループス関連自己抗体である抗ｄｓＤＮＡ抗体も調査した。図１５Ａに記載の通り、２９日目において、抗ＣＤ４０抗体を１５ｍｇ／ｋｇおよび１．５ｍｇ／ｋｇの用量で用いて処置されたマウスにおける総ＩｇＧレベルが無処置対照におけるものよりも有意に低いことが見出された。図１５Ｂに記載の通り、抗ＣＤ４０抗体１３８を１５ｍｇ／ｋｇで用いて処置されたマウスでは、有意に低い総ＩｇＧレベルが６３日目まで持続された。さらに、この時点では、抗ＣＤ４０抗体１３８を５ｍｇ／ｋｇで用いて処置されたマウスにおいても有意により低いレベルが観察された。循環ＩｇＭレベルにおいて差異は見出されなかった。
【０４０８】
図１６Ａに記載の通り、抗ｄｓＤＮＡ力価は、２９日目において、抗ＣＤ４０抗体１３８で処置されたマウスおよび処置されていない対照マウスで有意に異ならなかった。しかし、図１６Ｂに記載の通り、６３日目までに、無処置対照マウスでは抗ｄｓＤＮＡ力価が実質的に増大したが、１５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ４０抗体１３８を用いて処置されたマウスおよび５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ４０抗体１３８を用いて処置されたマウスでは、差異は有意でなかったが、低下した。
【０４０９】
上記の試験（実施例１１．１）から得られた結果から、抗ＣＤ４０抗体１３８が、ループスになりやすいＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける腎炎の発症の予防に効果的であることが示される。さらに、抗ＣＤ４０抗体１３８により、唾液腺および関節の炎症の発症が妨げられた。この試験により、Ａｂ１０２と同様の性質を有するアンタゴニストマウス抗ＣＤ４０抗体１３８がヒトＳＬＥの治療に効果的であることが示唆される。
【０４１０】
１１．２．ＳＬＥのＮＺＢ／Ｗ−Ｆ１マウスモデル
ＳＬＥの第２のマウスモデルも試験して、アンタゴニストマウス抗ＣＤ４０抗体１３８が当該疾患の治療に有効であるかどうかを決定した。詳細には、抗ＣＤ４０抗体１３８の有効性を決定するために、抗体を、ＮＺＢ／Ｗ−Ｆ１マウスにおいて試験し、ここで、以下の表２４に記載されている投薬スケジュールに従って、予防レジメンおよび治療レジメンの両方を使用した。試験１１．１と同様に、ＰＢＳが陰性対照としての機能を果たし、プレドニゾロンが陽性対照であった。
【０４１１】
【表２４】
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【０４１２】
予防的レジメンについては、マウスの処置を２６週齢で開始した。全てのマウスが＜３００ｍｇ／ｄＬのタンパク質を有することを検証した。治療レジメンについては、段階的組み入れ（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｅｎｒｏｌｌｍｅｎｔ）を使用した；無処置マウスを週に１回タンパク尿についてモニタリングし、≧３００ｍｇ／ｄＬのタンパク尿が発症したら治療レジメンの３つの群（ａｒｍ）のうちの１つに組み入れた。
【０４１３】
予防的処置
タンパク尿を週に１回モニタリングし、図１７Ａに示されている通り、無処置対照マウスの約５０％が３２週齢までにタンパク尿になった。対照的に、抗ＣＤ４０抗体１３８で処置されたマウスでは１匹のみで高タンパク尿が発症し、プレドニゾロンで処置されたマウスでは高タンパク尿が発症したものはいなかった。これらの結果は、無処置対照に対して有意なものであった。図１７Ｂに示されている通り、生存はタンパク尿の所見を反映し、全ての処置群がＰＢＳ対照とは有意に異なった。したがって、１５ｍｇ／ｋｇの処置用量と１．５ｍｇ／ｋｇの処置用量のどちらによってもタンパク尿が予防され、生存が延長された。
【０４１４】
治療的処置
抗ＣＤ４０抗体１３８を用いた治療的処置は、この第２のマウスＳＬＥモデルにおいても効果的であった。図１８Ａおよび図１８Ｂに示されている通り、抗ＣＤ４０抗体１３８を用いて処置されたマウスでは経時的に低タンパク尿が発症したが、無処置対照マウスでもプレドニゾロンで処置されたマウスでも低タンパク尿は発症しなかった。図１８Ｂに示されているタンパク尿からの回復率に基づいて、タンパク尿の回復までの平均時間は２３±７日であることが推定される。図１８Ｃに記載の通り、抗ＣＤ４０抗体１３８による処置により、生存も有意に延長された。
【０４１５】
唾液の産生量
予防的に処置されたマウスおよび治療的に処置されたマウスの両方において唾液の産生を測定して唾液腺機能を評価した。麻酔したマウスに硝酸ピロカルピンを投与し、８分間にわたって唾液を綿棒で採取した。唾液の産生量を綿棒の正味の重量増加として測定した。予防的試験では、図１９Ａおよび１９Ｂに記載の通り、無処置対照マウスによる唾液の産生は高度に変動したが、疾患を有さないＮＺＢＷＦ−１若年マウスとは有意に異なることが見出された。唾液の産生が最低であったビヒクル対照マウスの大多数がタンパク尿であったので、変動性は疾患のレベルに起因する可能性がある（図１９Ａおよび１９Ｂ、ビヒクル群における紫色対黒色）。しかし、重要なことに、抗ＣＤ４０抗体１３８で処置されたマウスによる唾液の産生は比較的に均一であり（図１９Ａ）、無処置対照マウスよりも有意に多かった。抗ＣＤ４０抗体１３８で処置されたコホートの全てで唾液の産生がより多かったが、体重の関数として測定した場合、１．５ｍｇ／ｋｇで処置されたコホートのみで有意性が保持された（図１９Ｂ）。それにもかかわらず、これらのデータから、予防的抗ＣＤ４０抗体１３８による処置により唾液腺機能の喪失が予防され得ることが示される。
【０４１６】
治療的に処置されたマウスでは、抗ＣＤ４０抗体１３８で処置されたマウスにおいて無処置対照よりも唾液の産生が有意に多いことが見出された（図２０Ａおよび２０Ｂ）。図２０Ａおよび２０Ｂは、唾液の産生が抗ＣＤ４０抗体の治療的投薬によって保護されることを示す。これは、総唾液で考えるか体重に対して正規化された唾液で考えるかにかかわらず明らかであった。特に、無処置マウスは全てがタンパク尿であったが、抗ＣＤ４０抗体で処置されたマウスはいずれもタンパク尿ではなかった。したがって、アゴニスト活性を実質的に有さないアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の治療的投薬により、唾液腺機能の低下が予防されるまたは逆転すると結論づけることができる。
【０４１７】
この試験から、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体１３８が、ループスになりやすいＮＺＢ／Ｗ−Ｆ１マウスにおける腎炎の発症の予防およびこれらのマウスの腎炎からの救出に効果的であったことが示される。さらに、抗ＣＤ４０抗体により、唾液腺および関節の炎症の発症が予防された。この試験により、アゴニスト活性を実質的に有さないアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体がヒトＳＬＥにおいて効果的であるという仮説が支持される。
【０４１８】
実施例１１．１および１１．２において使用された方法は以下を含んだ：
ＭＲＬ／ｌｐｒマウス
ＭＲＬ／ｌｐｒ：抗ＣＤ４０抗体（抗体１３８）を１０週齢のＭＲＬ／ｌｐｒマウスに４つの用量；１５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇもしくは１．５ｍｇ／ｋｇを週２回または１５ｍｇ／ｋｇを１週間に１回のうちの１つでｉ．ｐ．投与した。ＰＢＳ（ビヒクル）、ｉ．ｐ．、週２回を用いて処置されたマウスを陰性対照として含め、１０ｍｇ／ｋｇのプレドニゾロン、ＰＯ、ｓｉｄを用いて処置されたマウスを陽性対照として含めた。
【０４１９】
ＮＺＢ／Ｗ−Ｆ１：抗ＣＤ４０抗体１３８をＮＺＢ／Ｗ−Ｆ１マウスに予防レジメンおよび治療レジメンの両方で投与した。予防的レジメンについては、マウスに、抗ＣＤ４０を、２６週齢で開始して、２つの用量、１５ｍｇ／ｋｇまたは１．５ｍｇ／ｋｇのいずれかで、週２回、ｉ．ｐ．で与えた。プレドニゾロンを１０ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ  ｓｉｄで与えたマウスまたはＰＢＳを与えたマウスがそれぞれ陽性対照および陰性対照としての機能を果たした。マウスを、最初にタンパク尿について試験し、≧３００ｍｇ／ｄＬのマウスはいずれも予防的試験から排除した。治療レジメンについては、マウスに≧３００ｍｇ／ｄＬのタンパク尿が発症したら、これらのマウスの処置を開始した。マウスは、抗ＣＤ４０、ｉ．ｐ．を１５ｍｇ／ｋｇで週２回受けた。プレドニゾロンを１０ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ、ｓｉｄで与えたマウスまたはＰＢＳを与えたマウスがそれぞれ陽性対照および陰性対照としての機能を果たした。
【０４２０】
タンパク尿
尿を週に１回、タンパク質レベルについてＡｌｂｕｓｔｉｘ試験紙（Ｓｉｅｍｅｎｓ  ２１９１、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用して試験した。マウスは、少なくとも２回の連続した試験でまたは死亡もしくは安楽死の前に尿中タンパク質レベルが≧３００ｍｇ／ｄＬまで上昇していた場合にタンパク尿であるとみなされた。
【０４２１】
フローサイトメトリー
１％熱失活ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＨａｎｋｓ緩衝塩類溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の、脾臓の単一細胞浮遊液を作製した。赤血球を遠心分離によって除去し、細胞を染色バッファー（１．５％熱失活ウシ胎仔血清および０．０２％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に再浮遊させた。細胞を、ＣＤ３に対する抗体（１４５−２０１１、ＢＤ）、ＣＤ４に対する抗体（ＧＫ１．５  ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）、ＩＣＯＳに対する抗体（Ｃ３９８．４Ａ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＸＣＲ５に対する抗体（Ｌ１３８Ｄ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＤ−１に対する抗体（２９Ｆ．１Ａ１２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＧＬ７に対する抗体（Ａ４８８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１９に対する抗体（ＢＵＶ３９５、ＢＤ）、ＣＤ９５に対する抗体（Ｊｏ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて染色した。抗体をフルオレセインイソチオシアネート、フィコエリトリン、フィコエリトリンおよびシアニン５、アロフィコシアニン、ペリジニンクロロフィルならびにシアニン５．５またはビオチンと直接カップリングする。総Ｂ細胞をＣＤ１９＋として同定し、ＧＣ  Ｂ細胞をＣＤ１９＋、ＣＤ９５＋およびＧＬ７＋として同定し、Ｔｆｈ細胞をＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＣＯＳ＋、ＣＸＣＲ５＋およびＰＤ−１＋として同定した。細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターによって分析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン８．５、Ｔｒｅｅｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）を用いて解析した。
【０４２２】
組織学的検査
ビヒクル対照マウスは瀕死になったので、腎臓、足首および唾液腺組織を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン中に固定した。さらに、特定の中間の時点で、各群の代表的なマウスから、上記と同じ組織および血液を採取した。Ｈ＆Ｅのために、組織を１０％中性緩衝ホルマリン中に８時間にわたって固定し、処理し、パラフィン包埋した。腎臓、唾液腺および足首における炎症性浸潤を、慣用的なＨ＆Ｅ染色ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片の評価に基づいて評価した。腎臓については、病理医により、３μｍのＨ＆Ｅ切片が、糸球体疾患、血管周囲浸潤および尿細管間質浸潤について、以下のスコアリング基準に基づいて０から４までの尺度にスコア化された：糸球体疾患：０＝疾患なし；１＝少数の糸球体における糸球体間質の分節性肥厚；２＝大多数の糸球体における糸球体間質の分節性からびまん性肥厚；３＝糸球体間質のびまん性肥厚、細胞過形成、有足細胞の肥大、接着なし；４＝以下のうちの１つ以上を伴う、その他の領域よりも悪化した領域を伴う糸球体間質のびまん性肥厚：タンパク質の凝固、線維症、低細胞性、有足細胞の肥大、ボーマン嚢の接着および半月体。血管周囲腎炎：０＝少数の希なリンパ球まで；１＝少数のリンパ球が緩い凝集体を形成している；２＝リンパ球がばらばらの小さな凝集体を形成している；３＝リンパ球の分極した凝集体が隣接する静脈の内腔内に隆起しているが、弓状動脈を完全に包囲できていない；４＝リンパ球凝集体が弓状動脈を完全に包囲しており、極性化は伴わない。尿細管間質（ＴＩ）浸潤：０＝浸潤なし；１＝最小から軽度のＴＩ浸潤；２＝細管の２０％の間での軽度の浸潤；３＝細管の最大５０％の間での軽度から中程度の浸潤；４＝腎臓皮質全体を通して＞５０％の細管の間および周囲の中程度の浸潤。唾液腺の炎症スコアおよび関節の炎症スコアは、組織内の浸潤の増大に関する０−４のスコアと同じ原理に基づくものであった。
【０４２３】
唾液の産生量
唾液腺産出量を測定するために、マウスを、まず、小さな隔離チャンバー内で酸素／イソフルランを用いて鎮静させた。鎮静後、マウスに硝酸ピロカルピン（Ｓｉｇｍａ）３０μｌ（６０μｇ）をｉ．ｐ．投与した。注射の２分後、予め秤量した小児用安全綿棒（約１．５ｃｍまで切ったもの、綿プラス幹）を動物の口内の前歯の後ろに入れた。マウスを横向きにして頬内に唾液をプールさせ、綿棒に吸着させた。８分後、綿棒を取り出し、秤量して正味の唾液重量を算出した。
【０４２４】
ＥＬＩＳＡ
総循環ＩｇＧおよびＩｇＭレベルを、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅキット（カタログ番号８８−５０４００、８８−５０４７０）を使用し、製造業者の説明書に従って、ＥＬＩＳＡによって決定した。
【０４２５】
【表２５】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年5月27日(2019.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のトポグラフィー的領域Ｃｙｓ６２−Ｐｈｅ６７、Ｇｌｎ７９−Ｃｙｓ８３、Ａｒｇ９０−Ｔｈｒ９９およびＴｈｒ２４−Ｃｙｓ３７によって定義されるヒトＣＤ４０のエピトープと結合する、単離された抗体またはその抗原結合部分。