(57)【要約】【課題】簡便な血管機能障害の検査手段を提供する。【解決手段】この検査手段に利用する血管機能障害に関連して見られる血液試料中のポドカリキシン濃度を測定することによって、血管機能障害（例えば、糖尿病、高脂血症、高血圧症、原発性アルドステロン症、動脈硬化症、川崎病の一病因）としての血管機能の基質的変化（機能劣化・破綻）の有無やその障害の程度を評価することが可能となる。すなわち、被験体から得られた血液のヒトポドカリキシン濃度を測定することにより、血管機能障害の検出が可能となる。該血管機能障害としては、血管内皮の基質的変化（血管内皮障害）に起因する血管機能の変化（例えば、拡張性、収縮性、透過性、接着性）を指す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体から得られた血液試料中のポドカリキシンを検出または定量することを特徴とする、血管機能障害を検出または評価する方法。
【請求項２】
被験体から得られた血液試料中のポドカリキシンを検出または定量し、血管内皮機能障害を検出または評価する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血管内皮機能障害が、血管内皮細胞の障害である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
被験体から得られた血液試料中のポドカリキシンを定量し、血管内皮機能障害を一病態とする疾患の程度を評価する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
抗ポドカリキシン抗体を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法に用いられるための血管機能障害検査用試薬キット。
【請求項６】
標準品と、処理液とをさらに含む、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
抗ポドカリキシン抗体が、固相に固定化された請求項５または６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管機能障害を検出する方法およびそれに使用されるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ポドカリキシン(Podocalyxin, PCX)は腎臓糸球体上皮細胞に発現する分子量が約140kDaの糖タンパク質である。一方で、血管内皮細胞においてもポドカリキシンの発現が、その後報告され（非特許文献１）、その発現は血管内皮細胞の機能や造血細胞系列の分化に関与しているという報告もされた（非特許文献２、３、４）。ポドカリキシンに対するモノクローナル抗体を用いた尿中ポドカリキシン測定法が開発され、腎臓病における臨床的な測定意義が提案されている（特許文献１、２、３）。
【０００３】
上述の通り、ポドカリキシンは血管内皮細胞の管腔側に発現しているが、血液中のポドカリキシン濃度、あるいは血液中ポドカリキシンと疾患との関係についての報告は現在まで無い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００２／０３７０９９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１０／１４３４２２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２０１０／１４３４２３号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Reinhard Horvat, et al. The Journal of Cell Biology (1986) : 102 (2) : 484-491.
【非特許文献２】Christopher Sassetti, et al. The Journal of Experimental Medicine (1998) : 1965-1975.
【非特許文献３】Erin J. Debruin, et al. PLOS ONE (2014) : 9 (10) : e10881.
【非特許文献４】Hailan Zhang, et al. Stem Cells (2014) : 32 (1) : 191-203.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
血管機能障害性を有する代表的な疾患として、動脈硬化症があげられる。現在の動脈硬化症の評価指標については、検体検査としては血液中の脂質測定（コレステロールなど）、生理機能検査としては、脈派伝播速度測定、内皮機能検査、頸部動脈エコー検査などが臨床応用されている。しかし、血液中の脂質は動脈硬化発生の要因ではあるが、心・血管系疾患のリスクファクターとしての位置づけに限定されており、全身性の血管機能という基質的変化を直接に反映するものではない。生理機能検査においては血管機能・障害を直接的に評価できるが、評価する部位が限定的であり、正確には診断ができない場合もある。また、生理機能検査は検査に時間がかかり、多数検査には対応しにくい上に、検査薬価（診療報酬点数）が高く設定されており、医療経済上の負担ともなっている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記のように、血管機能障害の有無もしくはその障害の程度（病態の進展度）を的確かつ早期に判断するための新規検出マーカーならびに該マーカーを用いた血管機能障害の早期検出方法が望まれていた。本発明者らは、鋭意研究を進めた結果、血液中のポドカリキシン濃度の変動が、血管機能障害が想定される種々の病態と関連することを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］被験体から得られた血液試料中のポドカリキシンを検出または定量することを特徴とする、血管機能障害を検出または評価する方法。
［２］被験体から得られた血液試料中のポドカリキシンを検出または定量し、血管内皮機能障害を検出または評価する、［１］に記載の方法。
［３］血管内皮機能障害が、血管内皮細胞の障害である、［２］に記載の方法。
［４］被験体から得られた血液試料中のポドカリキシンを定量し、血管内皮機能障害を一病態とする疾患の程度を評価する、［２］に記載の方法。
［５］抗ポドカリキシン抗体を含む、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の方法に用いられるための血管機能障害検査用試薬キット。
［６］標準品と、処理液とをさらに含む、［５］に記載のキット。
［７］抗ポドカリキシン抗体が、固相に固定化された［５］または［６］に記載のキット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、被験体から得られた血液試料中のポドカリキシンを検出または定量することで、血管機能障害を検出または評価することができる。血液試料中のポドカリキシンは、血液試料中の脂質等の他の指標とは異なり、血管機能障害の存在そのものを示す点で臨床的意義が高い。また、血液試料中のポドカリキシンを検出または定量することで、血管内皮機能障害、特に、全身性の血管内皮機能の基質的破綻を検出し、またはその程度を評価することができ、さらに血管内皮細胞の障害を検出または評価することが可能である。さらに、機能検査とは異なり、血液試料中のポドカリキシンは全身性の病変を反映していると考えられ、血液試料中のポドカリキシンは、機能検査では難しい細小血管の病変も検出することができる。これにより、血液試料中のポドカリキシンを検出または定量することで、血管機能障害、特に血管内皮機能障害を一病態とする疾患（例えば、糖尿病、高脂血症、高血圧症、原発性アルドステロン症、動脈硬化症、川崎病）を検出することが可能である。また、そのような患者の血液試料中のポドカリキシンを定量することで、そのような疾患の程度、例えば、進行度、増悪、寛解度を評価することができる。加えて、血液試料中のポドカリキシンを検出または定量する抗ポドカリキシン抗体を含む、本発明の血管機能障害検査用試薬キットを用いることで、短時間で多数の被験体を簡便に評価することができる。加えて、本発明は、そのようなキットを廉価に提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】自己免疫疾患に起因する血管機能障害と血液中のポドカリキシン濃度の関連性を示す図である。
【図２】従来の炎症マーカー（CRP, C-Reactive Protein）濃度と血液中のポドカリキシン濃度の関係性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
（血管機能障害）
本明細書では、血管機能障害としては特に限定されないが、血管内皮の基質的変化に起因する血管機能（例えば、拡張性、収縮性、透過性、接着性）の変化、すなわち血管内皮機能障害が好ましい。本発明では血管内皮機能障害としては、全身性の血管機能という基質的変化を直接に反映する血管内皮機能障害が好ましい。本明細書では、血管内皮機能障害を一病態とする疾患とは、例えば、糖尿病、高脂血症、高血圧症、原発性アルドステロン症、動脈硬化症、川崎病を意味する。
【００１２】
（測定試料の処理）
本発明に使用される血液試料は血液自体でもよく、血液を遠心分離して得られる血液沈渣画分又はその上清画分であってもよい。本発明の測定方法は血液試料を用いて簡便に測定することが可能であるだけでなく、血液を遠心分離し血液沈渣と上清に二分画し、その二画分中の細胞表面に由来する物質、例えばポドカリキシンを測定することも可能である。測定に必要とされる血液の採取量は0.5mL程度であれば充分であり、好ましくは0.5ｍL〜5mL程度であり、より好ましくは1〜5mL程度である。含まれるポドカリキシンの濃度により、血液採取量を適宜減量させることも可能である。
【００１３】
（界面活性剤の添加）
本発明においては、血液試料中に含有される細胞表面に由来する物質、例えばポドカリキシンを遊離状態に変換する一つの手段として界面活性剤で処理することが挙げられる。用いる界面活性剤の種類、濃度は細胞表面に存在するポドカリキシンを遊離状態に変換できる作用があれば特に限定されないが、ポドカリキシンの免疫測定に妨害を及ぼさない種類、濃度で用いることが好ましい。
【００１４】
本発明に使用される界面活性剤の例として、非イオン界面活性剤としてトリトンＸ−１００を例示するが、格別にこれらに限定されるものではない。当業者は、本発明に開示する結果をもとに、単純な実験的繰り返しにより効果の比較を行い、血液試料中に含有される細胞表面由来のポドカリキシンを細胞膜成分から遊離させ得る、測定に有効な界面活性剤を得ることができる。非イオン界面活性剤以外に、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両イオン界面活性剤又は配糖体を適宜用いることも可能である。
【００１５】
さらに、界面活性剤を２種以上併用して用いることにより、より確実に可溶化又は分散させ均質化効果を達成することができる。
【００１６】
界面活性剤の添加量は、ポドカリキシンの遊離の程度を考慮して、適宜増量・減量することにより選択可能であるが、一般的には各種界面活性剤の臨界ミセル濃度以上の終濃度で使用される。界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、両性イオン系およびノニオン系の種別に特に限定されない。ノニオン系界面活性剤の中でも、ポリアルキレンオキサイド誘導体のポリエチレングリコール系、特にポリエチレンオキサイドモノ（p-イソオクチルフェニルエーテル）が好適に用いられる。本発明の界面活性剤のHLB値（Hydrophile - Lipophile Balance値）は特に限定されないが、10〜18であることが好ましく、11〜15であることがより好ましい。HLB値が上記範囲内であれば、血液試料が水相と油相の2相に分離せず正確な定量値が得られる。本発明における界面活性剤の添加量は、具体的には、Triton X-100（Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether）を使用した場合、0.02〜5 wt./v.％、好ましくは0.1〜2 wt./v.％、より好ましくは0.2〜1 wt./v.％の範囲で添加されるが、この限りではない。
【００１７】
界面活性剤による処理条件として、温度・時間等は最適な条件を選択することが好ましいが、単純な実験的繰り返しにより決定することができる。この場合、10〜60℃の温度で数秒から数十分程度の処理で充分である。また、前処理として予め界面活性剤を添加し、細胞表面に存在する物質、例えばポドカリキシンを遊離させ均質化処理を行っておくことも可能である。
【００１８】
（界面活性剤以外の遊離処理剤）
界面活性剤以外の遊離処理剤として、一般に知られた、尿素、チオシアン酸塩、過ヨウ素酸塩及び過塩素酸塩等のカオトロピック塩、塩酸グアニジン等が挙げられる。これらは単独または界面活性剤と併せて用いることも可能である。
【００１９】
（ポドカリキシンの測定方法）
血液試料中に含有されるポドカリキシン、典型的には細胞表面に由来するポドカリキシンを測定、例えば検出または定量する方法として、少なくとも直接または間接的にシグナル検出可能な物質または粒子で標識された標識抗ポドカリキシン抗体、またはその一部の画分を用いる、免疫学的測定法によるポドカリキシンの測定方法が挙げられる。上記、免疫学的測定法とは、抗ポドカリキシン抗体を使用したラテックス凝集法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法、FACS走査法、免疫ブロット法、放射免疫アッセイ法、ウエスタンブロッティング法、免疫沈降法、または酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）が挙げられるがこれらに限定されない。簡便性やコストの観点から好ましくは抗ポドカリキシン抗体は固相に固定化されることができる。そのような免疫学的測定法としては、抗ポドカリキシン抗体を使用したラテックス凝集法、ELISA法等が挙げられる。
【００２０】
（血管機能障害等の判定）
被験体から得られた血液試料中に、ポドカリキシンが検出される場合、被験体に血管機能障害、典型的には血管内皮機能障害が存在するとして判定される。また、ある被験体において以前測定したポドカリキシンの量のより多い、同じまたは少ないポドカリキシンが測定される場合、血管内皮機能障害を一病態とする疾患の程度が変化したとして判定される。
被験体から得られた血液試料中に、ポドカリキシンが検出される場合、被験体に血管内皮機能障害を一病態とする疾患が存在するとして判定される。また、ある被験体において以前測定したポドカリキシンの量のより多い、同じまたは少ないポドカリキシンが測定される場合、血管内皮機能障害を一病態とする疾患の程度が変化、例えば進行、増悪、または寛解したとして判定される。
【００２１】
（血管機能障害検査用試薬キット）
本発明は、血液試料中のポドカリキシンを検出または定量するための抗ポドカリキシン抗体を含む、血管機能障害の検出または評価を行うための血管機能障害検査用試薬および血管機能障害検査用試薬キットにも及ぶ。検査用試薬または検査用試薬キットに含まれる抗ポドカリキシン抗体は、例えば酵素などにより標識化されたものであってもよい。また、検査用試薬キットは２種類以上の抗ポドカリキシン抗体を含んでもよく、当該抗体は互いに異なるエピトープを認識する抗体であることが好ましい。さらに当該キットには、上記界面活性剤、および界面活性剤以外の遊離処理剤から選ばれる処理成分と水を含む処理液、発色基質等の試薬、標準品および、試験に必要な器具等を含むことができる。
【実施例】
【００２２】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００２３】
［実施例１］
ヒトポドカリキシン50μgをマウス腹腔にアジュバントと共に数回免疫し、その血清力価が上昇したことを確認した。追加免疫（静脈内）後3日目に脾臓を取り出し、脾細胞を得た。これとマウスミエローマ細胞をポリエチレングリコール3500の存在下（10:1細胞）で融合させ、ハイブリドーマ細胞を作製した。この細胞を1週間CO2気下37℃で培養し、その培養上清中の抗ヒトポドカリキシン抗体の有無を調べた。そこで、抗体産生を認めた陽性ウェル中の細胞を限界希釈法により希釈して2週間培養し、同様に培養上清の抗ヒトポドカリキシン抗体の有無を調べた。更にその後、抗体産生を認めた陽性ウェル中の細胞を再度限界希釈し、同様に培養を行った。この段階で抗ヒトポドカリキシン抗体を産生している細胞を、フラスコにて培養し、その一部をジメチルスルホキシド（DMSO）10％含有ウシ胎児血清（FCS）に懸濁混合し（5×106個/mL）、液体窒素中に保存した。
【００２４】
次に各ウェルの上清を用い、ヒトポドカリキシンに対する培養上清中の産生抗体の反応性を調べた。ヒトポドカリキシンを140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, pH7.3(以下、PBS, pH7.3と略す)に溶解した。プラスチック製マイクロタイタープレート(Nunc Immuno Module F8 Maxisorp Surface plate, サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)のウェルに、1ウェル当たり100μLの、上記ヒトポドカリキシン/PBS, pH7.3溶液を加え、3pmol/ウェル、4℃、12時間の条件下で、ヒトポドカリキシンをマイクロタイタープレート上に固相化した。12時間後、ウェルに加えておいたヒトポドカリキシン/PBS, pH7.3溶液をデカンテーションにより除去し、そのマイクロタイタープレートのウェルへ、145mM NaCl, 3.6mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4, 0.05%(v./v.) Tween20(以下、PBS-Tと略す)を200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるPBS-Tの除去を行い、ウェル内の吸着過剰分のヒトポドカリキシンを洗浄した。この洗浄工程を計2回行った。その後、145mM NaCl, 7.2mM Na2HPO4, 2.8mM KH2PO4, l%(wt./v.) BSA, 5%(wt./v.)ラクトース (以下、抗原固相プレート用ブロッキング液と称す)を200μL/ウェルで添加し、4℃、12時間の条件下でヒトポドカリキシン固相化マイクロタイタープレートのウェル内のブロッキングを行った。12時間経過後、4℃のままで保存状態とした。培養上清中の抗体の反応性を確認する為に、このプロッキング完了後のヒトポドカリキシン固相化マイクロタイタープレートを用いた。上記ヒトポドカリキシン固相化マイクロタイタープレートのウェルへ、ハイプリドーマ培養上清を100μL/ウェルで加え、37℃、1時間加温した。その後、ウェルに加えておいた培養上清をデカンテーシヨンにより除去し、そのマイクロタイタープレートのウェルへPBS-Tを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるPBS-Tの除去を行い、ウェル内の洗浄をした。この洗浄工程を計3回行った。その後、ウェルへPeroxidase-Conjugated Goat Anti-Mouse Immunoglobulins (DAKO社製)を100μL/ウェル(2000倍希釈：0.55μg/mL)で加え、37℃、1時間加温した。この酵素標識抗体の希釈には、145mM NaCl, 3.6mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4, 0.05%(v./v.) Tween20, 0.5%(wt./v.) BSA(以下、酵素標識抗体希釈液と称す)を用いた。その後、ウェルに加えておいた酵素標識抗体をデカンテーションにより除去し、そのマイクロタイタープレートのウェルへPBS-Tを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるPBS-Tの除去を行い、ウェル内の洗浄をした。この洗浄工程を計3回行った。その後、ウェルへ 3,3’，5,5’-tetramethylbenzidine (以下、TMBと略す)溶液(TMB One-Step Substrate System： DAKO社製)をペルオキシダーゼ酵素反応基質溶液として、100μL/ウェルで加え、25℃、30分放置した。その後直ちに、そのウェル内の基質反応液へ313mM H2SO4溶液(以下、反応停止液と称する)を100μL/ウェルで添加し、ウェル内での酵素反応を停止させた。その後、本ウェルの吸光度を測定し、450nmの吸光度から630nmの吸光度を差し引いた数値を反応性評価の指標とした（Josephy P.D., Mason R.P. et al.(1982) J. Biol. Chem. 257, 3669-3675)。その結果、固相化したヒトポドカリキシンへ抗ヒトポドカリキシン抗体の強い反応性を示すモノクローナル化ハイブリドーマ細胞を選択し、本培養上清中のイムノグロプリンのクラスとサブクラスをImmunoglobulin Typing Kit, Mouse(和光純薬工業社製)を用いて、培養上清原液100μLから、各クローン毎に確認した。その結果���基に、得られた単クローン細胞ライブラリーの中から、IgGクラスに限定して後述する腹水化へ移行した。 
【００２５】
次に、これらの細胞を25mLのフラスコで培養し、更に75mLのフラスコで培養した。この細胞をプリスタン処理マウス腹腔中に注射し、腹水を採取した。
【００２６】
［実施例２］
抗ヒトポドカリキシン・マウスモノクローナル(IgG)抗体の精製
【００２７】
得られた腹水(10mL)と混濁血清処理剤(FRIGEN（登録商標）II：シーメンスヘルスケア・ダイアグノスティクス社製)を、腹水1.5容に対してFRIGEN（登録商標）IIを1容の比率で混和し、1分攪拌振とうすることで、腹水からの脱脂を行った。遠心機で3000rpm(1930×g)、10分間遠心分離を行い、清澄化された腹水遠心上清(10mL)を分取した。この腹水遠心上清(10mL)に硫安分画処理(終濃度50%飽和硫安)を氷浴中で1時間施し、沈降したイムノグロブリン画分をPBSで懸濁溶解させた。このようにして、腹水からのイムノグロブリン粗画分を得た。得られたイムノグロブリン粗画分(10mL)に対して等量のIgG Binding Buffer（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を混合し、プロテインAカラム(HiTrap rProtein A FF,5mL：GEヘルスケア社製)を用いてアフィニティー精製を行った。サンプルをプロテインAカラムに吸着後、IgG Binding Buffer（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）をプロテインAカラム内に通し、サンプル中のIgG以外の夾雑物を洗浄除去した。その後、プロテインAカラムにアフィニティー吸着したIgGは、IgG Elution Buffer（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で溶出させ、カラムからの溶出直後の溶出画分を1M Tris(hydroxymethyl)aminomethane-HCl, pH9.0(以下、Tris(hydroxymethyl)aminomethaneをTrisと略す)で中和し回収した。中和後、アフィニティー精製物に対して200倍容のPBSで4℃、3時間以上の透析を行い、本透析は計2回行った。本透析操作に用いた透析膜はセルロースチューブ透析膜(エーディア社製)で行った。そこで得られたIgG溶出画分を、抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体の精製物とし、4℃での保存ならびに後述する操作に用いることとした。尚、本精製には、AKTAシステム(GEヘルスケア社製)に上述のプロテインAカラムを接続し、行った。
【００２８】
［実施例３］
抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体固相化マイクロタイタープレートの作製
【００２９】
精製抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体をPBS, pH7.3に終濃度7μg/mLで溶解した。プラスチック製マイクロタイタープレート（Nunc Immuno（登録商標）Module F8 Maxisorp（登録商標）Surface plate, サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）のウェルに、1ウェル当たり100μLの、上記抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体/PBS, pH7.3溶液を加え、4℃、12時間の条件下で、抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体をマイクロタイタープレート上に固相化した。12時間後、ウェルに加えておいた抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体/PBS, pH7.3溶液をデカンテーションにより除去し、そのマイクロタイタープレートのウェルへ、PBS-Tを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるPBS-Tの除去を行い、ウェル内の吸着過剰分の抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を洗浄した。この洗浄工程を計2回行った。その後、86mM NaCl, 100mM Tris, 0.5%(wt./v.) BSA, 0.05%(v./v.) Tween20(以下、抗体固相プレート用ブロッキング液と称す)を200μL/ウェルで添加し、4℃、12時間の条件下でヒトポドカリキシン固相化マイクロタイタープレートのウェル内のブロッキングを行った。12時間経過後、4℃のままで保存状態とした。
【００３０】
［実施例４］
ペルオキシダーゼ標識化抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体の作製
【００３１】
西洋ワサビペルオキシダーゼ(以下、HRPと略す)(Peroxidase from horseradish Type VI : Sigma社製)を純水に4mg/mLの濃度で溶かし、このHRP溶液500μL(2mg)に対して、100mMのメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液(100μL)を加えて、20分間、室温で攪拌した。これを、該 HRP溶液に対して500倍容の1mM 酢酸ナトリウム, pH4.0溶液(以下、lmM 酢酸緩衝液と称す)で4℃、6時間の透析を2回行った。透析操作に用いた透析膜は透析用セルロースチューブ(Viskase Companies社製)であった。次に、抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を、2.4mM Na2CO3, 7.6mM NaHCO3, pH9.6溶液（以下、10mM 炭酸緩衝液と称す）に8mg/mLの濃度で溶かした。上述のHRP溶液500μL(2mg)に、HRP溶液に対して1/3倍容の120mM Na2CO3, 380mM NaHCO3, pH9.6溶液（以下、0.5M炭酸緩衝液と称す）を加え、ここに、上述の抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体500μL(4mg)を混合し、室温で2時間攪拌した。その後、4mg/mLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(50μL)を加え、氷水浴中で2時間攪拌した。これに対し、硫安分画処理(終濃度50%飽和硫安)を氷浴中で1時間施し、沈降した画分を100mM Tris, 145mM NaCl, l%(v./v.) BSA, pH7.6溶液 (以下、標識抗体浮遊液と称す)lmLで懸濁溶解させた。この硫安分画操作を計2回行い、標識抗体溶液量に対して 3/4倍容の2.8mM KH2PO4, 7.2mM Na2HPO4, 145mM NaCl, l%(wt./v.) BSA, 0.02%(v./v.) フェノール， 40%(wt./v.) D-ソルビトール溶液(以下、標識抗体保存液と称す)を加えた。このようにして、HRP標識化抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を得た。尚、本HRP標識化の方法は、1974年にNakane P.K.とKawaoi A.が最初の報告をして以来、現在まで多くの報告がなされている(Nakane P.K., Kawaoi A. (1974) J. Histochem. Cytochem. 22, 1084)。
【００３２】
［実施例５］
血液試料中のポドカリキシン濃度の測定
【００３３】
上述した抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体固相化マイクロタイタープレートと、HRP標識化抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を用いて、血液試料中のヒトポドカリキシンを測定した。
【００３４】
以下では、マイクロタイタープレートへの固相化に用いた抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を第一抗体と、HRP標識化に用いた抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を第二抗体と、称す。
【００３５】
まず、被験者から得た血清75μLを56℃で30分間処理した。処理後の血清65μLと400mM TES-NaOH、40mM EDTA、0.4％（v./v.）TritonX-100、pH7.0の溶液65μLを混合した。混合して得られた血清試料溶液100μLを、第一抗体固相化マイクロタイタープレートのウェルへ加えた。37℃で１時間静置後、ウェルから血清試料溶液をデカンテーションにより除去した。PBS-Tを、マイクロタイタープレートのウェルに200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによりPBS-Tの除去を行い、洗浄を行った。この洗浄の工程を計3回行った。その後、HRP標識化第二抗体溶液を、100μL/ウェルで添加した。37℃で1時間静置後、HRP標識化第二抗体溶液をデカンテーションにより除去した。PBS-Tを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによりPBS-Tの除去を行い、洗浄を行った。この洗浄の工程を計3回行った。その後、TMB One-Step Substrate System（Dako社製）をHRP酵素反応の基質溶液として用いて、100μL/ウェルで添加し、25℃で30分間、遮光で静置した。その後、313mM H2SO4溶液を反応停止溶液として100μL/ウェルで添加し、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社製）を使用し、波長450nmと630nmで各ウェルの吸光度を測定した。そして、波長450nmの吸光度から波長630nmの吸光度を引いた値を測定値とした。精製ポドカリキシンを使用した場合の吸光度値を標準規格として、検体中のポドカリキシン濃度を導き出した。
【００３６】
表１は健常群と血管機能障害が一病態である疾患群（糖尿病、喫煙者、高脂血症、高血圧症、原発性アルドステロン症、クッシング症候群）での血液中のポドカリキシン濃度の群間層別化解析（一元配置分散分析）の結果を示している。症例数としては、健常群（40例）、糖尿病（58例）、喫煙者（30例）、高脂血症（55例）、高血圧症（75例）、原発性アルドステロン症（34例）、クッシング症候群（25例）である。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
表１が示すように、血液中のポドカリキシン量は、健常人に比して各疾患群（糖尿病、喫煙者、高脂血症、高血圧症、原発性アルドステロン症、クッシング症候群）で有意に上昇していることが明らかで、血液中のポドカリキシンが血管機能障害診断マーカーとして有用であることが判明した。
【００３９】
表２は臨床パラメータ（年齢、BI、Glu、HbA1c、Hb、LDL-C、HDL-C、TG、高感度CRP、足関節上腕血圧比、脈派伝播速度、内皮機能検査、内膜中皮複合体厚、FRS absolute risk）と血液中のPCX値との単相関を示している。症例数としては、年齢（145例）、BI（145例）、Glu（151例）、HbA1c（145例）、Hb（145例）、LDL-C（145例）、HDL-C（145例）、TG（145例）、高感度CRP（134例）、足関節上腕血圧比（130例）、脈派伝播速度（130例）、内皮機能検査（54例）、頸動脈エコー（内膜中皮複合体厚）（55例）、FRS absolute risk（132例）である。
【００４０】
【表２】
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【００４１】
IMT肥厚は主要な動脈硬化指標である。表３はIMT肥厚(>1mm）を目的変数として多変量解析した結果を示している（55例）。ロジスティック回帰から、他の動脈硬化リスクである年齢、糖尿病の有無、高血圧症の有無、脂質異常症の有無、現喫煙の有無を調整係数としても、IMT肥厚には血液中のポドカリキシン濃度と年齢が独立な危険因子であることが示された。IMT肥厚の独立因子である年齢を含め、糖尿病の有無、高血圧症の有無、脂質異常症の有無、現喫煙の有無で調整しても、Odds Ratio 1.089 (95%CI: 1.005-1.182)p=0.0385と血液中のポドカリキシンが説明変数として年齢とは独立に有意な危険因子であった。つまり、血液中のポドカリキシン値はIMT肥厚に関与する有用なバイオマーカーであり、血液中のポドカリキシン濃度がゼロの被験者に比して15ng/mLの血液中のポドカリキシン濃度を有する血管機能障害を有する患者では、動脈硬化症の発症に関して3.59 (95%CI: 1.08-12.28)倍高いリスクを有しているという結果を示している。
【００４２】
【表３】
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【００４３】
FRS（フラミンガムリスクスコア）は心血管病（冠動脈疾患）のリスク指標である。表４はFRSを目的変数として多変量解析した結果を示している（161例）。これまでに冠動脈疾患との関連性が示されてきた因子に追加して、血液中のポドカリキシン濃度と冠動脈疾患の関連性が示唆され、血管機能障害を一病態とする冠動脈疾患の指標としても血液中のポドカリキシンが用いられることが示された。
【００４４】
【表４】
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【００４５】
図１は小児川崎病患者の血液中のPCXの値を示している。急性期（57例）、回復期（66例）にて、マンホイットニーのU検定を実施したところ、症状のステージに応じて血液中のPCXの値が有意に変動していることが判明した。
【００４６】
図２は小児川崎病急性期症例における血液中のポドカリキシン濃度と血液中のCRP濃度との相関性について示している。Spearman順位検定より血液中のポドカリキシン値と血液中のCRP濃度とは相関性がないことが明らかである。
【００４７】
Ori Rogowskiらの報告 [Clinica Chimica Acta 358 (2005) 151-158]ではmicroinflammationを反映するバイオマーカーとしてのCRPの記載がされている。
【００４８】
microinflammationを評価し得る従来のマーカーとしてCRPが知られているが、CRPは外来異物の進入や悪性新生物の発生に対する代償性応答としての炎症の存在を反映するバイオマーカーであり、正常で機能している組織の基質的障害を反映したものではない。また、CRPの発現は肝臓に由来し、肝障害に応じて炎症病変への応答性が異なる問題も存在する。川崎病は全身の血管機能障害を有する疾患であり、血管の基質的変化を伴う全身性の炎症が病因と認識されている。小児川崎病患者の血液中のPCXの値が、健常群に比して有意に上昇していること、回復期に低下することから、血管内皮細胞の基質的障害、つまり機能的破綻の程度の実態を把握する事が可能との確証を得た。一方で、血液中のポドカリキシン濃度とバイオマーカーとしてのCRPについては相関性は認められず、これはCRPが必ずしも血管組織の基質障害をすべて反映していないことによるものと考えられた。すなわち、血液試料中のポドカリキシン濃度測定により、血管内皮細胞の基質的障害、つまり機能的破綻の程度の実態を把握する事が可能となった。今回得られた発明によって、microinflammationに由来する血管内皮細胞障害の基質的変化を把握することが可能となり、患者個々の病態（病勢）の即時的な機能性の把握とそれに基づいた治療方針の決定が可能となった。
【図１】
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【図２】
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