(57)【要約】【課題】発酵容器において目的のタンパク質が固体、結晶または非晶質形態で存在する発酵工程で調製されるタンパク質生成物を精製する方法の提供。【解決手段】発酵ブロスのｐＨが低ｐＨに調節され、それによって目的のタンパク質が溶解し、および不溶性物質から効率的に分離され得る。【選択図】図１
2019170384.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質生成物を精製する方法であって、前記タンパク質の少なくとも一部は、前記タンパク質の表面に位置する２〜６個のヒスチジン残基を有し、前記方法は、以下：
ａ．発酵ブロスを提供するステップ、
ｂ．任意選択で、ｐＨを６．０未満の値に調節するステップ、
ｃ．任意選択で、混合物をある期間にわたって保持するステップ、および
ｄ．前記発酵ブロスからの固体材料の少なくとも一部から、前記溶解したタンパク質生成物を分離するステップ
を含むステップで行われる、方法。
【請求項２】
前記タンパク質の前記表面に位置する２〜６個のヒスチジンが、一次配列の内部に配置されるか、または前記タンパク質の前記表面に位置する前記２〜６個のヒスチジンが、前記タンパク質のＣ−および／またはＮ−末端延伸の形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記目的のタンパク質の前記表面の前記２〜６個のヒスチジン残基の少なくとも１つが、置換または挿入によりもたらされる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質生成物が、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼ；例えば、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノトランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾチーム、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼから選択される酵素である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号２５に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するプロテアーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素が、配列番号１８に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するリゾチームである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ｐＨ４．５での前記目的のタンパク質の溶解度が、ｐＨ７．０での溶解度より少なくとも１０％高い、好ましくは少なくとも２０％高い、好ましくは少なくとも３０％高い、好ましくは少なくとも４０％高い、好ましくは少なくとも５０％高い、好ましくは少なくとも６０％高い、好ましくは少なくとも７０％高い、好ましくは少なくとも８０％高い、好ましくは少なくとも９０％高い、好ましくは少なくとも１００％高い、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記発酵ブロス中の前記タンパク質生成物の濃度が、少なくとも３ｇ／ｌ、例えば少なくとも４ｇ／ｌ、例えば少なくとも５ｇ／ｌ、例えば少なくとも６ｇ／ｌ；例えば少なくとも７ｇ／ｌ、例えば少なくとも８ｇ／ｌ、例えば少なくとも９ｇ／ｌ；例えば少なくとも１０ｇ／ｌ、例えば少なくとも１１ｇ／ｌ、例えば少なくとも１２ｇ／ｌ、例えば少なくとも１３ｇ／ｌ、例えば少なくとも１４ｇ／ｌ、例えば少なくとも１５ｇ／ｌ；例えば少なくとも１６ｇ／ｌ、例えば少なくとも１７ｇ／ｌ、例えば少なくとも１８ｇ／ｌ；例えば少なくとも１９ｇ／ｌ、例えば少なくとも２０ｇ／ｌである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｂ）における前記ｐＨが６．０未満、好ましくは５．５未満、好ましくは５．０未満、好ましくは４．５未満のｐＨ値に調節される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｃに保持期間を含み、前記保持期間が、１０秒〜９０分の範囲、好ましくは１分〜９０分の範囲、好ましくは１分〜６０分の範囲、好ましくは１分〜３０分の範囲、例えば５分〜３０分の範囲、最も好ましくは１０〜２０分の範囲である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記発酵ブロスが、増殖培地中で微生物を培養することによって得られる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物が、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌、例えば、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）およびバチルス・リキニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｉｎｉｆｏｒｍｉｓ）、またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ペニシルム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属する真菌、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、ショウユコウジカビ（Ａ．ｓｏｊａｅ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）もしくはトリコデルマ・ビリデ（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）；または好ましくはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハネンスラ（Ｈａｎｅｎｓｕｌａ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母；例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・オバルム（Ｓ．ｏｖａｒｕｍ）、ピチア・パストリス（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロマイセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップｄの前記分離が、ろ過、遠心分離またはデカンテーションを用いて実施される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップｄの前記分離の前に、希釈、塩添加およびポリマーの添加などの前処理ステップをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質生成物が、所与のアミノ酸配列を有する目的のタンパク質と、２〜６個のヒスチジン残基のＣ−および／またはＮ−末端延伸以外は同じアミノ酸配列を有する修飾タンパク質とを含有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ステップｃに保持期間を含み、前記保持期間が、１０秒〜９０分の範囲、好ましくは１分〜９０分の範囲、好ましくは１分〜６０分の範囲、好ましくは１分〜３０分の範囲、例えば５分〜３０分の範囲、最も好ましくは１０〜２０分の範囲である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
目的のタンパク質の産生を指令する１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされた前記目的のタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと、修飾タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、前記修飾タンパク質が、前記目的のタンパク質と比較して、前記タンパク質の表面に位置する２〜６個のヒスチジン残基を含有するように修飾されている、少なくとも１つのポリヌクレオチドとを含む組換え微生物であって、修飾遺伝子が、前記修飾タンパク質の産生を指令する１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされている、組換え微生物。
【請求項１８】
原核生物細胞、好ましくは、グラム陽性細胞、より好ましくは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞；最も好ましくは、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞である、請求項１７に記載の組換え微生物。
【請求項１９】
真核生物細胞、好ましくは真菌細胞、より好ましくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）またはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはピチア（Ｐｉｃｈｉａ）細胞；最も好ましくは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・アクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）  トリコデルマ・ビレデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｅｄｅ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・オバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖａｒｕｍ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞である、請求項１７に記載の組換え微生物。
【請求項２０】
前記目的のタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピー、好ましくは前記目的のタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドの少なくとも３つのコピー、より好ましくは少なくとも４つのコピー、最も好ましくは少なくとも５つのコピーを含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２１】
前記目的の同じタンパク質をコードする少なくとも２つの異なるポリヌクレオチド、好ましくは前記目的の同じタンパク質をコードする少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つ、最も好ましくは少なくとも５つのポリヌクレオチドを含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２２】
前記目的のタンパク質が、酵素、好ましくは、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼ、例えば、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノ−トランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾチーム、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼである、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２３】
前記酵素が、プロテアーゼであり、好ましくは、前記プロテアーゼが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号２５の１つに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項２２のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２４】
前記酵素が、リゾチームであり、好ましくは、配列番号１８に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項２２のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２５】
前記ポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体中に異なる遺伝子座において組み込まれる、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
酵素を生成する方法であって、前記酵素の生成を促進する条件下で、請求項１７〜２５のいずれか一項に記載の細胞を培養するステップを含む、方法。
【請求項２７】
前記酵素を回収するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
目的のタンパク質と、修飾タンパク質であって、前記目的のタンパク質と比較して、前記タンパク質の表面に２〜６個のヒスチジン残基を含有するように修飾されている修飾タンパク質とを含む、タンパク質生成物。
【請求項２９】
前記修飾タンパク質が、前記タンパク質のＣ−および／またはＮ−末端に結合した２〜６個のヒスチジン残基を含む、請求項２８に記載のタンパク質生成物。
【請求項３０】
前記目的のタンパク質が、酵素、好ましくは、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼ、例えば、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノ−トランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾチーム、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼである、請求項２８または２９に記載のタンパク質生成物。
【請求項３１】
前記酵素が、プロテアーゼであり、好ましくは、前記プロテアーゼが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号２５の１つに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項３０に記載のタンパク質生成物。
【請求項３２】
前記目的の酵素が、リゾチームであり、好ましくは、前記リゾチームが、配列番号１８に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項３０に記載のタンパク質生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本願は、コンピュータ読み取り可能な形態での配列表を含み、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、タンパク質精製の分野、特に、発酵工程により調製されるタンパク質のタンパク質精製の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
産業的タンパク質生成の重要な部分は、タンパク質が産生された生成混合物の残渣から所望のタンパク質を精製することである。
【０００４】
発酵産業では、タンパク質は、概して、所望のタンパク質を多量に産生するように設計または選択された特定の細胞により生成される。生成されたタンパク質は、細胞により細胞周囲の液体へと分泌され得る。発酵中にタンパク質が生成された後、一般に、タンパク質が所望の形態および純度になるまで、続くステップで精製される。精製工程中、生成されたタンパク質は、概して、生成培地の１つまたは複数の成分から分離されるが、これは、一般に固体細胞材料からの可溶性タンパク質の分離を含む。
【０００５】
タンパク質が十分多量に生成されれば、タンパク質は結晶形態で沈殿し、これは、通常、発酵に続く精製工程にさらなる課題をもたらす。何故なら、タンパク質は、固体細胞材料および／または生成混合物の他の固体成分から分離するために、可溶性である必要があるためである。こうした状況において、生成混合物は、沈殿したタンパク質を溶解させることができる追加の水または他の液体で希釈することができる。しかし、生成混合物を希釈することにより、生成混合物中の沈殿タンパク質の問題を解決することができるが、これはあまり望ましい解決法ではない。何故なら、それはまた、体積が増加し、結果的に、その後の精製設備が、希釈による増加した体積を処理することができなければならないことになり、これは、一般に、増加体積に対処するためにさらに多額の投資および高額の運転費用が必要になることを意味するからである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、大幅な体積増加なしに再可溶化が達成される分離工程のためのタンパク質生成物の再可溶化方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の態様では、本発明は、タンパク質生成物を精製する方法に関し、ここで、タンパク質の少なくとも一部は、タンパク質の表面に位置する２〜６個のヒスチジン残基を有し、この方法は、以下：
ａ．発酵ブロスを提供するステップ、
ｂ．任意選択で、ヒスチジン側鎖のｐＫａを下回る値にｐＨを調節するステップ、
ｃ．任意選択で、混合物をある期間にわたって保持するステップ、および
ｄ．発酵ブロスからの固体材料の少なくとも一部から、溶解したタンパク質生成物を分離するステップ
を含むステップで行われる。
【０００８】
第２の態様では、本発明は、目的のタンパク質の産生を指令する１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされた目的のタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと、修飾タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、修飾タンパク質が、目的のタンパク質と比較して、タンパク質の表面に位置する２〜６個のヒスチジン残基を含有するように修飾されている、少なくとも１つのポリヌクレオチドとを含む組換え微生物に関し、ここで、修飾遺伝子は、修飾タンパク質の産生を指令する１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされている。
【０００９】
第３の態様では、本発明は、目的のタンパク質の産生を指令する１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされた目的のタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと、修飾タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、修飾タンパク質が、目的のタンパク質と比較して、タンパク質の表面に位置する２〜６個のヒスチジン残基を含有するように修飾されている、少なくとも１つのポリヌクレオチドとを含む組換え微生物に関し、ここで、修飾遺伝子は、修飾タンパク質の産生を指令する１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされている。
【００１０】
別の態様では、本発明は、目的のタンパク質と、修飾タンパク質であって、目的のタンパク質と比較して、２〜６個のヒスチジン残基によりＣ−および／またはＮ−末端が延伸された同じアミノ酸配列を有する、修飾タンパク質とを含むタンパク質生成物を生成することを目的とする、第２の態様の組換え微生物の使用に関する。
【００１１】
好ましくは、目的のタンパク質は酵素である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａは、発酵中に採取したサンプルを含むリゾチーム発酵からの上清を示すＳＤＳ−ｐａｇｅゲルを示す。図面において、レーン１は、マーカーであり、レーン２〜６は、それぞれ、９７時間、１２０時間、１４４時間、１６９時間および１９２時間後のリゾチーム発酵からの発酵ブロスの上清サンプルであり、およびレーン７は、精製されたリゾチーム標準である。１６９および１９２時間後のリゾチームの量が、沈殿のために、１４４時間後と比較して減少しているのを認めることができる。図１Ｂは、発酵中に採取したサンプルのリゾチーム発酵からの上清を示すＳＤＳ−ｐａｇｅゲルを示す。図面において、レーン１は、マーカーであり、レーン２〜６は、それぞれ、９７時間、１２０時間、１４４時間、１６９時間および１９２時間後のリゾチーム発酵からの発酵ブロスの上清サンプルであり、およびレーン７は、精製されたリゾチーム標準である。リゾチームの量が、全発酵工程を通して増加しているのを認めることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
コード配列：「コード配列」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列を直接的に特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレームにより判定され、これは、ＡＴＧ、ＧＴＧ、またはＴＴＧなどの開始コドンで開始し、ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡなどの終止コドンで終わる。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはこれらの組み合わせであってよい。
【００１４】
制御配列：「制御配列」という用語は、本発明の成熟型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な核酸配列を意味する。各制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して在来（すなわち、同じ遺伝子由来）もしくは外来（すなわち、異なる遺伝子由来）のものであっても、または相互に在来もしくは外来のものであってもよい。このような制御配列としては、これらに限定されないが、リーダ、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、および転写ターミネータが挙げられる。少なくとも、制御配列は、プロモータ、ならびに転写および翻訳終止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコード領域に対する制御配列の連結を促進する特定の制限部位を導入する目的で、リンカーを備えていてもよい。
【００１５】
発現：「発現」という用語は、特にこれらに限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌を含むポリペプチドの生成に関与するいずれかのステップを含む。
【００１６】
発現ベクター：「発現ベクター」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、また、その発現をもたらす制御配列に作動可能にリンクされている直鎖または環状ＤＮＡ分子を意味する。
【００１７】
宿主細胞：「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクターによる形質転換、形質移入、形質導入等に対する感受性を有するいずれかの細胞型を意味する。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異によって、親細胞と同一ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。
【００１８】
単離された：「単離された」という用語は、自然界に存在しない形態または環境にある物質を意味する。単離された物質の非限定的例として、これらに限定されないが、（１）任意の非天然物質、（２）自然界では結合している、天然に存在する成分の１つまたは複数または全部から少なくとも部分的に取り出された任意の物質、例えば、これらに限定されないが、任意の酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチドもしくは補因子；（３）自然界で見出される物質に関して、人為的に修飾された任意の物質；（４）天然では結合している他の成分に関して、その物質の量を増加すること（例えば、宿主細胞における組換え生産；その物質をコードする遺伝子の多数のコピー；ならびに物質をコードする遺伝子と天然に結合したプロモータより強力なプロモータの使用）により、修飾された任意の物質。
【００１９】
成熟型ポリペプチド：「成熟型ポリペプチド」という用語は、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化等などの翻訳および任意の翻訳後修飾後における、その最終形態にあるポリペプチドを意味する。宿主細胞が、同じポリヌクレオチドによって発現されるさらに異なる成熟型ポリペプチド（すなわち、異なるＣ末端および／またはＮ末端アミノ酸を有する）の２つの混合物を産生し得ることは当技術分野において公知である。さらに、異なる宿主細胞は、ポリペプチドのプロセシングも異なるため、ポリペプチドを発現する１つの宿主細胞は、同じポリヌクレオチドを発現する別の細胞と比較して、異なる成熟型ポリペプチド（例えば、異なるＣ末端および／またはＮ末端アミノ酸を有する）を生成し得ることも公知である。
【００２０】
成熟型ポリペプチドコード配列：「成熟型ポリペプチドコード配列」という用語は、成熟型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００２１】
核酸構築物：「核酸構築物」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかである核酸分子を意味し、これは、天然の遺伝子から単離されるか、またはそうでなければ自然界に存在しないであろう方法で核酸のセグメントを含有するよう修飾されるか、あるいは合成のものであり、１つまたは複数の制御配列を含む。
【００２２】
作動可能にリンクされた：「作動可能にリンクされた」という用語は、制御配列がコード配列の発現を指令するよう、ポリヌクレオチドのコード配列に対して適切な位置に、制御配列が位置する構造を意味する。
【００２３】
配列同一性：２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性が、「配列同一性」というパラメータによって記載される。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳボージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
（同等の残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
【００２４】
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（前述のＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（前述のＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）を用いて判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ  ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
（同等のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
【００２５】
多くのタンパク質生成物は、今日、特定の基質および発酵プロトコルを用いて、発酵槽中で微生物を発酵させる発酵工程で調製される。これはよく知られており、多くの発酵プロトコルが当技術分野において記載されている。発酵中、微生物は、意図するタンパク質を産生し、このタンパク質を発酵ブロス中に排泄する。発酵工程の後、溶解した意図するタンパク質を含む液体部分を、細胞、細胞残屑および基質からの固体残渣などの固体から分離するが、タンパク質生成物は、当技術分野で公知の技術を用いて、液体部分からさらに精製してもよい。しかし、多くの産業的発酵において、意図するタンパク質生成物は、あまりにも多量に産生されるため、タンパク質が沈殿して、結晶もしくは非晶質固体を形成し、これは、固体部分から容易に分離されないため、精製に問題をもたらすことが起こっている。
【００２６】
本発明の方法に使用可能なタンパク質は、原則として、ヒスチジン側鎖のｐＫａを超えるｐＨ値での溶解度と比較して、ヒスチジン側鎖のｐＫａを下回るｐＨ値でより高い溶解度を有する任意のタンパク質である。
【００２７】
好ましくは、ヒスチジン側鎖のｐＫａを下回るｐＨ値は、ヒスチジン側鎖のｐＫａより少なくとも０．１ｐＨ単位低い、好ましくはヒスチジン側鎖のｐＫａ値より、好ましくは少なくとも０．２ｐＨ単位低い、好ましくは少なくとも０．３ｐＨ単位低い、好ましくは少なくとも０．４ｐＨ単位低い、好ましくは少なくとも０．５ｐＨ単位低い、好ましくは少なくとも０．６ｐＨ単位低い、好ましくは少なくとも０．７ｐＨ単位低い、好ましくは少なくとも０．８ｐＨ単位低い、好ましくは少なくとも０．９ｐＨ単位低い、好ましくは少なくとも１．０ｐＨ単位低い、好ましくは少なくとも１．５ｐＨ単位低い、好ましくは少なくとも２．０ｐＨ単位低い。
【００２８】
ヒスチジン側鎖のｐＫａを超えるｐＨ値は、ヒスチジン側鎖のｐＫａより少なくとも０．１ｐＨ単位高い、ヒスチジン側鎖のｐＫａ値より、好ましくは少なくとも０．２ｐＨ単位高い、好ましくは少なくとも０．３ｐＨ単位高い、好ましくは少なくとも０．４ｐＨ単位高い、好ましくは少なくとも０．５ｐＨ単位高い、好ましくは少なくとも０．６ｐＨ単位高い、好ましくは少なくとも０．７ｐＨ単位高い、好ましくは少なくとも０．８ｐＨ単位高い、好ましくは少なくとも０．９ｐＨ単位高い、好ましくは少なくとも１．０ｐＨ単位高い、好ましくは少なくとも１．５ｐＨ単位高い、好ましくは少なくとも２．０ｐＨ単位高い。
【００２９】
ヒスチジンは、３つのｐＫａ値、すなわち、カルボキシル基について１つ、ピロール基について１つ、およびＮＨ２基について１つを有することが理解されよう。ペプチド、例えば、ポリペプチドまたはタンパク質などの場合、カルボキシル基およびＮＨ２基の少なくとも１つは、ペプチド結合において、隣接するアミノ酸と結合することになる。
【００３０】
ヒスチジン側鎖のｐＫａは、本明細書および特許請求の範囲において、ヒスチジン分子のイミダゾール環のｐＫａを意味するものとする。イミダゾール基のｐＫａは、２５℃で約６．０である。当業者は、ｐＫａが、溶媒の温度、濃度およびイオン強度などの条件によって若干変動することを理解されよう。タンパク質の精製に関する本発明の場合、適切な条件は、タンパク質の変性を比較的わずかにしか引き起こさない条件、すなわち、比較的穏やかな条件である。こうした条件下で、本発明の目的のために、ヒスチジン側鎖のｐＫａは、６．０であると想定することができ、これは、別に明示されていない限り、本明細書および特許請求の範囲において想定される。
【００３１】
これは、６．０を下回るｐＨでは、ヒスチジン、特にタンパク質の表面に露出したヒスチジン上のイミダゾール基が、ほとんどプロトン化されて、その結果、陽荷電されるのに対し、６．０を超えるｐＨでは、ヒスチジン、特にタンパク質の表面に露出したヒスチジン上のイミダゾール基が、ほとんど非プロトン化されて、その結果、非荷電となることを意味する。
【００３２】
ヒスチジン側鎖のｐＫａは、遊離ヒスチジンの場合、約６．０である。ヒスチジン側鎖のｐＫａは、特に、タンパク質構造の内部に位置するヒスチジンの場合、周囲のアミノ酸によって影響され得る。本発明に適切なヒスチジンは、目的のタンパク質の表面に位置するヒスチジンであるため、周囲に対し高度に露出しており、従って、これらのヒスチジンのｐＫａの変化はわずかであるに過ぎない。従って、本発明の目的のために、ヒスチジン側鎖のｐＫａは、周囲のアミノ酸とは独立に、６．０であると考えることができる。
【００３３】
このように、一実施形態では、本発明の方法で用いるタンパク質は、ｐＨ６．５での溶解度と比較して、ｐＨ５．５で高い溶解度を有するタンパク質；またはｐＨ７．０での溶解度と比較して、ｐＨ５．０で高い溶解度を有するタンパク質；またはｐＨ８．０での溶解度と比較して、ｐＨ４．５で高い溶解度を有するタンパク質である。
【００３４】
本発明は、表面に２〜６個のヒスチジンを有するタンパク質は、典型的に、２〜６個のヒスチジン以外は同じ配列を有する対応するタンパク質と比較して、ヒスチジン側鎖（ヒスチジン側鎖またはその有意な部分が、陽荷電されている）のｐＫａを下回るｐＨで高い溶解度を有するという知見に基づく。ヒスチジン側鎖のｐＫａを超えるｐＨ値では、ヒスチジン側鎖は、概して非荷電であり、典型的には、これによって、このｐＨでは溶解度が低くなる。
【００３５】
特に、本発明は、タンパク質の表面領域にヒスチジン残基を挿入するか、またはこの領域のヒスチジン残基を置換することによって修飾されたタンパク質に関し、従って、修飾タンパク質は、表面に２〜６個のヒスチジンを含有する。２〜６個のヒスチジンは、一次配列の内部に位置してもよく、または成熟型タンパク質のＣ−もしくはＮ−末端に結合していてもよく、あるいはこれらの任意の組み合わせであってもよい。こうした修飾タンパク質は、恐らくこのｐＨでのヒスチジン残基の陽電荷のために、ヒスチジン側鎖のｐＫａを下回るｐＨでは高い溶解度という利点を有するが、ヒスチジン側鎖のｐＫａを超えるｐＨでは、修飾タンパク質は、非修飾タンパク質と同じ電荷を有するであろうことから、非修飾タンパク質と全く同様に使用することができる。
【００３６】
タンパク質生成物は、原則として発酵工程で調製されるあらゆるタンパク質であってよく、本発明は、結晶または非晶質形態のタンパク質生成物の一部の沈殿を結果的に引き起こす所与の条件下で、タンパク質がその可溶性を超える濃度で存在する分離工程に関する。
【００３７】
タンパク質は、治療用タンパク質または酵素であってよい。酵素は、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼ；好ましくは、目的の酵素は、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノ−トランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼである。
【００３８】
プロテアーゼ
好ましい実施形態では、プロテアーゼは、スブチリシンまたはメタロプロテアーゼである。
【００３９】
スブチリシンは、Ａｓｐ３２、Ｈｉｓ６４およびＳｅｒ２２１（スブチリシンＢＰＮの番号付け）から構成される触媒三残基を使用するセリンプロテアーゼである。
【００４０】
スブチリシンは、ペプチダーゼ分類法によれば、以下：クランＳＢ、ファミリーＳ８、ＭＥＲＯＰＳ  ＩＤ：Ｓ０８．００１のように表すことができる。
【００４１】
スブチリシンは、例えば、Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ，ｐ．２８９−２９４に記載されている。Ｓｉｅｚｅｎ  ａｎｄ  Ｌｅｕｎｉｓｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，６＆５０１−５２３には、スブチラーゼの説明が提供されている。
【００４２】
本発明のプロテアーゼの起源および／または本発明に従う使用について何ら限定はない。従って、プロテアーゼという用語には、天然または野生型プロテアーゼだけではなく、プロテアーゼ活性を呈示するその全ての突然変異体、変異体、断片など、さらには、シャッフルプロテアーゼ（ｓｈｕｆｆｌｅｄ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）およびコンセンサスプロテアーゼなどの合成プロテアーゼも含まれる。このような遺伝子操作されたプロテアーゼは、当技術分野で広く知られているように、例えば、部位特異的突然変異誘発法によって、ＰＣＲ（ＰＣＲ反応におけるプライマーの１つとして所望の突然変異を含むＰＣＲ断片を使用する）によって、またはランダム変異導入法によって調製することができる。コンセンサスタンパク質の調製は、例えば、欧州特許第８９７９８５号明細書に記載されている。
【００４３】
本発明に使用するプロテアーゼの例として、配列番号２（Ｓａｖｉｎａｓｅ）もしくは配列番号２５（ＢＰＮ’）などの野生型プロテアーゼ、または配列番号１、配列番号３もしくは配列番号４を有するＳａｖｉｎａｓｅ変異体などの変異型プロテアーゼが挙げられる。本発明に使用する好ましいプロテアーゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号２５の１つに対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するプロテアーゼである。
【００４４】
アミラーゼ
好適なアミラーゼ（αおよび／またはβ）は、細菌を起源とするものを含む。化学修飾、またはタンパク質改変された突然変異体も含まれる。アミラーゼとして、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えば、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の株から得られるα−アミラーゼが挙げられ、これについては、英国特許第１，２９６，８３９号明細書にさらに詳しく記載されている。
【００４５】
セルラーゼ
好適なセルラーゼは、細菌または真菌を起源とするものを含む。化学修飾、またはタンパク質が操作された（置換、挿入、および／または欠失を含む）突然変異体も含まれる。好適なセルラーゼとして、米国特許第４，４３５，３０７号明細書、同第５，６４８，２６３号明細書、同第５，６９１，１７８号明細書、同第５，７７６，７５７号明細書および国際公開第８９／０９２５９号パンフレットに開示されているバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属由来のセルラーゼ、例えば、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）およびフザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から産生される真菌性セルラーゼが挙げられる。
【００４６】
リパーゼ
好適なリパーゼは、細菌または真菌を起源とするものを含み、タンパク質が操作された（置換、挿入、および／または欠失を含む）突然変異体も含まれる。好適なリパーゼとして、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属およびリゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属由来のリパーゼ、例えば、フモコラ・ラヌギノセ（Ｈｕｍｏｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ）およびリゾムコール・ミヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｈｅｉ）から産生される真菌性リパーゼが挙げられる。
【００４７】
オキシドレダクターゼ
本発明に従い処理することができるオキシドレダクターゼとして、ペルオキシダーゼ（ＥＣ  １．１１．１．７）、およびラッカーゼなどのオキシダーゼ、ならびにカタラーゼ（ＥＣ  １．１１．１．６）が挙げられる。
【００４８】
リゾチーム
「リゾチーム」活性という用語は、Ｏ−グリコシルヒドロラーゼとして本明細書に定義され、これは、２つ以上の炭水化物の間、または炭水化物と非炭水化物部分との間のグリコシド結合の加水分解を触媒する。リゾチームは、細菌細胞壁のムコ多糖体およびムコペプチド中の特定の残基間のグリコシド結合、例えば、ペプチドグリカン中のＮ−アセチルムラミン酸およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基の間、ならびにキトデキストリン中のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基間の１，４−β−結合を切断する、溶菌をもたらす。リゾチームは、酵素クラスＥＣ  ３．２．１．１７に属する。
【００４９】
本発明で使用されるリゾチームの例として、国際公開第２００３／０７６２５３号パンフレットに開示されているリゾチームが挙げられる。本発明で使用される好ましいリゾチームは、配列番号１８に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するリゾチームである。
【００５０】
発酵工程の終了時の発酵ブロスのｐＨおよび低ｐＨは、目的のタンパク質の実効電荷が、発酵終了時のｐＨから低ｐＨまで変化するように選択する。これを確実にする１つの好ましい方法は、発酵終了時のｐＨ値から低ｐＨ値までのｐＫａ値を有する２〜６個のアミノ酸を有する目的のタンパク質を選択することであり、ここで、これらのアミノ酸は、目的のタンパク質の表面に位置する。
【００５１】
一般に使用される宿主細胞のｐＨ耐性および目的のタンパク質のｐＨ安定性を考慮した、好適な範囲内のｐＫａ値を有するアミノ酸残基の好ましい例として、側鎖のｐＫａが約６．０のヒスチジンを挙げることができる。
【００５２】
発酵終了時の発酵ブロスのｐＨは、宿主生物、発酵培地の組成、酸素供給、工程中のｐＨ調節の持続時間、および発酵工程下での総合的条件などの複数のパラメータに応じて変わり得る。しかし、典型的な産業的発酵工程は、ｐＨ調節され、発酵終了時のｐＨは、特定の工程に適用されるｐＨ調節によって決定される。
【００５３】
本発明に従い使用されるタンパク質は、天然に見出されるタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質として理解される天然のタンパク質であってもよく、またはアミノ酸配列が人間によって改変され、その結果、このようなアミノ酸配列を有するタンパク質が天然では見出されない操作タンパク質であってもよい。
【００５４】
本発明の方法で使用されるこうしたタンパク質の好ましい１クラスは、タンパク質の表面に位置する２〜６個のヒスチジン残基を有するタンパク質である。このようなタンパク質は、天然のタンパク質であってもよく、または操作されている、例えば、その表面に２〜６個のヒスチジンを含有するように操作されていてもよい。表面に位置する２〜６個のヒスチジン残基は、タンパク質の一次アミノ酸配列の内部に位置してもよく、またはタンパク質のアミノ酸配列の一端もしくは他端に位置してもよく、あるいはこれらの組み合わせであってもよい。
【００５５】
本発明の方法で使用される操作タンパク質の好ましい１クラスは、Ｎ−もしくはＣ−末端またはタンパク質に結合されたＨｉｓタグを有するタンパク質である。本願において、Ｈｉｓ−タグは、２〜６個の隣接するヒスチジン残基を含むアミノ酸の短い区間を意味するものとする。Ｈｉｓタグは、ｈｉｓ−タグを含むタンパク質の精製後にｈｉｓ−タグの除去を可能にし、これによって、ｈｉｓタグ残基が全くないタンパク質の取得を可能にするプロテアーゼ切断部位を含有してもよい。
【００５６】
本発明の方法で使用される他の操作タンパク質は、一次アミノ酸配列の内部に、およびタンパク質の表面に位置する２〜６個のヒスチジン残基を含有するように操作された酵素である。このようなタンパク質は、欧州特許庁に出願され、「ＥＮＺＹＭＥ  ＶＡＲＩＡＮＴＳ  ＡＮＤ  ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＥＮＣＯＤＩＮＧ  ＳＡＭＥ」という名称の同時係属出願欧州特許出願公開第１４１６２４３４．６号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように設計してもよく、その教示内容は、本明細書および特許請求の範囲にも適用される。
【００５７】
一般に、発酵工程でのｐＨは、最適な生成物収率および品質を達成するために、その工程中に制御する。これは、当技術分野ではよく知られている。表面に位置する２〜６個のヒスチジンを有するタンパク質の使用は、ｐＨを制御することによって、目的のタンパク質の溶解度に影響を与えることができるという点で特に有益となり得る。このように、ヒスチジン側鎖のｐＫａを下回るｐＨ値までｐＨを下げることにより、溶解度を高めることができ、また、ヒスチジン側鎖のｐＫａを超えるｐＨ値までｐＨを上げることにより、溶解度を低下させることができる。
【００５８】
これは、とりわけ、プロテアーゼ分解を受けやすい意図するタンパク質をもたらすと共に、最後には発酵ブロスとなるプロテアーゼももたらす発酵に有益である。こうした状況は、タンパク質が概して固体状態ではプロテアーゼ分解を受けにくいため、目的のタンパク質が発酵中に沈殿する条件下で上記工程を実施し、かつ固体部分から意図するタンパク質を分離するために、精製時にタンパク質を溶解する上で有益となり得る。
【００５９】
多くの微生物は、発酵中に、意図する生成物として、副活性として、または一部の細胞の溶解の結果としてのいずれかでプロテアーゼを産生し、これらは全て、目的の意図するタンパク質の幾分の分解、ならびにこれによる生成物の消失または生成物品質の低下を招き得ることがわかっている。特に、プロテアーゼ生成のための発酵の場合、産生されたプロテアーゼは、存在するタンパク質を分解する（自己タンパク質分解として知られる）ことになるため、発酵中にプロテアーゼが沈殿して、これにより、自己タンパク質分解から保護される条件下で、プロテアーゼ発酵工程を実施するのが有益であり得、その後、精製時にタンパク質を再可溶化して、この精製工程で、好適な分離技術を用いて生成物を固体から分離する。
【００６０】
これは、本発明に従い、６．０超のｐＨで発酵させた後、精製工程の少なくとも一部の間、６．０未満のｐＨまでｐＨを下げることにより、実施することができる。発酵は、例えば、６．０超、例えば、６．２超；例えば、６．５超；例えば、７．０超のｐＨで実施してよく、精製は、少なくとも一部を５．８未満、例えば、５．５未満、例えば、５．０未満のｐＨで実施してよい。
【００６１】
好ましい一実施形態では、目的の遺伝子をコードする１つまたは複数の遺伝子、ならびにコードされたタンパク質が、タンパク質の一次アミノ酸配列の内部に、およびタンパク質の表面に位置する２〜６個のヒスチジン、またはタンパク質のＮ−および／もしくはＣ−末端に結合された２〜６個のヒスチジンのＨｉｓ−タグを含有するように修飾された、目的の遺伝子の修飾形態をコードする１つまたは複数の遺伝子を含有するように操作された操作微生物によってタンパク質生成物が産生され、ここで、目的の遺伝子および目的の修飾遺伝子は全て、微生物の発酵中に発現される。驚くことに、このような操作微生物により産生された目的のタンパク質は、目的の修飾遺伝子を含まない対応する微生物よりも高い溶解度を有すること、さらには、沈殿した目的のタンパク質が、ｐＨを６．０未満に変更することによって容易に可溶性になることが判明した。
【００６２】
操作微生物における目的の遺伝子および目的の修飾遺伝子のコピー数は、１〜２０、例えば１〜１０、例えば１〜５の範囲であってよい。目的の遺伝子のコピー数は、目的の修飾遺伝子のコピー数と同じでも、同じでなくてもよい。好ましい一実施形態では、目的の修飾遺伝子のコピー数は、１であり、目的の遺伝子のコピー数は、１、２、３、４、５、６、７または８であり、別の好ましい実施形態では、目的の修飾遺伝子のコピー数は、２であり、目的の遺伝子のコピー数は、１、２、３、４、５、６、７または８である。
【００６３】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本明細書に記載する、ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドにも関する。
【００６４】
ポリヌクレオチドの単離またはクローン化に用いられる技術は技術分野において公知であり、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡからの単離、またはこれらの組み合わせが含まれる。ゲノムＤＮＡからのポリヌクレオチドのクローン化は、例えば、発現ライブラリの周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または抗体スクリーニングを用いて共有される構造機構を伴うクローン化されたＤＮＡ断片を検出することにより実施されることが可能である。例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，ＰＣＲ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、連結活性化転写（ＬＡＴ）およびポリヌクレオチドベース増幅（ＮＡＳＢＡ）などの他の核酸増幅法が用いられ得る。
【００６５】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾は、ポリペプチドに実質的に類似するポリペプチドの合成に必要であり得る。ポリペプチドに「実質的に同様」という用語は、ポリペプチドの非天然形態を指す。これらのポリペプチドは、天然のソースから単離されたポリペプチドとはいくらかの操作法で異なっていてもよく、例えば、特異活性、耐熱性、至適ｐＨ等が異なる変異体である。変異体は、ポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらさないが、酵素の生成のために意図される宿主生体のコドン利用に対応する、成熟型ポリペプチドコード配列として提示されるポリヌクレオチドに基づくか、または異なるアミノ酸配列をもたらし得るヌクレオチド置換の導入により構築され得る。ヌクレオチド置換の概要については、例えば、Ｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２：９５−１０７を参照のこと。
【００６６】
核酸構築物
本発明はまた、制御配列に適合する条件下で好適な宿主細胞中にコード配列を発現させる１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクした本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。
【００６７】
ポリヌクレオチドは、多様な方法で処置されてポリペプチドの発現がもたらされ得る。ベクターへ挿入される前のポリヌクレオチドの処置が、発現ベクターに応じて、望ましいか、または必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用するポリヌクレオチドを修飾するための技術は技術分野において周知である。
【００６８】
制御配列は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のための宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチドであるプロモータであり得る。プロモータは、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモータは、ミュータント、切断およびハイブリッドプロモータを含む宿主細胞において転写活性を示すいずれかのポリヌクレオチドであり得、ならびに宿主細胞に対して相同性または非相同性である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
【００６９】
細菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写を指令する上で好適なプロモータの例としては、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（Ａｇａｉｓｓｅ  ａｎｄ  Ｌｅｒｅｃｌｕｓ，１９９４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １３：９７−１０７）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペロン、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔｒｃプロモータ（Ｅｇｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、および原核β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７−３７３１）、ならびにｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５）から得られるプロモータがある。さらなるプロモータが、「Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ」，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２４２：７４−９４；および前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９に記載されている。タンデムプロモータの例は、国際公開第９９／４３８３５号パンフレットに開示されている。
【００７０】
糸状真菌宿主細胞において、本発明の核酸構築物の転写を指令するのに好適なプロモータの例は、以下：アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）耐酸性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）アルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）ダリア（Ｄａｒｉａ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）クイン（Ｑｕｉｎｎ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドラーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドラーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−キシロシダーゼ、およびトリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）翻訳延長因子の遺伝子から得られるプロモータ、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモータ（非翻訳リーダが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダにより置換されているアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）中性α−アミラーゼ遺伝子由来の修飾プロモータ；非限定的例として、非翻訳���ーダが、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダにより置換されているアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ遺伝子由来の修飾プロモータが挙げられる）；ならびにこれらの変異型、切断型、およびハイブリッドプロモータである。他のプロモータは、米国特許第６，０１１，１４７号明細書に記載されている。
【００７１】
酵母宿主において、有用なプロモータは、以下：サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メタロチオネイン（ＣＵＰ１）、およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモータは、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８により記載されている。
【００７２】
制御配列はまた、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる転写ターミネータであり得る。ターミネータは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’−末端に作動可能にリンクする。本発明においては、宿主細胞において機能するいずれかのターミネータが用いられ得る。
【００７３】
細菌宿主細胞の好ましいターミネータは、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）アルカリプロテアーゼ（ａｐｒＨ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ（ａｍｙＬ）、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）リボソームＲＮＡ（ｒｒｎＢ）の遺伝子から得られる。
【００７４】
糸状真菌宿主細胞のための好ましいターミネータは、以下：アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドラーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドラーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−キシロシダーゼ、およびトリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）翻訳延長因子の遺伝子から得られる。
【００７５】
酵母宿主細胞のための好ましいターミネータは、以下：サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）シトクロームＣ（ＣＹＣ１）、およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネータは、前述のＲｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２により記載されている。
【００７６】
制御配列はまた、プロモータの下流で、かつ遺伝子の発現を増大する遺伝子のコード配列の上流のｍＲＮＡ安定化領域でもあってもよい。
【００７７】
好適なｍＲＮＡ安定化領域の例は、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（国際公開第９４／２５６１２号パンフレット）および古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＰ８２遺伝子（Ｈｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７７：３４６５−３４７１）から得られる。
【００７８】
制御配列はまた、リーダ、すなわち、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域であってもよい。リーダは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’−末端に作動可能に連結されている。宿主細胞において機能性である任意のリーダを用いてよい。
【００７９】
糸状真菌宿主細胞のための好ましいリーダは、以下：アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびアスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。
【００８０】
酵母宿主細胞に好適なリーダは、以下：サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子、およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【００８１】
制御配列はまた、ポリアデニル化配列、すなわち、ポリヌクレオチドの３’−末端に作動可能にリンクされて、転写されると、宿主細胞によりシグナルとして認識され、転写ｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加する配列であってもよい。宿主細胞において機能性のあらゆるポリアデニル化配列を用いてよい。
【００８２】
糸状真菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、以下：アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、およびフザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
【００８３】
酵母宿主細胞に有用なポリアデニル化配列は、ＧｕｏおよびＳｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．１５：５９８３−５９９０に記載されている。
【００８４】
また、制御配列は、ポリペプチドのＮ−末端に連結したシグナルペプチドをコードし、細胞の分泌経路にポリペプチドを向かわせるシグナルペプチドコード領域であってもよい。ポリヌクレオチドのコード配列の５’−末端は、翻訳リーディングフレーム内で、ポリペプチドをコードするコード配列のセグメントと天然にリンクしたシグナルペプチドコード配列を内在的に含有し得る。あるいは、コード配列の５’−末端は、コード配列に対して外来のシグナルペプチドコード配列を含有し得る。外来のシグナルペプチドコード配列は、コード配列が、シグナルペプチドコード配列を天然に含有しない場合に必要となり得る。あるいは、ポリペプチドの分泌を促進するために、天然のシグナルペプチドコード配列を外来のシグナルペプチドコード配列で単に置換してもよい。しかし、発現されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に向かわせるいずれのシグナルペプチドコード配列を用いてもよい。
【００８５】
細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード配列は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＮＣＩＢ  １１８３７マルトジェニックアミラーゼ、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）スブチリシン、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）β−ラクタマーゼ、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α−アミラーゼ、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、および古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。さらなるシグナルペプチドは、Ｓｉｍｏｎｅｎ  ａｎｄ  Ｐａｌｖａ，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５７：１０９−１３７によって記載されている。
【００８６】
糸状真菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード配列は、以下：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）エンドグルカナーゼＶ、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ、およびリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。
【００８７】
酵母宿主細胞に有用なシグナルペプチドは、以下：サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼの遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード配列は、前述のＲｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２により記載されている。
【００８８】
制御配列はまた、ポリペプチドのＮ−末端に位置するプロペプチドをコードするプロペプチドコード配列であり得る。得られたポリペプチドは、酵素原またはプロポリペプチド（または、いくつかの場合においてチモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般に非活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒または自己触媒切断によって活性ポリペプチドに転換されることが可能である。プロペプチドコード配列は、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリ性タンパク分解酵素（ａｐｒＥ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中性タンパク分解酵素（ｎｐｒＴ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼおよびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子の遺伝子から得られ得る。
【００８９】
シグナルペプチドおよびプロペプチド配列の両方が存在する場合、プロペプチド配列は、ポリペプチドのＮ−末端の隣に位置し、また、シグナルペプチド配列は、プロペプチド配列のＮ−末端の隣に位置する。
【００９０】
また、宿主細胞の増殖に対してポリペプチドの発現を調節する調節配列を付加することが望ましい場合もある。調節配列の例としては、調節化合物の存在などの化学的または物理的刺激に応じて、遺伝子の発現をオンまたはオフにするものがある。原核系における調節配列としては、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐオペレータ系が挙げられる。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。酵母の場合、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系を使用することができる。糸状真菌の場合には、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼプロモータ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモータ、およびアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼプロモータ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドラーゼＩプロモータ、およびトリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドラーゼＩＩプロモータを使用することができる。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物系では、これらの調節配列は、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および重金属を用いて増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含む。このような場合、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、調節配列に作動可能に連結されている。
【００９１】
発現ベクター
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、プロモータ、ならびに転写および翻訳終止シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。種々のヌクレオチドおよび制御配列が一緒になって、このような部位でポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を可能とするために１つまたは複数の好都合な制限部位を含み得る組換え発現ベクターが生成される。または、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。発現ベクターの形成において、コード配列は、コード配列が、発現に適切な制御配列と作動可能にリンクするようベクター中に位置されている。
【００９２】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に簡便に供されることが可能であり、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことが可能であるいずれかのベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの親和性に応じることとなる。ベクターは、直鎖または閉鎖された環状プラスミドであり得る。
【００９３】
ベクターは、例えば、プラスミド、染色体外要素、微小染色体、または人工染色体といった、自律複製ベクター（すなわち、染色体外のエンティティとして存在し、その複製が染色体複製から独立しているベクター）であってよい。ベクターは、自己複製を確実とするための何らかの手段を含有してもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入された際に、ゲノムに組み込まれて、それが組み込まれている染色体と一緒に複製されるものであってもよい。さらに、単一のベクターもしくはプラスミド、または宿主細胞のゲノムに導入しようとする全ＤＮＡを互いに含有する２つ以上のベクターもしくはプラスミド、またはトランスポゾンを用いてもよい。
【００９４】
ベクターは、形質転換、形質移入、形質導入等された細胞の選択を容易とする１つまたは複数の選択マーカーを含有することが好ましい。選択マーカーは、その生成物が、殺生剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性等をもたらす遺伝子である。
【００９５】
細菌性選択マーカーの例としては、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）もしくは古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシン、またはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーがある。酵母宿主細胞に好適なマーカーとして、これらに限定されないが、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３が挙げられる。糸状真菌宿主細胞に用いられる選択マーカーとして、これらに限定されないが、ａｄｅＡ（ホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキシミドシンターゼ）、ａｄｅＢ（ホスホリボシルアミノイミダゾールシンターゼ）、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにこれらの同等物が挙げられる。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞で使用するのに好ましいのは、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子ならびにストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ｂａｒ遺伝子である。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞で使用するのに好ましいのは、ａｄｅＡ、ａｄｅＢ、ａｍｄＳ、ｈｐｈ、およびｐｙｒＧ遺伝子である。
【００９６】
ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの統合、またはゲノムとは無関係の細胞中のベクターの自律複製を許容する要素を含有することが好ましい。
【００９７】
宿主細胞ゲノムへの統合に関して、ベクターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列、または相同的もしくは非相同的組換えによるゲノムへの統合に係るベクターのいずれかの他の要素に依存し得る。または、ベクターは、染色体における正確な位置での宿主細胞のゲノムへの相同的組換えによる統合をもたらす追加のポリヌクレオチドを含有していてもよい。正確な位置で統合される可能性を高めるために、統合要素は、相同的組換えの確率を高めるために対応する標的配列に対して高度の配列同一性を有する、１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対および８００〜１０，０００塩基対などの十分な数の核酸を含有しているべきである。統合要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的であるいずれかの配列であり得る。さらに、統合要素は、非コーディングまたはコーディングポリヌクレオチドであり得る。他方で、ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに統合され得る。
【００９８】
自律複製に関して、ベクターは、対象の宿主細胞におけるベクターの自律的な複製を可能とする複製起点をさらに含んでいてもよい。複製起点は、細胞において機能する自律複製を媒介するいずれかのプラスミドレプリケータであり得る。「複製起点」または「プラスミドレプリケータ」という用語は、インビボでのプラスミドまたはベクターの複製を可能とするポリヌクレオチドを意味する。
【００９９】
細菌性複製起点の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における複製を許容するプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７およびｐＡＣＹＣ１８４の複製起点、ならびにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における複製を許容するｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０およびｐＡＭβ１の複製起点である。
【０１００】
酵母宿主細胞で使用する複製起点の例は、２μ複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１およびＣＥＮ３の組み合わせ、ＡＲＳ４およびＣＥＮ６の組み合わせである。
【０１０１】
糸状真菌細胞において有用な複製起点の例は、ＡＭＡ１およびＡＮＳ１（Ｇｅｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ  ９８：６１−６７；Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：９１６３−９１７５；国際公開第００／２４８８３号パンフレット）である。ＡＭＡ１遺伝子の単離および上記遺伝子を含むプラスミドもしくはベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号パンフレットに開示されている方法に従って達成することができる。
【０１０２】
本発明のポリヌクレオチドの２つ以上のコピーが宿主細胞に挿入されて、ポリペプチドの生成が高められてもよい。ポリヌクレオチドのコピーの数は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムに統合することにより、または増幅可能な選択マーカー遺伝子をポリヌクレオチドに含めることにより増加させることが可能であり、ここで、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、従って、ポリヌクレオチドの追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択可能な薬剤中で細胞を培養することにより選択可能である。
【０１０３】
上記の要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築するために用いられる手法は、当業者に周知である（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照のこと）。
【０１０４】
宿主細胞
本発明はまた、本発明のポリペプチドの生成を指令する１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされている本発明のポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞にも関する。ポリヌクレオチドを含む構築物もしくはベクターは、構築物もしくはベクターが染色体性組み込み体として、または既述の自己複製染色体外ベクターとして維持されるよう宿主細胞に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異により、親細胞と同一ではない親細胞のあらゆる子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子およびその供給源に応じて大きく変わるであろう。
【０１０５】
宿主細胞は、本発明のポリペプチドの組換え生成に有用なあらゆる細胞（例えば、原核生物）であってよい。
【０１０６】
原核生物宿主細胞は、いずれかのグラム陽性またはグラム陰性細菌であってよい。グラム陽性細菌としては、これらに限定されないが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。グラム陰性細菌としては、これらに限定されないが、カムピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイッセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、およびウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）が挙げられる。
【０１０７】
細菌宿主細胞は、これらに限定されないが、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞を含むいずれかのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であってよい。
【０１０８】
細菌宿主細胞はまた、これらに限定されないが、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）、およびストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）細胞を含むいずれかのストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞であってもよい。
【０１０９】
細菌宿主細胞はまた、これらに限定されないが、ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、およびストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）細胞を含むいずれかのストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞であってもよい。
【０１１０】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，１９７９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１−１１５を参照のこと）、コンピテント細胞形質転換（例えば、Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，１９６１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：８２３−８２９、またはＤｕｂｎａｕ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ，１９７１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：２０９−２２１を参照のこと）、電気穿孔法（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ  ａｎｄ  Ｄｏｗｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：７４２−７５１を参照のこと）、または接合により（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｅ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５２７１−５２７８を参照のこと）行われ得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｈａｎａｈａｎ，１９８３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０を参照のこと）または電気穿孔法（例えば、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６１２７−６１４５を参照のこと）により行われ得る。ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換、電気穿孔法（例えば、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）４９：３９９−４０５を参照のこと）、接合（例えば、Ｍａｚｏｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３５８３−３５８５）、または形質導入（例えば、Ｂｕｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：６２８９−６２９４を参照のこと）により行われ得る。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、電気穿孔法（例えば、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６４：３９１−３９７）または接合（例えば、Ｐｉｎｅｄｏ  ａｎｄ  Ｓｍｅｔｓ，２００５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：５１−５７を参照のこと）により行われ得る。ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、天然の受容能（例えば、Ｐｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ，１９８１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５−１２９７を参照のこと）、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃａｔｔ  ａｎｄ  Ｊｏｌｌｉｃｋ，１９９１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ  ６８：１８９−２０７を参照のこと）、電気穿孔（例えば、Ｂｕｃｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３８００−３８０４を参照のこと）、または接合（例えば、Ｃｌｅｗｅｌｌ，１９８１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４５：４０９−４３６を参照のこと）により行われ得る。しかし、宿主細胞にＤＮＡを導入するための、当技術分野では公知のいずれの方法を用いてもよい。
【０１１１】
宿主細胞はまた、真核生物、例えば、哺乳動物、昆虫、植物、または真菌細胞であってもよい。
【０１１２】
宿主細胞は、真菌細胞であってもよい。本明細書で用いる「真菌」は、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）門、担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）門、ツボカビ（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）門、および接合菌（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ門）、ならびに卵菌（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）門およびあらゆる栄養胞子形成菌（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫにより定義されている通り）を含む。
【０１１３】
真菌宿主細胞は、酵母細胞であってもよい。本明細書で用いる「酵母」は、有子嚢胞子酵母（エンドミケス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子菌酵母、および不完全菌類（Ｆｕｎｇｉ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉ）（不完全酵母菌綱（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））に属する酵母を含む。酵母の分類法は、将来変わり得ることから、本発明の目的のために、酵母は、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｐａｓｓｍｏｒｅ，ａｎｄ  Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．９，１９８０）に記載の通りに定義されるものとする。
【０１１４】
酵母宿主細胞は、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、もしくはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞、例えば、クルイベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、サッカロマイセス・カルスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ジアスタチクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・オビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、またはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｙｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞であってよい。
【０１１５】
真菌宿主細胞は、糸状真菌細胞であってもよい。「糸状真菌」は、真菌（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）門および卵菌（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）門（前述のＨａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５に定義される通り）のあらゆる糸状形態を包含する。糸状真菌は、概して、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、およびその他の複合多糖類から構成される菌糸壁を特徴とする。栄養成長は、菌糸伸長によるものであり、炭素異化作用は、絶対嫌気性である。対照的に、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母による栄養成長は、単細胞性葉状体の出芽によるものであり、炭素異化作用は、発酵性であり得る。
【０１１６】
糸状真菌宿主細胞は、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ヤケイロタケ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ヒトヨタケ（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、カワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロケーテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、シワウロコタケ（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロマイセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、テルモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、カワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞であってよい。
【０１１７】
例えば、糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ヤケイロタケ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ  ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレジエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベッセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・サブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・サブベルミスプラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クイーンスランジクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナツム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｚｏｎａｔｕｍ）、コプリヌス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、コリオルス・ヒルスツス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、���ザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラジアータ（Ｐｈｌｅｂｉａ  ｒａｄｉａｔａ）、プレウロツス・エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビア・テルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）細胞であってよい。
【０１１８】
真菌細胞は、それ自体知られている方法で、プロトプラストの形成、プロトプラストの形質転換、および細胞壁の再生を含む工程により形質転換することができる。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞を形質転換する好適な手順は、欧州特許第２３８０２３号明細書、Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：４７０−１４７４、およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１４１９−１４２２に記載されている。フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種を形質転換する適切な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ  ７８：１４７−１５６、および国際公開第９６／００７８７号パンフレットに記載されている。酵母は、次の文献に記載されている手順を使用して形質転換することができる：Ｂｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ  Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．  ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，ｐｐ  １８２−１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３；およびＨｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２０。
【０１１９】
生成方法
本発明はまた、本発明のポリペプチドを生成する方法であって、以下：（ａ）ポリペプチドの生成を促進する条件下で本発明の組換え宿主細胞を培養するステップ；および任意選択で（ｂ）ポリペプチドを回収するステップを含む方法にも関する。
【０１２０】
宿主細胞は、当技術分野で公知の方法を用いて、ポリペプチドの生成に好適な栄養培地中で培養する。例えば、細胞は、好適な培地中ならびにポリペプチドの発現および／または単離が可能な条件下で、振盪フラスコ培養により、または実験用もしくは産業用発酵槽における小規模もしくは大規模発酵（連続式、バッチ式、フェドバッチ式または固体状発酵を含む）により培養してよい。培養は、炭素源および窒素源と、無機塩類とを含む好適な栄養培地において、当技術分野では公知の手順を用いて行なわれる。好適な培地は、供給業者から入手可能であるか、または（例えば、米国微生物系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のカタログにおいて）公開されている組成に従って調製してもよい。ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合は、ポリペプチドを培地から直接回収することができる。ポリペプチドが分泌されない場合は、細胞溶解物からこれを回収することができる。
【０１２１】
ポリペプチドは、ポリペプチドの専門分野において公知の方法を用いて検出することができる。これらの検出方法としては、これらに限定されないが、特定の抗体の使用、酵素産物の形成、または酵素基質の消失が挙げられる。例えば、酵素アッセイを用いてポリペプチドの活性を測定してもよい。
【０１２２】
ポリペプチドは、当技術分野において公知の方法を用いて回収することができる。例えば、これらに限定されないが、収集、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、または沈殿などの従来の手順により栄養培地からポリペプチドを回収することができる。一態様では、ポリペプチドを含む発酵ブロスを回収する。
【０１２３】
ポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチドを得るために、当技術分野で公知の様々な方法により精製することができ、こうした方法として、これらに限定されないが、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、電気泳動法（例えば、分取等電点電気泳動）、較差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと）が挙げられる。
【０１２４】
代替的な態様においては、ポリペプチドを回収するのではなく、ポリペプチドを発現する本発明の宿主細胞をポリペプチドの供給源として用いる。
【０１２５】
発酵ブロス調合物または細胞組成物
本発明はまた、本発明のポリペプチドを含む発酵ブロス調合物または細胞組成物にも関する。発酵ブロス製品は、さらに、発酵工程に用いる別の成分、例えば、細胞（目的のポリペプチドを生成するのに用いられる本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を含有する宿主細胞など）、細胞残屑、バイオマス、発酵培地および／または発酵産物なども含む。一部の実施形態では、組成物は、有機酸、死滅細胞および／または細胞残屑、ならびに培地を含有する細胞死滅全ブロスである。
【０１２６】
本明細書で用いる場合、「発酵ブロス」という用語は、回収および／もしくは精製に一切付されないか、または最小限にしか付されない細胞発酵により生成される調製物を指す。例えば、発酵ブロスは、微生物培養物を飽和まで増殖させ、タンパク質合成（例えば、宿主細胞による酵素の発現）および細胞培地への分泌を可能にする炭素制限条件下でインキュベートする際に生成される。発酵ブロスは、発酵の終わりに得られる発酵物質の未分画もしくは分画成分を含有していてもよい。典型的に、発酵ブロスは、未分画であり、微生物細胞（例えば、糸状真菌細胞）を、例えば遠心分離により除去した後に存在する使用済み培地および細胞残屑を含む。一部の実施形態では、発酵ブロスは、使用済み細胞培地、細胞外酵素、ならびに生育可能なおよび／または生育不能な微生物細胞を含む。
【０１２７】
一実施形態では、発酵ブロス調合物および細胞組成物は、少なくとも１つの１〜５炭素有機酸および／またはその塩を含む第１有機酸成分と、少なくとも１つの６以上の炭素有機酸および／またはその塩を含む第２有機酸成分とを含む。特定の実施形態では、第１有機酸成分は、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、それらの塩、またはこれらのうちの２つ以上の混合物であり、また、第２有機酸成分は、安息香酸、シクロヘキサンカルボン酸、４−メチル吉草酸、フェニル酢酸、それらの塩、またはこれらのうちの２つ以上の混合物である。
【０１２８】
一態様では、組成物は、有機酸を含み、また任意選択で、死滅細胞および／または細胞残屑も含有する。一実施形態では、死滅細胞および／または細胞残屑は、これらの成分を含まない組成物を提供するために、細胞死滅全ブロスから除去される。
【０１２９】
発酵ブロス調合物または細胞組成物は、防腐剤および／または抗菌（例えば、静菌）剤を含んでもよく、このようなものとして、限定しないが、ソルビトール、塩化ナトリウム、ソルビン酸カリウム、および当技術分野では公知の他の物質などが挙げられる。
【０１３０】
細胞死滅全ブロスまたは組成物は、発酵の終わりに得られる発酵物質の未分画成分を含んでもよい。典型的に、細胞死滅全ブロスまたは組成物は、微生物細胞（例えば、糸状真菌細胞）を飽和まで増殖させ、タンパク質合成を可能にする炭素制限条件下でインキュベートした後に存在する使用済み培地および細胞残屑を含有する。一部の実施形態では、細胞死滅全ブロスまたは組成物は、使用済み細胞培地、細胞外酵素、ならびに死滅糸状真菌細胞を含有する。一部の実施形態では、細胞死滅全ブロスまたは組成物中に存在する微生物細胞を、当技術分野では公知の方法を用いて、透過性にするか、および／または溶解させることができる。
【０１３１】
本明細書に記載する全ブロスまたは組成物は、典型的に、液体であるが、死滅細胞、細胞残屑、培地成分、および／または不溶性酵素などの不溶性成分を含有してもよい。一部の実施形態では、清澄化した液体組成物を提供するために、不溶性成分を除去してもよい。
【０１３２】
本発明の全ブロス調合物および細胞組成物は、国際公開第９０／１５８６１号パンフレットまたは国際公開第２０１０／０９６６７３号パンフレットに記載の方法によって生成してもよい。
【０１３３】
発酵ブロス
本発明の発酵ブロスは、目的のタンパク質を産生する細胞を含み、目的のタンパク質は、その一部が、結晶および／または非晶質沈殿物として存在する。
【０１３４】
当技術分野で公知の任意の細胞を使用してよい。細胞は、微生物または哺乳動物細胞であってよい。本発明の微生物は、任意の属の微生物であってよい。
【０１３５】
好ましい実施形態において、目的のタンパク質は、細菌または真菌ソースから取得することができる。
【０１３６】
例えば、目的のタンパク質は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株、例えば、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、もしくはバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）；またはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）株、例えば、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）もしくはストレプトマイセス・ミュリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ）などのグラム陽性細菌；またはグラム陰性細菌、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）もしくはシュードモナス属種から得ることができる。好ましい実施形態では、細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞である。
【０１３７】
目的のタンパク質は、真菌供給源、例えば、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株、例えば、サッカロマイセス・カルスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ジアスタチクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）もしくはサッカロマイセス・オビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）株などの酵母株から取得することができる。
【０１３８】
目的のタンパク質は、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロマイセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、テルモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株などの糸状真菌株から取得することができ、特に、目的のポリペプチドは、アスペルギルス・アクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌ���  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）株から取得することができる。
【０１３９】
これらの種の株は、いくつかの微生物保存機関、例えば、米国微生物系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）（ＤＳＭ）、オランダの微生物保存機関（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＣＢＳ）、および農業研究局特許培養物コレクション、北方リサーチセンター（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）において容易に一般に入手可能である。
【０１４０】
好ましい実施形態において、本発明の細胞は、単一細胞である。一部の真菌は、酵母様形態で産生され得る。真菌細胞はまた、国際公開第２００５／０４２７５８号パンフレットに記載されているように、断片化および／または破砕してもよい。
【０１４１】
本発明の目的のために、「〜から得られる」という用語は、所与のソースに関連して本明細書で用いられるとき、目的のタンパク質が、ソースによって産生されるか、またはソース由来の遺伝子が挿入された細胞によって産生されることを意味する。
【０１４２】
細胞は、当技術分野で公知の任意の方法により発酵させることもできる。発酵培地は、複合窒素源および／または炭素源、例えば、ダイズミール、綿実粕、コーンスティープリカー、酵母エキス、カゼイン加水分解物、モラッセなどを含む複合培地であってよい。発酵培地は、例えば、国際公開第９８／３７１７９号パンフレットに定義されているように、既知組成培地であってもよい。
【０１４３】
発酵培地中のいくつかの商業的成分は、可溶性ではなく、非消化性成分を含有し、これらの成分は、発酵工程で発酵培地中に残留するため、発酵後に所望のタンパク質から分離する必要がある。従って、当業者であれば、発酵後の発酵培地が、本発明によれば、一部が結晶または非晶質形態である目的のタンパク質、細胞および細胞残屑ならびに発酵培地の不溶性残渣などのいくつかの固体成分を含むことは理解されよう。
【０１４４】
発酵は、フェドバッチ、反復フェドバッチ、または連続発酵工程として実施してよい。
【０１４５】
発酵中、目的のタンパク質が産生されるが、効率的な産業的発酵の場合、目的のタンパク質は、その可溶性を超える濃度で産生されるため、目的のタンパク質が沈殿することが往々にして観測される。
【０１４６】
目的のタンパク質の沈殿は、発酵後の目的のタンパク質の精製に際し当業者に課題をもたらし、精製工程では、細胞、細胞残屑および増殖培地の固体残渣を、ろ過などの公知の固体／液体分離方法で液体から分離する。目的のタンパク質が、固体形態で完全にまたは部分的に利用可能であれば、これは、分離工程で固体を維持するため、収率を低下させることになる。
【０１４７】
本発明の方法は、目的のタンパク質を精製する方法を提供し、ここで、目的のタンパク質は、結晶形態もしくは非晶質形態またはこれらの混合物のいずれかの固体形態で存在する。タンパク質ならびに他の化学化合物は、タンパク質の濃度が固溶限界を超えると、溶液から沈殿することは当技術分野ではよく知られている。従って、本発明の方法は、多量に目的のタンパク質を生成する場合に、特に有用である。従って、発酵ブロス中の目的のタンパク質の濃度は、好ましくは３ｇ／ｌ超、例えば４ｇ／ｌ超、例えば５ｇ／ｌ超、例えば６ｇ／ｌ超、例えば７ｇ／ｌ超、例えば８ｇ／ｌ超、例えば９ｇ／ｌ超、例えば１０ｇ／ｌ超、例えば１１ｇ／ｌ超、例えば１２ｇ／ｌ超、例えば１３ｇ／ｌ超、例えば１４ｇ／ｌ超、例えば１５ｇ／ｌ超、例えば１６ｇ／ｌ超、例えば１７ｇ／ｌ超、例えば１８ｇ／ｌ超、例えば１９ｇ／ｌ超、例えば２０ｇ／ｌ超である。
【０１４８】
固体形態という用語は、本明細書および特許請求の範囲において、目的のタンパク質の産生が、特定のタンパク質の固溶限界を超える十分に高いレベルに達したとき、発酵ブロス中に認められる固体形態を表すために使用される。固体形態は、結晶形態であってもよく、これは、規則的形状および角度を特徴とし、構造全体を通して同じ分子構成を有する構造で、分子が規則的に配置されていることを意味する。典型的に、結晶は、結晶の規則的構成のために、固定角で光を回折させることができる。固体形態はまた、非晶質形態であってもよく、これは、結晶に認められるものより非規則的に分子が配置され、かつ分子の構成が構造の部分によって異なる、非規則的構造として理解される。また、固体形態は、部分的に結晶形態であってもよく、この場合、材料の一部が結晶形態であり、これは、非晶質形態である固体材料の別の部分と混合している。目的のタンパク質が発酵ブロス中に存在する固体形態は、本発明を何ら限定するものではなく、反対に、本発明の方法は、発酵ブロスのｐＨでの溶解度と比較して、低ｐＨで、より溶解性である特性を有するあらゆる目的のタンパク質に適している。
【０１４９】
ｐＨの調節のためにほぼあらゆる酸を使用することができる。酸は、無機または有機のいずれであってもよい。いくつかの例として、塩酸、硫酸、亜硫酸、亜硝酸、リン酸、酢酸、クエン酸、およびギ酸がある。当業者は、一般に、費用、および後の精製工程でいずれの酸が許容可能であるかに関する考慮に基づいて、本発明の目的に好適な酸を選択することができるであろう。好ましい酸は、リン酸、ギ酸、クエン酸、および酢酸である。
【０１５０】
発酵ブロスのｐＨを低ｐＨに調節すると、目的のタンパク質の溶解度が、ｐＨの変化のために上昇することから、タンパク質は再び可溶化し始める。固体形態の目的のタンパク質の溶解は、容器内での特定の条件および特定のタンパク質の特性に応じて急速となるか、または緩徐となり得る。他の溶解過程と同様に、混合物を攪拌しない対応する状況と比較して、例えば、混合物の攪拌により、攪拌した混合物中で加速される。
【０１５１】
ｐＨの調節後、発酵ブロスを後処理工程、例えば、１つまたは複数の精製ステップで処理する前に、目的のタンパク質を溶解させるために保持期間を設けてもよい。保持期間は、後処理前に目的のタンパク質の満足な溶解を確実にするように十分な長さとすべきである。典型的には、保持期間は、少なくとも５分、例えば少なくとも１０分、例えば少なくとも２０分、例えば少なくとも３０分、例えば少なくとも４０分、例えば少なくとも５０分、例えば少なくとも６０分、例えば少なくとも７０分、例えば少なくとも８０分、例えば少なくとも９０分、例えば少なくとも１００分、例えば少なくとも１１０分、例えば少なくとも１２０分である。
【０１５２】
ｐＨの調節および任意選択の保持期間後、所望の最終生成物を取得するために、目的のタンパク質を含む発酵ブロスを後処理する。典型的には、後処理の第１ステップは、目的のタンパク質を溶解状態で含有する発酵ブロスの液体部分を不溶性部分、例えば、細胞および細胞残屑および増殖培地の残渣から分離する分離工程である。本発明は、いずれか特定のタイプの分離工程に限定されるわけではなく、原則として、不溶性物質から液体を分離することができるあらゆるタイプの分離工程、例えば、ろ過、遠心分離またはデカンテーションを使用することができる。分離後、所望の形態、純度および製剤で目的のタンパク質を取得するために、さらなるステップ、例えば、濃縮、クロマトグラフィ、安定化、噴霧乾燥、造粒を適用することができる。
【０１５３】
本発明の方法は、固体／液体分離前に、発酵ブロスの前処理をさらに含んでもよく、こうした前処理として、例えば、発酵ブロスを水または水溶液で希釈する希釈ステップ、塩の添加または精製の際に有益な作用を有する他の化合物（例えば、ポリマーもしくは安定剤など）の添加がある。前処理ステップは、ｐＨをヒスチジンのｐＫａを下回る値に調節する前または後のいずれに行ってもよい。
【０１５４】
好ましい実施形態
本発明を、以下の実施形態によって説明する：
１．タンパク質生成物を精製する方法であって、タンパク質の少なくとも一部は、タンパク質の表面に位置する２〜６個のヒスチジン残基を有し、この方法は以下：
ａ．発酵ブロスを提供するステップ、
ｂ．任意選択で、ヒスチジン側鎖のｐＫａを下回る値にｐＨを調節するステップ、
ｃ．任意選択で、混合物をある期間にわたって保持するステップ、および
ｄ．発酵ブロスからの固体材料の少なくとも一部から、溶解したタンパク質生成物を分離するステップ
を含むステップで行われる、方法。
２．ヒスチジン側鎖のｐＫａが６．０である、実施形態１の方法。
３．タンパク質の表面に位置する２〜６個のヒスチジンが、一次配列の内部に配置される、実施形態１または２の方法。
４．目的のタンパク質の表面の２〜６個のヒスチジン残基の少なくとも１つが、置換または挿入によりもたらされる、実施形態３の方法。
５．タンパク質の表面に位置する２〜６個のヒスチジンが、タンパク質のＣ−および／またはＮ−末端延伸の形態である、実施形態１または２の方法。
６．タンパク質生成物が酵素である、実施形態１〜５の方法。
７．酵素が、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼから選択される、実施形態６の方法。
８．酵素が、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノトランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾチーム、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼである、実施形態７の方法。
９．酵素が、メタロプロテアーゼおよびスブチラーゼから選択されるプロテアーゼである、実施形態８の方法。
１０．酵素が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号２５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するプロテアーゼである、実施形態９の方法。
１１．酵素が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号２５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するプロテアーゼである、実施形態１０の方法。
１２．酵素が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号２５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するプロテアーゼである、実施形態１１の方法。
１３．酵素が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するプロテアーゼである、実施形態１２の方法。
１４．酵素が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号２５に対して少なくとも９６％の配列同一性を有するプロテアーゼである、実施形態１３の方法。
１５．酵素が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号２５に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するプロテアーゼである、実施形態１４の方法。
１６．酵素が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号２５に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するプロテアーゼである、実施形態１５の方法。
１７．酵素が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号２５に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するプロテアーゼである、実施形態１６の方法。
１８．酵素が、配列番号１８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するリゾチームである、実施形態８の方法。
１９．酵素が、配列番号１８に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するリゾチームである、実施形態１８の方法。
２０．酵素が、配列番号１８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するリゾチームである、実施形態１９の方法。
２１．酵素が、配列番号１８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するリゾチームである、実施形態２０の方法。
２２．酵素が、配列番号１８に対して少なくとも９６％の配列同一性を有するリゾチームである、実施形態２１の方法。
２３．酵素が、配列番号１８に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するリゾチームである、実施形態２２の方法。
２４．酵素が、配列番号１８に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するリゾチームである、実施形態２３の方法。
２５．酵素が、配列番号１８に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するリゾチームである、実施形態２４の方法。
２６．ｐＨ４．５での目的のタンパク質の溶解度が、ｐＨ７．０での溶解度より少なくとも１０％高い、好ましくは少なくとも２０％高い、好ましくは少なくとも３０％高い、好ましくは少なくとも４０％高い、好ましくは少なくとも５０％高い、好ましくは少なくとも６０％高い、好ましくは少なくとも７０％高い、好ましくは少なくとも８０％高い、好ましくは少なくとも９０％高い、好ましくは少なくとも１００％高い、実施形態１〜２５のいずれかの方法。
２７．発酵ブロス中のタンパク質生成物の濃度が、少なくとも３ｇ／ｌ、例えば少なくとも４ｇ／ｌ、例えば少なくとも５ｇ／ｌ、例えば少なくとも６ｇ／ｌ；例えば少なくとも７ｇ／ｌ、例えば少なくとも８ｇ／ｌ、例えば少なくとも９ｇ／ｌ；例えば少なくとも１０ｇ／ｌ、例えば少なくとも１１ｇ／ｌ、例えば少なくとも１２ｇ／ｌ、例えば少なくとも１３ｇ／ｌ、例えば少なくとも１４ｇ／ｌ、例えば少なくとも１５ｇ／ｌ；例えば少なくとも１６ｇ／ｌ、例えば少なくとも１７ｇ／ｌ、例えば少なくとも１８ｇ／ｌ；例えば少なくとも１９ｇ／ｌ、例えば少なくとも２０ｇ／ｌである、実施形態１〜２６のいずれかの方法。
２８．ステップｂ）におけるｐＨが６．０未満、好ましくは５．５未満、好ましくは５．０未満、好ましくは４．５未満のｐＨ値に調節される、実施形態１〜２７のいずれかの方法。
２９．ステップｃに保持期間を含み、保持期間が、１０秒〜９０分の範囲、好ましくは１分〜９０分の範囲、好ましくは１分〜６０分の範囲、好ましくは１分〜３０分の範囲、例えば５分〜３０分の範囲、最も好ましくは１０〜２０分の範囲である、実施形態１〜２８のいずれかの方法。
３０．発酵ブロスが、増殖培地中で微生物を培養することによって得られる、実施形態１〜２９のいずれかの方法。
３１．微生物が、細菌および真菌から選択される、実施形態３０の方法。
３２．微生物が、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌、例えば、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）およびバチルス・リキニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｉｎｉｆｏｒｍｉｓ）から選択される、実施形態３１の方法。
３３．微生物が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ペニシルム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属する真菌、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、ショウユコウジカビ（Ａ．ｓｏｊａｅ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）もしくはトリコデルマ・ビリデ（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）；または好ましくはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハネンスラ（Ｈａｎｅｎｓｕｌａ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母；例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・オバルム（Ｓ．ｏｖａｒｕｍ）、ピチア・パストリス（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロマイセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）から選択される、実施形態３１の方法。
３４．ステップｄの分離が、ろ過、遠心分離またはデカンテーションを用いて実施される、実施形態１〜３３のいずれかの方法。
３５．方法が、ステップｄの分離の前に、前処理ステップをさらに含む、実施形態１〜３４のいずれかの方法。
３６．前処理ステップが、希釈、塩添加およびポリマーの添加から選択される、実施形態３５の方法。
３７．タンパク質生成物が、所与のアミノ酸配列を有する目的のタンパク質と、２〜６個のヒスチジン残基のＣ−および／またはＮ−末端延伸以外は同じアミノ酸配列を有する修飾タンパク質とを含有する、実施形態１〜３６のいずれかの方法。
３８．発酵ブロスが、目的のタンパク質をコードする遺伝子の１つまたは複数のコピーと、２〜６個のヒスチジン残基によりＣ−および／またはＮ−末端が延伸された目的のタンパク質の配列から構成される修飾タンパク質をコードする修飾遺伝子の１つまたは複数のコピーとを含む組換え微生物と一緒に基質を発酵することにより得られる、実施形態３７の方法。
３９．組換え微生物が、目的のタンパク質をコードする遺伝子の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つのコピーと、修飾遺伝子の１つまたは２つのコピーとを含有する、実施形態３８の方法。
４０．ステップｃに保持期間を含み、保持期間が、１０秒〜９０分の範囲、好ましくは１分〜９０分の範囲、好ましくは１分〜６０分の範囲、好ましくは１分〜３０分の範囲、例えば５分〜３０分の範囲、最も好ましくは１０〜２０分の範囲である、実施形態１〜３９のいずれかの方法。
４１．目的のタンパク質の産生を指令する１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされた目的のタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと、修飾タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、修飾タンパク質が、目的のタンパク質と比較して、タンパク質の表面に位置する２〜６個のヒスチジン残基を含有するように修飾されている、少なくとも１つのポリヌクレオチドとを含む組換え微生物であって、修飾遺伝子が、修飾タンパク質の産生を指令する１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされている、組換え微生物。
４２．原核生物細胞、好ましくは、グラム陽性細胞、より好ましくは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞；最も好ましくは、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞である、実施形態４１の組換え微生物。
４３．真核生物細胞、好ましくは真菌細胞、より好ましくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）またはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはピチア（Ｐｉｃｈｉａ）細胞；最も好ましくは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・アクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）  トリコデルマ・ビレデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｅｄｅ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・オバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖａｒｕｍ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞である、実施形態４１の組換え微生物。
４４．目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピー、好ましくは目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも３つのコピー、より好ましくは少なくとも４つのコピー、最も好ましくは少なくとも５つのコピーを含む、実施形態４１〜４３のいずれかの組換え微生物。
４５．目的の同じタンパク質をコードする少なくとも２つの異なるポリヌクレオチド、好ましくは目的の同じタンパク質をコードする少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つ、最も好ましくは少なくとも５つのポリヌクレオチドを含む、実施形態４１〜４４のいずれかの組換え微生物。
４６．目的のタンパク質が酵素である、実施形態４１〜４５のいずれかの組換え微生物。
４７．酵素が、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼである、実施形態４６の組換え微生物。
４８．酵素が、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノ−トランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾチーム、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼである、実施形態４７の組換え微生物。
４９．酵素が、プロテアーゼであり、好ましくは、プロテアーゼは、メタロプロテアーゼまたはスブチラーゼである、実施形態４８のいずれかの組換え微生物。
５０．プロテアーゼが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号２５の１つに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態４９の組換え微生物。
５１．プロテアーゼが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号２５から選択される、実施形態５０の組換え微生物。
５２．酵素が、リゾチームであり、好ましくは、リゾチームは、ＧＨ２５リゾチームである、実施形態４８の組換え微生物。
５３．リゾチームが、配列番号１８に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態５２の組換え微生物。
５４．リゾチームが、配列番号１８のアミノ酸配列を有する、実施形態５３の組換え微生物。
５５．ポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体中に異なる遺伝子座において組み込まれる、実施形態４１〜５４のいずれかの組換え微生物。
５６．酵素を生成する方法であって、酵素の生成を促進する条件下で、実施形態４１〜５４のいずれかに定義される細胞を培養するステップを含む、方法。
５７．酵素を回収するステップをさらに含む、実施形態５６の方法。
５８．目的のタンパク質の産生を指令する１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされた目的のタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと、修飾タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、修飾タンパク質が、目的のタンパク質と比較して、タンパク質の表面に位置する２〜６個のヒスチジン残基を含有するように修飾されている、少なくとも１つのポリヌクレオチドとを含む組換え微生物であって、修飾遺伝子が、修飾タンパク質の産生を指令する１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされている、組換え微生物。
５９．修飾タンパク質が、タンパク質のＣ−および／またはＮ−末端に結合した２〜６個のヒスチジン残基を含む、実施形態５８のタンパク質生成物。
６０．目的のタンパク質が酵素である、実施形態５８または５９のタンパク質生成物。
６１．酵素が、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼである、実施形態６０のタンパク質生成物。
６２．酵素が、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノ−トランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾチーム、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼである、実施形態６１のタンパク質生成物。
６３．酵素が、プロテアーゼであり、好ましくは、プロテアーゼは、メタロプロテアーゼまたはスブチラーゼである、実施形態６２のタンパク質生成物。
６４．プロテアーゼが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号２５の１つに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態６３のタンパク質生成物。
６５．プロテアーゼが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号２５から選択される、実施形態６４のタンパク質生成物。
６６．目的の酵素が、リゾチームであり、好ましくは、リゾチームが、ＧＨ２５リゾチームである、実施形態６２のタンパク質生成物。
６７．プロテアーゼが、配列番号１８に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態６６のタンパク質生成物。
６８．リゾチームが、配列番号１８のアミノ酸配列を有する、実施形態６７のタンパク質生成物。
【０１５５】
本発明を実施例と共にさらに詳しく説明するが、これらの実施例は、例示のために提供するに過ぎず、決して限定的と考慮すべきではない。
【実施例】
【０１５６】
材料および方法
プロテアーゼアッセイ（Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイ）
ｐＮＡ基質：Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ（Ｂａｃｈｅｍ  Ｌ−１４００）。
温度：室温（２５℃）
アッセイバッファー：１００ｍＭコハク酸、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＣＨＥＳ、１００ｍＭ  ＣＡＢＳ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．００１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ９．０。
【０１５７】
２０μｌのプロテアーゼ（０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に希釈）を１００μｌのアッセイバッファーと混合した。１００μｌのｐＮＡ基質（５０ｍｇを１．０ｍｌのＤＭＳＯに希釈した後、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００でさらに４５倍希釈した）を添加することにより、アッセイを開始した。ＯＤ４０５の増加を、プロテアーゼ活性の基準としてモニタリングした。
【０１５８】
リゾチーム活性（ＬＳＵ（Ａ）ＤＶ）の決定
リゾチーム（ＥＣ３．２．１．１７）は、グラム陽性細菌細胞壁中のペプチドグリカンを分解する酵素である。リゾチームの分析において、マイクロコッカス・リゾデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ番号４６９８（Ｓｉｇｍａ  Ｍ３７７０）を分解し、これにより、４５０ｎｍでの吸光度を低下させ、表１に示す条件下で測定する。吸光度の低下は、サンプル中に存在するＬＳＵ（Ａ）ＤＶ酵素活性に比例している。
【０１５９】
【表１】
2019170384.tif 000003
【０１６０】
標準（１９３−８１１１４：２３０００  ＬＳＵ（Ａ）ＤＶ／ｇ）
０．５０００ｇ／１００ｍｌ酢酸０．１Ｍ、ＮａＣｌ５０ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．１％、ｐＨ４．５
【０１６１】
一般的分子生物学的方法
ＰＣＲ、クローニング、ヌクレオチドの連結などの一般的方法は、当業者にはよく知られており、例えば、以下の文献に見出すことができる：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，（１９９５）；Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｃｕｔｔｉｎｇ，Ｓ．Ｍ．（ｅｄｓ．）；“ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ”，Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．（１９８５）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．（１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ（１９８５）；“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，（１９８４）。
【０１６２】
【表２】
2019170384.tif 000004
【０１６３】
３−ステップサイクル：
【数１】
2019170384.tif 000005
【０１６４】
培地および試薬
バッファーおよび基質のために使用する化学物質は、分析グレードの市販の製品であった：
−  Ｃｏｖｅ：３４２．３ｇ／Ｌのスクロース、２０ｍｌ／ＬのＣＯＶＥ塩類溶液、１０ｍＭアセトアミド、３０ｇ／Ｌのノーブル寒天。
−  Ｃｏｖｅ上層寒天：３４２．３ｇ／Ｌのスクロース、２０ｍｌ／ＬのＣＯＶＥ塩類溶液、１０ｍＭアセトアミド、１０ｇ／Ｌの低融点アガロース。
−  Ｃｏｖｅ−２：３０ｇ／Ｌのスクロース、２０ｍｌ／ＬのＣＯＶＥ塩類溶液、１０ｍＭアセトアミド、３０ｇ／Ｌのノーブル寒天。
−  ＣＯＶＥ塩類溶液は、２６ｇのＫＣｌ、２６ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、７６ｇのＫＨ2ＰＯ4および５０ｍｌのＣｏｖｅ微量金属、１リットルまでの水から構成される。
−  ＣＯＶＥのための微量金属溶液は、０．０４ｇのＮａＢ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ、０．４ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、１．２ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．０ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ２Ｏ、０．８ｇの中性アミラーゼＩＩＭｏＯ2・２Ｈ2Ｏ、および１０．０ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１リットルまでの水から構成される。
−  アミログルコシダーゼ微量金属溶液は、６．８ｇのＺｎＣｌ2・７Ｈ2Ｏ、２．５ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．２４ｇのＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、１３．９ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１３．５ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏおよび３ｇのクエン酸、１リットルまでの水から構成される。
−  ＹＰＧは、４ｇの酵母エキス、１ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．５ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏおよび１５ｇのグルコース（ｐＨ６．０）、１リットルまでの水から構成される。
−  ＳＴＣバッファーは、０．８Ｍのソルビトール、２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、および２５ｍＭのＣａＣｌ2、１リットルまでの水から構成される。
【０１６５】
ＳＴＰＣバッファーは、ＳＴＣバッファー中４０％ＰＥＧ４０００から構成される。
【０１６６】
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）形質転換
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）形質転換は、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９８８  ６  １４１９−１４２２により記載されている通りに実施した。好ましい手順を以下に記載する。
【０１６７】
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主株を、１０ｍＭウリジンで補充した１００ｍｌのＹＰＧ培地に接種してから、３２℃、８０ｒｐｍで１６時間インキュベートした。ペレットを収集し、０．６Ｍ  ＫＣｌで洗浄した後、１ｍｌ当たり２０ｍｇの最終濃度で市販のβ−グルカナーゼ製品（ＧＬＵＣＡＮＥＸ（商標）、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を含有する２０ｍｌの０．６Ｍ  ＫＣｌに再懸濁させた。懸濁液を３２℃、８０ｒｐｍで、プロトプラストが形成されるまでインキュベートした後、ＳＴＣバッファーで２回洗浄した。プロトプラストをヘマトメータで計数してから、ＳＴＣ：ＳＴＰＣ：ＤＭＳＯの８：２：０．１溶液中に再懸濁させて、最終濃度２．０×１０7プロトプラスト／ｍｌに調節した。約４μｇのプラスミドＤＮＡを１００μｌのプロトプラスト懸濁液に添加し、穏やかに混合した後、氷上で３０分インキュベートした。１ｍｌのＳＰＴＣを添加し、プロトプラスト懸濁液を３７℃で２０分インキュベートした。５０℃のＣｏｖｅ上層アガロース１０ｍｌの添加後、反応物をＣｏｖｅ寒天プレート上に注ぎ、プレートを３２℃で５日間インキュベートした。
【０１６８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
リゾチーム分析に用いるＳＤＳゲルは、ＢｉｏＲａｄ製のＡｎｙ  ｋＤ（商標）Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ  Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅ（商標）ゲルであった。１６ｕｌのサンプルをゲルにロードした（８μｌの各サンプルを８ｕｌのローディングバッファーと混合した）。また、１０ｕｌのＭＷ  Ｍａｒｋｅｒ：（Ａｍｅｒｓｈａｍ製のＬｏｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ＳＤＳ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ＃１７−０４４６−０１）も適用した。ゲルを１×ＳＤＳバッファー（ＢｉｏＲａｄ）において、２００Ｖの定電圧で２５分間電気泳動させた後、ＢｉｏＲａｄクライテリオン（ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）システムを用いることにより、製造者が推奨するように分析した。
【０１６９】
実施例１
変異体の調製および発現
以下に、発現カセットの突然変異および古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）への発現カセットの導入をまとめる。ＤＮＡ操作は全て、ＰＣＲ（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）により実施したが、これは、全ての当業者が再現することができる。
【０１７０】
スブチラーゼ変異体をコードする組換え古草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）構築物を用いて、濃厚な培地（例えば、ＰＳ−１：１００ｇ／Ｌのスクロース（Ｄａｎｉｓｃｏカタログ番号１０９−０４２９）、４０ｇ／Ｌのクラストソイ（ｃｒｕｓｔ  ｓｏｙ）（ダイズ粉）、１０ｇ／ＬのＮａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ（Ｍｅｒｃｋカタログ番号６５７９）、０．１ｍｌ／Ｌリプレイス（ｒｅｐｌａｃｅ）−Ｄｏｗｆａｘ６３Ｎ１０（Ｄｏｗ）を含有する振盪フラスコを接種した。培養は、典型的に、２２０ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で４日間実施する。
【０１７１】
以下のタンパク質が産生された。
参照：配列番号１
１ＨＩＳ：Ｎ−末端に結合した１ヒスチジンを有する配列番号１
２ＨＩＳ：Ｎ−末端に結合した２ヒスチジンを有する配列番号１
３ＨＩＳ：Ｎ−末端に結合した３ヒスチジンを有する配列番号１
４ＨＩＳ：Ｎ−末端に結合した４ヒスチジンを有する配列番号１
３ｉｎｔＨＩＳ：配列番号１＋Ｖ２３９Ｈ＋Ｎ２４３Ｈ＋Ｎ２４７Ｈ
【０１７２】
実施例２
実施例１で産生された参照および変異体を、欧州特許第１  ５２０  ０１２Ｂ１号明細書、実施例２に記載の方法を用いて、ＭＧＰは添加せずに、標準的実験室規模の発酵槽中で発酵させた。
【０１７３】
発酵中に変異体が沈殿したことが観測された。発酵中の活性から、参照、１ＨＩＳ、２ＨＩＳ、３ＨＩＳおよび４ＨＩＳの発酵によって、概ね同じ収率が得られたのに対し、３ｉｎｔＨＩＳ変異体の発酵では、参照より低い収率がもたらされたことが判明した。
【０１７４】
実施例３
実施例２からの発酵ブロスを水で３倍希釈し、ＨＣｌを用いて、４０℃でｐＨをｐＨ４．５に調節した後、発酵ブロスを６０分間攪拌した。
【０１７５】
ｐＨ調節直後および６０分後に、前述のプロテアーゼアッセイを用いて、上清中のプロテアーゼ活性を決定した。ｐＨ調節を１に設定した直後の参照の濃度に対して、プロテアーゼ濃度を決定した。結果を表３に示す。
【０１７６】
【表３】
2019170384.tif 000006
【０１７７】
これらの結果から、明らかに、本発明の変異体が全て、親（＝参照）と比較して、低ｐＨで、より高い溶解度を有することがわかる。さらにデータから、本発明の変異体の溶解度は、開始から高かったものの、６０分の保持期間中に、より多くの酵素が溶解状態となることも判明した。
【０１７８】
実施例４
変異体の調製および発現
以下に、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）への発現カセットの突然変異および導入をまとめる。ＤＮＡ操作は全て、ＰＣＲ（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）により実施したが、これは、全ての当業が再現することができる。
【０１７９】
２つの組換えバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株を調製した。参照株は、サビナーゼ（配列番号２）をコードする発現カセットを、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主株に形質転換した後、サビナーゼ遺伝子が組み込まれた発現カセットの５つのコピーを有する１形質転換体と、Ｎ−末端に４個のヒスチジン残基が結合したサビナーゼをコードする修飾遺伝子を含有する発現カセットの５つのコピーを有する１つの株を選択することにより調製した。
【０１８０】
組換え生物および参照生物を標準的実験室規模の発酵槽中で発酵させたところ、タンパク質が発酵中に沈殿することが観測された。発酵中の活性から、参照および４ＨＩＳの発酵は、概ね同じ収率をもたらしたことが判明した。
【０１８１】
実施例５
精製
実施例４から得られた発酵ブロスを水で６倍希釈し、酢酸を用いて、４０℃でｐＨをｐＨ４．５に調節した後、伝導性を調節するために、塩を添加し、発酵ブロスを４０℃の水浴中で６０分間攪拌した。
【０１８２】
ｐＨ調節直後および６０分後に、前述のプロテアーゼアッセイを用いて、上清中のプロテアーゼ活性を決定した。ｐＨ調節直後の参照の濃度（１に設定した）に対して、プロテアーゼ濃度を決定した。
【０１８３】
【表４】
2019170384.tif 000007
【０１８４】
これらの結果から、明らかに、修飾遺伝子の５つのコピーを有する組換え微生物を使用することが、目的の遺伝子のみで形質転換された参照組換え微生物と比較して、低ｐＨで、より高い溶解度をもたらしたことがわかる。さらにデータから、本発明の変異体の溶解度は、開始から高かったものの、６０分の保持期間中に、より多くの酵素が溶解状態となることも判明した。
【０１８５】
実施例６
以下に、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）への発現カセットの突然変異および導入をまとめる。ＤＮＡ操作は全て、ＰＣＲ（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）により実施したが、これは、全ての当業者が再現することができる。
【０１８６】
２つの発現カセットは、１つが、サビナーゼ変異体（配列番号３）をコードする遺伝子を含み、１つが、Ｃ−末端が４個のヒスチジン残基で延伸された配列番号３の配列を有する修飾サビナーゼ変異体を含む（配列番号３＋Ｈｉｓタグ）。
【０１８７】
組換え株は、サビナーゼ変異体（配列番号３）をコードする発現カセットと、修飾遺伝子を含有する発現カセットをバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主株に形質転換した後、サビナーゼ変異型遺伝子を含む発現カセットの５つのコピーと、組み込まれた修飾遺伝子（４Ｈｉｓ残基で延伸された）の１つのコピーを有する１形質転換体を選択することにより調製した。
【０１８８】
組換え生物を標準的実験室規模の発酵槽中で発酵させたところ、タンパク質が発酵中に沈殿することが観測された。
【０１８９】
発酵ブロスを水で６倍希釈し、酢酸を用いて、４０℃でｐＨをｐＨ４．５に調節した後、発酵ブロスを４０℃の水浴中で６０分間攪拌した。
【０１９０】
ｐＨ調節直後および１２０分後に、前述のプロテアーゼアッセイを用いて、上清中のプロテアーゼ活性を決定した。ｐＨ調節直後の参照の濃度（１に設定した）に対して、プロテアーゼ濃度を決定した。
【０１９１】
【表５】
2019170384.tif 000008
【０１９２】
これらの結果から、目的のプロテアーゼ（配列番号３）の５つのコピーと、同じプロテアーゼのＨｉｓ−タグ付き形態の１つのコピーとの組み合わせを用いると、沈殿したプロテアーゼの高度およびほぼ完全な溶解が達成されたことがわかる。比較して、目的のプロテアーゼを単独で（産生株にＨｉｓ−タグ付き形態のコピーを含有させずに）発酵させると、ｐＨを４．５に低下させた後、有意に少量のプロテアーゼしか溶解せず、１２０分後でも、より小さな画分の生成物しか試験条件下で溶解しない。
【０１９３】
以上の結果から、目的のプロテアーゼを含有する発現カセットのみを含有する参照微生物と比較して、目的のプロテアーゼを含有する発現カセットの５つのコピーと、Ｃ−末端に結合した４個のヒスチジンを有する目的のプロテアーゼを含有する発現カセットの１つのコピーとを含む組換え微生物を用いた場合、低ｐＨで、優れた溶解度が得られるという利点を確認した。
【０１９４】
実施例７
以下に、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）への発現カセットの突然変異および導入をまとめる。ＤＮＡ操作は全て、ＰＣＲ（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）により実施したが、これは、全ての当業者が再現することができる。
【０１９５】
２つの発現カセット、１つは、サビナーゼ変異体（配列番号３）をコードする遺伝子を含み、１つは、Ｃ−末端が４個のヒスチジン残基で延伸された配列番号４の配列を有する修飾サビナーゼ変異体を含む（配列番号４＋Ｈｉｓ−タグ）。
【０１９６】
組換え株は、サビナーゼ変異体（配列番号４）をコードする発現カセットと、修飾遺伝子を含有する発現カセットをバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主株に形質転換した後、サビナーゼ変異型遺伝子を含む発現カセットの５つのコピーと、組み込まれた修飾遺伝子（４Ｈｉｓ−残基で延伸された）の１つのコピーとを有する１形質転換体を選択することにより調製した。
【０１９７】
組換え生物を標準的実験室規模の発酵槽中で発酵させたところ、発酵中にタンパク質が沈殿することが観測された。
【０１９８】
発酵ブロスを水で６倍希釈し、酢酸を用いて、４０℃でｐＨをｐＨ４．５に調節した後、発酵ブロスを４０℃の水浴中で６０分間攪拌した。
【０１９９】
ｐＨ調節直後および１２０分後に、前述のプロテアーゼアッセイを用いて、上清中のプロテアーゼ活性を決定した。ｐＨ調節を１に設定した直後の参照の濃度に対して、プロテアーゼ濃度を決定した。
【０２００】
【表６】
2019170384.tif 000009
【０２０１】
これらの結果から、目的のプロテアーゼ（配列番号３）の５つのコピーと、同じプロテアーゼのＨｉｓ−タグ付き形態の１つのコピーとの組み合わせを用いると、沈殿したプロテアーゼの高度およびほぼ完全な溶解が達成されたことがわかる。比較して、目的のプロテアーゼを単独で（産生株にＨｉｓ−タグ付き形態のコピーを含有させずに）発酵させると、ｐＨを４．５に低下させた後、有意に少量のプロテアーゼしか溶解せず、１２０分後でも、より小さな画分の生成物しか試験条件下で溶解しない。
【０２０２】
以上の結果から、目的のプロテアーゼを含有する発現カセットのみを含有する参照微生物と比較して、目的のプロテアーゼを含有する発現カセットの５つのコピーと、Ｃ−末端に結合した４個のヒスチジンを有する目的のプロテアーゼを含有する発現カセットの１つのコピーとを含む組換え微生物を用いた場合、低ｐＨで、優れた溶解度が得られるという利点を確認した。
【０２０３】
実施例８．アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株におけるリゾチームの発現
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）発現カセットｐＪａＬ１４７０の構築
発現プラスミドｐＪａＬ１４６８は、プラスミドｐＨＵｄａ１２６０を鋳型として用い、それぞれ、プライマーセットｏＪａＬ５１９（ＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＴＴＣＡＴＣＴＴＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡ、配列番号５）／ｏＪａＬ５２２（ＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣ、配列番号６）、ｏＪａＬ５２１（ＧＧＡＴＴＴＡＧＴＣＴＴＧＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＡＴＧＣＧＴＴＴＣＡＴＴＴＣ、配列番号７）／ｏＪａＬ５２４（ＡＴＣＡＡＧＡＣＴＡＡＡＴＣＣＴＣ、配列番号８）、ｏＪａＬ５２３（ＴＧＧＡＡＧＴＴＡＣＧＣＴＣＧＣＡＴＴＣＴＧＴＡＡＡＣＧＧＧＣ、配列番号９）／ｏＪａＬ５２６（ＣＧＡＧＣＧＴＡＡＣＴＴＣＣＡＣＣ、配列番号１０）、ｏＪａＬ５２５（ＧＡＧＧＧＧＡＴＣＧＡＴＧＣＧＴＣＣＧＣＧＧＧＣＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧ、配列番号１１）／ｏＪａＬ５２８  （ＣＧＣＡＴＣＧＡＴＣＣＣＣＴＣＧＴＣ、配列番号１２）、ｏＪａＬ５２７（ＧＡＴＡＴＣＧＧＡＧＡＡＧＣＧＴＣＣＧＣＡＧＴＴＧＡＴＧＡＡＧＧ、配列番号１３）／ｏＪａＬ５３０（ＧＣＴＴＣＴＣＣＧＡＴＡＴＣＡＡＧ、配列番号１４）およびｏＪａＬ５２９（ＡＧＣＴＴＧＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧ、配列番号１５）／ｏＪａＬ５２０（ＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＧＣＡＴＧＣＡＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＴＧ、配列番号１６）による、以下：８４４ｂｐ、２９７２ｂｐ、３５１４ｂｐ、１５５ｂｐ、１５４８ｂｐおよび２６３３の６つのＰＣＲ断片の増幅によって作製した。６つのＰＣＲ断片を、製造者の指示に従い、Ｉｎｆｕｓｉｏｎクローニングによって互いに連結することにより、プラスミドｐＪａＬ１４６８を作出した。
【０２０４】
ＧＨ２５リゾチーム配列番号１８をコードするアクレモニウム・アルカロプフィルム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ａｌｃａｌｏｐｐｈｉｌｕｍ）（配列番号１７）の発現のために、アクレモニウム・アルカロプフィルム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ａｌｃａｌｏｐｐｈｉｌｕｍ）ゲノムＤＮＡを鋳型として用い、イントロンを含有するコード領域（配列番号１７）を、８７８ｂｐのＰＣＲ断片（配列番号１９）として、プライマーセットｏＪａＬ５１３（ＣＡＡＣＴＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣ、配列番号２０）およびｏＪａＬ５１４（ＧＴＧＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＣＧＡＴＣＧＣＴＴＡＧＴＣＴＣＣＧＴＴＡＧＣＧＡＧ、配列番号２１）により増幅した。８７８ｂｐＰＣＲ断片をＡｓｉＳＩＩおよびＮｏｔＩＩで消化することにより、８５２ｂｐ断片を得た。８５２ｂｐＡｓｉＳＩ−ＮｏｔＩ断片を、ｐＪａＬ１４６８内の対応する部位にクローニングして、プラスミドｐＪａＬ１４７０を取得した。
【０２０５】
ｐＨＵｄａ１２６０の構築
プラスミドｐＨＵｄａ１２６０は、ｐＲｉｋａ１４７において、アスペルギルス・ニズランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）からアスペルギルス・ニズランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）へと変更することにより構築した。
【０２０６】
プラスミドｐＲｉｋａ１４７（国際公開第２０１２１６００９３号パンフレットの実施例９に記載）をＳｐｈＩおよびＳｐｅＩで消化した後、その末端を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて、製造者のプロトコル（ＮＥＢ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）に従い充填した。断片を、ＴＡＥバッファーを用いて、０．８％アガロースゲル電気泳動により精製したが、その際、９，２４１ｂｐ断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出した。
【０２０７】
プラスミドｐＨＵｄａ１０１９（国際公開第２０１２１６００９３号パンフレットの実施例２に記載）を、ＸｂａＩおよびＡｖｒＩＩで消化した後、その末端を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて、製造者のプロトコル（ＮＥＢ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）に従い充填した。断片を、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製したが、その際、ａｍｄＳ遺伝子、アスペルギルス・オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ｔｅｆ１（翻訳延長因子１）プロモータおよびアスペルギルス・オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）ターミネータを含有する３，１１４ｂｐ断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出した。１μｌの９，２４１ｂｐ断片、３μｌの３，１１４ｂｐ断片、１μｌの５×リガーゼバッファー、５μｌの２×リガーゼバッファーおよび１μｌのリガーゼから構成される反応物（Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）において、９，２４１ｂｐ断片を３，１１４ｂｐ断片と連結した。連結反応物を室温で１０分間インキュベートした。５μｌの連結混合物をＤＨ５−αケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢおよびアンピシリンプレート上に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。ＱＩＡミニ−プレップキットを用いて、数個の形質転換体からプラスミドＤＮＡを精製した。ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動の後、適切な制限酵素の使用により、適正な連結について、プラスミドＤＮＡをスクリーニングした。１つのプラスミドをｐＨＵｄａ１２６０と称した。
【０２０８】
発現プラスミドｐＨｉＴｅ１５８の構築
アクレモニウム・アルカロフィルス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ａｌｃａｌｏｐｐｈｉｌｕｓ）由来のリゾチーム遺伝子の０．８５ｋｂ領域をプライマーペアＨＴＪＰ−４８３（ａｇｔｃｔｔｇａｔｃｇｇａｔｃｃａｃｃａｔｇａａｇｃｔｔｃｔｔｃｃｃｔｃｃｔｔｇ、配列番号２２）、およびＨＴＪＰ−５０４（ｃｇｔｔａｔｃｇｔａｃｇｃａｃｃａｃｇｔｇｔｔａｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｃｔｃｃｇｔｔａｇｃｇａｇａｇｃ、配列番号２３）を用いたＰＣＲにより、プラスミドｐＪａｌ１４７０から増幅した。
【０２０９】
得られた０．８５ｋｂＤＮＡ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）により、ＢａｍＨＩおよびＰｍｌＩで消化したｐＨｉＴｅ５０（ＮＺ  １２６８３）に連結して、ｐＨｉＴｅ１５８を作出した。
【０２１０】
アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）におけるリゾチームの形質転換
アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）（国際公開第２０１２／１６００９３号パンフレットに記載されている＿ＮＮ０５９２８０の誘導体）へのネイティブリゾチーム（ｐＪａＬ１４７０）またはａｍｄＳ選択マーカー含有のＣ−末端テトラヒスチジンタグ遺伝子を含むその変異体（ｐＨｉＴｅ１５８）のいずれかの染色体挿入を国際公開第２０１２／１６００９３号パンフレットに記載の通りに実施した。良好に増殖した株を精製し、サザンブロッティング分析に付すことにより、ｐＪａＬ１４７０またはｐＨｉＴｅ１５８のいずれかにおけるリゾチーム遺伝子が、ＮＡ１、ＮＡ２、ＳＰ２８８またはＰＡＹ遺伝子座に正しく導入されたか否かを確認した。非放射性プローブを作製するための以下のプライマーセットを用いて、選択した形質転換体を分析した。
【０２１１】
リゾチームコード領域の場合：
ＨＴＪＰ−４８３  Ａｇｔｃｔｔｇａｔｃｇｇａｔｃｃａｃｃａｔｇａａｇｃｔｔｃｔｔｃｃｃｔｃｃｔｔｇ（配列番号２２）
ＨＴＪＰ−５１３  Ｃｔｇｇｔａｇｃａｇｔｇｇｔａｇｇｇ（配列番号２４）
【０２１２】
選択した形質転換体から抽出したゲノムＤＮＡをＳｐｅＩおよびＰｍｌＩにより消化した後、リゾチームコード領域でプロービングした。正しい遺伝子の導入イベントによって、ＳｐｅＩおよびＰｍｌＩ消化による５．１ｋｂ（ＮＡ１）、１．９ｋｂ（ＳＰ２８８）、３．１ｋｂ（ＮＡ２）および４．０ｋｂ（ＰＡＹ）のサイズでハイブリダイズされたシグナルが、前述のようにプロービングされて観測された。
【０２１３】
ＮＡ１、ＮＡ２、ＳＰ２８８およびＰＡＹ遺伝子座の遺伝子の４コピーの正しい組み込みイベントが実施された株の中から、ネイティブリゾチームを含む１つの株（１４７０−Ｃ３０８５−１１）およびｈｉｓ−タグ付き変異体を含む１つの株（１５８−Ｃ３０８５−２）を選択した。
【０２１４】
実施例９．タンパク質溶解度に対するリゾチームのＣ−末端に対するテトラヒスチジンタグ付加の作用
ｈｉｓ−タグ付きリゾチームを含む株およびネイティブリゾチーム遺伝子を含む参照株を実験室規模のタンクにおいて発酵させた。
【０２１５】
リゾチーム生成のための実験室規模のタンクでの培養
発酵は、フェドバッチ発酵として実施した（Ｈ．Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ２０００，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，５３：２７２−２７７）。選択した株を液体培地中で前培養した後、さらなる酵素生成の培養のために、増殖した菌糸体をタンクに移した。培養は、グルコースおよびアンモニウムを供給しながら（酵素生成を妨げる過剰投与はせずに）、ｐＨ４．７５で、３４℃にて７日間実施した。遠心分離後、培養ブロスおよび上清を酵素アッセイのために使用した。
【０２１６】
ネイティブリゾチームの発酵ブロス中に結晶形成が観測されたが、Ｈｉｓ−タグ形態のブロス中には認められなかった。前述した方法の後、これらの酵素活性（ＬＳＵ活性）を測定し、結果を以下の表７に示す。
【０２１７】
【表７】
2019170384.tif 000010
【０２１８】
リゾチームが、１４７０−Ｃ３０８５−１１のブロス（１９２時間の発酵で調製）から得られる株のＬＳＵ活性を１．００に正規化する。発酵中、１４７０−Ｃ３０８５−１１中に形成された不溶化リゾチーム（結晶）は、水での培養ブロスの希釈後に、５０℃で１時間の熱処理により（部分的に）可溶化した。ｐＨｉＴｅ１５８からの形質転換体において結晶のないサンプルも同様に処理した。
【０２１９】
アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株の発酵からの上清サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に付すことにより、リゾチームの溶解度を調べ、比較した。予想通り、１４７０−Ｃ３０８５−１１からのサンプル中のリゾチームは、結晶のために発酵全体を通して有意に減少した（図１Ａ、レーン２〜６、および表８Ａ）のに対し、１５８−Ｃ３０８５−２からのサンプル中のリゾチームは、増加を続けた（図１Ｂ、レーン２〜６、および表８Ａ）が、これは、リゾチームの溶解性が、こうした条件下で、ｈｉｓ−タグ付加によって、強力に増強されたことを示唆している。
【０２２０】
【表８】
2019170384.tif 000011
【図１】
2019170384.tif 000012
【配列表】
2019170384000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月21日(2019.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のタンパク質の産生を指令する１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされた前記目的のタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと、修飾タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、前記修飾タンパク質が、前記目的のタンパク質と比較して、前記タンパク質の表面に位置する２〜６個のヒスチジン残基を含有するように修飾されている、少なくとも１つのポリヌクレオチドとを含む組換え微生物であって、修飾遺伝子が、前記修飾タンパク質の産生を指令する１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされている、組換え微生物。
【請求項２】
原核生物細胞、好ましくは、グラム陽性細胞、より好ましくは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞；最も好ましくは、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞である、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
真核生物細胞、好ましくは真菌細胞、より好ましくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）またはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはピチア（Ｐｉｃｈｉａ）細胞；最も好ましくは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・アクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）  トリコデルマ・ビレデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｅｄｅ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・オバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖａｒｕｍ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞である、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項４】
前記目的のタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドの少なくとも２つのコピー、好ましくは前記目的のタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドの少なくとも３つのコピー、より好ましくは少なくとも４つのコピー、最も好ましくは少なくとも５つのコピーを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項５】
前記目的の同じタンパク質をコードする少なくとも２つの異なるポリヌクレオチド、好ましくは前記目的の同じタンパク質をコードする少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つ、最も好ましくは少なくとも５つのポリヌクレオチドを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項６】
前記目的のタンパク質が、酵素、好ましくは、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼ、例えば、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノ−トランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾチーム、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項７】
前記酵素が、プロテアーゼであり、好ましくは、前記プロテアーゼが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号２５の１つに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項８】
前記酵素が、リゾチームであり、好ましくは、配列番号１８に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項７のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体中に異なる遺伝子座において組み込まれる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
酵素を生成する方法であって、前記酵素の生成を促進する条件下で、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞を培養するステップを含む、方法。
【請求項１１】
前記酵素を回収するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
目的のタンパク質と、修飾タンパク質であって、前記目的のタンパク質と比較して、前記タンパク質の表面に２〜６個のヒスチジン残基を含有するように修飾されている修飾タンパク質とを含む、タンパク質生成物。
【請求項１３】
前記修飾タンパク質が、前記タンパク質のＣ−および／またはＮ−末端に結合した２〜６個のヒスチジン残基を含む、請求項１２に記載のタンパク質生成物。
【請求項１４】
前記目的のタンパク質が、酵素、好ましくは、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼ、例えば、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノ−トランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾチーム、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼである、請求項１２または１３に記載のタンパク質生成物。
【請求項１５】
前記酵素が、プロテアーゼであり、好ましくは、前記プロテアーゼが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号２５の１つに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載のタンパク質生成物。
【請求項１６】
前記目的の酵素が、リゾチームであり、好ましくは、前記リゾチームが、配列番号１８に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載のタンパク質生成物。
【外国語明細書】
2019170384000001.pdf