(57)【要約】【課題】従来のコラーゲンコートを用いたPHHsのin vitroの細胞培養では、数日でPHHsの肝機能及び生存能力が低下するため、中長期的な創薬関連試験への適用が制限されている。すなわち、PHHsの機能を数日間維持できないという問題があった。本発明は、上記問題を解決する新規構造のコラーゲン構造体を提供することを課題とする。【解決手段】表面にディンプルを有するコラーゲン原線維を含むコラーゲン構造体が、上記課題を解決できることを見出した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面にディンプルを有する、コラーゲン原線維を含むコラーゲン構造体。
【請求項２】
前記表面のディンプルは、複数のコラーゲン原線維が重なり合うことにより生じる窪み形状の空間である請求項１に記載のコラーゲン構造体。
【請求項３】
前記ディンプルは、表面475 μm2あたりに、1個〜4,000個有する請求項１又は２に記載のコラーゲン構造体。
【請求項４】
前記表面475 μm2あたりのモチーフ数が4,377以下である請求項１〜３のいずれか１に記載のコラーゲン構造体。
【請求項５】
前記モチーフの平均面積が0.12 μm2以上である請求項４に記載のコラーゲン構造体。
【請求項６】
前記表面がランダムな配向である請求項１〜５のいずれか１に記載のコラーゲン構造体。
【請求項７】
前記コラーゲン構造体を形成する複数のコラーゲン原線維間に空間が形成されている請求項１〜６のいずれか１に記載のコラーゲン構造体。
【請求項８】
前記コラーゲン構造体を形成する複数のコラーゲン原線維はランダムに配向している請求項１〜７のいずれか１に記載のコラーゲン構造体。
【請求項９】
前記コラーゲン原線維がアテロコラーゲン原線維である請求項１〜８のいずれか１に記載のコラーゲン構造体。
【請求項１０】
前記コラーゲン構造体のコラーゲン密度が0.21 mg/cm2以上である請求項１〜９のいずれか１に記載のコラーゲン構造体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１に記載のコラーゲン構造体を含むコラーゲン担体。
【請求項１２】
細胞培養用である請求項１０又は１１に記載のコラーゲン担体。
【請求項１３】
培養細胞の酵素活性増強作用を有する請求項１２に記載のコラーゲン担体。
【請求項１４】
培養細胞の薬物応答性増強作用を有する請求項１２又は１３に記載のコラーゲン担体。
【請求項１５】
培養細胞の脱分化抑制作用を有する請求項１２〜１４のいずれか１に記載のコラーゲン担体。
【請求項１６】
以下の工程を含む、表面にディンプルを有するコラーゲン原線維を含むコラーゲン構造体の製造方法、
（１）濃度0.1 mg/ml〜100 mg/mlのコラーゲン溶液をコート対象の表面に被覆して、コラーゲン密度を0.21 mg/cm2以上にする工程。
【請求項１７】
さらに以下の工程を含む請求項１６に記載のコラーゲンの製造方法、
（２）前記コラーゲン構造体を架橋する工程。
【請求項１８】
前記コラーゲンがアテロコラーゲンである請求項１６又は１７に記載のコラーゲンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なコラーゲン構造体、該コラーゲン構造体を含むコラーゲン担体及び該担体を用いた細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（コラーゲン）
コラーゲンは、ヒト初代培養肝細胞（PHHs）等を培養するために一般的に用いられる細胞外基質（ECM）である。
従来の肝細胞2次元培養は、簡便で最も一般的な培養方法である（非特許文献２）。PHHsの培養における従来のコラーゲンコート（コラーゲンが表面にコーティングされている培養容器等）は、コラーゲン密度がマイクログラム/cm2オーダーで培養されている。
【０００３】
（肝細胞）
ヒト初代培養肝細胞は、創薬における候補薬物の肝薬物代謝、クリアランス（clearance）、薬物相互作用、トランスポーター活性、肝毒性等の有効性・毒性試験や肝再生研究において広く用いられている（非特許文献１〜３）。
従来のコラーゲンコート上で培養した初代培養肝細胞は、急速に機能を消失するため約１日（24時間時点）まで適した培養モデルであるが、中長期的な毒性試験に適さない(非特許文献４）。
【０００４】
（肝細胞様細胞）
人工多能性幹（iPS）細胞又は胚性幹（ES）細胞由来の肝細胞様細胞｛HLC(s)｝が、増殖能及び分化能から薬物試験等の利用に有望視されている。しかし、HLCsは未成熟な表現型を有し、必ずしもPHHsと類似した機能を示すわけではない（非特許文献５及び６）。
【０００５】
（先行特許文献）
任意の培養容器に所定の濃度のコラーゲン溶液を塗布後、所定の角度の傾斜を設けた面上に静置して、コラーゲン線維を重合させたことを特徴とするコラーゲンコート細胞培養容器が報告されている（特許文献１）。しかし、特許文献１に記載のコラーゲンコート細胞培養容器は、本発明のコラーゲン構造体とは明らかに構造が異なる。
アミノ基を有する基材表面にコラーゲン層を形成させ、該アミノ基とコラーゲンとを化学的に結合させたことを特徴とするコラーゲンコート細胞培養器が報告されている（特許文献２）。しかし、特許文献２に記載のコラーゲンコート細胞培養容器は、本発明のコラーゲン構造体とは明らかに構造が異なる。
少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成された担体の表面の少なくとも一部が、コラーゲンと親和性の高いタンパク質を介して、前記コラーゲンで被覆されてなることを特徴とするコラーゲン被覆担体が報告されている（特許文献３）。しかし、特許文献３に記載のコラーゲン被覆担体は、本発明のコラーゲン構造体とは明らかに構造が異なる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−１４２７５２
【特許文献２】特開平８−１６８３７２
【特許文献３】特開２００６−３２５４６７
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Godoy, P. et al. Recent advances in 2D and 3Din vitro systems using primary hepatocytes,alternative hepatocyte sources andnon-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms ofhepatotoxicity, cell signaling and ADME. Arch. toxicol. 87, (2013).
【非特許文献２】Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer,D. & Kn&ouml;spel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models.Exp. Biol. Med. 241, 1684-1698 (2016).
【非特許文献３】Fraczek, J., Bolleyn, J., Vanhaecke, T.,Rogiers, V. & Vinken, M. Primary hepatocyte cultures forpharmaco-toxicological studies: At the busy crossroad of variousanti-dedifferentiation strategies. Arch. toxicol. 87, (2013).
【非特許文献４】Beigel, J., Fella, K., Kramer, P.-J.,Kroeger, M. & Hewitt, P. Genomics and proteomics analysis of culturedprimary rat hepatocytes. Toxicol. In Vitro 22, 171-181 (2008).
【非特許文献５】Godoy, P. et al. Gene networks and transcription factormotifs defining the differentiation of stem cells into hepatocyte-like cells. J.Hepatol. 63, 934-942 (2015).
【非特許文献６】Baxter, M. et al. Phenotypic and functional analyses showstem cell-derived hepatocyte-like cells better mimic fetal rather than adulthepatocytes. J. Hepatol. 62, 581-589 (2015).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来のコラーゲンコートを用いたPHHsのin vitroの細胞培養では、数日でPHHsの肝機能及び生存能力が低下するため、中長期的な創薬関連試験への適用が制限されている。すなわち、PHHsの機能を数日間維持できないという問題があった。
本発明は、上記問題を解決する新規構造のコラーゲン構造体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究した結果、表面にディンプルを有するコラーゲン原線維を含むコラーゲン構造体（以後、「本発明のコラーゲン構造体」と称する場合がある）が、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、以下の通りである。
１．表面にディンプルを有する、コラーゲン原線維を含むコラーゲン構造体。
２．前記表面のディンプルは、複数のコラーゲン原線維が重なり合うことにより生じる窪み形状の空間である前項１に記載のコラーゲン構造体。
３．前記ディンプルは、表面475 μm2あたりに、1個〜4,000個有する前項１又は２に記載のコラーゲン構造体。
４．前記表面475 μm2あたりのモチーフ数が4,377以下である前項１〜３のいずれか１に記載のコラーゲン構造体。
５．前記モチーフの平均面積が0.12 μm2以上である前項４に記載のコラーゲン構造体。
６．前記表面がランダムな配向である前項１〜５のいずれか１に記載のコラーゲン構造体。
７．前記コラーゲン構造体を形成する複数のコラーゲン原線維間に空間が形成されている前項１〜６のいずれか１に記載のコラーゲン構造体。
８．前記コラーゲン構造体を形成する複数のコラーゲン原線維はランダムに配向している前項１〜７のいずれか１に記載のコラーゲン構造体。
９．前記コラーゲン原線維がアテロコラーゲン原線維である前項１〜８のいずれか１に記載のコラーゲン。
１０．前記コラーゲン構造体のコラーゲン密度が0.21 mg/cm2以上である前項１〜９のいずれか１に記載のコラーゲン構造体。
１１．前項１〜１０のいずれか１に記載のコラーゲン構造体を含むコラーゲン担体。
１２．細胞培養用である前項１０又は１１に記載のコラーゲン担体。
１３．培養細胞の酵素活性増強作用を有する前項１２に記載のコラーゲン担体。
１４．培養細胞の薬物応答性増強作用を有する前項１２又は１３に記載のコラーゲン担体。
１５．培養細胞の脱分化抑制作用を有する前項１２〜１４のいずれか１に記載のコラーゲン担体。
１６．以下の工程を含む、表面にディンプルを有するコラーゲン原線維を含むコラーゲン構造体の製造方法、
（１）濃度0.1 mg/ml〜100 mg/mlのコラーゲン溶液をコート対象の表面に被覆して、コラーゲン密度を0.21 mg/cm2以上にする工程。
１７．さらに以下の工程を含む前項１６に記載のコラーゲンの製造方法、
（２）前記コラーゲン構造体を架橋する工程。
１８．前記コラーゲンがアテロコラーゲンである前項１６又は１７に記載のコラーゲンの製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のコラーゲン構造体（又は、本発明のコラーゲン担体）は、少なくとも以下のいずれか１以上の効果を有する。
（１）培養細胞の肝細胞形状形成作用を有する。
（２）培養細胞の細胞間相互作用増強作用及び脱分化抑制作用を有する。
（３）培養細胞のエステラーゼ活性増強作用を有する。
（４）培養細胞のアルブミン分泌促進作用を有する。
（５）培養細胞のCYP3A4酵素活性増強作用を有する。
（６）培養細胞の薬物応答性（リファンピシンによるCYP3A4誘導酵素活性）増強作用を有する。
（７）培養細胞の肝特異的分泌タンパク質遺伝子発現促進又は維持作用を有する。また、培養細胞の肝関連タンパク質産生増強又は維持作用を有する。
（８）培養細胞のCYP活性増強又は維持作用を有する。
（９）培養細胞の核内受容体遺伝子発現促進又は維持作用を有する。
（１０）培養細胞の核内受容体遺伝子発現維持作用を有する。
（１１）培養細胞のインテグリン遺伝子の発現を抑制することにより、FAKシグナルの活性化を抑制し、脱分化及び肝機能低下を抑制する作用を有する。
（１２）培養細胞のDDR1遺伝子発現抑制又は維持作用を有する。
（１３）ヒトiPS細胞由来肝細胞様細胞のアルブミン分泌促進作用を有する。
（１４）ヒトiPS細胞由来肝細胞様細胞のCYP3A4酵素活性増強作用を有する。
（１５）ヒトiPS細胞由来肝細胞様細胞の肝特異的分泌タンパク質遺伝子発現促進作用を有する。
（１６）ヒトiPS細胞由来肝細胞様細胞の薬物代謝酵素Phase2遺伝子発現促進作用を有する。
（１７）ヒトiPS細胞由来肝細胞様細胞の薬物代謝酵素Phase3遺伝子発現促進作用を有する。
（１８）ヒトiPS細胞由来肝細胞様細胞の核内受容体遺伝子発現促進作用を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明のコラーゲン構造体の構造特性の評価。(a)〜(d)はSEMによるコラーゲンコート及び構造体表面の観察を示す。(e)〜(h)はDigital surf（商標）MountainsMap 解析ソフトによるモチーフ解析を示す。(k)及び(l)はTEMによるコラーゲン断面の観察を示す。(a)コラーゲン密度0.04 mg/cm2の従来法コラーゲンコート。(b)コラーゲン密度0.2 mg/cm2の従来法コラーゲンコート。(c)コラーゲン密度1 mg/cm2のコラーゲン構造体。(d)コラーゲン密度2 mg/cm2のコラーゲン構造体。(c)及び(d)において、矢印は代表的なコラーゲン原線維を示す。矢尻（arrow head）は代表的なディンプルを示す。スケールバー: 10 μm。(e)コラーゲン密度0.04 mg/cm2の従来法コラーゲンコート。(f)コラーゲン密度0.2 mg/cm2の従来法コラーゲンコート。(g)コラーゲン密度1 mg/cm2のコラーゲン構造体。(h)コラーゲン密度2 mg/cm2のコラーゲン構造体。(i)コラーゲン密度0.04 mg/cm2、0.2 mg/cm2、1 mg/cm2、2 mg/cm2におけるモチーフの数。(j)コラーゲン密度0.04 mg/cm2、0.2 mg/cm2、1 mg/cm2、2 mg/cm2におけるモチーフの平均面積。(k)コラーゲン密度0.04 mg/cm2の従来法コラーゲンコート。コラーゲンの中に認められる2つの傷はアーティファクトである。(l)コラーゲン密度2 mg/cm2のコラーゲン構造体。矢印は代表的なコラーゲン原線維を示す。矢尻（arrow head）は代表的なディンプルの断面を示す（各ディンプルの断面形状の相違は切断位置の相違に起因する）。スケールバー: 1 μm。(a)〜(h)、(k)及び(l)の全ての画像はウェルの中心付近から取得した。
【図２】LIVE/DEAD染色。（a、b、c）従来の0.04 mg/cm2コラーゲン。（d、e、f）0.2 mg/cm2コラーゲン。（g、h、i）1 mg/cm2コラーゲン。（j、k、l）2 mg/cm2コラーゲン。矢尻は細胞間相互作用を示唆する複数細胞の島様形態を示す。Hoechst33342（A：細胞の核）、Calcein AM（B：生細胞の細胞質）及びEthidium homodimer-1（C：死細胞の核）、の位相差観察のmerge画像を示した。スケールバー：100 μm。
【図３】アルブミン分泌量及びCYP3A4酵素活性の評価。（A）アルブミン分泌量。（B）CYP3A4基礎酵素活性。（C）CYP3A4誘導酵素活性（Rifampicin又はDMSO４８時間）。N=4、Mean±SD。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。統計解析はOne-way ANOVA tukey test（A、B）、t-test（C）を用いた。
【図４】肝関連遺伝子発現の評価（qRT-PCR、培養開始3日後）。（a）肝特異的分泌タンパク質。（b、c、d）薬物代謝関連遺伝子Phase1、Phase2、Phase3。（e）核内受容体。0.04 mg/cm2を1とした相対値を示した。N=4、Mean±SD。
【図５】肝関連遺伝子発現維持の評価（qRT-PCR、培養開始1、3、7日後）。（a）肝特異的分泌タンパク質。（b、c、d）薬物代謝関連遺伝子Phase1、Phase2、Phase3。（e）核内受容体。N=4、Mean±SD。0.04 mg/cm2（点線）と2 mg/cm2（実線）の発現を比較した。
【図６】細胞接着因子の遺伝子発現の評価（qRT-PCR、培養開始3日後）。0.04 mg/cm2を1とした相対値を示した。Day0は培養開始前の肝細胞の発現量。Day0はN=1、その他はN=4、Mean±SD。
【図７】iPS細胞から誘導した肝細胞の肝機能の評価（誘導開始21、26、31日後）。（A）アルブミン分泌量。（B）CYP3A酵素活性。Conv.は従来法を示す。（C）肝関連遺伝子の評価結果（qRT-PCR、誘導開始31日後）。GAPDHで補正。Conv.（従来法）の発現量を1とした相対発現量を示す。n=4。従来法（Cと略記）としてMatrigelコート上の分化誘導をコントロールとした。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、表面にディンプルを有するコラーゲン原線維を含むコラーゲン構造体、該コラーゲン構造体を含むコラーゲン担体、並びに、該コラーゲン構造体の製造方法に関する。以下に、本発明を詳細に説明する。
なお、本発明でのコラーゲン担体とは、なんらかの物質、細胞、組織を支持するためのコラーゲン構造体を意味する。コラーゲン担体は、コラーゲン構造体のみ又は主成分が実質的にコラーゲン構造体から構成されていても良いし、何らかの容器（特に、容器の表面）にコラーゲン構造体がコーティングされていても良い。
容器は、例えば、ウェルプレート、ディッシュ、フラスコ等が挙げられる。該容器の材質は、特に限定されず、プラスチック、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ガラス等が挙げられる。
【００１４】
（コラーゲン材料）
本発明のコラーゲン構造体（又は、本発明のコラーゲン担体）の材料として用いられるコラーゲンは、自体公知のコラーゲンを利用することができる。例えば、生体組織より採取された不溶性コラーゲン、例えばアキレス腱由来のテンドンコラーゲン、皮膚由来のコラーゲン、可溶性コラーゲン、可溶化コラーゲン、例えば酵素可溶化コラーゲン（アテロコラーゲン）、アルカリ可溶化コラーゲン、酸可溶性コラーゲン、塩可溶性コラーゲン等を用いることができるが、特にアテロコラーゲンが望ましい。
コラーゲンが由来する動物種にも特に制限はなく、培養時にコラーゲンが熱変性を起こすことのない変性温度を持つコラーゲンであれば問題はない。具体的にはウシ、ブタ等哺乳動物由来、ニワトリ等の鳥類由来、マグロ、イズミダイ等の魚類由来等を用いることができる。またリコンビナントコラーゲンも用いることができる。
さらに、必要に応じて、コラーゲンの構成アミノ酸側鎖が化学修飾されていてもよい。具体的にはアセチル化、サクシニル化、フタール化等のアシル化、メチル化、エチル化等のアルキル化、エステル化等されたコラーゲンが挙げられる。
【００１５】
（アテロコラーゲン材料）
アテロコラーゲンは、テロペプチドが酵素的に枯渇したコラーゲンであり、免疫原性が低い。更に、アテロコラーゲンは、天然のコラーゲンとして、同一の典型的な三重らせん構造を有し、生理的条件下でコラーゲン原線維を形成できる。よって、再生医学やドラッグデリバリーシステム等のin vivo及びin vitroの両方に適用できる。
【００１６】
高密度のアテロコラーゲンからなる厚みのあるコラーゲン担体としては、コラーゲンゲル及びビトリゲルが知られている。 走査型電子顕微鏡（SEM）観察により、コラーゲンゲル及びビトリゲルの両方が、個別のコラーゲン原線維から約70 nm毎の横紋線の特徴だけでなく多くのコラーゲン原線維からなる網状ネットワーク構造を有することが報告されている（参照：Takezawa, T. et al. Collagen vitrigel membrane useful forparacrine assays in vitro and drug delivery systems in vivo. J. Biotechnol. 131,76-83 (2007).）。
本発明のコラーゲン構造体の構造は、従来のコラーゲンコート（コラーゲン密度0.20 mg/cm2以下のコラーゲンコート）、コラーゲンゲル及びビトリゲルの構造とは大きく異なることを下記の実施例で確認している。
具体的には、本発明のコラーゲン構造体はコラーゲン原線維を含みかつ表面にディンプルを有するのに対し、従来のコラーゲンコートはコラーゲン原線維を含まずかつ表面にディンプルを有せず、並びに、コラーゲンゲル及びビトリゲルはコラーゲン原線維を含むが表面にディンプルを有しない。
【００１７】
（本発明のコラーゲン構造体）
本発明のコラーゲン構造体である「表面にディンプルを有する、コラーゲン原線維を含むコラーゲン構造体」は、少なくとも、複数のコラーゲン原線維が重なり合うことにより生じる窪み形状（例、略半円球形状の窪み）の空間であるディンプルを有する。
さらに、本発明のコラーゲン構造体は、以下の特徴のうち少なくとも１つ、好ましくは２以上、３以上、４以上、５以上、６以上又は全ての特徴を有する。
（１）ディンプルは、直径100 μm以下、好ましくは0.01 μm〜50 μm、より好ましくは0.5 μm〜30 μm、さらに好ましくは1 μm〜3.5 μmの略半円球形状を有する。
（２）ディンプルは、表面（コーティング対象の表面に接していない開放面及び／又はコーティング対象の表面に接している面）475 μm2あたりに、1個〜4,000個、好ましくは10個〜2,000個、より好ましくは70個〜700個有する。
なお、「表面475 μm2あたり」とは、例えば「SEM  5,000倍観察の写真1枚当たり」である。また、個数の算出方法は、該写真に記載のディンプル数を測定することである。
（３）表面475 μm2あたりのモチーフ数が4,377以下、好ましくは1,000〜4,000、より好ましく2,000〜3,000、さらに好ましくは2,100〜2,500、最も好ましくは2,200〜2,400である。
なお、「モチーフ」とは、ISO 25178対応のモチーフ解析によりセグメント化された領域である。「モチーフ数」は、コラーゲン構造体の表面475 μm2のSEM画像をMountainsMap（商標）ソフトウェア（Digital Surf）を用いて「底検知（ボトム検出）」の条件でモチーフ解析して得られる。
（４）モチーフの平均面積が0.12 μm2以上、好ましくは0.12 μm2〜1.00 μm2、より好ましくは0.20 μm2〜0.24 μm2である。
（５）表面の構造がランダムな配向性である。
（６）コラーゲン構造体がコラーゲン原線維を有し、コラーゲン原線維の直径が9 μm以下、好ましくは1 μm以下、より好ましくは0.01 μm〜0.3 μmである。
（７）コラーゲン原線維は好ましくはランダムに配向し、さらに、コラーゲン原線維間に10 μm2以下のスペースが存在し、より好ましくは0.01 μm2〜1 μm2のスペースが存在する。
【００１８】
（本発明のコラーゲン担体）
本発明のコラーゲン担体は、下記実施例に記載のように、細胞等の培養等をするための支持体（細胞外基質）として使用することができる。コラーゲン担体の態様、形状は、特に限定されないが、好ましくは容器にコーティングしたコラーゲン構造体である。
また、本発明のコラーゲン担体は、遺伝子、タンパク質等を含む物質の運搬体、各種の足場、組織培養等に利用することができる。
【００１９】
本発明のコラーゲン担体で培養する細胞は、特に限定されないが、好ましくは肝細胞、より好ましくはヒト初代培養肝細胞、ヒトiPS由来肝細胞様細胞、ES由来肝細胞様細胞、Muse由来肝細胞様細胞、MSC由来肝細胞様細胞、ヒト肝腫瘍由来細胞｛例えば、HepaRG（商標）等｝、ヒト肝癌由来細胞株（例えばHepG2、HuH7等）であり、さらに好ましくはヒト初代培養肝細胞、ヒトiPS由来肝細胞様細胞である。
【００２０】
（本発明のコラーゲン構造体の製造方法）
本発明の表面にディンプルを有するコラーゲン原線維を含むコラーゲン構造体の製造方法は、少なくとも以下の（Ａ）及び（Ｂ）の工程を含む。
（Ａ）濃度0.1 mg/ml〜100 mg/mlのコラーゲン溶液をコート対象の表面に添加し被覆させたのち、コラーゲン密度を0.21 mg/cm2以上又は0.21 mg/cm2〜50 mg/cm2にする工程、及び
（Ｂ）前記コラーゲン構造体を架橋する工程。
さらに、好ましくは、少なくとも以下の（１）〜（３）の工程を含む。
（１）濃度0.1 mg/ml〜100 mg/mlのコラーゲン溶液をコート対象の表面に添加し被覆させる工程、
（２）前記コラーゲン溶液を乾燥させコラーゲン密度を0.21 mg/cm2以上又は0.21 mg/cm2〜50 mg/cm2にする工程、及び
（３）前記乾燥済コラーゲン構造体を架橋する工程（特に、前記乾燥済コラーゲン構造体に紫外線（UV）照射することにより架橋する工程）。
【００２１】
工程（１）は、コラーゲンと溶媒とを混合したコラーゲン溶液でコート対象の表面を被覆すること含む。「コラーゲンと溶媒とを混合したコラーゲン溶液」とは、コラーゲンと溶媒が共存している溶液であればよく、コラーゲンが溶媒に溶解していない状態であっても、コラーゲンを溶媒に溶解した状態であってもよい。工程（１）には、以下の工程（１−１）及び／又は工程（１−２）が含まれる。
（１−１）コラーゲンを溶媒に添加して混合することにより、コラーゲン溶液を調製する工程、
（１−２）コラーゲンと溶媒とを混合したコラーゲン溶液をコート対象の表面に被覆する工程。
好ましくは、工程（１）は、工程（１−１）及び工程（１−２）の両方が含まれる。
工程（１）におけるコラーゲン溶液の濃度は特に限定されないが、好ましくは0.01 mg/ml〜100 mg/ml、より好ましくは0.1 mg/ml〜50 mg/ml、さらに好ましくは1.0 mg/ml〜10 mg/ml、特に好ましくは2.5 mg/ml〜7.5 mg/mlである。
コート対象の表面にコラーゲン溶液を被覆した際のコラーゲン密度は0.2 mg/cm2よりも高ければよく、好ましくは0.25 mg/cm2〜50.0 mg/cm2、より好ましくは0.5 mg/cm2〜20.0 mg/cm2、さらに好ましくは0.75 mg/cm2〜10.0 mg/cm2、特に好ましくは1.0 mg/cm2〜5.0 mg/cm2である。
工程（１−１）では、コラーゲン溶液を調製するための溶媒は特に限定されないが、酸性のｐＨを有する溶媒が好ましく、例えば、塩酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸等を用いることができる。またコラーゲン溶液は、本発明の目的を損なわない範囲で添加剤を含んでいてもよい。より具体的にはコラーゲン溶液のｐＨは、ｐＨ１以上４．５以下であり、好ましくはｐＨ２以上４以下である。
工程（１−２）においても、コラーゲン溶液は特に限定されないが、酸性のｐＨを有する溶媒が好ましい。より具体的にはコラーゲン溶液のｐＨは、ｐＨ１以上４．５以下であり、好ましくはｐＨ２以上４以下である。
【００２２】
工程（２）における乾燥時間及び乾燥温度は、コラーゲンの水分の少なくとも５０、６０、７０又は８０％が除去されればよい。乾燥時間は特に限定されず、例えば３時間以上、１２時間以上、２４時間以上でもよく、好ましくは１日〜１０日、より好ましくは２日〜８日、特に好ましくは４日〜６日である。乾燥温度は特に限定されず、例えば０℃〜１００℃、好ましくは１０℃〜５０℃、より好ましくは室温である。
【００２３】
工程（３）におけるコラーゲン構造体を架橋する方法は、特に限定されないが、紫外線（UV）照射による架橋、架橋剤による架橋等が挙げられ、好ましくはUV照射による架橋である。
UV照射による架橋の場合、UV波長は特に限定されないが、好ましくは100 nｍ〜400 nm、より好ましくは200 nｍ〜300 nm、さらに好ましくは240 nｍ〜270 nm、特に好ましくは254 nmである。UV照射量は特に限定されないが、好ましくは0.01 J/cm2〜100 J/cm2、より好ましくは0.1 J/cm2〜10 J/cm2、さらに好ましくは0.1 J/cm2〜5 J/cm2、特に好ましくは1 J/cm2である。UV照射は複数回に分けてもよく、例えばUV照射量を1 J/cm2とする場合、0.5 J/cm2を2回照射してもよい。
架橋剤による架橋の場合、架橋剤としては、同一の反応基を有するホモバイファンクショナルな試薬を用いることも可能だが、好ましくは両端が別々の反応基を有するヘテロバイファンクショナルな試薬が望ましい、より好ましくは、コラーゲンは溶液状態で反応できる架橋試薬、例えば、AMAS（N-[α-Maleimidoacetoxy]succinimideester）、BMPH（N-[β-Maleimidopropionic acid] hydrazideoTFA）、BMPS（N-[β-Maleimidopropyloxy] succinimide ester）、EDC（1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimidehydrochloride）、EMCS（N-[ε-Maleimidocaproyloxy] succinimide ester）、GMBS（N-[γ-Maleimidobutyryloxy]succinimide ester）、MBS（m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimideester）、SBAP（Succinimidyl3-[bromoacetamido] propionate）、SIA（N-Succinimidyl iodoacetate）、SIAB（N-Succinimidyl[4-iodoacetyl]aminobenzoate）、SMCC（Succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]-cyclohexane-1-carboxylate）、SM(PEG)n（Succinimidyl-([N-maleimidopropionamido]-n-ethyleneglycol)ester）、Sulfo-EMCS（N-[ε-Maleimidocaproyloxy] sulfosuccinimide ester）、Sulfo-GMBS（N-[γ-Maleimidobutyryloxy]sulfosuccinimide ester）等が挙げられる。
【００２４】
本発明のコラーゲン担体は、細胞培養容器にコーティングしていなくても、表面にディンプルを有することができる。
細胞培養容器等にコーティングしない場合の本発明のコラーゲン担体の製造方法は、例えば、以下の工程を含む製造方法により製造される。
（１）コラーゲンと溶媒とを混合したコラーゲン溶液を型に注ぐ工程。
（２）コラーゲン（溶液）を乾燥する工程。
（３）型から取り出す工程。
なお、必要に応じて、型から取り出す前又は後のコラーゲンに架橋する工程を追加しても良い。
【００２５】
本発明のコラーゲン構造体又はコラーゲン担体は、以下のいずれか１以上の効果を有する。
（１）培養細胞及び／又はヒトiPS細胞の肝機能維持作用を有する。
（２）ヒトiPS細胞由来肝細胞様細胞の肝細胞の機能の増強、維持、機能亢進及び／又は成熟亢進作用を有する。
（３）肝細胞（特に、ヒト初代培養肝細胞）の培養に用いることにより、従来のコラーゲンコートと比較して、該細胞及び該細胞から増殖した細胞をより丸く、より小さく及びより生体内の肝細胞に近い形態に形成できる。すなわち、培養細胞の肝細胞形状形成作用を有する。
（４）肝細胞（特に、ヒト初代培養肝細胞）の培養に用いることにより、該細胞及び該細胞から増殖した細胞を運動性のある島様形態に形成できる。すなわち、培養細胞の細胞間相互作用増強作用及び脱分化抑制作用を有する。
（５）肝細胞（特に、ヒト初代培養肝細胞）の培養に用いることにより、（少なくとも培養開始７日間）該細胞及び該細胞から増殖した細胞のエステラーゼ活性を増強し、細胞を生存させることができる。すなわち、培養細胞のエステラーゼ活性増強作用を有する。
（６）肝細胞（特に、ヒト初代培養肝細胞）の培養に用いることにより、従来のコラーゲンコートと比較して、アルブミン分泌量を増強する。すなわち、培養細胞のアルブミン分泌促進作用を有する。
（７）肝細胞（特に、ヒト初代培養肝細胞）の培養に用いることにより、従来のコラーゲンコートと比較して、CYP3A4の基礎酵素活性を増強する。すなわち、培養細胞のCYP3A4酵素活性増強作用を有する。
（８）肝細胞（特に、ヒト初代培養肝細胞）の培養に用いることにより、従来のコラーゲンコートと比較して、CYP3A4の誘導酵素活性を増強する。すなわち、培養細胞の薬物応答性（リファンピシンによるCYP3A4誘導酵素活性）増強作用を有する。
（９）肝細胞（特に、ヒト初代培養肝細胞）の培養に用いることにより、従来のコラーゲンコートと比較して、肝特異的分泌タンパク質であるアルブミン（ALB）、α1−アンチトリプシン（AAT）及びトリプトファン2,3−ジオキシゲナーゼ（TO）の遺伝子発現を増加又は維持する。すなわち、培養細胞の肝特異的分泌タンパク質遺伝子発現促進又は維持作用を有する。また、培養細胞の肝関連タンパク質産生増強又は維持作用を有する。
（１０）肝細胞（特に、ヒト初代培養肝細胞）の培養に用いることにより、従来のコラーゲンコートと比較して、薬物代謝酵素Phase1であるCYP1A2、CYP2C9、CYP2C19及びCYP2D6の遺伝子発現を増加又は維持する。すなわち、培養細胞の薬物代謝酵素Phase1遺伝子発現促進又は維持作用を有する。また、培養細胞のCYP活性増強又は維持作用を有する。
（１１）肝細胞（特に、ヒト初代培養肝細胞）の培養に用いることにより、従来のコラーゲンコートと比較して、核内受容体であるCAR、PXR及びHNF4αの遺伝子発現を増加又は維持する。すなわち、培養細胞の核内受容体遺伝子発現促進又は維持作用を有する。
（１２）肝細胞（特に、ヒト初代培養肝細胞）の培養に用いることにより、従来のコラーゲンコートと比較して、核内受容体であるAhr遺伝子発現を維持する。すなわち、培養細胞の核内受容体遺伝子発現維持作用を有する。
（１３）肝細胞（特に、ヒト初代培養肝細胞）の培養に用いることにより、従来のコラーゲンコートと比較して、細胞接着因子であるインテグリンα2、α3、α5、α6、αV、β1及びβ3の遺伝子発現を低減又は維持する。すなわち、培養細胞の細胞接着因子遺伝子発現抑制又は維持作用を有する。また、培養細胞のインテグリン遺伝子の発現を抑制することにより、FAKシグナルの活性化を抑制し、脱分化及び肝機能低下を抑制する作用を有する。
（１４）肝細胞（特に、ヒト初代培養肝細胞）の培養に用いることにより、従来のコラーゲンコートと比較して、DDR1の遺伝子発現を低減又は維持する。すなわち、培養細胞のDDR1遺伝子発現抑制又は維持作用を有する。
（１５）本発明のコラーゲン構造体は、ヒトiPS細胞の肝細胞様細胞分化誘導に用いることにより、従来のコラーゲンコートと比較して、アルブミン分泌量を増加する。すなわち、本発明のコラーゲン構造体は、ヒトiPS細胞由来肝細胞様細胞のアルブミン分泌促進作用を有する。
（１６）ヒトiPS細胞由来の肝細胞様細胞分化誘導に用いることにより、従来のコラーゲンコートと比較して、CYP3A酵素活性を増強する。すなわち、ヒトiPS細胞由来肝細胞様細胞のCYP3A酵素活性増強作用を有する。
（１７）ヒトiPS細胞の肝細胞様細胞分化誘導に用いることにより、従来のコラーゲンコートと比較して、肝特異的分泌タンパク質であるALB、AAT及びTO遺伝子発現量を増加する。すなわち、ヒトiPS細胞由来肝細胞様細胞の肝特異的分泌タンパク質遺伝子発現促進作用を有する。
（１８）ヒトiPS細胞の肝細胞様細胞分化誘導に用いることにより、従来のコラーゲンコートと比較して、薬物代謝酵素Phase2であるUGT1A1の遺伝子発現を増加する。すなわち、ヒトiPS細胞由来肝細胞様細胞の薬物代謝酵素Phase2遺伝子発現促進作用を有する。
（１９）ヒトiPS細胞の肝細胞様細胞分化誘導に用いることにより、従来のコラーゲンコートと比較して、薬物代謝酵素Phase3であるMRP2の遺伝子発現を増加する。すなわち、ヒトiPS細胞由来肝細胞様細胞の薬物代謝酵素Phase3遺伝子発現促進作用を有する。
（２０）ヒトiPS細胞の肝細胞様細胞分化誘導に用いることにより、従来のコラーゲンコートと比較して、核内受容体であるAhr遺伝子発現を増加する。すなわち、ヒトiPS細胞由来肝細胞様細胞の核内受容体遺伝子発現促進作用を有する。
（２１）培養細胞及び／又はヒトiPS細胞のインテグリン発現を介してFAK活性化を低減する作用を有する。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
［本発明のコラーゲン担体の作製］
本発明のコラーゲン担体は、以下の方法により作製した。
【００２８】
＜材料＞
96ウェルプレート（コーニング）、コラーゲン酸性溶液｛コラーゲン酸性溶液I-PC 5 mg/mL 50 mL Atelocollagen Bovine Dermis（IPC-50）、高研｝、1 mM HCl、プチローター（和研薬）、UVクロスリンカー（CL-1000、UVP）を用いた。
【００２９】
＜方法＞
以下はクリーンルーム内で調整した。コラーゲンは氷上で取り扱った。
１．コラーゲン溶液（pH3）を調製した。コラーゲン溶液の濃度は、本発明のコラーゲン担体の作製においては5 mg/mL（IPC-50原液）を使用し、従来のコラーゲンコートの作製においてはIPC-50に1 mM HClを加えて0.25 mg/ml及び1.25 mg/mlに調整したものを使用した。
２．冷蔵庫内で撹拌機（プチローター（Speed 8.5））を使用し、コラーゲン溶液を転倒混和した（4℃、15分）。
３．コラーゲン溶液を96 ウェルプレートに分注し、本発明のコラーゲン担体の作製においてはコラーゲン密度1 mg/cm2及び2 mg/cm2とし、従来のコラーゲンコートの作製においてはコラーゲン密度0.04 mg/cm2及び0.2 mg/cm2とした。
４．クリーンベンチ内で5日間風乾した。風乾中はUVライトによる架橋を防ぐためにUVライトをOFFにした。
５．コラーゲンが完全に乾燥した状態を肉眼で確認し、後日ＵＶ架橋を行うまで保存した。
６．クリーンルーム内で従来のコラーゲンコート又は本発明のコラーゲン担体でコーティングされた96ウェルプレートをUVクロスリンカーに入れ、1 J/cm2を照射した。
【実施例２】
【００３０】
［コラーゲン構造特性の評価］
実施例１で作製した本発明のコラーゲン担体及び従来のコラーゲンコートの構造特性を解析し比較した。
【００３１】
＜材料＞
オスミウムコータ（Neoc-STB、メイワフォーシス）、走査型電子顕微鏡（SU6600、日立）、ウルトラミクロトーム（Leica EM UC7、ライカ）、透過型電子顕微鏡（JEM-1400Plus、JEOL）、MountainsMap（商標）ソフトウェア（Digital Surf）、実施例１の従来のコラーゲンコート（コラーゲン密度0.04 mg/cm2）又は本発明のコラーゲン担体（2 mg/cm2）でコーティングされた96ウェルプレートを用いた。
【００３２】
＜方法＞
｛走査型電子顕微鏡（SEM）｝
１．実施例１のコラーゲン担体を2%のグルタルアルデヒドに固定した。
２．エタノールで脱水した。
３．t-ブチルアルコールに浸漬した。その後凍結乾燥し、Neoc-STBを用いてオスミウムでスパッタコーティングした。
４．SU6600を用いて画像を取得した。
５．取得したSEM画像のマイクロラフネス（微小な粗さ）を、MountainsMap（商標）ソフトウェアを用いたISO 25178対応のモチーフ解析（ボトム検出）により解析して評価した。
【００３３】
｛透過型電子顕微鏡（TEM）｝
１．実施例１のコラーゲン担体を2%のグルタルアルデヒドに固定した。
２．エタノールで脱水し、エポン包埋した。
３．ウルトラミクロトームを用いて70 nmの厚さに薄切し、酢酸ウランで染色した。
４．JEM-1400Plusを用いて画像を取得した。
【００３４】
＜結果＞
SEM及びTEMの画像を図1に示す。
本発明のコラーゲン担体を構成するコラーゲン構造体の構造特性を評価するために、従来のコラーゲンコート（コラーゲン密度0.04 mg/cm2）と比較した。従来のコラーゲンコートの表面は、微細で平坦な構造であった（図1(a)）。0.2 mg/cm2のコラーゲンコートも、従来のコラーゲンコートと同様であった（図1(b)）。対照的に、1 mg/cm2及び2 mg/cm2のコラーゲン構造体の表面は、粗いランダムな配向性の構造であった（図1(c)及び(d)）。1 mg/cm2及び2 mg/cm2のコラーゲン構造体においてのみコラーゲン原線維（図1(c)及び(d)の矢印）及び直径約2〜3 μmの特徴的なディンプル（図1(c)及び(d)の矢尻）が観察された。
【００３５】
表面の微小な粗さを分析するために、解析ソフトを用いてISO 25178に準拠したモチーフ解析を行った（図1(e)〜(j)）。このモチーフ解析は、ISO25178準拠のセグメント化アルゴリズムを使用して、隔離された表面を検出して定量化する手法である。
0.04 mg/cm2及び0.2 mg/cm2のコラーゲンコート、並びに1 mg/cm2及び2 mg/cm2のコラーゲン構造体のSEM  5,000倍観察の写真1枚あたり（表面475 μm2に相当する）のモチーフ数はそれぞれ5,949、4,378、2,320及び2,201であった（図1(i)）。このことから1 mg/cm2及び2 mg/cm2のコラーゲン構造体は、従来のコラーゲンコートよりも少ないモチーフ数（従来のコラーゲンコートのおよそ半数又は半数以下）で構成され、本発明のコラーゲン構造体が従来のコラーゲンコートより粗い表面を有することを示した。
0.04 mg/cm2及び0.2 mg/cm2のコラーゲンコート、並びに1 mg/cm2及び2 mg/cm2のコラーゲン構造体の平均モチーフ面積はそれぞれ0.08 μm2、0.11μm2、0.21 μm2及び0.22 μm2であった（図1(j)）。このことから1 mg/cm2及び2 mg/cm2のコラーゲン構造体は、従来のコラーゲンコートよりも大きなモチーフ（従来のコラーゲンコートのおよそ2倍又は2倍以上）から構成され、本発明のコラーゲン構造体が従来のコラーゲンコートより粗い表面を有することを示した。
【００３６】
コラーゲン分子は、長さ300 nm、幅1.5 nmの棒状構造を有する。TEMを用いてコラーゲン分子の配置を調べた。従来のコラーゲンコートではコラーゲン原線維はなく、少量のコラーゲンに空間（スペース）は観察されなかった（図1(k)）。一方、本発明のコラーゲン構造体はコラーゲン原線維からなり、それらはランダムに配向していた（図1(l)、矢印）。また、本発明のコラーゲン構造体はコラーゲン原線維間にはスペースが存在した（図1(l)）。ディンプルは本発明のコラーゲン構造体表面上にのみ観察され（図1(l)、矢尻）、SEM画像（図1(d)）と一致した。
【００３７】
以上より、本発明のコラーゲン構造体は、従来のコラーゲンコートと比較して、構造について以下の相違点を有する。
（１）従来のコラーゲンコートの表面は微細で平坦な構造であるのに対し、本発明のコラーゲン構造体の表面は粗いランダムな配向性の構造であった。
（２）本発明のコラーゲン構造体はコラーゲン原線維及び直径約2〜3 μmの特徴的なディンプルを有するが、従来のコラーゲンコートの表面はいずれも有しなかった。コラーゲン原線維はランダムに配向し、該コラーゲン原線維間にはスペースが存在した。
（３）本発明のコラーゲン構造体の表面は、従来のコラーゲンコートよりも少ないモチーフ数（2,320〜2,201）で構成され、従来のコラーゲンコートより粗い表面を有した。
（４）本発明のコラーゲン構造体の表面は、従来のコラーゲンコートよりも大きなモチーフ（0.21 μm2〜0.22μm2）から構成され、従来のコラーゲンコートより粗い表面を有した。
【実施例３】
【００３８】
［本発明のコラーゲン担体を使用したヒト初代培養肝細胞（PHHs）の培養］
本発明のコラーゲン担体を使用してヒト初代培養肝細胞（PHHs）の培養を行い、従来のコラーゲンコートを使用した培養と比較した。
【００３９】
＜細胞＞
PHHs１バイアル｛接着型ヒト肝細胞（酵素誘導試験用）CryoHuman Hepatocytes Induction Qualified（HUCPI）、lot: HUM4218B（男性、Caucasian、19 歳、09-May-2017 年、凍結細胞数7.4×106 cells/vial、Lonza）｝を用いた。
＜材料＞
HCMBullet kit｛HCM（商標）肝細胞培養培地BulletKit（商標）、基本培地及びSingleQuots（商標） キット（cc-3198、Lonza）｝、HCM（＋2%FBS、37℃保温）、実施例１の各コラーゲン密度の本発明のコラーゲン担体でコーティングされた96 ウェルプレート、リン酸緩衝塩（ダルベッコ,カルシウム,マグネシウム不含）（D-PBS）（DSファーマ）、イーグル最少必須培地（MEM）（M4655-500ML、Sigma）、遠心機｛CF8DL、搭載ローターT3S6、日立｝、RNeasy micro kit（Qiagen）を用いた。
【００４０】
＜培養方法＞
（コラーゲンプレートの準備）
１．実施例１で作製した本発明のコラーゲン担体でコーティングされた96 ウェルプレートをD-PBS0.1 mlで2 回洗浄し、HCM（＋2%FBS）を0.05 ml/well加えた。洗浄中にコラーゲンが乾燥しないように注意した。
２．37℃、 5%CO2 インキュベーターで一晩インキュベートした。
【００４１】
（PHHs解凍）
１．PHHsを37℃ウォーターバスで半解凍しHCM（37℃）50 mlに懸濁した。
２．遠心沈殿後に細胞をHCM（＋2%FBS、37℃）10 mlに懸濁した。
３．トリパンブルー染色及び細胞数計測を行った。
４．細胞懸濁液を100×104 viable cells/mlになるように希釈した。
５．96ウェルプレートに100 μl/well播種した。
６．37℃、5%CO2で７日間培養した。
７．後日RNAを抽出するために播種細胞の余りはRNeasy micro kitのBuffer RLTに溶解して−80℃保存した。
【００４２】
（培地交換）
１．PHHs解凍の翌日（培養開始１日後）に培地交換を行った。HCM（without FBS）0.15 ml/well で培地交換した。
２．以降、毎日、HCM（without FBS）0.15ml/wellに培地交換した。
【００４３】
（培養結果）
培養液10 mlにおける全細胞数は1.2×107 cellsであった。生存率は87％、生存細胞濃度は1.04×106viable cells/mlであった。
【実施例４】
【００４４】
［本発明のコラーゲン担体を使用したヒト初代培養肝細胞（PHHs）の形態及び生存の確認］
本実施例では、本発明のコラーゲン担体を使用したヒト初代培養肝細胞（PHHs）の形態及び生存を、従来のコラーゲンコートのそれらと比較した。
【００４５】
＜材料＞
LIVE/DEADViability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells（Thermo、Ethidium homodimer-1及びCalcein AMをキット内容に含む）、HCM bullet kit（Lonza）、Hoechst33342（同仁化学）、Working solution｛HCM 1ml、Ethidium homodimer-1（EhtD-1） 2μl、カルセインAM（Calcein AM）0.5μl、Hoechst33342 0.5μl｝、実施例３の培養細胞を用いた。
【００４６】
＜方法＞
１．上記の実施例３の培養開始１日後、３日後、７日後に培地を除き、あらかじめ調製したWorking solutionを50 μl/96well加えた。
２．37℃、5分間インキュベートした。
３．HCM50 μlに培地交換した。
４．蛍光顕微鏡（IX83、オリンパス）で写真を撮影した。
【００４７】
＜結果＞
従来のコラーゲンコート上で増殖させたPHHsは、培養開始1日目に典型的な多角形形状を示した（図2(a)）が、培養開始3日目及び培養開始7日目に徐々に伸長し（図2(b)、(c)）、脱分化を示した。 
一方、本発明のコラーゲン担体（1 mg/cm2及び2 mg/cm2）上で培養したPPHは、非常にコンパクトな細胞質で丸くなっていた（図2(g)、(j)）。本発明のコラーゲン担体（1 mg/cm2及び2 mg/cm2）上で培養したPPHは、従来のコラーゲンコート上で増殖させたPHHsと比較して、非常に小さかった（図2(g)、(j)）。本発明のコラーゲン担体上で増殖させた細胞の円形形状は、３日目まで維持していた（図2(h)、(k)）。すなわち、本発明のコラーゲン担体上で増殖させたPHHsは、従来のコラーゲンコート上で増殖させたPHHsと比較して生体内の肝細胞により近い形態であった。本発明のコラーゲン担体で増殖させた細胞の７日目では、運動性のある島様形態が観察できた（図2(i)、(l)）。７日目で検出された島様形態は、３日目よりも、細胞間の相互作用が高いことを示し、脱分化が進行していないことを示した。
本発明のコラーゲン担体で増殖させた細胞は、３日目には多数の死細胞が一時的に観察された（図2(h)、(k)）。しかし、死細胞は、培地交換によって減少し、ほとんどの細胞は7日目に生存した（図2(i)、(l)）。すなわち、該死細胞は、栄養不足が原因であり、本発明のコラーゲン担体を構成するコラーゲン構造体の構造に起因する理由ではないことを確認した。培養期間中、緑色蛍光強度（カルセインAM）は、従来のコラーゲンコートで低かったが、本発明のコラーゲン担体では高かった。これは、本発明のコラーゲン担体上で増殖させた細胞は、従来のコラーゲンコート上で増殖させた細胞と比較して、エステラーゼ活性が増強していることを意味する。
すなわち、本発明のコラーゲン担体を使用したヒト初代培養肝細胞（PHHs）では、従来のコラーゲンコートを使用した培養と比較して、（１）細胞間の相互作用を促進する、（２）脱分化が進行しにくいことを確認した。
【実施例５】
【００４８】
［肝機能（アルブミン分泌量）の評価］
本発明のコラーゲン担体を使用した培養でのPHHsの肝機能への影響を評価するため、肝機能マーカーであるアルブミン分泌量を調べた。
【００４９】
＜材料＞
HumanAlbumin ELISA kit（Bethyl Laboratories）、実施例３の培養細胞を用いた。
＜方法＞
１．上記の実施例３において培養開始１日後及び培養開始2日後に培地交換を実施してから24時間経過した培養上清を全量回収し−80℃で保存した。
２．後日、−80℃で保存した培養上清を解凍し、Human Albumin ELISA kitを用いて製品添付の方法でELISAを行った。上清量は150 μl/wellとしてwellあたりのアルブミン量を算出した。
【００５０】
＜結果＞
図３Ａに結果を示す。本発明のコラーゲン担体で培養した細胞のアルブミン分泌量は、従来のコラーゲンコートで培養した細胞のアルブミン分泌量と比較して、高い値を示した。詳しくは、本発明のコラーゲン担体で培養した細胞のアルブミン分泌量は、従来のコラーゲンコートで培養した細胞のアルブミン分泌量と比較して、約2.5倍〜約5倍高かった。例えば、24時間の培養により、本発明のコラーゲン担体（コラーゲン密度1 mg/cm2）で培養された細胞のアルブミン分泌量（7.0 ± 1.1 mg/mg RNA）は、従来のコラーゲンコートで培養した細胞のアルブミン分泌量（1.5 ± 0.3 mg/mg RNA）と比較して、4.7倍増加した。
以上により、本発明のコラーゲン担体は、細胞の肝機能マーカーであるアルブミン分泌量を増強させることを確認した。
【実施例６】
【００５１】
［肝機能（CYP3A4酵素活性）の評価］
本発明のコラーゲン担体を使用した培養でのPHHsの肝機能への影響を評価するため、肝機能マーカーであるCYP3A4酵素活性を調べた。
【００５２】
＜材料＞
Rifampicin（Sigma）、DMSO（和光純薬工業）、Millex-LG, 0.20 μm,25 mm（メルクミリポア）、25 mM Rifampicin（×1000）Stock（RifampicinをDMSOに溶解し、濾過滅菌（Millex-LG）した。用時調製）、P450-Glo（商標） CYP3A4 Assay with Luciferin IPA（Promega）、Assay用96ウェルプレート（Nunc）、プレートリーダー（ARVO MX-FLA、パーキンエルマ）、実施例３の培養細胞を用いた。
＜方法＞
（CYP3A4酵素活性の誘導）
反応条件は、最終濃度25 μM Rifampicin / 0.1% DMSO、37℃、48時間とした。
１．上記の実施例３の培養開始1日後に培地交換を行った。培地はHCM 1 ml あたり25 mM Rifampicin 1 μl（又は、溶媒のみの対照群としてDMSO 1 μl）を加え、37℃のウォーターバスでインキュベートした後に0.15 ml/well交換した。
２．培養開始２日後に培養開始1日後と同様に培地交換した。
３．培養開始３日後（薬物を暴露してから48時間後）にCYP酵素活性を評価した。
【００５３】
（CYP3A4酵素活性の評価）
１．HCM/ Luciferin-IPA 100 μl に培地交換した。
２．バックグラウンドサンプルとして細胞が無い2 ウェルにも同様に加えた。
３．37℃、１時間インキュベートした。
４．各ウェルからAssay用プレートに上清を40 μl（duplicate）を回収した。
５．等量のLuciferin Detection Reagentを加えた。
６．アルミで遮光し、室温20分間静置した。
７．ARVOMX-FLAを用いてLuminescenceを測定した（Integrationtime：１秒）。
【００５４】
＜結果＞
結果を図３Ｂ、Ｃに示す。本発明のコラーゲン担体で培養した細胞のCYP3A4の基礎酵素活性は、従来のコラーゲンコートで培養した細胞のCYP3A4の基礎酵素活性と比較して、約2倍〜約3倍の高い値を示した（図3B）。例えば、本発明のコラーゲン担体（コラーゲン密度1 mg/cm2）で培養されたPHHsのCYP3A4は、従来のコラーゲンコートで培養されたPHHsのCYP3A4と比較して、3.4倍高かった。
薬物応答性を確認用CYP3A4の誘導剤（Rifampicin：リファンピシン）を培地に添加し、48時間培養した結果、溶媒（DMSO）のみに対するCYP3A4の誘導酵素活性を測定した。従来のコラーゲンコート（0.04 mg/cm2）及び本発明のコラーゲン担体（2 mg/cm2）のCYP3A4の誘導酵素活性では、それぞれ11.8 ± 2.9倍（平均値±標準偏差）及び21.8 ± 1.9倍であった（図3C）。すなわち、本発明のコラーゲン担体の場合では、従来のコラーゲンコートの場合と比較して、約2倍薬物応答性（リファンピシンに対するCYP3A4の誘導酵素活性）が高かった。
以上により、本発明のコラーゲン担体は、細胞の肝機能マーカーであるCYP3A4酵素活性及び薬物応答性を増強させた。
【実施例７】
【００５５】
［肝関連遺伝子及び細胞接着因子の発現解析］
PHHsは培養中に肝機能が喪失されることが知られている。そこで、本実施例では、本発明のコラーゲン担体が、培養中のPHHsの肝機能を維持できるか（又は機能低下を抑えることができるか）を確認した。詳しくは、PHHsの肝関連遺伝子の発現をqRT-PCRにより調べた。
また、インテグリンは、細胞の細胞骨格と細胞外基質とを連結する膜貫通細胞接着タンパク質である。肝細胞は、インテグリンα1及びβ1を介してコラーゲンと相互作用することが知られている。 ジスコイジンドメイン受容体（DDR）は、既知のコラーゲン受容体である。そこで、培養時の各コラーゲン濃度による細胞−細胞外基質間の相互作用への影響を調べるために、肝細胞とコラーゲンとの相互作用を介在する細胞接着因子｛インテグリンα1、β1及びDDR等｝の発現をqRT-PCRにより調べた。
【００５６】
＜材料＞
SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（タカラバイオ）、プライマー（10μM、下記の表１に配列を示す）、cDNA（原液を蒸留水で2 倍希釈）、サーマルサイクラ―（Light Cycler（商標） ST-300、Roche）、キャピラリー｛Light Cycler Capillaries（20μl）、Roche｝、遠心機（LCCarousel Centrifuge 2.0、Roche）、HumanFetal Liver（Clontech）、HumanAdult Liver｛Clontech、PrimeScriptTMRTreagent kit（タカラバイオ）を用いて製品添付のプロトコルに従い、逆転写した後、原液を蒸留水で6倍希釈した｝、RNeasy Micro kit（Qiagen）、PrimeScript（商標） RT reagent kit（タカラバイオ）、実施例３の培養細胞を用いた。
【００５７】
【表１】
2019137639.tif 000002
【００５８】
＜方法＞
RNeasyMicro kit、PrimeScript（商標） RTreagent kitをそれぞれ用いて製品添付書に従って、上記の実施例３の培養開始１、３、７日後の実施例３の培養細胞からのTotal RNAの抽出及び逆転写反応を実施した。
１．SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）を用いて、製品添付書に記載された方法に従い、qRT-PCR 反応液のプレミックスを調整した（SYBR Premix 10 μl、Forward Primer 0.4 μl、Reverse Primer 0.4 μl、蒸留水7.2 μl）。
２．キャピラリーにプレミックス18 μlを分注した。
３．Template（6 倍希釈cDNA）を 2μl 加えた。
４．Light CyclerにセットしqRT-PCRを行った。反応条件は、変性（denature）（95℃ 60秒）、PCR（95℃ 5秒、60℃ 20秒、40 サイクル）、解離（melting）（65℃ 15秒）、冷却（cooling）（40℃ 30秒）を使用した。
５．ΔΔCt法を用いて比較定量解析を行った。
６．統計解析は、GraphPad Prism7 を用いてOne-ANOVA tukey test、又はMicrosoft Excelを用いてt-testを行った。
【００５９】
＜結果＞
本発明のコラーゲン担体で培養した細胞の肝関連遺伝子発現の結果を図４に示す。従来のコラーゲンコート（0.04 mg/cm2）での培養開始1日後の発現を1とした相対値で示した。肝特異的分泌タンパク質であるアルブミン（ALB）、α1−アンチトリプシン（AAT）及びトリプトファン2,3−ジオキシゲナーゼ（TO）が顕著に増加した（2.1 ± 0.2倍、1.5 ± 0.1倍、及び3.6 ± 0.3倍）。薬物代謝酵素Phase1であるCYP1A2、CYP2C9、CYP2C19及びCYP2D6についても顕著に増加した（それぞれ3.0 ± 0.2倍、2.0 ± 0.2倍、1.7 ± 0.1倍及び3.0 ± 0.1倍）。核内受容体であるCAR及びPXRの発現についても顕著に増加した。
よって、本発明のコラーゲン担体で培養した細胞でのこれらの遺伝子発現の増加傾向が認められた。当該結果は、本発明のコラーゲン担体が細胞の肝関連タンパク質産生及びCYP活性を増強したことを意味する。
細胞培養中の肝関連遺伝子発現維持に関する結果を図５に示す。培養開始1、3、7日後の肝関連遺伝子のqRT-PCRの結果を示した。本発明のコラーゲン担体｛2 mg/cm2（実線）｝において、太枠で示した肝特異的分泌タンパク質、薬物代謝酵素Phase1及び核内受容体が培養開始3、7日後に従来のコラーゲンコート｛0.04 mg/cm2（点線）｝と比較して遺伝子発現が高い傾向が認められた。例えば、従来のコラーゲンコートでの培養開始7日後において、アルブミン遺伝子発現は6.4 ± 0.4%まで減少した。一方、本発明のコラーゲン担体での培養開始7日後において、アルブミン遺伝子発現は17.4 ± 1.5%を維持した。AAT及びTO遺伝子発現は、本発明のコラーゲン担体での培養開始7日後において、2.2倍（454.4 ± 97.5%）及び1.7倍（20.7 ± 2.6%）に上昇した。CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19及びCYP2D6遺伝子発現は、本発明のコラーゲン担体での培養開始7日後において、3.3倍（797.9 ± 73.0%）、1.4倍（13.9±0.9%）、1.4倍（15.6 ±0.8%）及び6.3倍（9.6 ±0.5%）に上昇した。当該結果は、本発明のコラーゲン担体が従来のコラーゲンコートよりも効率的に肝機能を維持できたことを示す。
Ahr遺伝子発現に関し、本発明のコラーゲン構造体での培養開始7日後において、低かったが、融解直後の凍結保存したPHHsと類似した。すなわち、Ahr遺伝子発現は、本発明のコラーゲン担体で培養することにより生体内の遺伝子発現動態に近くなることが示唆された。
本発明のコラーゲン担体での培養開始7日後のCAR、PXR及びHNF4α遺伝子発現は、従来のコラーゲンコートよりも顕著に高かった（それぞれ6.6倍（6.1 ± 0.8%）、1.5倍（42.1 ± 5.7%）及び1.4倍（57.0 ±2.9%）。
細胞−細胞外基質の相互作用を調べるための細胞接着因子の遺伝子発現に関する結果を図６に示す。インテグリンは細胞骨格と細胞外基質を繋ぐ膜貫通細胞接着タンパク質である。インテグリンα1及びβ1を介してコラーゲンと相互作用する。培養開始前は、インテグリンα1を除く全遺伝子の発現レベルが低レベル又は検出限界以下であった。インテグリンα2、α3、α5、α6、αV、β1及びβ3並びにDDR1発現は、培養開始3日後において、従来のコラーゲンコート（0.04 mg/cm2）での培養では異常に増加したのに対し、本発明のコラーゲン担体での培養では低発現レベルが維持された。
当該結果は、細胞接着分子の遺伝子発現は、本発明のコラーゲン担体で培養することにより生体内の遺伝子発現動態に近くなったことを示す。また、本発明のコラーゲン担体での培養は、インテグリン遺伝子の発現を抑制することにより、FAKシグナルの活性化を抑制し、脱分化及び肝機能低下を抑制したことを示す。
【実施例８】
【００６０】
［本発明のコラーゲン担体を使用したiPS細胞由来の肝細胞培養］
本実施例では、本発明のコラーゲン担体を使用したiPS細胞由来の肝細胞培養を行い、従来のコラーゲンコートを使用した培養と比較した。
【００６１】
＜材料＞
Corning（商標） Matrigel（商標） Growth Factor Reduced (GFR)Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10mL（Corning）を用いた。
【００６２】
＜方法＞
ヒトiPS細胞（Tic）の肝細胞誘導はSi-Tayeb, K. etal及びMallanna, Sunil K.and
DuncanStephen, Aを参考に条件改良を加えた4段階の誘導法を実施した。
具体的には、以下の方法で、本発明のコラーゲン担体の肝細胞培養の増殖を、従来のコラーゲンコート及びMatrigel（商標）を用いた従来の分化誘導法（Conv.）と比較した。
１．Matrigel（商標）をDMEM（Gibco, 11965-092）で30倍希釈し、48ウェルプレートに0.2ml/well加えて4℃で一晩静置し、Matrigel（商標）コートを形成した。
２．ヒトiPS細胞（Tic）をMatrigel（商標）コート上に播種し、Activin A（R&D systems,338-AC-050/CF）を含む分化誘導培地にて5日間培養し、胚体内胚葉を分化誘導した。
３．分化誘導5日目にCXCR4陽性細胞をMACS（ミルテニーバイオテク）によりポジティブセレクションし、Matrigel（商標）コート上に播種してBMP4（Pepro Tech, 120-05ET）及びFGF2（Sigma, F0291-25UG）を含む培地で5日間培養して肝性内胚葉を誘導した。
４．分化誘導10日目から5日間HGF（Pepro Tech, 100-39）を含む培地で肝幹前駆細胞を分化誘導した。
５．肝前駆細胞に当たる培養15日目に細胞塊を回収し、細胞塊（100,000 cells/well）を各種コラーゲン担体またはMatrigel（商標）コート上に播種した。
６．OSM（R&D systems, 295-OM-010/CF）を含む培地0.1〜0.15 mlで分化誘導31日目までの間、成熟培養を行い、肝細胞様細胞を分化誘導した。iPS細胞から分化誘導した肝細胞様細胞（iPS-Hep）を、従来の分化誘導法（Conv.）であるMatrigel（商標）、本発明のコラーゲン担体（2 mg/cm2）、又は従来のコラーゲンコート（0.04mg/cm2）上で培養した。
７．評価時期は誘導開始21、26、31日後とした。培養上清中のアルブミン分泌量を上記の実施例５と同様に定量し（n＝4）、薬物代謝酵素CYP3A4の酵素活性を上記の実施例６と同様に定量した（n＝4）。
８．肝関連遺伝子発現を上記の実施例７と同様に評価した（n＝4）。
【００６３】
＜結果＞
結果を図７に示す。
本発明のコラーゲン担体で増殖した細胞のアルブミン分泌量及びCYP3A 酵素活性は、従来のコラーゲンコート及び従来の分化誘導法のそれらと比較して、経時的な増加が認められた（図７Ａ、Ｂ)。
本発明のコラーゲン担体上で増殖した細胞の肝関連遺伝子の発現量は、従来のコラーゲンコート及び従来の分化誘導法での細胞の肝関連遺伝子の発現量と比較して、有意に増加していた（図７Ｃ）。より詳しくは、肝特異的タンパク質（ALB、AAT、TO）が有意に増加していた。また、薬物代謝酵素は、Phase2関連ではグルクロン酸抱合に関与するUGT1A1が有意に増加し、Phase3関連ではMRP2が有意に増加し、核内受容体ではAhRが増加していた。
以上により、本発明のコラーゲン担体上での肝細胞培養では、全ての細胞由来の肝細胞において、あるいは、ヒト初代培養肝細胞、ヒトiPS由来肝細胞様細胞、ES由来肝細胞様細胞、Muse由来肝細胞様細胞、MSC由来肝細胞様細胞及びヒト肝腫瘍由来細胞｛例えば、HepaRG（商標）等｝において、あるいは、ヒト初代培養肝細胞及びヒトiPS由来肝細胞様細胞において、肝細胞の機能を増強、維持、機能亢進及び／又は成熟亢進することができる。
【００６４】
［総論］
以上の通り、本発明のコラーゲン担体及び従来のコラーゲンコート上での培養によるPHHsの形態及び機能を比較し、表面をSEMを用いて観察し、横断面をTEMを用いて観察した。
上記実施例の本発明のコラーゲン担体を構成するコラーゲン構造体において従来の50倍のコラーゲン量を使用した（従来のコラーゲンコートのコラーゲン密度0.04 mg/cm2に対して本発明のコラーゲン構造体のコラーゲン密度2 mg/cm2）。従来のコラーゲンコート（コラーゲン密度0.04 mg/cm2）は、微細かつ平坦な表面から成り（図1(a)）、断面画像ではコラーゲン原線維は観察されなかった（図1(k)）。一方、本発明のコラーゲン構造体（コラーゲン密度2 mg/cm2）は、特徴的な（微小）ディンプル表面｛（Micro） dimpled surface：(M)DS｝構造を示した（図1(d)）。このディンプルは1 mg/cm2で観察されたが、0.2 mg/cm2atelocollagenでは観察されなかった。従って、0.2 mg/cm2以下と1 mg/cm2以上のコラーゲンの間には明確な差異が存在する。これはモチーフ解析の結果（図1(e)〜(j)）と細胞培養実験の細胞形態と肝機能における0.2と1 mg/cm2の間の明らかな差と一致した。したがって、本発明のコラーゲン構造体の表面構造は、細胞の挙動に大きな影響を及ぼすと考えられる。
本発明のコラーゲン構造体は特徴的なディンプルを表面に有するため、コラーゲンゲル又はコラーゲンビトリゲルとは明らかに異なる。本発明のコラーゲン構造体は、コラーゲン原線維及び（微小）ディンプルを有することを特徴とするコラーゲン足場である。
本発明のコラーゲン構造体の従来のコラーゲンコートと異なる構造は、PHHsの形態及び機能に影響を及ぼした。より詳しくは、本発明のコラーゲン構造体は、従来のコラーゲンコートと比較して、PHHsの肝機能を増強した。
CYP3A4は、薬物代謝に最も関係がある。よって、本発明のコラーゲン担体を用いた培養モデルは、薬物代謝及び薬物誘導肝損傷のリスクの評価の感受性を改善できる。従来のコラーゲンコート又はマトリゲルサンドイッチ培養モデルを用いた初代ラット肝細胞は、72時間の培養の間CYP1A2発現を顕著に低減した（Choi, H. J. & Choi, D. Successful mouse hepatocyte culture withsandwich collagen gel formation. J. Korean Surg. Soc. 84, 202-208(2013).）。しかし、本発明のコラーゲン担体を使用した培養方法は、融解した直後の凍結保存したPHHsと比較してCYP1A2発現を増強した。よって、本発明のコラーゲン担体は、CYP1A2関連薬物代謝及び毒性の高感度解析を可能にする。CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2C19及びCYP3A4は、現在流通する薬物の90％を代謝し、それらの活性は、本発明のコラーゲン担体を用いて培養した細胞で維持されている。よって、本発明のコラーゲン担体は、薬理学、毒物学、組織工学及び臨床肝細胞移植等の多分野の実験期間の短縮を可能とする。
Focaladhesion kinase（FAK）及びその下流シグナルは、インテグリンを介したコラーゲンへの細胞接着により活性化する。硬い乾燥したコラーゲン上で培養されたマウス初代肝細胞において、FAKはSrcを介して活性化され、ERK及びAktシグナル伝達を活性化した。Ras/Raf/ERK経路（MAPキナーゼ）の活性化は、脱分化及び上皮間葉転換を引き起こし、PI3K/Akt経路の活性化は、アポトーシス耐性をもたらすことが知られている（Godoy, P. et al. Extracellular matrix modulates sensitivity ofhepatocytes to fibroblastoid dedifferentiation and transforming growth factorb-induced apoptosis. Hepatology 49, 2031-2043 (2009).）。本発明のコラーゲン担体での細胞培養は、従来のコラーゲンコートでの細胞培養における知見と比較して、FAK活性化を抑制した。インテグリンとFAK活性化との関係は、例えば、ヒト水晶体上皮細胞において、インテグリンβ1の阻害によりFAKリン酸化が阻害されることが知られている（Liu, J. et al. Electric field exposure promotes epithelial-mesenchymaltransition in human lens epithelial cells via integrin β1-FAK signaling. Mol. Med. Rep. 16, 4008-4014 (2017).）。FAKリン酸化は、β1コンディショナルノックアウトマウスにおいて顕著に低下したことが知られている（Wang, Y. et al. β1-Integrin deletion fromthe lens activates cellular stress responses leading to apoptosis and fibrosis.Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 58, 3896-3922 (2017).）。よって、本発明のコラーゲン担体は、インテグリン発現を介してFAK活性化を低減し、脱分化を抑制していると考えられる。
以上より、本実施例の結果は、本発明のコラーゲン担体を構成するコラーゲン構造体の構造がPHHsの機能及び形態の変化を引き起こしたことを示唆している。更に、本発明のコラーゲン担体は、従来のコラーゲンコートと比較して、肝機能の増強に有用である。従来の共培養及び／又はサンドイッチ培養法は、本発明の培養方法よりも煩雑である。本発明のコラーゲン担体は、簡便で有用であり、PHHsの機能維持に優れた培養担体となる。
よって、本発明のコラーゲン担体は、薬剤開発、特にヒトの肝臓薬物代謝の評価、クリアランス、薬物間相互作用、トランスポーター活性及び肝毒性のための細胞培養の担体として有用である。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明のコラーゲン構造体及びコラーゲン担体は、薬剤開発、特にヒトの肝臓薬物代謝の評価、クリアランス、薬物間相互作用、トランスポーター活性及び肝毒性のための細胞培養の担体を提供できる。
【図１】
2019137639.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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