(57)【要約】      （修正有）【課題】埋め込み型バイオセンサーのプローブに適用するために、検体の内部への侵入は阻害せず、かつ、検体応答性酵素の外部への流出は防止する保護膜を提供する。【解決手段】バイオセンサーのプローブに有用な膜構造体として、検体応答性酵素を含む酵素層と、前記酵素層上に形成した保護膜と、を備え、前記保護膜はポリウレタンを含む、膜構造体を用いる。【選択図】図１
2019170701.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも検体応答性酵素を含む酵素層および前記酵素層上に形成した保護膜を備え、前記保護膜は、一般式（１）：
【化１】
2019170701.tif 000009
［式中、RおよびR’は有機基を示し、xは整数を示す。］で表されるポリウレタンを含む、膜構造体。
【請求項２】
前記検体応答性酵素がグルコース酸化酵素である、請求項１の膜構造体。
【請求項３】
前記グルコース酸化酵素が、牛血清アルブミンおよびグルタルアルデヒドにより膜に固定化されている、請求項１の膜構造体。
【請求項４】
絶縁性基板、前記絶縁性基板の両面に形成された導電性薄膜、前記絶縁性基板の表側の導電性薄膜上に形成された作用電極および参照電極、前記絶縁性基板の裏側の導電性薄膜上に形成された対極、前記作用電極上に形成された酵素層ならびに前記作用電極、参照電極、対極および酵素層を被覆する保護膜を備えるバイオセンサー用プローブであって、
前記酵素層は、少なくとも検体応答性酵素を含み、
前記導電性薄膜はパラジウムを含み、かつ、
前記保護膜は一般式（１）：
【化１】
2019170701.tif 000010
［式中、RおよびR’は有機基を示し、xは整数を示す。］で表されるポリウレタンを含む、バイオセンサー用プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、バイオセンサーを構成するプローブを保護する膜およびそのような保護膜が形成されたバイオセンサープローブに関する。より詳しくは、体内に挿入されるバイオセンサープローブを構成する酵素などの流出を防止することができる保護膜が形成されたバイオセンサープローブが提供される。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサーとは、生体分子の分子認識能を利用した電気化学センサーであり、例えば、酵素−基質、抗原−抗体、ホルモン−レセプターなどの組合せのうち一方を検体（測定対象物質）とし、他方を受容体としてセンシング部位に固定化し、検体とその受容体との間の分子認識反応によって発生する化学的な変化をトランスデューサーで電気信号に変換し、得られた電気信号の強さに応じて検体の量を測定する測定装置である。
【０００３】
バイオセンサーに用いる生体分子として、上記以外にも遺伝子、糖鎖、脂質、ペプチド、細胞、組織なども含まれる。なかでも、酵素を用いたバイオセンサーは最も開発が進んでおり、その代表例が、グルコース酸化酵素（Glucose oxidase; GOx）を用いたグルコースセンサーである。
【０００４】
グルコースセンサーは、概略、少なくとも、作用電極、その上に形成された検体応答性酵素を含む酵素層を含むプローブを有する。検査対象である皮下間質液中に含まれる検体（グルコース）が、酵素層まで到達すると、酵素中の補酵素の働きにより酵素反応が起こる。この酵素反応によりグルコースが酸化されてグルコノラクトンとなり、同時に、酸素が還元されて過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が生成される。検査対象に含まれるグルコース濃度を検出するためには、酸素消費量を酸素電極で測定するか、生成したＨ２Ｏ２の量を過酸化水素電極で測定する。過酸化水素電極を用いる測定方法において、酵素層内のGOxにより生成したＨ２Ｏ２は、作用電極上で、下式：
【０００５】
【数１】
2019170701.tif 000003
に従って酸化されて、電子が発生する。この発生した電子を電流値として測定する（図１）。
【０００６】
このようなグルコースセンサーは、糖尿病患者による自己血糖測定に用いられる。糖尿病治療には血糖値をコントロールすることが大切であり、血糖値に基づく適切なインスリン投与や食事制限を行う必要がある。そのために、一日に何度も血糖値を測定しなければならず、その都度血液採取をすることは患者に苦痛を強いることとなるので、生活の質（Quality of Life; QOL）を維持することが困難であった。
【０００７】
すでに埋め込み型アンペロメトリックグルコースセンサーが開発されている。このような埋め込み型アンペロメトリックグルコースセンサー1の本体10を生体2に貼り付けてプローブ11を生体内に挿入して継続的に血糖値の測定を行う（図２および３）。これにより、その都度血液採取することなく、長時間にわたり血糖値を測定することができる。
【０００８】
厚生労働省は、「平成9年遠隔診療通知（平成9年12月24日付け健政発第1075号厚生省健康政策局長通知）」を行い、遠隔診療の基本的考え方や医師法第20条等との関係から留意すべき事項を示した。その後、情報通信機器の開発・普及の状況を踏まえ、２０１５年８月１０日付けで情報通信機器を用いた診療（いわゆる「遠隔診療」）について各都道府県知事に向けて事務連絡を行った。２０１５年通知により、遠隔診療は事実上解禁され、２０１６年には情報通信機器3（スマートフォン）と専用アプリケーションを用いて、バイオセンサー1と無線データ通信する遠隔診療ツールが世の中に出回り始めた（図４）。さらに、２０１７年７月１４日付けで、遠隔診療の取扱いについて、再度周知、明確化する趣旨で通知（医政発0714第4号）が行われた。２０１５年通知によれば、遠隔診療は、当事者が医師および患者本人であることが確認できる限り、テレビ電話や、電子メール、ソーシャルネットワーキングサービス等の情報通信機器を組み合わせた遠隔診療についても、直接の対面診療に代替し得る程度の患者の心身の状況に関する有用な情報が得られる場合には、直ちに医師法第20条等に抵触するものではない、とした。この２０１７年通知によって、情報通信機器を利用した遠隔診療がさらに発展するであろう。したがって、埋め込み型センサーの需要はますます高まることが期待される。
【０００９】
特許文献１は、無線送信機を使用して、患者に取り付けて皮膚に挿入する電気化学センサー制御装置を開示し、無線送信機を使用して、収集した検体量に関するデータを表示装置に伝送する技術を記載している。また、特許文献１は、このような電気化学センサーに取り付けるビニルピリジンなどの複素環式窒素基を含む膜も開示する。これらの膜は、電気化学センサー中の作用電極への検体の拡散を制限する。膜を有さないグルコースセンサーでは、グルコースの酵素層への流量がグルコース濃度とともに直線的に増加し、酵素層に到達する全てのグルコースが消費されるうちは、測定される出力信号はグルコースの流量に線形比例するが、グルコースの消費が酵素層中で制限された場合、測定信号はグルコースの流量または濃度に線形比例せず、飽和が起こる。そこで、特許文献１では、ポリビニルピリジンなどの複素環式窒素基を含む拡散制限膜を酵素層上に形成して、グルコースの酵素層への流量を減少させることによって、センサーの飽和を防止する技術を採用している。
【００１０】
特許文献２は、少なくとも一つの親水性ブロックおよび少なくとも一つの疎水性ブロックを有する単一のブロックコポリマーを含む拡散バリアを開示し、この拡散バリアは特許文献１と同様に、電極システムの外側から酵素分子への分析物の拡散を制御するものである。また、このような酵素分子は、電極に固定化され酵素層を形成する。このような酵素層の製造は、例えば、特許文献３に開示されているように、作用電極に吸着や捕捉によって酵素を固定化し、グルタルアルデヒドなどで架橋することによってより強固に固定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表第2010-517054号明細書
【特許文献２】特表第2015-515305号明細書
【特許文献３】国際公開第2007/147475号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
埋め込み型センサーは、そのプローブを長時間体内に挿入するので、構成要素である検体応答性酵素が流出する機会が増大する。検体応答性酵素がセンサー外部に流出すれば、センサー感度が劣化するのみならず、生体に対して害を与えることとなる。また、検体応答性酵素が外部に流出すれば、センサーの耐久性も低下する。したがって、検体応答性酵素の流出を防止する対策が非常に重要である。
【００１３】
埋め込み型バイオセンサーのプローブを構成する検体応答性酵素の流出を防止するために、検体応答性酵素を含む酵素層の上に膜を形成することが望まれる。このような膜は、グルコースなどの検体が内部に侵入することを阻害するものであってはならない。そこで、本開示では、埋め込み型バイオセンサーのプローブに適用するために、検体の内部への侵入は阻害せず、かつ、検体応答性酵素の外部への流出を防止する保護膜およびそのような保護膜が形成されたバイオセンサープローブを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本開示は、バイオセンサーのプローブに有用な膜構造体として、少なくとも検体応答性酵素を含む酵素層および前記酵素層上に形成した保護膜を備え、前記保護膜は、一般式（１）：
【００１５】
【化１】
2019170701.tif 000004
で表されるポリウレタンを含む、膜構造体を提供する。
【００１６】
本発明で用いるポリウレタンは、一般式（２）：
【００１７】
【化２】
2019170701.tif 000005
で表されるジオールと、一般式（３）：
【００１８】
【化３】
2019170701.tif 000006
で表されるジイソシアネートとの反応により得ることができる。
【００１９】
この発明において、検体がグルコースであり、検体応答性酵素がグルコース酸化酵素である。グルコース酸化酵素は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）架橋膜やポリビニルアルコール架橋膜を形成して固定化する。例えば、ＢＳＡおよびグルタルアルデヒドを用いてグルコース酸化酵素を固定化することができる。
【発明の効果】
【００２０】
埋め込み型バイオセンサーのプローブを構成する酵素を含む酵素層の上に、本開示のポリウレタンを用いて保護膜を形成すれば、グルコースなどの検体が内部に侵入することを阻害せず、かつ、酵素層に含まれる検体応答性酵素が外部に流出することを防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】酵素反応による検体（グルコース）の測定原理を説明する概略図。
【図２】埋め込み型バイオセンサーが生体（人体）に取り付けられた状態を示す概略図。
【図３】生体（人体）に取り付けられた状態の埋め込み型バイオセンサーを示す断面図。
【図４】スマートフォンと測定データを無線通信する埋め込み型バイオセンサーの概略図。
【図５】本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサーのプローブの製造工程。
【図６】本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサーのプローブの製造工程。
【図７】本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサーのプローブの製造工程。
【図８】本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサーのプローブ表側の上面図。
【図９】図８におけるA-A’切断線での断面図。
【図１０】図９におけるB-B’切断線での断面図。
【図１１】図９におけるC-C’切断線での断面図。
【図１２】本開示の保護膜が形成されたプローブのグルコース応答特性を示すグラフ。
【図１３】本開示の保護膜が形成されたプローブの耐久性を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
１．埋め込み型バイオセンサーのプローブの製造方法
本開示の膜構造体を適用するある具体例の埋め込み型バイオセンサー1のプローブ11の製造方法を説明する。以下に示す構造および製造方法は、本開示のひとつの具体例であり、プローブとして用いることができれば、下記した構成に限定されるものではない。
【００２３】
（１）絶縁性基板の準備
埋め込み型バイオセンサー1は本体10とプローブ11を含み、プローブ11は、概略、生体内に挿入するセンシング部分およびバイオセンサー本体10の内部回路と電気的接続するための端子部分からなる鍵形状である。センシング部分は体内に挿入できるように細く形成され、端子部分はバイオセンサー本体10に挿入して電気的接続を形成するように一定の大きさを有する。したがって、まず、鍵形状の絶縁性基板111を準備する（図５ａ）。上段には表側から見た上面図を示し、下段には裏側から見た上面図を示す（以下、同様）。この絶縁性基板111は、生体内に挿入するプローブとして使用できる材料および厚さであれば、特に限定されることなく、例えば、約200 μm厚のポリエチレンテレフタレート (PET)を用いることができる。
（２）導電性薄膜の形成
絶縁性基板111の両面に、炭素または金、銀、白金もしくはパラジウムなどの金属よりなる群から選択される導電性金属材料をスパッタ法、蒸着法、イオンプレーティングなどにより堆積することによって導電性薄膜112を形成する（図５ｂ）。導電性薄膜の好ましい厚さは、10 nm〜数百nmである。
（３）電極リードの形成
絶縁性基板111の表側に形成した導電性薄膜112にレーザー描写することによって絶縁性基板111の表面に達する深さの溝113を形成して、作用電極リード112aと参照電極リード112bに分離して電気的絶縁する（図６ｃ）。
（４）絶縁性レジスト膜の形成
絶縁性基板111の表側に、作用電極114および参照電極115ならびに本体10と電気接続するための作用電極用端子114aおよび参照電極用端子115aとして用いる領域を除いた部分に、スパッタ法、スクリーン印刷法などにより、開口を有する絶縁性レジスト膜116aを形成し、絶縁性基板111の裏側に、対極117および本体10と電気接続するための対極用端子117aとして用いる領域を除いた部分に、スパッタ法、スクリーン印刷法などにより、開口を有する絶縁性レジスト膜116bを形成する（図６ｄ）。絶縁性レジスト膜の好ましい厚さは、5〜40 μmである。
（５）参照電極の形成
絶縁性基板111の表側に形成したレジスト膜116aの参照電極用の開口にAg/AgClをスクリーン印刷法やインクジェット法により堆積させて、参照電極115を形成する（図６ｅ）。参照電極の好ましい厚さは、5〜40 μmである。
（６）酵素層の形成
作用電極114の上に、検体応答性酵素を含む水溶液を塗布乾燥して、検体応答性酵素を含む酵素層118を形成する（図７ｆ）。本開示において、「検体応答性酵素」とは、検体の酸化または還元を特異的に触媒することのできる生化学物質を意味する。バイオセンサーの検出目的に使用できれば、いかなる生化学物質でもよい。例えば、グルコースを検体とする場合、適した検体応答性酵素は、グルコース酸化酵素（Glucose oxidase; GOx）やグルコース脱水酵素 (Glucose dehydrogenase; GDH)などである。酵素層の好ましい厚さは、5〜80 μmである。
（７）保護膜の形成
センシング部分を、保護膜用ポリマーを含む溶液に浸漬して、センシング部分の両面、側面および先端に保護膜119を形成する（図７ｇ）。保護膜119は、作用電極用端子114a、参照電極用端子115aおよび対極用端子117aを被覆することなく、少なくとも、作用電極114、参照電極115、対極117および酵素層118を被覆し、生体内に挿入される長さ以上に形成する。保護膜の好ましい厚さは、5〜200 μmである。
【００２４】
２．埋め込み型バイオセンサーのプローブの内部構造
本開示の膜構造体を適用する埋め込み型バイオセンサーのプローブの内部構造をさらに説明する。
【００２５】
図８のA-A’切断線での断面図を図９に示す。絶縁性基板111の両側に導電性薄膜112が形成されている。表側の導電性薄膜112では、溝113によって作用電極リード112aと参照電極リード112bの２つのリードに分離され、電気的に絶縁されている。作用電極リード112aの一部が作用電極114として機能し、作用電極114上に酵素層118が形成されている。また、絶縁性レジスト膜116aの開口部分に参照電極115が形成されて、参照電極リード112bと電気的に接続している。裏側の導電性薄膜112は対極リード112cとなり、その一部が対極117として機能する。
【００２６】
図９のB-B’切断線での断面図を図１０に示す。絶縁性基板111の表側に作用電極114が形成され、その上に酵素層118が形成され、裏側に対極117が形成されている。さらに、センシング部分の周囲全体が本開示の保護膜119で被覆されていることが分かる。
【００２７】
図９のC-C’切断面での断面図を図１１に示す。絶縁性基板111の表側に、溝113で電気的に分離された作用電極リード112aと参照電極リード112bとが形成され、その上に絶縁性レジスト膜116aが形成されている。絶縁性レジスト膜116aの開口部に参照電極115が形成されている。基板111の裏側に対極リード112cが形成され、その上に絶縁性レジスト膜116bが形成されている。さらに、センシング部分の周囲全体が本開示の保護膜119で被覆されていることが分かる。
【実施例】
【００２８】
［実施例１］
＜プローブの作製＞
（１）絶縁性基板の準備
図６ａに示すように、ポリエチレンテレフタレート (PET)（東レ株式会社製ルミラーR E20 #188; 189 μm厚）を裁断して、鍵形状の絶縁性基板を準備した。
【００２９】
（２）導電性薄膜の形成
図６ｂに示すように、前記絶縁性基板の両面に、スパッタ法によりパラジウムを堆積することによって、導電性薄膜（厚さ30 nm）を形成した。
【００３０】
（３）電極リードの形成
図６ｃに示すように、絶縁性基板の表側に形成した導電性薄膜にレーザー描写することによって絶縁性基板の表面に達する深さの溝を形成して、作用電極リードと参照電極リードに分離して電気的分離した。
【００３１】
（４）絶縁性レジスト膜の形成
図６ｄに示すように、絶縁性基板の表側に、作用電極および参照電極ならびに、埋め込み型バイオセンサーの本体と電気接続するための作用電極用端子および参照電極用端子として用いる領域を除いた部分に開口を有する絶縁性レジスト膜をスクリーン印刷法により形成し、絶縁性基板の裏側に、対極および本体と電気接続するための対極用端子として用いる領域を除いた部分に開口を有する絶縁性レジスト膜（厚さ10-15 μm）をスクリーン印刷法により形成した。
【００３２】
（５）参照電極の形成
図６ｅに示すように、絶縁性基板の表側に形成したレジスト膜の参照電極用の開口にAg/AgClをスクリーン印刷法により堆積させて、参照電極（厚さ10-15 μm）を形成した。
【００３３】
（６）酵素層の形成
図７ｆに示すように、絶縁性基板の表側に形成した絶縁性レジスト膜の開口部から露出した導電性薄膜を作用電極とし、その上に、牛血清アルブミン（Bovine serum albmin; BSA）溶液と、グルコースに対する検体応答性酵素としてグルコース酸化酵素（Glucose oxidase; GOD）の溶液とを塗布し、さらにグルタルアルデヒドを滴下後、乾燥して酵素層（厚さ15 μm）を形成した。
【００３４】
（７）保護膜の形成
図７ｇに示すように、センシング部分を、架橋剤およびポリウレタンを含むジオキソラン溶液に浸漬して、センシング部分の両面、側面および先端に保護膜（厚さ5-40 μm）を形成した。
より具体的には、ポリウレタン60 mgを溶媒（ジオキソラン）1 mLに溶かした溶液に、上記で製造したプローブを10分間隔で９回浸漬した。その後、室温にて12時間乾燥することによって、プローブ（サンプル１および２）を得た。
【００３５】
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
得られた２つのプローブを埋め込み型アンペロメトリックグルコースセンサーに取り付け、37℃のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS, pH7)中にプローブを設置した。このPBS溶液に500秒ごとにグルコースを50、100、200、300、400、500 mg/dLずつ添加して、継続的に電流応答値 (nA)を測定した。
グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１２に示し、表１にまとめた。
【００３６】
［耐久性］
得られた２つのプローブを37℃のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS, pH7)中で２週間保管した。保管前（１日目）および保管後に、２つのプローブのそれぞれを埋め込み型アンペロメトリックグルコースセンサーに取り付けて、37℃のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS, pH7)中にプローブを設置した。このPBS溶液に500 mg/dL添加して、継続的に電流応答値 (nA)を測定した。1日目のグルコース濃度500 mg/dLでの電流応答値を100%として、各保管期間での応答率 (%)を算出した。
保管２週間後の応答特性は、1日目応答値の80％以上を保ち、耐久性は良好であった。結果を図１３に示し、表２にまとめた。
なお、保管一日後よりも、数日後の応答率が高くなっているが、これは、ＰＢＳで十分に馴染んだことによると推測される。最高値を100％とした時の保管１５日後の応答率は、それぞれ、88.7％および72.5％であり、十分に高い値を維持している。
【００３７】
【表１】
2019170701.tif 000007
【００３８】
【表２】
2019170701.tif 000008
【００３９】
本開示のポリウレタンを用いた保護膜をプローブのセンシング部分に用いれば、グルコース応答性は良好であり、耐久性が向上することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本開示の少なくとも検体応答性酵素を含む酵素層および前記酵素層上に形成した保護膜を備えた膜構造体は、埋め込み型バイオセンサーのプローブに有用である。
【符号の説明】
【００４１】
1    埋め込み型バイオセンサー
10   本体
11   プローブ
111  絶縁性基板
112  導電性薄膜
112a 作用電極リード
112b 参照電極リード
112c 対極リード
113  溝
114  作用電極
115  参照電極
116  絶縁性レジスト
117  対極
118  酵素層
119  保護膜
2    生体
3    情報通信機器
【図１】
2019170701.tif 000011
【図２】
2019170701.tif 000012
【図３】
2019170701.tif 000013
【図４】
2019170701.tif 000014
【図５】
2019170701.tif 000015
【図６】
2019170701.tif 000016
【図７】
2019170701.tif 000017
【図８】
2019170701.tif 000018
【図９】
2019170701.tif 000019
【図１０】
2019170701.tif 000020
【図１１】
2019170701.tif 000021
【図１２】
2019170701.tif 000022
【図１３】
2019170701.tif 000023